(57)【要約】  本明細書には、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）に関連する方法および組成物が提供され、ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を有している。本明細書に記載されるライブラリーは、少なくとも１つの予め決められた基準核酸配列の予め決められた変異体を各々がコードする核酸を含む、多様なライブラリーを含む。さらに本明細書には、核酸ライブラリーの翻訳時に生成され得るタンパク質ライブラリーが記載される。さらに本明細書には、本明細書に記載される多様な核酸ライブラリーを発現する細胞ライブラリーが提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、抗体。
【請求項２】
抗体であって、該抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；および、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、単一モノマー可変ドメインのみから成るフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又はそれらのａｂ抗原結合フラグメントである、抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体を投与する工程を含む、ＧＬＰ１Ｒ活性を阻害する方法。
【請求項４】
被験体に請求項１または２に記載の抗体を投与する工程を含む、代謝異常の処置のための方法。
【請求項５】
代謝異常はＩＩ型糖尿病または肥満症である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数の核酸を含む核酸ライブラリーであって、各核酸は、翻訳時に免疫グロブリンスキャホールドをコードする配列をコードし、免疫グロブリンスキャホールドはＧＰＣＲ結合ドメインを含むＣＤＲ−Ｈ３ループを含み、各核酸はＧＰＣＲ結合ドメインの配列変異体をコードする配列を含む、核酸ライブラリー。
【請求項７】
ＣＤＲ−Ｈ３ループの長さは約２０〜約８０のアミノ酸である、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項８】
ＣＤＲ−Ｈ３ループの長さは約８０〜約２３０の塩基対である、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項９】
免疫グロブリンスキャホールドは更に、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、軽鎖定常（ＣＬ）ドメイン、および重鎖定常（ＣＨ）ドメインから選択された１つ以上のドメインを含む、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１０】
ＶＨドメインがＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、またはＩＧＨＶ４−５９／６１である、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１１】
ＶＬドメインが、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、またはＩＧＬＶ２−１４である、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１２】
ＶＨドメインの長さは約９０〜約１００のアミノ酸である、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１３】
ＶＬドメインの長さは約９０〜約１２０のアミノ酸である、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１４】
ＶＨドメインの長さは約２８０〜約３００の塩基対である、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１５】
ＶＬドメインの長さは約３００〜約３５０の塩基対である、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１６】
ライブラリーは少なくとも１０５の非同一核酸を含む、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１７】
免疫グロブリンスキャホールドは単一の免疫グロブリンドメインを含む、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１８】
免疫グロブリンスキャホールドは多くとも１００のアミノ酸のペプチドを含む、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項１９】
ＧＰＣＲ結合ドメインはペプチド模倣体または小分子模倣体を含む、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
【請求項２０】
複数のタンパク質を含むタンパク質ライブラリーであって、複数のタンパク質の各々は免疫グロブリンスキャホールドを含み、免疫グロブリンスキャホールドはＧＰＣＲ結合ドメインの配列変異体を含むＣＤＲ−Ｈ３ループを含む、タンパク質ライブラリー。
【請求項２１】
ＣＤＲ−Ｈ３ループの長さは約２０〜約８０のアミノ酸である、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２２】
免疫グロブリンスキャホールドは更に、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、軽鎖定常（ＣＬ）ドメイン、および重鎖定常（ＣＨ）ドメインから選択された１つ以上のドメインを含む、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２３】
ＶＨドメインがＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、またはＩＧＨＶ４−５９／６１である、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２４】
ＶＬドメインが、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、またはＩＧＬＶ２−１４である、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２５】
ＶＨドメインの長さは約９０〜約１００のアミノ酸である、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２６】
ＶＬドメインの長さは約９０〜約１２０のアミノ酸である、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２７】
複数のタンパク質はペプチド模倣ライブラリーを生成するために使用される、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２８】
タンパク質ライブラリーは抗体を含む、請求項２０に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項２９】
複数のタンパク質を含むタンパク質ライブラリーであって、複数のタンパク質は、異なるＧＰＣＲ結合ドメインをコードする配列を含み、各ＧＰＣＲ結合ドメインの長さは約２０〜約８０のアミノ酸である、タンパク質ライブラリー。
【請求項３０】
タンパク質ライブラリーはペプチドを含む、請求項２９に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項３１】
タンパク質ライブラリーは免疫グロブリンを含む、請求項２９に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項３２】
タンパク質ライブラリーは抗体を含む、請求項２９に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項３３】
複数のタンパク質はペプチド模倣ライブラリーを生成するために使用される、請求項２９に記載のタンパク質ライブラリー。
【請求項３４】
請求項６−１９のいずれか１つに記載の核酸ライブラリーを含むベクターライブラリー。
【請求項３５】
請求項６−１９のいずれか１つに記載の核酸ライブラリーを含む細胞ライブラリー。
【請求項３６】
請求項２０−３３のいずれか１つに記載のタンパク質ライブラリーを含む細胞ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年９月１１日出願の米国仮特許出願６２／５５６，８６３号の利益を主張するものであり、当該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、種々様々な疾患に関係する。ＧＰＣＲが大抵は細胞中に低レベルで発現され、精製時に非常に不安定であるので、適切な抗原を得る際の問題により、ＧＰＣＲに対する抗体産生は困難であった。故に、ＧＰＣＲを標的とする治療的介入のための薬剤の改善が必要とされる。
【０００３】
引用による組み込み
本明細書で言及される出願公開、特許、および特許出願は全て、あたかも個々の出願公開、特許、または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的且つ個々に指示されるように同じ程度にまで、参照により本明細書に組込まれる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体が提供される。本明細書には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体が提供され；および、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、単一モノマー可変ドメインのみから成るフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、またはそれらのａｂ抗原結合フラグメントである。本明細書には、ＶＨドメインがＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、またはＩＧＨＶ４−５９／６１である、抗体が提供される。本明細書には、ＶＬドメインが、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、またはＩＧＬＶ２−１４である、抗体が提供される。本明細書には、ＧＬＰ１Ｒ活性を阻害する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるような抗体を投与する工程を含む。本明細書には、代謝異常の処置のための方法が提供され、該方法は、必要とする被験体に本明細書に記載されるような抗体を投与する工程を含む。いくつかの例において、抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。本明細書には、代謝異常または肥満症の処置のための方法が提供され、代謝異常はＩＩ型糖尿病である。本明細書には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むタンパク質をコードする核酸が提供される。
【０００５】
本明細書には、複数の核酸を含む核酸ライブラリーが提供され、各核酸は、翻訳時に免疫グロブリンスキャホールドをコードする配列をコードし、免疫グロブリンスキャホールドはＧＰＣＲ結合ドメインを含むＣＤＲ−Ｈ３ループを含み、各核酸はＧＰＣＲ結合ドメインの配列変異体をコードする配列を含む。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＣＤＲ−Ｈ３ループの長さは約２０〜約８０のアミノ酸である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＣＤＲ−Ｈ３ループの長さは約８０〜約２３０の塩基対である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、免疫グロブリンスキャホールドは更に、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、軽鎖定常（ＣＬ）ドメイン、および重鎖定常（ＣＨ）ドメインから選択された１つ以上のドメインを含む。本明細書には、ＶＨドメインがＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、またはＩＧＨＶ４−５９／６１である、核酸ライブラリーが提供される。本明細書には、ＶＬドメインが、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、またはＩＧＬＶ２−１４である、核酸ライブラリーが提供される。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＶＨドメインの長さは約９０〜約１００のアミノ酸である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＶＬドメインの長さは約９０〜約１２０のアミノ酸である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＶＨドメインの長さは約２８０〜約３００の塩基対である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＶＬドメインの長さは約３００〜約３５０の塩基対である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ライブラリーは、少なくとも１０５の非同一核酸を含む。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、免疫グロブリンスキャホールドは単一の免疫グロブリンドメインを含む。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、免疫グロブリンスキャホールドは多くとも１００のアミノ酸のペプチドを含む。本明細書には、本明細書に記載されるような核酸ライブラリーを含むベクターライブラリーが提供される。本明細書には、本明細書に記載されるような核酸ライブラリーを含む細胞ライブラリーが提供される。
【０００６】
本明細書には、複数の核酸を含む核酸ライブラリーが提供され、各核酸は、翻訳時にＧＰＣＲ結合ドメインをコードする配列をコードし、各核酸は、約２０〜約８０のアミノ酸の異なるＧＰＣＲ結合ドメインをコードする配列を含む。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＧＰＣＲ結合ドメインの長さは約８０〜約２３０の塩基対である。本明細書には核酸ライブラリーが提供され、ＧＰＣＲ結合ドメインは、立体構造リガンド相互作用、ペプチド−リガンド相互作用、小分子リガンド相互作用、ＧＰＣＲの細胞外ドメイン、またはＧＰＣＲを標的とする抗体に基づいて設計されている。本明細書には、本明細書に記載されるような核酸ライブラリーを含むベクターライブラリーが提供される。本明細書には、本明細書に記載されるような核酸ライブラリーを含む細胞ライブラリーが提供される。
【０００７】
本明細書には複数のタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが提供され、複数のタンパク質の各々は免疫グロブリンスキャホールドを含み、免疫グロブリンスキャホールドはＧＰＣＲ結合ドメインの配列変異体を含むＣＤＲ−Ｈ３ループを含む。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、ＣＤＲ−Ｈ３ループの長さは約２０〜約８０のアミノ酸である。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、免疫グロブリンスキャホールドは更に、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、軽鎖定常（ＣＬ）ドメイン、および重鎖定常（ＣＨ）ドメインから選択された１つ以上のドメインを含む。本明細書には、ＶＨドメインがＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、またはＩＧＨＶ４−５９／６１である、タンパク質ライブラリーが提供される。本明細書には、ＶＬドメインが、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、またはＩＧＬＶ２−１４である、タンパク質ライブラリーが提供される。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、ＶＨドメインの長さは約９０〜約１００のアミノ酸である。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、ＶＬドメインの長さは約９０〜約１２０のアミノ酸である。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、複数のタンパク質はペプチド模倣ライブラリーを生成するために使用される。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、タンパク質ライブラリーはペプチドを含む。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、タンパク質ライブラリーは免疫グロブリンを含む。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、タンパク質ライブラリーは抗体を含む。本明細書には、本明細書に記載されるようなタンパク質ライブラリーを含む細胞ライブラリーが提供される。
【０００８】
本明細書には、複数のタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが提供され、複数のタンパク質は、異なるＧＰＣＲ結合ドメインをコードする配列を含み、各ＧＰＣＲ結合ドメインの長さは約２０〜約８０のアミノ酸である。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、タンパク質ライブラリーはペプチドを含む。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、タンパク質ライブラリーは免疫グロブリンを含む。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、タンパク質ライブラリーは抗体を含む。本明細書にはタンパク質ライブラリーが提供され、複数のタンパク質はペプチド模倣ライブラリーを生成するために使用される。本明細書には、本明細書に記載されるようなタンパク質ライブラリーを含む細胞ライブラリーが提供される。
【０００９】
本明細書には、本明細書に記載される核酸ライブラリーを含むベクターライブラリーが提供される。本明細書には、本明細書に記載される核酸ライブラリーを含む細胞ライブラリーが提供される。本明細書には、本明細書に記載されるタンパク質ライブラリーを含む細胞ライブラリーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）リガンド相互作用表面の概略図を表わす。
【図２Ａ】免疫グロブリンスキャホールドの第１の概略図を表わす。
【図２Ｂ】免疫グロブリンスキャホールドの第２の概略図を表わす。
【図３】スキャホールドにおける配置のためのモチーフの概略図を表わす。
【図４】ＧＰＣＲの概略図を表わす。
【図５】クローンフラグメントおよび非クローンフラグメントのアセンブリのためのセグメントの概略図を表わす。
【図６】クローンフラグメントおよび非クローンフラグメントのアセンブリのためのセグメントの概略図を表わす。
【図７】本明細書に開示されるような遺伝子合成のための典型的なプロセスワークフローを実証する工程の図を提示する。
【図８】コンピューターシステムの例を例示する。
【図９】コンピューターシステムの構造を例示するブロック図である。
【図１０】複数のコンピューターシステム、複数の携帯電話、および個人用携帯情報端末、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを実証する図である。
【図１１】共有仮想アドレスメモリ空間を用いるマルチプロセッサーコンピューターシステムのブロック図である。
【図１２Ａ】免疫グロブリンスキャホールドの配列を表わす。
【図１２Ｂ】免疫グロブリンスキャホールドの配列を表わす。
【図１２Ｃ】免疫グロブリンスキャホールドの配列を表わす。
【図１３】Ｇタンパク質結合受容体スキャホールドの配列を表わす。
【図１４】重鎖可変ドメインのためのライブラリーに対する標準化された読み取りのグラフである。
【図１５】軽鎖可変ドメインのためのライブラリーに対する標準化された読み取りのグラフである。
【図１６】重鎖相補性決定領域３のためのライブラリーに対する標準化された読み取りのグラフである。
【図１７Ａ】フォールディングに対して分析された軽鎖フレームワークのプロットである。
【図１７Ｂ】耐熱性に対して分析された軽鎖フレームワークのプロットである。
【図１７Ｃ】ＦＬＡＧタグを使用してモチーフ表示に対して分析された軽鎖フレームワークのプロットである。
【図１７Ｄ】Ｈｉｓタグを使用してモチーフ表示に対して分析された軽鎖フレームワークのプロットである。
【図１８Ａ】フォールディングに対して分析された重鎖フレームワークのプロットである。
【図１８Ｂ】安定性に対して分析された重鎖フレームワークのプロットである。
【図１８Ｃ】ＦＬＡＧタグを使用してモチーフ表示に対して分析された重鎖フレームワークのプロットである。
【図１８Ｄ】Ｈｉｓタグを使用してモチーフ表示に対して分析された重鎖フレームワークのプロットである。
【図１８Ｅ】発現に対して分析された重鎖フレームワークのプロットである。
【図１８Ｆ】選択特異性に対して分析された重鎖フレームワークのプロットである。
【図１９Ａ】蛍光抗体により視覚化されたＧタンパク質結合受容体の画像を表わす。
【図１９Ｂ】蛍光抗体により視覚化されたＧタンパク質結合受容体の画像を表わす。
【図１９Ｃ】蛍光抗体により視覚化されたＧタンパク質結合受容体の画像を表わす。
【図２０Ａ】自己蛍光タンパク質により視覚化されたＧタンパク質結合受容体の画像を表わす。
【図２０Ｂ】自己蛍光タンパク質により視覚化されたＧタンパク質結合受容体の画像を表わす。
【図２０Ｃ】自己蛍光タンパク質により視覚化されたＧタンパク質結合受容体の画像を表わす。
【図２１Ａ】リンカーを使用してＶＬドメインに付けられたＶＨドメインを含む免疫グロブリンスキャホールドの概略図を表わす。
【図２１Ｂ】リンカー、リーダー配列、およびｐＩＩＩ配列を使用してＶＬドメインに付けられたＶＨドメインを含む免疫グロブリンスキャホールドの、完全ドメインの構造の概略図を表わす。
【図２１Ｃ】ＶＬまたはＶＨドメインに対する４つのフレームワーク要素（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＦＷ４）および可変３ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）要素の概略図を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、別段の定めのない限り、当該技術の範囲内である従来の分子生物学的技術を採用する。別段の定めのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００１２】
定義
【００１３】
本開示の全体にわたって、様々な実施形態は範囲表示形式で提示される。範囲表示形式での記載は単に利便性と簡潔さのためのものに過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈されてはならないということを理解されたい。従って、範囲の記載は、文脈で別段の定めのない限り、全ての可能な下位範囲と、下限の単位の小数第２位までのその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの下位範囲と、その範囲内の個々の数値、例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９を具体的に開示したと考えられなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。これらの介在する範囲の上限と下限は、より小さな範囲に独立して含まれることもあり、記載された範囲の任意の具体的に除外された限界に従って、本開示内にも包含される。記載された範囲が１つまたは両方の限界を含む場合、そのような含まれる限界の一方または両方を除外する範囲は、文脈に特段の定めのない限り、本開示にも含まれる。
【００１４】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためにあり、任意の実施形態を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。用語「含む」および／または「含むこと」は、本明細書での使用時に、明示された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を妨げないことが、更に理解される。本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。
【００１５】
別段の定めのない限りまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるように、数または数の範囲に関連する用語「約」とは、明示された数およびその数の＋／−１０％、または、ある範囲の列挙された値に対して列挙された下限の１０％以下および列挙された上限の１０％以上を意味する。
【００１６】
別段の定めのない限り、本明細書に使用されるように、用語「核酸」は、二本鎖または三本鎖の核酸に加え、一本鎖分子も包含する。二本鎖または三本鎖の核酸において、核酸鎖は同一の広がりをもつ必要はない（すなわち、二本鎖核酸は両方の鎖の全長に沿った二本鎖である必要はない）。他に明示されない限り、核酸配列は、提供されると、５’〜３’の方向に列挙される。本明細書に記載される方法は、単離された核酸の生成を提供する。本明細書に記載される方法は、単離かつ精製された核酸の生成を更に提供する。本明細書に言及されるような「核酸」は、長さが少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、またはそれ以上の塩基を含み得る。更に、本明細書には、ヌクレオチド配列をコードする任意数のポリペプチドセグメントの合成のための方法が提供され、前記ヌクレオチド配列は、非リボソームペプチド（ＮＲＰ）をコード化する配列、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）モジュールおよび合成変異体をコードする配列、抗体などの他の調節タンパク質のポリペプチドセグメント、例えば、プロモーター、転写因子、エンハンサー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ由来の核小体低分子ＲＮＡ、または対象の任意の機能的または構造的ＤＮＡまたはＲＮＡユニットといった、調節配列などの非コードＤＮＡまたはＲＮＡを含む他のタンパク質ファミリーからのポリペプチドセグメントを含む。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖解析から定義された遺伝子座（複数の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ、リボザイム、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写または増幅によって通常得られるｍＲＮＡのＤＮＡ表現である相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成的にまたは増幅により生成されるＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。本明細書で言及される遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするｃＤＮＡは、ゲノム等価配列に介入イントロン配列を含まないエクソン配列をコードする少なくとも１つの領域を含み得る。
【００１７】
ＧＰＣＲライブラリー
【００１８】
本明細書には、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）に関連する方法および組成物が提供され、ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーに結合する。本明細書に記載されるようなスキャホールドは、ＧＰＣＲ結合ドメインを安定して支持できる。ＧＰＣＲ結合ドメインは、ＧＰＣＲリガンドおよびＧＰＣＲの表面相互作用に基づいて設計され得る。本明細書に記載されるようなライブラリーは、少なくとも１つの予め決められた基準核酸配列の予め決められた変異体を各々がコードする核酸を含む、変異体ライブラリーを提供するために更に多様化（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）され得る。更に本明細書には、核酸ライブラリーの翻訳時に生成され得るタンパク質ライブラリーが記載される。いくつかの例において、本明細書に記載されるような核酸ライブラリーは、細胞ライブラリーを生成するために細胞へと転写される。また本明細書には、本明細書に記載される方法を使用して合成されたライブラリーのための下流の適用が提供される。下流の適用は、生物学的に関連する機能、例えば、改善された安定性、親和性、結合、機能活性を増強した、およびＧＰＣＲシグナル伝達に関連する病状の処置または予防のための、変異体核酸またはタンパク質配列の同定を含む。
【００１９】
スキャホールドライブラリー
【００２０】
本明細書には、スキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、ＧＰＣＲ結合ドメインのための配列はスキャホールドに配置される。本明細書に記載されるスキャホールドは、未修飾のスキャホールドと比較して、スキャホールドへの挿入時に配列をコードするＧＰＣＲ結合ドメインの範囲のための安定性の改善を可能にする。典型的なスキャホールドは、限定されないが、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例において、スキャホールドは免疫グロブリンである。本明細書に記載されるようなスキャホールドは、改善された機能活性、構造安定性、発現、特異性、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例において、スキャホールドはＧＰＣＲ結合ドメインの支持のために長い領域を含む。
【００２１】
本明細書には、スキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、スキャホールドは免疫グロブリンである。いくつかの例において、免疫グロブリンは抗体である。本明細書に使用されるように、抗体との用語は、典型的な抗体分子の特徴的な２群のＹ字形状を有するタンパク質の他、抗原に特異的に結合する能力を持つ抗体の１つ以上のフラグメントを含むと理解される。典型的な抗体は、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単一Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（ＶＬおよびＶＨが、ＶＬおよびＶＨの領域が対になり単鎖ＦａｂおよびｓｃＦａｂを含む形態の単価分子を形成する単一タンパク質鎖としての製造を可能にする合成または天然のリンカーによる組み換え方法を使用して結合される、フラグメントを含む）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインを含む単価フラグメントを含む）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントを含む）、Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１フラグメントを含むフラグメントを含む）、Ｆｖフラグメント（抗体の単一群のＶＬおよびＶＨドメインを含むフラグメントを含む）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂまたはｓｄＡｂ）（ＶＨドメインを含むフラグメントを含む）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、ダイアボディ（互いに結合され、かつ２つの異なる抗原を認識するための、２つのＶＬおよびＶＨドメインなどの二価の二量体を含むフラグメントを含む）、単一モノマー可変ドメインのみから成るフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、またはそれらのａｂ抗原結合フラグメントを含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるライブラリーはスキャホールドをコードする核酸を含み、スキャホールドは、完全抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントで構成されたＦｖ抗体を含む、Ｆｖ抗体である。幾つかの実施形態において、Ｆｖ抗体は、密な非共有結合会合における１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体、および、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定めるための各可変ドメイン相互作用の３つの超可変領域から成る。いくつかの実施形態において、６つの超可変領域は抗体に抗原結合特異性を与える。幾つかの実施形態において、単一可変ドメイン（または、ＶＨＨ抗体またはナノボディなどの１つの重鎖可変ドメインを含むラクダ科動物から単離された単一ドメイン抗体を含む、抗原に特異的なわずか３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）は、抗原を認識し結合する能力を持つ。いくつかの例において、本明細書に開示されるライブラリーは、スキャホールドをコードする核酸を含み、スキャホールドは、ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨとＶＬ両方のドメインを含む抗体フラグメントを含む、単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖであり、両ドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。幾つかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは更に、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、ｓｃＦｖが抗原結合性のために所望の構造を形成するのを可能にする。いくつかの例において、ｓｃＦｖはＦｃフラグメントに結合され、または、ＶＨＨはＦｃフラグメント（ミニボディを含む）に結合される。いくつかの例において、抗体は免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、例えば抗原結合部位を含む分子、を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの分子である。
【００２２】
スキャホールドをコードする核酸を含む、本明細書に記載されるライブラリーは、免疫グロブリンの少なくとも１つの領域に変形を含み、スキャホールドは免疫グロブリンである。変形のための抗体の典型的な領域は、限定されないが、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変ドメイン、または定常ドメインを含む。いくつかの例において、ＣＤＲはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である。いくつかの例において、ＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むがこれらに限定されない、重ドメインである。いくつかの例において、ＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むがこれらに限定されない、軽ドメインである。いくつかの例において、可変ドメインは、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインまたは重鎖可変（ＶＨ）ドメインである。いくつかの例において、ＶＬドメインはカッパまたはラムダの鎖を含む。いくつかの例において、定常ドメインは、軽鎖定常（ＣＬ）ドメインまたは重鎖定常（ＣＨ）ドメインである。
【００２３】
本明細書に記載される方法は、スキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーの合成を提供し、各核酸は少なくとも１つの予め決められた基準核酸配列の予め決められた変異体をコードする。場合によっては、予め決められた基準配列はタンパク質をコードする核酸配列であり、変異体ライブラリーは、合成された核酸によってコードされた後続するタンパク質中の単一の残基の複数の様々な変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも１つのコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、スキャホールドライブラリーは、複数の位置にて変異を総体的にコードする変異核酸を含む。いくつかの例において、変異体ライブラリーは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＶＬドメイン、またはＶＨドメインの少なくとも単一のコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、異なるライブラリーは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＶＬドメイン、またはＶＨドメインの複数のコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、異なるライブラリーは、フレームワーク要素１（ＦＷ１）、フレームワーク要素２（ＦＷ２）、フレームワーク要素３（ＦＷ３）、またはフレームワーク要素４（ＦＷ４）の複数のコドンの変異をコードする配列を含む。変異に対するコドンの典型的な数は、限定されないが、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンを含む。
【００２４】
いくつかの例において、変異に対する免疫グロブリンの少なくとも１つの領域は、重鎖Ｖ遺伝子ファミリー、重鎖Ｄ遺伝子ファミリー、重鎖Ｊ遺伝子ファミリー、軽鎖Ｖ遺伝子ファミリー、または軽鎖Ｊ遺伝子ファミリーに由来する。いくつかの例において、軽鎖Ｖ遺伝子ファミリーは免疫グロブリンカッパ（ＩＧＫ）遺伝子または免疫グロブリンラムダ（ＩＧＬ）を含む。典型的な遺伝子には、限定されないが、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−５９／６１、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、およびＩＧＬＶ２−１４が挙げられる。
【００２５】
本明細書には、免疫グロブリンスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、ライブラリーは、様々な数のフラグメントにより合成される。いくつかの例において、フラグメントは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＶＬドメイン、またはＶＨドメインを含む。いくつかの例において、フラグメントは、フレームワーク要素１（ＦＷ１）、フレームワーク要素２（ＦＷ２）、フレームワーク要素３（ＦＷ３）、またはフレームワーク要素４（ＦＷ４）を含む。いくつかの例において、スキャホールドライブラリーは、少なくともまたは約２つのフラグメント、３つのフラグメント、４つのフラグメント、５つのフラグメント、または５つを超えるフラグメントにより合成される。合成された核酸の核酸フラグメントの各々の長さ、または核酸の平均長さは、少なくともまたは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、または６００を超える塩基対でもよい。いくつかの例において、長さは、約５０〜６００、７５〜５７５、１００〜５５０、１２５〜５２５、１５０〜５００、１７５〜４７５、２００〜４５０、２２５〜４２５、２５０〜４００、２７５〜３７５、または３００〜３５０の塩基対である。
【００２６】
本明細書に記載されるような免疫グロブリンスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーは、翻訳時に様々な長さのアミノ酸を含む。いくつかの例において、合成されたアミノ酸のアミノ酸フラグメントの各々の長さ、またはアミノ酸の平均長さは、少なくともまたは約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、または１５０を超えるアミノ酸でもよい。いくつかの例において、アミノ酸の長さは、約１５〜１５０、２０〜１４５、２５〜１４０、３０〜１３５、３５〜１３０、４０〜１２５、４５〜１２０、５０〜１１５、５５〜１１０、６０〜１１０、６５〜１０５、７０〜１００、または７５〜９５のアミノ酸である。いくつかの例において、アミノ酸の長さは約２２〜約７５のアミノ酸である。いくつかの例において、免疫グロブリンスキャホールドは、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、または５０００を超えるアミノ酸を含む。
【００２７】
変異に対する免疫グロブリンの少なくとも１つの領域の多数の変異体配列は、本明細書に記載されるような方法を使用してデノボ合成される。いくつかの例において、多数の変異体配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＶＬ、ＶＨ、またはそれらの組み合わせに対してデノボ合成される。いくつかの例において、多数の変異体配列は、フレームワーク要素１（ＦＷ１）、フレームワーク要素２（ＦＷ２）、フレームワーク要素３（ＦＷ３）、またはフレームワーク要素４（ＦＷ４）に対してデノボ合成される。変異体配列の数は、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、または５００を超える配列でもよい。いくつかの例において、変異体配列の数は、少なくともまたは約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または８０００を超える配列である。いくつかの例において、変異体配列の数は、約１０〜５００、２５〜４７５、５０〜４５０、７５〜４２５、１００〜４００、１２５〜３７５、１５０〜３５０、１７５〜３２５、２００〜３００、２２５〜３７５、２５０〜３５０、または２７５〜３２５の配列である。
【００２８】
免疫グロブリンの少なくとも１つの領域の変異体配列は、いくつかの例において、長さまたは配列において変動する。いくつかの例において、デノボ合成される少なくとも１つの領域は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＶＬ、ＶＨ、またはそれらの組み合わせを対象とする。いくつかの例において、デノボ合成される少なくとも１つの領域は、フレームワーク要素１（ＦＷ１）、フレームワーク要素２（ＦＷ２）、フレームワーク要素３（ＦＷ３）、またはフレームワーク要素４（ＦＷ４）を対象とする。いくつかの例において、変異体配列は、野生型と比較して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超える変異体ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、変異体配列は、野生型と比較して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０の付加的なヌクレオチドを含む。いくつかの例において、変異体配列は、野生型と比較して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０より少ないヌクレオチドを含む。幾つかの例において、ライブラリーは、少なくともまたは約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１０を超える変異体を含む。
【００２９】
スキャホールドライブラリーの合成後、スキャホールドライブラリーはスクリーニングおよび解析のために使用され得る。例えば、スキャホールドライブラリーは、ライブラリーの表示能力（ｄｉｓｐｌａｙａｂｉｌｉｔｙ）およびパニングのために解析される。いくつかの例において、表示能力は選択可能なタグを使用して解析される。典型的なタグは、限定されないが、放射性ラベル、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色定量タグ、アフィニティータグ、または、その他当技術分野で既知のラベルまたはタグを含む。いくつかの例では、タグはヒスチジン、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）、またはＦＬＡＧである。いくつかの例において、スキャホールドライブラリーは、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ポロニーシーケンシング、ライゲーションシーケンシング、可逆的ターミネーターシーケンシング、プロトン検出シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ナノポアシーケンシング、電子シーケンシング、パイロシーケンシング、マクサム−ギルバートシーケンシング、連鎖停止（例えばサンガー）シーケンシング、＋Ｓシーケンシング、または合成によるシーケンシングを含むがこれらに限定されない、様々な方法を使用した配列決定により解析される。
【００３０】
いくつかの例において、スキャホールドライブラリーは、機能的活性、構造安定性（例えば熱安定性またはｐＨ安定性）、発現、特異性、またはそれらの組み合わせのために解析される。いくつかの例において、スキャホールドライブラリーは、フォールディング可能なスキャホールドのために解析される。いくつかの例において、抗体の領域は、機能的活性、構造安定性、発現、特異性、フォールディング、またはそれらの組み合わせのために解析される。例えば、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、機能的活性、構造安定性、発現、特異性、フォールディング、またはそれらの組み合わせのために解析される。
【００３１】
ＧＰＣＲライブラリー
【００３２】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインのための配列を含むスキャホールドをコードする核酸を含む、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）結合ライブラリーが提供される。いくつかの例において、スキャホールドは免疫グロブリンである。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインのための配列を含むスキャホールドは、ＧＰＣＲ結合ドメインとＧＰＣＲとの相互作用により判定される。
【００３３】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、ＧＰＣＲ結合ドメインはＧＰＣＲ上での表面相互作用に基づいて設計される。典型的なＧＰＣＲが表１にて確認される。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインは、ＧＰＣＲのアミノ末端またはカルボキシ末端と相互に作用する。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインは、膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）、膜貫通ドメイン３（ＴＭ３）、膜貫通ドメイン４（ＴＭ４）、膜貫通ドメイン５（ＴＭ５）、膜貫通ドメイン６（ＴＭ６）、および膜貫通ドメイン７（ＴＭ７）を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの膜貫通ドメインと相互に作用する。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインは、ＧＰＣＲの細胞内表面と相互に作用する。例えば、ＧＰＣＲ結合ドメインは、細胞内ループ１（ＩＣＬ１）、細胞内ループ２（ＩＣＬ２）、および細胞内ループ３（ＩＣＬ３）を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの細胞内ループと相互に作用する。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインは、ＧＰＣＲの細胞外表面と相互に作用する。図１を参照する。例えば、ＧＰＣＲ結合ドメインは、ＧＰＣＲの少なくとも１つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または細胞外ループ（ＥＣＬ）と相互に作用する。細胞外ループには、限定されないが、細胞外ループ１（ＥＣＬ１）、細胞外ループ２（ＥＣＬ２）、および細胞外ループ３（ＥＣＬ３）が挙げられる。
【００３４】
【表１−１】
2020536504.tif 000003
【００３５】
【表１−２】
2020536504.tif 000004
【００３６】
【表１−３】
2020536504.tif 000005
【００３７】
【表１−４】
2020536504.tif 000006
【００３８】
【表１−５】
2020536504.tif 000007
【００３９】
【表１−６】
2020536504.tif 000008
【００４０】
【表１−７】
2020536504.tif 000009
【００４１】
【表１−８】
2020536504.tif 000010
【００４２】
【表１−９】
2020536504.tif 000011
【００４３】
【表１−１０】
2020536504.tif 000012
【００４４】
【表１−１１】
2020536504.tif 000013
【００４５】
【表１−１２】
2020536504.tif 000014
【００４６】
【表１−１３】
2020536504.tif 000015
【００４７】
【表１−１４】
2020536504.tif 000016
【００４８】
本明細書にはＧＰＣＲ結合ドメインが記載され、ＧＰＣＲ結合ドメインは、ＧＰＣＲリガンドとＧＰＣＲとの表面相互作用に基づいて設計されている。いくつかの例において、リガンドは、亜原子粒子（例えば光子）、イオン、有機分子、ペプチド、およびタンパク質である。ＧＰＣＲにより結合可能なリガンドの非限定的な例には、次のものが挙げられる：（−）−アドレナリン、（−）−ノルアドレナリン、（リゾ）リン脂質メディエーター、［ｄｅｓ−Ａｒｇ１０］カリジン、［ｄｅｓ−Ａｒｇ９］ブラジキニン、［ｄｅｓ−Ｇｌｎ１４］グレリン、［Ｈｙｐ３］ブラジキニン、［Ｌｅｕ］エンケファリン、［Ｍｅｔ］エンケファリン、１２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸、１２Ｒ−ＨＥＴＥ、１２Ｓ−ＨＥＴＥ、１２Ｓ−ＨＰＥＴＥ、１５Ｓ−ＨＥＴＥ、１７β−エストラジオール、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ４、２−アラキドノイルグリセロール、２−オレオイル−ＬＰＡ、３−ヒドロキシオクタン酸、５−ヒドロキシトリプタミン、５−オキソ−１５−ＨＥＴＥ、５−オキソ−ＥＴＥ、５−オキソ−ＥＴｒＥ、５−オキソ−ＯＤＥ、５Ｓ−ＨＥＴＥ、５Ｓ−ＨＰＥＴＥ、７α，２５−ジヒドロキシコレステロール、アセチルコリン、ＡＣＴＨ、アデノシン二リン酸、アデノシン、アドレノメデュリン２／インテルメジン、アドレノメデュリン、アミリン、アナンダミド、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、アネキシンＩ、アペリン受容体早期内在性リガンド（ａｐｅｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ）、アペリン−１３、アペリン−１７、アペリン−３６、アスピリン誘導性リポキシンＡ４、アスピリン誘導性レゾルビンＤ１、ＡＴＰ、βデフェンシン４Ａ、大型ダイノルフィン、ウシ副腎髄質ペプチド８−２２、ブラジキニン、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃａ２＋、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カルシトニン、カテプシンＧ、ＣＣＫ−３３、ＣＣＫ−４、ＣＣＫ−８、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ケメリン、ケノデオキシコール酸、コール酸、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ＣＳＴ−１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２α、ＣＸＣＬ１２β、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、システイニル−ロイコトリエン（ＣｙｓＬＴｓ）、ウラシル−ヌクレオチド、デオキシコール酸、ジヒドロスフィンゴシン−１−ホスフェート、ジオレオイルホスファチジン酸、ドーパミン、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ−（１−１３）、ダイノルフィンＡ−（１−８）、ダイノルフィンＢ、エンドモルフィン−１、エンドセリン−１、エンドセリン−２、エンドセリン−３、Ｆ２Ｌ、遊離脂肪酸、ＦＳＨ、ＧＡＢＡ、ガラニン、ガラニン様ペプチド、胃抑制ポリペプチド、ガストリン−１７、ガストリン放出ペプチド、グレリン、ＧＨＲＨ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１−（７−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド１−（７−３７）、グルカゴン様ペプチド２、グルカゴン様ペプチド２−（３−３３）、ＧｎＲＨ  Ｉ、ＧｎＲＨ  ＩＩ、ＧＲＰ−（１８−２７）、ｈＣＧ、ヒスタミン、ヒューマニン、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ５、カリジン、キスペプチン−１０、キスペプチン−１３、キスペプチン−１４、キスペプチン−５４、キヌレン酸、大型ニューロメジンＮ、大型ニューロテンシン、Ｌ−グルタミン酸、ＬＨ、リトコール酸、Ｌ−乳酸、長鎖カルボン酸、ＬＰＡ、ＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＬＸＡ４、Ｌｙｓ−［Ｈｙｐ３］−ブラジキニン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、中鎖脂肪酸、メラニン凝集ホルモン、メラトニン、メチルカルバムイルＰＡＦ、Ｍｇ２＋、モチリン、Ｎ−アラキドニルグリシン、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、ニューロメジンＢ、ニューロメジンＮ、ニューロメジンＳ−３３、ニューロメジンＵ−２５、ニューロノスタチン、ニューロペプチドＡＦ、ニューロペプチドＢ−２３、ニューロペプチドＢ−２９、ニューロペプチドＦＦ、ニューロペプチドＳ、ニューロペプチドＳＦ、ニューロペプチドＷ−２３、ニューロペプチドＷ−３０、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＹ−（３−３６）、ニューロテンシン、ノシセプチン／オルファニンＦＱ、Ｎ−オレオイルメタノールアミド、オベスタチン、オクトパミン、オレキシン−Ａ、オレキシン−Ｂ、オキシステロール、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８、ＰＡＦ、膵臓ポリペプチド、ペプチドＹＹ、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＨＭ、ホスファチジルセリン、ＰＨＶ、プロキネティシン−１、プロキネティシン−２、プロキネティシン−２β、プロサポシン、ＰｒＲＰ−２０、ＰｒＲＰ−３１、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ、ＰＴＨｒＰ−（１−３６）、ＱＲＦＰ４３、リラキシン、リラキシン−１、リラキシン−３、レゾルビンＤ１、レゾルビンＥ１、ＲＦＲＰ−１、ＲＦＲＰ−３、Ｒ−スポンジン、セクレチン、セリンプロテアーゼ、スフィンゴシン１−ホスフェート、スフィンゴシルホスフォリルコリン、ＳＲＩＦ−１４、ＳＲＩＦ−２８、サブスタンスＰ、コハク酸、トロンビン、トロンボキサンＡ２、ＴＩＰ３９、Ｔ−キニン、ＴＲＨ、ＴＳＨ、チラミン、ＵＤＰ−グルコース、ウリジン二リン酸、ウロコルチン１、ウロコルチン２、ウロコルチン３、ウロテンシンＩＩ関連ペプチド、ウロテンシンＩＩ、バソプレシン、ＶＩＰ、Ｗｎｔ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−３、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−９ｂ、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、Ｚｎ２＋、α−ＣＧＲＰ、α−ケトグルタル酸、α−ＭＳＨ、α−ネオエンドルフィン、β−アラニン、β−ＣＧＲＰ、β−Ｄ−ヒドロキシ酪酸、β−エンドルフィン、β−ＭＳＨ、β−ネオエンドルフィン、β−フェニールエチルアミン、およびγ−ＭＳＨ。
【００４９】
ＧＰＣＲリガンドとＧＰＣＲとの表面相互作用に基づくＧＰＣＲ結合ドメインの配列は、様々な方法を使用して解析される。例えば、複数種の生物の計算解析が実行される。いくつかの例において、構造解析が実行される。いくつかの例において、配列解析が実行される。配列解析は、当技術分野で既知のデータベースを使用して実行可能である。データベースの非限定的な例は、限定されないが、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）、およびＩＵＰＨＡＲ／ＢＰＳ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ（ｇｕｉｄｅｔｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）が挙げられる。
【００５０】
本明細書には、様々な生物体中の配列解析に基づいて設計されたＧＰＣＲ結合ドメインが記載される。例えば、配列解析は異なる生物体における相同配列を同定するために実行される。典型的な生物体には、限定されないが、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、霊長類（例えばチンパンジー、ヒヒ、ゴリラ、オランウータン、サル）、イヌ、ネコ、ブタ、ロバ、ウサギ、魚類、鳥類、およびヒトが挙げられる。
【００５１】
ＧＰＣＲ結合ドメインの同定後、ＧＰＣＲ結合ドメインをコードする核酸を含むライブラリーが生成され得る。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインのライブラリーは、立体構造リガンド相互作用、ペプチド−リガンド相互作用、小分子リガンド相互作用、ＧＰＣＲの細胞外ドメイン、またはＧＰＣＲを標的とする抗体に基づいて設計されたＧＰＣＲ結合ドメインの配列を含む。ＧＰＣＲ結合ドメインのライブラリーはタンパク質ライブラリーを生成するように翻訳され得る。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインのライブラリーは、ペプチドライブラリー、免疫グロブリンライブラリー、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを生成するように翻訳される。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインのライブラリーは、タンパク質ライブラリーを生成するように翻訳され、これを更に修飾することでペプチド模倣ライブラリーが生成される。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインのライブラリーはタンパク質ライブラリーを生成するように翻訳され、これを用いて少分子が生成される。
【００５２】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの予め決められた基準核酸配列の予め決められた変異体を各々がコードする核酸を含む、ＧＰＣＲ結合ドメインのライブラリーの合成をもたらす。場合によっては、予め決められた基準配列はタンパク質をコードする核酸配列であり、変異体ライブラリーは、合成された核酸によってコードされた後続するタンパク質中の単一の残基の複数の様々な変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも１つのコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合タンパク質のライブラリーは、複数の位置にて変異を総体的にコードする変異核酸を含む。いくつかの例において、異なるライブラリーは、ＧＰＣＲ結合ドメインにおける少なくとも単一のコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、異なるライブラリーは、ＧＰＣＲ結合ドメインにおける複数のコドンの変異をコードする配列を含む。変異に対するコドンの典型的な数は、限定されないが、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンを含む。
【００５３】
本明細書に記載される方法は、ＧＰＣＲ結合ドメインをコードする核酸を含むライブラリーの合成をもたらし、ライブラリーは、ＧＰＣＲ結合ドメインの長さの変異をコードする含む配列を含む。いくつかの例において、ライブラリーは、予め決められた基準配列と比較して少ない、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンの長さの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、ライブラリーは、予め決められた基準配列と比較して多い、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンの長さの変異をコードする配列を含む。
【００５４】
ＧＰＣＲ結合ドメインの同定後、ＧＰＣＲ結合ドメインは、本明細書に記載されるようなスキャホールドに配置されてもよい。いくつかの例において、スキャホールドは免疫グロブリンである。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインはＣＤＲ−Ｈ３領域に配置される。スキャホールドに配置され得るＧＰＣＲ結合ドメインは、モチーフと呼ばれる場合もある。ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドは、結合、特異性、安定性、発現、フォールディング、または下流の活性に基づいて設計され得る。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドは、ＧＰＣＲとの接触を可能とする。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドは、ＧＰＣＲとの高親和性結合を可能とする。ＧＰＣＲ結合ドメインの典型的なアミノ酸配列を表２に記載する。
【００５５】
【表２−１】
2020536504.tif 000017
【００５６】
【表２−２】
2020536504.tif 000018
【００５７】
【表２−３】
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【００５８】
【表２−４】
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【００５９】
【表２−５】
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【００６０】
【表２−６】
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【００６１】
【表２−７】
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【００６２】
【表２−８】
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【００６３】
【表２−９】
2020536504.tif 000025
【００６４】
【表２−１０】
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【００６５】
【表２−１１】
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【００６６】
【表２−１２】
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【００６７】
本明細書にはＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドが提供され、ＧＰＣＲ結合ドメインの配列は少なくとも１つのＧＰＣＲとの相互作用を支持する。配列はＧＰＣＲリガンドの配列に相同する、またはそれと同一であり得る。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメイン配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメイン配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に対して、少なくともまたは約９５％の同一性を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメイン配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に対して、少なくともまたは約９７％の同一性を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメイン配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に対して、少なくともまたは約９９％の同一性を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメイン配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に対して、少なくともまたは約１００％の同一性を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメイン配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７の、少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、または４００を超えるアミノ酸を有する、少なくとも一部を含む。
【００６８】
ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーは、１つ以上のＧＰＣＲに結合し得る。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドは、単一のＧＰＣＲに結合する。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドは、同じファミリーまたはクラスのＧＰＣＲに結合する。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドは、複数のＧＰＣＲに結合する。例えば、スキャホールドは多量体であり、少なくとも２つのスキャホールドを含む。いくつかの例において、多量体スキャホールドは、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、または８を超えるスキャホールドを含む。いくつかの例において、多量体スキャホールドは、例えば二量化ドメイン、アミノ酸リンカー、ジスルフィド結合、化学的架橋、または当該技術分野で既知の他のあらゆるリンカーにより結合される、少なくとも２つのスキャホールドを含む。いくつかの例において、多量体スキャホールドは同じＧＰＣＲまたは異なるＧＰＣＲに結合する。
【００６９】
本明細書には、ドメイン型、ドメイン長さ、または残基の変異における変異を含む、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むＧＰＣＲ結合ライブラリーが提供される。いくつかの例において、ドメインは、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドにおける領域である。例えば、領域はＶＨ、ＣＤＲ−Ｈ３、またはＶＬドメインである。いくつかの例において、ドメインはＧＰＣＲ結合ドメインである。
【００７０】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの予め決められた基準核酸配列の予め決められた変異体を各々がコードする、オリゴ核酸のライブラリーの合成をもたらす。場合によっては、予め決められた基準配列はタンパク質をコードする核酸配列であり、変異体ライブラリーは、合成された核酸によってコードされた後続するタンパク質中の単一の残基の複数の様々な変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも１つのコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、複数の位置にて変異を総体的にコードする変異核酸を含む。いくつかの例において、変異体ライブラリーは、ＶＨ、ＣＤＲ−Ｈ３、またはＶＬドメインの少なくとも単一のコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、異なるライブラリーは、ＧＰＣＲ結合ドメインにおける少なくとも単一のコドンの変異をコードする配列を含む。例えば、表２に列挙されるようなＧＰＣＲ結合ドメインの少なくとも１つの単一コドンが変動される。いくつかの例において、変異体ライブラリーは、ＶＨ、ＣＤＲ−Ｈ３、またはＶＬドメインの複数のコドンの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、異なるライブラリーは、ＧＰＣＲ結合ドメインにおける複数のコドンの変異をコードする配列を含む。変異に対するコドンの典型的な数は、限定されないが、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンを含む。
【００７１】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの予め決められた基準核酸配列の予め決められた変異体を各々がコードする核酸のＧＰＣＲ結合ライブラリーの合成をもたらし、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、ドメインの長さの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、ドメインはＶＨ、ＣＤＲ−Ｈ３、またはＶＬドメインである。いくつかの例において、ドメインはＧＰＣＲ結合ドメインである。いくつかの例において、ライブラリーは、予め決められた基準配列と比較して少ない、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンの長さの変異をコードする配列を含む。いくつかの例において、ライブラリーは、予め決められた基準配列と比較して多い、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンの長さの変異をコードする配列を含む。
【００７２】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、様々な数のフラグメントにより合成される。いくつかの例において、フラグメントはＶＨ、ＣＤＲ−Ｈ３、またはＶＬドメインを含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、少なくともまたは約２つのフラグメント、３つのフラグメント、４つのフラグメント、５つのフラグメント、または５つを超えるフラグメントにより合成される。合成された核酸の核酸フラグメントの各々の長さ、または核酸の平均長さは、少なくともまたは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、または６００を超える塩基対でもよい。いくつかの例において、長さは、約５０〜６００、７５〜５７５、１００〜５５０、１２５〜５２５、１５０〜５００、１７５〜４７５、２００〜４５０、２２５〜４２５、２５０〜４００、２７５〜３７５、または３００〜３５０の塩基対である。
【００７３】
本明細書に記載されるようなＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むＧＰＣＲ結合ライブラリーは、翻訳時に様々な長さのアミノ酸を含む。いくつかの例において、合成されたアミノ酸のアミノ酸フラグメントの各々の長さ、またはアミノ酸の平均長さは、少なくともまたは約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、または１５０を超えるアミノ酸でもよい。いくつかの例において、アミノ酸の長さは、約１５〜１５０、２０〜１４５、２５〜１４０、３０〜１３５、３５〜１３０、４０〜１２５、４５〜１２０、５０〜１１５、５５〜１１０、６０〜１１０、６５〜１０５、７０〜１００、または７５〜９５のアミノ酸である。いくつかの例において、アミノ酸の長さは約２２〜約７５のアミノ酸である。
【００７４】
ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードするデノボ合成された変異体配列を含む、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、多数の変異体配列を含む。いくつかの例において、多数の変異体配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＶＬ、ＶＨ、またはそれらの組み合わせに対してデノボ合成される。いくつかの例において、多数の変異体配列は、フレームワーク要素１（ＦＷ１）、フレームワーク要素２（ＦＷ２）、フレームワーク要素３（ＦＷ３）、またはフレームワーク要素４（ＦＷ４）に対してデノボ合成される。いくつかの例において、多数の変異体配列は、ＧＰＣＲ結合ドメインのためにデノボ合成される。例えば、変異体配列の数は、ＶＨドメインでは約１〜約１０の配列、ＧＰＣＲ結合ドメインでは約１０８の配列、およびＶＫドメインでは約１〜約４４の配列である。図２を参照する。変異体配列の数は、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、または５００を超える配列でもよい。いくつかの例において、変異体配列の数は、約１０〜３００、２５〜２７５、５０〜２５０、７５〜２２５、１００〜２００、または１２５〜１５０の配列である。
【００７５】
ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードするデノボ合成された変異体配列を含む、ＧＰＣＲ結合ライブラリーの多様性は改善されている。例えば、変異体は、Ｎ末端ＣＤＲ−Ｈ３変異およびＣ末端ＣＤＲ−Ｈ３変異を含む免疫グロブリンスキャホールド変異体にＧＰＣＲ結合ドメイン変異体を配置することにより生成される。いくつかの例において、変異体は親和性成熟変異体を含む。代替的に、または組み合わせにおいて、変異体は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むがこれらに限定されない免疫グロブリンの他の領域中の変異体を含む。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ライブラリーの変異体の数は、少なくともまたは約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１０を超える非同一配列である。例えば、ＶＨ領域では約１０の変異体配列、ＣＤＲ−Ｈ３領域では約２３７の変異体配列、およびＶＬ・ＣＤＲ−Ｌ３領域では約４３の変異体配列を含むライブラリーは、１０５の非同一配列（１０×２３７×４３）を含む。図４Ａ−４Ｂを参照する。
【００７６】
ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むＧＰＣＲ結合ライブラリーの合成後、ライブラリーはスクリーニングおよび解析のために使用されてもよい。例えば、ライブラリーは、ライブラリーの表示能力およびパニングのために解析される。いくつかの例において、表示能力は選択可能なタグを使用して解析される。典型的なタグは、限定されないが、放射性ラベル、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色定量タグ、アフィニティータグ、または、その他当技術分野で既知のラベルまたはタグを含む。いくつかの例では、タグはヒスチジン、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）、またはＦＬＡＧである。例えば、図３に見られるように、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ、およびＬｕｃｙなどの複数のタグの他、ＤＮＡバーコードを伴うＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含む。いくつかの例において、ライブラリーは、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ポロニーシーケンシング、ライゲーションシーケンシング、可逆的ターミネーターシーケンシング、プロトン検出シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ナノポアシーケンシング、電子シーケンシング、パイロシーケンシング、マクサム−ギルバートシーケンシング、連鎖停止（例えばサンガー）シーケンシング、＋Ｓシーケンシング、または合成によるシーケンシングを含むがこれらに限定されない、様々な方法を使用した配列決定により解析される。
【００７７】
発現系
【００７８】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、ライブラリーは、特異性、安定性、発現、フォールディング、または下流の活性が改善されている。いくつかの例において、本明細書に記載されるライブラリーは、スクリーニングおよび解析のために使用される。
【００７９】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、核酸ライブラリーは、スクリーニングおよび解析のために使用される。いくつかの例において、スクリーニングおよび解析はインビボ、インビトロ、またはエクスビボのアッセイを含む。スクリーニングのための細胞は、生きている被験体または細胞株から得られた初代細胞を含む。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞および真菌細胞）または真核細胞（例えば、植物細胞および動物細胞）に由来し得る。典型的な動物細胞は、限定されないが、マウス、ウサギ、霊長類、および昆虫由来のものを含む。いくつかの例において、スクリーニングのための細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株を含むがこれらに限定されない細胞株を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸ライブラリーは、多細胞生物にも送達され得る。典型的な多細胞生物には、限定されないが、植物、マウス、ウサギ、霊長類、および昆虫が挙げられる。
【００８０】
本明細書に記載される核酸ライブラリーは、様々な薬学特性または薬物動態特性のためにスクリーニングされ得る。いくつかの例において、ライブラリーは、インビトロアッセイ、インビボアッセイ、またはエクスビボアッセイを使用してスクリーニングされる。例えば、スクリーニングされるインビトロの薬学特性または薬物動態特性には、限定されないが、結合親和性、結合特異性、および結合活性が挙げられる。スクリーニングされる本明細書に記載のライブラリーの、典型的なインビボの薬学特性または薬物動態特性には、限定されないが、治療効果、活性、前臨床毒性特性、臨床的有効度特性、臨床的毒性特性、免疫原性、効力、および臨床的安全性特性が挙げられる。
【００８１】
本明細書には核酸ライブラリーが提供され、核酸ライブラリーはベクターに発現され得る。本明細書に開示される核酸ライブラリーを挿入するための発現ベクターは、真核生物または原核生物の発現ベクターを含み得る。典型的な発現ベクターには、限定されないが、哺乳動物の発現ベクター：ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＮＥＯ−ＮＨ２−ＰＰＴ−３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＮＥＯ−ＣＯＯＨ−３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＵＲＯ−ＮＨ２−ＧＳＴ−ＴＥＶ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−ＣＯＯＨ−ＴＥＶ−ＦＬＡＧ（Ｒ）−６Ｈｉｓ、ｐＣＥＰ４  ｐＤＥＳＴ２７、ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｕｂ−ＫｒＹＦＰ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＭＤＶ−ｄａＧＦＰ、ｐＥＦ１ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１  Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＭＤＶ−Ｈｙｇｒｏ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ、ｐＭＣＰ−ｔａｇ（ｍ）、およびｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＵＲＯ−ＮＨ２−ＣＭＹＣ；細菌の発現ベクター：ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−ＢｅｔａＧａｌ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−Ｆｌｕｃ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０、およびｐＳＦ−Ｔａｃ；植物の発現ベクター：ｐＲＩ  １０１−ＡＮ  ＤＮＡおよびｐＣａｍｂｉａ２３０１；および酵母発現ベクター：ｐＴＹＢ２１およびｐＫＬＡＣ２、および昆虫のベクター：ｐＡｃ５．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＡおよびｐＤＥＳＴ８が挙げられる。いくつかの例において、ベクターはｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３．１である。
【００８２】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインの配列を含むスキャホールドを含む構築物を生成するためにベクターに発現される核酸ライブラリーが記載される。いくつかの例において、構築物のサイズは変動する。いくつかの例において、構築物は、少なくともまたは約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、２０００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、または１００００を超える塩基を含む。いくつかの例において、構築物は、約３００〜１，０００、３００〜２，０００、３００〜３，０００、３００〜４，０００、３００〜５，０００、３００〜６，０００、３００〜７，０００、３００〜８，０００、３００〜９，０００、３００〜１０，０００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜４，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜６，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜８，０００、１，０００〜９，０００、１，０００〜１０，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜６，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜８，０００、２，０００〜９，０００、２，０００〜１０，０００、３，０００〜４，０００、３，０００〜５，０００、３，０００〜６，０００、３，０００〜７，０００、３，０００〜８，０００、３，０００〜９，０００、３，０００〜１０，０００、４，０００〜５，０００、４，０００〜６，０００、４，０００〜７，０００、４，０００〜８，０００、４，０００〜９，０００、４，０００〜１０，０００、５，０００〜６，０００、５，０００〜７，０００、５，０００〜８，０００、５，０００〜９，０００、５，０００〜１０，０００、６，０００〜７，０００、６，０００〜８，０００、６，０００〜９，０００、６，０００〜１０，０００、７，０００〜８，０００、７，０００〜９，０００、７，０００〜１０，０００、８，０００〜９，０００、８，０００〜１０，０００、または９，０００〜１０，０００の塩基の範囲を含む。
【００８３】
本明細書には、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むライブラリーが提供され、核酸ライブラリーは、細胞に発現される。いくつかの例において、ライブラリーはレポーター遺伝子を発現するように合成される。典型的なレポーター遺伝子には、限定されないが、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、濃青色蛍光タンパク質、淡黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、サクランボ色蛍光タンパク質、緑青色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、ルシフェラーゼ、およびそれらの誘導体が挙げられる。レポーター遺伝子の調節を判定するための方法は当技術分野において周知であり、限定されないが、蛍光測定器方法（例えば蛍光分光学法、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡検査法）および抗生物質耐性判定が挙げられる。
【００８４】
疾患および障害
【００８５】
本明細書には、治療効果を有し得る、ＧＰＣＲ結合ドメインを含むスキャホールドをコードする核酸を含むＧＰＣＲ結合ライブラリーが提供される。いくつかの例において、ＧＰＣＲ結合ライブラリーは、疾患または障害を処置するために使用されるタンパク質を翻訳時にもたらす。いくつかの例において、タンパク質は免疫グロブリンである。いくつかの例において、タンパク質はペプチド模倣体である。典型的な疾患には、限定されないが、癌、炎症性疾患または障害、代謝疾患または障害、循環器疾患または障害、呼吸器疾患または障害、疼痛、消化器疾患または障害、生殖器疾患または障害、内分泌疾患または障害、または神経系疾患または障害を含む。いくつかの例において、癌は固形癌または血液癌である。いくつかの例において、本明細書に記載されるようなＧＰＣＲグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）などの阻害剤は、代謝異常の処置のために使用される。いくつかの例において、本明細書に記載されるようなＧＰＣＲ  ＧＬＰ１Ｒの阻害剤は、体重増加の処置（または体重減少の誘導）、肥満症の処置、またはＩＩ型糖尿病の処置のために使用される。いくつかの例において、被験体は哺乳動物である。いくつかの例において、被験体は、マウス、ウサギ、イヌ、またはヒトである。本明細書に記載される方法により処置される被験体は、幼児、成人、または小児であり得る。本明細書に記載されるような抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物は、静脈内または皮下に投与され得る。いくつかの例において、医薬組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２０〜２４３６のいずれか１つの配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、本明細書に記載される抗体または抗体フラグメントを含む。さらなる例において、医薬組成物は代謝異常の処置のために使用される。
【００８６】
変異体ライブラリー
【００８７】
コドン変異
【００８８】
本明細書に記載される変異体核酸ライブラリーは複数の核酸を含み、それぞれの核酸は、基準核酸配列と比較して、変異体コドン配列をコードする。いくつかの例において、第１の核酸母集団のそれぞれの核酸は単一の変異体部位に変異体を含む。いくつかの例において、第１の核酸母集団は、同じ変異体部位に１つを超える変異体を含むように、単一の変異体部位に複数の変異体を含む。第１の核酸母集団は、同じ変異体部位に複数のコドン変異体を総体的にコードする核酸を含み得る。第１の核酸母集団は、同じ位置に最大１９以上のコドンを総体的にコードする核酸を含み得る。第１の核酸母集団は、同じ位置に最大６０の変異体トリプレットを総体的にコードする核酸を含み、または、第１の核酸母集団は、同じ位置にコドンの最大６１の異なるトリプレットを総体的にコードする核酸を含み得る。それぞれの変異体は、翻訳中に異なるアミノ酸をもたらすコドンをコードし得る。表３は、異なる部位に対して起こり得る各コドン（および代表的なアミノ酸）のリストを提供する。
【００８９】
【表３−１】
2020536504.tif 000029
【００９０】
【表３−２】
2020536504.tif 000030
【００９１】
核酸母集団は、複数の位置にて最大２０のコドン変異を総体的にコードする様々な核酸を含むことがある。このような場合、母集団中の各核酸は、同じ核酸中の１つを超える位置でのコドンの変異を含む。いくつかの例において、母集団中の各核酸は、単一の核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のコドンでのコドンの変異を含む。いくつかの例において、それぞれの変異体の長い核酸は、単一の長い核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のコドンでのコドンの変異を含む。いくつかの例において、変異体の核酸母集団は、単一の核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のコドンでのコドンの変異を含む。いくつかの例において、変異体の核酸母集団は、単一の核酸中の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のコドンでのコドンの変異を含む。
【００９２】
高度に並列な核酸合成
【００９３】
本明細書には、革新的な合成プラットフォームを作るために、シリコン上のナノウェル内でのオリゴ核酸から遺伝子アセンブリへの末端間プロセスの小型化、並列化、および垂直的統合を利用する、プラットフォームアプローチが提供される。本明細書に記載される装置は、９６ウェルのプレートと同じフットプリントを提供し、シリコン合成プラットフォームは、従来の合成方法と比較して、最大１，０００倍以上のスループットを増加させることができ、単一の高度に並列されたラン（ｒｕｎ）において最大約１，０００，０００以上のポリヌクレオチド、または１０，０００以上の遺伝子を産生することができる。
【００９４】
次世代配列決定の出現により、高解像度のゲノムデータは、正常な生態および病因の両方において様々な遺伝子の生物学的役割を深く探究する研究に対する重要な因子となった。この研究の中心となるのは、分子生物学のセントラルドグマおよび「配列情報の残基ごとの移動」の概念である。ＤＮＡにコードされたゲノム情報は、メッセージへと転写され、これはその後、与えられた生物学的経路内の活性産物であるタンパク質へと翻訳される。
【００９５】
研究の別の刺激的な領域は、高特異的な細胞標的に焦点を置いた治療用分子の発見、開発、および製造に関するものである。高い多様性のＤＮＡ配列ライブラリーは、標的とされた治療薬のための開発パイプラインの中心にある。治療標的に対して高い親和性を有するタンパク質の高度な発現のために理想的には遺伝子の最適化に達する、設計、構造、および試験のタンパク質工学サイクルにおいてタンパク質を発現するために、遺伝子突然変異体が使用される。一例として、受容体の結合ポケットを考察されたい。結合ポケット内ですべての残基のすべての配列の順列を同時に試験する能力によって、徹底的な診査が可能になり、成功の可能性が増大する。研究者が受容体内の特定部位にてすべての起こり得る突然変異を発生させる試みを行う、飽和突然変異誘発は、この開発課題に対する１つの手法を表わす。費用がかかる上に、時間および労働に集約的ではあるが、この手法により、各変異体を各位置へと導入することができる。対照的に、少数の選択位置または短い一続きのＤＮＡが広範囲に修飾され得る、組み合わせの突然変異誘発は、偏った提示（ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を持つ変異体の不完全なレパートリーを発生させる。
【００９６】
薬物開発のパイプラインを促進するために、試験に利用可能な正しい位置において意図した頻度で利用可能な望ましい変異体を有するライブラリー、言い換えれば、高精度ライブラリー（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ）は、コストの削減に加えて、スクリーニングの所要時間の短縮も可能にする。本明細書には、望ましい頻度で各々の意図した変異体の正確な導入をもたらす核酸合成変異体ライブラリーを合成する方法が提供される。エンドユーザーにとって、これは、配列空間を徹底的にサンプリングするだけでなく、効率的な方法でこれらの仮説を問うことができる能力へと翻訳され、コストおよびスクリーニング時間を削減する。ゲノム全体の編集は、重要な経路、各変異体および配列の順列が最適な機能性に関して試験され得るライブラリーを解明することができ、全経路を再構築するために何千もの遺伝子を使用することができ、創薬のために生物系を再設計するべくゲノムを使用できる。
【００９７】
第１の実施例において、薬物自体は、本明細書に記載される方法を使用して最適化され得る。例えば、抗体の指定された機能を改善するために、抗体の一部をコードする変異体核酸ライブラリーが設計され、合成される。その後、抗体に対する変異体核酸ライブラリーが、本明細書に記載されるプロセス（例えば、ＰＣＲ突然変異誘発、その後のベクターへの挿入）によって生成され得る。その後、抗体は、生産細胞株（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）において発現され、活性の増強のためにスクリーニングされる。スクリーニングの例は、抗原に対する結合親和性、安定性、またはエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、補体、またはアポトーシス）の調節を検査することを含む。抗体を最適化する典型的な領域は、限定されないが、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、Ｆａｂ領域の可変領域、Ｆａｂ領域の定常領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）、およびＶＨまたはＶＬの特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００９８】
本明細書に記載される方法によって合成された核酸ライブラリーは、疾患状態に関連付けられた様々な細胞において発現され得る。疾患状態に関連付けられた細胞は、被験体からの細胞株、組織サンプル、初代細胞、被験体から拡大された培養細胞、またはモデル系における細胞を含む。典型的なモデル系は、限定されないが、疾患状態の植物および動物のモデルを含む。
【００９９】
疾患状態の予防、低減、または処置に関連付けられた変異体分子を特定するために、本明細書に記載される変異体核酸ライブラリーが、疾患状態に関連付けられた細胞、または疾患状態が誘発され得る細胞において発現される。いくつかの例において、細胞において疾患状態を誘発するための薬剤が使用される。疾患状態の誘発のための典型的なツールは、限定されないが、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系、ＬＰＳ炎症誘発、および低血糖症を誘発するストレプトゾトシンを含む。疾患状態に関連付けられた細胞は、モデル系からの細胞または培養細胞の他に、特定の病状を有する被験体由来の細胞であり得る。典型的な病状は、細菌性、真菌性、ウイルス性、自己免疫性、増殖性の障害（例えば癌）を含む。いくつかの例において、変異体核酸ライブラリーは、被験体由来のモデル系、細胞株、または初代細胞に発現され、少なくとも１つの細胞活性の変化に対してスクリーニングされる。典型的な細胞活性は、限定されないが、増殖、周期進行、細胞死、付着、遊走、繁殖、細胞シグナル伝達、エネルギー産生、酸素利用、代謝活性、および老化、遊離基損傷に対する反応、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１００】
基質
【０１０１】
ポリヌクレオチド合成のための表面として使用されるデバイスは、均質アレイ表面、パターン化されたアレイ表面、チャネル、ビーズ、ゲルなどを含むがこれらに限定されない、基質の形態でもよい。本明細書には、複数のクラスターを含む基質が提供され、ここで各クラスターは、ポリヌクレオチドの付着および合成を支持する複数の遺伝子座を含む。いくつかの例において、基質は均質アレイ表面を含む。例えば、均質アレイ表面は均質プレートである。本明細書で使用されるような用語「遺伝子座」は、表面から伸長する単一の予め決められた配列をコードするポリヌクレオチドへの支持を提供する構造上の離散的領域を指す。いくつかの例において、遺伝子座は、二次元表面、例えば、実質的に平らな表面上にある。いくつかの例において、遺伝子座は、三次元表面、例えば、ウェル、微小ウェル、チャネル、またはポスト上にある。いくつかの例において、遺伝子座の表面は、ポリヌクレオチド合成のための少なくとも１つのヌクレオチド、または好ましくは、ポリヌクレオチドの集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に付着するために、活発に官能基化される物質を含む。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは、同じ核酸配列をコードするポリヌクレオチドの集団を指す。場合により、基質の表面は、基質の１つ以上の表面を包含する。提供されるシステムおよび方法を用いて本明細書に記載のライブラリー内で合成されるポリヌクレオチドに関する平均エラー率は多くの場合、エラー補正を伴うことなく、１０００分の１未満、２０００分の１未満、３０００分の１未満、またはそれよりも遥かに少ない。
【０１０２】
本明細書には、共通の支持体上のアドレス可能位置にて異なる予め決められた配列を有している、複数のポリヌクレオチドのパラレル合成を支持する表面が提供される。いくつかの例において、基質は、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００、またはそれ以上の非同一ポリヌクレオチドの合成への支持を提供する。場合により、表面は、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００、またはそれ以上のポリヌクレオチドの合成への支持を提供する。いくつかの例において、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、同一の配列を有している、または同一の配列により合成されるように構成されている。いくつかの例において、基質は、少なくとも８０、９０、１００、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれ以上の塩基を有するポリヌクレオチドの成長のための表面環境を提供する。
【０１０３】
本明細書には、基質の別個の遺伝子座上でのポリヌクレオチド合成のための方法が提供され、各遺伝子座は、ポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。場合により、各遺伝子座は、別の遺伝子座上で成長したポリヌクレオチドの集団とは異なる配列を有するポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例において、各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド合成のために表面上の遺伝子座の同じクラスター内の異なる遺伝子座にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の余剰により合成される。いくつかの例において、基質の遺伝子座は複数のクラスター内に位置する。いくつかの例において、基質は、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、またはそれ以上のクラスターを含む。いくつかの例において、基質は、２，０００；５，０００；１０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，１００，０００；１，２００，０００；１，３００，０００；１，４００，０００；１，５００，０００；１，６００，０００；１，７００，０００；１，８００，０００；１，９００，０００；２，０００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；または１０，０００，０００、またはそれ以上の別個の遺伝子座を含む。いくつかの例において、基質は約１０，０００の別個の遺伝子座を含む。単一のクラスター内の遺伝子座の量は、様々な例において変動する。場合により、各クラスターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、またはそれ以上の遺伝子座を含む。いくつかの例において、各クラスターは、約５０−５００の遺伝子座を含む。いくつかの例において、各クラスターは、約１００−２００の遺伝子座を含む。いくつかの例において、各クラスターは、約１００−１５０の遺伝子座を含む。いくつかの例において、各クラスターは、約１０９、１２１、１３０、または１３７の遺伝子座を含む。いくつかの例において、各クラスターは、約１９、２０、６１、６４、またはそれ以上の遺伝子座を含む。代替的に、または組み合わせにおいて、ポリヌクレオチド合成は均質アレイ表面上で行われる。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、基質上で合成された別々のオリゴ核酸の数は、基質における利用可能な別々の遺伝子座の数に左右され得る。いくつかの例において、基質のクラスターまたは表面内の遺伝子座の密度は、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１、１０、２５、５０、６５、７５、１００、１３０、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、１，０００、またはそれ以上の遺伝子座である。場合によっては、基質は１０−５００、２５−４００、５０−５００、１００−５００、１５０−５００、１０−２５０、５０−２５０、１０−２００、または５０−２００ｍｍ２を含む。いくつかの例において、クラスターまたは表面内の２つの隣接する遺伝子座の中心間の距離は、約１０−５００、約１０−２００、または約１０−１００ｕｍである。いくつかの例において、隣接した遺伝子座の２つの中心間の距離は、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍより長い。いくつかの例において、２つの隣接した遺伝子座の中心間の距離は、約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例において、各遺伝子座は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｕｍの幅を持つ。場合によっては、各遺伝子座は、約０．５−１００、０．５−５０、１０−７５、または０．５−５０ｕｍの幅を持つ。
【０１０５】
いくつかの例において、基質内のクラスターの密度は、１００ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、１０ｍｍ２当たり１のクラスター、５ｍｍ２当たり１のクラスター、４ｍｍ２当たり１のクラスター、３ｍｍ２当たり１のクラスター、２ｍｍ２当たり１のクラスター、１ｍｍ２当たり１のクラスター、１ｍｍ２当たり２のクラスター、１ｍｍ２当たり３のクラスター、１ｍｍ２当たり４のクラスター、１ｍｍ２当たり５のクラスター、１ｍｍ２当たり１０のクラスター、１ｍｍ２当たり５０のクラスター、またはそれ以上である。いくつかの例において、基質は、１０ｍｍ２当たり約１のクラスターから１ｍｍ２当たり約１０のクラスターを含む。いくつかの例において、２つの隣接したクラスターの中心間の距離は、少なくともまたは約５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、または５０００μｍである。場合によっては、２つの隣接したクラスターの中心間の距離は、約５０−１００、５０−２００、５０−３００、５０−５００、および１００−２０００ｕｍである。場合によっては、２つの隣接したクラスターの中心間の距離は、約０．０５−５０、０．０５−１０、０．０５−５、０．０５−４、０．０５−３、０．０５−２、０．１−１０、０．２−１０、０．３−１０、０．４−１０、０．５−１０、０．５−５、または０．５−２ｍｍである。場合により、各クラスターは、約０．５〜約２、約０．５〜約１、または約１〜約２ｍｍの断面を有している。場合により、各クラスターは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍの断面を有している。場合により、各クラスターは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．１５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍの内部断面を有している。
【０１０６】
いくつかの例において、基質は、例えば、約１００〜約２００ｍｍ×約５０〜約１５０ｍｍの、およその標準の９６ウェルプレートのサイズである。いくつかの例において、基質は、約１０００、５００、４５０、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、または５０ｍｍ以下の直径を有している。いくつかの例において、基質の直径は、約２５−１０００、２５−８００、２５−６００、２５−５００、２５−４００、２５−３００、または２５−２００ｍｍである。いくつかの例において、基質は、少なくとも約１００；２００；５００；１，０００；２，０００；５，０００；１０，０００；１２，０００；１５，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００ｍｍ２、またはそれ以上の平面の表面積を有している。いくつかの例において、基質の厚みは、約５０−２０００、５０−１０００、１００−１０００、２００−１０００、または２５０−１０００ｍｍである。
【０１０７】
表面物質
【０１０８】
本明細書に提供される基質、デバイス、およびリアクターは、本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムに適したあらゆる様々な物質から作り上げられる。ある例において、低レベルのヌクレオチド結合を示すために、基質物質が作り上げられる。いくつかの例において、基質物質は、高レベルのヌクレオチド結合を示す別個の表面を生成するために修飾される。いくつかの例において、基質物質は、可視光および／またはＵＶ光に対して透過性である。いくつかの例において、基質物質は十分に導電性であり、例えば、基質の全てまたは一部にわたって均一な電場を形成できる。いくつかの例において、導電性材料は電気接地（ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｇｒｏｕｎｄ）に接続される。いくつかの例において、基質は、熱伝導性であるか、または断熱される。いくつかの例において、物質は、化学的または生化学的な反応、例えばポリヌクレオチド合成反応プロセスを支持するべく耐薬品性および耐熱性である。いくつかの例において、基質は可撓性材料を含む。可撓性材料に関して、物質は、限定されないが以下を含み得る：修飾および非修飾のナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレンなど。いくつかの例において、基質は剛性物質を含む。剛性物質に関して、物質は、限定されないが以下を含み得る：ガラス；石英ガラス；シリコン、プラスチック（例えばポリテトラフルオロエチレン）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびその混合など）；金属（例えば金、白金など）。基質、固形担体、またはリアクターは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース酸ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、およびガラスから成る群から選択される物質から製造され得る。本明細書中の基質／固形担体またはミクロ構造、リアクターは、本明細書中に列挙される物質の組み合わせ、または当該技術分野で既知の他の適切な物質により製造され得る。
【０１０９】
表面構造
【０１１０】
本明細書には、本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムのための基質が提供され、基質は、本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムに適した表面構造を有している。いくつかの例において、基質は、隆起した特徴および／または沈降した特徴を含む。そのような特徴を有する１つの利点は、ポリヌクレオチド合成を支持する表面積の増大である。いくつかの例において、隆起した特徴および／または沈降した特徴を有する基質は、三次元基質と呼ばれる。場合により、三次元基質は１つ以上のチャネルを含む。場合により、１つ以上の遺伝子座はチャネルを含む。場合により、チャネルは、物質堆積デバイスなどの堆積デバイスを介した試薬の堆積に利用可能である。場合により、試薬および／または流体は、１つ以上のチャネルと流体連通して、より大きなウェルに集まる。例えば基質は、クラスターを有する複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスターの１つのウェルと流体連通している。幾つかの方法において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、クラスターの複数の遺伝子座において合成される。
【０１１１】
本明細書には、本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムのための基質が提供され、基質はポリヌクレオチド合成のために構成される。いくつかの例において、構造は、表面上のポリヌクレオチド合成のための流れの制御および物質移動経路を可能にするように構成されている。いくつかの例において、基質の構成は、ポリヌクレオチド合成中の物質移動経路、化学暴露時間、および／または洗浄効果の制御と均一な分布を可能にする。いくつかの例において、基質の構成は、例えば、成長しているポリヌクレオチドによる排除体積が、ポリヌクレオチドの成長に利用可能または適切である、最初に利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％を超えて、またはそれ以下を占めないように、成長するポリヌクレオチドに対して十分な体積を提供することによって、奏効率の増大を可能にする。いくつかの例において、三次元構造は、化学暴露の急速な交換を可能にするために流体の流れの管理を可能にする。
【０１１２】
本明細書には、本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムのための基質が提供され、基質は、本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムに適した構造を含む。いくつかの例において、物理構造によって隔離が達成される。いくつかの例において、ポリヌクレオチド合成のために能動領域および受動領域を生成する表面の差次的な官能基化によって、隔離が達成される。いくつかの例において、差次的な官能基化は、基質表面にわたる疎水性を変え、それにより、堆積した試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）または湿りを引き起こす水接触角の効果を作り出すことによって達成される。より大きな構造を利用することで、飛び散り（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）、および隣接するスポットの試薬による別個のポリヌクレオチド合成位置の相互汚染を減らすことができる。場合により、物質堆積デバイスなどのデバイスが、別個のオリゴ核酸位置に試薬を堆積させるために使用される。三次元特徴を有する基質は、低いエラー率（例えば、約１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２，０００、１：３，０００、１：５，０００、または１：１０，０００未満）を伴う多数のポリヌクレオチド（例えば約１０，０００を超える）の合成を可能にする方法において構成される。いくつかの例において、基質は、１ｍｍ２当たり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００以上の特徴の密度を備えた特徴を含む。
【０１１３】
基質のウェルは、基質の別のウェルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有し得る。基質のチャネルは、基質の別のチャネルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有し得る。いくつかの例において、クラスターの直径、またはクラスターを含むウェルの直径、またはその両方は、約０．０５−５０、０．０５−１０、０．０５−５、０．０５−４、０．０５−３、０．０５−２、０．０５−１、０．０５−０．５、０．０５−０．１、０．１−１０、０．２−１０、０．３−１０、０．４−１０、０．５−１０、０．５−５、または０．５−２ｍｍである。いくつかの例において、クラスター、ウェル、またはその両方の直径は、約５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、または０．０５ｍｍ以下である。いくつかの例において、クラスター、ウェル、またはその両方の直径は約１．０〜１．３ｍｍである。いくつかの例において、クラスター、ウェル、またはその両方の直径は約１．１５０ｍｍである。いくつかの例において、クラスター、ウェル、またはその両方の直径は約０．０８ｍｍである。クラスターの直径は、二次元または三次元の基質内のクラスターを指す。
【０１１４】
いくつかの例において、ウェルの高さは、約２０−１０００、５０−１０００、１００−１０００、２００−１０００、３００−１０００、４００−１０００、または５００−１０００ｕｍである。場合によっては、ウェルの高さは、約１０００、９００、８００、７００、または６００ｕｍ未満である。
【０１１５】
いくつかの例において、基質はクラスター内の複数の遺伝子座に相当する複数のチャネルを含み、チャネルの高さまたは深さは、５−５００、５−４００、５−３００、５−２００、５−１００、５−５０、または１０−５０ｕｍである。場合によっては、チャネルの高さは、１００、８０、６０、４０、または２０ｕｍ未満である。
【０１１６】
いくつかの例において、チャネル、遺伝子座（例えば、ほぼ平面の基質における）、またはチャネルとび遺伝子座の両方（例えば、遺伝子座がチャネルに相当する三次元基質における）の直径は、約１−１０００、１−５００、１−２００、１−１００、５−１００、または１０−１００ｕｍ、例えば約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｕｍである。いくつかの例において、チャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の両方の直径は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０μｍ未満である。いくつかの例において、２つの隣接するチャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の中心間の距離は、約１−５００、１−２００、１−１００、５−２００、５−１００、５−５０、または５−３０ｕｍ、例えば約２０ｕｍである。
【０１１７】
表面修飾
【０１１８】
本明細書には、表面上のポリヌクレオチド合成のための方法が提供され、表面は様々な表面修飾を含む。いくつかの例において、基質表面、または基質表面の選択部位または領域の１つ以上の化学的および／または物理的な特性を変更する加算または減算のプロセスによる、化学的および／または物理的な変更のために、表面修飾が利用される。例えば、表面修飾は、限定されないが、（１）表面の湿潤性を変更すること、（２）表面を官能化すること、つまり、表面官能基を提供する、修飾する、または置換すること、（３）表面を脱官能基化すること、つまり、表面官能基を除去すること、（４）そうでなければ、例えばエッチングによって、表面の化学組成を変更すること、（５）表面粗さを増大または低減すること、（６）表面上にコーティング、例えば、表面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングを提供すること、および／または（７）表面上に粒子を堆積させることを含む。
【０１１９】
場合により、（付着プロモーターと呼ばれる）表面の上部の化学層の追加は、基質の表面上の遺伝子座の構造化されたパターン化を促進する。付着促進の適用のための典型的な表面は、限定されないが、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、および窒化ケイ素を含む。場合により、付着プロモーターは、高い表面エネルギーを有する化学物質である。いくつかの例において、基質の表面上に第２の化学層が堆積される。場合により、第２の化学層は、低い表面エネルギーを有している。場合により、表面上にコーティングされた化学層の表面エネルギーは、表面上での液滴の局在化を支持する。選択されるパターン化の配置に応じて、遺伝子座の近接および／または遺伝子座での流体接触の面積は変更可能である。
【０１２０】
いくつかの例において、例えばポリヌクレオチド合成のために、核酸または他の部分が堆積される、基質表面、または分解された遺伝子座は、滑らかであり、実質的に平面であり（例えば、二次元）、または隆起した特徴または沈降した特徴などの不規則性（例えば三次元特徴）を有している。いくつかの例において、基質表面は、化合物の１つ以上の異なる層により修飾される。対象となるそのような修飾層は、限定されないが、金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子などの無機層および有機層を含む。
【０１２１】
いくつかの例において、基質の分解された遺伝子座は、表面エネルギーを増大させるおよび／または低減させる、１つ以上の部分により官能化される。場合により、部分は化学的に不活性である。場合により、部分は、望ましい化学反応、例えば、ポリヌクレオチド合成反応における１つ以上のプロセスを支持するように構成されている。表面の表面エネルギー、すなわち疎水性は、表面上に付着するヌクレオチドの親和性を判定するための因子である。いくつかの例において、基質の官能化のための方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する基質を提供する工程；および（ｂ）本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で既知の、適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、表面をシラン処理する工程を含む。方法および官能化剤は米国特許第５，４７４，７９６号に記載され、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
いくつかの例において、基質表面は、典型的に基質表面上に存在する反応性の親水性部分を介して、基質表面にシランを結合させるのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含有する誘導体化組成物との接触によって官能基化される。シラン処理は通常、自己組織化を介して有機官能性アルコキシシラン分子で表面を覆う。当該技術分野において現在知られているように、例えば、表面エネルギーを低下または増大させるのための様々なシロキサン官能基化試薬が、さらに使用され得る。有機官能性アルコキシシランは、その有機官能基に応じて分類される。
【０１２３】
ポリヌクレオチド合成
【０１２４】
ポリヌクレオチド合成のための本開示の方法は、ホスホラミダイトの化学作用を含むプロセスを含み得る。幾つかの例において、ポリヌクレオチド合成は、塩基をホスホラミダイトと結合させる工程を含む。ポリヌクレオチド合成は、結合条件下でホスホラミダイトの堆積により塩基を結合することを含んでもよく、ここで、同じ塩基は随意に、１回より多く、すなわち二重の結合でホスホラミダイトとともに堆積される。ポリヌクレオチド合成は、未反応の部位のキャッピングを含んでもよい。いくつかの例において、キャッピングは随意である。ポリヌクレオチド合成はまた、酸化、または酸化工程を含んでもよい。ポリヌクレオチド合成は、脱ブロック化、脱トリチル化、および硫化を含んでもよい。いくつかの例において、ポリヌクレオチド合成は、酸化または硫化のいずれかを含む。いくつかの例において、ポリヌクレオチド合成反応中の１つまたは各工程の間に、デバイスは、例えばテトラゾールまたはアセトニトリルを使用して洗浄される。ホスホラミダイト合成方法における任意の１工程に対する時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、および１０秒未満であり得る。
【０１２５】
ホスホラミダイト方法を使用するポリヌクレオチド合成は、亜リン酸塩トリエステル結合の形成のために成長しているポリヌクレオチド鎖へのホスホラミダイト構築ブロック（例えば、ヌクレオシドホスホラミダイト）の付加を続けることを含み得る。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、３’方向から５’方向に進む。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、１つの合成サイクル当たり１つの成長している核酸鎖への１つのヌクレオチドの付加の制御を可能にする。いくつかの例において、各合成サイクルは結合工程を含む。ホスホラミダイト結合は、活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトと、例えばリンカーを介して基質に結合されたヌクレオシドとの間の亜リン酸塩トリエステル結合の形成を含む。いくつかの例において、ヌクレオシドホスホラミダイトは、起動されたデバイスに提供される。いくつかの例において、ヌクレオシドホスホラミダイトは、アクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）によりデバイスに提供される。いくつかの例において、ヌクレオシドホスホラミダイトは、基質に結合されたヌクレオシドよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍、またはそれ以上の過剰量で、デバイスに提供される。いくつかの例において、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加は、無水環境において、例えば無水アセトニトリルにおいて実行される。ヌクレオシドホスホラミダイトの追加の後、デバイスは随意に洗浄される。いくつかの例において、結合工程は、随意に基質へのヌクレオシドホスホラミダイトの追加の間の洗浄工程と共に、更に１回以上繰り返される。いくつかの例において、本明細書に使用されるポリヌクレオチド合成方法は、１、２、３、またはそれ以上の連続する結合工程を含む。結合前に、多くの場合において、デバイスに結合されたヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、ここで、保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。
【０１２６】
結合に続いて、ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成方法は、随意にキャッピング工程を含む。キャッピング工程において、成長しているポリヌクレオチドは、キャッピング剤で処置される。キャッピング工程は、更なる鎖伸長から、結合後の未反応の基質結合５’−ＯＨ基を遮断するのに有用であり、これにより、内部塩基欠失（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｂａｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を伴うポリヌクレオチドの形成を防ぐ。更に、１Ｈ−テトラゾールで活性化されたホスホラミダイトは、小さな程度にまで、グアノシンのＯ６位置と反応し得る。理論に縛られることなく、Ｉ２／水での酸化後、この副産物は、恐らくＯ６−Ｎ７遊走を介して、脱プリン化を受けることもある。脱プリン部位は、最終的にポリヌクレオチドの最後の脱保護の間に切断され、故に完全長産物の収率が低下する。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水での酸化前にキャッピング試薬による処置によって除去され得る。幾つかの例において、ポリヌクレオチド合成の間にキャッピング工程を含めることで、キャッピングなしでの合成と比較してエラー率が低下する。一例として、キャッピング工程は、無水酢酸と１−メチルイミダゾールとの混合物により基質結合オリゴ核酸を処置することを含む。キャッピング工程に続いて、装置は随意に洗浄される。
【０１２７】
いくつかの例において、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加後、および随意にキャッピングと１回以上の洗浄工程の後に、デバイスに結合された成長している核酸は酸化される。酸化工程において、亜リン酸塩トリエステルが、自然発生のリン酸ジエステルのヌクレオシド間の結合の保護された前駆体である、四配位リン酸塩トリエステルへと酸化される。いくつかの例において、成長しているポリヌクレオチドの酸化は、随意に弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素および水による処置によって達成される。酸化は、例えばｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、無水条件下で実行され得る。いくつかの方法において、キャッピング工程は、酸化後に実行される。持続し得る酸化からの残留水が後の結合を阻害できるため、第２のキャッピング工程はデバイスの乾燥を可能にする。酸化の後、デバイスおよび成長しているポリヌクレオチドは随意に洗浄される。いくつかの例において、酸化の工程は、ポリヌクレオチドホスホロチオエートを得るための硫化工程と置き換えられ、ここで、キャッピング工程は硫化後に実行され得る。３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン、ＤＤＴＴ、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、およびＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含むがこれらに限定されない多くの試薬が、効率的な硫黄移動を可能にする。
【０１２８】
その後のヌクレオシド取り込みのサイクルを、結合を介して生じさせるために、デバイスに結合された成長しているポリヌクレオチドの保護された５’末端は除去され、その結果、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホラミダイトと反応する。いくつかの例において、保護基はＤＭＴであり、デブロッキングがジクロロメタン中でトリクロロ酢酸により生じる。長時間にわたり、または推奨された酸の溶液よりも強力なもので脱トリチル化を行うことで、固形支持体に結合したポリヌクレオチドの脱プリン化の増大が引き起こされ、故に望ましい完全長産物の収率が低下され得る。本明細書に記載される本開示の方法および組成物は、望ましくない脱プリン化反応を制限するデブロッキング条件の制御を提供する。いくつかの例において、デバイスに結合されたオリゴ核酸は、デブロッキング後に洗浄される。いくつかの例において、デブロッキング後の効率的な洗浄は、エラー率が低い合成ポリヌクレオチドに寄与する。
【０１２９】
ポリヌクレオチドの合成のための方法には典型的に、下記工程の一連の繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が伴う：活性化された表面、リンカー、または以前に脱保護された単量体と結合するための、保護された単量体の動的に官能基化された表面（例えば遺伝子座）への適用；後に適用される保護された単量体と反応するように適用された単量体の脱保護；および結合のための別の保護された単量体の適用。１つ以上の中間工程は、酸化または硫化を含む。いくつかの例において、１以上の洗浄工程は、工程の１つまたはすべてに先行するか、またはそれらに続く。
【０１３０】
ホスホラミダイトベースのポリヌクレオチド合成のための方法は、一連の化学工程を含む。いくつかの例において、合成方法の１以上の工程は、試薬のサイクリングを伴い、ここで、方法の１以上の工程は、工程に有用な試薬の装置への適用を含む。例えば、試薬は、一連の液体堆積および真空乾燥の工程によって循環させられる。ウェル、マイクロウェル、チャネルなどの三次元特徴を含む基質のために、試薬は、随意にウェルおよび／またはチャネルを介して装置の１つ以上の領域に通される。
【０１３１】
本明細書に記載される方法およびシステムは、ポリヌクレオチドの合成のためのポリヌクレオチド合成デバイスに関する。合成は並行して実行され得る。例えば、少なくともまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、７５０００、１０００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドが、並行して合成され得る。並行して合成され得るポリヌクレオチドの総数は、２−１０００００、３−５００００、４−１００００、５−１０００、６−９００、７−８５０、８−８００、９−７５０、１０−７００、１１−６５０、１２−６００、１３−５５０、１４−５００、１５−４５０、１６−４００、１７−３５０、１８−３００、１９−２５０、２０−２００、２１−１５０、２２−１００、２３−５０、２４−４５、２５−４０、３０−３５であり得る。当業者は、並行して合成されたポリヌクレオチドの総数が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内、例えば２５−１００にあり得ることを認識する。並行して合成されたポリヌクレオチドの総数は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。デバイス内で合成されたポリヌクレオチドの総モル質量、またはポリヌクレオチドの各々のモル質量は、少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル、またはそれ以上であり得る。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長さは、少なくともまたは約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長さは、多くともまたは約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長さは、１０−５００、９−４００、１１−３００、１２−２００、１３−１５０、１４−１００、１５−５０、１６−４５、１７−４０、１８−３５、１９−２５であり得る。当業者は、デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長さが、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内、例えば１００−３００にあり得ることを認識する。デバイス内のポリヌクレオチドの各々の長さ、またはその平均長さは、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。
【０１３２】
本明細書で提供される、表面上でのポリヌクレオチド合成の方法は、高速での合成を可能にする。一例として、１時間につき少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５  ５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、またはそれ以上のヌクレオチドが合成される。ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジン構築ブロック、またはそれらのアナログ／修飾されたバージョンを含む。いくつかの例において、ポリヌクレオチドのライブラリーは基質上で並行して合成される。例えば、約または少なくとも１００；１，０００；１０，０００；３０，０００；７５，０００；１００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；または５，０００，０００の分解された遺伝子座を含むデバイスは、少なくとも同じ数の別個のポリヌクレオチドの合成を支持することができ、ここで、別個の配列をコードするポリヌクレオチドが、分解された遺伝子座の上で合成される。いくつかの例において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で、本明細書に記載される低いエラー率を伴う装置上に合成される。いくつかの例において、本明細書に記載される基質および方法を用いて低いエラー率により合成されるオリゴ核酸ライブラリーからアセンブルされる、より大きな核酸は、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で調製される。
【０１３３】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、複数のコドン部位にて異なる変異体核酸を含む、核酸のライブラリーの生成を提供する。いくつかの例において、核酸は、１つの部位、２つの部位、３つの部位、４つの部位、５つの部位、６つの部位、７つの部位、８つの部位、９つの部位、１０の部位、１１の部位、１２の部位、１３の部位、１４の部位、１５の部位、１６の部位、１７の部位、１８の部位、１９の部位、２０の部位、３０の部位、４０の部位、５０の部位、またはそれ以上の変異体コドン部位を有し得る。
【０１３４】
いくつかの例において、変異体コドン部位の１以上の部位が隣接し得る。いくつかの例において、変異体コドン部位の１以上の部位は隣接せず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコドンにより分離され得る。
【０１３５】
いくつかの例において、核酸は変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接しており、一続きのコドン部位を形成する。いくつかの例において、核酸は変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接していない。いくつかの例において、オリゴ核酸は変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、一部の変異体コドン部位は互いに隣接しており、一続きの変異体コドン部位を形成し、かつ、変異体コドン部位の一部は互いに隣接していない。
【０１３６】
図面を参照すると、図７は、より短いオリゴ核酸からの核酸（例えば遺伝子）の合成のための例示的なプロセスのワークフローを示す。ワークフローは、通常は以下の段階に分けられる：（１）一本鎖核酸ライブラリーのデノボ合成、（２）より大きなフラグメントを形成するための核酸の結合、（３）エラー補正、（４）品質管理、および（５）輸送。デノボ合成の前に、意図した核酸配列、または核酸配列の群が、予め選択される。例えば、遺伝子の群が生成のために予め選択される。
【０１３７】
一旦、生成のためにより大きな核酸が選択されると、核酸の予め定められたライブラリーは、デノボ合成のために設計される。高密度のポリヌクレオチドアレイを生成するための様々な適切な方法が知られている。ワークフローの例において、デバイスの表層が提供される。この例において、表面の化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、ポリヌクレオチド合成プロセスを改善するために変更される。表面エネルギーが低い領域は液体を弾くように生成され、一方で表面エネルギーが高い領域は液体を引き付けるように生成される。表面自体は、平坦な表面の形であり、または、表面積を増大させる突起またはマイクロウェルなどの様々な形状を含み得る。ワークフローの例において、全体において参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／０２１０８０に開示されるように、選択された高い表面エネルギー分子は、ＤＮＡの化学的性質を支持する二重機能を果たす。
【０１３８】
ポリヌクレオチドアレイのインサイツの調製は、固形支持体上に生成され、かつ、並行して複数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。物質堆積デバイスなどの堆積デバイスは、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、その結果、複数のポリヌクレオチドが並行して、一度に１つの残基を伸長させることで、予め定められた核酸配列（７０２）を持つオリゴマーを生成する。いくつかの例において、ポリヌクレオチドはこの段階で表面から切断される。切断は、例えばアンモニアまたはメチルアミンによる気相切断（ｇａｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。
【０１３９】
生成されたポリヌクレオチドライブラリーは、反応チャンバに配置される。この例示的なワークフローにおいて、反応チャンバ（「ナノリアクター」とも称される）は、シリコンで覆われたウェルであり、ＰＣＲ試薬を含み、ポリヌクレオチドライブラリー（７０３）へと低下される。ポリヌクレオチドの密閉（７０４）の前または後に、試薬を加えることで基質からポリヌクレオチドを放出させる。例示的なワークフローにおいて、ポリヌクレオチドは、ナノリアクター（７０５）の密閉後に放出される。いったん放出されると、一本鎖ポリヌクレオチドのフラグメントは、ＤＮＡの全体的に長い範囲の配列におよぶようにハイブリダイズされる。合成されたポリヌクレオチドが各々、少なくとも１つの他のポリヌクレオチドがプールにある小さな部分の重なりを持つように設計されるので、部分的なハイブリダイゼーション（７０５）が可能となる。
【０１４０】
ハイブリダイゼーション後、ＰＣＡ反応が始まる。ポリメラーゼサイクル中、ポリヌクレオチドは相補的フラグメントにアニールされ、隙間はポリメラーゼにより満たされる。各サイクルは、どのポリヌクレオチドが互いに見出されるかに無作為に依存して、様々なフラグメントの長さを増大させる。フラグメントの中の相補性は、二本鎖ＤＮＡ（７０６）の完全で大きな全長の形成を可能にする。
【０１４１】
ＰＣＡの完了後、ナノリアクターはデバイス（７０７）から分離され、ＰＣＲ（７０８）のためのプライマーを持つデバイスとの相互作用のために位置付けられる。密閉後、ナノリアクターはＰＣＲ（７０９）にさらされ、より大きな核酸が増幅される。ＰＣＲ（７１０）の後、ナノチャンバが開放され（７１１）、エラー補正試薬が加えられ（７１２）、チャンバは密封され（７１３）、エラー補正反応が生じることで二本鎖ＰＣＲ増幅生成物からの相補性が乏しいミスマッチ塩基対および／または鎖を取り除く（７１４）。ナノリアクターは開放されかつ分離される（７１５）。エラーを補正した生成物は次に、ＰＣＲおよび分子バーコーディングなどの付加的な処理工程にさらされ、その後輸送（７２３）のために包装される（７２２）。
【０１４２】
いくつかの例において、品質管理手段が取られる。エラー補正の後、品質管理工程は、例えば、エラーを補正した生成物の増幅のための配列決定プライマーを持つウェーハとの相互作用（７１６）、エラーを補正した増幅生成物を含むチャンバにウェーハを密封すること（７１７）、および更なる回数の増幅の実行（７１８）を含む。ナノリアクターは開放され（７１９）、生成物はプールされ（７２０）、配列決定される（７２１）。許容可能な品質管理の決定が行われた後、包装された生成物（７２２）は輸送（７２３）を承認される。
【０１４３】
いくつかの例において、図７のものなどのワークフローにより生成される核酸は、本明細書に開示される重複プライマーを使用した突然変異誘発にさらされる。いくつかの例において、プライマーのライブラリーは、固形支持体上でインサイツの調製により生成され、並行して複数のオリゴマーを伸長させるための単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。物質堆積デバイスなどの堆積デバイスは、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、その結果、複数のポリヌクレオチドが並行して、一度に１つの残基を伸長させることで、予め定められた核酸配列（７０２）を持つオリゴマーを生成する。
【０１４４】
コンピューターシステム
【０１４５】
本明細書に記載されるシステムの何れかは、コンピューターに動作可能に連結され、かつコンピューターを介して局所的にまたは遠隔で自動操作され得る。様々な例において、本開示の方法およびシステムは更に、コンピューターシステム上にソフトウェアプログラム、およびその使用を含み得る。従って、物質堆積デバイスの動作、分配行為、および減圧の作動を編成および同期するなど、機能の分配／減圧／再充填の同期のためのコンピューター制御は、本開示の範囲内にある。コンピューターシステムは、ユーザーに指定された塩基配列と物質堆積デバイスの位置との間に干渉するようにプログラムされ、基質の指定された領域に正確な試薬を送達する。
【０１４６】
図８に例示されるコンピューターシステム（８００）は、媒体（８１１）および／またはネットワークポート（８０５）から命令を読み取ることが可能な、論理的な装置として理解され、固定された媒体（８１２）を持つサーバー（８０９）に随意に接続され得る。図８に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（８０１）、ディスクドライブ（８０３）、キーボード（８１５）、および／またはマウス（８１６）などの随意の入力装置、および随意のモニター（８０７）を含み得る。データ通信は、局所または遠隔の位置にてサーバーへと、示された通信媒体を通じて達成され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ上での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図８に例示されるように当事者（８２２）による受理および／または検討のために、そのようなネットワークまたは接続上で伝達され得ることが想定される。
【０１４７】
図１４は、本開示の例と関連して使用され得るコンピューターシステム（１４００）の第１の構成の例を示すブロック図である。図１４に表されるように、コンピューターシステムの例は、命令を処理するためのプロセッサー（１４０２）を含み得る。プロセッサーの非限定的な例には、以下が挙げられる：Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサー、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサー、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２−ｂｉｔ  ＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサー、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ  ９３０（商標）プロセッサー、または機能的に同等なプロセッサー。複数のスレッドの実行が並列処理のために使用され得る。いくつかの例において、複数のプロセッサー、または複数のコアを持つプロセッサーはまた、単一のコンピューターシステム中でも、クラスターの中でも、または複数のコンピューター、携帯電話、および／または個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上のシステムにわたって分布されても、使用され得る。
【０１４８】
図９に例示されるように、高速キャッシュ（９０４）は、プロセッサー（９０２）に接続されるか、またはその中に組み込まれることで、プロセッサー（９０２）により近年使用されてきた、または頻繁に使用されている命令またはデータのための高速メモリーを提供することができる。プロセッサー（９０２）は、プロセッサーバス（９０８）によりノースブリッジ（９０６）に接続される。ノースブリッジ（９０６）は、メモリーバス（９１２）によりランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）（９１０）に接続され、プロセッサー（９０２）によりＲＡＭ（９１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（９０６）はまた、チップセットバス（９１６）によりサウスブリッジ（９１４）に接続される。サウスブリッジ（９１４）は次に、周辺バス（９１８）に接続される。周辺バスは、例えばＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジは頻繁に、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（９１８）上でプロセッサーと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的な構成において、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサーに組み込まれ得る。幾つかの例において、システム（９００）は、周辺バス（９１８）に付けられるアクセラレーターカード（９２２）を含み得る。アクセラレーターは、特定の処理を速めるためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレーターは、適応データの再構築のために、または、拡張設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。
【０１４９】
ソフトウェアとデータは、外部記憶装置（９２４）に記憶され、プロセッサーによる使用のためにＲＡＭ（９１０）および／またはキャッシュ（９０４）へとロードされ得る。システム（９００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み；オペレーティングシステムの非限定的な例には、以下が挙げられる：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に同等なＯＳのほか、本開示の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行されるアプリケーションソフトウェア。この例において、システム（９００）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、および分散並列処理に使用され得る他のコンピューターシステムにネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（９２０）および（９２１）を含む。
【０１５０】
図１０は、複数のコンピューターシステム（１００２ａ）および（１００２ｂ）、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末（１００２ｃ）、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１００４ａ）および（１００４ｂ）を含む、ネットワーク（１０００）を示す略図である。例において、システム（１００２ａ）、（１００２ｂ）、および（１００２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１００４ａ）および（１００４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルはこのデータに対して使用され、コンピューターシステム（１００２ａ）および（１００２ｂ）、および携帯電話および個人用携帯情報端末システム（１００２ｃ）にわたって分散並列処理を使用して評価され得る。コンピューターシステム（１００２ａ）および（１００２ｂ）、および携帯電話および個人用携帯情報端末システム（１００２ｃ）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１００４ａ）および（１００４ｂ）に記憶されたデータの適応データ再構築に対して並列処理を提供することができる。図１０は一例のみを示しており、様々な他のコンピューターの構成およびシステムは、本開示の様々な例と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは、並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサーブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを通じて接続され得る。ストレージはまた、別個のネットワークインターフェースを通ってバックプレーンに、またはネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続され得る。幾つかの例において、プロセッサーは、別個のメモリー空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサーによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達できる。他の例において、プロセッサーの幾つかまたは全てが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用できる。
【０１５１】
図１１は、例に従って共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサーコンピューターシステム（１１００）のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（１１０４）にアクセス可能な複数のプロセッサー（１１０２ａ−ｆ）を含む。システムは、メモリサブシステム（１１０４）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（１１０６ａ−ｆ）を組み込む。ＭＡＰ（１１０６ａ−ｆ）は各々、メモリー（１１０８ａ−ｆ）および１以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（１１１０ａ−ｆ）を含み得る。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはその一部は、各プロセッサーと密接に協働して処理を行うためにＦＰＧＡ（１１１０ａ−ｆ）に設けられ得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、かつ例における適応データの再構築を行なうために使用され得る。この例において、各ＭＡＰは、このような目的のためにプロセッサー全てによって世界的にアクセス可能である。１つの構成において、ＭＡＰは各々、関連するメモリ（１１０８ａ−ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサー（１１０２ａ−ｆ）とは別個に、かつこれらから非同期的にタスクを実行することが可能となる。この構成において、ＭＡＰは、パイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）およびアルゴリズムの並列の実行のために別のＭＡＰに結果を直接供給することができる。
【０１５２】
上述のコンピューターの構成およびシステムは単なる例であり、様々な他のコンピューター、携帯電話、個人用携帯情報端末の構成およびシステムが、一般的なプロセッサー、コプロセッサー、ＦＰＧＡ、および他のプログラム可能論理回路の任意の組み合わせを使用するシステム、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、および他の処理要素と論理素子を含む、実施形態の例と共に使用され得る。いくつかの例において、コンピューターシステムの全てまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアに実装され得る。様々なデータ記憶媒体が、例えばランダムアクセスメモリー、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および他のローカルまたは分散のデータ記憶装置およびシステムを含む例と共に、使用され得る。
【０１５３】
例において、コンピューターシステムは、上述または他のコンピューターの構成およびシステムの何れかにて実行されるソフトウェアモジュールを使用して、実施され得る。他の例において、システムの機能は、ファームウェア、図９で言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能論理回路、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理要素および論理素子において部分的または完全に実装され得る。例えば、セットプロセッサーおよびオプティマイザーは、図９に示されるアクセラレーターカード（９２２）などのハードウェアアクセラレーターカードの使用によるハードウェアアクセラレーションにより実施され得る。
【０１５４】
以下の実施例は、当業者に対し本明細書に開示される実施形態の原理および実践をより明白に示すために説明されるものであり、任意の請求された実施形態の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。他に明示されない限り、全ての部分およびパーセンテージは重量基準である。
【実施例】
【０１５５】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなる様式においても本開示を制限することを意図していない。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、現在好ましい実施形態を表わすものであり、例示的なものであり、および本開示の範囲に対する限定として意図されていない。その中での変更、および、請求項の範囲により定義されるような本開示の趣旨内に包含される他の用途は、当業者に想到される。
【０１５６】
実施例１：デバイス表面の機能化
【０１５７】
デバイスを機能化し、ポリヌクレオチドのライブラリーの付着および合成を支持した。デバイス表面をまず２０分間、９０％のＨ２ＳＯ４および１０％のＨ２Ｏ２を含むピラニア溶液を使用して、湿式洗浄した。デバイスを、ＤＩ水を含む様々なビーカーの中ですすぎ、５分間ＤＩ水のグーズネック形状の蛇口の下で保持して、Ｎ２で乾燥させた。デバイスを５分間、ＮＨ４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に浸し、ハンドガン（ｈａｎｄｇｕｎ）を使用してＤＩ水ですすぎ、ＤＩ水を含む３つの連続するビーカーの中に各々１分間浸し、その後ハンドガンを使用してＤＩ水により再びすすいだ。その後、デバイス表面をＯ２にさらすことにより装置をプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００機器を使用して、下流モードで１分間、２５０ワットでＯ２をプラズマエッチングした。
【０１５８】
以下のパラメーターを有するＹＥＳ−１２２４Ｐ気相蒸着オーブンシステムを使用して、洗浄されたデバイス表面をＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む溶液により動的に官能基化した：０．５〜１トル、６０分、７０℃、１３５℃の気化器。Ｂｒｅｗｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００Ｘスピンコーターを使用して、デバイス表面をレジストコートした（ｒｅｓｉｓｔ  ｃｏａｔｅｄ）。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、２５００ｒｐｍで４０秒間、デバイス上でスピンコートした。デバイスをＢｒｅｗｅｒホットプレート上で、９０℃で３０分間予め焼いた。Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ  ＭＡ６マスクアライナー機器を使用して、デバイスをフォトリソグラフィーにさらした。デバイスを２．２秒間さらし、ＭＳＦ  ２６Ａの中で１分間展開させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。残りの展開剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）をハンドガンですすぎ、デバイスを５分間水に浸した。デバイスを１００℃で３０分間焼き、その後、Ｎｉｋｏｎ  Ｌ２００を使用してリソグラフィーの欠損に対する目視検査を行った。デスカム処理を使用し、ＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００機器を用いて残りのレジストを取り除き、２５０ワットで１分間Ｏ２プラズマエッチングした。
【０１５９】
デバイス表面を、１０μＬの軽油と混合したパーフルオロオクチルトリクロロシランの１００μＬ溶液により動的に官能基化した。デバイスをチャンバに配し、１０分間ポンプでくみ出し、その後、バルブを閉じてポンプを止め、１０分間放置した。チャンバを通気した。最大出力（Ｃｒｅｓｔシステム上で９）での超音波処理による７０℃で５００ｍＬのＮＭＰにおける５分間の浸漬を２回行なうことにより、デバイスをレジスト剥離した。その後、最大出力での超音波処理により室温で５００ｍＬのイソプロパノールに５分間、デバイスを浸した。デバイスを、３００ｍＬの２００プルーフエタノール（２００  ｐｒｏｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ）に浸し、Ｎ２により送風乾燥した。官能基化した表面を活性化することで、ポリヌクレオチド合成のための支持体として機能した。
【０１６０】
実施例２：オリゴヌクレオチド合成デバイス上での５０ｍｅｒの配列の合成
【０１６１】
二次元オリゴヌクレオチド合成デバイスをフローセルに組み入れ、フローセルに接続させた（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （ＡＢＩ３９４  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ））。Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ）により二次元オリゴヌクレオチド合成デバイスを均一に機能化し、これを使用することで、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法を用いて５０ｂｐの例示的なポリヌクレオチド（「５０ｍｅｒのポリヌクレオチド」）を合成した。
【０１６２】
５０ｍｅｒの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に記載される通りであった。
５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ここで、＃は、チミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表わし、これは、脱保護中に表面からのオリゴの放出を可能にする切断可能なリンカーである。
【０１６３】
表４のプロトコルおよびＡＢＩシンセサイザーに従い標準ＤＮＡ合成化学（結合、キャッピング、酸化、およびデブロッキング）を使用して、合成を行った。
【０１６４】
【表４−１】
2020536504.tif 000031
【０１６５】
【表４−２】
2020536504.tif 000032
【０１６６】
【表４−３】
2020536504.tif 000033
【０１６７】
ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルを通じたバルク試薬の送達と同様に送達した。環境が時間全体にわたり試薬により「湿った」ままであると、乾燥工程を行わなかった。
【０１６８】
フローリストリクターをＡＢＩ３９４シンセサイザーから取り除き、より速い流れを可能にした。フローリストリクターを使用しない場合、アミダイト（ＡＣＮ中で０．１Ｍ）、活性化因子（ＡＣＮ中で０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３０−３０７０−ｘｘ））、およびＯｘ（２０％のピリジン、１０％の水、および７０％のＴＨＦ中の０．０２ＭのＩ２）の流量は、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）およびキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１の混合物ではおよそ〜１００ｕＬ／ｓｅｃであり、ここで、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢは、ＴＨＦ中の１６％の１−メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）ではおよそ〜２００ｕＬ／ｓｅｃ、および、Ｄｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）ではおよそ〜３００ｕＬ／ｓｅｃ（フローリストリクターを用いる全ての試薬に対し〜５０ｕＬ／ｓｅｃと比較して）であった。Ｏｘｉｄｉｚｅｒを完全に押し出す時間を観察し、化学フロー時間のタイミングを適宜調整し、余分なＡＣＮ洗浄を異なる化学物質間に導入した。ポリヌクレオチド合成の後、７５ｐｓｉで一晩、ガス状のアンモニア中でチップを脱保護した。表面に水を５滴加えて、ポリヌクレオチドを再生した。その後、回復されたポリヌクレオチドを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ小型ＲＮＡチップ上で解析した。
【０１６９】
実施例３：オリゴヌクレオチド合成デバイス上での１００ｍｅｒの配列の合成
【０１７０】
５０ｍｅｒの配列の合成について実施例２に記載されるのと同じプロセスを、２つの異なるシリコンチップ上で１００ｍｅｒのポリヌクレオチド（「１００ｍｅｒのポリヌクレオチド」；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’、ここで、＃はチミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表わす；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）の合成に使用し、一方のシリコンチップはＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドで均一に官能化され、他方のシリコンチップは１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合物により官能基化されており、表面から抽出されたポリヌクレオチドをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ機器の上で解析した。
【０１７１】
以下の熱サイクルプログラムを使用して、５０ｕＬのＰＣＲ混合物（２５ｕＬのＮＥＢ  Ｑ５  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２．５ｕＬの１０ｕＭフォワードプライマー、２．５ｕＬの１０ｕＭリバースプライマー、表面から抽出した１ｕＬのポリヌクレオチド、および最大５０ｕＬの水）の中で、フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）およびリバースプライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）を使用して、２つのチップからの１０個のサンプル全てを更に増幅させた：
９８℃、３０秒；
９８℃、１０秒；６３℃、１０秒；７２℃、１０秒；１２サイクルを繰り返す
７２℃、２分
【０１７２】
ＰＣＲ産物をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上でも実行し、１００ｍｅｒの位置にて急激なピークを実証した。次に、ＰＣＲ増幅サンプルをクローン化し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行った（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。表５は、チップ１のスポット１−５から得たサンプル、およびチップ２のスポット６−１０から得たサンプルに対する、Ｓａｎｇｅｒ配列決定による結果を要約する。
【０１７３】
【表５】
2020536504.tif 000034
【０１７４】
故に、高品質および高均一性の合成ポリヌクレオチドを、異なる界面化学的性質を持つ２つのチップ上で繰り返した。全体的に、配列決定された１００−ｍｅｒの８９％は、エラーのない完全な配列であり、２６２のうち２３３に相当する。
【０１７５】
表６は、スポット１−１０のポリヌクレオチドサンプルから得た配列に対するエラー特徴を要約する。
【０１７６】
【表６】
2020536504.tif 000035
【０１７７】
実施例４：立体構造リガンド相互作用に基づくＧタンパク質結合受容体結合ドメインの設計
【０１７８】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）結合ドメインを、ＧＰＣＲと相互に作用する立体構造リガンド間の相互作用表面を使用して設計した。ケモカインとサイトカインとＧＰＣＲとの相互作用表面の解析は、第１の立体構造システインに先行するＮ末端ペプチドが活性化ペプチドを表わし、中心の螺旋状でありβ・ターン・β（ｂｅｔａ−ｔｕｒｎ−ｂｅｔａ）であるトポロジーがＧＰＣＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との相互作用を媒介することを示した。
【０１７９】
さらに２５４のＧＰＣＲリガンドを、ＵｎｉｐｒｏｔとＩＵＰＨＡＲのデータベースの横断検索に基づいて設計した。リガンドは、１１２のヒト、７１のラット、４のブタ、１のヒツジ、および１のウシに由来する相互作用クラスを表わした。その後、リガンドを以下の１０１の異種間リガンド配列アノテーションに分けた（ｃｏｌｌａｐｓｅｄ）：ＡＤＭ、ＡＤＭ２、アグーチ関連タンパク質、アンジオテンシノゲン、アネキシンＡ１、アペリン、初期アペリン受容体（Ａｐｅｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅａｒｌｙ）、食欲調節ホルモン、β−デフェンシン４Ａ、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カテプシンＧ、カテプシンＧ（フラグメント）、コレシストキニン、補体Ｃ３、補体Ｃ５、補体Ｃ５（フラグメント）、コルチコリベリン、コルチスタチン、サイトカインＳＣＭ−１β、エンドセリン−２、エンドセリン−３、イオタキシン、フラクタルカイン、ガラニンペプチド、ガラニン様ペプチド、胃抑制ポリペプチド、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン、成長調節αタンパク質、ヘム結合タンパク質１、ヒューマニン、インスリン様３、インスリン様ペプチドＩＮＳＬ５、インターロイキン８、膵島アミロイドポリペプチド、キニノーゲン−１、リンホタクチン、転移抑制因子ＫｉＳＳ−１、ニューロキニン−Ｂ、ニューロメジン−Ｂ、ニューロメジン−Ｓ、ニューロメジン−Ｕ、ニューロペプチドＢ、ニューロペプチドＳ、ニューロペプチドＷ、ニューロテンシン／ニューロメジンＮ、食欲促進ニューロペプチドＱＲＦＰ、オレキシン、オキシトシン−ニューロフィジン１、膵臓プロホルモン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ペプチドＹＹ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、血小板塩基性タンパク質、血小板因子４、プレプロノシセプチン（Ｐｒｅｐｒｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ）、Ｐｒｏ−ＦＭＲＦアミド関連ニューロペプチドＦＦ、Ｐｒｏ−ＦＭＲＦアミド関連ニューロペプチドＶＦ、Ｐｒｏ−ＭＣＨ、Ｐｒｏ−ニューロペプチドＹ、Ｐｒｏ−オピオメラノコルチン、Ｐｒｏ−甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、プロエンケファリン−Ａ、プロエンケファリン−Ｂ、プロゴナドリベリン−１、プロゴナドリベリン−２、プロキネクチン−１、プロキネクチン−２、プロラクチン放出ペプチド、プロモチリン（Ｐｒｏｍｏｔｉｌｉｎ）、プロタキキニン−１、タンパク質Ｗｎｔ−２、タンパク質Ｗｎｔ−３ａ、タンパク質Ｗｎｔ−４、タンパク質Ｗｎｔ−５ａ、タンパク質Ｗｎｔ−７ｂ、プロトロンビン、プロトオンコジーンＷｎｔ−１、プロトオンコジーンＷｎｔ−３、推定の未特徴化タンパク質、ＲＣＧ５５７４８、レチノイン酸受容体、セクレチン、ソマトリベリン、ソマトスタチン、間質細胞誘導因子、Ｔ−キニノーゲン２、隆起漏斗状ペプチド、ウロコルチン、ウロコルチン−２、ウロコルチン−３、ウロテンシン−２、ウロテンシン−２Ｂ、ＶＥＧＦ同時制御ケモカイン、ＶＩＰペプチド、およびバソプレシン−ニューロフィジン２−コペプチン。
【０１８０】
リガンドの構造解析を行い、その大部分が約１１のアミノ酸のＮ末端活性化ペプチドを含むことが示された。その後、Ｎ末端活性化ペプチドを減らすことによりモチーフ変異体を作成した。表７に見られるように、変異体の典型的なセットを、間質性の誘導因子−１に対するＮ末端活性化ペプチドに基づいて作成した。モチーフ変異体も、ＣＤＲ−Ｈ３の複数の位置にて組み合わせて配置した。合計１０１６のモチーフをＣＤＲ−Ｈ３の配置のために抽出した。加えて、モチーフ変異体を、可変的に境界をつけた配置、およびＣＤＲ−Ｈ３にも配置された５−２０のサブストリング変異体と共に設けた。
【０１８１】
【表７】
2020536504.tif 000036
【０１８２】
表８に見られるように、変異体の典型的なセットを、以下の配列に基づいてインターロイキン−８に対して作成した：
ＭＴＳＫＬＡＶＡＬＬＡＡＦＬＩＳＡＡＬＣＥＧＡＶＬＰＲＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨ  ＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）。
【０１８３】
【表８】
2020536504.tif 000037
【０１８４】
実施例５：ペプチド−リガンド相互作用に基づくＧタンパク質結合受容体結合ドメインの設計
【０１８５】
ＧＰＣＲ結合ドメインを、クラスＢのＧＰＣＲと相互に作用するペプチド−リガンド間の相互作用表面に基づいて設計した。約６６の異なるリガンドを使用し、以下のリガンド配列アノテーションが含まれる：アドレノメデュリン、アミリン、アンギオテンシン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、アペリン、アプスタチン、ビッグエンドセリン、ビッグガストリン、ブラジキニン、セルレイン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＣＧＲＰ、コレシストキニン、エンドセリン、エンドセリン１、エンドセリン２、エンドセリン３、ＧＩＰ、ＧＩＰ、ＧＬＰ、ガラニン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ＩＡＰＰ、キスペプチン、Ｍｃａ、メタスチン（Ｍｅｔａｓｔｉ）、ニューロメジン、ニューロメジンＮ、ニューロペプチド、ニューロペプチドＦ、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、ノシセプチン、オレキシン、オレキシンＡ、オルファニン、オキシトシン、オキシトシンガラニン、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＲ（プロテアーゼ活性化受容体）ペプチド、ＰＡＲ−１アゴニスト、プラムリンタイド、シリオリニンＩ、セクレチン、センクチド、ソマトスタチン、ソマトスタチン１４、ソマトスタチン２８、サブスタンスＰ、ウロテンシンＩＩ、ＶＩＰ、ＶＩＰｓ、バソプレシン、キセニン、シンナモイル、フロイル、ガストリン、コレシストキニン（ｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）、α−メイティング因子。ペプチドがＧＰＣＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との安定した相互作用を形成したことを観察した。
【０１８６】
モチーフ変異体を、ＥＣＤのほか、Ｎ末端ＧＰＣＲリガンド相互作用表面とのペプチドの相互作用表面に基づいて生成した。これを、構造的モデリングを使用して行った。典型的なモチーフ変異体を、表９に見られるようなグルカゴン様ペプチドとそのＧＰＣＲとの相互作用に基づいて作成した。モチーフ変異体配列を、グルカゴン様ペプチドの以下の配列を使用して生成した：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）。
【０１８７】
【表９】
2020536504.tif 000038
【０１８８】
実施例６：小分子相互作用に基づくＧタンパク質結合受容体結合ドメインの設計
【０１８９】
ＧＰＣＲ結合ドメインを、ＧＰＣＲと相互に作用する小分子リガンド間の相互作用表面に基づいて設計した。複数のＧＰＣＲリガンドの解析により、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、およびＧｌｙのアミノ酸ライブラリーを、これらリガンドの構造的接触の多くを反復可能なものとして設計した。これらの観察に基づいて生成した典型的なモチーフ変異体は以下の配列を含む：
ｓｇｇｇｇ（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｐ，Ｙ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）。
【０１９０】
実施例７：細胞外ドメイン相互作用に基づくＧタンパク質結合の結合ドメインの設計
【０１９１】
ＧＰＣＲ結合ドメインを、ＧＰＣＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および細胞外ループ（ＥＣＬ）上での相互作用表面に基づいて設計した。ヒト（３５６）、マウス（３６９）、ラット（２５９）、ウシ（１０２）、ブタ（６０）、霊長類、魚類、ハエに由来する約２，２５７のＧＰＣＲ、および２００を超える他の生物体を解析し、ＥＣＤが１５アミノ酸の長さにてＧＰＣＲの他のループおよびヘリックスへの複数の相補的な接触をもたらすことが観察された。約２，２５７のＧＰＣＲからのＥＣＬ、およびＧＰＣＲの全ての解かれた構造のさらなる解析は、Ｎ末端ＥＣＤ１およびＥＣＬ２がより長い細胞外配列を含み、ＧＰＣＲ細胞外接触をもたらすことを実証した。
【０１９２】
その後、モチーフ変異体をこれらの配列に基づいて生成した。レチン酸誘導タンパク質３（ＧＰＲＣ５Ａ）からの以下の配列に基づき、典型的な変異体を生成した：
ＥＹＩＶＬＴＭＮＲＴＮＶＮＶＦＳＥＬＳＡＰＲＲＮＥＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）。
【０１９３】
【表１０】
2020536504.tif 000039
【０１９４】
実施例８：抗体スキャホールドの設計
【０１９５】
スキャホールドを生成するために、構造解析、重鎖のレパートリー配列解析、およびヘテロダイマー高スループット配列解読装置のデータセットの特異的な解析を実行した。各重鎖を各軽鎖スキャホールドに関連付けた。各重鎖スキャホールドに、５つの異なる長いＣＤＲ−Ｈ３ループのオプションを割り当てた。各軽鎖スキャホールドに、５つの異なるＬ３スキャホールドを割り当てた。重鎖ＣＤＲ−Ｈ３ステムを、個体とＶ遺伝子セグメントの両方を介して発見される、頻繁に観察された長いＨ３ループステム（Ｎ末端およびＣ末端上の１０のアミノ酸）から選択した。軽鎖スキャホールドＬ３を、長いＨ３を含むヘテロダイマーから選択した。プロテインデータバンク（ＰＤＢ）およびディープシーケンシングのデータセットの情報に基づくヘテロダイマーの方向付けを使用し、そこではＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＣＤＲ−Ｈ３のステムが固定された。その後、様々なスキャホールドをファージ上での表示のためにフォーマット化し、発現を評価した。
【０１９６】
構造解析
【０１９７】
約２，０１７の抗体構造を解析し、そこから、長さが少なくとも２５のアミノ酸である長いＣＤＲ−Ｈ３を伴う２２の構造を観察した。重鎖は以下を含んでいた：ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−４９、およびＩＧＨＶ３−２１。同定された軽鎖は以下を含んでいた：ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ１−４４、およびＩＧＫＶ１−１３。解析において、４つのヘテロダイマーの組み合わせを複数回観察し、これには以下が含まれる：ＩＧＨＶ４−５９／６１−ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２１−ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＨＶ１−６９−ＩＧＫＶ３−１１、およびＩＧＨＶ１−６９−ＩＧＫＶ１−５。配列および構造の解析は、長いＨ３安定性を支持するステムにおけるチロシンなどの巨大な側鎖のパッキングにより、少数の構造における内部ＣＤＲ−Ｈ３ジスルフィド結合を同定した。β・ターン・βシートおよび「ハンマーヘッド」サブドメインを含む二次構造も観察した。
【０１９８】
レパートリー解析
【０１９９】
レパートリー解析を、１２の健康な対照からの偏りのない５’ＲＡＣＥにより得られる、１，０８３，８７５のＩｇＭ＋／ＣＤ２７ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）配列および１，４３３，０１１のＣＤ２７＋配列上で実行した。１２の健康な対照は等しい数の男性と女性で構成され、４人の白人、４人のアジア人、および４人のヒスパニック人から構成された。レパートリー解析は、ヒトレパートリーの１％未満が２１のアミノ酸よりも長いＣＤＲ−Ｈ３を伴うＢＣＲを含むことを実証した。Ｖ遺伝子バイアスを長いＣＤＲ３サブレパートリーに観察し、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ１−１８、およびＩＧＨＶ１−８は長いＨ３ループを伴うＢＣＲ中に選択的な富化を示した。長いループに対するバイアスを、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ４−５９／６１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−５３／６６、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７２、およびＩＧＨＶ２−７０に対して観察した。ＩＧＨＶ４−３４スキャホールドは、自己反応性であり、半減期が短いと実証された。
【０２００】
長いループに対する生存可能なＮ末端およびＣ末端のＣＤＲ−Ｈ３スキャホールド変異も、５’ＲＡＣＥ基準レパートリーに基づいて設計された。アミノ酸長さ２２以上のアミノ酸の約８１，０６５のＣＤＲ−Ｈ３を観察した。Ｖ遺伝子スキャホールドごとに比較することにより、スキャホールドに特異的なＨ３ステム変異を回避し、それによりスキャホールドの多様性を複数のスキャホールド基準へとクローン化するのを可能にする。
【０２０１】
ヘテロダイマー解析
【０２０２】
ヘテロダイマー解析を、図１２Ａ−１２Ｃに見られるような配列を持つスキャホールド上で実行した。スキャホールドの変異体配列および長さを解析した。
【０２０３】
構造解析
【０２０４】
変異体配列のＧＰＣＲスキャホールドを使用して構造解析を実行し、長さを分析した。図１３を参照する。
【０２０５】
実施例９：ＧＰＣＲ抗体ライブラリーの生成
【０２０６】
ＧＰＣＲリガンド相互作用表面およびスキャホールド配置に基づいて、ライブラリーを設計し、デノボ合成した。実施例４−８を参照。図５を参照して、１０の変異体配列を重鎖可変ドメイン（５０３）に対して設計し、２３７の変異体配列を、重鎖相補性決定領域３（５０７）に対して設計し、４４の変異体配列を軽鎖可変ドメイン（５１３）に対して設計した。フラグメントを、実施例１−３に記載されるのと同様の方法に従い、図６に見られるような３つのフラグメントとして合成した。
【０２０７】
デノボ合成の後、１０の変異体配列を重鎖可変ドメイン（６０２）に対して生成し、２３６の変異体配列を重鎖相補性決定領域３（６０４）に対して生成し、４３の変異体配列を、軽鎖可変ドメイン（６０６）を含む領域に対して設計し、ＣＤＲ−Ｌ３、および軽鎖可変ドメインに対する９の変異体を設計した。この結果、約１０５の多様性（１０×２３６×４３）を有するライブラリーがもたらされた。これは、１６００万の読み取りによる次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して確認された。図１４に見られるように、重鎖可変ドメインの１０の変異体各々に対する標準化された配列決定の読み取りは、約１であった。図１５に見られるように、軽鎖可変ドメインの４３の変異体各々に対する標準化された配列決定の読み取りは、約１であった。図１６に見られるように、重鎖相補性決定領域３の２３６の変異体配列に対する標準化された配列決定の読み取りは、約１であった。
【０２０８】
その後、様々な軽鎖および重鎖を、発現およびタンパク質フォールディングに対して試験した。図１７Ａ−１７Ｄを参照すると、重鎖可変ドメインの１０の変異体配列は以下を含んでいた：ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎ、ＩＧＨＶ３−２８、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−３９、およびＩＧＨＶ４−５９／６１。１０の変異体配列のうち、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、およびＩＧＨＶ３−３０／３３ｒｎは、耐熱性の改善などの特徴の改善を示した。図１８Ａ−１８Ｆを参照すると、軽鎖可変ドメインの９の変異体配列は以下を含んでいた：ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＬＶ１−５１、およびＩＧＬＶ２−１４。９の変異体配列のうち、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＬＶ１−５１、およびＩＧＬＶ２−１４は、耐熱性の改善などの特徴の改善を示した。
【０２０９】
実施例１０：ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＣＲ抗体ライブラリーの発現
【０２１０】
実施例１３におけるようなＧＰＣＲ抗体ライブラリーの生成後、約４７のＧＰＣＲがスクリーニングのために選択された。約１．８ｋｂ〜約４．５ｋｂのサイズのＧＰＣＲ構築物を、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターに設計した。その後、ＧＰＣＲ構築物を、階層的アセンブリを含む実施例２−４に記載されるのと同様の方法に従い合成した。４７のＧＰＣＲ構築物のうち、４６のＧＰＣＲ構築物を合成した。
【０２１１】
合成されたＧＰＣＲ構築物を、ＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、免疫蛍光検査法を使用して発現に対して解析した。図１９Ａ−１９Ｃを参照すると、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｎ−末端赤血球凝集素（ＨＡ）でタグを付けたヒトＹ１受容体を含むＧＰＣＲ構築物によりトランスフェクトした。２４−４８時間のトランスフェクション後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドにより固定した。細胞を、ＨＡタグに関連付けられる蛍光一次抗体、またはフルオロフォアを含む二次抗体を使用して染色することで、母核を青色として視覚化した。図１９Ａ−１９Ｃを参照すると、ヒトＹ１受容体を、非透過性細胞中の細胞表面上に、および細胞内の透過性細胞中の細胞表面上に視覚化した。
【０２１２】
ＧＰＣＲ構築物はまた、自家蛍光タンパク質を含むＧＰＣＲ構築物を設計することにより視覚化された。図２０Ａ−２０Ｃを参照すると、ヒトＹ１受容体はそのＣ末端に縮合されたＥＹＦＰで構成され、ヒトＹ５受容体はそのＣ末端に縮合されたＥＣＦＰで構成された。ＨＥＫ２９３細胞はヒトＹ１受容体によりトランスフェクトされ、または、ヒトＹ１受容体とヒトＹ５受容体により同時にトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＤＡＰＩで染色した。ヒトＹ１受容体とヒトＹ５受容体の局在化を、蛍光顕微鏡検査法により視覚化した。
【０２１３】
実施例１１：免疫グロブリンライブラリーの設計
【０２１４】
免疫グロブリンスキャホールドライブラリーを、ＧＰＣＲ結合ドメインの配置のため、およびＧＰＣＲ結合ドメインコード配列の範囲の安定性の改善のために設計した。免疫グロブリンスキャホールドは、リンカーによりＶＬドメインに付着されたＶＨドメインを含んでいた。変異体核酸配列を、ＶＨドメインとＶＬドメインのフレームワーク要素およびＣＤＲ要素に対して生成した。設計の構造を図２１Ａに示す。完全なドメイン構造を図２１Ｂに示す。リーダー、リンカー、およびｐＩＩＩの配列を表１１に表記する。
【０２１５】
【表１１】
2020536504.tif 000040
【０２１６】
設計されたＶＬドメインは、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＬＶ１−５１、およびＩＧＬＶ２−１４を含む。４つのＶＬドメインの各々は、それぞれの４つの不変式フレームワーク要素（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＦＷ４）および３つの可変ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）要素によりアセンブルされた。ＩＧＫＶ１−３９では、Ｌ１に対して４９０の変異体が設計され、Ｌ２に対して４２０の変異体が設計され、およびＬ３に対して８２４の変異体が設計され、その結果、１．７×１０８（４９０＊４２０＊８２４）の多様性がもたらされた。ＩＧＫＶ３−１５では、Ｌ１に対して４９０の変異体が設計され、Ｌ２に対して２６５の変異体が設計され、およびＬ３に対して９０７の変異体が設計され、その結果、１．２×１０８（４９０＊２６５＊９０７）の多様性がもたらされた。ＩＧＫＶ１−５１では、Ｌ１に対して１８４の変異体が設計され、Ｌ２に対して１５１の変異体が設計され、およびＬ３に対して８２４の変異体が設計され、その結果、２．３×１０７（１８４＊１５１＊８２４）の多様性がもたらされた。ＩＧＫＶ２−１４では、Ｌ１に対して９６７の変異体が設計され、Ｌ２に対して５３５の変異体が設計され、およびＬ３に対して９２２の変異体が設計され、その結果、４．８×１０８（９６７＊５３５＊９２２）の多様性がもたらされた。表１２は、ＩＧＬＶ１−５１に対する４つのフレームワーク要素（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＦＷ４）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表記する。表１３は、ＩＧＬＶ１−５１の３つの可変ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）要素を表記する。４つのフレームワーク要素（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＦＷ４）および３つの可変ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）要素のための変異体アミノ酸配列およびヌクレオチド配列も、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ３−１５、およびＩＧＬＶ２−１４のために設計した。
【０２１７】
【表１２】
2020536504.tif 000041
【０２１８】
【表１３−１】
2020536504.tif 000042
【０２１９】
【表１３−２】
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【０２２０】
【表１３−３】
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【０２２１】
【表１３−４】
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【０２２２】
【表１３−５】
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【０２２３】
【表１３−６】
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【０２２４】
【表１３−７】
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【０２２５】
【表１３−８】
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【０２２６】
【表１３−９】
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【０２２７】
【表１３−１０】
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【０２２８】
【表１３−１１】
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【０２２９】
【表１３−１２】
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【０２３０】
【表１３−１３】
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【０２３１】
【表１３−１４】
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【０２３２】
【表１３−１５】
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【０２３３】
【表１３−１６】
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【０２３４】
【表１３−１７】
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【０２３５】
【表１３−１８】
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【０２３６】
【表１３−１９】
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【０２３７】
【表１３−２０】
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【０２３８】
【表１３−２１】
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【０２３９】
【表１３−２２】
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【０２４０】
【表１３−２３】
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【０２４１】
【表１３−２４】
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【０２４２】
【表１３−２５】
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【０２４３】
【表１３−２６】
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【０２４４】
【表１３−２７】
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【０２４５】
【表１３−２８】
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【０２４６】
【表１３−２９】
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【０２４７】
【表１３−３０】
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【０２４８】
【表１３−３１】
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【０２４９】
【表１３−３２】
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【０２５０】
【表１３−３３】
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【０２５１】
【表１３−３４】
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【０２５２】
【表１３−３５】
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【０２５３】
【表１３−３６】
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【０２５４】
【表１３−３７】
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【０２５５】
【表１３−３８】
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【０２５６】
【表１３−３９】
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【０２５７】
【表１３−４０】
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【０２５８】
【表１３−４１】
2020536504.tif 000082
【０２５９】
【表１３−４２】
2020536504.tif 000083
【０２６０】
【表１３−４３】
2020536504.tif 000084
【０２６１】
【表１３−４４】
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【０２６２】
【表１３−４５】
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【０２６３】
【表１３−４６】
2020536504.tif 000087
【０２６４】
ＣＤＲを事前にスクリーニングすることで、アミノ酸傾向（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）、隠蔽スプライス部位またはヌクレオチド制限部位は含まれなかった。ＣＤＲ変異は少なくとも２つの個体に観察され、単一、二重、および三重の突然変異の生殖細胞系列に近い空間が含まれていた。アセンブリの順序は図２１Ｃに見られる。
【０２６５】
設計されたＶＨドメインはＩＧＨＶ１−６９とＩＧＨＶ３−３０を含む。２つの重鎖ＶＨドメインの各々は、それぞれの４つの不変式フレームワーク要素（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＦＷ２）および３つの可変ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）要素によりアセンブルされる。ＩＧＨＶ１−６９では、４１７の変異体がＨ１に設計され、２５８の変異体がＨ２に設計された。ＩＧＨＶ３−３０では、５３５の変異体がＨ１に設計され、１６５の変異体がＨ２に設計された。ＣＤＲ  Ｈ３では、同じカセットが、ＩＧＨＶ１−６９とＩＧＨＶ−３０の両方に使用された、共に同一のＦＷ４を使用し、ＦＷ３の縁がＩＧＨＶ１−６９およびＩＧＨＶ３−３０の両方に対し同一であるためである。ＣＤＲ  Ｈ３は、１×１０１０の多様性を生成するために中心の中央要素に組み合わせて結合されるＮ末端要素とＣ末端要素を含む。Ｎ末端要素と中央要素は「ＧＧＧ」グリシンコドンに重なる。中央要素とＣ末端要素は「ＧＧＴ」グリシンコドンに重なる。ＣＤＲ  Ｈ３は、個別にアセンブルされた５つのサブプールを含む。様々なＮ末端要素とＣ末端要素は、表１４に見られるような配列を含む。
【０２６６】
【表１４】
2020536504.tif 000088
【０２６７】
実施例１２．ＧＰＣＲ  ＧＬＰ１Ｒ結合タンパク質に対する富化
【０２６８】
ＧＰＣＲ結合タンパク質の変異体フラグメントを伴うＣＤＲ−Ｈ３領域を有する抗体を本明細書に記載される方法により生成し、実施例１０に記載されるように、特定のＧＰＣＲに結合するように富化される、同定された変異体の細胞ベースの方法を使用してパン撮りした（ｐａｎｎｅｄ）。
【０２６９】
ＧＬＰ  Ｃ末端ペプチドの変異体を同定し（表１５に表記）、これを抗体のＣＤＲ−Ｈ３領域に埋め込むと、ＧＰＣＲ  ＧＬＰ１Ｒへの結合のための繰り返しかつ選択的に富化した。
【０２７０】
【表１５】
2020536504.tif 000089
【０２７１】
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多数の変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、これら特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法と構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１】
2020536504.tif 000090
【図２Ａ】
2020536504.tif 000091
【図２Ｂ】
2020536504.tif 000092
【図３】
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【図４】
2020536504.tif 000094
【図５】
2020536504.tif 000095
【図６】
2020536504.tif 000096
【図７】
2020536504.tif 000097
【図８】
2020536504.tif 000098
【図９】
2020536504.tif 000099
【図１０】
2020536504.tif 000100
【図１１】
2020536504.tif 000101
【図１２Ａ】
2020536504.tif 000102
【図１２Ｂ】
2020536504.tif 000103
【図１２Ｃ】
2020536504.tif 000104
【図１３】
2020536504.tif 000105
【図１４】
2020536504.tif 000106
【図１５】
2020536504.tif 000107
【図１６】
2020536504.tif 000108
【図１７Ａ】
2020536504.tif 000109
【図１７Ｂ】
2020536504.tif 000110
【図１７Ｃ】
2020536504.tif 000111
【図１７Ｄ】
2020536504.tif 000112
【図１８Ａ】
2020536504.tif 000113
【図１８Ｂ】
2020536504.tif 000114
【図１８Ｃ】
2020536504.tif 000115
【図１８Ｄ】
2020536504.tif 000116
【図１８Ｅ】
2020536504.tif 000117
【図１８Ｆ】
2020536504.tif 000118
【図１９Ａ】
2020536504.tif 000119
【図１９Ｂ】
2020536504.tif 000120
【図１９Ｃ】
2020536504.tif 000121
【図２０Ａ】
2020536504.tif 000122
【図２０Ｂ】
2020536504.tif 000123
【図２０Ｃ】
2020536504.tif 000124
【図２１Ａ】
2020536504.tif 000125
【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【国際調査報告】
2020536504.tif 000128
2020536504.tif 000129