(57)【要約】  本発明は、部分的に、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質、並びに癌及び／又は炎症性疾患のための免疫療法などの、疾患の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＳＦ１Ｒリガンドを結合できるコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の一部を含む第１ドメイン、
（ｂ）ＣＤ４０Ｌ受容体を結合できるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の一部を含む第２ドメイン、及び
（ｃ）前記第１ドメインと前記第２ドメインを連結するリンカー
を含む異種キメラタンパク質。
【請求項２】
前記第１ドメインが、前記ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインの実質的に全てを含みかつ前記第２ドメインが、前記ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインの実質的に全てを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３】
前記キメラタンパク質が、免疫抑制シグナルを阻害できる、請求項１又は請求項２に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４】
前記キメラタンパク質が、
（ａ）前記ＣＳＦ１Ｒの一部がそのリガンドに結合した時に免疫阻害シグナルを低減若しくは排除できかつ／又は
（ｂ）前記ＣＤ４０Ｌの一部がその受容体に結合した時に免疫刺激シグナルを増加若しくは活性化できる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項５】
前記ＣＳＦ１Ｒリガンドが、ＣＳＦ１又はＩＬ−３４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項６】
前記ＣＤ４０Ｌ受容体が、ＣＤ４０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項７】
前記キメラタンパク質が、前記ＣＳＦ１Ｒリガンド及び前記ＣＤ４０Ｌ受容体を同時に結合でき、前記ＣＳＦ１Ｒリガンドが、ＣＳＦ１又はＩＬ−３４でありかつ前記ＣＤ４０Ｌ受容体が、ＣＤ４０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項８】
前記キメラタンパク質が、インビトロで組換えヒトＣＤ４０及びヒトＣＳＦ１を同時に結合できる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項９】
前記キメラタンパク質が、必要に応じて血清中で、ＣＳＦ１及び／又はＩＬ−３４を枯渇させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１０】
前記キメラタンパク質が、ＣＤ４０アゴニスト抗体及び／又はＣＳＦ１Ｒ拮抗抗体と比較して高められた安全性プロファイル及び／又は低減された毒性プロファイルを示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１１】
前記キメラタンパク質が、ＣＤ４０アゴニスト抗体及び／又はＣＳＦ１Ｒ拮抗抗体と比較して増強された抗腫瘍効果を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１２】
前記キメラタンパク質が、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブ集団の低下を増加させること又は防止することができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１３】
前記キメラタンパク質が、Ｔ細胞による腫瘍殺傷活性を増強できる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１４】
前記キメラタンパク質が、持続的な免疫調節効果を提供できる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１５】
前記キメラタンパク質が、抗原提示細胞の活性化を引き起こすことができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１６】
前記キメラタンパク質が、抗原を提示する抗原提示細胞の能力を増強できる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１７】
前記キメラタンパク質が、腫瘍を保護する細胞とは反対に腫瘍を死滅させることができる細胞に有利に免疫細胞の比をシフトさせる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１８】
前記腫瘍を死滅させることができる細胞が、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞から選択され、腫瘍を保護する細胞が、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））から選択される、請求項１７に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１９】
前記キメラタンパク質が、抗腫瘍マクロファージ及び抗原提示細胞を刺激し、一方でＣＳＦ１及び／又はＩＬ−３４の阻害によるＭＤＳＣの誘導を回避する、請求項１８に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２０】
前記キメラタンパク質が、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２１】
前記キメラタンパク質が、免疫阻害シグナルの持続的なマスキング効果を提供する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２２】
前記キメラタンパク質が、前記キメラタンパク質の血清ｔ１／２と比較してより長いオンターゲット（例えば、腫瘍内）の半減期（ｔ１／２）を提供する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２３】
前記キメラタンパク質が、ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０に対する抗体での治療と比較して毒性を低減する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２４】
前記リンカーが、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されるポリペプチドである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２５】
前記リンカーが、ＩｇＧ４由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む、請求項２４に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２６】
前記ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４由来である、請求項２５に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２７】
前記キメラタンパク質が、分泌可能で機能的な単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞により発現される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２８】
前記ＣＳＦ１Ｒの一部が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２９】
前記ＣＤ４０Ｌの一部が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３０】
前記リンカーが、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３１】
前記リンカーが、配列番号２８〜７４から独立して選択される、１以上の結合リンカーを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３２】
前記リンカーが、配列番号２８〜７４からそれぞれ独立して選択される２以上の結合リンカーを含み、１つの結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｆｃ  ドメインに対しＮ末端でありかつ別の結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｆｃ  ドメインに対しＣ末端である、請求項３１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３３】
前記キメラタンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３４】
前記キメラタンパク質が、細胞間で安定なシナプスを形成できる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３５】
前記細胞間で安定なシナプスが、腫瘍縮小に有利である空間的配向を提供する、請求項３４に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３６】
前記空間的配向が、腫瘍細胞を攻撃するようＴ細胞を位置づけかつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされるもの以外の負のシグナルを含む、負のシグナルの送達から腫瘍細胞を立体的に防ぐ、請求項３４又は請求項３５に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３７】
そのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメインのいずれか又は両方の結合が、受容体とそのリガンドの長い相互作用を提供する遅いオフ速度（Ｋｏｆｆ）で生じる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３８】
前記長い相互作用が、より長い正のシグナル効果を送達する、請求項３７に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３９】
前記より長い正のシグナル効果が、抗腫瘍効果のためにエフェクター細胞が十分に刺激されることを可能にする、請求項３８に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４０】
前記長い相互作用が、Ｔ細胞増殖を提供しかつ抗腫瘍攻撃を可能にする、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４１】
前記長い相互作用が、刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４２】
前記刺激シグナルが、サイトカインである、請求項４１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の治療有効量の異種キメラタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項４６】
癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項４５に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４７】
患者の免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする対象に請求項４５に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
前記患者のＴ細胞が、活性化される、請求項４６又は請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者が、腫瘍を有しかつ１以上の腫瘍細胞が、免疫抑制シグナルを伝達することを防止される、請求項４６又は請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
それを必要とする対象に有効量の医薬組成物を投与することを含む癌又は炎症性疾患を治療するための方法であって、前記医薬組成物が、
（ａ）ＣＳＦ１Ｒリガンドを結合できるコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の一部を含む第１ドメイン、
（ｂ）ＣＤ４０Ｌ受容体を結合できるＣＤ−４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の一部を含む第２ドメイン、及び
（ｃ）前記第１のドメインと前記第２のドメインを連結するリンカー、
を含む異種キメラタンパク質を含む、方法。
【請求項５１】
前記対象のＴ細胞が、前記異種キメラタンパク質の第２のドメインにより結合される時に活性化されかつ、
（ａ）１以上の腫瘍細胞が前記異種キメラタンパク質の前記第１のドメインにより結合される時に免疫抑制シグナルを伝達することを防止され、
（ｂ）前記対象の末梢血中の定量化可能なサイトカイン応答が達成され、かつ／又は
（ｃ）腫瘍成長がＣＤ４０ブロッキング抗体、及び／若しくはＣＳＦ１若しくはＩＬ−３４ブロッキング抗体で治療された対象と比較してそれを必要とする対象において低下される、
請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を阻害しかつ抑制性骨髄細胞集団を阻害する、請求項５０又は請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が、ＣＤ４０シグナル伝達を刺激しかつ抗原提示細胞を活性化する、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較して腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の量又は活性を低下させる、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較して腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の量又は活性を低下させる、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較して制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量又は活性を低下させる、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較してＩＬ−１０及び／又はＩＬ−４の量又は活性を低下させる、請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較して炎症促進性マクロファージ及び樹状細胞の成熟並びに分化を増加させる、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較して前記対象の流入領域リンパ節においてエフェクターＴ細胞のプライミングを増加させる、請求項５０〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記方法が、未治療の対象又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの一方を標的とする対象と比較して免疫抑制細胞の全体的な減少及びより炎症性の腫瘍環境へのシフトを引き起こす、請求項５０〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
医薬としての使用のための請求項１〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６２】
癌の治療での使用のための請求項１〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６３】
炎症性疾患の治療での使用のための請求項１〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６４】
薬剤の製造における請求項１〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項６５】
Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含み、式中、
（ａ）が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありかつＣＳＦ１Ｒリガンドを結合できるＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、
（ｂ）が、前記第１のドメイン及び前記第２のドメインを連結しかつヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含むリンカーであり、かつ必要に応じて配列番号２８〜７４からの結合リンカー配列であり、並びに
（ｃ）が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありかつＣＤ４０Ｌ受容体を結合できるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、
組換え融合タンパク質。
【請求項６６】
前記リンカーが、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項６５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６７】
医薬としての使用のための、請求項６５又は請求項６６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６８】
癌の治療での使用のための、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６９】
炎症性疾患の治療での使用のための、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７０】
薬剤の製造における請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１７年２月２７日出願の米国仮出願第６２／４６３，９９７号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に送信された資料の参照による組み込み
本出願は配列リストを含有する。配列リストは、「ＳＨＫ−００２ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」というタイトルのＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送信された。配列リストは９２，９７６バイトのサイズであり、２０１８年２月２７日頃に作成された。配列リストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、部分的には、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質、並びに癌及び／又は炎症性疾患のための免疫療法などの、疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
最近の臨床データは、例えば、ヤーボイＹＥＲＶＯＹ、キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、及びオプジーボ（ＯＰＤＩＶＯ）の承認につながった臨床試験を含む、免疫共阻害分子を標的とする薬剤への印象的な患者の応答を実証した。これらの免疫療法は、チェックポイント阻害剤として集合的に特徴付けられ、不運にも、これらの治療法は、癌患者の約１５〜３０％に臨床的利益を提供するのみである。より広い癌患者の集団の臨床応答率を改善するための１つの有力なアプローチは、別の治療法とチェックポイント阻害剤療法を組み合わせることを含む。そのような組み合わせは、複数の個々の治療薬を使用して適用される場合に、臨床上の利益の向上につながり得るが、開発が厄介である。さらに、多くの免疫療法は、治療のための患者の治療ウィンドウを大幅に狭める重篤な副作用を併発する。
【０００５】
単一薬物中に複数の治療メカニズムを統合することを含む、効果的な免疫療法を提供する新規な方法及び組成物が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
概要
したがって、本発明は、部分的には、例えば、腫瘍微小環境において、複数の抑制メカニズムを克服すること、及び免疫抗腫瘍メカニズムを刺激することによる癌治療において使用される、組成物及び方法を提供する。同様に、組成物及び方法は、炎症性疾患の治療において使用される。例えば、本発明は、部分的には、ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を阻害することによる抑制性骨髄集団の二重標的化及びＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達を刺激することによる抗原提示細胞の活性化を可能にする組成物及び方法を提供する。そのような同時におこるＣＳＦ１Ｒ遮断及びＣＤ４０アゴニズムは、とりわけ、免疫抑制細胞の全体的な減少及びより炎症性環境へのシフト及び増加された抗腫瘍効果を引き起こす。
【０００７】
態様において、本発明は、（ａ）ＣＳＦ１Ｒリガンドに結合できるコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の一部を含む第１ドメイン、（ｂ）ＣＤ４０Ｌ受容体に結合できるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の一部を含む第２ドメイン、及び（ｃ）第１ドメインと第２ドメインを連結するリンカーを含む異種キメラタンパク質を提供する。態様において、本発明は、この異種キメラタンパク質で癌を治療する方法を提供する。態様において、本発明は、この異種キメラタンパク質で炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【０００８】
実施形態において、本発明は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含み、式中、（ａ）は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありＣＳＦ１Ｒリガンドに結合できるＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメイン及び第２のドメインを連結しヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含むリンカーであり（例えば、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列と９５％同一である）、並びに（ｃ）は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありＣＤ４０Ｌ受容体に結合できるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、組換え融合タンパク質を提供する。実施形態において、本発明は、この異種キメラタンパク質で癌を治療する方法を提供する。実施形態において、本発明は、この異種キメラタンパク質で炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【０００９】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】理論に縛られることなく、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の作用機序の概略図を示す。
【図１Ｂ】腫瘍細胞とＴ細胞の間にキメラタンパク質によって形成されるシナプスを示す。
【図１Ｃ】３つのドメインが、それらの天然状態でどのように形成すると予測されるかを示す、ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの予測される二次構造を示す。ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の予測分子量は、約１０５．４ｋＤａである。
【図２】非還元／煮沸条件下、還元／煮沸条件下、及び還元／脱グリコシル化／煮沸（ＰＮＧアーゼ）条件下でのヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの３つのドメインのウェスタンブロット分析による特徴付けを示す。バンドサイズは、約１０５．４ｋＤａの予測される単量体分子量を確認し、天然状態がグリコシル化二量体として存在することを示唆する。図に示すように、各ブロットで左から始まるレーン１は、タンパク質の分子量マーカーである。
【図３】ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの３つのドメインの標的への個別の結合（Ｆｃ−左上に示す、ＣＳＦ１Ｒ−右上に示す、及びＣＤ４０Ｌ−左下に示す）並びに組換えＣＳＦ１とＣＤ４０の両方への同時結合−右下に示す、を実証する機能的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を示す。左上パネルにおいて、上の曲線はＩｇＧ標準物質であり、下の曲線はｈＣＳＦＲ１−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌである。左下パネルにおいて、上の曲線はＣＤ４０Ｌ−Ｆｃであり、下の曲線はｈＣＳＦＲ１−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌである。
【図４】Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞株）により発現されるＣＤ４０受容体に結合するヒトＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の能力を実証するインビトロ細胞結合アッセイを示す。結合ＥＣ５０は７７ｎＭであると測定された。「ＡＲＣ」は、ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を指す。
【図５Ａ−５Ｆ】ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０ＬのＯｃｔｅｔ結合親和性を示す。オン速度、オフ速度、及び親和性（ＫＤ）を、ＣＤ４０−Ｈｉｓに対するヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（図５Ａ）、ＣＤ４０−Ｈｉｓに対する市販の片側ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ（図５Ｂ）、ＣＤ４０−Ｈｉｓに対する市販のＣＤ４０抗体（図５Ｃ）、ＣＳＦ１−Ｈｉｓに対するｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（図５Ｄ）、及びＣＳＦ１−Ｈｉｓに対する市販のＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ（図５Ｅ）について決定した。ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、４．８３ｎＭでＣＤ４０に、６４６ｐＭでＣＳＦ１に結合した（図５Ｆ）。用語「ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ  ＡＲＣ」は、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を指す。図５Ａ〜図５Ｅの全てにおいて、曲線の順序は、上から下へ：１００ｍＭの試験剤、３３ｍＭの試験剤、１１ｍＭの試験剤、及び空である。
【図６】組換えヒトＣＤ４０、ＣＳＦ１、及びＩＬ−３４へのヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの相対結合親和性のバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）による特徴付けを示す。同一の結合が２つのＣＦＦ１Ｒリガンド：ＣＳＦ１及びＩＬ−３４について観察された。そのため、曲線は互いに重なる。したがって、曲線の順序は、上にＣＤ４０−Ｈｉｓ、下で重なってＣＳＦ１−ｈｉｓ及びＩＬ−３４−ｈｉｓである。
【図７Ａ−７Ｂ】マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌのウェスタンブロット及び機能的ＥＬＩＳＡ結合による特徴付けを示す。図７Ａは、非還元処理（レーン２）、還元処理（レーン３）、及び還元＋ＰＮＧアーゼ処理（レーン４）の下での、ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の全３つのドメインのウェスタンブロット検出を示す。タンパク質の還元脱グリコシル化形態は、約１０５ｋＤａの予想分子量で移動する。図７Ｂは、上の各グラフの概略図で概説された検出方法を用いて、組換えＣＳＦ１へのＣＳＦ１Ｒ（左パネル）、ＩｇＧへのＦｃ（中央パネル）、及びｒＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌ（右パネル）の結合を検出するために行ったＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＣＤ１１５はＣＳＦ１Ｒと同義である。図７Ｂの左パネルにおいて、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは上の曲線であり、中央及び右パネルにおいて、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは下の曲線である。
【図８】ｍＣＤ４０を発現しない親のＣＨＯ−Ｋ１細胞株（下の曲線）と比較した、マウスＣＤ４０を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（上の曲線）へのマウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌのインビトロ細胞結合を示す。結合ＥＣ５０を９１．１ｎＭで測定した。
【図９】ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を用いるインビトロＮＦ−κΒ／ＮＩＫシグナル伝達アッセイからのデータを示す。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＮＩＫシグナル伝達アッセイからのＵ２ＯＳ細胞を、市販の片側ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ、片側ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ、又は抗ＣＤ４０、又はヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかの滴定と培養した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）は、示されるレジメンでの処理後に活性化されたＮＦ−κΒ／ＮＩＫシグナル伝達の相対強度を示す。曲線は、以下のように、Ｘ軸上で０．０１μｇ／ｍＬで、上から下に、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ、ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ、及び抗ＣＤ４０と特定される。
【図１０Ａ−１０Ｂ】マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ活性のインビボ機能読み出しを示す。図１０Ａは、ＣＳＦ１トラップ／シンクアッセイを示す。腫瘍を担持しないマウスに、０日目に、抗ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）の単回用量を注射した。２日目に、マウスを未処置のままにするか、又はマウスにＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の単回用量を注射した。血清を、キメラタンパク質の注射の２日前及びキメラタンパク質処置後３日目に採取した。マウスＣＳＦ１  ＥＬＩＳＡを血清で行い、それはマウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質が血清ＣＳＦ１を結合し排除することを示した。（図１０Ｂは、インビボＩＬ１５Ｒα誘導を示す。腫瘍担持マウスを、最初の腫瘍接種後５日目及び７日目に、１５０μｇのｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ  ＡＲＣの２回の用量で処置した。１３日目に、ＩＬ１５Ｒαのフローサイトメトリー分析のために、マウスのコホートを屠殺し、その脾臓及びリンパ節を摘出及び解離した。ＣＤ４０Ｌ機能の既知のメカニズムと一致して、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、両方の組織のコンパートメントにおいてＩＬ１５Ｒαの増加を示した。ＣＤ１１５はＣＳＦ１Ｒと同義である。図１０Ａのグラフについて、上の曲線は＋αＣＤ１１５であり、真ん中の曲線は＋αＣＤ１１５次いで２日目にＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌであり、下の曲線は未処置である。図１０Ｂ（上及び下のパネル）について、左の点は対照であり、右はＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌである。
【図１１Ａ−１１Ｃ】大腸ＣＴ２６腫瘍におけるマウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの抗腫瘍有効性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を接種した。腫瘍成長の４日後に、腫瘍が直径４〜５ｍｍに達すると、マウスを対照抗体又はｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかで処置した。その後、７日目に再び処置を繰り返した。上の図は、（図１１Ａ）各処置群の個々の腫瘍成長曲線、（図１１Ａ）実験の６０日目までの全生存率及び（図１１Ａ）各グループの治療結果をまとめた表を含む。ＣＤ１１５は、ＣＳＦ１Ｒと同義である。図１１Ｂについては、３５日目を参照して、曲線は（上から下へ）：ＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（１５０μｇ×２）、αＣＤ１１５、αＣＤ１１５／ＣＤ４０、αＣＤ４０（未処置マウスはこの時点までに生き残っていなかった）である。
【図１２Ａ−１２Ｅ】腫瘍担持マウスにおけるインビボ免疫表現型検査を示す。腫瘍接種後１３日目に各群からのマウスの脾細胞、リンパ節細胞及び腫瘍浸潤リンパ球を分析することによる腫瘍担持免疫表現型検査も各治療群について行った。図１２Ａは、マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌで処置したマウスが、対照と比較してリンパ節又は腫瘍ではなく、脾臓においてＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の頻度を増加させたことを実証する結果を示す。図１２Ｂは、脾臓及び腫瘍におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の割合の減少を示し、これは免疫制御性Ｔ細胞の減少を示し得る。興味深いことに、腫瘍内の全ＣＤ８＋細胞の割合の顕著な増加はなかったにもかかわらず（図１２Ｃ参照）、ＡＨ１腫瘍抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の顕著な増加（四量体染色による）が検出された。ＣＤ４０受容体活性化の潜在的な証拠を決定するために、ＣＤ１９＋細胞（図１２Ｄ）及びＩＬ−１５Ｒα陽性細胞（図１２Ｅ）の誘導を分析した。図１２Ａ〜図１２Ｅの全てについて、左の点は対照であり、右はＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌである。
【図１３Ａ−１３Ｂ】マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ対ＣＤ４０アゴニスト抗体の安全性を示す。ＣＤ４０アゴニスト抗体（クローンＦＧＫ４．５）での単剤療法又はＣＤ４０アゴニスト抗体と抗ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）抗体（クローンＡＦＳ９８）の併用療法は、実験の過程でマウスに著しい下痢及び体重減少を生じさせた。これらのデータは、ＣＤ４０アゴニスト抗体が下痢及び体重減少をもたらす腸内炎症反応を開始し、それが次いでＣＤ１１５遮断との組み合わせによって著しく悪化したことを示す。抗体組み合わせグループのマウスは、体重の２５％超を失い（図１３Ｂ参照）、瀕死の外観を有し（図１３Ａ）、場合によっては、この炎症応答は致死的であった。重要なことに、マウスＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の別名）で処置したマウスは、健康的に見え、下痢又は体重減少の兆候を現さず、正常に行動した（左パネルの写真を参照）。これらのデータは、ＣＤ４０アゴニスト抗体で治療したヒトにおける臨床データと一致しており、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの有益な安全性プロファイルを示唆する。ＣＤ１１５は、ＣＳＦ１Ｒと同義である。図１３Ｂにおいて、バーの順序は、未処置、αＣＤ１１５、αＣＤ４０、αＣＤ１１５＋αＣＤ４０、ＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ−ＦＰである。
【図１４】例示的キメラタンパク質（ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）の４つの可能性のある構成を示す。
【図１５】非還元条件下、還元条件下、並びに還元条件かつその後のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）による処理下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動したＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１６】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて泳動したＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のクロマトグラフを示す。
【図１７】非還元条件下（「−」）又は還元条件下（「＋」）で泳動したＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１８】リンカー中のＦｃドメインを欠くＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１９】理論に縛られることなく、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成する方法についてのモデルを示す。
【図２０】例示的なモジュラーリンカーに組み合わせることができるリンカー及びＦｃリンカーの結合を示す表である。示される例示的なモジュラーリンカーは、本明細書に記載のいずれかのＩ型及びＩＩ型タンパク質並びに／又は本明細書に記載のＩ型及びＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインと組み合わせて、本発明のキメラタンパク質を形成できる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
本発明は、部分的には、ＣＳＦ１Ｒリガンドに結合できるコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の一部を含む第１ドメインを含む工学処理したキメラタンパク質の発見に基づいている。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌ受容体に結合できるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の一部を含む第２ドメインをさらに含む。実施形態において、第１のドメイン及び第２のドメインはリンカーで連結される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えば、マクロファージ及び抗原提示細胞を活性化できる免疫刺激シグナルを提供し一方で、それ以外の場合はバランスを免疫抑制に向けてシフトさせることができる阻害シグナル（例えば、ＣＳＦ１又はＩＬ−３４）に対する局所的なトラップを提供する。本発明の実施形態はそれにより、癌及び／又は炎症性疾患の効果的な治療を提供する。
【００１２】
キメラタンパク質
実施形態において、本発明はドメイン、例えば、マクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ）及び分化のクラスター１１５（ＣＤ１１５）としても知られる免疫阻害受容体コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の細胞外ドメインを含むように工学処理されたキメラタンパク質に関する。そのため、この開示を通して、ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ１１５は、単独で参照される場合及び／又はキメラタンパク質の文脈で参照される場合に同義であり、そのため、例えば、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌと同じキメラタンパク質である。ＣＳＦ１Ｒは、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）の受容体として機能する１回膜貫通Ｉ型膜タンパク質である。ＣＳＦ１Ｒはまた、ＩＬ−３４の受容体であることが示されている。ＣＳＦ１又はＩＬ−３４のいずれかへのＣＳＦ１Ｒの結合は、造血前駆細胞、特に、マクロファージ及び単球などの単核性食細胞の生存、増殖、及び分化において重要な役割を果たす。さらに、ＣＳＦ１Ｒは、腫瘍微小環境内でＣＳＦ１又はＩＬ−３４のいずれかに結合することが示されている。これらのリガンドへの受容体の結合は、とりわけ、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の誘導を通じて免疫抑制を誘導する。
【００１３】
実施形態において、本キメラタンパク質はドメイン、例えば、ヒトＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む。ヒトＣＳＦ１Ｒは、配列番号１のアミノ酸配列（アミノ酸２０〜５１７を含む細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する）を含む。
【００１４】
実施形態において、本キメラタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する、ヒトＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒ、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する上記のＣＳＦ１Ｒ、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインの配列を含み得る。
【００１５】
ＣＳＦ１Ｒの構造は、例えば、Ｗ．Ｄ．Ｔａｐ，ら，「腱滑膜巨細胞腫瘍におけるＣＳＦ１Ｒキナーゼの構造誘導遮断（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＣＳＦ１Ｒ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  Ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ  Ｇｉａｎｔ−Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ）」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌ  ３０；３７３（５）：４２８−３７に記載されている。ＣＳＦ１Ｒの誘導体は、利用可能なＣＳＦ１Ｒ構造に基づいて調製できる。
【００１６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１に記載）が代替シグナルペプチドに置換されるＣＳＦ１Ｒの変異体細胞外ドメインを含み得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）又はヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞などのタンパク質産生細胞での発現のためにコドン最適化されたｃＤＮＡから発現されるＣＳＦ１Ｒの変異体細胞外ドメインを含み得る。
【００１７】
実施形態において、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用できるタンパク質の一部を指す。実施形態において、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあるタンパク質の全アミノ酸配列である。実施形態において、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあり、当技術分野で公知の方法（例えば、インビトロリガンド結合及び／又は細胞活性化アッセイ）を用いてアッセイされ得るように、シグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列の一部である。
【００１８】
実施形態において、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）に結合できるタンパク質の一部を指す。実施形態において、キメラタンパク質は、約１μΜ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約５ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＳＦ１に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、又は約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ未満のＫＤでヒトＣＳＦ１に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。
【００１９】
実施形態において、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは、ＩＬ−３４に結合できるタンパク質の一部を指す。実施形態において、キメラタンパク質は、約１μΜ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約５ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＫＤでヒトＩＬ−３４に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、又は約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ未満のＫＤでＩＬ−３４に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１００ｐＭ〜約６００ｐＭのＫＤでヒトＣＳＦ１に結合する。
【００２０】
本発明のキメラタンパク質はドメイン、例えば、免疫刺激分子ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４とも呼ばれる）の細胞外ドメインをさらに含む。ＣＤ４０Ｌは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示Ｂ細胞を含むマクロファージ及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ４０受容体に結合し、それは標的細胞型に応じて多くの効果をもたらす。ＣＤ４０Ｌは、インテグリンα５β１及びαＩＩｂβ３を結合することも示されている。ＣＤ４０Ｌは、共刺激分子として作用し、Ｔ濾胞ヘルパー細胞（ＴＦＨ細胞）と呼ばれるＴ細胞のサブセット上で特に重要である。ＴＦＨ細胞上では、ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞表面上でＣＤ４０を係合すること、したがって細胞間コミュニケーションを促進することにより、Ｂ細胞の成熟及び機能を促進する。
【００２１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質はドメイン、例えばヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む。ヒトＣＤ４０Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列（アミノ酸４７〜２６１を含む細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する）を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載のＣＤ４０Ｌ、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する上記のＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン、又はその変異体若しくは機能断片の配列を含み得る。
【００２２】
ＣＤ４０Ｌ誘導体は、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  Ｖ．，ら，「ＣＤ４０Ｌを結合するように工学処理されたフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン：２つの複合体のクローニング、発現、精製、結晶化及び予備Ｘ線回折分析（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ＣＤ４０Ｌ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｓｅｃｔ  Ｆ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３  Ｓｅｐ；６９（Ｐｔ  ９）：１０４５−８によって記載されたものを含む、利用可能な構造データから構築できる。
【００２３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、シグナルペプチド（例えば、配列番号３に記載の）が代替シグナルペプチドに置換されるＣＤ４０Ｌの変異体細胞ドメインを含み得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）又はＨＥＫなどのタンパク質産生細胞での発現のためにコドン最適化されたｃＤＮＡから発現されるＣＤ４０Ｌの変異体細胞ドメインを含み得る。
【００２４】
実施形態において、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用できるタンパク質の一部を指す。実施形態において、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあるタンパク質の全アミノ酸配列である。実施形態において、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあり当技術分野で公知の方法を用いてアッセイされ得るようにシグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要とされる、タンパク質のアミノ酸配列の一部である。
【００２５】
実施形態において、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、ＣＤ４０受容体に結合できるタンパク質の一部を指す。他のＴＮＦスーパーファミリーメンバーと同様に、膜結合ＣＤ４０Ｌはホモ三量体として存在する。ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０は樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞及びマクロファージを含む抗原提示細胞上で主に発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用は、造血コンパートメント及び非造血コンパートメントの多くの細胞の中で、樹状細胞、Ｂ細胞、及び内皮細胞に対して大きな影響を及ぼす。例えば、ＣＤ４０シグナル伝達は、成熟し効果的にＴ細胞の活性化及び分化を誘発するようにＤＣを誘導する。Ｂ細胞のＣＤ４０シグナル伝達は、胚中心（ＧＣ）形成、免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプスイッチング、抗原に対する親和性を高めるＩｇの体細胞高頻度変異（ＳＨＭ）、及び長期生存形質細胞及び記憶Ｂ細胞の形成を促進する。ＣＤ４０シグナル伝達は、免疫細胞の生存にも重要である。
【００２６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１μΜ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約５ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ４０に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、又は約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ未満のＫＤでヒトＣＤ４０に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約３００ｐＭ〜約７００ｐＭのＫＤでヒトＣＤ４０に結合する。
【００２７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００２８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００２９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。
【００３０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号２）及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００３１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号２）及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。
【００３２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む（配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７）。
【００３３】
実施形態において、キメラタンパク質は、図２０に示すようにモジュラーリンカーを含む。
【００３４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラは配列番号５）である。
【００３５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラは配列番号８）である。
【００３６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、配列番号５、すなわち、単量体ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−１１５１５４）、又はその変異体若しくは機能断片を含む。
【００３７】
実施形態において、キメラタンパク質は、配列番号５又は８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
【００３８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に開示される配列のいずれか１つに対して１以上のアミノ酸変異を有する配列を含み得る。実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に開示されるキメラタンパク質のアミノ酸配列のいずれか１つに対して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００又はそれより多いアミノ酸変異を有する配列を含む。
【００３９】
実施形態において、１以上のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠損、及び切り詰めから独立して選択され得る。
【００４０】
実施形態において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、かつ保存的及び／又は非保存的置換を含み得る。
【００４１】
「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、大きさ、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関与するアミノ酸残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。２０個の天然アミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸のグループ：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅにグループ化できる。
【００４２】
本明細書で使用する「保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループの同じグループ内にリストされた別のアミノ酸とのアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド中に１つの負電荷を保持する。加えて、グリシン及びプロリンは、α−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。
【００４３】
本明細書で使用する「非保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループ（１）〜（６）の異なるグループにリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【００４４】
実施形態において、置換はまた、非古典的アミノ酸（例えば、一般的に、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノベンゾイン酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、及びアミノ酸類似体）を含み得る。
【００４５】
変異はまた、コドン縮重を考慮することを含む、遺伝コードを参照することによってキメラタンパク質のヌクレオチド配列に行われ得る。
【００４６】
実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含む。本明細書の他の場所で説明するように、ジスルフィド結合を形成できるそのような少なくとも１つのシステイン残基は、理論に縛られることなく、キメラタンパク質の適切な多量体状態を維持し効率的な生成を可能にすることに関与する。
【００４７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、（ａ）コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の一部、例えば、ＣＳＦ１Ｒリガンドに結合できるＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン、を含む第１のドメイン、（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の一部、例えば、ＣＤ４０Ｌ受容体に結合できるＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン、を含む第２のドメイン、及び（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインを連結するリンカーを含む。
【００４８】
実施形態において、キメラタンパク質は、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン（及び、必要に応じてリンカー）を有する単一のポリペプチドである。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、細胞中で単一単位として翻訳される。実施形態において、キメラタンパク質は、複数のポリペプチド、例えばインビトロで（例えば、本明細書に記載の１以上の合成リンカーを用いて）連結されて単一単位をもたらす、例えば本明細書に記載の複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質を指す。実施形態において、キメラタンパク質は１つのポリペプチドとして化学合成されるか、又は各ドメインが別々に化学合成され、次いで組み合わされ得る。実施形態において、キメラタンパク質の一部は翻訳され、一部は化学合成される。
【００４９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の変異体であり得、例えば、本発明のキメラタンパク質は、本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号５及び８の１以上と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有し得る。
【００５０】
実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。実施形態において、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来し得るか、又は例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｃｈｉｌｉら、（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２）：１５３−１６７，Ｃｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載の実験的リンカーである。実施形態において、リンカーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９及びＣｒａｓｔｏら，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３０９−３１２に記載のものなどのデータベース及びコンピュータプログラムを設計するリンカーを用いて設計され得る。
【００５１】
実施形態において、リンカーはＰＥＧなどの合成リンカーである。
【００５２】
実施形態において、リンカーはポリペプチドを含む。実施形態において、ポリペプチドは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、又は約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、又は約２アミノ酸長未満であり得る。実施形態において、リンカーは柔軟である。実施形態において、リンカーは硬い。
【００５３】
実施形態において、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）で構成される。
【００５４】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内で自由に移動することを可能にする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列と長さの両方が変化する。例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で変化する。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６〜２３１を包含し、それが自由に柔軟であるため、Ｆａｂ断片は、それらの対称の軸を中心に回転し２つの重鎖間のジスルフィド架橋の第１を中心とする球内を移動できる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２のアミノ酸残基及び４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠き、比較的短く、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された硬いポリプロリン二重らせんを含有する。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、その特有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスと異なり、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的離れており、分子により高い柔軟性を与える。ＩｇＧ３中の伸長したヒンジはまた、他のサブクラスと比較してより高いその分子量に関与する。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１及びＩｇＧ２の柔軟性の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順序で減少すると報告されている。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体化（Ｓ２２８Ｐを含む）又はＦｃＲｎ結合を増強するための１以上の変異を含有し得る。
【００５５】
結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、さらに３つの領域：上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域に機能的に細分化できる。Ｓｈｉｎら，１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域は、ＣＨ１のカルボキシル末端〜動きを制限するヒンジ中の第１の残基のアミノ酸、一般に２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基、を含む。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域は重鎖間ジスルフィド架橋を含有し、下部ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインのアミノ末端に結合し、ＣＨ２中の残基を含む。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、ジスルフィド結合形成によって二量体化すると、ピボットとして作用すると考えられる環状オクタペプチドを生じ、そのため柔軟性を与える、配列ＣＰＰＣ（配列番号４８）を含有する。実施形態において、本リンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の１つ、又は２つ、又は３つを含む。ヒンジ領域はまた、炭水化物結合のための部位のいくつかの構造的に別個の種類を含む、１以上のグリコシル化部位を含有し得る。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含有し、分泌性免疫グロブリンに有利な性質と考えられる、腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの耐性を付与する。実施形態において、本発明のリンカーは、１以上のグリコシル化部位を含む。
【００５６】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増加及び結合の増強を示す。実施形態において、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、ＦｃＲｎへの結合を増強する１以上の変異を含む。理論に縛られることなく、ＦｃＲｎに対する親和性の増加及び結合の増強は、本発明のキメラタンパク質のインビボ半減期を増加させると考えられる。
【００５７】
実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３又は４３４（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での１以上のアミノ酸置換、又はそれらの等価物を含有する。実施形態において、アミノ酸残基２５０におけるアミノ酸置換はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５４におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５６におけるアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０９におけるアミノ酸置換は、プロリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３１１におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８５におけるアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン又はグリシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８６におけるアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、又はメチオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８７におけるアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、又はアラニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８９におけるアミノ酸置換は、プロリン、セリン又はアスパラギンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４１６におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換は、ロイシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３３におけるアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、又はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、又はチロシンとの置換である。
【００５８】
実施形態において、リンカー中のＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、又は４３６（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での置換などの１以上の変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異又はＹＴＥ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異又はＫＦＨ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＹＴＥ変異とＫＦＨ変異を含む。
【００５９】
実施形態において、本発明の改変されたヒト化抗体は、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４、及び４３５（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）における１以上の変異を含有するＩｇＧ定常領域を含む。例示的変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａを含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異又はＬＳ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異又はＱＬ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異又はＡＡＡ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異又はＩＨＨ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異とＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。
【００６０】
ＩｇＧ定常領域における追加の例示的変異は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｂｉｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７−６１５３，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４−２４，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１−８０，Ｋｏら，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）  ５１４：６４２−６４５，Ｇｒｅｖｙｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７−５０８，及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載される。
【００６１】
実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、配列番号２５（以下の表参照）、又は配列番号２５と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、安定性及び／又は半減期を増加させるために、変異が配列番号２５に行われる。例えば、実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、配列番号２６、又は配列番号２６と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。例示的なＦｃ安定化変異体はＳ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本リンカーは、これらの変異体の１、又は２、又は３、又は４、又は５個を含み得る。例えば、実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、配列番号２７（以下の表参照）、又は配列番号２７と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６２】
さらに、１以上の結合リンカーは、リンカー中のＦｃドメイン（例えば、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７、又はそれらと少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するものの１つ）と細胞外ドメインを連結するために使用され得る。例えば、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と本明細書に記載のリンカー内のＦｃドメインを連結し得る。必要に応じて、配列番号２８〜７４、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のＦｃドメインの間に位置する。実施形態において、キメラタンパク質は、Ｆｃドメインの前に１つの結合リンカー及びＦｃドメインの後ろに第２の結合リンカーを含み、そのため、キメラタンパク質は、以下の構造：ＥＣＤ  １（例えば、ＣＳＦ１Ｒ）−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２（例えば、ＣＤ４０Ｌ）を含み得る。
【００６３】
実施形態において、第１及び第２の結合リンカーは異なっていてよく、又は同じであってよい。
【００６４】
実施形態において、第１及び第２の結合リンカーは、配列番号２５〜７４のアミノ酸配列から選択され得、以下の表１に提供される。
【００６５】
【表１】
2020508063.tif 000003
2020508063.tif 000004
【００６６】
実施形態において、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）を含む。例えば、実施形態において、結合リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎは、約１〜約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８（それぞれ配列番号４９〜配列番号５６）である。実施形態において、結合リンカー配列はＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５７）である。追加の例示的な結合リンカーは、配列ＬＥ、（Ｇｌｙ）８（配列番号５８）、（Ｇｌｙ）６（配列番号５９）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号６０〜６２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号６３〜配列番号６６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号６７）、ＰＡＰＡＰ（配列番号６８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号６９）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号７０）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕである）を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。実施形態において、結合リンカーはＧＧＳである。
【００６７】
実施形態において、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号７１）、ＧＳＥＳＧ（配列番号７２）、ＧＳＥＧＳ（配列番号７３）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号７４）、及び４アミノ酸ごとの間隔でＧ、Ｓ、及びＥがランダムに配置される結合リンカーの１以上である。
【００６８】
実施形態において、キメラタンパク質は、図２０に示すモジュラーリンカーを含む。
【００６９】
実施形態において、リンカーは機能的であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明のキメラタンパク質の折りたたみ及び／又は安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、かつ／又は生理活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、特定の細胞型又は位置にキメラタンパク質を標的化するように機能し得る。
【００７０】
実施形態において、キメラタンパク質は、増強した安定性及びタンパク質半減期を示す。実施形態において、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎに結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、又は約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）に実質的に結合しない。
【００７１】
実施形態において、式ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２（式中、ＥＣＤ  １はＣＳＦ１Ｒであり、ＥＣＤ  ２はＣＤ４０Ｌである）を有するキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとして本開示で言及され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、一方又は両方の結合リンカーを欠き、そのようなキメラタンパク質もまた、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとして本開示で言及され得る。
【００７２】
実施形態において、キメラタンパク質は、式Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端（式中、（ａ）はＣＳＦ１Ｒであり、（ｂ）はＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＣＤ４０Ｌである）を有する融合タンパク質であり、本開示でＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌと呼ばれ得る。
【００７３】
実施形態において、キメラタンパク質は、マウスのリガンド／受容体用に最適化され／指向される。そのようなキメラタンパク質の例は、本明細書でｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとも呼ばれる、マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌである。
【００７４】
実施形態において、キメラタンパク質は、ヒトのリガンド／受容体用に最適化され／指向される。そのようなキメラタンパク質の例は、本明細書でｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとも呼ばれる、ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌである。
【００７５】
これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。例示的な結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２は、上の表１に記載される。キメラタンパク質を形成するのに有用であり、かつ特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図２０に示す。実施形態において、本発明のキメラタンパク質を、ＣＳＦ１Ｒ／ＣＳＦ１免疫阻害シグナル伝達経路を標的とするように工学処理する。実施形態において、キメラタンパク質を、ＣＳＦ１ＲへのＣＳＦ１の結合によって媒介される免疫阻害シグナルの伝達を破壊、阻止、低減、及び／又は阻害するように工学処理する。実施形態において、免疫阻害シグナルは、免疫応答を減少又は排除するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減少又は排除し得る。通常の生理的条件下で、阻害シグナルは、自己耐性の維持（例えば、自己免疫の予防）において、及び免疫系が病原性感染に応答しているときに組織を損傷から保護するためにも有用である。例えば、限定されないが、免疫阻害シグナルは、そのような阻害シグナルが遮断される場合に、細胞増殖、サイトカイン産生、細胞死滅活性又は食作用活性の増加を検出することによって特定され得る。
【００７６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１ＲへのＣＳＦ１又はＩＬ−３４の結合によって媒介される免疫阻害シグナルの伝達を破壊、遮断、低減、及び／又は阻害する。実施形態において、キメラタンパク質はＣＳＦ１又はＩＬ−３４に結合し、それらを補足し、それにより免疫細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ、抗原提示細胞、骨髄細胞、又はＴ細胞）への阻害性シグナル伝達を破壊、遮断、低減、及び／又は阻害する。
【００７７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害受容体／リガンド対であるＣＳＦ１Ｒ／ＣＳＦ１又はＣＳＦ１Ｒ／ＩＬ−３４の結合を阻害又は低減できるか、又はそれを阻害又は低減することを含む方法で使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えば、ＣＳＦ１又はＩＬ−３４を用いて免疫細胞上のＣＳＦ１Ｒの結合を低減することによって、ＣＳＦ１Ｒ活性化を阻止、低減及び／又は阻害する。
【００７８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合によって媒介される免疫刺激シグナルを標的とする。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合によって媒介される免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激する。実施形態において、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは抗腫瘍免疫を増強し得る。例えば、限定されないが、免疫刺激シグナルは、Ｔ細胞のサブセットを含む白血球の増殖、サイトカイン産生、死滅活性又は食作用活性を直接刺激することによって特定され得る。
【００７９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合によって媒介される免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激する。実施形態において、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０を発現する免疫細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、又はＴ細胞）に作用し、免疫細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及びＴ細胞）への刺激シグナル伝達を増強、増加、及び／又は刺激する。
【００８０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激受容体／リガンド対であるＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌの結合を刺激又は増強できるか、又はそれを刺激又は増強することを含む方法で使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０及び／若しくはＣＤ４０Ｌの１以上とＣＤ４０の結合を増加並びに／又は刺激する。
【００８１】
実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインを含む。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬを含む。本発明は、キメラタンパク質、並びに以下のキメラタンパク質：ＣＳＦ１Ｒ／４−１ＢＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ／ＣＤ３０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ／ＦａｓＬ、ＣＳＦ１Ｒ／ＧＩＴＲＬ、ＣＳＦ１Ｒ／ＬＩＧＨＴ、ＣＳＦ１Ｒ／ＯＸ４０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ／ＴＬ１Ａ、及びＣＳＦ１Ｒ／ＴＲＡＩＬを使用する方法をさらに含む  。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ３０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＦａｓＬ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬのうちの１つの一般構造を有する。
【００８２】
４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９、１１、１３、１５、１７、６、２１、及び２３を含む。
【００８３】
実施形態において、キメラタンパク質は、それぞれ、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、７、２２、及び２４を含む、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬのうちの１つの細胞外ドメインを含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、若しくはＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン、又はその変異体若しくは機能断片を含み得る。例えば、キメラタンパク質は、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、又はＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する上記に提供する４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、若しくはＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン、又はその変異体若しくは機能断片の配列を含み得る。
【００８４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫細胞（例えば、抗原提示細胞）へ免疫刺激を送達し、一方で免疫阻害シグナルの局所的なトラップ又は隔離を提供する。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫活性化の最終結果を有するシグナルを送達する。
【００８５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫活性化（例えば、腫瘍に対して）を促進でき、かつそれを促進することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害を抑制でき（例えば、腫瘍が生き残ることを可能にする）、かつそれを抑制することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、構築物のキメラ性質によって提供されるシグナル伝達の近接性に起因する免疫活性化の改善及び／又は免疫阻害の抑制の改善を提供する。
【００８６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫応答の増幅を調節すること、例えば、エフェクター出力のレベルを調節できるか、又はそれを調節することを含む方法で使用できる。実施形態において、例えば、癌及び／又は炎症性疾患の治療に使用される場合、本発明のキメラタンパク質は、サイトカインの生成、増殖又は標的殺傷能力のレベルの増加を刺激することを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞応答の増幅を増加させる免疫阻害と比較して、免疫刺激の程度を変える。
【００８７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍細胞の表面上の阻害リガンドをマスクしその免疫阻害リガンドを免疫刺激リガンドに置き換えることができるか、又はそれをマスクし置き換えることを含む方法で使用される。例えば、本発明のキメラタンパク質は、（ａ）ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及び（ｂ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含み、阻害性ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒシグナルの破壊を可能にし、それを刺激ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０シグナルと置き換えることを可能にする。したがって、本発明のキメラタンパク質は、実施形態において、阻害性免疫シグナルを低下させること若しくは除去すること、かつ／又は免疫刺激シグナルを増加すること若しくは活性化することができるか、又は阻害性免疫シグナルを低下させ若しくは除去するかつ／又は免疫刺激シグナルを増加することを含む方法で使用される。例えば、阻害シグナルを含む（ひいては、免疫応答を回避する）腫瘍は、次いで腫瘍細胞を攻撃できるマクロファージ又はＴ細胞上で結合する正のシグナルと置換され得る。したがって、実施形態において、阻害性免疫シグナルは、本発明の構築物によってマスクされ、刺激性免疫シグナルが活性化される。そのような有益な特性は、本発明のキメラタンパク質の単一構築アプローチによって増強される。例えば、シグナル置換をほぼ同時に、例えば、同時に行うことができ、シグナル置換は臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍微小環境）で局所的であるよう調整される。
【００８８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫調節を増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激できるか、又はそれを増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激することを含む方法で使用される。実施形態において、本明細書に記載の本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含むが、これらに限定されない腫瘍細胞に対する１以上の免疫細胞の活性又は活性化を回復し、促進し及び／又は刺激する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、非限定的な例として、生存促進シグナル；オートクリン又はパラクリン成長シグナル；ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ、ＪＡＫ、ＡＫＴ若しくはＰＩ３Ｋ媒介性シグナル；抗アポトーシスシグナル；並びに／又は炎症性サイトカイン生成若しくはＴ細胞移動若しくはＴ細胞腫瘍浸潤の１以上を促進しかつ／又はそれに必要なシグナルを含む、１以上のＴ細胞固有シグナルを活性化し及び／又は刺激することを含み、Ｔ細胞の活性及び／若しくは活性化を増強し、回復し、促進し並びに／又は刺激する。
【００８９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍若しくは腫瘍微小環境中へのＴ細胞（限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１以上）の１以上の増加を引き起こすことができるか、又はそれを引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に、腫瘍微小環境中に浸潤したそれらのＴ細胞による腫瘍抗原の認識を強化する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ１９発現を誘導し、かつ／又はＣＤ１９陽性細胞（例えば、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞）の数を増加させる。一実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＬ−１５Ｒα発現を誘導し、かつ／又はＩＬ−１５Ｒα陽性細胞（例えば、ＩＬ−１５Ｒα陽性樹状細胞）の数を増加させる。
【００９０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、特に、腫瘍及び／若しくは腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の減少を阻害し、かつ／又は引き起こすことができるか、又はそれらの減少を阻害すること、かつ／又は引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、本療法は、Ｍ１マクロファージを優先するように腫瘍部位及び／又はＴＭＥでＭ１対Ｍ２マクロファージの比率を変更し得る。
【００９１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の有効量のキメラタンパク質を対象に投与することを含む、Ｔ細胞の不活性化及び／若しくは腫瘍に対する免疫耐性を阻害する並びに／又は低下させることができ、かつそれを阻害する並びに／又は低下させることを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２の１以上を含むが、これらに限定されない様々なサイトカインの血清レベルを増加させることができる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、治療対象の血清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦα又はＩＦＮγを増強できる。そのようなサイトカイン応答の検出は、示されたキメラタンパク質について最適な投与レジメンを決定するための方法を提供し得る。
【００９２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を阻害し、阻止し及び／若しくは低下させるか；又は腫瘍促進性Ｔ細胞の細胞死を刺激し、誘導し、及び／若しくは増加させる。Ｔ細胞枯渇は、増殖機能及びエフェクター機能の進行性喪失を特徴とするＴ細胞機能障害の状態であり、クローン欠失に至る。したがって、腫瘍促進性Ｔ細胞は、多くの慢性感染症、炎症性疾患、及び癌の間に生じるＴ細胞機能障害の状態を指す。この機能不全は、不十分な増殖機能及び／又はエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現及び機能性エフェクター又は記憶Ｔ細胞の転写状態とは異なる転写状態によって定義される。枯渇は、感染症及び腫瘍の最適な制御を妨げる。例示的な腫瘍促進性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ、１以上のチェックポイント阻害受容体を発現するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞を含むが、これらに限定されない。チェックポイント阻害受容体は、制御されない免疫応答を防止又は阻害する免疫細胞上で発現する受容体を指す。対照的に、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を刺激できるＴ細胞を指す。
【００９３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させることができ、それを含む方法で使用できる。例示的なエフェクターＴ細胞は、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）；ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；エフェクター記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋、ＣＣＲ７低）；中央記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋；又はＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋）；ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ６２Ｌ−）及び後期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７−ＣＤ６２Ｌ−）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）を含むＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）；ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（低／−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（−）ＣＤ２５（−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞記憶エフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋及びＣＣＲ５＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−１２Ｒ＋、ＩＦＮγＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋及びＣＣＲ８＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−４Ｒ＋、ＩＬ−３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ−１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）；ＴＨ９  エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ−１Ｒ＋）；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（−）エフェクターＴ細胞；並びにＩＬ−２、ＩＬ−４及び／又はＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞を含む。例示的な制御性Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５高制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ３＋ＰＤ−１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌセレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢ低制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、ＢＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパータイプ３（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型の調節細胞（ＮＫＴｒｅｇ）、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８−制御性Ｔ細胞及び／又はＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ガレクチン−１、ＩＦＮ−γ及び／又はＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞を含む。
【００９４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞）の増加を引き起こす。
【００９５】
実施形態において、キメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の減少を引き起こす。
【００９６】
実施形態において、キメラタンパク質は、例えば、再発を防止するか、又は再負荷から動物を保護できる可能性がある記憶応答をもたらす。そのため、キメラタンパク質で処置された動物は後に、キメラタンパク質での初期の治療後に再負荷された場合に、腫瘍細胞を攻撃し、かつ／又は腫瘍の発症を防ぐことができる。したがって、本発明のキメラタンパク質は、活性腫瘍破壊と、再発を防止できる記憶応答をプログラミングするのに不可欠である腫瘍抗原の免疫認識の両方を刺激する。
【００９７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的にエフェクター免疫細胞を刺激でき、かつそれを刺激することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的に制御性又は免疫抑制性細胞を枯渇させること又は阻害することができ、かつそれを枯渇させること又は阻害することを含む方法で使用できる。実施形態において、エフェクターＴ細胞の一過性刺激及び／又は免疫阻害細胞の一過性枯渇若しくは阻害は実質的に、患者の血流において、又は、例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、非リンパ組織などのリンパ組織を含む特定の組織／位置において、又は腫瘍微小環境において生じる。
【００９８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、使用の容易さ及び生成の容易さを含む利点を提供する。これは、２つの異なる免疫療法剤が、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスを可能にする１つの生成物に組み合わされるためである。加えて、２つの別々の薬剤の代わりの単一薬剤の投与は、より容易な投与及びより多くの患者のコンプライアンスを可能にする。
【００９９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、分泌可能で完全に機能する単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞中で生成可能である。
【０１００】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、予期せず、遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）でそれらのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメイン成分の結合を提供する。実施形態において、これは、受容体のリガンドへの予想外に長い相互作用を提供し、その逆も同様である。そのような効果は、持続的な負のシグナルマスキング効果を可能にする。また、実施形態において、これは、より長い正のシグナル効果を提供し、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、免疫細胞増殖を提供し、抗腫瘍攻撃を可能にするのに十分なシグナル伝達を可能にする。さらなる例として、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、例えば、サイトカインなどの刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする。
【０１０１】
本発明の薬剤によって促進される細胞（例えば、負のシグナルを有する腫瘍細胞及び腫瘍を攻撃する可能性のあるＴ細胞）の安定なシナプスは、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を位置付け、かつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされたものを超える負のシグナルを含めて、腫瘍細胞が負のシグナルを送達するのを立体的に防ぐなどの、腫瘍の縮小を支持する空間的な向きを提供する。
【０１０２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＣＳＦ１又はＩＬ−３４に対し約２×１０６、約２．５×１０６、約３×１０６、約３．５×１０６、約４×１０６、約４．５×１０６、約５×１０６、約５．５×１０６、約６×１０６、約６．５×１０６、約７×１０６、約７．５×１０６、約８×１０６、約８．５×１０６、約９×１０６、又は約９．５×１０６超のｋｄ（１／ｓ）を示す（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１００ｐＭ〜約６００ｐＭのＫＤでヒトＣＳＦ１に結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約５．７×１０４のＫａオン速度（１／Ｍｓ）でヒトＣＳＦ１に結合し、約７．３×１０−６のＫｄオン速度（１／ｓ）でヒトＣＳＦ１から離れる。
【０１０３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＣＤ４０に対し約２×１０６、約２．５×１０６、約３×１０６、約３．５×１０６、約４×１０６、約４．５×１０６、約５×１０６、約５．５×１０６、約６×１０６、約６．５×１０６、約７×１０６、約７．５×１０６、約８×１０６、約８．５×１０６、約９×１０６、又は約９．５×１０６超のｋｄ（１／ｓ）を示す（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１．３×１０４のＫａオン速度（１／Ｍｓ）でヒトＣＤ４０に結合し、約６．７×１０−６のＫｄオフ速度（１／ｓ）でヒトＣＤ４０から離れる。
【０１０４】
実施形態において、これは、キメラタンパク質の血清ｔ１／２と比較して、より長いオンターゲット（例えば、腫瘍内）半減期（ｔ１／２）を提供する。そのような性質は、キメラタンパク質の全身分布に関連するオフターゲット毒性を低下させる利点の組み合わせを有し得る。
【０１０５】
実際に、ＣＳＦ１ブロッキング抗体及びＣＤ４０アゴニスト抗体を用いた逐次治療が、例えば、肝毒性を誘導すると報告されている。例えば、Ｂｙｒｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１６を参照されたい。本明細書に開示されるデータ（例えば、図１３参照）は同様に、２つの抗体は、マウスに同時投与されると非常に毒性が高く、致死性の腸炎症及び下痢を引き起こすことを示す。対照的にかつ驚くべきことに、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質による治療は、抗体の同時治療に起因する毒性なしに、ＣＳＦ１Ｒ（これは免疫阻害シグナルの伝達を阻害する）を遮断し、ＣＤ４０（これは免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激する）を活性化する。さらに、実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、それが２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用の改善を可能にするので、相乗的な治療効果（例えば、抗腫瘍効果）を提供する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０アゴニスト抗体及び／又はＣＳＦ１Ｒ拮抗抗体と比較した場合、相乗的な治療効果を提供する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、オフサイト及び／又は全身毒性を低減する可能性を提供する。
【０１０６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、増強された安全性プロファイルを示す。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、低下された毒性プロファイルを示す。例えば、本発明のキメラタンパク質の投与は、ＣＤ４０アゴニスト抗体及び／又はＣＤ１１５拮抗抗体の投与で観察される下痢、炎症（例えば、腸の）、又は体重減少のうちの１以上などの副作用を低減し得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、有効性を犠牲にすることなく、ＣＤ４０アゴニスト抗体及び／又はＣＤ１１５拮抗抗体と比較して、向上された安全性を提供する。
【０１０７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、現在の免疫療法、例えば、本明細書に記載のチェックポイント分子に対する抗体と比べ、低減された副作用、例えば、ＧＩ合併症、を提供する。例示的なＧＩ合併症は、腹痛、食欲不振、自己免疫効果、便秘、けいれん、脱水、下痢、摂食問題、疲労、鼓腸、腹水（ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｄｏｍｅｎ）又は腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、消化管（ＧＩ）腸内毒素症、ＧＩ粘膜炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｄ及びＩＢＳ−Ｃ）、吐き気、痛み、便又は尿の変化、潰瘍性大腸炎、嘔吐、保持液からの体重増加、及び／又は衰弱を含む。
【０１０８】
疾患、治療方法、及び患者選択
実施形態において、本発明は、癌及び／又は腫瘍、例えば、癌及び／若しくは腫瘍の治療又は予防に関する。本明細書の他の場所に記載するように、癌の治療は、実施形態において、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するように本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを伴い得る。
【０１０９】
癌又は腫瘍は、身体の器官及びシステムの正常な機能を妨げる細胞の制御不能な増殖並びに／又は異常に増加した細胞生存率並びに／又はアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに休眠腫瘍又は微小転移が含まれる。免疫系によって妨げられない異常増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。癌は、原発性癌又は転移性癌であり得る。原発性癌は、臨床的に検出可能になる原発部位の癌細胞の領域であり、原発性腫瘍であり得る。対照的に、転移性癌は、ある器官又は部分から別の非隣接器官又は部分への疾患の広がりであり得る。転移性癌は、局所的な領域の中の周囲の正常組織に浸透及び浸潤する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされ得、新しい腫瘍を形成し、それは局所的な転移であり得る。癌はまた、リンパ及び／又は血管の壁を貫通する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされる可能性があり、その後、癌細胞は、体内の他の部位及び組織に血流を介して循環できる（それによって循環腫瘍細胞である）。癌は、リンパ性の又は血行性の広がりなどのプロセスに起因し得る。癌はまた、別の部位で停止し、血管又は壁を通って再浸透し、増殖し続け、最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。癌は、この新しい腫瘍であり得、それは転移性（又は続発性）腫瘍であり得る。
【０１１０】
癌は、転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得、それは続発性又は転移性腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍中のものと同様であり得る。一例として、乳癌又は結腸癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は、肝臓に存在する間、異常な肝細胞からではなく、異常な乳房又は結腸細胞から構成される。肝臓中の腫瘍はそのため、肝臓癌ではなく、転移性乳癌又は転移性結腸癌であり得る。
【０１１１】
癌は、任意の組織からの起源を有し得る。癌は、黒色腫、結腸、乳房、又は前立腺に由来し、そのため、それぞれ、元は皮膚、結腸、乳房、又は前立腺であった細胞から構成され得る。癌はまた、血液学的悪性腫瘍であり得、それは白血病又はリンパ腫であり得る。癌は、肝臓、肺、膀胱、又は腸などの組織に侵入し得る。
【０１１２】
本発明の代表的な癌及び／又は腫瘍は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腸骨の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化管癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；肝腫；上皮内新生物；腎臓癌又は腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺の扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞種；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮又は子宮内膜癌；尿系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低グレード／濾胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレードの拡散性ＮＨＬ；高グレードの免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードのリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレードの小さい非正円形細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びウォルデンストロームのマクログロブリン血症；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他の癌腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
実施形態において、キメラタンパク質は、治療−難治性癌を有する対象を治療するために使用される。実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の免疫調節剤に難治性である対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、治療の１２週間程度後に、治療に対する応答、或いはさらに進行を示さない対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、対象は、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２剤に難治性であり、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及び／又はＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）難治性患者を含む。例えば、実施形態において、対象は、抗ＣＴＬＡ−４剤に対して難治性であり、例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）難治性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、実施形態において、本発明は、１以上の免疫調節剤の単剤療法を含む、様々な治療に応答しない患者を救済する癌治療の方法を提供する。
【０１１４】
実施形態において、本方法は、追加の薬剤に難治性である患者にキメラタンパク質での治療を提供し、そのような「追加の薬剤」は本明細書の他の場所に記載されており、本明細書に記載の様々な化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の炎症性の疾患又は状態を治療する、調節する又は予防するために使用される。炎症性疾患の非限定的な例は、にきび、急性炎症、アレルギー性鼻炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、常染色体劣性痙性失調症、気管支拡張症、セリアック病、慢性胆嚢炎、慢性炎症、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、家族性好酸球増加症（ｆｅ）、糸球体腎炎、グリセロールキナーゼ欠乏症、化膿性汗腺炎、過敏症、炎症、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、間質性膀胱炎、喉頭炎症性疾患、リー症候群、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、眼炎症性疾患、耳炎、疼痛、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、呼吸器疾患、再狭窄、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、珪肺症及び他の肺炎、移植拒絶反応、結核、及び血管炎を含む。
【０１１６】
実施形態において、炎症性疾患は、多発性硬化症、糖尿病、ループス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、強皮症、グッドパスチャー症候群、ウェーゲナー肉芽腫症、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛、メニエール症候群；移植拒絶反応（例えば、同種移植片拒絶の予防）悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、及び他の自己免疫疾患などの自己免疫の疾患又は状態である。
【０１１７】
態様において、本発明のキメラ薬剤は、例えば、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを介して、抗原提示細胞を活性化する方法において使用される。
【０１１８】
態様において、本発明のキメラ薬剤は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを介して、免疫抑制シグナルの細胞伝達を防止する方法において使用される。
【０１１９】
併用療法及びコンジュゲーション
実施形態において、本発明は、対象に追加の薬剤を投与することをさらに含むキメラタンパク質及び方法を提供する。実施形態において、本発明は、共投与及び／又は共製剤化に関する。本明細書に記載の組成物はいずれも、共製剤化及び／又は共投与され得る。
【０１２０】
実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、別の薬剤と共投与された場合に相乗的に作用し、そのような薬剤が単剤療法として使用される場合に、一般的に使用される用量よりも低い用量で投与される。実施形態において、本明細書で参照される任意の薬剤は、本明細書に記載のキメラタンパク質のいずれかと組み合わせて使用され得る。
【０１２１】
実施形態において、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、別のキメラタンパク質と共投与される。実施形態において、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、別のキメラタンパク質、例えば、適応免疫応答を調節するものと共投与される。実施形態において、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＧＩＴＲＬ、４−１ＢＢＬ、ＳＩＲＰα、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＧＨＴ及びＶＳＩＧ８の１以上を含むキメラタンパク質と共投与される。理論に縛られることなく、自然免疫応答を誘導する本発明のキメラタンパク質及び適応免疫応答を誘導する１以上のキメラタンパク質の投与を伴う併用レジメンは、相乗効果（例えば、相乗的な抗腫瘍効果）を提供し得ると考えられる。
【０１２２】
適応免疫応答を誘導する任意のキメラタンパク質が、本発明において利用され得る。例えば、キメラタンパク質は、適応免疫応答を誘導する、米国特許第６２／４６４，００２号に開示されたキメラタンパク質のいずれかであり得る。そのような実施形態において、キメラタンパク質は、Ｎ末端で又はその近くでＩ型膜貫通タンパク質の第１の細胞外ドメイン及びＣ末端で又はその近くでＩＩ型膜タンパク質の第２の細胞外ドメインを含み、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号に開示されるように第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫阻害シグナルを提供し、第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫刺激シグナルを提供する。例示的な実施形態において、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＰＤ−１の細胞外ドメイン及びＣ末端にＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、又は４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。実施形態において、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン及びＣ末端にＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、又は４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。
【０１２３】
実施形態において、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、自然免疫応答を刺激するために患者に投与され、その後（例えば、１日後、又は２日後、又は３日後、又は４日後、又は５日後、又は６日後、又は１週間後、又は２週間後、又は３週間後、又は４週間後）に、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質が投与される。
【０１２４】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例は、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコーン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ  １−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン系抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））を参照されたい；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロン酸塩などのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質（ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎ）エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシンドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどの���リン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２、２’、２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（例えば、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール  パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、アブラクサン  クレモフォールを含まない、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びタキソテール  ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ジェムザール  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン  ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサル、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵ及びロイコボリンとのイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤  ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、細胞増殖を低下させるエル���チニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）及びＶＥＧＦ−Ａ）並びに上記のいずれかの医薬として許容される塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されない。加えて、本治療方法は、放射線の使用をさらに含んでよい。加えて、本治療方法は、光力学療法の使用をさらに含んでよい。
【０１２５】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明の追加の薬剤は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１，ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（テセントリク、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ））、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及び／又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と４−１ＢＢリガンドの１以上の結合を増加及び／又は刺激する薬剤（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体）、並びにＣＴＬＡ−４の活性及び／又はＣＴＬＡ−４と、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１以上の結合及び／又はＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）から選択される１以上の免疫調節剤である。
【０１２６】
実施形態において、限定されないが、感染性疾患適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての抗感染剤に関する。実施形態において、抗感染剤は、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、及びホスカルネットを含むがこれらに限定されない抗ウイルス剤である。実施形態において、抗感染剤は、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テキン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、及びメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；及びカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、及びメロペネム）を含むがこれらに限定されない抗菌剤である。実施形態において、抗感染剤は、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、キニン、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメーター（ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）／ルメファントリン、アトバコン（ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）／プログアニル及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、ピランテルパモ酸塩、及びアルベンダゾールを含む。
【０１２７】
実施形態において、限定されないが、自己免疫適用を含み、追加の薬剤は、免疫抑制剤である。実施形態において、免疫抑制剤は、ステロイド系抗炎症剤又は非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に、副腎コルチコステロイド及びその合成類似体は、当技術分野で周知である。本発明に有用なコルチコステロイドの例は、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、ベータ−メチルベタメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンベンゾエート、ベタメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンバレレート、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾンジアセテート、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステル類のバランス、クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸塩を含むが、これらに限定されない。本発明で使用され得る（ＮＳＡＩＤ）は、サリチル酸、アセチルサリチル酸、メチルサリチル酸、グリコールサリチル酸、サリチルアミド（ｓａｌｉｃｙｌｍｉｄｅ）、ベンジル−２，５−ジアセトキシベンゾイン酸、イブプロフェン、スリンダク（ｆｕｌｉｎｄａｃ）、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、及びインドメタシンを含むが、これらに限定されない。実施形態において、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン（Ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ）、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレート、及び小さな生物学的薬剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞分裂阻害剤であり得る。
【０１２８】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、修飾される誘導体、すなわち、共有結合が組成物の活性を防止しないような、組成物への任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定されないが、誘導体は、特に、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質溶解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾された組成物を含む。多数の化学修飾のいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。さらなる実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、例示的な実施形態において、毒素、化学療法剤、放射性同位体、及びアポトーシス若しくは細胞死を引き起こす薬剤を含む、細胞傷害性薬剤をさらに含む。そのような薬剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートされ得る。
【０１２９】
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はしたがって、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質などの検出可能な部分、及び化学発光部分、又は、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、サイトトキシン、細胞傷害性薬剤、及び放射性物質などの機能的部分を付加するために翻訳後に修飾され得る。
【０１３０】
製剤
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される塩を形成するために、無機酸若しくは有機酸と反応できる十分に基本的な官能基、又は無機塩基若しくは有機塩基と反応できるカルボキシシル基を保有できる。医薬として許容される酸添加塩は、当技術分野で周知の医薬として許容される酸から形成される。そのような塩は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）並びに医薬塩のハンドブック；性質、選択、及び使用（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編集），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される医薬として許容される塩を含む。
【０１３１】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、医薬として許容される塩の形態である。
【０１３２】
また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される担体又はビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与できる。そのような組成物は、必要に応じて、適切な投与のための形態を提供するように、適量の医薬として許容される賦形剤を含んでよい。医薬用賦形剤は、水並びにピーナッツ油、大豆油、鉱物油、及びゴマ油などの、石油、動物、野菜、又は合成起源のものを含む油類などの、液体であり得る。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、及び尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用できる。一実施形態において、医薬として許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。水は、本明細書に記載の任意の薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のために、液体賦形剤として使用できる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールなども含む。本明細書に記載の任意の薬剤は、必要に応じて、微量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含んでよい。
【０１３３】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、及びＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない）に懸濁される。
【０１３４】
実施形態において、キメラタンパク質は、半減期を延長するか、又はそうでなければ、薬物力学的及び薬物動態学的性質を改善するために別の薬剤とコンジュゲート並びに／又は融合され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、及びトランスフェリンなどの１以上と融合又はコンジュゲートされ得る。実施形態において、個々のキメラタンパク質のそれぞれは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５〜２３９に記載の薬剤の１以上に融合される。
【０１３５】
投与、投薬、及び治療レジメン
本発明は、記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を様々な製剤中に含む。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、溶液、懸濁液、エマルション、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適する任意の他の形態をとり得る。タンパク質配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ構築物も使用され得る。一実施形態において、組成物は、カプセルの形態にある（例えば、米国特許第５、６９８、１５５号を参照されたい）。適切な医薬賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集，第１９版、１９９５）に記載されている。
【０１３６】
適宜、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、可溶化剤も含んでよい。また、薬剤は、当技術分野で公知の適切なビヒクル又は送達装置により送達できる。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクル又は送達装置で共送できる。投与のための組成物は、必要に応じて、注射部位での痛みを軽減するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含んでよい。
【０１３７】
本発明のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、単位剤形で都合よく提示され、薬学の当技術分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。そのような方法は、一般に、１以上の付属成分を構成する担体と治療薬を結合させる工程を含む。典型的には、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、又はその両方と治療薬を均一かつ密接に結合させ、必要に応じて、所望の製剤の剤形に生成物を形成する（例えば、湿式又は乾燥造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で公知の従来の方法を用いて打錠する）ことによって調製される。
【０１３８】
一実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。
【０１３９】
投与経路は、例えば、腫瘍内、皮内、筋肉内、経皮内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入による投与、又は局所的に、特に、耳、鼻、目、若しくは皮膚への投与を含む。実施形態において、投与は、経口又は非経口注射によってなされる。場合によって、投与は、血流への本明細書に記載の任意の薬剤の放出をもたらすか、或いは、薬剤は活性疾患の部位に直接投与される。
【０１４０】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、経口投与できる。そのようなキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はまた、任意の他の便利な経路によって、例えば、静脈内注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与でき、かつ別の生物学的活性剤と共に投与できる。投与は、全身的又は局所的であり得る。様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、投与のために使用できる。
【０１４１】
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。一実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍に近位に位置する他の免疫細胞を含む腫瘍細胞を取り囲み、かつ／若しくは腫瘍細胞に栄養を与える、例えば、細胞、分子、細胞外マトリックス並びに／又は血管）又はリンパ節に投与され、かつ／又は腫瘍微小環境若しくはリンパ節を標的とする。実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍内に投与される。
【０１４２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ（ＯＰＤＩＶＯ）、キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ヤーボイ（ＹＥＲＶＯＹ）及びテセントリク（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）の１以上での治療）に見られる副作用よりも少ない副作用をもたらす二重効果を可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、低血圧、大腸炎、肝炎、肺炎、発疹、及びリウマチ性疾患などの、皮膚、消化管、腎臓、末梢神経系及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、目、膵臓、及び内分泌系を含む様々な組織並びに器官に影響を与える一般的に観察される免疫関連有害事象を低減又は予防する。また、本発明の局所投与、例えば腫瘍内投与は、標準的な全身投与、例えば、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ、キイトルーダ、ヤーボイ、及びテセントリクの１以上での治療）で使用されるようなＩＶ注入で見られる有害事象を未然に防ぐ。
【０１４３】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内への注射並びに注入）に適する剤形は、例えば、溶液、懸濁液、分散剤、及びエマルションなどを含む。それらはまた、使用直前に無菌注射培地に溶解又は懸濁できる無菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造され得る。それらは、例えば、当技術分野で公知の懸濁剤又は分散剤を含有し得る。
【０１４４】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量並びに投薬スケジュールは、治療される疾患、対象の全体的な健康、及び投与する医師の裁量を含むが、これらに限定されない様々なパラメータに依存し得る。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、それを必要とする対象への追加の薬剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）か、追加の薬剤の投与と同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与できる。実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質及び追加の薬剤は、１分間間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与される。
【０１４５】
実施形態において、本発明は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質及び適応免疫応答を誘導する別のキメラタンパク質の共投与に関する。そのような実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。例えば、キメラタンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態において、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質及び適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、１週間間隔で投与されるか、又は隔週で投与される（すなわち、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質の投与は、その１週間後に、適応免疫応答などを誘発するキメラタンパク質などの投与を伴う）。
【０１４６】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量は、病態の重症度、病態が治療又は予防されるか否か、並びに治療される対象の年齢、体重、及び健康を含むいくつかの要因に依存し得る。さらに、特定の対象についての薬物ゲノムの（薬物動態、薬理力学的又は治療の有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響の）情報が、使用される投薬量に影響を与える可能性がある。また、正確な個々の投薬量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む様々な要因に依存して、幾分か調節できる。投薬量のいくつかのバリエーションが予想される。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の非経口注射による投与について、投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、１日あたり約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日あたり約３ｍｇ〜約５ｍｇであり得る。一般に、経口又は非経口投与の場合、本明細書に記載の任意の薬剤の投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は１日あたり約２００〜約１、２００ｍｇ（例えば、１日あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）であり得る。
【０１４７】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、治療あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は治療あたり約２００〜約１、２００ｍｇ（例えば、治療あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）の投薬量での非経口注射によるものである。
【０１４８】
実施形態において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の適切な投薬量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、その間の全ての値と範囲を含む約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．２ｍｇ／ｋｇ体重、約１．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．４ｍｇ／ｋｇ体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６ｍｇ／ｋｇ体重、約１．７ｍｇ／ｋｇ体重、約１．８ｍｇ／ｋｇ体重、約１．９ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約４ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約６ｍｇ／ｋｇ体重、約７ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重、約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態において、送達は、小胞中で、特にリポソーム中であり得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら，感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ），Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ及びＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照されたい）。
【０１４９】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、制御放出手段若しくは持続放出手段によるか、又は当業者に周知の送達装置によって投与できる。例は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第３、８４５、７７０号、同第３、９１６、８９９号、同第３、５３６、８０９号、同第３、５９８、１２３号、同第４、００８、７１９号、同第５、６７４、５３３号、同第５、０５９、５９５号、同第５、５９１、７６７号、同第５、１２０、５４８号、同第５、０７３、５４３号、同第５、６３９、４７６号、同第５、３５４、５５６号、及び同第５、７３３、５５６号に記載のものを含むが、これらに限定されない。そのような剤形は、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、微小球、又はそれらの組み合わせを用いる１以上の活性成分の制御放出又は持続放出を提供するのに有用であり得る。活性成分の制御放出又は持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、光の適切な波長による刺激、酵素の濃度又は利用可能性、水の濃度又は利用可能性、又は他の生理学的条件若しくは化合物を含むがこれらに限定されない、様々な条件によって刺激できる。
【０１５０】
一実施形態において、ポリマー材料を使用できる（制御放出の医学的用途（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ），Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；制御される薬物バイオアベイラビリティ、医薬品の設計と性能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ），Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。
【０１５１】
一実施形態において、制御放出システムは、治療される標的領域の近くに配置でき、したがって、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、上記のＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２巻，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説で説明されている他の制御放出システムが使用され得る。
【０１５２】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、独立して、１日に１〜４回、又は月に１〜４回、又は年に１〜６回、又は２年、３年、４年若しくは５年に１回であり得る。投与は、１日又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であり得、さらには対象の寿命の間であり得る。
【０１５３】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を利用する投薬量レジメンは、対象の種類、種、年齢、体重、性別及び病状；治療される病態の重症度；投与経路；対象の腎機能又は肝機能；個人の薬理ゲノミクス構造；及び使用される本発明の特定の化合物を含む様々な要因に従って選択できる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、毎日の単回用量で投与でき、又は総１日投薬量は、１日２回、３回又は４回の分割用量で投与できる。また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、投薬量レジメン全体を通して断続的ではなく、連続的に投与できる。
【０１５４】
細胞及び核酸
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。実施形態において、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。実施形態において、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
【０１５５】
原核生物ベクターと真核生物ベクターの両方が、キメラタンパク質の発現に使用できる。原核生物ベクターは、大腸菌配列に基づく構築物を含む（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，６０：５１２−５３８を参照されたい）。大腸菌での発現に使用できる調節領域の非限定的な例は、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７及びλＰＬを含む。原核生物発現ベクターの非限定的な例は、λｇｔ１１などのλｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈら，「ＤＮＡクローニング技術（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｉ巻：実用的なアプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編），ｐｐ．４９−７８，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０，１８５：６０−８９）を含み得る。しかしながら、原核生物宿主ベクター系は、哺乳動物細胞の翻訳後処理の多くを行うことができない。そのため、真核生物宿主ベクター系が、特に有用であり得る。様々な調節領域を、哺乳動物宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現に使用できる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞に有用であり得る誘導性プロモーターは、限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子に関連するプロモーター、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，４９：２７３５−４２；及びＴａｙｌｏｒら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，１０：１６５−７５を参照されたい）。ヒートショックプロモーター又はストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞における融合タンパク質の発現を促進するのに有利であり得る。
【０１５６】
実施形態において、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である、発現制御領域、若しくはその補体に作動可能に連結されたキメラタンパク質（及び／若しくは追加の薬剤）又はその補体をコードする核酸を含む。発現制御領域は、発現ベクターで形質転換されたヒト細胞でブロッキング剤及び／又は刺激剤が生成されるように、作動可能に連結されたブロッキング剤及び／又は刺激剤をコードする核酸の発現を促進できる。
【０１５７】
発現制御領域は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を与える、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（本明細書でエレメントと呼ばれることもある）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞中で作動可能に連結されたコード核酸を発現できる。実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。一実施形態において、細胞は非腫瘍細胞である。実施形態において、発現制御領域は、作動可能に連結された核酸に調節可能な発現を与える。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結された核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、多くの場合、誘導性と呼ばれる。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、多くの場合、抑制可能と呼ばれる。典型的には、そのようなエレメントによって与えられる増減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増減が大きくなる。
【０１５８】
実施形態において、本発明は、合図に応答して一過的に高レベルの発現をもたらすことができる誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近くにある場合、そのような発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）用の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換細胞を適切な合図に暴露することによって高レベルの薬剤を一過的に生成するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域は、低分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。特定の例は、例えば、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５、９８９、９１０号、同第５、９３５、９３４号、同第６、０１５、７０９号、及び同第６、００４、９４１号の中で見つけることができる。
【０１５９】
発現制御領域及び遺伝子座制御領域は、天然のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの全長プロモーター配列、並びに全長若しくは非バリアンド機能の全て又は一部を保持するサブ配列又はポリヌクレオチドバリアントを含む。本明細書で使用する用語「機能的」及びその文法的異形は、核酸配列、サブ配列又は断片を参照して使用される場合に、配列が天然核酸配列（例えば、非バリアント又は非改変配列）の１以上の機能を有することを意味する。
【０１６０】
本明細書で使用する「作動可能な連結」は、それらが意図される様式で機能することを可能にすると説明される構成成分の物理的な並置を指す。核酸との作動可能な連結における発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。典型的には、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端（すなわち「上流」）付近に並置される。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン）に配置できる。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離（例えば、核酸から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、又はそれより多くのヌクレオチド）に配置できる。発現制御エレメントの具体的な例はプロモーターであり、それは転写される配列の５’側に通常は位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、それは転写される配列の５’側若しくは３’側又は転写される配列内に配置できる。
【０１６１】
ヒト細胞で機能する発現系は、当技術分野で周知であり、かつウイルス系を含む。一般的に、ヒト細胞中で機能的なプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合しｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）転写を開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端に通常位置する、転写開始領域及び典型的には、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流に典型的に位置する、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用できる。ウイルス遺伝子は高度に発現される場合が多く広い宿主範囲を有するので、プロモーターとして特に使用されるのは、哺乳動物ウイルスゲノム由来のプロモーターである。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターを含む。
【０１６２】
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そのため、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネータ及びポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。イントロンも、発現構築物中に含まれ得る。
【０１６３】
生存細胞に核酸を導入するために利用可能な様々な技術がある。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適する技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーベースのシステム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。インビボ遺伝子導入に関しては、リポソーム；キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクルを含むいくつかの技術及び試薬を用いてもよい。ウイルスベクターも、インビボ形質導入に適する。場合によっては、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又はリガンドなどの、標的剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型を指向するカプシドタンパク質又はその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質を標的化し、かつ／又はその取り込みを促進するために使用され得る。受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。
【０１６４】
適宜、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達作用因子を用いることもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１−３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２−３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋら，ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３を参照されたい）。これらは、リコンビナーゼ及びトランスポサーゼを含む。例は、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６，１９８１）、ｌａｍｂｄａ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３−５４５，１９７４），Ｆｌｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ら，Ｃｅｌｌ，２９：２２７−２３４，１９８２），Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０−６１８，１９９０），ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）、マリナーファミリーのトランスポサーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋら、上記）、及びＡＡＶ、レトロウイルスなどのウイルスを組み込むための構成成分、並びにレトロウイルス又はレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する構成成分を有するアンチウイルス（Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３）を含む。加えて、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を挿入するために使用され得る。
【０１６５】
態様において、本発明は、ウイルスベクターであるキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の発現用の発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが公知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１  １７，１２２，２００３を参照されたい）。例示的なウイルスベクターは、アンチウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものを含むが、他のウイルスベクターも使用され得る。インビボ使用の場合、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターは、αウイルス及びアデノウイルスなどの使用に適する。αウイルスの例示的な種類は、シンドビスウイルス、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）を含む。インビトロ使用の場合、レトロウイルス、ＡＡＶ、及びアンチウイルスなどの、宿主ゲノムに組み込むウイルスベクターが適する。実施形態において、本発明は、インビボでヒト細胞を形質導入する方法であって、インビボで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む、方法を提供する。
【０１６６】
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【０１６７】
発現ベクターは、本発明のキメラタンパク質を生成するための宿主細胞に導入できる。細胞は、例えば、インビトロで培養されるか、又は遺伝子操作され得る。有用な哺乳動物宿主細胞は、限定されないが、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞を含む（例えば、「遺伝子導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」１９９０、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．を参照されたい）。これらは、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３、２９３−ＥＢＮＡ、又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，７７：４２１６）；ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８０，２３：２４３−２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）を含む。本明細書に記載の融合タンパク質を発現させるための例示的癌細胞型は、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びそのオブアルブミン形質移入体、Ｅ．Ｇ７、マウス黒色腫細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、及びヒト小細胞肺癌細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７を含む。
【０１６８】
宿主細胞は、健康なヒト、癌患者、及び感染症患者を含む健常又は罹患している患者、民間研究室預託、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの公共の培養物コレクション、又は商業サプライヤーから入手できる。
【０１６９】
インビトロ、エクソビボ、及び／又はインビボで本発明のキメラタンパク質の生成に使用できる細胞は、限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に、造血幹細胞又は前駆細胞（例えば、骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などを含む。細胞型の選択は、治療若しくは予防される腫瘍の種類又は感染症に依存し、当業者が決定できる。
【０１７０】
対象及び／又は動物
実施形態において、対象及び／又は動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又はサル、チンパンジー、若しくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。実施形態において、対象及び／又は動物は、例えば、ゼブラフィッシュなどの非哺乳動物である。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光タグ付き細胞（例えば、ＧＦＰで）を含み得る。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
【０１７１】
実施形態において、対象及び／又は動物は、ヒトである。実施形態において、ヒトは小児のヒトである。実施形態において、ヒトは、成人のヒトである。実施形態において、ヒトは、老人のヒトである。実施形態において、ヒトは、患者と呼ばれ得る。
【０１７２】
実施形態において、ヒトは、生後約０ヶ月〜約６ヶ月、生後約６ヶ月〜約１２ヶ月、生後約６ヶ月〜約１８ヶ月、生後約１８ヶ月〜約３６ヶ月、約１歳〜約５歳、約５歳〜約１０歳、約１０歳〜約１５歳、約１５歳〜約２０歳、約２０歳〜約２５歳、約２５歳〜約３０歳、約３０歳〜約３５歳、約３５歳〜約４０歳、約４０歳〜約４５歳、約４５歳〜約５０歳、約５０歳〜約５５歳、約５５歳〜約６０歳、約６０歳〜約６５歳、約６５歳〜約７０歳、約７０歳〜約７５歳、約７５歳〜約８０歳、約８０歳〜約８５歳、約８５歳〜約９０歳、約９０歳〜約９５歳、又は約９５歳〜約１００歳の範囲の年齢を有する。
【０１７３】
実施形態において、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学での使用に関する。特定の実施形態において、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態において、非ヒト動物は家畜動物である。
【０１７４】
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化できるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形で含む。一実施形態において、単位剤形は、殺菌できる予め充填された注射器などの容器であり、本明細書に記載の任意の薬剤及び医薬として許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する。キットは、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を説明するラベル又は印刷された説明書をさらに含んでよい。キットはまた、蓋スペキュラム、局所麻酔薬、及び投与場所のための洗浄剤を含み得る。キットはまた、本明細書に記載の１以上の追加の薬剤をさらに含んでよい。一実施形態において、キットは、本明細書に記載のものなどの、有効量の本発明の組成物及び有効量の別の組成物を含有する容器を含む。
【０１７５】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０１７６】
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明される。
【０１７７】
実施例
実施例１：単量体ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の予測される作用機序及びコンピュータ予測構造
図１Ａは、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の期待される作用機序の概略図を示す。ＣＳＦ１Ｒドメインは、ＣＳＦ１及び／又はＩＬ−３４を結合して「シンク効果」を提供し、ＣＳＦ１及び／又はＩＬ−３４が抗原提示細胞の表面でＣＳＦ１Ｒに結合するのを防ぎ、それにより免疫阻害シグナルを遮断する。同時に、キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌドメインは、抗原提示細胞の表面上でＣＤ４０を結合し、それにより免疫活性化シグナルを提供する。これらの２つの事象の最終効果は、阻害シグナル（ＩＬ−３４及び／又はＣＳＦ１を介する）を遮断すること及びＣＤ４０を介する活性化シグナルを提供することにより免疫応答を増加させる。
【０１７８】
図１Ｂは、腫瘍細胞とＴ細胞の間でキメラタンパク質によって形成されたシナプスを示す。
【０１７９】
図１Ｃは、ｐ値が１．６９×１０−２９である、９４７個のアミノ酸残基（配列番号５）を有する単量体ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−１１５１５４）のコンピュータ構造予測を示す。単量体タンパク質の分子量は、１０５．４ｋＤａであると予測された。キメラタンパク質の構造を図１Ａに提供する。
【０１８０】
具体的には、構造予測は、３３個のアミノ酸の位置（３％）が無秩序である可能性を明らかにした。キメラタンパク質の配列全体の二次構造予測は、タンパク質が２％のα−ヘリックス（Ｈ）、５１％のβ−シート（Ｅ）、及び４５％のコイル（Ｃ）の組成を有することを示した。絶対グローバル品質のＧＤＴ（グローバル距離検定）及びｕＧＤＴ（非正規化ＧＤＴ）も、キメラタンパク質について計算して、７３８（７８）の全体的なｕＧＤＴ（ＧＤＴ）を得た。タンパク質残基の溶媒アクセシビリティに関する３つの状態の予測は、３３％の露出（Ｅ）、４６％の中間（Ｍ）、及び１９％の埋没（Ｂ）であった。
【０１８１】
実施例２：ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（本明細書ではＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとも呼ばれる）キメラタンパク質を、詳細な説明で上に記載されるように、かつ内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号のように構築した。キメラタンパク質を、キメラタンパク質の各ドメインに対する、すなわち、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗Ｆｃ、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体によるウェスタンブロット分析を行うことにより特徴付けた。
【０１８２】
ウェスタンブロットは、非還元レーン（図２、各ブロットのレーン２）で、約２４０ｋＤａの見かけの分子量を有する単量体種（おそらく二量体）の存在を示し、これは還元剤β−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図２、各ブロットのレーン３）。図２、各ブロットのレーン４に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）とエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で、約１０５ｋＤａの予測分子量で単量体として移動した。
【０１８３】
実施例３：ＥＬＩＳＡを用いるＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性の特徴付け
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを、ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（本明細書ではＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとも呼ばれる）の異なるドメインの、それらのそれぞれの結合パートナー（すなわち、ＣＳＦ１、ｈＩｇＧ、又はＣＤ４０）に対する結合親和性を実証するために開発した。具体的には、キメラタンパク質のＦｃ部分を、プレート結合ヒトＩｇＧへ捕捉すること及びＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を介して検出することにより検出した（図３の左上四分円）。ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＣＳＦ１Ｒドメインを、プレート結合組換えヒトＣＳＦ１タンパク質に捕捉すること及びＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を介して検出することにより検出した（図３の右上四分円）。キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌドメインを、プレート結合組換えヒトＣＤ４０タンパク質に捕捉すること及びＣＤ４０Ｌ特異的抗体を介して検出することにより検出した（図３の左下四分円）。最後に、ＣＳＦ１とＣＤ４０の両方への同時結合を、組換えＣＤ４０を用いてＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを捕捉しかつ組換えＣＳＦ１を用いてＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（図３の右下部）を検出するデュアルＥＬＩＳＡフォーマットを用いて実証した。
【０１８４】
実施例４：ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のエクソビボ細胞結合親和性の特徴付け
細胞結合アッセイを行って、哺乳動物細胞膜の表面上のそれらのそれぞれの結合パートナーに対するｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証した。
【０１８５】
細胞結合アッセイのために、不死化細胞株を、ＣＤ４０（Ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ４０）を安定に発現するように工学処理した。漸増濃度のＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を、過剰発現（Ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ４０）細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。
【０１８６】
図４に示すように、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、濃度依存的に低いｎＭの親和性で、細胞表面上に存在するＣＤ４０に結合した。具体的には、図４に示すように、細胞結合アッセイは、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが、約７７ｎＭの親和性（ＥＣ５０計算による）でＣＤ４０に結合することを実証した。
【０１８７】
実施例５：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びバイオレイヤー表面干渉法によるＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性の特徴付け
ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６０システムを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。具体的には、ヒトＣＳＦ１及びＣＤ４０に対するキメラタンパク質の親和性を決定し、組換え対照タンパク質と比較し、結果を以下の表に示す。
【表２】
2020508063.tif 000005
【０１８８】
ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、高い親和性でＣＳＦ１及びＣＤ４０に結合することが判明した。特に、ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のオフ速度は対照タンパク質（すなわち、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ及びＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ）よりもはるかに遅いことが注目される。例えば、ＣＳＦ１からのキメラタンパク質のオフ速度はＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質よりも４５．９倍遅かった。
【０１８９】
加えて、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの各ドメインの結合親和性を、バイオレイヤー表面干渉法に基づくＯｃｔｅｔシステムを用いて測定した（図５Ａ〜図５Ｆ）。これらの結果はさらに、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の各結合パートナーへの高親和性結合を確認する。
【０１９０】
実施例６．両方のＣＳＦ１Ｒリガンドへの結合親和性
ＣＳＦ１Ｒは、２つのリガンド：ＣＳＦ１とＩＬ−３４の両方を結合することが報告されている。そのため、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０ＬがＣＳＦ１とＩＬ−３４の両方に結合できることを実証することが望ましい。これを、バイオレイヤー表面干渉法（Ｏｃｔｅｔ）を用いて試験し、結果を図６に示した。ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０ＬのＣＳＦ１及びＩＬ−３４への結合は、区別がつかなかった。そのため、曲線は事実上互いの上で重なる。
【０１９１】
実施例７．マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（本開示ではｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌとも呼ばれる）キメラタンパク質を、詳細な説明で上に記載されるように、かつ内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号のように構築した。キメラタンパク質を、キメラタンパク質の各ドメインに対する、すなわち、α−ＣＳＦ１Ｒ、α−Ｆｃ、及びα−ＣＤ４０Ｌ抗体によるウェスタンブロット分析を行うことにより特徴付けた。
【０１９２】
ウェスタンブロットは、非還元レーン（図７Ａ、各ブロットのレーン２）での約２４０ｋＤａの見かけの分子量を有するオリゴマー種（おそらく二量体）の存在を示し、これは還元剤β−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図７Ａ、各ブロットのレーン３）。図７Ａ、各ブロットのレーン４に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）とエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で、約１０５ｋＤａの予測分子量で単量体として移動した。
【０１９３】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを、ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの異なるドメインの、それらのそれぞれの結合パートナー（すなわち、ＣＳＦ１、ｍＩｇＧ、又はＣＤ４０）に対する結合親和性を実証するために開発した。具体的には、キメラタンパク質のＦｃ部分を、プレート結合マウスＩｇＧへ捕捉すること及びＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を介して検出することにより検出した（図７Ｂの真ん中のグラフ）。ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＣＳＦ１Ｒドメインを、プレート結合組換えマウスＣＳＦ１タンパク質に捕捉すること及びＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を介して検出することにより検出した（図７Ｂの左のグラフ）。キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌドメインを、プレート結合組換えマウスＣＤ４０タンパク質に捕捉すること及びＣＤ４０Ｌ特異的抗体を介して検出することにより検出した（図７Ｂの右のグラフ）。
【０１９４】
図７Ｂに示すように、ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインは、高い親和性でそれらのそれぞれの結合パートナーと効果的に相互作用した。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡアッセイでは、中央Ｆｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出すると、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、このアッセイでは標準物質と比較して低レベルのｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質が検出された。
【０１９５】
実施例８．マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のエクソビボ細胞結合親和性の特徴付け
細胞結合アッセイを行って、哺乳動物細胞膜の表面上のそれらのそれぞれの結合パートナーに対するｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証した。
【０１９６】
細胞結合アッセイのために、不死化細胞株を、ＣＤ４０（ＣＨＯＫ１／ＣＤ４０）を安定に発現するように工学処理した。漸増濃度のマウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を、過剰発現（ＣＨＯＫ１／ＣＤ４０）細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。
【０１９７】
図８に示すように、マウスＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、濃度依存的に低いｎＭの親和性で、細胞表面上に存在するＣＤ４０に結合した。具体的には、図８に示すように、細胞結合アッセイは、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが、約９１．１ｎＭの親和性（ＥＣ５０計算による）でＣＤ４０に結合することを実証した。陰性対照として、親（非ＣＤ４０発現）ＣＨＯＫ１細胞株への検出可能な結合はなかった。
【０１９８】
実施例９．インビトロでのＣＤ４０シグナル伝達の誘導
ヒトＣＤ４０はホモ三量体受容体であり、活性化されると、ＮＦ−κΒとＮＩＫの両方の活性化を伴うシグナル伝達カスケードの誘導をもたらす。図９は、ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を用いるインビトロＮＦ−κΒ／ＮＩＫシグナル伝達アッセイからの例示的なデータを示す。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＮＩＫシグナル伝達アッセイからのＵ２ＯＳ細胞を、市販の片側ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ、片側ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ、又はＣＤ４０アゴニスト抗体、又はヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかの滴定と培養した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）は、示されたレジメンによる処理後に活性化されたＮＦ−κΒ／ＮＩＫシグナル伝達の相対強度を示す。ｈＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃキメラタンパク質と同等の程度に、ＮＦ−κΒ及びＮＩＫを介するシグナル伝達を強く活性化したことが示される。ＣＤ４０アゴニスト抗体は、この抗体がＣＤ４０受容体の適切なクラスタリングを促進するためにＦｃ受容体架橋を必要とするので、このアッセイではＣＤ４０活性化を刺激しなかった。
【０１９９】
実施例１０：ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の機能アッセイ
ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５とも呼ばれる）は、腫瘍微小環境内でのＣＳＦ１及び／又はＩＬ−３４への結合におけるその役割のために、緊急免疫チェックポイントとして特定されている。図１Ａに示すように、これら２つのリガンドのいずれかへのＣＳＦ１Ｒの結合は、骨髄由来抑制細胞の誘導を含む様々なメカニズムを介して免疫抑制を刺激する。理論に縛られることなく、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は同時に、ＣＳＦ１／ＩＬ−３４のサイトカイントラップとして作用しかつＣＤ４０を介してマクロファージ及び抗原提示細胞を刺激し、それにより強力な抗腫瘍免疫を生じると考えられる。
【０２００】
２つの機能アッセイを、ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を特徴付けるために開発した。
【０２０１】
第１のアッセイは、ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質が可溶性ＣＳＦ１に結合し、その血清レベルを減少させる能力を評価するためのインビボトラップ／シンクアッセイである。具体的には、腫瘍を担持しないマウスに、０日目に抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（抗ＣＤ１１５抗体とも呼ばれる）の単回用量を注射した。２日目に、マウスを未処置のままにするか、又はマウスにＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の単回用量を注射した。血清を、キメラタンパク質の注射の２日前及びキメラタンパク質処置後３日目に採取した。マウスＣＳＦ１のＥＬＩＳＡアッセイを血清で行った。図１０Ａに示すように、ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、可溶性ＣＳＦ１に結合し、その血清レベルを著しく低減でき、したがってＥＬＩＳＡによるその検出を排除した。
【０２０２】
第２のアッセイは、ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質での処置後１３日目に、腫瘍担持マウスのインビボ免疫プロファイリングを伴った。具体的には、脾臓及びリンパ節におけるＩＬ１５Ｒα＋細胞のレベルを、キメラタンパク質（特に、キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌ部分）による免疫活性化の読み出しとして分析した。腫瘍担持マウスを、最初の腫瘍接種後５日目及び７日目に、１５０μｇのｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の２回用量で処置した。１３日目に、マウスのコホートを屠殺し、それらの脾臓及びリンパ節をＩＬ１５Ｒαのフローサイトメトリー分析のために摘出及び解離した。脾臓及びリンパ節中のＩＬ１５Ｒα＋細胞のレベルを、図１０Ｂに示すように決定した。ＣＤ４０Ｌ機能の既知のメカニズムと一致して、キメラタンパク質で処置したマウスは、未処置マウスと比較して、脾臓及びリンパ節でのＩＬ１５Ｒαの増加を示し、キメラタンパク質がＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路を介して免疫活性化を刺激したことを強く示唆する。
【０２０３】
実施例１１：ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性の特徴付け
ｍＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を、ＣＴ２６マウス大腸腫瘍モデルを用いて分析した。
【０２０４】
１組の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、３０日目にＣＴ２６腫瘍細胞の２回目の接種を行った。腫瘍成長の５日後に、腫瘍が直径４〜５ｍｍに達すると、マウスをＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）ブロッキング抗体、これら２つの抗体の組み合わせ、又はｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかで処置した。処置を７日目に繰り返した。
【０２０５】
各処置群の腫瘍成長を、図１１Ａに示すように評価した。具体的には、未処置マウスは腫瘍を迅速に発症した。ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）ブロッキング抗体、又はこれら２つの抗体の組み合わせのいずれかによる処置は、腫瘍の発症をわずかに遅らせるように思われた。これに対して、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質でのマウスの処置は、腫瘍の発症を著しく防ぎ、かつ／又は遅らせた。上のデータは、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質での処置がインビボで免疫記憶効果を生じさせることを示唆する。そのため、処置した動物は、キメラタンパク質での最初の処置後に再負荷した場合に、腫瘍細胞を後に攻撃し、かつ／又は腫瘍の発症を防ぐことができる。
【０２０６】
腫瘍接種後５０日目までのマウスの全生存率も評価した。未処置マウスの全ては、腫瘍接種後３０日以内に死亡した。ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）ブロッキング抗体、又はこれらの２つの抗体の組み合わせで処置したマウスの他のグループは、生存は延長したが、腫瘍接種後５０日まで生存したマウスはなお２５％未満であった。重要なことに、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスの７０％超が、図１１Ｂに示すように腫瘍接種後５０日を過ぎて生存した。図１１Ｃに示されるように、キメラタンパク質での処置は、ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）ブロッキング抗体、又は２つの抗体の組み合わせによる処置よりも顕著により高い腫瘍拒絶反応をもたらした。
【０２０７】
実施例１２．腫瘍担持マウスからのリンパ球集団の免疫表現型検査
免疫表現型検査もまた、腫瘍接種後１３日目に脾細胞、リンパ節細胞及び腫瘍浸潤リンパ球を分析することによって行った。図１２Ａに示すように、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、未処置マウスと比較してリンパ節又は腫瘍ではなく、脾臓においてＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の頻度の増加を示した。さらに、キメラタンパク質で処置したマウスは、脾臓及び腫瘍においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の割合の減少を示し、キメラタンパク質が制御性Ｔ細胞を減少させることを示唆する（図１２Ｂ）。特に、腫瘍内では全ＣＤ８＋細胞の割合は顕著に増加しなかったにもかかわらず（図１２Ａ）、ＡＨ１腫瘍抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の顕著な増加（四量体染色による）が、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスにおいて検出され（図１２Ｃ）、キメラタンパク質がＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍認識を高めたことを示唆する。
【０２０８】
ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質によるＣＤ４０受容体活性化を評価するために、キメラタンパク質によるＣＤ１９＋細胞及びＩＬ−１５Ｒα陽性細胞の誘導を分析した。図１２Ｄに示すように、ＣＤ１９＋細胞の顕著な増加がキメラタンパク質で処置したマウスの脾細胞で観察された。ＣＤ１９＋細胞のこの増加は、リンパ節又は腫瘍細胞では観察されなかった。さらに、キメラタンパク質で処置したマウスの脾細胞でのＩＬ−１５Ｒα陽性細胞の顕著な増加もあった（図１２Ｅ）。再び、増加はリンパ節又は腫瘍細胞では認められなかった。
【０２０９】
実施例１３．ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０抗体と比較して低減されたＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの毒性
インビボ研究もまた驚くべきことに、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質が高められた安全性プロファイルを示したことを実証した。具体的には、ＣＤ４０アゴニスト抗体とＣＤ４０＋ＣＤ１１５抗体の併用治療で処置したマウスは、実験の過程で著しい下痢及び体重減少を発症することが観察された。ＣＤ４０アゴニスト抗体で処置したマウスにおいて、腸内炎症応答が開始され下痢及び体重減少をもたらし、それはその後ＣＤ１１５遮断との併用治療によって顕著に悪化した。抗体併用（ＣＤ１１５＋ＣＤ４０抗体）グループのマウスは、体重を２５％超失い（図１３Ｂ）、瀕死の外観を有し、場合によっては、この炎症応答は致死的であった（図１３Ａ参照）。これに対し、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、健康的に見え、下痢又は体重減少の兆候は現れず、正常に行動した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
【０２１０】
全体として、これらのデータは、ｍＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質での処置が、ＣＤ１１５ブロッキング抗体単独、ＣＤ４０アゴニスト抗体単独、又はＣＤ１１５ブロッキング抗体とＣＤ４０アゴニスト抗体の組み合わせよりも、完全腫瘍拒絶反応の顕著に高い割合をもたらしたことを示す。さらに、キメラタンパク質での処置は、マウスに共投与した場合に非常に毒性が高く致死性の腸炎症及び下痢を引き起こした抗体での処置と比較して、高められた安全性プロファイルを提供した。
【０２１１】
実施例１４：キメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与の特徴付け
この実施例において、本発明のキメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与をアッセイした。ここで、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをＦｃ含有キメラタンパク質のモデルとして用いた。そのため、以下に示すデータは、本発明のキメラタンパク質に関連する。
【０２１２】
天然状態では、ＰＤ１は単量体として存在し、一方でＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用により二量体化する傾向がある。Ｆｃドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに結合する。まとめると、いくつかの分子間相互作用は、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの四次構造に寄与し得る。少なくとも、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの４つの潜在的な構造があり、キメラタンパク質は単量体、二量体、三量体、又は六量体として存在する。図１４を参照されたい。
【０２１３】
キメラタンパク質の単量体及び二量体の構造の存在を、キメラタンパク質を還元条件及び非還元条件に暴露し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動することによって試験した。非還元条件下（還元：「−」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２００ｋＤａの位置に移動した。ここで、ウェスタンブロットを、ＰＤ１、Ｆｃ、又はＯＸ４０Ｌに対する抗体でプローブし、それぞれ、図１５の左、真ん中、及び右のブロットに示した。キメラタンパク質の予測単量体分子量は５７．６ｋＤａであるので、２００ｋＤａ種は、少なくとも二量体であると予想された。しかしながら、ジスルフィド結合（例えば、Ｆｃドメイン間の）を還元する還元条件下（還元：「＋」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１００ｋＤａの位置に移動した。１００ｋＤａ種は予想よりも大きかったので、余分な質量はグリコシル化によるものと予測された。最後に、キメラタンパク質をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ「＋」）で処理し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。これらの条件下で、キメラタンパク質は約５７．６ｋＤａの位置に移動した。これらのデータは、キメラタンパク質がグリコシル化され、少なくとも二量体として天然に存在することを示唆しており、二量体化は、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合に起因する可能性が高い。
【０２１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル法は、高電荷及び／又は大きな分子量のタンパク質の分子量を正確に予測しない。そのため、キメラタンパク質を次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて特徴付けた。負電荷ＳＤＳがペプチド間の電荷ベースの相互作用を低下させるＳＤＳ−ＰＡＧＥとは異なり、ＳＥＣは界面活性剤又は還元剤を使用しない。ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をＳＥＣにかけると、約２００ｋＤａ付近にピークはなかった。これは、天然では、キメラタンパク質は二量体として存在しないことを示唆する。代わりに、６７０ｋＤａを超えるサイズを有するピークが検出された。図１６を参照されたい。このデータ及び以前のデータは、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がその天然状態で六量体として存在することを示唆する。
【０２１５】
上に示したように、非還元条件下又は還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動すると、試料及び／又は泳動緩衝液中のＳＤＳは、還元剤の有無にかかわらず、六量体のＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をそれぞれ優勢な二量体又は単量体に変換する。図１７（左ゲル）を参照されたい。ＳＤＳを欠くネイティブＰＡＧＥで泳動すると、還元剤の非存在下で、キメラタンパク質は六量体として存在する。しかしながら、還元剤（ジスルフィド結合を還元する）の存在下で、ネイティブＰＡＧＥで泳動すると、キメラタンパク質は予想よりも重く移動した。図１７に示すように（右ゲル、レーン２）、キメラタンパク質は、実質的に、ローディングウェルから移動できなかった。このデータは、キメラタンパク質が、より高次のタンパク質にオリゴマー化したことを示唆する。そのため、キメラタンパク質において、ジスルフィド結合は、より高次のオリゴマー化を制御するのに重要であると思われる。
【０２１６】
これをさらに確認するために、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質、例えば「ＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌ」を構築した。そのようなキメラタンパク質は、前述のキメラタンパク質中のＦｃドメイン間で生じるジスルフィド結合を有しない。図１８に示すように、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質をネイティブＰＡＧＥで泳動すると、どのタンパク質もそのローディングウェルから実質的に移動しなかった（レーン１〜４は、漸増ローディング濃度のＰＤ１−Ｎｏ  Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを示す）ことから、再び、「Ｆｃを含まない」キメラタンパク質は、多数のタンパク質を含むコンカテマー様複合体を形成したことを示唆する。そのため、キメラタンパク質中のＦｃドメインの除去は、タンパク質凝集体の形成をもたらす。これらのデータは、例えば、異なるキメラタンパク質上のＦｃドメイン間の、ジスルフィド結合が、キメラタンパク質を安定化しかつ、それらがより高次のタンパク質／コンカテマーとしてではなく、六量体としてそれぞれ存在することを保証することを示す。言い換えれば、Ｆｃドメインは驚くべきことに、キメラタンパク質複合体に秩序をもたらす。レーン１〜４はそれぞれ、ＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌを７．５μｇ、ＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌを１０μｇ、ＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌを２．５μｇ、及びＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌを５μｇ含む。
【０２１７】
図１９に示すのは、上記のデータをまとめ、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成される方法を示すモデルである。例示的なキメラタンパク質（ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）は、自然に六量体を形成する（ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用とＦｃドメインによる二量体化による）。しかしながら、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質について還元条件下で、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合の制御効果が存在せず、かつＰＤ１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌ中にＦｃドメインが存在しないために、これらの後者のキメラタンパク質はコンカテマーを形成する。
【０２１８】
さらに、Ｆｃドメイン（本明細書に記載の）がフィコリン（キメラタンパク質間のジスルフィド結合に必要なシステイン残基を欠く）と置換されたキメラタンパク質を構築した。Ｆｃを含まないキメラタンパク質及びＦｃを含みネイティブＰＡＧＥで還元剤の存在下で泳動したキメラタンパク質（両方ともゲル中に移動しない凝集体を形成した）と同様に、フィコリンを含むキメラタンパク質もまた、高次格子を形成するように見え、ゲル中に移動しなかった。これらのデータは、ジスルフィド結合が本発明のキメラタンパク質の適切な折りたたみ及び機能にとって重要であるという結論を強化する。
【０２１９】
最後に、キメラタンパク質を、コイル状Ｆｃドメイン（ＣＣＤＦｃ）を用いて調製した。機能評価において、ほとんどの精製タンパク質は送達されなかった。
【０２２０】
したがって、キメラタンパク質のリンカー中にＦｃドメインを含めること（これはキメラタンパク質間のジスルフィド結合を形成できる）は、不溶性で、おそらく非機能的なタンパク質コンカテマー及び／又は凝集体の形成を回避するのに役立つ。
【０２２１】
実施例１５：他のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインを含む追加のＣＳＦ１Ｒ含有キメラタンパク質の生成
この実施例で、本発明の追加のキメラタンパク質を記載する。このような追加のキメラタンパク質を、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の作製方法と同様に、例えば、詳細な説明で上に記載されるように、かつ内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号のように作製した。
【０２２２】
これらの追加のキメラタンパク質は、一般式：ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２を有し、式中、ＥＣＤ  １はＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインであり、ＥＣＤ  ２は、ＣＤ４０Ｌ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインである。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬを含む。これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。
【０２２３】
これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。例示的な結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２は、上の表１に記載されている。キメラタンパク質を形成するのに有用で、かつ特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図２０に示す。
【０２２４】
或いは、追加のキメラタンパク質は、一般式：Ｎ末端  −（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端（式中、（ａ）はＣＳＦ１Ｒであり、（ｂ）はＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーであり、（ｃ）はＣＤ４０Ｌ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインである）を有する融合タンパク質である。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬを含む。
【０２２５】
４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９、１１、１３、１５、１７、６、２１、及び２３を含む。４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、７、２２、及び２４を含む。ＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは配列番号２を含む。キメラタンパク質は、上記配列の変異体、例えば、上記の配列と少なくとも約９５％の同一性を含み得る。
【０２２６】
例示的なリンカーを上の表１に記載する。キメラタンパク質を形成するのに有用で、特定の結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを図２０に示す。
【０２２７】
したがって、本発明は、以下の追加のキメラタンパク質及び追加のキメラタンパク質を用いる方法（例えば、癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において）をさらに含む：ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ３０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＦａｓＬ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ。
【０２２８】
追加のキメラタンパク質を、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを特徴付けるのに必要というよりむしろ追加のキメラタンパク質に特異的である試薬（例えば、結合パートナー、組換え標的細胞、及び癌細胞型／腫瘍型）と共にであるが、実施例１〜１３の中のＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌについて上記のように特徴付ける。そのため、例としてＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬを用いて、実施例２と同様のＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬの特徴付けを、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌに必要な抗ＣＳＦ１Ｒ、抗Ｆｃ、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体よりむしろ抗ＣＳＦ１Ｒ、抗Ｆｃ、及び抗４−１ＢＢＬ抗体を用いて行うことができる。
【０２２９】
ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質でのように、追加のキメラタンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの１つの受容体／リガンドの活性化を介してＣＳＦ１Ｒを遮断すること（これは免疫阻害性シグナル伝達を阻害する）かつ免疫刺激シグナルの伝達を増強する、増加する、及び／若しくは刺激することによる癌の治療並びに／又は炎症性疾患の治療において有効である。さらに、追加のキメラタンパク質は、複数の抗体、例えば、ＣＳＦ１又はＩＬ−３４ブロッキング抗体及び４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの１つの受容体／リガンドに対するアゴニスト抗体を含む治療から生じる毒性なしに、癌及び／又は炎症性疾患を治療するのに有効である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月31日(2019.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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