(57)【要約】  組成物及び方法は、抗ヌクレオリン抗体又はそのフラグメントを使用して、壊死腫瘍細胞を特異的に標的とする。ゆえに、そして好ましい面において、組成物及び方法は、腫瘍微環境及びそのような環境内の癌細胞を標的とするのに用いられ得る。ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤により壊死細胞を標的とする方法も又挙げられる。
2020515634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壊死細胞を標的とする方法であって、前記壊死細胞を、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤と接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記壊死細胞は腫瘍細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記壊死細胞は、腫瘍微環境内の腫瘍細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオリンは、前記壊死細胞内に位置している、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
接触させる工程は、インビボで実行される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合剤はさらに、治療剤及び造影剤の少なくとも１つを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）のインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）アゴニスト又はリガンド、上皮間葉転換（「ＥＭＴ」）を妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
壊死細胞を含有する腫瘍微環境を標的とする方法であって、前記微環境内の前記壊死細胞を、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤と接触させる工程を含む方法。
【請求項１１】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記壊死細胞は腫瘍細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記壊死細胞は、固形腫瘍内の腫瘍細胞である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオリンは、前記壊死細胞内に位置している、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触させる工程は、インビボで実行される、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合剤はさらに、治療剤及び造影剤の少なくとも１つを含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、ＭＤＳＣのインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、ＴＬＲアゴニスト又はリガンド、ＥＭＴを妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に治療剤を送達する方法であって：
ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤に結合されている治療剤を用意することと；
前記結合剤が、前記腫瘍微環境内の前記壊死細胞中のヌクレオリンに結合し得る条件下で、前記微環境内の前記壊死腫瘍細胞を前記治療剤と接触させることと
を含む方法。
【請求項２０】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）のインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）アゴニスト又はリガンド、上皮間葉転換（「ＥＭＴ」）を妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍は固形腫瘍である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
接触させる工程は、インビボで実行される、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
血管透過性増強剤を投与する工程をさらに含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記壊死細胞内の前記ヌクレオリンは、細胞内位置にある、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に造影剤を送達する方法であって：
ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤に結合している造影剤を用意することと；
前記結合剤が、前記腫瘍微環境内の前記壊死細胞中のヌクレオリンに結合し得る条件下で、前記微環境内の前記壊死腫瘍細胞を前記造影剤と接触させることと
を含む方法。
【請求項２７】
前記造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍は固形腫瘍である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
接触させる工程は、インビボで実行される、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
血管透過性増強剤を投与する工程をさらに含む、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記壊死細胞内の前記ヌクレオリンは、細胞内位置にある、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤を含む治療ハイブリッド分子であって、前記結合剤は治療剤に結合されている、治療ハイブリッド分子。
【請求項３４】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項３３に記載の治療ハイブリッド分子。
【請求項３５】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）のインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト又はリガンド、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項３３又は３４に記載の治療ハイブリッド分子。
【請求項３７】
ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤を含む診断ハイブリッド分子であって、前記結合剤は、造影剤に結合されている、診断ハイブリッド分子。
【請求項３８】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項３７に記載の診断ハイブリッド分子。
【請求項３９】
前記造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む、請求項３７又は３８に記載の診断ハイブリッド分子。
【請求項４０】
ヌクレオリンに特異的に結合して壊死細胞を標的とする結合剤の使用。
【請求項４１】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記壊死細胞は腫瘍細胞である、請求項４０又は４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記壊死細胞は、腫瘍微環境内の腫瘍細胞である、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記ヌクレオリンは、前記壊死細胞内に位置している、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４５】
接触させる工程は、インビボで実行される、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４６】
前記結合剤はさらに、治療剤及び造影剤の少なくとも１つを含む、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４７】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）のインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト又はリガンド、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
ヌクレオリンに特異的に結合して、腫瘍微環境内の壊死腫瘍細胞を標的とする結合剤の使用。
【請求項５０】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記壊死細胞は腫瘍細胞である、請求項４９又は５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記壊死細胞は、固形腫瘍内の腫瘍細胞である、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記ヌクレオリンは、前記壊死細胞内に位置している、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
接触させる工程は、インビボで実行される、請求項４９から５３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５５】
前記結合剤はさらに、治療剤及び造影剤の少なくとも１つを含む、請求項４９から５４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５６】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）のインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）アゴニスト又はリガンド、上皮間葉転換（「ＥＭＴ」）を妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
腫瘍微環境内の壊死細胞への治療剤又は造影剤の標的送達のための、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤の使用。
【請求項５９】
前記治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、ＭＤＳＣのインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、ＴＬＲアゴニスト又はリガンド、ＥＭＴを妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
前記腫瘍は固形腫瘍である、請求項５８又は５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイ由来の剤である、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６２】
前記使用はインビボである、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６３】
前記壊死細胞内の前記ヌクレオリンは、細胞内位置にある、請求項５８から６２のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２０日出願の米国仮特許出願第６２／４７３，５５２号明細書の優先権の利益を主張する。この出願の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、壊死細胞、とりわけ固形腫瘍内の壊死細胞を標的とする組成物及び方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景の記載は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書中に記載される情報はいずれも、先行技術であること、又は特許請求される本発明に関連することの自認でなく、そして具体的に、又は暗に参照されるいずれの刊行物も、先行技術であることの自認でない。
【０００４】
本明細書中の公報及び特許出願は全て、あたかも個々の刊行物又は特許出願が参照によって組み込まれることが具体的に、且つ個々に示されているかのごとく、参照によって組み込まれる。組み込まれる参考文献内の用語の定義又は使用が、本明細書中に記載される当該用語の定義と矛盾又は相反する場合、本明細書中に記載される当該用語の定義が用いられて、参考文献内の当該用語の定義は用いられない。
【０００５】
腫瘍の標的化は長い間、癌処置に所望される戦略であり、多数のアプローチが企てられてきた。例えば、１つ以上の癌関連抗原、癌特異的抗原、又は腫瘍特異的ネオエピトープ及び患者特異的ネオエピトープを用いて、腫瘍細胞が標的とされ得る。そのようなアプローチは有利には、種々の治療用の物質の送達を可能にする。しかしながら、癌細胞への特異性のみが欠如し、又は単一の患者への排他的な特異性を有する傾向がある。さらに知られているアプローチにおいて、急速に分裂する腫瘍細胞も又、指数増殖中に上方制御される分子を用いて標的とされ得る。例えば、細胞表面ヌクレオリンが、抗癌治療用の潜在的な標的として用いられてきた。当該抗癌治療において、インヒビタが、（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；７１：３２９６−３０５，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；１０：３２５、又はＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２００８；３（６）：ｅ２５１８に記載される擬ペプチドリガンドを用いて）種々の分裂癌細胞の表面ヌクレオリンを妨げることが意図された。
【０００６】
不運にも、多くの癌細胞は、頻繁に低酸素となる腫瘍微環境において急速に分裂することとはならず、上皮から間葉系への転移を経ることによって、集団は、細胞の処置が困難な免疫回避に至る傾向がある。腫瘍壊死は、特に頻繁に低酸素となる腫瘍微環境において、全ての癌の主要な特性であり、そして典型的には、正常な組織及び臓器において見出されない。それゆえに、壊死の標的化は、部位特異性を標的化にもたらすこととなり、そして少なくとも概念的に、全てのヒト腫瘍に適用可能となろう。
【０００７】
この文脈において、腫瘍壊死の標的化が、腫瘍細胞を直接死滅させる方法としてではなく、腫瘍の内部への種々の免疫活性分子及び薬物の送達方法として見られるべきである点に留意する必要がある。したがって、標的分子が腫瘍微環境内に存在且つ残留する（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ）ことで、指向型治療が可能になることが所望されるであろう。しかしながら、現在まで、そのような標的分子を利用する確立された治療的介入は知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、腫瘍微環境を特異的に標的とする組成物及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主題は、ヌクレオリンに選択的に結合する抗体を用いて、壊死細胞、とりわけ腫瘍微環境内のヒト壊死細胞を標的とする、種々の組成物、系、及び方法に関する。実際に、発明者らは、ヌクレオリンが、腫瘍微環境において、とりわけ生きていない壊死した細胞及び細胞フラグメントにおいて共通し、且つ残留する標的であることを発見した。
【００１０】
本発明の主題の一面において、発明者らは、壊死細胞を、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤と接触させる工程を含む、壊死細胞を標的とする方法を意図する。最も典型的には、結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイから単離された剤である。さらに、壊死細胞は、腫瘍微環境内に位置され得る(may be located in)腫瘍細胞であることが通常好ましい。本発明の主題に限定しないが、ヌクレオリンは、壊死細胞の表面内若しくは表面上に位置していることとなる(will be located)こと、及び／又は接触させる工程は、インビボで実行されることが通常意図される。
【００１１】
さらに意図される面において、結合剤は又、治療剤及び／又は造影剤に結合されていてもよい。例えば、適切な治療剤として、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）又はＭ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）アゴニスト及びリガンド、上皮間葉転換(epithelial mesenchymal transition)（「ＥＭＴ」）を妨げる分子、ならびに種々の他の知られている化学療法薬が挙げられ、そして適切な造影剤として、放射性同位体、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）標識、及び単一光子放射形コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）標識が挙げられる。
【００１２】
ゆえに、そして異なる観点から見て、発明者らは又、壊死細胞を含有する腫瘍微環境を標的とする方法を意図する。そのような方法では、微環境内の壊死細胞（例えば腫瘍細胞）は、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤（例えば、抗体、抗体フラグメント、ファージディスプレイ又はＲＮＡディスプレイから単離された剤）と接触する。最も典型的には、壊死細胞は、固形腫瘍内の腫瘍細胞であり、ヌクレオリンは、壊死細胞内に位置しており、且つ／又は接触させる工程は、インビボで実行される。上記したように、結合剤は、治療剤及び／又は造影剤に結合されていてよい。例えば、適切な治療剤として、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、ＭＤＳＣ又はＭ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、ＴＬＲアゴニスト及びリガンド、ＥＭＴを妨げる分子、ならびに種々の他の知られている化学療法薬が挙げられ、そして適切な造影剤として、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識が挙げられる。
【００１３】
本発明の主題のさらに別の面において、発明者らはさらに、壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に治療剤を送達する方法を意図する。最も典型的には、そのような方法は、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤に結合されている治療剤を用意する工程と；結合剤が、腫瘍微環境内の壊死細胞中のヌクレオリンに結合し得る条件下で、微環境内の壊死腫瘍細胞を治療剤と接触させる更なる工程とを含むこととなる。
【００１４】
意図される更なる面において、治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、ＭＤＳＣのインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、及び放射性同位体の少なくとも１つを含み、且つ／或いは好ましい結合剤として、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイから単離される剤が挙げられる。さらに、接触させる工程は、インビボで実行されることが通常好ましい。このような場合、意図される方法は、血管透過性増強剤を投与する工程を含んでもよい。
【００１５】
同様に、発明者らは又、壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に造影剤を送達する方法を意図する。好ましい方法は、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤に結合している造影剤を用意する工程と；結合剤が、腫瘍微環境内の壊死細胞中のヌクレオリンに結合し得る条件下で、微環境内の壊死腫瘍細胞を造影剤と接触させる別の工程とを含むこととなる。
【００１６】
先に記載されるように、造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含んでよく、且つ／或いは結合剤は、抗体及び抗体フラグメント、又はファージディスプレイ若しくはＲＮＡディスプレイから単離された剤であってよい。又、そのような方法は、血管透過性増強剤を投与する工程をさらに含んでよいことが意図される。
【００１７】
結果的に、発明者らは又、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤を含む治療ハイブリッド分子を意図しており、当該結合剤は、治療剤に結合されている。そして、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤を含む診断ハイブリッド分子を意図しており、当該結合剤は、造影剤に結合されている。結合剤、治療剤、及び造影剤に関して、上記したのと同じ考えが当てはまる。さらに、そのようなハイブリッド分子は、腫瘍又は壊死組織があると診断された哺乳類（とりわけヒト）への投与用の医薬組成物に製剤化されてよい。
【００１８】
ゆえに、ヌクレオリンに特異的に結合して、壊死細胞を標的とする結合剤の使用、及びヌクレオリンに特異的に結合して、腫瘍微環境内の壊死腫瘍細胞を標的とする結合剤の使用が、とりわけ意図される。同様に、腫瘍微環境内の壊死細胞への治療剤又は造影剤の標的送達のための、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤の使用が意図される。
【００１９】
本発明の主題の種々の目的、特徴、面、及び利点が、同様の符号が同様の構成要素を表す添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明から、より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＮＡＮＴ−１を用いた免疫沈降から捕捉されたヌクレオリンの例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び捕捉されたヌクレオリンから同定された種々のタンパク質フラグメントのヒトヌクレオリン配列（配列番号１）である。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、ＮＡＮＴ−１に対する二次抗体で染色したｃｏｌｏｎ  ２６細胞（図２Ａ）及びラージ細胞（図２Ｂ及び図２Ｃ）の顕微鏡写真である。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、特定の細胞の文脈において、ＮＡＮＴ−１（３６４−５−１０−５）及び対照抗体を用いた固定細胞アッセイ由来のグラフを示す。
【図４】図４は、ＨＥＹゴースト細胞アッセイＮＡＮＴ−１（３６４−５−１０−５）及び対照抗体由来のグラフである。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｂは、例示的な吸収実験由来のグラフを示す。
【図６Ａ−６Ｄ】図６Ａ〜図６Ｄは、０．１ｍｇ／ｋｇ対１ｍｇ／ｋｇでの、放射ヨウ素標識されたＮＡＮＴ−１の例示的な比較生体内分布実験由来のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の主題は、壊死細胞、とりわけ壊死腫瘍細胞にとって、ヌクレオリンが高度に特異的な標的であるという発見に関する。これは、ヌクレオリンが典型的に、急速に分裂する細胞に付随するので、そしてヌクレオリンは又、静止細胞又は急速に分裂しない細胞において、多くの場合フラグメントに急速に分解するので、特に予想外である。
【００２２】
壊死細胞及び細胞フラグメントにおいて、とりわけ腫瘍微環境において、ヌクレオリンが一般的な、且つ残留性の標的であるという予想外の発見に基づいて、腫瘍微環境は、診断及び／又は治療に用いられ得る種々の剤と共に効果的に扱われ得ることが今回意図される。特に、壊死細胞中のそのように検出されるヌクレオリンは、核及び核周囲コンパートメント内に、そしてそれには大きく及ばない（又は検出限界未満である）が、壊死癌細胞の細胞膜上に、選択的に位置している。結果的に、腫瘍微環境は頻繁に、免疫回避の種々の機構を促進する、標的化が困難な環境（例えば、ＮＫ細胞の活性を引き下げる低酸素、ＥＭＴを促進する栄養素及び酸素の欠乏等）を示すので、種々の免疫刺激因子の特異的な送達及び保持が、免疫治療に特に有益であると思われる。
【００２３】
その点に関して、用語「アポトーシス」及び「壊死」は、本明細書中で互換的に用いられず、細胞死の互いに異なる主に２つの機構及び経路を指すことが理解されるべきである。アポトーシスは、特殊なシグナル伝達事象及び段階的な細胞閉鎖（例えば、ブレブ形成、細胞収縮、核フラグメンテーション、クロマチン凝集、ＤＮＡフラグメンテーション、ｍＲＮＡ崩壊）を包含するプログラム細胞死の明確に定義されたプロセスである一方、壊死は、典型的に、細胞小器官機能の付随する喪失、細胞破壊、及び環境中への細胞内容物の放出による細胞死の崩壊プロセスとして明示される。さらに、壊死は典型的に、炎症性の細胞応答を伴う。さらに、壊死は、免疫系が腫瘍を「見て」、免疫学的に反応する部位であることが理解されるべきである。これは重要である。なぜなら、壊死へのペイロードの送達が、免疫系の腫瘍の認識、及び腫瘍への反応を助けることとなるため、治療的に有効なペイロードの送達の好ましい部位となるからである。
【００２４】
ゆえに、本明細書中でより詳細に記載される発明者らの発見に基づいて、発明者らは、造影剤及び／又は治療剤を腫瘍微環境に送達するための、抗体（及びそのフラグメント）、及び他の特異的な結合剤、例えばＲＮＡディスプレイで選択したタンパク質又はファージディスプレイで選択したタンパク質の使用を意図する。最も典型的には、抗体若しくはそのフラグメント、又は他の結合剤は、結合が、ヒトヌクレオリンに特異的であることとなる（すなわち、例えば、ＳＰＲ又は他の技術によって判定して、Ｋｄが１０−７Ｍ未満、より典型的には１０−８Ｍ未満である結合）。例えば、当該技術において知られている多くの市販のモノクローナル抗ヌクレオリン抗体及びポリクローナル抗ヌクレオリン抗体（例えば、Ａｂｃａｍ  ａｂ１３６６４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢＣ５８７、クローン３６４−５−１０−５）があり、これらは全て、本明細書中での使用に適しているとみなされる。しかしながら、好ましい抗体として、好ましくはＩｇＧサブタイプの、ヒト抗ヌクレオリン抗体及びヒト化抗ヌクレオリン抗体が挙げられる。又、抗体は、ヒトヌクレオリンに向けた特異性を有することが通常好ましい。
【００２５】
同様に、ヌクレオリン（最も典型的には、ヒトヌクレオリン）に対する結合特異性をなお保持する限り、抗体の全てのフラグメントも又意図される。ゆえに、適切な抗体フラグメントとして、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ型抗体、ｓｄＡｂ（シングルドメイン抗体）、及び１つ以上の追加の機能を提供することとなる少なくとも第２のタンパク質ドメインとのキメラ抗体が挙げられる。同様に、結合ドメインが（例えば、ＲＮＡ又はファージディスプレイを介して）人工的に選択されたドメインである場合、そのような人工的に選択されたドメインを含有するＦｃ及び他の融合タンパク質も又適切であるとみなされる。
【００２６】
意図される更なる面において、少なくとも１つの結合ドメインの結合が、ヌクレオリンに対して特異的である（すなわち、Ｋｄが、１０−７Ｍ未満、より典型的には１０−８Ｍ未満の結合）場合、二重特異的、そして多重特異的な抗体及び結合分子も又、本明細書中での使用に適しているとみなされる点に留意する必要がある。例えば、適切な二重特異的抗体及び多重特異的抗体として、二重特異的Ｆａｂ２、二重特異的ダイアボディ、三重特異的Ｆａｂ３、及び三重特異的トリアボディが挙げられる。
【００２７】
抗体又は結合分子のタイプに関係なく、抗体又は結合分子は、診断薬及び／又は治療薬に結合されることとなることが通常意図される。最も典型的には、結合は、共有結合であることとなり、これは、従来の結合化学、例えばアミノ基反応性試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、種々のアルデヒド、カルボジイミド化合物、エポキシド、イミドエステル等）、若しくはスルフヒドリル基反応性試薬（例えば、種々のマレイミド、チオール等）を用いて達成され得、又は組換えクローニング技術を介して実行され得、そこでは抗体（フラグメント）が、注目する第２のタンパク質にフレーム単位で融合される任意選択のリンカーにフレーム単位で融合される。適切なリンカーは、所望の長さ（例えば、所望の空間距離を提供するような長さ）、アミノ酸組成（例えば、切断可能リンカー又は可撓性のあるリンカーを提供するような長さ）その他によって選択されてよい。結合の意図される更なる態様において、結合は、非共有結合であってよく、そしてとりわけ好ましい方法で、結合は、知られている結合対、例えば、ビオチン／アビジン、セルロース／セルロース結合タンパク質、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）／オリゴ−ヒスチジル等の要素によって提供される。
【００２８】
診断薬に関して、検出可能な（且つ、好ましくは定量的に検出可能な）剤は全て、本明細書中での使用に適しているとみなされることが意図される。さらに、検出は、当該技術において知られている適切な方法を用いて、エクスビボで（例えば、組織切片上で）、且つ／又はインビボで実行され得る点に留意すべきである。例えば、視覚的に検出可能な造影剤として、フルオロフォア、発光基、触媒活性基（例えば、色素を析出させ、且つ／又はクロモゲン若しくはルミノゲンを活性化するような触媒活性基）、Ｘ線撮影で検出可能な基（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＮＭＲ標識、放射性同位体等）が挙げられる。
【００２９】
同様に、そして治療剤に関して、治療剤は全て、本明細書中での使用に適しているとみなされることが意図される。しかしながら、本発明の主題の特に好ましい面において、治療剤は、免疫刺激作用を有することとなる。最も典型的には、そのような刺激因子の作用は、１つ以上の機構を取り消し、又は中和して、腫瘍微環境内の癌細胞の免疫回避に至ることとなる。例えば、免疫回避が、Ｍ２マクロファージ又は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の動員に基づく場合、適切な治療剤として、そのような阻害細胞を特異的に不活化又は破壊するもの（例えば、ゲムシタビン、ＲＰ−１８２（米国特許第９４９２４９９号明細書の配列番号１２１参照）、又はシクロホスファミド）が挙げられることとなる。加えて、又は代わりに、免疫回避が、エフェクタ細胞及び／又はヘルパー細胞によるチェックポイント阻害に基づく場合、ＣＴＬＡ４又はＰＤ１に対するバインダ又はアンタゴニスト（例えば、イピリムマブ、ペムブロリズマブ等）が意図される。
【００３０】
逆に、治療剤が免疫刺激活性を有する場合、治療剤の使用によって免疫治療が増強され得ることも理解されるべきである。そのような免疫刺激活性は、好ましくは１つ以上の腫瘍（ネオ）抗原の文脈において、抗体又はそのフラグメントに結合される共刺激性シグナルの使用を介して達成され得る。例えば、共刺激性シグナルとして、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ３、ＬＦＡ３、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳＬその他が挙げられる。又、免疫刺激剤として、免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、及びリガンドが挙げられることとなることが理解されるべきである。又さらに、治療剤が、免疫コンピテント細胞をさらに誘引することとなる（炎症誘発性）ケモカインを含んでもよいことが理解されるべきである。
【００３１】
所望される場合、治療剤は、ＩＬ−８及びＴＮＦ−βが挙げられる、腫瘍微環境内のＥＭＴ（上皮間葉転換）に寄与する因子を標的化することとなる剤を含んでもよい。したがって、適切な治療剤は又、ＩＬ−８及びＴＮＦ−βに結合し、又はそれ以外ではこれらを封鎖するものを含むこととなる。
【００３２】
加えて、治療剤は、癌の処置に用いられるより従来の薬物を含んでもよい。例えば、典型的な抗癌薬物として、代謝拮抗薬、微小管の形成又は脱アセンブリに干渉する薬物、ＤＮＡアルキル化剤、及びトポイソメラーゼインヒビタ、細胞毒性薬物その他が挙げられ、これらは全て、腫瘍微環境において一般的な条件下で切断可能であり得る。又、意図される治療剤として、放射線治療剤、例えばアルファエミッタ及びベータエミッタ（例えば、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２、Ｉ−１３１、Ａｃ−２２５、Ｓｒ−８９その他）が挙げられる。
【００３３】
結果的に、そして以下でより詳細に示されるように、発明者らは、通常、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤と、壊死細胞（典型的には腫瘍細胞、最も典型的には腫瘍微環境内の壊死腫瘍細胞）を接触させる工程を含む、壊死細胞を標的とする方法を意図する。上記したように、そのような結合剤は、最も典型的には、ファージディスプレイ又はＲＮＡディスプレイから選択される抗体、抗体フラグメント、又は剤である。さらに、接触は、そのような方法で、インビボ又はインビトロで実行され得る。例えば、工程がインビトロで実行される場合、比較的少量（例えば、０．００１〜１００μｇ、０．０１〜０．１μｇ、又は０．００１〜０．０１μｇ）の結合剤が必要とされ得る。他方、工程がインビボで実行される場合、比較的大量（例えば、０．０１〜１００ｍｇ、０．１〜１０ｍｇ、又は１〜１０ｍｇ）の結合剤が必要とされ得る。勿論、結合剤が造影剤及び／又は治療剤に結合される場合、結合剤の量は、所望の効果のために必要とされる造影剤及び／又は治療剤のタイプ及び量によって、少なくとも部分的に決定されることとなることが理解されるべきである。
【００３４】
結果的に、発明者らは又、壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に治療剤及び／又は造影剤を送達する方法を意図する。上記したように、そのような方法は典型的に、ヌクレオリンに特異的に結合する結合剤に結合されている治療剤を用意する工程と、結合剤が、腫瘍微環境内の壊死細胞中のヌクレオリンに結合し得る条件下で、微環境内の壊死腫瘍細胞を治療剤と（好ましくはインビボで）接触させる更なる工程とを含むこととなる。
【００３５】
又、本明細書中で意図される方法はさらに、腫瘍壊死を増大させることによって、腫瘍中への修飾抗体又は結合剤の吸収を増強することで、治療ペイロード又は診断ペイロードの送達を最適化する１つ以上の工程を含んでよい。例えば、適切な更なる工程として、放射線療法、化学療法、又は免疫療法、そしてとりわけ低用量のメトロノミック化学療法及び放射線療法が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
配列決定：ＮＡＮＴ−１抗体配列情報を、当該技術分野において周知の標準的なプロトコルに従って、ＮＡＮＴ−１を生成するハイブリドーマ細胞（マウス）のｍＲＮＡから得た。マウスＩｇＧ１アイソタイプの配列が知られているので、可変重鎖及び軽鎖の情報のみを以下に記載し、それぞれのＣＤＲ領域に下線を施した：
【００３７】
重鎖可変領域配列（配列番号２）：
【化１】
2020515634.tif 000003
【００３８】
軽鎖可変領域配列（配列番号３）：
【化２】
2020515634.tif 000004
【００３９】
免疫沈降及び質量分析：ヒトヌクレオリンへの結合を確認するために、ＮＡＮＴ−１抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズへの結合後に、免疫沈降アッセイにかけた。この研究のために、ＲＩＰＡバッファ中に調製したヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９のコールド溶解液(cold lysates)を得て、ＮＡＮＴ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａビーズと、連続回転を用いて４℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回、続いて０．５Ｍ  ＬｉＣｌ中で３回洗浄して、非結合タンパク質を除去した。次に、洗浄したビーズを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動にかけて、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで短時間染色して、分離されたタンパク質を検出した。次に、図１に見られる１１０Ｋｄの薄いバンド（矢印）を切り出して、質量分析に付託して、ヌクレオリンとの同一性を確認した。より詳細には、ヒト結腸癌ＨＴ２９細胞を溶解して、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファ中で超音波処理した。次に、溶解液を、ＮＡＮＴ−１に結合したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズと一晩インキュベートした。洗浄後、抗体及びその抗原を、５０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）で溶出して、１０％  １．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で中和した。図１の左のパネルに示すように、溶離液バンドの分子量を、１２％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル内のＳＤＳ−Ｐａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒで分析した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色後、約１１０ｋＤａの薄いバンドを抽出して、ＬＣ−ＭＳのために送付した。これにより、３５．２％の配列カバー率にて初期確率（ｉｎｉｔｉａｌ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）が＞９９．８％であるヒトヌクレオリンの存在が確認された。右のパネルに示すように、強調した領域は、質量分析によって検出された配列を示しており、これはヒトヌクレオリンと同じである。
【００４０】
間接免疫蛍光：固定された細胞調製物におけるＮＡＮＴ−１の局在化を実証して、ヒト細胞への特異性を判定するために、いくつかのヒト及びマウス細胞株に間接免疫蛍光アッセイを実行して、例示的な結果を以下の図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示す。試験した細胞株について、データは、ヒト細胞の核小体及び核周囲細胞質に局在化したＮＡＮＴ−１を実証するが、マウス起源の腫瘍細胞への結合を示さなかった。この手順について、ヒト及びマウス細胞株を、プリントした顕微鏡スライド上に空気乾燥させて、２％パラホルムアルデヒド（ＥＭグレード）で室温にて１０分間固定して、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で短時間透過処理して、５％ＢＳＡで２５℃にて１時間ブロックした。次に、サンプルを、ＮＡＮＴ−１一次抗体（２５ｕｇ／ｍＬ）と１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄して非結合抗体を除去した後に、ウェルを、二次抗体としてのＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ由来のＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２（１／２，５００）と室温にて１時間インキュベートした。最終工程として、スライドを、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（青色の蛍光）で短時間インキュベートして、核を対比染色して、水浸５０×対物レンズを用いたＬｅｉｔｚ  Ｏｒｔｈｏｐｌａｎ免疫蛍光顕微鏡を用いて観察して写真を撮り、そして免疫蛍光共焦点顕微鏡を用いて写真を撮った。
【００４１】
図２Ａから明らかなように、Ｃｏｌｏｎ  ２６マウス結腸癌細胞は、この方法によって、ＮＡＮＴ−１の結合を示さなかった。対照的に、図２Ｂ及び図２Ｃに見られるように、ヒトバーキットリンパ腫ラージ細胞は、核小体及び核周囲細胞質における抗体の明らかな局在化を示した（緑色の蛍光）。核を青色に染色するＤＡＰＩで、細胞を対比染色した（５０×水対物レンズ）。
【００４２】
固定細胞アッセイ：ヒト腫瘍細胞株ラージ及びＨＴ２９、ならびにマウス腫瘍細胞株Ｃ２６を、２％パラホルムアルデヒド（ＥＭグレード、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１５分間固定してから、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温にて１０分間透過処理した。次に、三反復で調製したサンプルを、一次抗体ＮＡＮＴ−１（２５ｕｇ／ｍＬ）と１時間インキュベートした。ＰＢＳリンスの後、細胞を、二次抗体ＦＩＴＣ結合抗マウスＦ（ａｂ）２（１／２５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で１時間染色してから、ＰＢＳで洗浄した。蛍光を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ分光光度計で測定して、ＭＦＩを判定した。データを、図３Ａ〜図３Ｃに示すようにプロットして、結合データを得て、以下の表１に示すように、固定した各細胞株に対するＫｄ及びＲ２を算出するのに用いた。この研究において、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を、陰性対照として用いた。
【００４３】
図３Ａ〜図３Ｃの実験において、ヒトヌクレオリンへのＮＡＮＴ−１の結合を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって実証するインビトロ固定アッセイを示す。核を、ＤＡＰＩで対比染色した（青色の蛍光）。結果は、マウス結腸癌細胞株Ｃ２６ではなくヒトラージ及びＨＴ−２９細胞へのＮＡＮＴ−１の結合を実証し、抗体のヒト特異性が示される。対照的に、ｃｈＴＮＴ−３は、予想された通り、このアッセイによってヒト及びマウス細胞の双方に結合した。比較すると、ＮＡＮＴ−１抗体は、ＨＴ−２９固定細胞について、ｃｈＴＮＴ−３よりも高い結合力を示した。
【００４４】
【表１】
2020515634.tif 000005
【００４５】
インビトロゴースト細胞アッセイ：壊死へのＮＡＮＴ−１の標的化をさらに評価するために、発明者らのラボで開発した、追加のインビトロアッセイ、ゴースト細胞アッセイを、ＨＥＹヒト卵巣癌細胞を用いて実行した。このアッセイについて、８％ＦＣＳ及び１％抗生物質溶液を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、ＨＥＹ細胞をトリプルフラスコ内で単層として増殖させた。一旦コンフルエントになると、細胞をトリプシン処理して、洗浄して、１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させてから、液体窒素及び３７℃の水浴を用いた３サイクルの凍結／解凍に曝した。各解凍サイクルの後、細胞を５０ｍｌのＰＢＳで洗浄して、１，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット化させた。３サイクルの完了後、細胞ゴースト(the cell ghosts)を１０ｍｌ  ＰＢＳ中に再懸濁させてから、１００ｕｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに三反復で加えた。次に、細胞ゴーストを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で４回洗浄してから、同じ希釈液を用いた３００ｕｌで、連続振盪により室温にて２時間ブロックした。ブロッキングの後、新たにビオチン化した３６４−５−１０−５の２ｕｇ／ｍｌから始めた１０倍の希釈液を三反復で加えて、連続振盪により室温にて２時間インキュベートした。４倍希釈液で洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰＴの二次試薬を加えて（５，０００中１の希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、振盪させながら室温にてさらに１時間インキュベートした。非結合ストレプトアビジンを除去するための追加の洗浄の後、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加えて、プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ分光光度計で４５０ｎｍにて読んだ。
【００４６】
この実験についてのデータを、図４に、そして以下の表２によって示し、これらは、ＮＡＮＴ−１についての優れた結合曲線、及び細胞ゴーストとの抗体親和性を示す。比較すると、ヒトＣＤ２５に対する陰性対照抗体ＲＡ４は、結合をほとんど示さず、ｃｈＴＮＴ−３は、ゴースト細胞調製物に対する親和性がかなり低かった。可溶性の細胞構成要素が環境から取り去られている場合、注目する抗原が細胞溶解後に保持されているかを同定する手段を、ゴースト細胞アッセイは提供する。これは、先に示す固定細胞アッセイよりもストリンジェントな、腫瘍又は組織の壊死領域を標的とする試験である。
【００４７】
【表２】
2020515634.tif 000006
【００４８】
インビボ生体内分布研究：ヌードマウス内にヘテロ移植されたヒト腫瘍へのＮＡＮＴ−１の特異的標的化を実証するために、組織生体内分布研究を実行した。この研究のために、６〜８週齢の雌無胸腺ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に、０．２ｍｌの接種原及び２５ゲージ針を用いて、左歯面（ｌｅｆｔ  ｆｌａｎｋ）において５×１０６個のＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞を移植した。腫瘍を、おおよそ直径１ｃｍに達するまで増殖させた（７〜１０日）。各群（ｎ＝５）内で、個々のマウスに、１００μＣｉ／１０μｇの１２５Ｉ標識ＭＡｂを含有する０．１ｍｌ接種原をｉ．ｖ．注射した。種々の注射後の時点にてマウスを犠牲にして、臓器、血液、及び腫瘍を取り出して、秤量した。次に、サンプル中の放射活性を測定して、％ＩＤ／ｇ及び腫瘍／臓器比（腫瘍１グラムあたりｃｐｍ／臓器１グラムあたりｃｐｍ）として表した。有意水準を、ウイルコックス順位和検定を用いて判定した。
【００４９】
図５Ａ〜図５Ｂに示すように、抗体ＮＡＮＴ−１は、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＨＴ−２９腫瘍内での優れた、特異的吸収を示した。ここで、当該結果は、２、５、及び８日目のＨＴ２９異種移植ヌードマウスモデルにおける（５Ａ）ＮＡＮＴ−１（マウス抗体３６４−５−１０−５）及び（５Ｂ）アイソタイプ対照抗体の比較生体内分布研究を示す。この研究のために、抗体を、１２５Ｉで放射性標識して、腫瘍ヌードマウスの群（ｎ＝５）にｉｖ注射した。次に、腫瘍及び組織を、示す日の検死時に取り出して、各サンプルにおける抗体吸収を定量化した。吸収レベルは、２日目にて注射用量／グラムの３０％を超え、５日目及び８日目におおよそ２０％に減少した。対照的に、血液の吸収は、２日目にておよそ１８％であり、８日目までにおよそ１０％に減少した。正常な臓器は、吸収が僅かであり、これは、８日目までに、臓器に応じて２〜４％未満に減少した（血液プールが各組織から一掃されるためである）。アイソタイプ対照セットのマウスについて、全ての組織及び腫瘍における血液プール以外に吸収は見られな且つた。
【００５０】
図６Ａ〜図６Ｄにおいて、０．１（放射性トレーサ用量）対ｌｍｇ（放射性トレーサ＋コールド用量(cold dose)）の放射性標識３６４−５−１０−５の比較生体内分布分析を実行して、腫瘍における抗原特異性を確認した。このように、固定放射性トレーサ用量での放射性標識抗体対濃度が増大する各コールド抗体(cold antibody)（高度に特異的な腫瘍吸収及び高い発現レベル（すなわち、注射後の所定の時間での腫瘍／臓器比がより高い）を明らかにするように設計されている）を用いた放射性トレーサ研究を使用することが実用的である。非標識抗体の用量が増大するにつれ、抗原−受容体占有レベルが増大することは、組織内の放射活性レベルが、競合結合阻害の概念に基づいて、実際に減少することを意味することを心に留めておくことが重要である。この状況において、放射性トレーサは、腫瘍における抗体レベルを追跡するマーカーとして用いられる。放射性トレーサの固定用量にて、腫瘍内の放射活性レベルは減少し、競合する結合に起因して非標識抗体の用量が増大して、より高い抗原−受容体占有時に、より低い吸収に至る。
【００５１】
より詳細には、図６Ａ〜図６Ｄは、例示的に、０．１ｍｇ／ｋｇ対１ｍｇ／ｋｇでの放射ヨウ素標識ＮＡＮＴ−１の比較生体内分布データを示しており、そして抗体のヌクレオリン特異性を実証している。ここで、１ｍｇ／ｋｇ（放射性トレーサ＋非標識抗体）のＮＡＮＴ−１を注射したマウスは、全ての時点にて腫瘍吸収が、放射活性吸収が類似する正常な組織と比較して、０．１ｍｇ／ｋｇ（放射性トレーサ用量）よりも低い。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ＮＡＮＴ−１用量と放射性標識抗体の腫瘍吸収との間に観察される逆の関係は、（正常な組織においては見られない）腫瘍における抗原特異性を確認する。トレーサ用量にて、そして全ての時点にて見られる高い腫瘍吸収（＞２０％  ＩＤ／ｇｍ）及び腫瘍／臓器比も又、非悪性組織に対する悪性組織内の標的抗原の高い発現レベルを確認する。
【００５２】
本明細書中に示される例示的なデータ及び更なる意図は、本発明の主題の例となる多くの実施形態を提供する。各実施形態は、本発明の要素の単一の組合せを表すが、本発明の主題は、開示される要素の、可能性がある全ての組合せを含むとみなされる。ゆえに、一実施形態が要素Ａ、Ｂ、及びＣを含み、そして第２の実施形態が、要素Ｂ及びＤを含むならば、本発明の主題は、たとえ明示的に開示されていないとしても、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤの残りの他の組合せも含むとみなされる。
【００５３】
一部の実施形態において、本発明の特定の実施形態を説明し、且つ特許請求するのに用いられる成分、特性、例えば濃度、反応条件その他の量を表す数値は、場合によっては、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、一部の実施形態において、明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。一部の実施形態において、数値パラメータは、報告される有意桁の数を考慮して、そして通常の四捨五入技術を用いることによって、解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにも拘らず、具体例に示される数値は、実行可能なほど正確に報告されている。本発明の一部の実施形態において示される数値は、それぞれの試験測定において見出される標準偏差に必然的に由来する特定の誤差を含有してよい。
【００５４】
本明細書中の記載に、そしてこれに従う特許請求の範囲の全体を通して用いられる「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照を含む。本明細書中の説明に用いられる「ｉｎ」の意味も又、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。又、本明細書中で用いられる用語「に結合した」は、文脈上、そうでないとする指示がない限り、直接的な結合（２つの要素が、互いに接触して互いに結合する）及び間接的な結合（少なくとも１つの付加的な要素が、２つの要素間に位置している）の双方を含むことが意図される。したがって、用語「に結合した」及び「と結合した」は、同義的に用いられる。
【００５５】
文脈上、そうでないとする指示がない限り、本明細書中で示される全ての範囲は、そのエンドポイントを含むと解釈されるべきであり、そしてオープンエンドの範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈されるべきである。同様に、値の全てのリストは、文脈上、そうでないとする指示がない限り、中間の値を含むとみなされるべきである。
【００５６】
既に記載されるもの以外のより多くの修飾が、本明細書中で発明概念を逸脱しない範囲で可能であることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて、制限されるべきでない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する際に、全ての用語は、文脈に合わせて最も広く可能なように解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含んでいる」は、要素、構成要素、又は工程に、非排他的に言及すると解釈されるべきであり、このことは、当該要素、構成要素、又は工程が、明示的に言及されていない他の要素、構成要素、又は工程と存在してもよいし、利用されてもよいし、組み合わされてもよいことを示す。本明細書又は特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つを指す場合、本文は、ＡプラスＮでもなく、ＢプラスＮその他でもない当該群由来の唯一の要素を必要とすると解釈されるべきである。
【図１】
2020515634.tif 000007
【図２Ａ】
2020515634.tif 000008
【図２Ｂ】
2020515634.tif 000009
【図２Ｃ】
2020515634.tif 000010
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020515634.tif 000016
【図６Ａ】
2020515634.tif 000017
【図６Ｂ】
2020515634.tif 000018
【図６Ｃ】
2020515634.tif 000019
【図６Ｄ】
2020515634.tif 000020
【配列表】
2020515634000001.app
【国際調査報告】
2020515634.tif 000021
2020515634.tif 000022
2020515634.tif 000023