(57)【要約】  対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定するための方法は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型内の少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性に基づき、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定するステップと；任意選択で、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を提供するステップとを有する。
2020535847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定するための方法であって、前記方法は、
前記対象の前記少なくとも１例の試料中の前記少なくとも１つの免疫細胞型内の少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性に基づき、前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状況を決定するステップと；任意選択で、
前記対象の前記少なくとも１例の試料中の前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状況を提供するステップと
を有する、方法。 
【請求項２】
前記少なくとも１つのシグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＡＲ、ＥＲ、及びＨＨシグナル伝達経路のグループから選択され、
前記少なくとも１つのシグナル伝達経路が、好ましくは、上記のグループから選択された、２つ又はこれを超えるシグナル伝達経路を含み、前記決定するステップが、前記２つ又はこれを超えるシグナル伝達経路の活性に基づく、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナル伝達経路が、好ましくは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路及びＮＦκＢシグナル伝達経路の少なくとも一方又は両方を含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状況が、前記シグナル伝達経路の１つ又は複数の活性を、前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状況と関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づき決定される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの免疫細胞型内の前記少なくとも１つのシグナル伝達経路の前記活性が、
前記少なくとも１つのシグナル伝達経路の１つの標的遺伝子、好ましくは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを受信するステップと、
前記３つ又はこれを超える標的遺伝子の転写を制御する、シグナル伝達経路と関連する転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、前記標的遺伝子の前記発現レベルを、前記少なくとも１つのシグナル伝達経路の前記活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデルを査定することに基づく、決定するステップと、
前記少なくとも１つの免疫細胞型内の少なくとも１つのシグナル伝達経路の前記活性を、前記シグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップと
を有する方法により推測可能であり、
前記較正された数学的経路モデルが、好ましくは、重心モデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状況が、休止状況、支持状況、抑制状況、ナイーブ状況、又はメモリー状況を有することが決定される、
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１例の試料が、組織、リンパ節、血液、気管支吸引物、骨髄吸引物、及び体腔試料からなるグループから選択され、かつ／又は
前記少なくとも１つの免疫細胞型が、
自然免疫細胞、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多形核白血球（ＰＭＮ）、特に好中球、マクロファージ、単球、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、及び古典的樹状細胞を含む樹状細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、並びに
獲得免疫細胞、特にＢリンパ球、Ｔリンパ球、及びこれらの亜型、特にＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞、ＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞、ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞
からなるグループから選択される、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状況の決定が、前記少なくとも１つの免疫細胞型の２つ又は３つの機能状態を識別することを含み、前記識別が、免疫細胞型１つ当たり以下の関係：
好中球において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＴＧＦ−β経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＷｎｔ経路、及び低度のＮｏｔｃｈ経路により特徴づけられること；
単球において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＴＧＦ−β経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること；
樹状細胞において、休止状況が、支持状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、低度のＴＧＦ−β経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること；
樹状細胞において、休止状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
樹状細胞において、支持状況が、抑制状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、高度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、及び高度のＴＧＦ−β経路により特徴づけられること；
マクロファージにおいて、休止状況が、支持状況より低度のＮＦκＢ経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、休止状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、及び低度のＴＧＦ−β経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、支持状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、高度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＴＧＦ−β経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞が、ＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞より低度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、高度のＴＧＦ−β経路、及び高度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
Ｔ−ｒｅｇ細胞において、休止状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＴＧＦ−β経路、及び低度のＮｏｔｃｈ経路により特徴づけられること；
ＣＤ８＋  Ｔ細胞において、休止状況が、支持状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＴＧＦ−β経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
メモリーＴ細胞が、ナイーブＴ細胞より高度のＰＩ３Ｋ、高度のＮＦκＢ経路、及び高度のＴＧＦ−β経路により特徴づけられること；
Ｂリンパ球において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること
のうちの少なくとも１つが当てはまる可能性に基づく、
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象の自然免疫系活性状況又は獲得免疫系活性状況を決定するための方法であって、前記方法は、
前記対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの自然免疫細胞型の機能状況に基づき、前記自然免疫系活性状況を決定するステップ、及び任意選択で、
前記自然免疫系活性状況を提供するステップ、又は
前記対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの獲得免疫細胞型の機能状況に基づき、前記獲得免疫系活性状況を決定するステップ、及び任意選択で、
前記対象の前記獲得免疫系活性状況を提供するステップ
を有し、
前記少なくとも１つの自然免疫細胞型又は獲得免疫細胞型の前記機能状況が、好ましくは、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により決定可能である、方法。
【請求項１０】
対象の全免疫系活性状況を決定するための方法であって、前記方法は、
前記対象の自然免疫系状態及び獲得免疫系状態に基づき、前記全免疫系活性状況を決定するステップであって、前記自然免疫系活性状態及び／若しくは獲得免疫系活性状態が、請求項７に記載の方法により決定可能である、ステップ、又は
前記対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの自然免疫細胞型、及び少なくとも１つの獲得免疫細胞型の機能状態に基づき、前記全免疫系活性状況を決定するステップ、並びに任意選択で、
前記対象の前記全免疫系活性状況を提供するステップ
を含み、
前記少なくとも１つの自然免疫細胞型及び／又は前記少なくとも１つの獲得免疫細胞型の前記機能状態が、好ましくは、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により決定可能である、方法。
【請求項１１】
前記免疫系活性状況を決定するステップが、前記少なくとも１つの免疫細胞型の前記機能状態を、前記免疫系活性状況と関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づき、
前記較正された数学的免疫モデルが、好ましくは、重心モデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである、
請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された少なくとも１つのデジタルプロセッサを含む、装置。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する、非一時的記憶媒体。
【請求項１４】
デジタル処理デバイス上で実行される場合に、前記デジタル処理デバイスに、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を実施させるためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム。
【請求項１５】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
前記キットは、
３つ又はこれを超えるＰＩ３Ｋ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素と、
３つ又はこれを超えるＮＦκＢ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素と
を含み、任意選択で、
３つ又はこれを超えるＴＧＦ−β標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＳＴＡＴ３標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＷｎｔ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＡＰ−１標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＡＲ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；
３つ又はこれを超えるＥＲ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素；及び
３つ又はこれを超えるＨＨ標的遺伝子の発現を定量するための構成要素
のうちの１又は複数を含み、
好ましくは、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ、及び質量分析からなるグループから選択され、
好ましくは、請求項１２に記載の装置、請求項１３に記載の非一時的記憶媒体、又は請求項１４に記載のコンピュータプログラムをさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１０月２日に出願され、「免疫診断法」と題される、米国特許仮出願第６２／５６６，７５５号、及び２０１８年６月１２日に出願され、「免疫診断法」と題される、米国特許仮出願第６２／６８３，７１０号の優先権を主張するものであり、それらの明細書、特許請求の範囲、及び図面の全体が、全ての目的で、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、バイオインフォマティクス、免疫学及び診断法、ゲノム情報処理、プロテオーム情報処理、並びに関連技術に関する。より詳細には、本発明は、少なくとも１つの免疫細胞型内の少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性に基づき、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定するための方法に関する。本発明は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの異なる自然免疫細胞型又は獲得免疫細胞型の機能状況に基づき、対象の自然免疫系活性状況又は獲得免疫系活性状況を決定するための方法にさらに関する。本発明は、対象の自然免疫系活性状況及び獲得免疫系活性状況に基づき、又は対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの異なる自然免疫細胞型、及び少なくとも１つの異なる獲得免疫細胞型の機能状況に基づき、対象の全免疫系活性状況を決定するための方法にさらに関する。本発明は、上記の方法のうちの少なくとも１つを実施するように構成された少なくとも１つのデジタルプロセッサを含む装置にさらに関する。本発明は、上記の方法のうちの少なくとも１つを実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する非一時的記憶媒体にさらに関する。本発明は、デジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、上記の方法のうちの少なくとも１つを実施させるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムにさらに関する。本発明は、上記の方法のうちの少なくとも１つを実施するためのキット並びにシステムにさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
適切に機能する免疫系は、健康を維持し、疾患による損傷を制限するために、極めて重要である。適切な免疫応答は、疾患に対して防御し、疾患の経過に関与性であり、治療剤の最適の効果のために要求される。
【０００４】
免疫系は、例えば、侵入病原体、又はがんなどの内部疾患に対する、正しい免疫応答をもたらす、協調的な形で、一体となって作用する、多数の免疫細胞型により構成される。初期の非特異的炎症性応答を制御する自然免疫系と、長期にわたる特異的な免疫応答を制御する獲得免疫応答とが区別される。
【０００５】
その機能の背後にある機構的原理は、免疫系が、感染性物質、又はがん細胞上のタンパク質の異常などの非自己抗原に対して、免疫応答を発生させることである。このような抗原の認識は、機能する免疫系の核心にある。非自己抗原を、非自己として認識する、精緻な過程の後、エフェクターＴ細胞が、特異的抗原を見出し、認識し、抗原を保有する侵入物質を攻撃するように命令される。
【０００６】
系の過剰活性と過小活性との正しい均衡は、疾患の発症にとって、極めて重要であり、均衡の是正は、重要な治療法である。
【０００７】
過剰活性並びに不活性のいずれも、疾患をもたらす可能性があるが、がん又は感染症などにおいて、免疫系の活性を増大させるか、又は自己免疫疾患若しくは同種移植などにおいて、その活性を低減するように、特異的な疾患を引き起こす免疫応答の不全を是正する、複数の薬物が、利用可能であり、開発されつつある。
【０００８】
どの治療が最も有効であるのかを、予測及びモニタリングすることは、困難であるが、とりわけ、免疫系の機能異常の根底をなす細胞機構を特異的にターゲティングする、（薬物ベースの）療法の場合にもまた困難である。
【０００９】
疾患を処置するために、免疫応答が治療的にモジュレートされる、少数の疾患の例は、がん、腎臓移植、関節リウマチ、乾癬、糖尿病である。
【００１０】
とりわけ、免疫療法によるがん患者の処置には、近年、多大な進歩がなされ、この目的で、多くの薬物が開発されており、開発されつつある。がんの場合、がん細胞のゲノムの変化の影響に加えて、がんの増殖及び転移は、主に、線維芽細胞及び免疫系細胞からなる、がん細胞の微小環境からも影響を受ける。自然免疫系及び獲得免疫系の両方の免疫細胞、例えば、単球マクロファージ系統及び様々なリンパ球亜型によるがん組織への浸潤は、免疫応答の惹起（適切な活性の抗原提示樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）、又はがん細胞に対する免疫寛容の創出（調節性／抑制性Ｔ細胞；ＩＬ１０又はＴＧＦ−βの産生による、免疫細胞の活性の阻害）、又はさらに腫瘍の進行の促進において、重要な役割を果たす。したがって、免疫細胞の浸潤は、存在する免疫亜型、それらの機能状況、及びがん細胞の種類に応じて、腫瘍抑制性の効果及び腫瘍促進性の効果の両方を持つ。
【００１１】
一般に、がん、とりわけ、進行がんでは、免疫応答は、存在するがん細胞を感知していないか、又はがん抗原との持続的な相互作用により、枯渇している（「寛容」である）ために、奏効していない。
【００１２】
がんのための免疫療法は、それぞれ、有効な抗がん免疫応答を可能とするか、又は回復させることを目的とする。免疫系が、存在するがんを感知していない、第１の場合、例えば、がん抗原のワクチン接種により、有効な免疫応答を発生させれば、がんの完全な治癒は、原則的に可能であり、治療持続期間も有限である。これに対し、免疫系が枯渇した場合、治癒は、一般に不可能であり、この場合、チェックポイント阻害薬を介して、がん細胞と、多様な免疫細胞、とりわけ、ＣＤ８＋  Ｔ細胞との免疫抑制性（相互）作用に干渉することによる、可能な限り長期にわたる治療が不可避となる。例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１（免疫活性チェックポイント）間の相互作用及びシグナル伝達を遮断することにより、免疫応答を、ターゲティングされた形で活性化させ、また、樹状細胞の抗原提示機能も増強する、多数の免疫療法薬が開発中である。
【００１３】
樹状細胞は、例えば、がん細胞に由来するが、また、病原体など、他の供給源にも由来する抗原を認識し、プロセシングし、提示し、かつ、細胞膜上のＨＬＡ  ＩＩ型分子内のこれらの抗原の提示を使用して、ナイーブリンパ球へと局所的に提示するか、又はリンパ節内のリンパ球へと提示する、これらの固有の能力により、免疫応答において、鍵となる役割を果たす。後者の場合、樹状細胞は、リンパ節へと移動する。
【００１４】
樹状細胞は、がんにおける免疫療法のために、臨床的に、極めて有用な標的である可能性があり、例えば、樹状細胞を、（黒色腫）がん患者の血液から単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、関与性のがん抗原と対峙させ、次いで、患者へと再導入して、腫瘍殺滅性リンパ球を活性化させることもでき；代替的に、放射線治療を使用して、がん抗原を、転移性腫瘍から放出させる結果として、樹状細胞の抗原提示機能の活性化をもたらすこともでき、これは、がんに対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるワクチン接種（「未照射部位効果」と呼ばれる）をもたらし、ある比率の患者では、がんに対する全般的な免疫応答及び疾患の完全な治癒をもたらし；代替的に、抗原提示の増強をもたらす、特異的な薬物の投与により、樹状細胞の抗原プロセシング機能／抗原提示機能を活性化させるように、薬物を使用することもできる。
【００１５】
現在のところ、いずれの場合にも、治療の開始の前に、このような樹状細胞ターゲティング療法に対するレスポンダーを同定することは不可能であり、応答の評価は、治療の数ヶ月後に初めて可能であるが、これは、費用を大きくし、副作用を引き起こす。応答を予測し、治療の開始の後で、実際の応答を、迅速に（すなわち、３カ月以内に、好ましくは、数週間以内に）測定する、良好なバイオマーカーが利用可能である場合、これは、応答率を増大させ、処置と関連する費用を低減し、副作用を軽減し、患者の生活の質を向上させることが期待される。
【００１６】
他の多くの疾患、具体的に、（自己）免疫媒介性疾患及び免疫不全性疾患もまた、免疫調節薬により処置されるが、第１の場合には、免疫応答を弱める必要があり、第２の場合には、免疫応答の有効性を増大させる必要がある。いずれの場合にも、薬物の効果が、不全の是正において、可能な限り特異的であることが重要である。ここでもまた、多数の薬物が開発されつつあり、がんについて記載した課題と同じ課題を伴うことが多い。
【００１７】
樹状細胞ターゲティング療法などの免疫療法（全ての疾患のための）には、多数の臨床的課題：（１）小さな比率の患者だけが応答するので、個々の患者における治療応答を予測する課題；これは、がんの場合、また、がん細胞からの抗原の放出を誘導することによる、ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種（例えば、放射線による）、及び他のワクチン接種療法でもある、単剤療法と対比した組合せ免疫療法に対する応答の予測もまた含む；（２）副作用及び費用の観点から、可能な限り早急に、治療が有効であるのかどうかを評価する課題；（３）免疫療法の重度の副作用の危険性がある患者を同定する課題が存在する。
【００１８】
いずれの課題も、十分に取り組まれていない。例えば、がんでは、治療応答を予測するのに、ＣＤ８＋細胞及びＣＤ３／４＋細胞の定量のほか、ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１による染色も利用可能であるが、いずれも信頼できない。治療応答についての評価は、一般に、治療の開始の、約３〜６カ月後に可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、がんの場合には、免疫療法薬と、放射線療法、化学療法、及びターゲティング療法など、がん細胞からの抗原の放出を誘導する、他の療法との組合せもまた含む、具体的な免疫療法薬又は薬物／療法の組合せに対する治療応答を予測及び評価／モニタリングしうる、バイオマーカーベースのアッセイが、強く必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の態様によると、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定するための方法であって、前記方法は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型内の少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性に基づき、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定するステップを有する方法により、上記の課題を解決する。一実施形態では、方法は、例えば、さらなる方法のための、特に、本発明の第２、第３、及び第４の態様による方法のための入力変数又は入力値として、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を提供するステップをさらに有する。
【００２１】
別の実施形態では、方法は、診断など、本明細書で開示される多様な使用の目的で、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を提供するステップをさらに有する。
【００２２】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの免疫細胞型内のシグナル伝達経路の活性プロファイルに基づく。シグナル伝達経路の活性プロファイルは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、若しくは８つ、なお又はこれを超える、異なるシグナル伝達経路を含みうる。
【００２３】
ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｔ−Ｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、好中球、単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの、あらゆる免疫細胞型は、原則的に、それを、特徴づけ、認識しうる、免疫応答内の特異的機能を有する。各免疫細胞型には、不活性状態（本明細書にまた、「休止」状態とも称する）、及び活性が、がん抗原又は病原体などの免疫標的を根絶することへと方向付けられる、活性化状態（本明細書ではまた、「支持」状態とも称する）が存在する。免疫細胞（樹状細胞、Ｔｒｅｇ細胞）の一部の種類にはまた、免疫細胞が、他の免疫細胞を、それらの機能において抑制する、「抑制」状態も存在する。免疫細胞は、細胞間相互作用を使用し、かつ、サイトカイン及びケモカインなどの可溶性分子を介して、互いとコミュニケートして、それらの活性を調整する。ＡＲ、ＥＲ、ＨＨ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮ（サイトカインである、Ｉ型インターフェロンにより活性化させられる）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮ（サイトカインである、ＩＩ型インターフェロンにより活性化させられる）を含む）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔは、細胞間のこのようなコミュニケーションを媒介し、細胞内の機能活性を、コミュニケーションの帰結として決定するシグナル伝達経路である。これらのシグナル伝達経路はまた、異なる免疫細胞型の機能における重要な役割も果たす。
【００２４】
本発明は、シグナル伝達経路活性の解析を使用して、免疫細胞型、並びに免疫応答において役割を果たす、多様な免疫細胞型の機能状況を特徴づけることができるという発見に基づく。多様な型の免疫細胞の間のコミュニケーションの帰結としてもたらされる免疫応答は、活性、例えば、抗腫瘍活性に向かう場合もあり、通常、体内の自己抗原についての場合であるが、また、免疫系が、がん細胞を攻撃しない場合の、がんにおける場合でもある、免疫抑制又は抗原に対する寛容に向かう場合もある。後者の場合、例として述べると、十分な抗腫瘍免疫細胞活性に干渉する、一部の膜タンパク質は、ＣＤ８＋リンパ球上のＰＤ１、及びがん細胞上のＰＤ−Ｌ１である。免疫細胞内の、一部の（限定的な）シグナル伝達経路活性は、それらの機能との関連で記載されている：ＰＤ１シグナル伝達は、ＦＯＸＯ転写因子活性の増大、ＰＩ３Ｋ経路活性の低減（これらは、反比例する）、及びＴＧＦ−β経路活性の増大を結果としてもたらす場合があり；ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達（腫瘍細胞及び免疫細胞）は、ＮＦκＢ経路及びＭＡＰＫ−ＡＰ−１経路を活性化させ；有効なＴ細胞受容体シグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ経路活性を誘導し；ＩＬ２は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路の活性化を介して、樹状細胞の抗原提示を活性化させる。これらの経路活性が、多様な免疫細胞の機能状態の決定において、互いとどのように関連するのかについては知られていない。
【００２５】
本発明は、初めて、免疫細胞の経路活性の解釈、及び機能状況の決定を可能とする方法を提供する。本発明者らは、異なる免疫細胞型内の免疫細胞機能を、免疫細胞型特異的に制御する、１つ又は複数のシグナル経路の活性を測定することにより、個別の免疫細胞型の機能状況（例えば、休止性、支持性、抑制性、ナイーブ、メモリー）を評価しうることを見出した。したがって、本発明者らは、既知の機能状況を有する、異なる免疫細胞型内の、異なるシグナル経路（ＡＲ、ＥＲ、ＨＨ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔによる経路）の活性を推測し、未知の機能状況を有する、免疫細胞型の機能状況を、経路活性に基づき予測することを可能とするために、測定された経路活性の、免疫細胞型ごとの解釈のためのコンピュータモデルを開発した。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路は、変化形のうちの一方が具体的に言及されるのでない限り、その変化形（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型インターフェロン（ＩＩ型ＩＦＮ））の一方又は両方を指し示すのに使用される。
【００２６】
したがって、１つ又は複数のシグナル伝達経路の活性は、免疫細胞、例えば、がん又は免疫応答を活性化させることが必要な、別の疾患を伴う患者における治療選択に有用となるが、また、例えば、関節リウマチ、又は免疫応答を弱めることが必要な、他の疾患を伴う患者における治療選択にも有用となる、樹状細胞の機能状態を特徴づけるバイオマーカーとして使用することができる。
【００２７】
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の生物を指す。一部の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト対象、好ましくは、医学的対象、特に、がんを有する対象である。さらに他の実施形態では、対象は、細胞系、培養細胞又は培養組織である。
【００２８】
本明細書では、「経路」、「シグナル伝達経路」、及び「シグナル伝達経路」という用語は、互換的に使用される。少なくとも１つのシグナル伝達経路は、少なくとも１つの免疫細胞型の免疫細胞機能を制御する。
【００２９】
「少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性」という用語は、標的遺伝子が発現することを駆動するときに、標的遺伝子の転写を制御する、試料中の転写因子（ＴＦ）エレメントと関連する、シグナル伝達経路の活性、すなわち、例えば、高度の活性（すなわち、大きな割合）又は低度の活性（すなわち、小さな割合）、又はこのような活性と関連する、それぞれのスコア、値、若しくはパラメータとの関連で、標的遺伝子が転写される割合を指す。転写因子活性は、関連する経路の活性についてのリードアウトである。経路活性は、例えば、活性レベルにより表される。このような活性レベルは、好ましくは、経路の活性を表す数値である。
【００３０】
本明細書では、「機能状況」という用語は、「機能状態」、「機能活性状態」、又は「活性状態」という用語と、互換的に使用され、免疫細胞の免疫機能の状況、例えば、活性、例えば、免疫機能が、活性であるのか、不活性であるのかについて記載する。用語はまた、機能状況を指し示すスコアも指す。「機能的」とは、本文献では、免疫細胞型及び／又は免疫応答の活性状況を指す。本明細書では、「機能状況を指し示すスコア」という用語は、活性スコア及び免疫細胞の活性スコアという用語と互換的に使用される。
【００３１】
本発明に従って使用される試料（複数例可）は、一般に、抽出試料、すなわち、対象から抽出された試料でありうる。試料の例は、組織、細胞、血液及び／又は気管支吸引物、骨髄吸引物、又は対象の体腔から採取された試料などの体液を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、少なくとも１例の試料は、少なくとも１つの免疫細胞型が存在する、対象の場所から生じうる。特に、試料は、免疫細胞型含有組織、リンパ節（例えば、流入領域リンパ節）、及び／又は血液試料である。試料中の細胞はまた、気管支吸引物、骨髄吸引物、又は体腔からも単離することができる。したがって、試料はまた、免疫細胞型を含有する、気管支吸引物、骨髄吸引物、及び／又は体腔試料でもありうる。一部の実施形態では、組織、リンパ節、及び血液の全てに由来する免疫細胞を評価する。がんに対する機能的免疫応答は、いわゆる「免疫サイクル」を使用して、まとめられ、説明されている（図８；Ｃｈｅｎ  Ｄ．Ｓ．及びＭｅｌｌｍａｎ  Ｉ．、「Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｙｃｌｅ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３９巻、１号、２０１３年７月、１〜１０頁を参照されたい）。単純化すると、サイクルは、有効な抗がん免疫応答のために、腫瘍組織内では、がん抗原が樹状細胞により取り込まれ、流入領域リンパ節へと運ばれ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞へと提示され、これらが活性化させられ；ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ＴＨ１細胞へと活性化させられ、これが、ＣＤ８＋細胞を共活性化させ、これが、血液を介して、がん組織へと移動し、ここで、がん細胞を攻撃する。ＮＫ細胞は、正常なＨＬＡ−Ｉ複合体の非存在により、腫瘍内で活性化させられる。がん組織内で、がん細胞は、適正な抗原の提示に失敗し、樹状細胞及びＴ細胞の活性を抑制する結果として、抗腫瘍活性の欠如をもたらす場合があることを示す。
【００３３】
例えば、がんを伴う患者では、組織試料は、腫瘍組織、リンパ節、及び／若しくは末梢血、並びに／又は上記でさらに記載した別の場所から採取することができ、適切な認識抗体、例えば、血液試料には、抗ＣＤ１ｃ＋抗体であり、骨髄ＤＣには、抗ＣＤ１４１＋抗体であり、形質細胞様ＤＣには、抗ＣＤ３０３＋抗体を使用して、試料（複数例可）から、樹状細胞などの抗原提示細胞など免疫細胞を単離することができる。樹状細胞の結果、及び提示された機能状態、又は機能状態を指し示すスコアに基づき、患者は、免疫療法の形態から利益を得る可能性が高いことを決定しうる。別の例では、応答の予測は、単一の試料型解析に基づく。
【００３４】
別の例では、患者は、免疫療法又は免疫調節療法の形態を施されており、異なる時点における、１例又は複数例の血液試料を採取して、免疫細胞型、例えば、樹状細胞（の亜集団）を単離し、活性状況を決定して、処置の効能を評価することができる。３つの場所（又は１つ若しくは２つの場所）に由来する免疫細胞型内の経路活性（又は、好ましくは、経路活性プロファイル、すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、若しくは８つ、又はこれを超える経路の各活性）を測定し、樹状細胞型又は樹状免疫細胞型の混合物の機能活性状況である、活性状況又は免疫抑制状況を、シグナル伝達経路活性との関係で評価することにより、例えば、免疫抑制（例えば、腫瘍寛容又は腫瘍寛容原性）状態と対比した（例えば、抗腫瘍）活性化状態と対比した休止状態を特徴づけることができる。
【００３５】
別の例では、患者は、がんを有さず、例えば、関節リウマチ又はＳＬＥなど、例えば、自己免疫疾患など、別の疾患を有する。この場合、組織試料は、疾患組織、例えば、関節リウマチの場合には、滑膜組織から採取することができ、かつ／又は細胞試料は、例えば、樹状細胞が単離される血液から採取することができ、活性状況を決定して、治療に対する応答を予測又はモニタリングすることができる（Ｋｈａｎ  Ｓ．、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｊ．Ｄ．、Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｎ．、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、５巻、１０号、２００９年１０月、５６６〜５７１頁を参照されたい）。
【００３６】
本明細書で使用される「試料」という用語はまた、例えば、対象の組織及び／又は流入領域リンパ節及び／又は血液を、対象から採取し、例えば、顕微鏡のスライド上に置く場合、及び特許請求される方法を実施するために、この試料の一部を、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により、又は目的の細胞を、スライドからこすり落とすことにより、又は蛍光活性化細胞分取法により抽出する場合も包摂する。
【００３７】
免疫細胞型内、例えば、樹状細胞型内の経路活性、好ましくは、経路活性プロファイルを測定し、免疫細胞型、例えば、樹状細胞型、又は樹状免疫細胞型の混合物の機能活性状況である、活性状況又は免疫抑制状況、機能活性状況、又は機能活性状況を指し示すスコアを評価することにより、例えば、（例えば、抗腫瘍）活性化状態と対比した休止状態、及び任意選択で、免疫抑制（例えば、腫瘍寛容又は腫瘍寛容原性）状態と対比した休止状態を特徴づけることができる。これを使用して、治療を開始する前に、腫瘍に対する、腫瘍内の免疫応答、具体的に、樹状細胞などの免疫細胞型の役割を評価することもでき、治療時の治療応答を測定することもでき、治療の投与量を調整／最適化することもでき、任意の疾患時の免疫応答状態をモニタリングすることもでき、免疫調節療法の副作用を予測することもでき、免疫調節薬への適合性を測定することもでき、かつ／又は免疫媒介性疾患をモニタリングすることもできる。治療は、免疫療法でありうるが、また、腫瘍細胞を死滅させることにより、抗原を、腫瘍細胞から放出し、これは、免疫応答に影響を及ぼす、別の治療（例えば、化学療法、ターゲティング療法、放射線療法など）でもありうる。
【００３８】
本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、少なくとも１つの免疫細胞型は、（ｉ）自然免疫細胞、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多形核白血球（ＰＭＮ）、特に好中球、マクロファージ、単球、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、及び古典的樹状細胞を含む樹状細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、並びに（ｉｉ）獲得免疫細胞、特にＢリンパ球、Ｔリンパ球、及びこれらの亜型、特にＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞、ＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞、ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞からなるグループから選択される。
【００３９】
本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、本発明の方法により決定される、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況は、休止状況、支持状況、抑制状況、メモリー状況、及びナイーブ状況からなるグループから選択される。
【００４０】
上記で論じた通り、各免疫細胞型は、不活性状態、すなわち、「休止」状態、及び活性が、がん抗原又は病原体などの免疫標的を根絶することへと方向付けられる、活性化状態、すなわち、「支持」状態において存在しうる。免疫細胞（例えば、樹状細胞、Ｔｒｅｇ細胞）の一部の種類にはまた、免疫細胞が、他の免疫細胞を、それらの機能において抑制する、「抑制」状態も存在する。
【００４１】
本明細書で使用される「休止性」とは、活性化状態又は抑制状態ではない場合における、全ての免疫細胞型のデフォルトの状態である。「免疫支持性」とは、一般に、細胞の活性が、免疫標的を根絶することへと方向付けられる状態について記載するのに対し、「免疫抑制」という用語は、細胞の活性が、１つ又は複数の他の免疫細胞（複数可）の機能の抑制へと方向付けられる状態を指し示す。
【００４２】
本明細書で使用される「ナイーブ」とは、細胞が、特異的抗原に遭遇していないことを意味するのに対し、本明細書で使用される「メモリー」とは、細胞が、特異的抗原に遭遇しているが、抗原へと曝露されると、速やかに活性となるように「休眠」状態にあることを意味する。
【００４３】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、免疫細胞型の機能状況の決定は、数学的モデル（本明細書ではまた、免疫系経路モデルとも表記される）、特に、較正された数学的モデルによりなされる。本明細書で開示される、少なくとも１つのシグナル伝達経路活性に基づき、好ましくは、経路活性プロファイルに基づき、免疫細胞型の機能状態を決定するように、このモデルをプログラムして、少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性を解釈する。特に、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況の決定は、（ｉ）少なくとも１つの免疫細胞型内の少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性を受信することと、（ｉｉ）少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定することであって、前記決定することは、少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性を、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を指し示すスコアと関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づく、決定することを含む。
【００４４】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態において、較正された数学的経路モデルは、重心モデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである。例えば、較正された数学的経路モデルは、確率論的モデル、好ましくは、少なくとも１つのシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、若しくは４つの機能状況、又は機能状況及び活性若しくは活性レベルを指し示すスコアを関連付ける条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである、或いは較正された数学的経路モデルは、少なくとも１つのシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの活性の１つ又は複数の線形結合に基づく。
【００４５】
数学的モデルに従って、シグナル伝達経路（複数可）の活性を解釈して、免疫細胞型の機能状況を指し示すスコアをもたらす。このスコアは、免疫細胞型の機能状況の確率を、例えば、休止性、支持性、抑制性、ナイーブ、又はメモリーの機能状況との関係で予測又は提供する。
【００４６】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態において、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況の決定は、少なくとも１つの免疫細胞型の２つ又は３つの機能状態を識別することを含む。識別は、以下の関係に基づきなされる。本発明の目的では、免疫細胞型１つ当たり、少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つ、なお若しくは３つ、４つ、なお又はこれを超える（存在する場合）関係が当てはまることを理解されたい。例を挙げると、好中球の機能状態を識別するために、少なくとも１つのシグナル伝達経路活性が、ＡＲ、ＥＲ、ＨＨ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔから選択され、例えば、ＰＩ３Ｋ経路活性が増大する（支持状態にある好中球と比較して）のかどうかが、以下の関係：
好中球において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＴＧＦ−β経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＷｎｔ経路、及び低度のＮｏｔｃｈ経路により特徴づけられること；
単球において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＴＧＦ−β経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること；
樹状細胞において、休止状況が、支持状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、低度のＴＧＦ−β経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること；
樹状細胞において、休止状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
樹状細胞において、支持状況が、抑制状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、高度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、及び高度のＴＧＦ−β経路により特徴づけられること；
マクロファージにおいて、休止状況が、支持状況より低度のＮＦκＢ経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、休止状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、及び低度のＴＧＦ−β経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、支持状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、高度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＴＧＦ−β経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞が、ＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞より低度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、高度のＴＧＦ−β経路、及び高度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
Ｔ−ｒｅｇ細胞において、休止状況が、抑制状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＴＧＦ−β経路、及び低度のＮｏｔｃｈ経路により特徴づけられること；
ＣＤ８＋  Ｔ細胞において、休止状況が、支持状況より低度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路、低度のＴＧＦ−β経路、低度のＮｏｔｃｈ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路により特徴づけられること；
メモリーＴ細胞が、ナイーブＴ細胞より高度のＰＩ３Ｋ経路、高度のＮＦκＢ経路、及び高度のＴＧＦ−β経路により特徴づけられること；
Ｂリンパ球において、休止状況が、支持状況より高度のＰＩ３Ｋ経路、低度のＮＦκＢ経路、及び低度のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路により特徴づけられること
に基づき決定される。
【００４７】
本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、少なくとも１つのシグナル伝達経路は、ＡＲ、ＥＲ、ＨＨ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔシグナル伝達経路のグループから選択される。
【００４８】
好ましい実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達経路は、前述のグループから選択される、２つ又はこれを超えるシグナル伝達経路を含み、決定するステップは、２つ又はこれを超えるシグナル伝達経路の活性に基づく。
【００４９】
好ましくは、少なくとも１つのシグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、Ｎｏｔｃｈ、及びＷｎｔシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は全てを含む。より好ましくは、少なくとも１つのシグナル伝達経路は、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てを含む。なおより好ましくは、少なくとも１つのシグナル伝達経路は、自然免疫細胞型の場合には、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路及びＮＦκＢシグナル伝達経路の少なくとも一方若しくは両方、又はＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、及びＴＧＦ−βシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、若しくは全てを含み、かつ／或いは獲得免疫細胞型の場合には、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３のうちの少なくとも１つ、２つ、若しくは全てを含む。
【００５０】
免疫細胞の全ての機能は、樹状細胞などの抗原提示細胞を含む、免疫サイクル（図８；Ｃｈｅｎ  Ｄ．Ｓ．及びＭｅｌｌｍａｎ  Ｉ．、「Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｙｃｌｅ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３９巻、１号、２０１３年７月、１〜１０頁を参照されたい）において記載されている。免疫細胞は、シグナル伝達経路により制御されており、これらのうちで、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、及びＴＧＦ−βによる経路が、重要であると見出されている。本明細書で記載される経路解析、及びその定量的解釈は、抗原提示細胞及び樹状細胞を含む、免疫細胞を、それらの機能状況に関して特徴づけることを可能とする。これは、例えば、免疫療法の効能を予測及び評価することを可能とする。
【００５１】
本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、多様な免疫細胞型のシグナル経路の活性は、例えば、本明細書で記載される経路解析により、対象から単離された細胞試料中又は組織試料中で決定可能である。
【００５２】
経路解析は、それぞれのシグナル伝達経路と関連する転写因子の、十分にバリデーションされた、直接的な標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定値から、シグナル伝達経路の活性を推測することに基づく、組織／細胞試料に存在する免疫細胞中のシグナル伝達経路活性の定量的測定を可能とする（例えば、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ」、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年６月、２９３６〜２９４５頁；Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．、ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔｏｌｐｅ  Ａ．、「Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌ」、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、５巻、１４号、２０１４年７月、５１９６及び５１９７頁を参照されたい）。
【００５３】
本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、１つ又は複数の経路の活性、複数の経路活性の組合せの決定、及びこれらの適用は、例えば、それらの各々が、その全体において、それぞれのシグナル伝達経路の活性を決定する目的で本明細書に組み込まれる、以下の文献：国際特許出願ＷＯ２０１３０１１４７９（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＷＯ２０１４１０２６６８（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」と題する）、ＷＯ２０１５１０１６３５（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＰＩ３Ｋ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＷＯ２０１６０６２８９１（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＧＦ−β  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＷＯ２０１７０２９２１５（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＦκＢ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＷＯ２０１４１７４００３（「Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する）、ＷＯ２０１６０６２８９２（「Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する）、ＷＯ２０１６０６２８９３（「Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する）、ＷＯ２０１８０９６０７６（「Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｒｅｓｓｉｖｅ  ＦＯＸＯ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ」と題する）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６３３（２０１８年９月２７日に出願され、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６２３２（２０１８年９月２７日に出願され、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６４８８（２０１８年９月２８日に出願され、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７６５１３（２０１８年９月２８日に出願された、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＡＰＫ−ＡＰ  １  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）、米国特許出願ＵＳ１６／１４３８８５（２０１８年９月２７日に出願され、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＰＡＴＨＷＡＹ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＵＳＩＮＧ  ＵＮＩＱＵＥ  ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＧＥＮＥＳ」と題する）、ＵＳ１６／１４３７０８（２０１８年９月２７日に出願され、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３  ＰＡＴＨＷＡＹ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＵＳＩＮＧ  ＵＮＩＱＵＥ  ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＧＥＮＥＳ」と題する）、ＵＳ１６／１４５２６３（２０１８年９月２８日に出願され、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＯＴＣＨ  ＰＡＴＨＷＡＹ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＵＳＩＮＧ  ＵＮＩＱＵＥ  ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＧＥＮＥＳ」と題する）、ＵＳ１６／１４５７２２（２０１８年９月２８日に出願され、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＡＰＫ−ＡＰ−１  ＰＡＴＨＷＡＹ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＵＳＩＮＧ  ＵＮＩＱＵＥ  ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＧＥＮＥＳ」と題する）、並びに欧州特許出願ＥＰ１６２００６９７．７（２０１６年１１月２５日に出願され、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｒｅｓｓｉｖｅ  ＦＯＸＯ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ」と題する）、ＥＰ１７１９４２８８．１（２０１７年１０月２日に出願され、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＥＰ１７１９４２９１．５（２０１７年１０月２日に出願され、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、ＥＰ１７１９４２９３．１（２０１７年１０月２日に出願され���「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）、及びＥＰ１７２０９０５３．２（２０１７年１２月２０日に出願され、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＡＰＫ−ＡＰ−１  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題する）において記載される通りに実施される。モデルは、いくつかの細胞型上で、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔによる経路について、生物学的にバリデーションされている。未だ公開されていない特許出願において援用されている数学的モデル、並びにこれらの出願における、これらのモデルの較正及び使用は一般に、既に公開された特許出願において開示されているモデル、較正、及び使用に対応することが注目される。
【００５４】
参考文献の迅速な同定を容易とするために、上記で言及された参考文献を、本明細書における、目的の各シグナル伝達経路へと割り当て、例示的に、シグナル伝達経路の活性の決定に適する、対応する標的遺伝子を指し示す。この点では、上記で言及された参考文献に提示された、標的遺伝子についての配列表が特に参照される。
ＡＲ：ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３  １、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２（ＷＯ  ２０１３／０１１４７９、ＷＯ  ２０１４／１０２６６８）；ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３  １、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２（ＷＯ  ２０１４／１７４００３）；
ＥＲ：ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢｌ、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１及びＮＲＩＰｌ（ＷＯ  ２０１３／０１１４７９、ＷＯ  ２０１４／１０２６６８）；ＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、及びＡＰ１Ｂ１（ＷＯ  ２０１４／１７４００３）；ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＣＴＳＤ、ＤＳＣＡＭ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲｌ、ＨＳＰＢｌ、ＫＲＴ１９、ＮＤＵＦＶ３、ＮＲＩＰＩ、ＰＧＲ、ＰＩＳＤ、ＰＲＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤｌ、ＴＦＦｌ、ＴＲＩＭ２５、ＸＢＰｌ、ＧＲＥＢｌ、ＩＧＦＢＰ４、ＭＹＣ、ＳＧＫ３、ＷＩＳＰ２、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２、ＣＤＨ２６、及びＣＥＬＳＲ２（ＷＯ  ２０１６／０６２８９２、ＷＯ  ２０１６／０６２８９３）；
ＨＨ：ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ及びＣＴＳＬ１（ＷＯ  ２０１３／０１１４７９、ＷＯ  ２０１４／１０２６６８、ＷＯ  ２０１４／１７４００３）；ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＨＨＩＰ、ＳＰＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＣＣＮＤ２、ＨＩ  ９、ＩＧＦＢＰ６、ＴＯＭ１、ＪＵＰ、ＦＯＸＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ２−８、ＲＡＢ３４、ＭＩＦ、ＧＬＩ３、ＦＳＴ、ＢＣＬ２、ＣＴＳＬ１、ＴＣＥＡ２、ＭＹＬＫ、ＦＹＮ、ＰＩＴＲＭ１、ＣＦＬＡＲ、ＩＬ１Ｒ２、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ９、ＣＣＮＤｌ、ＪＡＧ２、ＦＯＸＭ１、ＦＯＸＦ１、及びＦＯＸＬ１（ＷＯ  ２０１６／０６２８９２、ＷＯ  ２０１６／０６２８９３）；
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２：ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８（ＥＰ１７１９４２９１．５、前出）からなるグループから；
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３：ＡＫＴ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＤ１、ＣＤ２７４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＰ、ＦＧＦ２、ＦＯＳ、ＦＳＣＮ１、ＦＳＣＮ２、ＦＳＣＮ３、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＪｕｎＢ、ＭＣＬ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＵＣ１、ＭＹＣ、ＮＯＳ２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＴＧＳ２、ＳＡＡ１、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＩＭ及びＺＥＢ１（ＥＰ１７１９４２９３．１、前出）；
ＭＡＰＫ−ＡＰ−１：ＢＣＬ２Ｌ１１、ＣＣＮＤ１、ＤＤＩＴ３、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＥＺＲ、ＦＡＳＬＧ、ＦＩＧＦ、ＧＬＲＸ、ＩＬ２、ＩＶＬ、ＬＯＲ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＧＳ２、ＳＮＣＧ、ＴＩＭＰ１、ＴＰ５３及びＶＩＭ（ＥＰ１７２０９０５３．２、前出）；
ＮＦｋＢ：ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ３、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＩＣＡＭ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＲＦ１、ＭＭＰ９、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢ  ＩＥ、ＰＴＧＳ２、ＳＥＬＥ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＴＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ１及びＶＣＡＭ１（ＷＯ  ２０１７／０２９２１５）；
Ｎｏｔｃｈ：ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９及びＴＮＣ（ＥＰ  １７１９４２８８．１、前出）；
ＰＩ３Ｋ：ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫ  １Ａ、ＣＤＫ  １Ｂ、ＥＳＲｌ、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸ０３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩｌ、ＮＯＳ３、ＰＣＫｌ、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣＩＡ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２及びＴＮＦＳＦ１０（ＷＯ  ２０１５／１０１６３５）；ＡＴＰ８Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧｌ、ＣｌＯｏｒｆｌＯ、ＣＡＴ、ＣＢＬＢ、ＣＣＮＤｌ、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫＮＩＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＳＲｌ、ＥＸＴ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦＲ２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＮＳＲ、ＬＧＭＮ、ＭＸＩ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＤ２、ＴＬＥ４、及びＴＮＦＳＦ１０（ＷＯ  ２０１６／０６２８９２、ＷＯ  ２０１６／０６２８９３）；ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ及びＣＡＴ（ＥＰ１６２００６９７．７、前出）；
ＴＧＦ−β：ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮＩＡ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２−５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１及びＶＥＧＦＡ（ＷＯ  ２０１６／０６２８９１、ＷＯ  ２０１６／０６２８９３）；
Ｗｎｔ：ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７（ＷＯ２０１３／０１１４７９、ＷＯ２０１４／１０２６６８、ＷＯ２０１４／１７４００３）；ＡＤＲＡ２Ｃ、ＡＳＣＬ２、ＡＸＩＮ２、ＢＭＰ７、ＣＣＮＤｌ、ＣＤ４４、ＣＯＬ１８Ａ１、ＤＥＦＡ６、ＤＫＫｌ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＦＡＴ１、ＦＺＤ７、ＧＬＵＬ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＸＣＬ８（旧称：ＩＬ８）、ＣＥＭＩＰ（旧称：ＫＩＡＡｌ１９９）、ＫＬＦ６、ＬＥＣＴ２、ＬＥＦ１、ＬＧＲ５、ＭＹＣ、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＰＰＡＲＧ、ＲＥＧＩＢ、ＲＮＦ４３、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＯＸ９、ＳＰ５、ＴＢＸ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＤＧＦ１、及びＺＮＲＦ３（ＷＯ２０１６／０６２８９２、ＷＯ２０１６／０６２８９３）。
【００５５】
本明細書で開示される、異なるシグナル伝達経路の活性を決定するための経路解析法に共通するのは、試料中に存在する免疫細胞などの細胞内のシグナル伝達経路の活性が、シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子、好ましくは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを受信することと、３つ又はこれを超える標的遺伝子の転写を制御する、シグナル伝達経路と関連する転写因子（ＴＦ）エレメントの、試料中の活性レベルを決定することであり、前記決定することは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを、シグナル伝達経路の活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデルを査定することに基づく、決定することと、任意選択で、細胞型内のシグナル伝達経路の前記活性を、試料中のシグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測することとにより決定可能であるという、好ましくは、本発明の目的で、本明細書において適用される概念である。本明細書で記載される通り、活性レベルは、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を決定する入力として、直接使用される。したがって、シグナル伝達経路の活性を、ＴＦエレメントの活性レベルに基づき、明示的に推測することは必要ではなく、ＴＦエレメントの活性レベルが、シグナル伝達経路の活性レベルとして、直接使用される。
【００５６】
上記で指し示した通り、本明細書で使用される「転写因子エレメント」（ＴＦエレメント）という用語は、好ましくは、指定された標的遺伝子の発現を制御する、活性転写因子の中間体タンパク質若しくは前駆体タンパク質又はこれらのタンパク質複合体、或いは活性転写因子のタンパク質又はタンパク質複合体を指す。例えば、タンパク質複合体は、それぞれのシグナル伝達経路タンパク質のうちの１つの少なくとも細胞内ドメインを、１つ又は複数の補因子と共に含有し、これにより、標的遺伝子の転写を制御する。好ましくは、用語は、それぞれのシグナル伝達経路タンパク質のうちの１つの切断の結果として、細胞内ドメインをもたらすことにより誘発される、タンパク質又はタンパク質複合体の転写因子を指す。
【００５７】
本明細書で使用される、ＴＦエレメントの「活性レベル」という用語は、その標的遺伝子の転写に関するＴＦエレメントの活性レベルを意味する。
【００５８】
本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、その転写が、それぞれの転写因子エレメントにより、直接的に、又は間接的に制御される遺伝子を意味する。「標的遺伝子」は、「直接的な標的遺伝子」及び／又は「間接的な標的遺伝子」（本明細書で記載される）である。
【００５９】
較正された数学的経路モデルは、確率論的モデル、好ましくは、シグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの活性レベルと、３つ若しくはこれを超える標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである、又は較正された数学的経路モデルは、３つ若しくはこれを超える標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく。本発明の目的では、較正された数学的経路モデルは、好ましくは、重心モデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである。
【００６０】
特に、標的遺伝子の発現レベルの決定、及び任意選択で、対象におけるシグナル伝達経路の活性の推測は、例えば、とりわけ、（ｉ）対象の試料中で測定された細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを含む、入力のセットについて、細胞シグナル伝達経路を表す、較正された確率論的経路モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークを査定すること、（ｉｉ）細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の転写を制御する、シグナル伝達経路と関連する転写因子（ＴＦ）エレメントの、対象における活性レベルを推定することであり、前記推定することは、シグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの活性レベルと、対象の試料中で測定された細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける、条件付き確率に基づく、推定すること、及び任意選択で、（ｉｉｉ）細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料中で推定された、シグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの活性レベルに基づき推測することにより実施される。これについては、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）において、詳細に記載されている。
【００６１】
例示的な代替法では、発現レベルの決定、及び任意選択で、対象における細胞シグナル伝達経路の活性の推測は、とりわけ、（ｉ）細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の転写を制御する、シグナル伝達経路と関連する転写因子（ＴＦ）エレメントの、対象の試料中における活性レベルを決定することであり、前記決定することは、細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを、シグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデルであり、前記数学的経路モデルは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく数学的経路モデルを査定することに基づく、決定すること、及び任意選択で、（ｉｉ）対象の細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料中で決定された、シグナル伝達経路と関連するＴＦエレメントの活性レベルに基づき推測することにより実施される。これについては、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）において、詳細に記載されている。
【００６２】
標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の推測に関するさらなる詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ」、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁において見出すことができる。
【００６３】
ある実施形態において、シグナル伝達経路の測定は、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ、又は質量分析を使用して実施される。例えば、遺伝子発現マイクロアレイデータ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、又はＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーなどのＲＮＡシーケンシング法を使用することができる。
【００６４】
本発明の第２の態様に従って、問題を、対象の自然免疫系活性状況を決定するための方法であって、前記方法は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの自然免疫細胞型の機能状況に基づき、自然免疫系活性状況を決定するステップを有する方法により解決する。少なくとも１つの自然免疫細胞型の機能状況は、好ましくは、本発明の第１の態様による方法により決定可能である。
【００６５】
一実施形態では、方法は、自然免疫系活性状況を、例えば、さらなる方法、特に、本発明の第４の態様に従う方法のための入力変数又は入力値として提供するステップをさらに有する。
【００６６】
別の実施形態では、方法は、自然免疫系活性状況を、例えば、本明細書で開示される、多様な目的で提供するステップをさらに有する。
【００６７】
本発明の第３の態様に従って、問題を、対象の獲得免疫系活性状況を決定するための方法であって、前記方法は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの獲得免疫細胞型の機能状況に基づき、獲得免疫系活性状況を決定するステップを有する方法により解決する。少なくとも１つの獲得免疫細胞型の機能状況は、好ましくは、本発明の第１の態様による方法により決定可能である。
【００６８】
一実施形態では、方法は、獲得免疫系活性状況を、例えば、本発明の第４の態様に従う方法のための入力変数又は入力値として提供するステップをさらに有する。
【００６９】
別の実施形態では、方法は、獲得免疫系活性状況を、例えば、本明細書で開示される、多様な目的で提供するステップをさらに有する。
【００７０】
本発明の第４の態様に従って、問題を、対象の全免疫系活性状況を決定するための方法であって、前記方法は、対象の自然免疫系活性状況及び獲得免疫系活性状況に基づき、全免疫系活性状況を決定するステップであって、自然免疫系活性状況及び／又は獲得免疫系活性状況が、本発明の第２及び第３の態様に従う方法により決定可能であるステップを有する方法により解決する。代替的に、全免疫系活性状況は、対象の少なくとも１例の試料中の少なくとも１つの異なる自然免疫細胞型、及び少なくとも１つの異なる獲得免疫細胞型の機能状態であって、少なくとも１つの異なる自然免疫細胞型及び／又は獲得免疫細胞型の前記機能状態が、好ましくは、本発明の第１の態様に従う方法により決定可能である機能状態に基づき決定される。
【００７１】
一実施形態では、方法は、対象の全免疫系活性状況を、例えば、さらなる方法のための入力変数若しくは入力値として、又は本明細書で開示される、多様な目的で提供するステップをさらに有する。
【００７２】
「自然免疫系活性状況」、「獲得免疫系活性状況」、及び「全免疫系活性状況」という用語は、それぞれの免疫系の免疫応答の活性、及び／又はそれぞれの免疫系の、全免疫応答への寄与について、例えば、活性、休止性、又は抑制性との関係で記載する。本明細書で記載される通り、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況を指し示すスコアは、自然免疫系活性状況を決定するための入力として、直接使用することができる。したがって、用語はまた、免疫系活性状況を指し示すスコアも指す。
【００７３】
本発明者らは、自然免疫系及び／若しくは獲得免疫系について、個別の免疫系活性状況、又は全免疫系についての免疫系活性状況を、免疫細胞型の機能状況（複数可）に基づき決定しうると有利であることを見出した。免疫細胞は、それら自体では作用せず、まとまって、免疫応答を組織化する。よって、本発明の目的では、１つの免疫細胞型についての測定値の解釈で十分である。ある特定の場合に、解釈は、１つ又は複数の他の免疫細胞型の評価により検証されるか、又は解釈は、１つ若しくは複数の他の免疫細胞型に基づく。したがって、本発明の目的では、免疫応答の状況を予測するのに、複数の免疫細胞型の解析もまた想定される。例えば、本発明の第２、第３、及び第４の態様に従う方法では、自然免疫細胞型及び／又は獲得免疫細胞型は、各々、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、なお又はこれを超える、異なる免疫細胞型を含む。
【００７４】
方法は、自然免疫応答が、組織内の（非特異的な）炎症を、効果的に調節し、獲得免疫系とコミュニケートして、がん細胞又は病原体などの標的に対する、その特異的な作用を動員するのかどうかを決定することを可能とすると有利である（活性、すなわち、支持性であることが決定された場合）。獲得免疫応答が、自然免疫応答の一助を得て、標的に対する、高度に特異的な応答を、効果的に調節するのかどうかを決定することも、さらに可能である（活性であることが決定された場合）。特に、疾患に応じて、応答が、より生得的であったり、又はより後天的であったりする可能性がある場合に、自然免疫応答及び獲得免疫応答のそれぞれの、全免疫応答への寄与を決定することも、さらに可能である。
【００７５】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、決定は、少なくとも３つ、好ましくは４つの異なる自然免疫細胞型に基づく。本発明の第３の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、決定は、少なくとも３つ、好ましくは、少なくとも４つ、より好ましくは、少なくとも５つ、なおより好ましくは、少なくとも６つ最も好ましくは、７つの異なる獲得免疫細胞型に基づく。本発明の第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、決定は、少なくとも３つ、好ましくは４つの異なる自然免疫細胞型、及び／又は少なくとも３つ、好ましくは、少なくとも４つ、より好ましくは、少なくとも５つ、なおより好ましくは、少なくとも６つ、最も好ましくは、７つの異なる獲得免疫細胞型に基づく。一般に、異なる細胞型が多いほど、結果はより正確となる。よって、より多くの免疫細胞型は、精度を改善すると考えることができる。
【００７６】
本発明の第２、第３、及び第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態に従って、自然免疫系活性状況、獲得免疫系活性状況、及び／又は全免疫系活性状況の決定は、数学的モデル（本明細書ではまた、免疫応答コンピュータモデルとも表記される）、特に、較正された数学的モデルによりなされる。異なる免疫細胞型の機能状態の組合せに基づき、免疫系状況を決定するように、このモデルをプログラムして、異なる免疫細胞型の機能状態を解釈する。
【００７７】
特に、対象の自然免疫系活性状況は、（ｉ）少なくとも１つの自然免疫細胞型の機能状況であって、前記機能状況は、本発明の第１の態様に従う方法、及びこれらの多様な実施形態により決定可能である機能状況を受信するステップと、（ｉｉ）対象の自然免疫系状況（本明細書ではまた、「免疫応答活性スコア」とも称する）を決定するステップであって、前記決定するステップは、少なくとも１つの自然免疫細胞型の機能状態を、対象の自然免疫系活性状況と関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づく、決定するステップと、任意選択で、（ｉｉｉ）例えば、本明細書で記載される、多様な目的で、対象の自然免疫系活性状況を提供するステップとを有する方法により決定可能である。
【００７８】
対象の獲得免疫系活性状況は、対応する方法により決定可能である。特に、この方法は、（ｉ）少なくとも１つの獲得免疫細胞型の機能状況であって、前記機能状況は、本発明の第１の態様に従う方法、及びこれらの多様な実施形態により決定可能である機能状況を受信するステップと、（ｉｉ）対象の獲得免疫系活性状況を決定するステップであって、前記決定するステップは、少なくとも１つの獲得免疫細胞型の機能状態を、対象の獲得免疫系活性状況と関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づく、決定するステップと、任意選択で、（ｉｉｉ）例えば、本明細書で記載される、多様な目的で、対象の獲得免疫系活性状況を提供するステップとを有する。
【００７９】
対象の全免疫系活性状況は、獲得免疫系活性状況を決定するための方法と、自然免疫系活性状況を決定するための方法との組合せの解釈、又は自然免疫細胞の機能状態、及び獲得免疫細胞の機能状態を、入力値として使用することにより決定可能である。特に、対象の全免疫系活性状況は、（ｉ）少なくとも１つの獲得免疫細胞型及び少なくとも１つの自然免疫細胞型の各々の機能状況であって、前記機能状況は、本発明の第１の態様に従う方法、及びこれらの多様な実施形態により決定可能である機能状況を受信するステップと、（ｉｉ）対象の全免疫系活性状況を決定するステップであって、前記決定するステップは、少なくとも１つの獲得免疫細胞型及び少なくとも１つの自然免疫細胞型の機能状態を、対象の全免疫系活性状況と関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づく、決定するステップと、任意選択で、（ｉｉｉ）例えば、本明細書で記載される、多様な目的で、対象の全免疫系活性状況を提供するステップとを有する方法により決定可能である。
【００８０】
本発明の第２、第３、第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態において、較正された数学的経路モデルは、重心モデル若しくは線形モデル、又は条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである。例えば、較正された数学的経路モデルは、確率論的モデル、好ましくは、免疫系状況と、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状態とを関連付ける条件付き確率に基づく、ベイジアンネットワークモデルである、又は較正された数学的経路モデルは、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状態の１つ又は複数の線形結合に基づく。
【００８１】
コンピュータモデルに従って、例えば、免疫活性、免疫抑制性、又は休止性との関係で、全免疫応答の活性状況（本明細書ではまた、「免疫系活性状況」とも称する）の確率を予測又は提供する変数又は値の形態で、全免疫系状態を提供するように、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状態を解釈する。モデルはまた、自然免疫応答及び獲得免疫応答の活性を、個別に測定するのにも使用することができる。モデルは、免疫応答の全状態についての計算の一部である、免疫応答の、これらの異なる型について、免疫系活性状態を、内因的に提供することもでき、自然免疫応答及び獲得免疫応答のそれぞれについての２つの個別の部分へと、容易に分けることもできる。ベイジアンモデルでは、これは、記載されたモデルから、あらかじめ読み取ることができる。
【００８２】
本発明の第２、第３、第４の態様の好ましい実施形態、及びその多様な実施形態において、方法は、
自然免疫系状況、獲得免疫系状況、及び／又は全免疫系状況が、支持状態にあるのか、休止状態にあるのか、免疫抑制状態にあるのかを決定又は予測するステップ；
全免疫系状況が、自然免疫系状況により、主に統御されているのかどうかを決定又は予測するステップ；
全免疫系状況が、獲得免疫系状況により、主に統御されているのかどうかを決定又は予測するステップ；
少なくとも１つの免疫細胞型が、異常な機能状況を有するのかどうかを決定又は予測するステップであって、前記決定又は予測するステップは、異常が、ある特定の事態において、与えられるべき機能状況であり、前記機能状況は、例えば、がんの場合、機能状況が、活性であるべきであり、自己免疫疾患の場合、機能状況が、不活性であるべきである機能状況とは別の機能状況を意味する、決定又は予測するステップ；
治療に対する応答を予測、モニタリング、又は決定するステップ；
治療の有効性を予測、モニタリング、又は決定するステップ；
腫瘍に対する免疫応答を予測、モニタリング、又は決定するステップ；
対象が治療に適合するのかどうかを決定又はモニタリングするステップ；
治療、投与量、及び／又は投与レジメンを決定するか、最適化させるか、又は調整するステップ；
疾患、特に、免疫媒介性疾患を診断又は亜型分類するステップ；
免疫媒介性疾患の活動性状況をモニタリングするステップ；
疾患時又は治療時の免疫応答状態をモニタリングするステップ；
治療の、免疫系状況に対する副作用を予測するステップ；
がんなどの疾患の高度の危険性についての、個体の診断又はスクリーニング；
免疫障害状態の診断；又は
過剰活性の免疫応答の診断をさらに含み；
この場合、決定するステップ、予測するステップ、モニタリングするステップ、最適化させるステップ、調整するステップ、又は診断するステップは、少なくとも１つの免疫細胞型の機能状況、少なくとも１つの自然免疫細胞型及び／又は少なくとも１つの獲得免疫細胞型の、機能的な免疫細胞活性に基づき、
治療は、好ましくは、免疫療法、特に、抗腫瘍免疫療法、化学療法、ターゲティング療法、放射線療法、免疫活性化療法、免疫調節療法、免疫抑制療法、ワクチン接種、ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ樹状細胞ワクチン接種、抗病原体療法又は抗感染療法、例えば、抗生剤又は抗ウイルス療法又は抗真菌療法のグループから選択される。
【００８３】
本発明の第５の態様に従って、装置は、本発明の、第１、第２、第３、及び第４の態様、及びこれらの多様な実施形態に従う方法のうちのいずれか１つを実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む。
【００８４】
本発明の第６の態様に従って、非一時的記憶媒体は、本発明の、第１、第２、第３、及び第４の態様、及びこれらの多様な実施形態に従う方法のうちのいずれか１つを実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する。非一時的記憶媒体は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光学ディスク若しくは他の光学記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリなどのコンピュータ読取り型記憶媒体、又は他の電子記憶媒体、ネットワークサーバーなどである。デジタル処理デバイスは、携帯型デバイス（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型コンピュータ又はタブレット型デバイス、リモートネットワークサーバーなどである。
【００８５】
本発明の第７の態様に従って、コンピュータプログラムは、デジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、本発明の、第１、第２、第３、及び第４の態様、及びこれらの多様な実施形態に従う方法のうちのいずれか１つを実施させるためのプログラムコード手段を含む。デジタル処理デバイスは、携帯型デバイス（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型コンピュータ又はタブレット型デバイス、リモートネットワークサーバーなどである。
【００８６】
本発明の第８の態様に従って、本発明の、第１、第２、第３、及び第４の態様、及びこれらの多様な実施形態に従う方法のうちのいずれか１つを実施するためのキットは、
以下のシグナル伝達経路：
ＮＦκＢ及びＰＩ３Ｋ（転写因子：ＦＯＸＯ）
の各々の転写因子の標的遺伝子のうちの１つ、好ましくは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現を定量するための構成要素
を含み；任意選択で、
以下のシグナル伝達経路：
ＡＲ、ＥＲ、ＨＨ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２（転写因子：ＳＴＡＴ１／２）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（転写因子：ＳＴＡＴ３）、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１（転写因子：ＡＰ−１）、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔ
の各々の標的遺伝子のうちの１つ、好ましくは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現を定量するための構成要素
のうちの１つ又は複数を含む。
【００８７】
好ましい実施形態では、キットは、ＦＯＸＯ、ＮＦκＢ、及びＳＴＡＴ３の標的遺伝子のための構成要素を含み、任意選択で、ＴＧＦ−β、ＳＴＡＴ１／２、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＡＰ−１、ＡＲ、ＥＲ、及びＨＨの標的遺伝子のための構成要素のうちの少なくとも１つを含む。別の好ましい実施形態では、キットは、ＦＯＸＯ、ＮＦκＢ、及びＴＧＦ−βの標的遺伝子のための構成要素を含み、任意選択で、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１／２、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＡＰ−１、ＡＲ、ＥＲ、及びＨＨの標的遺伝子のための構成要素のうちの少なくとも１つを含む。別の好ましい実施形態では、キットは、ＦＯＸＯ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ３、及びＴＧＦ−βの標的遺伝子のための構成要素を含み、任意選択で、ＳＴＡＴ１／２、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＡＰ−１、ＡＲ、ＥＲ、及びＨＨの標的遺伝子のための構成要素のうちの少なくとも１つを含む。別の好ましい実施形態では、キットは、ＦＯＸＯ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＧＦ−β、及びＳＴＡＴ１／２の標的遺伝子のための構成要素を含み、任意選択で、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ、ＡＰ−１、ＡＲ、ＥＲ、及びＨＨの標的遺伝子のための構成要素のうちの少なくとも１つを含む。
【００８８】
標的遺伝子の発現レベルを測定するための１つ又は複数の構成要素又は手段は、ＤＮＡアレイチップ、オリゴヌクレオチドアレイチップ、タンパク質アレイチップ、抗体、複数のプローブ、例えば、標識されたプローブ、ＲＮＡ逆転写酵素シーケンシング構成要素のセット、及び／又はｃＤＮＡ、増幅プライマーを含む、ＲＮＡ若しくはＤＮＡからなるグループから選択されうる。好ましい実施形態では、キットは、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ、及び質量分析からなるグループから選択される。ある実施形態では、キットは、本明細書で記載される標的遺伝子の、ｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列の部分を対象とする、標識されたプローブのセットを含む。ある実施形態では、キットは、標的遺伝子の、ｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列の部分を対象とするプライマー及びプローブのセットを含む。ある実施形態では、標識されたプローブは、標準化された９６ウェルプレート内に含有される。ある実施形態では、キットは、基準遺伝子のセットを対象とするプライマー又はプローブをさらに含む。このような基準遺伝子は、例えば、本明細書で記載される、標的遺伝子発現レベルの正規化又は標準化に有用な、構成的に発現させた遺伝子でありうる。
【００８９】
本発明の第９の態様に従って、システムは、
本明細書で記載される、本発明のキットと、
本明細書で記載される、本発明の装置、本明細書で記載される、本発明の非一時的記憶媒体、又は本明細書で記載される、本発明のコンピュータプログラムとを含む。
【００９０】
開示される、別の態様に従って、本明細書で記載される、本発明のキット又はシステムを、本明細書で記載される、本発明の方法を実施するのに使用する。
【００９１】
本明細書で記載される、本発明はまた、例えば、以下の活動：
がん、自己免疫／免疫媒介性疾患、感染性疾患、炎症性疾患、免疫構成要素を伴う他の疾患のために、
免疫療法に対する応答／免疫活性化薬／免疫調節薬／免疫抑制薬／ワクチン接種／ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種／ｉｎ  ｖｉｔｒｏ樹状細胞ワクチン接種を予測する；
免疫療法に対する応答をモニタリングする；
免疫療法に対する応答を定量する；
樹状免疫細胞などの免疫細胞型からなる試料上で、細胞が、機能的に、休止状態にあるのか、活性化させられているのか、又は免疫抑制されているのかを同定する；
樹状免疫細胞からなる試料上で、細胞が、機能的に、休止状態にあるのか、活性化させられているのか、又は免疫抑制されているのかを同定する；
樹状細胞を含有する、臓器／組織に由来する組織試料上で、樹状細胞が、休止しているのか、活性であるのか、抑制されているのかを同定する；
樹状細胞を含有する、がん組織に由来する組織試料上で、樹状細胞が、休止しているのか、活性であるのか、抑制されているのかを同定する；
腫瘍流入領域リンパ節に由来する組織試料上で、樹状細胞が、休止しているのか、活性であるのか、抑制されているのかを同定する；
自己免疫疾患を伴う患者に由来する樹状細胞を含有する組織試料上で、樹状細胞が、休止しているのか、活性であるのか、抑制されているのかを同定する；
血液試料上で、樹状細胞が、休止しているのか、活性であるのか、抑制されているのかを同定する；
患者試料上で、免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
血液試料上で、免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
組織試料上で、免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
試料に由来する樹状細胞上で、免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
患者に由来する試料上で、導入された治療が、有効であるのかどうかを同定する；
患者に由来する試料上で、導入された免疫療法が、有効であるのかどうかを同定する；
血液試料上で、患者が、免疫活性化療法、とりわけ、樹状細胞活性化免疫療法又はワクチン接種療法に関して、適合性であるのかどうかを同定する；
がんを伴う患者に由来する試料上で、免疫活性化療法、とりわけ、樹状細胞活性化免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
がんを伴う患者に由来する試料上で、樹状細胞活性化免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
がんを伴う患者に由来する樹状細胞上で、樹状細胞活性化免疫療法が、有効となるのかどうかを同定する；
患者に由来する樹状細胞上で、ｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種が、有効となるのかどうかを同定する；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性化樹状細胞上で、後続の樹状細胞ワクチン接種が、有効となるのかどうかを同定する；
樹状細胞ワクチン接種療法後の血液に由来する樹状細胞上で、この療法が、有効であったのかどうかを同定する；
樹状細胞上で、ＳＴＩＮＧ経路活性化薬が、有効となるのかどうかを同定する；
樹状細胞上で、適用されたＳＴＩＮＧ経路活性化薬が、有効であった／であるのかどうかを同定する；
例えば、例えば、腫瘍内の免疫応答が、既に活性である場合、さらなる刺激は、有効ではないという仮定に基づき、免疫療法に対する応答を予測する；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞の機能的免疫活性又は免疫抑制状態を特徴づけること；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づき、治療応答を予測すること；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づき、免疫調節療法の形態に対する応答を予測すること；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づき、免疫刺激療法に対する応答を予測すること；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づき、免疫抑制療法に対する応答を予測すること；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づく、治療（上記で言及された全て）の効能の評価；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づく、治療応答のモニタリング；
抗原提示免疫細胞型、具体的に、樹状細胞型の機能的免疫活性又は免疫抑制状態に基づく、治療適合性の評価又はモニタリング
のうちの少なくとも１つにおいて使用されても有利でありうる。
【００９２】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、経路解析は、異なる免疫細胞型を、リンパ節の異なる機能領域内で個別に解析して、免疫応答におけるリンパ節の機能活性を評価しうるように、リンパ節組織、又は濾胞領域若しくは胚中心領域など、リンパ節組織のうちの特異的な部分について実施することができる。
【００９３】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、経路解析は、腫瘍内の免疫細胞の抗腫瘍活性を評価し、この情報を、リンパ節内及び／又は血液中の免疫細胞についての経路解析と組み合わせるように、濾胞様又は胚中心様の構造を伴う領域など、がん組織内のリンパ節様領域について実施することができる。
【００９４】
ある実施形態では、全てのがん型及びがん亜型；並びに炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、ＳＬＥ、多発性硬化症などの免疫系媒介性疾患、並びに喘息、アテローム性動脈硬化、糖尿病などの炎症性疾患、うつ病及び統合失調症などの精神疾患、座瘡、子宮内膜症など、並びに細菌感染若しくはウイルス感染、又は寄生虫感染などの感染性疾患について、免疫細胞型内の経路活性プロファイルの組合せを、罹患組織内又は感染組織内及び血液中で、個別に、又は混合状態で測定することは、例えば、免疫媒介性疾患の場合には、疾患の診断、亜型分類を容易とする。
【００９５】
樹状細胞の成熟度及び／又は機能活性を決定するステップを有し、任意選択で、エフェクター細胞の動員のためのそれらの能力を含む方法が記載される。
【００９６】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、樹状細胞の経路解析は、樹状細胞の成熟段階及び／又はエフェクター細胞の動員に関する機能活性を評価するのに使用される。
【００９７】
ある実施形態において、樹状細胞の成熟状態を測定して、免疫療法の、がんを伴う患者への投与についての決定を、この結果に基づかせる、例えば、抗がん治療として、エフェクター免疫細胞の動員を増大させる樹状細胞刺激療法は、樹状細胞が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、及びＮｏｔｃｈによる経路の活性、並びにＰＩ３Ｋ経路の活性の低減（ＦＯＸＯ転写因子活性の増大と反比例する）と関連する、要求される成熟状況を有さない場合に、有効である可能性が高い。
【００９８】
ある実施形態において、樹状細胞の成熟状態を測定して、免疫抑制療法の、自己免疫疾患を伴う患者への投与についての決定を、この結果に基づかせる、例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２阻害剤又はＪＡＫ−ＳＴＡＴ３阻害剤などの免疫抑制性薬物は、エフェクター細胞の動員に干渉する結果として、症状の軽減をもたらす可能性が高い。
【００９９】
ある実施形態において、患者由来のＰＭＢＣ又は樹状細胞を、患者のがんに対する処置として、患者へと戻す前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、成熟樹状細胞へと、分化又は成熟させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるワクチン接種手順として、特異的がん抗原へと曝露する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける曝露の前及び後に、ＤＣの機能状態を評価して、ＤＣプライミング手順の効能について決定し、患者へと戻した後で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効能について評価する。
【０１００】
例示的な方法は、血液若しくは組織、又は他の任意の体液、或いは細胞培養モデルなど、樹状細胞の供給源である試料を得ることにより実施し、単離された樹状細胞試料から、ＲＮＡを単離し、その後、上記で記載した通り、それぞれのシグナル伝達経路の標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定すること、並びにＡＲ、ＥＲ、ＨＨ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、及びＷｎｔによる経路についての経路活性スコアを、ｌｏｇ２オッズ又は確率として推測することにより、経路解析を実施する。経路の活性から、機能活性状況、及びエフェクター細胞の動員のための能力を推測する。
【０１０１】
樹状細胞の機能活性状況を決定するステップを有する方法が記載される。方法は、シグナル伝達経路の測定値を解釈して、抗原提示細胞、より具体的に、樹状細胞が、活性化状態（抗原の取込み、プロセシング、提示、及びリンパ球への提示のための、適正な場所への遊走を意味する）にあるのか、休止／不活性状態にあるのか、免疫抑制／寛容原性（非機能）状態にあるのかを、定量的に指し示す、機能的細胞活性スコアの計算値をもたらす数学的コンピュータモデルと組み合わせた、１つ又は複数のシグナル伝達経路の測定を含む。本明細書では、「経路」、「シグナル伝達経路」、及び「シグナル伝達経路」という用語は、互換的に使用される。
【０１０２】
樹状免疫細胞又は異なる樹状免疫細胞型の、シグナル伝達経路活性プロファイルの組合せを決定するステップと、数学的モデルを使用して、測定値を、機能活性スコアに向けて解釈するステップとを有する方法が記載される。
【０１０３】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、試料は、血液であり、かつ／又は対象は、健常個体である。
【０１０４】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、血液試料から得られた樹状免疫細胞型内の、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦ−β、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ、ＮＦκＢの経路活性の測定値は、個体における樹状免疫細胞型の免疫機能が、健常個体において見出されると規定される正常から逸脱するのかどうかを指し示す。
【０１０５】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、標準的な技術（例えば、フローサイトメトリー、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製ビーズ）を使用して、経路活性プロファイルを測定することにより、活性／免疫抑制状況に関して、個別に解析するように、血液中の、全ての樹状免疫細胞型（ｍＤＣ、ｐＤＣなど）を単離することができる。
【０１０６】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、患者の、機能的な樹状免疫細胞の活性が、健常個体における活性から逸脱しているのかどうかを結論づけるように、血液を、個体から採取して、個体における経路活性プロファイルの組合せ、又は樹状免疫細胞型の組合せを測定及び解釈する。
【０１０７】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、患者が、健常であるのか、罹患しているのかを結論づけるように、血液を、個体から採取して、個体における経路活性プロファイルの組合せ、又は樹状免疫細胞型の組合せを測定及び解釈する。
【０１０８】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、異なる樹状免疫細胞又は樹状免疫細胞の組合せにおいて、経路活性について測定される機能活性状況に対する治療の効果を評価するように、血液を、治療の開始の前及び後に、個体から採取して、個体における経路活性プロファイルの組合せ、又は樹状免疫細胞型の組合せを測定する。
【０１０９】
本明細書の態様のうちのいずれかの実施形態では、免疫調節療法の副作用を予測するように、血液を、治療の開始の前及び後に、個体から採取して、個体における経路活性プロファイルの組合せ、又は樹状免疫細胞型の組合せを測定及び解釈する。
【０１１０】
例示的な方法は、ヒトから採血することにより実施し、ＦＡＣＳなどの方法を使用して、ｍＤＣ及びｐＤＣなど、異なる樹状免疫細胞を分離し、ＲＮＡを単離し、その後、それぞれのシグナル伝達経路の標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定すること、並びにＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、Ｗｎｔ、及びＮｏｔｃｈによる経路についての経路活性スコアを、ｌｏｇ２オッズ又は確率（又は別のスコア）として推測することにより、記載した経路解析を実施する。数学的モデル（例えば、ベイジアンモデル又は線形モデル）により、試料中で測定された経路スコアを解釈して、免疫機能活性スコアを提供し、健常個体についての免疫機能活性スコアと比較する。１つ又は複数の樹状免疫細胞型、又は樹状免疫細胞型の組合せにおける正常値から逸脱する経路スコアは、この細胞型の免疫機能の異常を指し示す。これは、疾患又は処置により引き起こされる。
【０１１１】
さらなる利点は、添付の図面、以下の記載を読み、これらを理解すれば、特に、本明細書の下記に提示される詳細な例を読めば、当業者に明らかであろう。
【０１１２】
本出願は、いくつかの好ましい実施形態について記載する。前出の詳細な記載を読み、理解すれば、他の研究者らは、改変及び変更に想到する。本出願は、それらが、付属の特許請求の範囲又はそれらの同等物の範囲内に収まる限りにおいて、全てのこのような改変及び変更を含むものとみなされることが意図される。
【０１１３】
開示される実施形態に対する、他の変動も、図面、本開示、及び付属の特許請求の範囲の検討から、当業者により理解され、特許請求された本発明の実施においてなされうる。
【０１１４】
請求項１、８及び９に記載の方法、請求項１１に記載の装置、請求項１２に記載の非一時的記憶媒体、請求項１３に記載のコンピュータプログラム、請求項１４に記載のキット、及び請求項１５に記載のシステムは、特に、従属請求項において規定される通り、類似の好ましい実施形態及び／又は同一の好ましい実施形態を有することを理解されたい。
【０１１５】
特許請求の範囲では、「〜を含むこと」という語は、他の要素又はステップを除外せず、単数形は、複数形を除外しない。
【０１１６】
単一のユニット又はデバイスは、特許請求の範囲において列挙された、いくつかの項目の機能を果たす。ある特定の手段が、互いに異なる従属請求項内に列挙されるという事実だけで、これらの手段の組合せを使用しても有利でありえないことが指し示されるわけではない。
【０１１７】
１つ又はいくつかのユニット又はデバイスにより実施される、危険性スコアの決定などの計算は、他の任意の数のユニット又はデバイスにより実施することができる。
【０１１８】
コンピュータプログラムは、光学記憶媒体又は半導体媒体など、適切な媒体上に保存／分配され、他のハードウェアと併せて、又はこの一部として供給されるが、また、インターネット又は他の有線若しくは無線の通信システムなど、他の形態でも供給される。
【０１１９】
本発明の好ましい実施形態はまた、従属請求項又は上記の実施形態の、それぞれの独立請求項との任意の組合せでもありうることを理解されたい。
【０１２０】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、本明細書の後出で記載される実施形態から明らかであり、これらを参照することにより解明されるであろう。
【０１２１】
全般：シグナル伝達経路解析スコアを示す、全ての図では、これらのスコアを、ベイジアン経路モデル解析により提示される経路活性についての確率スコアに由来する、経路活性についてのｌｏｇ２オッズスコアとして与える。ｌｏｇ２オッズスコアは、線形スケール上の、シグナル伝達経路の活性のレベルを指し示す。
【０１２２】
解析された公開データセットを、それらのＧＳＥ番号と共に指し示し、個別の試料を、それらのＧＳＭ番号（原則として、最左欄）と共に指し示す。ＧＥＯデータベース内に存在する、試料ごとの注記を、注記情報に関する見出しを伴う、図の特記欄（経路解析スコアの左）に組み入れる。それぞれの経路スコアを含有する欄の右側の欄において、免疫細胞型、免疫系／免疫応答の活性についてのスコアを、各試料について加算する。
【０１２３】
経路解析欄では：ＦＯＸＯ又はＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯとは、ＦＯＸＯ転写因子の活性ＰＩ３Ｋ経路活性の逆である、すなわち、ＦＯＸＯのｌｏｄ２オッズスコアが高スコアである場合、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路活性は低度であることを意味し；ＮＦκＢとは、ＮＦκＢシグナル伝達経路を意味し；Ｎｏｔｃｈとは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を意味し；ＳＴＡＴ１２＿１とは、Ｉ型インターフェロンにより、特異的に活性化させられるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路を意味し；ＳＴＡＴ１２＿２とは、ＩＩ型インターフェロンにより、特異的に活性化させられるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路を意味し；ＳＴＡＴ３＿ｂｌｏｏｄとは、血液細胞上の特異的な使用について較正された、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を意味し；ＴＧＦＢ＿１又はＴＧＦＢとは、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を意味し；ＡＰ１とは、ＭＡＰＫ−ＡＰ１シグナル伝達経路を意味する。
【０１２４】
シグナル伝達経路モデル又は免疫応答／系モデルのための、全てのバリデーション試料は、独立の試料であり、それぞれのモデルの較正をバリデーションするために使用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、好中球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、非刺激血液由来好中球（休止性）及びＬＰＳで刺激した血液由来好中球（支持性）を含み、全ての試料は、健常個体に由来した（ＧＳＥ２２１０３）。ＬＰＳは、好中球を活性化させることが知られており、これらの試料を、免疫支持性試料と呼んだ。独立のモデルバリデーションセットは、同様に処理した試料（ＧＳＥ２８４９０）を含有した。重心モデルは、較正セット内並びにバリデーションセット内いずれの好中球の機能活性状態も、１００％正確に評定した。「状態」欄では、グラウンドトゥルースの細胞状態（休止性、支持性）を指し示す。バリデーションセットでは、最右欄は、各試料について、モデルの結論を含有し；正とは、正確及びグラウンドトゥルースとの整合を意味し、誤とは、過誤及びグラウンドトゥルースとの不整合を意味する。これは、同様の試料解析結果を含有する、以下の全ての図についても同じである。
【図１Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、好中球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図１Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−β、Ｗｎｔによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、非刺激血液由来好中球（休止性）及びＬＰＳで刺激した血液由来好中球（支持性）を含み、全ての試料は、健常個体に由来した（ＧＳＥ２２１０３）。ＬＰＳは、好中球を活性化させることが知られており、これらの試料を、免疫支持性試料と呼んだ。独立のモデルバリデーションセットは、同様に処理した試料（ＧＳＥ２８４９０）を含有した。線形モデルは、較正セット内並びにバリデーションセット内いずれの好中球の機能活性状態も、１００％正確に評定した。「状態」欄では、グラウンドトゥルースの細胞状態（休止性、支持性）を指し示す。バリデーションセットでは、最右欄は、各試料について、モデルの結論を含有し；正とは、正確及びグラウンドトゥルースとの整合を意味し、誤とは、過誤及びグラウンドトゥルースとの不整合を意味する。これは、同様の試料解析結果を含有する、以下の全ての図についても同じである。
【図２Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、単球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、プールされた（解析されるｍＲＮＡ試料１例当たり１０人ずつのドナーから）非刺激血液由来単球を含み、全ての試料は、健常個体に由来した（ＧＳＥ２８４９０）。健常ヒトドナーの血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された単球から得た、第２のデータセットに由来する試料データ（ＧＳＥ４３７００）も使用した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ加工、細胞培養プレートへの接着、及び１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を伴う培養媒体中の、２４時間にわたる培養により活性化させ、その後、活性化させたＣＤ１４＋単球を、この細胞集団から単離した。２つの独立のモデルバリデーションセットは、正常個体からの非刺激血液由来ＣＤ１４＋単球に由来する試料（休止性）（ＧＥ７２６４２）、及び較正セットと同様に活性化させたＣＤ１４＋単球（支持性）（ＧＳＥ１６３８５）を含有した。重心モデルは、較正セット内並びにバリデーションセット内いずれの単球の機能活性状態も、１００％正確に評定した。
【図２Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、単球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図２Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、プールされた（解析されるｍＲＮＡ試料１例当たり１０人ずつのドナーから）非刺激血液由来単球を含み、全ての試料は、健常個体に由来した（ＧＳＥ２８４９０）。健常ヒトドナーの血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された単球から得た、第２のデータセットに由来する試料データ（ＧＳＥ４３７００）も使用した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ加工、細胞培養プレートへの接着、及び１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を伴う培養媒体中の、２４時間にわたる培養により活性化させ、その後、活性化させたＣＤ１４＋単球を、この細胞集団から単離した。２つの独立のモデルバリデーションセットは、正常個体からの非刺激血液由来ＣＤ１４＋単球に由来する試料（休止性）（ＧＥ７２６４２）、及び較正セットと同様に活性化させたＣＤ１４＋単球（支持性）（ＧＳＥ１６３８５）を含有した。線形モデルは、わずかに評定不良（８０％）であった。
【図３Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、樹状細胞についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、２人の健常ドナーに由来する、血液由来単球性細胞であって、前記血液由来単球性細胞は、標準的なプロトコール（Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  Ｅ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｅｄ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８４巻、６号、２０１０年３月、２９０８〜２９１７頁において記載されている）を使用して、未成熟樹状細胞へと分化させた血液由来単球性細胞、及び、その後、媒体（上方の４例の試料；休止性と名付ける）又はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（下方の４例の試料；支持性と名付ける）を、１８時間にわたり感染させた血液由来単球性細胞（ＧＳＥ１８７９１）を含んだ。このＮＤＶ感染は、樹状細胞の正常活性化についてのモデル系（Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  Ｅ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｅｄ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８４巻、６号、２０１０年３月、２９０８〜２９１７頁）であり、１８時間後において、最大活性化状況が得られた。バリデーションセットは、ナイーブ樹状細胞（休止性）、ＮＤＶ感染細胞の上清へと曝露した細胞（支持性）、及びＮＤＶ感染細胞（支持性）を伴う試料（ＧＳＥ５２０８１）に由来するデータを含有した。重心モデルは、較正セット内及びバリデーションセット内の、樹状細胞の機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図３Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、樹状細胞についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図３Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、２人の健常ドナーに由来する、血液由来単球性細胞であって、前記血液由来単球性細胞は、標準的なプロトコール（Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  Ｅ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｅｄ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８４巻、６号、２０１０年３月、２９０８〜２９１７頁において記載されている）を使用して、未成熟樹状細胞へと分化させた血液由来単球性細胞、及び、その後、媒体（上方の４例の試料；休止性と名付ける）又はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（下方の４例の試料；支持性と名付ける）を、１８時間にわたり感染させた血液由来単球性細胞（ＧＳＥ１８７９１）を含んだ。このＮＤＶ感染は、樹状細胞の正常活性化についてのモデル系（Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  Ｅ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｅｄ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８４巻、６号、２０１０年３月、２９０８〜２９１７頁）であり、１８時間後において、最大活性化状況が得られた。バリデーションセットは、ナイーブ樹状細胞（休止性）、ＮＤＶ感染細胞の上清へと曝露した細胞（支持性）、及びＮＤＶ感染細胞（支持性）を伴う試料（ＧＳＥ５２０８１）に由来するデータを含有した。線形モデルは、較正セット内及びバリデーションセット内の、樹状細胞の機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図４Ａ】４つのシグナル伝達経路についての経路解析の重心モデルに基づく、樹状細胞についての３状態（休止性、支持性、抑制性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、１人の健常ドナーに由来する、血液由来ＣＤ１４＋単球性細胞の３例の試料であって、前記試料は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を使用して、未成熟樹状細胞（休止性）へと分化させた試料、及びＬＰＳにより、成熟／活性化樹状細胞（支持性）へと分化させた試料、又はＩＬ１０／デキサメタゾンの組合せにより、免疫抑制性樹状細胞（抑制性）へと分化させた試料（Ｊａｎｓｅｎ  Ｂ．Ｊ．ら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１１年６月、１２：３３０）（ＧＳＥ２３３７１）を含んだ。バリデーションセットは、血液由来ＣＤ１４＋単球性細胞の試料であって、前記試料は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を使用して、未成熟樹状細胞（休止性）へと分化させた試料、同様に得た、未成熟樹状細胞の試料であって、前記試料は、その後、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＰＧＥ２により成熟／活性化樹状細胞（支持性）へと分化させた試料（Ｃａｂｅｚｏｎ  Ｒ．ら、「ＭＥＲＴＫ  ａｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９７巻、４号、７５１〜７６０頁）（ＧＳＥ１３７６２＋ＧＳＥ５６０１７）からなった。重心モデルは、バリデーションセット内の、樹状細胞の機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図４Ｂ】４つのシグナル伝達経路についての経路解析の線形モデルに基づく、樹状細胞についての３状態（休止性、支持性、抑制性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図４Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）、及びＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、１人の健常ドナーに由来する、血液由来ＣＤ１４＋単球性細胞の３例の試料であって、前記試料は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を使用して、未成熟樹状細胞（休止性）へと分化させた試料、及びＬＰＳにより、成熟／活性化樹状細胞（支持性）へと分化させた試料、又はＩＬ１０／デキサメタゾンの組合せにより、免疫抑制性樹状細胞（抑制性）へと分化させた試料（Ｊａｎｓｅｎ  Ｂ．Ｊ．ら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１１年６月、１２：３３０）（ＧＳＥ２３３７１）を含んだ。バリデーションセットは、血液由来ＣＤ１４＋単球性細胞の試料であって、前記試料は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を使用して、未成熟樹状細胞（休止性）へと分化させた試料、同様に得た、未成熟樹状細胞の試料であって、その後、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＰＧＥ２により成熟／活性化樹状細胞（支持性）へと分化させた試料（Ｃａｂｅｚｏｎ  Ｒ．ら、「ＭＥＲＴＫ  ａｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９７巻、４号、７５１〜７６０頁）（ＧＳＥ１３７６２＋ＧＳＥ５６０１７）からなった。線形モデルは、かなりの評定不良（１１％正確）であった。
【図５Ａ】３つのシグナル伝達経路についての経路解析の重心モデルに基づく、樹状細胞についての３状態（休止性、支持性、抑制性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図４の場合と同じ較正試料及びバリデーション試料を使用した（較正：ＧＳＥ２３３７１；バリデーション：ＧＳＥ１３７６２＋ＧＳＥ５６０１７）。重心モデルは、図４Ａに記載した４経路モデルと同様に、良好に作動したことから、この経路解析の代替的組合せの例もまた、良好に作動することが例示される（１００％正確）。
【図５Ｂ】３つのシグナル伝達経路についての経路解析の線形モデルに基づく、樹状細胞についての３状態（休止性、支持性、抑制性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図５Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、及びＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。図４の場合と同じ較正試料及びバリデーション試料を使用した（較正：ＧＳＥ２３３７１；バリデーション：ＧＳＥ１３７６２＋ＧＳＥ５６０１７）。線形モデルは、かなりの評定不良であった（解釈は、再査定中である）。
【図６Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、マクロファージＭ１についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、２人の健常個体からの末梢血単球に由来するマクロファージ（三連）であって、前記マクロファージは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、マクロファージ（休止性）へと分化させたマクロファージ、又はその後、ＬＰＳにより活性化させたマクロファージ（支持性）（ＧＳＥ４３５９６）を含んだ。バリデーションセットは、気管支肺胞洗浄の前に、肺セグメントへと、生理食塩液（休止性）又はＬＰＳ（支持性）を導入された、７人の健常ボランティアから得られた、肺由来マクロファージの試料（ＧＳＥ４０８８５）に由来するデータを含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、較正セット内及びバリデーションセット内の、マクロファージの機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図６Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、マクロファージＭ１についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図６Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、２人の健常個体からの末梢血単球に由来するマクロファージ（三連）であって、前記マクロファージは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、マクロファージ（休止性）へと分化させたマクロファージ、又はその後、ＬＰＳにより活性化させたマクロファージ（支持性）（ＧＳＥ４３５９６）を含んだ。バリデーションセットは、気管支肺胞洗浄の前に、肺セグメントへと、生理食塩液（休止性）又はＬＰＳ（支持性）を導入された、７人の健常ボランティアから得られた、肺由来マクロファージの試料（ＧＳＥ４０８８５）に由来するデータを含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、較正セット内及びバリデーションセット内の、マクロファージの機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図７Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、ＣＤ４＋リンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、健常個体から得られた、非活性化ＣＤ４＋メモリーＴ細胞を含有する、７例の試料（休止性）、並びにＣＤ４＋メモリーＴ細胞を、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体を使用して、標準的な方式で活性化させた、３例の試料（試料８、９、１０；支持性）、並びに同様に、４例の患者に由来する、免疫抑制性乳がん上清により処理した、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含有した、下方の４例の試料（１１〜１４）（抑制性）（ＧＳＥ３６７６６）によるデータを含有した。バリデーションセットは、１例の非刺激ＣＤ４＋エフェクターＴリンパ球試料（休止性）、及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８により活性化させた、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞試料の時系列に由来する試料（支持性）（ＧＳＥ１１２９２）によるデータを含有した。重心モデルは、バリデーションセット内の、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図７Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、ＣＤ４＋リンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図７Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、健常個体から得られた、非活性化ＣＤ４＋メモリーＴ細胞を含有する、７例の試料（休止性）、並びにＣＤ４＋メモリーＴ細胞を、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体を使用して、標準的な方式で活性化させた、３例の試料（試料８、９、１０；支持性）、並びに同様に、４例の患者に由来する、免疫抑制性乳がん上清により処理した、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含有した、下方の４例の試料（１１〜１４）（抑制性）（ＧＳＥ３６７６６）によるデータを含有した。バリデーションセットは、１例の非刺激ＣＤ４＋エフェクターＴリンパ球試料（休止性）、及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８により活性化させた、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞試料の時系列に由来する試料（支持性）（ＧＳＥ１１２９２）によるデータを含有した。線形モデルは、較正セット及びバリデーション内の機能活性を、それぞれ、７１％及び１００％正確に評定した。
【図８Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、Ｔｈ１  ＣＤ４＋  Ｔリンパ球及びＴｈ２  ＣＤ４＋  Ｔリンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（臍帯血から）を、ヘルパー１  Ｔ（Ｔｈ１）リンパ球（Ａｃｔ＋  ＩＬ１２を使用する）（支持性）へと分化させた３例の試料（多連）、及びＣＤ４＋細胞を、ヘルパー２  Ｔ（Ｔｈ２）リンパ球（Ａｃｔ＋  ＩＬ４を使用する）（抑制性）へと分化させた３例の試料（多連）（ＧＳＥ７１５６６）を含有した。バリデーションセットは、ＩＬ１２（支持性）又は抗ＩＬ１２と組み合わせたＩＬ４（抑制性）により処理した、同様の試料（各々を生物学的三連とする）（ＧＳＥ３２９５９）を含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、バリデーションセット内の、Ｔｈ１リンパ球及びＴｈ２リンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定し、このように、Ｔｈ１リンパ球と、Ｔｈ２リンパ球とを、極めて良好に区別することができた。支持性＝Ｔｈ１；抑制性＝Ｔｈ２である。
【図８Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、Ｔｈ１  ＣＤ４＋  Ｔリンパ球及びＴｈ２  ＣＤ４＋  Ｔリンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図８Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（臍帯血から）を、ヘルパー１  Ｔ（Ｔｈ１）リンパ球（Ａｃｔ＋  ＩＬ１２を使用する）（支持性）へと分化させた３例の試料（多連）、及びＣＤ４＋細胞を、ヘルパー２  Ｔ（Ｔｈ２）リンパ球（Ａｃｔ＋  ＩＬ４を使用する）（抑制性）へと分化させた（ＧＳＥ７１５６６）３例の試料（多連）を含有した。バリデーションセットは、ＩＬ１２（支持性）又は抗ＩＬ１２と組み合わせたＩＬ４（抑制性）により処理した、同様の試料（各々を生物学的三連とする）（ＧＳＥ３２９５９）を含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、バリデーションセット内の、Ｔｈ１リンパ球及びＴｈ２リンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定し、このように、Ｔｈ１リンパ球と、Ｔｈ２リンパ球とを、極めて良好に区別することができた。支持性＝Ｔｈ１；抑制性＝Ｔｈ２である。
【図９Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、調節性Ｔリンパ球（Ｔ−ｒｅｇ細胞）についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正データセットは、６例の健常対照（ＧＳＥ６５０１０、休止性）に由来する末梢血から単離され、分取された調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）の試料によるデータ、及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２（ＧＳＥ１１２９２、抑制性）により刺激したＴ−ｒｅｇ細胞の時系列を含有した。独立のバリデーションデータセットは、Ｔ−ｒｅｇ細胞の１つの非処置試料（休止性）、及び免疫抑制機能を創出するのに必要な、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２により刺激されたＴ−ｒｅｇ細胞（ＧＳＥ１１２９２、抑制性）の時系列を含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、較正セット内及びバリデーションセット内の、Ｔ−ｒｅｇリンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図９Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、調節性Ｔリンパ球（Ｔ−ｒｅｇ細胞）についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図９Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正データセットは、６例の健常対照（ＧＳＥ６５０１０、休止性）に由来する末梢血から単離され、分取された調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）の試料によるデータ、及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２（ＧＳＥ１１２９２、抑制性）により刺激したＴ−ｒｅｇ細胞の時系列を含有した。独立のバリデーションデータセットは、Ｔ−ｒｅｇ細胞の１つの非処置試料（休止性）、及び免疫抑制機能を創出するのに必要な、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２により刺激されたＴ−ｒｅｇ細胞（ＧＳＥ１１２９２、抑制性）の時系列を含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、較正セット内及びバリデーションセット内の、Ｔ−ｒｅｇリンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定した。
【図１０Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、ナイーブＣＤ８＋  Ｔリンパ球（ＧＳＥ２６３４７、休止性）を含有し、１例の試料は、それらの特異的な抗原の存在下で活性化させたＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＧＳＥ６３１２９、支持性）を含有した。バリデーションセットは、健常個体（ＧＳＥ７２６４２、休止性）の血液に由来する休止ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、並びにＩＬ−２／抗ＣＤ３抗体により拡大されたＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンによる試料、及びｅＡＰＣ又はｅＡＰＣ：４−１ＢＢＬ（ＧＳＥ８６２８４、支持性）による試料を含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、較正セット内及びバリデーションセット内の、ＣＤ８＋リンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定した。抑制状態にあるＣＤ８＋  Ｔ細胞のデータは、利用可能ではなかった。
【図１０Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図１０Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−１（Ｉ型インターフェロン）及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２−２（ＩＩ型インターフェロン）、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３（血液で較正）、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、ナイーブＣＤ８＋  Ｔリンパ球（ＧＳＥ２６３４７、休止性）を含有し、１例の試料は、それらの特異的な抗原の存在下で活性化させたＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＧＳＥ６３１２９、支持性）を含有した。バリデーションセットは、健常個体（ＧＳＥ７２６４２、休止性）の血液に由来する休止ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、並びにＩＬ−２／抗ＣＤ３抗体により拡大されたＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンによる試料、及びｅＡＰＣ又はｅＡＰＣ：４−１ＢＢＬ（ＧＳＥ８６２８４、支持性）による試料を含有した。重心モデル及び線形モデルのいずれも、較正セット内及びバリデーションセット内の、ＣＤ８＋リンパ球の機能活性状態を、１００％正確に評定した。抑制状態にあるＣＤ８＋  Ｔ細胞のデータは、利用可能ではなかった。
【図１１Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、メモリーＴリンパ球についての２状態（ナイーブ、メモリー）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、６例の健常個体（ＧＳＥ６５０１０）の末梢血から単離された、メモリーＴエフェクター細胞（メモリー）及びナイーブＴエフェクター細胞（ナイーブ）を含有した。バリデーションセットは、健常個体の末梢血に由来するメモリ−Ｔ細胞（ＧＳＥ６５０１０＋ＧＳＥ２６４９５、メモリ−）、並びに健常個体に由来するＣＤ８ナイーブＴ細胞（ＧＳＥ２６４９５）及びナイーブＴ−ｒｅｇ細胞（ＧＳＥ６５０１０、ナイーブ）を伴う試料を含有した。重心モデルは、バリデーションセット内のＴ細胞（ナイーブ又はメモリー）の機能活性状態を、９６％正確（多連の試料１例は、メモリーと誤って評定された）（較正セットの結果と同様）に評定した。
【図１１Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、メモリーＴリンパ球についての２状態（ナイーブ、メモリー）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図１１Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βによる経路を、モデルのために使用した。較正セットは、６例の健常個体（ＧＳＥ６５０１０）の末梢血から単離された、メモリーＴエフェクター細胞（メモリー）及びナイーブＴエフェクター細胞（ナイーブ）を含有した。バリデーションセットは、健常個体の末梢血に由来するメモリ−Ｔ細胞（ＧＳＥ６５０１０＋ＧＳＥ２６４９５、メモリ−）、並びに健常個体に由来するＣＤ８ナイーブＴ細胞（ＧＳＥ２６４９５）及びナイーブＴ−ｒｅｇ細胞（ＧＳＥ６５０１０、ナイーブ）を伴う試料を含有した。線形モデルは、較正セット及びバリデーションセットのいずれについても、評定がやや不良であった。
【図１２Ａ】経路解析の重心モデルに基づく、Ｂリンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。較正セットは、健常個体からの血液に由来するＢリンパ球を伴う試料（ＧＳＥ３９４１１）であって、前記試料は、非刺激である試料（休止性）、又は培養物中のＢ細胞の時系列としての試料Ｂ細胞受容体を、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭにより刺激した試料（支持性）を含有した。バリデーションセット（ＧＳＥ９１１９）は、健常個体に由来する、同様に処理したＢリンパ球を伴う試料（休止性、支持性）を含有した。モデルは、バリデーションセット内の、Ｂ細胞の機能活性状態を、７５％正確に評定した。
【図１２Ｂ】経路解析の線形モデルに基づく、Ｂリンパ球についての２状態（休止性、支持性）免疫モデルの較正結果及びバリデーション結果を、例示的に示す図である。図１２Ｂ（続き）は、閾値による、休止性試料と、支持性試料との分離を示す。ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３による経路を、モデルのために使用した。較正セットは、健常個体からの血液に由来するＢリンパ球を伴う試料（ＧＳＥ３９４１１）であって、前記試料は、非刺激である試料（休止性）、又は培養物中のＢ細胞の時系列としての試料Ｂ細胞受容体を、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭにより刺激した試料（支持性）を含有した。バリデーションセット（ＧＳＥ９１１９）は、健常個体に由来する、同様に処理したＢリンパ球を伴う試料（休止性、支持性）を含有した。モデルは、バリデーションセット内の、Ｂ細胞の機能活性状態を、７５％正確に評定した。
【図１３Ａ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。免疫応答の２つの部分である、自然免疫応答及び獲得免疫応答からなる、免疫応答を計算するためのモデルである。モデルへと入力される変数又は可観測量は、各細胞型内のシグナル伝達経路解析により決定される、免疫細胞型の機能活性スコアである。可観測スコアを足し合わせて、自然免疫系活性及び獲得免疫系活性、並びに全免疫系活性についてのスコアを提供する。
【図１３Ｂ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。血液細胞解析に基づき、免疫系活性を計算するための事例である。免疫活性化状態：血液細胞解析における、がんに対する活性の応答についての事例である。
【図１３Ｃ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。血液細胞解析に基づき、免疫系活性を計算するための事例である。不活性の免疫応答、休止免疫応答：血液細胞解析において、活性の免疫応答が見られない場合についての事例である。
【図１３Ｄ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。血液細胞解析に基づき、免疫系活性を計算するための事例である。免疫抑制状態：血液細胞解析において、免疫応答が枯渇した場合についての事例である。
【図１３Ｅ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。この例では、総スコア範囲は、１９（最大値；完全に活性の免疫系）〜６（最小値、抑制性免疫系）の間にある。１９から６を減じた１３を、１〜１００％の免疫応答活性化のスケールにわたり除する。線形活性スコアは、以下の式：免疫活性百分率＝［（累計ポイント−６）／１３］×１００％により、活性化百分率へと変換することができる。＞７７％の百分率は、活性の免疫応答を指し示し；７７％より小さな百分率ほど、免疫抑制性の免疫応答を指し示す。このリードアウトを、免疫応答状況と呼ばれる、免疫抑制性と対比した免疫活性についての定量スコアへと転換するためには、％記号を外しながら、この「休止性」閾値を、７７％から０へとリセットすることができる。式は、以下：免疫応答活性％−７７＝免疫活性状況の通りとなり、式中、正の数は、免疫応答が活性であることを意味し、負の数は、免疫応答抑制性であることを意味する。前出の式への組込みにより、免疫応答状況＝｛［（累計ポイント−６）／１３］×１００％｝−７７となる。負の数は、免疫応答抑制性であることを指し示し、正の数は、免疫応答が活性であることを指し示す。
【図１３Ｆ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。２つの免疫細胞型の機能活性状態からの入力だけが利用可能である事例である。全ての入力値が利用可能であるわけではない場合における、免疫活性百分率の計算：免疫活性百分率＝［（スコア−最小値）／最大値−最小値］×１００％であり、式中、最小値＝測定された免疫細胞型についての最小ポイントの値（例では：０＋１＝１）；最大値＝測定された免疫細胞型についての最大ポイントの値（例では：２＋２＝４）である。事例では、免疫活性百分率＝［（スコア−１）／３］×１００％である。事例における結果は、１００％活性であるが、２つの可観測量だけを、モデルへと投入したため、不確実性が大きい。関連する不確実性を、結果へと組み込む場合：２つの累計ポイントの入力は、１００％の免疫系活性スコアをもたらすが、８２％の不確実性を伴う。
【図１３Ｇ】免疫活性応答スコアを提供する数学的モデル（機能的免疫応答モデル「１型」）に基づき、免疫応答活性（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の百分率を計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。全ての入力値が利用可能であるわけではない場合において、免疫活性百分率は、以下：免疫活性百分率＝［（スコア−最小値）／最大値−最小値］×１００％の通りに計算することができ、式中、最小値＝測定された免疫細胞型についての最小ポイントの値（例では：０＋１＝１）；最大値＝測定された免疫細胞型についての最大ポイントの値（例では：２＋２＝４）である。事例では、免疫活性百分率＝［（スコア−１）／３］×１００％である。事例では、１００％であるが、２つの可観測量だけを、モデルへと投入したため、不確実性が大きい。（不）確実性は、以下の通りに計算することができる：１１の可観測量（モデルへと入力される変数、すなわち、免疫細胞型の機能活性スコアを意味する）全てが、モデルへの入力として利用可能である場合、免疫活性状況の予測に関する最大の確実性は、１００％の確実性として規定される。仮定：可観測量の、最終スコアへの線形寄与：可観測量１つ当たり、（１００／１１）＝９％の確実性の寄与とする。事例では、２つの累計ポイントの入力は、８２％の不確実性と関連する、１００％の免疫活性スコアをもたらす。スコアの計算である。
【図１４Ａ】免疫応答活性についての確率又はｌｏｇ２オッズスコアを、ベイジアンネットワークモデルに基づく数学的モデル（「２型」機能的免疫応答モデル）に基づき計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。自然免疫細胞及び獲得免疫細胞の活性状態から、免疫応答活性へと向かう矢印、及び自然免疫細胞の活性状況から、獲得免疫の活性状況へと向かう矢印を伴う、ベイジアンネットワークモデルのための有向非巡回グラフである。矢印の方向は、ベイジアンネットワークモデルにおいて、規定的な意味を有する。モデルの一部である、免疫細胞型の各々についての、ベイジアンネットワークモデルノードパラメータ、すなわち、それぞれ、２つ及び３つの免疫活性状態を伴う、免疫細胞型についての、２状態モデル（休止性及び支持性）及び３状態モデル（休止性、支持性、抑制性）のノードのためのパラメータの例を、図中の表に指し示す。これらのパラメータは、自然免疫系及び獲得免疫系の活性状況の計算を、個別に可能とする。
【図１４Ｂ】免疫応答活性についての確率又はｌｏｇ２オッズスコアを、ベイジアンネットワークモデルに基づく数学的モデル（「２型」機能的免疫応答モデル）に基づき計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。全免疫応答／免疫系の状況活性の決定である。自然免疫系及び獲得免疫系の免疫活性スコアから、全免疫応答の活性状況についての結果を得ることができる。「全免疫応答」は、実質的に、検索表である。確率論的依存性は、存在しない。上図表：これは、転置フォーマットによる、２つの親（自然免疫系及び獲得免疫系）を伴うノードについての表である。右下図表は、以下の通りに読み取られるものとする：自然免疫系が、抑制性であることを踏まえると、獲得免疫系が、休止状態にある確率は、０．３である。所与の自然免疫は、活性であり、ＡＩについての、（１列目の）３つの選択肢は、活性、休止性、抑制性であり、これにより、列は、合計で１にならなければならないため、列内の確率は、１へと足し合わされる（行内は、必ずしもそうではない）ことに注意されたい。
【図１５Ａ】線形モデル（免疫応答モデル「３型」）に基づき、免疫応答活性の、数値的免疫スコアを計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。免疫応答を計算するために構築されたモデルである。図解された例では、スコアは、１０であり、最大限に活性の免疫系／応答を指し示す。
【図１５Ｂ】線形モデル（免疫応答モデル「３型」）に基づき、免疫応答活性の、数値的免疫スコアを計算する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。免疫応答活性の計算：累計ポイントが１０ポイントを超えるほど、免疫応答が、不活性／抑制ではないことを指し示すのに対し、累計ポイントが１０ポイントを下回るほど、免疫応答が抑制状態にあることを指し示す。図解された例では、スコアは、１０であり、最大限に活性の免疫系／応答を指し示す。
【図１６Ａ】線形モデル（線形免疫応答モデル「３型変化形Ａ」）又は百分率変換型線形モデルに基づき、免疫応答の免疫抑制状況を特異的に測定する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。ポイントから百分率への変換は、記載した（図１３）のと同様である。免疫抑制の計算のためのモデルについての図である。
【図１６Ｂ】線形モデル（線形免疫応答モデル「３型変化形Ａ」）又は百分率変換型線形モデルに基づき、免疫応答の免疫抑制状況を特異的に測定する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。ポイントから百分率への変換は、記載した（図１３）のと同様である。最大限に免疫抑制された免疫応答／系についての例である。
【図１６Ｃ】この例では、免疫抑制の最高免疫応答スコアは、１５ポイントであり、免疫抑制の最低応答スコアは、３ポイントである（［（累計ポイント−３）／１２］×１００％として計算される）ことを示す図である。
【図１７Ａ】数学的モデル（「３型変異体Ｂ」）を使用して、自然免疫応答（本明細書ではまた、自然免疫系状況とも称する）、及び獲得免疫応答（本明細書ではまた、獲得免疫系状況とも称する）の活性を測定する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。同じ手法を使用して、全免疫応答モデルについて記載することができる。図１７Ａ：活性の自然免疫系について、例示的に説明する図である。
【図１７Ｂ】数学的モデル（「３型変異体Ｂ」）を使用して、自然免疫応答（本明細書ではまた、自然免疫系状況とも称する）、及び獲得免疫応答（本明細書ではまた、獲得免疫系状況とも称する）の活性を測定する手法を、例示的、かつ、概略的に示す図である。同じ手法を使用して、全免疫応答モデルについて記載することができる。図１７Ｂ：活性の獲得免疫系について、例示的に説明する図である。
【図１８Ａ】免疫応答状況の測定についての結果（データセットであるＧＳＥ７２４６２）を、例示的に示す図である。異なる免疫細胞型（ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、及びＢリンパ球、好中球、単球）は、３人の健常個体の末梢血試料から単離され、マイクロアレイ結果は、重心モデルを使用して、多様な免疫細胞型の機能活性状況を評価する、本明細書で記載される方法により解析され、モデル結果は、１型（百分率免疫応答活性）免疫応答モデルのための入力として機能した。重心モデルの結果と併せて、逐次的に、ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球、Ｂ細胞、単球、ＰＭＮ（３例の試料全ての、データが入手可能な全ての免疫細胞型についての「休止性」スコア）についての経路解析結果を示すシリーズである。図の下方部分は、それぞれの免疫細胞型について、機能的な免疫細胞活性モデルの較正試料と比べた、解析試料の位置を示す。
【図１８Ｂ】免疫応答状況の測定についての結果（データセットであるＧＳＥ７２４６２）を、例示的に示す図である。異なる免疫細胞型（ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、及びＢリンパ球、好中球、単球）は、３人の健常個体の末梢血試料から単離され、マイクロアレイ結果は、重心モデルを使用して、多様な免疫細胞型の機能活性状況を評価する、本明細書で記載される方法により解析され、モデル結果は、１型（百分率免疫応答活性）免疫応答モデルのための入力として機能した。免疫応答モデルによる計算（図１８Ａによる重心モデル結果に基づく）：免疫活性百分率＝［（スコア−最小値）／（最大値−最小値）］×１００％であり、（５−４）／（１０−４）×１００％＝１７％である。不確実性の計算：欠失可観測量／変数＝６であり、不確実性：６×９＝５４％の不確実性である。範囲：０〜７１％であり、活性の免疫応答についての閾値は、７７％であることから、これらの試料が、不活性の免疫応答を表すことの、高度の信頼性が指し示される。この場合、データセット内の３例の試料全ての評定は、同様であった。
【図１８Ｃ】解析の結果を、２型免疫応答（ベイジアンモデルによる免疫応答活性）モデルを使用して示す図である。細胞型である、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞、単球、及びＰＭＮを選択することにより、ベイジアンネットワークのための１つの証拠のセットを形成し、これらを、１００％確実な休止状態に帰する。三連の各々について、状態が、１００％確実な休止状態ではなく、確率論的に規定されるデータセットが生成された。確率は、重心モデルでは、距離に由来する（図１８Ａで報告した通り；最大の確率は、距離が最小である状態に帰せられる）。以下のソフトマックス法を使用して、確率を決定する：ＳｏｆｔＭａｘ（−（ａ  ｂ））＝（ｅ−ａ／ｅ−ａ＋ｅ−ｂ）  ｅ−ｂ／ｅ−ａ＋ｅ−ｂ）ベイジアン免疫応答モデル計算の結果は、自然免疫細胞型、獲得免疫細胞型の両方、並びに全免疫応答が、活性状態である、正常／休止状態について、最大の確率を有し、健常個体に期待される免疫応答活性状況と完全に符合することを示す。
【図１９】免疫サイクルを、概略的に例示する図であり、がんを伴う患者において、免疫細胞を得うる、免疫系内の主要な３つの場所を指し示す。
【図２０Ａ】２状態（休止性対支持性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＴＧＦ−βの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である（独立のデータセット上の、ベイジアンモデルのバリデーションを、後出図に示す）。手法を概略的に示す。樹状細胞の休止（不活性）状態を計算するためのベイジアンモデルである。
【図２０Ｂ】２状態（休止性対支持性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＴＧＦ−βの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である（独立のデータセット上の、ベイジアンモデルのバリデーションを、後出図に示す）。手法を概略的に示す。樹状細胞の支持（活性）状態を計算するためのベイジアンモデルである。
【図２０Ｃ】２状態（休止性対支持性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＴＧＦ−βの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である（独立のデータセット上の、ベイジアンモデルのバリデーションを、後出図に示す）。上：ベイジアンモデルの一部である、３つの経路の各々についてのＣＰＴ値（ベイジアンノードパラメータ）であり；下：データセットであるＧＳＥ２３３７１を、解析される試料（ＧＳＭ番号）ごとに指し示される経路活性スコアと共に使用する、較正データセットの経路解析結果である。
【図２０Ｄ】２状態（休止性対支持性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＴＧＦ−βの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である（独立のデータセット上の、ベイジアンモデルのバリデーションを、後出図に示す）。データセットであるＧＳＥ２３３７１についての較正結果である。棒グラフでは、各解析試料は、バーにより表される。左：ｘ軸上の試料番号を伴う、較正結果についての、ｙ軸上の、ｌｏｇ２オッズ単位の最頻値により計算された免疫スコアであり、負のｌｏｇ２オッズは、休止性を意味し、正のｌｏｇ２オッズは、支持性を意味する；右：ｘ軸上の試料番号を伴う、較正結果についての、ｙ軸上の、モデル確率により計算された免疫スコアであり、小さな確率は、休止性を意味し、大きな確率は、支持性を意味する。グラウンドトゥルースは、免疫休止性又は免疫支持性であった。休止性ＤＣは、免疫休止性（不活性）であることの確率／ｌｏｇ２オッズが大きいことが見出された。支持性ＤＣは、免疫支持性であることの確率／ｌｏｇ２オッズが大きいことが見出された。
【図２１Ａ】３状態（休止性対支持性対抑制性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−β、ＭＡＰＫ−ＡＰ１、及びＰＩ３Ｋの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。手法を概略的に示す。樹状細胞内の不活性の休止状態を計算するための、３状態ベイジアンモデルである。
【図２１Ｂ】３状態（休止性対支持性対抑制性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−β、ＭＡＰＫ−ＡＰ１、及びＰＩ３Ｋの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。手法を概略的に示す。樹状細胞内の免疫支持状態を計算するための、３状態ベイジアンモデルである。
【図２１Ｃ】３状態（休止性対支持性対抑制性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−β、ＭＡＰＫ−ＡＰ１、及びＰＩ３Ｋの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。手法を概略的に示す。樹状細胞内の免疫抑制状態を計算するための、３状態ベイジアンモデルである。
【図２１Ｄ】３状態（休止性対支持性対抑制性）ベイジアンモデルを使用する、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−β、ＭＡＰＫ−ＡＰ１、及びＰＩ３Ｋの経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法及び較正結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。ＣＰＴ値（ベイジアンネットワークのノードパラメータ）である。続き：データセットであるＧＳＥ２３３７１を、解析される試料（ＧＳＭ番号）ごとに指し示される経路活性スコアと共に使用する、較正データセットの経路解析結果である。
【図２１Ｅ】データセットであるＧＳＥ２３３７１についての、ベイジアンモデルの較正結果を示す図である。最初の２つの棒グラフは、免疫抑制状態の評価についてのモデル結果を示し；棒グラフ３／４は、免疫支持状態の評価についての結果を示し；棒グラフ５／６は、休止状態の評価についての結果を示す。ｙ軸は、それぞれのスコアを示し、棒グラフ１、３、５について、これは、ｌｏｇ２オッズスコアにより；棒グラフ２、４、６について、これは、確率スコアによる。棒グラフでは、各解析試料は、バーにより表される。各棒グラフでは、左の３つのバーは、「免疫抑制」状態のグラウンドトゥルースを伴う試料のスコアを表し；バー４〜６は、「免疫支持」状態のグラウンドトゥルースを伴う試料を表し；バー７〜９は、「休止」状態のグラウンドトゥルースを伴う試料を表す。グラウンドトゥルースの状態は、バーの下方又は上方の、棒グラフの各々に指し示される。結果：抑制性ＤＣは、免疫抑制性である確率が最も高い。支持性ＤＣは、免疫支持性である確率が最も高い。休止性ＤＣは、免疫休止性である確率が最も高い。
【図２２Ａ】線形モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。２状態（休止性対支持性）モデルについてのスコアである。
【図２２Ｂ】線形モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。３状態（休止性対支持性対抑制性）についてのスコアである。
【図２２Ｃ】線形モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。２状態モデル（上）及び３状態モデル（下）についての、経路解析の較正結果であり、経路解析結果を、各個別の試料（ＧＳＭ番号により指し示される）並びに経路活性の合計（累計値）（最右欄）について指し示す。
【図２２Ｄ】線形モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。２状態モデルのための、独立のデータセットであるＧＳＥ１８７９１についてのバリデーション結果である。このデータセット内の試料は、それぞれ、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８時間にわたり、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）感染を使用して免疫活性化させるか、又は活性化させなかった（参考文献：Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  Ｅ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｅｄ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８４巻、６号、２０１０年３月、２９０８〜２９１７頁）。結果：短時間（最大で、４時間）にわたり活性化させた試料は、規定されたスコアに従って、免疫休止状態にある。中程度の持続期間にわたる活性化は、休止状態と、支持状態との間の中間状態を結果としてもたらす。長時間（＞８時間）の活性化は、一貫して、免疫支持状態を結果としてもたらす。試料を活性化させない場合（ＮＤＶにより感染させなかった対照試料の全シリーズ）、試料は、免疫休止状態にある（図２２Ｄの続き）。
【図２２Ｅ】線形モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の機能状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。３状態モデルのための、データセットであるＧＳＥ１３７６２及びＧＳＥ１８７９１についてのバリデーション結果である。データセットであるＧＳＥ１３７６２は、休止性樹状細胞及び免疫抑制性（寛容原性）樹状細胞の試料を含有する（参考文献：Ｓｚｅｌｅｓ  Ｌ．ら、「１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｓ  ａｎ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８２巻、４号、２００９年２月、２０７４〜２０８３頁）。データセットであるＧＳＥ１８７９１については、図２２Ｄの下に記載されている：試料は、それぞれ、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８時間にわたり、ＮＤＶにより活性化させるか、又は活性化させないか、若しくは抑制した。ＧＳＥ１８７９２のデータセットに由来する試料についての解析の結果は、図２２Ｄの下に記載した結果と同様であった：短時間にわたり活性化させた試料は、規定されたスコアに従って、免疫休止状態にある。中程度の持続期間にわたる活性化は、休止状態と、支持状態との間の中間状態を結果としてもたらす。長時間の活性化は、免疫支持状態を結果としてもたらす。モデルは、グラウンドトゥルースの樹状細胞活性状態を、正確に予測した。図２２Ｄの続きは、ＧＳＥ１８７９２に由来する、対照の非処置試料セットを示し、下方に、データセットであるＧＳＥ１３７６２に由来する、６例の試料を示す。「サブグループ」欄は、グラウンドトゥルースによる、「休止性」又は「免疫抑制性」の呼称を含有する。モデル計算の結果：試料は、モデルにより、休止性又は免疫抑制性として、正確に評定される。
【図２３Ａ】重心モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の活性状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。２状態（休止性対支持性）モデルである。
【図２３Ｂ】重心モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の活性状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。３状態（休止性対支持性対抑制性）である。
【図２３Ｃ】重心モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の活性状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。２状態モデル（上）及び３状態モデル（下）についての、較正データセットの経路解析結果である。重心モデルの較正結果を、各較正データセットの下方に示す。
【図２３Ｄ】重心モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の活性状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。２状態モデルのための、独立のデータセットであるＧＳＥ１８７９１（図２２において記載されている）についてのバリデーション結果である。試料を、それぞれについて、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８時間にわたり、ＮＤＶ感染により活性化させるか、又は活性化させなかった。結果：図２２の記載に報告された結果と同様である。
【図２３Ｅ】重心モデルを使用する、経路活性スコアに基づき、樹状細胞の活性状態を予測するための手法、較正結果、及びバリデーション結果を、概略的、かつ、例示的に示す図である。３状態モデルのための、データセットであるＧＳＥ１３７６２及びＧＳＥ１８７９１についてのバリデーション結果である。結果：図２２の記載に報告された結果と同様である。
【図２４】樹状細胞についての、ベイジアンモデルのバリデーションを示す図である。データセットであるＧＳＥ７９１８４についての、３状態ベイジアンモデルを使用して、ＩＬ−４及びＩＬ−１５と共に培養された樹状細胞の機能状況の決定についての、例示的な結果である。ＩＬ−１５と共に培養されたＤＣは、より大きな支持特性を有し、ＩＬ−４と共に培養されたＤＣは、より大きな抑制／寛容原性特性を有する（このデータセットと関連する参考文献（参考文献：ｖａｎ  Ａｃｋｅｒ  Ｈ．Ｈ．ら、「Ｄｅｓｉｒａｂｌｅ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、８巻、８号、２０１７、１３６５２〜１３６６５頁）により提示されているグラウンドトゥルース）。ｙ軸は、それぞれのスコアを示し、左側の棒グラフについて、これは、ｌｏｇ２オッズスコアにより；右側の棒グラフについて、これは、確率スコアによる。棒グラフでは、各解析試料は、バーにより表される。各棒グラフでは、左の３つのバーは、「免疫支持」状態の（ＩＬ−１５と関連する）グラウンドトゥルースを伴う試料のスコアを表し；右の３つのバーは、「免疫抑制」状態の（ＩＬ−４と関連する）グラウンドトゥルースを伴う試料を表す。棒グラフの左側には、解析のために、どのモデルによるリードアウト：上方〜下方において：免疫抑制性、免疫支持性、休止性を使用したのかが指し示される。３つの確率スコアの総和が、１であることに注意されたい。定義に従って、本明細書で使用される、最高のスコアを伴う状態は、試料へと帰せられた状態を規定する。
【図２５Ａ】データセットであるＧＳＥ１８７９１（図２２において記載されている）についてのベイジアン２状態モデル（免疫抑制及び免疫支持）のバリデーション結果を、例示的に示す図である。試料を、それぞれについて、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８時間にわたり、ＮＤＶにより活性化させるか、又は活性化させなかった。あらゆる棒グラフについて、較正試料は、垂直方向の直線の左側に指し示され、あらゆるバーは、解析される樹状細胞試料を表す（バー１〜３は、免疫抑制樹状細胞を表し、バー４〜６は、免疫支持樹状細胞を表し、バー７〜９は、休止樹状細胞を表す）。ＧＳＥ１８７９１のバリデーション試料は、垂直方向の直線の右側である：バー１〜４は、ＮＤＶによる活性化の開始の前における対照試料を表し；バー５〜８は、ＮＤＶによる活性化の開始の２時間後における試料を表し；バー９〜１２は、ＮＤＶによる活性化の開始の４時間後における試料を表し；バー１３〜１６は、ＮＤＶによる活性化の開始の６時間後における試料を表し；バー１７〜２０は、ＮＤＶによる活性化の開始の８時間後における試料を表し；バー２１〜２４は、ＮＤＶによる活性化の開始の１０時間後における試料を表し；バー２５〜２８は、ＮＤＶによる活性化の開始の１２時間後における試料を表し；バー２９〜３２は、ＮＤＶによる活性化の開始の１４時間後における試料を表し；バー３３〜３６は、ＮＤＶによる活性化の開始の１６時間後における試料を表し；バー３７〜３９は、ＮＤＶによる活性化の開始の１８時間後における試料を表し；バー４０〜５７は、ＮＤＶにより活性化させられなかった対照樹状細胞試料を表す。ＤＣの活性化は、それらを休止から、支持へと切り替えるのに、ある程度の時間を要することに注目されたい。試料（ＧＳＭ番号）１例ごとの経路活性スコアを伴う、バリデーションデータセットであるＧＳＥ１８７９１上における経路解析結果である。
【図２５Ｂ】データセットであるＧＳＥ１８７９１（図２２において記載されている）についてのベイジアン２状態モデル（免疫抑制及び免疫支持）のバリデーション結果を、例示的に示す図である。試料を、それぞれについて、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８時間にわたり、ＮＤＶにより活性化させるか、又は活性化させなかった。あらゆる棒グラフについて、較正試料は、垂直方向の直線の左側に指し示され、あらゆるバーは、解析される樹状細胞試料を表す（バー１〜３は、免疫抑制樹状細胞を表し、バー４〜６は、免疫支持樹状細胞を表し、バー７〜９は、休止樹状細胞を表す）。ＧＳＥ１８７９１のバリデーション試料は、垂直方向の直線の右側である：バー１〜４は、ＮＤＶによる活性化の開始の前における対照試料を表し；バー５〜８は、ＮＤＶによる活性化の開始の２時間後における試料を表し；バー９〜１２は、ＮＤＶによる活性化の開始の４時間後における試料を表し；バー１３〜１６は、ＮＤＶによる活性化の開始の６時間後における試料を表し；バー１７〜２０は、ＮＤＶによる活性化の開始の８時間後における試料を表し；バー２１〜２４は、ＮＤＶによる活性化の開始の１０時間後における試料を表し；バー２５〜２８は、ＮＤＶによる活性化の開始の１２時間後における試料を表し；バー２９〜３２は、ＮＤＶによる活性化の開始の１４時間後における試料を表し；バー３３〜３６は、ＮＤＶによる活性化の開始の１６時間後における試料を表し；バー３７〜３９は、ＮＤＶによる活性化の開始の１８時間後における試料を表し；バー４０〜５７は、ＮＤＶにより活性化させられなかった対照樹状細胞試料を表す。ＤＣの活性化は、それらを休止から、支持へと切り替えるのに、ある程度の時間を要することに注目されたい。試料上における、モデルバリデーション結果は、データセットであるＧＳＥ１８７９１による。較正試料結果は、左側に示され、棒グラフ内で「較正」と指し示される。各バーは、ｙ軸上にｌｏｇ２オッズスコア（上グラフ）及び確率スコア（下グラフ）を伴う試料結果を表す。まとめ：休止ＤＣは、免疫休止である確率が高い。支持ＤＣは、免疫支持である確率が高い。較正セットの結果と、バリデーションセットの結果とは、符合する。
【図２６】ＧＥＯデータセットであるＧＳＥ１８７９１（図２２において記載されている）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、樹状細胞の活性化時に測定された、シグナル伝達経路活性（ｙ軸上のｌｏｇ２オッズとして指し示される経路活性）の、時間（Ｘ軸上の時間単位）の関数としての結果を、例示的に示す図である。図２２、図２３、及び図２５に、多様なモデルにより解析された、対応する樹状細胞活性スコアを示す。ＮＤＶによる活性化後の複数の時点において、シグナル伝達経路活性を、樹状細胞試料上で測定した。ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＴＧＦ−βによる経路について、時点ごとの平均経路活性を示し、直線を介してつなぎ合わせる。経路の識別を、図中に、矢印と共に指し示す。記載される通りに実施したシグナル伝達経路解析は、１時間後に既に、ＮＦκＢ経路が活性となり；４時間後に、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路が活性となり、１０時間後に、ＴＧＦ−β経路が活性となることを示した。この、観察された、シグナル伝達経路の逐次的な活性化は、これらの樹状細胞試料の活性スコアの漸次的な増大と並行し、樹状細胞の、これらのシグナル伝達経路内の既知の機能と符合する：すなわち、ＮＦκＢ経路は、抗原プロセシングに重要であり、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路は、抗原提示に重要であり、最後に、ＴＧＦ−β経路は、細胞の遊走挙動に関与することが知られ、活性化させられて、抗原を発現させる樹状細胞が、リンパ節へと遊走して、獲得免疫応答を活性化させることを可能とする。
【図２７Ａ】樹状細胞活性状態を評価するためのベイジアン３状態（免疫抑制、免疫支持、免疫休止）コンピュータモデルについてのバリデーション結果を、例示的に示す図である。３つの状態の全てについて、スコアが提示され、本発明者による定義に従って、最高スコアを伴う状態は、試料に帰せられる状態を規定する（提示される３つの活性確率スコアの総和は、１であることに注意されたい）。図２７Ａ及び図２７Ａの続き：試料１例（ＧＳＭ番号）ごとに、経路活性スコア（ＡＰ１、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−β）を計算した、バリデーションデータセットＧＳＥ１３６７２及びＧＳＥ１８７９１である。データセットについて記載するために、図２３を参照する。
【図２７Ｂ】樹状細胞活性状態を評価するためのベイジアン３状態（免疫抑制、免疫支持、免疫休止）コンピュータモデルについてのバリデーション結果を、例示的に示す図である。３つの状態の全てについて、スコアが提示され、本発明者による定義に従って、最高スコアを伴う状態は、試料に帰せられる状態を規定する（提示される３つの活性確率スコアの総和は、１であることに注意されたい）。休止及び支持と注記された試料だけを含むデータセットである、ＧＳＥ１８７９１に由来する試料上のモデルバリデーション結果である。あらゆる棒グラフについて、較正試料は垂直方向の直線の左側に指し示され、あらゆるバーは、解析される樹状細胞試料を表す（バー１〜３は、免疫抑制樹状細胞を表し、バー４〜６は、免疫支持樹状細胞を表し、バー７〜９は、休止樹状細胞を表す）。ＧＳＥ１８７９１のバリデーション試料は、垂直方向の直線の右側である：バー１〜４は、ＮＤＶによる活性化の開始の前における対照試料を表し；バー５〜８は、ＮＤＶによる活性化の開始の２時間後における試料を表し；バー９〜１２は、ＮＤＶによる活性化の開始の４時間後における試料を表し；バー１３〜１６は、ＮＤＶによる活性化の開始の６時間後における試料を表し；バー１７〜２０は、ＮＤＶによる活性化の開始の８時間後における試料を表し；バー２１〜２４は、ＮＤＶによる活性化の開始の１０時間後における試料を表し；バー２５〜２８は、ＮＤＶによる活性化の開始の１２時間後における試料を表し；バー２９〜３２は、ＮＤＶによる活性化の開始の１４時間後における試料を表し；バー３３〜３６は、ＮＤＶによる活性化の開始の１６時間後における試料を表し；バー３７〜３９は、ＮＤＶによる活性化の開始の１８時間後における試料を表し；バー４０〜５７は、ＮＤＶにより活性化させられなかった対照樹状細胞試料を表す。左側の棒グラフは、結果を、ｌｏｇ２オッズスケール（Ｙ軸）上に示し、右側の棒グラフは、結果を、確率スケール（Ｙ軸）上に示す。３状態ベイジアンモデルを使用して、スコアを、免疫抑制状態（最初の２つの棒グラフ）、免疫支持状態（次の２つの棒グラフ）（図２７Ｂの続き）、及び休止状態（最後の２つの棒グラフ）（図２７Ｂの続き）について得る。結果は、ｌｏｇ２オッズスコアとしてのリードアウトと、確率スコアとしてのリードアウトとについて同様である。ＤＣの休止スコアと、免疫抑制（寛容原性）スコアとは、一体に近接するが、なお、信頼できる形で区別されうる。支持ＤＣは、それについての、高度の免疫支持スコアを有する。
【図２７Ｃ】樹状細胞活性状態を評価するためのベイジアン３状態（免疫抑制、免疫支持、免疫休止）コンピュータモデルについてのバリデーション結果を、例示的に示す図である。３つの状態の全てについて、スコアが提示され、本発明者による定義に従って、最高スコアを伴う状態は、試料に帰せられる状態を規定する（提示される３つの活性確率スコアの総和は、１であることに注意されたい）。休止及び抑制と注記された試料だけを含むデータセットである、ＧＳＥ１３７９１（図２２において記載されている）に由来する試料上のモデルバリデーション結果である。左側の棒グラフは、結果を、ｌｏｇ２オッズスケール（Ｙ軸）上に示し、右側の棒グラフは、確率スケール（Ｙ軸）上の結果を示す。垂直方向の直線の左側の試料バーは、較正試料であり、直線の右側は、バリデーション試料である。各棒グラフには、樹状細胞試料のグラウンドトゥルースの状態が指し示される。較正試料：バー１〜３は、免疫抑制 試料を表し、バー４〜６は、免疫支持 試料を表し、バー ７〜９は、免疫休止性試料を表す。バリデーション試料：バー１〜３は、休止樹状細胞試料を表し、バー４〜６は、免疫抑制（寛容原性）樹状細胞試料を表す。最初の２つの棒グラフは、免疫支持スコアを示し（図２７Ｃ）、棒グラフ３〜４は、休止スコアを示す（図２７Ｃの続き）。結果：支持樹状細胞は、低免疫抑制／休止スコア及び高免疫支持スコアを有する。免疫抑制試料及び休止性試料は、免疫支持性試料である確率が小さく、休止スコアが最大となるので、これらは、モデルにより、免疫抑制状態に近接することが多い、休止状態として分類された。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１２６】
以下の例は、特に好ましい方法、及びこれと関連して選択された態様だけを例示する。本明細書で提示される教示は、例えば、１つ又は複数の免疫細胞型、獲得免疫系、自然免疫系、又は全免疫系の機能状況を検出、予測、及び／又は診断するための、いくつかの検査及び／又はキットを構築するために使用される。さらに、本明細書で記載される方法を使用すると、薬物処方を、有利に導くことができ、薬物応答の予測及び薬物効能（及び／又は有害作用）のモニタリングを行うことができ、例えば、実施される後続の検査（複数可）（コンパニオン診断検査など）を選択するために、薬物耐性を予測及びモニタリングすることができる。以下の例は、本発明の範囲を限定するとはみなされないものとする。
【０１２７】
１：方法及び試料の記載
ＧＥＯデータセットのデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｄｓ／）を使用して、多様な型の免疫細胞を、休止状態において、かつ、多様な活性状態の下で探索し、関与性のサイトカインで刺激し、かつ、刺激せずにおいた、臨床研究及び前臨床研究による試料に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２．０Ｐｌｕｓデータを、経路モデルを使用して、シグナル伝達経路の活性に関して解析した（図１〜１２）。これは、休止状態にある異なる免疫細胞型について、特徴的な経路活性の組合せの同定を可能とし、活性状態又は免疫抑制状態、及び各免疫細胞型について、特徴的な免疫機能経路プロファイルを、活性化サイトカイン若しくは免疫抑制性サイトカイン又は他の因子への曝露と関連すると規定した。
【０１２８】
免疫応答の機能状況は、罹患組織、流入領域リンパ節、又は血液など、免疫応答が発生するか、又は達せられる、多様な場所において測定することができる。がんの場合、これらの場所は、いわゆる「免疫サイクル」にまとめられる（図１９）。簡略化すると、有効な抗がん免疫応答のために、腫瘍組織のがん、適切な炎症性環境において、抗原は、樹状細胞により取り込まれ、流入領域リンパ節へと運ばれ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞へと提示され、これらは活性化させられるが；ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、活性化させられて、Ｔｈ１細胞へと変化し、これは、ＣＤ８＋細胞を共活性化させ、これは、血液を介して、がん組織へと移動して、がん細胞を攻撃する。がん組織内で、がん細胞は、適正な抗原の提示に失敗し、樹状細胞及びＴ細胞の活性を抑制する結果として、抗腫瘍活性の欠如をもたらす場合がある。３つの場所に由来する、異なる免疫細胞型内の経路活性プロファイルの測定、及びそれらの個別の活性状況又は免疫抑制状況、全免疫応答の機能状態、例えば、休止状態、（抗腫瘍）活性化状態、又は免疫抑制（腫瘍寛容）状態の評価を使用して、治療の開始の前に、腫瘍に対する免疫応答を予測し、（免疫）療法への応答を予測及びモニタリングすることもでき、治療の投与量を調整／最適化することもでき、任意の疾患時の免疫応答状態をモニタリングすることもでき、免疫調節療法の副作用を予測することもでき、又は免疫調節薬への適合性を測定することもでき、免疫媒介性疾患をモニタリングすることもできる。治療は、免疫療法でありうるが、また、がんの場合、腫瘍細胞を死滅させることにより、抗原を、腫瘍細胞から放出し、これは、免疫応答に影響を及ぼす、別の治療（例えば、化学療法、ターゲティング療法、放射線療法など）でもありうる。
【０１２９】
自然免疫系／応答、及び獲得免疫系／応答において役割を果たす、以下の免疫細胞型について、休止状態、活性化状態又は免疫支持状態、寛容原性状態又は免疫抑制状態、メモリー細胞状態など、特異的な免疫細胞型について、異なる機能活性状態にあるそれぞれの細胞型に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータが利用可能な、公開ＧＥＯデータセットを同定した。各解析試料について、活性状況に関するグラウンドトゥルースが既知であることが要求された。
【０１３０】
各免疫細胞型についての、これらのデータセットから、較正セット及び少なくとも１つの査定／バリデーションセットを規定した。
【０１３１】
その後、本明細書で開示される経路解析を、免疫細胞型ごとに規定された較正セットを使用して、本明細書で記載される、利用可能な活性状態にある、異なる細胞型に対して実施した。
【０１３２】
将来、免疫細胞データを収集した後、この方法を使用して、本明細書で開示される基礎的経路モデルを、本明細書で記載される免疫解析への適用のために、より良好に機能するように選択される、データ解析、及び標的遺伝子の組合せに基づき、さらに改善しうることが考えられる。免疫細胞状況又は免疫応答状況に関する「グラウンドトゥルース」の証拠と組み合わせて、データを収集することは、免疫適用のための、標的遺伝子の組合せの改善、又は新たな標的遺伝子の追加を可能とする。
【０１３３】
Ａ．自然免疫応答：
ａ．単球：休止、免疫支持（較正：ＧＳＥ２８４９０＋ＧＳＥ４３７００／バリデーション：ＧＳＥ７２６４２＋ＧＳＥ１６３８５）
ｂ．マクロファージ：休止及び免疫支持（較正：ＧＳＥ４３５９６／バリデーション：ＧＳＥ４０８８５）
ｃ．樹状細胞：休止及び免疫支持の２状態モデル（較正ＧＳＥ１８７９１／バリデーション５２０８１）；入力としての、それぞれ、３つ（較正：ＧＳＥ２３３７１／バリデーション：ＧＳＥ１３７６２＋ＧＳＥ５６０１７）及び４つ（較正：ＧＳＥ２３３７１／バリデーション：ＧＳＥ１３７６２＋ＧＳＥ５６０１７）のシグナル伝達経路活性についての、休止及び免疫支持及び免疫抑制の３状態モデル
ｄ．好中球：休止、支持（較正：ＧＳＥ２２１０３／バリデーション：ＧＳＥ２８４９０）
Ｂ．獲得免疫応答
ａ．ＣＤ４＋  Ｔ細胞：休止、免疫支持（較正：ＧＳＥ３６７６６／バリデーション：ＧＳＥ１１２９２）
ｂ．ＣＤ４  Ｔｈ１亜型：免疫支持及びＣＤ４  Ｔｈ２亜型：免疫抑制（較正：ＧＳＥ７１５６６／バリデーション：ＧＳＥ３２９５９）
ｃ．ＣＤ８＋  Ｔ細胞：休止、免疫支持、免疫抑制（較正：ＧＳＥ２６３４７／バリデーション：ＧＳＥ７２６４２）
ｄ．Ｔｒｅｇ細胞：休止、免疫抑制（較正：ＧＳＥ６５０１０／バリデーション：ＧＳＥ１１２９２）
ｅ．Ｂ細胞：休止、免疫支持（較正：ＧＳＥ３９４１１／バリデーション：ＧＳＥ９１１９）
ｆ．メモリーＴ：ナイーブ、メモリー（較正：ＧＳＥ６５０１０／バリデーション：ＧＳＥ６５０１０＋ＧＳＥ２６４９５）
【０１３４】
免疫細胞の各試料機能活性状況について、ＧＥＯデータベースから得られる、全てのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットを、対応する論考の著者により提示されるグラウンドトゥルース、又はＧＥＯにおいて提供される注記に従って列挙した。次いで、免疫細胞型ごとに規定された較正セット及びバリデーションセットを使用して、表示される機能活性状態にある、異なる細胞型について、経路解析（ＥＲ、ＡＲ、ＰＩ３Ｋなど）を実施した。
【０１３５】
多様な免疫細胞型についての経路解析
異なる免疫細胞型の経路解析は、各免疫細胞型について、多様な機能的免疫状態、すなわち、休止状態、免疫支持状態、又は免疫抑制状態にある、活性のシグナル伝達経路の特異的な組合せを明らかにした（図１〜図１２）。
【０１３６】
Ａ．自然免疫応答に寄与する免疫細胞
休止状態にある好中球（図１）は、免疫経路である、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２（Ｉ型インターフェロン及びＩＩ型インターフェロン）、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３の低活性と関連する、ＰＩ３Ｋ経路の不活性又は低活性を指し示す、活性のＦＯＸＯ転写因子を有し、Ｎｏｔｃｈ及びＷｎｔのいずれによる経路も、不活性であった。支持状態では、ＦＯＸＯ転写因子の活性が低下することから、ＰＩ３Ｋ経路活性の増大が指し示され、免疫経路の活性は増大し、Ｎｏｔｃｈ／Ｗｎｔも活性となる。
【０１３７】
単球（図２）は、ＦＯＸＯ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型インターフェロン及びＮｏｔｃｈ、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３による経路において、好中球と同様のパターンを示す。
【０１３８】
樹状細胞（図３〜図５）内の、支持状態では、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２（両方の種類）、及びＴＧＦ−βの活性が増大するのに対し、抑制（寛容原性）状態では、ＮＦκＢ活性が最低であり、ＦＯＸＯ転写因子活性は、休止性と支持性との間の、中間の活性であった。
【０１３９】
マクロファージ（図６）においても、支持状態について、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ３及びＮｏｔｃｈによる経路もまた含む、同様のパターンが見出された。
【０１４０】
Ｂ．獲得免疫応答に寄与する免疫細胞
獲得免疫応答の細胞型は、経路活性の機能及び使用が、自然免疫応答の細胞型と比較して大きく異なる。支持状態にあるＣＤ４（図７）リンパ球は、免疫経路であるＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３の活性の増大、及びＴＧＦ−β経路の活性の低減と組み合わされた、ＰＩ３Ｋ経路活性の増大を指し示す、低ＦＯＸＯ転写因子活性を示す。それぞれ、支持性及び抑制性である、ＣＤ４＋リンパ球亜型Ｔｈ１及びＴｈ２（図８）は、ＦＯＸＯ転写因子活性（高度のＰＩ３Ｋ経路活性を指し示す、免疫支持性Ｔｈ１が最低である）と、Ｔｈ１細胞内で高度である、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、並びにＴＧＦ−βによる経路とに基づき区別することができる。Ｔｒｅｇ細胞（図９）は、活性化すると、免疫抑制性（抑制性）となり、次いで、明らかに、ＦＯＸＯ、ＮＦκＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３、及びＴＧＦ−βの活性プロファイルの強化を示す。
【０１４１】
残念ながら、ＣＤ８リンパ球（図１０）について、支持状態に利用可能な試料は、１例だけであったが、観察された経路活性は、免疫学知見に基づき、期待されること、すなわち、ＰＩ３Ｋ活性（細胞増殖を指し示す）の増大、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３による経路の強化を指し示す、ＦＯＸＯ転写因子活性の低減と符合した。包括的な機能的免疫応答予測モデルにおける使用のために、抑制性の別称として、「非支持性」という呼称を使用する。
【０１４２】
抗原刺激の後、メモリーＴ細胞（図１１）の発生は消失するが、活性のＦＯＸＯ転写因子の増大（活性のＰＩ３Ｋの経路活性及び増殖の低下）、活性ＮＦκＢの増大、及び高度のＴＧＦ−β経路活性により、未だ抗原に遭遇していない、ナイーブＴ細胞から区別することができる。支持状態では、Ｂ細胞（図１２）は、抗体を産生し、ＰＩ３Ｋ経路活性、並びにＮＦκＢ及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３の活性の増大を指し示す、ＦＯＸＯ転写因子活性の低下を示した。
【０１４３】
明らかに、獲得免疫系細胞では、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ３による経路の活性は、一般に、免疫支持状態（Ｔｒｅｇを例外として）を指し示すのに対し、ＴＧＦ−β及びＮｏｔｃｈなど、他の経路は、特異的な細胞型に応じて、高度に特異的な機能的役割を有する。
【０１４４】
免疫細胞型の機能状況を予測するためのコンピュータモデルの開発
次いで、較正データセットの経路結果を、モデルを較正するための入力として使用して、免疫細胞型の各々について、複数のコンピュータモデルが生成された（図１〜１２）。次いで、各モデルを凍結し、対応する独立のバリデーションデータセット上でバリデーションして、モデルの精度を調べた（図１〜１２）。モデルを創出するために、免疫細胞の機能状態の決定において、既知の役割（学術文献）を果たすシグナル伝達経路の活性状況を使用した。
【０１４５】
入力としての、変動する数のシグナル伝達経路解析に基づき、モデルの例について記載する。免疫細胞型ごとに記載された、シグナル伝達経路の組合せは、一般に、経路モデルの、唯一の可能な組合せではない。例のモデルで使用される、経路のサブグループ／別の組合せも、場合によって、それぞれの免疫細胞型の機能活性状態を予測するのに、同様に機能する（図４Ａ及び図５Ａ、並びに図４Ｂ及び図５Ｂにおいて例示される）。モデルの一部の種類は、より良好に作動した。
【０１４６】
３つの異なる型のモデルを創出して、本明細書で記載される、個々の免疫細胞型、重心モデル、線形モデル、及びベイジアンモデルを解析した。
【０１４７】
免疫系状況を予測するためのモデルの開発
少なくとも２つの異なる免疫細胞型上で測定された、機能的な免疫細胞活性（本明細書ではまた、免疫細胞の機能状態／状況とも称する）から、免疫応答（本明細書ではまた、免疫系状況とも称する）の機能状況を予測するのに、３つのモデルを開発した。
【０１４８】
免疫細胞は、それら自体では作用せず、まとまって、免疫応答を組織化するが、複数の免疫細胞型についての測定値の解釈が、免疫応答の状況を予測する、より良好な方法をもたらすのかの理由となっている。最後に、自然免疫応答及び獲得免疫応答の、免疫細胞型の各々の機能状態を区別するコンピュータモデルを開発し、バリデーションした後で、個体（健常個体又は罹患個体）における全免疫応答状況、すなわち、免疫応答が、休止性の不活性（休止性）状態にあるのか、免疫系が活性（支持性）状態にあるのか、抑制性状態にあるのか、及び任意の活性性又は抑制性が、自然免疫系又は獲得免疫系において示されるのかどうかを予測するための入力として、解析される細胞型ごとに、機能的な免疫細胞の活性スコアを提供する、免疫細胞型特異的コンピュータモデルの機能活性結果を使用する、２つのコンピュータモデルを開発した。
【０１４９】
免疫応答モデルの１つの種類では、それぞれが、完全に活性の免疫応答及び免疫抑制性の免疫応答を伴う仮想的個体に基づき、最高及び最低の免疫活性化スコアを規定した（図１３Ａ〜１３Ｇ）。免疫応答状況についてのスコアを、活性百分率の形態で計算しうる計算式を創出した。モデルのための各入力変数に、０、１、２ポイントを割り当てる（図１３Ａ）。加算されたポイントの総スコアは、１９〜６の間にある（図１３Ｂ〜１３Ｄ）。免疫応答活性は、活性化百分率（図１３Ｅ）として、入力可観測量（免疫細胞の活性スコアを意味する）が低減されたモデルのために計算する。
【０１５０】
免疫応答活性百分率は、以下：
免疫応答活性百分率＝［（累計ポイント−６）／１３］×１００％
の通りに計算することができる。
【０１５１】
免疫休止状態を、１０ポイントと規定する。これを使用して、活性化免疫応答（＞１０ポイント）と、抑制性免疫応答（＜１０ポイント）とを区別する閾値を創出することができる。１０ポイントの休止状態は、７７％の免疫活性化状態として計算される。したがって、＞７７％の百分率は、活性の免疫応答を指し示し；７７％より小さな百分率ほど、免疫抑制性の免疫応答を指し示す。このリードアウトを、免疫抑制性と対比した免疫活性についての定量スコアへと転換するためには、この閾値を、０へとリセットすることができる。
【０１５２】
式は、以下：
免疫応答活性％−７７＝免疫活性状況
の通りとなり、式中、正の数は、免疫応答が活性であることを意味し、負の数は、免疫応答抑制性であることを意味する。
【０１５３】
前出の式への組込みにより、
免疫活性百分率＝｛［（累計ポイント−６）／１３］×１００％｝−７７
となる。
【０１５４】
全ての入力値が利用可能であるわけではない場合（例えば、機能活性状況は、全ての免疫細胞型について、測定されていないため）、モデルは、やはり、免疫応答活性スコアを提供しうるが、推定される不確実性を伴う。
【０１５５】
別の免疫応答モデルは、個別の免疫細胞型解析のスコアを、免疫応答が、活性状態、休止状態、又は抑制状態にある確率へと解釈するベイジアンモデル（図１４Ａ及び図１４Ｂ）である。
【０１５６】
別のモデルは、線形モデルである。免疫応答活性は、以下：
累計ポイントが１０ポイントを超えるほど、免疫応答が、不活性／抑制ではないことを指し示し、累計ポイントが１０ポイントを下回るほど、免疫応答が抑制状態にあることを指し示す（図１５）
の通りに計算する。
【０１５７】
線形モデルに対するモデル変化形を使用して、免疫応答の免疫抑制状態を、特異的に測定することができる（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。
【０１５８】
モデルの各々はまた、自然免疫応答及び獲得免疫応答の活性を、個別に測定するのにも使用することができる。ベイジアンモデル法は、免疫応答の全状態の計算の一部である、免疫応答の、これらの異なる型についての活性スコアを、内因的に提供する。百分率免疫応答コンピュータモデル及び線形免疫応答コンピュータモデルは、それぞれについて、自然免疫応答及び獲得免疫応答のための２つの個別の部分へと容易に分けることができる（図１７Ａ及び図１７Ｂにおける例）が、また、代替的モデルについても同様である（図１６Ａ及び図１６Ｂにおける例）。ベイジアンモデルでは、これは、記載されたモデルから、あらかじめ読み取ることができる。
【０１５９】
全てのモデルについて、１つ又は複数の免疫細胞型の入力値（経路解析に基づく、機能的免疫活性解析により得られる）の重みを変化させることにより、予測の精度を、さらに増大させることが可能である。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、抑制状態にある場合、免疫抑制性の免疫応答に、高度に特異的であることが期待され、例えば、モデルのための入力として、「０」を、「−１」へと変化させることにより、この知見を、免疫活性百分率モデル及び線形モデルに組み込むことができ、ベイジアンモデルでは、ノードパラメータは、特異性を増大させるように、容易に適合させることができる（例えば、０．９を、０．９９へと変化させ、０．１を、０．００１へと低減することにより）。
【０１６０】
モデルのバリデーション及び結果
図１〜図６は、自然免疫応答の細胞型についての結果を示す。図７〜図１２は、獲得免疫応答の細胞型についての結果を示す。経路活性の結果（それぞれのコンピュータモデルに組み入れられたシグナル伝達経路）を、ｌｏｇ２オッズとして示し、試料中の免疫細胞の機能状況を指し示し（休止性、支持性、抑制性、ナイーブ、メモリー）、モデルにより提示される機能状況スコアを、右側に示すが、正とは、正確な機能表示を意味し、誤とは、不正確な機能表示を意味する。図１Ｂ〜図１２Ｂでは、２つの隣接する状態を、第１の状態の平均線形値及び第２の状態の平均線形値の総平均により決定される境界値により分離する。境界値は、以下の表に与える。
【０１６１】
【表１】
2020535847.tif 000003
【０１６２】
免疫応答モデルのバリデーションを目的として（図１８）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを使用して、試料１例当たり、少なくとも２つの免疫細胞型を解析する、多様な臨床データセットを同定した。バリデーションを、多様な数の免疫細胞型からなる、免疫応答モデルのための入力が、それぞれの試料中で利用可能な免疫細胞型の数に照らして変動しうることを示す、変動する数の臨床試料データセット上で実施した。
【０１６３】
例えば、図１８Ａ及び図１８Ｂは、データセットであるＧＳＥ７２４６２を使用する、免疫系状況の測定についての結果を示す。異なる免疫細胞型（ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、及びＢリンパ球、好中球、単球）を、３人の健常個体の末梢血試料から単離し、マイクロアレイ結果を、重心モデルを使用して、多様な免疫細胞型の機能（活性）状況を評価する、本明細書で記載された方法により解析した。図１８Ａの免疫細胞活性解析の重心モデル結果はまた、２型免疫応答（ベイジアンモデルによる免疫応答活性）モデルのための入力としても機能した。ベイジアン免疫応答モデル計算の結果は、自然免疫細胞型、獲得免疫細胞型の両方、並びに全免疫応答が、活性状態である、正常／休止状態について、最大の確率を有し、健常個体に期待される免疫応答活性状況と完全に符合することを示す。三連の各々について、状態が、１００％確実な休止状態ではなく、確率論的に規定されるデータセットが生成された。確率は、重心モデルでは、距離に由来する（図１８Ａで報告した通り；最大の確率は、距離が最小である状態に帰せられる）。ソフトマックス法を使用して、確率を決定した。結果を、以下の表にまとめる。
【０１６４】
【表２】
2020535847.tif 000004
【０１６５】
２：樹状細胞の機能状況の決定
ＧＥＯデータセットのデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｄｓ／）を使用して、樹状免疫細胞を、休止状態において、かつ、多様な活性状態及び寛容原性状態の下で探索し、関与性のサイトカインで刺激し、かつ、刺激せずにおいた、臨床研究及び前臨床研究による試料に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２．０Ｐｌｕｓデータを、経路モデルを使用して、シグナル伝達経路の活性に関して解析した。 これは、休止状態にある樹状細胞型について、特徴的な経路活性プロファイルの同定を可能とし、活性状態又は免疫抑制（寛容原性）状態、及び特徴的な免疫機能経路プロファイルを、活性化サイトカイン若しくは免疫抑制性サイトカイン又は他の因子への曝露と関連すると規定した。
【０１６６】
マイクロアレイデータの経路解析、及び試料ごとの経路結果についてのコンピュータによる解釈は、ｌｏｇ２オッズ活性スコアとして表される、健常個体における、典型的なシグナル伝達経路活性に関する、樹状細胞の特徴づけを可能とした（上記で言及した、経路モデルについての特許を参照する）。
【０１６７】
２つの事態：
（１）樹状細胞の休止状況と対比した活性状況についてのスコアを提供する（２Ｄモデルと呼ばれる）事態；
（２）樹状細胞の寛容原性状況と対比した休止状況と対比した活性状況についてのスコアを提供する（３Ｄモデルと呼ばれる）事態
についてのモデルを開発した。
【０１６８】
いずれの事態についても、ベイズ推定（ａ）及び線形数学的モデル（ｂ）及び重心コンピュータモデルを、測定された経路活性スコアを解釈するのに使用されうるモデルの例として開発した。
【０１６９】
樹状細胞の２つ（活性／支持；不活性／休止）又は３つの機能活性状況の可能性（活性／支持；不活性／休止；免疫抑制／寛容原性）のそれぞれに関する「グラウンドトゥルース」を伴う、公表されている、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０の試料を含有するＧＥＯデータセットに由来する試料を使用して、モデルを較正した。各試料について、各経路の活性スコアは、パラメータ計算のための入力として与えられる。
【０１７０】
その後、２状態モデル及び３状態モデル（本明細書でまた、２Ｄ及び３Ｄとも称する）を、ここでもまた、樹状細胞の２つ（活性／支持；不活性／休止）又は３つの機能活性状況の可能性（活性／支持；不活性／休止；免疫抑制／寛容原性）のそれぞれに関する「グラウンドトゥルース」を伴う、独立の、公開されている、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０の試料を含有するＧＥＯデータセット上でバリデーションした。各試料について、各経路の活性スコアは、パラメータ計算のための入力として与えられる。
【０１７１】
ベイジアンモデルでは、モデルを創出し、ＣＰＴノードを、手作業で設定した（２Ｄモデルについては、図２０Ａ〜図２０Ｄ；３Ｄモデルについては、図２１Ａ〜図２１Ｅ）。２Ｄモデルについては：ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−βによる経路の経路活性を、パラメータノードのための入力として使用した。３Ｄモデルについては：ＭＡＰＫ−ＡＰ−１、ＰＩ３Ｋ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２、ＴＧＦ−βによる経路の経路活性を、パラメータノードのための入力として使用した。任意選択のさらなる基準は、他の測定された経路が、樹状細胞の機能状態を識別しないことでありうる。
【０１７２】
線形コンピュータモデルでは、測定された経路（２Ｄモデルの場合には、３つの経路であり、３Ｄモデルの場合には、５つの経路）の経路活性スコアが足し合わされ、複数の経路活性スコアは、樹状細胞の機能活性状況を指し示す。不活性／休止性は、０を下回るスコアを有し、免疫抑制性／寛容原性は、０〜１０の間のスコアを有し、免疫活性化／支持性は、＞１０のスコアを有する（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。２Ｄモデル及び３Ｄモデルのために選択された経路、及び任意選択のさらなる基準は、ベイジアンモデルについて上記で記載したものと同じである。
【０１７３】
重心モデルでは、測定された経路の経路活性スコアは、２Ｄモデルの場合には、３つの経路について、式：
【数１】
2020535847.tif 000005
【数２】
2020535847.tif 000006
を使用する、ユークリッド距離の計算に基づき、３Ｄモデルの場合には、５つの経路について、式：
【数３】
2020535847.tif 000007
【数４】
2020535847.tif 000008
【数５】
2020535847.tif 000009
を使用する、ユークリッド距離の計算に基づき、式中、ｘ、ｙ、及びｚは、３つの経路を表し、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは、５つの経路を表し、平均の添え字である、ｒ、ｓ、及びＳＰは、較正データの平均を指し、添え字であるｒｉ、ｓｉ、及びＳＰＩは、個々のバリデーション試料の値を指す。最短の距離は、２状態モデルにおける休止又は支持、３状態モデルにおける休止、支持、又は抑制のそれぞれの状態を規定する（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。２Ｄモデル及び３Ｄモデルのために選択された経路、及び任意選択のさらなる基準は、ベイジアンモデルについて上記で記載したものと同じである。
【０１７４】
骨髄樹状細胞と、単球とは、共通の前駆細胞から生じ、これらを較正セット（ＧＳＥ２３３７１）として使用した研究では、文献において記載され、最も一般に使用されている通り、ＩＬ４及びＧＭＣＳＦを、培養物媒体へと添加することにより、血液由来の単球を、樹状細胞へと成熟させた（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００２、２５（５）：４２９〜４３８）。より近年の刊行物では、この成熟手順における、ＩＬ４の、ＩＬ１５による置きかえが、Ｔｒｅｇ細胞型及びＴｈ２細胞型の発生を増強するサイトカインの産生により示される通り、Ｔ細胞に対して、より抑制性の影響を及ぼす、ＩＬ４により成熟させたＤＣと比較して、エフェクターリンパ球を誘引する能力を改善した、成熟ＤＣをもたらすことが示された（出典：データセットであるＧＳＥ７９１８４；ｖａｎ  Ａｃｋｅｒ  Ｈ．Ｈ．ら、「Ｄｅｓｉｒａｂｌｅ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、８巻、８号、２０１７、１３６５２〜１３６６５頁）。これは、記載された３Ｄモデルが、「休止」状態と、寛容原性状態との間で、なぜ、比較的小さな差違しか示さず、このために、これらの２つの不活性の状態を区別することが困難になるのかを説明する。ＩＬ１５により成熟させたＤＣに由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータを、「休止性」較正セットとして使用すれば、逆の結果、すなわち、活性／支持状態と、「休止」状態とを、それほど良好には区別できないモデルがもたらされたであろう。モデルの最も重要な機能は、ＤＣが、非活性状態と対比した、活性／支持状態にあるのかどうかを同定することであるので、ＩＬ４により成熟させたＤＣデータを、「休止性」較正データとして選択した。３Ｄモデルを、ＩＬ４より成熟させたＤＣ及びＩＬ１５により成熟させたＤＣに由来するデータを含有する、ＧＳＥ７９１８４データセット上で使用することは、ＩＬ５により成熟させたＤＣを、弱活性化ＤＣとして分類することを示す（図２４）。
【０１７５】
例示的なバリデーション結果：ベイジアンモデル
２Ｄモデルは、樹状細胞の活性／支持状況についての、不活性／休止状況と対比したスコアを、ｌｏｇ２オッズスケール上で提供する（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。現況技術に従って、活性／支持状態へと誘導されるか、又は不活性／休止状態に保たれた、末梢血由来の分化樹状細胞に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２．０Ｐｌｕｓデータを、経路活性について解析し、モデルを使用して、免疫活性スコアを、ｌｏｇ２オッズとして提供した。較正試料結果を、左側に示し、図のキャプションにおいて、「較正」として指し示す。２Ｄベイジアンモデルを、データセットであるＧＳＥ１８７９１上でバリデーションし、この／これらのデータセット内の試料の活性スコアを、正確に予測した。
【０１７６】
データセットであるＧＳＥ１８７９１（図２６）は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を感染させた、２人の異なるドナーのヒト末梢血単球に由来する、従来のＤＣによる試料、又は尿膜腔液（ＡＦ）を伴う対照を含有する。ＮＤＶによる感染を使用して、体内の樹状細胞活性化についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系を創出する。図中に指し示される通り、ＮＤＶ感染後の複数の時点において、シグナル伝達経路活性を、細胞試料上で測定したところ、この解析は、既に１時間後に、ＮＦκＢ経路が活性となり、おそらく、抗原プロセシング機構を反映し；４時間後に、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路が、おそらく、抗原提示機構を反映し、１０時間後に、ＴＧＦ−β経路が完全に活性化し、樹状細胞内の遊走機構の活性化を反映することを示した（図２７）（参考文献：Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  Ｅ．ら、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｅｄ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８４巻、６号、２０１０年３月、２９０８〜２９１７頁）。使用された第２のデータセットであるＧＳＥ１４０００は、リポ多糖（ＬＰＳ）を、細胞へと添加することにより、代替的な形で活性化させた（活性／支持機能状態）ヒト末梢血単球に由来するＤＣによる試料を含有し、測定は、４時間後の時点が、部分的な活性化を表し、１６時間後の時点が、完全な活性化を表す、２つの時点において実施した（参考文献：Ｃｅｐｐｉ  Ｍ．ら、「Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍＲＮＡ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＬＰＳ」、Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９年１１月、５：５）。
【０１７７】
３Ｄモデルは、樹状細胞の、免疫抑制性／寛容原性状態と対比した、不活性／休止状況と対比した、活性／支持状況についてのスコアを、ｌｏｇ２オッズスケール上で提供する（図２７Ａ及び図２７Ｂ）。現況技術に従って、活性／支持状態へと誘導されるか、又は免疫抑制性／寛容原性状態、又は不活性／休止状態に保たれた、末梢血由来の分化樹状細胞に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２．０Ｐｌｕｓデータを、経路活性について解析し、モデルを使用して、免疫活性スコアを、ｌｏｇ２オッズとして提供した。較正試料結果を、左側に示し、「較正」として指し示す。３Ｄベイジアンモデルを、データセットであるＧＳＥ１８７９１上でバリデーションし、これらのデータセット内の試料の活性スコアを、正確に予測した。
【０１７８】
例示的なバリデーション結果：線形モデル
線形モデルを、２Ｄモデルについて、データセットであるＧＳＥ１８７９１上、及び３Ｄモデルについて、データセットであるＧＳＥ１３６７２上及びＧＳＥ１８７９１上でバリデーションしたところ、データセット内の試料の活性スコアを、正確に予測した（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）。
【０１７９】
例示的なバリデーション結果：重心モデル
重心モデルを、２状態モデルについて、データセットであるＧＳＥ１８７９１上、及び３状態モデルについて、データセットであるＧＳＥ１３６７２上及びＧＳＥ１８７９１上でバリデーションしたところ、データセット内の試料の活性スコアを、正確に予測した（図２３Ｃ及び図２３Ｄ）。
【図１Ａ−１】
2020535847.tif 000010
【図１Ａ−２】
2020535847.tif 000011
【図１Ｂ−１】
2020535847.tif 000012
【図１Ｂ−２】
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【図１Ｂ−３】
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【図２Ａ−１】
2020535847.tif 000015
【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
2020535847.tif 000017
【図２Ｂ−２】
2020535847.tif 000018
【図２Ｂ−３】
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【図３Ａ−１】
2020535847.tif 000020
【図３Ａ−２】
2020535847.tif 000021
【図３Ｂ−１】
2020535847.tif 000022
【図３Ｂ−２】
2020535847.tif 000023
【図３Ｂ−３】
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【図４Ａ−１】
2020535847.tif 000025
【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
2020535847.tif 000027
【図４Ｂ−２】
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【図４Ｂ−３】
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【図５Ａ−１】
2020535847.tif 000030
【図５Ａ−２】
2020535847.tif 000031
【図５Ｂ−１】
2020535847.tif 000032
【図５Ｂ−２】
2020535847.tif 000033
【図５Ｂ−３】
2020535847.tif 000034
【図６Ａ−１】
2020535847.tif 000035
【図６Ａ−２】
2020535847.tif 000036
【図６Ｂ−１】
2020535847.tif 000037
【図６Ｂ−２】
2020535847.tif 000038
【図６Ｂ−３】
2020535847.tif 000039
【図７Ａ−１】
2020535847.tif 000040
【図７Ａ−２】
2020535847.tif 000041
【図７Ａ−３】
2020535847.tif 000042
【図７Ｂ−１】
2020535847.tif 000043
【図７Ｂ−２】
2020535847.tif 000044
【図７Ｂ−３】
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【図７Ｂ−４】
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【図８Ａ−１】
2020535847.tif 000047
【図８Ａ−２】
2020535847.tif 000048
【図８Ｂ−１】
2020535847.tif 000049
【図８Ｂ−２】
2020535847.tif 000050
【図８Ｂ−３】
2020535847.tif 000051
【図９Ａ−１】
2020535847.tif 000052
【図９Ａ−２】
2020535847.tif 000053
【図９Ｂ−１】
2020535847.tif 000054
【図９Ｂ−２】
2020535847.tif 000055
【図９Ｂ−３】
2020535847.tif 000056
【図１０Ａ−１】
2020535847.tif 000057
【図１０Ａ−２】
2020535847.tif 000058
【図１０Ａ−３】
2020535847.tif 000059
【図１０Ｂ−１】
2020535847.tif 000060
【図１０Ｂ−２】
2020535847.tif 000061
【図１０Ａ−４】
2020535847.tif 000062
【図１０Ｂ−３】
2020535847.tif 000063
【図１１Ａ−１】
2020535847.tif 000064
【図１１Ａ−２】
2020535847.tif 000065
【図１１Ａ−３】
2020535847.tif 000066
【図１１Ｂ−１】
2020535847.tif 000067
【図１１Ｂ−２】
2020535847.tif 000068
【図１１Ｂ−３】
2020535847.tif 000069
【図１１Ｂ−４】
2020535847.tif 000070
【図１２Ａ−１】
2020535847.tif 000071
【図１２Ａ−２】
2020535847.tif 000072
【図１２Ｂ−１】
2020535847.tif 000073
【図１２Ｂ−２】
2020535847.tif 000074
【図１２Ｂ−３】
2020535847.tif 000075
【図１３Ａ】
2020535847.tif 000076
【図１３Ｂ】
2020535847.tif 000077
【図１３Ｃ】
2020535847.tif 000078
【図１３Ｄ】
2020535847.tif 000079
【図１３Ｅ】
2020535847.tif 000080
【図１３Ｆ】
2020535847.tif 000081
【図１３Ｇ】
2020535847.tif 000082
【図１４Ａ−１】
2020535847.tif 000083
【図１４Ａ−２】
2020535847.tif 000084
【図１４Ｂ】
2020535847.tif 000085
【図１５Ａ】
2020535847.tif 000086
【図１５Ｂ】
2020535847.tif 000087
【図１６Ａ】
2020535847.tif 000088
【図１６Ｂ】
2020535847.tif 000089
【図１６Ｃ】
2020535847.tif 000090
【図１７Ａ】
2020535847.tif 000091
【図１７Ｂ】
2020535847.tif 000092
【図１８Ａ−１】
2020535847.tif 000093
【図１８Ａ−２】
2020535847.tif 000094
【図１８Ａ−３】
2020535847.tif 000095
【図１８Ａ−４】
2020535847.tif 000096
【図１８Ａ−５】
2020535847.tif 000097
【図１８Ｂ】
2020535847.tif 000098
【図１８Ｃ】
2020535847.tif 000099
【図１９】
2020535847.tif 000100
【図２０Ａ】
2020535847.tif 000101
【図２０Ｂ】
2020535847.tif 000102
【図２０Ｃ】
2020535847.tif 000103
【図２０Ｄ】
2020535847.tif 000104
【図２１Ａ】
2020535847.tif 000105
【図２１Ｂ】
2020535847.tif 000106
【図２１Ｃ】
2020535847.tif 000107
【図２１Ｄ−１】
2020535847.tif 000108
【図２１Ｄ−２】
2020535847.tif 000109
【図２１Ｅ−１】
2020535847.tif 000110
【図２１Ｅ−２】
2020535847.tif 000111
【図２１Ｅ−３】
2020535847.tif 000112
【図２２Ａ】
2020535847.tif 000113
【図２２Ｂ】
2020535847.tif 000114
【図２２Ｃ】
2020535847.tif 000115
【図２２Ｄ−１】
2020535847.tif 000116
【図２２Ｄ−２】
2020535847.tif 000117
【図２２Ｄ−３】
2020535847.tif 000118
【図２２Ｅ−１】
2020535847.tif 000119
【図２２Ｅ−２】
2020535847.tif 000120
【図２２Ｅ−３】
2020535847.tif 000121
【図２２Ｅ−４】
2020535847.tif 000122
【図２２Ｅ−５】
2020535847.tif 000123
【図２２Ｅ−６】
2020535847.tif 000124
【図２３Ａ】
2020535847.tif 000125
【図２３Ｂ】
2020535847.tif 000126
【図２３Ｃ】
2020535847.tif 000127
【図２３Ｄ−１】
2020535847.tif 000128
【図２３Ｄ−２】
2020535847.tif 000129
【図２３Ｄ−３】
2020535847.tif 000130
【図２３Ｄ−４】
2020535847.tif 000131
【図２３Ｄ−５】
2020535847.tif 000132
【図２３Ｄ−６】
2020535847.tif 000133
【図２３Ｅ−１】
2020535847.tif 000134
【図２３Ｅ−２】
2020535847.tif 000135
【図２３Ｅ−３】
2020535847.tif 000136
【図２３Ｅ−４】
2020535847.tif 000137
【図２３Ｅ−５】
2020535847.tif 000138
【図２３Ｅ−６】
2020535847.tif 000139
【図２４−１】
2020535847.tif 000140
【図２４−２】
2020535847.tif 000141
【図２５Ａ−１】
2020535847.tif 000142
【図２５Ａ−２】
2020535847.tif 000143
【図２５Ｂ−１】
2020535847.tif 000144
【図２５Ｂ−２】
2020535847.tif 000145
【図２６】
2020535847.tif 000146
【図２７Ａ−１】
2020535847.tif 000147
【図２７Ａ−２】
2020535847.tif 000148
【図２７Ｂ−１】
2020535847.tif 000149
【図２７Ｂ−２】
2020535847.tif 000150
【図２７Ｂ−３】
2020535847.tif 000151
【図２７Ｂ−４】
2020535847.tif 000152
【図２７Ｂ−５】
2020535847.tif 000153
【図２７Ｂ−６】
2020535847.tif 000154
【図２７Ｃ−１】
2020535847.tif 000155
【図２７Ｃ−２】
2020535847.tif 000156
【図２７Ｃ−３】
2020535847.tif 000157
【図２７Ｃ−４】
2020535847.tif 000158
【図２７Ｃ−５】
2020535847.tif 000159
【図２７Ｃ−６】
2020535847.tif 000160
【国際調査報告】
2020535847.tif 000161
2020535847.tif 000162
2020535847.tif 000163
2020535847.tif 000164