(57)【要約】  本開示は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子操作株におけるエンデュラシジンの産生増強のための組成物及び方法を記載する。特に、本開示は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ由来のエンデュラシジン（エンラマイシン）生合成遺伝子クラスターに関連する調節遺伝子ｏｒｆ２４及びｏｒｆ１８の遺伝子操作をし、より高収量のエンデュラシジンを産生するベクター構築物及び組換え株の作製について記載する。【選択図】図１
2020500561.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増強型オープンリーディングフレーム−２４（ｏｒｆ２４）、減少型オープンリーディングフレーム−１８（ｏｒｆ１８）、及び増強型ｏｒｆ２４及び減少型ｏｒｆ１８の両方からなる群から選択される１つ又は複数の修飾遺伝子を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの組換え株であって、対照としてのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株で得られるものと比較して、増強されたエンデュラシジン産生が前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの組換え株で得られる、組換え株。
【請求項２】
前記減少型ｏｒｆ１８がヌル化されたために減少する、請求項１に記載の組換え株。
【請求項３】
前記減少型ｏｒｆ１８が、フレーム内欠失、フレームシフト突然変異、点突然変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロセスによってヌル化された、請求項２に記載の組換え株。
【請求項４】
前記減少型ｏｒｆ１８がフレーム内欠失によってヌル化されている、請求項３に記載の組換え株。
【請求項５】
前記フレーム内欠失が、前記ｏｒｆ１８のヌクレオチド５〜６６０（配列番号２７）のものである、請求項４に記載の組換え株。
【請求項６】
前記増強型ｏｒｆ２４が異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項７】
前記異種プロモーターが強力な構成的プロモーターである、請求項６に記載の組換え株。
【請求項８】
前記強力な構成的プロモーターがｅｒｍＥ＊ｐである、請求項７に記載の組換え株。
【請求項９】
前記増強型ＯＲＦ２４が過剰発現されているために増強されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１０】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２１０１３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１１】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１２】
前記組換え株によるエンデュラシジンの前記産生は、前記対照Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓによるエンデュラシジンの前記産生より少なくとも１．２倍大きい、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１３】
前記組換え株によるエンデュラシジンの前記産生が、前記対照Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓによるエンデュラシジンの前記産生よりも１．２〜４．６倍多い、請求項１２のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１４】
ＢＭ３８−２．２４／１６（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４００６）である、請求項１に記載の組換え株。
【請求項１５】
ＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４００７）である、請求項１に記載の組換え株。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの前記組換え株を、エンデュラシジンを産生するのに十分な条件下で培養することを含む、エンデュラシジンを産生する方法。
【請求項１７】
前記培養培地から前記エンデュラシジンを単離することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヌル化されているオープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）を含む破壊ベクター。
【請求項１９】
前記ｏｒｆ１８が、フレーム内欠失、フレームシフト突然変異、点突然変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるプロセスによってヌル化されている、請求項１８に記載の破壊ベクター。
【請求項２０】
前記ｏｒｆ１８がフレーム内欠失によってヌル化されている、請求項１９に記載の破壊ベクター。
【請求項２１】
前記フレーム内欠失が、ｏｒｆ１８（配列番号２７）のヌクレオチド５〜６６０のものである、請求項２０に記載の破壊ベクター。
【請求項２２】
増強型オープンリーディングフレームｏｒｆ２４（配列番号３８）を含む発現ベクター。
【請求項２３】
前記増強型ｏｒｆ２４が異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記異種プロモーターが強力な構成的プロモーターである、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記強力な構成的プロモーターがｅｒｍＥ＊ｐである、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記発現ベクターが、ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４（配列番号３）、ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ（配列番号２０）、及びｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒ（配列番号２３）からなる群から選択される、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
ｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（配列番号８）、ｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（配列番号１１）、ｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（配列番号１４）、及びｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）（配列番号１９）からなる群から選択される、請求項１８に記載の破壊ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月６日に出願された米国仮特許第６２／４３０，８３８号及び２０１７年３月３０日に出願された６２／４７９，０８７号の早期出願日の優先権を主張するものであり、これらの各々は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、抗生物質生合成、特に、エンデュラシジンの産生を増強するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多剤耐性細菌感染の世界的な出現は莫大な医療費をもたらし、公衆衛生に対する大きな脅威となっている。抗菌剤耐性の開発を先取りするために、より費用効果的な方法で新規の抗生物質及びそのような抗生物質を産生する方法を同定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの野生型株におけるエンデュラシジン（エンラマイシン）の制限された産生、ならびに、増加したレベルの所望のエンデュラシジンペプチド抗生物質を産生するための染色体の従来の放射線及び化学媒介変異誘発及び変異体の連続的な複数回の選択によって開発される工業株における産生の限界に関する問題を克服する。本明細書に開示されているのは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ由来のエンデュラシジン（エンラマイシン）生合成遺伝子クラスターに関連する調節遺伝子ｏｒｆ２４及びｏｒｆ１８の遺伝子操作をして、組換えベクター及びこのペプチド抗生物質のより高い収量をもたらす株を生成することである。野性型産生体であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓＢ−５４７７（ＡＴＣＣ２１０１３）、及び野生型株由来で現在エンデュラシジンの産業的産生で利用されているＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）の両方で組換え株を構築した。野生型生物において、ｏｒｆ２４の第２のコピーの過剰発現を駆動するプラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４の部位特異的組込みは、株ＳｆｐＸＹ１５２ｅｎｄｏｒｆ２４を生成した。変異誘発フォスミドｐＸＹＦ２４Ｄ３の野生型染色体への組込みは、天然のｏｒｆ１８を遺伝子の破壊されたコピーで置き換え、変異体ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３を創製した。商業的な産生体Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）で作働して、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４の組込みは組換え株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２．２４／１６を生成した。機能的なｏｒｆ１８を欠くＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）由来の株を作製するために、ｏｒｆ１８及びそのフランキング領域を欠失させるようにプラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲを構築し、この領域をアプラマイシン耐性マーカーで置換し、組換え株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲを作製した。遺伝子操作された株は、それぞれの親株よりも１．２〜４．６倍高い範囲のエンデュラシジンの収量を生じることが実証された。組換え株からの増加したエンデュラシジン収量は、より費用効果的なエンデュラシジンの産生を提供する。
【０００５】
本開示の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面を参照しながら進める以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】エンデュラシジンＡ及びＢの化学構造を提供する。
【図２】組込み発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４のマップである。
【図３】遺伝子欠失プラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄのマップである。
【図４】遺伝子欠失プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄのマップである。
【図５】遺伝子欠失プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲのマップである。
【図６】遺伝子欠失プラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）のマップである。
【図７】組込み発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒのマップである。
【図８】組込み発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒのマップである。
【図９】ストレプトマイシン活性化因子ＳｔｒＲタンパク質（配列番号２５）とＯｒｆ２４（配列番号２６）とのアラインメントを提供する。
【図１０Ａ】プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（ａ）及びｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（ｂ）のインサートのマップである。
【図１０Ｂ】プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（ａ）及びｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（ｂ）のインサートのマップである。構築物ｐＸＹ３０−ｏｒｆ１８ｉｆｄでは、ヌクレオチド位置２５７９５から２６４５０までのｏｒｆ１８の内部配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２）を削除し、ＰａｃＩ制限部位で置換した（ＴＴＡＡＴＴＡＡ、図１０Ｂ）。得られたフレーム内欠失ｏｒｆ１８（ＧＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＡ（配列番号２７））は、３アミノ酸ペプチド（ＶＦＮ）に翻訳することができた。一般に、ｏｒｆ１８の長さを超える任意の内部のフレーム内欠失は、その不完全性のためにＯｒｆ１８の機能をヌル化するはずである。
【図１１】Ｏｒｆ２４と、放線菌由来の６つの機能的に特徴付けられたＳｔｒＲ様経路特異的アクチベーターオルソログタンパク質とのアラインメント。Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓエンデュラシジン生合成遺伝子クラスター由来のＯｒｆ２４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２；配列番号２６）。ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）ストレプトマイシン合成遺伝子クラスター由来のＳｔｒＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ００４５９；配列番号２５）。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓテイコプラニン遺伝子クラスター由来のＴｅｉ１５＊（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ６３２２７０；配列番号３２）。Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ株ＤＳＭ  ５９０８バリヒミナ生合成遺伝子クラスター由来のＢｂｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１６９５２；配列番号２８）。Ｓ．ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓカスガマイシン遺伝子クラスター由来のＫａｓＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＦ７９６９０；配列番号２９）。Ｓ．ｎｉｖｅｕｓ株ＮＣＩＭＢ  ９２１９ノボビオシン生合成遺伝子クラスター由来のＮｏｖＧ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１７０８８０；配列番号３０）。Ｓ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ  Ｃ−１０２７生合成遺伝子クラスター由来のＳｇｃＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ０４８６７０；配列番号３１）。同一アミノ酸（＊）、保存的アミノ酸（．）、及び高度に保存的なアミノ酸置換（：）ＳｔｒＲのようなＤＮＡ結合タンパク質に特徴的な保存ヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフには下線が引かれている。
【図１２】Ｏｒｆ１８（配列番号３６）と他の機能的に特徴付けられた応答制御因子オルソログとのアラインメント。ＳＣＯ１７４５／ＡｂｒＡ２：ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）二成分応答制御因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ５０９６０；配列番号３３）。ＳＣＯ３２２６／ＡｂｓＡ２：ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）二成分応答制御因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ０８０５３；配列番号３４）。ＳＣＯ３８１８：ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）二成分系応答転写制御因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ４６９４１；配列番号３５）。
【０００７】
配列表
本明細書及び添付の配列表に列挙された核酸及びアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字の略語、及びアミノ酸についての３文字コードを用いて示される。核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補的な鎖は表示された鎖への任意の言及によって含まれると理解される。添付の配列表では：
配列番号１及び２は、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４のインサートを生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【０００８】
配列番号３は、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４の核酸配列である。
【０００９】
配列番号４〜７は、プラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄのインサートを生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１０】
配列番号８は、プラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄの核酸配列である。
【００１１】
配列番号９及び１０は、プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄのｏｒｉＴ断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１２】
配列番号１１は、プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄの核酸配列である。
【００１３】
配列番号１２及び１３は、プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲのａｍＲ断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１４】
配列番号１４は、プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲの核酸配列である。
【００１５】
配列番号１５〜１８は、プラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）のｏｒｉＴ及びａｍＲ断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１６】
配列番号１９は、プラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）の核酸配列である。
【００１７】
配列番号２０は、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒの核酸配列である。
【００１８】
配列番号２１及び２２は、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒのｂｌａ断片を作製するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１９】
配列番号２３は、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒの核酸配列である。
【００２０】
配列番号２４はアプラマイシン耐性遺伝子の領域に対応するオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２１】
配列番号２５は、ストレプトマイシン活性化因子ＳｔｒＲタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号２６は、ＯＲＦ２４によってコードされるアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号２７は、ｏｒｆ１８のフレーム内欠失を説明する核酸配列である。
【００２４】
配列番号２８は、Ｂｂｒインサートのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号２９は、ＫａｓＴ挿入物のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号３０は、ＮｏｖＧインサートのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号３１は、ＳｇｃＲ１インサートのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号３２は、Ｔｅｉｌ５＊挿入物のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号３３は、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）由来の応答制御因子オルソログＳＣＯ１７４５／ＡｂｒＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ５０９６０）のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号３４は、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ０８０５３）由来の応答制御因子オルソログＳＣＯ／３２２６／ＡｂｓＡ２のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号３５は、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）由来の応答制御因子オルソログＳＣＯ３８１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ４６９４１）のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号３６は、ＯＲＦ１８によってコードされるアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号３７は、ｏｒｆ１８の核酸配列である。
【００３４】
配列番号３８は、ｏｒｆ２４の核酸配列である。
【００３５】
配列番号３９は、ヌクレオチド位置２３１０９から２４０４４に位置するｏｒｆ２４を有するフォスミドｐＸＹＦ１４８の核酸配列である。
【００３６】
配列番号４０は、ヌクレオチド位置３１０９１〜３１７５３に位置するｏｒｆ１８を有するフォスミドｐＸＹＦ２４の核酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．導入
エンデュラシジン（図１）は、エンラマイシンとも呼ばれている、土壌細菌Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  Ｂ−５４７７（ＡＴＣＣ２１０１３）によって産生される１７アミノ酸リポデプシペプチド抗生物質である。このペプチドは、発酵ブロス及び菌糸体から、主に、結合した脂質鎖の長さが１炭素異なるエンデュラシジンＡ及びＢの混合物として単離される。構造的には、エンデュラシジンは、アスパラギン酸残基へのアミド結合によって結合されたＣ１２又はＣ１３  ２Ｚ、４Ｅ分岐脂肪酸部分、及びエンデュラシジン（Ｅｎｄ）、４−ヒドロキシフェニルグリシン（Ｈｐｇ）、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシン（Ｄｐｇ）、シトルリン（Ｃｉｔ）及びオルニチン（Ｏｒｎ）などの多数の非タンパク質性アミノ酸残基の存在によって区別される（図１参照）。１７個のアミノ酸のうち７個はＤ立体配置を有し、残基の６個はＨｐｇ又は塩素化誘導体Ｄｐｇである。
【００３８】
エンデュラシジン（簡単にするために、ペプチドは単数形で示す）は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ；ＶＲＥ）を含む広範囲のグラム陽性生物に対して強力なインビトロ及びインビボ抗菌活性を示す。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は０．０５μｇ／ｍＬと低く、効果は殺菌性である。４０％ＭＲＳＡを含む、様々な病理学的産生物から収集された１００株の黄色ブドウ球菌を用いた研究では、０．０９〜０．５６μｇ／ｍＬの範囲のＭＩＣが確立され、いずれも１μｇ／ｍＬの曝露に生存することができなかった。比較すると、黄色ブドウ球菌の感受性株に対するバンコマイシンの典型的なＭＩＣは０．５〜２μｇ／ｍＬの範囲である。さらに、エンデュラシジンは優れた毒物学的プロファイルを有する。マウス、ウサギ、イヌ、サルの研究では、急性ＬＤ５０は、静脈内投与が３０〜１２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内が７５０〜９１０ｍｇ／ｋｇ、皮下、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は経口が＞５〜１０ｇ／ｋｇであった。同じ研究において、６ヶ月間エンデュラシジンをｉ．ｍ．で投与されたサル、また同様に１２ヶ月間投与されたラットは、注射部位に限局性炎症のみを有することが見出された。ヒトにおいて、ＭＲＳＡに感染した２０人の入院成人患者にエンデュラシジンをｉ．ｍ．で投与した（１２時間ごとに１００ｍｇ）。このペプチドは副作用がなく、またＭＲＳＡによって引き起こされる尿路感染症及び皮膚感染症の治療にも非常に効果的であるが、慢性骨感染症には効果がないと報告されている（Ｐｅｒｏｍｅｔら，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ１９：５３−６１，１９７３）。
【００３９】
エンデュラシジンは、細菌性細胞壁構造の前駆体である細胞外脂質ＩＩと複合体を形成することによって、細菌性ペプチドグリカン細胞壁生合成を阻害する。脂質ＩＩ複合体形成の部位は、バンコマイシンによって認識される部位とは異なり、バンコマイシン耐性生物に対するエンデュラシジンの作用を司る。今日まで、エンデュラシジンと臨床的に使用されているいずれの抗生物質との交差耐性も文書化されておらず、発生耐性、獲得耐性、又は転移耐性の証拠はない。いかなる既知の形態の移動可能な耐性機構も欠如していること、経口バイオアベイラビリティの欠如、その低い毒性、及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）に対する優れた活性により、エンデュラシジンは、クロストリジウム性腸炎を制御するための家禽飼料添加物として使用される主要な市販のペプチド系抗生物質になった。
【００４０】
商業的使用に必要な量のペプチドを供給することができる産生生物の株を得るために、日本武田アニマルヘルス（現在はＩｎｔｅｒｖｅｔ／Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈの一部）は、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓＢ−５４７７を様々な従来の株改良法に供し、より高い収量のエンデュラシジンを産生する変異体のために選択した。エンデュラシジンの世界市場が拡大していることから、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）におけるこの抗生物質の収量をさらに向上させるための取り組みが推進されている。２００６年１０月３日にワールドワイドウェブ上で入手可能であるとして参照により本明細書に組み入れられる、入手可能なエンデュラシジン生合成遺伝子クラスターの遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２）を用いて、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）を遺伝子クラスターに関連する調節遺伝子の標的化された遺伝子操作のための出発株として用いて、本開示のための基礎を構成する。本明細書では、ｏｒｆ１８の産生物がエンデュラシジンの産生に負の影響を与え、ｏｒｆ２４遺伝子の産生物がエンデュラシジンの産生に正の影響を与えること、ならびにこれらの調節効果を利用するＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ野生型及びＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）生物両方に由来する組換え株が、高い収量のエンデュラシジンを産生することが開示される。さらに、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ及びｐＳＥＴ  １５２に基づく新規遺伝子置換及び統合的発現ベクターが本明細書に開示される。
【００４１】
ＩＩ．略語と用語
ａ．略語
ＡＡ：アミノ酸
Ａｍ：アプラマイシン
ＡｍＲ：アプラマイシン耐性マーカー
ａｍＲｐ：天然アプラマイシン耐性プロモーター
ＡＴＣＣ：アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関
ｂｌａ：アンピシリン耐性遺伝子
ＢＬＡＳＴ：ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール
ｃａｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子
ＣＦＵコロニー形成ユニット
ＣＴＡＢ：臭化セチルトリメチルアンモニウム
Ｃｉｔ：Ｌ−シトルリン
Ｄｐｇ：３，５−ジクロロ−Ｌ−４−ヒドロキシフェニルグリシン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン二ナトリウム四酢酸
Ｅｎｄ：エンデュラシジン
エンラジン：エンデュラシジン、エンラマイシン
ＥＰＭ：エンデュラシジン産生培地
Ｈｐｇ：Ｄ−及びＬ−４−ヒドロキシフェニルグリシン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＴＨ：ヘリックス・ターン・ヘリックス
ＩＭ：筋肉内
ＩＳＰ２：国際ストレプトミセス菌プロジェクト培地２
ＩＳＰ４：国際ストレプトミセス菌プロジェクト培地４
ＬＢ：ルリア−ベルターニ培地
ＬＤ５０：致死量、ＬＤ５０は、試験動物の集団の５０パーセントを死滅させるのに必要な個々の用量を表す。
【００４２】
ＭＡＨ：Ｉｎｔｅｒｖｅｔ／Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＩＣ：最低抑制濃度、
ＭＲＳＡ：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
ｎｍ：ナノメートル
ＮＲＰＳ：非リボソームペプチドシンテターゼ
ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム
Ｏｒｎ：Ｄ−オルニチン
ＰＣＰ：ペプチジル担体タンパク質
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｆｒｄ：プラスフランキング領域の欠失
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＮＰ：一塩基多型
ＳＰＤ：分光光ダイオード
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＳＢ：トリプチックソイブロス
ｔｓｒ：チオストレプトン耐性遺伝子
ＵＶ：紫外線
ＶＲＥ：バンコマイシン耐性腸球菌
ｂ．用語
特に断りのない限り、専門用語は通例の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが１９９４年に発行したＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．が１９９４年に発行したＴｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．）、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．が１９９５年に発行したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００４３】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
【００４４】
投与：動物への任意の経路による投与。本明細書中で使用される場合、投与は典型的には経口投与をいう。
【００４５】
対立遺伝子変異体：１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有することを特徴とするポリペプチドの代替形態。一例では、変異体はポリペプチドの生物学的機能を変えない。
【００４６】
増幅：核酸に関して使用される場合、サンプル又は標本の核酸分子のコピー数を増加させる技術。増幅の例はポリメラーゼ連鎖反応であり、対象から採取された生物学的サンプルはサンプルの核酸鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させられる。プライマーを適切な条件下で拡張させ、鋳型から解離させ、次いで再アニールし、拡張させ、解離させて核酸のコピー数を増幅する。インビトロ増幅の産生物は、標準的な技術を用いて、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション又はライゲーション、及び／又は核酸配列決定によって特徴付けることができる。インビトロ増幅技術の他の例は鎖置換増幅（米国特許第５，７４４，３１１号参照）、無転写等温増幅（米国特許第６，０３３，８８１号参照）、連鎖反応増幅の修復（国際公開第９０／０１０６９号参照）、リガーゼ連鎖反応増幅（ＥＰ−Ａ−３２０  ３０８参照）、ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅（米国特許第５，４２７，９３０号参照）、連結リガーゼ検出及びＰＣＲ（米国特許第６，０２７，８８９号参照）、及びＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写フリー増幅（米国特許第６，０２５，１３４号参照）を含む。
【００４７】
類似体、誘導体又は模倣物：類似体は、親化合物と化学構造が異なる分子、例えば同族体（アルキル鎖の長さの違いなどの化学構造の増分によって異なる）、分子断片、１つ以上の官能基だけ異なる構造、及び／又はイオン化の変化である。構造的類似体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５），ｃｈａｐｔｅｒ２８）に開示されているものなどの技法と共に、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）を用いて見出されることが多い。元の化合物への変更が実質的な場合、又は多くの増分の変更が組み合わされた場合、その化合物はもはや類似物ではない。例えば、ラモプラニンは、本明細書ではエンデュラシジンの類似体とは見なされない：ラモプラニンは、いずれのエンデュラシジンアミノ酸も含まず、異なるアミノ酸を含み、脂質側鎖を有するが鎖長は実質的に短い。エンデュラシジンの類似体は、リポデプシペプチドを構成するアミノ酸の官能基の付加又は欠失、あるアミノ酸の他のアミノ酸への置換（エンデュラシジンアミノ酸を除く）、又は官能基修飾とアミノ酸置換の組み合わせによって調製できる。例示的なエンデュラシジン類似体には、テトラヒドロレンズラシジンＡ、テトラヒドロエンデュラシジンＢ、デスクロロエンデュラシジンＡ、及びデスクロロエンデュラシジンＢが含まれる。
【００４８】
誘導体は、基本構造に由来する生物学的に活性な分子である。模倣物は、別の分子の活性を、斯かる分子、例えば生物学的に活性な分子などの構造を模倣することによって、模倣する分子である。したがって、用語「模倣物」は、活性に関連する明確な構造を示す。
【００４９】
抗生物質：エンデュラシジン、ペニシリン又はストレプトマイシンといった他の微生物の増殖を損なわせる又は阻害することが可能な、ある種の真菌、細菌、及び他の生物によって頻繁に産生されるかそれらから誘導される物質。
【００５０】
アンチセンス、センス、及びアンチジーン：二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、プラス鎖と呼ばれる５’→３’鎖、及びマイナス鎖と呼ばれる３’→５’鎖（逆相補）の２つの鎖を有する。ＲＮＡポリメラーゼは５’→３’方向に核酸を付加するので、ＤＮＡのマイナス鎖は転写中にＲＮＡの鋳型として働く。したがって、形成されたＲＮＡは、マイナス鎖に相補的で、プラス鎖と同一の配列を有する（ＵがＴに置換されることを除く）。アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はプラス鎖ＤＮＡのいずれかに特異的にハイブリダイズ可能又は特異的に相補的である分子である。センス分子は、ＤＮＡのマイナス鎖に特異的にハイブリダイズ可能又は特異的に相補的である分子である。アンチジーン分子は、ｄｓＤＮＡ標的に相補的なアンチセンス又はセンス分子のいずれかである。一実施形態では、アンチセンス分子は標的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、標的ｍＲＮＡの転写を阻害する。
【００５１】
結合又は安定結合：オリゴヌクレオチド又はタンパク質などの分子は、結合が検出可能であれば、標的核酸又はタンパク質などの標的分子に結合又は安定的に結合する。一例では、十分な量のオリゴヌクレオチドが塩基対を形成するか、その標的核酸にハイブリダイズする場合、その結合の検出を可能にするために、オリゴヌクレオチドは標的核酸に結合又は安定に結合する。結合は、標的、オリゴヌクレオチド複合体の物理的な特性又は機能的な特性のいずれかによって検出することができる。標的とオリゴヌクレオチドとの間の結合は、機能的結合アッセイと物理的結合アッセイの両方を含む、当業者に公知の任意の手順によって検出され得る。結合が遺伝子の発現、ＤＮＡの複製、転写、翻訳などの生合成過程に対して観察可能な作用を有するかどうかを判定することによって、結合を機能的に検出することができる。
【００５２】
ＤＮＡ又はＲＮＡの相補鎖の結合を検出する物理的方法は当技術分野において周知であり、ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント又はケミカル・フットプリント、ゲルシフトアッセイ及びアフィニティー開裂アッセイ、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング及び光吸収検出法などの方法が含まれる。例えば、非常に単純で信頼性があるので広く使用されている１つの方法は、温度が徐々に上昇するときに、２２０〜３００ｎｍでオリゴヌクレオチド（又は類似体）及び標的核酸を含有する溶液の光吸収の変化を観察することを含む。オリゴヌクレオチド又は類似体がその標的に結合している場合、オリゴヌクレオチド（又は類似体）と標的が互いに解離するか融解するときに、特有の温度で吸収が急激に増加する。
【００５３】
オリゴマーとその標的核酸との間の結合は、オリゴマーの５０％がその標的から融解する温度（Ｔｍ）によって頻繁に特徴付けられる。より高いＴｍは、Ｔｍがより低い複合体と比較して、より強い又は安定した複合体であることを意味する。
【００５４】
タンパク質とその標的タンパク質、例えば、抗原に対する抗体との間の結合は、結合親和性を判定することによって頻繁に特徴付けられる。一実施形態では、親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１−１０６，１９７９により計算されている。別の実施形態では、結合親和性は特異的結合剤受容体解離速度によって測定される。さらに別の実施形態では、高い結合親和性は競合ラジオイムノアッセイによって測定される。いくつかの例では、高結合親和性は少なくとも約１×１０−８Ｍである。他の実施形態では、高結合親和性は少なくとも約１．５×１０−８、少なくとも約２．０×１０−８、少なくとも約２．５×１０−８、少なくとも約３．０×１０−８、少なくとも約３．５×１０−８、少なくとも約４．０×１０−８、少なくとも約４．５×１０−８、又は少なくとも約５．０×１０−８Ｍである。
【００５５】
生物学的機能：それが天然に存在する細胞におけるポリペプチドの（１又は複数の）機能。ポリペプチドは、複数の生物学的機能を有することができる。
【００５６】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の非コードセグメント（イントロン）及び転写調節配列を欠くＤＮＡの一片。ｃＤＮＡはまた、対応するＲＮＡ分子における翻訳の制御に関与する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。ｃＤＮＡは実験室で細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡからの逆転写により合成される。
【００５７】
保存的置換：分子の活性（特異度又は結合親和性）を実質的に変えないアミノ酸置換。典型的には保存的アミノ酸置換は、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する別のアミノ酸へ１つのアミノ酸を置換することを含む。以下の表は、例示的な保存的アミノ酸置換を示す。
【表１】
2020500561.tif 000003
【００５８】
対照Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株：天然に存在する野生型株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２１０１３。
【００５９】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ほとんどの生物の遺伝物質を含む長鎖ポリマー（一部のウイルスはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む遺伝子を有する）。ＤＮＡポリマー中の反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、それらの各々はリン酸基が結合しているデオキシリボース糖に結合している４つの塩基、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのうちの１つを含む。ヌクレオチドの三つ組（コドンと呼ばれる）は、ポリペプチド中の各アミノ酸をコードする。コドンという用語は、ＤＮＡ配列が転写されるｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドの対応する（また相補的な）配列にも用いられる。
【００６０】
他に特定されない限り、ＤＮＡ分子へのいかなる言及も、そのＤＮＡ分子の逆相補体を含むことを意図する。一本鎖であることが本明細書の本文で必要とされる場合を除き、ＤＮＡ分子は、一本鎖のみを描いているように書かれているが、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を包含する。したがって、特定のタンパク質又はその断片をコードする核酸分子への言及は、センス鎖とその逆相補体の両方を包含する。したがって、例えば、開示された核酸分子の逆相補配列からプローブ又はプライマーを作製することが適切である。
【００６１】
ドメイン：分子の他の部分と構造的及び／又は機能的に異なるタンパク質又は核酸などの分子の部分。
【００６２】
コード：ポリヌクレオチドは、その天然の状態で、又は当業者に周知の方法によって操作されたときに、転写及び／又は翻訳されて、ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド又はその断片を産生することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われる。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補体であり、それからコード配列を推定することができる。
【００６３】
エンデュラシジン：エンデュラシジンＡ及びＢは、土壌細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  Ｂ−５４７７（ＡＴＣＣ２１０１３）の発酵から１９６０年代後半に発見された１７アミノ酸のリポデプシペプチドである。Ａ及びＢペプチドは、結合した脂質鎖の長さが１炭素異なるホモログである。構造的には、エンデュラシジンは、Ｃ１２又はＣ１３  ２Ｚ、４Ｅ分岐脂肪酸部分、及びエンデュラシジン（Ｅｎｄ）、４−ヒドロキシフェニルグリシン（Ｈｐｇ）、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシン（Ｄｐｇ）、シトルリン（Ｃｉｔ）及びオルニチン（Ｏｒｎ）などの多数の非タンパク質性アミノ酸残基の存在によって区別される。１７個のアミノ酸のうち７個はＤ立体配置を有し、残基の６個はＨｐｇ又は塩素化類似体Ｄｐｇである。
【００６４】
ポリペプチドの機能的断片及び変異体：親ポリペプチドの１つ以上の機能を維持する断片及び変異体が含まれる。ポリペプチドをコードする遺伝子又はｃＤＮＡは、１つ又は複数のポリペプチドの機能を実質的に変更することなく著しく変異させることができると認識されている。第１に、遺伝暗号は縮重しており、したがって異なるコドンが同じアミノ酸をコードする。第２に、アミノ酸置換が導入された場合でさえも、変異は保存的であり得、タンパク質の必須の（１又は複数の）機能に重大な影響を及ぼさない。Ｓｔｒｙｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，（ｃ）１９８８を参照のこと。第３に、ポリペプチド鎖の一部を、その全機能を損なうことなく又は除去せずに欠失させることができる。第４に、挿入又は付加は、その機能を損なう又は排除することなく、例えばエピトープタグを付加することにより、ポリペプチド鎖に行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（５）：２５０２−１２，１９９７）。ポリペプチドの１つ又は複数の機能を実質的に損なうことなく行うことができる他の修飾としては、例えば、インビボ又はインビトロの化学的及び生化学的修飾、あるいは異常なアミノ酸の組込みが挙げられる。そのような修飾としては、当業者には容易に理解されるように、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識、及び種々の酵素的修飾が挙げられる。ポリペプチドを標識するための様々な方法、及びそのような目的に有用な標識としては、３２Ｐなどの放射性同位体、標識特異的結合パートナー（例えば抗体）に結合する又は結合されるリガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素、及び抗リガンドが挙げられる。機能的断片及び変異体は様々な長さであり得る。例えば、いくつかの断片は少なくとも１０、２５、５０、７５、１００、２００、又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。
【００６５】
有効量：対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の化合物又は組成物の量又は濃度。有効量は、治療されている動物の種、動物の大きさ、及び／又は所望の効果の性質に少なくとも部分的に依存し得る。
【００６６】
遺伝子クラスター：染色体上にまとめられた遺伝的要素のセット、そのタンパク質産生物は、天然産生物生合成経路の形成などの関連する機能を有する。
【００６７】
異種：コード配列及び制御配列などの核酸配列に関連するので、「異種」とは、通常、組換え構築物の領域と関連していない、及び／又は通常特定の細胞と関連していない配列を意味する。したがって、核酸構築物の「異種」領域は、天然には他の分子と関連して見出せない、識別可能な別の核酸分子内の核酸のセグメントである。例えば、構築物の異種領域は、天然のコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、宿主細胞中に通常は存在しない構築物で形質転換された宿主細胞は、本開示の目的に対して異種と見なされる。
【００６８】
相同アミノ酸配列：コード領域核酸配列の任意の部分にハイブリダイズする核酸配列によって全体的に又は部分的にコードされているいずれかのポリペプチド。相同アミノ酸配列は、１以上の保存的アミノ酸置換によって配列表に示されるアミノ酸配列とは異なるものである。そのような配列はまた、対立遺伝子変異体（上で定義されている）ならびにポリペプチドの機能的特徴を保持する欠失又は挿入を含む配列も包含する。好ましくは、そのような配列は、アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９８％同一である。
【００６９】
相同アミノ酸配列は、配列表のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一である配列を含む。「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、参照のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％同一であり、保存的アミノ酸置換の大部分による参照の配列と好ましくは異なる配列を意味する。本発明のこの態様と一致して、配列表のアミノ酸配列のいずれか１つに相同な配列を有するポリペプチドは、天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに本明細書に開示されている配列の任意のポリペプチドの固有の特徴を保持する変異体又はいずれかの他の天然に存在しない変異体を含む。相同性は、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ  ５３７０５などの配列分析ソフトウェアを使用して測定することができる。アミノ酸配列は、同一性を最大にするように整列させることができる。最適なアラインメントを達成するためにギャップを人工的に配列に導入することもできる。最適なアラインメントが設定されたら、位置の総数に対して両方の配列のアミノ酸が同一であるすべての位置を記録することによって、相同性の程度を確立する。相同なポリヌクレオチド配列も同様に定義される。好ましくは、相同配列は、少なくとも４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はコード配列のいずれか１つと同一のものである。
【００７０】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチド及び他の核酸は、相補的塩基間の、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合によってハイブリダイズする。一般に、核酸は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、及びチミン（Ｔ））又はプリン（アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基はピリミジンとプリンとの間に水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は塩基対合と呼ばれる。より具体的には、ＡはＴ又はＵに水素結合し、ＧはＣに結合する。相補的とは、２つの異なる核酸配列又は同じ核酸配列の２つの異なる領域間に生じる塩基対合を指す。
【００７１】
特異的にハイブリダイズ可能および特異的に相補的とは、第１の核酸（例えばオリゴヌクレオチド）と、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間に、安定かつ特異的な結合が生じるように、十分な程度の相補性を示す用語である。第１の核酸（例えばオリゴヌクレオチド）は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的配列に対して１００％相補的である必要はない。第１の核酸（例えばオリゴヌクレオチド）は、特異的結合が望まれる条件下で非標的配列への第１の核酸（例えばオリゴヌクレオチド）の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
【００７２】
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーションの方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに応じて変わる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーションの緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを判定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄ．）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１により考察されている。
【００７３】
以下はハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定的であることを意味しない。
【００７４】
非常に高いストリンジェンシー（９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：１６時間６５ＥＣで５×ＳＳＣ
２回洗う：各１５分間、室温（ＲＴ）で２×ＳＳＣ
２回洗う：各６５ＥＣで２０分間、０．５×ＳＳＣ
高いストリンジェンシー（８０％以上の配列同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間６５ＥＣ〜７０ＥＣで５×〜６×ＳＳＣ
２回洗う：各５〜２０分間、室温で２×ＳＳＣ
２回洗う：５５ＥＣ〜７０ＥＣで各３０分間、１×ＳＳＣ
低いストリンジェンシー（５０％を超える配列同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：ＲＴで５５ＥＣまで１６〜２０時間、６×ＳＳＣ
少なくとも２回洗う：それぞれ２０〜３０分間、５５ＥＣまでの室温で２×〜３×ＳＳＣ。
【００７５】
単離：単離された生物学的構成要素（核酸分子又はタンパク質など）は、その成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的構成要素、例えば他の染色体及び他の染色体ＤＮＡとＲＮＡ、タンパク質及び細胞小器官から、実質的に分離又は精製されたものである。核酸及び／又はポリペプチドに関して、この用語は、典型的には天然にそれらに隣接する配列に、もはや隣接していない、核酸又はポリペプチドを指すことができる。単離された核酸及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。
【００７６】
変異：細胞又は生物の遺伝物質（通常はＤＮＡ又はＲＮＡ）の配列を変化させるプロセス。当技術分野で周知の分子技術（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発など）を使用して、突然変異を意図的に遺伝物質に導入することができる。
【００７７】
非リボソームペプチド（ＮＲＰ）：通常は細菌や真菌などの微生物によって産生される二次代謝産物のクラス。リボソーム上で合成されたポリペプチドとは異なり、これらのペプチドは、アミノ酸から非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）によって合成される。
【００７８】
非リボソームペプチド骨格結合：非リボソームペプチド生合成の第２段階。これはペプチド配列のアミド結合形成（縮合）を含む。
【００７９】
非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）：多くの場合にチオテンプレート合成として知られる非リボソーム機構によってポリペプチドを合成する大きな多機能タンパク質。（Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｄｏｅｈｒｅｎ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２５９−２８９，１９８７）。そのような非リボソームポリペプチドは、直鎖状、環状又は分岐環状構造を有することができ、頻繁に、タンパク質中に存在しないアミノ酸又はメチル化もしくはエピマー化によって修飾されたアミノ酸を含有することができる。特定の例において、ＮＲＰＳはジペプチドを産生する。
【００８０】
非リボソームペプチドの調整：非リボソームペプチド生合成の第３段階。非リボソームペプチドに見られる多数の新規前駆体アミノ酸があり、これらのビルディングブロックの多くは、特殊化タンパク質のＰＣＰドメイン又はＮＲＰＳに結合している間に形成又は修飾される。この合成後修飾は、ペプチド骨格のアミド結合形成後に起こり得る。例示的な修飾としては、α−炭素エピマー化、Ｎ−メチル化、Ｃｙｓ又はＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のチアゾリン及びオキサゾリンへの複素環化、ならびに側鎖ハロゲン化又はヒドロキシル化が挙げられる。酸化、アルキル化、アシル化及びグリコシル化などの他の修飾は、ＮＲＰＳ複合体からの新生ペプチドの放出後に起こり得、頻繁に完全な生物学的活性のために必要とされる。
【００８１】
非リボソーム前駆体アミノ酸生合成非リボソームペプチド生合成の第１段階非リボソームペプチドは、リボソーム上に集合するペプチド及びタンパク質には見られないアミノ酸を頻繁に有する。これらの非タンパク質原性アミノ酸は、これらのペプチドの多様性に寄与し、頻繁にそれらの生物学的活性において役割を果たす。これらのアミノ酸の生合成は、タンパク質結合中間体を介して、又は遊離の可溶性の種として生じ得る。
【００８２】
核酸：一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーは、他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に、核酸にハイブリダイズする、天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。
【００８３】
ヌクレオチド：この用語は、ピリミジン、プリン又はそれらの合成類似体などの糖に結合した塩基、又はペプチド核酸のようにアミノ酸に結合した塩基を含む単量体を含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの１つのモノマーである。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド中の塩基の配列をいう。
【００８４】
オリゴヌクレオチド：天然のホスホジエステル結合によって連結された、長さが約６〜約３００ヌクレオチドの複数の連結ヌクレオチド。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然には存在しない部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、変化した糖部分又はホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなどの糖間結合などの天然には存在しない部分を含むことができる。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体はＲＮＡ又はＤＮＡに結合することができ、ペプチド核酸分子を含む。
【００８５】
特定のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、長さが最大約２００ヌクレオチドまでの線状配列、例えば少なくとも６塩基、例えば少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００又は２００塩基もの長さ、又は約６〜約５０塩基、例えば約１０〜２５塩基、例えば１２、１５又は２０塩基である配列（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を含み得る。
【００８６】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：いずれの内部終止コドンをも含まないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は通常ペプチドに翻訳可能である。例えば、ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム、及びエンデュラシジンＯＲＦは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓから単離されたエンデュラシジン生合成遺伝子クラスター内のオープンリーディングフレームを指す。この用語はまた、他のエンデュラシジン合成生物に存在するのと同じＯＲＦを包含する。この用語は、対立遺伝子変異体及び一塩基多型（ＳＮＰ）を包含する。ある場合には、エンデュラシジンＯＲＦという用語は、エンデュラシジンＯＲＦによってコードされるポリペプチドと同義的に使用され、そのポリペプチド中に保存的置換を含み得る。特定の用法は文脈から明らかになる。
【００８７】
ヌル化されたオープンリーディングフレームは、コード配列中の１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は突然変異によって機能しなくなったオープンリーディングフレームである。
【００８８】
減少したオープンリーディングフレーム−１８（ｏｒｆ１８）を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓは、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓに対して、ｏｒｆ１８の遺伝子産生物の生物学的機能における減少、例えば２分の１倍、又はさらにはヌルにされる、ｏｒｆ１８を含むｏｒｆ１８の遺伝子修飾、及び／又は、ｏｒｆ１８の遺伝子産生物の発現の減少を生じるＯＲＦ１８をコードする遺伝子の非コード領域の修飾、挿入、除去及び／又は置換などの調節操作によるものである。例えば、ｏｒｆ１８の野生型プロモーターは、ｏｒｆ１８の転写を実質的に減少させるように修飾され得る。
【００８９】
増強されたオープンリーディングフレーム−２４（ｏｒｆ２４）を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓは、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓに対して、ｏｒｆ２４の遺伝子産生物の生物学的機能における増加、例えば２倍以上の増加などをする生物である。例えば、ｏｒｆ２４の遺伝子産生物の生物学的機能を増強するｏｒｆ２４の遺伝子修飾、及び／又は調節操作、例えば、ｏｒｆ２４遺伝子産生物の発現の増加を生じるＯＲＦ２４をコードする遺伝子の非コード領域の修飾、挿入、除去及び／又は置換によるものである。例えば、ｏｒｆ２４の野生型プロモーターは、以下に例示されるように、ｏｒｆ２４の転写を増強する強力な構成的プロモーターで置換された。
【００９０】
修飾遺伝子：天然に存在する（野生型）遺伝子に見られるものと比較して修飾を含む遺伝子配列。
【００９１】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、必要ならば、同じ読み枠内で２つのタンパク質コード領域を連結する。
【００９２】
オルソログ：２つの核酸又はアミノ酸配列は、共通の祖先配列を共有し、その祖先配列を有する種が２つの種に分かれたときに分岐した場合、互いにオルソログである。オルソログ配列もまたホモログ配列である。
【００９３】
ポリペプチド：モノマーがアミド結合を介して一緒に連結しているアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれかを使用することができ、場合によってはＬ−異性体が好ましい。本明細書で使用されるポリペプチド又はタンパク質という用語は任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質のような修飾配列を包含する。ポリペプチドという用語は、天然に存在するタンパク質（リボソーム機序又は非リボソーム機序によって産生される）、ならびに組換え又は合成によって産生されるものを網羅することを特に意図している。
【００９４】
ポリペプチド断片という用語は、少なくとも１つの有用なエピトープを示すポリペプチドの一部を指す。ポリペプチドの機能的断片という句は、その断片が由来するポリペプチドの活性（生物学的活性など）又は活性の測定可能な部分を保持するポリペプチドのすべての断片を指す。例えば、断片は、抗体分子を結合することができるエピトープと同じくらい小さいポリペプチド断片から、細胞内の表現型の変化の特徴的な誘導又はプログラミングに参加することができる大きなポリペプチドまでサイズが異なり得る。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、実質的に精製されたポリペプチドという用語は、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はそれが天然に付随する他の物質を実質的に含まないポリペプチドをいう。一実施形態では、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はそれが天然に付随している他の物質を少なくとも５０％、例えば少なくとも８０％含まない。他の実施形態では、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はそれが天然に付随している他の物質を少なくとも９０％含まない。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、それが天然で付随している他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質を少なくとも９５％含まない。
【００９６】
プローブ及びプライマー：核酸プローブ及びプライマーは、本開示において提供される核酸分子に基づいて容易に調製することができる。プローブは、検出可能な標識又はレポーター分子に付着した単離された核酸を含む。典型的な標識としては、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素が挙げられる。様々な目的に適した標識の方法及び誘導の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２）に記載されている。
【００９７】
プライマーは短い核酸分子、好ましくは１０ヌクレオチド以上の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、より長いＤＮＡオリゴヌクレオチドは、約１５、１７、２０、もしくは２３ヌクレオチド以上の長さであり得る。核酸ハイブリダイゼーションによってプライマーを相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いでＤＮＡポリメラーゼ酵素によってプライマーを標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長させることができる。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当技術分野で公知の他の核酸増幅方法による核酸配列の増幅のために使用され得る。
【００９８】
プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９８），及びＩｎｎｉｓら（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ０．５、（コピーライト）１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のような、目的のために意図されたコンピュータープログラムを使用することによって、既知の配列から誘導することができる。特定のプローブ又はプライマーの特異度はその長さが増すと増加する。したがって、より高い特異度を得るために、所望のヌクレオチド配列の少なくとも１７、２０、２３、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の連続ヌクレオチドを含むプローブ及びプライマーを選択することができる。
【００９９】
タンパク質：遺伝子によって発現され、アミノ酸から構成される生体分子。
【０１００】
精製：精製という用語は絶対的な純度を必要としない。むしろ、それは相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製タンパク質調製物は、言及されたタンパク質が細胞内のその天然の環境におけるタンパク質よりも純粋であるものである。
【０１０１】
組換え：天然には存在しない配列を有するか、２つの他の方法で分離された配列のセグメントの人工的な結合によって作製される配列を有する核酸。この人工的な結合は、化学合成によって、又はより一般的には、例えば遺伝子工学技術によって、単離された核酸セグメントの人工的な操作によって達成することができる。「組換え」はまた、人工的に操作されているが、遺伝子が単離された生物に見られるのと同じ制御配列及びコード領域を含む核酸分子を記述するためにも使用される。
【０１０２】
抗生物質産生の調節：抗生物質産生の量、種類又は質の変化、例えば増減などを引き起こすこと。本明細書に開示されているのは、エンデュラシジン産生を増強させたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの組換え株である。
【０１０３】
配列同一性：２つの核酸配列間又は２つのアミノ酸配列間の類似性は、配列間で共有される配列同一性のレベルに関して表される。配列同一性は、典型的には、同一性の割合に関して表される。パーセンテージが高いほど、２つのシーケンスは類似している。
【０１０４】
比較のために配列を整列させる方法は当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１６：１０８８１−１０８９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ８：１５５−１６５，１９９２；Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２４：３０７−３３１，１９９４；Ｔａｔｉａｎａら，（１９９９），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９．に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら．は、配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考察を提示している（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。
【０１０５】
配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（ＢＬＡＳＴ（商標）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）が、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州）、及びインターネットを含むいくつかの情報源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を判定する方法の説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）のヘルプセクションの下のインターネット上で利用可能である。
【０１０６】
約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｐ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能が、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して使用される（ギャップを開くためのコスト［デフォルト＝５］）；ギャップを拡大するためのコスト［デフォルト＝２］；不一致に対するペナルティ［デフォルト＝−３］；一致に対する報酬［デフォルト＝１］；期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝３］；１行の記述数（Ｖ）［デフォルト＝１００］；表示するアラインメント数（Ｂ）［デフォルト＝１００］）。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアラインメントするときは、デフォルトパラメータに設定されたＰＡＭ３０マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を使用してアラインメントを実行する必要がある（ギャップを開く、９、ギャップの拡張、１ペナルティ）。参照配列に対してはるかに高い類似性を有するタンパク質（又は核酸）は、この方法によって評価した場合、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性の同一性パーセンテージの増加を示す。
【０１０７】
核酸配列の比較のために、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能が、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して用いられる（ギャップを開くためのコスト［デフォルト＝１１］）；ギャップを拡大するためのコスト［デフォルト＝１］；期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝１１］；１行の記述数（Ｖ）［デフォルト＝１００］；表示するアラインメント数（Ｂ）［デフォルト＝１００］）。参照配列に対してはるかに高い類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価した場合、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性の同一性パーセンテージの増加を示す。
【０１０８】
２つの核酸分子が密接に関連しているという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである（上記の「ハイブリダイゼーション」を参照）。
【０１０９】
それにもかかわらず、高度の同一性を示さない核酸配列は、遺伝コードの縮重のために、類似のアミノ酸配列をコードし得る。核酸配列における変化は、この縮重を用いてなされ得、すべてが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を産生することが理解される。
【０１１０】
トランスフェクト：例えば分子生物学的技術により核酸分子を細胞に導入し、トランスフェクト（又は形質転換）細胞を得るプロセス。本明細書中で使用される場合、トランスフェクションという用語は、ウイルスベクターによる形質導入、プラスミドベクターによるトランスフェクション、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン加速によるＤＮＡの導入を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得るすべての技術を包含する。
【０１１１】
形質転換：形質転換細胞は、分子生物学的技術によって核酸分子が導入されている細胞である。この用語は、ウイルスベクターによる形質導入、プラスミドベクターによるトランスフェクション、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン加速による裸のＤＮＡの導入を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得るすべての技術を包含する。
【０１１２】
トランスポゾン：両端にほぼ同一の反復配列を有し、トランスポザーゼ（トランスポゾンをＤＮＡ配列に挿入するのに必要な酵素）をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む可動性遺伝要素。トランスポゾンは、細胞のゲノム内の異なる位置に、又はインビトロで、単離されたプラスミド、コスミド、もしくはフォスミドＤＮＡテンプレートを介して組み込むことができる。トランスポゾンは挿入に必要なもの以外の遺伝子も含み得る。
【０１１３】
ベクター：宿主細胞に導入され、それによってトランスフェクトされた宿主細胞を産生するような核酸分子。組換えＤＮＡベクターは組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、複製起点など、宿主細胞内でそれが複製することを可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び当技術分野で公知の他の遺伝的要素を含み得る。ウイルスベクターは、１つ以上のウイルスに由来する少なくともいくつかの核酸配列を有する組換えＤＮＡベクターである。プラスミドはベクターである。
【０１１４】
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈上明らかにそうでないと示さない限り、単語「又は」は「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基のサイズ又はアミノ酸のサイズ、及びすべての分子量又は分子量の値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」は「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」を意味する。矛盾がある場合は、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、及び実施例は例示的なものにすぎず、限定的であることを意図しない。
【０１１５】
開示された実施形態の実施のための適切な方法及び材料は以下に記載する。さらに、当業者に周知の任意の適切な方法又は技術を開示された実施形態の実行に使用することができる。本開示に適用可能ないくつかの従来の方法及び技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２  （ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９；ａｎｄ  Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，及びＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｃｏｌｎｅｙ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＮＲ４＆ＵＨ，Ｅｎｇｌａｎｄ，２０００に記載されている。
【０１１６】
本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾がある場合は、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、及び実施例は例示的なものにすぎず、限定的であることを意図しない。
【０１１７】
ＩＩＩ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子工学組換え発現ベクター
本明細書に開示されているのは、遺伝子工学組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ発現プラスミドベクターである。いくつかの実施形態では、遺伝子工学組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓベクターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの少なくとも１つの選択されたオープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子工学組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓベクターは、プロモーターの制御下で発現されるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの少なくとも１つの選択されたオープンリーディングフレームを含む。いくつかの例では、プロモーターが強力な構成的ストレプトミセス菌プロモーターであり、これは、ベクターがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの株で発現された場合に、エンデュラシジンの産生の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、それ自体の天然プロモーターの代わりに異種プロモーターに作動可能に連結されている。例えば、それは強力な構成的発現プロモーター又は誘導性プロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結されてもよい。いくつかの例では、強力な構成的プロモーターは、エリスロマイシン産生体からのｅｒｍＥ＊ｐである。いくつかの例において、誘導性プロモーターはｔｉｐＡである。いくつかの例では、Ｐ（ｎｉｔＡ）−ＮｉｔＲシステム（Ｈｅｒａｉ  Ｓ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，Ｈｉｇａｓｈｉｂａｔａ  Ｈ，Ｍａｓｅｄａ  Ｈ，Ｉｋｅｄａ  Ｈ，Ｏｍｕｒａ  Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００４．１０１（３９）：１４０３１−５）又はストレプトミセス菌プロモーターＳＦ１４が使用される。いくつかの例では、アプラマイシン耐性遺伝子（ａｍＲｐ）の天然のプロモーターが使用される。いくつかの例では、ＰｈｒｄＢ、Ｐｔｃｐ８３０、ＰＳＦ１４、ＰｅｒｍＥ＊及び／又はＰｎｅｏｓが使用される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子工学組換えベクターは、ヌル化されているオープンリーディングフレームｏｒｆ２４（配列番号３８）及び／又はオープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）を含む。いくつかの例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）は、フレーム内欠失、フレームシフト、及び／又は点突然変異によってヌル化される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子工学組換えベクターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓのエンデュラシジン遺伝子クラスターからのオープンリーディングフレームｏｒｆ２４を含む。いくつかの例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ２４（配列番号３８）は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。例えば、それは、ｅｒｍＥ＊ｐのような強力な構成的プロモーターに結合している。他の例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ２４は、プロモーターｔｉｐＡ、ＳＦ１４、ａｍＲｐ、ＰｈｒｄＢ、Ｐｔｃｐ８３０、ＰＳＦ１４、ＰｅｒｍＥ＊及び／又はＰｎｅｏｓに作動可能に連結されている。
【０１２０】
別の実施形態では、遺伝子工学組換えベクターは、エンデュラシジン遺伝子クラスターの上流領域に存在するオープンリーディングフレームｏｒｆ１８を含む。オープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）は、挿入破壊、フレーム内欠失、フレームシフト及び／又は点突然変異によってヌル化される。いくつかの例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８は、図９Ｂに示されるようなフレーム内欠失などのフレーム内欠失によってヌル化される。一例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）は、フレーム内欠失によってヌル化される。例えば、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）は、ｏｒｆ１８（配列番号３７）の５から６６０までの核酸のフレーム内欠失によってヌル化される。一般に、ｏｒｆ１８を超える任意の内部のフレーム内欠失は、その不完全性のためにＯｒｆ１８の機能をヌル化する。いくつかの例では、フレーム内欠失は、ｏｒｆ１８（配列番号３７）中の少なくとも３つの核酸、例えば３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、２６０、２６３、２６６、２６９、２７２、２７５、２７８、２８１、２８４、２８７、２９０、２９３、２９６、２９９、３０２、３０５、３０８、３１１、３１４、３１７、３２０、３２３、３２６、３２９、３３２、３３５、３３８、３４１、３４４、３４７、３５０、３５３、３５６、３５９、３６２、３６５、３６８、３７１、３７４、３７７、３８０、３８３、３８６、３８９、３９２、３９５、３９８、４０１、４０４、４０７、４１０、４１３、４１６、４１９、４２１、４２４、４２７、４３０、４３３、４３６、４３９、４４２、４４５、４４８、４５１、４５４、４５７、４６０、４６３、４６６、４６９、４７２、４７５、４７８、４８１、４８４、４８７、４９０、４９３、４９６、４９９、５０２、５０５、５０８、５１１、５１４、５１７、５２０、５２３、５２６、５２９、５３２、５３５、５３８、５４１、５４４、５４７、５５０、５５３、５５６、５５９、５６２、５６５、５６８、５７１、５７４、５７７、５８０、５８３、５８６、５８９、５９２、５９５、５９８、６０１、６０４、６０７、６１０、６１３、６１６、６１９、６２１、６２４、６２７、６３０、６３３、６３６、６３９、６４２、６４５、６４８、６５１、又は６５４の核酸を、ｏｒｆ１８（配列番号３７）の核酸５から６６０の間に含む少なくとも３つの核酸の欠失を含む。
【０１２１】
関連する実施形態では、遺伝子工学組換えプラスミドベクターは、エンデュラシジン遺伝子クラスター及び／又は遺伝子クラスターに隣接する領域又は他の放線菌株由来の２つ以上のオープンリーディングフレームを含む。２つ以上のオープンリーディングフレームは単一のプロモーターに連結されてもよい。あるいは、それらは２つの異なるプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。２つのプロモーターは同じ種類のプロモーターであり得る。あるいは、それらは２つの異なる種類のプロモーターであり得る。
【０１２２】
さらなる実施形態では、エンデュラシジン産生を増強し得るさらなる又は代替のオープンリーディングフレームが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子操作された株に導入され得るか不活性化され得る。
【０１２３】
いくつかの例では、組換えプラスミドはｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４（配列番号３）である。いくつかの例では、組換えプラスミドはｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（配列番号８）である。いくつかの例では、組換えプラスミドはｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（配列番号１１）である。いくつかの例では、組換えプラスミドは、ｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（配列番号１４）である。いくつかの例では、組換えプラスミドは、ｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）（配列番号１９）である。いくつかの例では、組換えプラスミドはｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ（配列番号２０）である。いくつかの例では、組換えプラスミドは、ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒ（配列番号２３）である。
【０１２４】
ＩＶ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子工学組換え株
本明細書に開示されているのは、対照株（野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株又は産業用の親の株など）と比較して、増強されたエンデュラシジンを産生することができる遺伝子工学組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株は、染色体に導入され、強力な構成的Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターなどのプロモーターの制御下で発現される、遺伝子操作された株におけるエンドラシジンの産生増強をもたらす、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ由来の少なくとも１つの選択的オープンリーディングフレームを含む。いくつかの態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓにおける導入されたオープンリーディングフレームの発現は、それ自体の天然プロモーターの代わりに、異種プロモーターによって駆動される。例えば、それは強力な構成的発現プロモーター又は誘導性プロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結されてもよい。いくつかの例では、強力な構成的プロモーターは、エリスロマイシン産生体からのｅｒｍＥ＊ｐである。いくつかの例において、誘導性プロモーターはｔｉｐＡである。いくつかの例では、Ｐ（ｎｉｔＡ）−ＮｉｔＲシステム（Ｈｅｒａｉ  Ｓ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，Ｈｉｇａｓｈｉｂａｔａ  Ｈ，Ｍａｓｅｄａ  Ｈ，Ｉｋｅｄａ  Ｈ，Ｏｍｕｒａ  Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００４．１０１（３９）：１４０３１−５参照）又はストレプトミセス菌プロモーターＳＦ１４が使用される。いくつかの例では、構成的発現プロモーターはａｍＲｐである。いくつかの例では、ＰｈｒｄＢ、Ｐｔｃｐ８３０、ＰＳＦ１４、ＰｅｒｍＥ＊及び／又はＰｎｅｏｓプロモーターが使用される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子工学株ベクターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓのエンデュラシジン遺伝子クラスターからのオープンリーディングフレームｏｒｆ２４を含む。いくつかの例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ２４は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。例えば、それは、ｅｒｍＥ＊ｐのような強力な構成的プロモーターに結合している。他の例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ２４は、プロモーターｔｉｐＡ、ＳＦ１４、ａｍＲｐ、ＰｈｒｄＢ、Ｐｔｃｐ８３０、ＰＳＦ１４、ＰｅｒｍＥ＊及び／又はＰｎｅｏｓに作動可能に連結されている。
【０１２６】
別の実施形態では、遺伝子工学株は、エンデュラシジン遺伝子クラスターの上流領域に存在するオープンリーディングフレームｏｒｆ１８に関する。オープンリーディングフレームｏｒｆ１８は、挿入破壊、フレーム内欠失、フレームシフト及び／又は点突然変異によってヌル化される。いくつかの例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８は、図９Ｂに示されるようなフレーム内欠失などのフレーム内欠失によってヌル化される。一例では、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）は、フレーム内欠失によってヌル化される。例えば、オープンリーディングフレームｏｒｆ１８（配列番号３７）は、（配列番号３７）の５から６６０までの核酸のフレーム内欠失によってヌル化される。一般に、ｏｒｆ１８を超える任意の内部のフレーム内欠失は、その不完全性のためにＯｒｆ１８の機能をヌル化するはずである。
【０１２７】
関連する実施形態では、遺伝子工学株は、エンデュラシジン遺伝子クラスター及び／又は遺伝子クラスターに隣接する領域又は他の放線菌株由来の２つ以上のオープンリーディングフレームを含む。２つ以上のオープンリーディングフレームは単一のプロモーターに連結されてもよい。あるいは、それらは２つの異なるプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。２つのプロモーターは同じ種類のプロモーターであり得る。あるいは、それらは２つの異なる種類のプロモーターであり得る。
【０１２８】
さらなる実施形態では、エンデュラシジン産生を増強し得るさらなる又は代替のオープンリーディングフレームが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子操作された株に導入され得るか不活性化され得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子操作株は、それだけに限らないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＡＴＣＣ）２１０１３などの野生型の親の株に由来する。他の実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子操作株は、それだけには限定されないが、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）などの産業用の親の株に由来する。他の実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子操作株は、非限定的にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ３１７２９、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ３１７３０及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ３１７３１などの通例の変異株に由来する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、対照のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株と比較して、増強したエンデュラシジン産生は、少なくとも１．２倍の増加、例えば少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍の増加、例えば、１．２から１０倍の増加、１．２から４．６倍の増加、２から５倍の増加、例えば１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５及び１０倍のエンデュラシジン産生増加を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、対照Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＡＴＣＣ）２１０１３又は限定されないが、ＢＭ３８などの野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株、又はそれだけには限らないが、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）などの産業親株、又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ３１７２９、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ３１７３０及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ３１７３１などの従来の変異株を非限定的に含む。一例では、対照はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２１０１３であり、増強されたエンデュラシジン産生の増加は少なくとも１．２倍の増加、例えば１．２から４．６倍の増加である。一例では、対照はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）であり、増強されたエンデュラシジン産生の増加は少なくとも１．２倍の増加、例えば１．２から４．６倍の増加である。
【０１３１】
Ｖ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子工学組換え株の構築
実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの組換え株は、少なくとも１つのエンデュラシジン産生増強オープンリーディングフレームを含む組換えプラスミドの、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの親株の染色体への組込みによって構築してもよい。統合的コンジュゲートベクターは、強力な構成的ストレプトミセス菌プロモーターを有するか、有するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドは連鎖球菌レプリコンを欠いていてもよく、部位特異的シングルクロスオーバー相同組換えによって染色体に組み込まれてもよい。他の実施形態では、プラスミドは遊離プラスミドとして存在してもよい。いくつかの実施形態では、プラスミド挿入物が、部分的又は完全に欠失した目的の遺伝子、及び二重交差相同組換え後に染色体に組み込まれてフレーム内欠失変異体を生成し得るそのフランキング領域を有する接合ベクターを遺伝子操作し得る。
【０１３２】
ＶＩ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子工学組換え株由来のエンデュラシジンの産生
本開示によって提供されるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子工学組換え株は、増強されたレベルのエンデュラシジンを産生する方法を提供する。当技術分野におけるこの技術的進歩により、エンデュラシジンの製造に関連する大幅なコスト削減が可能になる。いくつかの例では、エンデュラシジンを産生する方法は、開示されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの組換え株をエンデュラシジンを産生するのに十分な条件下で培養することを含む。いくつかの例では、方法は、培養後に培地からエンデュラシジンを単離することをさらに含む。いくつかの例では、方法は、微生物を示すものとして黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３を使用するＨＰＬＣ分析又はバイオアッセイなどによって、生成されたエンデュラシジンの抗菌活性を判定することをさらに含む。
【０１３３】
いくつかの例では、エンデュラシジンは、開示されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株によって、エンデュラシジンの産生について以前に記載されたように発酵条件を利用することによって産生される（Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２１：１２６−１３７，１９６８）。製造後、化合物は、実施例１に記載のようにＨＰＬＣ分析を含めて精製及び／又は分析することができる。エンデュラシジンを製造してこの化合物を増殖培地から収穫する方法は、米国特許第４，４６５，７７１号に見出すことができ、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３４】
いくつかの例では、開示されているＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株を振盪機においてトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中で（例えば２２５ｒｐｍ及び３０℃で４８時間）培養し、次いでエンデュラシジン産生培地（ＥＰＭ、下記の表１）に少なくとも５日間から１１日間までの連続発酵のための期間、例えば５日、６日、７日、８日、９日、１０日又は１１日の連続発酵を移す。いくつかの例では、野生型及び派生株によるエンデュラシジンの産生は自動発酵槽で行われる。
【表２】
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【０１３５】
いくつかの例では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓバイオマスは、ｐＨ、温度、酸素、曝気、撹拌を監視及び制御するためのシステムを備えた深型タンク衛生設計工業用発酵槽における発酵プロセスによって産生される。例えば、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの各発酵バッチは、安全な場所に貯蔵され低温環境に保持された産生種子の特徴付けられ管理された作業種子ストックから開始される。
【０１３６】
いくつかの例では、発酵プロセスは、次の３つの段階などの１つ又は複数の段階で行われ、場合によっては下流でさらに処理することができる。
【０１３７】
ステージＩ：
特徴付けられた確立された実用的な種培養物が発酵バッチを開始するために使用される。凍結種子バイアルの１〜５バイアルを低温貯蔵庫から取り出し、内容物が解凍されるまで自然に解凍するか２８℃〜３２℃の水浴中に入れる。解凍した（１又は複数の）培養物を室温に保った滅菌水に無菌的に移し、穏やかに混合して培養物を再懸濁する。
【０１３８】
ステージＩＩ：
再懸濁培養物を無菌的に０．００５ｍ３〜０．０５ｍ３の種の培地に移す。種の培地は、グルコース（０．１〜１．０ｇ／Ｌ）、デキストリン（０．１〜３ｇ／Ｌ）、コーンスティープリカー（０〜５．０ｍＬ／Ｌ）、大豆粉末（１〜５．０ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（０．１〜０〜０．５ｇ／Ｌ）、リン酸一カリウム（０．１３〜０．５４ｇ／Ｌ）、硫酸第一鉄（０．００〜０．５ｇ／Ｌ）、水酸化カリウム（０．１３ｍＬ／Ｌ）、炭酸カルシウム（１〜２ｇ／Ｌ）、シリコーン系消泡剤（０．１ｍＬ／Ｌ）、水、適量で構成される。培地を１２５℃〜１２８℃で３０〜４５分間滅菌し、次いで２８℃〜３２℃に冷却する。培地の量は滅菌水を用いて所望の作業量に調整される。ｐＨを６．５〜７．０に調整する。
【０１３９】
シードスケールアップサイクルの操作パラメータは、容器のサイズ及び構成に応じて、２８℃±２℃のインキュベーション温度、１．０±０．５ｋｇ／ｃｍ２の内圧、３±２Ｎｍ３／分の通気速度、及び約８０ｒｐｍの撹拌速度を含む。ｐＨ、酸素消費量及び粘度は監視されるが制御されない。培養物を４０〜８０時間増殖させた後、メインの産生発酵槽に移す。移したときの粘度は２００〜６００ｃｐｓの範囲であるべきで、ｐＨは≦６．０でなければならず、酸素消費量が増加するべきである。種の培養物を無菌的に主発酵培地に移して発酵サイクルを完了させる。
【０１４０】
ステージＩＩＩ：
産生発酵槽培地（１０ｍ３〜２５０ｍ３）組成物は、トウモロコシの粉（１３．０〜１５．０ｗ／ｖ％）、コーングルテンミール（３．０〜６．０ｗ／ｖ％）、綿実粉（０．１〜０．３ｗ／ｖ％）、コーンスティープリカー（０．１〜０．６ｖ／ｖ％）、塩化ナトリウム（０．３ｗ／ｖ％）、硫酸アンモニウム（０．２５〜０．６ｗ／ｖ％）、乳酸（０〜０．５ｖ／ｖ％）、塩化亜鉛（０．０１ｗ／ｖ％）、硫酸第一鉄（０．０〜０．０２ｗ／ｖ％）、水酸化カリウム（０．２０〜０．５ｖ／ｖ％）、硫酸カルシウム（０．０〜０．５ｗ／ｖ％）、カルシウム炭酸塩（０．５ｗ／ｖ％）、アミラーゼ（０．０２〜０．０６ｗ／ｖ％）、水酸化カリウム（０．０５ｖ／ｖ％）、植物油（０．５〜２．０ｖ／ｖ％）、消泡剤、及び水、適量などの天然成分及び化学成分を含む。成分ａ〜ｅは記載された順序に従って添加した。成分に水を加え、次に７０〜９０℃に加熱して酵素に複合炭水化物を１５分間その温度で分解させる。残りの成分を加え、ｐＨを６．６〜６．８に調整し、水を適量加える。１２５℃〜１２８℃で２５〜５０分間殺菌して培地を殺菌する。培地を２５℃〜３２℃に冷却し、水を適量、作業量に加える。
【０１４１】
内容物を種発酵槽からメインの発酵培地に移し、発酵槽を以下の条件に設定する：温度２８℃±３℃、通気速度２０〜６０Ｎｍ３／分、内圧０．１〜１．０ｋｇ／ｃｍ２、撹拌速度約１．８５ｋＷ／ｍ３である。通気速度、内圧及び撹拌速度は、溶存酸素が律速判定要素ではないことを保証するために必要に応じて調整される。汚染や流出を防ぐために、サイクル全体を通して発泡を慎重に制御されたい。酸素要求量が増加した後にｐＨの制御を開始。以下のパラメータは発酵サイクルを通して制御及び／又は監視される：ｐＨ、通気、溶存酸素、ＣＯ２、粘度、純度、撹拌速度、内圧、及び残留糖。細菌の増殖が止まるまでｐＨを６．８に維持し、次いで収穫までｐＨを自然に変化させる。典型的な発酵サイクルは２１０〜３００時間である。力価が５，０００μｌ／Ｌを超え、ｐＨが７．５以上に上昇し、粘度が低下し、酸素要求量がなくなると、培養液を収穫する準備が整う。
【０１４２】
培養物を３０分間７０℃に加熱して細菌を不活性化し、次いで収穫液を２５℃〜３２℃に冷却することによって発酵物を収穫する。
【０１４３】
いくつかの例では、下流処理は、バイオマスから水を除去すること、バイオマスを乾燥させること、及び乾燥バイオマスをプレミックスに配合することを含む。
【０１４４】
生物材料の寄託
以下の生物学的材料は、ブダペスト条約の条項に基づきアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されており、以下の登録番号が与えられている。
【０１４５】
寄託物                      登録番号              寄託日
ＢＭ３８−２−１８ｐｆｒｄ  ＰＴＡ−１２４００７  ２０１７年３月２日
ＢＭ３８−２−２４／１６    ＰＴＡ−１２４００６  ２０１７年３月２日
上記株は、本特許出願の係属中に、特許商標局長が３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４及び３５  ＵＳＣ．§１２２の下でそれに権利を付与すると判定したものに培養物の入手ができるようになることを保証する条件下で寄託されている。寄託物は寄託株の実質的に純粋な培養物を表す。寄託物は、本出願の相手方又はその子孫が出願されている国における外国特許法により要求されているように利用可能である。しかし、寄託物の利用可能性は、政府の措置によって付与される特許権を損なって本発明を実施するためのライセンスを構成するものではないことを理解されたい。
【０１４６】
以下の非限定的な例は、ある特定の特徴及び／又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、開示を記載された特定の特徴又は実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
【０１４７】
［実施例］
［実施例１］
増強されたエンデュラシジン産生のための材料及び方法
この実施例は、増強されたエンデュラシジン産生のための代表的な方法を提供する。
【０１４８】
細菌株、プラスミド、フォスミド及び培養条件
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  Ｂ−５４７７（ＡＴＣＣ２１０１３）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）はＡＴＣＣから購入した。Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ株ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）ならびにエンデュラシジンＡ及びＢの標準は、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ／Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（ＭＡＨ）により提供された。大腸菌株ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＥＰＩ３００（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）及びＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、大腸菌プラスミド、フォスミド及び大腸菌−ストレプトミセス菌シャトルベクターの宿主として使用した。プラスミドｐＳＥＴ１５２（Ｂｉｅｒｍａｎら．，Ｇｅｎｅ  １１６：４３−４９，１９９２、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）及びｐＩＪ７７３は、Ｋｅｉｔｈ  Ｃｈａｔｅｒ教授（ＪＩＣ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）によって提供された。ｅｒｍＥ＊ｐプロモーターを有するプラスミドｐＷＨＭ８６０は、Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｍｏｏｒｅ教授（ＵＣＳＤ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって提供された。ＩＳＰ２（Ｄｉｆｃｏ（商標）ＩＳＰ培地２）、ＩＳＰ４及びＴＳＢ（Ｂａｃｔｏ（商標）トリプチックソイブロス）は、ＶＷＲから購入した。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定に使用したプライマーは、Ｆｉｓｈｅｒ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから合成した。Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓを増殖させるための培地及び培養条件は、Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２１：１２６−１３７，１９６８）に記載されている。すべての大腸菌の処置は標準的なプロトコルに従って実施した。
【０１４９】
ＤＮＡの単離と操作
配列決定、フォスミドライブラリーの構築、サブクローニング及びＰＣＲのためのＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  Ｂ−５４７７、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）ならびに誘導体組換え及び変異株からゲノムＤＮＡを調製するために、個々の株から新たに収穫した胞子を接種し、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５％グリシンを補充した１００ｍＬのＴＳＢ液体培地で増殖させた。代表的な培養は、５００ｍＬの三角フラスコ中、回転振盪インキュベーターで、２２５ｒｐｍ及び３０℃で４８から７２時間実施した。菌糸細胞を４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間の遠心分離により回収した。上清を捨て、ペレットを１０．３％スクロースで１回、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０（ＴＥ緩衝液）で２回連続して洗浄した。水８０μＬの容量に相当する湿った細胞を１．５ｍＬの無菌の微量遠心管に分布させた。２００μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び０．３Ｍのスクロース（ＴＥＳ緩衝液）、５０μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ、５０μＬのリゾチーム（５０ｍｇ／ｍＬ）を含む３００μＬの溶解溶液を添加した後、溶液が粘性になるまで、チューブを３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。次に、５μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）及び１８０μＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を各チューブに加えた。穏やかだが十分に混合した後、溶液を３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、８０μＬの１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を加えた。十分に混合した後、チューブを６５℃で１０分間インキュベートした。溶液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）６００μＬで２回抽出した。上部水相中のゲノムＤＮＡを回収し、０．６容量のイソプロパノールで沈殿させた。採取したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで２回洗浄した。室温で１０分間乾燥した後、ゲノムＤＮＡを５０〜１００μＬの滅菌水に溶解した。良質のゲノムＤＮＡ調製物は、０．８％アガロースゲル電気泳動による完全な消化及び未消化のゲノムＤＮＡの分解を示さないＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩによる消化によって確認された。プールしたゲノムＤＮＡをＲＮａｓｅでさらに消化してＲＮＡの混入を除去した。ゲノムＤＮＡの純度及び量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて判定した。アガロースゲル電気泳動を含む一般的な連鎖球菌ＤＮＡ操作を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌株からプラスミド及びフォスミドを調製した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、トランスポザーゼ、クレノウ酵素、アルカリホスファターゼ及びリガーゼは、Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ及びＲｏｃｈｅから購入し、製造元の推奨に従って使用した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いてＤＮＡ断片を精製した。
【０１５０】
ＰＣＲ
コロニーＰＣＲは以下のように実施した：独立した変異体候補コロニーからの胞子をＴＳＢ液体培養物に接種した。４８〜７２時間増殖させた後、菌糸体を遠心分離により収穫し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０で２回洗浄した。菌糸体を滅菌Ｈ２Ｏに再懸濁し、６０μＬの菌糸体、１５０ｐｍｏｌの各プライマー、２０μＬの５×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＧＣリッチ緩衝液Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＥｘｐａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）から得た１μＬのＰｏｌｙｍｉｘ（８０℃で添加）を含有する１００μＬの最終容量でＰＣＲ反応混合物中の鋳型として使用した。ＰＣＲは以下のようにして行った：１サイクルを９５℃で３分間、３０サイクルを９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間とした。１回の延長サイクルで７２℃で１０分間反応を終了させた。ＰＣＲ産生物をゲル精製し、配列決定した。事前の精製なしに菌糸体コロニーから放出されたＤＮＡを直接使用する代わりに、単離されたゲノムＤＮＡ、プラスミド／フォスミドＤＮＡを鋳型として使用したことを除いて、上記と同様に一般的なＰＣＲを行った。
【０１５１】
組込み発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４の構築
Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ野生型及びＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）株においてエンデュラシジン遺伝子クラスターから推定上の調節遺伝子ｏｒｆ２４を異所的に発現させるために、ｏｒｆ２４をｐＸＹ１５２ａＲ２０由来の組込み型プラスミドｐＸＹ１５２にクローニングした（Ｙｉｎら，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，７３：５８３−５８９，２０１０、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ｏｒｆ２４は、フォワードプライマー（Ｅｎｄ２４Ｎｄｐｆ：
【化１】
2020500561.tif 000005
【０１５２】
（配列番号１、ＮｄｅＩ部位は太字））、及びリバースプライマー（Ｅｎｄ２４ＥＲｐｒ：
【化２】
2020500561.tif 000006
【０１５３】
（配列番号２、ＥｃｏＲＩ部位は太字））を用いてＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産生物をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。次いで、ゲル精製したｏｒｆ２４断片を同様に制限されたベクターｐＸＹ１５２と連結した。得られたプラスミドをｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４と命名した（図２；配列番号３）。ｏｒｆ２４インサートは配列決定によりエラーフリーであることが確認された。
【０１５４】
ｏｒｆ１８のフレーム内欠失のためのプラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄの構築
ｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄは、ｏｒｆ１８に隣接し、欠失の予定である２つの断片を、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓにおける選択のためのチオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）を含む大腸菌−ストレプトミセス菌シャトル接合体温度感受性ベクターであるｐＸＹ３００にクローニングすることによって構築した。ｏｒｆ１８に隣接する、それぞれｏｒｆ１８ｉｆｄＮＰ及びｏｒｆ１８ｉｆｄＰＨと呼ばれる、「上流」２ｋｂ及び「下流」２ｋｂのフランキング配列を、鋳型としてＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓゲノムＤＮＡ及び２組のプライマーを使用するＰＣＲによって生成した。断片ｏｒｆ１８ｉｆｄＰＨは、フォワード及びリバースプライマー（Ｉｆｄｅｎｏｒｆ１８ｐｆ１、
【化３】
2020500561.tif 000007
【０１５５】
（配列番号４）、Ｉｆｄｅｎｄｏｒｆ１８ｐｒ１、
【化４】
2020500561.tif 000008
【０１５６】
（配列番号５）、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰａｃＩ部位が太字）を用いて増幅した。断片ｏｒｆ１８ｉｆｄＮＰは、フォワード及びリバースプライマー（Ｉｆｄｅｎｄｏｒｆ１８ｐｆ２、
【化５】
2020500561.tif 000009
【０１５７】
（配列番号６）、Ｉｆｄｅｎｄｏｒｆ１８ｐｒ２、
【化６】
2020500561.tif 000010
【０１５８】
（配列番号７）、ＰａｃＩ及びＮｈｅＩ部位が太字）を用いて増幅した。これら２つのＰＣＲ断片を適切に制限し、同時にＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって調製したｐＸＹ３００ベクターと連結してプラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（図３；配列番号８）を得た。ｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄのエラーのないフレーム内欠失挿入物を配列決定により確認した。
【０１５９】
ｏｒｆ１８及びそのフランキング領域を欠失させるためのプラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲの構築
ｏｒｉＴ断片をフォワードプライマー（Ｏｒｉｔｎｈｅｘｂａｈｄ３ｆ、
【化７】
2020500561.tif 000011
【０１６０】
（配列番号９）、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は太字）及びリバースプライマー（Ｏｒｉｔｅｒ１ｐｓｔｘｈｏｒ、
【化８】
2020500561.tif 000012
【０１６１】
（配列番号１０）、ＸｈｏＩ部位は太字）を用いて、プラスミドｐＩＪ７７３からＰＣＲにより増幅した。ｏｒｉＴ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで消化し、ゲル精製し、次いで同様に制限されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ誘導体に連結してプラスミドｐＫＳ−Ｔを得た（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４９４，１９８９）。プラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄの挿入断片をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して切り出し、ゲル精製した後、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ線状化プラスミドｐＫＳ−Ｔと連結してプラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄを得た（図４、配列番号１１）。ａａｃ（３）ＩＶ、アプラマイシン耐性遺伝子（ａｍＲ）を担持する１ｋｂ断片を、フォワードプライマー（ＡｐｒａＮｃｏＩｐｆ、
【化９】
2020500561.tif 000013
【０１６２】
（配列番号１２）、ＮｃｏＩ部位は太字）及びリバースプライマー（ＡｐｒａＢａｍＨＩｐｒ、
【化１０】
2020500561.tif 000014
【０１６３】
（配列番号１３）、ＢａｍＨＩ部位は太字）を用いてｐＩＪ７７３から増幅した。断片ＡｍＲ及びプラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより、インサート及びベクターの両方を連結用に調製した。得られたプラスミドをｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲと命名した（図５；配列番号１４）。
【０１６４】
ｏｒｆ１８のフレーム内欠失のためのプラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−ＡｍＲ（ＮＳ）の構築
ｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄの挿入断片をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して切り出し、ゲル精製した後、ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ線状化ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳと連結してプラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄを得た。ｏｒｉＴ断片をフォワードプライマー（Ｏｒｉｔｎｈｅｘｂａｈｄ３ｆ、
【化１１】
2020500561.tif 000015
【０１６５】
（配列番号１５）、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は太字）及びリバースプライマー（ｏｒｉＴＸｈＮｄＳｐｒ、
【化１２】
2020500561.tif 000016
【０１６６】
（配列番号１６）、ＸｈｏＩ、ＮｄｅＩ及びＳｐｅＩ部位は太字）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ｏｒｉＴ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製した後、同様に制限されたプラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄと連結してプラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔを得た。ａａｃ（３）ＩＶ、アプラマイシン耐性を付与する遺伝子（ＡｍＲ）を担持する１ｋｂ断片を、フォワードプライマー（ＡｐｒａＮｄｅｐｆ、
【化１３】
2020500561.tif 000017
【０１６７】
（配列番号１７）、ＮｄｅＩ部位は太字）及びリバースプライマー（ＡｐｒａＳｐｅＩｐｒ、
【化１４】
2020500561.tif 000018
【０１６８】
（配列番号１８）、ＳｐｅＩ部位は太字）を用いてＰＣＲによりｐＩＪ７７３から増幅した。プラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−ＴをＮｄｅＩ及びＳｐｅＩで消化することにより線状化し、次いで同様に制限された断片ＡｍＲと連結してプラスミドｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）を生成した（図６；配列番号１９）。
【０１６９】
属間接合、ｐＸＹ３００ベース及びｐＫＳベースの遺伝子破壊処置
遺伝子破壊プラスミドを形質転換により大腸菌Ｓ１７−１に個別に導入し、次いで接合を介してＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ又はその誘導体に移した。手短に言えば、新たに採取したＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ胞子を前発芽させ、大腸菌Ｓ１７−１細胞をＴｅｒｒｉｆｉｃブロス中で３７℃で一晩増殖させた。発芽胞子懸濁液の連続希釈液を作製し、各希釈液１００ｍＬを、ｐＸＹ３００ベースの破壊プラスミドを有する等容量の大腸菌Ｓ１７−１と混合した。溶液を１０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加してＩＳＰ４寒天プレート上にプレーティングし、３０又は３７℃のいずれかで２２時間インキュベートした。各プレートに、ナリジクス酸ナトリウム及びアプラマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する３ｍＬの軟質栄養寒天を重層し、さらに３０℃で約１週間インキュベートした。抗生物質選択を生き残った単離された接合体を、ナリジクス酸ナトリウム及びアプラマイシン（各５０μｇ／ｍＬ）を補充したＩＳＰ４寒天プレート上に画線することによって精製した。
【０１７０】
ｐＸＹ３００ベースのプラスミドを用いて遺伝子破壊研究を行うために、最初に接合体をアプラマイシン（５μｇ／ｍＬ）を含有するＴＳＢ液体培地中で３０℃で２４時間培養し、その時点で菌糸体を収穫し、ホモジナイズしてアプラマイシン（５μｇ／ｍＬ）を添加したＴＳＢ液体培地を接種した。４０℃で３〜６日間インキュベートした後、菌糸体をホモジナイズし、アプラマイシン（５０μｇｍＬ）を含むＩＳＰ４寒天プレートにプレーティングし、３０℃で１週間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを無作為に選択された個々の生存コロニーから単離し、ＰＣＲ又はサザンブロットのいずれかにより分析して、単一又は二重交差破壊が起こったことを確認した。ｐＫＳベースの遺伝子破壊及びフレーム内欠失プラスミドについては、二重交差組換え体への変換を促進するために、いずれの抗生物質選択をも加えることなく胞子形成のために接合体をＩＳＰ４寒天プレート上で３回連続インキュベーションした。ｐＫＳベースの接合体は４０℃の温度選択を通過しなかった。すべての変異体の正しい構築は、ＰＣＲ及び／又はサザンブロット分析によって確認された。
【０１７１】
組込み発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ及びｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒの構築
ｏｒｆ１８及びそのフランキング領域の欠失を有するアプラマイシン耐性変異株においてｏｒｆ２４を異所的に発現させるために、組込み発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒを設計した。このプラスミドを構築するために、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びチオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）を有するカセット（ｃａｍｔｓｒ）をＳａｃＩ及びＮｈｅＩでの消化によりプラスミドｐＵＣ５７誘導体から切り出した。次にｃａｍｔｓｒカセットをＳａｃＩ及びＮｈｅＩ線状化プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４と連結して新しい構築物ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒを得た（図７；配列番号２０）。アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）を、フォワードプライマー（ａｍｐ２９５６ＳｗａＩｐｆ、
【化１５】
2020500561.tif 000019
【０１７２】
（配列番号２１）、ＳｗａＩ部位は太字）及びリバースプライマー（ａｍｐ１９７３ＳａｃＩｐｒ、
【化１６】
2020500561.tif 000020
【０１７３】
（配列番号２２）、ＳａｃＩ部位は太字）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳからＰＣＲ増幅した。次いで、ｂｌａをｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒのＳａｃＩ及びＳｗａＩ部位にクローニングしてカセットｃａｍｔｓｒをｂｌａｔｓｒと交換した。得られた接合体発現プラスミドをｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒと命名した（図８；配列番号２３）。
【０１７４】
インビトロトランスポゾン変異のためのＴｎ５ＡＴカセットの構築
Ｔｎ５ＡＴカセットは、トランスポゾンＴｎ５、ｏｒｉＴ、及びａａｃ３（ＩＶ）の３つの遺伝的要素を組み合わせるように設計されている。Ｔｎ５は、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって特異的かつ独特に認識され、大腸菌プラスミド及びフォスミド中にクローニングされた高Ｇ＋Ｃストレプトミセス菌ＤＮＡ中に容易に挿入される（米国特許第８，１８８，２４５号にて言及、これもまた本明細書中に参考として援用される）。ｏｒｉＴは大腸菌Ｓ１７−１からストレプトミセス菌へのＤＮＡの接合伝達に必要であり、ａａｃ（３）ＩＶはアプラマイシン耐性を付与する大腸菌−ストレプトミセス菌二機能選択マーカーである。ｏｒｉＴ及びａａｃ３（ＩＶ）の両方を、ＸｂａＩ断片としてプラスミドｐＩＪ７７３から切り出し、次に予めＸｂａＩで線状化したトランスポゾンドナープラスミドｐＭＯＤ（商標）−２（ＭＣＳ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）にクローニングした。得られたプラスミドｐＸＹＴｎ５ＡＴａ及びｐＸＹＴｎ５ＡＴｂは、ＸｂａＩ断片の配向のみが異なり、製造者の仕様書に従ってＰｖｕＩＩで消化することによってＴｎ５ＡＴカセットを調製するために使用した。
【０１７５】
インビトロトランスポゾン変異と変異誘発フォスミドｐＸＹＦ２４Ｄ３とｐＸＹＦ１４８Ｄ１２の選択
遺伝子置換研究のためのエンデュラシジン生合成クラスターのセグメントを保有するランダム変異誘発フォスミドのライブラリーを作製するために、フォスミドｐＸＹＦ２４及びｐＸＹＦ１４８のインビトロトランスポゾン挿入変異研究を行った。２つの推定エンデュラシジン生合成調節遺伝子、すなわちｏｒｆ１８及びｏｒｆ２４は、それぞれフォスミドｐＸＹＦ２４及びｐＸＹＦ１４８のインサート上に存在する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２）。１０μＬ（０．５μｇ）のフォスミドテンプレートＤＮＡ、２μＬ（２０ｎｇ）のＴｎ５ＡＴカセットＤＮＡ、２μＬの１０×反応緩衝液、１μＬのＴｎ５トランスポザーゼ、及び５μＬの滅菌水を混合した後、３７℃で２時間インビトロトランスポゾン反応を行った。トランスポゾン反応混合物を用いた大腸菌コンピテント細胞ＥＰＩ３００（商標）−Ｔ１Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）の形質転換をエレクトロポレーションによって行った。１００μｇ／ｍＬのアプラマイシンを補充したＬＢ寒天プレート上で変異誘発フォスミドを選択した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、生き残ったコロニーを無作為に選び、１００μｇ／ｍＬのアプラマイシンを添加したＬＢ液体培地中で増殖させた。これらのコロニーからの突然変異誘発フォスミドＤＮＡ及び対照のフォスミドｐＸＹＦ２４又はｐＸＹＦ１４８をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲル上での電気泳動により分析した。Ｔｎ５ＡＴカセットは単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、これはフォスミドインサート上の単一に対する複数の破壊事象についてスクリーニングするときに有用である。ｐＸＹＦ２４又はｐＸＹＦ１４８のフォスミドインサート中にはＨｉｎｄＩＩＩ部位は存在せず、フォスミドベクター中にはただ１つのＨｉｎｄＩＩＩ部位が存在する。それゆえ、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化は、ゲル中に２つのバンドが存在することによって、Ｔｎ５ＡＴの単一挿入のフォスミドを容易に同定する。単一のトランスポゾン挿入の変異誘発フォスミドを有するコロニーを無作為に選択し、ＬＢ液体培養中で増殖させて、フォスミド単離及び破壊された遺伝子の同定を可能にした。スクリーニングは、アプラマイシン耐性遺伝子の領域に対応するプライマー５’−ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号２４）を用いた配列分析によって行った。このようにして、フォスミドｐＸＹＦ２４Ｄ３及びｐＸＹＦ１４８Ｄ１２は、ヌクレオチド位置２６３８６のｏｒｆ１８及びヌクレオチド位置３４３３３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２）のｏｒｆ２４にそれぞれＴｎ５ＡＴが挿入されていることが見出された。
【０１７６】
野生型Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２１０１３におけるｏｒｆ１８及びｏｒｆ２４の挿入破壊。
【０１７７】
遺伝子置換フォスミドｐＸＹＦ２４Ｄ３及びｐＸＹＦ１４８Ｄ１２をエレクトロポレーションにより大腸菌Ｓ１７−１に別々に形質転換し、次いで属間接合によりＳ．．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓに導入した（Ｍａｚｏｄｉｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７１：３５８３−３５８５，１９８９、その全体が本明細書中に参考として援用される）。アプラマイシン選択を生き残った接合体コロニーを、ＩＳＰ２寒天プレート上での抗生物質の選択なしに、３回連続の胞子形成を通過させて、二重交差相同組換えを介して安定した変異株を作製した。得られた胞子をプールし、希釈し、アプラマイシン耐性の確認、及び種の培養及びエンデュラシジン産生発酵での使用のために、５０μｇ／ｍＬアプラマイシンを補充したＩＳＰ２寒天プレート上にプレーティングした。Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ野生型におけるｏｒｆ１８の挿入破壊を有する変異株をＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３と命名し、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ野生型におけるｏｒｆ２４の挿入破壊を有する変異株をＳｆｐＸＹＦ１４８Ｄ１２と命名した。
【０１７８】
実験室規模及び１０リットル発酵槽でのエンデュラシジンの産生
Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ野生型、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）及びその派生株におけるエンデュラシジンの産生のための実験室用振盪フラスコ発酵条件は、Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら．（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２１：１２６−１３７，１９６８）によって記載された通りであった。ただし、特許（米国特許第４４６５７７１号）に開示されたエンデュラシジン産生培地は除かれる。実験室規模の発酵のために、５ｍＬのＴＳＢを、新たに収穫したストレプトミセス菌胞子を種の培養に接種するために使用した。典型的には５〜１０ｍＬの種の培養物を回転式振盪機上で２２５ｒｐｍ及び３０℃で４８時間インキュベートし、次いで１０日間連続発酵のために５０ｍＬのエンデュラシジン産生培地に移した。厳密に制御された条件下での野生型及び誘導体株によるエンデュラシジンの産生もまた１０リットル自動発酵槽中で行われた。
【表３】
2020500561.tif 000021
【０１７９】
ＨＰＬＣ分析のための発酵産生物からのエンデュラシジンの抽出
エンデュラシジン産生のＨＰＬＣ分析のため代謝産物を抽出するために、新鮮な菌糸体を遠心分離によって収穫し、脱イオン水で洗浄し、５×容量の（水性菌体重量（ｇ）に対する水性メタノール（ｍＬ）の比）７０％水性メタノール（１ＮのＨＣｌでｐＨを３．５に調整した）に再懸濁した。懸濁液を室温で２００ｒｐｍで一晩振盪し、次いで４０００ｒｐｍ及び４℃で２０分間遠心分離した。次に、各サンプルから得た１．４ｍＬの上清を個々の１．５ｍＬ微量遠心用チューブに移し、室温で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。濾液を０．２２μｍのシリンジフィルターに通した後、ＨＰＬＣで分析した。１０Ｌの発酵槽で産生された菌糸体からの代謝産物の抽出が、実験室での発酵と同等の小規模で行われた。
【０１８０】
ＨＰＬＣ分析及びエンデュラシジン収量の判定
上記のように調製した５０μＬのＨＰＬＣサンプルを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣに接続したＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォルニア州）に注入した。溶媒Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ：アセトニトリルを用いた１８分の段階的線形勾配を用いて、分離を達成した。流速は、１０％Ｂから始めて１ｍＬ／分であり、１０分かけて４０％Ｂまで上げ、次いで８分かけて９５％Ｂまでさらに上げた。２００から３００ｎｍのＵＶ領域をＳＰＤ  Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器でスキャンした。７０％メタノール中のエンデュラシジン標準のストック溶液から作成した標準曲線と比較することにより、エンデュラシジンの収量を計算した。２、４、６、８、１０及び１２μｇのエンデュラシジンを含む一連の注射を用いて、２３０ｎｍにおけるエンデュラシジンＡ及びＢの吸光度面積の合計を用いて標準曲線を作成した。標準曲線から回帰式を生成し、これを用いてエンデュラシジンの収量を計算した。
【０１８１】
抗菌活性の評価
黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）をバイオアッセイにおける指標の微生物として利用した。細胞を用いてＬＢブロスに接種し、３７℃で一晩増殖させた後、１００μＬの培養物を５ｍＬの上層寒天（等量の栄養寒天と栄養ブロスの混合物）と混合した。上層寒天を栄養寒天プレート上に重層し、寒天プラグを切り取ることによって、適切な間隔でウェルを作った。エンデュラシジン標準及び一定分量の培養抽出物を５０％のＭｅＯＨに２０μｇ／ｍＬの濃度で溶解又は希釈し、１００μＬの各溶液をウェルに入れた。プレートを３７℃で１６時間インキュベートした後、阻害領域を観察及び比較し、プレートを写真撮影するか４℃で保存した。
【０１８２】
［実施例２］
野生型Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓにおけるｏｒｆ１８とｏｒｆ２４の破壊とエンデュラシジン産生への影響
この実施例は、野生型Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓにおけるｏｒｆ１８とｏｒｆ２４の破壊とエンデュラシジン産生への影響を記載する。
【０１８３】
エンデュラシジン生合成遺伝子クラスター及びそのフランキング領域を有する野生型Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２１０１３由来の１１６，０００  ｂｐのＤＮＡ配列（米国特許第８，１８８，２４５号、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）は以前に同定されており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＤＱ４０３２５２）にて入手可能である。４８の注釈付きｏｒｆの中には、ｏｒｆ５、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１８、ｏｒｆ２２、ｏｒｆ２４、ｏｒｆ４１、ｏｒｆ４２及びｏｒｆ４３の８つの推定調節遺伝子がある。エンデュラシジン産生における各遺伝子産生物の役割を解明するために、これらの推定上の調節遺伝子を含むエンデュラシジンクラスターのセグメントを担持するフォスミッドインサートを、実施例１に記載のようにトランスポゾン媒介のアプラマイシン耐性マーカーの挿入を用いてランダムに突然変異させた。
【０１８４】
突然変異誘発フォスミドを保有する大腸菌コロニー間のアプラマイシン耐性及び挿入位置についてのその後のスクリーニングにより、破壊されたｏｒｆ１８を保有するｐＸＹＦ２４Ｄ３、及び破壊されたｏｒｆ２４を保有するｐＸＹＦ１４８Ｄ１２が同定された。これらの各フォスミド及び挿入部位における単一の挿入突然変異は配列決定により確認された。次いで、これらの２つの突然変異誘発フォスミドを、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ野生型株への接合によって個々に導入した。次に、アプラマイシン耐性を示す接合体を、抗生物質の選択を追加することなくＩＳＰ２寒天培地上で３回の胞子形成に通過させて、単一交差相同組換えから二重交差変異への変換を促進した。得られた安定している変異株ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３及びＳｆｐＸＹＦ１４８Ｄ１２を実験室規模で振盪フラスコ中でエンデュラシジン産生培地（ＥＰＭ）中で発酵させた。１０日間の発酵からの菌糸体の７０％メタノール抽出のＨＰＬＣ分析は、ｏｒｆ１８破壊株ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３によるエンデュラシジン収量の１．３倍の増加、及び破壊されたｏｒｆ２４を有する株ＳｆｐＸＹＦ１４８Ｄ１２によるエンデュラシジン産生の完全な損失を明らかにした。菌糸体抽出物を、黄色ブドウ球菌に対する活性についても評価した。ｏｒｆ１８破壊株ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３は活性を保持したが、ｏｒｆ２４破壊株ＳｆｐＸＹＦ１４８Ｄ１２は黄色ブドウ球菌に対する活性を失った。
【０１８５】
［実施例３］
組換え株ＳｆｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４の構築とエンデュラシジン産生への影響
この実施例は、組換え株ＳｆｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４の構築及びこの株がエンデュラシジンを産生する能力を記載する。
【０１８６】
変異株ＳｆｐＸＹＦ１４８Ｄ１２におけるエンデュラシジン産生の喪失は、ｏｒｆ２４に対する可能性のある調節的役割を示した。Ｏｒｆ２４タンパク質配列を用いたＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索により、ストレプトマイシン生合成に関与する経路特異的調節タンパク質ＳｔｒＲとの高い配列類似性が明らかになった。Ｏｒｆ２４とＳｔｒＲとの間の配列アラインメントは、タンパク質が重大な類似性を共有することを示した（５４％のアミノ酸同一性、図９）。ｏｒｆ２４破壊時のエンデュラシジン産生の喪失及びＳｔｒＲとの類似性は、Ｏｒｆ２４がエンデュラシジン産生における経路特異的活性化因子として作用し得ることを示す。
【０１８７】
株を改良するための正の調節標的としてのｏｒｆ２４の役割を探究するために、統合的発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４（図２）を構築した（実施例１）。プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４を接合により野生型Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓに導入し、接合体をアプラマイシン耐性表現型についてスクリーニングし、新しい組換え株ＳｆｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４を同定した。この株からの少なくとも１０個の独立した接合体コロニーを無作為に選択して精製した。これらのコロニー株は、プラスミド上のａｔｔＰ部位との単一交差相同組換えによって、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ染色体上のａｔｔＢ部位に組み込まれたｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４プラスミドを保有する。
【０１８８】
組換え株によって産生された代謝産物を調べるために、２つのコロニー株からの胞子をＴＳＢ種の培養に接種し、次いで実験室規模の発酵のためにエンデュラシジン産生培地に移した。収穫された菌糸体の７０％メタノール抽出物のＨＰＬＣ分析から、野生型株（３０ｍｇ／Ｌ）と比較して両方の組換え株によるエンデュラシジンの産生における２倍の増加（６０ｍｇ／Ｌ）が明らかになった。ｏｒｆ２４を過剰発現することができるこれらのコロニー株において観察されたエンデュラシジンの高い収量は、この遺伝子がエンデュラシジン産生において正の調節的役割を果たすことのさらなる証拠であり、結果は、エンデュラシジンの産生の喪失をもたらしたｏｒｆ２４の破壊から得られるものと一致している。
【０１８９】
［実施例４］
Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）においてｏｒｆ２４を過剰発現する株ＢＭ３８−２．２４／１６の構築及びエンデュラシジン産生に対する影響
この実施例は、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）においてｏｒｆ２４を過剰発現している株ＢＭ３８−２．２４／１６（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４００６）の構築及びエンデュラシジン産生に対する影響を記載する。
【０１９０】
Ｏｒｆ２４の正の調節的役割をさらに探求するために、野生型生物に関して上記したように、プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４を商業産生株Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）の染色体に組み入れた。アプラマイシン耐性表現型を示す接合体の選択により、実験室用振盪フラスコ培養物２００ｍｇ／Ｌまでの高いエンデュラシジンレベル（ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）の３．３倍の増加に対して）を生じ得るＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２．２４／１６を含む多数の組換えコロニー株が得られた。予備スクリーニング中の収量に基づいて、エンデュラシジン産生能力をさらに評価するためにＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２−２４／１６を選択した。
【０１９１】
実験室用振盪フラスコ培養物における組換え株Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２．２４／１６によるエンデュラシジン産生は、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）を超える重大な改善の明らかな可能性を示し、収量もまた大きく変動することが観察された。振盪フラスコでは容易に管理されないｐＨ及び溶存酸素を含む、１０日間の増殖期間にわたる培養条件をより厳密に制御するために、１０Ｌ発酵槽での複数回の試行を通して産生を評価した。これらのより厳密に制御された条件下で、収量はより一貫しており、３つの１０Ｌ発酵は平均３７５ｍｇ／ｍＬ（４．６倍のＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２））であった。組換え株Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２．２４／１６（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４００６）におけるエンデュラシジンの収量増加は、エンデュラシジン産生におけるＯｒｆ２４の正の上方制御の役割をさらに支持する。
【０１９２】
［実施例５］
欠失変異株ＢＭ３８−１．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲの構築とエンデュラシジン産生への影響
この実施例は、欠失変異株ＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４００７）の構築及びエンデュラシジン産生に対する影響を記載する。
【０１９３】
ｏｒｆ１８は、エンデュラシジン生合成遺伝子クラスター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２）の上流領域に位置している。変異株ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３における遺伝子の挿入破壊がエンデュラシジンの収量を上昇させたので、Ｏｒｆ１８はエンデュラシジン産生において負の役割を果たしていると思われる。この観察に基づいて、構築物は、ｏｒｆ１８単独及びｏｒｆ１８及びそのフランキング領域の一部の欠失のために設計された。この目的のために、プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲを構築した（図５）。このｐＫＳベクター由来のプラスミドは、ストレプトミセス菌レプリコンもストレプトミセス菌染色体への組込みのための要素も持たない。それは二重交差相同組換えを介して宿主染色体中のＤＮＡの規定されたセグメントとその挿入物を交換することしかできない。このプラスミドの挿入マップを図１０に示す。ｏｒｆ１８、及びそのｏｒｆ１９全体及びｏｒｆ１７のＮ末端部分をコードする領域を含むフランキング領域は、プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲにおいて欠失されている。１ｋｂの左腕はｏｒｆ１７のＣ末端部分及びその下流領域をコードする領域を含み、１ｋｂの右腕はＮ末端領域をコードするｏｒｆ２０の部分セグメントを含む。それゆえ、二重交差相同組換え後の欠失は、全ｏｒｆ１８＋ｏｒｆ１９及びｏｒｆ１７のＮ末端部分をコードする領域が欠失されてアプラマイシン耐性遺伝子で置換されている組換え株をもたらした。
【０１９４】
プラスミドｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲをＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ  ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）に接合するように導入し、単一及び二重交差相同組換えをアプラマイシンを補給することなく、ＩＳＰ４寒天プレート上で促進した。その後のアプラマイシン選択を生き残ることができた接合体を精製し、この新しい組換え株をＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４００７）と命名した。この菌株からの胞子を種培養用のＴＳＢ培地に接種し、次いでエンデュラシジン産生培地に移した。１０日の発酵後、菌糸体を収穫し、処理してＨＰＬＣにより分析した。親株ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）と比較して、これらの実験室規模の発酵から、エンデュラシジン産生の１．２倍の増加が観察された。相対的な収量の増加は、野生型由来株ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３で観察されたものと同様であり、結果は、ｏｒｆ１８に隣接し、ＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲの構築において影響を受けたｏｒｆ１９及びｏｒｆ１７は、エンデュラシジン産生に対しほとんど又はまったく影響を与えないことを示唆する。したがって、組換え株ＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲにおけるエンデュラシジンの産生増加は、Ｏｒｆ１８の負の調節的役割の排除によるものである。
【０１９５】
ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）中のプラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄによるｏｒｆ１８単独の欠失に関しては、チオストレプトン耐性マーカーを有する接合体及び一重／二重変異体を積極的に選択することが困難に見舞われた。そのため、代替ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩを使用して、ｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（図４）又はｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ、ｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）などのマーカーがない遺伝子置換送達プラスミドを構築する（アプラマイシン耐性遺伝子はｏｒｆ１８への挿入の代わりにベクター上で保有される、図６参照）。
【０１９６】
［実施例６］
ｐＫＳ由来遺伝子不活化ベクターｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲシリーズの開発
本実施例では、ｐＫＳ由来遺伝子不活化ベクターｐＫＳ−Ｔ−ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲシリーズの開発について説明する。
【０１９７】
接合機能を有し、他のいくつかの遺伝子破壊ベクターが必要とするようにプラスミドを排除するために形質転換体を高温選択に通すことを必要としない一連のｐＫＳ由来遺伝子不活性化ベクターを開発した（図４、図５及び図６）。これらのｐＫＳ由来ベクターは、大腸菌中での複製を可能にする非ストレプトミセス菌レプリコンを保有し、ストレプトミセス菌及び大腸菌中のアプラムシン耐性マーカー又は大腸菌中のアンピシリンで維持及び選択することができる。それらは、接合のために大腸菌内で組換えプラスミドの大量の安定したコピーを産生し、またそれらは、挿入遺伝子の破壊及びフレーム内欠失の研究のためにプラスミドに標的ＤＮＡを集合させるのに都合よく使用することができる、ＰａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ及びＸｂａＩのようなストレプトミセス菌ＤＮＡに見られるいくつかの稀で独自の制限部位で設計された。
【０１９８】
［実施例７］
ｐＳＥＴ１５２由来組込み遺伝子発現ベクターｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ及びｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒの開発
この実施例は、ｐＳＥＴ１５２由来の組込み遺伝子発現ベクターｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ（配列番号２０）及びｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒ（配列番号２３）の開発を記載する。
【０１９９】
２つの新しいベクター、ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ（図７）及びｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒ（図８）を開発した。それらは、ストレプトミセス菌遺伝子発現及び相補性のために最も広く使用されている統合的ベクターであるベクターｐＳＥＴ１５２のような、共役的及び統合的機能を有する。これら両方のベクターは、発現構築物の便利なクローニング及び集合のためにストレプトミセス菌ＤＮＡにおいて稀であるいくつかの制限部位を有する。ベクターｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒは、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む大腸菌及び５０μｇ／ｍＬのチオストレプトンを含むストレプトミセス菌において維持及び選択することができる。ベクターｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒは、大腸菌中でアンピシリンと共に、ストレプトミセス菌中でチオストレプトンと共に維持及び選択することができる。
【０２００】
実施例１〜６の要約：
菌株改良のためのストレプトミセス菌調節及び生合成遺伝子の遺伝子操作
多数の天然産生物の微生物産生体のうち、既知の微生物抗生物質の約７５％が放線菌によって産生されている。ストレプトミセス菌、グラム陽性糸状土壌細菌は、放線菌科のメンバーであり、構造的に多様な、薬理学的及び生物学的に活性な二次代謝産物の多様な配列を産生するそれらの比類のない能力で知られている。ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって産生されるポリケチド及び非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）によって産生されるペプチド天然物が代表的である。
【０２０１】
天然物抗生物質生合成に関する研究にはいくつかの共通の課題がある。第１に、野生型又は遺伝子工学操作株によって産生される親化合物又は構造的に修飾された化合物の典型的な低産生を克服する方法。第２に、ゲノム配列から同定された多くの潜在的又は孤立した二次代謝産物生合成経路をどのように活性化して生成物の生物学的機能を研究することができるか。過去数十年にわたる天然産生抗生物質生合成の研究の進歩は、二次代謝産物の産生が多くの経路によって調節されていることを示している。例えば、前駆体及び構造集合体生合成遺伝子（ＰＫＳ及びＮＲＰＳなど）、調節遺伝子及び自己抵抗性遺伝子は、細菌染色体上に集まり得る。抗生物質産生は、アクチベーター及び／又はリプレッサーを含む経路特異的調節遺伝子、多面的異所性調節遺伝子、及び二成分調節系によって調節され得る。これらの調節遺伝子又はシステムのいずれかに生じる突然変異は、抗生物質産生を増加、減少、又は完全になくす可能性がある。潜在的な生合成経路は、これまで知られていなかった産生物の産生をもたらす予想外の突然変異によって活性化され得る。
【０２０２】
株の改善は、抗生物質又は他の微生物の二次代謝産物の費用対効果の高い工業規模の産生において重要な役割を果たす可能性がある。特定の代謝産物の収量を増加させることができる変異株は、ランダムな変異によって、又は特定の遺伝子の標的破壊によって、又は生合成経路におけるボトルネックを排除する（１又は複数の）遺伝子の導入によって生成することができる。標的化された二次代謝産物の過剰産生を生じさせるための正及び負の調節遺伝子ならびに生合成遺伝子の遺伝子操作は、放線菌株の改良の強力かつ非常に成功した戦略であることが証明されている。
【０２０３】
本開示では、エンデュラシジン産生に対するｏｒｆ２４の正の調節的役割及びｏｒｆ１８の負の調節的役割が実証された。ｏｒｆ２４の標的化挿入不活性化は、組換え株ＳｆｐＸＹＦ１４８Ｄ１２におけるエンデュラシジン産生の完全な喪失をもたらした。組換え株ＳｆｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４及びＢＭ３８−２．２４／１６における強力な構成的プロモーターｅｒｍＥ＊ｐの制御下でのその後のｏｒｆ２４の過剰発現は、約２〜４．６倍のエンデュラシジン収量の増加をもたらした。ｏｒｆ１８及びｏｒｆ１９全体及びｏｒｆ１７の一部を含むそのフランキング領域の欠失は、エンデュラシジンの収量を１．２倍増加させた。これらの結果は、エンデュラシジン生合成における、それぞれ陽性アクチベーター及び陰性リプレッサーとしてのｏｒｆ２４及びｏｒｆ１８の役割を支持する強力な遺伝的な証拠を提供した。
【０２０４】
Ｏｒｆ２４オルソログは他の抗生物質生合成経路から機能的に確認されている
ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対するＯｒｆ２４タンパク質配列を用いたＢＬＡＳＴクエリは、数百のヒットを明らかにした（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４０３２５２）。多くは非常に高いアミノ酸類似性（６０％から９９％の同一性）を示し、アミノグリコシド系抗生物質ストレプトマイシンの生合成における転写制御因子として注釈されている。しかし、このグループの遺伝子のどれも実験的に検証された機能を有していなかった。ＢＬＡＳＴの結果の分析は、機能的に特徴付けられたＯｒｆ２４に対してより低い類似性（４０％を超えるが６０％未満のアミノ酸同一性）を共有するいくつかの関連タンパク質を同定した。これらには、Ｏｒｆ２４とは低いが重大な類似性（３１１アミノ酸重複における５４％アミノ酸同一性）を共有する、よく特徴付けられているタンパク質ＳｔｒＲが含まれる。ＳｔｒＲは、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）におけるストレプトマイシン生合成遺伝子の発現の経路特異的な陽性アクチベーターとして機能することが遺伝的及び生化学的に実証されている。ＳｔｒＲは、経路特異的アクチベーターのファミリーを表し、その一握りは遺伝子操作又は生化学的研究のいずれかによって特徴付けられている。図１１は、６つの機能的に確認された放線菌ＳｔｒＲ様タンパク質とのＯｒｆ２４のアラインメントを示す。図１１に下線を引いたように、典型的で高度に保存されたヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）ＤＮＡ結合ドメインが７つすべてのタンパク質に存在する。Ｏｒｆ２４はまた、非リボソーム的に生成された糖ペプチド抗生物質テイコプラニンの生合成を支配する経路特異的活性化因子であるＴｅｉｌ１５＊と重大な配列類似性（５４％のアミノ酸同一性）を共有する。Ｔｅｉ１５＊は、テイコプラニンクラスター中の少なくとも１７個の遺伝子の転写を正に調節する。野生型Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓは、約１００ｍｇ／Ｌのテイコプラニンを産生するが、親Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ由来で、異なるプロモーターの制御下で発現されるｔｅｉ１５＊を保有する遺伝子組換え株は、テイコプラニンの収量を、ｅｒｍＥ＊ｐプロモーターの場合は１ｇ／Ｌに、天然アプラマイシン耐性遺伝子プロモーターの場合には約４ｇ／Ｌに増加させた。
【０２０５】
図１１に示すように、Ｏｒｆ２４はまた、バリマイシングリコペプチド抗生物質生合成クラスターからのＢｂｒに対して（５４％のアミノ酸同一性）、アミノグリコシド系抗生物質カスガマイシン生合成遺伝子の発現を支配するＫａｓＴに対して（５０％のアミノ酸同一性）、及びノボビオシン生合成に関与する経路特異的活性化剤であるＮｏｖＧ（４５％のアミノ酸同一性）に対して、重大な配列類似性を共有する。ΔｎｏｖＧ変異体は野生型と比較してわずか２％のノボビオシンしか産生せず、組換え株における多コピーのプラスミドからのｎｏｖＧの過剰発現はノボビオシン産生の３倍の増加をもたらした。Ｏｒｆ２４はまた、Ｓ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓにおける抗腫瘍抗生物質Ｃ−１０２７の産生に関与することが実験的に確認されている４つの調節遺伝子（ｓｇｃＲ１、ｓｇｃＲ２、ｓｇｃＲ３及びｓｇｃＲ）の１つであるＳｇｃＲ１と４２％のアミノ酸同一性を共有する。Ｓ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ  ＳＢ１０２２におけるｓｇｃＲ１の過剰発現は、野生型株と比較してＣ−１０２７収量を約７倍増加させた。組換え株における正の調整因子ｓｇｃＲ３の過剰発現は、Ｃ−１０２７産生の３０〜４０％の増加をもたらした。対照的に、負の制御因子ｓｇｃＲの不活性化は、Ｃ−１０２７及びヘプタン産生の両方を増加させた。さらに、ΔｓｇｃＲ変異株におけるｓｇｃＲ１の過剰発現は、Ｃ−１０２７産生の約７倍の増加をもたらした。ｓｇｃＲ３は、Ｃ−１０２７産生の階層的調節において、ｓｇｃＲ１及びｓｇｃＲ２の制御により、より高いレベルの調節を占める。結論として、ｏｒｆ２４の破壊及び発現効果、ならびにＯｒｆ２４と他の機能的に特徴付けられたオルソログとの比較は、Ｏｒｆ２４がエンデュラシジン産生における経路特異的な正の制御因子／活性化因子として作用することを示している。
【０２０６】
Ｏｒｆ１８は推定上の非定型オーファン応答制御因子であり機能的に確認されたオルソログと一致する
ストレプトミセス菌種における抗生物質の産生は、大規模で費用対効果の高い工業産生に必要な収量を生み出すことから、多くの野生型抗生物質産生体の能力を制限する複雑な遺伝的ネットワークによって厳しく調節されている。１つの重要な調節機構は二成分シグナル伝達系である。二成分系は、センサーキナーゼ及び同族応答調節因子を含む。センサーキナーゼは、ストレス、栄養及び化学物質などのような特定の外部環境刺激／シグナルに応答し、次いで標的遺伝子の転写を誘発及び活性化する細胞質応答制御因子にシグナルを中継する。センサーキナーゼと対になっていない応答制御因子は、オーファン応答制御因子と呼ばれる。
【０２０７】
二成分系及びオーファン応答制御因子は、ストレプトミセス菌ゲノムに存在し、二次代謝産物産生を抑制するように機能し得る。Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ由来のエンデュラシジン遺伝子クラスターにおいて、ｏｒｆ１８は、ストレプトマイセス・セリカラー由来の１つのオーファン応答制御因子ＳＣＯ３８１８を含む、３つの他の特徴付けられたストレプトミセス菌応答制御因子と低〜中程度の配列類似性を共有する推定オーファン応答制御因子をコードする（図１２）。Ｏｒｆ１８は、他のアラインメントされたタンパク質と比較してより長いＮ末端配列を有し、（共通位置１０５と比較して）位置１１８の高度に保存されたリジンがＯｒｆ１８に存在せず、トレオニンで置換されるので異型のオーファン応答制御因子であると思われる。リジンは、リン酸化ポケットを形成するために必要であると提案されている。
【０２０８】
機能的に特徴付けられているストレプトミセス菌応答制御因子はわずかしかない。ストレプトマイセス・セリカラーゲノムは、合計５つの非定型及び７つの典型的なオーファン応答制御因子を含む。Ｏｒｆ１８は、ＡｂｓＡ２と重複する１９１アミノ酸で、２６％のアミノ酸同一性を共有している。ストレプトマイセス・セリカラー中のＡｂｓＡ２の欠失は、２つの抗生物質、アクチノロジン及びウンデシルプロジギオシンの産生の増加をもたらした。Ｏｒｆ１８は、１７６アミノ酸中３２％のアミノ酸同一性がＳＣＯ３８１８と重複していることを示す。ｓｃｏ３８１８を欠失させるとアクチノロジンの産生が増強された。Ｏｒｆ１８は、１６６の重複中２９％のアミノ酸同一性をＳＣＯ１７４５（ＡｂｒＡ２）と共有している。ＡｂｒＡ２含有応答制御因子オペロンの欠失は、野生型産生体と比較して、組換え株ストレプトマイセス・セリカラーＭ１４５において抗腫瘍抗生物質オビエドマイシンの１００％の増加をもたらした。エンデュラシジン産生におけるＯｒｆ１８の観察された負の調節的役割は、関連する負の制御因子の実証された活性と一致する（図１２）。さらに、ＢＬＡＳＴ検索において、Ｏｒｆ１８がＬｕｘＲファミリーの転写制御因子のメンバーと最も高いタンパク質配列類似性を共有することが注目される。
【０２０９】
変異体ＢＭ３８−１．ｏｒｆ１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲにおける極性効果の欠如
変異体ＢＭ３８−１．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲ株の欠失領域は、ｏｒｆ１８の３つの遺伝子、ｏｒｆ１８の下流に位置するｏｒ１７のＮ末端部分をコードする領域、及びｏｒｆ１８の上流に位置するｏｒｆ１９全体を含む（図５及び図１０）。ｏｒｆ１７は、エンデュラシジンの生合成又は調節に関連する機能を明らかに持たないリボヌクレアーゼをコードすると予測される。また、ｏｒｆ１８及びそのフランキング領域を置換するアプラマイシン耐性遺伝子はｏｒｆ１７と多岐に転写され、アプラマイシン耐性遺伝子プロモーターからいずれかのリードスルー事象を生じさせるべきではない。それゆえ、ｏｒｆ１７の部分的欠失から生じる極性の影響はないはずである。
【０２１０】
ｏｒｆ１９はｏｒｆ１８と同じ方向に転写及び翻訳される。この遺伝子は未知の機能のタンパク質をコードすると注釈されている。ｏｒｆ１８単独の破壊を有する変異株ＳｆｐＸＹＦ２４Ｄ３ならびにｏｒｆ１８及びｏｒｆ１９の欠失を一緒に有する変異体ＢＭ３８−１．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲは、エンデュラシジン産生に対して同様に増強された効果を有し、これはｏｒｆ１９がエンデュラシジン産生において役割がない又は無視できる程度の役割を有することを意味する。遺伝子ｏｒｆ２０はｏｒｆ１９の上流に位置し、挿入されたアプラマイシン耐性マーカーと同じ方向に転写及び翻訳され（図１０）、ｏｒｆ２０は依然としてＢＭ３８−１．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲにおいて無傷であり、産生物は明らかにエンデュラシジン産生において役割を持たない。それゆえ、ｏｒｆ２０の発現に対するいかなる極性の影響も、ＢＭ３８−１．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲにおける増強されたエンデュラシジン産生の原因であるとは考えられていない。
【０２１１】
［実施例７］
増強されたエンデュラシジン産生株のためのｏｒｆ２４及び／又はｏｒｆ１８のさらなる適用及び操作
上記で提供された例に加えて、エンデュラシジン産生を改善するためにｏｒｆ２４及びｏｒｆ１８の調節的役割を利用するための他の可能な方法がある。
【０２１２】
ｉ．代替的、構成的又は誘導的過剰発現プロモーター下でのｏｒｆ２４の発現
ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４（図２に示す）は、広く使用されているストレプトミセス菌の強力な構成的発現プロモーターであるｅｒｍＥ＊ｐの制御下でのｏｒｆ２４の統合的異所性発現のために構築された。ｏｒｆ２４の過剰発現はまた、他の構成的又は誘導的プロモーターによっても駆動され得る。ｔｉｐＡプロモーターはチオストレプトン誘導性の過剰発現ストレプトミセス菌プロモーターである。ストレプトミセス菌遺伝子の過剰発現に首尾よく使用されてきた、マルチコピーｔｉｐＡプロモーター含有大腸菌−ストレプトミセス菌シャトルプラスミド、ｐＸＹ２００が開発された。本開示に関連する用途では、ｔｉｐＡプロモーターをｐＸＹ２００から切り出し、ｐＸＹ１５２にクローニングしてｅｒｍＥ＊ｐを置換し、ｏｒｆ２４の発現を駆動することができる。同様に、プラスミドベースの発現のために、ｏｒｆ２４はｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４からｐＸＹ２００に容易に移すことができる。他のプロモーターの選択肢には、Ｐ（ｎｉｔＡ）−ＮｉｔＲシステム及びストレプトミセス菌プロモーターＳＦ１４が含まれるが、これらに限定されない。最近、統合型プラスミドｐＫＣ１１３９及びアプラマイシン耐性遺伝子の天然プロモーターが、ペプチド抗生物質テイコプラニンの過剰産生のための調節遺伝子を発現するために首尾よく使用された。調節遺伝子ｓａｎＧは、ニッコマイシン産生の経路特異的活性化因子をコードする。５つの異なるプロモーター（ＰｈｒｄＢ、Ｐｔｃｐ８３０、ＰＳＦ１４、ＰｅｒｍＥ＊及びＰｎｅｏｓ）の制御下でｓａｎＧの余分なコピーを発現させると、ニッカマイシン収量がそれぞれ６９％、５１％、２６％、２２％、及び１３％増加した（Ｄｕら，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９７：６３８３−６３９６，２０１３参照）。
【０２１３】
ｉｉ．ｏｒｆ１８が欠失し、ｏｒｆ２４が過剰発現しているＳ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの二重変異株
増加したエンデュラシジン産生を示すｏｒｆ１８欠失変異体及びｏｒｆ２４過剰発現株の両方を用いて、両方を含有する二重変異体を作製することができ、このペプチド抗生物質の収量に対する付加的な効果があるかどうか観察された。二重変異体は、過剰発現プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒ（図８）を変異体ＢＭ３８−２．１８ｐｆｒｄ−ＡｍＲに導入することによって作製することができる。ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒは、ストレプトミセス菌における選択のためのチオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）及び大腸菌における選択のためのアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）を保有する接合型組込み型プラスミドである。接合に使用された大腸菌株Ｓ１７−１はクロラムフェニコール（ｃａｍ）に対して自然に耐性があるので、ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ（上記参照）のクロラムフェニコール耐性マーカーは、Ｓ１７−１形質転換体を選択するためにアンピシリン耐性（ｂｌａ）で置き換えられた。あるいは、ｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒ及び誘導体は、異なる接合大腸菌株ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２を使用することによってストレプトミセス菌に導入することができる。
【０２１４】
プラスミドｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｂｌａｔｓｒ又はｐＸＹ１５２−ｅｎｄｏｒｆ２４−ｃａｍｔｓｒのいずれかを使用してｏｒｆ２４の第２のコピーをｏｒｆ１８欠損変異体に導入することにより、チオストレプトン耐性により二重変異体を選択することが可能である。ＢＭ３８−２においてヌルｏｒｆ１８フレーム内欠失変異体（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）を作製するために、プラスミドｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ（図３）及びｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）（図６）をこの目的のために構築した。ｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄはチオストレプトンを有するｏｒｆ１８フレーム内欠失変異体の選択を可能にし、一方ｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）はフレーム内欠失変異体を選択するためにアプラマイシンを使用する。野生型Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの変異株はチオストレプトン耐性マーカーを用いて容易に選択されるが、ＢＭ３８−２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２２３４２）株においてこの耐性マーカーを用いることは困難であった。したがって、２つのプラスミド、ｐＸＹ３００−ｏｒｆ１８ｉｆｄ及びｐＫＳ−ｏｒｆ１８ｉｆｄ−Ｔ−ＡｍＲ（ＮＳ）を同じ目的のために構築した。
【０２１５】
開示された発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、図示された実施形態は本発明の好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。むしろ、本発明の範囲は、続く特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らはこれらの請求の範囲と精神の範囲内に入るすべてのものを自らの発明と主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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