(57)【要約】哺乳動物、好ましくはヒトにおける認知障害を処置又は防止するための方法及び組成物が提供される。該方法は、一般に、例えば低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの投与による、オステオカルシンを含むＧＰＲ１５８シグナル伝達経路の活性化を含む。該方法によって処置可能な障害としては、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害が挙げられるが、それらに限定されない。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における認知障害を処置又は防止する方法であって、それを必要とする哺乳動物に治療有効量のＧＰＲ１５８の活性化物質と薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記認知障害が、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記認知障害が、加齢による不安、加齢による抑欝、加齢による記憶喪失、又は加齢による学習障害である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化物質が、低分子、ペプチド、抗体又は核酸である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記認知障害が不安である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記認知障害が抑欝である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記認知障害が記憶喪失である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記認知障害が学習障害である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
患者における認知障害を診断及び処置する方法であって、
（ｉ）前記患者から採取した生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを測定するステップ、
（ｉｉ）低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの前記患者レベルと低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの対照レベルを比較するステップ、及び
（ｉｉｉ）前記患者レベルが前記対照レベルよりも有意に低い場合、前記患者に治療有効量のＧＰＲ１５８活性化物質を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
哺乳動物における認知障害を処置又は防止するための、ＧＰＲ１５８活性化物質を含む医薬組成物の使用。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトであり、前記オステオカルシンがヒトオステオカルシンである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記認知障害が、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記認知障害が、加齢による不安、加齢による抑欝、加齢による記憶喪失、又は加齢による学習障害である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記認知障害が不安である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記認知障害が抑欝である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１７】
前記認知障害が記憶喪失である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１８】
前記認知障害が学習障害である、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願（単数又は複数）の相互参照
本願は、その開示全体を参照により本明細書に援用する２０１７年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４５９，３２９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
米国政府利権の記述
本開示は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇによって授与された補助金２Ｐ０１ＡＧ０３２９５９−０６Ａ１の政府支援で成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本開示の分野
本開示は、哺乳動物における認知障害を処置又は防止するための方法及び組成物を対象とする。こうした認知障害としては、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害が挙げられるが、それらに限定されない。
【背景技術】
【０００４】
オステオカルシンは、極めて少ない骨芽細胞特異的タンパク質の一つであり、ホルモンの幾つかの特徴を有する。例えば、それは、プレプロ分子として合成され、全身循環で分泌される（非特許文献１、２）。それらの精巧な細胞特異的発現のために、オステオカルシン遺伝子は、骨芽細胞特異的転写因子を特定し、骨生理学の分子的基礎を定義するために、集中的に研究された（非特許文献３、４）。
【０００５】
オステオカルシンは、石灰化した骨基質に関連して発見された最も豊富な非コラーゲンタンパク質であり、現在、骨代謝回転の臨床評価用生物学的マーカーとして使用されている。オステオカルシンは、３ガンマカルボキシル化グルタミン酸残基をその一次構造に含む低分子（４６〜５０アミノ酸残基）骨特異的タンパク質である。オステオカルシンという名称（ｏｓｔｅｏ、骨のギリシア語；ｃａｌｃ、石灰塩のラテン語；ｉｎ、タンパク質）は、Ｃａ２＋に結合するタンパク質の能力、及び骨中のその存在量に由来する。オステオカルシンは特有の翻訳後修飾を受け、それによってグルタミン酸残基がカルボキシル化されてガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を形成する。したがって、オステオカルシンの別名は骨Ｇｌａタンパク質である（非特許文献１）。
【０００６】
オステオカルシンは、中脳及び海馬中のニューロンに結合し、神経伝達物質合成を調節し、不安を軽減し、記憶を増進する（非特許文献５）。オステオカルシン−／−マウスにおいて認められた行動上の欠陥の重症度は、マウスとヒトの両方における中年前の循環オステオカルシンレベルの急激な減少（非特許文献６）と一緒に、経時的な骨健康の変化が認知機能の加齢性低下の一因になり得るかどうか、また、どのようにしてその一因になり得るかという疑問を生じる。
【０００７】
成熟ヒトオステオカルシンは、４９個のアミノ酸を含み、予測分子量５，８００ｋＤａである（非特許文献７）。オステオカルシンは、骨芽細胞及び象牙芽細胞によって主に合成され、骨の非コラーゲンタンパク質の１５〜２０％を含む。非特許文献７によれば、成熟オステオカルシンは、グルタミン酸残基の翻訳後ビタミンＫ依存修飾によって形成される３つのカルボキシグルタミン酸残基を含むことが示されている。カルボキシル化Ｇｌａ残基は、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位にある。あるヒトオステオカルシンは、２つのＧｌａ残基しか含まないことが示された（非特許文献８）。
【０００８】
オステオカルシンは、ホルモンの幾つかの特徴を有する。非特許文献９は、高齢オステオカルシン欠乏マウス由来の石灰化した骨が野生型よりも２倍厚いことを示した。オステオカルシンの欠如は、骨吸収を損なわずに骨形成を増加させ、石灰化に影響しないことが示された。
複数の免疫反応型のヒトオステオカルシンが循環中（非特許文献１０）及び尿中（非特許文献１１）で発見された。ヒトオステオカルシンの断片は、骨基質の破骨細胞分解中に、又は骨芽細胞による合成後の循環タンパク質の異化分解の結果として、産生され得る。
【０００９】
骨生理学に影響する新規な器官の近年における特定は、骨格生物学において研究される問題の範囲を広げた。その一例は、脂肪細胞由来のホルモンレプチンがすべての試験種において骨量増加を減少させる機序を研究することによって最初に明らかにされた脳による骨量増加の調節である（非特許文献１２〜１５）。細胞特異的遺伝子欠損モデルの使用は、レプチンが脳幹ニューロンにおいてシグナルを送り、交感神経系の活性を低下させる神経伝達物質、骨量増加の阻害剤、セロトニンの合成を防止するという広範な証拠を明らかにした（非特許文献１６〜１８）。脳由来セロトニンのこの機能の重要性を最も良く示すのは、脳内のセロトニンの局所濃度を増加させる選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（非特許文献１９）がヒトにおける骨量に対して有害作用を有するということである。
【００１０】
骨格生物学における重要性の第２の進展は、骨が少なくとも２種のホルモンを分泌する内分泌器官であるという証明である。その一つであるオステオカルシンは、造骨細胞である骨芽細胞によって産生され、エネルギー消費、インスリン分泌、インスリン感受性、オスにおけるテストステロン合成などの骨健康に明らかに無関係である幾つかの機能を促進する（非特許文献２０、２１）。最後の機能は、ライディッヒ細胞上の特異的受容体ｇｐｒｃ６ａにオステオカルシンが結合した後に発生する（非特許文献２１）。
【００１１】
ＯＳＴ−ＰＴＰは、Ｅｓｐ遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｅｓｐ遺伝子は、最初に胚性幹（ＥＳ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）細胞ホスファターゼにちなんで命名され、マウスではＰｔｐｒｖ遺伝子とも呼ばれる。（非特許文献２２）。Ｅｓｐの遺伝子産物は、その骨及び精巣局在化のために、しばしば骨芽細胞精巣タンパク質チロシンホスファターゼ（ＯＳＴ−ＰＴＰ）と称される。ＯＳＴ−ＰＴＰは、３個の異なるドメインを含む大きな１，７１１アミノ酸長タンパク質である。ＯＳＴ−ＰＴＰは、複数のフィブロネクチンＩＩＩ型繰り返しを含む１，０６８アミノ酸長細胞外ドメインである。
【００１２】
Ｇｐｒｃ６ａは、ＧＰＣＲのＣファミリーに属する受容体であり（非特許文献２３）、アミノ酸受容体、又は補因子としてのオステオカルシンの存在下のカルシウム受容体、及びアンドロゲン受容体であると提唱されている（非特許文献２４〜２６）。
【００１３】
胚発生は、種々の環境シグナルによって影響される。特に、臨床成績研究とモデル生物において収集された実験証拠の両方が一致して示すところによれば、妊娠中の母親の健康は、胚発生の重要な決定因子である（非特許文献２７〜２９）。定義上、脊椎動物の胚発生に対するいかなる直接の母体の影響も、母から胚への循環分子の移送を可能にする器官である胎盤を通して起こる。しかし、現在まで、胎盤中で、又は母親によって産生され、胎盤を通過し、子の脳の発達に影響し得る分子は、特定されていない。これは、ますます多くの疫学的研究によって母親の健康も子孫における神経疾患及び精神疾患の危険因子かもしれないことが示唆されていることを考えると、重要な問題である（非特許文献３０〜３２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈａｕｓｃｈｋａら、１９８９、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ  ６９：９９０〜１０４７
【非特許文献２】Ｐｒｉｃｅ、１９８９、Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２１：５１〜５７（考察５７〜６０）
【非特許文献３】Ｄｕｃｙら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１５０１〜１５０４
【非特許文献４】Ｈａｒａｄａ  ＆  Ｒｏｄａｎ、２００３、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３４９〜３５５
【非特許文献５】Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１
【非特許文献６】Ｍｅｒａ，Ｐ．ら、２０１６、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２３：１０７８〜１０９２
【非特許文献７】Ｐｏｓｅｒら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８６８５〜８６９１
【非特許文献８】Ｐｏｓｅｒ  ＆  Ｐｒｉｃｅ、１９７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４３１〜４３６
【非特許文献９】Ｄｕｃｙら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８〜４５２
【非特許文献１０】Ｇａｒｎｅｒｏら、１９９４、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９：２５５〜２６４
【非特許文献１１】Ｔａｙｌｏｒら、１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７０：４６７〜４７２
【非特許文献１２】Ｄｕｃｙら、２０００、Ｃｅｌｌ  １００：１９７〜２０７
【非特許文献１３】Ｐｏｇｏｄａら、２００６、Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．２１：１５９１〜１５９９
【非特許文献１４】Ｅｌｅｆｔｅｒｉｏｕら、２００４、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１：３２５８〜３２６３
【非特許文献１５】Ｖａｉｒａら、２０１２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｒｅｖ．２９：２３７〜２５８
【非特許文献１６】Ｔａｋｅｄａら、２００２、Ｃｅｌｌ  １１１：３０５〜３１７
【非特許文献１７】Ｙａｄａｖら、２００９、Ｃｅｌｌ  １３８：９７６〜９８９
【非特許文献１８】Ｏｕｒｙら、２０１０、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２４：２３３０〜２３４２、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２４：２３３０〜２３４２
【非特許文献１９】Ｇａｒｄｉｅｒら、１９９６、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０：１６〜２７
【非特許文献２０】Ｌｅｅら、２００７、Ｃｅｌｌ  １３０：４５６〜４６９
【非特許文献２１】Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６〜８０９
【非特許文献２２】Ｌｅｅら、１９９６、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５９：１５３〜１６４
【非特許文献２３】Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ及びＢｒａｕｎｅｒ−Ｏｓｂｏｒｎｅ、２００４、Ｇｅｎｅ  ３３５：３７〜４６
【非特許文献２４】Ｐｉら、２００８、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３：ｅ３８５８
【非特許文献２５】Ｐｉら、２００５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４０２０１〜４０２０９
【非特許文献２６】Ｐｉら、２０１０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：３９９５３〜３９９６４
【非特許文献２７】Ｏｓｏｒｉｏら、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：６２４
【非特許文献２８】Ｌａｗｌｏｒら、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：６７９〜６８８
【非特許文献２９】Ｃｈａｌｌｉｓら、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：６２９〜６３０
【非特許文献３０】Ｗａｄｈｗａら、２００１、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１３３：１３１〜１４２
【非特許文献３１】Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈら、２００５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｒｅｖ．２９：２３７〜２５８
【非特許文献３２】Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、２００８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｒｅｖ．３２：１０７３〜１０８６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示は、認知障害の処置又は防止を必要とする哺乳動物に、脳におけるオステオカルシン受容体ＧＰＲ１５８を活性化する治療有効量の薬剤を含む医薬組成物を投与するステップを含む、哺乳動物における認知障害を処置又は防止する方法の例示的実施形態を提供する。ある例示的実施形態においては、薬剤は低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンであり、医薬組成物は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。ある例示的実施形態においては、哺乳動物はヒトであり、オステオカルシンはヒトオステオカルシンである。別の例示的実施形態においては、医薬組成物は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンではない薬剤及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。ある例示的実施形態においては、認知障害は、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害からなる群から選択される。ある例示的実施形態においては、認知障害は、加齢による不安、加齢による抑欝、加齢による記憶喪失、又は加齢による学習障害である。
【００１６】
本開示は、したがって、哺乳動物における認知障害を処置する方法であって、認知障害の処置又は防止を必要とする哺乳動物に、ＧＰＲ１５８を活性化する薬剤を含む医薬組成物を、加齢に付随する神経変性による認知欠損の軽減、不安の軽減、抑欝の軽減、記憶喪失の軽減、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の軽減からなる群から選択される哺乳動物における効果を生じる量で投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
ある例示的実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【００１８】
ある例示的実施形態においては、薬剤は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。ある例示的実施形態においては、薬剤は、ヒト低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。
【００１９】
ある例示的実施形態においては、薬剤は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンではない。
【００２０】
ある例示的実施形態においては、薬剤は、低分子、ペプチド、抗体又は核酸からなる群から選択される。
【００２１】
薬剤が低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンであるある例示的実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも１つは、カルボキシル化されていない。ある例示的実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の３つすべては、カルボキシル化されていない。
【００２２】
ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの調製物であり、調製物中の成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある全Ｇｌｕ残基の約２０％超が、カルボキシル化されていない。ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンが最大配列相同性で整列したときに、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を共有する。ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンが最大配列相同性で整列したときに、成熟ヒトオステオカルシンと約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％のアミノ酸配列相同性を共有する。ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基が成熟ヒトオステオカルシンとは異なる。
【００２３】
ある例示的実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも１つは、カルボキシル化されていない。ある例示的実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の３つすべては、カルボキシル化されていない。
【００２４】
ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、
（ａ）Ｃ末端から最後の１０個のアミノ酸が欠けている成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
（ｂ）Ｎ末端から最初の１０個のアミノ酸が欠けている成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸６２〜９０を含む断片、
（ｄ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１〜３６を含む断片、
（ｅ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１３〜２６を含む断片、
（ｆ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１３〜４６を含む断片、及び
（ｇ）上記のものの変異体
からなる群から選択されるポリペプチドである。
【００２５】
ある例示的実施形態においては、医薬組成物は、ＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化する抗体又は抗体断片を含む。好ましくは、抗体又は抗体断片は、モノクローナル抗体である。ある例示的実施形態においては、抗体又は抗体断片は、ＧＰＲ１５８の細胞外ドメインに結合する。
【００２６】
ある例示的実施形態においては、医薬組成物は、ＧＰＲ１５８を活性化する核酸を含む。ある例示的実施形態においては、核酸は、β−アレスチンの発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチド又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）である。
【００２７】
ある例示的実施形態においては、医薬組成物は、約０．５ｍｇ〜約５ｇ、約１ｍｇ〜約１ｇ、約５ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、又は約２５ｍｇ〜約２００ｍｇの薬剤を含む。ある例示的実施形態においては、医薬組成物は、制御放出製剤に処方される薬剤を含む。ある例示的実施形態においては、医薬組成物は、人体におけるその半減期を延長するように化学修飾された薬剤を含む。
【００２８】
ある例示的実施形態においては、哺乳動物における認知障害を処置するための医薬組成物は、アミノ酸配列
ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＸ１ＰＲＲＸ２ＶＣＸ３ＬＮＰＤＣＤＥＬＡＤＨＩＧＦＱＥＡＹＲＲＦＹＧＰＶ（配列番号１０）
を含む低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンポリペプチドを含む。式中、
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が各々グルタミン酸である場合、Ｘ１はカルボキシル化されず、又はＸ２の５０パーセント未満はカルボキシル化され、及び／又はＸ３の５０パーセント未満はカルボキシル化されるという条件で、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はアミノ酸又はアミノ酸類似体から各々独立に選択され、
或いは、前記オステオカルシンポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３を除いて１〜７位において配列番号１０とは異なるアミノ酸配列を含み、並びに／或いは
アミノ酸配列は、１個以上のアミド骨格置換を含むことができる。
【００２９】
ある例示的実施形態においては、配列番号１０のオステオカルシンポリペプチドは、融合タンパク質である。ある例示的実施形態においては、配列番号１０の４３位のアルギニンは、タンパク質分解に対するオステオカルシンポリペプチドの感受性を低下させるアミノ酸又はアミノ酸類似体で置換される。ある例示的実施形態においては、配列番号１０の４４位のアルギニンは、□−ジメチル−アルギニンで置換される。ある例示的実施形態においては、オステオカルシンポリペプチドは、非カルボキシル化ヒトオステオカルシンの逆鏡像異性体である（１〜４９）。
【００３０】
ある例示的実施形態においては、患者は、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害からなる群から選択される認知障害を有するか、又はそのリスクがある。
【００３１】
上記使用のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化する薬剤は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。したがって、本開示は、哺乳動物における認知障害の処置又は防止に使用される低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを提供する。特定の例示的実施形態においては、認知障害は、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害からなる群から選択される。ある例示的実施形態においては、認知障害は、加齢による不安、加齢による抑欝、加齢による記憶喪失、又は加齢による学習障害である。
【００３２】
上記使用のある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、加齢に付随する神経変性による認知欠損を軽減し、不安を軽減し、抑欝を軽減し、記憶喪失を軽減し、学習を改善し、又は妊娠中の食糧不足に付随する認知障害を軽減する。ある例示的実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも１つは、カルボキシル化されていない。ある例示的実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の３つすべては、カルボキシル化されていない。ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの調製物であり、調製物中の成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置にある全Ｇｌｕ残基の約２０％超が、カルボキシル化されていない。ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンが最大配列相同性で整列したときに、成熟ヒトオステオカルシンと約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％のアミノ酸配列相同性を共有する。ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基が成熟ヒトオステオカルシンとは異なる。
【００３３】
上記使用のある例示的実施形態においては、薬剤は、低分子、抗体又は核酸からなる群から選択される。
【００３４】
本開示は、哺乳動物における認知障害の処置用医薬品の製造のための低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンポリペプチド又はその模倣物の使用を提供する。ある例示的実施形態においては、障害は、加齢に付随する神経変性による認知欠損、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害からなる群から選択される。
【００３５】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面（単数又は複数）を含む本特許又は特許出願公報の複製は、請求次第、かつ必要な手数料の支払い次第、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】オステオカルシンが神経伝達物質の生合成に影響することを示す図である。（パネルＡ〜Ｂ）オステオカルシン−／−（ｎ＝６）及びＧｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝６）マウスにおける、３日間にわたる１２時間の明暗期中の（パネルＡ）全活動（ＸＴＯＴ）及び（パネルＢ）歩行活動（ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＡＭＢＸ）の測定。変異マウスをそのそれぞれのＷＴ（ｎ＝６）同腹仔と比較した。（パネルＣ）オステオカルシン−／−、Ｇｐｒｃ６ａ−／−及びＷＴ同腹マウスにおいて行われたオープンフィールドパラダイム試験のビデオトラッキング。（パネルＤ〜Ｇ）オステオカルシン−／−（ｎ＝１５）及び対照（ｎ＝１５）の脳の様々な部分における（パネルＤ）セロトニン、（パネルＥ）ＧＡＢＡ、（パネルＦ）ドーパミン及び（パネルＧ）ノルエピネフリン含有量のＨＰＬＣ分析。（パネルＨ）オステオカルシン−／−（ｎ＝１３）、Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝５）及び対照（ｎ＝１１）マウスの脳幹及び中脳におけるトリプトファンヒドロキシラーゼ−２（Ｔｐｈ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−１（ＧＡＤ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−２（ＧＡＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）及び芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（Ｄｄｃ）発現レベルの定量ＰＣＲ分析。エラーバーはＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定をバーの上に示す。
【図２】オステオカルシンが不安、抑欝、記憶及び学習に影響することを示す図である。（パネルＡ〜Ｌ）（パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ及びＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）並びにＷＴ（ｎ＝２１及びｎ＝１５）同腹マウスの行動分析。（パネルＡ〜Ｂ）明暗試験（Ｌ／ＤＴ）：点灯区画に進入する待ち時間（Ｓｅｃ＝秒）、区画間移動回数及び点灯区画消費時間を測定した。（パネルＣ〜Ｄ）高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ：Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ）：オープンアームにおける進入回数及び消費時間（Ｓｅｃ＝秒）を点数化した。（パネルＥ〜Ｆ）オープンフィールド試験（ＯＦＴ：Ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ）：総距離（ｃｍ）、中央対周辺における移動距離の％及び消費時間、並びに立ち上がり事象数を測定した。各マウス群のビデオトラッキングを右パネルに示す。（パネルＧ〜Ｊ）（パネルＧ〜Ｈ）強制水泳試験及び（パネルＩ〜Ｊ）尾懸垂試験中の静止消費時間（秒）の表示。両方の試験は、抑欝様行動を評価する。（パネルＫ〜Ｌ）１０日間行われたモリス水迷路試験。グラフは、各マウス群が水泳域において水没プラットホームの場所を突き止めるのに要する時間（秒）を示す。左パネルのビデオトラッキングは、分析した各群で得られた標準を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定をバーの上に示す。
【図３−１】オステオカルシンが脳内のニューロンに結合することを示す図である。（パネルＡ）非カルボキシル化オステオカルシン（３００ｎｇ／ｈ、右パネル）又はＰＢＳ（左パネル）を７日間皮下注入した３か月齢オステオカルシン−／−マウスにおける全オステオカルシンの測定。オステオカルシンレベルを骨、血清、並びに脳の様々な部分（皮質、中脳、視床下部、脳幹及び小脳）で測定した。（パネルＢ）ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチン（５０ｎｇ／ｍｌ、右パネル）又はＰＢＳ（左パネル）の７日間の皮下注入。レプチンレベルを血清、皮質、中脳、視床下部、脳幹及び小脳で測定した。（パネルＣ）ＧＳＴ−ビオチン（３０  ｇ／ｍｌ）（パネル１）及びビオチン化オステオカルシン（３００ｎｇ／ｍｌ）（パネル２〜４）と（抗５−ＨＴ免疫蛍光によって特定された）脳幹の背側（ＤＲ）及び正中（ＭＲ）縫線核、（抗ＴＨ免疫蛍光によって特定された）中脳の腹側被蓋野（ＶＴＡ：ｖｅｎｔｒａｌ  ｔｅｇｍｅｎｔａｌ  ａｒｅａ）、並びに（解剖学的に特定された）海馬のＣＡ３及びＣＡ４との結合。パネル５は、非標識オステオカルシン（１，０００倍過剰）との競合を示す。ＧＳＴ−ビオチン、オステオカルシン−ビオチン化との結合、及び競合アッセイを、隣接セクションで行った。
【図３−２】オステオカルシンが脳内のニューロンに結合することを示す図である。（パネルＤ）１０ｎｇ／ｍｌオステオカルシン又はビヒクルで処置された、ＷＴ及びＧｐｒｃ６ａ−／−マウス由来の脳幹外植片におけるＴｐｈ２及びＧＡＤ１並びに中脳外植片におけるＴｈの発現。（パネルＥ）１０ｎｇ／ｍｌオステオカルシン又はビヒクルで処置されたＷＴ原後脳ニューロン培養物における遺伝子発現。（パネルＦ）オステオカルシン処置に対する原後脳培養ニューロンのカルシウム流入応答。（パネルＧ〜Ｈ）オステオカルシン（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置された（パネルＧ）背側縫線核のニューロン及び（パネルＨ）脳幹のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの細胞外電流記録。
【図４】オステオカルシンの投与が不安及び抑欝を防止することを示す図である。（パネルＡ〜Ｅ）脳室内（ＩＣＶ）注入によってオステオカルシンを投与した成体オステオカルシン−／−マウスの行動分析。ビヒクル又はオステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を注入したＷＴ（ｎ＝７）及びオステオカルシン−／−のコホートにおいて行われた（パネルＡ）明暗試験、（パネルＢ）高架式十字迷路試験、（パネルＣ）オープンフィールド試験、（パネルＤ）強制水泳試験、及び（パネルＥ）尾懸垂試験。３本のバーの各組において、最も右のバーは、オステオカルシン投与後の結果を表す。
【図５−１】（パネルＡ）ＷＴマウスの脳におけるオステオカルシンの発現が定量ＰＣＲによって判断してオステオカルシン−／−マウスの脳におけるよりも検出されないことを示す図である。（パネルＢ）ＷＴマウスの脳におけるオステオカルシンの発現がｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって判断してオステオカルシン−／−マウスの脳におけるよりも検出されないことを示す図である。（パネルＣ）ｍ−Ｃｈｅｒｒｙ発現が、ｍ−Ｃｈｅｒｒｙ遺伝子がオステオカルシン遺伝子座に組み込まれたマウスモデルの骨では見られるが、脳では見られないことを示す図である。
【図５−２】（パネルＤ）タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスは、不安様及び抑欝様行動がＤＬＴ試験によって判断してα１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２又はオステオカルシンフロックス／フロックスマウスに比べて有意に増加した。（パネルＥ）タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスは、不安様及び抑欝様行動がＥＰＭ試験によって判断してα１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２又はオステオカルシンフロックス／フロックスマウスに比べて有意に増加した。（パネルＦ）タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスは、不安様及び抑欝様行動が尾懸垂試験によって判断してα１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２又はオステオカルシンフロックス／フロックスマウスに比べて有意に増加した。
【図５−３】（パネルＧ）タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスは、不安様及び抑欝様行動が尾懸垂試験によって判断してα１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２又はオステオカルシンフロックス／フロックスマウスに比べて有意に増加した。（パネルＨ）タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスは、不安様及び抑欝様行動がＥＰＭ試験によって判断してα１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２又はオステオカルシンフロックス／フロックスマウスに比べて有意に増加した。（パネルＩ）空間学習及び記憶は、タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスにおいて影響を受ける。
【図６】母体オステオカルシンが胎仔の神経形成に有利であることを示す図である。（パネルＡ）ＷＴ及びＯｃｎ−／−新生仔（出生後日数［Ｐ］０）及び胚（Ｅ１３．５〜Ｅ１８．５）の骨、脳及び胎盤におけるオステオカルシンの発現（ｑＰＣＲ）。（パネルＢ）ＷＴ又はＯｃｎ−／−新生仔（Ｐ０）及び胚（Ｅ１３．５〜Ｅ１８．５）におけるオステオカルシン循環レベル。（パネルＣ）胎盤を横断するオステオカルシンの輸送をモニターするエクスビボ二重潅流システム。非カルボキシル化マウスオステオカルシン（３００ｎｇ／ｍｌ）を、妊娠のＥ１４．５、Ｅ１５．５及びＥ１８．５においてＷＴマウスから得られた胎盤に子宮動脈を介して注射した。胎仔の溶出物中のオステオカルシンを母体入力に対する％として表した。（パネルＤ）ＷＴ又はＯｃｎ＋／−母由来のＷＴ胚、Ｏｃｎ＋／−又はＯｃｎ−／−母由来のＯｃｎ＋／−胚、及びＯｃｎ＋／−又はＯｃｎ−／−母由来のＯｃｎ−／−胚におけるオステオカルシンの循環レベル。測定はＥ１６．５及びＥ１８．５で行われた。（パネルＥ）ＷＴ母由来のＥ１８．５ＷＴ胚及びＯｃｎ＋／−又はＯｃｎ−／−母由来のＯｃｎ−／−胚の海馬の側脳室のクレシルバイオレット染色。脳面積に対する側脳室面積の測定値を画像の下に示す（％単位）（スケールバー＝０．５ｍｍ）。（パネルＦ）ＷＴ母によって保有されるＥ１８．５ＷＴ胚及びＯｃｎ＋／−又はＯｃｎ−／−母によって保有されるＯｃｎ−／−胚の海馬中のアポトーシス細胞数（ＴＵＮＥＬアッセイによる染色）。（パネルＧ及びＨ）Ｏｃｎ−／−又はＯｃｎ＋／−母から生まれたＷＴ及びＯｃｎ−／−マウスにおいて行われたＣＦＣ（パネルＧ）及びＮＯＲ（パネルＨ）（ｎ＝７〜１８／群）。ＣＦＣにおいては、Ｏｃｎ−／−母マウスから生まれたＯｃｎ−／−マウスは、文脈Ａ及びＡ’においてＷＴマウスよりも文脈誘導すくみが有意に少なかった。ＮＯＲにおいては、新規目標物が導入されたときに、Ｏｃｎ＋／−母又はＷＴマウスから生まれたＯｃｎ−／−マウスに比べてＯｃｎ−／−母から生まれたＯｃｎ−／−マウスにおいて探索期間が有意に増加した。（パネルＩ及びＪ）Ｏｃｎ−／−又はＯｃｎ＋／−母から生まれたＷＴ及びＯｃｎ−／−マウスの歯状回（ＤＧ：ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ）におけるＢｒｄＵ＋（パネルＩ）及びＤＣＸ＋（パネルＪ）細胞数の有意な減少を示すＢｒｄＵ及びＤＣＸ免疫組織化学。この減少は、ＤＧの腹側領域において更に一層明白であった。（スケールバー＝０．２ｍｍ）（パネルＡ）〜（パネルＦ）、（パネルＩ）、及び（パネルＪ）では、各グラフの上の統計的検定はスチューデントのｔ検定を表し、ｐ＜０．０５が有意である。（パネルＧ）及び（パネルＨ）では、各グラフの上の統計的検定はＡＮＯＶＡを表す。有意なＡＮＯＶＡについては、必要に応じて、フィッシャーのＰＬＳＤ検定によって追跡した。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、＊＊＊ｐ値＜０．００１。
【図７】母体オステオカルシンは、成体子孫において空間学習及び記憶を決定する。（パネルＡ〜Ｆ）ＷＴマウスと比較して、妊娠中にビヒクル又はオステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日１回注射したＯｃｎ−／−母から生まれた３か月齢Ｏｃｎ−／−マウスにおいて行われたＤＬＴ（パネルＡ）、ＥＰＭＴ（パネルＢ）、ＯＦＴ（パネルＣ）、ＦＳＴ（パネルＤ）、ＴＳＴ（パネルＥ）及びＭＷＭＴ（パネルＦ）。（パネルＧ）ＷＴ母由来のＷＴ胚及びオステオカルシンを注射したＯｃｎ−／−母由来のＯｃｎ−／−胚のＥ１８．５海馬冠状切片の脳面積に対する側脳室の表面（％）。（パネルＨ）ＷＴ母由来のＷＴ胚及びオステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を注射したＯｃｎ−／−母由来のＯｃｎ−／−胚のＥ１８．５海馬冠状切片のアポトーシス細胞数（ＴＵＮＥＬアッセイによる染色）。（パネルＩ）ＷＴ及びオステオカルシンを注射したＯｃｎ−／−母由来のＯｃｎ−／−胚のクレシルバイオレット、ＮｅｕＮ免疫蛍光及び歯状回面積（ＷＴに対する％）。スケールバー＝０．５ｍｍ。（パネルＪ）注射していないオステオカルシン−／−母由来のものに比べた、注射したオステオカルシン−／−母由来のオステオカルシン−／−Ｅ１８．５胚の海馬におけるセロトニン含有量。（パネルＫ）注射していないオステオカルシン−／−母由来のものに比べた、注射したオステオカルシン−／−母由来のオステオカルシン−／−Ｅ１８．５胚の海馬におけるＧＡＢＡ含有量。
【図８】オステオカルシンが成体野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）マウスにおいて認知機能を向上させることを示す図である。ビヒクル（ＰＢＳ）又はＯｃｎ（３、１０、３０ｎｇ／時間）をＩＣＶ注入した３か月齢ＷＴマウスにおいて行われた明暗（ＤＬＴ）及び高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）の結果を示す。（パネルＡ）進入待ち時間、進入回数及び点灯区画消費時間を測定するＤＬＴ。（パネルＢ）オープンアーム進入回数及び点灯区画消費時間を測定するＥＰＭＴ。
【図９】オステオカルシンが高齢野生型（ＷＴ）マウスにおいて海馬機能を向上させることを示す図である。ビヒクル又は１０ｎｇ／ｈ組換え非カルボキシル化オステオカルシンで１か月処置した１７か月齢マウスにおける新規目標物認識試験における定常及び新規目標物調査。
【図１０】オステオカルシン投与がＣＲＥＢリン酸化をもたらすことを示す図である。（パネルＡ）ＷＴ及びＯｃｎ−／−海馬領域の歯状回（ＤＧ）におけるｐ−ＣＲＥＢ免疫蛍光（ＩＦ）。（パネルＢ）海馬におけるビヒクル（ＰＢＳ）（左側）又はＯｃｎ（１０ｎｇ）（右側）の二重定位注射後のＷＴ脳切片におけるｐ−ＣＲＥＢ  ＩＦ。矢印はＤＧの方を指す。（パネルＣ）海馬におけるビヒクル（ＰＢＳ）（右側）又はＯｃｎ（１０ｎｇ）（左側）の二重定位注射後のＷＴ脳切片におけるＰＫＡ  ＩＦ。
【図１１】オステオカルシンによるＣＲＥＢ活性化が機能的に関連することを示す図である。文脈曝露の２４時間前に組換え非カルボキシル化オステオカルシン１０ｎｇを急性的に注射した３．５か月齢マウスにおける文脈的恐怖条件づけ。０．５５ｍＡのショックを３回マウスに１分間隔で加えた。１日目、すくみ％は両方の群で同じであった。すくみ％を最初のショックから２４時間後に再度測定した。オステオカルシン注射マウスは、過剰興奮と共にすくみが増加した。
【図１２】骨健康におけるオステオカルシンによる認知に対する影響を示す図である。（パネルａ）３か月齢ＷＴマウスの種々の組織におけるＲｕｎｘ２蓄積（ウエスタンブロット）。Ｇａｐｄｈを負荷対照として使用した。（パネルｂ）３か月齢Ｒｕｎｘ２及びＷＴ同腹仔における生理活性オステオカルシンの循環レベル。（パネルｃ）３か月齢Ｏｃｎ＋／−及びＷＴ同腹仔における生理活性オステオカルシンの循環レベル。（パネルｄ）３か月齢Ｒｕｎｘ２＋／−及びＷＴ同腹仔の脳幹及び中脳におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ−１（Ｇａｄ１）及びチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）発現（ｑＰＣＲ）。（パネルｅ）３か月齢Ｒｕｎｘ２＋／−及びＷＴ同腹仔の海馬における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ：Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）蓄積（代表的ウエスタンブロット、左）及びバンド強度の定量化（右）。βチューブリンを負荷対照として使用する。（パネルｆ）Ｒｕｎｘ２＋／−及びＷＴ同腹仔において行われた暗から明への移行（ＤＬＴ）試験。点灯区画及びオープンアームで消費された時間を測定した。（パネルｇ）Ｏｃｎ＋／−及びＷＴ同腹仔において行われた暗から明への移行（ＤＬＴ）試験。点灯区画及びオープンアームで消費された時間を測定した。（パネルｈ）Ｒｕｎｘ２＋／−及びＷＴ同腹仔において行われた高架式十字迷路（ＥＰＭＴ）試験。オープンアームにおける進入回数及び消費時間（秒）を点数化した。（パネルｉ）Ｏｃｎ＋／−及びＷＴ同腹仔において行われた高架式十字迷路（ＥＰＭＴ）試験。オープンアームにおける進入回数及び消費時間（秒）を点数化した。（パネルｊ）１０日間行われたモリス水迷路試験（ＭＷＭＴ：Ｍｏｒｒｉｓ  ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ）。グラフは、Ｒｕｎｘ２＋／−及びＷＴ同腹仔の各マウス群が水泳域において水没プラットホームの場所を突き止めるのに要する時間（秒）を示す。（パネルｋ）Ｒｕｎｘ２＋／−及びＷＴ同腹仔において行われた新規目標物認識（ＮＯＲ：Ｎｏｖｅｌ  ｏｂｊｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）。優先指数（新規目標物に消費された時間／総探索時間）を測定した。（パネルｌ）１０日間行われたＭＷＭＴ。グラフは、ビヒクル処置、アレンドロナート処置又はアレンドロナート＋オステオカルシン処置のＷＴマウスの各群が水泳域において水没プラットホームの場所を突き止めるのに要する時間（秒）を示す。（パネルｍ）ビヒクル処置、アレンドロナート処置及びアレンドロナート＋オステオカルシン処置ＷＴマウスにおいて行われたＮＯＲ。優先指数（新規目標物に消費された時間／総探索時間）を測定した。結果を平均±標準誤差として示す。＊Ｐ≦０．０５  ＊＊Ｐ≦０．０１  ＊＊＊ｐ≦０．００１。ｎ．ｓ．：ビヒクル若しくはＷＴに比べてスチューデントのｔ検定による有意差なし（ｂ〜ｉ、ｋ）、又は二元配置繰り返し測定ＡＮＯＶＡ、続いてフィッシャーのＬＳＤ検定による有意差なし（ｊ〜ｌ）。
【図１３】外因性オステオカルシンが高齢ＷＴマウスにおいて不安及び認知を改善することを示す図である。（パネルａ）高齢、若年ＷＴ又は若年Ｏｃｎ−／−マウス由来の血漿を投与した高齢マウス、及びオステオカルシン９０ｎｇ／ｇを補充した若年Ｏｃｎ−／−由来の血漿を投与した高齢ＷＴマウスにおいて行われたＥＰＭＴ。オープンアームにおける進入回数及び消費時間（秒）を点数化した。（パネルｂ）高齢若しくは若年ＷＴマウス、又は若年Ｏｃｎ−／−マウス、又はオステオカルシン９０ｎｇ／ｇを補充した若年Ｏｃｎ−／−由来の血漿を投与した高齢ＷＴマウスにおいて行われたＮＯＲ。優先指数（新規目標物に消費された時間／総探索時間）を各群で測定した。（パネルｃ）高齢若しくは若年ＷＴ又は若年Ｏｃｎ−／−マウス由来の血漿を投与した高齢ＷＴマウスの海馬におけるＢＤＮＦ蓄積（代表的ウエスタンブロット、左）及びバンド強度の定量化（右）。αチューブリンを負荷対照として使用する。（パネルｄ）ビヒクル又はオステオカルシンで処置された１２及び１６か月齢ＷＴマウスにおいて行われたＤＬＴ。点灯区画における進入回数を測定した。（パネルｅ）ビヒクル又はオステオカルシンで処置された１２及び１６か月齢ＷＴマウスにおいて行われたＥＰＭＴ。点灯区画及びオープンアームで消費された時間を測定した。（パネルｆ）ビヒクル又はオステオカルシンで処置された１２及び１６か月齢ＷＴマウスにおいて１０日間行われたＭＷＭＴ。グラフは、水泳域において水没プラットホームの場所を突き止める時間を示す。（パネルｇ）ビヒクル又はオステオカルシンで処置された１２及び１６か月齢ＷＴマウスにおいて行われたＮＯＲ。優先指数（新規目標物に消費された時間／総探索時間）を各群で測定した。（パネルｈ）ビヒクル、正の対照として使用されたカイニン酸、又はオステオカルシンが１６時間末梢注射されたＷＴマウスの海馬におけるＢＤＮＦ蓄積（ウエスタンブロット）。β−アクチンを負荷対照として使用する。結果を平均±標準誤差として示す。＊Ｐ≦０．０５  ＊＊Ｐ≦０．０１  ＊＊＊ｐ≦０．００１。ｎ．ｓ．：ビヒクルに比べてスチューデントのｔ検定による有意差なし（ｄ〜ｅ、ｇ〜ｈ）、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてフィッシャーのＬＳＤ検定による有意差なし（ａ〜ｃ）、又は二元配置繰り返し測定ＡＮＯＶＡ、続いてフィッシャーのＬＳＤ検定による有意差なし（ｆ）。
【図１４】海馬及び中脳におけるオステオカルシンの推定上の受容体の特定。（パネルａ）Ｅ１４．５ＷＴ胚におけるＧｐｒ１５８のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。（パネルｂ）１０日齢ＷＴマウスの脳におけるＧｐｒ１５８、Ｇｐｒ１５６、Ｇｐｒ１７９、Ｇｐｒｃ５ａ、Ｇｐｒｃ５ｂ、Ｇｐｒｃ５ｃ及びＧｐｒｃ５ｂのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。（パネルｃ）３か月齢ＷＴマウスの脳におけるＧｐｒ１５８のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＶＴＡについて、Ｔｈを正の対照として使用した。（パネルｄ）初代海馬ニューロン（ＤＩＶ１５）におけるＧｐｒ１５８、Ｍａｐ２及びＧｆａｐの免疫蛍光。（パネルｅ）３か月齢ＷＴマウスの組織におけるＧｐｒ１５８の発現。発現Ｇｐｒ１５８を小脳におけるものと比較した。（パネルｆ）可溶化Ｏｃｎ−／−海馬膜に対するビオチン化オステオカルシンを用いたプルダウンアッセイ。精製タンパク質を抗Ｇｐｒ１５８及び抗Ｇ  ｑを用いたウエスタンブロットに供した。（パネルＧ）ＷＴ又はＯｃｎ−／−海馬由来の可溶化膜におけるＧｐｒ１５８蓄積（ウエスタンブロット、左）及びバンド強度の定量化（右）。Ｎａ、Ｋ  ＡＴＰアーゼを負荷対照として使用する。結果を平均±標準誤差として示す。ＷＴと比較したスチューデントのｔ検定による＊Ｐ≦０．０５（ｇ）
【図１５】Ｇｐｒ１５８を介したオステオカルシンシグナル伝達の機能分析。（パネルａ）ビヒクル又はオステオカルシンで１時間処置されたＷＴ及びＧｐｒ１５８−／−海馬ニューロン（ＤＩＶ１５）におけるＩＰ１蓄積。グルタミン酸を正の対照として使用した。（パネルｂ）６か月齢Ｇｐｒ１５８＋／−及びＷＴ同腹仔の中脳におけるＴｈ及びＢｄｎｆの発現（ｑＰＣＲ）。（パネルｃ）ビヒクル又はオステオカルシンで４時間処置されたＷＴ及びＧｐｒ１５８−／−海馬ニューロン（ＤＩＶ１５）におけるＢｄｎｆの発現（ｑＰＣＲ）。（パネルｄ）ＷＴ（４個の細胞のうち４個）及びＧｐｒ１５８−／−マウスのＣＡ３錐体ニューロンにおける自発活動電位（ＡＰ：ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）頻度に対するオステオカルシンの効果。記録線の上のバーは、オステオカルシンの適用を示す。（パネルｅ）３か月齢Ｇｐｒ１５８−／−、Ｇｐｒ１５８＋／−及びＷＴ同腹仔において行われたＥＰＭＴ。オープンアームにおける進入回数及び消費時間（秒）を点数化した。（パネルｆ）３か月齢Ｇｐｒ１５８−／−、Ｇｐｒ１５８＋／−及びＷＴ同腹仔において行われたＤＬＴ。点灯区画及びオープンアームで消費された時間を測定した。（パネルｇ）３か月齢Ｇｐｒ１５８−／−、Ｇｐｒ１５８＋／−及びＷＴ同腹仔において行われたオープンフィールド試験。活動領域（単数又は複数）の中央における総移所運動（ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ）（ｃｍ）及び消費時間を測定した。（パネルｈ）３か月齢Ｇｐｒ１５８−／−及びＷＴ同腹仔において１０日間行われたＭＷＭＴ。グラフは、水泳域において水没プラットホームの場所を突き止める時間（秒）を示す。（パネルｉ）３か月齢Ｇｐｒ１５８−／−、Ｇｐｒ１５８＋／−、Ｏｃｎ＋／−、Ｇｐｒ１５８＋／−；Ｏｃｎ＋／−及びＷＴ同腹仔において行われたＮＯＲ。優先指数（新規目標物に消費された時間／総探索時間）を測定した。（パネルｊ）３か月齢ｓｈ対照又はｓｈ−Ｇｐｒ１５８注射マウスにおいて行われたＮＯＲ。回復後、マウスに食塩水又はオステオカルシン（１０ｎｇ）を注射した。優先指数（新規目標物に消費された時間／総探索時間）を測定した。（パネルｋ）３か月齢ｓｈ対照又はｓｈ−Ｇｐｒ１５８注射マウスにおいて行われたＣＦＣ。回復後、マウスに食塩水又はオステオカルシン（１０ｎｇ）を注射した。訓練の２４時間後にすくみ率を測定した。結果を平均±標準誤差として示す。＊Ｐ≦０．０５  ＊＊Ｐ≦０．０１  ＊＊＊ｐ≦０．００１。ｎ．ｓ．：ＷＴ又は無処置に比べてスチューデントのｔ検定による有意差なし（パネルａ〜ｃ）、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてフィッシャーのＬＳＤ検定による有意差なし（パネルｅ〜ｇ、ｉ）、又は二元配置繰り返し測定ＡＮＯＶＡ、続いてフィッシャーのＬＳＤ検定による有意差なし（パネルｈ、ｊ〜ｋ）。
【図１６】ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６５８０３．２由来のヒトＧＰＲ１５８をコードするアミノ酸配列（配列番号６）。
【図１７Ａ】ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ０２０７５２．２由来のヒトＧＰＲ１５８をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１７Ｂ】ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ０２０７５２．２由来のヒトＧＰＲ１５８をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１７Ｃ】ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ０２０７５２．２由来のヒトＧＰＲ１５８をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１８】ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ０２０７５２．２由来のヒトＧＰＲ１５８をコードするアミノ酸配列（配列番号８）。
【図１９Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２由来のヒトＧＰＲＣ６Ａをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）。
【図１９Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２由来のヒトＧＰＲＣ６Ａをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）。
【図２０】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２由来のヒトＧＰＲＣ６Ａをコードするアミノ酸配列（配列番号１２）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
図面を通して、同じ参照番号及び文字は、別段の記載がない限り、示した実施形態の同様の特徴、要素、成分又は部分を表すのに使用される。類似の特徴は、したがって、同じ参照番号によって記述することができ、それは、異なる実施形態間の特徴の交換が特に明示しない限り行われ得ることを熟練した読者に示すものである。さらに、本開示は、以下で図を参照して詳述されているが、それは説明のための実施形態に関連してそのように行われ、図示した特定の実施形態によって限定されない。添付の特許請求の範囲によって定義された本開示の真の範囲及び精神から逸脱することなく、記述された実施形態に変更及び改変を成し得ることが意図される。
【００３８】
本開示の例示的実施形態は、オステオカルシンと哺乳動物における認知プロセスとを関連づける未知の生化学的経路の発見に部分的に基づく。本発明者らは、オステオカルシンが血液脳関門を横断し、ＧＰＲ１５８に結合し、脳幹のニューロンにおいてシグナルを送り、ＧＡＢＡを阻害し、セロトニン及びドーパミンの合成に関与する酵素の活性を高めることによってセロトニン及びドーパミン合成を促進することを発見した。これらの効果は、記憶、学習、不安及び抑欝などの認知機能に有益な効果をもたらし、加齢に付随する神経変性に対しても有益な効果をもたらす。
【００３９】
骨形成又は骨吸収が減少したマウスモデルを使用して、ここで、骨健康が、部分的にオステオカルシンを介して不安及び認知の重要な決定因子であり、オステオカルシンが、加齢と共に発生する不安及び認知機能低下を治すのに必要であり、十分であることを示す。オステオカルシンがニューロンにおいてそのシグナルを伝達する方法を解読し始めるために、発現、生化学的、定位的レンチウイルスを用いた遺伝子下方制御、及び細胞を用いた遺伝学的アッセイを使用した。これらは、中脳及び海馬において発現されるオーファンＧＰＣＲであるＧＰＲ１５８の特定につながった。ＧＰＲ１５８は、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）に依存する様式で不安及び記憶のオステオカルシンの調節を媒介するのに必要である。これらの結果は、不安を軽減し、記憶を向上させる骨格の健康の予期しない能力を明らかにし、老年人口において治療目的でこの経路を利用するのに使用することができる分子ツールを特定するものである。
【００４０】
生理活性オステオカルシンの産生を骨リモデリングと結びつける複数の関連は一緒に、骨健康が不安及び認知機能にどの程度影響するかという問題を提起する。オステオカルシンが合成される場所及びそれがホルモンとして活性になる方法（Ｋａｒｓｅｎｔｙ，Ｇ．＆  Ｆｅｒｒｏｎ，Ｍ．、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  ４８１：３１４〜３２０）を考慮すると、この問題は、不安及び認知に対する骨リモデリング、形成及び吸収のいずれかのアームの影響を試験することによって取り組まれた。
【００４１】
オステオカルシンは、造骨細胞である骨芽細胞によって合成される（Ｆｅｒｒｏｎ，Ｍ．ら、２０１０、Ｃｅｌｌ  １４２：２９６〜３０８）。不安及び認知に対する骨形成の影響を求めるために、脳内で検出されない骨芽細胞分化の主要制御因子である（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：７４７〜７５４）Ｒｕｎｘ２の１つの対立遺伝子を欠くマウスを研究した。というのは、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスは、骨形成が減少し（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：７４７〜７５４；Ｌｅｅ，Ｂ．ら、１９９７、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：３０７〜３１０）、循環生理活性オステオカルシンレベルが５０％減少したからである（図ｌ２ａ〜ｂ）。オステオカルシンシグナル伝達によって下方制御される遺伝子（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）であるＧａｄ１の発現が増加したのに対して、オステオカルシンシグナル伝達によって上方制御される遺伝子（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）であるＴｈの発現はＲｕｎｘ２＋／−脳幹及び中脳において減少した（図１２ｄ）。さらに、骨由来シグナルによるその調節がまだ報告されていない（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）海馬依存性記憶形成のマーカー（Ａｎａｓｔａｓｉａ，Ａ．ら、２０１３、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４：２４９０；Ｈａｌｌ，Ｊ．ら、２０００、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：５３３〜５３５；Ｎａｇａｈａｒａ，Ａ．Ｈ．ら、２００９、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５：３３１〜３３７）であるＢｄｎｆの蓄積は、Ｒｕｎｘ２＋／−海馬において減少した（図１２ｄ）。不安様及び探索行動を、次に３か月齢Ｒｕｎｘ２＋／−マウス及び対照同腹仔において分析した。明るく照らされた領域に対する齧歯類の生得の嫌悪及び光に反応した自発的探索行動の減少（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１；Ｄａｖｉｄ，Ｄ．Ｊ．ら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３；Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．、１９８５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ  ９：３７〜４４；Ｚｅｒｎｉｇ，Ｇ．ら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １４３：１６９〜１７２；Ｖｉｃｅｎｔｅ，Ｍ．Ａ．ら、２００８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ４４５：２０４〜２０８）に基づく暗から明への移行試験（ＤＬＴ）においては、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスは、点灯区画で消費する時間がＷＴ同腹仔よりも少なかった（図１２ｆ）。高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）においては、不安は、オープンアームにおける消費時間を短くする（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１；Ｎａｇａｈａｒａ，Ａ．Ｈ．ら、２００９、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５：３３１〜３３７；Ｄａｖｉｄ，Ｄ．Ｊ．ら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３）。やはり、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスは、オープンアームにおける消費時間がＷＴ同腹仔よりも短かった（図１２ｈ）。空間学習及び記憶を２つの試験でも評価した。モリス水迷路試験（ＭＷＭＴ）においては、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスは、１０日間のプラットホームの場所の学習がＷＴ同腹仔に比べて有意に遅延した（図１２ｊ）。海馬依存性記憶を評価する（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１；Ｄｅｎｎｙ，Ｃ．Ａ．ら、２０１２、Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ２２：１１８８〜１２０１；Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ，Ｎ．Ｊ．ら、２０１０、Ｌｅａｒｎ  Ｍｅｍ  １７：５〜１１）新規目標物認識試験（ＮＯＲ）（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１；Ｅｎｎａｃｅｕｒ，Ａ．＆  Ｄｅｌａｃｏｕｒ，Ｊ．、１９８８、Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ３１：４７〜５９；Ｄｅｎｎｙ，Ｃ．Ａ．ら、２０１２、Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ２２：１１８８〜１２０１）においては、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスは、新規目標物を探索する時間がＷＴ同腹仔よりも有意に短かった（図１２ｋ）。これらの観察は、オステオカルシン＋／−マウスにおいて成されたものに全体的に類似し（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）（図１２ｃ、ｇ、ｉ）、骨形成を損なうと不安を増し、空間学習及び記憶を妨げることを示す。注目すべきことに、認知欠陥は、Ｒｕｎｘ２のハプロ不全患者で報告された（Ｉｚｕｍｉ，Ｋ．ら、２００６、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １４０：３９８〜４０１；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ，Ｔ．ら、２０１４、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ５７：３１９〜３２１）。
【００４２】
オステオカルシンは、吸収窩に存在する低ｐＨのために低カルボキシル化された後ホルモンとして活性になるので（Ｆｅｒｒｏｎ，Ｍ．ら、２０１０、Ｃｅｌｌ  １４２：２９６〜３０８）、不安及び認知に対する骨吸収の影響を調べた。骨吸収の低分子阻害剤である（Ｄｒａｋｅ，Ｍ．Ｔ．ら、２００８、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ  ８３：１０３２〜１０４５）アレンドロナートで３週間処置すると、骨吸収が阻害されただけでなく、生理活性オステオカルシンの循環レベルも減少した。
アレンドロナート処置マウスは、ＭＷＭＴにおける学習遅延、及びＮＯＲにおける記憶欠損を示した。重要なことには、これらの行動上の異常は、オステオカルシンの末梢送達によって治った（図１２ｌ〜ｍ）。総合すると、これらの実験の示すところによれば、健康な骨リモデリングは、不安を軽減し、認知を高めるのに必要であり、これらの有益な効果は、オステオカルシンによって部分的に媒介される。
【００４３】
上記不安及び認知に対する骨健康の影響は、年齢と共に生じる骨健康の低下（Ｅｂｂｅｓｅｎ，Ｅ．Ｎ．ら、１９９９、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１３９４〜１４０３）が、認知機能における加齢性低下の一因になるかどうかという疑問を生じた。中年近くで起こる循環オステオカルシンレベルの減少（Ｍｅｒａ，Ｐ．ら、２０１６、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２３：１０７８〜１０９２）は、オステオカルシンが認知健康に対する骨の影響をどの程度媒介するのか？という更に一層厳密な疑問を生じた。この疑問に答えるために、オステオカルシンが高齢マウスにおける認知及び不安に対する若年マウス由来の血漿の有益な効果に必要であるかどうかを調べた。既報のとおり、３か月齢ＷＴマウス由来の血漿を投与した１６か月齢ＷＴマウスは、高齢ＷＴマウス由来の血漿を投与したものに比べて、不安が有意に減少し、海馬依存性記憶が改善された（Ｖｉｌｌｅｄａ，Ｓ．Ａ．ら、２０１４、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０：６５９〜６６３）（図１３ａ〜ｂ）。重要なことには、この改善は、１６か月齢ＷＴマウスが３か月齢オステオカルシン−／−マウスから得られた血漿を代わりに投与された場合には認められなかった（図１３ａ〜ｂ）。Ｂｄｎｆ蓄積が、若年ＷＴマウス由来の血漿を投与した１６か月齢ＷＴマウスの海馬において増加したが、若年オステオカルシン−／−又は高齢ＷＴマウス由来の血漿を投与したものでは増加しなかったことは、Ｂｄｎｆがオステオカルシンによって調節される遺伝子であることを更に示唆した（図１３ｃ）。オステオカルシンが若年マウス由来の血漿の有益な効果を誘発するのに必要であり、オステオカルシンの効果へのいかなる発生上の成分を除外するのにも必要であることを証明するために、マウス組換えオステオカルシン（９０ｎｇ／ｇ）を補充したオステオカルシン−／−マウス由来の血漿を１６か月齢ＷＴマウスに注射した。この注射は、オステオカルシンの循環レベルを増加させ、若年ＷＴマウス由来の血漿の投与に起因するものと類似した１６か月齢ＷＴマウスにおける不安及び記憶の改善をもたらした（図１３ａ〜ｂ）。
【００４４】
ＷＴマウスが加齢したときに外因性オステオカルシンがＷＴマウスにおける不安及び認知を改善するのに十分であるかどうかを判断するために、行動を分析する前に、オステオカルシンは血液脳関門を横断するので、ビヒクル又はオステオカルシン（３０又は９０ｎｇ／ｈ）を１０又は１４か月齢ＷＴマウスの末梢にミニポンプで６０日間送達した。ＤＬＴで試験しても、又はＥＰＭＴで試験しても、１２及び１６か月齢オステオカルシン処置マウスは、ビヒクル処置同腹仔に比べて探索行動が改善し、不安様行動が減少した（図１３ｄ〜ｅ）。同様に、ＭＷＭＴ及びＮＯＲで試験すると、記憶は、１２及び１６か月齢オステオカルシン処置マウスにおいてビヒクル処置同腹仔に比べて有意に改善された（図１３ｆ〜ｇ）。これらの実験の示すところによれば、末梢に送達すると、外因性オステオカルシンは、１２及び１６か月齢ＷＴマウスにおいて不安を軽減し、記憶を改善するのに十分である。Ｂｄｎｆ蓄積がオステオカルシン投与マウスの海馬で増加したことは、オステオカルシンが海馬におけるこの遺伝子の発現を調節するという考えを更に支持するものである（図１３ｈ）。
【００４５】
高齢マウスにおける不安及び認知機能の調節におけるオステオカルシンの重要性を強調することによって、この一連のデータは、脳においてこのホルモンによって用いられるシグナル伝達経路の疑問を生じた。ニューロンにおけるオステオカルシンシグナル伝達の釣鐘状曲線（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）の示唆するところによれば、末梢組織におけるオステオカルシン受容体Ｇｐｒｃ６ａのように、脳におけるこのホルモンの受容体はＧＰＣＲかもしれない。このため、（１）Ｇｐｒｃ６ａのように、ＧＰＣＲのクラスＣファミリーに属し（Ｃｈｕｎ，Ｌ．ら、２０１２、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ３３：３１２〜３２３）、（２）中脳の腹側被蓋野（ＶＴＡ）及び海馬で発現されるが（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）、３］Ｇｐｒｃ６ａが発現される任意の細胞型において発現されない、オーファンＧＰＣＲの探索を行った。すべてのオーファンクラスＣ  ＧＰＣＲの発現パターンの分析は、Ｇｐｒ１５８が、ＶＴＡ及び海馬のＣＡ３領域で発現される唯一のものであることを明らかにしたが、そこは、オステオカルシンが結合することが以前に示された場所である（Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）（図１４ａ、ｂ）。ＧＰＲ１５８は、皮質の体性感覚野、運動野及び聴覚野、梨状皮質、並びに脳梁膨大後部野でも発現される（図１４ｃ）。初代海馬ニューロン培養物に対して行われた免疫蛍光研究によれば、Ｇｐｒ１５８はニューロンで発現され、グリア細胞では発現されない（図１４ｄ）ことが示された。さらに、あらゆる他のオーファンクラスＣ  Ｇｐｃｒとは異なり、Ｇｐｒ１５８は、発生中又は出生後にオステオカルシンがＧｐｒｃ６ａを介してシグナルを送る末梢組織では発現されない（図１４ａ、ｅ）。海馬組織由来の可溶化膜に対して行われたプルダウンアッセイにおいては、ビオチン化オステオカルシンは、Ｇｐｒ１５８及びＧ  ｑサブユニットを含む複合体に結合することができ、さらに、Ｇｐｒ１５８は、ＷＴ海馬よりもオステオカルシン−／−において豊富である（図１４ｆ〜ｇ）。これらの結果は、Ｇｐｒ１５８が中脳及び海馬におけるオステオカルシンのシグナル伝達機構の必要成分であるという仮説を支持するものである。次に、生化学、電気生理学及び行動アッセイをＷＴ及びＧｐｒ１５８−／−細胞又はマウスに対して使用して、これが当てはまるかどうか判定した。
【００４６】
組換えオステオカルシンは、ＷＴ培養海馬ニューロンにおいて、ｃＡＭＰ産生に影響しなかったが、二次メッセンジャーＩＰ３の副生物ＩＰ１の産生を増加させ、この効果はＧｐｒ１５８−／−ニューロンでははるかに少なかった。これらの実験においてはグルタミン酸を正の対照として使用した（図１５ａ）。この結果は、Ｇｐｒ１５８とＧαｑの相互作用と一致する（図１４ｇ）。Ｇｐｒ１５８が脳におけるオステオカルシンシグナルの伝達に必要であるという考えと一致して、オステオカルシンの２つの標的遺伝子Ｔｈ及びＢｄｎｆの発現は、ＷＴ中脳よりもＧｐｒ１５８−／−で低く、組換え非カルボキシル化オステオカルシンは、Ｇｐｒ１５８−／−海馬ニューロンよりもＷＴにおいてＢｄｎｆ発現を有意に増加させた（図１５ｂ〜ｃ）。ホールセル電流クランプ記録によれば、オステオカルシンは、ＷＴのＣＡ３領域の錐体細胞における活動電位頻度を有意に高めたが、Ｇｐｒ１５８−／−海馬では高めなかった（図１５ｄ）ことが示された。インビボで、ＥＰＭＴ及びＤＬＴで試験すると、３か月齢Ｇｐｒ１５８＋／−及びＧｐｒ１５８−／−マウスはＷＴ同腹仔よりも有意に不安であり、オステオカルシン＋／−及び−／−マウスも同様であった（図１５ｅ〜ｆ）。第３の試験のオープンフィールド試験においては、不安は、ボックスの中央において総移所運動及び消費時間を減少させ、これらのパラメータは３か月齢Ｇｐｒ１５８＋／−及び−／−マウスにおいても有意に減少し、ＷＴ同腹仔と比較したオステオカルシン欠乏マウスにおいても同様であった（図１５ｇ）。空間学習及び記憶をＭＷＭＴ及びＮＯＲによって評価した。両方の試験においては、３か月齢Ｇｐｒ１５８−／−マウスは学習が低下したが、ＭＷＭＴにおけるそれらの欠陥は、オステオカルシン−／−マウスにおいて認められたものよりも重大ではなかった（図１５ｈ〜ｉ）。Ｇｐｒ１５８が記憶を促進するためにオステオカルシンによって使用されるシグナル伝達装置の必要成分であるかどうかインビボで判定するために、２つの異なる実験を行った。まず、Ｇｐｒ１５８を標的にしたｓｈＲＮＡ（Ｇｐｒ１５８タンパク質レベルが６０％減少）又は対照としてのスクランブルｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを、ＷＴマウスの前側海馬に注射した。１５日後、オステオカルシン（１０ｎｇ）を同じ定位座標で注射した。オステオカルシンは、対照マウスにおいてＮＯＲによって分析して記憶能力を高めたが、Ｇｐｒ１５８発現が効率的に減少したマウスでは高めなかった（図１５ｊ）。同様の結果は、海馬の完全性を必要とする連想記憶を測定する試験である文脈的恐怖条件づけ（ＣＦＣ）でマウスを試験したときに得られた（図１５ｋ）。次に、３か月齢Ｇｐｒ１５８＋／−、又はオステオカルシン＋／−マウス及び化合物ヘテロ接合Ｇｐｒ１５８＋／−；オステオカルシン＋／−マウスを、ＮＯＲに供した。単一のヘテロ接合体マウスはこの試験でいかなる異常をも示さなかったが、Ｇｐｒ１５８＋／−、オステオカルシン＋／−マウスは、Ｇｐｒ１５８−／−又はオステオカルシン−／−マウスと同様に行動した（図１５ｉ）。これらの結果は、Ｇｐｒ１５８が認知機能のオステオカルシンの調節における必要成分であるとい���考えと一致する。
【００４７】
老年人口において見られる不安及び認知低下の増加は、増大しつつある公衆衛生問題であり、未対処の医学的ニーズである。ここに示す結果は、マウスにおいて不安を軽減し、加齢性認知機能低下を逆転させるのに十分であるホルモン及び分子経路を特定するものである。それらの治療可能性に加えて、これらの知見は、その受容体が発現されるＶＴＡ及び海馬に加えて、脳の別の領域におけるオステオカルシンの機能及び作用分子機序を解明するために道を開くものである。
【００４８】
本開示の例示的実施形態は、マウス胚において母体由来のオステオカルシンが胎盤を横断し、ニューロンアポトーシスを防止するという観察にも部分的に基づく。妊娠全体を通したオステオカルシン−／−マウス母における非カルボキシル化オステオカルシン注射は、このニューロンアポトーシスを防止する。これらの観察の示すところによれば、オステオカルシンは、ニューロンアポトーシスの重要な制御因子であり、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの投与は、ニューロンアポトーシスが重要な役割を果たす疾患の処置又は防止に有用である可能性がある。
【００４９】
さらに、成体オステオカルシン−／−マウス（オステオカルシン発現を完全に欠くマウス）の脳に低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを直接投与すると、マウスにおける不安、抑欝、学習及び記憶の欠陥が救済された。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは血液／脳関門を横断することができるので、この結果の示すところによれば、哺乳動物における低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの血中濃度を増加させるような方式で低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを投与すると、不安、抑欝、学習及び記憶に関する認知機能に有益な効果が与えられるはずである。
【００５０】
本明細書に記載の観察を考えると、オステオカルシンは、ＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化することによって、不安、抑欝、学習、記憶などの認知機能を調節すると結論される。したがって、本開示のある態様は、哺乳動物における認知に関連した障害を処置又は防止するＧＰＲ１５８を活性化する薬剤（例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン）の治療上の使用を対象とする。加齢は、軽度から重度の認知障害にしばしば関連することが知られている。加齢は、骨量減少にも関連する。骨芽細胞はオステオカルシンの主要な供給源であるので、本明細書に開示される知見は、ＧＰＲ１５８を活性化し、したがって加齢に付随する認知障害を処置するためのオステオカルシンの使用を支持するものである。ある例示的実施形態においては、障害は、加齢の結果として起こる不安の増加、抑欝の増加、記憶の低下、又は学習能力の低下である。
【００５１】
「認知障害」は、問題を学習し、記憶し、解決する能力、情報を処理する能力、正確に思考する能力、又は情報を思い起こす能力の全部又は一部の一時的又は恒久的な喪失を特徴とする状態を含む。本開示のある例示的実施形態においては、認知障害は、正常な加齢プロセスの結果として生じる。別の例示的実施形態においては、認知障害は、脳の傷害、特定の神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症）、血管性の症状（例えば、脳卒中、虚血）、脳における腫瘍又は感染症などの因子の結果である。認知障害が記憶喪失であるときには、喪失は、短期又は長期記憶において起こり得る。認知障害は、種々の形態の認知症も含む。
【００５２】
哺乳動物における認知に関連した障害の防止は、障害が顕性化する前に障害を防止する、又はその程度を最小限にする、又はその発生過程を遅らせるように本明細書に記載のように能動的に介在することを意味する。
【００５３】
哺乳動物における認知に関連した障害の処置は、障害を有することが知られている、又は疑いのある患者における障害を減速させる、その症候を改善する、その程度を最小限にする、又は逆転させるように、障害の発生後に能動的に介在することを意味する。
【００５４】
「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、イヌ若しくはネコなどの伴侶動物、又はウマ、ウシ、ブタ若しくはヒツジなどの家畜でもあり得る。ある例示的実施形態においては、患者は、５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０歳を超えるヒトである。ある例示的実施形態においては、患者は、５０〜８０歳、５５〜７５歳、又は６０〜７０歳のヒトである。ある例示的実施形態においては、患者は、５０〜５５歳、５５〜６０歳、６５〜７０歳、７０〜７５歳、７５〜８０歳、８０〜８５歳、又は８５〜９０歳のヒトである。
【００５５】
認知障害の処置又は防止を必要とする患者としては、認知障害を有する、又は発症するリスクのあることが知られている、又は疑いのある患者が挙げられる。処置を必要とするこうした患者は、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化レベルの低いことが知られている哺乳動物であり得る。本開示の方法による処置又は防止を必要とする患者としては、認知障害を処置又は防止するために血清低カルボキシル化／非カルボキシル化レベルを高める療法を必要とすることが知られている患者が挙げられる。一部の例示的実施形態においては、こうした患者としては、正常者の血清低カルボキシル化／非カルボキシル化レベルよりも約５％、約１５％又は約５０％低い血清低カルボキシル化／非カルボキシル化レベルを有すると確認された哺乳動物が挙げられる。
【００５６】
本開示の方法による認知障害の処置又は防止を必要とする患者は、認知障害を処置又は防止する以外の目的でのみ患者に治療薬が投与される、本明細書に記載の治療薬を投与される患者を含まない。したがって、例えば、本開示の方法による認知障害の処置又は防止を必要とする患者は、骨量疾患、代謝症候群、糖不耐性、１型糖尿病、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は肥満を処置する目的でのみオステオカルシンで処置される患者を含まない。耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵ベータ細胞増殖の増加、アディポネクチン血清レベルの増加、酸化リン脂質の減少、動脈硬化巣の後退、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの減少、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）増殖及び数の減少、又は動脈プラーク厚さの減少を起こす目的でのみオステオカルシンで処置される患者も含まない。本開示の方法による認知障害の処置又は防止を必要とする患者は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンではないオステオカルシンで処置される患者も含まない。
【００５７】
ある例示的実施形態においては、本開示の方法は、認知障害の治療を必要とする患者を特定するステップ（単数又は複数）／手順（単数又は複数）を含む。したがって、本開示は、
（ａ）認知障害の治療を必要とする患者を特定するステップ、
（ｂ）治療有効量のＧＰＲ１５８を活性化する薬剤を患者に投与するステップ
を含む方法を提供する。
【００５８】
本開示の別の例示的態様は、そのレベルが哺乳動物における認知に関連した障害に関連する、患者における低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルの検出に基づく診断法を対象とする。診断法に続いて、治療有効量のＧＰＲ１５８を活性化する薬剤、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを患者に投与することができる。
【００５９】
例示的一態様においては、患者における認知障害を診断する方法は、（ｉ）患者から採取した生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを測定するステップ、（ｉｉ）低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルと低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの対照レベルを比較するステップ、及び（ｉｉｉ）患者レベルが対照レベルよりも有意に低い場合、患者が認知障害を有する、又は認知障害のリスクがあると診断するステップを含むことができる。次いで、更なるステップは、患者又は患者のヘルスケア提供者に診断を知らせることであり得る。更なるステップは、ヘルスケア提供者が治療有効量のＧＰＲ１５８を活性化する薬剤、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを患者に投与することであり得る。
【００６０】
本開示の別の例示的態様は、低カルボキシル化／非カルボキシル化とカルボキシル化オステオカルシンの比の低下の検出に基づく診断法を対象とする。こうした比は、哺乳動物における認知に関連した障害に関連する。一態様においては、患者における認知に関連した障害を診断する方法は、（ｉ）患者から採取した生体試料における低カルボキシル化／非カルボキシル化とカルボキシル化オステオカルシンの患者比を決定するステップ、（ｉｉ）低カルボキシル化／非カルボキシル化とカルボキシル化オステオカルシンの患者比を低カルボキシル化／非カルボキシル化とカルボキシル化オステオカルシンの対照比と比較するステップ、及び（ｉｉｉ）患者比が対照比よりも有意に低い場合、患者が認知に関連した障害を有する、又はリスクがあると診断されるステップを含む。次いで、更なるステップは、患者又は患者のヘルスケア提供者に診断を知らせることであり得る。更なるステップは、ヘルスケア提供者が治療有効量のＧＰＲ１５８を活性化する薬剤、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを患者に投与することであり得る。
【００６１】
例示的実施形態の方法に使用される医薬組成物
本開示の例示的実施形態は、哺乳動物における認知障害の処置に使用される、ＧＰＲ１５８を活性化する薬剤を含む医薬組成物を提供する。ある例示的実施形態においては、薬剤は、ＧＰＲ１５８がイノシトール三リン酸経路を介してシグナルを送る能力を阻害する。薬剤は、低分子、ポリペプチド、抗体及び核酸からなる群から選択することができる。本開示の医薬組成物は、哺乳動物における認知障害を処置又は防止するのに有効な量の薬剤を提供する。ある例示的実施形態においては、医薬組成物は、加齢に付随する神経変性、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害を処置又は防止するのに有効な量の薬剤を提供する。
【００６２】
本開示の特定の例示的実施形態においては、本開示の方法において投与することができる治療薬としては、低カルボキシル化オステオカルシン又は非カルボキシル化オステオカルシン、及びＧＰＲ１５８を活性化する抗体、低分子、アンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００６３】
治療薬は、一般に、加齢に付随する神経変性による認知欠損を軽減する、不安を軽減する、抑欝を軽減する、記憶喪失を軽減する、学習を改善する、妊娠中の食糧不足に付随する認知障害を軽減するのに十分な量で投与される。
【００６４】
ある例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物を、哺乳動物における認知障害を処置するのに有用であることが知られている別の治療薬と一緒に投与することができる。こうした別の治療薬の例としては、セレギリンなどのモノアミンオキシダーゼＢ阻害剤；ニセロゴリン（ｎｉｃｅｒｏｇｏｌｉｎｅ）及びビンポセチンなどの血管拡張剤；ホスファチジルセリン；プロペントフィリン；タクリン、ガランタミン、リバスチグミン、ビンポセチン、ドネペジル（ＡＲＩＣＥＰＴ（登録商標）（ドネペジル塩酸塩））、メトリホナート及びフィゾスチグミンなどの抗コリンエステラーゼ（コリンエステラーゼ阻害薬）；レシチン；ミラメリン、キサノメリンなどのコリンコリン様作用薬；メマンチンなどのイオンチャネル型Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗薬；プレドニゾロン、ジクロフェナク、インドメタシン、プロペントフィリン、ナプロキセン、ロフェコキシン（ｒｏｆｅｃｏｘｉｎ）、イブルプロフェン（ｉｂｒｕｐｒｏｆｅｎ）及びスルジナク（ｓｕｌｄｉｎａｃ）などの抗炎症薬；クリキノール（ｃｌｉｑｕｉｎｏｌ）などの金属キレート剤；イチョウ；ビスホソホナート（ｂｉｓｐｈｏｓｏｐｈｏｎａｔｅｓ）；ラロキシフェン及びエストロゲンなどの選択的エストロゲン受容体調節物質；ベータ及びガンマセクレターゼ阻害剤；スタチンなどのコレステロール−降下剤；カルシトニン；リセドロナート；アレンドロナート；並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００６５】
一部の例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンなどのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤、及び哺乳動物における認知障害を処置するのに有用であることが知られている別の治療薬が、同じ医薬組成物中に存在することができる。別の例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンなどのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤、及び哺乳動物における認知障害を処置するのに有用であることが知られている別の治療薬が、別個の医薬組成物中で投与される。
【００６６】
別の例示的実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンなどのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤は、本開示の医薬組成物中に存在する唯一の医薬品有効成分である。
【００６７】
治療薬の生物学的に活性な断片又は変異体も本開示の範囲内である。「生物学的に活性」とは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンがＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化するときに活性化される経路を介してＧＰＲ１５８がシグナルを送るように、ＧＰＲ１５８を活性化可能であることを意味する。
【００６８】
「生物学的に活性」とは、哺乳動物における認知障害を処置又は防止する低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの能力を保持するオステオカルシンの断片又は変異体も指す。
【００６９】
「生物学的に活性」とは、加齢に付随する神経変性による認知欠損の軽減、不安の軽減、抑欝の軽減、記憶喪失の軽減、学習の改善、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の軽減からなる群から選択される哺乳動物における少なくとも１つの効果を生成可能であることも意味する。
【００７０】
低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物
本開示の特定の例示的一実施形態においては、哺乳動物における認知障害を処置又は防止するのに使用される低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物が提供される。
【００７１】
「低カルボキシル化オステオカルシン」とは、４９個のアミノ酸を有する成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１及びＧｌｕ２４の位置、又は別の形態のオステオカルシンにおけるＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１及びＧｌｕ２４に対応する位置のＧｌｕ残基の１個以上がカルボキシル化されていないオステオカルシンを意味する。低カルボキシル化オステオカルシンは、「非カルボキシル化オステオカルシン」、すなわち、１７、２１及び２４位のグルタミン酸残基の３個すべてがカルボキシル化されていないオステオカルシンを含む。オステオカルシンの調製物は、調製物の成熟オステオカルシン中のＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１及びＧｌｕ２４位の全Ｇｌｕ残基（又は別の形態の対応するＧｌｕ残基）の（まとめて）約１０％超がカルボキシル化されていない場合、「低カルボキシル化オステオカルシン」であるとみなされる。低カルボキシル化オステオカルシンの特定の調製物においては、調製物の成熟オステオカルシン中のＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１及びＧｌｕ２４位の全Ｇｌｕ残基（又は別の形態の対応するＧｌｕ残基）の約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超又は約９９％超がカルボキシル化されていない。特に好ましい例示的実施形態においては、調製物の成熟オステオカルシン中のＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１及びＧｌｕ２４位のＧｌｕ残基（又は別の形態の対応するＧｌｕ残基）の本質的にすべてがカルボキシル化されていない。
【００７２】
「低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン」は、本明細書では、低カルボキシル化及び非カルボキシル化オステオカルシンを総称するのに使用される。
【００７３】
ヒトオステオカルシンｃＤＮＡは、以下の配列（配列番号１）である。
【００７４】
cgcagccacc gagacaccat gagagccctc acactcctcg ccctattggc cctggccgca ctttgcatcg ctggccaggc aggtgcgaag cccagcggtg cagagtccag caaaggtgca gcctttgtgt ccaagcagga gggcagcgag gtagtgaaga gacccaggcg ctacctgtat caatggctgg gagccccagt cccctacccg gatcccctgg agcccaggag ggaggtgtgt gagctcaatc cggactgtga cgagttggct gaccacatcg gctttcagga ggcctatcgg cgcttctacg gcccggtcta gggtgtcgct ctgctggcct ggccggcaac cccagttctg ctcctctcca ggcacccttc tttcctcttc cccttgccct tgccctgacc tcccagccct atggatgtgg ggtccccatc atcccagctg ctcccaaata aactccagaa gaggaatctg aaaaaaaaaa aaaaaaaa
【００７５】
配列番号１は、ヒトオステオカルシンのプレプロ配列（配列番号２）をコードする。
ＭＲＡＬＴＬＬＡＬＬ  ＡＬＡＡＬＣＩＡＧＱ  ＡＧＡＫＰＳＧＡＥＳ  ＳＫＧＡＡＦＶＳＫＱ  ＥＧＳＥＶＶＫＲＰＲ  ＲＹＬＹＱＷＬＧＡＰ  ＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ  ＲＥＶＣＥＬＮＰＤＣ  ＤＥＬＡＤＨＩＧＦＱ  ＥＡＹＲＲＦＹＧＰＶ
【００７６】
成熟ヒトオステオカルシンタンパク質は、配列番号２の最後の４９個のアミノ酸（すなわち、５２〜１００位）であり、予測分子量５，８００ｋＤａである（Ｐｏｓｅｒら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８６８５〜８６９１）。成熟ヒトオステオカルシンタンパク質は、以下の配列（配列番号９）を有する。
ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶ  ＰＹＰＤＰＬＥＰＲＲ  Ｅ  ＶＣＥＬＮＰＤＣＤ  ＥＬＡＤＨＩＧＦＱＥ  ＡＹＲＲＦＹＧＰＶ
【００７７】
本願においては、成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸位置を参照する。成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸位置は、以下のように配列番号２のそれに対応することを理解されたい：成熟ヒトオステオカルシンの１位は配列番号２の５２位に対応し、成熟ヒトオステオカルシンの２位は配列番号２の５３位に対応するなど。特に、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位は、配列番号２のそれぞれ６８、７２及び７５位に対応する。
【００７８】
２つのアミノ酸配列における位置が対応するときには、２つのアミノ酸配列が互いに整列してそれらの最大相同性を与えるときに２つの位置が互いに整列することを意味する。対応のこの同じ概念が核酸にも当てはまる。
【００７９】
例えば、２つのアミノ酸配列ＡＧＬＹＳＴＶＬＭＧＲＰＳとＧＬＶＳＴＶＬＭＧＮにおいては、第１の配列の２〜１１位は、それぞれ第２の配列の１〜１０位に対応する。したがって、第１の配列の２位は第２の配列の１位に対応し、第１の配列の４位は第２の配列の３位に対応するなど。２つの配列の位置が同じアミノ酸によって占有されていなくとも、１つの配列の位置が別の配列の位置に対応し得ることに留意されたい。
【００８０】
「オステオカルシン」は成熟タンパク質を含み、更に、種々のドメインを含めて、完全長オステオカルシン（配列番号２）又は成熟タンパク質（配列番号９）に由来する生物学的に活性な断片、及び本明細書に記載の変異体も含む。
【００８１】
本開示の例示的一実施形態においては、本開示の方法に使用される医薬組成物は、哺乳動物非カルボキシル化オステオカルシンを含む。本開示の好ましい一実施形態においては、本開示の方法に使用される組成物は、配列番号２のアミノ酸配列又はその一部を有し、配列番号１の核酸又はその一部によってコードされるヒト非カルボキシル化オステオカルシンを含む。一部の例示的実施形態においては、本開示の方法に使用される組成物は、本明細書に記載の１個以上のヒトオステオカルシン断片を含むことができる。
【００８２】
本開示の例示的一実施形態においては、本開示の方法に使用される組成物は、配列番号９のアミノ酸配列を有するヒト非カルボキシル化オステオカルシンを含む。
【００８３】
本開示の特定の例示的一実施形態においては、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する１つ以上の位置にカルボキシル化グルタミン酸を含まないヒト低カルボキシル化オステオカルシンを含むことができる医薬組成物を提供することができる。本開示の方法に使用されるオステオカルシンの好ましい一形態は、１７、２１及び２４位のグルタミン酸残基の少なくとも１つがカルボキシル化されていない成熟ヒトオステオカルシンである。ある例示的実施形態においては、１７位のグルタミン酸残基がカルボキシル化されていない。好ましくは、１７、２１及び２４位のグルタミン酸残基の３個すべてがカルボキシル化されていない。成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列は配列番号９で示される。
【００８４】
オステオカルシンの一次配列は、種間で高度に保存され、人体における１０種の最も豊富なタンパク質の一つであり、その機能が進化を通して保存されていることを示唆している。保存された特徴としては、１７、２１及び２４位の３個のＧｌａ残基、並びにＣｙｓ２３とＣｙｓ２９の間のジスルフィド架橋が挙げられる。さらに、大部分の種は、ヒドロキシプロリンを９位に含む。オステオカルシンのＮ末端は、分子の別の部分と比較して最高の配列多様性を示す。ヒト及びマウスオステオカルシンの高度の保存は、健康状態と病的状態の両方における、ヒトの動物モデルとしてのマウスの関連性を強調するものであり、本明細書に開示されるマウスモデルから得られる実験データに基づくヒトにおける認知に関連した障害を処置又は防止するオステオカルシンの治療上及び診断上の使用を有効と認めるものである。
【００８５】
本開示の例示的実施形態は、ＧＰＲ１５８を活性化する薬剤としてのオステオカルシンのポリペプチド断片の使用も記述する。断片は、オステオカルシンの完全長天然アミノ酸配列（例えば、配列番号２）に由来し得る。断片は、成熟オステオカルシン（例えば、配列番号９）に由来することもできる。本開示は、本明細書に記載のオステオカルシンの変異体の断片も包含する。断片は、生物学的に活性である任意の長さのアミノ酸配列を含むことができる。
【００８６】
オステオカルシンの好ましい断片としては、成熟タンパク質のＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１及びＧｌｕ２４を含む断片が挙げられる。成熟タンパク質のＣ末端から最後の１０個のアミノ酸を欠く成熟タンパク質の断片も好ましい。成熟タンパク質のＮ末端から最初の１０個のアミノ酸を欠く断片も好ましい。Ｃ末端から最後の１０個のアミノ酸とＮ末端から最初の１０個のアミノ酸の両方を欠く成熟タンパク質の断片も好ましい。こうした断片は、配列番号２のアミノ酸６２〜９０を含む。
【００８７】
本明細書に記載の本開示の医薬組成物のためのオステオカルシンの別の好ましい断片は、以下のアミノ酸配列を含み、それからなる、及び／又は本質的にそれからなるポリペプチドを含む。
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜１９位
−成熟ヒトオステオカルシンの２０〜４３位
−成熟ヒトオステオカルシンの２０〜４９位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜４３位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜４２位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜４１位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜４０位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３９位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３８位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３７位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３６位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３４位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３３位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３２位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３１位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの１〜２９位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜４９位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜４５位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜４０位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの２〜２０位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜４９位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜４５位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜４０位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの４〜２０位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜４９位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜４５位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜４０位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜２０位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜４９位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜４５位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜４０位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの１０〜２０位
−成熟ヒトオステオカルシンの６〜３４位
−成熟ヒトオステオカルシンの６〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの６〜３６位
−成熟ヒトオステオカルシンの６〜３７位
−成熟ヒトオステオカルシンの６〜３８位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜３４位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜３５位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜３６位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜３７位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜３８位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜２３位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜２１位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜１９位
−成熟ヒトオステオカルシンの７〜１７位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜２３位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜２１位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜１９位
−成熟ヒトオステオカルシンの８〜１７位
−成熟ヒトオステオカルシンの９〜３０位
−成熟ヒトオステオカルシンの９〜２５位
−成熟ヒトオステオカルシンの９〜２３位
−成熟ヒトオステオカルシンの９〜２１位
−成熟ヒトオステオカルシンの９〜１９位
−成熟ヒトオステオカルシンの９〜１７位
【００８８】
成熟ヒトオステオカルシンの１〜３６位を含む断片であることが好ましい場合もある。別の好ましい断片は、成熟ヒトオステオカルシンの２０〜４９位を含む断片である。別の断片は、成熟ヒトオステオカルシンのＰｒｏ１３〜Ｔｙｒ７６又はＰｒｏ１３〜Ａｓｎ２６を含むように設計することができる。さらに、成熟ヒトオステオカルシンの２３及び２９位にシステイン残基を含む断片、並びにこれら２つのシステイン間でジスルフィド結合を形成することができる断片も有用である。
【００８９】
断片は、分離している（別のアミノ酸又はポリペプチドと結合していない）、又はより大きいポリペプチド内にあり得る。さらに、幾つかの断片は、単一のより大きいポリペプチド内に含まれ得る。一実施形態においては、宿主における発現のために設計された断片は、オステオカルシン断片のアミノ末端に融合した異種プレ及びプロポリペプチド領域、並びに／又は断片のカルボキシ末端に融合した追加の領域を有することができる。
【００９０】
例示的実施形態の例示的使用は、オステオカルシンの変異体及び上記オステオカルシン断片である本開示の組成物及び方法におけるものとすることができる。「変異体」とは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失及び／又は挿入などのそれらのアミノ酸配列の修飾を含むが、依然として生物学的に活性である、オステオカルシンペプチドを指す。ある場合には、変異体の抗原性及び／又は免疫原性は、変異体が由来する対応するペプチドに比べてほぼ変わらない。こうした修飾は、例えば、Ａｄｅｌｍａｎら、１９８３、ＤＮＡ  ２：１８３によって教示されるオリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発などの標準変異誘発技術を用いて、又は化学合成によって、容易に導入することができる。変異体と断片は、相互排他的用語ではない。断片は、依然として生物学的に活性であるように、１つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失及び／又は挿入を含むことができるペプチドも含む。
【００９１】
本開示の範囲内である変異体の特別な一タイプは、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する位置の１つ以上が、グルタミン酸ではないアミノ酸によって占有された変異体である。一部の例示的実施形態においては、グルタミン酸ではないアミノ酸は、アスパラギン酸でもない。こうした変異体は、低カルボキシル化オステオカルシンのバージョンである。というのは、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応する３つの位置の少なくとも１つは、これらの位置の少なくとも１つがグルタミン酸によって占有されないので、カルボキシル化されたグルタミン酸ではないからである。
【００９２】
本開示の特定の例示的実施形態においては、アミノ酸配列
ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶ  ＰＹＰＤＰＬＸ１ＰＲＲ  Ｘ２ＶＣＸ３ＬＮＰＤＣＤ  ＥＬＡＤＨＩＧＦＱＥ  ＡＹＲＲＦＹＧＰＶ（配列番号１０）
を含むオステオカルシン変異体を提供することができる。
式中、
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が各々グルタミン酸である場合、Ｘ１はカルボキシル化されず、又はＸ２の５０パーセント未満はカルボキシル化され、及び／又はＸ３の５０パーセント未満はカルボキシル化されるという条件で、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はアミノ酸又はアミノ酸類似体から各々独立に選択される。
【００９３】
ある例示的実施形態においては、オステオカルシン変異体は、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３を除いて１〜７位において配列番号１０とは異なるアミノ酸配列を含む。
【００９４】
別の例示的実施形態においては、オステオカルシン変異体は、１つ以上のアミド骨格置換を含むアミノ酸配列を含む。
【００９５】
完全に機能的な変異体は、典型的に、重要でない残基又は重要でない領域における保存的変異又は変異のみを含む。機能的変異体は、機能の変化をもたらさない、又は重要でない変化をもたらす、類似アミノ酸の置換を含むこともできる。あるいは、こうした置換は、機能にある程度ポジティブに又はネガティブに影響し得る。こうした機能的オステオカルシン変異体の活性は、本明細書に記載のものなどのアッセイによって求めることができる。
【００９６】
変異体は、天然に存在し得、又は組換え手段若しくは化学合成によって製造して、有用で新規な特性を低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンに付与することができる。例えば、変異オステオカルシンポリペプチドは、低下した免疫原性、増加した血清中半減期、増加した生物学的利用能、及び／又は増加した効力を有することができる。特定の例示的実施形態においては、血清中半減期は、成熟オステオカルシンの１９、２０、４３及び４４位の天然Ａｒｇ残基の１個以上を別のアミノ酸又はアミノ酸類似体、例えばβ−ジメチル−アルギニンで置換することによって増加する。こうした置換は、本明細書に記載のオステオカルシンの天然アミノ酸配列の別の変化と組み合わせることができる。
【００９７】
上記オステオカルシン及びオステオカルシン断片の誘導体でもある変異体が、本開示の医薬組成物及び方法に使用するために用意される。誘導体化は、化合物を誘導体と呼ばれる類似の化学構造の生成物に変換する化学反応に使用される技術である。
一般に、化合物の特定の官能基は、誘導体化反応に関与し、化合物を異なる反応性、溶解性、沸点、融点、凝集状態、機能活性又は化学組成の誘導体に変換する。得られる新しい化学的性質は、誘導体化合物の定量化若しくは分離に使用することができ、又は誘導体化合物を治療薬として最適化するのに使用することができる。周知の誘導体化技術を上記オステオカルシン及びオステオカルシン断片に適用することができる。したがって、上記オステオカルシン及びオステオカルシン断片の誘導体は、天然アミノ酸とは異なるように何らかの方法で化学修飾されたアミノ酸を含む。
【００９８】
オステオカルシン模倣物も提供することができる。「模倣物」とは、天然又は非天然オステオカルシンポリペプチドのほぼ同じ構造的及び機能的特性を有する合成化合物を指し、例えば、改変された骨格、側鎖及び／又は塩基を有するポリペプチド及びポリヌクレオチド様ポリマーを含む。ペプチド模倣物は、テンプレートペプチドと類似した性質を有する非ペプチド薬物として医薬産業に一般に使用されている。一般に、模倣物は、生物活性又は薬理活性を有するパラダイムポリペプチドに構造的に類似している（すなわち、同じ形状を有する）が、１個以上のポリペプチド結合が置換されている。模倣物は、アミノ酸の合成非天然類似体で完全に構成されるか、又は部分的天然ペプチドアミノ酸とアミノ酸の部分的非天然類似体のキメラ分子である。模倣物は、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を、こうした置換も模倣物の構造及び／又は活性を実質的に変えない限り、含むこともできる。
【００９９】
当業者によってオステオカルシンに適応させることができる例として、Ｃｈｏら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３〜１３０５には、種々の側鎖で置換されたキラルアミノカルボナートモノマーからなる「非天然生体高分子」、こうしたポリマーのライブラリの合成、及びモノクローナル抗体に対する結合親和性のスクリーニングが開示されている。Ｓｉｍｏｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：９３６７〜９３７１には、多様な側鎖を有するＮ置換グリシン（「ペプトイド」）からなるポリマーが開示されている。Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１８５４〜１８５７には、Ｄ−アミノ酸を用いて合成されたタンパク質に対するＬ−ペプチドのファージライブラリをスクリーニングし、次いで選択されたＬ−ペプチドをＤ−アミノ酸を用いて合成することによって特定されたＤ−ペプチドリガンドが開示されている。Ｂｒｏｄｙら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３８１〜８には、数百から数千のアプタマーの生成及びスクリーニングが記述されている。
【０１００】
本開示の範囲内である特別なタイプのオステオカルシン変異体は、１個以上の骨格アミドが異なる化学構造で置換された、又は１個以上のアミノ酸がアミノ酸類似体で置換された、オステオカルシン模倣物である。特定の例示的実施形態においては、オステオカルシン模倣物は、非カルボキシル化ヒトオステオカルシンの逆鏡像異性体である。
【０１０１】
オステオカルシン並びにその断片及び変異体は、場合によっては、化学合成又は組換え方法によって製造され、本明細書に記載のように、修飾オステオカルシン分子（すなわち、オステオカルシン断片又は変異体）として製造することができる。オステオカルシンポリペプチドは、任意の従来手段によって製造することができる（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１〜５１３５）。同時複数ペプチド合成が米国特許第４，６３１，２１１号に記載されており、使用することもできる。組換えによって製造するときには、オステオカルシンを融合タンパク質、例えば、ＧＳＴ−オステオカルシン融合タンパク質として製造することができる。
【０１０２】
本開示の方法に使用することができる低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン分子としては、別の生物に由来するタンパク質、すなわち、ヒトオステオカルシンのオルソログを含めて、ヒトオステオカルシンとほぼ同種であるタンパク質が挙げられる。一つの特別なオルソログはマウスオステオカルシンである。マウスオステオカルシン遺伝子１ｃＤＮＡは、以下の配列を有する配列番号３である。
【０１０３】
agaacagaca agtcccacac agcagcttgg cccagaccta gcagacacca tgaggaccat ctttctgctc actctgctga ccctggctgc gctctgtctc tctgacctca cagatgccaa gcccagcggc cctgagtctg acaaagcctt catgtccaag caggagggca ataaggtagt gaacagactc cggcgctacc ttggagcctc agtccccagc ccagatcccc tggagcccac ccgggagcag tgtgagctta accctgcttg tgacgagcta tcagaccagt atggcttgaa gaccgcctac aaacgcatct atggtatcac tatttaggac ctgtgctgcc ctaaagccaa actctggcag ctcggctttg gctgctctcc gggacttgat cctccctgtc ctctctctct gccctgcaag tatggatgtc acagcagctc caaaataaag ttcagatgag gaagtgcaaa aaaaaaaaaa aaaa
【０１０４】
マウスオステオカルシン遺伝子２ｃＤＮＡは、以下の配列を有する配列番号４である。
【０１０５】
gaacagacaa gtcccacaca gcagcttggt gcacacctag cagacaccat gaggaccctc tctctgctca ctctgctggc cctggctgcg ctctgtctct ctgacctcac agatcccaag cccagcggcc ctgagtctga caaagccttc atgtccaagc aggagggcaa taaggtagtg aacagactcc ggcgctacct tggagcctca gtccccagcc cagatcccct ggagcccacc cgggagcagt gtgagcttaa ccctgcttgt gacgagctat cagaccagta tggcttgaag accgcctaca aacgcatcta cggtatcact atttaggacc tgtgctgccc taaagccaaa ctctggcagc tcggctttgg ctgctctccg ggacttgatc ctccctgtcc tctctctctg ccctgcaagt atggatgtca cagcagctcc aaaataaagt tcagatgagg
【０１０６】
マウスオステオカルシン遺伝子１及び遺伝子２によってコードされるアミノ酸配列は、以下の配列を有する配列番号５である。
【０１０７】
MRTLSLLTLL ALAALCLSDL TDPKPSGPES DKAFMSKQEG NKVVNRLRRY LGASVPSPDP LEPTREQCEL NPACDELSDQ YGLKTAYKRI YGITI
【０１０８】
本明細書では、２つのタンパク質は、例えば、それらのアミノ酸配列が少なくとも約７０〜７５％相同であるときにほぼ相同であり得る。典型的に、相同性の程度は少なくとも約８０〜８５％であり、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上である。２つのアミノ酸配列又は核酸配列間の「相同性」は、本明細書に開示されるアルゴリズムを用いて決定することができる。これらの例示的な手順／アルゴリズムを使用して、２つのアミノ酸配列又は核酸配列間の同一性パーセントを決定することもできる。
【０１０９】
本開示の特定の一実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、配列番号２のヒトオステオカルシン又は少なくとも８アミノ酸長である配列番号２の一部と少なくとも８０％相同性を共有するオステオカルシン分子である。別の一実施形態においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、配列番号２のヒトオステオカルシン又は少なくとも８アミノ酸長である配列番号２の一部と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９７％のアミノ酸配列相同性を共有するオステオカルシン分子である。相同配列は、ほぼ同一である配列を含む。好ましい例示的実施形態においては、相同性又は同一性は、成熟ヒトオステオカルシンの全長にわたる。
【０１１０】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の相同性パーセント又は同一性パーセントを求めるために、配列を最適な比較目的で整列させる（例えば、最適な整列のために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に間隙を導入することができ、非相同配列を比較のために無視することができる）。好ましくは、比較のために整列させる参照配列の長さは、参照配列と比較される配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％又はそれ以上である。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを、次いで比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されるときには、分子はその位置において同一である。２つの配列の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある間隙の数及び各間隙の長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１１１】
本開示は、同一性の程度がより低いが、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンによって果たされる同じ機能の１つ以上を果たすように十分な類似性を有する、例えば、ＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化する、ポリペプチドも包含する。類似性は、保存されたアミノ酸置換を考慮して決定される。こうした置換は、ポリペプチドの所与のアミノ酸を特性の似た別のアミノ酸で置換するものである。保存的置換は、表現型的に無変化である可能性がある。表現型的に無変化である可能性があるアミノ酸変化に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１３１０に見つけることができる。
【０１１２】
保存的置換の例は、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ間の相互の置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＡｒｇの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの置換、極性残基ＧｌｎとＡｓｎの交換、並びに低分子残基Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ及びＧｌｙの交換である。
【０１１３】
２つのオステオカルシンポリペプチド間の配列比較並びに同一性及び相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，ＨＧ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖａｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい。こうした数学的アルゴリズムの非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７に記載されている。
【０１１４】
２つのオステオカルシンアミノ酸配列間の同一性又は相同性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３のアルゴリズムを用いて決定することができる。
【０１１５】
本開示に係るほぼ相同なオステオカルシンは、極めて厳密な条件下、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で６５℃でフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、及び０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３）、及び機能的に同等な遺伝子産物をコードすること、又は適度に厳密な条件などのより厳密性の低い条件下、例えば、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９上掲）によって、ヒトオステオカルシン核酸配列とハイブリッド形成可能な核酸配列によってコードされ、それでも生物学的に活性な低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンをコードする、ポリペプチドとすることもできる。
【０１１６】
本開示に係るほぼ相同なオステオカルシンは、厳密な条件下、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で６５℃でフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、及び０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３）、及び機能的に同等な遺伝子産物をコードすること、又は適度に厳密な条件などのより厳密性の低い条件下、例えば、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９上掲）によって、ヒトオステオカルシン核酸配列と少なくとも７０〜７５％、典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列とハイブリッド形成可能な核酸配列によってコードされ、それでも生物学的に活性な低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンをコードする、ポリペプチドとすることもできる。
【０１１７】
ヒトオステオカルシンの生物学的に活性な断片又は変異体は、天然ヒトオステオカルシンとは異なる数のアミノ酸を含み得ることを理解されたい。したがって、成熟ヒトオステオカルシンの１７、２１及び２４位に対応するアミノ酸残基の位置番号は、断片又は変異体では異なり得る。当業者は、断片又は変異体のアミノ酸配列と成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列の比較からこうした対応する位置を容易に認識するであろう。
【０１１８】
完全長オステオカルシン、成熟オステオカルシン又はオステオカルシン断片若しくは変異体が無関係のタンパク質又はポリペプチドに結合した融合タンパク質に相当するペプチドも本開示の範囲内であり、本明細書に開示されるオステオカルシンヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて設計することができる。こうした融合タンパク質は、マーカー機能を与える酵素、蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合を含む。本開示の好ましい一実施形態においては、融合タンパク質は、体内の特定の標的細胞又は場所にオステオカルシンを向ける能力のあるポリペプチドとの融合を含む。例えば、オステオカルシンポリペプチド配列は、リガンドの受容体を発現する細胞に融合タンパク質を向ける能力のあるリガンド分子と融合することができる。特定の一実施形態においては、オステオカルシンポリペプチド配列は、哺乳動物の脳において融合タンパク質を特定のニューロンに向ける能力のあるリガンドと結合することができる。
【０１１９】
オステオカルシンは、薬物スクリーニング用キメラタンパク質の一部として製造することもでき、又は組換えタンパク質の製造に使用することもできる。これらのキメラタンパク質は、オステオカルシンと実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種ペプチドに連結されたオステオカルシンペプチド配列を含む。異種ペプチドは、オステオカルシンのＮ末端若しくはＣ末端に融合することができ、又は内部に位置することができる。一実施形態においては、融合タンパク質は、オステオカルシン機能に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質は、オステオカルシン配列がＧＳＴ配列のＮ又はＣ末端に結合したＧＳＴ融合タンパク質とすることができる。別のタイプの融合タンパク質としては、酵素融合タンパク質、例えば、ベータガラクトシダーゼ融合物、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ−４融合物、ポリＨｉｓ融合物及びＩｇ融合物が挙げられるが、それらに限定されない。こうした融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合物は、組換えオステオカルシンの精製を容易にすることができる。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加し得る。したがって、融合タンパク質は、異種シグナル配列をそのＮ末端に含むことができる。
【０１２０】
当業者は、オステオカルシンと共に使用するために周知技術を適応させる方法を理解するであろう。例えば、欧州特許公報第０４６４５３３号は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）の様々な部分を含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃ領域は、治療及び診断に有用であり、したがって、例えば、薬物動態学的性質を改善する（例えば、欧州特許公報第０２３２２６２号を参照されたい）。創薬においては、例えば、拮抗物質を特定するハイスループットスクリーニングアッセイのために、ヒトタンパク質がＦｃ領域と融合された（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．８：５２〜５８及びＪｏｈａｎｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９〜９４７１）。したがって、本開示の種々の例示的実施形態は、オステオカルシンポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質、及び種々のサブクラスの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＢ）の重鎖又は軽鎖の定常領域の様々な部分も利用する。免疫グロブリンとして好ましいのは、融合がヒンジ領域で起こるヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部である。一部の用途では、融合タンパク質をその意図された目的で使用した後にＦｃ領域を除去することが望ましい。特定の一実施形態においては、Ｆｃ部は、例えば第Ｘａ因子を用いて、取り込むこともでき切断することができる切断配列によって、簡単な方法で除去することができる。
【０１２１】
キメラ又は融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を、従来技術に従ってインフレームで連結することができる。別の一実施形態においては、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、２個の連続遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行うことができ、続いて連続遺伝子断片をアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）。さらに、融合部分を既にコードした多数の発現ベクターが市販されている（例えば、ＧＳＴタンパク質）。オステオカルシンをコードする核酸を、融合部分がオステオカルシンにインフレームで連結されるように、こうした発現ベクターにクローン化することができる。
【０１２２】
異なるアイソフォームに、又は別の種由来の別のオステオカルシン分子に、１個以上の機能的部位が由来するキメラオステオカルシンタンパク質を製造することができる。部位は、哺乳動物ゲノムにおいて発生するが、まだ発見も特徴づけもされていないオステオカルシン関連タンパク質に由来することもできる。
【０１２３】
ポリペプチドは、２０種の天然アミノ酸と一般に称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多い。さらに、末端アミノ酸を含めて、多数のアミノ酸を、プロセシング及び別の翻訳後修飾などの天然プロセスによって、又は当該技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾することができる。
【０１２４】
したがって、本開示の方法に有用であるオステオカルシンポリペプチドは、置換基が含まれる、又は成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を延長する化合物などの別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と結合した、又はリーダー若しくは分泌配列、オステオカルシンポリペプチド若しくはプロタンパク質配列の精製用配列などの追加のアミノ酸がオステオカルシンポリペプチドに結合した、遺伝暗号によってコードされるものではない置換非天然アミノ酸残基を含む誘導体も包含する。
【０１２５】
低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、医薬品化学において公知の方法に従って修飾して、その安定性、半減期、取り込み又は有効性を増大させることができる。公知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介性アミノ酸付加、及びユビキチン化が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２６】
本開示の特定の例示的一実施形態においては、オステオカルシンを修飾して、血清中半減期を延長する手段として残基Ａｒｇ４３におけるタンパク質分解感受性を低下させることができる。こうした修飾は、例えば、レトロエナンチオ異性体、Ｄ−アミノ酸又は別のアミノ酸類似体の使用を含む。
【０１２７】
Ｎ末端アミノ基のアシル化は、ヒドロオロチン酸などの親水性化合物を用いて、又はメチルイソシアナート若しくはイソプロピルイソシアナートなどの適切なイソシアナートとの反応によって達成して、Ｎ末端に尿素部分を生成することができる。オステオカルシン誘導体の作用持続時間を延長する別の薬剤を、Ｎ末端に連結することもできる。
【０１２８】
還元的アミノ化は、アンモニアをアルデヒド又はケトンと縮合させてイミンを形成し、続けてそれをアミンに還元するプロセスである。還元的アミノ化は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン及びその断片又は変異体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させる有用な方法である。ＰＥＧと低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン並びにその断片及び変異体との共有結合は、高い水溶性、変化した生物学的利用能、薬物動態学、免疫原性及び生物活性を有する複合物をもたらし得る。例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら、１９９８、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４６〜１４４９を参照されたい。
【０１２９】
低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン並びにその断片及び変異体に適用することができる幾つかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、ヒドロキシル化及びＡＤＰリボシル化は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）などの最も基本的な教科書に記載されている。Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １〜１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６及びＲａｔｔａｎら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２など、この題目についての多数の詳細な総説が利用可能である。
【０１３０】
やはりよく知られているように、ポリペプチドは必ずしも完全に線状ではない。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐することもあり、一般に、天然プロセシング事象及び天然には起こらない人の操作によってもたらされる事象を含めた翻訳後事象の結果として、分岐のある又はない、環状である場合もある。環状、分岐及び分岐環状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセスによって、また、合成法によって、合成することができる。こうした非線形ポリペプチドを調製するための周知の技術を当業者は適応させて、非線形オステオカルシンポリペプチドを製造することができる。
【０１３１】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含めて、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン並びにその断片及び変異体のどこででも起こり得る。共有結合修飾によるポリペプチドのアミノ若しくはカルボキシル基又はその両方の封鎖は、天然及び合成ポリペプチドでは一般的であり、本開示で用いられる低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン又はその断片及び変異体に適用することができる。例えば、タンパク質分解プロセシング前に大腸菌中で産生されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほぼ確実にＮホルミルメチオニンである。したがって、Ｎホルミルメチオニンをアミノ末端残基として有する低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン並びにその断片及び変異体の使用は、本開示の範囲内である。
【０１３２】
本開示の範囲内にある種々のタンパク質修飾の簡単な説明を下表に記載する。
【０１３３】
表１
【表１】
2020508982.tif 000003
【表２】
2020508982.tif 000004
【表３】
2020508982.tif 000005
【表４】
2020508982.tif 000006
【０１３４】
本開示の例示的実施形態は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン又はその誘導体若しくは変異体などのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤のカルボン酸官能基を低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどでエステル化するによって生成され得る低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン又はその誘導体若しくは変異体などのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤のプロドラッグの使用も包含する。エステルではない低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン又はその誘導体若しくは変異体などのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤のプロドラッグの使用も企図される。例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン又はその誘導体若しくは変異体などのＧＰＲ１５８を活性化する薬剤の薬学的に許容されるカルボナート、チオカルボナート、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−アシルオキシアルキル誘導体、第三級アミンの第四級誘導体、Ｎ−マンニッヒ塩基、シッフ塩基、アミノ酸複合物、リン酸エステル、金属塩及びスルホン酸エステルも企図される。一部の例示的実施形態においては、プロドラッグは、生物学的加水分解性部分（例えば、生物学的加水分解性アミド、生物学的加水分解性カルバマート、生物学的加水分解性カルボナート、生物学的加水分解性エステル、生物学的加水分解性ホスファート、又は生物学的加水分解性ウレイド類似体）を含む。本明細書に開示される低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン又はその誘導体若しくは変異体のプロドラッグの調製ガイダンスは、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５；Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、１９９１、第５章、１１３〜１９１ページ；並びにＢｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ、１９９２、８、１〜３８ページなどの刊行物に見つけることができる。
【０１３５】
本開示の方法を実施するために、例えばオステオカルシンをコードするｃＤＮＡ配列を組換え発現することによって、オステオカルシンを組換え発現することが望ましい場合もある。ヒトオステオカルシンのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に表される。オステオカルシンヌクレオチド配列は、当業者に既知の種々の方法を用いて単離することができる。例えば、オステオカルシンを発現することが知られている組織由来のＲＮＡを用いて構築されたｃＤＮＡライブラリを、標識オステオカルシンプローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリをスクリーニングして、オステオカルシンをコードする核酸分子を誘導することができる。さらに、公知のオステオカルシンヌクレオチド配列に基づいて設計された２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施することによって、オステオカルシン核酸配列を誘導することができる。反応用テンプレートは、オステオカルシンを発現することが知られている細胞系又は組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡとすることができる。
【０１３６】
オステオカルシンポリペプチド及びペプチドは化学合成することができるが（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．参照）、オステオカルシンから誘導される大きいポリペプチド及び完全長オステオカルシン自体は、有利には、核酸を発現する当該技術分野で周知の技術を用いて組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。こうした方法を使用して、オステオカルシンヌクレオチド配列並びに適切な転写及び翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上掲に記載の技術を参照されたい。
【０１３７】
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、オステオカルシンヌクレオチド配列を発現することができる。好ましい一実施形態においては、オステオカルシンペプチド又はポリペプチドが分泌され、培地から回収することができる。
【０１３８】
適切な発現系を選択して、オステオカルシンタンパク質の正確な修飾、プロセシング及び細胞内局在が確実に起こるようにすることができる。このために、細菌宿主細胞は、こうした細胞がオステオカルシンをカルボキシル化することができないので、オステオカルシンの発現に有用である。
【０１３９】
単離オステオカルシンは、それを天然に発現する細胞、例えば骨芽細胞から精製することができ、又はオステオカルシンを天然に発現するがオステオカルシンを過剰産生するように組換えによって改変された細胞から精製することができ、又はオステオカルシンを天然に発現しないがオステオカルシンを発現するように組換えによって改変された細胞から精製することができる。特定の一実施形態においては、組換え細胞を操作して、内在性オステオカルシン遺伝子の発現を活性化する。例えば、国際公開第９９／１５６５０号及び国際公開第００／４９１６２号は、内在性オステオカルシンの発現を活性化又は増加させるのに使用することができる遺伝子発現のランダム活性化（ＲＡＧＥ）と称される内在性遺伝子を発現する方法を記述する。ＲＡＧＥ法は、下流内在性遺伝子の発現を活性化する制御配列の非相同組換えを含む。あるいは、国際公開第９４／１２６５０号、国際公開第９５／３１５６０号及び国際公開第９６／２９４１１号、並びに米国特許第５，７３３，７６１号及び米国特許第６，２７０，９８５号は、標的配列、制御配列、エキソン及びスプライスドナー部位を含むＤＮＡ構築物の相同組換えを含む内在性遺伝子の発現を高める方法を記述する。相同組換えによって、下流内在性遺伝子が発現される。上記特許に記載の内在性遺伝子を発現する方法を、参照により本明細書に明確に援用する。
【０１４０】
本開示の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化する治療薬を、約０．５μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約９０ｍｇ／ｋｇ／日、約５μｇ／ｋｇ／日〜約８５ｍｇ／ｋｇ／日、約１０μｇ／ｋｇ／日〜約８０ｍｇ／ｋｇ／日、約２０μｇ／ｋｇ／日〜約７５ｍｇ／ｋｇ／日、約５０μｇ／ｋｇ／日〜約７０ｍｇ／ｋｇ／日、約１５０μｇ／ｋｇ／日〜約６５ｍｇ／ｋｇ／日、約２５０μｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５００μｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約１５ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１６ｍｇ／ｋｇ／日、又は約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量範囲で患者に投与する。
【０１４１】
本開示の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化する治療薬を、約０．５μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約８０μｇ／ｋｇ／日、約３μｇ／ｋｇ／日〜約５０μｇ／ｋｇ／日、又は約３μｇ／ｋｇ／日〜約３０μｇ／ｋｇ／日の投与量範囲で患者に投与する。
【０１４２】
本開示の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化する治療薬を約０．５ｎｇ／ｋｇ／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ／日、約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約８０ｎｇ／ｋｇ／日、約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約５０ｎｇ／ｋｇ／日、又は約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日の投与量範囲で患者に投与する。
【０１４３】
ＧＰＲ１５８の例示的な抗体活性化物質
本開示の例示的実施形態は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンがＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化するときに活性化される経路を通してＧＰＲ１５８シグナル伝達を活性化することができる、抗体又は複数の抗体、並びにその生物学的に活性な断片又は変異体を含む組成物も提供する。
【０１４４】
ＧＰＲ１５８を活性化する抗体は、本明細書に記載の認知障害を処置する治療に使用することができる。ある例示的実施形態においては、抗体は、ＧＰＲ１５８の細胞外ドメインに結合する。
【０１４５】
ある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化する抗体は、配列番号６によってコードされるヒトＧＰＲ１５８中のエピトープ、又は配列番号７若しくは配列番号８とほぼ相同若しくは同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する。別の例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化する抗体は、配列番号７又は配列番号８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％相同又は同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド中のエピトープに結合する。
【０１４６】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、一般に、特定の３次元構造的特性及び特定の電荷特性を有する。エピトープは、一般に、少なくとも５個の隣接アミノ酸を有するが、一部のエピトープは、それらを含むタンパク質の折り畳みによって集合した非隣接アミノ酸によって形成される。
【０１４７】
「抗体」及び「複数の抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖Ｆｖ抗体断片、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片を含む。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に特異的である抗体分子の不均一な集団であり、モノクローナル抗体は、抗原に含まれる特定のエピトープに対する抗体の均一な集団である。モノクローナル抗体は本開示に特に有用である。
【０１４８】
ＧＰＲ１５８に対して特異的結合親和性を有する抗体断片を、公知技術によって生成することができる。こうした抗体断片としては、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ断片が挙げられるが、それらに限定されない。
あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを構築することができる。例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１を参照されたい。単鎖Ｆｖ抗体断片は、Ｆｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片をアミノ酸架橋（例えば、１５〜１８個のアミノ酸）によって連結して単鎖ポリペプチドを生成することによって形成される。単鎖Ｆｖ抗体断片は、米国特許第４，９４６，７７８号に開示されたものなどの標準技術によって生成することができる。
【０１４９】
抗体又はその断片は、生成した後に、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は放射性免疫測定法アッセイ（ＲＩＡ）を含めて、標準免疫測定法によって標的ポリペプチドの認識について試験することができる。Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。
【０１５０】
医薬組成物の例示的処方及び投与
本開示の例示的実施形態は、対象に投与する医薬組成物に処方される本明細書に記載のポリペプチド、核酸、抗体、低分子及び他の治療薬の使用を記述する。治療薬（「活性化合物」とも称される）は、対象、例えばヒトへの投与に適切な医薬組成物に組み込むことができる。こうした組成物は、一般に、ポリペプチド、核酸、抗体、低分子及び薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、例えば、こうした組成物は、ヒトに投与したときに非発熱性である。
【０１５１】
本開示の医薬組成物は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンがＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化するときに活性化される経路を通してＧＰＲ１５８シグナル伝達を活性化するのに十分な量で投与される。
【０１５２】
本明細書では「薬学的に許容される担体」という言語は、医薬品投与に適合した任意のすべての溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張化及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的活性物質のためのこうした媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物に適合する限り、こうした媒体を本開示の組成物に使用することができる。補充の活性化合物又は治療薬を、組成物に組み込むこともできる。本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、経口、吸入、経皮（局所的）、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。
【０１５３】
「投与する」という用語は、その最も広い意味で使用され、本開示の組成物を対象に導入する任意の方法を含む。これは、対象に体外から導入されたポリヌクレオチドの転写又は翻訳によってポリペプチド又はポリヌクレオチドをインビボで生成することを含む。したがって、外来組成物から対象中で生成されたポリペプチド又は核酸は、「投与する」という用語に包含される。
【０１５４】
非経口、皮内又は皮下適用に使用する溶液又は懸濁液は、以下の成分、すなわち、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコール、メチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム、デキストロースなどの張性調節剤を含むことができる。ｐＨは、塩酸、水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いて調節することができる。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアルに封入することができる。
【０１５５】
注射用に適切な例示的医薬組成物としては、無菌水溶液剤（治療薬は水溶性である）又は分散液剤、及び無菌注射液又は分散液を即座に調製するための無菌散剤が挙げられる。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流体であるべきである。それは、製造及び貯蔵条件下で安定であるべきであり、細菌、真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に入れることによって延長することができる。
【０１５６】
無菌注射液は、必要量の活性化合物（例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンタンパク質又はＧＰＲ１５８を活性化する抗体）を適切な溶媒中で上記成分の一つ又は組合せと混合し、必要に応じて、続いて濾過滅菌して調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒と上記のものからの必要な他の成分とを含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混ぜ込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望成分の粉末を、あらかじめ無菌濾過したその溶液から生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１５７】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入することができ、又は圧縮して錠剤にすることができる。処置する具体的状態に応じて、哺乳動物における認知障害の処置のための本開示の医薬組成物を処方することができ、全身的又は局所的に投与することができる。処方及び投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）及びＧｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００）に見つけることができる。経口投与の場合、薬剤を胃で残存するように腸溶性の形で含むことができ、又は更に被覆若しくは混合して、消化管の特定の領域において公知の方法によって放出されるようにすることができる。経口治療投与の目的で、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物は、洗口剤として使用するために流体担体を用いて調製することもでき、流体担体中の化合物を経口的に適用し、うがいし、吐き出し、又は嚥下する。薬学的に適合性の結合剤及び／又はアジュバント材料を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、又は類似の性質の化合物を含むことができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、ＰＲＴＭＯＧＥＬ（登録商標）、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ＳＴＥＲＯＴＥＳ（登録商標）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動化剤、スクロース、サッカリンなどの甘味剤、又はペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味剤などの香味剤。
【０１５８】
吸入による投与の場合、化合物をエアロゾル噴霧の形で、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む圧力容器若しくは分注器、又は噴霧器から送ることができる。
【０１５９】
全身投与は、経粘膜又は経皮手段によることもできる。経粘膜又は経皮投与の場合、通過すべき関門に適切な浸透剤を処方に使用する。こうした浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔噴霧剤又は坐剤を使用して実施することができる。経皮投与の場合、当該技術分野で一般に知られているように、活性化合物を軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤に処方する。
【０１６０】
適宜、化合物を直腸送達用の坐剤（例えば、カカオ脂、他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤と一緒に）又は保留浣腸の形で調製することもできる。
【０１６１】
一実施形態においては、活性化合物は、移植片及びマイクロカプセル送達系を含めて、制御放出製剤など、該化合物が体から急速に排出されるのを防止する担体と一緒に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。こうした製剤の調製方法は、当業者に明らかである。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。（例えばモノクローナル抗体で、特定の細胞を標的にしたリポソームを含めた）リポソーム懸濁液を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に既知の方法によって調製することができる。
【０１６２】
投与を容易にし、投与量を均一にするために、経口又は非経口組成物を単位剤形で処方することが特に有利である。本明細書では「単位剤形」とは、処置される対象に対する単位投与量として適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と一緒に、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物特有の特性、及び達成すべき特定の治療効果、並びに個体の処置のためにこうした活性化合物を配合する当該技術分野における固有の制約に従い、それらに直接依存する。
【０１６３】
本明細書に示すように、薬剤は、ポンプで連続的に、又は日中に長期間頻繁に、投与することができる。ある例示的実施形態においては、薬剤は、約０．３〜１００ｎｇ／ｈ、好ましくは約１〜７５ｎｇ／ｈ、より好ましくは約５〜５０ｎｇ／ｈ、更により好ましくは約１０〜３０ｎｇ／ｈの速度で投与することができる。薬剤は、約０．１〜１００μｇ／ｈ、好ましくは約１〜７５μｇ／ｈ、より好ましくは約５〜５０μｇ／ｈ、更により好ましくは約１０〜３０μｇ／ｈの速度で投与することができる。処置に使用される抗体、タンパク質又はポリペプチドの有効投与量は、特定の処置の過程で増減し得ることも理解されたい。投与量の変化は、生体試料、好ましくは血液又は血清の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルを監視することから得られ、明らかになり得る。
【０１６４】
本開示の例示的一実施形態においては、浸透圧ポンプを用いた皮下、長期、自動薬物送達によって薬剤を送達して、所望の用量の薬剤を所望の時間注入することができる。インスリンポンプは広く利用可能であり、糖尿病患者によってインスリンを長期間自動的に送達するのに使用される。こうしたインスリンポンプを本開示の方法に使用される薬剤を送達するのに適応させることができる。薬剤の送達速度は、個体の変動する要件（例えば、基本速度及び大量瞬時投与量）に適応する広い範囲で容易に調節することができる。新しいポンプは、周期的な投与様式を可能にし、すなわち、液体は、連続流通様式ではなく、一定の少量を周期的な不連続の用量で送達される。装置全体の液体送達速度は、投与期間を制御及び調節することによって制御及び調節することができる。ポンプは、「Ａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」と題する米国特許第６，５６０，４７１号に記載のシステムなどの連続モニタリング装置及び遠隔ユニットと連結することができる。こうした配置においては、連続血液モニタリング装置を制御する手持ちサイズの遠隔ユニットが、血液モニタリングユニットと本開示の方法に使用される治療薬を送達する流体送達装置の両方と無線通信し、それらを制御することができる。
【０１６５】
本開示の一部の例示的実施形態においては、治療薬による処置を開始する前に、患者を試験して、その血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルが正常レベル（約２５％以下）よりも有意に低いかどうか判定する。投与回数は、１日１回の投与から１日複数回の投与まで変わり得る。好ましい投与経路としては、経口、静脈内及び腹腔内が挙げられるが、別の投与形態を選択することもできる。
【０１６６】
タンパク質若しくはポリペプチド、低分子、抗体又は核酸の「治療有効量」は、所望の治療結果が得られる量である。例えば、治療薬を投与して哺乳動物における認知障害を処置又は防止する場合、治療有効量は、障害の１つ以上の症候を改善する量、又は加齢に付随する神経変性による認知欠損の軽減、不安の軽減、抑欝の軽減、記憶喪失の軽減、学習の改善、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の軽減からなる群から選択される少なくとも１つの効果を生じる量である。
【０１６７】
本開示に使用されるタンパク質若しくはポリペプチド、低分子又は核酸の治療有効量は、一般に変動し、対象において一般に約１ナノグラム／ミリリットル〜約１０マイクログラム／ミリリットルの血清治療薬レベルを達成するのに十分な量、又は対象において約１ナノグラム／ミリリットル〜約７マイクログラム／ミリリットルの血清治療薬レベルを達成するのに十分な量とすることができる。別の好ましい血清治療薬レベルとしては、約０．１ナノグラム／ミリリットル〜約３マイクログラム／ミリリットル、約０．５ナノグラム／ミリリットル〜約１マイクログラム／ミリリットル、約１ナノグラム／ミリリットル〜約７５０ナノグラム／ミリリットル、約５ナノグラム／ミリリットル〜約５００ナノグラム／ミリリットル、及び約５ナノグラム／ミリリットル〜約１００ナノグラム／ミリリットルが挙げられる。
【０１６８】
本開示の方法において患者に投与する本明細書に開示された治療薬の量は、当業者が常法に従って決定することができ、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約７５０ｍｇ／ｋｇ／日、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は別の適切な量であり得る。
【０１６９】
本開示の方法において患者に投与する本明細書に開示された治療薬の量は、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１，０００μｇ／ｋｇ／日、約５μｇ／ｋｇ／日〜約７５０μｇ／ｋｇ／日、約１０μｇ／ｋｇ／日〜約５００μｇ／ｋｇ／日、約２５μｇ／ｋｇ／日〜約２５０μｇ／ｋｇ／日、又は約５０μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日の範囲とすることもできる。
【０１７０】
本開示の方法において患者に投与する本明細書に開示された治療薬の量は、約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｎｇ／ｋｇ／日、約５ｎｇ／ｋｇ／日〜約７５０ｎｇ／ｋｇ／日、約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約５００ｎｇ／ｋｇ／日、約２５ｎｇ／ｋｇ／日〜約２５０ｎｇ／ｋｇ／日、又は約５０ｎｇ／ｋｇ／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ／日の範囲とすることもできる。
【０１７１】
当業者は、状態の重症度、以前の処置、対象の全般的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の障害又は疾患を含めて、ただしそれらに限定されない、ある種の要因が、対象を有効に処置するのに必要な投与量に影響し得ることを理解されたい。
【０１７２】
治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、ヌクレオチド又は抗体を用いた対象の処置は、単一の処置を含むことができ、又は好ましくは一連の処置を含むことができる。
【０１７３】
ある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を活性化するために低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを用いた対象の処置の結果、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、患者の血中の全オステオカルシンの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％又は約５０％である。
【０１７４】
低分子薬剤の適切な用量は、通常の熟練医師、獣医師又は研究者の理解の範囲内の多数の要因に依存すると理解される。低分子の用量（単数又は複数）は、例えば、処置する対象又は試料の素性、サイズ及び状態に応じて、更には組成物を投与する経路、及び開業医が望む低分子の有する効果に応じて、変わる。低分子の適切な用量は、調節すべき発現又は活性に関する低分子の効力に依存することが更に理解される。ＧＰＲ１５８を活性化するためにこれらの低分子の１種以上を動物（例えば、ヒト）に投与するときには、比較的低用量を最初に処方し、続いて適切な応答が得られるまで用量を増加させる。さらに、任意の特定の対象の具体的用量レベルは、使用する具体的化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的健康状態及び食事、投与時間、投与経路、排出速度、別の薬物を患者に投与しているかどうか、並びに調節すべき発現又は活性の程度を含めた種々の要因に依存すると理解される。
【０１７５】
防止又は処置のために、適切な対象は、哺乳動物における認知障害の疑いのある個体、認知障害と診断された個体、又は認知障害を発症するリスクがある個体であり得る。
【０１７６】
本開示の方法に有用な医薬組成物の適切な投与経路としては、経口、腸、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、皮下、経皮、直腸、髄内、髄腔内、静脈内、脳室内、心房内、大動脈内、動脈内又は腹腔内投与が挙げられる。本開示の方法に有用である医薬組成物は、カテーテル、風船、移植可能な装置、生分解性移植片、プロテーゼ、移植片、縫糸、パッチ、シャント、ステントなどのそれらに限定されない医療機器によって対象に投与することができる。好ましい一実施形態においては、治療薬（例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン）を標的領域に局在投与するためにステントに塗布することができる。この状況においては、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの緩効性調製物が好ましい。
【０１７７】
本開示の化合物は、取り込み、分布及び／又は吸収を助けるために、他の分子、分子構造体、又は化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所又は他の製剤と混合する、カプセル化する、複合化する、又は他の方法で併用することもできる。こうした取り込み、分布及び／又は吸収を助ける処方の調製を教示し、本開示を実施するために有用な技術について当業者が調べることができる代表的な米国特許としては、その各々を参照により本明細書に援用する、米国特許第５、１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７、１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３、１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号及び第５，５９５，７５６号が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７８】
非カルボキシル化オステオカルシンは血液脳関門を通過するが、ある種の誘導体、変異体、又は修飾形態のオステオカルシンは通過できないかもしれない。血液脳関門を通過しない形態のオステオカルシンを利用する本開示の例示的実施形態においては、血液脳関門を通して物質を輸送するための当該技術分野で公知の方法を利用することができる。例えば、米国特許出願第２０１３／００３４５９０号又は米国特許出願第２０１３／００３４５７２号に開示された方法を使用することができる。ヒトインスリン又はトランスフェリン受容体は、モノクローナル抗体で改変されたオステオカルシン複合物でこれらの受容体を標的にすることによって利用することができる（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、２００７、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：１７３３〜１７４４；Ｂｅｄｕｎｅａｕら、２００８、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １２６：４４〜４９）。修飾オステオカルシンを含む界面活性剤被覆ポリ（ブチルシアノアクリラート）ナノ粒子を使用することができる（Ｋｒｅｕｔｅｒら、２００３、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：４０９〜４１６）。あるいは、修飾オステオカルシンを含むＰＥＧ化ナノ粒子と複合化されたカチオン性アルブミンなどのカチオン性担体を使用して、修飾オステオカルシンを脳に送達することができる（Ｌｕら、２００６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１８７８〜１１８８７）。
【０１７９】
血液脳関門を通して物質を輸送するための当該技術分野で公知の上記方法は、ＧＰＲ１５８を活性化する別の治療薬が血液脳関門を単独で通過しない場合、その薬剤に対して利用することもできる。
【０１８０】
本開示の更に別の例示的な一態様においては、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを医薬組成物として薬学的に許容される賦形剤と一緒に投与する。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの例示的な医薬組成物としては、溶液としての注射剤、又は注射用自己硬化若しくは自己ゲル化無機質ポリマーハイブリッドとしての注射剤が挙げられる。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、リン酸カルシウムの多孔質結晶性生体模倣生理活性組成物を用いて投与することができる。そのすべてを参照によりその全体を本明細書に援用する、米国特許第５，８３０，６８２号、第６，５１４，５１４号及び第６，５１１，９５８号、並びに米国特許出願第２００６／００６３６９９号、第２００６／００５２３２７号、第２００３／１９９６１５号、第２００３／０１５８３０２号、第２００４／０１５７８６４号、第２００６／０２９２６７０号、第２００７／００９９８３１号及び第２００６／０２５７４９２号を参照されたい。
【０１８１】
例示的処置方法
本開示の例示的実施形態は、哺乳動物における種々の認知障害を処置又は防止するためにＧＰＲ１５８シグナル伝達経路を活性化する例示的な方法を提供する。本開示の例示的実施形態によれば、該方法は、ＧＰＲ１５８シグナル伝達経路に関連する認知障害を処置又は防止するのに有効な量の薬剤を提供することができる。薬剤は、低分子、抗体及び核酸からなる群から選択することができる。こうした障害としては、加齢に付随する神経変性、不安、抑欝、記憶喪失、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８２】
ある例示的実施形態においては、該方法は、加齢に付随する神経変性、不安、抑欝、記憶喪失、学習障害、又は妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の処置又は防止を必要とする患者を特定するステップ、次いで本明細書に開示される方法を患者に適用するステップを含むことができる。
【０１８３】
本開示の例示的一実施形態においては、処置方法は、それを必要とする患者に、患者の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの血中濃度を処置前の患者のレベルに比べて上昇させるのに十分な治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを投与するステップを含む。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは血液／脳関門を通過することができるので、これは、ＧＰＲ１５８を発現する脳の標的領域における治療有効レベルの低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンをもたらすことができる。好ましくは、患者はヒトである。別の一実施形態においては、処置方法は、それを必要とする患者に、患者の血中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと全オステオカルシンの比を処置前の患者の比に比べて上昇させるのに十分な治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを投与するステップを含む。
【０１８４】
本開示の別の例示的な一態様においては、哺乳動物における認知障害を処置又は防止する方法であって、ＧＰＲ１５８を活性化するのに十分であり、処置前のレベルに比べて、加齢に付随する神経変性による認知欠損の軽減、不安の軽減、抑欝の軽減、記憶喪失の軽減、学習の改善、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の軽減からなる群から選択される少なくとも１つの効果を生じる、治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンをそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１８５】
本開示のある例示的実施形態は、哺乳動物における認知障害を処置又は防止する方法（ｉ）であって、処置前のレベルに比べて、加齢に付随する神経変性による認知欠損の軽減、不安の軽減、抑欝の軽減、記憶喪失の軽減、学習の改善、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の軽減からなる群から選択される少なくとも１つの効果を生じるのに十分な程度にＧＰＲ１５８を活性化する薬剤を治療に有効な量でこうした処置又は防止を必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を対象とする。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１８６】
本明細書に記載の例示的な方法においては、疾患又は障害を「処置する」とは、疾患若しくは障害又はその症候の改善だけでなく、疾患若しくは障害の進行の遅延、又は疾患若しくは障害の有害作用の改善も包含することを理解されたい。
【０１８７】
本明細書に記載の処置の方法の有効性は、処置する疾患又は障害の症候のいずれかを該方法が改善するかどうか判定することによってモニターすることができる。
【０１８８】
例示的薬物スクリーニング及びアッセイ
低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンがＧＰＲ１５８を活性化するときに活性化される経路を通してＧＰＲ１５８シグナル伝達を活性化することができる候補薬剤を特定する、細胞を用いた及び細胞を用いない薬物スクリーニング法を提供する。こうした薬剤は、哺乳動物における認知障害を処置又は防止するのに使用される。
【０１８９】
ＧＰＲ１５８に結合し、それを活性化する化合物を特定する、細胞を用いないスクリーニング法を提供する。こうした細胞を用いない方法は、ＧＰＲ１５８に結合する薬剤を特定する、又はアッセイする方法であって、（ｉ）ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体を含む混合物を用意するステップ、（ｉｉ）混合物を候補薬剤と接触させるステップ、（ｉｉｉ）候補薬剤が混合物中のＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合するかどうかを決定するステップを含む方法を含み、薬剤がＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合する場合。該方法は、場合によっては、（ｉｖ）薬剤がＧＰＲ１５８を活性化するかどうかを判定するステップ、及び／又は（ｖ）哺乳動物における認知障害の処置を必要とする患者に薬剤を投与するステップを含む。ある例示的実施形態においては、混合物は、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体を含む膜断片を含む。
【０１９０】
上記アッセイにおける薬剤と標的分子の結合は、競合結合測定法を使用して測定することができる。競合剤は、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合することが知られている結合成分である。ある環境下では、薬剤と結合成分の競合的結合が存在する場合があり、結合成分が薬剤に取って代わり、又は薬剤が結合成分に取って代わる。ある例示的実施形態においては、競合剤は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。
【０１９１】
薬剤又は競合剤は、標識することができる。薬剤又は競合剤を、最初に、結合に十分な時間ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に添加する。最適な結合を促進する任意の温度、一般に４℃〜４０℃でインキュベーションを行うことができる。インキュベーション時間を最適結合のために選択することもできるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化することもできる。一般に、０．１〜１時間が十分である。過剰の薬剤及び競合剤は、一般に除去又は洗い流される。
【０１９２】
こうしたアッセイを用いて、競合剤を最初に、続いて薬剤を添加することができる。競合剤の置換は、薬剤がＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合し、したがってＧＰＲ１５８の活性を調節可能であり得ることを示すものである。この実施形態においては、どちらかの成分を標識することができる。したがって、例えば、競合剤を標識する場合、洗浄溶液中の標識の存在は薬剤による置換を示す。
【０１９３】
別の例においては、薬剤を最初に添加し、インキュベーション及び洗浄し、続いて競合剤を添加する。競合剤による結合の不在は、薬剤がＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に競合剤より高い親和性で結合することを示している可能性がある。したがって、薬剤を標識する場合、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体上の標識の存在は、競合剤の結合の不在と合わせて、薬剤がＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合可能であることを示している可能性がある。
【０１９４】
例示的な方法は、ＧＰＲ１５８を活性化可能である薬剤を特定するディファレンシャルスクリーニングを含むことができる。こうした場合においては、例示的な方法は、第１の試料においてＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体と競合剤を組み合わせるステップを含むことができる。第２の試料は、薬剤、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体、及び競合剤を含む。薬剤の添加は、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体の活性の調節を可能にする条件下で行われる。競合剤の結合は両方の試料で測定され、２つの試料間の結合の変化又は相違が、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合可能であり、ＧＰＲ１５８の活性を潜在的に活性化可能である、薬剤の存在を示す。すなわち、第２の試料における競合剤の結合が第１の試料と異なる場合、薬剤は、ＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体に結合可能である。
【０１９５】
正の対照及び負の対照をアッセイに使用することができる。好ましくは、すべての対照及び試験試料を少なくとも３つ組で行って、統計的に有意な結果を得る。すべての試料のインキュベーションは、薬剤とＧＰＲ１５８又はその断片若しくは変異体の結合に十分な時間である。インキュベーション後、すべての試料を洗浄して非特異的に結合した材料を除去し、結合した一般に標識された薬剤の量を測定する。例えば、放射性標識を使用する場合、試料をシンチレーションカウンターでカウントして、結合した薬剤の量を測定することができる。
【０１９６】
種々の他の試薬をスクリーニングアッセイに含むことができる。これらは、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進するのに、及び／又は非特異的若しくは背景相互作用を抑制するのに使用することができる、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤などのような試薬を含む。さらに、その他の点でプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのアッセイの効率を向上させる試薬を使用することができる。成分の混合物は、必要な結合を与える任意の順序で添加することができる。
【０１９７】
したがって、一例においては、方法は、ＧＰＲ１５８活性を含む試料を組み合わせるステップを含む。ＧＰＲ１５８活性とは、オステオカルシンによるＧＰＲ１５８の活性化に関連する生物活性の１つ以上を意味する。スクリーニングアッセイは、哺乳動物における認知障害の処置に有用である薬剤を見つけるように設計される。
【０１９８】
上記方法によって特定される薬剤を更にスクリーニングして、ＧＰＲ１５８を活性化するが活性化しない薬剤を特定することができる。ある例示的実施形態においては、更なるスクリーニングは以下を含むことができる。
（ａ）ＧＰＲＣ６Ａを発現する細胞を用意するステップ、
（ｂ）ＧＰＲ１５８活性化物質として特定された薬剤に細胞を曝露するステップ、及び
（ｃ）候補物質が細胞によって発現されるＧＰＲＣ６Ａに結合せず、及び／又はそれを活性化しないことを確認するステップ。
【０１９９】
場合によっては、方法は、（ｄ）ＧＰＲ１５８活性化物質として特定された薬剤が哺乳動物における認知障害の防止及び処置に使用するのに適しているかどうかを決定するステップも含む。
【０２００】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ａ）は、ＧＰＲＣ６Ａを組換えによって発現する細胞を用意するステップを含むことができる。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａを組換えによって発現する細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞又は昆虫細胞である。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６ＡはヒトＧＰＲＣ６Ａである。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２に開示されたタンパク質である。
【０２０１】
ある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８活性化物質として特定された薬剤は、候補物質のライブラリに由来する。ある例示的実施形態においては、物質のライブラリ全体をスクリーニングして、ＧＰＲ１５８を活性化する薬剤を特定する。ある例示的実施形態においては、ライブラリの一部をスクリーニングする。
【０２０２】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ｂ）は、細胞を組織培養で成長させ、ＧＰＲ１５８活性化物質として特定された薬剤を細胞が成長している媒体又は成長した媒体に添加することによって行われる。あるいは、細胞が成長している媒体又は成長した媒体を除去することができ、ＧＰＲ１５８の活性化物質として特定された薬剤を含む新しい媒体を、細胞が成長している又は成長した組織培養プレート又はウェルに添加することができる。
【０２０３】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ｃ）は、ＧＰＲ１５８活性化物質として特定された薬剤がＧＰＲＣ６Ａに結合するために標識非カルボキシル化オステオカルシンと競合するかどうか判定するステップを含む。ある例示的実施形態においては、ステップ（ｃ）は、ＧＰＲ１５８の活性化物質として特定された薬剤を標識し、ＧＰＲ１５８の活性化物質として特定された標識薬剤が細胞によって発現されるＧＰＲＣ６Ａに結合するかどうか判定するステップを含む。
【０２０４】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ｃ）は、ＧＰＲ１５８の活性化物質として特定された薬剤が、細胞におけるｃＡＭＰ濃度の増加、細胞におけるテストステロン合成の増加、細胞におけるＳｔＡＲ発現の増加、細胞におけるＣｙｐ１１ａ発現の増加、細胞におけるＣｙｐ１７発現の増加、細胞における３β−ＨＳＤ発現の増加、細胞におけるＧｒｔｈ発現の増加、細胞におけるｔＡＣＥ発現の増加、細胞におけるＣＲＥＢリン酸化の増加、及び細胞における切断されたカスパーゼ３の量の減少からなる群から選択される、細胞における生理応答を生じるかどうか判定するステップを含む。生理応答は、上記生理反応のいずれかの組合せとすることもできる。ある例示的実施形態においては、生理応答は、細胞におけるｃＡＭＰ濃度の増加に加えてチロシンリン酸化、ＥＲＫ活性化及び細胞内カルシウム蓄積の増加がないことである。生理応答が判定された例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａを天然に発現せず、ＧＰＲＣ６Ａを組換えによって発現するように操作された細胞を使用することが有利な場合もある。こうした例においては、ＧＰＲＣ６Ａを組換えによって発現する状態に転換される前の細胞は、負の対照として役立ち得る。
【０２０５】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ｃ）は、ＧＰＲ１５８の活性化物質として特定された薬剤がＧタンパク質とＧＰＲＣ６Ａの結合に影響するかどうか判定するステップを含むことができる。ここでも、ＧＰＲＣ６Ａを組換えによって発現する細胞を使用し、転換前の同じ細胞を負の対照として使用することが有利な場合もある。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａをコードする構築物及びＧαタンパク質をコードする構築物と細胞を同時導入する。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、２００７、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０：７９８〜８０７及びＰｉら、２００５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４０２０１〜４０２０９を参照されたい。
【０２０６】
本開示の例示的実施形態は、ＧＰＲ１５８を活性化し、哺乳動物における認知障害の防止及び処置に使用するのに適した薬剤を特定する、細胞を用いたスクリーニング法であって、以下を含む方法も提供する。
（ａ）ＧＰＲ１５８タンパク質を含む細胞を用意するステップ、
（ｂ）細胞を候補薬剤に曝露するステップ、
（ｃ）候補薬剤が細胞中でＧＰＲ１５８を活性化することを確認するステップ、及び
（ｄ）候補薬剤が、哺乳動物における認知障害の防止及び処置に使用するのに適しているかどうか判定するステップ。
【０２０７】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ａ）は、ＧＰＲ１５８を組換えによって発現する細胞を用意するステップを含むことができる。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８を組換えによって発現する細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞又は昆虫細胞である。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８は、配列番号６で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８は、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【０２０８】
ある例示的実施形態においては、候補薬剤は、候補薬剤のライブラリに由来し得る。ある例示的実施形態においては、薬剤のライブラリ全体が細胞に曝露される。ある例示的実施形態においては、ライブラリの一部が細胞に曝露される。
【０２０９】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ｃ）は、候補薬剤がＧＰＲ１５８に結合するために標識非カルボキシル化オステオカルシンと競合するかどうか判定するステップを含むことができる。ある例示的実施形態においては、ステップ（ｃ）は、候補薬剤を標識し、標識候補薬剤が細胞中でＧＰＲ１５８に結合するかどうか判定するステップを含む。
【０２１０】
ある例示的実施形態においては、ステップ（ｄ）は、候補薬剤を哺乳動物に投与し、候補薬剤が加齢に付随する神経変性による認知欠損の軽減、不安の軽減、抑欝の軽減、記憶喪失の軽減、学習の改善、及び妊娠中の食糧不足に付随する認知障害の軽減からなる群から選択される哺乳動物における効果を生じることを確認するステップを含むことができる。
【０２１１】
本明細書に記載の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６５８０３．２又はＮＭ０２０７５２．２に開示されたタンパク質である。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６５８０３．２又はＮＭ０２０７５２．２に開示されたヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ本願の図１６、１７Ａ〜Ｃ及び１８に示す。
【０２１２】
上で開示された方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６５８０３．２又はＮＭ０２０７５２．２に開示されたタンパク質と同種のタンパク質である。本明細書に記載の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６５８０３．２又はＮＭ０２０７５２．２に開示されたタンパク質と約８０〜９９％、約８５〜９７％又は約９０〜９５％のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質である。
【０２１３】
本明細書に記載の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２に開示されたタンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２に開示されたヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ本願の図１９Ａ〜Ｂ及び２０に示す。
【０２１４】
本明細書に記載の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２に開示されたタンパク質と同種のタンパク質である。上で開示された方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２９６２に開示されたタンパク質と約８０〜９９％、約８５〜９７％又は約９０〜９５％のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質である。
【０２１５】
本明細書に記載の方法のある例示的実施形態においては、ＧＰＲＣ６Ａは、Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ  ＆  Ｂｒａｕｎｅｒ−Ｏｓｂｏｒｎｅ、２００４、Ｇｅｎｅ  ３３５：３７〜４６に開示されたタンパク質である。
【０２１６】
本開示のある例示的実施形態においては、ＧＰＲ１５８及び／又はＧＰＲＣ６Ａに対するスクリーニング方法によって特定された薬剤を、認知障害の処置を必要とする哺乳動物に投与する。したがって、本開示は、哺乳動物における認知障害を処置する方法であって、ＧＰＲ１５８を活性化するがＧＰＲＣ６Ａを活性化しない治療有効量の薬剤と薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を認知障害の処置を必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を含む。
【０２１７】
ＧＰＣＲ６Ａを活性化する薬剤は、オルニチン、リジン及びアルギニンを含み、上記アッセイにおける対照として使用することができる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、２００７、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０：７９８〜８０７）。
【０２１８】
本明細書に記載のスクリーニング又はアッセイ方法に使用される細胞としては、ＧＰＲ１５８を天然に発現する細胞及びＧＰＲ１５８を発現する（又は過剰発現する）ように遺伝子操作された細胞が挙げられる。
【０２１９】
本明細書では「薬剤」という用語は、任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機低分子、多糖、ポリヌクレオチド、脂質など又はそれらの混合物を含む。
【０２２０】
一般に、本明細書に記載のアッセイにおいては、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度で並行して、様々な濃度に対する応答差を得る。一般に、これらの濃度の一つは負の対照として役立ち、すなわち、ゼロ濃度又は検出レベル未満である。
【０２２１】
スクリーニング用薬剤は、多数の化学クラスを包含するが、一般に、有機分子、好ましくは、１００ダルトンを超え約２，５００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量の低分子有機化合物である。薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、一般に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基の少なくとも２個を含む。薬剤は、上記官能基の１個以上で置換された環状炭素若しくはヘテロ環状構造及び／又は芳香族若しくは多環芳香族構造を含むことが多い。薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体又は組合せを含めた生体分子の中でも見つけられる。特に好ましい生体分子はペプチドである。
【０２２２】
詳細に記録された薬理活性を有する高純度低分子有機リガンド及びペプチドのライブラリは、本明細書に記載のアッセイに使用される多数の供給源から入手可能である。一例は、１，８６６種の薬物様化合物（低分子、中間疎水性）を含むＮＣＩの多様なセットである。別のものは、多数の広範囲な柔軟な化合物を含む公知の生理活性体（４６７種の化合物）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＣＣＢ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌによって維持されている）のセットである。ＩＣＣＢライブラリの幾つかの他の例は、Ｃｈｅｍ  Ｂｒｉｄｇｅ  ＤｉｖｅｒＳｅｔ  Ｅ（１６，３２０種の化合物）、Ｂｉｏｎｅｔ  １（４，８００種の化合物）、ＣＥＲＥＰ（４，８００種の化合物）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  １（８，８００種の化合物）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ２（７０４種の化合物）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ（１４，３７９種の化合物）、Ｐｅａｋｄａｌｅ  １（２，８１６種の化合物）、Ｐｅａｋｄａｌｅ  ２（３５２種の化合物）、ＣｈｅｍＤｉｖ  Ｃｏｍｂｉｌａｂ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２８，８６４種の化合物）、Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  １（３５２種の化合物）、Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  ２（３２０種の化合物）、Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  ３（２５１種の化合物）、Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  ４（３３１種の化合物）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｍｉｃｒｏｆｏｒｍａｔ（５０，０００種の化合物）、Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ１（５，０５６種の化合物）である。別のＮＣＩコレクションは、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ、バージョン２（１，９００種の化合物）、Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ（８７９種の化合物）、Ｏｐｅｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  １（９０，０００種の化合物）、Ｏｐｅｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２（１０，２４０種の化合物）、Ｋｎｏｗｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ：ＮＩＮＤＳ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１，０４０種の化合物）、ＩＣＣＢ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  １（４８９種の化合物）、ＳｐｅｃＰｌｕｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（９６０種の化合物）、ＩＣＣＢ  Ｄｉｓｃｒｅｔｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓである。以下のＩＣＣＢ化合物をＩＣＣＢ、Ｈａｒｖａｒｄ及び他の共同研究施設の化学者から個々に収集した：ＩＣＣＢ１（１９０種の化合物）、ＩＣＣＢ２（３５２種の化合物）、ＩＣＣＢ３（３５２種の化合物）、ＩＣＣＢ４（３５２種の化合物）。天然物抽出物：ＮＣＩ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（３５２ウェル）、Ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ−ＮＣＩ  Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（１，４０８ウェル）、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  １（２００ウェル）、ＩＣＣＢ−ＩＣＧ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＤＯＳ）  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、ＤＤＳ１（ＤＯＳ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ）（９６００ウェル）。化合物ライブラリは、ＡｃｔｉＭｏｌ、Ａ���ｂａｎｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴｉｍＴｅｃなどの供給業者から入手することもできる。
【０２２３】
スクリーニングで特定された公知及び新規薬剤をアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向又はランダム化学修飾に更に供して、構造類似体を生成することができる。
【０２２４】
化合物をスクリーニング、設計又は修飾するときには、考慮すべき他の要因としては、リピンスキールールオブファイブ（５個以下の水素結合供与体（ＯＨ及びＮＨ基）、１０個以下の水素結合受容体（特にＮ及びＯ）、分子量５００ｇ／ｍｏｌ未満、分配係数ｌｏｇＰ５未満）、並びに薬学技術分野で認識され、分子をやや薬物様にする性質及び構造的特徴に関係するＶｅｂｅｒ基準が挙げられる。
【０２２５】
薬剤はタンパク質とすることができる。この状況における「タンパク質」とは、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は、天然アミノ酸及びペプチド結合、又は合成ペプチド模倣構造で構成することができる。したがって、「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、本明細書では、天然アミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本開示の目的ではアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」は、プロリン、ヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含む。側鎖は（Ｒ）又は（Ｓ）配置とすることができる。好ましい実施形態においては、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ配置である。非天然側鎖を使用する場合、非アミノ酸置換基を使用して、例えば、インビボ分解を防止又は遅延させることができる。
【０２２６】
薬剤は、天然タンパク質又は天然タンパク質の断片若しくは変異体とすることができる。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質細胞抽出物のランダム若しくは定方向消化物を使用することができる。このようにして、原核生物及び真核生物タンパク質のライブラリを、種々のタンパク質の一つに対するスクリーニングのために作製することができる。細菌、真菌、ウイルス及び哺乳動物タンパク質のライブラリを使用することができ、最後のものが好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０２２７】
薬剤は、約５〜約３０個のアミノ酸のペプチドとすることができ、約５〜約２０個のアミノ酸が好ましく、約７〜約１５個が特に好ましい。ペプチドは、上で概説したように天然タンパク質の消化物、ランダムペプチド、又は「偏った」ランダムペプチドとすることができる。「ランダム」又は文法上の相当語句は、本明細書では、それぞれランダムヌクレオチド及びアミノ酸から本質的になる各核酸及びペプチドを意味する。一般にこれらのランダムペプチド（又は以下で考察する核酸）は化学合成されるので、それらは任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置に取り込むことができる。合成プロセスは、無作為化されたタンパク質又は核酸を生成し、配列の長さにわたって可能な組合せのすべて又は大部分を形成することができ、したがって無作為化された薬剤生理活性タンパク質薬剤のライブラリを形成するように設計することができる。
【０２２８】
ライブラリは、完全に無作為化し、任意の位置における配列の選択性も定常性もなくすることができる。あるいは、ライブラリを偏ったものにすることができる。すなわち、配列内の幾つかの位置を一定にし、又は限定数の可能性から選択する。例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸残基を、例えば、架橋の場合、システインの生成に対する、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さい又は大きい）残基、ＳＨ３ドメインの場合プロリン、リン酸化部位などの場合セリン、スレオニン、チロシン若しくはヒスチジン、又はプリンなどの明確なクラス内で無作為化する。
【０２２９】
薬剤は、単離核酸又はオリゴヌクレオチドとすることができる。「核酸」若しくは「オリゴヌクレオチド」又は文法上の相当語句は、本明細書では、共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。こうした核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含むが、ある場合には、以下に概説するように、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９９３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５及びその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、１９７０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら、１９７７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら、１９８４、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；並びにＰａｕｗｅｌｓら、１９８６、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１）；ホスホロチオアート（Ｍａｇら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）；Ｏ−メチルホホロアミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら、１９９２、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７参照）を含む、交互の骨格を有し得る核酸類似体が含まれる。これら刊行物のすべては、参照により援用され、本明細書に記載の方法に使用される核酸薬剤を設計する際のガイダンスについて当業者が調べることができる。
【０２３０】
別の類似核酸としては、正の骨格（Ｄｅｎｐｃｙら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、１９９１、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  １３：１５９７；第２及び３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ及びＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、１９９４、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７）、並びに米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、並びに第６及び７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ及びＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編に記載のものを含めて、非リボース骨格を有するものが挙げられる。１個以上の炭素環式糖を含む核酸も、本明細書に記載の薬剤として使用することができる核酸の定義に含まれる。幾つかの核酸類似体が、Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎ．２、１９９７、３５ページに記載されている。これらの参考文献のすべてを参照により本明細書に明確に援用する。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾を実施して、標識などの追加の部分の付加を容易にし、又は生理的環境におけるこうした分子の安定性及び半減期を増大させることができる。さらに、天然の酸及び類似体の混合物を製造することができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、並びに天然の核酸及び類似体の混合物を製造することができる。核酸は、一本鎖若しくは二本鎖とすることができ、又は二本鎖若しくは一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ又はハイブリッドとすることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組合せ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン  ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含めた塩基の任意の組合せを含む。
【０２３１】
上述したように、一般にタンパク質の場合、核酸薬剤を、天然核酸、ランダム核酸又は「偏った」ランダム核酸とすることができる。例えば、原核生物又は真核生物ゲノムの消化物を、タンパク質について上で概説したように使用することができる。
【０２３２】
薬剤は、コンビナトリアル化合物ライブラリから得ることができ、多種多様なそれらを商業的に又は文献として利用することができる。「コンビナトリアル化合物ライブラリ」は、本明細書では、明確な又は無作為な様式で、一般に化学合成によって、生成された多様な化合物のコレクションを意味する。数百万の化合物をコンビナトリアル混合によって合成することができる。
【０２３３】
薬剤とＧＰＲ１５８又はＧＰＲＣ６Ａの結合の測定は、多数の例示的な方法で行うことができる。好ましい例示的一実施形態においては、薬剤が標識され、結合が直接測定される。例えば、これは、ＧＰＲ１５８又はＧＰＲＣ６Ａのすべて又は一部を固体支持体に付着させ、標識薬剤（例えば、放射性又は蛍光標識を含む薬剤）を添加し、過剰の試薬を洗い流し、標識が固体支持体上に存在するかどうか判定することによって行うことができる。種々のブロッキング及び洗浄ステップを、当該技術分野で知られるように利用することができる。
【０２３４】
「標識された」とは、本明細書では、検出可能なシグナルを与える標識、例えば、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉなど）、蛍光又は化学発光化合物（フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ルシフェリンなど）、酵素（アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、抗体、磁性粒子などの粒子、特異的結合分子などで薬剤が直接又は間接的に標識されることを意味する。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどの対が挙げられる。特異的結合メンバーの場合、相補的メンバーは、通常、上で概説したように、公知の手順に従って、検出のために用意された分子で標識される。標識は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に与えることができる。成分の一つのみを標識することができる。あるいは、１つを超える成分を異なる標識で標識することができる。
【０２３５】
ノックイン及びノックアウトマウスを含めたトランスジェニックマウス、並びに本明細書に開示される核酸（例えば、ＧＰＲ１５８又はＧＰＲＣ６Ａ用ｃＤＮＡ）を過剰又は過小発現するそれらからの単離細胞を、当該技術分野で既知の常法を用いて、作製することができる。ある場合には、生物に核酸遺伝子又はｍＲＮＡを過剰発現させるプロモーター及び調節エレメント（内在性又は異種）に作動可能に接続され、それらの制御下にある宿主生物のゲノムに核酸を挿入する。増幅すべき遺伝子を有する遺伝子導入ベクターに含まれる外因性／異種プロモーターの一例は、アルファ１（Ｉ）コラーゲンである。多数のこうしたプロモーターが当該技術分野で知られている。
【０２３６】
ＧＰＲ１５８又はＧＰＲＣ６Ａを過剰発現するトランスジェニックマウス及びマウス細胞、並びに遺伝子導入されたヒト細胞が、本明細書に開示される。ＧＰＲ１５８及び／又はＧＰＲＣ６Ａ並びに変異体の種々の組合せの一方又は両方の対立遺伝子の欠損した変異マウスも、本明細書に開示される。
【０２３７】
標的動物又は細胞のゲノムに挿入するためのＧＰＲ１５８又はＧＰＲＣ６ＡをコードするｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを有するベクターも、本明細書に開示される。こうしたベクターは、場合によっては、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに作動可能に結合したプロモーター及び調節エレメントを含むことができる。「作動可能に結合した」とは、プロモーター及び調節エレメントが、プロモーター及び調節エレメントの制御下でｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの発現を可能にするようにｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに連結されることを意味する。
【０２３８】
本開示を以下の実施例によって説明するが、実施例を限定的なものと解釈すべきではない。本願を通して引用するすべての参考文献、係属中の特許出願、及び公開された特許の内容を、参照により本明細書に明確に援用する。当業者は、本開示が多種多様な形態で実施され得るものであり、本明細書に記載の例示的実施形態に限定されると解釈すべきではないことを理解するであろう。むしろ、これらの例示的実施形態は、本開示が当業者に本開示を十分伝達するように提供される。本開示の多数の改変及び他の例示的実施形態が、上記記述で示された教示の恩恵を受ける本開示が関係する技術分野の熟練者に想起されるであろう。特殊な用語が使用されるが、それらは、別段の記載がない限り当該技術分野におけるものと同様に使用される。
【実施例】
【０２３９】
実施例１−材料及び方法
インビボ実験
オステオカルシン−／−、Ｇｐｒｃ６ａ−／−、オステオカルシン−ｍＣｈｅｒｒｙ、及びオステオカルシンｌｏｘＰ導入マウスについては既述されている（Ｄｕｃｙら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８〜４５２；Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６〜８０９）。マウス遺伝子型をＰＣＲによって決定した。すべての実験で、対照は、同腹仔雌性ＷＴ、Ｃｒｅ発現、又はフロックス／フロックスであった。誘導性欠損オステオカルシンモデルを除いて（混合背景：２５％Ｃ５７／ＢＬ６及び７５％１２９ｓｖ）、すべてのマウスを純粋な１２９−Ｓｖ遺伝的背景で維持した。誘導遺伝子欠損マウスの場合、タモキシフェンをトウモロコシ油中で調製し、１週間腹腔内（ＩＰ）注射した（１ｍｇ／２０ｇ体重）。妊娠中のマウスにオステオカルシンを送達するために、栓が存在するとすぐにＩＰ注射（２４０ｎｇ／日）を出産まで毎日行った（Ｅ０．５〜Ｅ１８．５）。成体オステオカルシン−／−又はｏｂ／ｏｂマウスにおけるオステオカルシン又はレプチン注入の場合、オステオカルシン（３００ｎｇ／ｈ）、レプチン（５０ｎｇ／ｈ）又はビヒクルを送達するポンプ（Ａｌｚｅｔマイクロ浸透圧ポンプ、モデル１００２）を、３か月齢マウスの背中の皮下に外科的に設置した。オステオカルシン−／−マウスにおける認知機能の出生後救出のために、オステオカルシン（１０ｎｇ／ｈ）又はビヒクルを、既報のように脳室下内に（ｉｎｔｒａｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）（ｉｃｖ）送達した（Ｄｕｃｙら、２０００、Ｃｅｌｌ  １００：１９７〜２０７）。血清及び組織のレプチン及びオステオカルシン含有量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２４０】
オステオカルシンの母体胎児間輸送を、マウス胎盤のエクスビボ二重潅流によってモニターした（Ｇｏｅｄｅｎ  ＆  Ｂｏｎｎｉｎ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：６６〜７４）。オステオカルシン（３００ｎｇ／ｍｌ）を、妊娠のＥ１４．５、Ｅ１５．５及びＥ１８．５においてＷＴマウスから得られた胎盤に子宮動脈を介して母体側に注射した（ｎ＝３独立潅流／年齢）。胎盤を通したオステオカルシン輸送を、臍静脈を通して得られた胎仔溶出物中に存在するオステオカルシンの濃度を測定することによって分析した。各時点（１〜９）は１０分の採取期間に対応する（５μｌ／ｍｉｎ）。採取時点（潅流の１０〜３０分）を、材料流体注入中に得た。時点４〜６（潅流の３０〜６０分）を、母体子宮動脈へのオステオカルシン注入中に得た。時点７〜９（それぞれ潅流の６０〜９０分）の場合、母体子宮動脈に母体体液のみを注入した。
【０２４１】
組織学
すべての解剖を、氷冷ＰＢＳ１×中でＬｅｉｃａ  ＭＺ８解剖光学顕微鏡の下で行った。脳幹を小脳から単離し、採取中に視床下部を中脳から取り出した。単離した脳のすべての部分を液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で維持した。
【０２４２】
成体及び胚の脳全体の免疫蛍光を、４％ＰＦＡで固定し、Ｃｒｙｏｍａｔｒｉｘ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋し、−８０℃で貯蔵した組織の２０μｍ冠状凍結切片で行った。切片を室温で乾燥し、４％ＰＦＡで後固定し、続いて０．１％Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤で透過処理した。ロバ血清で室温ブロッキングした後、切片を抗５−ＨＴ（Ｓｉｇｍａ）又は抗Ｎｅｕｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一緒に終夜４℃でインキュベーションした。抗５−ＨＴスライドを、ロバ抗ウサギｃｙ−３複合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒に更にインキュベーションした。スライドにＦｌｕｏｒｏｇｅｌ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を載せた。
【０２４３】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションでは、成体マウス脳の２０μＭ冠状及び矢状切片を凍結切断し、正に帯電した顕微鏡スライド上に収集した。凍結切片をＤＩＧ標識プローブと一緒に６９℃でインキュベーションし、続いてアルカリホスファターゼ複合抗ＤＩＧ抗体と一緒にインキュベーションし、ＮＢＴ／ＢＣＩＰと一緒にインキュベーションして現像した。
【０２４４】
脳モルフォロジーを可視化するクレシルバイオレット染色を、１：１クロロホルム：エタノールで脱脂した２０μｍ凍結切片をクレシルバイオレット酢酸塩（１ｇ／Ｌ）中で終夜インキュベーションすることによって行った。染色を、エタノール及びキシレンを用いて識別し、組織学用ＤＰＸ封入媒体（Ｓｉｇｍａ）を用いてマウントした。
【０２４５】
ＷＴ及びオステオカルシン−／−脳におけるアポトーシスを評価するために、ＡＰＯＰＴＡＧ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて製造者の手順に従って２０μｍ凍結切片を処理した。画像を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ４０００Ｂを用いて得た。Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して、細胞数及び染色強度を定量化した。
【０２４６】
結合アッセイ
８週齢マウスの脳をイソペンタン中で瞬間凍結し、２０ｍｍ厚切片を調製し、終夜４℃で減圧下で乾燥させた。翌日、切片を氷冷結合緩衝剤（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＢＳＡ）中で１５分間再水和し、ビオチン化オステオカルシン（３、３０、３００、３０００ｎｇ／ｍｌ）又は対照としてビオチン化組換えＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で１時間インキュベーションした。収集緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄後、試料を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗ビオチン抗体（１：１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒に終夜４℃でインキュベーションした。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ５０００Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて抗ヤギＩｇＧ  Ｃｙ−３と一緒にインキュベーションすることによってシグナルを可視化した。結合アッセイを各試験条件で隣接切片に対して行った。
【０２４７】
生化学及び分子生物学
ウエスタンブロット法のために、Ｅ１８．５胚由来の凍結海馬を溶解し、２５０μｌ組織溶解緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１０ｍｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０）中で均質化した。試料を遺伝子型によって３つ組でプールして、ばらつきを抑えた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳＴ−５％乳でブロックした後、ＴＢＳＴ−５％ＢＳＡ中で一次抗体と一緒に終夜インキュベーションした。ＨＲＰ結合二次抗体及びＥＣＬを使用して、シグナルを可視化した。
【０２４８】
遺伝子発現研究のために、ＲＮＡを初代ニューロン又は組織からＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。ｃＤＮＡ合成をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準手順に従って行い、ｑＰＣＲ分析をＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製特異的定量ＰＣＲプライマー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ＲＴ２ＰＣＲ．ｐｈｐ）を用いて行った。
【０２４９】
セロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン及びＧＡＢＡ含有量を、ＨＰＬＣによって既報のように測定した（Ｂａｃｈら、２０１１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１８：１０６７〜１０７４）。各遺伝子型の７〜１５匹のマウスの神経伝達物質含有量を、大脳皮質、線条体、海馬、視床下部、中脳、脳幹及び小脳において測定した。
【０２５０】
細胞生物学
後脳ニューロンの初代培養のために、Ｅ１４．５胚を１２９−ＳｖＷＴマウスの交配から得た。後脳を解剖し、解剖が完了するまで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで緩衝した氷冷フィルター滅菌ＨＢＳＳ中に収集し、その時点で２ｍｍ立方体に細断し、先端熱加工したパスツールピペットを用いてすりつぶして解離させ、４℃で遠心沈殿させた。次いで、ポリＤ−リジン被覆カバーガラス又は皿の上の、２％Ｂ２７、０．２５ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．２５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリンＧ（５０Ｕ／ｍｌ）及び硫酸ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に細胞をまいた。Ｌ−グルタミンを含まない半分の置換媒体を、３〜６日ごとに培養物に供給した。
【０２５１】
カルシウムイメージングのために、１２ｍｍカバーガラス上にまかれた原後脳ニューロンに、構造上のネットワークを適切な時間形成させた。これらの培養物をＦＩＢＳＳで洗浄し、２．５μＭ  ＦＵＲＡ−２、ＡＭカルシウム指示薬を４５分間室温で製造者の手順に従って添加した。次いで、細胞を洗浄して過剰の指示薬を除去し、３０分間インキュベーションして、内部移行したエステルを脱エステル化した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充した１×ＨＢＢＳの対照緩衝剤を用いてオステオカルシン３０ｎｇ／ｍｌを調製した。潅流システムを備えたＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて、カバーガラスを対照及びオステオカルシンでまず潅流した。各刺激後、細胞を５０ｍＭ  ＫＣｌで脱分極して、画像化された生細胞の割合を求めた。すべての処置をＰｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの二光子レーザー走査型顕微鏡法によって記録し、ＩｍａｇｅＪを用いたＺ軸プロファイルプロッティングによって分析した。
【０２５２】
脳外植片
脳を解剖し、氷冷酸素化人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中で３０分間インキュベーションした。次いで、脳をそれぞれ正中及び背側縫線核を含むように中脳ではブレグマから−１．５５〜−２．３５ｍｍ、脳幹のレベルではブレグマから−４．０４〜−４．４８ｍｍ及び−４．６０〜−５．２０ｍｍで５００μｍにスライスした。これらのスライスをＡＣＳＦ中で１時間インキュベーションし、４時間絶え間なく酸素化し（９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２）、その後、オステオカルシン（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで４時間処理した。Ｔｐｈ２、ＴＨ、ＧＡＤ１、ＧＡＤ２及びＤｄｃの発現をｑＰＣＲによって測定した。
【０２５３】
電気生理学
脳切片調製及び電気生理学的記録を、当該技術分野で既知の方法に従って行った。手短に述べると、ＷＴマウスをエーテルで麻酔し、次いで断頭した。脳を迅速に除去し、スクロース２２０、ＫＣｌ２．５、ＣａＣｌ２  １、ＭｇＣｌ２  ６、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５、ＮａＨＣＯ３  ２６及びグルコース１０（ｍＭ単位）を含みＮａＯＨでｐＨ７．３にした酸素化浴液に４０℃で浸漬した。背側縫線核（ＤＲ：ｄｏｒｓａｌ  ｒａｐｈｅ）を含む冠状スライス（３５０μｍ厚）をビブラトームで切断し、ＮａＣｌ  １２４、ＫＣｌ  ３、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  ２、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２３、ＮａＨＣＯ３  ２６、グルコース１０（ｍＭ単位）を含みＮａＯＨでｐＨ７．４にした人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（５％ＣＯ２及び９５％Ｏ２通気）と一緒に保持チャンバ内で維持し、少なくとも１時間回復後に浴液（３３０Ｃ）を２ｍｌ／ｍｉｎで絶え間なく潅流した記録チャンバに移した。ホールセル電流クランプを行って、ＤＲセロトニン作動性（５−ＨＴ）ニューロンにおける活動電位をＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＣＡ）を用いて観察した。先端抵抗４〜６ＭΩのパッチピペットを、Ｓｕｔｔｅｒピペットプラー（Ｐ−９７）を用いてホウケイ酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で作製し、Ｋ−グルコン酸（又はＣｓ−グルコン酸）１３５、ＭｇＣｌ２  ２、ＨＥＰＥＳ１０、ＥＧＴＡ１．１、Ｍｇ−ＡＴＰ２、Ｎａ２−クレアチンリン酸１０及びＮａ２−ＧＴＰ０．３（ｍＭ単位）を含みＫＯＨでｐＨ７．３にしたピペット溶液を充填した。ギガオーム（ＧΩ）シール及びホールセルアクセスが得られた後、直列抵抗（２０〜４０ＭΩ）を増幅器によって部分的に補償した。５−ＨＴニューロンをそれらの独特の性質によって同定した（長期活動電位、ノルエピネフリンによる活性化、及びセロトニン自体による阻害。電流クランプ下、５−ＨＴニューロンは、通常、ノルアドレナリン作動性入力がないので、スライスにおいて静止状態であった。α１−アドレナリン作動物質フェニレフリン（ＰＥ、３μＭ）の適用は活動電位を誘発し、セロトニンクレアチニン硫酸塩複合体（３μＭ）の適用はこれらのニューロンにおける活動電位を阻害した。５−ＨＴニューロンに対するレプチンの効果を、ＰＥとセロトニンの両方に応答するＤＲニューロンにおいて調べた。オステオカルシン適用前に、脳幹ニューロンにおける活動電位を浴中でＰＥの適用によって回復させた。全データを３〜１０ｋＨｚで採取し、Ａｐｐｌｅ  ＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータとＡｘｏｇｒａｐｈ４．９（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１〜３ｋＨｚでフィルターにかけた。電気生理学的データをＡｘｏｇｒａｐｈ４．９を用いて分析し、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ、Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ）を用いてプロットした。
【０２５４】
生理学的測定
歩行活動（ｘａｍｂ）及び全活動（ｘｔｏｔ）を含めた身体活動性を、既報のようにＯｘｙｍａｘシステムに接続された赤外線ビームを用いて測定した（Ｆｅｒｒｏｎら、２０１２、Ｂｏｎｅ５０：５６８〜５７５）。エネルギー消費測定値を、６チャンバＯｘｙｍａｘシステム（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｈｉｏ）を用いて得た。装置に３０時間馴化後、２４時間測定データを収集し、製造者によって推奨されたように分析した。入力酸素流と出力酸素流の差を取ることによって酸素消費を計算した。出力と入力の二酸化炭素流の差を取ることによって二酸化炭素生成を計算した。呼吸交換比（ＲＥＲ：ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒａｔｉｏ）は、二酸化炭素生成と酸素消費の比に対応した（ＲＥＲ＝ＶＣＯ２／ＶＯ２）。熱産生を、間接熱量測定によって流れの式を用いて計算した。
熱＝ＣＶ×ＶＯ２／ＢＷ
ＣＶ＝３．８１５＋１．２３２×ＲＥＲ
【０２５５】
行動学的研究
尾懸垂試験（ＴＳＴ：Ｔａｉｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）
尾懸垂試験を既報のように行った（Ｍａｙｏｒｇａら、２００１、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２９８：１１０１〜１１０７；Ｓｔｅｍら、１９８５、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８５：３６７〜３７０）。マウスを保持施設から試験室まで短距離輸送し、そこで少なくとも１時間静かに放置した。マウスを、接着テープを用いて（尾の先端からの距離は２ｃｍであった）尾によって個々に懸垂した（床までの距離は３５ｃｍであった）。一般に、マウスは、幾つかの逃避志向の行動を示し、その間の静止期間が次第に増加した。記録されたパラメータは、静止秒数であった。マウスの遺伝子型を知らない高度に訓練された観察者によってマウスを５分間点数化した。
【０２５６】
オープンフィールドパラダイム試験（ＯＦＴ）
マウスの不安及び自発運動活性（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をオープンフィールド試験によって測定した（Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３）。各動物を４３×４３ｃｍオープンフィールドチャンバに入れ、３０分間試験した。マウスを、各試験セッションを通してビデオトラッキングによってモニターし、Ｍａｔｌａｂソフトウェアを用いて分析した。マウスを、個々にオープンフィールド活動領域の中央に置き、自由に探索させた。全運動活性（ｍｏｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を移動総距離として定量化した。立ち上がり回数並びにオープンフィールドチャンバの中央対周辺で消費した時間及び距離（％単位）を測定して不安を定量化した。
【０２５７】
高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）
各マウスに装置を５分間探索させた。オープンアームへの進入回数を測定することによって全体的活性を評価した（Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３）。オープンアームで消費した時間を比較することによって不安を評価した。
【０２５８】
マウス強制水泳試験（ＦＳＴ：ｆｏｒｃｅｄ  ｓｗｉｍ  ｔｅｓｔ）
強制水泳試験を、Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３に記載の方法によって行った。手短に述べると、２３〜２５℃に維持した水位１０ｃｍのガラスシリンダ（高さ：２５ｃｍ、直径：１０ｃｍ）にマウスを個々に落とした。動物を合計６分間試験した。静止時間の総持続時間を記録した。マウスがその頭部を水の上に維持するのに必要な動きを除いて逃げようとしないときを静止とみなした。マウスをそれらの遺伝子型を知らない観察者によって点数化した。
【０２５９】
明暗試験
試験を静かな暗室で行った。マウスをそのホームケージからの少数の寝わら（ｂｅｄｄｉｎｇ）を含むケージに個々に収容し、試験前に少なくとも１時間部屋に馴化させた。未処置マウスを、個々に試験チャンバの暗い区画に置いた。試験を５分間続け、明るい区画における消費時間及び進入回数を、マウスの遺伝子型を知らない高度に訓練された観察者が記録した。
【０２６０】
モリス水迷路試験
空間記憶を、モリス水迷路（ＭＷＭ）装置（Ｍｏｒｒｉｓ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：６８１〜６８３）を用いてマウス用訓練手順（Ｄ’Ｈｏｏｇｅら、２００５、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６５３９〜６５４９）によって評価した。迷路は、直径１５０ｃｍであり、無毒の白色塗料で不透明にした水（２３℃）を含んだ。コンピュータ、テーブル、及び壁に貼られた幾何学図形を有するポスターを含めて、末端の視覚的な合図を有する明るく照らされた部屋にプールを配置した。空間学習を反復試行で評価する（試行４回／日で１０日間）。
【０２６１】
試行中、小さいプラットホーム（直径１０ｃｍ）を表面下の固定位置に隠した。マウスは、迷路の縁の水中に置かれ、そのホームケージに戻される前にプラットホームに到達しなければならなかった。プラットホームに２分以内に到達しなかったマウスを優しくプラットホーム方向にガイドし、そのケージに戻す前に１０秒間その上に放置した。こうした毎日の訓練試行を４回（試行間隔：５分）連続１０日行った。プール内の開始位置を４つの固定位置（０°、９０°、１８０°及び２７０°）で変え、各位置を使用した。プラットホームを見つける待ち時間は２回目の習得日に既に減少したので、１回目の習得日も報告する。
【０２６２】
実施例２−オステオカルシンは、血液脳関門を通過し、脳における特定のニューロンに結合する
オステオカルシン−／−マウスの消極性は、それらを扱った全研究者によって認められた自明の特徴である。この表現型を３か月齢オステオカルシン−／−雌性マウスにおいて定量化し、それによれば、明暗期中の自発運動活性及び歩行活動が野生型（ＷＴ）同腹仔に比べて有意に減少した（図１Ａ〜Ｃ）。この観察は雌性変異マウスで行ったので、それは、この表現型が性ステロイドホルモンの欠乏に続発したという可能性を排除するものである。というのは、オステオカルシンは、雌性マウスにおいてそれらの合成を調節しないからである（Ｏｕｒｙ）。同様に、オステオカルシン−／−マウスとＷＴマウスはトレッドミル装置で同じように走ったので、それは、筋機能の測定可能な欠陥に続発したものでもなかった。歩行運動（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）のこの減少は、唯一の公知のオステオカルシン受容体（図１Ａ〜Ｃ）でありオステオカルシンの代謝機能を媒介すると考えられる受容体であるｇｐｒｃ６ａを欠くマウスでは見られなかった。この後者の結果は、オステオカルシン−／−マウスの消極性がその代謝異常の結果ではあり得ないことを意味する。というのは、それらは、オステオカルシン−／−マウスとＧｐｒｃ６ａ−／−マウスにおいて同様に重度であるからである。
【０２６３】
この行動的表現型がどのように発生するかを理解するために、オステオカルシンが血液脳関門（ＢＢＢ：ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）を通過するかどうかを、３か月齢オステオカルシン−／−マウスにおいてビヒクル又は非カルボキシル化オステオカルシン（５０ｎｇ／ｈ）を皮下に送達するポンプを設置することによって試験した。この実験の正の対照は、３か月齢ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチン（５０ｎｇ／ｈ）の皮下注入であった。というのは、レプチンはＢＢＢを通過することが知られているからである（Ｂａｎｋｓら、１９９６、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７：３０５〜３１１）。７日後、オステオカルシン及びレプチン含有量を、それぞれオステオカルシン−／−及びｏｂ／ｏｂマウスにおける血液、骨、及び脳の様々な部分で測定した。ｏｂ／ｏｂマウスにおいては、レプチンは、それが結合する２つの構造体である脳幹及び視床下部で検出することができた（図３Ｂ）（Ｙａｄａｖら、２００９、Ｃｅｌｌ  １３８：９７６〜９８９、Ｆｒｉｅｄｍａｎら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：７６３〜７７０）。オステオカルシンは、オステオカルシン−／−マウスにおいて脳幹、視床及び視床下部に蓄積し、その濃度は血清中に認められたものの５０％に近かった（図３Ａ）。
【０２６４】
脳の別々の領域におけるこの蓄積は、オステオカルシンが脳において特定のニューロンに結合するかどうかという疑問を生じた。成体又は胚（Ｅ１８．５）ＷＴ脳の切片をビオチン化低カルボキシル化オステオカルシン又はＧＳＴ−ビオチン単独（３０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベーションし、続いて抗ビオチン抗体を用いて免疫蛍光分析することによって、これを試験した。このアッセイの条件では、オステオカルシンは、前脳、中脳及び脳幹の幾つかのニューロン集団に結合した（図３Ｃ）。中脳では、オステオカルシンは、腹側被蓋野及び中脳の底の正中線の近くに位置する２個の核である黒質に結合した（図３Ｃ）。脳幹では、オステオカルシンは、縫線核のニューロンに結合した（図３Ｃ）。中脳及び脳幹におけるオステオカルシン結合は、過剰の非標識オステオカルシンによって追い払われたが、過剰のＧＳＴによっては追い払われなかったので、特異的であった（図３Ｃ）。
【０２６５】
実施例３−オステオカルシンは、脳における種々の神経伝達物質の生合成に影響する
脳由来セロトニンが合成される縫線核のニューロンにオステオカルシンが特異的に結合することは、脳セロトニンが骨量増加に及ぼす影響と共に（Ｙａｄａｖら、２００９、Ｃｅｌｌ  １３８：９７６〜９８９；Ｏｕｒｙら、２０１０、Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２４：２３３０〜２３４２）、オステオカルシンが種々の神経伝達物質の合成に影響し、この調節の欠如がオステオカルシン−／−マウスの消極性を説明するという可能性を生じた。３か月齢ＷＴ及びオステオカルシン−／−マウスの脳の種々の領域におけるセロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びそれらの代謝産物の含有量を、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって測定した。セロトニン及びノルエピネフリン含有量は脳幹において有意に減少したが、ドーパミン含有量は、オステオカルシン−／−マウスの中脳、皮質及び線条体においてＷＴマウスに比べて著しく減少した（図１Ｄ、１Ｆ〜Ｇ）。注目すべきことに、オステオカルシン−／−マウスにおける神経伝達物質蓄積のこのパターンは、Ｔｐｈ２＋／−マウスで観察されたものに類似した。逆に、ＧＡＢＡ含有量は、オステオカルシン−／−マウスの脳において試験されたすべての領域で増加した（図１Ｅ）。これは、ＧＡＢＡ含有量が後脳でのみ増加したＴｐｈ２＋／−マウスで観察されたものとは異なる。神経伝達物質の含有量は、ＷＴ脳とＧｐｒｃ６ａ−／−脳では区別できなかった。
【０２６６】
これらの神経伝達物質の生合成に関係する律速酵素をコードする遺伝子の発現を研究した。脳内セロトニン合成における初期の律速酵素であるＴｐｈ２の発現は、オステオカルシンマウス−／−の脳幹において減少し、ドーパミン合成における律速酵素であるＴｈの発現は中脳において減少した（図１Ｈ）。芳香族Ｌ−アミノデカルボキシラーゼ（Ｄｄｃ）についても同じであった。逆に、ＧＡＢＡ生合成に必要な２種の酵素ＧＡＤ１及び２の発現は、オステオカルシン−／−マウスの脳幹で増加した。これらの遺伝子すべての発現は、Ｇｐｒｃ６ａ−／−及びＷＴマウスにおいても同様であり（図１Ｈ）、脳におけるＧｐｒｃ６ａに無関係な様式のオステオカルシンシグナルを更に示すものである。
【０２６７】
オステオカルシンによるＴｈ発現の正の調節の結果は、脳幹のノルエピネフリン含有量によって測定した交感神経系の緊張及び褐色脂肪におけるＵｃｐ１発現が、オステオカルシン−／−マウスにおいて有意に減少することである。これは、これらの変異マウスにおいて最初に注目された高い骨量を説明するものである（Ｄｕｃｙら、１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８〜４５２）。
【０２６８】
オステオカルシンがニューロンに直接作用して神経伝達物質合成を調節するかどうか判定するために、幾つかのタイプのアッセイを行った。第１に、ＷＴ及びＧｐｒｃ６ａ−／−マウス由来の脳幹及び中脳外植片を作製した。脳を、セロトニン産生ニューロンが濃縮されるように脳幹の正中及び背側縫線核のレベル（それぞれ−４．０４〜−４．４８ｍｍ及び−４．６０〜−５．２０ｍｍ）で、並びに中脳の黒質及び腹側被蓋野（ＶＴＡ）のレベル（それぞれ−１．５５〜−２．３５ｍｍ及び−２．５５〜−３．２５ｍｍ）でスライスした（５００μｍ）。これらの外植片におけるセロトニン作動性及びカテコールアミン作動性ニューロンの濃縮は、それらの高いＴｐｈ２及びＴｈ発現によって確認された。ここでは正の対照として使用されるレプチンは、当然ながら、ＷＴ又はＧｐｒｃ６ａ−／−脳幹外植片におけるＴｐｈ２発現を減少させたが、オステオカルシン（３ｎｇ／ｍｌ）は、ＷＴとＧｐｒｃ６ａ−／−の両方の外植片でこの遺伝子の発現を２．５倍に増加させた。（図３Ｄ）。さらに、オステオカルシンは、中脳外植片におけるＴｈ発現を増加させ、ＷＴとＧｐｒｃ６ａ−／−の両方の後脳外植片におけるＧａｄ１発現を減少させた（図３Ｄ）。第２に、培養ＷＴ及びＧｐｒｃ６ａ−／−マウス原後脳ニューロン（ＭＰＨＮ）を、オステオカルシン（３ｎｇ／ｍｌ）で処置した。２又は４時間のオステオカルシン処置後、Ｔｐｈ２発現は３倍を超えて増加し、ＧＡＤ１発現はＷＴとＧｐｒｃ６ａ−／−初代脳幹ニューロン培養物の両方で６５％減少した（図３Ｅ）。第３に、オステオカルシンが後脳のニューロンにおいてシグナルを送ることを更に確認するために、低カルボキシル化又はカルボキシル化オステオカルシンで処置したＭＰＨＮにおけるカルシウム流入（図３Ｆ）を測定した。カルボキシル化オステオカルシンではなく低カルボキシル化オステオカルシンが、これらのニューロンにおけるカルシウム流入の変化を誘導した。最後に、電気生理学的分析によれば、ホールセル電流クランプ記録から、オステオカルシンは、脳幹ニューロンの活動電位頻度を活性化するが、青斑核のニューロンにおけるそれを減少させることが示された（図３Ｇ）。さらに、オステオカルシンは、後脳のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの活動電位頻度を阻害する（図３Ｈ）。
【０２６９】
総合すると、これら４つの異なるアッセイの結果は、オステオカルシンが、Ｇｐｒｃ６ａに無関係な様式で、縫線核のニューロンに結合するだけでなく、直接作用もして、Ｔｐｈ２発現、セロトニン蓄積、Ｔｈ発現及びノルエピネフリン含有量を増加させ、ＧＡＢＡ合成を阻害するという考えを支持する。オステオカルシンは、さらに、中脳のニューロンにおいてシグナルを送り、その領域におけるＴｈ発現及びドーパミン蓄積を促進する。したがって、フィードバック様式で、骨は、骨量の制御因子であるセロトニン作動性ニューロンにオステオカルシンを介してシグナルを送る。オステオカルシンによるＴｈ発現の調節の結果は、交感神経系の緊張がオステオカルシン−／−マウスにおいて低いという、これらの変異マウスにおいて最初に注目された高い骨量を説明する特徴である（Ｄｕｃｙら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８〜４５２）。
【０２７０】
実施例４−オステオカルシンは幾つかのタイプの行動に影響する
オステオカルシンによるセロトニン及びドーパミンの調節の意味は、オステオカルシン−／−マウスが、その低い交感神経系の緊張と一緒に、その消極性を説明し得る広範な認知障害を示すはずであるということである。これが事実かどうか試験するために、オステオカルシン−／−、オステオカルシン＋／−、Ｅｓｐ−／−及びＧｐｒｃ６ａ−／−マウスを一連の行動試験に供した。これらの実験の対照として、オステオカルシン−／−マウスで認められたものに類似したセロトニン及びドーパミン含有量の減少を示したＷＴ同腹仔及びＴｐｈ２＋／−マウスを使用した。
【０２７１】
不安様行動を３つのコンフリクトベースの試験によって分析した。第１に、暗／明移行試験（ＤＬＴ）は、明るく照らされた領域に対する齧歯類の生得の嫌悪及び光を回避するそれらの自発的探索行動に基づく（Ｃｒａｗｌｅｙら、１９８５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｂｅｈａｖｏｒｉａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９：３７〜４４；Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３）。試験装置は、暗い安全な区画及び照射された嫌悪の区画からなる。マウスを各々６分間試験し、３つのパラメータを記録する：（ｉ）点灯区画進入待ち時間、（ｉｉ）点灯区画消費時間及び（ｉｉｉ）区画間移動回数。オステオカルシン−／−マウスにおいては、不安関連行動の２つの指標である、点灯区画進入待ち時間が増加し、点灯区画消費時間が減少した。不安関連行動及び運動−探索活動の別の指標である区画間移動回数も減少した（図２Ａ〜Ｂ）。逆に、Ｅｓｐ−／−マウスではその逆であった。開放空間に対する齧歯類の嫌悪を利用した高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験（Ｌｉｒａら、２００３、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５４：９６０〜９７１；Ｈｏｌｍｅｓら、２０００、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７１：５０９〜５１６）も使用した。ＥＰＭは、２つのオープンアーム及び２つの閉鎖アームで構成され、各々床から６０ｃｍの高さのオープンルーフを有する。試験を明るい周辺光条件で行う。動物を１つの閉鎖アームに面した中心領域の上に置き、ＥＰＭを５分間探索させる。オープンアームにおける総アーム進入回数及び消費時間は、一般的活動性の尺度となる。消費時間の割合及びオープンアーム進入回数の減少は、不安の増加を示す。これはまさにオステオカルシン−／−マウスで見られたものであり、Ｅｓｐ−／−マウスはＷＴ同腹仔よりも不安様行動が少なく、探索動因が大きかった（図２Ｃ〜Ｄ）。最後に、新規環境が不安及び探索を惹起するオープンフィールドパラダイム試験（ＯＦＴ）を使用した（Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３；Ｓａｈａｙら、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：４６６〜４７０）。動物をオープンフィールドボックスの中央に置き、普通光条件下で３０分間ビデオトラッキングする。オステオカルシン−／−マウスは、移動距離、中央での消費時間、及び上下活動がＷＴ同腹仔に比べて極端に減少し、すべての特徴が不安の増加を示している（図２Ｅ〜Ｆ）。
【０２７２】
不安はしばしば抑欝を伴う。これを尾懸垂試験（ＴＳＴ）によって評価した。試験では、動物をその尾によって懸垂する短期の不可避のストレスに供し、動物は静止姿勢を取ることによってそれに応答する（Ｃｒｙａｎら、２００５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｅｈａｖｏｒｉａｌ  Ｒｅｖ．２０：５７１〜６２５；Ｃｒｏｗｌｅｙら、２００６；Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２９：５７１〜５７６；Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３）。この試験においては、マウスが静止している時間が長いほど、より抑圧されている。これは、オステオカルシン−／−マウスにおいて認められたものである（図２Ｇ〜Ｈ）。強制水泳試験（ＦＳＴ）においては、マウスを２回の試行に供し、その間に逃避不可能な水が充填されたガラスシリンダ中で強制的に泳がせる。第１の試行は１５分間続く。２４時間後、６分間の第２の試行をする。次第に、マウスは、その逃避する試みを止め、消極的に浮遊し、抑欝様状態を示す。他の行動試験と一致して、オステオカルシン−／−マウスは、ＷＴマウスよりも４５％長い時間浮遊した（図２Ｉ〜Ｊ）。
【０２７３】
記憶及び空間学習行動を評価するために、オステオカルシン−／−及びオステオカルシン＋／−マウスをモリス水迷路（ＭＷＭＴ）タスクに供した。この試験は、距離手掛かりを学習し、オープン水泳活動領域の周辺を進んで、水没プラットホームの場所を突き止めて、水から脱出するマウスの能力に依存する。空間学習を反復試行で評価する（試行４回／日で１２日間）。オステオカルシン＋／−及びオステオカルシン−／−マウスは、それぞれ、学習の遅延及び学習の完全な無能を示した（図２Ｋ〜Ｌ）。
【０２７４】
神経伝達物質含有量及び脳における遺伝子発現で記述したように、Ｇｐｒｃ６ａ−／−マウスはこれらの試験すべてでＷＴ同腹仔と区別がつかなかった。まとめると、これらの試験は、オステオカルシンが不安及び抑欝を防止し、探索行動、記憶及び学習を高めることを示している。
【０２７５】
実施例５−オステオカルシンの投与は認知欠陥を修正する
オステオカルシンがニューロンにおいてシグナルを送るこの能力の薬理学的関連性は、ＷＴ及びオステオカルシン−／−マウスにおいて非カルボキシル化オステオカルシンを脳室内（ＩＣＶ）注入（１０ｎｇ／ｈ）によって送達することによって確立された。カニューレの局在化は、これらのポンプを通してメチレンブルーを投与することによって確認された。染料はすべての脳室を標識し、オステオカルシンが恐らく脳全体に拡散していることを示した。さらに、注入されたオステオカルシン−／−マウスの血中のオステオカルシンの測定によれば、中央に送達されたホルモンの全身循環への漏出はなかったことが示された。この１週間にわたる非カルボキシル化オステオカルシンでの処置は、オステオカルシン−／−マウスで認められた不安及び抑欝の特徴を修正した（図４Ａ〜Ｅ）。まとめると、本明細書に記載の結果は、オステオカルシンが脳において直接作用することによってマウスにおける不安及び抑欝を防止することを示している。
【０２７６】
実施例６−オステオカルシンは出生後の認知機能を調節する
上記結果は、以下の２つの疑問を生じた。これらの機能を説明することができる脳におけるオステオカルシンの隠れた発現は存在するのか？及び、存在しなければ、認知機能に対するオステオカルシンの影響は出生後に生じるのか？
【０２７７】
定量ＰＣＲによる試験でも、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる試験でも、オステオカルシン−／−脳において見られたものを超えるＷＴ成体マウスの脳におけるオステオカルシンの発現（図５Ａ〜Ｂ）は検出されなかった。さらに、ｍ−Ｃｈｅｒｒｙ遺伝子がオステオカルシン遺伝子座に組み込まれたマウスモデルを用いると、ｍ−Ｃｈｅｒｒｙ発現が骨では見られたが、脳では見られなかった（図５Ｃ）。これらの結果を考慮して、オステオカルシンの骨芽細胞特異的及び誘導性欠損は、オステオカルシンのｌｏｘＰ導入対立遺伝子を有するマウスをＣｒｅｅｒｔ２を発現するマウスとマウスＣｏｌ１ａ１遺伝子の骨芽細胞特異的調節エレメントの制御下で交配して、骨芽細胞におけるオステオカルシンのみを除去することによって行った（オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウス）。オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスがタモキシフェン（１ｍｇ／ｇＢＷ  ５日間毎日）処置後にオステオカルシン循環レベルの著しい減少を示したことで、オステオカルシン遺伝子が効率的に不活性化されたことが確認された。
【０２７８】
オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスを、６週目にタモキシフェン（１ｍｇ／２０ｇ体重）を１週間毎日注射して処置した。オステオカルシンの安定な欠損を確実にするために、マウスにタモキシフェンをもう１回３週間ごとに再注射した。６週間後、α１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２、オステオカルシンフロックス／フロックス、及びオステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスを、次いで行動分析に供した。タモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスは、不安様及び抑欝様行動がα１（Ｉ）コラーゲン−Ｃｒｅｅｒｔ２又はオステオカルシンフロックス／フロックスマウスに比べて有意に増加した（図５Ｄ〜Ｉ）。空間学習及び記憶もタモキシフェン処置オステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスにおいて影響を受けたが、オステオカルシンの恒常的な欠損を有するマウスよりも軽度であった（図５Ｊ）。分子レベルでは、タモキシフェンで処置されたオステオカルシンｏｓｂｅｒｔ２−／−マウスの脳幹及び中脳でそれぞれＴｐｈ２及びＴｈ発現が減少し、それらの脳幹においてＧａｄ１及びＧａｄ２発現が増加した（図５Ｋ）。これらの実験の示すところによれば、不安及び抑欝様行動のオステオカルシン調節は出生後に生じ、一方、空間学習及び記憶は出生後にオステオカルシンによって部分的にしか影響されないように思われた。
【０２７９】
実施例７−母体オステオカルシンは胎盤を通過する
オステオカルシンは、ＷＴ胚の血清においてＥ１４．５の早期に測定することができる（図６Ａ）。Ｅ１３．５〜Ｅ１８．５の間の発達中にｑＰＣＲ又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるオステオカルシン発現の研究は、発生中の骨格を除いて、胚のどこにもオステオカルシンの発現を検出することができなかった（図６Ｂ）。同様に、ｍ−Ｃｈｅｒｒｙレポーター遺伝子がオステオカルシン遺伝子座に組み込まれたマウスモデルにおいては、ｍ−Ｃｈｅｒｒｙが発生中の骨格において発現されたが、Ｅ１３．５〜Ｅ１８．５の発生中の脳においては発現されなかった。オステオカルシン発現は、胎盤においてはこれらの発生段階のいずれでも検出されなかった。したがって、発生中には、出生後と同様に、オステオカルシンは骨特異的遺伝子である。この調査の最も重要な結果はオステオカルシン発現が発生中の骨格においてＥ１６．５まで検出できなかったことであるが、２日後には、タンパク質が胚の血中で検出可能である（図６Ａ〜Ｂ）。この観察は、母体由来のオステオカルシンが胎仔血流に到達し得ることを示唆している。
【０２８０】
胎仔の脳の発達に対する母体オステオカルシンのどの影響にもこのホルモンが胎盤を通過する必要がある。これは、マウス胎盤を通過する物質の輸送をモニターするエクスビボ二重潅流システムを通して調べられた（Ｂｏｎｎｉｎら、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：３４７〜３５０；Ｇｏｅｄｅｎ及びＢｏｎｎｉｎ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：６６〜７４）。この分析によれば、オステオカルシンは、オステオカルシン発現を胚で検出することができない発生段階である妊娠期間の１４．５日目に胎盤を通過し始めることが明らかになった。胎仔循環への母体オステオカルシンのより多量の経胎盤移行が妊娠期間の１５．５又は１８．５日目に観察された（図６Ｃ）。
【０２８１】
胎盤を通過するオステオカルシンの能力を考慮して、種々の遺伝子型及び起源の胚におけるその循環レベルを測定した。オステオカルシンが、オステオカルシン＋／−母によって保有されるＥ１８．５オステオカルシン−／−胚の血清中で検出可能であった（３．６ｎｇ／ｍｌ）ことで（図６Ｄ）、インビボの母体オステオカルシンが胎盤を通過することが確認された。Ｅ１８．５においてでも、ＷＴ胚のオステオカルシン循環レベルは、ＷＴ母によって保有されたときには２７．９ｎｇ／ｍｌであったが、それらの母がオステオカルシン＋／−であったときにはわずか７．４ｎｇ／ｍｌであった。Ｅ１６．５胚においては、ＷＴ母によって保有されるＷＴ胚の血清中のオステオカルシンは６．９ｎｇ／ｍｌであったが、オステオカルシン＋／−母によって保有されるＷＴ又はオステオカルシン＋／−胚の血清中でこのホルモンは検出できなかった（図６Ｄ）。オステオカルシンは、オステオカルシン＋／−母によって保有されるオステオカルシン−／−胚においても胚期において検出できなかった（図６Ｄ）。これらの結果の示すところによれば、母体由来のオステオカルシンは、Ｅ１６．５及びＥ１８．５胚の血清中に見られるこのホルモンのプールに有意に寄与する。
【０２８２】
実施例８−母体オステオカルシンは脳の発達に影響する
胎仔の脳の発達に対する母体オステオカルシンの影響を評価するために、ＷＴ、オステオカルシン＋／−又はオステオカルシン−／−母由来のＷＴ、オステオカルシン＋／−及びオステオカルシン−／−胚の組織学的解析を行った。
【０２８３】
母の遺伝子型にかかわらず、Ｅ１６．５におけるＷＴ胚とオステオカルシン−／−胚の脳重量と体重の比に差はなかった（図６Ｅ）。それに対して、この比は、オステオカルシン−／−母由来のＥ１８．５オステオカルシン−／−胚においてオステオカルシン＋／−母によって保有されるオステオカルシン−／−胚又はＷＴ母によって保有されるＷＴ胚に比べて有意に減少した（図６Ｅ）。これらの観察と一致して、組織学的切片のクレシルバイオレット染色は、オステオカルシン＋／−母由来のものに比べてオステオカルシン−／−母由来のＥ１８．５オステオカルシン−／−胚の脳における脳室の増大を示した（図６Ｆ）。トンネルアッセイによって測定すると、オステオカルシン＋／−母由来のオステオカルシン＋／−胚又はＷＴ母由来のＷＴ胚よりも、オステオカルシン−／−母由来のＥ１８．５オステオカルシン−／−胚の海馬におけるアポトーシス細胞が有意に増えた（図６Ｇ）。ＮｅｕＮ免疫蛍光研究によれば、Ｅ１８．５胚の海馬におけるニューロンは、それらの遺伝子型にかかわらず、オステオカルシン−／−母によって保有される場合、オステオカルシン＋／−母によって保有される胚よりも減少したことが確認された（図６Ｈ）。オステオカルシン−／−母から生まれた成体オステオカルシン−／−マウスの海馬における歯状回の分子層もオステオカルシン＋／−母から生まれたものに比べて薄かった。総合すると、これらの観察の示すところによれば、母体オステオカルシンは、胚マウス脳の適切な発達に必要である。
【０２８４】
実施例９−母体オステオカルシンは成体子孫における空間記憶及び学習を促進する
胎仔の脳の発達に対する母体由来のオステオカルシンの影響は、オステオカルシンが子孫において晩年に認知機能に対して何らかの影響を有するかどうかという疑問を生じた。この疑問に取り組むために、オステオカルシン−／−又はオステオカルシン＋／−母から生まれた３か月齢オステオカルシン−／−マウスを行動試験に供した。不安及び抑欝様表現型は、それらの母の遺伝子型にかかわらずオステオカルシン−／−マウスにおいて同様に重大であったが、学習及び記憶の欠陥は、オステオカルシン−／−母から生まれたオステオカルシン−／−マウスがオステオカルシン＋／−母から生まれたものよりも有意に重度であった（図７Ａ〜Ｆ）。この結果の示すところによれば、母体オステオカルシンは、成体子孫において空間学習及び記憶の習得に必要である。
【０２８５】
成体子孫における空間学習及び記憶の習得に対する母体オステオカルシンの重要性を更に評価するために、妊娠中のオステオカルシン−／−母Ｅ０．５〜Ｅ１８．５をオステオカルシン（２４０ｎｇ／日）の注射で１日１回処置した。これらの雌又はそれらの子には出産後にオステオカルシンを注射しなかった。この妊娠中のみの処置は、オステオカルシン−／−マウスの不安又は抑欝表現型に対していかなる有益な効果をも持たなかったが、それらの学習及び記憶の欠陥の２／３以上を救い、この表現型が大いに発生学的起源であることを示した（図７Ａ〜Ｇ）。この観察と一致して、組織学的切片のクレシルバイオレット染色は、妊娠中のオステオカルシン−／−母の注射後にＥ１８．５オステオカルシン−／−胚の脳における脳室増大の救済を示した（図７Ｈ）。同様に、注射されなかったオステオカルシン−／−母由来のオステオカルシン−／−胚に比べて、アポトーシス細胞数が減少し、ＮｅｕＮ陽性細胞数が増加した（図７Ｉ〜Ｊ）。この染色は、オステオカルシン−／−母由来の成体オステオカルシン−／−における海馬のＣＡ３及びＣＡ４領域において厚さ欠陥の救済も示した（図７Ｈ）。最後に、ウエスタンブロット分析によれば、注射されたオステオカルシン−／−母由来のオステオカルシン−／−Ｅ１８．５胚の海馬におけるカスパーゼ−３切断タンパク質レベルが、注射されなかったオステオカルシン−／−母由来のものよりも減少したことが示された（図７Ｋ）。
【０２８６】
実施例１０−組換えオステオカルシン
組換えオステオカルシンを標準手順に従って細菌によって産生し、グルタチオンビーズを用いて精製した。次いで、オステオカルシンをトロンビン消化によってＧＳＴサブユニットから切断した。トロンビン混入を、アフィニティカラムを用いて除去した。生成物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定性的に評価した。細菌は、ガンマカルボキシラーゼ遺伝子を持たない。したがって、細菌中で産生される組換えオステオカルシンは、３つの部位すべてが常に完全に低カルボキシル化されている。
【０２８７】
実施例１１−脳へのオステオカルシンの直接送達は野生型（ＷＴ）成体マウスにおける認知機能を用量依存的に改善する
オステオカルシンが成体マウスにおける認知機能の改善に十分であるかどうかを判定するために、ビヒクル（ＰＢＳ）又は３、１０若しくは３０ｎｇ／ｈ組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを１か月間送達するＩＣＶポンプをＷＴ２か月齢マウスに移植した。１か月の注入後、動物を行動試験に供した。暗から明への移行（Ｄ／ＬＴ）試験及び高架式十字迷路（ＥＰＭＴ）試験におけるそれらの能力に基づいて、３又は１０ｎｇ／ｈの組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを受けた動物は、不安様行動が減少した。この改善は、それぞれＤ／ＬＴ及びＥＭＰ試験における点灯区画及びオープンアームの探索の増加によって証明された（図８Ａ〜Ｂ）。
【０２８８】
実施例１２−高齢野生型（ＷＴ）マウスの脳へのオステオカルシンの直接送達は海馬機能を改善する
（１０ｎｇ／ｈ）組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを送達するＩＣＶポンプを、１６か月齢ＷＴマウスに移植した。１か月の注入期間後、マウスを改変バージョンの新規目標物認識試験に供して、記憶及び海馬機能をアッセイした。手短に述べると、マウスを、２個の目標物を含む新規活動領域に曝露間で３分間の休止間隔を置いて５分間５回曝露した。曝露１〜４の間、マウスは、等量の探索を誘発したこれら２個の目標物に馴化した。５回目の曝露では、目標物の一つを新規目標物で置換した。ＰＢＳ又は組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを受けた高齢マウスはどちらも、新規目標物と定常目標物を識別することができた。しかし、図９によれば、オステオカルシン処置を受けたマウスは、ビヒクル単独で処置したマウスよりも新規目標物探索時間が短く、海馬の状況エンコーディング効率及び／又は習得効率の改善が示された（Ｄｅｎｎｙら、２０１２、Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ２２：１１８８〜１２０１）。
【０２８９】
実施例１３−オステオカルシンは海馬におけるＣＲＥＢリン酸化に必要十分である
動物行動に対する直接組換え非カルボキシル化オステオカルシン送達の得られた効果は、脳におけるオステオカルシンの分子作用機序の疑問を生じる。オステオカルシンが別の組織、例えば、膵臓及び精巣においてＧタンパク質共役受容体経路を介して作用することを考慮して、Ｏｃｎ−／−及びＷＴ動物の海馬におけるリン酸化ＣＲＥＢレベルを調べた。ｐＣＲＥＢ染色がＯｃｎ−／−動物における海馬の歯状回（ＤＧ）において劇的に減少することが認められた（図１０Ａ）。海馬は、齧歯類における最適な空間学習及び記憶に不可欠である。次いで、ＷＴ動物の海馬に組換え非カルボキシル化オステオカルシン１０ｎｇを直接急性定位注射することがｐＣＲＥＢレベルに影響するかどうか問われた。注射後１６時間では、ｐＣＲＥＢ染色は、オステオカルシンを注射した半球において、同じ動物においてＰＢＳを注射したものより増加した（図１０Ｂ）。さらに、ＣＲＥＢ活性化をもたらすことが知られているＰＫＡ染色の広範な劇的な増加が、注射した半球において注射後１６時間で認められた（図１０Ｃ）。
【０２９０】
これらの急性注射とＣＲＥＢ経路の対応する活性化が機能上関連するかどうか判定するために、長期記憶を評価する海馬依存性タスクである文脈的恐怖条件づけ（ＣＦＣ）を行った。マウスの両方の半球にＰＢＳ又は１０ｎｇの組換え非カルボキシル化オステオカルシンを急性注射した。オステオカルシンを注射したマウス（１群当たりｎ＝４）はすくみ行動が対照に比べて増加し（図１１）、わずか１回のオステオカルシンが長期記憶の想起を改善したことを示している。
【０２９１】
実施例１４−ＧＰＲ１５８は脳オステオカルシン受容体である
材料及び方法
動物及び試料サイズ
Ｇｐｒ１５８−／−（Ｇｐｒ１５８ｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇ）マウスをＫＯＭＰリポジトリ（ＶＧ１０１０８）から購入した。化合物ヘテロ接合マウス（Ｇｐｒ１５８＋／−、Ｏｃｎ＋／−及びＧｐｒ１５８＋／−；Ｏｃｎ＋／−）を１２９−Ｓｖ／Ｃ５７／ＢＬ６混合遺伝的背景で維持した。Ｏｃｎ−／−、Ｏｃｎ＋／−及びＲｕｎｘ２＋／−については既述されている（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８〜４５２；Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：７４７〜７５４。Ｒｕｎｘ２＋／−をＣ５７／ＢＬ６背景で維持した。すべての実験で、同腹仔を対照として用いた。別段の記載がない限り、雌をすべての実験に使用した。定位手術をＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの貯蔵物から得られた３か月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスで行った。浸透圧ポンプ、血漿注射及びアレンドロナート注射実験をＴａｃｏｎｉｃ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られた１２か月、１６か月及び３か月齢１２９−Ｓｖマウスで行った。到着後、マウスをケージ（ポリカーボネートケージ（３５．５×１８×１２．５ｃｍ））１個当たり５匹の動物で１２時間明／暗サイクル下で少なくとも２週間収容し、実験前に食物及び水を自由に摂らせた。動物を含むすべての実験がＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒによって認可された。
【０２９２】
血漿採取
プールされたマウス血漿は、若年（３か月）ＷＴ又はＯｃｎ−／−又は高齢（１６か月）マウスから安楽死のときに心臓内採血によって収集された。Ｃａｐｉｊｅｃｔ  Ｔ−ＭＱＫチューブにＥＤＴＡと一緒に収集された血液から、続いて１，０００ｇで１０分間の遠心分離によって血漿を調製した。すべての血漿アリコートを使用まで−８０℃で貯蔵した。投与前に、血漿を３．５ｋＤａ  Ｄ−チューブ透析機（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳで透析して、ＥＤＴＡを除去した。若年成体マウスを８回の尾静脈注射によって２４日間血漿（１００μｌ／注射）で全身的に処置した。
【０２９３】
定位手術
マウスを２０ｍｇ／ｍｌＢＷケタミン塩酸塩（１０００Ｖｉｒｂａｃ）及び１００ｍｇ／ｍｌＢＷキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ２％、バイエル）の腹腔内注射で麻酔し、定位フレーム（９００ＳＬ−ＫＯＰＦ）に置いた。眼軟膏を角膜に塗布して、手術中の乾燥を防止した。切開周りの領域を切り取り、Ｖｅｔｅｄｉｎｅ溶液（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ）を塗布した。ｐＧＦＰ−Ｃ−ｓｈＬｅｎｔｉＶｅｃｔｏｒ中のＧｐｒ１５８を標的にしたｓｈＲＮＡ又は効力のないスクランブルｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを、海馬前部の両側に以下の座標で注射した：（ブレグマから）前側＝−２．０ｍｍ、側方＝＋／−１．４ｍｍ及び高さ＝−１．３３ｍｍ。座標を、定位座標におけるマウス脳を用いて決定した（Ｐａｘｉｎｏｓ及びＦｒａｎｋｌｉｎ、２００８）。２週間後、オステオカルシン（１０ｎｇ）又はＮａＣｌを、同じ座標を用いて注射した。レンチウイルス又はオステオカルシンを、１０μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（１７０１ＲＮ）を用いてそれぞれ１２又は４分間（注射速度：０．２５μｌ／ｍｉｎ）定位的に注射した。注射トラックに沿った逆流を制限するために、針を各１μｌの間ｉｎ  ｓｉｔｕで４分間維持した。次いで、皮膚を絹縫合糸で閉じ、マウスに外科的鎮痛薬（ケトプロフェン）を局所注射した。
【０２９４】
薬物処置
血漿注射実験では、血漿１００μｌを２４日間で８回尾静脈を介して注射した。記述された各群を各パネルにおいて個々に表す。ＷＴマウスにおけるオステオカルシン送達では、オステオカルシン（１２か月齢マウスでは３０ｎｇ／ｈ及び１６か月齢マウスでは９０ｎｇ／ｈ）又はビヒクルを送達するポンプ（Ａｌｚｅｔマイクロ浸透圧ポンプ、モデル１００２）をマウスの背中の皮下に外科的に設置した。３か月齢マウスへのアレンドロナート送達では、腹腔内注射（４０μｇ／ｋｇ）を週２回６週間行った。最後の４週間の処置中及び行動試験中、アレンドロナート処置マウスの半分は、６０ｎｇ／ｈオステオカルシンを浸透圧ポンプによって受けた。ビヒクルを受けた対照マウス又はアレンドロナートを受けたマウスに、ビヒクルのみを送達する浸透圧ポンプを移植した。
【０２９５】
ｐＧＦＰ−Ｃ−ｓｈＬｅｎｔｉＶｅｃｔｏｒ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＵＳＡ）にクローン化されたＧｐｒ１５８に対するｓｈＲＮＡ（力価：３，４’１０９ＧＣ／ｍｌ）又はスクランブルｓｈＲＮＡ（１，４’１０９ＧＣ／ｍｌ）を発現するレンチウイルス３μｌを用いて、海馬前部における両側定位注射（ブレグマからの以下の座標を用いた：Ｘ＝−２．０ｍｍ、Ｙ＝＋／−１．４ｍｍ及びＺ＝−１．３３ｍｍ）を行った。２週間後、オステオカルシン（１０ｎｇ／μｌ）又はＮａＣｌ（体積１μｌ）の局所両側定位注射を、海馬前部において行った（前述の同じ座標を用いた）。次に、マウスをオステオカルシンの定位注射の１２時間後に訓練期（ＮＯＲ及びＣＦＣ）に供し、馴化期の２４時間後に試験期に供した。
【０２９６】
行動学的研究
同じバッチの動物はすべて２週間の間隔内に生まれ、同じケージに５匹の雌の１群当たり混合遺伝子型で、標準研究室条件（１２時間暗／明サイクル、一定室温及び湿度、並びに標準研究室食事及び水を自由に）で維持された。各試験では、マウスを保持マウス施設から試験室までそれらのホームケージ又はそれらのホームケージからの寝わらを充填した輸送箱に入れて短距離輸送した。マウスの行動試験を３〜１６か月齢の間の一連の機能試験で行い、マウス重量は２２ｇ〜３２ｇであった。試験は、研究中のマウスの遺伝子型又は処置を知らない実験者によって行われた。
【０２９７】
高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）：この試験は、開放空間に対する齧歯類の嫌悪を利用する。ＥＰＭ装置は、２つのオープンアーム及び２つの閉鎖アームを含み、各々床から６０ｃｍの高さのオープンルーフを有する（Ｈｏｌｍｅｓ，Ａ．ら、２０００、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＆  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７１：５０９〜５１６；Ｌｉｒａ，Ａ．ら、２００３、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５４：９６０〜９７１）。試験を明るい周辺光条件で行う。動物を１つの閉鎖アームに面した中心領域に置き、ＥＰＭを６分間探索させる。オープンアームにおける総アーム進入回数及び消費時間を記録する。不安の増加は、オープンアームにおける消費時間の割合（オープンアームにおける時間／オープン又は閉鎖アームにおける合計時間）の減少、及びオープンアーム進入割合の減少によって示される。
【０２９８】
明暗移行試験：この試験は、明るく照らされた領域に対する齧歯類の生得の嫌悪及び光が示すストレス要因に応答したそれらの自発的探索行動に基づく。試験装置は、暗い安全な区画及び照射された嫌悪の区画からなる。マウスを６分間試験し、２つのパラメータを記録した：（ｉ）点灯区画進入待ち時間、（ｉｉ）この区画における消費時間、不安関連行動の指数、並びに（ｉｉｉ）区画間移動回数、不安関連行動及び探索活動の指数。
【０２９９】
オープンフィールド（ＯＦＴ）：この試験は、明るく照らされた領域に対する齧歯類の嫌悪を利用する（Ｄａｖｉｄ，Ｄ．Ｊ．ら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９〜４９３）。各マウスをＯＦＴチャンバ（白色４３×４３ｃｍチャンバ）の中央に置き、３０分間探索させる。マウスを、各試験セッションを通してビデオトラッキングによってモニターし、Ａｕｔｏｔｙｐｉｎｇを用いて分析した（Ｐａｔｅｌ，Ｔ．Ｐ．ら、２０１４、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｅｈａｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８：３４９）。全運動活性を移動（移所運動）総距離として定量化した。ＯＦＴチャンバの中央における消費時間を測定することによって不安を定量化した。
【０３００】
モリス水迷路試験：動物をそれらのホームケージに入れて試験室に輸送し、１回目の試行前に少なくとも３０分間静かに放置した。迷路は、無毒の白色塗料で不透明にした水（２３℃）を充填した大きい水泳プール（直径１５０ｃｍ）で構成される。プールは、（１２：００、３：００、６：００及び９：００）における試行の４つの固定開始位置の境界を画定する迷路の壁上の幾何学図形を含めて、視覚的な合図で満たされた明るく照らされた部屋に位置する。１５ｃｍの円形プラットホームが水面下１ｃｍの固定位置に隠れている。毎日の各試行ブロックは４回の水泳試行からなり、各マウスは同じ無作為に選択された開始位置から出発する。開始位置は、日ごとに変わる。１日目、プラットホームを２分以内に見つけられなかったマウスをプラットホームにガイドする。それらは、それらのホームケージに戻される前にプラットホーム上に１５秒間残らなければならない。マウスは１日目後にプラットホームにガイドされず、繰り返しの試行（次の１０日間３回／日）にわたるプラットホームに達するのにかかった時間を空間学習の尺度として記録する。
【０３０１】
新規目標物認識試験（ＮＯＲ）：ＮＯＲパラダイムは、環境において新規目標物を認識する齧歯類の能力を評価する。ＮＯＲタスクは、既述７のように、不透明プラスチック箱の中で２個の異なる目標物（１）透明プラスチック漏斗（直径８．５ｃｍ、最大高さ８．５ｃｍ）及び（２）黒色プラスチック箱（９．５ｃｍ３）を用いて行われる。これらの目標物は、パイロット実験で測定して同レベルの探索を誘発する（Ｄｅｎｎｙ，Ｃ．Ａ．ら、２０１２、Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ２２：１１８８〜１２０１；Ｏｕｒｙ，Ｆ．ら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８〜２４１）。ＮＯＲパラダイムは、３日間にわたる３回の曝露からなる。１日目、馴化期、マウスに目標物のない空の活動領域を５分間探索させる。２日目、習熟期、マウスに箱の両端に置かれた２個の同一目標物を１０分間探索させる。３日目、試験期、マウスに新規目標物１個及び習熟期からの目標物のコピー１個の２個の目標物を１５分間探索させる。新規目標物（漏斗又は箱）として役立つ目標物及び目標物の左／右開始位置を各群内で釣り合わせる。マウスを各曝露の開始時に活動領域の中央に置く。曝露間で、マウスを個々に標準ケージ内で保持し、目標物及び活動領域を掃除し、寝わらを交換する。新規目標物の優先度をマウスが習熟目標物に比べて新規目標物を探索するのにかかった時間の割合に基づいて評価する。探索を各曝露のビデオ記録から点数化し、Ｓｔｏｐｗａｔｃｈプログラムを用いて記録した。２個の目標物の探索時間が等しいこと、又はＷＴ対照に比べて新規目標物に消費する時間の割合の減少は、海馬記憶の障害を示す。
【０３０２】
文脈的恐怖条件づけ：条件づけ装置は、２個の音及び光が減衰された条件づけ箱（６７×５５×５０ｃｍ、Ｂｉｏｓｅｂ、フランス）からなり、マウスを個々に条件づけ箱で走らせた。各箱は、黒色メタクリラート壁及びＰｌｅｘｉｇｌａｓ前部ドアで構築された。チャンバの床は、フットショック送達用スクランブラーでショック発生装置に配線された２７本のステンレス鋼棒（直径３ｍｍ、７ｍｍ間隔（中心間）からなった。マウスの動きによって発生するシグナルを記録し、高感度重量変換器システムによって分析した。活動／静止（すくみ）に関した記録目的及び事後分析のために、類推シグナルをすくみソフトウェアモジュールにロードセルユニットを介して送った。対応するハードウェアに付随する追加のインターフェースによって、すくみソフトウェアからのショックの強度を制御することができた。恐怖条件づけ手順を連続２日間行った。１日目、マウスを条件づけチャンバに入れ、動物をチャンバに入れた６０、１２０及び１８０秒後の時点で３回のフットショック（１秒、０．５ｍＡ）を与えた。それらを最終ショックの６０秒後にそれらのホームケージに戻した。マウスを条件づけチャンバに戻し、４分間の保持試験中のすくみ行動を測定することによって、文脈的恐怖記憶を条件づけの２４時間後に評価した。Ｐａｃｋｗｉｎ２．０ソフトウェア（ｂｉｏｓｅｂ、フランス）を用いてすくみを点数化し、自動的に分析した。動物が少なくとも２秒間すくんだ場合にすくみ行動が起きたとみなした。ＣＦＣ手順及びデータ解析はすべて、処置について知らない２名の無関係の実験者によって行われた。
【０３０３】
骨組織形態計測
３か月齢雌性マウスから解剖された腰椎又は脛骨を標準手順に従って２４時間固定し、段階的濃度のエタノールで脱水し、メタクリル酸メチル樹脂で包埋した。フォンコッサ／ワンギーソン、トルイジンブルー及び酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色を使用して、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）を測定した。フォンコッサ／ワンギーソンの脊椎動物写真を、カメラ（ＤＦＣ３００ＦＸ、Ｌｅｉｃａ）を備えた顕微鏡（ＤＭ４０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ）を用いて倍率２．５×で得た。画像を、Ｆｉｒｅソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を用いて取得し、ＢＶ／ＴＶを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて分析した。
【０３０４】
電気生理学
海馬を含む冠状脳切片を、以前に報告されたように野生型及びＫＯマウス（３〜４週齢、雄）から調製した。手短に述べると、マウスをイソフルランで麻酔し、次いで脳を収集するために断頭し、脳を迅速に取り出し、スクロース２２０、ＫＣｌ２．５、ＣａＣｌ２  １、ＭｇＣｌ２  ６、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５、ＮａＨＣＯ３  ２６及びグルコース１０（ｍＭ単位）を含みＮａＯＨでｐＨ７．３に調節された酸素化切断溶液に４℃で浸漬した。海馬を含む冠状スライス（３００μｍ厚）をビブラトームで切断し、ちょうど海馬を含むように切り取った。調製後、ＮａＣｌ  １２４、ＫＣｌ  ３、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  ２、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２３、ＮａＨＣＯ３  ２６、グルコース１０（ｍＭ単位）を含みＮａＯＨでｐＨ７．４にした（５％ＣＯ２及び９５％Ｏ２で）酸素化された人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）と一緒に保持チャンバにスライスを貯蔵した。スライスを、少なくとも１時間貯蔵チャンバで回復後にＡＣＳＦを３３℃で速度２ｍｌ／ｍｉｎで絶え間なく潅流した記録チャンバに最終的に移した。ホールセル電流クランプを行って、海馬のＣＡ３領域で視覚的に確認された錐体ニューロンにおいてＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ａ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて自発活動電位（ＡＰ）を観察した。先端抵抗４〜６Ｍａのパッチピペットを、ピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−９７）を用いてホウケイ酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）で作製し、Ｋ−グルコン酸１３５、ＭｇＣｌ２  ２、ＨＥＰＥＳ  １０、ＥＧＴＡ  １．１、Ｍｇ−ＡＴＰ  ２、Ｎａ２−クレアチンリン酸１０及びＮａ２−ＧＴＰ  ０．３（ｍＭ単位）を含みＫＯＨでｐＨ７．３にしたピペット溶液を充填した。ＡＰの安定な基線が１０分間記録された後、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で５〜１０分間のバス適用によってオステオカルシンを記録セルに塗布し、次いでＡＣＳＦで洗い流した。全データを１０ｋＨｚで採取し、Ａｐｐｌｅ  ＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータとＡｘｏｇｒａｐｈ  Ｘ（ＡｘｏＧｒａｐｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を用いて６ｋＨｚでフィルターにかけた。活動電位をＡｘｏＧｒａｐｈ  Ｘを用いて検出し、分析し、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ、Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ）を用いてプロットした。
【０３０５】
実時間ＲＮＡ転写物測定
すべての解剖を、氷冷ＰＢＳ１×中でＬｅｉｃａ  ＭＺ８解剖光学顕微鏡の下で行った。採取中に脳幹を小脳及び視床下部から単離し、中脳から取り出した。単離した脳のすべての部分を液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で維持した。
【０３０６】
ＲＮＡを脳組織からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。ｃＤＮＡ合成を標準手順に従って行い、ｑ−ＰＣＲ分析を特異的定量ＰＣＲプライマー（配列は請求次第入手可能）を用いて行い、Ｇａｐｄｈレベルに対して表した。
【０３０７】
初代海馬培養物
海馬ニューロンをマウス胚（胎生期１６．５）から単離した。解剖後、海馬をＴｒｙｓｐｉｎ０．０５％及びＥＤＴＡ０．０２％で１５分間３７℃で消化した。１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＤＭＥＭ（高グルコース及びピルビン酸ナトリウム）で３回洗浄後、細胞をピペット中を上下させて解離させ、次いで平板培養した。培養が確立された後、培地を、Ｂ−２７補助剤及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸを補充した神経基本培地で１週間に２回交換した。１５日間の培養後に実験を細胞に対して行った（ＤＩＶ１５）。
【０３０８】
生化学及び分子生物学
ウエスタンブロット法のために、成体マウス由来の凍結海馬を溶解し、２５０  ｌ組織溶解緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１０ｍｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０）中で均質化した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳＴ−５％ＢＳＡで１時間ブロックした。抗体：抗Ｒｕｎｘ２  Ｍ−７０  ｓｃ−１０７５８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、抗ＢＤＮＦ：ｓｃ−５４６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；抗チューブリン：Ｔ６１９９、Ｓｉｇｍａ；抗Ｇｐｒ１５８  ＡＢＩＮ１５３５７２１、Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；抗Ｎａ，Ｋ  ＡＴＰアーゼ３０１０Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇを、ＴＢＳＴ−５％ＢＳＡで希釈し（１：１０００）、終夜４℃でインキュベーションした。ＨＲＰ結合二次抗体及びＥＣＬを使用して、シグナルを可視化した。ウエスタンブロットバンドを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ｃＡＭＰ蓄積を、初代海馬ニューロンにおいてｃＡＭＰ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定し、初代海馬ニューロン（ＤＩＶ１５）において製造者の指示に従って行った。ＩＰ１の場合、蓄積を、初代海馬ニューロン（ＤＩＶ１５）においてＩＰ−Ｏｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて製造者の指示に従って測定した。Ｇｐｒ１５８のプルダウンを、Ｏｃｎ−／−海馬由来の可溶化膜において標準手順を用いて行った。手短に述べると、海馬を氷上で解剖し、緩衝剤Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、３２０ｍＭスクロース及びプロテアーゼ阻害剤）中でＧｌａｓｓ／Ｔｅｆｌｏｎ  Ｐｏｔｔｅｒ  Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザー（２０ストローク）を用いて均質化した。均質化された海馬を、３０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。次いで、上清を、４００００ｇで２０分間４℃で超遠心分離した。ペレットを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシドを補充した緩衝剤Ａに再懸濁させた。可溶化膜を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．２％ｎ−オクチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシドを補充した緩衝剤Ａで希釈した。プルダウンのために、ビオチン化オステオカルシン（７ｕｇ）を、異なる時点で４℃でインキュベーションした。３０マイクロリットルのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジンを３０分間室温で添加し、続いてＰＢＳで洗浄した。精製タンパク質を、Ｌａｅｍｌｉタンパク質緩衝剤を添加してビーズから溶出させ、６５℃で１５分間加熱した。ホルモン測定のために、カルボキシル化、低カルボキシル化又は非カルボキシル化型のオステオカルシンの循環レベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。血清のＣＴＸ含有量（ｎｇ／ｍｌ）を、特異的ＥＬＩＳＡ（ＲａｔＬａｐｓ（商標）（ＣＴＸ−Ｉ）ＥＩＡ（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
【０３０９】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、３５Ｓ標識リボプローブを用いて記述されたように行った（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：７４７〜７５４）。Ｇｐｒ１５８、Ｔｈ、Ｇｐ１５６、Ｇｐｒ１７９、Ｇｐｒｃ５ａ、Ｇｐｒｃ５ｂ、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｇｐｒｃ５ｄプローブは各々３’ＵＴＲである。ハイブリダイゼーションを終夜５７℃で行い、洗浄を６３℃で行った。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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