(57)【要約】  集団由来のある特定の核酸配列を効率的に増幅及び検出するための手段を記載する。本発明は、プライミングオリゴヌクレオチド（プライマー）間の不必要な相互作用を最小化することにより、アッセイ特異性の向上をもたらすことを意図する。
2020535844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列の増幅のための方法であって、
ａ．ｉ．核酸試料、
ｉｉ．該試料の第１の標的領域に相補的である３’領域、及び該試料の領域に相補的でなく、天然には存在しない配列を有する５’領域を有する第１の核酸増幅プライマーであって、該５’領域が、自己相補的であり、これにより、該第１の核酸増幅プライマーの第１の鎖の５’末端が、該第１の核酸増幅プライマーの第２の鎖の５’末端とハイブリダイズすることが可能であるか、又は該第１の核酸増幅プライマーの該５’領域が、第２の核酸増幅プライマーの５’領域に相補的であり、該第１の核酸増幅プライマーの該５’非相補的領域が、ポリメラーゼにより複製不可能なスペーサー単位を介して該プライマーに結合する、第１の核酸増幅プライマー、
ｉｉｉ．核酸ポリメラーゼ、
ｉｖ．ヌクレオチド三リン酸モノマー、並びに任意選択で
ｖ．該第１のプライマーの伸長産物に相補的である３’領域、及び該第１のプライマーの該５’領域に相補的であり、該試料の領域に相補的でない５’領域を有する第２の核酸増幅プライマー
を含む反応混合物を得るステップと、
ｂ．該第１のプライマーを該試料とハイブリダイズさせるステップと、
ｃ．該核酸ポリメラーゼ及びヌクレオチド三リン酸モノマーを使用して該第１のプライマーを伸長させるステップと、
ｄ．ステップｂ及びｃを繰り返し、これにより、標的配列を増幅させ、ここで、該第１の核酸増幅プライマーが、該試料とハイブリダイズするステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記増幅が、前記第１の増幅プライマーのみを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が、前記第２の増幅プライマーを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅が、等温増幅である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記伸長させたプライマーが、酵素を使用して前記試料から離される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、ヘリカーゼ又はリコンビナーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅が、サーモサイクリングである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の核酸増幅プライマーの前記５’非相補的領域が、前記第１の核酸増幅プライマーの前記３’標的相補的領域よりも低い融解温度を有する、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸増幅プライマーの前記５’非相補的領域が、回文構造である、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の核酸増幅プライマーの前記５’非相補的領域が、同一であり、回文構造である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペーサー単位が、アルキル（ＣＨ２）鎖又はエチレングリコール（ＣＨ２Ｏ）鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記スペーサー単位が、修飾したヌクレオチド又はリボヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
２つ以上の前記第１の核酸増幅プライマーを使用する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
２つ以上の前記第２の核酸増幅プライマーを使用する、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸配列の増幅のためのキットであって、
ａ．試料の第１の標的領域に相補的である３’領域、及び該試料の領域に相補的でなく、天然には存在しない配列を有する５’領域を有する第１の核酸増幅プライマーであって、該５’領域が、自己相補的であり、これにより、該第１の核酸増幅プライマーの第１の鎖の５’末端が、該第１の核酸増幅プライマーの第２の鎖の５’末端とハイブリダイズすることが可能であるか、又は該第１の核酸増幅プライマーの該５’領域が、第２の核酸増幅プライマーの５’領域に相補的であり、該第１の核酸増幅プライマーの該５’非相補的領域が、ポリメラーゼにより複製不可能なスペーサー単位を介して該プライマーに結合する、第１の核酸増幅プライマー、
ｂ．核酸ポリメラーゼ、
ｃ．ヌクレオチド三リン酸モノマー、並びに任意選択で
ｄ．該第１のプライマーの伸長産物に相補的である３’領域、及び該第１のプライマーの該５’領域に相補的であり、天然には存在せず該試料の領域に相補的でない配列を有する５’領域を有する第２の核酸増幅プライマー
を含む、キット。
【請求項１６】
前記第２の増幅プライマーをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ヘリカーゼ又はリコンビナーゼをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記第１の核酸増幅プライマーの前記５’領域が、天然には存在しない配列を有する、請求項１５から１７までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記第１の核酸増幅プライマーの前記５’非相補的領域が、回文構造である、請求項１５から１８までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記スペーサー単位が、アルキル（ＣＨ２）鎖又はエチレングリコール（ＣＨ２Ｏ）鎖である、請求項１５から１９までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記スペーサー単位が、修飾したヌクレオチド又はリボヌクレオチドである、請求項１５から１９までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
２つ以上の前記第１の核酸増幅プライマーを含む、請求項１５から２１までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
２つ以上の前記第２の核酸増幅プライマーを含み、前記第１及び第２の核酸増幅プライマーの前記５’非相補的領域が、同一であり、回文構造である、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅、例えば、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び様々な等温増幅方法に基づく分子生物学アッセイの設計に関する。本発明は、プライミングオリゴヌクレオチド（プライマー）間の不必要な相互作用を最小化することにより、アッセイ特異性の向上をもたらすことを意図する。
【背景技術】
【０００２】
高い特異性、感度及び産物収率を達成することは、多くの核酸配列を単一反応において一度に増幅させる、高度に多重化した分子生物学アッセイにおいて重要である。１回のアッセイにおいて、数十、数百、又は数千のオリゴヌクレオチドプライマーを混合して、１つ又はいくつかの臨床的に関連する標的の増幅を実施することができる。多重化のレベルが上昇するにつれ、プライマー相互作用の組合せの複雑性も上昇し、一部の熱力学的ボトルネックにより、感度の低下又は偽陽性結果さえも生じると思われる。
【０００３】
典型的な例は、プライマーの非特異的交差反応性によるプライマーダイマーの不必要な増幅である。多数の生物化学的、生物物理学的、及び生物情報学的方法が開発され、不必要なプライマー相互作用が起こる確率を最小化することによってアッセイ設計に役立っている。多くの研究者は、すべての試薬が存在して反応が所望の温度に至る前に増幅が開始すること（例えば、「ホットスタート」増幅）を防ぐことに焦点を置いている。計算論的アプローチでは、候補プライマーのプールを、これらの３’末端における相補性についてスクリーニングし、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおけるプライマー二重鎖の熱力学的安定性を算出する。塩基のペアリングによりダイマー形成を促進し得るプライマー間の相補性が実質的に存在しないように、プライマーを設計することが可能であっても、プライマーダイマーは、配列非依存的に依然として形成し得る。このようなプライマーダイマーを形成する機構に光を投じる証拠は、非常に限られている。考えられる１つの説明は、ＤＮＡポリメラーゼの触媒部位におけるタンデム相互作用により、一方のプライマーが他方のプライマーにわたって伸長することである（図１）。
【０００４】
プライマーダイマーは、一旦形成されると、急速に増幅して、特に、標的のコピーが非常に少数しか存在しない場合には、標的の増幅が検出され得る前であっても、利用可能な試薬のプールを迅速に枯渇させ得る。
【０００５】
結果として、プライマーダイマーの形成は、プライミングオリゴヌクレオチドを使用するすべての核酸増幅方法、例えば、最も一般的に使用される方法である、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、特異性、感度、及び収率を制限する鍵となる因子のうちの１つである。ＰＣＲの他に、持続性のプライマーダイマー形成は、等温増幅方法のすべてではないが殆どにおいて、特に問題となる。例としては、ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。プライマーダイマーの増加による影響に対して等温増幅反応の感受性が相対的に高いことは、プライマー相互作用がＰＣＲの変性サイクルにより生じるため、それが連続的にはリセットされないという事実により、ある程度説明することができる。別の考えられる説明は、等温方法において、増幅速度がＤＮＡの長さに直接関連づけられ、産物が短いことが非常に好都合であることである。
【０００６】
米国特許出願公開第２００９／０２５８３５３号明細書に開示される方法では、５’ハイブリダイゼーションカセットを使用して増幅不可能なプライマーダイマー形成を促進するが、この方法では、５’領域は、３’標的特異的領域の開始部分の逆相補体である。これにより、プライマーが折り重なるヘアピン構造又は５’末端でハイブリダイズしたダイマーのいずれかが生じる。米国特許出願公開第２００９／０２５８３５３号明細書の方法は、この５’領域が、天然配列に相補的であるプライマーの標的特異的領域のうちの一部の逆相補体であるため、設計上、天然に見出される配列でなければならない。
【０００７】
国際公開第２０１５／１６４４９４号明細書における方法では、この場合もやはり、それらの５’領域によりダイマー形成し得るプライマーを使用する。しかし、この方法では、５’領域は、ニッキング酵素の制限部位を含む。従って、この部位は、天然に見出される配列でなければならない。
【０００８】
国際公開第２０１７／１１７２８７号明細書では、高度に特異的な新規のプライマー結合部位をアンプリコンに組み込むために使用される５’伸長部を有するプライマーの使用を開示している。このようなプライマーは、タグ化アンプリコンプライマー伸長（ＴＡＰＥ）のために、又は検出アッセイの信頼度を高めるために使用し得る。プライマーが伸長不可能なダイマーを形成し得ると言及されているが、これは、この発明の焦点ではない。
【０００９】
国際公開第２０１６１６１０５４号明細書では、５’を相補的に伸長させたプライマーを使用して、複数の核酸配列をともに融合するための方法を記載している。プライマーの複数のセットを使用して標的遺伝子を増幅させ、各対由来のプライマーは、別の対由来のプライマーの伸長に相補的であるように５’を伸長させる。これにより、ともに一本鎖に融合し得るアンプリコンが生成される。複製不可能なリンカーを使用すると、５’伸長が組み込まれず、これらを核酸融合に使用することができないため、このような複製不可能なリンカーは、この発明において存在しない。
【００１０】
国際公開第２０１７／１６５２８９号明細書のプライマーは、自己相補的５’伸長を特徴とし、これにより、ヘアピン構造又は伸長不可能なダイマーを形成し得る。しかし、このようなダイマーは、ランダム又はセミランダムな３’領域を有するため、細胞全体の増幅に使用する。これらは、特定の遺伝子の標的とはしない。加えて、これらは、複製不可能なリンカー領域を含まない。
【００１１】
国際公開第９４／２１８２０号では、５’を伸長させ、複製不可能なリンカー領域を有するプライマーを使用した、遊離の５’末端を有するアンプリコンを生成する方法を開示している。しかし、５’の伸長は、ハイブリダイズさせるように特異的には設計せず、その代わりに、アンプリコンが生成された場合に、アンプリコンの存在を検出するために利用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
プライマーダイマー形成の問題を解決する１つの方法は、例えば、５’末端のハイブリダイゼーションにより、プライマーの伸長を防ぐ方法で、プライマーがダイマー形成するように強制することである。一般的に使用されるすべての核酸ポリメラーゼが５’から３’への活性のみを有し、プライマーダイマーの３’末端は鋳型を有しないため、このような種類のプライマーダイマーは、伸長することができない。この技術の使用は、例えば、天然に見出されない核酸配列（ヌロマー（ｎｕｌｌｏｍｅｒ））を使用して５’ハイブリダイゼーションカセットを用意し、５’ハイブリダイゼーションカセットからプライマーの３’標的特異的結合領域をリンカー領域により分離し、これにより、５’ハイブリダイゼーションカセットのアンプリコンへの組込みを防ぐことにより向上させることができる。
【００１３】
ここで、本発明者らは、分子種においてプライミングオリゴヌクレオチドを可逆的に捕捉することにより、核酸増幅の間のプライマーダイマー形成を制限する新たな方法を提唱し、これを熱力学的トラップ（サーモトラップ）と呼ぶ。熱力学的トラップは、非常に単純であり、実践するのに費用対効果が高い。他の方法とは対照的に、サーモトラップは、反応化学の修飾を必要とせず、この方法は、プライマーの５’末端に付加し、これにより相互にハイブリダイズする、短い人工配列を使用するが、単独で作用する。プライマーの５’相補的領域は、アンプリコンの標的配列ではなく、他のプライマーとハイブリダイズさせることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
記載する方法は、核酸配列の増幅のための方法であって、
ａ．ｉ．核酸試料、
ｉｉ．試料の第１の標的領域に相補的である３’領域、及び試料の領域に相補的でない５’領域を有する第１の核酸増幅プライマーであって、５’領域が自己相補的であり、これにより、第１の核酸増幅プライマーの第１の鎖の５’末端が、第１の核酸増幅プライマーの第２の鎖の５’末端とハイブリダイズすることが可能であるか、又は第１の核酸増幅プライマーの５’領域が、第２の核酸増幅プライマーの５’領域に相補的である、第１の核酸増幅プライマー、
ｉｉｉ．核酸ポリメラーゼ、
ｉｖ．ヌクレオチド三リン酸モノマー、並びに任意選択で
ｖ．第１のプライマーの伸長産物に相補的である３’領域、及び第１のプライマーの５’領域に相補的であり、試料の領域に相補的でない５’領域を有する第２の核酸増幅プライマー
を含む反応混合物を得るステップと、
ｂ．第１のプライマーを試料とハイブリダイズさせるステップと、
ｃ．核酸ポリメラーゼ及びヌクレオチド三リン酸モノマーを使用して第１のプライマーを伸長させるステップと、
ｄ．ステップｂ及びｃを繰り返し、これにより、標的配列を増幅させ、ここで、第１の核酸増幅プライマーが、試料とハイブリダイズするステップと
を含む、方法を含む。
【００１５】
方法は、単一種の第１の増幅プライマーを使用して実施することができる。このような場合では、増幅は、ハイブリダイゼーション及び伸長の繰返しに基づく線形増幅である。伸長させた鎖は、鎖置換ポリメラーゼ酵素又は類似の酵素的置換を使用して置換することができる。
【００１６】
或いは、増幅では、第２の増幅プライマーを含み、これにより指数関数的に増幅させることができる。第２のプライマーにより、第１のプライマーからの伸長産物を複製する。第１のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を繰り返す方法により、第２のプライマーもハイブリダイゼーション及び伸長を繰り返し、これにより、コピーを複製する。
【００１７】
増幅は、等温増幅であり得るか、又はサーモサイクリングにより行うことができる。増幅が等温増幅である場合は、伸長させたプライマーは、酵素、例えば、ヘリカーゼ又はリコンビナーゼを使用して試料から離され得る。サーモサイクリングにより増幅を行う場合は、伸長させたプライマーは、熱を使用して試料から離される。
【００１８】
いかなる試料に対しても使用可能な普遍的配列を提供するために、第１の核酸増幅プライマーの５’領域は、天然には存在しない配列を有する。第１の核酸増幅プライマーの５’領域は、自己相補的であるか、又は第２の核酸増幅プライマーの５’領域に相補的である。第１の核酸増幅プライマーの５’領域が天然には存在しない配列を有する場合は、相補的なコピーもまた、天然には存在せず、このため、第２の核酸増幅プライマーの５’領域もまた、天然には存在しない配列を有する。
【００１９】
第１の核酸増幅プライマーの５’非相補的領域は、効果的に機能させるために、第１の核酸増幅プライマーの３’標的相補的領域よりも低い融解温度を有し得る。
【００２０】
プライマーのいかなる集団にも普遍的に適用可能とするために、第１の核酸増幅プライマーの５’非相補的領域は、回文構造であり得る。２つ以上のプライマー種が存在する場合は、各増幅プライマーの５’非相補的領域は、同一であり、回文構造であり得る。従って、集団のいかなるメンバーも、プライマーの集団の他の任意のメンバーとハイブリダイズさせることができる。
【００２１】
プライマーの５’及び３’領域は、ポリメラーゼにより複製不可能なスペーサー単位を介して結合し得る。適するポリメラーゼ耐性スペーサー単位は、アルキル（ＣＨ２）鎖又はエチレングリコール（ＣＨ２Ｏ）鎖を含む。スペーサー単位はまた、修飾したヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり得る。
【００２２】
方法は、異なる標的配列の２つ以上の第１の核酸増幅プライマーを有する多重化した形式において使用し得る。
【００２３】
核酸配列の増幅のためのキットであって、
ａ．試料の第１の標的領域に相補的である３’領域、及び試料の領域に相補的でない５’領域を有する第１の核酸増幅プライマーであって、５’領域が、自己相補的であり、これにより、第１の核酸増幅プライマーの第１の鎖の５’末端が、第１の核酸増幅プライマーの第２の鎖の５’末端とハイブリダイズすることが可能であるか、又は第１の核酸増幅プライマーの５’領域が、第２の核酸増幅プライマーの５’領域に相補的である、プライマー、
ｂ．核酸ポリメラーゼ、
ｃ．ヌクレオチド三リン酸モノマー、並びに任意選択で
ｄ．第１のプライマーの伸長産物に相補的である３’領域、及び第１のプライマーの５’領域に相補的であり、試料の領域に相補的でない５’領域を有する第２の核酸増幅プライマー
を含む、キットをまた、記載する。
【００２４】
キットは、第２の増幅プライマーを含み得る。
【００２５】
キットは、ヘリカーゼ又はリコンビナーゼを含み得る。
【００２６】
キットは、第１の核酸増幅プライマーの５’領域が、天然には存在しない配列を有する、第１の核酸増幅プライマーを含み得る。
【００２７】
キットは、第１の核酸増幅プライマーの５’非相補的領域が、回文構造である、第１の核酸増幅プライマーを含み得る。
【００２８】
キットは、第１の核酸増幅プライマーの５’非相補的領域が、ポリメラーゼにより複製不可能なスペーサー単位を介してプライマーに結合する、第１の核酸増幅プライマーを含み得る。適するポリメラーゼ耐性スペーサー単位は、アルキル（ＣＨ２）鎖又はエチレングリコール（ＣＨ２Ｏ）鎖を含む。スペーサー単位はまた、修飾したヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり得る。
【００２９】
キットは、２つ以上の第１の核酸増幅プライマーを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プライマーダイマーの形成及び増幅を生じるプライマー相互作用を示す図である。（Ａ）は、限定的な塩基ペアリングでの相互作用を示す。（Ｂ）は、塩基ペアリング無しでの相互作用の例を示す。両タイプの相互作用は、５’ＤＮＡ突出末端を生成し、これは、ＤＮＡポリメラーゼによる３’末端からの鎖伸長の鋳型として作用し、このすべては、３’から５’への方向性を有する。
【図２】熱力学的トラップの一般原理を示す図である。（Ａ）は、プライマーの５’末端に位置する相補的又は部分的相補的サーモトラップエレメント（斜めの縞模様で示す）間の相互作用により、３’突出末端を有するプライマー二重鎖が形成され、これは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長することができないことを示す。（Ｂ）は、増幅反応混合物中のプライマー対が、サーモトラップ媒介による二重鎖の形成において、配列相補性が制限されるか又は配列相補性のない３’対３’タンデムよりも、ＤＮＡポリメラーゼ触媒部位（灰色の円）に導入されている可能性がはるかに高いことを示す。（Ｃ）は、標的配列の存在下で、このような標的配列が、捕捉された易熱性プライマー二重鎖よりも高い親和性で、３’末端プライマー領域によって結合されることを示す。
【図３】サーモトラップデザインの選択された実施形態を示す図である。（Ａ）は、サーモトラップエレメントが、３末端標的結合領域から無関係な配列によって分離されることを示す。（Ｂ）は、サーモトラップエレメントが内部に位置し、無関係な配列と５’末端で隣接していることを示す。（Ｃ）は、サーモトラップエレメントが回文構造であり、これによりプライマーが、シングルプレックス又はマルチプレックス反応において、いかなる組合せでも、ホモ及びヘテロの両方の二重鎖を形成することが可能であることを示す。（Ｄ）は、２つ以上のサーモトラップエレメントが、プライマーに結合して高次のプライマー複合体を生成し、溶液中の有効な遊離の分子濃度をさらに低下させ得ることを示す。
【図４】サーモトラップエレメントと標的結合領域の化学的分離を示す図である。（Ａ）は、サーモトラップエレメントと標的特異的プライマー領域が、同一の連続的ヌクレオチド配列の一部である場合に、サーモトラップエレメントが、３’からの鋳型分子の伸長により、相補鎖上に複製されることを示す。（Ｂ）は、２つの配列の間にスペーサー（リボン）を導入することにより、後続の増幅ラウンドにおいてサーモトラップ配列の増加を防ぐことを示す。
【図５】鎖置換活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを使用した、増幅反応における能力を増強するための５’プライマー末端の修飾を示す図である。（Ａ）は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させると、３’末端からの鋳型分子の伸長により、捕捉されたプライマー分子の置換が生じることを示す。（Ｂ）は、鎖置換活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑを使用した場合に、捕捉されたプライマー分子がポリメラーゼにより分解され、一方、標的３’末端が伸長し得ることを示す。（Ｃ）は、サーモトラップ含有プライマーの５’末端（菱形の記号）を化学的に修飾して、鎖置換活性を欠くＤＮＡポリメラーゼによる、捕捉されたプライマーの分解を防ぐことを示す図である。明確化のために、サーモトラップエレメントが、無関係な配列により３’末端標的結合配列から分離されている、サーモトラッププライマーデザインを示す。
【図６】サーモトラッププライマーデザインでの溶液プライマーの析出(deposition)を示す図である。（Ａ）は、プライマー対を形成するプライマーのうちの１つが、共有結合又はその他の方法により、その５’末端で固体表面に結合していることを示す。明確化のために、内部に位置し、リンカーとして作用する無関係な配列と５’末端で隣接するサーモトラップエレメントを有する、サーモトラッププライマーデザインを示す。（Ｂ）は、溶液プライマーが添加され、サーモトラップエレメントを介して固定化したプライマーとハイブリダイズしていることを示す。（Ｃ）は、等温増幅反応において、増幅試薬の添加後に、ハイブリダイズした溶液プライマーがＤＮＡポリメラーゼにより置換されて、結合した鋳型分子の３’末端が伸長することを示す。
【図７】ライブラリー生成においてアダプターとして使用するサーモトラップ配列を示す図である。（Ａ）は、相補的サーモトラップエレメントにより、非対称的に適合したライブラリーが生成されることを示す。（Ｂ）は、回文構造サーモトラップエレメントにより、対称的に適合したライブラリーが生成されることを示す。
【図８】サーモトラッププライマーデザインにより、ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）アッセイにおける偽陽性プライマーダイマー増幅の発生率が低下することを示す図である。（Ａ）は、鋳型分子の非存在下における反応増幅曲線を示す図である。ゲル電気泳動により、産物のプライマーダイマーとしての同一性が確認された（提示せず）。（Ｂ）は、鋳型分子の存在下における反応増幅曲線を示す図である。
【図９】サーモトラッププライマーデザインにより、夾雑ＤＮＡの非特異的増幅を防ぐことができることを示す図である。標的ＤＮＡ又は規定量のヒトゲノムＤＮＡのいずれかの夾雑物の存在下における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子領域の増幅を示す。産物増幅曲線（左）及び産物融解曲線（右）を示す。実線は、種々の入力値のｕｉｄＡ標的コピー（１０〜１０．０００コピー）の存在下、夾雑するヒトゲノムＤＮＡ（Ｂ０１−Ｆ０２及びＢ０７−Ｆ０８）の非存在下で増幅させたＰＣＲ産物を表す。点線は、夾雑するヒトゲノムＤＮＡ（Ｇ０１、Ｇ０２、Ｇ０７、Ｇ０８及びＨ０１、Ｈ０２、Ｈ０７、Ｈ０８）５０〜５００ｎｇ並びに無鋳型対照（Ａ０１、Ａ０２及びＡ０７、Ａ０８）の存在下で増幅させたＰＣＲ産物を表す。（Ａ）は、標準的プライマーデザインによる増幅を示す図であり、この場合、プライマーは、標的結合配列のみを含む。（Ｂ）は、標的結合配列のみとその５’末端において共役するＡｌｐｈａ８サーモトラップ配列による増幅を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
公知のＤＮＡポリメラーゼはすべて、厳密な酵素方向性を有しており、１つのＤＮＡ鎖の３’末端上のヒドロキシ基においてのみ作用し、５’突出末端を有する第２のＤＮＡ鎖に存在するヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを付加する。不必要なプライマーダイマー増幅は、プライマー相互作用により発生し、このような５’突出末端を有する二重鎖を形成する。
【００３２】
サーモトラッププライマーデザインでは、従来とは違う方法でプライマーを相互に可逆的に相互作用させることにより、望ましくないプライマー相互作用を防ぎ、この方法では、増幅し得るダイマーの形成を生じない。これは、完全又は部分的相補性を有する、相対的に短く低融解温度のＤＮＡ配列（単数又は複数）を、それらの５’末端に付加することにより達成する（図２Ａ）。サーモトラップエレメントとさらに呼ばれる、このような配列による相互作用により、３’突出末端を有するプライマー二重鎖の形成が生じ、このプライマー二重鎖は、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させることができない。
【００３３】
標的ＤＮＡ配列と相互作用するように設計したプライマーの３’末端部分は、未修飾のままであり、完全に露出する。従って、有害な３’対３’プライマーダイマー相互作用は、理論上、サーモトラップ媒介による二重鎖の形成と同時に、なお発生し得る（図２Ｂ）。しかし、ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較して相対的に大型であるため、２つのプライマー立体構造は、酵素の触媒部位との結合について競合する。サーモトラップエレメントが、少なくとも部分的に相補的であるため、これらの導入は、熱力学的に好ましく、従って、不必要なプライマー二重鎖の導入及び伸長を立体的に防ぎ、これにより、相補性が共有されないか又は非常に制限される。
【００３４】
立体障害の他に、２つのプライマーがともに結合すると、プライマー分子の溶液中のモル濃度が半分にまで効果的に低下し、これにより、不必要な相互作用の起こる確率が熱力学的に低下する。
【００３５】
プライマーの標的特異的部分が、サーモトラップエレメントよりも長く、高い融解温度を有するため、標的ＤＮＡ配列との結合は、サーモトラップ媒介による二重鎖よりも熱力学的により有利であり、従って、標的配列を増幅させる能力がもたらされる（図２Ｃ）。捕捉されたプライマーは、増幅反応の間に二重鎖から自然発生的に分離することより利用可能となる。
【００３６】
配列組成
サーモトラップエレメントとして使用するヌクレオチド配列は、天然に存在する任意の配列から選択することができるが、一部の実施形態において、このようなヌクレオチド配列を酵素的に複製する必要がない場合に限り、部分的に又は完全に人工であってもよい。天然に見出されず（既知の任意の配列に対する著しい配列類似性を示さない配列であり、ヌロマーとも呼ばれる）、任意の天然標的配列の増幅との交差反応性が最小であるように予測又は最適化した、人口配列は、有用である。
【００３７】
ヌロマーを生成するプロセスは、以下であり得る。
ａ．予め定義した基準を満たすプライマーのランダム集団を生成する。基準は、ヌクレオチド配列の任意の特性、例えば、長さ、グアニン及びシチジンの割合（ＧＣ％）、配列融解温度、ギブズ自由エネルギー、二次構造形成の傾向又は所与のジヌクレオチド組成から選択することができる。
ｂ．発見的アルゴリズム、例えば、これらに限定されないが、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ又はＳＳＡＨＡ２を、天然に見出されるすべてのＤＮＡ配列の重複しないバンク（例えば、ＮＣＢＩ  ＮＲデータバンク）に適用することにより、そのプールから、天然に存在する配列に対する著しい配列類似性を有する配列を取り除く。
ｃ．ＥＸＡＣＴアルゴリズム、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎローカルアラインメント方法を適用することにより示される、著しい配列類似性を有する配列を取り除く。
ｄ．プライマーとすべての配列のすべての位置との間のアニーリングの熱力学的シミュレーション（例えば、最近隣熱力学表に基づく）を適用することにより示される、著しい結合親和性を有する配列を取り除く。
【００３８】
所与の標的特異的結合領域を用いた使用のために最適化した、サーモトラップエレメントの配列は、様々な生物情報学的並びに実験的方法により同定することができる。後者の場合では、サーモトラップ配列は、ハイスループットスクリーニングにおいて選択することができ、この場合、共通の標的特異的結合領域に結合したサーモトラップ配列のランダムプールを、負荷条件下、例えば、大量の夾雑するＤＮＡの存在下での増幅において使用する。その後、オンターゲット（特異的）及びオフターゲット（非特異的）増幅産物は、次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）により同定及び定量することができ、これにより、最良のオンターゲット対オフターゲット比で、サーモトラップ配列の選択が可能となる。
【００３９】
サーモトラップ領域と標的結合領域との間の距離
概説する作用の機構により、サーモトラップ媒介による二重鎖と非特異的プライマー二重鎖との間の、ＤＮＡポリメラーゼへの結合についての、立体障害による競合が説明される。従って、サーモトラップ領域と３’プライマー末端との間の距離は、このような競合を媒介するため、即ち、２つのＤＮＡポリメラーゼ酵素単位が２つのプライマー末端に独立して結合することを防ぐために、十分短くあるべきである（図２は、直接隣接した２つのエレメントを表す）。
【００４０】
しかし、この距離が長すぎて競合できないとしても、このような別々のサーモトラップ領域の存在は、遊離のプライマー分子の溶液中のモル濃度を低下させることにより、なお有用性をもたらす。従って、サーモトラップ領域と３’末端標的特異的領域との間の距離にかかわらず、これらが同一のオリゴヌクレオチド分子上に位置する限り、プライマーの設計を本開示に含む（図３Ａ）。
【００４１】
サーモトラップ領域の位置
図２Ａは、５’プライマー末端に直接位置するサーモトラップエレメントを表す。しかし、サーモトラップエレメントはまた、内部に位置し、任意のＤＮＡ配列が５’末端で開始する（図３Ｂ）。例えば、ヘリカーゼ依存的増幅のような適用においては、サーモトラップエレメントは、低融解温度配列と５’末端で隣接して、ヘリカーゼ酵素によるＤＮＡの巻き戻しが促進され得る。
【００４２】
サーモトラップ領域の相補性
図２Ａは、サーモトラップ配列が完全に相補的である設計を表す。しかし、サーモトラップエレメントはまた、不適正塩基対又は修飾塩基を含むように設計し得る。
【００４３】
さらに、図２Ａは、サーモトラップ配列が２つの異なるプライマーに結合し、これにより、プライマーヘテロ二重鎖が形成される設計を表す。しかし、サーモトラップ配列はまた、回文構造（５’から３’方向で読み取られる場合に同一である両相補鎖上の配列）として設計し得る。回文構造のサーモトラップエレメントは、ホモ及びヘテロの両方の二重鎖を、反応において存在する他の任意のサーモトラップ含有プライマーのすべてと組み合わせて、形成することができる（図３Ｃ）。従って、回文構造デザインにより、マルチプレックス反応の複雑なプライマープールにおいて、単一のサーモトラップエレメントデザインを利用することが可能となる。
【００４４】
サーモトラップ尾部の長さは、増幅効率とプライマーダイマー抑制との間のバランスを最適化するように調整することができる。長いサーモトラップ尾部は、低増幅効率という代償を払って、プライマーダイマー形成に対する高抵抗性を付与することが予測され、一方、短いサーモトラップ尾部は、プライマーダイマー形成に対する低抵抗性という代償を払って、高増幅効率を付与することが予想される。
【００４５】
高次の組合せ
図２Ａは、各プライマーが１つのサーモトラップエレメントを含む設計を表す。しかし、実際、異なるか又は同一の２つ以上のサーモトラップエレメントは、単一のプライマーに結合して、高次のプライマー複合体（即ち、３つ以上のプライマーによる）の形成を促進し得る。このような設計により、反応における遊離のプライマー分子の濃度をさらに低下させることが可能となる（図３Ｄ）。
【００４６】
化学的分離
サーモトラップエレメントと標的特異的プライマー領域が、同一の連続的ヌクレオチド配列の一部である場合は、サーモトラップ配列は、３’末端からの鋳型分子の伸長により、産物の相補鎖上に組み込まれる（図４Ａ）。その後、サーモトラップ配列の存在は、後続の増幅ラウンドにおいて、その標的に結合するプライマーの熱力学的特性に影響し、例えば、それらのアニーリング温度が上昇するか又はミスプライミングの確率が上昇する。
【００４７】
これを克服するために、オリゴヌクレオチド合成の間に、１つ又はいくつかのリンカー又は遮断分子、例えば、これらに限定されないが、ヘキサンジオール、エチレングリコール、ピレン又はホスホラミダイトにより、標的特異的プライマー領域からサーモトラップエレメントを化学的に分離し得る（図４Ｂ）。ＲＮＡ又は修飾ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）をまた、使用することができる。この実施形態では、化学的分離により、増幅させた標的ＤＮＡにおけるサーモトラップ配列の増加を防ぎ、一方、２つのプライマーエレメントの物理的結合を保持する。
【００４８】
プライマー融解温度の保持及びミスプライミングの低減に加えて、サーモトラップエレメントと標的特異的プライマー領域とを化学的に分離することもまた、増幅試薬、例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の消費が減少し、且つ標的増幅に干渉することなく、サーモトラップ領域を、より長くより複雑に設計する柔軟性をさらにもたらす。
【００４９】
鎖置換活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを使用した増幅反応における能力を増強するための修飾５’末端
殆どの等温増幅方法では、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、これにより、捕捉されたプライマーを、伸長ステップにおいて移動させることが可能となる（図５Ａ）。５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば、ＰＣＲで使用されるＴａｑポリメラーゼを利用する増幅方法では、サーモトラップの設計を使用すると、捕捉されたプライマーは、伸長ポリメラーゼにより分解され得る（図５Ｂ）。
【００５０】
これを回避するために、サーモトラップ含有プライマーの５’末端を、５’方向のエキソヌクレアーゼ活性からそれを保護する部分により修飾することができ、例えば、ホスホロチオエート結合、非ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾すると、鋳型分子のサーモトラップエレメントにわたる伸長が遮断され、これにより、化学的に分離したサーモトラップ及びプライミング領域の有用性がまた、もたらされる。
【００５１】
固相増幅におけるプライマーの析出
プライマー対のうちの一方のプライマーを固体表面にその５’末端により固定化する、固相増幅に基づくアッセイに適用する場合は、サーモトラッププライマーの設計を使用して、溶液プライマー分子をｉｎ  ｓｉｔｕで析出(deposition)させた後、鋳型を添加して反応を開始させることができる（図６）。これは、溶液プライマーと固定化プライマーを施した表面とを、例えば、マイクロウェルの底面に、プレハイブリダイズした後、反応混合物を添加することにより達成することができる。その後、鋳型ＤＮＡが結合及び伸長すると、捕捉された溶液プライマーが遊離し、これが鋳型分子の他方の遠位部位に結合することが可能となる。等温増幅では、これにより、（１）必要とされる位置に近接する溶液プライマーを濃縮し、（２）反応において利用可能な高総量のプライマーを達成し、（３）反応の間にプライマーを徐々に遊離させることが、必要に応じて可能となる。
【００５２】
ライブラリー生成においてアダプターとして使用するサーモトラップエレメント
多くの高度に多重化した分子生物学アッセイは、核酸増幅、例えば、これらに限定されないが、標的化次世代シーケンシング（ＮＧＳ）又は増幅産物のアッセイ（アンプリコンシーケンシングとして知られる）を含み、これらは、増幅させた鋳型分子のライブラリーの生成を必要とする。このようなライブラリーは、数百のプライマー対を含む超マルチプレックスＰＣＲ反応により生成することができる。ＮＧＳに適用するためのライブラリーの調製における１つの重要なステップは、普遍的アダプターの付加であり、これにより、後続のＰＣＲ反応において、一対のＰＣＲプライマーを用いてライブラリーを均一に増幅させることが可能となる。アダプターはまた、シーケンシングプライマーのためのプライミング部位、及びライブラリー分子がシーケンシングチップの表面へ結合することを促進する配列を含み得る。加えて、アダプターはまた、いわゆるインデックスを含み、これは、ユーザーが、１回のシーケンシング反応において種々の試料を混合し、これらの起源について後にデコンボリューションを行うことを可能とするバーコードとして作用し得る。
【００５３】
このような高度なマルチプレックスアッセイに使用する場合は、サーモトラップ配列は、サーモトラップエレメントと普遍的アダプターの二重の機能を果たすように利用し得る（図３Ｃ上に表す）。２つの相補的サーモトラップ配列を使用すると、すべてのプライマー対における２つのプライマーのそれぞれ１つは、２つの相補的アダプターを両末端に有する、普遍的に適合したライブラリーの生成を生じる（図７Ａ）。マルチプレックス反応において使用するすべてのプライマーと共役した、同一回文構造の単一サーモトラップ配列を使用すると、普遍的且つ対称的に適合したライブラリーの生成を生じる（図７Ｂ）。
【実施例】
【００５４】
（例１）：
ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）におけるサーモトラッププライマーデザイン
方法：
等温増幅の間のプライマーダイマーの発生率の低下におけるサーモトラッププライマーデザインの効率を、シングルプレックスヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）アッセイにおいて、ＩｓｏＡｍｐ  ＩＩＩ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｔＨＤＡ（登録商標）化学（Ｂｉｏｈｅｌｉｘ  Ｃｏｒｐ社）を使用して試験した。すべてのプライマーは、これらが共通の標的特異的結合領域AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGC及びAAAAACTCCTCTGGCACCGTGCTGCをこれらの３’末端に含むように設計し、フォワード及びリバースプライマーについてＨＤＡ７２＿Ｆ及びＨＤＡ７２＿Ｒとしてそれぞれ標識した。プライマーは、それらの５’末端において、追加の配列（対照プライマー）を含まないか、又は４つの変異体の１つである非回文構造サーモトラップエレメント：
（１）Ａｌｐｈａ８変異体ACTGACGT（又はＨＤＡ７２＿Ｒリバースプライマー中の、その相補的配列ACGTCAGT）、
（２）追加の４つのアデニンを５’末端に含む、Ａ＿Ａｌｐｈａ８変異体AAAAACTGACGT（又はＨＤＡ７２＿Ｒリバースプライマー中の、追加の４つのアデニンを有するその相補的配列AAAAACGTCAGT）、
（３）追加の４つのチミジンを５’末端に含む、Ｔ＿Ａｌｐｈａ８変異体TTTTACTGACGT（又はＨＤＡ７２＿Ｒリバースプライマー中の、追加の４つのチミジンを有するその相補的配列TTTTACGTCAGT）、
（４）８ヌクレオチド長のＡｌｐｈａ８エレメントの代わりに使用する、１６ヌクレオチド長の非回文構造サーモトラップエレメントである、Ａｌｐｈａ１６変異体ACTGACGTGATCTGCA（又はＨＤＡ７２＿Ｒリバースプライマー中の、その相補的配列TGCAGATCACGTCAGT）
のうちの１つを含んだ。
詳細について表１を参照されたい。
【表１】
2020535844.tif 000003
【００５５】
１×アニーリングバッファーＩＩ、０．３×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  １μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １．７５μｌ、４ｍＭのＭｇＳＯ４、４０ＮａＣｌ並びに７５ｎＭのフォワード及びリバースプライマーを５つのプライマー対のそれぞれについて含む、反応物２５μｌを調製した。ＨＤＡ７２＿Ｆ及びＨＤＡ７２＿Ｒ配列をそれらの末端に含む（鋳型含有反応物）か又は水を含む（ＮＴＣ、無鋳型対照）鋳型分子１０＾８コピーを各反応物に添加した。複製反応物を１６部、即ち、鋳型含有を８部及びＮＴＣを８部、５プライマー対のそれぞれについて調製した。反応物は、６５℃で２時間、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）においてインキュベートした。産物の蛍光の増加を１分間隔でモニターした。蛍光データを時間の関数としてプロットした。
【００５６】
結果：
サーモトラッププライマーデザインは、プライマーダイマー増幅を鋳型ＤＮＡの非存在下において防いだ。８ヌクレオチド長のトラップ配列及び４つの遊離のアデニンを５’末端に有する、サーモトラップデザインＡ＿Ａｌｐｈａ８では、ダイマー発生率が８７．５％低下したが、同時に、増幅時間は、４５％増加した。いかなる隣接配列をも５’末端に有しない、Ａｌｐｈａ８デザインでは、プライマーダイマー発生率が０にまで低下したが、増幅時間が１２７％増加した。他のデザインでは、標的増幅収率が著しく損なわれた（図８）。
【００５７】
（例２）：
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるサーモトラッププライマーデザイン
サーモトラッププライマーデザインのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における非特異的増幅の低下効率を、標的ＤＮＡ又は変化量のヒトゲノムＤＮＡのいずれかの夾雑物の存在下で大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子の領域を増幅させるようにデザインしたシングルプレックスアッセイにおいて試験した。
【００５８】
２つのプライマー対を比較した。これらは、標的特異的結合配列をこれらの３’末端に含んだ（Ｅｃｏｌ＿ｕｉｄＡ＿１＿３７９＿２０＿Ｐａｒ：AGTTGCAACCACCTGYTGAT、Ｅｃｏｌ＿ｕｉｄＡ＿１＿８０＿２２＿ＰＡｆ：GTATGTTATTGCCGGGAAAAGT）が、８ヌクレオチド長のＡｌｐｈａ８サーモトラップ配列のこれらの５’末端における存在又は非存在が異なった（それぞれフォワード及びリバースプライマー中のACTGACGT及びACGTCAGT）。
【００５９】
０．１２５×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ社）、２．６７ｍＭのＭｇＣｌ２、４８ｍＭのＫＣｌ、０．３２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、０．２ｍＭのｄＮＴＰをそれぞれ、１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びプライマー対由来の０．２μＭの各プライマーを含む、ＰＣＲ反応物２０μｌを調製した。
【００６０】
無鋳型、ヒトゲノムＤＮＡ抽出物を５０若しくは５００ｎｇ、又はｕｉｄＡ標的コピーを１反応あたり１０〜１０．０００コピー含む、反応物を調製した。反応物には、試験する２つのプライマー対のいずれかを各２部設定した。ＰＣＲは、サーモサイクラーにおいて、４０増幅サイクルについてのリアルタイム蛍光読取りにより、次のプログラムを使用して実施した。
【表２】
2020535844.tif 000004
【００６１】
産物の蛍光の増加をモニターし、蛍光データを時間の関数としてプロットした。増幅後、産物を融解曲線解析に供して、オンターゲット（融解温度約８９℃）増幅産物とオフターゲット（融解温度８９℃未満）増幅産物とに区別した。
【００６２】
結果：
サーモトラップ配列を欠くプライマーは、ヒトゲノム夾雑物の存在下で著しいオフターゲット増幅を示し、一方、Ａｌｐｈａ８サーモトラップデザインを含むプライマーは、オフターゲット増幅の遅延又は非存在を示した。同時に、Ａｌｐｈａ８サーモトラップ配列の存在は、標的増幅の感度及び速度に影響しなかった（図９）。
【図１】
2020535844.tif 000005
【図２】
2020535844.tif 000006
【図３】
2020535844.tif 000007
【図４】
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【図５】
2020535844.tif 000009
【図６】
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【図７】
2020535844.tif 000011
【図８】
2020535844.tif 000012
【図９】
2020535844.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
2020535844.tif 000014
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