(57)【要約】本発明は、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体のバリアント型を用いてワクチンに対する免疫応答を増強する方法を提供する。本発明における使用のためのバリアント抗ＣＴＬＡ−４抗体は非フコシル化イピリムマブを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンで処置されたヒト対象のワクチンに対する免疫応答を増強する方法であって、イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体を該対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
抗体が以下を含む、請求項１記載の抗体：
ａ．配列番号３の配列からなるＣＤＲＨ１；
ｂ．配列番号４の配列からなるＣＤＲＨ２；
ｃ．配列番号５の配列からなるＣＤＲＨ３；
ｄ．配列番号６の配列からなるＣＤＲＬ１；
ｅ．配列番号７の配列からなるＣＤＲＬ２；および
ｆ．配列番号８の配列からなるＣＤＲＬ３。
【請求項３】
抗体が以下を含む、請求項２記載の抗体：
ａ．配列番号９の配列からなる重鎖可変ドメイン；および
ｂ．配列番号１０の配列からなる軽鎖可変ドメイン。
【請求項４】
抗体が以下を含む、請求項３記載の抗体：
ａ．配列番号１２の配列からなる重鎖；および
ｂ．配列番号１３の配列からなる軽鎖。
【請求項５】
抗体が以下を含む、請求項４記載の抗体：
ａ．配列番号１１の配列を含む重鎖；および
ｂ．配列番号１３の配列を含む軽鎖。
【請求項６】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、実施例２に詳述されるＮＫ９２細胞介在性溶解アッセイにおいてイピリムマブの細胞溶解のＥＣ５０よりも少なくとも２倍低い細胞溶解のＥＣ５０を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、実施例２に詳述されるＮＫ９２細胞介在性溶解アッセイにおいてイピリムマブの細胞溶解のＥＣ５０よりも少なくとも１０倍低い細胞溶解のＥＣ５０を示す、請求項６記載の方法。
【請求項８】
抗体が以下を含む、請求項１記載の抗体：
ａ．配列番号１４の配列からなるＣＤＲＨ１；
ｂ．配列番号１５の配列からなるＣＤＲＨ２；
ｃ．配列番号１６の配列からなるＣＤＲＨ３；
ｄ．配列番号１７の配列からなるＣＤＲＬ１；
ｅ．配列番号１８の配列からなるＣＤＲＬ２；および
ｆ．配列番号１９の配列からなるＣＤＲＬ３。
【請求項９】
抗体が以下を含む、請求項８記載の抗体：
ａ．配列番号２０の配列からなる重鎖可変ドメイン；および
ｂ．配列番号２１の配列からなる軽鎖可変ドメイン。
【請求項１０】
抗体が以下を含む、請求項９記載の抗体：
ａ．配列番号２３の配列からなる重鎖；および
ｂ．配列番号２４の配列からなる軽鎖。
【請求項１１】
抗体が以下を含む、請求項９記載の抗体：
ａ．配列番号２２の配列を含む重鎖；および
ｂ．配列番号２４の配列を含む軽鎖。
【請求項１２】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、実施例２に詳述されるＮＫ９２細胞介在性溶解アッセイにおいてイピリムマブの細胞溶解のＥＣ５０よりも少なくとも２倍低い細胞溶解のＥＣ５０を示す、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、実施例２に詳述されるＮＫ９２細胞介在性溶解アッセイにおいてイピリムマブの細胞溶解のＥＣ５０よりも少なくとも１０倍低い細胞溶解のＥＣ５０を示す、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のフコシル化が低下している、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が低フコシル化または非フコシル化されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が非フコシル化されている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、ｉ）Ｇ２３６Ａ；ｉｉ）Ｓ２３９Ｄ；ｉｉｉ）Ｆ２４３Ｌ；ｉｖ）Ｅ３３３Ａ；ｖ）Ｇ２３６Ａ／Ｉ３３２Ｅ；ｖｉ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；ｖｉｉ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ；ｖｉｉｉ）Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ；ｉｘ）Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ；ｘ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；ｘｉ）Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；ｘｉｉ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ；およびｘｉｉｉ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択される変異または一群の変異を含むＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のフコシル化が低下している、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が低フコシル化または非フコシル化されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
イピリムマブの少なくとも２倍のＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が非フコシル化されている、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンに対する免疫応答を増強する方法、および免疫調節性抗体のワクチンアジュバントとしての具体的な使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、物質（病原体または腫瘍細胞など）に対する免疫応答を誘発することを目的とする。しかしながら、ワクチンは必ずしも免疫応答を誘発しない。アジュバントは免疫応答を増強するためにワクチンと共に投与される化合物であり、通常は細胞性免疫ではなく液性免疫を増強し、これはがんワクチンの有効性に特に重要である。Ikeda et al. (2004) Cancer Sci. 95:697。免疫調節性受容体に対する抗体がワクチンアジュバントとして提案されている。Keler et al. (2003) J. Immunol. 171:6251; Ponte et al. (2010) Immunol. 130:231; Kwek et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:289; ＷＯ２００９／１００１４０; ＷＯ２０１４／０８９１１３参照。（抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブを前立腺がんの治療ワクチンのための潜在的なアジュバントとして使用している）Clinical Trial NCT00113984も参照。しかしながら、既存のアジュバントは必ずしも完全に有効であるとは限らない。
【０００３】
ワクチンアジュバント活性が改善された物質の必要性が存在する。そのような改善されたアジュバントは所定の用量のワクチンに対する免疫応答の程度を理想的に増強し、所望のレベルの免疫応答を達成するのに必要とされるワクチンの量を減少させ、かつ／または免疫応答の持続時間を増加させる。そのような物質は好ましくは液性免疫応答だけでなく、細胞性免疫応答も増強する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いてワクチンに対する免疫応答を増強する方法を提供する。本発明のＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体はワクチン（腫瘍ワクチンなど）とともに投与される。
【０００５】
ある実施態様において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、それぞれ配列番号３〜８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む。別の実施態様において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、それぞれ配列番号９および１０のＶＨおよびＶＬ配列を含む。さらなる実施態様において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号１１または１２のＨＣ配列および配列番号１３のＬＣ配列を含む。
【０００６】
代替の実施態様において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、それぞれ配列番号１４〜１９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む。別の実施態様において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、それぞれ配列番号２０および２１のＶＨおよびＶＬ配列を含む。さらなる実施態様において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号２２または２３のＨＣ配列および配列番号２４のＬＣ配列を含む。
【０００７】
増強されたＡＤＣＣは、イピリムマブのＡＤＣＣ活性を基準にして測定される。様々な実施態様において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブと比較して２倍、１０倍またはそれ以上のＡＤＣＣを示す。ある実施態様において、ＡＤＣＣは、実施例２に記載のＮＫ９２細胞介在性溶解アッセイによって測定される。ある実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、実施例２に記載のアッセイにおいてイピリムマブのＥＣ５０よりも少なくとも２倍低いＥＣ５０を示す。別の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、実施例２に記載のアッセイにおいてイピリムマブのＥＣ５０よりも少なくとも１０倍低いＥＣ５０を示す。
【０００８】
他の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、フコシル化が低下しており、または低フコシル化(hypofucosylate)もしくは非フコシル化されている。さらなる実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ｉ）ＦｃγＲ結合を増強するためのＦｃ領域への１以上のアミノ酸変異、および任意でｉｉ）フコシル化の低下または除去を含む。
【０００９】
ある実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、フコシル化が低下したイピリムマブである。別の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、低フコシル化イピリムマブである。さらに別の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、非フコシル化イピリムマブである。
【００１０】
別の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、フコシル化が低下したトレメリムマブである。別の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、低フコシル化トレメリムマブである。さらに別の実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、非フコシル化トレメリムマブである。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本発明のＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）との結合を増強する少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、ｉ）Ｇ２３６Ａ、ｉｉ）Ｓ２３９Ｄ、ｉｉｉ）Ｆ２４３Ｌ、ｉｖ）Ｅ３３３Ａ、ｖ）Ｇ２３６Ａ／Ｉ３３２Ｅ、ｖｉ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、ｖｉｉ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、ｖｉｉｉ）Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、ｉｘ）Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、ｘ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、ｘｉ）Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、ｘｉｉ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、およびｘｉｉｉ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択される変異または一群の変異など）を含む。さらなる実施態様において、ＡＤＣＣを増強する１以上のアミノ酸を含むＡＤＣＣ活性が増強された抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体はまた、フコシル化が低下しており、または低フコシル化もしくは非フコシル化されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面において提供される実験結果は、実施例１に記述されるモーリシャス島産カニクイザル(Mauritian cynomolgus macaque)の3回の独立して反復された実験（反復Ａ、反復Ｂおよび反復Ｃ）に由来している。４匹のカニクイザル／群を含む反復Ａは、図１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａおよび９Ａに示されるデータを取得するのに使用された試料を提供した。６匹のカニクイザル／群を含む反復Ｂは、図１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ａ（反復Ａ由来のＮｅｆ ＬＴ９データはない）、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂおよび１１に示されるデータを取得するのに使用された試料を提供した。６匹のカニクイザル／群を含む反復Ｃは、図１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、６Ｂ（反復Ａ由来のＮｅｆ ＬＴ９データはない）、７Ｃ、８Ｃおよび９Ｃに示されるデータを取得するのに使用された試料を提供した。データ点の具体的な数値は、（例えば、反復ＡおよびＢを反復Ｃと比較すると）個別の実験プロトコルにおけるわずかな差異により反復間で変動し得るが、定性的傾向、したがって関連する科学的結論は同じである。
【００１３】
非フコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体について、反復ＢおよびＣでは抗ヒトＣＴＬＡ−４ ｍＡＢであるイピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））を用いたが、反復ＡではイピリムマブのＩｇＧ１ｆアロタイプバリアントを用いた。両アロタイプは本明細書の実験において機能的に同等である。
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＮｅｆ ＲＭ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｎｅｆ ＲＭ９＋細胞を、ＲＭ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４は、Ｎ結合型グリコシル化部位を除去したＮ２９７Ａ重鎖配列バリアントを指し、これはエフェクター機能を持たない非グリコシル化Ｆｃ領域を生成する。この図および「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用を説明する他の全ての図において、「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４抗体は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。図１Ａ〜図１Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＮｅｆ ＲＭ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｎｅｆ ＲＭ９＋細胞を、ＲＭ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４は、Ｎ結合型グリコシル化部位を除去したＮ２９７Ａ重鎖配列バリアントを指し、これはエフェクター機能を持たない非グリコシル化Ｆｃ領域を生成する。この図および「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用を説明する他の全ての図において、「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４抗体は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。図１Ａ〜図１Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＮｅｆ ＲＭ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｎｅｆ ＲＭ９＋細胞を、ＲＭ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４は、Ｎ結合型グリコシル化部位を除去したＮ２９７Ａ重鎖配列バリアントを指し、これはエフェクター機能を持たない非グリコシル化Ｆｃ領域を生成する。この図および「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用を説明する他の全ての図において、「不活性な」抗ＣＴＬＡ−４抗体は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。図１Ａ〜図１Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【００１５】
【図２Ａ】図２Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＧａｇ ＧＷ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｇａｇ ＧＷ９＋細胞を、ＧＷ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。図２Ａ〜図２Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＧａｇ ＧＷ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｇａｇ ＧＷ９＋細胞を、ＧＷ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。図２Ａ〜図２Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＧａｇ ＧＷ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｇａｇ ＧＷ９＋細胞を、ＧＷ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。図２Ａ〜図２Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【００１６】
【図３Ａ】図３Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＮｅｆ ＬＴ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｎｅｆ ＬＴ９＋細胞を、ＬＴ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。図３Ａ〜図３Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＮｅｆ ＬＴ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｎｅｆ ＬＴ９＋細胞を、ＬＴ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。図３Ａ〜図３Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られた全血中のＦＡＣＳでソーティングされたＮｅｆ ＬＴ９特異的ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｎｅｆ ＬＴ９＋細胞を、ＬＴ９ペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体との結合に基づいて選択した。図３Ａ〜図３Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【００１７】
【図４Ａ】図４Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｎｅｆ ＲＭ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。この図および本明細書における他の全ての図において、抗体は投与量が示されていない場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＮｅｆ ＲＭ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｎｅｆ ＲＭ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。この図および本明細書における他の全ての図において、抗体は投与量が示されていない場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＮｅｆ ＲＭ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｎｅｆ ＲＭ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。この図および本明細書における他の全ての図において、抗体は投与量が示されていない場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＮｅｆ ＲＭ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【００１８】
【図５Ａ】図５Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｇａｇ ＧＷ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＧａｇ ＧＷ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｇａｇ ＧＷ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＧａｇ ＧＷ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｇａｇ ＧＷ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＧａｇ ＧＷ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【００１９】
【図６Ａ】図６Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｎｅｆ ＬＴ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。この実験は、反復Ａ由来のデータを含まず、反復Ｂ由来のデータのみを含む。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＮｅｆ ＬＴ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ｎｅｆ ＬＴ９ペプチド誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。この実験は、反復Ａ由来のデータを含まず、反復Ｃ由来のデータのみを含む。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを１０μＭのＮｅｆ ＬＴ９の最小の最適ペプチドで１８時間刺激した。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの全血中を循環する（フローサイトメトリーによって測定される）Ｋｉ−６７＋ ＣＤ４＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｋｉ−６７は増殖の細胞内マーカーである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの全血中を循環する（フローサイトメトリーによって測定される）Ｋｉ−６７＋ ＣＤ４＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｋｉ−６７は増殖の細胞内マーカーである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの全血中を循環する（フローサイトメトリーによって測定される）Ｋｉ−６７＋ ＣＤ４＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｋｉ−６７は増殖の細胞内マーカーである。図７Ｃおよび８Ｃの４３日目に示される値は異常に高いように見受けられ、外れ値を示している可能性がある。
【００２１】
【図８Ａ】図８Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの全血中を循環する（フローサイトメトリーによって測定される）Ｋｉ−６７＋ ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｋｉ−６７は増殖の細胞内マーカーである。図８Ａ〜８Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの全血中を循環する（フローサイトメトリーによって測定される）Ｋｉ−６７＋ ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｋｉ−６７は増殖の細胞内マーカーである。図８Ａ〜８Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの全血中を循環する（フローサイトメトリーによって測定される）Ｋｉ−６７＋ ＣＤ８＋ ＣＤ３＋リンパ球の長期的な追跡を示す。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。Ｋｉ−６７は増殖の細胞内マーカーである。図８Ａ〜８Ｃの全てにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＣＴＬＡ４−ＮＦ（上向きの三角形）が最上部の曲線である。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ａｄ５タンパク質誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。抗体は投与量が示されていない場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを５Ｘ１０８個の熱失活したＡｄ５ウイルス粒子で１８時間刺激した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ａｄ５タンパク質誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。抗体は投与量が示されていない場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを５Ｘ１０８個の熱失活したＡｄ５ウイルス粒子で１８時間刺激した。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図に示す量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の図に示す抗体または賦形剤で処理した後２２および４３日目のＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルから得られたフィコール分離されたＰＢＭＣにおける、バックグラウンドを差し引いた後のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の値として示される、Ａｄ５タンパク質誘導性ＩＦＮ−γ産生を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。抗体は投与量が示されていない場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。動物はまた、２つの組換えＡｄ５ベクターで処理されており、これらのベクターは実施例１により詳細に記述されるように、一方がＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質を発現し、他方がＳＩＶ Ｇａｇタンパク質を発現する。ＰＢＭＣを５Ｘ１０８個の熱失活したＡｄ５ウイルス粒子で１８時間刺激した。
【００２３】
【図１０】図１０は、標的細胞の特異的なＮＫ細胞介在性溶解に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブの非フコシル化の効果を示す。これは、細胞株ＮＫ９２がヒトドナー由来の活性化Ｔｒｅｇの特異的な溶解を誘導する能力のアッセイにおけるアイソタイプ対照（三角形のデータ点、最下部の曲線）と比較した、イピリムマブ（円形のデータ点）およびイピリムマブの非フコシル化バリアント（四角形のデータ点、最上部の曲線）の滴定を与える。実施例２参照。非フコシル化されたＦｃは、イピリムマブの溶解活性を増加させ、ＥＣ５０を１．５μｇ／ｍｌから０．００６５μｇ／ｍｌに低下させた。
【００２４】
【図１１】図１１は、１０ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ、１０／ｍｇのイピリムマブ−ＮＦまたは賦形剤で処理したＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャス島産カニクイザルの血液中のＴｒｅｇの頻度を示す。データは反復Ｂのサルから取得した。実施例１参照。イピリムマブのデータを破線上のひし形として示し、これは概して最上部の曲線である。イピリムマブ−ＮＦのデータを実線上の三角形として示し、これは概して中間の曲線である。賦形剤対照のデータを点線上の円形として示し、これは概して最下部の曲線である。データ点は、１標準偏差を示すエラーバーを伴う６匹の動物の平均値である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語を最初に定義する。本願において使用される場合、本明細書で他に明示的に与えられている場合を除き、以下の各用語は以下で説明する意味を持つものとする。さらなる定義が本願のあらゆる箇所で説明される。
【００２６】
本明細書における「アジュバント」は、アジュバントを伴わないワクチンの投与に起因する免疫応答と比較してワクチンに対する免疫応答を増強するためにワクチンとともに対象に投与される物質を指す。本発明のアジュバントは、ＡＤＣＣ活性が増強した抗ＣＴＬＡ−４抗体である。
【００２７】
「投与している」、「投与する」または「投与」は、当業者に公知の様々な方法および送達システムのうちいずれかを用いた治療物質を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本発明の抗体の好ましい投与経路には、（例えば注射または注入による）静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書における語句「非経口投与」は、（通常、注射による）経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入、ならびにインビボにおけるエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は、非経口でない経路（局所、表皮または粘膜の投与経路など、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所）を介して投与され得る。投与は、例えば１回、複数回、および／または１以上の長期間にわたって実施され得る。
【００２８】
ワクチンと「ともに」ＡＤＣＣが増強した抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することは、ＡＤＣＣが増強した抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与がワクチンに対する免疫応答を高めることを目的としている場合、投与のあらゆる順序または同時投与（あらゆる投与スケジュールまたは投与回数を含む）を包含する。
【００２９】
「抗体」（Ａｂ）は、限定されないが、抗原に特異的に結合する糖タンパク質免疫グロブリンを含み、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が散在している超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分類され得る。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２，ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００３０】
従来の解釈に従い、本明細書において重鎖および／または軽鎖("a" heavy chain and/or "a" light chain)を含むと記述されている抗体は、記載されている重鎖および／または軽鎖のうち「少なくとも１つ」を含む抗体を指し、したがって２以上の重鎖および／または軽鎖を有する抗体を包含する。具体的には、そのように記載されている抗体は２つの実質的に同一の重鎖および２つの実質的に同一の軽鎖を有する通常の抗体を包含する。抗体鎖が翻訳後修飾（リジン残基のＣ末端切断、代替のグリコシル化パターンなど）により異なる場合には、抗体鎖は実質的に同一であり得るが、完全に同一ではない場合がある。しかしながら、グリカンにおけるフコシル化が異なっている抗体は実質的に同一ではない。
【００３１】
他の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、その標的特異性によって定義された抗体（例えば「抗ＣＴＬＡ−４抗体」）は、そのヒト標的（例えばヒトＣＴＬＡ−４）に結合できる抗体を指す。そのような抗体は他の種由来のＣＴＬＡ−４に結合してもよく、または結合しなくてもよい。
【００３２】
免疫グロブリンは一般的に知られているいずれかのアイソタイプ由来であり得、これは限定されないが、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む。ＩｇＧアイソタイプは特定の種においてサブクラスに分類され得る：ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにマウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。例として、抗体は天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方を含み、これはアロタイプバリアント；モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体；キメラ抗体およびヒト化抗体；ヒト抗体または非ヒト抗体；完全合成された抗体；ならびに単鎖抗体を含む。他の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において開示される抗体はヒトＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１定常ドメイン配列には、イピリムマブの定常ドメイン（ＩｇＧ１ｆａ、配列番号１１の１１９〜４４８残基、および配列番号１２の１１９〜４４７残基）およびＩｇＧ１ｚａ（配列番号２８および２９）として本明細書に提供されるＩｇＧ１アロタイプバリアントが含まれるが、これに限定されない。
【００３３】
「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する単離抗体は、ＣＴＬＡ−４以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原（異なる種由来のＣＴＬＡ−４分子など）と交差反応し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。比較すると、「単離」核酸は、天然に存在する核酸とは著しく異なる（すなわち、特有の化学的同一性、性質および有用性を有する）物質の核酸組成物を指す。例えば、単離ＤＮＡは天然のＤＮＡとは異なり、独立した天然のＤＮＡの一部であり、天然に見出されるより大きな構造複合体である染色体の不可欠な部分ではない。さらに、単離ＤＮＡは天然のＤＮＡとは異なり、特に疾患の診断または治療効果の予測のための遺伝子発現の測定およびバイオマーカー遺伝子または変異の検出のためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。単離核酸はまた、当分野で周知の標準的な技術を用いて他の細胞成分または他の混入物質（例えば他の細胞性核酸またはタンパク質）を実質的に含まないように精製され得る。
【００３４】
用語「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）は、単一の分子組成の抗体分子（すなわち、一次配列が本質的に同一であり、単一の結合特異性および特定のエピトープへの親和性を示す抗体分子）の調製物を指す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、トランスジェニック技術または当業者に公知の他の技術によって産生され得る。
【００３５】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がともにヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロ(in vitro)でのランダム変異もしくは部位特異的変異によって、またはインビボ(in vivo)での体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において用語「ヒト抗体」は、別の哺乳類種（マウスなど）の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は同意語として使用される。
【００３６】
「ヒト化」抗体は、ＣＤＲドメイン以外のいくつか、ほとんどまたは全てのアミノ酸がヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸に置換されている非ヒト動物（例えばげっ歯類）免疫グロブリン生殖系列配列由来のＣＤＲ領域を有する抗体を指す。ヒト化型抗体のある実施態様において、ＣＤＲドメイン以外のいくつか、ほとんどまたは全てのアミノ酸はヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸に置換されているが、１以上のＣＤＲ領域中のいくつか、ほとんどまたは全てのアミノ酸は変化していない。抗体が特定の抗原に結合する能力を抑制しない限り、アミノ酸の少数の付加、欠失、挿入、置換または改変が許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体に類似した抗原特異性を保持する。
【００３７】
「キメラ抗体」は、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来している抗体（可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来している抗体など）を指す。
【００３８】
「抗体フラグメント」は抗体全体の一部を指し、無傷の抗体が結合する抗原に特異的に結合する能力を保持し、ＦｃＲ結合能を媒介する抗体のＦｃ領域を保持している無傷の抗体の「抗体結合部分」（「抗体結合フラグメント」）を一般的に含む。
【００３９】
「抗体依存性細胞傷害」（「ＡＤＣＣ」）は、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球および好酸球）が標的細胞上の表面抗原に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を引き起こすインビトロまたはインビボでの細胞介在性反応を指す。原則として、活性化ＦｃＲを持つあらゆるエフェクター細胞がＡＤＣＣを介在するように誘発され得る。
【００４０】
本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体に関連して本明細書で使用される「増強されたＡＤＣＣ」または「増強されたＡＤＣＣ活性」は、改変されていないイピリムマブによって誘導されるＡＤＣＣよりも高いＡＤＣＣ活性レベルを指す。本発明のＡＤＣＣが増強されたイピリムマブは、例えば天然のＩｇＧ１定常ドメインを持つイピリムマブよりも高いＡＤＣＣを誘導する改変された形態のイピリムマブである。トレメリムマブの場合、増強されたＡＤＣＣはイピリムマブを基準として測定される。本明細書および図面で使用される「イピリムマブ」、「ｉｐｉ」およびヤーボイ（登録商標）は特に明記しない限り、配列番号１３の軽鎖および（Ｃ末端リジン残基を持たない）配列番号１２の重鎖を含む抗体を指す。反復Ａのみの実験の文脈において、「イピリムマブ」はＤ３５７Ｅ変異およびＬ３５９Ｍ変異を含むアロタイプバリアント（ＩｇＧ１ｆ）を包含する。いくつかの実施態様において、ＡＤＣＣ活性の増強レベルは、実施例２に記載のアッセイにおけるＮＫ９２細胞介在性細胞溶解のＥＣ５０の少なくとも２倍、例えば少なくとも１０倍の減少として測定される。
【００４１】
「がん」は、体内の異常細胞の制御されない増殖を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。無秩序な細胞分裂および増殖は、悪性腫瘍の形成または隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を通って身体の遠隔部位に転移し得る細胞の形成をもたらす。
【００４２】
「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、細胞の細胞膜を介してそのシグナルを伝達できる分子および分子の複合体を指す。
【００４３】
「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドとの相互作用またはそれに起因する生化学的イベントを指す。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ介在性エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）など）および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御が含まれる。このようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と結合するためにＦｃ領域を通常必要とする。
【００４４】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲはＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化受容体（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１つの阻害性受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）からなる。ヒトＦｃγＲの様々な性質を表１にまとめた。自然エフェクター細胞型(innate effector cell type)の大部分は１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩＢを共発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はマウスおよびヒトにおいて１つの活性化Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩ、ヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現し、阻害性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。
【００４５】
「Ｆｃ領域」（フラグメント結晶化可能領域）または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンと宿主組織または因子との結合（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体への結合、または古典的補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む）を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドである。抗体のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質フラグメントで構成される；ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖において３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２〜４）を含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣ２２６またはＰ２３０の位置のアミノ酸残基から重鎖のカルボキシ末端までの区間であると通常定義され、ここでこの番号付けはＫａｂａｔと同様にＥＵの指標に従う。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは約２３１位のアミノ酸から約３４０位のアミノ酸に広がっており、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域においてＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸に広がっている）。本明細書において、Ｆｃ領域は天然配列のＦｃまたはバリアントのＦｃであり得る。Ｆｃはまた、単離されたこの領域、または「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」（「Ｆｃ融合タンパク質」とも呼ばれる、例えば抗体またはイムノアドヘシン）などのＦｃを含むタンパク質ポリペプチドの文脈におけるこの領域を指す。
表１
ヒトＦｃγＲの性質
【表１】
2020509037.tif 000002
【００４６】
本明細書において、「フコシル化」および「非フコシル化」は、抗体のN297の位置のN結合型グリカン上のコアフコース残基の有無を指す（EUナンバリング）。
【００４７】
「免疫応答」は外来物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答はこれらの物質およびそれらによって生じる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）および、これらの任意の細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用によって媒介され、これは侵入した病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合に、正常ヒト細胞もしくは組織の選択的なターゲティング、結合、損傷、破壊および／または脊椎動物の身体からの除去をもたらす。
【００４８】
「免疫修飾物質」または「免疫調節物質」は、免疫応答の修飾、調節または改変に関与し得るシグナル伝達経路の構成要素を指す。免疫応答の「修飾」、「調節」または「改変」は、免疫系の細胞またはそのような細胞の活性のあらゆる変更を指す。そのような調節には、様々な細胞型の数の増加もしくは減少、それらの細胞の活性の増加もしくは減少、または免疫系において生じ得る他のあらゆる変化によって示され得る免疫系の刺激または抑制が含まれる。阻害性免疫調節物質および刺激性免疫調節物質は共に同定されており、それらのいくつかは腫瘍の微小環境において機能を増強し得る。本発明の好ましい実施態様において、免疫調節物質はＴ細胞の表面上に位置する。「免疫修飾標的」または「免疫調節標的」は、物質、化学物質、部分、化合物または分子による結合の標的とされ、それらの結合によって活性が変化する免疫調節物質である。免疫調節標的には、例えば細胞表面上の受容体（「免疫調節受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節リガンド」）が含まれる。
【００４９】
「免疫療法」は、免疫応答の誘導、増強、抑制または他の改変を含む方法による疾患に罹患している対象、または疾患の再発に罹患し、もしくは苦しむリスクがある対象の処置を指す。
【００５０】
「内因性免疫応答を増強すること」は、対象の既存の免疫応答の有効性または効力を増加させることを意味する。この有効性および効力の増加は、例えば内因性宿主免疫応答を抑制する機構を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機構を刺激することによって達成され得る。
【００５１】
「タンパク質」は少なくとも２つの連続的に結合したアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１以上のアミノ酸残基は修飾（限定されないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成など）を含み得る。用語「タンパク質」は本明細書において「ポリペプチド」と互換的に使用される。
【００５２】
「対象」は任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は脊椎動物（非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラットおよびモルモットなど）、鳥類（ニワトリなど）、両生類および爬虫類など）を含むが、これに限定されない。好ましい実施態様において、対象は哺乳類（非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットまたはげっ歯類など）である。本発明の任意の態様のより好ましい実施態様において、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は本明細書において互換的に使用される。
【００５３】
薬物または治療物質（本発明のＦｃ融合タンパク質など）の「治療有効量」または「治療有効用量」は、単独または別の治療物質と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防によって証明される疾患の退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の治療有効量または治療有効用量は「予防有効量」または「予防有効用量」を含み、これは疾患が発生するリスクがある対象または疾患の再発が起こるリスクがある対象に単独または別の治療物質と組み合わせて投与される場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬物の任意の量である。治療物質が疾患の退縮を促進し、または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、技術を持つ実行者に公知の多様な方法を用いて（例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、またはインビトロアッセイで物質の活性をアッセイすることによって）評価され得る。
【００５４】
例として、抗がん剤は対象のがんの退縮を促進する。好ましい実施態様において、治療有効量の薬物はがんを除去するまでがんの退縮を促進する。「がんの退縮を促進すること」は、有効量の薬物を単独または抗腫瘍物質と組み合わせて投与することが、腫瘍の増殖もしくはサイズの減少、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防、または患者の疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。さらに、処置に関する用語「有効」および「有効性」は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は薬物が患者のがんの退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性は薬物の投与に起因する毒性のレベル、または細胞、臓器および／または生物のレベルでの他の有害な生理学的効果（有害効果）を指す。
【００５５】
腫瘍の処置における例として、治療有効量または治療有効用量の薬物は、未処置の対象と比較して細胞増殖または腫瘍増殖を好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらになお好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施態様において、治療有効量または治療有効用量の薬物は細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する（すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する）。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は動物モデル系（ＣＴ２６結腸腺癌、ＭＣ３８結腸腺癌およびＳａ１Ｎ線維肉腫マウス腫瘍モデルなど）において評価され得、これらはヒト腫瘍での有効性を予測する。あるいは、組成物のこの性質は化合物が細胞増殖を阻害する能力を調べることにより評価され得、そのような阻害は技術を持つ実行者に公知のアッセイによりインビトロで測定され得る。本発明の他の好ましい実施態様において、腫瘍の退縮は、少なくとも約２０日間、より好ましくは少なくとも約４０日間、またはさらにより好ましくは少なくとも約６０日間観察され得、継続し得る。
【００５６】
対象の「処置」または「治療」は、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の発生、進行、発達、重症度または再発を回復、緩和、改善、阻害、減速または予防する目的で対象に対して実行されるあらゆる種類の介入もしくはプロセスまたは対象への活性物質の投与を指す。
【００５７】
ＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体はアジュバントとしてより有効である
ＣＴＬＡ−４は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞の２つの主要なサブセットに対する２つの異なる効果を介して生理的機能を発揮することが認識されている：（１）ヘルパーＴ細胞活性の下方調節、および（２）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性の増強。Lenschow et al. (1996) Ann. Rev. Immunol. 14:233; Wing et al. (2008) Science 322:271; Peggs et al. (2009) J. Exp. Med. 206:1717。Ｔｒｅｇは高レベルの表面ＣＴＬＡ−４を構成的に発現することが知られており、この分子は調節機能に不可欠であることが示唆されている。Takahashi et al. (2000) J. Exp. Med. 192:303; Birebent et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:3485。したがって、Ｔｒｅｇの集団は、ＣＴＬＡ−４遮断の影響を最も受けやすい可能性がある。イピリムマブ患者の研究は、応答者が非応答者とは異なり、処置後にＴｒｅｇ浸潤の減少を示し、これがＡＤＣＣ機構を介して生じ、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現する非古典的（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋）単球によって媒介される枯渇を伴うことを示す。
【００５８】
ある態様において、本発明は、増強されたＡＤＣＣを示すように改変された抗ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブなど）を投与することによってワクチンに対する免疫応答を増強する改善された方法を提供する。そのような抗体は、本明細書において提供される実験結果を考慮すると改善されたワクチンアジュバント活性を示す。
【００５９】
ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ワクチンに対する免疫応答を増強するとは予想されていなかった。実際に、がんの処置におけるそのような抗体の効果に関する従前の実験は、増強されたＡＤＣＣを有する、または有さない抗ＣＴＬＡ４抗体での処理が実際に末梢（すなわち、腫瘍の微小環境の外側）における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の集団を増加させたことを示し、これはワクチン応答を増強するのではなく、低下させると予想される。Selby et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1:32の要約および図２Ａ参照。
【００６０】
ＡＤＣＣが増強されたそのような抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用は、所定用量のワクチンにおいてワクチンの有効性を増強し得、またはより低い用量で所定のレベルの有効性を達成することを可能にし得、かつ／または免疫応答の持続性を向上し得る。ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用を含む本発明の方法は、自己抗原および外来抗原の両方ならびに優性エピトープおよび準優性エピトープの両方に対してＢ細胞およびＴ細胞の両方の免疫応答を増強することが予想される。そのようなものとして、本発明の方法は、ワクチン抗原にナイーブな対象における予防ワクチンの有効性を増強し得、既存の（ワクチン接種前の）抗抗原免疫応答が使い尽くされた対象における治療ワクチンの有効性を増強し得る。
【００６１】
マウスモデル実験
ＯＶＡワクチンプライムブースト(prime boost)モデルを用いて抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント活性に対する増強されたＡＤＣＣ活性の効果を検証した。マウスをマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ（これは非常に低いＦｃ関連エフェクター機能をもたらす−Baudino et al. (2008) J. Immunol. 181:6664）のいずれかとして、またはマウスＩｇＧ２ａ（これは増強されたＡＤＣＣを示す）として抗マウスＣＴＬＡ−４抗体９Ｄ９で処理した。ＷＯ２０１４／０８９１１３参照。実験には、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、ＯＶＡのみ、およびナイーブマウスも含めた。マウスＩｇＧ２ａ抗体はヒトＩｇＧ１抗体イピリムマブと比較して増強されたＡＤＣＣを示す。
【００６２】
マウスを０日目にＯＶＡペプチドで皮下（ｓｃ）免疫し、１４日目にＯＶＡペプチドを皮下投与した。抗体を、−１、１、１３および１５日目に１群当たり１０匹のマウスに０．１ｍｇ／用量で腹腔内（ｉｐ）投与した。２１日目に、血清および血液の抗ＯＶＡ力価およびアッセイのためにマウスから採血した。
【００６３】
（ＡＤＣＣが増強された）ｍＩｇＧ２ａ抗ＣＴＬＡ−４ ｍＡｂで処理されたマウスの脾臓は典型的に他の群より約２０％重く、他のグループは互いに全て類似していた。これらの同一のマウスは、２１日目に血清抗ＯＶＡ ＩｇＧ力価の増強を示し、ＥＬＩＳＰＯＴによる測定で脾臓においてＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ産生の増強を示した。
【００６４】
他の実験は、他のアイソタイプと比較してＡＤＣＣ活性が増強された９Ｄ９ ＩｇＧ２ａで処理されたマウスの血液、脾臓または鼠径リンパ節において（ＣＤ４５＋細胞の割合として測定される）Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの枯渇の増強がなかったことを実証した。
【００６５】
これらの同一の抗体を、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド誘導性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて検証した。ＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡを、０日目に６３匹の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５マウス／群＋３匹のナイーブマウス）に皮下投与した。百日咳毒素を０および２日目に静脈内投与した。抗体（９Ｄ９ ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、９Ｄ９ ＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照、および非ブロッキング抗ｍＣＴＬＡ−４ ｍＡｂ ５Ｇ６−ｍＩｇＧ２ａ）を０、３および６日目に投与し、０日目の抗体をＭＯＧと百日咳毒素の間に投与した。マウスを１５日目に屠殺した。両方のｍＩｇＧ２ａ抗体は、アイソタイプ対照と比較してＥＡＥ疾患スコアを劇的に向上させ、ｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａはわずかな向上を与えた。このモデルにおける疾患スコアの向上は抗ＭＯＧ免疫応答の増強と相関しているため、アジュバント活性を増強する。上記のＯＶＡモデルと同様に、増強されたＡＤＣＣ ｍＡｂ（ｍＩｇＧ２ａ）は脾臓またはリンパ節において（ＣＤ４５＋細胞の割合として測定される）Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを枯渇させず、中枢神経系（ＣＮＳ）においても枯渇させない。
【００６６】
ＯＶＡ誘導性およびＭＯＧ誘導性免疫応答モデルの両方において、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＴＬＡ−４ ｍＡｂ（ｍＩｇＧ２ａ）（ブロッキング抗体および非ブロッキング抗体の両方）はより大きな免疫応答を誘発するが、Ｔｒｅｇの枯渇は引き起こさない。
【００６７】
カニクイザルの実験
本明細書において開示されるさらなる実験により、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））および（ＡＤＣＣが増強された）非フコシル化イピリムマブ（ｉｐｉ−ＮＦ）を用いて、霊長類（カニクイザル）における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント活性に対する増強されたＡＤＣＣ活性の役割を調べた（図１０）。
【００６８】
様々な図および実施例に開示されるように、マウスの結果と一致して、ＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＡＤＣＣが増強されていない他の同等の抗ＣＴＬＡ−４抗体よりも（すなわちイピリムマブＮＦ対イピリムマブ）高く、頑強な免疫応答を誘発した。この増強された免疫応答は、ワクチン抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（図１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｃおよび３Ａ〜３Ｃ）、ワクチン抗原誘導性ＩＦＮ−γ産生（図４Ａ〜４Ｃ、５Ａ〜５Ｃおよび６Ａ〜６Ｂ）およびＡｄ５誘導性ＩＦＮ−γ産生（図９Ａ〜９Ｃ）に反映された。イピリムマブＮＦはまた、Ｋｉ−６７発現によって測定されるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させた（図７Ａ〜７Ｃおよび８Ａ〜８Ｃ）。イピリムマブの増強されたＡＤＣＣ形態（イピリムマブＮＦ）は、研究されたサルの血液においてＴｒｅｇ枯渇を引き起こさなかった（図１１）。
【００６９】
増強されたエフェクター機能を有する改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体
抗体のＦｃ領域への様々な改変はエフェクター機能を増強することが示されている。マウスでは、活性化Ｆｃガンマ受容体への結合の増強およびＦｃガンマ抑制性受容体への結合の減少は、序列：ｍＩｇＧ２ａ＞＞ｍＩｇＧ２ｂ＞＞ｍＩｇＧ１Ｄ２６５Ａに従う。この序列はNimmerjahn & Ravetch (2005) Science 310:1510によって定義され、ＡＤＣＣ機能を媒介する抗体について決定される、免疫グロブリンＦｃ領域の抑制性Ｆｃ受容体への結合に対する活性化Ｆｃ受容体への結合の活性比（Ａ／Ｉ比として知られる）に従う。
【００７０】
ある態様において、本発明の改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒトＩｇＧ１抗体である。本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体のＡＤＣＣ活性は、例えばＦｃ領域に１以上のアミノ酸置換を導入すること、Ｎ結合型グリカンのグリコシル化パターンを変化させること、またはその両方によって増強され得る。
【００７１】
エフェクター機能を増強するＦｃ変異
いくつかの実施態様において、ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域のアミノ酸配列を改変することにより向上する（例えば、天然に存在するヒトＩｇＧ１に変異を追加してＡＤＣＣを増強させる）。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であるため、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインがＡＤＣＣを増強させるための開始点として選択され得る。本明細書で定義されるように、イピリムマブにおいて生じる未改変のヒトＩｇＧ１は増強されたＡＤＣＣを有さない。Ｆｃ領域は、以下の位置の１以上のアミノ酸を改変することにより、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／またはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する親和性を増加させるように改変され得る：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９。ＷＯ２０１２／１４２５１５参照；ＷＯ００／４２０７２も参照。例示的な個別の置換には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが含まれる。例示的な一群のバリアントには、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが含まれる。例えば（任意でＩ３３２Ｅと組み合わされ得る）Ｇ２３６Ａバリアントを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγＩＩＡ／ＦｃγＩＩＢ結合親和性比を約１５倍増加させることが示されている。Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181。ＦｃγＲおよび補体相互作用を増強するための他の改変には、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌが含まれるが、これらに限定されない。これらおよびその他の改変は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。具体的には、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方はＩｇＧ１のＥ３３３の位置の変化（例えばＥ３３３Ａ）により増強され得る。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591。ＩｇＧ１のエフェクター機能を増強するためのＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ変異の使用はＷＯ２００６／０２０１１４に開示されており、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／ＶはＷＯ２００４／０７４４５５に開示されている。Ｋ３２６Ａ／ＷおよびＥ３３３Ａ／ＳバリアントはヒトＩｇＧ１においてエフェクター機能を増加させることが示されており、Ｅ３３３ＳバリアントはＩｇＧ２においてエフェクター機能を増加させることが示されている。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。他の実験により、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２ＥがＦｃＲＩＩａおよびＦｃＲＩＩＩａへの結合の増強をもたらすことが示されている。Smith et al. (2012) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 109:6181; Bournazos et al. (2014) Cell 158:1243。
【００７２】
他に明記されていない限り、または文脈から明らかな場合を除き、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基の番号付けは、配列表の配列内の残基を具体的に参照する場合（この場合、番号付けは必然的に連続的となる）を除き、ＥＵの番号付けの規則（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MDと同様のＥＵ指標；米国特許出願公開第２００８／０２４８０２８号の図３ｃ〜３ｆも参照）に従う。例えば、Ｆｃ領域のアミノ酸置換の効果に関する文献の参照では通常ＥＵナンバリングが使用され、これは結合している可変ドメインの長さに関係なく、抗体のＦｃ領域の任意の所定の残基を同一の番号で参照することを可能にする。まれに、参照されている正確なＦｃ残基を確認するために参照されている文書を参照する必要があり得る。
【００７３】
具体的には、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎのヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９の位置での特定の変異はＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示されており、これには（ＦｃγＲＩＩＩａ結合およびＡＤＣＣ活性の増強を有する）組合せ変異体Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａが含まれる。ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が著しく増強された他のＩｇＧ１バリアントが同定されており、これにはカニクイザルにおいてＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の最も大きな増加、ＦｃγＲＩＩｂ結合の減少および強力な細胞傷害活性を示したＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントが含まれる。Lazar et al. (2006) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。抗体（アレムツズマブ（ＣＤ５２特異的）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的）、リツキシマブ（ＣＤ２０特異的）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ特異的）など）への三重変異の導入はインビトロにおいて大幅に増強されたＡＤＣＣ活性に変換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥバリアントはマカクにおいてＢ細胞を枯渇させる増強された能力を示した。Lazar et al. (2006) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 103:4005。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳がんのモデルでヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するトランスジェニックマウスにおいてＦｃγＲＩＩＩａへの増強された結合および付随して増強されたＡＤＣＣ活性を示したＬ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が同定されている。Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882; U.S. Pat. No. 8,652,466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。
【００７４】
種々のＩｇＧアイソタイプはまた、異なるＣＤＣ活性を示す（ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４）。Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989。増強されたＣＤＣが要求される用途のために、Ｃ１ｑへの結合を増加させる変異を導入することが可能である。補体を補充する能力（ＣＤＣ）は、補体カスケードの第１成分であるＣ１ｑへの結合を増加させるＩｇＧ２のＫ３２６および／またはＥ３３３における変異（ＡＤＣＣ活性を減少させるＫ３２６Ｗ、およびＥ３３３Ｓなど）によって増強され得る。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。ヒトＩｇＧ１へのＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔの（単独または任意の組合せでの）導入はＣ１ｑ結合を増強させる。Moore et al. (2010) mAbs 2:181。Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863（その中の図１）のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体「１１３Ｆ」のＦｃ領域もまた、増強されたＣＤＣを与える。Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553およびRedpath et al. (1998) Immunology 93:595も参照。
【００７５】
エフェクター機能を増加または減少させ得るさらなる変異がDall’Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129に開示されている。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460も参照。
【００７６】
いくつかの実施態様において、ＡＤＣＣを増強させるためのＦｃ領域におけるアミノ酸置換が様々なＩｇＧ１アロタイプ（限定されないが、イピリムマブのＩｇＧ１ｆａアロタイプ（配列番号１１の１１９〜４４８残基および配列番号１２の１１９〜４４７残基）およびＩｇＧ１ｚａ（配列番号２８および２９）を含む）において行われ得る。
【００７７】
ＡＤＣＣが増強された非フコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体
表２に示されるように、非フコシル化または非改変ＩｇＧ１ｆ抗体を比較した実験は、活性化Ｆｃγ受容体への結合の増強を示し、これは本発明の増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体における使用への適合性を示す。アロタイプＩｇＧ１ｆは、イピリムマブアロタイプＩｇＧ１ｆａ（配列番号１１および１２）に対してＤ３５７ＥおよびＬ３５９Ｍ変異を有する。ＩｇＧ１ｆは、アロタイプＩｇＧ１ｚａ（配列番号２８および２９）に対してＫ９７Ｒ、Ｄ２３９ＥおよびＬ２４１Ｍ変異を有し、これは配列番号１１および１２のイピリムマブ配列番号付けに対するＫ２１５Ｒ、Ｄ３５７ＥおよびＬ３５９Ｍ変異に相当する。
表２
非フコシル化ＩｇＧ１ｆ Ｆｃ領域のＦｃ受容体結合
ＫＤ値（ｎＭ）
【表２】
2020509037.tif 000003
【００７８】
フコシル化の減少、非フコシル化および低フコシル化
抗体とＦｃγＲの相互作用はまた、各ＦｃフラグメントのＮ２９７残基に結合したグリカン部分を改変することによって増強され得る。特に、コアフコース残基の欠如は、抗原結合またはＣＤＣを変化させることなくＩｇＧの活性化ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の改善を介してＡＤＣＣを大幅に増強する。Natsume et al. (2009) Drug Des. Devel. Ther. 3:7。脱フコシル化(afucosylate)腫瘍特異的抗体がインビボにおけるマウスモデルの治療活性の増強につながるという確かな証拠がある。Nimmerjahn & Ravetch (2005) Science 310:1510; Mossner et al. (2010) Blood 115:4393.
【００７９】
抗体のグリコシル化の改変は、例えばグリコシル化機構が変化している宿主細胞で抗体を発現させることにより達成され得る。増強されたＡＤＣＣを示すフコシル化が減少または排除された抗体は、本発明の方法に特に有用である。グリコシル化機構が変化している細胞は当分野で記述されており、本開示の組換え抗体を発現し、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９はフコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α−（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を持たず（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号；Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87: 614参照）、これらの細胞株において発現した抗体はその糖鎖上にフコースを持たない。別の例として、ＥＰ１１７６１９５は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株、ならびに抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する活性をほとんどまたは全く持たない細胞株（例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２））を記載している。ＰＣＴ出願公開ＷＯ０３／０３５８３５はフコースをＡｓｎ（２９７）結合型糖鎖に結合させる能力が低下しているバリアントＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ１３を記載しており、これはその宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化をもたらす。Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733も参照。ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００６／０８９２３１に記載されるように、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は鶏卵においても産生され得る。あるいは、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は植物細胞（アオウキクサ属など）においても産生され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２７６０８６号参照。ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＩＩＩ））を発現するように設計された細胞株を記載し、この設計された細胞株において発現された抗体は抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示す。Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176も参照。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断され得る。例えば、酵素アルファ−Ｌ−フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する。Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516。米国特許第８，６４２，２９２号に記載されるように、フコシル化が低下している抗体はまた、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキシロースを基質として用いる酵素（ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキシロースレダクターゼ（ＲＭＤ）など）をコードする組換え遺伝子を有する細胞において産生され得る。あるいは、細胞は、培地中で増殖した細胞によって産生されるＮ結合型グリカンまたは糖タンパク質（抗体など）へのフコース残基の付加を遮断するフコース類似体を含む培地で増殖され得る。米国特許第８，１６３，５５１号；ＷＯ０９／１３５１８１。
【００８０】
非フコシル化抗体はフコシル化抗体と比較して大幅に増強されたＡＤＣＣを示すため、抗体調製物は本発明の方法に有用であるためにフコシル化された重鎖を全く含まない必要はない。フコシル化された重鎖の残存レベルは、非フコシル化重鎖の実質的な調製物のＡＤＣＣ活性をあまり妨害しない。（Ｎ−グリカンにコアフコースを付加するのに十分な能力を有する）従来のＣＨＯ細胞において産生された抗体は、それにもかかわらず、数パーセントから最大で１５％の非フコシル化抗体を含み得る。非フコシル化抗体は１０倍よりも高いＣＤ１６に対する親和性およびＡＤＣＣ活性の最大で３０〜１００倍の増強を示し得、したがって非フコシル化抗体の割合のわずかな増加でさえ、調製物のＡＤＣＣ活性を著しく増加させ得る。培養中の正常なＣＨＯ細胞において産生されるよりも多くの非フコシル化抗体を含む任意の調製物は、ＡＤＣＣのある程度の増強を示し得る。そのような抗体調製物は、本明細書においてフコシル化が低下した調製物と呼ばれる。正常なＣＨＯ細胞から得られた非フコシル化の元々のレベルに応じて、フコシル化が低下した調製物は、わずか５０％、３０％、２０％、１０％および５％の非フコシル化抗体を含み得る。フコシル化の低下は、正常なＣＨＯ細胞において調製された抗体と比較してＡＤＣＣの２倍以上の増強を示す調製物として機能的に定義され、非フコシル化種の任意の固定された割合に関連しない。
【００８１】
他の実施態様において、非フコシル化のレベルは構造的に定義されている。本明細書において、非フコシル化または脱フコシル化（これらの用語は同義語として使用される）抗体調製物は、９５％よりも多くの（１００％を含む）非フコシル化抗体重鎖を含む抗体調製物である。低フコシル化抗体調製物は、９５％以下のフコースを持たない重鎖を含む抗体調製物（例えば、８０〜９５％（８５〜９５％および９０〜９５％など）の重鎖がフコースを持たない抗体調製物）である。他に明記されない限り、低フコシル化は８０〜９５％の重鎖がフコースを持たない抗体調製物を指し、非フコシル化は９５％よりも多くの重鎖がフコースを持たない抗体調製物を指し、「低フコシル化または非フコシル化」は、８０％以上の重鎖がフコースを持たない抗体調製物を指す。
【００８２】
いくつかの実施態様において、低フコシル化または非フコシル化抗体は、フコシル化に必要な酵素（ＦＵＴ８など）を持たない細胞（例えば米国特許第７，２１４，７７５号）、外因性酵素がフコシル化の代謝前駆体のプールを部分的に枯渇させる細胞（例えば米国特許第８，６４２，２９２号）、またはフコシル化に関与する酵素の小分子阻害物質の存在下で培養される細胞（例えばＷＯ０９／１３５１８１）において産生される。
【００８３】
抗体調製物におけるフコシル化のレベルは、当分野で公知の任意の方法（限定されないが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を含む）で決定され得る。他に明記されない限り、本発明の目的のために、抗体調製物におけるフコシル化のレベルは実施例３に本質的に記載されているように、親水性相互作用クロマトグラフィー（または親水性相互作用液体クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ）で決定される。抗体調製物のフコシル化のレベルを決定するために、試料をＰＮＧａｓｅ Ｆで変性処理してＮ結合型グリカンを切断し、フコース含量を分析する。全長抗体鎖のＬＣ／ＭＳは抗体調製物のフコシル化のレベルを検出する代替方法であるが、質量分析法は本質的にあまり定量的ではない。
【００８４】
非フコシル化イピリムマブは増強されたＡＤＣＣを示す
非フコシル化型イピリムマブは、ヒトドナーからの活性化ＴｒｅｇのＮＫ９２細胞ベースの溶解を誘発するのにより効果的であることが示され、ＥＣ５０を１．５μｇ／ｍＬから６．５ｎｇ／ｍＬに減少させた。図１０参照。
【００８５】
さらなる潜在的なＦｃ改変
Ｆｃ領域は新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対するＩｇＧの親和性を増加させるように変異され得、これは抗体のインビボでの半減期を延長し得、抗腫瘍活性の増加をもたらし得る。例えば、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ特異的）およびセツキシマブ（ＥＧＦＲ特異的）のＦｃ領域にＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異を導入することは、サルにおいて抗体半減期を増加させ、マウスにおいて抗腫瘍応答を改善した。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。
【００８６】
抗ＣＴＬＡ−４抗体
ある実施態様において、ＡＤＣＣを増強するために改変される最初の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブもしくはトレメリムマブまたはそれらと可変ドメイン配列を共有する抗体である。ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを認識して結合するモノクローナル抗体が米国特許第５，９７７，３１８号に記載されている。本開示のヒトモノクローナル抗体は様々な方法を用いて（例えば、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックマウスまたは染色体導入マウスを用いて、またはファージディスプレイもしくは酵母ディスプレイなどのインビトロでのディスプレイ技術を用いて）作製され得る。例えば、Bradbury et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(3):245参照。トランスジェニックマウスおよび染色体導入マウスには、本明細書においてＨＵＭＡＢ ＭＯＵＳＥ（登録商標）（Lonberg et al. (1994) Nature 368:856）およびＫＭ ＭＯＵＳＥ（登録商標）（ＷＯ０２／４３４７８）と呼ばれるマウスがそれぞれ含まれる。本開示の例示的なヒト抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の産生は、米国特許第６，９８４，７２０号および７，６０５，２３８号に詳細に記載されている。これらの特許で１０Ｄ１として同定されたヒトＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブ（以前はＭＤＸ−０１０およびＢＭＳ−７３４０１６としても知られていた）としても知られ、ヤーボイ（登録商標）として市販されている。本開示の他の例示的なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体（ヒトＩｇＧ２抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体であるトレメリムマブ（以前はチシリムマブ；ＣＰ−６７５，２０６）を含む）は米国特許第６，６８２，７３６号および７，１０９，００３号に記載されている。
【００８７】
ヒト抗ヒトＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体であるイピリムマブは、切除不能または転移性黒色腫の処置およびＩＩＩ期黒色腫の補助的処置のために承認されており、（多くの場合他の物質との組合せにおいて）他のがんの臨床試験中である。Hoos et al. (2010) Semin. Oncol. 37:533; Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711; Pardoll (2012) Nat. Immunol. 13(12): 1129。イピリムマブはヒトＩｇＧ１アイソタイプを有し、これはほとんどのヒトＦｃ受容体に最もよく結合する(Bruhns et al. (2009) Blood 113: 3716)。
【００８８】
対照的に、トレメリムマブはＩｇＧ２アイソタイプであり、ＦｃγＲＩＩａバリアントＨ１３１を除いてＦｃ受容体に効率的に結合しない。Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716。トレメリムマブはＩｇＧ２アイソタイプであり、したがってＩｇＧ１であるイピリムマブより低いＡＤＣＣを示す。重鎖定常ドメインを置換して「ｔｒｅｍｅ−ＩｇＧ１」を作製することによるトレメリムマブのＩｇＧ１への変換は、ＡＤＣＣをイピリムマブと同様のレベルまで増加させることが期待される。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、イピリムマブよりも高いＡＤＣＣを有するトレメリムマブのバリアントまたはｔｒｅｍｅ−ＩｇＧ１のワクチンアジュバントとしての使用を含む。
【００８９】
さらなる抗ＣＴＬＡ−４抗体
さらなる抗ＣＴＬＡ−４抗体に関連した発明が、以下の本発明の譲受人に譲渡された特許出願公開に開示されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる：ＷＯ１９９３／０００４３１；ＷＯ９７／０２０５７４；ＷＯ００／０３２２３１；ＷＯ２００１／０１４４２４；ＷＯ２００３／０８６４５９；ＷＯ２００５／００３２９８；ＷＯ２００６／１２１１６８；ＷＯ２００７／０５６５４０；ＷＯ２００７／０６７９５９；ＷＯ２００８／１０９０７５；ＷＯ２００９／１４８９１５；ＷＯ２０１０／０１４７８４；ＷＯ２０１１／０１１０２７；ＷＯ２０１０／０４２４３３；ＷＯ２０１１／１４６３８２；ＷＯ２０１２／０２７５３６；ＷＯ２０１３／１３８７０２；ＷＯ２００９／０８９２６０；ＷＯ２０１３／１４２７９６；およびＷＯ２０１３／１６９９７１。増強されたＡＤＣＣ（すなわち、イピリムマブのＡＤＣＣよりも高いＡＤＣＣ）を有するこれらの抗体のバリアントは、本発明の方法における使用を見出し得る。
【００９０】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これは限定するものと解釈されるべきではない。本出願のあらゆる箇所で引用されたあらゆる図ならびにあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００９１】
実施例１
カニクイザルにおける抗ＣＴＬＡ−４ワクチンアジュバント実験
実験をＭａｆａ−Ａ１＊０６３＋モーリシャスカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；ＭＣＭ）において実施し、ＡＤＣＣ活性が異なる抗ＣＴＬＡ−４抗体バリアントのワクチン誘導性抗原特異的Ｔ細胞応答の免疫調節に対する効果を経時的に追跡した。３つの異なる抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を研究した：イピリムマブ（ｉｐｉ）、非フコシル化イピリムマブ（ｉｐｉ−ＮＦ）およびＮ結合型グリコシル化を完全に遮断するＮ２９７Ａ変異を有するイピリムマブ（ｉｐｉ−Ｎ２９７Ａ）。非フコシル化イピリムマブは増強されたＡＤＣＣを示すが、Ｎ２９７Ａイピリムマブはイピリムマブと比較して減少／排除されたＡＤＣＣを示す。
【００９２】
ウイルスワクチン免疫原を、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＧａｇおよびＮｅｆタンパク質の遺伝子をアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクターに導入することにより作製した。Ｎｅｆ遺伝子配列を、２番目と３番目のアミノ酸残基（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を除去するように改変し、ミリストイル化部位を除去した。Ｇａｇ−Ａｄ５およびＮｅｆ−Ａｄ５ウイルスを、免疫優勢の回避を促進するためにそれぞれ反対側の後肢に筋肉内投与した（３ｘ１０９ウイルス粒子／ＭＣＭ）。３ｘ１０９ウイルス粒子／ＭＣＭは準最適な投与であり、アジュバント活性の増強を観察する可能性を最大にするために選択された。次いで、動物を直ちにｉ）生理食塩水、ｉｉ）ｉｐｉ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、ｉｉｉ）ｉｐｉ−ＮＦ（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）、またはｉｖ）ｉｐｉ−Ｎ２９７Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）で（静脈内）処理した。血液試料を４、８、１５、２２、３６および４３日目に採取した。以下の実験において、動物が１群当たり４匹ではなく６匹であり、１ｍｇ／ｋｇ用量を使用しなかった場合を除き、実験をさらに２回繰り返した。以下の実験には、３日目の血液試料が含まれ、３５日目ではなく３６日目が使用された。さらに、第１の実験では、イピリムマブの重鎖（配列番号１１）に対してＤ３５７ＥおよびＬ３５９Ｍ変化を含むｉｐｉ−ＮＦ抗体にイピリムマブのアロタイプバリアントを使用したが、第２および第３の実験では使用しなかった。
【００９３】
抗原特異的Ｔ細胞を検出するための全血ＦＡＣＳ
Ａｄ５ワクチン内のいくつかのＳＩＶ特異的エピトープ（Ｎｅｆ ＲＭ９、Ｎｅｆ ＬＴ９、Ｇａｇ ＧＷ９）に特異的なＴ細胞応答を、全血蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイを用いて、８（反復Ａのみ８日目）、１５、２２、３６および４３日目にペプチドを持つＭＨＣクラスＩ四量体を使用して決定した。Ｎｅｆ ＲＭ９＝ＲＰＫＶＰＬＲＴＭ＝配列番号２５；Ｎｅｆ ＬＴ９＝ＬＮＭＡＤＫＫＥＴ＝配列番号２６；Ｇａｇ ＧＷ９＝ＧＰＲＫＰＩＫＣＷ＝配列番号２７。ペプチド（ＲＭ９／ＧＷ９／ＬＴ９）を持つＭＨＣ−Ｉ四量体を用いて、全血ＦＡＣＳにより抗原特異的Ｔ細胞を検出した。結果を図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｃおよび図３Ａ〜３Ｃに示し、これらはそれぞれＳＩＶエピトープＮｅｆ ＲＭ９、Ｇａｇ ＧＷ９およびＮｅｆ ＬＴ９の結果を与える。各反復および各エピトープにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのｉｐｉ−ＮＦは抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を最も高い割合で生成している。Ｎｅｆ ＬＴ９に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、２２日目から３６日目辺りにピークとなるエピトープＮｅｆ ＲＭ９およびＧａｇ ＧＷ９に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞よりも急速にピークとなり、減衰し始める。
【００９４】
ＰＢＭＣにおける抗原誘導性ＩＦＮ−γ産生を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを、２２日目および４３日目の血液試料から単離したフィコール分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して実施し、抗原刺激に応答して発現したＩＦＮ−γのレベルを決定した。ＰＢＭＣを１０μＭの最小の最適ＳＩＶエピトープペプチドで１８時間刺激した。スポット形成細胞（ＳＰＣ）の値を測定し、バックグラウンド値を差し引いた。
【００９５】
結果を図４Ａ〜４Ｃ、５Ａ〜５Ｃおよび６Ａ〜６Ｂに示し、これらはそれぞれＳＩＶエピトープＮｅｆ ＲＭ９、Ｇａｇ ＧＷ９およびＮｅｆ ＬＴ９での刺激の結果を与える。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、１０ｍｇ／ｋｇのｉｐｉ−ＮＦ処理が全ての反復および全てのＳＩＶエピトープにおいて最も高いＩＦＮ−γ産生を誘発したことが確認された。
【００９６】
Ｔ細胞の大量増殖
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーでＫｉ−６７発現について測定し、細胞増殖を測定した。結果を図７Ａ〜７Ｃおよび８Ａ〜８Ｃに示す。１０ｍｇ／ｋｇのｉｐｉ−ＮＦ処理は全ての反復で増殖を増強した。
【００９７】
ＰＢＭＣにおけるＡｄ５誘導性ＩＦＮ−γ産生を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
上記と同様のＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、Ａｄ５誘導性ＩＦＮ−γ産生を測定した。熱失活したＡｄ５ビリオン（５×１０８ウイルス粒子）を２２日目のＰＢＭＣまたは４３日目のＰＢＭＣとともに１８時間インキュベートした。スポット形成細胞（ＳＰＣ）の値を測定し、バックグラウンド値を差し引いた。結果を図９Ａ〜９Ｃに示す。図４Ａ〜４Ｃ、５Ａ〜５Ｃおよび６Ａ〜６Ｂに示されるＳＩＶ抗原を用いて得られた結果と同様に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４−ＮＦ処理は、全ての反復において２２日目および４３日目の両方で一貫して最も高いＩＦＮ−γ産生を誘発した。
【００９８】
検証した全てのアッセイにおいて、抗ＣＴＬＡ−４−ＮＦは、このカニクイザルワクチンモデルにおいて一般に３つの異なるＳＩＶ抗原およびＡｄ５抗原に対する免疫応答を増強した。非フコシル化抗体は、イピリムマブで観察された免疫応答よりも高く、頑強な免疫応答を一貫して生成した。
【００９９】
Ｔｒｅｇ枯渇
カニクイザルの血液中を循環しているＴｒｅｇの頻度を全血ＦＡＣＳアッセイによって決定した。反復Ｂの動物由来の試料をソーティングし、Ｔｒｅｇの頻度を抗体投与の機能として経時的に決定した。結果を図１１に示す。ＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４ ｍＡｂであるイピリムマブ−ＮＦは、イピリムマブと比較してＴｒｅｇ枯渇の増強を示さず、実際に賦形剤対照との有意差はない。
【０１００】
実施例２
初代ヒト細胞を用いたＮＫ介在性細胞溶解の促進により測定されるＡＤＣＣが増強された抗ＣＴＬＡ−４抗体
非フコシル化イピリムマブがヒトドナー由来のＴｒｅｇのＮＫ細胞介在性溶解を促進する能力について、以下のように検証した。簡潔に述べると、標的細胞として使用するためのＴｒｅｇを磁気ビーズを用いた陰性選択により分離し、７２時間活性化した。ヒトドナー由来のエフェクターとして使用するためのＮＫ細胞を磁気ビーズを用いた陰性選択により分離し、ＩＬ−２で２４時間活性化した。カルセイン標識された活性化Ｔｒｅｇ（Donor Leukopak AC8196）を様々な濃度のイピリムマブ、イピリムマブＮＦまたはＩｇＧ１対照で３０分間コーティングし、次いで１０：１の比率でＮＫエフェクター細胞とともに２時間インキュベートした。カルセイン放出を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて培地の蛍光強度を読み取ることにより測定し、抗体依存性細胞溶解の割合を以下の式を用いて平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて計算した：［（テストＭＦＩ−平均のバックグラウンド）／（平均の最大値−平均のバックグラウンド）］×１００。結果を図１０に示す。非フコシル化イピリムマブは、イピリムマブ（１．５μｇ／ｍｌ）よりも有意に低いＥＣ５０（０．００６５μｇ／ｍｌ）で活性化Ｔｒｅｇの溶解を誘導した。
【０１０１】
実施例３
抗ＣＴＬＡ−４抗体の試料における非フコシル化の割合を決定するためのアッセイ
非フコシル化抗ＣＴＬＡ−４ ｍＡｂ調製物を分析し、本質的に以下のように非フコシル化重鎖の割合を決定する。
【０１０２】
抗体を最初に尿素を用いて変性させ、次いでＤＴＴ（ジチオスレイトール）を用いて還元する。次に、試料をＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて３７℃で一晩消化し、Ｎ結合型グリカンを除去する。遊離したグリカンを回収し、ろ過および乾燥し、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）または２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）を用いて誘導体化する。次に、得られた標識化グリカンをＨＩＬＩＣカラム上で分離し、溶出画分を蛍光により定量化し、乾燥させる。次いで、画分をエキソグリコシダーゼ（コアα（１，６）結合型フコース残基を放出するα（１−２，３，４，６）フコシダーゼ（ＢＫＦ）など）で処理する。次に、未処理の試料およびＢＫＦで処理した試料を液体クロマトグラフィーで分析する。α（１，６）結合型フコース残基を含むグリカンはＢＫＦ処理後に溶出の変化を示すが、非フコシル化グリカンは変化しない。オリゴ糖の組成は質量分析によっても確認される。例えば、Zhu et al. (2014) MAbs 6:1474参照。
【０１０３】
非フコシル化の割合は、抗体重鎖のＮ２９７（ＥＵナンバリング）のＮ結合型グリカンにおいて最初のＧｌｃＮａｃ残基にα１，６結合したフコースを持たないグリカンの、その位置にある全てのグリカン（フコースを持たないグリカンおよびα１，６結合型フコースを持つグリカン）の合計に対するモル比の１００倍として計算される。
表３
配列表の要約
【表３】
2020509037.tif 000004
【０１０４】
抗体配列に関して、配列表は成熟可変領域ならびに重鎖および軽鎖の配列を提供する（すなわち、配列はシグナルペプチドを含まない）。
【０１０５】
均等物
当業者は本明細書に開示された具体的な実施態様の多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確認できる。そのような均等物は添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2020509037.tif 000005
【図１Ｂ】
2020509037.tif 000006
【図１Ｃ】
2020509037.tif 000007
【図２Ａ】
2020509037.tif 000008
【図２Ｂ】
2020509037.tif 000009
【図２Ｃ】
2020509037.tif 000010
【図３Ａ】
2020509037.tif 000011
【図３Ｂ】
2020509037.tif 000012
【図３Ｃ】
2020509037.tif 000013
【図４Ａ】
2020509037.tif 000014
【図４Ｂ】
2020509037.tif 000015
【図４Ｃ】
2020509037.tif 000016
【図５Ａ】
2020509037.tif 000017
【図５Ｂ】
2020509037.tif 000018
【図５Ｃ】
2020509037.tif 000019
【図６Ａ】
2020509037.tif 000020
【図６Ｂ】
2020509037.tif 000021
【図７Ａ】
2020509037.tif 000022
【図７Ｂ】
2020509037.tif 000023
【図７Ｃ】
2020509037.tif 000024
【図８Ａ】
2020509037.tif 000025
【図８Ｂ】
2020509037.tif 000026
【図８Ｃ】
2020509037.tif 000027
【図９Ａ】
2020509037.tif 000028
【図９Ｂ】
2020509037.tif 000029
【図９Ｃ】
2020509037.tif 000030
【図１０】
2020509037.tif 000031
【図１１】
2020509037.tif 000032
【配列表】
2020509037000001.app
【国際調査報告】
2020509037.tif 000033
2020509037.tif 000034
2020509037.tif 000035