(57)【要約】  本開示は、エピトープの部分を含むポリペプチド及びポリペプチド−核酸コンジュゲート、ならびにアプタマーなどの標的分子結合成分を用いて、テンプレート配列を提示する方法を提供し、標的分子結合成分は、認識分子のためのエピトープのテンプレート化アセンブリの目的のため、特異的細胞標的に固有の標的分子に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓを含む、単離ポリペプチドであって、
Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり；Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり；及びＸａａ3は、Ｓｅｒ（配列番号１）であり；
Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり；及びＸａａ3は、Ｓｅｒ（配列番号２）であり；または
Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり；及びＸａａ3は、Ｃｙｓ（配列番号３）である、前記単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのＮ末端が、ビオチンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓを含む、単離ポリペプチドであって、
Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号４）；
Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号５）；
Ｘａａ3は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号６）；
Ｘａａ4は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号７）；
Ｘａａ5は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号８）；
Ｘａａ6は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号９）；
Ｘａａ7は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１０）；
Ｘａａ8は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１１）；
Ｘａａ9は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１２）；
Ｘａａ10は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11はなく（配列番号１３）；または
Ｘａａ11は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はない（配列番号１４）、前記単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドのＮ末端が、ビオチンを含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
一対のポリペプチドを含む、組成物であって、
前記一対のポリペプチドが、
ａ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕ（配列番号１５）及びＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；
ｂ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕ（配列番号１７）及びＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；または
ｃ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕ（配列番号１９）及びＸａａ3Ｈｉｓ、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓである、前記組成物。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドのＣ末端が、第１のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、及び前記第２のポリペプチドのＮ末端が、第２のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、前記第１のバイオオルソゴナル反応基及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、互換性がある、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、直鎖アルキンであり、及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり、または前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、直鎖アルキンであり、及び前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり；
前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、歪みアルキンであり、及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり、または前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、歪みアルキンであり、及び前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり；または
前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、テトラジンであり、及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、シクロオクテンであり、または前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、テトラジンであり、及び前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、シクロオクテンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドのＣ末端が、第１の化学修飾をさらに含み、及び前記第２のポリペプチドのＮ末端が、第２の化学修飾をさらに含み、前記化学修飾及び前記第２の化学修飾が、互換性がある、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の化学修飾が、アミド化（ＣＯＮＨ2）またはエステル化（ＣＯＯＲ）であり、Ｒが、メチル、エチル、またはフェニルであり；及び
前記第２の化学修飾が、アセチル化または前記Ｎ末端アミノ基のＮ−メチル置換である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
一対のポリペプチドを含む、組成物であって、
前記一対のポリペプチドが、
ａ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎ（配列番号２０）及びＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２１）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｂ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1Ｌｅｕ（配列番号１５）及びＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２２）であり、式中、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｃ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2Ｇｌｙ（配列番号２３）及びＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ3は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｄ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3Ｐｒｏ（配列番号２４）及びＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２５）であり、式中、Ｘａａ4は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｅ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4Ｔｙｒ（配列番号１６）及びＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２７）であり、式中、Ｘａａ5は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｆ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5Ｇｌｕ（配列番号１７）及びＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２８）であり、式中、Ｘａａ6は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｇ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6Ｌｅｕ（配列番号２９）及びＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ7は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｈ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7Ｔｒｐ（配列番号３０）及びＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３１）であり、式中、Ｘａａ8は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｉ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8Ｇｌｕ（配列番号３２）及びＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３３）であり、式中、Ｘａａ9は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｊ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9Ｌｅｕ（配列番号１９）及びＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ、式中、Ｘａａ10は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11はなく；または
ｋ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10Ｓｅｒ（配列番号３４）及びＸａａ11Ｈｉｓ、式中、Ｘａａ11は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はない、前記組成物。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドのＣ末端が、第１のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、及び前記第２のポリペプチドのＮ末端が、第２のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、前記第１のバイオオルソゴナル反応基及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、互換性がある、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、直鎖アルキンであり、及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり、または前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、直鎖アルキンであり、及び前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり；
前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、歪みアルキンであり、及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり、または前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、歪みアルキンであり、及び前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、アジドであり；または
前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、テトラジンであり、及び前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、シクロオクテンであり、または前記第２のバイオオルソゴナル反応基が、テトラジンであり、及び前記第１のバイオオルソゴナル反応基が、シクロオクテンであるである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１のポリペプチドのＣ末端が、第１の化学修飾をさらに含み、及び前記第２のポリペプチドのＮ末端が、第２の化学修飾をさらに含み、前記化学修飾及び前記第２の化学修飾が、互換性がある、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１の化学修飾が、アミド化（ＣＯＮＨ2）またはエステル化（ＣＯＯＲ）であり、Ｒが、メチル、エチル、またはフェニルであり；及び
前記第２の化学修飾が、アセチル化または前記Ｎ末端アミノ基のＮ−メチル置換である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１のポリペプチドが、第１の核酸分子にコンジュゲートされ、及び前記第２のポリペプチドが、第２の核酸分子にコンジュゲートされる、請求項５〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、
ａ）前記標的細胞を一本鎖アプタマーと接触させること、
前記一本鎖アプタマーは、
ｉ）前記標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及び
ｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで前記第１の部分に連結した核酸分子を含む前記第２の部分；及び
を含み、
ｂ）前記標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させること；
を含み、
前記第１のエピトープハプロマーは、
ｉ）前記一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及び
ｉｉ）前記エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティ；
を含み、
前記第２のエピトープハプロマーは、
ｉ）前記一本鎖アプタマーの前記第２の部分に相補性のある核酸分子；及び
ｉｉ）前記エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティ；
を含み、
前記第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、前記第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある前記一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に空間的に近接している前記一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に相補性のある；及び
前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、前記エピトープの特異的アセンブリをもたらす、前記方法。
【請求項１７】
認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、
ａ）前記標的細胞を二本鎖近接アプタマー対と接触させること、前記二本鎖近接アプタマー対は、第１のアプタマー及び第２のアプタマーを含み、
前記第１のアプタマーは、
ｉ）前記標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及び
ｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで前記第１の部分に連結した核酸分子を含む前記第２の部分；及び
を含み、
前記第２のアプタマーは、
ｉ）前記標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及び
ｉｉ）前記第２の部分の３’または５’末端のいずれかで前記第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分；及び
を含み、
ｂ）前記標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させること；
を含み、
前記第１のエピトープハプロマーは、
ｉ）前記第１のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及び
ｉｉ）前記エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティ；
を含み、
前記第２のエピトープハプロマーは、
ｉ）前記第２のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及び
ｉｉ）前記エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティ；
を含み、
前記第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、前記第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある前記第２のアプタマーの第２の部分の領域に空間的に近接している前記第１のアプタマーの第２の部分の領域に相補性のある；及び
前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、前記エピトープの特異的アセンブリをもたらす、前記方法。
【請求項１８】
両方のアプタマーが、前記アプタマー対が物理的に近接するように、同じ標的分子に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
各アプタマーが、前記アプタマー対が物理的に近接するように、同じ細胞上の異なる標的分子に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記アプタマー対の５’及び３’末端が、一緒に連結される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、
ａ）前記標的細胞をバイナリーアプタマーと接触させること、前記バイナリーアプタマーは、
ｉ）前記標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；
ｉｉ）前記標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第２の部分；及び
ｉｉｉ）前記第１及び第２の部分の間に位置した核酸分子を含む第３の部分；及び
を含み、
ｂ）前記標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させること；
を含み、
前記第１のエピトープハプロマーは、
ｉ）前記バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子；及び
ｉｉ）前記エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティ；
を含み、
前記第２のエピトープハプロマーは、
ｉ）前記バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子；及び
ｉｉ）前記エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティ；
を含み、
前記第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、前記第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある前記バイナリーアプタマーの第３の部分の領域に空間的に近接している前記バイナリーアプタマーの第３の部分の領域に相補性のある；及び
前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、前記エピトープの特異的アセンブリをもたらす、前記方法。
【請求項２２】
前記バイナリーアプタマーの第１の部分及び前記バイナリーアプタマーの第２の部分が、両方とも核酸分子であり、各核酸分子が、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチドの長さを含み、約５５℃〜約６５℃のＴmを有し、前記第１の部分及び第２の部分の間に位置する前記バイナリーアプタマーの第３の部分が、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの長さを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子のうちのいずれか１つまたは複数が、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート変性ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ類）、プソイドウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、または塩基対形成が可能な他の核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のエピトープハプロマー及び前記第２のエピトープハプロマーのいずれかまたは両方の核酸分子、及びそれらに相補性のある前記アプタマーのモイエティが両方とも、Ｌ−ＤＮＡを含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のエピトープハプロマー及び／または前記第２のエピトープハプロマーの核酸分子が、約１０〜約１８ヌクレオチドの長さを含む、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的細胞が、がん細胞またはウイルス感染細胞である、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的分子が、抗体または細胞表面タンパク質である、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、ＩｇＭである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞表面タンパク質が、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記認識分子が、抗体、またはその断片である、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記一本鎖アプタマーの第１の部分、前記二本鎖近接アプタマー対の各アプタマーの第１の部分、または前記バイナリーアプタマーの第１の部分及び第２の部分が、前記標的分子のリガンドである、請求項１６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記リガンドが、αメラニン細胞刺激ホルモンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕ（配列番号１５）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ1が、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2が、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3が、Ｓｅｒであり；
ｂ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕ（配列番号１７）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ1が、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3が、Ｓｅｒであり；
ｃ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕ（配列番号１９）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ3Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ1が、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2が、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3が、Ｃｙｓであり；
ｄ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎ（配列番号２０）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２１）であり、式中、Ｘａａ1が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｅ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1Ｌｅｕ（配列番号１５）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２２）であり、式中、Ｘａａ2が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｆ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2Ｇｌｙ（配列番号２３）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ3が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｇ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3Ｐｒｏ（配列番号２４）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２５）であり、式中、Ｘａａ4が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｈ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4Ｔｙｒ（配列番号２６）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２７）であり、式中、Ｘａａ5が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｉ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5Ｇｌｕ（配列番号１７）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２８）であり、式中、Ｘａａ6が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｊ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6Ｌｅｕ（配列番号２９）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ7が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｋ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7Ｔｒｐ（配列番号３０）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３１）であり、式中、Ｘａａ8が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｌ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8Ｇｌｕ（配列番号３２）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３３）であり、式中、Ｘａａ9が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11がなく；
ｍ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9Ｌｅｕ（配列番号１９）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ10が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11がなく；または
ｎ）前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方が、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10Ｓｅｒ（配列番号３４）であり、及び前記第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び前記第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方が、Ｘａａ11Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ11が、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はない、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アプタマー（複数可）及び第１及び第２のエピトープハプロマーを、それを必要とするヒトに投与する、請求項１６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アセンブリエピトープに選択的に結合する治療薬を前記ヒトに投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記エピトープがｅｒｂ−Ｂ２である場合、前記治療薬が、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一部には、エピトープの部分を含むポリペプチド及びポリペプチド−核酸コンジュゲート、及びアプタマーなどの標的分子結合成分を用いて、テンプレート配列を提示する方法を提供し、標的分子結合成分は、認識分子のためのエピトープのテンプレート化アセンブリの目的のため、特異的細胞標的に固有の標的分子に結合する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤開発の目標は、ウイルス感染細胞、新生細胞、自己免疫反応を産生している細胞、及び他の調節または機能不全細胞などの、病原性細胞に強力な生物学的薬剤による治療介入を送達することである。病原性細胞と闘うことができる強力な生物学的薬剤による治療介入の例としては、免疫細胞を再指向させて、病原性細胞を排除する毒素、アポトーシス促進剤、及び免疫療法アプローチが挙げられる。残念ながら、これらの薬剤の開発は、隣接する正常細胞または患者の全体的な健康に対する毒性のリスクが高いため、極めて困難である。
【０００３】
正常細胞への毒性を軽減する一方で、病原性細胞に対しては強力な治療介入の送達を可能にするために浮上してきた方法は、病原性細胞に特異的な分子マーカーに対して治療薬を指向させることによる治療薬の標的化である。標的化治療薬は、制約された場合においては、驚くべき臨床結果を示したが、現在、標的化治療に対して利用可能なマーカーの欠如により、それらの応用には限界がある。多く病原性細胞の種類に対して、タンパク質マーカーを発見することは、極めて難しく、及び多くの場合は不可能である。
【０００４】
より最近では、病原性細胞に特異的な核酸標的を標的化した治療が開発されている。ｓｉＲＮＡなどの、既存の核酸標的化治療は、潜在的に危険な遺伝子の発現を下方調整できるが、強力な細胞毒性のまたは細胞増殖抑制性の治療介入を送達しないため、その危険な細胞自体を排除するのに特に効果的なわけではない。従って、既存の生物学的薬剤による治療介入の非力な効果及び／または重度の副作用と闘う必要性が存在する。
【０００５】
タンパク質または他の高分子において近位結合部位を見つけることは、簡単なハイブリダイゼーション規則に従って行うことができない。容易に適用されるデジタルコードではなく、リガンド結合は、アナログプロセスとして見ることができ、リガンド及びその受容体ポケットは、形状ベースの相補性を共有する。かかるリガンド媒介性テンプレート化の合理的な設計は、そのため、詳細な三次元の構造情報を必要とする。（可能な標的テンプレートと見なされる）タンパク質の結晶構造が利用可能である場合でも、相互作用リガンドの設計は、難易度がさらに上がり、特に、かかるリガンドは、互いに対して厳しく禁止された空間的境界内で結合しなければならない。さらに、かかる設計はまた、所望の空間的近接を不用意に破壊することができる結合関連配座変化（アロステリーに類似）の可能性を考慮に入れなければならない。これらの注意事項は、テンプレート化の目的のために、特異的タンパク質選択を試験することを除外しない一方、標的異常細胞における非核酸テンプレートを、現実的な時間枠で発見する難しさを強調している。
【０００６】
特定のがんに対する治療に対して多くの進歩が近年なされているが、非常に多くの治療ギャップがいまだ存在する。より良い治療に対するかかる満たされていないニーズは、多くの腫瘍型に非常に適用可能である。さらに、特定の病理細胞または望ましくない細胞を標的化することができる一般的治療が望まれる。
【発明の概要】
【０００７】
全ての可能な認識分子のうちで、例えば、規定されたエピトープを認識する任意のモノクローナル抗体を使用して、スプリットエピトープ・クリック・アセンブリ戦略を考案することができた。実際に、かかる選択を行う重要な考慮事項には、入手可能な構造情報のレベル、及び抗体または他の認識分子のアベイラビリティが含まれる。トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））によるＨＥＲ−２（ｅｒｂ−Ｂ２；ある特定の腫瘍で発現されるが、特に、乳癌のサブセットで発現される）の認識が適当である。ＨＥＲ−２と複合したトラスツズマブの構造は解明されており、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、腫瘍治療薬として有効であることが証明されている。
【０００８】
一般に、本開示は、式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓを含む、単離ポリペプチドであって、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒ（配列番号１）であり；Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒ（配列番号２）であり；またはＸａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓ（配列番号３）である、単離ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本開示はまた、式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓを含む、単離ポリペプチドであって、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号４）；Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号５）；Ｘａａ3は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号６）；Ｘａａ4は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号７）；Ｘａａ5は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号８）；Ｘａａ6は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号９）；Ｘａａ7は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１０）；Ｘａａ8は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１１）；Ｘａａ9は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１２）；Ｘａａ10は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11はなく（配列番号１３）；またはＸａａ11は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はなく（配列番号１４）である、単離ポリペプチドを提供する。
【００１０】
本開示はまた、一対のポリペプチドを含む組成物であって、一対のポリペプチドは、ａ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕ（配列番号１５）及びＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；ｂ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕ（配列番号１７）及びＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；またはｃ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕ（配列番号１９）及びＸａａ3Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓである、組成物を提供する。
【００１１】
本開示はまた、一対のポリペプチドを含む組成物であって、一対のポリペプチドは、ａ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎ（配列番号２０）及びＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２１）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｂ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1Ｌｅｕ（配列番号１５）及びＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２２）であり、式中、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｃ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2Ｇｌｙ（配列番号２３）及びＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ3は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｄ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3Ｐｒｏ（配列番号２４）及びＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２５）であり、式中、Ｘａａ4は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｅ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4Ｔｙｒ（配列番号２６）及びＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２７）であり、式中、Ｘａａ5は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｆ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5Ｇｌｕ（配列番号１７）及びＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２８）であり、式中、Ｘａａ6は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｇ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6Ｌｅｕ（配列番号２９）及びＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ7は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｈ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌ���ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7Ｔｒｐ（配列番号３０）及びＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３１）であり、式中、Ｘａａ8は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｉ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8Ｇｌｕ（配列番号３２）及びＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３３）であり、式中、Ｘａａ9は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；ｊ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9Ｌｅｕ（配列番号１９）及びＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ10は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11はなく；またはｋ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10Ｓｅｒ（配列番号３４）及びＸａａ11Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ11は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はない、組成物を提供する。
【００１２】
本開示はまた、認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、ａ）標的細胞を標的分子結合成分と接触させること、標的分子結合成分は、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含み；及びｂ）標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることを含み；第１のエピトープハプロマーは、ｉ）標的分子結合成分の第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第２のエピトープハプロマーは、ｉ）標的分子結合成分の第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある標的分子結合成分の第２の部分の領域に空間的に近接している標的分子結合成分の第２の部分の領域に相補性のある；及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす、方法を提供する。
【００１３】
本開示はまた、認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、ａ）標的細胞を一本鎖アプタマーと接触させること、一本鎖アプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含み；及びｂ）標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることを含み；第１のエピトープハプロマーは、ｉ）一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第２のエピトープハプロマーは、ｉ）一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に空間的に近接している一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に相補性のある；及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす、方法を提供する。
【００１４】
本開示はまた、認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、ａ）標的細胞を二本鎖近接アプタマー対と接触させること、二本鎖近接アプタマー対は、第１のアプタマー及び第２のアプタマーを含み、第１のアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含み；及び第２のアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含み；及びｂ）標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることを含み；第１のエピトープハプロマーは、ｉ）第１のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第２のエピトープハプロマーは、ｉ）第２のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある第２のアプタマーの第２の部分の領域に空間的に近接している第１のアプタマーの第２の部分の領域に相補性のある；及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす、方法を提供する。
【００１５】
本開示はまた、認識分子のための標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、ａ）標的細胞をバイナリーアプタマーと接触させること、バイナリーアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；ｉｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第２の部分；及びｉｉｉ）第１及び第２の部分の間に位置した核酸分子を含む第３の部分を含み；及びｂ）標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることを含み；第１のエピトープハプロマーは、ｉ）バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第２のエピトープハプロマーは、ｉ）バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含み；第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるバイナリーアプタマーの第３の部分の領域に空間的に近接しているバイナリーアプタマーの第３の部分の領域に相補性のある；及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】一次ビオチン化抗体及びストレプトアビジン架橋によって細胞表面上に配置した表面テンプレートに対する二重標識プローブ配列のハイブリダイゼーションの代表的なフロー分析を示す。
【図２】ＨＥＲ−２＋乳癌細胞株対照と比較して、ＨＥＲ−２ネガティブ腫瘍細胞上のトラスツズマブミモトープの配置の代表的なフロー分析を示す。
【図３】ビスマレイミド（ＰＥＧ）2（ＢＭＰ２）化合物によって両方の分子上の−ＳＨ基の架橋を介して、ＣＬＪペプチド（配列番号１３２）に結合したオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲート（オリゴ＃４０８（配列番号１３０）；ＪＬＣペプチド（配列番号１３３））に結合したオリゴ＃４１７（配列番号１３１）の代表的な調製、及び様々なペプチド−オリゴヌクレオチド組み合わせ及び反応条件による、変性１５％尿素ゲル上のコンジュゲート形成の実証を示す。
【図４】トラスツズマブのミモトープの希釈系列による代表的なＥＬＩＳＡの例を示す。
【図５】ビオチン化未修飾ミモトープ（Ｂｉｏ−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ；配列番号３５）及び対応するシステイン修飾ミモトープ（Ｂｉｏ−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＣＨ；配列番号３）を用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
細胞表面上のインサイチュの非機能的前駆体からの機能的エピトープのアセンブリは、無反応の病原性細胞を、対象となる抗体などの認識分子によって認識される標的へと変換させる可能性を有する。この技術を実現可能に描写するために、関与している断片がテンプレート化プロセスによって近い空間的近接になる場合に、エピトープが再構成することができるように、エピトープは、２つのセグメントに切断されなければならない。テンプレート化プロセスの例は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１４／１９７５４７号に記載されている。エピトープセグメントが、個別には不活性であるが、所望の標的細胞上でアセンブルする場合にのみ、それぞれの認識分子のリガンドとして活動する場合、治療文脈における毒性及びバイスタンダー反応を干渉する可能性は大幅に低下する。
【００１８】
本明細書に記載の標的分子結合成分は、標的細胞上の標的分子に結合することができる任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的分子結合成分は、標的細胞の表面上の標的分子を認識する抗体である。いくつかの実施形態では、標的分子結合成分は、標的細胞の表面上の標的分子を認識する、ペプチドリガンドなどのリガンドである。いくつかの実施形態では、標的分子結合成分は、標的細胞の表面上の標的分子を認識するアプタマーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、一本鎖アプタマー、二本鎖近接アプタマー対、またはバイナリーアプタマーである。
【００１９】
標的分子結合成分がペプチドリガンドまたは抗体である実施形態では、ペプチドリガンドまたは抗体は、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含む。方法は、標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることをさらに含む。第１のエピトープハプロマーは、ｉ）ペプチドリガンドまたは抗体の第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。第２のエピトープハプロマーは、ｉ）ペプチドリガンドまたは抗体の第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。この実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるペプチドリガンドまたは抗体の第２の部分の領域に空間的に近接しているペプチドリガンドまたは抗体の第２の部分の領域に相補性のある。この実施形態では、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす。第１及び第２のハプロマーは、以下により詳細に説明する（アプタマーを用いる文脈であるが、リガンド、ペプチドリガンド及び抗体などの任意の標的分子結合成分と一緒に使用することもできる）。
【００２０】
いくつかの実施形態では、標的分子に結合することができるペプチドリガンドの第１の部分は、約５アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約２０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、または約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、標的分子に結合することができるペプチドリガンドの第１の部分は、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸を含む。
【００２１】
本開示は、一本鎖アプタマーを用いて、標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、エピトープは、認識され、認識分子に相互作用または結合することができる、方法を提供する。この実施形態では、方法は、標的細胞を一本鎖アプタマーと接触させることを含む。一本鎖アプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含む。方法は、標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることをさらに含む。第１のエピトープハプロマーは、ｉ）一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。第２のエピトープハプロマーは、ｉ）一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。この実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に空間的に近接している一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に相補性のある。この実施形態では、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす。
【００２２】
いくつかの実施形態では、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる一本鎖アプタマーの第１の部分は、核酸分子である。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分である核酸分子は、約２０ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分である核酸分子は、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分である核酸分子は、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分である核酸分子は、約４５℃〜約６５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分である核酸分子は、約４５℃〜約５５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分である核酸分子は、約５５℃〜約６５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれる一本鎖アプタマーの第１の部分は、アプタマーの３’または５’末端のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれる一本鎖アプタマーの第１の部分は、アプタマーの３’末端を含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれる一本鎖アプタマーの第１の部分は、アプタマーの５’末端を含む。
【００２３】
一本鎖アプタマーはまた、アプタマーの３’または５’末端のいずれか（すなわち、どちらの末端も、第１の部分の一部ではない）を含む第２の部分を含む。従って、いくつかの実施形態では、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第１の部分は、アプタマーの５’部分を含み、第２の部分は、アプタマーの３’末端を含むままにする。あるいは、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第１の部分は、アプタマーの３’部分を含み得、第２の部分は、アプタマーの５’末端を含むままにする。
【００２４】
一本鎖アプタマーの第２の部分は、核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第２の部分は、約３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第２の部分は、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第１の部分及び第２の部分の両方は、増幅の目的のために、プライマー結合部位として機能する配列領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの５’末端領域は、増幅の目的のために、第１のプライマー結合部位として機能する第１の配列領域を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの３’末端領域は、増幅の目的のために、第２のプライマー結合部位として機能する第２の配列領域を含む。適当なプライマーと併せて両方の増幅プライマー結合部位を用いることで、一本鎖アプタマーを、例えば、ＰＣＲによって、増幅することができる。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第２の部分におけるそれぞれのプライマー結合領域は、テンプレート領域の一部を形成して、テンプレート化アセンブリの際に機能的エピトープを生成することもできる。
【００２６】
第１のエピトープハプロマーは、一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子、及びエピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第１の部分である）いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされる。
【００２７】
第２のエピトープハプロマーはまた、一本鎖アプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子、及びエピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第２の部分である）いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされる。
【００２８】
第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、一本鎖アプタマーの第２の部分の領域に相補性のある。第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、一本鎖アプタマーの第２の部分の領域にも相補性のある。第１のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある一本鎖アプタマーの第２の部分の領域は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある一本鎖アプタマーの第２の部分の領域と比較して、５’（一本鎖アプタマーの第２の部分を参照）である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約６ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、約８ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある一本鎖アプタマーの第２の部分の領域は、約１８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、または約９０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある一本鎖アプタマーの第２の部分の領域は、約１８ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。
【００３０】
一本鎖アプタマーの第２の部分と、第１及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子との間の相補性の領域の空間（すなわち、空間的近接）は、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接している第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティをもたらす。２つの反応性エフェクターモイエティの間の空間的近接の結果として、エピトープの特異的アセンブリが達成される。２つの反応性エフェクターモイエティが連結して、所望のエピトープを形成するように、化学反応（例えば、本明細書に記載の化学反応のいずれか１つ）が、それぞれの反応性エフェクターモイエティの間で生じ得る場合、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティと、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、空間的に近接している。
【００３１】
いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第２の部分は、第１のエピトープハプロマー及び／または第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる。アプタマーが、第１のエピトープハプロマーまたは第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる場合、こうして形成された複合体は、「アプタマー−ハプロマー」複合体と本明細書で呼ばれる。アプタマーが、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる場合、こうして形成された複合体は、「アプタマー−ハプロマー」複合体と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーの第２の部分（第１及び第２のエピトープハプロマーの両方に相補性のあるが）は、第１のエピトープハプロマー及び／または第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされない。
【００３２】
本開示はまた、二本鎖近接アプタマー対を用いて、標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、エピトープは、認識され、認識分子に相互作用または結合することができる、方法を提供する。この実施形態では、方法は、標的細胞を二本鎖近接アプタマー対と接触させることを含む。二本鎖近接アプタマー対は、第１のアプタマー及び第２のアプタマーを含む。第１のアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含む。第２のアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含む。方法は、標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることをさらに含む。第１のエピトープハプロマーは、ｉ）第１のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。第２のエピトープハプロマーは、ｉ）第２のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある第２のアプタマーの第２の部分の領域に空間的に近接している第１のアプタマーの第２の部分の領域に相補性のある。第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす。
【００３３】
二本鎖近接アプタマー対は、第１のアプタマー及び第２のアプタマーを含む。第１のアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第２の部分は、第２の部分の３’末端で、第１のアプタマーの第１の部分で連結される。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第２の部分は、第２の部分の５’末端で、第１のアプタマーの第１の部分で連結される。第２のアプタマーはまた、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；及びｉｉ）第２の部分の３’または５’末端のいずれかで第１の部分に連結した核酸分子を含む第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、第２のアプタマーの第２の部分は、第２の部分の３’末端で、第２のアプタマーの第１の部分に連結される。いくつかの実施形態では、第２のアプタマーの第２の部分は、第２の部分の５’末端で、第２のアプタマーの第１の部分に連結される。いくつかの実施形態では、第１のアプタマー及び第２のアプタマーの両方は、アプタマー対が物理的に近接するように、同じ標的分子に結合する。いくつかの実施形態では、第１のアプタマー及び第２のアプタマーは、アプタマー対が物理的に近接するように、同じ細胞上の異なる標的分子に結合する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分及び第２のアプタマーの第１の部分（各々は、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる）は、核酸分子である。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分である核酸分子と、第２のアプタマーの第１の部分である核酸分子は、各々独立して、約２０ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分である核酸分子と、第２のアプタマーの第１の部分である核酸分子は、各々独立して、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分である核酸分子と、第２のアプタマーの第１の部分である核酸分子は、各々独立して、約２５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分である核酸分子と、第２のアプタマーの第１の部分である核酸分子は、各々独立して、約４５℃〜約６５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分である核酸分子と、第２のアプタマーの第１の部分である核酸分子は、各々独立して、約４５℃〜約５５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分である核酸分子と、第２のアプタマーの第１の部分である核酸分子は、各々独立して、約５５℃〜約６５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分と、第２のアプタマーの第１の部分は、各々独立して、それぞれのアプタマーの３’または５’末端のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分と、第２のアプタマーの第１の部分は、各々独立して、それぞれのアプタマーの３’末端を含む。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第１の部分と、第２のアプタマーの第１の部分は、各々独立して、それぞれのアプタマーの５’末端を含む。
【００３５】
第１及び第２のアプタマーはまた、各々、３’または５’末端のいずれか（すなわち、どちらの末端も、第１の部分の一部ではない）を含む第２の部分アプタマーを含む。従って、いくつかの実施形態では、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第１及び第２のアプタマーの各々の第１の部分は、アプタマーの５’部分を含み、第１及び第２のアプタマーの各々の第２の部分は、アプタマーの３’末端を含むままにする。あるいは、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第１及び第２のアプタマーの各々の第１の部分は、アプタマーの３’部分を含み得、第２の部分は、アプタマーの５’末端を含むままにする。あるいは、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第１のアプタマーの第１の部分は、アプタマーの５’部分を含み、第１のアプタマーの第２の部分は、アプタマーの３’末端を含むままにし、及び標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第２のアプタマーの第１の部分は、アプタマーの３’部分を含み、第２のアプタマーの第２の部分は、アプタマーの５’末端を含むままにする。あるいは、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第１のアプタマーの第１の部分は、アプタマーの３’部分を含み、第１のアプタマーの第２の部分は、アプタマーの５’末端を含むままにし、及び標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれる第２のアプタマーの第１の部分は、アプタマーの５’部分を含み、第２のアプタマーの第２の部分は、アプタマーの３’末端を含むままにする。
【００３６】
第１及び第２のアプタマーの第２の部分は、核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のアプタマーの第２の部分は、各々独立して、約２５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のアプタマーの第２の部分は、各々独立して、約２５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のアプタマーの各々の第１の部分及び第２の部分は、増幅の目的のために、プライマー結合部位として機能する配列領域を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のアプタマーの５’末端領域は、増幅の目的のために、第１のプライマー結合部位として機能する第１の配列領域を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のアプタマーの３’末端領域は、増幅の目的のために、第２のプライマー結合部位として機能する第２の配列領域を含む。適当なプライマーと併せて両方の増幅プライマー結合部位を用いることで、第１及び／または第２のアプタマーを、例えば、ＰＣＲによって、増幅することができる。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のアプタマーの第２の部分におけるそれぞれのプライマー結合領域は、テンプレート領域の一部を形成して、テンプレート化アセンブリの際に機能的エピトープを生成することもできる。
【００３８】
第１のエピトープハプロマーは、第１のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子、及びエピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第１の部分である）いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第１の部分である）いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされる。
【００３９】
第２のエピトープハプロマーは、第２のアプタマーの第２の部分に相補性のある核酸分子、及びエピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第２の部分である）いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第２の部分である）いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約６ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、約８ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約１６ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。
【００４１】
第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第１のアプタマーの第２の部分の領域に相補性のある。第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のアプタマーの第２の部分の領域に相補性のある。第１のアプタマーの第２の部分と、第１のエピトープハプロマーの核酸分子、及び第２のアプタマーの第２の部分と、第２のエピトープハプロマーの核酸分子との間の相補性の領域の空間（すなわち、空間的近接）は、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接している第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティをもたらす。２つの反応性エフェクターモイエティの間の空間的近接の結果として、エピトープの特異的アセンブリが達成される。２つの反応性エフェクターモイエティが連結して、所望のエピトープを形成するように、化学反応（例えば、本明細書に記載の化学反応のいずれか１つ）が、それぞれの反応性エフェクターモイエティの間で生じ得る場合、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティと、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、空間的に近接している。
【００４２】
いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第２の部分は、第１のエピトープハプロマーにハイブリダイズされ、または第２のアプタマーの第２の部分は、第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる。アプタマーが、そのそれぞれのエピトープハプロマーにハイブリダイズされる場合、こうして形成された複合体は、「アプタマー−ハプロマー」複合体と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態では、第１のアプタマーの第２の部分（第１のエピトープハプロマーに相補性のあるが）は、第１のエピトープハプロマーにハイブリダイズされない。いくつかの実施形態では、第２のアプタマーの第２の部分（第２のエピトープハプロマーに相補性のあるが）は、第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、アプタマー対の５’及び３’末端は、一緒に連結される。
【００４４】
本開示はまた、バイナリーアプタマーを用いて、標的細胞上のエピトープの特異的アセンブリの方法であって、エピトープは、認識され、認識分子に相互作用または結合することができる、方法を提供する。この実施形態では、方法は、標的細胞をバイナリーアプタマーと接触させることを含む。バイナリーアプタマーは、ｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第１の部分；ｉｉ）標的細胞の表面上の標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれた第２の部分；及びiｉｉ）第１及び第２の部分の間に位置した核酸分子を含む第３の部分を含む。方法は、標的細胞を第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーと接触させることをさらに含む。第１のエピトープハプロマーは、ｉ）バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。第２のエピトープハプロマーは、ｉ）バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子；及びｉｉ）エピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるバイナリーアプタマーの第３の部分の領域に空間的に近接しているバイナリーアプタマーの第３の部分の領域に相補性のある。第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接しているため、エピトープの特異的アセンブリをもたらす。
【００４５】
いくつかの実施形態では、標的分子に結合することができる三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第１の部分及び／または第２の部分は、核酸分子である。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第１の部分及び第２の部分である核酸分子は、各々独立して、約２０ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第１の部分及び第２の部分である核酸分子は、各々独立して、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第１の部分及び第２の部分である核酸分子は、各々独立して、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第１の部分は、バイナリーアプタマーの３’または５’末端のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第１の部分は、アプタマーの３’末端を含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第１の部分は、アプタマーの５’末端を含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第２の部分は、バイナリーアプタマーの３’または５’末端のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第２の部分は、アプタマーの３’末端を含む。いくつかの実施形態では、三次構造に折り畳まれるバイナリーアプタマーの第２の部分は、アプタマーの５’末端を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第１の部分及び／または第２の部分は、各々独立して、約４５℃〜約８５℃、約４５℃〜約８０℃、約４５℃〜約７５℃、約５０℃〜約７０℃、約５０℃〜約６５℃、約５５℃〜約７０℃、または約５５℃〜約６５℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第１の部分及び第２の部分である核酸分子は、各々独立して、約５５℃〜約６５℃のＴｍを有する。
【００４７】
バイナリーアプタマーはまた、第１及び第２の部分の間に位置した核酸分子を含む第３の部分を含む。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第３の部分は、約３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第３の部分は、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、第３の部分は、完全に不規則（すなわち、ｄＡ：ｄＣ：ｄＧ：ｄＴが２５：２５：２５：２５の合成比）であってもよく、またはｗｉｔｈ  任意の形態の特異的パターニングを有してもよく、定められた塩基は、不規則領域で散在している。非限定的な例として、Ｇ四重鎖の選択を濃縮するように設計された６１塩基の不規則領域の（Ｎ9−Ｇ4）4−Ｎ9の形態を取ることができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第１の部分及び第２の部分の両方は、増幅の目的のために、プライマー結合部位として機能する配列領域を含む。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの５’末端領域は、増幅の目的のために、第１のプライマー結合部位として機能する第１の配列領域を含む。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの３’末端領域は、増幅の目的のために、第２のプライマー結合部位として機能する第２の配列領域を含む。適当なプライマーと併せて両方の増幅プライマー結合部位を用いることで、バイナリーアプタマーを、例えば、ＰＣＲによって、増幅することができる。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第３の部分におけるそれぞれのプライマー結合領域は、テンプレート領域の一部を形成して、テンプレート化アセンブリの際に機能的エピトープを生成することもできる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第３の部分はまた、第１の部分の適用のための３’プライマー結合領域（第１の部分の５’プライマー結合領域と一緒に）、及び第２の部分の増幅のための５’プライマー結合領域（第２の部分の３’プライマー結合領域と一緒に）を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、二本鎖近接アプタマー対の第１のアプタマーの３’末端と、二本鎖近接アプタマー対の第２のアプタマーの５’末端は、一緒に連結して、バイナリーアプタマーを形成することができる。例えば、二重近接核酸アプタマー対を参照すると、アプタマー対の５’及び３’末端は、一緒に連結することができる。
【００５２】
第１のエピトープハプロマーは、バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子、及びエピトープの第１の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第１の部分である）いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子の５’末端は、ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされる。
【００５３】
第２のエピトープハプロマーはまた、バイナリーアプタマーの第３の部分に相補性のある核酸分子、及びエピトープの第２の部分である反応性エフェクターモイエティを含む。いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、反応性エフェクターモイエティにコンジュゲートされる。反応性エフェクター分子が、ペプチドである（例えば、ペプチドが、エピトープの第２の部分である）いくつかの実施形態では、第２のエピトープハプロマーの核酸分子の３’末端は、ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約６ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、約８ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、各々独立して、約１６ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。
【００５５】
第１のエピトープハプロマーの核酸分子は、バイナリーアプタマーの第３の部分の領域に相補性のある。第２のエピトープハプロマーの核酸分子は、バイナリーアプタマーの第３の部分の領域にも相補性のある。第１のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるバイナリーアプタマーの第３の部分の領域は、第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるバイナリーアプタマーの第３の部分の領域と比較して、５’（一本鎖アプタマーの第３の部分を参照）である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるバイナリーアプタマーの第３の部分の領域は、約１８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、または約９０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のある及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子が相補性のあるバイナリーアプタマーの第３の部分の領域は、約１８ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。
【００５６】
バイナリーアプタマーの第３の部分と、第１及び第２のエピトープハプロマーの核酸分子との間の相補性の領域の空間（すなわち、空間的近接）は、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティに空間的に近接している第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティをもたらす。２つの反応性エフェクターモイエティの間の空間的近接の結果として、エピトープの特異的アセンブリが達成される。２つの反応性エフェクターモイエティが連結して、所望のエピトープを形成するように、化学反応（例えば、本明細書に記載の化学反応のいずれか１つ）が、それぞれの反応性エフェクターモイエティの間で生じ得る場合、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティと、第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティは、空間的に近接している。
【００５７】
いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第３の部分は、第１のエピトープハプロマー及び／または第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる。アプタマーが、第１のエピトープハプロマーまたは第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる場合、こうして形成された複合体は、「アプタマー−ハプロマー」複合体と本明細書で呼ばれる。アプタマーが、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされる場合、こうして形成された複合体は、「アプタマー−ハプロマー」複合体と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーの第３の部分（第１及び第２のエピトープハプロマーの両方に相補性のあるが）は、第１のエピトープハプロマー及び／または第２のエピトープハプロマーにハイブリダイズされない。
【００５８】
原則として、反応性エフェクターモイエティ（すなわち、認識分子のエピトープなどの所望のエフェクター生成物の組み合わせ可能なモイエティ）を共有的に保有する一対の分子（すなわち、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ１４／１９７５４７号で前述されたように、部分エフェクターモイエティ；「ハプロマー」と本明細書で呼ばれる）は、構造の任意のテンプレート化の際に、エフェクター生成物アセンブリを完成することができるが、但し、テンプレート−リガンド（すなわち、アプタマー−ハプロマー）結合は、２つの反応性エフェクターモイエティ間の相互反応性が生じる空間的近接をもたらす。従って、核酸を超える他の分子は、原則として、特異的テンプレートアセンブリプロセスのガイドとして作用することができる。かかる非核酸テンプレートは、タンパク質及び複合炭水化物を単独または組み合わせのいずれかで含み得る。また、タンパク質または複合炭水化物のいずれかは、原則として、核酸と協力してテンプレートとして作用し、各々は、グリコシル修飾の有無に依らず、特異的リボヌクレオタンパク質内に存在する。
【００５９】
類似体テンプレート化部位の性質に関してほとんどの仮定がなされていないアプローチでは、核酸アプタマーを使用する。ここでのアプタマーは、プロテオーム／グリコミック／核酸標的のリガンドとして選択され、空間的近接で標的に結合することは、テンプレート化アセンブリのハプロマーの担体として潜在的に有用である。アプタマーの対は、かかる担体リガンドとして使用することができ、またはあるいは、単一選択されたアプタマーは、ハプロマーも保有する公知のリガンドと協力して使用することができる。
【００６０】
アプタマーは、細胞表面上に発現した非核酸標的分子に結合するように選択することができるため、それらは、腫瘍細胞などの特異的細胞上に見られる新規の表面構造の認識及び適応テンプレート化の特に有用である。しかしながら、ほとんどのアプタマーは、大きくない核酸分子（すなわち、多くが、１００塩基未満）であり、折り畳まれかつコンパクト化された構造が想定され得ることが多いため、多くのタンパク質ベースの試薬よりも標的細胞により容易にトランスフェクトされる。従って、アプタマーの細胞内標的も望まれる。かかる細胞内標的は、特に、ＲＮＡが良く折り畳まれた安定した状態で存在するＲＮＡ分子も含み得る。後者の構成は、従来のハイブリダイゼーション媒介性テンプレート化アセンブリに対して無効であることが多いが、アプタマーによる認識及び二次適応テンプレート化に従順であり得る。
【００６１】
アプタマーは、対象となる特異的標的分子に結合する能力のために選択されている一本鎖の折り畳まれた核酸分子であり得る。いくつかの実施形態では、選択プロセスは、不規則集団を増幅することができる特異的プライマー配列、または特異的配列を有するそれらの任意のメンバーによって、伸長した不規則なトラクトが、３’または５’末端に隣接する核酸分子合成を伴う。大きな不規則集団内で、不規則領域の自己折り畳みから生じる構造モチーフのライブラリーが生成され、原則として、広範囲の標的分子が、このライブラリーの特異的メンバーによって結合することができる。これらの特異的結合核酸分子は、適切な選択手順によって濃縮された後、増幅することができる。所望の標的分子に結合する最初の非常に小さなサブセットの核酸分子のかかる増幅の後、選択ラウンドを繰り返し、所望の核酸分子のさらなる濃縮を促進する。加えて、結合を濃縮する増幅プロセス中に生じる突然変異は好まれ、十分な反復の後、対象となる所望の標的分子に高親和性で結合する特異的核酸分子を単離し、同定することができるため、このサイクルは進化的である。対象となる所望の標的分子に高親和性で結合するかかる特異的核酸分子は、核酸アプタマーとして機能し、これは、次いで、細胞を修飾することができる機能的生成物のテンプレート化アセンブリのテンプレートとして機能することができる。
【００６２】
一般に、アプタマーは、ヌクレオチドから構成され得るため、これらの一次配列の隣接セグメントとして、テンプレート化の目的のための短鎖直鎖配列を潜在的に提供することができる。かかる「ビルトイン」テンプレート化配列は、原則として、一次アプタマー配列内のどこにでも位置することができ、但し、ハプロマーのアプタマー上へのハイブリダイゼーションは、アプタマーの対象となる標的分子への結合を乱さない。実際には、アプタマー配列の５’または３’末端領域のいずれかの標的化は、アプタマー機能を乱す確率が低い可能性が高いが、かかる末端部位は、所望のように修飾しやすい、または二次的に付加されたセグメントとして生成しやすい。
【００６３】
本明細書に記載の標的分子結合成分、アプタマー、またはエピトープハプロマーのいずれかでは、その１つ以上のモイエティを形成する核酸分子は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート変性ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＸＮＡ、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ類）、プソイドウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２’−デオキシイノシンヌクレオチド、または塩基対形成が可能な他の核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、ＬＮＡであるモイエティであるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、エピトープハプロマーのハイブリダイゼーション領域、及びエピトープハプロマーのハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズするアプタマーのモイエティは、両方ともＬ−ＤＮＡを含む。例えば、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーのいずれかまたは両方の核酸分子、及びそれに相補性のあるアプタマーのモイエティは、両方ともＬ−ＤＮＡを含む。加えて、アプタマーは、非常に柔軟であり得る。例えば、ヌクレアーゼ耐性が、ホスホロチオエートを含むが、これらに限定されない修飾バックボーン、または、２’−Ｏ−メチル誘導体を含むが、これらに限定されない２’修飾によって与えられるように、アプタマーを修飾することができる。あるいは、所望の標的に結合するＬ−ＤＮＡ類似体（シュピーゲルマー）は、該当する場合には使用することができ、高いヌクレアーゼ耐性を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ（例えば、ポリペプチド；エピトープの第１の部分）のＣ末端は、第１のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ（例えば、ポリペプチド；エピトープの第２の部分）のＮ末端は、第２のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、第１のバイオオルソゴナル反応基及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、互換性がある。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ（例えば、ポリペプチド；エピトープの第１の部分）のＣ末端は、第１のバイオオルソゴナル反応基をさらに含まず、及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ（例えば、ポリペプチド；エピトープの第２の部分）のＮ末端は、第２のバイオオルソゴナル反応基をさらに含まない（すなわち、エピトープの２つのモイエティの共有結合が望ましくない場合）である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、第１のバイオオルソゴナル反応基は、直鎖アルキンであり、及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、アジドであり、または第２のバイオオルソゴナル反応基は、直鎖アルキンであり、及び第１のバイオオルソゴナル反応基は、アジドである。いくつかの実施形態では、第１のバイオオルソゴナル反応基は、歪みアルキンであり、及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、アジドであり、または第２のバイオオルソゴナル反応基は、歪みアルキンであり、及び第１のバイオオルソゴナル反応基は、アジドである。いくつかの実施形態では、第１のバイオオルソゴナル反応基は、テトラジンであり、及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、シクロオクテンであり、または第２のバイオオルソゴナル反応基は、テトラジンであり、及び第１のバイオオルソゴナル反応基は、シクロオクテンである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ（例えば、ポリペプチド；エピトープの第１の部分）のＣ末端は、をさらに含む。第１の化学修飾及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ（例えば、ポリペプチド；エピトープの第２の部分）のＮ末端は、第２の化学修飾をさらに含み、第１の化学修飾及び第２の化学修飾は、互換性がある。いくつかの実施形態では、第１の化学修飾は、アミド化（ＣＯＮＨ2）またはエステル化（ＣＯＯＲ）であり、Ｒは、メチル、エチル、またはフェニルであり、及び第２の化学修飾は、アセチル化またはＮ末端アミノ基のＮ−メチル置換である。追加のバイオオルソゴナル反応基及び化学修飾は、以下に記載される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のエピトープハプロマーのそれぞれの反応性エフェクターモイエティを介した２つのエピトープセグメントの共有結合は、必要ではない場合があり、対象となる認識分子の結合部位内の２つの半分またはスプリットエピトープの組み合わせた結合親和性は、元のエピトープに向かう親和性のかなりの割合に到達する。これは、２つのエピトープサブセグメントの熱運動が、これらの強制的な（テンプレート媒介性）空間的近接によって拘束されることで生じる機会を有する。効果的な親和性濃縮は、２つ以上の連結したエピトープによって二価認識分子が標的に向かって結合する結合から授与される結合力の利点に類似している。
【００６８】
２つのエピトープ断片を、共有結合の不在下で、認識分子結合部位内に収めるために、いくつかの実施形態では、化学修飾は、Ｎ末端及びＣ末端サブセグメントのそれぞれＣ末端及びＮ末端で望まれ得る。これは、隣接ペプチド配列の分割の結果として、新しい−ＣＯＯＨ及びＮＨ2−基の導入から生じ得、これらのモイエティは、認識分子結合部位内の局所化学環境との互換性が低いことがある。
【００６９】
Ｎ末端エピトープ断片のＣ末端の化学修飾としては、アミド化（ＣＯＮＨ2）及びエステル化（ＣＯＯＲ）が挙げられるが、これらに限定されず、Ｒは、メチル、エチル、またはフェニル基であり得るが、これらに限定されない。Ｃ末端エピトープ断片のＮ末端の化学修飾としては、アセチル化またはＮ末端アミノ基のＮ−メチル置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
いくつかの実施形態では、（反応性エフェクターモイエティを含む）第２のエピトープハプロマーの末端と空間的に近接している（反応性エフェクターモイエティを含む）第１のエピトープハプロマーの末端は、共有結合される。いくつかの実施形態では、第１のエピトープハプロマー及び第２のエピトープハプロマーは、これらそれぞれの反応性エフェクターモイエティ間に生じる化学反応によって、空間的近接にあるこれらそれぞれの末端に共有結合される。多くの反応性エフェクターモイエティが、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ１４／１９７５４７号に開示されている。
【００７１】
２つの反応性エフェクターモイエティの組み合わせにより、機能的生成物（例えば、認識分子のエピトープ）を形成することができる。２つの反応性エフェクターモイエティ間の相互作用には、化学結合（直接結合または中間構造を介してのいずれか）などの物理的相互作用、並びに静電引力、水素結合、及びファンデルワールス力／分散力などの非物理的相互作用及び引力が含まれ得る。
【００７２】
反応性エフェクターモイエティは、生物学的には不活性であり得る。特に、第１のエピトープハプロマーと会合する反応性エフェクターモイエティは、第２のエピトープハプロマーと関連する対応する反応性エフェクターモイエティと相互作用できるが、自然な生体分子とは、容易には相互作用しないであろう。この点が、対応するエフェクター部分モイエティが、標的分子に結合したアプタマー（複数可）上に組み立てられた場合にのみ、テンプレートアセンブリ生成物が形成されることを保証することである。これは、反応性エフェクターモイエティが、アセンブリが生じる環境で存在する他の分子上の官能基と反応することに対する予防対策でもあるため、及び意図しない生成物の形成を防ぐ。反応性エフェクターモイエティの一例としては、バイオオルソゴナルモイエティが挙げられる。バイオオルソゴナルモイエティは、対応するバイオオルソゴナルモイエティと化学的に反応し、他の生体分子とは容易には化学的に反応しない。
【００７３】
反応性エフェクターモイエティは、標的分子を含むか、または非標的コンパートメントとは異なる量の標的分子を含むサンプル内で、細胞、ウイルス、組織、腫瘍、溶解物、他の生物学的構造、または空間領域などの複合体標的コンパートメントにおけるテンプレート化反応を生じさせるメカニズムを提供する。反応性エフェクターモイエティは、対応する反応性エフェクターモイエティと反応することができるが、典型的な条件下で共通の生化学分子と反応しない。他の反応性エンティティとは異なり、反応性エフェクターモイエティの選択性は、生成物または反応体がアセンブルする前に反応基のアブレーションを防ぐ。
【００７４】
反応性エフェクターモイエティの一例としては、バイオオルソゴナルモイエティが挙げられ得る。バイオオルソゴナルモイエティには、アジドとアルキン間の「ｃｌｉｃｋ（クリック）」反応、アジドとホスフィン間のトレースレスまたは非トレースレスのシュタウディンガー反応、チオエステルとチオール間の天然の化学ライゲーションを受けることができるそれらの基を含むことができる。さらに、バイオオルソゴナルモイエティには、アジド、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリル酸化物、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾール、クアドリシクラン、及びそれらの誘導体のいずれかでもあり得る。複数の反応性エフェクターモイエティは、本明細書に開示の方法及び組成物で使用することができる。いくつかの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
【００７５】
クリック化学は、典型的な条件下の普通の生体分子との、アジドでもアルキンでもない反応として、非常に選択的である。Ｒ−Ｎ3形態のアジド、及びＲ−Ｃ≡ＣＨ形態の末端アルキンまたはＲ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ形態の内部アルキンは、互いに容易に反応し、１，２，３−トリアゾールの形態で、Ｈｕｉｓｇｅｎ（ヒュスゲン）環化付加反応生成物を生み出す。アジド及びアジド誘導体は、市販の試薬から容易に調合され得る。アジドはまた、反応性エフェクターモイエティの合成中に、反応性エフェクターモイエティに導入され得る。いくつかの実施形態では、アジド基は、標準的なペプチド合成法を使用した、反応性エフェクターモイエティペプチドの合成中に、市販のアジド誘導の標準アミノ酸またはアミノ酸類似体の組み込みによって、ペプチドからなる反応性エフェクターモイエティに導入される。アミノ酸は、α−アミノ基をアジドで置換して誘導されてよい。市販製品には、アミノ酸側鎖としてのアジド官能性を導入でき、以下の形態の構造をもたらす：
【化１】
2020535114.tif 000002
Ａは、標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸類似体の側鎖における、任意の原子及びその置換基である。
【００７６】
アジドはまた、ジアゾ転移法により、ペプチド上のアミン基をアジドに転換することによって、合成後の反応性エフェクターモイエティペプチドに導入されてよい。生体コンジュゲート反応化学もまた、市販の誘導アジドを化学リンカー、または適切な反応基を含む反応性エフェクターモイエティに結合するために使用できる。
【００７７】
標準的なアルキンはまた、アジドの組み込みと同様の方法で、反応性エフェクターモイエティに組み込むことができる。アルキン官能化ヌクレオチド類似体は、市販されており、反応性エフェクターモイエティの合成時に、アルキン基の直接的な組み込みを可能にする。同様に、アルキン誘導アミノ酸類似体は、標準的なペプチド合成法によって、反応性エフェクターモイエティに組み込まれてよい。さらに、生体コンジュゲート反応化学アプローチと互換的な、多官能性アルキンは、適切な官能基または側鎖を介して、他のモイエティへのアルキンの組み込みを促進するために使用されてよい。
【００７８】
標準的なアジド−アルキン化学反応は、通常は、銅（Ｉ）などの触媒を必要とする。触媒濃度での銅（Ｉ）は、多数の生態系に有毒であり、標準的なアジド−アルキン化学反応は、生きた細胞への使用には限界がある。活性化アルキンベースの銅を含まないクリック化学システムは、有毒触媒を回避する。活性化アルキンはしばしば、シクロオクチンの形態をとり、シクロオクチル基への組み込みは、アルキンに環状ひずみを持ち込む。
【００７９】
ヘテロ原子または置換基は、シクロオクチル環の多様な位置に組み込まれてよく、アルキンの反応性を変化させ、または化合物に他の代替の化学的性質を与え得る。環の多様な位置はまた、シクロオクチンの反応性エフェクターモイエティまたはリンカーへの結合に対する、接合点としての役割を果たす。環のこれらの位置またはその置換基は、任意でさらに、アクセサリー基で誘導され得る。複数のシクロオクチンが、標準的な生体コンジュゲート反応化学のプロトコルでの使用に適したいくつかの誘導体型を含んで、市販されている。市販のシクロオクチン誘導ヌクレオチドは、核酸合成中に、反応性エフェクターモイエティの簡便な組み込みを促進させるように援助できる。
【００８０】
アジドとホスフィンまたはＮ2を欠いた亜リン酸塩との間の急速反応に基づく、シュタウディンガー還元もまた、バイオオルソゴナル反応を表す。シュタウディンガー反応において、共有結合が反応体間で形成される、シュタウディンガーライゲーションは、テンプレート化アセンブリにおける使用に適している。シュタウディンガーライゲーションの非トレースレス及びトレースレス形態の両方において、これらの反応で形成される生成物の化学構造に、任意の多様化が可能である。
【００８１】
標準的なシュタウディンガーライゲーションは、アジドと、トリフェニルホスフィンなどのフェニル置換ホスフィンとの間の非トレースレス反応であり、メチルエステルなどの、ホスフィン上の求電子的捕獲の置換基は、ホスフィンオキシドによって連結されたライゲーション生成物を生み出すために、反応のアザ−イリド中間体で再配列する。求電子的捕獲を行うフェニル置換ホスフィンはまた、容易に合成され得る。誘導体型は、商業的に入手可能であり、及びテンプレート化アセンブリ反応体に組み入れるのに適している。
【００８２】
いくつかの実施形態では、トレースレス・シュタウディンガーライゲーションが可能なホスフィンは、反応性エフェクターモイエティとして利用することができる。トレースレス反応では、ホスフィンは、アザ−イリド中間体の再配列中に、遊離基として作用し、通常は、自然なアミド結合の形態で、ライゲーションを作る。トレースレス・シュタウディンガーライゲーションが可能な化合物は、一般に、チオエステル誘導のホスフィンまたはエステル誘導のホスフィンの形態をとる。エステル誘導ホスフィンは、トレースレス・シュタウディンガーライゲーションに使用することもできる。チオエステル誘導ホスフィンは、トレースレス・シュタウディンガーライゲーションに使用することもできる。
【００８３】
化学リンカーまたはアクセサリー基は、置換基として任意で結合されてよく、反応性エフェクターモイエティまたは反応体への追加の官能性の導入に対応する、結合点を与える。
【００８４】
非トレースレス・シュタウディンガー・フェニルホスフィン化合物との比較で、トレースレス・ホスフィノフェノール上の求電子的捕獲エステルの配向性は、フェニル基に対して逆である。これは、アジドとの反応を引き起こす、トレースレス・シュタウディンガーライゲーションを可能にし、ホスフィンオキシドを含有せずに、生成物に自然なアミド結合を生み出す。トレースレス・シュタウディンガーライゲーションは、仮に第四級アミンなどの、適切な親水性基が、そのフェニルホスフィンに結合されるならば、有機性の共溶媒を含まない水媒体中で実施されてよい。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などのエステル賦活剤などのカルボジイミドを使用した、温和なＳｔｅｇｌｉｃｈ（シュテークリヒ）・エステル化を介して、カルボン酸（ペプチドのＣ末端など）を含む、所望の反応性エフェクターモイエティを持たせることができる、水溶性ホスフィノフェノールの調合が報告されている（Ｗｅｉｓｂｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０１０，５，７８７−７８９）。
【００８５】
ホスフィノメタンチオールは、トレースレス・シュタウディンガーライゲーションを介在するホスフィノフェノールの代替品を表す。一般に、ホスフィノメタンチオールは、トレースレス・シュタウディンガー反応の介在において、ホスフィノフェノールと比較して、良好な反応動力学を有する。米国特許公開第２０１０／００４８８６６号及びＴａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，１１４２１−３０は、水溶性ホスフィノメタンチオールの調製を記述している。これらの化合物は、トレースレス・バイオオルソゴナル反応基としての使用に適したチオエステルを形成するために、活性エステルの形態で、ペプチドまたは他の搭載物質を搭載することができる。
【００８６】
ネイティブ化学ライゲーション反応は、チオエステルとチオール及びアミンを担持する化合物との間の反応に基づく、バイオオソゴナルなアプローチである。古典的なネイティブ化学ライゲーション反応は、Ｃ末端チオエステルを担持するペプチドとＮ末端システインを担持する別のペプチドとの間の反応である。ネイティブ化学ライゲーション反応は、ペプチド、または内部システイン残基もしくは仮に非標準アミノ酸を利用する場合には、他のチオール含有残基を含む、ペプチド模倣体を産生するトレースレス反応を介在するために利用されてよい。
【００８７】
Ｎ末端システインは、標準的なアミノ酸合成法によって組み込まれてよい。末端チオエステルは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの試薬を使用した、チオールを伴う活性エステルの濃縮、または「Ｓａｆｅｔｙ−Ｃａｔｃｈ（安全捕捉）」支持樹脂の使用を介した、ペプチド合成中での導入を含む、当該技術分野で公知のいくつかの方法によって生成することができる。
【００８８】
任意の適切なバイオオルソゴナル反応化学が、それが、複雑な生物環境において、高度に選択的な方法で、効果的に反応に介在する限り、反応性エフェクターモイエティの合成に利用することができる。適切であろう互換的なバイオオルソゴナル化学の、最近開発された非限定的な例は、水媒体中でバイオオルソゴナル反応を効果的に介在する、テトラジンとノルボルネン及びトランス−シクロオクテンなどの多様なアルキンとの間の反応である。
【００８９】
化学リンカーまたはアクセサリー基は、置換基として上述の反応体に任意で結合されてよく、核酸モイエティまたは反応体への追加の官能性の導入に対応する、結合点を与える。
【００９０】
いくつかの実施形態では、標的分子結合成分の第１の部分は、標的分子のリガンドである。いくつかの実施形態では、リガンドは、αメラニン細胞刺激ホルモンである。追加のリガンド／標的分子は、当業者に周知である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、標的分子結合成分の第１の部分は、標的分子のアプタマーである。アプタマー（または所望の標的分子に結合することができるその第１の部分）は、例えば：ライブラリーのメンバーを所望の固相標的に結合させること；固相標的を洗浄すること；ライブラリーの結合メンバーを溶出すること；ライブラリーの結合メンバーを沈殿させること；ライブラリーの結合メンバーを再構成すること；適当な増幅可能な濃度のために、ライブラリーの結合メンバーを解析すること；分取非対称ＰＣＲを行うこと；ゲル上のＰＣＲ生成物を試験すること；ＰＣＲ生成物をストレプトアビジン磁気ビーズに結合すること；ストレプトアビジン磁気ビーズを洗浄すること；トップ鎖を溶出すること；ゲル上の溶出鎖を試験すること；及び特異的に優勢なアプタマークローンの結合特性の解析を行うことができるように、結合アプタマー集団の多様性が十分に低下するまで、サイクルを複数回数、例えば、最大で９時間以上行うことを含む、ライブラリーから選択することができる。
【００９２】
一般的結合及び溶出手順が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１ｍＭの塩化マグネシウム（ＰＢＳＭ）を含む標準的なリン酸緩衝生理食塩水中で最初に調製し、８０℃で約３分間加熱した後、０℃（氷浴）で少なくとも５分間置いて、自己アニーリングさせて、アプタマー間相互作用を最小にした。いくつかの実施形態では、アプタマー集団（または特異的アプタマー）を標的でインキュベートし、固相を描写する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、アプタマー集団（または特異的アプタマー）は、室温で少なくとも１時間、標的でインキュベートした後、室温で約１時間を超えて過剰の固相捕捉マトリックスに加えた。一次アプタマー集団では、溶液中の標的による最初のインキュベーション時間は、約１６時間である。選択されたアプタマー集団の連続ラウンドでは、インキュベーション時間は、約２〜４時間である。特異的アプタマーでは、インキュベーション時間は、約１時間である。標的をビオチン化する場合、捕捉マトリックスは、過剰なストレプトアビジン磁気ビーズ（ＳＡＭＢ）または任意の他のストレプトアビジン樹脂であり得る。ビーズ量は、製造者によって提供されるように、ビオチン化標的の公知のモル入力及び最大ビーズ結合能力データから算出することができる。ＳＡＭＢは、実験ニーズに基づいて、ストレージ緩衝液中で所定体積を取り、それらを磁気分離し、磁気分離を毎回用いて、例えば、１．０ｍｌのＰＢＳＭで２回洗浄することで最初に調製することができる。最終的に、ビーズを原体積のＰＢＳＭ中に再懸濁させることができる。
【００９４】
他の実施形態では、アプタマー集団（または特異的アプタマー）は、適当なマトリックス上で固相が予め描写されている標的でインキュベートすることができる。これらのマトリックスとしては、ストレプトアビジン磁気ビーズ、ストレプトアビジンアガロース、または任意の他のストレプトアビジン樹脂（標的は、１つ以上のビオチンモイエティを担持する）が挙げられるが、これらに限定されない。標的はまた、アミン／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、またはチオール／マレイミドを含むが、これらに限定されない様々なケミストリーを介して、固相マトリックスに共有結合することができる。かかるケミストリーは、磁気ビーズ、またはアガロースまたは重合樹脂を含むが、これらに限定されない様々な他の物質に標的を共有結合することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、固相標的マトリックス上に捕捉されたアプタマーを洗浄することができる。標的を担持する固相マトリックス及び結合アプタマーは、例えば、０．５ｍｌのＰＢＳＭで１時間、２時間、３時間、または４時間洗浄し、同じ体積のＰＢＳＭ中で最終的に再懸濁させることができる。ＳＡＭＢが固相マトリックスをもたらす場合、各洗浄サイクル中にマトリックスを上清から分離することは、磁気分離によって実施することができる。他の固相物質を使用する場合、分離は、遠心分離または濾過を含むが、これらに限定されない他の手段によって実施することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、結合アプタマーを溶出する。アプタマー／固相標的マトリックスは、上述の洗浄工程のように、最後の洗浄上清から分離し、室温で約２０秒間、例えば、約１００μｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウム／５ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁することができる。上清を新鮮なチューブに移し、固相物質を、室温で約２０秒間、例えば、約１００μｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウム／５ｍＭのＥＤＴＡ中でもう一度再懸濁させた。両方の上清をプールし、約−２０℃で約３０分間、例えば、約２０μｇのグリコーゲン／２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム／６００μｌのエタノールで沈殿させることができる。調製物を（例えば、最大微量遠心速度で１０分間）遠心分離し、ペレットを、例えば、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、溶出したアプタマーを再構成することができる。例えば、上記の工程から７０％を洗浄した後、調製物を簡単に遠心分離し（例えば、最大微量遠心速度で１〜２分間）、上清を除去することができる。得られたペレットを乾燥させ、適切な体積（例えば、通常、２５μｌ）のＴＥ（１０／１．０）で再溶解した。分離手順で磁気ビーズを使用する場合、再可溶化アプタマー調製物に、別の磁気分離（例えば、１分間）を施し、残留キャリーオーバービーズを除去することができる。アプタマー調製物は、２６０ｎｍで分光測光法により定量化することができ、吸光度１．０＝３３μｇ／ｍｌの一本鎖ＤＮＡである。サンプルはまた、例えば、１０％変性尿素アクリルアミドゲルで解析することができる。これらの調製物は、サイクルＮの一次溶出一本鎖アプタマーと本明細書で呼ばれ、Ｎは、サイクル手順を繰り返した回数である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、約９〜１０サイクル後に解析することができる。例えば、結合及び溶出サイクルを継続すると、標的に大幅に結合するアプタマー集団の割合が増加し、同様に、集団（例えば、初期集団において最大（すなわち、不規則）多様性で始まる、一本鎖アプタマーの第１の部分のＮ領域の変動に対応する）の多様性が低下する。約９〜１０サイクル後、典型的には、アプタマー集団のクローナル解析は、再発の独立クローンが同一または関連配列を有することを示し、これは、大幅な結合特性を持つ集団メンバーに対応する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、クローナル解析手順は、本明細書に記載のように実施することができる。一般に、アプタマーは、サイクル工程中の任意の時点でクローニング及び配列決定によって解析することができるが、典型的には、高レベルの配列類似性を有する多数の再発クローンが得られる前には、約９〜１０サイクルが適当である。所望のサイクル数の後、一次溶出した左または右アプタマーは、適切なＬ／Ｒプライマーで増幅し、クローニングのための二本鎖の供給源を提供することができる。得られたＰＣＲ生成物を精製し、過剰なプライマーを除去した（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ｋｉｔｓ，Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）後、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａなどのベクターを含むが、これらに限定されない）によって生成された断片の直接クローニングに適当なベクターに連結することができる。適切なライゲーションインキュベーション後、有能なＥ．ｃｏｌｉ細胞を生成物に変換することができる。その後、得られたコロニーのミニ調製物を、アプタマーインサートをスパンしているプライマーで配列決定して、解析し、同様の４０マートラクトでクローニングすることができる。
【０１００】
例えば、標的分子は、アプタマー集団に結合した後に固相を描写することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化磁気ビーズへのコンジュゲーションによって、固相を描写することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、１つ以上のビオチンモイエティを担持し、固相ストレプトアビジンマトリックス（ストレプトアビジンアガロースまたはストレプトアビジン磁気ビーズなど）への結合によって、固相を描写することができる。非結合アプタマー種は、洗浄によって除去することができる。結合アプタマーは、０．０５または０．１Ｍの水酸化ナトリウムで溶出し、沈殿させ、洗浄した後、再増幅のために使用して、その後の選択ラウンドのための濃縮一本鎖ＤＮＡを得ることができる。
【０１０１】
増幅アプタマーからの正しいセンス鎖の一本鎖ＤＮＡの調製により、その後の選択ラウンドを繰り返することができる。予備の試行増幅を使用して、溶出したアプタマーの最良濃度を計り、大量ＰＣＲ調製物中で使用して、相当量の一本鎖アプタマーを得ることができる。典型的な試行増幅（すなわち、「範囲検定」）では、各サイクルから一次溶出したアプタマーを、例えば、１：１００、１：５００、及び１：２０００に希釈し、各々１．０μｌを、９５℃で７分間、２０×（６０℃で約２０秒、７２℃で約１分間、及び９４℃で約４０秒）、６０℃で約２０秒、及び７２℃で約２分間のサイクルで、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ）によるＰＣＲ増幅で使用した。生成物は、例えば、１０％の非変性アクリルアミドゲル上で解析し、出発標的濃度が高すぎる場合に生じる高い分子量型を含まない最良でかつ最も純粋な生成物の収率をもたらす濃度を決定することができる。この情報により、単鎖は、電気泳動、ビオチン化ボトム鎖による変性、及び非対称ＰＣＲを含むが、これらに限定されないいくつかの異なる選択肢で調製することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、差次的鎖ビオチン化を使用して、サブ集団から選択された大量の一本鎖アプタマーを調製することができる。固相標的から溶出した単鎖アプタマー調製物は、ボトム鎖（アプタマー補体に対応する）が５’−ビオチンを担持する場所で増幅することができる。固相ストレプトアビジンに結合した後、一本鎖アプタマー（トップ鎖）をアルカリ（例えば、０．０５Ｍまたは０．１Ｍ  ＮａＯＨなど、５ｍＭ  ＥＤＴＡとも）で溶出することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、非対称ＰＣＲプロセスを使用して、増幅した二本鎖アプタマー集団から単鎖を生成することができる。大きくモル過剰のトップ鎖プライマーを使用して、所望のアプタマーサブ集団に対応する過剰の単鎖の生成をもたらすことができる。任意のビオチン化鎖は、例えば、固相ストレプトアビジンに結合することで除去することができ、非結合上清は、適当な一本鎖調製物を含む。分取非対称ＰＣＲは、選択されたアプタマー集団の初期増幅に関与し、ボトム鎖は、ビオチン化された後、非対称ＰＣＲを行って、トップ鎖を差次的増幅する。残りのボトム鎖は、ＳＡＭＢ（例えば、上述の通り）に結合することで除去することができる。
【０１０４】
結合を選択した後、標的に結合した一本鎖アプタマーは、結合状態で特異的アプタマーの折り畳み構造に組み込まれている可能性があるため、ハイブリダイゼーションのためのアクセシブル末端配列を必ずしも提供する必要はない。アクセシブル末端を有する一本鎖は、追加の工程で選択することができ、一本鎖アプタマーは、非ビオチン化標的に結合し、次いで、所望のアクセシブル３’または５’末端に相補性のあるビオチン化プローブでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、アクセシビリティを必要とするため、その後、限定されないがストレプトアビジン磁気ビーズなどの固相ストレプトアビジンマトリックス上で適切な結合剤を選択することができる。溶出する際に、一本鎖アプタマーを増幅し、必要であればプロセスを繰り返すことができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、分取非対称ＰＣＲは、選択されたアプタマー集団を増幅すること（アプタマー補体に対応するボトム鎖は、ビオチン化される）、及び非対称ＰＣＲを行って、トップ鎖を差次的増幅することを含み、これにより、大きくモル過剰のトップ鎖プライマーを使用して、所望のアプタマーサブ集団に対応する過剰の単鎖の生成をもたらす。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ビオチン化鎖は、固相ストレプトアビジンに結合することで除去することができ、非結合上清は、適当な一本鎖調製物を含む。
【０１０７】
エピトープハプロマーにハイブリダイゼーションするために、アクセシブル３’または５’末端を有するアプタマーを選択する方法は、アプタマーを対応する標的分子と接触させること；アプタマーを、アプタマーの３’または５’末端に相補性のある領域を有するビオチン化プローブと接触させること；アプタマー−プローブ複合体を洗浄して、非結合プローブを除去すること；アプタマー−プローブ複合体をストレプトアビジン磁気ビーズと接触させること；及びストレプトアビジン磁気ビーズを洗浄して、アプタマーを溶出することを含み得、アプタマーは、エピトープハプロマーにハイブリダイゼーションするためのアクセシブル３’または５’末端を有する。この方法は、標的結合後にアクセシブル配列を提示する一本鎖アプタマーを選択するための一つの方法として示し、一本鎖アプタマーをその後のエフェクター部分アセンブリに使用することができる。
【０１０８】
バイナリーアプタマーを調製する方法は、標的分子または標的細胞を複数のアプタマーと接触させること；結合したアプタマーを溶出すること；標的分子または標的細胞を結合アプタマーの集団と接触させること；結合したアプタマーをリガーゼ及びＲＮＡスプリントと接触させること；及びスプリントをＲＮａｓｅ  Ｈで除去することで、共有的に連結したバイナリーアプタマーをもたらすことを含み得る。
【０１０９】
一般的なバイナリーアプタマー選択プロセスは、本明細書に記載される。例えば、特異的標的上で最初に別々で選択された左及び右の一次アプタマー集団は、等モル量で標的を共インキュベートすることができる。典型的な手順では、８ｐｍｏｌの各々のＬ−及びＲ−アプタマー及び特異的標的を使用することができる。室温で約２〜４時間インキュベーション後、標的を、上述のように（すなわち、一般的結合及び溶出手順）固相マトリックスに結合し、例えば、ＰＢＳＭで、４×０．５ｍｌの洗浄を施すことができる。固相調製物は、Ｌ−及びＲ−アプタマーそれぞれの３’及び５’末端をスパンする過剰のスプリントオリゴヌクレオチドでアニーリングすることができる。アニーリングは、例えば、約３７℃で約５分間、及び約２５℃で約３０分間のインキュベーションで実施することができる。調製物を、例えば、１ｍＭ  ＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む×１リガーゼ緩衝液で２回洗浄し、約５０μｌの同じリガーゼ緩衝液で再懸濁することができる。リガーゼを加え、調製物を室温でインキュベートすることができる。スプリント及びリガーゼまたは両方が省かれる対照を使用することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはクロレラＤＮＡリガーゼ（ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、対応する緩衝液を有する）である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはクロレラＤＮＡリガーゼである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、アプタマーを選択して、がん細胞に結合してもよく、正常細胞に結合するアプタマーは差し引くことができる。
【０１１３】
空間的近接において共通の標的分子上に共結合している一本鎖アプタマーのライゲーションは、バイナリーアプタマーと呼ばれる左及び右アプタマー間の連続的な融合をもたらす。任意の特異的バイナリーアプタマーまたはバイナリーアプタマーの集団から、完全なバイナリー配列は、結合した配列をスパンする単一対のプライマーで増幅することができる。所望の場合、任意の特異的バイナリーアプタマーまたはバイナリーアプタマーの集団から、左及び右アプタマーの成分を増幅することができる。
【０１１４】
バイナリーアプタマーは、特異性及び親和性を濃縮する利点を提供し、Ｌ−及びＲ−アプタマーセグメントの間の界面においてテンプレート化配列をもたらす。この配列は、所望のアセンブリ反応のテンプレート化、及びＬ−アプタマーリバースプライマー及びＲ−アプタマーフォワードプライマーのプライマー部位として両方の二重の役割を有する。
【０１１５】
一般的に、バイナリーアプタマーは、一般的なパターン：（Ｌ−フォワードプライマー）−（Ｌ−不規則領域）−（Ｌ−リバースプライマー／半スプリント領域）−（Ｒ−フォワードプライマー／半スプリント領域）−（Ｒ−不規則領域）−（Ｒ−リバースプライマー）に準拠している。結合した（Ｌ−リバースプライマー／半スプリント）−（Ｒ−フォワードプライマー／半スプリント）セグメントは、スプリント分子がＬ−及びＲ−連結することが可能な部位を構成し、テンプレート反応のための一本鎖アクセシブルテンプレートとしても機能する。
【０１１６】
左及び右アプタマーの各々のバイナリー型への結合は、例えば、左アプタマーの３’末端及び右アプタマーの５’末端に相補性のあるＲＮＡスプリントオリゴヌクレオチドの手段によって達成することができる。アプタマー末端のこのスプリントへのライゲーションは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、または、ＲＮＡスプリントによってＤＮＡ末端のライゲーションにおいて非常に効果的なクロレラＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によってより効率的に達成することができる。特異的バイナリー対は、近位バイナリー単位を単一隣接配列として増幅することによって同定し、特徴付けくことができる。ライゲーションの完了後、ＲＮＡスプリントは、ＲＮＡｓｅ  Ｈ（ＲＮＡでのみ活性：ＤＮＡハイブリッド）による処理によって除去し、左及び右アプタマーから結合したテンプレート領域を暴露した後、ハプロマーによりハイブリダイゼーションすることができる。
【０１１７】
標的共結合及びスプリントライゲーションによるバイナリーアプタマーの選択はまた、テンプレート領域がハイブリダイゼーション目的のためにアクセシブルであることを同時に保証する。３’及び５’末端が（これらの特異的標的結合の結果として）アクセスできない空間的近接におけるアプタマー対は、スプリントとハイブリダイズできず、バイナリーエンティティとしてその後のライゲーション及び増幅を行うことができる。
【０１１８】
代替のアプタマー選択プロセスも本明細書に開示する。例えば、左及び右アプタマーライブラリーを所望の標的分子上で最初に別々に選択し、結合サブ集団を溶出することができる。その後、これらに共結合選択を施して、近位バイナリーアプタマーを濃縮し、溶出したバイナリー集団成分から、左及び右アプタマー集団を増幅することができる。これら選択された集団の両方にリコンビナトリアルＤＮＡシャッフリングを施し（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０，３８９−３９１）、分子多様性を高めることができる。
【０１１９】
ＤＮＡシャッフリング工程（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４を参照）は、異なるアプタマー鎖間のクロスオーバープライミングを促進するように設計され、選択された左及び右アプタマーサブ集団の各々のＤＮａｓｅ  Ｉ限定消化の後、リアセンブリサイクル、及びその後、元のプライマーによる再増幅によって達成される。アプタマーＤＮＡシャッフリングの生成物は、高ストリンジェンシーで固相標的上でもう一度選択した後、共結合ライゲーション、溶出、及び増幅を行うことができる。このプロセスの生成物は、配列決定及び結合親和性の試験によって特徴付けることができる。
【０１２０】
テンプレート化アセンブリ目的のための一本鎖及びバイナリーアプタマーの両方の操作は、上記の通りである。バイナリーアプタマー適用は、２つのカテゴリーに分けることができる。第１のカテゴリーでは、近接結合一本鎖からこれらを同定した後、バイナリーは、することができる。（標的分子の不在下）溶液中で一緒に連結し、機能的な目的に展開することができる。第２のカテゴリーでは、バイナリーを、便利かまたは必要かに関わらず、標的分子上に直接アセンブルする。
【０１２１】
適応テンプレート化目的に生成された全てのアプタマーは、測定された（これらのＫd値によって示される）これらの結合親和性を有し得る。かかる親和性測定は、ＢｉａＣｏｒｅ計装、平衡透析、ゲルシフトアッセイ、フィルター結合アッセイ、及び結合及び非結合物質の分離プロセスと組み合わせた定量的ＰＣＲを含むが、これらに限定されない様々な方法によって実施することができる（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２０１１，６８６，９−１８を参照されたい）である。
【０１２２】
ハプロマーのテンプレート化アセンブリの任意の適用中に、所望のテンプレートへのハプロマーハイブリダイゼーションは、特異的であり得る。非特異的ハイブリダイゼーションは、対象となる細胞型に固有である標的分子を選択することによって最小化することができる。点突然変異のみが標的分子を区別する場合には、オフターゲット分子ハイブリダイゼーションのリスクが大きい。ハプロマーのテンプレートを提供するためのアプタマーの使用は、非標的分子ハイブリダイゼーションを完全に排除するユニークな機会を提供する。
【０１２３】
Ｄリボースの代わりにＬリボース（Ｌ−ＤＮＡ）を有するＤＮＡ類似体は、二本鎖を形成するためにホモキラル相補性核酸鎖を必要とする。従って、Ｌ−ＤＮＡからなるテンプレートは、任意の天然核酸とハイブリダイズすることができず、全ては、Ｄリボースを有する。Ｌ−ＤＮＡテンプレートタグは、ハイブリダイゼーション部分がＬ−ＤＮＡからなるエフェクター部分モイエティをテンプレート化する目的のために、アプタマーに付加することができる。Ｌ−ＤＮＡハプロマーは、これらのハイブリダイゼーション部分が、全てのヌクレアーゼに対する耐性が高い点で有利でもある。Ｌ−ＤＮＡの単鎖は、左巻きＤＮＡ二本鎖（Ｚ−ＤＮＡ）とは混同されない。
【０１２４】
アプタマー表示されたバイオオルソゴナルハイブリダイゼーション方法のいくつかの実施形態では、予め定められた一本鎖アプタマーのアクセシブル５’末端は、相互反応性クリック化学を介して、Ｌ−ＤＮＡ配列タグで誘導体化される。５’クリック基は、適当な修飾トップ鎖プライマーによる増幅を介して、アプタマーに導入され、ボトム鎖プライマーは、５’ビオチンを担持して、トップ（アプタマー）単鎖を生成しやすくする。３’クリック基を担持する過剰の所望のＬ−ＤＮＡとの化学ライゲーション（アプタマーによって運ばれる５’クリック基と相互反応性）の後、アプタマーは、所望のＬ−ＤＮＡ配列に対応する５’タグを運ぶ。標的結合すると、Ｌ−ＤＮＡタグは、これらのハプロマーが、同様に、相補性Ｌ−ＤＮＡハイブリダイゼーション部分を運ぶ場合にのみ、ハプロマーのテンプレートとして作用し得る。
【０１２５】
アプタマー表示されたバイオオルソゴナルハイブリダイゼーション方法のいくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーのアクセシブル３’末端は、相互反応性クリック化学を介して、Ｌ−ＤＮＡ配列タグで誘導体化される。この場合、予め定められたアプタマーの３’末端は、５’ホスフェート及び３’クリック基を担持する短鎖オリゴヌクレオチド配列（ｄＴ6-8）と、ＲＮＡリガーゼＩを介して酵素的に連結される。アプタマー５’末端は、この例では、５’ヒドロキシル基を担持する。この後、化学ライゲーションは、５’クリック基を担持する過剰の所望のＬ−ＤＮＡにより実施することができる（アプタマーによって運ばれる３’クリック基と相互反応性）。得られたアプタマー生成物は、所望のＬ−ＤＮＡ配列に対応する３’タグを運ぶ。標的結合すると、Ｌ−ＤＮＡタグは、これらのハプロマーが、同様に、相補性Ｌ−ＤＮＡハイブリダイゼーション部分を運ぶ場合にのみ、ハプロマーのテンプレートとして作用し得る。
【０１２６】
アプタマー表示されたバイオオルソゴナルハイブリダイゼーション方法のいくつかの実施形態では、指定された標的に空間的近接している二本鎖アプタマー結合を使用して、Ｌ−ＤＮＡテンプレートを表示する。このアプローチは、５’及び３’Ｌ−ＤＮＡ標識をそれぞれ担持する適切な左及び右アプタマーを使用する（共結合ライゲーションによって所望の標的分子に近接している結合として予め定められた）。この例では、Ｌ−ＤＮＡハイブリダイゼーション部分を有するハプロマーを使用するが、ハプロマーは、単一アプタマーの５’末端または単一アプタマーの３’末端にだけ配向されない。代わりに、バイオオルソゴナル反応性が、共通の標的分子上の二本鎖アプタマー結合の空間的近接を介して促進されるように、ハプロマーは、二本鎖アプタマー対のアプタマーの各々の末端に配向される。
【０１２７】
バイナリーアプタマーは、複合体分子上の近位に近い標的部位に共結合している一対のアプタマーから形成することができる。このスプリント上のアプタマー末端のライゲーションは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、またはより効率的には、ＲＮＡスプリントによるＤＮＡ末端のライゲーションに効率の高いクロレラＤＮＡリガーゼによって達成することができる（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。ライゲーション後、スプリントは、ＲＮａｓｅ  Ｈで除去することができる。点線の楕円は、ＲＮＡスプリント除去後のバイナリーアプタマーによって提供されるアクセシブルテンプレートを示す。
【０１２８】
非天然Ｌ−ＤＮＡタグは、一本鎖アプタマーの５’末端上に付加することができる。予め定められたアプタマーは再増幅され、ここで、トップ鎖プライマーは、５’クリック基を担持し、ボトム鎖プライマーは、５’ビオチンを担持する。増幅後、元のアプタマー配列に対応する単鎖を調製することができる。その後、得られたアプタマーは、３’−クリック基を担持する、アプタマークリック基とオルソゴナル反応性の、定められた配列の過剰のＬ−ＤＮＡタグと反応することができる。その標的分子に結合後、アプタマーは、付加されたＬ−ＤＮＡ配列を５’テンプレートとして表示し、相補性Ｌ−ＤＮＡハイブリダイゼーション部分を担持するハプロマーを認識することができる。曲線矢印は、異なるハプロマー間の近位に誘導された反応を示す。
【０１２９】
非天然Ｌ−ＤＮＡタグは、一本鎖アプタマーの３’末端上に付加することができる。アクセシブル３’末端を有する予め定められたアプタマーは、ＲＮＡリガーゼＩによって、５’ホスフェート及び３’クリック基を担持する短鎖単鎖オリゴヌクレオチド（ｄＴ8など）と連結される。その後、得られたアプタマーは、５’−クリック基を担持する、アプタマークリック基とオルソゴナル反応性の、定められた配列の過剰のＬ−ＤＮＡタグと反応することができる。その標的分子に結合後、アプタマーは、付加されたＬ−ＤＮＡ配列を３’テンプレートとして表示し、相補性Ｌ−ＤＮＡハイブリダイゼーション部分を担持するハプロマーを認識することができる。曲線矢印は、異なるハプロマー間の近位に誘導された反応を示す。
【０１３０】
非天然Ｌ−ＤＮＡタグは、バイオオルソゴナルハイブリダイゼーションによってハプロマーの空間的近接に配向させるために、二本鎖アプタマーの３’及び５’末端上に付加することができる。結合同じ標的分子に近位結合しているアプタマーの３’及び５’末端でのＬ−ＤＮＡタグは、本明細書に記載される通り、別々に付加することができる。
【０１３１】
アプタマー表示されたバイオオルソゴナルハイブリダイゼーション方法のいくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーを使用して、Ｌ−ＤＮＡテンプレートを表示する。これを達成するため、二重誘導体化プロセスを使用する。最初は、共結合によって近接のために予め選択されたバイナリーの左及び右セグメントを含む一本鎖アプタマーを、本明細書に記載されるものと同じ方法で、Ｌ−ＤＮＡタグで誘導体化する。この例では、Ｌ−ＤＮＡタグは、これらの３’及び５’末端にそれぞれ付加されたアミノ基を有する。各Ｌ−ＤＮＡタグ配列の最初の化学ライゲーションの後、アミノ基は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド化学を介して、適切なクリック基で誘導体化することができる。前のクリック基がいったん反応すると、生成物は第２の誘導体化に対して不活性になるため、これらの反応を行うことができる。完全に誘導体化されたＬ−ＤＮＡタグ付けアプタマーは、次いで、対象となる標的分子に共結合することによって、化学的に一緒に連結することができる。この例では、各Ｌ−ＤＮＡタグ間の相互作用は、短鎖（すなわち、４〜６塩基）相互相補性末端配列によって促進される。これは、短鎖ステムループを形成し、次に、オリゴヌクレオチド担持クリック−反応基で前に示したように、空間的近接を濃縮することで、Ｌ−ＤＮＡハプロマーをハイブリダイズするその後の反応を促進する。
【０１３２】
バイナリーアプタマーは、架橋非天然Ｌ−ＤＮＡ配列を備えており、バイオオルソゴナルハイブリダイゼーションによってハプロマーの空間的近接を配向させることができる。例えば、左アプタマーは、誘導体化Ｌ−ＤＮＡタグで調製することができる。Ｌ−ＤＮＡタグの初期連結は、Ｌ−ＤＮＡが、クリック基で二次誘導体化するための３’−アミノ基を担持する以外は、本明細書に記載の通りである。右アプタマーは、誘導体化Ｌ−ＤＮＡタグで調製することができる。Ｌ−ＤＮＡタグの初期連結は、Ｌ−ＤＮＡが、クリック基で二次誘導体化するための５’−アミノ基を担持する以外は、本明細書に記載の通りである。両方の場合、前のクリック基がいったん反応すると、生成物は第２の誘導体化に対して不活性になるため、二次誘導体化を行うことができる。
【０１３３】
バイナリーアプタマーは、架橋非天然Ｌ−ＤＮＡ配列を備えており、バイオオルソゴナルハイブリダイゼーションによってハプロマーの空間的近接を配向させることができる。Ｌ−ＤＮＡ配列を担持する左及び右誘導体化アプタマーの標的分子上の化学連結、及びその後のハプロマーとのハイブリダイゼーションを示す。左及び右Ｌ−ＤＮＡセグメントの各々は、短鎖（すなわち、４〜６塩基）相互相補性末端配列を有し、局所相互作用及びその後のハプロマー空間的近接の両方を促進するように設計されている。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、クリック反応基は、アジド及び歪みシクロオクチン基、またはテトラジン誘導体及びトランス−シクロオクテン基であり得るが、これらに限定されない。５’テンプレート修飾では、トップ鎖プライマーは、５’アミノ基と最初に合成することができ、これは、クリック基−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドモイエティとの反応を通じて、適当なクリック基にその後変換することができる。
【０１３５】
多くの場合のリガンド誘導アロステリック構造変化が、ＲＮＡ及びＤＮＡアプタマーの両方で文書化されている。かかる効果を有用に利用して、アプタビーコン及びアプタマーセンサーなどの特異的アプタマー機能性の生成してきた。この例では、アロステリック効果の選択は、アプタマー由来のテンプレートが、標的分子に結合した後、エフェクター部分モイエティハイブリダイゼーションにのみ暴露されるように行うことができる。これらの種類のアロステリックアプタマーは、テンプレート化アセンブリのディスプレイビヒクルとして、アプタマーの有用性にさらなる力をもたらす。具体的には、アクセシブルテンプレートが標的分子結合後にのみ暴露されるアプタマー系は、非特異的ハプロマー相互作用の減少をもたらす。言い換えれば、アプタマーが特異的標的に遭遇しない環境では、テンプレート化アセンブリにアクセス可能なテンプレートはない。
【０１３６】
ハプロマー適用のアロステリックアプタマーの選択方法のいくつかの実施形態では、一本鎖アプタマーが選択され、テンプレート化アセンブリの末端テンプレート配列が、アプタマーが特異的標的分子に結合後にのみ暴露され、アクセス可能になる。このプロセスは、ネガティブ及びポジティブ選択のサイクルを伴う。第１の工程は、未選択アプタマーライブラリーを、ビオチン化プローブ配列で定義されるように、溶液中でアクセシブル末端を有するこれらのメンバー、及びその末端がハイブリダイゼーションにアクセス可能ではないこれらのメンバーに画分することを伴う。ライブラリーの溶液アクセシブルメンバーは、アニーリングしたプローブを、例えば、固相ストレプトアビジンマトリックスに結合させることで除去することができる。従って、このプロセスは、テンプレート配列が追加プローブ分子にアクセス可能ではない溶液中で折り畳まれたアプタマーをネガティブ選択する。この集団内で、第２のポジティブ選択（例えば、ビオチン化プローブ配列によってもう一度）は、標的結合の結果としてアクセシブルテンプレート配列を生成するメンバーでなされることができる。このポジティブ選択は、アクセシブル標的による一本鎖アプタマーの選択プロセスに類似している。得られた選択アプタマーを増幅し、適当な一本鎖調製物を作製する場合、プロセスは、サイクルとして繰り返すことができる。Ｎサイクル後の選択集団の異質性が大きく減少する場合、得られた集団をクローニングし、個々のアプタマーをスクリーニングすることができる。候補アプタマーは、自由溶液中でテンプレートベースの相互作用に対して無効であるとして元の選択基準に準拠しているが、特異的テンプレートの存在下で、かかる相互作用に従順であり得る。アロステリック誘導アクセシブルテンプレートは、ハプロマーのテンプレート化アセンブリを許可することもできる。
【０１３７】
アプタマーアロステリーの選択プロセス（ここで、標的分子結合は、テンプレート配列の暴露及び／またはアクセシビリティを誘導する）も実施することができる。そのテンプレート化配列が（標的分子の存在前に）溶液中でアクセス可能であるアプタマーは、例えば、適切なビオチン化プローブ配列への初期ハイブリダイゼーション、及び、例えば、固相ストレプトアビジンマトリックス上への固定化によって除去することができる。上清画分は、溶液中の標的分子でインキュベートすることができる。標的分子に結合し、テンプレート配列アクセシブルを描写するアロステリック変化を受けるアプタマーは、例えば、ビオチン化プローブ結合によって選択可能である。テンプレート配列がマスクされたままであるかまたはアクセスできないアプタマーは選択されない。従って、例えば、固相ストレプトアビジンマトリックス上に前者を隔離することで、これらの選択的増幅が可能になる。その後、この方法で得られた溶出アプタマー調製物は、全サイクルの繰り返しを施すことができる。サイクリングは、得られた集団の解析が均質性の高い低下を示すまで行い、その後に、特異的にクローニングされたアプタマーの解析を実施することができる。
【０１３８】
エフェクター部分モイエティ適用のアロステリックアプタマーの選択方法のいくつかの実施形態では、バイナリーアプタマーが選択され、ここで、バイナリー型を含む一本鎖成分の各々の３’及び５’末端は、標的分子結合後に、アクセス可能な近接でのみ暴露される。対象となる標的に向けられる左及び右アプタマーの両方は、本明細書に記載の方法と同じ方法で、最初に導出することができ、ここで、両方のアプタマーは、標的分子との相互作用後にのみ、アロステリックに暴露可能なテンプレート配列を呈する。かかる標的特異的アプタマーの集団は、共結合プロセス及びスプリント特異的インサイチュライゲーションを施すことができる。特異的バイナリー対は、近位のバイナリー単位を単一隣接配列として増幅することによって同定し、特徴付けることができる。特定の対が同定される場合、スプリント除去は、ＲＮａｓｅ  Ｈを用いて達成することができ、その後に、接合型テンプレート配列は、ハプロマーテンプレート化アセンブリに利用可能である。
【０１３９】
結合したバイナリーのインサイチュ生成に向かうアプタマーアロステリーも可能である。バイナリーアプタマー対の各左及び右成分の間で連結しているテンプレート化配列は、標的分子結合、及び空間的近接における末端テンプレートのアロステリック暴露後にのみ利用可能である。かかる対は、元の標的上の共結合、ＲＮＡスプリント媒介性連結、及び増幅によって同定することができる。いったん特異的バイナリーアプタマー対が同定されると、それらを、本明細書に記載されるものと同じ方法でハプロマーテンプレート化に使用することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、結合剤の左及び右アプタマー選択の初期ラウンドは、対象となる腫瘍由来の原料物質を用いて行う。原料物質が全細胞である場合には、非結合物質は、低速遠心分離及び洗浄による結合選択中に除去することができる。原料物質が全細胞細胞質溶解物または全細胞ＲＮＡである場合には、非結合物質は、例えば、差次的ＰＥＧ沈殿によって除去することができる。この工程の後には、物質に結合しているアプタマーを、同系の正常な供給源から減算除去することを続けることができる。結合及び非結合の分離は、初期工程におけるものと同じである。これらの工程は、必要に応じて、一連のサイクルを通じて繰り返すことができる（１０のかかるサイクルが、通常は十分である）。
【０１４１】
特に、いくつかの方法は、腫瘍細胞供給源から標的に結合しているアプタマーと、適合した同系の正常細胞に結合しているアプタマーとの間の減算を伴う。原料物質は、全細胞（細胞表面標的を選択する）、全細胞細胞質溶解物（タンパク質、ＲＮＡ、及びリボヌクレオタンパク質を含む、全ての細胞内標的を選択する）、または全ＲＮＡであり得る。Ｌ−及びＲ−アプタマーライブラリーを最初に使用して、腫瘍源に結合し、かつ、腫瘍関連分子に排他的に結合するアプタマーを豊富にするために、対応する正常な供給源標的への結合によって除去を逃れるサブ集団を選択することができる。この結合及び減算プロセスは、適当な数のサイクルで繰り返すことができる。腫瘍に対するかかる正常な対応部分に直接結合するＬ−及びＲ−アプタマーライブラリーはまた、同じ数のサイクルを用いて、プロセスの次の段階に向けて直接選択することができる。
【０１４２】
かかる方法の変更例では、対象となる正常な原料物質（腫瘍原料物質に対応する）を使用して、左及び右アプタマー集団を直接結合させるように選択することもでき、結合及び非結合の分離は、上述したものと同じである。正常な標的分子に結合している左及び右アプタマーの得られたサブ集団を、その後の選択的目的に使用することができる。
【０１４３】
適切なサイクリング後に上に概説された工程後、対象となる腫瘍源に結合し、同系の正常な供給源を減算した左及び右アプタマーの選択されたサブ集団は、同じ元の腫瘍源で共結合実験に使用することができる。Ｌ（ＴΔＮ）及びＲ（ＴΔＮ）は、対象となる腫瘍源に結合し同系の正常な供給源を減算した左アプタマー、及び対象となる腫瘍源に結合し同系の正常な供給源を減算した右アプタマーをそれぞれ指す。加えて、同系の正常な標的（Ｒ（Ｎ）及びＬ（Ｎ）、それぞれ）に結合するように予め選択された対応する右及び左アプタマーと併せて、腫瘍標的に共結合したＬ（ＴΔＮ）及びＲ（ＴΔＮ）サブ集団の両方で試験を行うことは有用であり得る。Ｌ−及びＲ−腫瘍結合の、正常な供給源を減算したサブ集団だけでなく、対応する正常な供給源からＲ及びＬサブ集団（それぞれ）と共結合したこれらのＬ−及びＲ−集団の各々による共結合実験を行うことができる。「半正常」バイナリーの使用は、少なくとも１つの半分が腫瘍特異性を有する増幅可能なバイナリー生成物を見つける可能性を増やすためである。
【０１４４】
減算／共結合プロセスの根拠は、新規の腫瘍特異的標的の未知の表面密度から導出することができる。左及び右腫瘍制限エピトープの両方からなるバイナリーが望まれる一方、腫瘍サブセットを定める一本鎖エピトープは、いまだ非常に価値がある。近位正常エピトープと併せてかかるエピトープを認識するアプタマーは、標的腫瘍細胞を認識する能力を保持するが、バイナリーアプタマーと会合する特異性及び親和性の改善も得られる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、減算プロセスは、インビトロ薬物治療の有無に依らず、腫瘍標的細胞を伴う。ここで、薬物処置された全腫瘍細胞または処置された腫瘍細胞の抽出物を使用して、Ｌ−及びＲ−アプタマー結合剤を選択し、対応する未処置された腫瘍細胞も同様に、同じ選択プロセスを施すことができる。薬物処置されたコホートを選択する各サイクルでは、未処置細胞または未処置抽出物に結合しているアプタマーを除去することができる。最終的に、処置腫瘍標的に結合しているバイナリーアプタマーの共結合選択を行うことができ、ここで、Ｌ−及びＲ−成分のいずれかまたは両方が、腫瘍／正常細胞と同様に、処置された調製物に排他的に結合する。
【０１４６】
抗体または他の認識分子による認識を誘発するためのエピトープハプロマーのテンプレート化の有効性を試験することで、インビボ適用の前に全ての実施形態についてインビトロで最初に実証することができる。かかる評価は、ＥＬＩＳＡアッセイによって最良になされ、ここで、ビオチン化テンプレート核酸鎖は、ストレプトアビジン（ＳＡ）によって表面固定化される。その後、エピトープハプロマー及び適当な対照の対を表面テンプレートでハイブリダイズした後、対象となる認識分子（他の抗体）でインキュベーションした。最終読み出しは、標準開発試薬を介した酵素活性の視覚化のために、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼとカップリングした二次抗体の使用を（限定されないが）含む、様々な方法で達成される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、エフェクター部分モイエティのアプタマー媒介性テンプレート化は、よく特徴付けられた治療用抗体によって認識されるペプチドエピトープのアセンブリを指示する。かかる抗体としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦを認識する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。標的抗原上の認識部位に対応する短鎖ペプチド配列が利用可能でない場合、この実施形態は、リンパ腫抗体結合特異性の同定に採用される、例えば、ペプチドファージディスプレイライブラリーによって対象となる利用可能な抗体によるペプチドエピトープ同定も含む。認識分子として追加の抗体には、例えば、パリビズマブ、モタビズマブ、パニツムマブ、メツキシマブ、細菌性抗原に対する抗体、ウイルス抗原に対する抗体、及び寄生虫抗原に対する抗体が挙げられる。
【０１４８】
トラスツズマブのミモトープの一例は、配列ＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号３６）を有するペプチド、Ｌ１Ｑ置換によって高い結合親和性を有する最初のミモトープ同定（ＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ；配列番号３７）の誘導体である。いくつかの実施形態では、エピトープは、式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓを含むポリペプチドであり、式中、ａ）Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒ（配列番号１）であり；ｂ）Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒ（配列番号２）であり；またはｃ）Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓ（配列番号３）である。いくつかの実施形態では、エピトープは、式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号３）（すなわち、「Ｓ１１Ｃ」と呼ばれる）を含むポリペプチドであり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＮ末端は、ビオチンを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、エピトープは、式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓを含むポリペプチドであり、式中、ａ）Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号４）；ｂ）Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号５）；ｃ）Ｘａａ3は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号６）；ｄ）Ｘａａ4は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号７）；ｅ）Ｘａａ5は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号８）；ｆ）Ｘａａ6は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号９）；ｇ）Ｘａａ7は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１０）；ｈ）Ｘａａ8は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１１）；ｉ）Ｘａａ9は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく（配列番号１２）；ｊ）Ｘａａ10は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11はなく（配列番号１３）；またはｋ）Ｘａａ11は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はなく（配列番号１４）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＮ末端は、ビオチンを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、選択されたエピトープは、システイン残基による置換が許容される個々の残基をスクリーニングすることによって、機能的に分割される。トラスツズマブミモトープＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号３６）の非限定的な例として、以下のペプチドは、トラスツズマブへの結合の保持のために、合成され、スクリーニングされる：１）（Ｎ末端）ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＣＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号１）；２）（Ｎ末端）ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＣＷＥＬＳＨ（配列番号２）；及び３）（Ｎ末端）ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＣＨ（配列番号３）。加えて、ミモトープ誘導体をスクリーニングしてもよく、システイン残基は、残基置換を介してではなく、ミモトープ配列に徐々に挿入される。非限定的な例として、以下のペプチドは、トラスツズマブへの結合の保持のために、合成され、スクリーニングされる：４）（Ｎ末端）ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＣＬＷＥＬＳＨ（配列番号９）。Ｎ末端ビオチン化及びセリン−グリシンリンカーは、配列：（Ｎ末端）ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号３５）の親ミモトープで実行されるように、ＥＬＩＳＡアッセイからの最適信号を提供するように存在する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、認識分子は、パリビズマブであり、これは、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）のＦ糖タンパク質に結合し、ウイルスの細胞への侵入を遮断するヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、認識分子は、モタビズマブであり、これは、親和性が増したパリビズマブの誘導体である。パリビズマブ及びモタビズマブのエピトープの一例は、ヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフであり、２つのα螺旋は、短鎖（４−残基）ループセグメントによって分離される。抗体結合部位に向かう重要な接触残基は、両方の螺旋内である一方、ループ領域は、モタビズマブ結合に寄与しない。これらの抗体によって認識されるエピトープのネイティブ配列は、ＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮ（配列番号３８）であり、螺旋は太字であり、ループ領域は、太字の螺旋の間である。自然なＦタンパク質それ自体の内と比較して、溶液中の遊離ペプチドエピトープに向かう抗体結合の著しい損失があり、これは、単離ペプチドによるヘリックス・ループ・ヘリックス立体配座の採用が乏しいことに少なくとも一部は起因した。従って、スプリットエピトープワークのペプチドは、Ｎキャップ及びＣキャップ残基を濃縮して（可能であれば）設計される。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、パリビズマブ／モタビズマブのＮ末端エピトープ断片は、配列：ＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤ−ＭＧＰＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号３９）を含み、アジド基は、相補性反応性を有する５’または３’クリック基を有するオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションを容易にするように存在し、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。導入したＧＰＳ濃縮Ｃキャップは、太字である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端エピトープ断片は、螺旋性を濃縮するために、そのＮ末端に追加の２つの残基を含む。これらはまた、ネイティブＲＳＶ  Ｆタンパク質の文脈において、エピトープに対して直ちにＮ末端の２つの残基に対応する。代替配列は、ＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤ−ＭＧＰＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号４０）であり、導入したＮ末端（ＬＴ）残基は、ＬＴである。いくつかの実施形態では、ＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤ（配列番号４１）エピトープ断片配列のＣ末端の代替配列が使用され、ＭＰＩＴＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号４２）、ＭＧＧＳＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号４３）、ＭＧＡＰＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号４４）、ＧＧＰＳＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号４５）、及びＧＰＳＧＳＧＧＧＳ−（アジド）（配列番号４６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、パリビズマブ／モタビズマブのＣ末端エピトープ断片は、配列：（アジド）−ＳＧＧＧＧＬＳ−ＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮ（配列番号４７）を含み、アジド基は、相補性反応性を有する５’または３’クリック基を有するオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションを容易にするように存在し、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。導入したＧＰＳ濃縮Ｎキャップは、太字である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端エピトープ断片は、螺旋性を濃縮するために、そのＣ末端に追加の２つの残基を含む。これらはまた、ネイティブＲＳＶ  Ｆタンパク質の文脈において、エピトープに対して直ちにＣ末端の２つの残基に対応する。代替配列は、（アジド）−ＳＧＧＧＧＬＳ−ＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱ（配列番号４８）であり、導入したＣ末端残基は、ＶＱである。いくつかの実施形態では、ＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮ（配列番号４９）エピトープ断片配列のＮ末端の代替配列が使用され、（アジド）−ＳＧＧＧＧＬＳ（配列番号５０）、（アジド）−ＳＧＧＧＧＡＳ（配列番号５１）、（アジド）−ＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５２）、（アジド）−ＳＧＧＧＧＬＤ（配列番号５３）、及び（アジド）−ＳＧＧＧＧＬＮ（配列番号５４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、認識分子は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体であるパニツムマブである。ＥＧＦの多数のペプチド配列としては、ＩＹＰＰＬＬＲＴＳＱＡＭ（配列番号５５）、ＡＹＰＰＹＬＲＳＭＴＬＹ（配列番号５６）、ＹＰＰＡＥＲＴＹＳＴＮＹ（配列番号５７）、ＣＰＫＷＤＡＡＲＣ（配列番号５８）、及びＣＧＰＴＲＷＲＳＣ（配列番号５９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、認識分子は、ＡＴＶｉであり、これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａのＶｉ抗原に結合するモノクローナル抗体である。Ｖｉ抗原の多数のペプチド配列としては、ＴＳＨＨＤＳＨＧＬＨＲＶ（配列番号６０）、ＴＳＨＨＤＳＨＧＤＨＨＶ（配列番号６１）、ＴＳＨＨＤＳＨＧＶＨＲＶ（配列番号６２）、ＴＳＨＨＤＳＨＤＬＨＲＶ（配列番号６３）、ＴＳＨＨＤＹＨＧＬＨＲＶ（配列番号６４）、ＥＮＨＳＰＶＮＩＡＨＫＬ（配列番号６５）、ＥＮＨＳＰＶＮＩＡＨＫＶ（配列番号６６）、ＥＮＨＳＰＶＮＩＤＨＫＬ（配列番号６７）、ＥＤＨＳＰＶＮＩＤＨＫＬ（配列番号６８）、ＥＮＨＹＰＬＨＡＡＨＲＩ（配列番号６９）、ＥＳＨＱＨＶＨＤＬＶＦＬ（配列番号７０）、ＰＧＨＨＤＦＶＧＬＨＨＬ（配列番号７１）、ＥＮＨＹＰＶＮＩＡＨＫＬ（配列番号７２）、及びＤＮＨＳＰＶＮＩＡＨＫＬ（配列番号７３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、認識分子は、ＡＶＦｌｕＩｇＧ０１であり、これは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに結合するヒトモノクローナル抗体である。Ｈ５Ｎ１の多数のペプチド配列としては、ＹＩＮＰＨＭＹＷＭＳＶＡ（配列番号７４）、ＨＴＰＰＰＱＰＹＲＴＨＩ（配列番号７５）、ＴＦＷＶＱＴＡＫＰＮＰＬ（配列番号７６）、ＧＨＰＳＫＴＳＧＨＰＬＴ（配列番号７７）、ＴＹＶＮＩＶＬＹＤＤＶＥ（配列番号７８）、ＴＴＮＦＬＮＨＡＩＡＨＫ（配列番号７９）、ＹＹＮＰＳＰＰＮＰＲＴＱ（配列番号８０）、ＴＥＳＰＱＹＩＡＬＳＦＨ（配列番号８１）、ＨＷＹＤＷＬＴＲＹＳＨＬ（配列番号８２）、ＡＴＹＴＴＤＡＱＳＹＨＭ（配列番号８３）、ＤＨＹＷＨＲＳＮＴＬＳＨ（配列番号８４）、ＶＴＳＨＤＬＫＫＳＧＴＷ（配列番号８５）、ＷＥＦＡＹＫＮＴＲＹＹＷ（配列番号８６）、ＳＷＴＳＬＰＬＨＥＡＩＨ（配列番号８７）、ＴＬＡＨＴＨＴＳＴＳＳＦ（配列番号８８）、ＷＨＷＳＦＦＡＳＰＬＰＡ（配列番号８９）、ＷＨＷＮＡＲＮＷＳＳＱＱ（配列番号９０）、ＣＷＴＳＬＰＬＨＥＡＩＨ（配列番号９１）、ＶＰＴＥＣＳＧＲＴＳＣＴ（配列番号９２）、ＷＳＮＨＷＷＨＳＫＷＡＩ（配列番号９３）、ＨＩＷＮＷＳＮＷＴＱＷＴ（配列番号９４）、ＨＩＦＨＮＴＨＷＷＱＲＷ（配列番号９５）、ＴＮＹＤＹＩＰＤＴＱＮＴ（配列番号９６）、ＳＷＳＳＨＳＮＳＴＰＴＳＹＮＴＮＱＴＱＮＰＴＳＴＳＴＮＱＰＮＮＮ（配列番号９７）、及びＮＨＥＫＩＰＫＳＳＷＳＳＨＷＫＹＮＴＮＱＥＤＮＫＴＩＫＰＮＤＮＥＹＫＶＫ（配列番号９８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、認識分子は、メツキシマブ（ＬＩＣＡＲＴＩＮ（登録商標））であり、これは、ＣＤ１４７に結合する抗体である。ＣＤ１４７の多数のペプチド配列としては、ＹＰＨＦＨＫＨＴＬＲＧＨ（配列番号９９）、ＹＰＨＦＨＫＨＳＬＲＧＱ（配列番号１００）、ＤＨＫＰＦＫＰＴＨＲＴＬ（配列番号１０１）、ＦＨＫＰＦＫＰＴＨＲＴＬ（配列番号１０２）、ＱＳＳＣＨＫＨＳＶＲＧＲ（配列番号１０３）、ＱＳＳＦＳＮＨＳＶＲＲＲ（配列番号１０４）、及びＤＦＤＶＳＦＬＳＡＲＭＲ（配列番号１０５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、認識分子は、１５２−６６−９ｂであり、これは、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉに結合するモノクローナル抗体である。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉの多数のペプチド配列としては、ＶＬＬＲＲＩＧＧ（配列番号１０６）、ＨＬＬＲＬＳＥＩ（配列番号１０７）、ＳＬＬＴＹＭＫＭ（配列番号１０８）、及びＹＬＬＱＫＬＲＮ（配列番号１０９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
多種多様な認識分子の追加のエピトープは、当該技術分野で公知であり、本明細書に開示の方法のいずれかで使用することができる。
【０１６０】
本明細書に開示のスプリットエピトープ方法論で有用にするために、エピトープの各セグメント（すなわち、組み合わせた場合に認識分子のエピトープを形成するハプロマー対のモイエティを形成する各反応性エフェクターモイエティ）は、抗体のみに対する有意な結合が欠如しているべきであるが、活性は、それらの相互強制近接を介してまたはそれらの共有結合を通じて付与すべきである。いくつかの実施形態では、エピトープは、セリンをシステインに置き換えることによって変更することができる。いくつかの実施形態では、ただ１つのシステインが、エピトープに挿入または置換される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエピトープのいずれかのＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１１０）モイエティは、変更することができる。いくつかの実施形態では、エピトープのＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１１０）モイエティは、可変長であってよく、例えば、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１１１）である。いくつかの実施形態では、エピトープのＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１１０）モイエティは、例えば、トレオニン、グルタミン、及びアスパラギンなどの他のアミノ酸から成り得る。いくつかの実施形態では、エピトープのＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１１０）モイエティは、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＳｅｒＧｌｙＧｌｙ（配列番号１１２）と置き換えることができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ビオチンは、ＥＬＩＳＡ研究またはオンセル研究のいずれかのアンカーとして機能する。いくつかの実施形態では、ビオチンは、他の公知の適当な分子と置き換えることができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、抗体：標的抗原複合体からの構造情報を使用して、エピトープを２つのセグメントに開裂する部位を選択する。これは、エピトープが、構成：Ａ１Ａ２Ａ３…．Ａｎ−ｘｘｘｘｘｘｘｘ−Ｂ１Ｂ２Ｂ３…．Ｂｎを有する自然エピトープによって例示されるように、２つ以上の不連続成分からなることが公知である場合に特にそうであり、Ａ１〜Ａｎ及びＢ１〜Ｂｎは、抗体認識部位を接触させる残基のトラクトであり、及びｘは、効果的な抗体接触をしない拡張トラクトを示す。かかる場合、エピトープは、規定された非接触領域を有する配列Ａ１〜Ｂｎにわたって不連続である。そのため、これらの状況で、エピトープを２つの断片：Ａ１Ａ２Ａ３…．Ａｎ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３…．Ｓｎ−Ｖ及びＷ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３…．Ｓｎ−Ｂ１Ｂ２Ｂ３…．Ｂｎに分割することが論理的であり、Ｓ１Ｓ２Ｓ３…．Ｓｎは、リンカー配列の残基、通常、限定されないが、セリン及びグリシン残基の組成物を構成する。リンカー配列の１つの目的は、対象となる抗体への結合に有利な方法で、それぞれの（Ａ）及び（Ｂ）エピトープセグメントを空間的に配置することである。次に、必要なリンカー配列の長さは、入手可能な場合は構造情報から、定義可能な制限内で、評価することもできる。
【０１６４】
２つのスプリットエピトープセグメント（バイオオルソゴナル反応性化学基Ｖ及びＷを有する）の空間的近接が、相互テンプレート化によって達成された後、特異的化学反応性は、抗体反応性エピトープの再構成：Ａ１Ａ２Ａ３…．Ａｎ−Ｓ１．．Ｓｎ−［Ｒ］−Ｓ１．．Ｓｎ−Ｂ１Ｂ２Ｂ３…．Ｂｎをもたらし、Ｒは、相互にバイオオルソゴナルな反応基Ｖ及びＷの間の反応から生じる化学残基である。
【０１６５】
相互にバイオオルソゴナルな反応基Ｖ及びＷは、直鎖アルキン／アジド、歪みアルキン／アジド、及びテトラジン／シクロオクテン対を含むが、これらに限定されないクリック試薬の対によって構成することができる。追加のバイオオルソゴナル反応基は、本明細書に記載される。
【０１６６】
エピトープ配列内のシステイン置換または挿入が、（比較ＥＬＩＳＡ力価によって評価されるように、未修飾エピトープに向かう対象となる抗体の結合能力の５０〜１００％）抗体認識と互換性があることが分かると、システイン担持エピトープは、システイン部位で機能的に切断することができる。従って、スプリットエピトープを構成する２つの断片は、ネイティブ化学ライゲーション（ＮＣＬ）によって空間的近接である場合に、生成し、再アセンブルすることができる。これらの非限定的な例は、上記のペプチド配列１）：１）（Ｎ末端）ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＣＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号１）で提供され；スプリットペプチドは、１ａ）ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬ−（Ｃ末端フェニルチオエステル）（配列番号１５）及び１ｂ）ＣＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号１６）に対応する。エピトープが、式：ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号３）（すなわち、と呼ばれる「Ｓ１１Ｃ」）を含むポリペプチドであり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓである別の例では、得られたスプリットペプチド（これらのハプロマーの反応性エフェクター分子である）は、ＳＧＧＧＱＬＣＰＹＥＬＷＥＬ−（Ｃ末端フェニルチオエステル）（配列番号１１３）及びＣＨＧＧＧＳ（配列番号１１４）である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ネイティブ化学ライゲーション（ＮＣＬ）媒介性エピトープ再構成がオリゴヌクレオチドとコンジュゲートさせることができるようにさらに修飾してもよく、その結果、エピトープハプロマーとして描写することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ−またはＣ末端アジド基を付加するように修飾することができる。Ｎ末端アジドの場合、修飾は、Ｎ末端アジド酢酸基の組み込みによって達成することができる。Ｃ末端アジドの場合、修飾は、Ｃ末端アジドリシン残基によって達成することができる。いくつかの実施形態では、アジド修飾ペプチドは、銅フリー‘歪みクリック’反応のためにジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基を有するこれらの  ３’または５’末端で修飾されたオリゴヌクレオチドと反応する。いくつかの実施形態では、アジド修飾ペプチドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下で、直鎖アルキンによるそれらの３’または５’末端で修飾されたオリゴヌクレオチドと反応する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、トラスツズマブに対する反応性エフェクターモイエティの対（例えば、テンプレート化アセンブリの際にエピトープを形成することができるポリペプチドの対、またはそれらの組成物）としては、ａ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕ（配列番号１５）及びＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；ｂ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕ（配列番号１７）及びＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；及びｃ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕ（配列番号１９）及びＸａａ3Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｃｙｓである；が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、
ａ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕ（配列番号１５）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；
ｂ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕ（配列番号１７）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕＸａａ3Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ3は、Ｓｅｒであり；
ｃ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＬｅｕＸａａ1ＰｒｏＴｙｒＧｌｕＸａａ2ＴｒｐＧｌｕＬｅｕ（配列番号１９）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ3Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ1は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ2は、Ｌｅｕであり、及びＸａａ3が、Ｃｙｓであり；
ｄ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎ（配列番号２０）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２１）であり、式中、Ｘａａ1は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｅ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1Ｌｅｕ（配列番号１５）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈ（配列番号２２）であり、式中、Ｘａａ2は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｆ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2Ｇｌｙ（配列番号２３）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１６）であり、式中、Ｘａａ3は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｇ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3Ｐｒｏ（配列番号２４）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２５）であり、式中、Ｘａａ4は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｈ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4Ｔｙｒ（配列番号２６）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２７）であり、式中、Ｘａａ5は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｉ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5Ｇｌｕ（配列番号１７）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号２８）であり、式中、Ｘａａ6は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｊ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6Ｌｅｕ（配列番号２９）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号１８）であり、式中、Ｘａａ7は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｋ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7Ｔｒｐ（配列番号３０）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３１）であり、式中、Ｘａａ8は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ9、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｌ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8Ｇｌｕ（配列番号３２）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ9ＬｅｕＸａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓ（配列番号３３）であり、式中、Ｘａａ9は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ10、及びＸａａ11はなく；
ｍ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9Ｌｅｕ（配列番号１９）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ10ＳｅｒＸａａ11Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ10は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ11はなく；または
ｎ）第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの一方は、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸａａ1ＬｅｕＸａａ2ＧｌｙＸａａ3ＰｒｏＸａａ4ＴｙｒＸａａ5ＧｌｕＸａａ6ＬｅｕＸａａ7ＴｒｐＸａａ8ＧｌｕＸａａ9ＬｅｕＸａａ10Ｓｅｒ（配列番号３４）であり、及び第１のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティ及び第２のエピトープハプロマーの反応性エフェクターモイエティの他方は、Ｘａａ11Ｈｉｓであり、式中、Ｘａａ11は、Ｃｙｓであり、及びＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、及びＸａａ10はない。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドのＣ末端は、第１のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、第２のポリペプチドのＮ末端は、第２のバイオオルソゴナル反応基をさらに含み、第１のバイオオルソゴナル反応基及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、互換性がある。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、第１のバイオオルソゴナル反応基は、直鎖アルキンであり、及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、アジドであり、または第２のバイオオルソゴナル反応基は、直鎖アルキンであり、及び第１のバイオオルソゴナル反応基は、アジドであり；第１のバイオオルソゴナル反応基は、歪みアルキンであり、及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、アジドであり、または第２のバイオオルソゴナル反応基は、歪みアルキンであり、及び第１のバイオオルソゴナル反応基は、アジドであり；または第１のバイオオルソゴナル反応基は、テトラジンであり、及び第２のバイオオルソゴナル反応基は、シクロオクテンであり、または第２のバイオオルソゴナル反応基は、テトラジンであり、及び第１のバイオオルソゴナル反応基は、シクロオクテンである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドのＣ末端は、第１の化学修飾をさらに含み、及び第２のポリペプチドのＮ末端は、第２の化学修飾をさらに含み、化学修飾及び第２の化学修飾は、互換性がある。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、第１の化学修飾は、アミド化（ＣＯＮＨ2）またはエステル化（ＣＯＯＲ）であり、Ｒは、メチル、エチル、またはフェニルであり；及び第２の化学修飾は、アセチル化またはＮ末端アミノ基のＮ−メチル置換である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、２つのエピトープ断片は、共通テンプレートによるコンジュゲート核酸配列の相互ハイブリダイゼーションによって空間的近接になる。エピトープセグメント（反応性エフェクターモイエティ）−核酸コンジュゲートは、「エピトープハプロマー」と本明細書で呼ばれる。合成されたエピトープセグメントと所望の核酸配列の間のコンジュゲーションは、末端チオール基（還元システイン残基など）とマレイミド系架橋剤の間の反応、歪みアルキンクリック化学基間の反応、及び逆電子要求型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒクリック化学に関与している化学基間の反応を含むが、これらに限定されない多くの方法で達成することができる。ビスマレイミド（ＰＥＧ）2化合物（ＢＭＰ２、Ｓｉｇｍａ）を用いて、オリゴヌクレオチド上の５’または３’チオールと、ペプチド上の還元システイン残基からのチオールの間の共有結合を形成する例示のカップリング方法が、本明細書に記載される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、エピトープセグメントと核酸の間の化学反応から生じるコンジュゲーション生成物（エピトープハプロマー）を精製し、未反応物質を除去する必要がある。これは、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、及びＨＰＬＣアプローチを含むが、これらに限定されない様々な戦略によって達成することができる。
【０１７６】
適当な標的細胞には、がん細胞及びウイルス感染細胞を含むが、これらに限定されない標的化することが望まれる任意の細胞が含まれる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、ウイルスによって感染される病原性細胞である。テンプレート化方法、及び適当な認識分子のアセンブリエピトープへの投与は、ウイルス感染細胞のプログラムされた細胞死、ウイルス感染細胞のアポトーシス、ウイルス感染細胞の非特異的またはプログラムされた壊死、ウイルス感染細胞の溶解、ウイルス感染の阻害、及びウイルス複製の阻害のうちの少なくとも１つをもたらし得る。いくつかの実施形態では、ウイルス特異的標的は、ウイルス感染の結果として異常な発現パターンに誘発された細胞内ウイルス転写物または宿主転写物、またはウイルス複製の結果としても現れる表面構造であってよい。後者の非限定的な例としては、ホスファチジルセリンなどのリン脂質の異常な表面発現が挙げられる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、病原性細胞は、微生物感染細胞である。テンプレート化方法、及び適当な認識分子のアセンブリエピトープへの投与は、微生物感染細胞のプログラムされた細胞死、微生物感染細胞のアポトーシス、微生物感染細胞の非特異的またはプログラムされた壊死、微生物感染細胞の溶解、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害のうちの少なくとも１つをもたらし得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、様々な他の病原性細胞が標的化される。これらとしては、除去することがヒトまたは動物に有益である病原性免疫細胞または免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。かかる場合、特異的分子標的としては、クローナルＢまたはＴ細胞のそれぞれの抗体またはＴ細胞受容体のイディオタイプドメイン、細胞系譜特異的表面マーカー、及び細胞系譜特異的サイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、病原性細胞は、腫瘍またはがん細胞である。テンプレート化方法、及び適当な認識分子のアセンブリエピトープへの投与は、腫瘍またはがん細胞のプログラムされた細胞死、腫瘍またはがん細胞のアポトーシス、腫瘍またはがん細胞の非特異的またはプログラムされた壊死、腫瘍またはがん細胞の溶解、腫瘍またはがん細胞成長の阻害、腫瘍またはがん細胞におけるがん遺伝子発現の阻害、及びがんまたは腫瘍細胞における遺伝子発現の修飾のうちの少なくとも１つをもたらし得る。
【０１８１】
代表的な腫瘍またはがん細胞としては、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、肛門癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、基底細胞癌、胆トラクト癌、膀胱癌、骨癌（ユーイング肉腫、骨肉腫、及び悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍、乳癌、気トラクト支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、子宮頸癌、胆トラクト癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉症及びセザリー症候群）、腺トラクト上皮内癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜癌、子宮癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、小児眼内黒色腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵トラクト癌、骨の線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化トラクトカルチノイド腫瘍、消化トラクト間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、精巣癌、妊娠性絨毛性疾患、有毛状細胞性白血病、頭頚部癌、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、膵島腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、腎（腎細胞）癌、喉頭癌、乳頭腫症、口唇及び口腔癌、肝癌、肺癌（非小細胞及び小細胞）、男性乳癌、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、悪性小児中皮腫、転移性癌、転移性扁平上皮性頸部癌、正中線癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、血トラクト腫瘍、子宮肉腫、小腸癌、軟部肉腫、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、腎盂及び尿トラクトの移行上皮癌、尿道癌、腟癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。これらの種類のがん細胞の各々は、治療用認識分子のエピトープのテンプレート化アセンブリのために、望ましくはがん細胞に固有の標的分子を介して標的化することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、アプタマーベースのテンプレート化アセンブリの腫瘍特異的標的分子は、特に、腫瘍異質性の増加と関連するインビボでの進歩的な進化的変化をもたらす個々の腫瘍として特徴付けられない。新規のアプタマー標的は、同等の系統の適合した正常細胞によって、物理的減算アプローチによって単離することができる。最初は、対象となる特異的腫瘍細胞型を使用し、及び減算目的のために、適合した正常な対照細胞型も使用する。後者の代わりに、及び特に、多数の生検サンプルを時間をかけて漸進的に採取している場合、進化的進歩の初期段階での腫瘍サンプルは、「減算器」物質として使用することができる。
【０１８３】
１つ以上のアプタマーが結合する標的分子（複数可）は、任意のタンパク質または翻訳後修飾タンパク質、タンパク質複合体、炭水化物、脂質、リン脂質、糖脂質、核酸、または細胞と会合するリボヌクレオタンパク質であり得る。特定の標的分子としては、表面発現分子、一般的及び細胞内タンパク質、炭水化物、脂質関連分子、及び核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。表面発現分子としては、１）インテグリン（例えば、インテグリン−β１など）；２）メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）；３）他のＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）；４）免疫細胞マーカー（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ（全てのアイソタイプ）、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１など）；５）ホスファチジルセリン；６）ホスファチジルエタノールアミン；及び７）成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ及びＥＧＦＲなど）が挙げられるが、これらに限定されない。一般的及び細胞内タンパク質としては、１）キナーゼ；２）酵素；３）転写因子；４）翻訳後修飾タンパク質；５）変異タンパク質；及び６）タンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定されない。炭水化物としては、担体としてタンパク質（糖タンパク質）または他の分子に付加された複合炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。脂質関連分子としては、リン脂質及び糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子としては、リボヌクレオタンパク質及びｍＲＮＡ構造モチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、アプタマーによって標的化され、テンプレート化アセンブリによる選択的細胞殺傷が可能となる。いくつかの実施形態では、特異的タンパク質または翻訳後修飾タンパク質、タンパク質複合体、炭水化物、脂質、リン脂質、糖脂質、核酸、及びリボヌクレオタンパク質を標的化して、アプタマー結合及びテンプレート提示を行うことができる。特異的標的は、細胞系譜特異的または任意の腫瘍細胞に制限されるかまたはこれらの正常な細胞局在で変更されるように、正常な型と何らかの方法で変更することができる。指定された標的分子は、細胞表面に局在するか、または細胞質または核内のいずれかで細胞内に見られ得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、変異した腫瘍タンパク質の立体配座が変更されている場合、それらは、テンプレート化アセンブリの目的のために、アプタマー媒介性テンプレート提示の有用な標的を提供する。かかる配座変化としては、正常に内在化された残基のミスフォールディング及び暴露、プリオン様ドメインの誘発、及びタンパク質−タンパク質相互作用の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、腫瘍−特異的タンパク質標的分子が望まれ、アプタマーベースのテンプレート化アセンブリの潜在的な標的である。これらとしては、変異がん遺伝子、成長因子、細胞サイクル調節因子、及び転写因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、非タンパク質分子腫瘍マーカーが望まれ、アプタマーベースのテンプレート化アセンブリの潜在的な標的である。非限定的な例として、リン脂質（ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むが、これらに限定されない）は、腫瘍細胞及び腫瘍関連血トラクト系の外側に「裏返した」で異常発現することができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、病原性細胞内の標的分子は、最初には必ずしも存在する必要はなく、特定の事前または同時薬物治療の結果として発現してもよい。薬物によって誘発された腫瘍特異的マーカー発現の非限定的な一例として、脱メチル化剤は、大腸癌細胞中で優先的に内在性レトロウイルス配列を誘発することができる（Ｒｏｕｌｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６２，９６１−９７３）。この効果の別の非限定的な例として、腫瘍の異常な表面リン脂質発現は、場合によっては、従来の細胞毒性薬物治療によって選択的に濃縮され得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞発生中に生じる表面分子の異常なクラスタリングは、アプタマーベースのテンプレート化アセンブリの標的として利用することができる。非限定的な例として、細胞表面グリカン及び糖タンパク質の組成物の両方が、ある特定の腫瘍細胞に対して著しく変化し（Ｐａｓｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、２０１４、５１１、３１９−３２５）、他の分子の表面クラスタリングの増加をもたらすことが知られている。結果として、インテグリンなどの重要なシグナル伝達タンパク質は、適合した正常な組織細胞と比較して、かかる腫瘍細胞表面上の空間的近接の増加をもたらす。その結果、いくつかの実施形態では、アプタマーは、適当な表面発現インテグリンに対して開発することができる。
【０１９０】
標的細胞上に表面テンプレートを位置決めする手段としてアプタマーを用いるいくつかの実施形態では、表面免疫グロブリンは、かかる目的で採用することができる。非限定的な例として、ＢＪＡＢ腫瘍は、細胞表面上でそのモノクローナルＩｇＭも発現するＩｇＭ分泌Ｂ細胞株である。ＢＪＡＢ細胞株に結合することが公知のアプタマーが記載されており（Ｚｕｍｒｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）、これを使用して、表面免疫グロブリン分子に特異的に結合する二重目的の役割を果たし、トラスツズマブミモトープのハプロマーアセンブリのテンプレートとしても役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＢＪＡＢアプタマー配列は、ＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＡＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＡＧＧＧＡＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡ（配列番号１１５）である。いくつかの実施形態では、ハプロマーのテンプレート化のために３’配列を付加したＢＪＡＢアプタマー配列は、ＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＡＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＡＧＧＧＡＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（配列番号１１６）である。
【０１９１】
かかる表面テンプレート位置決めの代替戦略は、対象となる標的細胞上に存在する表面受容体の特異的リガンドとのテンプレートコンジュゲートによる。１つのかかる例は、メラノコルチン−１（ＭＣ１Ｒ）受容体であり、これは、αメラニン細胞刺激ホルモン及びある特定の公知のその類似体とよく特徴付けられた相互作用を有する。かかるＭＣ１Ｒリガンドは、システイン残基を欠失している短鎖ペプチドであるため、マレイミド化学を介した所望のテンプレート核酸とのコンジュゲーションに従順である。
【０１９２】
簡単に言えば、バイナリーアプタマーの左及び右成分は、その構造が利用可能である、またはその構造が高い配座柔軟性を有する、またはその構造が天然変性である公知の標的タンパク質内の短鎖隣接ペプチドの方に向けることができる。この非限定的な例は、ＭＣ１ＲのＮ末端細胞外ドメインであり、これは、３６アミノ酸残基からなり、正常なメラニン細胞及びメラノーマ細胞上で広く発現される。このトラクト内のペンタペプチド配列は、独立したアプタマー標的として機能することができ、最良の候補は、荷電または親水性残基の優勢を担持する。「エピトープ」と本明細書で呼ばれる選択部位（例えば、Ｎ末端から順に、ＳＱＲＲＬ（配列番号１１７）及びＱＴＧＡＲ（配列番号１１８））は、１つ以上のアルギニン残基も担持し、中性ｐＨでアルギニン側鎖によって運ばれる正電荷によるアプタマー標的化に有利である（Ｇｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６，６，１０２９−１０３６）。多くのタンパク質が、これらのペンタペプチド配列のいずれかを担持する一方、両方の配列を有する公知のタンパク質（ＭＣ１Ｒに加えて）は、現在のデータベースには存在しない。これらのペンタペプチドに結合しているＬ−及びＲ−アプタマーサブ集団の両方の組み合わせによる共結合実験が実施されている。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＳＱＲＲＬ（配列番号１１７）及びＱＴＧＡＲ（配列番号１１８）に別々に結合しているＬ−及びＲ−アプタマーサブ集団は、標準手順によって選択することができる。例えば、２つのペンタペプチドに対するＬ−及びＲ−アプタマーの各組み合わせは、以前に示された無傷のメラノーマ細胞上で共結合プロセスを施し、ＭＣ１Ｒを発現することができる。かかる状況下でのＬ／Ｒ−アプタマーの特異的共結合は、ＭＣ１Ｒ  Ｎ−末端で発生するが、それ以外では発生しない。ＭＣ１Ｒへのバイナリーアプタマー結合により、メラノーマ細胞を含むメラニン細胞系譜に向けられたスプリットエピトープのテンプレート化アセンブリを可能にする。
【０１９４】
この実施形態の変更態様では、Ｌ−及びＲ−アプタマーは、ＳＱＲＲＬ（配列番号１１７）及びＱＴＧＡＲ（配列番号１１８）配列のＤ異性体を選択することができる。これにより、元の標的（正常なＬアミノ酸）の反対のキラリティーを認識するＬ−アプタマー（シュピーゲルマー；Ｄ−リボースキラリティーを有する、選択された正常なアプタマーの由来配列から）をその後に合成する機会が与えられる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、アクセシブルな短鎖アミノ酸トラクトは、小胞体ストレス応答の誘発と関連する、異常フォールディングを通じて腫瘍関連タンパク質上に特異的に暴露される疎水性残基であり得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、バイナリー対の構成要素としてまたは一本鎖かに関わらず、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルイノシトールを含むが、これらに限定されない表面陰イオンリン脂質に結合する。いくつかの実施形態では、陰イオン標的に結合しているアプタマーの選択は、中性ｐＨで正電荷を有する補因子の提供を通じて増強される。これらとしては、プトレシン、スペルミン、及びスペルミジンなどの小アミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、細胞表面標的は、ヒトインテグリン−β１細胞外ドメインである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、標的分子は、抗体または細胞表面タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）である。
【０１９９】
認識分子は、アセンブリエピトープを認識する任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、認識分子は、抗体またはその断片であり、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一特異性Ｆａｂ2、二重特異性Ｆａｂ2、三重特異性Ｆａｂ3、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＦＣ、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ、Ｖ−ＮＡＲ、ｈｃＩｇＧ、及びＶｈＨタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、任意の組成物のアンキリン反復タンパク質、アフィマー、アビマー、及び核酸アプタマーなどの、人工の相補性決定領域を有する構造も含まれる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、エピトープが、ｅｒｂ−Ｂ２内である場合、治療薬は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、エピトープが、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）の糖タンパク質Ｆ内である場合、治療薬は、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、エピトープが、ＲＳＶの糖タンパク質Ｆ内である場合、治療薬は、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、エピトープが、ＥＧＦＲ内である場合、治療薬は、パニツムマブである。いくつかの実施形態では、エピトープが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａのＶｉ抗原内である場合、治療薬は、ＡＴＶｉである。いくつかの実施形態では、エピトープが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス内である場合、治療薬は、ＡＶＦｌｕＩｇＧ０１である。いくつかの実施形態では、エピトープが、ＣＤ１４７内である場合、治療薬は、メツキシマブ（ＬＩＣＡＲＴＩＮ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、エピトープが、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ内である場合、治療薬は、１５２−６６−９ｂである。
【０２０１】
本開示はまた、少なくとも１つアプタマーを病原性細胞に送達する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、治療上有効な量の本明細書に記載の任意の１つ以上のアプタマー及び対応するエピトープハプロマー対を病原性細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態では、病原性細胞中の少なくとも１つエピトープが生成される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１つまたは両方のエピトープハプロマーから別々に投与される。いくつかの実施形態では、病原性細胞のプログラムされた細胞死、病原性細胞のアポトーシス、病原性細胞の非特異的またはプログラムされた壊死、病原性細胞の溶解、及び病原性細胞の成長阻害のうちの少なくとも１つが生成される。いくつかの実施形態では、病原性細胞は、ウイルス感染細胞、腫瘍またはがん細胞、微生物に感染した細胞、及び、炎症、アレルギーまたは自己免疫病理を引き起こし得る疾患誘発または疾患調節分子を生成する細胞からなる群から選択される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、テンプレート化アセンブリプロセスは、インビトロ細胞選択プロセスまたは細胞診断に効果的に利用することができる。これは特に、Ｌ−ＤＮＡタグ付けバイナリーまたはバイナリーアロステリックアプタマーと同様に、標的分子上でバイナリーをより簡単にアセンブルするバイナリーアプローチに適用可能である。これは、インビトロ適用、特に、まれな細胞サブセットの特異的同定及び選択に従順であり得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、診断または研究目的で、インビトロ標的細胞サブ集団を標識して、例えば、バイナリー 蛍光アプタマー結合及びエフェクター部分モイエティテンプレート化によって、蛍光ベースの細胞選別をすることができる。蛍光モイエティは、アプタマーのいずれかまたは両方によって、またはハプロマー間の反応の仲介を通じて運ぶことができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、診断または研究目的で、インビトロ標的細胞サブ集団は、テンプレート化アセンブリ媒介性殺傷シグナルを送達するバイナリーアプタマーによって除去することができる。この方法の一例は、かかる状況で使用される特異的バイナリーアプタマーによって認識されないサブ集団のネガティブ選択である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、診断、治療、または研究目的で、インビトロ特異的細胞サブ集団は、ポジティブ選択可能なマーカーのテンプレート化アセンブリ媒介性生成を指示するバイナリーアプタマーによって標的化することができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは、限定されないが、蛍光モイエティ、その抗体が利用可能なペプチドまたは他の分子構造、または利用可能なタンパク質−リガンド系のアセンブリ親和性タグからなる。
【０２０７】
本開示はまた、アセンブリエピトープに選択的に結合する治療薬をヒトに投与することをさらに含む前述の方法を提供する。適当な抗体としては、トラスツズマブ、パリビズマブ、及びモタビズマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
従来のテンプレート化アセンブリと比較して、アプタマー媒介性適応テンプレート化には、多くの利点が存在する。例えば、アプタマーは、標的可能な分子の範囲を大きく広げる：タンパク質、ペプチド、炭水化物、特定の両親媒性脂質（例えば、リン脂質）、及び従来のテンプレート化アセンブリ（例えば、高度に折り畳まれたＲＮＡ二次構造）によって標的可能ではない核酸構造。アプタマーは、テンプレート化アセンブリを細胞表面上で行うことも可能である。細胞表面テンプレート化は、細胞透過を必要としないため、多くの送達の問題を回避する。
【０２０９】
抗体ベースの代替物と比較して、アプタマー媒介性適応テンプレート化には、多くの利点も存在する。多様な細胞表面標的を、免疫認識のために共通の標的構造に変換することは、アプタマーで可能である。例えば、標的細胞表面構造のアプタマー媒介性認識により、以前に開発された抗体またはＣＡＲ−Ｔ系によって認識されるトレースレスペプチドのテンプレート化アセンブリが可能になる。また、標的細胞表面構造のアプタマー媒介性認識により、以前に開発された抗体またはＣＡＲ−Ｔ系によって認識されるクリック連結ペプチド模倣体のテンプレート化アセンブリが可能になる。これらの両方の例では、アプタマーテンプレート化領域、及び反応性半エピトープを担持する相補的ハプロマーの両方はモジュール式であり、Ｌ−ＤＮＡタグを使用する場合には、系は、バイオオルソゴナルハイブリダイゼーションを伴い得る。
【０２１０】
加えて、標的構造が既知である場合、抗体−薬物複合体またはＣＡＲ−Ｔ系の開発は、複雑かつ高価である。これに対して、特異的認識アプタマーの単離後、適応テンプレート化系は、「使用準備が整って」おり、既存のテンプレート化アセンブリ技術を利用する。
【０２１１】
標的構造を新たに定める場合、対応する抗体よりも、標的特異性及びテンプレート化アセンブリテンプレートを組み合わせる新しいアプタマーを開発する方がはるかに速くかつ安価である。
【０２１２】
標的構造が未知の場合、アプタマーライブラリーを減算アプローチに使用して、正常細胞が不在の腫瘍細胞上の新規の表面構造、または薬物処置腫瘍細胞対未処置腫瘍細胞上の新規の構造を検出することができる。これは、抗体ベースの技術の場合には非現実的であるかまたははるかに困難である。
【０２１３】
アプタマーの代わりに抗体を使用し得る全ての場合において、比較的小さなサイズのアプタマーは、腫瘍微小環境における腫瘍細胞へのアクセスに明確な利点をもたらす。また、アプタマーは、抗体などの大きなタンパク質分子よりも（細胞内標的に結合する）細胞内で効果的にトランスフェクトできる可能性がはるかに高い。
【０２１４】
本明細書に開示する対象物質が、より効果的に理解されるように、実施例を、以下に提供する。これらの実施例は、説明目的だけのためにあり、及びいかなる方法においても、当該請求対象事項を限定するとの解釈はないと理解されるべきである。これらの実施例を通じて、分子クローニング反応、及び他の標準組み換えＤＮＡ技術は、特に断りのない限り、市販の試薬を用いて、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法に従って実施した。
【実施例】
【０２１５】
実施例１：固相標的上の共結合選択の実証、及び共結合選択後のバイナリーアプタマー候補の配列確認
左及び右アプタマーライブラリーの別々の選択を４サイクルした後、溶出したサブ集団をビオチン化免疫グロブリンＦａｂ標的（ＢＲＤ７タンパク質に対する；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でインキュベートした後、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合することで固相を描写した。０．５ｍｌのＰＢＳＭで３回洗浄し、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ、１ｍＭ  ＡＴＰを含む）で３回洗浄した後、調製物を二等分に細分し、３７℃で５分間加熱することで、ＤＮＡスプリント（５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ（配列番号１１９）；１００μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ）に＋／−アニーリングを施した後、室温で１時間保った。この後、調製物をリガーゼ緩衝液で２時間再洗浄した。次いで、管を２等分にもう一度分割し、＋／−Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで処理した。これら反応物の小サンプル（１μｌ）を次にプライマーＴｒｚ．Ｆ／Ｔｒｚ．Ｒで増幅し、１０％非変性アクリルアミドゲルで試験した。これにより、バイナリーサイズの強い生成物は、リガーゼの仲介を介してのみ、及びスプリントの存在下でのみ、４サイクル目の物質で観察されたことが示された。重大なことは、同程度の強い生成物バンドは、元の（未選択）アプタマー左及び右−ライブラリーからは見られなかった。これは、結合、洗浄、及び増幅のサイクルが、元の未選択集団を上回ってＦａｂ選択的結合剤を著しく濃縮したことを示す。４サイクル目の物質の共結合試験からの増幅生成物が、スプリントオリゴヌクレオチドを介して結合したように、左及び右アプタマー成分の完全な融合を示したことが、配列決定により判明した。
【０２１６】
特に、４サイクルのＦａｂ選択後に共結合の成功が実証され、共結合実験バイナリーアプタマー生成物の配列解析を行った。共結合−０１、ＥＬ４左及び右アプタマー集団からのクローン生成物の任意の例に、共結合プロセスを施した。太字配列は、元のアプタマーライブラリーにおいて不規則化された配列から得られる４０マートラクトである。四角い配列は、プライマー部位である。塗り無しは、プライマーＴｒｚ．Ｆである。薄い灰色塗りは、プライマーＡｐｔＩｎｔ．Ｒ（この配向におけるアンチセンス）である。斑入り塗りは、プライマーＡｐｔＩｎｔ．Ｆである。塗り無しの暗線は、プライマーＴｒｚ．Ｒ（この配向におけるアンチセンス）である。この特異的配列の例は、バイナリーアプタマーの一般的構造と比較することができる。
【０２１７】
実施例２：Ｆａｂ断片の１０サイクル選択後の一本鎖アプタマー解析及びバイナリーアプタマー生成（共結合プロセス）
ビオチン化Ｆａｂ標的上の一本鎖の左及び右アプタマーサブ集団の別々の選択を１０サイクルした後、得られたサブ集団をクローニングし、配列決定した。ここで（４サイクル目のからの結果と対照的に）、特異的アプタマー配列の複数の繰り返しが観察された。１４個の配列決定した特異的一本鎖（左及び右−クローン集団から各々７個）から、３つの繰り返しの特異的右アプタマー（２８８／１０ＡｐｔＲ１として指定された）が分かった。
【０２１８】
その後、Ｆａｂ標的からの左及び右−第１０サイクルのアプタマーサブ集団に、Ｆａｂ標的上の共結合手順を施した。増幅したバイナリー生成物を次に配列決定し、特徴付けた。繰り返し一本鎖クローンとして以前に観察された右アプタマークローン２２８／０ＡｐｔＲ１が、５個の独立したバイナリークローンで独立して見つかったことが判明した。とりわけ、これらのバイナリークローン（１０ＣＢ−１０）のうちの１つでは、左アプタマー成分（２２９／１０ＡｐｔＬ３）は、以前に独立して単離され、第１０サイクルの左アプタマーサブ集団から配列決定されている。Ｆａｂ結合のために選択されている一本鎖及びバイナリーアプタマーサブ集団の両方における同一配列の繰り返しは、有用なＦａｂ結合親和性を有する一連のアプタマーに向かって、サブ集団サイズの予想される減少と一致した。
【０２１９】
特に、ビオチン化Ｆａｂに結合しているアプタマーの第１０サイクルの解析を行った。一本鎖アプタマークローン２２８（１０ＡｐｔＲ１）の繰り返しが示される。第１０サイクルのＬ−及びＲ−アプタマーのビオチン化Ｆａｂへの共結合試験を行った。選択された（第１０サイクルの）アプタマー対の生成物が観察されたが、この感度レベルで、一次（未選択）アプタマーと共にかかる生成物は見られなかった。共結合プロセスは、４サイクル目のアプタマーに使用したものと同じであった。
【０２２０】
特に、特異的第１０サイクルのアプタマー（１０ＡｐｒＲ１、１０ＡｐｔＬ３）がｂＦａｂ（ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた直接結合アッセイ）に直接結合することが実証された。アプタマーをｂＦａｂ（２．５倍のモル過剰）でインキュベートした後、ＳＡＭＢに結合した。上清を採取し、ＳＡＭＢを３時間洗浄した。結合物質を０．１Ｍ  ＮａＯＨで溶出した後、沈殿させ、洗浄し、乾燥させ、再構成し、変性アクリルアミドゲル上にサンプルをロードした。「ビオチン化Ｆａｂ無し」（ｂＦａｂ）は、最初のインキュベーション中にｂＦａｂが存在しなかったが、（＋）ｂＦａｂチューブと共通のＳＡＭＢでアプタマーを処理したことを示す。
【０２２１】
実施例３：Ｆａｂ標的に向かう特異的第１０世代の一本鎖アプタマーの結合の直接的実証
第１０サイクルの一本鎖アプタマーの選択剤（Ｆａｂ標的）への結合を評価するため、直接結合アッセイを実施した。ここで、一本鎖アプタマー調製物（通常通り自己アニーリングした）を、ＰＢＳＭ中でビオチン化Ｆａｂ断片の有無に依らずインキュベートした後、ストレプトアビジン磁気ビーズ上に吸着した。インキュベーション期間の後、ビーズを磁気分離し、上清を保持した。ビーズを３回洗浄後、結合物質を、１００μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨと共に２×２０秒のインキュベーションによって溶出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び３体積のエタノールで溶出液を直ちに沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させた。５μｌのＴＥ中で再構成後、１μｌのサンプルをホルムアミド中で変性させ、１０％尿素（変性）ゲル上でランした。候補一本鎖アプタマー２２８／１０ＡｐｔＲ１及び２２９／１０ＡｐｔＬ３及び特異的な任意の未選択対照右アプタマー（＃１３６；配列は、ＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＣＡＣＴＴＡＴＡＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡＧＡＧＧＣ（配列番号１２０）に対応する；ここで、下線は、４０マーアプタマートラクトを示し；残りの配列は、プライマー部位である）によるかかる実験結果により、２２８／１０ＡｐｔＲ１及び２２９／１０ＡｐｔＬ３結合（＃１３６ではない）由来の上清が、ビオチン化Ｆａｂの存在下でのみ枯渇したことが示される。さらに、ストレプトアビジン磁気ビーズ上のビオチン化Ｆａｂからの溶出物質は、２２８／１０ＡｐｔＲ１及び２２９／１０ＡｐｔＬ３に対してのみアプタマーバンドが高く濃縮された。これらの結果は、選択されたアプタマー２２８／１０ＡｐｔＲ１及び２２９／１０ＡｐｔＬ３が、Ｆａｂ標的と有意かつ特異的な相互作用を示したことを強く示唆する。
【０２２２】
特に、代表的なバイナリークローン１０ＣＢ−０１は、第１０サイクルの共結合実験から得られた。このバイナリー（２２９／１０ＡｐｔＬ３）の左アプタマー成分は、左−一本鎖サブ集団から予め独立して直接単離され；右アプタマー成分（２２８／１０ＡｐｔＲ１）は、左−一本鎖サブ集団から予め独立して直接単離された。
【０２２３】
実施例４：Ｆａｂ標的に向かう特異的第１０世代のバイナリーアプタマーの結合の直接的実証
バイナリーアプタマーが結合する標的上にバイナリーアプタマーがうまくインサイチュアセンブリになったにも関わらず（実施例１と同様）、溶液中で形成されたバイナリーアプタマーは、同じ標的に結合できることが想定できなかった。直接結合試験で使用したのと同じアプタマー（実施例３；２２８／１０ＡｐｔＲ１及び２２９／１０ＡｐｔＬ３）を用いて評価したが、アプタマーは、実施例１で使用したのと同じスプリントオリゴヌクレオチドによって、最初に一緒にライゲーションされた。実施例３と同じ実験条件下、同等のサンプルを変性ゲル上でランする場合、バイナリー生成物に対応する結合バンドが見られ、並びに対応するスプリントオリゴヌクレオチドが予想される通りであった。成分一本鎖アプタマー（２２８／１０ＡｐｔＲ１）の１つを対照として使用し、結合バンドが、前に示したように観察された（実施例６を参照）。バイナリー生成物のストレプトアビジンビーズのみへの結合は観察されず、Ｆａｂ結合の必要性が示された。この場合、追加の対照を、ストレプトアビジンに直接の結合親和性を有する公知のアプタマーと共に使用し、ここで、結合バンドは、予測通り、Ｆａｂの存在とは独立して見られた。
【０２２４】
実施例５：ＩｇＧ１抗体上の共結合試験
上記の例で選択した標的は、ビオチン化Ｆａｂであったが、このプロセスから得られたアプタマーは、同じアイソタイプ（ネズミガンマ１）の無傷の免疫グロブリンも認識できることが望ましかった。本実施例は、大きな分子または分子複合体の少ない成分を使用して、別々の左及び右結合アプタマーを最初に同定した後、これらの初期サブ集団を使用して、大きな所望の標的を認識するバイナリーアプタマーを同定するジェネリック実証として機能する。
【０２２５】
ビオチン化Ｆａｂ上の第１０サイクルの選択からの左及び右アプタマー集団を使用して、無傷のネズミＩｇＧ１上で共結合試験を行った（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これは、ビオチン化Ｆａｂ上の前の共結合試験と同等の方法で実施したが、ＩｇＧ１をＦａｂ（同じモル量で）に置き換え、ＩｇＧ１自体は、タンパク質Ｇ磁気ビーズへの結合によって固相に吸着した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。スプリント媒介性連結、洗浄、及び溶出（実施例２と同様）の後、連結したバイナリーアプタマーを定義するプライマーで生成物を増幅し（２５サイクル）、非変性アクリルアミドゲル上で解析した。結果は、選択された左及び右アプタマー集団がバイナリー生成物バンドを生じ、これは、スプリントオリゴヌクレオチド及びリガーゼの両方が存在する場合にのみ生成されることを示した。このような簡単に検出可能なバンドは、一次（未選択）アプタマーライブラリーから観察されなかった。
【０２２６】
第１０サイクルのＦａｂ選択アプタマーのＩｇＧ１標的上の共結合を行った。ビオチン化ＦａｂではなくＩｇＧ１が標的であり、固相上の選択が、ＩｇＧ１がタンパク質Ｇ磁気ビーズに結合することによって達成されたことを除いて、共結合方法は、本明細書に記載されたものと同等であった。
【０２２７】
実施例６：固相テンプレートにおけるエフェクターオリゴヌクレオチドテンプレート化
アプタマーをテンプレート化アセンブリに対して有用にするため、アプタマーは、エフェクター部分のテンプレートとして作用するための十分な長さのアクセシブル配列を表示すべきである。指定されたアプタマー配列がテンプレートとして作用する能力は、ストレプトアビジン磁気ビーズ上の捕捉によって固相に描写された対応するデスチオビオチン化オリゴヌクレオチド配列によって最初に評価した。トレースレス・シュタウディンガー化学によるテンプレート化アセンブリの反応性に対する便利なモデルとして、逆電子要求型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）化学反応体で修飾したオリゴヌクレオチドを採用した。これをするために、５’または３’アミノ−修飾を有するオリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝生理食塩水中で室温にて４時間、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）エステルまたは対応するメチルテトラジン（ＭＴＺ）エステルと反応させた。この後、未反応エステルを脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）によって除去した。得られたオリゴヌクレオチド付加物は、明確なモビリティの違いを介して、変性ゲル上のオリゴヌクレオチドに対応する未反応対照と区別することができた。
【０２２８】
標的テンプレートにアニーリングし、ＩＥＤＤＡクリック化学を介して結合した試験オリゴヌクレオチドを直接増幅することはできないが、オリゴヌクレオチド対の反対末端が慣習的に連結される場合には、生成物を逆ＰＣＲによって増幅することができる。これを達成するため、試験テンプレートの相補性オリゴヌクレオチド（２０７及び２０８）には、相互互換性の制限部位を備えた。テンプレート化試験で使用する前に、ＴＣＯ修飾２０７及びＭＴＺ修飾２０８オリゴヌクレオチドを、これらの３’及び５’末端にそれぞれ相補性のある２８マーオリゴヌクレオチドでアニーリングした（２０７の３’末端に相補性のあるオリゴヌクレオチド：ＴＧＴＡＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＴＴＧＴＡＧＣ；配列番号１２１；２０８の５’末端に相補性のあるオリゴヌクレオチド：ＣＴＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＴ；配列番号１２２）。この後、部分二本鎖ＴＣＯ修飾２０７及びＭＴＺ修飾２０８オリゴヌクレオチドをＸｂａ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉでそれぞれ消化した。これらのオリゴヌクレオチドを、これらの相補性部位が隣接するテンプレートに相互アニーリングする場合、消化した末端は、互いに非常に近接しており、Ｔ４リガーゼによって効率的に連結することができる。連結した生成物は、オリゴヌクレオチドの元の５’及び３’末端に対して逆に、ＰＣＲによって増幅可能である。
【０２２９】
上記のＸｂａ  Ｉ部位５’オーバーハングを担持するＴＣＯ修飾２０７オリゴヌクレオチドをデスチオビオチン化標的（アプタマー−接合）オリゴヌクレオチドでアニーリングした後、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2（ＰＢＳＭ）と共にリン酸緩衝生理食塩水中のストレプトアビジン磁気ビーズに物質を結合させた。ＰＢＳＭで３回洗浄後、過剰なＭＴＺ修飾２０８オリゴヌクレオチドを加え、３７℃で５分間、及び室温で１時間インキュベートした後、さらに３回洗浄した。この後、固相磁気ビーズ調製物を、１ｍＭ  ＡＴＰ（ＮＥＢ）と共に×１のＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で２回洗浄し、４００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼの有無に依らず、２つの部分に分割した。室温で２時間後、調製物をＰＢＳＭ中で洗浄し、次に、１００μＭ  Ｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）によるインキュベーションによって、結合物質をストレプトアビジン磁気ビーズから溶出した。その後、サンプルを１０％変性アクリルアミドゲル上でランした。
【０２３０】
結果は、ＴＣＯ修飾２０７及びＭＴＺ修飾２０８オリゴヌクレオチド間のＩＥＤＤＡクリック生成物が固相テンプレート上に形成されたことを示した。このバンドは、予想される循環プロセスに対応する制限部位末端のライゲーションによってサイズがシフトした。未修飾の対照オリゴヌクレオチドは、ＩＥＤＤＡ生成物モビリティによるバンドを示さなかったが、制限末端結合に対応するライゲーション特異的バンドを示した。
【０２３１】
アプタマー中に存在する配列を用いた固相オリゴヌクレオチドベースのテンプレート化を行った。テンプレート及びオリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載の通りである。ＰＣＲ生成物形成（ＩＥＤＤＡ結合部位に対して逆）は可能であるが、予想される通り、制限末端のインサイチュライゲーションの後のみであることが、同じ溶出物質によりその後に示された。これにより、逆ＰＣＲが、モデルテンプレート化アセンブリ反応のインサイチュテンプレート化の読み出しに適当であることが示された。
【０２３２】
実施例７：標的上のエフェクターオリゴヌクレオチドのアプタマー媒介性テンプレート化
バイナリーアプタマーテンプレート化領域に対応する固相オリゴヌクレオチド上のテンプレート化の実証後、テンプレート化は、アプタマーテンプレート自体で達成される一方、特異的標的にインサイチュで結合できることを示した。ビオチン化抗ＢＲＤ７  Ｆａｂ（ｂＦａｂ）及び任意の未選択対照Ｌ−及びＲ−アプタマーに結合のために選択されたＬ−及びＲ−アプタマーの両方は、別々に自己アニーリングし、３５ｐｍｏｌのｂＦａｂ標的の有無に依らず、適切な組み合わせ（１４０ｐｍｏｌの各アプタマー；２５μｌの最終体積）でインキュベートした（表１を参照）。室温で１時間後、調製物を、攪拌しながら室温で３０分間、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズで処理した（ここで、ビーズを保存培地から最初に磁気分離し、１ｍｌのＰＢＳＭで２回洗浄し、使用前に原体積のＰＢＳＭ中に再懸濁させた）。この後、ビーズを磁気分離し、０．５ｍｌのＰＢＳＭで１回洗浄し、１００μｌの×１  ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で２回洗浄し、６０単位のネズミリボヌクレアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）も含有する５０μｌのＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ緩衝液（ＡＴＰと共に）中で再懸濁させた。その後、１４０ｐｍｏｌ（１．４μｌ）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを加え、これは、Ｌ／Ｒアプタマー間領域に対する補体に対応し、配列：ＵＣＣＡＧＡＵＧＵＣＵＵＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ（配列番号１２３）を有する。調製物を３７℃でアニーリングした後、３０℃で１時間アニーリングし、２５単位のＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＲＮＡテンプレート上のＤＮＡ鎖に対して高いニックシーリング能力を有するクロレラリガーゼ）を加えた。室温で１時間後、結合したｂＦａｂ／アプタマー−ＲＮＡ二本鎖を有する磁気ビーズを、１００μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で１回洗浄した後、５単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に、３７℃で１０分間及び室温で２０分間、５０μｌの同じ緩衝液中で再懸濁させた。０．５ｍｌのＰＢＳＭで１回洗浄後、サンプルを５０μｌのＰＢＳＭ中で再懸濁させた。次に、１０５ｐｍｏｌ（５．３μｌ；初期量のｂＦａｂよりも３倍モル過剰）のメチルテトラジン−３’修飾オリゴヌクレオチド２０８（実施例６と同様）を室温で３０分間加えた後、０．５ｍｌのＰＢＳＭで洗浄し、５０μｌのＰＢＳＭ中で再懸濁させた。その後、１０５ｐｍｏｌ（５．３μｌ；初期量のｂＦａｂよりも３倍モル過剰）のトランス−シクロオクテン−５’修飾オリゴヌクレオチド２０７（実施例６を参照）も、室温で３０分間加えた。次いで、調製物を０．５ｍｌのＰＢＳＭで洗浄し、結合したＤＮＡを、室温で２０秒間、１００μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ／５ｍＭ  ＥＤＴＡによる２回の処理で溶出した（磁気分離された上清の貯留）後、０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ、２０μｇグリコーゲン、及び３体積の１００％エタノールと共に、−２０℃で（３０分間）直ちに沈殿させた。調製物を１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、４．０μｌのＴＥ中で再溶解した。サンプル（１．０μｌ���を１５％尿素変性ゲル上でランした。
【０２３３】
【表１】
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【０２３４】
１４０ｐｍｏｌの各アプタマーを最初に自己アニーリングした後、３５ｐｍｏｌのビオチン化抗ＢＤＲ７  Ｆａｂ（ｂＦａｂ；４０倍アプタマー過剰）の有無に依らず、反応管でインキュベートした。２２９、２２８：特異的Ｌ−及びＲ−ｂＦａｂ−結合アプタマー；１３９、１３８：ｂＦａｂ結合に選択されなかった任意のＬ−及びＲ−アプタマー配列、太字で示す。
【０２３５】
ゲル解析は、モデルクリック標識オリゴヌクレオチド間の反応が、ｂＦａｂに結合したテンプレートとして両方の特異的アプタマー上に存在することを示した。しかしながら、この場合には、スプリント／リガーゼが省かれた場合に生成物が観察されたため、Ｌ−（２２９）及びＲ−（２２８）アプタマーのスプリント媒介性ライゲーションは不要であった。スプリントライゲーションを介したバイナリーアプタマーの形成は、バイナリー及び（一本鎖アプタマーの一例として）Ｒ−アプタマー型の両方で特異的なプライマーで示された。Ｒ−プライマーを有する一本鎖アプタマーは、予想される通り、ｂＦａｂ結合Ｒ−アプタマー＃２２８による調製物にのみ見られた。及び、そのパートナー＃２２９を有するバイナリー生成物＃２２８は、スプリント及びリガーゼを適用した場合にのみ観察された。
【０２３６】
ｂＦａｂ標的にインサイチュで結合しながら、アプタマーテンプレートによるモデルＩＥＤＤＡクリック反応のテンプレート化を実施した。アプタマー＃２２９及び＃２２８は、ｂＦａｂ標的上の近位バイナリーとして最初に選択され（ｐ−２２８は、ＲＮＡスプリントを介してそのパートナーアプタマーとのライゲーションが可能な５’ホスフェート基の存在を示す）；アプタマー＃１３９及び＃１３８は、公知の非結合剤である。
【０２３７】
ｂＦａｂにインサイチュで結合したアプタマーの結合及びバイナリー形成のＰＣＲ試験を実施した。＃２２８（公知のＲ−アプタマーｂＦａｂ結合剤）による全ての調製物は、良好なＲ一本鎖項バンドを示す。しかしながら、スプリント＋リガーゼによる２つの同じ調製物のみが、バイナリーバンドの存在を示した。非連結型の＃２２８／＃２２９は、強力なＲ一本鎖項バンド（ｂＦａｂ結合を示す）を示したが、バイナリーバンドを示さなかった。
【０２３８】
アプタマー媒介性近接のみが、クリック標識オリゴヌクレオチドのテンプレート化アセンブリを促進することができた一方、他のテンプレート化適用は、バイナリーＬ−Ｒアプタマー対によって得られた隣接の長いテンプレートから恩恵を得ることができる。従って、予め形成されたバイナリー＃２２９−＃２２８アプタマーは、上記のＲＮＡテンプレートを有する両方のアプタマー鎖を高濃度でアニーリングした後、テンプレートをＲＮａｓｅ  Ｈで除去することで調製した。残りの一本鎖鎖を除去するため、１７０塩基バイナリー鎖をアガロースゲル上で精製した。その後、アセンブルしたバイナリーアプタマーが、標的ビオチン化Ｆａｂにまだ結合し、２０７−２０８標識オリゴヌクレオチドクリック反応に対するアクセシブルテンプレートを提供したことが実証された。
【０２３９】
ｂＦａｂ標的上のバイナリーアプタマーのインサイチュ形成及び試験を実施した。一本鎖Ｌ−及びＲ−アプタマー＃２２９及び＃２２８のそれぞれの間のバイナリーアプタマーＲＮＡスプリント媒介性形成が、高濃度の溶液で観察された。スプリントを有する１７０ｂｐ  ＃２２９−＃２２８バイナリーの精製されたサンプル（１．５％アガロース）は、ＲＮａｓｅ  Ｈ（変性アクリルアミドゲル）によって除去した。特異的ｂＦａｂ標的に結合したバイナリーアプタマー上にモデルクリック生成物の形成が観察された。
【０２４０】
実施例８：短鎖ステムループ架橋によるバイナリーアプタマー中のアクセシブルテンプレートの形成
バイナリーアプタマーの形成は、除去可能なＲＮＡスプリントによってインサイチュで達成することができるが（実施例６を参照）、ライゲーションを必要としない代替方法が開発された。ここで、短鎖相補性配列は、Ｌ−及びＲ−アプタマーのそれぞれ３’及び５’末端上に付加し、それらは、共通の標的に近接して結合する。この結果として、アプタマーの相互相補性修飾末端が、短鎖ステムループ架橋を形成する。ステムループは、テンプレート化アセンブリの目的のためのテンプレート化に機能できることが知られており、モデルクリックオリゴヌクレオチドを用いて実証した。
【０２４１】
あるいは、バイナリーは、溶液中のステムループハイブリダイゼーションでアセンブルすることができる。ビオチン化Ｆａｂ−ＢＲＤ７タンパク質を標的化するアプタマー対＃２２９（Ｌ）及び＃２２８（Ｒ）は、それぞれ、相互相補性１０塩基  ３’及び５’末端で合成された。付加したセグメント配列は任意であるが、ここでは、Ｇ／Ｃ配列を最大二重安定性に使用した。短鎖ステム配列は、付加セグメントがアプタマー機能と相互作用することで、４０塩基アプタマー領域に相補性のある配列が除外される可能性を最小限にするのが望ましい。それにもかかわらず、アプタマー機能と互換性がある付加セグメントの追加が成功したかは、経験的に試験すべきである。付加アプタマーの機能的試験を行った。ビオチン化Ｆａｂに結合する＃２２９アプタマーは、ステムループタグについて幾分減少したが、同じ塩基組成物を有するがスクランブル配列である対照タグについてはそれほどではなかった。＃２２８アプタマーは、付加タグの存在によって機能的は影響をほとんど受けなかった。
【０２４２】
短鎖ステムループ架橋によって近位バイナリーアプタマー対からのテンプレートのインサイチュ代替形成を行った。ステムループ構造は、一般的に、モデルクリックオリゴヌクレオチドテンプレート化反応に使用できることが知られている。
【０２４３】
ｂＦａｂ−ＢＲＤ７に結合する能力に対するアプタマー伸長の効果の試験を実施した。１４０ｐｍｏｌの自己アニーリングしたアプタマーを、３５ｐｍｏｌのｂＦａｂ（２５μｌの最終体積）で室温にて３．５時間インキュベートした後、ＰＢＳＭ中の５０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ上に室温にて１時間吸着させた。その後、上清を磁気的に除去し、ビーズを０．５ｍｌのＰＢＳＭで２回洗浄した。結合物質を２×１００μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ／５ｍＭ  ＥＤＴＡで溶出し、２０μｇのグリコーゲン／０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ、３体積のエタノールで沈殿させ、１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥させ、２０μｌのＴＥ中に再溶解した。１μｌのサンプルを８Ｍ尿素変性ゲル上で直接ランした。
【０２４４】
次いで、モデルクリック反応のテンプレートとして作用する能力について、伸長アプタマーを評価した。伸長アプタマー２２９−３’−Ｅｘｔ１及び２２８−５’−Ｅｘｔ１を一緒にアニーリングすることで（８０℃で３分間、その後、０℃で５分間）、アプタマー自己アニーリング、及び相互相補性１０塩基伸長を介したアプタマー間ハイブリダイゼーションが可能になる。対照アプタマー＃２２９、＃２２８、及び１３６−５’−Ｅｘｔ１は、同じ方法で別々に自己アニーリングした。アプタマー調製物をｂＦａｂ標的でインキュベートし、洗浄し、及び結合物質を水酸化ナトリウムで溶出した。沈殿、洗浄、及び乾燥後、溶出物質を１０μｌのＴＥ中で再構成し、１μｌのサンプルを変性尿素ゲル上でランした。結果は、近接アプタマーのみ（空間的に近いが、バイナリー連結を欠いている）が、テンプレート化クリック反応性を強化できたことを示した。同様に、相互相補性が無い３’及び５’伸長を有する対照アプタマーは、同様のクリック活性を促進することができた。しかしながら、ステムループ連結バイナリー調製物は、クリック活性をまだ支持できただけでなく、生成物レベルは、対照と比べて増加した。これが標的結合自体の改善の結果であるかまたはテンプレート化の強化の結果であるかに関わらず、最終結果はそれでもテンプレート化アセンブリのテンプレート化を改善を示す。
【０２４５】
伸長アプタマー２２９−３’−Ｅｘｔ１及び２２８−５’−Ｅｘｔ１による相補的−末端バイナリーステム−ループアプタマーアプローチの試験を実施した。これらのアプタマーは、自己アニーリングし、溶液中で同時に共アニーリングし、ステムループ連結バイナリーを形成した。未伸長アプタマー対照は、通常通り別々に自己アニーリングした。本実施例で実証した原理は、上述のＬ−ＤＮＡタグ化手順に似ているが、それとは異なる。
【０２４６】
実施例９：特異的アプタマーの親和性測定
定められた標的のアプタマー親和性は、標的濃度の範囲で結合アプタマーと未結合アプタマーを区別するプロセスと併せて、ＱＰＣＲベースの方法によって測定可能である。これをアプタマー＃２２８に適用し、一本鎖として結合するｂＦａｂ、及びそのパートナー＃２２９と結合するバイナリーを選択した。結合曲線を構築するため、ｂＦａｂ標的（７００ｎＭから下向きで２倍希釈）の希釈物を、一定濃度の自己アニーリングした＃２２８（１０ｎＭ）で一晩（ＰＢＳＭ中で５０μｌの最終体積）インキュベートし、平衡条件を得た。その後、調製物を、７５μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（最高濃度のｂＦａｂを上回るモル過剰で）で室温にて１時間攪拌しながらインキュベートした。次いで、ビーズを上清から磁気分離し、各管を０．５ｍｌのＰＢＳＭで３回洗浄した（元の上清及び洗浄を組み合わせて、合計の非結合画分を得た）。続いて、０．１Ｍ  ＮａＯＨ／５ｍＭ  ＥＤＴＡによる２×２０秒のインキュベーションによって、結合物質をビーズから溶出し、磁気分離した溶出液の上清を単管にプールした。これらを２０μｇのグリコーゲン／０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ／３体積のエタノール（−２０℃で３０分間インキュベーション）で直ちに沈殿させた後、１．０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、５０μｌのＰＢＳＭ中で再構成した。その後、全ての調製物のサンプル（１．０μｌ）を、２０μｌの体積中でＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（９５℃で３０秒のサイクル；４０×（９５℃で５秒、及び６０℃で３０秒））によって、ＱＰＣＲによる９６ウェルプレートで三通りで解析した。反応混合物は、×１  ＢｉｏＲａｄ  ｉＴａｑ  ＰＣＲ混合物及び６ｐｍｏｌの各々のＲ−アプタマー特異的プライマーを使用した（フォワードＲ−プライマー：ＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣ（配列番号１２４）；リバースＲ−プライマー：ＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴ（配列番号１２５））。リアルタイムＳＹＢＲ緑色蛍光のサイクル中にウェルを解析し、ＣＴ値を割り当てた。全てのランは、＃２２８アプタマーの連続希釈の標準曲線を含んだ。複製結果を平均化し、結合及び非結合ＣＴ値をデータポイントごとに得て、総結合画分を計算することができた。これらの結合画分値対対応する［ｂＦａｂ］のプロットから、非線形回帰曲線を導出することができた。次に、（約１１ｎＭの）Ｋd推定値は、実験曲線の式から得ることができ、ここで、Ｋdは、結合画分＝０．５に相当する（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２０１１，６８６，９−１８）である。
【０２４７】
アプタマー＃２２８及びビオチン化Ｆａｂ−ＢＲＤ７の結合曲線を作成した。非線形回帰曲線式は、ｙ＝０．１１７９ｌｎ（×）＋０．２１８１である。
【０２４８】
実施例１０：Ｔ細胞ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープのアプタマー媒介表面アセンブリ
アプタマーを使用して、テンプレート化アセンブリプロセスのテンプレートとして多種多様な表面構造に適合させることができ、この適合プロセスには、「サンドイッチ」形式の配置で多数の認識分子が含まれ得る。本実施例では、バイナリーアプタマー対が向けられるビオチン化標的分子の使用を開示する。所望の予め定められた細胞表面マーカーに結合するビオチン化一次認識分子、及び多価ビオチン結合架橋分子も使用する。
【０２４９】
本実施例では、標的分子は、ビオチン化抗ＢＲＤ７  Ｆａｂ（実施例１〜４及び７〜９を参照）であり、一次認識分子は、ビオチン化抗ＩｇＭ（ＢＤ−ファーミンゲン）であり、架橋分子は、ストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（ＳＡ−ＰＥ；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）である。ストレプトアビジンのみ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をフィコエリトリンコンジュゲートの代わりに使用することもできる。表面ＩｇＭを発現する対象となる細胞（１０6）（ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞株）を収穫し、×１のＰＢＳで洗浄し、（製造者によって推奨される通りの）適当な濃度のビオチン化抗ＩｇＭで室温にて１時間処理した。３×ＰＢＳ洗浄後、ビオチン化抗ＢＲＤ７  Ｆａｂ（ｂＦａｂ）と適切なモル比で予め複合化された１００ｐｍｏｌのＳＡ−ＰＥを、プライム細胞懸濁液で室温にて１時間インキュベートし、細胞を時折再懸濁した。アセンブル前のＳＡ−ＰＥ複合体は、以下の方法で生成する：５０ｐｍｏｌのＳＡ−ＰＥを、１×ＰＢＳＭ中の５０〜１００ｐｍｏｌ  ｂＦａｂで室温にて１時間インキュベートする。ＳＡは四価であるため、これにより、全てのｂＦａｂが、利用可能なＳＡビオチン結合部位を飽和することなく確実に結合される。その後、細胞をＰＢＳＭで２回洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳＭ中で再懸濁した。プレアニーリングしたアプタマー２２９−３’−Ｅｘｔ１及び２２８−５’−Ｅｘｔ（実施例８と同様に、ステムループ架橋を介してバイナリーを形成する；１００ｐｍｏｌ）を、プライム細胞に室温で１時間加え、１．０ｍｌのＰＢＳＭで２回洗浄した。
【０２５０】
多層サンドイッチの形成の成功については、２つのレベルで評価する。標的表面抗原（ＩｇＭ）の存在は、一次抗ＩｇＭ抗体を排除する以外は同じように処理した対照細胞と比較して、ＰＥチャンネルにおける蛍光のフロー分析を複合化細胞サンプル（一次抗ＩｇＭ抗体／ＳＡ−ＰＥ／ｂＦａｂ／バイナリーアプタマー）に施すことによって示される。アプタマー結合は、（実施例１のＤＮＡスプリント（５’及び３’末端の両方が蛍光ＦＡＭモイエティで修飾された以外は、ＤＮＡスプリント（５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ；配列番号１１９）に関して）二重標識蛍光スプリントオリゴヌクレオチドで示される。蛍光スプリント（１００ｐｍｏｌ）を、ｂＦａｂを室温で１時間除外した以外は同一の完全複合化細胞及び対照と共にＰＢＳＭでインキュベートした後、０．５ｍｌの冷ＰＢＳＭで細胞を３回洗浄し、フルオレセインチャンネルによるフロー分析を行った。
【０２５１】
この系におけるバイナリーアプタマーテンプレート化領域は、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ１４／１９７５４７号に記載されるハプロマーヒトパピローマウイルス由来の配列でハイブリダイズするように設計されているため、これらの試験を通過した調製物を使用して、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＭｅｌａｎ  Ａ／ＭＡＲＴエピトープ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１２６）をアセンブリにすることができる。
【０２５２】
一次ビオチン化抗体によって認識される表面ＩｇＭを発現するＥＢＶ形質転換ＨＬＡ−Ａ２＋細胞上の複合体は、本実施例で詳細に上述したように、バイナリーステムループアプタマーを備える。上記のように洗浄した後、バイナリーアプタマーテンプレート化領域を認識するハプロマーで室温にて１時間、及びＭＡＲＴエピトープ半ペプチドを担持するハプロマーの両方で調製物をインキュベートした。このインキュベーション中に、ハプロマーは、互いに近接してアプタマー表面テンプレートにハイブリダイズし、無傷のアセンブルしたエピトープペプチドを形成することができる。その後、細胞を１ｍｌのＰＢＳＭで洗浄し、室温でさらに２時間インキュベートし、エンドサイトーシスを生じさせた。この後、処理細胞を、アセンブルしたペプチドのゲージ取り込み、プロセシング、及びＨＬＡ−Ａ２提示に使用する。これは、ＨＬＡ−Ａ２の文脈において、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１２６）を認識するＴ細胞受容体でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を用いて行い、ここで、Ｊｕｒｋａｔ活性化の読み出しは、Ｈａｇｇｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，１０，１８７−２０１に記載される通り、ＩＬ−２の分泌である。
【０２５３】
本実施例によって示されるプロセスは、アプタマーの変動、及び標的化、及びハプロマーの対の生成物としてアセンブルした構造の種類を伴う、多くの他の実施形態を包含し得る。従って、アプタマーは、細胞表面構造を直接、または続くサンドイッチ構造の任意の他の成分を標的にすることができる。代替ハプロマーアセンブリ生成物は、任意の他のＭＨＣクラスに結合するペプチド、または抗体による直接認識用に設計された構造を含み得る。後者のクラスの実施形態では、かかるハプロマーアセンブリ化合物は、天然ペプチド、ペプチド模倣構造、または非ペプチド小有機分子を含む。テンプレートアセンブリプロセスを介してハプロマーからアセンブルされたかかるアプタマー媒介性構造を標的化する抗体は、次に、抗体依存性細胞傷害、補体経路、またはカリケアミシンＡ及びエムタンシンを含むが、これらに限定されない高い細胞毒性薬との抗体コンジュゲートを介してを含むが、これらに限定されない様々な方法で、標的細胞殺傷を促進することができる。
【０２５４】
実施例１１：特異的マーカーを発現する細胞表面上のプローブ配列のハイブリダイゼーション媒介性位置決め
本実施例は、二重標識蛍光プローブ配列によるハイブリダイゼーションによって評価した通り、インビトロ系における細胞表面に対する表面テンプレートの配置の有効性を示す。
【０２５５】
表面テンプレートの配置における初期工程は、対象となる細胞の表面上に発現する適当なマーカーの同定である。このインビトロ実証では、選択された標的細胞であるヒトＥＢＶ形質転換Ｂリンパ系細胞株においてその有意な発現レベルにより、クラスＩ  ＭＨＣを利用した。ヒトクラスＩ（Ｗ６／３２）にパン特異的な一次抗体のビオチンコンジュゲートによる細胞（１０6／ｍｌ）のインキュベーション、及びリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２；ＰＢＳ）中での洗浄後、細胞調製物を、大過剰の未修飾四価ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ；１０6／ｍｌの細胞１００μｌ当たり、１００μＭストレプトアビジンの各々１０μｌ）で室温にて３０分間処理し、ＰＢＳ中で再洗浄した。ストレプトアビジンを過剰に適用し、かつ、四価であるため、（ビオチン化一次抗体を介して）細胞表面に結合するストレプトアビジンは、他の分子上にビオチンモイエティの利用可能な結合部位を有する。
【０２５６】
この後、ビオチン化テンプレートオリゴヌクレオチドを加え、その結果、その末端ビオチン基は、表面ストレプトアビジン上の遊離部位に結合する。原則として、ほぼ全ての核酸配列を、広範囲の修飾ホスホジエステルバックボーンと共に使用して、ヌクレアーゼ耐性を与えることができ、ホスホチオエート、モルホリノ類、及び２’−Ｏ−メチル類似体を含むが、これらに限定されない。本実施例で使用したＤＮＡテンプレート配列は、配列：５’−ビオチン−ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（配列番号１２７）のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の転写セグメントに対応する。対照として、この配列のスクランブルバージョンを使用した：５’ビオチン−ＴＡＧＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＧＡＴＧＡＴＡＴＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＧＧＴＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡ（配列番号１２８）である。
【０２５７】
ビオチン化テンプレートまたはスクランブル対照で細胞をインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて、表面ＨＰＶテンプレートに相補性があり、かつ、５’及び３’末端の両方で蛍光ＦＡＭ標識を担持するオリゴヌクレオチドプローブで処理した：５’−ＦＡＭ−ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡ−３’−ＦＡＭ（配列番号１１９）。これに加えて、同じ配列を有する別のオリゴヌクレオチドを対照として使用し、５’−ビオチン及び３’−ＦＡＭモイエティ：５’−ビオチン−ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡ−３’−ＦＡＭ（配列番号１２９）を保有するおかげで、ハイブリダイゼーションに独立して表面ストレプトアビジンの存在を直接示すことができる。
【０２５８】
プローブオリゴヌクレオチドによる処理、及びＰＢＳで洗浄後、フルオレセイン由来の蛍光をモニタリングする標準設定を用いたフローサイトメトリーによって細胞サンプルを分析し、その結果を図１に示す。二重標識プローブ配列に相補性のあるテンプレートを表示する細胞では著しいシグナルが観察されたが、対照スクランブル配列では観察されなかった（図１を参照）。
【０２５９】
実施例１２：ストレプトアビジン架橋を介したＨＥＲ−２ネガティブ細胞上のトラスツズマブミモトープのインビトロ位置決め
本実施例は、インビトロ系において、ＨＥＲ−２−ネガティブ細胞表面上のタンパク質ＨＥＲ−２を認識する治療抗体トラスツズマブのミモトープの配置を示す。
【０２６０】
実施例１１と共通して、細胞表面上にペプチドミモトープを配置することによる抗体エピトープの転用の場合、対象となる細胞型の表面マーカーを定めた。本実施例では、実施例１１と同じビオチン化一次抗体（Ｗ６／３２）を使用したが、メラノーマ細胞株の代わりに、表面ＨＥＲ−２発現がネガティブであることが予め実証されているＭＵ８９を標的として選択した。その後、複合体（ビオチン化テンプレート−ストレプトアビジン−一次抗体）をＭＵ８９表面上にアセンブルした。手順及び洗浄後、ビオチン化ミモトープ（ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ；配列番号３５）を表面ストレプトアビジンに結合させた。次の工程（洗浄後）は、トラスツズマブによる処理を伴い、表面−連結ミモトープに結合させた。その後、トラスツズマブは、κ軽鎖を有するヒト化抗体であるため、フルオレセイン化ヤギ抗κ抗体は、フロー分析を可能にする最終蛍光読み出しを提供するのに役立った。結果は、表面固定化ミモトープが、トラスツズマブから明確な蛍光シグナルを誘発したことを示した（図２を参照）。非常に高レベルのＨＥＲ−２を発現することが知られているポジティブ対照乳癌細胞株ＢＴ−４７４（図２を参照）は、ＭＵ８９からのミモトープシグナルよりも著しく強い蛍光を示した。しかしながら、蛍光シグナルの増幅効果は、このアプローチの多層サンドイッチ技術から得られる一方、全体的なシグナルは、一次抗体標的の発現レベルに最終的にはリンクすることに留意すべきである。
【０２６１】
実施例１３：スプリットエピトープセグメントと所望のテンプレートに相補性のある核酸鎖との間のコンジュゲートの調製（スプリットエピトープハプロマーの調製）
本実施例は、適当なテンプレート配列に相補性のある、特異的スプリットエピトープセグメントと所望の核酸鎖との間のコンジュゲートの形成を示す。
【０２６２】
コンジュゲートは、ビスマレイミド（ＰＥＧ）2化合物（ＢＭＰ２、Ｓｉｇｍａ；図３を参照）によって生成され、オリゴヌクレオチド上の５’または３’チオールとペプチド上の還元システイン残基からのチオールとの間に共有結合を形成した。初期工程では、ジスルフィド保護基を有する合成オリゴを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）で１６時間還元した後、Ｐ６スピンカラムを通過させて脱塩し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４（ＢｉｏＲａｄ）にした。この後、還元ＳＨオリゴヌクレオチド（典型的には、５ｎｍｏｌ）を大モル過剰（×１２０倍）のＢＭＰ２と反応させて、架橋ではなくオリゴヌクレオチドのモノ誘導体化をもたらした。５０ｍＭのホスフェート緩衝液ｐＨ７．０／１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で室温にて４．５時間反応を行った後、Ｐ６マイクロスピン脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を通じて２つのタンデム連続精製を行った。
【０２６３】
その後、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基のいずれかを担持する対象となるペプチドをＢＭＰ２修飾オリゴヌクレオチドと反応させた。以下の相互相補性オリゴヌクレオチドを使用した。その両方とも、末端ヌクレオチドと付加チオール（ＴｒｉＬｉｎｋ）との間に６炭素スペーサーを担持する：＃４０８：ＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡ−ＳＨ（配列番号１３０）及び＃４１７：ＨＳ−ＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣ−［ビオチン］（配列番号１３１）。また、オリゴヌクレオチド＃４１７は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、その後の結合アッセイの適用のための３’ビオチン基を担持する（実施例１４を参照）。
【０２６４】
以下のペプチドは、介在リンカー配列を有するミモトープＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号３６）のセグメントの非限定的な例として使用した：ＣＬ−ＪｍｉｍＮ：ＣＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＧＧＳ（配列番号１３２）及びＪｍｉｍＣ−ＬＣ：ＳＧＧＷＥＬＳＨＳＧＧＧＣ（配列番号１３３）。第１のペプチド、ＣＬ−ＪｍｉｍＮは、Ｎ末端システインを担持し、第２のペプチド（ＪｍｉｍＣ−ＬＣ）は、Ｃ末端システインを有する。
【０２６５】
最終コンジュゲーション反応では、６２５ｐｍｏｌのＢＭＰ２修飾オリゴヌクレオチド＃４０８及び＃４１７を、様々な条件下（室温及び３７℃で１６時間、及び３７℃で１時間後、室温で１５時間）で、２５００ｐｍｏｌのＣＬ−ＪｍｉｍＮまたはＪｍｉｍＣ−ＬＣ（４倍ペプチド過剰）と別々に反応させた。
【０２６６】
これらのインキュベーション後、１．０μｌのサンプル（オリゴヌクレオチド量の観点から、１２．５ｐｍｏｌ）を１５％変性８Ｍ尿素ゲル上で試験した（図３を参照）。ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄによる染色で、未反応ＢＭＰ２誘導オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートの両方を視覚化する。コンジュゲートバンドは、非コンジュゲート物質よりもゆっくりと遊走し、これらの異なる分子量のおかげでこれらを精製する機会が与えられる（図３を参照）。
【０２６７】
非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、及びサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない様々な方法で、精製を達成することができる。
【０２６８】
実施例１４：トラスツズマブを用いたミモトープのＥＬＩＳＡアッセイ、及びインビトロでのエピトープアセンブリ実証。
本実施例は、対象となる抗体によるミモトープの結合、及びインビトロでのテンプレート化エピトープアセンブリの実証のためにＥＬＩＳＡを実施するプロトコルを開示する。
【０２６９】
無傷のミモトープ及びこれらの類似体に関して、Ｎ末端ビオチン標識と、セリン及びグリシン残基（典型的には、ＳＧＧＧＳＧＧＧ；配列番号１１０）からなるフレキシブルスペーサーとを有するペプチドを使用した。ＥＬＩＳＡ用のトラスツズマブの無傷のミモトープの非限定的な例は、配列：ビオチン−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号３５）を有する。
【０２７０】
四価ストレプトアビジンで被覆したＥＬＩＳＡプレートは、市販の供給源（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）から、または、ＰＢＳ（１μＭ）中のストレプトアビジンの溶液でポリスチレン９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１６時間／４℃でインキュベートした後、１０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ  ７．２中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液でさらに１６時間／４℃で遮断して作製したのいずれかでアッセイのために得た。その後、プレートの溶液を空にし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１００μｌのＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗ２０）で３回洗浄した。
【０２７１】
対象となるビオチン化ペプチドの適当な希釈系列をＰＢＳ中で調製し、少なくとも二通り（またはより多くの複製）を１００μｌの体積中の予め指定されたウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした（サランラップで覆った）。この後、プレートを空にし、１００μｌのＰＢＳ−Ｔｗ２０で５回洗浄し、ミモトープへの結合について試験した抗体を、１００μｌ／ウェルで、ＰＢＳ中の適当な希釈物で加えた。この非限定的な例では、初期抗体は、典型的には、１：５００希釈のトラスツズマブ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）であった。室温でさらに一時間後、プレートを空にし、ＰＢＳ−Ｔｗ２０で２回洗浄し、最終抗体コンジュゲートの適当な希釈物を加えた。この具体的な例では、トラスツズマブの軽鎖がκクラスのものであったため、最終抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのヤギ抗ヒトκ軽鎖コンジュゲートであった。抗κ−ＨＲＰコンジュゲートの典型的な作業濃度は、１：５０００であり、１００μｌで各ウェルに加えた。覆ったプレートを室温でさらに１時間インキュベーション後、１００μｌのＰＢＳ−Ｔｗ２０で６回洗浄した。この時点で、１００μｌのＴＭＢ過酸化物展開試薬を（市販調製物の２つ成分の５０：５０混合物として（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｋｉｔ））加えた。３０分間インキュベーション後、１Ｍ硫酸で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで、自動化プレートリーダーで結果を評価した。標的ペプチド抗原を加えなかったウェルで観察された吸光度の減算による決定ごとに平均複製から最終データをコンパイルした。それにより、トラスツズマブからの未修飾ミモトープシグナルの標準曲線を構築した（図４を参照）。
【０２７２】
スプリットエピトープの抗体認識のＥＬＩＳＡ試験では、非限定戦略は、ＴＡＰＥＲ技術の実装として、核酸オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたペプチドエピトープセグメントを伴うハイブリダイゼーションを用いることを含む（実施例３）。１つのかかる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、相互相補性である。代替アーキテクチャーが利用可能であり、限定されないが、両方のオリゴヌクレオチドが、上記のように、ストレプトアビジン−ビオチン結合によって固定化された共通テンプレートにハイブリダイズする場合が挙げられる。
【０２７３】
実施例１５：表面テンプレート及び標的化エピトープハプロマー（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）による細胞表面上のエピトープアセンブリ
本実施例は、再構成したエピトープ配列の生成及びその後の認識のための、エピトープハプロマーの細胞表面テンプレート化の手順を開示する。
【０２７４】
対象となる病理細胞上の特異的表面標的は、当該技術分野において利用可能な知識から選択される、または、アプタマーベースの減算プロセスによって例示されるように、実験結果から得られる。標的がリガンドベースの相互作用系をもたらす場合、リガンド−タグ戦略を使用することができる；あるいは、特異的表面標的に結合するアプタマーが、認識エレメント及びテンプレート表示系の両方としてデュアルキャパシティで機能するアプタマーベース戦略の開発において、標的を使用することができる。
【０２７５】
表面テンプレートを表示する系がいったん開発されると、テンプレートは、実験的に実証したように、ハイブリダイゼーションの特異的部位として作用することができる。ハプタマー核酸モイエティのテンプレート化及びハイブリダイゼーションが、正反対のキラリティー（Ｌ−ＤＮＡ）のＤＮＡからなる場合には、バイオオルソゴナルハイブリダイゼーションを達成することができる（アプタマー特許）。次いで、エピトープセグメントを担持するハプロマーの近位ハイブリダイゼーションによるエピトープアセンブリは、インビトロで実施した同様のプロセスと類似の方法で得られる。
【０２７６】
実施例１６：トラスツズマブによるエピトープ結合
ビオチン化未修飾ミモトープ（Ｂｉｏ−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ；配列番号３５）及び対応するシステイン修飾ミモトープ（Ｂｉｏ−ＳＧＧＧＳＧＧＧＱＬＧＰＹＥＬＷＥＬＣＨ；配列番号３）は、実施例１４のように基本プロトコルを用いて、ＥＬＩＳＡによって並行して評価した。
【０２７７】
ストレプトアビジン被覆プレート中のウェルを、ＰＢＳ中の４００ｎＭビオチン化ペプチド１００μｌ、または対照としてＰＢＳのみで室温にて２時間被覆した。次いで、トラスツズマブを、二重に２倍連続希釈（１００μｌ／ウェル）で室温にて１時間、両方のペプチドで滴定した。ＰＢＳ対照（ペプチド無し）を最低希釈のトラスツズマブで処理した。その後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ鎖によるシグナル検出は、後者のＨＲＰ抗体を１１：７５００希釈で使用した以外は実施例１４と同様に行った。データは、トラスツズマブのみを有するウェルで見られたバックグラウンドレベルを補正し、図５に示すようにプロットした。
【０２７８】
結果は、両方のペプチドについて同様の滴定曲線を示し、ここで、システインペプチドの勾配は、非修飾ペプチドで見られたものの約１０％未満（繰り返し実験で確認済み）であり、トラスツズマブが、未修飾ミモトープとほぼ同程度に、システイン修飾ミモトープを認識することが示された。
【０２７９】
本明細書に記載された内容に加えて、前記した内容からの本明細書の多様な改良が、当業者には明らかである。かかる改良も、また付属する特許請求の範囲に収まることが意図されている。本明細書に記載された参考文献（雑誌記事、米国及び非米国特許、特許出願公報、国際特許出願公報、遺伝子銀行信託番号などを含むが、これらに限定されない）の各々は、参照することによりその全文が本明細書に組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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