(57)【要約】対象ポリペプチドを発現する組換え微生物が、本明細書中に提供される。微生物は、対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリンプロモーターを含む発現構築物を含み得る。フラジェリンプロモーター配列は、翻訳のCsrAによる阻害を低下させる遺伝子修飾を含み得る。微生物は、SigDによる転写開始のFlgMによる阻害を低下させる遺伝子修飾も含み得る。標的ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼであり得る。そのような微生物は、アルコールによる宿酔の処置において有用である。2020535801.tif 000041
2020535801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールによる宿酔を防止するかまたは処置するための方法であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成的に発現するように組換え的に改変された組換え細菌を含む組成物の有効量を、それを必要とする対象の消化管へ投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
組換え細菌が、
（a）アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、ポリヌクレオチド；および
（b）シグマ因子リプレッサーの遺伝子修飾であって、フラジェリン遺伝子プロモーターからのシグマ因子による転写開始の阻害を低下させる、修飾
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細菌が、バチルス（Bacillus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エシェリキア（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ペディオコッカス、およびストレプトコッカス（Streptococcus）より選択される属に属する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
（1）細菌がバチルス属に属し、（2）フラジェリン遺伝子プロモーターが、CsrA BS1結合部位および/またはCsrA BS2結合部位の1個または複数個の遺伝子修飾を含む修飾型バチルスhagプロモーターであり、（3）シグマ因子がSigDであり、（4）SigDリプレッサーがFlgMである、請求項2記載の方法。
【請求項５】
hagプロモーターが、12塩基対BS1結合部位における、またはBS1のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個の遺伝子修飾を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
hagプロモーターが、CsrA BS1認識配列AGGAの修飾を含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
hagプロモーターが、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000034
を含む、請求項4記載の方法。
【請求項８】
1個または複数個の遺伝子修飾が、CsrA BS2結合部位に対する1個または複数個の点変異を含む、請求項4記載の方法。
【請求項９】
hagプロモーターが、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS2のステムループ構造を破壊する1個または複数個の遺伝子修飾を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
hagプロモーターがBS2結合部位の修飾を含み、該修飾がヌクレオチド配列
2020535801.tif 000035
を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが細菌アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、（1）カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）由来のAcoD、および（2）大腸菌（E.coli）由来のAldBより選択される、請求項4記載の方法。
【請求項１３】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、flgM遺伝子の全部または一部の欠失を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１４】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、二次構造または三次構造を破壊するものである、請求項4記載の方法。
【請求項１５】
発現構築物が細菌染色体に位置する、請求項4記載の方法。
【請求項１６】
アルコールの消費中に組成物を対象へ投与する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
アルコールの消費の開始前24時間以内に組成物を対象へ投与する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
組成物が経口投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
組成物が、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質、水、カプセル増量剤、ならびに粘着性材料より選択される生理学的に許容される担体をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
組成物が、約104〜約1012コロニー形成単位の組換え細菌を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、ポリヌクレオチド；および
（b）SigDによる転写開始の阻害を低下させるflgM遺伝子の遺伝子修飾
を含む、組換え微生物。
【請求項２２】
ポリペプチドを構成的に発現する、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項２３】
プロバイオティックである、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項２４】
バチルス、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカス、大腸菌、ラクトバチルス、ロイコノストック、ペディオコッカス、ペディオコッカス、およびストレプトコッカスより選択される属に属する、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項２５】
バチルス属に属する、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項２６】
B.スブチリス（subtilis）である、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項２７】
フラジェリン遺伝子プロモーターがhagプロモーターである、前記請求項のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項２８】
hagプロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含み、遺伝子修飾が、CsrA BS1結合部位および/またはCsrA BS2結合部位の修飾（例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、または欠失）を含む、請求項27記載の組換え微生物。
【請求項２９】
1個または複数個の遺伝子修飾が、CsrA BS1認識配列AGGAに対する1個または複数個（例えば、2個、3個、または4個）の遺伝子修飾、例えば、配列AGAAへの修飾を含む、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３０】
1個または複数個の遺伝子修飾が、12塩基対BS1結合部位における、またはBS1のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個の遺伝子修飾を含む、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３１】
1個または複数個の遺伝子修飾が、BS1結合部位gcacaaggacgtにおける1個または複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個）の遺伝子修飾を含む、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３２】
1個または複数個の遺伝子修飾が、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS1のステムループ構造を破壊するものである、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３３】
1個または複数個の遺伝子修飾が、例えば、1個、2個、3個、4個、またはそれ以上の水素結合対を排除するための、水素結合に関与する配列
2020535801.tif 000036
における1個または複数個の遺伝子修飾を含む、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３４】
修飾型BS1が、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000037
を有する、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３５】
1個または複数個の遺伝子修飾が、CsrA BS2結合部位に対する1個または複数個の点変異を含む、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３６】
1個または複数個の遺伝子修飾が、13塩基対BS2結合部位における、またはBS2のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個）の遺伝子修飾を含む、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３７】
1個または複数個の遺伝子修飾が、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS2のステムループ構造を破壊するものである、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３８】
修飾型BS2が、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000038
を有する、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項３９】
BS2結合部位に対する1個または複数個の遺伝子修飾が、シャイン・ダルガーノ配列agggaggaのヌクレオチドの変更を含まない、請求項28記載の組換え微生物。
【請求項４０】
フラジェリン遺伝子プロモーターが、細菌染色体またはプラスミドに位置する、前記請求項のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項４１】
対象ポリペプチドがアルデヒドデヒドロゲナーゼである、前記請求項のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項４２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、カプリアビダス・ネカトール由来のAcoDであり、
2020535801.tif 000039
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項41記載の組換え微生物。
【請求項４３】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、例えば、
2020535801.tif 000040
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項41記載の組換え微生物。
【請求項４４】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、flgM遺伝子の全部または一部の欠失を含む、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項４５】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、flgMの活性部位をコードする配列における単一の変異または一連の変異を含む、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項４６】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、例えば、FlgM二次構造を規定するヘリックスのうちの1個において、二次構造または三次構造を破壊するものである、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項４７】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、例えば、B.スブチリスFlgMのI-58、K-62、I-65、G-68、D-73、A-78より選択される、FlgMタンパク質のC末端の3番目または4番目のヘリックスのアミノ酸の変更を含む、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項４８】
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、例えば、B.スブチリスFlgMのI-3、G-7、S-10、V-11、A-40、K-41、M43、I-58、L-61、K-62、I-65、Y-70、K-71、V-72、D-73、A-74、H-76、I-77、A-78、N-80、M-81、I-82、N-83、F-84、Y-85、およびK-86より選択される、FlgMのSigDとの結合に関係すると予測される1個または複数個のアミノ酸の変更を含む、請求項21記載の組換え微生物。
【請求項４９】
アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成的に発現する、組換えプロバイオティック微生物。
【請求項５０】
（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチド；および
（b）SigDによる発現の阻害を低下させるFlgM遺伝子における遺伝子修飾
を含む、請求項49の組換えプロバイオティック微生物。
【請求項５１】
フラジェリン遺伝子プロモーターが、該プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、請求項50記載の組換えプロバイオティック微生物。
【請求項５２】
対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項21または請求項49記載の組換え微生物を培養する工程を含む、ポリペプチドを作製する方法。
【請求項５４】
ポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
生理学的に許容される担体と組換えプロバイオティック微生物とを含む組成物であって、組換えプロバイオティック微生物が
（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチド；および
（b）SigDによる転写開始の阻害を低下させるFlgM遺伝子の遺伝子修飾
を含む、前記組成物。
【請求項５６】
フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、請求項55記載の組成物。
【請求項５７】
対象ポリペプチドがアルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項55記載の組成物。
【請求項５８】
生理学的に許容される担体が、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質、水、カプセル増量剤、ならびに粘着性材料より選択される、請求項55記載の組成物。
【請求項５９】
約104〜約1012コロニー形成単位の組換えプロバイオティック微生物を含む、請求項55記載の組成物の単位用量。
【請求項６０】
分析物を代謝する酵素を構成的に発現する微生物を含む組成物の有効量を、対象へ投与する工程を含む、対象の消化管内または循環血中の分析物を代謝する方法。
【請求項６１】
（a）請求項1記載の組換え微生物を含む培養物を分析物と接触させる工程であって、対象ポリペプチドが、該分析物を基質とする酵素である、工程、および
（b）微生物を培養する工程であって、酵素が分析物の標的化合物への変換を触媒する、工程
を含む、標的化合物を作製する方法。
【請求項６２】
酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼより選択される、請求項61記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって後援された研究に関する陳述
なし。
【０００２】
関連出願の参照
本願は、2017年9月13日に出願された米国仮出願第62/558,346号および2018年7月27日に出願された米国出願第16/048,147号の優先日の恩典を主張するものであり、それらの全ての内容が、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる。
【０００３】
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含有している。2018年6月21日に作成された該ASCIIコピーは、1642-001-US_SL.TXTという名称であり、29,323バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
背景
ヒトがアルコールを消費する場合、血流からの除去のための主要な経路は、肝臓におけるアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を介したアセトアルデヒドへの酸化を介したものである。アセトアルデヒドは、その後、肝臓においてアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を介して酢酸塩へ酸化される。アルコールが大量にかつ/または高速で消費される場合には、高度に毒性である中間体アセトアルデヒドが蓄積し、その後、血流へ逆放出され、その高い可溶性のため、全身で作用し得る。アセトアルデヒドは、公知の発癌物質であるのみならず、その毒性の影響は、アルコールによる宿酔の影響のうちの多くのよく研究され立証されている原因である。実際、アセトアルデヒドの除去は、宿酔症状を低減させることが証明されている。PMID：16554376（PubMed ID）。反対に、アセトアルデヒドを酢酸塩へ酸化する身体の能力が、（例えば、ジスルフィラムによって）化学的にまたは（例えば、東アジア集団において一般的なアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の一塩基多型によって）遺伝学的に阻害される場合には、極めて増幅された宿酔症状が経験される。
【０００５】
宿酔の影響を低減させるか、排除するか、または防止するため、いくつかの試みが以前になされてきた。酵素的にまたはその他の方法で、吸収されるエタノールの量を低下させるか、または身体からのエタノール除去の速度を増加させることが試みられた（特許公開US2009-0060894A1（特許文献１））。しかしながら、これらの方法は、少なくとも2点の可能性のある落とし穴を有する：（1）それらの作用の方法は、消費者の血中アルコール含量自体に影響を与えるが、そのことは望ましくない可能性がある；（2）エタノールのアセトアルデヒドへの加速された代謝は、身体のアセトアルデヒド曝露を増加させ、症状を悪化させ、かつ/または宿酔症状を防止するのではなく、より早く誘導するに過ぎない可能性がある。要するに、エタノール中心の戦略は、アセトアルデヒド毒性の問題を直接解決しない。
【０００６】
より直接的に、他のグループは、アセトアルデヒド自体を解決することを試みた。米国特許公開2013-0089535A1（特許文献２）は、口腔内で酵素調製物を使用した。アルコール消費は唾液中のアセトアルデヒド濃度を上昇させるという証拠が存在するが、口腔から除去されたアセトアルデヒドが、アルコールによる宿酔の原因となる全身的なアセトアルデヒド毒性に対して有意な効果を有する可能性は低い。
【０００７】
Sprince,H.ら（アルデヒド毒性に対するアスコルビン酸および硫黄化合物の保護作用：アルコール依存および喫煙における意義（Protective action of ascorbic acid and sulfur compounds against acetaldehyde toxicity:implications in alcoholism and smoking.）Agents Actions,1975.5(2):p.164-73（非特許文献１））は、アセトアルデヒドに結合しそれを除去するための低分子の使用に言及している［1］。
【０００８】
米国特許公開2015-0087702A1（特許文献３）は、アセトアルデヒドを除去するヒト酵素の速度または発現を増加させるための低分子の使用に言及している。
【０００９】
他のグループは、バチルス（Bacillus）もしくはその他の細菌の鞭毛制御領域に基づき（米国特許第7888064B2号（特許文献４）、欧州特許第EP2235045B1号（特許文献５））、またはflgMおよびCsrAを特異的に操作することによって（日本特許第JP5881352B2号（特許文献６））、発現系を開発した。
【００１０】
Liu,Y.ら（「低pHでのアセトアルデヒド解毒のためのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼの異種発現（Heterologous Expression of Aldehyde Dehydrogenase in Lactococcus lactis for Acetaldehyde Detoxification at Low pH）」、Appl Biochem Biotechnol.8 August 2017（非特許文献２））は、低pHでのアセトアルデヒドの酸化を触媒するための、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（istALDH）を発現させるためのNIsin Controlled Expression（NICE）系によるラクトコッカス・ラクティスの適用に言及している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許公開US2009-0060894A1
【特許文献２】米国特許公開2013-0089535A1
【特許文献３】米国特許公開2015-0087702A1
【特許文献４】米国特許第7888064B2号
【特許文献５】欧州特許第EP2235045B1号
【特許文献６】日本特許第JP5881352B2号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Sprince,H.ら（アルデヒド毒性に対するアスコルビン酸および硫黄化合物の保護作用：アルコール依存および喫煙における意義（Protective action of ascorbic acid and sulfur compounds against acetaldehyde toxicity:implications in alcoholism and smoking.）Agents Actions,1975.5(2):p.164-73
【非特許文献２】Liu,Y.ら（「低pHでのアセトアルデヒド解毒のためのラクトコッカス・ラクティスにおけるアルデヒドデヒドロゲナーゼの異種発現（Heterologous Expression of Aldehyde Dehydrogenase in Lactococcus lactis for Acetaldehyde Detoxification at Low pH）」、Appl Biochem Biotechnol.8 August 2017
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本明細書中に組み入れられ、明細書の一部を形成する添付の図面は、例示的な態様を例示し、説明と共に、これらの態様および当業者に明白であろうその他の態様を当業者が作成し使用することを可能にするためにさらに役立つ。本発明は、以下の図面と共に、より具体的に説明されるであろう。
【００１４】
【図１】アルデヒドデヒドロゲナーゼAldBまたはAcoDの誘導が、アセトアルデヒドの迅速な除去をもたらすことを示す。試料を37℃で200mMアセトアルデヒドと共に30分間インキュベートした。次いで、試料をろ過し、1:10希釈し、凍結させた。次いで、解凍した試料をHPLCで実行し、残存アセトアルデヒド濃度を計算するため、標準曲線と比較した。それらの値がここに提示される。「アセトアルデヒド10mM」とは、機械上にある間にアセトアルデヒドの確率的な損失がないことを確実にするため、HPLCランの最初に実行され、次いで、HPLCランの最後に再び実行された10mMアセトアルデヒド標準をさす。
【図２】GFPの発現が、修飾型hagプロモーターの調節下で、pHyspankプロモーターの調節下より5〜10倍強力であることを示す。（A）バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）PY79株（陰性対照；左のプレートの「2時」の位置）、lacIによる抑制が除去されたpHyspankプロモーターの下でGFPを発現するB.スブチリス（B. subtilis）（右のプレートの「11時」の位置）、および修飾型hagプロモーターの下でGFPを発現するB.スブチリス（左のプレートの「11時」の位置および右のプレートの「2時」の位置）の凍結ストックを、LB上にパッチ状に塗布し一夜増殖させた。緑色蛍光を、青色LED閃光およびオレンジ色フィルタによって可視化した。（B）個々のコロニーに由来する、lacIによる抑制が除去されたpHyspankプロモーターの下でGFPを発現するB.スブチリス（チャート内の下方の濃灰色の線；（A）の右のプレートの「11時」の位置）および修飾型hagプロモーターの下でGFPを発現するB.スブチリス（グラフ内の上方の薄灰色の線；（A）の左のプレートの「11時」の位置）を、LBブロスにおいて7時間培養し、蛍光およびOD600の読み取りを2.5時間後から開始して90分毎に行った。
【図３】LBにおいて4.5時間増殖させ、溶解し、8％SDS-PAGEゲルにおいてクーマシー染色によって全タンパク質について査定した、培養物からのペレット化された細胞中のタンパク質の存在によるGFP、AcoD、およびAldBの発現を示す。レーン1は、Bio-Rad Kaleidoscopeタンパク質標準ラダーである。レーン2および3は、pHyspankプロモーターの下でAldBを発現するB.スブチリスの、誘導されていない培養物および誘導された培養物（それぞれ）である。レーン4および5は、pHyspankプロモーターの下でAcoDを発現するB.スブチリスの、誘導されていない培養物および誘導された培養物（それぞれ）である。レーン6は、flgMが欠失しているがhagは未修飾のままであるB.スブチリスの培養物（異種タンパク質発現についての陰性対照）である。レーン7は、修飾型hagプロモーターの下でGFP（矢じりによって示された関心対象のタンパク質バンド）を発現するB.スブチリスの培養物である。レーン8、9、および10は、修飾型hagプロモーターの下でn末端6×ヒスチジンタグ付きAcoD（SEQ ID NO:22として開示された「6×ヒスチジン」）、タグ無AcoD、およびn末端6×ヒスチジンタグ付きAldB（SEQ ID NO:22として開示された「6×ヒスチジン」）を発現するB.スブチリスの培養物（それぞれ；矢じりによって示された関心対象のタンパク質バンド）である。
【図４】hag遺伝子のプロモーター構造［SEQ ID NO:7］を示す。図中に以下のものが同定されている：（矢印および「-182」によって示された）プロモーター開始位置、（下線が引かれ「-10」および「-35」と表示された）SigD RNAポリメラーゼ結合部位、（矢印および「+1」によって示された）転写開始部位、（括弧が付けられ「CsrA BS1/2」と表示された）CsrA結合部位1および2、方法において記述されるようにCsrA結合を防止するためのGからAへの点変異の標的とされた残基（丸で囲まれた「g」）、およびシャイン・ダルガーノ配列（ボックス内）。ATG（配列内の大文字）は、hagタンパク質または任意の異種ポリペプチドのための開始コドンである。
【図５】5'-UTRを含む、hag mRNA［SEQ ID NO:21］の予測された二次構造（University of ViennaのRNA折り畳みソフトウェアによって生成された折り畳み予測；引用：Gruber AR,Lorenz R,Bernhart SH,Neubock R,Hofacker IL.The Vienna RNA Websuite.Nucleic Acids Res.2008）。（A）折り畳まれた構造。（B）2個のCsrA結合部位を含有しているmRNAの領域の拡大図。CsrAによって認識される、両方の結合部位についてのステムループ二次構造のループ内の「AGGA」モチーフは、太い黒線で囲まれている。2個の結合部位が近接していることが明らかに理解され得るため、二次構造は重大である。従って、これらの2個の部位の接近を防止するように二次構造に影響する修飾は、結合部位または「AGGA」認識配列自体に対する修飾と等しい可能性がある有害な効果をCsrA結合に対して及ぼし得る。
【図６】hagプロモーターからの発現の抑制解除のための戦略を示す。FlgM遺伝子のノックアウト（「×」）は、SigD活性のFlgMによる阻害を防止する。SigDは、hagプロモーターおよび機能的に連結されたALDH遺伝子の転写を活性化する（太矢印）。hagプロモーター上のcsrA結合部位の変異（「×」）は、リボソーム結合およびALDH遺伝子の翻訳の阻害を低下させる。これは、ALDHタンパク質の頑強な発現（太矢印）をもたらす。
【発明の概要】
【００１５】
概要
一つの局面において、（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、ポリヌクレオチド；および（b）SigDによる転写開始の阻害を低下させるflgM遺伝子の遺伝子修飾：を含む組換え微生物が、本明細書中に開示される。一つの態様において、組換え微生物は、ポリペプチドを構成的に発現する。別の態様において、組換え微生物は、プロバイオティックである。別の態様において、組換え微生物は、バチルス、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エシェリキア（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ペディオコッカス、およびストレプトコッカス（Streptococcus）より選択される属に属する。別の態様において、組換え微生物は、バチルス属に属する。別の態様において、微生物は、バチルス・スブチリス（B.スブチリス）である。別の態様において、フラジェリン遺伝子プロモーターは、hagプロモーターである。別の態様において、hagプロモーターは、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含み、遺伝子修飾は、CsrA BS1結合部位および/またはCsrA BS2結合部位の修飾（例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、または欠失）を含む。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、CsrA BS1認識配列AGGAに対する1個または複数個（例えば、2個、3個、もしくは4個）の遺伝子修飾、例えば、配列AGAAへの修飾を含む。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、12塩基対BS1結合部位における、またはBS1のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個の遺伝子修飾を含む。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、BS1結合部位gcacaaggacgt（SEQ ID NO:8）における1個または複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個）の遺伝子修飾を含む。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS1のステムループ構造を破壊するものである。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、例えば、1個、2個、3個、4個、またはそれ以上の水素結合対を排除するための、水素結合に関与する配列
2020535801.tif 000003
における1個または複数個の遺伝子修飾を含む。別の態様において、修飾型BS1は、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000004
を有する。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、CsrA BS2結合部位の1個または複数個の点変異を含む。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、13塩基対BS2結合部位
2020535801.tif 000005
における、またはBS2のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個もしく複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個）の遺伝子修飾を含む。別の態様において、1個または複数個の遺伝子修飾は、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS2のステムループ構造を破壊するものである。別の態様において、修飾型BS2は、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000006
を有する。別の態様において、BS2結合部位に対する1個または複数個の遺伝子修飾は、シャイン・ダルガーノ配列agggaggaにおけるヌクレオチドの変更を含まない。別の態様において、フラジェリン遺伝子プロモーターは、細菌染色体またはプラスミドに位置する。別の態様において、対象ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。別の態様において、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）由来のAcoDであり、
2020535801.tif 000007
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、
2020535801.tif 000008
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼである。別の態様において、flgM遺伝子における遺伝子修飾は、flgM遺伝子の全部または一部の欠失を含む。別の態様において、flgM遺伝子における遺伝子修飾は、flgMの活性部位をコードする配列の単一の変異または一連の変異を含む。別の態様において、flgM遺伝子における遺伝子修飾は、例えば、FlgM二次構造を規定するヘリックスのうちの1個において、二次構造または三次構造を破壊するものである。別の態様において、flgM遺伝子における遺伝子修飾は、例えば、B.スブチリスFlgMのI-58、K-62、I-65、G-68、D-73、A-78より選択される、FlgMタンパク質のC末端の3番目または4番目のヘリックスにおけるアミノ酸の変更を含む。別の態様において、flgM遺伝子における遺伝子修飾は、例えば、B.スブチリスFlgMのI-3、G-7、S-10、V-11、A-40、K-41、M43、I-58、L-61、K-62、I-65、Y-70、K-71 、V-72、D-73、A-74、H-76、I-77、A-78、N-80、M-81、I-82、N-83、F-84、Y-85、およびK-86より選択される、FlgMのSigDとの結合に関係すると予測される1個または複数個のアミノ酸の変更を含む。
【００１６】
別の局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成的に発現する組換えプロバイオティック微生物が、本明細書中に開示される。一つの態様において、微生物は、（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチド；および（b）SigDによる発現の阻害を低下させるFlgM遺伝子における遺伝子修飾を含む。別の態様において、フラジェリン遺伝子プロモーターは、プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む。
【００１７】
別の局面において、対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターがフラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、ポリヌクレオチドが、本明細書中に開示される。
【００１８】
別の局面において、本明細書中に開示される組換え微生物を培養する工程を含む、ポリペプチドを作製する方法が、本明細書中に開示される。一つの態様において、方法は、ポリペプチドを単離する工程をさらに含む。
【００１９】
別の局面において、生理学的に許容される担体と組換えプロバイオティック微生物とを含む組成物であって、組換えプロバイオティック微生物が（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチド；および（b）SigDによる転写開始の阻害を低下させるFlgM遺伝子の遺伝子修飾を含む、組成物が、本明細書中に開示される。一つの態様において、フラジェリン遺伝子プロモーターは、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む。別の態様において、対象ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。別の態様において、生理学的に許容される担体は、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質、水、カプセル増量剤、ならびに粘着性材料より選択される。
【００２０】
別の局面において、約104〜約1012コロニー形成単位の組換えプロバイオティック微生物を含む、本明細書中に開示される組成物の単位用量が、本明細書中に開示される。
【００２１】
別の局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成的に発現する微生物を含む組成物の有効量を、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、アルコールによる宿酔を防止するかまたは処置するための方法が、本明細書中に開示される。別の態様において、組成物は、対象がアルコールを消費前に、消費中に、または消費後に、投与される。
【００２２】
別の局面において、分析物を代謝する酵素を構成的に発現する微生物を含む組成物の有効量を、対象へ投与する工程を含む、対象の消化管内または循環血中の分析物を代謝する方法が、本明細書中に開示される。
【００２３】
別の局面において、以下の工程を含む、標的化合物を作製する方法が、本明細書中に開示される：（a）本明細書中に開示される対象ポリペプチドを発現する組換え微生物を含む培養物を分析物と接触させる工程であって、対象ポリペプチドが、その分析物を基質とする酵素である、工程、および（b）微生物を培養する工程であって、酵素が分析物の標的化合物への変換を触媒する、工程。一つの態様において、酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼより選択される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
I.導入
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を構成的に発現するように遺伝子改変された微生物、例えば、細菌が、本明細書中に開示される。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）は、細菌細胞の内部で発現され、基質であるアセトアルデヒドに到達するが、それは、酵素の分泌によってではなく、アセトアルデヒドの細菌への拡散による。アセトアルデヒドは、高度に可溶性の分子であり、細胞膜を介して受動拡散することができる。低いpH、防御または栄養のため遊離の浮遊タンパク質を分解しようと捜している敵対的な細菌および真核細胞、NADのような酵素補助因子についての高度の競合、および細胞外プロテアーゼ、を特徴とする、消化管内腔の過酷で可変的な環境から細菌細胞の内部は保護されているため、このように酵素が細胞内に位置することは、分泌より機能的に有利である。
【００２５】
B.スブチリスの鞭毛制御機構を、ALDHの構成的な頑強な発現を達成するため、適応させた。B.スブチリスは、数種の正および負の制御因子を含む精巧な系によって運動性を制御している［2］。この系の基本戦略は、hagと呼ばれる高発現フラジェリン遺伝子の負の制御因子を除去することである。
【００２６】
B.スブチリスフラジェリンの鞭毛サブユニットをコードする遺伝子が、hagであり、従って、いずれも頑強である転写プロモーターおよびリボソーム結合部位を使用して、正しい条件においては、それは単一細菌内で数十万コピー産生される［3、4］。
【００２７】
転写は、シグマ因子SigDによって媒介されるが、SigDは、FlgMタンパク質によって抑制される［5］。flgMの欠失は、SigDの構成的な発現および活性を大いに増強し、従って、鞭毛オペロン、具体的には、hag遺伝子の、より高度の、より構成的な転写をもたらす。
【００２８】
hag遺伝子の翻訳は、高度に頑強なリボソーム結合部位によって可能にされるが、リボソーム結合部位は、CsrAと呼ばれるタンパク質によって転写後に結合され抑制される［6］。しかしながら、CsrA結合部位における単一の点変異は、その結合を消失させ、Hagタンパク質の構成的な翻訳をもたらす［7］。
【００２９】
flgM遺伝子の欠失と、CsrA結合部位の単一の点変異の作製との組み合わせを使用して、B.スブチリスの生活環において、Hagタンパク質の極めて高いレベルを構成的に達成することができる。同様に、hag遺伝子が、関心対象のタンパク質をコードする異種遺伝子に交換された場合、その遺伝子は、高レベルに構成的に転写され翻訳され得る。従って、hag遺伝子を、ALDHをコードする遺伝子に交換し、次いで、flgM遺伝子を欠失させ、hagプロモーターのCsrA結合部位における単一の点変異を作製することによって、B.スブチリスにおけるALDHの頑強かつ構成的な発現が達成された。
【００３０】
従って、ある種の態様において、flgM欠失と組み合わせられた、CsrAの結合部位における点変異を含む微生物が、本明細書中に提供される。これらの2種の変異を作製することによって、抑制を除去し、発現を構成的にすることによって、SigDに基づくプロモーター系またはフラジェリンプロモーター系の有用性は大きく増加する。理論によって拘束されることは望まないが、CsrAは、多くの細菌種において多能性の制御因子であり［8］、その欠失は、他の多くの望ましくない表現型効果を細胞に対して及ぼす可能性があるため、これは、CsrAの単純な欠失とは区別されると考えられる。結合部位においてのみ点変異を作製することによって、その変異は、可能性のある他の標的からのCsrAによる抑制は除去せず、hagプロモーターのCsrAによる抑制を特異的に独特に妨害する。
【００３１】
この戦略は、任意の所望のポリペプチドの構成的な発現のために有用である。これには、個体の消化管内で、または工業プロセス中の標的分子の作製において、標的分析物を代謝するその他の酵素が含まれる。
【００３２】
II.定義
本明細書中で使用されるように、「プロバイオティック微生物」または「プロバイオティック細菌」という用語は、有効量で投与された場合に、健康またはウェルネスの利益を宿主に授与する微生物または細菌をさす。
【００３３】
本明細書中で使用されるように、「組換え微生物」または「組換え細菌」という用語は、自然界において通常相互に接続していないヌクレオチド配列が接続したものを含むポリヌクレオチドを含む微生物または細菌をさす。
【００３４】
2種以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列の関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「より選択される」、「比較ウインドウ」、「同一」、「配列同一率」、「実質的に同一」、「相補的」、および「実質的に相補的」が含まれる。
【００３５】
「参照配列」とは、配列比較のための基礎として使用される明確な配列であり、より大きい配列、例えば、完全なcDNA、タンパク質、または遺伝子の配列のサブセットであり得る。
【００３６】
2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、（1）2種のポリヌクレオチドの間で類似している配列（即ち、完全なポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列の一部分のみ）、または（2）2種のポリヌクレオチドの間で相違している配列を含み得るため、2種（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、典型的には、配列類似性を有する局所的な領域を同定し比較するため、「比較ウインドウ」において2種のポリヌクレオチドの配列を比較することによって実施される。
【００３７】
「比較ウインドウ」とは、参照配列と比較される、典型的には、少なくとも12連続ヌクレオチドまたは4連続アミノ酸残基の、概念的なセグメントをさす。比較ウインドウは、少なくとも15ヌクレオチドもしくは少なくとも25ヌクレオチド、または少なくとも5アミノ酸もしくは少なくとも8アミノ酸の長さを有することが多い。比較ウインドウは、2種の配列の最適アライメントのため、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、約20パーセント以下の付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウを整列化するための配列の最適アライメントは、アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0（Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI）のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピューター化された実装によって、または視察によって実施され得、様々な方法のいずれかによって生成された最適アライメント（即ち、比較ウインドウにおいて最も高い相同率をもたらすもの）が選択される。
【００３８】
対象のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が参照配列と「同一」であるのは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の全長において、最大に一致するように整列化された場合に、それらの2種の配列が同一である場合である。
【００３９】
2種の配列の間の「配列同一率」は、2種の最適に整列化された配列を比較ウインドウにおいて比較し、両方の配列に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を与え、マッチする位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（即ち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に100を掛けて配列同一率を与えることによって計算される。
【００４０】
特記されない限り、2種の配列を比較するために使用される比較ウインドウは、短い方の配列の長さである。
【００４１】
方法は、Natl.Acad.Sci.USA 85:2444;Higgins & Sharp(1988)Gene 73:237-244；Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Research 16:10881-90；Huang et al.(1992)Computer Applications in the Biosciences 8:155-65；およびPearson et al.(1994)Methods in Molecular Biology 24:307-31にさらに記載されている。アライメントは、視察および手動アライメントによっても、しばしば実施される。
【００４２】
対象のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、比較ウインドウにおいて少なくとも70％の配列同一性を有する場合、その対象のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、参照配列と「実質的に同一」である。従って、参照配列との少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有する配列も、「実質的に同一」である。相互に同一である2種の配列も、当然、「実質的に同一」である。
【００４３】
ある種の態様において、対象ポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。「特異的にハイブリダイズする」または「特異的なハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」とは、配列が（例えば、全細胞）DNAまたはRNAの複雑な混合物の中に存在する場合、核酸分子が、ストリンジェントな条件の下で、特定のヌクレオチド配列と優先的に結合すること、二重鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることをさす。
【００４４】
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブが標的部分配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とは、より少ない程度にハイブリダイズするかまたは全くハイブリダイズしない条件をさす。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験に関して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細なガイドは、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays",Elsevier,New Yorkに見出される。
【００４５】
一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、明確なイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱融点（Tm）より約5℃低く選択される。Tmとは、標的配列の50％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（明確なイオン強度およびpHの下での）温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのTmと等しく選択される。
【００４６】
サザンブロットおよびノーザンブロットにおけるフィルタ上の100個を越える相補的な残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、1mgのヘパリンを含む50％ホルマリン、42℃であり、ハイブリダイゼーションは一夜実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.15M NaCl、72℃、約15分である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.2×SSCによる洗浄、65℃、15分である（SSC緩衝液の説明については、Sambrook et al.を参照すること）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するため、低ストリンジェンシー洗浄が、高ストリンジェンシー洗浄の前に行われる。例えば、100ヌクレオチドを超える二重鎖のための中ストリンジェンシー洗浄の一例は、1×SSC、45℃、15分である。例えば、100ヌクレオチドを超える二重鎖のための低ストリンジェンシー洗浄の一例は、4〜6×SSC、40℃、15分である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されるものより2倍（またはそれ以上）高いシグナルノイズ比が、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、「転写制御配列」という用語は、機能的に連結された第2のヌクレオチド配列の転写を制御する第1のヌクレオチド配列をさす。
【００４８】
「プロモーター」とは、DNA内のヌクレオチド配列のRNA転写物への転写を促進するために少なくとも十分な転写制御配列である。プロモーターから転写された転写物は、典型的には、転写開始部位の下流のプロモーター由来の配列を含み、mRNAのケースにおいては、アミノ酸配列をコードする下流配列も含む。プロモーターは、転写開始部位の直ぐ上流に位置することが予測可能であるため、最もよく特徴決定されている転写制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性をモジュレートする配列を含む。これらの配列は、シス作用性であってもよいし、またはトランス作用性因子に応答性であってもよい。プロモーターは、制御の性質に依って、構成的であってもよいしまたは制御されていてもよい。それらは、しばしば、コア領域および拡張プロモーター領域という2種の別々のセグメントを有するものとして記載される。
【００４９】
コアプロモーターは、RNAポリメラーゼの認識、結合、および転写開始のために十分である配列を含む。コアプロモーターは、転写開始部位、RNAポリメラーゼ結合部位、およびその他の一般的な転写結合部位を含み、前開始複合体が形成され一般的な転写機構が集合する場所である。前開始複合体は、一般に、転写開始部位（TSS）の50ヌクレオチド（nt）以内にある。
【００５０】
コアプロモーターは、mRNAのポリペプチドへの翻訳のために必要なリボソーム結合部位のための配列も含む。
【００５１】
拡張プロモーター領域は、転写開始部位の約250ヌクレオチド上流（即ち、-250nt）に及ぶ、いわゆる近位プロモーターを含む。それは、特異的な転写因子結合部位のような主な制御要素を含む。多くの遺伝子が、さらに上流に位置する転写制御要素を有することが見出されている。具体的には、遺伝子の転写制御要素の大部分を含む断片は、転写開始部位の700nt以上上流にまで及ぶ場合がある（例えば、U.S.2007-0161031を参照すること）。ある種の遺伝子において、転写制御配列は、転写開始部位の数千ヌクレオチド上流に見出されている。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、転写制御配列がヌクレオチド配列の転写を制御するために細胞において機能する場合、そのヌクレオチド配列はその転写制御配列と「機能的に連結されている」。これは、ポリメラーゼとプロモーターとの間の相互作用を通したヌクレオチド配列の転写の促進を含む。
【００５３】
本明細書中で使用されるように、第1のヌクレオチド配列が、自然界において第2のヌクレオチド配列と機能的に連結されていない場合、その第1のヌクレオチド配列は、その第2のヌクレオチド配列に対して「異種」である。拡張的に、ポリペプチドは、プロモーターに対して異種のヌクレオチド配列によってコードされる場合、発現調節配列に対して「異種」である。
【００５４】
本明細書中で使用されるように、「相同体」という用語は、明確なある属もしくは種とは別の属もしくは種に由来する、天然に存在する遺伝子、またはほぼ同一の折り畳みおよび機能を有するタンパク質をコードする、同一の株もしくは種における区別される遺伝子をさす。研究は、微生物の間で、議論されている遺伝子またはタンパク質との少なくとも30％のアミノ酸同一性を有するタンパク質が、そのような特性を有することを示した（引用：PMID 23352839）。さらに、「相同体」という用語は、議論されている遺伝子またはタンパク質との30％未満の同一性を有するタンパク質をコードするが、ピアレビューされた科学雑誌において該遺伝子またはタンパク質の相同体として同定された遺伝子にも及ぶ。
【００５５】
本明細書中で使用されるように、「オルソログ」という用語は、議論されている属または種とは別の属または種に存在する相同体をさす。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、「パラログ」という用語は、しばしば、遺伝子複製の結果として、議論されている株または種と同一の株または種に存在する相同体をさす。
【００５７】
本明細書中で使用されるように、「対立遺伝子バリアント」という用語は、遺伝子の天然に存在する変動をさす。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、「人工バリアント」という用語は、天然の機能を保持しながら、天然に存在する遺伝子またはタンパク質に対する1個または複数個の遺伝子修飾を含む遺伝子またはタンパク質をさす。
【００５９】
本明細書中で使用されるように、「変異」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変更をさす。変異には、1個もしくは複数個のヌクレオチドの置換（1塩基置換は「SNV」もしくは「点変異」と呼ばれる）、1個もしくは複数個のヌクレオチドの付加、または1個もしくは複数個のヌクレオチドの欠失が含まれ、もしあれば、これらのヌクレオチドの変更に起因するアミノ酸配列の変化も含まれ得る。
【００６０】
本明細書中で使用されるように、細菌株の「誘導体」とは、その株の遺伝学的に区別されるバージョンである。
【００６１】
本明細書中で使用されるように、「対象」という用語は、個体に関して使用される場合、個々の動物、例えば、ヒトをさす。
【００６２】
本明細書中で使用されるように、「治療」、「処置」、「治療的介入」、および「寛解」という用語は、症状の重症度の低下をもたらす活動をさす。「処置する」および「防止する」という用語は、絶対的な用語ではないものとする。処置および防止は、発症の遅延、症状の寛解、症状の重症度の緩和、患者の生存の改善、生存時間または生存率の増加等をさすことができる。処置の効果は、処置を受けていない個体もしくは個体のプールと比較されてもよいし、または処置前もしくは処置中の異なる時点での同一患者と比較されてもよい。いくつかの局面において、疾患の重症度は、例えば、投与前の個体または処置を受けていない対照個体と比較して、少なくとも10％低下する。いくつかの局面において、状態の重症度は、少なくとも25％、50％、75％、80％、もしくは90％低下するか、またはいくつかのケースにおいて、もはや標準的な診断技術を使用して検出可能でない。
【００６３】
本明細書中で使用されるように、「プロバイオティック組成物」という用語は、プロバイオティック微生物と生理学的に許容される担体とを含む組成物をさす。典型的には、プロバイオティック組成物は、それが投与される宿主対象に健康またはウェルネスの利益を授与する。
【００６４】
本明細書中で使用されるように、「生理学的に許容される」という用語は、組成物の他の成分と適合性であって、安全に対象へ投与され得る担体をさす。プロバイオティック組成物ならびにその調製および使用のための技術は、本開示を考慮すれば、当業者に公知である。適当な薬理学的組成物およびその投与のための技術の詳細なリストについては、Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.1985；Brunton et al.,"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," McGraw-Hill,2005；University of the Sciences in Philadelphia(eds.),"Remington:The Science and Practice of Pharmacy,"Lippincott Williams & Wilkins,2005；およびUniversity of the Sciences in Philadelphia(eds.),"Remington:The Principles of Pharmacy Practice,"Lippincott Williams & Wilkins,2008のような教科書を参照することができる。
【００６５】
プロバイオティック組成物は、液体製剤であってもよいしまたは固体製剤であってもよい。プロバイオティック組成物は、固体製剤である場合、錠剤、吸引（sucking）錠、咀嚼錠、チューインガム、カプセル、サシェ、粉末、顆粒、コーティング粒子、コーティング錠剤、腸溶性コーティング錠剤、腸溶性コーティングカプセル、メルティングストリップ、またはフィルムとして製剤化され得る。プロバイオティック組成物は、液体製剤である場合、経口溶液、懸濁液、乳濁液、またはシロップとして製剤化され得る。組成物は、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質、およびグリコシル化タンパク質からなる群より独立に選択されるが、これらに限定されるわけではない担体材料をさらに含んでいてよい。
【００６６】
本明細書中で使用されるように、プロバイオティック組成物は、必要とされた効果、例えば、アルコールによる宿酔の処置または防止が達成される限り、食品組成物、栄養補助食品、機能性食品、医療食品、または栄養製品として製剤化されてもよい。食品組成物は、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、クラッカー、シリアル、ヘルスバー、スプレッド、グミ、および栄養製品からなる群より選択され得る。食品組成物は、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質、およびグリコシル化タンパク質からなる群より選択される担体材料をさらに含んでいてもよい。
【００６７】
「有効量」および「有効用量」という用語は、障害または状態を寛解させるために有効な薬剤の量をさす。例えば、所定のパラメータについて、有効量は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、または少なくとも100％のいずれかの治療効果の増加または減少を示すであろう。効力は、増加または減少の「倍率」としても表され得る。例えば、有効量は、対照と比べて少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれ以上のいずれかの効果を有し得る。
【００６８】
薬剤の有効量は、意図された目標に基づき決定される。「単位用量」という用語は、対象において使用するために適当な物理的に不連続の単位をさし、各単位は、その投与、即ち、適切なルートおよび処置計画と共に、所望の応答を生じるよう計算された予め決定された量の組成物を含有している。処置の回数および単位用量の両方に依る、投与される量は、処置される対象、対象の状態、および望まれる防御に依存する。組成物の正確な量は、実務家の判断にも依存し、各個体に特有である。
【００６９】
「用量」および「投薬量」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。用量とは、各投与において個体へ与えられる活性成分の量をさす。本発明のため、用量とは、細菌の数、例えば、コロニー形成単位（CFU）の量をさすことができる。用量は、投与の頻度；個体のサイズおよび耐容性；状態の重症度；副作用のリスク；投与ルートを含む多数の要因に依存して変動するであろう。前記の要因に依存して、または治療進行に基づき、用量が修飾されてもよいことを、当業者は認識するであろう。「剤形」という用語は、医薬の具体的なフォーマットをさし、投与ルートに依存する。例えば、剤形は、液体、例えば、経口消費用の飲料であってよい。
【００７０】
III.発現構築物
フラジェリンプロモーターからの転写の阻害およびフラジェリンプロモーターからのmRNA転写物の翻訳の阻害の一方または両方を低下させる方法が、本明細書中に企図される。
【００７１】
本明細書中に開示されたある種のポリヌクレオチドは、対象ポリペプチド、即ち、発現を受けるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結された、フラジェリン遺伝子転写制御配列、例えば、プロモーターを含む発現構築物を含む。ある種の態様において、hagプロモーターは、hagプロモーターからのmRNAの転写時に、mRNA翻訳のCsrAによる阻害が抑制されるような遺伝子の変更を含む。
【００７２】
A.フラジェリン遺伝子転写制御配列
多くの細菌が、フラジェリン遺伝子相同体を有する。遺伝子は、多くの名称で呼ばれており、それらのいくつかの例は、B.スブチリスのhag；大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、およびいくつかのラクトバチルス種のfliC；ならびにレジオネラ（Legionella）種、ビブリオ（Vibrio）種、およびカンピロバクター（Campylobacter）種のflaAまたはflaB/C/D/E/F/等である。
【００７３】
一つの態様において、フラジェリン遺伝子プロモーターは、hag遺伝子プロモーターである。フラジェリン相同体は、バチルス、例えば、B.スブチリスのhagである。別の態様において、フラジェリン遺伝子プロモーターは、対象タンパク質が発現される微生物にネイティブである。例えば、これは、発現構築物が細菌染色体に位置する場合に当てはまり得る。
【００７４】
本明細書中で使用されるように、「Hag」（またはイタリック体の「hag」、または「hag」）という用語は、鞭毛を組み立てるために使用される、より総称的に「フラジェリン」としても公知の構造サブユニットである、B.スブチリスにおいて「Hag」としてアノテートされたタンパク質（もしくはそのようなタンパク質をコードする遺伝子）、または同一のもしくはその他の属、種、もしくは株における相同体をさす。それは、他の属、種、および株において、いくつかの他の名称によって公知である。B.スブチリスにおけるそれは、配列：
2020535801.tif 000009
によって定義される。
【００７５】
本明細書中で使用されるように、「hagプロモーター」という用語は、バチルス属由来の同族の天然に存在するフラジェリン遺伝子プロモーター、およびそれと実質的に同一の配列を有するかまたはそれと特異的にハイブリダイズするプロモーターをさす。B.スブチリスにおいて、hagプロモーターは、hag遺伝子の開始コドンの5'の273塩基対配列に含まれる。それはヌクレオチド配列：
2020535801.tif 000010
（「ATG」はhagの開始コドンを表す）を有する。TTAA（下線）から始まる開始コドンATGまでの太字の配列が、遺伝子発現を促進するために十分であると予想される。
【００７６】
具体的には、hagプロモーターは、-35 SigD RNAポリメラーゼ結合部位である「ttaa」配列（下線）および-10 SigD RNAポリメラーゼ結合部位である「tccgatat」配列（下線）によって定義されるSigD認識配列を含有している。さらに、hagは、配列
2020535801.tif 000011
（高親和性結合部位1または「BS1」）（下線）および
2020535801.tif 000012
（低親和性結合部位2または「BS2」）（下線）によって定義される2個のCsrA結合部位を有する。hagプロモーターは、シャイン・ダルガーノ配列「agggagga」によっても定義される。hagプロモーターの全体構造は、図4に図示される。
【００７７】
本明細書中で使用されるように、「CsrA」（「炭素貯蔵制御因子A」）という用語は、B.スブチリスにおいて「CsrA」としてアノテートされたタンパク質（もしくはそのようなタンパク質をコードする遺伝子）、またはその他の属もしくは種における相同体もしくはオルソログ、または同一の種におけるパラログをさす。CsrAは、いくつかの種において、RsmAと相同的に呼ばれる。CsrAタンパク質は、ループ内にコンセンサス配列AGGAを有するステムループRNAモチーフに結合し、それによって、コンセンサス配列を含むmRNAに組み入れられたヌクレオチド配列のポリペプチドへの翻訳を阻害する。CsrAは、RNAに結合し翻訳を防止することによって直接的に、または、そうでなければ鞭毛発現を制御するタンパク質をコードする他のRNAに結合することによって間接的に、hagプロモーターから転写されたmRNAの発現を阻害することができる。B.スブチリスにおけるCsrAは、配列：
2020535801.tif 000013
によって定義される。
【００７８】
ある種の態様において、本開示の発現構築物は、mRNAのような転写物へのプロモーターからの転写時に、mRNA翻訳のCsrAによる阻害を抑制する、フラジェリン遺伝子プロモーターにおける遺伝子修飾を含む。本開示は、この結果を達成するための、フラジェリン遺伝子プロモーター、具体的には、hagプロモーターに対する数種の遺伝子修飾を企図する。いくつかの態様において、翻訳のCsrAによる抑制を阻害するためのhagに対する遺伝子修飾は、BS1またはBS2の一方または両方におけるステムループ構造の変更を含み得る。いくつかの態様において、遺伝子修飾は、1個または複数個のヌクレオチドの挿入または欠失である。
【００７９】
遺伝子修飾は、CsrA BS1結合部位に対する1個または複数個の点変異であり得る。BS1は、CsrA認識配列AGGAにおける1個または複数個（例えば、2個、3個、または4個）のヌクレオチドの変更によって修飾され得る。例えば、BS1のAGGA結合モチーフを、AGAAへ修飾することができる。あるいは、遺伝子修飾は、12塩基対BS1結合部位における、またはBS1のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個の変異を含むことができる。これは、例えば、BS1結合部位gcacaaggacgt（SEQ ID NO:8）における1個もしく複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個）の修飾を含む。あるいは、遺伝子の変更は、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS1のステムループ構造を破壊するものであってよい。そのような変更は、例えば、1個、2個、3個、4個、またはそれ以上の水素結合対を排除するための、水素結合に関与する配列
2020535801.tif 000014
における1個または複数個の変異として作製され得る。一つの態様において、修飾型BS1は、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000015
を有する。
【００８０】
遺伝子修飾は、CsrA BS2結合部位に対する1個または複数個の点変異であってもよい。これは、13塩基対BS2結合部位における、またはBS2のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個）の変異を含む。これは、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS2のステムループ構造を破壊する遺伝子の変更も含む。例えば、修飾型BS2は、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000016
を有し得る。ある種の態様において、修飾は、シャイン・ダルガーノ配列agggaggaにおけるヌクレオチドの変更を含まない。
【００８１】
遺伝子修飾は、CsrA結合を阻害しながら、mRNAがリボソーム結合活性を保持し、翻訳を許容することを可能にするように選択されることが、認識されるであろう。
【００８２】
異種ヌクレオチド配列は、フラジェリンプロモーターに対して異種である。即ち、それは、自然界において通常はhagプロモーターの調節下にない配列であり、典型的には、その発現がフラジェリンプロモーターの調節下にないポリペプチドをコードする。対象ポリペプチドは、発現されることが望まれる任意のポリペプチドであり得る。ある種の態様において、ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【００８３】
B.対象ポリペプチド
当技術分野において公知の任意の方法によって、異種ヌクレオチド配列を、フラジェリンプロモーターと機能的に連結することができる。例えば、異種ヌクレオチド配列を、細菌染色体へ組み込むことができる。あるいは、異種ヌクレオチド配列を、微生物へ導入されるプラスミドにおいてフラジェリンプロモーターと接続させることができる。例えば、PMID：4994568に記載されるように、例えば、相同組換えによって、異種ヌクレオチド配列をhagプロモーターへターゲティングすることができる。別の有用な方法は、トランスポゾンテクノロジーを含む。トランスポゾンは、染色体内の特異的な配列を標的とし、その中のヌクレオチド配列を挿入し、接続させることができる。トランスポゾン組み込みのための材料は、例えば、EZ-Tn5トランスポサーゼを商品化しているLucigen（Middleton,WI）から入手可能である。
【００８４】
発現の対象であるポリペプチド（「対象ポリペプチド」）は、任意の所望のポリペプチドであり得る。そのようなポリペプチドは、大量のポリペプチドを得るため、構成的に発現させることが望まれるものであり得る。ポリペプチドは、生物学的薬物、アルブミンのような食品タンパク質、またはαガラクトシダーゼAのような生化学的経路の酵素であり得る。ある種の態様において、ポリペプチドは、動物の消化管内に見出される可能性が高い分析物を代謝する酵素である。そのような分析物は、摂取を通して、マイクロバイオームによる生成を通して、対象による生成を通して、または腸管の膜を介した拡散もしくは能動輸送を通して、そこに見出され得る。そのようなポリペプチドには、例えば、ジペプチジルペプチダーゼIVのようなペプチダーゼ；およびヒト膵リパーゼのようなリパーゼが含まれる。
【００８５】
一つの態様において、ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。本明細書中で使用されるように、「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」または「ALDH」という用語は、基質としてアセトアルデヒドを使用し、それを区別される生成物へ触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をさす。最も一般的には、これは、アルデヒドの酸化を触媒する機能が公知であるかまたは予測される酵素である。一般に、これは、補因子としてNAD（P）を使用して、アルデヒドのカルボン酸への酸化を触媒する、分類EC1.2.1.-の酵素をさす。それには、アセトアルデヒドを酢酸塩/酢酸へ酸化する酵素（例えば、EC1.2.1.3、1.2.1.4、および1.2.1.5）、ならびに補酵素Aをアセチル補酵素Aへ変換するアセチル化酵素（例えば、EC1.2.1.10）が含まれる。それは、（例えば、分類EC1.2.5.-の）キノンを使用する酵素または（例えば、分類EC1.2.99.-の）その他の未知のアクセプターを使用する酵素を含む（が、これらに限定されるわけではない）その他の明確なアクセプターを使用する酵素もさす。
【００８６】
ある種の態様において、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ALDH2）または非ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、AcoDもしくはAldB）である。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、細菌アルデヒドデヒドロゲナーゼであってもよく、それが発現される微生物は細菌である。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、遺伝子が発現される微生物にネイティブであってよい。
【００８７】
対象ポリペプチドは、本明細書中に記載されたフラジェリンプロモーターの転写制御調節下にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を置くことによって発現される。多くの遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、NCBI、uniprot、KEGG、BRENDA等のような公に利用可能なデータベースに見出され得る。これらのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の分野において周知の方法によってプロモーターに連結され得る。一つの態様において、対象ポリペプチドは、lacZではない。
【００８８】
IV.シグマ因子のリプレッサーの破壊
SigDおよびその相同体のようなシグマ因子は、フラジェリン合成を開始させる。FlgMおよびその相同体は、シグマ因子活性のリプレッサーとして機能する。本開示は、FlgMのようなシグマ因子リプレッサーの破壊によるシグマ因子活性の抑制解除を提供する。
【００８９】
本明細書中で使用されるように、「FlgM」という用語は、転写のためのRNAポリメラーゼの後期鞭毛遺伝子へのリクルートを担うシグマ因子を阻害する、B.スブチリスにおいて「FlgM」としてアノテートされたタンパク質（もしくはそのようなタンパク質をコードする遺伝子）、またはその他の属もしくは種における任意の相同体をさす。この阻害されるシグマ因子は、B.スブチリスにおいてはSigDと呼ばれ、大腸菌においてはFliAと呼ばれ、またはシグマ因子が相同体を有する他の属および種においてはシグマ28のような他の名称で呼ばれることがある。B.スブチリスにおけるFlgMは、配列：
2020535801.tif 000017
によって定義される。
【００９０】
本明細書中で使用されるように、「SigD」という用語は、とりわけ、転写のためのRNAポリメラーゼの後期鞭毛遺伝子へのリクルートを担う、B.スブチリスにおけるシグマ因子（またはそれをコードする遺伝子）をさす。「SigD」は、さらに、大腸菌におけるFliA、またはいくつかの種におけるシグマ28というより広い表示のような、その他の種における相同体をさす。B.スブチリスにおけるSigDは、配列：
2020535801.tif 000018
によって定義される。
【００９１】
FlgMは、いくつかの残基を介して、SigDに結合し、それらの残基の大多数が、FlgMタンパク質のC末端の4番目のヘリックスに位置する。不活化の標的は、B.スブチリスFlgMのI-58、K-62、I-65、G-68、D-73、A-78に相当する3番目および4番目のヘリックスにおける高度に保存された残基の変異であろう。より広く、（PMID：15068809において同定されたような）SigDとの結合に直接関与する26残基のいずれかまたは組み合わせを変異させて、低下した活性を有するかまたは活性を有しないタンパク質を生成し得る可能性がある。あるいは、二次構造または三次構造、具体的には、二次構造を規定する4個のヘリックスを破壊する任意の変異または変異の組み合わせが、FlgMのSigDを阻害する能力を成功裡に低下させ得るかまたは減弱させ得る可能性がある。
【００９２】
いくつかの態様において、組換え微生物は、FlgMのSigD活性を阻害する能力を低下させる遺伝子修飾を含む。具体的には、一つのそのような遺伝子修飾は、その生物学的活性を低下させるかまたは排除するためのFlgM遺伝子の部分的または完全な欠失である。部分的な欠失は、タンパク質のC末端の少なくとも25％をコードする遺伝子の一部の欠失を含むことができる。
【００９３】
その他の遺伝子修飾には、例えば、不活性FlgMタンパク質を生じるフレームシフト変異、またはFlgMプロモーターの破壊が含まれる。あるいは、FlgMを機能的に不活性にするか、またはSigDに結合する能力もしくはその他の方法でSigDを抑制する能力をその他の方法で阻害する点変異によって、FlgMを不活性にすることができる。間接的には、FlgMをComKもしくはDegUのような活性化剤に対して非感受性にすることによって、またはScoCのようなリプレッサーもしくはプロテアーゼEprおよびWprに対して過度に感受性にすることによって、FlgMを破壊することができる。
【００９４】
V.組換え微生物
本明細書中で使用することが企図される組換え微生物は、発現のための対象ポリヌクレオチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を少なくとも含む発現系を含み、ここで、翻訳のCsrAによる阻害を低下させるため、フラジェリン遺伝子プロモーターが遺伝子修飾されており；任意で、SigDによる発現の抑制を低下させるため、FlgM遺伝子が遺伝子修飾されている。
【００９５】
組換え微生物は、典型的には、動物、例えば、ヒトによる摂取のために安全であるプロバイオティック微生物である。プロバイオティック微生物には、非限定的に、バチルス、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカス、大腸菌、ラクトバチルス、ロイコノストック、ペディオコッカス、およびストレプトコッカスが含まれる。具体的には、本開示は、バチルス属の細菌、より具体的には、B.スブチリスの使用を企図する。微生物は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）またはBacillus Genetic Stock Center（BGSC）を含む任意の典型的な供給元から得られてよい。
【００９６】
ある種の態様において、微生物は、真核生物ではない。例えば、微生物は、サッカロミセス（Saccharomyces）のようなアルコール飲料の発酵のために使用される真核生物ではない。
【００９７】
VI.プロバイオティック組成物
プロバイオティック微生物を含む組成物も、本明細書中に提供される。組成物は、生理学的に許容される担体の中に本明細書中に提供される組換え微生物を含む。
【００９８】
ある種の態様において、プロバイオティック組成物は、単位用量で提供される。単位用量は、典型的には、104〜1012コロニー形成単位の微生物を適当な担体の中に有するであろう。これは本明細書中に記載される任意の有効用量を含む。用量の全体積は、約0.05mL〜500mL、例えば、約0.5mL〜約50mLまたは約2.5mL〜15mLであり得る。
【００９９】
VII.使用の方法
標的分析物を代謝しかつ/または健康もしくはウェルネスの利益を宿主に提供するため、組換え微生物およびプロバイオティック組成物を使用する方法も、本明細書中に提供される。
【０１００】
宿主は任意の動物であり得る。これには、例えば、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトが含まれる。哺乳類は、偶蹄目、食肉目、クジラ目、翼手目、皮翼類、貧歯目、イワダヌキ目、イワダヌキ目、食虫類、ウサギ目、有袋目、単孔目、奇蹄目、有蹄類、有隣目、およびアシカ亜目のような任意の綱に属するものであってよい。
【０１０１】
宿主は、意図された結果を生じるために有効な量の本開示のプロバイオティック組成物を摂取することができる。意図された結果とは、宿主の消化管内の標的分析物の代謝であり得る。このケースにおいて、対象ポリペプチドは、分析物を処理する酵素であり得る。具体的には、本開示は、アルコールによる宿酔の原因である、エタノール代謝の生成物アセトアルデヒドの代謝を企図する。
【０１０２】
本明細書中で使用されるように、「アルコールによる宿酔」という用語は、脱水、浅眠、ふらつき、悪心、嘔吐、頭痛、倦怠、口腔乾燥、光および音に対する感受性、発汗、筋肉痛、下痢、胃痛、胃腸障害、めまい、不安、うつ、短気、ならびに体内アセトアルデヒド濃度上昇のうちの一つまたは複数を特徴とする、アルコールの消費に起因する状態をさす。
【０１０３】
アルコールによる宿酔の防止または処置、例えば、緩和は、アルコールの消費の前、途中、または後に、本開示のプロバイオティック組成物を対象へ投与することを含み得る。組成物は、アルコール消費開始前、24時間以内、18時間以内、12時間以内、11時間以内、10時間以内、9時間以内、8時間以内、7時間以内、6時間以内、5時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、または1時間以内に摂取されてよい。プロバイオティック組成物は、アルコール消費中に投与されてもよい。プロバイオティック組成物は、アルコール消費後、12時間以内、11時間以内、10時間以内、9時間以内、8時間以内、7時間以内、6時間以内、5時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、もしくは1時間以内に、または対象がアルコールによる宿酔の症状に苦しむ任意の時点で投与されてもよい。
【０１０４】
組成物は、経口消費によって、または肛門を通して、個体の消化管（例えば、胃または腸）へ投与され得る。非生存微生物ではなく生存微生物が、個体へ投与され得る。微生物はアルコール飲料とは異なる組成物で提供され得る、即ち、アルコール飲料とは別に摂られ得る。これは、例えば、アルコールの消費の前に組成物が投与される場合に当てはまり得る。
【０１０５】
プロバイオティックの有効用量は、アルコールによる宿酔の症状の程度に依存し得る。一般に、組換え細菌の投薬量は、対象の年齢、体重、身長、性別、医学的全身状態、および以前の病歴のような要因に依存して変動するであろう。具体的な態様において、約104〜約1012CFU、105〜1011CFU、106〜1010CFU、108〜1010CFU、または108〜1012CFU（「コロニー形成単位」）の微生物の範囲の細菌を投与することが望ましい可能性がある。
【０１０６】
別の態様において、本明細書中に開示された微生物は、所望の組成物の作製のために使用される。そのような組成物を作製する方法は、標的分析物を、所望の組成物、または所望の組成物の生成の中間体へ変換する酵素を、構成的に発現する組換え微生物を、培養する工程を含み得る。このケースにおいて、標的分析物が、微生物培養物に添加され、酵素生成物を生成するために十分な時間インキュベートされる。
【実施例】
【０１０７】
実施例1
方法：
株、プラスミド、および培地
Bacillus Genetic Stock CenterからのB.スブチリスPY79株を、全ての操作のために使用した（1A747株）。本明細書中で使用される全てのB.スブチリス株が、PY79の誘導体である。
【０１０８】
特記されない限り、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母抽出物、0.5％塩化ナトリウム、［固形培地の場合、1.5％寒天］）において細菌を増殖させた。MLS耐性選択のため、1ug/mLエリスロマイシンおよび25ug/mLリンコマイシンを使用した。形質転換実験のため、修飾コンピテンス（modified competence）（MC）培地（100mMリン酸緩衝液、2％グルコース、3mMクエン酸三ナトリウム、22mg/Lクエン酸鉄アンモニウム、0.1％カゼイン加水分解物、0.16％グルタミン酸、3mM硫酸マグネシウム）において細菌を増殖させた。
【０１０９】
遺伝子修飾を作製するために使用されたプラスミドは、pMiniMAD［9］である。
【０１１０】
pHyspankプロモーターの下でIPTGによって誘導される発現のために使用されたプラスミドは、pDR111［10］である。1mM IPTGを全ての誘導のために使用した。
【０１１１】
flgM欠失
PstI制限酵素認識配列によって分離されたflgMのコード配列の最初および最後の15塩基対と共に、B.スブチリスPY79由来のflgM遺伝子の5'および3'のおよそ800塩基対を含有しているインビトロで転写された二本鎖DNA分子（表1の完全配列を参照すること）を構築した。次いで、pMiniMADを、プライマーZP24およびZP25（表1）を使用して直鎖化した。次いで、得られたPCR産物およびΔflgM配列を、ギブソンアセンブリ［11］を使用して、pMiniMADΔ-flgMを作るために共にライゲートした。熱形質転換を介して、得られたプラスミドで大腸菌を形質転換した。プラスミドを市販のキットを使用してミニプレップに供し、そのミニプレップされたプラスミドを、以下のように欠失を行うためのDNA起源として使用した：
i. 15mL試験管において2mLのMC培地にPY79の単一コロニーを接種する。
ii. 4.5時間または指数増殖を出た後およそ1時間、275rmpで振とうしながら37℃で培養物を増殖させる。
iii. 新しい15mL試験管に400uLの培養物を移し、（前記の）1ugのミニプレップされたプラスミドを添加する。
iv. DNAを含む培養物を37℃のシェーカーに1.5時間戻す。
v. 1ug/mLエリスロマイシンおよび25ug/mLリンコマイシンを含むLB寒天に培養物を蒔く。
vi. 37℃で一夜インキュベートする。
vii. プライマーZP77およびZP78を使用したPCRを介して、変異対立遺伝子について、単離されたコロニーをスクリーニングし、抗生物質を含まない3mLのLBブロスに陽性コロニーを接種する。
viii. 275rpmで振とうしながら室温で一夜増殖させる。
ix. 抗生物質を含まないLBに10uLの一夜培養物を分離用に塗布し、37℃で一夜増殖させる。抗生物質選択が無いため、プラスミドは一夜の複製の間に失われ得る。このプラスミドの観察された安定性は約90％であり、コロニー10個中約1個がこの段階でプラスミドを失う。
x. 二重に、つまり抗生物質（1ug/mLエリスロマイシンおよび25ug/mLリンコマイシン）を含むLB、および含まないLBに、単離されたコロニーを塗布し、37℃で一夜増殖させる。
xi. 変異対立遺伝子を有する株を同定するため、プライマーZP77およびZP78によって抗生物質感受性コロニーをPCRスクリーニングする。
【０１１２】
（表１）プライマーおよび構築された遺伝子/対立遺伝子
2020535801.tif 000019
2020535801.tif 000020
2020535801.tif 000021
2020535801.tif 000022
2020535801.tif 000023
2020535801.tif 000024
【０１１３】
hagの、acoD遺伝子、aldB遺伝子、またはGFP遺伝子への交換
hag遺伝子の5'および3'の800塩基対が隣接した、GFPの配列、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼAcoD（C.ネカトール由来）の配列およびAldB（大腸菌由来）の配列をコードする二本鎖DNAを構築した（配列については表1を参照すること）。さらに、GFP/AcoD/AldBコード配列の、正確に38塩基対5'側の、5'隣接hag相同性部に、天然に存在する「G」を「A」に変化させる単一の点変異を各構築物が有することを特定することによって、CsrA結合部位を破壊した（「A」変異は表2中のこれらの配列において強調されている）。これらを、ギブソンアセンブリを介して、ZP24およびZP25によって直鎖化されたpMiniMADプラスミドへライゲートした。熱形質転換を介して、得られたプラスミドで大腸菌を形質転換した。プラスミドを市販のキットを使用してミニプレップに供し、そのミニプレップされたプラスミドを、flgM欠失の場合と同一のプロトコルに従い、染色体修飾を行うためのDNA起源として使用した。
【０１１４】
プロモーター強度を定量化するためのGFPアッセイ
試験される株を、LBプレートに塗布し、37℃で一夜増殖させた。一夜増殖物からの単一のコロニーを3mLのLBに接種し、IPTG誘導可能pHyspankプロモーター下にGFPを有するB.スブチリスの株を誘導するため、1mM IPTGを添加した。株を、275rpmで振とうしながら37℃で7時間増殖させた。タイムポイントを2.5時間、4時間、5.5時間、および7時間で得た。各チューブから200uLの培養物を取り出し、2分間13,000×gで遠心沈殿させ、次いで、ペレットを200uLのPBSに再懸濁させることによって、タイムポイントを得た。次いで、これらの再懸濁液をcostar黒色96穴プレートのウェルに等分し、蛍光光度計（励起485nm；放射535nm）で読み取った。蛍光読み取りの後、蛍光を培養物の光学濃度に対してノーマライズするため、各ウェルの100uLを採取し、分光光度計で600nmにおける吸光度について読み取った。
【０１１５】
プレート可視化のため、凍結ストックをLBプレートにパッチ状に塗布し、37℃で一夜増殖させた。蛍光を、青色LED閃光（480nm波長）およびオレンジ色フィルタによって可視化した。
【０１１６】
ALDH活性を定量化するためのHPLCアッセイ
試料調製：LBプレート上の37℃での一夜増殖からの単一のコロニーを、4mLのLB培地に接種し、OD600がおよそ0.2になるまで、1.75時間、275rpmで振とうしながら37℃で増殖させ、次いで、各2mLの2本のチューブに分割した。各株について、一方のチューブは、1mM IPTGによって誘導し、他方のチューブは、対照として未誘導のままにした。誘導の5時間後（計6.75時間の増殖）、OD600を査定し（全ての株がOD600およそ4であった）、1.5mLの培養物を6000×Gで5分間遠心沈殿させ、ペレットを200uLのPBSに再懸濁させた。200mMアセトアルデヒドの最終濃度を与えるため、22uLの2Mアセトアルデヒドを細胞の各チューブに添加した。次いで、チューブを37℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を、4℃で20,000×Gで10分間遠心沈殿させ、得られた上清150uLを1350uLのPBSに添加した（従って、アセトアルデヒドが失われなければ、最終濃度は20mMになるであろう）。次いで、これらの希釈された上清を、1.5mL微量遠心管において-20℃で凍結させた。
【０１１７】
標準調製物：168uLのアセトアルデヒドを、2Mストックを作製するため、1332uLのPBSに添加し、-20℃で凍結させた。1mM、2.5mM、5mM、10mM、および20mMの最終濃度の標準物のため、この2MストックをPBSで希釈することによって、HPLC用の標準曲線を作製するための試料を、実験日に新たに調製した。各標準を2回反復で作製し、1セットを試料の前に実行し、1セットを試料の後に実行した。次いで、ヘッドスペースを限定するため、ネックまで充填されたHPLCバイアルへ、全ての標準および試料を負荷した。HPLCバイアルへ負荷する場合に、残存細菌を除去するため、試料は0.2umフィルタでろ過したが、標準はろ過しなかった。
【０１１８】
試料を、Aminex HPX-87Hカラムを含むShimadzuのシステムで実行した。試料を、50℃（カラム温度）で、0.6mL/分の流速で、0.005M硫酸移動相による均一濃度溶出で実行した。屈折率を介して試料を検出した。
【０１１９】
AcoD発現の定性分析（クーマシー染色）
LBプレート上の37℃での一夜増殖からの単一コロニーを、2.5mLのLB培地（pHyspankプロモーターを有する株については、＋1mM IPTG）に接種し、275rpmで振とうしながら37℃で4.5時間増殖させた。1.5mLの各培養物を、13,000×Gで2分間遠心沈殿させ、ペレットを50uLの溶解緩衝液（20mM TRIS、10mM EDTA、0.1％リゾチーム、0.01％RNaseA、0.002％DNaseI、および製造業者の説明に従って希釈されたRoche EDTA-free cOmpleteプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット）に再懸濁させた。次いで、試料を、37℃の水浴中で30分間、溶解緩衝液中でインキュベートした。次いで、50uLの2×レムリ緩衝液を試料に添加し、試料をサーモサイクラー上で、100℃で5分間インキュベートした。次いで、試料を、13,000×Gで2分間遠心沈殿させ、10uLを8％SDS-PAGEゲルに負荷し、140Vで1時間実行した。次いで、ゲルを、振とうしながらddH2Oによって6回、各5分間、濯いだ。次いで、それを、振とうしながら室温で、クーマシーブリリアントブルー染料中で一夜インキュベートした。
【０１２０】
結果：
B.スブチリスにおけるALDH遺伝子の異種発現は、アセトアルデヒド分解の生理学的に適切な速度をもたらす
B.スブチリスの機能性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを異種発現する能力を査定するため、IPTGによって誘導可能であるpHyspankプロモーターの調節下にアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする株を構築した。2種の異なるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを、文献のレビューの後に選択した。選択の基準は、酵素動力学が特徴決定されておりアセトアルデヒドに対して高い特異性を有すること；細菌起源であること；非病原性細菌に由来すること；タンパク質産物が可溶性である（即ち、膜結合型ではない）こと；およびアミノ酸配列が既知であることであった。そのような検索を実施した後、数種の候補が同定され、これらの基準に最もよく適合するものとして2種が選択された。第1は、C.ネカトール由来のacoD遺伝子によってコードされるAcoDであり［12］、それは、アセトアルデヒドに対しておよそ4uMという実験的に決定されたKmを有し、アセトアルデヒドを酢酸塩へ酸化するために補因子としてNADを使用する。第2は、大腸菌のaldB遺伝子によってコードされるAldBであり［13］、それは、およそ2.5uMという実験的に決定されたKm、および2U/mgというVmaxを有し、補因子としてNADPを使用する。
【０１２１】
pHyspankプロモーターの調節下にacoDを含むB.スブチリス、およびpHyspankプロモーターの調節下にaldBを含むB.スブチリスを、IPTG誘導の存在下または非存在下で増殖させ、次いで、200mM IPTGと共に室温で30分間インキュベートした。次いで、全ての細菌を除去するため、試料をろ過し、-20℃で凍結させた。
【０１２２】
試料を解凍し、PBSで1:10希釈し、標準を、HPLCアッセイの日に新たに調製した。次いで、全ての試料を、アセトアルデヒドの量を定量化するため、HPLCで実行した。2セットの標準を、一方は最初に、他方は最後に実行したのに加え、チューブが数時間機械上にあり、実行される順番が後の試料が誤ってより低く見えるのではないことを確実にすることが望まれるため、HPLCラン中のアセトアルデヒドの可能性のある蒸発またはその他の確率的な喪失を調節するため、アセトアルデヒドの10mM標準の単一の調製物をランの最初および最後に実行した（即ち、同一のチューブを2回実行した）。標準曲線は、各標準試料についての曲線下面積に基づき生成され、最良適合線は、＞0.99のR2を有していた。次いで、この線についての方程式を、試料の各々についての濃度を生成するために使用した。このアッセイの結果は、図1に提示される。2回実行されたアセトアルデヒド標準に差は本質的に存在せず、ラン中の試料からのアセトアルデヒドの有意な確率的な喪失はないことが示された。さらに、未誘導の細菌を含む試料は、20mM標準とよく一致するアセトアルデヒドレベルを有しており、未誘導の細菌は、天然に存在する機序によってアセトアルデヒドを効果的に除去しないことが証明された。
【０１２３】
しかしながら、AldBまたはAcoDが誘導された場合、試料は、アセトアルデヒド濃度の（それぞれ）およそ4mMおよびおよそ8mMの低下を示し、このことから、タンパク質の誘導がアセトアルデヒドの除去を引き起こしたことが示された。
【０１２４】
flqM欠失およびCsrA結合部位点変異の組み合わせは、hagプロモーターを介した頑強で構成的な異種タンパク質発現をもたらす
B.スブチリスにおいてhag遺伝子によってコードされるフラジェリンは、運動性が有利であると細胞が決定する場合、極めて高レベルに発現される。しかしながら、鞭毛の製造は、細胞にとって栄養的にもエネルギー的に極めて高価であるため、生活環中、運動性が不適切である場合にHagの産生を抑制するため、数種の機序を有する。
【０１２５】
FlgMは、hagの転写を活性化するシグマ因子SigDに結合しそれを抑制することが公知である。従って、flgMの欠失は、転写抑制を除去し、高レベルの発現を構成的にもたらすはずである。リボソーム結合部位においてhag転写物に結合し、それによって、リボソーム翻訳を競合的に阻害するCsrAによって、hagのタンパク質への翻訳は、さらに転写後に抑制される。この結合部位における単一の点変異は、CsrA結合を排除するが、リボソーム結合は排除せず、従って、hag転写物の構成的な翻訳を可能にする。
【０１２６】
これらの2種の重要な抑制機序の除去は異種タンパク質の頑強で構成的な発現をもたらすであろうという仮説を試験するため、flgMを欠失させ、単一の点変異をCsrA結合部位において作製し、hag遺伝子を発現のレポーターGFPに交換した。プレート上のこの株の蛍光を、抑制解除されたpHyspankプロモーターを介してGFPを発現する株（構成的な発現を確実にするため、この構築物からはlacIが欠失しており、ΔlacI株は、完全なlacIを含み1mM IPTGによって誘導された株と類似したレベルのGFP発現を有することが示された［示されないデータ］）のものと比較した。並べて塗布した場合、修飾型hag発現系の2個の異なる単離物は、pHyspank発現系より質的にはるかに明るかった（図2a）。
【０１２７】
しかしながら、発現が実際に構成的であったか否かを確かめ、これらの2種の発現系の間の差を定量化するため、ブロス増殖および蛍光のタイムコースを得た。株をLBにおいて増殖させ、OD600および蛍光を、増殖2.5時間目に査定し、次いで、その後、90分毎に7時間後まで査定した（図2b）。実際、2.5時間後、OD600に対してノーマライズされた蛍光は、pHyspank発現系より修飾型hag発現系において、およそ4倍高かった。これは、4時間後までにおよそ10倍にまで増加し、査定された7時間を通しておよそ10倍高いままであった。
【０１２８】
抑制解除されたhagプロモーターを利用して、pHyspankより質的に高いレベルのAcoDが産生される
修飾型hagプロモーターを介した頑強で構成的な発現が、GFPに特異的ではなく、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む他の異種タンパク質発現のために利用され得ることを確実にするため、2種の異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子：C.ネカトール由来のacoDおよび大腸菌由来のaldBを、2種の異なる株のhag遺伝子座へ挿入した。次いで、これらの株を、pHyspankプロモーターを介してacoDおよびaldBを発現する株、ならびに陽性対照としての修飾型hagプロモーターを介してGFPを発現する株と共に、ブロス培養において増殖させた。細菌をペレット化し、溶解し、溶解物をSDS-PAGEゲルで実行し、クーマシーを使用して全タンパク質について染色した。予想通り、GFPについての明瞭なバンドが存在する（図3）。さらに、修飾型hagプロモーターを介して発現された場合、hisタグ付きAcoD、タグ無しAcoD、およびhisタグ付きAldBについての等しい明るさのバンドが存在する（図3）。しかしながら、誘導されたpHyspank調節下にあるAcoDおよびAldBについては、予想されるサイズの微かなバンドしか存在しない。この明白に低い発現レベルにも関わらず、このレベルは、生理学的に適切な速度でのアセトアルデヒドの除去のために十分であることがHPLC実験から既知である。従って、クーマシー染色は、質的に明瞭に多いタンパク質が修飾型hagプロモーターを介して産生されることを証明しているため、この発現系は、はるかに高くはないにしても、少なくとも頑強なアセトアルデヒド除去の速度を生じるであろうと予想することは合理的である。
【０１２９】
考察：
酵素アプローチは、優れた効力、多用途性、および特異性のため、薬学の世界において急速に低分子に取って代わり標準になりつつある。その証拠に、2017年には2千億ドル超であった生物製剤市場が、その後の7年で2倍になった。さらに、2016年のベストセラー薬物トップ10のうちの8種が、生物製剤であった。
【０１３０】
しかしながら、生物製剤を作製するための現在のプロセスは、長く、高価であり、低分子薬物を製造するために使用されるのと類似の思考様式によって一般に取り組まれている。この強力な薬物クラスをより広範な使用のために利用可能にするためには、方法の段階的な変化が必要である。本発明の目的は、対費用効果が高く、経口送達可能な、アルコールによる宿酔のための酵素治療を作製することである。
【０１３１】
図1に示されるように、2種の異なる異種タンパク質の細胞内発現は、アセトアルデヒドの著しい除去をもたらした。実際、夜の大量飲酒がおよそ150uMの結腸アセトアルデヒドレベルを引き起こし［14］、72kgのヒトの体内におよそ15Lの細胞外液が存在すると仮定した場合、同一の量の細菌は、およそ3時間で15Lから150uMのアセトアルデヒドを除去し得る。当然、これは「簡略な」計算であるが、これらが比較的生理学的に適切な速度を表すと仮定することは、少なくとも非合理的ではない。
【０１３２】
さらに、非細菌対照は、その低下が単純な蒸発またはその他の何らかの除去の方法によるものではなかったことを証明しており、未誘導の対照は、除去が、ALDHの発現に特異的であって、細菌の何らかの固有の機能ではなかったことを証明している。さらに、同一の20mM標準チューブのランの最初および最後における再読み取りは、低下がHPLCラン中の蒸発によるものではなかったことを証明している。また、アセトアルデヒドの除去は、アルデヒドデヒドロゲナーゼの誘導に依存しており、このことは、細菌自身が天然にアセトアルデヒドを除去するのではなく、異種発現されたアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを必要とすることを示した。
【０１３３】
FlgMおよびCsrAによる抑制を除去することによって、本発明者らの株の増殖周期の間中、GFPの迅速かつ頑強な発現が構成的に達成された。B.スブチリスにおける発現についての学術的標準であるpHyspankプロモーターを使用した発現レベルより、これらのレベルが5〜10倍高いという事実は、この発現系の有用性を証明している。さらに、蛍光/OD600比が増殖曲線の間中、増加し続け、このことは、蛍光がODより速く増加し、即ち、各細胞がより多くのGFPを産生し続けていたことを示すことに注目することも重要である。これは、flgM欠失およびCsrA結合部位変異が構成的な頑強な発現をもたらすという仮説に一致している。発現が、増殖曲線の間中、構成的でなかったなら、絶対的な蛍光は上昇し続けたとしても、OD600に対する蛍光の比は、最終的には、プラトーに達するかまたは低下していたであろう。
【０１３４】
さらに、アセトアルデヒド除去の生理学的に適切な速度の証明が、pHyspankプロモーターを使用して行われ、編集されたpHagプロモーターを利用した本発明者らの系が、より多くのタンパク質を生成し、アセトアルデヒド除去の必要な速度をはるかに十分に超えることが示された。実際、クーマシーゲル（図2b）におけるAcoDのバンド密度の定性的な比較は、はるかに優れたタンパク質発現を示す、はるかに頑強なタンパク質バンドを示す。
【０１３５】
総合すると、現在記載されているまたは実行されている他の戦略とは区別される、身体からのアセトアルデヒド除去のための新規の系が開発された。それは、アセトアルデヒドを酵素的に直接除去するため、異種タンパク質を構成的に発現するように改変された食用細菌を含む。それは、フラジェリンプロモーターのリプレッサーの除去によって増強された頑強なフラジェリンプロモーターを活用する異種タンパク質発現戦略を利用する。
【０１３６】
実施例2
対象は、以下の修飾：FlgM欠失、本明細書中に記載されるBS1の変異、および本明細書中に記載される、hag遺伝子のAcoDへの交換、を含む、胞子調製物B.スブチリスの1E9 CFUの水懸濁液を摂取する。その直後に、その者は、6杯のアルコール飲料（12オンスの5％エタノール）を3時間かけて摂取した後、就寝する。典型的には、このアルコール量によって、その者は、ふらつき、重度の頭痛、悪心、倦怠、光および音に対する感受性、めまい、ならびに短気を特徴とするアルコールによる宿酔を有することになる。これらの症状は、典型的には、就寝中、8時間以内に始まり、その後、12時間持続する。しかしながら、その者は、前夜に消費したエタノールの代謝のため身体によって形成された過剰のアセトアルデヒドを有することなく、8時間後に起床する。従って、軽度のふらつきおよび脱水による軽微な頭痛は有するが、宿酔に関連したその他の症状は、大きく低下しているかまたは有していない。
【０１３７】
例示的態様
１．
アルコールによる宿酔を防止するかまたは処置するための方法であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成的に発現するように組換え的に改変された組換え細菌を含む組成物の有効量を、それを必要とする対象の消化管へ投与する工程を含む、前記方法。
２．
組換え細菌が、
（a）アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、ポリヌクレオチド；および
（b）シグマ因子リプレッサーの遺伝子修飾であって、フラジェリン遺伝子プロモーターからのシグマ因子による転写開始の阻害を低下させる、修飾
を含む、態様1の方法。
３．
細菌が、バチルス（Bacillus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エシェリキア（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ペディオコッカス、およびストレプトコッカス（Streptococcus）より選択される属に属する、態様2の方法。
４．
（1）細菌がバチルス属に属し、（2）フラジェリン遺伝子プロモーターが、CsrA BS1結合部位および/またはCsrA BS2結合部位の1個または複数個の遺伝子修飾を含む修飾型バチルスhagプロモーターであり、（3）シグマ因子がSigDであり、（4）SigDリプレッサーがFlgMである、態様2の方法。
５．
hagプロモーターが、12塩基対BS1結合部位における、またはBS1のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個の遺伝子修飾を含む、態様4の方法。
６．
hagプロモーターが、CsrA BS1認識配列AGGAの修飾を含む、態様4の方法。
７．
hagプロモーターが、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000025
を含む、態様4の方法。
８．
1個または複数個の遺伝子修飾が、CsrA BS2結合部位に対する1個または複数個の点変異を含む、態様4の方法。
９．
hagプロモーターが、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS2のステムループ構造を破壊する1個または複数個の遺伝子修飾を含む、態様4の方法。
１０．
hagプロモーターがBS2結合部位の修飾を含み、該修飾がヌクレオチド配列
2020535801.tif 000026
を含む、態様4の方法。
１１．
アルデヒドデヒドロゲナーゼが細菌アルデヒドデヒドロゲナーゼである、態様1の方法。
１２．
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、（1）カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）由来のAcoD、および（2）大腸菌（E.coli）由来のAldBより選択される、態様4の方法。
１３．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、flgM遺伝子の全部または一部の欠失を含む、態様4の方法。
１４．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、二次構造または三次構造を破壊するものである、態様4の方法。
１５．
発現構築物が細菌染色体に位置する、態様4の方法。
１６．
アルコールの消費中に組成物を対象へ投与する工程を含む、態様1の方法。
１７．
アルコールの消費の開始前24時間以内に組成物を対象へ投与する工程を含む、態様1の方法。
１８．
組成物が経口投与される、態様1の方法。
１９．
組成物が、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質、水、カプセル増量剤、ならびに粘着性材料より選択される生理学的に許容される担体をさらに含む、態様1の方法。
２０．
組成物が、約104〜約1012コロニー形成単位の組換え細菌を含む、態様1の方法。
２１．
（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、ポリヌクレオチド；および
（b）SigDによる転写開始の阻害を低下させるflgM遺伝子の遺伝子修飾
を含む、組換え微生物。
２２．
ポリペプチドを構成的に発現する、態様21の組換え微生物。
２３．
プロバイオティックである、態様21の組換え微生物。
２４．
バチルス、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカス、大腸菌、ラクトバチルス、ロイコノストック、ペディオコッカス、ペディオコッカス、およびストレプトコッカスより選択される属に属する、態様21の組換え微生物。
２５．
バチルス属に属する、態様21の組換え微生物。
２６．
B.スブチリス（subtilis）である、態様21の組換え微生物。
２７．
フラジェリン遺伝子プロモーターがhagプロモーターである、前記態様のいずれかの組換え微生物。
２８．
hagプロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含み、遺伝子修飾が、CsrA BS1結合部位および/またはCsrA BS2結合部位の修飾（例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、または欠失）を含む、態様27の組換え微生物。
２９．
1個または複数個の遺伝子修飾が、CsrA BS1認識配列AGGAに対する1個または複数個（例えば、2個、3個、または4個）の遺伝子修飾、例えば、配列AGAAへの修飾を含む、態様28の組換え微生物。
３０．
1個または複数個の遺伝子修飾が、12塩基対BS1結合部位における、またはBS1のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個の遺伝子修飾を含む、態様28の組換え微生物。
３１．
1個または複数個の遺伝子修飾が、BS1結合部位gcacaaggacgtにおける1個または複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個）の遺伝子修飾を含む、態様28の組換え微生物。
３２．
1個または複数個の遺伝子修飾が、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS1のステムループ構造を破壊するものである、態様28の組換え微生物。
３３．
1個または複数個の遺伝子修飾が、例えば、1個、2個、3個、4個、またはそれ以上の水素結合対を排除するための、水素結合に関与する配列
2020535801.tif 000027
における1個または複数個の遺伝子修飾を含む、態様28の組換え微生物。
３４．
修飾型BS1が、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000028
を有する、態様28の組換え微生物。
３５．
1個または複数個の遺伝子修飾が、CsrA BS2結合部位に対する1個または複数個の点変異を含む、態様28の組換え微生物。
３６．
1個または複数個の遺伝子修飾が、13塩基対BS2結合部位における、またはBS2のステムループ二次構造のステムを形成する結合部位のいずれかの側の周辺塩基における、1個または複数個（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個）の遺伝子修飾を含む、態様28の組換え微生物。
３７．
1個または複数個の遺伝子修飾が、水素結合を可能にする相補性の排除によってBS2のステムループ構造を破壊するものである、態様28の組換え微生物。
３８．
修飾型BS2が、ヌクレオチド配列
2020535801.tif 000029
を有する、態様28の組換え微生物。
３９．
BS2結合部位に対する1個または複数個の遺伝子修飾が、シャイン・ダルガーノ配列agggaggaのヌクレオチドの変更を含まない、態様28の組換え微生物。
４０．
フラジェリン遺伝子プロモーターが、細菌染色体またはプラスミドに位置する、前記態様のいずれかの組換え微生物。
４１．
対象ポリペプチドがアルデヒドデヒドロゲナーゼである、前記態様のいずれかの組換え微生物。
４２．
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、カプリアビダス・ネカトール由来のAcoDであり、
2020535801.tif 000030
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、態様41の組換え微生物。
４３．
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、例えば、
2020535801.tif 000031
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼである、態様41の組換え微生物。
４４．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、flgM遺伝子の全部または一部の欠失を含む、態様21の組換え微生物。
４５．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、flgMの活性部位をコードする配列における単一の変異または一連の変異を含む、態様21の組換え微生物。
４６．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、例えば、FlgM二次構造を規定するヘリックスのうちの1個において、二次構造または三次構造を破壊するものである、態様21の組換え微生物。
４７．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、例えば、B.スブチリスFlgMのI-58、K-62、I-65、G-68、D-73、A-78より選択される、FlgMタンパク質のC末端の3番目または4番目のヘリックスのアミノ酸の変更を含む、態様21の組換え微生物。
４８．
flgM遺伝子における遺伝子修飾が、例えば、B.スブチリスFlgMのI-3、G-7、S-10、V-11、A-40、K-41、M43、I-58、L-61、K-62、I-65、Y-70、K-71、V-72、D-73、A-74、H-76、I-77、A-78、N-80、M-81、I-82、N-83、F-84、Y-85、およびK-86より選択される、FlgMのSigDとの結合に関係すると予測される1個または複数個のアミノ酸の変更を含む、態様21の組換え微生物。
４９．
アルデヒドデヒドロゲナーゼを構成的に発現する、組換えプロバイオティック微生物。
５０．
（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチド；および
（b）SigDによる発現の阻害を低下させるFlgM遺伝子における遺伝子修飾
を含む、態様49の組換えプロバイオティック微生物。
５１．
フラジェリン遺伝子プロモーターが、該プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、態様50の組換えプロバイオティック微生物。
５２．
対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチドであって、フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、前記ポリヌクレオチド。
５３．
態様21または態様49の組換え微生物を培養する工程を含む、ポリペプチドを作製する方法。
５４．
ポリペプチドを単離する工程をさらに含む、態様53の方法。
５５．
生理学的に許容される担体と組換えプロバイオティック微生物とを含む組成物であって、組換えプロバイオティック微生物が
（a）対象ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されたフラジェリン遺伝子プロモーターを含む発現構築物を含むポリヌクレオチド；および
（b）SigDによる転写開始の阻害を低下させるFlgM遺伝子の遺伝子修飾
を含む、前記組成物。
５６．
フラジェリン遺伝子プロモーターが、フラジェリン遺伝子プロモーターから転写されたmRNAの翻訳のCsrAによる抑制を低下させる1個または複数個の遺伝子修飾を含む、態様55の組成物。
５７．
対象ポリペプチドがアルデヒドデヒドロゲナーゼである、態様55の組成物。
５８．
生理学的に許容される担体が、乳酸発酵食品、発酵乳製品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質、水、カプセル増量剤、ならびに粘着性材料より選択される、態様55の組成物。
５９．
約104〜約1012コロニー形成単位の組換えプロバイオティック微生物を含む、態様55の組成物の単位用量。
６０．
分析物を代謝する酵素を構成的に発現する微生物を含む組成物の有効量を、対象へ投与する工程を含む、対象の消化管内または循環血中の分析物を代謝する方法。
６１．
（a）態様1の組換え微生物を含む培養物を分析物と接触させる工程であって、対象ポリペプチドが、該分析物を基質とする酵素である、工程、および
（b）微生物を培養する工程であって、酵素が分析物の標的化合物への変換を触媒する、工程
を含む、標的化合物を作製する方法。
６２．
酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼより選択される、態様63の方法。
【０１３８】
参考文献
2020535801.tif 000032
2020535801.tif 000033
【０１３９】
本願の全体にわたって使用されるように、「であり得る」という単語は、義務的な意味（即ち、でなければならないという意味）ではなく、許容的な意味（即ち、その可能性を有するという意味）で使用される。「含む（include）」、「含む（including）」、および「含む（includes）」等の単語は、〜を含むが、それに限定されるわけではないことを意味する。本願の全体にわたって使用されるように、単数形「（a）」、「（an）」、および「（the）」には、前後関係がそうでないことを明示的に示さない限り、複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「要素（an element）」との言及には、「1または複数」のような1個または複数個の要素のための他の用語および語句の使用にも関わらず、2個以上の要素の組み合わせが含まれる。「または」という用語は、他のことが示されない限り、非排他的である、即ち、「および」および「または」の両方を包含する。
【０１４０】
本開示の態様が、本明細書中に示され説明されたが、そのような態様は、例として提供されるに過ぎないことが、当業者には明瞭であろう。本開示が、本明細書中に提供される具体的な例によって限定されることは意図されない。本開示は、上記の明細書に関して記載されているが、本明細書中の態様の説明および例示は、限定的な意味で解釈すべきものではない。多数の変動、変化、および置換が、本開示から逸脱することなく、当業者に想到されるであろう。さらに、本開示の全ての局面が、多様な条件および変量に依存する、本明細書中に示された具体的な描写、配置、または相対的な割合に限定されないことが、理解されるべきである。本明細書中に記載された本開示の態様の様々な代替物が、本開示の実施において利用され得ることが理解されるべきである。従って、本開示は、そのような代替物、修飾、変動、または等価物もカバーすることが企図される。添付の特許請求の範囲が、本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、それによってカバーされるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020535801.tif 000049
2020535801.tif 000050
2020535801.tif 000051
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