(57)【要約】単独で、または第２高調波発生、和周波発生、または差周波発生等の他の非線形光学測定と組み合わせてのいずれかで、２光子蛍光測定を使用し、繋留非線形活性バイオ分子の平均傾転角および分布幅等の構造パラメータを決定するための方法、デバイス、およびシステムが、説明される。開示される方法、デバイス、およびシステムはまた、２つ以上のバイオ分子サンプルの構造比較を実施するため、リガンドの結合に応じてバイオ分子配座の変化を検出するため、および候補結合パートナを選別し、バイオ分子の配座を変調させる化合物を識別するために、使用され得る。
2020519866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、
（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと、
（ｄ）第２の偏光を使用する前記第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質と比較し、前記平面に対する前記２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の物理的性質は、ｐ偏光された光強度Ｉｐであり、前記第２の物理的性質は、ｓ偏光された強度Ｉｓであり、ステップ（ｆ）における比較は、角度パラメータを決定するための方程式
【数１】
2020519866.tif 000017
を解くステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎にステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記一連の中の前記バイオ分子複合体はそれぞれ、同一の２光子蛍光標識を用いて異なる部位において標識される前記バイオ分子を含む、ステップと、前記２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎に決定される前記角度パラメータを使用して、前記バイオ分子の構造を決定するステップとをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオ分子は、タンパク質であり、前記一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体はそれぞれ、単一部位システインまたはメチオニン置換を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオ分子は、２つ以上の異なる部位において２つ以上の異なる２光子蛍光標識を用いて標識され、前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識のそれぞれによって生成される光の第１の物理的性質および第２の物理的性質は、前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識に関して同一である、または異なり得る、基本周波数の光による照明に応じて、ステップ（ｃ）および（ｅ）において同時または連続的に検出され、前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識毎に、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質とのステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質の比較は、前記平面に対する前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識のそれぞれの角度パラメータを決定するために使用される、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記付着したバイオ分子はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識を用いて既知の部位において標識される、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記２光子蛍光標識、および第１の第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、前記バイオ分子上の同一の既知の部位に付着した同一の標識である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
同時に、または続いて、第２の基本周波数の励起光による照明に応じて、ステップ（ｃ）において前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質、およびステップ（ｅ）において前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップをさらに含み、前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一である、または異なり得る、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質と比較し、前記平面に対する前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の２光子蛍光標識、第２高調波（ＳＨ）活性標識、和周波数（ＳＦ）活性標識、または差周波数（ＤＦ）活性標識、またはそれらの任意の組み合わせの前記角度パラメータのデータを、前記バイオ分子の構造モデルに大域的に適合させるステップをさらに含み、前記構造モデルは、前記バイオ分子内の前記１つ以上の標識の既知の部位についての情報を備える、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオ分子の構造モデル化のための構造的制約を提供する、Ｘ線結晶構造解析データ、ＮＭＲデータ、または他の実験データを組み込むステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオ分子は、タンパク質であり、前記２光子蛍光標識、または第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、非線形活性非天然アミノ酸である、請求項１−１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記非線形活性非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非線形活性部分は、明らかに非線形活性ではない非天然アミノ酸に付着される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光の第２の物理的性質は、前記光の第１の物理的性質と異なる、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記光の第１および第２の物理的性質は、同一の偏光を保有するが、異なる規模または強度である、請求項１−１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記光の第１および前記第２の物理的性質は、異なる偏光を保有する、請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記照明するステップは、前記励起光の偏光を調節するステップを含む、請求項１−１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記励起光の第１の偏光状態は、その入射面に対するｐ偏光を備え、前記励起光の第２の偏光は、その入射面に対するｓ偏光を備える、請求項１−１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）および（ｅ）における検出するステップは、検出器に到達する、前記２光子蛍光標識、または第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される前記光の偏光を調節するステップを含む、請求項１−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記光の第１および第２の物理的性質は、強度または偏光である、請求項１−２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記２光子蛍光標識によって生成される前記光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される、請求項１−２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記低開口数ピンホールは、前記励起光が前記平面上に入射する、前記平面上の点の直接上方および下方に設置される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記平面は、支持脂質二重層を備え、前記バイオ分子は、前記支持脂質二重層に付着される、またはその中に挿入される、請求項１−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に指向される、請求項１−２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性であり、
（ｇ）前記第１の基本周波数の励起光と同一である、または異なり得る、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記付着したバイオ分子に付着した前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の強度を同時または連続的に検出するステップであって、検出は、
（ｉ）前記励起光の第１の偏光状態、および
（ｉｉ）前記励起光の第２の偏光状態、
を使用して実施される、ステップと、
（ｈ）ステップ（ｃ）（ｉ）および（ｃ）（ｉｉ）において検出される光強度の比を計算することによって、基板表面への法線に対して第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定するステップと、
（ｉ）前記２光子蛍光標識の角度パラメータに関する方程式および２光子蛍光に関して計算される光強度比を積分し、前記２光子蛍光方程式を満たす角度パラメータ値対を決定するステップと、
（ｊ）前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータに関する方程式、および前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数（ＤＦ）光に関して計算される前記光強度比を積分し、前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式を満たす角度パラメータ値対を決定するステップと、
（ｋ）ステップ（ｉ）および（ｊ）において識別される前記角度パラメータ値対の交差を決定し、前記２光子蛍光および前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式の両方を満たす一意の一対の角度パラメータ値を決定するステップと、
によって、前記標識の角度パラメータを決定するステップをさらに含む、
請求項１−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
バイオ分子は、前記バイオ分子に付着した前記２光子蛍光標識の配向分布の幅が３５度以下であるように、前記平面に付着される、請求項１−２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記角度パラメータは、平均傾転角、配向分布幅、またはそれらの一対の組み合わせを備える、請求項１−２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
バイオ分子の配座変化を検出するための方法であって、前記方法は、
ａ）配向された様式で前記バイオ分子を平面に付着させるステップであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて標識される、ステップと、
ｂ）第１の偏光および第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）における前記第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質および光の第２の物理的性質を検出するステップと、
ｄ）前記付着したバイオ分子に、（ｉ）既知のリガンドとの接触、（ｉｉ）候補結合パートナとの接触、または（ｉｉｉ）実験条件の変化を受けさせるステップと、
ｅ）前記第１の偏光および前記第２の偏光を使用する前記第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）における前記第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第３の物理的性質および光の第４の物理的性質を検出するステップと、
（ｆ）ステップ（ｆ）において検出される前記光の第３および第４の物理的性質の比を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１および第２の物理的性質の比と比較するステップであって、前記光の物理的性質の比の変化は、前記バイオ分子が配座変化を受けたことを示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記２光子蛍光の物理的性質は、０．２以下である開口数を有する、ピンホール検出装置を使用して検出される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記開口数は、約０．０１〜約０．２である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記２光子蛍光の物理的性質は、レンズを使用することなく検出される、請求項２９−３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波、和周波数、または差周波数活性であり、第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質は、前記第１および第２の偏光を使用する第２の基本周波数の光を用いた照明の結果として、前記２光子蛍光の物理的性質の検出と連続的または同時に検出される、請求項２９−３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｆ）において比較される比は、前記第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質に対する前記２光子蛍光の物理的性質の比を備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一である、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１および第２の偏光は、ｓ偏光およびｐ偏光を備える、請求項２９−３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記バイオ分子は、タンパク質分子である、請求項２９−３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質分子は、薬剤標的である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記既知のリガンドは、既知の薬剤である、または前記候補結合パートナは、薬剤候補である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記２光子蛍光標識は、１つ以上の工学的システイン残基において前記タンパク質分子に付着される、請求項３７−３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記２光子蛍光標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）である、請求項２９−４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記２光子蛍光標識は、前記タンパク質分子に組み込まれた非線形活性非天然アミノ酸である、請求項３７−３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記非線形非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に送達される、請求項２９−４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記バイオ分子は、支持脂質二重層の中への挿入またはそこへの繋留によって前記平面に付着される、請求項２９−４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
候補結合パートナを選別し、標的分子の配座を変調させる結合パートナを識別するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記標的分子を基板表面に繋留するステップであって、前記標的分子は、結合パートナとの接触に応じて配座変化を受ける、前記標的分子の一部に付着される２光子蛍光標識を用いて標識され、前記繋留標的分子は、前記基板表面上に正味の配向を有する、ステップと、
（ｂ）第１の基本周波数の励起光を用いて前記繋留標的分子を照明するステップと、
（ｃ）前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出し、基準信号を生成するステップと、
（ｄ）連続的かつ個別に、前記繋留標的分子を前記１つ以上の候補結合パートナと接触させるステップと、
（ｅ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第１の基本周波数の励起光による照明に応答して、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、
（ｆ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第２の物理的性質を前記第１の物理的性質と比較するステップであって、前記第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する前記第２の物理的性質の値の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、ステップと、
を含む、方法。
【請求項４７】
前記光の第１および第２の物理的性質は、前記励起光の２つの異なる偏光の下の光の強度を備え、ステップ（ｆ）は、前記光の２つの強度の比を決定するステップを含み、前記比の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的分子はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識を用いて標識される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記２光子蛍光標識、および前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、同一の標識部分である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ｇ）ステップ（ｃ）を実施することと同時に、またはそれに続いて、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップであって、前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一である、または異なり得る、ステップと、
（ｈ）ステップ（ｅ）を実施することと同時に、またはそれに続いて、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、
（ｉ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される前記第２の物理的性質を、前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される前記第１の物理的性質と比較するステップであって、前記第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する前記第２の物理的性質の値の変化はさらに、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、ステップと
をさらに含む、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記光の第１および第２の物理的性質は、前記励起光の２つの異なる偏光の下の光の強度を備え、ステップ（ｉ）は、前記光の２つの強度の比を決定するステップを含み、前記比の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記励起光は、前記表面から完全に内部反射されるような方法で前記基板表面に指向される、請求項４６−５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
２光子蛍光は、前記第１の基本周波数の励起光が前記基板表面上に入射する点において前記基板表面の直接上方または下方に位置付けられるピンホール開口を使用して収集される、請求項４６−５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
２光子蛍光は、集光レンズを使用することなく収集される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ピンホール開口の開口数は、０．０１〜０．２である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記非線形活性標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）部分、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（バダン）部分、または６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）部分を含む、請求項４６−５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的分子は、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグを含むタンパク質である、請求項４６−５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｈｉｓタグは、６ｘ−Ｈｉｓタグ、７ｘ−Ｈｉｓタグ、８ｘ−Ｈｉｓタグ、９ｘ−Ｈｉｓタグ、１０ｘ−Ｈｉｓタグ、１１ｘ−Ｈｉｓタグ、または１２ｘ−Ｈｉｓタグを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記繋留標的分子は、全内部反射の使用を通して前記第１の基本周波数の光を用いて照明される、請求項４６−５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
標的タンパク質の構造内でジェネリック薬剤または薬剤候補および参照薬剤によって誘発される配座変化を比較するための方法であって、前記標的タンパク質は、非線形活性標識を用いて標識され、界面上に正味の配向を有するように前記界面に繋留され、前記方法は、
ａ）前記標的タンパク質を前記参照薬剤と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、特異的様式で前記参照またはブランド薬剤と相互作用する、ステップと、
ｂ）表面選択的技法を使用して、前記非線形活性標識によって生成される第１の信号または信号変化を測定することによって、前記標的タンパク質と前記参照薬剤との間の相互作用を検出するステップであって、前記第１の信号または信号変化は、前記参照薬剤に特異的である前記標的タンパク質の構造の配座変化を示す、ステップと、
ｃ）前記標的タンパク質を前記ジェネリック薬剤または薬剤候補と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、特異的様式で前記ジェネリック薬剤または薬剤候補と相互作用する、ステップと、
ｄ）表面選択的技法を使用して、前記非線形活性標識によって生成される第２の信号または信号変化を測定することによって、前記標的タンパク質と前記ジェネリック薬剤または薬剤候補との間の相互作用を検出するステップであって、前記第２の信号または信号変化は、前記ジェネリック薬剤または薬剤候補に特異的である前記標的タンパク質の構造の配座変化を示す、ステップと、
ｅ）前記第２の信号または信号変化を前記第１の信号または信号変化と比較し、前記ジェネリック薬剤または薬剤候補によって前記標的タンパク質において誘発される前記配座変化が、前記参照薬剤によって誘発される変化と同一または実質的に同一であるかどうかを決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項６１】
前記標的タンパク質は、細胞表面受容体または抗原である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記参照薬剤は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ジェネリック薬剤または候補薬剤は、小分子化合物、非抗体阻害性ペプチド、抗体、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項６０−６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ジェネリック薬剤または薬剤候補は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項６０−６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ジェネリック薬剤は、バイオ後続品である、請求項６０−６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的タンパク質の構造の配座変化は、リアルタイムで検出される、請求項６０−６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記非線形活性標識は、前記標的タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基によって前記標的タンパク質に結合される、請求項６０−６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上のスルフヒドリル基は、工学的スルフヒドリル基である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識または２光子蛍光標識である、請求項６０−６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記非線形活性標識は、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステル、バダン、およびアクリロダンから成る群から選択される、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、請求項６０−６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記非線形活性標識は、非天然アミノ酸である、請求項６０−６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
生体類似性の決定は、少なくとも第２の構造特性評価または機能分析技法から取得される構造または機能データと組み合わせて、誘発された配座変化の比較に基づいて行われる、請求項６０−７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも第２の構造特性評価または機能分析技法は、円偏光二色性，Ｘ線結晶構造解析、生物学的分析、結合分析、酵素分析、細胞ベースの分析、細胞増殖分析、細胞ベースのレポータ分析、および動物モデル研究から成る群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
２つ以上のタンパク質サンプルを比較するための方法であって、前記方法は、
ａ）タンパク質産生プロセスの同一のステップに関して異なる時間に、タンパク質産生プロセスの異なるステップにおいて、同一のタンパク質産生プロセスの別個の工程から、または公称上同一のタンパク質を産生する異なるタンパク質産生プロセスから収集される、２つ以上のタンパク質サンプルを提供するステップと、
ｂ）光学界面の１つ以上の離散領域中で前記１つ以上のタンパク質サンプルからのタンパク質を繋留するステップであって、各サンプルからの前記繋留タンパク質は、非線形活性標識を用いて標識され、前記光学界面において正味の配向を有する、ステップと、
ｃ）基本周波数の光を用いた前記非線形活性標識の照明に応じて生成される、前記１つ以上の繋留タンパク質サンプル毎に基準非線形光学信号を測定するステップと、
ｄ）前記１つ以上の繋留タンパク質サンプルの測定された基準非線形光学信号を、相互と、または参照サンプルに関して測定される基準非線形光学信号と比較するステップであって、規定割合未満である、前記１つ以上の固定化タンパク質サンプルに関して測定される前記基準非線形光学信号の差異、または前記１つ以上のタンパク質サンプルに関して測定される前記基準非線形光学信号と参照サンプルのものとの間の差異は、前記１つ以上のタンパク質サンプルまたは前記参照サンプルのタンパク質が同等構造を有することを示す、ステップと、
を含む、方法。
【請求項７６】
前記１つ以上のタンパク質サンプルは、タンパク質産生プロセスの終点において収集され、ステップ（ｄ）における比較は、タンパク質産物の品質管理に使用される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記１つ以上のタンパク質サンプルは、タンパク質産生プロセスの１つ以上のステップにおいて収集され、ステップ（ｄ）における比較は、前記タンパク質産生プロセスの最適化に使用される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記１つ以上のタンパク質サンプルは、公称上同一のタンパク質を産生する異なるタンパク質産生プロセスから収集され、ステップ（ｄ）における比較は、生体類似性を実証するために使用される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記光学界面は、ガラス表面、溶融石英表面、またはポリマー表面から成る群から選択される表面を備える、請求項７５−７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記光学界面は、支持脂質二重層を備える、請求項７５−７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記支持脂質二重層はさらに、Ｎｉ／ＮＴＡ−脂質分子を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記１つ以上のタンパク質サンプルのタンパク質は、Ｈｉｓタグを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記基準非線形光学信号またはその変化は、リアルタイムで監視される、請求項７５−８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記非線形活性標識は、前記タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基によって前記タンパク質に結合される、請求項７５−８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記１つ以上のスルフヒドリル基は、工学的スルフヒドリル基である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、請求項７５−８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記固定化または繋留タンパク質は、それ自体がＳＨＧ活性である、ペプチド、ペプチド模倣薬、または他のリガンドとそれを接触させることによって標識され、前記固定化または繋留タンパク質に結合された前記ＳＨＧ活性リガンドをもたらす、請求項７５−８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記非線形活性標識は、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステル、バダン、およびアクリロダンから成る群から選択される第２高調波（ＳＨ）活性標識である、請求項７５−８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記非線形活性標識は、前記１つ以上のタンパク質サンプルのタンパク質に遺伝学的に組み込まれた非天然アミノ酸である、請求項７５−８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性および２光子蛍光の両方であり、ステップ（ｃ）における測定するステップはさらに、基準第２高調波信号および基準２光子蛍光信号の両方を測定するステップを含む、請求項７５−９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
ステップ（ｄ）の比較はさらに、前記１つ以上の繋留されるタンパク質サンプルの２光子蛍光基準信号に対する第２高調波の比を、相互と、または参照サンプルのものと比較するステップを含み、規定割合未満の差異は、前記１つ以上のタンパク質サンプルまたは前記参照サンプルのタンパク質が同等の構造を有することを示す、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の２光子蛍光を検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、
（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記２光子蛍光標識によって生成される前記光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される、ステップと
を含む、方法。
【請求項９４】
前記低開口数ピンホールは、前記励起光が前記平面上に入射する、前記平面上の点の直接上方および下方に設置される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記平面は、支持脂質二重層を備え、前記バイオ分子は、前記支持脂質二重層に付着される、またはその中に挿入される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に指向される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記低開口数ピンホールは、０．０１〜０．２の開口数を有する、請求項９４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は、２０１７年５月３日に出願された米国仮出願第６２／５００，９１２号の利益を主張するものであり、該米国仮出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
開示される発明は、分子検出の分野に関し、特に、タンパク質検出および構造決定の分野に関する。タンパク質構造決定（およびより一般的には、バイオ分子構造決定）の分野は、高度に開発されているが、タンパク質構造の決定、異なるサンプルから、または異なる時点におけるタンパク質構造の比較、およびリアルタイムで溶液中のタンパク質配座変化の検出のための敏感かつ迅速な技法の必要性が残っている。タンパク質構造および動態についての殆どの情報は、主にＸ線結晶構造解析およびＮＭＲ研究に由来しているが、これらの技法は、比較的に作業および材料集約的である、実施することが遅い、またはタンパク質構造の静的スナップショットのみを提供する。
【０００３】
第２高調波発生（ＳＨＧ）は、第２高調波活性標識を用いて標識されるタンパク質および他の生物学的標的における結合相互作用および配座変化の検出を可能にする、表面選択的検出技法として構成され得る、非線形光学プロセスである（例えば、米国特許第６，９５３，６９４号および第８，４９７，０７３号参照）。現在まで、これらの方法は、種々の生物系においてリガンド誘発配座変化を検出するように、かつ標的タンパク質への結合に応じてそれらが誘発する配座変化のタイプによってリガンドを区別するように、適用されている（Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００１），  “ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ’  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４２，  ４８５−４９１、Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００３），  “Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８１，  ７０５−７０９、Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００６），  “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １２５、Ｍｏｒｅｅ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５），  “Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｉｔｓ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２９０（４６）；２７５８２−２７５９３、Ｍｏｒｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５），  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ａｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  １０９：８０６−８１５）。異なるタイプのリガンドを区別するためのＳＨＧの使用の実施例は、タンパク質に結合し、それぞれ、不活性および活性配座を誘発する、イマチニブおよびダサチニブ等のＩ型対ＩＩ型キナーゼ阻害剤を区別することを含む。
【０００４】
本開示に説明されるように、２光子蛍光（異なる非線形光学技法）もまた、限定ではないが、溶液中、高スループットにおける、かつ随意にリアルタイムでのバイオ分子構造決定、配座景観マッピング、選別用途における偽陽性または偽陰性の識別等を含む、構造生物学および高スループット選別の問題に対処するために、単独で、または第２高調波発生（ＳＨＧ）、和周波発生（ＳＦＧ）、または差周波発生（ＤＦＧ）等の非線形光学測定と組み合わせてのいずれかで、使用されることができる。故に、本開示の第１の側面は、２光子蛍光（ＴＰＦ）測定または２光子蛍光および他の非線形光学測定の組み合わせを使用して、タンパク質構造を決定するための方法、デバイス、およびシステムを説明する。
【０００５】
本開示の別の側面では、方法、デバイス、およびシステムが、ＳＨＧおよび関連非線形光学技法を使用し、タンパク質に付着した標識の絶対配向を決定し、それによって、タンパク質への標識の付着部位を系統的に変更することによってタンパク質構造をマップすること、または異なるサンプルの間で、または異なる時点における所与のサンプルに関してタンパク質構造を比較することを可能にするために、説明される。いくつかの実施形態では、これらの測定は、偏光を使用して、ＳＨＧ信号、例えば、基準ＳＨＧ信号を測定するステップを含んでもよい。いくつかの実施形態では、これらの測定は、ＳＨＧ対ＴＰＦ信号比、例えば、基準ＳＨＧ対ＴＰＦ信号比、または非線形光学信号の他の比を測定するステップを含んでもよい。
【０００６】
開示される方法、デバイス、およびシステムは、構造生物学および創薬および薬剤開発等の基礎研究分野を含む、種々の分野で有用性を有し得る。多くの場合、本情報は、Ｘ線結晶構造解析等の困難、時間集約的、かつ高価な技法を採用しなければ入手可能ではない場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，９５３，６９４号明細書
【特許文献２】米国特許第８，４９７，０７３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するための方法であって、（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと、（ｄ）第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）における照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）において検出される光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される光の第１の物理的性質と比較し、平面に対する２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第１の物理的性質は、ｐ偏光された光強度Ｉｐであり、第２の物理的性質は、ｓ偏光された強度Ｉｓであり、ステップ（ｆ）における比較は、角度パラメータを決定するための以下の方程式、すなわち、
【化１】
2020519866.tif 000003
を解法するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎にステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、一連の中のバイオ分子複合体はそれぞれ、同一の２光子蛍光標識を用いて異なる部位において標識されるバイオ分子から成る、ステップと、２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎に決定される角度パラメータを使用して、バイオ分子の構造を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、バイオ分子は、タンパク質であり、一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体はそれぞれ、単一部位システインまたはメチオニン置換から成る。いくつかの実施形態では、バイオ分子は、２つ以上の異なる部位において２つ以上の異なる２光子蛍光標識を用いて標識され、２つ以上の異なる２光子蛍光標識のそれぞれによって生成される光の第１の物理的性質および第２の物理的性質は、２つ以上の異なる２光子蛍光標識に関して同一である、または異なり得る、基本周波数の光による照明に応じて、ステップ（ｃ）および（ｅ）において同時または連続的に検出され、２つ以上の異なる２光子蛍光標識毎に、ステップ（ｃ）において検出される光の第１の物理的性質とのステップ（ｅ）において検出される光の第２の物理的性質の比較は、平面に対する２つ以上の異なる２光子蛍光標識のそれぞれの角度パラメータを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、付着したバイオ分子はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識を用いて既知の部位において標識される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識、および第１の第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、バイオ分子上の同一の既知の部位に付着した同一の標識である。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、同時に、または続いて、第２の基本周波数の励起光による照明に応じて、ステップ（ｃ）において第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質、およびステップ（ｅ）において第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップを含み、第２の基本周波数は、第１の基本周波数と同一である、または異なり得る。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、ステップ（ｅ）において検出される光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される光の第１の物理的性質と比較し、平面に対する第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、１つ以上の２光子蛍光標識、第２高調波（ＳＨ）活性標識、和周波数（ＳＦ）活性標識、または差周波数（ＤＦ）活性標識、またはそれらの任意の組み合わせの角度パラメータのデータを、バイオ分子の構造モデルに大域的に適合させるステップを含み、構造モデルは、バイオ分子内の１つ以上の標識の既知の部位についての情報を備える。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、バイオ分子の構造モデル化のための構造的制約を提供する、Ｘ線結晶構造解析データ、ＮＭＲデータ、または他の実験データを組み込むステップを含む。いくつかの実施形態では、バイオ分子は、タンパク質であり、２光子蛍光標識、または第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、非線形活性非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非線形活性非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である。いくつかの実施形態では、非線形活性部分は、明らかに非線形活性ではない非天然アミノ酸に付着される。いくつかの実施形態では、光の第２の物理的性質は、光の第１の物理的性質と異なる。いくつかの実施形態では、光の第１および第２の物理的性質は、同一の偏光を保有するが、異なる規模または強度である。いくつかの実施形態では、光の第１および第２の物理的性質は、異なる偏光を保有する。いくつかの実施形態では、照明するステップは、励起光の偏光を調節するステップを含む。いくつかの実施形態では、励起光の第１の偏光状態は、その入射面に対するｐ偏光を備え、励起光の第２の偏光は、その入射面に対するｓ偏光を備える。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）および（ｅ）における検出するステップは、検出器に到達する、２光子蛍光標識、または第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の偏光を調節するステップを含む。いくつかの実施形態では、光の第１および第２の物理的性質は、強度または偏光である。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識によって生成される光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される。いくつかの実施形態では、低開口数ピンホールは、励起光が平面上に入射する、平面上の点の直接上方および下方に設置される。いくつかの実施形態では、平面は、支持脂質二重層を備え、バイオ分子は、支持脂質二重層に付着される、またはその中に挿入される。いくつかの実施形態では、励起光は、全内部反射を使用して平面に指向される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性であり、（ｇ）第１の基本周波数の励起光と同一である、または異なり得る、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、付着したバイオ分子に付着した第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される、光の強度を同時または連続的に検出するステップであって、検出は、（ｉ）励起光の第１の偏光状態および（ｉｉ）励起光の第２の偏光状態を使用して、実施される、ステップと、（ｈ）ステップ（ｃ）（ｉ）および（ｃ）（ｉｉ）において検出される光強度の比を計算することによって、基板表面への法線に対して第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定するステップと、（ｉ）２光子蛍光標識の角度パラメータに関する方程式および２光子蛍光に関して計算される光強度比を積分し、２光子蛍光方程式を満たす角度パラメータ値対を決定するステップと、（ｊ）第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータに関する方程式、および第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数（ＤＦ）光に関して計算される光強度比を積分し、第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式を満たす角度パラメータ値対を決定するステップと、（ｋ）ステップ（ｉ）および（ｊ）において識別される角度パラメータ値対の交差を決定し、２光子蛍光および第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式の両方を満たす一意の一対の角度パラメータ値を決定するステップとによって、標識の角度パラメータを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオ分子は、バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の配向分布の幅が３５度以下であるように、平面に付着される。いくつかの実施形態では、角度パラメータは、平均傾転角、配向分布幅、またはそれらの一対の組み合わせを備える。
【００１０】
また、バイオ分子の配座変化を検出するための方法であって、ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて標識される、ステップと、ｂ）第１の偏光および第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）における第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質および光の第２の物理的性質を検出するステップと、ｄ）付着したバイオ分子に、（ｉ）既知のリガンドとの接触、（ｉｉ）候補結合パートナとの接触、または（ｉｉｉ）実験条件の変化を受けさせるステップと、ｅ）第１の偏光および第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、ｆ）ステップ（ｅ）における第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の第３の物理的性質および光の第４の物理的性質を検出するステップと、（ｆ）ステップ（ｆ）において検出される光の第３および第４の物理的性質の比を、ステップ（ｃ）において検出される光の第１および第２の物理的性質の比と比較するステップであって、光の物理的性質の比の変化は、バイオ分子が配座変化を受けたことを示す、ステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、２光子蛍光の物理的性質は、０．２以下である開口数を有する、ピンホール検出装置を使用して検出される。いくつかの実施形態では、開口数は、約０．０１〜約０．２である。いくつかの実施形態では、２光子蛍光の物理的性質は、レンズを使用することなく検出される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識はまた、第２高調波、和周波数、または差周波数活性であり、第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質は、第１および第２の偏光を使用する第２の基本周波数の光を用いた照明の結果として、２光子蛍光の物理的性質の検出と連続的または同時に検出される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）において比較される比は、第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質に対する２光子蛍光の物理的性質の比を備える。いくつかの実施形態では、第２の基本周波数は、第１の基本周波数と同一である。いくつかの実施形態では、第１および第２の偏光は、ｓ偏光およびｐ偏光を備える。いくつかの実施形態では、バイオ分子は、タンパク質分子である。いくつかの実施形態では、タンパク質分子は、薬剤標的である。いくつかの実施形態では、既知のリガンドは、既知の薬剤である、または候補結合パートナは、薬剤候補である。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識は、１つ以上の工学的システイン残基においてタンパク質分子に付着される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）である。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識は、タンパク質分子に組み込まれた非線形活性非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非線形非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である。いくつかの実施形態では、励起光は、全内部反射を使用して平面に送達される。いくつかの実施形態では、バイオ分子は、支持脂質二重層の中への挿入またはそこへの繋留によって平面に付着される。
【００１２】
候補結合パートナを選別し、標的分子の配座を変調させる結合パートナを識別するための方法であって、（ａ）標的分子を基板表面に繋留するステップであって、標的分子は、結合パートナとの接触に応じて配座変化を受ける、標的分子の一部に付着される２光子蛍光標識を用いて標識され、繋留標的分子は、基板表面上に正味の配向を有する、ステップと、（ｂ）第１の基本周波数の励起光を用いて繋留標的分子を照明するステップと、（ｃ）２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出し、基準信号を生成するステップと、（ｄ）連続的かつ個別に、繋留標的分子を１つ以上の候補結合パートナと接触させるステップと、（ｅ）１つ以上の候補結合パートナ毎に第１の基本周波数の励起光による照明に応答して、２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、（ｆ）１つ以上の候補結合パートナ毎に第２の物理的性質を第１の物理的性質と比較するステップであって、第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する第２の物理的性質の値の変化は、候補結合パートナが標的分子の配座を変調させることを示す、ステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、光の第１および第２の物理的性質は、励起光の２つの異なる偏光の下の光の強度を備え、ステップ（ｆ）は、光の２つの強度の比を決定するステップを含み、比の変化は、候補結合パートナが標的分子の配座を変調させることを示す。いくつかの実施形態では、標的分子はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識を用いて標識される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光標識、および第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、同一の標識部分である。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｇ）ステップ（ｃ）を実施することと同時に、またはそれに続いて、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップであって、第２の基本周波数は、第１の基本周波数と同一である、または異なり得る、ステップと、（ｈ）ステップ（ｅ）を実施することと同時に、またはそれに続いて、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、（ｉ）１つ以上の候補結合パートナ毎に第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される第２の物理的性質を、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される第１の物理的性質と比較するステップであって、第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する第２の物理的性質の値の変化はさらに、候補結合パートナが標的分子の配座を変調させることを示す、ステップとを含む。いくつかの実施形態では、光の第１および第２の物理的性質は、励起光の２つの異なる偏光の下の光の強度を備え、ステップ（ｉ）は、光の２つの強度の比を決定するステップを含み、比の変化は、候補結合パートナが標的分子の配座を変調させることを示す。いくつかの実施形態では、励起光は、表面から完全に内部反射されるような方法で基板表面に指向される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、第１の基本周波数の励起光が基板表面上に入射する点において基板表面の直接上方または下方に位置付けられる、ピンホール開口を使用して収集される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、集光レンズを使用することなく収集される。いくつかの実施形態では、ピンホール開口の開口数は、０．０１〜０．２である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）部分、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（バダン）部分、または６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）部分から成る。いくつかの実施形態では、標的分子は、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグから成るタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、６ｘ−Ｈｉｓタグ、７ｘ−Ｈｉｓタグ、８ｘ−Ｈｉｓタグ、９ｘ−Ｈｉｓタグ、１０ｘ−Ｈｉｓタグ、１１ｘ−Ｈｉｓタグ、または１２ｘ−Ｈｉｓタグから成る。いくつかの実施形態では、繋留標的分子は、全内部反射の使用を通して第１の基本周波数の光を用いて照明される。
【００１４】
標的タンパク質の構造内でジェネリック薬剤または薬剤候補および参照薬剤によって誘発される配座変化を比較するための方法であって、標的タンパク質は、非線形活性標識を用いて標識され、界面上に正味の配向を有するように界面に繋留され、ａ）標的タンパク質を参照薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、特異的様式で参照またはブランド薬剤と相互作用する、ステップと、ｂ）表面選択的技法を使用して、非線形活性標識によって生成される第１の信号または信号変化を測定することによって、標的タンパク質と参照薬剤との間の相互作用を検出するステップであって、第１の信号または信号変化は、参照薬剤に特異的である標的タンパク質の構造の配座変化を示す、ステップと、ｃ）標的タンパク質をジェネリック薬剤または薬剤候補と接触させるステップであって、標的タンパク質は、特異的様式でジェネリック薬剤または薬剤候補と相互作用する、ステップと、ｄ）表面選択的技法を使用して、非線形活性標識によって生成される第２の信号または信号変化を測定することによって、標的タンパク質とジェネリック薬剤または薬剤候補との間の相互作用を検出するステップであって、第２の信号または信号変化は、ジェネリック薬剤または薬剤候補に特異的である標的タンパク質の構造の配座変化を示す、ステップと、ｅ）第２の信号または信号変化を第１の信号または信号変化と比較し、ジェネリック薬剤または薬剤候補によって標的タンパク質において誘発される配座変化が、参照薬剤によって誘発される変化と同一または実質的に同一であるかどうかを決定するステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面受容体または抗原である。いくつかの実施形態では、参照薬剤は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。いくつかの実施形態では、ジェネリック薬剤または候補薬剤は、小分子化合物、非抗体阻害性ペプチド、抗体、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ジェネリック薬剤または薬剤候補は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。いくつかの実施形態では、ジェネリック薬剤は、バイオ後続品である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の構造の配座変化は、リアルタイムで検出される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、標的タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基によって標的タンパク質に結合される。いくつかの実施形態では、該１つ以上のスルフヒドリル基は、工学的スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識または２光子蛍光標識である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステル、バダン、およびアクリロダンから成る群から選択される、第２高調波（ＳＨ）活性標識である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である。いくつかの実施形態では、生体類似性の決定は、少なくとも第２の構造特性評価または機能分析技法から取得される構造または機能データと組み合わせて、誘発された配座変化の比較に基づいて行われる。いくつかの実施形態では、少なくとも第２の構造特性評価または機能分析技法は、円偏光二色性，Ｘ線結晶構造解析、生物学的分析、結合分析、酵素分析、細胞ベースの分析、細胞増殖分析、細胞ベースのレポータ分析、および動物モデル研究から成る群から選択される。
【００１６】
２つ以上のタンパク質サンプルを比較するための方法であって、ａ）タンパク質産生プロセスの同一のステップに関して異なる時間に、タンパク質産生プロセスの異なるステップにおいて、同一のタンパク質産生プロセスの別個の工程から、または公称上同一のタンパク質を産生する異なるタンパク質産生プロセスから収集される、２つ以上のタンパク質サンプルを提供するステップと、ｂ）光学界面の１つ以上の離散領域中で１つ以上のタンパク質サンプルからのタンパク質を繋留するステップであって、各サンプルからの繋留タンパク質は、非線形活性標識を用いて標識され、光学界面において正味の配向を有する、ステップと、ｃ）基本周波数の光を用いた非線形活性標識の照明に応じて生成される、１つ以上の繋留タンパク質サンプル毎に基準非線形光学信号を測定するステップと、ｄ）１つ以上の繋留タンパク質サンプルの測定された基準非線形光学信号を、相互と、または参照サンプルに関して測定される基準非線形光学信号と比較するステップであって、規定割合未満である、１つ以上の固定化タンパク質サンプルに関して測定される基準非線形光学信号の差異、または１つ以上のタンパク質サンプルに関して測定される基準非線形光学信号と参照サンプルのものとの間の差異は、１つ以上のタンパク質サンプルまたは参照サンプルのタンパク質が同等構造を有することを示す、ステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質サンプルは、タンパク質産生プロセスの終点において収集され、ステップ（ｄ）における比較は、タンパク質産物の品質管理に使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質サンプルは、タンパク質産生プロセスの１つ以上のステップにおいて収集され、ステップ（ｄ）における比較は、タンパク質産生プロセスの最適化に使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質サンプルは、公称上同一のタンパク質を産生する、異なるタンパク質産生プロセスから収集され、ステップ（ｄ）における比較は、生体類似性を実証するために使用される。いくつかの実施形態では、光学界面は、ガラス表面、溶融石英表面、またはポリマー表面から成る群から選択される表面を備える。いくつかの実施形態では、光学界面は、支持脂質二重層を備える。いくつかの実施形態では、支持脂質二重層はさらに、Ｎｉ／ＮＴＡ−脂質分子から成る。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質サンプルのタンパク質は、Ｈｉｓタグから成る。いくつかの実施形態では、基準非線形光学信号またはその変化は、リアルタイムで監視される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基によってタンパク質に結合される。いくつかの実施形態では、該１つ以上のスルフヒドリル基は、工学的スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識である。いくつかの実施形態では、固定化または繋留タンパク質は、それ自体がＳＨＧ活性である、ペプチド、ペプチド模倣薬、または他のリガンドとそれを接触させることによって、標識され、固定化または繋留タンパク質に結合されたＳＨＧ活性リガンドをもたらす。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステル、バダン、およびアクリロダンから成る群から選択される、第２高調波（ＳＨ）活性標識である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、１つ以上のタンパク質サンプルのタンパク質に遺伝学的に組み込まれた非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性および２光子蛍光の両方であり、ステップ（ｃ）における測定するステップはさらに、基準第２高調波信号および基準２光子蛍光信号の両方を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の比較はさらに、１つ以上の繋留されるタンパク質サンプルの２光子蛍光基準信号に対する第２高調波の比を、相互と、または参照サンプルのものと比較するステップを含み、規定割合未満の差異は、１つ以上のタンパク質サンプルまたは参照サンプルのタンパク質が同等の構造を有することを示す。繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の２光子蛍光を検出するための方法であって、（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、２光子蛍光標識によって生成される光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される、ステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、低開口数ピンホールは、励起光が平面上に入射する、平面上の点の直接上方および下方に設置される。いくつかの実施形態では、平面は、支持脂質二重層を備え、バイオ分子は、支持脂質二重層に付着される、またはその中に挿入される。いくつかの実施形態では、励起光は、全内部反射を使用して平面に指向される。いくつかの実施形態では、低開口数ピンホールは、０．０１〜０．２の開口数を有する。
【００１８】
バイオ後続薬剤候補および参照薬剤の構造同値を確立するための方法であって、ａ）同じ標識反応を使用する非線形活性標識を用いてバイオ後続薬剤候補および参照薬剤の両方を標識するステップと、ｂ）界面上に正味の配向を有するように、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤を界面に繋留するステップと、ｃ）第１の基本周波数の光を用いた照明に応じて、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤の両方に関して非線形活性標識によって生成される第２高調波光の物理的性質を測定するステップと、ｄ）随意に、第２の基本周波数の光を用いた照明に応じて、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤の両方に関して非線形活性標識によって生成される２光子蛍光の物理的性質を測定するステップと、ｅ）バイオ後続薬剤候補に関して測定される第２高調波光の物理的性質を参照薬剤のものと比較するステップであって、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関する物理的性質の統計的有意差は、それらが構造的に同等ではないことを示す、ステップと、ｆ）随意に、参照薬剤のものに対する、第２高調波光の物理的性質対バイオ後続薬剤候補に関して測定される２光子蛍光の物理的性質の比を計算するステップであって、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関して計算される比の統計的有意差は、それらが構造的に同等ではないことを示す、ステップとを含む、方法が、本明細書に開示される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１の基本周波数および第２の基本周波数は、同一である。いくつかの実施形態では、標識反応は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤上の天然官能基への非線形活性標識の共有共役を備える。いくつかの実施形態では、天然官能基は、天然アミン基、天然カルボキシル基、または天然スルフヒドリル基から成る。いくつかの実施形態では、標識反応は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤上の遺伝子操作された官能基への非線形活性標識の共有共役を備える。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された官能基は、遺伝子操作されたアミン基、遺伝子操作されたカルボキシル基、または遺伝子操作されたスルフヒドリル基から成る。いくつかの実施形態では、標識反応は、参照薬剤の特異的領域に結合することが公知である非線形活性標識ペプチドの間の非共有相互作用を備える。いくつかの実施形態では、非線形活性標識ペプチドは、モノクローナル抗体のＦＣ領域に結合することが公知であるペプチドから成る。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）部分、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（バダン）部分、または６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）部分から成る。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、同一の界面に繋留される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、異なる界面に繋留される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、界面上で固定化されるタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ分子を使用して、界面に繋留される。いくつかの実施形態では、界面は、支持脂質二重層を備え、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、支持脂質二重層に係留される、またはその中に埋め込まれる。いくつかの実施形態では、界面は、支持脂質二重層を備え、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、Ｎｉ−ＮＴＡ部分から成る二重層脂質に結合する、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグを使用して、支持脂質二重層に繋留される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグは、６ｘ−Ｈｉｓタグ、７ｘ−Ｈｉｓタグ、８ｘ−Ｈｉｓタグ、９ｘ−Ｈｉｓタグ、１０ｘ−Ｈｉｓタグ、１１ｘ−Ｈｉｓタグ、または１２ｘ−Ｈｉｓタグから成る。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、全内部反射の使用を通して第１の基本周波数の光を用いて照明される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、第１の基本周波数の励起光が界面上に入射する点において界面の直接上方または下方に位置付けられる、ピンホール開口を使用して収集される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、集光レンズを使用することなく収集される。いくつかの実施形態では、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関して測定される光の物理的性質、またはバイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関して測定される比の統計的有意差は、０．０５未満のｐ値によって示される。
【００２０】
（参照による引用）
本明細書で記述される全ての出版物、特許、および特許出願は、各個々の出版物、特許、または特許出願が、その全体として参照することによって組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同一の程度に、それらの全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。本明細書の用語と組み込まれた参照の中の用語との間の対立の場合は、本明細書の用語が優先する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の新規の特徴は、添付の請求項において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のさらなる理解が、本発明の原理が利用される例証的実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態、および付随する図面を参照することによって、取得されるであろう。
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｃは、２光子蛍光（図１Ａ）、１光子蛍光（図１Ｂ）、および第２高調波発生（図１Ｃ）に関するエネルギーレベル図の概略図を提供する。
【図１Ｂ】図１Ａ−Ｃは、２光子蛍光（図１Ａ）、１光子蛍光（図１Ｂ）、および第２高調波発生（図１Ｃ）に関するエネルギーレベル図の概略図を提供する。
【図１Ｃ】図１Ａ−Ｃは、２光子蛍光（図１Ａ）、１光子蛍光（図１Ｂ）、および第２高調波発生（図１Ｃ）に関するエネルギーレベル図の概略図を提供する。
【００２３】
【図２】図２は、（Ｘ、Ｙ、およびＺ軸によって画定されるような）研究室基準系と（Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’軸によって画定されるような）分子基準系との間の関係を図示する。いくつかの非線形活性分子に関して、超分極率テンソル（α（２））は、分子基準系内の単一の成分によって支配され得る、すなわち、α（２）＝α（２）Ｚ’Ｚ’Ｚ’である。
【００２４】
【図３】図３は、リガンドの結合によって誘発される（第２高調波活性標識、２光子蛍光標識、または他の非線形活性部分を用いて標識された）タンパク質の配座変化、およびタンパク質が付着される光学界面に関してＺ軸法線に対する標識の配向へのその影響を図示する。
【００２５】
【図４】図４は、支持脂質二重層を形成するために使用される基板表面の面積を囲繞する電極のパターン化アレイを備える、デバイスの一非限定的実施例の概略図を提供する。
【００２６】
【図５】図５は、ガラス底部マイクロプレート形式の基板に接合された、またはそれと統合された半球プリズムのアレイが、基板の頂面への励起光の良好な光学結合を提供するために使用される、表面選択的非線形光学技法を使用して、高スループット構造決定を実施するためのデバイスの一非限定的実施例の概略図を提供する。
【００２７】
【図６】図６は、非線形光学検出に基づいて、生体分子、例えば、タンパク質または他の生物学的実体の構造または配座変化を決定するための高スループット分析システムのためのシステムアーキテクチャの一非限定的実施例を図示する。
【００２８】
【図７】図７は、０．５ｍｍ直径ファイバが放射蛍光を収集するために使用される、低ＮＡ検出方式の概略図を提示する。ＴＰＦでは、蛍光は、全ての方向に放射される（薄い陰影）が、全立体角の小さい区画（濃い陰影）は、サンプルとファイバとの間の距離（７．５ｍｍ）に対するファイバ半径（０．５ｍｍ）の比が小さい、幾何学形状を使用し、それによって、低ＮＡ検出器を生成することによって、選択されることができる。
【００２９】
【図８】図８は、非線形光学検出を使用して、生体分子における構造または配座変化の分析に使用される光学設定の一非限定的実施例の概略図を示す。
【００３０】
【図９】図９は、励起光が基板の頂面において全内部反射を受けるように、適切な入射角において直接励起光を指向するためのプリズムの使用を描写する、概略図を示す。プリズムの右側の２本の鎖線は、反射励起光の光学経路および非線形活性種が表面に繋留されるときに基板表面において生成される非線形光学信号を示す。基板は、随意に、測定の合間に再配置するためのＸ−Ｙ平行移動ステージのアクチュエータに接続される。プリズムの頂面と基板の下面との間の曲線は、プリズムと基板との間の高い光学結合効率を確実にするために使用される、屈折率整合流体の薄い層（正確な縮尺ではない）の存在を示す。
【００３１】
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、基板の頂面への励起光の良好な光学結合を提供するための統合プリズムアレイを伴うマイクロウェルプレートを図示する。そのようなデバイスは、タンパク質および他の生体分子の高スループット構造決定を行う際に有用であり得る。図１０Ａ：上面不等角投影図。図１０Ｂ：底面不等角投影図。
【００３２】
【図１１】図１１Ａ−Ｂは、図１０Ａ−Ｂに示されるマイクロウェルプレートデバイスの分解図を示す。図１１Ａ：上面不等角投影図。図１１Ｂ：底面不等角投影図。
【００３３】
【図１２】図１２は、図１１Ａ−Ｂに図示される設計概念を使用して、全内部反射を介して励起光を基板表面に結合するための入射および出射光路を図示する。
【００３４】
【図１３】図１３は、本明細書に開示されるシステムの動作を制御するように構成され得る、コンピュータシステムを図示する。
【００３５】
【図１４】図１４は、本発明の例示的実施形態に関連して使用され得る、コンピュータシステムの第１の例示的アーキテクチャを図示するブロック図である。
【００３６】
【図１５】図１５は、複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話および携帯情報端末、およびネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）を伴うネットワークの一実施形態を示す、略図である。
【００３７】
【図１６】図１６は、例示的実施形態による、共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図である。
【００３８】
【図１７Ａ】図１７Ａ−Ｂは、開示される方法による、２光子蛍光（ＴＰＦ）および第２高調波発生（ＳＨＧ）測定を行うために使用される光学設定の非限定的概略図を提供する。図１７Ａ：上面図。図１７Ｂ：側面図。
【図１７Ｂ】図１７Ａ−Ｂは、開示される方法による、２光子蛍光（ＴＰＦ）および第２高調波発生（ＳＨＧ）測定を行うために使用される光学設定の非限定的概略図を提供する。図１７Ａ：上面図。図１７Ｂ：側面図。
【００３９】
【図１８】図１８は、ガウス配向分布を仮定して、２光子蛍光偏光強度比測定（緑色線）およびＳＨＧ偏光強度比測定（青色線）を適合することによって決定されるような、支持脂質二重層に繋留されたタンパク質ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のＭ１６Ｃ変異体に関して配向分布の幅と対比した平均配向傾転角のプロットを示す。２つの曲線の交差点は、一意の角度パラメータを定義する。
【００４０】
【図１９】図１９は、ガウス配向分布を仮定して、２光子蛍光偏光強度比測定（緑色線）およびＳＨＧ偏光強度比測定（青色線）を適合することによって決定されるような、１μＭのＴＭＰの存在下で支持脂質二重層に繋留されたタンパク質ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のＭ１６Ｃ変異体に関して配向分布の幅と対比した平均配向傾転角のプロットを示す。２つの曲線の交差点は、一意の角度パラメータを定義する。
【００４１】
【図２０】図２０は、実施例１に使用される全ての単一システインＤＨＦＲ変異体に関して平均配向および分布幅の角度データを表示する。配向平均角は、タンパク質の全体を通して異なる場所に設置されたときに、標識が広い範囲の角度を採用することを実証する、ＴＭＰの有無別に変異体毎に配向分布の関数としてプロットされる。
【００４２】
【図２１】図２１は、ＴＭＰの添加後の単一システイン変異体毎に配向平均角の変化および配向分布の変化を表示する。
【００４３】
【図２２】図２２は、ＤＨＦＲの２つの結晶構造のオーバーレイを示す。黄褐色の構造が、アポ形態である一方で、青色の構造は、ＭＴＸと結合される。システインと交換され得る残基が、図中で標識され、ペプチド骨格に対するそれらの側鎖の投影が、示される。２つの結晶構造の間で観察される側鎖配向の変化は、説明される方法によって予測される配向平均角および配向分布の変化と比較されることができる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、概して、バイオ分子構造および動態の決定を含む、第２高調波発生（ＳＨＧ）、和周波発生（ＳＦＧ）、差周波発生（ＤＦＧ）、および／または２光子蛍光（ＴＰＦ）を使用する、バイオ分子検出および特性評価の分野に関する。１つ以上の部位においてタンパク質または他の生体分子に付着した、非線形活性標識、例えば、ＳＨＧ標識またはＴＰＦ標識（「プローブ」とも称される）の相対および／または絶対配向を決定するため、かつそこから分子構造または配座を決定するための方法が、説明される。また、異なるサンプルから、または異なる時点における同一のサンプルに関して、タンパク質または他のバイオ分子構造の比較のための方法も、説明される。
【００４５】
本開示の第１の側面では、単独で、またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定と組み合わせて、２光子蛍光（ＴＰＦ）測定を使用して、タンパク質構造を決定するための方法、デバイス、およびシステムが、説明される。一般に、ＴＰＦを使用して、タンパク質または他のバイオ分子において構造を決定する、または配座変化を検出するための開示される方法は、（ａ）バイオ分子を平面に付着させるステップであって、バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと、（ｄ）第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、付着したバイオ分子を照明するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）における照明の結果として、２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）において検出される少なくとも光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される光の第１の物理的性質と比較し、表面の平面に対する２光子蛍光標識の配向を決定するステップとを含む。本方法の好ましい実施形態では、光の第１および第２の物理的性質は、それぞれ、表面の平面に対するｐ偏光およびｓ偏光された基本励起光の下で平面に付着し、全内部反射（ＴＩＲ）を受ける、単一部位特異的標識バイオ分子から低開口数（低ＮＡ）検出を用いて測定される、ＴＰＦまたはＳＨＧ強度であり、本好ましい実施形態のステップ（ｆ）は、ｐおよびｓ偏光励起の下で測定されるＴＰＦまたはＳＨＧ強度の比、例えば、ＲＴＰＦ＝Ｉｐ／Ｉｓを求めるステップを含み、ＲＴＰＦは、ｐ偏光またはｓ偏光励起の下のＴＰＦの強度の比を表す。
【００４６】
殆どのバイオ分子は、非線形活性標識を用いて標識され、それら自体が非線形活性にされなければならない。タンパク質等のバイオ分子に関して、タンパク質は、非線形光学活性を与えるために、２光子蛍光（ＴＰＦ）活性プローブ、第２高調波発生（ＳＨＧ）活性プローブを用いて、または随意に、ＴＰＦ活性およびＳＨＧ活性の両方であるプローブを用いて、例えば、１つ以上のアミンまたはスルフヒドリル部位（例えば、１つ以上のリシンまたはシステイン残基）において共有結合的に標識されてもよい。代替的標識方略もまた、下記でより詳細に説明されるであろうように、採用されてもよい。
【００４７】
上記のように、本開示の方法では、２光子蛍光（ＴＰＦ）測定が、タンパク質構造の決定または配座変化の検出のために、単独で、またはＳＨＧ測定技法への直交または補完的アプローチとして、使用されてもよい。ＳＨＧと異なり、ＴＰＦは、首尾一貫した方法ではなく、したがって、信号を生成するために標識分子の正味の平均配向を要求しない。いくつかの実施形態では、非線形光学信号測定の比、例えば、ＳＨＧ対ＴＰＦ信号比が、タンパク質構造決定または配座変化の検出に利用されてもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、開示される方法の照明（励起）ステップは、少なくとも１つの基本周波数の励起光の偏光を調節するステップを含んでもよい。他の実施形態では、励起光の周波数は、実験の間で変動され得る。いくつかの実施形態では、下記でより詳細に議論されるであろうように、ＴＰＦおよび／またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定を実施するために使用される励起光は、表面から完全に内部反射されるような方法で表面に指向される。いくつかの実施形態では、励起光の第１の偏光状態は、その入射面に対するｐ偏光を備え、励起光の第２の偏光は、その入射面に対するｓ偏光を備える。
【００４９】
いくつかの実施形態では、（単独で、またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定と組み合わせて）ＴＰＦ測定を使用する、標識バイオ分子における構造パラメータ、配座状態の決定、および／または配座変化の検出は、非線形光学信号の物理的性質または物理的性質の変化（例えば、信号強度または偏光の変化）、または非線形光学信号の物理的性質の比または比の変化（例えば、ＳＨＧ対ＴＰＦ信号強度の比）を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、光の第１の物理的性質は、標識バイオ分子をリガンドと接触させること、またはそれにある他の環境変化を受けさせることに先立って測定され、少なくとも第２の物理的性質は、標識バイオ分子をリガンドと接触させた、またはそれにある他の環境変化を受けさせた後に測定される。いくつかの実施形態では、光の少なくとも第２の物理的性質は、光の第１の物理的性質と同一である。いくつかの実施形態では、光の少なくとも第２の物理的性質は、光の第１の物理的性質と異なる。いくつかの実施形態では、複数の測定が、行われてもよく、励起光または検出された光の偏光、規模、または強度、またはそれらの任意の組み合わせは、変動される。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、タンパク質分子（または他のバイオ分子）の構造モデルに、タンパク質のための構造的制約を提供するＸ線結晶構造解析データ、ＮＭＲデータ、または他の実験データを組み込むステップを含む。
【００５０】
本明細書に開示されるＴＰＦベースの方法の第１の主要構成要素は、ＴＰＦ信号が全内部反射（ＴＩＲ）励起を使用して生成されることである。ＴＩＲ励起は、２つの重要な利点を有し、すなわち、（ｉ）十分に決定された直交偏光状態（ｐおよびｓ）を生じ、（ｉｉ）標識タンパク質が繋留される表面に隣接する薄いエバネセント領域（約１００ｎｍ）中のみでＴＰＦを生成する。両方の利点は、単純化された理論的分析およびプローブ（または標識）についての角度情報を計算する際の有意に少ない誤差につながり、これは、タンパク質等の標識バイオ分子の正確な構造測定のために重要である。前述で説明されたＴＰＦ作業の大部分は、表面の平面に対して法線であるビームによる励起を伴う、落射蛍光顕微鏡法を採用している。落射蛍光顕微鏡法は、撮像のために便宜的であるが、背景ＴＰＦ発生、および傾転角および他の配向情報の分析の有意な不確実性につながる。そのような構造分析に関して、高い信頼度を持って、放出された光子に関する光学システムの収集効率を把握することが要求される。また、落射蛍光励起を使用するときに、ｚ方向の偏光成分（ｐ偏光）を用いて繋留された標識分子を励起させることは可能ではない。
【００５１】
本明細書に開示されるＴＰＦベースの方法の第２の主要構成要素は、測定された蛍光強度をプローブ配向分布に関連させるために、レンズ開口数（ＮＡ）の詳細かつ精細な知識を要求するであろうため、（顕微鏡法の場合と異なり）レンズを使用することなく、２光子蛍光が収集されることである。むしろ、開示される方法は、励起光が集束される点の直接上方または下方のいずれかに位置付けられ、サンプル平面と平行に配向される（すなわち、焦点を通過する表面に対して法線である軸（ｚ軸）上で心合される）低ＮＡピンホールを利用する。ピンホールを通過する光は、次いで、光電子増倍管または他の好適な検出器を使用して、検出されてもよい。故に、本発明の主要な目的のうちの１つは、ピンホールが励起の点においてサンプルの直接上方または下方に位置付けられる、ＴＩＲ励起および低ＮＡピンホール検出を採用することによって、プローブ配向分布の高正確度測定を可能にする（それによって、タンパク質構造および配座についての情報を推測する）ことである。
【００５２】
開示されるＴＰＦベースの方法の第３の主要構成要素は、単層、支持脂質二重層膜等を用いて起こるように、バイオ分子が単一の平面に実質的に限定される、平面サンプル形式の使用である。本発明の本特徴は、分析を大いに単純化することと、従来技術の方法と比較して有意により高い正確度で、（例えば、ガウス分布を仮定して）平均傾転角および配向幅等の配向情報の決定を可能にすることとの両方を行う。
【００５３】
最後に、開示されるＴＰＦベースの方法の第４の主要構成要素は、特に、角度情報が所望される場合に関して、例えば、ガウス分布を仮定して、約３５度以下である標準偏差を有する平均傾転角を伴って、表面に対するその配向において比較的に狭く分配される着目バイオ分子内に組み込まれる、少なくとも１つのＴＰＦ活性プローブの使用である。下記の実施例で実証されるように、６Ｘ  Ｈｉｓタグを介して、タンパク質を、捕捉剤、Ｎｉ−ＮＴＡ脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−３−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）から成る、支持脂質二重層に繋留することによって、プローブの比較的に狭い配向分布を達成することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＴＰＦ測定に基づく構造決定は、単独で、またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定と組み合わせて、実験条件の２つ以上の異なるセットの下で測定を実施することによって、促進されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質（または他のバイオ分子）は、Ｈｉｓタグを使用して、表面または支持脂質二重層に付着される。いくつかの実施形態では、実験条件の第１のセットは、タンパク質のＮ末端に付着したＨｉｓタグを使用して、タンパク質分子を繋留することを含み、実験条件の少なくとも第２のセットは、Ｃ末端に付着したＨｉｓタグを使用して、タンパク質分子を繋留することを含む。代替として、いくつかの実施形態では、実験条件の第１のセットは、第１の分析緩衝剤の存在下で（または繋留タンパク質を第１の分析緩衝剤に暴露して）タンパク質分子を繋留することを含んでもよく、実験条件の少なくとも第２のセットは、第１の分析緩衝剤と異なる少なくとも第２の分析緩衝剤の存在下で（または繋留タンパク質を少なくとも第２の分析緩衝剤に暴露して）タンパク質分子を繋留することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記のように、実験条件の第１のセットと実験条件の少なくとも第２のセットとの間の差異は、繋留タンパク質分子を、タンパク質分子に結合し、その中で配座変化を誘発することが公知である少なくとも第１のリガンドと接触させることを含んでもよい。単独で、またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定と組み合わせて、ＴＰＦ測定に基づく構造決定を促進するために使用され得る、実験条件の異なるセットの非限定的実施例が、下記でより詳細に説明されるであろう。異なる実験条件を使用する目的は、配向分布が研究室基準系内で変動されるサンプルを産生し、したがって、所与の部位において標識されるバイオ分子に関して、すなわち、表面法線軸（ｚ軸）上のプローブ遷移双極子モーメントの異なる投影を伴って、角度測定の独立したセットを提供する。これは、バイオ分子の基準系内の配座分布（景観）を決定するためのより多くの方程式を可能にする。
【００５５】
本開示の別の側面では、異なるサンプルから、または異なる時点における所与のサンプルからのタンパク質構造の比較のためのＳＨＧまたは関連非線形光学基準信号（例えば、ＳＦＧおよびＤＦＧ基準信号）の使用が、説明される。一般に、これらの方法は、（ｉ）同じ標識反応および反応条件を使用して、非線形活性標識を用いて１つ以上のサンプル中のタンパク質を標識するステップと、（ｉｉ）界面上に正味の配向を有するように、標識タンパク質を界面（例えば、基板表面）に繋留するステップと、（ｉｉｉ）基本周波数の光を用いた照明に応じて、非線形活性標識によって生成される光の物理的性質を測定するステップと、（ｉｖ）異なるサンプルに関して測定される、または異なる時点において所与のサンプルに関して測定される、非線形光学信号を比較するステップとを含んでもよい。そのような基準信号測定は、例えば、（ｉ）精製タンパク質の異なるロット間でタンパク質構造を比較するように、（ｉｉ）タンパク質産物の発現、産生、および／または精製のためのバイオリアクタまたは製造プロセスの中の異なるステップにおいてタンパク質構造変動を監視するように、または（ｉｉｉ）タンパク質を異なる試薬と接触させること、またはそれに異なる実験条件を受けさせることに応じて、タンパク質安定性を監視するように、実施されてもよい。本アプローチは、非線形活性部分を用いて標識されるタンパク質の変性の程度の測定値として、基準ＳＨＧまたは他の非線形光学信号の変動を利用する。いくつかの実施形態では、これらの比較は、ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ基準信号の測定のみに依拠してもよい。好ましい実施形態では、これらの比較は、同一のサンプルに関して測定されるＴＰＦ基準信号に対するＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ基準信号の比を使用して、行われてもよく、ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ基準信号、およびＴＰＦ基準信号は、同時または連続的に測定される。ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ基準信号対ＴＰＦ基準信号比の使用は、ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ基準信号を正規化し、表面選択的様式で非線形活性標識を励起させるために使用される、ウェル間または実験間に存在し得る、基板に繋留された標識タンパク質分子の表面密度の変動を補正することを可能にする。そのような構造比較は、限定ではないが、生物学的薬剤のためのタンパク質安定性の監視、製造プロセス監視および品質管理、および生物学的薬剤候補と参照薬剤との間の生体類似性の実証を含む、種々の創薬および薬剤開発用途（および他の分野）で潜在的有用性を有する。
【００５６】
バイオ分子構造／配座を決定するため、かつ２つ以上の異なるサンプルに関して、または異なる時点における同一のサンプルに関してバイオ分子構造を比較するための開示される非線形光学方法に加えて、開示される方法の実施および／または分子配向または分子構造の分析のための高スループット形式でのそれらの実装を促進する、デバイスおよびシステムが、説明される。本開示のいくつかの側面では、方法、デバイス、およびシステムが、生体分子を１つ以上の試験分子（例えば、既知のリガンド、候補結合パートナ、および／または薬剤候補）と接触させることに応答して、生体分子の配向、配座、構造、または配向、配座、または構造の変化を決定するために説明される。本開示のいくつかの側面では、方法、デバイス、およびシステムが、生体分子に実験条件の２つ以上の異なるセットを受けさせることに応答して、生体分子の配向、配座、構造、または配向、配座、または構造の変化を決定するために説明される。本明細書で使用されるように、生体分子配向、配座、構造、またはその変化を決定することは、非線形活性標識またはタグの平均配向に比例し、表面に繋留された標識生体分子の表面密度にも比例し得る、少なくとも１つの非線形光学信号の測定を伴ってもよい。本明細書で使用されるように、「高スループット」は、随意に、１つ以上の既知のリガンド、候補結合パートナ、および／または薬剤候補と接触される、複数のバイオ分子の分子配向、配座、構造、またはその変化の（例えば、結晶学的構造決定に対して）高速分析を実施する能力、または随意に、多くの複数の既知のリガンド、候補結合パートナ、および／または薬剤候補と接触される、１つ以上の生体分子の分子配向、配座、構造、またはその変化の高速分析を実施する能力、またはこれらの様相の任意の組み合わせを指す。
【００５７】
定義：別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別様に明確に決定付けない限り、複数の指示対象を含む。本明細書の「または」の任意の言及は、別様に記述されない限り、「および／または」を包含することを意図している。
【００５８】
生体分子：主にタンパク質サンプルの特性評価との関連で説明されるが、当業者は、開示される非線形光学方法が、有利なこととして種々の他のタイプのバイオ分子の構造および配座特性評価に利用され得ることを認識するであろう。本明細書で使用されるように、用語「生体分子」、「バイオ分子」、またはある場合には「生物学的実体」は、限定されないが、タンパク質、タンパク質ドメインまたはサブドメイン、ペプチド、受容体、酵素、抗体、抗体断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマ、小分子、合成分子、炭水化物、またはある場合には、細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生体分子は、薬剤標的またはその部分から成ってもよく、「標的タンパク質」または「標的分子」と称され得る。本開示のいくつかの好ましい実施形態では、標的分子は、タンパク質、またはそのサブユニット、サブドメイン、または断片である。いくつかの好ましい実施形態では、標的タンパク質は、生物学的薬剤候補（バイオ後続薬剤候補）および／または参照薬剤である。
【００５９】
試験分子：同様に、用語「試験分子」、「試験化合物」、「候補結合パートナ」、「薬剤候補」、またはある場合には「試験実体」は、限定ではないが、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマ、生体分子、オリゴヌクレオチド、緩衝剤、溶媒、小分子、合成分子、炭水化物、またはある場合には、細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、試験分子は、既知のリガンド、薬剤候補、またはその部分から成ってもよい。本開示のいくつかの好ましい実施形態では、薬剤候補は、他のタンパク質、またはそのサブユニット、サブドメイン、または断片である。いくつかの好ましい実施形態では、薬剤候補は、生物学的薬剤候補（例えば、バイオ後続薬剤候補）である。
【００６０】
生物製剤：本明細書で使用されるように、用語「生物製剤」（「生物学的製剤」または「生物学的治療薬」とも称される）は、種々の天然源（例えば、ヒト、動物、または微生物）から単離される、または遺伝子工学および他の生物工学技術方法によって産生され得る、製剤を指す。生物製剤は、糖類、タンパク質、タンパク質断片、核酸、またはこれらの物質の複雑な組み合わせから成ってもよい、または臨床診断または治療用途を有する細胞（および組織）等の生体から成ってもよい。
【００６１】
バイオ後続品：本明細書で使用されるように、用語「バイオ後続品」（または「バイオ後続製剤」）は、それが規制当局の承認を受容した生物学的製剤（「参照製剤」として公知である）に極めて類似し、安全性および有効性の観点から参照製剤と臨床的に有意義な差がないという提示に基づいて承認される、生物学的製剤を指す。したがって、バイオ後続品は、既存の生物学的薬剤のジェネリックバージョンである。バイオ後続薬剤候補（または生物学的薬剤候補）は、まだ承認されていない生物製剤である。
【００６２】
参照薬剤：本明細書で使用されるように、用語「参照薬剤」（または「参照製剤」）は、それらが生物学的均等物であることを示すように新しいジェネリックバージョンが比較される、承認された薬剤製品（例えば、小分子薬剤または治療モノクローナル抗体等の生物製剤）を指す。
【００６３】
参照サンプル：本明細書で使用されるように、用語「参照サンプル」は、異なる時点で調製された、または異なる産生プロセスまたは産生ロットからのタンパク質を使用して調製されたタンパク質（または他のバイオ分子）サンプルを指す。公称上、研究されるタンパク質および参照サンプルのタンパク質は、同一のアミノ酸配列を有する。
【００６４】
角度パラメータ：本明細書で使用されるように、用語「角度パラメータ」は、表面法線に対するプローブの平均傾転角、平均傾転角の周囲の配向分布幅、すなわち、本明細書で定義されるような（φ，σ）、平均傾転角および配向分布幅の一対の組み合わせ、２つの異なる偏光において測定されるＴＰＦ、ＳＨＧ、ＤＦＧ、ＳＦＧの強度の比（例えば、ｓおよびｐ偏光強度の比）、または任意の他の角度パラメータ、具体的偏光における光の励起の下で測定される光の強度、またはプローブの角度パラメータを特性評価するために当業者に公知である、検出された光または励起光のいずれかの異なる周波数、偏光、または他の物理的性質において行われる強度測定の組み合わせを指す。
【００６５】
非線形光学技法：本明細書で使用されるように、用語「非線形光学技法」は、第２高調波発生、和周波発生、差周波発生、および／または２光子蛍光を含む。第２高調波発生は、基本周波数における励起光の２つの光子が、非線形材料または分子と相互作用し、励起光子のものと等しいまたは２倍のエネルギーを有する、すなわち、励起周波数のものの２倍である周波数を有する、単一の光子として再放出または散乱される、非線形光学プロセスである。和周波発生は、異なる励起波長または周波数の２つの光子が、非線形材料または分子と相互作用し、２つの励起光子のものの総和に等しいエネルギーを有する、すなわち、２つの励起周波数の総和に等しい周波数を有する、単一の光子として再放出または散乱される、非線形光学プロセスである。差周波発生は、異なる励起波長または周波数の２つの光子が、非線形材料または分子と相互作用し、２つの励起光子のものの差異に等しいエネルギーを有する、すなわち、２つの励起周波数の差異に等しい周波数を有する、単一の光子として再放出または散乱される、非線形光学プロセスである。本開示の全体を通して、用語「ＳＨＧ」、「ＳＦＧ」、および「ＤＦＧ」は、当業者によって理解されるであろうように、同義的に使用されてもよい。２光子蛍光は、同一の励起波長または周波数の２つの光子が、非線形材料または分子と相互作用し、材料または分子によって吸収され、その後に、より高いエネルギーを有する、すなわち、励起光子よりも高い周波数および短い波長を有する、単一の光子としての放出が続く、非線形光学プロセスである。
【００６６】
非線形活性：本明細書で使用されるように、用語「非線形活性」は、第２高調波活性（ＳＨ活性またはＳＨＧ活性）、和周波数活性（ＳＦ活性またはＳＦＧ活性）、差周波数活性（ＤＦ活性またはＤＦＧ活性）、または２光子蛍光活性（ＴＰＦ活性）である、すなわち、適切な波長、強度、および位相の光への暴露に応じて、それぞれ、第２高調波光、和周波数光、差周波数光、または２光子蛍光を生成することが可能である、分子、標識、またはタグを指す。ＴＰＦ測定、および随意に、併せてＳＦＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定を採用する、種々の方法が、開示される。ある場合には、分子、標識、またはタグは、適切な波長、強度、および位相の光への暴露に応じて、第２高調波光と、例えば、２光子蛍光との両方を放射するように、非線形活性であり得る。
【００６７】
２光子蛍光を使用する、分子配向、配座、および構造の検出：２光子蛍光（図１Ａ）は、より広く使用されている１光子蛍光ベースの技法（図１Ｂ）とは対照的に、同一の励起波長または周波数の２つの光子が、非線形材料または分子と相互作用し、材料または分子によって吸収され、その後に、より高いエネルギーを有する、すなわち、励起光子よりも高い周波数および短い波長を有する、単一の光子としての放出が続く、非線形光学プロセスである（図１Ａ）。本明細書で使用されるように、用語「非線形光学プロセス」は、２光子蛍光、第２高調波発生、和周波発生、または差周波発生を指し得る。一般に、非線形光学プロセスは、少なくとも１つの基本周波数の励起光を用いて非線形活性標識を照明することによって励起される。
【００６８】
２光子蛍光は、２光子活性プローブ（分子）が付着される表面の平面への法線に対する２光子遷移双極子モーメント（ＴＤＭ）の角度φ、および励起光の偏光と表面の平面法線との間の角度θに依存する。測定されたＴＰＦの強度を統制する方程式は、したがって、低ＮＡピンホール検出の限界では、
【化２】
2020519866.tif 000004
として書かれることができ、式中、Ｉｏは、最大強度であり、ｆは、励起光を基板表面に結合するために使用されるプリズム表面上の強度の損失を構成する定数（既知の値）であり、以下のＴＰＦ順序パラメータは、
【化３】
2020519866.tif 000005
として定義され、研究中のサンプル中のプローブ（ＴＰＦ活性）分子の配向分布にわたって起こる積分を伴う確率密度関数の三角モーメントである。
【００６９】
励起光の２つの異なる偏光を使用してＴＰＦ測定を行い、測定された強度の比を求めることによって、方程式（１）は、測定された強度と平均傾転角φとの間の以下の関係を生じさせるように再配列されることができ、
【化４】
2020519866.tif 000006
式中、Ｉｐは、Ｐ偏光を使用して測定されるＴＰＦ信号であり、Ｉｓは、Ｓ偏光を使用して測定されるＴＰＦ信号であり、括弧（＜＞）は、平均値を表す。
【００７０】
ＳＨＧおよび他の表面選択的技法を用いた場合と異なり、ＴＰＦ背景信号は、背景信号からＳＨＧプローブのみの信号を解析するために要求されるように、それらの間の位相を決定する必要なく、着目バイオ分子に付着したプローブから生じるＴＰＦ信号を決定するように、リガンドの存在または非存在下のいずれかで、単純に全ＴＰＦ信号から直線的に減算されることができる。これは、タンパク質がない場合にリガンドが背景信号に有意な影響を及ぼす、選別分析において、リガンドが真のリガンドまたは偽陽性であるかどうかを決定するという厄介な問題への有益な解決策を提供する。ＳＨＧを用いると、タンパク質のみの信号が、全信号および背景信号からデコンボリューションされなければならず、これは、多くの場合、不明または不確実である、異なる信号の間の相対位相の知識を要求する。ＴＰＦを用いると、全信号と背景信号との間の差異は、タンパク質のみの信号を直接生じさせる。したがって、ＴＰＦを使用して構造または配座変化を監視することによって、タンパク質のみの信号上でリガンドによって生成される正味の変化は、リガンドが真陽性であるかどうかを解明するために決定されることができる。真陽性であり、タンパク質への特異的結合に応じて配座変化を誘発する、化合物またはリガンドは、背景表面のみの上で生成する任意の変化に対して、ＴＰＦ信号の正味の変化を呈するであろう。
【００７１】
ＴＰＦおよびＳＨＧが配向分布への異なる順序依存性を有するため、それらは、検出様相（例えば、ＴＰＦおよび／またはＳＨＧ）、タンパク質サンプル、標識部位等が、基本分子配向分布の角度測定を取得するように変動される、１つの実験または別個の実験のいずれかで使用され得る、２つの独立した方程式を提供する。
【００７２】
ここで、ＴＰＦの使用が、例えば、標識生体分子についての付加的配向情報を取得するように、具体的実施形態で開示される。ＴＰＦ測定は、例えば、標識生体分子が繋留される表面への法線に対するＴＰＦおよび／またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ標識の平均傾転角の値を取得するために、単独で、またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定と組み合わせて、使用されてもよい。ＴＰＦは、標識（またはプローブ）の傾転角へのそのより高い順序依存性に起因して、１光子蛍光と比較して標識生体分子の配向分布に対して増進した角度感度を有する。また、ピンホールまたは低ＮＡ検出方式の場合、集光レンズがない場合に、着目サンプルの直接上方または下方で、表面に対して法線である軸に沿って設置される検出器を用いると、ＴＰＦ感度は、係数ｓｉｎ２φだけ増進される。本付加的感度は、双極パターンで放射状に広がるはずである、プローブ分子の放出パターンから生じる。ＴＰＦ信号の検出は、２つの別個のプロセスに依拠し、すなわち、２つの光子が、プローブ分子によって吸着されなければならず、単一の光子が、放出されなければならない。吸収プロセスでは、光子吸着効率は、傾転角φに依存する。同様に、放出プロセスでは、検出器に向かって放出される光子の割合もまた、傾転角φに依存する。プローブ分子の直接上方で表面に直交して位置付けられる検出器を用いた低ＮＡの限界では、検出器によって検出される光子の割合は、ｓｉｎ２φとともに変動する。故に、ＴＰＦ発生および構造または配座変化の検出を伴う本開示の好ましい実施形態は、低ＮＡピンホール検出アプローチを使用する。
【００７３】
繋留プローブ分子の配向分布が極めて広い（例えば、＞３５度）場合、ＴＰＦは、ＳＨＧよりもはるかに角度変化に対して感受性が低い傾向がある。例えば、対物または集光レンズがない場合に低ＮＡ検出によって提供されるｓｉｎ２φ増進の有無別に、平均傾転角に対するＴＰＦ測定の感度を開示する、表面に繋留されたＴＰＦおよびＳＨＧ活性プローブのガウス分布に関する平均傾転角および幅（標準偏差）の仮定値の計算の結果が、下記に説明される。
【００７４】
ＴＰＦ測定のための低ＮＡピンホール検出形式の使用：全内部反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）として公知である技法と異なり、本明細書に開示される方法は、ＴＩＲ条件を生成するために高ＮＡ対物レンズを要求しない。故に、プリズムが、ＴＩＲ励起を実装するために使用されてもよく、ＴＰＦが、サンプル平面の上方または下方のいずれかで検出される。好ましい実施形態では、本プリズム／ＴＩＲ励起光学配列は、平面的サンプル、例えば、ＴＰＦ活性プローブを用いて標識される着目バイオ分子が付着される支持脂質二重層膜、およびサンプル平面内の焦点の直接上方または下方のいずれかで心合される低ＮＡピンホール検出器と組み合わせて、使用される。本好ましい実施形態では、着目サンプルは、当業者に周知であるように、例えば、液浸油または光学的結合接着剤を使用して、それ自体が下方のプリズムに光学的に結合される、ガラス表面（すなわち、光学界面）上で繋留または固定化される。重要なこととして、サンプル平面内で分子によって放射される蛍光は、レンズを通過しないが、代わりに、液体ベースまたは別様に空気である場合に、潜在的にサンプルの体積を通して上向きにサンプル平面から、またはプリズムを通して下向きにサンプル平面からのいずれかで、通過するにつれて、検出器によって検出される。好ましい実施形態では、着目サンプルは、サンプル平面内に等方様式で（すなわち、方位角によって）分配される、またはそれらの配向分布の分析の中にあると仮定される、繋留または固定化分子から成る。さらに、高度な偏光純度を確実にするために、別の好ましい実施形態は、光が全内部反射角で本質的にコリメートされ、事実上、軸外偏光が存在しないように、励起光を非常に狭い円錐角に集束することを含む。例えば、一実施形態では、４ｍｍ直径のレーザビームが、１６０ｍｍの距離にわたって５０μｍ直径のスポットに集束され、それによって、約１．５度、または臨界角を約０．８度上回る、かつ下回る全円錐角をもたらす。
【００７５】
異なる検出方式の下の２光子蛍光感度分析：平均角度および分布幅に対するＴＰＦの感度を例証するために、同一の分布幅を伴って平均角度５°離れるように変化させる際に、所与の平均角度および分布幅におけるＴＰＦ強度変化の規模を決定するように、計算が実施された（例えば、ガウス分布を仮定して）。下記の計算は、レーザの電場が表面法線と垂直である（ｓ偏光）ときの信号の予期される変化を推定する。サンプルの直接上方または下方に位置付けられる表面法線と平行な検出器に関して、ＴＰＦからの検出された光子の数は、高ＮＡの場合は＜ｓｉｎ４φ＞、低ＮＡの場合は＜ｓｉｎ６φ＞としてスケーリングするべきである。
【００７６】
ガウス分布にわたる（ＴＰＦに関する）方程式（２）または（ＳＨＧに関する）方程式（６）の積分は、方程式を満たす傾転角および分布幅対を決定するように、以下の方程式を使用して実施されることができる。方程式（２）および（６）の中の括弧＜ｆ（φ）＞は、ガウス分布によって乗算される式ｆ（φ）の０〜πの傾転角φにわたる正規化された積分を示し、
【化５】
2020519866.tif 000007
式中、φ０は、平均角度であり、σは、分布幅である。ガウス関数が無限範囲を有し、積分が０〜πの間で評価されるため、ガウス分布は、ＳｉｍｐｓｏｎおよびＲｏｗｌｅｎ（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｗｌｅｎ  （１９９９），  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１：２６３５−２６３６）によって概説される手順に従って、−４π〜４πの間の全ての寄与を総和することによって、積分の中に「折り畳まれた」。これは、最大７０°の分布幅に関して有効である積分を生じるであろう。計算の結果は、表１の中で要約される。
【表１】
2020519866.tif 000008
【００７７】
表１の中で要約される結果から、可能性として考えられる値の範囲を横断する平均角度および分布幅の値に関して、低ＮＡ検出アプローチ（すなわち、レンズの使用を伴わない）が、角度変化に対する感度の有意な増加を提供することが分かり得る。
【００７８】
また、これらの計算から、２光子活性プローブの配向分布が狭い（≦２５°）場合、平均傾転角に対するＴＰＦ測定の感度が、ＳＨＧのものに接近することも発見される。例えば、３０°の平均角度および１５°の幅において、ＳＨＧ信号は、１０％だけ変化し、幅が１５°において同一のままで、３２°の角度になり、同一の初期および最終状態に関して、レンズを伴わない低ＮＡ検出を用いたＴＰＦは、１５％だけ変化する。同様に、２０°の平均角度および２５°の幅に関して、ＳＨＧは、１８％だけ変化し、２５°の平均角度および２５°の幅になり、低ＮＡ検出を用いたＴＰＦは、２４％だけ変化する。故に、本発明の主要側面および１つの好ましい実施形態は、外部から付着したプローブ、色素、または非天然アミノ酸、または遺伝学的に組み込まれた非天然アミノ酸または他の標識を含有する、少なくとも１つのサンプル（例えば、タンパク質サンプル）の使用を伴い、測定されたプローブ配向分布は、２５°（度）以下である幅を有する。
【００７９】
ＴＰＦ遷移双極子モーメント（ＴＤＭ）、随意に、ＳＨＧχ（２）、およびタンパク質構造への関係の測定：一般に、開示される方法、デバイス、およびシステムは、分子配向、配座、構造、またはその変化の決定のために、２光子誘発蛍光（ＴＰＦ）、随意に、第２高調波発生（ＳＨＧ）、または和周波発生（ＳＨＧ）または差周波発生（ＤＦＧ）の関連非線形光学技法の使用に依拠し得る。これらの方法では、偏光依存性測定が、２光子吸収遷移の遷移双極子モーメント（ＴＤＭ）の成分（または下記で議論されるように、ＳＨＧおよび関連非線形光学技法のための超分極率χ（２）の成分）を決定するために、使用される。ＴＰＦ強度またはＳＨＧのためのχ（２）の成分の値は、少なくとも１つの基本周波数の偏光された励起光を使用して、研究室基準系において測定されてもよい。いくつかの光源、例えば、いくつかのレーザは、実質的に偏光される基本周波数の光を生成する。いくつかの実施形態では、励起光の偏光は、１つ以上の光学偏光子、波長板等を使用して、さらに定義および／または調節されてもよい。典型的には、偏光の入射面（すなわち、励起光の伝搬方向および基板または反射表面の平面と垂直なベクトルによって定義される平面）は、図２に図示される研究室座標系のＸ−Ｚ平面であろう。入射面と平行なその電場ベクトルを有する、偏光は、ｐ偏光と呼ばれる。入射面と垂直なその電場ベクトルを有する、偏光は、ｓ偏光と呼ばれる。いくつかの実施形態では、非線形活性部分の励起によって生成される、検出された第２高調波光の偏光はまた、１つ以上の光学偏光子、波長板等を使用して、定義および／または調節されてもよい。上記で概説されるように、励起光の少なくとも２つの異なる偏光を使用して、２光子蛍光強度を測定することによって、標識の相対配向についての結果として生じる情報を使用し、タンパク質構造のモデルを作成し、単独で２光子蛍光を、またはＳＨＧ測定または関連非線形光学測定技法と併せて２光子蛍光を使用して、その変化を検出することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＴＰＦが、ＳＨＧ測定と組み合わせて使用され、バイオ分子についての構造情報を取得する目的のために、ひいては表面に繋留される、バイオ分子に付着したプローブについての付加的配向情報を取得するために、励起光の１つ以上の偏光において検出される。例えば、ＴＰＦが、ＳＨＧと異なるプローブ配向の順序パラメータに依存するため、２つの別個の配向パラメータ、例えば、プローブ分子のガウス分布の平均および幅について同時に解法することを可能にする、独立方程式を提供する。好ましい実施形態では、ＴＰＦ信号の検出は、下記に説明されるような低ＮＡまたはピンホール検出装置を使用して遂行され、プローブ配向へのさらに高い順序依存性をもたらし、したがって、感度を増進する。いくつかの実施形態では、ＳＨＧおよびＴＰＦによって決定される角度測定の最高の信頼度は、プローブおよびバイオ分子が比較的に狭い配向分布内で表面に繋留されるときに起こり、バイオ分子内の少なくとも１つのプローブ場所に関して、ガウス分布を仮定して、複合ＳＨＧおよびＴＰＦ測定によって決定されるようなプローブの角度分布は、３５度またはそれ未満（≦３５°）の配向分布幅をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳＨＧおよびＴＰＦによって決定される角度測定への最高の信頼度は、標識バイオ分子の繋留が、３０°以下である、２５°以下である、または２０°以下である比較的に狭い配向分布幅をもたらすときに起こる。いくつかの実施形態では、標識またはプローブは、ＴＰＦ活性であり、随意に、ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ活性でもあり、例えば、非線形活性非天然アミノ酸の組み込み等の当業者に公知である技法を使用して、タンパク質等の着目バイオ分子内の特異的部位において組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、そのようなプローブは、単一のバイオ分子構築物内の単一の部位において組み込まれることができる一方で、他の実施形態では、２つ以上のプローブは、単一のバイオ分子構築物内の複数の部位において組み込まれる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＴＰＦは、標識バイオ分子が表面に付着されるかどうかを解明するために、ＴＰＦ活性プローブを用いて標識されるバイオ分子から測定され、これは、ＳＨＧプローブの正味の平均配向が表面法線に対して比較的に平坦である場合、信号が比較的に小さいであろう一方で、同一のサンプルが、概して、対応して高いＴＰＦ信号を生成するであろうため、常にＳＨＧ測定を使用して明白であるとは限らない。したがって、ＴＰＦ活性およびＳＨＧ活性の両方であるプローブ群によって生成される信号の量は、理論的背景において下記でより詳細に説明されるように、２つの技法において反相関する傾向がある。
【００８２】
いくつかの実施形態では、バイオ分子は、ＳＨＧ活性のみまたはＴＰＦ活性のみであるプローブを用いて標識されてもよく、各実験の測定は、他方と比較されてもよい。ある場合には、バイオ分子が、１つの部位において標識されてもよい一方で、他の実施形態では、ＳＨＧおよびＴＰＦ活性の両方である、一意の単一部位においてプローブをそれぞれ担持する、バイオ分子の多くの異なるバージョンが、作成される。他の実施形態では、ｉ）ＴＰＦ活性またはｉｉ）ＳＨＧ活性（またはＳＦＧまたはＤＦＧ活性）のいずれかである、一意の単一部位においてプローブをそれぞれ担持する、バイオ分子の異なるバージョンが、作成される。
【００８３】
スループット、感度、非生理学的条件の使用、本技法に適したタンパク質のサイズ等の要因に起因して、創薬用途のための価値が限られている、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ方法から構造情報を取得することは、困難であり得る。したがって、本発明の別の側面は、タンパク質または他のバイオ分子中の機能的に関連性がある部位における配座の部位特異的読み出しを提供することである。本明細書で定義されるような「機能的に関連性がある」タンパク質部位は、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、またはＳＨＧ等の構造技法によって決定されるように、結合パートナ（例えば、エフェクタ分子）と直接または間接構造接触を行う、任意の部位を含む。直接構造接触は、任意のアミノ酸または他の構造残基として定義され、そのある部分は、結合パートナ分子のある部分の２ｎｍ以内にある。間接構造接触は、任意のアミノ酸または他の構造残基として定義され、そのある部分は、結合パートナ、模倣体、または類自体がない場合のその配向、配座、または相対座標に対して、Ｘ線、ＮＭＲ、またはＳＨＧ等の構造技法によって見られるような、結合パートナ（例えば、エフェクタ分子）、または結合パートナ模倣体または類自体の結合に応じて、その配向、配座、または相対座標を変化させる。用語「機能的に関連性がある」はまた、非構造手段による結合分子の結合または変調（例えば、活性化、阻害、調整等）において重要であることが公知である残基を含む（例えば、特定の残基が結合パートナの結合または変調のために重要であることを示す、突然変異生成または生化学データ）。
【００８４】
いくつかの実施形態では、開示される方法を使用して取得される、ＴＰＦ構造データ、随意に、ＳＨＧ構造データは、タンパク質結晶学的研究、ＮＭＲ研究、ＵＶ−Ｖｉｓおよび蛍光分光研究、円偏光二色性研究、架橋結合実験、小角度Ｘ線散乱研究等からの構造データとオーバーレイされる、または組み合わせられてもよい。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、１つ以上の非線形活性標識の相対配向のデータをタンパク質分子の構造モデルに大域的に適合させるステップを含み、構造モデルは、タンパク質分子内の１つ以上の非線形活性標識の既知の位置に基づく。随意に、付加的構造測定または制約が、そのようなモデル、例えば、Ｘ線、ＮＭＲ測定、または他の実験測定からのデータを決定する際に採用されることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＴＰＦおよび／またはＳＨＧ信号測定は、下記で議論されるように、種々の実験条件下で実施されてもよく、異なる実験条件は、光学界面に繋留された標識分子の配向分布の変化をもたらす。研究室基準系内の異なる基本配向分布に起因して、ＴＰＦ遷移双極子モーメント、随意に、ＳＨＧχ（２）の測定値の異なるセットにつながる、実験条件の各セットは、傾転角φの独立した測定が、ＴＰＦ、随意に、ＳＨＧによって決定されることを可能にする。２つ以上のそのような測定を組み合わせることによって、複数の配座状態の平衡において存在するタンパク質の構造を含む、タンパク質構造のより正確な決定が、行われることができる。ＴＰＦ遷移双極子モーメントの成分、随意に、ＳＨＧχ（２）の測定、およびφの値の決定は、当業者に公知である標準分子モデル化技法の使用、いくつかの実施形態では、適切な単純化仮定の選定を通して、構造モデルを作成するために使用されることができる。分析を単純化し、タンパク質構造モデルを作成するように行われ得る、仮定の一非限定的実施例は、タンパク質表面上のＴＰＦ活性および／またはＳＨＧ活性標識の配向が、研究室基準系内で１つの実験条件から別のものに（すなわち、表面の平面に対して法線である軸に対して）変動するが、タンパク質基準系に対するＴＰＧ活性および／またはＳＨＧ活性標識の配向が、異なる実験条件下で一定のままとなることである。事実上、本仮定の下では、それらの機能および配座景観を摂動させない方法で、表面上のタンパク質の配向分布を変動させる。各実験条件は、測定されたＴＰＦ  ＴＤＭ、随意に、異なる偏光におけるＳＨＧ強度を、分子配向分布に関連付ける、少なくとも１つの独立方程式を生成する。リガンド誘発配座変化、リガンド競合実験、リガンド結合の動力学、用量反応測定、およびその他等の適切な対照が、タンパク質が依然として機能的であり、したがって、天然様であることを確実にするように、各実験条件において実行されることができる。平均角度の測定は、例えば、タンパク質中の標識または２光子活性または過分極可能部分の配向分布の他のパラメータとともに、当業者に公知である方法に従って、デノボまたは統合構造モデル構築で制約として使用されることができる。いくつかの実施形態では、例えば、タンパク質のアポＸ線結晶構造解析構造が、モデルの中に含まれ、モデルの正確度を向上させるように、ＴＰＦおよび／またはＳＨＧ測定によって提供される構造データとオーバーレイされてもよい。
【００８６】
ＳＨＧ構造データの分析を単純化する目的のために、開示される方法のいくつかの実施形態で行われ得る、仮定の非限定的実施例は、（ｉ）ＴＰＦ  ＴＤＭ、随意に、α（２）項（例えば、αｚｚｚ（２））の単一の成分が、２光子吸収テンソル（随意に、ＳＨＧに関して、標識の超分極率）を支配することと、（ｉｉ）タンパク質内の標識の位置（すなわち、それらが付着されるアミノ酸残基の同一性）が把握されることと、（ｉｉｉ）繋留または固定化タンパク質分子の配向がＸ−Ｙ平面内で等方性である（すなわち、それらが基板表面の平面上または支持脂質二重層の平面内で無作為に配向される）こととを含む。
【００８７】
開示される方法の一実施例では、タンパク質は、２光子活性、随意に、ＳＨＧ活性標識を用いて、単一部位特異的に設計されたシステイン残基において標識され、これは、ひいては、２光子吸収テンソルの単一の優位要素を保有し、随意に、α（２）＝α（２）ｚ’ｚ’ｚ’である。標識タンパク質は、Ｈｉｓタグを介して、脂質頭部基に付着したＮｉ−ＮＴＡ部分から成る支持脂質二重層膜に付着される。基準ＴＰＦ信号、随意に、ＳＨＧ信号が、このようにして生成され、χ（２）のゼロになることのない成分が、以下の方程式によって、当業者に周知であるように求められる（Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００１），  “ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ｀  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４２，  ４８５−４９１、Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００３），  “Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８１，  ７０５−７０９、Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００６），  “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １２５）。
【化６】
2020519866.tif 000009
式中、ＮｓおよびαＺ’Ｚ’Ｚ’（２）は、それぞれ、表面密度および分子超分極率である。χ（２）の成分は、次いで、２つの異なる偏光依存性測定（ＩｚｚｚおよびＩｚｘｘ、または同等にＩｐｐｐおよびＩｐｓｓ）から決定されることができる。この場合、χｚｚｚ（２）は、ｐ偏光された基本励起光を使用して、ｐ偏光されたＳＨＧ信号を測定することによって決定されることができる。例えば、８００ｎｍにおける基本励起光が（例えば、Ｔｉ：サファイアモードロックされたレーザから）使用される場合、第２高調波信号が、４００ｎｍにおいて検出される。一般に、ｐ偏光励起およびｐ偏光ＳＨＧ検出の下で観察されるＳＨＧ信号強度であるＩｐｐｐは、非線形感受率のいくつかの成分によって統制される。しかしながら、本測定においてχｚｚｚ（２）のみを単離するための単純化されたアプローチが、シリカプリズムを使用して、全反射幾何学形状で臨界入射角においてＳＨＧ信号を測定することによって達成される。全内部反射（ＴＩＲ）幾何学形状では、測定されたＳＨＧ強度は、χ（２）の軸外テンソル成分がゼロになり、測定されたＩｐｐｐＳＨＧ信号強度（基本／ＳＨＧビームの偏光を指す）を決定するχｚｚｚ（２）のみを残すため、プリズムおよび表面繋留タンパク質が含浸される緩衝剤の屈折率によって決定される。同様に、χｚｘｘ（２）は、ｓ偏光された基本光を使用してＩｐｓｓを測定し、ｐ偏光されたＳＨＧ光強度を測定することによって、決定されることができる。Ｎｓおよびαｚ’ｚ’ｚ’が不明である場合において、異なる偏光の組み合わせの下で測定される強度の比が、これらのパラメータを排除し、φが分子フレーム内のｚ軸と表面法線との間の平均角度として定義される、三角関数である、配向分布自体の比のみを残すために、使用されることができる。配向分布が狭いとき、φは、直接決定されることができる。２つ以上の異なる部位において（例えば、これらのシステイン部位において２つ以上の異なる単一部位システイン変異体の中で）標識されるタンパク質を使用して、異なる偏光のＳＨＧ強度（例えば、ＩｚｚｚおよびＩｚｘｘ）の測定を繰り返すことによって、例えば、構造決定で制約として使用され得る、標識部位毎に異なるφを取得することができる。各測定は、好ましくは、タンパク質内の既知の位置において部位特異的に付着した（例えば、部位指向型システイン突然変異生成を介して共有結合的に付着した）標識を伴う、標識タンパク質を要求する。また、標識の２つ以上の異なる部位とともに、表面の平面に対して異なるように配向されたタンパク質を産生するように実験条件を変動させることによって、独立測定が、配向分布を表す複数のパラメータを決定し、それによって、タンパク質構造決定のための重要な制約を提供するように、行われることができる。本発明の主要ステップは、基本配向分布、またはχ（２）成分の比（例えば、χｚｚｚ（２）／χｚｘｘ（２））に依存する、χ（２）の異なる値をもたらす、２つ以上の異なる実験条件下で、２つ以上の異なる部位において（好ましくは、別個のタンパク質・標識複合体の中で）標識されるタンパク質の測定を行うことである。２つ以上の異なる実験条件下で２つ以上の異なる部位において標識される同一のタンパク質に関してχ（２）の値を測定することによって、（研究室基準系内で）φのより正確な測定を取得し、それらの間の差異、すなわち、タンパク質骨格の差異をタンパク質の構造に関連付けることができる。
【００８８】
複数の配座−平衡配向分布：タンパク質（または他のバイオ分子）が複数の配座状態の平衡において存在する場合、タンパク質は、各標識部位における多重モード（または多重状態）配向分布によって表されてもよい。分布が異なる加重、平均角度（φ）、および分布幅（σ）を伴うガウス分布の総和から成る場合、タンパク質の配座景観の完全な説明は、これらのパラメータのそれぞれに依存するであろう。例えば、標識部位１におけるタンパク質の局所構造が、これらの仮定の下で３つの配座を採用する場合、局所配向分布は、配座毎に振幅、平均角度、および幅を表す、決定される３×３パラメータ、または９つの未知数によって表されてもよい。標識部位２は、２つだけの局所配座を採用してもよく、その場合、同様に、６つのパラメータによって表されることができる。本発明の側面である、付加的独立測定が、タグ部位（例えば、ＣおよびＮ末端）、融合タンパク質配列、タグ長（例えば、６ｘ、８ｘ、１０ｘ、および１２ｘＨｉｓタグ）、緩衝条件（例えば、異なる塩濃度）等の実験条件、または一般に、表面上のタンパク質の配向を変動させ、したがって、χ（２）の測定値に影響を及ぼす任意の実験条件を変動させることによって、取得されることができる。これらの独立測定の全ては、次いで、これら２つの部位におけるタンパク質基準系内の溶液ベースの配座景観（すなわち、多重状態配向分布）を決定するために、例えば、大域的適合方法で使用されることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質のＸ線結晶構造座標が、随意に、モデル構築でさらなる制約として使用されてもよい。
【００８９】
ＳＨＧおよび関連非線形光学技法を使用する、分子配向、配座、および構造の検出：ＳＨＧおよび和周波発生（ＳＦＧ）の関連技法が、界面における色素分子の配向を研究するために過去に使用されてきた（Ｈｅｉｎｚ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３），  “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  Ａｄｓｏｒｂａｔｅｓ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａ  ２８（３）：１８８３−１８８５、Ｈｅｉｎｚ，  Ｔ，  （１９９１）  “Ｓｅｃｏｎｄ−Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｔ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ”，  ｉｎ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ  （Ｓｔｅｇｅｍａｎ，  Ｈ．  Ｐ．  ａ．  Ｇ．  ｅｄ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  ｐｐ  ３５３−４１６）。これらの測定では、標識界面の非線形感受性（χ２）の成分が、偏光を使用して決定される。界面における色素分子の分子配向分布の詳細が、次いで、χ２の実験的に決定された値、および界面の平面内の色素分子の配向の程度、分子基準系内の色素分子の超分極率（α２）の成分の相対規模等に関する仮定を使用して、推測されることができる。
【００９０】
表面におけるバイオ分子結合事象の検出のため、傾転角の測定のため、またはタンパク質における配座変化の測定のためのＳＨＧおよびＳＦＧおよびＤＦＧの関連非線形光学技法の使用が、以前の技術刊行物および特許出願で開示されている（例えば、Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  （２００６），  “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  １２５：０７４７０１、米国特許第６，９５３，６９４号、および米国特許第８，４９７，０７３号を参照）。一般に、これらの開示は、標的タンパク質を、結合パートナ、例えば、リガンドと接触させることに応じて、信号の変化を測定するためのＳＨＧまたは他の非線形光学技法の使用を説明する。
【００９１】
第２高調波発生（図１Ｃ）は、より広く使用されている１光子蛍光ベースの技法（図１Ｂ）とは対照的に、同一励起波長または周波数の２つの光子が、非線形材料と相互作用し、２倍のエネルギーを有する、すなわち、励起光子の２倍の周波数および半分の波長を有する、単一の光子として再放出される、非線形光学プロセスである。第２高調波発生は、反転対称が欠けている非線形材料の中で（すなわち、非中心対称材料の中で）のみ起こり、高強度励起光源を要求する。これは、和周波発生の特殊な場合であり、差周波発生等の他の非線形光学現象に関連する。
【００９２】
第２高調波発生および他の非線形光学技法は、非線形活性種の配向へのそれらの非常に高い順序依存性により、表面選択的検出技法として構成されることができる。表面への非線形活性種の繋留は、例えば、分子が溶液中で自由拡散を受けることができるときに欠けている正味の平均配向度を作成することができる。界面における非線形活性種の配向依存性をモデル化するために一般的に使用される方程式は、以下である。
【化７】
2020519866.tif 000010
【００９３】
式中、χ２は、非線形感受性であり、α（２）は、非線形感受性であり、Ｎｓは、界面における単位面積あたりの非線形活性分子の総数であり、＜α（２）＞は、これらの分子の非線形超分極率（α（２））の全ての配向にわたる平均である。第２高調波発生のための非線形相互作用を表す典型的方程式は、以下である。
【化８】
2020519866.tif 000011
【００９４】
式中、αおよびＰは、それぞれ、周波数２ωにおいて発振する誘導分子および巨視的双極であり、βおよびχ２は、それぞれ、超分極率および第２高調波（非線形）感受性テンソルであり、Ｅ（ω）は、周波数ωにおいて発振する入射放射線の電場成分である。巨視的非線形感受性χ２は、α２の配向平均によって巨視的β超分極率に関連付けられる。誘導巨視的双極の拡張における次の次項は、第３高調波発生等の他の非線形現象を表す。三次項は、２光子蛍光等の非線形現象に関与する。和または差周波発生に関して、駆動電場（基本波）は、異なる周波数（すなわち、ω１およびω２）において発振し、非線形放射線は、和または差周波数（ω１±ω２）において発振する。
【００９５】
ＳＨＧの強度は、非線形感受性の二乗に比例し、したがって、界面における配向された非線形活性種の数およびそれらの配向分布の両方に依存する。本性質は、配座変化を検出するために活用されることができる。例えば、受容体の配座変化は、標識が表面に繋留された受容体に付着される、またはそれと関連付けられる、非線形活性標識または部分を使用して、検出されることができ、配座変化は、表面の平面に対する標識の方向（配向）の変化、したがって、非線形光学信号の物理的性質（例えば、強度）の変化につながる。本技法は、空間的または時間的であるかどうかにかかわらず、界面における標識分子の配向分布の変化に本質的に敏感である。
【００９６】
励起光の２つの異なる偏光を使用してＳＨＧ測定を求め、測定された強度の比を求めることによって、測定された強度比と平均傾転角φとの間の関係から平均傾転角を導出することができる。
【化９】
2020519866.tif 000012
式中、Ｉｐｐｐは、Ｐ偏光を使用して測定されるＳＨＧ信号であり、Ｉｐｓｓは、Ｓ偏光を使用して測定されるＳＨＧ信号であり、ｆは、励起光を基板表面に結合するために使用されるプリズム表面上の強度の損失を構成する定数（既知の値）であり、括弧（＜＞）は、平均値を表す。
【００９７】
故に、開示される方法のいくつかの実施形態では、（方程式（６）で示されるように）平均傾転角φへの偏光された励起光を使用して測定されるＳＨＧ信号強度の強い依存性が、種々の検出偏光下でｐ偏光およびｓ偏光された励起光を使用して測定されるＳＨＧ信号の比の測定を行うことによって、標識タンパク質または他のバイオ分子における配座変化のより敏感な検出のために活用され、ｐ偏光されたＳＨＧ検出は、純粋なｐ偏光およびｓ偏光励起の両方を伴う好ましい実施形態である（例えば、χｚｚｚ（２）／χｚｘｘ（２））。別の実施形態では、ｐおよびｓ偏光された光の混合状態である、単一の偏光が、それ自体が２つの直交方向に偏光されるＳＨＧを生成するために使用されることができる。例えば、偏光ビーム分割立方体を使用して信号を分割することによって、これらの２つの直交して偏光されたＳＨＧ信号の相対強度を測定することによって、形態が方程式（６）に類似する方程式が、平均傾転角φについての情報を伝えるために公式化されることができる。
【００９８】
第２高調波発生および他の非線形光学技法（上記で議論されるようなＴＰＦを含む）は、加えて、非線形活性種が繋留または固定化されている光学界面（または表面）への励起光の送達のためのモードとしての全内部反射の使用を通して、表面選択的にされてもよい。入射励起光の全内部反射は、表面に近接近している、すなわち、典型的には約数十ナノメートルであるエバネセント波の空間減衰距離内にある、非線形活性標識のみを選択的に励起させるために使用され得る、「エバネセント波」を界面において作成する。本開示では、励起光の全内部反射を用いて生成されるエバネセント波は、非線形活性標識または分子を励起させるために優先的に使用される。本明細書に説明される非線形活性プロセスにおいて非線形活性種を励起させることの効率は、表面に対するそれらの平均配向に強く依存する。例えば、非線形活性種の正味の平均配向が存在しない場合、いかなるＳＨＧ信号も存在しないであろう。
【００９９】
ＳＨＧおよび他の非線形光学技法の本表面選択的性質は、界面に固定化された生体分子において平均配向、配座、構造、またはその変化を決定するために活用されることができる。例えば、リガンドの結合に起因する受容体分子の配座変化は、配座変化が界面に対する標識の配向または距離の変化（図３）、したがって、非線形光学信号の物理的性質の変化につながるような方法で、標識が受容体に付着される、またはそれと関連付けられる、非線形活性標識または部分を使用して検出されてもよい。過去に、表面選択的非線形光学技法の使用は、比較的に少ない生物学的サンプルが本質的に非線形活性であるため、主に物理および化学における用途に限定されてきた。近年、第２高調波活性標識（「ＳＨＧ標識」）および他の非線形活性標識の使用が導入されており、事実上、分子または粒子が非常に非線形活性にされることを可能にしている。これの第１の実施例は、オキサゾール色素を用いてタンパク質シトクロムｃを標識し、第２高調波発生を用いて空気・水界面におけるタンパク質複合体を検出することによって、実証された［Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．，  “‘ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ’  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  ３４２（５−６）：４８５−４９１  （２００１）］。標的タンパク質、生物学的薬剤候補、参照薬剤、および他の生物学的実体を標識する、または別様に非線形活性にするための技法が、下記でより詳細に説明されるであろう。
【０１００】
表面選択的ＳＨＧ、ＳＦＧ、およびＤＦＧ非線形光学技法はまた、首尾一貫した技法であり、基本および非線形光ビームが、明確に定義された空間および位相関係を伴って空間を通して伝搬する波面を有することを意味する。生体分子または他の生物学的実体の配座の分析のための表面選択的非線形光学検出技法の使用は、ｉ）非線形活性種の配向および／または双極子モーメントへの非線形信号の敏感かつ直接的な依存性、それによって、配座変化に対する感度を与えること、（ｉｉ）非線形光学信号が非中心対称系を作成する表面のみにおいて生成される、すなわち、本技法が非常に狭い「被写界深度」を本質的に有するため、蛍光ベースの検出よりも高い信号対雑音（より低い背景）、（ｉｉｉ）狭い「被写界深度」の結果として、本技法は、測定がオーバーレイソリューションの存在下で実施されなければならないとき、例えば、結合プロセスが分離または洗浄ステップによって排除または妨害され得る場合に、有用であることを含む、他の光学アプローチと比べていくつかの固有の利点を有する。本技法の本側面は、バルク種の存在を要求する、平衡結合測定、または測定が定義された時間周期にわたって行われる、動力学測定を実施するために、特に有用であり得、（ｉｖ）本技法は、２光子断面が、典型的には、所与の分子に関して１光子吸収断面よりもはるかに小さく、ＳＨＧ（および和周波発生または差周波発生）が吸収ではなくて散乱を伴うという事実に起因して、蛍光において起こるものよりも低い光漂白および加熱効果を呈し、（ｖ）最小限の収集光学系が要求され、基本および非線形光学ビーム（例えば、第２高調波光）が界面に対して明確に定義された入射および出射方向を有するため、より高い信号対雑音が予期される。これは、蛍光発光が等方性であり、焦点面外の蛍光種から生じる信号を検出するための大型蛍光背景成分も存在し得るため、１光子蛍光ベースの検出と比較して、特に有利である。ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧから生じる信号は、例えば、リガンド結合に応じて起こるような分子の構造、配座、またはその変化を研究することの瞬間リアルタイム手段を提供する。本性質は、リアルタイムでそれらの機能の一部として構造変化を受けるタンパク質のリアルタイム「動画」を取得するための開示される方法において非常に有用であり得る。
【０１０１】
例えば、基板・緩衝剤界面に起因して、背景ＳＨＧ信号が存在する場合、これは、種々の方法で「減算」されることができる。例えば、タンパク質上の標識からのＳＨＧ信号と背景に起因するＳＨＧ信号との間の位相差は、Ｒｅｉｄｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  “Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ａｒｔｉｆａｃｔｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂ−Ｌａｓｅｒｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ６８，  ３４３−３４７，  ｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｂｙ  Ｃｌａｎｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｌａｆｓｋｙ  （２０１７），  “Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｐｈａｓｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ”，  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  １９：３７２２−３７２８に説明されるもの等の干渉実験において測定されることができる。標識タンパク質のみに起因するＳＨＧ信号が、次いで、決定されることができる。
【０１０２】
構造決定、構造比較、および／または配座変化の検出の目的のために監視され得る、第２高調波光および関連非線形光学信号の物理的性質の実施例は、限定ではないが、強度、偏光、波長、強度、偏光、または波長の時間依存性、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１０３】
ＳＨＧ信号の正規化：本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかでは、着目バイオ分子内のリガンド結合部位またはリガンド結合領域の位置を識別するための方法はさらに、２光子蛍光（ＴＰＦ）信号の瞬間または順次測定、および界面の単位面積あたり繋留された分子の数（すなわち、界面上の繋留分子の表面密度または数密度）に測定された非線形信号を正規化する目的のためにＳＨＧ：ＴＰＦ信号比（または本明細書に説明されるようなＳＦＧ：ＴＰＦ信号比、ＤＦＧ：ＴＰＦ信号比、またはｐ偏光／ｓ偏光ＴＰＦまたはＳＨＧ比）を計算するためのその使用を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標的タンパク質を界面に繋留することに先立ってそれを標識するために使用される非線形活性（すなわち、ＳＨＧ活性、ＳＦＧ活性、またはＤＦＧ活性）標識はまた、第２高調波、和周波数、または差周波数光を生成するために使用されるものと同一である、または異なる、基本周波数の光を用いて照明されるときに、２光子蛍光を生成してもよい。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＳＨＧ活性、ＳＦＧ活性、またはＤＦＧ活性標識と異なる２光子蛍光標識を用いて標識されてもよい。２光子蛍光信号が、励起されている標識分子の数に直線的に関連するため、２光子蛍光信号は、ＳＨＧ（またはＳＦＧまたはＤＦＧ）信号を正規化し、繋留分子の表面密度の変動を補正するための手段を提供し、したがって、標識タンパク質の異なるサンプルに関して測定される信号の比較を促進する。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、全内部反射を使用する、界面への基本光（すなわち、典型的にはレーザによって提供される励起光）の送達によって励起されてもよい。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、（例えば、落射蛍光光学設定を使用して）界面の平面に直交する方向へ、または界面の平面に直交しない恣意的角度における基本光の送達によって励起されてもよい。いくつかの実施形態では、基本周波数光を用いた照明に応じて励起される２光子蛍光は、例えば、放射された２光子蛍光が、顕微鏡対物レンズを使用して収集される、落射蛍光光学設定を使用して、検出および測定されてもよい。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、励起光が集束され、界面の平面と平行であるように配向される点の直接上方および下方のいずれかに位置付けられる、低ＮＡピンホール（すなわち、レンズの使用を伴わない）を使用して、検出および測定されてもよい。（付加的レンズ、鏡、ダイクロイック反射体、帯域通過フィルタ、および／または開口等の任意の中間光学要素のうちのいずれかの使用の有無別に）集光レンズ、顕微鏡対物レンズ、またはピンホールを通過する２光子蛍光が、次いで、光電子増倍管または他の好適な検出器を使用して検出されてもよい。適切な反応条件下でシステイン残基に特異的であるＴＰＦおよびＳＨＧ活性プローブの実施例は、１−（２−マレイミドイルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホン酸塩である。
【０１０４】
構造類似性の決定、および異なるサンプルから、または異なる時点におけるタンパク質構造の比較：上記のように、本開示の第１の側面では、異なるサンプルから、または異なる時点におけるタンパク質構造（または他のバイオ分子構造）の比較のためのＳＨＧまたは関連非線形光学基準信号（例えば、ＳＦＧおよびＤＦＧ基準信号）の使用が、説明される。以前の開示と本発明との間の主要な差異は、基準ＳＨＧ信号自体が、異なるタンパク質サンプル中または異なる時点におけるタンパク質構造の比較のための有益なツールを提供するという認識である。非線形活性標識の正味の配向に対するその極端な感度により、基本周波数の光を用いた、異なるサンプル（例えば、同じ標識方法を使用して標識されており、同じ繋留または固定化技法を使用して、光学界面、例えば、ガラス基板の表面に繋留されている、またはその上で固定化されている）から、または異なる時点における同一サンプル中の標識タンパク質分子の照明に応じた、基準ＳＨＧ信号の測定は、タンパク質の構造の微妙な差異を検出するための便宜的かつ敏感なツールを提供する。公称上同じであるタンパク質産物は、実質的に同じ基準ＳＨＧ信号を有するはずである。例えば、産生中の折り畳みのわずかな差異の結果として、または所与の緩衝調合剤中の安定性のわずかな差異に起因して、それらの三次構造がわずかに異なるタンパク質産物は、異なる基準ＳＨＧ信号を有するはずである。完全変性タンパク質は、（すなわち、光学界面上に非線形活性標識の正味の配向を有していないことの結果として）ゼロの測定可能な基準ＳＨＧ信号を有するはずである。産生プロセスにおける異なるステップから、または同一の産生プロセスによって産生されるタンパク質の異なるロットから、または異なる時点における所与のタンパク質サンプルに関して、または異なる産生プロセスによって産生される推定上同じタンパク質に関して引き出される、標識タンパク質サンプルの基準ＳＨＧ信号の比較は、したがって、産生プロセスを最適化および監視する、異なる試薬への暴露に応じて、またはそれらに異なる実験条件を受けさせることに応じて、タンパク質安定性を監視する、（例えば、品質管理のために）産生プロセスの出力を監視する、かつ（例えば、生物学的薬剤候補と参照薬剤との間の生体類似性を実証するため、または臨床診断検査で使用されるモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体の構造同値を実証するために）構造基準で類似タンパク質産物を評価するための有用なツールを提供するはずである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、これらの比較は、ＳＨＧ基準信号（またはＳＦＧまたはＤＦＧ基準信号）の測定のみに依拠し得る。開示されるアプローチの成功した具体化は、タンパク質三次構造の差異、例えば、標識特異性または収率の差異、光学界面上の結合部位密度の差異、繋留または固定化効率の差異等以外の基準ＳＨＧ信号の誤差の全ての潜在的原因の識別および排除を要求する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、これらの比較は、ＳＨＧ基準信号およびＴＰＦ基準信号が同時または連続的のいずれかで測定される、同一サンプルに関して測定されるＴＰＦ基準信号に対するＳＨＧ基準信号（またはＳＦＧまたはＤＦＧ基準信号）の比を使用して、行われてもよい。好ましい実施形態では、第２高調波活性および２光子蛍光活性の両方である単一の非線形活性標識が、タンパク質サンプルを標識するために使用されてもよい。ＴＰＦ信号が表面に繋留される標識タンパク質の表面密度に直線的に比例する（上記で議論されるように、ＳＨＧ信号が単位面積あたり繋留される標識タンパク質の数の二乗に比例する）ため、ＳＨＧ対ＴＰＦ基準信号比の使用は、ＳＨＧ基準信号を正規化し、標識タンパク質分子の表面密度の変動を補正することを可能にする。
【０１０７】
タンパク質サンプル：開示される方法、デバイス、およびシステムは、種々の精製または非精製タンパク質のうちのいずれかのサンプルのタンパク質構造変動を監視するために利用されてもよい。本アプローチが好適であるタンパク質の実施例は、限定ではないが、酵素、受容体、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、融合タンパク質、または遺伝子操作されたタンパク質、およびそのサブユニットまたは断片を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生物学的薬剤または候補薬剤であってもよい。
【０１０８】
１つの好ましい実施形態では、三次構造が監視されるタンパク質は、非線形活性部分（すなわち、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦ活性である非線形活性標識またはタグ）を付着させるための一意の標識部位を組み込むように遺伝子操作されたタンパク質、および／または本質的に非線形活性である非天然アミノ酸を組み込むように遺伝子操作されたものであってもよい。遺伝学的に組み込まれ得る、一意の標識付着部位の実施例は、限定ではないが、タンパク質が適切に折り畳まれるときにタンパク質の表面上に位置することが公知である、アミノ酸配列位置におけるリシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、またはシステイン残基の組み込みを含む。リシン組み込みの場合、非線形活性標識が、次いで、当業者に公知である種々の共役化学のうちのいずれかを使用して、リシン残基の一次アミンに共役されてもよい。同様に、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩組み込みの場合、非線形活性標識が、次いで、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩残基のカルボキシル基に共役されてもよい。システイン組み込みの場合、非線形活性標識が、次いで、システイン残基のスルフヒドリル基に共役されてもよい。メチオニン標識の場合、本明細書に説明される一般的アプローチは、要求される化学ハンドルを伴うＳＨＧおよびＴＰＦ活性プローブが利用可能である、または合成されることを前提として、良好なアプローチを提供する。記述されるように、ある場合には、標識は、本質的に非線形活性の非天然アミノ酸の遺伝子組み込みを含んでもよい。本質的に非線形活性である非天然アミノ酸の一非限定的実施例は、Ｃｏｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  “Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６  （５５７３）：  １７００−１７０３に説明される、Ａｌａｄａｎである。好適な標識技法の他の実施例が、下記でより詳細に議論されるであろう。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、三次構造が監視されるタンパク質は、タンパク質を光学界面に付着させるための一意の繋留または固定化部位を組み込むように遺伝子操作されたタンパク質、および／または光学界面へのタンパク質の付着のため、または双直交様式でＳＨＧまたはＴＰＦ活性プローブを付着させるための一意の繋留または固定化部位としての役割を果たす、非天然アミノ酸残基を組み込むように遺伝子操作されたものであってもよい。遺伝学的に組み込まれ得る、一意の繋留または固定化部位の実施例は、限定ではないが、タンパク質が適切に折り畳まれるときにタンパク質の表面上に位置することが公知である、アミノ酸配列位置におけるリシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、メチオニン、またはシステイン残基の組み込みを含む。タンパク質は、次いで、当業者に公知である種々の共役およびリンカ化学のうちのいずれかを使用して、光学界面に繋留される、またはその上に固定化されてもよい。タンパク質産物に遺伝学的に組み込まれ得る、一意の繋留または固定化部位の別の非限定的実施例は、次いで、光学界面に付着したＮｉ／ＮＴＡ基に結合するための付着部位を提供し得る、Ｈｉｓタグ（例えば、一連の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、または１２個を上回るヒスチジン残基）であってもよい。一意の付着点を提供するように組み込まれ得る、非天然アミノ酸の一非限定的実施例は、ビオチン化非天然アミノ酸ビオシチンである。タンパク質は、次いで、タンパク質を基板表面上で固定化されるストレプトアビジン分子に繋留するように、高親和性ビオチン・ストレプトアビジン相互作用を使用して、光学界面に繋留される、またはその上に固定化されてもよい。好適な繋留または付着技法の他の実施例が、下記でより詳細に議論されるであろう。
【０１１０】
いくつかの好ましい実施形態では、三次構造が監視されるタンパク質は、一意の非線形活性標識部位または非線形活性アミノ酸残基、および一意の繋留または固定化部位の両方を組み込むように遺伝子操作されたタンパク質であってもよい。
【０１１１】
タンパク質構造安定性の測定：いくつかの実施形態では、開示される方法、デバイス、およびシステムは、タンパク質配座、タンパク質配向分布、またはその変化を監視するための非線形光学技法の使用を通して、経時的に、および／または異なる実験条件下で（例えば、異なる緩衝剤中、異なる貯蔵条件で、異なる付着リンカ等）（例えば、生物製剤、生物学的タンパク質ベースの薬剤、または他の着目タンパク質に関して）タンパク質安定性を監視するために使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質分子（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）薬剤または薬剤候補）は、ＳＨＧ活性または他の非線形活性標識を用いて標識され、当業者に公知である種々の手段のうちのいずれかによって光学界面に繋留されてもよい。基本周波数の光による照明に応じて、標識タンパク質から生じるＳＨＧまたは他の非線形光学信号強度（または非線形光学信号の他の物理的性質）の変化は、次いで、時間の関数として、または標識タンパク質を、１つ以上の候補安定化化合物、候補破壊性化合物、候補安定化または貯蔵緩衝剤等と接触させることに応じて、監視されるであろう。好ましい実施形態では、ＳＨＧ対ＴＰＦ信号強度の比（または非線形光学信号の他の物理的性質の比）が、時間の関数として、または標識タンパク質を、１つ以上のリガンド、候補安定化化合物、候補破壊性化合物、候補安定化化合物、温度、緩衝剤等と接触させることに応じて、タンパク質サンプルを監視するために使用されてもよい。結果として生じるＳＨＧまたは非線形光学信号または信号比（すなわち、「シグネチャ」）の比較は、次いで、タンパク質配座、配向分布、またはその変化を監視し、異なる実験条件下で時間の関数としてタンパク質の安定性を確立するための手段を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質の安定性は、異なる物理的条件下で（例えば、異なる温度において）、および異なる化学条件（例えば、異なるｐＨ、異なるイオン強度、異なる緩衝剤等）下で決定されてもよい。安定性決定は、リアルタイムで（例えば、反応速度測定基準で）ＳＨＧまたは他の非線形光学信号または信号比の変化を監視することに基づいてもよい、またはＳＨＧまたは他の非線形光学信号または信号比の終点測定に基づいてもよい。
【０１１２】
したがって、基準ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）は、経時的に、または実験条件の異なるセットの下で、タンパク質安定性の相対測定値を提供する。より不規則なタンパク質は、平均角度は必ずしもそうではないが、繋留タンパク質の配向分布の幅が、不安定化緩衝剤中で変化するため、より低い信号（および逆）につながり得る。ＳＨＧ信号強度は、＜ｃｏｓ３φ＞２に比例し、φは、（単一の優位テンソル要素であると仮定される）分子超分極率軸と標識分子基準系内の表面への法線との間の角度であり、括弧は、配向平均を表す。より不安定であり、したがって、折り畳まれていないタンパク質が、より広い配向分布およびより少ないＳＨＧ信号を生成するはずである。タンパク質が完全に変性される限界では、非線形活性色素が光学界面に接近する、または光学界面に対して完全に無作為に配向されるため、信号は、ゼロに接近する、またはゼロと等しくなるはずである。本予測は、非線形活性標識繋留Ｆａｂ断片が、変性曲線を生成するように増加する濃度の尿素に暴露された、添付実施例に説明される実験データによって証明される。また、そのような曲線から変性の自由エネルギーの推定値を所得することもできる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、開示される方法は、条件の定義されたセット、例えば、実験条件または貯蔵条件下で、または秒、分、時間、日、または週の時間尺度で条件の定義されたセットの変化に続いて、タンパク質安定性を監視するために使用されてもよい。
【０１１４】
タンパク質・タンパク質相互作用、およびタンパク質・タンパク質錯体を安定させる、または妨害する化合物の選別：いくつかの実施形態では、開示される方法、デバイス、およびシステムは、タンパク質・タンパク質相互作用を監視するために、および／またはタンパク質・タンパク質錯体を安定させる、または妨害する化合物を選別するために、使用されてもよい。ある場合には、光学界面上で繋留されるタンパク質は、非線形活性標識を用いて標識されてもよく、１つ以上の付加的タンパク質分子の結合は、例えば、繋留分子を１つ以上の付加的分子と接触させることに応じて、基準ＳＨＧ信号またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比の変化を測定することによって、繋留分子で誘発される配座変化によって監視されてもよい。ある場合には、光学界面上で繋留されるタンパク質は、標識されず、繋留タンパク質への１つ以上の非線形活性標識タンパク質の結合は、繋留分子を１つ以上の付加的分子と接触させることに応じて、基準ＳＨＧ信号またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比の変化を測定することによって監視されてもよい。ある場合には、１つ以上の付加的タンパク質分子は、繋留分子と同一であり得る。ある場合には、１つ以上の付加的タンパク質分子は、繋留分子と異なる、または相互と異なり得る。ある場合には、１つ以上の付加的タンパク質分子のうちの少なくとも１つは、繋留分子のための自然発生リガンドまたは結合パートナであってもよい。繋留されていないタンパク質分子（または自然発生リガンド）が非線形活性種である場合において、繋留タンパク質への非線形活性標識タンパク質（またはリガンド）の結合は、繋留タンパク質またはタンパク質・タンパク質錯体の原位置標識の形態と見なされ得る。ある場合には、研究されるタンパク質または他のバイオ分子は、標識されておらず、非線形活性ではないが、それらに結合する基板または分子リガンドは、非線形活性標識される、例えば、ＡＴＴＯ３９０ＧＴＰ：γ−（６−アミノヘキシル）−ＧＴＰ−ＡＴＴＯ−３９０γ−（６−アミノヘキシル）−グアノシン−５’−三リン酸塩）である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、開示される方法、デバイス、およびシステムは、上記に説明されるタンパク質・タンパク質結合相互作用の結果として光学界面上に形成される、結果として生じるタンパク質・タンパク質錯体を安定化させるか、または妨害するかのいずれかである、化合物を識別するために、候補化合物ライブラリを選別するように使用されてもよい、例えば、開示される方法、デバイス、およびシステムは、錯体を１つ以上の候補化合物と接触させることに応じて、タンパク質・タンパク質錯体を安定化させるか、または妨害するかのいずれかである、化合物を識別するために、候補化合物を選別するように使用されてもよい。ある場合には、タンパク質・タンパク質錯体を安定化させるか、または妨害するかのいずれかである、化合物のそのような選別は、下記でより詳細に説明されるデバイスおよびシステムを使用して、高スループット様式で実施されてもよい。
【０１１６】
２つ以上のサンプルに関するタンパク質構造の比較：いくつかの実施形態では、開示される非線形光学方法は、２つ以上のタンパク質サンプル（または他のバイオ分子サンプル）、例えば、同一の製造プロセスによって異なる時間に産生される２つ以上のタンパク質サンプル、または２つの異なる製造プロセスによって産生される２つ以上のタンパク質サンプル、または同一の製造プロセスによって産生されるが、続いて、異なる実験条件を受けている、２つ以上のタンパク質サンプルの構造比較のために、利用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質分子の２つ以上のサンプル（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）薬剤または薬剤候補）は、同じ標識プロトコルを使用して、ＳＨＧ活性または他の非線形活性標識を用いて標識され、同じ繋留プロトコルを使用して、光学界面に繋留されてもよく、ＳＨＧ基準信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の測定は、同一の光学計器を使用して（光学計器が信頼性のある参照標準に対して較正されていることを前提として、同時に、または異なる時間に）実施されてもよい。結果として生じる基準ＳＨＧ信号またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比の比較は、次いで、タンパク質構造、配座、配向分布、またはその差異を監視するための手段を提供し、２つのタンパク質サンプルが同一または実質的に同一の構造および配座のタンパク質から成ることを確立するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、開示される方法、デバイス、およびシステムは、同一の製造プロセスによって異なる時間に産生される、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または１００個を上回るタンパク質サンプルの構造比較のために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、開示される方法、デバイス、およびシステムは、２つ以上の異なる製造プロセスによって産生される、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または１００個を上回るタンパク質サンプルの構造比較のために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、開示される方法、デバイス、およびシステムは、同一の製造プロセスによって産生されるが、続いて、異なる実験条件を受けている、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または１００個を上回るタンパク質サンプルの構造比較のために使用されてもよい。
【０１１７】
プロセス最適化および品質管理：いくつかの実施形態では、開示される非線形光学方法が、プロセス最適化および／または品質管理のために利用されてもよい。一般に、（例えば、品質管理用途または生体類似性の実証の場合のように）プロセス最適化およびプロセス出力の監視のための非線形光学技法の使用の基礎にある方法は、（ｉ）（例えば、プロセスの同一のステップのための異なる時間において、プロセスの中の異なるステップにおいて、同一のプロセスの異なる工程（例えば、異なる産生ロット）から、または同一のタンパク質産物を公称上産生する異なる産生プロセスからの）タンパク質の１つ以上のアリコートの収集と、（ｉｉ）標準化された標識手順を使用する、（必要とされる場合）タンパク質の標識と、（ｉｉｉ）実験条件の標準化されたセット（例えば、緩衝剤ｐＨ、イオン強度、洗剤濃度、温度等）の下で標準化された繋留または固定化手順を使用する、標準化された光学表面（例えば、当業者に公知である種々の表面処理または修飾のうちのいずれかをさらに含み得る、ガラス基板の表面）上の標識タンパク質の繋留または固定化と、（ｉｖ）光の１つ以上の基本周波数において照明を提供するように、かつ照明の結果として非線形光学プロセスから生じる光を検出するように構成される計器の中の光学基板（いくつかの実施形態では、緩衝剤、分析試薬、または他の溶液の含有のためのウェルまたはチャンバを備える、デバイスに組み込まれ得る）の設置と、（ｖ）基準ＳＨＧ（または他の非線形光学）信号の（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比の）測定と、（ｖｉ）１つ以上のサンプルアリコートに関する基準ＳＨＧ信号またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号の相互と、または参照サンプルのものとの比較とを伴うであろう。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質サンプルは、基板への繋留またはその上への固定化に先立って、またはその後に、試験化合物を用いて培養されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質サンプルは、基板への繋留またはその上への固定化に先立って、またはその後に、実験条件の異なるセットに暴露されてもよい。いくつかの実施形態では、基準ＳＨＧ信号の測定に使用される光学システムはさらに、タンパク質または非線形活性標識の（またはタンパク質に付着した付加的蛍光標識の）固有の蛍光を監視するために使用され、かつ固定化タンパク質の表面密度のウェル間（サンプル間）変動に関して正規化するために使用され得る、蛍光検出チャネルを備える。開示される測定技法は、従来の構造特性評価技法、例えば、Ｘ線結晶構造解析研究と比較して、サンプル間のタンパク質構造変動を監視することのへの比較的に迅速かつ容易なアプローチを提供する。さらに、開示される測定技法は、溶液中のサンプル間のタンパク質構造変動を監視するためのアプローチを提供する。
【０１１８】
本方法は、反復時間間隔において、または異なるプロセスステップにおいて採取されるタンパク質サンプルに関して、または実験条件の異なるセットを受けたタンパク質サンプルに関して、タンパク質構造類似性を監視および／または確認するように要求する、任意の用途に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本アプローチは、タンパク質構造変動のリアルタイム監視を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記のように、アプローチは、例えば、緩衝調合剤の最適化中に、タンパク質安定性を監視するために使用されてもよい。これらの実施形態では、研究中のタンパク質が、基板表面に繋留された、またはその上に固定化されたままであり（すなわち、実験の固定パラメータ）、ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）が、測定される一方で、他の実験条件（例えば、緩衝条件）は、タンパク質安定性を最適化するように操作される。他の実施形態では、例えば、プロセス最適化に関して、１つ以上のサンプルアリコートが、異なる時間に、またはプロセスの中の異なるステップにおいて収集され（すなわち、タンパク質サンプルは、実験の可変パラメータである）、基準ＳＨＧ信号測定（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比測定）が、実験条件の標準化されたセット（例えば、緩衝剤ｐＨ、イオン強度、洗剤濃度、温度等）の下でタンパク質三次構造を査定するために使用される。例えば、本アプローチは、所与のプロセスステップを実施する前および後に（例えば、凍結または乾燥凍結ステップの前および後、または精製プロセスの中の１つ以上の異なるステップのそれぞれの後に）タンパク質三次構造を査定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本アプローチは、生物製剤の産生における品質管理目的のために、例えば、プロセス終点において産生プロセス出力を監視するために使用されてもよい。これらの後者の実施形態では、タンパク質構造は、実験条件の同じセットの下で査定および比較される（すなわち、非線形光学信号測定を行うために使用される実験条件は、固定されたままであり、タンパク質は、測定の合間に操作される）。
【０１１９】
統計的実験設計アプローチ：本開示のいくつかの実施形態、例えば、タンパク質安定性を監視し、緩衝調合剤を最適化するため、または生物学的薬剤製造プロセスを最適化および監視するための開示される非線形光学方法の使用では、本方法は、統計的実験設計（ＳＤＯＥ）アプローチを使用して適用されてもよい。ＳＤＯＥは、所望の成果（例えば、規定時間周期にわたるタンパク質安定性、または一貫した生物学的薬剤産生）が、多くの異なる実験入力パラメータ（例えば、緩衝剤ｐＨ、イオン強度、洗剤濃度、添加剤濃度、プロセスステップ持続時間等）の関数である、複雑な「応答表面」に関して極大値を構成するときに、最小限の数の離散実験試験条件のための実験測定を行うことによって、複雑な最適化手順を実施することを可能にする。
【０１２０】
生体類似性の実証：いくつかの実施形態では、開示される方法は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤の構造（または配座）の直接比較のための手段を提供する。いくつかの実施形態では、開示される方法は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤に結合する作用物質との接触に応じて、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤で誘発される配座変化の直接比較のための手段を提供する。いくつかの実施形態では、開示される方法は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤の接触に応じて、標的タンパク質または他の生物学的実体で誘発される配座変化の直接比較のための手段を提供する。また、本明細書では、これらの方法が高スループット様式で実装され得る、システムも開示される。
【０１２１】
上記のように、ＳＨＧおよび関連非線形光学技法（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の表面選択的性質は、非線形活性部分の平均配向を決定するために活用されることができ、したがって、構造類似性を比較するため、または界面において繋留される生体分子の配座変化を検出するために使用されることができる。例えば、生物学的（バイオ後続）薬剤候補および参照薬剤の構造類似性は、同じ標識反応を使用して、非線形活性部分を用いて生物学的薬剤候補および参照薬剤を標識し、それらが界面において正味の配向を有するように、同じ繋留方法を使用して、生物学的薬剤候補および参照薬剤を界面に繋留し、それぞれに関して（例えば、基準信号を測定することによって）基本周波数の光を用いた照明に応じて、非線形活性標識によって生成される光の物理的性質を測定することによって、実施されてもよい。いくつかの実施形態では、基準信号比、例えば、ＳＨＧ対ＴＰＦ基準信号強度の比は、生物学的薬剤候補と参照薬剤との間の構造類似性を実証するために測定および使用されてもよい。バイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関して測定される、光の物理的性質、例えば、基準信号強度または基準信号強度比の統計的有意差は、それらが構造的に同等ではないことを示し得る一方で、測定された光の物理的性質の統計的非有意差は、それらが実質的に同一の構造を有することを示し得る。
【０１２２】
ＳＨＧおよび他の非線形光学技法の表面選択的性質もまた、界面において繋留される生体分子の配座変化を検出するために活用されることができ、したがって、生体類似性をさらに実証するために使用されてもよい。例えば、リガンドの結合（例えば、生物学的薬剤候補または参照薬剤）に起因する標的タンパク質分子の配座変化が、非線形活性標識または部分を使用して検出され得、標識は、配座変化が界面に対する標識の配向または距離の変化（図３）、したがって、非線形光学信号の物理的性質の変化につながるように、標的タンパク質に付着される、またはそれと関連付けられる。ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の結果として生じた変化によって示されるように、標的タンパク質が、生物学的薬剤候補または参照薬剤の結合に応じて、同一の配座変化を受けるという実証は、したがって、生体類似性の証拠を提供するであろう。
【０１２３】
本明細書に開示される方法およびシステムは、生体類似性を確立する目的のために、参照生物学的薬剤への生物学的薬剤候補（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ））のリアルタイム構造比較のための手段を提供する。開示される方法およびシステムは、非線形活性標識生物学的薬剤候補および参照薬剤の構造または配座を比較するため、かつ非線形活性標識生物学的タンパク質標的分子（例えば、ｍＡｂ薬剤または薬剤候補の場合は抗原）を１つ以上の薬剤候補または参照薬剤と接触させることに応じて、タンパク質配座変化を監視し、それによって、それらの同値または差異を確立する目的のために結果として生じる配座変化（または「配座シグネチャ」）の比較を可能にするためのＳＨＧおよび関連非線形光学技法の使用を含む。同じく標識および繋留された薬剤候補および参照薬剤における同一または実質的に同一の構造または配座の観察は、生体類似性の証拠を提供し得る。薬剤候補および参照薬剤に関する同一または実質的に同一の配座変化またはシグネチャの観察は、作用および有効性の類似機構を示し得る。薬剤候補および参照薬剤に関する異なる配座変化またはシグネチャの観察は、作用の異なる機構および／または有効性の異なるレベルを示し得る。標的分子の配座変化は、ＳＨＧ信号強度（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号強度の比）の反応速度測定において、時間の関数として監視されてもよい、または終点測定によって監視されてもよい。開示される非線形光学分析技法は、したがって、生物学的薬剤候補および参照薬剤に関する構造のリアルタイム測定および比較、および標的分子を生物学的薬剤候補または参照薬剤と接触させることに応じて誘発される生物学的標的における配座変化のリアルタイム測定および比較を可能にする。
【０１２４】
生物学的薬剤候補（例えば、ジェネリック薬剤候補）を参照薬剤（例えば、ブランド薬剤）と比較するための開示される方法は、現在使用中であり、種々の異なる形式で実施され得る、構造特性評価技法の多くよりも構造／配座差に敏感であり得る。例えば、第１の実施形態では、１つ以上の候補生物学的薬剤分子および参照薬剤分子は、ＳＨＧ活性または非線形活性標識を用いて標識され、当業者に公知である種々の手段のうちのいずれかによって、光学界面に繋留されてもよい。例えば、全長ｍＡｂｓに関して、これは、表面上に固定化されるタンパク質ＡまたはＧ分子に結合することによって遂行され得る。候補薬剤分子（例えば、ジェネリックまたはバイオ後続品）および参照薬剤分子（例えば、ブランド薬剤）は、それらが構造的に同等であり、同一の方法で標識され、界面に繋留されている場合に、同じ基準信号を有するはずである。そうではない場合、ＳＨＧまたは非線形光学シグネチャの差異は、それらの差異の構造的証拠を提供するであろう。いくつかの実施形態では、構造類似性の程度（または逆に、構造相違性の程度）は、該当する場合、標識生物学的薬剤候補および参照薬剤に関して基準ＳＨＧ信号（または他の非線形光学信号）の測定の間で、差異の統計的有意性を決定することによって、査定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標識生物学的薬剤候補および参照薬剤に関する基準ＳＨＧ信号測定のセットの０．００１未満、０．００５未満、０．０１未満、０．０２未満、０．０３未満、０．０４未満、または０．０５未満のｐ値は、測定された基準信号の差異が有意に異なり、生物学的薬剤候補および参照薬剤が構造的に同等ではないことを示し得る。
【０１２５】
第２の実施形態では、標的分子（例えば、ｍＡｂ薬剤または生物学的薬剤候補のための抗原）は、ＳＨＧ活性または他の非線形活性標識を用いて標識され、当業者に公知である種々の手段のうちのいずれかによって、光学界面に繋留されてもよい。標的分子で誘発される配座変化から生じるＳＨＧまたは他の非線形光学信号強度（または非線形光学信号の他の物理的性質）の変化は、次いで、標識標的を１つ以上の候補生物学的薬剤または参照薬剤と接触させることに応じて、監視されてもよい。ＳＨＧ信号またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比（シグネチャ）の結果として生じる変化の比較は、次いで、標的分子との結合相互作用および／または標的分子で誘発される配座変化の観点から、参照薬剤への薬剤候補の類似性を確立するための手段を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、薬剤候補と参照薬剤との間の構造類似性の程度（または逆に、構造相違性の程度）は、該当する場合、標的分子を生物学的薬剤候補および参照薬剤と接触させることに応じて、標識標的分子に関してＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の測定された変化の間の差異の統計的有意性を決定することによって、査定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標識標的分子に関するＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の測定された変化のセットの０．００１未満、０．００５未満、０．０１未満、０．０２未満、０．０３未満、０．０４未満、または０．０５未満のｐ値は、測定された信号変化の差異が有意に異なり、生物学的薬剤候補および参照薬剤が構造的に同等ではないことを示し得る。
【０１２６】
第３の実施形態では、候補薬剤分子（例えば、ｍＡｂ薬剤候補）および参照薬剤分子（例えば、ｍＡｂ薬剤）は、非線形活性部分を用いて標識され、光学界面に繋留されてもよく、ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）は、繋留薬剤候補および参照薬剤が、続いて、生物学的標的分子（例えば、ｍＡｂ薬剤または薬剤候補の場合は抗原）と接触されるにつれて監視されてもよい。再度、２つの薬剤分子が同じ（または実質的に同一）である場合、それらを標的分子（例えば、抗原）と接触させることは、ＳＨＧ信号またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比（シグネチャ）の対応する変化によって示されるように、同じ配座応答を引き起こすはずである。例えば、いくつかの実施形態では、薬剤候補と参照薬剤との間の構造類似性の程度（または逆に、構造相違性の程度）は、該当する場合、標識薬剤候補および参照薬剤を標的分子と接触させることに応じて、それらに関してＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の測定された変化の間の差異の統計的有意性を決定することによって、査定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標識生物学的薬剤候補および参照薬剤に関するＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の測定された変化のセットの０．００１未満、０．００５未満、０．０１未満、０．０２未満、０．０３未満、０．０４未満、または０．０５未満のｐ値は、測定された信号変化の差異が有意に異なり、生物学的薬剤候補および参照薬剤が構造的に同等ではないことを示し得る。
【０１２７】
第４の実施形態では、標識生物学的薬剤候補（例えば、ｍＡｂ薬剤候補）または参照薬剤（例えば、ブランドｍＡｂ薬剤）が、表面に繋留される非標識標的タンパク質（例えば、抗原）に追加されることができる。結合は、標識、したがって、基準信号の正味の平均配向を生成するはずである。薬剤候補がブランド生物学的薬剤と同じである場合、両方が、同一の基準ＳＨＧまたは他の非線形光学信号を生成するはずである。いくつかの実施形態では、構造類似性の程度（または逆に、構造相違性の程度）は、該当する場合、標識生物学的薬剤候補および参照薬剤に関して基準ＳＨＧ信号（または他の非線形光学信号）の測定の間の差異の統計的有意性を決定することによって、査定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標識生物学的薬剤候補および参照薬剤に関する基準ＳＨＧ信号測定のセットの０．００１未満、０．００５未満、０．０１未満、０．０２未満、０．０３未満、０．０４未満、または０．０５未満のｐ値は、測定された基準信号の差異が有意に異なり、生物学的薬剤候補および参照薬剤が構造的に同等ではないことを示し得る。
【０１２８】
上記で開示される実施形態のうちのいずれかでは、構造同値を確立するための方法はさらに、２光子蛍光（ＴＰＦ）信号の瞬間または順次測定、および界面の単位面積あたり繋留された分子の数（すなわち、界面上の繋留分子の表面密度または数密度）に測定された非線形信号を正規化する目的のためにＳＨＧ：ＴＰＦ信号比（またはＳＦＧ：ＴＰＦ信号比またはＤＦＧ：ＴＰＦ信号比）を計算するためのその使用を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、生物学的薬剤候補および参照薬剤を界面に繋留することに先立ってそれらを標識するために使用される非線形活性（すなわち、ＳＨＧ活性、ＳＦＧ活性、またはＤＦＧ活性）標識はまた、第２高調波、和周波数、または差周波数光を生成するために使用されるものと同一である、または異なる、基本周波数の光を用いて照明されるときに、２光子蛍光を生成してもよい。いくつかの実施形態では、生物学的薬剤候補および参照薬剤は、ＳＨＧ活性、ＳＦＧ活性、またはＤＦＧ活性標識と異なる２光子蛍光標識を用いて標識されてもよい。２光子蛍光信号が、励起されている標識分子の数に直線的に関連するため、２光子蛍光信号は、ＳＨＧ（またはＳＦＧまたはＤＦＧ）信号を正規化し、繋留分子の表面密度の変動を補正するための手段を提供する。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、全内部反射を使用する、界面への基本光（すなわち、典型的にはレーザによって提供される励起光）の送達によって励起されてもよい。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、（例えば、落射蛍光光学設定を使用して）界面の平面に直交する方向へ、または界面の平面に直交しない恣意的角度における基本光の送達によって励起されてもよい。いくつかの実施形態では、基本周波数光を用いた照明に応じて励起される２光子蛍光は、例えば、放射された２光子蛍光が、顕微鏡対物レンズを使用して収集される、落射蛍光光学設定を使用して、検出および測定されてもよい。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、励起光が集束され、界面の平面と平行であるように配向される点の直接上方および下方のいずれかに位置付けられる、低ＮＡピンホール（すなわち、レンズの使用を伴わない）を使用して、検出および測定されてもよい。集光レンズ、顕微鏡対物レンズ、またはピンホール（および付加的レンズ、鏡、ダイクロイック反射体、帯域通過フィルタ、および／または開口等の任意の中間光学要素）を通過する２光子蛍光が、次いで、光電子増倍管または他の好適な検出器を使用して検出されてもよい。ＰｙＭＰＯ色素および類似体は、好適なＴＰＦ色素、例えば、１−（２−マレイミドイルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホン酸塩である、ＰｙＭＰＯマレイミドである。
【０１２９】
バイオ後続「フィンガプリント」を確立する：開示される方法およびシステムは、したがって、種々の治療標的のうちのいずれかを標的にする参照薬剤への生物学的薬剤候補（すなわち、バイオ後続薬剤候補）の生体類似性を確立するために使用されてもよい。いくつかの近年の出版物が、種々の直交構造および機能特性評価技法の使用、および完全生体類似性を実証するための「フィンガプリント様」比較データセットの収集の要求を強調している（例えば、Ｇｒｅｅｒ，  （２０１６），  “Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ  Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ”，  Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  Ｉｓｓｕｅ  ０９１６−４０１、およびＤｅｃｌｅｒｃｋ，  （２０１３），  “Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ”，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １３（２）：１５３−１５６を参照）。バイオ後続「フィンガプリント」の概念は、バイオ後続薬剤開発者が、バイオ後続品および参照薬剤の同値を実証するために使用される技法を慎重に考慮することを確実にするように、ＦＤＡによって導入された。
【０１３０】
臨床および非臨床データの両方が、生体類似性を実証するために使用され、構造および機能特性評価のために採用される技法は、典型的には、バイオ後続品によって変動するであろう。例えば、治療モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）に関して生体類似性を実証しようとする際に、それらが、それらの作用モードに寄与し、それらの臨床性質に影響を及ぼす、複数のペプチドドメインを備えることを認識することが重要である（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ（２０１３））。Ｆａｂ領域は、標的との特異的結合相互作用に関与する可変ペプチドドメインを含有する。Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）において重要な役割を果たし、シグナリング経路を誘起することによって、細胞周期に他の一般的調節作用を及ぼし得る。Ｆｃ領域は、グリコシル化され、グリコシル化のタイプおよび程度は、エフェクタ機能およびクリアランス率の両方に影響を及ぼす。Ｆａｂ領域もまた、グリコシル化され、機能へのその潜在的影響は、無視されるべきではない。したがって、バイオ後続ｍＡｂｓの評価は、Ｆａｂ媒介抗原結合だけではなく、Ｆｃ媒介機能（例えば、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、補体への結合）の特性評価も含むべきである。Ｆａｂ関連機能の特性評価は、抗原結合の決定に制限されるべきではないが、標的への予期される機能的影響（例えば、中和、受容体遮断、および受容体活性化）の検査も含むべきである。本複雑性により、ｍＡｂｓの生体類似性を実証することは、生体外構造／機能評価だけではなく、広範な生体内機能評価も要求し得る。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙによって発行されたガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  Ｓｉｍｉｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ｎｏｎ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ，  ２０１２）によると、ｍＡｂ生体類似性を実証する際の第１のステップは、特定の結合および機能特性の評価を含む。バイオ後続品および参照が、（ｉ）標的抗原への結合、（ｉｉ）関連性のある３つのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃＲｎ、および補体（Ｃ１ｑ）の代表的アイソフォームへの結合、（ｉｉｉ）Ｆａｂ関連機能（例えば、可溶性リガンドの中和、受容体活性化または遮断）、および（ｉｖ）Ｆｃ関連機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および補体活性化）に関して、相互と比較される、生体外特性評価研究が、要求される。生体内非臨床試験の必要性は、生体外特性評価データの評価、およびｍＡｂ薬剤候補と参照薬剤との間の関連構造差（例えば、新しい翻訳後修飾）または機能差（例えば、結合親和性、Ｆａｂ関連機能、またはＦｃ関連機能の変化）が識別されている程度に基づく。決定的な差異が生体外特性評価データにおいて識別された場合には、関連動物モデル研究が正当化され得る。
【０１３１】
バイオ後続フィンガプリントを確立するために要求され得る、構造特性評価データの実施例は、例えば、一次構造（質量分析によって、または核酸配列決定を実施することによって決定されるアミノ酸配列等）、高次構造（二次、三次、および四次構造（凝集を含む）を含む）、酵素翻訳後修飾（グリコシル化およびリン酸化等）、および他の潜在的構造変動（タンパク質脱アミドおよび酸化等）を含んでもよい。意図的な化学修飾（ＰＥＧ化部位および特性等）の構造特性評価もまた、要求され得る。
【０１３２】
生体類似性を確立する際のそれらの使用に加えて、開示される方法およびシステムはまた、バイオ後続薬剤のための品質仕様を確立するために使用されてもよい。ＩＣＨ  Ｔｏｐｉｃ  Ｑ６Ｂは、生物学的薬剤製品のための品質特異的仕様を設定するための試験手順を定義する、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅからのガイドラインである（Ｇｒｅｅｒ，  （２０１６），  “Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ  Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ”，  Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  Ｉｓｓｕｅ  ０９１６−４０１）。バイオ後続薬剤の構造特性評価のための６つの仕様要件、すなわち、（ｉ）アミノ酸配列、（ｉｉ）アミノ酸組成、（ｉｉｉ）末端アミノ酸配列、（ｉｖ）ペプチドマップ、（ｖ）スルフヒドリル基およびジスルフィド架橋、および（ｖｉ）炭水化物構造（適切である場合）が記述される。また、バイオ後続薬剤の物理化学特性評価のための６つの仕様要件、すなわち、（ｉ）分子量またはサイズ、（ｉｉ）アイソフォームパターン、（ｉｉｉ）消散係数、（ｉｖ）電気泳動パターン、（ｖ）液体クロマトグラフパターン、および（ｖｉ）分光学的プロファイルも存在する。バイオ後続薬剤候補および薬剤の構造および／または物理化学性質を決定するために現在使用されている、異なる特性評価技法およびツールの実施例が、表２に列挙される。現在開示されている非線形光学方法が適用可能であり得る、性質決定の非限定的実施例が、表に示される。
【表２】
2020519866.tif 000013
【０１３３】
生物学的薬剤候補の薬理活性（例えば、有効性、効能、および負の副作用の発生率）は、当業者に公知である種々の生体外および／または生体内機能分析を使用して、評価されてもよい。使用され得る生体外分析の実施例は、限定ではないが、生物学的分析、結合分析、酵素分析、および細胞ベースの分析（例えば、細胞増殖分析または細胞ベースのレポータ分析）を含む。生体内分析の実施例は、薬力学的マーカまたは有効性測定値への候補薬剤の機能的影響を評価するための疾患の動物モデル（例えば、病状または症状を呈するモデル）を使用する、動物モデル研究の使用を含んでもよい。これらの機能分析データを使用する、候補薬剤を参照薬剤と比較する機能評価は、生体類似性の実証の重要な部分であり、さらに、動物研究および／またはヒト患者を用いた臨床研究への選択的な標的アプローチを科学的に正当化するために使用されてもよい。
【０１３４】
したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質構造および配座シグネチャの非線形光学測定を使用する、生物学的薬剤候補および参照薬剤の比較のための開示される方法は、生体類似性のより完全な特性評価を提供するように、他の構造および／または機能分析技法と対合されてもよい。これらの実施形態では、候補生物学的薬剤および参照薬剤の非線形光学特性評価および比較は、上記で概説されるように、他の構造または機能分析と並行して、または順次に実施されてもよく、構造同値、配座シグネチャおよび効能（例えば、薬剤濃度の関数としての応答の規模）、結合親和性、結合特異性、反応速度、および他の構造特性評価データ（例えば、円偏光二色性または結晶学的データ）、細胞内シグナリング経路および／または遺伝子発現プロファイルへの影響、および同等物に基づいて、候補および参照薬剤の比較を提供してもよい。いくつかの実施形態では、薬剤候補（またはジェネリック薬剤）および参照薬剤（またはブランド薬剤）は、１つ以上の構造および／または機能特性に基づいて類似すると考えられ得るが、１つ以上の異なる構造および／または機能特性に基づいて異なると考えられ得、本開示の方法は、生体類似性を確認する、またはその反証を挙げることを可能にし得る。
【０１３５】
２つ以上のサンプルの構造比較、プロセス最適化、プロセス監視、または品質管理目的のための開示される方法、デバイス、およびシステムの使用は、標準化された標識、繋留、または固定化、および測定プロトコルの確立だけではなく、異なる時点において、プロセスの異なるステップにおいて、または異なるタンパク質ロットから収集されるタンパク質サンプルに関する基準ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）が比較され、「同等」と判断される、基準の開発も要求するであろう。多くの場合、基準は、タンパク質特異的であり得、おそらく、本明細書に開示されるＳＨＧ基準信号測定技法（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比測定技法）および他の構造または機能特性評価方法の両方を利用する、比較研究を実施することによって、確立される必要があろう。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、例えば、異なる時間に、またはプロセスの中の異なるステップ後に、またはタンパク質の異なるロットから収集されるタンパク質サンプルが、同等構造を有すると結論付けるために要求される、基準ＳＨＧ信号（または基準ＳＨＧ対ＴＰＧ信号比）の許容変動の範囲を規定することが必要であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質サンプルが同等構造を有すると結論付けるために要求される基準ＳＨＧ信号（または他の非線形光学信号）の最大許容変動は、約０．１％〜約１０％に及んでもよい。いくつかの実施形態では、基準ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の最大許容変動は、少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％であってもよい。いくつかの実施形態では、基準ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の最大許容変動は、最大で１０％、最大で９％、最大で８％、最大で７％、最大で６％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、最大で１％、最大で０．５％、最大で０．２５％、または最大で０．１％であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、基準ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の最大許容変動は、約２％〜約６％に及んでもよい。当業者は、基準ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の最大許容変動が、本範囲内の任意の値、例えば、約４．５％を有し得ることを認識するであろう。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、別の実施例として、比較される２つ以上のタンパク質サンプルの収集の合間に経過する許容時間量が約１分〜約１週間に及ぶことを要求することが必要であり得る。いくつかの実施形態では、比較される２つ以上のタンパク質サンプルの収集の合間に経過する許容時間量は、少なくとも１分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、または少なくとも７日であってもよい。いくつかの実施形態では、比較される２つ以上のタンパク質サンプルの収集の合間に経過する許容時間量は、最大で７日、最大で６日、最大で５日、最大で４日、最大で３日、最大で２日、最大で１日、最大で１８時間、最大で１２時間、最大で６時間、最大で５時間、最大で４時間、最大で３時間、最大で２時間、最大で１時間、最大で５０分、最大で４０分、最大で３０分、最大で２０分、最大で１０分、または最大で１分であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、比較される２つ以上のタンパク質サンプルの収集の合間に経過する許容時間量は、約１０分〜約２時間に及んでもよい。当業者は、比較される２つ以上のタンパク質サンプルの収集の合間に経過する許容時間量が、本範囲内の任意の値、例えば、約４５分を有し得ることを認識するであろう。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、タンパク質サンプルの収集と基準ＳＨＧ信号測定（または他の基準非線形光学信号測定、例えば、ＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）の実施との間に経過する最大時間量は、約１０分〜約８時間に及んでもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質サンプルの収集と基準ＳＨＧ信号測定（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比測定）の実施との間に経過する最大時間量は、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、または少なくとも８時間であってもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質サンプルの収集と基準ＳＨＧ信号測定（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比測定）の実施との間に経過する最大時間量は、最大で８時間、最大で７時間、最大で６時間、最大で５時間、最大で４時間、最大で３時間、最大で２時間、最大で１時間、最大で５０分、最大で４０分、最大で３０分、最大で２０分、または最大で１０分であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、タンパク質サンプルの収集と基準ＳＨＧ信号測定（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比測定）の実施との間に経過する最大時間量は、約２０分〜約２時間に及んでもよい。当業者は、タンパク質サンプルの収集と基準ＳＨＧ信号測定（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号比測定）の実施との間に経過する最大時間量が、本範囲内の任意の値、例えば、約２．５時間を有し得ることを認識するであろう。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質サンプルの確実な比較を取得するためにタンパク質サンプル毎に要求される反復測定の数は、約１回の反復〜約６回の反復に及んでもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質サンプル毎に要求される反復測定の数は、少なくとも１回の反復、少なくとも２回の反復、少なくとも３回の反復、少なくとも４回の反復、少なくとも５回の反復、または少なくとも６回の反復であってもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質サンプル毎に要求される反復測定の数は、最大で６回の反復、最大で５回の反復、最大で４回の反復、最大で３回の反復、最大で２回の反復、または最大で１回の反復であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、タンパク質サンプル毎に要求される反復測定の数は、約２回の反復〜約４回の反復に及んでもよい。当業者は、タンパク質サンプル毎に要求される反復測定の数が、本範囲内の任意の値、例えば、約３回の反復を有し得ることを認識するであろう。
【０１４０】
上記のように、多くの場合、２つ以上のサンプルの間の構造同値を確立するための基準は、タンパク質特異的であり得、おそらく、本明細書に開示されるＳＨＧ基準信号測定技法および他の構造または機能特性評価方法の両方を利用する、比較研究を実施することによって、確立される必要があろう。開示される非線形光学測定技法と組み合わせて実施され得る、好適な構造特性評価技法の実施例は、限定ではないが、円偏光二色性研究、核磁気共鳴（ＮＭＲ）研究、Ｘ線結晶構造解析研究、分子モデル化研究、および同等物を含む。好適な機能特性評価研究の実施例は、限定ではないが、リガンド結合分析、酵素分析、免疫学的検定、および同等物を含む。
【０１４１】
検出される他のタイプの生物学的相互作用：タンパク質および他の生体分子の配向または構造を決定または比較することに加えて、本明細書に開示される方法およびシステムは、採用される生物学的実体、試験実体、および非線形活性標識技法の選択肢に応じて、生物学的実体の間、または生物学的実体と試験実体との間の種々の相互作用の検出を提供する。一側面では、本開示は、受容体で誘発される、結果として生じる配座変化によって示されるように、結合事象、例えば、受容体へのリガンドの結合の定性的検出を提供する。別の側面では、本開示は、異なる濃度のリガンド分子を使用して、反復測定を実施し、観察される最大配座変化の変化率を使用して、容量応答曲線を生成することによって、結合事象、例えば、受容体へのリガンドの結合の定量的検出を提供する。同様に、本開示の他の側面は、酵素・阻害剤相互作用、抗体・抗原相互作用、生物学的巨大分子の錯体の形成、アロステリック調節因子との受容体の相互作用、候補薬剤・薬剤標的相互作用、タンパク質・タンパク質相互作用、表在性膜タンパク質・表在性膜タンパク質相互作用、表在性膜タンパク質・内在性膜タンパク質相互作用、表在性膜タンパク質・リン脂質二重層相互作用等の定性的または定量的測定のための方法を提供し得る。
【０１４２】
生物学的実体または生物学的実体と試験実体との間の相互作用（例えば、結合反応、配座変化等）は、現在開示されている方法を通して、および信号比、例えば、ＳＨＧ対ＴＰＦ信号強度比の測定を通して、以下の測定可能な非線形信号パラメータ、すなわち、（ｉ）非線形光の強度、（ｉｉ）非線形光の波長またはスペクトル、（ｉｉｉ）非線形光の偏光、（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の時間経過、および／またはｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のうちの１つ以上の組み合わせに相関し得る。
【０１４３】
絶対極性配向決定：研究室基準系内の標識の傾転角配向が決定されることができるが、本傾転角は、それぞれ、表面に向かって、およびそこから離れて指し示す、２つの円錐で縮退する。本発明はまた、単純な実験を使用して、標識の絶対方向、すなわち、標識が表面の平面に対して指し示す方向を取得するための新規の方法も開示する。本実験では、所与の偏光条件下のＳＨＧ信号は、ｉ）非標識表面に付着した標識タンパク質、ｉｉ）標識表面に付着した非標識タンパク質、およびｉｉｉ）標識表面に付着した標識タンパク質を使用して、測定される。標識表面は、例えば、アミノシラン機能性ガラス基板表面へのカルボキシル化非線形活性標識の共有カルボジイミド結合を通して、当業者に公知である種々の方法で調製されることができる。代替として、支持脂質二重層（ＳＬＢ）を用いると、アミンまたはチオール（例えば、リシンまたはシステイン残基側鎖に対応する）を介してタンパク質に付着する同一の非線形活性標識を、変動するモル百分率のアミンまたはチオール含有脂質でドープされた二重層に共有結合することができる。本表面は、次いで、標識がタンパク質標識のものと同一であるため、タンパク質から生成されるＳＨＧ信号と同相である、その独自のＳＨＧ信号を提供する。支持二重層に付着した標識は、表面およびその化学構造へのその既知の指向性結合により、既知の極性配向を有する。タンパク質上の標識の絶対極性配向（したがって、潜在的にタンパク質全体の極性配向）を決定するための実験が、以下のように実施されることができる。第１に、タンパク質がない場合の標識表面のＳＨＧ信号が、測定される（ＩＬ）。第２に、非標識表面に付着した標識タンパク質のＳＨＧ信号が、測定される（ＩＰ）。第３に、表面のＳＨＧ信号が、標識タンパク質が標識表面に付着されるときに測定される（ＩＴＯＴ）。異なるＳＨＧ信号の間の関係は、以下の通りである。
【化１０】
2020519866.tif 000014
式中、ｃｏｓ（θ）は、第３の測定（ＩＴＯＴ）におけるタンパク質分子に付着した標識と表面との間の位相関係（表面に向かった、またはそこから離れた絶対極性配向を伴って符号が反転する）を表す。ＩＴＯＴ、ＩＬ、およびＩＰを別個に測定し、測定された信号強度を比較することによって、タンパク質上の各標識の絶対極性配向が、決定されることができる。ある場合には、例えば、ＩＬ＋ＩＰがほぼ同程度の規模であるとき、ＩＴＯＴが独自でＩＬよりも小さい場合、相殺的干渉がタンパク質標識と表面標識との間で起こっており、したがって、標識は、反対極性配向に配向され、ＩＴＯＴが独自でＩＬよりも大きい場合、相殺的干渉が起こっており、標識が同一極性方向に配向されることを即時に決定することができる。ＩＬ＋ＩＰの規模は、例えば、色素のための支持二重層上の付着部位の密度、または表面に付着したタンパク質の密度を調整することによって、変動されることができる。類似様式で、バイオ分子に付着した色素プローブとバイオ分子がない場合の背景との間の位相差が、異なる測定において異なる割合の標識および非標識バイオ分子を配列する一方で、各測定を横断してバイオ分子の全濃度を一定に保つことによって、決定されることができる。このようにして、背景と非線形活性プローブとの間の干渉は、背景および色素プローブによって生成されるＳＨＧ波の間の位相差に依存する強度を生成するであろう。これは、例えば、ウェル内で同一の全タンパク質濃度を培養するが、標識および非標識タンパク質の割合を変動させることによって、最も単純に遂行されることができる。各ウェルは、タンパク質の同一の表面密度を呈するはずであるが、標識および非標識タンパク質の割合は、培養中のそれらの濃度比を反映するであろう。全測定強度ＩＴＯＴは、したがって、背景信号（例えば、表面＋水＋非標識タンパク質）および標識タンパク質信号から生成されるＳＨＧ波の間の位相差に依存するはずである。標識および非標識タンパク質の異なる比において連続実験を実施し、ＩＴＯＴを測定することによって、色素プローブの相対配向は、方程式（７）を使用して、背景と色素標識との間の干渉が建設的または破壊的であるかどうかを決定することによって取得されることができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、非線形活性標識表面は、アミノシラン機能性ガラス基板表面へのカルボキシル化非線形活性標識の共有カルボジイミド結合を使用して調製される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識表面は、支持脂質二重層を備え、支持脂質二重層はさらに、非線形活性標識が共有結合される、アミンまたはチオール含有脂質から成る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、非線形活性標識タンパク質は、アミノシラン機能性ガラス基板表面へのタンパク質のＣ末端の共有カルボジイミド結合を使用して、非標識または非線形活性標識表面上に配向された様式で繋留される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識タンパク質は、支持脂質二重層を備える非標識または非線形活性標識表面上に配向された様式で繋留され、非線形活性標識タンパク質は、支持脂質二重層の中に挿入される、または支持脂質二重層の中に挿入されるアンカ分子に付着される。標識タンパク質および他のバイオ分子を基板表面または支持脂質二重層に繋留するための方法が、下記でより詳細に説明されるであろう。
【０１４６】
要約すると、繋留タンパク質に付着した非線形活性標識の絶対配向を決定するための開示される方法は、（ａ）少なくとも１つの基本周波数の励起光の照明の結果として、非線形活性表面によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、検出は、励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと、（ｂ）非標識表面上に配向された様式で繋留される非線形活性標識タンパク質によって生成される、光の物理的性質を検出するステップであって、光は、少なくとも１つの基本周波数の励起光を用いた照明の結果として生成され、検出は、励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと、（ｃ）非線形活性標識表面上に配向された様式で繋留される非線形活性標識タンパク質によって生成される、光の物理的性質を検出するステップであって、光は、少なくとも１つの基本周波数の励起光を用いた照明の結果として生成され、検出は、励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと、（ｄ）ステップ（ａ）における光の物理的性質、ステップ（ｂ）において検出される光の物理的性質、およびステップ（ｃ）において検出される光の物理的性質を比較することによって、繋留タンパク質に付着した非線形活性標識の絶対配向を決定するステップとを含んでもよい。配向幅が狭いと仮定または把握される場合、２つの直交偏光状態（例えば、ｓおよびｐ偏光）の下で測定されるＴＰＦ強度の比を使用し、標識の配向、すなわち、遷移双極子モーメントと表面に対する法線軸との間の角度を決定することができる。同様に、プローブ内の優位超分極率成分と法線軸との間の角度は、２つの直交偏光の下のＳＨＧ強度の比を求めることによって決定されることができる。分布幅および平均角度の同時決定に関して、下記の実施例に示されるように、別個に、強度の各比（それぞれ、ｐおよびｓ偏光の下のＴＰＦおよびＳＨＧ）を満たす、２つの平均角度、幅軌道の交差点について解法する。
【０１４７】
電場配向、強度、および特性：いくつかの実施形態では、電場が、界面における研究室基準系内のバイオ分子の配向を操作するように印加されることができる。電場方向は、それと垂直である、または一般に、表面の平面に対して任意の角度にある、表面を横断し得る。一実施形態では、１つの電極が、基板、例えば、ガラス基板へのタンパク質付着のための脂質二重層膜または他の表面化学の下に設置される。対電極が、例えば、サンプルウェル内の液体の上部において、基板表面の平面の上方に設置される。別の実施形態では、２つ以上の電極が、基板表面の平面内に設置され、電場方向は、基板・膜界面と平行である。
【０１４８】
別の実施形態では、電極のアレイが、図４に図示されるように、繋留または固定化バイオ分子、例えば、タンパク質サンプルの周囲に設置されることができる。例えば、電極の円形アレイが、それぞれ相互から約１０度離間され、ガラス基板表面上の膜界面と平行に設置されることができる。相互から１８０度離れている一対の電極に印加される電圧は、電場の方位角方向が自由自在かつ迅速に変更されることを可能にする。例えば、電場の方位角方向は、１秒または数分の１秒で円全体の周囲に掃引されることができる。
【０１４９】
電極は、当業者に公知である種々の技法のうちのいずれかを使用して、基板表面上でパターン化されてもよい。実施例は、限定ではないが、スクリーン印刷、フォトリソグラフィパターン化、スパッタコーティング、化学蒸着、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１５０】
電極は、当業者に周知であるように、種々の材料のうちのいずれかから加工されてもよい。好適な電極材料の実施例は、限定ではないが、銀、金、白金、銅、アルミニウム、黒鉛、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、半導体材料、伝導性ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、例えば、水性緩衝剤と接触している電極表面の腐食を最小限にするため、および／またはタンパク質または他の生物学的成分の汚染またはそれによる干渉を防止するため、および／またはサンプル中の電流を防止するために、１つ以上の電極の表面を不動態化することが望ましくあり得る。当業者に公知である種々の不動態化技法のうちのいずれかが、使用されてもよく、一般に、電極を加工するために使用される材料の選択肢に依存するであろう。例えば、ガラス基板上のインジウムスズ酸化物電極は、３０ｎｍのＳｉＯ２層の成長または堆積によって不動態化されてもよい。金属または半導体電極は、多くの場合、空気への暴露に応じて、不動態化層としての役割を果たし得る、不活性「自然酸化物」層を発生させるであろう。本不活性表面層は、通常、白金に関しては単層（１−３Å）、シリコンに関しては約１５Åの厚さを伴う、酸化物または窒化物であり、空気への長い暴露後に、アルミニウムに関しては厚さ５０Åに近くあり得る。
【０１５２】
電場は、ＤＣまたはＡＣ、すなわち、時不変または時変であり得る。後者の場合、これは、任意の周波数の正弦波を要し得、または多くの周波数成分から成る複合波（例えば、ステップ関数、鋸歯パターン等）であり得、電場は、正または負の値の間で発振する、または全て正または負のままであることができる。非周期的またはパルス電場もまた、いくつかの実施形態では、印加されることができる。ＳＨＧ信号（またはＳＨＧ対ＴＰＦ信号の比）が、サンプルへの電場の印加の前、間、または後に読み取られることができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、電場強度は、約ゼロ〜約１０６Ｖ／ｃｍまたはそれより大きく及んでもよい。いくつかの実施形態では、電場強度は、少なくともゼロ、少なくとも１０Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０２Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０３Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０４Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０５Ｖ／ｃｍ、または少なくとも１０６Ｖ／ｃｍであってもよい。いくつかの実施形態では、電場強度は、最大で１０６Ｖ／ｃｍ、最大で１０５Ｖ／ｃｍ、最大で１０４Ｖ／ｃｍ、最大で１０３Ｖ／ｃｍ、最大で１０２Ｖ／ｃｍ、最大で１０Ｖ／ｃｍであってもよい。当業者は、電場強度が、本範囲内の任意の値、例えば、約５００Ｖ／ｃｍを有し得ることを認識するであろう。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、電場が変動される周波数は、約０Ｈｚ〜約１０５Ｈｚに及んでもよい。いくつかの実施形態では、電場が変動される周波数は、少なくとも０Ｈｚ、少なくとも１０Ｈｚ、少なくとも１０２Ｈｚ、少なくとも１０３Ｈｚ、少なくとも１０４Ｈｚ、または少なくとも１０５Ｈｚであってもよい。いくつかの実施形態では、電場が変動される周波数は、最大で１０５Ｈｚ、最大で１０４Ｈｚ、最大で１０３Ｈｚ、最大で１０２Ｈｚ、または最大で１０Ｈｚであってもよい。当業者は、電場が変動される周波数が、本範囲内の任意の値、例えば、約１２５Ｈｚを有し得ることを認識するであろう。
【０１５５】
電場は、タンパク質分子または他のバイオ分子の配向、したがって、基準ＳＨＧ信号（または基準ＳＨＧ対ＴＰＦ信号比）またはＳＨＧ（またはＳＨＧ対ＴＰＦ）偏光依存性を操作するために、使用されることができる。いくつかの実施形態では、基板表面の平面（すなわち、ＸＹ平面）内の配向等方性が、印加される電場がない場合に起こり、電場が印加されるときに留保される場合、非線形感受性（χ（２））の２つまたは３つだけの独立したゼロになることのない成分が存在するであろう。電場の印加の前、間、または後のいずれかで、配向異方性が表面の平面内に存在する、他の実施形態では、χ（２）の２つまたは３つを上回る独立したゼロになることのない成分が存在し、偏光された基本および第２高調波光の異なる組み合わせを用いた付加的独立ＳＨＧ測定を可能にするであろう。配向異方性が表面の平面に（例えば、標識タンパク質が付着される脂質生体膜に）存在する、いくつかの実施形態では、χ（２）の複数の独立測定が、異なる方位角において行われることができる。例えば、電場が表面と平行に印加され、これが等方性平面内から異方性平面内へのタンパク質分子の配向分布の変化を引き起こす場合、付加的独立光学測定が、分子配向分布を決定するように、印加される電場の方向に対して多くの方位角方向に行われることができる。
【０１５６】
統合電極を伴う光学マルチウェルプレート：下記でより詳細に議論されるであろうように、いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるＴＰＦおよび／またはＳＨＧ測定は、マイクロウェルプレート形式を使用して優先的に実施される。一般に、これらのデバイスは、（ａ）複数の離散領域をさらに備える、第１の表面を備える基板であって、各離散領域はさらに、電極のパターン化されたアレイと、随意に、支持脂質二重層とを備える、基板と、（ｂ）各離散領域が単一のウェル内に含有されるように、基板の第１の表面に結合または統合される、ウェル形成構成要素とを備える。３８４ウェルプレート（または他のマイクロウェルプレートまたはマルチチャンバ形式）を使用する、いくつかの実施形態では、電極は、ウェルの内側の基板表面上でウェルの壁に隣接して、ウェルを密閉するために使用される蓋の一部として、ウェル内の（ガラスであり得る）基板表面上の他の場所で、またはサンプル上で電場を生成するための電圧の印加およびＴＰＦおよび／またはＳＨＧ信号の光学読取の両方を可能にするいずれかの場所で、パターン化されることができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、複数のウェルは、さらに非線形活性標識タンパク質（または他の生物学的実体）から成る、支持脂質二重層を備える。いくつかの実施形態では、複数の支持脂質二重層はさらに、それぞれに同一である、非線形活性タンパク質から成る。いくつかの実施形態では、複数の支持脂質二重層はさらに、（例えば、複数のウェルの２つ以上のサブセットの中に存在する）支持脂質二重層の２つ以上のサブセットを備え、支持脂質二重層の各サブセットは、異なる非線形活性タンパク質から成る。いくつかの実施形態では、基板は、ガラス、溶融石英、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、光学的透明材料から加工される。いくつかの実施形態では、電極のパターン化されたアレイは、支持脂質二重層を囲繞する基板表面上でパターン化される、２つ以上の電極のアレイを備える。いくつかの実施形態では、電極のパターン化されたアレイは、ウェル形成ユニットの各ウェルの壁上でパターン化される、２つ以上の電極のアレイを備える。いくつかの実施形態では、電極のパターン化されたアレイは、各ウェルを密閉する蓋上でパターン化される、少なくとも１つの電極を備える。いくつかの実施形態では、ウェル形成ユニットは、９６個のウェルを備える。いくつかの実施形態では、ウェル形成ユニットは、３８４個のウェルを備える。いくつかの実施形態では、ウェル形成ユニットは、１，５３６個のウェルを備える。いくつかの実施形態では、デバイスはさらに、基板の第２の表面と統合され、第１の表面から完全に内部反射されるように励起光を基板の第１の表面に送達するように構成される、プリズムのアレイを備える。
【０１５８】
半球プリズムを伴う光学マルチウェルプレート：いくつかの実施形態では、特に、分子の異方性配向分布が表面に存在する場合において、異方性軸に対して異なる方位角方向においてサンプルを光学的に探査することが有用であろう。光学軸に対してサンプルを回転させることの代替として、光学軸は、固定されたサンプルに対して回転されることができる。これを遂行するために、各ウェルの底部に、またはウェルの近傍に設置される半球プリズムが、ウェルに対する恣意的角度においてプリズム上に入射する入射光を、分子を含有する界面領域に指向するために使用されることができる。いくつかの実施形態では、半球プリズムは、図５に図示されるように、ガラス底部マルチウェルプレート内で基板に結合または統合される。半球プリズムは、マルチウェルプレートと光学的に接触し、それによって、最小限の損失を伴って光学ビームの透過を可能にする。いくつかの実施形態では、光学マルチウェルプレートは、３８４ウェルガラス底部プレートまたは他のガラス底部マイクロウェルプレート形式（すなわち、当業者に周知である標準マイクロウェルプレート形式）を備えるであろう。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ウェルの底部を形成するガラス基板に結合または統合された半球プリズムのアレイを備える、マイクロウェルプレートデバイスはさらに、異なる電場強度の電場を印加する一方で、偏光ＴＰＦおよび／またはＳＨＧ測定が行われ得るように、各ウェル内のガラス基板の上面上に電極のパターン化されたアレイを備えてもよい。
【０１６０】
配座およびリガンド誘発配座変化の測定：一実施形態では、リガンド誘発配座変化（例えば、局所配座変化）が、タンパク質内の１つ以上の標識部位において測定される。一実施形態では、単一部位システイン残基が、使用される。偏光された基本光および非線形光測定の組み合わせが、リガンド追加の前および後に、χ（２）の成分を決定するために使用される。例えば、バイオ分子が表面上で等方的に配向され、分子超分極率が単一のテンソル要素（例えば、αｚ’ｚ’ｚ’またはある文献では同等にβｚ’ｚ’ｚ’）によって支配される場合には、ｐおよびｓ（ｚｚｚおよびｚｘｚ）励起偏光の下で行われるＳＨＧおよびＴＰＦの両方の強度比は、配向角（表面法線またはｚ軸に対する傾転角φ）および配向分布のみに依存する、比の２つの独立方程式を生じさせるように測定されることができる。本プロセスは、異なる単一部位システイン変異体を使用して、任意の数の標識部位に関して繰り返されることができ、局所または大域的リガンド結合構造のモデルが、決定されることができる。いくつかの実施形態では、モデルは、随意に、（例えば、ＮＭＲデータ、小角度Ｘ線散乱データ、または当業者に公知である任意の他の測定からの）Ｘ線結晶構造座標または他の構造的制約を組み込む。
【０１６１】
異なる実験条件下の構造パラメータの決定および配座変化の検出：いくつかの実施形態では、平均傾転角または分布幅等の構造パラメータの決定、および／またはＴＰＦ測定および／またはＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ測定、またはその比を使用する、標識生体分子の配座変化の検出は、実験条件の２つ以上の異なるセットがバイオ分子の構造パラメータまたは配座に影響を及ぼす、実験条件の２つ以上の異なるセットの下で測定を実施することによって、促進されてもよい。
【０１６２】
本明細書で定義されるように、「実験条件」は、その下でＳＨＧ、ＴＰＦ、および／または他の非線形光学信号が測定される、実験パラメータの任意のセットを指し、実験条件のセットの中の実験パラメータのうちの１つ以上のものの変化は、基本分子配向分布の変化に起因して、ＴＤＭまたはχ（２）の測定値の変化をもたらす。換言すると、研究室基準系内で異なる配向分布を生成する、実験条件の異なるセットは、異なる基準ＴＰＦおよび／またはＳＨＧ信号強度、異なる偏光依存性、同一のリガンド結合事象への異なる応答、または前述のうちのいずれかまたは全てを生成するであろう。これらの実験では、タンパク質構造および配座景観が一定のままであり、したがって、構造および配座景観決定のために、異なる角度で表面上に大域的に配向される、２つ以上の部位において標識されるバイオ分子から、事実上無制限の数の独立データ点を取得することを仮定し得る。例えば、支持脂質二重層に付着したタンパク質に電場を印加することは、分子の基本配向分布を変化させることができ、したがって、ＴＤＭまたはχ（２）の測定値を変化させ得る。実験条件のセットを定義するために使用され得る、実験パラメータの他の実施例は、限定ではないが、ｐＨ等の緩衝条件、イオン強度、洗剤内容物および濃度、（例えば、ＮまたはＣ末端Ｈｉｓタグの使用を通した）繋留付着部位等を含む。具体的には、実験条件の異なる独立したセットの下で測定されるＴＤＭまたはχ（２）の独立値は、研究室基準系内で基本分子配向分布を取得することを可能にする（図２）。これらの異なる研究室基準系測定を相互に関連付けることによって、分子配向分布をモデル化するために使用されるガウス分布の幅等の配向分布の他のパラメータとともに、タンパク質基準系内で２つ以上の異なる標識部位に位置付けられる非線形活性標識の間の角度の相対差を決定することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、標識タンパク質が繋留される表面の１つ以上の組成の使用は、実験条件の異なるセットを定義するために使用されてもよい。例えば、支持脂質二重層が標識タンパク質を繋留および配向するために使用される場合、（例えば、異なる静電電荷密度または異なるモル脂質ドーピング密度を伴う）二重層の２つ以上の異なる脂質組成が、同一のタンパク質の２つ以上の異なる配向分布を作成するために使用されることができる。例えば、異なる正味電荷を担持する頭部基を伴う脂質が、使用されることができる（例えば、両性イオン、正および負に帯電した脂質頭部基）。いくつかの実施形態では、例えば、異なる脂質成分の数および／またはそれらの相対濃度を変動させることによって、支持脂質二重層の脂質組成を変動させることが有利であり得る。支持脂質二重層を形成するために使用され得る、または支持脂質二重層の主要またはわずかな成分として挿入され得る、脂質分子の実施例は、限定されないが、ジアシルグリセロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール重リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン、ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン、Ｃｅｒ−ＰＥ）、セラミドホスホリル脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ニッケルニトリロ三酢酸キレート（Ｎｉ−ＮＴＡ）部分から成る脂質分子が、Ｈｉｓタグを用いてタンパク質を繋留する目的のために使用されてもよい。例えば、二重層は、種々のモル濃度において１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を組み込んでもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、脂質二重層の異なる脂質成分の数は、１〜１０またはそれを上回って及んでもよい。いくつかの実施形態では、異なる脂質成分の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０であってもよい。いくつかの実施形態では、異なる脂質成分の数は、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または最大で１であってもよい。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、脂質二重層の所与の脂質成分の相対割合は、約０．１％〜約１００％に及んでもよい。いくつかの実施形態では、所与の脂質成分の相対割合は、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％であってもよい。いくつかの実施形態では、所与の脂質成分の相対割合は、最大で約１００％、最大で約９０％、最大で約８０％、最大で約７０％、最大で約６０％、最大で約５０％、最大で約４０％、最大で約３０％、最大で約２０％、最大で約１０％、最大で約５％、最大で約１％、最大で約０．５％、最大で約０．４％、最大で約０．３％、最大で約０．２％、または最大で約０．１％であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、脂質二重層の所与の脂質成分の相対割合は、約０．５％〜約２０％に及んでもよい。当業者は、脂質二重層内の所与の脂質成分の相対割合が、本範囲内の任意の値、例えば、約１２．５％を有し得ることを認識するであろう。
【０１６６】
上記のように、いくつかの実施形態では、実験条件の第１のセットは、タンパク質のＮ末端に付着したＨｉｓタグを使用して、タンパク質分子を基板表面または支持脂質二重層に繋留することを含んでもよく、実験条件の少なくとも第２のセットは、Ｃ末端に付着したＨｉｓタグを使用して、タンパク質分子を繋留することを含む。Ｎ末端対Ｃ末端Ｈｉｓタグを用いた付着は、概して、異なる配向分布を生成し、したがって、ＴＤＭまたはχ（２）の異なる測定値を生じさせる、実験条件の異なるセットを定義するために使用されてもよい。Ｈｉｓタグ等のタグがタンパク質を繋留するために使用される場合、Ｈｉｓタグの異なる長さが、異なる配向分布を生成してもよく、したがって、実験条件の異なるセットを定義するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、実験条件の第１のセットは、例えば、２ｘＨｉｓ、４ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、１０ｘＨｉｓ、１２ｘＨｉｓ、および１４ｘＨｉｓから成る群から選択される、第１のＨｉｓタグを使用して、タンパク質分子を繋留することを含んでもよく、実験条件の少なくとも第２のセットは、第１のＨｉｓタグと長さが異なる少なくとも第２のＨｉｓタグを使用して、タンパク質分子を繋留することを含んでもよい。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、標識タンパク質を、付着したＮｉ−ＮＴＡ部分を有する脂質から成る支持脂質二重層に繋留するために使用される、Ｈｉｓタグの長さは、約１つのＨｉｓ残基〜約２０個のＨｉｓ残基またはそれを上回って及んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグの長さは、少なくとも１つのＨｉｓ残基、少なくとも２つのＨｉｓ残基、少なくとも３つのＨｉｓ残基、少なくとも４つのＨｉｓ残基、少なくとも５つのＨｉｓ残基、少なくとも６つのＨｉｓ残基、少なくとも７つのＨｉｓ残基、少なくとも８つのＨｉｓ残基、少なくとも９つのＨｉｓ残基、少なくとも１０個のＨｉｓ残基、少なくとも１１個のＨｉｓ残基、少なくとも１２個のＨｉｓ残基、少なくとも１３個のＨｉｓ残基、少なくとも１４個のＨｉｓ残基、少なくとも１５個のＨｉｓ残基、少なくとも１６個のＨｉｓ残基、少なくとも１７個のＨｉｓ残基、少なくとも１８個のＨｉｓ残基、少なくとも１９個のＨｉｓ残基、または少なくとも２０個の残基であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグの長さは、最大で２０個のＨｉｓ残基、最大で１９個のＨｉｓ残基、最大で１８個のＨｉｓ残基、最大で１７個のＨｉｓ残基、最大で１６個のＨｉｓ残基、最大で１５個のＨｉｓ残基、最大で１４個のＨｉｓ残基、最大で１３個のＨｉｓ残基、最大で１２個のＨｉｓ残基、最大で１１個のＨｉｓ残基、最大で１０個のＨｉｓ残基、最大で９つのＨｉｓ残基、最大で８つのＨｉｓ残基、最大で７つのＨｉｓ残基、最大で６つのＨｉｓ残基、最大で５つのＨｉｓ残基、最大で４つのＨｉｓ残基、最大で３つのＨｉｓ残基、最大で２つのＨｉｓ残基、または最大で１つのＨｉｓ残基であってもよい。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤と少なくとも第２の緩衝剤との間の差異が、実験条件の異なるセットを定義するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、実験条件の異なるセットを定義するために使用される緩衝剤の間の差異は、緩衝剤のタイプ、緩衝剤ｐＨ、緩衝剤粘度、イオン強度、洗剤濃度、両性イオン成分濃度、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）濃度、炭水化物、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチエレングリコールまたは他の添加剤濃度、酸化防止剤および還元剤、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されてもよい。異なる緩衝条件が、分子の配向分布、したがって、ＴＤＭまたはχ（２）の測定値を変化させてもよい。
【０１６９】
一例として、開示される方法で使用するための好適な緩衝剤は、限定ではないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、コハク酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、トリス、ＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、および同等物を含んでもよい。適切な緩衝剤の選択肢は、概して、緩衝溶液の標的ｐＨに依存するであろう。一般に、緩衝溶液の所望のｐＨは、約ｐＨ６〜約ｐＨ８．４に及ぶであろう。いくつかの実施形態では、緩衝剤ｐＨは、少なくとも６．０、少なくとも６．２、少なくとも６．４、少なくとも６．６、少なくとも６．８、少なくとも７．０、少なくとも７．２、少なくとも７．４、少なくとも７．６、少なくとも７．８、少なくとも８．０、少なくとも８．２、または少なくとも８．４であってもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤ｐＨは、最大で８．４、最大で８．２、最大で８．０、最大で７．８、最大で７．６、最大で７．４、最大で７．２、最大で７．０、最大で６．８、最大で６．６、最大で６．４、最大で６．２、または最大で６．０であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、緩衝剤ｐＨは、約６．２〜約８．２に及んでもよい。当業者は、緩衝剤ｐＨが、本範囲内の任意の値、例えば、約７．２５を有し得ることを認識するであろう。ある場合には、緩衝溶液のｐＨは、約４〜約１０に及んでもよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、実験条件の異なるセットを定義するために使用される緩衝剤のイオン強度は、一価塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等）、二価塩（例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等）、三価塩（例えば、ＡｌＣｌ３）、またはそれらの任意の組み合わせを使用することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、実験条件の異なるセットを定義するために使用される緩衝剤のイオン強度は、約０．０Ｍ〜約１Ｍまたはそれより高く及んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤のイオン強度は、少なくとも０．０Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、または少なくとも１．０Ｍであってもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤のイオン強度は、最大で１．０Ｍ、最大で０．９Ｍ、最大で０．８Ｍ、最大で０．７Ｍ、最大で０．６Ｍ、最大で０．５Ｍ、最大で０．４Ｍ、最大で０．３Ｍ、最大で０．２Ｍ、または最大で０．１Ｍであってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、緩衝剤のイオン強度は、約０．４Ｍ〜約０．８Ｍに及んでもよい。当業者は、緩衝剤のイオン強度が、本範囲内の任意の値、例えば、約０．１５Ｍを有し得ることを認識するであろう。
【０１７１】
緩衝剤調合で使用するための好適な洗剤は、限定ではないが、両性イオン洗剤（例えば、１−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、ＡＳＢ−Ｃ８０、Ｃ７ＢｚＯ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ水和物、ＣＨＡＰＳＯ、ＤＤＭＡＢ、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸）、およびアニオン性、カチン性、および非イオン性洗剤を含む。非イオン性洗剤の実施例は、ポリ（オキシエチレン）エーテルおよび関連ポリマー（例えば、Ｂｒｉｊ（Ｒ）、ＴＷＥＥＮ（Ｒ）、ＴＲＩＴＯＮ（Ｒ）、ＴＲＩＴＯＮＸ−１００、およびＩＧＥＰＡＬ（Ｒ）ＣＡ−６３０）、胆汁塩、およびグリコシド洗剤を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、緩衝剤中の洗剤の濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）に及んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤中の洗剤の濃度は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも１．５％、または少なくとも２％であってもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤中の洗剤の濃度は、最大で２％、最大で１．５％、最大で１．０％、最大で０．５％、最大で０．１％、最大で０．０５％、または最大で０．０１％であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、緩衝剤中の洗剤の濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１．５％（ｗ／ｖ）に及んでもよい。当業者は、緩衝剤中の洗剤の濃度が、本範囲内の任意の値、例えば、約０．１２％（ｗ／ｖ）を有し得ることを認識するであろう。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、界面領域と関連し、それらの濃度の関数としてタンパク質の異なる配向分布を生成する、ＰＥＧ４００、エチエレングリコール等の緩衝添加剤もまた、使用されることができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ４００の濃度（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチエレングリコールまたは他の添加剤濃度、酸化防止剤および還元剤等の任意の他の緩衝添加剤）は、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）に及んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ４００（または任意の他の緩衝加剤）の濃度は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ４００（または任意の他の緩衝加剤）の濃度は、最大で１０％、最大で９％、最大で８％、最大で７％、最大で６％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、最大で１．５％、最大で１．０％、最大で０．５％、最大で０．１％、最大で０．０５％、または最大で０．０１％であってもよい。本段落で説明される上限および下限値のうちのいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するように組み合わせられてもよく、例えば、ＰＥＧ４００（または任意の他の緩衝加剤）の濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）に及んでもよい。当業者は、ＰＥＧ４００（または任意の他の緩衝加剤）の濃度が、本範囲内の任意の値、例えば、約２．２５％（ｗ／ｖ）を有し得ることを認識するであろう。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦ偏光測定に使用される実験条件の異なるセットの数は、サンプリングされる独立分子配向分布の数および行われ得る独立偏光測定の数を増加させるために増加されてもよく、それによって、角度測定およびそこから導出されるタンパク質構造モデルの正確度を増加させる。いくつかの実施形態では、使用される実験条件の異なるセットの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００であってもよい。
【０１７５】
非線形活性標識および標識技法：上記のように、殆どの生体分子は、本質的にＴＰＦ活性またはＳＨ活性ではない。例外は、殆どの構造または荷重負担組織で見出される構造タンパク質である、コラーゲンを含む。ＳＨＧ顕微鏡法が、コラーゲン含有構造、例えば、角膜の研究で広範囲に使用されている。他の生体分子または実体は、タグまたは標識等の非線形活性部分を導入することによって非線形活性にされなければならない。本発明で使用するための標識は、結果として生じる体系をより非線形光学活性にするために、共有結合的または非共有結合的のいずれかで、分子、粒子、または位相（例えば、脂質二重層）に結合され得る、非線形活性部分、タグ、分子、または粒子を指す。標識は、分子、粒子、または位相（例えば、脂質二重層）が、体系を非線形活性にするように非線形活性ではない場合において、または余剰特性評価パラメータを体系の中に追加するようにすでに非線形活性である体系とともに、採用されることができる。外因性標識が、分子、粒子、または他の生物学的実体に事前に付着されることができ、任意の未結合または未反応標識が、本明細書に説明される方法で使用する前に標識実体から分離されることができる。本明細書に開示される方法の具体的側面では、非線形活性部分は、基板表面の離散領域中で標的分子または生物学的実体を固定化することに先立って、生体外で標的分子または生物学的実体に付着される。本明細書に開示される方法の別の側面では、非線形活性部分は、基板表面の離散領域中で標的分子または生物学的実体を固定化した後に、標的分子または生物学的実体に付着される。非線形活性標識を用いた生体分子または他の生物学的実体の標識は、相互作用が、表面選択的非線形光学技法を使用して、生体分子または実体の配向または配座の変化をもたらす場合において、標識生体分子または実体と別の分子または実体（すなわち、試験実体）との間の相互作用を検出する直接光学的手段を可能にする。
【０１７６】
開示される方法で使用するために好適な非線形活性タグまたは標識の実施例は、限定ではないが、表３に列挙される化合物およびそれらの誘導体を含む。
【表３】
2020519866.tif 000015
【０１７７】
種が非線形活性であり得るかどうかを評価する際に、以下の特性、すなわち、双極子モーメントの大きな差異（接地と分子の励起状態との間の双極子モーメントの差異）、蛍光の大きなストークスシフト、または芳香族または共役結合特性は、非線形活性の可能性を示すことができる。そのような種をさらに評価する際に、実験者は、例えば、非線形活性種が分配されている空気・水界面からのＳＨＧの検出を通して、当業者に公知である単純な技法を使用し、非線形活性を確認することができる。
【０１７８】
いったん好適な非線形活性種が目前の実験のために選択されると、種は、所望される場合、本明細書に開示される表面選択的非線形光学方法およびシステムで使用するための生体分子または実体に共役されることができる。以下の参考文献およびその中で引用される参考文献、すなわち、Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９６は、合成色素および多くの他の分子から標識生物学的実体を作成するために利用可能な技法を説明する。一般に、標識反応を実施するための重要な考慮事項は、一貫した再現可能な基準ＳＨＧ信号（または関連非線形光学信号）が達成されることを確実にするように最大限にされるはずである、反応の特異性および収率である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、タンパク質分子への非線形活性標識の付着は、標準共有共役化学を使用して、例えば、アミン基、カルボキシル基、チオール基、および同等物と反応する、非線形活性部分を使用して、実施されてもよい。いくつかの実施形態では、随意に、標識タンパク質の質量分光分析を実施し、タンパク質内の標識アミノ酸残基の位置を厳密に識別することが望ましくあり得る。
【０１８０】
使用され得る好適なアミン反応性共役化学の実施例は、限定ではないが、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、炭酸塩、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、およびフルオロフェニルエステル基を伴う反応を含む。好適なカルボキシル反応性共役化学の実施例は、限定ではないが、カルボジイミド化合物、例えば、水溶性ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣＬ）を伴う反応を含む。好適なスルフヒドリル反応性共役化学の実施例は、マレイミド、ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドを含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステル（ＰｙＭＰＯ−ＳＥ）、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（バダン）、および６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）から成る群から選択される、２光子蛍光および／または第２高調波（ＳＨ）活性標識である。（例えば、同一のタンパク質サンプルを使用する反復測定に関して厳密な変動係数（ＣＶ）によって示されるように）高度な分析再現性を達成するために、ＴＰＧまたはＳＨＧ信号測定のためにタンパク質サンプルを調製するために要求される標識ステップ（および繋留または固定化ステップ）の数は、最小限にされるはずである。例えば、理想的には、標識反応は、タンパク質上の標識付着部位に高度に特異的であるはずであり、非常に高い収率であるはずであり（すなわち、１：１化学量論標識を生じさせるはずであり）、標識後分離ステップを要求しないはずである。ＰｙＭＰＯマレイミドは、ＳＨＧおよびＴＰＦ活性の両方である、好適な非線形活性標識である。メチオニン化学選択的化学を具備するＰｙＭＰＯ類似体もまた、好適である。メチオニン化学選択的化学は、Ｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７），  “Ｒｅｄｏｘ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５５（６３２５）：５９７−６０２に説明される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基、アミン基、またはカルボキシル基によって、タンパク質に結合される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスルフヒドリル基、アミン基、またはカルボキシル基は、天然スルフヒドリル基、アミン基、またはカルボキシル基である。いくつかの実施形態では、１つ以上のスルフヒドリル基、アミン基、またはカルボキシル基は、工学的スルフヒドリル基、アミン基、またはカルボキシル基である。標識のための付着部位を設計するための遺伝子工学および部位指向型突然変異生成技法は、当業者に周知である（例えば、Ｅｄｅｌｈｅｉｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  “Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｗｏ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ”，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６１を参照）。本アプローチを使用して、例えば、スルフヒドリル（すなわち、チオール）基、アミン基、またはカルボキシル基から成る、アミノ酸残基（例えば、システイン、リシン、アスパラギン酸塩、またはグルタミン酸塩残基）が、非線形活性タグを用いて標識することに先立って、タンパク質内の精密な位置に設置されてもよい。好ましい実施形態では、工学的標識部位は、天然アミノ酸残基のためのシステイン残基の置換を備える。多くの場合、アミノ酸残基が置換される標識部位は、タンパク質が適切に折り畳まれるときにタンパク質の表面上に位置することが公知である、タンパク質のアミノ酸配列内の位置におけるアミノ酸残基であってもよい。変異および標識変異タンパク質が、次いで、当業者に公知である種々の分析のうちのいずれかを使用して、例えば、タンパク質のための既知のリガンドを使用して結合分析を実施することによって、天然様機能性に関して試験されてもよい。いくつかの実施形態では、一連の変異タンパク質が、調製されてもよく、各変異体は、タンパク質分子内の異なる部位において付着された非線形活性タグから成ってもよい。いくつかの実施形態では、変異タンパク質は、標識に使用される単一のアミノ酸置換から成ってもよい。いくつかの実施形態では、変異タンパク質は、標識に使用される２つ以上のアミノ酸置換から成ってもよい。いくつかの実施形態では、変異タンパク質はさらに、下記でより詳細に説明されるであろうように、好適なリンカ分子を用いて標識タンパク質を基板表面または支持脂質二重層に繋留するために使用される、工学的標識部位に加えて、アミノ酸置換（例えば、リシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸塩、またはグルタミン酸塩残基）から成ってもよい。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、第２高調波発生（ＳＨＧ）活性標識、和周波発生（ＳＦＧ）活性標識、差周波数（ＤＦＧ）活性標識、または２光子蛍光（ＴＰＦ）活性標識である。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ＳＨＧ活性およびＴＰＦ活性の両方である。
【０１８３】
他の好ましい実施形態では、遺伝子工学技法が、当業者に公知である種々の生体内または無細胞生体外技法のうちのいずれかを使用して、タンパク質内の特異的部位において非線形活性非天然アミノ酸を組み込むために使用されてもよい。例えば、Ｃｏｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  “Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１７００−１７０３、および米国特許第９，１８２，４０６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、非線形活性非天然アミノ酸残基は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、またはそれを上回る既知の部位における非線形活性非天然アミノ酸置換から成る、変異タンパク質群に組み込まれてもよい。そのようなタンパク質は、工学的である、自然発生である、生体外翻訳方法を使用して作製される、生体内で発現される、および一般に、当業者に公知である種々の方法のうちのいずれかを通して作成されることができる。いくつかの実施形態では、非線形活性非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの別の誘導体である。いくつかの実施形態では、生物学的薬剤候補の中への本質的に非線形活性の非天然アミノ酸残基の組み込みは、参照薬剤と比較して、薬剤候補の構造または機能への任意の悪影響に関して試験されてもよく、何も存在しない場合、続いて、バイオ後続薬剤の製造中に品質管理のための内部マーカとして使用されてもよい。
【０１８４】
開示される方法およびシステムの具体的側面では、金属ナノ粒子およびその集合が、生物学的非線形活性標識を作成するように修飾される。以下の参考文献、すなわち、Ｊ．Ｐ．  Ｎｏｖａｋ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌ．  Ｆｅｌｄｈｅｉｍ，  “Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌｅｎｅ−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ”，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２：３９７９−３９８０  （２０００）、Ｊ．Ｐ．  Ｎｏｖａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ”，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２：１２０２９−１２０３０  （２０００）、Ｖａｎｃｅ，  Ｆ．Ｗ．，  Ｌｅｍｏｎ，  Ｂ．  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｈｕｐｐ，  Ｊ．  Ｔ．，  “Ｅｎｏｒｍｏｕｓ  Ｈｙｐｅｒ−Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ”，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  １０２：１００９１−９３  （１９９９）が、金属ナノ粒子および集合の修飾を説明する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質（例えば、薬剤標的タンパク質、生物学的薬剤候補、生物学的参照薬剤、薬剤標的タンパク質等）は、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用、および／またはファンデルワールス相互作用、またはそれらの任意の組み合わせ等の局所非共有結合力を通して、タンパク質分子に特異的および／または可逆的に結合する、非線形活性ペプチドの結合を通して、非線形活性にされてもよい。ＳＨＧ活性、ＳＦＧ活性、ＤＦＧ活性、および／またはＴＰＦ活性部分を用いて標識される１つ以上のペプチドは、（光学界面への標的タンパク質の繋留の前または後に）着目タンパク質と合成および反応され、（例えば、繋留標的タンパク質分子の配向分布が、共有結合共役を通して、または非線形活性非天然アミノ酸の遺伝子組み込みを通してのいずれかで、非線形活性標識と直接標識された繋留標的タンパク質分子に関して行われる、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦ測定から独立し把握される、結合ペプチド上の非線形活性部分の配向角の分布の幅を決定するためのＳＨＧおよび／またはＴＰＦ測定を使用して）特異的様式で標的タンパク質に結合するそれらの能力に関して試験されてもよい。好ましい実施形態では、非線形活性ペプチドは、特異的タンパク質ドメインに結合することが公知であるペプチド配列から成ってもよい。例えば、高親和性（ヒトＩｇＧ−Ｆｃに関して、それぞれ、８．９×１０６Ｍ−１および６．５×１０６Ｍ−１）でマウスまたはヒトＩｇＧ分子のＦｃ部分に特異的に結合する、八量体ペプチド配列（例えば、ＮＫＦＲＧＫＹＫおよびＮＡＲＫＦＹＫＧ）が、文献の中で報告されている（Ｓｕｇｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ７９：３３−４０）。
【０１８６】
１つの非常に有用な実施形態は、ペプチド、ペプチド模倣薬、または小分子プローブ、例えば、抗体内の相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合することが公知であるもの、おそらく、抗原の断片を標識することである。そのようなペプチドは、例えば、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦ活性（例えば、Ｌ−Ａｎａｐ）である非天然アミノ酸、またはアミノ酸であるＰｙＭＰＯのバージョンとの固相合成で作製されることができる、またはそのようなペプチドは、当業者に公知である方法に従って、例えば、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳまたはＰｙＭＰＯ−マレイミドを使用して溶液中で標識されることができる。これらの標識ペプチドは、次いで、それ自体が、表面、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡ担持脂質から成る支持脂質二重層膜に繋留される、抗体に結合されることができる。ＳＨＧ活性ペプチドは、次いで、基準信号を生成するように抗体と接触されることができる。抗体は、例えば、熱、光、または他の手段によって「ストレスを加えられる」ことができ、本ストレスを加えられたサンプルの基準信号は、ストレスを加えられていないサンプルと比較されることができる。同様に、基準信号は、生物製剤が標識ペプチドによって探査される領域において一定の構造を維持していることを確実にするように、バイオプロセス監視設定で比較されることができる。さらに、ジェネリック対ブランド生物製剤が、同様に比較されることができる。そのような場合において（および／または他の種々の事例において）、配向および／または構造に対するＳＨＧおよび／またはＴＰＦの高い感度と、それ自体がＳＨＧおよび／またはＴＰＦ活性にされた、または作製されたペプチドまたはある他のリガンドを使用して、生物製剤または抗体等の着目標的タンパク質または分子を標識する能力とに依拠し得る。
【０１８７】
本明細書に開示される方法およびシステムのさらに別の側面では、システムの非線形活性はまた、分子ビーコンの非線形類似体、すなわち、フルオロフォアおよび消光剤の代わりに非線形活性標識（またはその調節因子）を組み込むように修飾された分子ビーコンプローブの導入を通して、操作されることができる。分子ビーコンのこれらの非線形光学類似体は、本明細書では分子ビーコン類似体（ＭＢ類似体またはＭＢＡ）と称される。説明される方法およびシステムで使用されるＭＢ類似体は、当業者に公知である手技に従って合成されることができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の非線形活性標識は、同一の個々のバイオ分子、例えば、タンパク質分子内の１つ以上の既知の位置（例えば、部位）に付着されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の非線形活性標識は、同一のタンパク質の異なる分子内で、すなわち、標識タンパク質の異なる単一標識バージョンから成るタンパク質群を作成するように、１つ以上の既知の位置（例えば、部位）に付着されてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質（またはタンパク質群）が標識される標識部位の数は、少なくとも１つの部位、少なくとも２つの部位、少なくとも３つの部位、少なくとも４つの部位、少なくとも５つの部位、少なくとも６つの部位、少なくとも７つの部位、少なくとも８つの部位、少なくとも９つの部位、少なくとも１０個の部位、またはそれを上回ってもよい。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、異なる単一部位システイン変異体または同一タンパク質の変異型に付着されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、以上の既知の位置に位置する非線形活性標識は、同一である。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、以上の既知の位置に位置する非線形活性標識は、異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上の非線形活性標識は、２光子活性標識である。いくつかの実施形態では、１つ以上の非線形活性標識は、２光子活性、および／または以下のうちの１つ以上のもの、すなわち、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦ測定は、単一の非線形活性標識を用いて標識されるタンパク質分子を使用することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦ測定は、少なくとも２つの異なる非線形活性標識、少なくとも３つの異なる非線形活性標識、少なくとも４つの異なる非線形活性標識、少なくとも５つの異なる非線形活性標識、少なくとも６つの異なる非線形活性標識、少なくとも７つの異なる非線形活性標識、少なくとも８つの異なる非線形活性標識、少なくとも９つの異なる非線形活性標識、または少なくとも１０個の異なる非線形活性標識を用いて標識される、タンパク質分子を使用することを含んでもよい。
【０１９０】
本明細書に説明される方法およびシステムの代替的側面では、少なくとも２つの区別可能な非線形活性標識が、使用される。付着した２つ以上の区別可能な標識の配向が、次いで、放射するコヒーレント非線形光ビームの明確に定義された方向を促進するように選定されるであろう。２つ以上の区別可能な標識は、少なくとも２つの非線形光ビームの結果として生じる放射を伴って、光学界面に対して１つ以上の偏光方向で入射する、１つ以上の周波数における複数の基本光ビームが使用される、分析で、使用されることができる。いくつかの実施形態では、使用される区別可能な非線形活性標識の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０であってもよい。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの区別可能な非線形活性標識が、相互に対して、または光学界面の表面法線に対して、少なくとも２つの区別可能な非線形活性標識毎に相対または絶対傾転角を決定し、それによって、（タンパク質内の区別可能な非線形活性標識毎に標識部位が把握されることを前提として）タンパク質構造のマッピングを促進するために、またはタンパク質へのリガンドの結合に応じて局所配座変化のマッピングを促進するために、光学界面に対して１つ以上の偏光方向で入射する、１つ以上の周波数における複数の基本光ビームと組み合わせて、使用されてもよい。
【０１９２】
繋留および固定化化学：本明細書に開示されるように、下記に説明される形式のうちのいずれかの基板は、基板の全体または一部の上のタンパク質または他のバイオ分子（またはある場合には、細胞または他の生物学的実体）の繋留のために構成される。多くの実施形態では、基板は、基板の規定離散領域内のタンパク質または他のバイオ分子の繋留または固定化のために構成されてもよい。生体分子または細胞の繋留（本明細書では、時として「付着」または「固定化」と称されることもある）は、例えば、アミン官能基を用いてガラスまたは溶融石英表面を官能基化するためのアミノプロピルシラン化学の使用、その後に続いて、着目生体分子と直接、または中間スペーサまたはリンカ分子を介してのいずれかで、アミン反応性共役化学を使用する、共有結合を通して、当業者に公知である種々の技法によって遂行されてもよい。非特異的吸着もまた、直接または間接的に、例えば、最初に、ＢＳＡの分子層を表面に付着させ、次いで、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルを用いてそれを活性化することによる、ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の使用を通して、使用されてもよい。ＢＳＡ上の活性化されたリシン、アスパラギン酸塩、またはグルタミン酸塩残基は、タンパク質上の表面アミンと反応する。
【０１９３】
支持脂質二重層の使用：本開示の好ましい側面では、生体分子は、「支持脂質二重層」に繋留すること、またはその中に埋め込むことによって、表面に繋留されてもよく、後者は、二重層が水性緩衝剤の薄い層上の基板表面の上方で「浮動している」、疎水性および静電相互作用によってシリコンまたはガラス表面に限定された脂質二重層の小片を備える。支持リン脂質二重層はまた、例えば、Ｓａｌａｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎａｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ：  Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５  （４７）：  １４７７３−１４７８１  （１９９６）、Ｇｅｎｎｉｓ，  Ｒ．，  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  １９８９、Ｋａｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｌａｎａｒ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｂｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ”，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．  １１０３：３０７−３１６  （１９９２）、およびＢｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｌａｎａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，  ＰＮＡＳ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８１（１９）：  ６１５９−６１６３  （１９８４）（その関連する部分が参照することによって本明細書に組み込まれる）に説明されるように、膜タンパク質または他の膜関連成分の有無別で、調製されることもできる。支持リン脂質二重層は、当技術分野で周知であり、それらの加工のために利用可能な多数の技法が存在する。基板表面または光学界面上のタンパク質または他の生物学的実体の固定化のために支持脂質二重層を使用することの潜在的利点は、研究中のタンパク質のタイプ（すなわち、膜または可溶性タンパク質）、二重層膜が基板表面上に形成される方法、および（可溶性タンパク質の場合）タンパク質が二重層に繋留される方法等の要因に応じて、（ｉ）典型的には、細胞の細胞膜または他の膜成分に跨架し、二次および三次構造の安定化のために二重層の疎水性コアとの相互作用を要求する、これらのタンパク質のための膜タンパク質構造の留保、（ｉｉ）二重層内のタンパク質成分の間の相互作用を研究するための２次元側方および回転拡散移動度の留保、および（ｉｉｉ）分子配向の留保を含む。支持二重層は、繋留または埋込タンパク質の有無別に、典型的には、空気に暴露されたときに、それらの破壊を防止するように水溶液に浸されるはずである。
【０１９４】
開示される方法およびデバイスのいくつかの実施形態では、タンパク質分子（例えば、表在性膜タンパク質）の結合を向上させる、膜または表在性膜タンパク質の天然構造を留保する、および／または生体内で観察される生理学的応答を模倣するために、支持脂質二重層の脂質組成、例えば、異なる脂質成分の数および／またはそれらの相対濃度を変動させることが有利であり得る。支持脂質二重層を形成するために使用され得る、または支持脂質二重層の主要またはわずかな成分として挿入され得る、脂質分子の実施例は、限定ではないが、ジアシルグリセロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール重リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン、ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン、Ｃｅｒ−ＰＥ）、セラミドホスホリル脂質、コレステロール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、支持脂質二重層の異なる脂質成分の数は、１〜１０またはそれを上回って及んでもよい。いくつかの実施形態では、異なる脂質成分の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０であってもよい。いくつかの実施形態では、異なる脂質成分の数は、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または最大で１であってもよい。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、支持脂質二重層の所与の脂質成分の相対割合は、約０．１％〜約１００％に及んでもよい。いくつかの実施形態では、所与の脂質成分の相対割合は、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％であってもよい。いくつかの実施形態では、所与の脂質成分の相対割合は、最大で約１００％、最大で約９０％、最大で約８０％、最大で約７０％、最大で約６０％、最大で約５０％、最大で約４０％、最大で約３０％、最大で約２０％、最大で約１０％、最大で約５％、最大で約１％、最大で約０．５％、最大で約０．４％、最大で約０．３％、最大で約０．２％、または最大で約０．１％であってもよい。当業者は、支持脂質二重層内の所与の脂質成分の相対割合が、本範囲内の任意の値、例えば、約１２．５％を有し得ることを認識するであろう。
【０１９７】
支持脂質二重層が２つ以上の異なる脂質成分から成る、これらの実施形態では、２つ以上の異なる脂質成分の相対割合は、同一であり得る、または異なり得る。一非限定的実施例では、支持脂質二重層は、２５％ＰＳ、７４．５％ＰＣ、および０．５％リサミンローダミンＰＥから成ってもよい。別の非限定的実施例では、支持脂質二重層は、５％ＰＩＰ、２０％ＰＳ、７４．５％ＰＣ、および０．５％リサミンローダミンＰＥから成ってもよい。いくつかのタイプの脂質に関して、安定した支持脂質二重層を形成するための要件は、二重層内のその脂質の相対割合を１００％未満に限定し得る。これらの場合において、不安定化脂質成分の相対割合は、典型的には、約１％〜約５０％に及んでもよい。いくつかの実施形態では、支持脂質二重層内の不安定化脂質成分の相対割合は、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％であってもよい。いくつかの実施形態では、支持脂質二重層内の不安定化脂質成分の相対割合は、最大で約５０％、最大で約４０％、最大で約３０％、最大で約２０％、最大で約１０％、最大で約５％、または最大で約１％であってもよい。当業者は、支持脂質二重層内の不安定化脂質成分の相対割合が、本範囲内の任意の値、例えば、約１２．５％を有し得ることを認識するであろう。
【０１９８】
上記で示されるように、支持脂質二重層はまた、標的タンパク質、またはそのサブユニット、サブドメイン、または断片から成ってもよい。いくつかの実施形態では、支持脂質二重層はまた、例えば、それ自体を脂質二重層の中に挿入する脂質様または疎水性部分への共有または非共有結合を通して、脂質二重層に繋留される非内在性タンパク質成分を含んでもよい。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、支持脂質二重層の中に含まれる異なるタンパク質成分（内在性または非内在性）の数は、約１〜約１０またはそれを上回って及んでもよい。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質成分の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０であってもよい。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質成分の数は、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または最大で１であってもよい。
【０２００】
いくつかの実施形態では、脂質二重層の所与のタンパク質成分のモル分率は、約０．１〜約１に及んでもよい。いくつかの実施形態では、所与のタンパク質成分のモル分率は、少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または少なくとも約１であってもよい。いくつかの実施形態では、所与のタンパク質成分のモル分率は、最大で約１、最大で約０．９、最大で約０．８、最大で約０．７、最大で約０．６、最大で約０．５、最大で約０．４、最大で約０．３、最大で約０．２、または最大で約０．１であってもよい。当業者は、脂質二重層内の所与のタンパク質成分のモル分率が、本範囲内の任意の値、例えば、約０．１５％を有し得ることを認識するであろう。
【０２０１】
アンカ分子、リンカ、および付着化学：可溶性タンパク質および他の生物学的実体は、いくつかの異なるアンカ分子、リンカ、および／または付着化学を使用して、配向された様式で支持脂質二重層に（または光学界面を備える基板に直接）繋留または付着されてもよい。本明細書で使用されるように、「アンカ分子」は、脂質二重層に埋め込まれ、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、または付着分子が共役される他の脂質または非脂質分子から成り得る、分子である。
【０２０２】
リンカ分子は、繋留されているタンパク質または他の生物学的実体の付着点と脂質二重層の平面内に埋め込まれたアンカ分子上の付着点との間に空間（「垂直」）分離を提供するために使用される分子である。いくつかの実施形態では、リンカ分子は、繋留されているタンパク質または他の生物学的実体の付着点と光学界面を備える基板の直接上の付着点との間に空間分離を提供するために使用されてもよい。好適なリンカ分子の実施例は、限定ではないが、オメガアミノ脂肪酸、ポリエチエレングリコール、および同等物を含む。
【０２０３】
付着部分（「親和性タグ」とも称される）は、２つの生物学的実体の間に共有または非共有結合を提供する、特異的化学構造または結合パートナである。本明細書に開示される方法で使用するために好適である付着部分または親和性タグの実施例は、ビオチンおよびアビジン（またはビオチンおよびストレプトアビジン）、およびＨｉｓタグ／Ｎｉ−ＮＴＡ結合パートナを含む。
【０２０４】
高親和性非共有ビオチン・ストレプトアビジン相互作用は、タンパク質または他の生物学的実体を共役または固定化するために生物学的分析技法で広く使用されている。タンパク質のビオチン化は、それら自体が表面（例えば、スライドガラスまたはビーズ）に付着される、または（例えば、ビオチン・ストレプトアビジン・ビオチン架橋またはリンカの使用を通して）別の分子に共役される、多価アビジンまたはストレプトアビジン分子による捕捉を可能にする。ビオチン部分は、十分に小さいため、ビオチン化は、典型的には、タンパク質機能に干渉しない。ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの間の結合相互作用の高い親和性（１０−１４Ｍ〜１０−１５ＭのＫｄ）および高い特異性は、複雑なサンプルからさえも着目ビオチン化タンパク質の捕捉を可能にする。極めて強い結合相互作用に起因して、厳しい条件が、多くの場合、着目タンパク質を変質させるであろう、ストレプトアビジンコーティングされた表面（典型的には、ｐＨ１．５における６ＭグアニジンＨＣｌ）からビオチン化タンパク質を溶出させるために必要とされる。約１０−８Ｍの減少したビオチン結合親和性を有する、アビジンまたはストレプトアビジンの単量体型の使用は、必要である場合、ビオチン化タンパク質が過剰な遊離ビオチンを伴って溶出されることを可能にし得る。本明細書に開示される方法では、ビオチン部分から成る脂質分子は、ビオチン・アビジン・ビオチン（またはビオチン・ストレプトアビジン・ビオチン）架橋を介して、ビオチン化タンパク質および／または他のビオチン化生物学的実体を二重層に固定化または繋留する目的のために、支持脂質二重層に組み込まれてもよい。
【０２０５】
タンパク質および他の生物学的実体のビオチン化は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を使用する、タンパク質の表面上の１級アミンの共役を通した、直接結合によって実施されてもよい。代替として、組み換えタンパク質が、ＡｖｉＴａｇアプローチを使用して、便宜的にビオチン化され、ＡｖｉＴａｇペプチド配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）が、遺伝子工学およびタンパク質発現技法の使用を通してタンパク質に組み込まれる。ＡｖｉＴａｇシーケンスの存在は、ＢｉｒＡ酵素を用いた処理によるタンパク質のビオチン化を可能にする。
【０２０６】
Ｈｉｓタグ化学は、組み換えタンパク質および他のバイオ分子の精製のための別の広く使用されているツールである。本アプローチでは、例えば、６〜９つのヒスチジン残基の列を規定するＤＮＡ配列が、それらのＮまたはＣ末端に融合される６ｘＨｉｓまたはポリＨｉｓタグから成る、組み換えタンパク質の産生に使用されるベクターに組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、標的タンパク質または他の生物学的タンパク質は、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡ部分から成る二重層脂質に結合する、２ｘ−Ｈｉｓタグ、３ｘ−Ｈｉｓタグ、４ｘ−Ｈｉｓタグ、５ｘ−Ｈｉｓタグ、６ｘ−Ｈｉｓタグ、７ｘ−Ｈｉｓタグ、８ｘ−Ｈｉｓタグ、９ｘ−Ｈｉｓタグ、１０ｘ−Ｈｉｓタグ、１１ｘ−Ｈｉｓタグ、または１２ｘ−Ｈｉｓタグを含むように設計されてもよい。
【０２０７】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、次いで、精製され、ヒスチジン残基の列が、具体的緩衝条件下で、ニッケル、コバルト、および銅を含む、いくつかのタイプの固定化金属イオンに結合するという事実の結果として、検出されることができる。アガロースビーズまたは磁性粒子等の支持体が、次いで、着目Ｈｉｓタグ付きバイオ分子の結合および精製のためのリガンドとして機能する、所望の金属イオンを固定化するように、キレート基と誘導体化されることができる。
【０２０８】
Ｈｉｓタグリガンドを作成するために最も一般的に使用されているキレート剤は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）およびイミノ二酢酸（ＩＤＡ）である。いったんＮＴＡまたはＩＤＡ共役支持体が調製されると、それらは、所望の二価金属（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、またはＦｅ）を「装填」されることができる。例えば、ニッケルを金属として使用するとき、結果として生じる親和性支持体は、通常、Ｎｉキレート、Ｎｉ−ＩＤＡ、またはＮｉ−ＮＴＡ支持体と呼ばれる。Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質の親和性精製は、タンパク質生物学研究における金属・キレート支持体のための最も一般的な用途である。ＮＴＡ−キレート化化学によって固定化されるニッケルまたはコバルト金属は、本用途のための最適なシステムである。本明細書に開示される方法では、Ｎｉ−ＮＴＡ基（または他のキレート化金属イオン）から成る脂質分子が、Ｈｉｓタグ付きタンパク質および他のＨｉｓタグ付き生物学的実体を二重層に固定化または繋留する目的のために、支持脂質二重層に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、支持脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンから成ってもよく、また、種々の濃度における１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を含有してもよい。
【０２０９】
ポリＨｉｓタグは、ほぼ中性緩衝条件（生理学的ｐＨおよびイオン強度）でキレート化金属イオンに最良に結合する。典型的結合／洗浄緩衝剤は、１０〜２５ｍＭイミダゾールを含有する、ｐＨ７．２のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）から成る。低濃度のイミダゾールは、ヒスチジンクラスタを有する内因性タンパク質の非特異的結合を防止することに役立つ。キレート化金属イオン支持体からの捕捉されたＨｉｓタグ付きタンパク質の溶出および回収は、所望されるとき、典型的には、高濃度のイミダゾール（少なくとも２００ｍＭ）、低ｐＨ（例えば、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）、または過剰な強いキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を使用して、遂行される。免疫グロブリンは、それらのＦｃ領域中に複数のヒスチジンを有することが公知であり、キレート化金属イオン支持体に結合することができ、したがって、免疫グロブリンが着目Ｈｉｓタグ付きタンパク質と比較して高い存在度でサンプル中に存在する場合、厳しい結合条件（例えば、適切な濃度のイミダゾールを使用する）が、高レベルの背景結合を回避するために必要である。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミンもまた、複数のヒスチジンを有し、より豊富なＨｉｓタグ付きタンパク質または結合／洗浄緩衝剤中のイミダゾールの使用がない場合に、キレート化金属イオン支持体への高レベルの背景結合を生じさせることができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、Ｎｉ／ＮＴＡまたは他の金属イオンキレート剤と誘導体化される基板表面が、Ｈｉｓタグが欠けているタンパク質を固定化するために使用されてもよい。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、表面との接触に応じて、Ｎｉ／ＮＴＡ表面と極めて容易に関連するであろう。金属イオンキレートと誘導体化される表面上のタンパク質の固定化の付加的実施例に関して、Ｂｌｏｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ−Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  （ＩＭＡＣ）：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ４６３，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質（例えば、薬剤標的タンパク質、生物学的薬剤候補、生物学的参照薬剤、薬剤標的タンパク質等）は、タンパク質を光学界面に付着させるための一意の繋留または固定化部位を組み込むように遺伝子操作されたタンパク質、および／または光学界面へのタンパク質の付着のための一意の繋留または固定化部位としての役割を果たす、非天然アミノ酸残基を組み込むように遺伝子操作されたものであってもよい。遺伝学的に組み込まれ得る一意の繋留または固定化部位の実施例は、限定ではないが、タンパク質が適切に折り畳まれるときにタンパク質の表面上に位置することが公知である、アミノ酸配列位置におけるリシン、アスパラギン酸塩、またはグルタミン酸塩残基の組み込みを含む。タンパク質は、次いで、当業者に公知である種々の共役およびリンカ化学のうちのいずれかを使用して、光学界面に繋留される、またはその上に固定化されてもよい。タンパク質産物に遺伝学的に組み込まれ得る、一意の繋留または固定化部位の別の非限定的実施例は、次いで、光学界面に付着したＮｉ／Ｎ基に結合するための付着部位を提供し得る、Ｈｉｓタグ（例えば、一連の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、または１２個を上回るヒスチジン残基）であってもよい。一意の付着点を提供するように組み込まれ得る、非天然アミノ酸の一非限定的実施例は、ビオチン化非天然アミノ酸ビオシチンである。タンパク質は、次いで、タンパク質を基板表面上で固定化されるストレプトアビジン分子に繋留するように、高親和性ビオチン・ストレプトアビジン相互作用を使用して、光学界面に繋留される、またはその上に固定化されてもよい。
【０２１２】
繋留後の浣濯／洗浄：いくつかの実施形態では、タンパク質繋留または固定化ステップ後に、基板表面を洗い流す、または洗浄することを回避することが有利であり得る、すなわち、繋留または固定化されていない任意の残留タンパク質は、タンパク質サンプルを基板表面と接触させるために使用される、ウェル、反応チャンバ、またはコンパートメントの中に残されてもよい。開示される測定技法の表面選択的性質、および光学界面におけるタンパク質分子の正味の配向へのそれらの依存性により、溶液中の任意の残留標識タンパク質は、測定された非線形光学信号への寄与を殆どまたは全く提供しないであろう。
【０２１３】
基板表面上の結合部位の飽和：一般に、分析される１つ以上のサンプル中のタンパク質の濃度は、繋留または固定化に使用される培養条件のセットの下で基板表面上の結合部位の飽和を確実にするために十分に高いはずである。これは、基準非線形光学信号測定のためのサンプルの調製において一貫性を最大限にするものである。いくつかの実施形態では、分析される１つ以上のサンプル中のタンパク質の濃度は、同一であり、参照サンプル中のものと同一であり得る。いくつかの実施形態では、例えば、サンプルアリコート中のタンパク質濃度が低い場合、より低い結合部位密度を伴う基板を提供すること、および／またはより長い培養時間を使用し、結合部位の飽和を確実にすることが望ましくあり得る。
【０２１４】
繋留分子の表面密度を変動させる：基板表面上のタンパク質結合部位の表面密度を変動させることが望ましい、これらの実施形態では、表面結合部位密度の制御は、当業者に公知である種々の方法で実装されてもよい。例えば、タンパク質が、アミン官能基を用いてガラスまたは溶融石英表面を官能基化するためのアミノプロピルシラン化学の使用を通して表面に結合され、その後に、アミン反応性共役化学およびリンカ分子を使用する共有結合が続く、実施形態では、反応混合物中の単官能性リンカ分子（例えば、カルボキシル官能基のみから成る）に対する二官能性リンカ分子（例えば、１級アミンおよびカルボキシル官能基の両方から成るリンカ）の比は、タンパク質との結合のために利用可能である１級アミン官能基の表面密度を制御するように変動されてもよい。繋留（標識）分子の表面密度はまた、単純に、溶液中の分子の異なる濃度において培養することによって、変動されることができる。
【０２１５】
別の実施例として、ビオチン・ストレプトアビジン結合相互作用が、ビオチン化タンパク質を（ビオチン・ストレプトアビジン・ビオチン架橋を介して）支持脂質二重層に組み込まれたビオチン化脂質分子に繋留するために使用される、実施形態では、二重層を形成するために使用されるビオチン化脂質分子のモル百分率は、結合のために利用可能であるビオチン基の表面密度を制御するために変動されてもよい。
【０２１６】
さらに別の実施例として、Ｈｉｓタグ付きタンパク質が、Ｎｉ−ＮＴＡ（または他のキレート化金属イオン）リガンドから成るアンカ脂質分子を使用して、支持脂質二重層に固定化される、実施形態では、二重層を形成するために使用されるＮｉ−ＮＴＡ含有脂質分子のモル百分率は、結合のために利用可能であるＮｉ−ＮＴＡリガンドの表面密度を制御するために変動されてもよい。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、支持脂質二重層上の付着部位の密度は、アミン基またはチオール基（または標準共役化学が利用可能である任意の他の官能基）から成る二重層の脂質成分の割合を変動させることによって、変動されてもよい。いくつかの実施形態では、アミンまたはチオール基から成る脂質成分の割合は、約０パーセント〜約１００パーセントに及んでもよい。いくつかの実施形態では、アミンまたはチオール基から成る脂質成分の割合は、少なくとも０パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも１００パーセントであってもよい。いくつかの実施形態では、アミンまたはチオール基から成る脂質成分の割合は、最大で１００パーセント、最大で９０パーセント、最大で８０パーセント、最大で７０パーセント、最大で６０パーセント、最大で５０パーセント、最大で４０パーセント、最大で３０パーセント、最大で２０パーセント、または最大で１０パーセントであってもよい。当業者は、アミン基またはチオール基から成る脂質成分の割合が、本範囲内の任意の値、例えば、約１２パーセントを有し得ることを認識するであろう。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、表面に付着した非線形活性標識タンパク質の密度は、支持脂質二重層と培養される溶液中の標識タンパク質の濃度を変動させることによって、変動されてもよい。例えば、Ｈｉｓタグ付き標識タンパク質の濃度は、さらにＮｉ−ＮＴＡ部分から成る脂質成分から成る、支持脂質二重層と培養される溶液中で変動されてもよい。ある実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、約１ｎＭ〜約１００μＭに及んでもよい。好ましい実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、約１００ｎＭ〜約５μＭに及んでもよい。いくつかの実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、または少なくとも１００μＭであってもよい。いくつかの実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、最大で１００μＭ、最大で１０μＭ、最大で１μＭ、最大で１００ｎＭ、最大で１０ｎＭ、または最大で１ｎＭであってもよい。当業者は、溶液中の標識タンパク質の濃度が、本範囲内の任意の値、例えば、約１２μＭを有し得ることを認識するであろう。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、約１０２個の分子／ｃｍ２〜約１０１４個の分子／ｃｍ２の範囲にわたって当業者に公知である種々の技法のうちのいずれかを使用して変動されてもよい。いくつかの実施形態では、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、少なくとも１０２個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０３個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０４個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０５個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０６個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０７個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０８個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０９個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０１０個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０１１個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０１２個の分子／ｃｍ２、少なくとも１０１３個の分子／ｃｍ２、または少なくとも１０１４個の分子／ｃｍ２であってもよい。いくつかの実施形態では、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、最大で１０１４個の分子／ｃｍ２、最大で１０１３個の分子／ｃｍ２、最大で１０１２個の分子／ｃｍ２、最大で１０１１個の分子／ｃｍ２、最大で１０１０個の分子／ｃｍ２、最大で１０９個の分子／ｃｍ２、最大で１０８個の分子／ｃｍ２、最大で１０７個の分子／ｃｍ２、最大で１０６個の分子／ｃｍ２、最大で１０５個の分子／ｃｍ２、最大で１０４個の分子／ｃｍ２、最大で１０３個の分子／ｃｍ２、または最大で１０２個の分子／ｃｍ２であってもよい。当業者は、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度が、本範囲内の任意の値、例えば、約４．０×１０１２個の分子／ｃｍ２を有し得ることを認識するであろう。
【０２２０】
高スループット方法、デバイス、およびシステム：第２高調波発生または関連非線形光学検出技法の使用、または２光子蛍光の使用、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、生体分子、例えば、タンパク質または他の生物学的実体中の構造、配座、または配座シグネチャの高スループット分析および比較を実装するための方法、デバイス、およびシステムも、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、高スループット分析のための開示される方法、デバイス、およびシステムは、例えば、候補生物学的薬剤および参照薬剤の比較のための選別ツールとして、使用されてもよい。本明細書で使用されるように、「高スループット」は、ＮＭＲまたはＸ線結晶構造解析等の従来的技法を使用して実施される構造測定と比較して使用される、相対用語である。下記でより詳細に説明されるであろうように、本明細書に開示されるＳＨＧベースおよび／またはＴＰＦベースの方法およびシステムは、これらの従来の技法のものよりも少なくとも１桁速い速度で構造決定を実施することが可能である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、高スループット形式のバイオ分子構造、配座、または配座変化の決定は、励起光を送達するために使用され、同時に、励起光と基板表面との効率的な光学結合が維持されることを確実にする、光学システムに対する（分析される繋留または固定化生物学的標的から成る）基板の迅速、精密、かつ交換可能な位置付けのための新規のデバイス設計および機構の使用を通して、可能にされる。生物学的サンプルの高スループット光学調査のための１つの好ましい形式は、ガラス底部マイクロウェルプレートである。本明細書に開示されるシステムおよび方法は、高スループット分析システムのための要件に適合する様式で、全内部反射（ＴＩＲ）によって、ＳＨＧおよび／またはＴＰＦのために要求される高強度励起光を、基板、例えば、ガラス底部マイクロウェルプレート内のガラス基板に結合するための機構を提供する。
【０２２２】
一側面では、本開示は、１つ以上の生体分子（例えば、タンパク質または他の生物学的実体）中の構造、配座、または配座変化の高スループット検出のための方法であって、（ｉ）同じ標識反応または技法を使用して、非線形活性標識またはタグを用いて、１つ以上の標的生体分子、例えば、タンパク質分子、生物学的薬剤候補、または参照薬剤分子を標識するステップと、（ｉｉ）平面的基板表面の１つ以上の離散領域において１つ以上の標識標的生体分子を繋留または固定化するステップであって、基板表面はさらに、光学界面を備える、ステップと、（ｉｉｉ）外部光源に対して基板の位置を変化させることによって、各離散領域を基本周波数の励起光に連続的に暴露するステップと、（ｉｖ）励起光に暴露されるにつれて、各離散領域から放出される非線形光学信号（例えば、ＳＨＧ、ＳＦＧ、ＤＦＧ、ＴＰＦ、またはそれらの任意の組み合わせ）を収集するステップと、（ｖ）該非線形光学信号を処理し、１つ以上の標的生体分子のそれぞれの配向、構造、配座、または配座変化を決定するステップとを含む、方法を提供する。別の側面では、本方法はさらに、（ｖｉ）励起光への第１の暴露後に、１つ以上の標識生体分子のそれぞれを１つ以上の試験実体（例えば、試験化合物、候補結合パートナ、参照薬剤、既知のリガンド、または他の対照）と接触させるステップと、（ｖｉｉ）続いて、１回またはそれを上回って各離散領域を励起光に再暴露するステップと、（ｖｉｉｉ）励起光に暴露されるにつれて、各離散領域から非線形光学信号を収集するステップと、（ｉｘ）該非線形光学信号を処理し、該１つ以上の試験実体との接触の結果として、配向または配座の変化が１つ以上の生物学的実体の中で起こったかどうかを決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、平面的基板の離散領域上で繋留または固定化される、標的タンパク質または他の生物学的実体に付着されてもよい。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、繋留または固定化標的タンパク質または他の生物学的実体に接触するために使用される、試験実体に付着されてもよい。いくつかの実施形態では、繋留または固定化標的タンパク質または他の生物学的実体および試験実体の両方が、非線形活性タグを用いて（すなわち、同一の非線形活性タグを用いて、または異なる非線形活性タグを用いて）標識されてもよい。好ましい実施形態では、標識は、標的バイオ分子（例えば、タンパク質）の表面上の複数の一意かつ異なる部位に付着され、構造、配座、または配座変化が、それに応じて決定され、すなわち、上記のステップｉ）からｉｘ）またはそれらのあるサブセットを複数回実施し、タンパク質または標的バイオ分子の異なる部位が各場合に標識され、これらの変異体はそれぞれ、それぞれが異なる実験条件を有する、複数の実験で測定される。例えば、タンパク質が非線形活性標識を用いて１０個の異なる部位において標識される場合、これは、各実験における基本配向分布が異なる、５０個の異なる実験条件下で研究されてもよい。結果として、法線軸上の遷移双極子モーメントの１０×５０＝５００回の異なる投影が、決定され得、これは、タンパク質の構造および配座景観のより正確かつより完全���決定を可能にするであろう。また、タンパク質に結合することが公知であるかどうかにかかわらず、複数のリガンドを試験することによって、各リガンド結合事象の関数として付加的角度情報、すなわち、リガンド結合および配座変化に起因する角度変化データを生成し得、本情報はまた、分子の構造および配座景観のより完全な決定を提供するために使用され得る。方法の一側面では、非線形光学信号は、（すなわち、終点分析モードで）１つ以上の試験実体との１つ以上の生物学的実体（標的タンパク質、生物学的薬剤候補、参照薬剤分子等）の接触後に１回だけ検出され、次いで、配座変化が起こったかどうかを決定するために使用される。別の側面では、非線形光学信号は、（すなわち、動力学モードで）１つ以上の試験実体との１つ以上の生物学的実体の接触後に、繰り返して、無作為または定義された時間間隔で収集され、次いで、１つ以上の生物学的実体における配座変化の動力学を決定するために使用される。
【０２２３】
方法の好ましい側面では、基板の各離散領域は、支持脂質二重層構造を備え、標的タンパク質または他の生物学的実体は、脂質二重層に繋留する、またはその中に埋め込むことによって、各離散領域中で固定化される。方法の別の好ましい側面では、励起光は、全内部反射によって、基板表面、すなわち、光学界面に送達され、基板表面の離散領域から放出される非線形光学信号は、反射励起光と同一の光学軸に沿って収集される。
【０２２４】
非線形光学検出を使用して、タンパク質構造、配座、または配座変化の高スループット分析を実装するために、本明細書に説明されるシステムは、（ｉ）少なくとも１つの励起光ビームを光学界面に送達するための少なくとも１つの好適な励起光源および光学系と、（ｉｉ）１つ以上の生物学的実体が基板の離散領域中で繋留または固定化されている、光学界面を備える交換可能な基板と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの励起光源に対して基板を位置付けるための高精度平行移動ステージと、（ｉｖ）励起光を用いて基板の離散領域のそれぞれを照明し、該非線形信号を検出器に送達することの結果として生成される、非線形光学信号を収集するための光学系と、（ｖ）検出器から受信される非線形光学信号データを分析し、基板上で固定化される１つ以上の生物学的実体のための構造、配座、または配座変化を決定するためのプロセッサとを含む、いくつかの構成要素（図６で図式的に図示される）を要求する。いくつかの側面では、本明細書に開示されるシステムおよび方法はさらに、（ｖｉ）試験実体を基板の離散領域のそれぞれに送達するためのプログラマブル流体分注システムの使用と、（ｖｉｉ）光学システムとの界面における基板の自動位置付けおよび再配置のためのプレート取扱ロボットの使用とを含む。好ましい実施形態では、比較的に低いＮＡ検出方式が、２光子蛍光の検出に使用され、光学検出器は、サンプルが付着される表面に対して法線である軸に沿って測定されるサンプル（例えば、レーザ焦点）の直接上方または下方に位置付けられる。光学検出器は、表面から距離を置き、測定のための十分な信号を依然として達成しながら、ＮＡが可能な限り低いように、比較的に小さい許容角度に対するはずである。図７に示される一実施形態では、検出器は、スライド表面からのその距離が７．５ｍｍである、０．５ｍｍのファイバ半径を伴うマルチモードプラスチック光ファイバである。ＴＰＦ信号が、空気に遷移する前に光学界面から２ｍｍ延在する水性環境を含有する、離散領域から生じる場合、結果として生じる検出ＮＡは、０．０５４であろう。
【０２２５】
本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、随意に、複数の薬剤候補または他の試験実体（例えば、参照薬剤、既知のリガンド、対照等）と接触される、単一の生物学的実体（例えば、タンパク質、生物学的薬剤候補、参照薬剤、または薬剤標的）の分析のため、または単一の試験実体と接触される複数の生物学的実体の分析のため、またはそれらの任意の組み合わせのために構成されてもよい。１つ以上の生物学的実体を複数の試験実体と接触させるとき、接触ステップは、連続的に、すなわち、規定時間周期にわたって固定化生物学的実体を単一の試験実体に暴露させ、その後に、試験実体溶液を除去し、次の試験実体に導入することに先立って固定化生物学的実体を再生するための随意の浣濯ステップを行うことによって、実施されてもよい、または接触ステップは、並行して、すなわち、同一の固定化生物学的実体から成る複数の離散領域を有し、複数の離散領域のそれぞれの中の生物学的実体を異なる試験実体に暴露することによって、実施されてもよい。本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、少なくとも１つの生物学的実体、少なくとも２つの生物学的実体、少なくとも４つの生物学的実体、少なくとも６つの生物学的実体、少なくとも８つの生物学的実体、少なくとも１０個の生物学的実体、少なくとも１５個の生物学的実体、または少なくとも２０個の生物学的実体において構造、配座、または配座変化の分析を実施するように構成されてもよい。いくつかの側面では、本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、最大で２０個の生物学的実体、最大で１５個の生物学的実体、最大で１０個の生物学的実体、最大で８つの生物学的実体、最大で６つの生物学的実体、最大で４つの生物学的実体、最大で２つの生物学的実体、または最大で１つの生物学的実体において構造、配座、または配座変化の分析を実施するように構成されてもよい。同様に、本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、少なくとも１つの試験実体、少なくとも５つの試験実体、少なくとも１０個の試験実体、少なくとも５０個の試験実体、少なくとも１００個の試験実体、少なくとも５００個の試験実体、少なくとも１，０００個の試験実体、少なくとも５，０００個の試験実体、少なくとも１０，０００個の試験実体、または少なくとも１００，０００個の試験実体への１つ以上の生物学的実体の暴露に応じて、構造、配座、または配座変化の分析を実施するように構成されてもよい。いくつかの側面では、本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、最大で１００，０００個の試験実体、最大で１０，０００個の試験実体、最大で５，０００個の試験実体、最大で１，０００個の試験実体，最大で５００個の試験実体、最大で１００個の試験実体、最大で５０個の試験実体、最大で１０個の試験実体、最大で５つの試験実体、または最大で１つの試験実体への１つ以上の生物学的試験実体の暴露に応じて、構造、配座、または配座変化の分析を実施するように構成されてもよい。
【０２２６】
レーザ光源および励起光学システム：図８は、第２高調波光（および／またはいくつかの実施形態では２光子蛍光、図８は、ＳＨＧの検出のための光学システムを図示する）が、サンプル界面（または光学界面）を備える基板の表面から入射基本励起光を反射させることによって生成される、本明細書に開示される方法およびシステムの一側面を図示する。いくつかの実施形態では、基板は、適切な角度においてレーザ光を送達し、基板表面において全内部反射を誘発するために使用される、プリズムに光学的に結合される（図９）。いくつかの実施形態では、光学結合は、屈折率整合流体の薄いフィルムの使用によって提供される。レーザは、サンプル界面において第２高調波光および蛍光を生成するために必要な基本光を提供する。典型的には、これは、調整可能または調整可能ではない波長のいずれかであり、市販されているピコ秒またはフェムト秒レーザ（例えば、Ｔｉ：サファイアフェムト秒レーザまたはファイバレーザシステム）であろう。基本周波数（ｗ）における光は、レーザから出射し、その偏光は、例えば、光の周波数および強度に適切な（例えば、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ、Ｏｒｉｅｌ、またはＮｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．から入手可能な）半波長板を使用して選択される。ビームは、次いで、基本光を通過させるが非線形光（例えば、第２高調波光）を遮断するように設計される高調波セパレータを通過する。本フィルタは、レーザ発振性質に妨害を引き起こし得る、レーザ空洞の中への第２高調波ビームの後方反射を防止するために使用される。鏡およびレンズの組み合わせが、次いで、基板表面において全内部反射を受けるように、基板表面上の具体的角度θで具体的場所において衝突するようにプリズムを介してビームを指向する最終的な鏡からの反射に先立って、ビームを操向および成形するために使用される。光学経路内の鏡のうちの１つは、要求される場合、検流計制御型鏡スキャナ、回転多角形鏡スキャナ、ブラッグ回折器、音響光学回折器、または鏡の位置の制御を可能にするための当業者に公知である他の手段を使用して、走査されることができる。光学界面および非線形活性サンプル表面を備える、基板は、第２高調波ビームおよび／または２光子蛍光の発生のための基板表面上の具体的場所を選択するように、ｘ−ｙ平行移動ステージ（コンピュータ制御型）上に搭載されることができる。現在説明されている方法およびシステムのいくつかの側面では、全内部反射のための入射角をわずかに変動させるために、１つの鏡を走査または回転させ、それによって、照明励起光スポットの位置を実質的に変化させることなく、基板表面の離散領域から放出される非線形光学信号を最大限にすることが望ましい。いくつかの側面では、異なる基本周波数を有する、２つ（以上の）レーザが、非線形活性サンプルが固定化される光学界面において和周波数または差周波数光を生成するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、光学励起はさらに、随意に、非線形活性標識の（または固定化タンパク質に付着した付加的蛍光標識の）固有の蛍光または２光子蛍光を励起させるために使用される、付加的光源（例えば、レーザ、アークランプ、タングステンハロゲンランプ、または高強度ＬＥＤ）を備えてもよい。
【０２２７】
基板形式、光学界面、および全内部反射：上記で説明されるように、本開示の方法、デバイス、およびシステムは、基板の頂面上で、１つ以上の生物学的実体、例えば、標的タンパク質の繋留または固定化のための平面的基板を利用し、上部基板表面はさらに、非線形光学信号を励起させるために使用される光学界面（またはサンプル界面）を備える。基板は、基本および第２高調波光ビームを透過させ、励起光が適切な角度において入射するときに基板／サンプル界面において全内部反射を支援する、ガラス、シリカ、溶融石英、プラスチック、または任意の他の固体材料であり得る。本発明のいくつかの側面では、内側で生物学的実体が含有される離散領域は、１次元または２次元アレイとして構成され、疎水性コーティングまたは薄い金属層を用いて相互から分離される。他の側面では、離散領域は、基板表面内にくぼみを備えてもよい。なおも他の側面では、離散領域は、基板がマイクロウェルプレート（またはマイクロプレート）の底部を形成し、各個々の離散領域がマイクロウェルプレート内の１つのウェルの底部を形成するように、ウェル形成構成要素を用いて相互から分離されてもよい。本開示の一側面では、ウェル形成構成要素は、基板の頂面を９６個の別個のウェルに分離する。別の側面では、ウェル形成構成要素は、基板の頂面を３８４個の別個のウェルに分離する。さらに別の側面では、ウェル形成構成要素は、基板の頂面を１，５３６個の別個のウェルに分離する。これらの側面の全てでは、基板は、平面アレイ、くぼんだアレイ、またはマイクロウェルプレート形式で構成されるかどうかにかかわらず、測定システムまたは高スループットシステムの他の光学および機械的構成要素と界面接触する、使い捨てまたは消耗デバイスまたはカートリッジを備えてもよい。
【０２２８】
本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムはさらに、分離が離散領域またはウェルの間で維持される方法にかかわらず、基板表面が分割される離散領域またはウェルの数を規定するステップを含む。基板上により多数の離散領域またはウェルを有することは、方法またはシステムのサンプル分析スループットを増加させることの観点から有利であり得る。本開示の一側面では、基板あたりの離散領域またはウェルの数は、１０〜１，６００である。他の側面では、離散領域またはウェルの数は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１，０００、少なくとも１，２５０、少なくとも１，５００、または少なくとも１，６００である。開示される方法およびシステムのさらに他の側面では、離散領域またはウェルの数は、最大で１，６００、最大で１，５００、最大で１，０００、最大で７５０、最大で５００、最大で４００、最大で３００、最大で２００、最大で１００、最大で５０、最大で２０、または最大で１０である。好ましい側面では、離散領域またはウェルの数は、９６である。別の好ましい側面では、離散領域またはウェルの数は、３８４である。さらに別の好ましい側面では、離散領域またはウェルの数は、１，５３６である。当業者は、離散領域またはウェルの数がこれらの値（例えば、約１２〜約１，４００）のうちのいずれかによって境界される任意の範囲内に入り得ることを理解するであろう。
【０２２９】
本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムはまた、分離が離散領域またはウェルの間で維持される方法にかかわらず、基板表面が分割される離散領域またはウェルの表面積を規定するステップも含む。より大きい面積の離散領域またはウェルを有することが、ある場合には、関連付けられる生物学的実体のアクセスし易さおよび操作を促進し得る一方で、より小さい面積の離散領域またはウェルを有することは、分析試薬体積要件を低減させ、本方法またはシステムのサンプル分析スループットを増加させることの観点から有利であり得る。本開示の一側面では、離散領域またはウェルの表面積は、１ｍｍ２〜１００ｍｍ２である。他の側面では、離散領域またはウェルの面積は、少なくとも１ｍｍ２、少なくとも２．５ｍｍ２、少なくとも５ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２、または少なくとも１００ｍｍ２である。開示される方法およびシステムのさらに他の側面では、離散領域またはウェルの面積は、最大で１００ｍｍ２、最大で７５ｍｍ２、最大で５０ｍｍ２、最大で４０ｍｍ２、最大で３０ｍｍ２、最大で２０ｍｍ２、最大で１０ｍｍ２、最大で５ｍｍ２、最大で２．５ｍｍ２、または最大で１ｍｍ２である。好ましい側面では、離散領域またはウェルの面積は、約３５ｍｍ２である。別の好ましい側面では、離散領域またはウェルの面積は、約８．６ｍｍ２である。当業者は、離散領域またはウェルの面積がこれらの値（例えば、約２ｍｍ２〜約９５ｍｍ２）のうちのいずれかによって境界される任意の範囲内に入り得ることを理解するであろう。
【０２３０】
基板表面の離散領域は、励起光源に対して基板を再配置することによって、励起光に連続的に暴露される（励起光を用いて照明される）。入射励起光の全内部反射は、非線形活性標識を励起させ、第２高調波および蛍光（またはいくつかの側面では、和周波数または差周波数光）の発生をもたらす、「エバネセント波」をサンプル界面において作成する。エバネセント波の強度、故に、生成される非線形光学信号の強度が、励起光ビームの入射角に依存するため、励起ビームの光学軸に対する基板平面の精密な配向および基板へのビームの効率的な光学結合は、離散領域のアレイを横断して最適なＳＨＧおよび／またはＴＰＦ信号を達成するために重要である。本開示のいくつかの側面では、全内部反射は、基板表面からの励起光の単一の反射によって達成される。他の側面では、基板は、励起光が導波管に沿って伝搬するにつれて複数の全内部反射を受けるように、導波管として構成されてもよい。さらに他の側面では、基板は、エバネセント場がナノ加工構造を用いて作成される、ゼロモード導波管として構成されてもよい。
【０２３１】
励起光ビームと、図８および図９に図示されるもの等の光学設定内の基板との間の効率的な光学結合は、典型的には、鉱油、鉱油および水素化テルフェニルの混合物、ペルフルオロカーボン流体、グリセリン、グリセロール、またはほぼ１．５の屈折率を有する類似流体等の屈折率整合流体の使用によって達成され、屈折率整合流体は、プリズムと基板の下面との間で吸い上げられる。屈折率整合流体の静的無気泡フィルムが、基板の高速再配置中に妨害される可能性が高いため、本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、高スループットシステムにおいて基板への励起ビームの効率的な光学結合を作成するための代替的アプローチを含む。
【０２３２】
図１０Ａ−Ｂおよび図１１Ａ−Ｂは、プリズムまたは格子のアレイが（マイクロウェルプレート形式で包装される）基板の下面と統合され、固定されたプリズムに取って代わるために使用され、それによって、屈折率整合流体またはエラストマ層の必要性を完全に排除する、本開示の高スループットシステムの好ましい側面を図示する。プリズム（または格子）のアレイは、入射励起光が、「入射プリズム」（「入射格子」）によって、サンプル界面からの励起光ビームの全内部反射を可能にする入射角（図１２参照）において入射プリズム（入射格子）に隣接するが直接上方にはない離散領域またはウェルに指向されるような方法で、かつ反射励起ビーム、および照明された離散領域において生成される非線形光学信号が、調査中の離散領域から再びオフセットされる（隣接するがその直接下にない）「出射プリズム」（「出射格子」）によって収集されるように、基板の上面上の離散領域またはウェルのアレイと整合され、離散領域毎の入射プリズムおよび出射プリズム（入射格子および出射格子）は、アレイの異なる非一意の要素である。
【０２３３】
一般に、Ｍ行×Ｎ列の個々の特徴を備える、離散領域のアレイに関して、対応するプリズムまたは格子アレイは、Ｍ＋２行×Ｎ列またはＮ＋２列×Ｍ行の個々のプリズムまたは格子を有するであろう。いくつかの実施形態では、Ｍ行×Ｎ列の個々の特徴を備える、離散領域のアレイに関して、対応するプリズムまたは格子アレイは、Ｍ＋４行×Ｎ列またはＮ＋４列×Ｍ行の個々のプリズムまたは格子を有するであろう。一般に、Ｍ≠Ｎである。いくつかの実施形態では、Ｍは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０行の値を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｍは、最大で５０、最大で４５、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２５、最大で２０、最大で１８、最大で１６、最大で１４、最大で１２、最大で１０、最大で８、最大で６、最大で４、または最大で２行の値を有してもよい。同様に、いくつかの実施形態では、Ｎは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０列の値を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｎは、最大で５０、最大で４５、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２５、最大で２０、最大で１８、最大で１６、最大で１４、最大で１２、最大で１０、最大で８、最大で６、最大で４、または最大で２列の値を有してもよい。当業者に明白であろうように、ＭおよびＮは、同一の値または異なる値を有してもよく、上記で規定される範囲内の任意の値、例えば、Ｍ＝１５およびＮ＝４５を有してもよい。
【０２３４】
プリズムまたは格子アレイ層の厚さを含む、個々のプリズムまたは格子の幾何学形状および寸法は、入射光が基板の選択された離散領域において全内部反射を受けることを確実にするように最適化され、選択された離散領域において生成される非線形光学信号は、励起光ビームに対する基板（マイクロウェルプレート）の位置から独立して、高い光学結合効率で収集される。プリズムまたは格子アレイは、当業者に公知である種々の技法によって加工されてもよく、例えば、好ましい側面では、それらは、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）または環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、アクリル、ポリエステル、または類似ポリマー等の円滑に流動する低い複屈折材料から射出成形されてもよい。いくつかの側面では、プリズムまたは格子アレイは、別個の構成要素素として加工され、続いて、基板の下面と統合されてもよい。他の側面では、プリズムまたは格子アレイは、基板自体の一体特徴として加工されてもよい。
【０２３５】
収集光学系および検出器：図８はさらに、基板の離散領域の順次照明に応じて生成されるＳＨＧおよび関連非線形光学信号を検出するために使用される、収集光学系および検出器を図示する。表面選択的非線形光学技法が首尾一貫した技法であり、基本および非線形光学光ビームが明確に定義された空間および位相関係を伴って空間を通して伝搬する波面を有することを意味するため、最小限の収集光学系が要求される。放出された非線形光学信号は、プリズム（または上記に説明されるマイクロプレートデバイスの統合プリズムまたは格子アレイ）を用いて収集され、ダイクロイック反射体および鏡を介して検出器に指向される。付加的光学構成要素、例えば、レンズ、光学帯域通過フィルタ、鏡等が、随意に、検出器に到達することに先立ってビームをさらに成形、操向、および／またはフィルタ処理するために使用される。限定ではないが、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＭＯＳセンサ、またはＣＣＤデバイスを含む、種々の異なる光検出器が、使用されてもよい。ある実施形態では、収集光学経路はさらに、随意に、タンパク質または非線形活性標識の（または固定化タンパク質に付着した付加的蛍光標識の）固有の蛍光または２光子蛍光を検出するために使用される、付加的光検出器を備えてもよい。
【０２３６】
同様に、２光子蛍光信号の収集は、低ＮＡ限界内で最小数の光学系を要求する。小直径光ファイバは、例えば、サンプルから離れた好適な距離に位置付けられたとき、プローブ分子から放射される光のごく一部を収集し、本技法の感度を増加させる、ピンホールとして作用することができる。ファイバを通過した後、光学フィルタが、背景光を拒否する一方で、蛍光に対応する適切な帯域幅を選択するために使用されることができる。ＳＨＧと同様に、限定ではないが、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＭＯＳセンサ、またはＣＣＤデバイスを含む、種々の異なる光検出器が、ＴＰＦ信号を検出するために使用されてもよい。
【０２３７】
Ｘ−Ｙ平行移動ステージ：図６に図示されるように、本明細書に開示される高スループットシステムの実装は、理想的には、励起光ビームに関連して（上記に説明される形式のうちのいずれかで）基板を再配置するための高精度Ｘ−Ｙ（またはある場合にはＸ−Ｙ−Ｚ）平行移動ステージを利用する。好適な平行移動ステージは、いくつかのベンダ、例えば、Ｐａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎから市販されている。精密平行移動ステージシステムは、典型的には、限定ではないが、線形アクチュエータ、光学エンコーダ、サーボおよび／またはステッピングモータ、およびモータコントローラまたは駆動ユニットを含む、いくつかの構成要素の組み合わせを備える。ステージ移動の高い精度および再現性は、光学検出および／または液体分注の繰り返しのステップを散在させるときに、非線形光学信号の正確な測定を確実にするために、本明細書に開示されるシステムおよび方法のために要求される。また、励起光の焦点のサイズ（直径または側面上で２０〜２００ミクロン）が基板上の離散領域のサイズよりも実質的に小さいため、本開示のいくつかの側面では、反復測定を行うときに所与の離散領域内でわずかに異なる位置に戻ること、または単一の測定の経過にわたって離散領域の一部を横断して励起ビームをゆっくりと走査し、それによって、長い暴露または以前の暴露の光漂白効果に関する潜在的懸念を排除することも望ましくあり得る。
【０２３８】
その結果として、本明細書に開示される方法およびシステムはさらに、平行移動ステージが励起光ビームに関連して基板を位置付けることが可能である、精度を規定するステップを含む。本開示の一側面では、平行移動ステージの精度は、約１μｍ〜約１０μｍである。他の側面では、平行移動ステージの精度は、約１０μｍまたはそれ未満、約９またはそれ未満、約８μｍまたはそれ未満、約７μｍまたはそれ未満、約６μｍまたはそれ未満、約５μｍまたはそれ未満、約４μｍまたはそれ未満、約３μｍまたはそれ未満、約２μｍまたはそれ未満、または約１μｍまたはそれ未満である。当業者は、平行移動ステージの精度がこれらの値（例えば、約１．５μｍ〜約７．５μｍ）のうちのいずれかによって境界される任意の範囲内に入り得ることを理解するであろう。
【０２３９】
流体分注システム：図６に図示されるように、本明細書に開示される高スループットシステムのいくつかの実施形態はさらに、基板表面上で固定化された生物学的または標的実体を試験実体（または試験化合物）と接触させる際に使用するための自動プログラマブル流体分注（または液体分注）システムを備え、後者は、典型的には、小型有機溶媒成分、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の添加の有無別に水性緩衝剤から成る溶液中に分注される。好適な自動プログラマブル流体分注システムは、いくつかのベンダ、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１、および多くのその他から市販されている。本明細書に開示されるシステムおよび方法の好ましい側面では、流体分注システムはさらに、基板上の複数のウェルまたは場所へのプログラム可能な体積の液体（例えば、約１マイクロリットル〜数ミリリットルに及ぶ）の同時送達のために、マルチチャネル分注ヘッド、例えば、４チャネル、８チャネル、１６チャネル、９６チャネル、または３８４チャネル分注ヘッドを備える。
【０２４０】
プレート取扱ロボット：本明細書に開示される高スループットシステムの他の側面では、本システムはさらに、光学励起および検出光学系に関連して（上記に説明される形式のうちのいずれかで）基板の自動交換および位置付けのため、または随意に、光学計器と流体分注システムとの間で基板を移動させるためのマイクロプレート取扱（またはプレート取扱）ロボットシステム（図６）を備える。好適な自動プログラマブルマイクロプレート取扱ロボットシステムは、いくつかのベンダ、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１、および多くのその他から市販されている。本明細書に開示されるシステムおよび方法の好ましい側面では、自動マイクロプレート取扱ロボットシステムは、冷蔵貯蔵ユニットを往復して、固定化生物学的実体および／または試験化合物のアリコートを備えるマイクロウェルプレートの集合を移動させるように構成される。
【０２４１】
プロセッサ／コントローラおよび制約ベースのスケジューリングアルゴリズム：本開示の別の側面では、開示される高スループットシステムはさらに、随意に、メモリユニット上に記憶され得、説明される種々のサブシステム（励起および検出光学システム、Ｘ−Ｙ（またはＸ−Ｙ−Ｚ）平行移動ステージ、流体分注システム、およびプレート取扱ロボット）を制御し、高スループットＳＨＧおよび／またはＳＨＧ対ＴＲＰＦ信号比測定および分析を実施することに関与する異なる動作ステップを同期化する、システムソフトウェアを起動するように構成されるプロセッサ（または「コントローラ」または「コンピュータ」）（図６）を備える。データ収集プロセス、すなわち、配座変化と関連付けられる非線形光学信号に対応する、検出器からの出力電子信号の収集を取り扱うことに加えて、プロセッサまたはコントローラはまた、典型的には、データを記憶し、データ処理および表示機能（基準信号、配向、または配座の変化が、試験された生物学的実体、または生物学的および試験実体の組み合わせに関して起こったかどうかという決定を含む）を果たし、オペレータによる双方向制御のためのグラフィカルユーザインターフェースを動作させるように構成される。プロセッサまたはコントローラはまた、他のプロセッサとネットワーク接続される、または遠隔場所における他の計器およびコンピュータとの通信のためにインターネットに接続されてもよい。
【０２４２】
プロセッサ／コントローラのための典型的入力パラメータは、分析されるマイクロウェルプレートの総数、プレートあたりのウェルの数、励起および検出ステップが（例えば、終点分析および動力学分析モードを規定するように）マイクロプレートの基板またはウェルの離散領域毎に実施される回数、動力学データが離散領域またはウェル毎に収集されるはずである総時間経過、各離散領域またはウェルに送達される試験化合物溶液の順序、タイミング、および体積、非線形光学信号の収集および積分のための滞留時間、出力データファイルの名称、および当業者に公知であるいくつかのシステム設定および制御パラメータのうちのいずれか等の設定パラメータを含んでもよい。
【０２４３】
本開示の好ましい側面では、プロセッサまたはコントローラはさらに、制約ベースのスケジュールアルゴリズムを実行することによってシステムスループット最適化を実施するように構成される。本アルゴリズムは、上記で説明されるようなシステム設定パラメータを利用し、システムの全体的スループットが、時間あたり分析される生物学的実体および／または試験実体の数の観点から最大限にされるように、相互に隣接する場合とそうではない場合がある、離散領域またはウェルのための散在励起／検出および液体分注ステップの最適な配列を決定する。システム動作ステップの最適化は、高スループット分析を達成することの重要な側面である。開示される方法およびシステムのいくつかの側面では、分析システムの平均スループットは、時間あたり試験される約１０個の試験実体〜時間あたり試験される約１，０００個の試験実体に及んでもよい。いくつかの側面では、分析システムの平均スループットは、時間あたり試験される少なくとも１０個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも２５個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも５０個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも７５個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも１００個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも２００個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも４００個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも６００個の試験実体、時間あたり試験される少なくとも８００個の試験実体、または時間あたり試験される少なくとも１，０００個の試験実体であってもよい。他の側面では、分析システムの平均スループットは、時間あたり試験される最大で１，０００個の試験実体、時間あたり試験される最大で８００個の試験実体、時間あたり試験される最大で６００個の試験実体、時間あたり試験される最大で４００個の試験実体、時間あたり試験される最大で２００個の試験実体、時間あたり試験される最大で１００個の試験実体、時間あたり試験される最大で７５個の試験実体、時間あたり試験される最大で５０個の試験実体、時間あたり試験される最大で２５個の試験実体、または時間あたり試験される最大で１０個の試験実体であってもよい。
【０２４４】
コンピュータシステムおよびネットワーク：種々の実施形態では、本発明の方法およびシステムはさらに、コンピュータシステム上にインストールされたソフトウェアプログラムおよびその使用を含んでもよい。故に、上記のように、種々のサブシステムのコンピュータ化制御、およびデータ分析および表示を含む、高スループット配座分析を実施することに関与する異なる動作ステップの同期化が、本発明の範囲内である。図１３に図示されるコンピュータシステム５００は、随意に、固定媒体５１２を有するサーバ５０９に接続され得る、媒体５１１および／またはネットワークポート５０５から命令を読み出し得る、論理装置として理解され得る。図１３に図示されるようなシステムは、ＣＰＵ５０１と、ディスクドライブ５０３と、キーボード５１５および／またはマウス５１６等の随意の入力デバイスと、随意のモニタ５０７とを含むことができる。データ通信は、ローカルまたは遠隔場所におけるサーバへの指示された通信媒体を通して達成されることができる。通信媒体は、データを伝送および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールドワイドウェブを経由した通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図１３に図示される関係者５２２による受信および／または精査のために、そのようなネットワークまたは接続を経由して伝送され得ることが想定される。
【０２４５】
図１４は、本発明の例示的実施形態に関連して使用され得る、コンピュータシステム１００の第１の例示的アーキテクチャを図示するブロック図である。図１４に描写されるように、例示的コンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ１０２を含むことができる。プロセッサの非限定的実施例は、Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ．ＴＭ．プロセッサ、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ．ＴＭ．プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２ビットＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０．ＴＭ．プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００．ＴＭ．プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４．ＴＭ．プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ９３０．ＴＭ．プロセッサ、または機能的に同等のプロセッサを含む。実行の複数のスレッドが、並列処理のために使用されることができる。いくつかの実施形態では、複数のコアを伴う複数のプロセッサまたはプロセッサもまた、単一のコンピュータシステム内にある、クラスタ内にある、または複数のコンピュータ、携帯電話、および／または携帯情報端末デバイスを備えるネットワークを経由してシステムを横断して分配されるかどうかにかかわらず、使用されることができる。
【０２４６】
図１４に図示されるように、高速キャッシュ１０４が、プロセッサ１０２によって最近使用された、または頻繁に使用される、命令またはデータのための高速メモリを提供するように、プロセッサ１０２に接続される、またはそれに組み込まれることができる。プロセッサ１０２は、プロセッサバス１０８によってノースブリッジ１０６に接続される。ノースブリッジ１０６は、メモリバス１１２によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１１０に接続され、プロセッサ１０２によるＲＡＭ１１０へのアクセスを管理する。ノースブリッジ１０６はまた、チップセットバス１１６によってサウスブリッジ１１４に接続される。サウスブリッジ１１４は、ひいては、周辺バス１１８に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジは、多くの場合、プロセッサチップセットと称され、プロセッサ、ＲＡＭ、および周辺バス１１８上の周辺コンポーネントの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的アーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりに、プロセッサに組み込まれることができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、システム１００は、周辺バス１１８に取り付けられた加速器カード１２２を含むことができる。加速器は、ある処理を加速するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のハードウェアを含むことができる。例えば、加速器は、適応データ再構成のために、または拡張セット処理で使用される代数式を評価するために、使用されることができる。
【０２４８】
ソフトウェアおよびデータは、外部記憶装置１２４の中に記憶され、プロセッサによる使用のためにＲＡＭ１１０および／またはキャッシュ１０４の中にロードされることができる。システム１００は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的実施例は、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）．ＴＭ．、ＭａｃＯＳ．ＴＭ．、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ．ＴＭ．、ｉＯＳ．ＴＭ．、および他の機能的に同等のオペレーティングシステム、および本発明の例示的実施形態による、データ記憶および最適化を管理するためのオペレーティングシステムの上で起動するアプリケーションソフトウェアを含む。
【０２４９】
本実施例では、システム１００はまた、分散並列処理に使用され得る、ネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）および他のコンピュータシステム等の外部記憶装置へのネットワークインターフェースを提供するために周辺バスに接続される、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）１２０および１２１も含む。
【０２５０】
図１５は、複数のコンピュータシステム２０２ａおよび２０２ｂ、複数の携帯電話および携帯情報端末２０２ｃ、およびネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂを伴うネットワーク２００を示す、略図である。例示的実施形態では、システム２０２ａ、２０２ｂ、および２０２ｃは、データ記憶を管理し、ネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂの中に記憶されたデータのためのデータアクセスを最適化することができる。数学モデルが、データに使用され、コンピュータシステム２０２ａおよび２０２ｂおよび携帯電話および携帯情報端末システム２０２ｃを横断して分散並列処理を使用して、評価されることができる。コンピュータシステム２０２ａおよび２０２ｂ、および携帯電話および携帯情報端末システム２０２ｃはまた、ネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂの中に記憶されたデータの適応データ再構成のための並列処理を提供することもできる。図１５は、実施例のみを図示し、多種多様な他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムが、本発明の種々の実施形態と併せて使用されることができる。例えば、ブレードサーバが、並列処理を提供するために使用されることができる。プロセッサブレードは、並列処理を提供するようにバックプレーンを通して接続されることができる。記憶装置はまた、バックプレーンに、または別個のネットワークインターフェースを通してネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）として接続されることもできる。
【０２５１】
いくつかの例示的実施形態では、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持し、他のプロセッサによる並列処理のために、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のコネクタを通してデータを伝送することができる。他の実施形態では、プロセッサのうちのいくつかまたは全ては、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【０２５２】
図１６は、例示的実施形態による、共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図である。本システムは、共有メモリサブシステム３０４にアクセスし得る、複数のプロセッサ３０２ａ−ｆを含む。本システムは、メモリサブシステム３０４の中に複数のプログラマブルハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）３０６ａ−ｆを組み込む。各ＭＡＰ３０６ａ−ｆは、メモリ３０８ａ−ｆと、１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）３１０ａ−ｆとを備えることができる。ＭＡＰは、構成可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの部分が、個別のプロセッサと密接に協調した処理のためにＦＰＧＡ３１０ａ−ｆに提供されることができる。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価するため、かつ例示的実施形態において適応データ再構成を実施するために使用されることができる。本実施例では、各ＭＡＰは、これらの目的のために、プロセッサの全てによって大域的にアクセス可能である。１つの構成では、各ＭＡＰは、ダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用し、関連付けられるメモリ３０８ａ−ｆにアクセスし、それが、個別のマイクロプロセッサ３０２ａ−ｆから独立し、かつそれから非同期的にタスクを実施することを可能にすることができる。本構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン化および並列実行のために別のＭＡＰに直接、結果をフィードすることができる。
【０２５３】
上記のコンピュータアーキテクチャおよびシステムは、実施例にすぎず、汎用プロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡおよび他のプログラマブル論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、および他の処理および論理要素の任意の組み合わせを使用するシステムを含む、多種多様の他のコンピュータ、携帯電話、および携帯情報端末アーキテクチャおよびシステムが、例示的実施形態に関連して使用されることができる。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムの全体または一部は、ソフトウェアまたはハードウェアで実装されることができる。ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）、および他のローカルまたは分散データ記憶デバイスおよびシステムを含む、任意の種類のデータ記憶媒体が、例示的実施形態に関連して使用されることができる。
【０２５４】
例示的実施形態では、コンピュータシステムは、上記または他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムのうちのいずれかの上で実行される、ソフトウェアモジュールを使用して実装されることができる。他の実施形態では、システムの機能は、部分的または完全に、ファームウェア、図１６で参照されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）等のプログラマブル論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理および論理要素で実装されることができる。例えば、セットプロセッサおよびオプティマイザは、図１４に図示される加速器カード１２２等のハードウェア加速器カードの使用を通して、ハードウェア加速を伴って実装されることができる。
【０２５５】
（実施例）
（実施例１）
これらの実施例は、本明細書で提供される請求項の範囲を限定するためではなくて、例証目的のみのために提供される。
実施例１−ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）変異体における構造パラメータの決定
【０２５６】
ガラス製品清掃：開始に先立って、全てのガラス製品をＰｉｒａｎｈａ洗浄（２０分）で清掃する。使用上の注意−洗浄は、極めて発熱性であり、特に有機物と接触しているときに、爆発する傾向がある。Ｈ２Ｏ２を最初に測定し、次いで、酢酸を添加することによって、ヒュームフード内でＰｙｒｅｘ（登録商標）等の耐熱ガラス製品の中で溶液を調製する。
【０２５７】
超音波分解脂質調製：クロロホルム（ＣＨＣｌ３）で真空ボトルを洗い流す。可能な限り空気への暴露を回避するように注意しながら、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）（ＤＧＳ  ＮＴＡ−Ｎｉ）に対するジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）脂質の所望のモル比を決定する。Ｒｏｔｏｖａｐ蒸発器上に脂質混合物を伴う真空ボトルを設置する。乾燥するまで（約３０秒）蒸発させ、次いで、蒸発した調製にわたってＮ２ガスを１０分間噴出し、残留ＣＨＣｌ３を除去する。２ｍＬのｄｉＨ２Ｏ中に脂質混合物を再懸濁させる。混濁した懸濁液が形成するまで（約５分）、活発にボルテックスする。懸濁液を４ｍＬポリスチレン試験管に移送する。溶液が透明になるまで、氷の上で脂質混合物を超音波で分解する。これは、２５％電力に設定された超音波処理器を用いると約６０〜９０秒を要求するはずである。
【０２５８】
超音波分解脂質溶液を、マイクロ遠心分離管の中に移送し、４℃で３０分間、１７，０００ｘＧで遠心分離する。上清を清潔なマイクロ遠心分離管の中に移送し、約１ヶ月間安定している、完成した脂質調製を４℃で貯蔵する。
【０２５９】
スライド調製およびタンパク質装填：ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質を適用する直前に、Ｐｉｒａｎｈａ洗浄で３０分間、顕微鏡スライドを清掃する。スライド染色容器内で、ｄｉＨ２Ｏで８回すすぐ。圧縮窒素でスライドを乾燥させる。接着ガスケットをＰｉｒａｎｈａで清掃したスライドに取り付けることによって、ＳＨＧウェルを組み立てる（すなわち、それぞれ１０〜２０μｌ体積を含有する、スライドあたり１６個のウェル）。組立治具を使用してガスケットを整合させ、スライドを治具の中に慎重に横たえ、しっかりと圧迫する。ＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝剤でＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質調製１：１を希釈する。１００ｍＭのＮａＣｌが、ガラススライドの静力学帯電を低減させ、支持脂質二重層（ＳＬＢ）が形成することを可能にするために要求される。１０〜２０μＬの希釈ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質をスライドのウェルの中にピペットで採取し、室温で３０分間培養する。いかなる時間にも空気をウェルの中に導入しないように注意して、緩衝剤（ＰＢＳまたはＴＢＳ）を２０μＬの新鮮緩衝剤１０ｘと交換することによって、ウェルを洗浄する。必要である場合、ウェル内の緩衝剤を適切なタンパク質装填緩衝剤に交換し、ウェル上に着目標的タンパク質を装填する。摂氏４度で１〜２４時間培養し、その後に、実験を開始する前に分析緩衝剤を用いたウェルの徹底的な浣濯が続く。
【０２６０】
小型単層ベシクル（ＳＵＶ）が、上記で説明されるような超音波分解によって調製され、ＳＬＢ表面を作製するように、Ｐｉｒａｎｈａで洗浄されたＦｉｓｈｅｒスライドにわたって適用される。ＮｉＣｌ２が、１０分間添加され、ウェルが、標識緩衝剤で洗浄された。
【０２６１】
標識タンパク質が、１μＭ（マイクロモル）で１〜２４時間、上記で説明されるように調製されるＳＬＢ表面上に搭載され、その後に、洗浄が続く。イミダゾールまたはＥＤＴＡが添加される場合、またはタンパク質が１つまたは両方の存在下でＳＬＢ表面と培養される場合、ＳＨＧ信号は、基準レベルまで降下し、表面への付着がタンパク質のＨｉｓタグを介して特異的に起こることを示す。
【０２６２】
Ｎ末端またはＣ末端８ｘＨｉｓタグのいずれかを伴う大腸菌タンパク質ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の変異体が、当業者に公知である方法を使用して作成された（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  “Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ：  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  ｏｆ  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９９（２１）：１３４８１−６、Ｇｏｏｄｅｙ，  Ｎ．  （２００８），  “Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｅｍｅｒｇｅ  ｖｉａ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｒｏｕｔｅ”，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４（８）：４７４−８２、Ａｎｔｉｋａｉｎｅｎ，  Ｎ．  （２００５），  “Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（５１）：１６８３５−４３）。第１の場合において、両方の天然システイン残基が除去された（Ｃ８５ＡおよびＣ１５２Ａ）、システインが最小限にされた変異体が作製された。次いで、単一の異なる残基（例えば、Ｍ１６Ｃ、Ｎ２３Ｃ、Ｑ６５Ｃ、Ｋ７６Ｃ等）が、システインに突然変異され、すなわち、単一部位変異構築物が、本システインが最小限にされた背景において作成された。突然変異のための部位を選択するために、タンパク質の表面上の種々の残基が、システインに突然変異され、ＳＨＧプローブによって標識される能力に関して試験された。第２の場合において、野生型タンパク質が、標識され、Ｃ１５２へのプローブの付着が、質量分析によって確認された。野生型または組み換えタンパク質が、ｐＨ７．２の２５ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌの中に精製された。タンパク質は、製造業者の指示に従ってＰｙＭＰＯマレイミドを使用して標識され、例えば、タンパク質は、２０：１の色素：タンパク質標識比で、ｐＨ７．２の２５ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、および約５０μＭにおける１０％グリセロール中で培養された（最終ＤＭＳＯ濃度は、５％であった）。タンパク質が、４℃で一晩撹拌され、次いで、ｐＨ７．２の２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰの中にゲル精製された。標識および精製タンパク質が、次いで、Ｈｉｓタグを介してＳＬＢ表面に繋留された。
【０２６３】
ＴＰＦおよびＳＨＧ測定：ＳＨＧ信号の偏光依存測定が、当業者に公知である方法を使用して、変異体に関するχ（２）の独立したゼロになることのない成分を決定するために使用された。例えば、最も単純な光学幾何学形状では、方位等方性および超分極率テンソルの単一の優位要素を仮定して、χ（２）の２つの独立したゼロになることのない成分（χｚｚｚおよびχｘｚｘまたはχｚｘｘ）を決定する。これらは、ひいては、変異体毎にφ（すなわち、φ１およびφ２）に関連する配向分布を最良に決定するために使用された。
【０２６４】
例えば、Ｃ末端におけるＨｉｓタグを介して固定化されるＭ１６Ｃ変異体に関して、ＴＰＦおよびＳＨＧ信号の測定が、図１７Ａ−Ｂに図示される光学設定を使用して、ｐおよびｓ偏光励起の両方の下で実施された。ＴＰＦは、表面の平面に対して法線で、かつ励起ビーム（サンプルの直接上方にある）および光電子増倍管による照明の下のサンプルの一部に対する軸に沿って位置付けられる、光ファイバケーブルから成るピンホール検出装置を使用して、検出された。ＴＰＦおよびＳＨＧ測定の両方を組み合わせ、励起の２つの異なる偏光の下でそれぞれの強度の比を求めることによって、プローブの角度配向分布の関数にすぎない、２つの独立方程式を取得する。ＴＰＦおよびＳＨＧ測定の両方を使用して、２つの独立方程式を有するため、ゼロ幅配向分布（すなわち、デルタ関数分布）を仮定する必要はなく、むしろ、我々のデータを、平均角度φおよび配向幅σの両方を含有する分布に適合させることができる。データを適合させる際に使用するためのガウス配向分布を仮定することによって（すなわち、上記で説明されるような方程式（２）および（６）の左側を積分し、強度比の測定値が代入されたときに方程式を満たす、平均傾転角および分布幅値の対を識別することによって）、Ｍ１６Ｃ  ＤＨＦＲ変異体に関する一意の平均角度および配向分布幅が、測定されたＴＰＦおよびＳＨＧ比の両方に一致する一対のφおよびσ値を示す、（φ，σ）の位相空間（図１８）内のＴＰＦおよびＳＨＧ曲線軌道（ＴＰＦ＝緑色トレース、ＳＨＧ＝青色トレース）の交差点から決定された。Ｍ１６Ｃ変異体に関して、平均配向傾転角が、７８°であることが決定された一方で、配向分布の幅は、２４°であることが決定された。
【０２６５】
リガンドの添加は、タンパク質集団を横断して標識の再配向から起因する、正または負のいずれかである、ＳＨＧ基準信号レベルの変化（ＳＨＧ変化率）を引き起こした。換言すると、ＳＨＧ基準信号の変化は、リガンド結合の結果として標識配向分布の変化に起因する。図１９（ＴＰＦ曲線＝緑色トレース、ＳＨＧ曲線＝青色トレース）は、ＤＨＦＲに結合することが公知であるリガンドである、１μＭ（マイクロモル）トリメトプリム（ＴＭＰ）が、リガンド結合状態に関して非常に異なる平均角度およびより広い配向分布幅をもたらす、ＴＰＦおよびＳＨＧに関する基準信号の微分変化を生じた、実験の結果を示す。１μＭのＴＭＰ（図１９）の存在下で、平均配向傾転角が、２６°であることが決定された一方で、配向分布の幅は、３３°であることが決定された。
【０２６６】
一意の配向平均角度および配向分布を決定するための上記で概説される手順は、残基Ｍ１６Ｃ、Ｎ２３Ｃ、Ｒ５２Ｃ、Ｑ６５Ｃ、Ｔ７３Ｃ、Ｋ７６Ｃ、およびＥ１１８Ｃにおいて標識される、単一システインＤＨＦＲ変異体に関して繰り返されている。実験が、リガンドＴＭＰの有無別に実施され、これらの実験の結果は、表４および図２０で詳述される。色素が単一システインＤＨＦＲ変異体毎にタンパク質の異なる領域上に位置するため、異なる角度応答が、ＴＭＰを結合することに応じて観察される。極端な場合では、Ｍ１６Ｃ変異体が、大型配座再配列を表示する一方で、Ｑ６５変異体の場合では、角度変化は、より適度である。全ての単一システイン変異体のためのリガンド添加後のタンパク質の配座再配列に起因する、色素配向（平均角度）および配向分布の変化は、表４で要約され、図２０に表示される。
【表４】
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【０２６７】
図２１は、ＴＭＰの添加後の単一システイン変異体毎に配向平均角の変化および配向分布の変化を表示する。鎖線の交差点は、配向変化なしの起点を画定する。データは、Ｍ１６Ｃ変異体およびＮ２３Ｃ変異体が、それぞれ、ＴＭＰの添加に応じて、配向平均角度および配向分布の最大の変化を表示することを示す。
【０２６８】
説明される方法を使用して測定される、単一システイン変異部位におけるリガンド添加に応じた配向変化は、ＴＭＰの存在または非存在下で公開された結晶構造を比較することによって定性的に確認されることができる。図２２は、ＴＭＰに類似するＤＨＦＲの配座変化を生じる、医薬阻害剤メトトレキサート（ＭＴＸ）の存在（青色）および非存在下（黄褐色）のＤＨＦＲの結晶構造のオーバーレイである。システインに突然変異された残基の場所が、図中で標識され、突然変異前のペプチド骨格に対する側鎖の角度配向が、示される。側鎖配向の大きな変化が、説明される方法（図２１参照）によって予測される、標識Ｍ１６Ｃ変異体等の変異タンパク質へのＭＴＸ添加に応じて、図２２で観察される。対照的に、Ｑ６５Ｃ等のいくつかの部位における側鎖配向は、同様に説明される方法（図２１参照）によって予測される、角度変化を殆どまたは全く図２２で表示しない。
【０２６９】
（実施例２）
実施例２−天然アミノ酸を用いて標識されたタンパク質における構造パラメータの決定
（先見的実施例）
ｐ１７タンパク質が、ＳＨＧおよびＴＰＦ活性の両方である非天然アミノ酸である、Ｌ−Ａｎａｐを標識として使用して、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３）の中で作製され、Ｌ−Ａｎａｐは、当業者に公知である種々の遺伝子工学技法のうちのいずれかを使用して、タンパク質に組み込まれる（例えば、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３），  Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  １３５（３４）：１２５４０−１２５４３、Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓ．  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  １３１（３６）：１２９２１−１２９２３）を参照）。
【０２７０】
実施例１に説明される実験プロトコルは、外因性標識の代わりに標識としてＳＨＧおよびＴＰＦ活性非天然アミノ酸（例えば、Ｌ−ＡｎａｐまたはＡｌａｄａｎ）を使用して、実施される。非天然アミノ酸標識ｐ１７が、次いで、当業者に公知である手順に従って、ホスファチジルセリン／ＤＯＰＣ支持脂質二重層（それぞれ、モル％で２５％〜７５％）に結合される（例えば、Ｎａｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．  ９９（８）：２５１６−２５２４参照）。ｐ１７（ひいては、支持脂質二重層に静電的に付着される）内に組み込まれる非天然アミノ酸の平均傾転角および配向分布幅が、次いで、ｐおよびｓ偏光励起の両方の下で、ＳＨＧおよびＴＰＦチャネルの両方の中で、低ＮＡ検出方式を使用して、例えば、レンズを用いることなく、検出された光の強度を決定することによって測定される。
【０２７１】
（実施例３）
実施例３−異なる実験条件下の構造パラメータの決定（先見的実施例）
実施例１の実験は、界面領域と関連し、繋留タンパク質に関して異なる配向分布を生成する、緩衝剤（すなわち、添加剤）（例えば、異なる濃度におけるＰＥＧ４００（例えば、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、および８０μＭマイクロモルＰＥＧ４００））に添加される異なる濃度の分子を含むように拡張されてもよい。これは、独立した分子配向分布および偏光測定の数を増加させ、したがって、角度測定およびタンパク質構造モデルの正確度を増加させる。
（実施例４）
【０２７２】
実施例４−異なる実験条件下で標的タンパク質の異なる変異体を使用する構造パラメータの決定（先見的実施例）
実施例１または２の実験は、異なる単一システイン部位においてそれぞれ標識される、ＤＨＦＲの１０個の異なる変異体を含むように拡張されてもよい。これは、独立した偏光測定の数を増加させ、したがって、角度測定および対応するタンパク質構造モデルの正確度を増加させる。本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態は、一例のみとして提供されることが当業者に明白であろう。多数の変形例、変更、および代用が、ここで、本発明から逸脱することなく、当業者に想起されるであろう。本明細書に説明される本発明の実施形態の種々の代替物が、本発明を実践する際に任意の組み合わせで採用され得ることを理解されたい。以下の請求項は、本発明の範囲を定義し、これらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造は、それによって網羅されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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