(57)【要約】  Ｌ−アスパラギン酸の脱炭酸を触媒してβ−アラニンを生成するのに有用な改変デカルボキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列、および改変デカルボキシラーゼポリペプチドの調製プロセス、ならびに産業に関連する条件下での反応プロセスが提供される。また、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、改変デカルボキシラーゼポリペプチドを発現することができる改変宿主細胞、および改変細胞を使用してβ−アラニンを生成する方法も提供される。野生型デカルボキシラーゼと比較して、提供される改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、より良好な活性および安定性を有し、Ｌ−アスパラギン酸および／またはβ−アラニンによる阻害を克服する。β−アラニンの調製のための改変ポリペプチドの使用は、より高い単位活性、より低いコストをもたらし、良好な産業用途の展望を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な反応条件下で、Ｌ−アスパラギン酸の脱炭酸を触媒し、配列番号２よりも良好な活性および／または安定性を有するβ−アラニンを生成することができる、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変デカルボキシラーゼポリペプチド。
【請求項２】
前記適切な反応条件は、約５ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、ｐＨ約４．０〜８．０、温度約１０〜６０℃を含む、請求項１に記載のデカルボキシラーゼポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列は、２、３、４、６、８、１５、１８、２１、２９、３０、３３、３４、３９、４０、４５、４６、５３、６４、６７、６８、７０、８０、８１、９１、９２、９３、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１３０、１３２、１３３、１３５、および１３６から選択される１つ以上のアミノ酸残基に配列番号２の配列とは異なるアミノ酸配列を含み、番号付けは配列番号２に言及し、前記ポリペプチドはデカルボキシラーゼ活性を有する、請求項１または２に記載のデカルボキシラーゼポリペプチド。
【請求項４】
前記デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸残基の１つ以上を含み、
Ｘ２はＦもしくはＳであり、
Ｘ３はＹであり、
Ｘ４はＳであり、
Ｘ６はＭであり、
Ｘ８はＧであり、
Ｘ１５はＴもしくはＩであり、
Ｘ１８はＳもしくはＶであり、
Ｘ２１はＨもしくはＮであり、
Ｘ２９はＳもしくはＴであり、
Ｘ３０はＧであり、
Ｘ３３はＩであり、
Ｘ３４はＬ、Ｙ、もしくはＭであり、
Ｘ３９はＬ、Ｒ、もしくはＭであり、
Ｘ４０はＩもしくはＶであり、
Ｘ４５はＱ、Ｌ、もしくはＰであり、
Ｘ４６はＣもしくはＶであり、
Ｘ５３はＤもしくはＥであり、
Ｘ６４はＷであり、
Ｘ６７はＮもしくはＦであり、
Ｘ６８はＡ、Ｋ、ＲもしくはＥであり、
Ｘ７０はＫであり、
Ｘ８０はＦであり、
Ｘ８１はＭ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＡであり、
Ｘ９１はＹであり、
Ｘ９２はＬもしくはＶであり、
Ｘ９３はＶであり、
Ｘ９９はＮ、Ｔ、ＤもしくはＳであり、
Ｘ１００はＬ、Ｆ、もしくはＷであり、
Ｘ１０２はＴ、Ｋ、ＬもしくはＱであり、
Ｘ１０３はＡであり、
Ｘ１０４はＹ、Ｓ、もしくはＮであり、
Ｘ１０６はＬもしくはＩであり、
Ｘ１０９はＴであり、
Ｘ１１０はＬ、Ｍ、もしくはＳであり、
Ｘ１１１はＡ、ＱもしくはＲであり、
Ｘ１１３はＧであり、
Ｘ１１４はＳ、Ｐ、Ｎ、ＷもしくはＶであり、
Ｘ１１５はＣ、ＦもしくはＷであり、
Ｘ１１６はＮ、ＲもしくはＶであり、
Ｘ１１７はＹもしくはＦであり、
Ｘ１１８はＲもしくはＣであり、
Ｘ１１９はＰ、Ａ、ＶもしくはＬであり、
Ｘ１２１はＧ、Ｓ、Ｔ、ＣもしくはＩであり、
Ｘ１２２はＧもしくはＳであり、
Ｘ１２４はＤ、Ｇ、ＨもしくはＴであり、
Ｘ１２５はＧ、ＤもしくはＩであり、
Ｘ１２６はＳであり、
Ｘ１２７はＥ、Ｒ、Ｄ、Ｉ、Ｓ、ＹもしくはＦであり、
Ｘ１２８はＫもしくはＬであり、
Ｘ１３０はＩであり、
Ｘ１３２はＹもしくはＰであり、
Ｘ１３３はＴ、Ｄ、ＨもしくはＶであり、
Ｘ１３５はＮ、ＨもしくはＱであるか、または
Ｘ１３６はＥ、Ｓ、Ｌ、ＲもしくはＦであり、
番号付けは配列番号２に言及する、請求項３記載のデカルボキシラーゼポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドである、改変ポリペプチド：
（ａ）配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、および３９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）（ａ）に列挙されるアミノ酸配列の１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、および（ｉｉ）（ａ）に列挙される前記１つのアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、または挿入、を有するアミノ酸配列を含む、デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
適切な反応条件下で、Ｌ−アスパラギン酸を脱炭酸し、配列番号２のものよりも高い活性および／または安定性でβ−アラニンを生成することができる、改変デカルボキシラーゼポリペプチド。
【請求項７】
化学結合または物理吸着法によって固体材料に固定化されたポリペプチドであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデカルボキシラーゼポリペプチドから選択される、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、および３８９である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターを含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくはＥ．ｃｏｌｉである、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、培養物からデカルボキシラーゼポリペプチドを得るステップを含む、デカルボキシラーゼポリペプチドを調製する方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養することによって、または請求項１３に記載の方法によって得られるデカルボキシラーゼ触媒であって、前記デカルボキシラーゼ触媒は、デカルボキシラーゼポリペプチドを含む細胞もしくは培養液、またはそれで処理された物品を含み、前記物品は、形質転換細胞の培養から得られる抽出物、前記抽出物からデカルボキシラーゼを単離もしくは精製することによって得られる単離生成物、または形質転換細胞、その抽出物、もしくは前記抽出物の単離生成物を固定化することによって得られる固定化生成物を指す、デカルボキシラーゼ触媒。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物を調製するプロセスであって、
【化１】
2020535810.tif 000018
式中、Ｒは、任意選択的に置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８ヒドロカルビル、または任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリールであり、前記プロセスは、適切な反応条件下で、式（ＩＩ）のアミノ酸基質
【化２】
2020535810.tif 000019
を、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドと接触させることを含む、プロセス。
【請求項１６】
式（Ｉ）の前記生成物はγ−アミノ酪酸：
【化３】
2020535810.tif 000020
である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
式Ａ２の化合物、β−アラニン：
【化４】
2020535810.tif 000021
を調製するためのプロセスであって、式Ａ１の化合物を式Ａ２の化合物に変換する適切な反応条件下で、式Ａ１の化合物
【化５】
2020535810.tif 000022
を、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドと接触させることを含む、プロセス。
【請求項１８】
前記反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記反応条件は、１０℃〜６０℃の温度を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記反応条件は、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０を含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記基質は、５ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌの負荷で存在する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学技術の分野に関し、特に、β−アラニンを生成するための改変デカルボキシラーゼの配列、ならびにその調製方法および反応プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
β−アミノプロピオン酸としても知られるβ−アラニンは、１９７２年にＲｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｒｏｅによってウラシルの分解産物中に発見された。これは非タンパク新生アミノ酸であり、天然に見られる唯一のβ型アミノ酸である。β−アラニンの主な生理活性は、タンパク質、脂肪、および糖の代謝に関与するパントテン酸および補酵素Ａの合成である。これはまた、カルノシンの合成および体内における抗体の形成の促進にも関与しており、抗酸化および免疫応答の低下等の生物学的機能を発揮する。現代の医学研究により、哺乳動物の神経系において、β−アラニンが、脳内の神経伝達物質、イオンチャネルの活性化因子として作用すること、また組織の低酸素症によって引き起こされる肝障害を治療できることも分かっている。ファインケミカルの分野では、β−アラニンは、ポリ（β−アラニン）、めっき緩衝液、色素等の合成に使用される。製薬業界では、β−アラニンは、ビタミンＢ群、パントテン酸カルシウム等の多くの薬物において中間体として使用することができ、様々な代謝に必要な補酵素Ａの構成成分である。さらに、Ｎ−（２，５−ＩＩクロロ−４−シアノチオベンゼン）−β−アラニンは、効果的な抗真菌剤である。したがって、β−アラニンには幅広い用途および市場の展望がある。
【０００３】
β−アラニンは、セリシン、ゼラチン、ゼイン等の加水分解および精製によって得ることができるが、そのような原料の供給源は限られており、コストが高い。現在、β−アラニンは、業界において主に（１）アクリロニトリル法、（２）アクリル酸法、（３）スクシンイミド（スクシンイミド）分解法、（４）β−アミノプロピオニトリル法を含む化学的方法によって製造されている。しかしながら、化学的方法を使用すると汚染ガスが発生する傾向があり、また一部の反応は高温高圧の条件下で行われ、有毒な副産物が生成されるため、結果として精製プロセスが困難になる。化学的方法と比較して、β−アラニンを生成するための酵素的方法は、単純なプロセス、便利な精製、および無公害という特徴を有する近年、これは注目の研究テーマになっているが、これまでに報告されている酵素変換は、低い酵素活性、低い変換率、基質阻害または他の問題を抱えている。
【０００４】
Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ＜＜Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ＞＞，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１，２００５，ｐｐ．５２−５５は、「β−アミノプロピオン酸の合成と応用」という題の記事を掲載した（β−アラニンはβ−アミノプロピオン酸とも称される）。この記事は、Ｃｈｕａｎ  Ｌｉｙａｎｇ  らが、ニトリラーゼを産生する微生物を使用してβ−アミノプロピオニトリルの加水分解を触媒してβ−アラニンを生成し、β−アラニン生成物の濃度が４．２ｇ／Ｌであったことを報告している。Ｔｏｓｈｉｏ  Ｓｈｉｎｉｃｈｉｒｏらは、β−アミノプロパノールのβ−アラニンへの変換に微生物を使用し、生成物の濃度は４ｇ／Ｌに達した。しかしながら、上記の生物学的方法による生産性は低く、工業生産の要件を満たすことは困難である。触媒反応の原理によれば、Ｌ−アスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼは、Ｌ−アスパラギン酸のβ−アラニンおよび二酸化炭素への変換を触媒することができる。この方法は単純であり、環境汚染がほとんどない。しかしながら、天然に見られるＬ−アスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼは、活性または安定性が低く、通常、基質（Ｌ−アスパラギン酸）または生成物（β−アラニン）によって阻害されるため、収率が不十分であり、工業生産の経済的要件を満たすことができない。
【０００５】
発明の内容
１．概要
β−アラニンを製造するための現在の化学プロセスに存在する問題を解決するために、本発明は、高い生成物濃度、穏やかな反応条件、および環境に優しいことを特徴とする酵素変換を使用して、経済的かつ効率的な解決策を提供する。それは操作が簡単で、工業環境において容易にスケールアップされるため、良好な産業用途の展望を有する。
【化１】
2020535810.tif 000002
スキーム１デカルボキシラーゼは、Ｌ−アスパラギン酸のβ−アラニンへの変換を触媒する。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、新規の改変デカルボキシラーゼポリペプチドを提供する。これらの改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、特定の数のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失による、低品質な野生型デカルボキシラーゼの人工的な定方向進化プロセスに由来する。この野生型デカルボキシラーゼは、Ｌ−アスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼであり、１３６アミノ酸からなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来し、配列番号２に示される配列を有する。野生型Ｌ−アスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼは低い活性および不良な安定性を示し、Ｌ−アスパラギン酸（基質）およびβ−アラニン（生成物）はその活性を阻害する。本発明者らによって測定されたように、１００ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸負荷および２０ｇ／Ｌの湿細胞（配列番号２で表される）負荷（ｐＨ７．０、４０℃）の反応条件下で、野生型Ｌ−アスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼは、反応開始後４時間で活性を失い、変換率は≦３０％であった。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示の改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２の活性と少なくとも等しいかまたはそれ以上の活性でＬ−アスパラギン酸をβ−アラニンに変換することができる。本発明によって提供される改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２に対応する野生型デカルボキシラーゼよりも高い活性および／または安定性を有し、Ｌ−アスパラギン酸の二酸化炭素およびβ−アラニンへの変換をより効率的に触媒することができる（スキーム１）。本発明によって提供される改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、たとえ高い基質（Ｌ−アスパラギン酸）濃度または生成物（β−アラニン）濃度であっても阻害されることなく、Ｌ−アスパラギン酸の二酸化炭素およびβ−アラニンへの変換を触媒することができる。これらの改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、残基位置Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ５３、Ｘ６４、Ｘ６７、Ｘ６８、Ｘ７０、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ９１、Ｘ９２、Ｘ９３、Ｘ９９、Ｘ１００、Ｘ１０２、Ｘ１０３、Ｘ１０４、Ｘ１０６、Ｘ１０９、Ｘ１１０、Ｘ１１１、Ｘ１１３、Ｘ１１４、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１１７、Ｘ１１８、Ｘ１１９、Ｘ１２１、Ｘ１２２、Ｘ１２４、Ｘ１２５、Ｘ１２６、Ｘ１２７、Ｘ１２８、Ｘ１３０、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ１３５、Ｘ１３６に、配列番号２の配列と比較して１つ以上の残基が異なるアミノ酸配列を含んでもよい。改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、以下の特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を含む（これらの特徴は、配列番号２の参照配列によるアミノ酸残基の置換である）：Ｌ２Ｆ、Ｌ２Ｓ、Ｒ３Ｙ、Ｔ４Ｓ、Ｌ６Ｍ、Ｓ８Ｇ、Ｖ１５Ｔ、Ｖ１５Ｉ、Ａ１８Ｓ、Ａ１８Ｖ、Ｄ２１Ｈ、Ｄ２１Ｎ、Ｄ２９Ｓ、Ｄ２９Ｔ、Ａ３０Ｇ、Ｖ３３Ｉ、Ｈ３４Ｌ、Ｈ３４Ｙ、Ｈ３４Ｍ、Ｉ３９Ｌ、Ｉ３９Ｒ、Ｉ３９Ｍ、Ｅ４０Ｉ、Ｅ４０Ｖ、Ａ４５Ｑ、Ａ４５Ｌ、Ａ４５Ｐ、Ｉ４６Ｃ、Ｉ４６Ｖ、Ａ５３Ｄ、Ａ５３Ｅ、Ａ６４Ｗ、Ｇ６７Ｎ、Ｇ６７Ｆ、Ｎ６８Ａ、Ｎ６８Ｋ、Ｎ６８Ｒ、Ｎ６８Ｅ、Ｃ７０Ｋ、Ｎ８０Ｆ、Ｐ８１Ｍ、Ｐ８１Ｖ、Ｐ８１Ｉ、Ｐ８１Ｌ、Ｐ８１Ａ、Ｌ９１Ｙ、Ｑ９２Ｌ、Ｑ９２Ｖ、Ａ９３Ｖ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｓ、Ａ１００Ｌ、Ａ１００Ｆ、Ａ１００Ｗ、Ｅ１０２Ｔ、Ｅ１０２Ｋ、Ｅ１０２Ｌ、Ｅ１０２Ｑ、Ｐ１０３Ａ、Ｋ１０４Ｙ、Ｋ１０４Ｓ、Ｋ１０４Ｎ、Ｖ１０６Ｌ、Ｖ１０６Ｉ、Ｄ１０９Ｔ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｓ、Ｄ１１１Ａ、Ｄ１１１Ｑ、Ｄ１１１Ｒ、Ｒ１１３Ｇ、Ｉ１１４Ｓ、Ｉ１１４Ｐ、Ｉ１１４Ｎ、Ｉ１１４Ｗ、Ｉ１１４Ｖ、Ｖ１１５Ｃ、Ｖ１１５Ｆ、Ｖ１１５Ｗ、Ａ１１６Ｎ、Ａ１１６Ｒ、Ａ１１６Ｖ、Ｌ１１７Ｙ、Ｌ１１７Ｆ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｃ、Ｎ１１９Ｐ、Ｎ１１９Ａ、Ｎ１１９Ｖ、Ｎ１１９Ｌ、Ｌ１２１Ｇ、Ｌ１２１Ｓ、Ｌ１２１Ｔ、Ｌ１２１Ｃ、Ｌ１２１Ｉ、Ａ１２２Ｇ、Ａ１２２Ｓ、Ａ１２４Ｄ、Ａ１２４Ｇ、Ａ１２４Ｈ、Ａ１２４Ｔ、Ｌ１２５Ｇ、Ｌ１２５Ｄ、Ｌ１２５Ｉ、Ｐ１２６Ｓ、Ｇ１２７Ｅ、Ｇ１２７Ｒ、Ｇ１２７Ｄ、Ｇ１２７Ｉ、Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１２７Ｙ、Ｇ１２７Ｆ、Ｓ１２８Ｋ、Ｓ１���８Ｌ、Ｌ１３０Ｉ、Ｔ１３２Ｙ、Ｔ１３２Ｐ、Ｓ１３３Ｔ、Ｓ１３３Ｄ、Ｓ１３３Ｈ、Ｓ１３３Ｖ、Ｓ１３５Ｎ、Ｓ１３５Ｈ、Ｓ１３５Ｑ、Ｉ１３６Ｅ、Ｉ１３６Ｓ、Ｉ１３６Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、Ｉ１３６Ｆ；または、上記の差異に加えて、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を含む。
【０００８】
より具体的には、いくつかの実施形態において、配列番号２よりも改善された改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０に対応する配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む。
【００１０】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の同一性は、当該技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムによって得ることができ、ＮＣＢＩ  ＢｌａｓｔｐおよびＢｌａｓｔｎソフトウェアを使用することによって、またはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用することによって、デフォルトパラメータに従って計算することができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用すると、配列番号２〜配列番号３７４のアミノ酸配列同一性は９２．６％である。
【００１１】
別の態様において、本発明は、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、改変デカルボキシラーゼポリペプチドの発現のための１つ以上の制御配列を有する発現ベクターの一部であり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９に対応する配列を含むことができる。
【００１２】
当業者に既知であるように、ヌクレオチドコドンの縮重のために、アミノ酸配列の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９に限定されない。本発明の改変デカルボキシラーゼポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、アミノ酸配列の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０をコードする任意の他のポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００１３】
別の態様において、本開示は、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、改変デカルボキシラーゼポリペプチドを発現することができる発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌宿主細胞であり得る。宿主細胞は、本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼを発現および単離するために使用することができるか、または代替として、基質を生成物に変換するための反応に直接使用することもできる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、全細胞、粗抽出物、単離酵素、または精製酵素の形態の改変デカルボキシラーゼは、単独で、または樹脂への固定化等の固定化された形態で使用することができる。
【００１５】
本開示はまた、式（ＩＩ）のアミノ酸を変換するために本明細書に開示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドを使用して式（Ｉ）のアミノ化合物を調製するプロセスも提供し、
【化２】
2020535810.tif 000003
式中、Ｒは、任意選択的に置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８ヒドロカルビル、または任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリールであり、プロセスは、式（ＩＩ）のアミノ酸基質を、適切な反応条件下でデカルボキシラーゼポリペプチドと接触させることを含み、デカルボキシラーゼポリペプチドは、本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、配列番号２と比較してより高い変換率で式（ＩＩ）の化合物を式（Ｉ）の化合物に変換することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、β−アラニンを調製するプロセスに使用することができる。
【化３】
2020535810.tif 000004
【００１７】
これらの実施形態において、プロセスは、適切な反応条件下で、式Ａ１の化合物
【化４】
2020535810.tif 000005
を、本明細書に開示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドと接触させることを含む。
【００１８】
このプロセスに使用するための改変デカルボキシラーゼポリペプチドの特定の実施形態は、実施例においてさらに提供される。上記のプロセスに使用することができる改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０に対応するアミノ酸配列から選択される１つ以上の配列を含むことができる。
【００１９】
本明細書に開示される改変ポリペプチドを使用する式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物の調製のためのプロセスはいずれも、限定されないが、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、圧力、および反応時間範囲を含む適切な反応条件範囲の下で行うことができる。例えば、いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物の調製を行うことができ、適切な反応条件は、（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（ＩＩ）またはＡ１）、（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの改変ポリペプチド、または改変ポリペプチドを発現する約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの湿細胞、（ｃ）限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノール（ＩＰＡ）を含む有機溶媒の０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）、（ｄ）約４．０〜約８．０のｐＨ、および（ｅ）約１０℃〜約６０℃の温度を含む。
【００２０】
２．詳細
２．１  定義
別途明示的に定義されない限り、本開示で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。
【００２１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化等）に関係なく、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書で互換的に使用される。この定義は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物を含む。
【００２２】
Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）とＬ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）は、本明細書で互換的に使用される。
【００２３】
「改変デカルボキシラーゼ」、「改変デカルボキシラーゼポリペプチド」、「改善されたデカルボキシラーゼポリペプチド」および「改変ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用される。
【００２４】
「細菌」または「湿細胞」は、実施例２および実施例８に示す調製手順で得られた湿細胞を含む、ポリペプチドまたは改変ポリペプチドを発現する宿主細胞を指す。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では互換的に使用される。
【００２６】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の一部（例えば、遺伝子）を指す。
【００２７】
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の源から単離することができ、手作業により意図的に修飾されていない、生物に存在する配列である。
【００２８】
例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「組換え」または「改変」または「天然に存在しない」は、さもなければ天然には存在しないであろう様式で修飾された、またはそれと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組み換え技術を用いた操作によって生成もしくは誘導される、材料または該材料の本来の形態に対応する材料を指す。
【００２９】
「配列同一性」および「相同性」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を指すために本明細書で互換的に使用され（「配列同一性」および「相同性」は一般にパーセンテージとして表される）、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に出現するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと整列する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算することができる。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解するであろう。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＦＭ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｊｏｉｎｔ  Ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）によって実施することができる。パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記参照）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを���むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。その後、累積アライメントスコアを増加することができる限り、ワードヒットは各配列に沿って両方向に伸長する。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一致する残基の対に対するリワードスコア：常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティースコア：常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。累積アライメントスコアがその達成された最大値から量Ｘだけ減少した場合、１つ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向へのワードヒットの拡張が中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、およびデフォルト値として両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）。配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【００３０】
「参照配列」は、配列比較のための基準として使用される規定された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列の断片であってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５の残基の長さ、少なくとも５０の残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部）を含む場合があり、また（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含む場合があるため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって行われる。いくつかの実施形態において、「参照配列」は、野生型配列に限定されることは意図されず、改変または変更された配列を含んでもよい。例えば、「配列番号２に基づく、Ｘ３９に対応する残基にロイシンを有する参照配列」は、プロリンである配列番号２の位置Ｘ３９の対応する残基がロイシンに変更された参照配列を指す。
【００３１】
「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列を、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ内の配列の一部が、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウは、２０の連続した残基より長くてもよく、任意選択的に３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の残基を含む。
【００３２】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において、「に対応する」、「への言及」または「と比較して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の特定の参照配列の残基の番号付けに言及する。換言すると、所与の配列の残基数または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、改変デカルボキシラーゼ等の所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基の一致を最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列と整列させることができる。これらの場合、ギャップは存在するものの、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けは、それらが整列された参照配列に対して行われる。
【００３３】
「アミノ酸の差異」または「残基の差異」は、参照配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と比較した、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸の差異の位置は、本明細書では一般に「Ｘｎ」と称され、ｎは、残基の差異が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較したＸ３９位における残基の差異」は、配列番号２の３９位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが３９位にプロリンを有する場合、「配列番号２と比較したＸ３９位における残基の差異」は、配列番号２の３９位に対応するポリペプチドの位置におけるプロリン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、位置における特定のアミノ酸残基の差異は「ＸｎＹ」として示され、「Ｘｎ」は、前述のように対応する位置を特定し、「Ｙ」は、改変ポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの例において（例えば、表１において）、本開示はまた、慣例的な表示法「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸の差異も提供し、Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、改変ポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。いくつかの例において、本開示の改変ポリペプチドは、参照配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の差異を含んでもよく、これは参照配列と比較して残基の差異が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドの特定の残基位置に１つ以上のアミノ酸残基が使用されてもよく、使用され得る様々なアミノ酸残基は「／」によって隔てられる（例えば、Ｘ３９Ｌ／Ｘ３９Ａ）。
【００３４】
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの修飾を指す。欠失は、改変デカルボキシラーゼの酵素活性を保持しながら、かつ／または改変デカルボキシラーゼの改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、全アミノ酸数の１０％まで、または全アミノ酸数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を含み得る。様々な実施形態において、欠失は、連続的なセグメントを含んでもよいか、または不連続であってもよい。
【００３５】
「挿入」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を付加することによるポリペプチドの修飾を指す。いくつかの実施形態において、改善された改変デカルボキシラーゼは、天然に存在するデカルボキシラーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、および他の改変デカルボキシラーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。アミノ酸は、ポリペプチドの内部部分に挿入され得るか、またはカルボキシル末端もしくはアミノ末端に挿入され得る。本明細書で使用される場合、挿入は、当該技術分野で既知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続的なセグメントであり得るか、または天然に存在するもしくは改変ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸によって隔てられ得る。
【００３６】
本明細書で使用される「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上、および完全長デカルボキシラーゼポリペプチドの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％までであり得る。
【００３７】
「単離されたポリペプチド」は、天然においてそれに付随する他の物質、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド等から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを含む。改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、細胞中、細胞培養培地中に存在し得るか、または溶解物もしくは単離された調製物等の様々な形態で調製され得る。そのため、いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００３８】
「改善された酵素特性」は、野生型デカルボキシラーゼまたは別の改善された改変デカルボキシラーゼ等の参照デカルボキシラーゼと比較して、特定の目的のためにより良好なまたはより望ましい酵素特性を指す。改善された酵素特性は、本開示の改変デカルボキシラーゼポリペプチドによって示される。改善が期待される酵素特性は、限定されないが、酵素活性（基質変換のパーセンテージとして表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性特性、補因子要件、阻害剤に対する耐性（例えば、基質または生成物阻害）、立体特異性および立体選択性（エナンチオ選択性またはジアステレオ選択性を含む）を含む。
【００３９】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的変換を指す。「変換率」または「変換」は、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセンテージを指す。したがって、デカルボキシラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換率」として表現することができる。
【００４０】
「熱安定性」は、一定期間（０．５〜２４時間）にわたって高温（例えば、３０〜８０℃）に曝露された後に同様の活性（例えば、５０％以上）を保持するデカルボキシラーゼポリペプチドを意味する。
【００４１】
「溶媒安定性」は、一定期間（例、０．５〜２４時間）にわたって様々な溶媒（エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル等）に曝露された後に同様の活性（例えば、５０％〜８０％超）を維持するデカルボキシラーゼポリペプチドを指す。
【００４２】
「適切な反応条件」は、本開示のデカルボキシラーゼポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる、生体触媒反応系における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒等）を指す。例示的な「適切な反応条件」が、本開示において提供され、実施例によって例示される。
【００４３】
「ヒドロカルビル」は、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指す。記号「Ｃ」の後の下付きの数字は、特定の基が含み得る炭素原子の数を特定する。例えば、「Ｃ１〜Ｃ８」は、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基を指す。ヒドロカルビル基は、１つ以上の置換基で任意選択的に置換されてもよい。「アリール」は、６〜約２０個の炭素原子の一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。「ヘテロアリール」および「ヘテロ芳香族」は、親芳香族環系の炭素原子の１つ以上がヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、またはＳ）で置き換えられているアリール基を指す。「置換された」は、特定の基またはラジカルを修飾するために使用される場合、特定の基またはラジカルの１つ以上の水素原子が、それぞれ、互いに独立して、同一または異なる置換基によって置き換えられることを意味する。「置換ヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール」は、１つ以上の水素原子が他の置換基で置き換えられたヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール基を指す。「任意選択的な」または「任意選択的に」は、記載される事象または状況が発生する場合と発生しない場合があることを意味し、例えば、「任意選択的に置換されたアリール」は、置換されていてもいなくてもよいアリール基を指す。この説明は、置換アリール基および非置換アリール基の両方を含む。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「化合物」は、本明細書で開示される化合物によって示される構造式および／または化学名に包含される任意の化合物を指す。化合物は、それらの化学構造および／または化学名によって識別され得る。化学構造と化学名が矛盾する場合、化学構造が化合物の同一性を決定する。別途明記または示されない限り、本明細書に記載される化学構造は、記載される化合物の全ての考えられる異性体形態を包含する。
【００４５】
２．２  改変デカルボキシラーゼポリペプチド
本発明は、産業に関連する条件下でのＬ−アスパラギン酸のβ−アラニンへの変換を触媒するのに有用な改変デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を提供する。本開示は、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。野生型デカルボキシラーゼと比較して、本発明によって提供される改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、より良好な活性および安定性を有し、酵素に対するＬ−アスパラギン酸および／またはβ−アラニンの阻害を克服し、β−アラニンの調製のための本発明の改変ポリペプチドの使用は、より高い単位活性、より低いコストをもたらし、良好な産業用途の展望を有する。
【００４６】
以下の表１は、本発明によって開発された改変デカルボキシラーゼポリペプチドを示している。各行は、特定の改変デカルボキシラーゼポリペプチドのヌクレオチド配列番号およびアミノ酸配列番号、ならびに配列番号２と比較した残基の差異を示している。例示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドのそれぞれの触媒性能（反応における全体的な性能、合わせた活性、安定性、および基質または生成物阻害に対する性能）は「＋」で示され、その特定の意味が表２に示される。
【表１−１】
2020535810.tif 000006
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表２】
2020535810.tif 000011
【００４７】
表１に列挙されたアミノ酸配列（すなわち、配列番号２〜３８４の偶数配列識別子）は、それぞれ１３６個のアミノ酸残基を含む。配列番号３８６、３８８、または３９０は、配列番号２と比較して、異なる数のアミノ酸残基の欠失または置換を有する。表２に示される反応条件下で、配列番号３８６、３８８、または３９０の改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２のものよりも高い触媒性能を有する。表２に記載される湿細胞は、表１のアミノ酸配列に対応するデカルボキシラーゼポリペプチドが等量で発現された湿細胞を指す。
【００４８】
２．３  改変デカルボキシラーゼポリペプチドを生成するために使用することができるポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクターおよび宿主細胞
別の態様において、本開示は、本明細書に記載のデカルボキシラーゼ活性を有する改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、改変ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生成するように遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に連結することができる。改変デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応する改変デカルボキシラーゼポリペプチドを発現させることができる。
【００４９】
当業者には明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、目的のタンパク質配列をコードする全ての可能なポリヌクレオチドの説明が提供される。同じアミノ酸が選択可能または同義のコドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、極めて多数のポリヌクレオチドの生成が可能になり、その全てが本明細書に開示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を決定すると、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない様式で１つ以上のコドンを修飾することのみによって、任意の数の異なるポリヌクレオチドを作成することができる。この点に関して、本開示は、表１に列挙された例示的な改変ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかについて、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することにより作成できるポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変更を特に企図しており、配列表の配列番号４〜３９０の偶数配列識別子として開示されるポリペプチドのいずれかは、参照により組み込まれ、それらは全て具体的に開示されると考えられる。
【００５０】
様々な実施形態において、コドンは、組換えタンパク質が産生される宿主細胞に適応するように選択されることが好ましい。例えば、細菌にとって好ましいコドンが細菌において遺伝子を発現させるために使用され、酵母にとって好ましいコドンが酵母において遺伝子を発現させるために使用され、哺乳動物にとって好ましいコドンが哺乳動物細胞における遺伝子発現に使用される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４〜３９０の偶数配列識別子である参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、デカルボキシラーゼ活性、および本明細書に記載される改善された特性のうちの１つ以上を有し、例えば、配列番号２のポリペプチドと比較して増加した活性で化合物Ａ１を化合物Ａ２に変換する能力を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、前述の同一性のパーセンテージを有し、かつ配列番号２と比較して１つ以上のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、本開示は、デカルボキシラーゼ活性を有する改変ポリペプチドを提供し、改変ポリペプチドは、以下の位置から選択される残基の差異を有する配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する組み合わせを含む：Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ５３、Ｘ６４、Ｘ６７、Ｘ６８、Ｘ７０、Ｘ８０、Ｘ８１、Ｘ９１、Ｘ９２、Ｘ９３、Ｘ９９、Ｘ１００、Ｘ１０２、Ｘ１０３、Ｘ１０４、Ｘ１０６、Ｘ１０９、Ｘ１１０、Ｘ１１１、Ｘ１１３、Ｘ１１４、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１１７、Ｘ１１８、Ｘ１１９、Ｘ１２１、Ｘ１２２、Ｘ１２４、Ｘ１２５、Ｘ１２６、Ｘ１２７、Ｘ１２８、Ｘ１３０、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ１３５、Ｘ１３６。
【００５３】
いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３〜３８９の奇数配列識別子を有する配列を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは本明細書に記載のポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルでは、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドと、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、参照ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３８９の奇数配列識別子を有する配列から選択される。
【００５５】
様々な様式で改変ポリペプチドの発現を可能にするように、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを操作することができ、これは、発現を改善するためのコドン最適化による配列のさらなる修飾、追加の制御配列を伴うまたは伴わない適切な発現要素への挿入、ならびに改変ポリペプチドの発現および産生に適した宿主細胞への形質転換を含む。
【００５６】
発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドを操作することが望ましいまたは必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当該技術分野で周知である。ガイダンスを以下に提供する：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２０１０  Ｙｅａｒ  ｕｐｄａｔｅ。
【００５７】
別の態様において、本開示はまた、導入される宿主の種類に応じて、改変デカルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびにプロモーターおよびターミネーター等の１つ以上の発現調節領域、複製起点等を含む、組換え発現ベクターにも関する。代替として、本開示の核酸配列は、核酸配列または該配列を含む核酸構築物を適切な発現ベクターに挿入することによって発現させることもできる。発現ベクターの作成において、コード配列は、コード配列が発現に適した制御配列に連結されるようにベクター内に位置する。
【００５８】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利に使用することができ、かつポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は一般に、ベクターと導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状プラスミドまたは閉環状プラスミドであり得る。発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である、染色体外実体として存在するベクターであってもよく、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体である。ベクターは、自己複製を保証するための任意の要素を含み得る。代替として、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製するベクターであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミドが使用されてもよい。
【００５９】
本開示の実施形態に有用な多くの発現ベクターが市販されている。例示的な発現ベクターは、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプラスミドｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入することによって調製することができる。
【００６０】
別の態様において、本開示は、本開示の改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるデカルボキシラーゼポリペプチドの発現のための１つ以上の制御配列に連結される。本開示の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現のための宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ＫＮＫ１６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞等の細菌細胞；酵母細胞等の真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞等の動物細胞；ならびに植物細胞を含む。例示的な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である。上記の宿主細胞は、野生型であってもよいか、または宿主細胞のゲノム中に保有される野生型デカルボキシラーゼ遺伝子のノックアウト等のゲノム編集による改変細胞であってもよい。上記の宿主細胞に適した培地および増殖条件は、当該技術分野で周知である。
【００６１】
改変デカルボキシラーゼを発現するために使用されるポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術は、とりわけ、電気穿孔、生体粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合を含む。ポリヌクレオチドを細胞に導入する異なる方法は、当業者には明らかである。
【００６２】
２．４  改変デカルボキシラーゼポリペプチドを生成するプロセス
改変デカルボキシラーゼは、デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定方向進化に供することによって得ることができる。例示的な方向性進化技術は、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」（２００９  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ａｓｉａ（Ｐｔｅ）Ｌｔｄ．ＩＳＢＮ：９７８−０−４７０−８２３１４−９）に見ることができる。
【００６３】
改変ポリペプチドの配列が既知である場合、コード化ポリヌクレオチドは、既知の合成方法に従って標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、約１００塩基までの断片を別々に合成し、次いで連結して（例えば、酵素的もしくは化学的連結法またはポリメラーゼ媒介法により）、任意の所望の連続した配列を形成することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動合成法において典型的に実践されるように、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９−６９、またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｏｐｌｅ，１９８４，ＥＭＢＯＪ．３：８０１−０５によって記載される古典的なホスホラミダイト法を用いた化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、例えば、自動ＤＮＡ合成機において、適切なベクターにクローニングされる。さらに、本質的にあらゆる核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから入手可能である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本開示はまた、適切な反応条件下で化合物Ａ１を化合物Ａ２に変換することができる改変デカルボキシラーゼポリペプチドを調製または生成するためのプロセスを提供し、該プロセスは、ポリペプチドの発現に適した培養条件下で改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含み、これらの宿主細胞は、化合物Ａ１を湿細胞の形態の化合物Ａ２に変換するプロセスに直接適用することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドを調製するプロセスは、ポリペプチドを単離することをさらに含む。改変ポリペプチドは、適切な細胞で発現させて、タンパク質精製のための周知の技術のいずれか１つ以上を用いて宿主細胞および／または培養培地から単離（または回収）することができ、タンパク質精製のための技術は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、均質化、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む。
【００６５】
２．５  改変デカルボキシラーゼおよびそれによって調製される化合物の使用方法
別の態様において、本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、アミノ酸の脱炭酸を触媒してアミノ化合物を形成することができる。本開示はまた、本明細書に開示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドを使用して、広範囲の化合物（Ｉ）またはその構造類似体を調製するプロセスも提供する。いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、構造式（Ｉ）の化合物を調製するプロセスに使用することができ、
【化５】
2020535810.tif 000012
式中、Ｒは、任意選択的に置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８アルキル、または任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリールであり、本明細書に記載のプロセスは、適切な反応条件下で、式（ＩＩ）のアミノ酸基質
【化６】
2020535810.tif 000013
を、デカルボキシラーゼポリペプチドと接触させることを含み、デカルボキシラーゼポリペプチドは、本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、配列番号２よりも高い変換率で式（ＩＩ）の化合物を式（Ｉ）の化合物に変換することができる。
【００６６】
上記のように、本開示のプロセスにおいて有用なデカルボキシラーゼポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン酸をβ−アラニンに変換する能力によって特徴付けられ得る。したがって、本明細書に開示されるプロセスの実施形態のいずれにおいてもプロセスを実行することができ、デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２よりも優れた触媒性能でＬ−アスパラギン酸をβ−アラニンに変換することができ、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００６７】
プロセスのいくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアミノ生成物はγ−アミノ酪酸であり、
【化７】
2020535810.tif 000014
式（ＩＩ）のアミノ酸基質はグルタミン酸塩（またはグルタミン酸）である。
【化８】
2020535810.tif 000015
【００６８】
いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、β−アラニンを調製するプロセスに使用することができる。
【化９】
2020535810.tif 000016
【００６９】
これらの実施形態において、本明細書に記載のプロセスは、適切な反応条件下で、式Ａ１の化合物
【化１０】
2020535810.tif 000017
を、本明細書に開示される改変デカルボキシラーゼポリペプチドと接触させることを含む。
【００７０】
プロセスで使用するための改変デカルボキシラーゼポリペプチドの特定の実施形態は、詳細な説明としてさらに提供される。上記プロセスにおいて使用することができる改善された改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２  ３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７１】
前述のように、本開示のプロセスに使用するためのデカルボキシラーゼ活性を有する改変ポリペプチドは一般に、配列番号４〜３９０の偶数配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００７２】
本明細書に記載され、実施例に例示されるように、本開示は、限定されないが、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、および反応時間を含む、本明細書に記載のプロセスに使用され得る一連の適切な反応条件を企図する。本明細書に記載の改変デカルボキシラーゼポリペプチドを使用して基質化合物を生成物化合物に酵素的に変換する方法を行うためのさらなる適切な反応条件は、改変デカルボキシラーゼポリペプチドを、限定されないが、様々な濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験反応条件下で基質化合物と接触させることを含むルーチン実験によって容易に最適化することができ、生成物化合物は、例えば、本明細書に提供される実施例に記載の方法を使用して検出される。
【００７３】
反応混合物中の基質化合物は、例えば、所望の生成物化合物の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および基質から生成物への変換率を考慮に入れて、変更することができる。プロセスのいくつかの実施形態において、適切な反応条件は、少なくとも約０．５〜約４００ｇ／Ｌ、約１〜約４００ｇ／Ｌ、約５〜約４００ｇ／Ｌ、約１０〜約４００ｇ／Ｌ、または約５０〜約４００ｇ／Ｌの基質（ＩＩ）または基質Ａ１の負荷を含む。いくつかの実施形態において、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｇ／Ｌ、少なくとも約３００ｇ／Ｌ、少なくとも約３５０ｇ／Ｌ、少なくとも約４００ｇ／Ｌまたはさらにはそれ以上の基質（ＩＩ）または基質Ａ１の負荷を含む。本明細書に提供される基質負荷の値は、化合物（ＩＩ）またはＡ１の分子量に基づいているが、化合物（ＩＩ）またはＡ１の等モル量の様々な水和物および塩もプロセスに使用され得ることも企図される。
【００７４】
本明細書に記載のプロセスにおいて、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、アミノ酸の脱炭酸を触媒して生成物を形成する。いくつかの実施形態において、反応条件におけるアミノ酸は、Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ，Ｌ−グルタミン酸、Ｄ，Ｌ−システイン、Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｄ，Ｌ−イソロイシン、Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｄ，Ｌ−スレオニンまたはＤ，Ｌ−バリンから選択される化合物を含む。
【００７５】
反応の実施形態において、反応条件は適切なｐＨを含み得る。上記のように、酸もしくは塩基、適切な緩衝液、または緩衝液と加えられる酸もしくは塩基との組み合わせを使用することにより、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲を維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応前および／または反応中に制御することができる。いくつかの実施形態において、適切な反応条件は、約４〜約８の溶液ｐＨ、約５〜約７のｐＨ、約６〜約７のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、反応条件は、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５または８の溶液ｐＨを含む。
【００７６】
本明細書に記載のプロセスの実施形態において、例えば、より高い温度での反応速度の増加、十分な反応期間における酵素の活性を考慮に入れて、反応条件に適切な温度を用いることができる。したがって、いくつかの実施形態において、適切な反応条件は、約１０℃〜約６０℃、約２５℃〜約５０℃、約２５℃〜約４０℃、または約２５℃〜約３０℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、適切な反応温度は、約２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、酵素反応中の温度は、反応全体を通して特定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態において、酵素反応中の温度は、反応過程における温度プロファイルにわたって調整され得る。
【００７７】
改変デカルボキシラーゼを使用するプロセスは、一般に溶媒中で実行される。適切な溶媒は、水、水性緩衝液、有機溶媒、および／または一般に水性溶媒および有機溶媒を含む共溶媒系を含む。水溶液（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝化または非緩衝化され得る。いくつかの実施形態において、改変デカルボキシラーゼポリペプチドを使用するプロセスは、一般に、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン等）、イオン液（例えば、１−メチル４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸等）を含む水性共溶媒系で実行される。水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性であり、単一の液相を提供し得るか、または水性成分と部分的に混和性もしくは非混和性であり、２つの液相を提供し得る。脱炭酸反応中に発生する二酸化炭素は、泡の形成を引き起こす可能性があり、消泡剤が適切に加えられてもよい。例示的な水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を含む。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、デカルボキシラーゼを完全に不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載されるような酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において定義された目的の基質を用いて特定の改変デカルボキシラーゼの酵素活性を測定することにより、容易に特定することができる。プロセスのいくつかの実施形態において、適切な反応条件は、約１％〜約１００％（ｖ／ｖ）、約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約５０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールを含む水性共溶媒を含む。プロセスのいくつかの実施形態において、適切な反応条件は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールを含む水性共溶媒を含む。
【００７８】
適切な反応条件は、基質化合物のその対応する生成物化合物への生体触媒変換を提供する反応パラメータの組み合わせを含むことができる。したがって、プロセスのいくつかの実施形態において、反応パラメータの組み合わせは以下を含む：（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの基質Ａ１負荷、（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの改変ポリペプチド濃度、（ｃ）約４．０〜８．０のｐＨ、および（ｄ）約１０℃〜６０℃の温度。
【００７９】
例示的な反応条件は、表２および実施例３に提供されるアッセイ条件を含む
【００８０】
本明細書に記載の脱炭酸反応を行う際に、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは、部分的に精製されたもしくは精製された形態で、改変デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、ならびに／または細胞抽出物および／もしくは溶解物として、反応混合物に加えられてもよい。改変デカルボキシラーゼまたは細胞抽出物、その溶解物、および単離された酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）または半固体（例えば、ウェットセル等の粗ペースト）を含む多種多様な異なる形態で使用することができる。細胞抽出物または細胞溶解物は、凍結乾燥の前に、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理等）、続いて脱塩手順（例えば、限外濾過、透析等）によって部分的に精製することができる。酵素調製物のいずれも、グルタルアルデヒド等の既知の架橋剤を使用した架橋、または固相材料（樹脂等）への固定化によって安定化させることができる。
【００８１】
本明細書に記載の脱炭酸反応のいくつかの実施形態において、反応は本明細書に記載の適切な反応条件下で行われ、改変デカルボキシラーゼポリペプチドは固体支持体に固定化される。反応を実施するために改変デカルボキシラーゼ酵素を固定化するのに有用な固体支持体は、限定されないが、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシ官能基を有するポリメタクリレート、ポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレート等のビーズまたは樹脂を含む。例示的な固体支持体は、限定されないが、以下の異なる種類のＳＥＰＡＢＥＡＤを含む、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、およびＳＥＰＡＢＥＡＤ（三菱）を含む：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０。
【００８２】
改変ポリペプチドが分泌ポリペプチドの形態で発現されるいくつかの実施形態において、分泌ポリペプチドを含む培養培地を本明細書に記載のプロセスに使用することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、固体反応物（例えば、酵素、塩等）は、粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）、溶液、乳液、懸濁液等を含む様々な異なる形態で反応に提供され得る。など。反応物は、当業者に既知の方法および機器を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液の少量のアリコートを−８０℃で凍結し、次いで、事前に冷却した凍結乾燥チャンバに加えた後、真空をかけることができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、反応物の添加の順序は重要ではない。反応物は同時に溶媒に一緒に加えられてもよいか（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系等）、または代替として、いくつかの反応物は別々に加えられてもよく、いくつかは異なる時点に一緒に加えられてもよい。例えば、デカルボキシラーゼと基質を最初に溶媒に加え、次いで、有機相を加えて混合してもよい。代替として、水相への添加の前に、有機相で基質を予備混合することもできる。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明はそれに限定されない。以下の実施例では、条件が指定されていない実験方法は、一般的に使用される条件で、または供給業者の提案に従って実施されました。
【００８６】
実施例１：遺伝子クローニングおよび発現ベクターの構築
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来する野生型デカルボキシラーゼのアミノ酸配列はＮＣＢＩから調達することができ、その後、対応する核酸が、当該技術分野における従来技術を使用して供給業者によって合成され、発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１にクローニングされた。組換え発現プラスミドを、４２℃および９０秒間の熱ショックの条件下でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに形質転換溶液を播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。組換え形質転換体を得た。
【００８７】
実施例２：デカルボキシラーゼポリペプチドの発現、およびデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する湿細胞の調製
本発明の湿細胞調製ステップは以下の通りである：実施例１で得た組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、２５０ｍＬ三角フラスコ内のクロラムフェニコールを含む５０ｍＬのＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス粉末５ｇ／Ｌ、塩素化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０±０．２、２５℃）に接種し、次いで、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩振盪した。継代培養液のＯＤ６００が２に達したとき、振盪インキュベーターにおいて、２５０ｍＬのＴＢ培地（トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム９．４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２±０．２、３０℃）を含む１０００ｍＬフラスコに培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで継代培養した、継代培養液のＯＤ６００が０．６〜０．８に達したとき、誘導剤としてＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加えた。３０℃で２０時間誘導した後、培養液を遠心分離した（８０００ｒｐｍ、１０分）：遠心分離後に上清を廃棄し、細胞ペレットを回収して湿細胞を得た。得られた湿細胞は、反応に直接使用することができるか、または使用のために−２０℃の冷蔵庫に入れることができる。
【００８８】
上記の振盪フラスコを使用した組換え発現プロセスに従って、スケールを比例的に縮小することにより９６ウェルプレートでの小規模発現プロセスを行い、上清培地を遠心分離して湿細胞を得た。必要に応じて、粉砕することにより酵素溶液を得ることができる。
【００８９】
例３：ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳ分析方法
ＨＰＬＣ分析方法：分析カラムはＣｈｉｌｅｘ−３１２６  ３０ｍｍ×４．６ｕｍ、移動相は３ｍＭ  ＣｕＳＯ４、流量は１．２ｍＬ／分、カラム温度は４５℃、検出波長は２３０ｎｍ、分析時間は４分である。β−アラニンの滞留時間は１．４５分、Ｌ−アスパラギン酸の滞留時間は２．５分である。
【００９０】
ＬＣ／ＭＳ分析法：ＬＣ検出波長は２３０ｎｍ、カラム温度は３０℃、流量１はｍＬ／分、移動相Ａは０．１％ギ酸水溶液（ｐＨ２．７５）の７０％、移動相Ｂは、メタノール中０．１％ギ酸の３０％である。質量分析法はＭＲＭであり、基質は１３４．１の親イオンの質量電荷比、７３．９の質量電荷比、２０Ｖのコーン電圧、１８Ｖの衝突セル電圧、８９．９７の生成物親イオンの質量電荷比、７１．８の質量電荷比、および２０Ｖのコーン電圧を有する。衝突セル電圧は１２Ｖ、注入量は１０ｕＬ、検出時間は１．６７分、β−アラニンおよびＬ−アスパラギン酸のピーク時間は０．２５分であった。
【００９１】
実施例４：デカルボキシラーゼ変異体ライブラリーの構築
ここでは、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（供給業者：Ａｇｉｌｅｎｔ）を好ましく使用した。突然変異誘発プライマーの配列設計は、キットの指示に従って行った。次に、単一の残基位置を有する飽和変異体ライブラリーの構築を一例として説明する。ＰＣＲシステムは、１０μｌの５×バッファー、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌのプラスミドＤＮＡテンプレート（５０ｎｇ／μｌ）、０．７５μｌ（１０ｕＭ）の上流および下流プライマー、０．５μｌの高忠実度酵素、ならびに３６μｌのｄｄＨ２Ｏからなり、ＰＣＲプライマーは変異位置にＮＮＫコドンを有する。ＰＣＲ増幅ステップ：（１）９８℃で３分間の前変性、（２）９８℃で１０秒間の変性、（３）７２℃で３分間のアニーリングおよび伸長、（２）〜（３）のステップを２５回繰り返し、（５）７２℃で１０分間の伸長、（６）４℃に冷却し、２μｌのＤｐｎＩをＰＣＲ産物に加え、３７℃で一晩消化させることによりプラスミドテンプレートを除去した。消化されたＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに播種して、標的残基位置の飽和変異体ライブラリーを得た。
【００９２】
実施例５：変異体酵素ライブラリーのスクリーニング
変異体酵素ライブラリーのコロニーを寒天プレートから採取し、９６ウェルの浅いプレートにクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に接種し（ウェル当たり２００μｌのＬＢ培地）、１８０ｒｐｍ、湿度８０％、３０℃で一晩振盪機に入れ、１８〜２０時間培養した。培養液のＯＤ６００が２〜３に達したとき、培養液２０μｌを９６ウェルの浅いプレートから取り出し、９６ウェルの深いウェルプレート中にクロラムフェニコールを含むＴＢ培地に接種し（ウェルあたりＴＢ培地４００μｌ）、２５０ｒｐｍの振盪機に入れ、３０℃および湿度８０％でインキュベートした。培養液のＯＤ６００が０．６〜０．８に達したとき、誘導剤としてＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加え、２５０ｒｐｍ、湿度８０％、３０℃で一晩（１８〜２０時間）、振盪機内で発現を行った。一晩の発現が終了してから、培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞ペレット（すなわち湿細胞）を得た。湿細胞を、使用のために−２０℃の冷凍庫に入れた。
【００９３】
スクリーニングアッセイは次のように実行した：４０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸溶液を調製し、アンモニア水または塩酸で溶液のｐＨを６に調整し、次いで、後に使用するために４℃の冷蔵庫に入れた。上記で調製した湿細胞を含む９６ウェルプレートを−２０℃の冷蔵庫から取り出し、分注器で各ウェルに４００μｌの純水を加え、次いでプレートを膜でヒートシールし、プレート振盪機で１０分間、７００ｒｐｍで振盪して細胞を再懸濁させた。次いで、２０μｌの細胞懸濁液を新しい深いウェルプレートに入れ、１００μｌの上記で調製したＬ−アスパラギン酸溶液をその深いウェルプレートに加えた。最後に、ＰＢＳ緩衝液を反応物に加え、ｐＨ７の０．１Ｍ  ＰＢＳで２００μｌ／ウェルの総反応体積とした。次いで、５０℃の振盪機で、２５０ｒｐｍの回転速度で１６時間反応を行った後、ＬＣ／ＭＳ分析を行って生成物の形成を検出した。
【００９４】
実施例６：改変デカルボキシラーゼポリペプチドによって触媒されるβ−アラニンの調製のためのプロセス
配列番号３６０のポリペプチドを発現する５ｇの湿細胞を水で再懸濁して、最終体積１５０ｍＬとした。５０ｇのＬ−アスパラギン酸を３００ｍＬの純水に加え、そのｐＨをアンモニアで６．０〜７．０に調整し、その最終体積を水で３５０ｍＬに調整した。このＬ−アスパラギン酸の溶液に、上記で調製した１５０ｍＬの細胞懸濁液を加えて反応を開始し、反応中に２１％リン酸溶液を加えて、反応溶液のｐＨを６．０〜７．０に制御した。反応温度は、４０℃〜５０℃に制御した。２４時間の反応後、Ｌ−アスパラギン酸のβ−アラニンへの変換率は≧９５％であった。
【００９５】
実施例７：基質または生成物阻害を克服するためのスクリーニングアッセイ
２００ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸および２００ｇ／Ｌのβ−アラニンの混合溶液を調製し、その調製中にアンモニアおよび／または塩酸で溶液のｐＨを６に調整し、次いで、後に使用するために４℃の冷蔵庫に入れた。実施例５に示した手順と同様に、９６ウェルプレート内の湿細胞を水に再懸濁し、８０μｌの細胞懸濁液を新しい深いウェルプレートに入れた。このプレートの各ウェルに、上記で調製したＬ−アスパラギン酸とβ−アラニンの混合溶液を１００μｌ加えた。反応系の緩衝液はｐＨ６の０．３Ｍ  ＰＢＳであり、反応溶液の総体積は２００μｌであった。最後に、ＰＢＳ緩衝液を反応物に加えて、ｐＨ６の０．３Ｍ  ＰＢＳで２００μｌ／ウェルの総反応体積とした。次いで、５０℃の振盪機で、２５０ｒｐｍで１６時間反応を行った後、ＬＣ／ＭＳまたはＨＰＬＣ分析を行って生成物の形成を検出した。
【００９６】
実施例８：改変デカルボキシラーゼポリペプチドの発現のための発酵プロセス
標的デカルボキシラーゼポリペプチドを担持する発現プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む５０ｍＬのＬＢブロス（５．０ｇ／Ｌ酵母エキスＬＰ００２１、１０ｇ／ＬトリプトンＬＰ００４２、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に接種した。３０℃の振盪機で、２５０ｒｐｍで振盪しながら、細胞を一晩（少なくとも１６時間）培養した。
【００９７】
２．０Ｌの増殖培地を含む５Ｌの発酵槽を、１２１℃のオートクレーブで３０分間滅菌した。発酵槽に一晩培養したＥ．ｃｏｌｉを接種した（前述のように振盪フラスコで１．４〜２．０の初期ＯＤ６００まで増殖させた）。発酵槽の温度を３０℃に維持し、ジャケット付き循環水で制御した。発酵槽内の増殖培地を２００〜８００ｒｐｍで撹拌し、空気を２〜８Ｌ／分で供給して、溶存酸素レベルを飽和の４０％以上に維持した。２５〜２８％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムを加えることにより培養物をｐＨ７．０に維持した。５００ｇ／Ｌのデキストロースグルコース一水和物、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、および５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物を含むフィード溶液を供給することにより、細胞の増殖を維持した。培養物のＯＤ６００が２５±５に達した後、発酵槽の温度を３０℃に維持し、１ｍＭの最終濃度までイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることにより、デカルボキシラーゼの発現を誘導した。次いで、発酵プロセスをさらに１８時間続けた。発酵プロセスが完了した後、Ｔｈｅｒｍｏ  ＭｕＬｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒ遠心機を４℃で１０分間、８０００ｒｐｍで使用して細胞を回収した。採取した細胞は、反応プロセスに直接使用したが、−２０℃で凍結保存することもできる。
【００９８】
実施例９：デカルボキシラーゼポリペプチドを改変することによって触媒されるγ−アミノ酪酸を生成するためのグルタミン酸の脱炭酸のためのプロセス
１０ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸溶液を調製し、その調製中にＫＯＨでｐＨを６に調整した。配列番号１６４のポリペプチドを発現する２００ｍｇの湿細胞を反応フラスコに加え、上記で調製したＬ−グルタミン酸溶液２．５ｍＬを反応フラスコに加え、純水を全体に加えて反応液の総体積を５．０ｍＬとした。反応は、温度３０℃、撹拌速度４００ｒｐｍで進行した。２０時間の反応後、９５℃で１０分間加熱して反応を停止した。次いで、反応物のアリコートを０．３％塩酸で検出濃度まで希釈した後、ＨＰＬＣ分析を行った。Ｌ−グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は≧７０％であった。ＨＰＬＣ分析法は以下の通りであった。カラム：Ｅｌｉｔｅ−ＮＨ２  １５０＊４．６ｍｍ、移動相：［アセトニトリル：ｐＨ３．５＝６５：３５の０．０２Ｍリン酸二水素カリウム溶液］、カラム温度３０℃、検出波長２０５ｎｍ、流量１．５ｍＬ／分。
【００９９】
本発明の上記内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な修正または変更を加えることができることを理解されたい。また、これらの同等の形態も、本発明の添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【配列表】
2020535810000001.app
【国際調査報告】
2020535810.tif 000023
2020535810.tif 000024
2020535810.tif 000025
2020535810.tif 000026