(57)【要約】  本開示は、結合モチーフ（ＢＭ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６ＲＸ１８ＱＹＸ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄを含む、インターロイキン−１受容体タイプ−Ｉ（ＩＬ−１Ｒ−Ｉ）に対して結合親和性を有する操作されたポリペプチドクラスに関する。本開示はまた、治療剤、予後剤、および／または診断剤としてのかかるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの使用に関する。【選択図】図３
2020515252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭを含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、前記モチーフが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６ＲＸ１８ＱＹＸ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄ（配列番号１６８６）
（相互に独立して、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、ＥおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ６は、ＱおよびＹから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＭから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される）、
および
ｉｉ）ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９３％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭを含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、前記モチーフが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６ＲＸ１８ＱＹＸ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄ（配列番号１６８６）
（相互に独立して、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、Ｈ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される）、
および
ｉｉ）Ｘ５がＩまたはＶであることを条件として、ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９６％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項３】
配列ｉ）が、以下の１０の条件Ｉ〜Ｘ：
Ｉ．Ｘ３はＥであること；
ＩＩ．Ｘ５は、ＩおよびＶから選択されること；
ＩＩＩ．Ｘ６は、ＱおよびＹから選択されること；
ＩＶ．Ｘ７は、ＦおよびＭから選択されること；
Ｖ．Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択されること；
ＶＩ．Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択されること；
ＶＩＩ．Ｘ２１はＴであること；
ＶＩＩＩ．Ｘ２５はＲであること；
ＩＸ．Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択されること；ならびに
Ｘ．Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択されること
のうちの少なくとも５つ（少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または全てなど）を満たす、請求項１または２に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項４】
配列ｉ）が、配列番号１〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項５】
配列ｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、請求項４に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項６】
配列ｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、請求項５に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成し、前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に、相互連結ループと共に２つのヘリックスの一部を本質的に形成することが好ましい、先行請求項のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項８】
前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、細菌受容体ドメイン、好ましくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡのドメインまたはその誘導体から選択される、請求項７に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項９】
ｘｉｘ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号１７２１）（［ＢＭ］が、先行請求項のいずれか１項に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）；および
ｘｘ）ＢＭに隣接する配列中の、ｘｉｘ）に定義の配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１０】
ｘｘｉ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ（配列番号１７０９）（［ＢＭ］が、請求項１〜８のいずれか１項に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）；および
ｘｘｉｉ）ＢＭに隣接する配列中の、ｘｘｉ）に定義の配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１１】
配列ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、請求項９または１０に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１２】
ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、請求項１１に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１３】
配列ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、請求項１２に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１４】
ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１サイトカインとの相互作用（ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βとの相互作用など）を遮断することができる、先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記相互作用のＫＤ値が最大で１×１０−６Ｍ（最大で１×１０−７Ｍなど、最大で１×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で９×１０−１０など）であるようにＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合することができる、先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉが、ヒトＩＬ−１Ｒ−ＩまたはカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉなど）である、請求項１４または１５に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１７】
少なくとも２つのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドモノマー単位を含み、そのアミノ酸配列が同一でも異なっていてもよい、多量体の形態の先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１８】
−先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
を含む、融合タンパク質または抱合体。
【請求項１９】
前記所望の生物学的活性が治療活性である、請求項１８に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２０】
前記所望の生物学的活性が結合活性である、請求項１８に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２１】
前記所望の生物学的活性が、前記融合タンパク質または抱合体の組織分布を改変する結合活性である、請求項１８に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２２】
前記所望の生物学的活性が、前記第２の部分が前記融合タンパク質または抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるようなｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性である、請求項１８に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２３】
前記第２の部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体；血清アルブミン；抗体のＦｃ部分、およびトランスフェリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２４】
前記第２の部分が、抗体のＦｃ部分（ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃなど）である、請求項２３に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２５】
前記Ｆｃが、未変異形態のＦｃと比較してＦｃＲｎに対する親和性の改善および／またはエフェクター応答の減少を示す変異Ｆｃである、請求項２４に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２６】
配列番号１６３９〜１６５８および１７３４〜１７３７からなる群（配列番号１６４８〜１６５４および１７３４〜１７３７からなる群など）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、または抱合体、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項３１】
少なくとも１つのさらなる活性薬剤（免疫応答改変剤および抗癌剤から選択される薬剤など）をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
医薬、診断剤、および／または予後剤として使用するための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体または請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
医薬として使用するための、請求項３３に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３５】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害の治療、予後、または診断における請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３６】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が、炎症性疾患、自己炎症性症候群、自己免疫疾患、感染症、心血管疾患、虚血性疾患、癌、および糖尿病からなる群から選択される、請求項３５に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３７】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に、疾患発症から２４時間以内に反復して（疾患発症から２４時間以内に少なくとも２回など、疾患発症から２４時間以内に少なくとも３回など、疾患発症から２４時間連続的になど）投与する、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３８】
前記融合タンパク質または抱合体が請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質または抱合体であり、前記組成物が請求項３２に記載の組成物である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の使用のための融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３９】
前記融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被検体に週１回投与する、請求項３８に記載の使用のための融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、インターロイキン−１受容体タイプ−Ｉ（以下、ＩＬ−１Ｒ−Ｉと呼ぶ）に対して結合親和性を有する操作されたポリペプチドクラスに関する。本開示はまた、治療剤、予後剤、および／または診断剤としてのかかるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＩＬ−１系は、炎症応答の開始および維持で中心的な役割を果たし、免疫系の先天免疫および適応免疫でも役割を果たすので、薬学的介入の魅力的な標的である（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，２００９，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５１９−５０；Ｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２）：８９−１０２）。ＩＬ−１系は、多くの場合、炎症応答におけるイニシエーターおよび主要サイトカインの役割を果たすので、病理学的免疫応答の進行の多くの局面をかかる介入によって調整することができる。ＩＬ−１βの生物学的活性を、タイプＩＬ−１受容体ＩＬ−１Ｒ−ＩへのＩＬ−１βの結合を防止するか調整する抗体によって薬理学的に阻害することができる。
【０００３】
ＩＬ−１系の生物学的活性を、ＩＬ−１Ｒの拮抗によって調整することもできる。アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））と呼ばれる組換え形態の内因性ＩＬ−１Ｒａは、例えば、ＵＳ６５９９８７３号、ＥＰ０３４３６８４号、およびＥＰ０５４１９２０号に記載されている。アナキンラは、関節リウマチ、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ；Ｋｏｎｅ−Ｐａｕｔ  ａｎｄ  Ｇａｌｅｏｔｔｉ，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０（１）：７−１８）、ならびに多数の他の炎症性および自己免疫性の容態（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｂｌｏｏｄ，１１７（１４）：３７２０−３２；Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，１１（８）：６３３−５２））において臨床的有効性が示されている。
【０００４】
ＩＬ−１受容体を、ＩＬ−１Ｒ−Ｉサブユニットに結合してリガンド媒介性のＩＬ−１受容体の活性化およびシグナル伝達を防止する抗体によって拮抗することもできる。いくつかのかかる抗体は、ＷＯ２００４／０２２７１８号に記載されており、これは１５Ｃ４などのＩＬ−１Ｒ−Ｉアンタゴニストを開示している。ＩＬ−１Ｒ−Ｉサブユニットに結合するＩＬ−１受容体拮抗抗体の他の例は、ＷＯ２０１０／０５２５０５号に記載されており、これは、９ＧＬ抗体などのＩＬ−１Ｒ−Ｉアンタゴニストを開示している。２Ｄ８と呼ばれるＩＬ−１受容体拮抗抗体のさらに別の例は、ＷＯ２００５／０２３８７２号に記載されている。
【０００５】
炎症性疾患が予測不可能かつ慢性であり、また、医学的必要性が高いにもかかわらずその要求が満たされていないことから、新規の治療様式を開発することが必要である。組織浸透率は分子サイズに反比例するので、比較的大きな抗体分子は、本質的に、組織への分布能力および浸透能力が低い。
【０００６】
したがって、抗体または他の大分子薬物を使用することが常に治療に最適というわけではなく、ＩＬ−１受容体に対して高い親和性を有する薬剤の提供が必要とされ続けている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本開示の目的は、例えば、治療、予後、および診断に適用するために使用することができる新規のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合剤を提供することである。
【０００８】
本開示の目的は、種々の形態の炎症疾患、自己炎症疾患、および自己免疫疾患を標的にする効率的な治療を可能にする分子を提供することである。
【０００９】
本開示のさらなる目的は、予後および診断への適用に適切な分子を提供することである。
【００１０】
本開示から当業者に自明のこれらおよび他の目的は、添付の特許請求の範囲に記載され、本明細書中に一般的に開示されている本発明の異なる態様によって満たされる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
したがって、本開示の第１の態様では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭを含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、そのモチーフが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６ＲＸ１８ＱＹＸ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄ（配列番号１６８６）
（相互に独立して、
Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｋ、Ｒ、およびＳから選択され；
Ｘ２１は、Ｑ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ２５は、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、およびＭから選択される）、
および
ｉｉ）Ｘ５がＩまたはＶであることを条件として、ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９６％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
関連する配列クラスであるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの上記定義は、いくつかの異なる選択実験においてＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用について選択された、親足場のいくつかの無作為なポリペプチドバリアントの統計解析に基づく。同定されたＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフ（すなわち、「ＢＭ」）は、親足場の標的結合領域に対応し、この領域は、３ヘリカルバンドルタンパク質ドメイン内の２つのαヘリックスを構成する。親足場では、２つのＢＭヘリックスのアミノ酸残基を変動させると、抗体のＦｃ定常部との相互作用のための結合表面が得られる。本開示では、結合表面残基を無作為に変動させ、その後にバリアントを選択することより、Ｆｃの相互作用能をＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用能と置換した。
【００１３】
当業者に認識されるように、本開示のポリペプチドのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合能などの任意のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造に依存する。したがって、ポリペプチドの機能に影響を及ぼすことなくポリペプチド中のアミノ酸配列にわずかな変更を加えることが可能である。したがって、本開示は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合特性を保持しているＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの改変バリアントを包含する。
【００１４】
このようにして、ｉ）に定義のポリペプチドに対して９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドも本開示に包含される。したがって、ｉ）に定義の配列の一定の配列バリアントが、上記定義に包含されるが、但し、かかる配列バリアント内でＸ５がＩまたはＶであることを条件とする。例えば、アミノ酸残基の一定の機能群（例えば、疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を同一の官能基に由来する別のアミノ酸残基と交換することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド配列の任意の位置でかかる変更を行うことができる。他の実施形態では、足場アミノ酸残基とも呼ばれる不変の位置でのみかかる変更を行うことができる。このような場合、可変位置（すなわち、配列ｉ）中の「Ｘ」を用いて示された位置）での変更は許されない。
【００１６】
用語「％同一性」は、本明細書を通して使用される場合、例えば、以下のように計算することができる。問い合わせ配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０）を使用して標的配列とアラインメントする。アラインメントした配列のうちで最短のものに対応するウィンドウにわたって比較する。場合によっては、アラインメントした配列のうちの最短のものが標的配列であり得る。他の例では、問い合わせ配列は、アラインメントした配列の最短のものを構成し得る。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中の同一の対応配列を有する問い合わせ配列中の位置の百分率を％同一性として報告する。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「Ｘｎ」おｙび「Ｘｍ」を、上記で定義の配列ｉ）中の位置ｎおよびｍのアミノ酸を示すために使用し、ここで、ｎおよびｍは、上記配列のＮ末端から数えた上記配列内のアミノ酸の位置を示す整数である。例えば、Ｘ３およびＸ７は、配列ｉ）のＮ末端からそれぞれ３位および７位のアミノ酸を示す。
【００１８】
第１の態様の実施形態では、配列ｉ）中のＸｎが、表１の可能な残基の群から独立して選択されるポリペプチドを提供する。当業者は、列挙した可能な残基の群のいずれか１つからＸｎを選択することができ、この選択がＸｍ中のアミノ酸の選択から独立しており、ｎ≠ｍであることを認識するであろう。したがって、表１中の位置Ｘｎの列挙した可能な残基のいずれかを、表１中の任意の他の可変位置中の列挙した可能な残基の群のいずれかと独立して組み合わせることができる。
【００１９】
当業者は、表１を以下のように読み取るべきであることを認識するであろう：第１の態様の１つの実施形態では、配列ｉ）中のアミノ酸残基「Ｘｎ」が「可能な残基」から選択されるポリペプチドを提供する。したがって、表１は、本開示の第１の態様のいくつかの具体的および個別化された実施形態を開示する。例えば、第１の態様の１つの実施形態では、配列ｉ）中のＸ４がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、およびＶから選択されるポリペプチドを提供し、第１の態様の別の実施形態では、配列ｉ）中のＸ４がＡ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、およびＶから選択されるポリペプチドを提供する。誤解を避けるために、列挙した実施形態を、さらに別の実施形態において自由に組み合わせることができる。例えば、１つのかかる組み合わせた実施形態は、Ｘ４がＡ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、およびＶから選択され、一方で、Ｘ６が、Ｈ、Ｑ、Ｔ、およびＹから選択され、Ｘ１１がＨ、Ｒ、およびＹから選択されるポリペプチドである。
【００２０】
【表１】
2020515252.tif 000003
2020515252.tif 000004
2020515252.tif 000005
2020515252.tif 000006
2020515252.tif 000007
2020515252.tif 000008
2020515252.tif 000009
2020515252.tif 000010
2020515252.tif 000011
2020515252.tif 000012
【００２１】
本開示の１つの実施形態では、ｉ）において、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される、
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００２２】
本開示の１つの実施形態では、ｉ）において、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、Ｈ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される、
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００２３】
本開示の１つの実施形態では、ｉ）において、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ｅ、Ｉ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、ＱおよびＹから選択され；
Ｘ７は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される、
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００２４】
本開示の別の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、ｉ）において、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、ＥおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ６は、ＱおよびＹから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＭから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される、配列から選択されるアミノ酸配列
および上記定義の配列に対して少なくとも９３％同一性を有するアミノ酸配列からなるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００２５】
本開示の別の実施形態では、ｉ）において、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、ＥおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、ＱおよびＹから選択され；
Ｘ７は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、およびＹ（Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、およびＹなど）から選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１はＴであり；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００２６】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドのサブクラスを定義する１つのより特定の実施形態では、配列ｉ）は、以下の１０の条件Ｉ〜Ｘ：
Ｉ．Ｘ３はＥであること；
ＩＩ．Ｘ５は、ＩおよびＶから選択されること；
ＩＩＩ．Ｘ６は、ＱおよびＹから選択されること；
ＩＶ．Ｘ７は、ＦおよびＭから選択されること；
Ｖ．Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択されること；
ＶＩ．Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択されること；
ＶＩＩ．Ｘ２１はＴであること；
ＶＩＩＩ．Ｘ２５はＲであること；
ＩＸ．Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択されること；ならびに
Ｘ．Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択されること
のうちの少なくとも５つを満たす。
【００２７】
第１の態様のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドのいくつかの例では、配列ｉ）１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも６つを満たす。より具体的には、配列ｉ）は、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも７つ（１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも８つなど、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも９つなど、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの全てなど）を満たし得る。
【００２８】
第１の態様のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドのいくつかの実施形態では、Ｘ２Ｘ３Ｘ６がＶＥＱまたはＶＥＹであるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｘ２Ｘ３Ｘ６がＩＥＱまたはＶＥＱであるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｘ６Ｘ１０は、ＱＦ、ＱＹ、ＹＦ、およびＹＹからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ６Ｘ１０はＱＦである。いくつかの実施形態では、Ｘ１０Ｘ１８は、ＦＫ、ＦＲ、ＹＫ、およびＹＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ１０Ｘ１８はＦＫまたはＦＲである。いくつかの実施形態では、Ｘ１８Ｘ２５Ｘ２８はＫＲＬまたはＲＲＬである。いくつかの実施形態では、Ｘ５Ｘ７は、ＡＭ、ＩＭ、またはＶＭである。いくつかの実施形態では、Ｘ５Ｘ７はＩＭまたはＶＭである。
【００２９】
１つの実施形態では、Ｘ５は、ＩおよびＶから選択される。別記の実施例４で証明されているように、ＢＭの位置Ｘ５の意図しない変更により、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド（Ｚ１８５５７、配列番号１２０５）がＩＬ−１Ｒ−Ｉに対して高い親和性を示すことが見出された（表１１を参照のこと）。この位置でのアラニンのバリンまたはイソロイシンとの交換により、ＩＬ−１Ｒ−Ｉに対して高親和性を有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドが生成される。
【００３０】
以下の実験の項で詳述するように、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドバリアントの選択により、いくつかの個別のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフ（ＢＭ）配列が同定された。これらの配列は、この態様の配列ｉ）の個別の実施形態を構成する。個別のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフの配列は、図１に示した配列番号１〜１６３２および１６７９として列挙したアミノ酸配列のアミノ酸の位置８〜３６に対応する。したがって、この態様のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２０６〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。
【００３１】
１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２０５および１２５０〜１６３２からなる群から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。
【００３２】
１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２０６〜１２５２および１６７９からなる群から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。
【００３３】
別の実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２５３〜１６３２からなる群から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。別の実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２５３〜１４４１からなる群または配列番号１４４２〜１６３２からなる群から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。
【００３４】
１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１５８、２２７、２６８、２９４、３２５、１１７６、１２０５、１２５１、１２５２、１２７０、１２８４、１２８５、１２９８、１３０７、１３０８、１３１１、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３３４、１３３９、１３４０、１３４３、１３５３、１３６１、１３６２、１３６４、１３６７、１３６８、１３７５、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、１４３５、１４７１、１４７２、１５７１、１５９４、および１６６２からなる群（配列番号２６８、１２０５、１２５２、１２７０、１２８４、１２８５、１２９８、１３０７、１３０８、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３３４、１３３９、１３４０、１３４３、１３６１、１３６４、１３６７、１３６８、１３７５、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、および５７１からなる群など、配列番号１２５２、１２８５、１２９８、１３０８、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３４０、１３６１、１３９３、１４１５、１４２０、および１４２１からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に相当する。
【００３５】
１つの特定の実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７９から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２５２、１３２８、１４３５、および１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、および１６７９からなる群；配列番号１２５２、１４３５、１６７９からなる群；配列番号１２５２および１６７９からなる群；または配列番号１３２８および１４３５からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２５２、１３２８、および１４３５からなる群から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する。
【００３６】
したがって、図１は、そのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合能が（少なくとも親和性ベースのアッセイでの単離によって）実験的に立証されているポリペプチドバリアントを例証している。このバリアントにより、配列ｉ）と９３％同一性、または、適用できる場合、９６％同一性を示すＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフ（ＢＭ）の個別の実施形態を構成するいくつかの個別のＢＭ配列が同定される。
【００３７】
本開示のいくつかの実施形態では、上記定義のＢＭは、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン「の一部を形成する」。これは、元の３ヘリックスバンドルドメイン内の類似の構造モチーフがＢＭに置換されるように、ＢＭの配列が元の３ヘリックスバンドルドメインの配列内に「挿入される」か、配列上にグラフトされることを意味すると理解される。例えば、理論に拘束されることを望まないが、ＢＭは、３ヘリックスバンドルの３つのヘリックスのうちの２つを構成すると考えられ、したがって、任意の３ヘリックスバンドル内のかかる２ヘリックスモチーフを置換することができる。当業者が理解するように、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように、３ヘリックスバンドルドメインのうちの２つのヘリックスが２つのＢＭヘリックスに置換されなければならない。すなわち、本発明のこの実施形態のポリペプチドのＣα骨格の折りたたみ全体は、ＢＭが一部を形成する３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの折りたたみと実質的に同一である（例えば、二次構造の同一のエレメントを同一の順序などで有する）。したがって、この実施形態のポリペプチドが元のドメインと同一の折りたたみを有する場合に、本開示のＢＭは３ヘリックスバンドルドメインの「一部を形成し」、これは、基本構造の性質を共有することを意味し、この性質により、例えば、類似のＣＤスペクトルが得られる。当業者は、関連する他のパラメーターを認識している。
【００３８】
特定の実施形態では、したがって、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフ（ＢＭ）は、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは、本質的に、上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に、相互連結ループと共に２つのαヘリックスを構成し得る。特定の実施形態では、上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。かかるドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリカルドメイン（ドメインＢなど）およびその誘導体である。いくつかの実施形態では、３ヘリカルバンドルタンパク質ドメインは、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢから誘導されるプロテインＺのバリアントである。
【００３９】
本明細書中に開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドが３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成するいくつかの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含むことができ、そのアミノ酸配列は、
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＸａＸｂＬＬＸｃＥＡＫＫＬＸｄＸｅＸｆＱ；（配列番号１６８７）
（［ＢＭ］は、本明細書中で定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり；
Ｘａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択され；
Ｘｄは、Ｅ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘｅは、Ｄ、Ｅ、およびＳから選択され；
Ｘｆは、ＡおよびＳから選択される）；
および
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義した配列に対して少なくとも９１％同一性を有するアミノ酸配列
から選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドは、産生および保存中ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて高い構造安定性（化学修飾、物理的条件の変化、およびタンパク質分解活性に対する耐性など）を有利に示し得る。
【００４１】
上記で考察するように、上記アミノ酸配列と比較して変化が小さく、この変化がポリペプチドの三次構造および機能に大きな影響を及ぼさないポリペプチドも、本開示の範囲内に含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、配列ｉｖ）は、ｉｉｉ）によって定義された配列に対して少なくとも９３％（少なくとも９５％同一性など、少なくとも９７％同一性など）を有する。特定の実施形態では、上記で例示したかかる小さな変化は、隣接配列（すなわち、上記のｉｉｉ）中のＢＭに隣接する配列の一部）中のみに存在し得る。他の実施形態では、小さな変化は、ＢＭ中および／または隣接配列中に存在し得る。
【００４２】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸａはＡである。
【００４３】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸａはＳである。
【００４４】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｂはＮである。
【００４５】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｂはＥである。
【００４６】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｃはＡである。
【００４７】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｃはＳである。
【００４８】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｃはＣである。
【００４９】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｄはＥである。
【００５０】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｄはＮである。
【００５１】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｄはＳである。
【００５２】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｅはＤである。
【００５３】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｅはＥである。
【００５４】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｅはＳである。
【００５５】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｄＸｅは、ＥＥ、ＥＳ、ＳＥ、およびＳＳから選択される。
【００５６】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｄＸｅはＥＳである。
【００５７】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｄＸｅはＳＥである。
【００５８】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｆはＡである。
【００５９】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）中のＸｆはＳである。
【００６０】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＡであり、ＸｆはＡである。
【００６１】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＣであり、ＸｆはＡである。
【００６２】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＳであり、ＸｆはＳである。
【００６３】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＣであり、ＸｆはＳである。
【００６４】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＡであり；ＸｄＸｅはＮＤであり、ＸｆはＡである。
【００６５】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＣであり；ＸｄＸｅはＮＤであり、ＸｆはＡである。
【００６６】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＳであり；ＸｄＸｅはＮＤであり、ＸｆはＳである。
【００６７】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＣであり；ＸｄＸｅはＮＤであり、ＸｆはＳである。
【００６８】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＡであり；ＸｄＸｅはＳＥであり、ＸｆはＡである。
【００６９】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＣであり；ＸｄＸｅはＳＥであり、ＸｆはＡである。
【００７０】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＳであり；ＸｄＸｅはＳＥであり、ＸｆはＳである。
【００７１】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＣであり；ＸｄＸｅはＳＥであり、ＸｆはＳである。
【００７２】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＡであり；ＸｄＸｅはＥＳであり、ＸｆはＡである。
【００７３】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＣであり；ＸｄＸｅはＥＳであり、ＸｆはＡである。
【００７４】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＳであり；ＸｄＸｅはＥＳであり、ＸｆはＳである。
【００７５】
１つの実施形態では、ｉｉｉ）中で、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＣであり；ＸｄＸｅはＥＳであり、ＸｆはＳである。
【００７６】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）またはｉｖ）は、配列番号１〜１６３８および１６６７〜１６７０からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００７７】
なおさらなる実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１６３８、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３８および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２０６〜１６３８および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２０６〜１６３２および１６７０〜１６７９からなる群など、配列番号１２１０〜１６３８および１６７０〜１６７９からなる群など、配列番号１２１０〜１６３２および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００７８】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２０５、１２５０〜１６３２、および１６７０〜１６７９からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００７９】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２０６〜１２５２、１６７２、および１６７９からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００８０】
別の実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２５３〜１６３２、１６７０〜１６７１、および１６７３〜１６７８からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。別の実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２５３〜１４４１、１６７０〜１６７１、および１６７４〜１６７８からなる群または配列番号１４４２〜１６３２、および１６７３からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００８１】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１５８、２２７、２６８、２９４、３２５、１１７６、１２０５、１２５１、１２５２、１２７０、１２８４、１２８５、１２９８、１３０７、１３０８、１３１１、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３３４、１３３９、１３４０、１３４３、１３５３、１３６１、１３６２、１３６４、１３６７、１３６８、１３７５、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、１４３５、１４７１、１４７２、１５７１、１５９４、１６６２、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２６８、１２０５、１２５２、１２７０、１２８４、１２８５、１２９８、１３０７、１３０８、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３３４、１３３９、１３４０、１３４３、１３６１、１３６４、１３６７、１３６８、１３７５、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、１５７１、１６７０〜１６７２、１６７４、および１６７６〜１６７９からなる群など、配列番号１２５２、１２８５、１２９８、１３０８、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３４０、１３６１、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１６７０〜１６７２、１６７４、１６７６〜１６７７、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００８２】
１つの特定の実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７０〜１６７９から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１２５２、１３２８、１４３５、１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、および１６７９からなる群；配列番号１２５２、１４３５、および１６７９からなる群；または配列番号１３２８および１４３５からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１２５２、１３２８、および１４３５からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００８３】
１つの実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群（配列番号１６７２および１６７５〜１６７６からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。
【００８４】
また、さらなる実施形態では、
ｖ）ＹＡ−［ＢＭｏｄ］−ＡＰ；（配列番号１６８８）
（［ＢＭｏｄ］は本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モジュールである）；および
ｖｉ）ｖ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００８５】
あるいは、
ｖｉｉ）ＦＮ−［ＢＭｏｄ］−ＡＰ；（配列番号１６８９）
（［ＢＭｏｄ］は本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モジュールである）；および
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００８６】
１つの実施形態では、
ｉｘ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＡＮＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＡＱＡ  Ｐ；（配列番号１６９０）
（［ＢＭ］は上記定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり、Ｘｃは、ＡおよびＣから選択される）；および
ｘ）ｉｘ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００８７】
別の実施形態では、
ｘｉ）ＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＳＥＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＳＥＳＱＡ  Ｐ；（配列番号１６９１）
（［ＢＭ］は上記定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり、Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択される）；および
ｘｉｉ）ｘｉ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００８８】
別の実施形態では、
ｘｉｉｉ）ＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＳＥＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＮＤＳＱＡ  Ｐ；（配列番号１６９２）
（［ＢＭ］は上記定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり、Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択される）；
ｘｉｖ）ｘｉｉｉ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００８９】
さらに別の実施形態では、
ｘｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＳＥＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＸｄＸｅＳＱＡ  Ｐ；（配列番号１６９３）
（［ＢＭ］は上記定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり、Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択され、Ｘｄは、Ｅ、Ｎ、およびＳから選択され、ならびにＸｅは、Ｄ、Ｅ、およびＳから選択される）；および
ｘｖｉ）ｘｖ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００９０】
さらに別の実施形態では、
ｘｖｉｉ）ＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＳＥＬＬＸｃ  ＥＡＫＫＬ  ＸｄＸｅＳＱＡ  Ｐ；（配列番号１６９４）
（［ＢＭ］は上記定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり、Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択され、Ｘｄは、Ｅ、Ｎ、およびＳから選択され、ならびにＸｅは、Ｄ、Ｅ、およびＳから選択される）；および
ｘｖｉｉｉ）ｘｖｉｉ）で定義した配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸を含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【００９１】
上記で考察するように、上記アミノ酸配列と比較して変化が小さく、この変化がポリペプチドの三次構造および機能に大きな影響を及ぼさないポリペプチドも、本開示の範囲内に含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、配列ｖｉ）、ｖｉｉｉ）、ｘ）、ｘｉｉ）、ｘｉｖ）、ｘｖｉ）、またはｘｖｉｉｉ）は、例えば、それぞれ、ｖ）、ｖｉｉ）、ｉｘ）、ｘｉ）、ｘｉｉｉ）、ｘｖ）、およびｘｖｉｉ）によって定義された配列に対して少なくとも９０％（少なくとも９２％など、少なくとも９４％など、少なくとも９６％など、少なくとも９８％など）同一であり得る。特定の実施形態では、上記で例示したかかる小さな変化は、隣接配列（すなわち、ｖ）、ｖｉｉ）、ｉｘ）、ｘｉ）、ｘｉｉｉ）、ｘｖ）、およびｘｖｉｉｉ）中のＢＭに隣接する配列の一部）のみに存在し得る。他の実施形態では、小さな変化は、ＢＭ中および／または隣接配列中のみに存在し得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフは、以下から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成し得る：
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ    配列番号１６９５；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１６９６；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１６９７；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ    配列番号１６９８；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１６９９；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７００；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ    配列番号１７０１；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７０２；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７０３；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７０４；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ    配列番号１７０５；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７０６；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ    配列番号１７０７；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７０８；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ      配列番号１７０９；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ      配列番号１７１０；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ    配列番号１７１１；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ    配列番号１７１２；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ    配列番号１７１３；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ    配列番号１７１４；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰ    配列番号１７１５；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ    配列番号１７１６；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７１７；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰ    配列番号１７１８；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７１９；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７２０；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７２１；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７２２；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ    配列番号１７２３；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ    配列番号１７２４；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ    配列番号１７２５；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ    配列番号１７２６；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７２７；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７２８；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７２９；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ    配列番号１７３０；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ    配列番号１７３１、
および
ＡＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７３２
（［ＢＭ］は上記定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）。
【００９３】
１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、上記定義の配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９４】
１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
ｘｉｘ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号１７２１）
（式中、［ＢＭ］は、本明細書中で定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）；および
ｘｘ）ｘｉｘ）中に定義した配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列。
【００９５】
１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
ｘｘｉ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ（配列番号１７０９）
（式中、［ＢＭ］は、本明細書中で定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）；および
ｘｘｉｉ）ｘｘｉ）中に定義した配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列。
【００９６】
１つの特定の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、配列番号１６６７〜１６６８および１６７０〜１６７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９７】
１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
ｘｘｉｉｉ）ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ（配列番号１７１１）（式中、［ＢＭ］は、本明細書中で定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフでありる）；および
ｘｘｉｖ）ｘｘｉｉｉ）中に定義した配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列。
【００９８】
また、上記アミノ酸配列と比較して変化が小さく、この変化がポリペプチドの三次構造および機能に大きな影響を及ぼさないポリペプチドも、本開示の範囲内に含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、配列ｘｘ）、ｘｘｉｉ）、またはｘｘｉｖ）は、例えば、それぞれ、ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）によって定義された配列に対して少なくとも８９％（少なくとも９１％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９６％など、少なくとも９８％など）同一であり得る。さらに同様に、特定の実施形態では、上記で例示したかかる小さな変化は、ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）中に記載のＢＭに隣接する配列中のみに存在し得る。他の実施形態では、小さな変化は、ＢＭ中および／または隣接配列中に存在し得る。
【００９９】
かかるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド中の配列ｘｉｘ）〜ｘｘｉｖ）を、図１に示す配列番号１〜１６３８、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列から選択することができる。
【０１００】
この態様のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３８、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２０６〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０１】
１つの実施形態では、配列ｘｖｉｉ）、ｘｉｘ）、またはｘｘｉ）は、配列番号１２０５、１２５０〜１６３２、および１６７０〜１６７９からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０２】
１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２０６〜１２５２、１６７２、および１６７９からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０３】
別の実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２５３〜１６３２、１６７０〜１６７１、および１６７３〜１６７８からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。別の実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２５３〜１４４１、１６７０〜１６７１、および１６７４〜１６７８からなる群または１４４２〜１６３２および１６７３からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０４】
１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１５８、２２７、２６８、２９４、３２５、１１７６、１２０５、１２５１、１２５２、１２７０、１２８４、１２８５、１２９８、１３０７、１３０８、１３１１、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３３４、１３３９、１３４０、１３４３、１３５３、１３６１、１３６２、１３６４、１３６７、１３６８、１３７５、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、１４３５、１４７１、１４７２、１５７１、１５９４、１６６２、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２６８、１２０５、１２５２、１２７０、１２８４、１２８５、１２９８、１３０７、１３０８、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３３４、１３３９、１３４０、１３４３、１３６１、１３６４、１３６７、１３６８、１３７５、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、１５７１、１６７０〜１６７２、１６７４、および１６７６〜１６７９からなる群など、配列番号１２５２、１２８５、１２９８、１３０８、１３２４、１３２８、１３３０、１３３１、１３４０、１３６１、１３９３、１４１５、１４２０、１４２１、１６７０〜１６７２、１６７４、１６７６〜１６７７、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０５】
１つの特定の実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７０〜１６７９からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２５２、１３２８、１４３５  １６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、および１６７９からなる群；配列番号１２５２、１４３５、および１６７９からなる群；または配列番号１３２８および１４３５からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１２５２、１３２８、および１４３５からなる群から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０６】
１つの実施形態では、配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）は、配列番号１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群（配列番号１６７２、１６７５、および１６７６からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する。
【０１０７】
１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、４５℃を超える融解温度を有する。
【０１０８】
本明細書中に定義のポリペプチドのＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかにおけるＩＬ−１Ｒ−Ｉを介したシグナル伝達を妨害し得る。したがって、１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ依存性シグナル伝達を遮断することができる本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【０１０９】
半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、ある物質の特定の定量化可能な生物学的機能または生化学的機能の阻害有効性の尺度である。この定量的尺度は、ある特定の物質がある特定の生物学的機能を５０％阻害するのに必要な量を示し、当該分野で一般的に使用されている。１つの特定の実施形態では、遮断の半数阻害濃度（ＩＣ５０）が最大で１×１０−７Ｍ（最大で５×１０−８Ｍなど、最大で２×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−８Ｍなど、最大で５×１０−９Ｍなど、最大で２×１０−９Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で５×１０−１０Ｍなど、最大で４×１０−１０Ｍなど、最大で３×１０−１０Ｍなど）であるようなＩＬ−１Ｒ−Ｉシグナル伝達を遮断することができる本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、遮断の半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、１×１０−１５Ｍと１×１０−７Ｍとの間（１×１０−１５Ｍと１×１０−８Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−９Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１０Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１１Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１２Ｍとの間など）である。
【０１１０】
本明細書中で使用される用語「ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合」および「ＩＬ−１Ｒ−Ｉに対する結合親和性」は、例えば、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーの使用によって試験することができるポリペプチドの性質を指す。例えば、以下の実施例に記載のように、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合親和性を、抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにポリペプチド試料を補足し、ビオチン化ＩＬ−１Ｒ−Ｉを添加後、ストレプトアビジン抱合ＨＲＰを添加する実験で試験することができる。ＴＭＢ基質を添加し、４５０ｎｍの吸光度を、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）など）を使用して測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得た結果を解釈することにより、ＩＬ−１Ｒ−Ｉに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な尺度を確立することができる。例えば相互作用についてのＥＣ５０値（半数効果濃度）を決定するための定量的尺度が望まれる場合、ＥＬＩＳＡも使用することができる。ビオチン化ＩＬ−１Ｒ−Ｉの希釈系列に対するポリペプチドの応答を、上記のＥＬＩＳＡを使用して測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈することができ、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５および非線形回帰を使用して結果からＥＣ５０値を計算することができる。
【０１１１】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉまたはそのフラグメントを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置のセンサーチップ上に固定し、試験すべきポリペプチドを含む試料をチップ上に通過させる実験においてＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合親和性を試験することもできる。あるいは、試験すべきポリペプチドを装置のセンサーチップ上に固定し、ＩＬ−１Ｒ−Ｉまたはそのフラグメントを含む試料をチップ上に通過させる。次いで、当業者は、かかる実験によって得た結果を解釈することにより、ＩＬ−１Ｒ−Ｉに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な尺度を確立することができる。例えば相互作用についてＫＤ値を決定するための定量的尺度が望まれる場合、表面プラズモン共鳴法を使用することもできる。結合値を、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置またはＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）装置で定義することができる。ＩＬ−１Ｒ−Ｉを装置のセンサーチップ上に適切に固定し、その親和性を決定すべきポリペプチドの試料を系列希釈によって調製し、無作為な順序で注入する。次いで、ＫＤ値を、例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアまたは装置の製造者によって提供された他の適切なソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデルを使用して、結果から計算することができる。
【０１１２】
したがって、１つの実施形態では、相互作用のＥＣ５０値が最大で１×１０−７Ｍ（最大で５×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−８Ｍなど、最大で５×１０−９Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で５×１０−１０Ｍなど、最大で４×１０−１０Ｍなど、最大で３×１０−１０Ｍなど、最大で２×１０−１０Ｍなど）であるようにＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合することができる本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、相互作用のＥＣ５０値は、１×１０−１５Ｍと１×１０−７Ｍとの間（１×１０−１５Ｍと１×１０−８Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−９Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと５×１０−１０Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１０Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと５×１０−１１Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１１Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと５×１０−１２Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１２Ｍなど）である。
【０１１３】
１つの特定の実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用のＫＤ値が最大で１×１０−６Ｍ（最大で１×１０−７Ｍなど、最大で５×１０−８Ｍなど、最大で４×１０−８Ｍなど、最大で３×１０−８Ｍなど、最大で２×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−８Ｍなど、最大で７×１０−９Ｍなど、最大で５×１０−９Ｍなど、最大で４×１０−９Ｍなど、最大で３×１０−９Ｍなど、最大で２×１０−９Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で９×１０−１０Ｍなど、最大で７×１０−１０Ｍなど、最大で５×１０−１０Ｍなど）であるようにＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合することができるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用のＫＤ値は、１×１０−１５Ｍと１×１０−６Ｍとの間、１×１０−１５Ｍと１×１０−７Ｍとの間、１×１０−１５Ｍと１×１０−８Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−９Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１０Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１１Ｍとの間など、１×１０−１５Ｍと１×１０−１２Ｍとの間などである。
【０１１４】
１つの実施形態では、本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、上記ＩＬ−１Ｒ−ＩがヒトＩＬ−１Ｒ−ＩまたはカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉなど）である、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【０１１５】
本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１サイトカインとの相互作用（ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βとの相互作用など）を遮断することが可能であり得る。したがって、１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１サイトカインとの相互作用（ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βとの相互作用など）を遮断することができる。
【０１１６】
当業者は、本開示の範囲を逸脱することなく特定の適用に本明細書中に開示の任意の態様のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを合わせるために、そのポリペプチドに種々の改変および／または付加を行うことができることを理解するであろう。
【０１１７】
例えば、１つの実施形態では、本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、そのポリペプチドが、Ｃ末端および／またはＮ末端でさらなるアミノ酸によって伸長されており、かつ／またはさらなるアミノ酸を含んでいる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは、ポリペプチド鎖中の最初および／または最後の位置に１つまたは複数のアミノ酸残基を有するポリペプチドと理解すべきである。したがって、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、任意の適切な数のさらなるアミノ酸残基（例えば、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基）を含み得る。各々のさらなるアミノ酸残基を、例えば、産生、精製、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定化、ポリペプチドのカップリングまたは検出を改善するために個別または集合的に付加することができる。かかるさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングのために付加された１つまたは複数のアミノ酸残基を含み得る。これの一例は、システイン残基の付加である。さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」も提供することができる（タグに特異的な抗体との相互作用のためのＨｉｓ６タグ、（ＨｉｓＧｌｕ）３タグ（「ＨＥＨＥＨＥ」タグ）、「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグ、または「ＦＬＡＧ」タグ、または固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）のためのＨｉｓ６−タグなど）。
【０１１８】
上記で考察したさらなるアミノ酸を、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドに、化学的抱合（公知の有機化学法を使用）または任意の他の手段（融合タンパク質としてのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの発現など）によってカップリングするか、任意の他の様式にて、直接またはリンカー（例えば、アミノ酸リンカー）を介して連結することができる。
【０１１９】
上記で考察したさらなるアミノ酸は、例えば、１つまたは複数のポリペプチドドメイン（複数）を含み得る。さらなるポリペプチドドメインは、別の機能（例えば、さらなる別の結合機能、酵素機能、有毒な機能、蛍光シグナル伝達機能、またはこれらの組み合わせなど）を有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供することができる。
【０１２０】
さらなるポリペプチドドメインは、同一のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合機能を有する別のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合部分をさらに提供することができる。したがって、さらなる実施形態では、多量体の形態のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。上記多量体は、モノマー単位として少なくとも２つの本明細書中に開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを含み、ここで、そのアミノ酸配列は同一でも異なっていても良いと理解される。多量体の形態のこのポリペプチドは、各々がＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフを有し、各々が多量体内でモノマーを形成する適切な数のドメインを含み得る。これらのドメインは、同一のアミノ酸配列を有し得るが、あるいは、異なるアミノ酸配列を有し得る。換言すれば、本発明のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、ホモ多量体またはヘテロ多量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。１つの実施形態では、上記単量体単位が相互に共有結合しているＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、上記単量体単位が相互に非共有結合しているＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドモノマー単位は、融合タンパク質として発現される。１つの実施形態では、二量体形態のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。産生後にジスルフィド結合した二量体を形成するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの一例は、配列番号１６５８に記載の配列を有するポリペプチドである。ＩｇＧ１  Ｆｃのヒンジ領域（配列番号１６６２の１〜１６位として図１に開示）を、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの二量体形態を得るために使用することができる。
【０１２１】
さらに、本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドまたはその多量体が第１のドメイン（すなわち、第１の部分）を構成し、第２およびさらなる部分がＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合以外の機能を有する「異種」融合ポリペプチドもしくはタンパク質、または抱合体も意図され、本開示の範囲内に含まれる。かかるタンパク質における融合ポリペプチドまたは抱合体の第２のおよびさらなる部分も所望の生物学的活性を適切に有する。
【０１２２】
したがって、本開示の第２の態様では、第１の態様のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドからなる第１の部分、および所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部分を含む融合タンパク質または抱合体を提供する。別の実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体は、第２の部分の生物学的活性と同一または異なり得る所望の生物学的活性を含むさらなる部分をさらに含み得る。
【０１２３】
したがって、１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドは、配列ｉ）またはｉｉ）に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭ；配列ｉｉｉ）またはｉｖ）に記載の結合モジュールＢＭｏｄ、または、配列ｖ）〜ｘｘｉｖ）のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。特に、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフは、８〜３６位のアミノ酸配列に対応し得；上記結合モジュールは、７位〜５５位のアミノ酸配列に対応し得；上記配列ｘｉｘ）、ｘｘｉ）、またはｘｘｉｉｉ）を、図１に示す配列番号および上に列挙する配列番号から選択される配列からなる群から選択することができる。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの好ましい実施形態は、第１の態様に開示されている。
【０１２４】
所望の生物学的活性の非限定的な例は、治療活性、結合活性、およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を含む。
【０１２５】
１つの実施形態では、上記所望の生物学的活性は、上記第２の部分が融合タンパク質または抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させるようなｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性である。
【０１２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性は、この文脈において、融合タンパク質または抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させる活性と理解すべきである。第１の部分（および可能性がある場合のさらなる部分）の半減期は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を有する第２の部分への融合または抱合によって増大される。対応する融合タンパク質または抱合体が上記の第１のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合部分、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を有する第２の部分、および任意選択的に１つまたは複数のさらなる部分（さらなるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合部分など）を含み得ると認識されるであろう。例えば、上記融合タンパク質または抱合体は、２つのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドおよび第２の部分を含むことができ、これは、２つのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドのみを含む融合物または抱合体と比較してｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増加している。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドおよび半減期延長部分を含む融合タンパク質の例を産生し、実験的に試験している（実施例１０）。１つの実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体は、配列番号１６３９〜１６５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１２７】
得られた融合タンパク質または抱合体の半減期を、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が本質的に長い第２の部分によって延長することができる。融合タンパク質または抱合体の水力学的サイズを増大させるポリペプチドは、例えば、融合タンパク質または抱合体の半減期を増大させることができる。あるいは、第２の部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が長い天然タンパク質（血清アルブミンまたは抗体のＦｃ部分など）からなり得る。
【０１２８】
１つの実施形態では、上記第２の部分は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体；アルブミン；抗体のＦｃ部分、およびトランスフェリンのうちの１つを含む。１つの実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体は、配列番号１６３９〜１６５８からなる群から選択される配列を含む。
【０１２９】
１つの実施形態では、上記第２の部分は、抗体のＦｃ部分（ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１６６２）またはＩｇＧ４  Ｆｃなど）である。半減期延長部分として使用することができるＩｇＧ４  Ｆｃは、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８６１、アミノ酸残基９９〜３２７に記載のＦｃ部である。１つの実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体は、配列番号１６４６〜１６５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１３０】
１つの実施形態では、上記抗体のＦｃ部分は、Ｆｃの未変異形態と比較してＦｃＲｎに対する親和性が改善されており、かつ／またはエフェクター応答が減少している変異Ｆｃである。したがって、上記Ｆｃ部分は、１つまたは複数の変異が導入されている天然に存在するＦｃのバリアントである。例えば、上記融合タンパク質または抱合体は、配列番号１７３４〜１７３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１３１】
上記第２の部分がｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を有する別の非限定的な例では、上記第２の部分はトランスフェリンである。本明細書中に開示の融合タンパク質または抱合体の特定の実施形態では、配列番号１６５７からなる群から選択されるポリペプチドを提供する。
【０１３２】
１つの特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性はアルブミン結合活性である。かかるアルブミン結合活性を提供する部分の非限定的な例は、アルブミン結合ラクダＩｇ  ＶＨＨドメインおよびアルブミン結合操作単一Ｉｇ  ＶＨドメインである。
【０１３３】
１つの実施形態では、上記アルブミン結合活性は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ由来のペプトストレプトコッカスアルブミン結合（ＰＡＢ）タンパク質のアルブミン結合ドメインまたはその誘導体によって得られる。
【０１３４】
１つの実施形態では、上記アルブミン結合活性は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体によって得られる。かかるアルブミン結合ドメインの例は、配列番号１６５９〜１６６１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましくは、アルブミン結合ドメインは、配列番号１６６１に記載されている。１つの実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体は、配列番号１６３９〜１６４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１３５】
別の非限定的な例では、上記ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）によって得られる。
【０１３６】
例えば、少なくとも１つのさらなる部分を含む上記融合タンパク質または抱合体は、［ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド］−［半減期増大部分］−［選択された標的に対する親和性を有する部分］を含み得る。この例における３つの部分をポリペプチドのＮ末端からＣ末端への任意の順序で配置することができると理解すべきである。
【０１３７】
別の非限定的な例は、非融合ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドと比較して融合タンパク質の組織分布を改変することが可能な結合活性である。１つの実施形態では、結合活性は、トランスフェリン受容体への結合である。かかる結合活性は、抱合体または融合タンパク質を、血液脳関門を通過して脳組織内に移行させると推測され得る（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３（８４）：８４ｒａ４４）。好ましい実施形態では、かかる結合活性は、抗体フラグメントによって得られる。
【０１３８】
結合活性の別の非限定的な例は、生物学的活性を遮断するように作用する活性である。
【０１３９】
１つの実施形態では、結合活性が生物学的活性を遮断するように作用するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、または抱合体を提供する。
【０１４０】
本開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを組み込んだ融合タンパク質または抱合体の上記説明に関して、第１の部分、第２の部分、およびさらなる部分の表示は、一方の本発明のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドまたはポリペプチドと、他方の他の機能を示す部分とを明確に区別するためであることに留意すべきである。これらの表示は、融合タンパク質または抱合体のポリペプチド鎖中の異なるドメインの実際の順序を指すことを意図しない。同様に、第１および第２の単位の表示は、上記単位を明確に区別するためのものである。したがって、例えば、上記第１の部分（またはモノマー単位）は、制限されないが、融合タンパク質または抱合体のＮ末端、中央、またはＣ末端に出現し得る。
【０１４１】
当業者は、融合タンパク質の構築では、しばしば、融合すべき機能的部分の間にリンカーを使用し、異なる性質を有する異なる種類のリンカー（可動性アミノ酸リンカー、固定アミノ酸リンカー、および切断可能なアミノ酸リンカーなど）が存在することを認識している。リンカーは、例えば、融合タンパク質の安定性を増大させるか折りたたみを改善するため、融合タンパク質の発現を増加させるため、生物学的活性を改善するため、ターゲティングを可能にするため、および薬物動態学を変化させるために使用されている。したがって、１つの実施形態では、本明細書中に開示の任意の態様のポリペプチドは、少なくとも１つのリンカー（可動性アミノ酸リンカー、固定アミノ酸リンカー、および切断可能なアミノ酸リンカーから選択される少なくとも１つのリンカーなど）をさらに含む。
【０１４２】
１つの実施形態では、上記リンカーは、本明細書中に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドからなる第１の部分と所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部分との間に配置される。別の実施形態では、上記リンカーは、上記第１の部分内に配置される。例えば、１つまたは複数のリンカーを、本明細書中に定義のポリペプチドの単量体単位の間に配置することができる。さらに別の実施形態では、リンカーを、上記第１の部分内および上記第１の部分と上記第２の部分との間に配置することができる。
【０１４３】
可動性リンカーは、連結されたドメインに一定の程度の運動または相互作用が必要である場合に当該分野でしばしば使用され、いくつかの実施形態で特に有用であり得る。かかるリンカーは、一般に、小さな非極性の（例えば、Ｇ）または極性の（例えば、ＳまたはＴ）アミノ酸から構成される。いくつかの可動性リンカーは、主に、一続きのＧ残基およびＳ残基からなる（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｐ）。機能的部分の間を適切に分離するためか、必要な部分間相互作用を維持するために、コピー数「ｐ」を調整してリンカーを最適化することが可能である。ＧおよびＳリンカーとは別に、他の可動性リンカーが当該分野で公知である（可動性を維持するためのさらなるアミノ酸残基（ＴおよびＡなど）ならびに可溶性を改善するための極性アミノ酸残基を含むＧおよびＳリンカーなど）。１つの実施形態では、上記リンカーは、グリシン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む可動性リンカーである。当業者は、他の適切なリンカーを認識している。
【０１４４】
１つの実施形態では、上記リンカーは、ＧＳ、ＶＤＳＳ、ＶＤＧＳ、ＶＥＧＳ、ＡＳＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６８３）、ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６８４）、および（（ＫＥＡＡＡ）３ＫＥＬＡＡ）２（配列番号１６８５）から選択される。１つの特定の実施形態では、上記リンカーは、ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６８４）または（（ＫＥＡＡＡ）３ＫＥＬＡＡ）２（配列番号１６８５）である。１つの実施形態では、リンカーを含む上記融合タンパク質または抱合体は、配列番号１６３９〜１６５８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特に、リンカーＡＳ（ＧＧＧＧＳ）２を含む例示的な融合タンパク質または抱合体は、配列番号１６４６〜１６５８（配列番号１６４８および１６５７など）のアミノ酸配列に記載されている。
【０１４５】
本開示のさらなる態様では、本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１４６】
上記のポリペプチドまたは融合タンパク質を産生する方法であって、上記ポリペプチドのその発現ベクターからの発現を許容する条件下で上記宿主細胞を培養する工程、およびポリペプチドを単離する工程を含む方法も本開示に含まれる。
【０１４７】
あるいは、本開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を使用した非生物学的ペプチド合成によって産生することができ、その非生物学的ペプチド合成は、
−アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を段階的にカップリングして、保護された反応性側鎖を有する第１の態様のポリペプチドを形成する工程、
−ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去する工程、および
−水溶液中でポリペプチドを折りたたむ工程
を含む。
【０１４８】
本開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドが独立して治療剤、診断剤、または予後剤として有用であり得るか、他の治療剤または診断剤を標的にする（例えば、ＩＬ−１Ｒ−Ｉに直接的または間接的に影響を及ぼす）ための手段として有用であり得ると理解すべきである。例えば、ＩＬ−１Ｒ−Ｉシグナル伝達の阻害によって直接的な治療効果を得ることができる。
【０１４９】
したがって、別の態様では、本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、または抱合体、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体を含む組成物を提供する。１つの実施形態では、上記組成物は、少なくとも１つのさらなる活性薬剤（少なくとも２つのさらなる活性薬剤など、少なくとも３つのさらなる活性薬剤など）をさらに含む。かかる組み合わせで有用であることを証明することができるさらなる活性薬剤の非限定的な例は、本明細書中に記載の免疫応答改変剤および抗癌剤である。１つの実施形態では、上記組成物は、上記所望の生物学的活性が、上記第２の部分が融合タンパク質または抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるようなｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性である融合タンパク質または抱合体を含む。かかる半減期増大活性を提供する部分の例は、本明細書中の他所に開示されている。
【０１５０】
それ故、本開示の別の態様では、医薬、予後剤、または診断剤として用いるための本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を提供する。１つの実施形態では、医薬として用いるための上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを提供する。
【０１５１】
１つの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１Ｒ−Ｉ機能を調整するための医薬として使用するための、本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または組成物を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「調整する」は、活性の変化（ＩＬ−１Ｒ−Ｉ機能をハイポモルフにすること、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ機能の部分的阻害または完全な阻害など）を指す。
【０１５２】
１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害の治療、予後、または診断における使用のための本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または組成物を提供する。
【０１５３】
本明細書中で使用する場合、用語「ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害」は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉがシグナル伝達経路において制御的役割を果たす任意の障害、疾患、または容態を指す。したがって、１つの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害（炎症性疾患、自己炎症性症候群、自己免疫疾患、感染症、心血管疾患、虚血性疾患、癌、および糖尿病からなる群から選択される障害など）の治療で用いる本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または組成物を提供する。１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害は、炎症性疾患、自己炎症性症候群、および自己免疫疾患からなる群から選択される。
【０１５４】
１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害は、家族性地中海熱（ＦＭＦ）；クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）；ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；高ＩｇＤ症候群（ＨＩＤＳ）；周期熱；アフタ性口内炎；咽頭炎；腺炎（ＰＦＡＰＡ）；関節リウマチ（ＲＡ）、若年性ＲＡ、若年性特発性関節炎、全身性若年性特発性関節炎，；成人発症スティル病；シュニッツラー症候群；マックル・ウェルズ症候群；マクロファージ活性化症候群；ベーチェット病；ブドウ膜炎；尋常性ざ瘡；壊疽性膿皮症；痛風；２型糖尿病、初発糖尿病；眼乾燥症候群；汗腺膿瘍；好中球性皮膚症、特に、組織球貪食性脂肪組織炎、ウェーバー・クリスチャン病、および好中球性脂肪組織炎；心血管疾患、心筋梗塞、卒中；肝不全、腎不全；急性肺損傷；偽痛風、カルシウムピロリン酸沈着症、軟骨石灰化症、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、ＩＬ−３６受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＴＲＡ）、ＡＤＡＭ２欠損症（ＤＡＤＡ２）、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症・アクネ（ＰＡＰＡ）症候群、壊疽性膿皮症・アクネ・化膿性汗腺炎（ＰＡＳＨ）症候群、ＰＡＰＡ・化膿性汗腺炎（ＰＡＰＡＳＨ）症候群、リンパ水腫を伴う自己炎症性症候群（ＡＩＳＬＥ）、ホスホリパーゼＣ−γ−２変異自己炎症性症候群、ＮＡＬＰ１２関連周期性症候群（ＮＡＰＳ１２）、メバロン酸キナーゼ欠損症（ＭＫＤ）、乾癬性関節炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、ヘモクロマトーシス関連関節炎、関節周囲石灰沈着症、骨関節炎、炎症性骨関節炎、変形性手関節症、膿疱性乾癬（全般性膿疱性乾癬（ＧＰＰ）、手挙足底膿疱症（ＰＰＰ）、アロボー稽留性肢端皮膚炎（ＡＣＨ）など）；ブラウ症候群；スイート症候群；種々の脈管炎（巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）、リウマチ性多発筋痛（ＰＭＲ）、高安動脈炎、川崎病、蕁麻疹様血管炎、およびヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）など）；好中球性蕁麻疹および特発性寒冷蕁麻疹；扁平苔癬；多発性筋炎、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、および封入体筋炎筋炎；種々の病期の骨髄腫（くすぶり型骨髄腫（ＳＭＭ）、無症候性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および多発性骨髄腫など）；腫瘍性悪液質；固形腫瘍成長；新生児期障害（気管支肺異形成（予防法）、壊死性小腸結腸炎（ＮＥＣ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、周産期脳虚血に起因する脳性麻痺、および乳児呼吸急迫症候群（ＩＲＤＳ）など）；ホイップル病；外傷性脳損傷；難治性癲癇；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；皮膚ループス；イェスナー・カノフ病；筋萎縮性側索硬化症；全身性硬化症（強皮症）；敗血症性ショック；急性膵炎；慢性再発性多病巣性骨髄炎、非細菌性骨炎（ＮＢＯ）、滑膜炎・ざ瘡・膿疱症・骨増殖症・骨炎（ＳＡＰＨＯ）症候群、およびマジード症候群；再発性多発性軟骨炎；特発性再発性心包炎（ＩＲＰ）；心筋炎；エルドハイム・チェスター病；若年性黄色肉芽腫；膵島細胞移植；血液透析誘導性全身性炎症；移植片対宿主病；ＡＮＣＡ関連糸球体腎炎および再発性糸球体腎炎；コーガン症候群；自己免疫性内耳疾患；慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）；キャッスルマン病；心不全；拡張期心不全；抗シンターゼ症候群；急性ＡＣＬ損傷；急性出血���白質脳炎；ＡＡアミロイド症；ディジョージ症候群；全般性疲労；慢性疲労症候群（ＣＦＳ）；湾岸戦争病（ＧＷＩ）；および発作睡眠からなる群から選択される。
【０１５５】
別の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害は、癌（結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、黒色腫、および前立腺癌からなる群から選択される癌など）である。
【０１５６】
当業者は、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または本明細書中に記載の抗ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体を含む組成物を標準的な投与技術（経口、局所、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口内、舌下、十二指腸、または坐剤での投与が含まれる）を使用して被験体に投与することができることを認識するであろう。したがって、１つの実施形態では、経口、局所、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口内、舌下、十二指腸、または坐剤での投与のための本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または組成物を提供する。１つの実施形態では、上記投与は、経口、静脈内、皮下、または十二指腸への投与であり、１つの特定の実施形態では、上記投与は経口投与である。
【０１５７】
本明細書中で使用する場合、用語「被験体」は、ヒト被験体などの哺乳動物被験体を指す。
【０１５８】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ媒介疾患において局所投与経路が特に関連し得る適応症の非限定的な例には、眼疾患（眼乾燥症、ブドウ膜炎、強膜炎、および潰瘍性角膜炎など）；皮膚科学的疾患（魚鱗癬および全般性膿疱性乾癬など）；肺疾患（成人呼吸急迫症候群、気管支肺異形成、慢性閉塞性肺疾患、石綿症、および珪肺症など）が含まれる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、上記使用のためのポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を一定期間以内に（例えば、疾患発症から２４時間以内に）繰り返し投与することが有利であり得る。１つの特定の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、必要とする被験体に疾患発症から２４時間以内に繰り返して（疾患発症から２４時間以内に少なくとも２回など、疾患発症から２４時間以内に少なくとも３回など）投与する。さらに特定の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、発症から制限された時間に（２４時間など）継続して投与する。脳への分布が必要である場合（卒中の急性処置など）、反復投与または継続投与が好ましいかもしれない。
【０１６０】
上記融合タンパク質または抱合体がｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を有する第２の部分を含むいくつかの実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体またはかかる融合タンパク質または抱合体を含む組成物を、それらを必要とする被験体に週に１回投与する。
【０１６１】
関連する態様では、有効量の本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を必要とする被験体に投与する工程を含む、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害の治療方法を提供する。上記方法のより特定の実施形態では、本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ機能をｉｎ  ｖｉｖｏで調整する。
【０１６２】
１つの実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害は、前の態様に関連した上記定義の群から選択される。
【０１６３】
上記治療方法のいくつかの実施形態では、上記のポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、一定の期間以内に（例えば、疾患発症から２４時間以内に）反復投与することが有利であり得る。１つの特定の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、必要とする被験体に疾患発症から２４時間以内に繰り返して（疾患発症から２４時間以内に少なくとも２回など、疾患発症から２４時間以内に少なくとも３回など）投与する。さらに特定の実施形態では、上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、発症から制限された時間に（２４時間以内など）継続して投与する。中枢神経系への分布が必要である場合（卒中の急性処置など）、反復投与または継続投与が好ましいかもしれない。
【０１６４】
上記治療方法の他の実施形態では、上記融合タンパク質または抱合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を有する第２の部分を含むか、上記組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性を有する第２の部分を含む融合タンパク質または抱合体を含む。かかる方法では、上記融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に週１回投与することができる。
【０１６５】
治療有効量の本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または組成物、および少なくとも１つの第２の薬物（上記の免疫応答調整剤または抗癌剤など）を投与することが有利であり得る。
【０１６６】
本明細書中で使用する場合、用語「共投与」は、併用投与および連続投与の両方を含む。したがって、１つの実施形態では、上記の免疫応答調整剤の共投与をさらに含む上記定義の方法を提供する。別の実施形態では、上記の抗癌剤の共投与をさらに含む上記定義の方法を提供する。
【０１６７】
本開示の別の態様では、ＩＬ−１Ｒ−Ｉを含むと疑われる試料を準備する工程、上記試料を本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物と接触する工程、およびＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物の結合を検出して、試料中のＩＬ−１Ｒ−Ｉの存在を示す工程を含む、ＩＬ−１Ｒ−Ｉを検出する方法を提供する。１つの実施形態では、上記方法は、試料との接触後に非結合のポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を除去するための中間体洗浄工程をさらに含む。
【０１６８】
種々の例示的な態様および実施形態を参照して本発明を記載しているが、本発明の範囲を逸脱することなく様々に変更を加えることができ、その要素を等価物に替えることができると当業者に理解されるであろう。さらに、その本質的な範囲を逸脱することなく、本発明の教示に特定の状況または分子を適応させるために、多くの修正を加えることができる。したがって、本発明は意図されるいかなる特定の実施形態にも制限されるべきではないが、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲に含まれる全ての実施形態を含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】本開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド（配列番号１〜１６３８および１６６７〜１６７９）、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号１６５９〜１６６１）；ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１６６２）、ヒトアルブミン（配列番号１６６３）、およびヒトトランスフェリン（配列番号１６６４）の例、任意選択的にリンカーを含む、上記ポリペプチド（配列番号１６３９〜１６５８および１７３４〜１７３７）を含むＩＬ−１Ｒ−１結合融合ポリペプチド、対照ポリペプチド（ＧＳ−ｈＩＬ−１β、配列番号１７３３）の例のアミノ酸配列、ならびに本発明を説明するために選択、スクリーニング、および／または特徴づけのために使用されたカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６（配列番号１６６５）およびカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ（配列番号１６６６）のアミノ酸配列の一覧表である。本明細書中に開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの推定ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜１６３８および１６６７〜１６６８および１６７０〜１６７９を有する配列中の残基８から残基３６にわたる。配列番号１６６９では、上記ＢＭは、残基５から残基３３にわたる。これらの各Ｚバリアント内で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予想される４９アミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５にわたるが、アミノ酸配列が残基４から残基５２にわたる配列番号１６６９を用いたＮ末端短縮Ｚバリアントを例外とする。
【図２】６つの抗ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質（ＰＳＩ０５３６、配列番号１６４８；ＰＳＩ０５３７、配列番号１６４９；ＰＳＩ０５３４、配列番号１６４６；ＰＳＩ０５３５、配列番号１６４７；ＰＳＩ０５３８、配列番号１６５０；ＰＳＩ０５３９、配列番号１６５１）についてのＮＨＤＦ細胞におけるＩＬ−１β誘導ＩＬ−６放出阻害の濃度−反応曲線を示す線図である。参照としてアナキンラ（点線）を含めた。
【図３】５〜１０人の個別のドナー由来のヒト全血におけるＩＬ−１β誘導ＩＬ−６放出の５０％阻害（ＩＣ５０）でのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの濃度を示す線図である。ＰＳＩ０５３６（配列番号１６４８）、ＰＳＩ５３７（配列番号１６４９）、およびアナキンラについてのＩＣ５０の中央値は、それぞれ、０．３１、１．２５、および０．３０ｎＭであった。
【０１７０】
実施例
概要
以下の実施例は、ファージディスプレイテクノロジーに基づくインターロイキン１受容体Ｉ（ＩＬ−１Ｒ−Ｉ）を標的にする新規のＺバリアント分子の開発を開示する。本明細書中に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを配列決定し、そのアミノ酸配列を、配列識別名として配列番号１〜１６３２を付して図１に列挙する。本明細書中に開示のさらなるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを、配列識別名として配列番号１６３３〜１６３８および１６６７〜１６７９を付して図１に列挙する。実施例は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドの特徴づけおよび上記ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性をさらに記載する。本明細書中で使用する場合、用語「ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアント」は、本明細書中に開示のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフを含む５８アミノ酸長のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドを指す。
【０１７１】
実施例１
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの選択およびスクリーニング
この実施例では、ヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉ（それぞれ、ｈＩＬ−１Ｒ−ＩおよびｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ）を、Ｚバリアントのファージライブラリーを用いたファージディスプレイ選択における標的タンパク質として使用した。選択したクローンのＤＮＡを配列決定し、Ｚバリアントを、ペリプラズム画分としてＥ．ｃｏｌｉ内で産生し、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）においてＩＬ−１Ｒ−Ｉに対してアッセイした。
【０１７２】
材料と方法
標的タンパク質のビオチン化：ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ（ｈＩＬ−１ＲＩ−Ｆｃ  Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔカタログ番号ＩＬ１ＲＩ−７７１Ｈ）およびヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ｈＩＬ−１ＲＩ、ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２６９−１Ｒ／ＣＦ）を、製造者の推奨にしたがって、１０倍モル過剰量のＮｏ−Ｗｅｉｇｈ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１３２７）を使用して、室温（ＲＴ）で３０分間ビオチン化した。ビオチン化前に、製造者の説明書にしたがって、透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ  ３．５  Ｋ，３５００  ＭＷＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６６３３３）を使用してｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃのためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸塩、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に緩衝液を交換し、ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。ビオチン化後、上記のように両タンパク質についてＰＢＳに緩衝液を交換した。
【０１７３】
ｈｉｓタグ化標的タンパク質の発現：カニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６（ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６、配列番号１６６５）を、本質的に製造者のプロトコールにしたがって、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発現させた。発現ベクターのトランスフェクション５日後に遠心分離によって上清を採取し、−７０℃で保存した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ培養由来の凍結上清を解凍し、濾過した（０．２２μｍ）。ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６を含む上清を、ＩＭＡＣカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィを使用して精製した。精製されたタンパク質を、ＰＢＳに緩衝液交換した。タンパク質の純度を、クーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）を使用して分子量を分析した。
【０１７４】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：野生型アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ００１と略す、配列番号１６６０）への融合においてバクテリオファージ上にディスプレイされたプロテインＺのランダムバリアントのライブラリーを使用してＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントを選択した。Ｚｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩと示したライブラリーのサイズは、１．５×１０１０ライブラリーメンバー（Ｚバリアント）である。ファージライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２における構築およびファージストックの生成は、以前にＷＯ２０１６／１１３２４６号に記載されていた。
【０１７５】
ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ、ビオチン化ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ（ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ）、ビオチン化ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ）、およびｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６（配列番号１６６５）に対する選択を、４つの選択サイクルで行った。第１のサイクルでは、４つの選択トラックを並行して実施した（１−１〜１−４）。選択トラック１−１および１−４を、サイクル２の２つのパートに分割し，それにより、表２に示すように、それぞれ、ラウンド２、３、および４中に合計６つのパラレルトラックを得た；２−１〜２−９、３−１〜３−９、および４−１〜４−９。選択のために使用したファージ粒子数は、前のサイクルにおける溶出ファージ粒子数の２０００倍であったが、選択トラック４−１〜４−５ではより少ない量で使用した。ファージストックの調製、選択手順、および選択サイクル間のファージの増幅は、以下の１〜８を例外として、本質的にＷＯ２００９／０７７１７５号に記載のように行った。例外１：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１０８−１６５）、１．５μＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、カタログ番号２３０−００５）、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、カタログ番号２３３３６２５００）を補足したＰＢＳを、選択緩衝液として使用した。例外２：表２に示すように、それぞれ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ＳＡビーズ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１２０６Ｄ）、ビオチン化ヒトＩｇＧ１−ＦｃでプレコーティングしたＳＡビーズ（ｂ−ｈＦｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号００９−０６０−００８）（Ｆｃ／ＳＡビーズ）、本質的にＷＯ２００９／０７７１７５号に記載のように調製したｂ−ｈＦｃおよび（Ｚ０００００）２−Ｃｙｓ−ビオチンでプレコーティングしたＳＡビース（Ｆｃ／Ｚ０００００／ＳＡビーズ）、ｂ−ｈＦｃでプレコーティングしたプロテインＡビーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｎｏｖｅｘ、カタログ番号１０００２Ｄ）（Ｆｃ／プロテインＡビーズ）、またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ（ＩＭビーズ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｎｏｖｅｘ、カタログ番号１０１０４Ｄ）とのファージストックのインキュベーションによって、ＲＴで６０分超または４℃で一晩サイクル１〜４において事前選択を行った。ｂ−ｈＦｃを、ビーズ（それぞれ、５、８．５、または１０μｇのｂ−ｈＦｃ／ｍｇ  Ｚ０００００／ＳＡビーズ、プロテインＡビーズ、またはＳＡビーズ）とＲＴで１時間超インキュベートし、次いで、ビーズを事前選択での使用前に２×ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補足したＰＢＳ）で洗浄した。例外３：選択で使用した全てのチューブおよびビーズを、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３０５９）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補足したＰＢＳで事前にブロックした。例外４：ＲＴの溶液中で選択し、選択時間は、第１のサイクルにおいては１４０分間であり、その後のサイクルでは１２０���間であった。例外５：以下の量の標的タンパク質およびビーズを使用して、標的−ファージ複合体をビーズ上に捕捉した：それぞれ、３．２μｇ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ／ｍｇ  Ｚ０００００／ＳＡビーズ、４μｇ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ／ｍｇプロテインＡビーズ、２μｇ  ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃまたは２μｇ  ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ／ｍｇ  ＳＡビーズ、および４．５μｇ  ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６／ｍｇ  ＩＭビーズ。各選択トラックのために使用したビーズのタイプは、表２で事前選択のために示したタイプと同一である。例外６：１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補足した培地で成長させたＥ．ｃｏｌｉＥＲ２７３８株細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、ファージ感染のために使用した。例外７：細菌と比較して５倍過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージにより、対数期細菌を感染させた。例外８：ラウンド２および３後のファージ粒子の増幅を、本質的にＷＯ２０１６／１１３２４６号に記載のように行った；しかし、実施例５では、一晩の培養において１００μＭ  ＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、および２％グルコースを補足したトリプシンダイズブロス＋酵母抽出物（ＴＳＢ−ＹＥ）培地を使用した。
【０１７６】
標的濃度の低下および洗浄数の増加によって得た選択サイクルにおけるストリンジェンシーの増加を記載している選択ストラテジーの概要を、表２に示す。
【０１７７】
【表２】
2020515252.tif 000013
【０１７８】
ＰＢＳＴ０．１％を使用して１分間洗浄し、ＷＯ２００９／０７７１７５号に記載のｐＨ２で溶出したビーズ結合ファージ／標的複合体についてのプロトコールのように溶出させた。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡのためのＺバリアントの産生：１ｍｌの培地から溶解したペレットの最終体積が１０００μｌ  ＰＢＳＴ  ０．０５％（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補足したＰＢＳ）であったことを除いて、本質的にＷＯ２０１６／１１３２４６号に記載のようにＺバリアントを産生した。
【０１８０】
ペリプラズム抽出物の最終上清は、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧ（Ｇｒoｎｗａｌｌら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２８：１６２−１８３）として示されるＡＢＤとの融合物（Ｚ−ＡＢＤ；ＡＢＤ００１、配列番号１６６０）としてＺバリアントを含んでいた。Ｚ＃＃＃＃＃は、個別の５８アミノ酸残基Ｚバリアントを指す。
【０１８１】
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：ＺバリアントのヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合を、標的としての１ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃおよび検出のための１：１０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４０−０５）を使用して、本質的にＷＯ２０１６／１１３２４６号に記載のようにＥＬＩＳＡで分析した。ブランクコントロールとして、ＰＢＳＴ０．０５％をＺ−ＡＢＤペリプラズム試料の代わりに添加し、ネガティブコントロールとして、ＡＢＤ００１（配列番号１６６０）を有するペリプラズム抽出物をＺ−ＡＢＤペリプラズム試料の代わりに添加した。コントロールプレートを、標的タンパク質の代わりの１００ｎＭ  ｂ−ｈＦｃおよび検出のための１：３０，０００に希釈したストレプトアビジン抱合ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｎ１００）を使用した類似の設定でアッセイした。
【０１８２】
配列決定：ＥＬＩＳＡスクリーニングと並行して、配列決定のためのクローンを選定した。単一クローンから増幅させたＰＣＲフラグメントを配列決定し、本質的にＷＯ２００９／０７７１７５号に記載のように分析した。
【０１８３】
ＺバリアントのＥＣ５０分析：ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの選択物を、上記のＥＬＩＳＡを使用したｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃの希釈系列に対する反応の分析に供した。標的タンパク質ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを、１００ｎＭから０．０１ｎＭまで１：１０で段階的に希釈した。バックグラウンドコントロールとして、標的タンパク質を添加せずにＺバリアントをアッセイした。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５および非線形回帰を使用して分析し、ＥＣ５０値（半数効果濃度）を計算した。
【０１８４】
結果
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：ヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉに対する４サイクルのファージディスプレイ選択後に、個別のクローンを得た。
【０１８５】
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：４サイクルの選択後に得たクローンが９６ウェルプレート中に個別に産生され、１ｎＭ標的タンパク質を使用したＥＬＩＳＡにおいてｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ結合活性についてスクリーニングした。並行して、Ｆｃ結合を除外するためのＥＬＩＳＡを行った。ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉに対して陽性のクローンを同定し、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ陽性クローンは、Ｆｃ単独に対しては陽性でなかった。ＡＢＤネガティブコントロールについての反応は得られなかった。４５の同定したＺバリアントが０，７１ＡＵ超（８．５×コントロールバックグラウンド）というＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示した。
【０１８６】
配列決定：ＥＬＩＳＡスクリーニングと並行して、４サイクルの選択後に得たクローンを配列決定した。各バリアントに固有の識別番号＃＃＃＃＃を与え、個別のバリアントをＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。同定された５８アミノ酸残基長のＺバリアントのサブセットのアミノ酸配列を、図１中および配列表中に配列番号１〜１９として列挙する。推定ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフは、各配列中の残基８から残基３６にわたる。これらの各Ｚバリアント内で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予想される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、残基７から残基５５にわたる。
【０１８７】
ＺバリアントのＥＣ５０分析：上記Ｚバリアントのサブセット（配列番号１〜１９）を、ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡ標的滴定に供した。得られた結果をＥＣ５０値の計算のために使用した（表３）。
【０１８８】
【表３】
2020515252.tif 000014
【０１８９】
実施例２
一次ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの産生および特徴づけ
この実施例は、一次ファージ選択に由来するＨｉｓタグ化Ｚバリアントのサブクローニングおよび産生、その標的結合の特徴づけ、標的の遮断、および融点についての一般的手順を記載する。
【０１９０】
材料と方法
Ｈｉｓ６タグを有するＺバリアントのサブクローニング：それぞれのＺバリアントのＤＮＡを、ファージライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅させた。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有する単量体Ｚバリアント分子の構築についてのサブクローニングストラテジーを、標準的な分子生物学技術を使用して適用した。Ｚ遺伝子フラグメントを、発現ベクターにサブクローン化し、それにより、コード配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを得た。
【０１９１】
培養：Ｅ．ｃｏｌｉＴ７Ｅ２細胞（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を、それぞれのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの遺伝子フラグメントを含むプラスミドで形質転換した。得られた組換え株を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足した培地中にて、ＥｎＰｒｅｓｓｏプロトコール（ＢｉｏＳｉｌｔａ）を使用して５０ｍｌのスケールで３０℃にて、または９３０ｍｌ  ＴＳＢ−ＹＥ培地中で３７℃にて培養した。タンパク質発現を誘導するために、ＩＰＴＧを、ＯＤ６００約１０（ＥｎＰｒｅｓｓｏ）または２（ＴＳＢ＋ＹＥ）での最終濃度０．２ｍＭまで添加した。誘導後、培養物を１６時間（ＥｎＰｒｅｓｓｏ）または５時間（ＴＳＢ＋ＹＥ）インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。
【０１９２】
Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの精製：およそ１〜２ｇの各細胞ペレットを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を補足した結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞破壊後、細胞片を遠心分離によって除去し、各上清を、１ｍｌ  Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ  ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）での洗浄によって夾雑物を除去し、引き続いてＺバリアントを溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。ＩＭＡＣ精製後、緩衝液を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）と交換した。全Ｚバリアントを、第２の精製工程に供した。各Ｚバリアントを、ＲＰＣ溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ、１０％ＡＣＮ、９０％水）で事前に平衡化した１ｍｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＲＰＣ溶媒Ａでのカラム洗浄後、結合したタンパク質を、２０ｍｌの直線勾配０−５０％ＲＰＣ溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ、８０％ＡＣＮ、２０％水）で溶出した。次いで、緩衝液を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）と交換した。
【０１９３】
ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計（Ｓａｖｅｅｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  ＡＢ）および各タンパク質の減衰係数を用いた２８０ｎｍでの吸光度の測定によってタンパク質濃度を決定した。およそ１ｍｇ／ｍｌ未満の濃度の試料を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３Ｋ（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。純度を、クーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、各精製Ｚバリアントの同一性を、ＬＣ／ＭＳ分析を使用して確認した。
【０１９４】
Ｂｉａｃｏｒｅ親和性分析：Ｈｉｓ６タグ化Ｚバリアントに対するヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉの親和性（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて決定した。ｈＩＬ−１Ｒ−ＩまたはｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｈｉｓ６を、ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００１２）の異なるフローセル内のカルボキシル化デキストラン層上に固定した。製造者のプロトコールにしたがってアミンカップリング化学を使用して固定した。酢酸塩（ｐＨ４．５）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５０）をリガンド希釈のために使用し、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００１８８）をランニング緩衝液として使用した。チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、分析物注入中のブランクとして使用するために不活性化した。動態実験では、ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液として使用し、流速は５０μｌ／分であり、温度は２５℃であった。分析物（すなわち、Ｚバリアント）を、それぞれＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で最終濃度４０ｎＭおよび１０ｎＭに希釈し、標的チップ表面上に２分間にわたって注入し、その後にランニング緩衝液中で８分間解離させた。速度定数を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において１：１結合モデルを用いて得られたセンサーグラムから計算した。
【０１９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１β中和アッセイ：ＴＦ−１細胞株は、多数の異なるサイトカイン（ＩＬ−１βが含まれる）に応答して増殖する。この細胞株を使用して、一次ＩＬ−１Ｒ１結合剤がＩＬ−１β作用を阻害する能力を評価した。ＴＦ−１細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、および２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足したＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を含むＲＰＭＩ１６４０中に維持した。使用前に、細胞を、ｒｈＧＭ−ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した。次いで、細胞をカウントし、３×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底プレートに分注した。別のプレートで、阻害結合剤の系列希釈物（Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアント（濃度範囲４００〜０．１ｎＭ）またはＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合タンパク質Ｋｉｎｅｒｅｔ（アナキンラ、Ｓｏｂｉ）（濃度範囲０．３〜０．０００３ｎＭ））を、０．６ｎＭ  ＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下でインキュベートした。ＺバリアントポリペプチドとＩＬ−１βとの事前に混合した複合体を、ＴＦ−１細胞を含むウェルに移した。細胞を、加湿５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で７２時間刺激した。最後の４時間のインキュベーション中に、ウェルあたり１９μｌの２倍希釈したＣＣＫ−８（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、増殖応答を決定した。マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞成長に関するデータを、４パラメーター用量−反応曲線に対する非線形回帰によって評価し、半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍプログラムを使用して決定した。
【０１９６】
円二色性（ＣＤ）分光分析：精製されたＨｉｓ６タグ化Ｚバリアントを、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。各々の希釈Ｚバリアントについて、２５０〜１９５ｎｍでのＣＤスペクトルを、２０℃で得た。さらに、可変温度測定（ＶＴＭ）を実施して融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭでは、２２１ｎｍでの吸光度を測定し、温度を温度勾配５℃／分で２０℃から９０℃に上昇させた。Ｚバリアントの再折りたたみ能力を研究するために、加熱手順後に２０℃での新規のＣＤスペクトルを得た。Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ）において光路長１ｍｍのセルを使用してＣＤを測定した。
【０１９７】
結果
Ｈｉｓ６タグ化Ｚバリアントの産生：Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で可溶性遺伝子産物として発現された。およそ１〜２ｇの細菌ペレットからのタンパク質の精製量を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって分光高度的に決定し、ＲＰＣ精製前の異なるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについてはおよそ３〜２５ｍｇの範囲であった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、これらが主にＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントを含むことを示していた。各Ｚバリアントの正確な同一性および分子量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認された。
【０１９８】
Ｂｉａｃｏｒｅ親和性分析：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置における固定化ＩＬ−１Ｒ−Ｉを含む表面上への２つの濃度の各Ｚバリアントの注入によって解析した。ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉについての親和性（ＫＤ）の計算値を表４に示す。ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉに対する最強の結合剤（Ｚ１２９６７、配列番号９）は、ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉに１．２×１０−９Ｍの親和性で結合し、カニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉに３．５×１０−８Ｍの親和性で結合した。
【０１９９】
【表４】
2020515252.tif 000015
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１β中和アッセイ：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのＩＬ−１β阻害能を、ＴＦ−１細胞アッセイで分析した。得られたＩＣ５０値を表５に示す。
【０２０１】
【表５】
2020515252.tif 000016
【０２０２】
ＣＤ分析：Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについて決定されたＣＤスペクトルは、各々が２０℃でα−ヘリックス構造を有することを示していた。この結果は、融解温度を決定した可変温度測定においても立証された（表６）。９０℃への加熱前後に測定したスペクトルを重ね合わせたときに全てのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについて可逆的折りたたみが認められた。
【０２０３】
【表６】
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【０２０４】
実施例３
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの第１の成熟ライブラリーの設計および構築
この実施例では、成熟ライブラリーを構築した。ライブラリーを、さらなるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの選択のために使用した。成熟ライブラリーからの選択は、通常、親和性が増大した結合剤が得られることが予想される（Ｏｒｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６（８）：４３３９−４８）。
【０２０５】
材料と方法
ライブラリーの設計：ライブラリーは、主に、実施例１および２に記載の一次選択に由来するヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントに基づいた。一次選択由来のＺバリアントのサブセットの配列を、図１および配列表に配列番号１〜１９として列挙している。名称がＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉの新規のライブラリーでは、Ｚ分子足場中の１０の可変位置が一定のアミノ酸残基に偏っており、３つの位置が一定に保持されていた。ＴＲＩＭテクノロジーによって生成された、無作為化した一連のトリヌクレオチド基本単位の組み込みが可能な２つのオリゴヌクレオチドを、Ｅｌｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取り寄せた。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、Ｚ分子のヘリックス１およびヌクレオチドを示し、１８の重複ヌクレオチドのアニーリング領域を含んでいた。アセンブリされた二本鎖ＤＮＡ配列は以下であった：５’−ＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３’（配列番号１６８０；設計されたコドンをＮＮＮと表示する）。この配列は、制限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩに隣接したＺバリアントアミノ酸配列の部分的に無作為化されたヘリックス１および２をコードする。新規のライブラリーの各アミノ酸残基（Ｚ分子足場中の１０の可変アミノ酸位置（９、１０、１１、１３、１４、１７、１８、２５、３２、および３５）および３つの一定のアミノ酸位置（２４、２７、および２８）が含まれる）の設計を、表７に示す。得られた理論上のライブラリーサイズは、９．７×１０８バリアントであった。選択したアミノ酸の一部の分布率が高い９、１３、１７、１８、３２、および３５位を除いて、異なるアミノ酸の理論上の均等分布を各アミノ酸の位置に適用した。
【０２０６】
【表７】
2020515252.tif 000018
【０２０７】
ライブラリーの構築：本質的にＷＯ２０１５／１８９４３０号における成熟ライブラリーについて記載のように、２つのオリゴヌクレオチドを、アセンブリし、増幅させ、ベクターｐＡＹ０２５９２にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に形質転換した。ライブラリー設計と比較した構築ライブラリーの内容を検証し、その結果を評価するために、Ｚｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉライブラリー由来のクローンを、（ＷＯ２００９／０７７１７５号に記載のように）配列決定した。
【０２０８】
ファージストックの調製：ファージミドライブラリーを含むファージストックを、浸透フラスコにて２つのバッチで調製した。ファージミドライブラリーを含むグリセロールストック由来の細胞を、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したそれぞれ２ｌおよび３ｌのＴＳＢ−ＹＥ培地に播種した。培養物を、ＯＤ６００が対数期の０．５〜０．９に到達するまで３７℃で成長させた。４〜１０倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを使用して培養物に感染させ、３７℃で３０分間培養した。バッチ１培養物を遠心分離によってペレット化し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、および０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを補足したＴＳＢ−ＹＥ培地に溶解し、３０℃で一晩成長させた。バッチ２培養物に、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、その後に３７℃で１時間インキュベートした。２５μｇ／ｍｌカナマイシンの添加後、培養物を３０℃で一晩成長させた。Ｇｒoｎｗａｌｌら、前出に記載のように、両バッチについて、一晩成長させた細胞を４，０００ｇの遠心分離でペレット化し、その後に培地中に残存しているファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ中で２回沈殿させ、濾過し、ＰＢＳおよびグリセロールに溶解した。ファージストックを、選択で使用するまで−８０℃で保存した。
【０２０９】
結果
ライブラリーの構築：新規のライブラリーＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉを、検証された結合特性を有する一連のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントに基づいて設計した（実施例１および２）。設計したライブラリーの理論上のサイズは、９．７×１０８Ｚバリアントであった。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８細胞に対する形質転換後の滴定によって決定された実際のライブラリーサイズは、５．６×１０９形質転換体であった。ライブラリーの質を、１９２の形質転換体の配列決定およびその実際の配列と理論上の設計との比較によって試験した。設計したライブラリーと比較した実際のライブラリーの内容は、満足なものであることが示された。したがって、ＩＬ−１Ｒ−Ｉに対する潜在的な結合剤の第１の成熟ライブラリーが首尾よく構築された。
【０２１０】
実施例４
第１の成熟ライブラリー由来のＺバリアントの選択およびスクリーニング
この実施例では、ヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉを、Ｚバリアントの成熟ファージライブラリーを使用したファージディスプレイ選択における標的タンパク質として使用した。選択されたクローンのＤＮＡを配列決定し、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム画分でＺバリアントを産生し、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅにおいてＩＬ−１Ｒ−Ｉに対してアッセイした。
【０２１１】
材料と方法
標的タンパク質の発現：本質的に製造者のプロトコールにしたがって、Ｆｃ融合カニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ、配列番号１６６６）を、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発現させた。発現ベクターのトランスフェクションの７日後に遠心分離によって上清を回収し、−７０℃で保存した。Ｅｘｐｉ２９３培養物由来の凍結上清を解凍し、濾過した（０．２２μｍ）。ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを含む上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム使用したアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した。精製したタンパク質の緩衝液を、ＰＢＳに交換した。タンパク質の純度を、クーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、分子量を、質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）を使用して分析した。
【０２１２】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：ビオチン化ヒト標的タンパク質ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃおよびｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ、ならびにカニクイザル標的タンパク質ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ（配列番号１６６６）およびｂ−ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ（実施例１中のｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃとしてビオチン化したｃＩＬ−１ＲＩ−Ｆｃ）を、実施例３に記載のＺバリアント分子の新規のライブラリーを使用したファージ選択で使用した。並行選択トラックおよび標的濃度を低下させ、洗浄数を増加させることによって得た選択サイクルにおける全体的なストリンジェンシーの増加を記載している選択ストラテジーの概要を、表８に示す。以下の１〜６を例外として、本質的に実施例１に記載のように４〜５サイクルで選択した。例外１：ファージストックの、それぞれＦｃ／ＳＡビーズ（選択トラック１−１、１−２、１−４、１−６、１−８、２−１４、および２−１６）、ＳＡビーズ（選択トラック１−３、１−７、１−９、２−１５、および２−１７）、またはＦｃ／プロテインＡビーズ（選択トラック１−５）のインキュベーションによってＲＴで６０分間を超えて事前選択を行った。例外２：表８中の各トラックに示すように、選択時間は３０〜１００分間であった。例外３：標的−ファージ複合体を、以下の量の標的タンパク質およびビーズを使用してビーズ上に補足した：それぞれ、８μｇ  ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ、１μｇ  ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ、または４μｇ  ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ／ｍｇ  ＳＡビーズ、および５μｇ  ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃ／ｍｇプロテインＡビーズ。選択ラウンド５では、２ｍｇ  ＳＰＨＥＲＯ  ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈカタログ番号ＮＶＭ−２０−５）を、標的−ファージ複合体捕捉のために使用した。例外４：トラック２−１４、２−１５、２−１７、３−１４、３−１５、および３−１７の第２の最終洗浄工程では、それぞれ、各トラックの標的濃度の１００倍のｈＩＬ−１Ｒ−Ｉを、洗浄緩衝液に添加し、１５〜２０分間洗浄した。例外５：ビーズ洗浄手順後に選択トラック４−１〜４−１３のファージ／標的／ビーズ複合体を２つに分割した。半分の試料を溶出に供し、４−１ｘ〜４−１３ｘと表示した残りの半分を溶出前のさらなる６６時間の洗浄工程に供した。例外６：表８に示すように、トラック４の２つの洗浄ラウンド４−４ｘおよび４−６ｘを第５の選択ラウンドに供し、それにより、トラック５−１および５−２が得られた。１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補足した培地中で成長させたＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２００２６８）をファージ感染のために使用し、細菌と比較して１０倍過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを、対数期細菌に感染させた。ラウンド１〜３後のファージ粒子を、本質的に実施例１のラウンド２および３についての記載のように増幅させた。
【０２１３】
【表８】
2020515252.tif 000019
2020515252.tif 000020
【０２１４】
第１の選択サイクルでは、９つの選択トラックを実施した；１−１〜１−９。サイクル２では、いくつかのトラックを２、３、または６トラックに分割し、２トラックを１つのトラックにプールし、それにより、サイクル２、３、および４に合計で１７の並行トラックが得られた；それぞれ、２−１〜２−１７、３−１〜３−１７、および４−１〜４−１７。サイクル５では、２トラックを実施した；５−１および５−２。それぞれ、選択トラック１−１〜１−５ではＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉのバッチ１を使用し、１−６〜１−９ではバッチ２を使用した。全選択トラックを、表８に示す。選択のために使用したファージ粒子数は、典型的には、前のサイクルにおける溶出ファージ粒子数の２０００倍であった。
【０２１５】
配列決定：異なる選択トラックのサイクル４または５由来の個別のクローンを、配列決定のために選定した。遺伝子断片の増幅および配列分析を、本質的に実施例１に記載のように行った。
【０２１６】
ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅスクリーニングのためのＺバリアントの産生：培養体積が１．２ｍｌであり、ペリプラズム抽出物を、凍結融解手順後に１．２μｍ  ９６ウェル濾板（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＭＳＡＮＬＹ５０）を使用した濾過によって清澄化したことを除いて、本質的に実施例１に記載のようにＺバリアントを産生した。ＢｉａｃｏｒｅでスクリーニングしたＺバリアントを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で５倍希釈した。
【０２１７】
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｚバリアントのヒトへの結合を、標的タンパク質として０．３ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを使用して、本質的に実施例１に記載のようにＥＬＩＳＡで分析した。ブランクコントロールとして、ＰＢＳＴ  ０．０５％をＺ−ＡＢＤペリプラズム抽出物の代わりに添加した。
【０２１８】
ＺバリアントのＥＣ５０分析：ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの選択物を、上記のＥＬＩＳＡを使用したｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃの希釈系列に対する応答の分析に供した。標的タンパク質ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを、１００ｎＭから０．０１ｎＭまで１：１０にて段階的に希釈した。バックグラウンドコントロールとして、標的タンパク質を添加せずにＺバリアントをアッセイした。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５および非線形回帰を使用して分析し、ＥＣ５０値（半数効果濃度）を計算した。Ｚ１２９６７（配列番号９）を有するペリプラズム抽出物を、シグナル比較のために並行して分析した。
【０２１９】
ＺバリアントのＢｉａｃｏｒｅスクリーニング：ＺバリアントのヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を使用した動態スクリーニングで分析した。ポリクローナルヤギ抗ＡＢＤ抗体（ヤギ抗ＡＢＤ）を、基本的には実施例２における他のタンパク質について記載のように、ＣＭ５チップ表面上に固定した。動態スクリーニングのために、分析物を２つの工程で注入した。第１に、Ｚ−ＡＢＤ（ＡＢＤ００１、配列番号１６６０）ペリプラズム抽出物を、表面上に５μｌ／分で１分間注入した。第２の工程として、１００ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉを３０μｌ／分で２分間注入し、その後にランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ中で２分間解離させた。グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）（カタログ番号ＢＲ１００３５５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、サイクル間の抗体表面の再生のために使用した。アッセイの温度は２５℃であった。動態解析を実施するために、ヤギ抗ＡＢＤを含むがＺ−ＡＢＤ試料を含まない基準表面上に注入した１００ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ由来のシグナルを、ｈＩＬ−１Ｒ−ＩへのＺ−ＡＢＤ結合のセンサーグラムから差し引いた。ラフスクリーニング親和性（ＫＤ）を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：１結合モデルを使用して、基準から１００ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ応答を差し引いて計算した。Ｚ１２９６７のペリプラズム抽出物を、比較のためにスクリーニング分析に含めた。４つのＺバリアントのペリプラズム抽出物も、上記と同一の設定を使用するが、５つの濃度のｈＩＬ−１Ｒ−Ｉを注射し、且つ単一サイクル動態のために１：１モデルを使用してデータを評価する、単一サイクル動態（ＳＣＫ）アッセイに供した。
【０２２０】
結果
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：各クローンを、４または５サイクルのヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉに対するファージディスプレイ選択後に得た。
【０２２１】
配列決定：４または５サイクルの選択後に得たクローンを配列決定した。各バリアントに固有の識別番号＃＃＃＃＃を与え、個別のバリアントをＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。５８アミノ酸残基長のＺバリアントのアミノ酸配列を、図１中および配列表中に配列番号２０〜１２０９として列挙する。推定ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフは、各配列中の残基８から残基３６にわたる。これらの各Ｚバリアント内で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予想される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、残基７から残基５５にわたる。１つの配列決定したＺバリアント（Ｚ１８５５７、配列番号１２０５）において、バリン残基が１２位に存在することが認められた。
【０２２２】
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：４または５サイクルの選択後に得たクローンを９６ウェルプレート中に個別に産生し、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合活性についてスクリーニングした。アッセイしたＺバリアントの９８％が、ブランクコントロールの２倍または０．３ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃに対してより高い陽性シグナルを生じた。
【０２２３】
ＺバリアントのＥＣ５０分析：０．９９ＡＵ（１６．５×ブランクコントロール）を超ええる結果を示す１１５のＺバリアントのサブセットを、ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡ標的滴定に供した。得られた結果をＥＣ５０値の計算のために使用した（表９）。Ｚ１２９６７（配列番号９）の結果は、２．４×１０−１０Ｍであった。
【０２２４】
【表９】
2020515252.tif 000021
2020515252.tif 000022
【０２２５】
平均して、このライブラリー（第１の成熟ライブラリー）に由来するＺバリアントは、一次選択に由来するＺバリアントの平均ＥＣ５０と比較してＥＣ５０値が１０倍改善された。
【０２２６】
ＺバリアントのＢｉａｃｏｒｅスクリーニング：ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの選択物を、Ｂｉａｃｏｒｅ動態スクリーニングに供した。単一濃度のｈＩＬ−１Ｒ−Ｉを、抗ＡＢＤ抗体を含むセンサーチップ表面上のペリプラズム抽出物から捕捉した各Ｚ−ＡＢＤ上に注射した。スクリーニング親和性の計算値を、表１０に示す。Ｚ１６０６２（配列番号２６６）では、アッセイした結合剤の最良のＫＤ値（７．６×１０−９Ｍ）を得た。Ｚ１２９６７のＫＤは２．５×１０−８Ｍであった。ＳＣＫ実験でアッセイした４つの結合剤は、その各スクリーニング動態親和性から０〜１４％逸脱したＫＤ値を得た。
【０２２７】
【表１０】
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2020515252.tif 000024
【０２２８】
実施例５
第１の成熟ライブラリー由来のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの産生および特徴づけ
この実施例は、Ｈｉｓ６タグ化ＺバリアントおよびＡＢＤ融合Ｚバリアント（第１の成熟ライブラリーファージ選択に由来する）のサブクローニングおよび産生の一般的な手順、そのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合の特徴づけ、遮断、および融点を記載する。
【０２２９】
材料と方法
Ｈｉｓ６タグを有するＺバリアントのサブクローニング：それぞれのＺバリアントのＤＮＡをファージライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅させ、本質的に実施例２に記載のように標準的な分子生物学技術を使用してＮ末端Ｈｉｓ６タグを用いてサブクローニングした。
【０２３０】
ＡＢＤとの融合物中のＺバリアントのサブクローニング：標準的な分子生物学技術を使用して、それぞれのＺバリアントのＮ末端配列の１および２位をそれぞれアミノ酸残基ＡおよびＥに変異させた。得られた新規のＺバリアントを、ＡＢＤバリアントを含む発現ベクターにサブクローン化し、それにより、コード配列［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＡＳＧＳ−ＡＢＤ（ＡＢＤバリアントはＰＰ０１３（配列番号１６６１）であった）を得た。Ｚ＃＃＃＃＃は、個別の５８アミノ酸残基長のＺバリアントを指す。
【０２３１】
培養：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ７Ｅ２細胞（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を、それぞれのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの遺伝子フラグメントを含むプラスミドで形質転換した。得られた組換え株を、ＥｎＰｒｅｓｓｏプロトコール（ＢｉｏＳｉｌｔａ）を使用して、５０ｍｌのスケールで５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足した培地中にて３０℃で培養した。タンパク質発現を誘導するために、ＩＰＴＧを、ＯＤ６００約１０での最終濃度０．２ｍＭまで添加した。誘導後、培養物を１６時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。
【０２３２】
Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの精製：本質的に実施例２に記載されているが、大多数の試料についてＩＭＡＣ精製工程とＲＰＣ精製工程との間の緩衝液の交換を行わずに精製した。ＲＰＣ精製中、ＲＰＣ溶媒Ａを０．１％ＴＦＡの１００％水溶液に変更し、直線勾配は１８ｍｌで０−６０％ＲＰＣ溶媒Ｂであった。
【０２３３】
ＡＢＤと融合したＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの精製：およそ２ｇの各細胞ペレットを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を補足したＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に再懸濁した。細胞破壊および遠心分離による清澄化後、各上清を、抗ＡＢＤリガンド（自家製）で固定した１ｍｌアガロースを使用した重力流カラムに適用した。ＴＳＴ緩衝液および５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．５）緩衝液での洗浄後、ＡＢＤ融合Ｚバリアントを、０．１Ｍ  ＨＡｃで溶出した。溶出物を含む緩衝液を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）と交換した。
【０２３４】
ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計（Ｓａｖｅｅｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  ＡＢ）およびそれぞれのタンパク質の減衰係数を使用した２８０ｎｍでの吸光度の測定によってタンパク質濃度を決定した。純度を、クーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、各精製Ｚバリアントの同一性を、ＬＣ／ＭＳ分析を使用して確認した。
【０２３５】
Ｂｉａｃｏｒｅ動態解析：Ｈｉｓ６タグ化Ｚバリアントに対するヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉの速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して決定した。１００、１０、および１ｎＭのＺバリアントを使用して、本質的に実施例２に記載のように実験を行った。分析物の注入時間は３分間であり、その後に１５分間解離し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを補足した２×５ｓグリシン（ｐＨ３．０）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５７）を、サイクル間の表面の再生のために使用した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において１：１結合モデルを使用して、得られた２つまたは３つの濃度のそれぞれのＺバリアントのセンサーグラムから速度定数を計算した。Ｈｉｓ６タグ化Ｚ１２９６７を、比較のためにアッセイに含めた。
【０２３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１β中和アッセイ：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ特異的Ｚバリアントを、ＴＦ−１細胞アッセイにおいてその阻害能力について試験した。実施例２に記載のようにアッセイを実施した。細胞成長に関するデータを、４パラメーター用量−反応曲線に対する非線形回帰によって評価し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍプログラムを使用して決定した。Ｈｉｓ６タグ化Ｚ１２９６７を、比較のために含めた。
【０２３７】
円二色性（ＣＤ）分光分析：ＣＤを、実施例２に記載のようにＨｉｓ６タグ化Ｚバリアントについて分析した。
【０２３８】
結果
Ｈｉｓ６タグでのサブクローニング：Ｚバリアントを、Ｎ末端Ｈｉｓ６を有する構築物にサブクローニングした。
【０２３９】
Ｈｉｓ６タグ化Ｚバリアントの産生：Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で可溶性遺伝子産物として発現された。タンパク質の精製量を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって分光高度的に決定し、およそ１〜７ｍｇタンパク質／ｇペレットの範囲であった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、これらが主にＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントを含むことを示していた。各Ｚバリアントの正確な同一性および分子量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認された。
【０２４０】
Ｂｉａｃｏｒｅ動態解析：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置における固定化ＩＬ−１Ｒ−Ｉを含む表面上への種々の濃度のＺバリアントの注入によって解析した。ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合についての動態パラメーター（ＫＤ、ｋｏｎ、およびｋｏｆｆ）の計算値の概略を、表１１に示す。ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉへの最強の結合剤であるＺ１８５５７（配列番号１２０５）のＫＤは、ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉに対して１．５×１０−１０、カニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉに対して７．６×１０−９Ｍであった。ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉに対するＺ１２９６７のＫＤは、５．１×１０−１０Ｍであった。
【０２４１】
【表１１】
2020515252.tif 000025
【０２４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１β中和アッセイ：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのＩＬ−１β阻害能を、ＴＦ−１細胞アッセイで分析した。得られたＩＣ５０値を表１２に示す。Ｚ１８５５７（配列番号１２０５）は最高の阻害能を示し、ＩＣ５０値は０．５ｎＭ未満であった。Ｚ１２９６７のＩＣ５０は５．２ｎＭであった。
【０２４３】
【表１２】
2020515252.tif 000026
【０２４４】
ＣＤ分析：Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについて決定されたＣＤスペクトルは、各々が２０℃でα−ヘリックス構造を有することを示していた。この結果は、融解温度を決定した可変温度測定においても立証された（表１３）。９０℃への加熱前後に測定したスペクトルを重ね合わせたときに全てのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについて可逆的折りたたみが認められた。
【０２４５】
【表１３】
2020515252.tif 000027
【０２４６】
実施例６
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの２つの第２の成熟ライブラリーの設計および構築
この実施例では、２つの第２の成熟ライブラリーを構築した。ライブラリーを、さらなるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの選択のために使用した。
【０２４７】
材料と方法
ライブラリーの設計：ライブラリーは、主に、実施例４および５に記載のヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの配列に基づいた。名称がＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩおよびＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩＩである新規のライブラリーでは、主に第１の成熟ライブラリーからの選択に由来する主にＺバリアント（配列番号１９〜１２０９）に基づいたストラテジーにしたがって、それぞれ、Ｚ分子足場中の１０の変動可能な位置が一定のアミノ酸残基に偏っており、３つの位置が一定に保持されていた。さらに、両方のライブラリーでは、変動させるために新規のアミノ酸位置（５８ａａＺバリアント配列の１２位）を含め、それにより、合計１１の可変位置を得た。実施例５で特徴づけたＺ１８５５７（配列番号１２０５）の１２位はバリンであった。このライブラリー設計により、１２位にアミノ酸Ａ、Ｖ、およびＩを得た。
【０２４８】
Ｚｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩについて、ＤＮＡリンカーを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）から取り寄せた以下の配列を含むスプリットプール合成を使用して生成した：５’−ＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３’（配列番号１６８１、設計されたコドンをＮＮＮと表示する）。新規のライブラリーの各アミノ酸残基（Ｚ分子足場中の１１の可変アミノ酸位置（９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、２５、２８、および３５）および３つの一定のアミノ酸位置（２４、２７、および３２）が含まれる）の設計を、表１４に示す。得られた理論上のライブラリーサイズは、２．２×１０７バリアントであった。選択したアミノ酸の一部の分布率が高い１０、１１、１２、１３、１７、２８、および３５位を除いて、異なるアミノ酸の理論上の均等分布を各アミノ酸位置内に適用した。
【０２４９】
Ｚｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩＩについて、ライブラリーを、ＴＲＩＭテクノロジーを使用して実施例３に記載のＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉと同様に構築した。ＤＮＡ配列５’−ＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３（配列番号１６８２、設計されたコドンをＮＮＮと表示する）を、Ｅｌｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取り寄せた。新規のライブラリーの各アミノ酸残基（Ｚ分子足場中の１１の可変アミノ酸位置（９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、２５、３２、および３５）および３つの一定のアミノ酸位置（２４、２７、および２８）が含まれる）の設計を、表１５に示す。得られた理論上のライブラリーサイズは、１．０×１０８バリアントであった。選択したアミノ酸の一部の分布率が高い１０、１１、１２、３２、および３５位を除いて、異なるアミノ酸の理論上の均等分布を各アミノ酸位置内に適用した。
【０２５０】
【表１４】
2020515252.tif 000028
【０２５１】
【表１５】
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【０２５２】
ライブラリーの構築およびファージストックの調製：Ｚｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩおよびＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩＩを、ＷＯ２０１６／１１３２４６号（実施例４）および実施例３にそれぞれ記載のように構築した。両方のライブラリーについて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅを、ライブラリー形質転換に使用した。ライブラリー設計と比較した構築ライブラリーの内容を検証し、その結果を評価するために、Ｚバリアントのライブラリー由来のクローンを、（実施例３に記載のように）配列決定した。
【０２５３】
ファージミドライブラリーを含むファージストックを、浸透フラスコ中に調製した。ファージミドライブラリーを含むグリセロールストック由来の細胞を、本質的に実施例３のＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉバッチ２について記載のように、それぞれ０．５ｌまたは１ｌのＴＳＢ−ＹＥ培地に播種した。培養物を、ＯＤ６０００．８〜０．９で１０〜２０倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを使用して感染させた。ファージストックを、実施例３に記載のように調製した。
【０２５４】
結果
ライブラリーの構築：新規のライブラリーを、検証された結合特性（実施例４および５）を有するＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉから選択された一連のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントに基づいて設計した。Ｚｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩおよびＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩＩの理論上のサイズは、それぞれ、２．２×１０７バリアントおよび１．０×１０８Ｚバリアントであった。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞の形質転換後の滴定によって決定された実際のライブラリーサイズは、それぞれ、１．２×１０９形質転換体および７．０×１０９形質転換体であった。
【０２５５】
それぞれＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩおよびＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩＩ由来の１９２および９６の形質転換体の配列決定およびその実際の配列と理論上の設計との比較によってライブラリーの質を試験した。設計したライブラリーと比較した実際のライブラリーの内容は、満足なものであることが示された。したがって、ＩＬ−１Ｒ−Ｉへの潜在的な結合剤の２つの成熟ライブラリーが首尾よく構築された。
【０２５６】
実施例７
第２の成熟ライブラリーからのＺバリアントの選択
この実施形態では、ヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉを、Ｚバリアントの２つの第２の成熟ファージライブラリーを使用したファージディスプレイ選択での標的タンパク質として使用した。
【０２５７】
材料と方法
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：ビオチン化ヒト標的タンパク質ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃおよびｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ、ならびにカニクイザル標的タンパク質ｂ−ｃＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを、実施例６に記載のＺバリアント分子の新規のライブラリーを使用したファージ選択で使用した。並行選択トラックならびに標的濃度の低下および洗浄数の増加によって得た選択サイクルにおけるストリンジェンシーの全体的な増加を記載している選択ストラテジーの概要を、表１６に示す。
【０２５８】
【表１６】
2020515252.tif 000030
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【０２５９】
以下の１〜３を例外として、本質的に実施例４に記載のように４サイクルで選択した。例外１：ＳＡビーズ（ｂ−ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉトラック）またはＦｃ／ＳＡビーズ（ｂ−ＩＬ−１ＲＩ−Ｆｃトラック）とのファージストックのインキュベーションによって、ＲＴで６０分を超えて選択ラウンド１および２において事前選択を行った。例外２：それぞれトラック２−１、２−４、２−９、２−１１、２−１２、３−１、３−４、３−９、３−１１、および３−１２の第２の最終洗浄工程において、ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉをそれぞれのトラックの標的濃度より１００倍の濃度で洗浄緩衝液に添加し、１５〜２０分間洗浄した。例外３：第４の選択ラウンドでは、トラック４−１、４−４、および４−６を、第２の最終洗浄工程前に２つに分割した。一方については、ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉをそれぞれのトラックの標的濃度より１００倍の濃度で洗浄緩衝液に添加し、第２の最終洗浄を一晩行った。他方については、第２の最終洗浄に１時間のＰＢＳＴでの洗浄を適用した。
【０２６０】
第１の選択サイクルでは、以下の１２の選択トラックを実施した；１−１〜１−１２。サイクル２では、２つのトラックを３つに分割し、６つのトラックを２つのトラックにプールし、それにより、サイクル２、３、および４において合計で以下の１２の並行トラックを得た；それぞれ、２−１〜２−１２、３−１〜３−１２、および４−１〜４−１２。全選択トラックを、表１６に示す。選択のために使用したファージ粒子数は、典型的には、前のサイクルにおける溶出ファージ粒子数の２０００倍であった。
【０２６１】
結果
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：ヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉに対する４サイクルのファージディスプレイ選択後に、個別のクローンを得た。
【０２６２】
実施例８
第１および第２の成熟ライブラリーからのＺバリアントのスクリーニング
この実施例では、実施例４および実施例７由来の選択クローンのＤＮＡを配列決定し、ＺバリアントをＥ．ｃｏｌｉペリプラズム画分中に産生し、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅにおいてＩＬ−１Ｒ−Ｉに対してアッセイした。
【０２６３】
材料と方法
潜在的な結合剤の配列決定：３つの成熟ライブラリーＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．Ｉ、Ｚｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩ、およびＺｌｉｂ００６ＩＬ−１ＲＩ．ＩＩＩを使用した選択のサクル４由来の個別のクローンを、配列決定のために選定した。遺伝子断片の増幅および配列分析を、本質的に実施例１に記載のように行った。
【０２６４】
ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅスクリーニングのためのＺバリアントの産生：熱処理（８２℃、２０分間）の後に濾過によって清澄化することによってペリプラズム抽出物を調製することを除いて、Ｚバリアントを本質的に実施例４に記載のように産生した。ＢｉａｃｏｒｅでスクリーニングしたＺバリアントを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で５倍希釈した。
【０２６５】
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：ＺバリアントのヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合を、標的タンパク質として０．２ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを使用して、本質的に実施例１に記載のようにＥＬＩＳＡで分析した。ネガティブコントロールとして、ＡＢＤ００１のペリプラズム抽出物を使用した。
【０２６６】
ＺバリアントのＥＣ５０分析：ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合の選択を、上記のＥＬＩＳＡを使用したｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃの希釈系列に対する応答の分析に供した。標的タンパク質ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを、２０から０．００２ｎＭまで１：１０にて段階的に希釈した。バックグラウンドコントロールとして、標的タンパク質を添加せずにＺバリアントをアッセイした。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５および非線形回帰を使用して分析し、ＥＣ５０値（半数効果濃度）を計算した。Ｚ１２９６７、Ｚ１６０６５、およびＺ１６２１８（それぞれ、配列番号９、２６８、および４１４に対応する）を有するペリプラズム抽出物を、シグナル比較のために並行して分析した。ネガティブコントロールとして、ＡＢＤ００１のペリプラズム抽出物を使用した。
【０２６７】
ＺバリアントのＢｉａｃｏｒｅスクリーニング：ＺバリアントのヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合を、Ｚ−ＡＢＤ（ＡＢＤ００１、配列番号１６６０）ペリプラズム抽出物を２分間注入することを除いて本質的に実施例４に記載のようにＢｉａｃｏｒｅ２０００装置を使用した動態スクリーニングで分析した。Ｚ１２９６７、Ｚ１６０６５、およびＺ１６２１８のペリプラズム抽出物を、比較のためにスクリーニング分析に二連で含めた。ＡＢＤ（ＡＢＤ００１、配列番号１６６０）を有するペリプラズム抽出物を、ネガティブコントロールとして含めた。
【０２６８】
結果
配列決定：４サイクルの選択後に得たクローンを配列決定した。各バリアントに固有の識別番号＃＃＃＃＃を与え、個別のバリアントをＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。５８アミノ酸残基長のＺバリアントのアミノ酸配列を、図１中および配列表中に配列番号１２１０〜１６３２として列挙する。推定ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフは、各配列中の残基８から残基３６にわたる。これらの各Ｚバリアント内で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予想される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、残基７から残基５５にわたる。
【０２６９】
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：４サイクルの選択後に得たクローンを９６ウェルプレート中に個別に産生し、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合活性についてスクリーニングした。アッセイしたＺバリアントの９９．５％が、ブランクコントロールの２倍または０．２ｎＭ  ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃに対してより高い陽性シグナルを生じた。
【０２７０】
ＺバリアントのＥＣ５０分析：０．７４ＡＵ（８．２×ブランクコントロール）を超える結果を示す１０２のＺバリアントのサブセットを、ｈＩＬ−１Ｒ−Ｉ−Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡ標的滴定に供した。得られた結果をＥＣ５０値の計算のために使用した（表１７）。Ｚ１２９６７、Ｚ１６０６５、およびＺ１６２１８の結果は、それぞれ、２．６×１０−１０、２．１×１０−１０、および２．２×１０−１０Ｍであった。
【０２７１】
【表１７】
2020515252.tif 000032
2020515252.tif 000033
【０２７２】
ＺバリアントのＢｉａｃｏｒｅスクリーニング：１８８のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのサブセットを、Ｂｉａｃｏｒｅ動態スクリーニングに供した。単一濃度のｈＩＬ−１Ｒ−Ｉを、抗ＡＢＤ抗体を含むセンサーチップ表面上のペリプラズム抽出物から捕捉した各Ｚ−ＡＢＤ上に注射した。スクリーニング親和性の計算値を、表１８に示す。Ｚ１２９６７、Ｚ１６０６５、およびＺ１６２１８のＫＤ値は、それぞれ、２．７×１０−８、７．５×１０−９、および１．３×１０−８Ｍ（二連の平均）であった。
【０２７３】
Ｚ１６０６５と結合モチーフＢＭのＸ５位のみが異なるアミノ酸配列を有するＺ１８８１４は、Ｚ１６０６５の３倍の親和性を有する。Ｚ１６０６５は、Ｘ５位にアラニン残基を有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの間で最も高い結合親和性（ＫＤ）を有する（表１１）。Ｚ１８８１４は、Ｘ５位にイソロイシン残基を有する。Ｘ５位にバリンまたはイソロイシンを有するいくつかのＺバリアントは、ＩＬ−１Ｒ−Ｉに対する親和性が高いことが見出された。
【０２７４】
【表１８】
2020515252.tif 000034
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【０２７５】
実施例９
第１および第２の成熟ライブラリー由来のＺバリアントの産生および特徴づけ
この実施例は、第１および第２の成熟ライブラリーファージ選択に由来するＨｉｓ６タグ化Ｚバリアントのサブクローニングおよび産生の一般的な手順、その標的結合の特徴づけ、標的の遮断、および融点についての一般的手順を記載する。
【０２７６】
材料と方法
Ｈｉｓ６タグを有するＺバリアントのサブクローニング：実施例８でスクリーニングしたＺバリアントのサブセットを、サブクローニングのために選択した。それぞれのＺバリアントのＤＮＡをファージライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅させ、本質的に実施例２に記載のように標準的な分子生物学技術を使用してＮ末端Ｈｉｓ６タグを用いてサブクローニングした。
培養：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ７Ｅ２細胞（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を、それぞれのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの遺伝子フラグメントを含むプラスミドで形質転換した。得られた組換え株を、ＥｎＰｒｅｓｓｏプロトコール（ＢｉｏＳｉｌｔａ）を使用して、５０ｍｌのスケールで５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足した培地中にて３０℃で培養した。タンパク質発現を誘導するために、ＩＰＴＧを、ＯＤ６００約１０での最終濃度０．２ｍＭまで添加した。誘導後、培養物を１６時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。
【０２７７】
Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの精製：実施例２に記載されているが、ＩＭＡＣ精製工程とＲＰＣ精製工程との間の緩衝液の交換を行わずに、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントのおよそ２／３を精製した。ＲＰＣ精製中の直線勾配も、１８ｍｌの０−６０％ＲＰＣ溶媒Ｂに変更した。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの残りの１／３に対してはＩＭＡＣ精製のみを行い、その後、最終的にＰＢＳに緩衝液を交換した。精製を、本質的に実施例２の第１の部分に記載のように行った。およそ１〜２ｇの各細胞ペレットを使用した。
【０２７８】
Ｂｉａｃｏｒｅ動態解析：Ｈｉｓ６タグ化Ｚバリアントに対するヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉの速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して決定した。４８、１２、３、および０．７５ｎＭのＺバリアントを使用して、本質的に実施例５に記載のように実験を行った。分析物の注入時間は、分析物の注入時間は３分間であり、その後に６分間解離し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを補足した２×５ｓグリシン（ｐＨ３．０）を、サイクル間の表面の再生のために使用した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において１：１結合モデルを使用して、得られた３つまたは４つの濃度のそれぞれのＺバリアントのセンサーグラムから速度定数を計算した。Ｈｉｓ６タグ化Ｚ１２９６７（配列番号９）、Ｚ１６０６５（配列番号２６８）、Ｚ１６１６３（配列番号３５９）、およびＺ１８５５７（配列番号１２０５）を、比較のためにアッセイに含めた。
【０２７９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１β中和アッセイ：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ特異的Ｚバリアントを、ＴＦ−１細胞アッセイにおいてその阻害能力について試験した。実施例２に記載のようにアッセイを実施した。細胞成長に関するデータを、４パラメーター用量−反応曲線に対する非線形回帰によって評価し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍプログラムを使用して決定した。Ｈｉｓ６タグ化したＺ１２９６７、Ｚ１６０６５、Ｚ１６１６３、およびＺ１８５５７を、比較のために含めた。
【０２８０】
円二色性（ＣＤ）分光分析：Ｈｉｓ６タグ化ＺバリアントについてのＣＤを、実施例２に記載のように分析した。
【０２８１】
結果
Ｈｉｓ６タグ化Ｚバリアントの産生：Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で可溶性遺伝子産物として発現された。タンパク質の精製量を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって分光高度的に決定し、ＩＭＡＣ精製およびＲＰＣ精製の両方を行ったＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについてはおよそ０．４〜７ｍｇタンパク質／ｇペレットの範囲であった。ＩＭＡＣ精製のみを行ったＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについては、タンパク質の精製量はおよそ４〜１５ｍｇタンパク質／ｇペレットの範囲であった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、これらが主にＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントを含むことを示していた。各Ｚバリアントの正確な同一性および分子量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認された。
【０２８２】
Ｂｉａｃｏｒｅ動態解析：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉとの相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置における固定化ＩＬ−１Ｒ−Ｉを含む表面上への種々の濃度のＺバリアントの注入によって解析した。ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合についての動態パラメーター（ＫＤ、ｋｏｎ、およびｋｏｆｆ）の計算値の概略を、表１９に示す。Ｚ１２９６７、Ｚ１６０６５、Ｚ１６１６３、およびＺ１８５５７のＫＤ値は、それぞれ、８．２×１０−１０、５．１×１０−１０、７．６×１０−１０、および１．４×１０−１０Ｍであった。カニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合のＫＤ値は、それぞれ、Ｚ１８７５４、Ｚ１８７６０、およびＺ１８８００について２．０×１０−９、６．７×１０−９、および３．３×１０−９Ｍであった。
【０２８３】
【表１９】
2020515252.tif 000036
2020515252.tif 000037
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１β中和アッセイ：Ｈｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのＩＬ−１β阻害能を、ＴＦ−１細胞アッセイで分析した。得られたＩＣ５０値を表２０に示す。Ｚ１２９６７、Ｚ１６０６５、Ｚ１６１６３、およびＺ１８５５７のＩＣ５０値は、それぞれ、７．４、３．３、３．３、および０．６ｎＭであった。
【０２８５】
【表２０】
2020515252.tif 000038
【０２８６】
ＣＤ分析：Ｈｉｓ６タグを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについて決定されたＣＤスペクトルは、各々が２０℃でα−ヘリックス構造を有することを示していた。この結果は、融解温度を決定した可変温度測定においても立証された（表２１）。９０℃への加熱前後に測定したスペクトルを重ね合わせたときに全てのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントについて可逆的折りたたみが認められた。
【０２８７】
ＢＭのＸ５位にバリン残基またはイソロイシン残基を有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアント（Ｚ１８９１２、Ｚ１８９２０、Ｚ１８９６８、Ｚ１９０７２、Ｚ１９０７５、Ｚ１９１４３、Ｚ１９１４７、Ｚ１９１５１、Ｚ１９１５８、Ｚ１９１５９、Ｚ１９１７０、Ｚ１９１７２、Ｚ１９１８０、Ｚ１９１８１、およびＺ１９１８２）の熱安定性およびα−ヘリックス含有量は、Ｘ５にアラニン残基を有するＺバリアントと実質的に異ならなかった。
【０２８８】
【表２１】
2020515252.tif 000039
【０２８９】
実施例１０
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質の産生および特徴づけ
この実施例は、異なるｉｎ  ｖｉｖｏ半減期延長融合パートナーに融合した異なるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合タンパク質バリアントのＤＮＡの構築および産生の一般的工程を記載する。
【０２９０】
材料と方法
ＤＮＡ構築：任意選択的に異なるリンカー（表２２）を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１６６２）、アルブミン結合ポリペプチドバリアント（ＰＰ０１３；配列番号１６６１）、ヒトアルブミン（配列番号１６６３）、またはヒトトランスフェリン（配列番号１６６４）に融合した一連のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアント（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドン最適化し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成サービスによって合成した。遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞またはＣＨＯ細胞でのその後の発現のための発現ベクターでクローン化した。
【０２９１】
融合タンパク質は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントａ）Ｚ１２９６７（配列番号９）、ｂ）Ｚ１２８９５（配列番号１２）、ｃ）Ｚ１８８３１（配列番号１３０８）、ｄ）Ｚ１８８４６（配列番号１３３１）、ｅ）Ｚ１８７５４（配列番号１２５２）、ｆ）Ｚ１９１５１（配列番号１５９４）、ｇ）Ｚ１８８７４（配列番号１４２１）、ｈ）Ｚ１８７６０（配列番号１４３５）、ｉ）Ｚ１８８００（配列番号１３２８）、ｊ）Ｚ１８８９８（配列番号１２８５）、およびｋ）Ｚ１９１４７（配列番号１３０７）、ならびに上記の異なる融合パートナーの結合モチーフに基づいていた。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントａ）〜ｋ）は、異なる足場変異（１、２、２３、５２、および／または５３位）または変異と組み合わせた欠失（１〜３位の欠失；ΔＶ１Ｄ２Ａ３、５２および５３位の変異）を含んでいた（以下の表２２を参照のこと）。変異Ｚバリアントを、配列番号１６６７〜１６６８および１６７０〜１６７９として図１に列挙している。これらの得られた融合ポリペプチドは、ＰＳＩ０４０５（配列番号１６３９）、ＰＳＩ０４０７（配列番号１６４０）、ＰＳＩ０４１１（配列番号１６４１）、ＰＳＩ０４１２（配列番号１６４２）、ＰＳＩ０４１５（配列番号１６４３）、ＰＳＩ０４１６（配列番号１６４４）、ＰＳＩ０４１７（配列番号１６４５）、ＰＳＩ０５３４（配列番号１６４６）、ＰＳＩ０５３５（配列番号１６４７）、ＰＳＩ０５３６（配列番号１６４８）、ＰＳＩ０５３７（配列番号１６４９）、ＰＳＩ０５３８（配列番号１６５０）、ＰＳＩ０５３９（配列番号１６５１）、ＰＳＩ０５７４（配列番号１６５２）、ＰＳＩ０５７５（配列番号１６５３）、ＰＳＩ０５７６（配列番号１６５４）、ＰＳＩ０５８０（配列番号１６５５）、ＰＳＩ０５８１（配列番号１６５６）、ＰＳＩ０５８２（配列番号１６５７）であった（表２２を参照のこと）。
【０２９２】
【表２２】
2020515252.tif 000040
2020515252.tif 000041
【０２９３】
融合タンパク質の培養および精製：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質（表２２を参照のこと）に対応する遺伝子フラグメントを含む発現ベクターで形質転換し、次いで、フェッドバッチ技術を使用してバイオリアクター中で培養するか浸透フラスコ中で培養し、その後にタンパク質を発現させ、遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを−２０℃で保存した。製造者のプロトコールに本質的にしたがってＥｘｐｉＣＨＯ  発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアント（表２２を参照のこと）も発現させた。発現ベクターのトランスフェクション１２日後に遠心分離によって上清を回収し、−７０℃で保存した。
【０２９４】
凍結Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペレットを再懸濁し、次いで、超音波処理によって破壊し、引き続いて細胞片を遠心分離で除去後、濾過した（０．２２μｍ）。ＥｘｐｉＣＨＯ培養物由来の凍結上清を解凍し、濾過した（０．２２μｍ）。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントを含む各上清を、従来のクロマトグラフィ法（アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、およびサイズ排除クロマトグラフィなど）を使用して精製した。動物研究で用いるＺバリアントも、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ内毒素除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２０３４４）を使用した内毒素除去精製に供した。精製ＺバリアントをＰＢＳ緩衝液に交換し、別段に記述しない限り、ＰＢＳは、その後の実験で使用される処方緩衝液でもあった。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントの純度を、クーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、各精製したＺバリアントの分子量を、質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）を使用して分析した。
【０２９５】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質ＰＳＩ０５８９（配列番号１６５８）（ジスルフィドによってヒンジ領域で連結された二量体Ｚ１８７５４バリアント）を、ＰＳＩ０５３６（表２２を参照のこと）由来のＩｇＧ１  Ｆｃ部分の除去によって得た。精製されたＰＳＩ０５３６のＩｄｅＳプロテアーゼ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ，Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ）とのインキュベーションによってこれを行った。次いで、切断産物を、従来のクロマトグラフィ法（イオン交換クロマトグラフィおよびアフィニティクロマトグラフィなど）を使用して精製した。精製された二量体Ｚ１８７５４バリアントを、ＰＢＳへの緩衝液交換に供し、ＰＢＳは、その後の実験で使用される処方緩衝液でもあった。純度を、クーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、分子量を、質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）を使用して分析した。
【０２９６】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）動態解析：４つのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質のヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉへの結合を、ＢＬＩを使用して分析した。ＰＳＩ０５３６、ＰＳＩ０５３７、ＰＳＩ０５３４、およびＰＳＩ０５３５（配列番号１６４８、１６４９、１６４６、１６４７）と示されたＦｃ融合ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合Ｚバリアントを、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６装置（Ｐａｌｌ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して各サイクルにおいて０．５μｇ／ｍｌで１５０秒間プロテインＡセンサー（Ｐａｌｌ、ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号１８−５０１０）にロードした。引き続いて、これらのセンサーを、異なる漸増濃度の０．１５〜５ｎＭの範囲のヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２６９−１Ｒ／ＣＦ）または２．５〜８０ｎＭの範囲のカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ（配列番号１６６５）に暴露した。会合を３００秒間記録し、解離を３００秒間（ヒト）または９０秒間（カニクイザル）記録し、スペクトログラムを記録し、全体的適合（Ｏｃｔｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ８．２ソフトウェア，Ｐａｌｌ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルにしたがって分析した。各センサーを、センサー上にロードされているが、緩衝液のみに暴露した同一のリガンドを有するセンサーに対して参照した。各会合／解離サイクル後、全センサーを、３パルスの１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）によってそれぞれ１０秒間再生させた。全工程を、２５℃で振盪速度１０００ｒｐｍにて行い、融合タンパク質（Ｚ−Ｆｃ融合タンパク質）および分析物（ヒトまたはカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉ）の全ての希釈物は、１×動態緩衝液（Ｐａｌｌ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中に存在していた。
【０２９７】
結果
培養および精製：全てのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質（表２２）は、可溶性タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ細胞またはＣＨＯ細胞中にて高レベルで発現した。精製により高純度のタンパク質調製物が得られ、これをクーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各Ｚバリアントの正確な同一性および分子量が、質量分析によって確認された。
【０２９８】
ＢＬＩ動態解析：４つのＺ−Ｆｃ融合タンパク質バリアント（配列番号１６４８、１６４９、１６４６、１６４７）を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６装置におけるＢＬＩテクノロジーを使用して、プロテインＡセンサー上にロードしたヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合する能力について分析した。４つ全てのバリアントは、１：１モデルにしたがって０．４６〜０．７２ｎｍ（ヒト）または０．３１〜０．３７ｎｍ（カニクイザル）の範囲のＢ−ｍａｘ値でＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合した。Ｚ−Ｆｃ融合タンパク質バリアントの動態データ（会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、および解離定数ＫＤ）を、表２３に示す。
【０２９９】
【表２３】
2020515252.tif 000042
【０３００】
実施例１１：
細胞ベースのアッセイを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理学的活性分析
材料と方法
正常ヒト皮膚線維芽（ＮＨＤＦ）細胞におけるＩＬ−１β誘導ＩＬ−６産生に及ぼすＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質の阻害性の影響をモニタリングした。
【０３０１】
タンパク質での処置の３日前に細胞を播種した。タンパク質（ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質またはアナキンラ）を、９μＭ組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の存在下の無血清成長培地で１００ｎＭの出発濃度に希釈し、引き続いて、１：４に９回連続希釈して、１００ｎＭ〜０．３８ｐＭの濃度範囲のタンパク質を得た。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質またはアナキンラを、チャレンジ用量の３．４ｐＭ  ＩＬ−１βの存在下で試験し、細胞を、タンパク質と共に３７℃で２２時間インキュベートし、その後に培地を回収した。回収した培地を４１倍に希釈後、ＩＬ−６含有量を、製造者の推奨条件にしたがってヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。ＸＬｆｉｔを使用してデータを解析し、ＩＣ５０値を濃度−反応曲線から計算した。
【０３０２】
実施例９に記載のように産生したＨｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのＮＨＤＦ細胞におけるＩＬ−１β誘導ＩＬ−６産生に及ぼす阻害性の影響を同様にモニタリングし、ＩＣ５０値を計算した。
【０３０３】
化学合成したタンパク質：ＰＳＩ０５５８と示した配列番号１６７２の化学合成バージョンを、ＢＡＣＨＥＭ  ＡＧから取り寄せた。ＰＳＩ０５５８の活性を、上記の方法にしたがって評価した。
【０３０４】
結果
ＮＨＤＦ細胞からのＩＬ−１β誘導ＩＬ−６放出は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質およびアナキンラによって濃度依存様式で低下した。各ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質を２回試験し、このアッセイにおける両実験由来のデータを、アナキンラの過去の平均値（ｎ＞２０）と共に表２４に示し、２つの実験のうちの１つを、図２にも示す。
【０３０５】
【表２４】
2020515252.tif 000043
【０３０６】
いくつかのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質を、同一の様式であるが、１回だけ試験した。この実験に由来する結果を、表２５に示す。
【０３０７】
【表２５】
2020515252.tif 000044
【０３０８】
ＴＦ−１細胞アッセイ（実施例９、表２０）で事前に証明されたＨｉｓ６タグ化ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ＺバリアントのＩＬ−１β阻害能を、このＮＨＤＦアッセイで確認した（結果を示さず）。
【０３０９】
化学合成したＰＳＩ０５５８のＩＣ５０値は、６９０ｐＭであった。
【０３１０】
実施例１２
全血アッセイを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理学的活性分析
個別のドナー由来の全血におけるＩＬ−１β誘導ＩＬ−６産生に及ぼすＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質の阻害性の影響を測定した。
【０３１１】
材料と方法
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質（配列番号１６４８−１６４９）での処置の１〜３時間前に健康なドナーから採血した。タンパク質（ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質またはアナキンラ）を、無血清ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、カタログ番号６１８７００１０）で５００ｎＭの出発濃度に希釈し、引き続いて、１：３に１０回連続希釈し、それにより、５００ｎＭ〜２５ｐＭの濃度範囲のタンパク質を得た。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合ポリペプチドまたはアナキンラを、チャレンジ用量の１００ｐＭ  ＩＬ−１βの存在下で試験した。血液をタンパク質と２１〜２３時間インキュベートし、その後に血漿を回収した。回収した血漿を２倍希釈し、ＩＬ−６の含有量を、製造者の推奨条件にしたがってヒトＩＬ−６キット（Ｖ−ＰＬＥＸヒトＩＬ−６キットヒトインターロイキン−６、ＭＳＤ）を使用して分析した。
【０３１２】
検量線（キットに用意されている）を使用してＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）を計算し、ＸＬｆｉｔを使用してデータを分析し、濃度−反応曲線からＩＣ５０値を計算した。
【０３１３】
結果
ヒト全血中のＩＬ−１β誘導ＩＬ−６放出は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質およびアナキンラによって濃度依存様式で低下した。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質を５〜６人の個別の健康なドナー由来の血液で試験し、１０人の個別の血液ドナー由来のアナキンラデータと比較した（図３）。配列番号１６４８（ＰＳＩ０５３６）、配列番号１６４９（ＰＳＩ０５３７）、およびアナキンラについてのＩＣ５０値の中央値は、それぞれ、０．３２、１．２５、および０．３１ｎＭであった。
【０３１４】
実施例１３
ラットにおけるＩＬ−ＩＲ−１結合融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学
この実施例では、ＩＬ−１Ｒ−１結合融合タンパク質（配列番号１６４６〜１６５１）の薬物動態学を、雄ラットの単回用量研究で評価した。
【０３１５】
材料と方法
融合タンパク質：ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質ＰＳＩ０５３４、ＰＳＩ０５３５、ＰＳＩ０５３６、ＰＳＩ０５３７、ＰＳＩ０５３８、およびＰＳＩ０５３９（表２２、配列番号１６４６〜１６５１を参照のこと）を、この研究で評価した。６つの全試験項目を、２５ｍＭリン酸ナトリウムおよび１２５ｍＭ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７．０）として構成した。
【０３１６】
生存期：６つの融合タンパク質の薬物動態学的性質を、雄スプレーグ・ドーリーラットで調査した。各試験項目について、３匹のラットの側方尾静脈に単回用量の１５ｍｇ／ｋｇ（２．５ｍｌ／ｋｇ）をｉ．ｖ．注射し、別の３匹のラットの頸部に単回用量の３０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）をｓ．ｃ．注射した。血清調製のための血液試料を、投与前、ｉ．ｖ．投与の５分後および２０分後、１、４、８、２４、４８、７２、および９６時間後、またはｓ．ｃ．投与の２０分後、１、４、８、２４、４８、７２、９６、および１２０時間後に回収した。
【０３１７】
定量的ＥＬＩＳＡ：ラット血清試料中の融合タンパク質レベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＥＬＩＳＡアッセイは、定量的サンドイッチ酵素免疫アッセイ技術を使用した。
【０３１８】
簡潔に述べれば；ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質のＺバリアントドメインを認識するヤギポリクローナル抗Ｚ抗体（自家製、Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ）を、マイクロプレート上にコーティングした。非結合ポリクローナル抗体を洗い流し、プラスチック表面への非特異的結合を減少させるためのブロッキング剤としてカゼインを添加した。第２の洗浄工程による非結合カゼインの除去後、標準および試料を、ウェルにピペットし、存在する任意の融合タンパク質が固定された抗体に結合した。任意の非結合物質を洗い流した後、ＨＲＰ標識されたブタ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｐ０３９９）を添加した。任意の非結合抗ウサギＨＲＰ試薬を除去するための洗浄後、基質溶液をウェルに添加し、最初の工程における融合タンパク質の結合量に対して比例して発色させた。発色を停止させ、色の強度を測定した。
【０３１９】
薬物動態学的解析：薬物動態学的解析は、各用量群由来の血清濃度の中央値対時間データに基づいていた。観察された最高（血中）濃度（Ｃｍａｘ）および最大血清濃度に到達するまでの時間（ｔｍａｘ）を、生物学的分析データから直接得た。他の薬物動態学的パラメーター（すなわち、クリアランス（ＣＬ）、ｓ．ｃ．投与後の見かけ上のクリアランス（ＣＬ／Ｆ）、定常状態での見かけ上の分布体積（Ｖｓｓ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および終末相半減期（ｔ１／２ｚ）を、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）を使用したノンコンパートメント解析によって推定した。ｉ．ｖ．投与後の終末相勾配の推定は、２４時間から９６時間までの４つのデータポイントに基づいていた。ｓ．ｃ．投与後の終末相勾配の推定は、２４時間から１２０時間までの５つのデータポイントに基づいていた。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して皮下生物学的利用能（Ｆ）を計算した。
【０３２０】
結果
６つの試験した融合タンパク質の間の薬物動態学に有意差は認められなかった。ｉ．ｖ．投与後の薬物動態学は、およそ２．４ｍｌ／ｈ・ｋｇのクリアランスおよび約１４０ｍｌ／ｋｇの分布体積を特徴とし、平均滞留時間が約６０時間であると解釈された（表２６）。
【０３２１】
【表２６】
2020515252.tif 000045
【０３２２】
皮下生物学的利用能は平均５０％であり、ピークレベルは投与２４時間後に認められた。次いで、血清レベルは、４５〜５９時間の範囲の半減期で低下した（表２７）。
【０３２３】
【表２７】
2020515252.tif 000046
【０３２４】
実施例１４
サルにおけるＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学
材料と方法
融合タンパク質：ＰＳＩ０５３６（配列番号１６４８）と示したＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質を、２５ｍＭリン酸ナトリウムおよび１２５ｍＭ塩化ナトリウムの溶液（ｐＨ７．０）として構成した。
【０３２５】
生存期：ＰＳＩ０５３６の薬物動態学的性質を、ナイーブ雄カニクイザルで調査した。３匹のサルの尾静脈に単回用量の５ｍｇ／ｋｇ（１ｍｌ／ｋｇ）をｉ．ｖ．注射し、別の３匹のサルの背部に単回用量の１０ｍｇ／ｋｇ（１ｍｌ／ｋｇ）をｓ．ｃ．注射した。血清調製のための血液試料を、投与前、ｉ．ｖ．投与の５分後および２０分後、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、２４０、および５０４時間後、またはｓ．ｃ．投与の２０分後、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、２４０、および５０４時間後に回収した。
【０３２６】
定量的ＥＬＩＳＡ：サル血清中のＰＳＩ０５３６を、実施例１３に記載のＥＬＩＳＡにしたがって定量した。
【０３２７】
薬物動態学的解析：薬物動態学的パラメーターは、個別の血清濃度対時間データに基づき、実施例１３に記載のようにＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用して決定した。ｉ．ｖ．投与後の終末相勾配の推定は、７２時間から５０４時間までの７つのデータポイントに基づいていた。ｓ．ｃ．投与後の終末相勾配の推定は、４８時間から５０４時間までの８つのデータポイントに基づいていた。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して皮下生物学的利用能（Ｆ）を計算した。
【０３２８】
結果
ｉ．ｖ．投与後のＰＳＩ０５３６（配列番号１６４８）の薬物動態学は、低クリアランス（１．０７ｍｌ／ｈ・ｋｇ）および少量の分布（１１７ｍｌ／ｋｇ）を特徴とし、平均滞留時間が１０９時間であると解釈された（表２８）。
【０３２９】
【表２８】
2020515252.tif 000047
【０３３０】
ＰＳＩ０５３６の平均皮下生物学的利用能は、７３．９％であった。ピークレベルは、投与後平均１８．７時間で認められた。次いで、血清レベルは、７７．３時間の半減期で低下した（表２９）。
【０３３１】
【表２９】
2020515252.tif 000048
【０３３２】
結論
最小標的血清濃度を１００ｎＭまたはさらに２００ｎＭと仮定すると、高皮下生物学的利用能の低クリアランスとの組み合わせは、サルにおける１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＳＩ０５３６の週１回の皮下用法を容易にする。
【０３３３】
実施例１５
Ｆｃ部分が変異したＩＬ−１−Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質の産生および特徴づけ
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃ部分の変異バリアントを有するＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドバリアントＺ１８７５４（配列番号１２５２）の４つのＩＬ−１−Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質を産生した。ＩｇＧ１  Ｆｃ部分では、ＦＣγＲ３Ａとの相互作用によるエフェクター機能を無効にするための１つの変異（Ｎ２９７Ａ）を導入した。哺乳動物細胞において産生されたＦｃ含有ポリペプチドは、変異がなければかかるエフェクター機能を生じ得る。さらに、一方の融合タンパク質（配列番号１７３５）において、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させるためにＬＳと示される２つの他の残基を導入し（ＷＯ２００９／０８６３２０）、別の融合タンパク質（配列番号１７３６）では、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させるためにＹＴＥと示される３つの変異（ＷＯ０２０６０９１９）を導入した。Ｚ１８７５４（配列番号１２５２）のＩｇＧ４  Ｆｃ（低エフェクター応答を誘発することが公知のサブタイプ）との１つの融合タンパク質を産生した（配列番号１７３７）。Ｓ２２８Ｐとして公知の１つの変異（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７（５８４４）：１５５４−７）を、この融合タンパク質のヒンジ領域にさらに導入した。この変異により、抗体のＩｇＧ４サブクラスで生じ得るアーム交換が排除される。
【０３３４】
材料と方法
融合タンパク質ＰＳＩ０６５３〜ＰＳＩ０６５６（配列番号１７３４〜１７３７）（詳細については表３０を参照のこと）を、実施例１０にしたがってＣＨＯ細胞中に産生させた。
【０３３５】
正常ヒト皮膚線維芽（ＮＨＤＦ）細胞におけるＩＬ−１β誘導ＩＬ−６産生に及ぼすＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質の阻害性の影響を、実施例１１に示すようにモニタリングした。
【０３３６】
ビオチン化ＦＣγＲ３Ａ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を動態学のためにストレプトアビジンバイオセンサー（Ｐａｌｌ／Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）上に固定し、タンパク質を１００および１０００ｎＭの濃度で試験したことを除いて、ＦＣγＲ３Ａに対する親和性を、本質的に実施例１０に開示のようにバイオレイヤー干渉法を使用して分析した。さらに、ヒトＩｇＧ（ＧａｍｍａＮｏｒｍ，Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）を、測定におけるコントロールとして使用した。
【０３３７】
ヒトビオチン化ＦｃＲｎ（Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ  ＡｐＳ）をビオチンＣＡＰｔｕｒｅチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定し、２．５〜２００ｎＭの範囲の５つの濃度で分析物を試験したことを除いて、ＦｃＲｎに対する親和性を、本質的に実施例９に記載のようにＢｉａｃｏｒｅを使用して評価した。
【０３３８】
【表３０】
2020515252.tif 000049
【０３３９】
結果
培養および精製：変異Ｆｃ部分を有する全てのＩＬ−１−Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質（表３０）は、可溶性タンパク質としてＣＨＯ細胞中にて高レベルで発現した。精製により高純度のタンパク質調製物が得られ、これをクーマシー・ブルーで染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各Ｚバリアントの正確な同一性および分子量を、質量分析によって確認した。
【０３４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理学的活性：ＮＨＤＦ細胞からのＩＬ−１β誘導ＩＬ−６放出は、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質によって濃度依存様式で低下した。ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合融合タンパク質を一度試験した。この実験由来の結果を、表３１に示す。
【０３４１】
【表３１】
2020515252.tif 000050
【０３４２】
ＦＣγＲ３Ａ親和性分析：ヒトＩｇＧは、１０００ｎＭの濃度で５７ｎＭの親和性でＦＣγＲ３Ａに結合した。融合タンパク質ＰＳＩ０６５３−ＰＳＩ０６５５（配列番号１７３４〜１７３６）は、いずれの濃度でも結合しなかった。ＰＳＩ０６５６（配列番号１７３７）は、１０００ｎＭで弱く結合したが、１００ｎＭでは結合しなかった。
【０３４３】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＦｃＲｎ親和性分析：ＦｃＲｎに対する親和性は、配列番号１７３５＞配列番号１７３６＞配列番号１７３４＝配列番号１７３７の順序であった。
【０３４４】
結論：融合タンパク質（配列番号１７３４：１７３７）の変異Ｆｃバリアントは、質および活性に関して前に産生されたタンパク質と等価であった（実施例１０を参照のこと）。グリカン結合部位の除去により、ＦＣγＲ３Ａへの結合が排除されたので、配列番号１７３４〜１７３６中のＩｇＧ１  Ｆｃ部分のエフェクター機能が取り除かれた。ＩｇＧ４  Ｆｃを含む配列番号１７３７は、ＦＣγＲ３Ａに対する親和性がそのサブクラスのＦｃで予想される親和性よりも低かった。配列番号１７３５および１７３６におけるＦｃＲｎ親和性増強変異は親和性を増加させ、配列番号１７３５の増加が最も大きかった。
【０３４５】
実施形態の項目別表
１．ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭを含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、そのモチーフが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６ＲＸ１８ＱＹＸ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄ（配列番号１６８６）
（相互に独立して、
Ｘ２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ａ、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｋ、Ｒ、およびＳから選択され；
Ｘ２１は、Ｑ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ２５は、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、およびＭから選択される）、
および
ｉｉ）Ｘ５がＩまたはＶであることを条件として、ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９６％同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、
ｉ）
Ｘ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、ＥおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ６は、ＱおよびＹから選択され；
Ｘ７は、ＦおよびＭから選択され；
Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２５は、ＩおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択される、配列、ならびに
ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９３％同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３．配列ｉ）が、以下の１０の条件Ｉ〜Ｘ：
Ｉ．Ｘ３はＥであること；
ＩＩ．Ｘ５は、ＩおよびＶから選択されること；
ＩＩＩ．Ｘ６は、ＱおよびＹから選択されること；
ＩＶ．Ｘ７は、ＦおよびＭから選択されること；
Ｖ．Ｘ１０は、ＦおよびＹから選択されること；
ＶＩ．Ｘ１８は、ＫおよびＲから選択されること；
ＶＩＩ．Ｘ２１はＴであること；
ＶＩＩＩ．Ｘ２５はＲであること；
ＩＸ．Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択されること；ならびに
Ｘ．Ｘ２８は、ＦおよびＬから選択されること
のうちの少なくとも５つを満たす、先行項目のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４．配列ｉ）が、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも６つを満たす、項目３に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５．配列ｉ）が、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも７つを満たす、項目４に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
６．配列ｉ）が、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも８つを満たす、項目５に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
７．配列ｉ）が、１０の条件Ｉ〜Ｘのうちの少なくとも９つを満たす、項目６に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
８．配列ｉ）が、１０の条件Ｉ〜Ｘの全てを満たす、項目７に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
９．Ｘ２Ｘ３Ｘ６がＶＥＱまたはＶＥＹである、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１０．Ｘ２Ｘ３Ｘ６がＩＥＱまたはＶＥＱである、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１１．Ｘ６Ｘ１０が、ＱＦ、ＱＹ、ＹＦ、およびＹＹからなる群から選択される、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１２．Ｘ６Ｘ１０がＱＦである、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１３．Ｘ１０Ｘ１８が、ＦＫ、ＦＲ、ＹＫ、およびＹＲからなる群から選択される、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１４．Ｘ１０Ｘ１８がＦＫまたはＦＲである、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１５．Ｘ１８Ｘ２５Ｘ２８がＫＲＬまたはＲＲＬである、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１６．Ｘ５Ｘ７がＩＭまたはＶＭである、項目１〜８のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１７．配列ｉ）が、配列番号１〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１８．配列ｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
１９．配列ｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２０．配列ｉ）が、配列番号１２５２中の８位〜３６位の配列に対応する、項目１９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２１．配列ｉ）が、配列番号１３２８中の８位〜３６位の配列に対応する、項目１９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２２．配列ｉ）が、配列番号１４３５中の８位〜３６位の配列に対応する、項目１９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２３．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２４．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に、相互連結ループと共に２つのヘリックスの一部を本質的に形成する、項目２３に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２５．上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、細菌受容体ドメインから選択される、項目２４に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２６．上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメインまたはその誘導体から選択される、項目２５に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２７．結合モジュールＢＭｏｄを含み、そのアミノ酸配列が、
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＸａＸｂＬＬＸｃＥＡＫＫＬＸｄＸｅＸｆＱ；（配列番号１６８７）
（
［ＢＭ］は、項目１〜２２のいずれか１つに定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフであり；
Ｘａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘｃは、Ａ、Ｓ、およびＣから選択され；
Ｘｄは、Ｅ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘｅは、Ｄ、Ｅ、およびＳから選択され；
Ｘｆは、ＡおよびＳから選択される）；および
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義した配列に対して少なくとも９１％同一性を有するアミノ酸配列
から選択される、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２８．配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１６３８、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３８および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
２９．配列ｉｉｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する、項目２８に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３０．配列ｉｉｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する、項目２８に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３１．配列ｉｉｉ）が、配列番号１６７２中の７位〜５５位の配列に対応する、項目３０に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３２．配列ｉｉｉ）が、配列番号１６７５中の７位〜５５位の配列に対応する、項目３０に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３３．配列ｉｉｉ）が、配列番号１６７６中の７位〜５５位の配列に対応する、項目３０に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３４．ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ    配列番号１６９５；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１６９６；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１６９７；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ    配列番号１６９８；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１６９９；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７００；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ    配列番号１７０１；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７０２；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７０３；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７０４；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ    配列番号１７０５；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７０６；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ    配列番号１７０７；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７０８；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ    配列番号１７０９；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ    配列番号１７１０；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ    配列番号１７１１；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ    配列番号１７１２；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ    配列番号１７１３；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ    配列番号１７１４；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰ    配列番号１７１５；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ    配列番号１７１６；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７１７；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰ    配列番号１７１８；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７１９；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７２０；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７２１；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７２２；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ    配列番号１７２３；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ    配列番号１７２４；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ    配列番号１７２５；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ    配列番号１７２６；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７２７；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７２８；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ    配列番号１７２９；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ    配列番号１７３０；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ    配列番号１７３１，
および
ＡＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ    配列番号１７３２，
から選択されるアミノ酸配列を含み、
［ＢＭ］は、項目１〜２２のいずれか１つに定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３５．ｘｉｘ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号１７２１）（［ＢＭ］は、項目１〜２２のいずれか１つに定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである、ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号１７２１））；および
ｘｘ）ＢＭに隣接する配列中の、ｘｉｘ）に定義の配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜３４のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３６．ｘｘｉ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ（配列番号１７０９）
（［ＢＭ］は、項目１〜２２のいずれか１つに定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである、ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ（配列番号１７０９））；および
ｘｘｉｉ）ＢＭに隣接する配列中の、ｘｘｉ）に定義の配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜３４のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３７．配列ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、項目３５または３６に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３８．ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、項目３７に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
３９．配列ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、項目３８に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４０．配列ｘｘｉ）が、配列番号１６７２中の１位〜５８位の配列に対応する、項目３９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４１．配列ｘｘｉ）が、配列番号１６７５中の１位〜５８位の配列に対応する、項目３９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４２．配列ｘｘｉ）が、配列番号１６７６中の１位〜５８位の配列に対応する、項目３９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４３．ＩＬ−１Ｒ−Ｉ依存性シグナル伝達を遮断することができる、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４４．遮断の半数阻害濃度（ＩＣ５０）が最大で１×１０−７Ｍ（最大で１×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で５×１０−１０Ｍなど）である、項目４３に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４５．ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１サイトカインとの相互作用（ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βとの相互作用など）を遮断することができる、項目４３または４４に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４６．相互作用のＥＣ５０値が最大で１×１０−７Ｍ（最大で１×１０−８Ｍなど、最大で５×１０−９Ｍなど、最大で１×１０−１０Ｍなど、最大で５×１０−１０Ｍなど、最大で２×１０−１０Ｍなど）であるようにＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合することができる、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４７．相互作用のＫＤ値が最大で１×１０−６Ｍ（最大で１×１０−７Ｍなど、最大で１×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で９×１０−１０など）であるようにＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合することができる、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４８．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉが、ヒトＩＬ−１Ｒ−ＩまたはカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉなど）である、項目４３〜４７のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
４９．Ｃ末端および／またはＮ末端にさらなるアミノ酸を含む、先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５０．上記さらなるアミノ酸が、産生、精製、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定化、ポリペプチドのカップリングまたは検出を改善する、項目４９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５１．少なくとも２つのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドモノマー単位を含み、そのアミノ酸配列が同一でも異なっていてもよい、多量体の形態の先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５２．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドモノマー単位が相互に共有結合している、項目５１に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５３．ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドモノマー単位が融合タンパク質として発現する、項目５２に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５４．項目５１〜５３のいずれか１つに記載の二量体形態のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
５５．−先行項目のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
を含む、融合タンパク質または抱合体。
５６．上記所望の生物学的活性が治療活性である、項目５５に記載の融合タンパク質または抱合体。
５７．上記所望の生物学的活性が結合活性である、項目５５に記載の融合タンパク質または抱合体。
５８．上記所望の生物学的活性が、上記融合タンパク質または抱合体の組織分布を改変する結合活性である、項目５５に記載の融合タンパク質または抱合体。
５９．上記所望の生物学的活性が、上記第２の部分が融合タンパク質または抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるようなｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性である、項目５７に記載の融合タンパク質または抱合体。
６０．上記ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性がアルブミン結合活性である、項目５９に記載の融合タンパク質または抱合体。
６１．上記アルブミン結合活性が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体によって得られる、項目６０に記載の融合タンパク質または抱合体。
６２．上記第２の部分が、配列番号１６５９〜１６６１（配列番号１６６１など）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目６１に記載の融合タンパク質または抱合体。
６３．上記第２の部分が血清アルブミンである、項目５９に記載の融合タンパク質または抱合体。
６４．上記第２の部分が、抗体のＦｃ部分（ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃなど）である、項目５９に記載の融合タンパク質または抱合体。
６５．上記Ｆｃが、未変異形態のＦｃと比較してＦｃＲｎの改善および／またはエフェクター応答の減少を示す変異Ｆｃである、項目６４に記載の融合タンパク質または抱合体。
６６．上記第２の部分がトランスフェリンである、項目５８または５９に記載の融合タンパク質または抱合体。
６７．配列番号１６３９〜１６５８および１７３４〜１７３７からなる群（配列番号１６４６〜１６５４および１７３４〜１７３７からなる群など）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目５９〜６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質または抱合体。
６８．上記結合活性が生物学的活性を遮断するように作用する、項目５７に記載の融合タンパク質または抱合体。
６９．少なくとも１つのリンカーをさらに含み、上記リンカーが可動性アミノ酸リンカー、固定アミノ酸リンカー、および切断可能なアミノ酸リンカーからなる群から任意選択的に選択される、項目５５〜６８のいずれか１項に記載の融合タンパク質または抱合体。
７０．上記リンカーが、上記第１の部分と上記第２の部分との間に配置されている、項目６９に記載の融合タンパク質または抱合体。
７１．上記リンカーが、上記第１の部分内に配置されている、項目６９に記載の融合タンパク質または抱合体。
７２．上記リンカーが、グリシン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む可動性リンカーである、項目６９または７０に記載の融合タンパク質または抱合体。
７３．上記リンカーが、ＧＳ、ＶＤＳＳ、ＶＤＧＳ、ＶＥＧＳ、ＡＳＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６８３）、ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６８４）、および（（ＫＥＡＡＡ）３ＫＥＬＡＡ）２（配列番号１６８５）からなる群から選択される、項目７２に記載の融合タンパク質または抱合体。
７４．上記リンカーが、ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６８４）および（（ＫＥＡＡＡ）３ＫＥＬＡＡ）２（配列番号１６８５）から選択される、項目７３に記載の融合タンパク質または抱合体。
７５．項目１〜７４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
７６．項目７５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
７７．項目７６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
７８．−上記発現ベクターからの上記ポリペプチドの発現を許容する条件下で項目７７に記載の宿主細胞を培養する工程、および
−上記ポリペプチドを単離する工程
を含む、項目１〜７７のいずれか１つに記載のポリペプチドを産生する方法。
７９．項目１〜７４のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、または抱合体、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体を含む組成物。
８０．少なくとも１つのさらなる活性薬剤（免疫応答改変剤および抗癌剤から選択される薬剤など）をさらに含む、項目７９に記載の組成物。
８１．上記融合タンパク質が請求項５９〜６７のいずれか１項に記載の融合タンパク質である、項目７９または８０に記載の組成物。
８２．医薬、診断剤、および／または予後剤として使用するための、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体または項目７９〜８１のいずれか１つに記載の組成物。
８３．医薬として使用するための、項目８２記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
８４．上記ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物が、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ機能をｉｎ  ｖｉｖｏで調整する、項目８３に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
８５．診断剤および／または予後剤として使用するための、項目８２に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
８６．ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害の治療、予後、または診断における項目８２〜８５のいずれか１項に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
８７．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が、炎症性疾患、自己炎症性症候群、自己免疫疾患、感染症、心血管疾患、虚血性疾患、癌、および糖尿病からなる群から選択される、項目８６に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
８８．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が、家族性地中海熱（ＦＭＦ）；クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）；ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；高ＩｇＤ症候群（ＨＩＤＳ）；周期熱；アフタ性口内炎；咽頭炎；腺炎（ＰＦＡＰＡ）；関節リウマチ（ＲＡ）、若年性ＲＡ、若年性特発性関節炎、全身性若年性特発性関節炎；成人発症スティル病；シュニッツラー症候群；マックル・ウェルズ症候群；マクロファージ活性化症候群；ベーチェット病；ブドウ膜炎；尋常性ざ瘡；壊疽性膿皮症；痛風；２型糖尿病、初発糖尿病；眼乾燥症候群；汗腺膿瘍；好中球性皮膚症、特に、組織球貪食性脂肪組織炎、ウェーバー・クリスチャン病、および好中球性脂肪組織炎；心血管疾患、心筋梗塞、卒中；肝不全、腎不全；急性肺損傷；偽痛風、カルシウムピロリン酸沈着症、軟骨石灰化症、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、ＩＬ−３６受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＴＲＡ）、ＡＤＡＭ２欠損症（ＤＡＤＡ２）、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症・アクネ（ＰＡＰＡ）症候群、壊疽性膿皮症・アクネ・化膿性汗腺炎（ＰＡＳＨ）症候群、ＰＡＰＡ・化膿性汗腺炎（ＰＡＰＡＳＨ）症候群、リンパ水腫を伴う自己炎症性症候群（ＡＩＳＬＥ）、ホスホリパーゼＣ−γ−２変異自己炎症性症候群、ＮＡＬＰ１２関連周期性症候群（ＮＡＰＳ１２）、メバロン酸キナーゼ欠損症（ＭＫＤ）、乾癬性関節炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、ヘモクロマトーシス関連関節炎、関節周囲石灰沈着症、骨関節炎、炎症性骨関節炎、変形性手関節症、膿疱性乾癬（全般性膿疱性乾癬（ＧＰＰ）、手挙足底膿疱症（ＰＰＰ）、アロボー稽留性肢端皮膚炎（ＡＣＨ）など）；ブラウ症候群；スイート症候群；種々の脈管炎（巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）、リウマチ性多発筋痛（ＰＭＲ）、高安動脈炎、川崎病、蕁麻疹様血管炎、およびヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）など）；好中球性蕁麻疹および特発性寒冷蕁麻疹；扁平苔癬；多発性筋炎、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、および封入体筋炎筋炎；種々の病期の骨髄腫（くすぶり型骨髄腫（ＳＭＭ）、無症候性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および多発性骨髄腫など）；腫瘍性悪液質；固形腫瘍成長；新生児期障害（気管支肺異形成（予防法）、壊死性小腸結腸炎（ＮＥＣ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、周産期脳虚血に起因する脳性麻痺、および乳児呼吸急迫症候群（ＩＲＤＳ）など）；ホイップル病；外傷性脳損傷；難治性癲癇；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；皮膚ループス；イェスナー・カノフ病；筋萎縮性側索硬化症；全身性硬化症（強皮症）；敗血症性ショック；急性膵炎；慢性再発性多病巣性骨髄炎、非細菌性骨炎（ＮＢＯ）、滑膜炎・ざ瘡・膿疱症・骨増殖症・骨炎（ＳＡＰＨＯ）症候群、およびマジード症候群；再発性多発性軟骨炎；特発性再発性心包炎（ＩＲＰ）；心筋炎；エルドハイム・チェスター病；若年性黄色肉芽腫；膵島細胞移植；血液透析誘導性全身性炎症；移植片対宿主病；ＡＮＣＡ関連糸球体腎炎および再発性糸球体腎炎；コーガン症候群；自己免疫性内耳疾患；慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）；キャッスルマン病；心不全；拡張期心不全；抗シンターゼ症候群；急性ＡＣＬ損傷；急性出血性白質脳炎；ＡＡ  アミロイド症；ディジョージ症候群；全般性疲労；慢性疲労症候群（ＣＦＳ）；湾岸戦争病（ＧＷＩ）；および発作睡眠からなる群から選択される、項目８６または８７に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
８９．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が、癌（多発性骨髄腫、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、黒色腫、および前立腺癌からなる群から選択される癌など）である、項目８７に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
９０．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に、疾患発症から２４時間以内に反復して（疾患発症から２４時間以内に少なくとも２回など、疾患発症から２４時間以内に少なくとも３回など、疾患発症から２４時間連続的になど）投与する、項目８２〜８９のいずれか１項に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
９１．上記融合タンパク質または抱合体が項目５８〜６７のいずれか１つに記載の融合タンパク質または抱合体であり、上記組成物が項目８１に記載の組成物である、項目８２〜８４、８６〜８９のいずれか１つに記載の使用ための融合タンパク質、抱合体、または組成物。
９２．上記融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に、週１回投与する、項目９１に記載の使用のための融合タンパク質、抱合体、または組成物。
９３．有効量の項目１〜７４のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体または項目７９〜８１のいずれか１つに記載の組成物を、それらを必要とする被験体に、投与する工程を含む、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害を治療する方法。
９４．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が、炎症性疾患、自己炎症性症候群、自己免疫疾患、感染症、心血管疾患、虚血性疾患、癌、および糖尿病からなる群から選択される、項目９３に記載の方法。
９５．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が項目８８に定義の群から選択される、項目９３または９４に記載の方法。
９６．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が癌（多発性骨髄腫、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、黒色腫、および前立腺癌からなる群から選択される癌など）である、項目９４に記載の方法。
９７．上記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に、疾患発症から２４時間以内に反復して（疾患発症から２４時間以内に少なくとも２回など、疾患発症から２４時間以内に少なくとも３回など、疾患発症から２４時間連続的になど）投与する、項目９３〜９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．上記融合タンパク質または抱合体が項目５９〜６７のいずれか１つに記載の融合タンパク質または抱合体であり、上記組成物が項目８１に記載の組成物である、項目９３〜９６のいずれか１つに記載の方法。
９９．上記融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に、週１回投与する、項目９７に記載の方法。
【図１Ａ】
2020515252.tif 000051
【図１Ｂ】
2020515252.tif 000052
【図１Ｃ】
2020515252.tif 000053
【図１Ｄ】
2020515252.tif 000054
【図１Ｅ】
2020515252.tif 000055
【図１Ｆ】
2020515252.tif 000056
【図１Ｇ】
2020515252.tif 000057
【図１Ｈ】
2020515252.tif 000058
【図１Ｉ】
2020515252.tif 000059
【図１Ｊ】
2020515252.tif 000060
【図１Ｋ】
2020515252.tif 000061
【図１Ｌ】
2020515252.tif 000062
【図１Ｍ】
2020515252.tif 000063
【図１Ｎ】
2020515252.tif 000064
【図１Ｏ】
2020515252.tif 000065
【図１Ｐ】
2020515252.tif 000066
【図１Ｑ】
2020515252.tif 000067
【図１Ｒ】
2020515252.tif 000068
【図１Ｓ】
2020515252.tif 000069
【図１Ｔ】
2020515252.tif 000070
【図１Ｕ】
2020515252.tif 000071
【図１Ｖ】
2020515252.tif 000072
【図１Ｗ】
2020515252.tif 000073
【図１Ｘ】
2020515252.tif 000074
【図１Ｙ】
2020515252.tif 000075
【図１Ｚ】
2020515252.tif 000076
【図１ＡＡ】
2020515252.tif 000077
【図１ＡＢ】
2020515252.tif 000078
【図１ＡＣ】
2020515252.tif 000079
【図１ＡＤ】
2020515252.tif 000080
【図１ＡＥ】
2020515252.tif 000081
【図１ＡＦ】
2020515252.tif 000082
【図１ＡＧ】
2020515252.tif 000083
【図１ＡＨ】
2020515252.tif 000084
【図１ＡＩ】
2020515252.tif 000085
【図１ＡＪ】
2020515252.tif 000086
【図１ＡＫ】
2020515252.tif 000087
【図１ＡＬ】
2020515252.tif 000088
【図１ＡＭ】
2020515252.tif 000089
【図１ＡＮ】
2020515252.tif 000090
【図１ＡＯ】
2020515252.tif 000091
【図１ＡＰ】
2020515252.tif 000092
【図１ＡＱ】
2020515252.tif 000093
【図１ＡＲ】
2020515252.tif 000094
【図１ＡＳ】
2020515252.tif 000095
【図１ＡＴ】
2020515252.tif 000096
【図１ＡＵ】
2020515252.tif 000097
【図１ＡＶ】
2020515252.tif 000098
【図１ＡＷ】
2020515252.tif 000099
【図１ＡＸ】
2020515252.tif 000100
【図１ＡＹ】
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【図１ＡＺ】
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【図１ＢＡ】
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【図１ＢＢ】
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【図１ＢＣ】
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【図１ＢＤ】
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【図１ＢＥ】
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【図１ＢＦ】
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【図１ＢＧ】
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【図１ＢＨ】
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【図１ＢＩ】
2020515252.tif 000111
【図１ＢＪ】
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【図１ＢＫ】
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【図２】
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【図３】
2020515252.tif 000115
【配列表】
2020515252000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月19日(2019.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭを含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、前記モチーフが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６ＲＸ１８ＱＹＸ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄ（配列番号１６８６）
（相互に独立して、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ３は、Ｅ、およびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ５は、Ｉ、およびＶから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、およびＹから選択され；
Ｘ７は、Ｆ、およびＭから選択され；
Ｘ１０は、Ｆ、およびＹから選択され；
Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹから選択され；
Ｘ１６は、Ｎ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｋ、およびＲから選択され；
Ｘ２１は、Ｔ、およびＶから選択され；
Ｘ２５は、Ｉ、およびＲから選択され；
Ｘ２６は、Ｋ、およびＳから選択され、ならびに
Ｘ２８は、Ｆ、およびＬから選択される）、
および
ｉｉ）Ｘ５がＩまたはＶであることを条件として、ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９３％同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフＢＭを含むＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドであって、前記モチーフが、
ｉ）配列番号１〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列
および
ｉｉ）Ｘ５がＩまたはＶであることを条件として、ｉ）で定義した配列に対して少なくとも９６％同一性有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる、ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項３】
配列ｉ）が、以下の１０の条件Ｉ〜Ｘ：
Ｉ．Ｘ３はＥであること；
ＩＩ．Ｘ５は、Ｉ、およびＶから選択されること；
ＩＩＩ．Ｘ６は、Ｑ、およびＹから選択されること；
ＩＶ．Ｘ７は、Ｆ、およびＭから選択されること；
Ｖ．Ｘ１０は、Ｆ、およびＹから選択されること；
ＶＩ．Ｘ１８は、Ｋ、およびＲから選択されること；
ＶＩＩ．Ｘ２１はＴであること；
ＶＩＩＩ．Ｘ２５はＲであること；
ＩＸ．Ｘ２６は、Ｋ、およびＳから選択されること；ならびに
Ｘ．Ｘ２８は、Ｆ、およびＬから選択されること
のうちの少なくとも５つ（少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または全てなど）を満たす、請求項１に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項４】
配列ｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２および１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、請求項２に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項５】
配列ｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の８位〜３６位の配列に対応する、請求項４に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成し、前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフが、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に、相互連結ループと共に２つのヘリックスの一部を本質的に形成することが好ましい、先行請求項のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項７】
前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、細菌受容体ドメイン、好ましくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡのドメインまたはその誘導体から選択される、請求項６に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項８】
ｘｉｘ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号１７２１）（［ＢＭ］が、先行請求項のいずれか１項に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）；および
ｘｘ）ＢＭに隣接する配列中の、ｘｉｘ）に定義の配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項９】
ｘｘｉ）ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ（配列番号１７０９）（［ＢＭ］が、請求項１〜８のいずれか１項に定義のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合モチーフである）；
および
ｘｘｉｉ）ＢＭに隣接する配列中の、ｘｘｉ）に定義の配列に対して少なくとも８９％同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１０】
配列ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号２０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、請求項８または９に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１１】
ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１２０６〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２１０〜１６３２、１６６７〜１６６８、および１６７０〜１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、請求項１０に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１２】
配列ｘｉｘ）またはｘｘｉ）が、配列番号１２５２、１２８５、１３０７、１３０８、１３２８、１３３１、１４１５、１４２１、１４３５、１５９４、および１６７０〜１６７９からなる群（配列番号１２５２、１３２８、１４３５、１６７２、１６７５〜１６７６、および１６７９からなる群など）から選択される配列中の１位〜５８位の配列に対応する、請求項１１に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１３】
ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１サイトカインとの相互作用（ＩＬ−１Ｒ−ＩのＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βとの相互作用など）を遮断することができる、先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記相互作用のＫＤ値が最大で１×１０−６Ｍ（最大で１×１０−７Ｍなど、最大で１×１０−８Ｍなど、最大で１×１０−９Ｍなど、最大で９×１０−１０など）であるようにＩＬ−１Ｒ−Ｉに結合することができる、先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉが、ヒトＩＬ−１Ｒ−ＩまたはカニクイザルＩＬ−１Ｒ−Ｉ（ヒトＩＬ−１Ｒ−Ｉなど）である、請求項１３または１４に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１６】
少なくとも２つのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドモノマー単位を含み、そのアミノ酸配列が同一でも異なっていてもよい、多量体の形態の先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド。
【請求項１７】
−先行請求項のいずれかに記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
を含む、融合タンパク質または抱合体。
【請求項１８】
前記所望の生物学的活性が治療活性である、請求項１７に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項１９】
前記所望の生物学的活性が結合活性である、請求項１７に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２０】
前記所望の生物学的活性が、前記融合タンパク質または抱合体の組織分布を改変する結合活性である、請求項１７に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２１】
前記所望の生物学的活性が、前記第２の部分が前記融合タンパク質または抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるようなｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増大活性である、請求項１７に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２２】
前記第２の部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体；血清アルブミン；抗体のＦｃ部分、およびトランスフェリンからなる群から選択される、請求項１７に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２３】
前記第２の部分が、抗体のＦｃ部分（ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃなど）である、請求項２２に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２４】
前記Ｆｃが、未変異形態のＦｃと比較してＦｃＲｎに対する親和性の改善および／またはエフェクター応答の減少を示す変異Ｆｃである、請求項２３に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２５】
配列番号１６３９〜１６５８および１７３４〜１７３７からなる群（配列番号１６４８〜１６５４および１７３４〜１７３７からなる群など）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または抱合体。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、または抱合体、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項３０】
少なくとも１つのさらなる活性薬剤（免疫応答改変剤および抗癌剤から選択される薬剤など）をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質である、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
医薬、診断剤、および／または予後剤として使用するための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、もしくは抱合体または請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
医薬として使用するための、請求項３２に記載のＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３４】
ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害の治療、予後、または診断における請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３５】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ関連障害が、炎症性疾患、自己炎症性症候群、自己免疫疾患、感染症、心血管疾患、虚血性疾患、癌、および糖尿病からなる群から選択される、請求項３４に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３６】
前記ＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物を、それらを必要とする被験体に、疾患発症から２４時間以内に反復して（疾患発症から２４時間以内に少なくとも２回など、疾患発症から２４時間以内に少なくとも３回など、疾患発症から２４時間連続的になど）投与する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＩＬ−１Ｒ−Ｉ結合ポリペプチド、融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３７】
前記融合タンパク質または抱合体が請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質または抱合体であり、前記組成物が請求項３１に記載の組成物である、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の使用のための融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【請求項３８】
前記融合タンパク質、抱合対、または組成物を、それらを必要とする被検体に、週１回投与する、請求項３７に記載の使用のための融合タンパク質、抱合体、または組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月25日(2019.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020515252000001.app
【国際調査報告】
2020515252.tif 000116
2020515252.tif 000117
2020515252.tif 000118
2020515252.tif 000119