(57)【要約】ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴというＰＡＣＥ４の腫瘍促進性選択的スプライシングアイソフォーム、抗体などのＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物、および前立腺癌などの癌を検出するためのその使用を提供する。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、患者において癌を治療する方法、および癌を検出するためのＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬を含んでなるキットも提供する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において癌を検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記対象から生体サンプルを得る工程と、
ｂ）前記生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの存在を検出することにより、前記癌を検出する工程と、
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
工程ｂ）が、
ｂｉ）分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体の形成を可能にするような条件下で、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬を前記生体サンプルと接触させる工程と、
ｂｉｉ）工程ｂｉ）の前記分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体を検出することにより、前記癌を検出する工程と、
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの存在の検出の前または後に、ＧＤＦ−１５の発現を検出する工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ＦＬの存在を検出し、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ／ＰＡＣＥ４−ＦＬの比を計算する工程をさらに含んでなり、２を超える比が前記癌の存在を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、血液サンプル、尿、組織検体、生検針洗浄液、または循環細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物が、抗体、ペプチド、プライマー、またはプローブである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはポリクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、ニワトリ、ロバ、ラクダ、アルパカ、シチメンチョウ、またはウサギ抗体である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が配列番号９に特異的に結合する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出されるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴがタンパク質または核酸分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブがオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブが配列番号５または６を含んでなる塩基配列に特異的に結合する、請求項６または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ｃ）分析物−ＰＡＣＥ４ａｌｔＣＴ複合体を検出する検出剤を適用する工程をさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出剤を、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫細胞化学、免疫組織化学、ＰＣＲ、またはＲＴ−ＰＣＲによって検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを質量分析により検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量分析により検出する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が、肺、甲状腺、副腎、精巣、子宮内膜、膵臓、食道、前立腺、卵巣、肝臓、乳房、結腸、胃、腎臓、膀胱、脳、子宮頸部、およびリンパ組織の少なくとも一つにある、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が前立腺癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象のサンプルにおける癌を検出するためのＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬の使用。
【請求項２２】
前記サンプルが、血液サンプル、尿、組織検体、生検針洗浄液、または循環細胞である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記分析物が、抗体、ペプチド、プライマー、またはプローブである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはポリクローナル抗体である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記抗体が、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、ニワトリ、ロバ、ラクダ、アルパカ、シチメンチョウ、またはウサギ抗体である、請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記抗体が配列番号９に特異的に結合する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体が、配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
検出されるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴがタンパク質または核酸分子である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記プローブがオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子である、請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
前記プローブが、配列番号５または６を含んでなる塩基配列に特異的に結合する、請求項２３または２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを質量分析またはＥＬＩＺＡにより検出する、請求項２１に記載の使用。
【請求項３３】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量分析により検出する、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記癌が、肺、甲状腺、副腎、精巣、子宮内膜、膵臓、食道、前立腺、卵巣、肝臓、乳房、結腸、胃、腎臓、膀胱、脳、子宮頸部、およびリンパ組織の少なくとも一つにある、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記癌が前立腺癌である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する抗体。
【請求項３７】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはポリクローナル抗体である、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、ニワトリ、ロバ、ラクダ、アルパカ、シチメンチョウ、またはウサギ抗体である、請求項３６または３７に記載の抗体。
【請求項３９】
前記抗体が配列番号９に特異的に結合する、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４１】
癌を検出および／または治療するための請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４２】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、患者において癌を治療する方法。
【請求項４３】
前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、抗体、またはペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ペプチドが、以下の式：
Ｙ−Ａｒｇ４−Ｘａａ３−Ｘａａ２−Ａｒｇ１−ＮＨ２
を含んでなり、
式中、
−Ａｒｇ１は、アルギニンまたはアルギニン誘導体であり；
−Ｘａａ２およびＸａａ３は、任意のアミノ酸またはその立体異性体であり、
−Ｙは、存在しないか、または式Ｚ−Ｘａａ８−Ｘａａ７−Ｘａａ６−Ｘａａ５を含んでなり、式中、
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇからなる群から独立して選択され、
Ｚは、存在しないか、または前記ペプチド配列のＮ末端に結合したＮ末端アシル基を含んでなり、
ただし、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、芳香族または負に帯電したアミノ酸ではない、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８が、正に帯電したアミノ酸またはその立体異性体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
Ｘａａ３がＶａｌである、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｘａａ２およびＸａａ３が、ＧｌｙおよびＡｌａから独立して選択される、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
Ｘａａ２がＬｙｓまたはＡｒｇである、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８が、脂肪族の疎水性アミノ酸である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記脂肪族の疎水性アミノ酸がＬｅｕ、Ｉｓｏ、またはＶａｌである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８がＬｅｕである、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ペプチドが、
Ａｃ−ＬＬＬＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−ＬＬＬＩＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＩＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−ＬＬＩＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＩＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−ＬＬＬＱＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＱＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ａｚａβ３Ｌ］ＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］；Ａｃ−ＬＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］；またはＡｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］
からなる、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはポリクローナル抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、またはウサギ抗体である、請求項４３または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が配列番号９に特異的に結合する、請求項４３、５４、および５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が、配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する、請求項４３および５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４、５、および６からなる群から選択される配列に相補的である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、１２，１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
患者において癌を治療するためのＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤の使用。
【請求項６０】
前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、抗体、またはペプチドである、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記ペプチドが、以下の式：
Ｙ−Ａｒｇ４−Ｘａａ３−Ｘａａ２−Ａｒｇ１−ＮＨ２
を含んでなり、
式中、
−Ａｒｇ１は、アルギニンまたはアルギニン誘導体であり；
−Ｘａａ２およびＸａａ３は、任意のアミノ酸またはその立体異性体であり；
−Ｙは、存在しないか、または式Ｚ−Ｘａａ８−Ｘａａ７−Ｘａａ６−Ｘａａ５を含んでなり、式中、
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇからなる群から独立して選択され、
Ｚは、存在しないか、または前記ペプチド配列のＮ末端に結合したＮ末端アシル基を含んでなり、
ただし、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、芳香族または負に帯電したアミノ酸ではない、
請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８が、正に帯電したアミノ酸またはその立体異性体である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
Ｘａａ３がＶａｌである、請求項６１または６２に記載の使用。
【請求項６４】
Ｘａａ２およびＸａａ３が、ＧｌｙおよびＡｌａから独立して選択される、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６５】
Ｘａａ２がＬｙｓまたはＡｒｇである、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６６】
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８が、脂肪族の疎水性アミノ酸である、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６７】
前記脂肪族の疎水性アミノ酸が、Ｌｅｕ、Ｉｓｏ、またはＶａｌである、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８が、Ｌｅｕである、請求項６１〜６７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６９】
前記ペプチドが、以下：
Ａｃ−ＬＬＬＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−ＬＬＬＩＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＩＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−ＬＬＩＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＩＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−ＬＬＬＱＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＱＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；
Ａｃ−［Ａｚａβ３Ｌ］ＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］；
Ａｃ−ＬＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］；または
Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］
からなる、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７０】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはポリクローナル抗体である、請求項６０に記載の使用。
【請求項７１】
前記抗体が、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、またはウサギ抗体である、請求項６０または７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記抗体が配列番号９に特異的に結合する、請求項６０、７０、および７１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７３】
前記抗体が、配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する、請求項６０および７０〜７２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７４】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４、５、および６からなる群から選択される配列に相補的である、請求項６０に記載の使用。
【請求項７５】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる、請求項６０に記載の使用。
【請求項７６】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤および担体を含んでなる、癌を検出および／または治療するための組成物。
【請求項７７】
前記ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤が、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の抗体またはｓｉＲＮＡである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４、５、および６からなる群から選択される配列に相補的である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる、請求項７７または７８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月２９日に出願された米国仮出願第６２／４２７，２０９号、２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６５，２７６号の利益を主張し、その内容をその全体で参照により本明細書に援用する。
【０００２】
ＰＡＣＥ４の選択的スプライシング（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ）、ならびに癌を検出および／または治療するためのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍の中で、前立腺癌（ＰＣａ）は、依然として男性において最も一般的な癌の種類であり、米国では毎年２３３，０００件の症例があり、全新規症例の２７％を示し、癌関連死亡率の２番目の死因でもある。前立腺癌（ＰＣａ）がその早期の進行ステージで診断された場合、臨床的介入は、疾患の進行を回避し、５〜１５年にわたって高い生存率を生み出すことができる。しかしながら、診断時または腫瘍再発後に腫瘍が転移性播種を開始した場合、生存率が著しく低下し、約７５％の症例で５年以内に患者が死亡する。また、不活性状態に留まる癌と高リスクの悪性腫瘍との識別を可能にするマーカーは事実上存在しない。さらに、進行性ＰＣａの管理に使用されるほとんどの抗悪性腫瘍薬は、従来の化学療法およびアンドロゲン軸操作薬（androgen axis manipulating agent）に限定されている。血管新生因子（抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ）、チロシンキナーゼ受容体および下流の成長促進経路、成長因子および活性プロテアーゼ、例えばメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、またはＡディスインテグリン、およびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）を含む様々な分子標的が治療用に考えられているが、患者で試験したときに充分な生存率の上昇はもたらされなかった。未だ探索されていない生体経路から生じる新規の治療手段が、単独で、または共同標的（co-target）として、解決手段を提供する可能性がある。
【０００４】
未だ完全に定義されていない潜在的な標的の中には、プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）がある。これらの酵素は、プロタンパク質基質の翻訳後プロセシングに関与し、９つのメンバー、すなわち；ｆｕｒｉｎ、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／６、ＰＣ７、ＰＣ１／３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＣＳＫ９、およびＳＫＩ−１から構成される。最初の７つは、コンセンサス切断部位がＲ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｒ↓である、対の塩基性残基で切断するカルシウム依存性セリンプロテアーゼである。ＰＣは、腫瘍細胞によって過剰発現される癌関連タンパク質基質、例えば、プロテアーゼのＡＤＡＭファミリーのメンバー、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ＭＭＰ、およびＩＧＦ１Ｒファミリーメンバーの活性を増強することができるため、悪性腫瘍と緩やかに関連している。
【０００５】
ＰＣのうち、ＰＡＣＥ４は、癌細胞系アッセイにおいて悪性転換と関連している。しかしながら、ヒトにおいて、ＰＡＣＥ４の過剰発現と癌との関連は明確であり、ＰＣａ腫瘍におけるＰＡＣＥ４の過剰発現が観察されたが（非特許文献１）、他のＰＣのレベルは、著しく変わることはなかった。ＰＣａ異種移植動物モデルにおけるＰＡＣＥ４の分子サイレンシングは腫瘍増殖を阻害したが、他のＰＣの分子サイレンシングは阻害しなかったため、動物モデルを用いたその後の研究は、ＰＡＣＥ４過剰発現がＰＣａ腫瘍進行における役割を有するという仮説を支持した（非特許文献２）。これらの観察により、分子サイレンシングを模倣し、ＰＣａの異種移植モデルにおいて抗腫瘍特性を示し、細胞の静止状態を増加させ、腫瘍血管新生を減少させる、ＰＡＣＥ４阻害剤の開発（特許文献１および特許文献２）がなされた（非特許文献３）。この著しい進歩およびインビボでの実証実験にもかかわらず、ＰＣａ細胞における持続的ＰＡＣＥ４過剰発現に関する機構に関してはまだほとんど分かっておらず、ＰＡＣＥ４レベルが疾患の転帰、例えば腫瘍の攻撃性および／または患者の生存と関係がある可能性に関して疑問が残っている。様々な報告が、ＰＡＣＥ４発現の空間的および時間的調節、ならびに胚発生段階の調節におけるその役割を指摘している。しかしながら、様々な癌の種類において、変形性関節症およびアテローム性動脈硬化症において、組織全体でレベルが変動するにもかかわらず、病態生理学においてＰＡＣＥ４発現の調節に関する情報は比較的少ない。癌細胞においてＰＡＣＥ４特異的基質は同定されておらず、ＰＡＣＥ４ノックダウン癌細胞の観察された表現型に関与する基質の同一性は説明されていないままである。したがって、観察された薬理効果は広範な下流因子の結果であると述べる以外に、連続性のＰＣａ疾患（the continuum of PCa disease）における治療標的として、または潜在的なバイオマーカーとしてのＰＡＣＥ４の位置づけを完全に理解することはできない。
【０００６】
ＰＣａ細胞は、抗アンドロゲン療法に急速に順応し、それにより、アンドロゲン非依存性になるため、抗アンドロゲン療法の抗増殖効果を阻止することが知られている。それにもかかわらず、今日使用されているＰＣａ管理のためのほとんどの治療法は、アンドロゲンをベースとする作用機序を有する。この不変の連続作用（this unchanged continuum）とは対照的に、研究者らは、受容体を活性化するためのアンドロゲン−受容体リガンド要件を替えるために（アウトロー経路（outlaw pathway）としても知られる）、または発癌遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子経路への作用により、増殖、血管新生、免疫抑制などの重要な癌細胞の能力を直接調節するために使用される、無差別成長因子経路（promiscuous growth factor pathway）などの非アンドロゲン性経路を明らかにするように試みた。正常な前立腺では、成長因子は、前立腺の成長および分化の調節においてパラクリンおよびオートクライン微調節剤として作用するように分泌される。しかしながら、ＰＣａ細胞が出現する場合、より重要な場合として疾患が早期から末期に進行する場合、成長因子およびそれらの受容体ならびに浸潤促進性（pro-invasive）マトリックス修飾酵素におけるいくつかの変化は、パラクリン媒介の持続的増殖からオートクライン媒介の持続的増殖への劇的な変化をもたらす。これらの変化が癌性形質転換の原因であるのか、または付随的であるのかは、ＰＣａの強い異質性が分かり、明らかにすることが難しい場合が多い。
【０００７】
したがって、癌治療用の新規分子標的を提供することが、非常に望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００３２３１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０２９１８０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】D’Anjou et al., 2011, Translational Oncology, 4: 157-172
【非特許文献２】Couture et al., 2012, Neoplasia, 14: 1032-1042
【非特許文献３】Levesque et al., 2015, Oncotarget, 6: 3680-3693
【発明の概要】
【００１０】
本開示において、対象において癌を検出する方法であって、前記対象から生体サンプルを得る工程と；前記生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの存在を検出することにより、前記癌を検出する工程とを含んでなる、前記方法が提供される。
【００１１】
本開示において、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する抗体も提供される。
【００１２】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬、および使用説明書を含んでなるキットがさらに提供される。
【００１３】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体の形成を可能にするような条件下で、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬を生体サンプルと接触させることと；分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体を検出することにより、癌を検出することとを含んでなる。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書に記載の方法は、生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの存在の検出の前または後にＧＤＦ−１５の発現を検出する工程をさらに含んでなる。
【００１５】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ＦＬの存在を検出し、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ／ＰＡＣＥ４−ＦＬの比を計算する工程をさらに含んでなり、ここで、２を超える比が癌の存在を示す。
【００１６】
追加的な実施形態において、サンプルは、血液サンプル、尿、組織検体、生検針洗浄液、または循環細胞である。
【００１７】
別の実施形態において、分析物は、抗体、ペプチド、プライマー、またはプローブである。
【００１８】
別の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはポリクローナル抗体である。
【００１９】
他の実施形態において、抗体は、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、ニワトリ、ロバ、ラクダ、アルパカ、シチメンチョウ、またはウサギ抗体である。
【００２０】
追加的な実施形態において、抗体は、配列番号９に特異的に結合する。
【００２１】
別の実施形態において、抗体は、配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する。
【００２２】
他の実施形態において、検出されるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴは、タンパク質または核酸分子である。
【００２３】
一実施形態において、核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子である。
【００２４】
一実施形態において、プローブは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子である。
【００２５】
別の実施形態において、プローブは、配列番号４、５、または６を含んでなる塩基配列に特異的に結合する。
【００２６】
他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる。
【００２７】
別の実施形態において、本明細書に記載の方法は、分析物−ＰＡＣＥ４ａｌｔＣＴ複合体を検出する検出剤を適用する工程をさらに含んでなる。
【００２８】
一実施形態において、検出剤を、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫細胞化学、免疫組織化学、ＰＣＲ、またはＲＴ−ＰＣＲによって検出する。
【００２９】
他の実施形態において、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを質量分析により検出する。
【００３０】
追加的な実施形態において、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量分析により検出する。
【００３１】
他の実施形態において、癌は、肺、甲状腺、副腎、精巣、子宮内膜、膵臓、食道、前立腺、卵巣、肝臓、乳房、結腸、胃、腎臓、膀胱、脳、子宮頸部、およびリンパ組織の少なくとも一つにある。
【００３２】
特定の実施形態において、癌は、前立腺癌である。
【００３３】
一実施形態において、本明細書に記載のキットは、ＰＡＣＥ４−ＦＬに特異的に結合する分析物特異的試薬をさらに含んでなる。
【００３４】
別の実施形態において、本明細書に記載のキットは、分析物を検出する検出剤をさらに含んでなる。
【００３５】
対象のサンプルにおける癌を検出するための、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬の使用がさらに提供される。
【００３６】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、患者において癌を治療する方法も提供される。
【００３７】
一実施形態において、阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、抗体、またはペプチドである。
【００３８】
別の実施形態において、ペプチドは、以下の式：
Ｙ−Ａｒｇ４−Ｘａａ３−Ｘａａ２−Ａｒｇ１−ＮＨ２；
を含んでなり
式中、
−Ａｒｇ１は、アルギニンまたはアルギニン誘導体であり；
−Ｘａａ２およびＸａａ３は、任意のアミノ酸またはその立体異性体であり；かつ
−Ｙは、存在しないか、または式Ｚ−Ｘａａ８−Ｘａａ７−Ｘａａ６−Ｘａａ５を含んでなり、式中、
Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇからなる群から独立して選択され；
Ｚは、存在しないか、または前記ペプチド配列のＮ末端に結合したＮ末端アシル基を含んでなり；
ただし、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、芳香族または負に帯電したアミノ酸ではない。
【００３９】
他の実施形態において、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、正に帯電したアミノ酸またはそれらの立体異性体である。
【００４０】
別の実施形態において、Ｘａａ３はＶａｌである。
【００４１】
補助的な実施形態において、Ｘａａ２およびＸａａ３は、ＧｌｙおよびＡｌａから独立して選択される。
【００４２】
一実施形態において、Ｘａａ２はＬｙｓまたはＡｒｇである。
【００４３】
別の実施形態において、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８は、脂肪族の疎水性アミノ酸である。
【００４４】
別の実施形態において、脂肪族の疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕ、Ｉｓｏ、またはＶａｌである。
【００４５】
追加的な実施形態において、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、およびＸａａ８はＬｅｕである。
【００４６】
別の実施形態において、ペプチドは、Ａｃ−ＬＬＬＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−ＬＬＬＩＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＩＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−ＬＬＩＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＩＬＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−ＬＬＬＱＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＱＲＶＫ−［ＡＭＢＡ］；Ａｃ−［Ａｚａβ３Ｌ］ＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］；Ａｃ−ＬＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］；Ａｃ−［Ｄ−Ｌｅｕ］−ＬＬＬＲＶＫ−［ΔＲ−ＣＯＯ］からなる。
【００４７】
患者において癌を治療するためのＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤の使用が提供される。
【００４８】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、患者において癌を治療する方法も提供される。
【００４９】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤および担体を含んでなる、癌を治療するための組成物がさらに提供される。
【００５０】
一実施形態において、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの阻害剤は、抗体またはｓｉＲＮＡである。
【００５１】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号４、５、および６からなる群から選択される配列に相補的である。
【００５２】
別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に示される塩基配列を含んでなる。
【００５３】
ここで、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＰＡＣＥ４発現が前立腺癌の腫瘍の攻撃性と相関することを示す。（Ａ）新鮮な前立腺組織検体におけるＰＡＣＥ４発現レベルのｑＰＣＲ分析は、レベルと腫瘍グリーソンスコアとの間の有意な相関関係を示す。（Ｂ）Broad/Cornel Nature Genetics 2012およびMSKCC Cancer Cell 2010を使用し、c-BioPortal for Cancer Genomicsを使用して行った類似解析。（Ｃ〜Ｈ）タンパク質レベルでのＰＡＣＥ４発現の付随的増強を示す、ＰＣａ代表検体におけるＰＡＣＥ４  ＩＨＣ（触媒ドメインターゲティング抗体を使用）、ここで、r値はスピアマンの相関係数であり、スケールバーは２００μｍを表す。
【図２】ＰＡＣＥ４末端エキソンの選択的スプライシングが、３’ＵＴＲの短縮をもたらし、ｍＲＮＡ転写物を安定化させることを示す。（Ａ）アガロースゲル上で泳動された（第２レーン）、エキソン２３でプライミングされたＬＮＣａＰ  ３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物は、コンセンサス３’ＵＴＲ長（予想された長さ：１３３５ｂｐｓ  ３’ＵＴＲに対応する１５６４ｂｐｓ）、ならびに２つの代替３’ＵＴＲ長（２つのポリＡ部位の存在による代替ポリアデニル化によって引き起こされる、それぞれ１６４および１１８ｂｐｓの３’ＵＴＲに対応する３４１ｂｐｓおよび３９７ｂｐｓ）を示す。ここで、ＰＣＲ産物は、スパニングプライマーを使用するネステッドＰＣＲにより両方を確認した（第３レーン）。第１および第５レーンは、ＤＮＡ長ラダーであり、第４レーンは、テンプレートとして同等に希釈した出発ｃＤＮＡを使用するネステッドＰＣＲ用ネガティブコントロールである。（Ｂ）エキソン、３’ＵＴＲの位置および長さ、ならびに３’ＲＡＣＥおよびＴＰ−ＰＣＲに使用されるプライマー設計、ならびに代替第２５エキソンの関連（respected）スプライシングモチーフを包含する、ゲノム上およびｍＲＮＡ転写物上のＰＣＳＫ６の３’末端を表す。（Ｃ）ＴＰ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡを使用）による、様々な一般的に使用されている細胞株のスクリーニングは、この選択的スプライシングイベントが細胞内で通常起こることを示す。（Ｄ）ＬＮＣａＰ細胞で行われたアクチノマイシン−Ｄ追跡とその後のｑＰＣＲは、代替の短縮３’ＵＴＲを有する転写物が、コンセンサスなものと比較して安定性が増強されたことを示す。（Ｅ）ｍｉＲＤＢおよびＲｅｇＲＮＡ２．０ツールを使用して両方の３’ＵＴＲにおいて得られたｍｉＲＮＡの推定部位。（Ｆ）異なるＰＡＣＥ４  ３’ＵＴＲを保有するホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いるルシフェラーゼレポーターアッセイは、３’ＵＴＲスイッチングによって誘発されたタンパク質産生の増強を示す。（Ｇ）各レーンの上部に示されているプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動であり、最初の３つのレーンは、それぞれ１）ＴＰ−ＰＣＲおよび各個々の反応（２および３）であり、レーン４および５は、１／６２５当量のＰＣＲ産物、またはネガティブコントロールとして働くｃＤＮＡ同等物（レーン６）を使用して行った、エキソン２４とエキソン２５ａｌｔとの間のジャンクションに広がるプライマーを使用するセミネステッドＰＣＲである。（Ｈ）ＰＡＣＥ４−ＦＬプライマー（パネルＧ参照）または（Ｉ）ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴプライマー（パネルＧ参照）のいずれかを使用して、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰの両方についての安定なＰＡＣＥ４ノックダウン細胞株からのｃＤＮＡ調製物について行ったＲＴ−ｑＰＣＲ分析，ＰＡＣＥ４をノックダウンするために使用されるｓｈＲＮＡは、ＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡ中のエキソン２を標的とする。両方のスプライス変異体について、ノックダウンレベルは同様であった。
【図３】ＰＡＣＥ４選択的スプライシングが前立腺癌検体において強く増強され、腫瘍の攻撃性と相関することを示す。（Ａ）代替エキソン含有ＰＡＣＥ４転写物についての強い濃縮を示す、マッチさせた正常（ＡＮＣＴ）および癌性前立腺組織（ＰＣａ）に対して行ったＴＰ−ＰＣＲ。（Ｂ）コンセンサスおよび代替の第２５エキソンを保有する転写物の両方についてのペアの腫瘍サンプルとＡＮＣＴサンプルとの間の変化倍率のｑＰＣＲ定量のチューキーのボックスプロットは、代替ＰＡＣＥ４について７．９５倍強い識別能を示す。（Ｃ）腫瘍グリーソンスコアに従って提示されているパネル（Ｂ）からのデータ。（Ｄ）前立腺における免疫染色の異なる細胞内分布パターン，ＰＡＣＥ４−ＦＬは、膜／細胞周囲染色を示し、一方、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴは、より細胞内染色を示す，スケールバーは２００μｍを表す。
【図４】ＰＡＣＥ４選択的スプライシングおよびポリアデニル化が、ＣＴＣＦ媒介エキソン包含に依存し、エキソン内のＤＮＡメチル化により調節されることを示す。（Ａ）報告されたＣｈｉＰ−Ｓｅｑ濃縮配列およびそれらの関連転写因子を包含するＰＡＣＥ４末端エキソンのＵＣＳＣゲノムブラウザビュー。TargetScanからのｍｉＲＮＡもまた、転写レベルおよび多数の脊椎動物間のアラインメントと共に示されている。（Ｂ）ペアのＡＮＣＴおよびＰＣａ組織において分析されたＣｐＧジヌクレオチドメチル化（ｎ＝１３ペア）。（Ｃ）ＣＴＣＦを標的とするｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞のｑＰＣＲ分析。（Ｄ）ｓｉＣＴＣＦトランスフェクト細胞の全細胞溶解抽出物。（Ｅ）ｓｉＣＴＣＦおよびコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞においてｑＰＣＲによって測定されたＰＡＣＥ４エキソン第２５のスプライシング指数。（Ｆ）５−アザ−ｄＣで７２時間処理されたＤＵ１４５およびＬＮＣａＰにおいてｑＰＣＲおよびＴＰ−ＰＣＲ（Ｇ）によって測定されたスプライシング指数（それぞれ、約１．５〜２の倍化時間に相当）。（Ｈ）５−アザ−ｄＣで７２時間処理した、または処理しなかったＤＵ１４５（およびＬＮＣａＰ）細胞において抗ＣＴＣＦおよび正常のＩｇＧで行ったＣｈＩＰ，入力ＤＮＡのパーセンテージは、正常ウサギＩｇＧで行ったＣｈＩＰと比較した変化倍率として報告されており、ポジティブコントロールは（Ｋｃｎｑ５遺伝子）である。
【図５】ＰＣＳＫ６遺伝子中の目的のＣｐＧジヌクレオチドを低メチル化するときのデシタビン（５−アザ−ｄＣ）の効率を示す。（Ａ）エキソン２４、エキソン２５、およびエキソン２５  ａｌｔの間のコード領域および非コード領域を強調している、ＰＣＳＫ６遺伝子の３’末端の略図。ここで、ＵＣＳＣゲノムブラウザＣｈｉＰ−Ｓｅｑで見られるＣｈｉＰ−Ｓｅｑ濃縮領域が楕円として表されており、分析された各ＣｐＧヌクレオチドが強調表示されており、５’および３’末端の逆位が読みやすくするために示されている。（Ｂ）ＤＵ１４５細胞およびＬＮＣａＰ細胞（Ｃ）を示された濃度のデシタビンで７２時間処理し（培地およびデシタビンを２４時間ごとに補充した）、ＤＮＡを抽出し、パイロシークエンシングを使用するＣｐＧメチル化状態分析に使用した。大部分のＣｐＧは用量依存的にデシタビンに対して感受性であり、ＤＵ１４５はＬＮＣａＰと比較してより高い応答を示し、これはおそらく、ＤＵ１４５の増殖速度がより速いことによるものであり、デシタビンは、エピジェネティックなマークを維持するように有糸分裂中にデノボ合成ＤＮＡに対して主に作用するＤＮＭＴの阻害剤であり、結果は、少なくとも３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６】複数のヒト組織におけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのマッピングを示し、様々な癌の種類が、共通の腫瘍分子スイッチ機構を表す。（Ａ）ｑＰＣＲ（スプライシング指数）による、またはＴＰ−ＰＣＲによる、プールされたヒト臓器からの標準的なＲＮＡ調製物におけるＰＡＣＥ４第２５エキソンｍＲＮＡスプライシング分析。（Ｂ）１７種類の癌性および非癌性組織ｃＤＮＡにおいて測定されたスプライシング指数。（Ｃ）正常組織と癌性組織との間の平均変化倍率として報告されている、利用可能な癌の種類における全ての試験したＰＣの定量化。（Ｄ）組織マイクロアレイ上の様々な臓器からのマッチさせた正常組織および癌性組織に対して行ったＰＡＣＥ４  Ｃ末端のＩＨＣ，ここで、可視化された組織切片が、試験された両方の抗体について並べられており、スケールバーは１００μｍを表す。
【図７】代替Ｃ末端を有するＰＡＣＥ４は、同等に活性であるが、細胞によって差次的に保持されることを示す。（Ａ）エキソン２５がコードする代替Ｃ末端アミノ酸配列。（Ｂ）Ｖ５タグ付きＰＡＣＥ４−ＦＬまたはＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのいずれかでトランスフェクトされたＬＮＣａＰの分泌動態は、培地中で特有の分泌レベルを示す。ここで、「Ｃ」および「Ｍ」は、それぞれ細胞溶解物および培地を示す。（Ｃ）総体積（培地について）／ゲルにロードされたタンパク質量の割合に基づく細胞内および分泌ＰＡＣＥ４の定量的表示または割合。（Ｄ）安定発現Ｓ２細胞の馴化培地、ブランクの役割をするトランスフェクトされていないＳ２細胞からの馴化培地内で得られた両方のＰＡＣＥ４アイソフォームの酵素活性およびＭＬ−ペプチド阻害剤による阻害プロファイル。（Ｅ）ＩＰ−ＭＳに使用された溶解物に対して行った免疫沈降のウエスタンブロット。（Ｆ）３つのＩＰ条件におけるＰＡＣＥ４由来トリプシン消化ペプチドの積分した曲線下面積（ＡＵＣ）は、両方の条件において強い濃縮を示す（ｎ＝６）。（Ｇ）トランスフェクトされていない細胞（ｎ＝６）において行ったＩＰと比較した、一過性に発現するＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞の非変性溶解物において行ったＶ５抗体免疫沈降（ＩＰ）からの選択されたタンパク質の濃縮倍率。（Ｈ）〜（Ｋ）Ｖ５ならびにＲＣＡＳ１（Ｈ）、Ｒａｂ５（Ｉ）、Ｒａｂ７（Ｊ）、およびＲａｂ９（Ｋ）を用いた共焦点画像および定量的共局在分析。ここで、計算値は、異なる露光設定を考慮して、各マーカーについてのみ（ＩＦ間ではない）互いに相対的である。（Ｍ）４０μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を添加した後のＶ５タグ付きＰＡＣＥ４−ＦＬまたはＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのいずれかからのＬＮＣａＰ細胞溶解物は、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴが細胞によって強く保持されるということだけでなく、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのレベルがＰＡＣＥ４−ＦＬよりも経時的により安定した状態を保つことを示す。（Ｎ）ＨＥＫ２９３、ＤＵ１４５、およびＬＮＣａＰにおけるＣＨＸ−追跡中の溶解物中のタンパク質含有量の定量分析。
【図８】トランスフェクト細胞におけるＰＡＣＥ４タンパク質安定性および自己活性化を示す。（Ａ）ＰＡＣＥ４−ＦＬまたはＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのいずれかをコードするｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５  ＨｉｓＡによるトランスフェクション後、細胞をシクロヘキシミド（最終濃度：４０μｇ／ｍＬ）で、０、１、２、および４時間の時点で処理した。ＰＡＣＥ４プロドメインプロセシングを、ウエスタンブロットデンシトメトリーによって測定し（ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５についてそれぞれ（Ｂ）および（Ｃ））、ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５について成熟／プロタンパク質間の比として報告した。タンパク質レベルが一部の場合においてかなり減少し、不正確な定量をもたらしたたため、この分析では６時間の時点を除外した。細胞溶解物ならびに培地（Ｄ）および（Ｅ）を、それぞれ示された時点で回収し、抗Ｖ５抗体または抗ベータアクチン抗体の両方を用いてウエスタンブロットにより分析し、３つの独立した実験からの代表実験を示す。
【図９】ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴが前立腺癌細胞における持続的増殖能力に関与していることを示す。（Ａ）安定なｐＬｅｎｔｉ６トランスフェクトＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＡＣＥ４レベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｂ）両方のアイソフォームについての安定過剰発現ＬＮＣａＰ細胞株のウエスタンブロット（タグなし；触媒ドメイン指向性抗体（catalytic domain oriented antibody）を使用）。（Ｃ）ヒストグラムは、安定細胞溶解物（ｎ＝７）におけるデンシトメトリー分析によって、プロ形態と成熟形態の両方の合計で割った成熟の比によって測定した自己活性化を示す。示されているブロットは（Ｂ）と同じであるが、露光量が低い。（Ｄ）安定過剰発現ＬＮＣａＰ細胞株に対して行ったコロニー形成アッセイ，画像は代表染色ウェルを示す。（Ｅ）ＬＮＣａＰ細胞におけるノックダウンレベルを評価するためのトランスフェクションの４８時間後のＰＣのｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｆ）トランスフェクトＬＮＣａＰ細胞溶解物および無血清馴化培地のウエスタンブロット分析。（Ｇ）２００細胞／ウェルの密度で播種したトランスフェクトＬＮＣａＰ上での１２日間のコロニー形成アッセイ，代表視野が、ＳｉＮｏｎ−Ｔａｒｇｅｔトランスフェクト細胞と比較した相対的定量の上に示されている。（Ｈ）トランスフェクションの７２時間後にＤＵ１４５トランスフェクト細胞で行ったＸＴＴ増殖アッセイ。
【図１０】前立腺癌細胞におけるＰＡＣＥ４特異的基質としてのＧＤＦ−１５の同定および検証を示す。（Ａ）ノックダウン、過剰発現、および阻害剤処理ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ（Ｂ）株における候補ＰＣ基質のウエスタンブロット。（Ｃ）成熟ＧＤＦ−１５が培地中に分泌されていることを示す、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞におけるＧＤＦ−１５の発現。（Ｄ）ＥＬＩＳＡによって測定したＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ馴化培地中のＧＤＦ−１５濃度。（Ｅ）ＬＮＣａＰ細胞パネルにおけるＧＤＦ−１５切断分析。（Ｆ）ＥＬＩＳＡによって測定した馴化培地中のＧＤＦ−１５濃度。（Ｇ）ＭＬ−ペプチドまたは細胞不透過性類似体（ＰＥＧ８−ＭＬ）のいずれかで処理したＬＮＣａＰにおけるＧＤＦ−１５切断分析。（Ｈ）ＨＰＬＣによりモニタリングしたＰＡＣＥ４およびｆｕｒｉｎによるＧＤＦ−１５スパニングペプチド切断，スパニングペプチド配列において切断部位に下線が引かれている，関連画分を回収して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりペプチド同一性を確認した。（Ｉ）ペアの隣接非癌性組織（ＡＮＣＴ）および前立腺組織（ＰＣａ）のウエスタンブロット分析。（Ｊ）様々な癌の悪性度を示すブロットが、２１の組織ペアのデンシトメトリー分析と共に示されている（ｎ＝６（３＋３），７（３＋４），６（４＋３），２（５＋Ｘ）Ｘは３および４である）。
【図１１】ウエスタンブロットによるＰＣ基質の分析を示す。（Ａ）ＤＵ１４５溶解物および（Ｂ）培地、ならびに（Ｃ）ＬＮＣａＰ溶解物および（Ｄ）培地のイムノブロッティング，馴化培地からのタンパク質のクーマシー染色も、ローディングコントロールとして与えられている。
【図１２】ＰＣａ患者におけるＰＡＣＥ４およびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの血漿濃度を示す。（Ａ）ＰＣａ患者および正常患者からの血漿中の総ＰＡＣＥ４およびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのＥＬＩＳＡ測定濃度。個々のデータ点はそれぞれドットとして示されており、バーはＳＥＭと共に平均を表す。（Ｂ）各ＰＣａ患者についてのＰＡＣＥ４およびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの濃度間の相関分析，破線は線形回帰を表す。（Ｃ）総ＰＡＣＥ４の濃度および相関分析。（Ｄ）ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ濃度。（Ｅ）患者の腫瘍グリーソンスコア別の正常およびＰＣａ患者の血漿中のＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ／総ＰＡＣＥ４比，個々のデータ点はそれぞれドットとして示されている。データは平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
詳細な説明
本開示において、ＰＡＣＥ４の腫瘍促進性選択的スプライシングアイソフォーム（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴと呼ばれる）が提供される。
【００５６】
プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）は、現在、広範な癌関連タンパク質の活性化を介した悪性腫瘍への関与が認められている。薬剤標的としてのＰＣの利用に重要なことは、ＰＣの細胞機能および分子機能の理解である。依然として男性で最も罹病率の高い癌である前立腺癌において、プロタンパク転換酵素ＰＡＣＥ４（ＰＣＳＫ６遺伝子名）は、腫瘍進行におけるその重要性が実証されているため、魅力的な標的として提案されている。ＰＣは、多数の発癌過程の上流に位置するため、癌治療薬の開発のための有望な標的として示唆されている。癌の重要な特徴の全てに関係するメディエーターを含むプロタンパク質の細胞内タンパク質分解性プロセシングにより、ＰＣによる活性化は、軸成分の過剰発現後の生物活性に関する利得（例えば、成長因子受容体軸によるシグナル伝達の増加）間の制限的なステップであることが分かった。この理由のために、ＰＣ基質が癌細胞によって過剰発現されてオートクライン刺激を最大化するならば、完全な生物学的成果を得るためには、ＰＣ活性に関する付随的増加が達成されなければならない。したがって、ＰＣの過剰発現が多くの癌の種類で実証されていることが分かっても驚くことではないが、多くの研究は、ＰＣの活性を単一のメンバー、すなわちｆｕｒｉｎに帰属させることのみを研究または想定していることが多いため、発現が増加したと報告されたＰＣは、全ての癌において一致しておらず、このことは、腫瘍の種類における差異および／または完全なＰＣスキャニングが存在しないことを説明し得る。
【００５７】
本明細書において、ＰＡＣＥ４は、腫瘍の攻撃性と相関して、前立腺癌において過剰発現されるが、ＰＡＣＥ４はまた、Ｃ末端修飾アイソフォーム（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴと呼ばれる）を生じる腫瘍促進性選択的スプライシングイベントを受けることが示されている。ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でのマッピングは、様々な種類の癌において強い腫瘍反応性を示した。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの生物学的キャラクタリゼーションは、ＰＡＣＥ４と同等の酵素活性を示した。末端エキソン置換はまた、ｍＲＮＡ安定化および自己活性化率の増強を介して、癌細胞におけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ発現および発癌活性を促進する。置換された末端エキソンの周囲における低メチル化はスプライシングの増加をもたらしたので、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの開始（initiation）は、この領域におけるＤＮＡメチル化に感受性である。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴは、細胞内に保持され、癌細胞増殖の増加をもたらす明確な局在化パターンを有する。前立腺癌におけるＰＡＣＥ４特異的基質は、本明細書に開示されており、その中には増殖分化因子１５がある。
【００５８】
現在、かなりの量のデータにより、プロタンパク質転換酵素ＰＡＣＥ４は、様々な癌関連タンパク質の活性化／成熟による様々な腫瘍促進過程の上流にあるため、前立腺癌および他の悪性腫瘍において魅力的な標的を表すことが示されている。前立腺癌におけるＰＡＣＥ４過剰発現が、腫瘍グリーソンスコアと相関することと、まだ報告されていない選択的スプライシングイベントが、この過剰発現過程の間に出現し、ｍＲＮＡ安定化、自己活性化の増強、および細胞における明確な局在化パターンを介してＰＡＣＥ４発現／活性を促進する発癌性をもたらす（pro-oncogenic）特徴を有するＣ末端修飾アイソフォームを生じさせることが示されている。このスプライス変異体は、正常組織にはほとんど見られないが、胎児組織および様々な悪性腫瘍に共通しているエピジェネティック制御に感受性であり、ＰＡＣＥ４発現を促進するように癌細胞によって回復される厳密制御分子スイッチが示唆される。さらに、増殖分化因子１５は、ＰＡＣＥ４活性（PACE4 activity）としても、腫瘍関与バイオマーカーとしても役立ち得る、前立腺癌細胞における第１のＰＡＣＥ４特異的基質として報告されている。
【００５９】
ＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡおよびタンパク質、ならびに細胞の移動および基質のプロセシングに大きな影響を与える重要な転写後の変化が示されている。ＰＡＣＥ４選択的スプライシングは、ＰＣａにおいてＰＡＣＥ４発現を調節する手段として記載されている。ＰＣＲおよび３’ＲＡＣＥによるＰＡＣＥ４スプライシングの分析は、ＰＣａ細胞が、選択的切断およびポリアデニル化をもたらすスプライシングイベントを利用して、ＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡ  ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を置換し、それにより、ｍＲＮＡの安定性を高め、Ｃ末端修飾タンパク質アイソフォーム（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ）の発現を促進し、その活性および細胞内での保持を調節することを明らかにした。このまだ報告されていないスプライス変異体は、ＰＣａ組織、ならびに他の癌の種類、例えば、限定はされないが、肺癌、甲状腺癌、および副腎癌などにおいて、ｍＲＮＡおよび結果として生じるタンパク質アイソフォームの両方のレベルで強くアップレギュレートされる。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴアイソフォームは、細胞内に保持され、その親アイソフォームとは異なる細胞分布パターンを有する。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴはまた、その触媒的自己活性化も促進され、癌細胞におけるＰＡＣＥ４活性の増加と、細胞増殖能力の増強もさらに持続させる。複数のヒト組織および腫瘍におけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのマッピングは、内因性発現パターンが限られていることを明らかにし、最高レベルは胎児組織および様々な腫瘍の種類で見られた。このことは、癌細胞が利用する増殖条件下で持続的なＰＡＣＥ４活性を可能にする、厳密に調節された機構を示唆する。ＰＡＣＥ４選択的スプライシングは、前立腺の正常組織と癌組織との間で異なるエキソン内のＤＮＡメチル化にさらに関連しており、代替エキソンにおける局所的低メチル化およびＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）のＤＮＡ結合後に好ましい末端エキソン置換をもたらす。最後に、プロテオームベースのセクレトーム解析により、ＰＣａにおける新規のＰＡＣＥ４基質としての増殖分化因子１５（ＧＤＦ−１５）の同定が可能になった。
【００６０】
ＰＡＣＥ４過剰発現が前立腺腫瘍における安定した特徴であるのか、または腫瘍の攻撃性の指標であるのかを検討するために、新鮮なマッチさせた正常および癌性一次組織検体を得、ＲＮＡ抽出および分析に用いた。リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析は、ＰＡＣＥ４過剰発現が、腫瘍サンプルにおいて明らかに認められることと、そのレベルが腫瘍グリーソンスコアと密接に相関していることとを示した（図１Ａ，ｒ＝０．４６０１，Ｐ値＝０．００３７）。患者の術前血中前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルおよび／または腫瘍の病期分類を用いた同様の分析では、有意な相関は示されなかった。この観察は、cBioPortal for Cancer Genomicsを使用して検索された２つの異なるデータセットで得られた同様の結果によって支持された（Cerami et al., 2012, Cancer Discov, 2: 401-404; Gao et al., 2013, Sci Signal, 6, pl1）（図１Ｂ）。タンパク質触媒ドメインを標的とするポリクローナル抗体を用いた様々な腫瘍悪性度からの検体の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析は、悪性度が高い病巣ほどレベルが増加して過剰発現が再び見られたため、これらの結果を裏付けている（図１Ｃ）。腫瘍がある腺および正常な腺において、ＰＡＣＥ４は、大部分が前立腺組織上皮細胞内に局在し、より低い程度で間質細胞内に局在していた。上皮の染色強度は、腫瘍性病巣の悪性度が増加するとともに、すぐに増加したが、間質の染色は変化しなかった。
【００６１】
選択的スプライシングの使用は、現在、増殖を持続させる遺伝子の発現を促進するために癌細胞が使用する重要な機構として認識されている。最近明らかにされたより正確な機構は、発癌遺伝子および癌原遺伝子の３’ＵＴＲ領域が短縮され、これにより、マイクロＲＮＡによる抑制などの翻訳後調節機構からの回避による遺伝子発現のアップレギュレーションがさらに可能となるというものである。ＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡは、１５ｑ２６．３遺伝子座に位置する１８６ｋｂｓ  ＰＣＳＫ６遺伝子がコードする９６９アミノ酸長のタンパク質（配列番号１）であり、当該遺伝子座は、ＰＣａ検体（OncomineTMデータベース）において頻繁な変化を受けやすいと報告されている遺伝子座（配列番号２に示される部分塩基配列）ではない。ＬＮＣａＰ細胞におけるｃＤＮＡ末端の３’迅速増幅（３’ＲＡＣＥ）およびＴＰ−ＰＣＲによるＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡ３’末端の分析は、コンセンサス１３３５ヌクレオチド長３’ＵＴＲ（配列番号４）の存在を明らかにしたが、短縮３’ＵＴＲ（１６４ヌクレオチド，配列番号６；図２Ａ）の存在の存在も明らかにした。これらの産物の長さ、ならびにネステッドＰＣＲおよびアンプリコンシークエンシングは、２５番目のコンセンサスに使用されるエキソンの６．３ｋｂｓ下流に位置する遠位末端エキソンを組み込むための代替ポリアデニル化の使用を示した（図２Ｂ）。様々な癌細胞株を、その代替末端エキソンの組み込みについて、スリープライム（three prime）ＰＣＲ（ＴＰ−ＰＣＲ；図２ＣおよびＧ参照）により評価し、本発明の新規の選択的スプライシングイベントを確認した。エキソン２を標的とするｓｈＲＮＡを用いてＰＡＣＥ４をノックダウンしたところ、両方のスプライス変異体がダウンレギュレートされ、両方の転写物が同じ遺伝子から容易に得られ、同じコード部分を有することが確認された（図２ＨおよびＩ）。興味深いことに、最も高いスプライシング指数を有する細胞が、ＬＮＣａＰ  ＰＣａ細胞およびＡ５４９肺癌細胞において観察された。
完全にＰＡＣＥ４陰性であったＷｉ３８正常肺線維芽細胞を除いて、ほとんどの細胞が、代替エキソンを含むＰＡＣＥ４転写物（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ）を発現した。
【００６２】
したがって、
ＡＤＥＴＦＣＥＭＶＫＳＮＲＬＣＥＲＫＬＦＩＱＦＣＣＲＴＣＬＬＡＧ（配列番号８）；
からなるエキソン２５配列を含んでなるネイティブのＰＡＣＥ４タンパク質と比較して、
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴは、
ＧＤＩＷＱＲＬＥＴＦＷＶＶＴＴＧＲＭＹＳＨＰＶＧＧＧＱＥＣＣ（配列番号９）
からなるエキソン２５の代替配列を本質的に含んでなる。
【００６３】
コンセンサスおよび代替の３’ＵＴＲの両方の配列をＲｅｇＲＮＡおよびｍｉＲＤＢを使用するｍｉＲＮＡ部位の予測に付したところ、３’ＵＴＲの性質およびｍＲＮＡ安定性の調節におけるそれらの役割と一致して、配列内の予測されたｍｉＲＮＡ部位に関して著しい違いが示され、長い３’ＵＴＲと比較して、短縮３’ＵＴＲ内で、部位は約９０％少なかった。興味深いことに、TargetScanによって予測されたｍｉＲ−９、−２１、−１２４、および−５４３のｍｉＲＮＡ調節部位は、ＰＡＣＥ４転写物から全て取り除かれている。ｍｉＲ−１２４（ＰＣａにおいて通常ダウンレギュレートされる腫瘍抑制ｍｉＲＮＡ）およびｍｉＲ−２１は、両方ともＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡ発現の負の調節因子として実証されており、そのため、この３’ＵＴＲスイッチによるｍｉＲＮＡ回避が示唆される。アクチノマイシン−Ｄ追跡とその後のＲＴ−ｑＰＣＲは、短縮３’ＵＴＲを有する転写物は、コンセンサスなものと比較して、経時的により安定なものとなりやすく、計算された半減期は、３倍超で長かった（図２Ｅ）。ｐＭＩＲベクターでホタルルシフェラーゼの下流の短縮およびコンセンサス３’ＵＴＲの両方をクローニングした後に行ったルシフェラーゼレポーターアッセイもまた、短縮３’ＵＴＲとコンセンサス３’ＵＴＲを比較して、トランスフェクトされた細胞株においてホタルの産生が約２倍増幅されたため、３’ＵＴＲ短縮によるｍＲＮＡの安定性の増強と整合するものであった（図２Ｆ）。これらのデータは、ＰＡＣＥ４  ｍＲＮＡが、２つの異なる３’ＵＴＲ、コンセンサスＰＡＣＥ４転写物（ＰＡＣＥ４−ＦＬ）、または代替Ｃ末端（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ）を有し得ることを示す。
【００６４】
ＰＡＣＥ４が腫瘍の攻撃性と相関してＰＣａ細胞において強く過剰発現されるという事実に基づいて、ペアにした前立腺隣接非癌性組織（ＡＮＣＴ）および腫瘍組織を、代替およびコンセンサスｍＲＮＡ終始エキソンの両方を増幅するＴＰ−ＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲにより、両方のＰＡＣＥ４スプライス変異体について分析した。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ  ｍＲＮＡは、腫瘍検体でのみ観察可能であり、ＡＮＣＴのマッチさせた検体では非常に低いレベルまたは検出不可能なレベルであった（図３Ａ）。ＲＴ−ｑＰＣＲによる分析は、これらの結果を確証し、代替エキソンが腫瘍領域と正常領域の間で約８倍高い識別力を有することを示し、ＰＡＣＥ４−ＦＬでは約３０倍であったことと比較して、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ  ｍＲＮＡでは最大２５０倍の差があった（図３Ｂ）。腫瘍グリーソンスコアで層別化した場合（図３Ｃ）、変化倍率は、両方のスプライス変異体で増加を示した。ＰＡＣＥ４には他のスプライス変異体があることが報告されているため（Tsuji et al., 1997, Journal of Biochemistry, 122: 438-452）、ＡＮＣＴおよび癌組織のペアを、エンドポイントＲＴ−ＰＣＲによりＰＡＣＥ４スプライシングイベントの比較プロファイリングに付して、特に代替末端エキソン置換を含むAceViewデータベースに従って全てのエキソン−エキソンジャンクションをマッピングした。反応の中で、３つの潜在的に活性なスプライス部位、（ｉ）エキソン４スキッピング、（ｉｉ）エキソン１８スキッピング（それぞれ、第１８エキソンを有する、または有しない、ＰＡＣＥ４−ＩおよびＰＡＣＥ４−ＩＩ変異体としても報告されていいる（Tsuji et al., 1997, Journal of Biochemistry, 122: 438-452）、および（ｉｉｉ）第２５エキソン置換に着目した。トランケート型ＰＡＣＥ４触媒ドメインをもたらすエキソン４スキッピングは、以前に、乳癌の潜在的なバイオマーカーとして報告されたが、この場合、検出することができたエキソン４スキッピングは非常に少なく、２５ペアのＡＮＣＴおよび腫瘍検体におけるＲＴ−ｑＰＣＲによる分析の後、弱いスプライシングイベントの腫瘍特異性は観察されなかった。エキソン１８スキッピングは、非常に活性なスプライシングイベントであり、ＰＡＣＥ４のＲＧＤモチーフとＣｙｓリッチドメインとの間の１．５ｋＤａの短いタンパク質セグメントをコードするエキソンを有する、または有しない約１：１の転写物が得られることが分かった。第１８エキソンの包含率は、ＡＮＣＴと腫瘍検体との間で一定であることが分かった。
【００６５】
２つのスプライス変異体がコードする２つの異なるＣ末端を利用して、ポリクローナル抗体を作製し、ウサギ抗血清からアフィニティー精製して、両方のタンパク質アイソフォームを識別した。ウエスタンイムノブロッティングでは性能が不充分であるにもかかわらず、ＰＡＣＥ４ノックダウン細胞株を用いて形成された異種移植組織によって示されるように、抗体はＩＨＣを解釈可能なものとした。両方の抗体を用いたＰＣａ検体におけるＰＡＣＥ４のＩＨＣ（図３Ｄ）は、ｍＲＮＡで観察されたように、両方のアイソフォームが腫瘍細胞で過剰発現されやすいことと、腫瘍性病巣の悪性度が増加するとともに、レベルが増加することとを示した。一方、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの染色は、腫瘍上皮内で強い陽性シグナルを示し、正常上皮には全く存在しなかった。ＰＡＣＥ４−ＦＬに関しては、ＩＨＣは前立腺間質で顕著であったが、程度は低いが、上皮にも存在した。さらに、ｍＲＮＡ分析から予測されるように、正常前立腺と腫瘍細胞との間のＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ染色強度の差は、ＰＡＣＥ４−ＦＬについて観察された差よりもはるかに大きかった（図３ＢおよびＣ）。興味深いことに、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの細胞分布パターンは、細胞の内側で主に小胞性（vesicular）で現れ、ＰＡＣＥ４−ＦＬの場合はそうではなかった（より細胞表面で出現する）。
【００６６】
ＰＡＣＥ４末端エキソンスプライシングを調節する機構をさらに調べるために、ゲノム配列をＵＣＳＣゲノムブラウザで視覚化して、代替エキソンの周囲環境にＤＮＡ相互作用タンパク質を配置させた。興味深いことに、タンパク質ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）は、クロマチン免疫沈降とその後のシークエンシングデータベース（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ；図４Ａ）によると、３つの報告された結合部位を有することが分かった。ＣＴＣＦは、エキソン内領域における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの結合を介して上流のエキソンの包含を調節することが最近報告されている。興味深いことに、９つのＣｐＧジヌクレオチドがこれらのＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ濃縮配列内に位置していた（図５Ａ）ため、類似の調節機構が示唆された。注目すべきことに、一部の細胞株における転写レベルを評価するＲＮＡ−ｓｅｑデータは、コンセンサス第２５エキソンから代替第２５エキソンまで転写が依然として維持されることを示した（図４Ａ）。また、代替第２５エキソンは、霊長類でのみ保存されているが（図４Ａ）、他の利用可能な脊椎動物被験体では完全に存在せず、これは、選択的スプライシングの共通の特徴である。
【００６７】
ＡＮＣＴおよびＰＣａの癌性検体の両方からのＤＮＡを、代替末端エキソン内の異なるＣｐＧのメチル化状態について分析し、有意な腫瘍特異的ＣｐＧ低メチル化が、エキソン内および上流のＣＴＣＦ結合部位で見られた（図４Ｂ）。興味深いことに、観察された低メチル化は、他の周囲の遺伝子座がこれらの患者の正常組織および腫瘍に影響を及ぼさなかったため、これらの遺伝子座に特有であった。このような局所的低メチル化は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によるメチル化からＤＮＡを保護する、ＤＮＡ修飾または結合因子の遺伝子座特異的動員によって媒介される厳密な調節機構を示す。ＣＴＣＦ自体がＤＮＡメチル化パターンを調節し得ることだけでなく、癌性細胞または不死化細胞が、正常細胞と比較して、ゲノム上の異なったＣＴＣＦ結合ランドスケープを有し、メチル化関連調節の複雑性をさらに包含し、遺伝子座特異的な様式で対処される場合に、より一層複雑性を包含することが示された。
【００６８】
ＤＵ１４５細胞およびＬＮＣａＰ細胞において、ｓｉＲＮＡを用いてＣＴＣＦを一過的にサイレンシングさせ、７２時間後に測定したＰＣＡＥ４−ａｌｔＣＴ／ＰＡＣＥ４−ＦＬ  ｍＲＮＡＳの測定比は、ＣＴＣＦと共に、結果的に減少を示し（図４Ｃ〜Ｅ）、スプライシング指数は、両方の細胞株において７０％減少し、ＣＴＣＦによるエキソン２５置換の直接的調節を示す。５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）としても知られているデシタビンでこれらの細胞を処理した場合（図５）、スプライシング指数は、処理した細胞において用量依存的に増加し、観察された選択的スプライシングとＤＮＡメチル化との間の関係を示唆する（図４ＦおよびＧ）。抗ＣＴＣＦ抗体を用いたＣｈＩＰ実験により、ＣＴＣＦが、代替末端エキソンの５’および３’のイントロン領域内、ならびに代替エキソン自体内でＤＮＡに容易に結合することが実証された（図４Ｈ）。デシタビン処理細胞（ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ）でＣｈＩＰを実施した場合、これらの領域についての明らかな濃縮を、エキソン内領域および上流領域において観察することができ、ＤＮＡメチル化依存性ＣＴＣＦ結合およびエキソン包含促進が確認された。ＤＵ１４５（図４Ｈ）は、デシタビンの存在下で７２時間の間で、ＬＮＣａＰよりも細胞分裂周期が多かったことの結果である可能性が最も高いが、（図５に見られるように）より重要な差異を示し、より強いゲノム低メチル化をもたらした。
【００６９】
ＰＣａサンプルにおいてＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ  ｍＲＮＡの発現が増加したことを鑑みて、発現パターンを他の組織または他の癌の種類において観察した。正常なヒト組織由来のＲＮＡを用いて、両方の転写物をマッピングした。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ  ｍＲＮＡは、より高いＰＡＣＥ４レベルを発現することが報告されている臓器である肝臓、非常に高いスプライシング活性で知られる臓器である精巣、および脳／脊髄で強く検出され、他の臓器では非常に少ない発現レベルであった（図６Ａ）。興味深いことに、肝臓、精巣、および脳は、他のヒト組織と比較して、より高い選択的スプライシング率で知られる臓器である。さらに、成人と比較して、胎児組織、すなわち肝臓および脳において、非常に高いスプライシング指数が観察され、厳密に調節された発現機構が示唆された。コントロールとして、比較可能性を確保するために、これらの標準化されたＲＮＡ調製物において、全てのＰＣのレベルも測定した。
【００７０】
スプライシング指数を、様々な腫瘍の種類および正常組織由来のｃＤＮＡ調製物のアレイについて求めた（図６Ｂ）。ＰＣａ以外の多くの癌の種類も、特に肺癌、甲状腺癌、副腎癌、および膵臓癌において、腫瘍検体におけるスプライシング活性の増強を示した。他のＰＣも、これらの腫瘍検体において、ｃＤＮＡを評価した（図６Ｃ）。ＰＡＣＥ４は、再び、ＰＣａにおいて、ただ一つの過剰発現されるＰＣであることが分かった。さらに、ＰＡＣＥ４、ｆｕｒｉｎ、およびＰＣ１／３だけが、多数の癌の種類において過剰発現レベルを示すことが多いＰＣであった。対照的に、ＰＣ５／６は、腫瘍においてダウンレギュレートされる場合が多く、これは、腸の腫瘍形成における当該ＰＣの抗腫瘍性効果を示し得る。様々な臓器に由来する正常検体および腫瘍検体を用いたＩＨＣ分析は、正常組織におけるｍＲＮＡマッピングを支持し、ここでもまた、大腸および精巣において、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのレベルが高く、肺、副腎、および卵巣では、最も低い観察レベルであった（図６Ｄ）。ｍＲＮＡレベルの観察と一致して（図６Ｂ）、試験した胎盤ならびにリンパ組織（胸腺、リンパ節、リンパ腫、および扁桃）は、ＩＨＣにより、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴについて全て陰性であったが、胃、膵臓、肝臓、および腎臓などの臓器では、ある程度陽性であった。さらに、マッチさせた腫瘍検体はまた、一部が記載されている、肺癌、食道癌、精巣癌、および甲状腺癌を含む多数の癌の種類において、ｍＲＮＡレベルで観察された発現シフトを裏付け、ＰＡＣＥ４が、ＰＣａにおいてだけでなく、ＰＡＣＥ４が癌の促進因子（driving factor）として作用し得る他の種類の癌においても、発癌性選択的スプライシングイベントを受けるという考えを支持する。
【００７１】
これらの２つのアイソフォームが、それらのＣ末端において相違するにもかかわらず、同等の機能を示すのかどうかという問題に取り組むために、Ｖ５タグ付きタンパク質を細胞株において発現させた（図７Ａ）。観察された最初の主な違いは、培地中に効率的に分泌されたＰＡＣＥ４−ＦＬと比較して、細胞内保持を伴うＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの分泌の欠如であった（図７ＢおよびＣ）。この観察は、ＩＨＣにおいて各アイソフォームについて観察された異なる細胞分布と相関していた。すなわち、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴが小胞性の細胞内コンパートメントに限定されているのと比較して、ＰＡＣＥ４−ＦＬは、膜／細胞外表面により多く蓄積されている（図３Ｄ）。ＰＡＣＥ４、少なくともＰＡＣＥ４−ＦＬは、培地中に分泌されることと、そのシステインリッチドメインによるヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を介して細胞外マトリックスに保持されることと、ヘパリンにより移動可能であることとが知られている。分泌がないことから予想されるように、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴは、用量を増加させながらヘパリンを添加することによって移動させることはできなかったが、ＰＡＣＥ４−ＦＬは、培地中の量の増加をもたらした。これは細胞内蓄積を示唆しており、トランスフェクション後に全細胞溶解物においてタンパク質レベルが高くなっていることによっても明らかになった（図７Ｂ）。
【００７２】
各アイソフォームを含有する馴化培地を使用して、蛍光発生基質Ｐｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−メチルクマリル−７−アミドの切断をモニタリングすることにより、両酵素の酵素活性を比較した。Ｃ末端置換は、活性を変えず（図７Ｄ）、両方のアイソフォームは、マルチ−ロイシン（ＭＬ）ペプチドにより依然として同等に阻害された（国際公開第２０１０／００３２３１号参照）。
【００７３】
一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞での免疫沈降を、全理論質量スペクトルの逐次ウィンドウ取得（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra）（ＳＷＡＴＨ−ＭＳ）をベースとする分析に付した（図７ＦおよびＧ）。各プルダウンで同定されたタンパク質を用いて、２つの異なるアイソフォーム間の濃縮を比較した。細胞コンパートメントに通常関連するタンパク質を特に分析し、図７Ｉに示す。両方のアイソフォームは、同様の濃縮度で小胞体（ＥＲ）タンパク質をプルダウンした。Ａｒｆ６、Ｒａｂ１３、またはＶｐｓ１６などのエンドソームコンパートメント関連タンパク質に関しては、２つのアイソフォームは明らかに異なるパターンを有し、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴプルダウンは、これらのタンパク質について、より高い濃縮レベルを示した。一方、ＰＡＣＥ−ＦＬプルダウンは、Ｅｘｏｃ２またはＶｐｓ１３などのエクソシスト複合体関連タンパク質とのより強い関連性を示した。ゴルジマーカーとしてＲＣＡＳ１（ＳｉＳｏ細胞上に発現される受容体結合癌抗原）を用いて、ＰＡＣＥ４−ＦＬが、ＰＣＡＥ４−ａｌｔＣＴと比較して、ゴルジ内にほぼ２倍多く存在することが分かった（図７Ｈ）。Ｒａｂ  ＧＴＰアーゼマーカーを用いて、共局在分析は、ＰＡＣＥ４−ＦＬと比較して、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴが、Ｒａｂ５陽性エンドソームコンパートメントおよびＲａｂ９関連コンパートメントに蓄積することを示し（図７ＩおよびＫ）、エンドソーム経路を介した差次的経路制御（differential routing）を示唆した。タンパク質の一次構造におけるスプライシングによって引き起こされるわずかな置換を考慮して（図７Ａ）、ＰＴＭ予測ツールを使用して、ＦＬのものと比較して、特徴的なＰＴＭモチーフが代替Ｃ末端に見られ得るかどうかを評価した。最も高いスコアを付けた予測ＰＴＭ部位は、タンパク質のＣ末端に付加されたＣｙｓクラスター上のＳ−パルミトイル化、非コンセンサスＳ−ファルネシル化、およびＳ−ゲラニルゲラニル化であった（ＳＨＰＶＧＧＧＱＥＣＣ；図８Ａ参照）。これら３つのＰＴＭの存在を確認するために様々な検証アッセイ；Ｓ−パルミトイル化についてのアシル−ビオチン交換、ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ−２７７；図８ＢおよびＣ参照）、パルミトイル−トランスフェラーゼ阻害剤（２−ＢＰ；２−ブロモ−パルミテート，図８Ｄ参照）、およびゲラニルゲラニル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＧＧＴＩ−２１３３；図８Ｅ参照）による細胞の処理を行い、分泌レベルに関しては、大きな差はなかった。
【００７４】
これらのアイソフォームに特有の特徴の生物学的意義を評価するために、ＰＡＣＥ４−ＦＬおよびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを、レンチウイルス形質導入（ｐＬｅｎｔｉ６ベクター）を用いて、細胞株においてタグなしタンパク質として安定して発現させた。同様のｍＲＮＡ発現レベルにもかかわらず（図９Ａ）、全細胞溶解物内で発現され見られたタンパク質の量は、ＰＡＣＥ４−ＦＬと比較して、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴについてはるかに多かった（図９Ｂ）。これらの過剰発現細胞の培地では、ごくわずかなＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを観察することができた。ＰＡＣＥ４−ＦＬと比較して、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの優れた自己触媒活性化が観察された（図９Ｃ）。ＰＡＣＥ４−ＦＬおよびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ過剰発現細胞は、増殖アッセイならびにコロニーの大きさおよび量によって表されるように、増殖能力およびクローン原性能力の増強を示した（図９Ｄ）。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの過剰発現は、特にＬＮＣａＰ細胞およびＨＴ１０８０細胞において、より強い効果をもたらしたが、ＤＵ１４５細胞では効果が中程度であった。これらの安定な細胞株においてＲＴ−ｑＰＣＲにより同類のＰＣの発現の分析をすると、ＰＣ７およびｆｕｒｉｎは、ＰＡＣＥ４過剰発現によりかなり影響を受け、これらのＰＣを調節する経路間のクロストークが示唆された。
【００７５】
その親アイソフォームＰＡＣＥ４−ＦＬと比較して内因性ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの重要性を評価するために、各スプライス変異体を特異的に標的とするｓｉＲＮＡを設計した。トランスフェクション後、各ｓｉＲＮＡは、そのスプライス変異体を有効にサイレンシングした（すなわち、他の共発現ＰＣに影響を与えずに、７０〜９５％をノックダウンした）（図９Ｅ）。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを標的とするｓｉＲＮＡは、ＰＡＣＥ４−ＦＬを標的とするｓｉＲＮＡよりも、ＰＡＣＥ４の細胞内レベルの大きな減少をもたらした（すなわち、それぞれ、０．５５対０．８７)(図９Ｆ）。馴化培地において、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを標的とするｓｉＲＮＡは、分泌されるＰＡＣＥ４に対して最小の効果しか及ぼさなかったが、ＰＡＣＥ４−ＦＬを標的とするｓｉＲＮＡは、非常に大きな減少をもたらした（すなわち、＞８０％）。ｓｉＲＮＡを用いて得られたこれらのデータは、２つのアイソフォームの差次的分泌に関する以前の観察とよく相関している。
【００７６】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのサイレンシングは、ＬＮＣａＰ細胞およびＤＵ１４５細胞の両方において、増殖能力およびクローン原性能力に関して、これらのパラメータにほとんど影響を及ぼさないＰＡＣＥ４−ＦＬサイレンシングよりも、はるかに大きい低下をもたらした（図９Ｇ〜Ｈ）。これらの結果は、癌細胞の増殖の持続におけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの役割を実証している。
【００７７】
分泌因子が、遺伝子サイレンシング時のＰＡＣＥ４関連癌細胞増殖表現型の主なエフェクターとして以前に示唆されている。このため、ＰＡＣＥ４の変異に基づいて基質候補を同定するために、セクレトーム解析を実施した。ＳＩＬＡＣベースのプロテオームアプローチを使用して、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ  ＰＣａ細胞の両方でセクレトーム含有量を分析した。両方の株のｓｈＮｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ細胞を重いアミノ酸（１３Ｃ６−Ａｒｇおよび１３Ｃ６−Ｌｙｓ）と共に培養し、非標識（軽いアミノ酸培地）ｓｈＰＡＣＥ４細胞と比較した。細胞内への重いアミノ酸の取り込みを、内因的に生じた分解ペプチドを用いて確認した。セクレトームを１：１にプールし、アセトン−メタノール沈殿により濃縮し、SageELF（Sage Science，米国マサチューセッツ州ビバリー）を用いてアガロース−ゲル電気泳動により分画した。各画分をタンデムＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。得られたタンパク質同定から、ProteINSIDEを使用して分泌タンパク質を検索し、各細胞株について軽／重（Ｌ／Ｈ；ｓｈＰＡＣＥ４／Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ）比の割合に基づいてヒートマップを描くために使用した。Uniprot PTM / Processingデータ両方により、またはProP 1.0 Serverにより決定された、ＰＣ系またはＰＣ様プロセシングイベントを有するタンパク質を明らかにした。
【００７８】
ウエスタンブロッティングは、（ｉ）ｓｈＰＡＣＥ４、ｓｈｆｕｒｉｎ、およびｓｈＰＣ７でサイレンシングされた細胞株、（ｉｉ）ＰＡＣＥ４−ＦＬおよびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを安定的に発現する細胞株、ならび（ｉｉｉ）非選択的かつ不可逆的ＰＣ阻害剤であるデカノイル−ＲＶＫＲ−クロロメチルケトン（ＣＭＫ）、または本明細書では以後Ｃ２３と呼ぶ（Levesque et al.2015, Oncotarget, 6: 3680-3693）ＰＡＣＥ４高親和性ペプチド阻害剤［ｄＬｅｕ］ＬＬＬＲＶＫ−アミジノベンジルアミド（Ａｍｂａ；ｄＬ−ＭＬ−Ａｍｂａ）で処理した細胞株について行った。ウエスタンブロットアレイを試験するために、既知のＰＣ基質、すなわちインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）およびインテグリンアルファ−６（ＩＴＧＡ６）という２つの充分に認められているｆｕｒｉｎ基質（図１０ＡおよびＢ）ならびにＥ−カドヘリンを評価した。ＩＧＦ１ＲおよびＩＴＧＡ６の両方について、ｆｕｒｉｎノックダウンおよびＣＭＫ処理のみが、それらのプロ型のプロセシングを妨いだが、ＰＡＣＥ４ノックダウンおよびＣ２３  ＰＡＣＥ４阻害剤は効果がなかった。対照的に、ＰＡＣＥ４−ＦＬおよびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの過剰発現は、ＩＧＦ１ＲおよびＩＴＧＡ６のプロ型のプロセシングを増加させ、過剰発現研究において慎重な解釈が必要とされることが明らかになった。Ｅ−カドヘリンに関しては、ＰＣ７ノックダウンが、そのプロ型のプロセシングを阻止する最良の結果を示した（図１０ＡおよびＢ）。
【００７９】
ＰＣ系またはＰＣ様切断部位を示したＤＵ１４５またはＬＮＣａＰのいずれかにおいてＬ／Ｈ＜１の比で検出された候補タンパク質（図１１）を、利用可能である場合には、ヒトのプロおよび成熟タンパク質形態の識別を可能にする抗体を用いて、イムノブロッティングによってさらに調べた。これらには、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ，Ｍｅｔとしても知られる）、クラステリン（ＣＬＵ）、デスモグレイン−２（ＤＳＧ２）、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、および増殖分化因子１５（ＧＤＦ−１５）が含まれる（図１１）。これまでのところ、ｆｕｒｉｎは、これらの基質の全てに対してではなかったが、多くの基質に対して最も重要な転換酵素であった。これらには、ＬＲＰ１、ＨＧＦＲ、ＤＳＧ２、およびＣＬＵが含まれる。ＰＣ７ノックダウンも、これらの基質に対して、いくつかの効果を有したが、程度がはるかに低かった。ＰＡＣＥ４ノックダウンおよびＣ２３阻害剤をふまえると、これらの基質は、いずれも、ＰＡＣＥ４特異的ではない。場合によっては、基質レベルの変化が観察され（しかし、プロ形態から成熟形態への転換は観察されない）、ＳＩＬＡＣプロテオーム方法論における差次的検出が説明される。（前立腺分化因子（ＰＤＦ）またはマクロファージ阻害性サイトカイン１（ＭＩＣ−１）としても知られる）ＧＤＦ−１５の場合、明瞭なウエスタンブロッティングパターンが観察され、当該タンパク質がＰＡＣＥ４によって特有にプロセシングされることが示された。
【００８０】
ＧＤＦ−１５は、ＬＮＣａＰ細胞の増殖能力およびクローン原性能力の両方を支持することが知られており、このことは、また、ＰＡＣＥ４ノックダウン細胞および過剰発現細胞の両方について観察された表現型と一致している。このタンパク質は、培地にさらに分泌されるジスルフィド結合二量体として会合する約１７ｋＤａのＣ末端成熟形態を生じさせるためにＡＲＧＲＲＲＡＲ１９６↓部位でのＰＣ系切断を必要とする、３５ｋＤａプロタンパク質として合成される。ＧＤＦ−１５は、ＬＮＣａＰ細胞においてのみ検出され、一方、ＤＵ１４５は、培地および細胞溶解物の両方において非常に低いレベルを表す（図１０ＣおよびＤ）。ウエスタンブロットアレイにおいて、およびＥＬＩＳＡにより（図１０ＥおよびＦ）、ｓｈＰＡＣＥ４ノックダウン、ＣＭＫ、またはＣ２３処理細胞では培地中に実質的にｐｒｏ−ＧＤＦ−１５を観察することはできなかったが、ｆｕｒｉｎノックダウンおよびＰＣ７ノックダウン後では、プロセシングされたＧＤＦ−１５は、依然として視認性が高かった。ＰＡＣＥ４−ＦＬおよびＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ過剰発現細胞株では、分泌されたＧＤＦ−１５の量は、ｐＬｅｎｔｉ６コントロール細胞よりも、約５倍高かった（図１０Ｆ）。全ての条件下で、分泌されたＧＤＦ−１５の差異は、細胞溶解物中のｐｒｏ−ＧＤＦ−１５の蓄積と直接相関し、ＧＤＦ−１５含有量の変化とは相関せず、切断がその分泌の必要条件であることが確認された。これらの結果は、ＧＤＦ−１５が他の共発現ＰＣからの非常に限られた冗長性でＰＡＣＥ４によって完全に切断されることを実証し、ＰＡＣＥ４陰性ＰＣ３細胞においてＧＤＦ−１５が切断されないままであることを示す以前の報告と一致する。興味深いことに、細胞環境から離してｆｕｒｉｎ酵素およびＰＡＣＥ４酵素の調製物と共にインキュベートした場合、合成ペプチド（ＱＡＡＲＧＲＲＲＡＲＡＲＮＧ）で単離されたＧＤＦ−１５切断部位は、両方のＰＣによってＱＡＡＲＧＲＲＲＡＲ↓部位で切断されていた（図１０Ｈ）。この結果は、研究されている状況に依るＰＣ間の基質切断冗長性に関する大きな相違をさらに包含する。
【００８１】
ＧＤＦ−１５のプロペプチドは、切断されるまで切断されていない形態で保存され得る場合、細胞外マトリックスへのタンパク質保持を媒介することが報告された。悪性度が低いＰＣａ（グリーソン≦６）の臨床検体におけるプロ−ＧＤＦ１５の間質保存の増加が、腫瘍の再発と逆相関することさえ観察された。しかしながら、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ（細胞内）およびＰＡＣＥ４−ＦＬ（分泌され細胞外マトリックスにもある）を過剰発現している細胞では、ＧＤＦ−１５のプロセシングにわずかな差異しか観察できなかった。細胞透過型およびＰＥＧ化細胞不透過型のＭＬ  ＰＡＣＥ４ペプチド阻害剤で処理した場合、ＧＤＦ−１５の切断は、細胞透過型に対して感受性がより高かったため、切断の重要な部分が細胞内で行われ（図１０Ｇ）、より小さい部分がＰＥＧ化ペプチドによっても影響を受けるが、マトリックス関連ＰＡＣＥ４に起因する可能性があるより低い範囲までであることが再び示された。
【００８２】
興味深いことに、ＧＤＦ−１５は成人の前立腺において発現が高いが、成熟ＧＤＦ−１５は、癌領域と比較して、正常組織において通常検出されないことが実証された。ウエスタンブロットによる非癌性および腫瘍性前立腺組織のペアの分析は、同じパターンを示し（図１０Ｉ）、腫瘍におけるプロセシングの定量化は、腫瘍の悪性度が増加するとともに切断が増加する明瞭な傾向があることを明らかにした（図１０Ｊ）。表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）により、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において、成熟形態がより多く存在したことと、ＰＣａ患者において、成熟形態の分泌に依存して、その血清濃度が増加したこととを示す同様の結果が以前に報告されていた。ＰＡＣＥ４発現が腫瘍領域で大きく上昇することが分かっているため、これらのイベントの間には、おそらく関係がある。両方のタンパク質を一緒に(Brown et al.Clin Cancer Res, 12:89-96)ＰＣａの予後バイオマーカー（Brown et al., Clin Cancer Res, 15: 6658-6664）と測定すると、ＧＤＦ−１５血清レベルが転移性ＰＣａにおいて大きく上昇し、さらに、ＰＳＡ感受性をより良好にすることを示す報告もなされている。
【００８３】
新規のＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴアイソフォームを、良性前立腺領域と比較してＰＣａ検体において強く発現されることと共に発見したことにより、ＰＡＣＥ４活性を利用して腫瘍増殖を促進する持続的増殖の重要な機構が明らかになる。輸送および自己触媒活性化速度に関して大きく異なる特徴を有するこの増殖促進性（pro-proliferative）アイソフォームの生成は、いくつかの調節要素の回避を介してＰＡＣＥ４活性を維持する精巧な分子スイッチとして現れる。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴと同様に、癌細胞による様々な癌促進性遺伝子の３’ＵＴＲ短縮は、多数の癌の種類に由来する細胞株において報告されていた。さらに、様々な癌の種類も、強いＰＡＣＥ４選択的スプライシング比を示したため、この観察結果は、ＰＣａ癌細胞および組織に特有のものではなく、重要な作用機構が示唆される。この結果だけで、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ（ｍＲＮＡまたはタンパク質）がＰＡＣＥ４依存性の癌のバイオマーカーであることが分かる。
【００８４】
このような広範な癌の種類間で全てのＰＣの発現レベルを比較する網羅的解析（図６ＢおよびＣ）は、ＰＣ５／６などの一部のＰＣが、ほとんどの場合に、ダウンレギュレートされるか、または変化せず、一方、ｆｕｒｉｎおよびＰＡＣＥ４などの他のＰＣが、通常過剰発現されるが、必ずしも併発しないことを実証する。正常なヒト組織に対して行ったマッピング（図６ＡおよびＤ）は、特にＲＴ−ｑＰＣＲにより同時に測定した各ＰＣのレベルを比較すると、意義深い。このマッピングからの最も印象的な結果は、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの発現パターンが非常に限られていることであり、精巣および肝臓ではレベルが高いが、より重要なことには胎児組織（脳および肝臓；図６Ａ）において高く、したがって、発生に使用され、さらに、癌細胞の増殖を維持するために癌細胞により回復される機構が示唆される。このことは、遺伝子内エピジェネティック修飾による当該機構の調節、ならびにＣＴＣＦおよび場合によっては当該クロマチンセグメントに結合することが報告されている他のＤＮＡ結合因子の結合の他の調節によってさらに補強される。しかしながら、興味深いことに、ヒトおよび霊長類のみがゲノムの観点からこの代替エキソンを保存しているのに対し、他の全ての種は末端エキソン置換を可能にする類似のゲノム環境を欠いていることが分かる。このことは、霊長類からの進化距離が増加すると選択的スプライシング頻度が急激に低下することを示す観察結果と一致しており、したがって、マウスモデルで行われた研究は、ＰＡＣＥ４バイオロジーに関する重要な要素を欠いている可能性があることが示唆される。実際、ＰＡＣＥ４のこの新規のスパイス変異体の発見は、蓄積された文献の理解をかなり修正するものであり、これは、全ての場合において、ＰＡＣＥ４−ＦＬを使用して結論が出され、細胞内局在性の相違のためにほとんどの結論が直接適用できないことが今や明らかであるためである。さらに、マウスおよびげっ歯類モデルにおけるこのアイソフォームの欠如はまた、種間の一部のデータの解釈を偏らせる。ポリエチレングリコール修飾ペプチドを用いて、ＰＣａ細胞に対するＰＡＣＥ４阻害剤の抗増殖活性がそれらの細胞透過特性に強く依存していることが以前に実証されているため、この細胞内アイソフォームの発見はまた、ワーキングモデルを改良する。このことを知った上で、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴがはるかに高い増殖刺激能力を示すという観察結果と組み合わせて、ＭＬペプチドの効果的な標的は、両方のアイソフォームがインビトロで当該阻害剤によって等しく阻害されたとしても、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴであることが開示される。このことは、ｉ）癌細胞のＰＡＣＥ４レベルに対する癌細胞内へのＭＬペプチドの強力な細胞内保持、およびｉｉ）標的が純粋にＰＡＣＥ４−ＦＬのような分泌タンパク質である場合には静める（conciliate）のが困難である、担癌マウスに投与したときのＭＬペプチドの強力な異種移植片取り込み（xenograft uptake）によってさらに明らかになる。しかしながら、このことは、ｆｕｒｉｎ欠乏条件下で細胞表面でＰＡＣＥ４によって切断されるインスリン受容体のＢアイソフォームの場合が含まれるように、全てのＰＡＣＥ４基質が細胞内で切断さ���ることを意味しない。この所見はまた、異なる細胞浸透特性を有する阻害剤を用いて測定された。
【００８５】
ＰＡＣＥ４プロドメイン除去が、ＥＲからの連続的輸送（sequential export）、ならびにカルシウムおよびｐＨ条件がより高い活性を可能にするゴルジおよびＴＧＮ（および最終的には細胞外間隙）へのさらなる輸送、分泌経路へのＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの蓄積の前に予め必要なステップであることは、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴが細胞内成熟型に関して強力な濃縮を示し（図９Ｃ）、過剰発現している細胞で、ＰＡＣＥ４−ＦＬと比較して同等の活性を示す（図１０Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ）という観察結果と一致している。この異なる経路制御（routing）は、ａｌｔ−Ｃ末端において２Ｃｙｓを５Ｃｙｓに置換した後の（通常４４Ｃｙｓ残基を含む）Ｃｙｓリッチドメイン再配置によるものであり得、これは、ＥＲ、ゴルジ、またはＴＧＮにおける分泌経路中のタンパク質相互作用に影響を及ぼし得る。
【００８６】
ＰＡＣＥ４は、ＰＣａで過剰発現される唯一のＰＣであると考えられ（図６Ｃ）、癌細胞は、増殖を維持するために、この一種のＰＣに依存している。本明細書に開示されているように、サイレンシングアプローチを使用して、過剰発現に関連して起こりうる欠点を排除して、ＧＤＦ−１５をＰＣａ細胞における直接的なＰＡＣＥ４基質として同定した。細胞に対するＧＤＦ−１５の活性は広範であり、乳癌細胞では、放射線照射後のＧＤＦ−１５の発現が、放射線誘発細胞死から乳癌細胞を保護することが知られており、悪性黒色腫では、ＧＤＦ−１５の過剰発現が、持続的な血管新生をもたらす。興味深いことに、血管系発生障害（impaired vasculature development）はまた、ＰＡＣＥ４ノックダウンまたはＰＡＣＥ４阻害剤処理異種移植片の観察された表現型でもある。ＰＡＣＥ４の基質ではないにもかかわらず、分泌タンパク質の多くがｓｈＰＡＣＥ４細胞の馴化培地においてレベルの大幅な低下を伴って検出されたことは非常に興味深い。腫瘍血管新生および細胞外マトリックスリモデリングの重要な調節因子として作用するカテプシンＤ、Ｚ、Ｂ、およびＨなどのプロテアーゼ、ならびに血管新生因子（例えば、エフリン−Ａ１およびアンギオゲニン）は、これらの興味深い下流の分子の一部であり、おそらく、シグナル伝達経路の上流における基質のプロセシングの減弱の結果物である。
【００８７】
このようなＰＡＣＥ４活性のバイオマーカーを血清中で測定可能にすることは、ＰＡＣＥ４阻害剤を使用する薬理学的介入における標的の関与を評価することを可能にするが、単純な血液サンプルを通して臓器中のＰＡＣＥ４レベルを測定するための間接的方法でもある。ＧＤＦ−１５は、発現が前立腺（および胎盤）に非常に限定されているので、このような分析のための理想的なマーカーである。診断／予後の観点では、ＰＡＣＥ４、またはより正確にはＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴは、ＩＨＣにより、または直接血清マーカーとして、直接的にマーカーに相当する。
【００８８】
さらに、血漿中のＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴのレベルは、腫瘍グリーソンスコアと相関する。根治的前立腺全摘除術の直前に患者から採取されたＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの血漿レベルが予想通りを示した場合、総ＰＡＣＥ４レベルは、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴレベルよりはるかに高く、それぞれ、平均が３１ｎｇ／ｍＬおよび５．４ｎｇ／ｍＬであった（図１２Ａ）。正常患者とＰＣａ患者からの血漿中の総ＰＡＣＥ４レベルは異ならず（それぞれ、平均が３１対３７ｎｇ／ｍＬ）、一方、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴレベルは、ＰＣａで、正常患者と比較して、はるかに高かった（それぞれ、平均が５．４対０．９ｎｇ／ｍＬ）。相関分析は、両方のアイソフォームのレベルが互いに相関しているが（ピアソンのｒ：０．５５３８，Ｐ値:＜０．０００１；図１２Ｂ）、ＰＳＡレベルとは相関していないことを示した。総ＰＡＣＥ４血漿濃度は、腫瘍グリーソンスコアと相関しなかった（図１２Ｃ）。しかしながら、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴレベルは、腫瘍の攻撃性と相関する明らかな傾向を示した（スピアマンのｒ：０．１３２５，Ｐ値：０．０５２９；図５Ｄ）。総循環ＰＡＣＥ４に対するＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの割合を（ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ／ＰＡＣＥ４の比として）正規化すると、腫瘍グリーソンスコアとの明瞭かつ有意な相関が求められた（スピアマンのｒ：０．２４２４，Ｐ値：０．０００３；図５Ｅ）。
【００８９】
ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ特異的ＥＬＩＳＡの開発および検証は、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴがＰＣａ組織において増加するだけでなく、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴが血流に見られ得ることの確認を可能にした。
【００９０】
本明細書において、対象において前立腺癌を検出する方法であって、前記対象から生体サンプルを得る工程と、前記生体サンプルにおけるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの存在を検出することにより、前記前立腺癌を検出する工程とを含んでなる前記方法が記載されている。
【００９１】
本明細書に記載の方法は、分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体の形成を可能にするような条件下で、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する分析物特異的試薬を前記生体サンプルと接触させるさらなる工程と、前記分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体を検出することにより、前立腺癌を検出するさらなる工程とを含んでなることができる。
【００９２】
用語「分析物特異的試薬」または「ＡＳＲ」は、分析物のレベルの定量的評価を可能にする、任意の化学物質、核酸配列、ポリペプチド（例えば、受容体タンパク質）、もしくは複合分子を含む任意の分子、および／または任意の組成物を指す。したがって、分析物は、抗体、ペプチド、プライマー、またはプローブであることができる。
【００９３】
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの存在を決定する結合反応を指す。
【００９４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびキメラ抗体を含むものとする。抗体は、組み換え供給源由来でもよく、かつ／またはトランスジェニック動物で産生されてもよい。本明細書で使用される用語「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ，ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらのマルチマー、ならびに二重特異性抗体断片を含むものとする。抗体は、従来の技術を用いて断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって得ることができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド架橋を還元してＦａｂ’断片が得られるように処理することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、ならびに他の断片は、組み換え技術により合成することもできる。
【００９５】
ヒトモノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、癌を有するヒトから採取し、標準的な体細胞融合手順によってミエローマ細胞と融合させ、それにより、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は、当該技術分野で周知であり（例えば、Kohler and Milstein (Nature 256:495-497 (1975))により元々開発されたハイブリドーマ技術）、他の技術、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunol.Today4:72 (1983))、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., Methods Enzymol, 121:140-67 (1986))、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science 246:1275 (1989)）も周知である。ハイブリドーマ細胞を、癌細胞と特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００９６】
特定の標的ポリペプチド遺伝子産物抗原に対して反応性である特異的抗体または抗体断片を、細菌において発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーを細胞表面成分でスクリーニングすることによって得ることもできる。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域、およびＦＶ領域を、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌で発現させることができる（例えば、Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)；Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)；およびMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990))。
【００９７】
したがって、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを特異的に認識する、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの分析物が包含される。したがって、一実施形態において、プローブは、配列番号８に示されるＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに存在する代替エキソン２５を認識する。
【００９８】
より具体的には、前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。別の実施形態では、前記抗体は、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、またはウサギ抗体である。ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを特異的に認識するヒト化抗体も含まれる。本明細書に記載の抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるエピトープ結合断片を含んでなり得る。
【００９９】
より具体的には、本明細書に記載の抗体は、配列番号１８、２３、２４、２５、および２６のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含んでなるエピトープに特異的に結合する。
【０１００】
本明細書で使用される用語「プローブ」は、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴをコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸配列を指す。例えば、プローブは、標的核酸配列中の連続する塩基および／またはヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズする、少なくとも１０個以上の塩基またはヌクレオチドを含んでなる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーション条件ならびにプローブおよび核酸標的配列の配列に依存し、例えば、１０〜２０、２１〜７０、７１〜１００、１０１〜５００、またはそれ以上の塩基長またはヌクレオチド長であることができる。プローブは、必要に応じて、アレイチップまたはマイクロアレイチップなどの固体支持体に固定することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、精製された制限消化物に含まれるなど、天然に生じる、または合成により得られる、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に（例えば、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、適切な温度およびｐＨに）置かれた場合の合成点として作用することができる核酸配列を指す。プライマーは、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成をプライミングするのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの配列、および使用する方法を含む因子に依存するであろう。プライマーは、典型的には、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むことができる。適当な長さのプライマーの決定に関わる因子は、当業者には容易に分かる。
【０１０２】
したがって、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを特異的に認識するプローブは、例えばＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴを特異的に認識する、プライマー、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子であり得る。より具体的には、本明細書に包含されるプローブは、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに特異的に結合する。例えば、本明細書に記載のプローブは、配列番号５または６を含んでなる塩基配列に特異的に結合することができる。別の実施形態では、本明細書に包含されるｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１５または１６に示される塩基配列を含んでなる。
【０１０３】
本明細書に記載の方法は、分析物−ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ複合体を検出する検出剤を適用する工程をさらに含んでなることができる。
【０１０４】
本明細書で使用される「検出可能な標識」または「検出可能な薬剤」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な薬剤または組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されているもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および放射性標識をペプチドに組み込むことなどにより検出可能にすることができるか、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することができるタンパク質が挙げられる。
【０１０５】
検出剤は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫細胞化学、免疫組織化学、ＰＣＲ、またはＲＴ−ＰＣＲなどの当該技術分野において公知の技術によって検出することができる。そのため、検出されるＰＡＣＥ４スプライシングアイソフォームは、タンパク質または核酸分子であることができる。
【０１０６】
したがって、論じたエピトープのいずれかに対して作製した抗体を使用して、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴタンパク質を検出するために、血液由来検体（粗製または濃縮）に対してウエスタンブロットを実施することができた。
【０１０７】
さらに、論じたエピトープのいずれかに対して作製した抗体を使用して、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴタンパク質を定量するために、血液由来検体（粗製または濃縮）に対してＥＬＩＳＡを実施することができた。
【０１０８】
さらに、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いる質量分析（ＭＳ）をベースとする定量化は、高い構造特異性および高い多重化能力（multiplexing capacity）を可能にするため（Anderson and Hunter, 2010, Mol Cell Proteomics, 5: 573-588）、報告された問題の多くを解決する（Makawita and Diamandis, 2010, Clin Chem, 56: 212-222）。ＭＲＭ定量化は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と高感度三連四重極ＭＳの組み合わせによって行われる。現在までのところ、ＭＳ技術の最も重大な限界は感度であり、主に量が多いタンパク質からの干渉のために、血液中のｍｇ／Ｌの定量化にしか到達していない。適当なサンプル調製；（ｉ）サンプル分画（Fortin 2009, Anal Chem, 81: 9343-9352）、（ｉｉ）量が多いタンパク質の除去（Anderson and Hunter, 2010, Mol Cell Proteomics, 5: 573-588）、および（ｉｉｉ）標的タンパク質（Nicol et al., 2008, Mol Cell Proteomics, 7: 1974-1982）または標的ペプチド（名称：抗ペプチド抗体による安定同位体標準および捕捉（Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies）；ＳＩＳＣＡＰＡ）（Anderson et al., 2004, J Proteome Res, 3: 235-244）の親和性捕捉を使用して、タンパク質の定量下限（ＬＯＱ）（例えば、ＰＳＡ(Keshishian et al, 2007, Mol Cell Proteomics, 6: 2212-2229）は、現在、１０００倍（ｍｇ／Ｌからμｇ／Ｌに）改善されており、変動係数のパーセント（％ＣＶ）は２．８％まで低下し、結果はＥＬＩＳＡアッセイに匹敵する（Fortin 2009, Anal Chem, 81: 9343-9352）。ある報告では、血清ＰＡＣＥ４検出は、ＳＩＳＣＡＰＡ法を用いて得られた（Klee et al., Clin Chem, 2012, 58: 599-609)。
【０１０９】
ＰＡＣＥ４スプライシングアイソフォームの選択的検出のために抗ＰＡＣＥ４ペプチド（ＳＩＳＣＡＰＡ）を使用して、全てのＰＡＣＥ４スプライシングアイソフォームまたはＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴに対する親和性を有する抗体を使用するＰＡＣＥ４の親和性濃縮により、ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの検出を行うことができた。これらの全ての方法について、ＰＡＣＥ４スプライシングアイソフォームを、選択的酵素消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって定量および検出し得る。
【０１１０】
あるいは、標的ペプチドの選択的濃縮を用いて、抗体を使用しない方法論を適用し得る。選択性酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン）によるＰＡＣＥ４消化後、目的のペプチドを、再現性のある直交型液体クロマトグラフィーによって、またはイオン交換もしくはポリマーイオン交換固相抽出とそれに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量によって、選択的に濃縮し得る。
【０１１１】
さらなる他の態様において、本開示は、臨床試験のために前立腺癌対象を選択する方法を提供する。当該方法は、本明細書に記載の方法に従って対象の試験ＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ発現プロファイルおよび予後を決定することと、予後に基づいて臨床試験に対象を含める、または除外することとを含んでなる。
【０１１２】
他の態様において、前立腺癌の初期診断を受けた対象の予後のための方法が提供される。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「予後」は、特定の臨床転帰の可能性の指標、例えば、再発、転移、および／もしくは疾患による死亡の可能性、全生存率、または回復の可能性の指標を指し、「予後良好」および「予後不良」を含む。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「予後良好」は、対象が、例えば、前立腺癌の初期診断から５年後などの設定された期間内に、生存する、および/または再発もしくは遠隔転移を有しない、もしくは有するリスクが低いと予測されることを示す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「予後不良」は、対象が、例えば、前立腺癌の初期診断から５年などの設定された期間内に、生存していない、および/または再発もしくは遠隔転移を有する、もしくは有するリスクが高いと予測されることを示す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「再発」は、初期診断から設定された期間内、例えば５年以内の前立腺癌などの癌の再出現を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「無病生存」は、初期診断から設定された期間内、例えば５年以内の前立腺癌などの癌の再出現がないことを指す。
【０１１８】
本開示の他の態様は、前立腺癌の治療に使用するための薬剤の同定方法を含む。臨床試験は、新規の治療法の有効性を試験しようとするものである。有効性は、何ヶ月もの治療の後に初めて決定できることが多い。本明細書に開示されている方法は、予後に関連するＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴの発現をモニタリングするのに有用である。したがって、より良好な予後と関連するＰＡＣＥ４−ａｌｔＣＴ発現レベルの変化は、その薬剤が化学療法剤としての候補であることを示す。
【０１１９】
したがって、一実施形態において、本開示は、前立腺癌の治療に使用するための候補薬剤を同定する方法を提供する。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「サンプル」は、遺伝子発現レベル、特に前立腺癌を有する、または有しない患者において差次的に発現される遺伝子についてアッセイすることができる、腫瘍関連間質細胞を含んでなる流体、細胞、または組織サンプルを含むがこれらに限定されない、任意の対象のサンプルを指す。サンプルには、例えば、バルク腫瘍、単離された間質細胞、生検材料、切除された腫瘍サンプル、凍結組織サンプル、新鮮な組織検体、細胞サンプル、および／またはパラフィン包埋切片もしくは材料が含まれる。
【０１２１】
本明細書で使用される「患者」とも呼ばれる用語「対象」は、動物界の任意の動物、好ましくはヒトを指す。
【実施例】
【０１２２】
実施例Ｉ
細胞培養および増殖アッセイ
細胞株を得、以下の条件で培養した：ＤＵ１４５(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）;ATCC，米国マナサス，RPMI 1640；５％ウシ胎児血清；ＦＢＳ，Wisent Bioproducts，ケベックシティのセントブルーノ（St Bruno））、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＨＴ−２９(ATCC, RPMI 1640；１０％ＦＢＳ）、ＳＫＯＶ３(ATCC, DMEM-F12K;１０％ＦＢＳ)、ＨＥＫ２９３−ＦＴ(Life Technologies Inc.，DMEM；１０％ＦＢＳ，５００μｇ／ｍｌ  Geneticin）、Ｈｕｈ７およびＡ５４９（ATCC，DMEM；１０％ＦＢＳ）、ＨＴ１０８０およびＨｅｐＧ２（ATCC，EMEM；１０％ＦＢＳ）。安定なノックダウン細胞株は、（Couture et al., 2012）に報告されたものと同じであった。Fuge're et al.（2002, Journal of Biological Chemistry, 277: 7648-7656)に記載されているように、Ｓ２細胞を培養し、組み換えＰＣの製造に使用した。
【０１２３】
アクチノマイシン−Ｄ（Sigma Aldrich）またはシクロヘキシミド（Sigma Aldrich）処理では、化合物を最初にＤＭＳＯに溶解し、それぞれ培地中最終濃度５μｇ／ｍＬおよび４０μｇ／ｍＬに希釈した。アクチノマイシンＤ処理は、初期アポトーシス誘導の前の時間枠である８時間を決して超えなかった。５−アザ−２’−デオキシ−シチジン（Sigma Aldrich）による処理では、化合物を最初にＤＭＳＯに溶解し、細胞培養培地に添加する前にさらに希釈し、これを毎日交換し、化合物を含む新鮮なものと交換して、合計７２時間の曝露とした。ＤＮＡトランスフェクションでは、細胞をLipofectamine 3000（Invitrogen）およびＤＮＡプラスミド（QIAgenプラスミド精製キットを用い、製造業者のガイドラインに従って精製）を用いてリポフェクションし、別段の記載がない場合、細胞を１×プロテアーゼ阻害剤（Roche Diagnostics）を含む溶解バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＳＤＳ  ０．１％、Ｎａ−デオキシコレート  ０．５％、Triton-X100  １％、およびNP-40  １％）に溶解した。Lipofectamine RNAiMax（Life Technologies）を用い、製造業者のガイドラインに従って、ｓｉＲＮＡ（Cell Signaling Technologies）をトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡは、Cell Signaling Technologiesから購入した（ＣＴＣＦ  ｓｉＲＮＡ  Ｉ＃６２６５およびコントロールｓｉＲＮＡ  ＃６５６８）。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出のために細胞を溶解した。
【０１２４】
ＰＡＣＥ４分泌アッセイでは、細胞を完全培地中で２４時間、６ウェルプレートに等密度で播いた。２４時間後、培地を必要最小限の体積の新鮮な培地（ＦＢＳを含まない６００μＬ）と交換し、細胞を(分泌動態について）または（阻害剤処理について）示された時間分泌させ、示された濃度の薬剤（ヘパリン（Sandoz，ドイツのニュルンベルク）、２−ブロモパルミテート（Sigma Aldrich）、ＦＴＩ−２７７(Sigma Aldrich)、ＧＧＴＩ−２１３３（Santa Cruz Biotechnology Inc.，米国カリフォルニア州サンタクルーズ）の存在下で、さらに２４時間分泌させた。
【０１２５】
遺伝子合成（GeneArt, Thermo Fisher Scientific）により得られたＰＡＣＥ４スプライス変異体をコードするｃＤＮＡを、ｐＡｃ５．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ、またはｐＬｅｎｔｉ６ベクターのいずれかにクローニングした。一過性発現では、Lipofectamine 3000試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡコンストラクト（６ウェルプレート中に２．５μｇのＤＮＡ）を用いて、細胞をトランスフェクトした。安定に過剰発現する哺乳動物細胞株では、細胞を（D’Anjou et al., 2013）に記載されているように作製されたレンチウイルス調製物で形質導入し、さらに、ブラストサイジン（ＨＴ１０８０およびＤＵ１４５：５μｇ／ｍＬ，ＬＮＣａＰ：２０μｇ／ｍＬ）を用いて選別した。
【０１２６】
基質分析では、ｐ１００ｍｍプレートで完全培地に同数の細胞を播くことによって、細胞溶解物を調製した。２４時間後、培地を６ｍＬの無血清新鮮培地（示されている場合は、５０μＭのｄＬ−ＭＬ−Ａｍｂａまたはｄｅｃ−ＲＶＫＲ−ＣＭＫ（Bachem，カリフォルニア州トーランス）で処理）と交換し、細胞を４８時間さらにインキュベートした。次に、培地を回収し、室温で１０分間１，０００×ｇで遠心分離して浮遊細胞を除去し、次いで、培地のアリコートを採取し（８００μＬ）、液体窒素中で瞬間凍結し、一晩凍結乾燥し、１００μＬのＬａｅｍｍｌｉバッファー：８Ｍ尿素（１：１）中に戻し、完全に再懸濁するまで５分間煮沸した。２５μＬの濃縮した培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした（２００μＬの培地に相当）。細胞をＰＢＳで慎重に洗浄し、（Couture et al., 2012）に記載されているように放射性免疫沈降アッセイバッファー（ＲＩＰＡ）を用いて（１，０００×ｇの遠心分離から得られた）細胞ペレットから溶解させた。サンプルを氷上で２０分間インキュベートし、さらに、４℃、１３．０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。タンパク質濃度を、ポリアクリルアミドゲルに１５μｇをロードするビシンコニン酸アッセイ（Pierce）によって測定した。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、馴化培地については、タンパク質のローディングをコントロールするためにクマシーブルー染色をルーチンに実施した。
【０１２７】
増殖アッセイでは、細胞を９６ウェルプレートに同じ密度で播き、７２時間後に、Levesque et al.（2012, Journal of Medicinal Chemistry, 55: 10501-10511）に記載のように３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）試薬を用いて代謝活性を測定した。コロニー形成アッセイでは、細胞を低密度（ＨＴ１０８０では５０細胞、ＤＵ１４５では１００細胞、ＬＮＣａＰでは５００細胞）で播き、１０日間完全培地中でコロニーを形成させ、その後、クリスタルバイオレットで染色し、人手でカウントした。染色したプレートもスキャンし（Odyssey Imager，LI-COR Biosciences）、コロニー面積をImageJソフトウェアを用いて測定した。
【０１２８】
活性アッセイでは、ＰＡＣＥ４アイソフォームを発現する安定なＳ２細胞培養物から回収した培地を集め、ＰＡＣＥ４活性バッファー（ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ  ｐＨ６．５，１ｍＭ  ＣａＣｌ２）を用いて、Amicon-Ultra  ３０Ｋ回転可能ユニット（spinnable unit）（Millipore）でバッファー交換した。ウエスタンブロッティングにより、各調製物中のＰＡＣＥ４相当量を確認し、さらにこれを使用して、活性アッセイをLevesque et al.(2012, Journal of Medicinal Chemistry, 55: 10501-10511)に記載されているように実施した。ＭＬ−ペプチド阻害のために、５０μＭの阻害剤を活性アッセイに添加した。野生型Ｓ２細胞からの同一の調製物をブランクとして使用した。
【０１２９】
共焦点顕微鏡法では、ＨＴ１０８０細胞をポリ−Ｌ−リジンコートカバーガラス上に播き、さらに、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ；０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００；２．５％ヤギ血清；１％ＢＳＡ）で室温で１時間透過処理した。次いで、細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。蛍光二次抗体（AlexaFluor-488および-594抗体，ThermoFisher）をさらに使用し（１時間インキュベーション，室温）、続いてＤＡＰＩ（３００ｎＭ；１０分間，室温）を使用し、最後にSlowFade（Invitrogen）でマウントした。倒立型スペクトル走査型共焦点顕微鏡FV1000（Olympus，日本の東京）でPlan Apo ６０×油浸対物レンズNA 1.42を用いて細胞を調べた。発せられたAlexa Fluor 488とAlexa Fluor 594との間のクロストークを回避するために、蛍光を順次収集した。装置の同一の設定を用いて、通常各実験条件から同様のサイズの７〜１５個の細胞から、同じ日に画像を取得した。定量分析のために、バックグラウンド（Ｃ）、赤のみ（Ｄ）、緑のみ（Ａ）、および共局在領域（Ｂ）を形成して、オーバーラップする四分円のランク（閾値）を設けた。共局在化指数を（Ｂ）／（Ｂ＋Ｄ）として計算し、共局在化の％を（Ｂ）／（Ｂ＋Ｄ）×１００として計算した。各実験条件について最小７個のサイズがマッチした細胞について定量分析を行った。
実施例ＩＩ
新鮮組織の切除およびアッセイ
【０１３０】
ＲＮＡ抽出に使用する前立腺組織を、Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrookeで行われた根治的前立腺全摘除術から得られた前立腺検体から新鮮なまま（通常３０分以内に）切除した。患者は、参加することに同意し、同意書に自由意志で署名し、研究プロトコルは、Centre Hospitalier Universitaire de SherbrookeのInstitutional Review Committee for the Use of Human Resected Materialによって承認された。組織をＯＣＴ化合物（Tissue-Tek；Miles Scientific）を用いて−２０℃で凍結し、５μｍの切片を切り出し、直ちにホルマリンで固定して、病理検査のためにヘマトキシリン−エオシン染色を行った。臨床病理学者によって、隣接する非癌性組織と共に腫瘍領域の範囲が定められ、それに従って切除を行った。切除した組織を、ナノレベルで純度の高い（nano-pure）ＲＮａｓｅフリー水（Wisent）で洗浄して、目に見える微量のＯＣＴ化合物を全て除去した。次いで、組織を液体窒素中で粉砕し、QIAgen RNeasyスピンカラム（QIAgen，米国カリフォルニア州バレンシア）を用いて、製造業者の指示に従って、ＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡの完全性は、RNA Nano Chipを備えたAgilent Bioanalyser（Agilent Technologies，米国カリフォルニア州パロアルト）を用いる分析によって評価した。
【０１３１】
１μｇのＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Invitrogen）処理し、Superscript II逆転写酵素（Invitrogen）を用いて逆転写し、ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ambion，テキサス州オースティン）処理し、その後、Stratagene Mx3005P装置を用いて定量ＰＣＲを行った。相対的発現レベルは、式（１＋増幅効率）−（ＣＴ）により、標準遺伝子としてβ−アクチンを使用して計算した。実験を少なくとも３回の独立した実験（ｎ＝３）で行った。
【０１３２】
全ての考えられるエキソン−エキソンジャンクションに隣接するＰＣＲ実験を設計した。さらに、ほとんどのＥＳＴ転写物を含むAceViewデータベースに基づいて、可能な場合は、選択的スプライシングイベントを２つ以上の独立した反応によりカバーした。AceView転写物セットをLISAデータベースにマッピングし、LISAは、スプライシングマップを自動的に作製した。可能な場合は、予測されるアンプリコンサイズが１００〜４００ｂpの範囲に収まるように設計を行った。１００ｂｐの下限を、プライマーシグナルとプライマー−ダイマーシグナルとのオーバーラップを避けるために設定した。
Klinck et al.（2008, Cancer Research, 68: 657-663）に記載されているように、エンドポイントＰＣＲ反応を、０．２ｍｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ、１．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、０．６μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、および０．２ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する最終体積１０μＬ中２０ｎｇのｃＤＮＡに対して行った。９５℃で２分間の最初のインキュベーションの後に、９４℃３０秒、５５℃３０秒、および７２℃６０秒で３５サイクルを行った。増幅を７２℃で２分間のインキュベーションにより完了させた。サーモサイクラーに連結された液体取扱システムを使用してＰＣＲ反応を実施し、増幅産物をCaliper LC-90装置（Caliper LifeSciences）で自動化されたチップを用いるマイクロキャピラリー電気泳動（chip-based microcapillary electrophoresis）により分析した。アンプリコンサイジングおよび相対的定量を、製造業者のソフトウェアによって行い、その後、ＬＩＳＡデータベースにアップロードした。
【０１３３】
１０μＭのｃＤＮＡクローニングプライマー（ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ，配列番号４０；IDT,アイオワ州コーラルヴィル）で逆転写したＬＮＣａＰ全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡ３’末端の迅速増幅を行った。遺伝子特異的プライマー（ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＣＧＧ，配列番号４１）および３’ＲＡＣＥプライマー（０，０５μＭ；ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ，配列番号４２）としてＦ２４（０，２μＭ）を含む１μＬのｃＤＮＡを用いるＰＣＲ（３５サイクル；９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃３分）によって３’ＵＴＲをさらに増幅した。ネステッドＰＣＲでは、ＰＣＲ産物を１：１０００に希釈し、１μＬをコントロールとしての役割を果たす元のｃＤＮＡの同等希釈物と並べて使用した。ＤＮＡバンドを臭化エチジウム染色アガロースゲルから電気溶出させ、エタノール沈殿後にシークエンシングに使用した。（終止コドンの直後から始まる）ＡｓｃＩおよび（ポリアデニル化シグナルの直後で終わる）ＸｂａＩをそれぞれ含むプライマーを用い、Ｑ５高忠実度ポリメラーゼＰＣＲ産物（Q5 high-fidelity polymerase PCR product）（New Englands Biolabs，カナダ）を用いるネストＰＣＲにより、３’ＵＴＲをクローニングした。３’ＵＴＲをｐＭＩＲレポーターベクター（OriGene Technologies, Inc.；メリーランド州ロックビル）に挿入し、その後、２４ウェルプレートで１ウェルあたり４ｎｇのＤＮＡを用いて、ベクターシークエンシング後に、細胞におけるトランスフェクションに使用した。ルシフェラーゼ活性を、SIRIUSルミノメーター（Berthold Detection Systems，ドイツのプフォルツハイム（Pforzhein））を使用して、最初に培地を除去し、次いでDual-Gloアッセイ溶液（Promega）を添加することにより、製造業者の指示に従って、２４時間後に測定した。発光を、ビシンコニン酸アッセイ（Pierce）によって測定されたサンプル中のタンパク質含有量に対して正規化した。ｍｉＲＮＡのアライメントについては、３’ＵＴＲの配列をRegRNAおよびmiRDBに実行依頼した。
実施例ＩＩＩ
使用および作製した抗体ならびに免疫組織化学
【０１３４】
ウサギポリクローナル抗体を作製し、ペプチドコートクロマトグラフィーカラム（Pacific Immunology，カリフォルニア州ラモーナ）で血清から精製した。免疫組織化学のために、４μｍの組織切片を有するスライドを以下の各溶液中で：２×キシレン、２×エタノール１００％、９５％、８５％、７０％、５０％、３０％、２×超純水、１０ｍＭクエン酸バッファー  ｐＨ６、室温で５分間インキュベートし、さらに１０ｍＭクエン酸バッファー  ｐＨ６で４５分間オートクレーブ処理（１６ｐｓｉ，２５０°Ｆ）した。室温で冷却後、ペルオキシダーゼ検出キット（Peroxidase Detection Kit）（Pierce）を用いてＩＨＣを実施した。組織切片をＴＢＳＴ中５％ＢＳＡで希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、洗浄後に二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（BioRadからの抗ウサギ（Anti-Rabbit）ＨＲＰ；ＴＢＳＴ中５％ＢＳＡで適宜希釈，１／５００）でさらにインキュベートした。次にスライドをハリスヘマトキシリン（Sigma-Aldrich）で対比染色した。ブロッキングペプチドの共インキュベーションのために、３０μｇのエピトープペプチドを一次ブロッティング溶液に添加した。抗体検証に使用した異種移植系組織は、Longuespe'e et al.（2014, Translational Oncology, 7: 410-419）に記載のものであった。他の癌の種類における免疫組織化学については、原発性腫瘍およびマッチさせた非腫瘍性組織がのせられたパラフィン組織アレイ（Paraffin Tissue Array）をBiochain（カリフォルニア州ニューアーク）から入手した。
【０１３５】
タンパク質を電気泳動にかけ、さらに、ニトロセルロース膜（Hybond，GE Healthcare，英国チャルフォント・セント・ジャイルズ）に転写した。免疫検出前に、膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ溶液中５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングした。次いで、膜を一次抗体と共に撹拌しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて、IRDye800に結合したヤギ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ（LI-COR Biosciences、ネブラスカ州リンカーン）と共にインキュベートした。次いで、赤外線イメージャー（Odyssey Imager，LI-COR Biosciences）を用いて免疫検出を行った。ImageJソフトウェアを使用して、相対的タンパク質発現レベルを計算した。
実施例ＩＶ
ＤＮＡメチル化分析
【０１３６】
DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen、＃６９５０４）を使用して、１４ペアの腫瘍性および非腫瘍性前立腺生検材料、ならびに５ａｘａ−ｄＣで処理したＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞からＤＮＡを精製した。ｇＤＮＡサンプルの濃度、収率、および純度を分光法を用いて測定した。全てのサンプルで良好なｇＤＮＡ収量および質が得られた（Ａ２６０／Ａ２８０比が１．７〜２．０）。ゴールドスタンダードのパイロシークエンシング法を使用して、グアニンの上流に位置する塩基特異的シトシンメチル化レベル（ＣｐＧジヌクレオチドと呼ばれる配列）を求めた。Factorbook（UCSC Genome Bioinformatics）を用いるENCODEプロジェクトから転写因子ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって同定されたＰＣＳＫ６遺伝子のエキソン２５および代替エキソン２５に近接して、３つの可能性のあるＣＴＣＦ結合部位を標的とした（図４ＡおよびＢ）。パイロシークエンシングアッセイは、これまでに記載されているように（Guay et al.2012, Epigenetics, 7: 464-472）、亜硫酸水素ナトリウムＤＮＡ変換化学作用ｇＤＮＡ（６００ｎｇ；EpiTech Bisulfite Kits；Qiagen，＃５９１０４）、Ｎａ−Ｂｉｓ処理ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Pyromark PCR Kit；Qiagen，＃９７８７０３）、およびＰＣＲ産物の合成アッセイによるシークエンシング（Pyromark Gold Q24 Reagents；Qiagen，＃９７８８０２）を組み合わせる。簡単に説明すると、亜硫酸水素ナトリウムは、優先的に非メチル化シトシンをチミンに脱アミノ化するが（ＰＣＲ増幅後）、メチル−シトシンは修飾を受けない。パイロシークエンシング分析において、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各ＣｐＧ部位に順次添加し、パイログラム上に得られたｄＣＴＰに対するｄＴＴＰの相対的ピーク高さにより、塩基特異的ＤＮＡメチル化レベルの決定が可能になった（PyroMark Q24 1.1.10）。ＰＣＲおよびシークエンシングプライマーを、PyroMark Assay Designソフトウェアv.2.0.1.15を使用して設計した。全体として、（ＣｐＧジヌクレオチド関連（a CpG dinucleotides context）における）９つの潜在的にメチル化されるシトシンをＰＣＳＫ６遺伝子座で分析した。
実施例Ｖ
クロマチン免疫沈降
【０１３７】
細胞を１５０ｍｍ培養皿で培養し、終濃度１．１％になるようにホルムアルデヒドを添加することにより、室温で１０分間架橋に付し、続いてさらに５分間、１２５ｍＭグリシンによるクエンチング工程に付した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて集め、液体窒素中で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。細胞ペレットをＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ  ｐＨ６．５；０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００に再懸濁し、４，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離した。２００μＬのＴｒｉｓ５０ｍＭ  ｐＨ８．１;１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳを添加することによって、ペレットをさらに溶解させ、２８Ｇシリンジに３回通した。細胞調製物を絶えず撹拌しながら４℃で１時間インキュベートし、５，０００ｒｐｍでの遠心分離により核をペレット化した。４００μＬの水を（ＥＤＴＡを希釈するために）核に添加し、溶液を氷上で強度６／１０で３×１０秒超音波処理し、続いて４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。１．１×１０４小球菌ヌクレアーゼゲルユニット（New England Biolabs）をその製造されたバッファーおよびＢＳＡと共に添加し、氷上で５分間インキュベートした後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡで中和した（最終濃度：１０ｍＭ）。ＤＮＡ断片化を、（ＲＮａｓｅ  Ａ  １０μｇ／ｍＬで１０分間予め処理した）１０μＬの断片化ＤＮＡ溶液を用いて、アガロースゲル電気泳動によって、ルーチンに評価した。各ＩＰでは、（ＯＤ２６０ｎＭを使用して測定した濃度に基づいて）３５０μｇのＤＮＡを使用し、対応する体積の５％を定量用の入力ＤＮＡとして取っておいた。各ＩＰをＩＰバッファー（Ｔｒｉｓ  １６．７ｍＭ  ｐＨ８．１；１６７ｍＭ  ＮａＣｌ，１．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０１％ＳＤＳ）で１ｍＬにした。ＤＮＡを１０μｇの特異抗体または通常のＩｇＧと４℃で一晩インキュベートすることにより、免疫沈降を行った。３５０μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡと共に４℃で１時間予めインキュベートした４０μＬのプロテインＡ  MagneResynを添加することにより、抗体−ＤＮＡ複合体を回収した。ビーズを添加してから１時間後、ビーズを以下のバッファーのそれぞれで５分間２回連続して洗浄した：ｉ）Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ  ｐＨ８．１；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，０．１％  ＳＤＳ，ｉｉ）Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ  ｐＨ８．１；５００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，０．１％  ＳＤＳ，ｉｉｉ）Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ  ｐＨ８．１；１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ４０，１％  Ｎａ−デオキシコレート，０．２５Ｍ  ＬｉＣｌ、およびｉｖ）Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ  ｐＨ８．１；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ。プロテアーゼ阻害剤（Complete Mini；Roche）を全てのバッファーに添加し、その直後に、最後に、ビーズ（およびそれらに対応する５％の入力ＤＮＡ）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３；１％ＳＤＳに再懸濁させ、頻繁に攪拌しながら６５℃で加熱して、ビーズからＤＮＡを溶出させた。遠心分離後、ＤＮＡを含む上清を、５０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫおよび２５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ  Ａと共に６５℃で一晩インキュベートした。QIAquick PCR purification Kitを用いて、製造業者のガイドラインに従って、ＤＮＡを最終的に精製し、３Ｍ酢酸ナトリウムで溶液のｐＨを調整した。ＣｈＩＰで単離したＤＮＡを５０μＬのＴＥバッファー中に溶出させ、一方、対応する５％の入力ＤＮＡを２５０μＬ中に溶出させ、濃度を１％当量にした。３μＬの精製ＤＮＡをｑＰＣＲ分析にさらに使用し、標準として１％の入力を使用して、定量化を達成した。
実施例ＶＩ
正常ＲＮＡおよび腫瘍ｃＤＮＡ解析
【０１３８】
正常ＲＮＡ標準化調製物を、Clontech Laboratories （Total RNA Master Panel II；カリフォルニア州マウンテンビュー）から入手した。コントロール源からの全ＲＮＡからなるこれらを、キャピラリー電気泳動および変性ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動のコントロールとした。さらなるＲＴ−ｑＰＣＲ分析に、１μｇのＲＮＡを使用した。正常および腫瘍性ｃＤＮＡについて、同一のｑＰＣＲプレートにおいて様々な癌を網羅するOrigene（メリーランド州ロックビル）Cancer Survey cDNA ArrayからｃＤＮＡを入手した。プレートあたり単一の転写物についてのプレミックスされたSYBR greenおよびプライマーの添加によって、供給されたアクチンプライマーを正規化遺伝子として製造者の指示に従って使用して、全てのサンプルを分析した。
実施例ＶＩＩ
細胞培養およびセクレトーム調製におけるアミノ酸による安定同位体標識化
【０１３９】
ＳＩＬＡＣ標識化のために、標識する細胞を、４２ｍｇ／Ｌの［１３Ｃ６］−Ｌ−アルギニン、７３ｍｇ／Ｌの［１３Ｃ６］−Ｌ−リジン（Cambridge Isotope Laboratories, Inc，マサチューセッツ州）、および透析ウシ胎児血清を補充したＬ−アルギニンおよびＬ−リジンを含まないＲＰＭＩ  １６４０（ThermoFisher Scientific）中でそれらのクライオバイアルから戻した。重い培地中で３回以上継代後、Scmidt et al.((2007, Rapid Commun Mass Spectrom, 21: 3919-3926)に記載の方法を用いて、細胞を完全標識化について調べ、他の用途のために凍結保存した。プロリン変換をＰｒｏ含有ペプチドにおいて人手により評価し、＜０．１％であることが分かった。馴化培地作製のために、固定数の細胞をｐ１５０ｍｍ培養プレートに３６時間播き（ＤＵ１４５については４．５×１０６およびＬＮＣａＰについては６×１０６）、その後、細胞を洗浄し、新鮮な無血清培地を添加した。細胞を２４時間培地に馴化させ、それを集めた後、１，０００×ｇで５分間遠心分離し、０．２２μｍのシリンジユニットで濾過し、使用するまで液体窒素中で瞬間凍結した。解凍したら、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し（ＥＤＴＡを含む最終濃度１×，Miniプロテアーゼ阻害剤，Roche）、３ｋＤａのAmicon-Ultra遠心式ユニット（Millipore）で濃縮し、通常１５ｍＬを１．５ｍＬに濃縮し、その後、非標識条件と１：１（体積：体積）でプールし（pooler）（例えば、Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ：ｓｈＰＡＣＥ４）、アセトン：メタノール（８：１，ＭＳグレードのFisherの試薬）の体積９の添加により沈殿させた。沈殿は−８０℃で一晩行った。タンパク質沈殿物を、４℃で３０分間、１７．０００×ｇでの遠心分離により集め、反転によりメタノールで３回洗浄した（４℃，１０分間）。次いで、洗浄したペレットを（ＳＤＳを含む）SAGE-Elfサンプルローディング溶液に可溶化し、ＤＴＴ（最終濃度１０ｍＭ）と共に９５℃で１０分間加熱した。サンプルをSAGEゲルカセット（３％アガロース）にロードし、１時間移動させ、その後、１３の画分に電気溶出させた。画分を集め、５倍に希釈し、ＤＴＴ還元（５ｍＭ，室温，３０分間）、ヨードアセトアミドアルキル化（５ｍＭ，室温，３０分間暗所）、およびＤＴＴによるクエンチング（５ｍＭ，室温，３０分間，暗所）に使用した。次いで、タンパク質を、１００μｇあたり１μｇのトリプシンを用いて（ＢＣＡタンパク質滴定アッセイを用いて測定）、サーモシェーカーで３７℃で一晩消化した。ペプチド溶液を５μＬのギ酸で酸性化し、その後、体積１のＫＣｌ  ４Ｍを添加した。サンプルを１分間ボルテックスし、室温で１０分間静置した後、最大体積の酢酸エチルをチューブに添加することによって、酢酸エチル有機液液抽出に付した。有機相を捨て、ペプチドを含有する水相を２回の抽出に再度付して、完全にＳＤＳが除去されるようにした。チューブをドラフト内で２０分間開いたままにすることによって、残留有機物を蒸発させた。次いで、５μＬのギ酸を添加することによってペプチド溶液を再び酸性化し、真空マニホールドで以下の手順を使用して、ペプチドを固相抽出（Strata-X 33uポリマー逆相，３０ｍｇ／１ｍＬ）によってクリーンアップした（各溶液は、次の溶液を添加する前に完全に排出させた）：１ｍＬ  ＡＣＮ，１ｍＬ  Ｈ２Ｏ  ０．１％ギ酸，酸性化ペプチド溶液，１ｍＬ  Ｈ２Ｏ  ０．１％ギ酸，５０％ＡＣＮ  ０．１％ギ酸：溶出用）。Speed-Vacシステムでペプチドをさらに乾燥し、Ｈ２Ｏ  ０．２％ギ酸、３％ＤＭＳＯ中に戻し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に付した。
【０１４０】
取得は、２５μｍのｉＤキャピラリーを有するエレクトロスプレーインターフェースを備え、Eksigent μUHPLC（Eksigent，米国カリフォルニア州レッドウッドシティ）に連結されたSciex TripleTOF 5600（Sciex，米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて行った。装置の制御、ならびにデータ処理および取得のために、Analyst TF 1.6ソフトウェアを使用した。電源電圧を５．２ｋＶに設定し、３２５℃に維持し、カーテンガスを２７ｐｓｉに、ガス１を１２ｐｓｉに、ガス２を１０ｐｓｉに設定した。情報依存式取得（Information Dependant Acquisition）（ＩＤＡ）で取得を実行した。６０℃に維持した、内径０．３μｍ、粒子２．７μｍ、長さ１５０ｍｍの逆相ＨＡＬＯ  Ｃ１８−ＥＳカラム（Advance Materials Technology，デラウェア州ウィルミントン）で分離を行った。サンプルを５μＬのループにループオーバーフィル（loop overfilling）により注入した。１２０分のＬＣグラジエントでは、移動相は、３μＬ／分の流速で、以下の溶媒Ａ（水中０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ  ｖ／ｖ）ならびに溶媒Ｂ（エタノール中０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ）からなっていた。
【０１４１】
グラジエントは以下の通りであった：０〜８８分は２％Ｂから３０％Ｂへ、８８〜１０８分は３０％Ｂから５５％Ｂへ、１０８〜１１５分は５５％Ｂから９５％Ｂへ、９５％Ｂを５分間保持、次いで、最終条件で１分のポストフラッシュ（a 1 minute post flush）。生データを、Protein Pilotソフトウェア（Sciex，米国カリフォルニア州フォスターシティ）によって処理した。ペプチドおよびタンパク質の同定後、非標識：標識（軽：重）比およびｐ値を、各タンパク質について個々のペプチドからソフトウェアによって計算した。得られたタンパク質の同定から、分泌されるタンパク質をProteINSIDE（Kaspric et al., 2015）を用いて検索し、（シグナルペプチドの存在に基いて）分泌されると予測されるタンパク質のみを考慮した。Ｌ／Ｈ＞１で検出された多くのタンパク質がウシタンパク質と高い相同性を有するペプチドから構成されており、馴化培地サンプル中に残留アルブミンが存在するために誤った解釈を招き得ることから、Ｌ／Ｈ比＜１のみを考慮した。重い条件（Ｌ／Ｈ＝０）でのみ同定されたタンパク質については、Ｐ値に基づく一次除外基準を適用し、Ｐ＜０．０５のみを保存した。Uniprot PTM/Processingデータの両方を使用して、またはProP 1.0 Serverにより、全てのタンパク質をＰＣ系またはＰＣ様プロセシングイベントについて人手により検索した。
【０１４２】
ＩＰ−ＭＳ分析では、各条件を２回注入した。まず、イオンライブラリーの生成のために、情報依存式取得（Information Dependant Acquisition）で取得を実行した。次に、サンプルを再注入し、定量化のためにＳＷＡＴＨモードでサイズが可変のウィンドウで取得を行った。６０℃に維持した、内径０．３μｍ、粒子２．７μｍ、長さ１５０ｍｍの逆相ＨＡＬＯ  Ｃ１８−ＥＳカラム（Advance Materials Technology，デラウェア州ウィルミントン）で分離を行った。サンプルを５μＬのループにループオーバーフィル（loop overfilling）により注入した。６０分のＬＣグラジエントでは、移動相は、３μＬ／分の流速で、以下の溶媒Ａ（水中０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ  ｖ／ｖ）ならびに溶媒Ｂ（エタノール中０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ）からなっていた。グラジエントは以下の通りであった：０〜４４分は２％Ｂから３０％Ｂへ、４４〜５４分は３０％Ｂから５５％Ｂへ、５４〜５７分は５５％Ｂから９５％Ｂへ、９５％Ｂを５分間保持、次いで、最終条件で５分のポストフラッシュ（a 5 minute post flush）。タンパク質データベースおよびイオンライブラリーを、ProteinPilotソフトウェア（Sciex，米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて各ＩＤＡファイルを同時に分析することによって作成した。次いで、このデータベースを使用して、Peakviewソフトウェア（Sciex，米国カリフォルニア州フォスターシティ）でＳＷＡＴＨ定量化ツールを用いてタンパク質を定量した。Peakviewは、サンプル中で検出された各ペプチドのクロマトグラムの曲線下面積、ならびにピークスコアおよび偽発見率を出力する。ピークスコアが０．５より高かった場合、または偽発見率が１％より低かった場合、ペプチドを正しく積分されたものと見なした。タンパク質定量は、全ての正しく積分されたペプチドの合計を表す。カラムにロードされたペプチドの量の差を補正するために、全てのサンプルの総タンパク質量の平均と比較して、サンプルの総タンパク質量を考慮に入れる補正係数で全てのタンパク質を除算した。
実施例ＶＩＩＩ
ペプチド合成
【０１４３】
ＭＬペプチドおよびその誘導体（Ｐｅｇ８−ＭＬおよびＣ２３）を、Kwiatkowska et al.(2014, Journal of Medicinal Chemistry, 57: 98-109)にこれまでに記載されているように合成した。ＧＤＦ−１５スパニングペプチドの合成を、TentaGel S RAMアミド樹脂（０．５ｇ，０．１３ｍｍｏｌ／ｇ）上で標準的な固相ペプチド法によって人手により行った。簡単に説明すると、Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピぺリジンを用いて行い（５分および１０分）、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（３当量）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ，３当量）、１−ヒドロキシ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ，３当量）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ，９当量）をカップリングに使用した。反応の完了をカイザー（Kaiser）テストによって確認した。最後のＦｍｏｃ脱保護の後、酢酸無水物／ＤＩＰＥＡ／ジクロロメタンの混合物（１５：１５：７０  ｖ／ｖ／ｖ，１０ｍｌ）を使用して、Ｎ末端にＬ−Ｇｌｎ残基を有するＧＤＦ−１５ペプチドをアセチル化して、ピログルタメートの形成を防止した。室温で３時間、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）のカクテル（９５：２．５：２．５  ｖ／ｖ／ｖ，２０ｍｌ）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。生成物を冷たいジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離により集め、溶解し、凍結乾燥して白色固体を得た。粗製ペプチドを分取ＨＰＬＣ（VARIAN ProStar）により精製した。純粋な生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。ペプチドの同一性および純度（９７％）を、ＨＲＭＳ（TripleTOF 5600，ABSciex）およびAgilent Eclipse XDB C18カラムを有するダイオードアレイ検出器を備えた分析用ＨＰＬＣ（Agilent Technologies 1100システム）によって確認した。
【０１４４】
ＧＤＦ−１５ペプチド（４０μｇ）を、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１．８ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７．５中の組み換えＰＡＣＥ４または可溶性ｆｕｒｉｎ（１６Ｕ）と共に（総サンプル体積：３００μｌ）、３７℃で１時間かけてインキュベートした。以下のコントロールを使用した：バッファー単独およびバッファー中でインキュベートしたペプチドまたは酵素。インキュベーション後、反応物を分析用ＨＰＬＣ（Agilent Technologies，ダイオードアレイ検出器およびフラクションコレクターを備えた１１００シリーズ；注入量：９５μｌ，グラジエント：５０分間２〜２５％［Ｂ］中［Ａ］；［Ａ］０．１％ＴＦＡ水溶液および［Ｂ］アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ水溶液；カラム：Agilent Eclipse XDB C18カラム（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）により直ちに分析した。集めた画分をSELDI-TOF質量分析計（Bio-Rad Laboratories）により分析して切断生成物を同定した。
実施例ＩＸ
血漿採取
【０１４５】
参加に同意した患者から、前立腺摘除術の直前に血液サンプルを採取した。正常な患者については、参加することに同意し同意書に署名した、ＰＳＡタイトレーションのために参照される患者からサンプルを採取した。血液をＥＤＴＡコートチューブ（Vacutainer; BD）に集め、５，０００×ｇ（４℃）で１５分間遠心分離した。次に、血漿を等分し、ＥＬＩＳＡアッセイ（詳細な方法のセクションに記載）に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１４６】
本開示をその具体的な実施形態に関連して説明してきたが、本開示はさらなる変更が可能であり、本出願は、当技術分野内の公知技術または慣行の範囲内に入る本開示からの逸脱、上記の本質的な特徴に適用され得る本開示からの逸脱、添付の特許請求の範囲に従う本開示からの逸脱を含む、あらゆる変形、使用、または応用を包含することが意図されていることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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