(57)【要約】  幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階と、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を回収する段階と、を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法、該方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液、及び該方法を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法を提供する。【選択図】図６
2020525039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して、幹細胞由来の皮膚前駆細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）に分化させる段階と、
前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液を回収する段階と、を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液を製造する方法。
【請求項２】
前記アスコルビン酸の濃度は０．０３ないし３μＭであり、ヒドロコルチゾンの濃度は０．０５ないし５μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幹細胞を幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階は、１２０ないし６００時間培養することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階は、１０ないし３５０時間培養することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階は、前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を無血清培地で培養することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞を幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階以前に、前記幹細胞を、血清を含む培地で１０ないし３５０時間培養する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質1（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン１を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質1（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン１を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液。
【請求項１１】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質１０（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン１を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を含むことを特徴とする請求項１０に記載の培養液。
【請求項１２】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質10（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン１を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で含むことを特徴とする請求項１０に記載の培養液。
【請求項１３】
幹細胞を、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階と、 
前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞馴化培養液を回収する段階と、を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法。
【請求項１４】
前記アスコルビン酸の濃度は０．０３ないし３μＭであり、ヒドロコルチゾンの濃度は０．０５ないし５μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞を幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階は、１２０ないし６００時間培養することによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階は、１０ないし３５０時間培養することにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階は、前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を無血清培地で培養することにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞を幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階以前に、前記幹細胞を、血清を含む培地で１０ないし３５０時間培養する段階を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質13（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン１を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法、前記方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液、及び幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は多分化能があって特定細胞に分化し、胚性幹細胞と、成体幹細胞と、人工多能性幹細胞とに分けられる。現在まで成体幹細胞の研究はほとんど骨髄で行われており、一部では脂肪組織あるいは臍帯血から幹細胞を分離及び培養する方式で行われている。しかし、骨髄及び脂肪組織細胞は侵襲的な方法で採取されるが、壮年期や老年期の患者から分離した幹細胞の場合、分化能及び増殖力が減少する。また、臍帯血の場合に採取が容易ではあるが、臍帯血内の幹細胞の含量は低い。臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ：ＵＣ）及び胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）は骨髄または脂肪由来細胞とは異なり、すでに体から分離された組織から抽出するため、非侵襲である。また、胚芽由来幹細胞とは異なり、倫理的側面からも自由である。よって、最近難治性または再生医学の有用な材料として脚光を浴びており、原始細胞として増殖能及び分化能を同時に満たすことができ、組織の再生だけではなく組織の特性に合わせて分化した後で使用できるという利点を有する。
【０００３】
一方、細胞治療剤は、体内移植後の生存率が高くなく、免疫拒絶反応を引き起こす可能性があって、実際の臨床適用で広範かつ安定的に成功した例を見出し難い。それにより、細胞治療剤の代わりに、細胞の条件培養液が注目を浴びている。細胞の条件培養液（または細胞培養液という）は、細胞を培養した後で得られた細胞を含まない培地であって、細胞の成長に欠かせない様々な成分、例えば、サイトカイン、成長因子などが含まれている。細胞培養液は、細胞の成長を促進させたり、特定の成分を分離するために使用されており、この他にも、培養液自体に様々な疾患の治療に応用されている。
【０００４】
本発明者らは有用なタンパク質の含有量を高めるために、最適の培養条件を確立し、これにより、以前の細胞培養液を製造する環境では発現されていないか、または非常に少ない量でのみ発現されることが知られている様々なタンパク質を含有する細胞培養液を開発した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一態様は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法を提供する。
【０００６】
他の態様は、前記方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を提供する。
【０００７】
他の態様は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様は、幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階と、前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を回収する段階と、を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法を提供する。
【０００９】
用語「幹細胞」は、分化能（ｐｏｔｅｎｃｙ）及び自己再生能（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）を持つ細胞を意味する。幹細胞は、分化能力によって全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、または単一分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）に分けられる。前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳＣ）（着床前の胚芽内細胞）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（各組織や臓器に存在する未分化細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳＣ）（体細胞に遺伝子及び／またはタンパク質を挿入して脱分化が誘導された細胞、または誘導多能性幹細胞）からなる群から選択された一つ以上でありうる。
【００１０】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞でありうる。用語「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｒｍ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）」は成体幹細胞であって、多分化能及び自己再生能を持ち、増殖能に優れて遺伝的に安定している。前記間葉系幹細胞は、脂肪、軟骨、骨、骨髄間質、筋肉、神経などを作るのに役に立つ細胞であり、多様な細胞、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞及び骨細胞などに分化する。
【００１１】
前記幹細胞は、分化能及び自己再生能を持つものであれば、その種類や由来は制限されない。前記幹細胞は、例えば、哺乳動物、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、または兎などに由来したものでありうる。前記幹細胞は、分離された臍帯、胎盤、脂肪、骨髄、臍帯血、または羊水に由来したものでありうる。用語「分離された」とは、自然に発生する細胞または組織の環境とは異なる環境に存在することを意味する。
【００１２】
用語「臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ」は、哺乳類の胎児が胎盤で成長できるように母体と胚とを連結する緒を意味し、一般的にホウォートンゼリーで取り囲まれている３個の血管、すなわち、２個の臍動脈及び１個の臍静脈で構成された組織でありうる。用語「胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）」は、哺乳類の妊娠の中に胎児のために作られる器官を意味し、胎盤の一方は母体と接しており、もう一方は、胎児と接しており、その間の空間に母体の血液が込められており、胎児に栄養分を供給するものでありうる。胎盤は羊膜、絨毛膜、脱落膜の３層で構成されている。羊膜は、胎児を取り囲んでいる薄くて透明な膜であり、羊水が入っており、羊水及び／または羊膜には胎児の幹細胞が存在する。脱落膜は、受精卵が子宮に着床されるために子宮の上皮細胞が変形して形成された膜であり、母体の幹細胞が存在する。絨毛膜は、胎児や羊水を取り囲んでいる羊膜と脱落膜との間にある膜であって、受精卵で発生して卵膜の一部を構成する。胎盤由来の幹細胞は、胎児または母体に由来したものでありうる。羊水由来の幹細胞は、胎児に由来したものでありうる。臍帯または胎盤路に由来した幹細胞は、その量が非常に豊かで増殖がよくでき、他の細胞への分化も可能である。用語「骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）」は、赤血球、白血球及び血小板などを含む血液細胞を作る組織を意味する。用語「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」は、分娩後に新生児の臍帯から出た血液を意味する。用語「脂肪」は、体脂肪を意味し、脂肪に由来した幹細胞は収得が容易であり、脂肪細胞の約１％が幹細胞であると推定されるため、収率が高い。
【００１３】
前記方法は、分離された臍帯、胎盤、脂肪、骨髄、臍帯血または羊水を収得する段階を含む。前記分離された臍帯、胎盤、脂肪、骨髄、臍帯血または羊水は、通常の解剖学的な方法によって得ることができる。前記臍帯、胎盤、羊水または臍帯血は、母親の母体から出産後に分離された臍帯、胎盤、羊水または臍帯血でありうる。前記分離された臍帯、胎盤、羊水または臍帯血は、分離された後で速かに滅菌された容器及び氷に入れて保管される。
【００１４】
胎盤の場合、例えば、胎盤内に存在する胎盤組織を滅菌されたはさみで複数の部位に切り取ることにより得る。前記胎盤組織は、羊膜、絨毛膜、または脱落膜でありうる。臍帯の場合、例えば、臍帯を胎盤から分離することで得る。前記臍帯から動脈及び静脈をさらに除去できる。脂肪の場合、例えば、腹部または太ももの皮下脂肪層の脂肪吸引（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）を行うことによって得る。得られた胎盤組織、臍帯または脂肪は、抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、またはそれらの組み合わせが含まれているリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で１回、２回または３回以上洗浄することで組織に存在する血液などの汚染物質を除去できる。
【００１５】
前記方法は、分離された臍帯、胎盤または脂肪を直接酵素と反応させるか、または滅菌されたはさみなどを使ってさらに細かく切り取った後で酵素と反応させる段階を含むことができる。例えば、前記分離された臍帯、胎盤または脂肪を滅菌されたはさみなどを使ってさらに細かく（例えば、約２０ｍｍ以下、または約１０ｍｍ以下）切り取った後、細切された細胞を酵素と反応させるのである。 
前記方法は、幹細胞を収得する段階を含む。前記幹細胞を収得する方法は、当業者に公知の方法で行われる。臍帯または胎盤の場合、例えば、前記分離された臍帯または胎盤を培養容器に付着させ、５ないし２０日、１０ないし２０日、または１０ないし１５日培養する段階と、前記培養された臍帯または胎盤から細胞が伸び出ることを確認する段階、及び／または臍帯または胎盤と分離酵素とを反応させる段階を含む。または、臍帯または胎盤の場合、例えば、前記分離された臍帯または胎盤と分離酵素とを反応させる段階を含む。前記分離酵素は、コラゲナーゼを含む。前記コラゲナーゼは、コラーゲンのペプチド結合を破壊する酵素を意味し、コラゲナーゼタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶまたはこれらの組み合わせを含むものでありうる。前記分離酵素は、１０Ｕ／ｍｌないし４０００Ｕ／ｍｌ、２０Ｕ／ｍｌないし２０００Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌないし８００Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌないし４００Ｕ／ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌないし３００Ｕ／ｍｌ、または２００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼを含む。また、前記分離酵素は、トリプシン、ディスパーゼまたはこれらの組み合わせを含むものでありうる。また、前記分離酵素を含む溶液は、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼまたはこれらの組み合わせを含む水、塩水（ｓａｌｉｎｅ）、例えば、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含むものでありうる。前記臍帯または胎盤と分離酵素とを反応させる段階は振とうまたは静置によって行われる。前記振とうまたは静置は、約２０℃ないし約４０℃、約３０℃ないし約４０℃、約３５℃ないし約４０℃、または約３７℃で行われ、１ないし２０時間、２ないし１０時間、４ないし９時間、または５ないし６時間行われる。脂肪の場合、例えば、前記分離された脂肪と分離酵素とを反応させる段階を含むことができる。前記分離酵素は、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼまたはこれらの組み合わせを含むものでありうる。前記分離酵素を含む溶液は、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼまたはこれらの組み合わせを含む水、塩水、例えば、ＨＢＳＳを含むものでありうる。前記脂肪と分離酵素とを反応させる段階は、振とうまたは静置により行われる。
【００１６】
さらに、前記臍帯、胎盤または脂肪と分離酵素とを反応させた後で分離酵素を不活性化するための過程を行うことができ、例えば、血清を添加して酵素反応を停止させることができる。また、前記臍帯、胎盤または脂肪と分離酵素とを反応させた後で臍帯、胎盤または脂肪から幹細胞を得る方法は、当業者に公知の方法によって行われ、例えば、遠心分離した後で細胞体（ｓｔｒａｉｎｅｒ）を使って細胞を分離して行われる。
【００１７】
前記方法は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階以前に、前記幹細胞を、血清を含む培地で培養する段階を含む。前記血清は、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、仔ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＢＣＳ）またはこれらの組み合わせでありうる。前記血清は、分化培地の総体積対比約１％ないし約５０％、約２％ないし約２５％、約５％ないし約２０％、約７．５％ないし約１２．５％、または約１０％である。前記培地は、線維芽細胞成長因子−４（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−４：ＦＧＦ−４）及び／またはヘパリンを含むものである。前記培地の中でＦＧＦ−４の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌないし約４０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌないし約３０ｎｇ／ｍｌ、または約２５ｎｇ／ｍｌである。前記培地の中でヘパリンの濃度は、約０．５μｇ／ｍｌないし約２μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌないし約１．５μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌである。前記培地は抗生物質を含む。前記抗生剤は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンまたはこれらの組み合わせを含む。前記培地の中で抗生物質の濃度は、約１０μｇ／ｍｌないし約２５０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌないし約１００μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌないし約６５μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌである。 
前記方法は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階以前に、前記幹細胞を、血清を含む培地で１０ないし３５０時間培養する段階を含む。前記培養は１０ないし３５０時間、２０ないし１７０時間、または５０ないし７０時間、または０．５ないし１４日、１日ないし７日、または２日ないし３日行われる。前記培養は、分離された幹細胞をＰ０にすることである。前記培養の継代数は特に制限されるものではなく、所望の増殖細胞の数によって適当に継代数を選択できる。前記培養の継代数は、１ないし２０継代、２ないし１０継代、３ないし７継代、または４ないし５継代行うことで必要な数の累積増殖細胞を得る。
【００１８】
前記方法は、前記幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階を含む。前記幹細胞は、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化する。
用語「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、細胞が分裂増殖して成長する間に互いに構造や機能が特殊化する現象、すなわち、生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられたところを行うために形態や機能が変わることを意味する。特定細胞類型への分化程度を測定または判断することは、当業界で公知の方法によって行われる。また、前記分化は、流細胞分析または免疫細胞化学などの技法を使って細胞表面標識（例えば、組織−特異的または細胞−標識特異的抗体で細胞を染色する）及び細胞形態の変化を測定しつつ、光学顕微鏡または共焦点顕微鏡を使って細胞形態を調査することで、または重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）及び遺伝子−発現プロファイルなどの当業界で公知の技法を使って遺伝子発現相の変化を測定することで確認される。
【００１９】
前記幹細胞は、周辺微細環境（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ）によって細胞の分裂、分化または移動というような行動様相が変わる。前記幹細胞は、周辺微細環境からの刺激によって遺伝子発現様相が変わることがあり、これによって分化する細胞が変わる。
【００２０】
前記分化培地は、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む。アスコルビン酸は抗酸化特性を持つ有機化合物であって、ビタミンＣの一種であり、水溶性であり、分子式はＣ６Ｈ８Ｏ６を持つ。前記アスコルビン酸はＬ−アスコルビン酸である。前記アスコルビン酸は、アスコルビン酸またはその塩の形態である。前記アスコルビン酸の塩は、無機酸塩、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であり、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などであり、例えば、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸マグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸カリウム、Ｌ−アスコルビン酸カルシウムなどのＬ−アスコルビン酸塩である。前記アスコルビン酸は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞の増殖及び基底膜形成（ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に影響を与える。培地の中の前記アスコルビン酸の濃度は、約０．０３μＭないし約３μＭ、約０．０５ないし約２μＭ、約０．１ないし約１μＭ、または約０．１μＭないし約０．５μＭである。
【００２１】
前記ヒドロコルチゾンは副腎皮質ホルモンの一種であり、分子式Ｃ２１Ｈ３０Ｏ５を持つ。前記ヒドロコルチゾンは、ヒドロコルチゾンまたはその塩の形態を持つ。前記ヒドロコルチゾンの塩は酸付加塩であり、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭素化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸、亜リン酸などの無機酸塩、脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル−置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエート及びアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの無毒性有機酸などである。ヒドロコルチゾンは、皮膚前駆細胞への分化能を刺激する因子であって、小さくは脂質合成（ｌｉｐｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の構成に役割を果たし、表皮層の上部に位置する角質層の形成を促進させる。培地の中の前記ヒドロコルチゾンの濃度は、約０．０５μｇ／ｍｌないし約５μｇ／ｍｌ、約０．０７５μｇ／ｍｌないし約３．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌないし約２．５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌないし約１．２５μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌないし約１μｇ／ｍｌ、または約０．４μｇ／ｍｌないし約０．６μｇ／ｍｌである。 
前記分化培地は、細胞培養に用いられるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地、ＡｍｉｎｏＭａｘＩＩ ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地、ＥＢＭ−２ Ｂａｓａｌ培地、Ｃｈａｎｇ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ及びＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦからなる群から選択された一つ以上を含む。前記分化培地は血清を含む。前記血清は、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、仔ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＢＣＳ）またはこれらの組み合わせでありうる。前記血清は、分化培地の総体積対比約１％ないし約５０％、約２％ないし約２５％、約５％ないし約２０％、または約７．５％ないし約１２．５％である。
【００２２】
前記方法は、前記幹細胞を分化培地で１２０ないし６００時間、１５０ないし５００時間、１８０ないし４５０時間、または２００ないし３００時間、または５ないし２５日、６ないし２１日、７ないし１８日、８ないし１５日、または９ないし１２日培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させることを含む。
【００２３】
皮膚は表皮層、真皮層及び皮下脂肪層で構成される。表皮層の最も下の部分には基底層が位置し、新たな表皮細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、皮膚組織細胞または角質形成細胞）は、細胞分裂を通じてこの基底層で形成され、形成された表皮細胞は表皮層の上部の死んだ細胞を続けて代替する。このような過程は皮膚細胞の再生を誘導する。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、表皮層、例えば、基底層を構成する細胞である。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、表皮細胞の前駆細胞である。
【００２４】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、その分化能及び自己再生能が幹細胞に比べて制限された細胞である。例えば、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、１００％の分化能を持つ細胞または任意の％の分化能を持つ幹細胞から、０％の分化能を持つ細胞または任意の％より低い％の分化能を持つ細胞に転換された細胞である。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、幹細胞由来の表皮前駆細胞、分化した皮膚前駆細胞、分化した表皮細胞、皮膚幹細胞または表皮幹細胞と互換的に使われる。
【００２５】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、分化培地で培養する前の幹細胞に比べて、ケラチン５（Ｋｒｔ５）、ケラチン１（Ｋｒｔ１）及びケラチン１４（Ｋｒｔ１４）からなる群から選択された一つ以上の発現が増加したものでありうる。すなわち、前記幹細胞が皮膚前駆細胞に分化しつつＫｒｔ５、Ｋｒｔ１及びＫｒｔ１４からなる群から選択された一つ以上の発現が増加する。前記増加は、遺伝子の発現、すなわち、ｍＲＮＡの量またはタンパク質の量が２倍以上、４倍以上、８倍以上、１０倍以上、または２０倍以上増加したものである。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、分化程度によってＫｒｔ１０及び／またはインボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ：ＩＶＬ）を多量に発現する分化後期に到逹していない状態に分化する。前記発現は、例えば、リアルタイム重合酵素連鎖反応法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ：ＲＴ−ＰＣＲ）、または免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ：ＩＢ）などの技法を使って遺伝子発現上の変化を測定することで確認される。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、一定のサイズの円形の特異的な形態を示すものである。 
前記方法は、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階を含む。
【００２６】
前記培養は、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で継代培養なしに培養して行われる。前記培地は、タンパク質生産に適した培地であって、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞が培養される過程で、細胞間の相互作用を介して有用なタンパク質を生産し、かつ細胞の外に分泌できる培地を意味する。前記培地は、無血清培地である。前記培地は、塩化コリン、フェノールレッド（またはフェノースルホンフタレイン）またはこれらの組み合わせを含まない培地である。前記培地は、細胞培養に用いられるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地、ＡｍｉｎｏＭａｘＩＩ ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地、ＥＢＭ−２ Ｂａｓａｌ培地、Ｃｈａｎｇ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ及びＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦからなる群から選択された一つ以上を含む。
【００２７】
前記方法は、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を、培地で１０ないし３５０時間、１５ないし２００時間、２０ないし１７０時間、または４０ないし８０時間、または０．５ないし１５日、１ないし８日、１．５ないし４日、または２ないし３日培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させることを含む。
【００２８】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物は、分化した皮膚前駆細胞を培地で培養する過程中、または培養した後で収得した培地、分化した皮膚前駆細胞、またはそれらの混合物を意味する。
【００２９】
前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、培地で培養されつつ細胞間の相互作用を通じて細胞の外に皮膚前駆細胞由来のタンパク質を分泌できる。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、周辺環境からの刺激によって遺伝子発現様相が変わり、これによって、幹細胞由来の皮膚前駆細胞から分泌されるタンパク質の種類及びその量も変わる。前記刺激は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞が培養される培地及び／または培養時間を含む。すなわち、培養される培地及び／または培養時間によって幹細胞由来の皮膚前駆細胞から分泌されるタンパク質の種類及びその量が変わり、幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液内に存在するタンパク質の組成及び含量も変わる。 
【００３０】
前記方法は、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を回収する段階を含む。前記回収は、分化した皮膚前駆細胞を培地で培養する過程中、または培養した後で収得された、幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物またはその上澄み液をそのまま収得するものである。前記回収は、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養する過程中、または培養した後で収得された、幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物またはその上澄み液を遠心分離するか、またはフィルタで濾過して、分化した皮膚前駆細胞及び／または巨大分子をとり除いた後で収得するものである。 
【００３１】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞が細胞の外に分泌するタンパク質を含む。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞は、培地で培養されることでタンパク質を生産して分泌する。前記タンパク質は、サイトカイン、成長因子などの有用なタンパク質を含む。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、下記の図５に記載のタンパク質を含む。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ２：ＴＩＭＰ２）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質１（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ１）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン１を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を含む。 
【００３２】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質1（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン２を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上の濃度を約１０ｐｇ／ｍｌ以上、約１５ｐｇ／ｍｌ以上、または約２０ｐｇ／ｍｌ以上含む。
【００３３】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、グルーチョ（ｇｒｏｕｃｈｏ：ＧＲＯ）、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質（ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｂｐ１）、クロスベインレス−２（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ−２：ＣＶ−２）、スマッド４（Ｓｍａｄ４）、インターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８：ＩＬ−８）、アクチビンＣ（ＡｃｔｉｖｉｎＣ）、インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６：ＩＬ−６）、マクロファージ炎症タンパク質２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２：ＭＩＰ２）、及びアクチビンＡ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ）からなる群から選択された一つ以上を含む。
【００３４】
幹細胞を前記分化培地で培養して皮膚前駆細胞に分化させることで収得された、分化した皮膚前駆細胞を培地で培養する場合、幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含まない培地で培養することで、収得された細胞を培地で培養する場合に比べて、または通常の皮膚前駆細胞を培地で培養する場合に比べて、細胞の培養物中及び／または細胞由来のタンパク質中の前記有用なタンパク質の量が増加する。前記増加は、例えば、リアルタイム重合酵素連鎖反応法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ：ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫ブロット（ＩＢ）、または酵素結合免疫吸着分析法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）などの技法を使って遺伝子発現相の変化を測定することで確認される。
【００３５】
他の態様は、幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階と、前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を回収する段階と、を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を提供する。 
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞が細胞の外に分泌するタンパク質を含んでもよく、下記の図５に記載のタンパク質を含んでもよい。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質1（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ 1：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン２を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）からなる群から選択された一つ以上を含む。 
【００３６】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、分化した皮膚前駆細胞を培地で培養した後で得られる条件培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）であって、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞が培養される過程中で細胞間の相互作用を通じて細胞の外に分泌するタンパク質を含む。前記タンパク質は、サイトカイン、成長因子などの有用なタンパク質を含む。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液は、培養液内の複数の有用なタンパク質を高濃度で含んでおり、前記製造方法によれば、前記過程を繰り返して行う場合にも、有用なタンパク質の組成及びその濃度の一定な幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を収得する。 
【００３７】
他の態様は、幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階と、前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を回収する段階と、を含む幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法を提供する。
【００３８】
前記幹細胞をアスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含む分化培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞に分化させる段階と、前記分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞を培地で培養して幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物を生成させる段階と、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞の培養物から幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を回収する段階と、タンパク質とについては前記の通りである。 
【００３９】
前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞から生産されたタンパク質は、分化した幹細胞由来の皮膚前駆細胞が培地で培養される過程中で細胞間の相互作用を通じて細胞の外に分泌される有用なタンパク質を含む。前記タンパク質は、サイトカイン、成長因子などの有用なタンパク質を含む。前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法によって生産されたタンパク質は、複数の有用なタンパク質を高濃度で含んでおり、前記生産方法によれば、前記過程を繰り返して行う場合にも、有用なタンパク質の組成及びその濃度の一定なタンパク質を収得する。また、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞からタンパク質を生産する方法によれば、複数の有用なタンパク質を量産できる。
【発明の効果】
【００４０】
一態様による幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液を製造する方法、及び前記方法によって生産された幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液によれば、前記幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液内に有用なタンパク質を多量含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】皮膚由来の未分化表皮細胞（ｓｋｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を表皮細胞に分化させた後、及び胎盤由来の幹細胞及び臍帯由来の幹細胞を分化培地で１１日間皮膚前駆細胞に分化させた後、各細胞の形態を示す図面である。
【図２】胎盤由来の幹細胞を分化培地で皮膚前駆細胞に分化させる過程中、３日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日にＫｒｔ５、Ｋｒｔ１、ＩＶＬ、Ｋｒｔ１４、及びＫｒｔ１０の発現レベルを測定した結果を示す図面である。
【図３】胎盤由来の幹細胞を分化培地で皮膚前駆細胞に分化させる過程中、３日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日にＫｒｔ１４のタンパク質レベルを測定した結果を示す図面である。
【図４】胎盤由来の幹細胞を分化培地で皮膚前駆細胞に分化させる過程中、３日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日にＫｒｔ１４のタンパク質レベルを測定した結果を示す図面である。
【図５】幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液で発現量の多いサイトカインのうち、上位２４種を示す図面である。
【図６】幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液（分化培養液）、未分化幹細胞培養液（未分化培養液）、及び通常の表皮細胞培養液（表皮細胞培養液）において、ニドゲン−１の濃度を示す図面である。
【図７Ａ】胎盤由来の幹細胞の表面抗原特性を示す結果を示す図面である。
【図７Ｂ】胎盤由来の幹細胞にそれぞれ分化誘導物質を添加し、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞に分化を誘導した結果を示すイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液の製造及び幹細胞由来の皮膚前駆細胞から生産されたタンパク質成分の確認
１．幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液の製造
（１）幹細胞から皮膚前駆細胞への分化 
正常分娩した健康な母親から事前に十分な説明に基づく同意（ｉｎｆｏｒｍｅｄ ｃｏｎｓｅｎｔ）を受け、正常の胎盤の分娩時に収集された胎盤から臍帯を分離した。分離された胎盤及び臍帯それぞれを、Ｃａ／Ｍｇを含んでいない（ｆｒｅｅ）ダルベッコ・リン酸緩塩緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＤＰＢＳ）で２ないし５回洗浄して血液除去した。次いで、胎盤組織を１ないし５ｍｍほどのサイズに切り取った。また、臍帯から動脈及び静脈を除去した後、１ないし５ｍｍほどのサイズに臍帯を切り取った。次いで、前記胎盤及び臍帯それぞれを培養容器に付着して１０ないし１５日培養をし、前記培養された組織から細胞が伸び出ることを確認した後、５ないし６時間２００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩを加えて胎盤由来の幹細胞及び臍帯由来の幹細胞をそれぞれ分離した。
【００４４】
胎盤由来の幹細胞が間葉系幹細胞の特性を示すかどうかを確認するために、表面タンパク質の分析のために流細胞分析を行った。細胞をＤＰＢＳを使って洗浄し、２％のＦＢＳが含まれているＤＰＢＳに入れてＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ２９、ＣＤ４９、ＣＤ９、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＥＲ抗体と約２０分間反応させた。次いで、流細胞分析機（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｂｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じて表面抗原特性を分析した。図７Ａは、胎盤由来の幹細胞の表面抗原特性を示す結果を示す図面である。図７Ａに示したように、胎盤由来の幹細胞でＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４９、ＣＤ９及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現量が多く現れたことから、前記胎盤由来の幹細胞が間葉系幹細胞の性格を持つということが分かる。
【００４５】
また、胎盤由来の幹細胞の分化能分析のために、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化を誘導した。次いで、脂肪細胞への分化を誘導した試料はＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色し、軟骨細胞への分化を誘導した試料はＡｌｃｉａｎ ｂｌｕｅで染色し、骨芽細胞への分化を誘導した試料はＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓで染色して、分化能を分析した。図７Ｂは、胎盤由来の幹細胞にそれぞれ分化誘導物質を添加し、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞に分化を誘導した結果を示すイメージである。図７Ｂに示したように、前記分離された細胞は、間葉系幹細胞のような多分化能を持つものであって、それからそれぞれ脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞に分化が誘導されたということが分かる。前記分離された細胞を１００ないし５，０００細胞／ｃｍ２の濃度でマルチフラスコに分注し、前記細胞をＰ０として、２５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子−４（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−４：ＦＧＦ−４）、１μｇ／ｍｌのヘパリン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）が含有されているＭＥＭ ａｌｐｈａ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＰＳ−ＣＭ）培地で３７℃、５％のＣＯ２の条件で２日間、５継代の間継代培養した。
【００４６】
次いで、培養された細胞にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）培地と０．３μＭのアスコルビン酸、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、及び１０％のＦＢＳを含む分化培地をマルチフラスコに５ｍｌ／ｃｍ２になるように添加し、３７℃、５％のＣＯ２の条件の下で１１日間培養した。対照群は、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含まない培地で培養したものを使った。
【００４７】
図１は、皮膚由来の未分化表皮細胞を表皮細胞に分化させた後、及び胎盤由来の幹細胞及び臍帯由来の幹細胞を分化培地で１１日間皮膚前駆細胞に分化させた後、各細胞の形態を示す図面である。胎盤由来の幹細胞及び臍帯由来の幹細胞それぞれは、分化培地で皮膚前駆細胞の形態に類似した小さくて一定のサイズの円形の細胞状に分化した。図１に示したように、胎盤由来の幹細胞及び臍帯由来の幹細胞は、分化培地で培養された後で皮膚前駆細胞の形態を示すということが分かる。 
【００４８】
（２）分化した皮膚前駆細胞での遺伝子発現の確認
（２．１）リアルタイム重合酵素連鎖反応法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ：ＲＴ−ＰＣＲ）の分析
（１）の胎盤由来の幹細胞を皮膚前駆細胞に分化させる過程中、中期及び末期段階に発現する遺伝子であるＫｒｔ５、Ｋｒｔ１、ＩＶＬ、Ｋｒｔ１４、及びＫｒｔ１０の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。 
【００４９】
胎盤由来の幹細胞を皮膚前駆細胞に分化させる過程中、３日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日に細胞を収得し、フェノール／クロロホルムを使って細胞からＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの遺伝子発現の程度は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７００配列検出システム（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で、ＲＴ−ＰＣＲで分析した。この時、合成されたｃＤＮＡ、下記の表１に記載のＫｒｔ５、Ｋｒｔ１、ＩＶＬ、Ｋｒｔ１４、及びＫｒｔ１０それぞれに特異的なプリマーセット、２ｘＴａｑＭａｎマスター混合物及び２０ｘｐｒｅｍａｄｅ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キットを用いた。ＰＣＲ条件は、次の通りである：９５℃で１０分、９５℃で１５秒及び６０℃で１分、４０回繰り返し。Ｋｒｔ５、Ｋｒｔ１、ＩＶＬ、Ｋｒｔ１４、及びＫｒｔ１０のｍＲＮＡレベルを、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＰＤＨ）数値に正規化した。
【００５０】
【表１】
2020525039.tif 000003
【００５１】
図２は、胎盤由来の幹細胞を皮膚前駆細胞に分化させる過程中、３日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日にＫｒｔ５、Ｋｒｔ１、ＩＶＬ、Ｋｒｔ１４、及びＫｒｔ１０遺伝子の発現レベルを測定した結果を示す。Ｙ軸は、ヒトＧＡＰＤＨに正規化した前記遺伝子の発現量を示す。図２に示したように、分化が進みつつ５日以後に皮膚前駆細胞の分化段階で中期に発現するＫｒｔ１４のｍＲＮＡレベルが増加した。 
【００５２】
（２．２）免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ：ＩＢ）
（１）の胎盤由来の幹細胞を皮膚前駆細胞に分化させる過程中、中期段階に発現する遺伝子であるＫｒｔ１４の発現レベルを免疫ブロットで測定した。 
【００５３】
胎盤由来の幹細胞を皮膚前駆細胞に分化させる過程中、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日に細胞を収得し、収得した細胞を細胞溶解バッファで溶解した。前記細胞溶解バッファは、ＲＩＰＡバッファ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含むものを使った。細胞溶解物に含まれているタンパク質を定量し、各試験群及び対照群において、タンパク質２０μｇを７．５％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動法（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。分離されたタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移動させた。前記ＰＶＤＦ膜を１次抗体と４℃で一晩中反応させた。翌日、前記ＰＶＤＦ膜をＴｗｅｅｎとＴｒｉｓ、ＮａＣｌが含有されているＴＢＳＴ溶液で洗浄し、ＨＲＰが結合された２次抗体と常温で反応させた。タンパク質バンドを、増加した化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＥＣＬ）キットシステム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って可視化した。
【００５４】
図３及び図４は、胎盤由来の幹細胞を分化培地で皮膚前駆細胞に分化させる過程中、３日、５日、７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、１９日及び２１日にＫｒｔ１４のタンパク質レベルを測定した結果を示す。図３及び図４に示したように、胎盤由来の幹細胞は、分化培地で培養された５日以後からＫｒｔ１４タンパク質の量が段々増加したということが分かる。一方、胎盤由来の幹細胞は、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含まない培地で培養された後、Ｋｒｔ１４遺伝子が発現しないか、または非常に低い程度に発現するということが分かった。
【００５５】
（３）幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液の製造
（１）で分化した皮膚前駆細胞から培養液を生産した。 
（１）で分化した皮膚前駆細胞から分化培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄して残留血清を除去した。次いで、塩化コリン及びフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を培養プレートに２ないし３ｍｌ／ｃｍ２になるように添加し、３７℃、５％のＣＯ２の条件で２ないし４日間培養した。その後、分化した皮膚前駆細胞及び培地が混合された皮膚前駆細胞の培養物から上澄み液を回収した。次いで、前記上澄み液を０．２２μｍのフィルタでろ過して分化した皮膚前駆細胞培養液を収得した。対照群は、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含まない培地で培養された胎盤由来の幹細胞（以下、未分化幹細胞）及び通常の表皮細胞それぞれに培地を添加し、かつ培養して回収された培養液を使った。
【００５６】
（４）幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液のタンパク質成分の分析
（３）で収得した、分化した皮膚前駆細胞培養液内で細胞由来のタンパク質の成分をセクリトム分析で確認した。具体的に総５０７種のサイトカインのレベルを確認した。 
セクレトーム分析は、ＲａｙＢｉｏヒトサイトカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ）のプロトコルによって、ＲａｙＢｉｏＴＭ カスタムＬ−シリーズヒトサイトカインアレイ（ＲａｙＢｉｏＴＭ Ｃｕｓｔｏｍ Ｌ−Ｓｅｒｉｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ）（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を用いて行った。得られたスポットの相対強度は、イメージＪによって測定され、背景除去（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）によって補正された。結果は、２回判読結果の平均値で示した。 
【００５７】
図５は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液で発現量の多いサイトカインのうち、上位２４種を示す図面である。表２は、分化した皮膚前駆細胞培養液で多量に発現するサイトカイン２４種を示したものである。分化した皮膚前駆細胞培養液は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質1（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ １：ＴＩＭＰ１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１：ＴＩＭＰ２）、エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）、Ｘ連鎖エクトジスプラシン−Ａ受容体（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ−Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＸＥＤＡＲ）、アンジオポエチン−１、酸性かつシステイン豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＰＡＲＣ）、上皮細胞成長因子類似及び二つのフォリスタチン類似のドメイン２を持つ膜貫通タンパク質／トモレグリン−１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｔｗｏ Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１：ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１）、ニドゲン−１、インスリン類似成長因子結合タンパク質−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ＩＧＦＢＰ−３）、トロンボスポンジン−２、腫瘍懐死因子関連の活性誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ：ＴＲＡＮＣＥ）、及びインターロイキン−１５受容体アルファ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＬ−１５Ｒアルファ）などを多量に含有するということが分かる。
【００５８】
【表２】
2020525039.tif 000004
【００５９】
（５）幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液内のタンパク質濃度の分析
前記分化した皮膚前駆細胞培養液で表２のタンパク質が多量分泌するということを確認し、これらの分泌量を、酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）で定量的に分析した。対照群は、アスコルビン酸及びヒドロコルチゾンを含まない培地で培養された胎盤由来の幹細胞（以下、未分化幹細胞）に培地を添加し、２ないし４日間培養して回収された培養液、及び表皮細胞に培地を添加し、２ないし４日間培養して回収された培養液を使った。ＥＬＩＳＡキットは、トロンボスポンジンに対してＤＴＰ００Ｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｉｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ニドゲン−１に対してＥＬＨ−Ｎｉｄｏｇｅｎ １（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、ＴＲＡＮＣＥに対してＭＢＳ２６２４６３（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ＩＬ−１５Ｒアルファに対してＥＬＨ−ＩＬ１５ＲＡ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を用い、製造社の指示に従って行った。いずれも４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーＥｐｏｃｈ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｃ．）を使って吸光度を測定し、Ｇｅｎ５（２．００）ソフトウェアを用いて分析した。
【００６０】
下記の表３は、分化した皮膚前駆細胞培養液でトロンボスポンジン、ニドゲン−１、ＴＲＡＮＣＥ、及びＩＬ−１５Ｒアルファの濃度を測定した結果である。分化した皮膚前駆細胞培養液は、ニドゲン、トロンボスポンジンなどを多量含むということが分かる。図６は、幹細胞由来の皮膚前駆細胞培養液、未分化幹細胞培養液及び通常の表皮細胞培養液におけるニドゲン−１の濃度を示したものである。図６に示したように、分化した皮膚前駆細胞培養液は、未分化幹細胞培養液及び通常の表皮細胞培養液に比べてニドゲン−１の含量が１０倍以上高いということが分かる。 
【００６１】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2020525039.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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