(57)【要約】  本発明は、ガス状基質からポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を生成するための微生物および方法を提供する。具体的には、本発明は、（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素、および（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換する酵素を含む、非自然発生型のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物と、それに関連する方法とを提供する。
2020536520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非自然発生型のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物であって、
ａ．アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素と、
ｂ．アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素と、
ｃ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換する酵素と、を含む、微生物。
【請求項２】
アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する前記酵素が、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来する、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する前記酵素が、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
前記アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来する、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
前記３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する、請求項４に記載の微生物。
【請求項７】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換する前記酵素が、ポリポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＥＣ２．３．１．−）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
前記ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６１−３、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏに由来する、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の微生物。
【請求項１０】
前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する、請求項１に記載の微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する、請求項１に記載の微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、嫌気性である、請求項１に記載の微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、ポリヒドロキシブチレートを分解することができない、請求項１に記載の微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、光栄養性、光合成性、またはメタン資化性ではない、請求項１に記載の微生物。
【請求項１６】
ガス状基質の存在下で請求項１に記載の微生物を培養し、それにより前記微生物がポリヒドロキシブチレートを生成することを含む、ポリヒドロキシブチレートを生成する方法。
【請求項１７】
前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養することが、嫌気性条件下で実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養することが、炭水化物基質の不在下で実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養することが、光の不在下で実行される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月４日に出願された米国特許出願６２／５６８，１２７の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子操作された微生物と、微生物発酵による、具体的には、ガス状基質の微生物発酵によるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の生成のための方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
石油由来のプラスチックは、主にその軽量性、堅牢性、耐久性、および耐劣化性により、現代の生活に不可欠である。しかしながら、石油由来のプラスチックへの依存により、原油の枯渇、汚染、埋め立て地の蓄積を含む、多くの深刻な問題を引き起こしている。プラスチックの環境への影響を減少させるために、従来の石油由来のポリマーを、従来のプラスチックと同様の物理化学的特性を有するポリラクチド、多糖類、脂肪族ポリエステル、およびポリヒドロキシアルカノエート等のバイオポリマーに置き換える努力が進められている（Ａｎｊｕｍ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ，８９：１６１−１７４，２０１６）。しかしながら、このようなバイオポリマーを生成するための微生物および方法は、依然として大部分が開発されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＰＨＢを生成することができる遺伝子操作された微生物を提供する。具体的には、本発明は、（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素、および（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをＰＨＢに変換する酵素を含む、非自然発生型のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物を提供する。
【０００５】
一実施形態では、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素は、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）である。例えば、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来し得る。
【０００６】
一実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）である。例えば、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来し得る。別の例では、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来し得る。
【０００７】
一実施形態では、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換する酵素は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＥＣ２．３．１．−）である。例えば、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６１−３、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来し得る。
【０００８】
一実施形態では、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである。例えば、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する。好ましい実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する。
【０００９】
一実施形態では、微生物は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する。別の実施形態では、微生物は、嫌気性である。さらに別の実施形態では、微生物は、ＰＨＢを分解することができない。
【００１０】
本発明は、ガス状基質の存在下で本発明の微生物を培養することを含む、ＰＨＢを生成する方法をさらに提供する。例えば、ガス状基質は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上数を含み得る。一実施形態では、培養することは、嫌気性条件下で実行される。別の実施形態では、培養することは、炭水化物基質の不在下で実行される。さらに別の実施形態では、培養することは、光の不在下で実行される。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とともに以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲の範囲が、その中の記述によって定義され、本説明に記載された特徴および利点の具体的な議論によって定義されないことに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）生成への酵素経路を示す図である。
【図２】ｐＰＨＢ＿０１のプラスミドマップである。
【図３】ＰＨＢ生合成経路を有するプラスミド（ｐＰＨＢ＿０１）またはネガティブ対照としての空のプラスミド（ｐＭＴＬ８３１５７）のいずれかを運ぶＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでのＰＨＢ生成を示すグラフである。細菌は、ＣＯおよびＣＯ２のみを炭素源とする圧力定格ボトルで嫌気的に増殖した。ＰＨＢの収率（乾燥細胞質量の重量％として表される）は、ＨＰＬＣにより決定された。値は、生物学的トリプリケートの平均に、これらの平均の標準偏差をプラスまたはマイナスして表す。ＰＨＢは、ｐＭＴＬ８３１５７（空の）プラスミドを含む試料では検出されなかった。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、様々な増殖条件下でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの増殖を示すグラフである。細菌は、空のプラスミド（ｐＭＴＬ８３１５７）またはＰＨＢ合成経路を含むプラスミド（ｐＰＨＢ＿０１）のいずれかを含んでいた。各プロットは、異なる条件の組を表す。図４Ａ（条件１）は、唯一の炭素源として５０／１８／３／２９のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２を含むガスミックスを使用して、図３で観察されたデータを生成するために使用される条件の繰り返しを示す。図４Ｂ（条件２）は、条件１と同一条件を示すが、新しいガス基質（５０／３０／１０／１０のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２）を含む。図４Ｃ（条件３）は、条件２と同一条件を示すが、インキュベーション時間が延長されている。図４Ｄ（条件４）は、条件３と同一条件を示すが、ガス基質が定期的に更新されている。値は、生物学的トリプリケートの平均に、これらの平均の標準偏差をプラスまたはマイナスして表す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｄは、様々な増殖条件下でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの増殖を示すグラフである。細菌は、空のプラスミド（ｐＭＴＬ８３１５７）またはＰＨＢ合成経路を含むプラスミド（ｐＰＨＢ＿０１）のいずれかを含んでいた。各プロットは、異なる条件の組を表す。図４Ａ（条件１）は、唯一の炭素源として５０／１８／３／２９のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２を含むガスミックスを使用して、図３で観察されたデータを生成するために使用される条件の繰り返しを示す。図４Ｂ（条件２）は、条件１と同一条件を示すが、新しいガス基質（５０／３０／１０／１０のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２）を含む。図４Ｃ（条件３）は、条件２と同一条件を示すが、インキュベーション時間が延長されている。図４Ｄ（条件４）は、条件３と同一条件を示すが、ガス基質が定期的に更新されている。値は、生物学的トリプリケートの平均に、これらの平均の標準偏差をプラスまたはマイナスして表す。
【図５】図４Ａ〜４Ｄに関連して説明したように、条件１〜４下でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＰＨＢ生成を示すグラフである。値は、生物学的トリプリケートの平均に、これらの平均の標準偏差をプラスまたはマイナスして表す。ＰＨＢは、ｐＭＴＬ８３１５７（空の）プラスミドを含む試料では検出されなかった。
【図６】連続発酵におけるガス状炭素源からのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＰＨＢ生成を示すグラフである。細菌を、ＰＨＢ合成経路を含むプラスミドｐＰＨＢ＿０１と接合した。ＰＨＢを、発酵の完了時に測定した。ガス基質は、５０／２０／２０／１０のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ａｒまたは５０／２０／２／２８のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２の混合物の一部として２０％水素または２％水素のいずれかをそれぞれ含んだ。５のｐＨが維持された。値は、重複した発酵の平均に、これらの平均の標準偏差をプラスまたはマイナスして表す。
【図７】連続発酵におけるガス状炭素源からのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＰＨＢ生成の向上を示すグラフである。細菌は、ＰＨＢ合成経路を含むプラスミドｐＰＨＢ＿０１と接合した。ＰＨＢを発酵の完了時に測定した。ガス基質は、５０／２０／２０／１０のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ａｒまたは５０／２０／２／２８のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２の混合物の一部として２０％水素または２％水素のいずれかをそれぞれ含んだ。２０％の水素、低バイオマスでは、他の実行と比較してバイオマスの濃度が減少した。２０％の水素、変動ｐＨは、６のｐＨから始まり、次に５．５まで低下した。２０％水素、ｐＨ６は、培養が低下するまで、発酵実行全体にわたって維持された。値は、重複した発酵の平均に、これらの平均に関する標準偏差をプラスまたはマイナスして表す。
【図８】ゲノムスケールの代謝モデル再構築（ＧＥＭ）を使用したシミュレーションのＰＨＢ値を示すグラフである。実験的に検出されたＰＨＢを、ＰＨＢ収率の最大化を使用してＧＥＭによって予測されたＰＨＢのレベルと比較した。ＰＨＢ収率の最大化も、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、Ｆｄｒｅｄ、またはＡＴＰのいずれかの２ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ／ｈの摂取で試験した。試験した条件は、ＰＨＢ２０（対照）、ＰＨＢＬｏｗＢ（低バイオマス）、およびＰＨＢｐＨ５．５（ｐＨ５．５）であった。ＡＴＰは、ＰＨＢを最も制限する（達成された最高のＰＨＢ値）ことが分かり、Ｆｄｒｅｄ、ＮＡＤＰＨ、および次にＮＡＤＨが続いた。データは、２つの生物学的反復ケモスタットの平均±標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
フィッシャー−トロプシュ法等の触媒過程を使用して、産業廃棄物ガスまたは合成ガス等の二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、および／または水素（Ｈ２）を含むガスを、様々な燃料および化学物質へ変換し得ることが長い間認識されている。しかしながら、最近、ガス発酵が、このようなガスの生物学的固定のための代替基盤として浮上している。具体的には、酢酸生成（すなわち、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ）微生物が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むガスを、エタノールおよび２，３−ブタンジオール等の生成物に変換することが実証されている。これらのガスからＰＨＢ等のより複雑なポリマー分子を生成することが望ましいことが十分に文書化されている（Ｄｒｚｙｚｇａ，Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９０：１７３５−１７５１，２０１５）。しかしながら、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、生命の熱力学的エッジで動作するため（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１２：８０９−８２１，２０１４）、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物が細胞の増殖および維持に十分な炭素を蓄積することが難しくなり、複雑な炭素生成物の生成がかなり少なくなる。これらの代謝の課題は、炭水化物または糖基質と比較して、発酵培地におけるガス状基質（例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２）の不十分な溶解によって複雑になる。ゆえに、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物がＰＨＢまたは他のポリヒドロキシアルカノエートを合成するように操作される可能性は低いように思われ、これは、特に、これらのポリマーが過剰な炭素を貯蔵する手段としてＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍおよびＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ等の種によって天然に生成されるためである。実際、現在まで、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２からＰＨＢを生成する酢酸生成微生物を操作する試みは成功していない（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＳＹＮＰＯＬ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，２０１２−２０１７）。
【００１４】
しかしながら、熱心な研究および技術的努力の後、本発明者らは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物における史上初のＰＨＢの合成を達成した。これは、再生可能かつ持続可能なバイオポリマーの生成への道のりにおける大きな節目を表す。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、ＰＨＢを生成することができるＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物を提供する。第２の態様では、本発明は、ガス状基質の存在下で前述のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物を培養することによってＰＨＢを生成する方法を提供する。
経路
【００１６】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物はＰＨＢを天然に生成しないため、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物におけるＰＨＢの生成には、少なくとも１つの異種酵素の導入が必要になる。本発明の微生物は、一般に、３つの異種酵素、すなわち（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素、および（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換する酵素を含む。この経路を図１に示す。
【００１７】
（１）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換
【００１８】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換は、任意の好適な酵素によって触媒作用を及ぼされてもよい。ある特定の酢酸生成細菌にはこの反応のための天然の活性が存在し得る可能性があるが、通常、この反応に触媒作用を及ぼすために異種（すなわち、非天然）酵素を導入する必要がある。好ましい実施形態では、酵素は、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼまたは３−ケトチオラーゼとしても知られている）であり、これは、ＥＣ２．３．１．９（すなわち、２アセチル−ＣｏＡ←→ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ）によって定義される活性を有する。アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ等の任意の好適な宿主微生物に由来してもよい。
【００１９】
具体的には、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＰｈａＡ（ＳＣＺ１６９６６）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０４３１６２４７０）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ  ＰｈａＡ（ＡＡＣ８３６５９）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿００６６１７４７２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｈａＡ（ＣＵＢ５２０８０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０４３１８７４５２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＴｈｌＡ（ＷＰ＿０１０９６６１５７１）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０１３９５６４５２．１）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ＢｋｔＢ（ＷＰ＿０１１６１５０８９．１）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ｐｈａＡ（ＷＰ＿０１０８１０１３２．１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡｔｏＢ（ＮＰ＿４１６７２８．１）、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿００４０５９３４４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０３８８２３５３６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０７３５２５７０７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０１９５８２１４４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０７４８５９３１４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０５８５４０２１８）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＰｈａＡ（ＷＰ＿０１１０３０２２１）であり得、またはそれらに由来し得る。
【００２０】
（２）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換
【００２１】
アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換は、任意の好適な酵素によって触媒作用を及ぼされてもよい。ある特定の酢酸生成細菌にはこの反応のための天然の活性が存在し得る可能性があるが、通常、この反応に触媒作用を及ぼすために異種（すなわち、非天然）酵素を導入する必要がある。好ましい実施形態では、酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼであり、これは、ＥＣ１．１．１．３６（すなわち、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ＋←→３−オキソアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋）によって定義される活性を有する。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ等の任意の好適な宿主微生物に由来してもよい。具体的には、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０９５３８９４６４）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０４１２１６９１９）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ  ＰｈａＢ（ＡＡＣ８３６６０）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０４３４６９１１３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０７０５４８９５５）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０５９２３４０３２）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０１０８１０１３１．１）、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿００４５７２３９２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０３１６９０８７９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０３０１４１４２５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０９４４６７４６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０７４８５８６２４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＢ（ＢＡＢ９６５５４）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＰｈａＢ（ＷＰ＿０１１０２７７３４）であり得る。別の好ましい実施形態では、酵素は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、これは、ＥＣ１．１．１．１５７（すなわち、（Ｓ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ＋＝３−アセトアセチル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋）によって定義される活性を有する。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉ���ｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ等の任意の好適な宿主微生物であってもよく、またはそれらに由来してもよい。具体的には、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  Ｈｂｄ（ＷＰ＿０１１９６７６７５．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈｂｄ（ＮＰ＿３４９３１４．１）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  Ｈｂｄ１（ＷＰ＿０１１９８９０２７．１）であり得る。
【００２２】
好ましくは、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素は、（Ｒ）−特異的であり、すなわち、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを生成し、これは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが、ＰＨＢの酵素生成の典型的な基質であるからである。しかしながら、場合によっては、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素は、（Ｓ）−特異的であり、すなわち、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを生成する。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、発明者らは、酢酸生成細菌における天然または導入されたエピメラーゼ活性により、（Ｓ）−および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの相互変換が可能になり得、このような（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ変換され、次に、これがＰＨＢに変換され得ることを確信している。
【００２３】
（３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからＰＨＢへの変換
【００２４】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからＰＨＢへの変換は、任意の好適な酵素によって触媒作用を及ぼされてもよい。ある特定の酢酸生成細菌にはこの反応のための天然の活性が存在し得る可能性があるが、通常、この反応に触媒作用を及ぼすために異種（すなわち、非天然）酵素を導入する必要がある。好ましい実施形態では、酵素は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼであり、これは、ＥＣ２．３．１．Ｂ２（型Ｉ）（すなわち、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ＋［（Ｒ）−３−ヒドロキシブタノアート］ｎ＝［（Ｒ）−３−ヒドロキシブタノアート］ｎ＋１＋ＣｏＡ）、ＥＣ２．３．１．Ｂ３（型ＩＩ）（すなわち、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ＋［（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル］ｎ＝［（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル］ｎ＋１＋ＣｏＡ）、またはＥＣ２．３．１．Ｂ４（型ＩＩＩ）（すなわち、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ＋［（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル］ｎ＝［（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル］ｎ＋１＋ＣｏＡ）等のＥＣ２．３．１．−によって定義される活性を有する。この酵素は、ポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ、ポリヒドロキシブチレートシンターゼ、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ等とも呼ばれ得る。ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６１−３、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ等の任意の好適な宿主微生物に由来してもよい。具体的には、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＰｈａＣ（ＳＣＹ７１０７２）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ  ＰｈａＣ（ＷＰ＿０４５５２４５７４）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ  ＰｈａＣ１（ＷＰ＿０１７７８０１９１）もしくはＰｈａＣ２（ＡＡＶ４１８７２）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ  ＰｈａＣ（ＷＰ＿０８４２６７３１７）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  ＰｈａＣ（ＷＰ＿００６６１７４５６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｈａＣ（ＣＵＢ５８８８１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＰｈａＣ（ＷＰ＿０２７７８４５６７）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ＰｈａＣ（ＷＰ＿０１１６１５０８５またはＷＰ＿０１３９５６４５１．１）、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  ＰｈａＣ（ＷＰ＿００４０５６１３８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰｈａＣ１（ＷＰ＿０３８８２３５３９）もしくはＰｈａＣ２（ＷＰ＿０２５２７１４１９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｈａＣ１（ＷＰ＿０５７３９９２９２）もしくはＰｈａＣ２（ＷＰ＿０３０１４１００１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ  ＰｈａＣ１（ＷＰ＿０９４４６７４６０）もしくはＰｈａＣ２（ＷＰ＿０１０４６５９５１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  ＰｈａＣ１（ＡＡＬ１７６１１）もしくはＰｈａＣ２（ＷＰ＿０３７０４９８７５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＣ１（ＢＡＢ９６５５２）もしくはＰｈａＣ２（ＷＰ＿０２９８８６３６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６１−３  ＰｈａＣ１（ＢＡＡ３６１９８）もしくはＰｈａＣ２（ＢＡＡ３６２０２）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ  ＰｈａＣ１（ＷＰ＿０１１３８８０２８）、ＰｈａＣ２（ＷＰ＿０１１３９０１６６）、もしくはＰｈａＣ３（ＷＰ＿０１１３９８５６９）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＰｈａＣであり得、またはそれらに由来し得る。
【００２５】
ある特定の実施形態では、１つ以上の破壊的変異を１つ以上の内因性酵素に導入して、導入された異種酵素との競合を低減または排除し得る。具体的には、「破壊的変異」は、遺伝子または酵素の発現または活性を低減または排除（すなわち「破壊する」）する変異である。破壊的変異は、遺伝子または酵素を、部分的に不活性化し得るか、完全に不活性化し得るか、または欠失し得る。破壊的変異は、ノックアウト（ＫＯ）変異であり得る。破壊的変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を低減、防止、または阻害する任意の変異であり得る。破壊的変異には、例えば、酵素をコードする遺伝子の変異、酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントの変異、酵素の活性を低減または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ）および／もしくはタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の導入が含まれ得る。破壊的変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入されてもよい。
【００２６】
例えば、本発明の微生物は、内因性チオエステラーゼ酵素に破壊的変異を有し得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでは、３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＧＹ７４９４７．１、パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼと注釈が付けられる）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＧＹ７５７４７．１、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼと注釈が付けられる）、および（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＧＹ７５９９９．１、推定チオエステラーゼと注釈が付けられる）とが同定されている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉでは、３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＤＫ１５６９５．１、予測アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１と注釈が付けられる）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＤＫ１６６５５．１、予測チオエステラーゼと注釈が付けられる）、および（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＤＫ１６９５９．１、予測チオエステラーゼと注釈が付けられる）も同定されている。破壊的変異は、これらのチオエステラーゼまたは本発明の微生物に内因性であり得る任意の他のチオエステラーゼのうちのいずれかに影響を及ぼし得る。
微生物
【００２７】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用する場合、「微生物」の記述は、「細菌」を包含するように解釈されるべきである。
【００２８】
本発明の微生物は、非自然発生型である。微生物に関して使用される場合の「非自然発生型」という用語は、参照種の野生型株を含む参照種の自然発生型の株には見られない少なくとも１つの遺伝子改変を微生物が有することを意味するように意図される。非自然発生型の微生物は、典型的には、実験室または研究施設で開発される。対照的に、「野生型」は、自然界で発生する生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態を指す。
【００２９】
「遺伝子改変」、「遺伝子変化」、または「遺伝子操作」という用語は、広範には、人間の手による微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子改変される」、「遺伝子変化される」、または「遺伝子操作される」という用語は、このような遺伝子改変、遺伝子変化、または遺伝子操作を含む微生物を指す。これらの用語は、実験室で作り出された微生物と自然発生型の微生物を区別するために使用し得る。遺伝子改変の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータの挿入または欠失、核酸変異、改変遺伝子発現または不活性化、酵素操作、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。
【００３０】
「組み換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子改変、操作、または組み換えの生成物であることを示す。一般に、「組み換え」という用語は、２つ以上の異なる株もしくは種の微生物等の複数の源に由来する遺伝材料を含むか、またはそれらによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本発明の微生物は、典型的には組み換えである。
【００３１】
「〜に由来する」という用語は、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成するように、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から改変または適合されることを示す。このような改変または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に、本発明の微生物は、本発明の微生物を作り出すために使用される微生物である「親微生物」に由来する。親微生物は、自然発生型の微生物（すなわち、野生型微生物）または以前に改変されたことのある微生物（すなわち、突然変異体または組み換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物において発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように改変され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物により含まれていなかった１つ以上の遺伝子を含むように改変され得る。本発明の微生物は、親微生物において発現されていた１つ以上の酵素を発現しないように、またはより少ない量を発現させるようにも改変され得る。一実施形態では、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親微生物に由来する。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、親微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１に由来し、これは、ブタペスト条約の条件下で２０１０年６月７日にドイツのブラウンシュヴァイク、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ  ７Ｂ、Ｄ−３８１２４に位置するＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に、２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を与えられた。この株については、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００１４４号に記載されており、ＷＯ２０１２／０１５３１７として公開されている。
【００３２】
本発明の微生物は、機能特徴に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物、Ｃ１固定微生物、嫌気性菌、アセトゲン、エタノロジェン、および／またはカルボキシド栄養生物であり得、またはそれらに由来し得る。表１は、微生物の代表的なリストを提供し、微生物の機能特徴を同定する。
【表１】
2020536520.tif 000003
2020536520.tif 000004
【００３３】
「Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ」は、例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８に記載されている炭素固定のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を指す。「Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物」は、予想通り、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む微生物を指す。一般に、本発明の微生物は、天然のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む。本明細書において、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、天然の未改変のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよく、またはある程度の遺伝子改変（例えば、過剰発現、異種発現、ノックアウト等）を伴うＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよいが、依然としてＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２をアセチル−ＣｏＡに変換するように機能する場合に限る。
【００３４】
「Ｃ１」は、一炭素分子、例えばＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または唯一の炭素源としての役割を果たす１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物は、Ｃ１固定細菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるＣ１固定微生物に由来する。本発明の目的のために、メタン（ＣＨ４）は、例えば、ＷＯ２０１６／１３８０５０に記載のようにメタン代謝経路を含むように本発明の細菌が操作された場合にのみ、Ｃ１炭素源と考えられ得るが、これは、酢酸生成細菌がメタンを炭素源として使用することが天然にできないからである。
【００３５】
「嫌気性菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性菌は、酸素がある特定の閾値を超えて存在する場合に、負の反応を起こし得るか、または死滅し得る。しかしながら、一部の嫌気性菌は、低レベルの酸素（例えば、０．０００００１〜５％の酸素）に耐性を有することができる。典型的には、本発明の微生物は、嫌気性菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定される嫌気性菌に由来する。
【００３６】
「アセトゲン」は、エネルギー節約のため、およびアセテート等のアセチル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡ由来生成物の合成のためのその主要機構としてＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。アセトゲンは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元的合成の機構として、（２）末端電子受容、エネルギー節約過程として、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）の機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。全ての自然発生型のアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物は、アセトゲンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるアセトゲンに由来する。
【００３７】
「エタノロジェン」は、エタノールを生成する、または生成することができる微生物である。典型的には、本発明の微生物は、エタノロジェンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるエタノロジェンに由来する。
【００３８】
「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下で増殖することができる微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２等の無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は、独立栄養生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定される独立栄養生物に由来する。
【００３９】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素およびエネルギーの唯一の源としてＣＯを利用することができる微生物である。典型的には、本発明の微生物は、カルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるカルボキシド栄養生物に由来する。
【００４０】
より広範には、本発明の微生物は、表１で同定される任意の属または種に由来し得る。例えば、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーであり得る。具体的には、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親細菌に由来し得る。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターに由来する。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって初めて報告され、かつ特徴付けられた。
【００４２】
これらの種は、多くの類似点を有する。具体的には、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、酢酸生成、エタノール生成、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約および発酵代謝のモードを有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、約２２〜３０モル％の含有量でＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態およびサイズを有し（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖する）、約４〜７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種は全て、ＣＯを含むガスで強い独立栄養増殖も示し、主な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成し、ある特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【００４３】
しかしながら、これらの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる源から単離された。これらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、ある特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列に違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的な組織および数は、全ての種で同じであることがわかっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。  
【００４４】
したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの特徴の多くは、その種に固有ではなく、むしろ、Ｃ１固定、嫌気性、酢酸生成、エタノール生成、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のメンバーのこのクラスターの一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子改変または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果がない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【００４５】
本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの単離物または突然変異体にも由来し得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの単離物および突然変異体には、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）（ＷＯ２０１２／０１５３１７）が含まれる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの単離物および突然変異体には、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ  ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が含まれる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの単離物および突然変異体には、ＰＩ  １（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が含まれる。
【００４６】
好ましくは、本発明の微生物は、光栄養性または光合成性ではない。好ましくは、本発明の微生物は、メタン資化性ではない。
【００４７】
好ましくは、本発明の微生物は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの属のメンバーではない。具体的には、本発明の微生物は、好ましくは、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ（以前はＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに由来しない。他の実施形態では、本発明の微生物は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来しない。
酵素
【００４８】
「内因性」または「天然」は、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物に存在または発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内因性遺伝子またはタンパク質は、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子またはタンパク質である。一実施形態では、内在性遺伝子の発現は、外因性プロモータ等の外因性調節エレメントによって制御され得る。
【００４９】
「外因性」は、本発明の微生物の外側から生じる核酸またはタンパク質を指す。例えば、外因性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に人工的または組み換え的に作成され、導入または発現され得る。外因性遺伝子または酵素は、異種微生物から単離され、本発明の微生物に導入または発現され得る。外因性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態にとどまるように適合され得る。
【００５０】
「異種」は、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物に存在しない核酸またはタンパク質を指す。例えば、異種遺伝子または酵素は、異なる株または種に由来し、本発明の微生物に導入または発現され得る。
【００５１】
典型的には、（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素、または（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをＰＨＢに変換する酵素のうちの少なくとも１つは、細菌に対して異種（すなわち、非天然）である。例えば、これらの酵素のうちの１つ、２つ、または３つ全ては、細菌に対して異種（すなわち、非天然）であり得る。しかしながら、細菌がこれらのステップのうちの１つ以上について天然の酵素活性を有することがある場合、異種酵素を導入してこれらのステップに触媒作用を及ぼす必要がない場合がある。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。
【００５３】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的活性を指す。したがって、酵素活性を「増加させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増加させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を増加させることを含む。同様に、酵素活性を「減少させること」は、酵素の活性を減少させること、酵素の量を減少させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を減少させることを含む。
【００５４】
「コドン最適化」は、特定の株または種における核酸の最適化または改善された翻訳のための、遺伝子等の核酸の変異を指す。コドン最適化により、翻訳速度の高速化または翻訳精度の向上がもたらされ得る。好ましい実施形態では、本発明の遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、具体的には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉでの発現のためにコドン最適化される。本明細書で使用する場合、「コドン最適化された」および「コドン適合された」という用語は、同じ意味で使用することができる。
【００５５】
「変異体」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列等の、参照核酸およびタンパク質の配列とは異なる、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する変異体核酸またはタンパク質を使用して実施され得る。例えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的に同じ反応に触媒作用を及ぼし得る。変異体遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードし得る。変異体プロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有し得る。
【００５６】
このような核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等な変異体」と呼ばれ得る。例として、核酸の機能的に同等な変異体には、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片、突然変異遺伝子、多型等が含まれ得る。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等な変異体の例である。これらには、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ等の種の相同遺伝子が含まれ得、その詳細はＧｅｎＢａｎｋまたはＮＣＢＩ等のウェブサイト上で公開されている。機能的に同等の変異体には、特定の微生物のコドン最適化の結果として配列が異なる核酸も含まれる。核酸の機能的に同等な変異体は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超える核酸配列同一性（相同性割合）を有する。タンパク質の機能的に同等な変異体は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性割合）を有する。変異体核酸またはタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して評価され得る。
【００５７】
本明細書に記載の酵素は、典型的には、本発明の微生物に導入された核酸から発現される。核酸は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の微生物に送達され得る。例えば、核酸は裸の核酸として送達されてもよく、リポソーム等の１つ以上の薬剤とともに配合されてもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態では、制限阻害剤を使用してもよい。追加のベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、および人工染色体が含まれ得る。好ましい実施形態では、核酸は、プラスミドを使用して本発明の微生物に送達される。例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的または自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または接合によって達成され得る。活性制限酵素系を有するある特定の実施形態では、核酸を微生物に導入する前に核酸をメチル化する必要があり得る。
【００５８】
さらに、特定の核酸の発現を増加または制御するために、プロモータ等の調節エレメントを含むように核酸を設計してもよい。プロモータは、構成的プロモータまたは誘導性プロモータであり得る。理想的には、プロモータは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路プロモータ、フェレドキシンプロモータ、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモータ、Ｒｎｆ複合オペロンプロモータ、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモータ、またはホスホトランスアセチラーゼ／アセテートキナーゼオペロンプロモータである。
基質
【００５９】
「基質」は、本発明の微生物のための炭素源および／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、ガス状であり、Ｃ１−炭素源、例えば、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子等の他の非炭素成分をさらに含み得る。  
【００６０】
基質は、一般に、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯ等の少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０モル％のＣＯ等の、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０〜７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼所または高炉ガス）、約２０〜３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、または約１５〜４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態では、基質は、約１〜１０または１〜２０モル％のＣＯ等の、比較的少量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形態では、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００６１】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態では、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２等の、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態では、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００６２】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態では、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態では、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００６３】
ある特定の実施形態では、条件「ＰＨＢ２０」および「ＥＰ２０」とそれぞれ称される２０％のＨ２類似合成ガス（５０％ＣＯ、２０％ＣＯ２、２０％Ｈ２、１０％アルゴン）、または条件「ＰＨＢ２」および「ＥＰ２」とそれぞれ称される２％のＨ２類似製鋼所オフガス（５０％ＣＯ、２０％ＣＯ２、２％Ｈ２、２８％窒素との、２つの異なるＣＯおよびＣＯ２含有ガスミックスを使用して、ＰＨＢ生成株の増殖を、対照（「空のプラスミド」または「ＥＰ」）株と比較する。
【００６４】
基質は、典型的にはガス状であるが、基質は、代替的な形態でも提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散体発生器を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００６５】
基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化から等の、産業過程の副産物として得られる、または何らかの他の源からの廃ガスであり得る。ある特定の実施形態では、産業過程は、製鋼所製造等の鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の簡便な方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業過程から捕捉され得る。
【００６６】
基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース材料のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガス等の、合成ガスであり得る。別の実施形態では、合成ガスは、都市固形廃棄物または産業固形廃棄物のガス化から得られてもよい。
【００６７】
基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵過程の効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子等のいかなる望ましくない不純物も除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００６８】
ある特定の実施形態では、発酵または培養は、糖、デンプン、リグニン、セルロース、またはヘミセルロース等の炭水化物基質の不在下で実行される。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「ＰＨＢＬｏｗＢ」という用語は、３倍低い定常状態バイオマス濃度等の低い定常状態バイオマス濃度での実験を指すために使用される。本明細書で使用する場合、「ＰＨＢｐＨ５．５」という用語は、５．５のｐＨで行われた実験を指すように使用される。図８参照。
生成物
【００７０】
本発明の微生物は、１つ以上の生成物を生成するように培養され得る。具体的には、本発明の微生物は、アセトアセチル−ＣｏＡまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ等の、ＰＨＢまたはその前駆体を生成し得る。
【００７１】
ＰＨＢは、３−ヒドロキシブチレートモノマーのポリマーである。本発明に従って生成されたＰＨＢは、任意の数の３−ヒドロキシブチレートモノマー、例えば、約１０〜１，０００，０００個のモノマーを含み得る。さらなる例として、ＰＨＢは、約１０〜１００，０００個のモノマー、１００〜１００，０００個のモノマー、１００〜１０，０００個のモノマー、５００〜５，０００個のモノマー、１，０００〜１０，０００個のモノマー、または５，０００〜２０，０００個のモノマーを含み得る。好ましい実施形態では、ＰＨＢは、約１００〜１２，０００個のモノマーを含む。
【００７２】
本発明の細菌によって生成されるＰＨＢの分子量は、約１，０００〜１００，０００，０００Ｄａの範囲であり得る。例えば、ＰＨＢの分子量は、約１，０００〜１０，０００Ｄａ、１０，０００〜１，０００，０００Ｄａ、１０，０００〜１０，０００，０００Ｄａ、または１０，０００，０００〜１００，０００，０００Ｄａであり得る。好ましくは、ＰＨＢの分子量は、約１０，０００〜１，０００，０００Ｄａ、例えば、１０，０００〜１００，０００Ｄａ、１０，０００〜５００，０００Ｄａ、１００，０００〜５００，０００Ｄａ、３００，０００〜８００，０００Ｄａ、または５００，０００〜１，０００，０００Ｄａであり得る。
【００７３】
ＰＨＢ生成は、乾燥細胞重量の割合と呼ばれることが多い。本発明の微生物は、例えば、０．００５〜０．９９５重量％のＰＨＢを生成し得る。好ましくは、本発明の微生物は、約０．０１重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、１．５重量％、２重量％、３重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、または９５重量％のＰＨＢを生成する。
【００７４】
ＰＨＢの物理的特徴は、当該技術分野において周知である。概算として、ＰＨＢは、ヤング率１４９７〜３５００ＭＰａ、引張強度１８〜４３ＭＰａ、破断伸び１．９〜４５％、結晶化度６０〜８０％、融解温度１６２〜１８０℃、結晶化温度４５〜１１６℃、および／またはガラス転移温度−１．２〜１０℃を有する。
【００７５】
加えて、本発明の微生物は、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２およびＷＯ２０１６／０９４３３４）、乳酸（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６１５２）、１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、およびコリスマート由来生成物（ＷＯ２０１６／１９１６２５）等の他の生成物も生成し得るか、またはそれらを生成するように操作され得る。１つ以上の標的生成物に加えて、本発明の微生物は、エタノール、アセテート、および／または２，３−ブタンジオールも生成し得る。ある特定の実施形態では、微生物バイオマス自体が生成物と考えられ得る。
【００７６】
好ましくは、本発明の微生物は、ＰＨＢを分解することができない。ＰＨＢおよび他のポリヒドロキシアルカノエートを天然に生成する生物は、一般に、他の栄養素（例えば、窒素およびリン）が制限的であり、かつ炭素が過剰な場合に、ポリマーを炭素貯蔵材料として合成する。次に、これらの生物は、制限的な栄養素が貯蔵炭素にアクセスできるように補充されると、ポリマーを解重合／分解し得る。ＰＨＢ生成を最大化する目的のために、本発明の微生物等の非天然の生成菌は、一旦ポリマーが生成されると、ポリマーを酵素的に分解することができないという利点を有することが多い。これにより、本質的に炭素がポリマーに永久的に固定され、収率が増加する。
【００７７】
「選択性」は、微生物によって生成される全発酵生成物の生成に対する標的生成物の生成の比率を指す。本発明の微生物は、ある特定の選択性で、または最小の選択性で生成物を生成するように操作され得る。一実施形態では、標的生成物は、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、または７５％を占める。一実施形態では、標的生成物は、本発明の微生物が少なくとも１０％の標的生成物のための選択性を有するように、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態では、標的生成物は、本発明の微生物が少なくとも３０％の標的生成物のための選択性を有するように、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占める。
発酵
【００７８】
本発明は、ガス状基質の存在下で本発明の微生物を培養し、それによって微生物がＰＨＢを生成することを含む、ＰＨＢを生成する方法をさらに提供する。ガス状基質は、一般に、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含む。
【００７９】
典型的には、培養は、バイオリアクタ中で実行される。「バイオリアクタ」という用語は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他のデバイス等の１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培養／発酵反応器を含み得る。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供され得る。本明細書で使用する場合、「培養」および「発酵」という用語は、同じ意味で使用される。これらの用語は、培養／発酵過程の増殖期および生成物生合成期の両方を包含する。  
【００８０】
培養は、一般に、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／またはミネラルを含む水性培養培地で維持される。好ましくは、水性培養培地は、最小嫌気性微生物増殖培地等の嫌気性微生物増殖培地である。好適な培地は、当該技術分野において周知である。  
【００８１】
培養は、望ましくは、標的生成物の生成のための適切な条件下で行われるべきである。典型的には、培養は、嫌気性条件下で実行される。考慮すべき反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地レドックス電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。
【００８２】
上昇した圧力でバイオリアクタを作動させることによって、気相から液相へのガス質量移動の速度上昇が可能になる。したがって、大気圧よりも高い圧力で発酵を実行することが好ましい場合がある。また、所定のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すことから、加圧システムの使用によって、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵設備の資本コストを大幅に削減することができる。これは、同様に、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持されるときに短縮し得ることを意味する。最適反応条件は、使用する特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を作動させることが好ましい。また、所定のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の保持時間を達成することが同様にバイオリアクタの必要な体積を示すことから、加圧システムの使用によって、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵設備の資本コストを大幅に削減することができる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、発酵は、光の不在下で、または光合成性または光栄養性微生物のエネルギー要件を満たすのに不十分な量の光の存在下で実行される。
【００８４】
本発明の方法は、ＰＨＢの分離または精製をさらに含み得る。ＰＨＢは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して分離または精製され得る。例えば、沈殿（Ｃｈｅｎ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５７：５０−５５，２００１）または連続分離（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７５：６４３−６５１，２００９；Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，２：５９，２０１２）に続く凍結乾燥によって、細胞を収集し得る。フリーズドライの後に、エチルアセテート（Ｃｈｅｎ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５７：５０−５５，２００１）、アセトン（Ｅｌｂａｈｌｏｕｌ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７５：６４３−６５１，２００９）、または次亜塩素酸ナトリウム（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，２：５９，２０１２）等の材料で、ポリマーを細胞から除去し得る。次に、ポリマーを残留／可溶化細胞塊から除去し得る。ポリヒドロキシアルカノエートの精製のための多数の代替過程が公開され開発されているが、大規模精製のためにはまだ確立されていない（Ｋｕｎａｓｕｎｄａｒｉ，Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｏｌｙｍ  Ｌｅｔｔ，５，６２０−６３４，２０１１）。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
実施例１
【００８６】
本実施例は、ＰＨＢ合成が可能なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物の構築を実証する。
【００８７】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒからのＰＨＢ経路遺伝子（ｐｈａＣ、ｐｈａＡ、およびｐｈａＢ）（配列ＩＤ番号：１、４、および７）を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、ＰＨＢを天然に生成しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物に導入した。注目すべきは、これらの種には、染色体ＧＣ含有量に著しい違いがあることである。具体的には、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒのＧＣ含有量は６６％（Ｐｏｈｌｍａｎｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２４：１２５７−１２６２，２００６）であり、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＧＣ含有量は３１％だけである（Ｂｒｏｗｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，７：４０，２０１４）。コドン使用に基づいて遺伝子発現の問題を予測し、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒからのＰＨＢ遺伝子の配列を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのタンパク質のより高い発現プロファイルにより良く合うようにコドン適合した。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒと同一のタンパク質をコードする新規配列（配列ＩＤ番号３、６、および９）を有する遺伝子を合成し、発現ベクターｐＭＴＬ８３１５７（配列ＩＤ番号１０）に組み立てた。このプラスミドは、ｐＭＴＬ８０００シリーズ（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８：７９−８５，２００９）と同様であり、遺伝子転写を駆動するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍから取得した天然のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌプロモータを有する。遺伝子を、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒゲノムに現れるのと同じ順序、ｐｈａＣ、ｐｈａＡ、およびｐｈａＢでプロモータの下流に配置した。抗生物質選択マーカー、ｃａｔＰも使用した。得られたプラスミドを、ｐＰＨＢ＿０１（配列ＩＤ番号１１）と命名した（図２）。
【００８８】
他で記載されるように（Ｍｏｃｋ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １９７：２９６５−２９８０，２０１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を使用した細菌接合によってｐＰＨＢ＿０１をＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに挿入した。別に、「空の」ｐＭＴＬ８３１５７プラスミドをネガティブ対照としてＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに挿入した。次に、これらの株を使用して、ガス状基質からのＰＨＢ生成を試験した。
【００８９】
好ましい実施形態では、微生物は、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素を含み、この酵素は、配列ＩＤ番号２に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する酵素を含み、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素は、配列ＩＤ番号５に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する酵素を含み、および／または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに変換する酵素は、配列ＩＤ番号８に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する酵素を含む。
実施例２
【００９０】
本実施例は、ショットボトル内のガス状基質からのＰＨＢの生成を実証する。
【００９１】
実施例１で構築された株を、ＰＨＢの生成を試験するために小さなバッチで増殖させた。全ての作業は、厳しい嫌気性条件下で行われた（Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  １１７−１３２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９６９）。プラスミド保持のためのチアンフェニコールおよび緩衝のための２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を含む改変ＰＥＴＣ培地（Ｋｏｐｋｅ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：５４６７−５４７５，２０１１）を含む圧力定格ショットボトルに株を接種し、唯一の炭素源としてのＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、およびＮ２（それぞれ５０、１８、３、および２９％）を含むガスをボトルに２１ｐｓｉまで添加した。培養物を３７℃で回転振とうしながら増殖させた。
【００９２】
培養物が固定相に入るまで、細胞増殖を定期的に監視した。増殖が完了すると、細胞は嫌気性条件下で処理されなくなった。細胞を遠心分離によって収集し、その上清を廃棄し、−２０℃で凍結し、凍結乾燥を介して乾燥させた。
【００９３】
ＰＨＢ収率は、他で記載される（Ｋａｒｒ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４６、１３３９−１３４４、１９８３）のと同様に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって推定された。簡単に言うと、乾燥した細胞を濃硫酸で処理し、加熱してＰＨＢをクロトン酸に変換した。試料を冷却、希釈、濾過し、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣで分析してクロトン酸を定量化した。初期ＰＨＢ生成の結果を図３に要約し、これはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物で約１．１５重量％ＰＨＢの生成に成功したことを示している。
【００９４】
しかしながら、重量の９０％以上を占めるようにＰＨＢのようなポリマーを合成することができるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ等の天然の生成菌と比較して収率が低いことを考えると、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物のガスからのＰＨＢ合成が非ガス状基質で増殖する天然の生成菌ほど単純ではないようである。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、発明者らは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物と天然のＰＨＢ生成菌との間のｐＨ選好、酸素要件、基質利用等の違いを克服するために、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物におけるＰＨＢ生成にはコドン適応が必要であり得ると仮定している。
【００９５】
ガス状基質からＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでＰＨＢの合成を達成した後、ＰＨＢ収率を支持／改善し得る条件を探求するために、増殖条件を変えて上記の作業を繰り返した。具体的には、上記の条件（条件１、図４Ａ）を繰り返し、ガス組成を５０／３０／１０／１０のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２（条件２、図４Ｂ）に変更し、培養物のインキュベーションを固定相に延長し（条件３、図４Ｃ）、ボトル内のガスを定期的に更新する（条件４、図４Ｄ）実験を実行した。図４Ａ〜４Ｄに示すように、全ての試験条件下で、操作された株および対照株の両方について増殖が類似していた。
【００９６】
上述のように、細胞を採取し、ＰＨＢ生成について分析した。その結果を図５に示し、これは、条件１で約１．６５重量％のＰＨＢ、条件２で約１．５０重量％のＰＨＢ、条件３で約１．５０重量％のＰＨＢ、条件４で約０．８５重量％のＰＨＢの生成を示す。
実施例３
【００９７】
本実施例は、連続発酵におけるガス状基質からのＰＨＢの生成を実証する。
【００９８】
実施例１で構築された株を、Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ，４：５０５−５１５，２０１７に記載されている条件と同様の条件下で、主な炭素源としてガスを使用した連続発酵下で試験した。ショットボトルで実行した実験と同様に、連続培養物は、嫌気的に増殖および処理された。ショットボトルとは異なり、培養物は、約２０日間、培地を絶えず供給しながら連続的に増殖した。増殖およびＰＨＢの生成には、５０／２０／２０／１０のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ａｒおよび５０／２０／２／２８のＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／Ｎ２の２つの異なるガス組成を使用した。質量分析（ＭＳ）を使用してガス摂取を監視し、試料を定期的に採取して、液体代謝産物をＨＰＬＣで定量化した。
【００９９】
ＰＨＢは、連続発酵が完了するまで定量化されなかった。ショットボトルの実験と同様に、細胞を遠心分離によって収集し、凍結し、凍結乾燥によって乾燥した。その後、硫酸および熱で処理してＰＨＢをクロトン酸に変換することにより、乾燥細胞をＰＨＢについて分析した。次に、ＨＰＬＣを介してＰＨＢ定量化を行った。連続発酵でのＰＨＢ生成の結果を図６に示す。具体的には、２０％水素ガスで増殖した微生物は、約０．４５重量％のＰＨＢを生成し、２％水素ガスで増殖した微生物は、約０．２５重量％のＰＨＢを生成した。
実施例４
【０１００】
本実施例は、ＰＨＢ生成を増加させるための発酵槽の最適化を実証する。
【０１０１】
細胞内のＰＨＢ含有量を増加させるために、連続発酵内で様々な条件を試験した。アセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＰＨのプールは、バイオマス濃度がより低くなると増加する（Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ．，４：５０５−５１５，２０１７）。ゆえに、定常状態バイオマスレベルがより低くなると、アセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＰＨプールのレベルの増加を通じて結果的にＰＨＢがより高くなるか否かを試験した。ＣＯの摂取速度、ひいては発酵槽のバイオマス濃度を低下させると、ＰＨＢへの細胞資源のフラックスが増加することが示された（図７）。
【０１０２】
ＰＨＢを増加させることが分かった別の要因はｐＨであった。ｐＨがより高くなると、酢酸の拡散が少なくなり、プロトン駆動力（ＰＭＦ）が分離される（Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ．，４：５０５−５１５，２０１７）。ゆえに、ｐＨを５〜５．５または６に増加させると、ＰＭＦを維持するために消耗するエネルギーが少なくなるか否かを試験した。余分の利用可能エネルギーによって、ＡＴＰ生成に必要なアセテート生成を低減することにより、ＰＨＢ生成をサポートする追加のＡＴＰが提供される。ｐＨを５．０〜５．５または６．０に変更すると、結果的にＰＨＢ生成が増加した（ｐＨ５．５で約１２．５倍）。しかしながら、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはより酸性のｐＨで最適に増殖するため、６．０のｐＨ値を維持することは難しい。
実施例５
【０１０３】
本実施例は、対照（空のプラスミド）株と比較して、ＰＨＢを生成するときの転写およびメタボロームレベルの変化を実証する。
【０１０４】
ＲＮＡシーケンスからのトランスクリプトームデータの分析は、以前に公開されたＲスクリプト（Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ．，４：５０５−５１５，２０１７）に基づいており、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＮＣＢＩ参照配列ＣＰ００６７６３．１の使用およびＢｒｏｗｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，７：４０，２０１４に記載のその注釈付きゲノム、３つのＰＨＢ遺伝子のヌクレオチド配列の追加（配列ＩＤ番号：３、６、９）の修正が加えられている。
【０１０５】
Ｒで利用可能なメタボロミクスパッケージ（Ｌｉｖｅｒａ  ａｎｄ  Ｂｏｗｎｅ，Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ，２０１４）を使用して、細胞内メタボロミクスデータの統計分析を実行した。このスクリプトは、メタボロミクスデータを正規化し、線形モデル適合に統合する（Ｄｅ  Ｌｉｖｅｒａ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８４：１０７６８−１０７７６，２０１２）。データをスクリプトにインポートする前に、細胞内代謝産物濃度をバイオマス（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ）毎に正規化した。メタボロームデータの統計分析には、通常の統計（すなわち、非ベイジアン）を使用した線形モデル適合を使用した（Ｄｅ  Ｌｉｖｅｒａ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８４：１０７６８−１０７７６，２０１２；Ｄｅ  Ｌｉｖｅｒａ，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｎａｔｕａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１３）。
【０１０６】
アルギニンは供給されなかったが、アセトゲンにＡＴＰを供給することがわかっている代替ルートであるアルギニンデイミナーゼ経路の上方調節が観察された（Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．４１：２０２−２１１，２０１７）（ｑ値＜０．０１）、アルギニンデイミナーゼ（ＣＡＥＴＨＧ＿３０２１、約７倍）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＣＡＥＴＨＧ＿３０２２、約６倍）、カルバメートキナーゼ（ＣＡＥＴＨＧ＿３０２５、約３．３倍）。加えて、Ｒｎｆ複合体をコードする３つの遺伝子は、アセトゲンのエネルギー節約複合体の一部であり（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：８０９−８２１，２０１４）、ＰＨＢ株で約２倍の増加を示した（ＣＡＥＴＨＧ＿３２３１、ｑ値＝０．０２、ＣＡＥＴＨＧ＿３２２８、ｑ値＝０．０４およびＣＡＥＴＨＧ＿３２３０、ｑ値＝０．０３）。これらの観察結果によって、異種生成によるエネルギー代謝の変化が強調される。加えて、ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼをコードするＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路（ＷＬＰ）の２つの遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿１６１０、約１．４倍、ＣＡＥＴＨＧ＿１６１１、約１．２倍）と（ＦｅＦｅ）−ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿１６９１、約２．５倍）の発現は、ＰＨＢ株で上方調節された。これらの変化は、ＰＨＢ生成のためのアセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＰＨの生成に必要な増加を反映し得る（図１）。
【０１０７】
メタボロームレベルでは、ＰＨＢ株はＥＰと比較して細胞内ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比が高かった。これは、ＰＨＢ発現後のレドックス状態の潜在的な変化を示唆する。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ代謝の主な天然の副生成物であるアセテートの生成（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６１：３４５−３５１，１９９４；Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．，１８：３０２０−３０２８，２０１６）は、合成ガスのＥＰ株と比較して減少した（ｐ値＜０．０１、両側等分散ｔ検定）。製鋼オフガスでは変化は観察されなかった。
実施例６
【０１０８】
本実施例は、ゲノムスケールの代謝モデル再構築（ＧＥＭ）の結果を示す。ＰＨＢ経路を追加して、ゲノムスケールの代謝モデルＧＥＭ  ｉＣＬＡＵ７８６（Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ．，４：５０５−５１５，２０１７）を使用した。上記の全ての条件で、合成ガスで増殖したＰＨＢ株についてシミュレーションを実行した。
【０１０９】
フラックスシミュレーションにより、ＰＨＢがより高い条件（すなわち、「低バイオマス」および「ｐＨ５．５」）で散逸するＣＯ２が少ないことが確認された。加えて、以前に観察されたように（Ｖａｌｇｅｐｅａ，Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ．，４：５０５−５１５，２０１７）、これらのシミュレーションは、ＣＯ２を直接還元して、電子分岐ヒドロゲナーゼ−ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＨｙｔＡ−Ｅ／ＦｄｈＡ）酵素複合体のホルメート−Ｈ２リアーゼ活性を通してＨ２でホルメートにしたことも示した（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９５：４３７３−４３８６，２０１３）。これは、前の酵素複合体を使用したＷＬＰでのＣＯ２還元中にレドックスが消費されないため、レドックスを消費するホルメートデヒドロゲナーゼによるＣＯ２の削減よりも有利である。また、「低バイオマス」および「ｐＨ５．５」実験では、還元フェレドキシンの総量の均衡が、対照（ＰＨＢ２０）と比較して、いくつかの重要反応、例えば、ＡＯＲ（アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ）、Ｎｆｎ複合体、またはメチレンＴＨＦレダクターゼ分岐反応に対してフラックスを増加または減少させるかのいずれかによって達成されたことも観察された。
【０１１０】
驚くべきことに、「対照」条件（ＰＨＢ２０）は、「ＰＨＢｐＨ５．５」条件と比較して、インシリコで、維持ＡＴＰコスト（ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ／ｈ）および総ＡＴＰ生成からの維持ＡＴＰコスト（ｍＡＴＰ％）が低かった。
【０１１１】
ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、または還元フェレドキシン（Ｆｄｒｅｄ）がＰＨＢ生成を制限していたか否かを決定するシミュレーションも実行した。シミュレーションにより、ＡＴＰが提供されるとき、ＰＨＢ生成（ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ／ｈ）が、試験された全ての条件（すなわち、「ＰＨＢ２０」、「ＰＨＢＬｏｗＢｉｏｍａｓｓ」、「ＰＨＢｐＨ５．５」）の「制限」候補の中で最大値に達したことが示された。この観察は、ＡＴＰが制限されているアセトゲン代謝の理解と一致している（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：８０９−８２１，２０１４）。モデルはまた、ＡＴＰ制限の後に、ＰＨＢ生成がＦｄｒｅｄ、ＮＡＤＰＨ、および次にＮＡＤＨ可用性によって制限されることを示した（図８）。
【０１１２】
この結果によって、アセトゲンの高エネルギーキャリアとしてのＡＴＰおよびＦｄｒｅｄの重要性が確認された。ＡＴＰが主に同化作用および細胞維持をサポートするため、Ｆｄｒｅｄは、Ｒｎｆエネルギー節約複合体に不可欠であり（Ｂｉｅｇｅｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６８：６１３−６３４，２０１１）、Ｆｄｒｅｄのみが、ＷＬＰのカルボニル分岐でＣＯ２からＣＯへの還元のための電子を提供することが知られている（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：８０９−８２１，２０１４）。
【０１１３】
本明細書に引用される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、あたかも各参考文献が参照により組み込まれるように個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の先行技術への言及は、その先行技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０１１４】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。「から本質的になる」という用語は、組成物、過程、もしくは方法の範囲を、特定の材料もしくはステップに、または組成物、過程、もしくは方法の基本的および新規の特徴に実質的に影響しないものに限定する。代替の使用（例えば、「または」）は、代替の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味するように理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
【０１１５】
本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各個々の値を個々に言及する省略法としての役割を果たすことを単に意図し、各個々の値は、あたかも本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、任意の濃度範囲、割合範囲、比率範囲、整数範囲、サイズ範囲、または厚さ範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１／１０および１００分の１等）を含むように理解されるべきである。
【０１１６】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な文言（例えば、「等」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠ないかなる特許請求されていない要素を示すものと解釈するべきではない。
【０１１７】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形におけるいかなる組み合わせも、本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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