(57)【要約】  核因子κＢリガンドのヒトおよびマウス受容体アクチベーターに結合する抗体およびこれらの抗体の使用方法を提供し、該抗体は、骨関連障害又は癌によって引き起こされる骨格異常に関連する状態を治療するための薬剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、ヒトＲＡＮＫＬに結合する抗体であって、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１２であり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１３であり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１４であり、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号９であり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１０であり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１１である、抗体。
【請求項２】
ａ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａがＡｌａであり、
ｂ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａがＰｒｏであり、
ｃ．配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａがＴｒｐである、
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａがＡｒｇであり、
ｂ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａがＴｙｒであり、
ｃ．配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａがＡｓｎである、
請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、ヒトＲＡＮＫＬに結合する抗体であって、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号４または配列番号８であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号３または配列番号７である、抗体。
【請求項５】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号４であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号３である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号８であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７である、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号２または配列番号６であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号１または配列番号５である、ヒトＲＡＮＫＬに結合する抗体。
【請求項８】
前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号２であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号１である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号６であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号５である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体、および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野に属する。より具体的には、本発明は、核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）に対する抗体を含む抗体およびその医薬組成物に関する。本発明の抗体は、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）などの骨関連障害、ならびに非小細胞肺癌および多発性骨髄腫などの癌によって引き起こされる骨格異常の治療に有用であることが期待される。
【０００２】
骨関連障害に何百万人もの個人が冒され、該障害は疼痛を伴う衰弱性の症状をしばしば引き起こす。骨粗鬆症は、一般的な代謝性骨関連障害であり、骨芽細胞骨形成に対する過剰な破骨細胞骨吸収から少なくとも一部生じる進行性の骨量喪失を特徴とする。骨粗鬆症に関連する骨量喪失により、骨折の危険性がより高まる。骨粗鬆症関連の骨量喪失の長期にわたる結果は、骨折、慢性疼痛、身体障害、および／または不動状態を含む重篤な身体的結果をもたらし得るとともに、骨格による充分な体の構造支持ができなくなり得る。
【０００３】
ＲＡＮＫＬは、タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、骨リモデリングにおいて重要な役割を果たす。ＲＡＮＫＬは、骨芽細胞によって発現され、破骨細胞および破骨細胞前駆細胞の表面上にある同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体ＲＡＮＫに結合する。ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合は、成熟破骨細胞の形成、活性化、及び生存、ならびに細胞内シグナル伝達カスケードの刺激を誘導して、骨吸収の増加を引き起こす。ＲＡＮＫＬに対する中和抗体は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，７４０，５２２号は、唯一の認可された抗ＲＡＮＫＬ治療抗体であるＰｒｏｌｉａ（登録商標）およびＸｇｅｖａ（登録商標）（それぞれ、閉経後の女性および骨折の危険性が高い男性における骨粗鬆症の治療、ならびに固体腫瘍からの骨転移を有する患者における骨格関連事象の予防のために認可された）という名称で市販されているデノスマブを含む、抗ＲＡＮＫＬ抗体を開示している。
【０００４】
骨粗鬆症関連の骨折は、医療制度にとって主要な健康懸念および経済的負担となる。国際骨粗鬆症財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によると、９９０万人のアメリカ人が骨粗鬆症を有し、さらに４，３１０万人が低骨密度に悩まされている。毎年、２００万件超の骨折および４０万件超の入院が骨粗鬆症に起因している。米国公衆衛生局長官は、骨粗鬆症関連の骨折により毎年１２０〜１８０億ドルの直接医療費が生ずると推定している。
【０００５】
現在の療法は、骨吸収抑制または同化性（ａｎａｂｏｌｉｃ）化合物などの他の薬剤との共投与または共製剤化（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）には適していない。さらに、マウスモデルなどのインビボ前臨床モデルで研究するのに有用な抗ＲＡＮＫＬ抗体が不足している。したがって、患者により良い転帰をもたらし得る、骨関連障害または癌によって引き起こされる骨格異常のための代替療法が依然として必要である。そのような代替療法は、好ましくは、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）などの骨関連障害の治療、ならびに非小細胞肺癌および多発性骨髄腫などの癌によって引き起こされる骨格異常の治療において有効性を示すことができるであろう。本発明の抗体は、上記の必要性のうちの少なくとも１つを満たすことが期待される代替療法を提供する。
【０００６】
本発明は、ヒトＲＡＮＫＬに結合する抗体であって、該抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、該ＬＣＶＲは相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、該ＨＣＶＲはＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、該ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１２であり、該ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１３であり、該ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１４であり、該ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号９であり、該ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１０であり、該ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１１である、抗体を提供する。いくつかの特定の実施形態において、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａはＡｌａであり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａはＰｒｏであり、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａはＴｒｐである。他の特定の実施形態において、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａはＡｒｇであり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａはＴｙｒであり、配列番号１４で表されるアミノ酸配列の４位のＸａａはＡｓｎである。
【０００７】
いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＬＣＶＲが配列番号４または配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲが配列番号３または配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。いくつかの特定の実施形態において、ＬＣＶＲは配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲは配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態において、ＬＣＶＲは配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲは配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する。
【０００８】
いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＬＣが配列番号２または配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、ＨＣが配列番号１または配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する抗体を提供する。いくつかのそのような実施形態において、ＬＣは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣは配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、ＬＣは配列番号６で示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣは配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒトＲＡＮＫＬに結合する。他のそのような実施形態において、本発明の抗体はマウスＲＡＮＫＬに結合する。他のそのような実施形態において、本発明の抗体はヒトＲＡＮＫＬおよびマウスＲＡＮＫＬに結合する。
【００１０】
本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸分子および発現ベクターに関する。一実施形態において、本発明は、ＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、ＨＣのアミノ酸配列が配列番号１である、ＤＮＡ分子を提供する。いくつかのそのような実施形態によれば、該ＤＮＡ分子は配列番号１５で示されるポリヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
一実施形態において、本発明はまた、ＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、ＬＣのアミノ酸配列が配列番号２である、ＤＮＡ分子を提供する。いくつかのそのような実施形態によれば、該ＤＮＡ分子は配列番号１６で示されるポリヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１６で示される。
【００１３】
本発明はまた、ＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、該細胞は本発明のＨＣおよびＬＣを含む抗体を発現することができ、ＨＣは配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、哺乳動物細胞を提供する。本発明はまた、ＨＣおよびＬＣを含む抗体の作製方法であって、本発明の抗体が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養することを含む方法を提供する。本発明はまた、該方法によって作製される抗体を提供する。本発明はまた、ＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、該細胞は本発明の２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体を発現することができ、各ＨＣは配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、哺乳動物細胞を提供する。本発明はまた、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む抗体の作製方法であって、本発明の抗体が発現されるような条件下で哺乳動物細胞を培養することを含む方法を提供する。本発明はまた、該方法によって作製される抗体を提供する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の抗体、および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は骨関連障害の治療に使用することができ、かかる治療は、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。いくつかのそのような実施形態において、骨関連障害は、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）のうちの１つ以上である。他のそのような実施形態において、本発明の医薬組成物は癌によって引き起こされる骨格異常の治療に使用することができ、かかる治療は、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、癌は、非小細胞肺癌および多発性骨髄腫のうちの１つ以上である。
【００１５】
本発明はまた、骨関連障害または癌によって引き起こされる骨格異常の治療方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかのそのような実施形態において、骨関連障害は骨粗鬆症である。いくつかのそのような実施形態において、骨関連障害は骨減少症である。いくつかのそのような実施形態において、骨関連障害は関節炎である。より特定の実施形態において、骨関連障害は関節リウマチである。他のそのような実施形態において、骨関連障害は、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）のうちの１つ以上である。本発明はまた、非小細胞肺癌によって引き起こされる骨格異常および多発性骨髄腫によって引き起こされる骨格異常のうちの１つ以上の治療方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、療法で使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。より具体的には、本発明は、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）のうちの１つ以上の治療に使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。本発明はまた、非小細胞肺癌によって引き起こされる骨格異常および多発性骨髄腫によって引き起こされる骨格異常のうちの１つ以上の治療において使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、骨関連障害または癌によって引き起こされる骨格異常の治療のための医薬の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物の使用を提供する。いくつかの特定の実施形態によれば、本発明は、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）のうちの少なくとも１つ以上の治療のための医薬の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。本発明はまた、非小細胞肺癌によって引き起こされる骨格異常および多発性骨髄腫によって引き起こされる骨格異常のうちの１つ以上の治療のための医薬の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。
【００１８】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの１つ以上および残基１２５〜１３２のうちの１つ以上でヒトＲＡＮＫＬに結合する。別の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＲＡＮＫＬ上のエピトープに結合し、該エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも１つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含む。さらなる実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも２つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも２つのアミノ酸を含む。別のさらなる実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも３つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも３つのアミノ酸を含む。別のさらなる実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも４つのアミノ酸および１２５〜１３２の範囲内の少なくとも４つのアミノ酸を含む。他のさらなる実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも５つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも５つのアミノ酸を含む。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む抗体とヒトＲＡＮＫＬへの結合について競合することができる抗体であって、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１である、抗体を提供する。より特定の実施形態において、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａはＡｌａであり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａはＰｒｏであり、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａはＴｒｐである。別のより特定の実施形態において、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａはＡｒｇであり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａはＴｙｒであり、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａはＡｓｎである。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ヒト、ヒト化、マウス、またはマウス−ラットのキメラであってもよい。抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む免疫グロブリン分子である。各ＨＣおよびＬＣのアミノ末端部分は、可変領域中に含まれるＣＤＲを介して抗原認識を主に担う、約１００〜１２０個のアミノ酸の可変領域を含む。ＣＤＲは、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域とともに点在している。各ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。ＬＣの３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称し、ＨＣの３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する残基のほとんどを含む。特定の抗原に結合する抗体の機能的能力は、６つのＣＤＲによって大きく影響される。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け則（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、およびＮｏｒｔｈ番号付け則（Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１））に基づく。本発明の抗体のＣＤＲは表１に従って定義される。
【表１】
2020500836.tif 000002
【００２１】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）である。本発明のｍＡｂは、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含有する完全ｍＡｂである。本明細書で言及する場合、ｍＡｂは、例えば任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一コピーまたはクローン由来の抗体であり、それが作製される方法ではない。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えば、ＣＤＲグラフティング、または当該技術分野で既知のそのようなもしくは他の技術の組み合わせによって作製することができる。抗体の作製および精製方法は当技術分野で周知であり、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５−８  ａｎｄ  １５，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２に見出すことができる。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、既知の方法を用いて調製および精製することができる。例えば、ＨＣ（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）およびＬＣ（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化して、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）発現ベクター中に操作することができる。次いで、操作された免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクトすることができる。当業者が理解するように、抗体の哺乳動物発現により、典型的にはＦｃ領域中の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で、グリコシル化がもたらされるであろう。安定したクローンを、ＲＡＮＫＬに特異的に結合する抗体の発現について検証することができる。陽性クローンは、バイオリアクター中での抗体産生のために無血清培地で増殖させることができる。抗体が分泌された培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、培地をリン酸緩衝生理食塩水などの適合する緩衝液で平衡化したプロテインＡまたはＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに好都合に適用にすることができる。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗体は例えばｐＨ勾配により溶出され、抗体分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され、その後プールされる。抗体は、一般的な技術を用いて濃縮および／または滅菌濾過することができる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効率的に除去することができる。生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は患者の治療に使用することができる。より具体的には、本発明の抗体は、骨粗鬆症、骨減少症、および関節炎（関節リウマチなど）などの骨関連障害、ならびに非小細胞肺癌および多発性骨髄腫などの癌によって引き起こされる骨格異常を治療することが期待される。本明細書で互換的に使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および／もしくは「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」ならびに／または「治療する（ｔｒｅａｔ）」は、本明細書に記載される障害の進行の遅延、妨害、抑止、制御、停止、または反転があり得る全ての方法を指すことを意図するが、全ての障害症状の完全な消失を必ずしも示さない。治療は、ＲＡＮＫＬ活性の低下から利益を受ける、ヒトの疾患または状態の治療のための本発明の抗体の投与を含み、（ａ）疾患の更なる進行を阻害すること、および（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくは障害の退行を引き起こすか、またはその症状もしくは合併症を緩和することとを含む。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「患者」という用語はヒトを指す。ある特定の実施形態において、患者は、ＲＡＮＫＬ活性の低下から利益を受ける疾患、障害、または状態（例えば、骨関連障害）を有することをさらに特徴とする。
【００２５】
本明細書で使用される場合、ＲＡＮＫＬに「結合する（ｂｉｎｄ）」（または「結合する（ｂｉｎｄｓ）」）という用語は、抗体とヒトＲＡＮＫＬのエピトープとの相互作用を指す。好ましくは、「結合する」とは、水素重水素交換によって決定される本発明の抗体とエピトープとの相互作用を指す（例えば、実施例４を参照のこと）。好ましくは、エピトープはヒトＲＡＮＫＬの立体構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープである。一実施形態において、ＲＡＮＫＬに「結合する（ｂｉｎｄ）」（または「結合する（ｂｉｎｄｓ）」）という用語は、ヒトＲＡＮＫＬの立体構造的エピトープとの相互作用を指し、該エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの１つ以上および残基１２５〜１３２のうちの１つ以上である。別の実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも２つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも２つのアミノ酸である。別の実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも３つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも３つのアミノ酸である。別の実施形態において、エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも４つのアミノ酸および１２５〜１３２の範囲内の少なくとも４つのアミノ酸である。別の実施形態において、立体構造的エピトープは、配列番号１７の残基８９〜９７のうちの少なくとも５つのアミノ酸および残基１２５〜１３２のうちの少なくとも５つのアミノ酸である。
【００２６】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、本発明のモノクローナル抗体によって認識される抗原の個別の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）三次元部位を指す。エピトープは、水素重水素交換、アラニンスキャニング、またはＸ線結晶学などの当技術分野において現在既知である方法によって決定することができる。本明細書で使用される場合、「競合する（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）」または「競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）」は、本発明の抗体のうちのいずれか１つがヒトＲＡＮＫＬに結合するのを阻害または阻止することができる抗体を指す。例えば、別の抗体の存在下で本発明の抗体のうちのいずれか１つによるヒトＲＡＮＫＬへの結合の減少または完全な喪失がある場合、該抗体は結合を阻害または阻止することができる。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができ、本発明のモノクローナル抗体ならびに１つ以上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む、医薬組成物に組み込むことができる。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、本明細書に記載される疾患もしくは障害の危険性があるまたは該疾患もしくは障害を示す患者に非経口経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、本明細書中で互換的に使用される「有効」または「治療有効」量の、本発明のモノクローナル抗体を含む。有効量とは、所望の治療結果を達成するための（投与量および投与期間、ならびに投与手段での）必要な量を指す。モノクローナル抗体の有効量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個人における所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて変動し得る。有効量はまた、本発明のモノクローナル抗体の任意の毒性または有害効果よりも、治療上有益な効果が上回る量である。
【実施例】
【００２９】
実施例１：抗体の発現および精製
本発明の例示的な抗体は、本質的に以下のように発現および精製される。配列番号１５（配列番号１の例示的な重鎖をコードする）および配列番号１６（配列番号２の例示的な軽鎖をコードする）で示されるポリヌクレオチド配列を含有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターを使用して、エレクトロポレーションにより、チャイニーズハムスター細胞株（ＣＨＯ、ＧＳノックアウト）にトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶ  Ｅａｒｌｙ（シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳ遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞について５０μＭ  Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いてバルク選択を行う。ＭＳＸによるＧＳの阻害を用いて、選択のストリンジェンシーを高める。発現ベクターｃＤＮＡが宿主細胞ゲノムの転写活性領域に組み込まれた細胞を、ＣＨＯ野生型細胞に対して選択することができる。トランスフェクトされたプールを低密度でプレーティングして、安定した発現細胞のクローンに近い成長（ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ｃｌｏｎａｌ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にする。マスターウェルを抗体発現についてスクリーニングし、次いで無血清懸濁培地中でスケールアップして、産生に使用する。
【００３０】
例示的な抗体が分泌された清澄化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合する緩衝液で平衡化されたプロテインＡアフィニティーカラムに適用する。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗体を例えばｐＨ勾配によって溶出し、例えばｐＨ８のトリス緩衝液で中和する。抗体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出し、次いでプールする。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、Ｃａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィー、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効率的に除去することができる。抗体を一般的な技術を用いて濃縮および／または滅菌濾過する。これらのクロマトグラフィー工程後の例示的な抗体の純度は９８％より高い（モノマー）。抗体は、−７０℃で直ちに凍結してもよく、または４℃で数ヶ月間保存してもよい。
【００３１】
実施例２：結合親和性
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器を用いて、結合親和性を測定する。すべての測定を２５℃で行う。２μｇ／ｍＬの実施例１の例示的な抗体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解する。プロテインＡを、アミン結合キットを用いて、５００応答単位（Ｒｕｓ）のレベルでＣＭ４センサーチップのフローセル１〜４に固定化する。
【００３２】
複数の分析サイクルを用いて結合を評価する。各サイクルを２０μＬ／分の流量で行う。約１００〜２００Ｒｕｓの捕捉を目的として、約１０μＬの実施例１の例示的な抗体を２μｇ／ｍＬの濃度で注射する。２５０μＬのヒトＲＡＮＫＬ（５ｎＭで開始し、各サイクルについて２倍連続希釈を用いる）を注入し、解離のために１０分間とり、１０μＬのｐＨ１．５の１０ｍＭ塩酸グリシンを再生に使用する。各サイクルの会合および解離速度を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの「物質移動を伴う１：１（１：１  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」結合モデルを用いて評価する。
【００３３】
実施例１の例示的な抗体の操作の際に、ＨＣＤＲ３の最後の位置から３番目のロイシン（例えば、配列番号１１で示されるＨＣＤＲ３の残基１２）の存在は、本発明の抗体のヒトＲＡＮＫＬに対する操作された親和性の向上を与えるために必須であると同定された。例えば、定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）分析では、ロイシンがＨＣＤＲ３の最後の位置から３番目に存在しなかった（例えば、イソロイシンがロイシンに置換された）場合、本発明の抗体に対するさらなるアミノ酸変化はＲＡＮＫＬに対する親和性を増加させることができなかった。
【００３４】
本質的に上記の手順に従い、抗体は、２．８２ｐＭのＫＤでヒトＲＡＮＫＬに結合し、３４．４３ｐＭのＫＤでラットＲＡＮＫＬに結合し、６．６４ｐＭのＫＤでマウスＲＡＮＫＬに結合する。これらのデータは、実施例１の例示的な抗体が、１０ｐＭ未満のＫＤの、ヒトおよびマウスのＲＡＮＫＬに対する高い親和性結合を有することを実証している。
【００３５】
実施例３：インビトロでのＲＡＮＫＬ誘導性ＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼ活性の中和
ヒトＲＡＮＫおよびＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼレポーターを安定して共発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、実施例１の例示的な抗体がＲＡＮＫＬ活性を中和する能力を評価する。このＨＥＫ２９３細胞モデルにおいて、ＲＡＮＫは、ヒトＲＡＮＫＬによって結合されたときにＮＦ−ｋＢシグナル伝達を誘導し、これによりルシフェラーゼ発光がもたらされる。実施例１の例示的な抗体によるＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合の中和は、ルシフェラーゼ発光の低下によって測定される。
【００３６】
ＨＥＫ２９３細胞を、７００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎの選択圧下で日常的に行うように培養する。２５，０００細胞／ウェルを、アッセイ培地（０．５％ＦＢＳ、２０ｎＭ  Ｈｅｐｅｓ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する５０μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：３）培地）中、９６ウェル組織培養プレートのウェルに加える。細胞を３７℃で（５％  ＣＯ２および９５％湿度で）一晩インキュベートする。
【００３７】
１ｎＭおよび１０ｎＭの濃度のヒトＲＡＮＫＬを含むアッセイ培地を用いて、実施例１の例示的な抗体について１０ｎＭ〜０．００５ｎＭ（１：３連続希釈）の用量範囲を調製し、該用量を室温で１５分間インキュベートする。アッセイ培地は、「培地のみ」対照用に使用される。その後、５０μｌの抗体を培養細胞を含有する５０μｌの培地に添加し、３７℃で一晩インキュベートする。
【００３８】
一晩インキュベーションした後、既存の成長培地を除去し、１Ｌの１％  Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００溶解緩衝液（３０ｍＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＬのＭｇＣｌ、１０８．１５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ  ＨＣＬ、４１．８５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ、および８１７ｍＬのＨ２Ｏ））中の５０μＬのＢｕｇＬｉｔｅ（２．２９６ｇ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、１．１５２ｇのコエンザイムＡ、および０．２４８ｇのＡＴＰ）に細胞を懸濁する。次いで、細胞をプレートシェーカーで５〜１０分間、穏やかに撹拌しながら溶解させる。細胞溶解後、発光をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー）上で測定する。全ての処置群についてのＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６による３パラメータロジスティック回帰モデルを用いて算出する。
【００３９】
本質的に上記の手順に従い、ヒトＲＡＮＫＬに結合する抗体のＩＣ５０は０．０６９ｎＭであった。この結果は、実施例１の抗体の例示的な抗体が、ヒトＲＡＮＫＬ誘導性ＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼ発光を中和することを実証している。培地対照は、試験したいずれの濃度でも、ＨＥＫ２９３細胞モデルにおいてヒトＲＡＮＫＬ誘導性ＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼ発光を中和しなかった。
【００４０】
実施例４：水素重水素交換によるエピトープマッピング
実施例１の例示的な抗体がＲＡＮＫＬタンパク質に結合する場所を決定するために、水素重水素交換質量分析（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＨＤＸＭＳ）を行う。この方法を用いて、いくつかの抗体のエピトープをマッピングすることに成功している（Ｏｂｕｎｇｕ  ｅｔ．  ａｌ．  ２００９  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：７２５１−６０  Ｌｕ  ｅｔ．  ａｌ．  ２００５  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４：１１１０６−１４）。
【００４１】
１０μｇのヒトＲＡＮＫＬ溶液を１０μｇの実施例１の例示的な抗体と混合し、次いで１×ＰＢＳで希釈することにより、ＲＡＮＫＬ／抗体複合体を作製した。タンパク質表面標識研究のための複合体を酢酸ヒドロキシスクシンイミドエステルで標識し、４μＬのＲＡＮＫＬ／抗体複合体を１６μＬの１００％Ｄ２Ｏ（交換中８０％Ｄ）と混合し、混合物を周囲温度で６０秒間保持することにより、ＨＤＸＭＳ分析を行う。交換を０℃で５０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを用いてクエンチし、直ちに２μＬの２ｍｇ／ｍＬペプシン溶液で０℃で３．５分間処理し、次いで手動でＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入する。その後、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣと組み合わせたＷａｔｅｒｓ  ＳＹＮＡＰＴ質量分析により、消化物溶液についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行う。
【００４２】
本質的に上記の手順に従い、２つのヒトＲＡＮＫＬペプチド２３９〜２７２および２８１〜２９０は有意な負のデルタを示した。この分析により、実施例１の例示的な抗体のＲＡＮＫＬエピトープが立体構造的であり、配列番号１７のアミノ酸８９〜９７および１２５〜１３２であることが実証された。最初の領域（８９〜９７）は、ヒトおよびげっ歯類のＲＡＮＫＬで同一である。他の領域（１２５〜１３２）は、げっ歯類ＲＡＮＫＬではセリンがアラニンで置換されている１２９位の単一アミノ酸の違いを除き、ヒトおよびげっ歯類ＲＡＮＫＬの両方で同一である。
【００４３】
実施例５：インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）雌マウスモデルを用いて、インビボでの骨量密度に対する効果を評価する。
２０〜２２週齢のインタクトなＣ５７／Ｂ６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で食餌（０．７２％  Ｃａおよび０．６１％  Ｐ、ビタミンＤ  ０．９９ＩＵ／ｇを含むＴＤ  ２０１４、Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および水に自由にアクセスできるようにして維持する。
【００４４】
マウスを、１０ｍｇ／ｋｇの実施例１の例示的な抗体（ｎ＝６動物）またはＰＢＳビヒクル対照を毎週皮下注射した処置動物に分ける。４週間目にマウスを犠牲死させる。遠位および中位大腿骨の骨量密度（ＢＭＤ）を、Ａｌｏｋａ  ＬａＴｈｅｔａ  ＬＴＣ−１００モデルＣＴ走査装置を使用する定量的コンピュータ断層撮影法（ｑＣＴ）によって監視する。
【００４５】
本質的に上記の手順に従い、抗体で処置した動物では、対照動物と比較して、遠位大腿骨ＢＭＤが２３％増加し、中位大腿骨ＢＭＤが４％増加した。これらの結果は、実施例１の例示的な抗体を毎週投与した動物では遠位大腿骨および中位大腿骨の両方におけるＢＭＤが増加したことを実証している。
【００４６】
実施例６：卵巣摘出したマウスモデルにおけるインビボ有効性分析
卵巣摘出したマウスモデルを用いて、インビボでの骨量密度に対する効果を評価する。２０週齢の雌Ｃ５７／Ｂ６マウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を卵巣摘出し（または偽手術した対照群）、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で食餌（０．７２％  Ｃａおよび０．６１％  Ｐ、ビタミンＤ  ０．９９ＩＵ／ｇを含むＴＤ  ２０１４、Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および水に自由にアクセスできるようにして維持する。骨減少症は、卵巣摘出したマウスを６週間にわたり骨量を喪失させることによって、マウスにおいて確立される。
【００４７】
６週間の骨減少症確立期間後に、マウスを処置群（各群につきｎ＝６動物）またはビヒクルＰＢＳ対照群に分ける。マウスの各処置群は、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの実施例１の例示的な抗体またはＰＢＳを毎週皮下注射を受ける。４週間目にマウスを犠牲死させる。犠牲死させた後に、第５椎骨の骨格骨量密度（ＢＭＤ）をＡｌｏｋａ  ＬａＴｈｅｔａ  ＬＴＣ−１００モデルＣＴ走査装置を使用する定量的コンピュータ断層撮影法（ｑＣＴ）によって評価する。
【００４８】
本質的に上記の手順に従い、対照と比較して、３ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した動物ではＢＭＤが２％増加し、１０ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した動物ではＢＭＤが１１％増加した。これらの結果は、実施例１の例示的な抗体は、毎週投与した場合、卵巣摘出マウスにおいて椎骨のＢＭＤの用量依存的増加をもたらすことを実証している。
【００４９】
実施例７：精巣摘出したマウスモデルにおけるインビボ有効性分析
精巣摘出したマウスモデルを用いて、骨量密度および骨塩含量に対するインビボでの効果を評価する。１６週齢の雄Ｃ５７／Ｂ６マウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を精巣摘出し（またはビヒクル対照群、ｎ＝６）、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で食餌（０．７２％  Ｃａおよび０．６１％  Ｐを含むＴＤ  ２０１４、Ｖｉｔ．Ｄ  ０．９９ＩＵ／ｇ、Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および水に自由にアクセスできるようにして維持する。骨減少症は、マウスを６週間にわたり骨量を喪失させることによって、精巣摘出したマウスにおいて確立される。
【００５０】
６週間の骨減少症確立期間後、９匹のマウスに、２ｍｇ／ｋｇ用量の実施例１の例示的な抗体を週に２回皮下注射する。ＰＢＳを注射した動物を対照とする。２週間目にマウスを犠牲死させる。遠位大腿骨の骨量密度（ＢＭＤ）および腰椎の骨塩含量（ＢＭＣ）を、Ａｌｏｋａ  ＬａＴｈｅｔａ  ＬＴＣ−１００モデルＣＴ走査装置を使用する定量的コンピュータ断層撮影法（ｑＣＴ）によって評価する。
【００５１】
本質的に上記の手順に従い、抗体で処置したマウスでは、対照動物と比較して、遠位大腿骨においてＢＭＤが１９％増加し、腰椎においてＢＭＤが１３％増加した。これらの結果は、実施例１の例示的な抗体による処置により、精巣摘出したマウスにおける遠位大腿骨および腰椎のＢＭＤの増加がもたらされることを実証している。
配列
例示的なＨＣ（配列番号１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
例示的なＬＣ（配列番号２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＤＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
例示的なＨＣＶＲ（配列番号３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
例示的なＬＣＶＲ（配列番号４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＤＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
例示的なＨＣ（配列番号５）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＬＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＦＦＣＡＲＲＤＴＲＨＧＹＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＴＡＬＫＳＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＡＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＧＬＹＴＬＴＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＮＣＧＧＤＣＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧ
例示的なＬＣ（配列番号６）
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＹＮＤＹＰＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＴＥＱＬＡＴＧＧＡＳＶＶＣＬＭＮＮＦＹＰＲＤＩＳＶＫＷＫＩＤＧＴＥＲＲＤＧＶＬＤＳＶＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＳＬＳＫＡＤＹＥＳＨＮＬＹＴＣＥＶＶＨＫＴＳＳＳＰＶＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
例示的なＨＣＶＲ（配列番号７）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＬＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＦＦＣＡＲＲＤＴＲＨＧＹＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
例示的なＬＣＶＲ（配列番号８）
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＹＮＤＹＰＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＩＫ
例示的なＨＣＤＲ１（配列番号９）
ＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥ
例示的なＨＣＤＲ２（配列番号１０）
ＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
例示的なＨＣＤＲ３（配列番号１１）
ＡＲＲＤＴＸＨＧＹＹＡＬＤＸ
６位のＸはＡｌａまたはＡｒｇであり、１４位のＸはＰｒｏまたはＴｙｒである。
例示的なＬＣＤＲ１（配列番号１２）
ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ
例示的なＬＣＤＲ２（配列番号１３）
ＹＳＡＳＹＲＹＳ
例示的なＬＣＤＲ３（配列番号１４）
ＱＱＹＸＤＹＰＬＴ
４位のＸはＴｒｐまたはＡｓｎである。
配列番号１のＨＣタンパク質をコードする例示的なＤＮＡ（配列番号１５）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＴＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
配列番号２のＬＣをコードする例示的なＤＮＡ（配列番号１６）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン（配列番号１７）
ＭＳＫＬＥＡＱＰＦＡＨＬＴＩＮＡＴＤＩＰＳＧＳＨＫＶＳＬＳＳＷＹＨＤＲＧＷＡＫＩＳＮＭＴＦＳＮＧＫＬＩＶＮＱＤＧＦＹＹＬＹＡＮＩＣＦＲＨＨＥＴＳＧＤＬＡＴＥＹＬＱＬＭＶＹＶＴＫＴＳＩＫＩＰＳＳＨＴＬＭＫＧＧＳＴＫＹＷＳＧＮＳＥＦＨＦＹＳＩＮＶＧＧＦＦＫＬＲＳＧＥＥＩＳＩＥＶＳＮＰＳＬＬＤＰＤＱＤＡＴＹＦＧＡＦＫＶＲＤＩＤ
【配列表】
2020500836000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月26日(2019.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、ヒトＲＡＮＫＬに結合する抗体であって、前記ＬＣＶＲが相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲがＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１２であり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１３であり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１４であり、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号９であり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１０であり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１１であり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａがＡｌａまたはＡｒｇであり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａがＰｒｏまたはＴｙｒであり、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａがＴｒｐまたはＡｓｎである、抗体。
【請求項２】
ａ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａがＡｌａであり、
ｂ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａがＰｒｏであり、
ｃ．配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａがＴｒｐである、
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の６位のＸａａがＡｒｇであり、
ｂ．配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１４位のＸａａがＴｙｒであり、
ｃ．配列番号１４で示されるアミノ酸配列の４位のＸａａがＡｓｎである、
【請求項４】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号４または配列番号８であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号３または配列番号７である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号４であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号３である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号８であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７である、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号２または配列番号６であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号１または配列番号５である、請求項１または４に記載の抗体。
【請求項８】
前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号２であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号１である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号６であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号５である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
2020500836.tif 000003
2020500836.tif 000004
2020500836.tif 000005