(57)【要約】  それを必要とする対象に対する逃避走性レベルのＣＸＣＬ１２を発現するヒトトランスジェニックベータ細胞が、本明細書に記載される。ＣＸＣＬ１２をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含むベータ細胞も、本明細書に記載される。
2020535834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトベータ細胞をヒト免疫細胞に対して抵抗性にするのに十分な量でヒト逃避走性剤（fugetactic agent）を発現または過剰発現するヒトベータ細胞であって、インスリンを発現することができ、細胞分裂できない、ヒトベータ細胞。
【請求項２】
ヒトＣＸＣＬ１２をコードする核酸配列をそれ自体に含むベクターを含むヒトベータ細胞であって、ヒト免疫細胞に対して抵抗性である、ヒトベータ細胞。
【請求項３】
１型糖尿病の対象から入手した自家ベータ細胞である、請求項１または２に記載のヒトベータ細胞。
【請求項４】
同種ベータ細胞である、請求項１または２に記載のヒトベータ細胞。
【請求項５】
前記ヒト免疫細胞が、ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項６】
逃避走性量（fugetactic amount）でヒトＣＸＣＬ１２を発現する、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項７】
前記ＣＸＣＬ１２が、ＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータからなる群から選択される、請求項６に記載のヒトベータ細胞。
【請求項８】
内在性ＣＸＣＬ１２コード領域の上流にトランスジェニック調節領域を含むヒトベータ細胞であって、ヒト免疫細胞に抵抗性である、ヒトベータ細胞。
【請求項９】
自家ベータ細胞である、請求項８に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１０】
同種ベータ細胞である、請求項８に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１１】
１型糖尿病の対象から入手または由来する自家ベータ細胞である、請求項９に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１２】
１型糖尿病でない対象から入手または由来する同種ベータ細胞である、請求項１０に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１３】
前記トランスジェニック調節領域が、外来性構成的または誘導可能なプロモーターである、請求項８から１２のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１４】
逃避走性量でＣＸＣＬ１２を発現する、請求項８から１０のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１５】
前記ＣＸＣＬ１２が、ＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータからなる群から選択される、請求項１４に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１６】
ＣＸＣＬ１２ベータを発現する、請求項１５に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１７】
細胞分裂できない、請求項２から１６のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１８】
前記ヒトＣＸＣＬ１２が、ＣＸＣＬ１２アルファ、ＣＸＣＬ１２ベータ、ＣＸＣＬ１２デルタおよびＣＸＣＬ１２ガンマからなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項１９】
前記ヒト免疫細胞が、ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔ細胞およびＢ細胞を含む、請求項８から１８のいずれか一項に記載のヒトベータ細胞。
【請求項２０】
高血糖環境に応答してインスリンを産生させる方法であって、請求項１から１９のいずれか一項に記載のヒトトランスジェニックベータ細胞の集団を前記環境と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記高血糖環境が、ヒト免疫細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒト免疫細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
糖尿病の治療に使用する組成物であって、請求項１から１９のいずれか一項に記載のヒトトランスジェニックベータ細胞を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月３日に出願の米国仮出願第６２／５６７，６０４号；２０１７年１０月４日に出願の第６２／５６８，１１７号；２０１８年３月２日に出願の第６２／６３７，９１３号；２０１８年４月２５日に出願の第６２／６６２，６５１号；２０１８年７月６日に出願の第６２／６９４，６３４号；２０１８年７月１１日に出願の第６２／６９６，６０３号；２０１８年８月１０日に出願の第６２／７１７，５８７号；２０１８年８月２０日に出願の第６２／７１９，９７５号；および２０１８年９月２１日に出願の第６２／７３４，９１０号の優先権を主張し；それぞれの全体を参照により本明細書に組み込む。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、ここにその全体を参照により組み込む。２０１８年９月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、054610-501001WO_SL.txtと命名され、サイズは８，６６８バイトである。
技術分野
本発明は、遺伝子修飾されたヒトベータ細胞およびそのような細胞を使用する方法を対象とする。遺伝子修飾された（トランスジェニック）ヒトベータ細胞は、逃避走性量（fugetactic amount）の逃避走性剤（fugetactic agent）を発現し、それによりヒト単核免疫細胞に対する保護をもたらす。一実施形態において、逃避走性剤は、例えば、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３である。一実施形態において、トランスジェニックベータ細胞は、ベクターを含み、ベクターは、逃避走性剤、好ましくはヒト逃避走性剤をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、トランスジェニックベータ細胞は、老化するように更に修飾される。本発明の方法は、糖尿病患者、特に１型糖尿病患者に見られる環境を含めた高血糖環境においてインスリンを発現させるためのこれら細胞の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
ベータ細胞は、膵臓におけるインスリンの産生に関与する。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の対象において、ベータ細胞は、免疫系によって攻撃され、崩壊され、その結果Ｔ１Ｄの対象は、自身のインスリンを効率的に産生することができない。Cloning technique used to create pancreatic cells for type 1 diabetes, Diabetes. Co.Uk, www.diabetes.co.uk/news/2014/apr/cloning-technique-used-to-create-pancreatic-cells-for-type-l-diabetes-94233303.html (Apr. 29, 2014)。
【０００３】
対象の持続的に高い血糖が、対象において高血糖症を防止するのに十分なインスリンを産生する対象のベータ−細胞の能力を圧倒し、ベータ細胞の機能不全、脱分化、および死をもたらす場合に２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は起こる。Felicia W Pagliuca & Douglas A. Melton, How to make a functional β-cell," Development 2013, 140(12), 2472-2483。
【０００４】
正常ドナーから糖尿病レシピエントへの同種（allogenic）ベータ細胞移植、別名膵島細胞移植が、糖尿病を治療する方法として考えられてきた。しかしながら、単核免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）の浸潤が、ベータ細胞移植の不全をもたらす。Cloning technique used to create pancreatic cells for type 1 diabetes, Diabetes. Co.Uk, http://www.diabetes.co.uk/news/2014/apr/cloning-technique-used-to-create-pancreatic-cells-for-type-l-diabetes-94233303.html (Apr. 29, 2014)； Alan H. Cruickshank & Emyr W Benbow, "Recurrence of Diabetes," Pathology of the Pancreas (2d ed. 1995)； Felicia W Pagliuca & Douglas A. Melton, "How to make a functional β-cell," Development 2013, 140(12), 2472-2483。
【０００５】
膵臓から放出されるインスリンの大多数は肝臓において利用され、その部位が最も侵襲の少ない手順により容易に利用可能であるという理由で、現在の臨床診療は、門脈を介して肝臓にベータ細胞を含有する小島を移植することになる。しかしながら、ベータ細胞の半分は移植直後に死滅し、これは肝臓における低い酸素分圧、活性な免疫応答ならびに高レベルの毒素および薬物によると考えられる。加えて、即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）は、フィブリン凝塊中に、移植された小島を封入し、移植片に対する免疫反応を増強させる。したがって、腸、腎臓被膜、大網および皮下を含めたいくつかの代替部位が、移植のために試験されてきた。それらの部位は、患者の安全性には最善であり得るが、インスリンの全身的放出について十分には評価されてこなかった。
【０００６】
単核免疫細胞へのベータ細胞の曝露を防止するために、ベータ細胞は、免疫破壊からベータ細胞を隔離し、移植片から宿主を保護する二重機能に役立つと報告されているデバイス内に封入されてきた。非自家細胞（例えば、同種または異種細胞）が移植に使用される場合、または自家細胞が１型糖尿病患者などの自己免疫環境に移植される場合、免疫保護が必要とされる。これは、半透膜または骨格を使用して細胞を物理的に隔離することによって細胞応答を遮断することにより達成され得る。この手法は、免疫抑制の必要性を減少させ、近年、他の文献で詳細に概説されている（Sakata et al, World J Gastrointest Pathophysiol. 2012;3: 19-26；Qi, Adv Med. 2014;2014:429710）。封入化は、細胞が移植片の場所を逃れることも防止し、必要に応じて、除去を可能にする。制御の効かない分化および成長、例えば奇形腫が、幹細胞由来膵臓前駆体でグラフトしたマウスにおいてしばしば観察されたので、これは特に関連する（Kroon et al, Nat Biotechnol. 2008;26:443-452；Kelly et al, Nat Biotechnol. 2011;29:750-756）。奇形腫形成は、細胞精製を使用する（Kelly et al, 2011）か分化方法を改善するかいずれかによって成熟ベータ細胞の純粋な集団からなる移植片を生成することにより予防でき得る。インスリノーマ／奇形腫が、移植された細胞によって形成される場合、封入化は潜在的な転移も防止する。
【０００７】
この手法は、効果的で再生可能なマイクロ封入化プロトコールを必要とし、一部の細胞は、一掃または除去されることなく封入された材料内で死滅することができる。一部の報告は、マイクロ封入化されたベータ細胞が、インプラント後最長６カ月間生存し続けられ得ることを示した（Orlando et al, Diabetes. 2014;63: 1433-1444）。これは、デバイスが機能しなくなった場合にマイクロ封入化デバイスを置きかえるために繰り返し手術が必要とされることを意味している。
【０００８】
上記のことを考えると、糖尿病、特に１型糖尿病を効果的に治療する技術を開発するという必要性は長く満たされていない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、細胞がヒト免疫細胞に対して抵抗性になるように逃避走性剤の有効量を発現するトランスジェニック、ヒトベータ細胞およびトランスジェニック、老化、ヒトベータ細胞を対象とする。逃避走性剤は、「ＣＸＣＬ１２」を含めて当技術分野において周知である。このサイトカイン、別名ＳＤＦ−１は、胸腺および骨髄ストロマによって産生される（例えば、"Human stromal derived factor lα. and 1β.," Honjo, et alと題される１９９８年５月２６日に発行された米国特許第５，７５６，０８４号を参照のこと）。ＣＸＣＬ１２は、解剖学的部位に免疫抑制性制御性Ｔ細胞を集める一方、エフェクターＴ細胞を忌避することが報告されている。例えば、Poznansky et al, Nature Medicine 2000, 6:543-8を参照のこと。ＣＸＣＬ１２およびその受容体であるＣＸＣＲ４も、血管形成の不可欠な部分であることが報告されている。
【００１０】
それだけには限らないが、ｇｐｌ２０、他のＣＸＣＲ４リガンド、ＩＬ−８、ＣＸＣＲ４結合抗体、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５リガンド、ＣＸＣＲ５結合抗体、等を含めたＣＸＣＬ１２以外の薬剤が免疫細胞を忌避することも開示される。
【００１１】
本発明の実施形態は、細胞がヒト免疫細胞に対して抵抗性になるように逃避走性剤、好ましくはＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３の有効量を発現するトランスジェニックヒトベータ細胞である。一実施形態において、逃避走性剤のそのような逃避走性有効量は、ベータ細胞またはベータ細胞の前駆体（例えば、多能性幹細胞）へ薬剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）のためのヒト導入遺伝子を導入することによって生成される。これらのヒトトランスジェニックベータ細胞は、高血糖環境においてインスリンを発現すると更に特徴付けられる。したがって、これらの細胞は、対象において糖尿病を治療する方法に使用され得る。本明細書に記載される方法に使用されるトランスジェニックヒトベータ細胞は、自家（autologous）でもよくまたは非自家でもよく、例えば、同種の、ベータ細胞である。一実施形態において、患者はＴ１Ｄを患っている。別の実施形態において、がん細胞へのこれら細胞のいかなる更なる分化も排除され、不適当な細胞分裂により発生するアポトーシスの誘導が無効にされるように、トランスジェニックヒトベータ細胞を修飾して老化させる（分裂できない）ことができる。
【００１２】
本発明の実施形態は、糖尿病でないヒト対象もしくは糖尿病を患っているヒト対象から入手または由来するベータ細胞、例えば、自家もしくは同種ベータ細胞を使用する。これらのベータ細胞は、機能的な逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）発現ベクターを含む。そのようなベクターは、ベータ細胞の周りに逃避走性緩衝帯を生成するのに十分なレベルでトランスジェニックベータ細胞において薬剤を発現するように設計される。理論に束縛されるものではないが、この緩衝帯により、ベータ細胞は、免疫細胞の攻撃に抵抗できるようになるが、糖尿病の対象において適当な血糖レベルを維持するために必要とされるようにインスリンをなお発現すると考えられる。糖尿病を患っている患者由来の自家ベータ細胞の生成は、当技術分野において公知である。例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、Egli, et al., EMBO J. 2015 Apr 1; 34(7): 841-855を参照のこと。幹細胞に由来する同種ベータ細胞は、市販されている。
【００１３】
本発明の態様は、それを必要とする対象へ逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックヒトベータ細胞を投与して、インスリンのレベルをモジュレートし、対象の糖尿病を治療することである。加えて、十分な量の逃避走性剤の発現は、単核免疫細胞浸潤によるトランスジェニックベータ細胞の破壊の危険性から保護する。トランスジェニックヒトベータ細胞は、自家でもよくまたは同種でもよい。本発明の一実施形態において、トランスジェニックベータ細胞は、糖尿病を患っている患者に由来する自家ベータ細胞である。別の実施形態において、トランスジェニックベータ細胞は、同種ヒトベータ細胞である。別の実施形態において、患者は１型糖尿病を患っている。
【００１４】
本発明の別の態様は、免疫破壊に対して抵抗性になるように逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の逃避走性有効量を発現する能力があるトランスジェニックヒトベータ細胞に関する。逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）は、内在性薬剤、即ち、治療しようとする対象によって発現される薬剤または外来性薬剤、例えば、非自家供給源由来の薬剤もしくは修飾された逃避走性剤でもよい。一実施形態において、ベータ細胞中で逃避走性剤をコードする遺伝子は、無修飾遺伝子と比較して過剰発現するように修飾される。遺伝子発現を修飾する方法は当技術分野において公知であり、例えば、内在性プロモーターを異なるプロモーター（例えば、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、等）で置きかえる部位特異的遺伝子編集である。一実施形態において、逃避走性剤が組換えポリヌクレオチドから発現されるように、逃避走性剤をコードする組換えポリヌクレオチドがベータ細胞に挿入される。細胞に組換え遺伝子を挿入する方法（形質導入、トランスフェクション、等）は当技術分野において周知であり、細胞に挿入するために組換えポリヌクレオチドでベクターを作製する方法も同様である。
【００１５】
一部の実施形態において、逃避走性剤は、修飾された逃避走性剤である。例えば、逃避走性剤のポリペプチド配列は、循環半減期を増大させる、保存的アミノ酸変化を組み込む、細胞外マトリックスに対する結合を増強させる、薬剤の活性を改善する、等のために修飾されてもよい。したがって、修飾された逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）をコードする遺伝子は、遺伝子が天然の遺伝子に対して少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは天然の遺伝子に対して９９％の配列同一性を有するように修飾され得る。同様に、修飾された逃避走性剤（例えば、修飾されたＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）のアミノ酸配列は、天然の薬剤に対して少なくとも９５％、好ましくは９９％の配列同一性を有する。
【００１６】
一実施形態において、ヒトＣＸＣＬ１２または修飾されたＣＸＣＬ１２をコードする核酸配列をそれ自体に含むベクターを含むヒトベータ細胞が提供され、前記ベータ細胞は、ヒト免疫細胞に対して抵抗性にされる。
【００１７】
一実施形態において、ヒトトランスジェニックベータ細胞は、１型糖尿病の対象から入手した自家ベータ細胞である。
【００１８】
一実施形態において、ヒトベータ細胞は、同種ベータ細胞である。
【００１９】
一実施形態において、ヒト単核免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は細胞障害性Ｔ細胞を含む。
【００２０】
一実施形態において、トランスジェニックヒトベータ細胞は、逃避走性量でヒトＣＸＣＬ１２を発現する。
【００２１】
一実施形態において、ヒトＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータからなる群から選択される。
【００２２】
一実施形態において、ヒトトランスジェニックベータ細胞は、内在性ＣＸＣＬ１２コード領域の上流にトランスジェニック調節領域を含み、前記ベータ細胞は、ヒト免疫細胞に抵抗性である。好ましくは、内在性ＣＸＣＬ１２コード領域の調節領域は、構成的プロモーターを含む。一部の実施形態において、内在性ＣＸＣＬ１２コード領域の調節領域は、誘導可能なプロモーターを含む。
【００２３】
一実施形態において、内在性ＣＸＣＬ１２コード領域の上流にトランスジェニック調節領域を含むヒトトランスジェニックベータ細胞であって、前記ベータ細胞が、ヒト免疫細胞に抵抗性である細胞は、自家ベータ細胞、好ましくは、糖尿病の患者から入手される細胞である。
【００２４】
一実施形態において、内在性ＣＸＣＬ１２コード領域の上流にトランスジェニック調節領域を含むヒトトランスジェニックベータ細胞であって、前記ベータ細胞が、ヒト免疫細胞に抵抗性である細胞は、同種ベータ細胞である。
【００２５】
一実施形態において、発現可能なヒトＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３遺伝子を含むヒトトランスジェニックベータ細胞が提供され、前記細胞は、ヒト免疫細胞に抵抗性になるようにＣＸＣＬ１２またはＣＸＣｌ１３の逃避走性有効量を発現する
【００２６】
一実施形態において、ヒト、トランスジェニックベータは、ＣＸＣＬ１２のためのヒト遺伝子を含む。
【００２７】
一実施形態において、ヒト、トランスジェニックベータ細胞は、ＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータからなる群から選択されるヒト遺伝子を含む。
【００２８】
一実施形態において、ヒト、トランスジェニックベータ細胞は、ＣＸＣＬ１２ベータのヒト遺伝子を含む。
【００２９】
一実施形態において、発現可能なヒトＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３遺伝子を含むヒト、トランスジェニック、老化ベータ細胞が提供され、前記細胞は、ヒト免疫細胞に抵抗性になるようにＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３の逃避走性有効量を発現し、更に前記細胞は老化する。
【００３０】
一実施形態において、ヒト、トランスジェニック、老化ベータ細胞は、ＣＸＣＬ１２のための発現可能なヒト遺伝子を含み、その細胞は高血糖培地の存在下でインスリンを発現する能力がある。
【００３１】
一実施形態において、ヒト、トランスジェニック、老化ベータ細胞は、ＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータからなる群から選択される発現可能なヒト遺伝子を含む。
【００３２】
一実施形態において、ヒト、トランスジェニック、ベータ細胞は、ＣＸＣＬ１２ベータである発現可能なヒト遺伝子を含む。
【００３３】
一実施形態において、高血糖環境に応答してインスリンを産生する方法が提供され、その方法は、上述のヒトトランスジェニックベータ細胞の集団を前記環境と接触させるステップを含む。
【００３４】
一実施形態において、ヒトトランスジェニックベータ細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞からなる群から選択されるヒト免疫細胞およびその混合物に抵抗性である。
【００３５】
一実施形態において、本明細書に記載されるベータ細胞は：
（ａ）ヒト対象由来のヒトプロジェニター細胞またはヒト多能性幹細胞の集団を入手するステップと；
（ｂ）対象のプロジェニター細胞または多能性幹細胞をベータ細胞に分化させるステップと；
（ｃ）ベータ細胞に逃避走性剤をコードする核酸分子を導入するステップとによって入手される。
【００３６】
一実施形態において、逃避走性剤は、サイトカイン、ケモカイン、ＣＸＣＲ４結合性抗体、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ５結合抗体またはＣＸＣＲ５リガンドである。
【００３７】
一実施形態において、逃避走性剤は、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ｇｐｌ２０またはＩＬ−８である。
【００３８】
一態様において、ベータ細胞を修飾して、免疫細胞が前記ベータ細胞を死滅させるのを阻害または遮断するのに十分なレベルで逃避走性剤を発現させることにより免疫細胞を含む生体サンプルにおいてベータ細胞の生存を促進する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＣＸＣＬ１２アルファ、ＣＸＣＬ１２ベータ、ＣＸＣＬ１２ガンマ、ＣＸＣＬ１２シータおよびＣＸＣＬ１２デルタ、ならびにＣＸＣＬ１４のそれぞれをベータ細胞において過剰発現させた場合の相対量を示すウェスタンブロットの写真である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ＰＢＭＣ：ベータ細胞比３０：１でＰＢＭＣと２４および４８時間インキュベートしたＣＸＣＬ１２アルファまたはＣＸＣＬ１２ベータ発現ベータ細胞から放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ、細胞溶解のマーカー）の相対量を示す棒グラフである。
【図３】各サイトカインを発現しているベータ細胞の２つの組においてＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータの発現のレベルを示す図である。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ベータ細胞の老化の誘導有りもしくは無しで（マイトマイシンＣ処理による）ＰＢＭＣ：ベータ細胞比３０：１でＰＢＭＣと２４および４８時間インキュベートしたＣＸＣＬ１２アルファまたはＣＸＣＬ１２ベータ発現ベータ細胞から放出されるＬＤＨの相対量を示す棒グラフである。
【図５】マイトマイシンＣによる処理の有りもしくは無しで、ＣＸＣＬ１２アルファまたはＣＸＣＬ１２ベータを発現しているベータ細胞の高血糖負荷によるインスリン誘導を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、トランスジェニックであり、ヒト逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする導入遺伝子を含み、または遺伝子修飾されて逃避走性量で内在性（ヒト）逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現もしくは過剰発現する自家／同種ヒトベータ細胞を提供する。好ましい実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニックベータ細胞は、老化するように更に修飾される。その方法の別の態様において、ベータ細胞は、トランスジェニックヒトベータ細胞の免疫破壊を阻害し、高血糖環境に応答してインスリンを産生するように修飾または処理されて、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の有効量を発現する。
【００４１】
本発明を更に詳細に開示する前に、以下の用語を、最初に定義することにする。用語が定義されない場合、その用語は当技術分野において理解される一般に認められた科学的な意味を有する。
【００４２】
用語「ＣＸＣＬ１３」とは、その公知のアイソフォーム全てのことを指す。ＣＸＣＬ１３が、特定のがん細胞増殖を媒介することは公知なので、それは好ましくない。例えばhttps ://www.ncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMC3839818/を参照のこと。
【００４３】
用語「逃避走性」または「逃避走性の」とは、遊走能を持つ真核細胞を忌避させる（または化学的に忌避させる）薬剤の能力のことを指す。細胞によって発現されるＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３（または他の逃避走性剤）の逃避走性量は、細胞に向かう免疫細胞遊走を遮断もしくは阻害するまたはいくつかの態様において細胞から免疫細胞を忌避させるのに十分な量である。
【００４４】
用語「ヒト免疫細胞」は、用語「ヒト単核免疫細胞」と互換的に使用され、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む。
【００４５】
用語「免疫細胞抵抗性」または「免疫系に見えない」は、ベータ細胞が、その細胞に向かう免疫細胞遊走を遮断もしくは阻害するまたはいくつかの態様においてベータ細胞から免疫細胞を忌避させるのに十分な量の逃避走性剤を発現することを示す。好ましい実施形態において、そのような遮断または阻害は、ヒト単核免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）へ本発明のベータ細胞を曝露した後の細胞死の程度によって測定される。細胞死は、溶解を受けた細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出によって評価され得る。好ましくは、本発明の免疫細胞抵抗性ベータ細胞は、約３０：１の免疫細胞対本発明のベータ細胞の比で２日間にわたるインキュベーションの間に対照と比較して５０％未満のＬＤＨレベルを証明する細胞によって評価され得る。より好ましくは、免疫抵抗性ベータ細胞は、対照と比較して６０％未満のＬＤＨレベル；更により好ましくは対照と比較して７５％未満のＬＤＨレベル；最も好ましくは対照と比較して９５％未満のＬＤＨレベルを証明する。ＬＤＨレベルを評価する手順は、本明細書の実施例２に説明される。
【００４６】
逃避走性剤は、逃避走性活性を有する薬剤である。逃避走性剤には、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ｇｐｌ２０、ＩＬ−８、ＣＸＣＲ４結合性抗体、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＲ５結合性抗体またはＣＸＣＲ５リガンドがあるがこれに限定されなくてもよい。
【００４７】
用語「エフェクターＴ細胞」とは、サイトカインを放出することによって特定の免疫応答を起こすことができる分化したＴ細胞のことを指す。
【００４８】
用語「制御性Ｔ細胞」とは、抗原に対するＢ細胞または他のＴ細胞の免疫応答を減少させるもしくは抑制するＴ細胞のことを指す。
【００４９】
用語「ＣＸＣＬ１２」または「ＳＤＦ−１ポリペプチド」とは、当技術分野において周知のサイトカインのことを指す（例えば表１を参照のこと）。一実施形態において、用語は、ＣＸＣＬ１２特異的抗体を結合し、走化性または逃避走性活性を有するタンパク質またはその断片のことを指す。走化性または逃避走性活性は、Ｔ細胞遊走の方向（例えば、対象の薬剤に向かうまたはそれから離れる）をアッセイすることによって決定される。例えば、Poznansky et al, Nature Medicine 2000, 6:543-8；N. Papeta et al, "Long-term survival of transplanted allogeneic cells engineered to express a T Cell chemorepellent," Transplantation 2007, 83(2), 174-183を参照のこと。「逃避走性」（fugetaxis）または「逃避走性遊走」（fugetactic migration）は、薬剤供給源から離れる（即ち、より低濃度の薬剤に向かう）遊走性細胞の運動である。用語「ＣＸＣＬ１２」とは、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、エプシロン、ファイおよびシータアイソフォームを含めたその公知のアイソフォーム全てのことを指すものと理解される。好ましいＣＸＣＬ１２アイソフォームは、アルファおよびベータである。ＣＸＣＬ１２が、血管形成を誘導することは、公知である。
【００５０】
用語「１型糖尿病」および「２型糖尿病」とは、血糖症の増大と関係のある２つの主要な病態生理学のことを指す。１型糖尿病は、膵臓インスリン産生ベータ細胞に対する自己免疫攻撃によって特徴付けられ、それに対して２型糖尿病は、弱いベータ細胞機能および末梢インスリン抵抗性の増大に関連する。１型と類似して、ベータ細胞死が、２型糖尿病においても観察される。１型およびしばしば２型糖尿病では、人がインスリンを注射する必要がある。１型糖尿病は、インスリン欠乏をもたらす膵臓中のランゲルハンス島のインスリン産生ベータ細胞の喪失によって一般に特徴付けられる。この型の糖尿病は、免疫介在性または特発性として更に分類され得る。ベータ細胞喪失がＴ細胞媒介性自己免疫攻撃による場合、大多数の１型糖尿病は、免疫介在性の性質のものである。２型糖尿病は、インスリン抵抗性と組み合わせてベータ細胞機能不全によって特徴付けられる。インスリンに対する体組織の不完全な応答性が、インシュリン受容体および下流の細胞シグナル伝達に関係すると考えられている。１型糖尿病と類似して、不十分なベータ細胞質量も、多くの２型糖尿病患者における病原因子である。２型糖尿病の初期段階において、高血糖症は、インスリン分泌を改善するおよび肝臓によるグルコース産生を減少させる様々な措置ならびに治療薬によって回復させ得る。疾患が進行するにつれて、インスリン分泌の機能障害が起こり、特定の患者においてインスリンの治療的置きかえが時には必要になる場合がある。
【００５１】
「対象」または「患者」とは、哺乳動物、好ましくはヒト対象のことを指す。
【００５２】
「それを必要とする対象」または「それを必要とする患者」は、１型または２型糖尿病の対象である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、などは、関連する障害および／もしくは症状を減少させるまたは良くすることを指す。除外されるものではないが、障害または状態の治療が、関連する障害、状態もしくは症状が完全に排除されることを必要としないことはいうまでもない。
【００５４】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法に帰する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、などを意味することができ；同様に「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、米国特許法に帰する意味を有し、その用語には制限がないので、記載される基本または新規の特徴は、記載されているよりも多くの存在によって変更されない限り、記載されているそれよりも多く存在することが可能になるが、先行技術の実施形態は除外される。
【００５５】
用語「約」は、範囲を含めた数字表示、例えば、温度、時間、量、濃度、その他の前に使用される場合、（＋）または（−）１０％、５％、１％変動し得る近似値または任意の部分的範囲もしくはその間の部分的値を示す。他の定義は、本開示の全体を通じて文脈中に記載される。
【００５６】
本発明の態様は、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）がベータ細胞微環境において逃避走性レベルで発現されるように、プロモーターと作動可能に連結されている逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸を含むトランスジェニックベータ細胞、例えば、ヒト自家ベータ細胞または非自家ベータ細胞、例えば、同種ベータ細胞である。プロモーターは、ベータ細胞に対して内在性プロモーターでもよくまたは異種性でもよいが、ベータ細胞中で機能的である。好ましくは、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸は、トランスジェニックベータ細胞で治療される対象に対して内在性である。一実施形態において、同種ベータ細胞は、非ＴＩＤドナーに由来する。
【００５７】
本発明の態様は、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする遺伝子修飾された内在性ヒト遺伝子を含むヒトベータ細胞であり、ベータ細胞微環境において逃避走性剤が逃避走性レベルで内在性遺伝子から発現されるように遺伝子を修飾して、逃避走性剤コード配列と作動可能に連結されている異種プロモーターを含む。プロモーターは、当技術分野において公知のゲノム編集技術を使用して逃避走性剤コード配列と作動可能に連結されてベータ細胞に導入されてもよい。ＣＸＣＬ１２が、アルファ、ベータ、ガンマおよびシータを含めたいくつかのアイソフォームを有することは周知である。好ましい実施形態において、利用されるアイソフォームは、ＣＸＣＬ１２ベータである。本明細書に記載されるトランスジェニックヒトベータ細胞は、高血糖環境に応答してインスリンを産生する。用語「インスリン」は、プロインスリンとインスリン両方を網羅すると意図される。
【００５８】
一般に、本発明は、ベータ細胞への免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の遊走を遮断もしくは阻害するのに十分なまたは免疫細胞を忌避させるのに十分なレベルで逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現するベータ細胞、好ましくはヒトベータ細胞を提供する。用語免疫細胞および単核細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）は、互換的に使用されてもよい。免疫細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）を忌避する逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）ポリペプチドの能力は、ボイデンチャンバーアッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価され得る。例えば、前述のPoznansky et al., Journal of Clinical Investigation, 109, 1101 (2002)を参照のこと。別法として、トランスジェニックヒトベータ細胞の生存率が、ヒトＰＢＭＣとそのような細胞を組み合わせることによって評価される。細胞死の率は、経時的に１つまたは複数の細胞死マーカーを測定することによって査定され得る。一般的に使用されるそのようなマーカーの１つは、細胞壊死の間に放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である。
【００５９】
どんな理論に束縛されるものでもないが、出願者は、本発明の態様において、トランスジェニックベータ細胞によって産生される逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の量は、ベータ細胞微環境において逃避走性効果を得るのに十分であるが、薬剤の全身的レベルを上昇させ、あるプロセスにおける薬剤の有益な効果と別のプロセスにおける有害な帰結の生成の間の均衡を混乱させるのに十分な量では産生されないと考える。加えて、ＣＸＣＬ１２が、その受容体であるＣＸＣＲ４に結合している場合に血管形成を誘導することは公知である。また、どんな理論にも束縛されることはないが、ＣＸＣＬ１２を発現しているインプラントされたトランスジェニックベータ細胞の微環境は、インプラントされた細胞の生存性を増強させる血管形成応答を誘導することになると考えられる。
【００６０】
逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の逃避走性有効量は、免疫細胞がトランスジェニックベータ細胞を死滅させるのを遮断するのに十分な任意の量である。例えば、トランスジェニックベータ細胞微環境における逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の逃避走性有効量は、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１００ｎＭであり得る。一部の実施形態において、トランスジェニックベータ細胞微環境における逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の量は、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬである。例えば、以下の特定の範囲：約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約６００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約７００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約８００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約９００ｎＭ、または約１００ｎＭ〜約１μＭが、本発明に適している。
【００６１】
実施形態において、トランスジェニックベータ細胞微環境における逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の逃避走性有効量は、２０ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの範囲である。実施形態において、逃避走性有効量は、２０ｎｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬの範囲である。実施形態において、ベータ細胞微環境における逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の量は、約１００ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、または約１０００ｎｇ／ｍＬ〜約５０００ｎｇ／ｍＬの範囲である逃避走性十分な量である。理論に束縛されるものではないが、トランスジェニックと非トランスジェニックベータ細胞が一緒に使用される場合、逃避走性効果を生じさせる微環境が、非トランスジェニックベータ細胞の近傍に及ぶように、トランスジェニックベータ細胞は、十分な量の逃避走性剤を発現し得ると考えられる。トランスジェニックベータ細胞微環境における逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の逃避走性有効量は、任意の値または終点を含めて、記載されている範囲内の部分的な範囲でもよい。
【００６２】
免疫学者は、マウスおよびマウスＤＮＡを広く使用してヒト免疫系の働きに対する洞察を得ているが、ヒトとマウスの間には有意な差異が存在する。したがって、ベクターにコードされる逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）は、好ましくはヒト薬剤である。Javier Mestas & Christopher C. W. Hughes, "Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology," Journal of Immunology 2004, 172(5), 2731-2738；O. Cabrera et al, "The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function," PNAS 2006, 103(7), 2334- 2339；M. Votey, "Of mice and men: how the nPOD program is changing the way researchers study type 1 diabetes" diaTribe, Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (Aug. 21, 2015)。
【００６３】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは当技術分野において公知である。例えば、その両方をその全体において参照により本明細書に組み込む、Poznansky et al., Nature Medicine 2000, 6:543-8および米国特許出願公開第２０１７／０２４６２５０号明細書を参照のこと。用語ＣＸＣＬ１２およびＳＤＦ−１は、互換的に使用されてもよい。典型的なＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１アイソフォームは、米国特許出願公開第２０１７／０２４６２５０号明細書の表１に提供されている。典型的なＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１アイソフォームも、表１（下）に提供される：
【００６４】
【表１−１】
2020535834.tif 000003
【００６５】
【表１−２】
2020535834.tif 000004
【００６６】
一実施形態において、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、ＮＰ００１０２９０５８に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ケモカインまたは逃避走性活性を有する。一実施形態において、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ケモカインまたは逃避走性活性を有する。そのような配列同一性は、公知の保存的な第２のアミノ酸による第１のアミノ酸の置きかえに基づく。そのような保存的置きかえは、当技術分野においてよく確立されており、逃避走性特性に対する得られた修飾ＣＸＣＬ１２ポリペプチドの試験は、当技術分野において周知である。例えば上記Poznanskyを参照のこと。
【００６７】
ＣＸＣＬ１３ペプチドは当技術分野において公知である。ＣＸＣＬ１３は、Ｂリンパ球化学誘引物質（ＢＬＣ）またはＢ細胞誘引ケモカイン１（ＢＣＡ−１）としても公知であり、これらの用語は互換的に使用され得る。例えば、ヒトＣＸＣＬ１３は、アクセッション番号Ｑ５３Ｘ９０で見ることができる。一実施形態において、ＣＸＣＬ１３ポリペプチドは、
ＭＫＦＩＳＴＳＬＬＬＭＬＬＶＳＳＬＳＰＶＱＧＶＬＥＶＹＹＴＳＬＲＣＲＣＶＱＥＳＳＶＦＩＰＲＲＦＩＤＲＩＱＩＬＰＲＧＮＧＣＰＲＫＥＩＩＶＷＫＫＮＫＳＩＶＣＶＤＰＱＡＥＷＩＱＲＭＭＥＶＬＲＫＲＳＳＳＴＬＰＶＰＶＦＫＲＫＩＰ（配列番号７）を含むアミノ酸配列を有する。一実施形態において、ＣＸＣＬ１３ポリペプチドは、Ｑ５３Ｘ９０に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ケモカインまたは逃避走性活性を有する。一実施形態において、ＣＸＣＬ１３ポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ケモカインまたは逃避走性活性を有する。
【００６８】
本明細書に記載される方法に使用されるトランスジェニックベータ細胞は、自家でもよくまたは非自家でもよく、例えば、同種の、ベータ細胞である。「自家」細胞は、同じ個体由来の細胞である。「同種」細胞は、遺伝的に類似しているが、同じ種の同一でないドナー由来の細胞である。本発明の方法に有用な同種細胞は、好ましくはヒト対象由来である。本発明の方法に有用な同種細胞は、おそらく親族、例えば、兄弟、いとこ、親もしくは子供、または非親族由来である。同種ドナーを選択する基準は当技術分野において周知である、例えばTatum et al., Diabetes Metab Syndr Obes 2017: 10 73-78を参照のこと。ヒト同種ベータ細胞は市販されており、自家ベータ細胞はEgliら、上記に記載される方法によって産生される。
【００６９】
一実施形態において、本発明の方法に使用されるトランスジェニックヒトベータ細胞は、当技術分野において公知の方法によって患者から入手される多能性プロジェニター細胞または多能性幹細胞からベータ細胞を得ることによって調製され得る自家トランスジェニックベータ細胞である。これらの得られたベータ細胞は、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでもよい（例えば、それでトランスフェクト、感染されている、等）。
【００７０】
別法として、本発明の方法に使用されるトランスジェニックベータ細胞は、それを必要とする対象から小島ベータ細胞を単離することによって調製されてもよい。これらの単離された小島ベータ細胞は、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでもよい（例えば、それでトランスフェクト、感染されている、等）。別法として、ベータ細胞が、逃避走性有効量の逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を構成的に産生するように、細胞を遺伝子修飾して内在性逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）遺伝子を発現させてもよい。
【００７１】
本発明の一実施形態において、ベータ細胞は、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含み（例えば、それでトランスフェクト、感染されている、等）、前記核酸分子は、ベータ細胞における発現に適したプロモーターと作動可能に連結されている。ベクターは、ベータ細胞のゲノムに組み込まれてもよく、またはエピソーム的に存在し、ゲノムに組み込まれなくてもよい。
【００７２】
本発明のトランスジェニックベータ細胞は、対象から成体幹細胞を単離し、適当な条件下で幹細胞を培養して集団を拡大し、ベータ細胞への分化誘導することによって成体幹細胞から調製されてもよい。細胞を修飾して、逃避走性量の逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする発現ベクターを細胞に導入するまたはゲノムを編集して逃避走性量の逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現させることによって逃避走性有効量の逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現させてもよい。ベクターは、ベータ細胞への分化前に幹細胞に導入されてもよく、または幹細胞のゲノムを編集して異種プロモーターを含有させてもよい。別法として、ベクターは、得られたベータ細胞に導入されてもよく、または得られたベータ細胞のゲノムを編集して異種プロモーターを含有させてもよい。
【００７３】
本発明のトランスジェニックベータ細胞は、対象の体細胞、例えば、ベータ細胞、線維芽細胞またはケラチン生成細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するステップと；ｉＰＳ細胞を処理してベータ細胞へと分化を誘導するステップと；逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを分化したベータ細胞へ導入するステップとにより調製されてもよい。
【００７４】
本発明のトランスジェニックベータ細胞は、対象の体細胞から生成した人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を調製するステップと；逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸配列を含む発現ベクターをｉＰＳ細胞へ導入するステップと、導入遺伝子の導入前または後にｉＰＳ細胞を処理して、ベータ細胞へ分化を誘導するステップとにより調製されてもよい。
【００７５】
本発明のトランスジェニックベータ細胞は、プロジェニター細胞またはプロジェニター様細胞、例えば、膵臓β細胞プロジェニターを入手するステップと、細胞に逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸配列を含むベクターを導入するステップと、当技術分野において公知の方法によりベクターを導入する前または後のいずれかに細胞を処理して、ベータ細胞もしくは体内のグルコースレベルに応答するインスリン放出細胞への分化を誘導するステップとにより生成されてもよく、例えば、Millman et al. Nature Communications (10 May 2016) 1-8頁)；Baek et al. Curr Stem Cell Rep (2016) 2:52-61；Russ et al., EMBO. J. 34, 1759-1772 (2015)；およびQadir et al, Cell Reports 22,2408-2420 (Feb 27. 2018)を参照のこと。プロジェニター細胞およびプロジェニター様細胞は、トランスジェニック細胞で治療される対象に対して自家でもよくまたは非自家、例えば同種でもよい。体内のグルコースレベルに応答するインスリン産生細胞（例えば、上記のQadir et alを参照のこと）は、本明細書に記載の通り遺伝子修飾されて、逃避走性レベルの逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現してもよく、本発明の実施形態でもある。そのような遺伝子修飾されたインスリン産生細胞を本発明の方法において同様に使用して、本明細書に記載の通り糖尿病を治療することができる。
【００７６】
対象由来の任意の適切な体細胞が、当技術分野において公知の方法によってｉＰＳ細胞へと再プログラムされてもよく、例えば、Pagliuca and Melton (2013) How to make a functional β-cell, Development (3013) 140(12); 2472-2483；Yu et al. (2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920；Takahashi and Yamanaka, 2006, Cell 126(4):663-676；Wernig et al, 2007, Nature 448:7151；Okita et al, 2007 Nature 448:7151；Maherali et al, 2007 Cell Stem Cell 1 :55-70；Lowry et al, 2008 PNAS 105:2883-2888；Park et al, 2008 Nature 451 : 141-146.；Takahashi et al, 2007 Cell 131, 861-872；米国特許第８，５４６，１４０号明細書；米国特許第７，０３３，８３１号明細書および；米国特許第８，２６８，６２０号明細書を参照のこと。ｉＰＳ細胞は、当技術分野において公知の方法を使用してベータ細胞に分化されてもよい、例えば、米国特許出願公開第２０１７／００８１６４１号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０１６４７８７号明細書、およびMillette and Georgia, "Gene Editing and Human Pluripotent Stem Cells: Tools for advancing Diabetes Disease Modeling and Beta Cell Development", Current Diabetes Reports November 2017, 17: 116；米国特許出願公開第２０１３／０２７３６５１号明細書；Shi, Y., et al. Stem Cells., 25: 656-662 (2005)；またはTateishi, K., et al, J Biol Chem., 283: 31601-31607 (2008)を参照のこと。
【００７７】
好ましくは、逃避走性剤コード配列は、ベータ細胞における発現に適する調節領域と作動可能に連結されている。適切な調節領域は当技術分野において公知であり、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βアクチンプロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーターおよびヒト伸長因子プロモーター（ＥＦｌα）、ＧＡＰＤＨプロモーター、アクチンプロモーターおよびユビキチンプロモーターを含めた哺乳動物プロモーターならびにＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ニワトリ肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、アデノウイルスプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーターまたは単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含めたウイルス性プロモーターなどのプロモーターを例えば含む。他の関連するプロモーター、例えば、ウイルスおよび真核生物プロモーターも、当技術分野において周知である（例えば、Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressにおいて参照のこと）。逃避走性剤コード配列と作動可能に連結される調節領域は、対象の細胞における発現に適する任意の構成的プロモーターでもよい。
【００７８】
自家または非自家、例えば同種であるにせよ、本発明の逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現するトランスジェニック細胞は、ベータ細胞を投与する当技術分野において公知の任意の手段によってそれを必要とする対象に投与されてもよい。本発明のトランスジェニック細胞は、低いレベルのインスリンに関連する症状の少なくとも一部を軽減できるインスリンのレベルを得るのに十分な量で投与され得る。
【００７９】
本発明の別の態様は：（ａ）ベータ細胞もしくはインスリン産生ベータ様細胞を対象から入手または得るステップと；（ｂ）細胞に逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする適切な発現ベクターを導入して、導入された逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現する自家トランスジェニック細胞を形成するステップと；（ｃ）対象に自家トランスジェニック細胞を移植するステップとを含む、それを必要とする対象において糖尿病を治療する方法である。
【００８０】
ゲノムに組み込むベクターおよびゲノムに組み込まないが、エピソームとして存在するベクターを含めて、哺乳動物細胞、例えばベータ細胞に外来性遺伝子を移すのに有用な多くのベクター、ならびに細胞にそのようなベクターを導入する方法は、当技術分野において利用可能であり、公知である。例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴（ＡＡＶ）に基づくベクターおよびＥＢＶに基づくベクターが使用されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２０１１０２８０８４２号明細書、Narayanavari and Izsvak, Cell Gene Therapy Insights 2017;3(2),131-158；Hardee et al, Genes 2107, 8, 65；Tipanee et al, Bioscience Reports (2017) 37およびChira et al. Oncotarget, Vo. 6, No. 31, 30675-30703頁を参照のこと。
【００８１】
本発明の別の態様は、ベータ細胞に逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする発現ベクターを導入するステップを含む、またはベータ細胞が逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の逃避走性量を発現するようにベータ細胞のゲノムを編集するステップによって免疫細胞を含む生体サンプルにおいてベータ細胞の生存を促進する方法である。本発明の一態様において、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）は、ベータ細胞への免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞および／またはＮＫ細胞の遊走を遮断もしくは阻害するのに十分なレベルでベータ細胞によって発現される。本発明の一態様において、逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）は、ベータ細胞から免疫細胞を忌避させるのに十分なレベルでベータ細胞によって発現される。本発明の一態様において、遺伝子修飾されたベータ細胞は、対象、例えば、１型または２型糖尿病のヒト対象内にある。一実施形態において、ベータ細胞は、対象の自家ベータ細胞である。
【００８２】
哺乳動物細胞へウイルス性ベクターおよび非ウイルス性ベクターを送達する方法は当技術分野において周知であり、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリ陽イオンまたは脂質−核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオンおよびＤＮＡの薬剤強化取り込みがある。リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効果的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質は、公知である。核酸は、細胞に（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織に（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）送達され得る。免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含めて、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である。組換え媒介性系を使用して、細胞にベクターを導入することができる。そのような組換え方法には、例えば、Ｃｒｅ、ＦｌｐまたはＰＨＩＣ３１の様な部位特異的リコンビナーゼの使用があり（例えば、Oumard et al, Cytotechnology (2006) 50: 93-108を参照のこと）、その酵素は、導入遺伝子の指向的挿入を媒介できる。
【００８３】
本発明における使用に適するベクターには、転写を指令するためのプロモーターと作動可能に連結されている逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）をコードする核酸を含む発現ベクターがある。適切なプロモーターは当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されている。逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）の発現を指令するために使用されるプロモーターは、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ニワトリ肉腫ウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞における発現に有効であることが示されている他のプロモーターでもよい。
【００８４】
本発明の方法に有用なベクターには、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターがある。
【００８５】
本発明に使用されるベクターは、例えば、効果的な転写産物のポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合および／または翻訳終結のためのシグナルを含めて、真核生物ウイルス、例えば、ＳＶ４０、パピローマウイルスならびにエプスタインバーウイルス由来の調節エレメントを含んでもよい。ベクターの追加の要素には、例えば、エンハンサーおよび異種スプライスイントロンシグナルがあり得る。
【００８６】
本発明の一実施形態において、ベータ細胞のゲノムを遺伝子修飾して、内在性逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）遺伝子の発現レベルを増大させてもよい。ベータ細胞が、逃避走性レベルの逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を発現するように内在性逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）遺伝子と作動可能に連結して異種プロモーターを導入するまたは内在性逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）プロモーターを改変することによってそのような発現の増大が達成されてもよい。そのような発現の増大は、プロモーターが内在性逃避走性剤コード配列と作動可能に連結され、それにより逃避走性量で逃避走性剤を発現または過剰発現するようにベータ細胞のゲノムにプロモーターを導入することによって達成されてもよい。
【００８７】
ゲノムを修飾する遺伝子編集技術は、当技術分野において周知であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、Ｐｉｇｇｙｂａｃ、スリーピングビューティーゲノム編集システム（例えば、Zhang et al. Molecular Therapy Nucleic Acids, Vol 9, December 2017, 230-241頁を参照のこと；システム（例えば、Cong et al, Science. 2013; 339(6121): 819-23；Mali et al, Science. 2013; 339(6121): 823-6；Gonzalez et al, Cell Stem Cell. 2014; 15(2): 215-26；He et al, Nucleic Acids Res. 2016; 44(9)；Hsu et al, Cell. 2014; 157(6): 1262-78を参照のこと）、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼに基づくシステム（例えば、Porteus and Carroll, Nat Biotechnol. 2005; 23(8): 967-73；Urnov et al, Nat Rev Genet. 2010; 11(9): 636-46を参照のこと）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）に基づくシステム（例えば、Cermak et al, Nucleic Acids Res. 2011; 39(12)；Hockemeyer et al., Nat Biotechnol. 2011 ; 29(8): 731-4；Joung and Sander JD, Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14(1): 49-55；Miller et al, Nat Biotechnol. 2011; 29(2): 143-8およびReyon et al, Nat Biotechnol. 2012; 30(5): 460-5を参照のこと）がある。
【００８８】
一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニックベータ細胞は、細胞を生存可能にする薬剤で処理され、患者の血糖を制御する能力があるが、複製することはできない（即ち、誘導性細胞老化）。そのような薬剤の１つは、公知のＤＮＡ架橋薬剤であるマイトマイシンＣである。処理により、これら細胞内のＤＮＡは架橋され、それにより複製に必要な一本鎖ＤＮＡの形成ができなくなる。細胞が、がん細胞に変形する場合に分裂できないように、そのような処理は、細胞、特に幹細胞から生成される細胞が分裂することを防止する。細胞老化を誘導できる他の公知の薬剤には、その参照をその全体において本明細書に組み込む、Petrova, et al, "Small Molecule Compounds that Induce Cellular Senescence" Aging Cell, 15(6):999-1017 (2016)に記載されている薬剤がある。そのような薬剤には、単なる例として、複製関連テロメアの短縮によりテロメア機能不全を引き起こす薬剤、紫外線、ガンマ照射、過酸化水素および低酸素への曝露などの準細胞毒性ストレスがある。これらの細胞が、細胞分裂の危険性なしにインプラントされ得るならば、本発明のベータ細胞が非複製性になる特定の手段は、重要ではない。研究は、ヒト成人膵臓のベータ細胞回転が殆どないことを示し、このことは、細胞が分裂する能力を限定することは、インプラントした細胞によるインスリン産生に対して殆どまたは全く効果がないであろうことを示唆している。例えばPerl et al, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Volume 95, Issue 10, 1 October 2010, E234-E239頁を参照のこと。
【００８９】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象に本発明のベータ細胞を投与するステップを含む、対象においてインスリンのレベルをモジュレートする方法であって、ベータ細胞はインスリンを発現し、逃避走性量で逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を産生する。ベータ細胞は、自家ベータ細胞または非自家ベータ細胞、例えば同種ベータ細胞でもよく、逃避走性剤を発現するベクターを保有してもよく、そのベクターは、ベータ細胞ゲノムに組み込まれてもまたはエピソーム的に存在してもよい。本発明の一実施形態において、トランスジェニックベータ細胞を遺伝子修飾して、逃避走性レベルで内在性逃避走性剤（例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３）を過剰発現させてもよい。
【００９０】
本明細書に記載されるトランスジェニックベータ細胞を個体に導入する方法は、当業者に周知であり、注射、静脈内、門脈内または非経口投与があるが、これに限定されない。単回、複数回、連続的または断続的な投与が、果たされ得る。例えば、Schuetz and Markmann, Curr Transplant Rep. 2016 Sep; 3(3): 254-263を参照のこと。
【００９１】
薬学的に許容される担体には、無菌の注射可能な液剤または分散剤を即時調製するための無菌の水溶液もしくは分散剤および無菌の粉剤がある。細胞を含めた薬学的に活性がある物質に対する培地および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。ベータ細胞を静脈注入するための典型的な医薬組成物は、無菌リンガー溶液２５０ｍＬ、および１００ｍｇの組合せを含有するように作ることができた。非経口的に投与可能な化合物を調製する実際の方法は、当業者に公知または明らかになり、例えば、参照により本明細書に組み込む、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)ならびにその18thおよび19th版により詳細に記載されている。
【００９２】
トランスジェニックおよび遺伝子修飾された本発明のベータ細胞は、対象の膵臓、腹腔、腎臓、肝臓、門脈または脾臓を含むがこれに限定されない当技術分野において周知のいくつかの異なる部位のいずれかに導入され得る。
【００９３】
加えて、患者が腫瘍を発症する可能性をもたらし得るがん細胞へのトランスジェニックベータ細胞の考え得るあらゆる変換を回避するために、トランスジェニックベータ細胞は、マイトマイシンＣなどの公知の薬剤と接触させる、またはイオン化放射線、低酸素、過酸化水素、等からの準毒性ストレスへ曝露することにより老化させ得る。多能性幹細胞に由来する細胞は、不適当な細胞分裂の間にまたは免疫細胞クリアランスによりアポトーシスを一般に受ける。本明細書に記載される老化トランスジェニックベータ細胞は、分裂することができず、それにより細胞分裂の間に発生するアポトーシスの引き金を排除する。加えて、本明細書に記載される老化トランスジェニックベータ細胞は免疫細胞抵抗性であり、それにより免疫細胞クリアランスによるアポトーシス誘導に対する保護を得られる。したがって、本明細書に記載されるトランスジェニックベータ細胞は、非老化トランスジェニックベータ細胞より長い寿命、有意により長い寿命を有することになると考えられる。
【００９４】
トランスジェニック、好ましくは、老化修飾ベータ細胞は、移植片によって対象に移植されてもよい。理想的なベータ細胞移植部位は、対象においてインプラント、長期機能およびグラフトされた細胞の生存を支持し、最大限の患者安全性のために容易に利用可能な部位である。インプラントの部位には、肝臓、腸、皮下および膵臓部位がある。
【００９５】
本明細書に使用される以下の省略形は、以下の意味を有し、省略形が定義されない場合、それらは一般に認められている科学的意味を有する。アミノ酸は、確立されている１文字省略形を使用して、本明細書に記載される。
ＦＬＡＧ＝ＤＹＫＤＤＤＤＫタンパク質タグ（配列番号１０）
ｇ／Ｌ＝リットル当たりのグラム
ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＬＤＨ＝乳酸脱水素酵素
ｉＢＬＯＴ＝半乾燥タンパク質転写装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ｍＬ＝ミリリットル
Ｎ／Ａ＝適用せず
ｎＭ＝ナノモル濃度
ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞
ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水
ＴＭＢ＝３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジン
μＬ＝マイクロリットル
μｇ＝マイクログラム
×ｇ＝×重力
【実施例】
【００９６】
[実施例１]
ＣＸＣＬ１２−ａおよび−ｂアイソフォームの発現レベルを評価するために使用したモデル細胞
ＨＥＫ２９３細胞を、各アイソフォームに対して市販されているプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから利用可能なプラスミド）を使用してＣＸＣＬ１２の異なる２つのアイソフォーム（アルファおよびベータ）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されている）で選択し、各アイソフォームについて安定なプールを作製した。細胞を、適切な培地に３日間馴化させた。ＣＸＣＬ１２アルファおよびＣＸＣＬ１２ベータを発現するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地を、アッセイ希釈緩衝液で１：１に希釈した。２つの別々のプールを、各アイソフォームについて確立し、次いで溶液中の各アイソフォームの濃度を、標準化した濃度曲線を使用して吸収によって入手した。この実験を２回繰り返し、結果は以下の通りである：
ＣＸＣＬ１２アルファ  ＣＸＣＬ１２ベータ
１．  ３１０ｎＭ  １４１０ｎＭ
２．  ２７４ｎＭ  １３３０ｎＭ
【００９７】
上の結果は、トランスジェニックモデル細胞が、ＣＸＣＬ１２アルファを発現するトランスジェニックモデル細胞より有意に高いレベルでＣＸＣＬ１２ベータを発現することを証明する。
【００９８】
[実施例２]
ＣＸＣＬ１２の他のアイソフォームの発現レベルを評価するために使用したモデル細胞
ＨＥＫ２９３細胞を、各アイソフォームに対して市販されているプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから利用可能なプラスミド）を使用してＣＸＣＬ１２の異なる５つのアイソフォーム（アルファおよびベータ）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されている）で選択し、各アイソフォームについて安定なプールを作製した。細胞を、適切な培地に３日間馴化させた。馴化培地を、ＭＥＳ緩衝液を用いて４〜８％  ＮｕＰａｇｅゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されている）で分離し、ニトロセルロース（ｉＢＬＯＴ）に移した。
【００９９】
図１に示すように、発現レベルを、ウェスタンブロット上でＨＲＰ標識、抗ＦＬＡＧタグ抗体／ＴＭＢクロモゲン（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから利用可能）で検出した。結果は、ＣＸＣＬ１２のガンマ、デルタおよびシータアイソフォームが、アルファまたはベータアイソフォームより高い濃度を有することを証明した。
【０１００】
[実施例３]
トランスジェニックベータ細胞の調製
ヒト誘導多能性幹細胞から得られた膵臓ベータ細胞を、ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から購入し、提供された指示に従って培養した。
【０１０１】
細胞を、ヒトＣＸＣＬ１２アイソタイプ（ＣＸＣＬ１２ａ／ＳＤＦ−１アルファまたはＣＸＣＬ１２ｂ／ＳＤＦ−１ベータ）または対照を含有するレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で形質導入した。レンチウイルスベクターを、ベータ細胞当たり約１０：１の比で使用した。タグ（下線を引いた）を含めた配列を、下に提供する。ＣＸＣＬ１２アイソタイプの濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏＴｅｃｈ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）によって決定した（表１）。
【０１０２】
【化１】
2020535834.tif 000005
ＣＸＣＬ１２ａ（別名ＳＤＦ１ａ）
【０１０３】
【化２】
2020535834.tif 000006
ＣＸＣＬ１２ｂ（別名ＳＤＦ１ｂ）
【０１０４】
[実施例４]
トランスジェニックベータ細胞は、ＰＢＭＣを忌避する
実施例３のトランスジェニックベータ細胞を、比３０：１（ＰＢＭＣ対ベータ細胞）でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、ＭＩ）と接触させた。簡潔には、ＰＢＭＣをベータ完全培養培地に再懸濁し、計数し、調整して、（発現されるＣＸＣＬ１２の希釈を最小限にするために）ＰＢＭＣ  １００μＬの添加によりＰＢＭＣ：ベータ細胞比３０：１を可能にした。最終容量は、１．１ｍＬであった。ＰＢＭＣを含まないベータ細胞のバックグラウンド対照およびベータ細胞を含まないＰＢＭＣも作製した。各サンプルから培地１５０μＬを直ちに取り出し、１２００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を取り出し、４℃で貯蔵した（時間０）。細胞をインキュベーターに戻し、２４および４８時間後両方で時間０のサンプルと類似の方法でサンプル採取した。
【０１０５】
ＬＤＨの放出を、製造業者の指示に従ってＰｉｅｒｃｅ  ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して接触２４および４８時間後に試験した。ＬＤＨの増大は、細胞毒性（細胞溶解）の指標である。
【０１０６】
代表的な実験のデータ（バックグラウンドを減算した）を、表１および図２Ａに提供する。第２の代表的な実験のデータを、図２Ｂに提供する。
【０１０７】
【表２】
2020535834.tif 000007
【０１０８】
これらのデータは、ベータ島細胞によるＣＸＣＬ１２の発現が免疫細胞攻撃からベータ島細胞を保護し、それにより細胞が抵抗性になることを示している。本実験においてＳＤＦ１ａ／ＣＸＣＬ１２ａより高レベルで発現されたＳＤＦ１ｂ／ＣＸＣＬ１２ｂを発現するベータ細胞は、ＰＢＭＣの存在下で本質的に細胞毒性を示さない。
【０１０９】
[実施例５]
トランスジェニックベータ細胞の別の調製
ベータ細胞を、１型糖尿病の対象から単離し、ＣＸＣＬ１２をコードするレトロウイルス発現ベクターもしくはＣＸＣＬ１２をコードしない対照レトロウイルスベクターでｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトするまたは感染させる。ＣＸＣＬ１２をコードするレトロウイルスベクターを保有しているトランスジェニックベータ細胞を、Poznansky et al., Journal of Clinical Investigation, 109, 1101 (2002)内の前述のボイデンチャンバーアッセイを使用して逃避走性量のＣＸＣＬ１２の発現についてアッセイする。少なくとも１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２を発現しているトランスジェニックベータ細胞は、本アッセイにおいて免疫細胞を忌避することになると予想される。
【０１１０】
[実施例６]
トランスジェニックサイトカイン発現に対するトランスジェニックベータ細胞の強制的老化の効果
ベータ細胞を、実施例３に記載の通り調製した。ＳＤＦ１ａ／ＣＸＣＬ１２ａおよびＳＤＦ１ｂ／ＣＸＣＬ１２ｂの発現レベルをマイトマイシンＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから利用可能）処理前にＥＬＩＳＡによってアッセイして、ベースライン発現（「前」）を決定した。培地を、老化を誘導することが公知の薬剤であるマイトマイシンＣ  １０μｇ／ｍＬを含有する新鮮な培地と置きかえた。細胞を、インキュベーターに２時間戻した。マイトマイシンＣ含有培地を、穏やかなピペット操作によって除去した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後に、細胞に新鮮な完全培地を与えた。ＳＤＦ１ａ／ＣＸＣＬ１２ａまたはＳＤＦ１ｂ／ＣＸＣＬ１２ｂ発現を、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。
【０１１１】
２回の代表的な実験のデータを、表２および図３Ａに示す。ＳＤＦ１ａ／ＣＸＣＬ１２ａおよびＳＤＦ１ｂ／ＣＸＣＬ１２ｂ発現は、トランスジェニックベータ細胞の強制的老化の影響を受けない。
【０１１２】
【表３】
2020535834.tif 000008
【０１１３】
[実施例７]
ＰＢＭＣ負荷に対するトランスジェニックベータ細胞の強制的老化の効果
ベータ細胞を、実施例３に記載の通り調製した。細胞を、実施例４に記載の通りマイトマイシンＣまたは対照で処理した。細胞を、実施例２に記載の通りＰＢＭＣと接触させた。
【０１１４】
２回の代表的な実験のデータを、図４Ａおよび図４Ｂに示す。ＬＤＨレベルは、トランスジェニックベータ細胞の強制的老化の影響を受けない。
【０１１５】
[実施例８]
インスリン産生に対するトランスジェニックベータ細胞の強制的老化の効果
ベータ細胞を、実施例３に記載の通り調製した。細胞を実施例４に記載の通りマイトマイシンＣまたは対照で処理した。
【０１１６】
完全な成長培地を、培地２  １ｍＬと置きかえ、２４時間毎に培地を置きかえながら培地２上で２日間維持した。３日目に、ベータ細胞を、高血糖培地（４．５ｇ／Ｌグルコース）で負荷をかけた。高血糖負荷２４時間後に馴化培地のサンプルを採取し、インスリン発現をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１１７】
２回の代表的な実験のデータを、表３および図５に示す。結果は、トランスジェニックベータ細胞およびトランスジェニック老化ベータ細胞が、高血糖負荷に応答して対照ベータ細胞と実質的に等しい量のインスリンを産生したことを証明する。
【０１１８】
【表４】
2020535834.tif 000009
【０１１９】
[実施例９]
トランスジェニックベータ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
ヒト化免疫系を有するヒト化マウス、例えば、N. Walsh, "Humanized mouse models of clinical disease," Annu Rev Pathol 2017, 12, 187-215; E. Yoshihara et alを参照、に逃避走性量のＣＸＣＬ１２を発現しているトランスジェニックヒトベータ細胞または対照トランスジェニックヒトベータ細胞のいずれかを投与し、マウスにおけるインスリンの産生およびトランスジェニックベータ細胞の生存を、初回投与後の様々な時点でアッセイする。逃避走性量のＣＸＣＬ１２を発現しているトランスジェニックヒトベータ細胞は、対照トランスジェニックヒトベータ細胞より長期間生存することになると考えられる。逃避走性量のＣＸＣＬ１２を発現しているトランスジェニックベータ細胞を受けたマウスは、対照トランスジェニックヒトベータ細胞を受けたマウスより多量のヒトインスリンを有することにもなり、より高いレベルのヒトインスリンは、対照トランスジェニックヒトベータ細胞を投与したマウスにおけるレベルと比較して、より長い期間持続することになることも考えられる。
【０１２０】
ヒト化免疫系を有するヒト化マウス、例えば、N. Walsh, "Humanized mouse models of clinical disease," Annu Rev Pathol 2017, 12, 187-215; E. Yoshihara et al.を参照、に内在性ＣＸＣＬ１２遺伝子由来ＣＸＣＬ１２を過剰発現する遺伝子修飾されたヒトベータ細胞または対照ヒトベータ細胞のいずれかを投与し、マウスにおけるヒトインスリンの産生およびベータ細胞の生存を、初回投与後の様々な時点でアッセイする。ＣＸＣＬ１２を過剰発現する遺伝子修飾されたヒトベータ細胞は、ＣＸＣＬ１２を過剰発現するように遺伝子修飾されなかった対照ヒトベータ細胞より長期間生存することになると考えられる。ＣＸＣＬ１２を過剰発現している遺伝子修飾されたヒトベータ細胞を受けたマウスは、対照ヒトベータ細胞を受けたマウスより多量のヒトインスリンを有することになり、より高いレベルのヒトインスリンは、対照ヒトベータ細胞を投与したマウスにおけるレベルと比較して、より長い期間持続することになることも考えられる。
【０１２１】
任意選択で、細胞を細胞内のＤＮＡを架橋する薬剤で処理して、細胞分裂を防止する（例えば、マイトマイシンＣ）。
【０１２２】
前述の説明は、単に本発明を例示するために説明され、限定することを意図しない。本発明の精神および実体を組み込んだ記載されている実施形態の修飾は、当業者に発想され得るので、本発明は、特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の全ての変形を含むように広く解釈されるべきである。
【図１】
2020535834.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020535834.tif 000015
2020535834.tif 000016
2020535834.tif 000017