(57)【要約】本発明は、ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞からユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体を製造する方法に関するものである。本発明の方法はＴＡＬＥＮ技術によって無血清培地で懸濁培養に適したＣＨＯ細胞におけるｆｕｔ８遺伝子を編集することで、編集されたＣＨＯ宿主細胞からユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体を産生できる方法である。当該ユニークな糖鎖スペクトルは、主に非フコシル化のＮ−結合オリゴ糖鎖を有し、Ｎ−グリコシル化の不均質性の程度が低く、均一な糖鎖を有することを特徴とする。本発明の方法により調製される抗体は、ＡＤＣＣ活性及び抗体の安定性が増加している。【選択図】図１０
2020534862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるアミノ酸配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列を有する、一対のポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の一対のポリペプチドをそれぞれコードする一対のポリヌクレオチドであり、好ましくは、前記一対のポリヌクレオチドの配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示される配列であり、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示される配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つ配列である、一対のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載の一対のポリペプチドが、それぞれ天然または人工Ｆｏｋ  ＩのＤＮＡ切断ドメインに融合される一対の融合タンパク質であり、好ましくは、前記一対の融合タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される配列であり、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つ配列である、一対の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載の一対の融合タンパク質をそれぞれコードする一対のポリヌクレオチドであり、好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される配列であり、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つ配列である、一対のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２又は４に記載の一対のポリヌクレオチドの中の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターであり、好ましくは、前記ベクターがプラスミドである、ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターでトランスフェクションされている宿主細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、より好ましくは、前記ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１であり、より好ましくは、前記ＣＨＯ−Ｋ１は無血清培養に適したものであり、
好ましくは、前記宿主細胞は抗体発現用のものであり、より好ましくは、前記宿主細胞はユニークな糖鎖スペクトルを有する抗体発現用のものであり、好ましくは、野生型糖鎖スペクトルと比べて前記ユニークな糖鎖スペクトルの中の少なくとも１種の糖部分のレベルが改変されており、
好ましくは、前記糖部分はブドウ糖、フコース、ガラクトース、マンノース、高マンノース、グルコサミン、Ｇ０又はアセトグルコサミンからなる群から選ばれるものであり、
好ましくは、前記抗体の糖部分は以下の1つ以上の条件を満たすものであり：
ａ．前記抗体においてフコースのレベルが低下し、好ましくは、前記フコースのレベルが５％以下であり、より好ましくは、前記フコースのレベルが０であり、
ｂ．前記抗体においてマンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記マンノースの含有率は５％以下であり、
ｃ．前記抗体において高マンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記高マンノースの含有率は５％以下であり、
ｄ．前記抗体においてガラクトースのレベルが低下し、好ましくは、前記ガラクトースのレベルが３０％以下、より好ましくは、ガラクトースのレベルが５％以下であり、
ｅ．前記抗体のＧ０含有率が上昇し、好ましくは、前記Ｇ０含有率が６０％以上、より好ましくは、前記Ｇ０のレベルが８０％以上であり、
好ましくは、前記Ｇ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、より好ましくは、Ｇ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、かつマンノース或いは／及び高マンノースの含有率は５％以下であり、
好ましくは、前記抗体は図１０に示される糖鎖スペクトルを有し、
好ましくは、前記抗体は抗ＥＧＦＲ又はＣＤ２０又はＴｒｏｐ２抗体であり、より好ましくは、前記抗体はヒト化或いは全部ヒト来源の抗ＣＤ２０抗体であり、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ１２０６Ｆであり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ１２０６ＦはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ４４０６Ｆであり、より好ましくは、前記ＢＡＴ４４０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ４３０６Ｆであり、より好ましくは、前記抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ０２０６Ｆであり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ０２０６ＦはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ０８０８であり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ０８０８はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示される重鎖を両本有する、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の一対のポリペプチドの中の少なくとも１つのポリペプチドを含むキットであり、好ましくは、請求項２に記載の一対のポリヌクレオチドの中の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、好ましくは、請求項３に記載の一対の融合タンパク質の中の少なくともいずれ１つ融合タンパク質を含み、好ましくは、請求項４に記載の一対のポリヌクレオチドの中の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、好ましくは、請求項５に記載のベクターを含み、好ましくは、請求項６に記載の宿主細胞を含む、キット。
【請求項８】
請求項１−５のいずれか１項に記載の一対のポリペプチド/一対のポリヌクレオチド/一対の融合タンパク質/一対のポリヌクレオチド/ベクターの、ＣＨＯ細胞のＦｕｔ８遺伝子の編集への使用。
【請求項９】
請求項１−６のいずれか１項に記載の一対のポリペプチド/一対のポリヌクレオチド/一対の融合タンパク質/一対のポリヌクレオチド/ベクター／宿主細胞の、抗体の調製への使用又はそれらを用して調製した抗体であり、
好ましくは、前記抗体がユニークな糖鎖スペクトルを有し、より好ましくは、野生型糖鎖スペクトルと比べて、前記ユニークな糖鎖スペクトルには少なくとも１種の糖部分のレベルが改変されており
好ましくは、前記糖部分はブドウ糖、フコース、ガラクトース、マンノース、高マンノース、グルコサミン、Ｇ０又はアセトグルコサミンからなる群から選ばれるものであり、
好ましくは、前記抗体の糖部分は以下の1つ以上の条件を満たすものであり：
ａ．前記抗体においてフコースのレベルが低下し、好ましくは、前記フコースのレベルが５％以下、より好ましくは、前記抗体においてフコースのレベルが０であり、
ｂ．前記抗体においてマンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記マンノースの含有率は５％以下であり、
ｃ．前記抗体において高マンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記高マンノースの含有率は５％以下であり、
ｄ．前記抗体においてガラクトースのレベルが低下し、好ましくは、前記ガラクトースのレベルが３０％以下、より好ましくは、ガラクトースのレベルが５％以下であり、
ｅ．前記抗体のＧ０含有率が上昇し、好ましくは、前記Ｇ０含有率が６０％以上、より好ましくは、前記Ｇ０のレベルが８０％以上であり、
好ましくは、前記抗体のＧ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、より好ましくは、Ｇ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、かつマンノース或いは／及び高マンノースの含有率は５％以下であり、
好ましくは、前記抗体が図１０に示される糖鎖スペクトルを有し、
好ましくは、前記抗体がＥＧＦＲ又はＣＤ２０又はＴｒｏｐ２に結合し、より好ましくは、前記抗体がＣＤ２０に結合し、より好ましくは、前記抗体はヒト化或いは全部ヒト来源の抗ＣＤ２０抗体であり、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ１２０６Ｆであり、より好ましくは、上記ＢＡＴ１２０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ４４０６Ｆであり、より好ましくは、前記ＢＡＴ４４０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ４３０６Ｆであり、より好ましくは、前記ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ０２０６Ｆであり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ０２０６ＦがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ０８０８であり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ０８０８がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示される重鎖、を両本有する、抗体の調製への使用又はそれらを用して調製した抗体。
【請求項１０】
ＣＨＯのＦｕｔ８遺伝子を編集する方法であって、
請求項３に記載の一対の融合タンパク質、又は請求項４に記載の一対のポリヌクレオチド、又は請求項５に記載のベクターを、ＣＨＯ細胞に導入して、その細胞を培養することでＦｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞が得られることを含む、ＣＨＯのＦｕｔ８遺伝子を編集する方法。
【請求項１１】
抗体の産生方法又はそれを用いて製造した抗体であって、
（１）請求項３に記載の一対の融合タンパク質、又は請求項４に記載の一対のポリヌクレオチド、又は請求項５に記載のベクターでトランスフェクションされているＣＨＯ細胞を、凝集素圧力スクリーニング、限界希釈法により、ＣＨＯゲノムにおけるα−１−６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８がノックアウトされたＣＨＯ細胞系ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦが得られる工程、
（２）抗体の遺伝子発現カセットを含む真核発現ベクタープラスミドをＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦへエレクトロポレーションし、圧力スクリーニングによりフコースを除去した抗体タンパク質が得られる工程
を含む、抗体の産生方法又はそれを用いて製造した抗体。
【請求項１２】
工程（１）において、請求項５に記載のベクターは野生型ＣＨＯ細胞へトランスフェクションし、より好ましくは、請求項５に記載のプラスミドを野生型ＣＨＯ細胞へトランスフェクションする、請求項１１記載された抗体の産生方法又はそれを用いて製造した抗体であり、
好ましくは、前記抗体がユニークな糖鎖スペクトルを有し、より好ましくは、野生型糖鎖スペクトルと比べて、前記ユニークな糖鎖スペクトルには少なくとも１種の糖部分のレベルが改変されており、
好ましくは、前記糖部分はブドウ糖、フコース、ガラクトース、マンノース、高マンノース、グルコサミン、Ｇ０又はアセトグルコサミンからなる群から選ばれるものであり、
好ましくは、前記抗体の糖部分は以下の1つ以上の条件を満たすものであり：
ａ．前記抗体においてフコースのレベルが低下し、好ましくは、前記フコースのレベルが５％以下、より好ましくは、前記抗体においてフコースのレベルが０であり、
ｂ．前記抗体においてマンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記マンノースの含有率は５％以下であり、
ｃ．前記抗体において高マンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記高マンノースの含有率は５％以下であり、
ｄ．前記抗体においてガラクトースのレベルが低下し、好ましくは、前記ガラクトースのレベルが３０％以下、より好ましくは、ガラクトースのレベルが５％以下であり、
ｅ．前記抗体のＧ０含有率が上昇し、好ましくは、前記Ｇ０含有率が６０％以上、より好ましくは、前記Ｇ０のレベルが８０％以上であり、
好ましくは、前記抗体のＧ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、より好ましくは、Ｇ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、かつマンノース或いは／及び高マンノースの含有率は５％以下であり、
好ましくは、前記抗体は図１０に示される糖鎖スペクトルを有し、
好ましくは、前記抗体がＥＧＦＲ又はＣＤ２０又はＴｒｏｐ２に結合し、より好ましくは、前記抗体がＣＤ２０に結合し、より好ましくは、前記抗体はヒト化或いは全部ヒト来源の抗ＣＤ２０抗体であり、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ１２０６Ｆであり、より好ましくは、上記ＢＡＴ１２０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ４４０６Ｆであり、より好ましくは、前記ＢＡＴ４４０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ４３０６Ｆであり、より好ましくは、前記ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ０２０６Ｆであり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ０２０６ＦがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体はＢＡＴ０８０８であり、より好ましくは、前記抗体ＢＡＴ０８０８はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１であり、より好ましくは、前記ＣＨＯ−Ｋ１は無血清培養に適したものである、請求項１１記載された抗体の産生方法又はそれを用いて製造した抗体。
【請求項１３】
抗体であり、前記抗体はＢＡＴ４３０６Ｆ抗体であり、前記ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体のＧ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、
より好ましくは、ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体のＧ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、かつマンノース或いは／及び高マンノースの含有率は５％以下であり、
より好ましくは、前記抗体は図１０中のＢＡＴ４３０６Ｆに示される糖鎖スペクトルを有し、
好ましくは、前記ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される重鎖を両本有し、
好ましくは、前記抗体は請求項１１に記載の方法によって調製する、抗体。
【請求項１４】
寄託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１７１２７、２０１７年８月１０日に中国典型的培養物寄託センターに寄託した細胞であり、
好ましくは、上記細胞のＦｕｔ８遺伝子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列を有する、細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞であり、前記細胞は抗体を発現し、
好ましくは、前記宿主細胞は抗体を発現し、
好ましくは、前記宿主細胞がユニークな糖鎖スペクトルを有する抗体を発現し、より好ましくは、野生型糖鎖スペクトルと比べて、前記ユニークな糖鎖スペクトルには少なくとも１種の糖部分のレベルが改変されており、
好ましくは、前記糖部分はブドウ糖、フコース、ガラクトース、マンノース、高マンノース、グルコサミン、Ｇ０又はアセトグルコサミンからなる群から選ばれるものであり、
好ましくは、前記抗体の糖部分は以下の1つ以上の条件を満たすものであり：
ａ．前記抗体においてフコースのレベルが低下し、好ましくは、前記フコースのレベルが５％以下、より好ましくは、前記フコースのレベルが０であり、
ｂ．前記抗体においてマンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記マンノースの含有率は５％以下であり、
ｃ．前記抗体において高マンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記高マンノースの含有率は５％以下であり、
ｄ．前記抗体においてガラクトースのレベルが低下し、好ましくは、前記ガラクトースのレベルが３０％以下、より好ましくは、抗体においてガラクトースのレベルが５％以下であり、
ｅ．前記抗体のＧ０含有率が上昇し、好ましくは、前記Ｇ０含有率が６０％以上、より好ましくは、前記Ｇ０のレベルが８０％以上であり、
好ましくは、前記抗体のＧ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、より好ましくは、Ｇ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、かつマンノース或いは／及び高マンノースの含有率は５％以下であり、
好ましくは、前記抗体は図１０に示される糖鎖スペクトルを有する、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の細胞の抗体分野の使用又はそれを用いて調製した抗体であり、
好ましくは、前記抗体がユニークな糖鎖スペクトルを有し、好ましくは、野生型糖鎖スペクトルと比べて、前記ユニークな糖鎖スペクトルには少なくとも１種の糖部分のレベルが改変されており、
好ましくは、前記糖部分はブドウ糖、フコース、ガラクトース、マンノース、高マンノース、グルコサミン、Ｇ０又はアセトグルコサミンからなる群から選ばれるものであり、
好ましくは、前記抗体の糖部分は以下の1つ以上の条件を満たすものであり：
ａ．前記抗体においてフコースのレベルが低下し、好ましくは、前記フコースのレベルが５％以下、より好ましくは、前記抗体においてフコースのレベルが０であり、
ｂ．前記抗体においてマンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記マンノースの含有率は５％以下であり、
ｃ．前記抗体において高マンノースのレベルが低下し、好ましくは、前記高マンノースの含有率は５％以下であり、
ｄ．前記抗体においてガラクトースのレベルが低下し、好ましくは、前記ガラクトースのレベルが３０％以下、より好ましくは、ガラクトースのレベルが５％以下であり、
ｅ．前記抗体のＧ０含有率が上昇し、好ましくは、前記Ｇ０含有率が６０％以上、より好ましくは、前記Ｇ０のレベルが８０％以上であり、
好ましくは、前記抗体のＧ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、より好ましくは、Ｇ０含有率が６０％以上、フコースが含まれず、かつマンノース或いは／及び高マンノースの含有率は５％以下であり、
好ましくは、前記抗体は図１０に示される糖鎖スペクトルを有する、細胞の抗体分野の使用又はそれを用いて調製した抗体であり。
【請求項１７】
請求項９、１１、１３又は１６のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物であり、好ましくは、前記医薬組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
有効量の請求項９、１１、１３又は１６に記載の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾病の予防／治療方法。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％の同一性を持つ配列を含む、核酸配列又は当該配列を含むＣＨＯ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学与技術分野に属し、ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞からユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体、当該宿主細胞と抗体を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＣＨＯ細胞とは、１９５７年米国コロラド大学、Ｄｒ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｔ．Ｐｕｃｋが成獣のメスハムスターの卵巣から単離したチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）を意味し、上皮接着培養型細胞に属する従来生物工学的に汎用的な細胞系である。その中、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は工業的に多く使用するものである。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は形質転換細胞系であり、その細胞染色体分布頻度は２ｎ＝２２であり、サブ二倍体細胞に属する。番号：ＣＣＬ−６１でＡＴＣＣに保存されたＣＨＯ−Ｋ１細胞系は、組み換えＤＮＡプロテインの発現に汎用したものである。その細胞は最初、接着培養型細胞であるが、数世代の継代、スクリーニングを経って、懸濁的に生長することもできる。ＣＨＯ細胞の遺伝子が変異しやすく、遺伝子のトランスフェクションも比較的容易である。早期の検討によっても、他の工程細胞系と比べて、ＣＨＯ細胞で産生される抗体は、ヒトの血清抗体と糖鎖タイプが最も近いことを証明した。このため、ＣＨＯ細胞は良い哺乳動物の遺伝子発現用宿主細胞である。
治療性抗体の作用機序は、標的分子と複合物を形成することで、ターゲット抗原の中和が引き起こされ、或いは抗体Ｆｃセグメントによる免疫応答で抗原或いは病原体を排除する。抗体医薬の標的分子への特異的に結合や活性作用の執行は、その複雑な高次構造と翻訳後修飾に依存している。その中、抗体に対して最も重要な翻訳後修飾であるグリコシル化は、抗体の生物活性、Ｉｎ  ｖｉｖｏ代謝と免疫原性に対して重要な作用を持つ。抗体医薬のグリコシル化の形は、主としてＮ−グリコシル化であり、係る単糖は主に：ブドウ糖、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、シアリン酸（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡ）がある。末端のガラクトースの数によって、抗体分子ＦｃセグメントＡｓｎ２９７が連結した二分岐又は多分岐２本鎖（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合型オリゴ糖は、Ｇ０、Ｇ１（１、３）、Ｇ１（１、６）とＧ２の複数種類に分けられる。その中、タイプ毎にフコース（Ｆ）或いはｂｉｓｅｃｔｉｎｇガラクトース（Ｂ）を有するかによって、１６種に分けられる（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１５，１−１０．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｖ０６５）。従って、抗体の重鎖のオリゴ糖タイプは、末端にシアリル化と高マンノース型を存在するかを考慮しなくても、少なくとも３６の種類がある。また、抗体の両本の重鎖が無作為に組み合わせることにより、存在し得る糖鎖タイプは４００以上の種類になるため、抗体は高度な不均質性を呈している。
【０００３】
異なる糖鎖タイプは、治療性抗体の薬学的なキャラクターに与える影響も異なる。高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ５）の含有率は、抗体が血液から迅速な排除され、半減期の短縮に繋がる（ＭＡｂｓ、２０１２、４（４）：５０９−５２０）。Ｇ０Ｆは補体経路の作用を寄与し、排除速率に加速させる。Ｇ２Ｆは、妊婦、新生児の臍帯において含有率が上昇している。シアリン酸修飾は、免疫グロブリン静注による炎症作用に著しい影響が与える。フコースの低下は、ＡＤＣＣ活性の顕著な増強を招く（ＪＢＣ（２００３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８，３４６６−３４７３）。したがって、治療性抗体の主な作用機序と医薬上の用途に応じて、抗体の糖鎖についての設計と改良を行こうことは必要がある。
【０００４】
タンパク質合成とは異なり、抗体のグリコシル化には従うできる鋳型がない。抗体のグリコシル化タイプ、各オリゴ糖成分の割合は、宿主細胞のタイプおよび培養要件により影響された。宿主細胞をエンジニアすることで、モノクローナル抗体のオリゴ糖成分を改良してそのＦｃにより媒介される活性が増強される方法は、異なる文献、特許報告に散在している。例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現したＣＨＯ細胞で調製した抗体は、親細胞で発現した抗体と比べて、より高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性の差は約１０〜２０倍（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．（２００１）Ａｕｇ  ２０；７４（４）：２８８−９４）である。しかし、ＧｎＴＩＩＩの過剰発現自体はＣＨＯ細胞に対して毒性を有り、また、その発現は外来性のものであるため、培養過程中に継代回数の増やすに伴ってＧｎＴＩＩＩの発現量は減少しまうので、宿主細胞として用する場合に、産生される抗体のフコース含有率が改変され、抗体医薬の均一性が影響される。脱フコース化抗体を産生する細胞系の例としては、タンパク質フコース化欠損Ｌｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）が挙げられるが、そのプロテイン収量が極めて低くため、治療性抗体産生用宿主細胞としてには適さない（Ｙｕｔａｋａ  Ｋａｎｄａら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．（２００６）Ｊｕｌ  ５；９４（４）：６８０−８）。α−１−６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８がノックアウトされたＣＨＯ細胞にも（ＹａｍａｎｅーＯｈｎｕｋｉ ｅｔ  ａｌ．（２００４），バイオテク．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４）、生産される抗体のフコース含有率の低減を招く。例えば、ＹａｍａｎｅーＯｈｎｕｋｉとＫｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏの特許に記載したＦＵＴ８ノックアウト細胞系中に、抗体のフコース化程度を制御し、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害活性）活性を高める方法について開示した。前記方法は、特異なｓｉＲＮＡを用いて宿主細胞中のｆｕｔ８遺伝子の発現を抑えることで、当該宿主細胞が生産される抗体のフコースのレベルを低減するものである。当該方法は、前述したＧｎＴＩＩＩを過剰発現するＣＨＯ細胞系と同じ欠点有し、まず、宿主細胞に外来性の配列を導入することは必要になり、次に、ｓｉＲＮＡによる目的遺伝子の抑制効率は最も多く７０％程度であり、最後、ｓｉＲＮＡ発現の安定性は抗体医薬の品質面の属性に影響する場合がある。
【０００５】
最近、新興のゲノム編集技術を活用して宿主細胞中の目的遺伝子を編集して、細胞内のＦＵＴ８酵素を失活させ、抗体のフコースのレベルを低減する方法が異なる文献、特許によって報告された。例えば、Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓら（２０１０）は、ジンクフィンガー酵素（ＺＦＮ）技術を採用し、親細胞のＤＧ４４からノックアウトすることで、ホモ接合型ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトＤＧ４４誘導クローンが得られ、当該細胞系から生産した抗体がフコースをまったく含まないことは報告された。Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１２）は、ＴＡＬＥＮ技術を採用し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のｆｕｔ８遺伝子を編集して、宿主細胞におけるＦＵＴ８酵素活性が欠失させることを報告された。また、Ｓｕｎら（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によりｆｕｔ８遺伝子の１０番目のエクソンを編集して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＦＵＴ８酵素活性を欠失させることを報告された。
【発明の概要】
【０００６】
これに基づいて、既存の抗体医薬には、ほぼＦｃに対する単一Ｎ−グリコシル化修飾に限定するものであるが、糖鎖タイプ成分と含有率は一致していないで変動し易い、そして製造安定性が影響されるという等の問題があることについて、ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する抗体、及び当該抗体の製造方法を提供する必要がある。本発明の上述の目的は、以下の手段で果たす：
本発明の第一は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるアミノ酸配列を有する、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つ配列を有する、一対のポリペプチドに関する。一部の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される一対のポリペプチドは、ＴＡＬＥＮの上流と下流のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列であり、それぞれ特異な遺伝子の特定塩基区域に結合できる。
【０００７】
本発明の第二は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される一対のポリペプチドをコードする一対のポリヌクレオチドを提供する。一部の態様において、前記一対のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示される核酸配列を有し、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つものである。
【０００８】
本発明の第三は、前記一対のポリペプチドが、転写活性化因子様エフェクター（ＦｏｋＩ）のＤＮＡ切断ドメインのアミノ酸配列に融合された、一対の融合タンパク質を提供する。一部の態様において、転写活性化因子様エフェクター（ＦｏｋＩ）のＤＮＡ切断ドメインのアミノ酸配列は天然のもの又は人工的に改造されたものである。一部の態様において、前記一対の融合タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示すアミノ酸配列を有し、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つものである。一部の態様において、当該一対の融合タンパク質は、ＣＨＯのＦｕｔ８遺伝子の二つのヌクレオチド配列断片を特異性に認識できる。一部の態様において、前記Ｆｕｔ８遺伝子の二つのヌクレオチド配列断片はＦｕｔ８遺伝子のエクソン１（Ｅｘｏｎ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）中の二つのヌクレオチド配列断片である。一部の態様において、前記Ｆｕｔ８遺伝子の二つのヌクレオチド配列断片はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列を有するものである。一部の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるヌクレオチド配列との間には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示される配列を有する一つのスペーサーがある。
【０００９】
本発明の第四は、また、前述の一対の融合タンパク質をそれぞれコードするヌクレオチドのペアを提供する。一部の好ましい態様において、上記ヌクレオチドのペアはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される核酸配列を有し、或いはＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を持つものである。
【００１０】
本発明の第五は、また、前記いずれかの一対のポリヌクレオチドの中の、少なくともいずれかの１本のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。一部の態様において、前記ベクターはプラスミドである。
【００１１】
本発明の第六は、また、前記ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１２】
この中の一部の態様において、これら前記ベクターによって形質転換された細胞はゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞であり、その親細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞系由来である。
【００１３】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞は、親細胞が無血清懸濁培養に適し、前記親細胞はＣＨＯ−ＢＡＴと命名した。
【００１４】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞の親細胞ＣＨＯ−ＢＡＴが以下特徴の一つまたは複数項を満たすように選択されたＣＨＯ−Ｋ１である：
上記細胞は高いトランスフェクション効率を有し、
上記細胞は短く対数増殖時間を有し、
上記細胞はＣＤ−ＣＨＯ培養で高い細胞密度を到達できる能力を有する。
【００１５】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞は、親細胞と比べて、ＦＵＴ８遺伝子の区域が塩基の欠失、挿入、ナンセンス変異があるので、当該細胞の内在性α１，６-ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｆｕｔ８）が酵素活性を失った。
【００１６】
上記細胞には外来性ＤＮＡ配列を含まない。
上記細胞が宿主細胞として発現する組み換え抗体は、ユニークな糖鎖スペクトル特徴を持つ。
【００１７】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞は、ＦＵＴ８遺伝子のエクソン１のゲノムが編集されることで当該細胞の内在性Ｆｕｔ８が酵素活性を失うこと、上記細胞には、ＦＵＴ８遺伝子に対して塩基欠失、ナンセンス変異を産生させる過程中に組み込まれた発現ベクターのＤＮＡ配列を含まないこと、を特徴とする。
【００１８】
上記細胞は、宿主細胞として発現する組み換え抗体がユニークな糖鎖スペクトル特徴を有する。その特徴には、主に非フコシル化Ｎ−結合オリゴ糖鎖を有することを含み、また、抗体の他の糖鎖スペクトル特徴を含む。
【００１９】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞にはＦＵＴ８遺伝子がノックアウトされた。前記細胞が凝集素ＬＣＡに結合した場合に陰性を示している。上記細胞はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦと命名した。
【００２０】
本発明の第七は、前述の一対のポリペプチドの中の少なくとも１つを、又は前述の一対のポリヌクレオチドの中の少なくとも１つを、又は前述の一対の融合タンパク質の中の少なくともいずれ１つを、又は前述のベクターを、又は前述の宿主細胞を含むキットを提供する。
【００２１】
本発明の第八は、前述の一対のポリペプチド/一対のポリヌクレオチド/一対の融合タンパク質/ベクターの、ＣＨＯ細胞のＦｕｔ８遺伝子に対する編集への使用を提供する。
【００２２】
本発明の第九は、前述の一対のポリペプチド/一対のポリヌクレオチド/一対の融合タンパク質/ベクター／宿主細胞が抗体、特にユニークな糖鎖スペクトルを有する抗体の調製への使用を提供しており、或いは、前述の一対のポリペプチド/一対のポリヌクレオチド/一対の融合タンパク質/ベクター／宿主細胞により調製した抗体を提供する。
【００２３】
本発明の第十は、前述の一対の融合タンパク質、又は一対のポリヌクレオチド、又はベクターをＣＨＯ細胞へ導入して、３７℃条件で１４日間培養して、圧力スクリーニング、限界希釈法によりＦｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞が得られることを含む、ＣＨＯのＦｕｔ８遺伝子を編集する方法を提供する。例示できる方法は、Ｗｏｏｄ ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１（１９９０）に参照ことができる。
【００２４】
本発明の第十一方面は、以下工程を含む、ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞からユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体を産生する、製造方法又はそれを用いて製造した抗体を提供する：
【００２５】
（１）前述の一対の融合タンパク質、又は一対のポリヌクレオチド、又はベクターをＣＨＯ細胞（例えば、野生型のＣＨＯ細胞）へトランスフェクションして、圧力スクリーニング、限界希釈法によりＦｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞が得られる工程、
（２）抗体の遺伝子の発現カセットをコードするプラスミドを、Ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞へエレクトロポレーションし、圧力スクリーニング、限界希釈法により抗体を分泌する安定なＣＨＯ細胞系が得られる工程。
【００２６】
好ましい実施態様としては、工程（１）においてベクターを野生型ＣＨＯ細胞へトランスフェクションし、より好ましくは、プラスミドを安定な野生型ＣＨＯ細胞へトランスフェクションする。
好ましい実施態様としては、前述のＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１であり、より好ましくは、前述のＣＨＯ−Ｋ１は無血清培養に適したものである。
好ましい実施態様としては、前述の抗体は抗ＣＤ２０抗体であり、より好ましくは、前述の抗体はヒト化或いは全部ヒト来源の抗ＣＤ２０抗体であり、より好ましくは、前述の抗体はＢＡＴ４３０６Ｆであり、より好ましくは、前述のＢＡＴ４３０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される重鎖を両本有するものである。発明者は本発明の方法、細胞、ポリペプチド等を採用して複数種類の抗体の調製に用いており、検討を重ねたところ、調製された複数種類の抗体は、いずれも高度に一致な糖鎖タイプを表現し、かつその糖鎖タイプの不均質化の程度が低いことを見出した。それから、本発明の方法、細胞等はあらゆるタイプの抗体の調製に適することが示された。一態様において、上記抗体はＣＤ２０に結合する。一態様において、ＣＤ２０結合抗体はヒト化抗体である。好ましい態様において、前記ＢＡＴ４３０６Ｆヒト化抗体は、特許ＷＯ２００５０４４８５９からのＢ−Ｌｙ１抗体配列の重鎖可変領域のＢ−ＨＨ６アミノ酸配列と軽鎖可変領域のＢ−ＫＶ１アミノ酸配列である。ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される配列である一対の軽鎖と重鎖を含む。一態様において、ＣＤ２０結合抗体は全部ヒト来源のＢＡＴ４４０６Ｆ抗体であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示される配列である一対の軽鎖と重鎖を含む。一態様において、前記抗体はＢＡＴ１２０６Ｆであり、ＢＡＴ１２０６Ｆ抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示される重鎖を両本有する。一態様において、前記抗体はＢＡＴ０２０６Ｆであり、ＢＡＴ０２０６ＦがＥＧＦＲに結合し、同抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示される重鎖を両本有する。一態様において、前記抗体はＢＡＴ０８０８であり、同抗体がＴｒｏｐ２に結合し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示される重鎖を両本有する。一部の態様において、上記修飾された糖タンパク質は宿主細胞から分泌されたものである。一部の態様において、上記修飾された糖タンパク質は抗体である。
【００２７】
具体的な実施態様の一例として、本発明のゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体を産生する、製造方法又はそれを用いて製造した抗体は、以下の具体的な工程を含む：
前述の一対の融合タンパク質、又は一対のポリヌクレオチド、又はベクターを野生型ＣＨＯ細胞へ導入してトランスフェクションする後、細胞を植物凝集素（ＬＣＡ）を含むＣＤ  ＣＨＯ（シグマ）＋１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を加え、圧力スクリーニングして、１４日間後、生細胞は０．５  細胞／ウェルで細胞培養用９６ウエルプレートに接種し、血清濃度が５％に下げ、そして７日間後、細胞は細胞培養用２４ウェルプレートに導入して、ＣＯ２インキュベータに戻し、７日間後に一部の細胞を取り出し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離し、ＰＢＳへの交換を一回行い、２μｌフルオレセインで標識化されたＬＣＡを取って細胞と混合し、氷の上に３０ｍｉｎ培養し、ＰＢＳにて洗浄を一回行い、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃ６）で蛍光値を読み取し、陰性コントロールとして、トランスフェクションされなかった野生型ＣＨＯ細胞を使用し、陽性細胞を細胞培養用６ウェルプレートに転移し、血清濃度は１％に下げ、７日間後に、細胞を小さいローラーボトルに転移し、この時の培地は無血清のＣＤ  ＣＨＯであり、馴化過程を完了した。一部の細胞を取り、プラスミド抽出キット（Ｏｍｅｇａ）でＣＨＯゲノムを抽出し、ゲノムを鋳型としてプライマーであるＬ１３０ｆｏｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）、Ｌ１３０ｒｅｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）、ｔａｑ酵素を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ＰＣＲ産物はＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結、形質転換を行ってプレートに塗布され、翌日、単一コロニーをＴ７  プライマーにてシークエンシングし、ＤＮＡＳＴＡＲ分析ソフトで配列を分析し、野生型ＣＨＯゲノム配列と比べて塩基欠を出現したＣＨＯ細胞はスケールアップ培養され、ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦと命名した。対数増殖期のＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦから細胞ライブラリを樹立し、７．５％ＤＭＳＯを含むＣＤ  ＣＨＯ凍結保存液で細胞を凍結保存し、液体窒素缶に導入し、長期保存した。抗体遺伝子をコードするプラスミドを取って消化し、そのＯＤ２６０を測り、エレクトロポレーションカップに５０μｇプラスミドを１０７のＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦと混均し、エレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏｒａｄ）でトランスフェクションし、細胞培養用９６ウェルプレートに接種し、４８ｈ後にメチオニンイミノスルホン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ，ＭＳＸ）を加え、１４日間後、抗ＦＣポリクローナル抗体でコートされたＥＬＩＳＡプレートが３％ＢＳＡでブロックした後、上清をプレートに加えて３７℃で２ｈ培養した。ＰＢＳＴにて５回洗浄し、抗ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識されたヒツジ抗ヒトｋａｐｐａ／ｌａｍｂｄａ軽鎖、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加え、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を読み取った。力価が高いものはクローンして拡大培養し、収集細胞上清を集め、フコースがノックアウトされた抗体タンパク質が得られた。
【００２８】
本発明は、また、ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞である、細胞を提供する。
前記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞は、編集されたＦｕｔ８遺伝子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％の同一性を持つ配列を有する。
【００２９】
本発明は、また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列を含む核酸、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％の同一性を持つ配列を含む核酸を提供する。
【００３０】
本発明は、さらに中国典型的培養物寄託センターに寄託し、寄託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１７１２７、受託日期２０１７．８．１０、住所：中国、武漢、武漢大学、分類と命名：チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ  ｆｕｔ８（−／−）である、ＣＨＯ宿主細胞を提供する。
一部の態様において、上記宿主細胞は無血清培地に維持する。一部の態様において、上記宿主細胞は懸濁液培養物に維持する。本発明は、さらに上記宿主細胞を含んでいる培地、及び培地に上記宿主細胞を複数含んでいる培養発酵缶に関する。一部の態様において、上記培地は無血清のものである。
【００３１】
本発明の第十二は、ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体であり、上記抗体はヒト化或いは全部ヒト来源の抗体であり、ユニークなグリコシル化様式を有し、Ｎ−グリコシル化の不均質性の程度が低く、かつＡＤＣＣ活性が著しく増加しておる、抗体を提供する。
【００３２】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、細胞膜表面ＣＤ２０に結合するヒト化抗体である。
【００３３】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体はユニークなグリコシル化様式を有する。上記グリコシル化様式は、上記抗体においてＮ−連結多糖の中の一つ又は複数の、ブドウ糖（Ｇｌｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、高マンノース、グルコサミン（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｇ０とアセトグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる群から選択される糖部分のレベルが変動する特徴を持つ。上記グリコシル化様式の特徴は、以下好ましい要件の中の１つ又は複数を満たす：
上記抗体においてはフコース含有率が低く、（０−５％）
上記抗体に含まれるガラクトースのレベルが比較的低く、（≦３０％）
上記抗体においてマンノースのレベルが比較的低く、（≦５％）
上記抗体において高マンノースのレベルが比較的低く、（≦５％）
上記抗体のＧ０のレベルは比較的高い。（≧６０％）
【００３４】
その中、一部の態様において、上記抗体に含まれるガラクトースのレベルがより低く、≦５％である。
その中、一部の態様において、上記抗体に含まれるＧ０のレベルが比較的高く、≧８０％である。
【００３５】
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、フコース含有率が０であるという好ましい要件を満たす。
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、Ｎ−多糖の不均質の程度は極めて低く、均一な糖鎖を有するものである。
この中、一部の態様において、上記ゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、ＦｃのＡＤＣＣ活性が比較的強い。
その中、一部の態様において、前記抗体は、図１０の上方に位置するＢＡＴ４３０６Ｆに示される糖鎖スペクトルを有するものである。
【００３６】
その中、一部の態様において、前記ＢＡＴ４３０６ＦがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される重鎖を両本有するものである場合には、当該配列には変異が起こることを排除しないことを意味し、これらの変異が当該抗体の作用を影響しない範囲であればよい。
【００３７】
本発明の第十三は、ＣＨＯ宿主細胞中のＦｕｔ８遺伝子の一番目のエクソンには一つの失活性変異を含む、Ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ宿主細胞を提供する。前記変異は、一つ又は複数アミノ酸の置き換え又は欠失、又はフレームシフト変異、例えば図６に示された変異であってもよい。
【００３８】
本発明は、さらに前述の抗体を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施態様としては、前記医薬組成物には、さらに薬学的に許容される担体を含む。
【００３９】
本発明は、さらに、有効量の本発明に開示した抗体／抗体断片をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患の予防又は治療する方法を提供する。一部の態様において、前記疾患は癌、アレルギー疾患、循環器疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経性疾患、ウィルス感染及び／又は菌感染からなる群から選ばれるものである。例えば、上記疾患は癌又はアレルギー疾患であってもよい。一部の態様において、上記対象は哺乳動物、例えばヒトである。
【００４０】
従来の抗体医薬と比べて、本発明は以下のような利点を有する。
従来、市販の抗体医薬は、ほぼＦｃに対する単一Ｎ−グリコシル化修飾に限定するものであるが、その糖鎖タイプ成分と含有率は一致していないで変動し易いので、また一定の複雑性が存在しており、特に、生産安定性の面に煩雑となる。本発明が提供するゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞から産生される、ユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、一方でＮ−グリコシル化の不均質性の程度が低く、糖鎖の均一性が良いしつつ、ＡＤＣＣ活性が強くなり、抗体医薬の品質属性と薬学的なキャラクターが多大な改善された。
前記抗体は、その対応する修飾されなかったＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）又は懸濁に適した親細胞ＣＨＯ−ＢＡＴから産生された抗体と比べて、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体への結合親和性が増加している。
【００４１】
上記修飾された宿主細胞から産生される抗体は、その対応する修飾されなかった宿主細胞から産生される対応の抗体と比べて、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和力が増加している。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は貼壁成長しているＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）と、無血清培地での懸濁生長を適応された細胞系ＣＨＯ−ＢＡＴが示す。
【図２】図２はＴＡＬＥＮ発現プラスミドｐＣＳ２ーＦｏｋ１の模式図である。
【図３】図３はＴＬＥＮタンパク質の機能の検証について、電気泳動図の左側は野生型であり、遺伝子を編集された細胞ゲノムのＰＣＲ産物は５００ｂｐおよび７５０ｂｐに両本のバンドが見られ、野生型は７５０ｂｐに一本のバンドだけが見られた。予測される結果と一致しており、Ｔａｌｅｎタンパク質ペアは機能性を有することを証明した。ここで、Ｌａｎｅ１：１００ｂｐ  マーカー、Ｌａｎｅ２：ｗｔ、Ｌａｎｅ３：ｐｏｏｌ。
【図４】図４はＦＡＣＳにて２４ウェルプレートに成長した細胞を分析した。遺伝子が編集された細胞クローンは、ＦＩＴＣで標識されたＬＣＡ結合が陰性を示す細胞であり、野生型細胞は、ＦＩＴＣで標識されたＬＣＡ結合が陽性を示す細胞である。
【図５】図５は糖鎖チップによる分析から、被検した遺伝子を編集された４１、４３号クローンは、フコース含有率が０−１０％に低減し、野生型抗体１２０６のフコース含有率は８０％であることが示された。
【図６】図６はＴＡＬＥＮタンパク質のターゲッティング配列はＰＣＲにて増幅してシークエンシングを行い、その結果をｌａｓｅｒｇｅｎｅＭｅｇＡｌｉｇｎ配列分析ソフトによってアラインメントした結果を示す図である。１９１−１、１９１−２、２１７−１、２１７−３は、選んた四つのゲノムが調整された細胞クローンであり、それらに対してゲノムをそれぞれ抽出し、ＤＮＡ鋳型として用いて、プライマー  Ｌ１３０  ｆｏｒとＬ１３０  ｒｅｖでＰＣＲ反応した後、増幅産物をＣＥＬ−１塩基ミスマッチ解析を行った。結果から、細胞クローン１９１−１、１９１−２はヘテロ接合型であり、細胞クローン２１７−１、２１７−３はホモ接合型であることが示された。アラインメント結果により、ゲノム編集されたホモ接合型２１７−１、２１７−３は選択され、ＣＨＯ−２Ｇ８、ＣＨＯ−１Ｄ６と表記される。最後に、ＣＨＯ−２Ｇ８は宿主細胞として選定されて続く試験に付し、当該宿主細胞はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦと命名された。
【図７】図７はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦが親細胞ＣＨＯ−ＢＡＴの増殖密度との比較の図である。
【図８】図８はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦが親細胞ＣＨＯ−ＢＡＴの増殖能との比較の図である。
【図９】図９はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量分析計にてＢＡＴ４３０６Ｆと４３０６抗体分子のＮ−多糖に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析をした図である。ＢＡＴ４３０６Ｆ由来のＮ−多糖は、いずれも４３０６由来のＮ−多糖に比べて１つのフコースを減った。左図は親細胞から生産した４３０６抗体分子であり、右図はＢＡＴ４３０６Ｆ抗体分子である。
【図１０】図１０はＢＡＴ４３０６ＦがＧＡＺＹＶＡ（オビヌツズマブ）により低くフコース含有率を有し、糖鎖の不均質性の程度がより低く、製品がより優れた均一性を有することを示す。
【図１１】図１１はＲａｊｉが標的細胞とし、ＰＢＭＣがエフェクター細胞とする場合に、ＢＡＴ４３０６野生型、糖鎖修飾されたＢＡＴ４３０６Ｆ、オビヌツズマブ、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ活性を比較した。
【図１２】図１２は、糖鎖修飾されたＢＡＴ４３０６Ｆ、オビヌツズマブ、リツキシマブの三種の抗体の、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏにて５０、２５、１０ｎｇ／ｍＬ濃度で全血中のＢ細胞を排除する能力を比較した図である。
【図１３】図１３はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞で生産された抗ＣＤ２０抗体ＢＡＴ４３０６ＦやＢＡＴ４４０６Ｆ、抗ＥＧＦＲ抗体ＢＡＴ０２０６Ｆ、抗Ｔｒｏｐ２抗体ＢＡＴ０８０８の、糖鎖スペクトルを比較した図である。本発明のゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞は、中国典型的培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託し、寄託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１７１２７、受託日２０１７．８．１０、寄託機関あて先：中国、武漢、武漢大学、分類と命名：チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ  ｆｕｔ８（−／−）である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、具体的実施例に基づいて本発明の技術構成をさらに説明するが、本発明の保護を求める範囲はこれらに限定されるものではない。本発明の趣旨に基づいて、本発明に対する非本質的な変更、調整も、本発明の保護を求める範囲にふくまれる。
【００４４】
なお、本発明において、抗体の糖部分の「レベル」又は「含有率」とよう表現は同様の旨を表し、いずれもある種の糖部分が抗体の全糖部分に占める質量比を意味する。
【００４５】
例えば、本発明において、「アミノ酸」とは、核酸から直接又は前駆体としてコードできるカルボキシルα−アミノ酸である。単一アミノ酸は、三つのヌクレオチド（いわゆるコドン、又は塩基トリプルボディ）からなる核酸によりコードされる。一つのアミノ酸は、少なくとも一つのコドンでコードされる。同じアミノ酸が異なるコドンによってコードされることは、「コドンの縮重性」と呼ばれる。本出願で用いた用語「アミノ酸」とは、天然発生されたカルボキシα−アミノ酸であり、アラニン（三字母コード：ａｌａ、単字母コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトソーヤ（ｔｒｐ、Ｗ）、トリプトファン（ｔｙｒ、Ｙ）とバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００４６】
本発明において、互換できる用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」又は「核酸配列」とは、１ヌクレオチド（塩基とも称される）であるａ、ｃ、ｇとｔ（又は、ＲＮＡにおいて、ｕ）によって構成される多量体分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はその改変体。当該ポリヌクレオチド分子は、天然発生されたポリヌクレオチド分子でもよいし、又は合成されたポリヌクレオチド分子、又は一つ又は複数の天然発生されたポリヌクレオチド分子と一つ又は複数の合成されたポリヌクレオチド分子との組み合わせであってもよい。当該定義では、この中の一つ又は複数のヌクレオチドが変更（例えば、変異誘発することで）、欠失又は付加された、天然発生されたポリヌクレオチド分子も包含される。前記核酸は、単独であってもよい、又は他の核酸、例えば発現カセット、プラスミド又は宿主細胞の染色体に組み込まれたものでもよい。核酸は、単一ヌクレオチドによって構成される核酸配列で特徴付ける。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を、当該アミノ酸配列をコードする対応核酸配列に形質転換するための作業や方法は、当業者が良く知られているものである。したがって、核酸は、対応する単一ヌクレオチドによって構成される核酸配列で特徴付けるでもよいし、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列で特徴付けることもできる。
【００４７】
なお、前記「ポリヌクレオチド」又は「核酸」又は「核酸配列」は、核酸分子に存在する全ヌクレオチドの数に占める修飾されたヌクレオチドのパーセンテージが、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である、修飾されたヌクレオチドも含む。
【００４８】
本発明において、「ポリペプチド」はペプチド結合によって連結されたアミノ酸からなるポリマーであり、天然であってもよいし、合成したものであってもよい。約２０つ以下のアミノ酸残基を有するポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれる。なお、２つ又は複数ペプチドによって構成した分子、又は１００つ以上のアミノ酸残基を有する一つのポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」と呼ばれる。ポリペプチドには、例えば、グリコシル、金属イオン又はカルボキシレート類の非アミノ酸成分を含有してもよい。非アミノ酸成分は、該ポリペプチドを発現する細胞にで加えることができ、細胞のタイプの変動に応じて変わることもできる。ここで、ポリペプチドは、そのアミノ酸主鎖の構造、又はそれをコードした核酸によって特徴付ける。例えばグリコシルの添加は、通常、規定ではないが、存在している場合もある。」なお、前記「ポリペプチド」には、アミノ酸分子に存在する全アミノ酸の数に占める修飾されたアミノ酸のパーセンテージが例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である、修飾されたアミノ酸も含む。
【００４９】
本発明において、「宿主細胞」とは、単核実体培養した微生物又は真核細胞又は細胞系を意味し、組み換えベクターとして用いたものであっても、又は他の転移されたポリヌクレオチドのレシピエント、又はトランスフェクションされた元始細胞の継代細胞であってもよい。一部の態様において、上記宿主細胞は非リンパ球であり、前記宿主細胞が同じユニークな糖鎖スペクトルを示す。一部の実施態様において、前記宿主細胞は例えば、ＮＳ０細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等である。一部の実施態様、上記宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からなる群から選ばれるものである。一部の実施態様において、前記宿主細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−１Ｅ５、ＣＨＯ３Ｆ、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＢＡＴとＣＨＯ−２．６細胞からなる群から選ばれるものである。一部の態様において、上記宿主細胞が、ユニークな糖鎖スペクトルを呈する抗体を産生するものである。本発明のゲノムが編集されたＣＨＯ宿主細胞、例えばＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ  ｆｕｔ８（−／−）は、培養物、培養物の成長を可能にするデバイス（発酵缶を含む）の中に成長できる。前記細胞は生長して単層になってもよいし、表面に接着してもよく。或いは、宿主細胞は懸濁液の中に成長されてもよく。当該細胞は、血清を含まない培地に成長されることもよい。上記培地は市販の培地であってもよい、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２であるが、それに限定されることはない。編集されたＣＨＯ宿主細胞は、培地に多くの継代を経過でも、その特定のユニークな糖鎖スペクトルを維持できる。例えば、編集されたＣＨＯ宿主細胞は、少なくとも約２０、３０、４０又は５０世代後に、その特定のユニークな糖鎖スペクトルも維持している。一部の態様において、修飾されたＣＨＯ宿主細胞は少なくとも約６０世代後、その特定のユニークな糖鎖スペクトルも維持している。もう１つの態様において、修飾されたＣＨＯ宿主細胞は、少なくとも約１００、１５０、２００、５００又は１０００以上の世代後、その特定のユニークな糖鎖スペクトルも維持している。
【００５０】
宿主細胞のグリコシル化様式については、いかなるタンパク質部分にＮ−又はＯ−グリコシル化が起きってもよい。なお、それぞれ、アスパラギンのアミドの窒素の位置、或いはハイドロキシリジン、セリン又はスレオニンのハイドロキシの酸素の位置に一つ又は複数の糖分子を加えでもよい。グリコシル化様式の特徴は、少なくとも両つの又は複数の糖分子又は糖類（例えば、単糖、二糖、多糖又はオリゴ糖）のレベルが改変されている。例えば、糖分子は、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖又はこれらの誘導体例えばデオキシ糖（例えば、デオキシ六糖）、Ｎ−又はＯ−置き換した誘導体例えばシアリン酸、或いはアミノ基を有する糖であってもよい。糖分子は、ガラクトース（Ｇａｌ）、ブドウ糖（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、並びにキシロース（Ｘｙｌ）を包含してもよいが、これらに限るものではない。糖分子はα又はβ結合で他の糖分子に連接しってもよい。
【００５１】
本発明の「抗体」は、あらゆる形式の抗体、例えば組み換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、融合抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等を含まれる。前記抗体は、また、断片であってもよい。前記抗体は、また、ドラッグ、トキシン又は治療用放射性同位元素と結合してもよい。本発明の宿主細胞から、バイスペシフィックな抗体融合タンパク質も産生でき、その中、一つ以上の抗原に結合するヘテロ化抗体も含られる。そのため、抗体にはｎａｋｅｄ抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、結合抗体、または抗体断片を含め、これらがモノスペシフィックでもよいし、多重特異性であってもよい。
【００５２】
選択し得る実施態様としては、前記抗体又は抗体断片は特別な制限は無いが、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ２０、抗ＥＧＦ、抗ＶＥＧＦ、抗ＰＤＧＦ、抗ＥｐＣａｍ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ５５、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ９５、抗ＣＣＲ２、抗ＣＣＲ３、抗ＣＣＲ４、抗ＣＣＲ５、抗葉酸、抗ＣＸＣＲ４、抗ＥＧＦＲ又はＴｒｏｐ２抗体等が挙げられる。好ましい実施態様としては、前記抗体はヒト化或いは全部ヒト来源の抗体である。
本発明の医薬組成物において、所要程度の純度である抗体と選択し得る生理学的に許容し得るキャリア、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））を混合することで、凍結乾燥製剤又は水性溶液として、貯存用の本発明の抗体の医薬品製剤を得る。許容し得るキャリア、賦形剤又は安定剤は、応用剤量と濃度でレシピエントに対して無毒のものであり、例えばホスファイト、クエン酸塩ならびにその他有機酸のバッファー、アスコルビン酸とメチオニンの抗酸化剤、（例えば、ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール、アルキルパラベン例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３ープロパノール、ならびにｍ−クレゾール）の防腐剤、低分子量（約10残基未満）のポリペプチド、例えば血清アルブミン、ゲラチン、又はイムノグロブリンのタンパク質、例えばポリエチレンピロリドンの親水性ポリマー、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンのアミノ酸、ブドウ糖、マンノース又はデキストリンからなる単糖、二糖類ならびにその他の炭水化物、例えばＥＤＴＡのキレート剤、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールの糖、例えばナトリウムの塩形成対イオン、金属錯体（例えばＺＮ−タンパク質錯体）、及び／又は、例えばＴｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ又はポリエチレングリコール（マクロゴール）のノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００５３】
本発明の抗体、医薬組成物、医薬品製剤の投与は、いかなる適した手段で投与することもでき、非経口、皮下、腹腔内、肺内又は鼻腔内の方式が挙げられるが、なお、必要であれば、局所免疫抑制治療を行こうことには、病巣内での投与する手段も採用できる。非経口灌流手段は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与方式を含む。また、本発明の抗体はパルス式灌流（とくに、本発明の抗体の剤量グラジェント変わる）ことで好適に投与することができる。投与時間の短さ又は長さによって、注射投与することが好ましくは、静脈内又は皮下注射で投与することが最も好ましい。ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害活性）とは、細胞により媒介される反応であり、その中、ＦｃＲを発現するエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球とマクロファージ）は標的細胞に結合した抗体を認識して、続いて標的細胞を裂解させる。ＡＤＣＣを媒介される初代細胞は、ＮＫ細胞、単核球とマクロファージを含む。ＮＫ細胞は、通常、主としてＦｃγＲＩＩＩを発現し、単核球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩを発現する。本発明で、親ＣＨＯ細胞系がユニークな糖鎖スペクトルを有するＣＨＯ細胞系を産生するように編集された。その後、当該編集されたＣＨＯ細胞系は、親ＣＨＯ細胞から産生された抗体のＡＤＣＣ活性よりＡＤＣＣ活性が高い抗体を産生できる。
【００５４】
実施例１  無血清懸濁培養に適した親細胞のスクリーニング
１０％ＦＢＳを含むのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養したＣＨＯ−Ｋ１は、細胞のコンフルエンスが８０％ー９０％になる時に、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養終止し、カウントして遠心分離した。５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で細胞を再縣濁し、１×１０５の細胞／ｍｌの密度で細胞を接種した。細胞のコンフルエンスが８０％ー９０％になる時に、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化し、２％ＦＢＳを含む培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養終止し、カウントして遠心分離した。２％ＦＢＳを含む培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を再縣濁し、１×１０５の細胞／ｍｌの密度で細胞を接種した。前記細胞のコンフルエンスが８０％ー９０％になる時、上に述べた工程に従う前記細胞をトリプシンで消化し、含１％ＦＢＳのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養終止し、３−４世代を継代された。ＣＤ  ＣＨＯ培地とＤＭＥＭ／Ｆ１２を１：１（Ｖ／Ｖ）の割合で混合して、終濃度が６ｍＭ  グルタミンになるように調整し、血清含有率が１％に調整された。前記得った低血清に適したＣＨＯ−Ｋ１細胞は、３×１０５細胞／ｍＬの密度でＴ２５  ボトルに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞はコンフルエンスが８０−９０％になる時、トリプシンで消化し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＤ  ＣＨＯ培地を混合した培地（ボリューム比は、１：２）で培養終止し、カウントして遠心分離し、３×１０５細胞／ｍＬの密度でＴ２５  ボトルに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。混合液培地中のＤＭＥＭ／Ｆ１２の割合を徐々に（１：８）に減らしていき、細胞生存率が９０％以上になる時、この時の細胞培地中のＤＭＥＭ／Ｆ１２からの成分はまったく排除されることができ、化学成分限定のＣＤ  ＣＨＯ培地での１％血清を含む培養に適したＣＨＯ−Ｋ１細胞を樹立てきた。１％ＦＢＳを含む化学成分限定のＣＤ  ＣＨＯ培地で培養したＣＨＯ−Ｋ１は、細胞コンフルエンスが８０％ー９０％になる時に、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化し、０．５％ＦＢＳを含むＣＤ  ＣＨＯ培地で培養終止し、カウントして遠心分離した。０．５％ＦＢＳを含むＣＤ  ＣＨＯ培地で細胞を再縣濁し、１×１０５の細胞／ｍｌの密度でＴ２５  ボトルに接種し、細胞の増殖能が８０％ー９０％になる時、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化し、０．２５％ＦＢＳを含むＣＤ  ＣＨＯ培地で培養終止し、カウントして遠心分離した。０．２５％ＦＢＳを含むＣＤ  ＣＨＯ培地で細胞を再縣濁し、１×１０５の細胞／ｍｌの密度で細胞を接種した。細胞が該ステージで健康に増殖するまでに、次のステージの血清濃度の低下を始まった。無血清ＣＤ  ＣＨＯ培養に適したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、限界希釈し、３０枚９６ウェルプレートに接種し、細胞密度が１つ細胞／ウェルように調整した。２周後に、顕微鏡で観察して、モノクロナールを産生した細胞を標識した。細胞面積が大きいクローンは２４ウェルプレートに転移し、１周後に、顕微鏡で観察し、生長密度が比較的高い、細胞の大きさがそろった細胞クローンを標識して、６ウェルプレートに転移して、培養を続けた。１周後、顕微鏡で観察し、完全に懸濁して、塊に凝集した程が軽いで細胞密度が���きくクローンが標識され、１００ｍＬ三角ボトルに転移し、培養ボリュームは１０ｍＬであった。細胞株あたりについて細胞密度、増殖能を記録した。馴化を経て無血清培養に適したＣＨＯ−Ｋ１細胞は、新たにＣＨＯ−ＢＡＴと命名した。
【００５５】
実施例２  ＦＵＴ８  ＴＡＬＥＮ組み換えプラスミドの構築
【００５６】
チャイニーズハムスター卵巣癌細胞ＣＨＯ−Ｋ１のゲノム全配列（ＮＷ．００３６１３８６０）を解析することで、Ｆｕｔ８ゲノム配列（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１００７５１６４８）とそのｃＤＮＡ（表１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示す）配列が得られた。Ｆｕｔ８ゲノムは９つのエクソンと１１つのイントロンで構成している。Ｆｕｔ８の酵素活性センターは、エクソン１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）でコードするアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、下線で示したアミノ酸配列）によって構成されるため、Ｔａｌｅｎのターゲッティング配列としてＦｕｔ８遺伝子のエクソン１の左右の両翼によってデザインした。ＴＡＬＥＮデザインガイド原則および遺伝子の編集作用機序によって、Ｆｕｔ８  ＴＡＬＥＮタンパク質Ｌ１３０Ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）、Ｒ１８４Ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１）をデザインてきた。Ｌ１３０ＰとＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを融合タンパク質Ｌ１３０ーＦｏｋＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４）に形成し、該融合タンパク質はエクソン１の左翼の塩基Ｌ１３０ＰＴＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）を認識する。融合タンパク質Ｌ１３０ーＦｏｋＩが対応する核酸配列Ｌ１３０ーＦｏｋＩＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示す。その長さが１９ｂｐである。Ｒ１８４ＰとＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを融合タンパク質Ｒ１８４ＰーＦｏｋＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６）に形成し、該融合タンパク質はエクソン１の右翼の塩基Ｒ１８４ＰＴＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）を認識する。融合タンパク質Ｒ１８４ＰーＦｏｋＩが対応する核酸配列Ｒ１８４ＰーＦｏｋＩＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示す。その長さが１７ｂｐである。ＴＡＬＥＮタンパク質のエクソン１左翼Ｌ１３０ＰＴＮと右翼Ｒ１８４ＰＴＮをコードするプラスミドベクター（図２に参考）は、Ｔｏｍａｓ  Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ  ａｌ．（２０１１）に記載されたように構築した。Ｌ１３０ーＦｏｋＩＮ、Ｒ１８４ＰーＦｏｋＩＮの両端に制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＸｂａＩの酵素消化サイトを加え、当該二つの断片配列を合成し、ＮｃｏＩとＸｂａＩによってｐＣＳ２ーｐｅａｓーＴベクターにクローニングした（図２）。左翼の結合配列と右翼の結合配列の間には、１９ｂｐ長さのスペーサー（Ｓｐａｃｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）が有する。Ｆｕｔ８  ＴＡＬＥＮの両つのプラスミド：Ｌ１３０ＮとＲ１８４ＮのＤＮＡシークエンシング結果は、表１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２、ＳＥＱＮＯ．１３に示しており、Ｌ１３０Ｎ、Ｒ１８４Ｎ核酸配列はアミノ酸に翻訳され、対応する配列アミノ酸配列のＬ１３０Ｐ、Ｒ１８４Ｐは、表１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示している。
表１  配列表
【００５７】
【表１−１】
2020534862.tif 000003
【表１−２】
2020534862.tif 000004
【表１−３】
2020534862.tif 000005
【表１−４】
2020534862.tif 000006
【表１−５】
2020534862.tif 000007
【表１−６】
2020534862.tif 000008
【表１−７】
2020534862.tif 000009
【表１−８】
2020534862.tif 000010
【表１−９】
2020534862.tif 000011
【表１−１０】
2020534862.tif 000012
【表１−１１】
2020534862.tif 000013
【００５８】
実施例３  ＦＵＴ８  ＴＡＬＥＮタンパク質の機能有効性の解析
【００５９】
ＣＥＬ−Ｉ酵素は、二本鎖ＤＮＡの中のミスマッチした塩基を認識し、二本鎖ＤＮＡをミスマッチした位置から切断できるヌクレアーゼである。ターゲッティング配列がＦｕｔ８ＴＡＬＥＮに編集された場合、親ゲノムから増幅したターゲッティング配列を含む区域と、形質転換された細胞のゲノムから増幅したターゲッティング配列を含む区域とを混合して変性させ、アニーリングした後、アニーリングされた二本鎖ＤＮＡには塩基ミスマッチがあった。そうすると、ＣＥＬ−Ｉ酵素がアニーリングされた二本鎖ＤＮＡを切断し、その表現は、アガロース電気泳動結果に両本のバンドを発見した。５×１０５のＣＨＯ−ＢＡＴ細胞を取し、トランスフェクション前日、６ウェルプレートに接種した。培地は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２である。プラスミドＬ１３０ＮとＲ１８４Ｎは、試薬の説明に提供した方法で、細胞へ一過性トランスフェクションされている。トランスフェクション３日間後、細胞を遠心分離して収穫し、ゲノム抽出キットでゲノムを抽出した。それを鋳型とし、プライマー  Ｌ１３０  ｆｏｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）とプライマー  Ｌ１３０  ｒｅｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）にてＰＣＲ反応を行った。親細胞に含まれるターゲッティング配列の区域に対するＰＣＲ増幅は、同様にした。両つのＰＣＲ産物は、それぞれ２０μｌを取って混合して、９４℃に昇温して、その後室温に放冷した。アニーリングしたＤＮＡ  ２００ｎｇに０．５μｌ  ＣＥＬ−Ｉ酵素を加え、４２℃で３０分間培養した。ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動した。当該反応産物がアガロース電気泳動で解析した結果は、図３に示す。
【００６０】
結果から、野生型と比べて、遺伝子を編集されたＰＣＲ産物が５００ｂｐおよび７５０ｂｐに両本のバンドを確認され、野生型が７５０ｂｐに一本のバンドを確認され、予測結果に該当し、Ｔａｌｅｎタンパク質ペアは機能できることを証明した。
【００６１】
実施例４  ＦＵＴ８  ＴＡＬＥＮタンパク質が抗体のフコース含有率に対する影響
【００６２】
デザインされたＦＵＴ８  ＴＡＬＥＮタンパク質が宿主ゲノムに対する調整は、調製した抗体の糖鎖に影響を与えるか（フコース含有率が変動かどうか）ことを目的として、Ｌ１３０ＮとＲ１８４  Ｎプラスミドを、すでに樹立した抗ＣＤ２０抗体を安定な発現する細胞系へ一過性トランスフェクションされている。方法は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）試薬の説明から提供する方法を参照した。簡単な説明しれば、１０ｃｍ  セルカルチャーディッシュインナーにおいて、１×１０６の細胞に、それぞれＬ１３０ＮとＲ１８４Ｎの４μｇプラスミドＤＮＡを組み入れたリポソーム２４μＬを加えた。トランスフェクション両日間後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＧＢＩＣＯ）と４００μｇ／ｍＬ  ＬＣＡ（Ｖｅｃｔｏｒ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換した。１周間後、細胞の大部分は丸くなって培地に懸濁し、他の一部の細胞は正常に接着成長した。上清を捨てて、トリプシン０．２５％（ｖ／ｖ）でＬＣＡ耐性である細胞を消化し、遠心分離後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再縣濁した。ウェル毎に０．５細胞の密度で９６ウェルプレートに接種した。培養２周後、モノクロナールである細胞は選択され、２４ウェルプレートに導入した。ＦＡＣＳにて２４ウェルプレートに成長した細胞を分析し、ＦＩＴＣで標識したＬＣＡ結合が陰性を示した細胞（図４）は、スケールアップ培養されて抗体を産生させた。２種細胞から生産した抗体のオリゴ糖含有率は、北京愛▲徳▼諾会社（ｂｉｏｄｏｎｏｒ）により測定し、結果は図５に示す。
【００６３】
その結果、抗体を調製する細胞へのＬ１３０とＲ１８４プラスミドの一過性トランスフェクションは、抗体のフコース含有率を低減した。
【００６４】
実施例５  ゲノムが調整された宿主細胞の樹立
【００６５】
フコースフリータンパク質および抗体の産生のためにゲノムを調整されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を樹立するため、Ｌ１３０とＲ１８４プラスミドをＣＨＯ−Ｋ１の細胞系へ一過性トランスフェクションした。抗ＬＣＡのモノクロナール細胞のスクリーニングは、実施例３と同様にした。候補としての細胞クローンは、ゲノムがそれぞれ抽出され、プライマー  Ｌ１３０  ｆｏｒ（表１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）とプライマー  Ｌ１３０  ｒｅｖ（表１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）でＰＣＲ反応して、候補としての細胞クローンに含まれるターゲッティング配列の区域のＰＣＲ増幅産物に対してＣＥＬ−１塩基ミスマッチを分析した。候補クローンはヘテロ接合型であれば、ＣＥＬ−１で酵素消化後のアガロース電気泳動には両本のバンドを有し、ホモ接合型であれば、ＣＥＬ−１で酵素消化しても、切断できないため、アガロース電気泳動には１本のバンドを有する。当該ＰＣＲフラグメントはそのままＴベクター（ｐＧＥＭーＴ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングし、その後、シークエンシングした。シークエンシング結果と、親細胞における当該区域のフラグメント配列のペア比は、図６に示す。アラインメント結果によって、両つのゲノム編集されたホモ接合型が選択され、ＣＨＯ−２Ｇ８，ＣＨＯ−１Ｄ６と表記される。
【００６６】
実施例６  宿主細胞の成長特性の評価
【００６７】
宿主細胞としてｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたクローンＣＨＯ−２Ｇ８を選定し、新たにＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦと命名した。３０ｍＬ終濃度が６ｍＭ  Ｇｌｎを含むＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭをそれぞれ取って、細胞密度が３０万／ｍＬの３株のＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦと、１株のＣＨＯ−ＢＡＴを１２５ｍＬの小さいローラーボトルに接種した。ｄ０、ｄ３、ｄ６、ｄ７で０．５  ｍＬ細胞を取って、それぞれカウントし、細胞密度および細胞生存率を測定して、Ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされた後の細胞の成長特性の変動を評価した。細胞成長密度は図７、細胞成長増殖能は図８に示す。図７と図８から分かるように、ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦは、ｆｕｔ８遺伝子がノックアウトされないＣＨＯ−ＢＡＴ細胞と比べて、成長密度と活性には有意差がない。
【００６８】
実施例７  宿主細胞から産生した抗体のグリコシル化スペクトルの解析
【００６９】
本発明に記載されたゲノムが調整されたＣＨＯ−２Ｇ８細胞系から産生した抗体の糖鎖が、変異したＮ−多糖修飾を有していることを確認するためには、タンパク質Ａ親和カラムで培地からＣＨＯ−２Ｇ８細胞から産生されたＢＡＴ４３０６Ｆと、ＣＨＯ−Ｋ１細胞から産生された４３０６を精製し、紫外線ＵＶ２８０にて定量した。塩除去したモノクローナル抗体（１ｍｇ）はＰＮＧａｓｅＦと３７℃でオーバーナイト培養して、抗体からＮ−グリカンが放出された。放出したＮ−ポリ糖は、３０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過によって抗体と分けられた。フロースルーは凍結乾燥して、２００μｌ脱イオン水に再縣濁した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量分析計にて前述した両つの抗体分子からのＮ−多糖に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを分析した。ＣＨＯ−２Ｇ８から産生されたＢＡＴ４３０６Ｆ抗体のオリゴ糖は、単ピークで存在しており、そして基本的に同じポピュレーションに属した。当該ポピュレーションは、親宿主細胞から産生された抗体４３０６のオリゴ糖のスペクトルとは異なるものである（図９）。
【００７０】
その結果、４３０６のＮ−多糖の三つのピークは、それぞれＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆである。ＢＡＴ４３０６ＦのＮ−多糖のピークが現れた時間と分子量により、Ｎ−多糖の３つのピークはそれぞれＧ０、Ｇ１、Ｇ２であると推定し、即ち、４３０６からのＮ−多糖よりも、ＢＡＴ４３０６Ｆ由来のＮ−多糖あたり1つフコースが少ない。
【００７１】
同時に、市販のＧａｚｙｖａがＢＡＴ４３０６Ｆの糖鎖と比べて、その糖鎖の不均質性の程度を分析する結果を図１０に示す。その結果、ＢＡＴ４３０６ＦのＮ−多糖の不均質程度はより低く、更なる均一な糖鎖を持つ。ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞から産生された異なる抗体の糖鎖タイプを分析した。結果は表４に示す。
【００７２】
実施例８  宿主細胞から産生した抗体のＡＤＣＣ活性の解析
【００７３】
本発明のＮ−多糖を有する抗体の修飾は、抗体のバイオ機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を高めるかどうかを確認するためには、ＣＤ２０に標的化された精製した抗体を用いることで、これらのＩｎ  ＶｉｔｒｏでのＡＤＣＣ活性（ＬＤＨ法、ｐｒｏｍｅｇａ）を測定した。抗体は、タンパク質Ａ親和カラムによって、培地からＣＨＯ−２Ｇ８細胞が産生したＢＡＴ４３０６Ｆを精製し、紫外線ＵＶ２８０で定量した。親抗体として修飾されなかった４３０６は、野生型ＣＨＯ細胞に発現され、同様の方式で精製した。ＡＤＣＣの検出ために、１０％ＦＢＳを含むのＲＰＭＩ−１６４０培養液でＷｉｌ２−ｓ細胞を培養し、状態が良い（４−７日間）。対数増殖期の細胞を取り、１０００回で１０分間遠心分離して上清を捨てた。Ａ液（１０％ＦＢＳを含むフェノールレッドフリーのＲＰＭＩ−１６４０培養液）を加えよく混ぜた。前記同様に遠心分離して両回洗い、カウントし、Ａ液で細胞を３×１０５個／ｍＬに調整し、ウェル毎に１００μｌでＵ−９６ウェル細胞培養用プレートに加えた。抗体の終濃度は、ウェル毎に順に１．２、０．２４、０．０４８、０．００９６、０．００１９２、０．０００３８４、０．００００７６８、０．００００１５３６（μｇ／ｍＬ）に調節された。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに入れて、３０ｍｉｎ培養した。エフェクター細胞ＰＢＭＣを収集し、Ｂ液（血清を含まないフェノールレッドフリーのＲＰＭＩ−１６４０培養液）を加えた。前記同様に遠心分離して両回洗い、カウントして、Ｂ液で細胞を３×１０５個／ｍｌに調整し、よく混ぜてウェル毎に５０ｕｌで前記Ｕ−９６ウェル細胞培養用プレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに入れて、３時間培養した。３ｈの培養時間の中の４５ｍｉｎが残る時に、標的細胞最大放出ウェルに２０μｌ溶解液を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで４５ｍｉｎ培養を続けた。Ｕ−９６ウェル細胞培養用プレートを遠心分離機に載せて、２５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離した。５０μｌ／ウェル上清を他の平底９６ウェルプレートに移し、すでに調合した発色基質溶液５０μｌ／ウェルを加え、軽く振盪しよく混ぜ、室温で３０ｍｉｎ避光反応した。停止液５０μｌ／ウェルを加え、軽く振盪しよく混ぜた。マイクロプレートリーダーによってＯＤ４９０で結果を読み取った。
【００７４】
その結果、親ＣＨＯ細胞が産生した修飾されなかった４３０６と比べて、無血清培地にＣＨＯ−２Ｇ８細胞クローンから産生されたＮ−多糖を有するＢＡＴ４３０６Ｆは、  Ｒａｊｉ細胞とＷｉｌ２−ｓ細胞に対するＡＤＣＣ活性が著しく向上する（図１１）。
【００７５】
実施例９  宿主細胞から生産された抗体のＣＤ２０に対する親和力の解析
【００７６】
本発明に記載された細胞から産生されたＮ−多糖が修飾された抗体は、ＣＤ２０陽性細胞に結合する能力には影響があるかどうかを確認するためには、Ｋｌｅｒｖｉ  Ｅｖｅｎ−Ｄｅｓｒｕｍｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）の方法を参照し、ＦＡＳＣ方法にてＢＡＴ４３０６Ｆ、４３０６、対照リツキシマブの、異なる細胞表面のＣＤ２０に対する親和力を検出した。簡単な説明しれば、対数増殖期の細胞Ｗｉｌ２−ｓを収集し、８００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離し、上清を捨てた。ＰＢＳで一回洗い、密度を算出し、ＰＢＳで再縣濁して、チューブ毎に５０万の細胞になるように１．５  ｍＬ遠心分離チューブに入れた。遠心分離し、１２００  ｒｐｍ、５ｍｉｎで、上清を捨てた。抗体濃度はそれぞれ３０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１、０．０４、０．０１４、０．００４６μｇ／ｍＬに配置され、前記細胞へ２００ｕｌの抗体を順に加え、細胞を再縣濁しよく混ぜた。同時にネガティブコントロールとして同体積のＰＢＳを加えた。４℃、２ｈ避光放置した。遠心分離し、１２００  ｒｐｍ、５ｍｉｎで、上清を捨てて、ＰＢＳで一回洗った。１００μｌ  ＰＢＳを加えて細胞を再縣濁し、２μｌ  ＦＩＴＣーヒツジ抗ヒトＩｇＧ１  Ｆａｂの２次抗体を加え、４℃で、３０ｍｉｎ避光放置した。１２００  ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離し、上清を捨てて、ＰＢＳで一回洗い。フローサイトメーターＣ６で検出した。結果算出公式：Ｋｄ＝［Ａｂ］＊｛Ｆｍａｘ／（ＦーＦｂａｃｋ）ー１｝。結果は下表に示す。
【００７７】
表２  抗体による細胞結合実験のＩＣ５０値およびＫｄ値の結果の統計
【表２】
2020534862.tif 000014
その結果、Ｎ−多糖が修飾された抗体には、抗体ＣＤ２０に結合する親和力が影響されない。
【００７８】
実施例１０  ＢＡＴ４３０６Ｆが異なるＮＨＬ患者の全血においてＢ細胞を排除する能力のＩｎ  Ｖｉｔｒｏ評価
【００７９】
抗ＣＤ２０抗体がＢリンパ腫患者の体内の作用機序については、ＡＤＣＣ、ＣＤＣが直接誘導したＢ細胞アポトーシス等の多様な機序がある。しかし、特定の一種の抗ＣＤ２０抗体の効果については、ある一つの作用機序を高めることではなく、やがてその抗体が患者体内のＢ細胞を排除する能力で反映したものである。本発明のＮ−多糖を有する抗体の修飾が、そのＢ細胞を排除する能力を高めるかどうかを確認するためには、それに対してＩｎ  ＶｉｔｒｏでＢＡＴ４３０６Ｆの、異なるＮＨＬ患者の全血においてＢ細胞を排除するバイオ機能を評価した。簡単な説明しれば、ヘパリンナトリウム抗凝固チューブで、ＮＨＬ病にあらたに診断された者の血を３ｍＬ程度に取った。作業者が取りに来るまで、室温で静置保存した。被検血様からそれぞれ９０μＬを取って新たなＦＡＣＳチューブに入れて、各チューブの被検サンプルの中の抗体終濃度がそれぞれ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１  ｎＭ、０．０１  ｎＭ、０．００１  ｎＭになるように、各チューブのサンプルへ１０μＬ異なる濃度のＢＡＴ４３０６Ｆ抗体希釈液を加えた。３７℃インキュベータに３−４時間静置し、その後各チューブから５０ｕＬ血様を取ってＢＤ  ＴｒｕＣｏｕｎｔ  ｔｕｂｅｓに加え、血様へＢＤのＢ細胞カウント抗体混合物（抗ＣＤ４５（リンパ球集団）、抗ＣＤ３（Ｔ細胞）、又は抗ＣＤ１９（Ｂ細胞））を加えた。室温で暗所で１５ｍｉｎ静置し，ＢＤ  ＦＡＣＳ溶解液を加えた後、機器に載せて計測した（ＢＤ  Ｃ６）。結果は図１２に示す。
【００８０】
その結果、試験した三つの濃度レベルにおいて、ＢＡＴ４３０６Ｆ抗体のＢ細胞を排除する能力は、いずれもＮ−多糖が修飾されなかった抗体リツキシマブにより強い。
【００８１】
実施例１１  ＢＡＴ４３０６ＦとＦｃγＲＩＩＩａ分子との親和力の増強
【００８２】
ゲノムが編集されたＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞が産生したユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡとの親和力を増強することを検証するために、ＢＡＴ４３０６Ｆ、市販ＧＡＺＹＶＡ、リツキシマブの、ＦｃγＲＩＩＩＡとの親和力をそれぞれ測定した。センサーはＰＢＳに置いて、１０ｍｉｎ準備濡れされた。ビオチンで標識したＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８ＦをＡＢで２．５μｇ／ｍＬに希釈した。Ｌｏａｄｉｎｇ：ビオチンで標識したＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖの希釈液にＬｏａｄｉｎｇ  １０ｍｉｎ（シグナルが約１．３  ｎＭになるまで）、３．６．３とＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｖ親和力のテスト：被検医薬であるＢＡＴ４３０６Ｆ、オビヌツズマブはＡＢで５００ｎＭに希釈した。リツキシマブはＡＢで３０００ｎＭに希釈した。その後と同様なバッファーを用いて２倍グラジェントで７つの点に希釈した。ＡＢ、ＦｃγＲＩＩａ  Ｖ１５８、再生バッファー、医薬希釈液、中和バッファーを、順に９６ウェルプレートの対応する列に加えた。ＳＡセンサーで以下工程を実行した。Ｂａｓｅｌｉｎｅ：ＡＢにベースラインを検出した。１５０ｓ、アソシエーション：濃度グラジェントの医薬希釈液サンプルおよびブランク（ＡＢ）に、９０ｓ結合した。ディソシエーション：ＡＢに１２０ｓ解離した。再生：ｐＨ  １０．５であるＮａＯＨの中に５ｓ再生した。中和：ＡＢで５ｓ中和した。再生、中和は３回を繰り返した。データを採取した後、機器のデータ解析ソフトＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ８．２によってデータを分析したところ、Ｂａｓｅｌｉｎｅで採取するシグナルをベースラインとして、参照シグナル（サンプルブランクとセンサブランクの双重減算）を引いて、得られるデータに対してグループを分析してフィッティングを行った。
表３  ＢＡＴ４３０６ＦがＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆに対する親和力の統計結果
【００８３】
【表３】
2020534862.tif 000015
その結果、試験した三つの抗体において、ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞から産生されたユニークな糖鎖スペクトルを有する組み換え抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡとの親和力が最も強い。
【００８４】
実施例１２
【００８５】
上記ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ宿主細胞において、他の抗体配列から発現された抗体の糖鎖スペクトルが安定、一致していることを検証するためには、ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞が他の数種抗体をそれぞれ発現した。その抗体の１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示される重鎖を両本有するＢＡＴ４４０６Ｆ抗体である。その抗体の１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示される重鎖を両本有する抗ＥＧＦＲ抗体ＢＡＴ０２０６Ｆである。その抗体の１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示される軽鎖を両本、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示される重鎖を両本有する抗Ｔｒｏｐ２抗体ＢＡＴ０８０８。具体の実験は製品明細書（ＬｕｄｇｅｒＴａｇＴＭ  ＰＲＯＣ（ｐｒｏｃａｉｎａｍｉｄｅ）Ｇｌｙｃａｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）を参照し、サンプルを変性還元後、グリコシダーゼでグリコシル化サイトからサンプルの糖鎖を切除した。プロカインアミド塩酸塩ーフルオレセインコンジュゲートで標識した後、ＨＩＬＩＣカラムにて単離し、移動相ＡとしてｐＨ  ４．５である１００ｍＭ  ギ酸アンモニウムを、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて溶出単離した。溶出グラジェントは０−３６分間掛けて２８％Ａ−３８％Ａであり、蛍光検出器で検出した。システム適性溶液の中、糖鎖タイプＧ１与Ｇ１’の分離度は１．０以上であることは必要である。結果は図１３、表４が示された。４種の抗体の糖鎖タイプが高度にそろった、糖鎖の均一性が良い。本発明の方法或いは細胞は、一般応用性を有し、抗ＣＤ２０抗体の調製だけでなく、他の作用サイトを有する抗体の調製にも適用でき、ＡＤＣＣ活性が増強される均質な標的抗体を産生することができる。
【００８６】
表４．ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞で調製した四種の抗体における糖鎖タイプの割合（％）
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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