(57)【要約】  本発明は、一般的に、イムノコンジュゲート、特に、突然変異インターロイキン−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド分子、ならびにこのようなポリヌクレオチド分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、さらに、突然変異イムノコンジュゲートを産生するための方法、それを含む薬学的組成物、およびその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＰＤ−１に結合する抗体と、（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒβγを通じてシグナル伝達するポリペプチド、特にＩＬ−２ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲート。
【請求項２】
ＩＬ−２ポリペプチドが、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドであり、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
ＩＬ−２ポリペプチドが、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドであり、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり、
抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、およびＫａｂａｔ番号付けによる７１〜７３位に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
ＩＬ−２ポリペプチドが、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドであり、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり、
抗体が、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
ＩＬ−２ポリペプチドが、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドであり、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり、
抗体が、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３Ａおよび／またはアミノ酸置換Ｃ１２５Ａをさらに含む、請求項２から５のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、配列番号２０の配列を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８】
１つ以下の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含む、請求項２から７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
抗体が、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項２から８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである、請求項９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項９または１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
抗体が、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである、請求項２から１１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、内部に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能な、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する、請求項９から１３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基が、トリプトファン残基により置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基が、バリン残基により置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のスレオニン残基が、セリン残基により置き換えられていてもよく（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基が、アラニン残基により置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９から１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１６】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、３５４位のセリン残基が、システイン残基により置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、または３５６位のグルタミン酸残基が、システイン残基により置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基が、システイン残基により置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、そのアミノ末端アミノ酸でＦｃドメインのサブユニットのうちの１つ、特にＦｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸と、任意選択的にリンカーペプチドを通じて融合されている、請求項９から１６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
リンカーペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合性、および／またはエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項９から１７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）の群から選択される１つまたは複数の位置にある、請求項１９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
Ｆｃドメインの各サブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）を含む、請求項９から２０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
配列番号２２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３または配列番号２４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項２から２１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２３】
リンカー配列により繋がった突然変異ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる、請求項２から２２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２４】
請求項２から２３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートをコードする、１つまたは複数の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）請求項２５に記載の宿主細胞をイムノコンジュゲートの発現に適した条件で培養すること、および任意選択的に（ｂ）イムノコンジュゲートを回収することを含む方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法により産生される、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲート。
【請求項２９】
請求項２から２３または２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項２から２３または２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３１】
疾患の治療における使用のための、請求項２から２３または２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３２】
前記疾患が、がんである、請求項３１に記載の疾患の治療における使用のためのイムノコンジュゲート。
【請求項３３】
疾患の治療のための医薬の製造における、請求項２から２３または２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートの使用。
【請求項３４】
前記疾患が、がんである、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態で治療的有効量の請求項２から２３または２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記疾患が、がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
個体の免疫系を刺激する方法であって、薬学的に許容される形態で有効量の請求項２から２３または２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項３８】
本明細書の前記に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、イムノコンジュゲート、特に、突然変異インターロイキン−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド分子、ならびにこのようなポリヌクレオチド分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、さらに、突然変異イムノコンジュゲートを産生するための方法、それを含む薬学的組成物、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）としても公知のインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、リンパ球生成、生存およびホメオスタシスに中心的な役割を果たす１５．５ｋＤａの球状糖タンパク質である。ＩＬ−２は、１３３アミノ酸長を有し、その機能に不可欠な四次構造を形成する４つの逆平行両親媒性α−ヘリックスからなる（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０、１１６９−７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７、４１０−４１３（１９９２））。異なる種由来のＩＬ−２の配列は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ０００５７７（ヒト）、ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）またはＮＰ５１７４２５（チンパンジー）に見出される。
【０００３】
ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）への結合によりその作用を媒介し、ＩＬ−２Ｒは、最大３つの個別のサブユニットからなり、これらのサブユニットの異なる会合が、ＩＬ−２に対する親和性の異なる受容体形態を産生することができる。α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）、およびγ（γｃ、ＣＤ１３２）サブユニットの会合の結果、ＩＬ−２に対するトリマー性高親和性受容体が生じる。βおよびγサブユニットからなるダイマー性ＩＬ−２受容体は、中親和性ＩＬ−２Ｒと呼ばれる。αサブユニットは、モノマー性低親和性ＩＬ−２受容体を形成する。ダイマー性中親和性ＩＬ−２受容体は、トリマー性高親和性受容体の約１００分の１の親和性でＩＬ−２と結合するものの、ダイマー性およびトリマー性ＩＬ−２受容体変異体の両方は、ＩＬ−２が結合するとシグナルを伝達することができる（Ｍｉｎａｍｉら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１、２４５−２６８（１９９３））。したがって、α−サブユニットであるＣＤ２５は、ＩＬ−２シグナル伝達に必須ではない。ＣＤ２５は、その受容体に高親和性の結合性を付与するのに対し、βサブユニットであるＣＤ１２２およびγ−サブユニットは、シグナル伝達に重要である（Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０７、１１９０６−１１（２０１０））。ＣＤ２５を含むトリマー性ＩＬ−２受容体は、（静止）ＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞により発現される。トリマー性ＩＬ−２受容体は、通常型活性化Ｔ細胞上にも一過性に誘導されるのに対し、これらの細胞は、静止状態ではダイマー性ＩＬ−２受容体だけを発現する。Ｔｒｅｇ細胞は、最高レベルのＣＤ２５をインビボで一貫して発現する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、１１４２−５１（２００５））。
【０００４】
ＩＬ−２は、主に、活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって合成される。これは、Ｔ細胞の増殖および分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成および末梢血リンパ球の細胞傷害性細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘導し、Ｔ細胞によるサイトカインおよび細胞溶解分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖および分化ならびにＢ細胞による免疫グロブリンの合成を推進し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生成、増殖および活性化を刺激する（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、５９５−６０１（２００９）；ＯｌｅｊｎｉｃｚａｋおよびＫａｓｐｒｚａｋ、Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ  １４、ＲＡ１７９−８９（２００８）；Ｍａｌｅｋ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６、４５３−７９（２００８）に概説がある）。
【０００５】
ＩＬ−２がリンパ球集団をインビボで増殖させ、これらの細胞のエフェクター機能を増加できることにより、ＩＬ−２に抗腫瘍効果が付与され、ＩＬ−２免疫療法がある特定の転移がんのための魅力的な治療選択肢になる。その結果、高用量ＩＬ−２治療は、転移性腎細胞癌および悪性メラノーマの患者における使用のために承認されている。
【０００６】
しかし、ＩＬ−２は、エフェクター細胞の増殖および活性を媒介するだけでなく、末梢性免疫寛容の維持に決定的に関与する点で、免疫応答に二重の機能を有する。
【０００７】
末梢性自己寛容の基礎をなす主なメカニズムは、Ｔ細胞におけるＩＬ−２誘導性活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）である。ＡＩＣＤは、完全に活性化したＴ細胞が、ＣＤ９５（Ｆａｓとしても公知）またはＴＮＦ受容体などの細胞表面発現デスレセプターの結合によりプログラム細胞死を受けるプロセスである。（ＩＬ−２への事前曝露後に）高親和性ＩＬ−２受容体を発現している増殖中の抗原活性化Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を介して抗原で再刺激されると、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現が誘導され、細胞がＦａｓ媒介性アポトーシスに対して感受性になる。このプロセスは、ＩＬ−２依存性であり（Ｌｅｎａｒｄｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３、８５８−６１（１９９１））、ＳＴＡＴ５を介して媒介される。Ｔリンパ球におけるＡＩＣＤプロセスにより、自己抗原だけでなく、腫瘍抗原などの明らかに宿主の構成物の一部ではない持続性抗原に対しても寛容が樹立される可能性がある。
【０００８】
そのうえ、ＩＬ−２は、また、サプレッサーＴ細胞としても公知の末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持に関与する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、１１４２−５１（２００５）；Ｄ’ＣｒｕｚおよびＫｌｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、１１５２−５９（２００５）；ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６、１１７１−７２（２００５）。Ｔｒｅｇ細胞は、細胞間接触を通じてＴ細胞の助けおよび活性化を阻害することにより、またはＩＬ−１０もしくはＴＧＦ−βなどの免疫抑制サイトカインの放出を通じてのいずれかで、エフェクターＴ細胞がその（自己）標的を破壊するのを抑制する。Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ−２誘導性抗腫瘍免疫を高めることも示された（Ｉｍａｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ９８、４１６−２３（２００７））。
【０００９】
したがって、ＩＬ−２の存在下では、生成したＣＴＬが腫瘍を自己として認識し、ＡＩＣＤを受ける場合があるか、または免疫応答がＩＬ−２依存性Ｔｒｅｇ細胞により阻害される場合があるかのいずれかであるので、ＩＬ−２は、腫瘍増殖を阻害するために最適ではない。
【００１０】
ＩＬ−２免疫療法に関するさらなる懸念は、組換えヒトＩＬ−２治療により生じる副作用である。高用量ＩＬ−２治療を受けている患者は、集中監視および入院患者管理を要する、重症の心血管、肺、腎、肝、消化管、神経、皮膚、血液および全身の有害事象をしばしば経験する。これらの副作用の大部分は、いわゆる血管（または毛細血管）漏出症候群（ＶＬＳ）の発生、多臓器において体液溢出をもたらす血管透過性の病的増加（例えば、肺および皮膚浮腫ならびに肝細胞損傷を引き起こす）および血管内液減少（血圧低下および心拍数における代償性増加を引き起こす）により説明することができる。ＩＬ−２の中止以外にＶＬＳの治療はない。ＶＬＳを回避するために、患者において低用量ＩＬ−２レジメンが試験されてきたが、最適以下の治療結果という犠牲を払ったものである。ＶＬＳは、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αなどの、炎症性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられていたが、低〜中レベルの機能性αβγＩＬ−２受容体を発現している肺内皮細胞へのＩＬ−２の直接結合が原因で、ＩＬ−２誘導性肺浮腫が起こったことが、最近示されている（Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７、１１９０６−１１（２０１０））。
【００１１】
ＩＬ−２免疫療法に関連するこれらの問題を克服するためにいくつかの手法が採られている。例えば、ＩＬ−２と、ある特定の抗ＩＬ−２モノクローナル抗体との組み合わせがＩＬ−２のインビボ治療効果を高めることが見出されている（Ｋａｍｉｍｕｒａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７、３０６−１４（２００６）；Ｂｏｙｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１、１９２４−２７（２００６））。代替的な手法では、ＩＬ−２の毒性を低減し、かつ／またはその有効性を増加させるために、ＩＬ−２が様々な方法で突然変異されている。Ｈｕら（Ｂｌｏｏｄ  １０１、４８５３−４８６１（２００３）、米国特許公開第２００３／０１２４６７８号）は、ＩＬ−２の血管透過活性を除去するためにＩＬ−２の３８位のアルギニン残基をトリプトファンにより置換した。Ｓｈａｎａｆｅｌｔら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８、１１９７−１２０２（２０００））は、アスパラギン８８をアルギニンに突然変異させて、ＮＫ細胞よりもＴ細胞に対する選択性を高めた。Ｈｅａｔｏｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３、２５９７−６０２（１９９３）；米国特許第５，２２９，１０９号）は、ＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの分泌を低減するために２つの突然変異、Ａｒｇ３８ＡｌａおよびＰｈｅ４２Ｌｙｓを導入した。Ｇｉｌｌｉｅｓら（米国特許公開第２００７／００３６７５２号）は、ＶＬＳを低減するために、中親和性ＩＬ−２受容体に対する親和性に寄与するＩＬ−２の３つの残基を置換した（Ａｓｐ２０Ｔｈｒ、Ａｓｎ８８Ａｒｇ、およびＧｌｎ１２６Ａｓｐ）。Ｇｉｌｌｉｅｓら（ＷＯ２００８／００３４４７３）は、有効性を高めるために、アミノ酸置換Ａｒｇ３８ＴｒｐおよびＰｈｅ４２ＬｙｓによりＩＬ−２とＣＤ２５との接触面を突然変異させて、Ｔｒｅｇ細胞のＣＤ２５との相互作用および活性化を低減した。同じ狙いで、Ｗｉｔｔｒｕｐら（ＷＯ２００９／０６１８５３）は、ＣＤ２５に対して強化された親和性を有するが、この受容体を活性化しないことでアンタゴニストとして作用するＩＬ−２突然変異体を産生した。導入された突然変異は、この受容体のβ−サブユニットおよび／またはγ−サブユニットとの相互作用を破壊することを狙いとした。
【００１２】
ＩＬ−２免疫療法に関連する上記問題（ＶＬＳの誘導により引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘導により引き起こされる腫瘍寛容、およびＴｒｅｇ細胞の活性化により引き起こされる免疫抑制）を克服するために設計された特定の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、ＷＯ２０１２／１０７４１７に記載されている。ＩＬ−２の４２位のフェニルアラニン残基のアラニンによる置換、４５位のチロシン残基のアラニンによる置換および７２位のロイシン残基のグリシンによる置換は、ＩＬ−２受容体のα−サブユニット（ＣＤ２５）への突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの結合を本質的に消失させる。
【００１３】
上記手法に付け加えて、ＩＬ−２免疫療法は、例えば、腫瘍細胞上に発現した抗原に結合する抗体を含むイムノコンジュゲートの形態で、ＩＬ−２を腫瘍に選択的に標的化することにより改善され得る。いくつかのこのようなイムノコンジュゲートが、記載されている（例えば、Ｋｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００４）２７、２３２−２３９；Ｋｌｅｉｎら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１７）６（３）、ｅ１２７７３０６参照）。
【００１４】
しかし、腫瘍は、抗体の標的抗原をシェディング、突然変異または下方制御することにより、このような標的化を回避できる場合がある。そのうえ、リンパ球を活発に排除する腫瘍微小環境では、腫瘍を標的化するＩＬ−２が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのエフェクター細胞と最適に接触するようにならない場合がある。
【００１５】
したがって、ＩＬ−２免疫療法をさらに改善する必要性が残る。腫瘍標的化の問題を回避し得る手法は、ＩＬ−２をエフェクター細胞、特にＣＴＬに直接標的化することである。
【００１６】
Ｇｈａｓｅｍｉらは、ＩＬ−２をナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのＮＫＧ２Ｄ担持細胞に標的化するための、ＩＬ−２とＮＫＧ２Ｄ結合タンパク質との融合タンパク質を記載している（Ｇｈａｓｈｅｍｉら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ（２０１６）７、１２８７８）。
【００１７】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含むＣＤ２８ファミリー受容体の阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、細胞表面受容体であり、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、および骨髄細胞上に発現される（Ｏｋａｚａｋｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９−８２；Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：７１１−８）。ＰＤ−１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様細胞外ドメインならびに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容スイッチ性チロシンモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する細胞質ドメインからなるモノマー性１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−１に対する２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が同定されており、これらのリガンドは、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒら（２００２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方は、ＰＤ−１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ−１に対する１つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１は、多種多様なヒトがんに豊富に存在する（Ｄｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ８：７８７−９）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介増殖の減少、およびがん性細胞による免疫回避を結果として生じる（Ｄｏｎｇら（２００３）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００）。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所相互作用を阻害することにより後退させることができ、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用も同様にブロックされる場合、その効果は相加的である（Ｉｗａｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ  ７．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９９：１２２９３−７；Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６）。
【００１８】
ＰＤ−１に結合する抗体は、例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３２４８に記載されている。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、免疫療法のために有利な特性を有する突然変異形態のＩＬ−２を、腫瘍細胞よりむしろ細胞傷害性Ｔリンパ球などの免疫エフェクター細胞に直接標的化する新規な手法を提供する。免疫エフェクター細胞への標的化は、ＰＤ−１に結合する抗体への突然変異ＩＬ−２分子のコンジュゲーションにより達成される。
【００２０】
本発明に使用されるＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２免疫療法に関連する問題、特に、ＶＬＳの誘導により引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘導により引き起こされる腫瘍寛容、およびＴｒｅｇ細胞の活性化により引き起こされる免疫抑制を克服するために設計されている。上記の腫瘍標的化からの腫瘍の逃避を回避することに加えて、免疫エフェクター細胞へのＩＬ−２突然変異体の標的化は、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞と比べたＣＴＬの優先的活性化をさらに増加させる場合がある。ＰＤ−１に結合する抗体を使用することにより、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用により誘導されるＴ細胞活性抑制が、追加的に後退することで、免疫応答がさらに高まる場合がある。
【００２１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブを含むＩＬ−２融合タンパク質が、Ｃｈｅｎら（Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（２０１６）４８０、１６０−１６５）により記載されている。
【００２２】
注目すべきことに、ＰＤ−１に結合する抗体を含む本発明のイムノコンジュゲートは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する類似のイムノコンジュゲートと比較して、有意に優れたインビボ抗腫瘍有効性を示す（本明細書下記の実施例３を参照されたい）。
【００２３】
一般的な態様では、本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体と、ＩＬ−２Ｒβγを通じてシグナル伝達するポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートを提供する。ＩＬ−２Ｒβγを通じてシグナル伝達するポリペプチドは、特に、ＩＬ−２ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドである。第１の態様では、本発明は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供し、その際、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子である。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供し、その際、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり；抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、およびＫａｂａｔ番号付けによる７１〜７３位に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、または抗体は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供し、その際、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり；抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２６】
本発明によるイムノコンジュゲートの一部の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３Ａおよび／またはアミノ酸置換Ｃ１２５Ａをさらに含む。一部の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２０の配列を含む。一部の実施形態では、イムノコンジュゲートは、１つ以下の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗体は、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。一部のこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、かつ／またはＦｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。
【００２７】
イムノコンジュゲートがＦｃドメインを含む一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、内部に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能な、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する。一部の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基が、トリプトファン残基により置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基が、バリン残基（Ｙ４０７Ｖ）により置き換えられ、場合により、３６６位のスレオニン残基が、セリン残基により置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基が、アラニン残基により置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一部のこのような実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、３５４位のセリン残基が、システイン残基により置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、または３５６位のグルタミン酸残基が、システイン残基により置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基が、システイン残基により置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一部の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸でＦｃドメインのサブユニットのうちの１つ、特にＦｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸と、場合によりリンカーペプチドを通じて融合されている。一部のこのような実施形態では、リンカーペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。
【００２８】
イムノコンジュゲートがＦｃドメインを含む一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合性および／またはエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部のこのような実施形態では、前記１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）の群から選択される１つまたは複数の位置にある。一部の実施形態では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲートは、配列番号２２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３または配列番号２４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、イムノコンジュゲートは、リンカー配列により繋がった突然変異ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる。
【００３０】
本発明は、本発明のイムノコンジュゲートをコードする１つまたは複数の単離ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクター（特に発現ベクター）、および前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【００３１】
また、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞をイムノコンジュゲートの発現に適した条件で培養すること、および場合により、（ｂ）イムノコンジュゲートを回収することを含む方法が、提供される。前記方法により産生される、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートも、本発明により提供される。
【００３２】
本発明は、本発明のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物、および本発明のイムノコンジュゲートを使用する方法をさらに提供する。
【００３３】
特に、本発明は、医薬としての使用のため、および疾患の治療における使用のための、本発明によるイムノコンジュゲートを包含する。特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。
【００３４】
また、疾患の治療のための医薬の製造における本発明によるイムノコンジュゲートの使用が、本発明により包含される。特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。
【００３５】
さらに、個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態で本発明によるイムノコンジュゲートを含む治療的有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。
【００３６】
また、個体の免疫系を刺激する方法であって、薬学的に許容される形態で本発明によるイムノコンジュゲートを含む有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含むＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲート形式の略図である。
【図２】ＰＤ１  ＩｇＧおよびＣＥＡ−ＩＬ２ｖと比較した、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ内のＣＤ４  Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）へのＰＤ１−ＩＬ２ｖの結合性を示す図である。
【図３】ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、およびＰＤ１  ＩｇＧ＋ＣＥＡ−ＩＬ２ｖの組み合わせによる、ＰＢＭＣ内のＮＫ細胞（Ａ）、ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）の増殖を示す図である。ＰＤ１  ＩｇＧをコントロールとして含めた。
【図４】ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、およびＰＤ１  ＩｇＧ＋ＣＥＡ−ＩＬ２ｖの組み合わせによる、ＰＢＭＣ内のＮＫ細胞（Ａ）、ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）の活性化を示す図である。ＰＤ１  ＩｇＧをコントロールとして含めた。ＮＫ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現を活性化マーカーとして使用した。
【図５】ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、およびＰＤ１  ＩｇＧ＋ＣＥＡ−ＩＬ２の組み合わせによるＰＢＭＣ内のＰＨＡ予備活性化ＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｂ）の増殖を示す図である。ＰＤ１  ＩｇＧをコントロールとして含めた。
【図６】ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、およびＰＤ１  ＩｇＧ＋ＣＥＡ−ＩＬ２ｖの組み合わせによるＰＢＭＣ内のＰＨＡ予備刺激ＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｂ）の活性化を示す図である。ＰＤ１  ＩｇＧをコントロールとして含めた。ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５発現を活性化のマーカーとして使用した。
【図７】２日後に測定された、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖと比較したＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖ（Ａ）、またはＰＤ１−ＩＬ２ｖと比較したＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖ（Ｂ）により誘導されるヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２の増殖を示す図である。
【図８】ＰＤ−Ｌ１陽性マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ２へのＰＤ−Ｌ１−ｍｕＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１  ｍｕＩｇＧ１の結合性を示す図である。
【図９】３日後に決定された、ＣＥＡ−ｍｕＩＬ２ｖと比較したＰＤ１−ｍｕＩＬ２ｖ（Ａ）、またはＰＤ−Ｌ１−ｍｕＩＬ２ｖと比較したＰＤ１−ｍｕＩＬ２ｖ（Ｂ）により誘導されるマウスＰＤ−Ｌ１陽性Ｔ細胞株ＣＴＬＬ２の増殖を示す図である。
【図１０】単一薬剤としてＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖまたはＰＤ１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体を用いた有効性実験の結果を示す図である。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃトランスフェクタント膵臓癌細胞株をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射して、膵臓同所性同系モデルにおける生存を研究した。
【図１１】単一薬剤としてＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖまたはＰＤ１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体を用いた有効性実験の結果を示す図である。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃトランスフェクタント膵臓癌細胞株をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射して、膵臓同所性同系モデルにおける生存をバイオルミネッセンスにより研究した。
【図１２】単独、ＩＬ−２ｖとの組み合わせ、または融合タンパク質としての抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１のいずれかの存在下でＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いて４８時間リコールしたときの、ＣＤ４  Ｔ細胞がＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ（Ｂ）またはＩＦＮ−γ（Ｃ）を分泌する能力を示す図である。
【図１３】単独、ＩＬ−２ｖとの組み合わせ、または融合タンパク質としての抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１のいずれかの存在下でＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いて４８時間リコールしたときの、ＩＬ−２のみ（Ａ）、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの両方（Ｂ）、またはＩＦＮ−γのみ（ＣおよびＤ）を分泌するウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の分化状態を示す図である。
【図１４】活性化通常型Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞へのＰＤ１およびＰＤ１−ＩＬ２ｖの競合結合アッセイを示す図である。Ｔｒｅｇと比べたＴｃｏｎｖ上の結合頻度のデルタ（図１４Ａ）およびＴｒｅｇと比べたＴｃｏｎｖへの結合性（図１４Ｂ）。
【図１５】ＰＤ１−ＩＬ２ｖがＴｃｏｎｖのＴｒｅｇ抑制を後退させることを示す図である。共培養の５日後のＴｒｅｇによるグランザイムＢ（図１５Ａ）およびＴｃｏｎｖにより分泌されるインターフェロン−γ（図１５Ｂ）の抑制パーセンテージ。
【図１６】ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖをｍｕＦＡＰ−ＩＬ２ｖおよびｍｕＰＤ−１抗体と、単一薬剤としておよび組み合わせで比較する有効性実験の結果を示す図である。
【図１７】ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖをＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ１およびそれらの組み合わせと比較する有効性実験の結果を示す図である。
【図１８Ａ】抗マウスＣＤ３について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図１８Ｂ】Ｔ細胞定量分析を示す図である。
【図１９】抗マウスＰＤ１について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図２０】抗マウスＩＣＯＳについて染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図２１】ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖをＦＡＰ−ＩＬ２ｖおよびｍｕＰＤ１と、単一薬剤としておよび組み合わせで比較する有効性実験の結果を示す図である。
【図２２】ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖをＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ１および２つの異なる用量のそれらの組み合わせと比較する有効性実験の結果を示す図である。
【図２３】抗マウスＣＤ３について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図２４Ａ】抗マウスＣＤ８について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図２４Ｂ】Ｔ細胞定量分析を示す図である。
【図２５Ａ】抗グランザイムＢについて染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図２５Ｂ】グランザイムＢマーカー面積の定量分析を示す図である。
【図２６Ａ】抗マウスＰＤ１について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像を示す図である。
【図２６Ｂ】ＰＤ１陽性細胞定量分析を示す図である。
【図２７】Ａ−Ｄは、単独、ＩＬ−２ｖとの組み合わせ、または融合タンパク質としてのいずれかの抗ＰＤ−１の存在下でＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いて４８時間リコールしたときに、ＣＤ４  Ｔ細胞がＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ（Ｂ）またはＩＦＮ−γ（Ｃ）を分泌する能力、ならびに増殖する（Ｄ）能力を示す図である。
【図２８】単独、ＩＬ−２ｖとの組み合わせ、または融合タンパク質としてのいずれかの抗ＰＤ−１の存在下でＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いて４８時間リコールしたときの、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌの発現によるＩＦＮ−γ分泌ウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の分化状態。
【図２９】Ａ−Ｄは、第１のドナーの静止ＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイを示す図である（ＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）および制御性Ｔ細胞（Ｄ））。
【図３０】Ａ−Ｄは、第２のドナーの静止ＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイを示す図である（ＣＤ４  Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）、制御性Ｔ細胞（Ｃ）およびＮＫ細胞（Ｄ））。
【図３１】Ａ−Ｄは、第３のドナーの静止ＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイを示す図である（ＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）および制御性Ｔ細胞（Ｄ））。
【図３２】Ａ−Ｄは、第４のドナーの静止ＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイを示す図である（ＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）および制御性Ｔ細胞（Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
以下に特に定義されない限り、用語は、本明細書において当該技術分野で一般的に使用されるように使用される。
【００３９】
本明細書に使用される「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」という用語は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物起源の任意のネイティブなＩＬ−２を指す。本用語は、プロセシングされていないＩＬ−２および細胞中でのプロセシングの結果として生じた任意の形態のＩＬ−２を包含する。本用語は、また、ＩＬ−２の天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＩＬ−２のアミノ酸配列は、配列番号１９に示される。プロセシングされていないヒトＩＬ−２は、追加的に、成熟ＩＬ−２分子に不在である、配列番号２６の配列を有する２０アミノ酸のシグナルペプチドをＮ末端に含む。
【００４０】
本明細書に使用される「ＩＬ−２突然変異体」または「突然変異ＩＬ−２ポリペプチド」という用語は、完全長ＩＬ−２、ＩＬ−２のトランケーションされた形態およびＩＬ−２が融合または化学コンジュゲーションなどにより別の分子と連結された形態を含む、ＩＬ−２分子の様々な形態の任意の突然変異体形態を包含することが意図される。ＩＬ−２に関連して使用される場合の「完全長」は、成熟した天然長ＩＬ−２分子を意味することが意図される。例えば、完全長ヒトＩＬ−２は、アミノ酸１３３個を有する分子（例えば、配列番号１９参照）を指す。様々な形態のＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２とＣＤ２５との相互作用に影響する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有することで特徴付けられる。この突然変異は、通常その位置に置かれる野生型アミノ酸残基の置換、欠失、トランケーションまたは修飾を伴い得る。アミノ酸置換により得られた突然変異体が好ましい。別途指示がない限り、ＩＬ−２突然変異体は、本明細書において突然変異ＩＬ−２ペプチド配列、突然変異ＩＬ−２ポリペプチド、突然変異ＩＬ−２タンパク質または突然変異ＩＬ−２アナログと呼ばれる場合がある。
【００４１】
ＩＬ−２の様々な形態の名称は、本明細書において、配列番号１９に示される配列を基準として付けられる。同じ突然変異を示すために、本明細書において様々な名称が使用され得る。例えば、４２位のフェニルアラニンからアラニンへの突然変異は、４２Ａ、Ａ４２、Ａ４２、Ｆ４２Ａ、またはＰｈｅ４２Ａｌａと表示することができる。
【００４２】
本明細書に使用される「ヒトＩＬ−２分子」により、配列番号１９のヒトＩＬ−２配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％または少なくとも約９６％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ−２分子が意味される。特に、配列同一性は、少なくとも約９５％であり、より詳細には少なくとも約９６％である。特定の実施形態では、ヒトＩＬ−２分子は、完全長ＩＬ−２分子である。
【００４３】
本明細書に使用される「アミノ酸突然変異」という用語は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および修飾を包含することが意味される。最終コンストラクトが所望の特徴、例えば、ＣＤ２５との低減した結合性を有するならば、最終コンストラクトに到達するために置換、欠失、挿入、および修飾の任意の組み合わせを行うことができる。アミノ酸配列の欠失および挿入は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失ならびにアミノ酸の挿入を含む。末端欠失の例は、完全長ヒトＩＬ−２の１位におけるアラニン残基の欠失である。好ましいアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。例えば、ＩＬ−２ポリペプチドの結合特徴を変えるために、非保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を、異なる構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸により置き換えることが、特に好ましい。好ましいアミノ酸置換には、親水性アミノ酸により疎水性アミノ酸を置き換えることが含まれる。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、または２０種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸突然変異は、当該技術分野で周知の遺伝的方法または化学的方法を使用して生成することができる。遺伝的方法には、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれる場合がある。化学修飾などの、遺伝子工学以外の方法によりアミノ酸の側鎖基を変える方法も有用であり得ると考えられている。
【００４４】
本明細書に使用される、ＩＬ−２の「野生型」形態は、野生型形態が突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの各アミノ酸位置で野生型アミノ酸を有することを除き、それ以外は突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと同じであるＩＬ−２の形態である。例えば、ＩＬ−２突然変異体が完全長ＩＬ−２（すなわち、任意の他の分子と融合もコンジュゲートもしていないＩＬ−２）ならば、この突然変異体の野生型形態は、完全長のネイティブなＩＬ−２である。ＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２と、ＩＬ−２の下流にコードされる別のポリペプチドとの間の融合体ならば（例えば、抗体鎖）、このＩＬ−２突然変異体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドと融合された、野生型アミノ酸配列を有するＩＬ−２である。さらに、ＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２のトランケーションされた形態（ＩＬ−２のトランケーションされていない部分内に突然変異または修飾された配列）ならば、このＩＬ−２突然変異体の野生型形態は、野生型配列を有する、同じようにトランケーションされたＩＬ−２である。ＩＬ−２突然変異体の様々な形態のＩＬ−２受容体結合親和性または生物活性をＩＬ−２の対応する野生型形態と比較するために、野生型という用語は、例えば、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置のシステインのアラニンへの置換などの、天然に存在するネイティブなＩＬ−２と比較してＩＬ−２受容体への結合性に影響しない１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むＩＬ−２の形態を包含する。一部の実施形態では、本発明のための野生型ＩＬ−２は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む（配列番号２９参照）。本発明によるある特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが比較される野生型ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが比較される野生型ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本明細書に使用される「ＣＤ２５」または「ＩＬ−２受容体のα−サブユニット」という用語は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物起源の任意のネイティブなＣＤ２５を指す。本用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ２５および細胞中でのプロセシングに起因するＣＤ２５の任意の形態を包含する。本用語は、また、ＣＤ２５の天然に存在する変異体、例えばスプライスバリアントまたは対立遺伝子変異体を包含する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２５は、ヒトＣＤ２５である。ヒトＣＤ２５のアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１５８９（バージョン１８５）に見出される。
【００４６】
本明細書に使用される「高親和性ＩＬ−２受容体」という用語は、受容体γ−サブユニット（共通サイトカイン受容体γ−サブユニット、γｃ、またはＣＤ１３２としても公知、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１４７８４（バージョン１９２）参照）、受容体β−サブユニット（ＣＤ１２２またはｐ７０としても公知、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ３１７８５（バージョン１９７）参照）および受容体α−サブユニット（ＣＤ２５またはｐ５５としても公知、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１５８９（バージョン１８５）参照）からなる、ＩＬ−２受容体のヘテロトリマー形態を指す。対照的に、「中親和性ＩＬ−２受容体」という用語は、α−サブユニットなしでγ−サブユニットおよびβ−サブユニットだけを含むＩＬ−２受容体を指す（概説については、例えば、ＯｌｅｊｎｉｃｚａｋおよびＫａｓｐｒｚａｋ、Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ  １４、ＲＡ１７９−１８９（２００８）を参照されたい）。
【００４７】
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。特に示さない限り、本明細書に使用される「結合親和性」は、結合ペアのメンバーの間（例えば、抗原結合部分および抗原、または受容体およびそのリガンド）の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離速度定数と会合速度定数と（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である、解離定数（ＫＤ）により表すことができる。したがって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は、異なる速度定数を含む場合がある。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で公知の十分に確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００４８】
ＩＬ−２受容体の様々な形態に対する突然変異または野生型ＩＬ−２ポリペプチドの親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ＷＯ２０１２／１０７４１７に示される方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装を使用して決定することができ、そのような受容体サブユニットは、組換え発現により得られる場合がある（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８、１１９７−１２０２（２０００）を参照されたい）。あるいは、ＩＬ−２受容体の異なる形態に対するＩＬ−２突然変異体の結合親和性は、受容体の１つまたは他のこのような形態を発現することが公知の細胞株を使用して評価される場合がある。結合親和性を測定するための具体的な例証的および例示的の実施形態は、本明細書に後述される。
【００４９】
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」により、他のＴ細胞の応答を抑制することができる特殊な種類のＣＤ４＋  Ｔ細胞が意味される。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−２受容体のα−サブユニット（ＣＤ２５）および転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現により特徴付けられ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２、５３１−６２（２００４））、腫瘍により発現される抗原を含む、抗原に対する末梢性自己寛容の誘導および維持に重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞は、その機能および発生ならびにその抑制特徴の誘導のためにＩＬ−２を必要とする。
【００５０】
本明細書に使用される「エフェクター細胞」という用語は、ＩＬ−２の細胞傷害効果を媒介するリンパ球集団を指す。エフェクター細胞には、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞およびマクロファージ／単球などのエフェクターＴ細胞が含まれる。
【００５１】
本明細書に使用される、「ＰＤ１」、「ヒトＰＤ１」、「ＰＤ−１」または「ヒトＰＤ−１」という用語（プログラム細胞死タンパク質１、またはプログラム死１としても公知）は、ヒトタンパク質ＰＤ１（配列番号２７、シグナル配列を有さないタンパク質）／（配列番号２８、シグナル配列を有するタンパク質）を指す。ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ１５１１６（バージョン１５６）も参照されたい。本明細書に使用される、「ＰＤ−１に結合性の」、「ＰＤ−１と特異的に結合性の」、「ＰＤ−１に結合する」抗体または「抗ＰＤ−１抗体」は、ＰＤ−１、特に細胞表面の発現されたＰＤ−１ポリペプチドと十分な親和性で結合することが可能なことにより、ＰＤ−１の標的化における診断および／または治療剤として有用な抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＰＤ−１タンパク質に対する抗ＰＤ−１抗体の結合性の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴アッセイにより測定するとき、ＰＤ−１に対する抗体の結合性の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）という、ヒトＰＤ−１に対する結合性についての結合親和性のＫＤ値を有する。一実施形態では、結合親和性のＫＤ値は、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ−１−ＥＣＤ、配列番号４３参照）を抗原として使用する表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。
【００５２】
「特異的結合」により、結合が抗原に選択的であり、望まれないまたは非特異的な相互作用と識別できることが意味される。抗体が特異的抗原（例えば、ＰＤ−１）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者が精通している他の技術のいずれか、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いる分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７、３２３−３２９（２０００））および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８、２１７−２２９（２００２））により測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗体の結合性の程度は、例えば、ＳＰＲにより測定されるような、抗原に対する抗体の結合性の約１０％未満である。本明細書に記載されるイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、ＰＤ−１と特異的に結合する。
【００５３】
本明細書に使用される、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖的に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸が２つ以上の任意の鎖を指すのであって、特定長の産物を指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはアミノ酸が２つ以上の鎖を指すために使用される任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、また、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むが、それに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術により産生される場合があるが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。これは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。ポリペプチドは、所定の三次元構造を有する場合があるものの、必ずしもそのような構造を有するわけではない。所定の三次元構造を有するポリペプチドは、フォールディングしていると呼ばれ、所定の三次元構造を有さずに、多数の異なるコンフォメーションを採用することができるポリペプチドは、フォールディングしていないと呼ばれる。
【００５４】
「単離」ポリペプチドもしくは変異体、またはその誘導体により、その自然ミリューにないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルは、必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、そのネイティブまたは自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中に発現される、組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドであるとして、本発明の目的で単離されたと見なされる。
【００５５】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一パーセントを達成した後で、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一パーセントを決定するための整列は、当該技術分野における技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたり最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるために適したパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用してＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ  ８５：２４４４−２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８；およびＰｅａｒｓｏｎら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６：２４−３６により著作されたものであり、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に利用可能である。あるいは、局所的ではなく大域的整列が行われることを保証するために、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉからアクセス可能な公的サーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムおよびデフォルトのオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：−１０；ｅｘｔ：−２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して配列を比較することができる。アミノ酸同一パーセントは、出力整列ヘッダー中に与えられる。
【００５６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的ホスホジエステル結合または非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などに見られるアミド結合を含み得る。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
【００５７】
「単離」核酸分子またはポリヌクレオチドにより、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的で単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ポリヌクレオチドには、通常、ポリヌクレオチド分子を含有する細胞中に含有されるポリヌクレオチド分子が含まれるが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外またはその自然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する。単離ＲＮＡ分子には、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物のみならず、プラス鎖およびマイナス鎖形態ならびに二本鎖形態が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に産生されたこのような分子がさらに含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントの場合がある、またはそれを含む場合がある。
【００５８】
「［例えば、本発明のイムノコンジュゲート］をコードする単離ポリヌクレオチド（または核酸）」は、抗体重鎖および軽鎖ならびに／またはＩＬ−２ポリペプチド（もしくはその断片）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド分子を、単一のベクターまたは別々のベクター中のこのようなポリヌクレオチド分子および宿主細胞中の１つまたは複数の位置に存在するこのような核酸分子を含めて、指す。
【００５９】
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて組換え的または合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でとりわけ、転写すべき核酸配列およびプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、本発明のイムノコンジュゲートまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、細胞においてそれが動作可能に関連する特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。本用語には、自己複製核酸構造としてのベクターおよびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定ｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に入った後、遺伝子によりコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞転写および／または翻訳機構により産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明のイムノコンジュゲートまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【００６１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を、このような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代回数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量が完全には同一でない場合があり、突然変異を含有し得る。本来の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する突然変異子孫が、本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートを生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば、いくつかだけを挙げるならばＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織内に含まれる細胞が含まれる。
【００６２】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含むが、それに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００６３】
本明細書に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団中に含まれる個別の抗体は、例えば、天然に存在する突然変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の精製の間に生じる、可能性のある変異抗体（このような変異体は、一般的に少量存在する）を除き、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を示すのであって、任意の特定の方法により抗体を産生することを必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるべきモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ−ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン座位の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、それに限定されない多様な技術により製造される場合があり、モノクローナル抗体を製造するための、このような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載される。
【００６４】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離された抗体、すなわち、その自然ミリューにない抗体である。特定の精製レベルは、必要とされない。例えば、単離抗体は、そのネイティブまたは自然環境から取り出すことができる。宿主細胞において発現された、組換え産生された抗体は、任意の適切な技術により分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換え抗体と同様に、本発明の目的で単離されたと見なされる。このように、本発明のイムノコンジュゲートは、単離されている。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により決定されるとき、９５％または９９％よりも高い純度に精製される。抗体の純度の評定のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００６５】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、ネイティブな抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体を指すために、本明細書において互換的に使用される。
【００６６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体が含まれるが、それに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６（２００５）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照されたく；また、ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０、６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディは、また、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号参照）。抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を含むが、それに限定されない、様々な技術ならびに本明細書に記載される組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生によって製造することができる。
【００６７】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、２つの軽鎖および２つの重鎖がジスルフィド結合したもので構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー性糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）に続く、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）に続く、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリン重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうち１つに割り当てられる場合があり、これらのうちいくつかは、サブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられる場合がある。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうち１つに割り当てられる場合がある。免疫グロブリンは、本質的に、２つのＦａｂ分子およびＦｃドメインが免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結したものからなる。
【００６８】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部または全てに特異的に結合し、それと相補的な区域を含む、抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００６９】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブな抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般的に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。可変領域配列に関連して本明細書に使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）により示される番号付けシステムを指す。
【００７０】
本明細書に使用される、重鎖および軽鎖の全ての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、本明細書において「Ｋａｂａｔによる番号付け」または「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムにより番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の６４７〜６６０頁参照）は、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬのために使用され、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１〜７２３頁参照）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）のために使用され、これは、この場合にＫａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことにより、本明細書においてさらに明らかにされる。
【００７１】
本明細書に使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触部」）を含有する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中に３つおよびＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中に３つの、６つのＨＶＲを含む。本明細書における例示的なＨＶＲには：
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、および９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組み合わせ
が含まれる。
【００７２】
別途指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔら、上記により番号付けされる。
【００７３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）中に以下の順序で出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７４】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうち実質的に全てを含み、可変ドメイン中のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のうち全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲのうち全てまたは実質的に全ては、ヒト抗体のＦＲに対応する。このような可変ドメインは、本明細書において「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。一部の実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が本来の抗体の定常領域から追加的に修飾または変更されて、特に、Ｃ１ｑ結合性および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合性に関して本発明による特性を生じる形態である。
【００７５】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する、非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ある特定の実施形態では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳類、例えば、マウス、ラット、またはウサギに由来する。ある特定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片も、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【００７６】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖により有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられる場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００７７】
本明細書における「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに異なり得るものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、重鎖のＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に伸びると定義される。しかし、宿主細胞により産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つまたは複数、特に１つまたは２つのアミノ酸の翻訳後切断を受ける場合がある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により、宿主細胞により産生される抗体は、完全長重鎖を含む場合または完全長重鎖の切断変異体（本明細書において「切断変異体重鎖」とも呼ばれる）を含む場合がある。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸が、グリシン（Ｇ４４６）およびリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）である場合であり得る。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、またはＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）およびリジン（Ｋ４４７）は、存在する場合も存在しない場合もある。Ｆｃドメイン（または本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されない限り、本明細書においてＣ末端グリシン−リジンジペプチドを有さずに表示される。本発明の一実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲート中に含まれる、本明細書に詳記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲート中に含まれる、本明細書に詳記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載される薬学的組成物などの、本発明の組成物は、本発明のイムノコンジュゲートの集団を含む。イムノコンジュゲートの集団は、完全長重鎖を有する分子および切断変異重鎖を有する分子を含み得る。イムノコンジュゲートの集団は、完全長重鎖を有する分子と切断変異体重鎖を有する分子との混合物からなる場合があり、その際、イムノコンジュゲートの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、切断変異重鎖を有する。本発明の一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの集団を含む組成物は、本明細書に詳記されるＦｃドメインのサブユニットを追加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と共に含む重鎖を含むイムノコンジュゲートを含む。本発明の一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの集団を含む組成物は、本明細書に詳記されるＦｃドメインのサブユニットを追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と共に含む重鎖を含むイムノコンジュゲートを含む。本発明の一実施形態では、このような組成物は、本明細書に詳記さ��るＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；本明細書に詳記されるＦｃドメインのサブユニットを追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と共に含む重鎖を含む分子；および本明細書に詳記されるＦｃドメインのサブユニットを追加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）共に含む重鎖を含む分子で構成されるイムノコンジュゲートの集団を含む。本明細書に特に詳記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１（上記も参照）に記載されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによる。本明細書に使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、ダイマー性Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうち１つ、すなわち、安定に自己会合することができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００７８】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、同一のポリペプチドとが会合してホモダイマーを形成するのを低減または防止する、ペプチド主鎖の操作またはＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書に使用される、会合を促進する修飾には、特に、会合することが望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニットおよび第２のサブユニット）のそれぞれに対する別々の修飾が含まれ、その際、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの会合をそれぞれ立体的または静電的に好都合にするために、それらの一方または両方の構造または電荷を変える場合がある。したがって、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に（ヘテロ）ダイマー化が起き、これらのサブユニットは、各サブユニットに融合したさらなる構成成分（例えば抗原結合部分）が同じではないという意味で、非同一である場合がある。一部の実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン中にアミノ酸突然変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに別々のアミノ酸突然変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【００７９】
抗体に関して使用される場合の「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプにより異なる、抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が含まれる。
【００８０】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体で被覆された標的細胞の、免疫エフェクター細胞による溶解をもたらす免疫メカニズムである。標的細胞は、抗体またはＦｃ領域を含むその誘導体が、一般的にＦｃ領域のＮ末端側のタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書に使用される「低減したＡＤＣＣ」という用語は、所与の時間で、標的細胞周囲の培地中に所与の抗体濃度で、上に定義されたＡＤＣＣのメカニズムにより溶解される標的細胞数における減少、および／または所与の時間で、ＡＤＣＣのメカニズムにより所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞周囲の培地中の抗体濃度における増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣにおける低減は、同じ標準的な産生、精製、製剤および保存方法（当業者に公知の）を使用するが、操作されていない、同じ種類の宿主細胞により産生される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと比べたものである。例えば、ＡＤＣＣを低減するアミノ酸置換をそのＦｃドメイン中に含む抗体により媒介されるＡＤＣＣにおける低減は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を有さない同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと比べたものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００６／０８２５１５またはＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照されたい）。
【００８１】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる結合後に、受容体担持細胞を刺激してエフェクター機能を遂行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【００８２】
本明細書に使用される「操作する、操作された、操作すること」という用語は、ペプチド主鎖の任意の操作、または天然に存在するもしくは組換えのポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、または個別のアミノ酸の側鎖基の修飾のみならず、これらの手法の組み合わせが含まれる。
【００８３】
「低減した結合性」、例えば、Ｆｃ受容体またはＣＤ２５との低減した結合性は、例えば、ＳＰＲにより測定されたときの、それぞれの相互作用についての親和性の減少を指す。明確にするために、この用語は、ゼロ（または分析方法の検出限界未満）への親和性の低減、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「増加した結合性」は、それぞれの相互作用についての結合親和性における増加を指す。
【００８４】
本明細書に使用される、「イムノコンジュゲート」という用語は、少なくとも１つのＩＬ−２分子および少なくとも１つの抗体を含むポリペプチド分子を指す。ＩＬ−２分子は、本明細書に記載の多様な相互作用により、多様な立体配置で抗体と繋ぐことができる。特定の実施形態では、ＩＬ−２分子は、ペプチドリンカーを介して抗体に融合されている。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、本質的に、１つまたは複数のリンカー配列により繋がった１つのＩＬ−２分子および抗体からなる。
【００８５】
「融合されている」により、成分（例えば、抗体およびＩＬ−２分子）が、直接または１つもしくは複数のペプチドリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合により連結されていることが意味される。
【００８６】
本明細書に使用される、Ｆｃドメインサブユニットなどに関する「第１の」および「第２の」という用語は、部分の各種類が１つよりも多くある場合に、識別の都合のために使用されるものである。これらの用語の使用は、そのように明白に述べられない限り、イムノコンジュゲートの特定の順序または方向を付与することを意図しない。
【００８７】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞または組織に生理的変化を結果として生じるために必要な量を指す。
【００８８】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な投薬量および時間で有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、例えば、疾患の有害作用を除去する、減少させる、遅延させる、最小限にするまたは予防する。
【００８９】
「個体」または「対象」は、哺乳類である。哺乳類には、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、それに限定されない。特に、個体または対象は、ヒトである。
【００９０】
「薬学的組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物活性を有効にさせるような形態の調製物であって、組成物が投与される対象に容認できないほど有毒な追加的な成分を含有しない調製物を指す。
【００９１】
「薬学的に許容される担体」は、有効成分以外の、薬学的組成物中の対象に無毒な成分を指す。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、それに限定されない。
【００９２】
本明細書に使用される、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変形）は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防のためまたは臨床病理経過中のいずれかに行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症候の緩和、疾患の任意の直接または間接的病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患の進行速度を減少させること、病態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、それに限定されない。一部の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、疾患の発生を遅らせるため、または疾患の進行を減速するために使用される。
【００９３】
実施形態の詳細な説明
突然変異ＩＬ−２ポリペプチド
本発明によるイムノコンジュゲートは、免疫療法のための有利な特性を有する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含む。特に、毒性の原因となるが、ＩＬ−２の有効性に必須ではないＩＬ−２の薬理的特性は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドから除去される。このような突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、その全内容が本明細書に参照により援用されるＷＯ２０１２／１０７４１７に詳細に記載されている。上記のように、ＩＬ−２受容体の異なる形態は、異なるサブユニットからなり、ＩＬ−２に対して異なる親和性を示す。βおよびγ受容体サブユニットからなる中親和性ＩＬ−２受容体は、静止エフェクター細胞上に発現され、ＩＬ−２シグナル伝達するために十分である。この受容体のα−サブユニットを追加的に含む高親和性ＩＬ−２受容体は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上のみならず、活性化エフェクター細胞上に主として発現され、そこで、ＩＬ−２による結合が、それぞれＴｒｅｇ細胞媒介性免疫抑制または活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を促進することができる。したがって、理論に縛られることを望むわけではないが、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対するＩＬ−２の親和性を低減または消失させることは、制御性Ｔ細胞によるエフェクター細胞機能のＩＬ−２誘導性下方制御およびＡＩＣＤ過程による腫瘍寛容の発生を低減するはずである。他方、中親和性ＩＬ−２受容体に対する親和性を維持することは、ＩＬ−２によるＮＫ細胞およびＴ細胞のようなエフェクター細胞の増殖および活性化の誘導を保つはずである。
【００９４】
本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる突然変異インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドは、それぞれ野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を消失または低減させ、かつ中親和性ＩＬ−２受容体に対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を保つ、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。
【００９５】
ＣＤ２５に対する親和性が減少したヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）突然変異体は、例えば、アミノ酸３５、３８、４２、４３、４５もしくは７２位またはそれらの組み合わせ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）でのアミノ酸置換により生成され得る。例示的なアミノ酸置換には、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋが含まれる。本発明のイムノコンジュゲートに有用な特定のＩＬ−２突然変異体は、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５、もしくは７２、またはその組み合わせに対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、前記アミノ酸突然変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換、より具体的には、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇの群から選択されるアミノ酸置換である。これらの突然変異体は、中親和性ＩＬ−２受容体に対して実質的に類似の結合親和性を示し、野生型形態のＩＬ−２突然変異体と比較して、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットおよび高親和性ＩＬ−２受容体に対して実質的に低減した親和性を有する。
【００９６】
有用な突然変異体の他の特性には、ＩＬ−２受容体担持Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ−２受容体担持Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞においてＩＬ−２シグナル伝達を誘導する能力、ＮＫ細胞によりインターフェロン（ＩＦＮ）−γを第２のサイトカインとして生成する能力、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）により第２のサイトカイン、特にＩＬ−１０およびＴＮＦ−αの同化を誘導する能力の低減、制御性Ｔ細胞を活性化する能力の低減、Ｔ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力の低減、ならびに低減したインビボ毒性プロファイルが含まれる場合がある。
【００９７】
本発明に有用な特定の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を消失または低減させるが、中親和性ＩＬ−２受容体に対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を保つ３つのアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、前記３つのアミノ酸突然変異は、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５および７２に対応する位置にある。一実施形態では、前記３つのアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、前記３つのアミノ酸突然変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。特定の実施形態では、前記３つのアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇである（配列番号１９のヒトＩＬ−２配列に対する番号付け）。
【００９８】
ある特定の実施形態では、前記アミノ酸突然変異は、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を５分の１以下、具体的には１０分の１以下、より詳細には２５分の１以下に低減する。ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を低減する１つよりも多いアミノ酸突然変異がある実施形態では、これらのアミノ酸突然変異の組み合わせは、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を３０分の１以下、５０分の１以下、またはさらには１００分の１以下に低減し得る。一実施形態では、前記アミノ酸突然変異またはアミノ酸突然変異の組み合わせは、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を消失させることにより、結合は、表面プラズモン共鳴により検出不能である。
【００９９】
ＩＬ−２突然変異体が、中親和性ＩＬ−２受容体に対する野生型形態のＩＬ−２突然変異体の親和性の約７０％超を示す場合、中親和性受容体への実質的に類似の結合性、すなわち前記受容体に対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性の保存が達成される。本発明のＩＬ−２突然変異体は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示す場合がある。
【０１００】
ＩＬ−２のＯ−グリコシル化の除去と組み合わせたＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対するＩＬ−２の親和性の低減は、改善した特性を有するＩＬ−２タンパク質を結果として生じる。例えば、Ｏ−グリコシル化部位の除去は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞などの哺乳類細胞において発現される場合、結果としてより均質な産物を生じる。
【０１０１】
したがって、ある特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置のＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を除去する追加的なアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置のＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を除去する前記追加的なアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換には、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、およびＴ３Ｐが含まれる。特定の実施形態では、前記追加的なアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換Ｔ３Ａである。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、本質的に完全長ＩＬ−２分子である。ある特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２分子である。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、前記突然変異を有さない配列番号１９を含むＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を消失または低減させるが、中親和性ＩＬ−２受容体に対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を保つ、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する配列番号１９の配列を含む。別の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、前記突然変異を有さない配列番号２９を含むＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を消失または低減させるが、中親和性ＩＬ−２受容体に対する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を保つ、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する配列番号２９の配列を含む。
【０１０３】
特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、およびＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞傷害性からなる群から選択される１つまたは複数の細胞応答を誘発することができる。
【０１０４】
一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して制御性Ｔ細胞においてＩＬ−２シグナル伝達を誘導する低減した能力を有する。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して小さい活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をＴ細胞において誘導する。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して低減したインビボ毒性プロファイルを有する。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して延長した血清半減期を有する。
【０１０５】
本発明に有用な特定の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２の残基３、４２、４５および７２に対応する位置に４つのアミノ酸置換を含む。特異的アミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇである。ＷＯ２０１２／１０７４１７に示されるように、前記四重突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ＣＤ２５に対する検出不能の結合性、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導する低減した能力、Ｔｒｅｇ細胞においてＩＬ−２シグナル伝達を誘導する低減した能力、および低減したインビボ毒性プロファイルを示す。しかし、これは、エフェクター細胞においてＩＬ−２シグナル伝達を活性化する、エフェクター細胞の増殖を誘導する、およびＮＫ細胞によりＩＦＮ−γを第２のサイトカインとして生成する能力を保持する。
【０１０６】
そのうえ、前記突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ＷＯ２０１２／１０７４１７に記載されたような、低減した表面疎水性、良好な安定性、および良好な発現収率などのさらなる有利な特性を有する。予想外に、前記突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、また、野生型ＩＬ−２と比較して延長した血清半減期を提供する。
【０１０７】
本発明に有用なＩＬ−２突然変異体は、ＣＤ２５またはグリコシル化部位とのＩＬ−２の接触面を形成するＩＬ−２領域に突然変異を有することに加えて、また、これらの領域外のアミノ酸配列に１つまたは複数の突然変異を有する場合がある。ヒトＩＬ−２におけるこのような追加的な突然変異は、発現または安定性の増加などの追加的な利点を提供し得る。例えば、１２５位のシステインは、米国特許第４，５１８，５８４号に記載されたように、セリン、アラニン、スレオニンまたはバリンなどの中性アミノ酸により置き換えられ、それぞれ、Ｃ１２５Ｓ  ＩＬ−２、Ｃ１２５Ａ  ＩＬ−２、Ｃ１２５Ｔ  ＩＬ−２またはＣ１２５Ｖ  ＩＬ−２が得られる場合がある。本明細書に記載されるように、また、ＩＬ−２のＮ末端アラニン残基が欠失され、ｄｅｓ−Ａ１  Ｃ１２５Ｓまたはｄｅｓ−Ａ１  Ｃ１２５Ａなどの突然変異体が得られる場合がある。代替的または接続的に、ＩＬ−２突然変異体は、野生型ヒトＩＬ−２の１０４位に通常存在するメチオニンが、アラニンなどの中性アミノ酸により置き換えられた突然変異を含む場合がある（米国特許第５，２０６，３４４号参照）。結果として生じる突然変異体、例えば、ｄｅｓ−Ａ１  Ｍ１０４Ａ  ＩＬ−２、ｄｅｓ−Ａ１  Ｍ１０４Ａ  Ｃ１２５Ｓ  ＩＬ−２、Ｍ１０４Ａ  ＩＬ−２、Ｍ１０４Ａ  Ｃ１２５Ａ  ＩＬ−２、ｄｅｓ−Ａ１  Ｍ１０４Ａ  Ｃ１２５Ａ  ＩＬ−２、またはＭ１０４Ａ  Ｃ１２５Ｓ  ＩＬ−２（これらおよび他の突然変異体は、米国特許第５，１１６，９４３号およびＷｅｉｇｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８０、２９５−３００（１９８９）に見出される場合がある）は、本発明の特定のＩＬ−２突然変異と併せて使用される場合がある。
【０１０８】
したがって、ある特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置に追加的なアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、前記追加的なアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。
【０１０９】
当業者は、どの追加的な突然変異が本発明のために追加的な利点を提供し得るかを決定することができる。例えば、当業者は、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８ＲまたはＱ１２６Ｄなどの、中親和性ＩＬ−２受容体に対するＩＬ−２の親和性を低減または消失させるＩＬ−２配列中のアミノ酸突然変異（例えば、ＵＳ２００７／００３６７５２参照）が、本発明による突然変異ＩＬ−２ポリペプチド中に含まれるのに適さない場合があることを認識している。
【０１１０】
一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ−２配列、例えば、配列番号１９のヒトＩＬ−２配列と比較して、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、または５個以下のアミノ酸突然変異を含む。特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ−２配列、例えば、配列番号１９のヒトＩＬ−２配列と比較して、５個以下のアミノ酸突然変異を含む。
【０１１１】
一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２０の配列を含む。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２０の配列からなる。
【０１１２】
イムノコンジュゲート
本明細書に記載されるイムノコンジュゲートは、ＩＬ分子および抗体を含む。このようなイムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍微小環境にＩＬ−２を直接標的化することによりＩＬ−２療法の有効性を顕著に増加させる。本発明によると、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、全抗体もしくは免疫グロブリン、または抗原特異的結合親和性などの生物学的機能を有するその一部分もしくは変異体であり得る。
【０１１３】
イムノコンジュゲート療法の一般的な利点は、容易に明らかである。例えば、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、腫瘍特異的エピトープを認識し、その結果、イムノコンジュゲート分子を腫瘍部位に標的化する。したがって、高濃度のＩＬ−２を腫瘍微小環境に送達することができ、それにより、結果として非コンジュゲートＩＬ−２に必要な用量よりもずっと低い用量のイムノコンジュゲートを使用して、本明細書に言及される多様な免疫エフェクター細胞の活性化および増殖をもたらすことができる。そのうえ、イムノコンジュゲートの形態のＩＬ−２の適用は、このサイトカイン自体をより低い用量にさせるので、ＩＬ−２の望ましくない副作用の潜在性が限定される。イムノコンジュゲートにより身体の特定部位にＩＬ−２を標的化することも、結果として、全身曝露を低減することで、非コンジュゲートＩＬ−２で得られるよりも低い副作用をもたらし得る。加えて、非コンジュゲートＩＬ−２と比較して、イムノコンジュゲートの増大した循環半減期は、イムノコンジュゲートの有効性の一因になる。しかし、ＩＬ−２イムノコンジュゲートのこの特徴は、また、ＩＬ−２分子の潜在的副作用を悪化させる場合があり、非コンジュゲートＩＬ−２と比べた血流中のＩＬ−２イムノコンジュゲートの有意に長い循環半減期のせいで、融合タンパク質分子のＩＬ−２または他の部分が、脈管構造中に一般的に存在する成分を活性化する可能性が高まる。結果として循環中のＩＬ−２の半減期延長を生じる、Ｆｃまたはアルブミンなどの別の部分と融合したＩＬ−２を含有する他の融合タンパク質に、同じ懸念事項が当てはまる。したがって、野生型形態のＩＬ−２と比較して低減した毒性を有する、本明細書およびＷＯ２０１２／１０７４１７に記載されるような突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートが、特に有利である。
【０１１４】
本明細書の上記に記載するように、ＩＬ−２を腫瘍細胞よりも免疫エフェクター細胞に直接標的化することが、ＩＬ−２免疫療法にとって有利であり得る。
【０１１５】
したがって、本発明は、本明細書の前記に記載された突然変異ＩＬ−２ポリペプチドおよびＰＤ−１に結合する抗体を提供する。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドおよび抗体は、融合タンパク質を形成し、すなわち、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、抗体とペプチド結合を共有する。一部の実施形態では、抗体は、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸でＦｃドメインのサブユニットのうち１つのカルボキシ末端アミノ酸と、場合によりリンカーペプチドを通じて融合されている。一部の実施形態では、抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、より詳細には、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である。このような一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のうち１つとアミノ末端ペプチド結合を共有する。ある特定の実施形態では、抗体は、抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ分子またはｓｃＦｖ分子である。一実施形態では、抗体は、Ｆａｂ分子である。別の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖ分子である。イムノコンジュゲートは、また、１種よりも多い抗体を含み得る。１つよりも多い抗体、例えば、第１および第２の抗体が、イムノコンジュゲート中に含まれる場合、各抗体は、独立して、様々な形態の抗体および抗体断片から選択することができる。例えば、第１の抗体は、Ｆａｂ分子であり得、第２の抗体は、ｓｃＦｖ分子であり得る。特定の実施形態では、前記第１および前記第２の抗体のそれぞれは、ｓｃＦｖ分子である、または前記第１および前記第２の抗体のそれぞれは、Ｆａｂ分子である。特定の実施形態では、前記第１および前記第２の抗体のそれぞれは、Ｆａｂ分子である。一実施形態では、前記第１および前記第２の抗体のそれぞれは、ＰＤ−１に結合する。
【０１１６】
イムノコンジュゲートの形式
例示的なイムノコンジュゲートの形式は、その全内容が本明細書に参照により援用されるＰＣＴ公報ＷＯ２０１１／０２０７８３に記載されている。これらのイムノコンジュゲートは、少なくとも２種の抗体を含む。したがって、一実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲートは、本明細書に記載の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、少なくとも第１および第２の抗体とを含む。特定の実施形態では、前記第１および第２の抗体は、Ｆｖ分子、特にｓｃＦｖ分子、およびＦａｂ分子からなる群から独立して選択される。特定の実施形態では、前記突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、前記第１の抗体とアミノまたはカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第２の抗体は、ｉ）突然変異ＩＬ−２ポリペプチドまたはｉｉ）第１の抗体のいずれかとアミノまたはカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、１つまたは複数のリンカー配列により連結された、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、第１および第２の抗体、特にＦａｂ分子とから本質的になる。このような形式は、それらが標的抗原（ＰＤ−１）と高い親和性で結合するが、ＩＬ−２受容体とモノマー性の結合だけを提供することで、標的部位以外の位置でＩＬ−２受容体担持免疫細胞にイムノコンジュゲートを標的化することを回避するという利点を有する。特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子は、第１の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドとアミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子とカルボキシ末端ペプチドを共有する。特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、第１の重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の重鎖可変領域とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の軽鎖可変領域とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の重鎖または軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合により突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと繋がり、さらに、アミノ末端ペプチド結合により第２の重鎖または軽鎖可変領域と繋がっている。別の実施形態では、第１の重鎖または軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合により突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと繋がり、さらに、カルボキシ末端ペプチド結合により第２の重鎖または軽鎖可変領域と繋がっている。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、第１のＦａｂ重鎖または軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖または軽鎖とアミノ末端ペプチド結合と共有する。別の実施形態では、第１のＦａｂ重鎖または軽鎖は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖または軽鎖とアミノ末端ペプチド結合を共有する。他の実施形態では、第１のＦａｂ重鎖または軽鎖は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドとアミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖または軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施形態では、イムノコンジュゲートは、１つまたは複数のｓｃＦｖ分子とアミノ末端ペプチド結合を共有する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドであって、さらに、１つまたは複数のｓｃＦｖ分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含む。
【０１１７】
しかし、本発明によるイムノコンジュゲートに特に適した形式は、抗体として免疫グロブリン分子を含む。このようなイムノコンジュゲートの形式は、その全内容が本明細書に参照により援用されるＷＯ２０１２／１４６６２８に記載されている。
【０１１８】
したがって、特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、本明細書に記載される突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より詳細にはＩｇＧ１分子とを含む。一実施形態では、イムノコンジュゲートは、１つ以下の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含む。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、ヒトである。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、ヒト定常領域、例えば、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＬドメインを含む。一実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、免疫グロブリン分子とアミノまたはカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施形態では、イムノコンジュゲートは、本質的に、１つまたは複数のリンカー配列により繋がった、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より詳細にはＩｇＧ１分子とからなる。特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、場合によりリンカーペプチドを通じて、免疫グロブリン重鎖のうち１つのカルボキシ末端アミノ酸と融合されている。
【０１１９】
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、直接、または１つもしくは複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むリンカーペプチドを通じて、抗体と融合されている場合がある。リンカーペプチドは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。適切な非免疫原性リンカーペプチドには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎリンカーペプチドが含まれる。「ｎ」は、一般的に、１〜１０、典型的には２〜４の整数である。一実施形態では、リンカーペプチドは、少なくとも５アミノ酸長、一実施形態では、５〜１００、さらなる実施形態では１０〜５０アミノ酸長を有する。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、１５アミノ酸長を有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍ［Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン］（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５もしくは６、およびｍ＝０、１、２もしくは３）または（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４もしくは５およびｍ＝０、１、２もしくは３）であり、一実施形態では、ｘ＝４およびｎ＝２または３であり、さらなる実施形態では、ｘ＝４およびｎ＝３である。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２１）である。一実施形態では、リンカーペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する（またはそれからなる）。
【０１２０】
特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、突然変異ＩＬ−２分子と、ＰＤ−１に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子とを含み、その際、突然変異ＩＬ−２分子は、そのアミノ末端アミノ酸で配列番号２１のリンカーペプチドを通じて免疫グロブリン重鎖のうち１つのカルボキシ末端アミノ酸と融合されている。
【０１２１】
特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、突然変異ＩＬ−２分子と、ＰＤ−１に結合する抗体とを含み、その際、抗体は、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、突然変異ＩＬ−２分子は、そのアミノ末端アミノ酸で配列番号２１のリンカーペプチドを通じてＦｃドメインのサブユニットのうち１つのカルボキシ末端アミノ酸と融合されている。
【０１２２】
ＰＤ−１抗体
本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、ＰＤ−１、特にヒトＰＤ−１に結合し、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを、ＰＤ−１が発現している標的部位に、特に、例えば腫瘍と関連するＰＤ−１を発現するＴ細胞に方向付けることができる。
【０１２３】
本発明のイムノコンジュゲートに使用され得る適切なＰＤ−１抗体は、その全内容が本明細書に参照により援用されるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３２４８に記載されている。
【０１２４】
本発明のイムノコンジュゲートは、同じまたは異なる抗原に結合し得る２種以上の抗体を含む場合がある。しかし、特定の実施形態では、これらの抗体のそれぞれがＰＤ−１に結合する。一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、単一特異性である。特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、単一の、単一特異性抗体、特に単一特異性免疫グロブリン分子を含む。
【０１２５】
抗体は、ＰＤ−１、特にヒトＰＤ−１に対する特異的結合性を保持する任意の種類の抗体またはその断片であり得る。抗体断片には、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、およびＦ（ａｂ’）２分子が含まれるが、それに限定されない。しかし、特定の実施形態では、抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、抗体は、免疫グロブリン、特にＩｇＧクラス、より詳細にはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。
【０１２６】
一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１２７】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、Ｋａｂａｔ番号付けによる７１〜７３位に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、およびＫａｂａｔ番号付けによる７１〜７３位に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒト化可変領域である。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒト化可変領域である。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１３２】
特定の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＬドメインを含むＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３１および３２（それぞれヒトカッパＣＬドメインおよびラムダＣＬドメイン）ならびに配列番号３３（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示される。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列、特に配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されるＦｃドメイン中にアミノ酸突然変異を含み得る。
【０１３４】
Ｆｃドメイン
特定の実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖のペアからなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、その各サブユニットは、ＣＨ２  ＩｇＧ重鎖定常ドメインおよびＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、相互に安定に会合することができる。一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、１つ以下のＦｃドメインを含む。
【０１３５】
一実施形態では、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３８、８４−９１（２０１０））。さらなる特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。さらにより特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号３０に示される。
【０１３６】
ヘテロダイマー化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明によるイムノコンジュゲートは、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち一方または他方と融合した、突然変異ＩＬ−２ポリペプチド、特に単一（１つ以下の）突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には、２つの非同一ポリペプチド鎖中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現およびそれに続くダイマー化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え産生におけるイムノコンジュゲートの収量および純度を改善するために、抗体のＦｃドメイン中に所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
【０１３７】
したがって、特定の実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範囲のタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中である。したがって、一実施形態では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中である。
【０１３８】
ヘテロダイマー化を強化するためにＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中に修飾を行うためのいくつかの手法が存在し、それらは、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１に十分に記載されている。典型的には、全てのこのような手法では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、両方とも、相補的に操作され、それにより、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）は、それ自体ともはやホモダイマー化できず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインと強制的にヘテロダイマー化される（それにより、第１のＣＨ３ドメインと第２のＣＨ３ドメインは、ヘテロダイマー化し、２つの第１のＣＨ３ドメインまたは２つの第２のＣＨ３ドメインの間のホモダイマー化は形成しない）。
【０１３９】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つに「ノブ」修飾およびＦｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つに「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。
【０１４０】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、ＵＳ５，７３１，１６８；ＵＳ７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９、６１７−６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８、７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、隆起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの接触面に、対応する空洞（「ホール」）を第２のポリペプチドの接触面に導入することを伴い、それにより、ヘテロダイマーの形成を促進し、ホモダイマーの形成を妨害するように隆起を空洞中に配置できる。第１のポリペプチドの接触面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）により置き換えることにより、隆起が構築される。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）により置き換えることによって、隆起と同一または類似のサイズの代償的な空洞が、第２のポリペプチドの接触面に創出される。
【０１４１】
したがって、特定の実施形態では、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能な、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起を内部に配置可能な、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞が生成する。
【０１４２】
好ましくは、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【０１４３】
好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【０１４４】
隆起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることにより、例えば、部位特異的突然変異誘発により、またはペプチド合成により作製することができる。
【０１４５】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基は、トリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）により置き換えられ、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基は、バリン残基（Ｙ４０７Ｖ）により置き換えられる。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３６６位のスレオニン残基は、セリン残基（Ｔ３６６Ｓ）により置き換えられ、３６８位のロイシン残基は、アラニン残基（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）により置き換えられる。
【０１４６】
なおさらなる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、３５４位のセリン残基は、システイン残基（Ｓ３５４Ｃ）により置き換えられ、または３５６位のグルタミン酸残基は、システイン残基により置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基は、システイン残基により置き換えられ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基は、システイン残基（Ｙ３４９Ｃ）により置き換えられる（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成を結果として生じ、さらにダイマーを安定化する（Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８、７−１５（２００１））。
【０１４７】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１４８】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、追加的に、アミノ酸置換Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１４９】
特定の実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、Ｆｃドメイン（「ノブ」修飾を含む）の第１のサブユニットと融合されている（場合によりリンカーペプチドを通じて）。理論に縛られることを望むわけではないが、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットとの融合は、２つの突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートの生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）を（さらに）最小限にする。
【０１５０】
ヘテロダイマー化を強制するＣＨ３修飾の他の技術は、本発明による代替として考えられ、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、ＷＯ２０１３／０９６２９１に記載されている。
【０１５１】
一実施形態では、ＥＰ１８７０４５９に記載されたヘテロダイマー化手法が、代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン接触面の特異的アミノ酸位置に、反対荷電を有する荷電アミノ酸を導入することに基づく。本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体に好ましい一実施形態は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインのうち１つにおけるアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０ＥおよびＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方の１つにおけるアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｔ３６６ＷおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、ならびに追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０ＥおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含む、または前記抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、ならびに追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０ＥおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（全て、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５４】
一実施形態では、ＷＯ２０１３／１５７９５３に記載されたヘテロダイマー化手法が、代替的に使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９ＤおよびＬ３６８Ｅから選択されるアミノ酸突然変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５５】
一実施形態では、ＷＯ２０１２／０５８７６８に記載されたヘテロダイマー化手法が、代替的に使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、またはＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１ＥまたはＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９ＹまたはＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、またはＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＶまたはＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＦまたはＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）から選択されるさらなるアミノ酸突然変異を含む。さらなる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９ＲおよびＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５６】
一実施形態では、ＷＯ２０１１／１４３５４５に記載されたヘテロダイマー化手法は、例えば、３６８および４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸修飾を有して代替的に使用される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５７】
一実施形態では、同じく、上記ノブ・イントゥー・ホール技術を使用する、ＷＯ２０１１／０９０７６２に記載されるヘテロダイマー化手法が、代替的に使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５８】
一実施形態では、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体またはそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスであり、ＷＯ２０１０／１２９３０４に記載されるヘテロダイマー化手法が、代替的に使用される。
【０１５９】
代替的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの修飾促進会合は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電操縦効果を媒介している修飾を含む。一般的にこの方法は、ホモダイマー形成が、静電的に不利になるが、ヘテロダイマー化が静電的に有利になるような、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面での１つまたは複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基による置き換えを伴う。このような一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸によるＫ３９２またはＮ３９２のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２ＤまたはＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、またはＥ３５７のアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、またはＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸によるＫ４０９またはＲ４０９のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９ＤまたはＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９および／またはＫ３７０のアミノ酸置換をさらにまたは代替的に含む（全て、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６０】
なおさらなる実施形態では、ＷＯ２００７／１４７９０１に記載されたヘテロダイマー化手法が、代替的に使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、およびＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、およびＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６１】
なお別の実施形態では、ＷＯ２００７／１１０２０５に記載されたヘテロダイマー化手法を代替的に使用することができる。
【０１６２】
一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６３】
Ｆｃ受容体の結合性および／またはエフェクター機能を低減するＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、標的組織中での良好な蓄積および好都合な組織−血液分布比の原因となる長い血清半減期を含む、好都合な薬物動態特性をイムノコンジュゲートに付与する。しかし、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原担持細胞よりもむしろＦｃ受容体発現細胞へのイムノコンジュゲートの望まれない標的化をもたらすおそれがある。そのうえ、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化は、ＩＬ−２ポリペプチドおよびイムノコンジュゲートの長い半減期と共に、全身投与されたときにサイトカイン受容体の過度の活性化および重症の副作用を生じる、サイトカイン放出をもたらし得る。これと一致して、通常のＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートは、急性輸液反応と関連すると記載されている（例えば、Ｋｉｎｇら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２、４４６３−４４７３（２００４）を参照されたい）。
【０１６４】
したがって、特定の実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインは、ネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性および／または低減したエフェクター機能を示す。このような一実施形態では、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体）は、ネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（もしくはネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、Ｆｃ受容体に対して５０％未満、好ましくは２０％未満、；より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合親和性、および／またはネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメイン（もしくはネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメインドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体）は、Ｆｃ受容体と実質的に結合せず、かつ／またはエフェクター機能を誘導しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびサイトカイン分泌の群から選択される１つまたは複数である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に類似の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に類似の結合性は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体）が、ＦｃＲｎに対して、ネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（またはネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗体）の結合親和性の約７０％超、特に約８０％超、より詳細には約９０％超を示す場合に達成される。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対して低減した結合親和性および／または低減したエフェクター機能を有するように操作される。特定の実施形態では、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性および／またはエフェクター機能を低減する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に同じ１つまたは複数のアミノ酸突然変異が存在する。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低減する。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を２分の１以下、５分の１以下、または１０分の１以下に低減する。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低減する、１つよりも多いアミノ酸突然変異がある実施形態では、これらのアミノ酸突然変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、１０分の１以下、２０分の１以下、またはさらには５０分の１以下に低減し得る。一実施形態では、操作Ｆｃドメインを含む抗体は、非操作Ｆｃドメインを含む抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対して２０％未満、特に１０％未満、より詳細には５％未満の結合親和性を示す。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合性は、低減される。一部の実施形態では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性が、また、低減される。一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低減されない。ＦｃＲｎに対する実質的に類似の結合性、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体）が、ＦｃＲｎに対する非操作形態のＦｃドメイン（または前記非操作形態のＦｃドメインを含む抗体）の結合親和性の約７０％超を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、または前記Ｆｃドメインを含む本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。ある特定の実施形態では、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して低減したエフェクター機能を有するように操作される。低減したエフェクター機能には、以下：低減した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、低減した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、低減した抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）、低減したサイトカイン分泌、低減した抗原提示細胞による補体媒介性抗原取り込み、ＮＫ細胞に対する低減した結合性、マクロファージに対する低減した結合性、単球に対する低減した結合性、多形核細胞に対する低減した結合性、低減したアポトーシス誘導直接シグナル伝達、低減した標的結合抗体の交差結合、低減した樹状細胞成熟、または低減したＴ細胞プライミングのうち１つまたは複数が含まれ得るが、それに限定されない。一実施形態では、低減したエフェクター機能は、低減したＣＤＣ、低減したＡＤＣＣ、低減したＡＤＣＰ、および低減したサイトカイン分泌の群から選択される１つまたは複数である。特定の実施形態では、低減したエフェクター機能は、低減したＡＤＣＣである。一実施形態では、低減したＡＤＣＣは、非操作Ｆｃドメイン（または非操作Ｆｃドメインを含む抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０１６６】
一実施形態では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性および／またはエフェクター機能を低減するアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換ならびにＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７およびＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施形態では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４およびＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」または「ＬＡＬＡＰＧ」）。具体的には、特定の実施形態では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基は、アラニン残基により置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基は、アラニン残基により置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基は、グリシン残基により置き換えられる（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、その全内容が本明細書に参照により援用されるＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されるように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（および補体）結合性をほぼ完全に消失させる。ＷＯ２０１２／１３０８３１は、また、このような突然変異Ｆｃドメインを調製する方法およびＦｃ受容体の結合性またはエフェクター機能などのその特性を決定するための方法を記載している。
【０１６７】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較してＦｃ受容体に対する低減した結合親和性および低減したエフェクター機能を示す。したがって、一部の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲート中に含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性および／またはそのエフェクター機能をさらに低減するために、一実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５およびＰ３２９にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン突然変異体およびそれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全内容が本明細書に参照により援用されるＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されている。
【０１６８】
特定の実施形態では、ネイティブなＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する低減した結合親和性および／または低減したエフェクター機能を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａおよび場合によりＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、またはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅおよび場合によりＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化は、除去されている。このような一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸突然変異、特にアスパラギンをアラニンにより（Ｎ２９７Ａ）またはアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）により置き換えるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７０】
本明細書の上およびＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されるＦｃドメインに加えて、低減したＦｃ受容体結合性および／またはエフェクター機能を有するＦｃドメインには、また、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうち１つまたは複数の置換を有するＦｃドメインが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうち２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる。
【０１７１】
突然変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的または化学的方法を使用するアミノ酸欠失、置換、挿入または修飾により調製することができる。遺伝的方法には、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成、およびその他が含まれる場合がある。正確なヌクレオチド変化は、例えば、配列決定により検証することができる。
【０１７２】
Ｆｃ受容体との結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装を使用して、ＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は、組換え発現により得られる場合がある。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む抗体の結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現しているヒトＮＫ細胞などの特定のＦｃ受容体を発現することが公知の細胞株を使用して評価される場合がある。
【０１７３】
Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３、７０５９−７０６３（１９８６）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２、１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６、１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が、採用される場合がある（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的または追加的に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５、６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評定される場合がある。
【０１７４】
一部の実施形態では、補体成分、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合性は、低減される。したがって、低減したエフェクター機能を有するようにＦｃドメインが操作された一部の実施形態では、前記低減したエフェクター機能は、低減したＣＤＣを含む。Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む抗体が、Ｃ１ｑに結合することができ、それゆえにＣＤＣ活性を有するかどうかを判定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実施される場合がある。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイが行われる場合がある（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇら、Ｂｌｏｏｄ  １０１、１０４５−１０５２（２００３）；ならびにＣｒａｇｇおよびＧｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ  １０３、２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。
【０１７５】
ＦｃＲｎ結合性およびインビボクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ、Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）；ＷＯ２０１３／１２０９２９を参照されたい）。
【０１７６】
本発明の特定の態様
一態様では、本発明は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供し、
その際、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり；
抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７７】
一態様では、本発明は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供し、
その際、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２ＧおよびＣ１２５Ａ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり；
抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７８】
一態様では、本発明は、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供し、
その際、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７９】
本発明の上記態様のいずれかによる一実施形態では、抗体は、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＩｇＧクラスの免疫グロブリンであり、
その際、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基は、トリプトファン残基により置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基は、バリン残基により置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、場合により、３６６位のスレオニン残基は、セリン残基により置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基は、アラニン残基により置き換えられており（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、
さらに、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）。
【０１８０】
この実施形態では、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、配列番号２１のリンカーペプチドを通じてＦｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸と融合されている場合がある。
【０１８１】
一態様では、本発明は、配列番号２２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３または配列番号２４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１８２】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載のイムノコンジュゲートまたはその断片をコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施形態では、前記断片は、抗原結合断片である。
【０１８３】
本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲート全体をコードする単一のポリヌクレオチドまたは共発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現される場合がある。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合または他の手段により会合して、機能的イムノコンジュゲートを形成する場合がある。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖部分と突然変異ＩＬ−２ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの部分と別のポリヌクレオチドによりコードされる場合がある。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合してイムノコンジュゲートを形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち１つと、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの部分が、２つのＦｃドメインサブユニットのうち他方を含むイムノコンジュゲートの部分と別のポリヌクレオチドによりコードされることができる。共発現されると、Ｆｃドメインサブユニットが会合してＦｃドメインを形成する。
【０１８４】
一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明によるイムノコンジュゲート全体をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明によるイムノコンジュゲートに含まれるポリペプチドをコードする。
【０１８５】
一実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体の重鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖）、および突然変異ＩＬ−２ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲート中に含まれる抗体の軽鎖をコードする。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。
【０１８７】
組換え方法
本発明に有用な突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、当該技術分野で周知の遺伝的または化学的方法を使用して、欠失、置換、挿入または修飾により調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成、およびその他を含む場合がある。正しいヌクレオチド変化は、例えば、配列決定により検証することができる。これに関して、ネイティブなＩＬ−２のヌクレオチド配列は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（Ｎａｔｕｒｅ  ３０２、３０５−１０（１９８３））により記載されており、ヒトＩＬ−２をコードする核酸は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）などの公的寄託期間から入手可能である。ネイティブなヒトＩＬ−２の配列は、配列番号１９に示される。置換または挿入は、天然および非天然アミノ酸残基を伴い得る。アミノ酸修飾には、グリコシル化部位の付加または糖の結合、およびその他などの周知の化学修飾法が含まれる。
【０１８８】
本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、固体ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）または組換え産生により得られる場合がある。組換え産生のために、例えば上記のようなイムノコンジュゲート（断片）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドが、単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つまたは複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、通常の手順を使用して容易に単離および配列決定され得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドのうち１つまたは複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが、提供される。当業者に周知の方法を使用して、イムノコンジュゲート（断片）のコード配列を、適切な転写／翻訳コントロールシグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載されている技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部の可能性があり、または核酸断片であり得る。発現ベクターは、イムノコンジュゲート（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわち、コード化領域）が、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳コントロールエレメントと動作可能に関連してクローニングされる、発現カセットを含む。本明細書に使用される「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないものの、存在する場合はコード化領域の一部と見なされる場合があるが、いかなるフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域、ならびにその他も、コード化領域の一部ではない。２つ以上のコード化領域が、例えば、単一のベクター上の単一のポリヌクレオチドコンストラクト、または例えば、別々の（異なる）ベクター上の別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に存在し得る。さらに、任意のベクターが、単一のコード化領域を含有する場合または２つ以上のコード化領域を含む場合があり、例えば、本発明のベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする場合があり、それらのポリペプチドは、翻訳後または翻訳と同時にタンパク質分解切断により最終タンパク質中に分離される。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明のイムノコンジュゲート、またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されたまたは融合されていない、異種コード化領域をコードする場合がある。異種コード化領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能的ドメインなどの専門のエレメントまたはモチーフが含まれるが、それに限定されない。動作可能な関連は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード化領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響またはコントロール下に置く方法で１つまたは複数の調節配列と関連する場合である。プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を結果として生じ、２つのＤＮＡ断片の間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力に干渉せず、ＤＮＡ鋳型が転写される能力にも干渉しないならば、２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード化領域およびそれに関連するプロモーターなど）は、「動作可能に関連している」。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の転写をプロモーターが引き起こすことができたならば、プロモーター領域は、その核酸と動作可能に関連している。プロモーターは、事前に決定された細胞だけにＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外に、他の転写コントロールエレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルは、ポリヌクレオチドと動作可能に関連して細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーターおよび他の転写コントロール領域が、本明細書に開示されている。多様な転写コントロール領域は、当業者に公知である。これらには、非限定的に、サイトメガロウイルス（例えば、最初期プロモーター、イントロン−Ａと併用）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどの脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域が含まれるが、それに限定されない。他の転写コントロール領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビン、ならびに真核細胞における遺伝子発現をコントロールすることができる他の配列などの脊椎動物遺伝子に由来するものが含まれる。追加的な適切な転写コントロール領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導可能プロモーター）が含まれる。同様に、多様な翻訳コントロールエレメントが、当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる配列内リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ）が含まれるが、それに限定されない。発現カセットは、複製開始点、および／もしくはレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントなどの他の特徴も含む場合がある。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加的なコード化領域と関連し得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を通過する成長中タンパク質鎖の搬出が開始された後、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端と融合されたシグナルペプチドを有し、それが、翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌型または「成熟」型のポリペプチドを産生することを認識している。例えば、ヒトＩＬ−２は、ポリペプチドのＮ末端に２０アミノ酸のシグナル配列を有して翻訳され、それが続いて切り離されて、１３３アミノ酸の成熟ヒトＩＬ−２を産生する。ある特定の実施形態では、ネイティブなシグナルペプチド、例えば、ＩＬ−２シグナルペプチドまたは免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、あるいはそれと動作可能に関連するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳類シグナルペプチド、またはその機能的誘導体が、使用される場合がある。例えば、野生型リーダー配列が、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置換される場合がある。
【０１９０】
その後の精製を容易にするまたはイムノコンジュゲートの標識を援助するために使用することができる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードするイムノコンジュゲート（断片）内またはその末端に含まれる場合がある。
【０１９１】
さらなる実施形態では、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が、提供される。ある特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞が、提供される。ポリヌクレオチドおよびベクターは、それぞれポリヌクレオチドおよびベクターと関係して、本発明に記載の特徴のうちいずれかを単一でまたは組み合わせて組み込む場合がある。このような一実施形態では、宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクターを含む（例えば、それで形質転換またはそれをトランスフェクトされている）。本明細書に使用される「宿主細胞」という用語は、本発明のイムノコンジュゲートまたはその断片を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。イムノコンジュゲートの発現を複製および支持するために適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターを必要に応じてトランスフェクトまたは形質導入される場合があり、大規模発酵槽に接種するために大量のベクター含有細胞を成長させて、臨床応用のために十分な量のイムノコンジュゲートを得ることができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核微生物、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞、もしくはその他などの様々な真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化が必要でない場合、ポリペプチドは、細菌において産生され得る。発現後、ポリペプチドが、細菌細胞ペーストから可溶型画分中に単離される場合があり、それをさらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生を結果として生じる真菌および酵母株を含む、ポリペプチドコードベクターに適したクローニング宿主または発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２、１４０９−１４１４（２００４）、およびＬｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４、２１０−２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と共に、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用され得る数多くのバキュロウイルス株が、同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用される場合がある。例えば、懸濁状態での成長に適応した哺乳類細胞株が、有用な場合がある。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ��６、５９（１９７７）に記載の２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２３、２４３−２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏ系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ３８３、４４−６８（１９８２）に記載）、ＭＲＣ  ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７、４２１６（１９８０））；ならびにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適したある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５−２６８頁（２００３）を参照されたい。宿主細胞には、いくつかを挙げるならば、培養細胞、例えば、哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞またはリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳類細胞である。
【０１９２】
これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当該技術分野で公知である。抗体の重鎖または軽鎖のいずれかと融合した突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを発現している細胞は、発現される突然変異ＩＬ−２融合産物が、重鎖および軽鎖の両方を有する抗体であるように、他方の抗体鎖も発現するように操作される場合がある。
【０１９３】
一実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲートを産生する方法であって、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、イムノコンジュゲートの発現に適した条件で培養すること、および場合により宿主細胞（または宿主細胞の培地）からイムノコンジュゲートを回収することを含む方法が提供される。
【０１９４】
本発明のイムノコンジュゲートでは、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、抗体と遺伝的に融合されている場合、または抗体と化学的にコンジュゲートされる場合がある。ＩＬ−２ポリペプチドと抗体との遺伝的融合は、ＩＬ−２配列がポリペプチドと直接またはリンカー配列を通じて間接的に融合されているように設計することができる。組成物およびリンカー長は、当該技術分野で周知の方法により決定される場合があり、有効性について試験される場合がある。特定のリンカーペプチドが、本明細書に記載されている。融合物の個別の成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加的な配列、所望により例えばエンドペプチダーゼ認識配列が含まれる場合もある。加えて、ＩＬ−２融合タンパク質は、また、当該技術分野で周知であるポリペプチド合成方法（例えば、メリフィールド固相合成）を使用して、化学的に合成される場合がある。突然変異ＩＬ−２ポリペプチドは、周知の化学的コンジュゲーション法を使用して、他の分子、例えば、抗体と化学的にコンジュゲートされる場合がある。当該技術分野で周知のホモ機能性およびヘテロ機能性架橋試薬などの二機能性架橋試薬をこの目的のために使用することができる。使用すべき架橋試薬の種類は、ＩＬ−２とカップリングすべき分子の性質に依存し、当業者により容易に同定されることができる。代替的または追加的に、コンジュゲートされることが意図される突然変異ＩＬ−２および／または分子が、化学的に誘導体化される場合があり、それにより、これら２つを当該技術分野でも周知のように別々の反応でコンジュゲートすることができる。
【０１９５】
本発明のイムノコンジュゲートは、抗体を含む。抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換え産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載のように）、または例えば可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに授与された米国特許第５，９６９，１０８号参照）。イムノコンジュゲート、抗体、およびそれを産生するための方法は、また、例えばＰＣＴ公報ＷＯ２０１１／０２０７８３、ＷＯ２０１２／１０７４１７、およびＷＯ２０１２／１４６６２８に詳細に記載されており、これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０１９６】
任意の動物種の抗体が、本発明のイムノコンジュゲートに使用される場合がある。本発明に有用な非限定的な抗体は、マウス、霊長類、またはヒト起源であり得る。イムノコンジュゲートが、ヒトの使用を目的とするならば、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化または完全ヒト型の抗体は、また、当該技術分野で周知の方法により調製することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに授与された米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性もしくは抗体機能の保持に重要な残基）を保持するまたは保持しないヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク領域および定常領域上に非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲをグラフトすること、（ｂ）ヒトフレームワーク領域および定常領域上に非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲもしくはａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）だけをグラフトすること、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによりそれらをヒト様区分で「覆い隠すこと」を含むが、それに限定されない様々な方法により達成される場合がある。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説があり、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフト化を記載している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「ガイド下選択」手法を記載している）にさらに記載されている。ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ｂｅｓｔ−ｆｉｔ」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）参照）；特定のサブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３）参照）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）参照）��ならびにＦＲライブラリーをスクリーニングすることに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）参照）が含まれるが、それに限定されない。
【０１９７】
当該技術分野で公知の様々な技術を使用してヒト抗体が産生され得る。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５、３６８−７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０、４５０−４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、抗原誘発に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製される場合がある。このような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン座位の全てまたは一部分を含有する。これらの座位は、内因性の免疫グロブリン座位を置き換える、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれる。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性の免疫グロブリン座位は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾される場合がある。
【０１９８】
ヒト抗体は、また、ハイブリドーマ−ベース法により作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体は、また、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。追加的な方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載された方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、また、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７−９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１９９】
ヒト抗体は、また、本明細書に記載のヒト抗体ライブラリーからの単離により生成され得る。
【０２００】
本発明に有用な抗体は、所望の１つまたは複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離される場合がある。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：４９８−５０８（２０１６）に概説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で多様な方法が公知である。このような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌら、ｍＡｂｓ  ８：１１７７−１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８：１８１７−１８２８（２０１２）およびＺｈａｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３６：２７６−２８９（２０１６）だけでなく、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）に概説がある。
【０２０１】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリー中にランダムに組み換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合性ファージについてファージライブラリーをスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：７２５−７３４（１９９３）により記載されるように、全く免疫化せずに広範囲の非自己抗原およびまた自己抗原に対する単一起源の抗体を提供することができる。最終的に、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒによりＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングすること、ならびに高可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロ再配列を達成するランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体のファージライブラリーを記載している特許公開には、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号；同第７，９８５，８４０号；同第７，７８５，９０３号および同第８，６７９，４９０号ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号および同第２００７／０２９２９３６号が含まれる。所望の１つまたは複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする、当該技術分野で公知の方法のさらなる例には、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイのみならず、細菌、哺乳類細胞、昆虫細胞または酵母細胞への抗体ディスプレイおよび選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０３：１３５−５６（２０１２）およびＣｈｅｒｆら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３１９：１５５−１７５（２０１５）のみならず、Ｚｈａｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８９：７３−８４（２０１２）に概説がある。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：５１３２−５１３４（１９９７）およびＨａｎｅｓら、ＰＮＡＳ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）に記載されている。
【０２０２】
本発明のイムノコンジュゲートのさらなる化学修飾が、望ましい場合がある。例えば、免疫原性および短い半減期の問題が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの実質的に直鎖のポリマーとのコンジュゲーションにより改善され得る（例えば、ＷＯ８７／０００５６参照）。
【０２０３】
本明細書に記載のように調製されたイムノコンジュゲートは、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびその他などの当技術分野において公知の技術により精製される場合がある。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の状況は、一部、実効電荷、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明白であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、イムノコンジュゲートが結合する抗体、リガンド、受容体または抗原を使用することができる。例えば、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと特異的に結合する抗体が、使用される場合がある。本発明のイムノコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡまたはプロテインＧを有するマトリックスが使用される場合がある。例えば、順次プロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載されるようにイムノコンジュゲートを単離することができる。イムノコンジュゲートの純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、およびその他を含む、多様な周知の分析法のいずれかにより決定することができる。
【０２０４】
組成物、製剤、および投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、下記の治療法のいずれかに使用するための、本明細書に記載のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートのいずれか、および少なくとも１つの追加的な治療剤、例えば下記の治療剤を含む。
【０２０５】
本発明のイムノコンジュゲートをインビボ投与に適した形態で産生する方法であって、（ａ）本発明によるイムノコンジュゲートを得ること、および（ｂ）イムノコンジュゲートを、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に製剤化することであって、イムノコンジュゲートの調製物が、インビボ投与のために製剤化されることを含む方法が、さらに提供される。
【０２０６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散された治療的有効量のイムノコンジュゲートを含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに一般的に無毒であり、すなわち、例えば必要に応じてヒトなどの動物に投与されたときに有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を産生しない、分子実体および組成物を指す。イムノコンジュゲートと、場合により追加的な有効成分とを含有する薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０により例示されるように、本開示に照らして当業者に公知である。そのうえ、動物（例えば、ヒト）の投与のために、調製物が、ＦＤＡ生物学的基準部署または他の国の相当する当局により要求される無菌状態、発熱性、全般安全性および純度基準に適合すべきであることが理解されている。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」には、任意および全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、当業者に公知の物質およびその組み合わせなどが含まれる（例えば、本明細書に参照により援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、１２８９−１３２９頁を参照されたい）。任意の一般的担体が有効成分と不適合な場合を除き、治療用組成物または薬学的組成物中でのその使用が考えられている。
【０２０７】
本発明のイムノコンジュゲート（および任意の追加的な治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内を含む、任意の適切な手段により、所望であれば局所治療、病巣内投与のために投与することができる。非経口点滴には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が急速または慢性であるかどうかに一部依存して、任意の適切な経路により、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によることができる。
【０２０８】
非経口組成物には、注射、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたものが含まれる。注射のために、本発明のイムノコンジュゲートは、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合するバッファー中に製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤を含有する場合がある。あるいは、イムノコンジュゲートは、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質不含水で構成するために粉末形態であり得る。滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に本発明のイムノコンジュゲートを所要の量で、必要に応じて、下に挙げた様々な他の成分と共に組み込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成され得る。一般的に、分散体は、基本分散媒および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に様々な滅菌有効成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁物またはエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過されたその液体培地から有効成分と、任意の追加的な所望の成分との粉末を回収する真空乾燥または凍結乾燥技術である。液体培地は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、最初に等張にされ、その後十分な食塩水またはグルコースと共に注射される。組成物は、製造および保存の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシンの混入は、最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満の安全レベルに保つべきであることが認識されている。適切な薬学的に許容される担体には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、それに限定されない。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン、またはその他などの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有する場合がある。場合により、懸濁液は、また、化合物の溶解度を増加させて、高濃度溶液の調製を可能にする、適切な安定剤または薬剤を含有する場合がある。追加的に、活性化合物の懸濁液が、必要に応じて油性注射用懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはエチルクレエート（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔｓ）もしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。
【０２０９】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に封入される場合がある。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）に開示されている。徐放性調製物が調製される場合がある。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。特定の実施形態では、注射用組成物の長期吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはその組み合わせなどの吸収遅延剤の組成物中での使用によりもたらすことができる。
【０２１０】
上記組成物に加えて、イムノコンジュゲートは、また、持効性製剤として製剤化される場合がある。このような長期作用製剤は、植え込み（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射により投与される場合がある。したがって、例えば、イムノコンジュゲートは、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、あるいはやや溶けにくい誘導体、例えば、やや溶けにくい塩として製剤化される場合がある。
【０２１１】
本発明のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスにより製造される場合がある。薬学的組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはタンパク質のプロセシングを促進する助剤を使用して、一般的な方法で、薬学的に使用できる調製物に製剤化される場合がある。妥当な製剤は、選ばれる投与経路に依存する。
【０２１２】
イムノコンジュゲートは、遊離酸または塩基、中性または塩形態として組成物に製剤化される場合がある。薬学的に許容される塩は、遊離酸または塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質様組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、あるいは例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸と形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、また、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することができる。薬学的な塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性溶媒および他のプロトン性溶媒中の溶解性が高い傾向にある。
【０２１３】
治療方法および組成物
本明細書に提供されるイムノコンジュゲートのいずれかが、治療方法に使用され得る。本発明のイムノコンジュゲートは、免疫療法剤として、例えば、がんの治療に使用される場合がある。
【０２１４】
治療方法に使用するために、本発明のイムノコンジュゲートは、医学行動規範と一致した様式で製剤化、用量決定、および投与される。これに関連して考慮するための要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳類、個別の患者の臨床状態、障害の経過、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画作成、および医学施術者に公知の他の要因が含まれる。
【０２１５】
本発明のイムノコンジュゲートは、宿主の免疫系の刺激が有益である病状、特に、増強した細胞性免疫応答が望ましい状態を治療するのに特に有用であり得る。これらには、宿主免疫応答が不十分または欠損している病状が含まれ得る。本発明のイムノコンジュゲートが投与され得る病状は、例えば、細胞性免疫応答が特異的免疫に重要なメカニズムである腫瘍または感染症である。本発明のイムノコンジュゲートは、それ自体で、または任意の適切な薬学的組成物として投与され得る。
【０２１６】
一態様では、医薬として使用するための本発明のイムノコンジュゲートが提供される。さらなる態様では、疾患の治療に使用するための本発明のイムノコンジュゲートが提供される。ある特定の実施形態では、治療方法に使用するための本発明のイムノコンジュゲートが提供される。一実施形態では、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための、本明細書に記載のイムノコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、治療的有効量のイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用するためのイムノコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、処置すべき疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、この方法は、個体に、治療的有効量の少なくとも１つの追加的な治療剤、例えば、治療すべき疾患ががんならば抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、免疫系の刺激に使用するためのイムノコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、有効量のイムノコンジュゲートを個体に投与して免疫系を刺激することを含む、個体における免疫系を刺激する方法に使用するためのイムノコンジュゲートを提供する。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、哺乳類、好ましくはヒトである。上記実施形態のいずれかによる「免疫系の刺激」には、免疫機能における全般的増加、Ｔ細胞機能における増加、Ｂ細胞機能における増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ−２受容体の発現における増加、Ｔ細胞応答性における増加、ナチュラルキラー細胞活性またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性における増加、およびその他のうち任意の１つまたは複数が含まれる場合がある。
【０２１７】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造または調製における本発明のイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施形態では、医薬は、それを必要とする個体における疾患の治療のためである。一実施形態では、医薬は、治療的有効量の医薬を、疾患を有する個体に投与することを含む、疾患を治療する方法に使用するためである。ある特定の実施形態では、治療すべき疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。一実施形態では、この方法は、治療的有効量の少なくとも１つの追加的な治療剤、例えば、治療すべき疾患ががんならば、抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、医薬は、免疫系を刺激するためである。さらなる実施形態では、医薬は、有効量の医薬を個体に投与して、免疫系を刺激することを含む、個体における免疫系を刺激する方法に使用するためである。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、哺乳類、好ましくはヒトであり得る。上記実施形態のいずれかによる「免疫系の刺激」には、免疫機能における全般的増加、Ｔ細胞機能における増加、Ｂ細胞機能における増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ−２受容体の発現における増加、Ｔ細胞応答性における増加、ナチュラルキラー細胞活性またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性における増加、およびその他のうち任意の１つまたは複数が含まれる場合がある。
【０２１８】
さらなる態様では、本発明は、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、治療的有効量の本発明のイムノコンジュゲートを、このような疾患を有する個体に投与することを含む。一実施形態では、薬学的に許容される形態で本発明のイムノコンジュゲートを含む組成物が、前記個体に投与される。ある特定の実施形態では、治療すべき疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、この方法は、治療的有効量の少なくとも１つの追加的な治療剤、例えば、治療すべき疾患ががんならば、抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、有効量のイムノコンジュゲートを個体に投与して免疫系を刺激することを含む、個体における免疫系を刺激するための方法を提供する。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、哺乳類、好ましくはヒトであり得る。上記実施形態のいずれかによる「免疫系の刺激」には、免疫機能における全般的増加、Ｔ細胞機能における増加、Ｂ細胞機能における増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ−２受容体の発現における増加、Ｔ細胞応答性における増加、ナチュラルキラー細胞活性またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性における増加、およびその他のうち任意の１つまたは複数が含まれる場合がある。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、治療すべき疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、および腎臓がんが含まれる。本発明のイムノコンジュゲートを使用して治療され得る他の細胞増殖障害には、腹、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれるが、それに限定されない。また、前がん状態または病変およびがん転移が含まれる。ある特定の実施形態では、がんは、腎臓がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、前立腺がんおよび膀胱がんからなる群から選ばれる。熟練の専門家は、多くの場合にイムノコンジュゲートが治癒を与えない場合があり、部分的利益だけを与える場合があることを容易に認識している。一部の実施形態では、いくらかの利益を有する生理的変化も、治療的に有益と見なされる。したがって、一部の実施形態では、生理的変化を与えるイムノコンジュゲートの量は、「有効量」または「治療的有効量」と見なされる。治療を必要とする対象、患者、または個体は、典型的には哺乳類、より詳細にはヒトである。
【０２２０】
一部の実施形態では、有効量の本発明のイムノコンジュゲートが、細胞に投与される。他の実施形態では、治療的有効量の本発明のイムノコンジュゲートが、疾患の治療のために個体に投与される。
【０２２１】
疾患の予防または治療のために、本発明のイムノコンジュゲート（単独で、または１つもしくは複数の他の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合）の適切な投薬量は、治療すべき疾患の種類、投与経路、患者の体重、分子の種類（例えば、Ｆｃドメインを含むまたは含まない）、疾患の重症度および経過、イムノコンジュゲートが予防目的それとも治療目的で投与されるか、事前のまたは同時的な治療的介入、患者の病歴およびイムノコンジュゲートに対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。投与を担当する施術者が、いずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度および個別の対象に適した用量を決定する。様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス点滴を含むが、それに限定されない様々な投与計画が、本明細書において考えられている。
【０２２２】
イムノコンジュゲートは、患者に単回、または一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のイムノコンジュゲートが、例えば、１つもしくは複数の別々の投与、または連続的注入のいずれにせよ、患者に投与するための初回候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。状態に応じて数日以上にわたる反復投与のために、治療は、病徴の所望の抑制が起こるまで、一般的に持続する。イムノコンジュゲートの１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の非限定的な例では、用量は、また、投与１回当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、およびその中から導き出せる任意の範囲を含み得る。本明細書に挙げられた数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記数字に基づき投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはその任意の組み合わせ）の１つまたは複数の用量が、患者に投与され得る。このような用量は、（例えば、患者が、イムノコンジュゲートを約２〜約２０、または例えば、約６用量受け入れるように）間欠的に、例えば、毎週または３週毎に投与される場合がある。より高い初回負荷用量に続く、１つまたは複数のより低い用量が投与され得る。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。この治療法の進歩は、一般的な技術およびアッセイにより容易に監視される。
【０２２３】
本発明のイムノコンジュゲートは、意図される目的を達成するために有効な量で一般的に使用される。病状を治療または予防するために使用するために、本発明のイムノコンジュゲートまたはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与または適用される。治療的有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内に十分入る。
【０２２４】
全身投与のために、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定することができる。次いで、用量を動物モデルで設定して、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用用量をより正確に決定することができる。
【０２２５】
初回投薬量は、また、当該技術分野で周知である技術を使用して、インビボデータ、例えば、動物モデルから推定することができる。当業者は、動物データに基づきヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０２２６】
投薬量および投薬間隔は、治療効果を維持するために十分なイムノコンジュゲートの血漿レベルを提供するために個別に調整される場合がある。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療有効血漿レベルは、毎日複数用量を投与することにより達成される場合がある。血漿中レベルは、例えば、ＨＰＬＣにより測定される場合がある。
【０２２７】
局所投与または選択的取り込みの場合、イムノコンジュゲートの有効局所濃度は、血漿濃度と無関係な場合がある。当業者は、過度の実験なしに治療有効局所投薬量を最適化することができる。
【０２２８】
本明細書に記載のイムノコンジュゲートの治療有効用量は、実質的な毒性を引き起こさずに治療上の利益を一般的に提供する。イムノコンジュゲートの毒性および治療的有効性は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物試験を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することができる。有毒作用と治療効果との間の用量比は、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる治療指数である。大きい治療指数を示すイムノコンジュゲートが好ましい。一実施形態では、本発明によるイムノコンジュゲートは、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトにおける使用に適した投薬量範囲を設定するのに使用することができる。投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さずにＥＤ５０を含む一連の循環濃度内にある。投薬量は、多様な要因、例えば、採用される剤形、利用される投与経路、対象の状態、およびその他に応じてこの範囲内で変動する場合がある。正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個別の医師により選ばれることができる。（例えば、その全内容が本明細書に参照により援用されるＦｉｎｇｌら、１９７５、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁を参照されたい）。
【０２２９】
本発明のイムノコンジュゲートを用いて治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全、およびその他のせいで投与をどのように、いつ終了、中断、または調整すべきか分かっている。逆に、主治医は、臨床応答が不十分（毒性を除く）ならば、治療をより高いレベルに調整することも分かっている。対象となる障害の管理における投与される用量の大きさは、治療すべき状態の重症度、投与経路、およびその他に応じて変動する。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価法により部分的に評価される場合がある。さらに、用量およびおそらく投薬回数は、また、個別の患者の年齢、体重、および応答に応じて変動する。
【０２３０】
本明細書に記載の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートの最大治療用量は、野生型ＩＬ−２を含むイムノコンジュゲートのために使用される用量から増加される場合がある。
【０２３１】
他の薬剤および治療
本発明によるイムノコンジュゲートは、療法において１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与される場合がある。例えば、本発明のイムノコンジュゲートは、少なくとも１つの追加的な治療剤と共に同時投与される場合がある。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体における症候または疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の適応に適した任意の有効成分、好ましくは相互に不利に影響しない相補活性を有する有効成分を含む場合がある。ある特定の実施形態では、追加的な治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシス活性化物質、またはアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施形態では、追加的な治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊物質、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシス活性化物質、または抗血管新生剤である。
【０２３２】
このような他の薬剤は、組み合わせで、意図される目的のために有効な量で適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるイムノコンジュゲートの量、障害または治療の種類、および上述の他の要因に依存する。イムノコンジュゲートは、一般的に、上記と同じ投薬量および投与経路で、または本明細書に記載の投薬量の約１〜９９％で、または適切であると経験的／臨床的に決定された任意の投薬量および経路により使用される。
【０２３３】
上述のこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別々の組成物中に含まれる場合）、および分別投与を包含し、この場合、本発明のイムノコンジュゲートの投与は、追加的な治療剤および／またはアジュバントの投与の前、それと同時、および／またはその後に起こり得る。本発明のイムノコンジュゲートは、また、放射線療法と組み合わせて使用される場合がある。
【０２３４】
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防および／または診断に有用な物質を含有する製造品が、提供される。製造品は、容器と、容器上または容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な物質から形成される場合がある。容器は、それ自体である、または状態を治療、予防および／もしくは診断するために有効な別の組成物と組み合わせた、組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明のイムノコンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、選ばれた状態を治療するために組成物が使用されることを示す。そのうえ、製造品は、（ａ）組成物がその中に含有される第１の容器であって、組成物が、本発明のイムノコンジュゲートを含む、第１の容器；および（ｂ）組成物がその中に含有される第２の容器であって、組成物が、さらなる細胞傷害性剤またはその他の治療剤を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物を使用して特定の状態を治療できることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的または追加的に、製造品は、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストローズ溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２（または第３）の容器をさらに含む場合がある。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、市販および使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含む場合がある。
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【実施例】
【０２３５】
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供される全般的な説明から、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０２３６】
実施例１
実施例１Ａ
ＰＤ１−ＩＬ２ｖ融合タンパク質の調製
抗体重鎖−インターロイキン−２（ＩＬ−２）融合タンパク質［抗ヒトＰＤ−１抗体の重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１重鎖（エフェクター機能の除去のための突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）、ならびにヘテロダイマー化のための突然変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）（「ノブ」）を担持する）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、およびヒトＩＬ−２ｖ（突然変異Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２ＧおよびＣ１２５Ａを担持する）］のための発現カセット、抗体重鎖［抗ヒトＰＤ−１抗体の重鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１重鎖（エフェクター機能の除去のための突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）、ヘテロダイマー化のための突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４１０Ｖ（ＥＵ番号付け）（「ホール」）、ならびに場合により突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）を担持する］のための発現カセットならびに抗体軽鎖［抗ヒトＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域、およびヒトＣカッパ定常領域］のための発現カセットを遺伝子合成により産生した。
【０２３７】
それぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ消化により、これらを、ＣＭＶ−プロモーターのコントロール下で、イントロンＡが続き、ＢＧＨ−ポリＡシグナルにより終止するように発現ベクター中にクローニングした。ベクターは、細菌性アンピシリン耐性遺伝子および大腸菌由来の複製開始点をさらに含有した。
【０２３８】
ヒトＰＤ１−ＩＬ−２ｖ融合タンパク質（配列番号２２、２４および２５）を、振盪フラスコ中で１：１：１の比の上記ベクターによるＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の共トランスフェクションにより生成した。１週間後に上清を回収し、滅菌フィルターを通して濾過した。
【０２３９】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの組み合わせにより、融合タンパク質を上清から精製した。質量分析により同一性について、ならびにキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）により純度、モノマー含有率および安定性などの分析特性について、得られた産物を特徴付けた。
【０２４０】
マウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖ融合タンパク質（配列番号３４〜３６）を同じように産生した。代用分子は、マウスＩｇＧ１抗マウスＰＤ−１抗体（エフェクター機能の除去およびヘテロダイマー化のためのＦｃ突然変異を担持する）と、ヒト分子と類似の突然変異を有するマウスインターロイキン−２とを含む。
【０２４１】
両方の融合タンパク質は、十分な収量で産生することができ、安定である。
【０２４２】
実施例１Ｂ
ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖ融合タンパク質の調製
抗体重鎖−インターロイキン−２（ＩＬ−２）融合タンパク質［抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１重鎖（エフェクター機能の除去のための突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）、ならびにヘテロダイマー化のための突然変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）（「ノブ」）を担持する）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、およびヒトＩＬ−２ｖ（突然変異Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２ＧおよびＣ１２５Ａを担持する）］のための発現カセット、抗体重鎖［抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１重鎖（エフェクター機能の除去のための突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）、ヘテロダイマー化のための突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４１０Ｖ（ＥＵ番号付け）（「ホール」）を担持する）］のための発現カセット、ならびに抗体軽鎖［抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖可変領域、およびヒトＣカッパ定常領域］のための発現カセットを遺伝子合成により産生した。抗体発現は、キメラＭＰＳＶプロモーターにより推進され、合成ポリＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に位置した。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有した。
【０２４３】
懸濁状態で成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、ポリエチレンイミンを使用して哺乳類発現ベクターを共トランスフェクトすることにより、分子を産生した。対応する発現ベクターを細胞に１：１：２の比（「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＩＬ２ｖ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」）でトランスフェクトした。
【０２４４】
トランスフェクションのために、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２５０ｍｇ／ｌ  Ｇ４１８培地を含有する無血清Ｅｘｃｅｌｌ培地中でＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を懸濁培養した。６００ｍｌチューブスピンフラスコ（最大稼働容積４００ｍＬ）中での産生のために、６億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を予め加温したＣＤ  ＣＨＯ培地２０ｍｌに交換した。発現ベクターをＣＤ  ＣＨＯ培地、２０ｍｌ中に混合し、最終量４００μｇのＤＮＡとした。ＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）１０８０μｌの添加後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌチューブスピンフラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、Ｅｘｃｅｌｌ＋６ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋５ｇ／Ｌ  Ｐｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭ  ＶＰＡ培地３６０ｍｌを添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後に７％  Ｆｅｅｄ  ７を添加した。７日間培養後、３６００×ｇで２０〜３０分間遠心分離することにより（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心分離機）、精製のための上清を集め、溶液をフィルター滅菌し（０．２２ｍｍフィルター）、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）で添加した。溶液を４℃に保った。
【０２４５】
ヒトＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖコンストラクト（配列番号３７〜３９）を、プロテインＡを用いた１つのアフィニティー段階（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、２５ｍｌで平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄することによって未結合のタンパク質を除去し、６カラム容積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０中に標的タンパク質を溶出した。１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０を添加することによってタンパク質溶液を中和した。標的タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０２４６】
マウスＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖコンストラクト（配列番号４０〜４２）を、プロテインＡを用いた１つのアフィニティー段階（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、同じように精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を２Ｍグリシン、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．６と１：１に混合し、１Ｍグリシン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．６、２５ｍｌで平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５  ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。少なくとも１０カラム容積の１Ｍグリシン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．６で洗浄することによって未結合のタンパク質を除去し、標的タンパク質を、６カラム容積の１Ｍグリシン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０中に溶出した。１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０を添加することによってタンパク質溶液を中和した。標的タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０２４７】
ヒトＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖの最終調製物は、モノマーを９９％含有し（２５℃の２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）で決定）、純度１００％を有した（非還元ＳＤＳキャピラリー電気泳動により、製造業者の説明書に従って使用したＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）で決定）。産生収量は、２３ｍｇ／Ｌであった。質量分析により、大部分は正しく集合した分子で、痕跡量（＜５％）の分子がインターロイキン−２を有さないことが明らかになった（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＮＵＣＬＥＯＧＥＬ  ＲＰ１０００−８、２５０ｍｍ×４．６ｍｍカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  ＧｍｂＨ）を用い、アセトニトリル−ギ酸勾配をかけて質量分析を行った）。
【０２４８】
マウス代用ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖについて、モノマー含有率は９６％、純度は１００％、産生収量は３．８ｍｇ／Ｌであった。
【０２４９】
実施例１Ｃ
マウス代用ＣＥＡ−ＩＬ２ｖおよびマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖの調製
抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成を低減するために、完全免疫適格マウスにおいてインビボ腫瘍モデルを使用するためのｍｕＣＥＡ−ｍｕＩＬ２ｖと呼ばれる（ｍｕＣＥＡ−ＩＬ２ｖとも呼ばれる）ＣＥＡ−標的化ＩＬ−２変異イムノサイトカインＣＥＡ−ＩＬ２ｖのマウス化代用分子を生成した。加えて、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成を低減するために、完全免疫適格マウスにおいてインビボ腫瘍モデルを使用するための、それぞれｍｕＦＡＰ−ｍｕＩＬ２ｖと呼ばれる（ｍｕＦＡＰ−ＩＬ２ｖとも呼ばれる）マウス化キメラバージョンのＦＡＰ−標的化ＩＬ−２変異イムノサイトカインＦＡＰ−ＩＬ２ｖを生成した。マウス化代用分子では、Ｆｃドメインのノブ・イントゥー・ホール突然変異は、ｍｕＩｇＧ１でのＤＤＫＫ突然変異により置き換えられ、ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ｇ突然変異は、ｍｕＩｇＧ１でのＤＡＰＧ突然変異により置き換えられていた（全体として参照により援用されるＰＣＴ出願ＷＯ２０１６／０３３０３５０Ａ１に開示）。
【０２５０】
例えば、ｍｕＣＥＡ−ｍｕＩＬ２ｖは、以下の特徴により特徴付けられる。親抗体として、ヒト（化）可変領域を有するが、マウス定常領域を有するヒト−マウスキメラＩｇＧ１抗体が適用される。潜在的な免疫原性を回避するために、対応するＢｌａｃｋ  ６アロタイプを使用した（Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔにより配列が公開されている）。ヒトＩＬ−２ｖに確認される突然変異と相同の３つの突然変異により、ｍｕＩＬ２Ｒαへの結合性は消失し、それぞれのＯ−グリコシル化部位を除去した：Ｔ２３Ａ（Ｏ−グリコ）、Ｆ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、Ｌ１０６Ｇ。加えて、アルデスロイキンのように、Ｃ１６０Ａ突然変異（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０４３５１に基づく番号付け、シグナルペプチドを含む）によりシステイン残基を突然変異させて、凝集を回避した。ｍｕＩｇＧ１は、すでに低減したＦｃγＲ結合性を有するものの、マウスＦｃγＲへの結合性は、ＤＡＰＧ突然変異（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）の導入により完全に消失し、それに対し、ｍｕＦｃＲｎ結合性は保持される。非免疫原性（Ｇ４Ｓ）２−コネクターだけを介して、ｍｕＩＬ−２ｖをｍｕＩｇＧ１抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合した。これを達成するために静電操縦を使用してＦｃドメインにおけるＤＤＫＫ突然変異を介してイムノサイトカインを操作して、マウスのバックグラウンドにおけるヘテロダイマー化を可能にした。
【０２５１】
ｍｕＣＥＡ−ｍｕＩＬ２ｖのポリペプチド配列は、以下の通りである：
ＤＤ突然変異を有し、ｍｕＩＬ２ｖが融合した重鎖（配列番号４４）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＡＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＩＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＮＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＤＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＤＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰＡＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＡＫＦＡＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＧＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＡＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
ＫＫ突然変異を有する重鎖（配列番号４５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＡＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＩＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＫＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＮＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＫＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ
軽鎖（配列番号４６）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＡＡＶＧＴＹＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＫＲＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
【０２５２】
ｍｕＦＡＰ−ｍｕＩＬ２ｖのポリペプチド配列は、以下の通りである：
ＤＤ突然変異を有し、ｍｕＩＬ２ｖが融合した重鎖（配列番号４７）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＩＧＳＧＡＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＷＦＧＧＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＡＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＩＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＮＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＤＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＤＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰＡＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＡＫＦＡＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＧＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＡＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
ＫＫ突然変異を有する重鎖（配列番号４８）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＩＧＳＧＡＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＷＦＧＧＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＡＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＩＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＫＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＮＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＫＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ
軽鎖（配列番号４９）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＴＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＮＶＧＳＲＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＧＩＭＬＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
【０２５３】
ｍｕＰＤ１のポリペプチド配列は、以下の通りである：
重鎖（配列番号５０）：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴＳＳＹＲＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＲＬＥＷＭＧＹＩＮＳＡＧＩＳＮＹＮＰＳＬＫＲＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＶＮＳＶＴＴＥＤＡＡＴＹＹＣＡＲＳＤＮＭＧＴＴＰＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＡＡＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＧＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫ
軽鎖（配列番号５１）：
ＤＩＶＭＴＱＧＴＬＰＮＰＶＰＳＧＥＳＶＳＩＴＣＲＳＳＫＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹＬＮＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＷＭＳＴＲＡＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＧＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＱＱＧＬＥＦＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＲＴＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
【０２５４】
本実施例で調製されたイムノコンジュゲートを以下の実施例でさらに使用した。
【０２５５】
実施例２
実施例２Ａ
活性化ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞に対するＰＤ１−ＩＬ２ｖの結合性
健康ヒトドナーから新鮮単離されたＰＢＭＣをＣＤ３およびＣＤ２８で一晩刺激して、Ｔ細胞上のＰＤ１の上方制御を誘導した。１μｇ／ｍｌ  ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、＃３１７３０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、３７℃で１時間被覆された細胞培養フラスコ中の培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン）にＰＢＭＣを播種した。ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、＃３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を濃度２μｇ／ｍｌの溶液としてＰＢＭＣに添加した。翌日、ＰＢＭＣを回収し、９６ウェル丸底プレートに移した（２００’０００細胞／ウェル）。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２５％  ＮａＮ３）で洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中の表示の分子（ＰＤ１  ＩｇＧ、ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＣＥＡ−ＩＬ２ｖ）４０μｌにより４℃で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄して未結合の分子を除去した。次いで、希釈したＰＥ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（＃１０９−１１６−１７０、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）４０μｌを細胞に添加した。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。Ｔ細胞を検出するために、ＰＢＭＣをＣＤ３  ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１、＃３００４０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４  ＡＰＣ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、３００５１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ８  ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ８、＃３０１０３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物４０μｌにより４℃で３０分間染色した。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄することにより未結合の抗体を除去した。最終的に、細胞をＦＡＣＳバッファー中の１％  ＰＦＡで固定し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（ＣＤ４  Ｔ細胞）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８  Ｔ細胞）に関するＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａゲーティングを使用して測定した。
【０２５６】
図２に示すように、ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよび対応するＰＤ１  ＩｇＧは、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞と同様に結合した。ＰＤ１の代わりに腫瘍細胞上のＣＥＡを標的化する同じようなイムノサイトカイン、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖは、ＰＤ１に標的化されないＩＬ２ｖベースのイムノサイトカイン単独の効果と比較するための非標的化コントロールとして役立った。
【０２５７】
実施例２Ｂ
ＰＤ１−ＩＬ２ｖによるＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖
健康ヒトドナーから新鮮単離されたＰＢＭＣを一晩インキュベートし、次いでＣＦＳＥ（５（６）−カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、＃２１８８８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。簡潔には、３０００万個のＰＢＭＣをＰＢＳで１回洗浄した。平行して、ＣＳＦＥ原液（ＤＭＳＯ中に２ｍＭ）をＰＢＳ中に１：２０希釈した。ＰＢＭＣを、予め加温したＰＢＳ  ３０ｍｌ中に再懸濁し、ＣＦＳＥ溶液３０μｌを添加し、直ちに細胞を混合した。最適な標識のために、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、予め加温した培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、１％  グルタミン）１０ｍｌを添加して、標識反応を停止した。細胞を４００×ｇで１０分間遠沈し、新鮮培地２０ｍｌ中に再懸濁し、３７℃で追加的に３０分間インキュベートした。最終的に、細胞を培地で１回洗浄し、新鮮培地中に１００万細胞／ｍｌで再懸濁した。標識されたＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート中に播種し（２００’０００細胞／ウェル）、表示の分子（ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、ＰＤ１  ＩｇＧ、およびＰＤ１  ＩｇＧとＣＥＡ−ＩＬ２ｖとの組み合わせ）で５日間処理した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中のＣＤ３  ＡＰＣ／Ｃｙ７（クローンＵＣＨＴ１、＃３００４２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６  ＡＰＣ（クローンＨＣＨ５６、３＃１８３１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４  ＰＥ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、＃３００５０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ２５  ＢＶ４２１（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物２０μｌにより４℃で３０分間染色した。その後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、それらをＦＡＣＳバッファー中の１％  ＰＦＡで固定し、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて蛍光を測定した。ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−）、ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）のＣＦＳＥ希釈を測定することにより、増殖を決定した。
【０２５８】
図３に示すように、ＰＤ１−ＩＬ２ｖの活性は、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、およびＰＤ１  ＩｇＧと組み合わせたＣＥＡ−ＩＬ２ｖの活性と同程度である。ＰＤ１  ＩｇＧ単独は、この設定で活性を有さない。
【０２５９】
図４は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがＮＫ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の（ＣＤ２５の上方制御により測定される）活性化を誘導することを示すものである。ＣＥＡ−ＩＬ２ｖにより誘発される活性化は、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖとＰＤ１  ＩｇＧとの組み合わせにより誘導される活性化と類似である。ＰＤ１  ＩｇＧ単独は、この設定で活性化を誘導しない。
【０２６０】
実施例２Ｃ
ＰＤ１−ＩＬ２ｖによる予備活性化ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の活性化および増殖
健康ヒトドナーからの新鮮単離されたＰＢＭＣをＣＦＳＥ（５（６）−カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、＃２１８８８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。簡潔には、３０００万個のＰＢＭＣをＰＢＳで１回洗浄した。平行して、ＣＳＦＥ原液（ＤＭＳＯ中に２ｍＭ）をＰＢＳ中に１：２０希釈した。ＰＢＭＣを予め加温したＰＢＳ  ３０ｍｌ中に再懸濁し、ＣＦＳＥ溶液３０μｌを添加し、細胞を直ちに混合した。最適な標識のために細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、予め加温した培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、１％  グルタミン）１０ｍｌを添加して、標識反応を停止した。細胞を４００×ｇで１０分間遠沈し、新鮮培地２０ｍｌ中に再懸濁し、３７℃で追加的に３０分間インキュベートした。最終的に、細胞を培地で１回洗浄し、新鮮培地中に１００万細胞／ｍｌで再懸濁した。ＣＦＳＥ標識されたＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（＃Ｌ８９０２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩予備活性化して、Ｔ細胞上のＰＤ−１の上方制御を誘導した。翌日、予備活性化ＰＢＭＣを収集し、計数した。次いで、ＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレートに播種し（２００’０００細胞／ウェル）、表示の分子（ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、ＰＤ１  ＩｇＧ、およびＰＤ１  ＩｇＧとＣＥＡ−ＩＬ２ｖとの組み合わせ）で４日間処理した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中のＣＤ３  ＡＰＣ／Ｃｙ７（クローンＵＣＨＴ１、＃３００４２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８  ＡＰＣ（クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ２５  ＢＶ４２１（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物２０μｌにより４℃で３０分間染色した。その後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、その後、ＦＡＣＳバッファー中の１％  ＰＦＡで固定し、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて蛍光を測定した。ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）およびＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８−）のＣＦＳＥ希釈を測定することにより、増殖を決定した。
【０２６１】
図５は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが、ＰＤ−１を発現するＰＨＡ活性化ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を誘導することを示すものである。活性は、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖおよびＣＥＡ−ＩＬ２ｖとＰＤ１  ＩｇＧとの組み合わせと同程度である。ＰＤ１  ＩｇＧ単独は、この設定で活性を有さない。この設定でＰＤ−１ブロッキングの追加的な効果が観察できないのは、おそらく、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞が不在であるせいである。
【０２６２】
図６に示すように、ＰＤ１−ＩＬ２ｖは、ＰＤ−１を発現するＰＨＡ活性化ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を誘導する（活性化のマーカーとしてＣＤ２５発現を使用）。ＣＥＡ−ＩＬ２ｖおよびＣＥＡ−ＩＬ２ｖとＰＤ１  ＩｇＧとの組み合わせは、Ｔ細胞の同程度の活性化を誘導する。ＰＤ１  ＩｇＧ単独は、この設定で活性を有さない。この設定でＰＤ−１ブロッキングの追加的な効果が観察できないのは、おそらく、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞が不在であるせいである。
【０２６３】
実施例２Ｄ
ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖによるＮＫ９２の増殖
ＮＫ９２細胞を回収し、計数し、生存率について評定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄して、残留ＩＬ−２を除去し、ＩＬ−２を有さない培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、１％グルタミン）中に再懸濁した。洗浄したＮＫ９２細胞を細胞インキュベーター中で２時間インキュベートした（ＩＬ−２飢餓）。飢餓後、ＩＬ２−を有さない新鮮培地中に細胞を２００’０００細胞／ｍｌで再懸濁し、細胞培養物処理した９６ウェル平底プレートに細胞懸濁液５０μｌを移し、希釈抗体（ＩＬ−２を有さない培地中）、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（最終濃度１．５μｇ／ｍｌ）または培地（コントロールウェル）５０μｌを補充して、最終体積１００μｌ／ウェルに到達させた。プレートをインキュベーター中で２日間インキュベートした。２日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬および細胞培養プレートを室温に平衡化した。製造業者の説明書に記載されたようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ溶液を調製し、溶液１００μｌを各ウェルに添加した。１０分間インキュベーション後、ピペッティングにより残りの凝集物を再懸濁し、混合物１５０μｌを白色平底プレートに移した。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ  １０Ｍマルチモードリーダーを用いて発光を測定した。
【０２６４】
図７Ａは、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖがＮＫ９２細胞の増殖をＣＥＡ−ＩＬ２ｖと同じくらい効率的に誘導することを示すものである。図７Ｂは、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ１−ＩＬ２ｖが、ＮＫ９２細胞の増殖を誘導するのに同じ活性を有することを示すものである。ＮＫ９２細胞は、ＰＤ１陰性である。
【０２６５】
実施例２Ｅ
ＣＴＬＬ２細胞へのＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖの結合性
マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ２は、ＰＤ−Ｌ１を発現する。これらの細胞を使用して、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖ（マウス代用）の結合性を試験した。細胞を回収し、生存率をチェックし、細胞を９６ウェル丸底プレート（２００’０００細胞／ウェル）中に移した。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２５％  ＮａＮ３）で洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中の表示の分子４０μｌにより４℃で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄して、未結合の分子を除去した。次いで、希釈されたＡＰＣ抗マウスＦｃ特異的二次抗体（＃１１５−１３６−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）４０μｌを細胞に添加した。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞をＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
【０２６６】
図８は、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖが対応するＰＤ−Ｌ１  ｍｕＩｇＧ１と同じくらい十分にＣＴＬＬ２細胞に結合することを示すものである。これらの細胞は、ＰＤ１陰性である。
【０２６７】
実施例２Ｆ
ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖによるＣＴＬＬ２細胞の増殖
ＣＴＬＬ２細胞を回収し、計数し、生存率について評定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し（残留ＩＬ−２を除去するため）、ＩＬ−２を有さない培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、１％  グルタミン）中に再懸濁し、細胞インキュベーター中で２時間インキュベートした（ＩＬ−２飢餓）。飢餓後、２００’０００個／ｍｌのＣＴＬＬ２細胞を、ＩＬ２を有さない新鮮培地中に再懸濁し、細胞懸濁液５０μｌを、細胞培養物で処理した９６ウェル平底プレートに移した。希釈したマウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、マウス代用ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖ、マウス代用ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ、希釈したＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（最終濃度１．５μｇ／ｍｌ）または培地単独（全てＩＬ−２不含培地を使用）５０μｌをウェルに添加して最終体積１００μｌ／ウェルとした。試料を細胞インキュベーター中で３日間インキュベートし、製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用して増殖を評定した。簡潔には、試薬１００μｌを各ウェルに添加し、１０分間インキュベートした。ピペッティングにより残りの凝集物を再懸濁し、混合物１５０μｌを白色平底プレートに移した。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ  １０Ｍマルチモードリーダーを用いて発光を測定した。
【０２６８】
図９Ａは、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖがＣＴＬＬ２細胞の増殖を誘導することを示すものである。おそらくＣＴＬＬ２細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現のせいで、活性はＣＥＡ−ＩＬ２ｖと比較して高いと思われる。図９Ｂは、再度、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがＣＴＬＬ２細胞の増殖を誘導することを示すものである。おそらくこれらの細胞がＰＤ１ではなくＰＤ−Ｌ１だけを発現することが原因で、活性は、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖと比較して低いように思われる。
【０２６９】
実施例３
同系マウス腫瘍モデルにおけるＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖのインビボ有効性
ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲート（マウス代用）を、単独で、ならびに対応するＰＤ１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体と比較して、Ｐａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ同系モデルにおけるそれらの抗腫瘍有効性について試験した。
【０２７０】
Ｐａｎｃ０２−Ｈ７細胞（マウス膵臓癌）は、本来、ＭＤアンダーソンがんセンター（Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）から得られたものであり、増殖後にＲｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ施設内細胞バンクに寄託された。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ細胞株を、カルシウムトランスフェクションおよびサブクローニング技術により社内で産生した。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃを、１０％  ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、５００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ）および１％  Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。２３回継代物を移植のために使用した。細胞生存率は、９０．４％であった。０．３ｍｌツベルクリンシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して動物１匹当たり細胞１×１０５個をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射した。このために、麻酔マウスの左腹部に小切開を行った。腹膜壁を開放し、膵臓をピンセットで慎重に単離した。細胞懸濁液１０マイクロリットル（ＲＰＭＩ培地中１×１０５個のＰａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ細胞）を膵尾に注射した。５／０分解可能縫合糸を使用して腹膜壁および皮膚創傷を閉鎖した。
【０２７１】
実験開始時に１０〜１２週齢の雌Ｂｌａｃｋ  ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を、関係するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明／１２時間暗の１日サイクルの特定の病原体がない条件で維持した。地方自治体により実験研究プロトコールが審査され、承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。到着後、動物を１週間維持して、新しい環境に慣らし、観察した。定期ベースで連続的な健康モニタリングを実施した。
【０２７２】
試験０日目に１×１０５個のＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ細胞をマウスに膵臓内注射し、無作為化し、秤量した。腫瘍細胞注射の１週間後に、ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖまたはＰＤ１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体を１週間に１回、４週間、マウスにｉ．ｖ．注射した。
【０２７３】
適切な溶液２００μｌを全てのマウスにｉ．ｖ．注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを、治療群に、必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈したマウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖコンジュゲートおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖコンジュゲートまたは対応するＰＤ１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体を注射した。マウス１匹当たり注射された抗体の量（ｍｇ／ｋｇ）は以下の通りであった：ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖは１．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＤ１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体は１０ｍｇ／ｋｇ。
【０２７４】
図１０および表１は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが、特にＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖを含む、試験された全ての他の単一薬剤と比較して、高い生存率中央値および全生存の点で有意に優れた有効性を媒介したことを示すものである。
2020515275.tif 000011
【０２７５】
ＩＶＩＳ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＵＭによるバイオルミネッセンスイメージングのために、バイオルミネッセンスイメージング取得（ＢＬＩ）の１０分前にマウスに１５０ｍｇ／ｋｇ  Ｄ−ルシフェリンを腹腔内注射し、その後４％イソフルランで麻酔した。続いて、ＩＶＩＳ（登録商標）ｓｐｅｃｔｒｕｍ中に位置付けた隔離チャンバーにマウスを移した。発光シグナルを１０〜５０秒間取得することによりインビボＢＬＩ取得を行った。データは、放射輝度（光子）／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒとして記憶させた。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）４．４ソフトウェアを用いてインビボＢＬＩデータ解析を行い、腫瘍抑制曲線により表した。
【０２７６】
図１１は、特にＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖを含む全ての他の群と比較してバイオルミネッセンスシグナル（光子／秒）を減少させる点から見た、ＰＤ１−ＩＬ２ｖの優れた有効性を示すものである。最初の治療的投与後７日目という早期に、いくつかの治療群でＩＶＩＳ（登録商標）ＳｐｅｃｔｒｕｍによりＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃのバイオルミネッセンスシグナルの低減が検出されたが、ＰＤ１−ＩＬ２ｖだけが、大部分のマウスにおいて実験の全期間にわたり継続したＢＬＩシグナルの完全消失を示し、これは、マウス８匹中７匹において完全寛解を示した。
【０２７７】
実施例４
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかのブロックによるウイルス特異的消耗Ｔ細胞へのＩＬ−２ｖの送達効果
ＰＤ−１の発現は、ウイルス抗原への慢性曝露の結果としてウイルス特異的消耗Ｔ細胞上に初めて記載されており、これは、Ｔ細胞が有効な抗ウイルス応答を開始できないことに関連している。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを同時分泌できるウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、慢性感染におけるウイルス再活性化からの防御を付与する。実際、ＣＤ４  Ｔ細胞の多機能性シグネチャーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルスウイルス（ＥＢＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に感染した健康個体、ならびに数年間無症候のままであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体におけるウイルスコントロールと関連している。
【０２７８】
したがって、本発明者らは、慢性ウイルス感染に関連して、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１標的化が機能障害性抗原特異的Ｔ細胞に突然変異バージョンのＩＬ−２（ＩＬ−２ｖ）を送達する効果を評価するためのインビトロアッセイを開発した。本発明者らのアッセイに適したドナーの量に関する制限を回避するために、本発明者らは、集団のおよそ８０％がＣＭＶ血清陽性であることを考えて、Ｔ細胞についてのリコール抗原としてＣＭＶ免疫原性ウイルスタンパク質（ｐｐ６５）を選んだ。したがって、本発明者らは、健康ヒトドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＭＶ−ｐｐ６５で２時間刺激し、その後、本発明者らのコンストラクトを濃度１０μｇ／ｍｌで添加した。４３時間後に、本発明者らは、Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）およびＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（モネンシン）を添加することによりゴルジ体からのタンパク質輸送をブロックし、細胞を３７℃で追加的に５時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ抗体で表面を染色し、その後Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。最後に、本発明者らは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＫｉ６７（両方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）について細胞内染色を行った。
【０２７９】
本発明者らは、ＰＤ１−ＩＬ２ｖおよびＰＤ−Ｌ１−ＩＬ２ｖの両方、ならびに対応するＩｇＧ抗体とＩＬ−２ｖとの組み合わせが、多機能性（図１２Ｂ）ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−γ単一機能性（それぞれ図１２Ａおよび１２Ｃ）ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を同程度のレベルで増加させ、それぞれ抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１のブロックと比較して高い効果を提供したことを観察した。多機能性（図１３Ｂ）およびＩＦＮ−γ単機能性ＣＤ４  Ｔ細胞において増殖した集団（図１３Ｃおよび１３Ｄ）は、エフェクター−メモリープロファイル（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−）および最終分化したエフェクタープロファイル（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ−）を示す。逆に、ＰＤ−Ｌ１拮抗により誘導され、ＩＬ−２ｖの共送達によりさらに増殖したＩＬ−２単機能性ＣＤ４  Ｔ細胞は、ナイーブシグネチャー（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−）を表す（図１３Ａ）。
【０２８０】
本発明者らは、ＰＤ１−ＩＬ−２ｖ融合タンパク質を通じてＣＭＶ特異的消耗ＣＤ４  Ｔ細胞にＩＬ−２ｖを送達する結果として、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを共分泌する能力によって特徴付けられる長寿命防御性ウイルス特異的集団の増殖が生じたと結論することができる。
【０２８１】
実施例５
実施例５Ａ
活性化制御性Ｔ細胞よりも活性化通常型Ｔ細胞への優先的なＰＤ１−ＩＬ２ｖの結合
活性化通常型Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞へのＰＤ１−ＩＬ２ｖの結合特性を競合結合アッセイで評定した。２ステップ制御性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０−０９４−７７５）を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を単離した。平行して、ＣＤ２５陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０−０９２−９８３）の陰性画分を収集し、続いてＣＤ４＋の富化を行うことにより（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０−０４５−１０１）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）を単離した。ＴｃｏｎｖをＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃６５−０８５０−８４）で標識し、ＴｒｅｇをＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ３４５５７）で標識して、両方の集団の増殖を追跡した。ＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇを、１μｇ／ｍｌ  ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、＃３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により４℃で一晩被覆した培養プレート中に一緒に播種した。ＣＤ２８を濃度１μｇ／ｍｌ  ＣＤ８（クローンＣＤ２８．２、＃３０２９２３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の溶液として添加した。５日間刺激後、両方とも施設内でＡＦ６４７標識したＰＤ１（０３７６）およびＰＤ１−ＩＬ２ｖ（０５９０）を用いて結合アッセイを行った。
【０２８２】
ＰＤ１−ＩＬ２ｖ二重特異性抗体は、ＰＤ１と同程度の結合プロファイルを示す（図１４Ａおよび１４Ｂ）。図１４Ａは、同じ試料内でＴｒｅｇと比べてＴｃｏｎｖ上に結合した所与の抗体の頻度のデルタを示すものである。各記号は、別々のドナーを表し、水平の線は、Ｎ＝４の中央値を示す。両方の分子は、ＴｒｅｇよりもＴｃｏｎｖ上で高いＰＤ−１の発現レベルのせいで、Ｔｒｅｇと比べてＴｃｏｎｖへの高い結合能を示す（図１４Ｂ；Ｔｃｏｎｖ（黒い線）およびＴｒｅｇ（灰色）に結合性を示す１つの代表的なドナーからのデータ）。したがって、ＰＤ１−ＩＬ２ｖ二重特異性抗体は、ＩＬ２ｖが抗体に結合しているにもかかわらず、ＰＤ１の結合特性を維持している。
【０２８３】
実施例５Ｂ
Ｔｒｅｇ抑制アッセイにおけるＰＤ１−ＩＬ２ｖ処理時のＴｃｏｎｖエフェクター機能の救出
次のステップで、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがＴｃｏｎｖのＴｒｅｇ抑制を後退できるかどうかを試験した。したがって、ＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇを一緒に、ブロッキング抗体と共にまたはブロッキング抗体なしで、アロ特異的刺激のための無関係のドナーからのＣＤ４−ＣＤ２５−の存在下で５日間培養する抑制機能アッセイを確立した。この目的のために、ＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇを単離し、上記のように標識した。ＦＡＣＳ染色の前にタンパク質輸送阻害剤（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ＃５５５０２９、ＢＤおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ＃５５４７２４、ＢＤ）を５時間適用することによって、ゴルジ複合体中のサイトカイン蓄積は高まった。
【０２８４】
増殖したＴｃｏｎｖがＴｒｅｇの存在下および不在下でグランザイムＢ（ＧｒｚＢ；図１５Ａ）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ；図１５Ｂ）を分泌する能力を測定した。Ｔｒｅｇの抑制を次式により計算した：
サイトカイン抑制（％）＝１００−（％サイトカインＴｃｏｎｖ＋Ｔｒｅｇ±ブロッキング抗体）／（％サイトカインＴｃｏｎｖ未処理）＊１００）
式中、％サイトカインＴｃｏｎｖ＋Ｔｒｅｇ±ブロッキング抗体は、Ｔｒｅｇ±ブロッキング抗体の存在下でＴｃｏｎｖにより分泌されるサイトカインのレベルであり、％サイトカインＴｃｏｎｖ未処理は、Ｔｒｅｇの不在下でＴｃｏｎｖにより分泌されるサイトカインのレベルである。図１５Ａおよび１５Ｂにおいて、各記号は、別々のドナーを表し、水平の線は、Ｎ＝５での中央値を示し、０％での点線は、Ｔｒｅｇによる無抑制を表す。Ｐは、一方向ＡＮＯＶＡを使用して計算した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０２８５】
図１５Ａは、ＰＤ１抗体（０３７６）を用いた処理が、未処理群における６８．６％抑制という中央値と比較してＴｃｏｎｖ機能の４７．７％抑制という中央値を結果として生じることを示す（統計的に有意でない）。同様に、アテゾリズマブ、ニボルマブおよびペムブロリズマブとのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用のブロッキングは、ＰＤ１抗体と同じ傾向を示した。興味深いことに、ＤＰ４７−ＩＬ２ｖ（中央値＝−１１．３％、ｐ＝０．００１１）およびＰＤ１−ＩＬ２ｖ（中央値＝−４３．６％、ｐ＜０．０００１）は、ＴｃｏｎｖのＧｒｚＢエフェクター機能をＴｒｅｇの抑制から救出した。さらに、ＰＤ１−ＩＬ２ｖは、ＰＤ１抗体単独よりもいっそう有意に強力（ｐ＝０．００２６）であった。
【０２８６】
平行して、ＴｒｅｇによるＴｃｏｎｖのＩＮＦｙ抑制について同じ分析を行った（図１５Ｂ）。ＤＰ４７−ＩＬ２ｖ（中央値＝５１．７７％、ｐ＝０．０２５１）およびＰＤ１−ＩＬ２ｖ（中央値＝３１．２３％、ｐ≦０．０００１）は、ＴｃｏｎｖのＩＦＮｙエフェクター機能をＴｒｅｇの抑制から救出した。
【０２８７】
実施例６
単一薬剤および組み合わせとしてのＰＤ１抗体およびＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体と比較した、マウス腫瘍細胞株の同系モデルにおけるＰＤ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートのインビボ有効性
同系モデルにおいてマウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲート（ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖ）をマウス代用ＰＤ１とマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ（ｍｕＦＡＰ−ＩＬ２ｖ）との組み合わせと比較して、その抗腫瘍有効性について試験した。使用した同系モデルは、Ｐａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ膵臓同系モデルであった。
【０２８８】
Ｂｌａｃｋ  ６マウスに膵臓内注射されたマウス膵臓Ｐａｎｃ０２−Ｆｌｕｃトランスフェクタント細胞株においてマウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートを試験した。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７細胞（マウス膵臓癌）は、本来、ＭＤアンダーソンがんセンター（Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）から得られたものであり、増殖後にＲｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ施設内細胞バンクに寄託された。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ細胞株を、カルシウムトランスフェクションおよびサブクローニング技術により社内で産生した。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃを、１０％  ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、５００μｇ／ｍｌヒグロマイシンおよび１％  Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。移植のために２３回継代したものを使用した。細胞生存率は、８７．５％であった。０．３ｍｌツベルクリンシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して動物１匹当たり細胞１×１０５個をマウスの膵臓に注射した。このために、麻酔Ｂｌａｃｋ  ６マウスの左腹部に小切開を行った。腹膜壁を開放し、ピンセットで膵臓を慎重に単離した。細胞懸濁液１０マイクロリットル（ＲＰＭＩ培地中１×１０５個のＰａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ細胞）を膵尾に注射した。５／０分解可能縫合糸を使用して腹膜壁および皮膚創傷を閉鎖した。
【０２８９】
実験開始時に１０〜１２週齢の雌Ｂｌａｃｋ  ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を、関係するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明／１２時間暗の１日サイクルで、特定の病原体がない条件で維持した。地方自治体により実験研究プロトコールが審査され、承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。到着後、動物を１週間維持して、新しい環境に慣らし、観察した。定期ベースで健康モニタリングを実施した。
【０２９０】
試験０日目に１×１０５個のＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ細胞をマウスに膵臓内注射し、無作為化し、秤量した。腫瘍細胞注射の１週間後に、ＰＤ１抗体とＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体との組み合わせと比較して２つの異なる用量のＰＤ１−ＩＬ２ｖをマウスに１週間に１回、４週間静脈内注射した。
【０２９１】
全てのマウスに適切な溶液２００μｌを静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを、治療群にＰＤ１−ＩＬ２ｖ（０．５ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）抗体およびＦＡＰ−ＩＬ２ｖ（２．５ｍｇ／ｋｇ）抗体またはＰＤ１抗体とＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＤ１および２．５ｍｇ／ｋｇ  ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ）との組み合わせを注射した。２００μｌ当たり適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要な場合は表２に従って原液をヒスチジンバッファーで希釈した。
2020515275.tif 000012
【０２９２】
ＩＶＩＳ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＵＭによるバイオルミネッセンスイメージングのために、バイオルミネッセンスイメージング取得（ＢＬＩ）の１０分前にマウスに１５０ｍｇ／ｋｇ  Ｄ−ルシフェリンを腹腔内注射し、その後４％イソフルランで麻酔した。続いて、ＩＶＩＳ（登録商標）ｓｐｅｃｔｒｕｍ中に位置付けた隔離チャンバーにマウスを移した。発光シグナルを１０〜５０秒間取得することによりインビボＢＬＩ取得を行った。データは、放射輝度（光子）／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒとして記憶される。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）４．４ソフトウェアを用いてインビボＢＬＩデータ解析を行い、腫瘍抑制曲線により表した。
【０２９３】
組織学により免疫薬力学を評価するために、最初の療法の４日後に１群３匹のマウスを頸椎脱臼により屠殺した。膵臓腫瘍を回収し、１０％ホルマリン中で直ちに固定した。組織をホルマリン溶液中に一晩放置し、その後、ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）用に処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスＣＤ３、ＰＤ１およびＩＣＯＳの免疫組織化学をＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。
【０２９４】
図１６は、マウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖを、単一薬剤としてまたは組み合わせのマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖおよびマウス代用ＰＤ−１抗体と比較する有効性実験の結果を示すものである。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃトランスフェクタント膵臓癌細胞株をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射して、膵臓同所性同系モデルにおける生存を試験した。マウス１匹当たり注射した抗体の量（ｍｇ／ｋｇ）は、以下の通りである：０．５および１ｍｇ／ｋｇマウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖ抗体、１０ｍｇ／ｋｇマウス代用ＰＤ１抗体および２．５ｍｇ／ｋｇマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体。抗体を１週間に１回４週間、静脈内注射した。全ての他の単一薬剤およびマウス代用ＰＤ−１とマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖとの組み合わせと比較して、０．５および１ｍｇ／ｋｇマウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖにおいて有意に優れた生存期間中央値および全生存が観察された。図１６および表３は、両方の用量のＰＤ１−ＩＬ２ｖが、全ての他の単一薬剤だけでなく、ＰＤ１とＦＡＰ−ＩＬ２ｖとの組み合わせと比較して、高い生存期間中央値および全生存の点で優れた有効性を媒介したことを示すものである。
2020515275.tif 000013
【０２９５】
図１７は、マウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖをＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、マウス代用ＰＤ１およびそれらの組み合わせと比較する有効性実験の結果を示すものである。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃトランスフェクタント膵臓癌細胞株をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射して、膵臓同所性同系モデルにおける生存をバイオルミネッセンスにより試験した。最初の療法投与後７日目という早期に、いくつかの治療群でＩＶＩＳ（登録商標）ＳｐｅｃｔｒｕｍによりＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃバイオルミネッセンスシグナルの低減が検出されたが、ＰＤ１−ＩＬ２ｖだけが、大部分のマウスで実験の全持続期間にわたり継続したＢＬＩシグナルの完全消失を示し、０．５ｍｇ／ｋｇ用量についてマウス７匹中４匹および１ｍｇ／ｋｇ用量についてはマウス７匹中７匹で完全寛解を示した。図１７は、両方の用量のＰＤ１−ＩＬ２ｖが、全ての他の単一薬剤および組み合わせの群と比較して、バイオルミネッセンスシグナル（光子／秒）を減少させる点で優れた有効性を媒介したことを示すものである。
【０２９６】
図１８Ａおよび１８Ｂは、抗マウスＣＤ３について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像（図１８Ａ）およびＴ細胞定量分析（図１８Ｂ）の結果を示すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍に対してＣＤ３  Ｔ細胞の免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のために組織試料を調製した：治療的投与後に動物から腫瘍を回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後、ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４μｍパラフィン切片を切り出した。マウスＣＤ３の免疫組織化学を抗マウスＣＤ３（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｍｕＣＤ３陽性Ｔ細胞の定量を行った。多重比較検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより統計解析した。最初の療法投与後４日目という早期に、ビヒクル群と比較してＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群においてＣＤ３陽性Ｔ細胞数の有意な増加が検出された。ＣＤ３陽性細胞の増加傾向は、また、ビヒクルに対してマウス代用ＰＤ１とマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖとの組み合わせで見られたが、有意ではなかった。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが最初の療法の４日後に全ての群と比較して膵臓腫瘍におけるＣＤ３浸潤の増加を誘発したことを示すものである。
【０２９７】
図１９は、抗マウスＰＤ１について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像の結果を示すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍にＰＤ１陽性Ｔ細胞の免疫組織化学染色を行った。組織試料を免疫組織化学染色のために調製した：腫瘍を治療投与後の動物から回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４μｍパラフィン切片を切り出した。マウスＰＤ１免疫組織化学を抗マウスＰＤ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。最初の療法投与後４日目という早期に、ビヒクル群と比較してＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群においてＰＤ１陽性Ｔ細胞数の非常に高い増加が検出された。ビヒクルと比較してマウス代用ＰＤ１とマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖとの組み合わせにおいても、ＰＤ１陽性細胞の中等度の増加が見られた。図１９は、最初の療法の４日後にＰＤ１−ＩＬ２ｖが全ての群と比較して膵臓腫瘍にＰＤ１陽性Ｔ細胞の浸潤増加を誘起したことを示すものである。
【０２９８】
図２０は、抗マウスＩＣＯＳについて染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像の結果を示すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍にＩＣＯＳ陽性Ｔ細胞の免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のために組織試料を調製した：治療投与後に動物から腫瘍を回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスＩＣＯＳ免疫組織化学を、抗マウスＩＣＯＳ（Ｍｙ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。最初の療法投与後４日目という早期に、ＩＣＯＳ陽性Ｔ細胞数の減少が、ビヒクル群と比較してＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群で検出された。図２０は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが、全ての群と比較して最初の療法の４日後に膵臓腫瘍におけるＩＣＯＳ陽性Ｔ細胞浸潤の減少を誘起したことを示すものである。
【０２９９】
実施例７
単一薬剤として、および組み合わせのＰＤ１抗体およびＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体（異なる２つの用量）と比較したマウス腫瘍細胞株の同系モデルにおけるＰＤ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートのインビボ有効性
ＰＤ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートを、１つの同系モデルにおいてマウス代用ＰＤ１と、２つの異なる用量のマウス代用ＦＡＰ−ＩＬ２ｖとの組み合わせと比較して、その抗腫瘍有効性について試験した。使用した同系モデルは、Ｐａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ膵臓同系モデルであった。マウス代用ＰＤ１−ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートを、Ｂｌａｃｋ  ６マウスに膵臓内注射したマウス膵臓Ｐａｎｃ０２−Ｆｌｕｃトランスフェクタント細胞株において試験した。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７細胞（マウス膵臓癌）は、本来、ＭＤアンダーソンがんセンター（Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）から得られたものであり、増殖後にＲｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ施設内細胞バンクに寄託された。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ細胞株を、カルシウムトランスフェクションおよびサブクローニング技術により社内で産生した。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃを、１０％  ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、５００μｇ／ｍｌヒグロマイシンおよび１％  Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。５％  ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。移植のために１６回継代したものを使用した。細胞生存率は、８３．３％であった。０．３ｍｌツベルクリンシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して動物１匹当たり細胞１×１０５個をマウスの膵臓に注射した。このために、麻酔Ｂｌａｃｋ  ６マウスの左腹部に小切開を行った。腹膜壁を開放し、ピンセットで膵臓を慎重に単離した。細胞懸濁液１０マイクロリットル（ＲＰＭＩ培地中１×１０５個のＰａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ細胞）を膵尾に注射した。５／０分解可能縫合糸を使用して腹膜壁および皮膚創傷を閉鎖した。
【０３００】
実験開始時に１０〜１２週齢の雌Ｂｌａｃｋ  ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を、関係するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明／１２時間暗の１日サイクルの特定の病原体がない条件で維持した。地方自治体により実験研究プロトコールが審査され、承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。到着後、動物を１週間維持して、新しい環境に慣らし、観察に供した。定期ベースで連続的な健康モニタリングを実施した。
【０３０１】
試験０日目に１×１０５個のＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ細胞をマウスに膵臓内注射し、無作為化し、秤量した。腫瘍細胞注射の１週間後に、ＰＤ１＋２つの異なる用量のＦＡＰ−ＩＬ２ｖ  Ｍａｂの組み合わせと比較して、ＰＤ１−ＩＬ２ｖをマウスに１週間に１回、３週間静脈内注射した。
【０３０２】
全てのマウスに適切な溶液２００μｌを静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジンバッファーを、治療群にＰＤ１−ＩＬ２ｖ（１ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＦＡＰ−ＩＬ２ｖ（０．６２５ｍｇ／ｋｇもしくは１．２５ｍｇ／ｋｇ）抗体またはＰＤ１＋ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体の組み合わせ（１０ｍｇ／ｋｇ＋１．２５ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ＋０．６２５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。２００μｌ当たり適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要な場合は表４に従って原液をヒスチジンバッファーで希釈した。
2020515275.tif 000014
【０３０３】
ＩＶＩＳ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＵＭによるバイオルミネッセンスイメージングのために、バイオルミネッセンスイメージング取得（ＢＬＩ）の１０分前にマウスに１５０ｍｇ／ｋｇ  Ｄ−ルシフェリンを腹腔内注射し、その後４％イソフルランで麻酔する。続いて、ＩＶＩＳ（登録商標）ｓｐｅｃｔｒｕｍ中に位置付けた隔離チャンバーにマウスを移した。発光シグナルを１０〜５０秒間取得することによりインビボＢＬＩ取得を行う。データは、放射輝度（光子）／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒとして記憶される。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）４．４ソフトウェアを用いてインビボＢＬＩデータ解析を行い、腫瘍抑制曲線により表した。
【０３０４】
組織学により免疫薬力学を評価するために、最初の療法の４日後に、選ばれた群からの３匹のマウスを頸椎脱臼により屠殺した。膵臓腫瘍を回収し、１０％ホルマリン中で直ちに固定した。組織をホルマリン溶液中に一晩放置し、その後、ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスＣＤ３、ＣＤ８、ＰＤ１およびグランザイムＢの免疫組織化学をＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。
【０３０５】
図２１および表５は、ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖを単一薬剤としておよび組み合わせのｍｕＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体およびｍｕＰＤ−１抗体と比較する有効性実験の結果を示す。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃトランスフェクタント膵臓癌細胞株をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射して、膵臓同所性同系モデルにおける生存を試験した。マウス１匹当たり注射した抗体の量（ｍｇ／ｋｇ）は、以下の通りである：ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖは１ｍｇ／ｋｇ、ｍｕＰＤ１は１０ｍｇ／ｋｇおよびｍｕＦＡＰ−ＩＬ２ｖ抗体は０．６２５または１．２５ｍｇ／ｋｇ。抗体を１週間に１回４週間、静脈内注射した。試験した両方の用量で、全ての他の単一薬剤およびｍｕＰＤ−１＋ｍｕＦＡＰ−ＩＬ２ｖの組み合わせと比較して１ｍｇ／ｋｇ  ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖで有意に優れた生存期間中央値および全生存が観察された。したがって、ＰＤ１−ＩＬ２ｖは、試験した両方の用量で、全ての他の単一薬剤およびＰＤ１＋ＦＡＰ−ＩＬ２ｖの組み合わせと比較して、高い生存期間中央値および全生存の点で優れた有効性を媒介したと結論することができる。
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【０３０６】
図２２は、ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖを２つの異なる用量のＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ１およびそれらの組み合わせと比較する有効性実験の結果を示すものである。Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃトランスフェクタント膵臓癌細胞株をＢｌａｃｋ  ６マウスの膵臓に注射して、膵臓同所性同系モデルにおける生存をバイオルミネッセンスにより試験した。試験の経過中にいくつかの治療群でＩＶＩＳ（登録商標）ｓｐｅｃｔｒｕｍによりＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃバイオルミネッセンスシグナルの低減が検出されたが、ｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖ療法だけが、全てのマウスでＢＬＩシグナルの完全消失を示し、それは、実験の全持続期間にわたり継続し、６匹のマウス全てで完全寛解を示した。図２２は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが、全ての他の単一薬剤および組み合わせの群と比較して、バイオルミネッセンスシグナル（光子／秒）を減少させる点で優れた有効性を媒介したことを示すものである。
【０３０７】
図２３は、抗マウスＣＤ３について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像の結果を示すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍にＣＤ３  Ｔ細胞の免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のために組織試料を調製した：治療投与後に動物から腫瘍を回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスＣＤ３免疫組織化学を、抗マウスＣＤ３（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。最初の療法投与後４日目という早期に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞数の非常に大きな増加が、ビヒクル群と比較してｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群で検出された。また、ビヒクルと比較した場合、全てのその他の治療群においてＣＤ３陽性細胞の中等度の増加も見られた。図２３は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが最初の療法の４日後に全ての群と比較して膵臓腫瘍におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞浸潤の増加を誘起したことを示すものである。
【０３０８】
図２４Ａおよび２４Ｂおよび表６は、抗マウスＣＤ８について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像（図２４Ａ）およびＴ細胞定量分析（図２４Ｂ）の結果を示すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍にＣＤ８  Ｔ細胞の免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のために組織試料を調製した：治療投与後に動物から腫瘍を回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスＣＤ８免疫組織化学を、抗マウスＣＤ８（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。ｍｕＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量を、Ｄｅｆｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。多重比較検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより統計解析した。最初の療法投与後４日目という早期に、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数の有意な増加が、全ての他の群と比較してｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群で検出された。また、試験した全てのその他の治療群においてＣＤ８陽性細胞の増加傾向も見られたが、有意ではなかった。したがって、図２４Ａおよび２４Ｂは、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが最初の療法の４日後に全ての群と比較して膵臓腫瘍におけるＣＤ８浸潤の増加を誘発したことを示すものである。
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【０３０９】
図２５Ａおよび２５Ｂおよび表７は、抗グランザイムＢ（５Ａ）およびグランザイムＢマーカー面積定量分析（５Ｂ）について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像の結果を示すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍にグランザイムＢの免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のために組織試料を調製した：治療投与後に動物から腫瘍を回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスグランザイムＢ免疫組織化学を、抗マウスグランザイムＢ（Ａｂｃａｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてグランザイムＢマーカー面積の定量を行った。多重比較検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより統計解析した。最初の療法投与後４日目という早期に、グランザイムＢの有意な増加が、全ての他の群と比較してｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群で検出された。また、全てのその他の治療群においてグランザイムＢマーカー面積の増加傾向も見られたが、有意ではなかった。したがって、図２５Ａおよび２５Ｂは、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが最初の療法の４日後に全ての群と比較して膵臓腫瘍におけるグランザイムＢ陽性面積の増加を誘起したことを示すものである。
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【０３１０】
図２６Ａおよび２６Ｂおよび表８は、抗マウスＰＤ１について染色された膵臓腫瘍の免疫組織化学画像（図２６Ａ）およびＰＤ１陽性細胞定量分析（図２６Ｂ）の結果を表すものである。表示の治療群に由来するＢｌａｃｋ  ６マウス膵臓腫瘍にＰＤ１細胞の免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色のために組織試料を調製した：治療投与後に動物から腫瘍を回収し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で固定し、その後ＦＦＰＥＴ（Ｌｅｉｃａ  １０２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために処理した。続いて４μｍパラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切り出した。マウスＰＤ１免疫組織化学を、抗マウスＰＤ１（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬｅｉｃａ自動染色機（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造業者のプロトコールに従って行った。画像をＯｌｙｍｐｕｓスキャナーでスキャンした。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｍｕＰＤ１陽性細胞の定量を行った。多重比較検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより統計解析した。最初の療法投与後４日目という早期に、ＰＤ１陽性細胞数の有意な増加が、全ての他の群と比較してｍｕＰＤ１−ＩＬ２ｖ治療群で検出された。また、試験した全てのその他の治療群においてＰＤ１陽性細胞の増加傾向も見られたが、有意ではなかった。したがって、図２６Ａおよび２６Ｂは、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが最初の療法の４日後に全ての群と比較して膵臓腫瘍におけるＰＤ１陽性細胞の増加を誘発したことを示すものである。
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【０３１１】
実施例７
ＰＤ−１ブロックによるウイルス特異的消耗Ｔ細胞へのＩＬ−２ｖ送達効果
ＰＤ−１の発現は、ウイルス抗原への慢性曝露の結果としてウイルス特異的消耗Ｔ細胞上に初めて記載されており、これは、Ｔ細胞が有効な抗ウイルス応答を開始できないことに関連している。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを同時分泌できるウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、慢性感染におけるウイルス再活性化からの防御を付与する。実際、ＣＤ４  Ｔ細胞の多機能性シグネチャーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルスウイルス（ＥＢＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に感染した健康個体、ならびに数年間無症候のままであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染個体におけるウイルスコントロールと関連している。
【０３１２】
したがって、本発明者らは、慢性ウイルス感染に関連して、ＰＤ−１標的化が機能障害性抗原特異的Ｔ細胞に突然変異バージョンのＩＬ−２（ＩＬ−２ｖ）を送達する効果を評価するためのインビトロアッセイを開発した。本発明者らのアッセイに適したドナーの量に関する制限を回避するために、本発明者らは、集団のおよそ８０％はＣＭＶ血清陽性であることを考えて、Ｔ細胞についてのリコール抗原としてＣＭＶ免疫原性ウイルスタンパク質（ｐｐ６５）を選んだ。したがって、本発明者らは、濃度１０μｇ／ｍｌの本発明者らのコンストラクトの存在下で健康ヒトドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＭＶ−ｐｐ６５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で刺激した。４３時間後に、本発明者らは、Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ブレフェルジンＡ）およびＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、モネンシン）を添加することによりゴルジ体からのタンパク質輸送をブロックし、細胞を３７℃で追加的に５時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ抗体で表面を染色し、その後ＦｏｘＰ３転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。最後に、本発明者らは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＫｉ６７（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）について細胞内染色を行って細胞増殖を測定した。
【０３１３】
図２７は、ＣＤ４  Ｔ細胞が、単独、ＩＬ−２ｖとの組み合わせ、または融合タンパク質としてのいずれかの抗ＰＤ−１の存在下でＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５による４８時間のリコールを受けたときに、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ（Ｂ）またはＩＦＮ−γ（Ｃ）を分泌する能力および増殖する能力（Ｄ）を示すものである。本発明者らは、ｐｐ６５および抗ＰＤ１で処理された試料と比較した場合、ＰＤ１−ＩＬ２ｖが、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを共分泌できる多機能性ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を増加できる傾向（図２１Ｂ）、ならびにＩＦＮ−γ単独分泌集団における有意な増加（図２１Ｃ）を観察した。逆に、ｐｐ６５と非標的ＩＬ−２ｖ（ＤＰ４７−ＩＬ２ｖ）との組み合わせは、ＩＬ−２単機能性ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を増加させた（図２１Ａ）。予想通り、Ｋｉ６７染色陽性により示されるように、標的または非標的ＩＬ−２ｖで処理された全ての細胞は、増殖した。
【０３１４】
図２８は、ＩＦＮ−γを分泌しているウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が、単独、ＩＬ−２ｖとの組み合わせ、または融合タンパク質としてのいずれかの抗ＰＤ−１の存在下でＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５による４８時間のリコールを受けたときのＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌの発現により分化状態を示すものである。増殖したＩＦＮ−γ分泌ウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の表現型特徴づけ（図２２）により、エフェクター−メモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−）プロファイルが明らかとなった。本発明者らは、ＰＤ１−ＩＬ２ｖ融合タンパク質によりＣＭＶ特異的消耗ＣＤ４  Ｔ細胞にＩＬ−２ｖを送達する結果として、分化したメモリープロファイルならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−γの両方を分泌する能力によって特徴付けられる長寿命防御ウイルス特異的集団の増殖が生じると結論することができる。
【０３１５】
実施例８
実施例８Ａ
ドナー１および２（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）の細胞活性化
健康ドナーからの新鮮単離されたＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート内の温培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン）に播種した（２００’０００細胞／ウェル）。プレートを３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ＩＬ２分子を含有する培地５０μｌ中に細胞を再懸濁し、３７℃で２０分間刺激した。リン酸化状態を保つために、細胞を等量の予備加温Ｃｙｔｏｆｉｘバッファー（５５４６５５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により３７℃で１０分間刺激後、直ちに固定した。その後、プレートを３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。細胞内染色させるために、細胞をＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）２００μｌ中に入れて４℃で３０分間透過処理した。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳバッファー１５０μｌで２回洗浄し、２枚の９６ウェル丸底プレートに分割し、それぞれ２０μｌの抗体ミックスＩまたはＩＩを用いて冷蔵庫内で６０分間染色した。抗体ミックスＩを使用して、ＣＤ４  Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を染色し、抗体ミックスＩＩを使用して、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２％  ＰＦＡ含有ＦＡＣＳバッファー２００μｌ／ウェル中に再懸濁した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して分析を行った。
【０３１６】
表９および表１０によるＦＡＣＳ抗体ミックスを使用した。
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【０３１７】
図２９は、ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖおよびＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔを用いてドナー１の静止ＰＢＭＣの治療を行ったときのＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）および制御性Ｔ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示すものである。３つの被験分子は、全て、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｔｒｅｇを除く）に対して等しく効力がある。ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する効力がより高く、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがそれに続く。ＦＡＰ−ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇに対する活性が最低である。
【０３１８】
図３０は、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、ＰＤ１−ＩＬ２ｃ、ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔおよびＰＤ１−ＴＩＭ３−ＩＬ２ｖを用いてドナー２の静止ＰＢＭＣの処理を行ったときのＣＤ４  Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）、制御性Ｔ細胞（Ｃ）およびＮＫ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示すものである。４つの被験分子は、全て、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｔｒｅｇを除く）に対して同程度の活性である。ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する効力がより高く、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがそれに続く。ＦＡＰ−ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇに対する活性が最低である。
【０３１９】
実施例８Ｂ
ドナー３および４の細胞活性化（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）
健康なドナーから単離された凍結ＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩培養した。翌日、細胞を９６ウェル丸底プレート中の温培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン）に播種した（２００’０００細胞／ウェル）。プレートを３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ＩＬ２分子を含有する培地５０μｌ中に細胞を再懸濁し、３７℃で２０分間刺激した。リン酸化状態を保つために、細胞を等量の予備加温Ｃｙｔｏｆｉｘバッファー（５５４６５５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により３７℃で１０分間刺激後、直ちに固定した。その後、プレートを３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。細胞内染色させるために、細胞をＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）２００μｌ中に入れて４℃で３０分間透過処理した。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳバッファー１５０μｌで２回洗浄し、２枚の９６ウェル丸底プレートに分割し、それぞれ２０μｌの抗体ミックスＩまたはＩＩを用いて冷蔵庫内で６０分間染色した。抗体ミックスＩを使用して、ＣＤ４  Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を染色し、抗体ミックスＩＩを使用して、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２％  ＰＦＡ含有ＦＡＣＳバッファー２００μｌ／ウェル中に再懸濁した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して分析を行った。表１１および表１２によるＦＡＣＳ抗体ミックスを使用した。
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【０３２０】
図３１は、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔ、ＰＤ１−ＴＩＭ３−ＩＬ２ｖを用いてドナー３の静止ＰＢＭＣの処理を行ったときのＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）および制御性Ｔ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示すものである。４つの被験分子は、全て、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｔｒｅｇを除く）に対して同程度の活性である。ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する効力がより高く、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがそれに続く。ＦＡＰ−ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇに対する活性が最低である。
【０３２１】
図３２は、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ、ＰＤ１−ＩＬ２ｖ、ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔ、ＰＤ１−ＴＩＭ３−ＩＬ２ｖを用いてドナー４の静止ＰＢＭＣの処理を行ったときのＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）および制御性Ｔ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示すものである。４つの被験分子は、全て、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞（Ｔｒｅｇを除く）に対して同程度の活性である。ＦＡＰ−ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する効力がより高く、ＰＤ１−ＩＬ２ｖがそれに続く。ＦＡＰ−ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇに対する活性が最低である。
【０３２２】
本発明のさらなる態様
１．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であるイムノコンジュゲート。
２．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり、
抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、およびＫａｂａｔ番号付けによる７１〜７３位に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、イムノコンジュゲート。
３．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり、
抗体が、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、イムノコンジュゲート。
４．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、
突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ−２配列、配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ−２分子であり、
抗体が、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、イムノコンジュゲート。
５．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３Ａおよび／またはアミノ酸置換Ｃ１２５Ａをさらに含む、態様１〜４のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
６．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、配列番号２０の配列を含む、態様１〜５のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
７．  １つ以下の突然変異ＩＬ−２ポリペプチドを含む、態様１〜６のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
８．  抗体が、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、態様１〜７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
９．  Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである、態様８に記載のイムノコンジュゲート。
１０．  Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、態様８または９に記載のイムノコンジュゲート。
１１．  抗体が、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである、態様１〜１０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１２．  Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、態様８〜１１のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１３．  Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えられ、それにより、内部に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能な、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する、態様８〜１２のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１４．  Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基が、トリプトファン残基により置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基が、バリン残基により置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、場合により、３６６位のスレオニン残基が、セリン残基により置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基が、アラニン残基により置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、態様８〜１３のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１５．  Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、３５４位のセリン残基が、システイン残基により置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、または３５６位のグルタミン酸残基が、システイン残基により置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基が、システイン残基により置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、態様１４に記載のイムノコンジュゲート。
１６．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドが、そのアミノ末端アミノ酸でＦｃドメインのサブユニットのうちの１つ、特にＦｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸と、場合によりリンカーペプチドを通じて融合されている、態様８〜１５のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１７．  リンカーペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、態様１６に記載のイムノコンジュゲート。
１８．  Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合性、および／またはエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様８〜１６のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
１９．  前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）の群から選択される１つまたは複数の位置にある、態様１８に記載のイムノコンジュゲート。
２０．  Ｆｃドメインの各サブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）を含む、態様８〜１９のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
２１．  配列番号２２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３または配列番号２４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
２２．  リンカー配列により繋がった突然変異ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる、態様１〜２１のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
２３．  態様１〜２２のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートをコードする、１つまたは複数の単離ポリヌクレオチド。
２４．  態様２３に記載のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数ベクター、特に発現ベクター。
２５．  態様２３に記載のポリヌクレオチドまたは態様２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
２６．  突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）態様２５に記載の宿主細胞をイムノコンジュゲートの発現に適した条件で培養すること、および場合により（ｂ）イムノコンジュゲートを回収することを含む、方法。
２７．  態様２６に記載の方法により産生される、突然変異ＩＬ−２ポリペプチドと、ＰＤ−１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲート。
２８．  態様１〜２２または２７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
２９．  医薬としての使用のための、態様１〜２２または２７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
３０．  疾患の治療における使用のための、態様１〜２２または２７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
３１．  前記疾患が、がんである、態様３０に記載の疾患の治療における使用のためのイムノコンジュゲート。
３２．  疾患の治療のための医薬の製造における、態様１〜２２または２７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートの使用。
３３．  前記疾患が、がんである、態様３２に記載の使用。
３４．  個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態で治療的有効量の態様１〜２２または２７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートを含む組成物を前記個体に投与することを含む方法。
３５．  前記疾患が、がんである、態様３４に記載の方法。
３６．  個体の免疫系を刺激する方法であって、薬学的に許容される形態で有効量の態様１〜２２または２７のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートを含む組成物を前記個体に投与することを含む方法。
３７．  本明細書の前記に記載された発明。
【０３２３】
理解を明瞭にすることを目指して、例証および例により前述の発明を幾分詳細に説明してきたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。本明細書において引用される全ての特許文献および科学文献の開示は、全体として参照により本明細書に明確に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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