(57)【要約】緑内障の予防及び／又は治療のための薬物の製造における金クラスター又は金クラスター含有物質の使用が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造におけるＡｕＣ含有物質の使用。
【請求項２】
前記ＡｕＣ含有物質は、ＡｕＣとＡｕＣの外側を覆うリガンドＹとを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＡｕＣ含有物質は、溶液、粉末、又は綿状物である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＡｕＣの金コア直径は、０．５ｎｍ〜２．６ｎｍ又は１．１ｎｍ〜２．６ｎｍである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記リガンドＹは、限定されるものではないが、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、並びにその他のチオール含有化合物の１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体は、Ｌ（Ｄ）−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、又はＮ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システイン（ＲＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニン（ＣＲ）、Ｌ−システイン−Ｌ−ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）、Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−システインジペプチド（ＨＣ）、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｌ−リジン−Ｌ−システイン−Ｌ−プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、グリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、グリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、又はグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記その他のチオール含有化合物は、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）−グリシン、又はドデシルメルカプタン等から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＡｕＣ含有物質を製造する方法は、以下の工程：
（１）ＨＡｕＣｌ4をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ4の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
（２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
（３）工程（１）における溶液Ａと工程（２）における溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ4とリガンドＹとの間のモル比が１：０．０１〜１：１００であるように混合し、該混合物を氷浴中で０．１時間〜１２時間にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ4の溶液を添加し、次いで、その反応系を氷浴中で０．１時間〜１２時間にわたり撹拌するにあたり、ＮａＢＨ4とリガンドＹとの間のモル比は１：０．０１〜１：１００であり、こうしてＡｕＣ含有の溶液様物質が得られる工程と、
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
工程（２）における前記溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール、及び酢酸プロピルの１つ以上である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
工程（３）で得られる前記ＡｕＣ含有の溶液様物質を、透析及び凍結乾燥した後に、ＡｕＣを含有する粉末状物質又は綿状物質が得られ、好ましくは、前記透析は具体的には、前記ＡｕＣ含有の溶液様物質を透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析することを示す、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造におけるＡｕＣの使用であって、前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満であり、前記ＡｕＣは、緑内障に活性又は不活性な成分であり得る種々のリガンドで修飾され得る、使用。
【請求項１４】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造における、Ｌ−ＮＩＢＣ、Ｄ−ＮＩＢＣ、ＣＲ、ＲＣ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＡＣ）、ＧＳＨ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、Ｌ−システイン、又はＤ−システインのリガンドで修飾されたＡｕＣの使用。
【請求項１５】
前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満、好ましくは０．５ｎｍ〜２．６ｎｍである、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートルの薬物の技術分野に関し、特に緑内障の予防及び／又は治療のための薬物の製造におけるＡｕＣ（金クラスター）又はＡｕＣ含有物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、視神経損傷、視野欠損、及び視機能の漸進的喪失を特徴とする不可逆的な視神経変性疾患である。緑内障は、白内障に次ぐ世界で２番目の不可逆的な失明性眼疾患である。臨床分析データによると、２０２０年までに世界の緑内障患者数は、特にアジア及びアフリカでは７６００万人に達すると予想され、その一方で、中国での緑内障患者数は、その時までに２１００万人に達すると予想されている。緑内障の病因はいまだ未知のままである。長い間、病的な眼内圧の上昇は、神経損傷及び緑内障を引き起こす主な要因の１つとみなされている。緑内障の臨床治療は、主として患者の眼内圧の低下に基づいている。しかしながら、膨大な臨床データによれば、眼内圧を制御するだけでは緑内障を治癒する目標を達成することができないことが分かっている。なぜならば、眼内圧の制御が理想的であるとしても、進行性視神経損傷、及び網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のアポトーシスが更に悪化する場合があるからである。したがって、高い眼内圧は、緑内障に関連する視神経損傷の１つの早期の素因であり得るにすぎず、眼内圧を低下させるだけで視神経機能の更なる喪失を防ぐことは困難である。上記の理由から、緑内障の治癒への手掛かりは、視神経機能を増強し、視神経細胞のアポトーシス及び視神経損傷を遮断又は遅延させることである。しかしながら、緑内障に関連する視神経損傷を効果的に防ぐ臨床薬は、今のところ見出されていない。研究により、酸化ストレス、機械的ストレス、自己免疫系異常、血糖値、炎症性分子、及び異常なタンパク質の沈着等の様々な要因が視神経障害を引き起こし得ることが分かっている。これらの要因のなかでも、アミロイド−β（Ａβ）のミスフォールディング、異常凝集、及び線維化にはより一層の注意が払われており、細胞内外のタウタンパク質は、視神経変性疾患及びＲＧＣの死の過程において極めて重要な役割を担っている。
【０００３】
Ａβは、β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の加水分解から生成される３９個〜４３個のアミノ酸残基を有するタンパク質である。Ａβは、神経損傷及び神経細胞のアポトーシスに関係する重要な因子である。研究により、Ａβの神経毒性は、アルツハイマー病（ＡＤ）等の様々な神経変性疾患の形成及び病因に関する共通の機序であることが分かっており、Ａβは長い間、関連薬物の研究及び開発のための重要な標的として使用されている。近年の研究により、Ａβの神経毒性は、眼の神経変性疾患である緑内障においても極めて重要な役割を担うことが分かっている。臨床的緑内障患者のＲＧＣ及び房水中でのＡβの発現は、コントロール群よりも大幅に高い。緑内障動物モデルにおいて、長期の高眼内圧によって誘発されるＲＧＣのアポトーシスは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の増加、Ａβの発現、及びタウタンパク質の過度の過剰リン酸化に密接に関連している。一方で、臨床データによれば、ＡＤ患者は、より緑内障及び失明に罹りやすいことが分かっている。そしてＡＤトランスジェニック動物の網膜では、大量のＡＰＰが合成され、Ａβ斑の凝集が現れる。したがって、緑内障及びＡＤは、類似したＡβ機序を有し得る。より重要なことには、緑内障動物モデルにおいて、アポトーシス段階にあるＲＧＣはＡβと同時発現され、そしてＡβの過剰産生を遮断し得るＡβ抗体又は薬物は、ＲＧＣのアポトーシスを効果的に阻害し、視神経損傷を減らすことができる。これらの研究結果により、Ａβは緑内障の病因において重要な役割を担い、そして視神経保護機序に基づく緑内障の治療のための重要な標的であることが明らかになった。
【０００４】
視神経挫滅損傷ラットモデルは、広く使用される高い眼内圧を伴わない緑内障の動物モデルである。該動物モデルは、視神経上膜の完全性を維持し、臨床的な緑内障の損傷特性に近い緑内障の視神経軸索輸送障害及びＲＧＣ死を模擬している。同時に、上記モデルは、標準的な様式で作製され、操作しやすいことから、誤差が小さく再現性が良好な明確で定量的な視神経損傷が引き起こされ得る。上記モデルは、緑内障の視神経損傷、及びＲＧＣ損傷の病理学的機序の研究、並びに視神経保護のための薬物のスクリーニングに広く使用される、国内外で十分に認識されている緑内障の視神経損傷の正確なモデルである。例えばこのモデルから、ジンセノサイドＲｇ１、デキサメタゾン、イチョウ、及びα−リポ酸は、幾らかの視神経保護効果を有するが、それらの保護効果は満足のいくものではないことが明らかになった。Ａβ機序は、視神経損傷過程において重要な役割を担うので、Ａβの凝集及び線維化を阻害し得ると同時に、視神経を保護しかつ視機能を改善する薬物を動物モデルにおいて開発することは、緑内障の予防及び治療に大きな意義を有することとなる。
【０００５】
金ナノ粒子はナノスケールの金粒子である（金コアの直径は、一般的に３ｎｍ〜１００ｎｍである）。それらの独特の光学的特性及び電気的特性、良好な生体適合性、並びに簡便な表面修飾のため、金ナノ粒子は、生物学及び関連の医療分野、例えばバイオセンサ、医用イメージング、及び腫瘍検出において広く使用される。それらの化学的不活性及び大きな比表面積及び低濃度での血液−脳関門の透過能力により、金ナノ粒子は、薬物の指向性輸送及び制御可能放出等の研究における薬物担体としても使用される。近年では、金ナノ粒子と線維性タンパク質の凝集を阻害する特定のリガンド（例えば、ヘテロポリ酸及び特定の配列のポリペプチド）との結合について研究がなされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質線維化の阻害実験において一定の効果を上げているが、細胞モデルの結果によれば、金ナノ粒子の使用は、フィブリン損傷された細胞の生存率に明らかな効果を有しないことが指摘されている（文献１：非特許文献１）。動物モデルのレベルでの実験は、まだ報告されていない。さらに、これらの研究では、金ナノ粒子は、主として有効成分としてではなく薬物担体として使用された。
【０００６】
金クラスター（ＡｕＣ）は、金コアの直径が３ｎｍ未満である超微細な金ナノ粒子である。それは僅か数個から数百個の金原子を含み、従来の金ナノ粒子中の金原子の面心立方充填構造の崩壊及びエネルギー準位の分裂が引き起こされ、こうして３ｎｍを上回る従来の金ナノ粒子とは全く異なる分子様の特性を示す。一方で、エネルギー準位の分裂のため、ＡｕＣは、従来の金ナノ粒子の表面プラズモン効果及びそれに由来する光学的特性を有さずに、半導体量子ドットと類似した優れた蛍光発光特性を示す。他方では、ＡｕＣの紫外−可視吸収スペクトルにおいて、５２０±２０ｎｍでのプラズモン共鳴ピークが消失し、その一方で１つ以上の新たな吸収ピークが５７０ｎｍより高いところで現れるが、そのような吸収ピークは、従来の金ナノ粒子では観察することができない。したがって、紫外−可視吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴吸収ピーク（５２０±２０ｎｍ）の消失及び５７０ｎｍより高いところでの新たな吸収ピークの出現は、ＡｕＣの製造に成功したかどうかを判断するための重要な指標である（文献２：非特許文献２）。ＡｕＣはまた、従来の金ナノ粒子とは大幅に異なる磁気的特性、電気的特性、及び触媒的特性を有するため、ＡｕＣは、単分子光電子工学、分子触媒作用の分野において広い応用の見通しがある。さらに、ＡｕＣはまた、それらの優れた蛍光発光特性のためバイオプローブ及び医用イメージングの分野においても使用されている。例えば、Sandeep Vermaのチームは、核イメージングのための緑色蛍光プローブとしてプリン修飾されたＡｕＣを使用している（文献３：非特許文献３）。この種類の文献は、ＡｕＣの蛍光特性を利用するものであり、ＡｕＣ自体の医薬活性には関連していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】N. Gao, H. Sun, K. Dong, J. Ren, X. Qu, Chemistry-A European Journal 2015, 21, 829
【非特許文献２】H.F. Qian, M.Z. Zhu, Z.K. Wu, R.C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470
【非特許文献３】V. Venkatesh, A. Shukla, S. Sivakumar, S. Verma, ACS Applied Materials & Interfaces 2014, 6, 2185
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ＡｕＣの医学的使用を提供することであり、特に緑内障の予防及び治療のための薬物の製造におけるＡｕＣの新規使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様においては、本発明は、緑内障の予防及び／又は治療のための薬物の製造におけるＡｕＣ含有物質の使用を提供する。
【００１０】
上記ＡｕＣ含有物質は、ＡｕＣとＡｕＣの外側を覆うリガンドＹとを含む。
【００１１】
上記ＡｕＣ含有物質は、溶液、粉末、又は綿状物である。
【００１２】
上記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満である。
【００１３】
上記ＡｕＣの金コア直径は、０．５ｎｍ〜２．６ｎｍ又は１．１ｎｍ〜２．６ｎｍである。
【００１４】
上記リガンドＹは、限定されるものではないが、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、並びにその他のチオール含有化合物の１つ以上を含む。
【００１５】
上記Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体は、Ｌ（Ｄ）−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、又はＮ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）であることが好ましい。
【００１６】
上記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システイン（ＲＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニン（ＣＲ）、Ｌ−システイン−Ｌ−ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）、Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−システインジペプチド（ＨＣ）、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｌ−リジン−Ｌ−システイン−Ｌ−プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、グリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、グリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、又はグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）から選択される。
【００１７】
その他のチオール含有化合物は、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）−グリシン、又はドデシルメルカプタン等から選択される。
【００１８】
上記ＡｕＣ含有物質を製造する方法は、以下の工程：
（１）ＨＡｕＣｌ4をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ4の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
（２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
（３）工程（１）における溶液Ａと工程（２）における溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ4とリガンドＹとの間のモル比が１：０．０１〜１：１００（好ましくは１：（０．１〜１０）、より好ましくは１：（１〜１０））であるように混合し、該混合物を氷浴中で０．１時間〜１２時間（好ましくは０．１時間〜２時間、より好ましくは０．５時間〜２時間）にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ4の溶液（好ましくはＮａＢＨ4の水溶液、ＮａＢＨ4のエタノール溶液又はＮａＢＨ4のメタノール溶液）を滴加し、次いで、その反応系を氷浴中で０．１時間〜１２時間（好ましくは０．１時間〜２時間、より好ましくは１時間〜２時間）にわたり撹拌するにあたり、ＮａＢＨ4とリガンドＹとの間のモル比は１：０．０１〜１：１００（好ましくは１：（０．１〜８）、より好ましくは１：（１〜８））であり、こうしてＡｕＣ含有の溶液様物質が得られる工程と、
を含む。
【００１９】
工程（２）における上記溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール、及び酢酸プロピルの１つ以上である。
【００２０】
工程（３）で得られる上記ＡｕＣ含有の溶液様物質を、透析及び凍結乾燥した後に、ＡｕＣを含有する粉末状物質又は綿状物質が得られ、好ましくは、上記透析は、上記ＡｕＣ含有の溶液様物質を透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析することである。
【００２１】
第２の態様においては、本発明は、緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造におけるＡｕＣの使用を提供する。上記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満である。上記ＡｕＣは、緑内障に活性又は不活性な成分であり得る種々のリガンドで修飾され得る。
【００２２】
第３の態様においては、本発明は、緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造における、Ｌ−ＮＩＢＣ、Ｄ−ＮＩＢＣ、ＣＲ、ＲＣ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＡＣ）、ＧＳＨ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、Ｌ−システイン、又はＤ−システインのリガンドで修飾されたＡｕＣの使用を提供する。
【００２３】
上記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満、好ましくは０．５ｎｍ〜２．６ｎｍである。
【００２４】
本発明において提供されるＡｕＣ又はＡｕＣ含有物質（リガンド修飾されたＡｕＣを指す）は、経口、注射（筋内注射又は静脈内注射）、又は局所的点眼により投与され得る。投与量及び投与頻度は、細胞モデル実験、動物モデル実験、薬物のｉｎ−ｖｉｖｏ分布、及び代謝実験の結果に従って計算され得る。
【００２５】
効力の点では、本発明において提供されるＡｕＣ又はＡｕＣ含有物質は、Ａβの凝集阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験においてＡβの凝集の阻害に対して優れた効果を示し、そしてＲＧＣ−５視神経節細胞損傷モデルにおける細胞生存率の改善に対して大きな効果を示す。ラットの緑内障視神経クランプ損傷モデルにおいて、上記ＡｕＣ又はＡｕＣ含有物質は、視神経挫滅損傷モデルラットでフラッシュ視覚誘発電位のＮ２−Ｐ２振幅を大幅に増大させ得て、ＲＧＣの喪失を大幅に低下させ得る。上記ＡｕＣ又はＡｕＣ含有物質は、視神経損傷に対して明らかな保護効果を有し、視野欠損及びＲＧＣのアポトーシスを減少させ得て、網膜組織及び視神経組織の構造の改善、並びに視機能障害の緩和に対して顕著な機能を有する。さらに、上記ＡｕＣ又はＡｕＣ含有物質は、動物レベルで優れた生体適合性を示す。したがって、上記ＡｕＣ又はＡｕＣ含有物質は、緑内障の予防及び治療のための新たな薬物の研究及び開発のために重要である。
【００２６】
同時に、本発明によれば、リガンド分子自体は、Ａβの凝集阻害の動態実験においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、及びＲＧＣ−５細胞損傷の緑内障細胞モデルにおいて明らかな効果を有しないことも裏付けられ、こうして緑内障に対する効力は、リガンドではなくＡｕＣに起因することが示される。ＡｕＣの新たな医学的使用は、本発明の重要な貢献である。ＡｕＣの緑内障への医薬活性に基づいて、ＡｕＣが更に既知の活性物質（限定されるものではないが、緑内障に対する活性を含む）又は担体及び助溶剤等のその他の不活性物質と組み合わせられれば、より優れた新たな薬物が形成されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】種々の粒度を有するリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の紫外（ＵＶ）−可視スペクトル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像、及び粒度分布図を示す。
【図２】種々の粒度を有するリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの紫外−可視スペクトル、ＴＥＭ像、及び粒度分布図を示す。
【図３】種々の粒度を有するリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの赤外スペクトルを示す。
【図４】１．８ｎｍの平均直径のＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの励起スペクトル及び近赤外蛍光発光スペクトルを示す。
【図５】Ａβ（１−４０）とリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子又はＡｕＣとを４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーを示す。
【図６】種々の粒度及び種々の濃度のリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子又はＡｕＣによるＡβ線維化の動態曲線を示す。
【図７】リガンドＣＲ修飾されたＡｕＣ（ＣＲ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布グラフを示す。
【図８】リガンドＲＣ修飾されたＡｕＣ（ＲＣ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。
【図９】リガンド１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（すなわち、Ｃａｐ）修飾されたＡｕＣ（Ｃａｐ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。
【図１０】リガンドＧＳＨ修飾されたＡｕＣ（ＧＳＨ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。
【図１１】リガンドＤ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ（Ｄ−ＮＩＢＣ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。
【図１２】種々のリガンド修飾されたＡｕＣの、Ａβ（１−４０）の凝集及び線維化に対する阻害効果の曲線を示す。
【図１３】リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の、ＲＧＣ−５細胞モデルにおけるＨ2Ｏ2誘発性の酸化ストレス緑内障の細胞生存性に対する効果を示す。
【図１４】リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の、ＲＧＣ−５細胞モデルにおけるニトロプルシドナトリウム誘発性のアポトーシス緑内障の細胞生存性に対する効果を示す。
【図１５】ＡｕＣ含有物質の、緑内障モデルにおけるラットの眼のｆＶＥＰのＮ２潜時に対する効果を示す。
【図１６】ＡｕＣ含有物質の、緑内障モデルにおけるラットの眼のｆＶＥＰのＰ２潜時に対する効果を示す。
【図１７】ＡｕＣ含有物質の、緑内障モデルにおけるラットの眼のｆＶＥＰのＮ２−Ｐ２振幅に対する効果を示す。
【図１８】ＡｕＣ含有物質を１４日連続で投与した後の、動物の網膜パッチのＢｒｎ３ａ染色、及び染色された陽性細胞の数の統計分析図を示す。
【図１９】ＡｕＣ含有物質を１４日連続で投与した後の、動物の網膜の病理切片のＨＥ染色結果、及びＲＧＣの数の統計分析図を示す。
【図２０】種々の粒度及び種々の濃度のＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの、ＳＨ−ｓｙ５ｙ神経芽腫細胞生存性に対する効果を示している図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
一定のリガンドを有する金ナノ粒子（金コア直径３ｎｍ〜１００ｎｍ）のＡβの凝集に対する効果を研究することにより、本発明者らは、金ナノ粒子の金コア直径を大きいものから小さいものへと変更した場合に、同じリガンドで表面が修飾された金ナノ粒子のＡβの凝集に対する促進効果は、阻害効果へと切り替わり、その粒度が金クラスター（ＡｕＣ）（金コア直径は３ｎｍ未満である）となるのに十分に小さい場合に、Ａβの凝集の完全な阻害が達成され得ることを見出した。この効果においては、リガンドではなくＡｕＣ自体が阻害の役割を担う。
【００２９】
一般的に、上記研究で使用される金ナノ粒子の金コア直径は、３ｎｍより大きく、該金コアの直径が３ｎｍより小さい場合に、金ナノ粒子は金クラスター（ＡｕＣ）と呼ばれる。紫外−可視吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴吸収ピーク（５２０±２０ｎｍ）の消失及び５６０ｎｍ又は５７０ｎｍより高いところでの新たな吸収ピークの出現は、ＡｕＣの製造に成功したかどうかを示す指標である。リガンドを有しないと、ＡｕＣは溶液中で安定に存在することができない。ＡｕＣがチオール含有リガンドと結合することで、リガンド修飾されたＡｕＣ（又はＡｕＣと呼ばれる）がＡｕ−Ｓ結合を介して形成される。
【００３０】
文献に開示される現存のリガンド修飾されたＡｕＣには、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）等で修飾されたＡｕＣが含まれる。製造方法は、文献（文献４：H. F. Qian, M. Z. Zhu, Z. K. Wu, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470、文献５：C. Gautier, T. Buergi, Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 11079）に示されており、それらは、主として触媒作用、キラル認識、分子検出、バイオセンシング、薬物送達、及びバイオイメージングの分野において利用される（文献６：G. Li, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2013, 46, 1749、文献７：H. F. Qian, M. Z. Zhu, Z. K. Wu, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470、文献８：J. F. Parker, C. A. Fields-Zinna, R. W. Murray, Accounts of Chemical Research 2010, 43, 1289、S. H. Yau, O. Varnavski, T. Goodson, Accounts of Chemical Research 2013, 46, 1506）。
【００３１】
本発明では、ＡｕＣのＡβの凝集の阻害に対する効果が調査され、最初に、種々のリガンド（Ａβの凝集に対して阻害効果を有しないリガンド）を含む種々のサイズのＡｕＣを研究対象として使用することを少なくとも含む。Ａβの凝集の阻害についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験と、ＲＧＣ−５視神経節細胞損傷モデル実験と、視神経挫滅損傷ラットモデルとを含む３段階の実験での研究と共に、ＡｕＣ細胞毒性、マウスにおける急性毒性実験、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ分布及び薬物動態の実験等を考慮して、リガンド修飾されたＡｕＣが提供され、緑内障を治療する薬物の製造におけるそれらの使用が見出され、そしてそれらの結果を金ナノ粒子の実験結果と比較することで、３ｎｍより大きい直径を有する金ナノ粒子は、この目的のために望ましい効果を有さず、緑内障を治療する薬物の製造に使用することができないが、その一方でリガンド修飾されたＡｕＣは、緑内障を治療する薬物の製造に使用することができることが示された。
【００３２】
以下で、本発明を更に実施形態において詳説するが、それらの実施形態は、本発明に何らかの限定を課すものと解釈されるべきではない。
【００３３】
以下の実施形態で使用される原材料の純度は、化学的純度又はそれより高いものとする。それらは全て市場から購入することができる。
【００３４】
実施形態１：リガンド修飾されたＡｕＣの製造
この実施形態は、リガンド修飾されたＡｕＣ（リガンド修飾されたＡｕＣは、本発明においてはＡｕＣ含有物質とも呼ばれる）を製造する方法であって、以下の工程：
（１）ＨＡｕＣｌ4をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ4の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
（２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
リガンドＹには、限定されるものではないが、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその他のシステイン誘導体、例えばＮ−イソブチリル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＩＢＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＩＢＣ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮ−アセチル−Ｄ−システイン、限定されるものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むシステイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、例えばＬ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−ヒスチジン（ＣＨ）、Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−システイン（ＨＣ）、Ｌ−リジン−Ｌ−システイン−Ｌ−プロリン（ＫＣＰ）、グリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ＧＳＨ）、グリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）並びにその他のチオール含有化合物、例えば１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール及びドデシルメルカプタンの１つ以上が含まれ、上記溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール及び酢酸プロピルの１つ以上である；
（３）溶液Ａと溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ4とリガンドＹとの間のモル比が１：（０．１〜１０）であるように混合し、それらを氷浴中で０．１時間〜２４時間にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ4の水溶液、エタノール溶液、又はメタノール溶液を添加し、氷水浴中で撹拌し続けて、０．１時間〜２時間にわたり反応させる工程と、
ＮａＢＨ4とリガンドＹとの間のモル比は１：（０．１〜８）であり、その際、ＡｕＣ含有の溶液様物質が得られる；
種々のサイズのＡｕＣを得て、粒度を測定し、そして使用を容易にするために、以下の工程が更に採用され得る：
（４）工程（３）において得られた溶液を、８０００回転／分〜１７５００回転／分の範囲内の種々の速度で反応完了後１０分間〜１００分間にわたり勾配により遠心分離することで、種々の回転速度下で種々の平均粒度のリガンド修飾されたＡｕＣ沈降物を得る工程と、
（５）工程（４）において得られた種々の平均粒度のＡｕＣ沈降物を水中に溶解させ、それを透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析する工程と、
（６）ＡｕＣを透析後１２時間〜２４時間にわたり凍結乾燥させることで、粉末状物質又は綿状物質、すなわちリガンド修飾されたＡｕＣを得る工程と、
を含む、方法を開示している。
【００３５】
得られた粉末状物質又は綿状物質（具体的な検出法は、実施形態２に示されている）を特性評価した。種々の回転速度で遠心分離することにより得られた沈降物の粒度は、３ｎｍより小さい（一般的に０．５ｎｍ〜２．６ｎｍに分布している）ことが判明した。紫外−可視吸収スペクトルは、５７０ｎｍより高いところに１つ以上の吸収ピークを有し、５２０ｎｍには明らかな吸収ピークを有しない。得られた粉末状物又は綿状物がＡｕＣであることが決定づけられる。
【００３６】
実施形態２：Ｎ−イソブチリル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＩＢＣ）であるリガンドを有するＡｕＣの製造
この実施形態においては、リガンドＬ−ＮＩＢＣを例にとって、種々の粒度のリガンドＬ−ＮＩＢＣで修飾されたＡｕＣの製造及び確認を詳説する。
【００３７】
（１）１．００ｇのＨＡｕＣｌ4を秤量し、それを１００ｍＬのメタノール中に溶解させることで、０．０３Ｍの溶液Ａを得る。
【００３８】
（２）０．５７ｇのＬ−ＮＩＢＣを秤量し、それを１００ｍＬの氷酢酸（酢酸）中に溶解させることで、０．０３Ｍの溶液Ｂを得る。
【００３９】
（３）１ｍＬの溶液Ａを計量し、それをそれぞれ０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬの溶液Ｂ（すなわち、ＨＡｕＣｌ4とＬ−ＮＩＢＣとの間のモル比はそれぞれ１：０．５、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５である）と混合し、氷浴中で撹拌しながら２時間にわたり反応させ、溶液が山吹色から無色に変わったら１ｍＬの新たに調製した０．０３Ｍ（１１．３ｍｇのＮａＢＨ4を秤量し、それを１０ｍＬのエタノール中に溶解させることにより調製される）のＮａＢＨ4エタノール溶液を素早く添加し、溶液が暗褐色に変わった後３０分間にわたりその反応を継続させ、そして１０ｍＬのアセトンを添加することで、その反応を止める。
【００４０】
（４）上記反応後に、その反応溶液を分画遠心分離（すなわち、勾配遠心分離による）にかけることで、種々の粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ粉末が得られる。この工程は限外濾過チューブと組み合わせて使用され得る。具体的な方法：工程（３）における反応が完了した後に、その反応溶液を、ＭＷＣＯが１０００００の５０ｍＬ容の限外濾過チューブに移し、１００００回転／分で２０分間にわたり遠心分離し、該チューブ中の保持液の沈降物は、約２．６ｎｍの粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ粉末であった（２．６ｎｍは、この保持液の沈降物を超純水中に再懸濁させることにより測定された）。次いで、該チューブの外側の溶液を５０ｍＬ容のＭＷＣＯが５００００の限外濾過チューブに移し、１３０００回転／分で３０分間にわたり遠心分離する。該チューブ中の保持液の沈降物は、約１．８ｎｍの粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ粉末である（１．８ｎｍは、この保持液の沈降物を超純水中に再懸濁させることにより測定された）。次いで、該チューブの外側の溶液を５０ｍＬ容のＭＷＣＯが３００００の限外濾過チューブに移し、１７５００回転／分で４０分間にわたり遠心分離する。内側チューブ中の保持液の沈降物は、約１．１ｎｍの粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ粉末である（１．１ｎｍは、この保持液の沈降物を超純水中に再懸濁させることにより測定された）。
【００４１】
（５）３種の異なる粒度の粉末が勾配遠心分離により得られ、溶剤をそれぞれ除去することで、粗生成物が得られた。該粗生成物をＮ2で吹き乾かし、５ｍＬの超純水中に溶解させ、透析バッグ（ＭＷＣＯは７０００Ｄａである）中に入れ、その後にそれを２Ｌの超純水中に入れた。１日おきに水を交換し、７日間にわたり透析し、それを凍結乾燥し、そして後で使用するために保持した。
【００４２】
特性評価実験は、上記で得られた粉末（リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ）について実施した。一方で、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子がコントロールとして使用される。Ｌ−ＮＩＢＣであるリガンドを有する金ナノ粒子の製造方法は、参考文献（文献１０：W. Yan, L. Xu, C. Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang and N. A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114、X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan and J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623）を参照する。
【００４３】
１．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態の観察
試験粉末（実施形態２で製造されたＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料及びＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子試料）を、試料として超純水中に溶解させて２ｍｇ／Ｌとし、次いで試験試料をハンギングドロップ法によって製造した。具体的な方法：５μＬの試料を超薄カーボンフィルム上に滴り落とし、水滴が消えるまで自然に蒸発させ、次いで該試料の形態を、ＪＥＭ−２１００Ｆ  ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出型高分解能ＴＥＭにより観察した。
【００４４】
リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の４つのＴＥＭ像は、図１のパネルＢ、パネルＥ、パネルＨ、及びパネルＫに示されており、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの３つのＴＥＭ像は、図２のパネルＢ、パネルＥ、及びパネルＨに示されている。
【００４５】
図２における画像は、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料が均一な粒度及び良好な分散性を有し、かつＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの平均直径（金コアの直径を指す）がそれぞれ１．１ｎｍ、１．８ｎｍ、及び２．６ｎｍであることを示しており、図２のパネルＣ、パネルＦ、及びパネルＩにおける結果とよく合致している。比較すると、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子試料は、より大きな粒度を有する。それらの平均直径（金コアの直径を指す）は、それぞれ３．６ｎｍ、６．０ｎｍ、１０．１ｎｍ、及び１８．２ｎｍであり、図１のパネルＣ、パネルＦ、パネルＩ、及びパネルＬにおける結果とよく合致している。
【００４６】
２．紫外（ＵＶ）−可視（ｖｉｓ）吸収スペクトル
試験粉末を、濃度が１０ｍｇ・Ｌ-1になるまで超純水中に溶解させ、室温でＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルにより測定した。スキャン範囲は、１９０ｎｍ〜１１００ｎｍであり、試料セルは、１ｃｍの光路を有する標準的な石英キュベットであり、参照セルは、超純水で満たした。
【００４７】
異なるサイズを有する４つのリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子試料のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルは、図１のパネルＡ、パネルＤ、パネルＧ、及びパネルＪに示されており、粒度の統計分布は、図１のパネルＣ、パネルＦ、パネルＩ、及びパネルＬに示されており、異なるサイズを有する３つのリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルは、図２のパネルＡ、パネルＤ、及びパネルＧに示されており、粒度の統計分布は、図２のパネルＣ、パネルＦ、及びパネルＩに示されている。
【００４８】
図１は、表面プラズモン効果により、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子が、約５２０ｎｍに吸収ピークを有したことを示している。その吸収ピークの位置は、粒度と関連している。粒度が３．６ｎｍである場合に、ＵＶ吸収ピークは５１６ｎｍに現れ、粒度が６．０ｎｍである場合に、ＵＶ吸収ピークは５１７ｎｍに現れ、粒度が１０．１ｎｍである場合に、ＵＶ吸収ピークは５２０ｎｍに現れ、そして粒度が１８．２ｎｍである場合に、その吸収ピークは５２３ｎｍに現れる。上記４つの試料のいずれも、５６０ｎｍ又は５７０ｎｍより高いところに吸収ピークを一切有しない。
【００４９】
図２は、実施形態２における異なる粒度を有する３つのリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料のＵＶ吸収スペクトルにおいて、５２０ｎｍでの表面プラズモン効果の吸収ピークが消失し、２つの明らかな吸収ピークが５７０ｎｍより高いところに出現し、吸収ピークの位置は、ＡｕＣの粒度と共に僅かに変化したことを示している。この理由は、ＡｕＣが面心立方構造の崩壊のため分子様の特性を示し、それによりＡｕＣの状態の密度の不連続性がもたらされ、エネルギー準位が分裂し、プラズモン共鳴効果が消失し、そして長波長方向に新たな吸収ピークが現れるからである。実施形態２において得られた異なる粒度における３つの粉末試料は、全てリガンド修飾されたＡｕＣであると結論付けることができた。
【００５０】
３．フーリエ変換赤外分光分析法
赤外スペクトルは、Bruker社により製造されたＶＥＲＴＥＸ８０Ｖフーリエ変換赤外分光計において固体粉末の高真空の全反射モードで測定した。スキャン範囲は４０００ｃｍ-1〜４００ｃｍ-1であり、スキャン数は６４である。実施形態２において製造されたＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料を例にとると、該試験試料は、３つの異なる粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ乾燥粉末であり、コントロール試料は、純粋なＬ−ＮＩＢＣ粉末であった。それらの結果を図３に示す。
【００５１】
図３は、種々の粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの赤外スペクトルを示す。純粋なＬ−ＮＩＢＣ（先頭の曲線）と比較すると、種々の粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣのＳ−Ｈ伸縮振動の全ては２５００ｃｍ-1〜２６００ｃｍ-1で完全に消失したが、一方で、Ｌ−ＮＩＢＣのその他の特徴的なピークは依然として観察されたため、Ｌ−ＮＩＢＣ分子は、Ａｕ−Ｓ結合を介してＡｕＣの表面にうまくつながっていることが分かる。図３は、リガンド修飾されたＡｕＣの赤外スペクトルがそのサイズと無関係であることも示している。
【００５２】
４．近赤外蛍光スペクトル
近赤外蛍光スペクトルは、Horiba JobinYvon社により製造されたNanoLog型の紫外可視近赤外蛍光分光光度計で測定した。試料セルは、１ｃｍの光路を有する標準的な石英キュベットであった。励起波長は４１５ｎｍであり、スリット幅は１０ｎｍであった。検出される発光波長の範囲は７００ｎｍ〜１５００ｎｍであり、スリット幅は１０ｎｍであった。実施形態２におけるＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料を例にとると、結果は図４に示された。
【００５３】
図４は、１．８ｎｍの平均直径のＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの励起スペクトル及び近赤外蛍光発光スペクトルであった。エネルギー準位の分裂のため、ＡｕＣは半導体量子ドットと類似した蛍光発光特性も示すことが判明した。その他の粒度及びリガンドのＡｕＣもこの特性を有したが、励起スペクトル及び発光スペクトルのピーク位置は、リガンド及びＡｕＣの粒度により僅かに変化した。同じリガンドを有する金ナノ粒子は、全てのバンドにおいて蛍光発光特性を有しなかった。
【００５４】
その他のリガンドＹにより修飾されたＡｕＣは、上記方法と同様であるが、但し、溶液Ｂの溶剤、ＨＡｕＣｌ4とリガンドＹとの間の供給比、反応時間、及び添加されるＮａＢＨ4の量が僅かに調節された方法により製造した。例えば、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＩＢＣ）又はＮ−イソブチリル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＩＢＣ）がリガンドＹとして使用される場合に、溶剤として酢酸が選択され、ジペプチドＣＲ、ジペプチドＲＣ又は１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリンがリガンドＹとして使用される場合に、溶剤として水が選択される等であり、その他の工程は同様であるため、それらは本明細書では詳細に記載しないものとする。
【００５５】
本発明では、上記方法により一連のリガンド修飾されたＡｕＣが製造及び取得された。リガンド及び製造方法のパラメータを、表１に示す。
【００５６】
【表１】
2020500858.tif 000002
【００５７】
表１に列挙される実施形態における試料は、上記方法により確認される。図７〜図１１は、リガンドＣＲ、ＲＣ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（略語：Ｃａｐ）、ＧＳＨ、及びＤ−ＮＩＢＣで修飾されたＡｕＣのＵＶスペクトル（図７〜図１１におけるパネルＡ）、赤外スペクトル（図７〜図１１におけるパネルＢ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図７〜図１１におけるパネルＣ）、及び粒度分布（図７〜図１１におけるパネルＤ）である。
【００５８】
それらの結果は、表１から得られる種々のリガンドで修飾されたＡｕＣの直径が全て３ｎｍより小さいことを示している。紫外スペクトルはまた５２０±２０ｎｍでのピークの消失と、５６０ｎｍより高いところ（５６０ｎｍ又は５７０ｎｍ）での吸収ピークの出現を示す。この吸収ピークの位置は、リガンド及び粒度によって僅かに変化するにすぎない。一方で、フーリエ変換赤外スペクトルはまた、リガンドのチオールの赤外吸収ピーク（図７〜図１１のパネルＢにおける点線の間）の消失を示すが、一方でその他の赤外の特徴的なピークは全て維持されるので、全てのリガンド分子はＡｕＣの表面にうまくつながっており、かつ本発明では、表１中に列挙されるリガンドで修飾されたＡｕＣを得ることに成功したことが示唆される。
【００５９】
実施形態３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡβの凝集動態実験
上記のように、Ａβは緑内障の病因において重要な役割を担い、そして視神経保護機序に基づく緑内障の治療のための重要な標的である。この実施形態は、Ａβの凝集動態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によりＡｕＣ（リガンド修飾されたＡｕＣ）の機能を調査し、同じリガンド修飾された金ナノ粒子及びリガンド分子の独立した使用によるＡβの凝集動態に対する効果を比較することで、ＡｕＣはＡβの凝集を完全に阻害し得るが、金ナノ粒子はこの機能を有しないことが分かった。さらに、その機能は、リガンドではなくＡｕＣに起因するものである。それらの実験では、Ａβ（１−４０）の凝集及び線維化の動態を特性評価するためにＴｈＴ蛍光標識法が使用された。
【００６０】
チオフラビンＴ（略記：ＴｈＴ）は、アミロイド線維を特異的に染色するための色素である。ＴｈＴをポリペプチド又はタンパク質の単量体と一緒にインキュベートする場合に、その蛍光はほぼ変化しない。ＴｈＴが線維構造を有するアミロイドポリペプチド又はタンパク質に出くわすと、そのアミロイドポリペプチド又はタンパク質と直ちに結合し、その蛍光強度は指数関数的に増加することとなる。まさにこの特性のため、ＴｈＴは、ペプチド又はタンパク質のアミロイドーシスをモニタリングするためのマーカーとして広く使用されている。Ａβ（１−４０）の線維化過程はまた、核形成に制御される重合過程でもある。したがって、ＴｈＴ蛍光標識法により測定されるＡβ（１−４０）線維の成長曲線は、主として３つの段階、すなわち初期段階、成長段階、及び定常段階に分けられる。初期段階は、主としてＡβ（１−４０）がコンフォメーション遷移を受けることでミスフォールディングが形成され、その後に凝集及び核形成する段階である。成長段階は、Ａβ（１−４０）単量体がオリゴマーのコア上に軸方向に沿って蓄積することで、線維を形成し、素早く成長する段階である。定常段階は、全てのＡβ（１−４０）分子が完全な長い線維を形成している段階、すなわち線維がもはや成長しない段階である。ＴｈＴ蛍光標識法は、Ａβ（１−４０）分子の線維性凝集の動態過程を簡便にモニタリングすることができる。
【００６１】
１）Ａβ（１−４０）単量体の前処理
アミロイドポリペプチドＡβ（１−４０）の凍結乾燥粉末（Invitrogen Corp.社）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解させることで、１ｇ／ＬのＡβ（１−４０）溶液を得て、その溶液を、密封後に室温で２時間〜４時間にわたりインキュベートし、次いでＨＦＩＰを、高純度窒素（Ｎ2、９９．９％）を用いて適切な流速でドラフトチャンバ内にて風乾（約１時間にわたり）させた。最後に、乾燥されたＡβ（１−４０）を２００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、密封後にその溶液を、後に使用するために１週間以内にわたり冷凍機中で−２０℃に保った。使用前に、アミロイドポリペプチドのＤＭＳＯ溶液を、Ａβ（１−４０）の濃度が２０μＭに達するまで、大量のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で希釈することで、Ａβ（１−４０）ＰＢＳ溶液を得た。実験のための全てのＡβ（１−４０）ＰＢＳ溶液は新たに調製された。
【００６２】
２）試料の調製及び検出
リガンド修飾されたＡｕＣ及び金ナノ粒子を、それぞれ２０μＭのＡβ（１−４０）ＰＢＳに添加することで、種々の濃度及び種々の粒度の、種々のリガンドで修飾されたＡｕＣの試料を形成し、相応して種々のリガンドで修飾された金ナノ粒子の試料を形成した。それらの試料を、９６ウェルプレート中で３７℃においてＴｈＴ蛍光標識法によって連続的にインキュベートし、蛍光強度をマイクロプレートリーダにより１０分毎に１回モニタリングした。Ａβ（１−４０）凝集の動態過程を、ＴｈＴの蛍光強度の変化によって特性評価した。
【００６３】
実施形態２においてそれぞれ製造された２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、及び１．１ｎｍの粒度を有する３つのサイズのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを、実験群として使用した。それぞれ１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、及び３．６ｎｍの粒度を有する４つのサイズのＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子、並びにＡｕＣ又は金ナノ粒子と結合されていないＬ−ＮＩＢＣ分子を、コントロール群として使用した。全てのサイズのＡｕＣ又は金ナノ粒子は、それぞれ６つの濃度で存在し、それぞれ０ｐｐｍ（ブランクコントロールとしてＡｕＣ、金ナノ粒子、又はＬ−ＮＩＢＣを含有していない）、０．１ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ、５．０ｐｐｍ、１０．０ｐｐｍ、及び２０．０ｐｐｍであった。それぞれ１．０ｐｐｍ及び１０．０ｐｐｍである２つの濃度でＬ−ＮＩＢＣ分子を使用した。
【００６４】
それらの結果を図５及び図６に示す。
【００６５】
図５は、それぞれの実験群及びコントロール群を４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡβ（１−４０）のＡＦＭトポグラフィーを示す。パネルＡは、Ａβ（１−４０）を単独で４８時間にわたりインキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。パネルＢは、Ａβ（１−４０）をＬ−ＮＩＢＣと一緒に４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。パネルＣ及びパネルＤは、Ａβ（１−４０）をそれぞれ６．０ｎｍ及び３．６ｎｍの平均粒度を有する金ナノ粒子（Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されている）と一緒に４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。そして、パネルＥは、Ａβ（１−４０）を１．８ｎｍの平均粒度におけるＡｕＣ（Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されている）と一緒に４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。
【００６６】
図６において、Ｌ−ＮＩＢＣの種々の濃度におけるＡβ（１−４０）のアミロイドーシス動態曲線がパネルＡに示されている。それぞれ１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、及び３．６ｎｍのサイズを有する金ナノ粒子の種々の濃度におけるＡβ（１−４０）のアミロイドーシス動態曲線がパネルＢ〜パネルＥに示されている。それぞれ２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、及び１．１ｎｍのサイズを有するＡｕＣの種々の濃度におけるＡβ（１−４０）のアミロイドーシス動態曲線がパネルＦ〜パネルＨに示されている。パネルＡ〜パネルＨにおけるＡβのアミロイドーシス動態曲線は、Ａβ（１−４０）を種々の濃度において金ナノ粒子又はＡｕＣと同時インキュベートした場合の曲線であり、□は０ｐｐｍ（すなわち、金ナノ粒子及びＡｕＣなし）を表し、○は０．１ｐｐｍを表し、△は１ｐｐｍを表し、▽は５ｐｐｍを表し、◇は１０ｐｐｍを表し、☆は２０ｐｐｍを表した。
【００６７】
図５から、コントロールとしてＡβ線維がパネルＡ中に張り巡らされており、パネルＢも同じであり、線維が或る程度は減少したが、長い線維は依然としてパネルＣ中に見ることができ、長い線維は存在しないが、多くのＡβの短い線維が依然としてパネルＤ中に存在することが見て取れる。Ｌ−ＮＩＢＣはＡβ（１−４０）線維の形成に対して明らかな効果を有しないことが示された。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された小さなサイズの金ナノ粒子の添加は、Ａβ（１−４０）のアミロイドーシス過程を遅延させ得るが、完全に阻害し得なかった。それというのも、上記短い線維は、更なる時間後に長い線維へと成長し続けることとなるからである。図５のパネルＥには、長い線維も短い線維も存在しないので、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣはＡβ（１−４０）のアミロイドーシス過程を完全に阻害し得ることが示唆された。
【００６８】
図５は、定性的実験であるが、図６は、定量的実験である。図６の結果は、Ｌ−ＮＩＢＣの添加が、Ａβ（１−４０）アミロイドーシスの動態に明らかな効果を有さず（図６のパネルＡ）、粒子直径が１０．１ｎｍ以上である場合の金ナノ粒子については、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の添加がＡβの凝集動態の成長段階及び定常段階の両方を前倒すので（金ナノ粒子の濃度が２０ｐｐｍである場合に、Ａβの凝集動態の成長段階は第１２時間目まで前倒され、そして定常段階は第１６時間目まで前倒された）、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子はＡβの凝集を加速させ得ることが示唆され（図６のパネルＢ及びパネルＣ）、金ナノ粒子の直径が６．０ｎｍ以下である場合には（図６のパネルＤ及びパネルＥ）、Ａβの凝集の開始時間が遅延され得るので（Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の濃度が２０ｐｐｍである場合に、Ａβの凝集動態の成長段階は第５４時間目まで遅延された）、金ナノ粒子はＡβの凝集に対して阻害効果を有することが示唆されることを示している。しかしながら、図６は、上記濃度が非常に高い（２０．０ｐｐｍ）としても、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の添加は完全に阻害する（すなわち、成長段階は現れず、蛍光曲線は完全に平坦にする）ことができなかったことを示している。他方で、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の添加後に、ＴｈＴの蛍光発光ピークは５１５ｎｍに位置している一方で、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子のプラズモン共鳴吸収ピークは５２０ｎｍ近くに位置するので、ここで観察されたＴｈＴ蛍光強度の減少は、該金ナノ粒子のＴｈＴ蛍光に対するプラズモン共鳴効果の部分的クエンチングであり、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子のＡβ（１−４０）凝集に対する阻害効果によるものではないはずである。
【００６９】
図６のパネルＦ〜パネルＨは、全てのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣが、Ａβの凝集を大幅に阻害し得た（成長段階の開始時間が延期された。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの濃度が５ｐｐｍである場合に、２０μＭのＡβの凝集動態における成長段階の開始時間が、５０時間より後に遅延され得た）ことを示している。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの濃度が１０ｐｐｍ以上である場合に、Ａβの凝集は、完全に阻害され得た（成長段階は現れず、蛍光曲線は完全に平坦であった）。完全な阻害のために必要とされるＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの最小濃度は、リガンドの種類及びＡｕＣの直径に関連している。１．１ｎｍ、１．８ｎｍ、及び２．６ｎｍのサイズを有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの最小濃度は、それぞれ５．０ｐｐｍ、５．０ｐｐｍ、及び１０．０ｐｐｍであった。さらに、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣはプラズモン共鳴効果を有しないので、それらはＴｈＴ蛍光に対してクエンチング効果を有しない。したがって、ここで観察される蛍光強度における減少は、もっぱらＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣのＡβ（１−４０）凝集に対する阻害効果によるものであった。図６の定量的結果は、図５の定性的結果とよく合致している。
【００７０】
この実験は、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子のサイズが６．０ｎｍ以下である場合に、該金ナノ粒子は、Ａβの凝集及び線維化に対して一定の阻害効果を有するが、それは限定的であり、またＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、Ａβの凝集及び線維化を完全に阻害する機能を有することを示している。Ｌ−ＮＩＢＣ分子自体はＡβの凝集及び線維化に影響を及ぼし得ないので（図５のパネルＢ及び図６のパネルＡの点からみて）、この機能はＡｕＣに起因するものであり、Ｌ−ＮＩＢＣリガンドに起因するものではない。
【００７１】
この実験結果は、ＡｕＣを使用してＡβの凝集及び線維化に関連する疾患に対する医薬を形成する研究及び開発を力強く支持したので、Ａβの凝集及び線維化に関連する疾患（例えば、緑内障）のための医薬の形成のための礎を築いた。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、本発明において規定されるＡｕＣ含有物質として分類され得る。
【００７２】
また、この実施形態により、表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣの機能が確認される。例えば、図１２のパネルＡ〜パネルＨは、ＣＲ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）、ＧＳＨ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、Ｄ−ＮＩＢＣ、ＲＣ又はＬ−システイン及びＤ−システインで修飾されたＡｕＣ（用量は１０ｐｐｍである）の、Ａβ（１−４０）の凝集及び線維化に対する阻害効果を示している。同様の現象が、種々のリガンドで修飾されたＡｕＣについて観察され、同じ結論となり得る。これらのリガンド自体は、Ａβの凝集及び線維化に影響を及ぼし得ず、３ｎｍより大きいサイズを有するリガンド修飾された金ナノ粒子は、Ａβの凝集及び線維化に対して限られた阻害効果しか有さず、そしてより大きい金ナノ粒子は、Ａβの凝集及び線維化の促進さえもするが、リガンド修飾されたＡｕＣは、Ａβの凝集及び線維化に対して優れた阻害効果を有し、また、その濃度が５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍを上回る場合に、完全な阻害効果を達成することができ、完全な阻害のために必要とされる最小濃度は、リガンド及びＡｕＣの粒度に伴い僅かに変動する。同様に、これらのリガンド修飾されたＡｕＣは、本発明において定義されるＡｕＣ含有物質に分類される。
【００７３】
ＡｕＣはリガンドなしには溶液中で安定的に存在し得ないので、ＡｕＣはこの実験においてはリガンドで修飾される。しかしながら、実験結果によれば、ＡｕＣ自体は機能的成分としてＡβの凝集及び線維化に影響を及ぼすことが示された。したがって、本発明においてもたらされるＡｕＣの上述の機能に基づいてなされた他の変更、例えばリガンドなし、リガンドの変更、活性リガンド又は不活性リガンド、及びＡｕＣと他の運搬体又は医薬との併用は全て本発明に基づいてなされる。
【００７４】
実施形態４：Ｈ2Ｏ2誘発性のＲＧＣ−５細胞の酸化ストレス損傷モデル実験
細胞生存性をこの実施形態の実験における指標として使用した。ＣＣＫ−８法の試験結果は、リガンド修飾されたＡｕＣのＨ2Ｏ2誘発性細胞毒性に対する効果を反映し、リガンド修飾されたＡｕＣが、神経節細胞の酸化ストレス損傷機序に対する神経保護効果を有することが示された。
【００７５】
実験１：
対数増殖期におけるＲＧＣ−５細胞を、完全培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）で希釈して、５×１０4／ｍＬの密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬで接種し、５％ＣＯ2を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。実験群における投与方式の１つは以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、５０μＬの試験物質（試験物質は、２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、若しくは１．１ｎｍの粒度の３種のＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ、又は１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、若しくは３．６ｎｍの粒度の４種のＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子、又は参照としてのＡｕＣ若しくは金ナノ粒子と結合されていないＬ−ＮＩＢＣ分子であった）の、維持培地（ＤＭＥＭ培地＋２％のＦＢＳ＋１％のペニシリン−ストレプトマイシン）により調製された種々の濃度の溶液を異なるウェルに加えて、それぞれ０．０１ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いで５０μＬのＨ2Ｏ2（最終濃度は１００μＭであった）を、２時間の前処理後に投与群及びモデル群に加えた。それらの細胞を２４時間にわたりインキュベートし、次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＨ2Ｏ2損傷に対する予備的保護効果を評価した。実験群における他の投与方式は、以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、維持培地により調製された５０μＬのＨ2Ｏ2溶液を異なるウェルに加え（最終濃度は、１００μＭであった）、それぞれ４時間、８時間、１２時間、及び２４時間にわたりインキュベートし、次いで維持培地により調製された種々の濃度の５０μＬの試験物質溶液を、異なるインキュベート時間でウェルのそれぞれの群に加えて、０．０１ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いでそれぞれ２４時間にわたりインキュベートした。次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＨ2Ｏ2損傷に対する治癒効果を評価した。上記実験においては、細胞を有しないブランクコントロール群、細胞の処置を伴わないコントロール群、及び１００μＭのＨ2Ｏ2により処置された細胞を有する損傷コントロール群を設けた。
【００７６】
上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＨ2Ｏ2損傷されたＲＧＣ細胞モデルの細胞生存性を大幅に高め得ることが示されたことから、それらのリガンド修飾されたＡｕＣは、酸化ストレスにより惹起されるＲＧＣのアポトーシスに対抗し得ることが示された。比較して、同じリガンドで修飾されているがより大きなサイズの金ナノ粒子は、酸化ストレスにより惹起されるＲＧＣのアポトーシスに対して良好又は明確な効果を有さず、Ｌ−ＮＩＢＣは、酸化ストレスにより惹起されるＲＧＣのアポトーシスに対して明確な効果を有しなかった。種々のリガンドで修飾されたＡｕＣは類似の効果を有したが、対応するリガンド自体は明確な効果を有しなかったため、この効果はリガンドではなくＡｕＣに由来するものであることが示された。
【００７７】
実験２：
対数増殖期におけるＲＧＣ−５細胞を、完全培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）で希釈して、５×１０4／ｍＬの密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬで接種し、５％ＣＯ2を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、ＡｕＣ又は金ナノ粒子の、維持培地（ＤＭＥＭ培地＋２％のＦＢＳ＋１％のペニシリン−ストレプトマイシン）により調製された種々の濃度の５０μＬの溶液を異なるウェルに加えて、それぞれ０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いで５０μＬのＨ2Ｏ2（最終濃度は１０５μＭであった）を、２時間の前処理後に投与群及びモデル群に加えた。それらの細胞を２４時間にわたりインキュベートし、次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＨ2Ｏ2損傷に対する予備的保護効果を評価した。上記実験においては、何ら処置がなされていないブランクコントロール群、１０５μＭのＨ2Ｏ2で処置された細胞のモデルコントロール群、１００ｐｐｍのＡｕＣを加えたがＨ2Ｏ2を加えなかった細胞のＡｕＣコントロール群、及び１０ｐｐｍのリガンド及び１０５μＭのＨ2Ｏ2を加えたがＡｕＣ又は金ナノ粒子を加えなかった細胞のリガンドコントロール群を同時に設けた。
【００７８】
Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の実験結果は、例えば図１３に示された。上記結果により、２４時間の培養後に、１００ｐｐｍのＡｕＣを加えたがＨ2Ｏ2で処置されなかったＡｕＣコントロール群の細胞生存性が、ブランクコントロール群（１００％であると定める）に対して１１１．５±６．２％に高まることが示されたので（Ｐ＜０．０５）、ＡｕＣは無毒性であることが示唆された。１００μＭのＨ2Ｏ2が加えられたがＡｕＣ又は金ナノ粒子を加えなかったモデルコントロール群の細胞生存性は、４３．０±７．８％に減少し（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．００５）、１０ｐｐｍのＬ−ＮＩＢＣ及び１００μＭのＨ2Ｏ2を加えたがＡｕＣ又は金ナノ粒子を加えなかったリガンドコントロール群の細胞生存性は４７．５±６．６％であったので（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１、及びモデルコントロール群に対して、Ｐ＞０．０５）、リガンド単独は、Ｈ2Ｏ2損傷された細胞モデルの細胞生存性を高めないことが示唆された。０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍのＡｕＣを加えた投与群の細胞生存性は、それぞれ６９．８±９．５％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０５）、８３．３±６．１％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、及び８６．８±７．４％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）に高まった。その一方で、３つの実験濃度での６．０ｎｍの平均サイズでの相応のリガンドの金ナノ粒子は、細胞生存性の点でモデルコントロール群とは明確な差を有しなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００７９】
上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＨ2Ｏ2損傷されたＲＧＣ細胞モデルの細胞生存性を大幅に高め得ることが示されたことから、それらのリガンド修飾されたＡｕＣは、酸化ストレスにより惹起されるＲＧＣのアポトーシスに対抗し得る一方で、Ｌ−ＮＩＢＣは、酸化ストレスにより惹起されるＲＧＣのアポトーシスに対して明確な効果を有さず、この効果は、リガンドではなくＡｕＣに由来するものであることが示唆された。同じリガンドで修飾されているがより大きなサイズの金ナノ粒子は、酸化ストレスにより惹起されるＲＧＣのアポトーシスに対して明確な効果を有しないことから、金ナノ粒子は、緑内障を予防及び治療する薬物として使用され得ないことが示唆された。
【００８０】
表１に列挙される種々のリガンドで修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子に同じ工程を採用して、実験を行った。それらの効果は同様であったので、それらは本明細書では詳細に記載しないこととする。
【００８１】
実施形態５：Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）誘発性のＲＧＣ−５細胞の興奮毒性モデル実験
この実施形態は、指標として細胞生存率を使用した。ＣＣＫ−８法の試験結果は、リガンド修飾されたＡｕＣのＮＭＤＡ誘発性細胞毒性に対する効果を反映し、こうしてＡｕＣが神経伝達物質の興奮毒性損傷機序に対する神経保護効果を有することが示された。
【００８２】
対数増殖期におけるＲＧＣ−５細胞を、完全培地で希釈して、５×１０4／ｍＬの密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬで接種し、５％ＣＯ2を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。実験群における投与方式の１つは以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、５０μＬの試験物質（試験物質は、２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、若しくは１．１ｎｍの粒度の３種のＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ、又は１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、若しくは３．６ｎｍの粒度の４種のＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子、又は参照としてのＡｕＣ若しくは金ナノ粒子と結合されていないＬ−ＮＩＢＣ分子であった）の、維持培地により調製された種々の濃度の溶液を異なるウェルに加えて、それぞれ０．０１ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いで５０μＬのＮＭＤＡ（最終濃度は２５０μＭであった）を、２時間の前処理後に投与群及びモデル群に加えた。それらの細胞を２４時間にわたりインキュベートし、次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＮＭＤＡ損傷に対する予備的保護効果を評価した。実験群における他の投与方式は、以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、維持培地により調製された５０μＬのＮＭＤＡ溶液を加え（最終濃度は、２５０μＭであった）、それぞれ４時間、８時間、１２時間、及び２４時間にわたりインキュベートし、次いで維持培地により調製された種々の濃度の５０μＬの試験物質溶液を加えて、０．０１ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いでそれぞれ２４時間にわたりインキュベートした。次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＮＭＤＡ損傷に対する治癒効果を評価した。上記実験においては、細胞を有しないブランクコントロール群、細胞の処置を伴わないコントロール群、及び２５０μＭのＮＭＤＡにより処置された細胞を有する損傷コントロール群を設けた。
【００８３】
上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＮＭＤＡ誘発性の興奮毒性損傷ＲＧＣ細胞モデルの細胞生存性を大幅に高め得ることが示されたことから、それらのリガンド修飾されたＡｕＣは、神経伝達物質媒介性の興奮性ＲＧＣアポトーシスを阻害し得ることが示された。比較して、同じリガンドで修飾されているがより大きなサイズの金ナノ粒子は、神経伝達物質媒介性の興奮性ＲＧＣアポトーシスに対して良好又は明確な効果を有さず、Ｌ−ＮＩＢＣは、神経伝達物質媒介性の興奮性ＲＧＣアポトーシスに対して明確な効果を有しなかった。種々のリガンドで修飾されたＡｕＣは類似の効果を有したが、対応するリガンド自体は明確な効果を有しなかったため、この効果はリガンドではなくＡｕＣに由来するものであることが示された。
【００８４】
実施形態６：ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）誘発性のＲＧＣ−５アポトーシスモデル実験
細胞生存性をこの実施形態の実験における指標として使用した。ＣＣＫ−８法の試験結果は、リガンド修飾されたＡｕＣのＳＮＰ誘発性細胞毒性に対する効果を反映し、リガンド修飾されたＡｕＣが、ＳＮＰ誘発性のＲＧＣ−５アポトーシスに対する神経保護効果を有することが示された。
【００８５】
実験１：
対数増殖期におけるＲＧＣ−５細胞を、完全培地で希釈して、５×１０4／ｍＬの密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬで接種し、５％ＣＯ2を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。実験群における投与方式の１つは以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、５０μＬの試験物質（試験物質は、２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、若しくは１．１ｎｍの粒度の３種のＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ、又は１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、若しくは３．６ｎｍの粒度の４種のＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子、又は参照としてのＡｕＣ若しくは金ナノ粒子と結合されていないＬ−ＮＩＢＣ分子であった）の、維持培地により調製された種々の濃度の溶液を加えて、それぞれ０．０１ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いで維持培地により調製された５０μＬのＳＮＰ溶液（最終濃度は７５０μＭであった）を、２時間の前処理後に投与群及びモデル群に加えた。それらの細胞を２４時間にわたりインキュベートし、次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＳＮＰ損傷に対する予備的保護効果を評価した。実験群における他の投与方式は、以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、維持培地により調製された５０μＬのＳＮＰ溶液を加え（最終濃度は、７５０μＭであった）、それぞれ４時間、８時間、１２時間、及び２４時間にわたりインキュベートし、次いで維持培地により調製された種々の濃度の５０μＬの試験物質溶液を加えて、０．０１ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いでそれぞれ２４時間にわたりインキュベートした。次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＳＮＰ損傷に対する治癒効果を評価した。上記実験においては、細胞を有しないブランクコントロール群、細胞の処置を伴わないコントロール群、及び２５０μＭのＳＮＰにより処置された細胞を有する損傷コントロール群を設けた。
【００８６】
上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＳＮＰ損傷されたＲＧＣ細胞モデルの細胞生存性を大幅に高め得ることが示されたことから、それらのリガンド修飾されたＡｕＣは、脳虚血及び低酸素症により誘発されたＲＧＣのアポトーシスに対して保護効果を有することが示された。比較して、同じリガンドで修飾されているがより大きなサイズの金ナノ粒子は、脳虚血及び低酸素症により誘発されたＲＧＣのアポトーシスに対して良好又は明確な保護効果を有さず、Ｌ−ＮＩＢＣは、脳虚血及び低酸素症により誘発されたＲＧＣのアポトーシスに対して明確な効果を有しなかった。種々のリガンドで修飾されたＡｕＣは類似の効果を有したが、対応するリガンド自体は明確な効果を有しなかったため、この効果はリガンドではなくＡｕＣに由来するものであることが示された。
【００８７】
実験２：
対数増殖期におけるＲＧＣ−５細胞を、完全培地で希釈して、５×１０4／ｍＬの密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬで接種し、５％ＣＯ2を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。実験群における投与方式の１つは以下の通りである：細胞がウェルに付着したら最初の培養培地を除去し、ＡｕＣ又は金ナノ粒子の、維持培地により調製された種々の濃度の５０μＬの溶液を加えて、それぞれ０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍの最終濃度にし、次いで維持培地により調製された５０μＬのＳＮＰ溶液（最終濃度は７００μＭであった）を、２時間の前処理後に投与群及びモデル群に加えた。それらの細胞を２４時間にわたりインキュベートし、次いで１０％のＣＣＫ−８をそれぞれのウェルに加え、そして４時間にわたりインキュベートした。それぞれのウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度値を測定することで、ＡｕＣのＳＮＰ損傷に対する予備的保護効果を評価した。上記実験においては、何ら処置がなされていないブランクコントロール群、７００μＭのＳＮＰで処置された細胞のモデルコントロール群、１００ｐｐｍのＡｕＣを加えたがＳＮＰを加えなかった細胞のＡｕＣコントロール群、及び１０ｐｐｍのリガンド及び７００μＭのＳＮＰを加えたがＡｕＣ又は金ナノ粒子を加えなかった細胞のリガンドコントロール群を同時に設けた。
【００８８】
Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の実験結果は、例えば図１４に示された。上記結果により、２４時間の培養後に、１００ｐｐｍのＡｕＣを加えたがＳＮＰで処置されなかったＡｕＣコントロール群の細胞生存性が、ブランクコントロール群（１００％であると定める）に対して１１５．４±４．８％に高まることが示されたので（Ｐ＜０．０５）、ＡｕＣは無毒性であることが示唆された。モデルコントロール群の細胞生存性は、５６．７±６．０％に減少し（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．００１）、リガンドコントロール群の細胞生存性は５２．８±８．０％であったので（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１、及びモデルコントロール群に対して、Ｐ＞０．０５）、リガンド単独は、ＳＮＰ損傷された細胞モデルの細胞生存性を高めないことが示唆された。０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍのＡｕＣを加えた投与群の細胞生存性は、それぞれ８９．０±７．２％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、９２．５±７．７％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、及び８３．５±５．２％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）に高まった。その一方で、３つの実験濃度での６．０ｎｍの平均サイズでの相応のリガンドの金ナノ粒子は、細胞生存性の点でモデルコントロール群とは明確な差を有しなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００８９】
上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＳＮＰ損傷されたＲＧＣ細胞モデルの細胞生存性を大幅に高め得ることが示されたことから、それらのリガンド修飾されたＡｕＣは、ＳＮＰ誘発性ＲＧＣアポトーシスに対抗し得る一方で、Ｌ−ＮＩＢＣは、ＳＮＰ誘発性ＲＧＣアポトーシスに対して明確な効果を有さず、この効果は、リガンドではなくＡｕＣに由来するものであることが示唆された。同じリガンドで修飾されているがより大きなサイズの金ナノ粒子は、ＳＮＰ誘発性ＲＧＣアポトーシスに対して明確な効果を有しないことから、金ナノ粒子は、緑内障を予防及び治療する薬物として使用され得ないことが示唆された。
【００９０】
表１に列挙される種々のリガンドで修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子に同じ工程を採用して、実験を行った。それらの効果は同様であったので、それらは本明細書では詳細に記載しないこととする。
【００９１】
実施形態７：視神経挫滅損傷ラットモデル実験
視神経挫滅損傷ラットモデルは、高い眼内圧を伴わない緑内障のための広く使用される動物モデルである。該モデルは、逆作用ピンセットを用いて一定の圧力下でラットの視神経をクランプすることにより作製される不完全な損傷モデルである。該モデルは視神経の神経上膜の完全性を維持し、作業が簡単であり、再現性が良く、そして緑内障の臨床的特徴に近い。該モデルは、緑内障関連の視神経損傷及び網膜機能の調査のための完成された動物モデルである。特にこのモデルは、ＲＧＣ死の病理学的過程、並びに視神経損傷及びＲＧＣのアポトーシスを阻害又は遅延させる薬物の調査において広く使用される。
【００９２】
実験１：
１）ラットの視神経クランプ損傷モデルの作製
１０８匹のＳＰＦの雄の成体のブラウンノルウェーラットに、１週間の適応的採餌の後に５％の抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔した。ラットの右眼周りの皮膚を通常のように殺菌した。双眼手術顕微鏡下で、外側眼角及び結膜を切り開き、Hada腺（Hada gland：ハーダー腺）及び涙腺組織を押し開き、強膜壁に沿って外直筋まで分離した。視神経を剥離して露出させた。その視神経を非侵襲型血管クランプを用いて眼球に対して１ｍｍ後方で１０秒間にわたりクランプすることで、視神経の損傷を引き起こした。クランプ過程の間に血管は避けられるべきである。クランプが終わった後に、外直筋の破断端と組織層と縫合することで結膜嚢を修復した。手術後に、眼底網膜血管の状態を観察し、トブラデックス点眼剤を適用し、そして眼瞼を縫合した。手術後の初日に、ラット視神経クランプモデルの作製に成功したかどうかを観察した。合併症（網膜虚血及び網膜前方の硝子体出血等）が観察されなかった場合に、それを成功したモデルとみなした。不成功のモデルは実験から取り除くこととする。全てのラットの左眼はコントロールとして処置しなかった。
【００９３】
２）動物実験：１０８匹の視神経クランプ損傷モデルラットを、投薬時間に応じて無作為に３つの群、すなわち７日目の標本群、１４日目の標本群、及び２１日目の標本群（ｎ＝３６匹のラット／群）に分けた。各群を更に高用量群（ＡｕＣの濃度：５ｇ／Ｌ）、低用量群（ＡｕＣの濃度：１ｇ／Ｌ）、及びコントロール群（生理食塩水）（ｎ＝１２匹のラット／群）を含む３つの小群に無作為に分けた。モデル作製の日から２０μｌ／眼の試験化合物溶液を、高用量群及び低用量群におけるラットの右眼に滴加した。モデル作製が成功した日から１０μｌ／眼の生理食塩水を、コントロール群におけるラットの右眼に滴加した。１０μｌ／眼の生理食塩水を、コントロールとして、ラット（コントロール群、高用量群、及び低用量群を含む）の左眼に滴加した。滴加頻度及び時間は、それぞれ７日間、１４日間、及び２１日間にわたり３回／日（７．００ａｍ、３．００ｐｍ、及び１１．００ｐｍ）であった。
【００９４】
３）検出指標、及び検出法
眼底写真：全てのラットの眼底の写真を、投与前及び７日／１４日／２１日の投与後に撮影した。腹腔内注射による５％の抱水クロラールでのラットの全身麻酔後に、ラットのひげ（whiskers）を剃り、化合物トピラミン（topiramine：トロピカミド）の点眼剤によりラットに散瞳を行い、網膜の標的血管がスクリーン上にはっきり見えるまで、ラット眼を露出させてレンズ方向を調節し、眼底のカラー写真を最終的に撮影した。注：全過程において、角膜はヒプロメロース点眼剤で潤した。
【００９５】
ＶＥＰ（視覚誘発電位）検出：全てのラットの２つの眼のＶＥＰを、国際臨床視覚電気生理学標準を参照して投与前及び７日／１４日／２１日の投与後に検出した。腹腔内注射により５％の抱水クロラールで動物に麻酔した後に、化合物トピラミンの点眼剤によりラットに散瞳を行った。耐干渉性を低下させるために、ラットの大泉門及び視覚野に対応する体表面上の毛を除去した。ラットを暗室に保持し、３０分間にわたり環境に順応させた。全視野フラッシュ刺激装置を採用した（刺激周波数１．０Ｈｚ、周波数帯域幅０．１Ｈｚ〜７５Ｈｚ）。分析時間は２５０ｍｓであり、サンプリング周波数は２．７Ｈｚであり、それを１００回重ね合わせ、測定は連続して少なくとも３回行った。皮膚記録電極は７ｍｍのディスク形状の塩化銀であり、作用電極は角膜の表面に配置され、参照電極は同側股に配置され、そして接地電極は尾の皮下組織に配置された。一方の眼を確認する時には、もう一方の眼は不透明な黒いアイマスクで完全に覆った。ＶＥＰの記述においてａｂ波較正法を採用した。潜時及び振幅のその他の変動妨害を排除するために、臨床診療と一致するＬ５ｂ及び振幅Ａ５を観察指標として使用した。毎回３つの安定した波形を観察して、記録し、そしてＬ５ｂ及びＡ５の平均値を観察値として使用した。
【００９６】
従来のヘマトキシリン及びエオシン染色（ＨＥ染色）：６匹のラットを各群から無作為に選択し、それらの眼球及び眼窩の眼神経を、５％の抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔した後に完全に摘出した。それらをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、角膜、水晶体、及び硝子体を手術顕微鏡下で取り出した。眼杯及び視神経を４％のパラホルムアルデヒド緩衝液中に浸漬させて、それらを２４時間にわたり固定した。組織を取り出し、ＰＢＳで３回すすぎ、エタノールで勾配（５０％のエタノールで９０分間、７０％のエタノールで９０分間、８５％のエタノールで９０分間、９５％のエタノールで６０分間、１００％のエタノールで６０分間）により脱水した。それをキシレンとエタノールとの１：１混合物中に１時間にわたり浸し、次いで純粋なキシレン中に１時間にわたり浸した。パラフィン浸漬、包埋、及び切片化：ヒアリン化された組織を、パラフィンとキシレンとの１：１混合物中に９０分間にわたり浸漬させ、次いでパラフィン中に１２０分間にわたり置き、そして直ちに冷却した。次いで、眼杯標本を５μｍで連続的に切り出し、後に使用するために６０℃でベーキングした。これらのスライドを、キシレン中で５分間にわたり浸漬させ、その作業を３回繰り返した。該スライドを、エタノール中で順次勾配（１００％、９０％、及び７０％）によりそれぞれ５分間にわたり浸漬させ、これらの切片を最後に水道水で５分間にわたり洗浄した。該スライドを、ヘマトキシリン染色において５分間にわたり染色した。スライド上の過剰な染色液を水で洗い流してから、７５％のＨＣｌエタノール溶液で色を１０秒間分離させ、該スライドを、小核及び核クロマチンが顕微鏡下で明らかに検出されるまで水道水で洗浄した。それを０．５％のエオシン溶液で５分間にわたり染色し、そして７０％のエタノール、８５％のエタノール、９５％のエタノール、及び１００％のエタノールで順次２分間にわたり脱水した。それをキシレンにより毎回１分間にわたり２回ヒアリン化させた。切片の周囲の過剰なキシレンを拭き取り（切片が乾燥してはならないことに注意する）、適量の中性ガムを素早く滴加し、それらのスライドを覆ってから、網膜形態及びＲＧＣの変化を、光学顕微鏡下及び試料写真で観察した。
【００９７】
全網膜パッチ、Ｂｒｎ３ａ免疫蛍光染色、及びＲＧＣのコンピュータ画像解析：６匹のラットを各群から無作為に選択し、それらの眼球を、５％の抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔した後に完全に摘出し、ＰＢＳですすいだ。眼球を４％のパラホルムアルデヒド緩衝液中に浸漬させて、それらを室温で３０分間にわたり固定した。次いで、角膜、虹彩、及び水晶体を手術顕微鏡下で摘出し、そして残りの眼杯組織を４％のパラホルムアルデヒド緩衝液中に再浸漬させて、それらを室温で３０分間にわたり固定した。網膜を平らにするために強膜に４つの放射状の切れ目を入れた。網膜を優しく剥離し、ＰＢＳで１回すすぎ、次いで、硝子体を上向きに置き、残りの硝子体を刷毛先で慎重に取り除き、網膜パッチを調製し、４℃で一晩乾燥させた。その網膜パッチをＰＢＳで５分間にわたり合計３回すすぎ、そして網膜全体を０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＰＢＳで調製した）ブロッキング溶液でブロッキングし、室温で１５分間にわたり閉じ込めた。過剰のブロッキング溶液をＰＢＳで５分間にわたり全部で３回すすぎ、次いでＢｒｎ３ａ一次抗体を含有する希釈剤（２％のウシ血清アルブミン及び２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００をＰＢＳに溶解させた。抗体の希釈率は１：１００であった）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。それをＰＢＳにより５分間にわたり全部で３回すすいだ。二次抗体の希釈剤による調製物（Ｃｙ３標識されたロバ抗ヤギ二次抗体、希釈率１：２００）を添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。最後にそれをＰＢＳで１０分間にわたり全部で３回すすぎ、ブロッキングし、次いで蛍光顕微鏡下に置き、観察し、そして写真撮影した。カメラ及びアドビ社のＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して、視神経乳頭を中心として試験網膜パッチから写真を収集した。Ｓｃｉｏｎ画像分析ソフトウェア（Scion Corp.社、メリーランド州、フレデリック）を使用して、視野（７２００平方ミクロン、４０倍の倍率）中のＢｒｎ３ａ陽性網膜細胞の総数を数えた。顕微鏡下で視神経乳頭から等距離を有する４箇所〜６箇所の異なる領域からＲＧＣを数えた。網膜の標識細胞数の比較パラメータを表すために平均値を計算した。ＳＰＳＳ  ２１．０統計ソフトウェア（イリノイ州、シカゴ）を採用して、データの統計分析を行った。実験データは、実験の平均±標準偏差（平均±ＳＥＭ）で表現した。データを分散により分析し、そして群間の統計分析を一元配置分散分析法によって検査した。Ｐ＜０．０５は統計学的に有意差があることを意味した。
【００９８】
上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣは、投与群におけるモデルラットの右眼の視野欠損を狭くし、ＲＧＣのアポトーシスを減少させ、網膜細胞の構造及び配列を改善し、そしてモデルラットの右眼の機能障害の軽減に重要な役割を担い得ることが示されたことから、ＡｕＣは、緑内障を予防及び治療するための薬物を製造するために使用され得ることが示された。
【００９９】
実験２：
１）視神経挫滅損傷ラットモデルの作製
ＳＰＦの成体の雄のスプラグ・ダウレイ（ＳＤ）ラットを、１週間にわたり順応させた後に、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。ラットの眼の周りの毛及び皮膚を、１：１０希釈率のポビドンヨード溶液で消毒し、結膜嚢を生理食塩水で洗浄した。血管の拡張を避けるために、結膜を、外側眼角の約２ｍｍ上の位置から切開し、そして鈍的剥離を後方に外直筋外側に沿って行い、眼球結膜を持ち上げて、眼球を前方に僅かに引っ張ることで視神経を露出させた。次いで、止血鉗子を使用して、視神経を眼球の後方約２ｍｍで３０秒間にわたりクランプし、眼球を慎重に元の位置に戻して、眼科用抗生物質ゲルを手術用結膜嚢に適用した。動物をケージに戻し、意識を取り戻すまで観察した。鎮痛薬を該モデルの作製後の１日〜３日間に与えた。手術後に、視神経挫滅ラットモデルの作製に成功したかどうかを観察した。合併症（網膜虚血及び網膜前方の硝子体出血等）が観察されなかった場合に、それを成功したモデルとみなした。不成功のモデルは実験から取り除くこととする。全てのラットの左眼はコントロールとして処置しなかった。
【０１００】
２）動物実験：コンピュータ生成無作為法を採用して６０匹のＳＰＦの成体ＳＤラットを５つの群（ｎ＝１２匹のラット／群）に分けた。該動物群の１つは、ノーマルコントロール群として一切処置を行わなかった。その他の動物群の右眼を使用して、クランプ法によりラット視神経挫滅モデルを作製した。それらの群は、ネガティブコントロール群、低用量群、中用量群、及び高用量群であった。モデル作製日を１日目として記録した。生理食塩水中の０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、又は０．５ｇ／ＬのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを、それぞれ低用量群、中用量群、及び高用量群においてモデル作製日以降１日３回、１０μＬ／眼でラットの右眼に滴加した（投薬間隔は５±０．５時間であった）。生理食塩水を、コントロール群においてモデル作製日以降１日３回、１０μＬ／眼でコントロールとしてラットの右眼に滴加した。それぞれの群におけるラットのｆＶＥＰ（フラッシュ視覚誘発電位）を、それぞれ７日目及び１４日目に測定した。１５日目に全ての動物を屠殺した。それらの右眼を取り出して適切に処置し、ＨＥ染色及び免疫蛍光染色を行った（ｎ＝６匹／群）。
【０１０１】
３）検出指標、及び検出法
フラッシュ視覚誘発電位（ｆＶＥＰ）：Roland Consult社の電気生理学的診断システム（ＲＥＴＩｐｏｒｔ  ＶＥＰ−ＥＲＧ−ＡＥＰ  バージョン６．１６．３．４、ドイツ）を採用して、実験前に全ての動物のｆＶＥＰの確認を行い、次いで該動物の右眼のｆＶＥＰの確認を、それぞれの群において７日目及び１４日目に行った。主工程：実験前に、上記動物を、少なくとも１２時間にわたり暗所に順応させた。１．０％のトロピカミドにより該動物に散瞳を行い、それらの動物にケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。それらの動物を匍匐状態で昇降台上に置き、接地電極をラットの尾根の皮下組織に挿入し、参照電極をラットの口内に配置し、そして試験電極をラットの後頭結節の皮下組織に挿入した。それぞれの電極の抵抗を確認した。要件が満たされた後に電気生理学的信号の収集を開始し（刺激周波数１．３Ｈｚ、周波数帯域７．３Ｈｚ）、ｆＶＥＰ波形をＮＰ波較正法により記述し、Ｎ２及びＰ２の平均値を観測値として選択し、それぞれ動物の安定波形を繰り返し３回収集した。ＳＰＳＳ  ２１．０統計ソフトウェア（イリノイ州、シカゴ）を採用して、データの統計分析を行った。実験データは、平均±標準偏差（平均±ＳＥＭ）で表現した。データを分散により分析し、そして群間の統計分析を一元配置分散分析によって検査した。Ｐ＜０．０５は統計学的に有意差があることを意味した。
【０１０２】
全網膜パッチ及びＢｒｎ３ａ免疫蛍光染色：６匹のラットをそれぞれの群から無作為に選択し、安楽死させた後に右眼球を取り出し、針を用いて強角膜接合部に数個の穴を開け、４％のパラホルムアルデヒド中に約２０分間にわたり保持した後に、それらの眼球を取り出し、そして角膜及び水晶体を摘出した。網膜を氷表面上で慎重に剥離し、四つ葉形状に切り、そして４％のパラホルムアルデヒドへと戻して５分間にわたり固定した。その網膜を０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で６分間にわたりすすいだ。ブロッキング溶液（ＵｌｔｒａＣｒｕｚ（商標）ブロッキング試薬、製品番号：ＳＣ−５１６２１４、バッチ番号：Ｃ１３１７、Santa Cruz Biotechnology, Inc.社）を加え、室温で２時間にわたり振盪器上にて振盪し、その後に吸引した。Ｂｒｎ−３ａ抗体（１４Ａ６）を添加した（製品番号：ＳＣ−８４２９、バッチ番号Ｂ１２１６、Santa Cruz Biotechnology, Inc.社、希釈剤により１：５０で希釈した後に使用した；希釈剤：２．５ｍＬのブロッキング溶液及び０．１５ｍＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を４７．３５ｍＬのＰＢＳに添加し、そして十分に混合した）。それを約７２時間にわたり２℃〜８℃で振盪器上にて振盪及びインキュベートした。次いでそれを取り出し、室温になるまで３０分間にわたり平衡化させた後に、ＰＢＳで５回洗浄した。Ｍ−ＩｇＧκ  ＢＰ−ＣＦＬ  ４８８（製品番号：ＳＣ−５１６１７６、バッチ番号Ａ１９１７、Santa Cruz Biotechnology, Inc.社、希釈剤により１：１００で希釈した後に使用した）を加え、２℃〜８℃で一晩振盪器上にて振盪及びインキュベートした。それをＰＢＳで５回洗浄し、スライド上に置いた。次いで該スライドを封入剤で封入した。蛍光顕微鏡を使用して、Ｂｒｎ３ａ染色された陽性神経節細胞（網膜神経節細胞、ＲＧＣ）を観察し、評価した。四つ葉状の網膜パッチの各葉部の中心を４０倍の共焦点顕微鏡下で写真撮影し、各写真におけるＲＧＣを６４ビットのＪａｖａ  １．６．０＿２４ソフトウェアがバンドルされたＩｍａｇｅＪ（寸法選択範囲：５０〜無限）により計数し、そして４つの計数の平均値をこの動物のＲＧＣ量として使用した。ＳＰＳＳ  ２１．０統計ソフトウェア（イリノイ州、シカゴ）を採用して、データの統計分析を行った。Ｐ＜０．０５は統計学的に有意差があることを意味した。
【０１０３】
病理組織学的検査（ヘマトキシリン−エオシン染色、ＨＥ染色）：６匹のラットを各群から無作為に選択し、その眼球を安楽死後に採取し、改変デビッドソン溶液中に入れて２４時間〜７２時間にわたり固定した後に、１０％の中性緩衝ホルマリン溶液に移した。眼球をＨＥ染色の前に取り出し、ＰＢＳで３回洗浄し、エタノールで勾配（５０％のエタノールで９０分間、７０％のエタノールで９０分間、８５％のエタノールで９０分間、９５％のエタノールで６０分間、１００％のエタノールで６０分間）により脱水した。それをキシレンとエタノールとの１：１混合物中に１時間にわたり浸し、次いで純粋なキシレン中に１時間にわたり浸した。パラフィン浸漬、包埋、及び切片化：ヒアリン化された組織を、パラフィンとキシレンとの１：１混合物中に９０分間にわたり浸漬させ、次いでパラフィン中に１２０分間にわたり置き、そして直ちに冷却した。次いで、眼杯標本を５μｍで連続的に切り出し、後に使用するために６０℃でベーキングした。スライドを、キシレン中で５分間にわたり浸漬させ、その処置を３回繰り返した。該スライドを、エタノール中で順次勾配（１００％、９０％、及び７０％）によりそれぞれ５分間にわたり浸漬させ、それらのスライドを最後に水道水で５分間にわたり洗浄した。該スライドを、ヘマトキシリン染色において５分間にわたり染色した。スライド上の過剰な染色液を水で洗い流してから、７５％のＨＣｌエタノール溶液で色を１０秒間分離させ、該スライドを、小核及び核クロマチンが顕微鏡下で明らかに検出されるまで水道水で洗浄した。それを０．５％のエオシン溶液で５分間にわたり染色し、そして７０％のエタノール、８５％のエタノール、９５％のエタノール、及び１００％のエタノールで順次２分間にわたり脱水した。それをキシレンにより毎回１分間にわたり２回ヒアリン化させた。切片の周囲の過剰なキシレンを拭き取り（切片が乾燥してはならないことに注意する）、適量の中性ガムを素早く滴加し、それらのスライドを覆った。病理切片を光学顕微鏡下で観察し、４０倍の光学レンズの下で写真を撮影した。各々の解剖体を、視神経の２つの端部に２つの視野を選ぶことにより写真撮影し、次いで同じ大きさの計数フレーム（計数フレームの寸法：長さ１８．００ｃｍ×幅３．４７ｃｍ）で囲った。各写真の計数フレーム中のＲＧＣ量を、それぞれ２人で計数した。２人の計数の平均値を、各々の写真における細胞量とみなした。最終的に、各々の眼の４回の計数の平均値が、この動物のＲＧＣ量とみなされた。ＳＰＳＳ  ２１．０統計ソフトウェア（イリノイ州、シカゴ）を採用して、データの統計分析を行った。Ｐ＜０．０５は統計学的に有意差があることを意味した。
【０１０４】
実験結果は以下の通りであった：
１）モデルラットのｆＶＥＰに対する種々の用量でのＡｕＣの効果
この実験においては、ラットの視神経損傷モデルを挫滅法により樹立した。ＳＤラットのｆＶＥＰに対する種々の用量でのＡｕＣの効果を、１日３回（投薬間隔５±０．５時間）で連続して１４日間にわたり１回につき１０μＬ／眼で、眼に滴下投与することにより、それぞれ７日目及び１４日目にｆＶＥＰで評価した。視神経を挫滅させた後に、より低いｆＶＥＰ振幅、より広い波形、及びより長い潜時は、より重度の損傷を意味した。
【０１０５】
Ｎ２潜時及びＰ２潜時：モデルの作製及び投与の前に、ノーマルコントロール群、ネガティブコントロール群、並びに低用量群、中用量群、及び高用量群における動物はＮ２潜時及びＰ２潜時に有意差を有しなかったことから（Ｐ＞０．０５）（図１５及び図１６）、実験のグループ分けがその後の実験結果に影響を及ぼさないことが示唆された。モデルの作製及び投与後の７日目及び１４日目に、ノーマルコントロール群と比較して、ネガティブコントロール群、並びに低用量群、中用量群、及び高用量群における動物のＮ２潜時及びＰ２潜時は、大幅に延長された（Ｐ＜０．０００１）（図１５及び図１６）。それにより、この実験において視神経挫滅ラットモデルの樹立に成功したことが示された。モデルの作製及び投与後の７日目及び１４日目に、ネガティブコントロール群と比較して、低用量群、中用量群、及び高用量群における動物のＮ２潜時及びＰ２潜時は、有意差を有しなかった（Ｐ＞０．０５）（図１５及び図１６を参照）。
【０１０６】
Ｎ２−Ｐ２振幅：モデルの作製及び投与の前に、ノーマルコントロール群、ネガティブコントロール群、並びに低用量群、中用量群、及び高用量群における動物はＮ２−Ｐ２振幅に有意差を有しなかったことから（Ｐ＞０．０５）（図１７のパネルＡ及びパネルＢ）、実験のグループ分けがその後の実験結果に影響を及ぼさないことが示唆された。モデルの作製及び投与後の７日目に、ノーマルコントロール群（２２．２±２．３μＶ）と比較して、ネガティブコントロール群のＮ２−Ｐ２振幅（１４．７±１．２μＶ）は大幅に減少したことから（３３．７±５．４％だけ減少、Ｐ＜０．０５）、ラットの視機能及び視神経が大幅に影響を受けたこと、そしてこの実験において視神経挫滅ラットモデルの作製に成功したことが示された。ネガティブコントロール群と比較して、高用量群のＮ２−Ｐ２振幅（２２．０±２．０μＶ）は大幅に増加した（４９．４±９．１％だけ増加、Ｐ＜０．０５）。ネガティブコントロール群と比較して、低用量群及び中用量群のＮ２−Ｐ２振幅は、或る程度は増加したが（低用量群：２０．２±１．６μＶ、３７．６±７．３％だけ増加、中用量群：２９．９±１．５μＶ、３５．５±６．８％だけ増加）、それらは有意差を有しなかった（Ｐ＞０．０５）。モデルの作製及び投与後の１４日目に、ネガティブコントロール群（１３．２±１．５μＶ）のＮ２−Ｐ２振幅は、ノーマルコントロール群（１９．７±１．２μＶ）のＮ２−Ｐ２振幅より大幅に低かった（３２．９±８．０％だけ低下、Ｐ＜０．０５）。ネガティブコントロール群と比較して、ＡｕＣの高用量群におけるラットのＮ２−Ｐ２振幅（２２．４±１．７μＶ）は、大幅に増加したが（６９．０±８．５％だけ増加、Ｐ＜０．０１）、一方で、低用量群及び中用量群は、Ｎ２−Ｐ２振幅の改善に大きな効果を有しなかった（低用量群：１５．２±１．２μＶ、１４．５±６．２％だけ増加、Ｐ＞０．０５、中用量群：１７．６±１．４μＶ、３２．８±７．０％だけ増加、Ｐ＞０．０５）。上記の結果により、ＡｕＣの短期投与及び長期投与は、両者ともＳＤラットのＮ２−Ｐ２振幅を大幅に増加させることができ、そしてこの効果は、用量依存的であることが示された。一方で、顕微鏡下での観察により、ＡｕＣの投与は、視神経挫滅損傷モデルにより引き起こされる視野欠損を大幅に改善することができ、これもまた用量依存的であることが判明した。それにより、ＡｕＣは動物の視神経損傷に対して明らかな改善効果を有することが明らかになった。
【０１０７】
２）ＳＤラットのＲＧＣに対する種々の投与量でのＡｕＣの１４日間の連続投与の効果を確認するためのＢｒｎ３ａ免疫染色
Ｂｒｎ３ａは、ニューロンの生存、分化関連遺伝子の活性化、並びにＲＧＣの分化及び生存、並びに齧歯類の網膜発生の間の軸索伸長に重要な効果を有した。Ｂｒｎ３ａは、ＲＧＣのための重要で非常に適したマーカーであった。Ｂｒｎ３ａ免疫染色においては、よりＢｒｎ３ａ陽性の細胞は、より多くのＲＧＣの生存を意味する。その結果を図１８に示した。ノーマルコントロール群（図１８のパネルＡ）（単独の計数フレーム内のＢｒｎ３ａにより染色された陽性細胞の数：１２６．５±７．０）と比較して、ネガティブコントロール群におけるＢｒｎ３ａ陽性細胞の数（７．６±１．６）（図１８の画像Ｂ）は、ノーマルコントロール群における数の僅か６．０±１．３％にすぎないことから（Ｐ＜０．０１）（図１８のパネルＦ）、視神経挫滅の後に動物の多くの神経節細胞が失われたことが示唆された。ネガティブコントロール群と比較して、ＡｕＣの高用量群におけるＢｒｎ３ａ陽性細胞の数（５０．８±２２．９）（図１８のパネルＥ）は大幅に増加した（５．６倍だけ増加、Ｐ＜０．０１）（図１８のパネルＦ）。ネガティブコントロール群と比較して、ＡｕＣの低用量群（図１８のパネルＣ）及び中用量群（図１８のパネルＤ）におけるＲＧＣ量は或る程度増加したが（それぞれ１９．６±９．６及び１５．８±５．４）、それらは統計的差異を有しなかった（Ｐ＞０．０５）（図１８のパネルＦ）。上記の結果はｆＶＥＰ実験結果を裏付けていることから、ＡｕＣは視神経の損傷後に神経節細胞の喪失に対して明らかな保護効果を有し、その効果は用量依存的であることが示唆された。
【０１０８】
３）ＳＤラットの網膜組織形態及びＲＧＣ量に対する種々の投与量でのＡｕＣの１４日間の連続投与の効果を確認するためのＨＥ染色
ラット網膜症例の切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した（ヘマトキシリン−エオシン染色、ＨＥ染色）。こうして、網膜組織形態を、顕微鏡下で別の角度から観察することができ、一方で、ＲＧＣの数を数えた。その結果を図１９に示した。ノーマルコントロール群（図１９のパネルＡ）（単独の計数フレーム内のＲＧＣの数：２７．１±０．９）と比較して、ネガティブコントロール群（図１９のパネルＢ）の網膜は、不均等な厚さを有する明らかな組織浮腫、ＲＧＣの喪失（１５．５±０．５、４４．８±１．８％だけ減少、Ｐ＜０．０１）、及びＲＧＣの明らかな不均一な配列を示した。ネガティブコントロール群と比較して、ＡｕＣの高用量群におけるＲＧＣ量（１９．１±１．２）（図１９のパネルＥ）は大幅に増加し（２７．４±４．４％だけ増加、Ｐ＜０．０５）、網膜組織構造は明らかに改善され、そして組織浮腫及び空胞形成は明らかに減少した。ネガティブコントロール群と比較して、ＡｕＣの低用量群（図１９のパネルＣ）及び中用量群（図１９のパネルＤ）のＲＧＣ量は、或る程度増加したが（低用量群：１６．５±０．６、１０．４±２．４％だけ増大、中用量群１６．２±１．１、８．４±４．１％だけ増大）、それらは有意差を有しなかった（Ｐ＞０．０５）（図１９のパネルＦ）。上記の結果は、Ｂｒｎ３ａによって免疫染色されたＲＧＣの計数結果に対応したことから、ＡｕＣは、視神経損傷により引き起こされるＲＧＣ喪失を減少させ、網膜構造及びＲＧＣの配列を大幅に改善し、そして視神経に対する保護効果を有し、この効果は用量依存的であることが示唆された。
【０１０９】
上記の結果により、ＡｕＣが視神経挫滅損傷ラットモデルにおけるラットのｆＶＥＰのＮ２−Ｐ２振幅を大幅に増加させ得て、ＲＧＣの喪失を大幅に減少させ、視神経損傷、視野欠損、及びＲＧＣのアポトーシスに対する保護効果を有し、網膜及び視神経組織構造の改善並びに視機能障害の軽減において重要な役割を担い、そして緑内障を予防又は治療する薬物を製造するためにＡｕＣ含有物質として使用され得ることが示された。
【０１１０】
表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣは同様の効果を有するので、それらは本明細書で詳細に記載しないものとする。
【０１１１】
実施形態８：バイオセーフティ評価
１．ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞系統を、ＡｕＣ含有物質のバイオセーフティを細胞レベルで評価するために採用した。
【０１１２】
具体的な方法：細胞の対数増殖期にあるＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞（第６代継代の細胞）を収集した。細胞懸濁液の濃度を調節し、それぞれのウェル中に１００μＬで添加した。それらの細胞を撒いて、細胞密度を１ウェル当たり１０００個〜１００００個に調節した。細胞培養プレート（９６ウェルプレートの縁のウェルを細胞培養培地で満たした）を、細胞インキュベーター中に入れ、細胞が壁部に接着するように５％のＣＯ2中で３７℃の環境で２４時間にわたりインキュベートした。該９６ウェルプレートを取り出し、次いでアルコールによる殺菌後にバイオセーフティキャビネット中に入れた。当初の細胞培養培地を吸い出し、次いで表１に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣの溶液を添加し、それらを細胞培養培地で希釈して、それぞれ１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、及び５００ｐｐｍの最終濃度を得た。等容量の新しい細胞培養培地をコントロール群（ＡｕＣなし）に添加した。そしてそれを細胞インキュベーター中に入れ、４８時間にわたりインキュベートした。実験群及びコントロール群のそれぞれについて、６連の重複ウェルを用意した。４８時間のインキュベートの後に、培養培地を遠心分離により除去し、次いでＰＢＳで２回〜３回洗浄した。１００μＬの新しい培養培地及び２０μＬのメチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液（５ｍｇ／ｍｌ、すなわち０．５％のＭＴＴ）を各ウェルに添加し、４時間にわたり培養し続けた。培養を止め、９６ウェルプレートを取り出し、１０分間にわたり遠心分離（１０００回転／分）した。上清を吸い出し、２００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、振盪台上に載せ、ウェル中の色が均一になり、結晶が完全に溶解するまで低速で１０分間にわたり振動させた。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダにより４９０ｎｍで測定した。上記作業は、滅菌環境で実施せねばならない。検出を除き、全ての工程はバイオセーフティキャビネット中で完結させた。実験用品を、使用前にオートクレーブ中で殺菌した。
【０１１３】
実施形態２におけるＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとり、それらの結果を図２０に示した。そこではパネルＡ〜パネルＣは、２．６ｎｍ、１．８ｎｍ又は１．１ｎｍの粒度を有するＡｕＣの、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ又は５００ｐｐｍの最終濃度でのＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞生存性に対する効果を示した。かなり高い濃度（例えば１００ｐｐｍ）でも、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの添加は、細胞生存性に対して殆ど何ら影響を及ぼさないことが示された。より高い濃度（例えば２００ｐｐｍ及び５００ｐｐｍ）では、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの添加は、僅かしか細胞の傷害をもたらさないこととなる（細胞死の率は２０％未満である）。１００ｐｐｍはＡｕＣの最小効果濃度（０．１ｐｐｍ以下）よりも遥かに高いので、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、細胞レベルで高い安全性を有すると結論付けることができた。
【０１１４】
種々のサイズを有するその他のリガンド修飾されたＡｕＣはまた、同様の効果を有していた。それらは本明細書では詳細に記載しないこととする。
【０１１５】
２．ＡｕＣ含有物質の急性毒性を評価するためのマウス急性毒性研究の採用
具体的な方法：表１に列挙される種々のリガンド修飾されたＡｕＣ（実施形態２における１．８ｎｍの平均直径を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとる）に関して、６０匹の成体マウスを、１つのコントロール群及び３つの実験群である、各々の群内に１５匹のマウスを有する４つの群に分けた。コントロール群においては、マウスには通常の給餌を行ったが、３つの実験群においては、マウスには、経口投与（強制栄養により）により、それぞれ１日につき０．１ｇ／体重ｋｇ、０．３ｇ／体重ｋｇ、及び１ｇ／体重ｋｇの用量で通常の食餌条件下で１週間にわたりＡｕＣを供給した。ＡｕＣの供給が終わった後に、それらのマウスには３０日間にわたり通常の給餌を行った。マウスの異常な応答を観察した。
【０１１６】
上記のマウス実験において、種々のサイズを有するＡｕＣの３つの濃度での摂取は、マウスの生存及び活動に影響を及ぼさなかった。１ｇ／体重ｋｇの高用量摂取の場合でさえも、マウスは健康なままであった。
【０１１７】
表１に列挙されるその他のリガンド修飾されたＡｕＣはまた、同様の結果を有していた。それらは本明細書では詳細には記載しないこととする。上記結果に基づいてＡｕＣが非常に安全であると結論付けることができた。
【０１１８】
実施形態９：マウスにおけるＡｕＣの組織分布及び代謝分布
実験１：
作業工程：８０匹のマウスを、各々の群内に２０匹のマウスで４つの群に無作為に分け、表１に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣを経口投与（強制栄養により）により上記群においてそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇの用量で供給した。ＡｕＣを供給した後で、各々の群内の２０匹のマウスを、各小群内に５匹のマウスを有する４つの小群に無作為に分けた。それらのマウスを、供給後のそれぞれ２時間、６時間、２４時間、及び４８時間の時点で屠殺した。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び脳の組織を別々に採取した。各組織を秤量し、２ｍＬの水を添加して均質化し、次いで２ｍＬの王水を添加し、ボルテックス混合し、振動装置上で７２時間にわたり振動させた。２重量％の硝酸溶液を添加して１０ｍＬの最終容量にし、１５０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。４ｍＬの上清を吸引し、組織液中の金元素の含量を、原子吸光分光法により測定した。
【０１１９】
上記結果により、ＡｕＣが血液−脳関門を通過することができ、脳に到達することが示された。ＡｕＣは時間の経過と共に体外へ排出され得るので、体内での明らかな蓄積を有しなかった。したがって、本発明において提供されるＡｕＣ含有物質は、ＡＤ又はＰＤを治療する医薬を製造する用途において良好な展望を有した。
【０１２０】
実験２：
作業工程：８０匹のマウスを、各々の群内に２０匹のマウスで４つの群に無作為に分け、表１に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣを腹腔内注射した。各群におけるＡｕＣの用量（１．８ｎｍの平均直径を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとる）は、それぞれマウスの体重の１００ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１ｐｐｍであった。ＡｕＣを注射した後で、各々の群内の２０匹のマウスを、各群内に５匹のマウスを有する４つの群に無作為に分けた。それらのマウスを、投与後のそれぞれ２時間、６時間、２４時間、及び４８時間の時点で屠殺した。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び脳の組織を別々に採取した。各組織を秤量し、２ｍＬの水を添加して均質化し、次いで２ｍＬの王水を添加し、ボルテックスにより混合し、振動装置上で７２時間にわたり振動させた。２重量％の硝酸溶液を添加して５ｍＬの最終容量にし、１５０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。１ｍＬの上清を吸引し、組織液中の金元素の含量を、原子吸光分光法により測定した。
【０１２１】
表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣについて実験を実施するために上記工程を採用した。
【０１２２】
上記結果により、２時間後に、脳内の金元素の含量が初期濃度の１％〜１０％に達することが示された。６時間後に、脳内の含量は同様のレベルで維持され得た。２４時間後に、脳内の含量は大きく減少した。４８時間の時点で、上記含量は１００ｐｐｍの用量での検体を除き、検出限界近く又はそれを下回るまで減少した。上記結果により、ＡｕＣ含有物質が動物レベルで良好なバイオセーフティを有し、血液−脳関門を通過することができ、体内での明らかな蓄積を有しないことが示された。
【０１２３】
まとめると、上記実験結果は、以下の点を明らかにした（以下に挙げられる「金ナノ粒子」及び「ＡｕＣ」は全て、リガンド修飾を伴う場合を指す）。
【０１２４】
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡβの凝集についての実験（実施形態３）において、金ナノ粒子のＡβの凝集動態に対する効果が、サイズに関連することが判明した。粒径が１０．１ｎｍ以上である場合に、金ナノ粒子の添加は、Ａβの凝集を促進し得て、粒度が６．０ｎｍ以下である場合に、Ａβの凝集は阻害されるが、Ａβの凝集の完全な阻害は達成され得なかった。しかしながら、ＡｕＣが使用される場合に（平均直径は３ｎｍ未満である）、全てのＡｕＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡβの凝集を大幅に阻害し、この効果は、ＡｕＣの濃度に関連していた。ＡｕＣの濃度が５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍに達した場合に、Ａβの凝集は完全に阻害され得て、完全な阻害のために必要とされる最小濃度は、リガンドの種類及びＡｕＣの直径に関連していた。
【０１２５】
（２）ＲＧＣ−５視神経節細胞損傷モデル実験（実施形態４〜実施形態６）において、本発明における種々のリガンドで修飾された種々のサイズ（平均直径は３ｎｍ未満）のＡｕＣが、ＲＧＣ−５損傷モデルの細胞生存性を大幅に増加させ得たことから、ＡｕＣは細胞レベルで大きな効力を有することが示唆された。比較して、より大きなサイズの金ナノ粒子は、大きな効果を有しなかった、又は効果を有しなかった。どのリガンドもＡβの凝集及び種々のＲＧＣ−５視神経節細胞損傷モデルに対して効果を有しなかったので（実施形態３〜実施形態６）、ＡｕＣの効力がＡｕＣ自体に起因すると結論付けることができた。それは、ＡｕＣの利用のための新しいアプローチを提供した。
【０１２６】
（３）さらに、本発明はラット緑内障視神経クランプ損傷モデル（実施形態７）を採用して、ＡｕＣの効力を更に検証したことで、ＡｕＣは、視神経挫滅損傷モデルにおけるラットのｆＶＥＰのＮ２−Ｐ２振幅を大幅に増加させ得て、ＲＧＣの喪失を大幅に減少させ、視神経損傷、視野欠損、及びＲＧＣのアポトーシスに対する明らかな保護効果を有し、網膜細胞の構造及び配列の改善に明らかな役割を担うことが示された。それにより、ＡｕＣは緑内障関連の視機能障害を軽減し、関連疾患を予防及び／又は治療する薬物を製造するために使用され得ることが示された。
【０１２７】
（４）バイオセーフティの更なる評価のための実験において（実施形態８）、１００重量ｐｐｍ（以降のｐｐｍは重量割合を指す）の濃度でのＡｕＣが神経細胞と同時培養された場合に、ＡｕＣは細胞の生存性に明らかな影響を及ぼさず、その濃度が１００ｐｐｍを超過した場合に（ＡｕＣの最小効果濃度より遥かに高い）、細胞生存性は僅かに減少した。ＡｕＣの最小効果濃度（０．１ｐｐｍ〜１ｐｐｍ）は１００ｐｐｍより遥かに低いので、ＡｕＣは細胞レベルで優れたバイオセーフティを有すると結論付けることができた。マウス急性毒性試験においては、１日１回で７日間にわたり連続的に投与された１ｇ／体重ｋｇ（１０００ｐｐｍに相当）の用量のＡｕＣは、有害作用を及ぼさないことが判明した。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ分布及び薬物動態の研究において（実施形態９）、脳内の金元素の含量が、２時間後に初期濃度の１％〜１０％に達した。６時間後に、脳内の含量は、同様のレベルで維持された。２４時間後に、脳内の含量は大きく減少した。４８時間の時点で、上記含量は、１００ｐｐｍの用量での検体を除き、検出限界を下回るまで減少した。上記の結果により、ＡｕＣ含有物質は動物レベルでも良好なバイオセーフティを有し、血液−脳関門を通過することができ、そして体内での明らかな蓄積を有しないことが示され、こうして緑内障を治療する医薬の製造での用途において十分な展望が示された。
【０１２８】
（５）現行技術と比較して、本発明で使用されるリガンドは、Ａβの凝集挙動のために特別に設計されておらず、対比実験により、使用されるリガンドは、Ａβの凝集に対して明らかな効果を有しないことが示された（実施形態３）。しかしながら、ＡｕＣのサイズはそのＡβタンパク質自体のサイズより小さいので、Ａβの凝集は、サイズ効果及び弱い分子相互作用の組み合わせにより大きく阻害され得た。ＲＧＣ−５視神経節細胞損傷モデル及びラットの緑内障視神経クランプ損傷モデルにおける優れた効力により、更に緑内障の予防又は治療のための医薬の製造におけるＡｕＣの可能性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造におけるＡｕＣ含有物質の使用を提供する。上記ＡｕＣ含有物質は、緑内障の視神経挫滅損傷ラットモデルにおけるラットのＲＧＣの喪失を大幅に減少させ、視神経損傷に対する明らかな保護効果を有し、そして視野欠損を狭くすることができ、ＲＧＣのアポトーシスを減らし、網膜及び視神経組織構造の改善並びに視機能障害の軽減において重要な役割を担い、そして動物レベルで良好な生体適合性を有し、緑内障を予防及び／又は治療する新規の薬物として使用され得る。ＡｕＣ含有物質は、産業上の利用のために適している。
【図１】
2020500858.tif 000003
【図２】
2020500858.tif 000004
【図３】
2020500858.tif 000005
【図４】
2020500858.tif 000006
【図５】
2020500858.tif 000007
【図６】
2020500858.tif 000008
【図７】
2020500858.tif 000009
【図８】
2020500858.tif 000010
【図９】
2020500858.tif 000011
【図１０】
2020500858.tif 000012
【図１１】
2020500858.tif 000013
【図１２】
2020500858.tif 000014
【図１３】
2020500858.tif 000015
【図１４】
2020500858.tif 000016
【図１５】
2020500858.tif 000017
【図１６】
2020500858.tif 000018
【図１７】
2020500858.tif 000019
【図１８】
2020500858.tif 000020
【図１９】
2020500858.tif 000021
【図２０】
2020500858.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月26日(2019.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造におけるＡｕＣ含有物質の使用。
【請求項２】
前記ＡｕＣ含有物質は、ＡｕＣとＡｕＣの外側を覆うリガンドＹとを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＡｕＣ含有物質は、溶液、粉末、又は綿状物である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＡｕＣの金コア直径は、０．５ｎｍ〜２．６ｎｍ又は１．１ｎｍ〜２．６ｎｍである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記リガンドＹは、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、並びにその他のチオール含有化合物の１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体は、Ｌ（Ｄ）−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、又はＮ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システイン（ＲＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニン（ＣＲ）、Ｌ−システイン−Ｌ−ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）、Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−システインジペプチド（ＨＣ）、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｌ−リジン−Ｌ−システイン−Ｌ−プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、グリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、グリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、又はグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記その他のチオール含有化合物は、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）−グリシン、又はドデシルメルカプタンから選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＡｕＣ含有物質を製造する方法は、以下の工程：
（１）ＨＡｕＣｌ4をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ4の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
（２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
（３）工程（１）における溶液Ａと工程（２）における溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ4とリガンドＹとの間のモル比が１：０．０１〜１：１００であるように混合し、該混合物を氷浴中で０．１時間〜１２時間にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ4の溶液を添加し、次いで、その反応系を氷浴中で０．１時間〜１２時間にわたり撹拌するにあたり、ＮａＢＨ4とリガンドＹとの間のモル比は１：０．０１〜１：１００であり、こうしてＡｕＣ含有の溶液様物質が得られる工程と、
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
工程（２）における前記溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール、及び酢酸プロピルの１つ以上である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
工程（３）で得られる前記ＡｕＣ含有の溶液様物質を、透析及び凍結乾燥した後に、ＡｕＣを含有する粉末状物質又は綿状物質が得られる、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記透析は、前記ＡｕＣ含有の溶液様物質を透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析することを示す、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造におけるＡｕＣの使用であって、前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満であり、前記ＡｕＣは、緑内障に活性又は不活性な成分であり得る種々のリガンドで修飾され得る、使用。
【請求項１５】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物の製造における、Ｌ−ＮＩＢＣ、Ｄ−ＮＩＢＣ、ＣＲ、ＲＣ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＡＣ）、ＧＳＨ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、Ｌ−システイン、又はＤ−システインのリガンドで修飾されたＡｕＣの使用。
【請求項１６】
前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＡｕＣの金コア直径は、０．５ｎｍ〜２．６ｎｍである、請求項１５に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
工程（２）における上記溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール、及び酢酸プロピルの１つ以上である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
上記結果により、ＡｕＣが血液−脳関門を通過することができ、脳に到達することが示された。ＡｕＣは時間の経過と共に体外へ排出され得るので、体内での明らかな蓄積を有しなかった。したがって、本発明において提供されるＡｕＣ含有物質は、緑内障を治療する医薬を製造する用途において良好な展望を有した。
【国際調査報告】
2020500858.tif 000023
2020500858.tif 000024
2020500858.tif 000025
2020500858.tif 000026