(57)【要約】  本願に記載されるのは、葉酸受容体および他の葉酸結合タンパク質によって認識されて選択的に結合される葉酸受容体リガンド、例えば、葉酸または葉酸類似体にコンジュゲートされたＥＥＴ類似体、ならびに葉酸受容体を有する細胞集団に治療剤を標的化送達するための、そのようなコンジュゲートＥＥＴ類似体の使用である。より具体的には、本願において提供されるのは、葉酸受容体リガンドにコンジュゲートされたＥＥＴ類似体、および腎臓標的化治療薬としてのそのようなコンジュゲートＥＥＴ類似体の使用である。
2020534279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸受容体リガンドにコンジュゲートされたＥＥＴ類似体。
【請求項２】
ＥＥＴが、
【化１】
2020534279.tif 000011
からなる群から選択された式を有する、請求項１に記載のＥＥＴ類似体。
【請求項３】
ＥＥＴが、ＥＥＴ−Ａ、ＥＥＴ−Ｂ、およびＥＥＴ−Ｃ２２からなる群から選択される、請求項１に記載のＥＥＴ類似体。
【請求項４】
式
【化２】
2020534279.tif 000012
を有する、請求項１に記載のＥＥＴ類似体。
【請求項５】
式
【化３】
2020534279.tif 000013
を有する、請求項１に記載のＥＥＴ類似体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＥＥＴ類似体と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤からなる群から選択された少なくとも１つの成分とを含む医薬組成物。
【請求項７】
腎臓疾患の処置を必要とする対象において腎臓疾患を処置する方法であって、治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって腎臓疾患を処置するステップを含む方法。
【請求項８】
腎毒性の軽減を必要とする対象において腎毒性を軽減する方法であって、治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって腎毒性を軽減するステップを含む方法。
【請求項９】
腎毒性が薬物誘発性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
腎毒性がシスプラチン誘発性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
葉酸受容体を含む標的細胞集団に治療剤を送達する方法であって、請求項６に記載の医薬組成物を用意するステップと、標的細胞集団を治療有効量の医薬組成物に接触させて、化合物が葉酸受容体に結合できるようにするステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月１５日に出願された米国仮出願第６２／５５９，３５５号の優先権を主張するものであり、上記出願は、参照により、その内容全体が記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
該当なし
【背景技術】
【０００２】
米国腎臓財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によると、世界人口の１０％が慢性腎臓病（ＣＫＤ）に罹患し、経済的に利用可能な処置または有効な処置がないために、毎年数百万人が死亡している。ＣＫＤおよび末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の有病率が高まるのに伴い、ＣＫＤの経済的負担は、患者、その介護者および支払者のますます増大する懸念となっている。ＣＫＤおよびＥＳＲＤ患者の臨床的複雑さを管理するためには、ＣＫＤの検出および管理、ＥＳＲＤ処置、ならびに糖尿病、高血圧症、およびうっ血性心不全のような併存する状態の同時管理に関連する費用を含め、著しい医療費が発生する。腎疾患および心血管疾患に関連する進行性臓器障害は、有病率および死亡率の主な原因となっている。高血圧症および糖尿病は、ＥＳＲＤのおよび透析患者の数の増加の原因となる主な２つの疾患である。慢性腎臓病（ＣＫＤ）が重大な世界的医療問題であるとの認識が高まっているにもかかわらず、ＣＫＤが末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に進行するのを防止または遅延するために利用可能な薬理学的療法は未だにほとんどなく、まして治癒に至る療法はなおさらである。
また、薬物誘発腎毒性は、さまざまな悪性腫瘍の処置のために白金ベース化学療法剤の投与を受けている患者にとっての問題である。例えば、シスプラチンは、有効な化学療法剤であるが、臨床現場において、いくつかの有害副作用がシスプラチンの使用と関連付けられている。シスプラチンの投与を受けている患者において最も一般的な有害作用は、シスプラチン処置患者の２５〜４０％で発生する、重度の腎毒性である。シスプラチンの臨床使用中にその有害作用から腎臓を保護することができる薬剤を開発する必要があることは、広く認識されている。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】慢性試験プロトコルを示す概略図である。
【図２】葉酸コンジュゲート型のＥＥＴ類似体が腎臓を標的とすることを示すグラフである。
【図３】葉酸コンジュゲート型のＥＥＴ類似体を使用して、シスプラチン誘発腎損傷が減少することを示す図である。
【図４】葉酸コンジュゲートＥＥＴ類似体の実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本明細書において引用されている、特許および特許出願を含むがそれらに限定されないすべての刊行物は、参照により、それらの内容全体が本願に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
本明細書以下に記載されているのは、腎臓標的化エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）類似体、ならびに腎疾患および心血管疾患の処置のためにそのようなＥＥＴ類似体を使用する方法である。より具体的には、本明細書において提供されるのは、葉酸受容体および他の葉酸結合タンパク質によって認識されて選択的に結合される葉酸受容体リガンド、例えば、葉酸または葉酸類似体にコンジュゲートされたＥＥＴ類似体、ならびに腎臓標的化治療薬としてのそのようなコンジュゲートＥＥＴ類似体の使用である。一般に、これらの化合物および方法は、本発明者が心血管疾患および腎疾患に対する有望な治療可能性を有するＥＥＴアゴニストおよび類似体を開発したことに、少なくとも一部基づいている。本発明者らは、以前に、１４，１５−ＥＥＴの一連の類似体を合成し、基本的なファーマコフォアを定義し、これを代謝により不活性化されないように安定化させた。ＥＥＴ−Ａ、ＥＥＴ−Ｂ、およびＥＥＴ−Ｃ２２と称されるこれらの類似体のサブセットは、優れた薬物動態特性で、経口活性を示す。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３２０９０、ならびに米国特許第９，４２２，３１８号および第９，１２７，０２７号（これらはそれぞれ、参照により、その内容全体が記載されているかのように、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０００５】
第１の態様では、本明細書において提供されるのは、葉酸（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）としても知られている）受容体リガンド、例えば、葉酸、メトトレキサート、または葉酸受容体（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する葉酸類似体（ｆｏｌａｔｅ  ａｎａｌｏｇ）などにコンジュゲートされたエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）類似体を含む、ＥＥＴの腎臓標的化類似体である。特定の理論または作用機序に拘束されるものではないが、葉酸受容体リガンドのＥＥＴ類似体との連結により、この葉酸連結化合物は、高レベルの葉酸受容体（ＦＲ）を発現する細胞、例えば、腎臓の近位尿細管細胞を標的とすると考えられる。適切な葉酸受容体リガンドとしては、葉酸、メトトレキサート、および葉酸受容体に結合する葉酸類似体が挙げられる。葉酸受容体リガンドは、ＥＥＴ類似体に直接コンジュゲートしてもよく、または代替的に、葉酸受容体リガンドは、リンカーによってＥＥＴ類似体に間接的にコンジュゲートされてもよい。
場合によっては、コンジュゲート化合物を形成するために使用されるＥＥＴ類似体は、
【０００６】
【化１】
2020534279.tif 000003
からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、以下の式を有し、葉酸受容体に対する結合親和性をさらに示す。
【０００７】
【化２】
2020534279.tif 000004
腎臓標的化ＥＥＴ類似体を合成するためのＥＥＴ類似体の葉酸コンジュゲーションに適したリンカーおよび連結化学には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ＰＥＧ−ジアミンリンカーが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ある特定の実施形態では、ＥＥＴ類似体は、ＰＥＧジアミンリンカーを介して、葉酸受容体リガンドにコンジュゲートされる。他の例では、リンカーは、エチレンジアミン（例えば、図４を参照）、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート（ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、カルボジイミド、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む。
【０００８】
リンカーは、永久的な連結または半永久的な（不安定な）連結のいずれか作成してもよい。半永久的な連結を含めることは、薬物の細胞取り込みが望まれる用途では特に有利である。
腎臓標的化ＥＥＴ類似体の合成は、下記の例示的合成プロトコルに従って達成することができる。他の葉酸類似体の合成は、当業者に公知の方法により達成することができる。さらに、任意選択によるリンカーの組み込みもまた、当業者に公知の方法により達成することができる。
葉酸コンジュゲートの合成
ＥＥＴ−Ｆ０１の合成
【０００９】
【化３】
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実験
【００１０】
【化４】
2020534279.tif 000006
【００１１】
ジイロプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．１８ｍＬ、６．７８ｍｍｏｌ、３．００当量）を、無水ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）中の葉酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル1（１）（１１．４４ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）と２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］−Ｎ−トリチルエタン−１−アミン2（２）（１．０６ｇ、２．７１ｍｍｏｌ、１．２０当量）との混合物に添加した。１８時間後、ＤＭＳＯを蒸発させ（５０℃、０．１トル）、残留物をアセトン／エーテル（２０／７０、２×５０ｍＬ）、次いでアセトン（２×５０ｍＬ）を用いてすりつぶした。残留物を高真空下で一晩乾燥させて、オレンジ色の固体を得（オレンジ色の固体、２．００ｇ）、これをさらに精製せずに次のステップに引き継いだ。
【００１２】
【化５】
2020534279.tif 000007
【００１３】
ＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏ（５／１、６ｍＬ）中の粗３（１．０９ｇ、１．３４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、５．３６ｍＬ）を滴下した。穏やかに２時間振盪した後、混合物を真空中で濃縮し、無水トルエン（１０ｍＬ）を用いて残留物を共沸脱水した。残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）を用いてすりつぶした。このとき、黄色がかったＣＨ2Ｃｌ2上澄みを毎回ピペットで除去し、洗浄するたびに徐々に黄色が薄くなり、やがてほぼ無色になった。粗４（濃厚な赤色の油）をさらに精製せずに次のステップで使用した。
【００１４】
【化６】
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無水ＤＭＳＯ（６ｍＬ）中の粗４（０．８９１ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（１．１３ｍＬ、６．５０ｍｍｏｌ、５．００当量）を滴下した。１５分後、無水ＣＨ2Ｃｌ2（６ｍＬ）中のＥＥＴ類似体ＮＨＳエステル５（０．５６９ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間後、反応混合物を氷冷２０％アセトン／Ｅｔ2Ｏ（５０ｍＬ）で希釈した。上澄みをデカントして得られた沈殿物から取り除き、残留物をさらなる２０％アセトン／Ｅｔ2Ｏ（５０ｍＬ）、５０％アセトン／Ｅｔ2Ｏ（１００ｍＬ）、０．１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）、次いでアセトン（２×５０ｍＬ）を逐次用いてすりつぶした。残留物を高真空下で一晩乾燥させて、オレンジ色の固体としてＥＥＴ−Ｆ０１（６）を得た（０．６９０ｇ、５９％）。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.65 (s, 1H), 7.93-7.80 (m, 1H), 7.73-7.58 (m, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.64 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 2H), 5.79-5.69 (m, 2H), 5.38-5.28 (m, 2H), 4.49 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.52-3.45 (m, 4H), 3.22-3.13 (m, 4H), 3.01-2.87 (m, 4H), 2.10-2.09 (m, 2H), 2.05 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.93 (m, 4H), 1.51-1.40 (m, 2H), 1.40-1.14 (m, 18H), 0.86 (t, J = 7.0 Hz, 3H). LCMS (ES-APCI+) [C44H67N11O9]+の計算値894.1, 実測値894.4.
【００１５】
ＥＥＴ類似体ＮＨＳエステル５の合成。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、０．１６５ｇ、１．４３ｍｍｏｌ、１．１０当量）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．３２２ｇ、１．５６ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、無水ＥｔＯＡｃ（２６ｍＬ）中のＥＥＴ類似体3７（０．４４３ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）の０℃の攪拌溶液に添加した。５分後、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ、１５．９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、０．１００当量）を添加し、懸濁液を室温まで温めた。２４時間後、反応物をＣｅｌｉｔ（商標）のパッドを通して濾過し、このＣｅｌｉｔ（商標）ベッドをＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で脱水し、濾過し、真空中で濃縮して粗５を得、これをさらに精製せずに次のステップで使用した。
ＥＥＴ−Ａ葉酸コンジュゲートの合成
【００１６】
【化７】
2020534279.tif 000009
【００１７】
９の合成。ＥＥＴ−Ａ二ナトリウム塩3（１００ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ、８８ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ、２．３当量）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、６．１０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．２当量）の無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中の混合物を室温で攪拌した。２時間後、無水ＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）中の２（１８８ｍｇ、０．４８１ｍｍｏｌ、２．４０当量）およびＤＩＰＥＡ（７９μＬ、０．４４０ｍｍｏｌ、２．２０当量）を逐次添加した。さらに４０時間後、混合物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で希釈し、真空中で濃縮した。Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）Ｒfクロマトグラフシステム（４ｇ  ＳｉＯ2カラム）を使用してこの粗生成物を精製し（２５分間にわたる０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン；１５分間の１００％ＥｔＯＡｃ；および７分間の１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2のグラジエントで溶出）、９（１６９ｍｇ、７０％）を得た。
【００１８】
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.51-7.44 (m, 14H), 7.33-7.25 (m, 14H), 7.24-7.17 (m, 6H), 5.87 (s, 1H), 5.40-5.33 (m, 2H), 4.69 (dd, J = 7.5, 5.9 Hz, 1H), 3.71-3.49 (m, 18H), 3.17-3.07 (m, 4H), 2.62 (dd, J = 15.0, 6.0 Hz, 1H), 2.53 (dd, J = 15.0, 7.7 Hz, 1H), 2.35 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 2.21 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 2.13-1.99 (m, 4H), 1.66-1.54 (m, 2H), 1.53-1.45 (m, 4H), 1.43-1.26 (m, 14H), 0.93 (t, J = 6.9 Hz, 3H).
【００１９】
１０の合成。Ｈ2Ｏ（０．５０ｍＬ）およびＣＨＣｌ3（１．５ｍＬ）中のトリチル保護アミン９（１３０ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）の混合物に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．４０ｍＬ）を滴下した。４５分後、反応物をＭｅＯＨ（３ｍＬ）で希釈し、真空中で濃縮した。トルエンとの共蒸発（３×５ｍＬ）により、白色の固体として１０を得、これをさらに精製せずに次のステップに進めた。
【００２０】
１１の合成。粗１（１１６ｍｇ、０，２１６ｍｍｏｌ、２当量）および１０（７７ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（１．５０ｍＬ）中の混合物に、ＤＩＰＥＡ（７７μＬ、０．４３２ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。４０時間後、混合物を撹拌しながら０℃のＥｔ2Ｏ（２５ｍＬ）中に注いだ。上澄みを慎重にデカントして得られた沈殿物から取り除き、沈殿物を、アセトン／Ｅｔ2Ｏ（３０／７０、３０ｍＬ）およびアセトン／ＣＨ2Ｃｌ2（３０／７０、３０ｍＬ）を用いてすりつぶした。残留物を高真空下で乾燥させて、オレンジ色の固体として１１（５７ｍｇ）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.73-8.61 (m, 2H), 8.12-7.83 (m, 4H), 7.76-7.55 (m, 3H), 7.03-6.88 (m, 2H), 6.64 (dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 4H), 5.76 (br s, 2H), 5.40-5.20 (m, 2H), 4.57-4.42 (m, 5H), 3.68-3.44 (m, 14H), 3.22-3.08 (m, 6H), 3.06-2.88 (m, 6H), 2.02-1.84 (m, 7H), 1.53-1.14 (m, 18H), 0.92-0.78 (m, 3H).
【００２１】
本明細書に記載の腎臓標的化ＥＥＴ類似体は、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に製剤化して、一次治療剤を形成してもよい。「薬学的に許容される担体」とは、治療剤または予防剤（例えば、腎臓標的化ＥＥＴ類似体）を投与するためのビヒクルとして使用することができる物質であり、そのために、この物質は、その薬剤と適合性があるだけでなく、不活性であるか、あるいは医学的に許容される物質である。
また、コンジュゲートおよび／または複合体と、治療剤を形成するための薬学的に許容される賦形剤とを一緒に含むキットも開示される。キットは、治療剤を投与するための道具を含んでもよい。さらに、キットは、１つ以上の補助治療剤および／または診断剤を含んでもよい。
【００２２】
本明細書に記載の腎臓標的化ＥＥＴ類似体の有利な特性にはまた、ＥＥＴ類似体を腎臓に標的化送達し、それにより、ＥＥＴの有用な生物学的特性（例えば、血管拡張、抗炎症、抗アポトーシス、および抗線維症）を標的化した形で活用すること、腎毒性を防止または制限するための予防薬としても介入治療としても有用であること、対応する非標的化ＥＥＴと比較して、１０分の１の用量で有効であること、および全身性副作用が少ないことが含まれる。
別の態様では、本明細書において提供されるのは、腎臓疾患の処置を必要とする対象において、本明細書に記載の化合物で腎臓疾患を処置する方法である。また、葉酸受容体を含む標的細胞集団に治療剤を送達する方法であって、請求項１に記載の化合物を用意するステップと、標的細胞集団を有効量の化合物に接触させて、化合物が葉酸受容体に結合できるようにするステップとを含む方法も本明細書において提供される。
本明細書に記載の腎臓標的化ＥＥＴ類似体の治療的および予防的応用には、限定するものではないが、近位尿細管から始まった腎疾患、急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、およびバイパスまたは移植手術後の虚血性腎損傷の処置、シスプラチン誘発腎毒性を含む薬物誘発腎毒性の処置または予防、移植用の腎臓を保存するための保存剤としての使用、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、および慢性腎臓病（ＣＫＤ）の処置が含まれる。本明細書において提供される腎臓標的化ＥＥＴ類似体のその他の治療的および予防的応用としては、薬物および放射線誘発腎障害、高血圧症および心腎症候群腎障害、ならびにメタボリックシンドロームおよび糖尿病腎症の処置および／または予防が挙げられる。
【００２３】
別途定めのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同様の意味を有する。本発明を試験または実施する上で、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を本明細書に記載する。
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を例示する。実施例において提示する例、方法、および条件は、本発明の範囲および趣旨を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
ＥＥＴ類似体の腎臓標的化送達
エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）類似体は、心血管疾患および腎疾患に対処する非常に優れた治療可能性を有する。ＥＥＴ類似体は、急性および慢性腎臓病モデルにおける障害に対処する。ＥＥＴ類似体に起因する生物学的作用、例えば、血管拡張、抗炎症、抗アポトーシス、および抗線維症は、腎疾患の処置に理想的に適している。ＥＥＴ類似体は、いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて良好な結果を示しているが、ＥＥＴ類似体の腎臓への標的化送達は、腎臓における治療効果を達成するために必要とされる薬物レベルを減少させ、かつ副作用の可能性を取り除くことが合理的に予想できる。
【００２５】
ＥＥＴ類似体の腎臓標的化送達のために、本発明者らは、腎組織に高濃度の葉酸受容体が存在することから、ＥＥＴ類似体を葉酸にコンジュゲートした。ＥＥＴ類似体は、ＰＥＧ−ジアミンリンカーを介して葉酸にコンジュゲートした。次いで、本発明者らは、腎臓標的化ＥＥＴ類似体、ＥＥＴ−Ｆ０１を、十分に研究されているＥＥＴ類似体、ＥＥＴ−Ａと比較した。ＥＥＴ−ＡまたはＥＥＴ−Ｆ０１をラット頸静脈から６時間静脈内注入した（１０ｍｇ／ｋｇ／時）。血漿および腎組織を採取し、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによりＥＥＴ−ＡまたはＥＥＴ−Ｆ０１を測定した。ＥＥＴ−Ａ血漿レベルは、１．６ｎｇ／ｍＬであったが、腎臓ではＥＥＴ−Ａは検出されなかった。一方、ＥＥＴ−Ｆ０１は、血漿中では６．５ｎｇ／ｍＬであり、腎組織中では２６．７ｎｇ／ｍＬであった。これらのデータは、ＥＥＴ−Ｆ０１が腎臓を標的とすることを示している。ＥＥＴ−Ｆ０１とＥＥＴ−Ａを比較して、シスプラチン誘発腎毒性の減少を実験した。ビヒクル、ＥＥＴ−Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）、またはＥＥＴ−Ｆ０１（２０ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で５日間処置したＷＫＹラットに、単一の注射によりシスプラチン（７ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を投与した。シスプラチンは、対照（ＢＵＮ３６±９ｍｇ／ｄＬおよびＮＡＧ４±１ＩＵ／Ｌ）と比較して、ＢＵＮ（１２５±１１ｍｇ／ｄＬ）およびＮＡＧ（１２±４ＩＵ／Ｌ）を上昇させた。ＥＥＴ−Ｆ０１は、シスプラチン投与５日後のＢＵＮ、ＮＡＧ、および腎組織損傷の減少に、ＥＥＴ−Ａと同様の効果があった。ＥＥＴ−Ｆ０１は、ＥＥＴ−Ａと比較して分子量がほぼ２倍であったにもかかわらず、２０ｍｇ／ｋｇ／日および１０分の１の用量の２ｍｇ／ｋｇ／日で、ＢＵＮおよびＮＡＧを低下させるのに有効であった。これらのデータは、ＥＥＴ−Ｆ０１が腎臓を標的とし、より低い有効用量を可能にすることを明確に示している。結論として、本発明者らは、腎疾患の治療薬として優れた可能性を示す腎臓標的化ＥＥＴ類似体、ＥＥＴ−Ｆ０１を開発した。
【００２６】
（実施例２）
腎臓標的化ＥＥＴ類似体を用いた、シスプラチン誘発腎毒性の予防
シスプラチンは、さまざまな悪性腫瘍を処置するために利用できる、白金ベース無機化学療法剤である（１〜３）。しかしながら、臨床現場において、いくつかの有害副作用がシスプラチンの使用と関連付けられている。いくつかの有害副作用の中でも、最も一般的な有害作用は、シスプラチン処置患者の２５〜４０％で発生する重度の腎毒性であり、これは、この化学療法剤の効果的な使用に影響を与えている（４〜７）。シスプラチンの臨床使用中にその有害作用から腎臓を保護することができる薬剤を開発する必要があることは、広く認識されている。シスプラチン腎毒性に対する腎臓保護剤を開発するために利用することができる１つの手法は、アラキドン酸からエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を産生するＣＹＰエポキシゲナーゼ経路を標的とすることである。
【００２７】
いくつかの研究は、ＥＥＴが、腎臓を含む臓器の保護に役立つ無数の生物学的作用を示すことを立証している（８、９）。本発明者らは、これらの研究で、合成ＥＥＴ模倣体が、高血圧症、シスプラチン腎毒性、および放射線腎症のような多数の病的状態において、腎臓を保護することを立証した（１０〜１４）。これらの研究は、さまざまな病因の病的状況において腎臓を保護する、ＥＥＴベース手法の可能性を明確に示し、本発明者らは、ＥＥＴ模倣特性を有するいくつかの合成ＥＥＴ類似体を開発した。
近年、腎臓を標的とする独自の特性に加え、ＥＥＴ模倣活性を有するＥＥＴ類似体を開発する試みがなされている。本発明者らは、ＥＥＴファーマコフォアを葉酸にコンジュゲートすることにより、新規の形態の腎臓標的化ＥＥＴ類似体を開発した。予備的研究において、本発明者らは、その腎臓を標的とする能力を、葉酸コンジュゲーションを含まないＥＥＴ類似体と比較して研究した。本発明者らはまた、シスプラチン腎毒性から腎臓を保護する葉酸コンジュゲートＥＥＴ類似体の能力を、葉酸部分を含まない元のＥＥＴ類似体と比較した。
【００２８】
材料および方法
すべての化学物質とアッセイキットは、別段に記載のない限り、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ＥＥＴ類似体は、米国テキサス州ダラスのテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンター生化学科Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｆａｌｃｋ研究室で設計および合成された。
【００２９】
動物実験：すべての動物実験は、ウィスコンシン医科大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに従って承認を受け、これに従って実施された。動物は、１２時間明暗周期の温度制御環境下で維持し、飼料および水は自由に摂取させた。ラットに、実験前に６日間の馴化期間を与えた。
急性試験：一晩絶食させた（１２〜１４時間）オスＳＤラット（１０週齢）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。気管切開後、左頸静脈にカニューレを挿入して、６ｍｌ／ｋｇ／時の速度で６時間、ビヒクル、またはＥＥＴ−Ａ、または葉酸コンジュゲートＥＥＴ類似体を連続的に注入した。プロトコルの終了時に、血漿および腎臓試料を採取し、液体窒素中で急速凍結させ、ＬＣ−ＭＳ分析まで−８０0Ｃで保存した。生理食塩水中の０．１％ＤＭＳＯおよび１％ＰＥＧ−４００で、ＥＥＴ−Ａおよび葉酸コンジュゲートＥＥＴ類似体の溶液を調製した。
慢性試験：慢性試験では、１８０〜２００ｇのオスＷｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。ラットを４群に割り当てた（各群ｎ＝４）。第１群のラットは、飲料水を自由に摂取させ、７日目に、シスプラチン溶液の調製に使用したＤＭＳＯ（３００〜５００μｌ、ｉ．ｐ．）を投与した。一方、第２群、第３群、第４群、および第５群のラットはそれぞれ、浸透圧ミニポンプ（２ＭＬ、Ａｌｚｅｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）に入れたビヒクル（ＰＥＧ−４００中ＤＭＳＯ２０％ｖ／ｖ）、ＥＥＴ類似体（再蒸留水中のＥＥＴ類似体）、または２０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ用量の新規葉酸コンジュゲートＥＥＴ類似体Ｆ０１（ＰＥＧ４００中の２０％ＤＭＳＯの混合物で調製）で７日間前処置した。７日目に、これらのラットに、単一用量のシスプラチン（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与し、その後、ビヒクル、ＥＥＴ−Ａ、およびＦ０１で５日間処置した。安楽死の１日前、それぞれのラットの尿を２４時間採取した。シスプラチンまたはビヒクル投与の５日後、血液試料採取のためにラットを麻酔し、その後安楽死させた。このプロトコルの概略図を１に示す。
【００３０】
生化学分析：血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および尿中Ｎ−アセチル−β−（Ｄ）−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）（Ｄｉａｚｙｍｅ（Ｄｉａｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のキット）を測定した。
【００３１】
質量分析：ＥＥＴ−Ａおよび葉酸コンジュゲートＥＥＴ−Ａの血漿レベルおよび腎臓レベルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法によって測定した。Ｖａｒｉａｎ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ（登録商標）Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた固相抽出によって、ＥＥＴ−Ａまたは葉酸コンジュゲートＥＥＴ−Ａで処置したラットの血漿もしくは腎ホモジネート２００μｌから試料を調製した。抽出した試料を分析前に−８０℃で保存した。試料を室温に温め、窒素流で乾燥し、残留物をアセトニトリル２０μＬで再構成し、１２μＬを注入した。細孔径１００Åを有する粒径５μｍの粒子を充填した２５０ｍｍ×２．０ｍｍのＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８−カラムで成分を分離した。溶出液流量０．２ｍＬ／分で、８０％Ａ〜１０％Ａのグラジエント溶出を使用した。溶媒Ａは、ギ酸０．０１％を含む水、溶媒Ｂは、ギ酸０．０１％を含むアセトニトリルとし、以下のプロファイルを使用した：１０分間で２０％Ｂ〜３０％Ｂ、１７分間で３０％Ｂ〜６０％Ｂ、２８分間で６０％Ｂ〜９０％Ｂ、１００％で７分間維持後、７分間再平衡化。Ｊｅｔ  Ｓｔｒｅａｍ（商標）インターフェースを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  ６４６０三連四重極型質量分析計で、ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。負の極性でそれぞれの化合物について、プリカーサーイオン、プロダクトイオン、コリジョンエネルギー、およびフラグメンター電圧を最適化した。その他のパラメータは、以下のとおりである：ドライガス流量＝３２５℃で１０Ｌ／分、ネブライザー＝２０ｐｓｉ、シースガス流量＝３２５℃で１１Ｌ／分、キャピラリー＝３．５ｋＶ、およびノズル＝１．０ｋＶ。単位質量分解能で結果を得た。
【００３２】
結果
急性静脈内投与後、Ｆ０１の血漿および腎含有量はＥＥＴ−Ａよりも高い。
急性動物実験では、同じ用量のＥＥＴ−ＡおよびＦ０１を６時間静脈内投与してから、血漿および腎組織を採取した。本発明者らは、Ｆ０１およびＥＥＴ−Ａの６時間連続投与後、Ｆ０１の血漿レベルが、ＥＥＴ−Ａと比較して５倍高いことを示した（図２）。興味深いことに、本発明者らはまた、６時間連続投与後、ＥＥＴ−Ａの腎含有量が、Ｆ０１の腎含有量と比較して、ほぼ検出不能であることも示した（図２）。
Ｆ０１の慢性処置は、シスプラチン腎毒性に対し、ＥＥＴ−Ａよりも良好な腎臓保護作用を示した。
別の一連の実験では、ラットの群をＦ０１およびＥＥＴ−Ａで前処置してから、シスプラチン腎症を誘発し、その後、試験化合物（Ｆ０１およびＥＥＴ−Ａ）でさらに５日間処置した。Ｆ０１およびＥＥＴ−Ａの腎臓保護作用を血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルおよび尿中ＮＡＧ含有量から判定した。本発明者らは、Ｆ０１が、非葉酸型ＥＥＴ類似体であるＥＥＴ−Ａと比較して、より良好な腎臓保護作用を有することを示した（図３）。
【００３３】
結論
葉酸コンジュゲート型のＥＥＴ類似体Ｆ０１は、その非葉酸コンジュゲート型よりも、速い速度で血漿および腎臓に到達する能力を有する。また、Ｆ０１化合物は、シスプラチン腎毒性に対し、ＥＥＴ−Ａよりも優れた腎臓保護作用を示した。
【００３４】
参考文献
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本発明を１つ以上の好適な実施形態に関して記載してきたが、明示的に記載されているものに加え、多数の同等形態、代替形態、変形形態、および修正形態が可能であり、かつ本発明の範囲に含まれることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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