(57)【要約】  本発明は、生化学、代謝プロセスに関連する生化学、分子生物学、遺伝学、薬学、薬化学の分野内にある。より具体的には、本発明は、トロンビンを阻害する新規クラスのタンパク質、特にダニの唾液腺のトランスクリプトーム分析で同定されたスカルプチンから修飾されたトロンビンの直接阻害剤、ならびにその断片および組換えタンパク質を提供するものであり、これらは、抗凝固剤として、および血栓塞栓性疾患の予防および／または治療のために使用することができる。
2020511164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせと少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列を含むことを特徴とする、組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせと少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせを有する配列の１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせを有する配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
ダニのアンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）の唾液腺ｃＤＮＡ由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質を得るためのプロセス。
【請求項６】
配列番号１７と少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列を含むことを特徴とする、合成遺伝子。
【請求項７】
配列番号１７と少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列からなることを特徴とする、請求項６に記載の合成遺伝子。
【請求項８】
配列番号１７を有する１つの配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の合成遺伝子。
【請求項９】
配列番号１７を有する１つの配列からなることを特徴とする、請求項６に記載の合成遺伝子。
【請求項１０】
血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための薬剤または医薬組成物を調製するためのものであることを特徴とする、スカルプチンまたは請求項１に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項１１】
血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための、ならびに／または直接かつ特異的トロンビン阻害剤としてのものであることを特徴とする、スカルプチンまたは請求項１に記載の組換えタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規クラスのトロンビン阻害タンパク質、特にトロンビンの直接阻害剤、ならびに抗凝固剤として使用できるその断片および組換えタンパク質について記載する。本発明は、生化学、代謝プロセスに関連する生化学、分子生物学、遺伝学、薬学、薬化学の分野内にある。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは、凝固カスケードでの主な機能を持つ多機能酵素である。その機能的調節は、正常な血液凝固または血栓症などの障害を引き起こす可能性がある。したがって、トロンビンの新規の強力かつ特異的な阻害剤の同定は非常に重要である。
【０００３】
血液凝固は、酵素の下流活性化につながるプロ酵素カスケードを含む動的プロセスである。通常の状態では、恒常性がもたらされる。血栓と出血のバランスは、複雑かつ議論を引き起こすメカニズムによって体内で決定的に維持される。しかしながら、その障害は、出血または血栓症をもたらす可能性が高い。３７ｋＤａのヘテロダイマーであるトロンビンは、凝固カスケードの中心的な酵素である。トロンビンは、凝固因子（Ｖ、ＶＩＩＩ、ＸＩおよびＸＩＩＩ）を活性化し、血小板凝集を誘発するフィブリノーゲン切断を介して凝固促進剤として作用する多機能酵素である。一方、トロンビンはトロンボモジュリン結合を介して抗凝固剤として作用し、プロテインＣを活性化する。さらに、動脈および静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、癌、炎症性脳疾患、創傷治癒およびアテローム性動脈硬化において極めて重要な役割を果たす。その有害な影響を克服するために、トロンビンは、３つのドメイン（つまり活性部位とエキソサイト１および２）の１つまたは２つの遮断によって直接的または間接的に阻害される場合がある。従来、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、抗トロンビンとトロンビンのエキソサイト２とに同時に結合することにより、間接的にトロンビンを阻害する抗凝固剤として使用されてきた。しかしながら、ヘパリン（ＵＦＨおよびＬＭＷＨ）はフィブリン−トロンビンブリッジを生成し、血栓形成を増加させ、ヘパリン誘発性血小板減少症を引き起こすことがある。直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）は、トロンビンの活性部位に直接結合し、その活性をブロックする補因子を必要としない抗凝固剤のグループである。ＤＴＩは、抗血小板作用を持たず、免疫介在性血小板減少症を引き起こさないので、予測可能な抗凝固剤であることから、間接阻害剤に対する利点を有する。組換えヒルジンおよびそのヒルログを含むいくつかのＤＴＩは、抗凝固剤としての使用が承認されている。６５アミノ酸ペプチド（７ｋＤａ）であるヒルジンは、最初に薬用ヒルのヒルドメディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の唾液から単離された直接トロンビン阻害剤である。次に、硫酸化されていないＴｙｒ残基で天然のヒルジンとは異なる、組換えヒルジン形態が生成された。そのような違いは、組換えヒルジン活性をわずかに減少させた。しかし、組換えヒルジンによるトロンビン阻害は不可逆的であり、抗ヒルジン抗体を生成し、薬物の蓄積をもたらす。現在、組換えヒルジンの結果を逆転させる対応策はない。さらに、トロンビンに対する阻害剤活性に関して、いくつかの合成ヒルログが開発および試験されたが、これらの阻害剤は組換えヒルジンよりもほぼ８００倍（ｔｉｍｅｒ）弱かった。すべてのヒルログの中で、ビバリルジンがＦＤＡ承認の抗凝固剤であり、直接トロンビン阻害剤であるが、半減期が短い。このような抗凝固剤のほとんどすべては、ヒルジン−トロンビン複合体の不可逆的な形成、ヒルログの半減期の短さなどの副作用に関連しているため、その投与量を注意深く観察する必要がある。このようなトロンビン阻害剤のほとんどはヒルからのものであり、広く調査されている。一方、ダニからのトロンビン特異的阻害剤は完全に���れられていたが、クニッツ型阻害剤は詳細に調査されている。
【０００４】
これらの事実により、抗凝固剤として使用できる新規クラスの直接トロンビン阻害剤、ならびにその断片および組換えタンパク質の開発は興味深い。
【０００５】
科学および特許文献の最新技術を検索し、このテーマに取り組んだ文書として以下のものを見つけた：
１．Ｐｏｓｍａ，Ｊ．Ｊ．Ｎ．，Ｐｏｓｔｈｕｍａ，Ｊ．Ｊ．＆Ｓｐｒｏｎｋ，Ｈ．Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１４，１９０８−１９１６（２０１６）．
２．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｊ．＆Ａｎｓｅｌｌ，Ｊ．ＡＮＤ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２，５８１−５９２（２０１１）．
３．Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｔ．Ｂ．，Ｚａｎａｒｄｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｃｈｉｏｎ，Ｃ．Ｋ．Ｎ．Ｋ．＆Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａ．Ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ：Ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５，９５−１０１（２００７）．
４．Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｗａｍｅｉｓ，Ｍ．，Ｂｌａｎｎ，Ａ．，Ｍａｎｎｈａｌｔｅｒ，Ｃ．＆Ｊｉｌｍａ，Ｂ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｓ  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１０６，１０２０−１０３３（２０１１）．
５．Ｃｏｐｐｅｎｓ，Ｍ．，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ，Ｊ．Ｗ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｄ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．＆Ｈｉｒｓｈ，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｃｃｅｓｓ  Ｓｔｏｒｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１１１，９２０−９２９（２０１２）．
６．Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｈｕｄｏｂａ，Ｍ．，Ｍａｓｓｅｌ，Ｄ．，Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．＆Ｈｉｒｓｈ，Ｊ．Ｃｌｏｔ−ｂｏｕｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｅｐａｒｉｎ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６，３８５−３９１（１９９０）．
７．Ｎａｓｉｅｆ，Ｎ．Ｎ．，Ｓａｉｄ，Ａ．Ｍ．＆Ｈａｎｇａｕｅｒ，Ｄ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｂａｓｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ：Ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｔｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２５，９７５−９９１（２０１７）．
８．Ｓｏｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＧＤ−ｈｉｒｕｄｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６０，１０３−１０８（２００７）．
９．Ｔｕｌｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２２，１１７−１２４（１９９６）．
１０．Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｌｅｓｌｉｅ，Ｂ．＆Ｈｕｄｏｂａ，Ｍ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｗｈｅｒｅ  ｉｔ  Ｉｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈｅｐａｒｉｎ−Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｂｕｔ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７，５４４−５５２（１９９８）．
１１．Ｄｏｄｔ，Ｊ．，Ｋｏｈｌｅｒ，Ｓ．＆Ｂａｉｃｉ，Ａ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｉｒｕｄｉｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  α−ｔｈｒｏｍｂｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２９，８７−９０（１９８８）．
１２．Ｚａｖｙａｌｏｖａ，ＡＮＤ．＆Ｋｏｐｙｌｏｖ，Ａ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ａｍｏｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｔｅｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１３５，２１２−２１６（２０１５）．
１３．Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｐ．，Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ，Ｊ．，Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｋ．Ｌ．＆Ｆｅｎｔｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｒｕｌｏｇｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）２９，７０９５−７１０１（１９９０）．
１４．Ｂｒａｎｃｏ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍｂｌｙｏｍｉｎ−Ｘ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｍａｉｎ，ｉｓ  ａ  ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＦＸａ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ＢＢＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １８６４，１４２８−１４３５（２０１６）．
１５．Ｍａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｏｐｈｉｌｉｎ，ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｋｕｎｉｔｚ−Ｔｙｐｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃａｔｔｌｅ  Ｔｉｃｋ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３，ｅ１６２４（２００８）．
１６．Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｘｏｐｈｉｌｉｎ，Ａ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ  ｏｆ  Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８，ｅ６８０１２（２０１３）．
１７．Ｌｉａｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｌｉｎ，  ａ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｉｄｇｕｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈａｒｄ  ｔｉｃｋ  Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ．Ｊ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５，１６５−１７４（２００９）．
１８．Ｎａｖａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ  （）  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｅｗ  ｓｐｅｃｉｅｓ，Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｔｏｎｅｌｌｉａｅ  ｎ．ｓｐ．，Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｉｎｔｅｒａｎｄｉｎｕｍ  ｎ．ｓｐ．ａｎｄ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｐａｔｉｎｏｉ  ｎ．ｓｐ．，ａｎｄ  ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｍｉｘｔｕｍ，ａｎｄ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｓｃｕｌｐｔｕｍ  （Ｉｘｏｄｉｄａ：Ｉｘｏｄｉｄａｅ）．Ｔｉｃｋｓ  Ｔｉｃｋ−Ｂｏｒｎｅ  Ｄｉｓ．５，２５２−２７６（２０１４）．
１９．Ｂａｔｉｓｔａ，Ｉ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ（ＥＳＴｓ）ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｃｋ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ（Ａｃａｒｉ：Ｉｘｏｄｉｄａｅ）．Ｔｏｘｉｃｏｎ  ５１，８２３−８３４（２００８）．
２０．Ｋｅｌｌｙ，Ｌ．Ｍ．ＦＬＴ３  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９９，３１０−３１８（２００２）．
２１．Ｕｓｏｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  １．２  Å  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｉｒｕｓｔａｓｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７，５５−６３（１９９９）．
２２．Ｔａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｉｒｕｄｉｎ  ＩＩＩ  ｉｎ  ＡＮＤ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５，４３０−４３６（２００２）．
２３．Ｋｉｋｕｍｏｔｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｂｙ（２Ｒ，４Ｒ）−４−ｍｅｔｈｙｌ−１−［Ｎ２−［１，２，３，４−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−Ｌ−ａｒｇｉｎｙｌ］−２−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）２３，８５−９０（１９８４）．
２４．Ｔｅｗ，Ｄ．Ｊ．＆Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，Ｓ．Ｐ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｒｐｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９４，３０−３３（２００１）．
２５．Ｗｉｔｔｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．，Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｐ．，Ｂｒｅｚｎｉａｋ，Ｄ．  Ｖ．，Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．Ｍ．＆Ｆｅｎｔｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｄ  ｓｌｏｗ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｈｉｒｕｌｏｇ−１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８３，７３７−７４３（１９９２）．
２６．Ｐａｒｒｙ，Ｍ．Ａ．Ａ．，Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．Ｍ．＆Ｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｒ．Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｒｕｌｏｇ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ．）３３，１４８０７−１４８１４（１９９４）．
２７．Ｈｓｕ，Ｈ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１２３４３−１２３５３（２００８）．
２８．Ｂｏｒｅｎｓｚｔａｊｎ，Ｋ．，Ｐｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｐ．＆Ｓｐｅｋ，Ｃ．Ａ．Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ：ａｔ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１４，４２９−４４０（２００８）．
２９．Ｂｏｒｅｎｓｚｔａｊｎ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｍ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．３１３，２６２２−２６３３（２００７）．
３０．Ｂｏｒｅｎｓｚｔａｊｎ，Ｋ．，Ｐｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｐ．＆Ｓｐｅｋ，Ｃ．Ａ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＬＩＭＫ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｆｉｌｉｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２５，ｅ３２３−ｅ３２８（２０１０）．
３１．Ｇｌｅｅｓｏｎ，ＡＮＤ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９９，１８５−１９３（２０１４）．
３２．Ｓｉｅｒｋｏ，ＡＮＤ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２９，ｅ１１２−ｅ１１８（２０１２）．
３３．Ｄｒｏｚｄｅｔｓｋｉｙ，Ａ．，Ｃｏｌｅ，Ｃ．，Ｐｒｏｃｔｅｒ，Ｊ．＆Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．ＪＰｒｅｄ４：ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｒｖｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３，Ｗ３８９−Ｗ３９４（２０１５）．
３４．Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｇ．＆Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．ＭＥＧＡ７：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．  ０  ｆｏｒ  Ｂｉｇｇｅｒ  Ｄａｔａｓｅｔｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３３，１８７０−１８７４（２０１６）．
３５．Ａｓｉｆ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｙｚｙｇｉｕｍ  ｃｕｍｉｎｉ（Ｌ．）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ．Ｔｒｅｅ  Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｅｓ  ９，８６７−８７７（２０１３）．
３６．Ｉｑｂａｌ，Ａ．＆Ａｚｉｍ，Ｍ．Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｐａｋｉｓｔａｎｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐａｋ．３３，９３５−９３８（２０１１）．
３７．Ｍａｒｔｉｎｓ−Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，Ｍ．，Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｃ．，Ａｓｉｆ，Ｈ．，Ｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ａ．＆Ｍｅｎｃｋ，Ｃ．Ｆ．Ｍ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｈａ  Ｒｅｇｕｌｏｎ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｏｎｔｅｘｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  １１，ｅ０１５０７７２（２０１６）．
３８．Ｆｒａｎｃｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｉ．Ｍ．Ｂ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｊ．Ｇ．＆Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｊ．Ｍ．Ｃ．Ａｎｏｐｈｅｌｉｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）３８，１６６７８−１６６８５（１９９９）．
３９．Ｉｑｂａｌ，Ａ．，Ａｚｉｍ，Ｍ．Ｋ．，Ｈａｓｈｍｉ，Ｎ．，Ａｌｉ，Ｓ．Ａ．＆Ｍｕｓｈａｒａｆ，Ｓ．Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｖｉｂｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｌｅｔｔ．１８，２８７−２９４（２０１１）．
４０．Ｓａｌｉ，Ａ．＆Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４，７７９−８１５（１９９３）．
４１．Ｉｑｂａｌ，Ａ．＆Ａｚｉｍ，Ｍ．Ｋ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｅｎｏｌ  Ｐｙｒｕｖｙｌ  Ｓｈｉｋｉｍａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐａｋ．３４，１２０−１２６（２０１２）．
４２．Ｔａｏ，Ｃ．，Ｊｉｎ，Ｘ．，Ｚｈｕ，Ｌ．＆Ｌｉ，Ｈ．Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｓｃ７０  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｃｏｔｔｏｎ  Ｆｉｂｅｒｓ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３６９６１（２０１６）．
４３．Ｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｒ．＆Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ，Ｊ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｂｙ  ｈｉｒｕｄｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）２５，４６２２−４６２８（１９８６）．
【０００６】
したがって、検索された文献から推測されるものから、本発明の教示を予測または示唆する文書はなく、そのため、本明細書で提案される解決策は、最新技術に対して新規性および進歩性を有する。
【０００７】
本明細書で提案する解決策は、抗血栓療法からの制限を克服するための、または血栓塞栓性疾患の治療もしくは予防のための代替方法がないという問題を解決する。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、トロンビンの直接かつ特異的阻害において作用する、抗血栓性特性を有するか、または血栓塞栓性疾患の治療または予防のための新規タンパク質および／もしくはその断片の開発によって、従来技術に存在する問題を解決することである。
【０００９】
発現ベクターで使用されるヌクレオチド配列は、自然に見られる配列とは異なる。アミノ酸配列は、ダニの唾液腺のｃＤＮＡライブラリーを分析することで特定されているが、発現ベクターで使用されるヌクレオチド配列を精製するために、コドンの最適化、制限部位の追加およびヒスチジンテールが実行され、これにより、大腸菌を使用した大規模な組換えタンパク質（元々ダニ唾液腺に存在するスカルプチンの修飾）を得るためのプロセスを開発することができ、そのような組換えタンパク質はすべての研究で使用された。
【００１０】
そのようにして得られた分子は、競合する方法で選択的にトロンビンを阻害した。当該分子は、トロンビンとＸａ因子によってゆっくりと切断された。質量分析とエドマン分析に基づいて、トロンビン活性部位の結合ペプチドが提案され、薬用ヒルの古典的なヒルジンと比較してわずかな保存残基しか持たないが、同じ強度を示す。収集したデータから、そのような分子は抗血栓薬になる可能性を有しており、古典的なヒルジンおよびその類似体と潜在的に競合する可能性があると結論づけた。
【００１１】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはそれらの組み合わせと少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列を含む組換えタンパク質という第１の目的を有する。配列番号１は組換えタンパク質に関連し、配列番号２〜１６はその断片に関連している。一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせを含む１つの配列を含む。
【００１２】
本発明は、ダニのアンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）の唾液腺ｃＤＮＡから前記組換えタンパク質および／またはその断片を得るためのプロセスという第２の目的を有する。
【００１３】
本発明は、配列番号１７と少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列を含む合成遺伝子という第３の目的を有する。一実施形態では、合成遺伝子は、配列番号１７の１つの配列を含む。
【００１４】
第４の目的において、本発明は、血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための薬剤または医薬組成物を調製するためのスカルプチンまたは組換えタンパク質の使用を提示する。
【００１５】
第５の目的において、本発明は、血栓塞栓性疾患の予防もしくは治療のための、またはトロンビンの直接かつ特異的阻害剤としての、スカルプチンまたは組換えタンパク質の使用を提示する。
【００１６】
第６の目的において、本発明は、本発明に記載される合成遺伝子を含む発現ベクター、遺伝子構築物またはプラスミドを提示する。
【００１７】
第７の目的において、本発明は、有効用量の本発明のスカルプチンまたは組換えタンパク質および／もしくはその断片の投与を含む、血栓塞栓性疾患の予防のための治療方法を提示する。
【００１８】
本発明のこれらの目的および他の目的は、当業者およびそのような分野に関心のある企業によって直ちに認識され、以下の説明において再現のために十分詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】スカルプチンの系統分析を示す。トロンビンのダニおよびヒル阻害剤のタンパク質配列をデータベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から取得し、ＭＥＧＡ７．０に組み込まれた近隣結合法を使用して系統プロファイルを決定した。ブートストラップコンセンサスは１００であり、圧縮ツリーのしきい値は破損したブートストラップの６０％の複製であった（実験手順を参照）。各シーケンスのアクセス番号が指定され、クエリの位置が赤で強調表示される。スカルプチンの単一ドメインは、系統学的構築中に考慮された。
【００２０】
【図２】トロンビンに対する組換えタンパク質の特異性とその用量依存性、およびトロンビンの阻害のＩＣ５０を示す。（Ａ）組換えタンパク質によるセリンプロテアーゼの阻害。セリンプロテアーゼ（１００ｐＭ；トロンビン、プラスミン、トリプシンまたは第Ｘａ因子）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  ＰＥＧ  ６０００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３７℃にて６時間組換えタンパク質（１、１００および２００ｎＭ）と共にインキュベートした。反応混合物に対応する発色基質の添加後、その加水分解を４０５ｎｍで測定した。第Ｘａ因子活性については、緩衝液にはホスファチジルセリンとホスファチジルコリン５０μＭが含まれていた。（Ａ）に示されている図は、実験で使用された精製組換えタンパク質（配列番号１）のＳＤＳＰＡＧＥを示す。（Ｂ）組換えタンパク質の非存在下（トレースａ）または存在下（トレースｂ、１５ｐＭ；トレースｃ、３０ｐＭ；トレースｄ、６０ｐＭ；トレースｅ、１００ｐＭ）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％ＰＥＧ  ６０００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中３７℃での、トロンビン０．１ｎＭによる発色基質Ｓ−２２３８（１５μＭ）の加水分解の典型的な曲線。（Ｃ）濃度が増加した組換えタンパク質の存在下でのトロンビンの残留活性。（Ｄ）組換えタンパク質によるトロンビン阻害の用量反応曲線。トロンビン阻害の割合を組換えタンパク質の濃度記録に対してプロットした。（Ｃ）と（Ｄ）の実験条件は（Ｂ）と同じである。
【００２１】
【図３】組換えタンパク質によるトロンビン阻害の動態を示す。（Ａ）組換えタンパク質の非存在下（トレースａ）および存在下（トレースｂ、２０ｐＭ；トレースｃ、４０ｐＭ；トレースｄ、６０ｐＭ；トレースｅ、８０ｐＭ）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％ＰＥＧ  ６０００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中３７℃での、トロンビン０．１ｎＭによる発色基質Ｓ−２２３８の加水分解の典型的なプログレス曲線。組換えタンパク質およびＳ−２２３８を含む混合物にトロンビンを加えることにより、反応を開始した。（Ｂ）式（１）を使用した組換えタンパク質によるトロンビン阻害のラインウィーバー＝バークプロット。異なる基質濃度での組換えタンパク質の非存在下（トレースａ）および存在下（トレースｂ、２０ｐＭ；トレースｃ、４０ｐＭ；およびトレースｄ、６０ｐＭ）でのトロンビン阻害の初期速度の往復。（Ｃ）（Ｂ）から得られた知覚Ｋｍを、Ｋｉを得るための各濃度に対してプロットした。（Ｄ）式（２）を使用した競合阻害の非線形回帰。異なる基質濃度での組換えタンパク質の非存在下（トレースａ）および存在下（トレースｂ、２０ｐＭ；トレースｃ、４０ｐＭ；トレースｄ、６０ｐＭ；およびトレースｅ、８０ｐＭ）でのトロンビン阻害の初期速度。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の実験条件は（Ａ）と同じである。
【００２２】
【図４】見かけ上の１次速度と組換えタンパク質の強結合阻害剤濃度との関係を示す。（Ａ）組換えタンパク質の非存在下（トレースａ）および存在下（トレースｂ、１０ｐＭ；トレースｃ、３０ｐＭ；トレースｄ、７０ｐＭ；トレースｅ、１００ｐＭ；トレースｆ、２００ｐＭ；およびトレースｇ、５００ｐＭ）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％ＰＥＧ  ６０００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中３７℃での、トロンビン０．１ｎＭによる発色基質Ｓ−２２３８  １５μＭの加水分解の典型的なプログレス曲線。反応は、組換えタンパク質およびＳ−２２３８を含む混合物にトロンビンを加えることにより、反応を開始した。（Ｂ）組換えタンパク質の濃度に関するトロンビンの平衡速度（Ｃ）一定のオフレートの計算。見かけの一次速度の定数を、非線形回帰調整を使用して計算した。ここで、交差と勾配はそれぞれｋｏｎとｋｏｆｆである。（Ｂ）と（Ｃ）の実験条件は（Ａ）と同じである。
【００２３】
【図５】セリンプロテアーゼによる組換えタンパク質の分解とそのトロンビン阻害活性を示す。組換えタンパク質（１０μＭ）を、セリンプロテアーゼ１μＭ（トロンビン、プラスミン、トリプシンまたは第Ｘａ因子）の有無にかかわらず、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％  ＰＥＧ  ６０００を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３７℃にて４、６、７または１８時間インキュベートした。反応混合物（２０μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割した。（Ａ）６時間のインキュベーション後のセリンプロテアーゼによる組換えタンパク質の加水分解ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）。（Ｂ）セリンプロテアーゼとの６時間のインキュベーション後の組換えタンパク質によるトロンビン阻害の割合（実験手順を参照）。（Ｃ）１８時間のインキュベーション後のセリンプロテアーゼによる組換えタンパク質の加水分解ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）。（Ｄ）セリンプロテアーゼとの１８時間のインキュベーション後の組換えタンパク質によるトロンビン阻害の割合（実験手順を参照）。（Ｂ）と（Ｄ）の番号付けは、（Ａ）と（Ｃ）それぞれの番号付けに対応し、組換えタンパク質制御はＣＴＲＬで表される。組換えタンパク質（ストリップ１）；トロンビン（ストリップ２）および組換えタンパク質とトロンビン（ストリップ３）；プラスミン（ストリップ４）およびプラスミンと組換えタンパク質（ストリップ５）；トリプシン（ストリップ６）および組換えタンパク質とトリプシン（ストリップ７）；Ｘａ因子（ストリップ８）および組換えタンパク質とＸａ因子（ストリップ９）およびタンパク質マーカー（ストリップ１０；Ａにおける）。（Ｅ）７時間のインキュベーション後の組換えタンパク質中のトロンビンの切断部位の同定。（Ｆ）４時間のインキュベーション後の組換えタンパク質中のＸａ因子の切断部位の同定。組換えタンパク質配列中のトロンビンおよびＸａ因子の切断部位は、それぞれ図Ｓ１およびＳ２に示されている。（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）の実験手順は、インキュベーション時間と使用したセリンプロテアーゼの種類を除いて、（Ａ）および（Ｂ）と同じであった。
【００２４】
【図６】Ｘａ因子によって生成された組換えタンパク質断片のトロンビン阻害活性を示す。組換えタンパク質（１０μＭ）は、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリン５０μＭ、を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＭで、Ｘａ因子１μＭの有無にかかわらず、３７℃で１８時間インキュベートした。（Ａ）反応混合物を逆相ＨＰＬＣカラムＣ−１８で分割した。（Ｂ）集められたピーク（Ｈ１〜Ｈ５）にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびトロンビン阻害試験を行った（対応するペプチド配列については表１を参照）。（Ｃ）組換えタンパク質断片１００ｐＭ（トレースＨ１およびＨ３）または保存された組換えタンパク質（トレースＳｃｐｔ）の非存在下（トレースＣｔｒｌ）および存在下、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％のＰＥＧ  ６０００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＭ中３７℃での、トロンビン０．１ｎＭによる発色基質Ｓ−２２３８  １５μＭの加水分解の典型的なプログレス曲線。（Ｄ）組換えタンパク質およびその断片によるトロンビン阻害の割合。トロンビン阻害の割合の反応条件は、（Ｃ）から得られた。
【００２５】
【図７】トロンビン結合組換えタンパク質とヒルジンの代表的なデザイン（固体ストリップ）を示す。茶色とシアン色は、それぞれトロンビンの重鎖と軽鎖を表す。（Ａ）トロンビンに結合した組換えタンパク質（緑色）。（Ｂ）トロンビンに結合したヒルジン（青色）。阻害剤からの残留溶解物は黄色で示され、トロンビン活性部位からのＳｅｒ１９５の残留物は赤色で示されている。
【００２６】
【図８】タンパク質配列の分析を示す。（Ａ）スカルプチンから修飾された組換えタンパク質配列。ダニ唾液腺のトランスクリプトーム分析が同定された。想定されるペプチドシグナルには下線を引いている。組換えタンパク質内の４つのペプチド反復は、灰色と黄色が交互に表示される。（Ｂ）アンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）、リピセファルスアペンジクラーツス（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）およびヒルドメディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）からのヒルジンと組換えタンパク質の多重整列。保存された残基は灰色で強調表示される。ヒルドメディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）からのヒルジンＰＫＰ結合活性部位は、スカルプチンでＰＫＭに修飾される。Ｘａ因子とトロンビンの切断部位は、それぞれアスタリスクとハッシュマークで識別される。
【００２７】
【図９】組換えタンパク質の発現と精製を示す。組換えタンパク質の合成遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２８ａにクローニングし、組換えタンパク質を３７℃の液体培地で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。非誘導培養または誘導培養（ＩＰＴＧ  ０．５ｍＭ）の両方からの全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（１５％）。（Ａ）組換えタンパク質の誘導ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ストリップＭ、ＮＩおよびＩは、それぞれタンパク質マーカー、非ＩＰＴＧ誘導を表す。（Ｂ）組換えタンパク質発現後の大腸菌からの細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ストリップＭ、ＴＥ、ＩＮ、ＳＯは、それぞれタンパク質マーカー、完全抽出物、不溶性および可溶性画分に対応する。（Ｃ）組換えタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる精製。可溶性画分を０．４５μｍの膜でろ過し、ＨｉｓタグのＮｉキレートアフィニティーカラムに適用した。結合したタンパク質をイミダゾールで溶出し、各画分から１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。（Ｄ）アフィニティークロマトグラフィー画分からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ストリップＴＥ、Ｅ、ＭおよびＵは、それぞれ完全抽出物、溶出タンパク質画分、タンパク質マーカーおよび非結合タンパク質画分を表す。（Ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製。精製組換えタンパク質のストリップからのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す挿入画像。
【００２８】
【図１０】トロンビン特異的阻害剤である組換えタンパク質の精製を示す。（Ａ）従来のクロマトグラフィー法を使用した精製組換えタンパク質からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実験手順および図Ｓ２を参照）。（Ｂ）精製組換えタンパク質からのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。
【００２９】
【図１１】様々な濃度の組換えタンパク質とインキュベートした単離ヒト血漿におけるインビトロでのＡＰＴＴ、ＰＴおよびＴＴ評価を示す。健常ヒトボランティアの血液から血漿を採取し、様々な濃度の組換えタンパク質とともにインキュベートした。ＡＰＴＴ、ＰＴおよびＴＴは、実験手順と同様に決定された。（Ａ）活性化部分トロンボプラスチン時間、（Ｂ）プロトロンビン時間、および（Ｃ）トロンビン時間。Ｃｔｒｌは血漿に関連し、Ｓａｌは血漿と生理食塩水に関連している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書では、新規クラスのトロンビン阻害剤、特にダニ唾液腺のトランスクリプトーム解析で同定されたスカルプチンから修飾された直接かつ特異的トロンビン阻害剤について説明する。４つの正確に類似したリピートを持つ１６８残基で構成され、古典的なヒルジンから進化した分岐を示す。組換えタンパク質は、競合する特異的かつ可逆的なトロンビン阻害剤であり、Ｋは１８．５±２．２ｐＭである。トロンビンによってゆっくりと消化され、その阻害活性を失う。したがって、組換えタンパク質はＸａ因子によって加水分解され、各ポリペプチド断片は独立した方法でトロンビンを阻害することができる。組換えタンパク質の単一ドメインは、約４５％の阻害活性のみを保持する。これは、二価の方法でトロンビンに結合するために提案された。組換えタンパク質のドメインからの活性部位の残基を結合することによるヘリックス／小さなターンに類似した構造の形成は、ヒルログよりも最も強力なトロンビン阻害剤になる可能性がある。さらに、組換えタンパク質は、その外因性および内因性代謝経路を介して凝固を延長する。データと併せて、組換えタンパク質およびその独立したドメイン（１つまたは複数）が治療用抗血栓化合物になる、または血栓塞栓性疾患の新規治療に対する強い可能性があることを認めることが考慮された。
【００３１】
本発明は、トロンビン阻害剤、特に直接トロンビン阻害剤およびその断片を、そのいくつかの目的に共通する発明概念として有する。
【００３２】
１つの第１の目的において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはそれらの組み合わせと少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列を含む組換えタンパク質を示す。一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはそれらの組み合わせと少なくとも７０％、より優先的には少なくとも９０％、より優先的には少なくとも９５％、さらにより優先的には少なくとも９９％の同一性を有する１つの配列を含む。
【００３３】
一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせと少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列からなる。一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはそれらの組み合わせと少なくとも７０％、より優先的には少なくとも９０％、より優先的には少なくとも９５％、さらにより優先的には少なくとも９９％の同一性を有する１つの配列からなる。
【００３４】
一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせを含む１つの配列を含む。
【００３５】
一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６またはその組み合わせを有する配列からなる。
【００３６】
本発明は、第２の目的として、ダニのアンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）の唾液腺ｃＤＮＡから前記組換えタンパク質および／またはその断片を得るためのプロセスを有する。
【００３７】
第３の目的において、配列番号１７と少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列を含む合成遺伝子を示す。一実施形態において、合成遺伝子は、配列番号１７と少なくとも７０％、より優先的には少なくとも９０％、より優先的には少なくとも９５％、さらにより優先的には少なくとも９９％の同一性を有する１つの配列を含む。
【００３８】
一実施形態では、合成遺伝子は、配列番号１７と少なくとも６０％の同一性を有する１つの配列からなる。一実施形態では、合成遺伝子は、配列番号１７と少なくとも７０％、より優先的には少なくとも９０％、より優先的には少なくとも９５％、さらに優先的に少なくとも９９％の同一性を有する１つの配列からなる。
【００３９】
一実施形態では、合成遺伝子は、配列番号１７の１つの配列を含む。
【００４０】
一実施形態では、合成遺伝子は、配列番号１７の１つの配列からなる。
【００４１】
第４の目的において、本発明は、血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための薬剤または医薬組成物を調製するためのスカルプチンまたは組換えタンパク質の使用を示す。
【００４２】
第５の目的において、本発明は、血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための、ならびに／またはトロンビンの直接かつ特異的阻害剤としての、スカルプチンまたは組換えタンパク質の使用を示す。
【００４３】
第６の目的において、本発明は、本発明に記載される合成遺伝子を含む発現ベクター、遺伝子構築物またはプラスミドを示す。
【００４４】
第７の目的において、本発明は、有効用量の本発明のスカルプチンまたは組換えタンパク質および／もしくはその断片の投与を含む、血栓塞栓性疾患の予防のための治療方法を示す。
【００４５】
本発明の文脈において、「血栓塞栓性疾患」は、局所的に形成された凝血塊または全身循環で送達される血栓による血管（動脈または静脈）の凝固または閉塞に関連する障害として理解することができ、例えば血栓症、心臓発作、脳卒中、狭心症（不安定狭心症を含む）、血管形成術または冠動脈バイパス術後の再閉塞および再狭窄、末梢動脈閉塞性疾患、一過性虚血発作、肺塞栓症、深部静脈血栓症、または播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）などである。
【００４６】
したがって、本発明は健康関連分野に貢献し、新規トロンビン阻害剤、特に血栓塞栓性疾患の治療または予防に有用な、高度に特定された直接かつ特異的トロンビン阻害剤が開示されている。
【００４７】
例−実施形態
本明細書に示される例は、本発明を実施するためのいくつかの方法のうちの１つを単に例示することを目的としているが、決してその範囲を限定するものではない。
【００４８】
スカルプチンのアミノ酸配列は、ダニのアンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）（現在のアンブリオマスカルプタム（Ａｍｂｌｙｏｍａ  ｓｃｕｌｐｔｕｍ））の唾液腺のｃＤＮＡライブラリーの分析から同定された。
【００４９】
ライブラリーで特定されたアミノ酸配列から、大腸菌からのコドンの使用表を使用してソフトウェアＢＬＡＳＴ−Ｘ（ＮＣＢＩ）を介して逆翻訳が実行され、それにより、異種システム（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるタンパク質発現のための、組換えタンパク質のコードＤＮＡ配列が得られた。
【００５０】
スカルプチンのコードヌクレオチド配列から、合成遺伝子が設計され（配列番号１７に記載）、これには５’末端に制限酵素ＮｃｏＩの切断部位および３’末端にヒスチジンテールのコード配列（ＨＩＳ６）および制限酵素ＸｈｏＩの切断部位が組み込まれている。次に、合成遺伝子配列をＧｅｎＯｎｅ  Ｓｏｌｕｃｏｅｓ  ｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ社（リオデジャネイロ、ブラジル）に送信して、独自のアルゴリズムによるコドン最適化、遺伝子合成、大腸菌の発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドラムシュタット、ドイツ）におけるクローニングを行った。
【００５１】
ＧｅｎＯｎｅ社によって合成され、提供されたプラスミドを、塩化カルシウムを用いた方法により、大腸菌  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）の株を形質転換するために使用した。
【００５２】
１０ｎｇのプラスミドｐＥＴ２８ａ−スカルプチンを５０μＬの競合細胞懸濁液ＢＬ２１（ＤＥ３）と氷中で３０分間インキュベートした。次に、４２℃で３０分間インキュベートし、その後氷中で１０分間インキュベートすることにより、細胞に熱ショックを与えた。その後、１ｍＬのＬＢ培地を加え、懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。
【００５３】
上記に続いて、細胞を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む固体ＬＢ培地に播種し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、コロニーを単離し、３７℃で一晩１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１０ｍＬの接種に使用した。翌日、培養液にグリセロール５０％を添加し、懸濁液を１ｍＬの懸濁液を含むチューブに分配し、それを−８０℃で凍結し、マスターシードロットを作成した。
【００５４】
大腸菌での組換えタンパク質の発現の実験は、常にシードロットのボトルから開始し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、２４０ｒｐｍで一晩攪拌しながら３７℃で維持した。これは前接種物を構成する。
【００５５】
翌日、十分な量の前接種物を使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に、前接種物１容量：培地１００容量の比率で接種した。０．５〜０．６の光学密度（ＯＤ６００）を達成するまで、約２時間、２４０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で培養物を維持した。そのような光学密度が達成されたら、ＩＰＴＧインダクターを最終濃度１ｍＭで添加し、培養物を３７℃で４時間再びインキュベートした。
【００５６】
インキュベーション後、６０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により細胞を回収し、遠心分離が終了したら上清を廃棄した。細胞を生理食塩水ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）に、溶液１ｍＬ：湿細胞塊８ｇの比率で再懸濁した（この工程から、すべてのプロセスにおいて、８ｇの湿塊ごとに氷冷溶液１ｍＬの比率を使用した）。上記のように細胞を再び遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁した。すべての細胞壁破壊に対してリゾチームを最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬで懸濁液に加え、インキュベーションを８０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で３０分間維持した。次に、細胞破壊とゲノムＤＮＡの断片化のために、懸濁液を７０％の強度で４回の超音波処理サイクルにかけた。
【００５７】
不溶性物質を可溶性物質から分離するために、懸濁液を１６０００ｒｐｍ（４℃）で１時間遠心分離した。
【００５８】
組換えタンパク質（配列番号１）は細菌の細胞質で発現したため、可溶性画分は、クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ＡＶＡＮＴ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ州、米国）およびカラムＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦを使用して、アフィニティークロマトグラフィーによりヒスチジンテールを含むタンパク質の精製に使用された。カラムに可溶性物質を適用することにより、組換えタンパク質を固定化した。その後、１０ＣＶ（カラム容量）の溶解緩衝液で洗浄を行った。タンパク質の溶出は、緩衝液Ｂの０〜１００％の線形勾配（１０ＣＶ）で行った。部分的に精製されたタンパク質を含む収穫された画分をは、脱塩カラム（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０）で緩衝液交換し、上記の線形勾配による同じ洗浄および溶出工程を使用して、ＣａｐｔｏＱカラムでのイオン交換クロマトグラフィーにより、組換えタンパク質の１秒の精製工程を行った。精製タンパク質を含む画分をプールで組み合わせ、脱塩カラム（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０）を通してＰＢＳ緩衝液への緩衝液交換を実施した。
【００５９】
そのようなプロセスを通して得られた純粋な形態の組換えタンパク質（配列番号１）を、本明細書に記載のすべての実験で使用した。
【００６０】
スカルプチン配列と系統発生の分析
スカルプチン配列は、アンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）の唾液腺からのトランスクリプトームプロファイルで同定された。１６８アミノ酸のポリペプチドであるスカルプチンは、単一のペプチドと、３４アミノ酸の４つの正確に類似したリピートからなる（図８Ａ）。薬用ヒルからの古典的なヒルジンの複数の配列は、わずかな類似性のみを示し、トロンビン活性部位に結合した残基さえも保存されていなかった。単一のスカルプチンリピートのドメインから他のセリンプロテアーゼ阻害剤までの系統分析は、ヒルのヒルジンの変異体と共通の先祖を有することを示唆したが、進化時間に関しては異なる。実際、進化ツリーでは、スカルプチンは、ヒルからの古典的なヒルジンよりも、アンチスタシンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤、すなわちヒルスタシン、グアメリン、ブラデラスタシン、セロミンおよびセロスタシンに近かった。予想通り、スカルプチンはダニのヒルジンと同じ配列ファミリーに属する（図１）。
【００６１】
組換えタンパク質の精製
シグナルペプチドを含まず、１つのポリヒスチジンテールＣ末端を有する組換えタンパク質の合成構築物を、発現ベクターｐＥＴ２８ａにクローニングした。組換えタンパク質はよく発現し、主に可溶性画分に存在していた（図９）。組換えタンパク質を、従来のアフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製した（図９）。質量分析による分析では、精製された形態の組換えタンパク質（配列番号１）について１６９９０．９０Ｄａの質量が示されたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、２０ｋＤａのマーカーストリップのすぐ上で実行される（図１０Ａおよび１０Ｂ）。精製された組換えタンパク質を追加の実験に使用した（図２Ａに画像を挿入）。
【００６２】
組換えタンパク質はトロンビン特異的阻害剤である
最初に実施された実験は、組換えタンパク質によるセリンプロテアーゼ阻害の試験であった。この目的のために、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびＸａ因子が選択された。組換えタンパク質の存在下および非存在下でのセリンプロテアーゼによる発色性基質の加水分解を分光光度計の方法で測定した。濃度が１ｎＭの組換えタンパク質は、トロンビンの残留活性を約９７％減少させる（図２Ａ）。一方、組換えタンパク質（１、１００、２００ｎＭ）は、Ｘａ因子、トリプシンおよびプラスミンを阻害しなかった（図２Ａ）。
【００６３】
組換えタンパク質によるトロンビン残留活性の阻害とＩＣ５０値の計算
トロンビンは、組換えタンパク質によって阻害される唯一の酵素であった。さらに、組換えタンパク質の濃度を増加させてトロンビン阻害を分析した。データは、組換えタンパク質の濃度の増加がトロンビンの残留活性を減少させることを示した（図２Ｂ〜２Ｄ）。阻害対濃度ログのパーセントプロットは、式１の用量反応関数で適合され、８６．６±１．９ｐＭのＩＣ５０値が算出された（図３Ｄ）。
【００６４】
組換えタンパク質によるトロンビン阻害動態
トロンビン中の組換えタンパク質によって実行される阻害の種類を評価するために、組換えタンパク質の存在下でのトロンビンによる発色基質Ｓ−２２３８の加水分解の動態パラメーターを決定した。この目的のために、以下を使用していくつかの試験を実施した：（ｉ）一定の基質濃度と増加する組換えタンパク質濃度；（ｉｉ）一定の組換えタンパク質濃度と増加するＳ−２２３８濃度。トロンビンによるＳ−２２３８の典型的な加水分解曲線を図３Ａに示す。組換えタンパク質の存在下でのトロンビンによる発色基質Ｓ−２２３８の加水分解の初期速度は、式２を使用してラインウィーバー＝バークプロットに適合された。ラインウィーバー＝バークプロットは、組換えタンパク質の非存在下での反応と比較して、Ｖｍａｘ定数とＫｍの変化とを示し、これらは競合阻害の特徴である（図３Ｂ）。各阻害剤濃度の見かけのＫｍをそれぞれの阻害剤濃度に対してプロットし、式３を使用してＫｉを計算した。得られたＫｉ値は、トロンビン阻害に対する組換えタンパク質の１８．５±２．２ｐＭであり（図３Ｃ）、式３および４を使用した競合酵素阻害の非線形回帰に対するデータ適合によっても確認された（図３Ｄ）。この方法で得られた１８．１±１．７ｐＭのＫｉ値は、以前に計算した値と同様であった（図４Ｄ）。
【００６５】
組換えタンパク質のトロンビンへの結合動態
結合速度については、事前混合した基質と組換えタンパク質の濃度を、トロンビンを既に含んでいる反応混合物に加えた（実験手順を参照）。阻害の痕跡は、反応の開始直後から直線的かつ別個の線であり、したがって、組換えタンパク質とトロンビンとの迅速かつ強固な結合を示唆している（図４Ａ）。さらに、Ｍｏｒｒｉｓｏｎタイトバインディングの式５を使用して、阻害剤濃度に対して速度の一部をプロットした。データは式に最適である（図４Ｂ）。１９．５±３．５ｐＭのＫｉは、競合酵素阻害の非線形回帰によって決定されたものと類似したＭｏｒｒｉｓｏｎタイトバインディングの式によって計算した。さらに、式６を使用して計算したｋｏｂｓを組換えタンパク質濃度に対してプロットした。プロットからｋｏｎとｋｏｆｆを計算すると、それぞれ４．０４±０．０３×１０７  Ｍ−１  ｓ−１と０．６５±０．０４×１０−３  ｓ−１となった（図４Ｃ）。１６．１±１．４ｐＭの阻害定数（Ｋｉ）は、式７を使用して計算した。
【００６６】
セリンプロテアーゼによる組換えタンパク質の分解
その後、トロンビン、プラスミン、Ｘａ因子、トリプシンなどのセリンプロテアーゼが組換えタンパク質を加水分解するかどうかを判定した。この目的のために、組換えタンパク質（１０μＭ）を、セリンプロテアーゼ１μＭ（トロンビン、プラスミン、トリプシンまたは第Ｘａ因子）と共に又は無しで、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％  ＰＥＧを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３７℃にて６時間または１８時間インキュベートした。インキュベーション６時間後の反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、組換えタンパク質の対照ストリップと比較して、２０ｋＤａのストリップ強度（非消化組換えタンパク質に対応）が減少し、低分子量のストリップがトロンビンによりインキュベートされた組換えタンパク質で出現したことを示した（図５Ａ）。一方、６時間のインキュベーション後、プラスミンとトリプシンによってインキュベートされた組換えタンパク質では、２０ｋＤａのストリップが完全に消失していた（図５Ａ）。それ故、同じインキュベーション時間の後、Ｘａ因子も組換えタンパク質を断片に変換した（図５Ａ）。トロンビン阻害の試験のために、同じサンプルを１００ｐＭの組換えタンパク質の最終濃度のために１０万倍に希釈し、反応混合物にトロンビン１００ｐＭをさらに補充した。発色基質Ｓ−２２３８を添加して、トロンビンによるその加水分解を分光光度計の方法で測定した。データは、セリンプロテアーゼなしで６時間インキュベートした組換えタンパク質が、対照と同様の方法でトロンビンを阻害したことを明らかにする（対照は１００ｐＭの新鮮な組換えタンパク質である；図５Ｂ）。一方、トロンビンとインキュベートした組換えタンパク質はその阻害活性が２０％減少し、プラスミンまたはトリプシンと６時間インキュベートした組換えタンパク質はその阻害活性が８０％減少した（図５Ｂ）。興味深いことに、Ｘａ因子で消化した組換えタンパク質は、トロンビン阻害活性を保持していた（図５Ｂ）。その後、セリンプロテアーゼと１８時間インキュベートした組換えタンパク質を調べた。組換えタンパク質モノマーに相当する２０ｋＤａのストリップは、セリンプロテアーゼとインキュベートした組換えタンパク質の反応混合物から完全に消失していた（図５Ｃ）。同様に、トロンビン阻害の試験のために、サンプルを１０万倍に希釈し、さらにトロンビン１００ｐＭを追加した。予想通り、セリンプロテアーゼなしで１８時間インキュベートした組換えタンパク質は、新鮮な組換えタンパク質の制御と同様の方法でトロンビンを阻害した（図５Ｄ）。しかし、トロンビン、プラスミンおよびトリプシンとインキュベートした組換えタンパク質は、トロンビンを阻害しなかった（図５Ｄ）。興味深いことに、Ｘａ因子によってインキュベートされた組換えタンパク質は、トロンビン活性を阻害しさえした（図５Ｄ）。
【００６７】
トロンビンにより加水分解された組換えタンパク質のＮ末端の配列決定
上記のように、トロンビンは組換えタンパク質を分解する。以下、次の工程は、組換えタンパク質配列におけるトロンビンの切断部位を決定することであった。この目的のために、組換えタンパク質をトロンビンとともに７時間インキュベートし、加水分解中に生成されたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分割した。個々のピークを収集し、エドマンＮ末端配列決定を行った。最初のピークの配列決定された残基はＧＫＰＱＧで、組換えタンパク質の最初の５残基であった（図５Ｅ）。次の３つのピーク（２番目、３番目および４番目）の配列決定された残基はＭＰＫＧＧであり、基本的にはトロンビンによって生成された組換えタンパク質ペプチドのＮ末端残基である（図５Ｅ）。対照に等しい保持時間を持つ最後のピーク（５番目）は、Ｎ末端にＭＰＫＧＧおよびＧＫＰＱＧの残基を持つように配列決定され、このピークが組換えタンパク質を保存し、部分的に分解したことを示唆する（図５Ｅ）。画分も質量分析にかけ、それらはエドマン配列決定のデータに準拠していた（表１）。ペプチドの理論的および実験的質量を表１に示す。
【表１】
2020511164.tif 000003
【００６８】
組換えタンパク質（１０μＭ）は、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．１％ＰＥＧ  ６０００  を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中トロンビン１μＭと３７℃で４時間インキュベートした。反応混合物を逆相ＨＰＬＣカラムＣ−１８により分割した。画分は、エドマン配列決定または質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにかけた。
【００６９】
Ｘａ因子により加水分解された組換えタンパク質のＮ末端の配列決定
組換えタンパク質中のＸａ因子の切断部位も決定した。組換えタンパク質とＸａ因子との４時間のインキュベーションにより生成されたペプチドを、逆相クロマトグラフィーにより分割した。エドマン配列決定により、最初のピークのＮ末端残基はＧＫＰＱＧであり、組換えタンパク質の最初の５残基であった（図５Ｆ）。次の２つのピーク（２番目と３番目）の配列決定された残基はＳＤＡＶＨであり、実際には、Ｘａ因子によって生成された組換えタンパク質ペプチドのＮ末端残基であった（図５Ｆ）。保持時間が対照に等しい最後のピーク（４番目）は、Ｎ末端残基ＭＰＫＧＧおよびＳＤＡＶＨを持つように配列決定され、このピークが組換えタンパク質を保存し、部分的に分解したことを示唆する（図５Ｆ）。次に、収集されたピークを質量分析にかけた。これらは、エドマン配列決定のデータに基づいていた（表２）。ペプチドの理論的および実験的質量を表２に示す。
【表２】
2020511164.tif 000004
【００７０】
組換えタンパク質（１０μＭ）を、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび５０μＭ  ｄｅ  ＰＳ／ＰＣを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中Ｘａ因子１μＭと３７℃で４時間インキュベートした。反応混合物を逆相ＨＰＬＣカラムＣ−１８により分割した。画分は、エドマン配列決定または質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにかけた。
【００７１】
Ｘａ因子によって生成された組換えタンパク質断片は、トロンビン阻害活性を保持する
さらに、組換えタンパク質をＸａ因子と１８時間インキュベートし、得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーで分割した（図６Ａ）。ピーク（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５と命名）を収集し、質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにかけた（図６Ｂ）。質量分析の分析によれば、Ｈ１は５１５３．５７Ｄａの平均質量に対応し、Ｈ２は３６６７．５０Ｄａおよび４５８２．４０Ｄａの平均質量に対応し、Ｈ３は８２２０．５５Ｄａおよび６７７０．６０Ｄａの平均質量に対応する。同様に、Ｈ４は平均質量７２９９．６１Ｄａおよび１２４２７．５４Ｄａに対応し、Ｈ５は１６９９０．９０、１２４２７．５４Ｄａおよび１１８４３．１７Ｄａに対応する（図６Ｂ、表１）。さらに、画分（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４）のトロンビン阻害を試験した（図６Ｃ）。画分Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４は、加水分解されていない組換えタンパク質の約５０％、４５％、７０％および８０％のトロンビン阻害活性を保持していた（図６Ｄ）。ピークＨ５は主に組換えタンパク質を保存していたため、トロンビン阻害の試験には考慮されなかった。
【００７２】
ａＰＴＴ、ＰＴおよびＴＴにおける組換えタンパク質の効果
最後に、ＰＴ、ａＰＴＴおよびＴＴは、３７℃で３分間の組換えタンパク質とのインキュベーション後の健常ヒトボランティアの分離血漿で評価された。データは、ａＰＴＴおよびＰＴが濃度依存的に組換えタンパク質によって延長されたことを示す（図１１Ａおよび１１Ｂ）。１２ｎＭの後にａＰＴＴの最大試験リーディングが達成され、６ｎＭの組換えタンパク質の後にＰＴが達成された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。一方、ＴＴはピークモル範囲で組換えタンパク質によって延長された（図１１Ｃ）。
【表３】
2020511164.tif 000005
【００７３】
当業者は、本明細書に提示される教示を理解し、添付の特許請求の範囲内に包含される提示されたモデルおよび他の変形形態で本発明を再現し得る。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列表１  ＜２２３＞スカルプチン組換えタンパク質
配列表２〜９  ＜２２３＞トロンビンによって生成されたスカルプチン断片
配列表１０〜１６  ＜２２３＞Ｘａ因子によって生成されたスカルプチン断片
配列表１７  ＜２２３＞スカルプチンをコードする合成遺伝子
【図１】
2020511164.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020511164.tif 000010
【図６】
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【図７Ａ】
2020511164.tif 000012
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月22日(2019.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６によって表される１つの配列を含むことを特徴とする、組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６によって表される１つの配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
ダニのアンブリオマカジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）の唾液腺ｃＤＮＡ由来のものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質を得るためのプロセス。
【請求項４】
配列番号１７によって表される１つの配列を含むことを特徴とする、合成遺伝子。
【請求項５】
配列番号１７によって表される１つの配列からなることを特徴とする、請求項４に記載の合成遺伝子。
【請求項６】
血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための薬剤または医薬組成物を調製するための、スカルプチンまたは請求項１又は２に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項７】
血栓塞栓性疾患の予防および／もしくは治療のための、ならびに／または直接かつ特異的トロンビン阻害剤として使用するための、スカルプチンまたは請求項１又は２に記載の組換えタンパク質を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
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