(57)【要約】  本発明は、ジチオカルバメート−金属錯体と少なくとも１つの血液タンパク質との粒子形態を提供する。粒子形態は、個々の成分の連続添加または同時添加を含む方法によって得られ、その結果、それらの成分の自己集合が生じる。粒子形態の水性分散液は、非経口、経口および局所投与、ならびに癌の治療および可視化に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジチオカルバメート−金属錯体と少なくとも１つの血液タンパク質との粒子形態。
【請求項２】
有機溶媒を実質的に含まない、請求項１に記載の粒子形態。
【請求項３】
分子集合体の形態である、請求項１または２に記載の粒子形態。
【請求項４】
平均粒子径が２〜９００ｎｍの範囲である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項５】
ジチオカルバメート−金属錯体と実質的に純粋な血液タンパク質、特に実質的に純粋な血清タンパク質との粒子形態。
【請求項６】
有機溶媒を実質的に含まない、および／または、分子集合体の形態である、および／または、平均粒子径が２〜９００ｎｍの範囲である、請求項５に記載の粒子形態。
【請求項７】
金属が銅、亜鉛、銀および金から選択され、好ましくは金属が銅である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項８】
金属が、６３Ｃｕ、６５Ｃｕ、６４Ｃｕおよびそれらの混合物から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項９】
ジチオカルバメートが式（Ｒ１）（Ｒ２）Ｎ−ＣＳ２−を有し、式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なっており、独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むＣ４〜Ｃ１４ヘテロアリール、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むＣ３〜Ｃ１０ヘテロシクリルから選択され；または、Ｒ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と共に複素環を形成し、−Ｒ１−Ｒ２−はＣ２〜Ｃ６アルキレンまたはＣ２〜Ｃ６アルケニレンであり、１〜２個の炭素原子は任意で、Ｏ、Ｓ、ＮＨから選択されるヘテロ原子によって置換されていてもよく；Ｒ１およびＲ２を形成する部分は置換されていなくてもよく、または、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ヒドロキシ、メルカプト、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルチオ、ハロゲン、フェニル、ベンジル、ケト基、カルボキシル基、Ｃ１〜Ｃ４アルキルオキシカルボニルから選択される少なくとも１つの置換基によってさらに置換されてもよい、請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１０】
Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１〜Ｃ６（またはＣ１〜Ｃ４）アルキル、Ｃ２〜Ｃ６（またはＣ１〜Ｃ４）アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、フェニルから選択され；または、Ｒ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と共に複素環を形成し、−Ｒ１−Ｒ２−はＣ２〜Ｃ６アルキレンまたはＣ２〜Ｃ６アルケニレンである、請求項９に記載の粒子形態。
【請求項１１】
ジチオカルバメートがジエチルジチオカルバメートである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１２】
血液タンパク質が、血清タンパク質、好ましくは、アルブミン、実質的に純粋なアルブミン、トランスフェリン、実質的に純粋なトランスフェリン、免疫グロブリン、実質的に純粋および／またはモノクローナルである免疫グロブリンを含む群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１３】
少なくとも１つの血液タンパク質が、全血、血漿または血清を含む血清タンパク質を含む混合物であり、血清タンパク質が好ましくはアルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリンを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１４】
有機溶媒を実質的に含まない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１５】
粒子の少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または少なくとも９０％が、２〜２２０ｎｍの範囲、または２〜１００ｎｍの範囲、または２〜９０ｎｍの範囲、または２〜８０ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１６】
負のゼータ電位、好ましくは−１５ｍＶよりも低いゼータ電位、より好ましくは−３０ｍＶよりも低いゼータ電位を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１７】
実質的に乾燥形態、好ましくは凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１８】
凍結乾燥形態であり、さらに、マンニトール、トレハロース、サッカロース、アルブミン、ラクトース、デキストロース、スクロース、グルコース、マルトース、イノシトール、ラフィノース、イヌリン、マルトデキストリン、多糖類、ヘパリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、グリセロール、イノシトール、ソルビトール、メルカプタン、ポリエチレングリコール、アドニトール、アミノ酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ポリビニルピロリドン、デキストランから選択される少なくとも１つの凍結保護剤を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項１９】
注射液または注入液、滴剤、スプレー、点滴、坐剤、カプセル、錠剤、粉末、軟膏、ローションまたはクリームの形態である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項２０】
滅菌濾過されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の粒子形態の調製方法であって、
（ａ）ジチオカルバメートおよび金属塩から選択される第１成分と少なくとも１つの血液タンパク質とを、水性溶媒中において混合する工程と、
（ｂ）ジチオカルバメートおよび金属塩から選択される第２成分を同時にまたは続けて添加する工程と、
（ｃ）得られた溶液を任意で凍結乾燥する工程と、を含み、
第１成分がジチオカルバメートであるときは第２成分が金属塩であり、または、第１成分が金属塩であるときは第２成分がジチオカルバメートである、方法。
【請求項２２】
ジチオカルバメートがジエチルジチオカルバメートであり、金属塩が銅塩であり、任意に血液タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）水性溶媒（例えば、水または水系バッファ）中において、少なくとも１つの血液タンパク質を、０．０１％（ｗ／ｖ）〜飽和濃度の溶液、好ましくは０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解する工程、または、患者の全血または血漿または血清を提供する工程と、
（ｂ）１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの範囲のジチオカルバメートになるように、水性溶媒に少なくとも１つのジチオカルバメートを添加し溶解させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後に、１μＭ〜１００Ｍ、好ましくは１〜１０ｍＭの金属塩濃度を有するように、水性溶媒中に金属塩溶液を添加する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）水性溶媒（例えば、水または水系バッファ）中において、少なくとも１つの血液タンパク質を、０．０１％（ｗ／ｖ）〜飽和濃度の溶液、好ましくは０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で溶解する工程、または患者の全血または血漿または血清を提供する工程と、
（ｂ）工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後に、１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの金属塩濃度を有するように、水性溶媒中の金属塩溶液を添加する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後に、１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの範囲のジチオカルバメートになるように、水性溶媒に少なくとも１つのジチオカルバメートを添加し溶解させる工程と、を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）において、アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリンもしくはそれらの混合物、または、全血、血清もしくは血漿が、血液タンパク質として使用される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
金属イオン：ジチオカルバメートイオンのモル比が１：５〜５：１である、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
水性溶媒が水、または、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、生理食塩水等の水系バッファであり、好ましくは水性溶媒が無菌である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、ジチオカルバメート−金属錯体と少なくとも１つの血液タンパク質との粒子形態。
【請求項２９】
治療剤および／または診断剤として使用される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項３０】
癌の化学療法、癌の放射線療法、腫瘍処置、温熱療法および／または腫瘍の可視化から選択される治療において使用される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項３１】
非経口投与用、経口投与用、局所投与用である、請求項２９または３０のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項３２】
注射投与１時間後の血液中のＣｕＥＴの濃度が少なくとも１ｎｇ／Ｌであるか、または、注入投与中の血液中のＣｕＥＴの濃度が少なくとも５ｎｇ／Ｌである、請求項２９または３０のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項３３】
血液タンパク質として免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有血液タンパク質混合物を含み、腫瘍抗原または細胞特異的マーカーに対する抗体または抗体断片をさらに含む、請求項１〜２０および２９〜３２のいずれか１項に記載の粒子形態。
【請求項３４】
ジチオカルバメートと、金属塩と、好ましくは水または水系バッファである水性溶媒と、ジチオカルバメート、金属塩および少なくとも１つの血液タンパク質を無菌条件下において水性溶媒中で混合するための容器を含む、パーツキット。
【請求項３５】
少なくとも１つの血液タンパク質、好ましくは実質的に純粋な血液タンパク質をさらに含む、請求項３４に記載のパーツキット。
【請求項３６】
ジチオカルバメートがジエチルジチオカルバメートであり、金属塩が銅塩であり、血液タンパク質が任意でヒト血清アルブミンである、請求項３４または３５に記載のパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、癌処置および診断を含む医学用途に適する抗腫瘍組成物を得るのに有用である、Ｒ１，Ｒ２−ジチオカルバメート−金属錯体と血清タンパク質または血清タンパク質の混合物との粒子、ならびに当該粒子の製造方法に関する。
［背景技術］
Ｒ１，Ｒ２−ジチオカルバメート（ＤＴＣ）は、文献で公知となっている強力な金属イオンキレート剤である。一度、ＤＴＣと金属との錯体が形成されると、一部の錯体は、種々の癌細胞モデルを用いる細胞系において抗癌活性を示す。しかしながら、提唱される抗腫瘍活性を有する錯体は水溶性ではないため、このような錯体を患者に投与することは特に困難である。また、このような錯体は癌細胞に対する優先毒性が低く、したがって治療指数がほぼ狭い。上記の２つの制限は、本発明によって克服し得る。
【０００２】
ジチオカルバメート（ＤＴＣ）は、特に種々の二価金属との錯体について、種々の前臨床モデルにおいて有望な抗癌活性を示す。ＤＴＣの金属キレート特性は抗腫瘍活性と同様に、長年知られている。いくつかの特許文献には、種々の悪性腫瘍の治療戦略として、重金属（特に銅、亜鉛、金または銀）とのジチオカルバメート錯体の使用が含まれている（例えば、ＵＳ２００３０２２９０６４、ＵＳ２００５００９６３０４を参照）。しかしながら、これらの特許文献のいずれも、これまでヒトにおける実用化には至っていない。明らかに、臨床手順におけるジチオカルバメート−金属錯体の使用の主な障害は、好ましくない薬理学的特性（すなわち、安定性および水性製剤化への可能性）である。例えば、最も有望な抗癌錯体であるビス（ジエチルジチオカルバメート）銅（ＩＩ）（または銅ビス（ジエチルジチオカルバメート））については、水中での溶解度定数が１Ｌ当たりナノグラムの範囲にすぎず、これは患者において治療用量を送達するには不十分である。
［発明の概要］
本発明の主な目的は、ジチオカルバメート−金属錯体の新規な粒子形態、および抗癌剤または診断剤として直接使用可能な粒子の生体利用可能な分散液の形態におけるその調製方法（例えば、インサイチュ（in-situ）調製）である。
【０００３】
粒子形態は、ジチオカルバメート−金属錯体、および少なくとも１つの血液タンパク質（好ましくは、少なくとも１つの血清タンパク質）を含むか、またはそれらから成る。好ましくは、ジチオカルバメート−金属錯体および血液タンパク質は分子集合体の形態である、および／または、２〜９００ｎｍの範囲のサイズを有する。好ましくは、粒子形態は有機溶媒を実質的に含まない。
【０００４】
用語「分子集合体」は、ジチオカルバメート−金属錯体および少なくとも１つの血液タンパク質を含む分子複合体を示す。分子集合体の成分は、典型的には非共有結合相互作用によって共に結合し、分子複合体を形成する。
【０００５】
分子集合体の構造は、特に、分子集合体が非共有結合相互作用によって共に結合された成分の分子を化学量論比で含む点で、例えば、コア−シェル粒子、凝集体、混合物等とは異なる。
【０００６】
平均粒子径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるＺ−平均径を指す。Ｚ−平均はキュムラントの技術を用いた分析によるＤＬＳデータから得られる。ＤＬＳデータからＺ−平均径を決定する方法は当業者に知られている。Ｚ−平均径は流体力学的サイズを示す。
【０００７】
好ましくは、粒子形態がジチオカルバメート−銅錯体および少なくとも１つの血液タンパク質、好ましくは少なくとも１つの血清タンパク質を含むか、またはそれらから成る。ジチオカルバメート−金属錯体および血液タンパク質は好ましくは分子集合体の形態であり、および／または２〜９００ｎｍの範囲のサイズを有する。粒子形態は、好ましくは有機溶媒を実質的に含まない。
【０００８】
本発明によれば、粒子形態（本明細書では粒子、好ましくはナノ粒子とも示す）はジチオカルバメートおよび金属塩から選択される第１成分を、水性溶媒中において少なくとも１つの血液タンパク質と混合させ、同時にまたは続いて、ジチオカルバメートおよび金属塩から選択される第２成分を添加することによって調製される。一方、第１成分がジチオカルバメートである場合、第２成分は金属塩である。第１成分が金属塩である場合、第２成分はジチオカルバメートである。
【０００９】
本発明の構成の範囲内において、本明細書に記載されるように試薬を同時添加または連続添加の実施を行うとき、第２成分の添加後、血液タンパク質は溶液中で速やかに形成されるジチオカルバメート−金属錯体に結合する重要な能力を有し、好ましくは２〜９００ｎｍの平均粒子径を有する粒子に自然に集合し、注射可能である生体利用可能な粒子の分散液が形成されることを見出した。本粒子形態において、ジチオカルバメート−銅錯体等のジチオカルバメート−金属錯体分子は均一に分布し、元々の化学特性を維持し、インビトロおよびインビボにおける生物学的活性が実質改善される。よって、別の方法における水不溶性化合物の予想外の医薬的使用（癌処置および腫瘍可視化における使用を含む）を可能にする。
【００１０】
粒子の調製方法は、非常に短時間（１分未満）で、患者の病床においてでも、有機（非極性）溶媒を必要とせず即時または持続的非経口投与のいずれかを可能にする単一の反応容器中で実施することができる。
【００１１】
本発明はさらに、ジチオカルバメートと、金属塩と、滅菌水性溶媒（好ましくは、滅菌水性溶媒は水または水系バッファである）と、ジチオカルバメート、金属塩および少なくとも１つの血液タンパク質を無菌条件下において水性溶媒中で混合するための容器を含む、パーツキットを含む。パーツキットは、少なくとも１つの血液タンパク質、好ましくは実質的に純粋な血液タンパク質をさらに含み得る。キットの成分は、キット内の別個の容器に提供されていてもよい。
［発明の詳細な説明］
本発明において、「金属」は、遷移金属（またはｄ−金属）ならびに周期律表のＩＩＩＡ族およびＩＶＡ族の金属から選択される金属を意味する。好ましくは、金属は遷移金属である。より好ましくは、金属が銅、亜鉛、カドミウム、水銀から選択される。最も好ましくは、金属は銅である。本発明の全ての利点は、銅においても最も強く顕著である。
【００１２】
金属は、単一の同位体または同位体混合物の形態であってもよい。同位体は、放射性同位体であっても非放射性同位体であってもよい。銅については、非放射性同位元素は６３Ｃｕおよび６５Ｃｕであり、放射性同位元素は好ましくは６４Ｃｕまたは６７Ｃｕである。６４Ｃｕが銅の陽電子放出同位体であり、分子放射線療法および陽電子放出断層撮影法に適用される。
【００１３】
「金属塩」は、陰イオンを有する陽イオンの形態である金属塩を意味する。粒子分散液の意図される医薬用途に関して、当業者は陰イオンが薬学的に許容し得る陰イオンであるべきであり、好ましくは水溶性であることを理解するであろう。陰イオンは例えば、ハロゲン化物（特に塩化物、臭化物、ヨウ化物）、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩；カルボン酸陰イオン、ジカルボン酸陰イオン、トリカルボン酸陰イオン、スルホン酸陰イオン、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、トリフラート、グルコン酸塩、ビスグリシネート等の無機酸陰イオンから選択してもよい。
【００１４】
「ジチオカルバメート」は、式（Ｒ１）（Ｒ２）Ｎ−ＣＳ２−（本明細書では、Ｒ１，Ｒ２−ジチオカルバメートとも示す）を有する部分を意味する。式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むＣ４〜Ｃ１４ヘテロアリール、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むＣ３〜Ｃ１０ヘテロシクリルから選択され；または、Ｒ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と共に複素環を形成し、−Ｒ１−Ｒ２−はＣ２〜Ｃ６アルキレンまたはＣ２〜Ｃ６アルケニレンであり、１〜２個の炭素原子は任意で、Ｏ、Ｓ、ＮＨから選択されるヘテロ原子によって置換されてもよい。Ｒ１およびＲ２を形成する部分は、置換されていなくてもよく、または、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ヒドロキシ、メルカプト、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルチオ、ハロゲン、フェニル、ベンジル、ケト基、カルボキシル基、Ｃ１〜Ｃ４アルキルオキシカルボニルから選択される少なくとも１つの置換基によってさらに置換されていてもよい。
【００１５】
より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１〜Ｃ６（またはＣ１〜Ｃ４）アルキル、Ｃ２〜Ｃ６（またはＣ２〜Ｃ４）アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、フェニルから選択され；またはＲ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と共に複素環を形成し、−Ｒ１−Ｒ２−はＣ２〜Ｃ６アルキレンまたはＣ２〜Ｃ６アルケニレンである。
【００１６】
最も好ましくは、ジチオカルバメートはジエチルジチオカルバメートである（Ｒ１およびＲ２はエチルである）。
【００１７】
ジチオカルバメートは、負に帯電した陰イオンの形態、典型的にはジチオカルバメート−金属錯体として存在し得る。本発明の方法における出発化合物としては、中性化合物（Ｒ１）（Ｒ２）Ｎ−Ｃ（Ｓ）ＳＨの形態として使用してもよい。好ましくは、［（Ｒ１）（Ｒ２）Ｎ−ＣＳ２］ｍ−Ｃａｔｍ＋の塩の形態として使用してもよい。当該塩の例は、アルカリ金属塩（Ｃａｔ＋はアルカリ金属陽イオンであり、ｍ＝１である）、アンモニウム塩（Ｃａｔ＋はアンモニウム陽イオンであり、ｍ＝１である）、または、アルカリ土類金属塩（Ｃａｔ＋はアルカリ土類金属陽イオンであり、ｍ＝２である）。当業者は、用語「ジチオカルバメート」が使用される文脈に依って、どの形態を意味しているか、またはどの形態が必要であるかを理解する。
【００１８】
「ジチオカルバメート−金属錯体」は、少なくとも１つのジチオカルバメート部分および少なくとも１つの金属（好ましくは、１つの金属）を含む錯体である。例えば、ジチオカルバメート−金属錯体は、式（Ｉ）に対応し得る。
【００１９】
【化１】
2020535221.tif 000002
【００２０】
式中、Ｍは金属であり、好ましくは銅であり、
Ａｎは薬学的に許容し得る陰イオンであり、好ましくは本明細書で定義されるとおりであり、
ｎはｄ−金属の原子価であり、典型的には、ｎは１、２、または３であり、
Ｒ１およびＲ２は、本明細書中で定義されるとおりである。
【００２１】
ジチオカルバメートに対する金属の比率（金属：ジチオカルバメート）は、例えば、１：５〜５：１の範囲、または１：２〜５：１の範囲であり得る。ジチオカルバメートに対する金属の比率は、錯体中のそれらの化学量論比率、またはそれらの化学量論比率±２０％、またはそれらの化学量論比率±５０％に最適に対応し得る。例えば、銅において、化学量論比は２：１である。
【００２２】
「血液タンパク質」は、動物（ヒトを含む）の血液中に天然に存在するタンパク質を意味する。血液タンパク質は好ましくは、動物（ヒトを含む）の血清中に天然に存在するタンパク質を意味する「血清タンパク質」である。好ましくは、本発明はヒト血液タンパク質またはヒト血清タンパク質を使用する。イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシの血液タンパク質または血清タンパク質を使用してもよい。血液タンパク質または血清タンパク質は、血液または血清からそれぞれ単離してもよいし。組換え由来であってもよい。
【００２３】
血液タンパク質（より具体的には、血清タンパク質）は、実質的に純粋なタンパク質の形態であってもよく、タンパク質の混合物の形態であってもよい。
【００２４】
血清タンパク質は好ましくは、アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン、セルロプラスミン、およびこれらのタンパク質を含む混合物を含む群から選択される。最も好ましくは、血清タンパク質はアルブミンである。いくつかの好ましい実施形態において、血清タンパク質は免疫グロブリンである。
【００２５】
「少なくとも１つの血液タンパク質」は、１つまたは複数の血液タンパク質を意味する。したがって、本発明の方法における反応混合物および／または本発明の粒子は、１つの血液タンパク質または血液タンパク質の混合物を含み得る。血液タンパク質の混合物は例えば、全血、血漿または血清、または少なくとも２つの血液タンパク質の人工的に調製された混合物であり得る。
【００２６】
「少なくとも１つの血清タンパク質」は、１つまたは複数の血清タンパク質を意味する。したがって、本発明の方法における反応混合物および／または本発明の粒子は、１つの血清タンパク質または血清タンパク質の混合物を含み得る。血清タンパク質の混合物は例えば、全血、血漿または血清、または少なくとも２つの血清タンパク質の人工的に調製された混合物であり得る。
【００２７】
粒子状分子集合体は、いくつかの実施形態においては、水性溶媒中の懸濁液または分散液の形態である。いくつかの実施形態においては、それらは凍結乾燥形態または乾燥形態で提供される。
【００２８】
「水性溶媒」は、水、または、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、生理食塩水または他の一般的なバッファ等の水系バッファである。好ましくは、水性溶媒は無菌である。
【００２９】
自己集合粒子（すなわち、分子集合体）のサイズは、２〜９００ｎｍである。好ましくは、粒子の少なくとも９０％が２〜５００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、粒子の少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または少なくとも９０％が２〜１００ｎｍ、または１０〜１００ｎｍ、または２〜９０ｎｍ、または２〜８０ｎｍ、または２〜２２０ｎｍ、または２〜２００ｎｍ、または１０〜２００ｎｍの範囲のサイズを有する。粒子径およびそれらの分布は動的光散乱（ＤＬＳ）法によって測定された。本明細書を通して使用される用語「サイズ」または「平均径」は、ＤＬＳによって決定される平均径を示す。
【００３０】
本発明の粒子状分子集合体は、好ましくは負のゼータ電位を有する。より好ましくは、粒子状分子集合体は−１５ｍＶより低い（＝−１５ｍＶよりも負である）ゼータ電位を有する。さらにより好ましくは、粒子状分子集合体は−２０ｍＶよりも低い、または−３０ｍＶよりも低いゼータ電位を有する。
【００３１】
ジチオカルバメート−金属錯体および少なくとも１つの血液タンパク質から成るかまたはそれらを含む粒子形態は、濾過滅菌（滅菌濾過）してもよい。好ましくは０．２２マイクロメートルフィルターを使用して濾過滅菌（滅菌濾過）してもよい。
【００３２】
ジチオカルバメート−金属錯体および少なくとも１つの血液タンパク質から成るかまたはそれらを含む粒子形態は、注射液または注入液（溶液、分散液または懸濁液）、滴剤、スプレー、点滴、坐剤、カプセル、錠剤、軟膏、ローションまたはクリームの形態で提供され得る。医薬製剤は、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤、等張性調整剤、ｐＨ調整剤、保存剤、安定剤、抗酸化剤、還元剤、可溶化剤、金属イオン、結合剤、流動促進剤、滑沢剤、希釈剤、崩壊剤、甘味料、風味料、コーティングポリマー、エマルジョン成分、軟膏基剤またはクリーム基剤から選択される少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤および／または成分をさらに含む。
【００３３】
ジチオカルバメート−金属錯体および少なくとも１つの血液タンパク質から成る、またはそれらを含む粒子形態は、乾燥形態において、特に凍結乾燥（lyophilized）（凍結乾燥（freeze-dried））形態で、または噴霧乾燥形態で提供することができる。凍結乾燥製剤は、典型的には凍結保護剤、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤、等張性調整剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、還元剤、可溶化剤、金属イオンから選択される少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。噴霧乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤、等張性調整剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、還元剤、可溶化剤、金属イオンから選択される少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含んでもよい。特に、凍結乾燥は安定性をさらに改善し、したがって、貯蔵および物流を容易にする。凍結乾燥粒状成形は特に、粉末、カプセル、錠剤、軟膏、ローションまたはクリームに使用され得、同様に、再懸濁による、注射液、注入液および他の液体医薬形態の調製のために使用され得る。
【００３４】
緩衝剤は、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、トリエタノールアミン、アルギニン、リン酸塩緩衝剤を含むことができる。
【００３５】
界面活性剤は例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７であってもよい。
【００３６】
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、グルタミン酸、アスパラギン酸を含むことができる。
【００３７】
等張性調整剤は例えば、マンニトール、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、ソルビトール、デキストロースから選択され得る。
【００３８】
ｐＨ調整剤としては、例えば、酢酸、塩酸を用いることができる。
【００３９】
安定剤は、アルギニン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、アスパラギン酸、脂肪酸、ホスファチジルコリン、エタノールアミン、アセチルトリプトファネート、ＰＥＧ、ＰＶＰ（１０、２４、４０）、ソルビトール、グルコース、プロピレングリコール、エチレングリコールを含むことができる。
【００４０】
抗酸化剤としては、グリセリン、アスコルビン酸、システインＨＣｌ、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、グルタチオン、αトコフェロール、二硫化ナトリウムが挙げられる。
【００４１】
還元剤は、例えばチオールである。
【００４２】
可溶化剤は、例えばアラニンであってもよい。
【００４３】
金属イオンには、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋が含まれる場合がある。
【００４４】
防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メタクレゾールおよびパラベンを含み得る。
【００４５】
凍結保護剤（cryoprotectants）（または凍結保護剤（lyoprotectants））は単糖類、二糖類、アミノ酸、多糖類高分子、および凍結保護性を有する他の物質、ならびにそれらの誘導体を含んでいてもよい。特に、凍結保護剤（または凍結保護剤）は、マンニトール、トレハロース、サッカロース、アルブミン、ラクトース、デキストロース、スクロース、グルコース、マルトース、イノシトール、ラフィノース、イヌリン、マルトデキストリン、多糖類、ヘパリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、グリセロール、イノシトール、ソルビトール、メルカプタン、ポリエチレングリコール、アドニトール、アミノ酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ）、ドデシル硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ Ｋ１５）、デキストランから選択されるそれらの誘導体を含み得る。
【００４６】
結合剤としては、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、アルファ化でんぷん、ラクトース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムを含み得る。
【００４７】
流動促進剤は、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、デンプン、タルクを含み得る。
【００４８】
滑沢剤は、ケイ酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシルステアレート、ポリソルベート、脂肪酸硫酸ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル、タルクを含み得る。
【００４９】
希釈剤は、ラクトース、微結晶セルロース、マンニトール、炭酸水素ナトリウムを含み得る。
【００５０】
崩壊剤は、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム、変性デンプングリコール酸ナトリウムを含み得る。
【００５１】
コーティングポリマーとしては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等のセルロースエーテル；メタクリル酸コポリマー、メタクリレートアミノエステルコポリマーおよび他の種類メタクリレートエステルコポリマー等のアクリルポリマー；酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸ビニルフタレート、セラック、酢酸セルローストリメリテートを含む。
【００５２】
ナノ粒子形態（任意で、薬学的に許容し得る賦形剤と共に）を、任意の適切な方式で、特に非経口的に、経口的に、または局所的に、治療を必要とする対象に投与してもよい。
【００５３】
特に明記しない限り、パーセンテージはｗ／ｖ％である。
【００５４】
本発明は、ジチオカルバメート−銅錯体および少なくとも１つの血液タンパク質のナノ粒子へのインサイチュ自己集合のプロセスを記載する。当該プロセスは、以下の工程を含む方法によって達成される：
（ａ）水性溶媒（例えば、水または水系バッファ）中において、少なくとも１つの血液タンパク質を０．０１％（ｗ／ｖ）〜飽和濃度の溶液（好ましくは０．１％〜１０％（ｗ／ｖ））の濃度に溶解する工程、または患者の全血または血漿または血清を提供する工程；
（ｂ）水性溶媒（例えば、水または水系バッファ）に溶解した少なくとも１種のジチオカルバメートを、１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの範囲の濃度に添加する工程；
（ｃ）１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの金属塩濃度を有するように、水性溶媒（例えば、水または水系バッファ）中に金属塩溶液を添加する工程；
上記工程について、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順番で行ってもよいし、工程（ａ）、（ｃ）、（ｂ）の順番で行ってもよいし、工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行ってもよい。
【００５５】
好ましくは、振盪またはボルテックスを伴う少なくとも１０秒間の遅延が個々の工程の間に生じる。
【００５６】
この単一管反応はタンパク質−ジチオカルバメート−銅ナノ粒子形態の迅速で自発的な自己集合をもたらし、ナノ粒子の分散液を形成する。
【００５７】
工程（ａ）において、血液タンパク質、好ましくは、アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン、またはそれらの混合物のような血清タンパク質；または血清、血漿もしくは全血が使用され得る。最終製品を受ける患者から採取した血清または血漿または全血を使用することが有利であり得る。
【００５８】
工程（ａ）は、好ましくは１０〜４５℃、好ましくは２０〜３８℃の範囲の温度、および／または５〜８、最も好ましくは６．８の範囲のｐＨで行われる。
【００５９】
工程（ｂ）において、ジチオカルバメートは、好ましくは中性化合物または塩の形態である。
【００６０】
好ましい実施形態では、金属イオン：ジチオカルバメートイオンのモル比は１：２である。
【００６１】
水性溶媒の使用はさらなる精製の必要なしに、生物学的に適合性であるナノ粒子形態をもたらす。ジチオカルバメートを溶解するのに好ましい有機溶媒が使用される場合、得られるナノ粒子はコア−シェル構造（分子集合体構造ではない）を形成し、除去するのが困難な残留量の有機溶媒を含む。これは、ナノ粒子の生体適合性、安全性および生体利用可能性を低下させる。さらに、有機溶媒の使用は血液タンパク質の変性および修飾をもたらすことが知られており、これは、修飾されたタンパク質構造、増加した免疫原性をもたらし得、そして修飾、変性または部分的変性によって引き起こされる血液タンパク質構造の変化に起因する強力な望ましくない免疫系反応をもたらし得る。従って、本発明の枠組み内で、驚くべきことに、調製方法が水性溶媒中で実施される場合、ジチオカルバメートは水中で低い溶解度を有するが、分子集合体構造を有するナノ粒子形態が形成されることが見出された。水性溶媒の使用は、有機溶媒の使用に起因するのであろう欠点を除去する。
【００６２】
本発明のナノ粒子は生体利用可能なナノ粒子の分散液を形成し、このような治療を必要とする患者に投与することができる。ナノ粒子の分散液は特に、化学療法、放射線療法、免疫療法、腫瘍治療照射野を含む癌治療や、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、結腸直腸癌、乳癌、膵癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、結腸の腺癌およびリンパ節転移または肝転移、固形癌および血液癌の脳転移、多発性骨髄腫、膠芽腫等の固形腫瘍の治療等の温熱療法に使用することができる。好ましくは、治療すべき癌は固形腫瘍、多発性骨髄腫、膠芽腫および膵癌の脳転移から選択される。ナノ粒子の分散液は例えば、陽電子放出断層撮影法、単一光子放出断層撮影法等による腫瘍可視化等の診断にも使用することができる。
【００６３】
本発明に従って反応が行われる場合、タンパク質−ジチオカルバメート−銅ナノ粒子の得られた分散液は、抽出、分離、製品洗浄、濃度増強等の追加の化学的または物理的処理を必要とせず、処置された被験体（ヒトまたは動物）への直接的な非経口、経口または局所適用を可能にすることに留意することが重要である。
【００６４】
本発明の治療用の粒子形態は好ましくは、注射投与１時間後の血液中のＣｕＥＴの濃度が少なくとも１ｎｇ／Ｌになる、または、注入投与中の血液中のＣｕＥＴの濃度が少なくとも５ｎｇ／Ｌになるように、処置対象に投与してもよい。
【００６５】
さらに、本発明の反応は、薬学的に許容し得る成分の組み合わせを用いて、患者の病床で直接的に、または病院の薬局で実施することができる。例えば、ヒト血清アルブミン溶液、ジエチルジチオカルバメートおよびＣｕＣｌ２は、医薬グレードで一般に市販されている。このような処置は、高価な化学反応器、追加の装置での処理を必要とせず、規制の承認を単純化することができる。さらに、ナノ粒子の分散液の貯蔵に関連するロジスティックな問題の一部を著しく制限し、新鮮な薬物を高い再現性で調製し、直ちに適用することができる。
【００６６】
本発明はまた、組み立てられたナノ粒子のサイズの単純な変更を可能にする。ジチオカルバメート−金属（特に銅）錯体とタンパク質との間の比率を変化させることによって、高いタンパク質濃度がより小さい粒子をもたらすという規則に従って、形成されたナノ粒子は異なるサイズとなる。ナノ粒子のサイズはインビボでのその挙動、特に生体分布（例えば、血液脳関門浸透）および動態の重要な決定因子であるので、最適な反応条件を決定して、最適な薬理学的特性を有するナノ粒子を生成することができる。製造されるナノ粒子のサイズは、反応に入るジチオカルバメートの置換基Ｒ１、Ｒ２にも依存する。例えば、アルブミンを有するジメチルジチオカルバメートは、アルブミンを有するピロリジンジチオカルバメートと比較して、２つの反応の他の全ての条件が同一であるにもかかわらず、より大きな粒子を形成する。このことは、より長いＲ１、Ｒ２基を有すると、より小さな粒子の形成を示唆する。
【００６７】
調製されたナノ粒子の分散液は比較的安定であり、４℃で数ヶ月間、有意な分解または沈殿なしに保存することができる。タンパク質−ジチオカルバメート−金属の形成されたナノ粒子は安定性、貯蔵および物流をさらに改善するために、乾燥または凍結乾燥によってさらに処理することができる。乾燥ナノ粒子は、滅菌水ベースのバッファに繰り返し溶解され、治療に使用され得る。タンパク質−ジチオカルバメート−金属ナノ粒子特性のこの重要な側面は、大規模または小規模の工業生産の両方に、貯蔵および物流に対して特に価値がある。
【００６８】
免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有混合物はナノ粒子の製造に使用し得るので、得られるナノ粒子は、特定の腫瘍または組織抗原に対する抗体（または抗体断片）を含み得る。このアプローチは腫瘍／組織へのナノ粒子の特異的標的化を可能にし、より良好な抗癌効果および全身毒性の減少を生じる。
【００６９】
この粒子の一般的な適用性を示すために、以下の実施例は、アルブミン、トランスフェリンおよび免疫グロブリンをそれぞれ単独でまたはこれらの組み合わせを含む血液タンパク質を含むジチオカルバメート−金属錯体ナノ粒子の調製および特徴付けを示し、ナノ粒子の分散液により得られる一般的な製剤、癌標的化および腫瘍可視化能力を示した。実施例は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
［図面の簡単な説明］
［図１］図１は、実施例１で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約２０〜１００ｎｍ；最大画分：３０〜４０ｎｍを形成する。
【００７０】
［図２］図２は、およその垂直寸法を有する粒子の代表的な原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。実施例１に従って調製した約２０〜４０ｎｍの範囲。
【００７１】
［図３］図３は、ナノ粒子（約３０ｎｍ）の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す；結晶面の表示なく、電子回折なく、実施例１に従って調製された分子集合体（ナノ粒子）の全体的な特徴を示す。
【００７２】
［図４］図４は、ｃｃａ  ６０ｎｍ分子集合体のＨＡＡＤＦ／ＥＤＳ画像を示す。実施例１に従って調製したナノ集合体中に、主要元素（Ｃｕ、Ｎ、Ｓ）が明確に埋め込まれている。
【００７３】
［図５］図５は、ビス（ジエチルジチオカルバメート）銅錯体（ＣｕＥＴ）のＸバンド電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを示す（ａ−ｂは東京化学工業（株）から入手した純粋なＣｕＥＴ粉末の共鳴であり；ｃ−ｄは実施例１に従って調製したＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子の共鳴である）。２．０４４の推定ｇａｖｇ−ｖａｌｕｅと全共鳴プロファイルから、ナノ粒子生成に際して銅酸化状態の修飾はなく、Ｃｕ八面体場の実質的な変質は生じないことを明確に示している。
【００７４】
［図６］図６は、０．０１％アルブミン（実施例２）または５％アルブミン（実施例３）の存在下での化学反応中に形成されたナノ粒子の多分散系のＤＬＳスペクトル（上側画像）および代表的なＴＥＭ画像（下側２つの画像）を示す。この分析は、より高いアルブミン濃度が化学反応に入る場合に、より小さい粒子に向かう顕著なシフトを示す。
【００７５】
［図７］図７は、ジチオカルバメート（ジメチルジチオカルバメート−ＤＭＣ対ピロリジンジチオカルバメート−ＰＤＴ）の使用されるタイプに応じて、形成されたナノ粒子（実施例４、５）の異なるサイズを示す、形成されたナノ粒子のＤＬＳ粒度分布（上部画像）および代表的なＴＥＭ画像（下部２つの画像）を示す。
【００７６】
［図８］図８は、実施例７で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約１０〜４０ｎｍ；最大画分：１５〜３０ｎｍを形成する。
【００７７】
［図９］図９は、実施例８で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約１５〜１００ｎｍ；最大画分：２０〜４０ｎｍを形成する。
【００７８】
［図１０］図１０は、実施例９で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約５０〜８００ｎｍ；最大画分：６０〜２００ｎｍを形成する。
【００７９】
［図１１］図１１は、種々の濃度（１２５ｎＭ〜１０μＭ）の２４時間処理後の、実施例１に従って調製されたＣｕＥＴ−アルブミン（ＣｕＥＴ−ＨＳＡ）ナノ粒子毒性の２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ）−ベースの細胞生存度分析を示す。癌細胞株（ＤＵ−１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、正常細胞（ＲＰＥ−１、ＲＷＰＥ−１）と比較して高い感受性を示す。ＣｕＥＴ−ＨＳＡナノ粒子は、癌細胞株においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された純粋なＣｕＥＴ粉末と同様の効力を有するが、正常細胞によってより寛容される。
【００８０】
［図１２］図１２は、５ｍｇ/ｋｇＣｕＥＴの腹腔内へ１回適用後の、マウス血清中のＣｕＥＴ濃度に関する、飛行時間型質量分析計と連結した高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ）による分析を示す。ＣｕＥＴは、実施例１に従ってアルブミンナノ粒子として製剤化されたＣｕＥＴ、またはオリーブオイルに溶解した純粋なＣｕＥＴ粉末（東京化成工業（株）から入手した）として製剤化されたＣｕＥＴである。オリーブオイルは、マウス実験において腹腔内投与される非極性化合物用の標準製剤である。測定された濃度は、ナノ粒子製剤の場合、有意に高いＣｕＥＴ循環濃度を示す。
【００８１】
［図１３］図１３は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中の、コンピュータ断層撮影と複合陽電子放出断層撮影を組み合わせた画像化（ＰＥＴ／ＣＴ）によって視覚化された腫瘍（矢印によってマークされる）における６４Ｃｕ放射性同位元素の存在を示す。ＰＥＴシグナルは、ＭＳＡ−ジエチル−ジチオカルバメート−銅６４ナノ粒子（左）のナノ粒子の分散液およびヒトトランスフェリン−ジエチル−ジチオカルバメート−銅６４ナノ粒子（右）のナノ粒子の分散液を、それぞれ実施例１０および１１に従って調製した後、後眼窩注入の２２時間後に収集した。ＰＥＴシグナルは、複合体に包埋された６４ＣｕがＭＤＡ−ＭＢ−２３１皮下腫瘍塊内に蓄積されることを示す。ＧＩＴ陽性は、化合物が腸管から排泄されることを示す。
【００８２】
［図１４］図１４は実施例１に従ってナノ粒子として製剤されたＣｕＥＴ（１ｍｇ／ｍｌ）または非極性化合物の標準製剤であるオリーブオイルに溶解した純粋なＣｕＥＴ粉末（東京化成工業株式会社より取得）を、マウス実験にて腹腔内に適用した処置の後の、ＳＣＩＤマウスに皮下異種移植したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌腫瘍の成長を示す。ＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子のみが、腫瘍増殖に対して有意な効果を示す。
【００８３】
［図１５］図１５は、実施例１に従ってアルブミンナノ粒子として製剤化されたＣｕＥＴ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置したＳＣＩＤマウスに皮下異種移植したＡＭＯ−１腫瘍の増殖を示す。ナノ粒子治療は腫瘍増殖（上部画像、カリパス）を有意に減少させ、そしてこの治療された動物はアルブミンのみによって治療された対照マウスと比較して、延長された生存（下部画像、カプラン−マイヤー生存プロット）を示す。この動物は、５日間の処置＋２日間の休薬の処方で、１日１回、腹腔内適用により処置された。また、これらの実験は動物に１００回以上注射したときのＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子の非常に良好な耐容性を示す。
［実施例］
＜材料および方法＞
調製したナノ粒子の平均径およびサイズ分布を決定することを可能にする動的光散乱（ＤＬＳ）分析を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ器具（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕ．Ｋ．）によって、以下のパラメータ設定で行った：Ｖ＝４００ｕＬ、Ｔ＝２５℃、実行回数：１０、実行持続時間：１ｓ、測定回数：３、測定角度：１７３°後方散乱（ＮＩＢＳデフォルト）、セルタイプ：ＺＥＮ００４０。
【００８４】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を、１００ｋＶで動作するＬａＢ６型発光銃を有するＴＥＭ  ＪＥＯＬ  ２０１０器具で得た。ナノ粒子の結晶構造／非晶質性の分析は、制限視野電子回折（ＳＡＥＤ）分析で可能である。ナノ粒子の元素組成のＥＤＳ（エネルギー分散Ｘ線分光）マッピングのためのＳＴＥＭ／ＨＡＡＤＦ（走査透過型電子顕微鏡／高角度環状暗視野）分析を８０ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｔｉｔａｎ  Ｇ２  ＨＲＴＥＭ顕微鏡で行った。ＳＴＥＭ測定には、４個のシリコンドリフト検出器（Ｂｒｕｋｅｒ）を持つＳｕｐｅｒ‐Ｘシステムを用いた。これら全ての顕微鏡分析のために、ナノ粒子含有分散液の水滴を、炭素被覆銅グリッド上に堆積させ、室温でゆっくりと乾燥させた。
【００８５】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像は走査型トンネル顕微鏡Ｎｔｅｇｒａ（Ｎｔ−ＭＤＴ社）の半接触ＡＦＭモードにて撮影された。サンプルをＨａ−ＮＣチップでスキャンした。サンプル調製のために、ナノ粒子含有分散液１滴をマイカ支持体上に置き、室温で乾燥させた。
【００８６】
凍結したナノ粒子の分散液の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを、可変温度制御ＥＳ  １３０６０ＤＶＴ５器具を装備し、Ｘバンド周波数（９．１７ＧＨｚ）で動作するＪＥＯＬ  ＪＥＳ‐Ｘ‐３２０器具上で１４０Ｋにて記録した。高純度石英管を使用した（Ｓｕｐｒａｓｉｌ、Ｗｉｌｍａｄ、≦０．５ＯＤ）。他の実験パラメータは以下の通りである。：１００ＫＨｚ変調周波数、０．１ｍＷマイクロ波電力、０．０３ｓ時定数、８Ｇａｕｓｓ変調幅。
【００８７】
＜細胞株＞
細胞株を、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した適切な培地中で培養し；そして加湿された３７℃の５％ＣＯ２大気内で維持した。ＤＭＥＭ培地中で培養した株は、ＨＣＴ１１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣから入手）、ＤＵ１４５（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＥＣＡＣＣから入手）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）、Ｕ−２−ＯＳ（ＥＣＡＣＣ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ）、Ａ２５３（ＡＴＣＣ）、ＦａＤｕ（ＡＴＣＣ）、ｈ−ＴＥＲＴ−ＲＰＥ１（ＡＴＣＣ）であった。ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した細胞株は、ＡＭＯ−１（ＡＴＣＣ）、ＭＭ−１Ｓ（ＡＴＣＣ）、ＯＶＣＡＲ−３（ＮＣＩ６０）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ）、７８６−０（ＮＣＩ６０）であった。ＥＭＥＭ培地中で培養した細胞株は、Ｕ８７−ＭＧ（ＡＴＣＣ）、ＳｉＨＡ（ＡＴＣＣ）であった。細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ）を、ＭｃＣｏｙ培地中のＦ１２Ｋ培地、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ）中で培養した。ＲＷＰＥ−１（ＡＴＣＣ）細胞を、ウシ下垂体抽出物およびヒト組換え上皮成長因子（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したケラチノサイト無血清培地中で培養した。
【００８８】
＜細胞生存度試験＞
細胞生存度をＸＴＴテストによって測定した。１００００細胞を９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を示したように処理した。２４時間後、ＸＴＴアッセイを、製造業者の使用書（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ）に従って行った。ＸＴＴ溶液を培地に添加し、３０〜６０分間インキュベートし、次いで分光計（ＴＥＣＡＮ、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００ＰＲＯ）を用いて４７５ｎｍ波長で色素強度を測定した。結果は、３回の独立した実験からの平均値および標準偏差として示され、各々３回繰り返して行った。拡張データ２ｄに列挙した細胞株のパネルにわたるＬＤ５０（致死量）分析のために、細胞株を種々の投与（少なくとも５投与）で４８時間処理した。ＬＤ５０は、少なくとも２つの独立した実験からの生存曲線に基づいて、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算される。
【００８９】
＜ＣｕＥＴの薬物動態および／または組織分布のＨＰＬＣ／ＭＳ分析のためのサンプル調製＞
液体窒素凍結生物学的サンプル（脳組織）を、メスによって小片に切断した。サンプル（３０〜１００ｍｇ）を、サンプル対アセトンを１：１０の比率で、１００％アセトン中で均質化することによって直ちに処理した（血漿または血清については、比率は１：４であった）。均質化は、冷室（４℃）に置かれた卓上ホモジナイザー（Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ３０１）にて、２個のガラスボール（５ｍｍ）を有する２ｍｌのエッペンドルフチューブ中で１分間、３０Ｈｚで行った。次に、チューブを直ちに４℃、２０．０００Ｇ、２分で遠心分離した。上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに静かに移し替え、直ちに−８０℃フリーザー内に置いた小型表遠心分離機（ＢｉｏＳａｎ  ＦＶＬ−２４００Ｎ）を用いて３０分間遠心分離した。上清をガラスＨＰＬＣバイアルに迅速に移し替え、−８０℃で６時間以下維持した。ＨＰＬＣ分析の直前に、バイアルを予め冷却した（４℃）ＬＣサンプルラックに入れ、直ちに分析した。薬物動態分析からの血清サンプルを、均質化せずに、同様に処理した。分析されたＣｕＥＴの定量を可能にするために、検量線を作成した。次いで、標準を、上記のサンプルと同様に処理した。
【００９０】
＜銅−ジエチルジチオカルバメート錯体のＨＰＬＣ−ＭＳ検出＞
銅−ジエチルジチオカルバメート分析は、ＤｕｏＳｐｒａｙ  ＥＳＩを用いて、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００＋質量分析計を備えたＨＰＬＣクロマトグラフＴｈｅｒｍｏ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００からなるＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦシステムで行った。データはＣｕＥＴの分析のために、２つの親質量３５８．９および３６０．９を有する生産モードで取得した。クロマトグラフィー分離は、Ｃ１８吸着剤（ＩｎｔｅｌｌＭｅｄ、ｃａｔ．ｎｏ．ＩＭ＿３０１）で満たされた強力な金属キレート剤の分析のために特に設計されたＰＴＦＥカラムによって行った。分析は、アイソクラティッククロマトグラフィーを用いて、室温および流量１５００μＬ／分で行った。移動相は、ＨＰＬＣグレードのアセトン（Ｌａｃｈｎｅｒ）９９．９％、ＨＰＬＣ水（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）０．１％および０．０３％のＨＰＬＣギ酸（Ｓｉｇｍａ）からなる。取得した質量スペクトルをソフトウェアＰｅａｋＶｉｅｗ  １．２で評価した。０．１質量許容範囲の遷移８８．０と１１６．０（両親質量共通）の抽出したイオンクロマトグラムを２点の幅でＧａｕｓｓ平滑化した。
【００９１】
＜ＰＥＴ画像＞
腫瘍中の６４Ｃｕ放射性同位元素の存在を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有する重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける複合陽電子放出断層撮影とコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）を組み合わせた画像化によって可視化した。ＰＥＴシグナルはＭＳＡ−ジエチル−ジチオカルバメート−銅６４ナノ粒子の、ナノ粒子の分散液の、後眼窩注入の２２時間後に収集され、ヒトトランスフェリン−ジエチル−ジチオカルバメート−銅６４ナノ粒子のナノ粒子の分散液はそれぞれ、活性３３ＭＢｑおよび２９ＭＢｑに対応した。シグナルは、Ａｌｂｉｒａ  ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて記録した。
【００９２】
＜マウスのインビボ実験＞
ＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子の効果を直接試験するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡＭＯ１モデルを用いた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を注射して（５×１０６細胞を皮下移植した）、ＳＣＩＤマウス（Ａｎｌａｂ、ＣＺ）において腫瘍を増殖させた。同様に、ＡＭＯ−１異種移植片をＳＣＩＤマウスで増殖させた。各群は１０匹の動物からなり、各々２つの腫瘍が認められた。ＣｕＥＴは、実施例１２に従ってマウス血清アルブミン中のナノ粒子系として、または腹腔内に最終濃度１ｍｇ／ｍＬまで適用するマウス実験において、非極性化合物のための標準製剤であるオリーブオイルに溶解された純粋なＣｕＥＴ粉末（東京化学工業（株）から入手）として、製剤化された。オリーブオイル単独およびマウス血清アルブミン溶液をビヒクル対照群として使用した。全ての溶液を、５日間のオンおよび２日間のオフのスケジュールで腹腔内に適用し、ＣｕＥＴを、体重１ｋｇあたり１ｍｇの最終用量で適用した。動物実験のすべての側面が、実験動物の医療および実験使用のために認められた基準に合致した。
【００９３】
＜ＨＰＬＣ−ＭＳを用いたタンパク質同定＞
アセトン沈殿タンパク質をダイジェスションバッファ（８Ｍ尿素、０．５重炭酸アンモニウム、ｐＨ＝８）に、タンパク質濃度１〜５μｇ／μＬ)にて溶解した。サンプル中のタンパク質を、５６℃で３０分間、還元のためにジチオトレイトールで処理し、続いて暗所で室温で３０分間、アルキル化のためにヨードアセトアミドで処理した。サンプルを５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファで０．８Ｍ尿素に希釈し、タンパク質を、３７℃で一晩、トリプシン（１／６０）で分解した。ＴＦＡ（ｐＨ＝２）を添加することによって分解を停止させた。Ｃ１８カラムを用いてペプチドを精製した。サンプルは、ＥＡＳＹ−ｓｐｒａｙイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介してＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣｎａｎｏシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなるＬＣ−ＭＳを用いて測定した。精製したペプチドを５０ｃｍ  ＥＡＳＹ−ｓｐｒａｙカラム（内径７５μｍ、ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８、２μｍ粒子、孔径１００Å；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離した。各ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析について、約１μｇのペプチドを１６５分間の実験に使用した。最初の５分間、ペプチドを、６μＬ／分の流速で、ローディングバッファ（９８．９％／１％／０．１％、ｖ／ｖ／ｖ、水／アセトニトリル／ギ酸）中の２ｃｍトラップカラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  １００、内径１００μｍ、Ｃ１８、５μｍ粒子、１００Å孔径；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に装填した。その後、バルブを切り替え、ペプチドをバッファＡ（９９．９％／０．１％、ｖ／ｖ、水／ギ酸）に装填し、２％〜３５％のバッファＢ（９９．９％／０．１％、ｖ／ｖ、アセトニトリル／ギ酸）の直線(linear)１２０分勾配でＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙカラムから溶出し、続いて、流速３００ｎＬ／分で５分間９０％Ｂ洗浄した。ＥＡＳＹ−ｓｐｒａｙカラム温度を３５℃に保った。質量分析データは、上位１２個のデータ依存ＭＳ／ＭＳスキャン法を用いて取得した。フルスキャンＭＳスペクトルの目標値は３００〜１７００ｍ／ｚ温度範囲で１×１０６電荷であり、最大注入時間は３５ｍｓ、分解能はｍ／ｚ４００で１２０，０００であった。ＭＳ／ＭＳスキャンのために２ｍ／ｚ分離ウィンドウを使用した。前駆体イオンのフラグメンテーションは、３５の正規化衝突エネルギーでのＣＩＤ解離によって行った。ＭＳ／ＭＳスキャンを、１×１０４のイオン目標値および１００ｍｓの最大注入時間を有するイオントラップ中で行った。同一ペプチドの反復配列決定を避けるために、ダイナミックエクスクルージョンを７０秒に設定した。
【００９４】
＜タンパク質のデータ解析＞
質量分析生ファイルを、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア環境（バージョン１．５．６．５）およびその内蔵Ａｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを使用して分析した。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（ＵＰ０００００５６４０、２０１７年１月）からのヒトプロテオーム、および一般的な汚染物質データベースに対するＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータを検索することによって、タンパク質を同定した。システインのカルバミドメチル化をｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎとして設定した。メチオニンのＮ末端アセチル化および酸化をｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎとして設定した。トリプシンをプロテアーゼとして設定し、データベース検索において、最大２回の切断失敗を許容した。ペプチド同定は、７ｐｐｍまでの許容初期前駆体質量偏差（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）および０．５Ｄａの許容フラグメント質量偏差（衝突誘起解離、イオントラップ）で行った。「ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｕｎｓ」オプションは、２０秒の時間ウィンドウ内のａｌｉｇｎｅｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅでのサンプル間の識別をマッチングすることを可能にした。誤発見率はタンパク質および最小７アミノ長のペプチドの両方について０．０１に設定された。ＬＦＱは最小比カウント２で行われた。タンパク質存在度は特異的な「ｒａｚｏｒ」ペプチドの合計ペプチド強度に基づいて計算された。ｒｅｖｅｒｓｅデータベースへのタンパク質のマッチングおよび修飾ペプチドのみで同定されたタンパク質を抽出した。
【００９５】
〔実施例１〕
０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【００９６】
手順：
ＦＤＡの規格（ｐＨ＝６．９±０．５）に準拠した注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ水溶液を、注射のための滅菌水で０．２％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を０．２％ＨＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む０．２％ＨＳＡ溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【００９７】
結果：
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−ＨＳＡナノ粒子を含む。この反応から得られたナノ粒子を、ＤＬＳ、ＡＦＭ、ＴＥＭ、ＥＤＳおよびＥＰＲを含む種々の高度な分析ツールによってさらに分析し、それらの基本的な物理的および化学的特性を示した（図１〜５参照）。分析はナノ粒子が多分散系を形成することを示す。粒子のサイズはＤＬＳ分析によって示されるように、約２０〜１００ｎｍの範囲にわたり、２０〜４０ｎｍの最大画分を有した（図１）。ＡＦＭ画像（図２）およびＴＥＭ画像（図３）は、ＤＬＳサイズ分布の結果を裏付ける。さらに、ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像は、結晶面の兆候を示していない（および非晶質様パターンを有する電子回折がない）。このことは、ナノ粒子が分子集合体の特性を有することを裏付ける事実である。単一ナノ粒子のＥＤＳ化学マッピング（図４）は、銅ビス（ジエチルジチオカルバメート）構造の重要な元素（Ｃｕ、Ｎ、Ｓ）が分子集合体内に均一に分布していることを示している。Ｘ−バンドＥＰＲ分光法による比較分析（図５）は、純粋なビス（ジエチルジチオカルバメート）銅錯体（ＣｕＥＴ）とほぼ同じナノ粒子中に埋め込まれたＣｕＥＴのスペクトルを示す。推定されたｇａｖｇ−値と全共鳴プロファイルは、薬物のカプセル封入で銅酸化とスピン状態（ＣｕＩＩ、Ｓ＝１／２）の改質がなく、Ｃｕ八面体照射の実質的な改質が生じないことを明確に示している。得られた粒子はまた、溶液中で良好な安定性を示し、電気化学的インピーダンス分光法によって測定された低いゼータ電位（ζ）−３５，６ｍＶを示す。
【００９８】
ナノ粒子の分散液はまた、形質細胞腫（ＡＭＯ−１；ＬＤ５０＝６３ｎＭ）、膵臓腺癌（Ｃａｐａｎ−１；ＬＤ５０＝６４ｎＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ１ｓ；ＬＤ５０＝６９ｎＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ；ＬＤ５０＝７０ｎＭ）、卵巣腺癌（ＯＶＣＡＲ３；ＬＤ５０＝８３ｎＭ）、肺癌（Ａ５４９；ＬＤ５０＝９１ｎＭ）、結腸直腸癌（ＨＣＴ１１６；ＬＤ５０＝１１７ｎＭ）、唾液腺癌（Ａ２５３；ＬＤ５０＝２１４ｎＭ）、腎細胞腺癌（７８６−Ｏ；ＬＤ５０＝２３５ｎＭ）、骨肉腫（Ｕ２ＯＳ；ＬＤ５０＝２７１ｎＭ）、扁平上皮癌（ＦＡＤＵ；ＬＤ５０＝３３０ｎＭ、ＳｉＨＡ；ＬＤ５０＝７７７ｎＭ）、慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２；ＬＤ５０＝３１８ｎＭ）、乳腺癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；ＬＤ５０＝５１７ｎＭ）、神経膠芽腫（Ｕ８７−ＭＧ；ＬＤ５０＝６９６ｎＭ）、正常網膜上皮細胞（ｈＴＥＲＴ−ＰＲＥ１；ＬＤ５０＝１０００ｎＭ以上）および正常前立腺上皮細胞（ＲＷＰＥ；ＬＤ５０＝２０００ｎＭ以上）を含む初代（正常）細胞を含むヒト細胞株パネルでの細胞毒性試験を含む生物学的実験で試験された。ナノ粒子の毒性を、ＸＴＴに基づく細胞生存率アッセイで試験した。癌細胞株（ＤＵ−１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、正常細胞（ＲＰＥ−１、ＲＷＰＥ−１）と比較して高い感受性を示す。重要なことに、ＣｕＥＴ−ＨＳＡナノ粒子は癌細胞株においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された純粋なＣｕＥＴ粉末と同様の効力を有するが、正常細胞によってより寛容され、腫瘍細胞に対する一般的な優先毒性を示唆する（図１１参照）。
【００９９】
ナノ粒子の分散液も、４℃での長期保存安定性試験で試験した。リードアウトとして、細胞培養物中の活性を選択した。４℃で４週間保存したナノ粒子は、骨肉腫系統Ｕ２ＯＳ（２７１ｎＭと比較してＬＤ５０  ２８０ｎＭ）を用いたＸＴＴ細胞生存率試験において、新たに調製したナノ粒子と細胞毒性に関して同様の効力を示した。
【０１００】
ナノ粒子の分散液を、乾燥および続いての再溶解の可能性についても試験した。ナノ粒子を真空下で１６時間室温で乾燥させた。乾燥粉末を４℃で１週間保存し、次いで滅菌水と混合し、２４時間振盪機上で維持して、完全な再溶解を達成した。得られた再溶解ナノ粒子を、ＤＬＳおよび電気化学インピーダンス分光法によって分析した。測定された８２ｎｍの最確平均粒子径およびゼータ電位（ζ）−４０ｍＶは、乾燥および再溶解処理後のナノ粒子の化学的／物理的特性の最小の変化を示す。
【０１０１】
〔実施例２〕
０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１０２】
＜手順＞
ＦＤＡの規格（ｐＨ＝６．９±０．５）に準拠した注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ水溶液を、注射のための滅菌水で０．０１％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を０．０１％ＨＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む０．０１％ＨＳＡ溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１０３】
＜結果＞
得られた溶液は２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−ＨＳＡナノ粒子を含む。次いで、ナノ粒子をＤＬＳおよびＴＥＭによってさらに試験したところ、ナノ粒子の主要画分は約５０〜６０ｎｍであり、優位に、より大きな粒子の画分ではあるが、サイズは５００ｎｍを超えなかったことが示された（図６参照）。
【０１０４】
〔実施例３〕
５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１０５】
＜手順＞
ＦＤＡの規格（ｐＨ＝６．９±０．５）に準拠した注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ水溶液を、注射のための滅菌水で５％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、５％ＨＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む５％ＨＳＡ溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１０６】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−ＨＳＡナノ粒子を含む。この反応の結果、ＤＬＳおよびＴＥＭによって試験したところ、約２０〜３０ｎｍの粒子の主要画分を示したナノ粒子が生じ；一般に、サイズ分布は、ＨＳＡ濃度が増加することにつれて、より小さい粒子に向かって有意にシフトする（図６を参照）。
【０１０７】
〔実施例４〕
１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびジメチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１０８】
＜手順＞
ＦＤＡの規格（ｐＨ＝６．９±０．５）に準拠した注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ水溶液を、注射のための滅菌水で１％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩（ＤＭＣ）の滅菌溶液を、１％ＨＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＭＣを含む１％ＨＳＡ溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１０９】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジメチルジチオカルバメート−銅−ＨＳＡナノ粒子を含む。この反応の結果、ＤＬＳおよびＴＥＭによって試験したところ、粒子の主要画分が６０〜７０ｎｍの範囲を示したナノ粒子が生じた（図７を参照）。
【０１１０】
〔実施例５〕
１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびピロリジンジチオカルバメートおよび塩化銅塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１１１】
＜手順＞
ＦＤＡの規格（ｐＨ＝６．９±０．５）に準拠した注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ水溶液を、注射のための滅菌水で１％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したピロリジンジチオカルバミン酸塩（ＰＤＣ）の滅菌溶液を、１％ＨＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＰＤＣを含む１％ＨＳＡ溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１１２】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のピロリジンジチオカルバメート−銅−ＨＳＡナノ粒子を含む。この反応の結果、ＤＬＳおよびＴＥＭで試験したところ、主要画分が約１５ｎｍの粒子を示したナノ粒子が生じた（図７を参照）。明らかに、アルブミンを有するジメチルジチオカルバメートは、アルブミンを有するピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴ）と比較して、２つの反応の他の全ての条件が同一であるにもかかわらず、より大きな粒子を形成する。この事実は、より長いＲ１、Ｒ２基を有すると、より小さい粒子が形成されることを反映する。
【０１１３】
〔実施例６〕
１％ヒト血清トランスフェリンおよびジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩のナノ粒子の分散液の調製。
【０１１４】
＜手順＞
注射可能である１％（ｗ／ｖ）ヒト血清トランスフェリン水溶液を、注射のための滅菌水中に調製する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、１％トランスフェリンに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む１％トランスフェリン溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１１５】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−トランスフェリンナノ粒子を含む。この反応は、ＤＬＳによって試験したところ、最確平均径が約６０ｎｍを示したナノ粒子を生じた。得られた粒子は、電気化学的インピーダンス分光法によって測定された低いゼータ電位（ζ）−２１，５  ｍＶを示し、溶液中での良好な安定性を示している。
【０１１６】
〔実施例７〕
１％ヒト血清免疫グロブリン（ＩｇＧ）およびジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩のナノ粒子の分散液の調製。
【０１１７】
＜手順＞
注射可能である１％（ｗ／ｖ）免疫グロブリン水溶液（ヒトガンマグロブリン画分）を、注射のための滅菌水中に調製する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、１％トランスフェリンに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む１％免疫グロブリン溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１１８】
＜結果＞
得られた溶液は、約２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−免疫グロブリンナノ粒子を含む。この反応は、ＤＬＳによって試験したところ、約２０ｎｍの最確平均径が約２０ｎｍを示したナノ粒子を生じた（図８参照）。得られた粒子は電気化学的インピーダンス分光法によって測定したところ、ゼータ電位（ζ）−１，３９ｍＶを示し、溶液中での安定性が比較的低いことを示している。
【０１１９】
〔実施例８〕
１％ヒト血清トランスフェリンおよび１％ヒト血清アルブミンならびにジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩の混合物からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１２０】
＜手順＞
注射可能である１％（ｗ／ｖ）ヒト血清トランスフェリン水溶液を、注射可能である１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ水溶液と混合する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、タンパク質の混合物に最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含むタンパク質溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１２１】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−トランスフェリン／ＨＳＡナノ粒子を含む。この反応は、ＤＬＳによって試験したところ、最確平均径が約３０ｎｍを示したナノ粒子を生じた（図９参照）。
【０１２２】
〔実施例９〕
１％ヒト血清アルブミンおよび１％（ｗ／ｖ）免疫グロブリン溶液ならびにジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩の混合物からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１２３】
＜実験設定＞
注射可能である１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン水溶液を、注射可能である１％（ｗ／ｖ）免疫グロブリン水溶液と混合する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、タンパク質の混合物に最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含むタンパク質溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１２４】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−アルブミン／免疫グロブリンナノ粒子を含む。この反応は、ＤＬＳによって試験したところ最確平均径が約１２０ｎｍを示したナノ粒子を生じた（図１０を参照）。
【０１２５】
〔実施例１０〕
腫瘍イメージングおよび生体内分布のための、０．２％マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）およびジエチルジチオカルバメートおよび放射性酢酸銅（６４Ｃｕ）塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１２６】
＜実験設定＞
濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、１％ＭＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む１％ＭＳＡ水溶液に、滅菌銅（６４Ｃｕ）（ｉｉ）アセテートおよび非活性塩化銅（水中濃度１００ｍＭ）の混合物を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１２７】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍｌ）のジエチルジチオカルバメート−銅（６４Ｃｕ）−ＭＳＡナノ粒子を含む。この反応から得られたナノ粒子を、皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片を有するマウスへの後眼窩注入（活動３３ＭＢｑに対応する投与１ｍｇ／ｋｇ）によってインビボでさらに適用し、続いて、この適用後の複数の時点で、Ａｌｂｉｒａ  ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用して、ＰＥＴ分析した。測定されたＰＥＴシグナルは、腫瘍塊内の蓄積を示す（図１３）。
【０１２８】
〔実施例１１〕
腫瘍イメージングおよび生体内分布のための、０．２％ヒト血清トランスフェリン（ＨＳＴ）およびジエチルジチオカルバメートおよび放射性酢酸銅（６４Ｃｕ）塩からのナノ粒子の分散液の調製。
【０１２９】
＜実験設定＞
濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、１％ＨＳＴに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む１％ＨＳＴ溶液に、滅菌銅（６４Ｃｕ）（ｉｉ）アセテートおよび非活性塩化銅（水中濃度１００ｍＭ）の混合物を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１３０】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍｌ）のジエチルジチオカルバメート−銅（６４Ｃｕ）−ＨＳＴナノ粒子を含む。この反応から得られたナノ粒子を、皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片を有するマウスへの後眼窩注入（活性２９ＭＢｑに対応する投与１ｍｇ／ｋｇ）によってインビボでさらに適用し、続いて、この適用後の複数の時点で、Ａｌｂｉｒａ  ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用して、ＰＥＴ分析した。ＰＥＴシグナルは、腫瘍塊内の蓄積を示す（図１３）。
【０１３１】
〔実施例１２〕
０．２％マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）およびジエチルジチオカルバメートおよび塩化銅塩のナノ粒子の分散液の調製。
【０１３２】
＜実験設定＞
注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＭＳＡ水溶液（ｐＨ＝６．９±０．５）を、注射のための滅菌水で０．２％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度２８０ｍＭの、水に溶解したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、０．２％ＭＳＡに最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭのＤＴＣを含む０．２％ＭＳＡ溶液に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１３３】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−ＭＳＡナノ粒子を含む。この反応から得られたナノ粒子を、ＨＰＬＣ／ＭＳによるＣｕＥＴの血清薬物動態を含む種々のマウスのインビボ実験によってさらに分析した（図１２を参照）。動物を、５ｍｇ／ｋｇのＣｕＥＴに相当する濃度のナノ粒子で腹腔内処理した。投与後１および３時間に血清を採取した。対照として、オリーブオイル中に分散させた５ｍｇ／ｋｇのＣｕＥＴを使用した。抗腫瘍活性については、ナノ粒子を１ｍｇ／ｋｇのＣｕＥＴに対応する濃度で投与した（図１４〜１５および方法を参照）。ＣｕＥＴ濃度もまた、脳組織におけるＨＰＬＣ／ＭＳによって分析した（方法を参照）。動物を、１ｍｇ／ｋｇのＣｕＥＴに相当する濃度のナノ粒子で腹腔内処理した。動物を、１ｍｇ／ｋｇのＣｕＥＴに相当する濃度のナノ粒子で腹腔内処理した。腹腔内投与の１時間後、脳のＣｕＥＴレベルは血中レベルと同様であり、約３ｎｇ／ｍｌに達した。これは、ａｓｘ  ＭＳＡナノ粒子に製剤化されたＣｕＥＴが、血液脳関門を通って非常に良好に浸透することを示す。
【０１３４】
〔実施例１３〕
０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および塩化銅塩およびジエチルジチオカルバメートからのナノ粒子の分散液の調製。
【０１３５】
＜実験設定＞
注射可能である２０％（ｗ／ｖ）ＭＳＡ水溶液（ｐＨ＝６．９±０．５）を、注射のための滅菌水で０．２％（ｗ／ｖ）に希釈する。濃度１Ｍの、水に溶解した滅菌塩化銅（ｉｉ）の滅菌溶液を、０．２％ＨＳＡに最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。２．８ｍＭ塩化銅（ｉｉ）を含む０．２％ＨＳＡ溶液に、滅菌ジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（水中濃度２８０ｍＭ）を最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。
【０１３６】
＜結果＞
得られた溶液は、２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍＬ）のジエチルジチオカルバメート−銅−ＨＳＡナノ粒子を含む。
【０１３７】
〔実施例１４〕
塩化銅塩およびジエチルジチオカルバメートとナノ粒子を形成可能な血漿タンパク質のプロテオミック同定。
【０１３８】
＜実験設定＞
健常ボランティアからのヘパリン血漿を、超遠心分離（４℃で３時間２０００００ｇ）によって予備浄化して、血漿中の天然に存在する全ての沈殿物および大きな複合体を除去する。濃度２８０ｍＭの水に可溶化したジエチルジチオカルバメートナトリウム塩（ＤＴＣ）の滅菌溶液を、予備浄化した血漿に最終濃度５．６ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。５．６ｍＭＤＴＣを含む予備洗浄した血漿に、滅菌塩化銅（ｉｉ）（水中濃度１Ｍ）を最終濃度２．８ｍＭまで添加し、続いて短時間撹拌する。ナノ粒子溶液を、４５０ｎｍポアフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濾過して、全ての大きな粒子を除去する。濾過した溶液を超遠心分離（４℃で３時間２０００００ｇ）して、ナノ粒子を単離する。ナノ粒子を含むペレットを洗浄し、生理食塩水に再懸濁して、潜在的な汚染物質を除去し、再び超遠心分離する（４℃で３時間２０００００ｇ）。ナノ粒子を含むペレットを８０％アセトンに溶解させて、タンパク質を沈殿させ、単離する。タンパク質は、ＨＰＬＣ−ＭＳに基づくプロテオミック同定のため、さらに使用される（確認されたタンパク質は、多くの血液タンパク質が本発明のナノ粒子形態を形成可能なことを示す）。
【０１３９】
＜結果＞
得られた溶液は、ＨＰＬＣ−ＭＳプロテオミクスにより、さらに同定された種々の血漿タンパク質を有するジエチルジチオカルバメート−銅ナノ粒子２．８ｍＭ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む。以下のタンパク質が同定された：フィブリノーゲンベータ鎖；フィブリノーゲンガンマ鎖；アルファ−２−マクログロブリン；フィブリノーゲンα鎖；Ｉｇ  ｍｕ鎖Ｃ領域；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ；Ｉｇ  ｍｕ重鎖ｄｉｓｅａｓｅタンパク質；Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域；血清アルブミン；ＣＤ５抗原様；クラステリン；Ｉｇガンマ−１鎖Ｃ領域；アポリポタンパク質Ｂ−１００；アポリポタンパク質Ｂ−４８；アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ；Ｉｇアルファ−１鎖Ｃ領域；フィブロネクチン；アナステリン；Ｕｇｌ−Ｙ１；Ｕｇｌ−Ｙ２；Ｕｇｌ−Ｙ３；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド５；Ｉｇラムダ−１鎖Ｃ領域；Ｃ４Ｂ結合タンパク質アルファ鎖；アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ；切断アポリポタンパク質Ｃ−１；補体Ｃ３；補体Ｃ３−ベータ鎖；補体Ｃ３−ベータ−ｃ；補体Ｃ３アルファ鎖；Ｃ３ａアナフィラトキシン；アシル化刺激タンパク質；補体Ｃ３ｂアルファ鎖；補体Ｃ３ｃアルファ鎖フラグメント１；補体Ｃ３ｄｇフラグメント；補体Ｃ３ｄフラグメント；補体Ｃ３ｆフラグメント；補体Ｃ３ｃアルファ鎖フラグメント２；未同定タンパク質Ｃ１ｏｒｆ１７７；補体Ｃ１ｒサブ成分；補体Ｃ１ｒサブ成分重鎖；補体Ｃ１ｒサブ成分軽鎖；補体Ｃ１ｓサブ成分；補体Ｃ１ｓサブ成分重鎖；補体Ｃ１ｓサブ成分軽鎖；インター−アルファ−トリプシンインヒビターＨ４；７０ｋＤａインター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４；３５ｋＤａインター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４；ビトロネクチン；ビトロネクチンＶ６５サブユニット；ビトロネクチンＶ１０サブユニット；ソマトメジン−Ｂ；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ；プロアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ；補体Ｃ１ｑサブ成分サブユニットＢ；免疫グロブリンＪ鎖；補体因子Ｈ；アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ；プロアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ；切断アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ；Ｉｇ  ガンマ−３鎖Ｃ領域；Ｉｇ  ガンマ−４鎖Ｃ領域；補体Ｃ１ｑサブ成分サブユニットＡ；ハプトグロビン関連タンパク質；アポリポタンパク質Ｅ；ハプトグロビン；ハプログロビンアルファ鎖；ハプトグロビンベータ鎖；補体Ｃ４−Ａ；補体Ｃ４ベータ鎖；補体Ｃ４−Ａアルファ鎖；Ｃ４ａアナフィラトキシン；Ｃ４ｂ−Ａ；Ｃ４ｄ−Ａ；補体Ｃ４ガンマ鎖；補体Ｃ４−Ｂ；補体Ｃ４ベータ鎖；補体Ｃ４−Ｂアルファ鎖；Ｃ４ａアナフィラトキシン；Ｃ４ｂ−Ｂ；Ｃ４ｄ−Ｂ；補体Ｃ４ガンマ鎖；トランスサイレチン；ヘモグロビンサブユニットベータ；ＬＶＶ−ヘモルフィン−７；スピノルフィン；ガレクチン−３結合タンパク質；フィコリンー３；Ｉｇガンマ−２鎖Ｃ領域；プラスミノーゲン；プラスミン重鎖Ａ；活性化ペプチド；アンジオスタチン；プラスミン重鎖Ａ短鎖型；プラスミン軽鎖Ｂ；補体Ｃ１ｑサブ成分サブユニットＣ；ヒスチジン−リッチ糖タンパク質；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＣＡＭ；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域２３；Ｉｇカッパ重鎖Ｖ−ＩＶ領域；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＢＵＴ；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＫＯ��；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＥＡ；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＲＯ；Ｉｇアルファ−２鎖Ｃ領域；Ｉｇラムダ−３鎖Ｃ領域；Ｉｇラムダ−２鎖Ｃ領域；Ｉｇラムダ−６鎖Ｃ領域；Ｉｇラムダ−７鎖Ｃ領域；Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＶＧ；アポリポタンパク質Ｄ；アポリポタンパク質（ａ）；ゲルソリン；インターアルファートリプシンインヒビター重鎖Ｈ１；プロトロンビン；活性化ペプチドフラグメント１；活性化ペプチドフラグメント２；トロンビン軽鎖；トロンビン重鎖；セルコプラスミン；ビタミンＫ−依存タンパク質Ｓ；Ｉｇ  ラムダ鎖Ｖ−Ｉ領域ＨＡ；Ｉｇ  ラムダ鎖Ｖ−Ｉ領域ＶＯＲ；補体Ｃ５；補体Ｃ５ベータ鎖；補体Ｃ５アルファ鎖；Ｃ５ａアナフィラトキシン；補体Ｃ５ａアルファ鎖；Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＰＯＭ；セロトランスフェリン；β−２−糖タンパク質１；インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２；一過性受容器電位チャネルサブファミリーＭメンバー６；補体成分Ｃ８アルファ鎖；ヘモグロビンサブユニットアルファ；Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域Ｂ６；キニノーゲン−１；キニノーゲン−１重鎖；Ｔ−キニン；ブラジキニン；リシル−ブラジキニン；キニノーゲン−１軽鎖；低分子量成長促進因子；Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩ領域ＦＲ；補体成分Ｃ８ベータ鎖；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩ領域ＮＥＷＭ；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩ領域ＡＲＨ−７７；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩ領域ＷＡＨ；Ｃ４ｂ−結合タンパク質ベータ鎖；補体因子Ｂ；補体因子ＢＢａ断片；補体因子ＢＢｂフラグメント；アルファ−１−アンチトリプシン；ＡＡＴ由来の短鎖ペプチド；補体因子Ｈ関連タンパク質１；補体因子Ｈ関連タンパク質２；アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質Ａ；アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質Ｂ；アポリポタンパク質Ｍ；アポリポタンパク質Ｌ１；Ｉｇラムダ鎖Ｖ−Ｉ領域ＮＥＷＭ；Ｉｇラムダ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＬＯＩ；凝固因子Ｖ；凝固因子Ｖ重鎖；凝固因子Ｖ軽鎖；ＩｇＧＦｃ−結合タンパク質；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１重鎖；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１軽鎖；Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ；血漿カリクレイン；血漿カリクレイン重鎖；血漿カリクレイン軽鎖；血清パラオキソナーゼ／アリルエステラーゼ１；タンパク質ＡＭＢＰ；アルファ−１−マイクログロブリン；インター−アルファ−トリプシンインヒビター軽鎖；トリプスタチン；Ｉｇラムダ鎖Ｖ領域４Ａ；ヘモペキシン；フィコリン−２；アルファ−１−酸糖タンパク質２；アルファ−１−酸糖タンパク質１；補体成分Ｃ８ガンマ鎖；フィブリン−１；細胞外マトリックスタンパク質１；凝固因子ＸＩＩ；凝固因子ＸＩＩａ重鎖；ベータ−因子ＸＩＩａパート１；凝固因子ＸＩＩａ軽鎖；カリスタチン；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２Ａ鎖；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２Ｂ鎖；フォン・ヴィレブランド因子；フォン・ヴィレブランドアンチジン２；ヘパリン補因子２；コレステリルエステル転移タンパク質、ＳＵＮドメイン含有タンパク質３；Ｉｇデルタ鎖Ｃ領域；補体成分Ｃ６；ホスファチジルイノシトール−グリカン特異的ホスホリパーゼＤ；アポリポタンパク質Ｆ；血清アミロイドＡ−２タ��パク質；血清アミロイドＡ−１タンパク質；アミロイドタンパク質Ａ；血清アミロイドタンパク質Ａ（２−１０４）；血清アミロイドタンパク質Ａ（３−１０４）；血清アミロイドタンパク質Ａ（２−１０３）；血清アミロイドタンパク質Ａ（２−１０２）；血清アミロイドタンパク質Ａ（４−１０１）；２−ヒドロキシアシルスフィンゴシン１−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ；ビタミンＤ結合タンパク質；アンギオテンシノーゲン；アンギオテンシン−１；アンギオテンシン−２；アンギオテンシン−３；アンギオテンシン−４；アンギオテンシン１−９；アンギオテンシン１−７；アンギオテンシン１−５；アンギオテンシン１−４；ケラチン、Ｉ型細胞骨格１０；血清アミロイドＡ−４タンパク質；Ｉｇ重鎖Ｖ−ＩＩ領域ＭＣＥ；ケラチン、Ｉ型細胞骨格９；Ｉｇ重鎖Ｖ−Ｉ領域ＨＧ３；Ｉｇ重鎖Ｖ−Ｉ領域ＥＵ；ポリコームタンパク質ＳＵＺ１２；アファミン；補体成分Ｃ９；補体成分Ｃ９ａ；補体成分Ｃ９ｂ；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格１；補体成分Ｃ７；凝固因子ＸＩ；凝固因子ＸＩａ重鎖；凝固因子ＸＩａ軽鎖；アルファ−２−アンチプラスミン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；マトリックスグリアタンパク質；ヘモグロビンサブユニットデルタ；Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ２；Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ３；カルボキシペプチダーゼＮ触媒鎖；推定上のヒストン−リジンＮ−メチルトランスフェラーゼＰＲＤＭ６；ＵＢＡ様ドメイン含有タンパク質２；液胞融合タンパク質ＭＯＮ１ホモログＡ；Ｉｇカッパ鎖Ｖ−Ｉ領域ＨＫ１０２；凝固因子ＸＩＩＩＡ鎖；高分子免疫グロブリン受容体；分泌成分；アクチン、細胞質１；アクチン、細胞質１、Ｎ末端修飾された；アクチン、細胞質２；アクチン、細胞質２、Ｎ−末端修飾された；Ｉｇ重鎖Ｖ−Ｉ領域Ｖ３５；インヒビンベータＣ鎖；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＶ；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１重鎖；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１軽鎖；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格２表皮；レチノール結合タンパク質４；血漿レチノール結合タンパク質（１−１８２）；血漿レチノール結合タンパク質（１−１８１）；血漿レチノール結合タンパク質（１−１７９）；血漿レチノール結合タンパク質（１−１７６）；血漿プロテアーゼＣ１インヒビター；ルミカン；ＷＤリピート含有タンパク質２０；Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｇ様レクチン１６；アルファ−１Ｂ−糖タンパク質；ビンクリン；クロモドメイン−ヘリケース−ＤＮＡ結合タンパク質７；未同定タンパク質Ｃ１７ｏｒｆ１０２；トランスロケーションタンパク質ＳＥＣ６２；Ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ６；ベータ−２−マイクログロブリン；ベータ−２−マイクログロブリンｆｏｒｍ  ｐＩ  ５．３；トランスゲリン−２；テトラネクチン；タンパク質Ｓ１００−Ａ９；ジンクフィンガータンパク質２１５；ジンクフィンガーＦＹＶＥドメイン含有タンパク質１；Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩ領域Ｃｕｍ；組織因子経路インヒビター；線維芽細胞増殖因子受容体１；妊娠性血漿タンパク質；セレノプロテインＰ；リン脂質転送タンパク質；ミオトロフィン；ジンクフィンガーＭＹＮＤドメイン含有タンパク質１１；シナプトタグミン−１３；未同定タンパク質Ｃ１９ｏｒｆ６８；Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＲＮＦ１６９；ＬＩＭドメイン−ｏｎｌｙタンパク質７；ソーティングネキシン−２７。これらのタンパク質またはそれらの組み合わせは、ＣｕＥＴナノ粒子の工業的製造に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、実施例１で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約２０〜１００ｎｍ；最大画分：３０〜４０ｎｍを形成する。
【図２】図２は、およその垂直寸法を有する粒子の代表的な原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。実施例１に従って調製した約２０〜４０ｎｍの範囲。
【図３】図３は、ナノ粒子（約３０ｎｍ）の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す；結晶面の表示なく、電子回折なく、実施例１に従って調製された分子集合体（ナノ粒子）の全体的な特徴を示す。
【図４】図４は、ｃｃａ  ６０ｎｍ分子集合体のＨＡＡＤＦ／ＥＤＳ画像を示す。実施例１に従って調製したナノ集合体中に、主要元素（Ｃｕ、Ｎ、Ｓ）が明確に埋め込まれている。
【図５】図５は、ビス（ジエチルジチオカルバメート）銅錯体（ＣｕＥＴ）のＸバンド電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを示す（ａ−ｂは東京化学工業（株）から入手した純粋なＣｕＥＴ粉末の共鳴であり；ｃ−ｄは実施例１に従って調製したＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子の共鳴である）。２．０４４の推定ｇａｖｇ−ｖａｌｕｅと全共鳴プロファイルから、ナノ粒子生成に際して銅酸化状態の修飾はなく、Ｃｕ八面体場の実質的な変質は生じないことを明確に示している。
【図６】図６は、０．０１％アルブミン（実施例２）または５％アルブミン（実施例３）の存在下での化学反応中に形成されたナノ粒子の多分散系のＤＬＳスペクトル（上側画像）および代表的なＴＥＭ画像（下側２つの画像）を示す。この分析は、より高いアルブミン濃度が化学反応に入る場合に、より小さい粒子に向かう顕著なシフトを示す。
【図７】図７は、ジチオカルバメート（ジメチルジチオカルバメート−ＤＭＣ対ピロリジンジチオカルバメート−ＰＤＴ）の使用されるタイプに応じて、形成されたナノ粒子（実施例４、５）の異なるサイズを示す、形成されたナノ粒子のＤＬＳ粒度分布（上部画像）および代表的なＴＥＭ画像（下部２つの画像）を示す。
【図８】図８は、実施例７で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約１０〜４０ｎｍ；最大画分：１５〜３０ｎｍを形成する。
【図９】図９は、実施例８で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約１５〜１００ｎｍ；最大画分：２０〜４０ｎｍを形成する。
【図１０】図１０は、実施例９で調製したナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルを示す。ナノ粒子は、多分散系：約５０〜８００ｎｍ；最大画分：６０〜２００ｎｍを形成する。
【図１１】図１１は、種々の濃度（１２５ｎＭ〜１０μＭ）の２４時間処理後の、実施例１に従って調製されたＣｕＥＴ−アルブミン（ＣｕＥＴ−ＨＳＡ）ナノ粒子毒性の２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ）−ベースの細胞生存度分析を示す。癌細胞株（ＤＵ−１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、正常細胞（ＲＰＥ−１、ＲＷＰＥ−１）と比較して高い感受性を示す。ＣｕＥＴ−ＨＳＡナノ粒子は、癌細胞株においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された純粋なＣｕＥＴ粉末と同様の効力を有するが、正常細胞によってより寛容される。
【図１２】図１２は、５ｍｇ/ｋｇＣｕＥＴの腹腔内へ１回適用後の、マウス血清中のＣｕＥＴ濃度に関する、飛行時間型質量分析計と連結した高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ）による分析を示す。ＣｕＥＴは、実施例１に従ってアルブミンナノ粒子として製剤化されたＣｕＥＴ、またはオリーブオイルに溶解した純粋なＣｕＥＴ粉末（東京化成工業（株）から入手した）として製剤化されたＣｕＥＴである。オリーブオイルは、マウス実験において腹腔内投与される非極性化合物用の標準製剤である。測定された濃度は、ナノ粒子製剤の場合、有意に高いＣｕＥＴ循環濃度を示す。
【図１３】図１３は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中の、コンピュータ断層撮影と複合陽電子放出断層撮影を組み合わせた画像化（ＰＥＴ／ＣＴ）によって視覚化された腫瘍（矢印によってマークされる）における６４Ｃｕ放射性同位元素の存在を示す。ＰＥＴシグナルは、ＭＳＡ−ジエチル−ジチオカルバメート−銅６４ナノ粒子（左）のナノ粒子の分散液およびヒトトランスフェリン−ジエチル−ジチオカルバメート−銅６４ナノ粒子（右）のナノ粒子の分散液を、それぞれ実施例１０および１１に従って調製した後、後眼窩注入の２２時間後に収集した。ＰＥＴシグナルは、複合体に包埋された６４ＣｕがＭＤＡ−ＭＢ−２３１皮下腫瘍塊内に蓄積されることを示す。ＧＩＴ陽性は、化合物が腸管から排泄されることを示す。
【図１４】図１４は実施例１に従ってナノ粒子として製剤されたＣｕＥＴ（１ｍｇ／ｍｌ）または非極性化合物の標準製剤であるオリーブオイルに溶解した純粋なＣｕＥＴ粉末（東京化成工業株式会社より取得）を、マウス実験にて腹腔内に適用した処置の後の、ＳＣＩＤマウスに皮下異種移植したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌腫瘍の成長を示す。ＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子のみが、腫瘍増殖に対して有意な効果を示す。
【図１５】図１５は、実施例１に従ってアルブミンナノ粒子として製剤化されたＣｕＥＴ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置したＳＣＩＤマウスに皮下異種移植したＡＭＯ−１腫瘍の増殖を示す。ナノ粒子治療は腫瘍増殖（上部画像、カリパス）を有意に減少させ、そしてこの治療された動物はアルブミンのみによって治療された対照マウスと比較して、延長された生存（下部画像、カプラン−マイヤー生存プロット）を示す。この動物は、５日間の処置＋２日間の休薬の処方で、１日１回、腹腔内適用により処置された。また、これらの実験は動物に１００回以上注射したときのＣｕＥＴ−アルブミンナノ粒子の非常に良好な耐容性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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