(57)【要約】  ナノリザーバおよびその使用、特に医療機器、生体材料またはバイオプロテーゼの表面を被覆するためのナノリザーバの使用。
2020515304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノゲルのナノ粒子を含むナノリザーバであって、前記ナノゲルが、親水性骨格と１つ以上の反応性部分とを含む第２ポリマーに架橋された式Ｉ：
【化１】
2020515304.tif 000020
の第１ポリマーを含み、前記ナノリザーバが１つ以上の生物活性分子、治療用分子または薬物をさらに含む、ナノリザーバ。
【請求項２】
表面またはその一部が請求項１に記載のナノリザーバで被覆されている、生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項３】
前記ナノリザーバが抗生物質および／または抗血小板剤を含む、請求項１に記載のナノリザーバまたは請求項２に記載の生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項４】
前記親水性ポリマーまたはコポリマー骨格が、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリラート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリウレタンもしくはＰＥＧまたは高分子電解質（カチオン性、アニオン性もしくは両性イオン性）または親水性バイオポリマー（例えばキトサンまたはヒアルロナンなどの多糖類）の１つ以上を含み得る、請求項１〜３のいずれかに記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項５】
前記第１ポリマーがＰ（ｍＰＯＰＡ）である、請求項１〜４のいずれかに記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項６】
前記第２ポリマーがポリ（アリルアミン塩酸塩）である、請求項１〜５のいずれかに記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項７】
前記ナノ粒子が１００ｎｍ〜２５０ｎｍの直径を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項８】
前記ナノ粒子の少なくともいくつかが親水性官能化配位子で装飾されている、請求項１〜７のいずれかに記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項９】
前記親水性官能化配位子がチオールまたはビニル末端官能化配位子である、請求項８に記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項１０】
親水性官能化配位子が、ＰＥＧ２、または２０００を超える分子量を有するＰＥＧである、請求項９に記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項１１】
前記ナノリザーバが２つ以上のナノ粒子層を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のナノリザーバまたは生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項１２】
前記バイオプロテーゼが心臓弁である、請求項１〜１１のいずれかに記載の生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ。
【請求項１３】
少なくとも２種の生物活性分子、治療用分子または薬物を含むナノリザーバの作製方法であって、前記方法が
ｉ）水溶液中のＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を、１種の生物活性分子、治療用分子または薬物と混合する工程と、
ｉｉ）第１ナノゲル溶液を形成するために、工程ｉ）で得られた結果としてのＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨ溶液を添加する工程と、
ｉｉｉ）第２ナノゲル溶液を形成するために、第２生物活性分子、治療用分子または薬物を用いて工程ｉ）と工程ｉｉ）を繰り返す工程と、
ｉｖ）２種の生物活性分子、治療用分子または薬物を有するナノリザーバを得るために、前記第１および第２ナノゲル溶液を混合する工程と
を含む、方法。
【請求項１４】
被覆表面を有する医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼの製造方法であって、
ｉ）被覆されるべき表面を第１ポリマーの溶液中に浸漬する工程であって、前記第１ポリマーが式Ｉ： 
【化２】
2020515304.tif 000021
のポリマーを含む、工程と、
ｉｉ）前記第１ポリマーを酸化させる工程と、
ｉｉｉ）得られた表面を第２ポリマー溶液に浸漬する工程であって、前記第２ポリマーが親水性骨格と１つ以上の反応性部分とを含む、工程と、
ｉｖ）当該表面に被覆を生成するために、ナノゲルのナノ粒子を含むナノリザーバ溶液中に当該表面を浸漬する工程であって、前記ナノゲルは、親水性骨格と１つ以上の反応性部分とを含む第２ポリマーに架橋された式Ｉ：
【化３】
2020515304.tif 000022
の第１ポリマーを含む、工程と、
ｖ）場合により、親水性官能化配位子の溶液に当該被覆表面を浸漬する工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
工程ｉｖ）における前記ナノリザーバが請求項１および３〜１０のいずれかに定義された通りである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、工程ｉ）において前記第１ポリマーはＰ（ｍＤＯＰＡ）である、および／または工程ｉｉ）において前記酸化ポリマーはＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）である、および／または工程ｉｉｉ）において前記第２ポリマーはＰＡＨであり、工程ｉｖ）において前記ナノリザーバは架橋Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）およびＰＡＨのナノ粒子を含み、場合により以下：
【化４】
2020515304.tif 000023
の一方または両方の式を有する、および／または工程ｖ）において前記親水性官能化配位子はＰＥＧ２または２０００を超えるＭＷを有するＰＥＧである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノリザーバ、そのようなナノリザーバの作製方法およびその使用、特に医療機器を被覆するのに適したナノリザーバの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療機器および生体材料インプラントは、様々な用途で臨床的に使用され、その性能は患者の全体的な健康状態および生活の質にとって重要である。
【０００３】
ほとんどの医療機器は生体適合性の問題を引き起こす。重要なことに、血管系への異物の移植は凝固の接触経路を活性化し、血栓性合併症につながることがある。特に、現在最も広く使用されている心臓血管装置の１つである人工心臓弁の生体適合性および耐久性を改善することが医学的に必要とされている。機械的人工心臓弁は、血栓塞栓症および血栓性閉塞のかなりの危険性があり、しばしば慢性の抗凝固療法を必要とし、それがひいては出血性合併症の危険性の増大に関連する。対照的に、生体人工心臓弁は、抗凝固を伴わずに血栓塞栓症の危険性が低いにもかかわらず、その耐久性は石灰化または非石灰化の組織劣化によって制限される。
【０００４】
医療機器および生体材料も感染する可能性があり、そのような感染症の治療は一般に、全体的な構成要素／システムの除去、および原因となる細菌を標的とする抗生物質の投与を必要とする。
【０００５】
上記で強調したように、生体材料または医療機器の表面に固定または取り付けることができる得る抗菌性、抗バイオフィルム性、抗血栓性、抗炎症性および／または抗石灰化生成物の創製が必要とされている。
【０００６】
血液接触機器の生体適合性を改善するために、生体材料および医療機器の表面を改変するための試みが従来行われてきた。生体材料および医療機器の表面を抗菌特性を有する銀で被覆するなど、バクテリアによる生体材料汚染を防止するための表面修飾戦略も採用されてきた。しかしながら、これらの表面修飾はいずれも、例えば抗菌性、抗バイオフィルム性、抗血栓性および抗石灰化性の複合特性を提供しない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、生物活性化合物を取り込むために使用され得る、より大きな積荷スペースを提供するナノゲルなどのナノリザーバに関する。そのようなナノリザーバは、金属またはポリマーであるかまたはバイオプロテーゼであるかにかかわらず、任意の生体材料または医療機器の表面上に固定または取り付けることができ、それによって感染を低減または防止し、一時的または恒久的に移植された材料の生体適合性および血液適合性を改善してその機能性を維持し耐久性を向上させるのに役立つ。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、第１ポリマーと第２ポリマーとを含むナノリザーバが提供され、第１ポリマーは１つ以上のカテコール部分を有し、第２ポリマーは１つ以上の反応性部分を有する親水性骨格を含む。
【０００９】
ナノリザーバは、架橋された親水性ポリマーネットワークを有するヒドロゲルで構成されるナノゲルを好ましくは含むナノ粒子を指すことができる。ナノゲルは、ほとんどの場合、化学的または物理的に架橋されている合成ポリマーまたはバイオポリマーで構成される。ナノゲル中の細孔は、小分子または高分子で充填することができ、それらの特性（膨潤、分解、および化学官能性など）は制御することができる。
【００１０】
本発明の一実施形態では、ナノリザーバは、ナノゲルから形成されたナノ粒子を含む。ナノ粒子は、最長寸法が１０００ｎｍ未満（例えば、約１０ｎｍ〜３００ｎｍ）である任意の粒子である。例えば、ナノリザーバは、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満の最長寸法を有し得る。特定の実施形態において、本発明のナノリザーバは、約１５０ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有するナノ粒子を含む。特定の実施形態において、本発明のナノリザーバは、約１００〜約２５０ｎｍの直径を有するナノ粒子を含む。
【００１１】
好ましくは、本発明のナノリザーバ中のナノ粒子は、第１および第２ポリマーで作られている。第１および第２ポリマーは架橋されていてもよい。
【００１２】
第１ポリマーと第２ポリマーとの間の架橋は、アミン−キノン反応を含み得る。好ましくは架橋はラジカル重合を使用しない。
【００１３】
第１ポリマーは、式１：
【化１】
2020515304.tif 000003
に定義されるような構造を有してもよい。
【００１４】
カテコール部分は、ベンゼン１，２ジオールとしても知られる以下の構造を有し得る。
【化２】
2020515304.tif 000004
【００１５】
リンカーは、アルキルエステル、Ｎ−アルキルアミド、アルキル、またはアルコキシ基であり得る。
【００１６】
親水性ポリマーまたはコポリマー骨格は、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリラート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリウレタンもしくはＰＥＧまたは高分子電解質（カチオン性、アニオン性もしくは両性イオン性）または親水性バイオポリマー（例えばキトサンまたはヒアルロナンなどの多糖類）の１つ以上を含み得る。
【００１７】
第１ポリマーは、ポリＤＯＰＡ、例えば以下に示すようにＰ（ｍＤＯＰＡ）とも呼ばれるポリ（Ｎ−メタクリロイル３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル）であり得る。
【化３】
2020515304.tif 000005
【００１８】
使用前に、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を酸化して、以下に示すようにＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を形成することができる。
【化４】
2020515304.tif 000006
【００１９】
第１ポリマーは、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）、またはポリＤＯＰＡ、または親水性モノマー（カチオン性、アニオン性、両性イオン性モノマー、または中性水溶性モノマー）とのそれらのコポリマーであり得る。好ましい実施形態において、第１ポリマーはＰ（ｍＤＯＰＡ）コポリマーである。
【００２０】
第２ポリマーにおいて、親水性骨格は、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリラート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリウレタン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、一級もしくは二級アミンまたはチオールなどの反応性基を有する高分子電解質（カチオン性、アニオン性または両性イオン性）、または親水性バイオポリマー（例えばキトサンまたはヒアルロナンなどの多糖類）の１つ以上を含み得る。
【００２１】
反応性部分は、一級もしくは二級アミンまたはチオールであり得る。
【００２２】
第２ポリマーは、第１級アミン官能基を有する天然または合成ポリマー、例えばポリビニルアミン、キトサンまたはタンパク質であり得る。好ましい実施形態では、第２ポリマーは、以下に示すように、ＰＡＨとしても知られるポリ（アリルアミン塩酸塩）などのポリアリルアミンを含んでもよい。
【化５】
2020515304.tif 000007
【００２３】
好ましい実施形態では、ナノリザーバは、架橋Ｐ（ｍＤＯＰＡ）およびＰＡＨから形成されたナノ粒子を含み、これらは、以下の結合の一方または両方を含む。
【化６】
2020515304.tif 000008
【００２４】
好ましい実施形態では、ナノリザーバは、架橋された第１および第２ポリマーのナノ粒子に加えて、１つ以上の生物活性分子、治療用分子または薬物を含む。
【００２５】
ナノリザーバには、生物活性分子、治療用分子、あるいは抗生物質、抗バイオフィルム形成剤、抗血小板剤、抗凝固剤、抗血栓剤および抗石灰化剤を含む薬物などの１つ以上の生物活性剤が装填され得る。生物活性剤は、ナノリザーバ内のナノ粒子内および／またはナノリザーバ内のナノ粒子間に位置してもよい。
【００２６】
生物活性剤は、治療効果のためなど、分子または細胞機能を調節あるいは改変するために、分子、細胞、組織または器官に送達されることが望まれる任意の薬剤を含み得る。生物活性剤には、薬学的に活性な化合物または診断用化合物が含まれるが、それらに限定されない。生物活性化合物には、限定されるものではないが、ヌクレオチド（アプタマー、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アポタンパク質、糖タンパク質、抗原およびその抗体もしくは抗体フラグメント、受容体および他の膜タンパク質、レトロインベルソオリゴペプチド、少なくとも１つの非ペプチド結合がペプチド結合を置換するタンパク質類似体、酵素、補酵素、酵素阻害剤、アミノ酸およびそれらの誘導体、ホルモン、脂質、リン脂質、リポソーム、リシンまたはリシンフラグメント；アフラトキシン、ジゴキシン、キサントトキシン、ルブラトキシンなどの毒素；アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンなどの鎮痛薬；テオフィリン、アルブテロールなどの気管支拡張剤；プロプラノロール、メトプロロール、アテノロール、ラベトロール、チモロール、ペンブトロール、ピンドロールなどのβ遮断薬；上記のものならびにシプロフロキサシン、シノキサシンおよびノルフロキサシンなどの抗菌剤；クロニジン、メチルドパ、プラゾシン、ベラパミル、ニフェジピン、アプトプリル、エナラプリルなどの降圧剤；抗不整脈薬、強心配糖体、抗狭心症薬、血管拡張薬を含む心血管薬：興奮剤、向精神薬、抗躁薬、抗鬱薬を含む中枢神経系薬；抗ウイルス剤；クロルフェニラミン、ブロムフェニラミンなどの抗ヒスタミン薬；クロラムブシル、カルボプラチン、ブスルファン誘導体、ドキソルビシン、エトポシド、トポテカン（ＴＰＴ）などの化学療法剤を含む制癌剤；ジアゼパム、コルジアゼポキシド（ｃｈｏｒｄｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）、オキサゼパム、アルプラゾラム、トリアゾラムなどの精神安定剤、フルオキセチン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、イミプラミンなどの抗鬱剤、ニザチジン、シメチジン、ファモチジン、ラニチジンなどのＨ−２アンタゴニスト；抗けいれん薬；抗嘔吐剤；プロスタグランジン；筋弛緩剤；抗炎症物質；刺激剤；鬱血除去薬；制吐剤；利尿薬；鎮痙薬；抗喘息薬；抗パーキンソン剤；去痰剤；せき抑制剤；粘液溶解薬；ビタミン；ミネラルおよび栄養添加物が含まれる。他の分子は、ヌクレオチド；オリゴヌクレオチド；ポリヌクレオチド；例えばメチル化ポリヌクレオチド、ホスホロチオアート結合を有するヌクレオチド類似体を含む当技術分野で認識されている生物学的に機能的なそれらの類似体および誘導体；プラスミド、コスミド、人工染色体、その他の核酸ベクター；少なくとも１つの内因性核酸に実質的に相補的なもの、または選択されたウイルスもしくはレトロウイルスゲノムの少なくとも一部とは反対の意味を持つ配列を有するものを含むアンチセンスポリヌクレオチド；プロモーター；エンハンサー；阻害剤；遺伝子の転写および翻訳を調節するための他の配位子を含む。
【００２７】
生物活性剤は抗感染剤であり得る。抗感染剤には、限定されるものではないが、抗生物質、例えばアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドルペネム（ｄｏｒｐｅｎｅｍ）、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロキシル（ｃｅｆｐｒｏｘｉｌ）、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セドフィトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダイババンシン（ｄａｉｂａｖａｎｃｉｎ）、オリタバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、リネゾリド、アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフラキシシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、銀スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニリミド、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、デメクロサイリン（ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｌｉｎｅ）、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、リファンピシン、リファブチン、アルスペナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、メトロニダゾール、チアンフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、およびトリメトプリムが含まれる。
【００２８】
抗バイオフィルム形成剤には、限定されるものではないが、ヒトカテリシジンＬＬ−３７またはウシペプチドインドリシジンなどの天然ペプチド、または１０１８などの合成ペプチド、２−アミノイミダゾール部分を有する天然化合物、２−アミノイミダゾール系阻害剤、ベンズイミダゾール類似体、インドール−トリアゾ−アミド類似体、エモジン、フロレチン、カスバンジテルペン、レスベラトロールおよびそのオリゴマーなどの植物由来バイオフィルム抑制剤、硫黄誘導体、臭素化フラノン類似体、ブロモピロールアルカロイド、スカイラマイシンおよび（−）−アジェロキシムＤ構造、センブラノイド、Ｎ−アシルホモセリンラクトン類似体、カロラクトン、アミロイド様繊維の形成を妨害する分子、脂肪酸、一酸化窒素供与体、１−アルキル−３−メチルイミダゾリウムクロリドなどのイオン液体、１−アルキルキノリニウムブロミドが含まれ、これら全ての薬剤は従来の抗生物質と組み合わせて使用することができる。
【００２９】
抗血小板剤には、限定されるものではないが、アスピリンおよびトリフルサール（Ｄｉｓｇｒｅｎ）などの不可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害剤、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ）、プラスグレル（Ｅｆｆｉｅｎｔ）、チカグレロル（Ｂｒｉｌｉｎｔａ）、チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ）などのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤、シロスタゾール（Ｐｌｅｔａｌ）などのホスホジエステラーゼ阻害剤、ボラパキサール（Ｚｏｎｔｉｖｉｔｙ）などのプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）アンタゴニスト、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）、エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）、チロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）などの糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤（静脈内投与のみ）、ジピリダモール（Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ）などのアデノシン再取り込み阻害剤、トロンボキサンシンターゼ阻害剤、テルトロバンなどのトロンボキサン受容体アンタゴニスト、Ｒｅｖａｃｅｐｔなどの糖タンパク質ＶＩ阻害剤、糖タンパク質Ｉｂ阻害剤およびフォンウィルブランド因子阻害剤が含まれる。
【００３０】
抗凝固剤としては、限定されるものではないが、アセノクマロール、クマテトラリル、ジクマロール、ビスクマ酢酸エチル、フェンプロクモン、ワルファリン、クロリンジオン、ジフェナジオン、フェニンジオン、チクロマロール、ベミパリン、セルトパリン、アルデパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、ダビガトラン、  アピキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン、アルテプラーゼ、ダナパロイド、チンザパリン、およびフォンダパリヌクスが含まれる。
【００３１】
血栓溶解剤としては、限定されるものではないが、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、サルプラーゼ、ウロキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アンクロッド、ブリナーゼおよびフィブリノリシンが挙げられる。
【００３２】
石灰化防止剤としては、限定されるものではないが、ビスホスホナート、アルミニウム塩、グルタルアルデヒド、アミノオレイン酸、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明のナノリザーバは、架橋した第１および第２ポリマーのナノ粒子、ならびに少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２種の生物活性分子、治療用分子および／または薬物を含む。ナノリザーバは、抗血小板剤および／または抗生物質を含み得る。生物活性分子、治療用分子または薬物は、ナノ粒子内に封入されていてもよく、および／またはナノ粒子の反応性部分に共有結合していてもよい。
【００３４】
ナノリザーバは、約１部の抗生物質と約５部の抗血小板剤、または約２部の抗生物質と約３部の抗血小板剤の比率で抗生物質および抗血小板剤を含み得る。
【００３５】
さらなる実施形態では、親水性官能化配位子は、集合した架橋ナノゲルナノ粒子上にグラフトされてもよい。親水性配位子はチオールまたはビニル末端官能化配位子を含んでもよい。官能化配位子は、１つ以上のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分子および／または１つ以上のビニル末端官能化ＰＥＧ配位子、例えばＰＥＧ−アクリラート分子を含み得る。ＰＥＧが使用される場合、ＰＥＧは、ＰＥＧ１．５（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ、Ｍｗ２，０００）、ＰＥＧ２（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ、Ｍｗ２，０００）、ＰＥＧ５（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ、Ｍｗ５，０００）またはＰＥＧ１０（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ、Ｍｗ１０，０００）であり得る。ＰＥＧ−アクリラート（ＡＰＥＧ）が使用される場合、分子は、ＡＰＥＧ（ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリラート、Ｍｗ４８０）またはＡＰＥＧ１（ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリラート、ＭＷ１，０００）であり得る。官能化配位子はポリベタインも含み得る。好ましい実施形態において、少なくともＰＥＧ２、またはより高い分子量を有するＰＥＧが官能化配位子として使用される。
【００３６】
親水性配位子を有するナノ粒子を含むナノリザーバは、親水性配位子を含まないナノゲルナノ粒子と比較した場合、血小板および細菌に対して抗付着特性を示すことが好ましい。
【００３７】
好ましくは、親水性配位子は、ナノゲルナノ粒子の形成後に添加され、ナノ粒子表面上に取り付けられる。
【００３８】
したがって、本発明は、第１ポリマーと第２ポリマーとを含むナノ粒子を含むナノリザーバを提供し、１つ以上のカテコール部分を有する第１ポリマーは、１つ以上の反応性部分を有する親水性骨格を含む第２ポリマーに架橋され、ナノ粒子は、親水性の配位子で表面を装飾されている。
【００３９】
別の態様によれば、本発明は、２層以上のナノゲルを含むナノリザーバを提供する。ナノゲルの各層は、本明細書に記載のようにナノ粒子を含み得る。各層は同じでも異なっていてもよい。例えば、１つの層は生物活性剤を含み得る。１つの層は、異なる生物活性分子を装填したナノゲルを含み得る。あるいは、異なる層が異なる生物活性剤を含み得る。ナノリザーバは、ナノゲルのナノ粒子の２、３、４、５またはそれ以上の層を含み得る。多層ナノリザーバを使用することによって、ナノリザーバの抗血栓特性および／または抗バイオフィルム特性を改善することができる。ナノゲルの複数の層の存在は、ナノリザーバ内からの生物活性剤の放出を延長し得る。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明のナノリザーバは、少なくとも５層のナノゲルのナノ粒子を含み、少なくとも最上層のナノ粒子は官能化配位子を有する。ナノリザーバは少なくとも２、３、４、５またはそれ以上の層を含むことができ、ここで少なくとも１、２、３、４または５つの層は生物活性分子、治療用分子または薬物、例えば抗菌剤および／または抗−血小板剤を含み、その最上層に官能化配位子を有する。抗菌剤はミノサイクリンであり得る。抗血小板剤はチカグレロルであり得る。官能化配位子は、ＰＥＧ２または約２０００以上のＭＷを有するＰＥＧ分子であり得る。
【００４１】
本発明のナノリザーバは、ナノリザーバに組み込まれた生物活性剤によって、および／またはナノ粒子を製造するのに使用された化学組成物の結果として与えられる抗菌性および／または抗血栓性／抗血小板性を有し得る。
【００４２】
本発明のさらなる態様において、本発明のナノリザーバは、例えば生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼの表面を被覆するための被覆物として使用することができる。
【００４３】
またさらなる態様では、本発明は、その表面の少なくとも一部が本発明によるナノリザーバで被覆された生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼを提供する。
【００４４】
生体材料インプラントは、人工関節、ペースメーカー、植込み型除細動器、血管内カテーテルまたは尿道カテーテルを含むカテーテルまたは材料、冠状動脈ステントを含むステント、機械的および生物学的人工心臓弁、眼内レンズ、歯科用インプラントなど、宿主哺乳動物における臨床使用のための植込み型異物であり得る。好ましい実施形態では、生体材料インプラントはバイオプロテーゼである。
【００４５】
医療機器は、限定されるものではないが、医学またはヒトもしくは獣医学の診療に関連する、または疾患もしくは状態を治すまたは治療するための使用を意図した任意の装置、道具、器具、インプラントなどを含む。医療機器は、全ての天然材料および合成材料、ならびに繊維状材料および非繊維状材料の両方を含み得る。例えば、材料は、金属、プラスチック、紙、ガラス、セラミック、布地、ゴム、ポリマー、複合材料または他の任意の材料または材料の組み合わせから構成されてもよい。例示的な医療機器としては、限定されるものではないが、任意の種類のカテーテル；カニューレ；針；任意のサイズ、形状、または配置のステント；任意のサイズ、形状、または配置のコイル；コンタクトレンズ；  ＩＵＤ；蠕動ポンプチャンバ；気管内チューブ；胃腸栄養チューブ；動静脈シャント；コンドーム；人工肺および腎臓膜；手袋；ペースメーカーリード；創傷ドレッシング；金属製のピン、プレートおよびネジ；金属製人工股関節；人工膝；ゲル；クリームおよび軟膏が含まれる。
【００４６】
バイオプロテーゼは、限定されるものではないが、生物学的材料で作られたプロテーゼを含む。例としては、心臓弁、心膜、血管移植片、膀胱プロテーゼ、腱プロテーゼ、ヘルニアパッチ、外科用メッシュおよび代用皮膚が挙げられる。一実施形態では、本発明のナノリザーバを使用して、バイオプロテーゼ心臓弁、例えば脱細胞化ブタ心臓弁またはウシ心膜を被覆することができる。別の態様では、本発明はバイオプロテーゼ心臓弁、例えば本発明のナノリザーバで被覆された脱細胞化ブタ心臓弁またはウシ心膜を提供する。
【００４７】
本発明の一実施形態では、本発明のナノリザーバは、エレクトログラフト（モノマーの存在下で金属表面を分極することによる重合の電気的開始）、表面照射、レイヤーバイレイヤー（ＬｂＬ）集合体、スピンコーティング、化学蒸着（ＣＶＤ）、レーザ蒸着、血液タンパク質、ムール貝にヒントを得た被覆、植物性フェノール（Ｑｉａｎｇ  ＷｅｉおよびＲａｉｎｅｒ  Ｈａａｇ、２００５、Ｍａｔｅｒ．Ｈｏｒｉｚ．２０１５，２：５６７−５７７、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ユニバーサルポリマーコーティングおよびそれらの代表的な生物医学的用途））などの様々な物理的または化学的戦略を用いて医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼの表面に固定または取り付けることができる。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、第１ポリマーと第２ポリマーとを架橋させることによって形成されたナノリザーバが提供され、第１ポリマーは１つ以上のカテコール部分を有し、第２ポリマーは１つ以上の反応性部分を有する親水性骨格を含む。ポリマーは、１つ以上の生物活性剤の存在下で架橋されて、その中に捕捉された生物活性剤と共に第１および第２ポリマーを含むナノ粒子を生成し得る。
【００４９】
なおさらなる態様において、１つ以上のカテコール部分を有する第１ポリマーを、１つ以上の反応性部分を有する親水性骨格を含む第２ポリマーで架橋することを含む、ナノリザーバを形成する方法が提供される。製造されたナノリザーバは、好ましくは架橋ポリマーのナノ粒子を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、ナノリザーバの作製方法は、
ｉ）Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を得る工程と、
【化７】
2020515304.tif 000009
ｉｉ）Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液を形成するために、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を酸化させる工程と、
【化８】
2020515304.tif 000010
ｉｉｉ）Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨ溶液を添加する工程と、
【化９】
2020515304.tif 000011
ｉｖ）次式のナノ粒子のナノゲル溶液を形成するために、ｉｉ）およびｉｉｉ）の化合物を架橋する工程と、
【化１０】
2020515304.tif 000012
を含む。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも２種の生物活性分子、治療用分子または薬物を含むナノリザーバの作製方法を提供し、その方法は
ｉ）水溶液中のＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を、１種の生物活性分子、治療用分子または薬物と混合する工程と、
ｉｉ）第１ナノゲル溶液を形成するために、ｉ）で得られた結果としてのＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨ溶液を添加する工程と、
ｉｉｉ）第２ナノゲル溶液を形成するために、第２生物活性分子、治療用分子または薬物を用いて工程ｉ）およびｉｉ）を繰り返す工程と、
ｉｖ）２種の生物活性分子、治療用分子または薬物を有するナノリザーバを得るために、第１および第２ナノゲル溶液を混合する工程と
を含む。
【００５２】
ナノリザーバは、第１生物活性分子、治療用分子または薬物を装填したナノゲルと、第２生物活性分子、治療用分子または薬物を装填したナノゲルとの比が、第１生物活性分子、治療用分子または薬物が約１部、および第２生物活性分子、治療用分子または薬物が約５部の間であるか、または第１生物活性分子、治療用分子または薬物が約２部、第２生物活性分子、治療用分子または薬物が約３部で構成され得る。
【００５３】
第１生物活性分子、治療用分子または薬物は抗生物質であり得る。第２生物活性分子、治療用分子または薬物は抗血小板剤であり得る。
【００５４】
別の態様によれば、本発明は、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼの表面を本発明によるナノリザーバで被覆することを含む、被覆表面を有する医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼの製造方法を提供する。
【００５５】
方法は、
ｉ）被覆されるべき表面を第１ポリマーの溶液に浸漬する工程と、
ｉｉ）第１ポリマーを酸化させる工程と、
ｉｉｉ）得られた表面を第２ポリマー溶液に浸漬する工程と、
ｉｖ）表面に被覆を形成するために、本明細書に記載のナノリザーバの溶液に表面を浸漬する工程と、
ｖ）場合により、親水性官能化配位子の溶液に被覆表面を浸漬する工程と
を含み得る。
【００５６】
第１ポリマーはＰ（ｍＤＯＰＡ）であり得る。第１ポリマーの酸化形態は、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）であり得る。第２ポリマーはＰＡＨであり得る。
【００５７】
工程ｉｖ）におけるナノリザーバは、第１ポリマーと第２ポリマーとを架橋することによって形成されたナノゲルのナノ粒子を含み得る。第１ポリマーはＰ（ｍＤＯＰＡ）であり得、第２ポリマーはＰＡＨであり得る。
【００５８】
工程ｉｖ）におけるナノリザーバは、１つ以上、好ましくは２つ以上の生物活性分子、治療用分子および／または薬物を含み得る。生物活性分子は、抗生物質および／または抗血小板剤を含み得る。
【００５９】
２層以上のナノ粒子を含むナノリザーバで表面を被覆された医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼは、上記方法の工程ｉｉｉ）およびｉｖ）を繰り返すことによって製造され得る。２、３、４、５またはそれ以上の層を含むナノリザーバを製造することができる。
【００６０】
バイオプロテーゼは人工心臓弁であり得る。
【００６１】
本発明の方法は、医療機器、生体材料インプラントもしくはバイオプロテーゼの表面の一部のみ、または医療機器、生体材料インプラントもしくはバイオプロテーゼの実質的に全体もしくは全体の表面を被覆するために使用され得る。
【００６２】
本発明はさらに、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼを対象に移植する際に感染の予防または低減に使用するための、本発明によるまたは本発明の方法によって製造される被覆された医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼを提供する。
【００６３】
本発明はさらに、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼを対象に移植する際に感染の予防または低減に使用するための、本発明によるまたは本発明の方法によって製造されるナノリザーバを提供する。対象は哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、医療機器、生体材料インプラント、またはバイオプロテーゼの表面をナノリザーバで被覆する方法が提供され、この方法は、
ｉ）被覆されるべき表面をＰ（ｍＤＯＰＡ）の溶液に浸漬する工程と、
ｉｉ）Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を形成するために、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を酸化させる工程と、
ｉｉｉ）得られた表面をＰＡＨ溶液に浸漬する工程と、
ｉｖ）表面を本発明によるナノリザーバの溶液に浸漬する工程と、
ｖ）場合により、得られた被覆表面を親水性官能化配位子の溶液に浸漬する工程と
を含む。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼの表面を、２つ以上の異なる生物活性分子、治療用分子または薬物を含むナノリザーバで被覆する方法が提供され、方法は、
ｉ）表面をｐ（ｍＤＯＰＡ）の溶液に浸漬する工程と、
ｉｉ）Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を形成するために、ｐ（ｍＤＯＰＡ）を酸化させる工程と、
ｉｉｉ）得られた表面をＰＡＨ溶液に浸漬する工程と、
ｉｖ）表面を、２つ以上の生物活性分子、治療用分子または薬物を含有する本発明によるナノリザーバの溶液中に浸漬する工程と、
ｖ）多層被覆を構築するために、工程ｉｉｉ）およびｉｖ）を少なくとも３、４または５回繰り返す工程と、場合により、
ｖｉ）被覆表面を親水性官能化配位子の溶液に浸漬する工程と
を含む。
【００６６】
さらなる態様によれば、本発明による少なくとも２、３、４、５、６またはそれ以上の層を含むナノリザーバで少なくとも部分的に被覆された人工心臓弁などの生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼが提供される。ナノリザーバの少なくとも１つの層は、少なくとも２種の生物活性分子、治療用分子または薬物を含むことが好ましい。好ましくは、ナノリザーバの最外層は本発明による官能基を有する。
【００６７】
本発明のさらなる態様によれば、生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼ上の被覆物として使用するための、第１ポリマーと第２ポリマーとを架橋させることによって形成されたナノリザーバが提供され、第１ポリマーは１つ以上のカテコール部分を有し、第２ポリマーは１つ以上の反応性部分を有する親水性骨格を含み、場合により、ナノリザーバは１つ以上の生物活性分子、治療用分子または薬物を含む。
【００６８】
本発明の別の態様によれば、少なくとも式Ｉ：
【化１１】
2020515304.tif 000013
のポリマーを含むナノゲルを含むナノリザーバが提供され、親水性ポリマー骨格は、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリラート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリウレタンもしくはＰＥＧまたは高分子電解質（カチオン性、アニオン性もしくは両性イオン性）または親水性バイオポリマー（例えばキトサンまたはヒアルロナンなどの多糖類）の１つ以上を含む。
【００６９】
本発明のさらなる態様によれば、式Ｉ：
【化１２】
2020515304.tif 000014
のポリマーを架橋させることによって形成されたナノゲルを含むナノリザーバが提供され、親水性ポリマー骨格は、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリラート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリウレタンもしくはＰＥＧまたは高分子電解質（カチオン性、アニオン性もしくは両性イオン性）または親水性バイオポリマー（例えばキトサンまたはヒアルロナンなどの多糖類）の１つ以上を含む。
【００７０】
本発明のさらなる態様では、本発明によるナノリザーバは、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼ上の被覆組成物に使用することができる。
【００７１】
本発明のさらなる態様では、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼ上の被覆物としての本発明によるナノリザーバの使用が提供される。
【００７２】
本発明のさらなる態様では、医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼ上の被覆組成物としての本発明によるナノリザーバの使用が提供される。
【００７３】
本発明の別の態様では、ナノリザーバは医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼ上の被覆組成物に使用することができ、ここでナノリザーバは１つ以上の生物活性化合物または薬物を含む。
【００７４】
さらなる態様では、本発明は、表面上に本発明のナノリザーバを有する医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼを提供する。医療機器、生体材料インプラントまたはバイオプロテーゼの表面は、本発明のナノリザーバで被覆されていてもよい。
【００７５】
生体材料インプラント、医療機器もしくはバイオプロテーゼ、またはそれらの一部は、生体材料インプラント、医療機器もしくはバイオプロテーゼを本発明のナノリザーバを含む溶液に浸漬することによって、または本発明のナノリザーバを含む溶液を生体材料インプラント、医療機器もしくはバイオプロテーゼに噴霧することによって、本発明のナノリザーバで被覆することができ、その後、被覆した生体材料インプラント、医療機器またはバイオプロテーゼを乾燥させる。
【００７６】
本発明では、ナノリザーバは、血小板および細菌の両方に対して抗付着性であるように構成することができ、また、治療用分子または活性分子の周囲組織への送達速度を制御する関連する被覆の有無で生物学的および非生物学的活性分子（例えば、薬物、生物製剤）などの治療用および／または活性分子を保存および／または送達するために構成することができる。送達速度は、少なくとも１日、２日、３日、７日の放出期間にわたってもよく、一方、抗付着効力は少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月維持されるであろう。
【００７７】
好ましい実施形態では、ナノリザーバは抗生物質および抗血小板剤を含有する。さらに好ましい実施形態では、ナノリザーバはミノサイクリンおよびチカグレロルを含有する。好ましい実施形態では、ナノリザーバは抗バイオフィルム形成剤および抗凝固剤を含有する。好ましい実施形態では、ナノリザーバは、抗バイオフィルム形成剤および抗血小板剤を含有する。
【００７８】
本発明の別の態様によれば、
（ｉ）１つ以上の生物活性分子または薬物の存在下で水溶液中でキノン官能化ポリマーを混合する工程と、
（ｉｉ）ナノゲル溶液を形成するために、ポリマー溶液を水溶液に添加する工程であって、ポリマーがポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリラート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリウレタンもしくはＰＥＧまたは高分子電解質（カチオン性、アニオン性もしくは両性イオン性）または親水性バイオポリマー（例えばキトサンもしくはヒアルロナンなどの多糖類）の１つ以上から選択される、工程と
を含むナノリザーバの作製方法が提供される。
【００７９】
本発明の他の態様によれば、
（ｉ）水溶液中のキノン官能化ポリマーＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を１つ以上の生物活性分子、治療用分子または薬物と混合する工程と、
（ｉｉ）ナノゲル溶液を形成するために、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨ溶液を添加する工程と
を含むナノリザーバの作製方法が提供される。
【００８０】
本発明の好ましい態様では、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を形成するためにｐ（ｍＤＯＰＡ）を酸化させる最初の工程がある。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態では、ナノゲル溶液を凍結乾燥させる追加の工程がある。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態では、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液および／またはＰＡＨ溶液は、少なくとも８、好ましくは少なくとも１０のｐＨを有する。
【００８３】
本発明はまた、
（ｉ）酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を生成するために、第１ポリマー、例えば３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを有するメタクリルアミド（Ｐ（ｍＤＯＰＡ））を蒸留水中に溶解する工程と、
（ｉｉ）酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＮａＯＨ（０．１Ｍ）を室温で添加する工程と、
（ｉｉ）室温で少なくとも１時間激しく撹拌しながら、酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液に約ｐＨ１０のＰＡＨ溶液を添加する工程と
を含むナノゲルの作製方法を提供する。
【００８４】
好ましくは工程（ｉｉ）において、ＮａＯＨおよび酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を少なくとも６時間、好ましくは一晩混合する。好ましくは、溶液のｐＨは１０以上である。
【００８５】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を生成するために、生物活性分子または薬物の存在下で蒸留水に３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを有するメタクリルアミド（Ｐ（ｍＤＯＰＡ））を６℃で１時間溶解する工程と、
（ｉｉ）酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＮａＯＨ（０．１Ｍ）を室温で一晩添加する工程と、
（ｉｉ）６℃で一晩激しく撹拌しながら、酸化Ｐ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にｐＨ１０のＰＡＨ溶液を添加する工程と
を含むナノゲルの作製方法が提供される。
【００８６】
本発明の別の態様によれば、本発明の任意の方法によって得られたナノゲルが提供される。
【００８７】
本発明の一態様または実施形態に適用可能な任意選択的特徴は、任意の組み合わせで、かつ任意の数で使用できることを理解されよう。さらに、それらはまた、本発明の他の態様または実施形態のいずれかと共に、任意の組み合わせおよび任意の数で使用することができる。これは本願の任意の他の請求項の従属請求項として使用されている任意の請求項からの従属請求項を含むが限定されない。
【００８８】
以下の図面および実験例を参照しながら、単に非限定的な例によって本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】（１）Ｐ（ｍＤＯＰＡ）、（２）Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）、（３）ＰＡＨの化学構造を示す図である。
【図２】Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／ＰＡＨのナノゲルを形成するための戦略を示す図である。
【図３】（ａ）凍結乾燥なしおよび（ｂ）凍結乾燥ありの本発明によるナノゲルのＴＥＭ分析を示す図である。
【図４】ナノゲル溶液のＤＬＳ分析を示す図である。
【図５】ナノゲル、ナノゲル（ＡＢＴ）およびナノゲル（ＡＢＴ−Ｔｉｃａ）のＤＬＳ分析を示す図である。
【図６】ポリドーパミン（ＰＤＯＰＡ）層を用いたＴｉ表面の修飾を示し、ＰＡＨおよびナノゲルは、ＰＤＯＰＡ被覆Ｔｉ基材上のシッフ塩基結合を介して自己架橋している図である。
【図７】ＰＤＯＰＡ修飾前後のＴｉ表面の画像を示す図である。
【図８】電界放出走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を示す図である。
【図９】水晶振動子微量てんびんによって分析したナノリザーバの堆積を示す図である。
【図１０】本発明によるナノゲルを用いたＴｉ表面の修飾を示す図である。
【図１１】第２の手法に従ってＴｉ表面上に堆積させた本発明によるナノゲルのＳＥＭ分析を示す図である。
【図１２】ＰＤＯＰＡ修飾前後の生物学的弁の写真を示す図である。
【図１３】ナノゲル堆積前（左上）およびＰＤＯＰＡ被覆（右上）または非被覆（左下）でのナノゲル堆積後の生物学的弁表面のＳＥＭ画像を示す図である（倍率＝５０００倍）。
【図１４】ナノゲル堆積前（左上）およびＰＤＯＰＡ被覆（右上）または非被覆（左下）でのナノゲル堆積後の生物学的弁表面のＳＥＭ画像を示す図である（倍率＝３００００倍）。
【図１５】２分間１８００秒−１の一定剪断速度でＩｍｐａｃｔ−Ｒシステムを用いた動的血液適合性試験を示す図である。２種類のポリマー被覆ＰＥＧまたはＡＰＥＧを用いた異なる時点での血小板付着（左グラフ）および凝集体形成（右グラフ）に対する剪断応力の影響を示す。健常ドナー（Ｎ＝４）に関する中央値が両方のグラフに報告されている。統計分析は、グループ化二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後検定を用いてＧｒａｐｈ  Ｐａｄソフトウェアを使用して行った。さらに、血小板付着はガラス支持体上の被覆の水接触角と相関し、より小さい接触角を有する表面（すなわち、より親水性のＰＥＧ表面）はより少ない血小板付着を生じた。
【図１６】２分間（ＡおよびＢ）または４分間（Ｃ）の１８００秒−１の一定剪断速度における動的衝撃Ｒ試験を示す図である。Ａは、健常ドナー３名について測定したＳＣおよびＡＳ中央値である（ドナーごと条件ごとに二重）。Ｂは、Ａに示した試験の代表的な写真である。
【図１７】４分間にわたる１８００秒−１の一定剪断速度における動的衝撃Ｒ試験を示す図である。剪断応力負荷後に血小板数を測定した。試験は１人のドナーについて４重に実施した。
【図１８】ナノゲル修飾表面に付着した血球を分析する静的試験を示す図である。血液を、非被覆（ＮＣ）、またはＮａｎｏｇｅｌ（ＮＧ）もしくはＮａｎｏｇｅｌ  Ｐｅｇ（ＮＰ）もしくはＮａｎｏｇｅｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｐｅｇ（ＮＡＰ）で被覆した２４ウェルのポリスチレン上でインキュベートした。表面に付着した細胞をクリスタルバイオレットで染色した。ポリスチレン表面に固定された細胞の画像を処理した。光学顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１（倍率２０倍）で画像を撮影した。細胞の数はＦｉｊｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（粒子分析プラグイン）を用いて各視野で計数した。数字は１条件当たり８視野の平均を表す。
【図１９】ＰＳ  ＮＣ（非被覆ポリスチレン）またはＮＡＰ（ナノゲル抗生物質ＰＥＧ）で被覆したウェル上で３７℃で１分間（Ａ）または４５分間（Ｂ）静的条件下でインキュベートした血小板２５００００個／μｌの濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）を示す図である。０．９％ＮａＣｌで３回洗浄した後、血小板をメイ−グリュンバルド溶液で染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１光学顕微鏡（倍率１０倍）で観察した。
【図２０】クリスタルバイオレットを用いた黄色ブドウ球菌バイオフィルムの定量化を示す図である。示したように、抗生物質装填または非装填ナノゲルで修飾したポリスチレン表面で細菌を２４時間増殖させた。
【図２１】黄色ブドウ球菌と共に２４時間インキュベートした後の生物学的弁表面のＳＥＭ分析を示す図である。非被覆表面とナノゲル修飾表面を比較している（倍率＝２０００倍）。
【図２２】静的または振盪条件下で修飾ポリスチレン表面上で２４時間増殖させたフェカリス細菌を示す図である。ＴＳＢ寒天プレート上にプレーティングした浮遊性細菌のＣＦＵ計数も示す。
【図２３】血小板凝集アッセイによる溶液中のナノリザーバ抗血栓特性の研究の結果を示す図である。（Ａ）示されるように、チカグレロルなしまたは漸増濃度のチカグレロルを含有するナノリザーバの溶液と共にＰＲＰを１０分間プレインキュベートした。撹拌条件下（１２００ｒｐｍ）、３７℃で１０μＭのＡＤＰを添加することによって血小板凝集を誘導した。光透過凝集測定法によって記録された最大凝集のパーセンテージが示されている。データは平均値±ＳＤを表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｂ）異なる比率のチカグレロル装填ナノゲルおよびミノサイクリン装填ナノゲルの存在下で得られた最大血小板凝集を示す。ＮＧはＰＥＧ１５００を有するナノゲル、ＮＧＴはＰＥＧ１５００を有するチカグレロル装填ナノゲル、ＮＧＭはＰＥＧ１５００を有するミノサイクリン装填ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図２４】ヒト血漿中の凝固接触相の活性化に対する固定化ナノリザーバの効果の研究の結果を示す図である。標準血漿を、被覆および非被覆ＰＳ表面上で１０分間インキュベートした。比率２／３（ＮＧＴ６０：ＮＧＭ４０）で混合したミノサイクリン装填およびチカグレロル装填ナノゲルを、２種類の薬物を装填したナノゲル（ＮＧＴＭ）と比較している。基礎は試験表面と接触していない血漿を示す。ＮＣは非被覆を示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図２５】黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成に対する多層ナノゲル集合体の研究の結果を示す。（Ａ）被覆および非被覆ＰＳ表面に細菌を２４時間付着させた後、クリスタルバイオレット染色を行った。データは平均値±ＳＤを表す。（Ｂ）被覆および非被覆チタン表面に細菌を２４時間付着させた後、クリスタルバイオレット染色を行った。データは２つの独立した実験を代表するものである。ＮＣは非被覆、ＮＧはＰＥＧ１５００を有する非装填ナノゲル、ＬＢＬはミノサイクリンおよびチカグレロルを２／３の比率で装填した１，３，５，５：１，３および５層のナノゲル混合物を示す。
【図２６】ナノリザーバの抗血小板効果に対する多層ナノゲル集合体の研究の結果を示す図である。ＮＣは非被覆、ＮＧはＰＥＧ１５００を有する非装填ナノゲル、ＬＢＬはミノサイクリンおよびチカグレロルを２／３の比率で装填した１，３，５，５：１，３および５層のナノゲル混合物を示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図２７】５層ナノゲルとドーパミンとの架橋が黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成に対する抗生物質効力を４８時間を超えて持続させることを示す図である。（Ａ）表面を新鮮な培地と共に２４時間２回インキュベートした後、黄色ブドウ球菌細菌を添加した。バイオフィルム形成は、２４時間後にクリスタルバイオレット染色によって定量した。（Ｂ）試験表面との２回目の２４時間の接触後に除去された培地の抗バイオフィルム効果を示す。ＮＣは非被覆、ＮＧはＰＥＧ１５００を有する５層ナノゲル、ＮＴＭＶはチカグレロル、ミノサイクリンおよびバンコマイシンを装填したＰＥＧ１５００を有する５層ナノゲル、Ｄ−ＮＴＭＶはチカグレロル、ミノサイクリンおよびバンコマイシンを装填した、ＰＥＧ１５００を有するドーパミン架橋５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図２８】チタンインプラント上に固定化したナノリザーバの抗バイオフィルム効力のインビボ分析の結果を示す図である。（Ａ）黄色ブドウ球菌前感染チタンディスクをマウス（ｎ＝３）の皮下に移植し、３時間静置した後、インプラント上の生細菌をＣＦＵ計数により分析した。（Ｂ）ＳＥＭによるインプラントの表面分析（倍率２０００倍）を示す。
【図２９】ＣＤＣｌ３において記録されたチオール末端官能化ＰＥＧ１．５の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをピークの帰属と共に示す図である。
【図３０】（Ａ）Ｄ２０において記録された重合（２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをピークの帰属と共に示す図である。（Ｂ）これらのポリベタインの４つの異なる分子量の水性サイズ排除クロマトグラムを示す。
【図３１】ポリスチレン表面への血小板付着のＬＤＨ活性アッセイを示す図である。示された被覆および非被覆表面上でＰＲＰを４５分間インキュベートした。ＮＣは非被覆、ＮＧはＰＥＧ１５００を有する５層ナノゲル、ＮＴＭはミノサイクリンおよびチカグレロル含有ナノリザーバ（比率２／３の５層ナノゲル−ＰＥＧ１５００）、ＮＴＭ−ＡＰＥＧ１はミノサイクリンおよびチカグレロル含有ナノリザーバ（比率２／３の５層ナノゲル−ＰＥＧアクリラート１０００）、ＮＴＭ−ＡＰＥＧ２はミノサイクリンおよびチカグレロル含有ナノリザーバ（比率２／３の５層ナノゲル−ＰＥＧアクリラート２０００）を示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３２】チオールまたはビニル官能化末端を有する異なる配位子を有する５層ナノゲルによる被覆および非被覆チタンインプラント上の黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成を示す図である。細菌を３時間付着させた後、ＣＦＵ計数を行った。ＮＣは非被覆、ＮＧ−ＰＢ１５は５層ナノゲルで最終層としてポリベタイン１５ｋＤを有し、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ２は５層ナノゲルで最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、または２ｋＤを有する。ＮＧ−ＡＰＥＧ０．５は、５層ナノゲル−ＰＥＧアクリラート５００、ＮＧ−ＡＰＥＧ１は５層ナノゲル−ＰＥＧアクリラート１０００を示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３３】異なる分子量のＰＥＧを有する５層ナノゲルによる被覆および非被覆ＰＳ表面上の黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成を示す図である。細菌を２４時間付着させた後、クリスタルバイオレット染色によるバイオフィルム定量化を行った。対照は非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ２、ＮＧ−Ｐ５、ＮＧ−Ｐ１０は最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤを有する５層ナノゲルである。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３４】Ｉｍｐａｃｔ−Ｒを用いた流動下での血小板付着に対する異なる分子量のチオール末端ＰＥＧの効果の研究の結果を示す。クエン酸添加全血をＰＳウェルに添加した後、７８０ｒｐｍを４分間適用した。表面被覆率（ＳＣ）および凝集体サイズ（ＡＳ）を決定した。ＮＣは非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ２、ＮＧ−Ｐ５、ＮＧ−Ｐ１０は最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３５】凝固の接触相の活性化に対する、異なる分子量のＰＥＧチオールを有する５層ナノゲルの効果の研究の結果を示す図である。標準ヒト血漿を３７℃で１０分間インキュベートした後、Ｎｏｄｉａ非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮａＰＴＴ）試薬の存在下で凝固時間を分析した。カオリンを陽性対照として使用する。ＣＴＩはコーントリプシン阻害剤、ＮＣは非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ２、ＮＧ−Ｐ５、ＮＧ−Ｐ１０は最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３６】ＰＥＧチオールまたは異なる分子量のポリベタインを含むかまたは含まない５層ナノゲルで被覆したＰＳ表面上の黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ−２９バイオフィルム形成を示す図である。細菌を４時間付着させた後、培地を除去し、光子放出を定量化したところ、即時（上のパネル）または２時間後（下のパネル）のいずれも細菌の付着に正比例する。ＮＣは非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−ＰＢ７、ＮＧ−ＰＢ１５、ＮＧ−ＰＢ４４、ＮＧ−ＰＢ７０は最終層としてポリベタイン７ｋＤ、１５ｋＤ、４４ｋＤ、７０ｋＤを有する５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ２は最終層としてＰＥＧ２ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３７】Ｉｍｐａｃｔ−Ｒを用いた流動下の血小板付着に対するチオール末端ＰＥＧおよびポリベタインの効果の研究の結果を示す図である。クエン酸添加全血をＰＳウェルに添加した後、７８０ｒｐｍを４分間適用した。表面被覆率（ＳＣ）および凝集体サイズ（ＡＳ）を決定した。ＮＣは非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−ＰＢ７、ＮＧ−ＰＢ１５、ＮＧ−ＰＢ４４、ＮＧ−ＰＢ７０は最終層としてポリベタイン７ｋＤ、１５ｋＤ、４４ｋＤ、７０ｋＤを有する５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ２は最終層としてＰＥＧ２ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３８】ポリスチレン表面への血小板付着のｐＮＰＰアッセイの結果を示す図である。示された被覆および非被覆表面上でＰＲＰを４５分間インキュベートした。ＮＣは非被覆、ＮＧ−ＰＢ７、ＮＧ−ＰＢ１５は最終層としてポリベタイン７、または１５ｋＤを有する５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ５は最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、または５ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。ＮＧ−ＡＰＥＧ０．５は、５層ナノゲル−ＰＥＧアクリラート５００、ＮＧ−ＡＰＥＧ１は５層ナノゲル−ＰＥＧアクリラート１０００を示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図３９】凝固の接触相の活性化に対する、異なる分子量のＰＥＧチオールまたはポリベタインを有する５層ナノゲルの効果の研究の結果を示す図である。標準ヒト血漿を３７℃で１０分間インキュベートした後、Ｎｏｄｉａ非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮａＰＴＴ）試薬の存在下で凝固時間を分析した。カオリンを陽性対照として使用する。ＮＣは非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−ＰＢ７、ＮＧ−ＰＢ１５、ＮＧ−ＰＢ４４は最終層としてポリベタイン７ｋＤ、１５ｋＤ、４４ｋＤを有する５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ２、ＮＧ−Ｐ５は最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【図４０】標準的なヒト血漿を３７℃で１０分間インキュベートした後、被覆および非被覆ポリスチレン表面に付着した血漿タンパク質の定量化を示す図である。ＮＣは非被覆、ＮＧはグラフトポリマーを含まない５層ナノゲル、ＮＧ−ＰＢ７、ＮＧ−ＰＢ１５、ＮＧ−ＰＢ４４は最終層としてポリベタイン７ｋＤ、１５ｋＤ、４４ｋＤを有する５層ナノゲル、ＮＧ−Ｐ１．５、ＮＧ−Ｐ２、ＮＧ−Ｐ５は最終層としてＰＥＧ１．５ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤを有する５層ナノゲルを示す。データは平均値±ＳＤを表す。
【００９０】
本発明は一般的に記載されており、以下の例を参照することによってより容易に理解されるであろう。例は本発明の特定の態様および実施形態の説明の目的のためだけに含まれ、決して本発明を限定することを意図しない。
【００９１】
材料および方法
材料
試薬
抗生物質（ミノサイクリン、バンコマイシン）はＳｉｇｍａから購入し、抗血小板薬チカグレロルはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【００９２】
採血チューブ：クエン酸ナトリウムＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（３．２％クエン酸ナトリウム）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【００９３】
細菌株および培地：表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、株ＲＰ６２Ａ（＃３５９８４）はＡＴＣＣから入手し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）はＡＴＣＣから購入し（２５９０４および２９２１２）、黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９生物発光病原性細菌はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（＃１１９２４０）から入手した。トリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）および寒天粉末は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【００９４】
試料調製
インビトロ試験前の表面の滅菌：被覆または非被覆の全ての表面を１００％無水エタノール中で１０分間滅菌し、続いて蒸留水で２〜５分間インキュベートし、０．９％ＮａＣｌで１回洗浄した。
【００９５】
健常ドナー（無投薬下で、採血前の最後の２０日にアスピリンまたは他の抗凝固薬を服用しなかった）からの血液を、静的テスト用に１８ｇの針を用いて３．２％クエン酸ナトリウム（９体積の血液に対して１体積のクエン酸）を含有する５０ｍＬのポリプロピレンチューブに直接流すか、または動的テスト用に２１ｇの針とクエン酸ヴァキュテーナーチューブを使用して採取した。この研究はベルギーのリエージュ大学病院の倫理委員会によって承認された。ドナーはインフォームドコンセントに署名した。
【００９６】
黄色ブドウ球菌を用いた実験は、ＧＩＧＡ−Ｒのバイオセーフティレベル２の部屋で行った。
【００９７】
動的インビトロＩｍｐａｃｔ−Ｒ試験
血液をチューブ内に４５分間静置した後、コーンプレート装置Ｉｍｐａｃｔ−Ｒシステム（Ｍａｔｉｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で任意の処理を行った。次に、血液を室温で１分間１０ｒｐｍで混合した後、剪断応力を加えた。各試験について、１３０μＬの血液を慎重にウェルに入れた。加えた剪断応力は４分間１８００秒−１（７８０ｒｐｍのベル速度に相当）であった。この速度およびインキュベーション時間は、ポリスチレン表面上の層状の動脈血流をシミュレートし、剪断応力下の血小板機能を分析するのに有用である。
【００９８】
４分間の剪断応力を加えた後、血液を集め、１回の血小板数をＣｅｌｌ  Ｄｙｎによって分析し、その間、被覆または非被覆のＰＳウェルを蒸留水で４回穏やかに洗浄し、室温で１分間メイ−グリュンバルド染色溶液で染色した。表面に付着した血小板を光学顕微鏡で視覚化し、Ｉｍｐａｃｔ−Ｒソフトウェアを使用して定量した。２つのパラメータが、（ｉ）表面被覆率（ＳＣ％）および（ｉｉ）血小板の凝集体サイズ（ＡＳμｍ）の分析から得られた。各ドナーにつき各条件を二重で繰り返した。
【００９９】
静的インビトロ試験
表面上の血小板付着を、測光アッセイＬＤＨ（乳酸脱水素酵素試験）およびｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）試験のうちの一方を用いて分析した。両方の試験から得られた値は、表面に付着している血小板の数に正比例している。血小板溶解時に放出されたＬＤＨは、４５０ｎｍで検出されるＮＡＤのＮＡＤＨへの変換を測定することによって間接的に分析する。ｐＮＰＰ試験で血小板溶解時に放出されるアルカリホスファターゼおよび酸性ホスファターゼのレベルを測定する。これらのホスファターゼの基質であるｐＮＰＰの加水分解はｐ−ニトロフェノールを生成し、ｐ−ニトロフェノールは、４０５ｎｍで最大吸光度を有し、表面に結合した血小板の量に比例する。
【０１００】
乏血小板血漿（ＰＰＰ）または多血小板血漿（ＰＲＰ）を、被覆ポリスチレン表面上に３７℃で４５分間重層した。表面を０．９％ＮａＣｌで３回洗浄した。付着した血小板の溶解は、ＬＤＨ試験についてはＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎを添加することによって達成され、ｐＮＰＰアッセイについては５ｍＭのｐＮＰＰを含有するクエン酸ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍクエン酸ｐＨ５．４）中の１％Ｔｒｉｔｏｎ中に添加することによって達成された。ＰＰＰインキュベーションからのバックグラウンド読み取り値をＰＲＰ読み取り値から差し引いた。
【０１０１】
血小板凝集試験
多血小板血漿（ＰＲＰ）は、クエン酸抗凝固処理したヒト血液を１００×ｇで１５分間室温で遠心分離することによって調製した。血小板凝集実験は、光凝集測定法（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｍｏｄｅｌ  ７００凝集計、Ｋｏｒｄｉａ）を使用して、３７℃で撹拌（１２００ｒｐｍ）しながらＰＲＰアリコートで実施した。
【０１０２】
血漿−生体材料相互作用：凝固アッセイと血漿タンパク質付着
凝固試験は、Ｓｔａｇｏ  ＳＴａｒｔ（登録商標）４  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＮｏｄｉａ非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮａＰＴＴ）試薬を用いて行った。ＮａＰＴＴ試薬は、凝固接触相の活性化の研究を目的とした合成リン脂質血小板代替品である。Ｓｔａｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒは、電気機械的凝塊検出方法（粘度ベースの検出システム）と統合された半自動システムである。クエン酸添加ヒト標準血漿（Ｓｔａｇｏ）における凝塊形成は、リン脂質による場合と同様にＣａ２＋イオンの添加によって触媒される。接触相活性化の陽性対照としてカオリンを使用し、一方で、接触活性化経路を開始する因子である第ＸＩＩａ因子の特異的阻害剤であるコーントリプシン阻害剤（ＣＴＩ）を使用して、この経路とは無関係に凝固時間を決定した。標準的なヒト血漿を３７℃の水浴中で解凍し、撹拌せずに３７℃で１０分間、被覆および非被覆ポリスチレン（ＰＳ）ウェルに添加した。次に、血漿をドライアイス／アセトン浴（−７８℃）中で急速冷凍し、分析まで−８０℃で保存した。試験当日、血漿を３７℃で解凍し、直ちにＳｔａｇｏ  ＳＴａｒｔ（登録商標）装置４台で処理した。予熱した３７℃のＮｏｄｉａ試薬を、被覆金属ビーズを含有するキュベット中の予熱した血漿１００μｌに添加した後、予熱したカルシウム溶液（８．３ｍＭ）の添加によって凝固を開始した。凝固終点は、電磁場によって整列されたビーズの振り子運動によって測定される。そのような動きは血漿の粘性によって影響され、粘性が最大になるとき、すなわち血漿凝固が起こるときに止まる。
【０１０３】
タンパク質付着は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ（ビシンコニック酸）アッセイを用いて測定し、これは５ｎｇ／ｍｌまでのタンパク質を検出する非常に高感度の方法である。ビシンコニック酸は、Ｃｕ＋イオンに２：１の化学量論で結合し、高感度を実現する。このアッセイは、塩基性環境におけるタンパク質によるＣｕ２＋イオンのＣｕ＋への変換に基づいている。３７℃に予熱した１２０μｌの血漿（Ｓｔａｇｏ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｌａｓｍａ）を４８ウェルポリスチレン（ＰＳ）プレート（直径１１ｍｍのウェル）の被覆ウェルおよび非被覆ウェルに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．９％ＮａＣｌで３回洗浄した後、ＰＢＳ中１％ＳＤＳの溶液２５０μｌを室温で１０分間添加することにより、付着したタンパク質を剥離した。希釈していないタンパク質溶液をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイで使用した。
【０１０４】
細菌付着およびバイオフィルム形成分析
表皮ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌またはフェカリス菌の１つのコロニーを撹拌しながら（２２０ｒｐｍ）ＴＳＢ培地中で３７℃で一晩増殖させ、翌日ＴＳＢ新鮮培地中で１：１００の希釈を行い、懸濁液を対数期（ＯＤ５９５＝０．５）に達するまで４時間増殖させた。次に、細菌を滅菌ＮａＣｌ  ０．９％で１／２０に希釈して約２０万ｃｆｕ／μｌにし、５００μＬを被覆または非被覆ポリスチレン２４ウェルプレート中３７℃で２４時間静的条件または動的条件下でインキュベートした。細菌懸濁液を寒天平板培養およびＣＦＵ（コロニー形成単位）計数によって分析し、バイオフィルムをクリスタルバイオレット染色によって分析した。浮遊性細菌を除去するために表面を最初にＮａＣｌ  ０．８５％で３回洗浄し、次に１％クリスタルバイオレットで４０分間染色した。水で３回洗浄した後、細菌中に保持されているクリスタルバイオレット染料を１０％酢酸を用いて１０分間遊離させた。分光光度計プレートリーダーを用いて９６ウェルプレート中で５９５ｎｍで強度を測定した。条件は二重であり、読み取りは三重であった。ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と共に生物発光黄色ブドウ球菌細菌を使用することによって、表面上の細菌付着およびバイオフィルム形成の動態も評価した。細菌を３時間付着させた後、ウェルを洗浄し、次に細菌密度に正比例する発光シグナルを時間の経過と共に記録した。バイオフィルムは、ＩＶＩＳカメラシステムを用いて画像化した。選択したウェルからの総光子放出を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアパッケージを用いて定量化した。
【０１０５】
生体材料関連感染症マウスモデルのマウスモデル：感染前のチタン製装置の皮下移植およびインビボバイオフィルム形成
黄色ブドウ球菌を対数期に達するまでＴＳＢ培地中３７℃で２時間増殖させた。細菌を２％ＮａＣｌ＋１％グルコースを添加したＴＳＢで１：１００００に希釈し、８００μｌアリコート（２万ＣＦＵ／ディスクに相当）を直径０．２ｃｍのチタンディスク（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ）上に重層した。細菌を静的条件下、３７℃で３時間全てのディスクに付着させた。細菌懸濁液を除去し、表面をＰＢＳで３回穏やかに洗浄した。チタンディスク上に付着した細菌の数を決定するために、ディスクの半分をフィッシャー水浴用超音波処理器内で５分間超音波処理した。分離した細菌をＴＳＢ寒天プレート上にプレーティングして移植前のディスク当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を決定した。ディスクの他の半分は、８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に以下のように移植した。麻酔の２時間前に、マウスに０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィン鎮痛薬（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）を皮下注射した。移植の１５分前に、ケタミン（１２５ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１２．５ｍｇ／ｋｇ）混合物の腹腔内注射によってマウスを麻酔した。マウスの胸郭下部の腹側下側を剃毛し、その領域をベタジン、続いて７０％エタノール溶液で滅菌した。滅菌メスを使用して皮膚を切開し、黄色ブドウ球菌感染ディスクまたは非感染ディスクを皮膚と筋肉の間に挿入した。４時間インキュベートした後、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、装置を分析してＣＦＵ／ディスクを決定した（前述のような超音波処理による）。プロトコルは、ＵＬｉｅｇｅ大学の倫理委員会によって承認された（＃１６−１７７４）。外植したチタンディスクのＳＥＭ画像をＱｕａｎｔａ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（倍率は４０００倍）で撮影した。チタンディスクを穏やかに洗浄し、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ緩衝液中の２．５グルタルアルデヒド中で４℃で１時間固定し、続いてＳｏｒｅｎｓｅｎ緩衝液中で３回洗浄し、２％ＯｓＯ４中で４℃で１時間固定した。ディスクをエタノール濃度を上げながら脱水し、生物学的構造を保つためにＣＯ２雰囲気下で乾燥させ（臨界点乾燥）、次に金属化した。
【０１０６】
結果と考察
例
例１：架橋ナノゲルの調製と生物活性分子の装填
３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを有するメタクリルアミドのホモポリマー（Ｐ（ｍＤＯＰＡ）、１、図１）は、ナノゲルを調製し、かつ物理的捕捉または共有結合により活性（バイオ）分子を固定化するように特に設計した。架橋反応性ナノゲルは、バイオインスパイアードポリドーパミン層で予め被覆された表面上に直接堆積させることができる。この戦略は、既存の方法に対して以下のようないくつかの利点を有する。ｉ）外部架橋剤を使用しない、ｉｉ）カップリング反応が室温、水中で速い、ｉｉｉ）望ましくない副生成物が形成されず、フィルムから放出されない、ｉｖ）活性生体分子を表面に共有結合させることができる。
【０１０７】
ナノゲル形成およびナノゲル官能化に利用可能な反応性機能をもたらすために、高速かつ水ベースの架橋プロセスを使用して、ＤＯＰＡ分子のレドックス特性を利用した。
【０１０８】
水中のナノゲルの安定な溶液は、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）ポリマーの酸化還元状態およびＰＡＨ溶液のｐＨの両方を適切に制御することによって調製した。調製条件は、ナノゲル形成の成功にとって極めて重要である。最初に、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を塩基性条件下、水性媒体中で１２時間酸化して、水溶性Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を形成する。Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の酸化したＤＯＰＡ部分は、アミン／キノン反応および／または室温でのシッフ塩基形成によるＰＡＨの共有結合相互作用のため、したがって安定した架橋ナノゲルの調製のために必要である（図２）。
【０１０９】
ナノゲルＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／ＰＡＨの形成はまず、室温でＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨの溶液をゆっくり添加することにより行った。ナノゲルの安定な分散液（Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／ＰＡＨ）を形成するために２つのパートナーの重量比および添加様式を制御した。その目的のために、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨをゆっくり添加し、室温で架橋したナノゲルの安定で透明な薄茶色の溶液の自発的形成が生じた。ナノゲルの存在を、凍結乾燥後に実施した透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって確認し、これは１００〜２００ｎｍの範囲の直径を有するナノゲルを示した（図３ｂ）。分析前にナノゲル溶液をＴＥＭグリッド上で凍結乾燥しなければならなかったことに注意することが重要である。溶液をグリッド上に単純に滴下し、大気条件下、室温でゆっくり乾燥させると、ナノゲルは強く凝集した（図３ａ）。
【０１１０】
濾過なしの動的光散乱（ＤＬＳ）による分析は、やや高い多分散性（ＰＤＩ＝０．２）を伴う平均流体力学直径１３０ｎｍのナノゲル凝集を示した（図４）。ナノゲル溶液は、室温およびｐＨ約１０で撹拌せずに保存した場合、少なくとも１ヶ月間安定であった。溶液は沈殿することなく透明のままであり、ＤＬＳによって得られた流体力学的直径分布は１ヶ月の保存後もほとんど変化しなかった。
【０１１１】
ナノゲルに複数の薬物を装填し送達する能力をさらに探求した。共有結合、静電相互作用および疎水性相互作用、ならびに水素結合形成の組み合わせによって、異なる生物活性剤が組み込まれた。共有結合は、アミン官能基に対するＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）のキノン基の反応性を利用することによって行った。その目的のために、配列中に第１級アミンを含有するグリコペプチド抗生物質であるバンコマイシン（Ｖ）を結合に使用し、テトラサイクリンクラスの抗生物質であるミノサイクリン（Ｍ）、および抗血栓性を有する抗血小板剤であるチカグレロル（Ｔ）の組み込みには物理的捕捉を使用した。
【０１１２】
次に、ＶＭＴ装填Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の水溶液にＰＡＨ溶液を添加することによって、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）−ＶＭＴ／ＰＡＨ）を同様の方法で調製し、黄褐色の懸濁液の外観が生じた。濾過なしのＤＬＳ測定は、おそらくＶＭＴ（生体）分子の存在に起因して、以前のものよりわずかに大きい２００ｎｍの平均流体力学直径を有するナノゲルの存在を証明した（図５）。
【０１１３】
全ての合成工程は穏やかな条件で水性媒体中で行われるため、ビルディングブロック合成経路は環境に優しいプロセスの開発に関連する。
【０１１４】
塩基性培地中でのＰ（ｍＤＯＰＡ）の酸化：酸化は以前の研究（Ｆａｕｒｅら、Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ．２０１２：２８（７）：７１９〜２８）に従って実施した。Ｐ（ｍＤＯＰＡ）（２０ｍｇ）を蒸留水（２０ｍＬ）に溶解し、ｐＨを１０超に上げるためにＮａＯＨ溶液（０．１Ｍ）をゆっくり加えた。この酸化工程は空気下で少なくとも一晩続いた。
【０１１５】
Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／ＰＡＨ架橋ナノゲルの調製は以下の通りであった。
ナノゲルの調製：Ｐ（ｍＤＯＰＡ）（２．５ｍｇ）を蒸留水（５ｍＬ）に溶解し、ｐＨを１０超に上げ、かつＰ（ｍＤＯＰＡ）のカテコール基の酸化を促進するためにＮａＯＨ（０．１Ｍ）をゆっくり加えた。室温で一晩後、激しく撹拌しながらＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の溶液にｐＨ１０のＰＡＨ水溶液（０．５ｍＬ；  ０．５ｇ／Ｌ）をゆっくり加えた。溶液を激しく撹拌しながら室温で１時間反応させた。１５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲の直径を有するナノゲルがＤＬＳによって観察された。
【０１１６】
ナノゲル抗生物質（ＡＢＴ）の調製：手順は、ポリマー鎖と薬物との間の相互作用を高めるためにＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）をＡＢＴ（ミノサイクリンおよびバンコマイシン）の存在下で可溶化したこと以外は、上記の手順と同一である。６℃で１時間後、激しく撹拌しながらＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の溶液にｐＨ１０のＰＡＨ（０．５ｍＬ；  ０．５ｇ／Ｌ）の水溶液をゆっくり加えた。溶液を激しく撹拌しながら６℃で一晩反応させた後、ナノゲルを堆積させた。ナノゲル溶液中のＡＢＴの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１７】
ナノゲルチカグレロル（Ｔ）の調製：手順は、ポリマー鎖と薬物との間の相互作用を高めるためにＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を１ｍｌのチカグレロル溶液（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で可溶化したこと以外は、上記の手順と同一である。６℃で１時間後、激しく撹拌しながらＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／Ｔの溶液にｐＨ１０のＰＡＨ（０．５ｍＬ；  ０．５ｇ／Ｌ）の水溶液をゆっくり加えた。溶液を激しく撹拌しながら６℃で一晩反応させた後、ナノゲルを堆積させた。
【０１１８】
例２：ポリドーパミン被覆を用いたチタン基材上へのナノゲル固定化
第１の戦略は、ＤＯＰＡ／金属相互作用によって第１の層を表面に強く固定するために、基材をＤＯＰＡのトリス緩衝液中に最初に浸漬することからなる（図６）。次に、表面を第一級アミンを有するポリマーであるポリアリルアミン（ＰＡＨ）の水溶液に引き続いて浸漬し、次いでＰ（ｍＤＯＰＡ）ベースのナノゲルの溶液に浸漬することにより、次の層を構築した。各モノマー単位上に酸化したＤＯＰＡ部分を有するポリ（メタクリルアミド）（図１、式（２））。（Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ））をＰＡＨと組み合わせて使用して、室温、水中のナノゲルの安定な溶液を調製し、これはチタン（Ｔｉ）表面に容易に堆積させることができる。
【０１１９】
ポリドーパミン被覆
ポリドーパミン（ＰＤＯＰＡ）は、様々な材料表面に付着できるため、生物学的に不活性な表面を改変するために使用されてきた。ドーパミン分子は３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン−リジンモチーフを有し、これは穏やかな条件で重合して材料表面にＰＤＯＰＡ層を形成することができる。プライマーフィルムとしてＰＤＯＰＡを組み込むことにより、生体材料を非汚染表面で官能化するための代替経路が提供され、生物医学的用途のための望ましい生物学的、化学的、および治療的特性をさらに高めることができる。
【０１２０】
ドーパミン（２ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）に溶解し、基材を溶液に浸漬した。ｐＨによる酸化により溶液の色が暗褐色に変わり、薄い付着性ポリマーフィルムが自然に堆積した（図７）。微粒子の堆積を避けるために、より低いドーパミン濃度を０．１２５ｍｇ／ｍｌで使用することができ、および／または垂直の試料配向が必要であった。被覆表面を超純水ですすぎ、保存前にＮ２ガスで乾燥するか、または付加層（ａｄ−ｌａｙｅｒ）形成のために下記のように処理した。
【０１２１】
ポリドーパミン支援自己組織化ＰＡＨ単層
第１の層としてＰＤＯＰＡを使用してチタン表面を修飾した後、室温でアミン／キノン反応および／またはシッフ塩基形成を介して、したがって層間架橋のために、ＰＡＨの共有結合グラフト化が起こる（スキーム１）。重要なことに、脱プロトン化状態のポリマーを得るために、次のＰＡＨ溶液を１０を超えるｐＨで堆積させた。そのため、第一級アミンとＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）のキノン基との間の反応が可能になった。酸性媒体中では、アミン基がプロトン化され、Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）と反応しなかったため、フィルムの架橋および成長は起こり得ない。ＰＡＨ付加層形成のために、１ｍｇ／ｍｌのＰＡＨ溶液を超純水に溶解し、０．１ＭのＮａＯＨ溶液を添加することによって１０を超えるｐＨで平衡化した。その後、ポリドーパミン被覆基材を溶液に浸漬した。４時間以上経過した後（典型的には一晩１８時間の反応）、基材を超純水ですすいだ。
【０１２２】
超純水を１０μＬ滴下した後の乾燥チタン表面の接触角を測定した。純チタンおよびポリドーパミンで被覆されたチタン表面上の静的接触角は、それぞれ８５°±２°および４７±６°であり、表面の修飾を証明した。
【０１２３】
ナノゲル集合体
ナノゲル中のＰＡＨ単層の第一級アミンとＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）のキノン基との間の同じ反応および／またはシッフ塩基形成を通して、ナノゲルの共有結合グラフト化を行った。次に、ＰＤＯＰＡの層およびＰＡＨの層で被覆された表面を、以下に記載のプロトコルに従ってナノゲルＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／ＰＡＨの水溶液と共にインキュベートした。接触角は、ＰＡＨおよびナノゲルを用いて修飾チタン表面上で測定した。ＰＡＨの接触角は約６５°であった。その振幅は、おそらく無極性アミン基の存在のために、ポリドーパミン被覆表面上で測定したものよりも大きかった。ポリドーパミンと同じカテコール基を示すナノゲルの堆積後、接触角は約４２°に減少した。
【０１２４】
ＰＥＧグラフト化単層
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、表面にタンパク質耐性を付与するために最も一般的に使用されている合成ポリマーの１つである。その種のポリマーを用いて基材を修飾するためのいくつかの戦略が文献に見られ、例えばエレクトログラフティング、自己組織化単層（ＳＡＭ）、コポリマーの吸着などがほんの数例として挙げられる。ＰＥＧグラフト化は、チオールに対するＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）のキノン基の反応性を利用することによって行った。その目的のために、チオール末端官能化ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＳＨ）を結合のために考慮した。このチオールベースの戦略は、ｐＨ≧１０を必要とするアミノベースの戦略とは対照的に、穏やかな条件でｐＨを制限することなく特定のグラフト化を可能にする。ＰＥＧグラフト化のために、５ｍｇ／ｍＬのメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−チオール（ｍＰＥＧ−ＳＨ、１．５ｋＤａ）を１０ｍＭトリスｐＨ８．０に溶解した。ｍＰＥＧ−ＳＨに使用した緩衝液は、チオール基間の酸化（−Ｓ−Ｓ−）を防ぐために約１時間真空脱気した。マイケル型付加およびシッフ塩基反応を介してＰＥＧをＰＤＯＰＡ層（ナノゲル層）に反応させて、非特異的相互作用を抑制し、生理学的条件下で親水性を高めた。水接触角は修飾Ｔｉ表面へのＰＥＯ鎖の固定を立証した。驚くべきことに、４３°±１の接触角を示すＰＥＯ層が見出された。
【０１２５】
簡単に言うと、第１の層としてＰＤＯＰＡを用いたナノゲル堆積を室温で５段階で行った。
工程１：Ｔｉディスク（直径１ｃｍ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、エタノール、および水中で各工程について１０分間超音波処理した。
工程２：Ｔｉを直ちにＤＯＰＡトリス緩衝液（０．１２５ｇ／Ｌ  −  １）に１８時間浸漬した。
工程３：水５ｍｌで２回すすいだ後、修飾基材をＰＡＨの溶液（ｐＨ＞１０）に１８時間浸漬し、水５ｍｌで２回すすいだ。
工程４：水５ｍｌで２回すすいだ後、修飾基材をナノゲルの溶液（ＡＢＴおよびＴを装填）に１８時間浸漬し、水５ｍｌで２回すすいだ。
工程５：水５ｍｌで２回すすいだ後、修飾基材を１時間ＰＥＧ−ＳＨの溶液に浸漬し、水５ｍｌで２回すすいだ。
【０１２６】
表面形態は、界面エネルギー、さらには生体成分と材料表面との間の相互作用に影響を及ぼし得る生体医療機器にとって重要なパラメータである。さらなる情報を得てナノゲル被覆Ｔｉ表面の微細構造を理解するために、電界放出走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を行った（図８）。手付かずのＴｉ表面は、比較的滑らかな形態を示した（左パネル）。対照的に、ナノゲル堆積後、サイズが８０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲の多数のよく分散したナノゲルが観察された（右パネル）。結果は、堆積したナノゲルのサイズが、溶液中のＴＥＭによって測定されたナノゲルのサイズを裏付けることを示した（図２ｂ）。
【０１２７】
レイヤーバイレイヤー（ＬｂＬ）集合体
ＬｂＬ堆積は、工程２〜４を５回繰り返して５つの層を得たこと以外は、上記の手順と同様の手順を用いて同じ条件で行った。
【０１２８】
水晶振動子微量てんびん
多層フィルム形成の最初の証拠として、散逸と組み合わせた水晶振動子微量てんびん（ＱＣＭ−Ｄ）を使用して、時間に対する共鳴周波数（Δｆ）の変動を測定することによって金センサー上でのリアルタイムでのフィルム成長を追跡した。Δｆの減少はポリマー堆積を示す。図９は、全ての成分が選択された堆積プロトコルおよび酸化還元／ｐＨ条件に従って首尾よく堆積し、水ですすいだ後でさえ基材上に残ることを示す。
【０１２９】
第１に、ＤＯＰＡ（０．１２５ｇ／Ｌ）のトリス緩衝液を室温でセルに流し、第１の固定層を得た。ＤＯＰＡが試料チャンバから洗い流されるまで、ｆシフトは減少し続けた。第２に、ＰＡＨ溶液（ｐＨ＞  １０）を注入するとすぐに負のシフトが観察され、これはポリマーが金表面に吸着するにつれて、界面での質量が増加することを示す。水ですすいで過剰の結合していないポリマーを除去した後、すすぎ工程中に安定したベースラインが達成され、これはポリマー付加層が表面上に強くつながれていることを実証している。可逆的に吸着したポリマーをすすぎ工程で除去した後、ミリＱ水（ｐＨ約１０）中のナノゲル溶液を同じ流速および温度でセンサーチャンバに導入した。ナノゲル溶液の堆積は、周波数振動の大幅な減少によって観察された。重要なことに、このナノゲル層は、水ですすいだ後に除去することができないため安定していた。最後の工程では、チオール官能基とナノゲル中に存在する残留キノン基との反応により、ＰＥＧ−ＳＨ溶液の注入後の生のΔｆから不可逆的に結合したポリマーを見ることができる（図９）。
【０１３０】
例３：チタン基材上への直接ナノゲル固定化
第２の手法では、プライマー被覆を必要とせずにチタン表面をナノゲル溶液に直接浸漬してナノゲル修飾表面を得た。この場合、集合体のメカニズムは、ナノゲルの表面に存在するカテコールとキノン基の付着性に基づく（図１０）。
【０１３１】
ＳＥＭ分析を用いて、Ｔｉ上のナノゲルＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）／ＰＡＨの単層の形成が観察された（図１１）。ナノゲルの推定直径は、８０ｎｍ〜１２０ｎｍの間で変動することがわかった。
【０１３２】
例４：弁バイオプロテーゼへのナノゲルの固定化
上記で報告したものと同じ手法を用いて生物学的弁を修飾した。同じ工程を考慮して、生物学的弁を最初にＤＯＰＡのトリス緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））に浸して、ポリドーパミンの第１の層を強く固定した。薄い付着性ＰＤＯＰＡフィルムの堆積の結果として、インプラントは暗褐色になった（図１２）。
【０１３３】
次に、弁をポリアリルアミン（ＰＡＨ）の水溶液に引き続いて浸漬し、次いでＰ（ｍＤＯＰＡ）ベースのナノゲルの溶液に浸漬することにより、次の層を構築した。
【０１３４】
以下の工程を室温で行った。
工程１：生物学的ディスク（直径１ｃｍ）を１０ｍｌの水中に１０分間３回浸漬した。
工程２：生物学的ディスクを直ちにＤＯＰＡトリス緩衝液（０．１２５ｇ／Ｌ−  １）に１８時間浸漬した。
工程３：水５ｍｌで２回すすいだ後、修飾組織をＰＡＨの溶液（ｐＨ＞１０）に１８時間浸漬し、水５ｍｌで２回すすいだ。
工程４：水５ｍｌで２回すすいだ後、修飾組織をナノゲルの溶液に１８時間浸漬し、水５ｍｌで２回すすいだ。
工程５：水５ｍｌで２回すすいだ後、修飾組織をＰＥＧ−ＳＨの溶液に１時間浸漬し、水５ｍｌで２回すすいだ。
【０１３５】
走査型電子顕微鏡ＳＥＭを用いて修飾生物学的組織の表面形態を分析した。修飾前の生物学的組織の表面は、比較的滑らかで規則正しいコラーゲンナノファイバーを示すことが観察された。ナノゲル堆積後、コラーゲン繊維はより緻密に見え（図１３）、コラーゲン繊維の表面にはよく分散したナノゲルが観察された（図１４）。ＰＤＯＰＡプライマー被覆はナノゲル堆積を増強した。
【０１３６】
散逸技術（ＱＣＭ−Ｄ）と組み合わせた水晶振動子微量てんびんを用いて、フィルム成長（ＰＤＯＰＡおよびナノゲル）をリアルタイムで追跡した。この研究ではＱ−Ｓｅｎｓｅ  Ｅ４を使用した。ステンレス鋼で被覆したＡＴカット共振器（基本周波数５ＭＨｚ）をそのまま使用した。まず、蒸留水をセルに導入し、安定したベースラインが得られるまで流れを維持した。次に、振動子にさらされた液体を蒸留水からＮａＣｌ  ０．１５Ｍを含むＤＯＰＡ溶液０．１２５ｇ／Ｌ−１に流速２００μＬ／分−１、温度２５℃で切り替えることによってＬｂＬ堆積を開始させた。１０分後、基材を蒸留水ですすいで過剰の結合していないＤＯＰＡを除去した。次に、各層の間に蒸留水を用いたすすぎ工程を行いながら、ＰＡＨ（１ｇＬ−１）およびナノゲル溶液の交互堆積を行った（各工程について約１０分）。最後に、ＰＥＧ−ＳＨ溶液を最終層としてシステムに導入し、安定したシグナルが得られたときにさらにすすいだ。
【０１３７】
レーザダイオード源（波長６５８ｎｍ；出力３０ｍＷ）を備えたＤｅｌｓａ  Ｎａｎｏ−Ｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、水性ナノゲル溶液の流体力学的直径を測定した。一定の散乱角で少なくとも５０回の個々の測定について散乱データを収集し、各試料について平均した。得られた散乱データを体積加重累積分析を用いてフィッティングさせ、溶液中のナノゲルの拡散係数を推定した。試料の流体力学的直径（ＤＨ）は、ストークス−アインシュタインの関係式を用いて得た。
【０１３８】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用の試料は、コントラストを高めるために、Ａｕ−Ｐｄの薄い層（１０ｎｍ）の後、３ｋＶで動作する電界放出銃走査電子顕微鏡（ＦＥＧ−ＳＥＭ）ＭＥＢ  ＵＬＴＲＡ５５を試料の観察に用いて分析した。
【０１３９】
Ｎ−メタクリロイル３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの合成
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３５０ｍＬ）中のＤＯＰＡメチルエステル塩酸塩（９ｇ、０．０３６３ｍｏｌ）を滴下漏斗およびマグネチックスターラーを備えた二口丸底フラスコに添加し、窒素下に置いた。次に、新たに蒸留したＥｔ３Ｎ（１７．７ｍＬ、０．１２７ｍｏｌ）を加え、フラスコを０℃に冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍＬ）中の塩化メタクリロイル（３．５１ｍＬ、０．０３６３ｍｏｌ）の溶液を、窒素下で激しく撹拌しながら滴下漏斗を通して滴下した。最終混合物を室温で４８時間撹拌し続けた。反応後、副生成物として形成された塩化トリエチルアンモニウムを濾過により除去し、過剰の試薬を減圧下で除去した。生成物を粘着性固体として収率９０％で回収した。
【０１４０】
Ｐ（ｍＤＯＰＡ）合成
重合前に、ラジカル重合中の副反応を避けるために、ｍＤＯＰＡのカテコール基をその−ＯＨ基から保護しなければならない。保護カテコール基を有する２ｇのｍＤＯＰＡ（保護工程については下記参照）（２．６ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを備えた一口丸底フラスコ中で窒素下に置いた。同時に、１９ｍｇ（０．０６７ｍｍｏｌ）のＶ５０１開始剤を７ｍＬの蒸留水に溶解した。白色粉末が完全に溶解するまで、ｐＨ溶液をＮａ２ＣＯ３で９より上に調整した。次に、溶液に窒素を１５分間吹き込むことによって溶液を脱気した。次に、保護ｍＤＯＰＡを含有するガラスフラスコ中に窒素下でキャピラリーを用いてＶ５０１開始剤の水溶液を移した。反応器を７０℃に温度調節した油浴中で２４時間加熱した。次に、濃ＨＣｌでｐＨを約２に調整することによってカテコール基を脱保護した。得られた混合物を４８時間水に対して透析し（膜多孔度１０００Ｄａ）、続いて凍結乾燥した。共重合体を白色粉末として８８％の収率で回収した。
【０１４１】
α−メトキシ−ω−メルカプト−ポリ（エチレンオキシド）（ＭＰＥＧ−ＳＨ）の合成
α−メトキシ−ｘ−メルカプト−ポリ（エチレンオキシド）（ＭＰＥＧ−ＳＨ）は、メルカプト酢酸を用いたモノメトキシポリ（エチレンオキシド）（ＭＰＥＧ−ＯＨ）のヒドロキシル末端基のエステル化（Ｍｎ＝１５００ｇ／ｍｏｌ）によって合成した。典型的な反応は以下のように実施した。ＭＰＥＧ−ＯＨ（１０ｇ、５ｍｍｏｌ）を、撹拌機およびディーンスターク装置を備えた１００ｍｌの二口フラスコに加えた。ＭＰＥＧ−ＯＨをトルエンとの３回の共沸蒸留により乾燥させ、最後に５０ｍｌのトルエンに溶解した。次に、メルカプト酢酸（３．５ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）および濃硫酸（２滴）を加えた。フラスコを油浴中１１０℃で一晩加熱した。ＭＰＥＧ−ＳＨを０℃でエーテル中で沈殿させることにより集め、次に４０℃で２４時間真空乾燥させた。
【０１４２】
例５：生物活性ナノゲルの抗血栓特性
動的Ｉｍｐａｃｔ−Ｒ試験
動的条件における血液−物質相互作用を研究するために、Ｉｍｐａｃｔ−Ｒ装置を使用した。これは循環中の血液の層流を模倣した生理的に近いインビボシステムであり、血流下での血小板機能および血栓形成を研究するために使用される。ウェル上に堆積した薄い血液層上でピストン（ベルおよびコーン）を一定速度で回転させることによって生じる層流は、剪断応力によって血小板を活性化し、血小板は，ウェルのポリスチレン表面に付着し、次にメイ−グリュンバルド染色で染色される。システムは速度の変化を可能にし、速度が速いほど（より速い心拍数に対応）より多くの血栓が表面上に形成される。
【０１４３】
光学顕微鏡でのポリスチレン表面の検査および画像分析によって、血小板凝集体で覆われた表面の割合（ＳＣ、％）、および凝集体（血栓）の平均サイズ（ＡＳ、μｍ２）の２つのパラメータを得ることが可能である。
【０１４４】
試験は健常ドナーのクエン酸添加血液で行われた。得られたＳＣおよびＡＳは、特定のウェル半径におけるコーンの速度回転に比例した（速度は半径と共に増加する）。
【０１４５】
異なる時点における異なるポリマー被覆の効果を試験した（図１５）。ポリマー（ＰＥＧおよび網状ＰＥＧ、ＡＰＥＧ）を薄いポリドーパミン層ＤＯＰＡ（単独でも試験した）に共有結合させたところ、血小板活性化および付着の減少に対してわずかな、ただし有意ではない効果を有した。血液に適用される剪断応力の時間を増加させると、２つのパラメータＳＣおよびＡＳは有意に増加した。ＳＣおよびＡＳパラメータの両方について、非被覆（ＮＣ）表面とＰＥＧ被覆表面との間には全ての時点で有意差が見られた。
【０１４６】
次に、健常ドナー３名についてＩｍｐａｃｔ−Ｒのインビトロで２分間剪断応力１８００秒−１を使用して、ポリドーパミン（ＤＯＰＡ）、ＤＯＰＡ−ＰＥＧ（ＰＥＧ）、ＤＯＰＡ−ナノゲル（ＮＧＥＬ）およびＤＯＰＡ−ナノゲル−ＰＥＧ（ＮＧＥＬ−ＰＥＧ）の被覆を試験した（図１６Ａ、図１６Ｂ）。ＤＯＰＡ以外は、ＮＣと比較して全ての被覆についてＳＣ値の有意差が観察された。ＰＥＧ被覆ＰＳウェルでは最も低いＳＣ値およびＡＳ値が生じた。血小板はＰＥＧ被覆表面上に凝集体を形成することができなかった。重要なことに、ナノゲル堆積は血小板付着特性を示さなかった。
【０１４７】
図１７の試験は、流動誘発性血小板消費に対するチカグレロル単独（ＮＧ−Ｔ−ＰＥＧ）または２つの抗生物質との組み合わせ（ＮＧ−ＴＡ−ＰＥＧ）の効果を研究するために行った。ドナー１名からの血液試料についての試験を１８００秒−１で４分間行った。非被覆（ＮＣ）ウェル以外では、血小板の結合はいかなる条件でも観察されなかった。図１７に報告した値は、試験後の血中の単一の血小板数を表し、したがって表面上および／または血中の血小板凝集体形成を表す。両方のナノゲルについて血小板数の有意な増加が観察され、血小板が単一の血小板として懸濁状態を維持し（すなわち活性化されていない）、表面に付着しなかったことを示している。
【０１４８】
静的テスト
静的条件（剪断応力が加えられていない）における被覆の血液適合性を調べた。静的試験は、５００μＬの新鮮血液を２４ウェル無処理プレート中で３７℃および５％ＣＯ２で２時間、穏やかに撹拌しながら（６０ｒｐｍ）インキュベートし、被覆の存在下または非存在下で光学顕微鏡で細胞付着を観察することにより行った。クリスタルバイオレット染料を用いて細胞を染色した。図１８では、クリスタルバイオレットで染色した細胞の光学顕微鏡画像はＰＳ表面修飾後の血球付着の阻害を強調した。条件は、非被覆（ＮＣ）、ナノゲル（ＮＧ）、ナノゲルＰｅｇ（ＮＰ）およびポリドーパミン層に結合したナノゲル抗生物質Ｐｅｇ（ＮＡＰ）であった。
【０１４９】
血小板懸濁液（ＰＲＰ：多血小板血漿）もＮＡＰ被覆ＰＳウェルと共に１分間（図１９Ａ）または４５分間（図１９Ｂ）インキュベートした。ＮＣ−ＰＳウェルと比較して表面被覆率に明らかな差が観察された。ＮＣ−１分は９０％の表面被覆率（ＳＣ）、ＮＡＰ−１分は５％ＳＣ、ＮＣ−４５分は９９．５％ＳＣ、ＮＡＰ−４５分はＳＣ４０％であった。
【０１５０】
したがって、これら全てのデータは、本発明のナノゲル調製物による表面修飾が静的および動的条件下で血小板を活性化しないことを示している。
【０１５１】
例６：生物活性ナノゲルの抗バイオフィルム特性：黄色ブドウ球菌
静的条件下、２４ウェルプレート中で２４時間増殖させた黄色ブドウ球菌のバイオフィルムをクリスタルバイオレット染色によって分析した（図２０）。ナノゲルにミノサイクリンを装填した場合にバイオフィルムの減少が観察された。対照的に、共有結合したバンコマイシンはバイオフィルム形成を減少させない。したがって、Ｎｇ−Ｍｉｎｏ−Ｐｅｇ条件は他の全ての条件と比較して浮遊性細菌の９５％の減少をもたらした。
【０１５２】
２４ウェルプレート中で黄色ブドウ球菌と２４時間静的条件でインキュベートした生物学的弁ディスクの場合、Ｎｇ−ＡＢｓＰｅｇ修飾ディスクとインキュベートした場合に浮遊性細菌は完全に死滅したが、非被覆ディスク条件では生存細菌が存在した。
【０１５３】
興味深いことに、バンコマイシン、ミノサイクリン、およびチカグレロルを装填したナノゲルで修飾した生物学的弁表面のＳＥＭ分析ではいかなる細菌も検出されなかったが、非修飾表面では多くのバイオフィルムが明らかになった（図２１）。したがって、本発明の生物活性ナノゲルは、生物学的弁に強力な抗バイオフィルム特性を付与する。
【０１５４】
例８：生物活性ナノゲルの抗バイオフィルム特性：フェカリス菌
図２２は、フェカリス菌のバイオフィルム形成に対するＰＳ表面修飾の効果を示す。抗菌活性は、懸濁液中の細菌の生存率を評価することによって観察した。バンコマイシン装填ナノゲルは、静的条件下で抗菌活性を示し、ナノゲル中の抗生物質の共有結合がその活性を保存したことを実証した。ミノサイクリンは、振盪条件および静的条件の両方において有効であった。
【０１５５】
例９：抗血栓特性を有するナノリザーバを作成するためのミノサイクリンとチカグレロルの最適比の定義
最適な抗血栓特性を示すであろう抗菌活性と抗血小板活性の両方を有するナノリザーバを製造するために、抗血小板薬チカグレロルの最適濃度を最初に決定した。この目的のために、漸増濃度のチカグレロルを装填した１ｍｌのナノゲル懸濁液を１２０００ｇで１５分間遠心分離し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、３００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。２６０μＬの多血小板血漿（ＰＲＰ）を１０μＬの精製ナノゲル懸濁液と共に１０分間インキュベートした。次に、撹拌条件下、３７℃で１０μＭのＡＤＰを添加することによって血小板凝集を誘導した。ＡＤＰ誘導血小板凝集を阻害するためのナノゲル懸濁液の効力を、遊離チカグレロルのＩＣ５０濃度の効力と比較した。チカグレロル１１２μｇ／ｍＬを装填したナノゲルは、チカグレロル１．８μｇ／ｍＬと同程度に強力に血小板凝集を阻害することが観察された（図２３Ａ）。この装填濃度をその後の研究に使用した。
【０１５６】
ミノサイクリンの非存在下で抗血小板ナノゲル（１１２μｇ／ｍＬチカグレロルを装填）がより容易に形成されることが確認された。したがって、ミノサイクリンとチカグレロルを含有するナノリザーバを得るために、２つのナノゲル溶液をｘ／ｙ比で混合するという戦略を採用した。ｘ（ミノサイクリン）／ｙ（チカグレロル）の比率１／５〜２／３は、ＡＤＰ誘導血小板凝集の最適な阻害を提供した（図２３Ｂ）。さらに、ポリスチレン表面上に２／３の比率で調製したナノゲル混合物を固定すると、非被覆表面と比較して、ヒト血漿の凝固を活性化しなかった（図２４）。
【０１５７】
例１０：ナノゲルの多層集合体は、ナノリザーバの抗バイオフィルムおよび抗血栓効力を改善する
次に、多層集合体がナノリザーバの抗菌効力および抗血小板効力を改善できるかどうかを評価した。１、３、または５層ごとのナノゲルをポリスチレンまたはチタン表面に固定化した。次に表面を黄色ブドウ球菌とインキュベートし、バイオフィルム形成を方法に記載のように定量した。ナノゲル層の数を増やすと、ナノリザーバ抗バイオフィルム作用が増強されることがわかった（図２５）。
【０１５８】
固定化多層ナノリザーバの抗血小板効果を研究するために、Ｉｍｐａｃｔ  Ｒ装置（方法参照）を用いた試験を設定した。全血を、穏やかに撹拌しながら室温で１分間ＡＤＰ２．８μＭで予備活性化した後に、またはこれを行わずに、７２０ｒｐｍの回転を４分間適用した。表面被覆率および凝集体サイズを各試験表面について決定し、血小板数の低下を上清中で分析した。ナノリザーバから放出されたチカグレロルは、血小板Ｐ２Ｙ１２受容体に対してより高い親和性を有するため、ＡＤＰ効果を元に戻すことができると予想された。
【０１５９】
１層チカグレロル／ミノサイクリン装填ナノゲルの効果を５層装填ナノゲルと比較した（図２６）。非被覆表面および非装填ナノゲル被覆表面も含まれていた。ＡＤＰによる予備活性化は、溶液中でミクロ凝集体の形成を誘導し、それが表面被覆率の減少（図２６Ａ）および凝集体サイズのわずかな増大（図２６Ｂ）をもたらし、非被覆（ＮＣ）表面上または非装填ナノゲル（ＮＧ）被覆表面上でインキュベーションした非活性化血液と比較した場合に、単一の血小板の喪失（図２６Ｃ）に変容した。装填ナノゲル被覆表面上での血液インキュベーションは、ナノリザーバからのチカグレロル放出の結果として、ＡＤＰの効果を阻害した。５層ナノリザーバの効力は、表面被覆率および凝集体サイズに関して、１層のものよりも優れていた。両方のナノリザーバは、溶液中の単一の血小板のＡＤＰ誘導喪失を回復した。
【０１６０】
例１１：多層ナノゲル集合体の網状化は、生物活性分子の放出を遅らせ、効力を延長する
生物活性分子の放出は、ナノリザーバ形成の最終工程でドーパミンを用いて５層ナノゲル集合体を網状化することによって減速することが観察された。ナノゲル被覆の架橋密度を調整することによって、装填分子の拡散速度を実際に調整することができる。ドーパミンは、ナノリザーバからの生物活性分子の拡散を遅らせるための架橋剤として作用する。このドーパミン処理は、２つの異なる方法で分子の拡散に影響を与え得る。第１に、ドーパミンは、ＬＢＬナノゲル集合体の異なる層内に浸透し、ナノゲルと反応し、それによってその架橋密度を増加させることができる。第２に、ドーパミンは溶液中で重合し、ＬＢＬの表面上に薄層として沈殿することにより沈着し、生物活性分子の拡散に対する追加の障壁として作用することができる。
【０１６１】
異なる層の堆積工程の後、得られたＬＢＬ集合体を０．１２５ｍｇ／ｍｌのドーパミン溶液に１時間浸漬した。表面を洗浄した後、表面にＰＥＧ１５００をグラフトした。被覆表面および非被覆表面を培地単独で４８時間インキュベートした。培地を２回交換した後、細菌を前述のように付着させた。図２７Ａは、ミノサイクリンおよびバンコマイシンを装填した非網状ナノリザーバ（ＮＴＭＶ）は黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成を阻害できなかったが、網状ナノリザーバ（Ｄ−ＮＴＭＶ）は４８時間後もなお活性であったことを示す。図２７Ｂは、２種類のナノリザーバとの２回目の２４時間の接触後に除去した培地の抗菌効果を示し、この接触期間中に網状ナノリザーバからより高濃度の抗生物質が放出されることを実証している。
【０１６２】
例１２：Ｔｉインプラント上に固定化したナノリザーバの抗菌効力のインビボ実証
インビボでのナノリザーバの抗バイオフィルム効力を実証するために、チタンインプラント黄色ブドウ球菌感染症のマウスモデルを使用した。感染前のチタン製装置を皮下に移植し、４時間後にインビボバイオフィルム形成を評価した。図２８Ａは、移植時のディスク当たりの初期ＣＦＵを補正した後の、外植チタンディスク当たりのＣＦＵ数を示す。ナノリザーバは、非装填ナノゲルと比較して、チタンインプラント上のバイオフィルム形成を完全に防止した。この結果は、チタンインプラントの走査型電子顕微鏡法によってさらに確認された（図２８Ｂ）。細菌は、非装填ナノゲルのみで被覆したチタン上で見られた。免疫細胞は、ナノリザーバ被覆インプラント上で観察された。
【０１６３】
例１３：異なるチオールまたはビニル末端官能化配位子で被覆されたＬＢＬ集合架橋ナノゲルの調製
血小板および細菌に対して固有の抗付着特性を発揮するであろうナノゲル配合物を同定するために、異なるチオールまたはビニル末端官能化配位子をＬＢＬ集合ナノゲルの最終層として添加した。
【０１６４】
ＰＥＧ１．５と呼ばれるα−メトキシ−ω−メルカプト−ポリ（エチレンオキシド）（ＭＰＥＧ−ＳＨ）は、以下の通りメルカプト酢酸を用いたモノメトキシポリ（エチレンオキシド）（ＭＰＥＧ−ＯＨ）のヒドロキシル末端基のエステル化によって合成した（Ｍｎ＝１５００ｇ／ｍｏｌ）。
【化１３】
2020515304.tif 000015
撹拌機およびディーンスターク装置を備えた１００ｍｌの二口フラスコにＭＰＥＧ−ＯＨ（１０ｇ、５ｍｍｏｌ）を加えた。ＭＰＥＧ−ＯＨをトルエンとの３回の共沸蒸留により乾燥させ、最後に５０ｍｌのトルエンに溶解した。次にメルカプト酢酸（３．５ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）および濃硫酸（２滴）を加えた。フラスコを油浴中１１０℃で一晩加熱した。ＭＰＥＧ−ＳＨを０℃でエーテル中で沈殿させることにより集め、次に４０℃で２４時間真空乾燥させた。ＰＥＧ−ＳＨは、１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けられた（図２９）。
【０１６５】
ＰＥＧ２（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ、Ｍｗ２，０００、化学名：α−メルカプトエチル−ω−メトキシ、ポリオキシエチレン、参照記号ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ−０２０ＳＨ）、ＰＥＧ５（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ）、Ｍｗ５，０００、化学名：α−メルカプトエチル−ω−メトキシ、ポリオキシエチレン、参照記号ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ−０５０ＳＨ）、およびＰＥＧ１０（メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）２−ＳＨ、Ｍｎ１０，０００、化学名：α−メルカプトエチル−ω−メトキシ、ポリオキシエチレン、参照記号ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ−１００ＳＨ）は、ＮＯＦ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。
【０１６６】
ＮＯＦ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＭＰＥＧ−ＳＨの化学式は以下の通りである。
【化１４】
2020515304.tif 000016
【０１６７】
ビニル末端官能化ＰＥＧ配位子（ＰＥＧ−アクリラート）は、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリラート、Ｍｎ４８０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、参照記号４５４９９０（ＡＰＥＧ０．５）、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリラート、Ｍｎ１，０００、Ａｌｆａ  Ａｅｚａｒ．参照記号４６５３７（ＡＰＥＧ１）を使用した。それらの化学式は以下の通りである。
【化１５】
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ポリベタインの合成方法を以下に示す。２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）の重合は、マグネチックスターバーを備えたシュレンクフラスコ中でＭＰＣ（０．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾアート（ＣＴＰ；１０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（１．２ｍｇ、７．３×１０−３ｍｍｏｌ）、および脱イオン化したＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ３：１（５．０ｍｌ）を添加することによって達成した。次に、混合物を氷浴中で撹拌してＣＴＰおよびＡＩＢＮを完全に溶解させた。次に溶液を窒素でパージした後、７０℃の予熱した油浴に浸した。１２時間後、急冷および空気への暴露により重合を停止した。次に、重合溶液を脱イオン水を３回交換しながら脱イオン水に対して１２時間透析した。次に、ホモポリマーを凍結乾燥によって回収した。ポリベタインは、１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けられた（図３０）。
【化１６】
2020515304.tif 000018
【０１６８】
水中のナノゲルの安定な溶液は、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）ポリマーの酸化還元状態およびＰＡＨ溶液のｐＨの両方を適切に制御することによって調製した。最初に、Ｐ（ｍＤＯＰＡ）を塩基性条件下、水性媒体中で１２時間酸化して水溶性Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）を形成する。Ｐｏｘ（ｍＤＯＰＡ）の酸化したＤＯＰＡ部分は、アミン／キノン反応および／または室温でのシッフ塩基形成によるＰＡＨの共有結合相互作用のため、したがって安定な架橋ナノゲルの調製のために必要である。
【０１６９】
基材の表面上への架橋ナノゲルの固定化は、第１の層を表面に強く固定するために、基材をＤＯＰＡのトリス緩衝液中に最初に浸す／浸漬することによって達成された。次に、表面を第一級アミンを有するポリマーであるポリアリルアミン（ＰＡＨ）の水溶液およびナノゲルの溶液に連続的に浸漬し、続いて脱イオン水で２回洗浄することにより、次の層が構築される。上記の堆積および洗浄工程を繰り返すことによって、レイヤーバイレイヤー（ＬＢＬ）集合体を得た。次に、チオールおよびビニル末端官能化配位子の溶液（１０ｍＭトリスｐＨ８．０中５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ、チオールに対するＰｏｘ（ｍＤＯＰＡ）のキノン基の反応性を利用することにより、およびマイケル型付加およびＰＡＨのアミン基とのシッフ塩基反応を通して、最終層として加えた。
【０１７０】
以下の表は、ポリドーパミンと比較して、チオールまたはビニル官能化末端を有する異なる配位子を有するナノゲル被覆表面上で測定した接触角を示す。
【０１７１】
【表１】
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【０１７２】
以下の例では、最終層として異なる配位子をグラフトした表面固定化５層ナノゲルの抗付着（血漿タンパク質、血小板および細菌）特性を試験した。凝固の接触相の活性化に対する効果も研究した。
【０１７３】
例１４：チオール官能化末端を有する配位子は、固定化ナノリザーバへの血小板付着防止についてビニル官能化末端を有する配位子よりも優れている
チオールまたはビニル官能化末端を含むＰＥＧの最上層を有する５層ナノゲルまたはナノリザーバで被覆された、または被覆されていないポリスチレン表面上の血小板付着を比較するために、ＬＤＨ活性アッセイを実施した（図３１）。表面上でのＰＲＰの４５分間のインキュベーションの後、ミノサイクリンおよびチカグレロル装填ＰＥＧ−ＳＨナノゲル（比率２／３、上記参照）で作製したナノリザーバは、非装填ナノゲルと比較して血小板付着を効率的に阻害したが、ＰＥＧ−アクリラートを有するナノゲルで作製した同じナノリザーバはあまり効率的ではなかった。
【０１７４】
例１５：ナノゲル被覆チタンインプラント上で黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成を防止するためのチオール官能化末端を有するＰＥＧ２０００配位子の優位性
ナノゲル上への配位子グラフト化がそれ自体で表面に対する抗付着特性を付与できるかどうかを決定するために、チオールまたはビニル官能化末端を含む異なる配位子を有する５層ナノゲルで被覆した、または被覆していない医療グレードのチタンインプラントで黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成を比較した。バイオフィルム形成は、インプラント上に３時間後に付着した細菌を分離しプレーティングすることによって評価した。次にＣＦＵ数を決定した。チオール末端ＰＥＧ２０００配位子は、ポリベタイン１５０００ならびにＰＥＧ−アクリラート５００および１０００と比較して、最も効率的な抗バイオフィルム特性をチタンに付与し得ると思われた（図３２）。
【０１７５】
例１６：チオール官能化末端を有するＰＥＧ配位子：細菌付着に対する分子量の影響
２０００を超える分子量のＰＥＧチオールを有するナノゲルの黄色ブドウ球菌抗バイオフィルム効力のさらなる比較を行った。図３３は、ＰＥＧチオール−ナノゲルの抗バイオフィルム効果がＰＥＧ分子量と共に増加することを示す。
【０１７６】
例１７：チオール官能化末端を有するＰＥＧ配位子：流動下の血小板付着に対する分子量の影響
抗バイオフィルムおよび抗血小板特性の両方を有する表面を作成する目的で、Ｉｍｐａｃｔ−Ｒシステムを用いて流動下での血小板付着の実験を行い、例１６（図３４）と同じＰＥＧチオール配位子を比較した。バイオフィルム形成とは対照的に、結果は、非被覆表面と比較して血小板による表面被覆のパーセンテージが低いこと、および凝集体サイズが小さいことによって示されるように、グラフト化ポリマーを含まないナノゲルが表面に抗血小板効果をすでに付与していることを示す。ＰＥＧチオール分子量に関して、抗バイオフィルム効果と抗血小板効果との間にも違いが観察された。実際、最適な抗血小板被覆は、ＰＥＧ１５００またはＰＥＧ２０００を使用することによって達成されたが、分子量を増加させても効果は改善されなかった。
【０１７７】
例１８：チオール官能化末端を有するＰＥＧ配位子：凝固に対する分子量の影響
被覆表面および非被覆表面と接触している血漿の凝固時間を比較した。参照は、基礎状態の血漿、すなわち表面（チューブおよびチップの表面を除く）と接触していない血漿であった（図３５）。図３５は、負に荷電したカオリンを表面に固定化した場合に得られる凝固時間の短縮、およびＦＸＩＩａ阻害剤ＣＴＩの反対の効果を示す。ＰＥＧ配位子を有する５層ナノゲルで被覆した表面は、非被覆表面と比較して、凝固時間をわずかに延長させることが観察された。異なる分子量のＰＥＧを比較すると、最長の凝固時間は、ＰＥＧ２０００および５０００を有するナノゲルによって生じたことが観察された。したがって、凝固の接触相の完全な抑制には達していないが、これらのナノゲルは非被覆表面の効果を改善することができた。
【０１７８】
例１９：ＰＥＧチオール配位子はバイオフィルム形成の防止についてポリベタインよりも優れている
ここに提示されたデータは、ナノゲル集合体へのＰＥＧ２０００のグラフト化が、血小板および細菌の両方に対して表面への抗付着性を付与し得ることを示している。ＰＥＧ２０００を基準として、異なる鎖サイズおよび分子量のポリベタインをさらに比較した。バイオフィルム形成は、最初にＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステムおよび生物発光黄色ブドウ球菌を用いて評価した（図３６）。この技術により、試験面へのバクテリア付着の動態を追跡することができた。図３６に示すように、ＰＥＧ２０００は、試験した全てのポリベタインの中で最良の抗バイオフィルム配位子のままであった。
【０１７９】
例２０：ＰＥＧチオール配位子は流動条件下の血小板付着防止についてポリベタインよりも優れている
上記と同様に、流動条件下で血小板付着を防止するための異なる鎖サイズおよび分子量のポリベタイン配位子の効力を評価した（図３７）。表面被覆率および表面上に形成された血小板凝集体のサイズに関して、ＰＥＧ２０００がいずれのポリベタインよりも優れていることが観察された。対照的に、静的条件下で血小板付着を評価する場合、チオール末端ＰＥＧとポリベタインとの間に差は観察されなかった（図３８）。
【０１８０】
例２１：チオール官能化末端を有するＰＥＧ配位子は凝固に関してポリベタインよりも優れている
チオール末端ＰＥＧ配位子の中で、ＰＥＧ２０００が最も低い凝固活性化を生じることが示された（図３５）。増加する鎖サイズおよび分子量のチオール末端ポリベタインを有するＰＥＧ２０００も比較した。図３９はポリベタインポリマーにおける鎖サイズの影響を示さないが、ＰＥＧ２０００はＰＳウェルの表面に接触していない基礎血漿よりも多くの接触相活性化を生じないことが確認された。
【０１８１】
例２２：チオール官能化末端を有するＰＥＧ配位子は、血漿タンパク質付着の防止についてポリベタインよりも優れている
血漿または血液が異物表面に接触すると、最初の事象はタンパク質吸着であり、これは血小板の付着を促進し、凝固の内在的カスケードの活性化をもたらす。したがって、血漿タンパク質付着の試験は、血液適合性装置の開発における重要な工程である。
【０１８２】
ポリスチレンウェルの表面は、最後の最上層として異なる分子量のＰＥＧまたはポリベタインを含むかまたは含まない５層ナノゲルで被覆または非被覆とした。この試験は、グラフトポリマーの長さがタンパク質の非特異的吸着を防止し得るという一般的な考えと一致している。本発明者らの結果は、ＰＥＧ２０００（ＮＧ−Ｐ２）および５０００（ＮＧ−Ｐ５）はグラフトポリマーを含まないナノゲル（ＮＧ）と比較して表面の防汚性を改善するが、ポリベタイン（ＮＧ−ＰＢ７、１５、４４）は改善できないことを示す（図４０）。
【０１８３】
例におけるナノゲルへの言及は、ナノリザーバへの言及に置き換えることもできることが理解されよう。ナノゲルという用語は、ナノゲルから作製されたナノ粒子を含むナノリザーバを指すために使用され得ることを読者は理解するであろう。
【０１８４】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように意図的に本発明の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020515304.tif 000028
【図６】
2020515304.tif 000029
【図７】
2020515304.tif 000030
【図８】
2020515304.tif 000031
【図９】
2020515304.tif 000032
【図１０】
2020515304.tif 000033
【図１１】
2020515304.tif 000034
【図１２】
2020515304.tif 000035
【図１３】
2020515304.tif 000036
【図１４】
2020515304.tif 000037
【図１５】
2020515304.tif 000038
【図１６Ａ】
2020515304.tif 000039
【図１６Ｂ】
2020515304.tif 000040
【図１７】
2020515304.tif 000041
【図１８】
2020515304.tif 000042
【図１９】
2020515304.tif 000043
【図２０】
2020515304.tif 000044
【図２１】
2020515304.tif 000045
【図２２】
2020515304.tif 000046
【図２３】
2020515304.tif 000047
【図２４】
2020515304.tif 000048
【図２５】
2020515304.tif 000049
【図２６】
2020515304.tif 000050
【図２７】
2020515304.tif 000051
【図２８】
2020515304.tif 000052
【図２９】
2020515304.tif 000053
【図３０Ａ】
2020515304.tif 000054
【図３０Ｂ】
2020515304.tif 000055
【図３１】
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【図３２】
2020515304.tif 000057
【図３３】
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【図３４】
2020515304.tif 000059
【図３５】
2020515304.tif 000060
【図３６】
2020515304.tif 000061
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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