(57)【要約】  本発明は、活性物質−ヘキサペプチド複合体、並びにこれを含んでなる化粧料組成物に関するものである。本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体は、有機酸またはステロイドと、ヘキサペプチドとを結合することにより、従来の有機酸、ステロイド、又はヘキサペプチドよりも、優れた抗酸化と皮膚再生の効果を見せる。したがって、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体、並びにこれを含んでなる化粧料組成物は、抗酸化かつ皮膚老化防止に有効に使用することができる。【選択図】図３８ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＥＭＱＲＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヘキサペプチドと、活性物質とが結合された、活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項２】
上記活性物質が、有機酸又はステロイドである、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項３】
上記有機酸は、１価酸、２価酸、３価酸、脂肪酸、ケイ皮酸、及び芳香族酸からなる群より選択される何れか一つである、請求項２に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項４】
上記１価酸は、ギ酸（Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ）、グルクロン酸（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、乳酸（Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、メバル酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、プロピオン酸（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ピルビン酸（Ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ）、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）、アビエチン酸（Ａｂｉｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アシアト酸（Ａｓｉａｔｉｃ  ａｃｉｄ）、コール酸（Ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ウルソデオキシコール酸（Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、及びウルソール酸（Ｕｒｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項３に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項５】
上記２価酸は、アゼライン酸（Ａｚｅｌａｉｃ  ａｃｉｄ）、ジピコリン酸（Ｄｉｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、イタコン酸（Ｉｔａｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リンゴ酸（Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、しゅう酸（Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、酒石酸（Ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、及びα‐ケトグルタル酸（α−Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項３に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項６】
上記３価酸は、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）である、請求項３に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項７】
上記脂肪酸は、リポ酸（Ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲラン酸（Ｇｅｒａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビン酸（Ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、及びトレチノイン酸（Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項３に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項８】
上記ケイ皮酸は、カフェ酸（Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）、シナミック酸（Ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、及びロスマリン酸（Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項３に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項９】
上記芳香族酸は、ニコチン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、及びシリング酸（Ｓｙｒｉｎｇｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項３に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１０】
上記ステロイドは、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、エストリオール（ｅｓｔｒｉｏｌ）、ベタメタゾンバレラート（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ）、ベタメタゾンジプロピオナート（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｄｉｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、モメタゾンフロアート（Ｍｏｍｅｔａｓｏｎｅ  ｆｕｒｏａｔｅ）、ヒドロコルチソン１７−ブチラート（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  １７−ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ジフルコルトロンバレラート（Ｄｉｆｌｕｃｏｒｔｏｌｏｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ）、及びメチルプレドニゾロンアセポナート（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ａｃｅｐｏｎａｔｅ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項２に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１１】
上記ステロイドが、リンカーを介して結合することを特徴とする、請求項２に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１２】
上記リンカーは、下記化学式５０で表されるものである、請求項１１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。  
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（上記Ｚは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニレン基、又はＣ６〜Ｃ１４アリーレン基である。）
【請求項１３】
上記Ｚは、
2020534356.tif 000081
からなる群より選択される何れか一つである、請求項１２に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。 
【請求項１４】
上記リンカーは、グルタル酸（Ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、マレイン酸（Ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、マロン酸（Ｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、イソフタル酸（Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ）、テレフタル酸（Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、及び２，６‐ナフタレンジカルボン酸（２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つである、請求項１１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１５】
上記活性物質が、ヘキサペプチドのＮ末端とペプチド結合をすることを特徴とする、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１６】
上記ヘキサペプチドのＣ末端にカルボキシ基がアミド基で置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１７】
上記アミド基は、第１級アミド基、第２級アミド基、及び第３級アミドからなる群より選択される何れか一つのアミド基である、請求項１６に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１８】
上記アミド基は、第１級アミドであることを特徴とする、請求項１６に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体。
【請求項１９】
請求項１ないし請求項１８の何れか一項に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体を、有効成分として含む、化粧料組成物。
【請求項２０】
上記化粧料組成物は、化粧水、クリーム、ローション、セラム、及びエッセンスからなる群より選択される何れか一つの製剤であることを特徴とする、請求項１９に記載の化粧料組成物。
【請求項２１】
請求項１ないし請求項１８の何れか一項に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体を、有効成分として含む、皮膚傷の治療用薬学組成物。
【請求項２２】
皮膚状態を改善するための、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体の使用。
【請求項２３】
皮膚状態の改善用化粧料組成物を製造するための、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体の使用。
【請求項２４】
皮膚傷を治療するための、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体の使用。
【請求項２５】
皮膚傷の治療用薬学組成物を製造するための、請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体の使用。
【請求項２６】
請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体により、個体の皮膚を処理するステップを含む、皮膚状態の改善方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の活性物質−ヘキサペプチド複合体により、個体の皮膚を処理するステップを含む、皮膚傷の治療方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質−ヘキサペプチド複合体、及びこれを含む化粧料組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化現像は、内因性老化と外因性老化とに分けられる。内因性老化とは、時間が経つにつれて、膠原繊維、弾性繊維などの細胞外基質タンパク質の合成量が減ることにより、弾力性が減少され、角質層の構造が変化して、皮膚細胞内の水分量が減少する自然老化を意味する。外因性老化とは、紫外線、大気汚染、タバコの煙、ストレスなどのような外部からの刺激が原因とされる老化であり、光老化が代表的な外因性老化に該当する。光老化とは、皮膚が過剰な紫外線に露出されると、活性酸素種が発生し、これにより、ＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｔｉｎ−１）及びＮＦ−ｋＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ−ｋＢ）の活性化による炎症反応が誘導され、皮膚を構成する脂質、タンパク質、核酸、酵素などが損傷されて、老化が起こることを意味する。
【０００３】
また、紫外線暴露による、皮膚内での活性酸素種の生成は、抗酸化防御機構を損傷させ、皮膚のタンパク質と他のポリマーにおいて、酸化ストレスと光損傷を引き起こす。これらの紫外線暴露による皮膚の老化は、皮膚に様々な形で影響を与え、深いしわ、小じわ、皮膚粗鬆症、乾燥肌のような現象を引き起し、皮膚の老化を加速させる（Ｈｏｎｇ  Ｊａｅ  Ｋｅｅ、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ  ７  Ｎｏ．２：５１−６２、２００９）。
【０００４】
最近、オゾン層の破壊に伴う紫外線の照射量の増加、生活空間の乾燥化、個人のアレルギー体質、ストレス、有害化学素材の増加による皮膚損傷がより多く発生しており、このような皮膚損傷の予防と改善に対する需要が増加している。皮膚損傷の予防と改善に対する需要の増加により、機能性化粧品の研究において、既存のような美白やシワの予防のみに留まらず、皮膚損傷の予防と改善、並びにそのための抗酸化活性に係る新素材の開発は、新たに脚光を浴びる分野であり、その重要性がさらに増大している。
【０００５】
特に、環境汚染により、敏感肌を持つ消費者が増加しており、化学素材による刺激を最小限にするために、いくつかの機能性を持つ天然物を利用した化粧品に対する需要が、継続的に増加している。また、最近、皮膚炎やアトピー性疾患を治療するためのステロイド系素材が活発に研究されている。
【０００６】
このような理由から、皮膚内での副作用を抑えながら効能が現れることができる、天然物由来の機能性素材及びステロイド系素材の開発への関心が高まっており、これを利用した様々な機能性化粧品の開発、及び有効性成分の開発に関して、多くの研究結果が報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これに伴い、本発明者らは、活性物質を利用した化粧料組成物を開発するための研究を行った結果、自然界に存在する有機酸と、機能性ペプチドであるヘキサペプチドとを結合して、有機酸−ヘキサペプチド複合体を開発した。また、本発明者らは、皮膚炎やアトピーの患者において効能があるステロイドと、機能性ペプチドであるヘキサペプチドとを結合させ、改変したヘキサペプチド複合体を開発した。上記有機酸−ヘキサペプチド複合体、且つその改変したヘキサペプチド複合体が、抗酸化と皮膚再生の効果を見せることを確認することで、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る第一形態は、ＥＥＭＱＲＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヘキサペプチドと活性物質とが結合された、活性物質−ヘキサペプチド複合体を提供する。
【０００９】
また、他の形態は、上記活性物質−ヘキサペプチド複合体を有効成分として含む化粧料組成物が提供する。
【００１０】
さらに、他の形態は、上記活性物質−ヘキサペプチド複合体を有効成分として含む皮膚傷の治療用薬学組成物を提供する。
【００１１】
さらに、他の形態は、皮膚状態を改善するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【００１２】
さらに、他の形態は、皮膚状態を改善する化粧料組成物を製造するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【００１３】
さらに、他の形態は、皮膚傷を治療するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【００１４】
さらに、他の形態は、皮膚傷を治療する薬剤を製造するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【００１５】
さらに、他の形態は、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体により、個体の皮膚を処理するステップを含む、皮膚状態の改善方法を提供する。
【００１６】
さらに、他の形態は、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体により、個体の皮膚を処理するステップを含む、皮膚傷の治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体は、有機酸またはステロイドと、ヘキサペプチドとを結合することにより、従来の有機酸、ステロイド、又はヘキサペプチドよりも、優れた抗酸化と皮膚再生の効果を見せる。したがって、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体、並びにこれを含んでなる化粧料組成物は、抗酸化と皮膚老化防止に有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ギ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２】図２は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、グルクロン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３】図３は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、乳酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４】図４は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、メバル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図５】図５は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、プロピオン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図６】図６は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ピルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図７】図７は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、キナ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図８】図８は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、シキミ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図９】図９は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、アビエチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１０】図１０は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、アシアト酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１１】図１１は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、コール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１２】図１２は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ウルソデオキシコール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１３】図１３は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ウルソール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１４】図１４は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、アゼライン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１５】図１５は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ジピコリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１６】図１６は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、フマル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１７】図１７は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、イタコン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１８】図１８は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、リンゴ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図１９】図１９は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、しゅう酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２０】図２０は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、コハク酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２１】図２１は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、酒石酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２２】図２２は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、α‐ケトグルタル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２３】図２３は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、クエン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２４】図２４は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、リポ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２５】図２５は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２６】図２６は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ソルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２７】図２７は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ビオチン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２８】図２８は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、トレチノイン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図２９】図２９は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、カフェ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３０】図３０は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、シナミック酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３１】図３１は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、フェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３２】図３２は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３３】図３３は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ニコチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３４】図３４は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、シリング酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図３５】図３５は、ヘキサペプチドのＣ末端に有機酸を結合する合成プロセスを示した図である。
【図３６】図３６は、ヘキサペプチドのＮ末端に有機酸を結合する合成プロセスを示した図である。
【図３７】図３７は、ヘキサペプチドの側鎖に有機酸を結合する合成プロセスを示した図である。
【図３８ａ】図３８ａは、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、カフェ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、フェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、酒石酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、リンゴ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アゼライン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アビエチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ピルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びコハク酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図３８ｂ】図３８ｂは、アシアト酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ビオチン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、コール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シナミック酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、クエン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジピコリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ギ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、フマル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、グルクロン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、イタコン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、リポ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、乳酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メバル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ニコチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、しゅう酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、プロピオン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、キナ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シキミ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ソルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シリング酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、トレチノイン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ウルソデオキシコール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ウルソール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びα‐ケトグルタル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図３８ｃ】図３８ｃは、本発明に係るヘキサペプチドであるＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、Ａｃｅｔｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２（Ａｃｅｔｙｌ  ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ−８）、ロスマリン酸、フェルラ酸、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びフェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図３９】図３９は、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図４０】図４０は、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の細胞毒性を知るために行った、ＷＳＴ−１分析の結果を示したグラフである。
【図４１】図４１は、グルタル酸無水物をリンカーとする、ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の合成工程を示した図である。
【図４２】図４２は、マロン酸をリンカーとする、ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の合成工程を示した図である。
【図４３】図４３は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４４】図４４は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、デキサメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４５】図４５は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、ヒドロコルチゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４６】図４６は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、プレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４７】図４７は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、メチルプレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４８】図４８は、高性能液体クロマトグラフィーによって精製された、エストリオール−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体に関する分析結果を示した図である。
【図４９】図４９は、ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、デキサメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、プレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びエストリオール−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図５０】図５０は、ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びメチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図５１】図５１は、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体における皮膚再生の効果について、傷の回復の実験で確認したグラフである。
【図５２】図５２は、ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びメチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の細胞毒性を知るために行った、ＷＳＴ−１分析の結果を示したグラフである。
【図５３】図５３は、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の細胞毒性を知るために行った、ＷＳＴ−１分析の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明に係る第一形態は、ＥＥＭＱＲＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヘキサペプチドと活性物質とが結合された、活性物質−ヘキサペプチド複合体が提供する。
【００２１】
上記活性物質は、有機酸であることができる。具体的には、上記有機酸は、１価酸、２価酸、３価酸、脂肪酸、ケイ皮酸、及び芳香族酸からなる群より選択される何れか一つであることができる。上記有機酸は、少なくとも一つのカルボキシ基を有することができる。
【００２２】
上記１価酸は、ギ酸（Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ）、グルクロン酸（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、乳酸（Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、メバル酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、プロピオン酸（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ピルビン酸（Ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ）、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）、アビエチン酸（Ａｂｉｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アシアト酸（Ａｓｉａｔｉｃ  ａｃｉｄ）、コール酸（Ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ウルソデオキシコール酸（Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、及びウルソール酸（Ｕｒｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【００２３】
本発明で用いられる用語の「ギ酸」とは、蟻酸またはメタン酸とも呼ばれ、アリのほか、イラクサなどの植物に含まれている有機酸を意味する。上記ギ酸の構造は、下記化学式１の通りである。
【００２４】
【化１】
2020534356.tif 000003
（化学式１）
【００２５】
本発明で用いられる用語の「グルクロン酸」とは、わら、木材などの構造多糖類の構成成分として存在しており、動物界には高等動物のムコ多糖類の主要構成要素として、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸などに含有されている有機酸を意味する。上記グルクロン酸の構造は、下記化学式２の通りである。
【００２６】
【化２】
2020534356.tif 000004
（化学式２） 
【００２７】
本発明で用いられる用語の「乳酸」とは、Ｌａｃｔｉｃ酸とも呼ばれ、乳酸菌によって糖から生成される有機酸を意味する。上記乳酸は、自然界に広く分布しており、ほとんどの植物にラス状態として存在するほか、植物の果実の発酵時に生成される。上記乳酸の構造は、下記化学式３の通りである。
【００２８】
【化３】
2020534356.tif 000005
（化学式３） 
【００２９】
本発明で用いられる用語の「メバル酸」とは、火落酸（ｈｉｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ）とも呼ばれ、清酒やビールに含まれている有機酸を意味する。上記メバロン酸は、清酒に繁殖して腐敗させる真性ヒオチ菌であるラクトバチルスヘテロヒオチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｈｉｏｃｈｉｉ）の生育に必要である。上記メバル酸の構造は、下記化学式４の通りである。
【００３０】
【化４】
2020534356.tif 000006
（化学式４） 
【００３１】
本発明で用いられる用語の「プロピオン酸」とは、アルコール又はプロピオン酸における発酵の産物として、乳糜（ｃｈｙｌｅ）と汗の中に含まれている有機酸を意味する。上記プロピオン酸の構造は、下記化学式５の通りである。
【００３２】
【化５】
2020534356.tif 000007
（化学式５） 
【００３３】
本発明で用いられる用語の「ピルビン酸」とは、細菌や酵母の発酵において、エムデン‐マイヤーホフ経路（解糖経路）（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ  Ｐａｔｈｗａｙ）、又はエントナー・ドゥドロフ経路（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒ  ｏｆｆ  Ｐａｔｈｗａｙ）によって生成される有機酸を意味する。上記ピルビン酸の構造は、下記化学式６の通りである。
【００３４】
【化６】
2020534356.tif 000008
（化学式６） 
【００３５】
本発明で用いられる用語の「キナ酸」とは、キナの樹皮、コーヒーの種子、りんご、桃などの果実などに含まれている、高等植物特有のリング構造をもつ有機酸を意味する。上記キナ酸の構造は、下記化学式７の通りである。
【００３６】
【化７】
2020534356.tif 000009
（化学式７） 
【００３７】
本発明で用いられる用語の「シキミ酸」とは、キナ酸の不飽和誘導体であり、シキミの実に含まれているテトラヒドロトリヒドロキシ安息香酸のような、有機酸の一種を意味する。上記シキミ酸の構造は、下記化学式８の通りである。
【００３８】
【化８】
2020534356.tif 000010
（化学式８） 
【００３９】
本発明で用いられる用語の「アビエチン酸」とは、松脂の主成分であるジテルペンのような、有機酸の一種を意味する。上記アビエチン酸の構造は、下記化学式９の通りである。
【００４０】
【化９】
2020534356.tif 000011
（化学式９） 
【００４１】
本発明で用いられる用語の「アシアト酸」とは、センテラアジアチカに含有されているダンマロール酸のような、有機酸の一種を意味する。上記のアシアト酸の構造は、下記化学式１０の通りである。
【００４２】
【化１０】
2020534356.tif 000012
（化学式１０） 
【００４３】
本発明で用いられる用語の「コール酸」とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類など、胆汁を分泌する動物の胆汁中に存在する有機酸を意味する。上記コール酸の構造は、下記化学式１１の通りである。
【００４４】
【化１１】
2020534356.tif 000013
（化学式１１） 
【００４５】
本発明で用いられる用語の「ウルソデオキシコール酸」とは、熊胆の主成分として知られている胆汁酸を意味する。上記ウルソデオキシコール酸の構造は、下記化学式１２の通りである。
【００４６】
【化１２】
2020534356.tif 000014
（化学式１２） 
【００４７】
本発明で用いられる用語の「ウルソール酸」とは、りんご、サクランボなどの果物や葉において、ワックス状態の皮膜物質であり、α−アミリン系トリテルペンのような、有機酸の一種を意味する。上記ウルソール酸の構造は、下記化学式１３の通りである。
【００４８】
【化１３】
2020534356.tif 000015
（化学式１３） 
【００４９】
上記２価酸は、アゼライン酸（Ａｚｅｌａｉｃ  ａｃｉｄ）、ジピコリン酸（Ｄｉｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、イタコン酸（Ｉｔａｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リンゴ酸（Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、しゅう酸（Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、酒石酸（Ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、及びα‐ケトグルタル酸（α−Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【００５０】
本発明で用いられる用語の「アゼライン酸」とは、小麦、ライ麦、及び大麦などの穀物に含まれている、飽和ジカルボン酸のような、有機酸の一種を意味する。アゼライン酸は、抗菌剤として、毛包と毛穴の中の細菌を減少させ、抗酸化及び抗炎症の効果があると知られている。また、アゼライン酸は、皮膚細胞または毛包がニキビに異常増殖したり変形したりする場合、それを正常に回復させ、嚢胞性ニキビ、ニキビに起因する色素沈着と赤みを緩和してくれる。アゼライン酸の構造は、下記化学式１４の通りである。
【００５１】
【化１４】
2020534356.tif 000016
（化学式１４） 
【００５２】
本発明で用いられる用語の「ジピコリン酸」とは、枯草菌を含む多くのバシラス属細菌の胞子内に含まれているピリジン−ジカルボン酸のような、有機酸の一種を意味する。また、上記ジピコリン酸は、食品中でアスコルビン酸の抗酸化剤として作用する。上記ジピコリン酸の構造は、下記化学式１５の通りである。
【００５３】
【化１５】
2020534356.tif 000017
（化学式１５） 
【００５４】
本発明で用いられる用語の「フマル酸」とは、アイスランド苔や菌類などに含まれている不飽和ジカルボン酸のような、有機酸の一種を意味する。上記フマル酸の構造は、下記化学式１６の通りである。
【００５５】
【化１６】
2020534356.tif 000018
（化学式１６） 
【００５６】
本発明で用いられる用語の「イタコン酸」とは、メチレンコハク酸とも呼ばれ、梅干カビが糖類を用いて生成するジカルボン酸のような、有機酸の一種を意味する。また、梅干カビ以外に、紫紋羽病菌もイタコン酸を少量培地中に蓄積する。上記イタコン酸の構造は、下記化学式１７の通りである。
【００５７】
【化１７】
2020534356.tif 000019
（化学式１７） 
【００５８】
本発明で用いられる用語の「リンゴ酸」とは、林檎酸またはオキシコハク酸とも呼ばれ、リンゴやブドウなどの果実に多く含まれているヒドロキシコハク酸に該当する有機酸を意味する。上記リンゴ酸の構造は、下記化学式１８の通りである。
【００５９】
【化１８】
2020534356.tif 000020
（化学式１８） 
【００６０】
本発明で用いられる用語の「しゅう酸」とは、カリウム塩またはカルシウム塩の形で植物界に広く分布されている有機酸を意味する。上記しゅう酸は、２つのカルボキシ基が結合した最も簡単なジカルボン酸である。上記しゅう酸の構造は、下記化学式１９の通りである。
【００６１】
【化１９】
2020534356.tif 000021
（化学式１９） 
【００６２】
本発明で用いられる用語の「コハク酸」とは、スクシン酸とも呼ばれ、カボチャ（ａｍｂｅｒ）、テレビン油、二枚具、地衣類、菌類などの有機酸を意味する。上記コハク酸は、２価カルボン酸である。上記コハク酸の構造は、下記化学式２０の通りである。
【００６３】
【化２０】
2020534356.tif 000022
（化学式２０） 
【００６４】
本発明で用いられる用語の「酒石酸」と、タルタル酸とも呼ばれ、ブドウやワインに存在するジオキシコハク酸のような、有機酸の一種を意味する。酒石酸は、錫に炭酸カルシウムを入れて生成された沈殿物に硫酸を処理して得ることができる。上記酒石酸の構造は、下記化学式２１の通りである。
【００６５】
【化２１】
2020534356.tif 000023
（化学式２１） 
【００６６】
本発明で用いられる用語の「α‐ケトグルタル酸」とは、シュードモナス属の微生物の発酵によって、グルコースからケトグルコン酸を経て合成される有機酸を意味する。上記α‐ケトグルタル酸の構造は、下記化学式２２の通りである。
【００６７】
【化２２】
2020534356.tif 000024
（化学式２２） 
【００６８】
上記３価酸は、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）であり得る。
【００６９】
本発明で用いられる用語の「クエン酸」とは、枸櫞酸とも呼ばれ、主にレモンやライムのような柑橘類の果物に存在する有機酸を意味する。上記クエン酸は、ヒドロキシ基を有する多塩基カルボン酸の一つであり、多くの植物の種や果汁の中にガラス状態の酸として含有されている。上記クエン酸の構造は、下記化学式２３の通りである。
【００７０】
【化２３】
2020534356.tif 000025
（化学式２３）
【００７１】
上記脂肪酸は、リポ酸（Ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲラン酸（Ｇｅｒａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビン酸（Ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、及びトレチノイン酸（Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）からなる群から選択される何れか一つであり得る。
【００７２】
本発明で用いられる用語の「リポ酸」とは、チオクト酸とも呼ばれ、脂肪酸とジスルフィド結合を有する有機酸を意味する。上記リポ酸の構造は、下記化学式２４の通りである。
【００７３】
【化２４】
2020534356.tif 000026
（化学式２４） 
【００７４】
本発明で用いられる用語の「ゲラン酸」とは、バラ、ハーブなどに含まれる香り成分である有機酸を意味する。上記ゲラン酸の構造は、下記化学式２５の通りである。
【００７５】
【化２５】
2020534356.tif 000027
（化学式２５） 
【００７６】
本発明で用いられる用語の「ソルビン酸」とは、２，４−ヘキサジエン酸とも呼ばれ、ナナカマド（Ｓｏｒｂｕｓ  ｃｏｍｍｉｘｔａ  Ｈｅｄｌｕｎｄ）の未熟果実に含有されている有機酸を意味する。上記ソルビン酸は、微生物の生育を抑制し、加工食品の保存料として使用される。上記ソルビン酸の構造は、下記化学式２６の通りである。
【００７７】
【化２６】
2020534356.tif 000028
（化学式２６）
【００７８】
本発明で用いられる用語の「ビオチン」とは、ビタミンＢ群の一つであり、硫黄を含有し、バレル酸基を持つテトラヒドロチオフェン環とウレイド環とが接合されている有機酸を意味する。上記ビオチンの構造は、下記化学式２７の通りである。
【００７９】
【化２７】
2020534356.tif 000029
（化学式２７） 
【００８０】
本発明で用いられる用語の「トレチノイン酸」と、ビタミンＡの誘導体であるトレチノイン酸の全トランス（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ）型異性体を意味する。上記トレチノイン酸の構造は、下記化学式２８の通りである。
【００８１】
【化２８】
2020534356.tif 000030
（化学式２８） 
【００８２】
上記ケイ皮酸は、カフェ酸（Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）、シナミック酸（Ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、及びロスマリン酸（Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【００８３】
本発明で用いられる用語の「カフェ酸」とは、コーヒー豆、ジャガイモ、穀物、野菜などの様々な農作物に存在するフェノール酸化合物の一種であり、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペン酸（３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で表示される有機酸を意味する。上記カフェ酸の構造は、下記化学式２９の通りである。
【００８４】
【化２９】
2020534356.tif 000031
（化学式２９） 
【００８５】
本発明で用いられる用語の「シナミック酸」とは、シナモン油や、エゴノキのようなバルサミモミに含まれている不飽和カルボン酸のような、有機酸の一種を意味する。上記シナミック酸の構造は、下記化学式３０の通りである。
【００８６】
【化３０】
2020534356.tif 000032
（化学式３０） 
【００８７】
本発明で用いられる用語の「フェルラ酸」とは、植物の細胞壁を形成するリグニンの前駆体物質を意味する。上記フェルラ酸の構造は、下記化学式３１の通りである。
【００８８】
【化３１】
2020534356.tif 000033
（化学式３１） 
【００８９】
本発明で用いられる用語の「ロスマリン酸」とは、主にペパーミント、スペアミント、ローズマリーのようなハーブ植物に含有されている有機酸を意味する。上記ロスマリン酸の構造は、下記化学式３２の通りである。
【００９０】
【化３２】
2020534356.tif 000034
（化学式３２） 
【００９１】
上記芳香族酸は、ニコチン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、及びシリング酸（Ｓｙｒｉｎｇｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【００９２】
本発明で用いられる用語の「ニコチン酸」とは、ビタミンＢ３又はナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）とも呼ばれ、動物の肝臓、酵母、豆類、穀物など、生体内に広く存在しているピリジン−３カルボン酸のような、有機酸の一種を意味する。上記ニコチン酸の構造は、下記化学式３３の通りである。
【００９３】
【化３３】
2020534356.tif 000035
（化学式３３） 
【００９４】
本発明で用いられる用語の「シリング酸」とは、アカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄａｃａｃｉａ  Ｌ）、カスカラサグラダ（Ｃａｓｃａｒａ  ｓａｇｒａｄａ）などの植物に含まれている、トリヒドロキシ安息香酸のような、有機酸の一種を意味する。上記シリング酸の構造は、下記化学式３４の通りである。
【００９５】
【化３４】
2020534356.tif 000036
（化学式３４） 
【００９６】
本発明の活性物質−ヘキサペプチド複合体において、活性物質が有機酸である場合、有機酸と結合したヘキサペプチドを、「有機酸−ヘキサペプチド複合体」と名付けた。
【００９７】
具体的には、本発明は、ＥＥＭＱＲＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヘキサペプチドに有機酸が結合された、有機酸−ヘキサペプチド複合体を提供する。
【００９８】
上記有機酸は、ヘキサペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または側鎖に結合することができる。具体的には、上記有機酸のカルボキシ基は、ヘキサペプチドのＮ末端とペプチド結合をすることができる。
【００９９】
上記有機酸は、リンカーを介して、ヘキサペプチドのＣ末端と結合することができる。この際、有機酸は、置換または非置換のＣ１−Ｃ６などのリンカーを介して、ヘキサペプチドのＣ末端に結合することができる。本発明に係る第一形態では、上記リンカーとしてエチレングリコールを使用した。また、上記有機酸において、ヘキサペプチドのＣ末端が、カルボキシ基がアミド基に置換されたヘキサペプチドと、ペプチド結合することができる。
【０１００】
上記有機酸は、ヘキサペプチドの側鎖に結合することができる。具体的には、上記有機酸は、ヘキサペプチドの側鎖において、カルボキシ基またはアミド基の位置に結合することができる。この際、有機酸がカルボキシ基の位置に結合する場合、エチレングリコールなどのリンカーを介して結合することができ、有機酸がアミド基の位置に結合する場合には、ペプチド結合することができる。
【０１０１】
上記有機酸−ヘキサペプチド複合体に係る第一形態は、下記化学式３５で表すことができる。
【０１０２】
【化３５】
2020534356.tif 000037
（化学式３５） 
（上記式において、Ｘは有機酸であり、Ｒ’及びＲ”がそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−Ｃ３アルキル基である。）
【０１０３】
また、上記有機酸が、リンカーを介して、ヘキサペプチドのＮ末端と結合した複合体に係る第一形態は、下記化学式３５−１で表すことができる。
【０１０４】
【化３５−１】
2020534356.tif 000038
（化学式３５−１） 
（上記式において、Ｘは有機酸であり、Ｌはリンカーであり、Ｒ’及びＲ”がそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−Ｃ３アルキルである。）
【０１０５】
本発明で用いられる用語の「ヘキサペプチド」とは、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するヘキサペプチドを意味する。また、上記ヘキサペプチドは、ヘキサペプチドのＣ末端において、カルボキシ基がアミド基に置換されたものであり得る。上記ヘキサペプチドは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列であり得る。
【０１０６】
上記アミド基は、第１級アミド基、第２級アミド基、及び第３級アミド基からなる群より選択される何れか一つのアミド基である。好ましくは、上記アミド基は、第１級アミド基である。上記ヘキサペプチド構造に係る第一形態は、下記化学式３６の通りである。
【０１０７】
【化３６】
2020534356.tif 000039
（化学式３６）
【０１０８】
上記有機酸−ヘキサペプチド複合体に係る化学式は、表１に示した。
【０１０９】
【表１】
2020534356.tif 000040
2020534356.tif 000041
2020534356.tif 000042
2020534356.tif 000043
2020534356.tif 000044
2020534356.tif 000045
2020534356.tif 000046
2020534356.tif 000047
2020534356.tif 000048
2020534356.tif 000049
【０１１０】
本発明者らは、天然物質を利用した化粧料組成物を開発するために、自然界に存在する有機酸とヘキサペプチドとを結合し、有機酸−ヘキサペプチド複合体を製造した（図１〜図３４）。
【０１１１】
また、本発明者らは、上記有機酸−ヘキサペプチド複合体が、ビタミンＣに相当の優れた抗酸化活性を示すことを確認した（表７）。さらに、本発明者らは、上記有機酸−ヘキサペプチド複合体が、皮膚の再生や傷の回復に優れた効果を見せることを確認した（図３８ａ〜図３８ｃ）。したがって、本発明に係る有機酸−ヘキサペプチド複合体を、有効成分として含む、皮膚再生と創傷治療用の組成物として、有効に使用することができる。
【０１１２】
また、上記活性物質は、ステロイドであり得る。具体的には、上記ステロイドは、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、エストリオール（ｅｓｔｒｉｏｌ）、ベタメタゾンバレラート（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ）、ベタメタゾンジプロピオナート（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｄｉｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、モメタゾンフロアート（Ｍｏｍｅｔａｓｏｎｅ  ｆｕｒｏａｔｅ）、ヒドロコルチソン１７−ブチラート（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  １７−ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ジフルコルトロンバレラート（Ｄｉｆｌｕｃｏｒｔｏｌｏｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ）、及びメチルプレドニゾロンアセポナート（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ａｃｅｐｏｎａｔｅ）からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【０１１３】
本発明で用いられる用語の「ベタメタゾン」とは、糖質コルチコイド作用を示す副腎皮質ホルモン剤を意味する。上記ベタメタゾンは、優れた抗炎症効果を見せる。上記ベタメタゾンの構造は、下記化学式３７の通りである。
【０１１４】
【化３７】
2020534356.tif 000050
（化学式３７） 
【０１１５】
本発明で用いられる用語の「デキサメタゾン」とは、プレドニゾロンの誘導体として、糖質コルチコイド作用を示す副腎皮質ホルモン剤を意味する。上記デキサメタゾンの構造は、下記化学式３８の通りである。
【０１１６】
【化３８】
2020534356.tif 000051
（化学式３８） 
【０１１７】
本発明で用いられる用語の「ヒドロコルチゾン」とは、コルチゾンとも呼ばれ、糖質コルチコイド作用を示す副腎皮質ホルモン剤を意味する。上記ヒドロコルチゾンの構造は、下記化学式３９の通りである。
【０１１８】
【化３９】
2020534356.tif 000052
（化学式３９） 
【０１１９】
本発明で用いられる用語の「プレドニゾン」とは、コルチゾン誘導体であり、糖質コルチコイド作用を示す副腎皮質ホルモン剤を意味する。上記プレドニゾンの構造は、下記化学式４０の通りである。
【０１２０】
【化４０】
2020534356.tif 000053
（化学式４０） 
【０１２１】
本発明で用いられる用語の「メチルプレドニゾン」とは、プレドニゾンの６番目の炭素の位置に結合された水素原子を、α−メチル基に置換した、副腎皮質ホルモン剤を意味する。上記メチルプレドニゾンの構造は、下記化学式４１の通りである。
【０１２２】
【化４１】
2020534356.tif 000054
（化学式４１） 
【０１２３】
本発明で用いられる用語の「エストリオール」とは、卵胞ホルモンに属するエストロゲンのような、ホルモン剤の一種を意味する。上記エストリオールの構造は、下記化学式４２の通りである。
【０１２４】
【化４２】
2020534356.tif 000055
（化学式４２） 
【０１２５】
上記ベタメタゾンバレラートの構造は、下記化学式４３の通りである。
【０１２６】
【化４３】
2020534356.tif 000056
（化学式４３） 
【０１２７】
上記ベタメタゾンジプロピオナートの構造は、下記化学式４４の通りである。
【０１２８】
【化４４】
2020534356.tif 000057
（化学式４４） 
【０１２９】
上記ジフルコルトロンバレラートの構造は、下記化学式４５の通りである。
【０１３０】
【化４５】
2020534356.tif 000058
（化学式４５） 
【０１３１】
上記ヒドロコルチソン１７−ブチラートの構造は、下記化学式４６の通りである。
【０１３２】
【化４６】
2020534356.tif 000059
（化学式４６） 
【０１３３】
上記モメタゾンフロアートの構造は、下記化学式４７の通りである。
【０１３４】
【化４７】
2020534356.tif 000060
（化学式４７）
【０１３５】
上記メチルプレドニゾロンアセポナートの構造は、下記化学式４８の通りである。
【０１３６】
【化４８】
2020534356.tif 000061
（化学式４８） 
【０１３７】
本発明の活性物質−ヘキサペプチド複合体において、活性物質がステロイドである場合、ステロイドと結合したヘキサペプチドを、「改変したヘキサペプチド複合体」と名付けた。
【０１３８】
具体的には、本発明は、ＥＥＭＱＲＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヘキサペプチドと、ステロイドとが結合された、改変したヘキサペプチド複合体を提供する。
【０１３９】
上記ステロイドは、ヘキサペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又は側鎖に結合することができる。具体的には、上記ステロイドは、リンカーを介して、ヘキサペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又は側鎖に結合することができる。
【０１４０】
上記ステロイドは、ヘキサペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または側鎖に位置するカルボキシ基やアミド基に、リンカーを介して結合することができる。上記側鎖に位置するカルボキシ基は、グルタミン酸の側鎖に位置するものであり得る。また、上記側鎖に位置するアミド基は、グルタミンの側鎖に位置するものであり得る。
【０１４１】
上記改変したヘキサペプチド複合体に係る第一形態は、下記化学式４９で表すことができる。
【０１４２】
【化４９】
2020534356.tif 000062
（化学式４９） 
（上記式において、Ｙはステロイドであり、Ｒ’及びＲ”がそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−Ｃ３アルキル基である。）
【０１４３】
上記ステロイドは、リンカーを介して、ヘキサペプチドのＮ末端と結合した複合体に係る第一形態においては、下記化学式４９−１で表すことができる。
【０１４４】
【化４９−１】
2020534356.tif 000063
（化学式４９−１） 
（Ｙはステロイドであり、Ｌ’はリンカーである。具体的には、上記リンカーは下記化学式５０で表すことができる。）
【０１４５】
【化５０】
2020534356.tif 000064
（化学式５０） 
（この際、上記ＺはＣ１〜Ｃ１０アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニレン基またはＣ６〜Ｃ１４アリーレン基である。）
【０１４６】
当分野で用いられる慣例に基づいて、本願に係る構造式では、
2020534356.tif 000065
は、核または骨格構造において、残基または置換基の付着点での結合を表すために使用される。
【０１４７】
本発明で用いられる用語の「アルキレン」とは、母体（ｐａｒｅｎｔ）アルカンの同一または異なる２つの炭素原子から、２つの水素原子が除去されて誘導される２つの１価ラジカル中心を有する、分岐鎖または直鎖、或いは、環状の飽和炭化水素ラジカルを意味する。例えば、アルキレン基は、１〜２０個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、または１〜６個の炭素原子を有することができる。典型的なアルキレンラジカルは、メチレン（−ＣＨ２−）、１，１−エチル（−ＣＨ（ＣＨ３）−）、１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，１−プロピル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−）、１，２−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）などを含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
本発明で用いられる用語の「アルケニレン」とは、母体アルケンの同一または異なる２つの炭素原子から、２つの水素原子が除去されて誘導される２つの１価ラジカル中心を有する、分岐鎖または直鎖、或いは、環状の不飽和炭化水素ラジカルを意味する。例えば、アルケニレン基は、１〜２０個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、または１〜６個の炭素原子を有することができる。典型的なアルケニレン基は、１，２−エチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含むが、これに限定されない。
【０１４９】
当業者であれば、「アルキル」、「アリール」、「ヘテロシクリル（複素環）」などの残基が、一つ以上の置換基によって置換される場合、これらは選択的に、「アルキレン」、「アリーレン」、「ヘテロシクリレン」などの残基として呼ばれること（即ち、母体である「アルキル」、「アリール」、「ヘテロシクリル」残基の一つ以上の水素原子が、言及した置換基で置換されることを意味する。）を認識するだろう。「アルキル」、「アリール」、「ヘテロシクリル」などのような残基が、本願において、「置換された」と呼ばれたり、図面上置換されたもの（または任意に置換されたもの。例えば、置換基の数が０ないし正の整数の場合）として図示される場合、「アルキル」、「アリール」、「ヘテロシクリル」などの用語は、「アルキレン」、「アリーレン」、「ヘテロシクリレン」などと相互互換的であると理解すべきである。
【０１５０】
本発明で用いられる用語の「アリール」とは、母体芳香族環システムの６つの炭素原子から、一つの水素原子が除去されて誘導される芳香族炭化水素ラジカルを意味する。例えば、アリール基は、６〜２０個の炭素原子、６〜１４個の炭素原子、又は６〜１２個の炭素原子を有することができる。典型的なアリール基は、ベンゼン（例えば、フェニル）、置換されたベンゼン、置換または非置換のナフタレン、置換または非置換のアントラセン、置換または非置換のビフェニル等から誘導されるラジカルを含むが、これらに限定されない。
【０１５１】
具体的には、上記Ｘは、
2020534356.tif 000066
からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【０１５２】
具体的に、上記リンカーは、グルタル酸（Ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、マレイン酸（Ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、マロン酸（Ｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、イソフタル酸（Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、テレフタル酸（Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、及び２，６‐ナフタレンジカルボン酸（２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される何れか一つであり得る。
【０１５３】
本発明で用いられる用語の「ヘキサペプチド」とは、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するヘキサペプチドを意味する。また、上記ヘキサペプチドは、ヘキサペプチドのＣ末端にカルボキシ基がアミド基で置換されたものであることができる。上記ヘキサペプチドは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列であり得る。
【０１５４】
上記アミド基は、第１級アミド基、第２級アミド基、及び第３級アミド基からなる群より選択される何れか一つのアミド基であり得る。好ましくは、上記アミド基は、第１級アミド基であり得る。上記ヘキサペプチド構造に係る第一形態は、有機酸−ヘキサペプチド複合体について上述したことと同じである。
【０１５５】
上記６種のステロイドが結合されたヘキサペプチド複合体の化学式を、表２に表した。
【０１５６】
【表２】
2020534356.tif 000067
2020534356.tif 000068
【０１５７】
また、上記８種のリンカーを介してベタメタゾンが結合されたヘキサペプチド複合体の構造を、表３に示した。
【０１５８】
【表３】
2020534356.tif 000069
2020534356.tif 000070
2020534356.tif 000071
【０１５９】
また、上記９種のリンカーを介してベタメタゾンバレラートが結合されたヘキサペプチド複合体を、表４に示した。
【０１６０】
【表４】
2020534356.tif 000072
【０１６１】
本発明者らは、ヘキサペプチドを利用した化粧料組成物を開発するために、皮膚炎やアトピー皮膚疾患に効能のあるステロイドと、化粧品向けの生理活性機能のヘキサペプチドとを結合し、改変したヘキサペプチド複合体を製造した（図４３〜図４８）。
【０１６２】
また、本発明者らは、上記ステロイドを用いた複合体に、抗酸化活性が現れることを確認した（表１１）。さらに、本発明者らは、上記の改変したヘキサペプチド複合体が、皮膚の再生や傷の回復に優れた効果を見せることを確認した（図５０及び５１）。したがって、本発明に係る改変したヘキサペプチド複合体は、それを有効成分として含む皮膚再生用と創傷治療用の組成物として、有効に使用することができる。
【０１６３】
本発明に係る他の形態は、活性物質−ヘキサペプチド複合体を有効成分として含んでなる、化粧料組成物を提供する。上記活性物質−ヘキサペプチド複合体は、有機酸−ヘキサペプチド複合体または改変したヘキサペプチド複合体であることができる。
【０１６４】
上記化粧料組成物は、皮膚老化防止、皮膚の再生効果を見せることができる。
【０１６５】
また、上記化粧料組成物は、化粧水、クリーム、ローション、セラム、エッセンス、及び紫外線遮断剤からなる群より選択される何れか一つの製剤であり得る。
【０１６６】
上記化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分として、有機酸−ペプチド複合体または改変したヘキサペプチド複合体のほか、一般的に、化粧品組成物に利用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解剤、ビタミン、顔料、及び香料のような、通常の補助剤または担体を含むことができる。
【０１６７】
また、上記化粧料組成物は、当業界で、一般的に製造される任意の剤型でも製造することができる。例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、パウダーファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されない。より詳細には、化粧水（収束化粧水、柔軟化粧水など）、クリーム、ローション、セラム、エッセンス、栄養ゲル、又はマッサージクリームの剤形として製造され得る。
【０１６８】
上記化粧料組成物の剤形が、ペースト、クリームまたはゲルインの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などを使用することができる。
【０１６９】
上記化粧料組成物の剤形が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解剤、または乳濁化剤を用いることができる。具体的には、担体成分は、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルであり得る。
【０１７０】
上記化粧料組成物の剤形が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール、またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラカントなどを利用することができる。
【０１７１】
上記化粧料組成物の剤形が、界面活性剤を含有するクレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテル硫酸、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを利用することができる。
【０１７２】
本発明に係る他の形態は、活性物質−ヘキサペプチド複合体を有効成分として含む、皮膚傷の治療用薬学組成物を提供する。上記活性物質−ヘキサペプチド複合体は、有機酸−ヘキサペプチド複合体、又は改変したヘキサペプチド複合体であり得る。
【０１７３】
上記薬学組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。具体的には、薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むことができるが、これに限定されない。
【０１７４】
上記薬学組成物は、上記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【０１７５】
上記薬学組成物は、当該発明の属する技術分野において、通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に従って、薬剤学的に許容される担体、及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量形態に製造したり、又は、多容量容器内に入れて製造することができる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳化液の形態であるか、エキス製剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【０１７６】
上記薬学組成物は、軟膏基剤（Ｏｉｎｔｍｅｎｔ  ｂａｓｅ）に希釈して、局所塗布剤用軟膏を製造して、一日に１〜５回、病変部位に塗布することができ、ゲル製剤に希釈した局所塗布剤用パック剤を製造して、一日に１〜５回、病変部位に適用することができる。
【０１７７】
本発明に係る他の形態は、皮膚状態を改善するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【０１７８】
本発明に係る他の形態は、皮膚状態を改善する化粧料組成物を製造するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【０１７９】
本発明に係る他の形態は、皮膚傷を治療するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【０１８０】
本発明に係る他の形態は、皮膚傷を治療する薬剤を製造するべく、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体の用途を提供する。
【０１８１】
本発明に係る他の形態は、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体を、個体の皮膚に処理するステップを含む、皮膚状態の改善方法を提供する。上記皮膚状態を改善するとは、皮膚の老化を防止したり、皮膚の再生を促進させたりすることを意味する。
【０１８２】
本発明に係る他の形態は、本発明に係る活性物質−ヘキサペプチド複合体を、個体の皮膚に処理するステップを含む、皮膚傷の治療方法を提供する。
【実施例】
【０１８３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の一例を示すものであり、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【０１８４】
実施例１．有機酸−ヘキサペプチド複合体の製造
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの原料は、ＧＬＳ（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）から購入した。また、有機酸は、ＴＣＩ（ＴＣＩ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａ）とＳｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）から購入した（表５）。また、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ＤＩＥＡ（Ｎ、Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、ＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、及びピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）は、Ｄａｅｊｕｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｍｅｔａｌｓ（Ｋｏｒｅａ）から購入して使用した。
【０１８５】
【表５】
2020534356.tif 000073
【０１８６】
実施例１．１．有機酸−ヘキサペプチド複合体の合成
有機酸−ヘキサペプチド複合体の合成工程は、下記（１）〜（６）の工程プロセスで示した。また、合成工程の条件は、下記表６に示した。
【０１８７】
【表６】
2020534356.tif 000074
【０１８８】
（１）樹脂膨張（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）
ろ過膜が装着された固相（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ）合成反応器に、合成末端にカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有するペプチドの合成は、クロロトリチルクロリド樹脂（２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、Ｂｅａｄ  Ｔｅｃｈ）を用いた。また、合成末端にペプチド結合（−ＣＯＮＨ２）に終わるペプチド合成は、リンクアミド樹脂（Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、ＧＬＳ）を用いた。ＤＣＭ及びＤＭＦを使用して、３０分間樹脂を膨張させた。
【０１８９】
（２）アミノ酸ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）
クロロトリチルクロライド樹脂を用いた合成は、最初のアミノ酸を樹脂にロードさせるプロセスが含まれた。膨張させた樹脂を減圧下で、ろ過膜にて溶媒を除去した。上記樹脂に２当量のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨをＤＭＦに完全に溶かした後、クロロトリチルクロライド樹脂に添加し、密度を調整したＤＩＥＡを、クロロトリチルクロライド樹脂の４当量に対応する量で添加した。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で反応を行った。
【０１９０】
（３）樹脂Ｆｍｏｃ脱保護
上記クロロトリチルクロライド樹脂またはリンクアミド樹脂を用いた合成プロセスは、Ｆｍｏｃの脱保護反応させるプロセスが含まれた。樹脂Ｆｍｏｃ脱保護のプロセスは、減圧下で、ろ過膜にて溶媒を除去した後、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを添加したＤＭＦを使用して、５分間洗浄した。次に、また２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを添加したＤＭＦを使用して、１０分間洗浄した。減圧下で濾過して反応液を除去し、ＤＣＭまたはＤＭＦを使用して、２分ずつ６回以上洗浄した。
【０１９１】
（４）アミノ酸の合成と有機酸の結合
上記リンクアミド樹脂に、３〜５当量のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（ＧＬＳ）を、ＤＭＦに完全に溶かした後、溶媒を除去したリンクアミド樹脂に入れた。カップリング試薬（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）で、２Ｍ  ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ／ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を、アミノ酸当量とリンクアミド樹脂の量に合わせて入れた。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で合成を行った。反応完了後、溶媒をベントしてから、きれいなＤＭＦで２分ずつ６回かけて洗浄した。
【０１９２】
洗浄後、上記アミノ酸の結合方法と同じ方法で、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨのアミノ酸を順番にカップリングした。次に、ヘキサペプチドが合成された状態の樹脂に、フェルラ酸を４当量、２Ｍ  ＨＯＢｔ／ＤＩＣを、アミノ酸当量と樹脂量に合わせて入れた。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で反応させた。
【０１９３】
（５）分離（Ｃｌｅａｖａｇｅ）
上記反応の完了後、減圧下で、ろ過膜にて溶媒を除去した後、きれいなＤＭＦで２分ずつ２回、ＤＣＭで２分ずつ２回かけて洗浄した。次に、殆どの溶媒をベントして除去した。乾燥されたフェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の樹脂を、７０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／２９％（ｖ／ｖ）ＤＣＭ／１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ 溶液を用いて、４時間分離を行った。
【０１９４】
（６）再結晶（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅ）
分離が完了した溶媒を、エチルエーテル（Ｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を用いて、粗（Ｃｒｕｄｅ）製品を再結晶化させて抽出した。
【０１９５】
また、ギ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、グルクロン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、乳酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メバル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、プロピオン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ピルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、キナ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シキミ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アビエチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アシアト酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、コール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ウルソデオキシコール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ウルソール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アゼライン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジピコリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、フマル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、イタコン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、リンゴ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、しゅう酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、コハク酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、酒石酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、α‐ケトグルタル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、クエン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、リポ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ソルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ビオチン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、トレチノイン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、カフェ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シナミック酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ニコチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びシリング酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体においても、上記フェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の合成工程と同じ方法で合成した。
【０１９６】
実施例１．２．有機酸−ヘキサペプチド複合体の精製
実施例１．１．で合成したフェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の粗製品を、１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを添加した蒸留水の溶液に溶かした。次に、下記のようなグラデーション（ｇｒａｄｉｅｎｔ）の条件下で、ＨＰＬＣで精製した後、凍結乾燥してフェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体を得た（図１〜図３４）。上記グラデーションは下記表７に示した。
【０１９７】
Ａ．機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ８Ａ（５ｃｍ＊２５ｃｍ）／８Ａ（ｐｒｅｐ（ｄｉａ５ｃｍ））
Ｂ．溶媒の組成：バッファＡ＝０．０５％ＴＦＡ／アセトニトリル、バッファＢ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ
Ｃ．流れ速度（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１４ｍｌ／分
Ｄ．カラム：Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  Ｃ１８  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ
Ｅ．吸光度：２３０ｎｍ
Ｅ．グラデーション
【０１９８】
【表７】
2020534356.tif 000075
【０１９９】
また、ギ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、グルクロン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、乳酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メバル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、プロピオン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ピルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、キナ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シキミ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アビエチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アシアト酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、コール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ウルソデオキシコール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ウルソール酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、アゼライン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジピコリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、フマル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、イタコン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、リンゴ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、しゅう酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、コハク酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、酒石酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、α‐ケトグルタル酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、クエン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、リポ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ソルビン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ビオチン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、トレチノイン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、カフェ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、シナミック酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ニコチン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びシリング酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体においても、上記フェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２の精製工程と同じ方法を用いて精製した。
【０２００】
実験例１．ヘキサペプチドのＮ末端、Ｃ末端または側鎖の位置での有機酸結合の確認
ヘキサペプチドのＮ末端、Ｃ末端または側鎖の位置において、有機酸が結合できるかどうかを確認するために、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２の複合体を合成した。
【０２０１】
上記ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の合成方法は、図３５〜図３７に示した。ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体は、実施例１と同じ方法で合成した（図３５）。
【０２０２】
上記ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸複合体は、下記プロセスを通して合成した。まず、トリチル樹脂（ｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ）を反応器に入れ、ＤＣＭ／ＤＭＦを用いて２回洗浄した後、ＤＣＭを用いて、３０分間、反応器で樹脂を膨潤させた。次に、樹脂にアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）アミノ酸２ｅｑ及びＤＩＥＡ  ｌｅｑを入れ、４時間ロードした。ロード後、ＤＭＦを用いて、５回洗浄した。上記アルギニンをロードした方法と同じ方法で、アルギニン、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン酸の順で、残り５つのアミノ酸をロードした。このプロセスを繰り返して、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲを合成した後、樹脂を５％ＴＦＡ／ＤＣＭを用いて、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲを抽出した。次に、ＨＯＢｔ、ＤＩＣを用いて、ゲラン酸をＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲのＮ末端に結合させた（図３６）。
【０２０３】
反応が完了したＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸を、ＤＭＦで３〜４回、ＤＣＭで３〜４回洗浄し、ポンプを利用して乾燥した。乾燥プロセスが完了した後、７０％ＴＦＡを用いて、実施例１．１の（５）分離プロセスと同様に、４時間分離プロセスを行った。
【０２０４】
実施例１．１の（６）再結晶プロセスと同様に、反応器から、分離プロセスが終わった溶液（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、チューブに移して空気乾燥し、エチルエーテルを利用して、溶液内に溶けているＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸を固体状態で回収した。回収したＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸を、ＨＰＬＣ分析後、精製を行った。
【０２０５】
上記ＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２は、上記実験例１と同様の方法で、ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２をペプチド合成した後、グルタミンの保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を除去した後、ＥＤＣ、ＨｏＡｔを添加してエチレングリコールリンカーを結合し、ＤＭＦで３回洗浄した後、ＨＯＢｔ、ＤＩＣを用いてゲラン酸を結合させた（図３７）。次に、実施例１．１の（５）分離及び（６）再結晶のプロセスと同様に、分離及び再結晶のプロセスを行った。回収したＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２を、ＨＰＬＣ分析後、精製を行った。
【０２０６】
実験例２．有機酸−ヘキサペプチド複合体の抗酸化効果の確認
安定したフリーラジカルであるＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｈｙｄｒａｚｙｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｄ９１３２−１Ｇ）を利用して、ラジカルが減少する程度を分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定し、間接的に試料の抗酸化活性を測定した。具体的には、エタノール０．４ｍｌに、０．１ｍＭのＤＰＰＨ溶液０．５ｍｌ、及び上記実施例１で合成した様々な濃度の有機酸−ヘキサペプチド複合体（試料）を、それぞれ０．１ｍｌずつ添加し、１０秒間、強くヴォルテックスした後、冷暗所で３０分間反応させた。
【０２０７】
次に、分光光度計ＥＬＩＳＡを用いて、５１７ｎｍの波長で吸光度を測定した。陽性対照群としては、ビタミンＣ（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）を使用した。
【０２０８】
（数式１）
ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉活性（％）＝｛１−試料の吸光度／Ｂｌａｎｋの吸光度）×１００｝
【０２０９】
ＤＰＰＨは、エタノール内で固有の紫色を表しており、抗酸化物質によって還元されると、固有の紫色を失い、黄色に変わることになる。ＤＰＰＨは、５１７ｎｍの波長で、分光分析によって、ラジカルの測定が可能である。
【０２１０】
その結果、ヘキサペプチド複合体を濃度別に処理した際、ＤＰＰＨのフリーラジカルの捕捉活性が、濃度に応じた抗酸化活性の増加を確認した。また、抗酸化作用の優れたビタミンＣと比較すると、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、且つカフェ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２で、ビタミンＣと同様のＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉活性を示した（表８）。
【０２１１】
【表８】
2020534356.tif 000076
【０２１２】
上記表８におけるＳＣ５０は、フリーラジカルを５０％消去するときの試料濃度を示す。その他の有機酸−ヘキサペプチド複合体でも、ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉活性を示しており、上記３４種の有機酸−ヘキサペプチド複合体は、抗酸化化粧料組成物として使用できることを確認した。
【０２１３】
実験例３．有機酸−ヘキサペプチド複合体における皮膚再生効果の確認
傷の回復実験（Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）で、有機酸−ヘキサペプチド複合体による細胞増殖と移動促進の有無に基づいて、皮膚再生の効果を評価した。ヒト表皮角化細胞株（ＨａＣａＴ（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＡｄｄｅｘＢｉｏ、ＵＳ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：Ｔ００２０００１））を使用しており、細胞培養のためのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃは、ＧＩＢＣＯから購入し、ＦＢＳ（ｆａｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）は、Ｃａｐｒｉｃｏｒｎから購入して使用した。
【０２１４】
ＨａＣａＴ細胞は、ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃと一緒に、１００ｍｍ／６０．１ｃｍ２のペトリ皿で、３７℃、５％ＣＯ２，１００％湿潤の条件下で、培養器で培養した。ＨａＣａＴ細胞の細胞飽和度が９０％程度になるとき、１００ｍｍ／６０．１ｃｍ２のペトリ皿で、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１２−ウェル−プレートに分注し、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２，１００％湿潤の条件下で、培養器で培養した。
【０２１５】
次に、ＦＢＳを添加していないＤＭＥＭに交換した後、各ウェルに２００μｌピペット‐チップを利用してスクラッチングをした。実験群として実施例１で製造した有機酸−ヘキサペプチド複合体を使用しており、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。陽性対照群としてｈＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用しており、０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。陰性対照群として１×ＰＢＳを使用した。
【０２１６】
実験群または対照群を処理した後、直ぐに細胞の写真を顕微鏡で撮り、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。更に２０時間培養した後、顕微鏡で細胞の写真を撮って、ＩｍａｇｅＪプログラムを利用し、細胞の再生の程度を計算した。ＳＰＳＳ統計分析プログラムで統計分析を行い、シグマプロットプログラムでグラフに表した。統計学的有意性は、Ｐ値（ｖａｌｕｅ）が０．０５ 以下である場合、有意であると評価した。
【０２１７】
（数式２）
傷の回復面積（Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）（％）＝｛（ＡＢ）／Ａ｝×１００
Ａ＝実験群または対照群の処理直後、０時間帯、傷の面積
Ｂ＝実験群または対照群の処理後、２０時間帯、傷の面積
【０２１８】
その結果、有機酸−ヘキサペプチド複合体の３４種の全てにおいて、陰性対照群（ＰＢＳ）に比べて、回復面積が増加した。その中でも、フェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２が、陰性対照群に比べ、それぞれの回復面積（ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）が約２倍以上増加した。そして効能の良いフェルラ酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２と、ロスマリン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２と、それぞれのＡｃｅｔｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２（Ａｃｅｔｙｌ  ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ−８）、ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２（ヘキサペプチド）、及び有機酸とにおいて、傷の回復面積を比較すると、有機酸−ヘキサペプチド複合体の方が、それぞれ（有機酸、ヘキサペプチド）で処理した方よりも、回復面積（ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）が増加した（図３８ａ〜図３８ｃ）。
【０２１９】
また、実験例１で製造したゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体による、細胞増殖且つ移動促進の有無に基づいて、皮膚再生の効果を評価した。実験方法は、上記と同様に行った。
【０２２０】
その結果、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の全てにおいて、陰性対照群に比べて、それぞれの回復面積（ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）が約２倍以上増加した。これにより、有機酸−ヘキサペプチド複合体が細胞の増殖と移動を促進し、回復面積を増加させることに効果的であり、したがって、皮膚の再生にも効能を有するため、化粧料組成物として使用できることを確認した（図３９）。
【０２２１】
実験例４．有機酸−ヘキサペプチド複合体における細胞毒性の確認
ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の細胞毒性を確認するために、ＷＳＴ−１分析を行った。
【０２２２】
具体的には、十分に成長した細胞を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、９６−ウェル−プレートに移し培養した。細胞がプレートの底にすべて取り付けられるように、２４時間培養しており、いくつかのウェルは、細胞なしで培地のみを詰めた。サンプルは、ＤＭＥＭを用いて、最終体積が１００μｌ になるように製造した。ＷＳＴ−１試薬は、各ウェル当り１０μｌを分注し、分注後、４時間、３７℃の温度で培養した。その後、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒを利用して、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０２２３】
その結果、図４０に示したように、ゲラン酸−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ−ＥＥＭＱＲＲ−ゲラン酸、及びＣＯＯＨ−ＥＥ（ゲラン酸）ＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の全てにおいて、細胞毒性が現れないことを確認した。
【０２２４】
実施例２．改変したヘキサペプチド複合体の製造
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの原料は、ＧＬＳ（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）から購入した。また、ベタメタゾン、ベタメタゾンバレラート（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ）、ベタメタゾンジプロピオナート（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｄｉｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、モメタゾンフロアート（Ｍｏｍｅｔａｓｏｎｅ  ｆｕｒｏａｔｅ）、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチソン１７−ブチラート（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  １７−ｂｕｔｙｒａｔｅ）、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、及びエストリオールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）から購入した。また、グルタル酸無水物（ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）は、ＴＣＩ（ＴＣＩ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。また、ジフルコルトロンバレラート（Ｄｉｆｌｕｃｏｒｔｏｌｏｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ）、及びメチルプレドニゾロンアセポナート（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ａｃｅｐｏｎａｔｅ）は、Ｈｅｎａｎ  Ｔｉａｎｆｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。また、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ＤＩＥＡ（Ｎ、Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、ＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、及びピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）は、Ｄａｅｊｕｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｍｅｔａｌｓ（Ｋｏｒｅａ）から購入して使用した。
【０２２５】
実施例２．１．改変したヘキサペプチド複合体の合成
改変したヘキサペプチド複合体の合成工程は、下記（１）〜（８）の工程で示した。また、合成工程の条件は、下記表９に示した。
【０２２６】
【表９】
2020534356.tif 000077
【０２２７】
（１）樹脂膨張（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）
ろ過膜が装着された固相（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ）合成反応器において、合成末端にカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有するペプチドの合成は、クロロトリチルクロリド樹脂（２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、Ｂｅａｄ  Ｔｅｃｈ）を用いた。また、合成末端にペプチド結合（−ＣＯＮＨ２）に終わるペプチド合成は、リンクアミド樹脂（Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、ＧＬＳ）を用いた。ＤＣＭとＤＭＦを使用して、３０分間、樹脂を膨張させた。
【０２２８】
（２）アミノ酸ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）
クロロトリチルクロライド樹脂を用いた合成は、最初のアミノ酸を樹脂にロードさせるプロセスを含んでいる。膨張させた樹脂を、減圧下で、ろ過膜にて溶媒を除去した。上記樹脂に、２当量のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを、ＤＭＦに完全に溶かした後、クロロトリチルクロライド樹脂に添加し、密度を調整したＤＩＥＡを、クロロトリチルクロライド樹脂の４当量に対応する量で添加した。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で反応を行った。
【０２２９】
（３）樹脂Ｆｍｏｃ脱保護
上記クロロトリチルクロライド樹脂またはリンクアミド樹脂を用いた合成プロセスは、Ｆｍｏｃの脱保護の反応をさせるプロセスが含まれた。樹脂Ｆｍｏｃ脱保護プロセスは、減圧下で、ろ過膜にて溶媒を除去した後、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを添加したＤＭＦを使用して、５分間洗浄した。次に、また２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを添加したＤＭＦを使用して、１０分間洗浄した。減圧下で、ろ過して反応液を除去し、ＤＣＭまたはＤＭＦを使用して、２分ずつ６回以上洗浄した。
【０２３０】
（４）アミノ酸の合成
上記リンクアミド樹脂に、３〜５当量のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（ＧＬＳ）を、ＤＭＦに完全に溶かした後、溶媒を除去したリンクアミド樹脂に入れた。カップリング試薬（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）で、２Ｍ  ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ／ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を、アミノ酸当量とリンクアミド樹脂の量に合わせて入れた。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で合成を行った。反応が完了したら、溶媒をベントした後、きれいなＤＭＦで２分ずつ６回かけて洗浄した。
【０２３１】
洗浄後、上記のアミノ酸の結合方法と同様の方法で、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨのアミノ酸を順番にカップリングした。
【０２３２】
（５）リンカー結合
（５−１）ＤＩＥＡを用いたリンカー結合
上記ヘキサペプチドが合成された状態の樹脂に、Ｆｍｏｃ脱保護を行い、洗浄された樹脂に、リンカーとして、グルタル酸無水物（ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を３当量、２Ｍの濃度のＤＩＥＡを、グルタル酸無水物当量とリンクアミド樹脂量に合わせて入れた。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で合成を行った。反応が完了したら、溶媒をベントした後、きれいなＤＭＦで２分ずつ６回かけて洗浄した。
【０２３３】
上記グルタル酸無水物の代わりに、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはマレイン酸無水物（Ｍａｌｅｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を利用して、コハク酸リンカーまたはマレイン酸リンカーを結合させた。
【０２３４】
（５−２）ＨＯＢＴ／ＤＩＣを用いたリンカー結合
また、上記ヘキサペプチドが合成された状態の樹脂に、Ｆｍｏｃ脱保護を行い、洗浄された樹脂に、リンカーとして、マロン酸（Ｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を３当量、２Ｍの濃度のＨＯＢＴ／ＤＩＣを、マロン酸当量とリンクアミド樹脂量に合わせて入れた。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で合成を行った。反応が完了したら、溶媒をベントした後、きれいなＤＭＦで２分ずつ６回かけて洗浄した。
【０２３５】
上記マロン酸の代わりに、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、イソフタル酸（Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、テレフタル酸（Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、又は２，６‐ナフタレンジカルボン酸（２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を利用して、アジピン酸リンカー、フマル酸リンカー、イソフタル酸リンカー、テレフタル酸リンカー、又は２，６‐ナフタレンジカルボン酸リンカーを結合させた。
【０２３６】
（６）ステロイド結合
次に、リンカー結合された状態のヘキサペプチド樹脂に、ベタメタゾンを３当量、２Ｍの濃度のＤＭＡＰ／ＤＩＣを、アミノ酸当量と樹脂量に合わせて入れた。次に、反応器を用いて、５時間以上、２５℃〜３２℃の温度で反応させた。
【０２３７】
（７）分離（Ｃｌｅａｖａｇｅ）
反応が完了したら、減圧下で、ろ過膜にて溶媒を除去した後、きれいなＤＭＦで２分ずつ２回、ＤＣＭで２分ずつ２回かけて洗浄した。次に、殆どの溶媒をベントして除去した。乾燥された改変したヘキサペプチド複合体樹脂を、７０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／２９％（ｖ／ｖ）ＤＣＭ／１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ溶液を用いて、４時間分離を行った（図４１及び図４２）。
【０２３８】
（８）再結晶（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅ）
分離が完了された溶媒を、エチルエーテル（Ｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を用いて、粗（Ｃｒｕｄｅ）製品を再結晶化させて、ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２を抽出した。
【０２３９】
上記ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２の合成方法と同様の方法で、デキサメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、プレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、エストリオール−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２  、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２を合成した。
【０２４０】
実施例２．２．改変したヘキサペプチド複合体の精製
実施例２．１．で合成したベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の粗製品を１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを添加した蒸留水の溶液に溶かした。次に、下記グラデーション（ｇｒａｄｉｅｎｔ）の条件下で、ＨＰＬＣで精製した後、凍結乾燥してベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体を得た（図４３〜図４８）。上記グラデーションは、下記表１０に示した。
【０２４１】
Ａ．機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ８Ａ（５ｃｍ＊２５ｃｍ）／８Ａ（ｐｒｅｐ（ｄｉａ  ５ｃｍ））
Ｂ．溶媒の組成：バッファＡ＝０．０５％ＴＦＡ／アセトニトリル、バッファＢ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ
Ｃ．流れ速度（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１４ｍｌ／分
Ｄ．カラム：Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  Ｃ１８  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ
Ｅ．吸光度：２３０ｎｍ
Ｅ．グラデーション
【０２４２】
【表１０】
2020534356.tif 000078
【０２４３】
また、デキサメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、プレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びエストリオール−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体、ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂ ｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体においても、上記ベタメタゾン−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の精製工程と同様の方法で精製した。
【０２４４】
実験例４．改変したヘキサペプチド複合体の抗酸化効果の確認
安定フリーラジカルであるＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｈｙｄｒａｚｙｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｄ９１３２−１Ｇ）を利用して、ラジカルが減少する程度を分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定し、間接的に試料の抗酸化活性を測定した。具体的には、エタノール０．４ｍｌに、０．１ｍＭのＤＰＰＨ溶液０．５ｍｌ且つ上記実施例２．で合成した、様々な濃度の改変したヘキサペプチド複合体（試料）を、それぞれ０．１ｍｌずつ添加し、１０秒間、強くヴォルテックスした後、冷暗所で３０分間反応させた。
【０２４５】
次に、分光光度計ＥＬＩＳＡを用いて、５１７ｎｍの波長で吸光度を測定した。陽性対照群としては、ビタミンＣ（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）を使用した。
【０２４６】
（数式１）
ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉活性（％）＝｛１−試料の吸光度／Ｂｌａｎｋの吸光度）×１００｝
【０２４７】
ＤＰＰＨは、エタノール内で固有の紫色を示しており、抗酸化物質によって還元されると、固有の紫色を失い、黄色に変わることになる。ＤＰＰＨは、５１７ｎｍの波長で、分光分析にてラジカルを測定することができる。
【０２４８】
その結果、改変したヘキサペプチド複合体を濃度別に処理した際に、ＤＰＰＨのフリーラジカルの捕捉活性が、濃度に応じて抗酸化活性が増加することを確認した（表１１）。
【０２４９】
【表１１】
2020534356.tif 000079
【０２５０】
上記表１１は、改変したヘキサペプチド複合体のＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉活性を示した表である。ＳＣ５０は、フリーラジカルを５０％消去する際の試料濃度に意味する。その他、改変したヘキサペプチド複合体でも、ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉活性を示しており、上記の６種の改変したヘキサペプチド複合体は、抗酸化の化粧料組成物として使用できることを確認した。
【０２５１】
実験例５．改変したヘキサペプチド複合体の皮膚再生効果の確認
傷の回復実験（Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）にて、改変したヘキサペプチド複合体による細胞増殖と移動の促進有無に基づいて、皮膚再生の効果を評価した。ヒト表皮角化細胞株（ＨａＣａＴ（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＡｄｄｅｘＢｉｏ、ＵＳ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：Ｔ００２０００１））を使用しており、細胞培養のためのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃは、ＧＩＢＣＯから購入し、ＦＢＳ（ｆａｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）は、Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ から購入して使用した。
【０２５２】
ＨａＣａＴ細胞は、ＤＭＥＭに、１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃと一緒に、１００ｍｍ／６０．１ｃｍ２のペトリ皿で、３７℃、５％ＣＯ２，１００％湿潤の条件下で、培養器で培養した。ＨａＣａＴ細胞の細胞飽和度が９０％程度になるとき、１００ｍｍ／６０．１ｃｍ２のペトリ皿で、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１２ウェル−プレートに分注して、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２，１００％湿潤の条件下で、培養器で培養した。
【０２５３】
次に、ＦＢＳを添加していないＤＭＥＭに交換した後、各ウェルに２００μｌのピペット‐チップを利用してスクラッチングをした。実験群として、実施例２で合成して改変したヘキサペプチド複合体を使用し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。陽性対照群として、ｈＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用し、０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。陰性対照群として１×ＰＢＳを使用した。
【０２５４】
実験群または対照群を処理した後、直ぐに細胞の写真を顕微鏡で撮り、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。更に２０時間培養した後、顕微鏡で細胞の写真を撮って、ＩｍａｇｅＪ プログラムを利用して、細胞の再生の程度を計算した。ＳＰＳＳ統計分析プログラムで統計分析を行い、シグマプロットプログラムでグラフに表した。統計学的有意性は、Ｐ値（ｖａｌｕｅ）が０．０５ 以下である場合、有意であると評価した。
【０２５５】
（数式２）
傷の回復面積（Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）（％）＝｛（ＡＢ）／Ａ｝×１００
Ａ＝実験群または対照群の処理直後、０時間帯、傷の面積
Ｂ＝実験群または対照群の処理後、２０時間帯、傷の面積
【０２５６】
その結果、改変したヘキサペプチド複合体の６種の全てにおいて、陰性対照群（ＰＢＳ）に比べて、回復面積が増加した（図４９）。
【０２５７】
また、実施例２．で合成したベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びメチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体による細胞増殖と移動の促進有無に基づいて、皮膚再生の効果を評価した。実験方法は、上述した方法と同様に行った。
【０２５８】
その結果、ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びメチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の全てにおいて、陰性対照群に比べて、それぞれの回復面積（ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）が約２倍以上増加した（図５０）。
【０２５９】
さらに、実施例２．で製造した９種のリンカーを用いて、ステロイドを結合させたベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体による、細胞増殖と移動の促進有無に基づいて、皮膚再生の効果を評価した。実験方法は、上述した方法と同様に行った。
【０２６０】
その結果、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の全てにおいて、陰性対照群に比べて、それぞれの回復面積（ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅａ）が約２倍以上増加した。これにより、改変したヘキサペプチド複合体が、細胞の増殖と移動を促進して、回復面積を増加させることに効果的であり、したがって、皮膚の再生にも効果を有しており、化粧料組成物として使用できることを確認した（図５１）。
【０２６１】
実験例６．改変したヘキサペプチド複合体の細胞毒性の確認
ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の細胞毒性を確認するために、ＷＳＴ−１分析を行った。
【０２６２】
具体的には、十分に成長した細胞を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、９６ウェル−プレートに移し培養した。細胞をプレートの底にすべて取り付けられるように、２４時間培養しており、いくつかのウェルは、細胞なしで培地のみを詰めた。サンプルは、ＤＭＥＭを用いて、最終的体積が１００μｌ になるように製造した。ＷＳＴ−１試薬は、各ウェル当り１０μｌを分注し、分注後、４時間、３７℃の温度で培養した。その後、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒを利用して、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０２６３】
その結果、図５２及び図５３に示したように、ベタメタゾンバレラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンジプロピオナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ジフルコルトロンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｏｙｌ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ヒドロコルチソン１７−ブチラート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、モメタゾンフロアート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、メチルプレドニゾロンアセポナート−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｇｌｕｔａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｓｕｃｃｉｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｅｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｍａｌｏｎｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ａｄｉｐｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｆｕｍａｒｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｉｓｏｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、ベタメタゾンバレラート−Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２、及びベタメタゾンバレラート−２，６−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ−ＥＥＭＱＲＲ−ＮＨ２複合体の全てにおいて、細胞毒性が現れないことを確認した。
【図１】
2020534356.tif 000082
【図２】
2020534356.tif 000083
【図３】
2020534356.tif 000084
【図４】
2020534356.tif 000085
【図５】
2020534356.tif 000086
【図６】
2020534356.tif 000087
【図７】
2020534356.tif 000088
【図８】
2020534356.tif 000089
【図９】
2020534356.tif 000090
【図１０】
2020534356.tif 000091
【図１１】
2020534356.tif 000092
【図１２】
2020534356.tif 000093
【図１３】
2020534356.tif 000094
【図１４】
2020534356.tif 000095
【図１５】
2020534356.tif 000096
【図１６】
2020534356.tif 000097
【図１７】
2020534356.tif 000098
【図１８】
2020534356.tif 000099
【図１９】
2020534356.tif 000100
【図２０】
2020534356.tif 000101
【図２１】
2020534356.tif 000102
【図２２】
2020534356.tif 000103
【図２３】
2020534356.tif 000104
【図２４】
2020534356.tif 000105
【図２５】
2020534356.tif 000106
【図２６】
2020534356.tif 000107
【図２７】
2020534356.tif 000108
【図２８】
2020534356.tif 000109
【図２９】
2020534356.tif 000110
【図３０】
2020534356.tif 000111
【図３１】
2020534356.tif 000112
【図３２】
2020534356.tif 000113
【図３３】
2020534356.tif 000114
【図３４】
2020534356.tif 000115
【図３５】
2020534356.tif 000116
【図３６】
2020534356.tif 000117
【図３７】
2020534356.tif 000118
【図３８ａ】
2020534356.tif 000119
【図３８ｂ】
2020534356.tif 000120
【図３８ｃ】
2020534356.tif 000121
【図３９】
2020534356.tif 000122
【図４０】
2020534356.tif 000123
【図４１】
2020534356.tif 000124
【図４２】
2020534356.tif 000125
【図４３】
2020534356.tif 000126
【図４４】
2020534356.tif 000127
【図４５】
2020534356.tif 000128
【図４６】
2020534356.tif 000129
【図４７】
2020534356.tif 000130
【図４８】
2020534356.tif 000131
【図４９】
2020534356.tif 000132
【図５０】
2020534356.tif 000133
【図５１】
2020534356.tif 000134
【図５２】
2020534356.tif 000135
【図５３】
2020534356.tif 000136
【配列表】
2020534356000001.app
【国際調査報告】
2020534356.tif 000137
2020534356.tif 000138
2020534356.tif 000139
2020534356.tif 000140
2020534356.tif 000141
2020534356.tif 000142