(57)【要約】  本発明は、新規の抗ＰＤ−Ｌ１抗体製剤に関する。特に、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ抗体アベルマブの水性医薬製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから３５ｍＭの濃度のグリシン、コハク酸、クエン酸リン酸またはヒスチジン；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、リジン一水和物、リジン酢酸塩、デキストロース、スクロース、ソルビトールまたはイノシトール；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のポビドン、ポリオキシルヒマシ油またはポリソルベート；
を含み、メチオニンを含まず、さらにｐＨが３．８から５．２である、水性医薬抗体製剤。
【請求項２】
抗酸化剤を含まない、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
アベルマブの濃度が約１０ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記グリシン、コハク酸、クエン酸リン酸またはヒスチジンの濃度が約１０ｍＭから約２０ｍＭである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項５】
前記リジン一塩酸塩の濃度が約１４０ｍＭから約２８０ｍＭである、または前記リジン一水和物の濃度が約２８０ｍＭである、または前記リジン酢酸塩の濃度が約１４０ｍＭである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項６】
前記デキストロース、スクロース、ソルビトールまたはイノシトールの濃度が約２８０ｍＭである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項７】
前記ポビドン、ポリオキシルヒマシ油またはポリソルベートの濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項８】
前記ポビドンが、低分子量ポビドンＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたは１７ＰＦである、または前記ポリオキシルヒマシ油がポリオキシル３５ヒマシ油である、または前記ポリソルベートがポリソルベート８０である、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項９】
アベルマブの濃度が約２０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度のグリシンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロースまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ、ポリオキシル３５ヒマシ油またはポリソルベート８０を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが約３．８から４．６である、請求項２に記載の製剤。
【請求項１１】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度のコハク酸を含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロースまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたはポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．９から５．２である、請求項２に記載の製剤。
【請求項１２】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として１０ｍＭから２０ｍＭの濃度のクエン酸リン酸を含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロースまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたはポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが３．８から４．７である、請求項２に記載の製剤。
【請求項１３】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度のヒスチジンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロース、イノシトールまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたはポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．８から５．２である、請求項２に記載の製剤。
【請求項１４】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のグリシンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩を含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．２から４．６である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１５】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のグリシンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約１４０ｍＭの濃度のリジン酢酸塩を含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．２から４．６である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１６】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のヒスチジンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約２８０ｍＭの濃度のスクロースを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦを含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．８から５．２である、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１７】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のコハク酸を含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩を含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．８から５．２である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１８】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のグリシン；
（ｉｉｉ）１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが４．４（±０．１）である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１９】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のグリシン；
（ｉｉｉ）１４０ｍＭの濃度のリジン酢酸塩；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが４．４（±０．１）である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項２０】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のヒスチジン；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のスクロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．０（±０．１）である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項２１】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のコハク酸；
（ｉｉｉ）１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．０（±０．１）である、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２２】
前記アベルマブが、（配列番号１）または（配列番号２）のいずれかの重鎖配列、（配列番号３）の軽鎖配列を有し、Ａｓｎ３００にグリコシル化を有し、主なグリカン種としてＦＡ２およびＦＡ２Ｇ１を含み、合わせて全グリカン種の＞７０％を占める、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２が全グリカン種の４４％〜５４％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１が全グリカン種の２５％〜４１％を占める、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２が全グリカン種の４７％〜５２％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１が全グリカン種の２９％〜３７％を占める、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２が全グリカン種の約４９％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１が全グリカン種の約３０％〜約３５％を占める、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
前記アベルマブのグリコシル化が、少ないグリカン種として全グリカン種の＜５％を占めるＡ２、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ１、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ２、全グリカン種の＜７％を占めるＦＡ２Ｇ２をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２が全グリカン種の３％〜５％を占め、前記Ａ２Ｇ１が全グリカン種の＜４％を占め、前記Ａ２Ｇ２が全グリカン種の＜３％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２が全グリカン種の５％〜６％を占める、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２が全グリカン種の約３．５％〜約４．５％を占め、前記Ａ２Ｇ１が全グリカン種の約０．５％〜約３．５％を占め、前記Ａ２Ｇ２が全グリカン種の＜２．５％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２が全グリカン種の約５．５％を占める、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記アベルマブが（配列番号２）の重鎖配列を有する、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３０】
静脈内（ＩＶ）投与用である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３１】
請求項３０に記載の製剤を含有するバイアル。
【請求項３２】
２０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液１０ｍＬ中にアベルマブ２００ｍｇを含有する、請求項３１に記載のバイアル。
【請求項３３】
ガラスバイアルである、請求項３１または３２に記載のバイアル。
【請求項３４】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の製剤を患者に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
【請求項３５】
前記がんが、非小細胞性肺がん、尿路上皮癌、膀胱がん、中皮腫、メルケル細胞癌、胃もしくは胃食道接合部がん、卵巣がん、乳がん、胸腺腫、胃腺癌、副腎皮質癌、頭頚部扁平上皮癌、腎細胞癌、メラノーマ、および／または古典的ホジキンリンパ腫から選択される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の抗ＰＤ−Ｌ１抗体製剤に関する。特に、本発明は抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブの水性医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム死１（ＰＤ−１）受容体ならびにＰＤ−１リガンド１および２（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）は、免疫制御に重要な役割を果たす。活性化Ｔ細胞上に発現されると、ＰＤ−１は、間質細胞、腫瘍細胞、またはその両方によって発現されるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２によって活性化され、Ｔ細胞死および局所免疫抑制を開始し（Dong H, Zhu G, Tamada K, Chen L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med 1999;5:1365-69；Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med 2000;192:1027-34；Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med 2002; 8:793-800. Erratum, Nat Med 2002;8:1039；Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol 2012;24:207-12）、腫瘍の発生および増殖のために免疫寛容な環境を提供する可能性がある。逆に、この相互作用の阻害により、非臨床動物モデルにおいて局所的なＴ細胞応答を増強し、抗腫瘍活性を媒介することができる（Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Nat Med 2002; 8:793-800. Erratum, Nat Med 2002;8:1039；Iwai Y, Ishida M, Tanaka Y, et al. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:12293-97）。臨床現場において、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する抗体による処置は、進行性または転移性固形腫瘍を患う患者において客観的奏効率７％から３８％をもたらし、忍容可能な安全性プロファイルを示すことが報告されている（Hamid O, Robert C, Daud A, et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab (Anti-PD-1) in melanoma. N Engl J Med 2013;369:134-44；Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med 2012;366(26):2455-65；Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012;366(26):2443-54；Herbst RS, Soria J-C, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 2014;515:563-67）。明らかに、応答は、患者の大半において１年またはそれ以上の期間にわたり継続して現れた。
【０００３】
アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても公知）は、イムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。アベルマブはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を競合的に遮断する。
【０００４】
Ｔ細胞を標的とする抗ＰＤ−１抗体と比較して、アベルマブは腫瘍細胞を標的とするため副作用が少ないことが期待され、ＰＤ−Ｌ１の遮断はＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１経路はそのままであり末梢の自己寛容を促進するため、低リスクの自己免疫関連の安全性の問題を含む（Latchman Y, Wood CR, Chernova T, et al. PD-L1 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol 2001;2(3):261-68）。
【０００５】
アベルマブは現在、非小細胞性肺がん、尿路上皮癌、中皮腫、メルケル細胞癌、胃または胃食道接合部がん、卵巣がん、および乳がんを含む多くの癌種で臨床試験中である。
【０００６】
アベルマブのアミノ酸配列および配列変異体およびそれらの抗原結合断片は国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示され、ここではアベルマブのアミノ酸配列を有する抗体はＡ０９−２４６−２と呼ばれる。また、製造方法および特定の医薬品用途も開示されている。
アベルマブのさらなる医薬品用途は、国際公開第２０１６１３７９８５号パンフレット、国際公開第２０１６１８１３４８号パンフレット、国際公開第２０１６２０５２７７号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３９３９、米国特許出願公開第６２／４２３，３５８号明細書に記載される。国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットも、２．４節にアベルマブのアミノ酸配列を有する抗体のヒト水性製剤を記載する。この製剤は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体、抗酸化剤としてのメチオニンを含み、ｐＨが５．５である。抗酸化剤を含まないアベルマブ製剤はＰＣＴ／ＥＰ２０１６／００２０４０に記載される。
ＩｇＧ１型のアグリコシル抗ＰＤ−Ｌ１抗体の製剤試験は、国際公開第２０１５０４８５２０号パンフレットに記載され、ここではｐＨが５．８の製剤が臨床試験のために選択された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
アベルマブは通常、静脈内注入によって患者に送達され、したがって水性剤形で提供されるため、本発明は、翻訳後修飾を伴うアベルマブの安定化に好適であり、国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示されるように高濃度であるさらなる水性製剤に関する。
【０００８】
図１ａ（配列番号１）は、宿主生物として使用したＣＨＯ細胞によって発現された場合の、アベルマブの全長重鎖配列を示す。
しかしながら、抗体産生過程において、重鎖のＣ末端リジン（Ｋ）の切断が頻繁に観察される。Ｆｃ部分に局在して、この修飾は抗体−抗原結合に影響を及ぼさない。したがって、いくつかの実施形態では、アベルマブの重鎖配列のＣ末端リジン（Ｋ）は存在しない。Ｃ末端リジンがないアベルマブの重鎖配列を図１ｂ（配列番号２）に示す。
図２（配列番号３）は、アベルマブの全長軽鎖配列を示す。
【０００９】
関連性の高い翻訳後修飾はグリコシル化である。
真核細胞生物の小胞体内で産生されるほとんどの可溶性タンパク質および膜結合タンパク質はグリコシル化を受け、グリコシルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、タンパク質の特定のグリコシル化部位に１つまたはそれ以上の糖単位を結合する。最も頻繁には、結合点はＮＨ２基またはＯＨ基であり、Ｎ−結合グリコシル化またはＯ−結合グリコシル化をもたらす。
これは、真核生物宿主細胞において組換えにより産生される抗体などのタンパク質にもあてはまる。組換えＩｇＧ抗体は、ＣＨ２ドメインにおけるＦｃ領域の特定のアスパラギン残基において保存されたＮ−結合グリコシル化部位を含有する。その可溶性および安定性、プロテアーゼ耐性、Ｆｃ受容体への結合、細胞輸送、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期に影響を及ぼすなど、抗体におけるＮ−結合グリコシル化の多くの公知の身体機能がある（Hamm M. et al., Pharmaceuticals 2013, 6, 393-406）。ＩｇＧ抗体Ｎ−グリカン構造は、ｂ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、ならびに頻繁にはガラクトース（Ｇａｌ）およびフコース（Ｆｕｃ）単位を含む、主に二分岐複合体型構造である。
【００１０】
アベルマブにおける単一のグリコシル化部位はＡｓｎ３００であり、両重鎖のＣＨ２ドメインに位置する。グリコシル化の詳細は実施例１に記載する。
【００１１】
グリコシル化が抗体の可溶性および安定性に影響を及ぼすため、抗体の、安定で薬学的に好適な製剤を開発する場合、このパラメーターを考慮に入れることは賢明である。
【００１２】
驚くべきことに、本特許出願の発明者らによって、５．２未満のｐＨ値で、抗酸化剤を含まない多くの水性製剤において、そのアミノ酸配列およびその翻訳後修飾によって完全に特性評価されたアベルマブを安定化することが可能なことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１ａはアベルマブの重鎖配列（配列番号１）を示す図であり、図１ｂはＣ末端Ｋを欠損している、アベルマブの重鎖配列（配列番号２）を示す図である。
【図２】アベルマブの軽鎖配列（配列番号３）を示す図である。
【図３】アベルマブの二次構造を示す図である。
【図４】アベルマブグリカンの２ＡＢ  ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図５】図４のピークの番号付けを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用した以下の用語は下記に記載した以下の意味を有する。
【００１５】
本明細書で参照する「アベルマブ」は、国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットにそのアミノ酸配列を定義され、本特許出願にそのアミノ酸配列およびその翻訳後修飾を定義されたＩｇＧ１型の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。本明細書で参照する「アベルマブ」は、例えば国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、好適には少なくとも９５％、好適には少なくとも９６％、好適には少なくとも９７％、好適には少なくとも９８％、または最も好適には少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有するバイオシミラーを含み得る。代わりにまたはさらに、本明細書で参照する「アベルマブ」は、本明細書で開示したものと翻訳後修飾、特にグリコシル化パターンが異なるバイオシミラーを含み得る。
【００１６】
用語「バイオシミラー」（後発生物製剤としても公知）は当技術分野で周知であり、原薬がアベルマブのバイオシミラーであると考えられる場合に、当業者は容易に認識するであろう。用語「バイオシミラー」は、通常、事前に販売承認を公式に認可された「革新的バイオ医薬品」（原薬が生物によって産生される、または生物由来である、または組換えＤＮＡもしくは制御された遺伝子発現方法による「生物製剤」）の後続版（通常異なる供給源由来）を記載するために使用される。生物製剤は分子の複雑性が高く、通常製造工程の変化に感受性であるため（例えば、異なる細胞系をそれらの生産に使用した場合）、ならびに後続の後発製造が通常発案者の分子クローン、細胞バンク、発酵および精製工程に関するノウハウ、または有効な原薬自体（革新者の市販の製剤のみ）にアクセスを有しないため、いずれの「バイオシミラー」も革新的な製剤と全く同じではないようである。
本明細書において、用語「緩衝液」または「緩衝溶液」は、通常、酸（通常弱酸、例えば酢酸、クエン酸、ヒスチジンのイミダゾリウム形態）およびその共役塩基（例えば、酢酸塩またはクエン酸塩、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、またはヒスチジン）の混合物、または代わりに塩基（通常弱塩基、例えばヒスチジン）およびその共役酸（例えばプロトン化ヒスチジン塩）の混合物を含む水性溶液を指す。「緩衝溶液」のｐＨは、「緩衝剤」によって付与された「緩衝効果」により少量の強酸または強塩基の添加時に非常にわずかに変化する。
【００１７】
本明細書において、「緩衝系」は１つもしくはそれ以上の緩衝剤および／またはその共役酸／塩基を含み、より好適には１つまたはそれ以上の緩衝剤およびその共役酸／塩基を含み、最も好適には１つのみの緩衝剤およびその共役酸／塩基を含む。特に明記しない限り、「緩衝系」に関して本明細書で規定した任意の濃度（すなわち、緩衝液濃度）は、好適には緩衝剤および／またはその共役酸／塩基を合わせた濃度を指す。言い換えると、「緩衝系」に関して本明細書で規定した濃度は、好適には全ての関連緩衝種（すなわち、例えばクエン酸塩／クエン酸など互いに動的平衡状態にある種）を合わせた濃度を指す。したがって、ヒスチジン緩衝系の所与の濃度は、通常ヒスチジンおよびヒスチジンのイミダゾリウム形態を合わせた濃度を指す。しかしながら、ヒスチジンの場合、そのような濃度は通常、ヒスチジンまたはその塩の入力量を参照することにより算出しやすい。関連緩衝系を含む組成物の全体のｐＨは、通常、各関連緩衝種の平衡濃度（すなわち、緩衝剤とその共役酸／塩基とのバランス）を反映する。
【００１８】
本明細書において、用語「緩衝剤」は、緩衝液または緩衝溶液の酸または塩基成分（通常弱酸または弱塩基）を指す。緩衝剤は、所与の溶液のｐＨをあらかじめ決定した値にまたはあらかじめ決定した値付近に維持するのに役立ち、緩衝剤は通常、あらかじめ決定した値を補足するために選択される。緩衝剤は好適には、特に適切な量（あらかじめ決定した所望のｐＨによる）のその相当する「共役酸／塩基」と混合される（好適にはプロトン交換できる）場合、または必要量のその相当する「共役酸／塩基」がｉｎ  ｓｉｔｕで形成される場合−これは必要なｐＨに達するまで強酸または強塩基を添加することにより達成され得る−、所望の緩衝効果を生じる単一の化合物である。例えば、酢酸ナトリウム緩衝系では、酢酸ナトリウム（塩基性）の溶液から始め、次いで例えば塩酸によって酸性化され、または酢酸（酸性）の溶液に水酸化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを所望のｐＨに達するまで添加することができる。
【００１９】
通常、「安定剤」は、特に冷凍および／または凍結乾燥および／または保管中（特にストレスに曝露された時）に、バイオ医薬品の構造的完全性の維持を容易にする成分を指す。この安定化効果は様々な理由から生じるが、典型的にはそのような安定剤は、タンパク質変性を軽減するオスモライトとして作用し得る。本明細書で使用する場合、安定剤は、糖アルコール（例えば、イノシトール、ソルビトール）、二糖類（例えば、スクロース、マルトース）、単糖類（例えばデキストロース（Ｄ−グルコース））、またはアミノ酸リジンの形態（例えば、リジン一塩酸塩、酢酸塩または一水和物）、または塩（例えば、塩酸ナトリウム）であってよい。
【００２０】
本発明による緩衝剤、抗酸化剤、または界面活性剤として使用される薬剤は、とりわけそれらが安定化作用を示し得る場合でも、本明細書で使用する用語「安定剤」の意味から除外される。
【００２１】
本明細書において、用語「界面活性剤」は、表面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を指す。本明細書で使用する界面活性剤の例としては、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレート、商標名Ｔｗｅｅｎ８０としても公知）；ポリオキシルヒマシ油、例えば、ヒマシ油をモル比１：３５で酸化エチレンと反応させることによって作成され、商標名Ｋｉｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰとしても公知のポリオキシル３５ヒマシ油；または低分子量ポビドン（ポリビニルピロリドン）であり、ＣＡＳ番号９００３−３９−８で公知であり、わずかに異なる分子量を有するＫｉｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦもしくは１７ＰＦ（１２ＰＦ：２０００〜３０００ｇ／ｍｏｌ、１７ＰＦ：７０００〜１１０００ｇ／ｍｏｌ）を含む。
【００２２】
本発明により緩衝剤、抗酸化剤、または安定剤として使用される薬剤は、とりわけそれらが界面活性作用を示し得る場合でも、本明細書で使用する用語「界面活性剤」の意味から除外される。
【００２３】
本明細書において、用語「安定な」は通常、保存／保管中の成分、典型的には有効成分またはそれらの組成物の物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的安定性を指す。
【００２４】
本明細書において、用語「抗酸化剤」はバイオ医薬品の酸化を防ぎまたは減少し、製剤中で安定化され得る薬剤を指す。抗酸化剤は、ラジカルスカベンジャー（例えば、アスコルビン酸、ＢＨＴ、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、または没食子酸プロピル）、キレート剤（例えばＥＤＴＡまたはクエン酸）、または連鎖停止剤（例えばメチオニンまたはＮ−アセチルシステイン）を含む。
本発明により緩衝剤、安定剤、または界面活性剤として使用される薬剤は、とりわけそれらが抗酸化作用を示し得る場合でも、本明細書で使用した用語「抗酸化剤」の意味から除外される。
【００２５】
「希釈剤」は、例えば重量百分率が合計１００％になるように任意の液体医薬組成物の成分のバランスを構成する薬剤である。本明細書において、液体医薬組成物は、本明細書で使用する「希釈剤」が水、好ましくは注射用の水（ＷＦＩ）であるため、水性医薬組成物である。
【００２６】
本明細書において、用語「粒子径」または「孔径」はそれぞれ、所与の粒子または孔の最長寸法の長さを指す。両径はレーザー粒子径分析器および／または電子顕微鏡（例えば、トンネル電子顕微鏡、ＴＥＭまたは走査電子顕微鏡、ＳＥＭ）を使用して測定し得る。粒子数（任意の所与の径に関して）は、サブビジブル粒子の粒子数に関する実施例に概説した手順および装置を使用して得ることができる。
【００２７】
本明細書において、用語「約」は、本技術分野において当業者に公知のそれぞれの値の通常のエラー範囲を指す。本明細書において「約」を付した値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。分からない場合、または特定の値もしくはパラメーターのエラー範囲に関して当技術分野において認識される共通の理解がない場合、「約」はこの値またはパラメーターの±５％を意味する。
【００２８】
本明細書において、グリカン種に関連する用語「パーセントを占める」は、異なる種の数を直接指す。例えば、用語「前記ＦＡ２Ｇ１は、全グリカン種の２５％〜４１％を占める」は、１００個の重鎖を有する分析した５０個の抗体分子において、２５〜４１個の重鎖がＦＡ２Ｇ１グリコシル化パターンを示すことを意味する。
【００２９】
「処置する」または「処置」への言及は、病状の確立された症状の予防および軽減を含むと考えられる。したがって、状態、障害、または病状を「処置する」またはそれらの「処置」は以下を含む：（１）状態、障害、または病状に苦しんでいるまたは罹患しやすいが、状態、障害、または病状の臨床症状または無症候性症状はいまだ経験していないまたは表していないヒトで発症する状態、障害、または病状の臨床症状の出現を予防するまたは遅らせること、（２）状態、障害、または病状を阻害する、すなわち疾患の発生またはその再発（維持処置の場合）または少なくとも１つの臨床症状もしくはその無症候性症状を抑止する、軽減する、または遅らせること、あるいは（３）疾患を緩和するまたは減弱する、すなわち状態、障害、もしくは病状、または少なくとも１つのその臨床症状もしくは無症候性症状の退縮を引き起こすこと。
【００３０】
水性抗ＰＤ−Ｌ１抗体製剤
第１の態様では、本発明は、
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから３５ｍＭの濃度のグリシン、コハク酸、クエン酸リン酸またはヒスチジン；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、リジン一水和物、リジン酢酸塩、デキストロース、スクロース、ソルビトールまたはイノシトール；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のポビドン、ポリオキシルヒマシ油またはポリソルベート；
を含み、メチオニンを含まず、さらにｐＨが３．８から５．２である、新規の水性医薬抗体製剤を提供する。
【００３１】
好ましい実施形態では、製剤は抗酸化剤を含まない。
【００３２】
一実施形態では、前記製剤中のアベルマブの濃度は約１０ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬである。
さらに別の実施形態では、前記製剤中のグリシン、コハク酸、クエン酸リン酸またはヒスチジンの濃度は、約１０ｍＭから約２０ｍＭである。
さらなる実施形態では、前記製剤中のリジン一塩酸塩の濃度は約１４０ｍＭから約２８０ｍＭである、または前記リジン一水和物の濃度は約２８０ｍＭである、または前記リジン酢酸塩の濃度は約１４０ｍＭである。
さらに別の実施形態では、前記製剤中のデキストロース、スクロース、ソルビトールまたはイノシトールの濃度は約２８０ｍＭである。
さらに別の実施形態では、前記製剤中のポビドン、ポリオキシルヒマシ油またはポリソルベート、イノシトールの濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬである。
好ましい実施形態では、前記製剤中の前記ポビドンは、ＣＡＳ番号９００３−３９−８の低分子量ポリビニルピロリドンＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたは１７ＰＦである。
別の好ましい実施形態では、前記ポリオキシルヒマシ油はポリオキシル３５ヒマシ油である。
さらに別の好ましい実施形態では、前記ポリソルベートはポリソルベート８０である。
【００３３】
より好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度のグリシンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロースまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ、ポリオキシル３５ヒマシ油またはポリソルベート８０を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが約３．８から４．６であり、抗酸化剤を含まない。
【００３４】
等しく好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度のコハク酸を含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロースまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたはポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．９から５．２であり、抗酸化剤を含まない。
【００３５】
等しく好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として１０ｍＭから２０ｍＭの濃度のクエン酸リン酸を含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として１００ｍＭから３２０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩、デキストロース、スクロースまたはソルビトールを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦまたはポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが３．８から４．７であり、抗酸化剤を含まない。
【００３６】
等しく好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のグリシンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩を含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．２から４．６であり、抗酸化剤を含まない。
【００３７】
より好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のグリシンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約１４０ｍＭの濃度のリジン酢酸塩を含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．２から４．６であり、抗酸化剤を含まない。
【００３８】
等しく好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のヒスチジンを含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約２８０ｍＭの濃度のスクロースを含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦを含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．８から５．２であり、抗酸化剤を含まない。
【００３９】
等しく好ましい実施形態では、新規の水性医薬抗体製剤は：
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブを含み；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度のコハク酸を含み、他のいずれの緩衝剤も含まず；
（ｉｉｉ）安定剤として約１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩を含み、他のいずれの安定剤も含まず；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油を含み、他のいずれの界面活性剤も含まず；
ｐＨが４．８から５．２であり、抗酸化剤を含まない。
【００４０】
上記の実施形態のより好ましい実施形態では、アベルマブの濃度は約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００４１】
さらにより好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のグリシン；
（ｉｉｉ）１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが４．４（±０．１）である、
または
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のグリシン；
（ｉｉｉ）１４０ｍＭの濃度のリジン酢酸塩；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが４．４（±０．１）である、
または
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のヒスチジン；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のスクロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．０（±０．１）である、
または
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度のコハク酸；
（ｉｉｉ）１４０ｍＭの濃度のリジン一塩酸塩；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリオキシル３５ヒマシ油；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌまたはＮａＯＨ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．０（±０．１）である。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、製剤は２７０ｍＯｓｍ／ｋｇと３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のオスモル濃度を有する。
【００４３】
一実施形態では、上記の製剤中の前記アベルマブは、図１ａ（配列番号１）または図１ｂ（配列番号２）のいずれかの重鎖配列、図２（配列番号３）の軽鎖配列を有し、Ａｓｎ３００にグリコシル化を有し、主なグリカン種（main glycan species）としてＦＡ２およびＦＡ２Ｇ１を含み、合わせて全グリカン種の＞７０％を占める。
【００４４】
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２は全グリカン種の４４％〜５４％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１は全グリカン種の２５％〜４１％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２は全グリカン種の４７％〜５２％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１は全グリカン種の２９％〜３７％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２は全グリカン種の約４９％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１は全グリカン種の約３０％〜約３５％を占める。
【００４５】
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化は、少ないグリカン種（minor glycan species）として全グリカン種の＜５％を占めるＡ２、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ１、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ２、全グリカン種の＜７％を占めるＦＡ２Ｇ２をさらに含む。
【００４６】
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２は全グリカン種の３％〜５％を占め、前記Ａ２Ｇ１は全グリカン種の＜４％を占め、前記Ａ２Ｇ２は全グリカン種の＜３％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２は全グリカン種の＜５％〜６％を占める。
【００４７】
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２は全グリカン種の約３．５％〜約４．５％を占め、前記Ａ２Ｇ１は全グリカン種の約０．５％〜約３．５％を占め、前記Ａ２Ｇ２は全グリカン種の＜２．５％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２は全グリカン種の約５．５％を占める。
【００４８】
一実施形態では、上記の製剤中の前記アベルマブは、図１ｂ（配列番号２）の重鎖配列を有する。
【００４９】
一実施形態では、上記のアベルマブ製剤は静脈内（ＩＶ）投与用である。
【００５０】
薬物送達デバイス
第２の態様では、本発明は、本明細書に定義した液体医薬組成物を含む薬物送達デバイスを提供する。好適には、薬物送達デバイスは、医薬組成物が内部に存在するチャンバーを含む。好適には薬物送達デバイスは無菌である。
薬物送達デバイスは、バイアル、アンプル、シリンジ、注射ペン（例えば、基本的にはシリンジを含む）、またはｉ．ｖ．（静脈内）バッグであり得る。
水性医薬製剤は、非経口的に投与され、好ましくは皮下注射、筋肉内注射、ｉ．ｖ．注射、またはｉ．ｖ．注入による。投与の最も好ましい方法はｉ．ｖ．注入である。
好ましい実施形態では、薬物送達デバイスは上記の製剤を含有するバイアルである。
より好ましい実施形態では、前記バイアルは、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液１０ｍＬ中にアベルマブ２００ｍｇを含有する。
さらにより好ましい実施形態では、バイアルはガラスバイアルである。
【００５１】
医学的処置
第３の態様では、本発明は、上記の製剤を患者に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。
一実施形態では、処置するがんは、非小細胞性肺がん、尿路上皮癌、膀胱がん、中皮腫、メルケル細胞癌、胃もしくは胃食道接合部がん、卵巣がん、乳がん、胸腺腫、胃腺癌、副腎皮質癌、頭頚部扁平上皮癌、腎細胞癌、メラノーマ、および／または古典的ホジキンリンパ腫から選択される。
【００５２】
製造方法
本発明は、本明細書に定義した水性医薬製剤を製造する方法も提供する。本方法は、好適には、適切だと思われる任意の特定の順番で、水性医薬製剤を形成するために必要な任意の関連する成分を一緒に混合するステップを含む。当業者は、水性医薬製剤（特に、シリンジによる注射またはｉ．ｖ．注入のためのもの）を形成するための当技術分野で周知の実施例または技術を参照することができる。
【００５３】
本方法は、まずアベルマブを除くいくつかのまたは全ての成分（任意選択により、いくつかのまたは全ての希釈物を含む）の予混合物（または予溶液）を調製するステップを含み、次いでアベルマブはそれ自体（任意選択により、いくつかの希釈物を含むまたはいくつかの希釈物にあらかじめ溶解する）、予混合物（または予溶液）と混合されて水性医薬製剤を得る、または次いで最終成分が添加される組成物を得て最終水性医薬製剤を供給する。好ましくは、本方法は、緩衝系、好適には本明細書に定義した緩衝剤を含む緩衝系を形成するステップを含む。緩衝系は、好適には、アベルマブの添加前の予混合物において形成される。緩衝系は、緩衝剤（既製で供給される）とその共役酸／塩基（好適には、所望のｐＨを提供するのに適切な相対量−これは当業者によって理論的にまたは実験的に決定され得る）を単に混合することにより形成され得る。酢酸塩緩衝系の場合、これは例えば酢酸ナトリウムとＨＣｌを混合すること、または酢酸とＮａＯＨもしくは酢酸塩を混合することを意味する。最終水性医薬製剤の予混合物のいずれかのｐＨは、必要量の塩基もしくは酸、または緩衝剤もしくは共役酸／塩基を添加することによって賢明に調整され得る。
【００５４】
特定の実施形態では、緩衝剤および／または緩衝系は別々の混合物としてあらかじめ形成され、緩衝系は、緩衝液交換（例えば、関連濃度またはオスモル濃度に達するまで透析濾過を使用する）によって水性医薬製剤（緩衝剤および／または緩衝系を除くいくつかのまたは全ての成分を含み、好適にはアベルマブを含み、アベルマブのみの可能性もある）の前駆体へと移される。その後必要であれば、最終液体医薬組成物を産生するためにさらなる賦形剤が添加され得る。ｐＨは全ての成分が存在すると、または全ての成分が存在する前に調整され得る。
【００５５】
いずれかの、いくつかの、または全ての成分は、あらかじめ溶解される、または他の成分と混合する前に希釈剤とあらかじめ混合される。
最終水性医薬製剤は濾過され、好適には粒子状物質を除去され得る。好適には、濾過は１μｍのまたは１μｍ未満のサイズのフィルター、好適には０．２２μｍのフィルターを通す。好適には、濾過はＰＥＳフィルターまたはＰＶＤＦフィルターのいずれかを通し、好適には０．２２μｍのＰＥＳフィルターによる。
【００５６】
当業者は、抗体原薬が静脈内に投与され得るようにどのように水性医薬製剤がＩＶ溶液を調製するために使用され得るかを周知している。
ＩＶ溶液の調製は、典型的にはプラスチックシリンジ（ＰＰ）および針によって生理食塩水バッグ（例えば、０．９％または０．４５％生理食塩水）から吸引される特定の量の溶液からなり、水性医薬製剤と置き換えられる。置き換えられる溶液の量は患者の体重に依存する。
【００５７】
略語
ＡＮＯＶＡ  分散分析
ＣＤ  円偏光二色性
ＣＥ−ＳＤＳ  キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
ｃＩＥＦ  キャピラリー等電点電気泳動
ＤｏＥ  実験デザイン
ＤＰ  製剤
ＤＳ  原薬
ＦＴ  凍結融解
ＨＭＷ  高分子量
ＬＭＷ  低分子量
ＳＥ−ＨＰＬＣ  サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＯＤ  吸光度
ＰＥＳ  ポリエーテルスルホン
ＰＶＤＦ  フッ化ポリビニリデン
ＲＨ  相対湿度
ＳＥ−ＨＰＬＣ  サイズ排除高速クロマトグラフィー
ＵＶ  紫外線
ＷＦＩ  注射用水
【実施例】
【００５８】
[実施例１]
アベルマブの構造
１．１  一次構造
アベルマブは２つの重鎖分子および２つの軽鎖分子を有するＩｇＧである。２つの鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図１ａ（配列番号１）／１ｂ（配列番号２）および２（配列番号３）に示す。
【００５９】
１．２  二次構造
ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ法は、分子の完全な鎖およびタンパク質への翻訳後修飾の存在を確認するために使用された。アベルマブ分子サブユニットの二次構造は図３に示す。
【００６０】
トリプシン消化によって得られたペプチドのＵＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって確認されたように、ジスルフィド結合Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９６、Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９０、Ｃｙｓ１４７−Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ１３８−Ｃｙｓ１９７、Ｃｙｓ２１５−Ｃｙｓ２２３、Ｃｙｓ２２９−Ｃｙｓ２２９、Ｃｙｓ２３２−Ｃｙｓ２３２、Ｃｙｓ２６４−Ｃｙｓ３２４およびＣｙｓ３７０−Ｃｙｓ４２８は、９つの典型的なＩｇＧ結合パターンを形成する。
【００６１】
１．３  グリコシル化
分子は、重鎖のＡｓｎ３００に１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。ペプチドマッピングによって決定したように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定された主な構造は、０個（Ｇ０Ｆ）、１個（Ｇ１Ｆ）、または２個のガラクトース（Ｇ２Ｆ）残基を有する複雑な二分岐型のコアフコシル化オリゴサッカライドであった。主な種はＧ０ＦおよびＧ１Ｆである。２−アミノベンズアミドによって蛍光標識したアベルマブグリカンを、ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによって分析した。図４は、見出されたグリカン種のＵＰＬＣプロファイルを示す。
【００６２】
【表１−１】
2020509065.tif 000002
【００６３】
【表１−２】
2020509065.tif 000003
【００６４】
使用したグリカンの命名法は、Harvey et al. (Proteomics 2009, 9, 3796-3801)によって提案されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎｏｔａｔｉｏｎに従った。フコースを含有する種において（ＦＡ２、ＦＡ２Ｇ１、ＦＡ２Ｇ２）、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ連結はα１〜６である。末端ＧｌｃＮＡｃを有する種において、ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ連結はβ１〜２である。ガラクトースを含有する種において、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ連結はβ１〜４である。
【００６５】
報告したクロマトグラフプロファイルは統合され、表２ａに示すようにアベルマブのグリカン種分布をもたらした。
【００６６】
【表２】
2020509065.tif 000004
【００６７】
グリカンマッピング分析により、ペプチドマッピングによって行った同定（２つの主なグリカン種の同定が可能）を確認し、さらにグリカン分析に特異的なこの方法によって、二次および少ない種も特性評価された。
【００６８】
別の測定において、以下のグリカン種分布が観察された。
【００６９】
【表３】
2020509065.tif 000005
【００７０】
[実施例２]
ＤｏＥスクリーニング
２０ｍｇ／ｍＬのアベルマブでスクリーニングする実験デザインは、様々な緩衝液型／ｐＨ、安定剤、界面活性剤型、および関連濃度などのいくつかの因子の影響を評価した。８０個の異なる製剤を試験する試験は、タンパク質の安定性を最大にし得る好適な条件の選択をもたらした。
【００７１】
このＤｏＥにおいて、異なる緩衝液型および有効ｐＨ緩衝範囲にわたる４つの異なる緩衝液を調べた：
グリシン（有効ｐＨ４．０から７．５）およびヒスチジン（有効ｐＨ５．０から６．６）などのアミノ酸緩衝液。
クエン酸などのキレートイオン緩衝液（有効ｐＨ４．０から７．５）。
コハク酸（有効ｐＨ５．０から６．０）。
【００７２】
化学構造に基づき、ＤｏＥにおいて７つの安定剤を選択した。ＤｏＥは、糖、ポリオール、塩、およびアミノ酸を含んだ。内訳は以下の通りである：
糖：二糖スクロースおよびマルトース、ならびに単糖デキストロース（Ｄ−グルコース）を選択した。
糖アルコール：２つの糖アルコール／ポリオールを、ＤｏＥのために選択した−ソルビトールおよびイノシトール
塩：塩化ナトリウムを、このＤｏＥにおいて独立型の安定剤として調べた。
アミノ酸：正に荷電したアミノ酸であるリジンを調べた。
【００７３】
表３は、試料およびそれらのそれぞれの組成物を列挙する。
【００７４】
【表４−１】
2020509065.tif 000006
【００７５】
【表４−２】
2020509065.tif 000007
【００７６】
表４は、このＤｏＥスクリーニングのおよび本明細書に提示のフレームワークにおいて実施した分析試験（短期安定性、機械的ストレス、光曝露、Ｆ／Ｔ）を列挙する。
【００７７】
【表５】
2020509065.tif 000008
【００７８】
２．１  安定性の測定に使用する方法
熱安定性
製剤の熱安定性を、以下について４０±２℃（７５％Ｒ．Ｈ．）での保存の４週間後に調べた：
・凝集指標：吸光度によって算出し、ＨＭＶ不純物の凝集および形成を追跡する
・視覚的な粒子の存在の目視検査
・ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷ含量（凝集を追跡する）
・バイオアナライザーによるＬＭＷ含量（断片化を追跡する）
【００７９】
光ストレス
製剤を、ＩＣＨＱ１Ｂガイドラインの要件を満たす、７６５Ｗ／ｍ２の強度の光に７時間曝露した。製剤を以下の技術によって分析した。
・凝集指標：ＯＤによって算出し、光ストレスから生じる凝集形成の程度を測定する。
・目視検査：凝集から生じるビジブル粒子の存在のため
・ＣＥ−ＳＤＳ：ＬＭＷ不純物の産生のため、ＨＭＷ不純物も示す
・ＳＥ−ＨＰＬＣ：凝集から生じるＨＭＷ不純物の定量
・ｃＩＥＦ：荷電変異体の相対量への洞察を提供し、酸化をモニターできる（光ストレスの産物により）
【００８０】
機械的ストレス
機械的（振盪）ストレスは、タンパク質の自己会合および溶液中のタンパク質の疎水性領域間の相互作用による凝集の産生と関連することが多い。本研究におけるＤｏＥ製剤を、室温において２００ｒｐｍでの撹拌の２４時間後の振盪ストレスへの耐性について調べた。振盪ストレス製剤を、以下のように分析した：
・凝集指標：吸光度によって算出し、凝集およびＨＭＶ不純物の形成を追跡する
・視覚的な粒子の存在の目視検査
・ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷ含量（ＨＭＷ不純物生成を追跡し、したがって凝集をモニターする）
・バイオアナライザーによるＬＭＷ含量（断片化を追跡する）
【００８１】
凍結／融解ストレス
タンパク質製剤を凍結する場合、固化を始める溶液内の微小領域として界面が形成される。これらの微小環境では、製剤緩衝液の異なる成分が固化している液体マトリックスから除外されるまたは含まれる場合、極性の変化がある。親水性／疎水性相互作用が、これらの変化する微小環境における分子に作用した場合、タンパク質の沈殿が生じる。ＤｏＥにおいて、様々な安定剤および界面活性剤の有効性を確かめるため、試料を凍結−溶解の３サイクルに曝露した。試料を、次いで以下の分析によって調べ、凍結−融解による沈殿／凝集／分解へのそれらの耐性を測定した：
・凝集指標：吸光度によって算出し、凝集およびＨＭＶ不純物の形成を追跡する
・視覚的な粒子の存在の目視検査
・ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷ含量（ＨＭＷ不純物生成を追跡し、したがって凝集をモニターする）
【００８２】
２．２  製造
組成物の原薬材料：２０．６ｍｇ／ｍＬアベルマブ、５１ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−マンニトール、０．６ｍｇ／ｍＬ氷酢酸、ｐＨ５．２（界面活性剤を含まない）を、３つの緩衝液：
−  １０ｍＭクエン酸−リン酸  ｐＨ５．２、
−  １０ｍＭグリシン  ｐＨ５．２、
−  １０ｍＭヒスチジン  ｐＨ５．２、
−  １０ｍＭコハク酸  ｐＨ５．２、
中でタンジェント流濾過（ＰＥＳ中、１０ｋＤａの排除限界でＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｂｉｏｍａｘを使用）によって平衡化した。
緩衝液交換を、４つの適当な緩衝液の１つで、上記のＤＳの５倍希釈によって行い、最初の容積が得られるまで平衡化／濃縮した。操作は３回繰り返した。４つの平衡化した原薬材料のタンパク質含量を、製剤製造の前にＯＤによって試験した。
【００８３】
製剤１〜２１（クエン酸−リン酸緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２６．４ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（３０．３０グラム）中で計量した。必要であれば、緩衝液の強度をリン酸水素二ナトリウム二水和物およびクエン酸一水和物を添加することによって調整した（交換したＤＳの開始モル濃度：１０ｍＭ；ＤｏＥ製剤におけるモル濃度範囲：１０〜５０ｍＭ）。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで安定剤：ソルビトール（２．０４グラム）またはデキストロース（２．０２ｇ）またはイノシトール（２．０２ｇ）またはマルトース一水和物（４．０４ｇ）またはリジン一塩酸塩（２．０２ｇ）または塩化ナトリウム（０．３２７ｇ）またはスクロース（３．８３ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ４０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストックまたは２０ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（保存溶液の必要なし）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して希釈したｏ−リン酸または水酸化ナトリウムで目標に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（４０ｇ）にした。
【００８４】
製剤２２〜３１（グリシン緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２４．５ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（３２．６５ｇ）中で計量した。必要であれば、緩衝液の強度を、グリシンを添加することによって調整した（交換したＤＳの開始モル濃度：１０ｍＭ；ＤｏＥ製剤におけるモル濃度範囲：１０〜５０ｍＭ）。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで安定剤：ソルビトール（２．０４ｇ）またはデキストロース（２．０２ｇ）またはイノシトール（２．０２ｇ）またはマルトース一水和物（４．０４ｇ）またはリジン一塩酸塩（２．０２ｇ）または塩化ナトリウム（０．３２７ｇ）またはスクロース（３．８３ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ４０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストックまたは２０ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（保存溶液の必要なし）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（４０ｇ）にした。
【００８５】
製剤３２〜４３（グリシン緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２３．２ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（３４．４８ｇ）中で計量した。必要であれば、緩衝液の強度を、グリシンを添加することによって調整した（交換したＤＳの開始モル濃度：１０ｍＭ；ＤｏＥ製剤におけるモル濃度範囲：１０〜５０ｍＭ）。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで安定剤：ソルビトール（２．０４ｇ）またはデキストロース（２．０２ｇ）またはイノシトール（２．０２ｇ）またはマルトース一水和物（４．０４ｇ）またはリジン一塩酸塩（２．０２ｇ）または塩化ナトリウム（０．３２７ｇ）またはスクロース（３．８３ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ４０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストックまたは２０ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（保存溶液の必要なし）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（４０ｇ）にした。
【００８６】
製剤６４〜８０（コハク酸緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２２．５ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（３５．５５グラム）中で計量した。必要であれば、緩衝液の強度を、コハク酸を添加することによって調整した（交換したＤＳの開始モル濃度：１０ｍＭ；ＤｏＥ製剤におけるモル濃度範囲：１０〜５０ｍＭ）。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで安定剤：ソルビトール（２．０４ｇ）またはデキストロース（２．０２ｇ）またはイノシトール（２．０２ｇ）またはマルトース一水和物（４．０４ｇ）またはリジン一塩酸塩（２．０２ｇ）または塩化ナトリウム（０．３２７ｇ）またはスクロース（３．８３ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ４０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストックまたは２０ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（保存溶液の必要なし）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（４０グラム）にした。
【００８７】
製剤４４〜６３（ヒスチジン緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２４．４ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（３２．８０ｇ）中で計量した。必要であれば、緩衝液の強度を、ヒスチジンを添加することによって調整した（交換したＤＳの開始モル濃度：１０ｍＭ；ＤｏＥ製剤におけるモル濃度範囲：１０〜５０ｍＭ）。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで安定剤：ソルビトール（２．０４ｇ）またはデキストロース（２．０２ｇ）またはイノシトール（２．０２ｇ）またはマルトース一水和物（４．０４ｇ）またはリジン一塩酸塩（２．０２ｇ）または塩化ナトリウム（０．３２７ｇ）またはスクロース（３．８３ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ４０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０ストックまたは０．４ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストックまたは２０ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（保存溶液の必要なし）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（４０グラム）にした。
【００８８】
濾過および充填
５０ｍｌシリンジに付けた０．２２ミクロンフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＥＳ膜またはＭｉｌｌｅｘ  ＧＶ  ０．２２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ膜）を通し濾過した各溶液を使用した。次いで、濾過した溶液を関連容器に充填した（２ｍＬ／容器）。
【００８９】
２．３  結果
製造時のＯＤによるタンパク質含量の確認
タンパク質含量を時間０（製造時）でＯＤによって測定した。予測される目標と一致する値（２０ｍｇ／ｍＬ）が見出された。
【００９０】
２．３．１  熱ストレス
ＯＤによる凝集指標
凝集指標をＯＤによって測定した。ＳＥ−ＨＰＬＣによって検出できないサブビジブル粒子／より大きな凝集を検出するためのツールとして凝集指標へのさらなる情報を添付の節に提供する。
ヒスチジン緩衝液は通常、ストレス時の凝集指標のより高い増加（すなわち、粒子のより大きな増加）と関連し、ｐＨが５．０から６．６に増加する場合に最も著しいことが見出された（ｐＨ依存的効果）。
他の緩衝液では、凝集指標の変化は通常低く、したがってサブビジブル粒子のより低い増加を示す。
クエン酸−リン酸およびグリシン緩衝液中で製剤化されたいくつかの（わずかな）試料で観察された凝集指標の増加は、特定の因子（例えば、安定剤または界面活性剤型）に直接は帰せられない。
データを、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌｉｎｅａｒ  ＭｏｄｅｌのＡＮＯＶＡによって統計的に評価し、以下の転帰を提供した：
緩衝液型、強度およびｐＨの統計的に有意な影響（全てｐ値＜０．００１を有する）：凝集指標を最小にするため、クエン酸−リン酸（４．０〜５．０）およびグリシン（４．０〜５．８）およびコハク酸（５．０〜５．５）の低いｐＨ範囲と関連して、低い緩衝液強度を目標（１０ｍＭ）とするべきであるが、ヒスチジンは通常、サブビジブル粒子／より大きな凝集の形成への負の影響を決定する。
【００９１】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集
総凝集（ＨＭＷ）を、時間０および熱ストレス時にＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。クエン酸−リン酸は通常、特にｐＨが増加する場合に、参照製剤（チャート内の赤い水平な棒として強調した参照閾値）よりも高い凝集をもたらす。グリシン緩衝液では、より高いｐＨ値はより高い凝集と関連するが、低ｐＨ範囲が好まれる（５．０より低い）（クエン酸緩衝液を使用した場合と同様）。コハク酸は通常、全ての条件で参照より高い凝集値をもたらすが、低ｐＨ（５．０〜５．５）のヒスチジン緩衝液は、参照に相当する凝集値を提供するようである。
データをまた、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌｉｎｅａｒ  ＭｏｄｅｌのＡＮＯＶＡによって統計的に評価し、緩衝液型が有意な因子（ｐ値＝０．０２）であると確認された。
全体として、熱ストレス時の凝集を減らすため、クエン酸−リン酸（ｐＨ範囲４．０〜５．０）、グリシン（ｐＨ範囲４．０〜６．８）およびヒスチジン（ｐＨ範囲５．０〜５．８）は、コハク酸緩衝液よりも好まれるべきである。
【００９２】
製剤＃２（クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ４．０中Ｔｗｅｅｎ４０＋デキストロース）、製剤＃２２（グリシン緩衝液ｐＨ４．０中Ｋｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ＋塩化ナトリウム）および製剤＃２８（グリシン緩衝液ｐＨ４．５中Ｔｗｅｅｎ４０＋塩化ナトリウム）に存在するもののような組合せは、おそらくはＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦおよびＴｗｅｅｎ４０の低ｐＨ（約４．０〜４．５）との不適合／塩化ナトリウムのような特定の安定剤との相互作用のために、タンパク質安定化に好ましくないようである（最適なｐＨ／緩衝液条件が適用されるにもかかわらず凝集が著しく増加する）。
【００９３】
バイオアナライザーによる断片化
断片化のレベルをバイオアナライザーによって評価した。ＡＮＯＶＡ評価によって統計的に有意な結果は強調され得なかったが、参照組成物と一致するＬＭＷパーセンテージを提供する断片化を最小にするのに最も有効な条件が強調され得た：
−  ｐＨ範囲４．５〜７．０のクエン酸−リン酸緩衝液
−  ｐＨ範囲４．０〜５．８のグリシン緩衝液。
方法の変化性を考慮して（バイオアナライザーが適用される場合、ＬＭＷの±２〜３％までが一般的である）、他の条件（ヒスチジンおよびコハク酸緩衝液中の残りの組成物のような）は、ＬＭＷ％を相対的に低く維持することが観察され、したがってさらに調べる価値がある。
【００９４】
目視検査によるビジブル粒子
ビジブル粒子の存在を、熱ストレス前後に目視検査によって評価した。クエン酸−リン酸緩衝液中の変化する条件は、熱ストレス後のビジブル粒子の存在を生成することができる（最も典型的には微粒子様懸濁液）。
グリシン緩衝液では、粒子形成は、Ｔｗｅｅｎ種（Ｔｗｅｅｎ４０を含有する試料ＩＤ＃２３、２４、２６、２８）およびＴｗｅｅｎ８０を含有する製剤＃３０の存在と最も頻繁に関連する。グリシン緩衝液中の他の製剤（試料ＩＤ＃３２から＃３９）は、ストレス時に減少する傾向がある時間０での粒子の存在を示した（可能な可逆的クラスター）。
ヒスチジンでは、Ｔｗｅｅｎ種は通常、ストレス時のビジブル粒子形成と関連する（ストレス後にビジブル粒子を示す全ての製剤は、２つのＴｗｅｅｎ代替え物の１つを含有する）。
コハク酸緩衝液では、ほとんどの製剤において時間０で観察される粒子は、熱ストレス時に減少することが見出された（経時的な可逆的関連の可能な破壊）。
【００９５】
概要：熱ストレス
熱ストレス時のＳＥ−ＨＰＬＣ、ＯＤおよびバイオアナライザーによれば、好ましい性能を提供できる条件は、以下を含む：
−  緩衝液：クエン酸−リン酸またはグリシン（好ましくはより酸性ｐＨであり、クエン酸リン酸では４．０〜５．０およびグリシンでは４．０〜５．８の範囲で最も関連性がある）。
−  緩衝液強度：好ましくは低い（凝集指標転帰あたりとして）。
−  安定剤：特定の兆候は得られなかった。
−  界面活性剤：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰはサブビジブル粒子を減らすのに有効であることが観察された。
【００９６】
２．３．２  光ストレス
Ｏ．Ｄ．による凝集指標
クエン酸−リン酸緩衝液中のほとんどのＤｏＥ組成物の凝集指標は、参照製剤よりも高いことが見出された（高いｐＨ範囲で最も著しい）。ｐＨ効果もまた、グリシン緩衝液中で確認されたが、クエン酸−リン酸緩衝液に関してかなり低い凝集指標が見出された（ｐＨ範囲４．０〜４．５で、参照組成物に相当する値またはそれ以下の値が強調された）。ヒスチジンおよびコハク酸緩衝液は通常、凝集指標のかなりの増加を引き起こすことができる（ヒスチジンはコハク酸よりも明らかに悪い）。
ＡＮＯＶＡによる統計分析は、緩衝液型、ｐＨおよび強度（ｐ値＜０．０００１）からの有意な影響を確認し、粒子形成を最小にする最良の条件がクエン酸リン酸緩衝液（４．０〜５．０の範囲および低い緩衝液強度）、グリシン（４．０〜５．８の範囲）の利用を含むことを示した。
界面活性剤もまた、安定性にいくらかの影響を及ぼすことが観察され、粒子の減少を狙う場合、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰが、考慮に入れる最良のオプションであった。
【００９７】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集
総凝集（ＨＭＷ）を、時間０および光ストレス時にＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。クエン酸−リン酸は通常、特にｐＨが増加する場合に、参照製剤よりも高い凝集をもたらす。グリシン緩衝液では、より高いｐＨ値はより高い凝集と関連するが、低いｐＨ範囲が好まれる（４．８より低い）（クエン酸緩衝液を使用した場合と同様）。コハク酸は通常、全ての条件で参照より高い凝集値をもたらすが、ヒスチジン緩衝液（少しの例外を別にした全範囲）は、参照に相当する凝集値を提供するようである。
データをまた、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌｉｎｅａｒ  ＭｏｄｅｌのＡＮＯＶＡによって統計的に評価し、緩衝液型およびｐＨが有意な因子（ｐ値＜０．０００１）であると確認された。
全体として、熱ストレス時の凝集を減らすため、グリシン（ｐＨ範囲４．０〜５．０）およびヒスチジン（ｐＨ範囲５．０〜６．０）は、コハク酸およびクエン酸リン酸緩衝液よりも好まれるべきである。
重要なことに、リジン、デキストロース、ソルビトールおよびスクロースのような安定剤は、塩化ナトリウム、マルトースおよびイノシトールよりも光ストレスに対してより良い安定化を提供する（ｐ値＜０．０１）。
【００９８】
ＣＥ−ＳＤＳによる純度
ＣＥ−ＳＤＳによって測定した純度は、計算：１００−ＣＥ−ＳＤＳによる％ＨＭＷ−ＣＥ−ＳＤＳによる％ＬＭＷの結果であるように、ＨＭＷおよびＬＭＷ種両方の情報を有する。
純度値を光ストレスの前後で測定した。
ほとんどの製剤は、光ストレス時に参照組成物よりも高い純度を示す。安定性に負に影響し得る条件は、典型的には、高ｐＨ（＞７．０）のクエン酸リン酸および低ｐＨ（４．０）のグリシン緩衝液であり；後者は、低ｐＨでＴｗｅｅｎ４０／Ｋｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦからの負の影響によって最も説明されるだろう。
ヒスチジンは、光曝露に対する製剤性能を最大にする純度に正に影響することが見出された。
ＡＮＯＶＡによる統計分析は、クエン酸−リン酸、グリシンまたはコハク酸緩衝液を使用する場合に得られた相当する性能により、緩衝液としてのヒスチジンの利用と関連する優れた挙動を確認した。
【００９９】
ｃＩＥＦによるアイソフォームプロファイル
アイソフォームプロファイルを、時間０および光曝露後に測定した。光曝露は通常、光酸化現象による酸性アイソフォームの増加を測定する。そのような増加は、全てのＤｏＥ製剤で算出された。
クエン酸−リン酸およびグリシン緩衝液（最も典型的には低いｐＨ範囲）など、いくつかの条件がタンパク質の安定化（すなわち、アイソフォームプロファイルの低い変化）に好ましい。ヒスチジンが製剤緩衝液として使用される場合、低い性能を観察した。
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌｉｎｅａｒ  ＭｏｄｅｌのＡＮＯＶＡによって評価されたデータは、上記を確認した（ｐ値＜０．０００１の統計的に有意な因子の緩衝液型）。
統計分析はまた、Ｌ−リジンを安定剤として使用する場合、正の影響を確認した（酸性アイソフォーム変化の減少）。製剤＃１１、２９、３１、３８に見出される変化を観察する場合、効果は非常に明確であり、代替えの安定剤による周辺製剤スペースのものよりかなり低い。
【０１００】
目視検査によるビジブル粒子
ビジブル粒子の存在を、光ストレスの前後で目視検査によって評価した。ほとんどの製剤は、ビジブル粒子に関して、光ストレスによって影響されない。どの特定の条件も光ストレス時の粒子形成に関連しなかった。
【０１０１】
概要：光曝露ストレス
光ストレス時のＳＥ−ＨＰＬＣ、ＯＤ、ＣＥ−ＳＤＳ、ｃＩＥＦおよび目視検査によれば、好ましい性能を提供できる条件は、以下を含む：
−  緩衝液：グリシン緩衝液（好ましくは、より酸性ｐＨであり、範囲４．０〜４．５で最も関連性がある）。
−  緩衝液強度：好ましくは低い（凝集指標結果あたりとして）。
−  安定剤：リジン（一塩酸塩）、デキストロースおよびソルビトールはタンパク質安定性に正の影響を示した。
−  界面活性剤：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰはサブビジブル粒子を減らすのに有効であることが観察された。
【０１０２】
２．３．３  凍結−融解
光学密度による凝集指標
３×の凍結−融解サイクル（−８０℃→室温）後、もう一度、グリシン緩衝液（低ｐＨ）は、低い粒子形成を示す最も低い値を提供することが確認される。凝集指標の増加は、ｐＨが増加する場合にクエン酸−リン酸緩衝液およびグリシン緩衝液の両方で観察される（ｐＨは、クエン酸−リン酸緩衝液でより決定的に作用する）。通常、参照組成物よりも高い凝集指標値はヒスチジンおよびコハク酸緩衝液で観察される。
ＡＮＯＶＡによる統計分析は、緩衝液型、ｐＨおよび界面活性剤型からの中程度に有意な影響を強調し（０．０１＜ｐ値＜０．０５）、６．０より低いｐＨのクエン酸−リン酸およびグリシン緩衝液は、凍結−融解によって誘導される粒子形成に対するタンパク質安定化に最良のオプションであり、コハク酸およびヒスチジン緩衝液は、参照組成物に関してわずかに下回ることを示す。
異なる界面活性剤の影響の比較は、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰ（わずかに好ましい）からの相当する性能を示すが、Ｔｗｅｅｎ４０は凝集指標を増加すると予測される。
【０１０３】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集
全ての製剤は、凍結−融解ストレス時に参照組成物よりも低い総凝集を示す（値は時間０に相当する）。
クエン酸−リン酸緩衝液では、凝集は、凍結−融解時に少ない／無視できる変化を伴う範囲７．０〜７．５まで増加するｐＨ（２．０〜２．５％  ＨＭＷ）の主な作用として、参照組成物のレベルまで増加する傾向にあるが、ｐＨ＜７．０での総凝集は、典型的には１．５％より低い量である（ストレス前後）。
グリシンおよびヒスチジン緩衝液では、ストレス後の全ての総凝集値は１％より少ない量である（時間０値に相当）。コハク酸では、凍結−融解は時間０に関して重大な変化を測定することを見出されなかったが、総凝集は通常、グリシンおよびヒスチジンよりもわずかに高い（１．５％以下、すなわちストレス後の参照よりかなり低い）。
統計分析は、緩衝液型およびｐＨからの有意な影響を確認し（ｐ値＜０．０００１）、凍結−融解に対するタンパク質安定化の最良のオプションは、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、グリシン緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０）およびヒスチジン（５．０〜６．６）である。
有意な影響（ｐ値＜０．０１）はまた、安定剤型因子についても強調された：リジン塩酸塩は時間０の凝集および凍結−融解ストレスに関する影響を最小にする（クエン酸緩衝液中の試料ＩＤ＃６−９−１１−１７参照）；スクロースおよびデキストロースは、同様に安定化特性を示す。
【０１０４】
目視検査によるビジブル粒子
凍結−融解時の目視検査の結果において、強調され得る大まかな傾向は、以下である：
−  クエン酸−リン酸では、粒子形成は、高いｐＨでより起こるようである。
−  低いｐＨ（＜５）のグリシン緩衝液では、粒子形成は主にＴｗｅｅｎ４０（不安定化界面活性剤）の存在と関連する。
−  ヒスチジン緩衝液では、Ｔｗｅｅｎ種は通常粒子形成と関連する。
−  コハク酸では、どの特定の因子も粒子形成に関連しないようであるが、これは、この緩衝液が使用される場合、非常に頻繁に起こる。
【０１０５】
概要：凍結−融解ストレス
３×の凍結−融解サイクル（−８０℃→室温）時の、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＯＤおよび目視検査によれば、好ましい改善した性能を提供できる条件は、以下を含む：
−  緩衝液：グリシンまたはクエン酸−リン酸緩衝液（好ましくは、より酸性ｐＨであり、範囲４．０〜６．０で最も関連性がある）。
−  安定剤：リジン（一塩酸塩）、デキストロースおよびスクロースは、タンパク質安定性に正の影響を示した（ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集の減少）。
−  界面活性剤：Ｔｗｅｅｎ種のグリシンおよびヒスチジン緩衝製剤との配合禁忌を考慮して避け、ビジブル粒子形成を最小にした。
【０１０６】
２．３．４  機械的ストレス
吸光度による凝集指標
先に示したように、参照と最も類似した凝集指標値を可能にする因子（すなわち時間０に関して最小または増加なし）は、以下である：
クエン酸−リン酸は通常、特にｐＨが増加する場合およびＴｗｅｅｎ種：試料ＩＤ＃２（Ｔｗｅｅｎ４０）、＃８（Ｔｗｅｅｎ８０）、＃１１（Ｔｗｅｅｎ４０）、＃１９（Ｔｗｅｅｎ４０）、＃２１（Ｔｗｅｅｎ４０）の存在下で、参照よりも高い凝集指標値をもたらす。
グリシンは、低ｐＨ範囲で著しい安定化効果を提供する（凝集指標値は参照よりもわずかに低い）。
ヒスチジン緩衝液は、好ましくは５．０に近いｐＨ値で、およびＴｗｅｅｎ４０およびＴｗｅｅｎ８０なしで使用され、これは最も高い凝集指標値：試料ＩＤ＃５０（Ｔｗｅｅｎ４０）、＃６０（Ｔｗｅｅｎ８０）、＃６２（Ｔｗｅｅｎ４０）と関連するようである。
コハク酸は通常、含まれる特定の因子にかかわらず、参照組成物よりもわずかに高い凝集指標値をもたらす。
上記の結果は、ＡＮＯＶＡによって確認され、緩衝液型およびｐＨを統計的に有意な因子（ｐ値＜０．０１）および界面活性剤を中程度に有意な因子（０．０１＜ｐ値＜０．０５）を示した。
低ｐＨ（４．０〜５．５）のグリシン緩衝液は、凝集指標を最小にするための選択緩衝液として強調される。Ｔｗｅｅｎ種（Ｔｗｅｅｎ４０はＴｗｅｅｎ８０より悪い）によって与えられる凝集指標の増加に対する傾向は表面応答モデルによって確認される。
【０１０７】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集
時間０での最小の増加は、この型のストレスからの小さな影響を示すほとんどの製剤で観察された。総凝集に関する区別は、ＡＮＯＶＡによって統計的に有意な因子であることが確認された（ｐ値＜０．０００１）、すでに強調した緩衝液型およびｐＨ；ならびに緩衝液強度（ｐ値＜０．０１）および安定剤型（０．０１＜ｐ値＜０．０５）のように、緩衝液型およびｐＨの主要な効果であるようである。
参照組成物のレベル（＜１％）まで凝集を最小にする好ましい範囲および条件は：クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ＜５および低イオン強度）；グリシン緩衝液（全ｐＨおよびイオン強度範囲）；ヒスチジン緩衝液（全範囲）およびコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５および低イオン強度）を含む。好ましい安定剤は、Ｌ−リジン一塩酸塩、マルトース、スクロースおよびデキストロースである。
【０１０８】
バイオアナライザーによる断片
試料ＩＤ＃２２−２３−２４（グリシン緩衝液中、ｐＨ４．０、Ｔｗｅｅｎ４０またはＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦを含有する）を除いて、残りの製剤は、この方法の変化性も考慮に入れて、機械的ストレス時に参照組成物に相当するまたはより低いＬＭＷ％を示した（ＬＭＷ％結果の±２〜３％は特徴的である）。したがって、試験したほとんどの条件が、グリシン緩衝液（低ｐＨ）＋Ｔｗｅｅｎ４０のような組合せが避けられる限り、断片化に対するタンパク質の耐性の改善を助けることができると結論付けることができる。
統計的な詳細は、コハク酸およびヒスチジン緩衝液における製剤のより良い性能を強調したが、上記の方法の変化性により、注意深く検討され、クエン酸−リン酸およびグリシン緩衝液における他の製剤に実質的に相当する／よりわずかに良いと評価された。
【０１０９】
目視検査によるビジブル粒子
凍結−融解時の目視検査の結果では、強調され得る通常の傾向は、以下である：
−  クエン酸−リン酸緩衝液（試料ＩＤ＃１〜２１）では、粒子形成は、含まれる特定の因子にかかわらずほぼ全ての条件で起こる。
−  グリシン緩衝液では、粒子形成は主にＴｗｅｅｎ４０（試料ＩＤ＃２３、２６、２８）およびＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（製剤＃２２、３２、３７、４３）の存在と関連する。
−  ヒスチジン緩衝液では、機械的な振盪時にビジブル粒子の増加を示す全ての製剤は、Ｔｗｅｅｎ４０またはＴｗｅｅｎ８０のいずれかを含有する。
−  コハク酸では、どの特定の因子も粒子形成に関連しないようである。
【０１１０】
概要：機械的ストレス
機械的振盪時のＳＥ−ＨＰＬＣ、ＯＤ、バイオアナライザーおよび目視検査によれば、参照組成物に関して好ましい性能を提供できる条件は、以下を含む：
−  緩衝液：グリシン（好ましくは、より酸性ｐＨであり、範囲４．０〜５．５で最も関連性がある）、ｐＨ約５．０のヒスチジンおよびコハク酸。
−  安定剤：リジン（一塩酸塩）、スクロース、マルトースおよびデキストロースは、タンパク質安定性に正の影響を示した（ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集の減少）。
−  界面活性剤：Ｔｗｅｅｎ種のグリシン、クエン酸−リン酸およびヒスチジン緩衝製剤との配合禁忌を考慮して避け、ビジブル粒子形成を最小にした。
【０１１１】
[実施例３]
製剤最適化
３．１  製剤最適化
実施例２に示したデータを組み合わせ、熱、凍結−融解、機械的および光ストレスに対してアベルマブ（評価した因子：緩衝液型、ｐＨおよび強度、安定剤型および界面活性剤）を好適に安定化することができる製剤スペースを同定した。
【０１１２】
各緩衝液型に関して以下の基準
・熱ストレス、機械振盪、凍結−融解および光ストレス後の（ＳＥ−ＨＰＬＣによる）最小化ＨＭＷ、
・熱ストレスおよび機械振盪後の（バイオアナライザーによる）最小化ＬＭＷ、
・光ストレス後の（ＣＥ−ＳＤＳによる）最大化純度、
・光ストレス後の（ｃＩＥＦによる）最小化酸性アイソフォーム変化、
・熱ストレス、機械振盪、凍結−融解および光ストレス後の２より低い（ＯＤによる）目標凝集指標値、
を使用して、表５に示すように１０個の最も有望な製剤を推定した。
【０１１３】
【表６−１】
2020509065.tif 000009
【０１１４】
【表６−２】
2020509065.tif 000010
【０１１５】
３．２  さらに評価されるリード製剤
表５の製剤のうち、表６に列挙した１１個の製剤が最も有望なようであった。したがって、それらを製造し、表７に示す分析パネルにより熱ストレス時に評価し、凍結−融解サイクルを繰り返した。
【０１１６】
熱ストレスは、製剤性能を評価し、冷凍条件での安定性を予測し得る最も適当なストレス条件として選択された。温度可動域／あらかじめ配合したＤＳ材料の保存に関する任意の問題を予想するために、凍結−融解も考慮した。
これらの製剤で実行した実験の結果を、以下の段落に記載する。
【０１１７】
【表７】
2020509065.tif 000011
【０１１８】
【表８】
2020509065.tif 000012
【０１１９】
３．３  ＤｏＥステップから生じるリード製剤の製造
組成物の原薬材料：１８．６ｍｇ／ｍＬアベルマブ、５１ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−マンニトール、０．６ｍｇ／ｍＬ氷酢酸、ｐＨ５．２（界面活性剤を含まない）を、３つの緩衝液：
１０ｍＭグリシンｐＨ４．４、
１０ｍＭヒスチジンｐＨ５．０、
１５ｍＭクエン酸−リン酸ｐＨ４．２、
１０ｍＭコハク酸ｐＨ５．０、
中でタンジェント流濾過（ＰＥＳ中５０ｋＤａの排除限界でＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｂｉｏｍａｘを使用）によって平衡化した。
緩衝液交換を、４つの適当な緩衝液の１つで、上記のＤＳの５倍希釈によって行い、最初の容積が得られるまで平衡化／濃縮した。操作は３回繰り返した。４つの平衡化した原薬材料のタンパク質含量を、製剤製造の前にＯＤによって試験した。
【０１２０】
製剤１〜５（グリシン緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２１．８ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（６４．２ｇ）中で計量した。次いで安定剤：リジン一塩酸塩（ＤＰ１は３．５８グラムまたはＤＰ２は１．７９ｇ）またはリジン一水和物（ＤＰ３およびＤＰ５は３．２２グラム）またはリジン酢酸塩（ＤＰ４は２．０２ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．７ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストック（ＤＰ１−２−３−４は１０ｍＭグリシンｐＨ４．４中）または０．７ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０（ＤＰ５は１０ｍＭグリシンｐＨ４．１中）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して、希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（７０ｇ）にした。
【０１２１】
製剤６〜７（ヒスチジン緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２３．２ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（６０．３ｇ）中で計量した。次いで安定剤：デキストロース（ＤＰ６は３．５３ｇ）またはスクロース（ＤＰ７は６．７１ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：０．７ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰストック（ＤＰ６および７は１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．０中）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して、希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標（ｐＨ５．０）に調整した。溶液を適当な緩衝液（１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．０）で最終重量（７０ｇ）にした。
【０１２２】
製剤８〜９（クエン酸−リン酸緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２３．４ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（５９．８ｇ）中で計量した。必要であれば（ＤＰ９）、緩衝液の強度をクエン酸（一水和物）およびリン酸水素二ナトリウム（二水和物）を添加することによって調整した。次いで安定剤：リジン一塩酸塩（ＤＰ８は１．７９ｇ）またはスクロース（ＤＰ９は６．７１ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：３５ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１７ＰＦ（ＤＰ８および９両方）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して、希釈したｏ−リン酸または水酸化ナトリウムで目標（ＤＰ８はｐＨ４．２およびＤＰ９は４．３）に調整した。溶液を適当な緩衝液で最終重量（７０ｇ）にした。
【０１２３】
製剤１０〜１１（コハク酸緩衝液中）
交換したＤＳ材料（２４．５ｍｇ／ｍＬ）をガラスビーカー（５７．１グラム）中で計量した。次いで安定剤：リジン一塩酸塩（ＤＰ１０は１．７９ｇ）またはスクロース（ＤＰ１１は６．７１ｇ）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。次いで界面活性剤：１０ｍＭコハク酸緩衝液ｐＨ５．０（ＤＰ１０）中の０．７ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰ保存溶液または３５ｍｇのＫｏｌｌｉｄｏｎ１７ＰＦ（ＤＰ１１）を添加した。溶液を、完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨを測定して、希釈した塩酸または水酸化ナトリウムで目標（ＤＰ１０および１１はｐＨ５．０）に調整した。溶液を１０ｍＭコハク酸緩衝液ｐＨ５．０で最終重量（７０ｇ）にした。
【０１２４】
３．４  結果
３．４．１  熱ストレス
ＯＤによるタンパク質含量：４０℃で４週間後の時間０に関して大きな変化は観察されなかった。
ｐＨ：時間０でのｐＨ値は目標と一致した。４０℃で４週間後の時間０に関して大きな変化は観察されなかった。
【０１２５】
目視検査によるビジブル粒子
全ての製剤は、時間０でビジブル粒子がないことが見出された。ストレス時、１つの製剤（ＤＰ６）は粒子の存在を示した（おそらく、製剤関連）。
【０１２６】
比濁計による濁度
ほとんどの製剤は、ストレス後の最小変化により透明またはわずかに乳白色の範囲の濁度値を有する（ＤＰ２−４−６−７−９−１０−１１）。他の製剤は、わずかに乳白色から乳白色の範囲のより高い濁度変化（ＤＰ１）またはストレス後の少ない／無視できる変化により時間０ですでに乳白色の範囲の値（ＤＰ３−８）のいずれかを示す。製剤ＤＰ５は、ストレス後の濁度の著しい増加を示す（＞１８ＮＴＵ）。
【０１２７】
光オブスキュレーションによるサブビジブル粒子
≧２５ミクロンの粒子は、６００粒子／容器（典型的には＜１００粒子）の薬局方制限を十分に下回った。
≧１０ミクロンの粒子は、いくらか大きな数を有するが、依然として６０００粒子／容器制限以下であった。クエン酸−リン酸緩衝液中のＤＰ８および９は、ストレス後の著しい減少により時間０で他よりも高い数を示した（依然として上記制限以下）。
【０１２８】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集
時間０および熱ストレス後のＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集に関して、ＤＰ１−２−３−４（グリシン緩衝液）は安定剤型および量が様々であったが、同じ緩衝液強度、界面活性剤およびｐＨを有し：２８０ｍＭ（ＤＰ１）から１４０ｍＭ（ＤＰ２）へのリジン一塩酸塩の減少は、タンパク質安定性を好むようである。高い凝集率は、２８０ｍＭのリジン一水和物が使用された場合に確認された（ＤＰ３）。リジン酢酸塩（１４０ｍＭ）は、同じ濃度で使用したリジン一塩酸塩と類似の性能を提供した（ＤＰ２）。
ＤＰ５（グリシン緩衝液）は、凝集の著しい増加を示した（おそらく、２８０ｍＭのリジン一水和物＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰの代わりにＴｗｅｅｎ８０の好ましくない組合せによる）。
ＤＰ６−７（ヒスチジン緩衝液）は、凝集の変化を示さなかった。
ＤＰ８−９（クエン酸−リン酸緩衝液）：ＤＰ９のスクロースは、他の成分／パラメーターがかなり類似している場合（同じ緩衝液型、同じ界面活性剤および類似のｐＨ：４．２対４．３）、ＤＰ８（リジン一水和物）に関して、製剤性能を著しく改善することができる重要な因子であるようである。
ＤＰ１０−１１（コハク酸緩衝液）：凝集の著しい変化は観察されなかった（この緩衝液中のリジン一水和物およびスクロースの類似の性能）。
【０１２９】
バイオアナライザーによる低分子量
時間０および熱ストレス後のバイオアナライザーによる断片：
ＤＰ１−２−３−４（グリシン緩衝液）は安定剤型および量が様々であったが、同じ緩衝液強度、界面活性剤およびｐＨを有した：断片の同様の増加（ストレス後＋３〜５％）。
ＤＰ５（グリシン緩衝液）は、低分子量種の著しい増加を示した（おそらく、２８０ｍＭのリジン一水和物＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰの代わりにＴｗｅｅｎ８０の好ましくない組合せによる）：ストレス後＋１３％増加。
ＤＰ６−７（ヒスチジン緩衝液）は、断片の変化を示さなかった。
ＤＰ８−９（クエン酸−リン酸緩衝液）：ＤＰ９のスクロース（ストレス後断片で＋６％）は、他の成分／パラメーターがかなり類似している場合（同じ緩衝液型、同じ界面活性剤および類似のｐＨ：４．２対４．３）、ＤＰ８（リジン一水和物；断片で＋１１％）に関して、製剤性能を著しく改善することができる重要な因子であるようである。
ＤＰ１０−１１（コハク酸緩衝液）：両方とも最小変化（この緩衝液中のリジン一水和物およびスクロースの類似の性能）：ストレス後低分子量種で＋１〜３％。
【０１３０】
ｃＩＥＦによるアイソフォームプロファイル
時間０および熱ストレス後のアイソフォームプロファイル：熱ストレス時、全ての試料は通常、酸性種の増加および塩基性アイソフォームのわずかな変化と同時に主な種の一部を欠損する傾向があった。より詳細には：ＤＰ１−２−３−４−５（グリシン緩衝液）：アイソフォームプロファイルで類似の変化が観察された。５つの試料では、主な種は約１０〜１２％減少した（酸性アイソフォームの１４〜１７％増加および塩基性アイソフォームの−４／−６％減少）。
ＤＰ６−７（ヒスチジン緩衝液）：ＤＰ６はアイソフォームプロファイルの大きな変化を示し、得られたプロファイルは、おそらくは選択された成分および／または分析前の試料の汚染からの不安定性のために、詳しく調べることができなかった。ＤＰ７は、グリシン緩衝液中の試料と類似の変化を示した。
ＤＰ８−９（クエン酸−リン酸緩衝液）：他の緩衝液で観察されたよりも高い両製剤における著しい変化。酸性種は、ストレス後２４〜２９％まで増加することが見出された。
ＤＰ１０−１１（コハク酸緩衝液）：ＤＰ１０は、他の緩衝液中の他の試料よりも一層低い最小の変化を示した：主な種は、約７％減少した（酸性アイソフォームの約１２％増加および塩基性アイソフォームの約−５％減少）。ＤＰ１１は、より高い変化を示した（ストレス後の酸性アイソフォームの増加は＋２０％であった）。
【０１３１】
円偏光二色性による三次構造
円偏光二色性は、リード製剤へのストレス前後に実施した。
試料は、ＷＦＩで１．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで室温、走査速度２０ｎｍ／分、２５０ｎｍ〜３２０ｎｍの範囲でＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０の分光偏光計測装置によって、１ｃｍ光路長の石英キュベットで試験した（感度：標準；バンド幅：１ｍｍ；データ間隔０．２ｎｍ；Ｄ．Ｉ．Ｔ：８秒；４回）。
ほとんどの製剤のタンパク質構造は有効に保持され、２６０〜２８０ｎｍの領域でのわずかな変化のみであった（チロシンおよびフェニルアラニンシグナル）。しかしながら、少しの例外が観察され、熱ストレス後の構造の部分的な破壊／変性および欠損を示し得るより著しい変化が見出された：ＤＰ５（界面活性剤型の可能な効果が存在）、ＤＰ８および９（クエン酸−リン酸緩衝液中の製剤；緩衝液型および他の成分との組合せの可能な効果が存在）。
【０１３２】
３．４．２  凍結−融解
目視検査によるビジブル粒子
繰返しのＦＴサイクルは、ビジブル粒子の著しい増加を引き起こすことが観察されなかった。いくつかの製剤は、ストレス時に線維様粒子を提示した（典型的には製剤関連の微粒子／沈殿または他の形態はない）。
【０１３３】
比濁計による濁度
凍結−融解時、試験した製剤に著しい変化は生じない。ほとんどの製剤は、時間０およびストレス後に、透明またはわずかに乳白色である（例外：ＤＰ３、５、８、ストレス後の無視できる変化による、時間０での乳白色の溶液範囲）。
【０１３４】
光オブスキュレーション法によるサブビジブル粒子
≧２５ミクロンの粒子は、６００粒子／容器（典型的には＜１００粒子）の薬局方制限を十分に下回った。
≧１０ミクロンの粒子は、より大きな数を有するが、依然として６０００粒子／容器制限以下であった。クエン酸−リン酸緩衝液中のＤＰ８および９は、ＦＴストレス時のさらなる増加なく、時間０で他よりも高い数を示す（依然として上記制限以下）。
【０１３５】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集
ＦＴストレス前後のＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集では、最小の変化が全ての製剤で観察された（総凝集は３ＦＴサイクル後０．２〜０．５％増加した）。
【０１３６】
３．５  結論
グリシン緩衝液中での、抗体安定化の最も好適な条件は、以下を含む：
低イオン強度（１０ｍＭ）、
低ｐＨ（４．０〜４．４）、
安定剤としてリジン（一塩酸塩）、デキストロース、スクロースおよびソルビトール、
好ましい界面活性剤：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰおよびＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（ビジブル粒子の懸念からＴｗｅｅｎ８０はできる限り避けるべきである）。
【０１３７】
コハク酸緩衝液中での、抗体安定化の最も好適な条件は、以下を含む：
低イオン強度（１０ｍＭ）、
ｐＨ５．０〜５．１、
安定剤としてリジン（一塩酸塩）、デキストロース、スクロースまたはソルビトール、
好ましい界面活性剤：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰおよびＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（ビジブル粒子の懸念からＴｗｅｅｎ８０はできる限り避けるべきである）。
【０１３８】
クエン酸−リン酸緩衝液中での、抗体安定化の最も好適な条件は、以下を含む：
低イオン強度（１０〜３０ｍＭ）、
低ｐＨ（４．０〜４．５）、
安定剤としてリジン（一塩酸塩）、デキストロース、スクロースまたはソルビトール、
好ましい界面活性剤：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰおよびＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（ビジブル粒子の懸念からＴｗｅｅｎ８０はできる限り避けるべきである）。
【０１３９】
ヒスチジン緩衝液中での、抗体安定化の最も好適な条件、以下を含む：
低イオン強度（１０〜１５ｍＭ）、
ｐＨ５．０〜５．１、
安定剤としてデキストロース、スクロース、リジン（一塩酸塩）、イノシトール、ソルビトール、
好ましい界面活性剤：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＥＬＰおよびＫｏｌｌｉｄｏｎ１２ＰＦ（ビジブル粒子の懸念からＴｗｅｅｎ８０はできる限り避けるべきである）。
【０１４０】
表６の最も好ましい製剤は、ＤＰ２、４、７、および１０であることが見出された。
【図１】
2020509065.tif 000013
【図２】
2020509065.tif 000014
【図３】
2020509065.tif 000015
【図４】
2020509065.tif 000016
【図５】
2020509065.tif 000017
【配列表】
2020509065000001.app
【国際調査報告】
2020509065.tif 000018
2020509065.tif 000019
2020509065.tif 000020
2020509065.tif 000021