(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ分子を脱ハイブリダイズさせるための、または相補的ｓｓＤＮＡのハイブリダイゼーションを防ぐための、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用に関し、ＳＳＢが、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含み、また、ＤＮＡ分子またはｓｓＤＮＡは、以下のうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝される；（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ分子を脱ハイブリダイズさせるための、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用であって、前記ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含み、前記ＤＮＡ分子が、
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオンのうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝される、使用。
【請求項２】
相補的なｓｓＤＮＡのハイブリダイゼーションを防ぐための、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用であって、前記ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含み、前記ｓｓＤＮＡは、
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオンのうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝される、使用。
【請求項３】
前記溶液が、少なくとも５００ｍＭ、好ましくは少なくとも７５０ｍＭのナトリウムイオンを含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記溶液が、少なくとも１００ｍＭ、好ましくは少なくとも３００ｍＭ、好ましくは少なくとも６００ｍＭのカリウムイオンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記溶液が、少なくとも２００ｍＭ、好ましくは２５０ｍＭのマグネシウムイオンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記溶液が、少なくとも２５０ｍＭ、好ましくは３００ｍＭのカルシウムイオンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＳＳＢが、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ＳＳＢが、配列番号１の１７位および／または７１位に置換を組み込んでいる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記置換アミノ酸が、その側鎖にｐＨ７．０で正電荷を担持しており、好ましくは、前記置換アミノ酸がリジンおよびアルギニンから選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記使用が、
ｉ）核酸増幅、精製またはシーケンシング、好ましくはナノポアシーケンシング；
ｉｉ）部位特異的突然変異誘発；
ｉｉｉ）試料中の核酸構造の顕微鏡検査；
ｉｖ）制限酵素消化；
ｖ）逆転写；
ｖｉ）Ｔ４ポリメラーゼの活性の増強；または
ｖｉｉ）ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレアーゼ消化からの保護の方法の間に行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈し、かつ配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含み、かつ１７位および／または７１位の前記アミノ酸が置換されている、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＳＳＢ。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のＳＳＢをコードする、核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞またはウイルス。
【請求項１６】
５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈するＳＳＢをコードする、配列番号４の核酸配列またはその断片を含む、核酸分子。
【請求項１７】
５００ｍＭのナトリウムイオンおよび緩衝液および任意により安定化剤の存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する単離されたＳＳＢを含む組成物であって、前記ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含む、組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離されたＳＳＢ、または請求項１１もしくは１２に記載の単離されたＳＳＢ、または請求項１７に記載の組成物を、任意によりポリメラーゼ、洗浄緩衝液または他の緩衝液、ヌクレオチド、核酸プライマー、リガーゼ、トポイソメラーゼまたはジャイレースのうちの１つ以上と共に含む、キット。
【請求項１９】
シーケンシング装置での使用に好適であるカートリッジ内に収容されている、請求項１７に記載のＳＳＢ、または請求項１１もしくは１２に記載のＳＳＢ、または請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）（一本鎖型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）としても公知である）ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、特に、高塩濃度で機能し得るＳＳＢのクラスに関する。
【０００２】
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡを結合して、核タンパク質複合体を形成できるが、二本鎖ＤＮＡに対する親和性は低い。そのような複合体に存在する核酸はひいては、ポリメラーゼまたは他のＤＮＡまたはＲＮＡ修飾酵素の基質として機能し得る。最もよく特徴が明らかになっているＳＳＢは、大腸菌由来のものであり、ホモ四量体としてｓｓＤＮＡに結合する１７８のアミノ酸のタンパク質である。
【０００３】
ＳＳＢは、インビボにおいてＤＮＡ複製および組換えに関与し、解裂されたＤＮＡ二本鎖の分離を効率よく維持し（再アニーリングを防止する）、２本の鎖を一本鎖の形態に保つ。ＳＳＢは、ＤＮＡまたはＲＮＡを一本鎖の形態で保存する必要があるすべての用途において使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ＳＳＢを追加して、これにより変性ＤＮＡを安定化でき、二本鎖の形成を防ぎ、かつヌクレアーゼによる消化からｓｓＤＮＡを保護することによって最適化することができる。また、ＳＳＢは、逆転写ＰＣＲおよび核酸の等温増幅にも使用される。他の用途としては、部位特異的突然変異誘発におけるＲｅｃＡと組み合わせて使用することが挙げられる。ＳＳＢは、ＤＮＡシーケンシング反応およびパイロシーケンシング技術の文脈で使用される特定のＤＮＡポリメラーゼを刺激し、シグナル強度を増加させ、非特異的シグナルを減少させ、かつ重合効率を向上させる。
【０００４】
分子生物学におけるＳＳＢの有用性は明らかであるが、ＳＳＢの熟達度は、反応混合物に存在する塩の種類および濃度に大きく依存する（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ［２００８年］第３６巻、第１号、２９４−９頁）。特に、高塩濃度で、安定した核タンパク質複合体を形成できる市販のＳＳＢは存在しない。塩安定核タンパク質複合体は、例えば「次世代」のＤＮＡシーケンシング、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａのワークフローメソッドにおいて、非常に望ましい、高塩緩衝液での洗浄に耐性があり得る。広い範囲の塩条件、特に高塩濃度で、安定な核タンパク質複合体を形成し得るＳＳＢ、および高濃度の塩の存在下で実施し得る核酸増幅およびシーケンシングの方法が必要とされている。
【０００５】
本発明者らは、好適に適合するＳＳＢ分子を用いるこうした方法を開発した。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、反応混合物または試料溶液が、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む、核酸増幅またはシーケンシングの方法を提供する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、反応混合物が５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む部位特異的突然変異誘発の方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、顕微鏡を用いて試料中の（例えば細胞内の）核酸構造を調べる方法を提供し、この方法では、核酸試料は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させる。こうした方法では、ＳＳＢにより、ｓｓＤＮＡの領域を安定化させる、かつ／またはマーキングする。
【０００９】
こうした方法では、例えば、電子顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用することができる。蛍光顕微鏡法で使用されるＳＳＢは、例えば蛍光標識を組み込んでいる蛍光誘導体であり得る。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、反応混合物が５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む制限酵素消化方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、反応混合物が、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む、逆転写方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲの方法における第１のステップとして）を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、Ｔ４ポリメラーゼの活性を増強する方法を提供し、この方法は、Ｔ４ポリメラーゼを、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させることを含む。別の観点では、本発明は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用を提供して、Ｔ４ポリメラーゼの活性を増強する。
【００１３】
上記方法におけるＳＳＢ結合のための標的核酸は、好ましくはｓｓＤＮＡであるが、ＲＮＡでもよい。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、ヌクレアーゼ消化からｓｓＤＮＡまたはＲＮＡを保護する方法を提供する。この方法において、反応混合物が、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む。こうした保護は、試料／生成物の「クリーンアップ」または精製方法において有用であり得る。別の観点では、本発明は、ヌクレアーゼ消化からｓｓＤＮＡを保護するために、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用を提供する。別の観点では、本発明は、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡをヌクレアーゼ消化から保護する方法を提供し、この方法は、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡを、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させることを含む。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、核酸の精製方法、すなわち、試料から１つ以上の核酸分子を単離する方法を提供する。この方法では、試料は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させる。好ましくは、核酸分子は、好ましくは０．５Ｍｂｐ以上、より好ましくは１Ｍｂｐ以上のサイズのＤＮＡ分子である。こうした大きいＤＮＡ断片は、そのサイズが原因で、単離の間に機械的破損を起こしやすい。しかしながら、本発明のＳＳＢを使用することで、ＤＮＡ構造が安定化し、無傷の分子の単離が可能になる。
【００１６】
いずれの場合においても、上記の方法または使用は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈するＳＳＢを使用する。そのような特性は、ＳＳＢが高塩濃度に耐性があり、かつ高塩濃度において活性であることを意味する。すなわち、好塩性と見なすことができる。
【００１７】
上記のような核酸のシーケンシング、増幅、突然変異誘発、検査、消化および逆転写の方法は、当技術分野において周知であり、標準的な条件および試薬が使用され得る。
【００１８】
上記で定義された本発明の方法の多くは、ＤＮＡポリメラーゼを用いたヌクレオチド重合を伴う。典型的には、本方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸分子、ＳＳＢ（５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する）、鋳型核酸分子の一部分とヌクレオチドの１つ以上の種にアニールできるオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸、ｄＮＴＰ）を含む反応混合物を提供することと、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型核酸分子にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼが１つ以上のヌクレオチドを重合することによりオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる条件下で、反応混合物をインキュベートすることとを含む。好適な条件は、当技術分野で周知である。任意により、ポリヌクレオチド生成物の生成が検出される（例えば、ゲル電気泳動により）。
【００１９】
５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、本明細書においては、本発明のＳＳＢと称され得る。それは標準的な市販のＳＳＢ、例えば大腸菌ＳＳＢが使用され得る従来の方法において使用され得るが、有利には、高い塩濃度を使用する方法において使用される。
【００２０】
上記の方法および使用（例えば、増幅、シーケンシングおよび部位特異的突然変異誘発）は、典型的には、以下のうちの１つ以上を含む反応混合物、試料溶液または洗浄緩衝液を使用する：
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオン。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、ＤＮＡ分子を脱ハイブリダイズするための、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用を提供し、ＤＮＡ分子は、以下のうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝される：
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオン。
【００２２】
本発明のＳＳＢは、部分的にハイブリダイズしたｓｓＤＮＡ分子を脱ハイブリダイズすることができ、例えば、ＳＳＢの非存在下では、ｓｓＤＮＡ分子は、少なくとも２、４または６対のヌクレオチド（すなわち、１、２または３またはより多くの水素結合対）の１つ以上の二重鎖領域を有し得る。本発明のＳＳＢの存在下では、ＤＮＡ分子は二重鎖領域を有し得ない、すなわち本質的に二次構造を有し得ない。
【００２３】
「部分的にハイブリダイズした」ｓｓＤＮＡ分子は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、または４０％ハイブリダイズし得る。すなわち、そのヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、２０％などが二重鎖の一部である。典型的には、ヌクレオチドの６０％以下、例えば、ヌクレオチドの５０％または４０％以下が二重鎖の一部である。この文脈では、「二重鎖」および「ハイブリダイゼーション」は、水素結合を介して二重鎖領域を形成する一本鎖内の内部領域を指す。
【００２４】
標的ｓｓＤＮＡ分子は、典型的には２０〜５０００ヌクレオチド長、典型的には２０〜３０００、例えば３０〜１５００ヌクレオチド長であり得る。
【００２５】
他の実施形態では、脱ハイブリダイズされるＤＮＡは、ｄｓＤＮＡ分子である。こうした実施形態では、ＤＮＡ二本鎖の一部またはＤＮＡ二本鎖のすべてが脱ハイブリダイズされ得る。例えば、ＰＣＲでは、ＳＳＢは、新しく分離した鎖に結合し、二重鎖のかなり小さい部分の脱ハイブリダイズに関与し、これにより、新しい相補的ヌクレオチドの取り込みが可能になる。
【００２６】
シーケンシング法、例えばナノポアシーケンシング法において、ｄｓＤＮＡ標的分子は、非常に大きく、例えば最大２００キロベース（ｋｂ）、または最大３００ｋｂさえあり得る。典型的には、最大５０ｋｂまたは１００ｋｂ、例えば５０塩基から３００ｋｂ、より通常は１００塩基から２００ｋｂである。（例えば、ナノポア）シーケンシングのための基質は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドであり得る。
【００２７】
異なる塩濃度で、ｓｓＤＮＡを結合する能力を分析するための好適な方法は、本明細書の実施例および図に示されている。こうした方法は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、所与のＳＳＢ分子が、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈するかどうかを立証するために使用され得る。好適な方法では、蛍光色素および消光剤部分を含むｓｓＤＮＡで作られた分子ビーコンを使用する。蛍光は、ＳＳＢ結合の範囲、これが分子ビーコンの領域内のハイブリダイゼーションに与える影響、したがって色素および消光剤の相互の近接性に依存する。
【００２８】
代替的に、または追加的に、本発明のＳＳＢ（ならびに本発明の方法および使用に使用される）は、２５０ｍＭのカリウムイオンの存在下、および／または１５０ｍＭのマグネシウムイオンの存在下、および／または２００ｍＭのカルシウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、または６０％を呈する。
【００２９】
好ましくは、本発明のＳＳＢは、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％を呈する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、相補的ｓｓＤＮＡのハイブリダイゼーションを防ぐための、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用を提供し、ｓｓＤＮＡは、以下のうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝される：
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオン。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、以下のうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝されるＤＮＡ分子を接触させることを含む、ＤＮＡ分子を脱ハイブリダイズする方法を提供する：
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオン。
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈し、ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含む。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、以下のうちの１つ以上を含む溶液中に存在するかまたはその溶液に曝されるｓｓＤＮＡを接触させることを含む、相補的ｓｓＤＮＡのハイブリダイゼーションを防ぐ方法を提供する：
（ｉ）少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、
（ｉｉ）少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、
（ｉｉｉ）少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオン、または
（ｉｖ）少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオン。
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈し、ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含む。
【００３３】
「相補的ｓｓＤＮＡ」は、ｓｓＤＮＡの一本鎖内の相補性の内部領域、ならびに相補性領域（複数可）を有する２つの別々のｓｓＤＮＡ分子を含む。相補性領域（複数可）は、２つのｓｓＤＮＡ分子が天然で標準的なｄｓＤＮＡ二本鎖を形成するように、分子の長さの全体または実質的にすべてに沿って延在し得る。ハイブリダイゼーションの防止は、部分的または完全であり得、部分的ハイブリダイゼーションは、例えば、元の二本鎖の解裂および新しい相補鎖の生成が進行するにつれて、二本鎖の小さい領域のハイブリダイズの防止のみが必要な増幅反応において起こる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭまたは少なくとも１０００ｍＭのナトリウムイオンを含有する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも６００ｍＭ、または少なくとも１０００ｍＭのカリウムイオンを含有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、少なくとも２００ｍＭまたは少なくとも２５０ｍＭのマグネシウムイオンを含有する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、少なくとも１５０ｍＭ、２００ｍＭまたは３００ｍＭのカルシウムイオンを含有する。
【００３８】
上記の濃度は、本文脈ではすべて高塩濃度と見なされる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、有機塩、例えば酢酸塩またはグルタミン酸塩、ならびに１つ以上の無機塩を含有する。いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、上記のレベルでナトリウムイオンおよびカリウムイオンを含み、好ましくは、上記のレベルでマグネシウムイオンおよびまたはカルシウムイオンも含む。洗浄緩衝液は、例えば、タンパク質精製プロトコルにおいてタンパク質複合体を破壊するために、またはＤＮＡ試料からＤＮＡ結合タンパク質を除去するために、高濃度の１つより多い塩を有利にも含み得る。いくつかの実施形態では、上記で定義された方法および使用で用いられる反応混合物、溶液または洗浄緩衝液は、カオトロピック塩を含む。
【００４０】
本発明者らは、細菌Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｅｒ由来のＳＳＢを同定し、かつ特徴を明らかにし（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［２００２年］５２、４８５−４９１）、このタンパク質およびその誘導体、断片、多様体および相同体は、本発明に従って特に好ましい。
【００４１】
野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢ配列は以下のとおりである：
ＭＡＲＧＶＮＫＶＩＬＩＧＮＬＧＤＤＰＥＬＲＹＴＧＳＧＴＡＶＣＮＭＳＬＡＴＮＥＴＹＴＤＳＤＧＮＥＶＱＮＴＥＷＨＤＶＶＡＷＧＲＬＧＥＩＣＮＥＹＬＤＫＧＳＱＶＹＦＥＧＫＬＱＴＲＳＷＥＤＲＤＮＮＴＲＹＳＴＥＶＫＡＱＥＭＭＦＬＤＳＮＲＱＧＧＡＤＭＤＧＦＤＱＴＲＧＤＥＳＬＤＱＴＲＱＥＱＰＡＧＳＳＧＰＱＰＧＱＱＡＳＳＧＧＥＤＥＤＴＦＥＰＤＤＤＬＰＦ（配列番号１）。
【００４２】
したがって、本発明による好ましいＳＳＢ分子（すなわち、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する）は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含むか、またはこれらからなる。
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明のＳＳＢは、配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％、例えば少なくとも９８％、または９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列またはその断片を含むかまたはそれからなる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＳＳＢは、配列番号１と比較して、単一または複数のアミノ酸改変（付加、置換、挿入または欠失）を有するアミノ酸配列を含む。こうした配列は、好ましくは、最大２０個、例えば最大１０個または５個、好ましくは１、２または３個、より好ましくは１個または２個の改変アミノ酸を含み得る。置換は、保存的または非保存的アミノ酸によるものであり得る。好ましくは、この改変は、保存的アミノ酸置換である。
【００４５】
好ましくは、ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。
【００４６】
好ましい実施形態では、ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能的断片からなる。最も好ましい実施形態では、ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００４７】
ＳＳＢの機能的断片は、用語「一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質」および「ＳＳＢ」および「本発明のＳＳＢ」によって提供され、包含される。機能的断片とは、本明細書で定義されている高塩濃度で、ｓｓＤＮＡに結合できる断片である。したがって、それらは５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する。活性断片は、典型的には、八量体形成を担う７５のアミノ酸Ｃ末端領域の機能部分（例えば、全部または実質的に全部）を含み、より好ましくは、活性断片は、１００のアミノ酸Ｃ末端領域の機能部分（例えば、全部または実質的に全部）を含み、より好ましくは、１１１のアミノ酸Ｃ末端領域を含む。本明細書のいずれかの場所で使用されているように、アミノ酸またはヌクレオチド配列の領域に関して「実質的に」という用語は、関係する領域の長さの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％を意味する。「実質的に含まない」という用語は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％含んでいないことを意味する。
【００４８】
機能的断片は、長さが少なくとも１４０アミノ酸であり得る。好ましい断片は、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０または少なくとも１７５アミノ酸長である。断片は、配列番号１の対応する部分と、少なくとも７５％もしくは８０％、好ましくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば、少なくとも９８％もしくは９９％もしくは９９．５％）、または１００％同一である。
【００４９】
したがって、本発明による機能的断片は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する。
【００５０】
本発明によるすべてのＳＳＢ（機能的断片を含む）は、ｓｓＤＮＡに対して高い親和性を有し、特に、１０ｘ１０-8Ｍ以下、好ましくは５ｘ１０-8Ｍ以下、いくつかの非常に好ましい実施形態では、３ｘ１０-8Ｍ未満の１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中の１５０ヌクレオチドのｓｓＤＮＡ分子への結合のモル濃度（Ｍ）として測定される解離定数（ＫＤ）を有し得る。実施例では、表面プラズモン共鳴を使用してＫＤを決定する好適な方法について記述している。これらの値は、低塩濃度での性能を表しており、本明細書の他の場所で論じられているように、本発明のＳＳＢの独特の利点は、高塩濃度で実現される。
【００５１】
本発明者らは、中程度から高濃度など、広い範囲の塩濃度で、Ｓ．ｒｕｂｅｒのＳＳＢがｓｓＤＮＡ（二本鎖領域（複数可）を有する分子の一部であり得るか、または一部でなくてもよい）に結合する能力を保持していることを見出した。結果として、本ＳＳＢは、高塩濃度でｓｓＤＮＡのハイブリダイゼーションを防止し、ＤＮＡ（完全にまたは部分的にハイブリダイズされ得、二次構造の領域を有するｓｓＤＮＡ分子であり得るか、またはｄｓＤＮＡ分子、例えば天然に存在する二重鎖であり得る）を脱ハイブリダイズする能力を維持している。安定した二重らせんを形成する２つの相補鎖を分離する（例えば、標準的なｄｓＤＮＡ複製中に起こる）には、脱ハイブリッド化を達成するため、ヘリカーゼならびにＳＳＢを必要とする。その一方で、ＳＳＢ単独では、二次構造を含まないいくつかの二重鎖領域を有するｓｓＤＮＡ分子を付与できる。
【００５２】
配列番号１のＳＳＢの代替として、Ｓａｌｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｉｒａｎｉｃｕｓまたはＳ．ｌｕｔｕｅｕｓ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ［２０１２年］６２、１５２１−１５２７）由来のＳＳＢ、またはその誘導体、断片もしくは多様体が使用され得る。これらの分子の誘導体および多様体としては、Ｓ．ｒｕｂｅｒに関して本明細書で論じたものと同じ野生型配列との配列同一性関係（％同一性）を有するものが挙げられる。
【００５３】
溶液中の一本鎖ＤＮＡ二次構造の形成は、主にワトソン−クリック塩基対形成および塩基スタッキングによるものである。こうした構造の安定性およびｓｓＤＮＡの全体的な剛性の両方が、高塩濃度溶液中で著しく増大する。塩イオンは、リン酸骨格に結合し、主に静電力によって駆動されるｓｓＤＮＡ−リガンド相互作用を妨げる。したがって、高塩分環境では、ｓｓＤＮＡの生物物理学的特性が変化することにより、細胞維持系の機能不全を引き起こし得る。大腸菌ＳＳＢについては、高塩濃度により、ＳＳＢ機能が妨げられるか、またはｓｓＤＮＡ−ＳＳＢ核タンパク質複合体が既に形成されている場合には、ｓｓＤＮＡ−タンパク質複合体の過剰縮合が引き起こされることが示されている。塩濃度が２０ｍＭ以下のＮａＣｌでは、大腸菌ＳＳＢは高協同様態でｓｓＤＮＡに結合し、細長いフィラメント状の核タンパク質複合体を形成し、塩濃度が２０〜２００ｍＭのＮａＣｌでは、大腸菌ＳＳＢ四量体は、四量体が限られた協同性で結合する「ビーズオンストリング」構造を作製し、これらの塩濃度であり、またｓｓＤＮＡの存在下であっても、大腸菌ＳＳＢではオリゴマー／ポリマーの四次構造は観察されないことがわかっている。
【００５４】
実施例に示されるように、本発明のＳＳＢは、高塩条件下において、ｓｓＤＮＡの非存在下では八量体四次構造を形成し（図３）、ｓｓＤＮＡに結合するときに、高塩条件下で高分子四次構造を形成する（図２Ａ、図４）。
【００５５】
本明細書に記載の塩条件下で、本発明のＳＳＢは、好ましくは、ｓｓＤＮＡの非存在下で、主に少なくとも八量体四次構造を有する。好ましくは、本発明のＳＳＢは、最大で２ＭのＮａＣｌ濃度で、ｓｓＤＮＡの非存在下では、主に八量体四次構造を有する。本明細書に記載の塩条件下で、本発明のＳＳＢは、好ましくは、ｓｓＤＮＡの存在下で、主に高分子四次構造を有する。本明細書で使用する場合、「主に」とは、試料中のＳＳＢタンパク質の５０％超が、指示されたオリゴマー／ポリマー状態を有することを意味する。
【００５６】
「高分子四次構造」は、当技術分野において周知の用語であり、単量体として発現したタンパク質が同じタンパク質の複数のコピーと会合して、ポリマーを形成することを示すために使用される。
【００５７】
タンパク質の四次構造、すなわちオリゴマー状態を決定するための方法は、当技術分野で周知であり、そのような任意の方法を使用して、ＳＳＢの四次構造、すなわちオリゴマー状態を決定することができる。例えば、実施例に示されるように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、タンパク質の平均オリゴマー質量を決定し、それによりそのタンパク質の四次構造を示すことができる。フェリチン（４４０ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、コンカルブミン（７５ｋＤａ）およびオボアルブミン（４３ｋＤａ）などの既知の分子量を有する標準タンパク質を使用したキャリブレーションが、当技術分野で周知である。
【００５８】
ＳＳＢ単量体のサイズの１０倍を超える平均オリゴマー質量は、主に高分子四次構造を指し示している。ＳＳＢ単量体のサイズの６倍を超える平均オリゴマー質量は、主に八量体四次構造を指し示している。
【００５９】
好ましくは、本発明のＳＳＢは、標準的なタンパク質フェリチン（４４０ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、コンカルブミン（７５ｋＤａ）およびオボアルブミン（４３ｋＤａ）を参照して、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む緩衝液（ｐＨ７．５、指定のＮａＣｌ濃度）中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定した場合、０．１５Ｍ  ＮａＣｌにおいて、ＳＳＢ単量体のサイズの少なくとも１０倍、および／またはＳＳＢ単量体のサイズの少なくとも６倍、より好ましくは２Ｍ  ＮａＣｌにおいて、ＳＳＢ単量体のサイズの少なくとも７倍の平均オリゴマー質量を示す。
【００６０】
本発明者らは、驚くべきことに、野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢの突然変異が、一本鎖核酸に対するその結合親和性を有意に上昇させることを発見した。したがって、本発明による好ましいＳＳＢ分子は、１７位または７１位、あるいは最も好ましくはその両方に置換を組み込む。７１位での置換が特に好ましい。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈し、かつ配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的断片を含み、かつ１７位または７１位のアミノ酸が置換されている、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を提供する。
【００６２】
野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢでは、１７位および７１位は、アスパラギン酸が占有している。置換アミノ酸は、好ましくは負電荷を有さず、好ましくは、ｐＨ７．０で（その側鎖に）正電荷を担持している。適切な置換アミノ酸としては、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ、リジンおよびアルギニンが好ましく、リジンが特に好ましい。
【００６３】
１７位および７１位は、配列番号１の全長野生型配列を参照して定義されることが理解されよう。本発明のいくつかのＳＳＢ分子では、「１７位および７１位」は、アミノ酸の付加または欠失、または異なる開始配列を選択することにより、標準的な配列アラインメントが行われる場合の同等の位置として理解される。すなわち、置換された残基は、その分子の１７番目または７１番目の残基でないことがあり得る。
【００６４】
これらのＳＳＢ（１７位および／または７１位またはその均等物で置換されている）は、本明細書では突然変異ＳＳＢと称され、上記で定義された本発明の方法おける使用および使用に好ましいＳＳＢである。上述の本発明のＳＳＢの好ましい特徴は、これらの突然変異ＳＳＢによっても呈される。例えば、突然変異ＳＳＢは、２５０ｍＭのカリウムイオンおよび／または１５０ｍＭのマグネシウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも４０％を呈することが好ましい。好ましくは、突然変異ＳＳＢは、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％を呈する。好ましくは、突然変異ＳＳＢは、カオトロピック塩、特に本明細書で定義される高濃度のカチオンを組み込んだカオトロピック塩の存在下で、それらの最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％を呈する。
【００６５】
好ましい実施形態では、突然変異ＳＳＢは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％、例えば少なくとも９８％または９９％同一であるが、１７位および／もしくは７１位に置換、または置換（複数可）を組み込んでいるその機能的断片を有する、アミノ酸配列を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、１７位または７１位での突然変異と同様に、突然変異ＳＳＢは、配列番号１と比較して、単一または複数のアミノ酸変化（追加、置換、挿入または削除）を有する。こうした配列は、好ましくは、最大２０個、例えば最大１０個または５個、好ましくは１個、２個または３個、より好ましくは１個または２個の改変アミノ酸を含み得る。置換は、保存的または非保存的アミノ酸であり得る。好ましくは、この改変は、保存的アミノ酸置換である。
【００６７】
好ましくは、１７位および７１位のアミノ酸は、配列番号１と比較して置換されている。
【００６８】
特に好ましい実施形態では、本発明の突然変異ＳＳＢは、配列番号１のアミノ酸を含むか、またはそれからなるが、以下に示すように、１７位または７１位、好ましくは両方におけるアミノ酸は、リジンである。
【化１】
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【００６９】
本発明の突然変異型ＳＳＢ（その断片を含む）をコードする核酸分子、またはそれらと実質的に相同である核酸分子は、本発明のさらなる態様を形成する。好ましい核酸分子は、配列番号１のＳＳＢをコードする核酸であるが、１７位または７１位のアミノ酸は、リジン、アルギニン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンから選択されるアミノ酸で置換されている。特に好ましい核酸は、配列番号２のＳＳＢをコードするもの、例えば配列番号５に示される核酸分子である。配列番号５の縮重型は、配列番号２をコードする。
【００７０】
本発明の核酸分子およびタンパク質は、好ましくは「単離されている」または「精製されている」。
【００７１】
配列同一性は、任意の簡便な方法によって評価することができる。ただし、配列間の相同同一性の程度を決定するには、複数の配列アライメントを行うコンピュータープログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｇｉｂｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：４６７３−４６８０、１９９４年）が有用である。所望の場合、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ  ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９、１９９２年）およびギャップオープニングペナルティ１０およびギャップエクステンションペナルティ０．１と共に使用でき、これにより、配列のうちの１つの全長の少なくとも５０％がアライメントに関与している２つの配列間で、最高次の一致が得られる。配列を整列させるために使用され得る他の方法は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの整列方法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３、１９７０年）、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎによる改訂（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２、１９８１年）であり、これにより、２つの配列間で最高次の一致が得られ、２つの配列間で同一アミノ酸の数が決定される。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を計算する他の方法は、一般的に技術的に認識され、例えば、ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎに記載されているもの、（Ｃａｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３、１９８８年）および「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載されているものが挙げられる。
【００７２】
通常、このような計算には、コンピュータープログラムが使用される。配列ペアを比較し、整列するプログラム（ＡＬＩＧＮ（ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７、１９８８年）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８、１９８８年；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３：６３−９８、１９９０年）およびｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２、１９９７年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｈａｅｂｅｒｌｉ、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：３８７、１９８４年）など）が、この目的では、有用である。さらに、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのＤａｌｉサーバーは、タンパク質配列の構造ベースのアライメントを提供している（Ｈｏｌｍ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０：４７８−４８０、１９９５年；Ｈｏｌｍ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３３：１２３−３８、１９９３年；Ｈｏｌｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２６：３１６−９、１９９８年）。
【００７３】
基準点を提供するために、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する本発明による配列は、デフォルトパラメータを用いて、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して決定され得る（例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバ（ＩＧＨ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）においてインターネット上で利用可能である）。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基（例えば正に荷電している、疎水性など）で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。
【００７５】
本発明のＳＳＢは、遺伝的にコードされたアミノ酸を含むが、１つ以上の遺伝的にコードされていないアミノ酸または修飾アミノ酸、またはＮ末端修飾もしくはＣ末端修飾を含んでもよい。
【００７６】
核酸分子または配列およびタンパク質またはポリペプチド（例えば、ＳＳＢ）に関して、本明細書で使用される用語「単離された」または「精製された」は、それらの天然環境から単離された場合、精製された場合、または実質的に含まない場合、例えば、生物（実際に、それらが自然に発生する場合）または産生に使用される宿主細胞から単離または精製された場合のこうした分子、または技術的プロセスによって産生される場合のこうした分子、すなわち、組換えおよび合成で産生された分子などを指す。
【００７７】
したがって、ＳＳＢなどのタンパク質またはポリペプチド分子と関連して使用される場合、「単離された」または「精製された」という用語は、典型的には、細胞材料を実質的に含まないタンパク質、またはそれらの発生源からの他のタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、こうして単離または精製されたタンパク質は、組換え技術により産生される場合、培地を実質的に含まず、または化学合成される場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を含まない。
【００７８】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義した本発明の核酸分子と、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列とを含む発現ベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を提供する。
【００７９】
考えられる発現ベクターとしては、そのベクターが使用する宿主細胞と適合性がある限り、コスミドまたはプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に好適であり、これは発現ベクターが、本発明の核酸分子、および発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、作動可能に核酸分子に連結されている調節配列を含むことを意味する。作動可能に連結されるとは、核酸の発現を可能にする様式で、核酸が調節配列に連結されることを意味することを意図している。
【００８０】
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子など、さまざまな発生源に由来してもよく、これらは、当技術分野において周知である。適切な調節配列の選択は、以下で論じるように選択された宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成され得る。こうした調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルなどのリボソーム結合配列が挙げられる。追加的に、選択された宿主細胞および使用されたベクターに応じて、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列などの他の配列が、発現ベクターに組み込まれてもよい。
【００８１】
本発明の組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００８２】
組換え発現ベクターはまた、組換えタンパク質の発現の増加、組換えタンパク質の溶解性の増大をもたらす融合部分をコードする遺伝子を含み得る。また、発現ベクターは、このアフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、標的組換えタンパク質の精製を助ける（例えば、精製および／または同定を可能にする適切な「タグ」、例えば、Ｈｉｓタグまたはｍｙｃタグが存在し得る）。
【００８３】
組換え発現ベクターは、宿主細胞に導入して、形質転換宿主細胞を産生できる。「により形質転換された」「によりトランスフェクトされた」、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当技術分野で公知の多くの可能な技術のうちの１つによって、細胞に核酸（例えば、ベクター）を導入することを包含することを意図している。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）および他のラボテキストに見い出され得る。
【００８４】
好適な宿主細胞としては、多種多様の原核生物宿主細胞および真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、本発明のタンパク質は、大腸菌などの細菌宿主細胞中で発現させ得る。
【００８５】
タンパク質またはペプチド（例えば、エピトープタグまたは精製タグ）などの他の分子にコンジュゲートした本発明のＳＳＢを含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組換え技術により融合することにより調製され得る。
【００８６】
本発明のＳＳＢは、他の部分、例えば蛍光部分を組み込んでいるものなどのレポーター部分にもコンジュゲートすることができる。融合タンパク質は、核酸ポリメラーゼに融合した本発明のＳＳＢを含み得、ポリメラーゼは、熱安定性および／または耐塩性であり得る。
【００８７】
またさらなる態様は、本発明の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞またはウイルスを提供する。本発明の核酸分子のうちの１つ以上を含む宿主細胞またはウイルスもまた提供される。本発明のＳＳＢを発現することができる宿主細胞またはウイルスは、さらなる様態を形成する。
【００８８】
適切な場合、本発明のＳＳＢは、天然源から単離され得る、例えば、サリノバクターの抽出物から単離されたか、または宿主細胞内において組換えにより産生され、そこから単離および精製され得る。特定の実施形態では、ＳＳＢは、ＳＳＢが天然に見出されるものと同じではない生物ではない宿主細胞、またはその生物由来ではない宿主細胞、すなわち異種宿主細胞において、組換え技術によって産生される。
【００８９】
本発明者らは、野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢ遺伝子のコドン最適化型を調製し、本明細書では配列番号４と命名している。配列番号４の核酸配列またはその機能的断片を含む核酸分子は、本発明のさらなる態様を構成する。機能的断片は、上記で定義されたＳＳＢの機能的断片をコードする断片である。配列番号５の核酸配列を含む核酸分子はコドン最適化され、１７位および７１位にリジンのコドンが組み込まれ、これが、本発明の好ましい実施形態である。
【００９０】
本発明のＳＳＢは、組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。代替的には、ＳＳＢを産生するために、無細胞発現系を使用することができる。代替的には、本発明のＳＳＢは、一度に１つのアミノ酸の段階的伸長による化学合成を用いて生成され得る。こうした化学合成技術（例えば、固相合成）は、タンパク質の化学において周知である。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む、本発明のＳＳＢ（突然変異ＳＳＢなど）を産生する方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）コードされたＳＳＢの発現に好適である条件下で、組換え発現ベクターのうちの１つ以上、または本発明の核酸分子のうちの１つ以上を含む宿主細胞を培養するステップと、任意により、（ｉｉ）ＳＳＢを宿主細胞から、もしくは増殖培地／上清から単離させるか、または取得するステップと、を含む。また、こうした製造方法は、ＳＳＢを精製するステップ、および／またはＳＳＢを適切な緩衝液または担体などの少なくとも１つの追加成分を含む組成物または生成物に配合するステップを含み得る。
【００９２】
ＳＳＢは、当該分野で公知であり、文献に広く記載されているタンパク質のための精製技術のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせを使用して、宿主細胞／培地または天然の発生源から分離または単離され得る。こうした技術としては、例えば沈殿、限外濾過、透析、種々のクロマトグラフィー技術、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離などを挙げることができる。上記のように、本発明のＳＳＢは、単離、可溶化および／または精製もしくは同定を補助するために、アミノ酸モチーフまたは他のタンパク質もしくは非タンパク質タグ、例えばポリヒスチジンタグを担持するように改変され得る。
【００９３】
上述のように、本発明の一態様は、核酸シーケンシングの方法である。好ましい実施形態では、これらの方法は次世代シーケンシング方法である。いわゆる「次世代」、または「第２世代」または「第３世代」のシーケンシングアプローチ（「第１世代」のアプローチとしてのＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド法に対して）が広く普及してきている。これらのより新しい技術は、並列（例えば、大量の並列シーケンシング反応など）を使用した結果としての、または所要時間のより短いステップによる高い処理能力を特徴とする。さまざまなハイスループットシーケンシング方法により、単一分子のシーケンシングがもたらされ、この方法では、パイロシーケンシング、リバーシブルターミネーターシーケンシング、ライゲーションによる切断可能なプローブシーケンシング、ライゲーションによる切断不可能なプローブシーケンシング、ＤＮＡナノボール、単一分子、リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）、およびナノポアシーケンシングなどの技術を用いる。
【００９４】
本発明の方法および使用に従って生成され得る塩安定性核タンパク質複合体は、高塩緩衝液による洗浄に耐え得る。これは、次のプロセスに記載するように、次世代シーケンシングにおいて非常に有用である。表面結合ＤＮＡオリゴヌクレオチドのクラスタを生成する固相ＤＮＡ増幅の間、複数の洗浄が用いられる。洗浄ステップの目的は、非結合鋳型を除去し、非相補的鋳型のアニールを表面結合オリゴに制限することである。これらのほとんどの洗浄液には、高濃度の塩が含まれている。塩活性のＳＳＢタンパク質を導入することにより、ＤＮＡは全洗浄サイクルにおいて一本鎖に保たれるため、多くのＤＮＡプロセシング酵素の活性を低下させる二次構造を形成できない。ＳＳＢタンパク質の添加により、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度および処理能力が向上することが示されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ［２００３年］３１（２２）：６４７３−６４８０）。これらのパラメータは、クラスタ生成プロセスにおいて非常に重要であり、以下のシーケンシングフェーズが、可能な限り確実に効率的に実行される。
【００９５】
高塩洗浄は、第２世代のハイスループットシーケンシングのコアプロセスである合成時解読（ＳＢＳ）法にも組み込まれている。次のサイクルの中断を防ぐために、過剰なヌクレオチドおよび切断された合成阻害剤、切断酵素などの他の成分が洗浄ステップで除去される。ここでも、全洗浄手順を通じてＤＮＡを一本鎖形態に保つことができるＳＳＢタンパク質により、シーケンシングの質が大いに改善される。
【００９６】
したがって、本発明の好ましいシーケンシング方法は、固相ＤＮＡ増幅ステップおよび／または合成時解読（ＳＢＳ）ステップを含む。
【００９７】
ナノポアシーケンシングは、「第三世代」シーケンシング法として知られており、本発明の特に好ましいシーケンシング法である。ナノポアシーケンシングでは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇのそれぞれが細孔内を通過するときに観察される細孔全体の電流に対する異なる効果を利用する（Ｗａｎｇら、（２０１５年）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５巻、Ａｒｔｉｃｌｅ  ４４９）。微細孔は、内径が約１ナノメートル以下（例えば約２ｎｍ）の孔であり、細孔は、膜貫通タンパク質、シリコンまたはグラフェンなどの有機または無機材料で形成されている。典型的には、ｄｓＤＮＡ分子は、その鎖のうちの１つが細孔を通過することによって配列決定され、各ヌクレオチドは細孔全体の電流に読み取り可能な変化を引き起こす。ＳＳＢは、細孔の上流にある（まだ）配列決定されていない鎖および／または細孔を通過した鎖のいずれかに結合する場合に有用であり得る。
【００９８】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、試料溶液が、５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、その最大ｓｓＤＮＡ結合能の少なくとも５０％を呈する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含むナノポアシーケンシング方法である。好ましくは、ＳＳＢは、Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢまたはその誘導体、断片、多様体もしくは相同体である。したがって、ＳＳＢは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも７５％同一であるか、または上記で定義されたその機能的断片であるアミノ酸配列を有する。
【００９９】
本発明の特に好ましい「第二世代」シーケンシング方法は、パイロシーケンシングであり、この方法では、ＳＳＢにより、シグナル強度が増大し、非特異的シグナルが減少し、重合効率が改善され、非定量的シグナルが減少し、かつ／または酵素アピラーゼおよびポリメラーゼの阻害が減少し得る。パイロシーケンシングは、ヌクレオチドの組み込み時に放出されるピロリン酸の検出に基づく、合成時解読（ＳＢＳ）法の一例である。
【０１００】
上記のように、本発明の一態様は、核酸増幅方法である。典型的には、この方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、上記で定義された本発明のＳＳＢ、鋳型核酸分子、オリゴヌクレオチドプライマー（複数可）（例えば、２つ以上のプライマー、例えば２、３、４、５または６プライマー）を含む反応混合物を提供することを含む。これにより、鋳型核酸分子の酸分子の一部分、およびヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸、ｄＮＴＰ）にアニールすること、およびオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）が鋳型核酸分子にアニールする条件下で反応混合物をインキュベートすることが可能であり、ＤＮＡポリメラーゼは、１つ以上のヌクレオチドを重合して、ポリヌクレオチドを生成することによってオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を伸長させる。好適な条件は、当技術分野で周知である。本発明の増幅方法は、ＰＣＲ（およびＲＴ−ＰＣＲ）を含むが、核酸増幅の好ましい方法は、等温増幅方法である。本発明の等温増幅法は、一定温度で行われ、好ましい温度は、本明細書の他の箇所に記載されている。任意により、ポリヌクレオチド生成物の生成が検出される（例えば、ゲル電気泳動により）。
【０１０１】
例示的な等温増幅方法としては、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）およびクロスプライミング増幅（ＣＰＡ）が挙げられる。
【０１０２】
上記のように、本発明の一態様は、部位特異的突然変異誘発の方法である。こうした方法は、そうでなければ突然変異部位の周りの鋳型ＤＮＡに相補的である所望の突然変異（複数可）を含むＤＮＡプライマーを使用してもよい。本明細書で定義されるＳＳＢをさらに含む反応混合物中の鋳型にプライマーをアニールさせる場合、ＤＮＡポリメラーゼを使用してプライマーを伸長させる。反応混合物は、典型的にはタンパク質ＲｅｃＡも含む。鋳型配列のコピーには、所望の突然変異が組み込まれており、これをベクターに挿入し、宿主細胞に導入して、クローン化させ得る。
【０１０３】
本発明の使用および方法は、典型的には、インビトロで実施される。
【０１０４】
本発明はまた、上で定義された本発明のＳＳＢを含む組成物を提供する。そのような組成物は、好ましくは、緩衝液、およびグリセロールまたはスクロースなどの安定化剤を含み、ＤＮＡポリメラーゼも含み得る。組成物は、水性であり得、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなどの標準緩衝液で緩衝され得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＢを含有する緩衝液は、例えば少なくとも３５０ｍＭのナトリウムイオン、少なくとも５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも１５０ｍＭのマグネシウムイオンおよび／または少なくとも２００ｍＭのカルシウムイオンなどの高塩濃度を含み得る。したがって、本発明のＳＳＢは、こうした高塩濃度の洗浄緩衝液に有利にも含まれ得る。上記で定義された本発明のＳＳＢに適した配合物は、ｐＨ８．０の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０％グリセロールを含む。
【０１０５】
本発明は、上記で定義された本発明のＳＳＢのうちの１つ以上、または本発明の１つ以上の組成物、または本発明の核酸分子のうちの１つ以上、または本発明の１つ以上の発現ベクター、または本発明の１つ以上の宿主細胞もしくはウイルスを含むキットをさらに含む。好ましくは、キットは、方法における使用および本明細書に記載の使用（例えば、核酸増幅またはナノポアシーケンシング法などのシーケンシング方法）のためのものである。好ましくは、キットは、例えば、核酸増幅またはシーケンシングのためのキット構成要素の使用に関する指示書を含む。したがって、キットは、ポリメラーゼ、洗浄緩衝液もしくは他の緩衝液（本明細書でさらに論じるように高塩濃度を含み得る）、ヌクレオチド、核酸プライマー、リガーゼ、トポイソメラーゼもしくはジャイレース（またはナノポアシーケンシングを補助するため他の分子モータータンパク質）のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【０１０６】
さらなる態様において、本発明は、シーケンシング装置、例えばＭｉｎＩＯＮまたはＧｒｉｄＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での使用に好適であるカートリッジ内に含まれる、上で定義された本発明のＳＳＢ、または本発明の組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
本発明は、以下を参照して以下の非限定的な実施例でさらに説明される：
【図１】図１Ａ）、Ｂ）、Ｃ）およびＤ）は、一価および二価の塩の存在下でのＳ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢ（野生型および突然変異型）および大腸菌ＳＳＢのＤＮＡへの結合を示す図である。
【図２】図２Ａ）ｓｓＤＮＡを含まないか、または５または１２０‘について、Ｍ１３ファージｓｓＤＮＡでインキュベートし、電子顕微鏡で可視化させた塩の混合物（３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６００ｍＭ  ＫＣｌおよび１５０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2）の存在下でのＳｒ  ＳＳＢ  Ｄ１７ＫＤ７１Ｋ突然変異体を示す図である。図２Ｂ）塩の混合物（３５０ｎＭ  ＮａＣｌ、６００ｎＭ  ＫＣｌ、および１５０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2）の存在下で、Ｓ．ルベーＳＳＢ（野生型および突然変異型）および大腸菌ＳＳＢのＤＮＡへの結合を示す図である。
【図３】０．１５Ｍ、２Ｍおよび４Ｍ  ＮａＣｌにおいてサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定されたＳ．ｒｕｂｅｒ野生型ＳＳＢの見かけのオリゴマー質量、および０．１５Ｍ  ＮａＣｌでサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定されたＳ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢ  ｃｄｅｌ  １１１末端欠失突然変異体を示す図である。
【図４】高塩濃度条件下でのＳ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢの結晶構造を示す図である。この構造は、重合させた四量体からなるフィラメント状の構造を示している。（Ａ）重合界面は、別々の四量体に属する２つの隣接する二量体によって形成され、フィラメントに沿って繰り返される。（Ｂ）フィラメント中の四量体の結晶充填。結合ＤＮＡの短いＤＮＡ断片は、（ｄＴ）８オリゴヌクレオチドに浸漬されている。実施例野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢおよびＤ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体の同定およびクローニング
【０１０８】
単一ＳＳＢのオープンリーディングフレームは、クエリ（ＮＣＢＩ：ＷＰ＿０４２２０１７１０．１）として、大腸菌ＳＳＢ配列によるｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して、Ｓ．ｒｕｂｅｒ株ＤＳＭ  １３８５５ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０００１６０．１）において同定された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ［１９９０年］２１５、４０３−４１０）。１７位および７１位においてアスパラギン酸をリジンに置換する２つの点突然変異を導入し、Ｄ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体を得た。
【０１０９】
野生型ＳＳＢおよびＤ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体をコードする遺伝子を、（ＤＮＡ２．０を用いて）大腸菌での発現のためのコドン最適化を用いて合成した。コドン最適化遺伝子では、元のヌクレオチドの２６％が置換され、ＧＣ含有量が元の６３％から４７％に変化したため、得られた遺伝子は大腸菌での発現により適したものとなった。
【表１】
2020508664.tif 000003
【０１１０】
大腸菌におけるＳｒ  ＳＳＢタンパク質多様体の発現のための構築物は、高速クローニング法（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ［２０１１年］１１、ｐ９２）でクローニングされた。挿入断片は、Ｓｒ  ＳＳＢ  ｉ  ＦＷ（フォワード）およびＳｒ  ＳＳＢ  ｉ  ＲＷ（リバース）オリゴヌクレオチドと、鋳型としてのｗｔ  Ｓｒ  ＳＳＢまたはＳｒ  ＳＳＢ  Ｄ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ合成遺伝子とのＰＣＲ反応により生成した。ベクター断片は、ＳｒＳＳＢのｖ  ＲＷおよびＳｒ  ＳＳＢのｖ  ＦＷのオリゴヌクレオチドと、鋳型としてのｐＣＯＬＤ  ＩＩ発現ベクター（Ｔａｋａｒａ）とのＰＣＲ反応によって生成した。鋳型ＤＮＡを除去するために、ＤｐｎＩ制限酵素を加え、断片を混合し、３７℃で３時間インキュベートした。次に、混合物は、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に形質転換し、大腸菌細胞中で両方の遺伝子を発現させるための構築物を得た。
【０１１１】
両方のインサートおよびベクター断片を生成するために、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用した。遺伝子クローニングに使用したオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。クローン化構築物は、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【表２】
2020508664.tif 000004
タンパク質の発現および精製
【０１１２】
ｗｔ  Ｓｒ  ＳＳＢ発現プラスミドで形質転換した大腸菌細胞株Ｂｌ２１を一晩成長させた後、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補充した新鮮なＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地で１：５０に希釈した。ＯＤ６００が０．５に達するまで細胞を培養し、その後、培養物を１８℃まで冷却した。組換えタンパク質の発現は、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導され、１８℃で一晩培養を続けた。次いで、細胞を遠心分離（８０００ｘｇ、４℃、１０分間）により収穫し、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、イミダゾール１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％、グリセロール１０％）に再懸濁した。フレンチプレス（２７ｋｐｓｉ適用）で細胞を破砕した後、粗抽出物を遠心分離（６５，０００ｘｇ、４℃、３０分）で清澄化し、上清を、１ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるタンパク質精製に使用した。装填前に、カラムを、５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａで平衡化した。清澄化したライセートをカラムに充填した後、緩衝液Ａを含む５ＣＶ洗浄液により、未結合の物質を除去した。タンパク質は、１０ＣＶの緩衝液Ａで１０ｍＭ〜５００ｍＭのイミダゾールから、線形勾配で溶出した。ＳＳＢを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した後、それらを合わせて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を用いて、分子量カットオフ１００ｋＤａで濃縮した。最終透析は、緩衝液Ｂ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、β−メルカプトエタノール５ｍＭ、グリセロール１０％）に対して実施した。Ｄ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体の精製は、同じプロトコルに従って行った。精製したＳＳＢタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９５％以上）を使用して推定し、濃度は蛍光測定法で測定した。
一本鎖ＤＮＡ結合活性測定
蛍光測定
【０１１３】
野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢおよびＤ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体を、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を補充した反応緩衝液中でｓｓＤＮＡに結合するそれらの能力について試験した。大腸菌ＳＳＢは、十分に特徴が明らかにされている参照タンパク質として使用した。
【０１１４】
アッセイでは、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチド（表２、配列番号１０）の蛍光の変化が検出されている。オリゴヌクレオチドＭＢは、短い８塩基対（ｂｐ）の二本鎖ステムおよび２４塩基の一本鎖ループを有する部分的ヘアピンを形成するように設計されている。オリゴは、蛍光色素−ＦＡＭ（カルボキシフルオレセインおよびＤＡＢＣＹＬ（４−（４‘−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸））で標識されており、これはＦＡＭ蛍光を消光する。オリゴヌクレオチドがその天然の状態にあるとき、ステムの５‘末端および３‘末端の両方が近接してヘアピン状態にあり、ＦＡＭ蛍光はＤＡＢＣＹＬによって消光される。ＳＳＢタンパク質が２４ヌクレオチドループに結合することで、二本鎖ステム中の水素結合が破壊され、オリゴヌクレオチドの脱ハイブリダイズが強制的に行われる。ＦＡＭおよびＤＡＢＣＹＬの空間的分離により、色素蛍光の測定が可能になる（Ｔａｎｇら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ［２０１１年］４７（１９）、ｐ５４８５−５４８７）］。
【０１１５】
野生型およびＤ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体タンパク質は両方とも、高塩濃度の一価および二価の塩の両方において、蛍光プローブを効率よく結合して脱ハイブリダイズすることができる。それぞれ１０ｍＭ〜１Ｍ、０Ｍ〜１Ｍおよび０Ｍ〜２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）の存在下でのｓｓＤＮＡプローブとの核タンパク質複合体形成を図１Ａ〜図１Ｃに示す。
【０１１６】
反応液は、０．１２５μＭの分子ビーコンおよび０．２５μＭの大腸菌ＳＳＢ四量体（単一結合単位）、４μＭのｗｔ  Ｓｒ  ＳＳＢおよび２μＭのＤ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋを含んでいた。蛍光プローブを含み、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の指示濃度のＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＭｇＣｌ2を補充した５０μｌの反応緩衝液ＭＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で反応混合物を三連で準備した。指示されたＳＳＢタンパク質を添加することにより結合反応が開始し、次の反応を２５℃で１５分間インキュベートし、Ｇｅｍｉｎｉ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で４９５ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光において蛍光を測定した。すべてのグラフは、蛍光単位で測定した、初期応答の１００％に対して正規化した。
【０１１７】
塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの濃度が上昇しても、両方のＳｒ  ＳＳＢ多様体は、ｓｓＤＮＡに結合して脱ハイブリダイズするそれらの能力を維持している。Ｄ１７ＫのＤ７１Ｋ突然変異体は、野生型タンパク質と非常に類似しているが、その濃度のわずかに半分で、結合レベルを示し、ｓｓＤＮＡに対して増大した親和性を示す。
【０１１８】
塩濃度を２００〜４００ｍＭ（ＮａＣｌ）に上昇させると、前述の大腸菌ＳＳＢタンパク質の結合親和性が、劇的に低下する（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［１９８８年］２７、４５６−４７１）。こうした低下は、タンパク質と核酸との間の静電的相互作用の破壊および相補的ｓｓＤＮＡによって形成された二本鎖ＤＮＡのセグメントの安定性の増大の両方によるものである。これまでの観察と一致して、大腸菌由来の参照ＳＳＢのｓｓＤＮＡへの親和性は、試験したすべての塩濃度の上昇と共に、有意に低下した。
【０１１９】
この実験はまた、上昇した濃度のＣａＣｌ2に対する大腸菌、野生型および突然変異体のＳ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢの感受性を試験するためにも行われた。この結果を図１Ｄに示す。
表面プラズモン共鳴
【０１２０】
Ｄ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体のより高い結合親和性はまた、Ｔ２００機器（ＢＩＡＣＯＲＥ）で表面プラズモン共鳴を使用してタンパク質−ｓｓＤＮＡ相互作用強度を直接調べることによっても確認された。このバイオセンサーベースの技術により、核タンパク質複合体など、様々な複合体の平衡解離定数（ＫＤ）の計算を可能にする結合パラメータのリアルタイム測定が可能になる。確実に測定値がヌクレオチド配列によって偏らないようにするために、無作為に生成した１５０ヌクレオチドの５’−ビオチニル化ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した（表２、配列番号１１）。オリゴヌクレオチドをビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介してＳＡ  Ｓ型チップ（ＢＩＡＣＯＲＥ）の表面に付着させた。次に、両方のタンパク質をＭＢ緩衝液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）でチップ表面に希釈して（１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ）、流した。結合事象は、チップ表面上の質量変化によって検出され、これによりタンパク質−ｓｓＤＮＡ相互作用の速度論的パラメータのリアルタイム測定が可能になった。速度論的パラメータは、表３の表に示す。
【表３】
2020508664.tif 000005
【０１２１】
表３は、１５０  ｎｔの一本鎖ＤＮＡへの結合の解離定数（ＫＤ）、および野生型タンパク質およびＤ１７Ｄ７１Ｋ  Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢの結合モデルへのフィッティングの質を示す。１未満のＣｈｉ2値は、実験データが、ＫＤ計算に使用されるモデルに非常によく適合していることを示す。Ｄ１７ＫＤ７１Ｋ突然変異体のＫＤは、１．８倍以上低く、これは突然変異タンパク質の結合親和性が増大していることを示す。
【０１２２】
ＫＤ値の低下により、Ｄ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異を導入することで、一本鎖ＤＮＡに対する野生型ＳＳＢタンパク質の初期の、すでに高い親和性が大幅に上昇することが確認される。
【０１２３】
この実験は、必然的に低塩濃度で実施されたが、それでもなお突然変異タンパク質の優れた結合親和性が示されている。
塩の混合物における結合および脱ハイブリダイズ蛍光アッセイ
【０１２４】
野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢ、Ｄ１７Ｋ  Ｄ７１Ｋ突然変異体、および野生型ＳＳＢのＣ末端１１１残基を欠くＳ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢ  ｃｄｅｌ１１１  Ｃ末端欠失突然変異体が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｍｇ（ＯＡｃ）2の混合物を含む反応緩衝液中においてｓｓＤＮＡと結合する能力について、それぞれ、試験した。大腸菌ＳＳＢは十分に特徴が明らかにされている参照タンパク質として使用した。反応物は、０．１２５μＭの分子ビーコン、０．２５μＭの大腸菌ＳＳＢ四量体（単一結合単位）、４μＭのｗｔ  ＳｒＳＳＢ、Ｄ１７ＫＤ７１Ｋ突然変異体八量体またはｃｄｅｌ１１１突然変異体を含んでいた。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６００ｍＭ  ＫＣｌおよび１５０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含有する１００μｌの反応緩衝液ＭＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７）中で反応を三連で準備し、２５℃で、５時間インキュベートした。蛍光は、４９５ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光を５分ごとに測定した。分子ビーコンを含む反応のベースライン蛍光は、差し引いた。測定は、Ｇｅｍｉｎｉマイクロプレートプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で行った。
【０１２５】
実験の過程で、本発明者らは、野生型および突然変異型のＳ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢの両方について蛍光の増大を観察した。これはタンパク質がＤＮＡプローブへ結合していることを示している。Ｄ１７ＫＤ７１Ｋ突然変異体は、高濃度の塩混合物中のｓｓＤＮＡに対する親和性が有意に増大した。大腸菌ＳＳＢおよびｃｄｅｌ１１１は、実験条件下で測定可能な結合活性は有さなかった。結果は、図２Ｂに示す。
【０１２６】
四量体が比較的低濃度の二価塩、例えば塩化マグネシウム中で安定性を失う大腸菌ＳＳＢとは異なり、Ｓｒ  ＳＳＢは、その高次構造を維持し、高濃度の一価および二価塩の混合物中でｓｓＤＮＡを結合することができる（図２）。
ＳｒＳＳＢ−ｓｓＤＮＡ複合体の電子顕微鏡
【０１２７】
Ｓｒ  ＳＳＢ  Ｄ１７ＫＤ７１Ｋ突然変異体タンパク質は、「塩混合物中の結合および脱ハイブリダイズ蛍光アッセイ」単独で、または２００倍過剰において、ｓｓＤＮＡと（Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、ＮＥＢ）共に、同じ反応条件でインキュベートした。タンパク質濃度は、１７μＭ（八量体）で、インキュベーション時間は５〜１２０分である。ネガティブ染色電子顕微鏡用の試料を調製するために、３μｌの液滴の分析物を１分間カーボンコートしたグリッドに入れ、その後吸い取った。グリッドをＭｉｌｉ−Ｑ水で５回洗浄し、吸い取り、２％酢酸ウラニルで１分間染色した。次いで、グリッドをブロットし、１００ｋＶの加速電圧で操作させた低線量モードのＪＥＯＬ  １２００  ＥＸＩＩで観察するために真空乾燥させた。
【０１２８】
図２Ａに、ＥＭの可視化を示す。タンパク質単独またはＭ１３ファージｓｓＤＮＡとの反応混合物中で５’についてインキュベートしたとき、限られた量の高度に規則化された環状様および鎌状様構造が観察された。インキュベーションを１２０’まで伸長させた場合、大量の大きく規則化された構造が観察された。観察された広範な構造は、Ｓｒ  ＳＳＢ−ｓｓＤＮＡの核タンパク質複合体であり、これはタンパク質をｓｓＤＮＡとインキュベートしたときに広範に形成される。このため、このタンパク質は、大きく規則的なフィラメント様核タンパク質複合体を形成し、また、高濃度の塩溶液でｓｓＤＮＡを結合し、脱ハイブリダイズできることが確認される。
オリゴマー構造
【０１２９】
他の既知のＳＳＢに対するＳａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｅｒ（Ｓｒ  ＳＳＢ）の配列アラインメントは、タンパク質が細菌ＳＳＢの大部分と同様に四量体を形成することを示唆したが、最初にＳｒ  ＳＳＢの特徴を明らかにする間に、タンパク質が、予想外のより高いオリゴマー状態に存在することが発見された。
【０１３０】
大腸菌ＳＳＢについては、高塩濃度により、ＳＳＢ機能が妨げられるか、またはｓｓＤＮＡ−ＳＳＢ核タンパク質複合体が既に形成されている場合には、ｓｓＤＮＡ−タンパク質複合体の過剰縮合が引き起こされることが示されている。ＮａＣｌが２０ｍＭ以下の塩濃度では、大腸菌ＳＳＢは、高協同性様態でｓｓＤＮＡに結合し、細長いフィラメント状核タンパク質複合体を形成し、ＮａＣｌが２０〜２００ｍＭの塩濃度では、大腸菌ＳＳＢ四量体が、限定された協同性で四量体が結合する「ビーズオンストリング」構造を生成することが知られている。
【０１３１】
高塩条件および低塩条件でのＳａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｅｒ由来のＳＳＢの集合状態を決定するために、サイズ排除クロマトグラフィーおよび示差走査熱量測定により、組換えにより産生されたＳｒ  ＳＳＢを分析した。ＳＳＢオリゴマー状態に対する塩濃度の影響を調べるために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによってＳＳＢオリゴマー分子量推定を行った。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５および０．１５Ｍ（緩衝液Ｃ１）、２Ｍ（緩衝液Ｃ２）、４Ｍ（緩衝液Ｃ３）ＮａＣｌを含有する緩衝液Ｃ中で分析を実施した。次に、野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢタンパク質の溶出パターンを標準タンパク質の溶出パターンと比較した：フェリチン（４４０ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、コンカルブミン（７５ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）。
【０１３２】
図３にその結果を示す。サイズ排除による精製Ｓｒ  ＳＳＢの分析により、約２２５ｋＤａの分子量に対応する単一のピークが明らかになり、これは単量体の分子量の約１０．３倍である。この結果は、タンパク質が前述のＳＳＢよりも大きいオリゴマーを形成し、おそらくＳｒ  ＳＳＢ四量体が集合して、八量体（四量体の二量体）、十二量体（四量体の三量体）および４の倍数のより高いオリゴマー状態となることを示している。したがって、観察された単量体の１０．３倍の質量は、平衡状態で約４２％の八量体および５８％の十二量体との混合物を表す。塩濃度の上昇に伴い、観察されたオリゴマーのサイズは、それぞれ２Ｍおよび４ＭのＮａＣｌで、単量体のサイズの約７．６倍（約９０％八量体、１０％四量体）および４．９倍（約２５％八量体、７５％四量体）に低下した。オリゴマー状態の分析もまた、５００ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で行われ、ここでタンパク質オリゴマーのサイズは、単量体のサイズの約８倍であった（データは示さず）。
【０１３３】
したがって、Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢは、ｓｓＤＮＡの非存在下であっても、高塩条件の存在下で、顕著な四次構造安定性を示す。このような四次構造は、ｓｓＤＮＡへの結合に必要である。Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢのＣ末端欠失突然変異体は、高濃度の塩の混合物ではｓｓＤＮＡに結合しないことが示され（図２Ｂ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで単量体のサイズの３．８倍（四量体の四次構造のみを示す）の推定サイズを有することが示された（図３）。
【０１３４】
驚くべきことに、ｗｔ  ＳＳＢとは異なり、Ｃ末端欠失突然変異体ＣΔ１１１は、八量体を形成できず、代わりに四量体を形成した（データは示していない）。上記のように、ＣΔ１１１はまた、高塩中でｓｓＤＮＡに結合することができなかった。したがって、Ｓｒ  ＳＳＢの場合、Ｃ末端ドメインは、高塩におけるフィラメント形成およびｓｓＤＮＡ結合活性の両方にとって極めて重要である。
結晶化および構造決定
【０１３５】
野生型Ｓ．ｒｕｂｅｒ  ＳＳＢの小さい角柱状結晶が、２０μＭのｄ（Ｔ）75オリゴヌクレオチドおよび１μｌのリザーバ溶液を含有する１μｌのタンパク質溶液（５ｍｇ／ｍｌ）からなるシッティングドロップ（２７％ｗ／ｖ  ＰＥＧ３３５０、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ2、１Ｍ硫酸アンモニウム）で得られた。浸漬実験は、形成された結晶を含む液滴にｄ（Ｔ）8オリゴヌクレオチドを最終濃度０．２５μＭまで添加することによって行った。
【０１３６】
図４は、結晶構造Ｓｒ  ＳＳＢ（ＰＤＢ  ＩＤ５ＯＤＮ）が、四量体の二量体から構築された非対称単位として八量体を有することを示す。各ＯＢフォールドが、ｓｓＤＮＡの１つの短い断片を結合し、その結果、非対称単位の８つのタンパク質および８つのｓｓＤＮＡ断片となった。図４Ａには、八量体化界面を示す。図４Ｂは、ＳＳＢタンパク質が、使用される高塩結晶化条件下（０．２５ＭのＭｇＣｌ2、１Ｍ硫酸アンモニウム）であっても、密集した四量体のフィラメントを形成することを示している（図３Ｂ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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