(57)【要約】  本発明は、Ａβペプチド凝集が関与する神経変性疾患の予防および／または処置おいて使用するための、具体的には、アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置のための、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体に関する。抗体は、したがって、記憶喪失および認知機能障害の出現前、または最初期ステージの疾患において、使用することができる。該抗体は、実際、Ａβペプチドによって誘発される神経毒性に対する神経細胞保護作用を有する。
2020515524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置における使用のためのＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体。
【請求項２】
記憶喪失および／または認知機能障害を患っていない対象におけるアルツハイマー病の予防における、請求項１に記載の使用のための抗体。
【請求項３】
老人斑を有さない、神経変性を有さない、および／またはシナプス機能不全を有さない対象における、アルツハイマー病の予防における、請求項１または２に記載の使用のための抗体。
【請求項４】
神経細胞においてＡβによって誘発される細胞毒性を、少なくとも部分的に予防する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項５】
Ａβによって誘発される神経細胞のアポトーシスを少なくとも部分的に予防する、および／またはＡβによって誘発される神経突起ネットワークの減少を少なくとも部分的に予防する、請求項４に記載の使用のための抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項７】
（ｉ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、および２０の配列のＣＤＲ、（ｉｉ）配列番号１０、１２、１４、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲ、または（ｉｉｉ）配列番号１０、１２、３０、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項８】
（ｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、および１９のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号９、１１、１３、３１、１７、および１９のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号９、１１、２９、３１、１７、および１９のヌクレオチド配列、または（ｉｖ）それぞれ１、２、３、４、もしくは５つのヌクレオチドがこれらの（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の配列とは異なるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項９】
（ｉ）その重鎖の可変部分は、配列番号５もしくは配列番号２７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる、および／または（ｉｉ）その軽鎖の可変部分は、配列番号７もしくは配列番号２３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１０】
（ｉ）その重鎖の可変部分は、配列番号６もしくは配列番号２８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、および／または（ｉｉ）その軽鎖の可変部分は、配列番号８もしくは配列番号２４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１もしくは配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号３もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる軽鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２６のポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号４もしくは配列番号２２のポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１３】
（ｉ）配列番号５および７のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号５および２３のヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
その配列は、（ｉ）配列番号６および８のポリペプチド配列、（ｉｉ）配列番号６および２４のポリペプチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１５】
（ｉ）配列番号１および３のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１および２１のヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２５および２１のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１６】
（ｉ）配列番号２および４のポリペプチド配列、（ｉｉ）配列番号２および２２のポリペプチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２６および２２のポリペプチド配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防および／または処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、複雑な多因子性の神経変性障害であり、特に、記憶の喪失および認知機能の障害をもたらす。アルツハイマー病の神経病理学的所見は、老人斑におけるベータアミロイド（Ａβ）ペプチドの細胞外沈着物の蓄積および神経原線維濃縮体におけるタウタンパク質の細胞内凝集を特徴とする。アルツハイマー病（ＡＤ）の進行は、原線維Ａβプラークの密度増加と関連している。
【０００３】
特許文献１の文書には、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的なヒト化抗体、および神経変性障害と関連する疾患、たとえば、アルツハイマー病の処置のためのそれらの使用が開示されている。特許文献１の文書に開示されているＡβペプチドのプロトフィブリル形態は、２００ｋＤａを上回る分子量を有するオリゴマーに相当する。このヒト化抗体は、ペプチドＡβのその他の形態に対するそれらの親和性と比較して、ペプチドＡβのプロトフィブリル形態に対する大幅に改善された親和性を特徴とし、これにより、びまん性沈着物ではなく老人斑に対するこれらの抗体の特異的な結合がもたらされる。
【０００４】
老人斑は、主として、高分子量を有する不溶性の線維状凝集体、いわゆるフィブリル、および２００ｋＤａを上回る分子量を有することが示されているプロトフィブリル形態から構成される。対照的に、びまん性沈着物は、フィブリルおよびＡβペプチドのプロトフィブリル形態をまったく含まないかまたはほとんど含まない。びまん性プラークは、老人斑の前駆体であると考えられている。不溶性フィブリルは、実際、可溶性Ａβペプチドの進行性凝集によって形成されるが、この進行性凝集では、最初は可溶性であるフィブリル形態、すなわち、プロトフィブリル形態が生じた後、不溶性形態に変換される。
【０００５】
Ａβペプチドの可溶性オリゴマーは、二量体、三量体、およびさらに大きなオリゴマーを含め、初期ステージのアルツハイマー病においてシナプス機能不全および認知機能不全を引き起こすことが示唆される。これらの可溶性オリゴマーが、神経細胞機能不全を引き起こす主要なシナプス毒性Ａβ種であり得る。
【０００６】
アルツハイマー病は、無症候期、症候性前認知症期（ＡＤまたは前駆ＡＤに起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ））、および認知症期を含む、一連の進行性病態生理学的変化として、近年、再概念化された。無症候期においては、明白な症状を有さないかまたは極めてわずかに有する対象におけるＡＤ病理の存在を確立するために、バイオマーカーが使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１３０９４６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アルツハイマー病の予防のため、より具体的には、認知機能障害を生じていない、危険性を有する個体においてアルツハイマー病の臨床的な発症を予防するために開始される介入による予防のため、および／または最初期ステージの疾患の処置のための解決策を提供する必要性が、依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体、特に、２００ｋＤａを上回る分子量を有するオリゴマーに特異的な抗体が、ＡβペプチドのいくつかのＳＤＳ安定形態を含む調製物に対して、神経細胞保護作用を有することを発見した。これらの形態には、小さなオリゴマー、大きなオリゴマー、および２００ｋＤａ未満の分子量を有する凝集体が含まれる。
【００１０】
Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的なこれらの抗体は、老人斑に特異的に結合し、びまん性沈着物には結合しないとして、これまでに開示されているが、これらの抗体が、合成Ａβ４２に由来するいくつかの形態を含むＡβ調製物の神経毒性作用を予防し得ることは、予想外であった。
【００１１】
本発明者らは、実際に、ヒト化抗体Ａｂ１（配列番号２の配列の２つの重鎖および配列番号４の配列の２つの軽鎖からなる）が、マウス初代神経細胞培養物において、Ａβ４２ペプチドのいくつかのＳＤＳ安定形態を含む調製物（「ｏＡβ４２」と称される）によって誘発される神経毒性作用を有意に阻害することを示した。このヒト化抗体は、実際に、濃度依存性様式で、ｏＡβ４２によって誘発されるカスパーゼ−３／７酵素活性の増加およびｏＡβ４２によって誘発される神経突起ネットワークの減少を阻害する。
【００１２】
Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体は、したがって、Ａβペプチドの凝集が関与する疾患の予防、具体的には、アルツハイマー病の予防、より具体的には、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象においてアルツハイマー病の臨床的な発症を予防するために、特に有用である。これらの抗体は、実際に、記憶喪失および認知機能の障害の予防を可能にする。より具体的には、これらの抗体は、老人斑によってではなく毒性Ａβオリゴマーによって生じる、記憶喪失および認知機能の障害の予防を可能にする。
【００１３】
本発明は、したがって、アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置における使用のための、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体に関する。
【００１４】
本発明はまた、アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、該対象に、有効量の、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体を投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本発明は、具体的には、（ｉ）記憶喪失および／もしくは認知機能障害を患っていない対象、ならびに／または（ｉｉ）老人斑を有さない、神経変性を有さない、および／もしくはシナプス機能不全を有さない対象におけるアルツハイマー病の予防における使用のための、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体に関する。
【００１６】
本発明による使用のための抗体は、好ましくは、神経細胞におけるＡβによって誘発される細胞毒性を少なくとも部分的に予防し、具体的には、神経細胞におけるＡβによって誘発される細胞毒性を予防または低減する。
【００１７】
本発明による使用のための抗体は、好ましくは、Ａβによって誘発される神経細胞のアポトーシスを少なくとも部分的に予防する、および／またはＡβによって誘発される神経突起ネットワークの減少を少なくとも部分的に予防する。
【００１８】
抗体は、好ましくは、ヒト化抗体である。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、および２０の配列のＣＤＲ、（ｉｉ）配列番号１０、１２、１４、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲ、または（ｉｉｉ）配列番号１０、１２、３０、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲを含む。
【００２０】
抗体は、好ましくは、（ｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、および１９のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号９、１１、１３、３１、１７、および１９のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号９、１１、２９、３１、１７、および１９のヌクレオチド配列、または（ｉｖ）それぞれ、１、２、３、４、もしくは５つのヌクレオチドがこれらの（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の配列とは異なるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲを含む。
【００２１】
１つの好ましい実施形態において、（ｉ）抗体の重鎖の可変部分は、配列番号５もしくは配列番号２７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる、および／または（ｉｉ）抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号７もしくは配列番号２３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる。
【００２２】
１つの好ましい実施形態において、抗体の重鎖の可変部分は、配列番号６もしくは配列番号２８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、および／または抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号８もしくは配列番号２４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【００２３】
抗体は、好ましくは、（ｉ）配列番号１もしくは配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号３もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列によってコードされる軽鎖を含む。
【００２４】
抗体は、好ましくは、（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２６のポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号４もしくは配列番号２２のポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００２５】
抗体は、好ましくは、（ｉ）配列番号５および７のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号５および２３のヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。
【００２６】
抗体は、好ましくは、その配列が、（ｉ）配列番号６および８のポリペプチド配列、（ｉｉ）配列番号６および２４のポリペプチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含むことを特徴とする。
【００２７】
抗体は、好ましくは、（ｉ）配列番号１および３のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１および２１のヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２５および２１のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。
【００２８】
抗体は、好ましくは、（ｉ）配列番号２および４のポリペプチド配列、（ｉｉ）配列番号２および２２のポリペプチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２６および２２のポリペプチド配列を含む。
【００２９】
Ａβペプチドおよびその凝集形態
「Ａβペプチド」または「アミロイドベータペプチド」または「Ａベータペプチド」という表現は、本明細書において、ベータセクレターゼおよびガンマセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の連続的な切断により生じる３６〜４３個のアミノ酸のペプチドを意味する。
【００３０】
Ａβ４２ペプチドは、より疎水性かつ原線維生成性のペプチドであり、脳に沈着される主要な種を構成している。
【００３１】
Ａβペプチドは、単量体として見出すことができるか、または凝集して可溶性オリゴマーもしくは不溶性フィブリルを形成し得る。
【００３２】
可溶性オリゴマーは、たとえば、Ａβペプチドの二量体、三量体、四量体、さらに大きなオリゴマー、またはプロトフィブリル形態である。
【００３３】
「プロトフィブリル形態」という表現は、本明細書において、インビトロで可溶性であり、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、または５００ｋＤａを上回る分子量の実体として単離することができ、チオフラビン−Ｓまたはコンゴーレッドなどの作用物質を固定することができる、Ａβペプチドのオリゴマー形態を意味する。
【００３４】
「老人斑」という表現は、本明細書において、ジストロフィー性神経突起およびグリア細胞の反応物で囲まれたアミロイドコア（チオフラビンＳまたはコンゴーレッドを固定する）から構成されるプラークを意味する。インビボにおいて、老人斑は、主として、不溶性フィブリルおよび２００ｋＤａを上回る分子量を有するプロトフィブリル形態を含む。老人斑は、特に、アルツハイマー病を有する患者において見出される。
【００３５】
「びまん性アミロイド沈着物」または「びまん性沈着物」という表現は、本明細書において、チオフラビンＳまたはコンゴーレッドを固定せず、かつフィブリルおよびプロトフィブリル形態をまったく含まないかまたはほとんど含まない、無定形のＡβ副構造を意味する。びまん性アミロイド沈着物は、はるかに多く存在するが、この疾患には関連していない。
【００３６】
処置しようとする対象
本発明によるアルツハイマー病の予防および／または処置のために処置を必要とする対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトであり得る。
【００３７】
対象が、ヒトである場合、「個体」または「患者」という用語もまた、使用することができる。
【００３８】
該ヒトは、あらゆる年齢、たとえば、乳児、小児、青年、成人、高齢者であり得る。
【００３９】
非ヒト哺乳動物は、好ましくは、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、または霊長類である。
【００４０】
対象は、特に、アルツハイマー病の予防については、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象、または特に、症候性アルツハイマー病の処置については、初期ステージの症候性アルツハイマー病の対象であり得る。
【００４１】
症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象は、記憶喪失を患っておらず、認知機能の障害を患っていない。換言すると、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象は、正常な認知を有するか、または場合によりわずかな認知低下を有する。
【００４２】
記憶喪失は、当業者に周知の任意の方法、たとえば、限定されないが、手がかりなしおよび手がかりありの選択式想起検査、レイ聴覚性言語学習検査、および／またはカリフォルニア言語学習検査によって、評価することができる。
【００４３】
認知機能の障害は、当業者に周知の任意の方法、たとえば、限定されないが、ミニメンタルステート検査、アルツハイマー病評価尺度−認知機能下位尺度、神経心理学的検査バッテリー、および／または神経心理学状態の反復的評価バッテリーによって、評価することができる。
【００４４】
症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象は、前アルツハイマー対象であってもよく、または無症候性アルツハイマー病を有する対象であってもよい。
【００４５】
前アルツハイマー対象は、症候性アルツハイマー病を発症する危険性と関連するいずれのバイオマーカーも有さない。
【００４６】
無症候性アルツハイマー病を有する対象は、症候性アルツハイマー病を発症する危険性と関連する少なくとも１つのバイオマーカーおよび／または少なくとも１つの遺伝因子を有する。
【００４７】
症候性アルツハイマー病を発症する危険性と関連するそのようなバイオマーカーとしては、脳におけるＡβペプチド蓄積のバイオマーカー（たとえば、アミロイドＰＥＴイメージングにおける異常なトレーサー保持および／もしくは脳脊髄液（ＣＳＦ）における低いＡβペプチドレベル）、ならびに／または神経細胞の変性もしくは傷害のバイオマーカー（たとえば、ＣＳＦにおける高いタウタンパク質レベル、および／もしくはＰＥＴイメージングにおける脳フルオロデオキシグルコースの取り込みの減少、および／もしくは構造的磁気共鳴における脳萎縮）が挙げられる。
【００４８】
症候性アルツハイマー病を発症する危険性と関連するそのような遺伝因子としては、
−  常染色体優性アルツハイマー病については、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、および／またはＰＳＥＮ２遺伝子における変異、
−  散発性アルツハイマー病については、脂質代謝に関与する遺伝子（ＡＰＯＥ４、ＣＬＵ、および／もしくはＡＢＣＡ７）、免疫系に関与する遺伝子（ＣＬＵ、ＣＲ１、ＡＢＣＡ７、ＣＤ３３、ＥＰＨＡ１、および／もしくはＭＳ４Ａ遺伝子クラスター）、ならびに／またはシナプス機能に関与する遺伝子（ＰＩＣＡＬＭ、ＣＤ３３、ＣＤ２ＡＰ、ＥＰＨＡ１、および／もしくはＢＩＮ１）の変異
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
記憶喪失および認知機能の障害は、少なくとも部分的に、シナプス機能不全および／または神経変性により生じる。
【００５０】
したがって、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象は、シナプス機能不全および／もしくは神経変性を有さないか、または症状に転換されないレベルのシナプス機能不全および／もしくは神経変性を有する。
【００５１】
「シナプス機能不全」という表現は、本明細書において、シナプスの機能的活性に障害をもたらす、シナプスの数、構造、および／または構成、特に、神経変性状態における、異常な変化を意味する。シナプス機能不全は、シナプス喪失の機序を含む。
【００５２】
シナプス機能不全は、当業者に周知の任意の方法、たとえば、安静時もしくはタスク時の機能的ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）（たとえば、Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｅａｒｌｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｆｒｏｎｔ．  Ａｇｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｖｏｌ．  ８、ａｒｔｉｃｌｅ  １３９を参照されたい）を使用した脳機能の連結性の評価、および／またはＣＳＦにおけるシナプスタンパク質（たとえば、ニューログラニン）のレベルの測定などによって、評価することができる。
【００５３】
インビボにおいて観察されるシナプス機能不全は、たとえば、インビトロにおける神経突起ネットワーク障害に相当する。
【００５４】
「神経突起ネットワーク障害」という表現は、本明細書において、神経突起ネットワークの減少、すなわち、神経突起長のサイズの減少を意味する。
【００５５】
神経突起ネットワークは、当業者に周知の任意の方法、たとえば、免疫細胞化学法に続けて細胞イメージングによって、評価することができる。
【００５６】
「神経変性」という表現は、本明細書において、神経細胞の喪失および／または神経細胞の機能もしくは活性の減少を意味する。
【００５７】
神経変性は、当業者に周知の任意の方法、たとえば、ＣＳＦにおける高いタウタンパク質レベル、および／またはＰＥＴイメージングにおける脳フルオロデオキシグルコース取り込みの減少、および／または構造的磁気共鳴における脳萎縮などによって、評価することができる。
【００５８】
インビボにおいて観察される神経変性は、たとえば、インビトロにおける異常な神経細胞アポトーシスに相当する。
【００５９】
異常な神経細胞アポトーシスは、対照である健常細胞と比較して増加した神経細胞アポトーシスを意味する。
【００６０】
神経細胞アポトーシスは、当業者に周知の任意の方法、たとえば、カスパーゼ３／７の酵素活性の測定によって、評価することができる。
【００６１】
本発明の１つの好ましい実施形態において、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象は、
−  症候性アルツハイマー病、より好ましくは、常染色体優性形態のアルツハイマー病を患っているかもしくはそれを患う危険性がある家族が少なくとも１人いる、正常な認知を有する対象、ならびに／または
−  常染色体優性形態のアルツハイマー病に関与する少なくとも１つの変異を有すると診断されている、正常な認知を有する対象、ならびに／または
−  症候性アルツハイマー病を発症する危険性と関連するバイオマーカーおよび／もしくは遺伝因子に基づいて、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある、正常な認知を有するかもしくはわずかな認知低下を有する対象であって、たとえば、散発性形態のアルツハイマー病を発症する危険性がある対象
である。
【００６２】
症候性アルツハイマー病を発症する危険性と関連する該バイオマーカーおよび／または遺伝因子は、上記に定義される通りである。
【００６３】
「家族」という表現は、好ましくは、前の世代の家族（たとえば、親、祖父母、もしくは曽祖父母）、兄、姉、または場合により子もしくは孫を意味する。家族とは、一般的には、親または兄弟姉妹である。
【００６４】
「常染色体優性形態のアルツハイマー病」という表現は、本明細書において、少なくとも１つの遺伝子変異により生じるアルツハイマー病を意味する。
【００６５】
常染色体優性形態のアルツハイマー病は、当業者に周知である。常染色体優性形態のアルツハイマー病は、たとえば、アミロイドベータ前駆体タンパク質をコードする遺伝子（ＡＰＰ）、プレセニリン１をコードする遺伝子（ＰＳＥＮ１）、およびプレセニリン２をコードする遺伝子（ＰＳＥＮ２）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子に、少なくとも１つの変異を含む。
【００６６】
そのような変異の非限定的な例は、Ｃａｃａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｖｏｌ．１２、７３３〜７４８頁）によって説明されている。
【００６７】
症候性アルツハイマー病を発症した対象、すなわち、症候性アルツハイマー病を患っている対象は、好ましくは、初期ステージの症候性アルツハイマー病にある。
【００６８】
「初期ステージの症候性アルツハイマー病」とは、本明細書において、記憶喪失および／または認知機能の障害が始まるステージを意味する。
【００６９】
初期ステージの症候性アルツハイマー病の例は、症候性前認知症である。
【００７０】
症候性前認知症には、たとえば、アルツハイマー病または前駆アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）が含まれる。アルツハイマー病および前駆アルツハイマー病に起因するＭＣＩの特徴は、それぞれ、Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ、７、２７０〜２７９頁およびＤｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ、１２、２９２〜３２３頁に見出すことができる。
【００７１】
症候性アルツハイマー病の後期ステージは、アルツハイマー病に起因する認知症、好ましくは、アルツハイマー病に起因する軽度認知症である。アルツハイマー病に起因する認知症の特徴は、ＭｃＫｈａｎｎ、２０１１、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ、７、２６３２６９に見出すことができる。
【００７２】
本発明の１つの好ましい実施形態において、対象は、症候性アルツハイマー病を患っていない。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、対象は、老人斑を有さない。
【００７４】
老人斑の非存在は、たとえば、脳のアミロイドＰＥＴ（ポジトロン放出断層）イメージングによって評価することができる。
【００７５】
アルツハイマー病の予防または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置
「アルツハイマー病の予防」という表現は、本明細書において、処置しようとする対象において、好ましくは、症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象において、特に、神経細胞におけるＡβによって誘発される細胞毒性を少なくとも部分的に予防することによって（具体的には、神経細胞におけるＡβによって誘発される細胞毒性を予防、遅延、および／または低減することによって）、記憶喪失および／または認知機能の障害を、少なくとも部分的に予防すること（具体的には、予防、低減、および／または遅延すること）を意味する。
【００７６】
アルツハイマー病の予防の望ましい効果としては、
−  少なくとも部分的に、神経変性を予防すること、具体的には、神経変性を予防、遅延、および／もしくは低減すること、ならびに／または
−  少なくとも部分的に、シナプス機能不全を予防すること、たとえば、シナプス機能不全を予防、遅延、および／もしくは低減すること、特に、少なくとも部分的に、シナプスの喪失を予防すること（具体的には、シナプスの喪失を予防、遅延、および／もしくは低減すること）
が挙げられる。
【００７７】
「初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置」という表現は、本明細書において、処置しようとする対象において、好ましくは、初期ステージの症候性アルツハイマー病を患っている対象、たとえば、症候性前認知症を患っている対象において、神経細胞におけるＡβによって誘発される細胞毒性を少なくとも部分的に予防することによって（具体的には、神経細胞におけるＡβによって誘発される細胞毒性を停止、遅延、および／または低減することによって）、記憶喪失および／または認知機能の障害を、少なくとも部分的に処置することを意味する。
【００７８】
初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置の望ましい効果としては、
−  神経変性を停止もしくは遅延させること、および／または
−  シナプス機能不全の発症を停止もしくは遅延させること、具体的には、シナプスの喪失を停止もしくは遅延させること
が挙げられる。
【００７９】
「記憶喪失」、「認知機能の障害」、および「処置しようとする対象」という表現は、上記に定義される通りである。
【００８０】
神経変性、シナプス機能不全、およびシナプス喪失は、上記に定義される通りであり、上述のように評価することができる。
【００８１】
本発明により予防および／または処置しようとする記憶喪失および認知機能の障害は、老人斑によってではなく、毒性Ａβオリゴマーによって生じるものである。
【００８２】
抗体
天然に存在する抗体は、典型的に、四量体を含む。それぞれのそのような四量体は、典型的に、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、それぞれの対が、１つの全長「軽」鎖（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重」鎖（典型的に、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。「重鎖」および「軽鎖」という用語は、本明細書において使用されるとき、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。それぞれの軽鎖および重鎖のアミノ末端部分には、典型的に、約１００〜１１０個またはそれよりも多いアミノ酸の可変ドメインが含まれ、これが、典型的に、抗原認識を担っている。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分には、典型的に、エフェクター機能を担う定常ドメインが定められる。したがって、天然に存在する抗体において、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含み、ここで、ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ここで、ＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインは、カルボキシル末端にある。
【００８３】
ヒト軽鎖は、典型的に、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的に、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定めている。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびｌｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ｌｇＭは、ｌｇＭ１およびＩｇＭ２を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＡは、同様に、ｌｇＡ１およびｌｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに、さらに分割される。全長軽鎖および重鎖内で、可変ドメインおよび定常ドメインは、典型的に、１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合されており、重鎖には、約１０個多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。たとえば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ，  Ｗ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）を参照されたい。それぞれの軽鎖／重鎖の対の可変領域が、典型的に、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的に、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域が結合した比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般構造を呈する。それぞれの対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的に、フレームワーク領域によってアラインされており、これにより、特定のエピトープに結合することが可能となり得る。アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、軽鎖および重鎖のいずれの可変ドメインも、典型的に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のドメインを含む。
【００８４】
「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる、単一の可変領域に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの厳密な境界部は、様々なシステムによって様々に定義されている。Ｋａｂａｔによって説明されているシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＳＥＱＵＥＮＣＥｓ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））は、抗体のいずれの可変領域にも適用可能な明確な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定める厳密な残基境界部も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲと称することができる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび同僚（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．  Ｍ０１．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１〜１７頁、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８３頁）は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内のある特定の部分が、アミノ酸配列レベルでは高い多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構成を採用していることを発見した。これらの部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と表記されており、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖の領域を表す。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと称することができ、ＫａｂａｔのＣＤＲとオーバーラップする境界部を有する。ＫａｂａｔのＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定める他の境界部は、Ｐａｄｌａｎ、１９９５、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１３３〜３９頁、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、１９９６、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２（５）：７３２〜４５頁、およびＬｅｆｒａｎｃ、２００３、Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：５５〜７７頁によって説明されている。さらに他のＣＤＲ境界部の定義は、本明細書に記載のシステムの１つに厳密に従わない場合があるが、それにもかかわらず、ＫａｂａｔのＣＤＲとオーバーラップすることになる。但し、それらは、特定の残基または残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響を及ぼさないという予測または実験による発見を踏まえて、短くなっていることも、または長くなっていることもある。本明細書において使用される方法は、これらのシステムのうちのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用し得るが、ある特定の実施形態では、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義されるＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を使用した、予測されるＣＤＲの特定は、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．２．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ．、Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、３３〜５１頁（２０１０）におけるものなど、当該技術分野において周知である。重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、他の従来的な方法によって、たとえば、他の重鎖および軽鎖可変領域の公知のアミノ酸配列と比較して、配列��可変性の領域を判定することによって、調査して、ＣＤＲの配列を特定することもできる。番号付けした配列は、目視によって、またはアライメントプログラム、たとえば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３〜８０頁に記載されているＣＬＵＳＴＡＬスイートのプログラムのうちの１つを利用することによって、アラインすることができる。従来的には、分子モデルを使用して、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域を正確に示し、それによって配列に基づく割当てを補正する。
【００８５】
「抗体」という用語は、本明細書において使用されるとき、上記に定義される抗体および抗体のあらゆる機能性フラグメントを包含する。好ましくは、抗体の機能性フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、Ｆａｂ（抗原結合性フラグメント）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ダイアボディ、多重特異性抗体（特に、二重特異性）、１つまたはそれ以上のＣＤＲを含む合成ポリペプチドのタイプのフラグメントであり、これは、一般的に、それらが由来する抗体と同じ結合の特異性を有する。抗体の機能性フラグメントは、酵素、たとえば、ペプシンもしくはパパインによる消化、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断などの方法によって、得ることができる。ナノボディもまた、抗体の定義に含まれる。
【００８６】
「Ｆｃ」という用語は、本明細書において使用されるとき、単量体形態であるか多量体形態であるかにかかわらず、抗体の消化によって生じるかまたは他の手段によって産生される、非抗原結合性フラグメントの配列を含む分子を指し、これは、ヒンジ領域を含み得る。天然のＦｃの起源となる免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、免疫グロブリンのうちのいずれであってもよいが、ｌｇＧ１およびｌｇＧ２が、好ましい。Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合による会合によって、連結されて、二量体または多量体の形態になり得る単量体ポリペプチドで構成される。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合した二量体である。「Ｆｃ」という用語は、本明細書において使用されるとき、単量体、二量体、および多量体の形態を包括するものである。
【００８７】
Ｆ（ａｂ）フラグメントは、典型的に、１つの軽鎖、ならびに１つの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、ここで、Ｆ（ａｂ）フラグメントのＶＨ−ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書において使用されるとき、Ｆ（ａｂ）フラグメントはまた、アミノ酸リンカーによって分離した２つの可変ドメインを含む１つの軽鎖、ならびにアミノ酸リンカーによって分離した２つの可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む１つの重鎖を含み得る。
【００８８】
Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、典型的に、１つの軽鎖、および定常領域をより多くを含有する１つの重鎖の一部分（ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間）を含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が、２つの重鎖の間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子が生じる可能性がある。
【００８９】
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の部位を意味する。抗原が、ポリマー、たとえば、タンパク質または多糖類である場合、エピトープは、連続的な残基によって形成されてもよく、または非連続的な残基によって形成されてもよい。本明細書において、エピトープは、構成的である、すなわち、プロトフィブリルＡ−βペプチドの３次元構造に関連している。
【００９０】
「ＶＨ」という用語は、本明細書において使用されるとき、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ）’のフラグメントの重鎖を含め、抗体の重鎖の可変領域を指す。
【００９１】
「ＶＬ」という用語は、本明細書において使用されるとき、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ）’のフラグメントの軽鎖を含め、抗体の軽鎖の可変領域を指す。
【００９２】
「ヒト化抗体」とは、主としてヒト免疫グロブリン配列を含有する、抗体を意味する。この用語は、一般的に、ヒト配列において見出されるヒト配列または残基を組み込むことによって修飾されている、非ヒト免疫グロブリンを指す。
【００９３】
一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のうちのすべてまたは一部が、非ヒト親配列に由来する部分に相当し、ＦＲ領域のうちのすべてまたは一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来する、１つまたは典型的には２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、そのため、免疫グロブリンの定常領域のうちの少なくとも一部分（Ｆｃ）、特に、選択された参照ヒト免疫グロブリンのものを含み得る。
【００９４】
ヒト化抗体は、好ましくは、ヒトにおいて可能な限り免疫原性が低い。その目的のために、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に対する抗体の結合特異性を実質的に低減させることなく、１つまたはそれ以上のＣＤＲの１つまたは２つのアミノ酸を、ヒト宿主に対して免疫原性が低いアミノ酸によって修飾することが、可能である。さらに、フレームワーク領域の残基は、抗体の免疫原性能に寄与しないため、ヒトである必要がなく、それらを修飾しないことが可能である。
【００９５】
非ヒト親抗体を修飾して、ヒトにおいて免疫原性が低い抗体にするための、いくつかのヒト化方法が、当業者に公知である。ヒト抗体との配列の完全な同一性は、必須ではない。実際に、完全な配列同一性は、かならずしも、免疫原性の低減を予測する指標ではなく、限られた数の残基を修飾することにより、ヒトにおいて非常に減弱化された免疫原性能を示すヒト化抗体をもたらすことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２００７）  ４４、１９８６〜１９９８頁）。
【００９６】
一部の方法としては、たとえば、ＣＤＲの包含（グラフト）（欧州特許第０  ２３９  ４００号、国際公開第９１／０９９６７号、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０  ５９２  １０６号、欧州特許第０  ５１９  ５９６号、Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍ  ２８（４／５）：４８９〜４９８頁、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４頁、およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３頁）、または鎖の混合（米国特許第５，５６５，３３２号）がある。
【００９７】
ヒト化抗体は、国際出願第２００９／０３２６６１号において説明されている技術に従って修飾された可変部分を有してもよい。
【００９８】
この技法は、注目すべきことに、抗体の３次元モデルに基づく動的分子シミュレーションを使用し、このモデルは、相同性によって構築されている。
【００９９】
免疫系の受容体に対するその親和性を低減するＦｃドメインの変異を保持する免疫グロブリン、またはナノボディなど、抗体は、エフェクター機能が減少していてもよい。
【０１００】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃドメインの、受容体または免疫応答を誘発するタンパク質への任意の結合を意味する。これらのエフェクター機能を減少させることにより、微小出血の誘発などの有害な作用を低減することが可能となる（Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００５、２５：６２９頁）。
【０１０１】
親和性は、当業者に公知の任意の技法によって測定することができる。有益なことに、これは、Ｒａｔｋｏｖｓｋ  Ｄ  Ａ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄｙ  Ｔ  Ｊ（Ｂｉｏ−ｍｅｔｒｉｃｓ、１９８６、４２、５７５〜８２頁）によって説明されているアルゴリズムに基づいて開発されたＢｉｏｓｔａｔ  Ｓｐｅｅｄ技法によって測定することができる。
【０１０２】
抗体の重鎖および／または軽鎖の発現させるために、これらの鎖をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶに由来するエピソーム、または当業者がこれらの鎖の発現に好適であると判断し得る任意のベクターであり得る。
【０１０３】
ベクターは、細胞、有益には１つの細胞株に由来するものを形質転換させるために使用することができる。この細胞株は、さらにより有益には、哺乳動物に由来する。これは、有益には、ＣＨＯ株もしくはこの株に由来する株、またはＨＥＫ２９３株もしくはこの株に由来する株である。
【０１０４】
細胞の形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための当業者に周知の任意の方法によって実行することができる。この方法は、デキストランを用いた形質転換、リン酸カルシウムによる沈殿、ポリブレンを用いたトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、遺伝子銃注入、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションであり得る。
【０１０５】
配列同一性
「参照配列に少なくともｘ％同一なアミノ酸または核酸配列」とは、対象となるペプチドまたは核酸の配列が、参照配列に同一であるか、または参照配列のアミノ酸もしくはヌクレオチド１００個につき、最大で１００−ｘ個のアミノ酸もしくはヌクレオチドの改変が参照配列と異なることを、意図する。換言すると、参照配列に少なくともｘ％同一である配列を有するポリペプチドまたは核酸を得るためには、対象となる配列において、最大で１００−ｘ％のアミノ酸またはヌクレオチドが、挿入されている、欠失している、または別のアミノ酸またはヌクレオチドと置換されている可能性がある。
【０１０６】
参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するポリペプチドは、参照配列と比較して、変異、たとえば、欠失、挿入、および／または置換を含み得る。置換の事例において、置換は、好ましくは、以下の表１に示される保存的置換、および／または免疫原性の低いアミノ酸、より具体的には、ヒト宿主のための置換に相当する。
【０１０７】
参照配列に「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一な」核酸配列は、参照配列と比較して、変異、たとえば、欠失、挿入、および／または置換を含み得る。置換の事例において、置換は、好ましくは、サイレント置換、またはたとえば、下記の表１に示されるように、翻訳されるアミノ酸配列における保存的置換もしくは参照配列と比較して免疫原性の低いアミノ酸をもたらす置換に相当する。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
好ましい実施形態において、参照配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一な核酸配列は、サイレント置換ならびに／または保存的アミノ酸置換および／もしくは免疫原性の低いアミノ酸をもたらす置換が、参照配列と異なるだけである。
【０１１０】
２つまたは３つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１において利用可能なプログラム、たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰのプログラムを使用して、２つの配列間の同一性％を判定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「局所的相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間における類似性の最も高い単一の領域を見出す。また、配列間の同一性を判定するための他のプログラム、たとえば、Ｎｅｅｄｌｅプログラムが、当該技術分野において公知であり、このプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３〜４５３に記載されているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムに基づき、たとえば、ポリペプチド配列比較マトリックスについては以下のパラメーター：比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始ペナルティ：１０およびギャップ伸長ペナルティ：０．５、ならびにギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップ開始ペナルティ＝１０、エンドギャップ伸長ペナルティ＝０．５を用い、ポリヌクレオチド配列比較マトリックスについては以下のパラメーター：比較マトリックス：ＤＮＡＦＵＬＬ、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップ開始ペナルティ＝１０、エンドギャップ伸長ペナルティ＝０．５を用いる。
【０１１１】
Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体
本発明による使用のための抗体は、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的である。
【０１１２】
抗体は、したがって、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態、すなわち、上記に定義されるように、高分子量ペプチドに、特異的に結合する。抗体は、具体的には、２００、３００、４００、または５００ｋＤａを上回る分子量を有するＡβペプチドに結合する。
【０１１３】
抗体は、好ましくは、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的に結合するが、アミロイド構造の他のタンパク質（たとえば、ＩＡＰＰ、膵島アミロイドポリペプチド）には特異的に結合しない。
【０１１４】
「特異的に結合する」とは、本明細書において、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態への結合の強度と、このペプチドの他の形態への結合の強度との間に、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、または１００倍の差があること意味する。
【０１１５】
抗体は、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に対して、このペプチドの他の形態に対する親和性よりも、好ましくは少なくとも１００倍高い、より好ましくは少なくとも１５０倍高い、さらにより好ましくは少なくとも１７０倍高い、親和性を有する。親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０であり得る。
【０１１６】
抗体は、したがって、凝集してプロトフィブリルになったＡβペプチドに結合する能力を特徴とする。
【０１１７】
本発明による使用のための抗体はまた、特に、インビトロで、Ａβによって誘発される神経細胞のアポトーシスを少なくとも部分的に予防する、および／またはＡβによって誘発される神経突起ネットワークの減少を少なくとも部分的に予防する。
【０１１８】
「抗体は、Ａβによって誘発される神経細胞のアポトーシスを少なくとも部分的に予防する」という表現は、具体的には、この抗体が、特に、この抗体の非存在下におけるＡβによって誘発される神経細胞のアポトーシスと比較して、インビトロにおいて、Ａβによって誘発されるアポトーシスを予防または低減することを意味する。
【０１１９】
「抗体は、Ａβによって誘発される神経突起ネットワークの減少を少なくとも部分的に予防する」という表現は、具体的には、この抗体が、特に、この抗体の非存在下におけるＡβによって誘発される神経突起ネットワークの減少と比較して、インビトロにおいて、Ａβによって誘発される神経突起ネットワークの減少を予防または低減することを意味する。
【０１２０】
神経細胞のアポトーシスおよび神経突起ネットワークは、上記または実施例に記載されるように評価することができる。
【０１２１】
抗体は、好ましくは、ヒト化抗体である。
【０１２２】
ヒト化抗体は、好ましくは、エフェクター機能が低減されており、これにより、微小出血および／または血管原性浮腫の発生など、有害な作用を制限することが可能となる。
【０１２３】
本発明による使用のための好ましい抗体は、もはやエフェクター機能を有さない。
【０１２４】
有益なことに、抗体は、Ｆｃドメインが、半分子の産生を低減する変異を受けている、免疫グロブリンＧ４であってもよい。
【０１２５】
有益なことに、抗体は、Ｆｃドメインが、エフェクター機能を低減させる変異を受けている、免疫グロブリンＧ４であってもよい。
【０１２６】
抗体は、広範囲にシアル酸付加されている場合がある。一実施形態において、抗体は、広範囲にシアル酸付加されていない。
【０１２７】
「広範囲にシアル酸付加されている」という表現は、本明細書において、抗体のＦｃドメインが保持するＮ−グリカンのうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおも最も好ましくは少なくとも９７％、または最も好ましくは少なくとも９９％が、オリゴ糖鎖により２つのシアル酸残基を含むことを意味する。
【０１２８】
広範囲にシアル酸付加されている抗体は、たとえば、抗体を、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を示す細胞株において、Ｆｃドメイン、たとえば、Ｄ２６５位、Ｆ２４３位、および／またはＶ２６４位（配列番号１または配列番号２５の配列におけるＤ２６０位、Ｆ２３８位、および／またはＶ２５９に相当する）に変異を有する重鎖をコードする核酸配列から発現させることによって、得られる。
【０１２９】
Ｆｃドメインにおける変異は、たとえば、アラニン、グリシン、ロイシン、およびリシンからなる群から選択されるアミノ酸による、アミノ酸の置換である。
【０１３０】
変異は、たとえば、配列番号１または配列番号２５の配列を参照して、Ｄ２６０Ｌ、Ｄ２６０Ｋ、Ｄ２６０Ａ、Ｆ２３８Ａ、またはＶ２５９Ａである。
【０１３１】
抗体は、好ましくは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、および１９の配列のうちの１つと同一な配列を有するヌクレオチド配列、またはそれぞれ１、２、３、４、もしくは５つのヌクレオチドがこれらの配列と異なる配列によってコードされる、少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【０１３２】
抗体は、好ましくは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、および２０の配列のうちの１つと同一な配列を有する、少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【０１３３】
抗体は、好ましくは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、および３２の配列のうちの１つと、１〜２つのアミノ酸が異なる配列の、少なくとも１つのＣＤＲを含むが、抗体が、その結合特異性を維持することを条件とする。
【０１３４】
好ましい抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、および２０の配列のＣＤＲ、配列番号１０、１２、１４、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲ、または配列番号１０、１２、３０、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲを含む。
【０１３５】
抗体は、たとえば、（ｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、および１９のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号９、１１、１３、３１、１７、および１９のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号９、１１、２９、３１、１７、および１９のヌクレオチド配列、または（ｉｖ）それぞれ、０、１、２、３、４、もしくは５つのヌクレオチドがこれらの（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の配列とは異なる配列によってコードされるＣＤＲを含む。
【０１３６】
１つの好ましい実施形態において、抗体は、
−  配列番号１０、１２、１４、１６、１８、および２０の配列のＣＤＲ、配列番号１０、１２、１４、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲ、または配列番号１０、１２、３０、３２、１８、および２０の配列のＣＤＲを含み、
−  Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に対して、このペプチドの他の形態に対する親和性よりも少なくとも１００倍高い親和性を有し、親和性は、好ましくは、ＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０である、
ヒト化抗体である。
【０１３７】
１つの有益な実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号５の配列もしくは配列番号２７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列によってコードされる重鎖の可変部分（ＶＨ）、および／または（ｉｉ）配列番号７の配列もしくは配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列によってコードされる軽鎖の可変部分（ＶＬ）を含むかまたはそれらからなる。
【０１３８】
１つの有益な実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号６の配列もしくは配列番号２８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖の可変部分（ＶＨ）、および／または（ｉｉ）配列番号８の配列もしくは配列番号２４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖の可変部分（ＶＬ）を含むかまたはそれらからなる。
【０１３９】
１つのさらにより有益な実施形態において、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号５もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列によってコードされる可変部分（ＶＨ）を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号７もしくは配列番号２３のヌクレオチド配列によってコードされる可変部分（ＶＬ）を含む軽鎖を含むかまたはそれらからなる。
【０１４０】
１つのさらにより有益な実施形態において、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号６もしくは配列番号２８のポリペプチド配列の可変部分（ＶＨ）を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号８もしくは配列番号２４のポリペプチド配列の可変部分（ＶＬ）を含む軽鎖を含むかまたはそれからなる。
【０１４１】
１つの有益な実施形態において、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号５および７のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号５および２３のヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２７および２３のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含むかまたはそれらからなる。
【０１４２】
１つの有益な実施形態において、ヒト化抗体は、（ｉ）配列番号６および８のポリペプチド配列、（ｉｉ）配列番号６および２４のポリペプチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号２８および２４のポリペプチド配列を含むかまたはそれらからなる。
【０１４３】
抗体は、（ｉ）配列番号１もしくは配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列によってコードされる重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号３もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列によってコードされる軽鎖を含み得るかまたはそれらからなり得る。
【０１４４】
抗体は、（ｉ）配列番号２のポリペプチド配列もしくは配列番号２６のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号４もしくは配列番号２２のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含み得るかまたはそれらからなり得る。
【０１４５】
ヒト化抗体は、たとえば、配列番号１および３のヌクレオチド配列、配列番号１および２１のヌクレオチド配列、または配列番号２５および２１のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むかまたはそれらからなる。
【０１４６】
ヒト化抗体は、たとえば、配列番号２および４のポリペプチド配列、配列番号２および２２のポリペプチド配列、または配列番号２６および２２のポリペプチド配列を含むかまたはそれからなる。
【０１４７】
ヒト化抗体、たとえば、抗体Ａｂ１（ＶＨ１＋ＶＬ１）、Ａｂ２（ＶＨ１＋ＶＬ２）、またはＡｂ３（ＶＨ２＋ＶＬ２）は、哺乳動物株、たとえば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆと表記されるＨＥＫ２９３株における一過的発現によって産生することができる。
【０１４８】
軽鎖および重鎖のヒト化可変ドメイン（たとえば、ＶＬ１またはＶＬ２、およびＶＨ１またはＶＨ２）をコードするｃＤＮＡは、ヒト定常領域、たとえば、それぞれ、ＣカッパおよびＩｇＧ４をコードするｃＤＮＡと融合される。定常領域ＩｇＧ４の配列は、半分子の産生（たとえば、Ａｎｇｌａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：１０５〜１０８頁を参照されたい）およびエフェクター機能（たとえば、国際公開第９７／０９３５１号を参照されたい）を大幅に低減させるために、Ｋａｂａｔの命名法におけるＳ２４１ＰおよびＬ２４８Ｅの置換を有するバリアントの配列であってもよい。
【０１４９】
重鎖（たとえば、ＶＨ１＋ＣＨ１またはＶＨ２＋ＣＨ２）および軽鎖（たとえば、ＶＬ１＋ＣＬ１またはＶＬ２＋ＣＬ２）をコードする核酸配列は、それぞれ、２つの発現ベクターにおいて独立してクローニングしてもよい。ヒト化抗体は、次いで、これらの２つの発現ベクターでのコトランスフェクションの後に、哺乳動物細胞における一過的発現によって産生される。抗体は、次いで、好ましくは、たとえば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において、親和性クロマトグラフィーによって精製され、好ましくは、緩衝液、たとえば、ＰＢＳ緩衝液中で製剤化され、場合によっては、滅菌濾過（０．２μｍ）に供される。
【０１５０】
医薬組成物
本発明による使用のためのＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体は、好ましくは、医薬組成物で提供される。
【０１５１】
「医薬組成物」という用語は、本明細書において使用されるとき、対象に適切に投与された場合に、所望される治療効果を誘発することができる組成物を指す。
【０１５２】
医薬組成物は、上記に定義されるＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。
【０１５３】
「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という表現は、本明細書において使用されるとき、抗体の送達の達成または強化に好適な１つまたはそれ以上の製剤化材料を指す。
【０１５４】
医薬組成物は、好ましくは、注射用製剤のための少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルを含む。そのようなビヒクルは、当業者に周知であり、滅菌の等張塩類溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸ニナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウム、および／またはこれらの塩の混合物）、または滅菌水もしくは生理学的血清を適宜添加することによって注射用溶液を構成することができる、乾燥組成物、とりわけ、凍結乾燥させたものが挙げられる。
【０１５５】
例として、医薬組成物は、（１）場合により１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有する、ダルベッコリン酸緩衝液（ｐＨ約７．４）、（２）０．９％重量／体積の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および（３）５％（重量／体積）のデキストロースを含む。医薬組成物はまた、トリプタミンなどの酸化防止剤、およびＴｗｅｅｎ  ２０などの安定剤を含んでもよい。
【０１５６】
医薬組成物は、好ましくは、有効量の、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。
【０１５７】
「有効量」および「治療有効量」という用語は、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体を含む医薬組成物を参照して使用される場合、所望される治療上の結果をもたらすのに十分な量または投薬量を指す。より具体的には、治療有効量は、処置されている状態と関連する臨床的に定義される病理過程のうちの１つまたはそれ以上を、ある一定の期間、少なくとも部分的に、予防するのに十分な抗体の量である。有効量は、使用されている具体的な抗体に応じて、また処置を受けている対象に関連する様々な要因および状態、ならびに疾患の重症度に応じて、変動し得る。たとえば、抗体を、インビボで投与しようとする場合、それらの要因のなかでもとりわけ、患者の年齢、体重、および健康状態、ならびに前臨床動物研究において得られた用量応答曲線および毒性データといった要因が考慮されるであろう。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の判定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５８】
医薬組成物は、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、脳内、および／または眼内の経路による投与に適切であり得る。
【０１５９】
アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置における使用のためのＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体
本発明は、特に、アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置における、特に、それを必要とする対象における使用のための、上記に定義されるＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体に関する。
【０１６０】
本発明はまた、アルツハイマー病の予防および／または初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、該対象に、有効量の、上記に定義されるＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体を投与することを含む方法に関する。
【０１６１】
「アルツハイマー病の予防」、「初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置」、および「Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体」という表現は、具体的に、上記に定義されている。
【０１６２】
該抗体は、上記に定義されるように、医薬組成物の形態で提供することができる。
【０１６３】
それを必要とする対象は、「処置しようとする対象」の節において、上記に定義されている。
【０１６４】
アルツハイマー病の予防を必要とする対象は、好ましくは、無症候性アルツハイマー病を発症する危険性がある対象、たとえば、前アルツハイマー対象または無症候性アルツハイマー病を有する対象である。
【０１６５】
初期ステージの症候性アルツハイマー病の処置を必要とする対象は、好ましくは、症候性前認知症を有する。
【０１６６】
抗体は、好ましくは、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、脳内、および／または眼内の経路によって、使用または投与される。
【０１６７】
抗体の用量は、所望される作用、処置の期間、および使用される投与経路に依存する。一般的には、医師が、疾患のステージ、対象の年齢および体重、または考慮しなければならない任意の他の対象関連の要因に関連して、適切な投薬量を決定するであろう。
【０１６８】
抗体は、特に、成人に関して、好ましくは、１回の投与当たり５ｍｇ〜４５００ｍｇの抗体、より好ましくは、１回の投与当たり１００ｍｇ〜１２００ｍｇの抗体、さらにより好ましくは、１回の投与当たり１００ｍｇ〜４５０ｍｇの抗体を含む量で使用または投与される。
【０１６９】
本発明を、以下の実施例および図面を考慮して、さらに例示する。
【０１７０】
雑誌論文および要約、公開済みもしくは公開前の特許出願、発行された特許、または任意の他の参考文献を含め、本明細書に引用されるすべての参考文献は、引用される参考文献に提示されているすべてのデータ、表、図面、および文言を含め、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】マウス初代神経細胞培養物における、ｏＡβ４２によって誘発されるカスパーゼ−３／７酵素活性の増加の、ヒト化抗体Ａｂ１（ｈ）およびそのマウス対応物（ｍ）による阻害を示す図である。縦座標：カスパーゼ３／７酵素活性（対照に対する％）。横座標：μｇ／ｍｌ単位での濃度。点は、対照群に対する割合として表されるデータの実験ごとおよび処置ごとの平均を表す。バーは、中央値に対応する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｏＡβ４２と対比、ダネットの両側検定。
【図２】マウス初代神経細胞培養物における、ｏＡβ４２によって誘発される神経突起ネットワークの減少の、ヒト化抗体Ａｂ１（ｈ）およびそのマウス抗体対応物（ｍ）による阻害を示す図である。縦座標：神経突起ネットワーク（対照に対する％）。横座標：μｇ／ｍｌ単位での濃度。点は、対照群に対する割合として表されるデータの実験ごとおよび処置ごとの平均を表す。ｘは、平均値に対応する。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、ｏＡβ４２と対比、ダネットの両側検定。
【図３】ｏＡβ４２で処置したマウス初代神経細胞培養物における、カスパーゼ−３／７酵素活性に対するヒト化抗体Ａｂ１（ｈ）（１５０μｇ／ｍＬ）およびそのマウス対応物（ｍ）（１５０μｇ／ｍＬ）の作用の、それぞれの対応するアイソタイプ対照ｈＩｇＧ４（１５０μｇ／ｍＬ）およびｍＩｇＧ１（１５０μｇ／ｍＬ）との比較を示す図である。＊＊ｐ＜０．００１、ＩｇＧ４と対比。＊＊＊ｐ＜０．００１、ＩｇＧ１と対比。ｐ：７つの群をＩｇＧ対応群と、すなわち、それぞれの濃度のＡｂ１およびそのマウス対応物を、それぞれ、同じ濃度のｈＩｇＧ４およびｍＩｇＧ１と、ｏＡβ４２の非存在下または存在下において比較するために、ランク変換を行ったデータに対する一方向分析後の、多重性に関するボンフェローニ−ホルム調整を用いた対比分析のｐ値に対応する。ｏＡβ４２の存在下における試験した最も高い濃度の結果のみを、表す（１５０μｇ／ｍＬのＡｂ１＋ｏＡβ４２とＩｇＧ４との対比、および１５０μｇ／ｍＬのそのマウス抗体＋ｏＡβ４２とＩｇＧ１との対比）。点は、対照群に対する割合として表されるデータの実験ごとおよび処置ごとの平均を表す。バーは、中央値に対応する。
【図４】ｏＡβ４２で処置したマウス初代神経細胞培養物における、神経突起ネットワークに対する、ヒト化抗体Ａｂ１（ｈ）（１５０μｇ／ｍＬ）およびそのマウス対応物（ｍ）（１５０μｇ／ｍＬ）の作用の、それぞれ、その対応するアイソタイプ対照ｈＩｇＧ４（１５０μｇ／ｍＬ）およびｍＩｇＧ１（１５０μｇ／ｍＬ）との比較を示す図である。＊＊ｐ＜０．００１、ＩｇＧ４と対比。＊＊＊ｐ＜０．００１、ＩｇＧ１と対比。ｐ：７つの群をＩｇＧと、すなわち、それぞれの濃度のＡｂ１およびそのマウス対応物を、それぞれ、同じ濃度のｈＩｇＧ４およびｍＩｇＧ１と、ｏＡβ４２の非存在下または存在下において比較するために、ランク変換を行ったデータに対する一方向分析後の、多重性に関するボンフェローニ−ホルム調整を用いた対比分析のｐ値に対応する。ｏＡβ４２の存在下における試験した最も高い濃度の結果のみを、表す（１５０μｇ／ｍＬのＡｂ１＋ｏＡβ４２と、１５０μｇ／ｍＬのＩｇＧ４との対比、および１５０μｇ／ｍＬのマウス抗体＋ｏＡβ４２と、１５０μｇ／ｍＬのＩｇＧ１との対比）。点は、対照群に対する割合として表されるデータの実験ごとおよび処置ごとの平均を表す。ｘは、平均値に対応する。
【図５】抗Ａβ  ４Ｇ８  ｍＡｂを使用した、凝集型Ａβ−４２（ｏＡｂ４２、５μＭ）調製物のウエスタンブロットを示す図である。分子量：分子量マーカー。
【発明を実施するための形態】
【０１７２】
配列の簡単な説明
以下の表２は、Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的なヒト化抗体Ａｂ１、Ａｂ２、およびＡｂ３の配列を要約する。
【０１７３】
「ＶＨ」、「ＶＬ」、「ＣＨ」、または「ＣＬ」の後の数字（１または２）は、本明細書において、配列バリアントを指し、たとえば、３つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の従来的な表記を指すものではない。
【０１７４】
【表２】
2020515524.tif 000004
【実施例１】
【０１７５】
インビトロにおけるＡβペプチドのプロトフィブリル形態に特異的な抗体の神経細胞保護作用
材料および方法
（ｉ）動物
１６日齢のマウス胎仔に由来する大脳皮質（ＯＦ１、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、初代神経細胞培養物の調製に使用した。
【０１７６】
（ｉｉ）化合物
試験化合物：ヒト化抗体Ａｂ１（５０ｍｇ／ｍＬ）およびそのマウス対応物（３０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓａｎｏｆｉ  Ｒ＆Ｄ、Ｖｉｔｒｙ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅによって合成した。
【０１７７】
対照アイソタイプ：マウスＩｇＧ１（抗ＤＭ４＿ｈｙｂ＿ＣＡＡ１６２＿ＩｇＧ１）（７．２８ｍｇ／ｍＬ）およびヒトＩｇＧ４（抗ＤＭ４＿ｈｙｂ＿ＣＡＡ１６２＿ＩｇＧ４）（４．９７ｍｇ／ｍＬ）を、Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓａｎｏｆｉ  Ｒ＆Ｄ、Ｖｉｔｒｙ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅによって合成した。
【０１７８】
実験の日に、すべての抗体および対照アイソタイプの濃縮作業溶液は、それぞれのストック溶液を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、１．５ｍｇ／ｍＬに希釈することによって、１０倍溶液として調製した。さらに低い試験濃度は、濃縮作業溶液を、ＤＭＥＭ中に希釈することによって調製した。培養ウェル内の試験抗体の最終濃度は、１５０、５０、または１５μｇ／ｍＬであった、すなわち、それぞれ、１、０．３３、または０．１μＭに相当した。
【０１７９】
ベータアミロイド（１−４２）：ヒト（Ａβ４２）、参照６４１−１５（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を、ヘキサフルオロイソプロパノール、Ｓｉｇｍａ  Ｈ８５０８（ＨＦＩＰ）中１ｍＭで、ストック溶液として調製した。結果として得られた溶液を、微量遠心チューブ（ＶＷＲ  ２０１７０−２９３）にアリコートをとり、次いで、ＨＦＩＰを、Ｓｏｒｂｏｎｎｅのフードで蒸発させ、結果として得られた透明なペプチドフィルムを、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて真空下で乾燥させ、真空下において−２０℃で乾燥保管した。
【０１８０】
実験の日に、濃縮作業溶液を、凍結ＨＦＩＰ処置アリコートから調製し、ピペット混合によってジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０、バッチＲＮＢＢ９７０２）中に５ｍＭで再懸濁させ、次いで、超音波浴において１０分間インキュベートした（Ｂｒａｎｓｏｎ）。Ａβ４２オリゴマー（ｏＡβ４２）を、５ｍＭのＡβ４２作業溶液を氷冷細胞培養培地（フェノールレッド不含Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０４−１４５５９）中１００μＭに希釈し、３０秒間ボルテックスし、室温で１時間インキュベートした。この種類の調製物は、主として高分子量のＡβ４２オリゴマーを含有するＡβ４２凝集物を含むことが報告されている。このＡβ４２調製物を、５μＭの最終濃度で、培養培地に添加した。
【０１８１】
（ｉｉｉ）初代神経細胞培養物
初代神経細胞培養物を、１６日齢のマウス（ＯＦ１）胎仔の脳を、切片にした後、０．２５％トリプシン中に大脳皮質を解離させることによって、調製した。室温において１２０ｇで遠心分離した後、得られた細胞ペレットを、１０ｍＬの培養培地に、４×１０５個の細胞／ｍＬの密度で再懸濁させ、これを、９６ウェルの培養マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５９４６、Ｇｅｒｍａｎｙ）のポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたウェルに、Ｎ２およびＢ２７を補充した１００μＬの培養ＤＭＥＭにおいて播種した。
【０１８２】
６日間インビトロにおいた後、培養培地を取り出し、Ｂ２７を含まない新しいものと交換し、ニューロンを、抗Ａβ抗体とともに、１時間予備処置した。次いで、ニューロンを、ｏＡβ４２（５μＭ）とともに４８時間インキュベートした。薬物不含であるが、対応するＤＭＳＯ濃度（すなわち、０．１％、ｏＡβ４２処置と同じ）を補充した対照の適用を、試験物質の適用と並行して行った。
【０１８３】
以下の２つの読み取りを使用して、試験化合物の作用を評価した：カスパーゼ−３／７酵素活性および神経突起ネットワーク。
【０１８４】
（ｉｖ）カスパーゼ−３／７酵素活性の定量化
実験処置に続いて、５０μＬの培地を、ウェルから取り出し、５０μＬのカスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７アッセイキット溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＵＳＡ、Ｇ７７９０）を、それぞれのウェルに混合し、次いで、室温で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、それぞれのサンプルの蛍光を、４９９ｎｍを励起波長として使用し、５２１ｎｍを放出波長として使用して、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（ＸＳ、ｓ／ｎ  ＸＳＯ  ２８１０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｏｆｔＭａｘ  ＰＲＯ３．１ソフトウェア）を使用して、定量化した。蛍光強度の測定値は、カスパーゼ−３／７酵素活性に比例する。
【０１８５】
（ｖ）神経突起ネットワークの定量化
細胞の固定
実験処置に続いて、１００μＬの４％ホルムアルデヒド溶液（Ｍｅｒｃｋ、１００４９６）を、それぞれのウェルに添加し、次いで、室温で１０分間インキュベートした。次いで、培地を取り出し、１００μＬの４％ホルムアルデヒド溶液の溶液と交換し、室温でさらに１０分間インキュベートした。次いで、培地を取り出し、ウェルを、１００μＬのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０）で４回洗浄した。マイクロプレートを、ＤＰＢＳ中、４℃で保管した後、染色した。
【０１８６】
免疫細胞化学法
免疫細胞蛍光手順を、培養マイクロプレートのウェルに固定した細胞に適用した。簡単に述べると、細胞膜を、ＤＰＢＳ／１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）−０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で、３０分間、室温において透過処理した。透過処理した細胞を、神経細胞タンパク質マーカーＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）を認識する一次抗体、ここでは、抗ＭＡＰ２ウサギポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ５６２２、バッチ２０４９２０８、１／１０００希釈）とともに、４℃で終夜インキュベートし、次いで、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ中での洗浄工程の後に、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４結合型抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０１２、バッチ４７０９８Ａ、１／１０００希釈）に対応する二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。追加の洗浄工程の後、固定した細胞を、次に、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ  Ｈ３５７０）とともに１５分間インキュベートして、核を染色し（０．２μｇ／ｍＬ）、最後に、ＤＰＢＳですすいだ後、イメージングにより分析した。神経細胞関連の伸長、すなわち、神経突起の測定は、ＭＡＰ−２陽性の免疫蛍光陽性シグナルに基づいて行った。
【０１８７】
定量的画像分析
神経突起ネットワークの分析は、ハイコンテンツイメージ分析を使用して、９６ウェルの培養マイクロプレートからのＭＡＰ−２免疫染色およびＨｏｅｃｈｓｔ染色された細胞に基づいて行った。２色励起波長での１ウェル当たり５視野の自動化蛍光イメージ取得を、ソリッドステート励起光で、２０倍の高開口数拡大レンズおよび１６ビットのｓＣＭＯＳカメラを備えるＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２２００イメージングシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫ）において行った。
【０１８８】
定量的イメージ分析プロセスは、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、コンピュータに基づくワークステーションで行った。核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色に基づく）および神経突起（検出されたＭＡＰ２免疫反応性に基づく）の分割の後に、神経突起面積を測定する前に、それぞれの細胞に対する「オブジェクトマスク」を定め、続いて、取得したそれぞれの視野に対する後処理工程を行い、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌスプレッドシートにおいてＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェアによる自動的編集を行った。神経突起面積の測定値（μｍ２として表される）を、神経突起ネットワークインデックスとして使用した。
【０１８９】
分析に使用したデータは、一般的に、５回の独立した実験に由来する。
【０１９０】
（ｖｉ）統計学的分析
それぞれのパラメーターについて、データは、対照群に対する割合として表した。次いで、それぞれの処置群の実験ごとの平均を、統計学的分析のために計算した。統計学的分析は、ＳＡＳ  ９．２ソフトウェアを使用して行った。５％未満の確率（ｐ＜０．０５）を、有意とみなした。
【０１９１】
結果
神経毒性を誘発させるために実験において使用した凝集型Ａβ４２調製物は、小さなオリゴマーおよび大きなオリゴマーを含め、いくつかのＳＤＳ安定種を含む（図１を参照されたい）。
【０１９２】
マウス初代神経細胞培養物において、ｏＡβ４２が、カスパーゼ３／７酵素活性の顕著な増加（＋６４８．６％）を通じて、毒性作用を誘発することが示された（ｐ＝０．０１０５）。
【０１９３】
５０および１５０μｇ／ｍＬのヒト化抗体Ａｂ１での共処置後に、９７％および９８％の保護作用に相当する、ｏＡβ４２によって誘発される毒性の有意な阻害が観察された（それぞれ、ｐ＝０．００６２およびｐ＜０．０００１、ｏＡβ４２と対比）（図１を参照されたい）。
【０１９４】
５０および１５０μｇ／ｍＬのマウス抗体での共処置後に、９６％および９８％の保護作用に相当する、ｏＡβ４２によって誘発される毒性の有意な阻害が観察された（それぞれ、ｐ＝０．０３５２およびｐ＜０．０００１、ｏＡβ４２と対比）（図１を参照されたい）。
【０１９５】
ｏＡβ４２の非存在下においては、対照と、５０および１５０μｇ／ｍＬのヒト化抗体Ａｂ１との間に、有意差は観察されなかった（それぞれ、ｐ＝０．５３０９およびｐ＝０．４２０７）。１５および５０μｇ／ｍＬの濃度で単独で試験した場合、対照とマウス抗体との間に有意差は観察されなかった（それぞれ、ｐ＝０．９２７９およびｐ＝０．１８１１）（表３を参照されたい）。カスパーゼ−３／７酵素活性の統計学的に有意な増加が、最も高い１５０μｇ／ｍＬの濃度のマウス抗体で、対照に対して観察された（＋１５％、ｐ＝０．０３５２）。
【０１９６】
ｏＡβ４２が、マウス初代神経細胞培養物における神経突起ネットワークの顕著な減少を通じて、マウス初代神経細胞培養物において毒性作用を誘発することもまた、示された（対照と対比して−４７％、ｐ＝０．０００９）。
【０１９７】
ｏＡβ４２によって誘発される神経突起ネットワークの減少の有意な阻害が、ｏＡβ４２ならびに５０および１５０μｇ／ｍＬのヒト化抗体Ａｂ１の共処置後に観察され、８４％および１１１％の神経保護作用に相当した（いずれの濃度についても、ｐ＜０．０００１、ｏＡβ４２と対比）（図２を参照されたい）。
【０１９８】
ｏＡβ４２により誘発される神経突起ネットワークの減少の明らかな阻害が、ｏＡβ４２ならびに５０および１５０μｇ／ｍＬのマウス抗体での共処置後に観察された（それぞれ、ｐ＝０．００２３およびｐ＜０．０００１、ｏＡβ４２と対比）（図２を参照されたい）。
【０１９９】
ｏＡβ４２の非存在下においては、神経突起ネットワークのレベルに、処置による作用は観察されなかった（ｐ＝０．３５８０）。ｏＡβ４２の存在下においては、分析した両方の読み取り値、すなわち、カスパーゼ３／７酵素活性および神経突起ネットワークについて、１５０μｇ／ｍＬで試験したＡｂ１とアイソタイプ対照ｈＩｇＧ４との間に、有意差が観察された（それぞれ、ｐ＝０．０００７およびｐ＜０．０００１）（図３および４を参照されたい）。
【０２００】
また、分析した両方の読み取り値、すなわち、カスパーゼ３／７酵素活性および神経突起ネットワークについては、ｏＡβ４２の存在下において、１５０μｇ／ｍＬのマウス抗体とアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１との間に、有意差が観察され（両方のパラメーターについて、ｐ＜０．０００１）、神経突起ネットワークについては、ｏＡβ４２の存在下において、５０μｇ／ｍＬで、有意差が観察された（ｐ＝０．００２６）（図３および４を参照されたい）。
【０２０１】
結論
アッセイ条件下において、ｏＡβ４２調製物は、カスパーゼ３／７酵素活性の有意かつ顕著な増加、ならびにこれと並行した神経突起ネットワークの有意な減少によって観察されるように、マウス初代神経細胞培養物にとって神経毒性である。
【０２０２】
アッセイ条件下において、ｏＡβ４２によって誘発されるカスパーゼ−３／７酵素活性の増加およびｏＡβ４２によって誘発される神経突起ネットワークの減少の濃度依存的阻害によって示されるように、ｏＡβ４２ならびにヒト化抗体Ａｂ１またはそのマウス対応物の共処置により、ｏＡβ４２によって誘発されるマウス初代神経細胞培養物に対する神経毒性作用が有意に阻害される。
【０２０３】
Ａβペプチドのプロトフィブリル形態に対する抗体、たとえば、Ａｂ１は、驚くべきことに、インビトロで、ｏＡβ４２によって誘発される神経毒性に対する神経保護活性を有し、したがって、アミロイドによって誘発される病理の疾患の最初期ステージの治療薬として、および疾患の予防に、有用である。
【実施例２】
【０２０４】
抗体Ａｂ１の神経細胞保護作用の、他の抗体との対比
材料および方法
皮質ニューロンの初代培養物を、１６日齢のマウス胎仔（ＯＦ１）から切片にし、Ｎ２およびＢ２７を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、ポリ−Ｄ−リシンをコーティングした９６ウェルの培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに、播種した（４０，０００個の細胞／ウェル／１００μｌ）。
【０２０５】
６日間インビトロにおいた後、すべての培地を取り出し、Ｂ２７を含まない新しいものと交換し、ニューロンを、抗Ａβ抗体とともに、１時間予備インキュベートした。ニューロンを、次いで、ｏＡβ４２調製物（実施例１にあるように得た）とともに、４８時間の間、インキュベートした。薬物不含であるが、対応するＤＭＳＯ濃度（ｏＡβ４２と同じ）を補充した対照の適用を、試験物質の適用と並行して行った。
【０２０６】
試験化合物は、Ａｂ１、Ａｂ４（配列番号３３の配列の２つの重鎖および配列番号３４の配列の２つの軽鎖からなる）、およびＡｂ５（配列番号３５の配列の２つの重鎖および配列番号３６の配列の２つの軽鎖からなる）であった。対照抗体は、ｈＩｇＧ４およびｈＩｇＧ１であった。
【０２０７】
抗体の濃度は、５０μｇ／ｍＬまたは１５０μｇ／ｍＬであった。
【０２０８】
カスパーゼ３／７活性および神経突起ネットワーク阻害は、実施例１にあるように評価した。
【０２０９】
結果
２つの他の試験抗体に関して、Ａｂ４は、Ａβフィブリルの構成的エピトープに特異的に結合し、Ａｂ５は、Ａβ小および大Ａベータアセンブリに結合する。
【０２１０】
まず、カスパーゼ３／７および神経突起ネットワークの両方のパラメーターについて、ｏＡβ４２なしの対照およびｏＡβ４２群の間に、有意差が観察されたこと、ならびにｏＡβ４２の非存在下において、試験抗体の有意な処置効果が観察されなかったことについて、最初に調べた。
【０２１１】
実施例１において上記で示したように、カスパーゼ３／７および神経突起ネットワークの両方のパラメーターについて、試験した濃度において、抗体Ａｂ１＋ｏＡβ４２で、ｏＡβ４２と比較して、有意差が観察された。しかしながら、ｏＡβ４２と比較しての有意差は、５０および１５０μｇ／ｍＬの濃度のＡｂ４ならびに５０および１５０μｇ／ｍＬの濃度のＡｂ５に関して、神経突起ネットワークのみについて観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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