(57)【要約】免疫スコアを生成するための方法であって、同方法は、以下のステップ：（ｉ）試料中の腫瘍浸潤リンパ球の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉ）試料中のＴ細胞受容体シグナル伝達の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉｉ）試料中の変異負荷の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｖ）予測アルゴリズムを用いて、腫瘍浸潤リンパ球の決定された定性的および／または定量的評価、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の決定された定性的および／または定量的評価、ならびに変異負荷の決定された定性的および／または定量的評価、に基づいて免疫スコアを生成するステップと、を含む。
2020500294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫スコアを生成するための方法であって、前記方法は、
試料中の腫瘍浸潤リンパ球の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中のＴ細胞受容体シグナル伝達の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中の変異負荷の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
予測アルゴリズムを用いて、腫瘍浸潤リンパ球の決定された定性的評価および決定された定量的評価の少なくとも一方、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の決定された定性的評価および決定された定量的評価の少なくとも一方、ならびに変異負荷の決定された定性的評価および決定された定量的評価の少なくとも一方、に基づいて免疫スコアを生成するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記免疫スコアに基づいて、１つ以上の可能な治療療法を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測アルゴリズムは機械学習を使用して訓練され、かつ更新される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍を分析するための方法であって、前記方法は、
試料中の腫瘍浸潤リンパ球の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中のＴ細胞受容体シグナル伝達の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中の変異負荷の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
腫瘍浸潤リンパ球の決定された定性的評価および決定された定量的評価の少なくとも一方、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の決定された定性的評価および決定された定量的評価の少なくとも一方、ならびに変異負荷の決定された定性的評価および決定された定量的評価の少なくとも一方に基づいて、治療に対するレスポンダーまたは治療に対するノンレスポンダーとして試料を分類するステップと、
を含む、方法。
【請求項５】
前記方法は、決定された分類に基づいて、１つ以上の可能な治療療法に対する腫瘍の応答を決定するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料は治療に対する鑑別困難レスポンダーとして分類される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
治療に対するノンレスポンダーとして分類された試料および治療に対するノンレスポンダーは、癌の急速な進行のリスクがあるものとしてさらに分類され得る、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
決定された試料の分類を第２の分類と相関させるステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記相関に基づいて、１つ以上の可能な治療療法に対する腫瘍の応答を決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料についての免疫組織化学データを決定するステップをさらに含み、前記分類するステップはさらに、決定された免疫組織化学データに基づいている、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍を分析するための方法であって、前記方法は、
試料中の少なくとも４個の遺伝子の発現レベルの定量的評価を決定するステップと、
４個の遺伝子のうちの最初の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するレスポンダーとして前記試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの最初の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超えない場合、次のステップへ進む、ステップと、
４個の遺伝子のうちの２番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値より大きい場合、治療に対するノンレスポンダーとして前記試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの２番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、次のステップへ進む、ステップと、
４個の遺伝子のうちの３番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するレスポンダーとして前記試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの３番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、次のステップへ進む、ステップと、
４個の遺伝子のうちの４番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するノンレスポンダーとして前記試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの４番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するレスポンダーとして前記試料を分類するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記方法は、決定された分類の１つに基づいて、１つ以上の可能な治療療法に対する応答を決定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料は治療に対するノンレスポンダーとして分類される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
治療に対するノンレスポンダーとして分類された試料は、癌の急速な進行のリスクがあるものとしてさらに分類される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
決定された試料の分類を第２の分類と相関させるステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記相関に基づいて、１つ以上の可能な治療療法を決定するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍を分析するための方法であって、前記方法は、
試料中の免疫細胞浸潤に関連する複数の遺伝子の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中のＴ細胞活性化に関連する複数の遺伝子の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中のサイトカインシグナル伝達に関連する複数の遺伝子の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
前記試料中の免疫応答調節に関連する複数の遺伝子の定性的評価および定量的評価の少なくとも一方を決定するステップと、
（ｖ）決定された定性的評価および決定された定量的評価のそれぞれを正規化するステップと、
免疫細胞浸潤の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超える場合、試料中のＴ細胞活性化の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方の分析に進むステップであって、ここで、Ｔ細胞活性化の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超える場合、前記試料はレスポンダーとして分類され、Ｔ細胞活性化の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超えない場合、試料はノンレスポンダーとして分類される、前記ステップと、
免疫細胞浸潤の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を下回る場合、次のステップに進むステップと、
免疫調節応答の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超える場合、試料は鑑別困難レスポンダーとして分類されるか、或いは、免疫調節応答の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超えない場合は次のステップへ進む、ステップと、
サイトカインシグナル伝達の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超える場合、試料は鑑別困難レスポンダーとして分類されるか、或いは、サイトカインシグナル伝達の正規化された定性的評価および正規化された定量的評価の少なくとも一方が所定の閾値を超えない場合、試料はノンレスポンダーとして分類される、ステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記方法は、決定された分類の１つに基づいて、１つ以上の可能な治療療法に対する腫瘍の応答を決定するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療に対するノンレスポンダーとして分類された試料は、癌の急速な進行のリスクがあるものとしてさらに分類され得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
決定された試料の分類を第２の分類と相関させるステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記相関に基づいて、１つ以上の可能な治療療法を決定するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料についての免疫組織化学データを決定するステップをさらに含み、前記分類するステップの一方または両方は、決定された免疫組織化学データにさらに基づいている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
免疫プロファイル腫瘍報告を提供するための方法であって、前記方法は、
患者の腫瘍から１つ以上の試料を取得するステップと、
１つ以上の試料から、複数の腫瘍浸潤リンパ球タンパク質および複数のＴ細胞受容体シグナル伝達タンパク質の発現についての情報を含むＲＮＡシーケンスデータを生成するステップと、
前記１つ以上の試料から、複数の遺伝子についての変異負荷情報を含むＤＮＡシーケンスデータを生成するステップと、
前記１つ以上の試料から、免疫組織化学データを生成するステップと、
前記ＲＮＡシーケンスデータ、前記ＤＮＡシーケンスデータおよび前記免疫組織化学データから、患者の腫瘍が複数の可能な治療に応答する可能性を計算するステップと、
免疫プロファイル報告であって、患者の腫瘍が複数の可能な治療に応答する計算された可能性を含む免疫プロファイル報告を提供するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、腫瘍治療の推奨を生成するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
黒色腫および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者では、体細胞変異の割合が高いこと−いわゆる「変異負荷」（ＭｕＢ）−および、免疫抑制分子ＣＤ２７４（プログラム死−リガンド１タンパク質（ＰＤ−Ｌ１）として最もよく知られている）を含むチェックポイント遮断の腫瘍内発現の上昇は、免疫チェックポイントブロッカー（ＩＣＢ）ベースの免疫療法に対する改善された臨床応答と相関することが示されている。しかしながら、免疫療法に対する他の悪性腫瘍に罹患した患者の応答を予測すること−そしておそらく免疫療法と免疫チェックポイント遮断のための他の標的との組み合わせ−は、免疫学的腫瘍微小環境のより深いデコンボリューションが必要である。同様に、悪性腫瘍の免疫学的構成の詳細な特徴付けは、特に標準的なＩＣＢに基づく免疫療法に失敗した患者にとって、臨床上の意思決定を支援するために必要であり得る。
【０００３】
例えば、免疫チェックポイント分子を標的とする治療用抗体は、いくつかの種類の癌の治療に関してＦＤＡによって承認されている。しかしながら、腫瘍チェックポイント遮断の評価は、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）タンパク質の状態を測定するＦＤＡに承認されたＩＨＣアッセイに限定されており、これは主観的で分析的に確固たるものではない。免疫チェックポイントを標的とする抗体の数が増えるにつれて、これらの薬物に対する患者の応答を正確に予測するために、腫瘍標本中のさらなるバイオマーカを評価することができるアッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、治療上の決定のための指針として免疫学的腫瘍微小環境を特徴付けることができるアッセイに対する必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、１つ以上の個別化された腫瘍治療に対する癌細胞感受性の有無を決定するための進歩的な方法に関する。
本発明の一態様に従うのは免疫スコアを生成するための方法であり、同方法は、以下のステップ：（ｉ）試料中の腫瘍浸潤リンパ球の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉ）試料中のＴ細胞受容体シグナル伝達の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉｉ）試料中の変異負荷の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｖ）予測アルゴリズムを用いて、腫瘍浸潤リンパ球の決定された定性的および／または定量的評価、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の決定された定性的および／または定量的評価、ならびに変異負荷の決定された定性的および／または定量的評価、に基づいて免疫スコアを生成するステップと、を含む。
【０００６】
一実施形態によれば、同方法は、免疫スコアに基づいて、１つ以上の可能な治療療法を決定するステップをさらに含む。
一実施形態によれば、予測アルゴリズムは機械学習を使用して訓練され、かつ更新される。
【０００７】
本発明の一態様に従うのは腫瘍を分析する方法であり、同方法は、以下のステップ：（ｉ）試料中の腫瘍浸潤リンパ球の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉ）試料中のＴ細胞受容体シグナル伝達の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉｉ）試料中の変異負荷の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｖ）腫瘍浸潤リンパ球の決定された定性的および／または定量的評価、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の決定された定性的および／または定量的評価、ならびに変異負荷の決定された定性的および／または定量的評価に基づいて、治療に対するレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）または治療に対するノンレスポンダー（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として試料を分類するステップと、を含む。
【０００８】
一実施形態によれば、同方法は、決定された分類に基づいて、１つ以上の可能な治療療法に対する腫瘍の応答を決定するステップをさらに含む。
一実施形態によれば、試料は治療に対する鑑別困難レスポンダー（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として分類される。一実施形態によれば、治療に対するノンレスポンダーとして分類された試料および治療に対するノンレスポンダーは、癌の急速な進行のリスクがあるものとしてさらに分類されてもよい。
【０００９】
一実施形態によれば、同方法は、決定された試料の分類を第２の分類と相関させるステップをさらに含む。
一実施形態によれば、方法は、相関に基づいて、１つ以上の可能な治療療法に対する腫瘍の応答を決定するステップをさらに含む。
【００１０】
一実施形態によれば、同方法は、試料の免疫組織化学データを決定するステップをさらに含み、前記分類するステップはさらに、決定された免疫組織化学データに基づいている。
【００１１】
別の態様に従うのは腫瘍を分析するための方法であり、同方法は以下のステップ：（ｉ）試料中の少なくとも４個の遺伝子の発現レベルの定量的評価を決定するステップ、（ｉｉ）４個の遺伝子のうちの最初の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するレスポンダーとして試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの最初の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超えない場合、次のステップへ進む、ステップと、（ｉｉｉ）４個の遺伝子のうちの２番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値より大きい場合、治療に対するノンレスポンダーとして試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの２番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、次のステップへ進む、ステップと、（ｉｖ）４個の遺伝子のうちの３番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するレスポンダーとして試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの３番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、次のステップへ進む、ステップと、（ｖ）４個の遺伝子のうちの４番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するノンレスポンダーとして試料を分類するか、あるいは、４個の遺伝子のうちの４番目の遺伝子の発現レベルの決定された定量的評価が所定の閾値を超える場合、治療に対するレスポンダーとして試料を分類するステップと、を含む。
【００１２】
別の態様に従うのは腫瘍を分析するための方法であり、同方法は以下のステップ：（ｉ）試料中の免疫細胞浸潤に関連する複数の遺伝子の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉ）試料中のＴ細胞活性化に関連する複数の遺伝子の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｉｉ）試料中のサイトカインシグナル伝達に関連する複数の遺伝子の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｉｖ）試料中の免疫応答調節に関連する複数の遺伝子の定性的および／または定量的評価を決定するステップと、（ｖ）決定された定性的および／または定量的評価のそれぞれを正規化するステップと、（ｖｉ）免疫細胞浸潤の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超える場合、試料中のＴ細胞活性化の正規化された定性的および／または定量的評価の分析に進むステップであって、ここで、Ｔ細胞活性化の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超える場合、試料はレスポンダーとして分類され、Ｔ細胞活性化の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超えない場合、試料はノンレスポンダーとして分類される、前記ステップと、（ｖｉｉ）免疫細胞浸潤の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を下回る場合、次のステップに進むステップと、（ｖｉｉｉ）免疫調節応答の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超える場合、試料は鑑別困難レスポンダーとして分類されるか、或いは、免疫調節応答の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超えない場合は次のステップへ進む、ステップと、（ｉｘ）サイトカインシグナル伝達の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超える場合、試料は鑑別困難レスポンダーとして分類されるか、或いは、サイトカインシグナル伝達の正規化された定性的および／または定量的評価が所定の閾値を超えない場合、試料はノンレスポンダーとして分類される、ステップと、を含む。
【００１３】
別の態様に従うのは、包括的な免疫プロファイリング臨床報告を患者の臨床医に提供するための方法であり、同方法は、以下のステップ：（ｉ）患者の腫瘍から１つ以上の試料を取得するステップと、（ｉｉ）１つ以上の試料から、複数の腫瘍浸潤リンパ球タンパク質および複数のＴ細胞受容体シグナル伝達タンパク質の発現についての情報を含むＲＮＡシーケンスデータを生成するステップと、（ｉｉｉ）１つ以上の試料から、複数の遺伝子についての変異負荷情報を含むＤＮＡシーケンスデータを生成するステップと、（ｉｖ）１つ以上の試料から、他のタンパク質の中でも、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現およびコピー数増加ならびにＣＤ３およびＣＤ８についての腫瘍浸潤リンパ球タンパク質発現のパターンを測定するための免疫組織化学データおよび蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）データを生成するステップと、（ｖ）ＲＮＡシーケンスデータ、ＤＮＡシーケンスデータ、ならびに免疫組織化学およびＦＩＳＨデータから、患者の腫瘍が複数の可能な治療に応答する可能性を計算するステップと、（ｖｉｉ）患者の臨床医に包括的な免疫プロファイリング臨床報告を提供するステップであって、同報告は患者の腫瘍が複数の可能な治療に応答する可能性の計算値を含む前記ステップと、含む。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下に記載される実施形態から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一実施形態に従う、訓練のために遡及的試料（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅｓ）のパネルを用いた５４遺伝子モデルについての結果のグラフである。
【図２】一実施形態に従う、５４個の遺伝子および変異負荷（ＭｕＢ）を利用するモデルの特徴空間の概略図である。
【図３】一実施形態に従う、４遺伝子モデルに対する決定木の概略図である。
【図４】一実施形態に従う、訓練のために遡及的試料のパネルを使用した４遺伝子モデルについての結果のグラフである。
【図５】一実施形態に従う、免疫機能モデルの決定木の概略図である。
【図６】一実施形態に従う、訓練のために遡及的試料のパネルを使用した免疫機能モデルの結果のグラフである。
【図７】一実施形態に従う、５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、および免疫機能モデルからの出力を用いた最終予測のためのベイジアンモデル平均化（ＢＭＡ）の概略図である。
【図８】一実施形態に従う、訓練のために８７の遡及的試料のパネルを使用したベイジアンモデル平均化の結果、および５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、および免疫機能モデルからの結果のグラフである。
【図９】一実施形態に従う、１つ以上の個別化腫瘍治療に対する癌細胞の感受性を決定するための４個の異なるモデルからの全体的な結果の表である。
【図１０】一実施形態に従う、患者の臨床医に報告を提供する方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図面において、同様の参照文字は、一般に、異なる図を通して同じ部分を指す。また、図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに本発明の原理を説明することに重点が置かれている。
【００１７】
本開示は、１つ以上の個別化腫瘍治療に対する癌細胞の感受性を決定するための方法およびシステムの実施形態に関する。
一実施形態によれば、本開示は、治療有効性を予測するためのアルゴリズム分析アプローチを用いた多検体アッセイ（ＭＡＡＡ）を適用するための方法に関する。
【００１８】
Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅ（ＩＡ）は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、変異負荷（ＭｕＢ）、Ｔ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲＳ）、免疫関連薬物標的スコア（ＩＲＤＴＳ）、および全体的な免疫活性化状態（すなわち、免疫スコア）についての情報を提供するように設計された次世代シーケンシング（ＮＧＳ）アッセイである。ＴＩＬの評価はＣＤ８＋Ｔ細胞に焦点を当てているが、Ｔ細胞の他のサブセットおよびＢ細胞やマクロファージなどの関連する免疫エフェクター細胞に関するさらなる情報を提供している。ＭｕＢの評価は、腫瘍内の体細胞変異の総数（高い  対  低い）についての情報を提供するように設計されており、特定の変異について遺伝子レベルで報告するように意図されていない。ＴＣＲＳ、または新生物細胞および他の免疫関連細胞の両方を用いたＴ細胞のシグナル伝達は、これらの様々な細胞型の相互作用において受容体およびリガンドの両方を表す遺伝子からの発現情報を利用する。ＩＲＤＴＳは、ＣＴＬＡ４およびイピリムマブのような１つ以上の免疫調節剤の直接の標的である一連の遺伝子である。免疫スコア（ＩＳ）は、１つ以上のチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）で治療された患者に関する以前の臨床転帰の参照データベースの文脈で、ＴＩＬ、ＭｕＢ、およびＴＣＲＳからの情報を利用して、検査した腫瘍の免疫状態の活性化の評価を提供する。
【００１９】
Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅ（ＩＡ）は、ＲＮＡ配列を使用して多数の免疫関連（ＩＲ）遺伝子および複数の発現制御遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価し、ＤＮＡ配列を使用して１．５Ｍｂターゲットキャプチャにおける変異負荷を評価する次世代シーケンシングアッセイである。ＲＮＡ配列コンポーネントは最も臨床的に重要な遺伝子の発現を検証し、ＤＮＡ配列コンポーネントは関与する特定の遺伝子を参照せずに非同義変異（ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の数を報告する。例えば、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および変異負荷分析のうちの１つ以上において利用され得る７６７個の遺伝子の代表的な表は、本明細書において表２として提供される。
【００２０】
ＩＡのＲＮＡ配列コンポーネントは、最高レベルで４０を超える独自の（ｕｎｉｑｕｅ）遺伝子機能を表す多数の遺伝子を調べる。ＩＡは最も臨床的に重要な遺伝子に焦点を当てており、その多くはＴ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲＳ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分類するための他のいくつかに直接関係している。すべての同定された臨床的に重要な遺伝子のＩＡの臨床検証部分では、複数のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本のＲＮＡ配列データを、カスタムＴａｑＭａｎアッセイの結果、並びに、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓプロジェクト（ＴＣＧＡ）による全トランスクリプトーム分析用の同じ試料セットについての公開されている情報と、比較する。
【００２１】
ＴＣＲＳに関連する遺伝子は、免疫浸潤細胞または新生物細胞上に発現させることができ、典型的には受容体と関連リガンドの対として分類される。ＴＣＲＳに関連するものとしてＩＡに分類された全ての遺伝子について、リガンドまたは受容体のいずれかがＴ細胞の１つ以上のサブセットによって発現される。このＴＣＲＳ遺伝子リストへの現在のアプローチは、それらを共刺激性もしくは共阻害性Ｔ細胞機能、またはチェックポイント経路に分割することである。ＴＣＲＳに関連する遺伝子は、１つ以上のチェックポイント阻害薬の直接の標的である遺伝子とそうでない遺伝子にさらに分類することができる。チェックポイント阻害薬の直接的な標的は、受容体またはリガンドのいずれかであり得るが、同時に両方ではない。チェックポイント阻害薬および標的の例は、イピリムマブおよび活性化Ｔ細胞上に発現される受容体ＣＴＬＡ−４である。
【００２２】
ＴＩＬに関連する遺伝子は多種多様の浸潤性免疫細胞を包含し、ＩＡは既存の分類および関連する遺伝子発現マーカを採用している。古典的には、「免疫スコア」は、３つ以下のＴＩＬのマーカを用いて複数の腫瘍型における予後マーカとして報告されている。ＩＡは、ＣＰＩへの応答について患者を層別化するためにＴＩＬに関連する３つ以上の遺伝子を利用している。
【００２３】
ＩＡのＤＮＡ配列コンポーネントは、例えば、多くの異なる癌関連遺伝子の１．５Ｍｂ  ＡｍｐｌｉＳｅｑキャプチャである。ＩＡについては、特定の変異は報告されないかもしれないが、むしろ非同義変異の数が報告されるかもしれない。したがって、ＩＡのＤＮＡ配列コンポーネントの出力は、変異負荷の評価である。
【００２４】
薬物−標的遺伝子発現分析は、１つ以上のチェックポイント阻害薬によって標的とされる各遺伝子に焦点を当てており、そして特定の薬物標的についての予め定められた閾値に基づいてそれぞれの結果を、高い関連性、中間または中程度の関連性、または低い関連性として分類する。各薬物標的についての高い関連性、中間または中程度の関連性、または低い関連性は、標的遺伝子についての１００万当たりのリード（ｒｅａｄ）の単純な評価よりも多く、そしてその標的遺伝子についての上流および下流エフェクターを包含する。例えば、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達の主な機能は、第２の受容体であるＣＤ２８によって送達される共刺激シグナルに対抗することによってＴ細胞活性化を下方制御することである。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の両方は同じリガンド、ＣＤ８０（Ｂ７．１としても知られる）およびＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られる）を共有する。ＣＴＬＡ−４は、リガンド結合に関してＣＤ２８よりもこれらのリガンドの両方に対して高い親和性を有し、同等のレベルで発現された場合に全体的な共阻害シグナルを生じる。臨床的には、これはＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤のイピリムマブを投与することによって打ち消される。
【００２５】
ＴＩＬ分析は、ＴＩＬの半定量的評価および／または定量的評価、ならびに免疫エフェクター細胞のさらなるサブセットの定性的および／または定量的評価に焦点を当てている。第１の例において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は発現されたＣＤ３＋およびＣＤ８＋転写物の数（リード（ｒｅａｄ））として報告されている。ＴＩＬの発現レベルの解釈を助けるために、Ａｐｅｒｉｏ画像分析プラットフォームを用いてＣＤ３およびＣＤ８について直接免疫組織化学的比較が行われる。第２の例において、Ｔ−調節細胞についてＦＯＸＰ３、マクロファージについてＣＤ１６３およびＣＤ６８、Ｔ−ヘルパー細胞についてＩＣＯＳおよびＣＤ２８、ならびに免疫細胞のサブセットのいくつかの他のマーカのようなＴｉｉｃのさらなる定性的および／または定量的マーカは、予め定められた転写物のリード閾値に基づいて、高、中、または低として相対的な発現結果として、各々が分類される。薬物−標的評価とは対照的に、Ｔｉｉｃのさらなる様々なマーカについての分析はより簡単であり、そして以前に観察された値に対するランク付けを反映する。
【００２６】
変異負荷分析は、エクソームシーケンシングと同等の非同義変異の数に焦点を当てている。１．５Ｍｂターゲットキャプチャ配列の結果は、ＩＡのＤＮＡ配列コンポーネントの検証におけるエクソームシーケンシングの状況において提供される。これらの結果は、高い、中程度の、または低い、変異負荷として提供される。２００のエクソンの非同義変異に相当するものより大きい変異負荷は高いと報告され、２００未満かつ１５０以上は中程度と報告され、そして１５０未満が低いと報告される。カットオフ値は任意であり、１つ以上のチェックポイント阻害剤に対する臨床的応答に関してこれまでに文献に報告されているものの要約を反映している。従って、他の多くの閾値が可能である。
【００２７】
薬物−標的遺伝子発現、免疫細胞浸潤、および変異負荷の結果をまとめるために、ＩＡは、免疫活性化の全体的評価のために０〜１００のスケールで単一の免疫スコア（「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｏｒｅ」）を提供する。ＩＳは、この検証における臨床的有用性について試験された単一の患者の結果を表す。
【００２８】
別の実施形態によれば、本開示は、比較目的および任意選択的にベイジアンモデリングに利用することができる、独立して開発された少なくとも３つの独自のモデルまたはアプローチを使用して腫瘍治療推奨を生成する方法およびシステムに関する。複数のモデルは、腫瘍治療への機械学習アプローチおよび生物学的アプローチの両方を扱う。一実施形態によれば、少なくとも３つのモデルはチェックポイント阻害剤に対して同様の応答を提供し、ベイジアン平均モデルを利用して最良の適合を表すことができる。
【００２９】
５４遺伝子モデルと呼ばれ、以下でより詳細に論じる第１のモデルは、多項式機械学習回帰モデル（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）である。一実施形態によれば、５４遺伝子モデルまたはアプローチは、予測のためにＭｕＢと組み合わせて、ＴＩＬを表す１１個の遺伝子およびＴＣＲＳについて４３個の遺伝子を使用するが、他の遺伝子および組み合わせも可能である。
【００３０】
４遺伝子モデルと呼ばれ、以下でより詳細に論じられる第２のモデルは、遺伝子レベルでの生物学的アプローチを表す。一実施形態によれば、４遺伝子モデルまたはアプローチは、予測のためにＴＩＬまたはＴ細胞活性化遺伝子の最良の最小セットを選択するために決定木（ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ）モデルを利用する。
【００３１】
免疫機能モデルまたは遺伝子機能群モデルと呼ばれ、そして以下により詳細に議論される第３のモデルは、機能レベルでの生物学的アプローチを表す。一実施形態によれば、このモデルまたはアプローチは、免疫細胞浸潤を表す１３個の遺伝子、Ｔ細胞活性化について２３個の遺伝子、サイトカインシグナル伝達について１０個の遺伝子、および免疫応答調節について８個の遺伝子を利用するが、他の遺伝子および組み合わせも可能である。
【００３２】
任意選択である第４のモデルは、一次免疫マーカモデルまたはアプローチと呼ばれる。一次免疫マーカモデルまたはアプローチは、１つ以上の免疫マーカを分析する。一実施形態によれば、一次免疫マーカモデルまたはアプローチは、免疫組織化学を使用してＰＤ−Ｌ１タンパク質発現および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）発現（ＣＤ３および／またはＣＤ８を含むがこれらに限定されない）を分析する。別の実施形態によれば、一次免疫マーカモデルまたはアプローチは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）方法論を利用してＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２コピー数増加を分析する。
【００３３】
別の実施形態によれば、同方法はまた、他の可能性のある要因の中でも特に、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を分析するためにＰＣＲ分析または任意の他の方法論を任意に利用し得る。
【００３４】
２つのアプローチの各々は以下により詳細に説明される。
アプローチ１−アルゴリズム分析を用いたＩＡ多検体アッセイ（ＭＡＡＡ）
個別化された腫瘍治療法を導き出すための第１のアプローチによれば、Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅ（ＩＡ）と呼ばれる多因子分析は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、変異負荷（ＭｕＢ）、およびＴ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲＳ）の定性的および／または定量的評価を提供する。３つの値は、免疫スコアと呼ばれる全体的なスコアを導き出すために使用され、同免疫スコアは、１つ以上のチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）に対する腫瘍の応答の予測因子である。ほんの一例として、免疫スコアは１〜１００のスケールで報告することができ、他の多くの可能な報告メカニズムの中でも、ＣＰＩに対する高い、中程度の、または低い全体的奏効率（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ）のような３つの臨床的に関連性のある群として分類できる。
【００３５】
ＩＡは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、変異負荷（ＭｕＢ）、およびＴ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲＳ）の定性的および／または定量的評価を提供するために独自のアルゴリズム分析を利用する。次に、これら３つの値は、全体の免疫スコアを導き出すために使用される。これらの分析のすべては、将来の評価のためにこの検証を通じて開発された以前のＩＡの結果の参照データベースを利用する。この参照データベースは、以前の臨床結果が既存の結果に追加されるにつれて、例えば四半期ごとに更新される。参照データベースへのこの更新は、更新時より前の臨床結果には影響を与えることはないであろう。ＴＩＬ、ＭｕＢ、およびＴＣＲＳの評価は既知の臨床転帰とは無関係であるが、以前のＩＡの結果の参照データベースにおけるこれらのパラメータの観察値に依存する。対照的に、免疫スコアは、現在のＦＤＡ承認チェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）に対する応答に関して、参照データベースの臨床転帰の利用を必要とする。
【００３６】
ＩＡ分析のためのアプローチは、標本のコホートからのＲＮＡ配列データを用いて発見された一群の同時発現されたＴＣＲＳ遺伝子を最初に分析することによって開発された。ＴＩＬおよびＭｕＢを使用するという概念は、ＣＰＩへの応答およびさまざまな腫瘍タイプにおける予後結果に関する査読文献に提供されている情報に基づく評価に追加された。査読文献およびＲＰＣＩ  ＴＣＧＡコホートからのＲＮＡ配列データの分析に基づいて、いくつかの遺伝子をＴＩＬ評価に利用することができる。このアプローチは、ＴＩＬおよびＴＣＲＳが高度に関連しており、そして同時発現されているのに対して、ＭｕＢはこれら２つのパラメータといくらかは一致するが、それほどではないことを示している。
【００３７】
ＩＡ分析の最後のアプローチは、ＣＰＩに対する応答の患者層別化の文脈においてＴＩＬ、ＭｕＢ、ＴＣＲＳおよびＩＡＳの評価に使用できる数式（つまり、アルゴリズム）を開発することであった。この分析のエンドポイントは、これらの各パラメータを１００のスコアに正規化して結果の数値基準（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を提供することであった。アルゴリズムは、ＣＰＩへの応答のための最終的な患者層別化を導き出すために独特の順序で３つの異なる分析またはステップを利用する。
【００３８】
アルゴリズム分析のステップ１は、観察された試験結果のＴＩＬ、ＭｕＢおよびＴＣＲＳについての参照データベースへのランク付けまたはスコアに基づいている。患者の結果を報告する目的のためには、ＴＣＲＳスコアは報告されていない中間値であるが、ＴＩＬスコアおよびＭｕＢスコアは報告された値である。このランク付けまたはスコアに使用される数式は、以下のとおりである。
【００３９】
ＴＩＬスコアは、試験試料に対するＴＩＬ同定遺伝子の平均の百万当たりの正規化ｌｏｇ２リード（ｒｅａｄｓ）以下の参照試料の数／参照試料の総数＊１００を意味し、最も近い整数に四捨五入されている。
【００４０】
ＴＣＲＳスコアは、試験試料に対するＴＣＲＳ同定遺伝子の平均の百万当たりの正規化ｌｏｇ２リード以下の参照試料の数／参照試料の総数＊１００を意味し、最も近い整数に四捨五入されている。
【００４１】
ＭｕＢスコアは、試験試料に対する体細胞変異の数以下の参照試料の数／参照試料の総数＊１００を意味し、最も近い整数に四捨五入されている。
アルゴリズム分析のステップ２では、ＴＩＬ、ＭｕＢ、およびＴＣＲＳのスコアは、これらの各パラメータの加重値を使用して、単一の値、すなわち免疫活性化加重スコア（ＩＡＷＳ）に結合される。この免疫加重スコア（ＩＷＳ）に使用される数式は次のとおりである。
【００４２】
ＩＷＳスコア＝（ＴＩＬスコア×ＴＩＬの加重値）＋（ＭｕＢスコア×ＭｕＢの加重値）＋（ＴＣＲＳスコア×ＴＣＲＳの加重値）であり、かつ最も近い整数に四捨五入されている。
【００４３】
ＴＩＬ、ＭｕＢおよびＴＣＲＳに対する加重値は、例えば、参照データセット中の既知の治療リスポンダー対ノンリスポンダーに対する最適なＩＷＳ（ステップ３参照）を生成するために分類器を訓練する機械学習アプローチに基づくことができる。この分類器は、２つのクラスのＩＷＳが最もよく区別され、ＴＩＬの加重値＋ＭｕＢの加重値＋ＴＣＲの加重値＝１．０となるように機能する。レスポンダー／ノンレスポンダーの指示がある参照データセットのランク付けされたＩＷＳ内で、高／低スコアを呼び出すために２つの閾値がさらに決定されるため、高閾値を超えるすべての参照試料はレスポンダーを予測する上で９５％ＰＰＶ以上になり、低閾値を下回るすべての参照試料はノンレスポンダーを予測する上で９５％ＮＰＶ以上になる。
【００４４】
アルゴリズム分析の任意のステップ３は、観察された試験ＩＷＳ結果のランク付けまたはスコアに基づいて、ＩＷＳを参照データベースへの免疫スコア（ＩＳ）に変換することを含む。患者の結果を報告する目的のために、ＩＷＳは報告されない中間値であるが、ＩＳは報告された値である。このランク付けまたはスコアに使用される数式は、以下のとおりである。
【００４５】
ＩＳ＝（試験試料のＩＷＳスコア以下である参照データセット内の試料数）／参照試料の総数＊１００であり、最も近い整数に四捨五入される。
ＩＡアルゴリズムは変わらないが、ＣＰＩに対する患者の応答の参照データベースは、将来の臨床試験および患者の応答の追跡調査によって拡大し続けるであろう。ＴＩＬ、ＭｕＢ、ＴＣＲＳ、ＩＷＳ、またはＩＳの定性的および／または定量的評価のいずれかにスコアが割り当てられると、その値は今後の参照データベースへの追加によって変わることはないであろう。
【００４６】
アプローチ２−３つ以上のモデルの統合
個別化された腫瘍治療法を導き出すための第２のアプローチによれば、３つの独立したモデル（５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、そして免疫機能モデル）は、個々にまたは１つ以上の可能な組み合わせで利用される。例えば、３つのモデルのうちの２つ以上が比較目的で利用されてもよく、および／またはベイジアン（Ｂａｙｅｓｉａｎ）または他の種類のモデル化のために使用されてもよい。３つのモデルのそれぞれは、１つ以上のチェックポイント阻害剤に対する腫瘍の応答の予測を提供し、そして高度な比較およびモデリング技術は、３つのモデルのうちの２つ以上からの出力を使用して平均または全体予測を提供し得る。
【００４７】
個別化された腫瘍治療法を導き出すための第２のアプローチによれば、３つの独立したモデル（５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、そして免疫機能モデル）は、個々にまたは１つ以上の可能な組み合わせで利用される。５４遺伝子モデルと呼ばれる第１のモデルは、予測のためにＭｕＢと組み合わせて、ＴＩＬを表す１１個の遺伝子およびＴＣＲＳについて４３個の遺伝子を使用する多項式機械学習回帰モデルである。４遺伝子モデルと呼ばれる第２のモデルは、遺伝子レベルでの生物学的アプローチを表し、予測のためにＴＩＬまたはＴ細胞活性化遺伝子の最良の最小セットを選択するために決定木モデルを利用する。免疫機能モデルと呼ばれる第３のモデルは、機能レベルでの生物学的アプローチを表し、免疫細胞浸潤を表す１３個の遺伝子、Ｔ細胞活性化について２３個の遺伝子、サイトカインシグナル伝達について１０個の遺伝子、および免疫応答調節について８個の遺伝子を利用する。以下に記載されるように、３つのモデルは、個別化された腫瘍治療法を生成または導き出すために独立しておよび／または共同して利用され得る。
【００４８】
第２のアプローチのさらなる実施形態によれば、一次免疫マーカモデルまたはアプローチと呼ばれる第４のモデルもまた利用される。第４のモデルは、本明細書に記載されているかまたはそうでなければ想定されるように、免疫組織化学を使用して１つ以上の免疫マーカを分析する。
【００４９】
モデル１−５４遺伝子モデル
一実施形態によれば、５４遺伝子モデルは、予測のためにＭｕＢと組み合わせて、ＴＩＬを表す１１個の遺伝子およびＴＣＲＳについて４３個の遺伝子を使用する多項式機械学習回帰モデルであるが、他の遺伝子の組み合わせも可能である。
【００５０】
５４遺伝子モデルは、治療方法および腫瘍応答が知られている複数の遡及的試料（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅｓ）に基づいて訓練および試験データサイズの異なる組み合わせをベンチマークすること（ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ）によって導き出された。Ｎ個の試料の訓練サイズに対して、それぞれ無作為に引き出されたＮ個の試料を使用し、残り（（遡及的試料の総数）−Ｎ）の試験試料を使用して分類器の性能を評価して、２万回の反復の訓練が行われた。
【００５１】
Ｎ個の訓練−試料（Ｎ−ｔｒａｉｎｉｎｇ−ｓａｍｐｌｅ）に対する分類器の全体的なパフォーマンスは、２万回のベンチマークの平均から計算した。内部ベンチマークから、Ｎが最初の遡及的母集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の合計の約５０％に達すると、分類器のＲＯＣ／ＡＵＣ性能は収束することが観察された。公開されているパフォーマンスメトリクス（ＲＯＣプロット、ＡＵＣスコア、ＰＰＶ、ＮＰＶなど）は、より明示的な一個抜きの（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）試験、つまり、各反復（ｅａｃｈ  ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）が、試験目的のために１つの一意の（ｕｎｉｑｕｅ）試料を残しながら訓練のために８６の試料を使用する、一意のＮ＝８６テストの８７の反復（８７  ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  Ｎ＝８６  ｔｅｓｔｓ）で計算される。しかしながら、将来の試験目的のための最終予測モデルは、訓練のためにすべての遡及的試料を使用し、それは１つの実験的研究において合計８７試料であった。
【００５２】
図１を参照すると、一実施形態において、訓練のために遡及的試料のパネルを用いた５４遺伝子モデルについての結果のグラフである。グラフに示されるように、結果は、母集団の２６％について９６％の正の予測値（ＰＰＶ）、母集団の４９％について９０％の負の予測値（ＮＰＶ）、および母集団の２５％を表す鑑別困難群を有する。
【００５３】
図１には示されていない一実施形態によれば、５４遺伝子モデルは、治療に対するレスポンダー、鑑別困難レスポンダー、またはノンレスポンダーとして腫瘍を分類するように決定または設計することができ、かつ癌の急速な進行（ｈｙｐｅｒ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）のリスクを予測するように決定または設計することができる。例えば、５４遺伝子モデルは、急速進行性（ｈｙｐｅｒ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）疾患のリスクを有するノンレスポンダーのサブセットを同定するように決定または設計することができる。急速進行性疾患のリスクは定性的および／または定量的であり得る。
【００５４】
一実施形態によれば、５４遺伝子モデルは、５４個の異なる遺伝子についての発現情報、および／または４０９個の遺伝子における変異数の合計としての変異負荷を利用する。表１は、５４遺伝子モデルにおいて発現情報を利用することができる遺伝子の代表的なリストを含む。しかしながら、表２で同定された遺伝子を含むがこれに限定されない他の多くの遺伝子がこのモデルにおける発現分析のために可能である。
【００５５】
【表１】
2020500294.tif 000003
【００５６】
図２を参照すると、一実施形態において、さらなる特徴としての変異負荷（ＭｕＢ）と組み合わされた、５４個の遺伝子または５４個の特徴を利用するモデルの特徴空間の概略図である。一実施形態によれば、個々の特徴としてのＭｕＢは、５４個の遺伝子または５４個の特徴と等しく扱われる。
【００５７】
５４遺伝子モデルに適している可能性がある遺伝子を列挙することに加えて、表２はまた、本明細書に記載の免疫機能モデルにおいて発現情報を利用することができる遺伝子を提供する。したがって、表２に列挙された遺伝子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、および変異負荷分析のうちの１つ以上において利用され得る。
【００５８】
【表２】
2020500294.tif 000004
2020500294.tif 000005
2020500294.tif 000006
2020500294.tif 000007
2020500294.tif 000008
モデル２−４遺伝子モデル
一実施形態によれば、４遺伝子モデルは決定木モデルを利用して、予測のためにＴＩＬまたはＴ細胞活性化遺伝子の最良の最小セットを選択する。４遺伝子モデルは、例えば、５４個の遺伝子（他の遺伝子も可能ではあるが）の最初の選択から独立した決定木機械学習アプローチを用いて導き出された。機械学習アルゴリズムは遺伝子のサブセットを選択し、８７の訓練試料の全母集団からレスポンダーとノンレスポンダーを最もよく区別する、人間が解釈可能な決定木を構築した。自動的に選択された４個の遺伝子は、Ｔ細胞活性化に関連する２個の遺伝子、免疫応答調節に関連する遺伝子およびサイトカインシグナル伝達に関連する遺伝子を含む。
【００５９】
図３を参照すると、一実施形態において、４遺伝子モデルに対する決定木の概略図である。４遺伝子モデルにおいて、利用される４個の遺伝子の同一性および特定のカットオフ値は変わり得る。一実施形態によれば、４個の遺伝子はＰＤ−Ｌ１、ＴＧＦＢ１、ＴＢＸ２１、およびＢＴＬＡであり、これらの遺伝子のそれぞれに対するカットオフ値はそれぞれ１７１、２０４３、７０．５６、および２６．３８である。さらなる実施形態によれば、第１の遺伝子はＰＤ−Ｌ１であり、第２の遺伝子はＴＧＦＢ１であり、第３の遺伝子はＴＢＸ２１であり、そして第４の遺伝子はＢＴＬＡである。決定木は、各遺伝子の（１００万あたりの正規化リード（ｎＲＰＭ）における）発現レベルを利用して一連のＹＥＳまたはＮＯ決定を提供する。例えば、遺伝子１のｎＲＰＭが特定の閾値またはカットオフ未満である場合、その腫瘍はレスポンダーであると決定される。遺伝子１のｎＲＰＭが閾値またはカットオフよりも大きい場合、決定木は次の遺伝子に進む。決定木の結果は、図３に示すように、腫瘍をレスポンダーまたはノンレスポンダーのいずれかとして分類する。
【００６０】
図３には示されていない一実施形態によれば、４遺伝子モデルは、治療に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして腫瘍を分類するように決定または設計することができ、また癌の急速な進行のリスクを予測するように決定または設計することができる。例えば、４遺伝子モデルは、急速進行性疾患のリスクを有するノンレスポンダーのサブセットを同定するように決定または設計することができる。急速進行性疾患のリスクは定性的および／または定量的であり得る。
【００６１】
図４を参照すると、一実施形態において、訓練のために８７の遡及的試料のパネルを用いた４遺伝子モデルについての結果のグラフである。グラフに示されているように、結果は、母集団の４３％に対して７２％のＰＰＶ、母集団の４９％に対して９２％のＮＰＶを有し、そして鑑別困難群はなかった。
【００６２】
モデル３−免疫機能モデル
一実施形態によれば、免疫機能モデルは、免疫細胞浸潤を表す１３個の遺伝子、Ｔ細胞活性化について２３個の遺伝子、サイトカインシグナル伝達について１０個の遺伝子、および免疫応答調節について８個の遺伝子を利用するが、他の遺伝子も可能である。免疫機能モデルは、４遺伝子モデルと同様に、決定木学習法を利用する。しかしながら、個々の遺伝子の予測的重要性を評価する代わりに、免疫機能モデルは、免疫細胞浸潤、免疫応答調節、Ｔ細胞活性化、およびサイトカインシグナル伝達を含む所与の免疫機能群における複数の遺伝子の加重平均相対ランクをとる。相対ランクは、遺伝子の正規化発現値（ｎＲＰＭ）を参照母集団のものに対してランク付けし、さらにランクを０〜１００までの同じ範囲に正規化することによって確立される。免疫機能相対ランクは、参照母集団と比較して同じ機能を有する複数の遺伝子の発現の程度をまとめて反映する。
【００６３】
図５を参照すると、一実施形態において、免疫機能モデルの決定木の概略図が示されている。遺伝子セットの同一性は変わり得る。決定木は、４つの異なる免疫機能群（免疫細胞浸潤、免疫応答調節、Ｔ細胞活性化、およびサイトカインシグナル伝達）のそれぞれについて相対ランクカットオフ値を利用して一連のＹＥＳまたはＮＯ決定を提供し、そして、治療に対するレスポンダー、治療に対するノンレスポンダー、または治療に対する鑑別困難レスポンダーとして、腫瘍を分類することができる。
【００６４】
図５に示されていない一実施形態によれば、免疫機能モデルは、治療に対するレスポンダー、鑑別困難レスポンダー、またはノンレスポンダーとして腫瘍を分類するように決定または設計することができ、癌の急速な進行のリスクを予測するように決定または設計することもできる。一実施形態によれば、４つの機能は免疫細胞浸潤、免疫応答調節、Ｔ細胞活性化、およびサイトカインシグナル伝達であり、これらの各機能のカットオフ値はそれぞれ５８．９、６０．２５、４２．９８および６９．７８である。例えば、免疫機能モデルは、急速進行性疾患のリスクを有するノンレスポンダーのサブセットを同定するように決定または設計することができる。急速進行性疾患のリスクは定性的および／または定量的であり得る。
【００６５】
図６を参照すると、一実施形態において、訓練のために８７の遡及的試料のパネルを用いた免疫機能モデルについての結果のグラフである。グラフに示されるように、結果は、母集団の２１％について７２％のＰＰＶ、母集団の５５％について８５％のＮＰＶ、および母集団の２４％を表す鑑別困難群を有する。
【００６６】
一実施形態によれば、免疫機能モデルは、５４個の遺伝子（免疫細胞浸潤を表す１３個の遺伝子、Ｔ細胞活性化について２３個の遺伝子、サイトカインシグナル伝達について１０個の遺伝子、および免疫応答調節について８個の遺伝子）の発現情報を利用するが、表２に同定された遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの他の遺伝子の組み合わせも可能である。表３は、免疫機能モデルにおいて発現情報を利用することができる遺伝子のリストを含む。
【００６７】
【表３】
2020500294.tif 000009
【００６８】
モデル４−一次免疫マーカモデル
一次免疫マーカモデルまたはアプローチは任意であり、そして免疫組織化学を利用して１つ以上の免疫マーカを分析する。一実施形態によれば、一次免疫マーカモデルまたはアプローチは、免疫組織化学を使用してＰＤ−Ｌ１タンパク質発現および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）発現（ＣＤ３および／またはＣＤ８を含むがこれらに限定されない）を分析する。別の実施形態によれば、一次免疫マーカモデルまたはアプローチは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）方法論を利用してＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２コピー数増加を分析する。
【００６９】
多重モデル相関（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）
一実施形態によれば、５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、および免疫機能モデルのうちの２つ以上からの出力が組み合わされて、個別化腫瘍療法のための最終的な推奨が提供される。
【００７０】
例えば、図７を参照すると、一実施形態において、５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、および免疫機能モデルからの出力は、最終予測のためにベイジアンモデル平均化（ＢＭＡ）を使用して組み合わされた。一実施形態に従って、ＢＭＡアルゴリズムは多数決投票の概念に類似しているが、アルゴリズムはまた、最終予測を最適化するために各個々のモデルの性能の事前確率分布（ｐｒｉｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を利用する。
【００７１】
図７に示されるようなさらなる実施形態によれば、５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、免疫機能モデル、および一次免疫マーカモデルからの出力は、最終予測のためにＢＭＡを使用して組み合わされた。
【００７２】
図８を参照すると、一実施形態において、訓練のために８７の遡及的試料のパネルを使用したＢＭＡについての結果、および５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、および免疫機能モデルからの結果のグラフである。グラフに示されるように、結果は、母集団の３０％について９６％のＰＰＶ、母集団の７０％について９０％のＮＰＶを有し、そして鑑別困難群を有さない。
【００７３】
図９を参照すると、一実施形態において、５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、免疫機能モデル、およびベイジアンモデル平均化（ＢＭＡ）のそれぞれからの全体的な結果の表である。
【００７４】
本明細書に記載されるかまたはそうでなければ想定される様々なアプローチおよびモデルは、遡及的訓練パネルおよび機械学習を利用して、５４遺伝子モデル、４遺伝子モデル、および免疫機能モデルを導き出す。様々なアプローチおよびモデルがより大きくおよび／または異なる遡及的訓練パネルを利用するので、様々な遺伝子およびモデルは変わり得る。
【００７５】
免疫報告カード
図１０を参照すると、患者の腫瘍微小環境が免疫療法に応答する可能性を含む報告を作成するための方法１００が示されている。一実施形態によれば、報告はまた、患者の包括的な免疫プロファイルに基づく１つ以上の個別化治療オプションを含む。一実施形態によれば、この方法は、５つのデータ入力のうちの３つ以上を利用して、可能性（単数または複数）および個別化された治療オプションを決定するために必要なデータを生成する。一実施形態によれば、これら５つのデータ入力は少なくとも以下を含むことができる。
【００７６】
１．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に関連する遺伝子および抗癌免疫応答および免疫療法標的に関連するＴ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲＳ）遺伝子の相対転写産物レベルを測定するためのＲＮＡ配列。
【００７７】
２．変異負荷（ＭＵＢ）を推定するためのＤＮＡ配列。
３．ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）の発現（ＣＤ３およびＣＤ８）のパターンを測定するための免疫組織化学（ＩＨＣ）。
【００７８】
４．マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を評価するためのＰＣＲ、および／または
５．ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２コピー数増加を検出するための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。
【００７９】
したがって、方法のステップ１１０において、１つ以上の腫瘍試料または標本が収集される。試料は、現在知られているかまたは将来開発される任意の方法を使用して収集され得る。試料は、患者および／または腫瘍から直接取得されてもよく、または患者および／または腫瘍から以前に取得された試料から得られてもよい。試料は、腫瘍試料であり得るか、または個体から取得された非腫瘍試料であり得る。試料は直ちに分析されてもよく、および／または将来の分析のために保管されてもよい。したがって、試料は、出荷、保管、および／または他の現在もしくは将来の使用のために処理されてもよい。
【００８０】
方法のステップ１２０において、ＲＮＡ配列データ入力が得られる。一実施形態によれば、ＲＮＡ配列データ入力は、デジタル遺伝子発現検出のためのアンプリコンベースの標的ＮＧＳを使用して免疫関連遺伝子機能を表す３９５個の遺伝子を調べる次世代シーケンシング（ＮＧＳ）アッセイを含む。一実施形態は、これらの３９５個の遺伝子のうち５４個に集中し、追加の１０個の遺伝子を対照として使用することができる。この実施形態または他の実施形態において、１つ以上の追加の遺伝子（本明細書の１つ以上の表に挙げられている遺伝子のようなもの）を分析して方法の結果において提供することができる。
【００８１】
一実施形態によれば、ＲＮＡ配列データ入力のＴＩＬ遺伝子コンポーネントは、浸潤性免疫細胞のサブセットを分類するために同定された遺伝子を含む。遺伝子は、本明細書で同定された１１個の遺伝子（ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４、ＣＤ６８、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＦＯＸＰ３およびＣＤ２０）であり得るか、または異なるおよび／または追加の遺伝子を含み得る。予測的免疫バイオマーカまたは生存の予後マーカとしてのＴＩＬの適用は、多種多様な腫瘍型において研究されてきた。エビデンスは、ＣＤ３＋  ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球がＣＰＩに対する応答と正に関連しているのに対して、ＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇｓは負の関連性を有していることを示している。腫瘍におけるＴＩＬのパターンもまた重要性を有することが示されている。
【００８２】
一実施形態によれば、ＲＮＡ配列データ入力のＴ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲＳ）コンポーネントは、免疫浸潤細胞、新生物細胞、または腫瘍微小環境の他の細胞上で発現される遺伝子を含み、免疫表現型によって、チェックポイント遮断に直接関与するものとして、または適応免疫応答に関連する他の機能に関与するものとして、分類される。遺伝子は、本明細書中で同定された４３個の遺伝子（例えば、表１参照）であり得るか、または異なるおよび／またはさらなる遺伝子を含み得る。
【００８３】
一実施形態によれば、チェックポイント遮断に関連する免疫表現型は、典型的には受容体および関連リガンドとして分類される。ＴＣＲＳ関連遺伝子のサブセットによれば、リガンドまたは受容体のいずれかが１つ以上のＴ細胞サブセットによって発現される。チェックポイント遮断に関連する遺伝子は、１つ以上のチェックポイント阻害薬の直接の標的であるものとそうでないものとにさらに分類することができる。チェックポイント阻害薬の直接の標的は、受容体またはリガンドのいずれかであり得るが、同時に両方ではない。チェックポイント阻害薬および標的の例は、イピリムマブおよび活性化Ｔ細胞上に発現される受容体ＣＴＬＡ−４である。一実施形態によれば、可能性の報告および個別化された治療オプションはまた、表３に示すように、チェックポイント遮断（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４）、チェックポイント遮断（その他）、またはプライムされたＴ細胞（Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｐｒｉｍｅｄ）として、チェックポイント遮断に関連する遺伝子を報告する。チェックポイント遮断およびチェックポイント遮断（その他）は、エフェクターＴ細胞に対する共阻害シグナル伝達に関連しているが、プライムされたＴ細胞は共刺激性である。ＴＣＲＳに間接的に影響を及ぼす適応免疫応答に関連する他の免疫表現型には、骨髄抑制、炎症促進性応答、抗炎症性応答、および代謝免疫回避が含まれる。
【００８４】
【表４】
2020500294.tif 000010
【００８５】
各遺伝子の発現は参照母集団（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と比較され、１〜１００の間の値に正規化され、そして相対ランクと呼ばれる。一実施形態によれば、この方法の基準となる参照母集団は、１６７の固有の腫瘍に由来するＲＮＡ配列の結果からなっていた。９５以上の値であるスコア（または相対ランク）の上位９５パーセンタイルは非常に高い発現と解釈され、８５〜９４パーセンタイルは高い発現と解釈される。４９未満の値であるスコア（または相対ランク）の下位５０パーセンタイルは、低いまたは非常に低い発現と見なされる。５０〜８５のスコアは中程度の発現と見なされる。免疫表現型の解釈は、そのクラスの全遺伝子の平均に由来し、個々の遺伝子の発現と同じ方法で正規化値としてランク付けされている。
【００８６】
方法のステップ１３０において、同方法のうち、ＤＮＡ配列データ入力が得られる。一実施形態によれば、ＤＮＡ配列データ入力は、全エクソン変異プロファイリングアッセイにおいて、一意のエクソンＤＮＡの１，１６５，２９４塩基対をカバーする合計６，６０２エクソンを評価する完全なエクソンのカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を備えた４０９個の癌遺伝子の１．７５Ｍｂ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ（登録商標）キャプチャを含む。変異負荷（ＭＵＢ）は、エクソンＤＮＡのメガベース（Ｍｂ）あたりの変異の数として報告されている。ＭｕＢは、ＩＲＣパネル内の一意のエクソンＤＮＡの９０％以上で２０倍のカバレッジを提供するバリアントコーリングパイプライン（ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ）の開発のための全エクソームシーケンシングを用いて試料のサブセットに対して較正することができる。一実施形態に従って、ＭｕＢは、黒色腫におけるチェックポイント阻害剤への応答との高い変異負荷の相関関係を報告する４つの臨床的に関連する査読付き刊行物に対して較正した。同等の全エクソームおよびこれらの４つの参考文献をキャリブレータとして使用して、ＭｂＤＮＡあたりの変異の数によって測定されるＭｕＢのカットオフ値を、１６７人の患者の内部参照母集団を使用して確立した。これに関して、ＭｕＢは、「非常に高い」、「高い」、「中程度の」、「低い」、および「非常に低い」として分類される。高いＭｕＢおよび非常に高いＭｕＢの分類は単一バイオマーカとしてのレスポンダーである可能性が高いが、この測定は感度および特異性を欠いており、ＩＲＣにおける他のアッセイ結果から独立して使用されるべきではない。
【００８７】
方法のステップ１４０において、免疫組織化学データ入力が得られる。一実施形態によれば、免疫組織化学データ入力は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）発現（ＣＤ３およびＣＤ８）の測定値を含む。一実施形態によれば、免疫組織化学データ入力は、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３およびＣＤ８についての発現データを提供するために自動ＤＡＫＯプラットフォームおよび市販の抗体を利用して得られる。同方法は、３つの全ての分析物についてのタンパク質発現パターンを報告して、腫瘍微小環境において生じる多次元相互作用、ならびにＰＤ−Ｌ１に関する発現の半定量的（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）測定をより明確にすることができる。
【００８８】
一実施形態によれば、黒色腫について、ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ  ２８−８  ＦＤＡ承認アッセイを使用して行われ、任意の強度の膜染色を示す新生物細胞の割合を報告するためのスコアリングガイドラインに従う。ＰＤ−Ｌ１  ２２  Ｃ３  ＦＤＡ承認アッセイは、非小細胞肺癌および他の腫瘍型を試験するために使用され、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、任意の強度で部分的または完全な膜染色を示す生存腫瘍細胞の百分率である腫瘍比率スコア（Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  Ｓｃｏｒｅ）（ＴＰＳ）を用いて決定される。
【００８９】
一実施形態によれば、ＴＩＬＳ発現パターン（ＩＨＣによって測定される場合のＣＤ３およびＣＤ８）は、「浸潤」、「非浸潤」、または「最小から不在（ｍｉｎｉｍａｌ  ｔｏ  ａｂｓｅｎｔ）」として報告される。「浸潤」パターンは、検査された腫瘍の大部分における新生物細胞の群内のＴＩＬの染色を指す。「非浸潤」は、存在するが、検査された腫瘍の大部分において新生物細胞の浸潤群のパターンと矛盾するＴＩＬを指す。ＣＤ３およびＣＤ８の染色の非浸潤パターンには、腫瘍の前縁に豊富なＴＩＬがあるが新生物細胞の浸潤はない場合が含まれる。最小から不在のパターンは、腫瘍の任意の部分内に存在するＴＩＬが本質的に最小からゼロである。
【００９０】
一実施形態によれば、ＣＤ３はＴ細胞（このアッセイではＴＩＬと呼ばれる）を強調し、そして新生物に関連するＴ細胞集団を同定するために有用である。ＣＤ８は、（新生物細胞の真ん中に見いだされたときに）チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）に対する応答を反映する傾向がある細胞傷害性Ｔ細胞を強調している。このレポートで提供されている情報は、ＦＤＡが承認した１つ以上のチェックポイント阻害剤による免疫療法がこの患者に有益かどうかを判断するために医師が使用することがある。
【００９１】
一実施形態によれば、本方法のＰＣＲコンポーネントは、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を検出するために、２つのモノヌクレオチド反復マーカ（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６）および３つのジヌクレオチド反復マーカ（Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６およびＤ１７Ｓ２５０）を含む５つのマーカを使用する。別の実施形態によれば、同方法のＮＧＳコンポーネントは、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を検出するために１００個までのホモポリマー、ジヌクレオチド、トリヌクレオチドおよび／またはテトラヌクレオチドマーカを使用する。いずれの場合も、結果は「ＭＳＩ−高」、「ＭＳＩ−低」、または「ＭＳＳ」（マイクロサテライト安定）として報告される。遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）とも呼ばれるリンチ症候群の設定における生存の予後マーカとして通常使用されるＭＳＩは、他の治療オプションのない大腸癌におけるチェックポイント阻害薬および固形癌における二次治療に対する応答のＦＤＡマーカである。
【００９２】
結腸直腸癌、子宮内膜癌、およびＭＳＩ−Ｈを伴う他の種類の新生物は散発性である可能性があり（すなわち、マイクロサテライト不安定性は新生物においてのみ見出され、したがって遺伝による疾患の一部ではない）、または遺伝による疾患である（すなわち、ＤＮＡ修復遺伝子における家族性の遺伝的変異、典型的にはＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ６に関連する）リンチ症候群に二次的である。ＭＳＩ試験ではマイクロサテライト不安定性の存在を判断できるが、どの特定のＤＮＡ修復遺伝子が影響を受けているのかを判断することはできない。ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ６に対する免疫組織化学を使用して、影響を受ける特定のタンパク質を見つけることができる。発現喪失パターンおよび起源の癌腫組織に応じて、わずかに異なる戦略が示される。具体的には、全米総合癌センターネットワーク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、ＮＣＣＮ）のガイドラインを検討することを推奨する。リンチ症候群の存在は、病原性のＤＮＡ修復遺伝子変異が患者の非腫瘍性組織に見いだされたときに確実に決定される。このような場合、遺伝カウンセリングは、リンチ症候群を患うリスクがある家族の一員の関与を伴って推奨される。ＭＳＩ−Ｈ結腸直腸癌（散発性およびリンチ症候群関連）は、ＭＳＳ（マイクロサテライト安定）結腸直腸癌とは異なる臨床プロファイル（予後および化学療法応答性）を有することが知られている。
【００９３】
一実施形態によれば、同方法のＦＩＳＨコンポーネントは、増幅されたときにＰＤ−Ｌ１発現と関連する２つのＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）のコピー数を測定する。２個の遺伝子は９ｐ２４．１上で４０ｋｂ離れて位置し、そして遺伝子領域にマッピングする蛍光標識されたＢＡＣクローンのプールを用いて検出される（ＲＰ１１−６３５Ｎ２１、ＲＰ１１−８１２Ｍ２３およびＲＰ１１−４８５Ｍ１４）。結果は、コピー数を増幅している、曖昧である、または増幅していないと判断するためのＡＳＣＯ−ＣＡＰ  ＨＥＲ２テストガイドライン推奨を使用して報告される。増幅されたという結果は、ＰＤ−Ｌ１／２の任意のコピー数の値について、ＣＥＰ９に対するＰＤ−Ｌ１／２の比が２．０以上の場合、またはＣＥＰ９に対するＰＤ−Ｌ１／２の比が２．０未満であり、かつＰＤ−Ｌ１／２のコピー数の値が６．０以上の場合、である。曖昧であるという結果は、ＣＥＰ９に対するＰＤ−Ｌ１／２の比率が２．０未満で、かつＰＤ−Ｌ１／２のコピー数の値が４．０以上６．０未満の場合に発生する。増幅されていないという結果は、ＣＥＰ９に対するＰＤ−Ｌ１／２の比が２．０未満であり、かつＰＤ−Ｌ１／２のコピー数の値が４．０以上の場合に生じる。ＩＲＣは、ＰＤ−Ｌ１／２コピー数試験について、従来のＮＹＳ−ＣＬＥＰが承認したＯｍｎｉＳｅｑの「ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２増幅および検証データＳＯＰ」を使用する。
【００９４】
方法のステップ１５０において、ステップ１２０、１３０および１４０のうちの１つまたは複数から入力されたデータが照合され分析される。例えば、一実施形態によれば、出力は、個別化された腫瘍治療に対する最終的な推奨を提供するために組み合わされる。例えば、一実施形態によれば、出力は、最終予測のためにベイジアンモデル平均化（ＢＭＡ）を使用して組み合わされる。一実施形態によれば、ＢＭＡアルゴリズムは多数決投票の概念に類似しているが、アルゴリズムはまた、最終予測を最適化するために各個々のモデルの性能事前確率分布を利用する。しかしながら、２つ以上のデータ入力からデータを照合するための他の多くの方法が可能である。
【００９５】
方法のステップ１６０において、臨床報告が患者の臨床医に提供される。報告は、少なくとも、患者の腫瘍微小環境が特定の免疫療法、および／または組み合わせ免疫療法、および／または免疫療法の臨床試験に応答する可能性を含む。一実施形態によれば、方法のステップ１７０で、データ入力、照合データ、および／または最終分析を利用して、患者の包括的な免疫プロファイルに基づいて１つ以上の個別化治療オプションを生成する。したがって、患者に提供される報告はまた、１つ以上の個別化された治療オプションを含み得る。
【００９６】
一実施形態によれば、患者の臨床医に提供される報告は、以下のうちの１つまたは複数を含むことができる。
・優先免疫マーカ  −  ＰＤ−Ｌ１発現、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）のパターンおよび発現、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）変異負荷（ＭＵＢ）、およびＰＤ−Ｌ１／Ｌ２コピー数増加、を含むがこれらに限定されない、治療管理のための臨床的に関連する免疫マーカについての一目でわかる情報。各マーカについての治療上の関連性についてのエビデンスは、試験した腫瘍の種類に文脈において提供することができる。
【００９７】
・要約の解釈  −  優先的免疫マーカおよびＴＣＲＳ遺伝子発現の両方に基づくこの腫瘍の全体的な免疫状態の病理学者による解釈および特徴付け。要約の解釈は、ＦＤＡが承認したチェックポイント阻害剤に対する応答の可能性の主張と免疫表現型評価に基づく臨床治験機会の試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｔｒｉａｌｓ）の概要を提供することができる。
【００９８】
・免疫表現型の要約  −  適用可能な各表現型内で高度に発現された遺伝子を示す、いくつかの免疫表現型についての遺伝子発現の概要。各免疫表現型に関連する遺伝子は、類似または同一の作用を有する遺伝子をすべて含むことを意図するものではなく、むしろ発現が厳密に検証された遺伝子である。所与の免疫表現型内のいくつかの遺伝子は、ＦＤＡ承認治療法または臨床治験のいずれかとして利用可能な関連免疫療法剤である。
【００９９】
・免疫表現型の詳細  −  免疫表現型によるＴＣＲＳ遺伝子の遺伝子レベルの発現ランクと解釈。各遺伝子の発現は、ＲＮＡ配列コンポーネントにおいて以前に記載されたようにランクおよび解釈として提供される。遺伝子に関連する免疫療法は、試験した腫瘍の種類に関係なく列挙されている。ＰＤ−Ｌ１を除いて、あらゆる免疫表現型遺伝子の過剰発現および関連するあらゆる免疫療法に対する応答を裏付けるエビデンスは限られているかもしれない。
【０１００】
・腫瘍浸潤リンパ球  −  さまざまな免疫関連細胞の分化に関連するＴＩＬＳ遺伝子の遺伝子レベルの発現ランクと解釈。
・臨床治験  −  臨床治験は、試験された腫瘍の種類、臨床開発中の治療が「高い」または「非常に高い」にランク付けられる過剰発現マーカについて表示される。「高い」または「非常に高い」にランク付けられるマーカが存在しない場合は、「中程度に高い」にランク付けられるマーカについて臨床治験が表示される。腫瘍へのリンパ球の動員に関する治験は、腫瘍が炎症を起こしていないと見なされる場合に常に表示される。
【０１０１】
実施例−固形腫瘍における免疫応答の分析
一実施形態によれば、免疫学的腫瘍微小環境の特徴付けを、固形腫瘍に罹患した患者に対する治療上の決定の指針として提供するために、本明細書に記載または他の方法で想定された方法論を利用してホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍標本における免疫応答を分析した。
【０１０２】
本明細書中に記載されるように、分析は、ＲＮＡ配列データを利用して、抗癌免疫応答に関連する転写物のレベルおよび腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の相対存在量を反映する転写物のレベル、並びに、変異負荷を推定するためにＤＮＡ配列データについて、半定量的に測定した。この実施例には記載されていないが、分析は、本明細書に記載されているかまたはそうでなければ想定されているような一次マーカ免疫データを含み得る。
【０１０３】
ＲＮＡ配列データおよびＤＮＡ配列データを取得および／または分析するための方法論の実施形態は、以下に記載される。しかしながら、これは単に１つの可能な実施形態であり、したがって決して限定的ではないことが理解される。ＲＮＡ配列データおよびＤＮＡ配列データを取得および／または分析するための他の方法論が可能である。
【０１０４】
このアッセイは、既存の変異プロファイリングアッセイとは異なり、広範囲のバイオマーカを用いて、患者の腫瘍の免疫学的構成に基づいて免疫療法的治療に患者を正確に一致させる。
【０１０５】
方法
アッセイの分析性能を評価するために、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、および膀胱癌患者由来の１６７個のＦＦＰＥ標本および一致する新鮮凍結（ＦＦ）組織のサブセットを得た。標本は、患者の同意を得た機関のバンキングポリシーの下で収集され、この研究は、非ヒト対象研究のための機関のポリシーに従い、内部審査委員会の審査（ＩＲＢプロトコル番号ＢＤＲ０７３１１６）によって承認された。
【０１０６】
標本には、２００２年から２０１６年の、細針吸引生検、パンチ生検、針コア生検、切開生検、切除生検、および切除標本が含まれていた。標本のサブセットについては、全エクソームシーケンシングおよび全トランスクリプトームＲＮＡ配列データが、比較の目的ためにＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）プロジェクトの一部として利用可能であった。４つのヒト細胞株、リンパ芽球体ＧＭ１２８７８細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）、結腸直腸癌ＫＭ−１２細胞（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＣＴＤ、メリーランド州ベセスダ）、ＮＳＣＬＣ  ＨＣＣ−７８細胞（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）、およびＦＦＰＥブロックとして処理された大細胞リンパ腫ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞（ＡＴＣＣ）もまた、開発のためにおよび内部試験対照として使用された。
【０１０７】
認定解剖病理学者が、試験されるべき領域を同定するために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した腫瘍切片を検査した。Ｈ＆Ｅ染色切片上の腫瘍表面積はスライドあたり≧２ｍｍ２であり、腫瘍細胞性は≧５０％、そして壊死は≦５０％であった。潜在的な分析前干渉の検査のために、核酸抽出のために、非悪性組織および壊死組織も対応する未染色スライドから巨視的に解剖された。病理学者によって同定された領域を、３〜５個の未染色スライドから組織を掻き取るためのガイドとして使用した。ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡを、ｔｕｒＸＴＲＡＣ  ＦＦＰＥ抽出キット（コバリス社（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．）マサチューセッツ州ウーバン）を用いて、製造者の指示に従っていくつかの修正を加えて、この材料から同時に抽出した。精製後、ＲＮＡおよびＤＮＡをそれぞれ３０および５０μＬの水中に溶出し、収率をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＲＮＡ  ＨＳアッセイおよびＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒヒトＤＮＡ定量キット（ともにサーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、マサチューセッツ州、ウォルサム）によって、製造元の推奨事項に従って、決定した。適切なライブラリー調製を確実にするための許容基準として、１０ｎｇＲＮＡおよび３０ｎｇＤＮＡの予め定められた収量を使用した。
【０１０８】
ライブラリー調製、濃縮およびＮＧＳのために運転管理が確立され、そして使用された。それらは、陽性（ＭｕＢ−ＤＮＡ、ＧＥＸ−ＲＮＡ）対照および陰性（ＭｕＢ−ＤＮＡ陰性、ＧＥＸ−ＲＮＡ陰性）対照の両方、ならびにテンプレートなしの対照（ＮＴＣ、水）を含んでいた。陽性対照は、認定と下流の正規化の目的のためのすべての標的のためのテンプレートを提供する一方で、陰性対照はアッセイの特異性を監視する。ＲＮＡ配列では、ＮＴＣを使用して個々の試料レベルでの検出限界を同定する。ＤＮＡ配列については、ランレベルで偽陽性の閾値を同定するためにＮＴＣが使用される。これら５つのラン対照（ｒｕｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）の性能特性を複数週にわたって評価して、ランおよび試料の日々のＱＣパラメータとして機能する閾値およびフィルタを開発した。
【０１０９】
アッセイは、ＧＥＸについてはＯｎｃｏｍｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈアッセイ（ＯＩＲＲＡ）を、ＭｕＢについてはＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＣＰ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を利用した。これらのパネルは両方とも、ＦＦＰＥスライドから抽出された核酸を増幅するために、多重化された遺伝子特異的プライマーペアおよびＮＧＳを使用する。ＯＩＲＲＡは、正規化因子（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒｓ）として１０個の構成的発現ハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子を使用して５４個の標的遺伝子の発現を定量化するように適合された。ＣＣＰパネルに含まれる４０９個の癌関連遺伝子のすべてを用いて、ゲノムＤＮＡからＭｕＢを推定した。
【０１１０】
ＯＩＲＲＡライブラリーは、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ標的配列決定技術（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して調製した。簡単に説明すると、１０ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、標的を多重プライマープールで増幅した。ＤＮＡ配列については、３０ｎｇのＤＮＡを用いてＣＣＰライブラリーを調製した。バーコードアダプターを部分的に消化されたアンプリコンにリゲートし、精製し、そして５０ｐＭに標準化した。Ｉｏｎ  Ｃｈｅｆシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いた濃縮およびテンプレート調製の前に、最大１６等モルのＲＮＡおよびＤＮＡライブラリーをプールした。Ｉｏｎ  Ｓ５ＸＬ５４０チップで２００ｂｐ配列決定を実施して、試料あたり１．５〜２．５ＭのＲＮＡ配列マッピングリードおよび１００〜１５０Ｘ  ＤＮＡ配列平均深さを得た。
【０１１１】
すべての試料について報告されているすべての遺伝子についてはｑＲＴ−ＰＣＲとの比較により、そして（適切な材料を含む５７試料のサブセットについては自動画像分析に基づいて）ＣＤ８ＡについてはＩＨＣとの比較によりＲＮＡ配列の精度を評価した。直交ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて５４個の標的および１０個のＨＫ遺伝子をモニタするＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイによって１００ｎｇのＲＮＡを逆転写し、増幅し、そして三連で測定した。ＩＨＣについては、腫瘍ごとに配列された３つの０．６ｍｍ組織コアを有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）からの５μｍの厚さの切片を、標準的な手順に従ってＣＤ８Ａに特異的な抗体（Ｃ８／１４４Ｂ、Ｄａｋｏ、アジレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州サンタクララ）で染色し、そしてＰＤ−Ｌ１は、ＦＤＡガイドラインに従って、腫瘍組織学（２２Ｃ３、Ｄａｋｏ、または２８−８Ｄａｋｏ、またはＳＰ１４２  Ｖｅｎｔａｎａ）に特異的に実施される。ＣＤ８Ａ＋Ｔ細胞数に関する定量的ＩＨＣデータは、２０倍明視野光学顕微鏡法に基づき、Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ（アペリオテクノロジーズ社（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ビスタ）を用いて得た。画像はｅＳｌｉｄｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ１２．２．１（アペリオテクノロジーズ社）を用いて分析し、そして、各ＴＭＡコアについて１平方ミリメートル（ｓｑｍｍ）あたりの陽性細胞の数を計数した。ＰＤ−Ｌ１の定量的ＩＨＣ発現データは、腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）、Ｈスコア（ＨＳ）、および修正Ｈスコア（ＭＨＳ）を解釈する訓練を受けた病理医によって得られた。最終分析に含めるには、３つのうち２つ以上の評価可能なコア（ｃｏｒｅｓ）が必要であった。１平方ミリメートル当たりのＣＤ８Ａ＋細胞の平均数、ＴＰＳ、ＨＳ、およびＭＨＳは、少なくとも２つのコアの個々の分析時に各試料から導き出された。
【０１１２】
配列決定データは、参照マッピングおよびベースコール（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）のためにＴｏｒｒｅｎｔ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（ｖ５．２．０）を使用して最初に処理され、その間に、マッピングされたリード、オンターゲットリード、平均リード長、平均深度、均一性、および有効パーセントリードに対する検証定義ＱＣ仕様（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ＱＣ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を許容基準として使用した。高品質の結果を保証するために、検証時に生成されたＮＧＳデータに基づいてＱＣシステムが開発された。ＱＣ基準は、配列決定の１つ以上の態様を許容または棄却するために定義された値を用いて、各核酸の種類およびラン対照閾値に対するラン、試料、アンプリコンおよび塩基対レベルでいくつかの測定基準に対して確立された。同様に、特定のＱＣ測定基準を長期間にわたってモニタして、潜在的な長期アッセイドリフトを検出する。品質フィルタは、アンプリコンレベルで検出のための閾値を下回るカウントを削除するために使用され、低品質のバリアントコールのために塩基対レベルで使用される。
【０１１３】
ＲＮＡ配列絶対リードは、Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＳｕｉｔｅのプラグインｉｍｍｕｎＲｅｓｐｏｎｓｅＲＮＡ（ｖ５．２．０．０）を使用して生成した。各転写物について、ＮＴＣからの絶対リード数（ｃｏｕｎｔｓ）をライブラリー調製のバックグラウンドとみなし、そしてそれ故に同じ調製バッチ中の他の全ての試料の同じ転写物の絶対リード数から差し引いた。ラン間のＮＧＳ測定値を評価および解釈に匹敵させることを可能にするために、バックグラウンドを差し引いたリード数を続いて以下のように１００万回あたりの正規化リード（ｎＲＰＭ）値に正規化した。各ＨＫ遺伝子のバックグラウンドを差し引いたリード値を、１００万回あたりの所定のＨＫリード（ＨＰＭ）プロファイルと比較した。ＨＫのＲＰＭプロファイルは、検証の異なる配列決定ランにわたるＧＭ１２８７８試料の複数の複製の平均ＲＰＭに基づいて確立された。これにより、各ＨＫ遺伝子について倍率変化比（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ  ｒａｔｉｏ）が得られた。
【０１１４】
【数１】
2020500294.tif 000011
【０１１５】
この後、すべてのＨＫ比の中央値を特定の試料の正規化比として使用した。
正規化比＝中央値（すべてのＨＫ比）
特定の試料（Ｓ）の全遺伝子（Ｇ）のｎＲＰＭを次のように計算した。
【０１１６】
【数２】
2020500294.tif 000012
【０１１７】
ＤＮＡ配列バリアントコール（ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｉｎｇ）は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（バージョン５．２．０）のｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌｅｒ（バージョン５．２．０．３４）プラグインを使用して実施され、これは０．１の最小マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）および２０倍の最小範囲を必要とする。以下の基準を満たすＭｕＢ修飾（ＭｕＢ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）バリアントサブセットを生成したバリアントに一連のフィルタを適用した：少なくとも１つのマイナー対立遺伝子が両方の鎖を読み、１，０００ゲノム、Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）およびＥｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＥＳＰ）データベースでＭＡＦが＜０．２％；ミスセンスまたはナンセンス；は、Ｅｎｓｅｍｂｌチームの精選データベースにおけるように共存した体細胞バリアントを有している。ＭｕＢ修飾バリアントの数は、入力ＢＡＭファイルに反映されているように、２０倍以上の範囲で、エクソン塩基の数に対してさらに正規化され、１００万エクソン塩基当たりの突然変異の数として解釈される、正規化されたＭｕＢスコアを生成する。高ＭｕＢは、変化する組織型の腫瘍参照母集団におけるメガベースＤＮＡあたりの平均変異数の２倍を超える標準偏差として定義された。
【０１１８】
ＲＮＡ配列については、ＦＦＰＥ標本から得られたＲＮＡ配列の結果を対応するＦＦ試料と比較することによって、ＦＦＰＥ標本の適合性が確立された。主成分分析（ＰＣＡ）を用いて、所与のＦＦＰＥ試料から得られた異なる切片は異なるＲＮＡ配列の結果をもたらさないこと、間質の量または質などの潜在的な交絡因子がアッセイによって十分に許容されること、および試験する転移性腫瘍の多発性病巣または原発性病変のいずれも、結果に対する影響は最小限である（データは示さず）、ことを示した。ＭｕＢについては、バリアント検出の感度を使用して、腫瘍性核の割合の最低閾値を評価した。
【０１１９】
ＲＮＡ配列をゴールドスタンダードのＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲと比較するために、標的遺伝子のｎＲＰＭ値をｌｏｇ２変換し、これによりｑＲＴ−ＰＣＲ測定からのΔＣｔ値との適切な比較が可能になった。対数変換されたＧＥＸ測定値およびΔＣｔ値に基づいて、各遺伝子についてピアソン積率相関係数（Ｒ）を計算した。低い相関値（＜０．７）を有する遺伝子はいずれも最終報告から除外した。分析前、分析および再現性試験のためのＧＥＸ相関を評価するために、５４個の標的遺伝子のｎＲＰＭについてのＲ値を変数の一部として使用した。Ｒは、ＦＦＰＥ対未染色切片、ＦＦ対ＦＦＰＥ切片、様々な割合の非腫瘍性組織含有量、壊死性組織含有量、投入（ｉｎｐｕｔ）ＲＮＡ量（ｎｇ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）混入、バッチサイズ、発現の直線性、ラン間での（ｉｎｔｅｒ−ｒｕｎ）再現性、ラン内での（ｉｎｔｒａ−ｒｕｎ）再現性、作業者間での（ｉｎｔｅｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）再現性および日にち間での（ｉｎｔｅｒ−ｄａｙ）再現性について計算した。さらに、異なるライブラリー希釈に対する絶対リードにおける直線性を実証するために、決定係数（Ｒ２）を使用した。また、５４個の標的遺伝子のｎＲＰＭについての平均変動係数（ＣＶ）を、様々なバッチサイズについてのＧＥＸ測定値の分散の尺度として計算した。
【０１２０】
ＭｕＢ数とゴールドスタンダードのＴＣＧＡ全エクソームデータとの相関を評価するために、ＴＣＧＡ全エクソーム数をフィルタリングしてＭｕＢパネルからゲノム領域を選択した。パネルのブラウザ拡張データ（ＢＥＤ）ファイルにマップされたＴＣＧＡバリアント数は、ピアソンの積率相関を使用してＭｕＢ数と相関していた。未染色切片に対するＦＦＰＥの平均ＭｕＢ値の間の両側スチューデントｔ検定を用いてＤＮＡ安定性を試験した。平均ＣＶは、未染色切片に対するＦＦＰＥについてのＭｕＢ測定における変動性の尺度として計算した。ＣＶはまた、ＭｕＢ測定に対するＤＮＡ入力量（ｎｇ）の効果を実証するためにも使用された。
【０１２１】
本明細書では様々な実施形態について説明および図示してきたが、当業者は、機能を実行するための、および／または本明細書に記載されている結果および／または利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想起するだろう。そして、そのような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は特定の用途あるいはその教示が使用される用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または単なる日常的な実験を使用して確かめることができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内であり、実施形態は具体的に説明および特許請求されている以外の方法で実施できることを理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載されている個々の各特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象としている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が互いに矛盾しない場合、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の範囲内に含まれる。
【０１２２】
特許請求の範囲は、その旨が記載されていない限り、記載された順序または要素に限定されると解釈されるべきではない。添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更が当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲およびその均等物の精神および範囲内にあるすべての実施形態が特許請求されている。
【図１】
2020500294.tif 000013
2020500294.tif 000014
【図２】
2020500294.tif 000015
2020500294.tif 000016
【図３】
2020500294.tif 000017
【図４】
2020500294.tif 000018
【図５】
2020500294.tif 000019
【図６】
2020500294.tif 000020
【図７】
2020500294.tif 000021
【図８】
2020500294.tif 000022
【図９】
2020500294.tif 000023
【図１０】
2020500294.tif 000024
【国際調査報告】
2020500294.tif 000025
2020500294.tif 000026
2020500294.tif 000027
2020500294.tif 000028
2020500294.tif 000029
2020500294.tif 000030
2020500294.tif 000031