(57)【要約】  本発明は、ａ）少なくとも１種類のポリソルベートを含む、試料を提供する工程と、ｂ）試料とカルボシアニン色素とを混合させる工程と、ｃ）混合物の蛍光を測定する工程と、ｄ）当該蛍光とポリソルベートの量とを相関させる工程と、を含む、試料中のポリソルベートを定量するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のポリソルベートを定量するための方法であって、
ａ）少なくとも１種のポリソルベートを含む、試料を提供する工程と、
ｂ）前記試料とカルボシアニン色素とを混合させる工程と、
ｃ）前記混合物の蛍光を測定する工程と、
ｄ）前記蛍光と、前記ポリソルベートの量とを相関させる工程と、を含む、試料中のポリソルベートを定量するための方法。
【請求項２】
前記カルボシアニン色素が、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）、３，３′−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＯ）、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン４−クロロベンゼンスルホナート塩（ＤｉＤ）およびＣＭ−ＤｉＩからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボシアニン色素が、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、薬学的に活性である化合物を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬学的に活性である化合物がタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、更に化粧用化合物を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、凍結乾燥され、工程ｃ）の前に溶媒で液状に戻される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ウェルプレートであって、複数のウェルが規定量のカルボシアニン色素を含み、かつ前記複数のウェルのうち、少なくとも１つのウェルが、更に規定量のポリソルベートを含む、ウェルプレート。
【請求項１０】
前記カルボシアニン色素が、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）、３，３′−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＯ）、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン４−クロロベンゼンスルホナート塩（ＤｉＤ）およびＣＭ−ＤｉＩからなる群から選択される、請求項９に記載のウェルプレート。
【請求項１１】
前記カルボシアニン色素が、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）である、請求項１０に記載のウェルプレート。
【請求項１２】
前記ウェルプレートが、ウェルのサブセットを含み、前記サブセットの各ウェルが、更に規定量のポリソルベートを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のウェルプレート。
【請求項１３】
少なくとも１つのウェルが、更に緩衝液を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のウェルプレート。
【請求項１４】
前記緩衝液がリン酸塩緩衝液である、請求項１３に記載のウェルプレート。
【請求項１５】
前記ウェルの少なくとも１つが、更に安定化剤を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のウェルプレート。
【請求項１６】
前記安定化剤が糖である、請求項１５に記載のウェルプレート。
【請求項１７】
前記糖がマンニトールである、請求項１６に記載のウェルプレート。
【請求項１８】
前記ウェルプレートが、少なくとも２つの異なるウェルのサブセットを含み、前記２つのセットそれぞれの、各ウェルが、
ａ）規定量のカルボシアニン色素を含む、組成物を含み、
かつ少なくとも１つのウェルのサブセットの各ウェルが、
ｂ）緩衝液と、
ｃ）安定化剤と、
ｄ）規定量のポリソルベートと、を、前記組成物中に更に含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のウェルプレート。
【請求項１９】
前記組成物が、凍結乾燥組成物である、請求項１８に記載のウェルプレート。
【請求項２０】
試料中のポリソルベートを定量するための、カルボシアニン色素の使用。
【請求項２１】
試料中のポリソルベートを定量するためのキットであって、
ａ）カルボシアニン色素と、
ｂ）前記試料に対する標準希釈緩衝液と、
ｃ）任意には、校正試料と、を含む、試料中のポリソルベートを定量するためのキット。
【請求項２２】
前記カルボシアニン色素が、キュベット中または請求項９〜１９のいずれか一項に記載のウェルプレート中に提供される、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポリソルベートは、医薬製品においておよび食品業界において賦形剤として広く使用されている、非イオン界面活性剤の系統である。ポリソルベート２０（ＰＳ２０）およびポリソルベート８０（ＰＳ８０）は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０としても知られている。これは、界面への吸着および関連の不安定性に対して治療用タンパク質を保護するのに使用される、最も一般的な界面活性剤である。バイオ医薬製品のタンパク質の安定化に対する、ＰＳ２０およびＰＳ８０の貢献は十分に受け入れられており、双方ともが、規制機関により承認されている非経口投与のための賦形剤である。ペプチド、タンパク質、抗体およびワクチンを含有するバイオ医薬製品の大部分は、ポリソルベートで製剤化される。例えば、約８０％の市販のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ＰＳ２０またはＰＳ８０を含有する。モノクローナル抗体の高い親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値および低い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、たとえ低濃度であっても、高い界面活性の原因となる。バイオ医薬品において、ポリソルベートの通常濃度は、０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）の間であり、これは０．０１〜１ｍｇ／ｍｌに相当する。
【０００２】
安定化に関する分子の詳細は未だ完全には理解されていないが、ポリソルベートは２つの異なるメカニズムによってタンパク質の安定性に貢献することが知られている。このメカニズムはすなわち、（ｉ）疎水性界面への競合吸着、および／または（ｉｉ）タンパク質への直接結合によるものである。第１の場合では、ポリソルベートは、タンパク質に比べ単位面積あたりでより高い吸着エネルギーを示し、そのため、タンパク質と効果的に競合し、疎水性界面への吸着に対しタンパク質を保護する。更に、ポリソルベートは、タンパク質と直接相互作用することができ、結果、タンパク質と結合することにより溶液中での安定性を増強させ、かつ露出している疎水性領域を保護する。これは、タンパク質間の相互作用を低減させることで凝集を防止するものである。これら２つのメカニズムのうち、特定のタンパク質の安定化においてどちらの方が効果があるかはタンパク質およびポリソルベートに依存する。
【０００３】
ポリソルベートは両親媒性構造である。ポリソルベートの親水性部分は、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ／ポリエチレンオキシド鎖／ＰＯＥ）に結合している各ヒドロキシル基を有する、ソルビタン頭基を含む。疎水性部分は、ヒドロキシル基でエステル化されている脂肪酸（ＦＡ）によって特徴づけられている。理論上では、各種ポリソルベートは、ポリソルベートの脂肪酸により識別され得る。実際には、市販されているポリソルベートは構造的に関連する分子を含有し、そして全ポリソルベート物質のうち約２０％（ｗ／ｗ）のみが、理論的な分子構造に適合する。
【０００４】
合成中形成される副生成物の他、分解反応（酸化および加水分解）も、ポリソルベート溶液が不均質となる一因となり得る。ポリソルベート分解生成物の形成により、製剤化中に界面活性剤濃度の低下が生じる可能性がある。それとは別として、上記のような界面活性剤の特性は失われ得る。特性が失われることで、潜在的にタンパク質の安定性に悪影響を与える可能性があり、更には、タンパク質の凝集体や粒子の形成を引き起こす可能性もある。こういったことから、分解反応は防止される必要がある。ポリソルベートの分解に関する一般的な概要およびそれらの分解の分析は、Ｍａｒｔｏｓ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１７．０３．００１に見出すことができる。
【０００５】
治療用タンパク質の製剤化中だけでなくポリソルベートの分解中に、ポリソルベート濃度を測定することは極めて難しいため、試料のポリソルベート含有量はもとより、ポリソルベート分解生成物の含有量も分析するために何点かの技術がこれまでに開発されてきた。一般には、タンパク質を除去するための試料調製（例えば、有機溶媒または固相抽出によるタンパク質析出）後、試料成分（ポリソルベート種）を分離し、かつ更なる分析（質量分析、ＥＬＳＤまたはＣＡＤ検出を適用することによる）を目的としてこの成分を調製するため、試料を逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）にかける。更には、ポリソルベート８０に対する加水分解およびオレイン酸の放出後、ＵＶ／Ｖｉｓ検出が適用され得る。こうした方法の大半は複雑で時間を消費するものであり、そしてタンパク質による妨害に弱いものである。次に、定量目的でこの蛍光色素アプローチを適用する。最も一般的なアッセイは、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン（ＮＰＮ）に基づく、蛍光ミセルアッセイ（ＦＭＡ）である。これは、蛍光色素と、詳細にはＣＭＣ超のミセルが存在する疎水性環境との相互作用に基づくものである。このアッセイの欠点は、ＰＳに対する特異性が欠如していること（すなわち、ＮＰＮはタンパク質、シリコーンオイルと相互作用し得、溶液粘度に影響され得る）、およびＰＳの定量はＣＭＣ超の濃度でのみ実施可能であることである。
【０００６】
こういった理由から、迅速かつ理想的に、自動化または半自動化された、ポリソルベートの検出および定量を可能とするような新規方法を提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｏｓ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１７．０３．００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは驚くべきことに、カルボシアニン色素を用いることにより、試料中のポリソルベートの量が正確に定量され得ることを見出した。カルボシアニン色素は、詳細には、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）またはその誘導体であるＤｉＤ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン４−クロロベンゼンスルホナート）およびＤｉＯ（３，３′−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート）から選択されるカルボシアニン色素である。
【０００９】
したがって第１の態様では、本発明は、
ａ）少なくとも１種のポリソルベートを含む、試料を提供する工程と、
ｂ）試料とカルボシアニン色素とを混合させる工程と、
ｃ）混合物の蛍光を測定する工程と、
ｄ）当該蛍光と、ポリソルベートの量とを相関させる工程と、を含む、試料中のポリソルベートを定量するための方法に関する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、試料中のポリソルベートを定量するためのカルボシアニン色素の使用に関する。
【００１１】
本発明はまた、９６ウェルプレートなどのウェルプレートに関する。このウェルプレートは、少なくともいくつかのウェルまたは均一な各ウェルが規定量のカルボシアニン色素を含む。
【００１２】
更なる態様では、本発明は、
ａ）カルボシアニン色素と、
ｂ）希釈緩衝液と、
ｃ）任意では、校正試料と、を含む試料中のポリソルベートを定量するためのキットに関する。
【００１３】
特定の実施形態では、キットは、各ウェル中に規定量のカルボシアニン色素を含む、ウェルプレートを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）（Ａ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＯ）（Ｂ）、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン４−クロロベンゼンスルホナート塩（ＤｉＤ）（Ｃ）といった、好ましい色素の構造を示す図である。
【図２】ＤｉＩ存在下でのポリソルベート２０（ＰＳ２０）の蛍光発光特性の図である。  （Ａ）ＰＳ２０−ＤｉＩ−蛍光発光スペクトル（５５０ｎｍでの励起（Ｅｘｃ．））。ＤｉＩ（３５７ｎＭ）添加後の異なるＰＳ２０濃度（０．０００２〜０．００２５％（ｗ／ｖ））の蛍光スペクトル（発光（ＥＭ．５６０〜６２０ｎｍ））。キュベットベースの蛍光分光光度計で測定を実施した：０％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−．．−．．−、０．０００２％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−．−．−．−、０．０００３％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０．．．．、０．０００５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−、０．０００９％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−、０．００１５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−−−−、０．００２５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−−−−。  （Ｂ）（Ａ）の低光度範囲の増幅。  （Ｃ）６１５ｎｍでのＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００８〜０．００２１％（ｗ／ｖ））。対応するＰＳ２０濃度に対してプロットされ、観察される最大蛍光強度。
【図３】ＤｉＤ存在下でのＰＳ２０の蛍光発光特性の図である。  （Ａ）ＰＳ２０−ＤｉＤ−蛍光発光スペクトル（Ｅｘｃ．６４６ｎｍ）。ＤｉＤ（３５７ｎＭ）添加後の異なるＰＳ２０濃度（（０．０００２〜０．００２５％（ｗ／ｖ））の蛍光スペクトル（６５６〜８００ｎｍ）。キュベットベースの蛍光分光光度計で測定を実施した：０％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−．．−．．−、０．０００２％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−．−．−．−、０．０００３％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０．．．．、０．０００５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−、０．０００９％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−、０．００１５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−−−−、０．００２５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０−−−−−−−。  （Ｂ）（Ａ）の低光度範囲の増幅。  （Ｃ）６６５ｎｍでのＰＳ２０−ＤｉＤ−検量線（０．０００８〜０．００２１％（ｗ／ｖ））。対応するＰＳ２０濃度に対してプロットされ、観察される最大蛍光強度。
【図４】ＤｉＩ存在下でのポリソルベート８０（ＰＳ８０）の蛍光発光特性の図である。  （Ａ）ＰＳ８０−ＤｉＩ−蛍光発光スペクトル（Ｅｘｃ．５５０ｎｍ）。ＤｉＩ（３５７ｎＭ）添加後の異なるＰＳ８０濃度（（０．０００２〜０．００２５％（ｗ／ｖ））の蛍光スペクトル（５６０〜６２０ｎｍ）。キュベットベースの蛍光分光光度計で測定を実施した：０％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−．．−．．−、０．０００４％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−．−．−．、０．０００６％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０．．．、０．００１０％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−、０．００１６％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−、０．００２７％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−−、０．００４５％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−−−。  （Ｂ）（Ａ）の低光度範囲の増幅。  （Ｃ）６１５ｎｍでのＰＳ８０−ＤｉＩ−検量線（０．０００７〜０．００１８％（ｗ／ｖ））。観察され、対応するＰＳ８０濃度に対して描かれた最大蛍光強度。測定はプレートリーダで実施した。
【図５】ＤｉＤ存在下でのＰＳ８０の蛍光発光特性の図である。  （Ａ）ＰＳ８０−ＤｉＤ−蛍光発光スペクトル（Ｅｘｃ．６４６ｎｍ）。ＤｉＤ（３５７ｎＭ）添加後の異なるＰＳ８０濃度（（０．０００２〜０．００４５％（ｗ／ｖ））の蛍光スペクトル（６５６〜８００ｎｍ）。キュベットベースの蛍光分光光度計で測定を実施した：０％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−．．−．．−、０．０００４％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−．−．−．−、０．０００６％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０．．．．、０．００１０％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−、０．００１６％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−、０．００２７％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−−−−、０．００４５％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０−−−−−−−。    （Ｂ）（Ａ）の低光度範囲の増幅。  （Ｃ）６６５ｎｍでのＰＳ８０−ＤｉＤ−検量線（それぞれ、−●−０．００１１〜０．００２６％（ｗ／ｖ）および−−△−−０．００１４〜０．００２６％（ｗ／ｖ））。観察され、対応するＰＳ８０濃度に対して描かれた最大蛍光強度。測定はプレートリーダで実施した。
【図６】シリコンオイル液滴の影響を示す図である。水（−−−−）、０．００２％（ｗ／ｖ）（−−−）および０．０３％（ｗ／ｖ）（…．）濃度でのシリコンオイルの水性溶液に対し、キュベット蛍光光度計で計測される、５５０ｎｍでの励起後のＤｉＩ（３５７ｎＭ）の蛍光発光スペクトル（５６０〜６２０ｎｍ）。
【図７】プレートリーダにて、６４６ｎｍで励起後の６６５でのＤｉＤ（３５７ｎＭ）の蛍光発光強度を示す、検量線（タンパク質なし−−●−−で調製される）である。０．００１７５％（ｗ／ｖ）の理論濃度（□として示される）により、試料中のＰＳ２０の定量を目的として検量線が使用された。
【図８】プレートリーダにて、５５０ｎｍで励起後の６６５でのＤｉＩ（３５７ｎＭ）の蛍光発光強度を示す、検量線（タンパク質なし−−●−−で調製される）である。０．０００７％（ｗ／ｖ）の理論濃度（□として示される）により、試料中のＰＳ８０の定量を目的として検量線が使用された。
【図９】プレートリーダにて、５５０ｎｍで励起後、６１５ｎｍでのＤｉＩ（３５７ｎＭ）の蛍光発光強度を示す、検量線（タンパク質なし−−●−−により調製、および１５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ１−−□−−により調製される）である。０．００２％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０の理論濃度を有する試料１〜５中、ＰＳ２０の定量を目的として検量線を使用した。
【図１０】ＰＳ２０試料と３５７ｎＭＤｉＩを、振盪（４０ｒｐｍ）させることを含む、３７℃で直接９６ウェルプレート内でインキュベーションした後のＤｉＩ蛍光強度（Ｅｘｃ．５５０ｎｍ）を示す図である。  （Ａ）０分時点（□）、１５分後（●）および３０分（△）後のインキュベーションでＤｉＩを直接添加した後測定された、５６５ｎｍでの発光を使用したＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００１５％（ｗ／ｖ））。  （Ｂ）０分時点（□）、１５分（●）後および３０分（△）後のインキュベーションでＤｉＩを直接添加した後測定された、６１５ｎｍでの発光を使用したＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００１５％（ｗ／ｖ））。
【図１１】ＰＳ２０試料と３５７ｎＭＤｉＩを、直接９６ウェルプレート内でインキュベーションした後のＤｉＩ蛍光強度（Ｅｘｃ．５５０ｎｍ）を示す図である。３７℃、４０ｒｐｍで振盪させながらインキュベーション（□）。３７℃、振盪なしでインキュベーション（■）。ボルテックス（●）および振盪なしでの、室温でのインキュベーション（△）。  （Ａ）５６５ｎｍでの発光を使用したＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００１５％（ｗ／ｖ））。  （Ｂ）６１５ｎｍでの発光を使用したＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００１５％（ｗ／ｖ））。
【図１２】ＤｉＩの３ロット（ロット１□、ロット２●、ロット３△）についてのＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００３０％（ｗ／ｖ））を示す図である。４０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で１５分間、９６ウェルプレート内で、３５７ｎＭＤｉＩを使用し、ＰＳ２０のインキュベーションを行った後のＤｉＩ蛍光強度（Ｅｘｃ．５５０ｎｍ、Ｅｍ．５６５ｎｍ）。
【図１３】３つの異なる三局対応のＰＳ２０（□タイプ１、●タイプ２、△タイプ３）についてのＰＳ２０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００２０％（ｗ／ｖ））を示す図である。３７℃、４０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で１５分間、９６ウェルプレート内で、３５７ｎＭＤｉＩを使用し、ＰＳ２０試料のインキュベーションを行った後のＤｉＩ蛍光強度（Ｅｘｃ．５５０ｎｍ、Ｅｍ．５６５ｎｍ）。
【図１４】３つの異なる三局対応のＰＳ８０（□タイプ１、●タイプ２、△タイプ３）についてのＰＳ８０−ＤｉＩ−検量線（０．０００４〜０．００２０％（ｗ／ｖ））を示す図である。４０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で１５分間、９６ウェルプレート内で、３５７ｎＭＤｉＩを使用し、ＰＳ８０試料のインキュベーションを行った後のＤｉＩ蛍光強度（Ｅｘｃ．５５０ｎｍ、Ｅｍ．５６５ｎｍ）。
【図１５】１〜１５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１（黒色バー）、１〜１０ｍｇ／ｍＬのＦｃ融合タンパク質（ストライプ状バー）および１〜５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ３（白色バー）の異なる濃度の存在下で、０．００６％（ｗ／ｖ）までのＰＳ２０（Ａ）およびＰＳ８０（Ｂ）を伴う３５０ｎＭのＤｉＩの発光強度（Ｅｘｃ：５５０ｎｍ、Ｅｍ：６１５ｎｍ）を示す図である。
【図１６】凍結乾燥前（黒色バー）および９６ウェルプレート内での凍結乾燥かつ水で戻した（白色バー）後の、３５０ｎＭのＤｉＩの発光強度（Ｅｘｃ：５５０ｎｍ、Ｅｍ：６１５ｎｍ）を示す図である。  １：ＭｉｌｌｉＱ水中、３５０ｎＭのＤｉＩ  ２：ＭｉｌｌｉＱ水中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋０．００２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０  ３：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋１％（ｗ／ｖ）のマンニトール  ４：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋０．００２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０＋１％（ｗ／ｖ）のマンニトール  ５：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ  ６：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋０．００２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、蛍光カルボシアニン色素を使用して試料中のポリソルベートを定量するための新規方法に関する。
【００１６】
こういった理由から、第１の態様では、本発明は、
ａ）少なくとも１種のポリソルベートを含む、試料を提供する工程と、
ｂ）試料とカルボシアニン色素とを混合させる工程と、
ｃ）混合物の蛍光を測定する工程と、
ｄ）当該蛍光と、ポリソルベートの量とを相関させる工程と、を含む、試料中のポリソルベートを定量するための方法に関する。
【００１７】
任意には、試料は液状の試料であり、そのままの状態でまたは適切に希釈した後で、この方法で使用され得る。代替的には、試料は凍結乾燥組成物などの固体材料を表していてもよい。この場合、試料を工程ｃ）を実施する前、または工程ｂ）を実施する前であったとしても、液状に戻す。好ましくは、少なくとも１種のポリソルベートを含む試料を、水性試料であるか、または仮に固体材料として提供された場合には、工程ｃ）またはｂ）の前に、水性液体溶媒で水性試料へと戻す。しかしながら、蛍光測定が可能である任意の試料が好適である。いくつかの実施形態では、試料は非水性溶媒中の液状の試料である。
【００１８】
多くの場合、試料は更に、１つ以上のタンパク質、ペプチド、小分子および／または他の化合物を含む。好ましくは、試料は水性緩衝液を含む。したがって、好ましい実施形態では、試料は緩衝剤を含む。
【００１９】
好適な緩衝剤は、当業者に既知である。タンパク質またはペプチドを含む試料に使用される、いくつかの一般的な緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、コハク酸塩、グリシンおよびリン酸塩を含む。
【００２０】
最も好ましい実施形態では、試料は、少なくとも１種のポリソルベートを含む水性緩衝溶液である。
【００２１】
代替的には、試料は液状の非水性試料である。試料の溶媒は、任意の好適な溶媒であってもよい。好適な溶媒には、メタノール、エタノールまたはＤＭＳＯが挙げられるが、これに限定されない。任意には、試料は水およびメタノール、エタノールまたはＤＭＳＯなどの有機溶媒の両者を含有してもよい。
【００２２】
試料は、任意には１つ以上の更なる化合物を含み得る。好ましい実施形態では、試料は、更に１つ以上の薬学的にまたは化粧用として活性である化合物を含む。
【００２３】
好ましい実施形態では、試料は薬学的に活性である化合物を含む。より好ましくは、試料はタンパク質、抗体、ペプチド、核酸、ウイルス様粒子、細胞、バクテリア、ウイルスおよび小分子を含む群から選択される、薬学的に活性である化合物を含む。特定の好ましい実施形態では、試料はタンパク質を含む。
【００２４】
この方法は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を定量するのに特に好適であるが、これらのポリソルベートに限定されない。この方法は、他のポリソルベートにも好適であり、他の界面活性剤にも好適となり得る。好ましい実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。
【００２５】
カルボシアニン色素は、好ましくは親油性カルボシアニン色素である。現在、最も好ましいカルボシアニン色素はＤｉＩファミリーと呼ばれる色素である。詳細には、ＤｉＩ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート）、ＤｉＯ（３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート）およびＤｉＤ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン４−クロロベンゼンスルホナート塩）である。上記色素の構造を、図１のＡ、Ｂ、Ｃに示す。更に好適なカルボシアニン色素は、ＣＭ−ＤｉＩである。
【００２６】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、カルボシアニン色素はＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＤおよびＣＭ−ＤｉＩを含む群から選択される色素である。別の好ましい実施形態では、カルボシアニン色素はＤｉＩである。
【００２７】
本発明の方法は、蛍光検出が先行技術の方法よりも速く安価であり、また容易に自動化もしくは半自動化可能であるといった利点を有する。本発明の方法はまた、一般的なＮＰＭアッセイよりも特異的である。
【００２８】
この方法は、任意の好適な蛍光検出器を用いることにより実施されてもよい。好ましくは、蛍光光度計である。いくつかの実施形態では、この蛍光光度計は、キュベットベースの蛍光光度計であり得る。代替的な実施形態では、この方法は、プレートリーダベースの蛍光分光計で実施される。代替的には、蛍光検出器は使用され得、そして試料は、カラムの有無に関わらずＨＰＬＣ／ＵＰＬＣシステムにより検出器へと導入され得る。
【００２９】
一般的には、規定の波長の蛍光強度が測定されることが好ましい。本発明者らは、ポリソルベートの定量を可能にする異なるカルボシアニン色素に対し、好適な波長を識別することが可能であった。
【００３０】
カルボシアニン色素およびポリソルベートによっては、励起波長のみならず検出される発光波長は適合される必要がある。例えば、本発明者らは、ＤｉＩの蛍光はポリソルベート２０の存在下での青方偏移を示す一方で、蛍光スペクトルはポリソルベート８０の存在下で安定することを表すことを見出した。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、カルボシアニン色素はＤｉＩであり、ポリソルベートはＰＳ２０またはＰＳ８０であり、励起波長は約５５０ｎｍであり、また検出波長は約６１５ｎｍまたは代替的には５６５ｎｍである。
【００３２】
更に好ましい実施形態では、カルボシアニン色素はＤｉＤであり、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０であり、励起波長は約６４４ｎｍであり、また検出波長は約６６５ｎｍである。
【００３３】
更に好ましい実施形態では、カルボシアニン色素はＤｉＤであり、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０であり、励起波長は約４９０ｎｍであり、また検出波長は約５０４ｎｍである。代替的な実施形態では、カルボシアニン色素はＤｉＤであり、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０であり、励起波長は約４９０ｎｍであり、また検出波長は約５４０ｎｍである。
【００３４】
本発明者らは、カルボシアニン色素を使用したポリソルベート含有量の測定により、分解生成物の存在には関係なく、迅速かつ確実なポリソルベートの定量が可能となることを見出した。本発明者らはまた、本方法が更にタンパク質、他の賦形剤および／またはシリコーンオイルを含む試料において生じる、確実な結果を提供することも見出した。したがって、この方法により、例えば、バイアルまたは予め充填済のシリンジなどの適切な薬学的な包装材料中のバイオ医薬製剤といった、貯蔵された試料の迅速かつ急速な品質コントロールを行うことが可能となる。
【００３５】
本発明の方法の更なる利点は、この方法が異なる温度で機能することである。しかしながら、工程ｃ）すなわち蛍光測定を実施するために、そして実際の測定実施前に、工程ｂ）中または工程ｂ）後に試料を保存するため、特異的な温度範囲が選択されることが好ましい。詳細には、一連の測定中、温度は好ましくは、比較的安定状態で維持されなくてはならない。
【００３６】
工程ｃ）に関して、蛍光測定は好ましくは約１０〜約４０℃の間の温度で、好ましくは約１５〜約３７℃の間の温度で、より好ましくは約１５〜約３５℃の間の、約１７〜約３０℃の間または約２０〜約３０℃の間などの温度で、詳細には、約２２〜約２７℃の間で、それぞれ実施される。特に好ましい実施形態では、この方法は約１５、１８、２０、２２、２５、２７または３０℃で実施される。別の特に好ましい実施形態では、この方法は約２０、２５または３０℃で実施される。
【００３７】
本測定の前に、試料を好ましくは色素とインキュベートする。これは工程ｂ）と工程ｃ）の間の追加工程として理解されてもよい。測定前に試料を少なくとも約１分間インキュベートすることが好ましい。インキュベーション時間は、インキュベーションを起こす温度によって選択されなければならない。好ましくは、測定前に、試料を少なくとも約１、２、３、４、５、７、１０、１５、２０または３０分間インキュベートする。代替的な好ましい実施形態では、試料を約１０〜６０分間（例えば約１０、２０、３０、４０、５０または６０分間）インキュベートする。もちろん、より長いインキュベーション時間もまた選択されてもよい。詳細にはこれは、仮に試料が選択されたインキュベーション温度で物理的および化学的に比較的安定な場合である。
【００３８】
一実施形態では、インキュベーション温度は、約２０〜４５℃の範囲で選択される。別の好ましい実施形態では、インキュベーション温度は約２５〜４０℃の範囲であるか、または約３０〜４０℃（例えば約３０、３５、３７もしくは４０℃）の範囲である。より高いインキュベーション温度がまた選択されてもよい。これは詳細には、仮に試料が物理的および化学的に比較的安定な場合、または短いインキュベーション時間が選択される場合である。
【００３９】
インキュベーション時間、インキュベーション温度および蛍光測定を実施する温度に関して上で規定された選択は、それらの組合せで解釈されなくてはならない。例えば好ましい実施形態の１つでは、本発明の方法は、約２０〜４５℃の範囲のインキュベーション温度、約１０〜６０分の範囲のインキュベーション時間および約１０〜４０℃の範囲の測定温度を使用して実施される。別の特定の実施形態では、インキュベーション温度は約３７℃であり、インキュベーション時間は約３０分であり、測定温度はおよそ室温または約２３℃である。当業者は、特定の試料に対する更なる測定条件を識別することが容易に可能となるであろう。
【００４０】
上記方法に加え、本発明は更に、試料中のポリソルベートの定量のためのカルボシアニン色素の使用に関する。詳細には、本発明は、試料中のポリソルベートの定量のためのＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＤまたはＣＭ−ＤｉＩの使用に関する。特定の実施形態では、本発明は試料中のポリソルベートの定量のためのカルボシアニン色素の使用に関する。別の実施形態では、本発明は好ましくはポリソルベート２０または８０といった試料中のポリソルベートの定量のための、ＤｉＩまたはＤｉＤの使用に関する。
【００４１】
更なる実施形態では、本発明は、試料中のポリソルベートの定量のためのＤｉＩの使用に関する。最も特定の実施形態では、本発明は、試料中のポリソルベート２０またはポリソルベート８０の定量のためのＤｉＩの使用に関する。
【００４２】
本発明者らは、この方法は９６ウェルプレートおよび蛍光分析を可能とする９６ウェルプレートリーダの使用により、容易に並列化可能であることを見出した。こういった理由から、本発明は、試料中のポリソルベートを迅速かつ大量に並列定量するための方法を提供する。したがって、この方法により、例えば品質保証機関に対する、非常に大きな改善を提供する。
【００４３】
このため、本発明はまた、カルボシアニン色素を含むウェルプレートに関する。好ましい実施形態では、本発明は、ウェルプレートに関し、このウェルプレートにおいて、ウェルの少なくとも１つが規定量のカルボシアニン色素を含む。一実施形態では、本発明はウェルプレートに関し、このウェルプレートの複数のウェルが規定量のカルボシアニン色素を含み、少なくとも１つのウェルが規定量のポリソルベートを更に含む。
【００４４】
好ましい実施形態では、プレートは９６ウェルプレートである。ただし、任意の他のタイプのウェルプレートも同様に好適である。ウェルプレートの少なくともいくつかのウェルは、ある量のカルボシアニン色素を含む。プレートの全てのウェルが、同じ量のカルボシアニン色素を含むこともまた好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、プレートは、規定量のポリソルベートを更に含むいくつかのウェルを含む。この文脈において、カルボシアニン色素の選択に関する同様の選択は、本発明による方法に対して上記で説明されたものに当てはまる。
【００４５】
好ましくは、ウェル中の色素およびポリソルベートなどの更なる任意の成分は、ウェル中に凍結乾燥形態で提供される。本発明の代替的な実施形態では、ウェルは、色素および任意にはいくつかのウェル内で、規定量のポリソルベートも含む液状の溶液を含む。凍結乾燥とは別に、乾燥のための他の方法が使用されてもよい。当業者は好適な方法を認識している。
【００４６】
特定の好ましい実施形態では、本発明は、
ａ）セットの各ウェルが規定量であるカルボシアニン色素を含む、ウェルのセットと、
ｂ）セットの各ウェルがカルボイシアニン（ｃａｒｂｏｙｃｙａｎｉｎｅ）色素および規定量のポリソルベートを含む、ウェルのセットと、を含む、ウェルプレートに関する。
【００４７】
本明細書内で使用される場合、ウェルのセット（またはサブセット）はウェルプレートのウェルのサブセットであり、セット（またはサブセット）は少なくとも２つのウェルを含む。好ましくは、カルボシアニン色素および規定量のポリソルベートを含むウェルは、異なる量のポリソルベートを含み、より好ましくは、当該ウェルのセットによるポリソルベートの検量線生成が可能となる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ウェルプレートは、ブランクとして機能し得る空のウェルまたはカルボシアニン色素なしのウェルを更に含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、当該プレートは、カルボシアニン色素および上で規定される規定量のポリソルベートを含む、１つ以上のウェルのセットを含む。こうした場合には、各セットのウェルは、同様のまたは異なるポリソルベートを含んでもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ウェルは凍結乾燥組成物を含む。こうした場合には、プレートは、ウェル内またはウェル内の組成物中の、緩衝化合物および／もしくは安定化化合物を更に含むことが好ましい。
【００５１】
本発明者らは、いくつかのウェルはポリソルベートを更に含む、カルボシアニン色素を有するウェルを含むウェルプレートを提供する組成物が、ウェルに充填され、続いて凍結乾燥できる水性組成物として調製できることを見出した。
【００５２】
末端消費者は、試料を規定のウェルのセットに添加し、かつ規定量の水を用いて残りのウェルを充填することのみを行う必要がある。
【００５３】
当該水性組成物は、ウェルのセットによっては、規定量のカルボシアニン色素および任意のポリソルベートのみを含んでもよい。このことにより、組成物を液状に戻した後に蛍光シグナルを十分回収することが可能である。
【００５４】
本発明者らは、仮に組成物は更に緩衝液を含み、かつ任意には、安定化剤（好ましくは糖、より好ましくはマンニトール）を含む場合、凍結乾燥組成物を液状に戻した後に蛍光シグナルの最適な回収が得られ得ることを見出した。
【００５５】
好ましい実施形態では、当該安定化剤は最大１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。特定の実施形態では、当該安定化剤は０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）の間の濃度で存在する。好ましくは、当該安定化剤は最大５％（ｗ／ｖ）の濃度で、とりわけ０．５〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。特定の好ましい実施形態では、安定化剤は約１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【００５６】
任意の緩衝液は好適であってよく、ルーティン使用のための緩衝液は当業者に既知である。好ましくは、ＤｉＩの他に、当該緩衝液は蛍光シグナルを提供しない。好適な１つの緩衝液はリン酸塩緩衝液である。
【００５７】
更なる態様では、本発明は、
ａ）カルボシアニン色素と、
ｂ）希釈緩衝液と、
ｃ）任意には、それぞれ規定量のポリソルベートを含む標準溶液のセットと、を含む試料中のポリソルベートを定量するためのキットに関する。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態では、カルボシアニン色素はキュベット中にある。より好ましくは、当該キットは規定量のカルボシアニン色素を含む、少なくとも１つのキュベットを含む。特定の実施形態では、当該キュベットはマイクロキュベットである。
【００５９】
キットは任意には、更なる化合物、詳細には使用指示も含んでもよい。特定の実施形態では、キットはＤｉＩ、ＤｉＤ、ＤｉＯ、ＣＭ−ＤｉＩから選択されるカルボシアニン色素を含む。最も好ましくは、キットはＤｉＩを含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は濃縮緩衝液である。
【００６０】
標準溶液は、溶液または希釈するための溶液を使用できる用意があり得る。好ましくは、標準溶液は濃縮溶液である。いくつかの実施形態では、キットは異なる溶媒内に異なる標準溶液を含む。
【００６１】
標準溶液は、異なるベース用途に適合し得る。詳細には、標準溶液は規定量である異なるポリソルベートを含む。好ましくは、標準溶液はポリソルベート２０、ポリソルベート８０またはこれらの混合物を含む。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、当該キットは上記で定義されるウェルプレートを含む。
【実施例】
【００６３】
方法
ＰＳ検量線の作成
ＰＳ２０およびＰＳ８０の貯蔵液（水中で１．０％（ｗ／ｖ）に調製）を、１ｍＬアリコットを使用し、調製かつ−２０℃で貯蔵した。これらのストックは、報告された全ての実験で使用された。おおよそ０．０００２〜０．００７％（ｗ／ｖ）の範囲内で水または緩衝液で連続希釈を実施することにより、ＰＳ検量線を作成した。対照として、水または対応する緩衝液のみを含有する試料を使用した。
【００６４】
蛍光アッセイ
ＤｉＩ−Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）貯蔵液は、エタノールにＤｉＩが溶解している１ｍＭの溶液である。水に溶解している中間貯蔵液（２０μＭの濃度で）は、２μＬの初期色素溶液を９８μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に添加することにより調製された。試料に添加する前に、このＤｉＩ−希釈標準溶液（ＤｉＩ−ＷＳ）を新たに調製した。ＰＳ検量線のため、ＤｉＩを異なる試料に添加した。分析試料中のＤｉＩの最終濃度は３５７ｎＭであった。試料への色素添加後、直ちにボルテックスし、光から保護した状態で３７℃、３０分インキュベートした。同様に、ＤｉＤ−Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）（エタノールにＤｉＤが溶解している１ｍＭの溶液）試料を調製し、処理した。
【００６５】
ＤｉＩのための蛍光測定キュベットシステム
ＦＰ−８５００蛍光光度計（Ｊａｓｃｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０×２ｍｍ石英キュベットを測定に使用した。励起波長を５５０ｎｍ（帯域幅２．５ｎｍ）に設定し、一方発光を５６０〜６２０ｎｍ（帯域幅：２．５ｎｍ、間隔：１ｎｍ、速度：低、感度：高、蓄積値：１）の範囲で記録した。水を常に基準として使用した。全ての実験を２１℃（温度調節性機器）で実施した。
【００６６】
蛍光測定プレートリーダシステム
ウェルプレートベースの測定のため、プレートリーダ（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２，Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。ＤｉＩのための励起波長を５５０ｎｍ（帯域幅：５ｎｍ）に固定し、発光を５６０〜６２０ｎｍ（帯域幅：５ｎｍ、発光波長工程のサイズ：１ｎｍ）の範囲で収集した。読み取り数は２０回に設定した。高濃度のＰＳを含有するウェルに基づいた装置により、ゲインおよびｚ位置を測定した。最終的にはゲインを１２０に固定し、そしてｚ位置を８１００μｍに調整した。測定は、平らな底部を有する黒色の９６ウェルプレートを使用し、２反復で実施した。ウェルあたりの最終容量は２００μＬであった。通常のプレートだけでなく、低結合プレートを試験した。全ての実験はおおよそ２３℃（非温度調節性機器）で実行した。
【００６７】
ＵＶ／Ｖｉｓ測定
ＵＶ／Ｖｉｓ測定は、Ｓａｆｉｒｅ  ２マルチモードリーダを使用して実施した。希釈系列を実施することにより得られる溶液およびブランクとして対応する溶媒（水／緩衝液）を利用して、更に試料を検査した。２回の蓄積から得られた吸収スペクトルを、２７０〜９９９ｎｍの範囲内で記録した。この実験では、ウェルあたりの最終容量が１５０μＬである９６ウェルプレートを使用した。
【００６８】
ＤｉＩまたはＤｉＤの存在下での、ＰＳ２０の蛍光調査
キュベットベースの蛍光光度計を使用し、ＤｉＩの存在下でのＰＳ２０の蛍光特性を測定した。この目的のため、０．０００２〜０．００２５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲を含む試料を調製した。結果を図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃに示す。最大蛍光強度をおおよそ５９０ｎｍで得た。蛍光強度を、０．０００５％（ｗ／ｖ）より高いＰＳ２０濃度で、より低い波長（〜５６５ｎｍ）に移動した。
【００６９】
繰り返し測定を実施した際、６１５ｎｍでの蛍光シグナルは一貫した結果を示した。この結果とは別として、上述の波長における強度は図１Ｃに表すような試験濃度に比例した。
【００７０】
こうした結果に基づき、ＰＳ２０定量のための発光波長を６１５ｎｍに固定した。内部フィルタ効果に対する調査を行うため、発光波長および励起波長における吸収を更なる実験で測定した。実験に基づき、蛍光分析中の内部フィルタ効果を阻止するためにＤｉＩおよびＰＳの濃度が選択された。
【００７１】
ＤｉＤおよびＰＳ２０を用いて同じ実験を実施し、同様の結果を得た。図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃを確認されたい。ＤｉＤに対する発光波長を６６５ｎｍであるように選択した。
【００７２】
ＤｉＩおよびＤｉＤの存在下でのＰＳ８０の蛍光調査
ＰＳ２０定量のために適用可能である、示される蛍光アッセイもまた、ＰＳ８０に対して試験した。最初に、対応する蛍光プロファイルを、ＤｉＩおよびＤｉＤに対するＰＳ２０に見られるように設定されているパラメータを用いる蛍光光度計で測定した。
【００７３】
得られたデータに基づき、異なるグラフを描いた。図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａおよび図５Ｂは、６１５ｎｍ（ＤｉＩ）または６６５ｎｍ（ＤｉＤ）で得られる、測定された試料全ての蛍光強度の一覧を表す。０．０００４５〜０．００１１４％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０に対する試料の検量線は、図４Ｃおよび図５Ｃで確認可能である。
【００７４】
ＤｉＩ蛍光におけるシリコーンオイルの影響
更なる実験では、ＤｉＩ蛍光における、組成物中の他の化合物の影響を測定した。蛍光光度計を使用した第１の測定では、試料中のシリコンオイルの液滴の影響を分析した。
【００７５】
この実験では、水性溶液中のＤｉＩの蛍光を測定し、０．００２％（ｗ／ｖ）の水性溶液中のＤｉＩの蛍光と比較した。そして０．０３％（ｗ／ｖ）のシリコーンオイルを試験した。結果は図６で確認することができる。
【００７６】
結果は、シリコーンオイル液滴は大きくＤｉＩの蛍光性を変化させないことを示す。
【００７７】
プレートリーダ中のＤｉＤ／ＤｉＩ蛍光測定および試料分析
方法を並列化させる可能性を試験するため、ＤｉＤおよびＰＳ２０ならびにＤｉＩおよびＰＳ８０を用いた蛍光測定をプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２，Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施した。
【００７８】
ＰＳ２０およびＤｉＤに対する検量線を測定し、そして０．００１７５％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含む試料をプレートリーダを使用して測定した。結果を図７に示し、表１に集計した。
【００７９】
【表１】
2020525794.tif 000002
【００８０】
ＰＳ８０およびＤｉＩに対する更なる検量線を測定し、そして０．０００７％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有する試料をプレートリーダを用いて計測した。結果を図８に示し、表２に集計する。
【００８１】
【表２】
2020525794.tif 000003
【００８２】
ＤｉＩによるＰＳ定量におけるタンパク質の影響
更なる実験では、ＤｉＩによるＰＳ２０定量における、試料中の標本タンパク質としての２つの異なるモノクローナル抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）が存在する影響を試験した。検量線と、いくつかのＰＳ２０を含有する試料をプレートリーダで測定した。結果は図９および表３で確認可能である。
【００８３】
【表３】
2020525794.tif 000004
【００８４】
ＤｉＩ蛍光におけるインキュベーション時間の影響
更なる実験では、ＰＳを含有する試料でのＤｉＩ蛍光強度における、測定前のインキュベーション時間の影響がある場合、その影響を分析した。試料を上のように調製し、直接または１５分間または３０分間のインキュベーションの後に測定した。結果を図１０に示す。図に示すように、得られたＤｉＩ蛍光およびＰＳ２０検量線におけるインキュベーション時間の影響はさほど重要ではない。
【００８５】
ＤｉＩ蛍光におけるインキュベーション中のプレート振盪および温度の影響
追加の実験では、蛍光測定におけるインキュベーション温度およびインキュベーション中のプレート振盪の影響を、９６ウェルプレートで実施されるアッセイに対する特定要件を決定するために分析した。
【００８６】
１セットの試料（ＰＳ２０検量線）を調製し、このセットのアリコットを（ｉ）３７℃で振盪させながら、または（ｉｉ）３７℃で振盪させることなく、および（ｉｉｉ）室温で振盪させることなく、１５分間インキュベートした。
【００８７】
この実験の結果を図１１に示す。この結果は、振盪とインキュベーション中の温度のどちらも検量線に影響を及ぼすことがないことを明確に示す。
【００８８】
異なる色素バッチの影響
更なる実験では、ＤｉＩ色素の異なるバッチを有する結果の再現性を分析した。この実験では、同じ供給元からの異なるバッチのＤｉＩを有する３つの試料（ＰＳ２０の検量線）を分析した。全ての試料を３７℃で１５分インキュベーションした後、分析した。
【００８９】
結果を図１２に示す。この結果は、これらの試料が類似しており、色素バッチには関係しないことを示す。
【００９０】
異なる供給元からのＰＳ２０およびＰＳ８０に対するＤｉＩアッセイの適用性
異なる供給元からのＰＳ２０およびＰＳ８０を用いて、同様の実験を行った。３つの異なる供給元のポリソルベートを、事前のＤｉＩによる分析と同じ方法で分析した。結果を図１３および図１４に示す。結果が類似しており、ＰＳ２０またはＰＳ８０の供給元には関係しないことを示すことが改めて明らかになった。こういった理由から、オリジナルの供給元には関係なく試料中のＰＳを定量するため、単一のＰＳ検量線が使用されてもよい。
【００９１】
ＤｉＩ蛍光による異なるタンパク質の影響
更なる実験では、０．００６％ｗ／ｖのポリソルベート２０または様々な濃度である、ポリソルベート８０および異なるタンパク質（ＩｇＧ１、Ｆｃ融合タンパク質またはＩｇＧ）を含む試料を測定した。結果を図１５に示した。この結果は、試験されたタンパク質の存在による蛍光測定への影響がないことを示す。
【００９２】
ＤｉＩ蛍光における凍結乾燥の影響
１つの実験では、いくつかの試料を調製して９６ウェルプレートへと充填し、ＤｉＩ蛍光強度を測定した。その後、試料を９６ウェルプレートで凍結乾燥させ、続いて液状に戻した。蛍光強度は液状に戻した後に測定した。以下の試料を調製し、測定した：
１：ＭｉｌｌｉＱ水中、３５０ｎＭのＤｉＩ
２：ＭｉｌｌｉＱ水中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋０．００２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０
３：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋１％（ｗ／ｖ）のマンニトール
４：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋０．００２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０＋１％（ｗ／ｖ）のマンニトール
５：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ
６：１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、３５０ｎＭのＤｉＩ＋０．００２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０
【００９３】
結果を図１６に示す。この結果は、このアッセイに対し、凍結乾燥組成物を用いてプレートを調製し、凍結乾燥および液状に戻した後もＤｉＩ蛍光特性を維持することが可能であることを示す。この結果は、マンニトールなどの安定化剤を含む、緩衝組成物の使用により、結果が改善されることを示す。
【図１Ａ】
2020525794.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2020525794.tif 000021
【図１４】
2020525794.tif 000022
【図１５Ａ】
2020525794.tif 000023
【図１５Ｂ】
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【図１６】
2020525794.tif 000025
【国際調査報告】
2020525794.tif 000026
2020525794.tif 000027
2020525794.tif 000028