(57)【要約】  ３次元細胞培養培地において使用するためのマイクロゲル粒子が述べられている。マイクロゲル粒子は膨潤可能であってよく、３次元細胞培養培地内に分散した細胞の改善された機能及び健康に資する特性を有していてよい。関連する組成物、システム、及び方法がまた述べられている。また与えられているのは、複数のマイクロゲル粒子及び液体細胞培養培地であり、該マイクロゲル粒子は液体細胞培養培地で膨潤して顆粒状のゲルを形成する。また与えられているのは、３次元培養培地を調製する方法である。該方法は、複数のマイクロゲル粒子（例えば、前記のもの）を液体細胞培養培地中で混合する工程を含んでよい。また与えられているのは、細胞を３次元細胞培養培地に配置する方法である。また与えられているのは、タンパク質を合成する方法である。
2020509746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元細胞培養培地に使用するための組成物であって、
該組成物が、
複数のマイクロゲル粒子であって、
複数のマイクロゲル粒子の各々が、架橋されたポリマーネットワークを含み、
該架橋されたポリマーネットワークが、
低電荷密度ポリマー分子、及び
架橋剤
を含む、マイクロゲル粒子
を含む、組成物。
【請求項２】
低電荷密度ポリマー分子の各々が複数の電荷を帯びた基を含み、電荷を帯びた基間の平均間隔がビエルム長の１／４、１／２、１倍、１．５倍、又は２倍より大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記電荷を帯びた基が、負の電荷を帯びた基である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記低電荷密度ポリマーの各々が、第１次のモノマー単位及び第２次のモノマー単位を含み、第２次のモノマー単位が酸性モノマー由来であり、第２次のモノマー単位が電荷を帯びた基を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
第１及び第２次のモノマー単位の合計の６０％未満が第２のモノマー単位である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第１及び第２次のモノマー単位の合計の２０％未満が第２のモノマー単位である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
第１次のモノマー単位がアクリルアミド由来である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
第２次のモノマー単位がメタクリル酸由来である、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記架橋剤が、２５０ｇ／ｍｏｌと１０，０００ｇ／ｍｏｌとの間の平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記架橋剤が、ＰＥＧＤＡ又はＭＢＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記架橋剤が親水性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
マイクロゲル粒子を形成する方法であって、
該方法が、
架橋剤、
第１のモノマー、
第２のモノマーであって、酸性モノマーである第２のモノマー、
開始剤、及び
溶媒、
を含む溶液を形成する工程、
該溶液中でポリマーの形成を開始する工程、及び
該溶液からポリマーを析出させる工程であって、ポリマーはマイクロゲル粒子を形成する工程、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記溶媒がエタノールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１及び第２のモノマー分子の合計の６０％未満が第２のモノマー分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
第１及び第２のモノマー分子の合計の２０％未満が第２のモノマー分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記架橋剤が、２５０ｇ／ｍｏｌと１０，０００ｇ／ｍｏｌとの間の平均分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記架橋剤が、ＰＥＧＤＡ又はＭＢＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
溶液中に存在する架橋剤に対する前記第１のモノマーのモル比が、１０：１と２００：１との間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記架橋剤が親水性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のモノマーがアクリルアミドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸性モノマーがメタクリル酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記開始の工程が、溶液を加熱することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記開始剤が熱的開始剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記熱的開始剤がＡＩＢＮである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記開始剤が、光開始剤又は触媒開始剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記請求項のうちのいずれか一項に記載の複数のマイクロゲル粒子、及び
該マイクロゲル粒子が液体細胞培養培地で膨潤して顆粒上のゲルを形成する、液体細胞培養培地
を含む、３次元細胞培養培地。
【請求項２７】
前記３次元細胞培養培地が、５．５と６との間の、６．５と７．５との間の、又は４．５と８との間のｐＨを有する、請求項２６に記載の３次元細胞培養培地。
【請求項２８】
前記３次元細胞培養培地が、およそ１Ｐａ〜およそ１０Ｐａ、およそ１Ｐａ〜およそ５Ｐａ、又はおよそ１Ｐａ〜およそ２Ｐａの降伏応力を有する、請求項２６に記載の３次元細胞培養培地。
【請求項２９】
３次元細胞培養培地を調製する方法であって、
該方法が、前記請求項のうちのいずれか一項に記載の複数のマイクロゲル粒子を液体細胞培養培地中で混合する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
細胞を３次元細胞培養培地に配置する方法であって、
該方法が、
細胞を、液体細胞培養培地で膨潤させた、前記請求項のうちのいずれか一項に記載の複数のマイクロゲル粒子を含む顆粒状のゲル内に堆積させる工程
を含む、方法。
【請求項３１】
タンパク質を合成する方法であって、
該方法が、
細胞を、液体細胞培養培地で膨潤させた、前記請求項のうちのいずれか一項に記載の複数のマイクロゲル粒子を含む顆粒状のゲルを含む容器内で培養する工程、及び
該培養した細胞により合成されたタンパク質を容器から抽出する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記培養した細胞が膵島細胞であり、前記合成されたタンパク質がインシュリンである、請求項３１に記載のタンパク質を合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４６９，９３９号、及び２０１８年１月１１日に出願された米国特許出願公開第６２／６１６，１０７号の利益を主張し、それらは参照により本明細書にそのまま組み入れられる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金第ＤＭＲ１３５２０４３号の下、政府の援助を得てなされたものである。政府は本発明において、所定の権利を有する。
【０００３】
開示されている実施形態は、三次元細胞培養に関連する化合物、方法、及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
従来の細胞培養技術は、２次元（２Ｄ）基材、例えば、マイクロウェルプレート又はペトリ皿上での細胞培養を含む。かかる２Ｄ細胞培養は、しばしば細胞の培養を促進するために基材上に配置された培養培地を含む。しかしながら、従来の細胞培養の２Ｄ環境は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞により構築される３次元（３Ｄ）環境の代わりとしては、しばしば貧弱な代用である。例えば、細胞の振舞いは、しばしば細胞周りのミクロ環境に強く依存する、すなわち２Ｄ細胞培養においては、細胞周りのミクロ環境は、細胞が３Ｄミクロ環境に構築するであろうものとは異なり得る。
【０００５】
したがって、３Ｄ細胞培養培地のための改良された組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
３次元細胞培養培地（及び関連する方法、用途、及び組成物）に使用するためのマイクロ粒子について述べられている。ある実施形態において、３次元細胞培養培地に使用するための組成物は、複数のマイクロゲル粒子を含む。マイクロゲル粒子は架橋ポリマーネットワークを含んでよい。架橋ポリマーネットワークは、次に、低電荷密度ポリマー分子及び架橋剤を含んでよい。低電荷密度ポリマー分子は、複数の電荷を帯びた基を含んでよく、電荷を帯びた基間の平均間隔は、電荷を帯びた基についてのビエルム長の１／４、１／２、１倍、１．５倍、又は２倍より大きい。
【０００７】
ある実施形態において、マイクロゲル粒子を形成する方法が提供される。該方法は、架橋剤、第１のモノマー、第２のモノマー（第２のモノマーは酸性モノマー、塩基性モノマー、永久カチオン性モノマー、又は双性モノマーである）、開始剤、及び溶媒を含む溶液を形成する工程を含んでよい。該方法は、溶液中でポリマーの形成を開始する工程、及び該ポリマーをポリマーがマイクロ粒子を形成する溶液から析出させる工程をさらに含んでよい。
【０００８】
ある実施形態において、３次元細胞培養培地が提供される。該培地は、複数のマイクロゲル粒子、例えば前記のようなもの、及び液体細胞培養培地（マイクロゲル粒子は液体細胞培養培地で膨潤して顆粒状のゲルを形成する）を含んでよい。
【０００９】
ある実施形態において、３次元細胞培養培地を調製する方法が開示されている。該方法は、複数のマイクロゲル粒子、例えば、前記のようなものを、液体細胞培地中で混合する工程を含む。
【００１０】
ある実施形態において、細胞を３次元細胞培養培地内に配置する方法が開示されている。該方法は、細胞を液体細胞培養培地で膨潤させた複数のマイクロゲル粒子、例えば、前記のようなもの、を含む顆粒状のゲルに堆積させる工程を含んでよい。
【００１１】
ある実施形態において、タンパク質を合成する方法が開示されている。該方法は、細胞を液体細胞培養培地で膨潤させた複数のマイクロゲル粒子を含む顆粒状のゲルを含む容器中で培養する工程、及び培養した細胞により合成されたタンパク質を該容器から抽出する工程を含んでよい。
【００１２】
本発明の他の利点及び特徴は、添付の図と併せて考慮した際、以降の本発明の種々の限定されない実施形態の詳細な説明より明らかとなる。別段注意がない限り、本明細書に引用されている参照は参照によりそのまま組み入れられる。本明細書及び参照により組み入れられた文書が衝突及び／又は矛盾した開示を含む場合、本明細書が支配するものとする。
【００１３】
本発明の１つ以上の詳細が、添付の図及び以降の説明に規定されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書の記載及び図、及び請求項から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
添付の図は、正確な比率であることを目的としていない。図において、種々の図に示されている各同一又はほぼ同一の要素は、同様の符号で表され得る。明確のため、すべての要素を各図において符号付けしているわけではない。図において：
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃは、低電荷密度粒子についての略図及び式である。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｃは、低電荷密度粒子についての略図及び式である。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｃは、低電荷密度粒子についての略図及び式である。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、３Ｄ細胞培養物を培養し及びそれと相互作用するための装置の例を示すものである。
【図３】図３は、１セットの実施形態による、沈殿重合を通じてのアニオン性アクリルアミドヒドロゲルの合成の略図である。
【図４】図４は、１セットの実施形態による、沈殿重合を通じてのｐＨ応答性アニオン性アクリルアミドヒドロゲルの合成の略図である。
【図５】図５は、１セットの実施形態による、沈殿重合を通じてのｐＨ応答性カチオン性アクリルアミドヒドロゲルの合成の略図である。
【図６】図６は、１セットの実施形態による、沈殿重合を通じての永久カチオン性アクリルアミドヒドロゲルの合成の略図である。
【図７】図７は、１セットの実施形態による、沈殿重合を通じての双性アクリルアミドヒドロゲルの合成の略図である。
【図８】図８は、沈殿反応を通じて、種々の電荷密度を有する多電解質マイクロゲルを調製するための方法を示すものである。ＭＡＡ−メタクリル酸、ＣＢＭＡ−カルボキシベタインメタクリラート、ｑＤＭＡＥＭＡ−４級（ｑｕａｄｒａｎｉｚｅｄ）ジメチルアミノエチルメタクリラート。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、カルシウムを添加したカチオン性マイクロゲルのレオロジー変化を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、カルシウムを添加したカチオン性マイクロゲルのレオロジー変化を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、カルシウムを添加したカチオン性マイクロゲルのレオロジー変化を示すグラフである。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、カルシウムを添加したカチオン性マイクロゲルのレオロジー変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、アニオン性及びカチオン性マイクロゲル中での、Ｃ塩／Ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、アニオン性及びカチオン性マイクロゲル中での、Ｃ２帯電／Ｃ塩（ｍＭ２／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【図１２】図１２は、双性マイクロゲル中での、Ｃ塩／Ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【図１３】図１３は、アニオン性（ＭＡＡ）、双性（ＣＢＭＡ）、及びカチオン性（ｑＤＭＡＥＭＡ）マイクロゲル中での、Ｃ塩／Ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【図１４】図１４は、アニオン性（ＭＡＡ）、双性（ＣＢＭＡ）、及びカチオン性（ｑＤＭＡＥＭＡ）マイクロゲル中での、細胞生存率（％）を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、アニオン性（ＭＡＡ）及び双性（ＣＢＭＡ）マイクロゲルについての、Ｃ塩／Ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として遊離のカルシウム（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で開示されているのは、３Ｄ細胞培養培地中で培養した細胞の機能を増加させる組成物及び方法である。本明細書に記載されている材料を使用して３Ｄ細胞培養培地を創作することで、より速い細胞培養、細胞移動、及び／又はより堅実な蛍光材料及び／又は培地中で培養された細胞によるタンパク質の発現が可能となる。例えば、３Ｄ細胞培養培地内に分散した細胞の改善された機能及び健康を与えるのに、本明細書に記載されている３Ｄ細胞培養培地を構築することができる。
【００１６】
例えば、３Ｄ細胞培養培地は、液体細胞培養培地で膨潤させた市販のカルボマーを使用して提唱されてきた。しかしながら、市販のカルボマー（３Ｄ細胞培養培地を形成するのに使用されてきた）は、液体細胞培地から養分を隔離する傾向がある。ある実施形態によると、該３Ｄ細胞培養培地は、マイクロゲル粒子を膨潤させるのに使用された液体細胞培養培地由来の養分、例えば、鉱物（例えば、カルシウム）に対して低減した親和性を有するポリマーで調製したマイクロゲル粒子を使用して、調製される。
【００１７】
本明細書で開示されている低電荷密度を有するマイクロゲル粒子の使用により、ある実施形態において、高電荷密度を有する材料で調製した３Ｄ細胞培養培地よりはるかに良好に機能する３Ｄ細胞培養培地が得られる。本明細書で使用する限り、用語『低電荷密度』とは、ポリマー骨格の電荷を帯びた基の平均間隔が、標準外気温度（２５℃）で系のビエルム長と近い又は系のビエルム長より大きいマイクロゲル粒子の特性を指す。低電荷密度マイクロゲル粒子のある実施形態において、マイクロゲル粒子の電荷を帯びた基の平均間隔は、系のビエルム長の１／４、１／２、３／４より大きい。ある実施形態において、マイクロゲル粒子の電荷を帯びた基の平均間隔は、系のビエルム長より大きい。ある実施形態において、マイクロゲル粒子の電荷を帯びた基の平均間隔は、系のビエルム長より１．５倍、２．０倍、２．５倍、又は３．０倍大きい。
【００１８】
ビエルム長は、ポリマー骨格上の電荷を帯びた基が静電相互作用し始める交差長を特徴付けるものである。図に戻ると、図１Ａ−Ｃは低電荷密度及びビエルム長の概念をさらに明確にするのに役立つ。図１Ａは、中性の基及び電荷を帯びた基を含むコポリマー鎖の略図を提供するものである。かかるコポリマー鎖の１つのあり得る例として、図１Ｂは、中性アクリルアミド基又はモノマー単位及び電荷を帯びたメタクリル酸基又はモノマー単位を含むコポリマーを示すものである。図１Ｃは、図１Ａの電荷を帯びた基間の平均距離を決定するための、及び電荷を帯びた基のビエルム長を決定するための式を提供するものである。図１Ｃにさらに示されているように、低電荷密度を有するポリマーは、電荷を帯びた基間の平均距離が系のビエルム長より大きいものとして定義される。
【００１９】
電荷を帯びた基間の平均距離は、式１で定義される：
【数１】
2020509746.tif 000003
【００２０】
系、例えば、３Ｄ細胞培養培地についてのビエルム長は、式２で定義される：
【数２】
2020509746.tif 000004
【００２１】
かかるポリマーは、液体細胞培養培地で膨潤させられ得るマイクロゲル粒子を形成するのに使用してよい。これにより時折規定のパターンで細胞が堆積し得る、『降伏応力』材料を形成する３Ｄ細胞培養培地が得られる。該降伏応力材料は、細胞クラスターの培養を可能とするのに降伏することができる。
【００２２】
ある実施形態によると、３Ｄ細胞培養培地が低電荷密度マイクロゲル粒子を含む際、該３Ｄ細胞培養培地は液体細胞培養培地から養分を隔離することとはならない。かかる養分は、ある実施形態において、鉱物であってよい。かかる養分は、ある実施形態において、多価イオン（例えば、カルシウムイオン）であってよい。しかしながら、マイクロゲル粒子のポリマー骨格上の電荷を帯びた基間の平均間隔が、ビエルム長より小さい又ははるかに小さい（すなわち、該粒子が高電荷密度を有する）場合、多価イオンは、しばしば隔離されることとなる。多価イオン、例えば、カルシウムイオンの隔離は、３Ｄ細胞培養培地内の細胞の機能及び健康に顕著に悪影響を及ぼし得る。それゆえ、本明細書に開示されている低電荷密度マイクロゲル粒子の使用は、３Ｄ細胞培養培地内の細胞の改善された機能及び健康を提供し得る。本明細書に開示されている低電荷密度粒子は、所望の膨潤能を提供する一方、高電荷密度粒子により引き起こされる細胞の健康及び生存率に関する欠点を回避させる。
【００２３】
本明細書に記載されている３Ｄ細胞培養培地は、スフェロイド、胚様体、腫瘍、嚢胞、及び微細組織を含むがこれらに限定されない多様な細胞構造の培養を可能なものとし、細胞工学組織構造物の構造を保存するのにまた使用してもよい。ある実施形態において、３Ｄ細胞培養培地は、液体細胞培養培地に分散したマイクロゲル粒子を含むヒドロゲルを含んでよい。
【００２４】
ある実施形態によると、前記マイクロゲル粒子は、生体適合性ポリマー及び架橋剤を含んでよい。該ポリマーは、ポリマーネットワークを形成して架橋剤が結合するポリマー骨格として機能する。ポリマーは第１及び第２のモノマー単位を含むコポリマーであってよい。第１のすなわち最初のモノマー単位は中性であってよく、一方第２のモノマー単位、又はコモノマー単位は電荷を帯びているものであってよい。ポリマーネットワークの構成要素は、低電荷密度マイクロゲル粒子の形成を促進するよう、選択されてよい。
【００２５】
主要パーセンテージのマイクロゲル粒子を含むモノマーは、アクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、及びアクリラートを含んでよい。限定されない例は、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）アクリラート、ポリ（エチレングリコール）メタクリラート、Ｎ−ビニルカプロラクタム、酢酸ビニル、２−ヒドロキシエチルアクリラート、及びＮ−ビニルピロリドンを含む。
【００２６】
電荷を帯びたコモノマーは、イオン性（すなわち、酸性又は塩基性官能基を有する）コモノマーを含んでよい。ある場合において、このコモノマーは、酸性官能基を有していてよく、酸性コモノマーであってよい。酸性コモノマーの限定されない例は、メタクリル酸、アクリル酸、４−スチレンスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−カルボキシエチルアクリラート、及びビニル安息香酸（全異性体）を含む。ある実施形態において、マイクロゲル粒子中の酸性コモノマーの取り込みは、２０ｍｏｌ％未満である。ある実施形態において、酸性コモノマーの取り込みは、およそ０ｍｏｌ％〜およそ３０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ２０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１５ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１０ｍｏｌ％、又はおよそ０ｍｏｌ％〜およそ５ｍｏｌ％であってよい。
【００２７】
電荷を帯びたコモノマーは、イオン性（すなわち、酸性又は塩基性官能基を有する）コモノマーを含んでよい。ある場合において、このコモノマーは、塩基性官能基を有していてよく、塩基性コモノマーであってよい。塩基性コモノマーの限定されない例は、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリラート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリラート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリラート、２−アミノエチルメタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミドを含む。ある実施形態において、マイクロゲル粒子中の塩基性コモノマーの取り込みは、３０ｍｏｌ％未満、例えば、２０ｍｏｌ％未満である。ある実施形態において、酸性コモノマーの取り込みは、およそ０ｍｏｌ％〜およそ３０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ２０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１５ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１０ｍｏｌ％、又はおよそ０ｍｏｌ％〜およそ５ｍｏｌ％であってよい。
【００２８】
電荷を帯びたコモノマーは、永久イオン化（すなわち、永久正又は負電荷、又はいずれも有する）コモノマーを含んでよい。ある場合において、このコモノマーは、永久カチオン性官能基を有していてよく、永久カチオン性コモノマーであってよい。永久カチオン性コモノマーの限定されない例は、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、及び（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリラート）メチルクロリドを含む。ある実施形態において、マイクロゲル粒子中の酸性コモノマーの取り込みは、２０ｍｏｌ％未満である。ある実施形態において、永久カチオン性コモノマーの取り込みは、およそ０ｍｏｌ％〜およそ３０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ２０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１５ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１０ｍｏｌ％、又はおよそ０ｍｏｌ％〜およそ５ｍｏｌ％であってよい。
【００２９】
電荷を帯びたコモノマーは、永久イオン化（すなわち、永久正又は負電荷、又はいずれも有する）コモノマーを含んでよい。ある場合において、このコモノマーは、双性（すなわち、正及び負電荷いずれも有する）官能基を有していてよく、双性コモノマーであってよい。一般的な双性基は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、及びホスホベタインを含む。双性コモノマーの限定されない例は、３−［［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、及び（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）を含む。ある実施形態において、マイクロゲル粒子中の双性コモノマーの取り込みは、２０ｍｏｌ％未満である。ある実施形態において、酸性コモノマーの取り込みは、およそ０ｍｏｌ％〜およそ３０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ２０ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１５ｍｏｌ％、およそ０ｍｏｌ％〜およそ１０ｍｏｌ％、又はおよそ０ｍｏｌ％〜およそ５ｍｏｌ％であってよい。
【００３０】
ある実施形態において、第１のモノマー及び第２のモノマーのモル比は、所望の低電荷密度マイクロゲル粒子を提供するのに制御され得る。例えば、ある実施形態において、第１及び第２のモノマーの合計の６０％未満が、第２のモノマー（例えば、酸性、塩基性、永久カチオン性、又は双性コモノマー）である。ある実施形態において、第１及び第２のモノマーの合計の５０％未満、４０％未満、３０％未満、又は２０％未満が、第２のモノマー（例えば、酸性コモノマー）である。
【００３１】
架橋剤は、典型的に、２つ以上のポリマー鎖と反応することが可能な化合物である。ある実施形態において、例えば、架橋剤は、少なくとも２つのビニル基を含む化合物である。ある場合において、架橋剤は、低分子量化合物である。好適な架橋剤の限定されない例は、Ｎ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡ）、ジエチレングリコールジアクリラート、ペンタエリトリトールトリアリルエーテル、及びＮ，Ｎ−エチレンビス（メタクリルアミド）を含む。
【００３２】
ある実施形態において、前記架橋剤はポリマーである。ある実施形態において、ポリマーはポリエーテルであってよい。好適な架橋剤の限定されない例は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート（『ＰＥＧｄａ』）である。架橋剤は、所望の膨潤特性を有するマイクロゲル粒子の形成を促進させるのに好適な数平均分子量を有する架橋剤を選択してよい。ある場合において、架橋剤は、２５０ｇ／ｍｏｌと１０，０００ｇ／ｍｏｌとの間の数平均分子量を有する。ある場合において、架橋剤は、少なくともおよそ５００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ１０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ２０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ５０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくともおよそ５０，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する。ある実施形態において、架橋剤は、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ２０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０００ｇ／ｍｏｌ、およそ２０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ２０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ２０００ｇ／ｍｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、又はおよそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量を有する。
【００３３】
開始剤は、一般的に、ある条件の下（例えば、光及び／又は熱への曝露、又は酸化還元条件）、ラジカル種を生成することが可能な物質を指す。開始剤は、アゾ及び過酸化物化合物を含む、熱的開始剤を含んでよい。例としては、アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビス（シロヘキサン−１−カルボニトリル）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルヴァレロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルヴァレロニトリル）、ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオナート）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］四水和物、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−ｙｌ）プロパン］、４、４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル、過酸化ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化２−エチルヘキシルカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ラウロイル、及び過酸化２−ブタノンを含むが、これらに限定されない。開始剤は、光開始剤をまた含んでもよい。例としては、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、Ｉｒｇａｃｕｒｅ開始剤（例えば、Ｃｉｂａ（登録商標）ＩＲＧＡＣＵＲＥ（登録商標）２９５９）、又は２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
重合は、酸化還元開始剤系で開始することができ、一般に助触媒として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）又は過硫酸カリウム（ＫＰＳ）及びジアミン化合物を含む。ジアミンの例は、ＴＥＭＥＤ及びジメチルアミノプロピオニトリル（ＤＭＰＮ）を含む。
【００３５】
反応混合物中（例えば、そこからマイクロゲル粒子が沈殿する溶液）のモノマーの濃度は、得られるマイクロゲル粒子の性質に影響を与え得る。使用され得るモノマー濃度は、およそ０．０１Ｍ〜およそ０．１Ｍ、およそ０．１Ｍ〜およそ１Ｍ、およそ１Ｍ〜およそ２Ｍ、およそ０．１Ｍ〜およそ０．８Ｍ、およそ０．１Ｍ〜およそ０．６Ｍ、およそ０．１Ｍ〜およそ０．４Ｍ、及びおよそ０．１Ｍ〜およそ０．２Ｍを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
マイクロゲル粒子の架橋密度は、反応混合物中の架橋剤に対するモノマーの比により支配され得る。架橋剤に対するモノマーのモル比は、およそ１０：１、およそ２０：１、およそ５０：１、およそ１００：１、およそ１５０：１、又はおよそ２００：１を含むが、これらに限定されない。範囲は、またこれらの比（例えば、およそ１０：１からおよそ２０：１）から形成してよい。
【００３７】
ある実施形態によると、方法はマイクロゲル粒子を形成するために実行され得る。方法は、架橋剤；第１のモノマー；第２のモノマー（第２のモノマーは酸性モノマー、塩基性モノマー、永久カチオン性モノマー、又は双性モノマーである）；開始剤；及び溶媒を含む溶液を形成する工程を含む。方法は、溶液中でポリマーの形成を開始する工程；及び該ポリマーを溶液から析出させる工程（ポリマーはマイクロゲル粒子を形成する）をさらに含んでよい。
【００３８】
ある実施形態によると、マイクロゲル粒子は、沈殿重合法を使用して調製される。この方法において、モノマーは反応媒体に溶解するが、形成されたポリマーは溶解しない。ポリマーが形成されるにつれ、ポリマーは不溶性となり溶液から析出する。架橋剤が存在する場合においては、ある条件の下、離散したマイクロ粒子が形成され得る。
【００３９】
フリーラジカル重合システムは、一般的に、ラジカル源として振舞うことが可能な開始剤（例えば、光開始剤、熱的開始剤、酸化還元開始剤）、１つ以上のモノマー（例えば、ビニルモノマー）、及び、要すれば、溶媒を含む。フリーラジカル重合の機構は次の通りである。第１に、開始剤が（例えば、均等結合開裂を通じて）フリーラジカルを形成する。ある場合において、フリーラジカルのうちの少なくとも１つが、続いてモノマーと反応してモノマーラジカルを形成し得る。モノマーラジカルは、それから１つ以上のさらなるモノマーと反応して活性ポリマー鎖（すなわち、ポリマーラジカル）を形成し得る。ある場合において、活性ポリマー鎖は、ビラジカル停止（例えば、再結合又は不均化）を通じて停止し、さらに反応することが不可能な不活性ポリマー鎖を形成し得る（例えば、活性ポリマー鎖Ｐｎ及び活性ポリマー鎖Ｐｍが反応して不活性ポリマー鎖Ｄｎ＋ｍ又は不活性ポリマー鎖Ｄｎ及びＤｍを形成する）。
【００４０】
沈殿重合において、モノマーを溶媒和させ及び形成されたポリマーを脱溶媒和する溶媒が必要である。好適な溶媒の限定されない例は、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキソラン、アニソール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、水、メタノール、ヘキサン、ヘプタン、及びアセトニトリルを含む。
【００４１】
重合温度は、およそ０°Ｃ〜およそ１２０°Ｃに及んでよい。ある場合において、重合が行われる温度は、およそ１２０°Ｃ以下、およそ１１０°Ｃ以下、およそ１００°Ｃ以下、およそ９０°Ｃ以下、およそ８０°Ｃ以下、およそ７０°Ｃ以下、およそ６０°Ｃ以下、およそ５０°Ｃ以下、およそ４０°Ｃ以下、およそ３０°Ｃ以下、およそ２０°Ｃ以下、およそ１０°Ｃ以下、およそ０°Ｃ以下、又はおよそ−１０°Ｃ以下である。ある実施形態において、重合が行われる温度は、およそ−１０°Ｃ〜およそ２０°Ｃ、−１０°Ｃ〜およそ５０°Ｃ、−１０°Ｃ〜およそ１００°Ｃ、およそ０°Ｃ〜およそ２０°Ｃ、およそ０°Ｃ〜およそ３０°Ｃ、およそ０°Ｃ〜およそ４０°Ｃ、およそ０°Ｃ〜およそ５０°Ｃ、およそ０°Ｃ〜およそ１００°Ｃ、およそ１０°Ｃ〜およそ２０°Ｃ、およそ１０°Ｃ〜およそ３０°Ｃ、およそ１０°Ｃ〜およそ４０°Ｃ、およそ１０°Ｃ〜およそ５０°Ｃ、およそ１０°Ｃ〜およそ１００°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ３０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ４０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ５０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ６０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ７０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ８０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ９０°Ｃ、およそ２０°Ｃ〜およそ１００°Ｃ、およそ３０°Ｃ〜およそ５０°Ｃ、およそ３０°Ｃ〜およそ１００°Ｃ、およそ５０°Ｃ〜およそ６０°Ｃ、およそ５０°Ｃ〜およそ７０°Ｃ、およそ５０°Ｃ〜およそ８０°Ｃ、およそ５０°Ｃ〜およそ９０°Ｃ、およそ５０°Ｃ〜およそ１００°Ｃ、およそ５０°Ｃ〜およそ１１０°Ｃ、又はおよそ５０°Ｃ〜およそ１２０°Ｃの範囲にある。
【００４２】
得られる個々のマイクロゲル粒子のサイズは、位相差光学顕微鏡を使用して測定される。マイクロゲル粒子のサイズは、１０μｍ未満が好ましい。ある場合において、マイクロゲル粒子のサイズは、５μｍ未満である。ある場合において、マイクロゲル粒子のサイズは、３μｍ〜５μｍである。
【００４３】
得られるポリマーは、モノマー及びイオン性コモノマーの架橋されたコポリマーを含み得る。ある実施形態において、得られるポリマーは、少なくともおよそ５００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ１０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ２０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ５０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ３０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ４５，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ６０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ７０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ９０，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ２００，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、少なくともおよそ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくともおよそ５００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する。ある実施形態において、１つ以上の休止状態の官能基を含むポリマーは、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４５，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ６０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ７０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ９０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ５００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４５，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ６０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ７０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ９０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ６０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ７０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ９０，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ４０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ８０，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ２００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、およそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、又はおよそ１００，０００ｇ／ｍｏｌ〜およそ５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の数平均分子量を有する。
【００４４】
数平均分子量Ｍｎは、式３に従って、個々のポリマー鎖の分子量の数平均をとることにより得られ得る。
【数３】
2020509746.tif 000005
【００４５】
ある実施形態によると、３Ｄ細胞培養培地は、マイクロゲル粒子を液体細胞培養培地に分散させることにより調製され得る。マイクロゲル粒子は、遠心分離混合機、シェイカー、又は任意の他の好適な混合装置を使用して、液体細胞培養培地と混合してよい。混合の間、マイクロゲル粒子は液体細胞培養培地で膨潤して、前記のように、印加されたせん断応力が降伏応力を下回る際に実質的に固体である材料を形成し得る。混合の後、混合工程の間、取り込まれた同伴空気又は気泡は、遠心分離、撹拌、又は３Ｄ細胞培養培地から気泡を除く任意の他の好適な方法を経由して、取り除いてよい。
【００４６】
ヒドロゲル、例えば、３Ｄ細胞培養培地は、マイクロゲル粒子を種々の濃度で水溶液に加えることで調製してよい。ある実施形態において該水溶液は液体細胞培養培地を含んでよい。例としては、（水溶液に対して）１０ｗｔ％未満のポリマー濃度を使用してよい。好ましくは、５％未満のポリマー濃度が使用される。非常に好ましくは、２％未満のポリマー濃度が使用される。
【００４７】
ある実施形態において、３Ｄ細胞培養培地の調製は、マイクロゲル粒子及び液体細胞培養培地混合物のｐＨを所望の値に調節する緩衝工程を含む。例えば、あるマイクロゲル粒子は３Ｄ細胞培養培地を過度に酸性（所望の値を下回るｐＨを有する）とし得る、主に負電荷を有するポリマーから製造してよい。３Ｄ細胞培養培地のｐＨは、強塩基を添加して酸を中和し、ｐＨを上昇させて所望のｐＨに近づけることで調節してよい。代わりに、混合物は所望の値より高いｐＨを有していてよく、かかる混合物のｐＨは酸を添加することで低下させてもよい。ある実施形態によると、前記所望のｐＨは５．５と６との間、又は４．５と８との間の範囲にあり得る。
【００４８】
１つの限定されない例として、３Ｄ細胞培養培地は、およそ０．２質量％〜およそ０．７％のマイクロゲル粒子を含む。マイクロゲル粒子は、前記のように、任意の好適な細胞培養培地と混合され及び膨潤されておよそ９９．３質量％〜９９．８質量％の液体細胞培養培地を含む３Ｄ細胞培養培地を形成し得る。
【００４９】
液体細胞培養培地と混合した際、マイクロゲル粒子は、液体細胞培養培地で膨潤されて３Ｄ細胞培養培地として機能する顆粒状のヒドロゲル材料を形成し得る。具体的な実施形態に応じて、膨潤したマイクロゲル粒子は、ミクロン又はサブミクロンスケールの特徴的なサイズを有していてよい。例えば、ある実施形態において、前記膨潤したマイクロゲル粒子は、およそ０．１μｍと１００μｍとの間の、およそ１μｍと１００μｍとの間の、およそ１μｍと５０μｍとの間の、又はおよそ０．１μｍと５０μｍとの間のサイズを有していてよい。他の値もまた可能である。
【００５０】
本明細書で使用する限り、用語『マイクロゲル粒子』とは、ヒドロゲル中での使用に好適な粒子を指し、ヒドロゲルに取り込まれる際、及びゲルへの取り込み前後いずれの粒子にも適用される。
【００５１】
任意の好適な液体培養培地を使用してよい。具体的な液体細胞培養培地は、３Ｄ細胞培養培地内に配置される細胞のタイプに応じて選択してよい。好適な液体細胞培養培地は、ヒト細胞培養培地、ネズミ細胞培養培地、ウシ細胞培養培地又は任意の他の好適な細胞培養培地であってよい。具体的な実施形態に応じて、マイクロゲル粒子及び液体細胞培養培地を任意の好適な組み合わせで組み合わせてよい。例えば、ある実施形態において、３Ｄ細胞培養培地は、およそ０．５重量％〜１重量％のマイクロゲル粒子を含む。
【００５２】
さらに、３Ｄ細胞培養培地は、任意の好適な機械的特性を有していてよく、ある実施形態において、機械的特性は、マイクロゲル粒子及び液体細胞培養培地の相対濃度を経由して調節され得る。例えば、高濃度のマイクロゲル粒子により、高弾性率及び／又は高降伏応力を有する３Ｄ細胞培養培地が得られる。
【００５３】
開示されている調節性は、３Ｄ細胞培養培地内に配置された細胞群周りの環境を制御するのに有利である。例えば、３Ｄ細胞培養培地は、細胞３Ｄ細胞培養培地が細胞の自然な環境を模倣し得るよう、ｉｎ  ｖｉｖｏで見つかるものと同様となるよう調節された機械的特性を有していてよい。しかしながら、３Ｄ細胞培養培地の機械的特性はｉｎ  ｖｉｖｏで見つかるものと同様のものではあり得ず、又は本開示でそのように限定されていないように、任意の好適な値に調節してよいと解すべきである。
【００５４】
ヒドロゲルのせん断弾性率は、広範囲の周波数に亘って１％歪みでオシレーター周波数掃引を行うことにより測定される。ヒドロゲルのせん断弾性率は、１００Ｐａ未満の比較的一定の値でせん断粘性率を上回ることが好ましい。ある場合において、ヒドロゲルのせん断弾性率は５０Ｐａ未満である。ある場合において、ヒドロゲルのせん断弾性率は、およそ１０Ｐａ〜およそ１００Ｐａ、およそ１０Ｐａ〜およそ８０Ｐａ、およそ１０Ｐａ〜およそ６０Ｐａ、およそ１０Ｐａ〜およそ４０Ｐａ、又はおよそ１０Ｐａ〜およそ２０Ｐａである。
【００５５】
ヒドロゲルシステム（例えば、３Ｄ細胞培養培地）の降伏応力は、応力値とは独立したせん断速度に相当する。ヒドロゲルの降伏応力は、単一方向のせん断速度をヒドロゲルサンプルに適用し、得られるせん断応力を記録し、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙモデルを得られる応力対対歪み速度曲線にフィットさせることにより測定される。３Ｄ細胞培養培地の降伏応力は、１０Ｐａ未満であることができる。ある場合において、３Ｄ細胞培養培地の降伏応力は、５Ｐａ未満である。ある場合において、３Ｄ細胞培養培地の降伏応力は、およそ５Ｐａである。ある場合において、３Ｄ細胞培養培地の降伏応力は、およそ１Ｐａ〜およそ１０Ｐａ、およそ１Ｐａ〜およそ８Ｐａ、およそ１Ｐａ〜およそ６Ｐａ、およそ１Ｐａ〜およそ４Ｐａ、又はおよそ１Ｐａ〜およそ２Ｐａである。
【００５６】
ある実施形態によると、３Ｄ細胞培養培地は、前記顆粒状のゲル材料が印加された応力のために一時的な相変化を受けるよう、材料から製造してよい（例えば、チキソトロピー性又は『降伏応力』材料）。かかる材料は固体又は降伏応力を下回る程度で印加された応力の下、その形状を保持する、ある別の相であってよい。降伏応力を超える応力の印加では、これらの材料は、流体又は形状を変化させ得るある他のより展性の層となり得る。印加された応力が除かれた際には、降伏応力材料は、また固体となり得る。応力はかかる材料に任意の好適な方法で印加してよい。例えば、エネルギーをかかる材料に加えて相変化を創出させてもよい。エネルギーは、機械的、電気的、放射、又は光、などを含む、任意の好適な形態であってよい。
【００５７】
用語『降伏応力』及び『降伏応力材料』は、当該技術分野において、種々の意味で使用され、特徴付けられてきた。本明細書では説明を容易にするため、用語『降伏応力』及び『降伏応力材料』を使用するが、別段示さない限りは、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ方程式
【数４】
2020509746.tif 000006
【００５８】
さらに、『降伏応力』（すなわち、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ降伏応力）は、当該技術分野において、種々の方法で測定されている。本明細書において別段示さない限り、サンプルの降伏応力は、プレート−プレート配置を使用してレオメーター中でサンプルをせん断することにより及びＨｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ方程式を経由して、次の方法を経由して決定される。せん断に先立ち、レオメーターツール表面は、サンプルツール界面で滑ることを防止し又は軽減するために粗いものであってよい。レオメーターを使用して、サンプルは高せん断速度（例えば、１０００ｓ−１）と低せん断速度（０．００１ｓ−１）との間の、種々のせん断速度でせん断される。各せん断速度について、サンプルを３０秒間せん断し、その後、せん断応力データを集め、平均化する。一連のせん断応力測定が各せん断速度について連続的に集められる。これらのせん断速度は、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ方程式を経由して、（１）材料が降伏応力（すなわち、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ降伏応力）を有するか、及び（２）材料についての降伏応力、を決定するのに使用される。当業者は、降伏応力を有する材料について、せん断応力対せん断速度のプロットが、低せん断速度で、材料の降伏応力に漸近的に近づくデータポイントとともに、低せん断速度でプラトー領域を示すことが分かるであろう。降伏応力は、これらの小さい、ほぼ０のせん断速度でのせん断応力であるか、又は小さい又はほぼ０のせん断速度、例えば、１０−３ｓ−１のせん断速度、を使用して決定される、０歪み速度でのせん断応力の概算値である。本明細書で使用する限り（別段示されていない限り）、『降伏応力材料』とは、この方法を経由して決定することが可能な降伏応力を有する材料であることとなる。当業者は、低せん断（例えば、ほぼ０のせん断速度）での降伏応力材料（すなわち、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ降伏応力材料）について、せん断応力は、せん断速度とは独立のものであり、代わりに材料の弾性成分にのみ依存するせん断応力を示すことが分かるであろう。
【００５９】
降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地は、前記のように、３Ｄ細胞培養培地内の任意の所望の位置でグループ細胞の容易な配置及び／又は回収を可能とし得る。例えば、細胞の配置は、細胞が所望の位置で注入され又はそうでなければ配置された際に降伏応力材料が流れて置換されることとなるよう、固体から液体への相変化を、降伏応力材料内の所望の位置で起こすことにより達成し得る。注入の後、降伏応力材料は配置された細胞周りで固化し、それゆえ所望の位置で細胞を捕捉し得る。
【００６０】
しかしながら、任意の好適な方法が、３Ｄ細胞培養培地内に細胞又は他の生体材料を堆積させるのに使用してよいことを理解されたい。例えば、シリンジ、ピペット又は他の好適なツールを使用して、細胞を３Ｄ細胞培養培地の１つ以上の位置に注入してよい。ある実施形態において、注入された細胞は、例えば、遠心分離によりペレットとして成形してよい。しかしながら、本明細書に述べられている３Ｄ細胞培養培地により、液体中に吊り下げられた細胞が可能となり、それにより試験を行う際、遠心分離工程を回避してよいことは理解されたい。
【００６１】
どのように細胞が培地中に配置されているかにかかわらず、降伏応力材料の降伏応力は、３Ｄ細胞培養培地内の細胞の位置が時間を経ても実質的に一定であり得るよう、細胞により行使される重力及び／又は拡散力が原因となる降伏を抑止するのに十分な程、大きいものであってよい。細胞が定位置に固定されているため、降伏応力材料に相変化を起こして細胞を除くことによるアッセイ又は試験のために、後にそれらを同一の場所から回収してよい。下記でより詳細に述べるように、細胞群の配置及び／又は回収は手作業又は自動で行なってよい。
【００６２】
本明細書に記載されている降伏応力材料は、任意の好適な機械的特性を有していてよい。例えば、ある実施形態において、降伏応力材料は、降伏応力を下回る程度の印加応力で材料がその形状を保持する固相又は他の相である際、およそ１Ｐａと１０００Ｐａとの間の弾性率を有し得る。ある実施形態において、降伏応力材料を流体様の相に変換するために必要とされる降伏応力は、およそ１Ｐａと１０００Ｐａとの間であり得る。流体様の相に変換された際、降伏応力材料は、およそ１Ｐａ  ｓと１０，０００Ｐａ  ｓとの間の粘度を有し得る。しかしながら、本開示においてそのように限定されていないように、弾性率、降伏応力、及び／又は降伏応力材料の粘度についての他の値もまた可能であることは理解されたい。
【００６３】
ある実施形態において、前記降伏応力は、前記のように、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞群により感じ取られる圧縮応力に適合するように調節してよい。任意の特定の理論に拘束されるのを望むわけではないが、特定の応力値で降伏する降伏応力材料により、限定されない及び／又は非制限的な細胞群の培養又は拡張が可能となる。具体的には、細胞群は成長するにつれ、取り囲む降伏応力材料に静水圧を行使し得る；この静水応力は、降伏材料の降伏を引き起こすのに十分なものであり得、それにより細胞群の拡大が可能となる。かかる実施形態において、細胞群の培養の間の降伏材料の降伏は、培養の間、細胞群に一定の圧力を維持する降伏応力材料を与え得る。さらに、降伏応力材料は、印加された応力が降伏応力を超えた際に降伏することとなるため、降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地が、降伏応力を超える応力を細胞群に印加することは不可能であり得る。本願発明者は、細胞群に適用される応力のかかる上限により、細胞が不自然に束縛され、損傷し、又はそうでなければ大きい圧縮応力の印加のために変化しないことを確実なものとするのに役立ち得ることを、認識し、理解している。
【００６４】
ある実施形態によると、降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地は、排出物、例えば、３Ｄ細胞培養培地内に配置された細胞群由来の流体又は他の細胞外物質を収容するために降伏し得る。任意の特定の理論に拘束されるのを望むわけではないが、細胞群由来の流体又は他の物質の排出により細胞外空間の圧力が増加し得る；３Ｄ細胞培養培地の降伏応力を超えた場合には、３Ｄ細胞培養培地は排出物を収容するのに降伏し、細胞群は制限なく流体又は他の物質を排出し得る。かかる３Ｄ細胞培養培地の細胞排出物収容能により、３Ｄ細胞培養培地は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの環境により近接に匹敵することが可能となり得る。さらに、本願発明者は、以降より詳細に説明するように、降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地により、アッセイ、試験、又は任意の他の好適な目的のために細胞排出物の容易な除去が可能となることを認識し、理解している。
【００６５】
細胞群は、任意の好適な方法を経由して、降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地に配置してよい。例えば、ある実施形態において、細胞は、シリンジ、ピペット、又は他の好適な配置又は注入装置で注入又はそうでなければ３Ｄ細胞培養培地内の特定の位置に配置してよい。ある実施形態において自動化された細胞ディスペンサーの配列を、３Ｄ培養培地の容器に多数の細胞サンプルを注入するのに使用してよい。配置装置のチップが３Ｄ細胞培養培地を通って移動することで、配置ツールが３Ｄ細胞培養培地内の任意の位置に容易に移動され得るよう、チップ周りの領域に降伏を引き起こすのに十分な量のエネルギーが与えられ得る。ある例において、３Ｄ細胞培養培地内に細胞群を堆積させるために配置ツールにより印加される圧力は、３Ｄ細胞培養培地が流れて細胞群を収容するよう、降伏を起こすのに十分なものでまたあり得る。配置ツールの移動は、手動で（例えば、『手で』）行ってよく、又は機械又は任意の他の好適な機構で行ってよい。
【００６６】
ある実施形態において、多数の独立した細胞群を、３Ｄ細胞培養培地の単一容積内に配置してもよい。例えば、３Ｄ細胞培養培地の容積は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、又は任意の他の好適な数の独立した細胞群を収容するのに十分な程、大きいものであってよい。代わりに、３Ｄ細胞培養培地の容積は、１つの細胞群のみを有するものであってよい。さらに、細胞群は任意の好適な細胞数を含んでよく、細胞は１つ以上の種々のタイプからなるものであってよいと解すべきである。
【００６７】
具体的な実施形態に応じて、細胞群は、任意の好適な形状、構造、及び／又はパターンに応じた３Ｄ細胞培養培地内に配置してよい。例えば、独立した細胞群は、スフェロイドとして堆積してよく、スフェロイドは、３Ｄグリッド、又は任意の他の好適な３Ｄパターン上に配置されてよい。独立したスフェロイドはおよそ同一細胞数をすべて含んでよく、およそ同一のサイズであってよく、又は代わりに、異なるスフェロイドは、異なる細胞数及び異なるサイズを有していてよい。ある実施形態において、細胞は、形状、例えば、胚様体又はオルガノイド体、チューブ、シリンダー、トロイド、階層に枝分かれした導管ネットワーク、高アスペクト比物、薄い閉じた殻、又は組織、導管又は他の生体組織の構造に相当し得る他の複雑な形状に配置されてよい。
【００６８】
ある実施形態によると、降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地により、細胞の３Ｄプリンティングが３次元に所望のパターンを形成することが可能となり得る。例えば、コンピュータ制御されたインジェクターチップは３Ｄ細胞培養培地内の空間パスを描き出し、所望の３Ｄパターン又は形状を形成するパスに沿って、複数の位置で細胞を注入し得る。３Ｄ細胞培養培地を通って、インジェクターチップが移動することで、インジェクターチップ周りの領域に降伏を起こすのに十分な機械的エネルギーが与えら得て、インジェクターチップが容易に３Ｄ細胞培養培地を通って移動すること、及びまた細胞の注入を収容することが可能となる。注入の後、３Ｄ細胞培養培地は、固体様の相に戻って、プリントした細胞を支持及びプリントした構造を維持し得る。しかしながら、３Ｄプリント技術は本明細書に説明されている３Ｄ細胞培養培地を使用するのには必要とされないことは理解されたい。
【００６９】
降伏応力材料から製造された３Ｄ細胞培養培地により、細胞を堆積させるのに使用したものとは逆の工程を経由して、細胞培養培地から細胞群を回収することが容易となり得る。例えば、細胞は、単に除去装置、例えば、シリンジ又はピペットを、細胞群が配置されている場所に移動させることにより、及び吸引して細胞を細胞培養培地から取り出すことにより除いてよい。前記のように、３Ｄ細胞培養培地を通って除去装置のチップが移動することにより、材料に降伏を起こし及び３Ｄ細胞培養培地由来の細胞の除去物を収容するのに十分なエネルギーが与えられ得る。かかるアプローチは、例えば、３Ｄ細胞培養培地に多数の細胞サンプルが堆積している試験工程の一部として使用してよい。堆積した細胞は同一条件の下、培養してよいが、サンプルの異なるものは、異なる薬物又は他の処理条件に曝してよい。１つ以上のサンプルを細胞に及ぼす処理条件の影響を調査するために幾度も収集してよい。
【００７０】
ある実施形態において、３Ｄ細胞培養培地は、細胞工学組織構造物を支持するのに及び／又は保存するのに使用してよい。例えば、複数の細胞が配置される足場又は他の好適な構造を含む組織構造物を、３Ｄ細胞培養培地に配置してよい。３Ｄ細胞培養培地は、組織構造物の複雑な構造を保存する支持体を提供し得る一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで見つかるものを模倣し得る細胞培養のための３Ｄ環境もまた提供する。
【００７１】
１つ以上の化合物が細胞と共に及び／又は細胞と隣接して堆積し得ることを理解されたい。例えば、溶解性、非細胞質成分は、細胞と共に堆積し得る。これらは、構造的タンパク質（例えば、コラーゲン、ラミニン）、シグナル分子（成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ペプチド）、化学化合物（医薬品）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡｓ）、及び他のもの（ナノ粒子、ウィルス、遺伝子移入ベクター）を含み得る。
【００７２】
ある実施形態によると、タンパク質を合成する方法が提供される。細胞は、液体細胞培養培地で膨潤させた複数のマイクロゲル粒子を含む顆粒状のゲルを含む容器中で培養してよい。培養細胞により合成されたタンパク質は、それから容器から抽出され得る。例えば、ある実施形態において、培養細胞は膵島細胞であり、タンパク質はインシュリンである。
【００７３】
図２Ａ−２Ｂは、かかる装置のインタラクション装置の例を含む、細胞培養及びインタラクション装置の例を示す。
【００７４】
図２Ａは、生体細胞２０２が３Ｄ細胞培養培地２０４内の特定の位置に吊り下げられている装置２００を示す。装置は、３Ｄ細胞培養培地２０４に材料を与えるインタラクション装置２１０Ａ及び２１０Ｂを含む。装置２１０Ａは、マイクロゲル粒子と混合した際、３Ｄ細胞培養培地２０４を形成する液体細胞培養培地を与える。装置２１０Ａは、細胞２０２が３Ｄ細胞培養培地２０４から液体細胞培養培地を吸収し、使用する際、養分を与える液体培養培地を与え得る。装置２１０Ｂが、例えば、薬物を搭載した制御放出物質２０６を３Ｄ細胞培養培地２０４に与えることにより、物質をまた与え得る。制御放出物質２０６は、３Ｄ細胞培養培地２０４を通じて拡散し、細胞２０２に吸収され得る。
【００７５】
装置２００は、３Ｄ細胞培養培地２０４から流体を除くインタラクション装置をさらに含んでよい。図２Ａに示すように、装置２００はポンプ（例えば、真空ポンプ）２１２を含んでよく、ポンプは流出２１４を経由して３Ｄ細胞培養培地２０４から流体を取り出し得る。ある実施形態において、図２Ａに示すように、装置２００は、フィルター様の薄膜２１６を含んでよく、それによりある物質は流出２１４に流れることが可能となり得るが、３Ｄ細胞培養培地２０４のヒドロゲル又は他の物質は通過からブロックされ得る。
【００７６】
図２Ｂは、種々のインタラクション装置を含む、装置２５０の他の例を示す。図２Ａの装置／材料と同一である図２Ｂの例の装置及び材料は、同一の参照数字を共有する。図２Ｂの例は、１つ以上の物質を３Ｄ細胞培養培地２０４に与えることを可能とする、かん流チューブ２６０を示す。３つのかん流チューブが示されている。同一の物質を各チューブ２６０から与えてよく、又は種々の物質を与えてもよい。与えられ得る物質は、液体細胞培養培地、医薬品、又は他の物質を含む。
【００７７】
図３Ａ及び３Ｂの例の装置２１０Ｂ及び２６０は、ある実施形態において、３Ｄ細胞培養培地２０４内の特定の位置に物質を与えるために稼働してよく、ある実施形態において、物質を与えて３Ｄ細胞培養培地２０４に沿って物質の濃度勾配を形成するために稼働してよい。勾配を形成することにより、種々の細胞２０２を種々の濃度の物質に曝し得る。曝露に続き、細胞２０２は（３Ｄ細胞培養培地２０４内外で）調査して種々の濃度が細胞２０２に与える影響を決定してよい。
【００７８】
ある実施形態において、前記のように、図２Ａ及び２Ｂの装置２１０Ｂ及び２６０は、３Ｄ細胞培養培地２０４に直接挿入してもよく、除いてもよい。一方、細胞２０２は３Ｄ細胞培養培地２０４中で培養される。
【００７９】
図２Ａ及び２Ｂの例において、ポンプ２１２を、任意の好適な目的のために３Ｄ細胞培養培地２０４から物質を除くのに使用してよい。例えば、ポンプ２１２は、細胞により生成された老廃物又はタンパク質、又は収集されることとなる細胞活性の副産物を含む、細胞活性の副産物を除くのに稼働してよい。他の例として、ポンプ２１２は、３Ｄ細胞培養培地２０４を通じて物質（例えば、装置２１０Ａ、２１０Ｂ、２６０により与えられる物質）を取り出すのに３Ｄ細胞培養培地２０４に力を課してもよい。かかる力を適用するポンプ２１２を、図２Ａ及び２Ｂの例に示すが、他の実施形態において、力源は、装置２００、２５０を遠心回転させるもの、又は重力、又は任意の他の好適な力源であってよい。
【００８０】
本発明のこれらの及び他の態様は、以降の実施例の考慮の上にさらに理解されることとなるが、実施例は、本発明のある具体的な実施形態を示すことを目的としているが、その範囲を請求項に規定されたものに限定することは意図していない。
【実施例】
【００８１】
下記実施例は、本発明の種々の態様の非限定的な実施形態について述べるものである。表１及び２は、方法パラメータの鍵となる特徴の要約を提供するものであり、ヒドロゲルは下記実施例に記載する。表１は、沈殿重合条件の要約を提供するものである。表２は、詰められたヒドロゲルの特性の要約を提供するものである。
【００８２】
【表１】
2020509746.tif 000007
【００８３】
【表２】
2020509746.tif 000008
【実施例１】
【００８４】
本実施例は、マイクロゲル粒子及び得られる粒子を形成するための限定されない方法について述べる。本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。
【００８５】
アクリルアミド、メタクリル酸、及びポリ（エチレングリコール）ジアクリラートを熱的開始剤（ＡＩＢＮ）とともにエタノールに溶解させ、加熱した。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを４５：４：１：０．５：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。ポリマーが形成されるにつれ、ポリマーが個別のマイクロゲル粒子として溶液から析出した。図３は、アニオン性マイクロゲル粒子の合成についての反応を示す。モノマーのモル比は、図３に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１である。
【００８６】
マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。マイクロゲル粒子は、およそ１〜３μｍの直径を有していた。これらの粒子からなるヒドロゲル（３ｗｔ％ポリマー）の１Ｈｚでのせん断弾性率は、およそ２０Ｐａであった。これらの粒子からなるヒドロゲル（３ｗｔ％ポリマー）の降伏応力は、およそ２Ｐａであった。
【実施例２】
【００８７】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図３に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを９５：４：１：０．５：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例３】
【００８８】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図３に示すように、ｘ＝０．９０、ｙ＝０．０９、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを４５：４：０．５：０．５：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。マイクロゲル粒子は１〜３μｍの直径を有していた。これらの粒子からなるヒドロゲル（１０ｗｔ％ポリマー）の１Ｈｚでのせん断弾性率は、およそ４０Ｐａであった。これらの粒子からなるヒドロゲル（１０ｗｔ％ポリマー）の降伏応力は、およそ４Ｐａであった。
【実施例４】
【００８９】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図３に示すように、ｘ＝０．８３、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．００２であった。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを４５：４：１：０．１：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させる。
【実施例５】
【００９０】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。
【００９１】
アクリルアミド、メタクリル酸、及びＮ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）を熱的開始剤とともにエタノールに溶解させ、加熱した。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）、及びＡＩＢＮを４５：４：０．５：０．１：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。図４は、合成マイクロゲル粒子についての合成反応を示す。モノマーのモル比は、図４に示すように、ｘ＝０．９０、ｙ＝０．０９、及びｚ＝０．０１であった。
【００９２】
マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例６】
【００９３】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図４に示すように、ｘ＝０．８１、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０２であった。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）、及びＡＩＢＮを４５：４：１：０．２：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。マイクロゲル粒子はおよそ直径２〜４μｍを有していた。これらの粒子からなるヒドロゲル（２ｗｔ％ポリマー）の１Ｈｚでのせん断弾性率は、およそ２０Ｐａであった。これらの粒子からなるヒドロゲル（２ｗｔ％ポリマー）の降伏応力は、およそ２Ｐａであった。
【実施例７】
【００９４】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図４に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）、及びＡＩＢＮを４５：４：１：０．１：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例８】
【００９５】
本実施例は、モノマー、酸性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図４に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）、及びＡＩＢＮを９５：４：１：０．１：０．０５の比（重量比）で混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例９】
【００９６】
本実施例は、モノマー、塩基性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図５に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリラート、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例１０】
【００９７】
本実施例は、モノマー、永久カチオン性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図６に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムヨージド、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例１１】
【００９８】
本実施例は、モノマー、双性コモノマー、架橋剤、熱的開始剤、及び溶媒を含む組成物について述べる。モノマーのモル比は、図７に示すように、ｘ＝０．８２、ｙ＝０．１７、及びｚ＝０．０１であった。エタノール、アクリルアミド、３−［［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート、ＰＥＧｄａ（Ｍｎ＝７００ｇ／ｍｏｌ）、及びＡＩＢＮを混合した。混合物をアルゴンで３０分間パージし、反応物から酸素を除いた。フラスコを６０°Ｃで４時間予熱したオイルバス中に置いた。マイクロゲル粒子はろ過し、エタノールに再懸濁させ、再度ろ過し、及び真空オーブン中で一晩乾燥させた。
【実施例１２】
【００９９】
図８は、沈殿反応を通じて種々の電荷密度を有する多電解質マイクロゲルを調製するための方法を示す。ＭＡＡ−メタクリル酸；ＣＢＭＡ−  カルボキシベタインメタクリラート；ｑＤＭＡＥＭＡ−４級ジメチルアミノエチルメタクリラート。
【０１００】
図９Ａ〜９Ｄは、カルシウムを添加したカチオン性マイクロゲル中でのレオロジー変化を示すグラフである。
【０１０１】
図１０は、アニオン性及びカチオン性マイクロゲル中での、ｃ塩／ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【０１０２】
図１１は、アニオン性及びカチオン性マイクロゲル中での、ｃ２帯電／ｃ塩（ｍＭ２／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【０１０３】
図１２は、双性マイクロゲル中での、ｃ塩／ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【０１０４】
図１３は、アニオン性（ＭＡＡ）、双性（ＣＢＭＡ）、及びカチオン性（ｑＤＭＡＥＭＡ）マイクロゲル中での、ｃ塩／ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として降伏応力（σｙ／σｙ０）を示すグラフである。
【０１０５】
図１４は、アニオン性（ＭＡＡ）、双性（ＣＢＭＡ）、及びカチオン性（ｑＤＭＡＥＭＡ）マイクロゲル中での細胞生存率（％）を示す棒グラフである。
【０１０６】
図１５は、アニオン性（ＭＡＡ）及び双性（ＣＢＭＡ）マイクロゲルについての、ｃ塩／ｃ帯電（ｍＭ／ｍＭ）の関数として遊離のカルシウム（％）を示すグラフである。
【０１０７】
別段定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術及び科学用語は、開示されている発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書で引用されている刊行物及び刊行物が引用する材料は、具体的に参照により組み入れられる。
【０１０８】
当業者は、ルーチンにすぎない実験を使用して、多くの本明細書に記載されている発明の具体的実施形態と等価なものを認識、又は確認することが可能となる。かかる等価体は、以降の請求項に含まれることを目的としている。
【図１Ａ】
2020509746.tif 000009
【図１Ｂ】
2020509746.tif 000010
【図１Ｃ】
2020509746.tif 000011
【図２Ａ】
2020509746.tif 000012
【図２Ｂ】
2020509746.tif 000013
【図３】
2020509746.tif 000014
【図４】
2020509746.tif 000015
【図５】
2020509746.tif 000016
【図６】
2020509746.tif 000017
【図７】
2020509746.tif 000018
【図８】
2020509746.tif 000019
【図９Ａ】
2020509746.tif 000020
【図９Ｂ】
2020509746.tif 000021
【図９Ｃ】
2020509746.tif 000022
【図９Ｄ】
2020509746.tif 000023
【図１０】
2020509746.tif 000024
【図１１】
2020509746.tif 000025
【図１２】
2020509746.tif 000026
【図１３】
2020509746.tif 000027
【図１４】
2020509746.tif 000028
【図１５】
2020509746.tif 000029
【国際調査報告】
2020509746.tif 000030
2020509746.tif 000031