(57)【要約】  分散された粒子（２４ａ〜２４ｐ）を有する流体試料（２０）を分析する方法であって、試料に光を照射するステップであって、結果、光の光子（ａ〜ｄ）が粒子（２４ａ〜２４ｐ）に運動量を伝達する、照射するステップと、上記運動量の伝達によって変化している粒子（２４ａ〜２４ｐ）の少なくとも１つの特性を測定するステップとを含み、光が、伝播方向（３ａ）に沿って安定的に変化している間に、伝播方向（３ａ）に対して垂直な各平面（３６）内の２つ以上の点を指す勾配（３１ａ〜３１ｐ）を有する強度分布（３１）を有する伝播ビーム（３）、および／または、高い強度勾配によって３次元ボリューム内に粒子（２４ａ〜２４ｐ）を閉じ込めるように構成された３Ｄ渦トラップビームである、方法。  本発明による方法を実行する装置（１）であって、軸（２ａ）に沿って細長い試料（２０）を保持し、上記軸（２ａ）に沿って光のビーム（３）を通過させるように構成されているチャンバ（２）を備え、チャンバ（２）が、ビーム（３）の伝播方向（３ａ）において実質的に拡大する円錐形の内側断面を有する、装置（１）。
2020525779.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分散された粒子（２４ａ〜２４ｐ）を有する流体試料（２０）を分析する方法であって、
光の光子（ａ〜ｄ）が前記粒子（２４ａ〜２４ｐ）に運動量を伝達するように、前記試料に光を照射するステップと、
前記運動量の伝達によって変化された前記粒子（２４ａ〜２４ｐ）の少なくとも１つの特性を測定するステップとを含み、
前記光が、伝播方向（３ａ）に沿って安定的に変化している間に、前記伝播方向（３ａ）に対して垂直な各平面（３６）内の２つ以上の点を指す勾配（３１ａ〜３１ｐ）を有する強度分布（３１）を有する伝播ビーム（３）、および／または、高い強度勾配によって３次元ボリューム内に前記粒子（２４ａ〜２４ｐ）を閉じ込めるように構成された３Ｄ渦トラップビームであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ビーム（３）は、ＴＥＭ００以外の横電磁モードを有するレーザビームである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記横電磁モードが、伝播軸（３ａ）の周りに環状である、前記伝播方向（３ａ）に対して垂直な平面（３６）内に少なくとも１つの極大値（３４）を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記横電磁モードが円筒形ＴＥＭ０１＊モードである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
粒子（２４ａ〜２４ｐ）が照射されている間に到達する定常速度、前記照射の中断もしくは開始後の粒子（２４ａ〜２４ｐ）の速度の減衰もしくは構築挙動、または前記照射によって誘発される軌道角運動量もしくは回転の少なくとも１つを測定するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記伝播方向（３ａ）と実質的に平行または実質的に反対の方向に前記流体試料（２０）を流動させるステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記流量の空間分布（２６）は、所定の連続方程式を満たすように構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記流量が放物線状に流れの断面（２１ａ、２１ｂ）上で変化し、前記断面（２１ａ、２１ｂ）の中心において最高である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子のうちの残余（２４ｆ〜２４ｈ）とは異なる速度で前記伝播方向（３ａ）に移動する粒子（２４ａ〜２４ｅ）を、前記粒子のうちの前記残余（２４ｆ〜２４ｈ）から分離するステップをさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子（２４ａ〜２４ｐ）によって前記伝播方向（３ａ）に対して実質的に垂直な方向に散乱された光を捕捉するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記光の波長よりも大きい少なくとも１つの粒子（２４ａ〜２４ｐ）を不均一に照射するステップと、
前記不均一な照射によって引き起こされた前記粒子（２４ａ〜２４ｐ）の圧縮を検出するステップとをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実行するための装置（１）であって、軸（２ａ）に沿って細長く、前記軸（２ａ）に沿って光のビーム（３）を通過させるように構成された、試料（２０）を保持するためのチャンバ（２）を備え、
前記チャンバ（２）は、前記ビーム（３）の前記伝播方向（３ａ）に実質的に拡大する円錐形の内側断面を有することを特徴とする、装置（１）。
【請求項１３】
ビーム（３）を前記チャンバ（２）へと通過させるように構成されたレーザ（４）をさらに備える、請求項１２に記載の装置（１）。
【請求項１４】
前記ビーム（３）は、前記チャンバ（２）の前記内側断面（２１ａ、２１ｂ）が拡大するにつれて、前記伝播方向（３ａ）に拡大する、請求項１３に記載の装置（１）。
【請求項１５】
前記レーザ（４）と前記チャンバ（２）との間の光路内に回折光学素子（６）と列をなした半波長板（５）をさらに備える、請求項１３または１４に記載の装置（１）。
【請求項１６】
前記試料（２０）中の粒子（２４ａ〜２４ｐ）によって前記伝播方向（３ａ）に対して実質的に垂直に散乱された光のための少なくとも第１の位置感知検出器（１０）と、
前記伝播方向（３ａ）に沿って前記試料（２０）を完全に横切った光のための第２の検出器（１２）とをさらに備える、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の装置（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散された粒子を有する流体試料を分析するための光学的方法、およびこの方法を実施するのに特に適した装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ナノ粒子は、特にバイオテクノロジーおよび医薬品の分野において、将来の用途に大きい可能性を有する。しかし、不確定かつ異原性の粒子集団は、焦点が合わされ制御された用途のための分析ツールおよび高度な操作ならびに分離機器を必要とする。運動量の伝達を通じてナノサイズからミクロサイズ領域の粒子を操作するために光子を使用することができることが発見されたため、研究の取り組みは、この手法を使用した種々の応用および革新に焦点を当ててきた。この分野の特別な方法論の１つである光学力クロマトグラフィ（ＯＦＣ）が、（Ｔ．Ｉｍａｓａｋａ著「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．」（Ａｎａｌｕｓｉｓ  ２６．５：５３〜５３（１９９８）））に開示されている。この方法は、毛細管内で明確に規定された流体抗力に反作用する光学力を適用することによって、液体媒体中の不均一混合物の特性評価および分離を実現する。それ以来、この技術は成熟して多くの実験機器に結実しており、その一例が、ＬｕｍａＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．が販売しており、例えば米国特許第８，７５３，８９１号において特許を取得したレーザ力細胞診装置である。
【０００３】
これまでのところ、ＯＦＣの欠点は、濃度およびスループットに限界があることである。すべての粒子は、レーザビームに対応する１本の線に沿って並んでいる必要がある。これによって、分離領域内での粒子間相互作用に関するダイナミックレンジの限界および深刻な問題が発生する。最終的に、ＯＦＣの用途は、高く希釈された試料および特定の単一粒子の用途に限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の目的
したがって、本発明の目的は、ＯＦＣにおける粒子間相互作用の問題を軽減し、より希釈度の低い試料においてもＯＦＣの使用を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、主請求項に記載の方法およびさらなる独立請求項に記載の装置によって達成される。さらなる有利な実施形態が、従属請求項に詳述されている。
【０００６】
発明の開示
本発明者らは、分散された粒子を有する流体試料を分析するための方法を開発した。試料に光が照射され、結果、光の光子が粒子に運動量を伝達する。上記運動量の伝達によって変化する粒子の少なくとも１つの特性が測定される。
【０００７】
本発明によれば、光は、
−伝播方向に沿って安定的に変化しながら、伝播方向に対して垂直な各平面内の２つ以上の点を指す勾配を有する強度分布を有する伝播ビーム、および／または、
−高強度勾配によって、粒子を３次元ボリューム内に閉じ込めるように構成された３Ｄ渦トラップビームである。
【０００８】
本発明者らは、ＯＦＣの前述の限界の根本原因は、Ｉｍａｓａｋａによる方法の当初の概念以来使用されていたビームのタイプにあることを発見した。この光学構成は、力の誘導に標準のＴＥＭ００レーザビームプロファイルを使用する。伝播方向に対して垂直な断面では、ＴＥＭ００ビームはビームの中心に１つのみの極大値を有する。この単一の極大値は、伝播軸に沿って１本の線を規定し、ここで、運動量の伝達を受ける場合、単一の極大値を指す勾配力に起因してすべての粒子が整列する。作用空間は基本的に１次元に制限される。
【０００９】
対照的に、本発明によるビームプロファイルは、粒子が運動量の伝達を受けることができる作用空間として機能することができる３次元ボリューメトリック領域において高い強度を提供する。作用空間は、例えば、円錐形であり得る。粒子は、この３次元作用空間内でより自由度が高く、作用空間内でほぼ自由に動き、他の粒子を追い抜く場合さえある。これによって、運動量の伝達によって変化する特性の測定のダイナミックレンジ、感度およびスループットが向上する。例えば、この妨げられない運動を通じて、レーザ力によって誘導される、平衡位置に向かう粒子速度軌道が測定され得、これは、対応する粒子サイズに直接起因し得る。
【００１０】
伝播方向に対して垂直な各平面内の２つ以上の点を指す勾配を有するビームは、例えば、ＴＥＭ００以外の横方向電磁モードを有するレーザビームであり得る。そのようなモードが、断面全体に分布するいくつかの異なる極大値を有する強度プロファイルを有する場合、すなわち、粒子が１つの極大値から次の極大値に移動することができない場合であっても、これらの極大値の各々は粒子にボリューメトリック作用空間を直ちに与える。
【００１１】
そのようなビームは、伝播方向に沿った成分を有する好ましい方向で、粒子に正味の力を及ぼすことができる。流体抗力などの反作用力が一切ない場合、粒子は、流体試料を保持している容器の壁に最終的に当たるまで、この好ましい方向に安定的に移動することができる。対照的に、３Ｄ渦トラップビームは、高強度の勾配から構成される「非材料壁」によって粒子を閉じ込める。粒子は、渦トラップビームによって画定される３次元ボリューム内を自由に移動することができるが、このボリュームから出ることはできない。このボリュームは、コンテナの任意の壁から遠く離れるように構成することができ、そのため、コンテナ壁に起因する構造物が一切ない状態で粒子を調べることができる。
【００１２】
横電磁モードが使用される場合、本発明の特に有利な実施形態では、このモードは、伝播軸を中心として環状である伝播方向に対して垂直な平面内に、少なくとも１つの極大値を有する。この環状の極大値が（ビームの可能な拡大を含む）伝播軸に沿って「押し出される」と、３次元作用空間が形成され、ここで、粒子は環の周に沿った方位角方向に追加の自由度を有する。例えば、照射はまた、粒子に角運動量も伝達することができ、例えば、３次元作用空間内のらせん経路上に粒子を送る。
【００１３】
粒子に角運動量を伝達するビームの一例は、円筒形ＴＥＭ０１＊モードである。したがって、本発明の特に有利な実施形態では、このようなモードを使用して、３次元作用空間の構築と、粒子への角運動量の伝達の両方を同時に行う。
【００１４】
本発明の主な利点は、粒子への運動量の伝達の効果が研究される測定セットアップから、粒子間相互作用の効果が排除されることである。これによって、特に運動量の伝達に応じて粒子が行う運動の解析から、主な誤差の原因が排除される。したがって、本発明のさらに特に有利な実施形態では、方法は、粒子が照射されている間に到達する定常速度、照射の中断もしくは開始後の粒子の速度の減衰もしくは構築挙動、または照射によって誘発される軌道角運動量もしくは回転の少なくとも１つを測定することをさらに含む。
【００１５】
同様の誤差の原因が、運動量の伝達に起因する力が流体抗力によって増大または相殺される測定から排除される。したがって、本発明のさらに特に有利な実施形態では、この方法は、伝播方向と実質的に平行または実質的に反対の方向に流体試料を流動させることをさらに含む。
【００１６】
粒子の挙動の定量的な分析のために、流体試料を保持しているチャンバ内のすべての粒子の流体抗力が既知であることが最良である。この目的のために、好ましくは、流量の空間分布は、所定の連続方程式を満たすように構成される。例示的な実施形態では、流量は流れの断面上で放物線状に変化し得、同時に上記断面の中心で最も高い。
【００１７】
運動量の伝達によって及ぼされる力を流体抗力に対して平衡させることは、例えば、伝播の方向において、粒子のうちの残余とは異なる速度で動く粒子を、粒子のうちの上記残余から分離するために使用され得る。例えば、伝播方向に正味の動きをする粒子が、或る割合のみ存在し得、一方で、他の粒子は静止したまま、または反対方向に移動し得る。この粒子分離は、前述のＯＦＣと同様に機能するが、重要な差異がある。それは、粒子間の実際の違いによって引き起こされる粒子間の動きの違いが、もはや粒子間相互作用の効果と畳み込まれないために、例えば異なるサイズといった粒子を互いに区別できる精度が大幅に改善されることである。
【００１８】
粒子を追跡するために、好ましくは、粒子によって伝播方向に対して実質的に垂直な方向に散乱された光が捕捉される。散乱光は個々の粒子に直接起因し得、粒子を保持する領域の画像を取得することによって、多数の粒子を同時に監視することができる。
【００１９】
サイジングおよび特性評価方法は、大まかに、アンサンブル法、カウント法、および分離法に分類することができる。分離と追跡の両方を提供することによって、本発明は、組み合わせ分離−カウント法を提供する。今日使用されている主要なアンサンブル手法は、動的光散乱ＤＬＳであり、これには以下の利点がある。
【００２０】
−それが使いやすい方法であること。
−必要な試料情報量が最小限であること。
【００２１】
−非常に柔軟な試料濃度範囲にわたって使用することができること。
−非常に小さい試料サイズ（０．３ｎｍまで）を測定することができること。
【００２２】
−標準化されたプロトコルが利用可能な既知の技法であること。
ただし、以下の点が犠牲となる。
【００２３】
−高い多分散指数、ＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を有する試料は、散乱強度の差が大きいことに起因して小さい粒子をカバーする傾向があること。
【００２４】
−高ＰＤＩ試料では、平均化によって方法誤差が大きくなること。
−材料の混合が測定に影響を与え、誤差を引き起こすこと。
【００２５】
−濃度の低い粒子集団はほとんど検出することができないこと。
−濃度測定は、例えば試料透過を介してなど、間接的な方法でのみ可能であること。
【００２６】
−「ユーザーが観察可能な」測定原理ではない。
ＤＬＳと比較して、本発明による分離と追跡との組み合わせには以下のいくつかの利点がある。
【００２７】
−高ＰＤＩの影響は無視することができ、そのため、すべてのサイズピンを通じた走査が可能である。
【００２８】
−測定は直接的かつリアルタイムで観測可能な測定値であり、顧客の信頼度が増大する。
【００２９】
−検出感度は、各サイズピンにおいて単一粒子検出まで調整することができること。
−少なくとも２０ｎｍ〜１００μｍの広い範囲の粒子サイズが測定可能であること。
【００３０】
−必要な試料ボリュームが、例えば５μｌ〜１００μｌと少量であること。
−総粒子濃度および各サイズピンの粒子濃度を直接的に導出することができること。
【００３１】
−粒子を同じ測定ステップにおいて分離およびサイジングすることができること。
−トラップ、選別、または蛍光測定などの追加の動作を、同じプラットフォーム上で実行することができること。
【００３２】
−粒子の固有の特性が検出可能かつ選別可能になる（例えば、タンパク質と脂質との複数の異なる比率）こと。
【００３３】
これらの利点に対する些細な代償は、測定の物理的経路がより複雑ということである。サイズ分布は、ブラウン運動を介して直接得られるのではなく、光学的運動量の伝達によって誘発される力の差を介して得られる。また、試料に関してやや多くの情報（すなわち、屈折率）が必要である。
【００３４】
今日使用されている主なカウント法は、ナノ粒子追跡分析ＮＴＡであり、これは、ブラウン運動の速度を粒子サイズと相関させる方法である。この方法には以下の利点がある。
【００３５】
−粒子を直接視覚化することによって、顧客の高い信頼および視覚的な予備試料評価が可能になること。
【００３６】
−ブラウン運動のみが検出されるため、散乱強度はサイズ測定に一切影響を与えないこと。
【００３７】
−「ワンバイワン（1つずつ）」アプローチが、多分散性をより良好に解決すること。
−屈折率による寄与のない純粋なサイズ測定が可能であること。
【００３８】
−粒子の凝集および軟凝集がリアルタイムで観察可能であること。
−濃度測定が可能であること。
【００３９】
ただし、以下の点が犠牲となる。
−この方法は、広いサイズ分布に限定されること。「ワンバイワン（1つずつ）」アプローチに起因して、すべてのサイズピンを測定することができるとは限らないため、ＰＤＩは完全に推定可能ではない。
【００４０】
−３次元ブラウン運動の２次元検出は、固有の測定誤差をもたらすこと。
−追跡間隔が短いと、精度がさらに低下すること。
【００４１】
−ガウスビームプロファイルが、異なるサイズの粒子の測定に影響し、さらなる誤差をもたらすこと。
【００４２】
−高ＰＤＩ試料は、散乱強度の差が大きいことに起因して、小さい粒子をカバーすることができること。
【００４３】
ＮＴＡと比較して、本発明による分離と追跡との組み合わせには以下のいくつかの利点がある。
【００４４】
−粒子が測定ウィンドウを通じて自動的に輸送され、高い粒子測定統計を可能にすること。
【００４５】
−濃度比に関係なく、大小の粒子の検出が可能であり、そのため、すべてのサイズピンを評価することができ、完全なＰＤＩを推定することが可能であること。
【００４６】
−光学的に誘導される力が、好ましい方向を有することができ、結果、３次元における統計的ブラウン運動と比較して、明確な１次元測定パラメータが利用可能であること。したがって、距離、速度、および加（減）速度を、追跡アルゴリズムによって導き出すことができること。
【００４７】
−検出感度は、単一粒子の検出まで、各サイズピンにおいて調整することができること。
【００４８】
−粒子の固有の特性が検出可能であり、選別可能である（タンパク質と脂質との比率など）こと。
【００４９】
−トラップ、選別、または蛍光測定などの追加の操作を、同じプラットフォーム上で実行することができること。
【００５０】
ＤＬＳとの比較と同様に、主な代償は、試料の屈折率が分かっていることが必要であり、測定の物理的経路がより複雑ということである。
【００５１】
現在使用されている主な分離方法は、非対称フロー式フィールドフロー分別（ＡＦ４）、およびサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）であり、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）が最も顕著な実施形態である。これらの分離方法には、以下の利点がある。
【００５２】
−ＧＰＣ／ＳＥＣは非常に小さい粒子（少数のＤＡ分子）を分離可能であること。
−ＧＰＣ／ＳＥＣは、はるかに高いスループットに拡張可能であること。
【００５３】
−ＡＦ４は、１ｎｍ〜５０μｍの広い分離範囲を提供すること。
−ＡＦ４には固定相がなく、そのため、マトリックス相互作用が一切ないこと。
【００５４】
−これらの技術は十分に確立されており、そのため、承認された規格およびプロトコルが利用可能であること。
【００５５】
ただし、以下の点が犠牲となる。
−高度な訓練を受けたオペレータが必要であること。
【００５６】
−せん断劣化、カラムの目詰まり、および固定相との望ましくない相互作用によって、ＧＰＣ／ＳＥＣ測定にアーチファクトがもたらされること。
【００５７】
−マトリックス相互作用が回復の問題を引き起こすこと。
−分離と検出とは別個の装置によって実行する必要があり、分析がより複雑になること。
【００５８】
−ＧＰＣ／ＳＥＣは、より大きい分子とポリマーとをほとんど分離することができない（範囲は約２０ｎｍにおいて終端する）こと。
【００５９】
−ＡＦ４では、膜相互作用および初期分離開始条件が非常に厳密であること。
−ＡＦ４膜は消耗部品であり、設置が難しく、細孔サイズの製造ばらつきに起因して再現性が低いこと。
【００６０】
−ＧＰＣ／ＳＥＣは非常にコストがかかること。
ＧＰＣ／ＳＥＣおよびＡＦ４と比較して、本発明による分離と追跡との組み合わせには、以下のいくつかの利点がある。
【００６１】
−同種および異種試料に適用可能であること。粒子は、溶液中に存在することもでき、または、エマルジョンもしくは分散液などのコロイド系として存在することもできること。
【００６２】
−ＧＰＣ／ＳＥＣとは対照的に、固定相は不要であること。
−ＡＦ４とは対照的に、膜は不要であること。
【００６３】
−この方法は非常に感度が高く、単一粒子ろ過まで、非常に低濃度の試料に使用可能であること。
【００６４】
−動作を直接観察し、性能を評価することができること。
些細な代償として、分離ボリュームは溶媒の屈折率に依存し、分離は光学コントラストに依存する（光学コントラストが高いほど分離性能が向上する）。
【００６５】
本発明のさらに特に有利な実施形態では、光の波長よりも大きい少なくとも１つの粒子が不均一に照明され、不均一な照明によって引き起こされる粒子の圧縮が検出される。この圧縮はより正確に測定することもでき、３次元作用ボリューム内で利用可能な空間がより多いため、問題の粒子に対する照明パターンは、光を遮る他の粒子によって意図せずに変更されることはなく、問題の粒子はまた、他の粒子と直接相互作用することもない。
【００６６】
本発明による方法の主な利点は以下のとおりである。
粒子はビーム内で妨げられずに移動することができるため、光学的に誘導された力と流体抗力との間の単なる平衡位置に加えて、粒子の非平衡速度追跡が可能になる。
【００６７】
３次元作用空間のボリュームは、ＴＥＭ００モードによって形成される単なる１次元チャネルの「ボリューム」よりも何倍も大きいため、それに応じて大きい分離領域を使用して、粒子をろ過、分離、濃縮することができる。これによって、１０８粒子／ｍｌ程度の粒子濃度を使用することができるようになるが、従来技術では、低濃度試料中の単一粒子の研究しかできなかった。
【００６８】
試料のマイクロ流体流を円錐粒子閉じ込めに合わせて調整することによって、測定は高強度領域と低強度領域の両方で高感度となり、ダイナミックレンジをさらに改善することができる。
【００６９】
粒子が互いに整列する必要がないため、はるかに大きい３次元作用空間が、はるかに高いスループットを可能にする。１０６粒子／分程度のスループットに到達可能である。
【００７０】
３次元作用空間では、粒子が凝集する傾向が大幅に減少する。
本発明は、本発明による方法を実行するための装置も提供する。この装置は、試料を保持するためのチャンバを備える。チャンバは軸に沿って細長く、上記軸に沿ってビームを通過させるように構成される。
【００７１】
本発明によれば、チャンバは、ビームの伝播方向において実質的に拡大する円錐形の内側断面を有する。
【００７２】
本発明者らは、この設計が、光の光子から粒子への運動量の伝達によって誘発される力に対して、チャンバ内のマイクロ流体抗力を有利に適合させることを発見した。ビームの伝播軸に沿った異なる平衡位置が、この伝播軸に対して垂直な軸に沿った異なる距離に対応する。その結果、マイクロ流体工学的に決定される流れプロファイルに起因して、大きい粒子ほど、低光学強度領域において小さい抗力を受ける。これによって、明確で効率的かつ高感度の作用空間が作成され、感度およびダイナミックレンジがさらに向上する。
【００７３】
チャンバは、例えば、計算流体力学を使用して設計され、対応する微細加工技術を使用して製造されてもよい。
【００７４】
本発明の特に有利な実施形態では、装置は、ビームをチャンバに通過させるように構成されたレーザをさらに備える。好ましくは、チャンバの内側断面が拡大するにつれて、ビームは伝播方向に拡大する。このとき、チャンバの形状は、その中に作成された３次元作用空間の形状に最適に適合される。
【００７５】
本発明のさらに特に有利な実施形態では、レーザとチャンバとの間の光路は、回折光学素子と列をなした半波長板を備える。このセットアップを使用して、上記の方法のコンテキストにおいて最も有用であるＴＥＭ０１＊モードを形成することができる。
【００７６】
本発明のさらに特に有利な実施形態では、装置は、試料中の粒子によって伝播方向に対して実質的に垂直に散乱された光のための少なくとも第１の位置感知検出器と、伝播方向に沿って試料を完全に横切った光のための第２の検出器とをさらに備える。このとき、個々の粒子が光子からの運動量の伝達とマイクロ流体抗力との組み合わせの下でチャンバを通じて移動しているときにそれらを追跡するために、第１の検出器を使用することができる。同時に、第２の検出器を使用して、チャンバの状態を制御し、ビームプロファイルを評価することができる。
【００７７】
３次元作用空間は、試料チャンバのマイクロ流体設計とともに用いて、ＯＦＣを「特殊な用途のためのニッチな存在」から、マルチパラメータ粒子特性評価、分離、および操作プラットフォームにする。このプラットフォームは、
−粒子特性評価、
−粒子分離、ならびに、
−トラップおよび単一粒子分析、
の３つの主要な操作モードにおいて操作することができる。
【００７８】
これらのすべての動作モードは、ラベルフリー、無接触（すなわち、固定相なし）、かつ非侵襲的に、高価な医薬品または希少な生物学的抽出物向けの５μｌまでの極めて低い試料ボリュームを許容する連続フローまたは液体環境におけるバッチセットアップとして動作する。以下に、３つの動作モードを要約し、現在市販されている競合技術を参照する。
【００７９】
粒子特性評価は、例えばＤＬＳ、ＮＴＡおよびＭＡＬＳと競合する。粒子サイズおよびサイズ分布は、「粒子速度追跡」および増強された「平衡距離検出」によって、２０ｎｍ〜１００μｍの範囲内で測定することができる。粒子散乱によって、任意の選択した「サイズピン」の粒子を単一粒子感度まで視覚化することができる。
【００８０】
粒子分離は、例えばＡＦ４、ＧＰＣ／ＳＥＣ、ＦＰＬＣ、ＦＡＣＳおよびＡＵＣと競合する。粒子は、サイズを参照するか、または、粒子組成の差などの固有の特性を参照して分離することができる。このように、例えば、細胞集団を、ＦＡＣＳまたは超遠心分離と同様に選別することができる。したがって、本方法は、調整可能な膜サイズを有する機械的フィルタと同様に機能する光学フィルタを提供し得る。
【００８１】
トラップおよび単一粒子分析は、例えば、ＡＦＭ、マイクロピペット吸引、光ストレッチャ、光トラップ、マイクロ流体ラボオンチッププラットフォームと競合する。３次元作用空間内での粒子の妨げられない運動に起因して、粘弾性粒子の特性および細胞剛性が、粒子の観察される挙動から推定可能である。赤血球などの粒子の変形性を調べることができる。トラップされた、または他の様態で分離された単一の細胞または粒子は、透過光および蛍光顕微鏡法、またはラマン分光法などの他の光学的方法を使用して分析することもできる。
【００８２】
本方法および装置は、例えば、製薬産業において、
−薬物設計（例えば、ワクチン特性評価、抗体およびタンパク質ベースの薬物開発）、
−ヒト免疫ワクチン接種のためのピーナッツアレルゲンによってコーティングされたプロタミンオリゴヌクレオチドなどの薬学的に活性なナノ粒子の特性評価および分離、
−ワクチン開発（例えば、ワクチン接種の可能性を提供する外膜小胞の形成のサイズ測定および時間関連定量化）、
−製剤開発（例えば、治療薬投与のための乳化制御、またはマイクロエマルジョンの物理的パラメータ）、
−オンライン品質管理（例えば、微粒子形成制御、充填密度評価、産業用マイクロ流体スタックのバイパス評価、または化学療法用のドキシル−リポソーム製剤）、
のために使用されてもよい。
【００８３】
本方法および装置は、例えば、
−赤血球の変形能（例えば、糖尿病診断のためのヘモグロビンのグリコシル化）、または、
−細胞粘弾性特性の測定（例えば、がん細胞は正常細胞に対して細胞軟化を示す）、
を研究するための医学的および臨床的診断に使用されてもよい。
【００８４】
本方法および装置は、例えば、ナノサイズの食品添加物の開発（例えば、立体安定性測定を介した香味料および栄養素のナノカプセル化）のために食品産業で使用されてもよい。
【００８５】
本方法および装置は、例えば、化粧品および香水産業において、
−リポソームクリーム製剤の特性評価（例えば、ニオソームの研究開発）、
−日焼け止め、化粧品およびクリームに使用される粒子の特徴、または、
−香りの保持に使用されるナノ粒子の特性評価、
のために使用されてもよい。
【００８６】
本方法および装置は、例えば、バイオテクノロジーにおいて、
−細菌の細胞外膀胱の研究（例えば、検出、定量化およびサイジング）、または、
−微生物叢の研究および特性評価、
のために使用されてもよい。
【００８７】
図面の説明
以下では、本発明を、範囲を限定することを一切意図することなく、図を使用して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】装置１のプロトタイプ実施形態の概略図である。
【図２】いくつかの使用可能な横電磁モードの図である。
【図３】３Ｄ円錐形状作用空間の光線光学モデルの図である。
【図４】粒子分離中に予想され得る顕微鏡写真の例示的な図である。
【図５】粒子の速度を追跡することができる顕微鏡写真の例示的な図である。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
図１は、装置１のプロトタイプの実施形態を示している。装置１は、流体試料２０を収容するためのチャンバ２を備えている。試料２０は、マイクロ流体シリンジポンプ１５によって、１ｍｌシリンジから０．１〜１０μｌ／分の速度で２０μｌ試料ループ１６を通り、直径約６００μｍの１０μｌ溶融シリカ毛細管チャンバ２へと圧送され、チャンバ２を右から左へと横切る。チャンバ２を横切った後、試料２０は試料収集器１７によって収集される。チャンバ２は、軸２ａで細長くなっている。
【００９０】
５３２ｎｍ  ＤＰＳＳレーザ４から放出される光が、対物レンズ８ａと絞り８ｂとを備える空間フィルタ８を通過する。第１のレンズ７ａによって、光は、第２のレンズ７ｂによって再集束される前に、溶融シリカ半波長板５および回折光学素子６を通過する平行ビームに変換される。このようにして、規定の環サイズを有する円筒形のＴＥＭ０１＊モードから実質的になるビーム３が形成され、言い換えれば、対物レンズ８ａの焦点領域におけるレーザビームプロファイルは、渦変換されて環状モードになる。
【００９１】
チャンバ２は透明であり、対物レンズ１０ａおよびカメラ１０ｂを備える位置感知検出器１０によって観察することができる。この位置感知検出器１０は、チャンバ２内の試料２０によって伝播方向３ａに対して垂直な方向に散乱された光、および、補助光源９からチャンバ２を通過し同じ方向に透過した補助光を捕捉することができる。
【００９２】
チャンバ２を通過した後、ビーム３の一部分は、ビームスプリッタ１１によって分割され、レンズ１２ａとカメラ１２ｂとを備える第２の検出器１２に供給される。ビームスプリッタ１１は、レーザ４が非常に強い（例えば、３ＷのＣＷ出力）ため、強度を低減する役割を果たす。したがって、ほとんどの強度は、ビームダンプ１３において破棄される。
【００９３】
カメラ１０ｂおよびカメラ１２ｂの両方からの画像情報は、コンピュータ１４によって記録され、コンピュータ１４はまた、レーザ４およびマイクロ流体シリンジポンプ１５も制御する。
【００９４】
図２は、本発明のコンテキストにおいて使用可能な２つの例示的なモードについて、伝播方向３ａに対して垂直な平面３６におけるレーザビーム３の強度分布３１を示している。
【００９５】
図２ａは、円筒形ＴＥＭ０１＊モードを示している。断面の様々な領域の強度が、各領域を埋めるドットの密度によって示される。円３２の内側および円３５の外側では、強度が消失するため、これらの領域はドットで埋められていない。円３２から半径方向外側に移動すると、比較的低い強度の領域に行き当たり、この領域から、円３３ａおよび円３３ｂによって境界付けられる比較的高い強度の領域に移行することになる。後者の領域内で、環状強度極大値が円３４によって示される。円３３ｂと円３５との間には、比較的強度の低いさらなる領域がある。より低い強度からより高い強度を指す様々な例示的な勾配３１ａ〜３１ｐを図２ａに示す。
【００９６】
円３３ａと円３３ｂとの間の高強度領域が、図面の平面に対応する平面３６から伝播方向３ａに沿って「押し出される」と、この領域は、流体試料２０に含まれる粒子２４ａ〜２４ｐがビーム３からの運動量の伝達によって駆動されて移動し得る連続的な３次元作用空間を形成する。具体的には、この空間内で、粒子２４ａ〜２４ｐは互いに追い越し合い、環の円周を回って方位角方向にも（例えば、極大値を表す円３４に沿って）移動する可能性がある。したがって、伝播方向３ａに沿った前進運動と組み合わさって、粒子２４ａ〜２４ｐの運動は、例えばらせん運動になり得る。
【００９７】
図２ｂは、本発明のコンテキストにおいて使用可能な別のモードを示している。これは円筒形ＴＥＭ０２モードである。強度プロファイル３１は、基本的に、低強度領域３７ａおよび高強度領域３８ａが埋め込まれた第１のローブと、低強度領域３７ｂおよび高強度領域３８ｂが埋め込まれた第２のローブと、低強度領域３７ｃおよび高強度領域３８ｃが埋め込まれた第３のローブと、低強度領域３７ｄおよび高強度領域３８ｄが埋め込まれた第４のローブとに分割される。
【００９８】
各高強度領域３８ａ〜３８ｄは、平面３６から伝播方向３ａに押し出されると、試料２０に含まれる任意の粒子２４ａ〜２４ｐに対するそれ自体の作用空間を形成する。しかしながら、粒子２４ａ〜２４ｐは、そのような領域３８ａ〜３８ｄから別の領域に移動することはできない。
【００９９】
図３は、散乱力Ｆｓｃａｔがチャンバ２内の流体抗力Ｆｄｒａｇとどのように平衡するかを示しており、散乱力Ｆｓｃａｔを理解するために、光線光学モデルが使用される。強度プロファイル３１を有するビーム３の伝播方向３ａに沿って、チャンバ２の断面２１ａ、２１ｂは、ビーム３が拡大するにつれて実質的に拡大する。これによって、ビーム３の伝播方向３ａとは反対の方向に左側の入口２２から右側の出口２３に流れる試料２０の流量２６が、断面２１ａ、２１ｂの中心で最大となる放物線状に変化し、一方、強度プロファイル３１を有するビーム３の強度は断面２１ａ、２１ｂの中心で最小となる。
【０１００】
粒子２４ｃ〜２４ｐは様々なサイズを有し、それらは、両方とも粒子サイズとともに増加する散乱力Ｆｓｃａｔおよび抗力Ｆｄｒａｇを受ける。その結果、両方の力が平衡状態にあるチャンバ２内の位置は、異なるサイズの粒子２４ｃ〜２４ｐに対して異なる。これを使用して、粒子をそれらのサイズに従って分離することができる。
【０１０１】
図３の右側には、４つの例示的な光子ａ〜ｄからの運動量の伝達によって、ビーム３の強度プロファイル３１が例示的な粒子２４ａおよび２４ｂに力を及ぼす様子が概略的に示されている。光子ａ〜ｄがプロセス中に散乱される方向、および衝突時に各光子ａ〜ｄが粒子２４ａ〜２４ｂに及ぼす力が示される。厳密に言えば、レーザビーム３の強度が高いということは、１秒あたりより多くの光子が粒子２４ａ、２４ｂに衝突することを意味する。図３の部分光線光学モデルでは、これは、より強い力を及ぼす強度分布３１のより高い強度の領域から入来する光子によってモデル化される。
【０１０２】
すべての衝突する光子によって粒子２４ａ、２４ｂに加えられる合計の力は、伝播方向３ａに平行な方向の成分Ｆｓｃａｔ、および、伝播方向３ａに対して垂直な、強度極大値に向かう方向における成分Ｆｇｒａｄを有すると理解することができる。
【０１０３】
図１および図３において説明したセットアップでは、粒子への力の伝達は１ｐＮ〜１ｎＮ程度であり得る。試料２０の液体は、例えば、水、ＥｔＯＨ、またはイソプロパノールであってもよい。濃度勾配によって、液体環境に追加の力が導入され得る。
【０１０４】
図４は、試料２０が異なるサイズの粒子２４ａ〜２４ｇを含む場合に、図１に示される装置１のカメラ１０ｂ上で予測され得る顕微鏡画像を示している。図４に示す例では、試料２０は、ポリスチレンビーズが水の中で非常に高く希釈された試料である。ビーズは、図４において５つの例が２４ａ〜２４ｅとラベル付けされている、各々が９４０ｎｍのサイズのビーズの第１の部分と、図４において３つの例が２４ｆ〜２４ｈとラベル付けされている、各々が２００ｎｍのサイズのビーズの第２の部分とを含む。
【０１０５】
より大きいビーズ２４ａ〜２４ｅは、レーザビーム３による照射からより大きい力を受けるため、それらはチャンバ２の左側の第１の領域２５ａに蓄積する。一方、小さいビーズ２４ｆ〜２４ｈは、右側で、チャンバ２の右側の第２の領域２５ｂに蓄積する。領域２５ａおよび２５ｂの幅は、ビーズ群２４ａ〜２４ｅおよび２４ｆ〜２４ｈにおける分散度の測度である。
【０１０６】
図４に示される粒子のサイズは、相対的な縮尺では描かれていない。すなわち、２００ｎｍサイズのビーズ２４ｆ〜２４ｈは、９４０ｎｍサイズのビーズ２４ａ〜２４ｅのサイズの４分の１未満に描かれていない。この理由は、粒子２４ａ〜２４ｈによって散乱される光の画像では、両方のタイプの粒子がほぼ同じサイズにされてしまうためである。
【０１０７】
図５は、異なるサイズの３つの例示的な粒子２４ａ〜２４ｃが、右から左に向けられるレーザビーム３からの散乱力、および、左から右に向けられる流体流からの抗力を受けている間に、いくつかの画像フレームｉ）〜ｉｖ）の期間にわたって追跡されるときに、図１に示す装置１のカメラ１０ｂ上で予測され得る顕微鏡画像を示す。図４とは対照的に、粒子２４ａ、２４ｂ、および２４ｃ間のサイズ差は、これらの粒子間の区別をよりよく視覚化するために、図５では誇張されたスケールで描かれている。
【０１０８】
粒子２４ａは最大の粒子であり、フレームｉ）〜ｉｖ）のシーケンス内で右から左に最も速く移動する。粒子２４ｂは最小の粒子であり、最も遅く移動する。粒子２４ｃは、粒子２４ａのサイズと粒子２４ｂのサイズとの間のサイズを有する。粒子２４ｃは粒子２４ａと同時にチャンバ２の左側に到達するが、フレームｉ）内で粒子２４ａよりも左側から移動し始めている。したがって、粒子２４ｃは、粒子２４ａよりも低速に移動するが、粒子２４ｂよりも高速に移動する。
【０１０９】
粒子２４ａ〜２４ｃの速度は、それらのサイズに数学的に相関させることができ、そのため、個々の粒子２４ａ〜２４ｃを追跡することによって、それらのサイズを決定することができる。
【０１１０】
参照記号のリスト
１  装置
２  チャンバ
２ａ  チャンバ２の軸
３  ビーム
３ａ  ビーム３の伝播方向
４  レーザ
５  半波長板
６  回折素子
７ａ，７ｂ  レンズ
８  空間フィルタ
８ａ  空間フィルタ８の対物レンズ
８ｂ  空間フィルタ８の絞り
９  補助光源
１０  位置感知検出器
１０ａ  検出器１０の対物レンズ
１０ｂ  検出器１０のカメラ
１１  ビームスプリッタ
１２  透過光の検出器
１２ａ  検出器１２のレンズ
１２ｂ  検出器１２のカメラ
１３  ビームダンプ
１４  コンピュータ
１５  マイクロ流体シリンジポンプ
１６  試料ループ
１７  試料収集器
２０  流体試料
２１ａ，２１ｂ  チャンバ２の断面
２２  チャンバ２の入口
２３  チャンバ２の出口
２４ａ〜２４ｐ  粒子
２５ａ，２５ｂ  サイズの異なる粒子２４ａ〜２４ｈが集まる領域
２６  チャンバ２の流量の空間分布
３１  ビーム３の強度分布
３１ａ〜３１ｐ  強度分布３１の勾配
３２  低強度領域の内部限界
３３ａ  高強度領域の内部限界
３３ｂ  高強度領域の外部限界
３４  環状強度極大値
３５  低強度領域の外部限界
３６  伝播方向３ａに対して垂直な平面
３７ａ〜３７ｄ  低強度領域
３８ａ〜３８ｄ  高強度領域
ａ〜ｄ  光子
Ｆａ〜Ｆｄ  光子ａ〜ｄが及ぼす力
Ｆｄｒａｇ  流体抗力
Ｆｇｒａｄ  低強度に向かう勾配力
Ｆｓｃａｔ  光誘導散乱力
ｘ，ｚ  座標軸
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2020525779.tif 000010
2020525779.tif 000011
2020525779.tif 000012
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