(57)【要約】本開示は、概して、Fc受容体結合が低減している変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体、およびこれらの抗原結合受容体を発現するT細胞に関する。より具体的には、本願は、CD28の内部ドメインと膜貫通ドメインとに結合したCD3の細胞内ドメインからなる、工学的に操作されたFc受容体を扱う。細胞外部分は、好ましくは抗Pro329Gly抗体可変ドメインからなる。がんの治療および診断において使用される。2020515256.tif 000104
2020515256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンカリング膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合受容体であって、該抗原結合部分が、変異型結晶性フラグメント（fragment crystallizable）（Fc）ドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該変異型Fcドメインが、非変異型親Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、抗原結合受容体。
【請求項２】
変異型FcドメインのFc受容体結合が、非変異型親FcドメインのFc受容体結合と比較して低減しており、特にFc受容体がFcγ受容体または新生児型Fc受容体（FcRn）である、請求項1記載の抗原結合受容体。
【請求項３】
抗原結合部分がscFv、Fab、crossFab、またはscFabである、請求項1または請求項2のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項４】
アンカリング膜貫通ドメインが、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインであり、特にアンカリング膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項５】
少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項６】
少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメイン、FCGR3Aの細胞内ドメイン、およびNKG2Dの細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択され、特に少なくとも1つの刺激シグナリングドメインがCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項７】
少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD27の細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、CD137の細胞内ドメイン、OX40の細胞内ドメイン、ICOSの細胞内ドメイン、DAP10の細胞内ドメイン、およびDAP12の細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択され、特に少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインがCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項８】
CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの刺激シグナリングドメインを含み、かつCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの共刺激シグナリングドメインを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項９】
抗原結合部分がscFvフラグメントであり、該scFvフラグメントが、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１０】
抗原結合部分がFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントであり、該FabフラグメントまたはcrossFabフラグメントが、重鎖のC末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１１】
変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うL234、L235、I253、H310、P331、P329、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異を含み、特に該アミノ酸変異がL234A、L235A、I253A、N297A、H310A、P329G、および/またはH435Aである、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１２】
変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うP329Gのアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインのFcγ受容体結合が、非変異型親FcドメインのFcγ受容体結合と比較して低減している、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１３】
変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うI253、H310、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインのFcRn結合が、非変異型親FcドメインのFcRn結合と比較して低減している、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１４】
少なくとも1つの抗原結合部分が、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列RYWMN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020515256.tif 000097
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000098
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000099
（e）CDR L2アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000100
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１５】
少なくとも1つの抗原結合部分が、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列SYGMS（SEQ ID NO:53）、
（b）CDR H2アミノ酸配列SSGGSY（SEQ ID NO:54）、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000101
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000102
（e）CDR L2アミノ酸配列KVSNRFS（SEQ ID NO:57）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000103
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、請求項1〜11または請求項13のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入T細胞。
【請求項１７】
請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項17記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
【請求項１９】
請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入T細胞。
【請求項２０】
（A）請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キット。
【請求項２１】
（A）請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キット。
【請求項２２】
変異型Fcドメインを含む抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、がん胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合することができる、請求項20または請求項21のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３】
医薬としての使用のための、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４】
疾患の処置における使用のための、特に悪性疾患の処置における使用のための、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５】
変異型Fcドメインを含む抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に、
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合受容体
を発現する形質導入T細胞が、投与される、
医薬としての使用のための、請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体または請求項19記載の形質導入T細胞。
【請求項２６】
変異型Fcドメインを含む抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後での、
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合受容体
を発現する形質導入T細胞の投与を含む、悪性疾患の処置
における使用のための、請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体または請求項19記載の形質導入T細胞。
【請求項２７】
請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞を対象に投与する工程と、
該形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に、変異型Fcドメインを含む抗体の治療有効量を投与する工程と
を含む、対象における疾患を処置する方法であって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
方法。
【請求項２８】
標的細胞を、請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、変異型Fcドメインを含む抗体の存在下で接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法であって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
方法。
【請求項２９】
悪性疾患の処置のための医薬の製造のための、
請求項1〜15のいずれか一項記載の抗原結合受容体、請求項17記載のポリヌクレオチド、または請求項19記載の形質導入T細胞
の使用。
【請求項３０】
実質的に実施例のいずれか一つまたは添付の図面のいずれか一つを参照して上述した抗原結合受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、Fc受容体結合が低減している変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体、およびこれらの抗原結合受容体を発現するT細胞に関する。より具体的には、本発明は、治療用抗体の変異型Fcドメインと特異的に結合/相互作用することによって動員される、抗原結合受容体をトランスフェクト/形質導入したT細胞に関する。さらにまた、本発明は、本発明のT細胞および/または本発明の抗原結合受容体を発現する核酸分子、ベクター、ならびに変異型Fcドメインを含む1種または複数種の腫瘍ターゲティング抗体を含む、キットに関する。本発明は、腫瘍特異的抗体と併用される、特定の疾患の処置方法におけるT細胞の生産および使用、ならびにT細胞および/または治療用抗体を含む薬学的組成物/医薬を提供し、ここで、T細胞は、Fc受容体結合が低減している変異型Fcドメインを含む1種または複数種の治療用腫瘍ターゲティング抗体と組み合わせて投与される。
【背景技術】
【０００２】
背景
養子T細胞治療（ACT）は、がん特異的T細胞を用いる強力な処置アプローチである（Rosenberg and Restifo,Science 348（6230）（2015）,62-68（非特許文献1））。ACTでは、天然の腫瘍特異的細胞を使用するか、またはT細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体を使って遺伝子工学で特異的にしたT細胞を使用することができる（Rosenberg and Restifo,Science 348（6230）（2015）,62-68（非特許文献1））。ACTは、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫または黒色腫などといった他の方法では処置不応性の進行疾患を患っている患者でさえ、うまく処置し、寛解させることができる（Dudley et al.,J Clin Oncol 26（32）（2008）,5233-5239（非特許文献2）、Grupp et al.,N Engl J Med 368（16）（2013）,1509-1518（非特許文献3）、Kochenderfer et al.,J Clin Oncol.（2015）33（6）:540-549,doi:10.1200/JCO.2014.56.2025.Epub 2014 Aug 25（非特許文献4））。
【０００３】
しかしACTは、その際立った臨床有効性にも関わらず、処置関連毒性による制約を受ける。ACTにおいて使用される工学的に操作されたT細胞の特異性、そしてその結果生じるオンターゲット効果およびオフターゲット効果は、主に、キメラ抗原受容体（CAR）に実装された腫瘍ターゲティング抗原結合部分によって駆動される。腫瘍抗原の非排他的発現または発現レベルの時間的相違は、重篤な副作用をもたらすことがあり、処置の認容できない毒性によってACTが中止されることさえある。
【０００４】
加えて、効率のよい腫瘍細胞溶解のために腫瘍特異的T細胞を利用できるかどうかは、工学的に操作されたT細胞のインビボでの長期生存能および長期増殖能に依存する。その一方で、インビボでのT細胞の生存および増殖は、無制御なCAR-T応答の持続による不要な長期効果をもたらしうる（Grupp et al.2013 N Engl J Med 368（16）:1509-18（非特許文献3）、Maude et al.2014 2014 N Engl J Med 371（16）:1507-17（非特許文献5））。
【０００５】
重篤な処置関連毒性を制限し、ACTの安全性を改良するためのアプローチの1つは、免疫シナプスにアダプター分子を導入することによってCAR-T細胞の活性化および増殖に制約を課すことである。そのようなアダプター分子は、例えば最近記載された葉酸-FITCスイッチのような小分子二モジュール型スイッチを含む（Kim et al.J Am Chem Soc 2015;137:2832-2835（非特許文献6））。別のアプローチには、CAR-T細胞の特異性を標的腫瘍細胞に導き、向かわせるタグを含む、人工的に修飾された抗体が含まれた（Ma et al.PNAS 2016;113（4）:E450-458（非特許文献7）、Cao et al.Angew Chem 2016;128:1-6（非特許文献8）、Rogers et al.PNAS 2016;113（4）:E459-468（非特許文献9）、Tamada et al.Clin Cancer Res 2012;18（23）:6436-6445（非特許文献10））。
【０００６】
しかし既存のアプローチにはいくつかの制約がある。分子スイッチに依存する免疫シナプスには追加要素の導入が必要であるが、この追加要素は、免疫応答を誘発したり非特異的なオフターゲット効果をもたらしたりする可能性がある。さらにまた、そのような多成分系の複雑さが処置の有効性および忍容性を制限することもある。一方、既存の治療用モノクローナル抗体へのタグ構造の導入は、これらの構築物の有効性および安全性プロファイルに影響を及ぼしうる。
【０００７】
したがって標的腫瘍治療、特に養子T細胞治療は、がん患者のニーズを満たすために、改良される必要がある。したがって、ACTの安全性および有効性を改良して上述の欠点を克服する潜在的能力を有する改良された手段を提供することが、今なお必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rosenberg and Restifo,Science 348（6230）（2015）,62-68
【非特許文献２】Dudley et al.,J Clin Oncol 26（32）（2008）,5233-5239
【非特許文献３】Grupp et al.,N Engl J Med 368（16）（2013）,1509-1518
【非特許文献４】Kochenderfer et al.,J Clin Oncol.（2015）33（6）:540-549,doi:10.1200/JCO.2014.56.2025.Epub 2014 Aug 25
【非特許文献５】Maude et al.2014 2014 N Engl J Med 371（16）:1507-17
【非特許文献６】Kim et al.J Am Chem Soc 2015;137:2832-2835
【非特許文献７】Ma et al.PNAS 2016;113（4）:E450-458
【非特許文献８】Cao et al.Angew Chem 2016;128:1-6
【非特許文献９】Rogers et al.PNAS 2016;113（4）:E459-468
【非特許文献１０】Tamada et al.Clin Cancer Res 2012;18（23）:6436-6445
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、概して、Fc受容体結合が低減している変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体、およびこれらの抗原結合受容体を発現するT細胞に関する。
【００１０】
一局面において、本発明は、アンカリング膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む抗原結合受容体であって、抗原結合部分は、変異型結晶性フラグメント（fragment crystallizable）（Fc）ドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、変異型Fcドメインは非変異型親Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、抗原結合受容体に関する。
【００１１】
一態様において、変異型FcドメインのFc受容体結合は、非変異型親FcドメインのFc受容体結合と比較して低減しており、特にFc受容体はFcγ受容体または新生児型Fc受容体（FcRn）である。一態様において、Fc受容体結合は25℃における表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される。
【００１２】
一態様において、抗原結合部分は、scFv、Fab、crossFab、またはscFabである。好ましい態様において、抗原結合部分はscFvである。別の好ましい態様において、抗原結合部分はFabまたはcrossFabである。
【００１３】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。
【００１４】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインであり、特に、アンカリング膜貫通ドメインはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
一態様において、抗原結合受容体は、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3zの細胞内ドメイン、FCGR3Aの細胞内ドメイン、およびNKG2Dの細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3zの細胞内ドメインのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む。一態様において、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインは、CD27の細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、CD137の細胞内ドメイン、OX40の細胞内ドメイン、ICOSの細胞内ドメイン、DAP10の細胞内ドメイン、およびDAP12の細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。一態様において、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインのフラグメントである。一態様において、抗原結合受容体は、CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの刺激シグナリングドメインを含み、そして抗原結合受容体は、CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの共刺激シグナリングドメインを含む。一態様において、刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含み、共刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一態様において、細胞外ドメインは、アンカリング膜貫通ドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:17）を含む。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、共シグナリングドメインまたはシグナリングドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。一態様において、シグナリングドメインおよび/または共シグナリングドメインは、任意で少なくとも1つのペプチドリンカーを介して連結されている。
【００１７】
一態様において、抗原結合部分はscFvフラグメントであり、scFvフラグメントは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。
【００１８】
一態様において、抗原結合部分はFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントであり、FabフラグメントまたはcrossFabフラグメントは、重鎖のC末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。
【００１９】
一態様において、抗原結合受容体は1つの共シグナリングドメインを含み、共シグナリングドメインは、N末端において、アンカリング膜貫通ドメインのC末端へと連結されている。一態様において、抗原結合受容体は1つの刺激シグナリングドメインを含み、刺激シグナリングドメインは、N末端において、共刺激シグナリングドメインのC末端へと連結されている。
【００２０】
一態様において、非変異型親FcドメインはIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うL234、L235、I253、H310、P331、P329、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異を含み、特にアミノ酸変異はL234A、L235A、I253A、N297A、H310A、P329G、および/またはH435Aである。
【００２１】
一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うL234、L235、およびP329からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にL234A、L235A、およびP329G（「PGLALA」）のアミノ酸変異を含む。
【００２２】
一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うP329Gのアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインのFcγ受容体結合は非変異型親FcドメインのFcγ受容体結合と比較して低減しており、特にFcγ受容体はヒトFcγRIIIaおよび/またはFcγRIIaである。
【００２３】
一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うI253、H310、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインのFcRn結合は非変異型親FcドメインのFcRn結合と比較して低減している。
【００２４】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列RYWMN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020515256.tif 000003
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000004
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000005
（e）CDR L2アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000006
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００２５】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、抗原結合部分は、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:32からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:33からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００２６】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分はSEQ ID NO:8の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:9の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００２７】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvであり、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、抗原結合受容体はSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:48からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:50からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖ポリペプチドと
を含む。
【００２９】
一態様において、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:39の重鎖融合ポリペプチドと
b）SEQ ID NO:41の軽鎖ポリペプチドと
を含む。
【００３０】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列SYGMS（SEQ ID NO:53）、
（b）CDR H2アミノ酸配列SSGGSY（SEQ ID NO:54）、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000007
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000008
（e）CDR L2アミノ酸配列KVSNRFS（SEQ ID NO:57）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000009
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００３１】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、抗原結合部分は、SEQ ID NO:61のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:62のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００３２】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は
a）SEQ ID NO:61の重鎖可変領域（VH）と
b）SEQ ID NO:62の軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００３３】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvであり、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:59のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、抗原結合受容体はSEQ ID NO:59のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないFabフラグメントであり、抗原結合受容体は
a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖ポリペプチドと
を含む。
【００３５】
一態様において、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:39の重鎖融合ポリペプチドと
b）SEQ ID NO:41の軽鎖ポリペプチドと
を含む。
【００３６】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体の重鎖融合ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一態様では、重鎖融合ポリペプチドをコードする第1の単離されたポリヌクレオチドと軽鎖ポリペプチドをコードする第2の単離されたポリヌクレオチドとを含む、本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする組成物が提供される。
【００３７】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたは本明細書に記載の組成物によってコードされるポリペプチドが提供される。
【００３８】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターが提供される。
【００３９】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを含む形質導入T細胞が提供される。一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞が提供される。一態様では、標的抗原について特異的に結合することができるT細胞受容体（TCR）が共形質導入されている、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００４０】
一態様では、
（A）本明細書に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キットが提供される。
【００４１】
一態様では、
（A）本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キットが提供される。
【００４２】
一態様では、
（A）本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする本明細書に記載の組成物またはベクターと、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キットが提供される。
【００４３】
一態様において、非変異型親FcドメインはIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。一態様では、EUナンバリングに従うL234、L235、I253、H310、P331、P329、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異を含む変異型Fcドメインが提供され、特にアミノ酸変異はL234A、L235A、I253A、N297A、H310A、P329G、および/またはH435Aである。一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うL234、L235、およびP329からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にL234A、L235A、およびP329G（「PGLALA」）のアミノ酸変異を含む。一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うP329Gのアミノ酸変異を含む。一態様において、変異型Fcドメインは、EUナンバリングに従うI253、H310、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含む。
【００４４】
一態様において、変異型Fcドメインを含む抗体は腫瘍細胞の表面にある抗原に対して、特にFAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、およびCA-IXからなる群より選択される抗原に対して、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して、特異的に結合することができる。一態様において、変異型Fcドメインを含む抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、がん胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合することができる。
【００４５】
一態様では、医薬としての使用のための本明細書に記載のキットが提供される。
【００４６】
一態様では、医薬としての使用のための本明細書に記載の抗原結合受容体または形質導入T細胞が提供され、ここで、抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞は、変異型Fcドメインを含む抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与され、抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない。
【００４７】
一態様では、悪性疾患の処置における使用のための本明細書に記載のキットが提供される。一態様では、悪性疾患の処置における使用のための本明細書に記載の抗原結合受容体または形質導入T細胞が提供され、ここで、処置は、変異型Fcドメインを含む抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後での、抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の投与を含み、抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない。
【００４８】
一態様において、悪性疾患は、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される。
【００４９】
一態様において、形質導入T細胞は、処置されるべき対象から単離された細胞に由来する。一態様において、形質導入T細胞は、処置されるべき対象から単離された細胞に由来しない。
【００５０】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞を対象に投与する工程と、形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に、変異型Fcドメインを含む抗体の治療有効量を投与する工程とを含む、対象における疾患を処置する方法であって、抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、方法が提供される。一態様では、さらに、T細胞が対象から単離され、形質導入T細胞は、単離されたT細胞に、本明細書に記載のポリヌクレオチド、組成物またはベクターを形質導入することによって作製される。一態様において、T細胞は、レトロウイルスベクター構築物もしくはレンチウイルスベクター構築物で、または非ウイルスベクター構築物で、形質導入される。一態様において、非ウイルスベクター構築物はスリーピング・ビューティー（sleeping beauty）ミニサークルベクターである。
【００５１】
一態様において、形質導入T細胞は静脈内注入によって対象に投与される。一態様では、対象への投与に先だって、形質導入T細胞を抗CD3抗体および/または抗CD28抗体と接触させる。一態様では、対象への投与に先だって、形質導入T細胞を、少なくとも1つのサイトカインと、好ましくはインターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、および/もしくはインターロイキン-21、またはそれらの変異体と、接触させる。
【００５２】
一態様において、疾患は悪性疾患である。一態様において、悪性疾患は、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される。
【００５３】
一態様では、標的細胞を、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、変異型Fcドメインを含む抗体の存在下で接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法であって、抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、方法が提供される。
【００５４】
一態様において、標的細胞はがん細胞である。一態様において、標的細胞は、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、およびCA-IXからなる群より選択される抗原を発現する。一態様において、標的細胞は、がん胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原を発現する。
【００５５】
一態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは形質導入T細胞は医薬の製造のために使用される。一態様において、医薬は悪性疾患の処置のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図1は、例示的な本発明の抗原結合受容体のアーキテクチャを示している。図1Aは、抗P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDフォーマットおよび抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDフォーマットのアーキテクチャを表す。P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。抗原結合部分は可変重鎖および可変軽鎖からなる。両者は（Gly4Ser）4リンカーによって連結されている。可変軽鎖に取り付けられたGly4Serリンカーが、抗原認識ドメインを、CD28の細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたCD28膜貫通ドメイン（TM）に連結し、そしてそのCD28の細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は、CD3zの刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。図1Bは、抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDフォーマットおよび抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDフォーマットのアーキテクチャを表す。P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。抗原結合部分はIg重鎖およびIg軽鎖からなる。重鎖に取り付けられたGly4Serリンカーが、抗原認識ドメインを、CD28の細胞内共刺激シグナリングドメインに融合されたCD28膜貫通ドメインに連結し、そしてそのCD28の細胞内共刺激シグナリングドメインは、CD3zの刺激シグナリングドメインに融合されている。
【図２】図2は、本発明の抗原結合受容体をコードする例示的発現構築物のモジュール組成を説明する概略図である。図2AはP392G標的scFvフォーマットを示す。図2BはP392G標的Fabフォーマットを示す。
【図３】図3は、本発明の抗P329G抗原結合受容体によって認識される、Fcドメイン中にP329G変異を有する例示的IgG1分子を示している。
【図４】図4は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合した、P329G変異を有するIgGの概略図である。そしてこの抗体は、抗P329G抗原結合受容体発現T細胞によって認識されることができ、それによってT細胞が活性化される。
【図５】図5はJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイの概略図である。TAAに結合した、P329G変異を有するIgGは、抗P329G抗原結合受容体発現Jurkat NFAT T細胞によって認識されうる。この認識は、発光（cps）を測定することによって検出することができる細胞の活性化につながる。
【図６】図6は、標的細胞としてCD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗CD20 IgG抗体（GA101）を使用した。この抗体は、一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方では本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。図6Aでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。図6Bでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図７】図7は、標的細胞としてCD20腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗CD20 IgG抗体（GA101）を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。図7Aでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の単一クローン5をエフェクター細胞として使用し、WSUDLCL2細胞を腫瘍細胞として使用した。図7Bでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の単一クローン2をエフェクター細胞として使用し、WSUDLCL2細胞を腫瘍細胞として使用した。図7Cでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の単一クローン5をエフェクター細胞として使用し、SUDHL4細胞を腫瘍細胞として使用した。図7Dでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の単一クローン2をエフェクター細胞として使用し、SUDHL4を腫瘍細胞として使用した。
【図８Ａ】図8は、標的細胞として付着性FAP発現NIH/3T3-huFAP cl 19腫瘍細胞を使用して行われたJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗FAP IgG抗体クローン4B9を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図8Aでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図８Ｂ】図8は、標的細胞として付着性FAP発現NIH/3T3-huFAP cl 19腫瘍細胞を使用して行われたJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗FAP IgG抗体クローン4B9を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図8Bでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図８Ｃ】図8は、標的細胞として付着性FAP発現NIH/3T3-huFAP cl 19腫瘍細胞を使用して行われたJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗FAP IgG抗体クローン4B9を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図8Cでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図８Ｄ】図8は、標的細胞として付着性FAP発現NIH/3T3-huFAP cl 19腫瘍細胞を使用して行われたJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗FAP IgG抗体クローン4B9を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図8Dでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図９Ａ】図9は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEA IgGクローンA5B7または抗CEA IgGクローンT84 LCHAのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図9Aおよび図9Bでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図９Ｂ】図9は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEA IgGクローンA5B7または抗CEA IgGクローンT84 LCHAのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図9Aおよび図9Bでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図９Ｃ】図9は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEA IgGクローンA5B7または抗CEA IgGクローンT84 LCHAのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図9Cおよび図9Dでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図９Ｄ】図9は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEA IgGクローンA5B7または抗CEA IgGクローンT84 LCHAのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図9Cおよび図9Dでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１０Ａ】図10は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEAクローンCH1A1A 98 99または抗CEA IgGクローンhMN14 IgGのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図10Aおよび図10Bでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１０Ｂ】図10は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEAクローンCH1A1A 98 99または抗CEA IgGクローンhMN14 IgGのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図10Aおよび図10Bでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１０Ｃ】図10は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEAクローンCH1A1A 98 99または抗CEA IgGクローンhMN14 IgGのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図10Cおよび図10Dでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１０Ｄ】図10は、標的細胞として付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。どちらもP329G変異を有する抗CEAクローンCH1A1A 98 99または抗CEA IgGクローンhMN14 IgGのどちらか一方を使用した。これらの抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図10Cおよび図10Dでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１１Ａ】図11は、標的細胞として付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗TNC IgGクローンA2B10をIgG抗体として使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図11Aおよび図11Bでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１１Ｂ】図11は、標的細胞として付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗TNC IgGクローンA2B10をIgG抗体として使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図11Aおよび図11Bでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１１Ｃ】図11は、標的細胞として付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗TNC IgGクローンA2B10をIgG抗体として使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図11Cおよび図11Dでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１１Ｄ】図11は、標的細胞として付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗TNC IgGクローンA2B10をIgG抗体として使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。図11Cおよび図11Dでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１２Ａ】図12Aおよび図12Bは、標的細胞として付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗TNC IgGクローンA2B10を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１２Ｂ】図12Aおよび図12Bは、標的細胞として付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異を有する抗TNC IgGクローンA2B10を使用した。この抗体は、腫瘍関連抗原を認識すると共に、本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞によって認識される。さらに、P329G変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールをエフェクター細胞として使用した。
【図１３Ａ】図13は、標的細胞としてCD20腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異およびLALA変異を有する、P329G変異およびD265A変異を有する、もしくはLALA変異のみを有する、または変異を全く含まない、抗CD20 IgG抗体（GA101）のいずれか1つを、腫瘍関連抗原を検出するために使用し、それを本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞で認識した。図13Aでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の細胞プールをエフェクター細胞として使用し、SUDHL4細胞を腫瘍細胞として使用した。
【図１３Ｂ】図13は、標的細胞としてCD20腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異およびLALA変異を有する、P329G変異およびD265A変異を有する、もしくはLALA変異のみを有する、または変異を全く含まない、抗CD20 IgG抗体（GA101）のいずれか1つを、腫瘍関連抗原を検出するために使用し、それを本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞で認識した。図13Bでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の細胞プールをエフェクター細胞として使用し、SUDHL4細胞を腫瘍細胞として使用した。
【図１４Ａ】図14は、標的細胞としてCD20腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異およびLALA変異を有する、P329G変異のみを有する、もしくはLALA変異のみを有する、または変異を全く含まない、抗CD20 IgG抗体（GA101）を、腫瘍関連抗原を検出するために使用し、それを本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞で認識した。図14Aでは、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の細胞プールをエフェクター細胞として使用し、SUDHL4細胞を腫瘍細胞として使用した。
【図１４Ｂ】図14は、標的細胞としてCD20腫瘍細胞を使用したJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。P329G変異およびLALA変異を有する、P329G変異のみを有する、もしくはLALA変異のみを有する、または変異を全く含まない、抗CD20 IgG抗体（GA101）を、腫瘍関連抗原を検出するために使用し、それを本発明の抗原結合受容体を発現するJurkat NFAT T細胞で認識した。図14Bでは、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の細胞プールをエフェクター細胞として使用し、SUDHL4細胞を腫瘍細胞として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
定義
本明細書において、用語は、以下に別段の定義がある場合を除き、当技術分野において一般に使用されているように使用される。
【００５８】
「活性化Fc受容体」は、抗体のFcドメインによる結合に続いて、エフェクター機能を遂行するように受容体保持細胞を刺激するシグナリング事象を誘発するFc受容体である。ヒト活性化Fc受容体には、FcγRIIIa（CD16a）、FcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）およびFcαRI（CD89）が含まれる。
【００５９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（「ADCC」）は、抗体で被覆された標的細胞の、免疫エフェクター細胞による溶解につながる、免疫機序である。標的細胞は、Fc領域を含む抗体またはその誘導体が、一般的にはFc領域のN末端側にあるタンパク質部分を介して結合する細胞である。本明細書において使用する用語「低減したADCC」は、標的細胞を取り巻く培地中の所与の抗体濃度において、所与の時間内に、上に定義したADCCの機序によって溶解される標的細胞の数の低減、および/または所与の時間内に、所与の数の標的の、ADCCの機序による溶解を達成するのに必要な、標的細胞を取り巻く培地中の抗体濃度の増加と定義される。ADCCの低減は、同じ標準的生産方法、精製方法、製剤方法および貯蔵方法（当業者に公知のもの）を使って、同じタイプの宿主細胞によって生産される同じ抗体であるが、変異が導入されていないものによって媒介されるADCCとの比較である。例えば、ADCCを低減させるアミノ酸変異をそのFcドメインに含む抗体によって媒介されるADCCの低減は、Fcドメインにこのアミノ酸変異を持たない同じ抗体によって媒介されるADCCとの比較である。ADCCを測定するための適切なアッセイは当技術分野において周知である（例えばPCT公開番号WO 2006/082515またはPCT公開番号WO 2012/130831参照）。
【００６０】
作用物質（例えば、抗体）の「有効量」とは、それが投与される細胞または組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【００６１】
「アフィニティー」とは、ある分子（例えば受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の表示がある場合を除き、本明細書において使用する「結合アフィニティー」は、結合ペアのメンバー（例:抗原結合部分と抗原および/または受容体とそのリガンド）間の1:1相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。分子Xの、そのパートナーYに対するアフィニティーは、一般に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれkoffおよびkon）の比である解離定数（KD）によって表すことができる。したがって等価なアフィニティーは、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。アフィニティーは、本明細書に記載する方法を含む、当技術分野において公知の確立された方法によって測定することができる。アフィニティーを測定するための好ましい方法は表面プラズモン共鳴（SPR）であり、好ましい測定温度は25℃である。
【００６２】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているもの、および後から修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾されたR基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造は保っている。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。本明細書では、一般に公知であるそれぞれの三文字記号によって、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会の勧告による一文字記号によって、アミノ酸に言及する場合がある。
【００６３】
本明細書において使用する用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入および修飾を包含するものとする。最終構築物が所望の特徴、例えばFc受容体への低減した結合、を持つ限り、置換、欠失、挿入および修飾を任意に組み合わせて、最終構築物に到達することができる。アミノ酸配列の欠失および挿入には、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失ならびにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばFc領域の結合特徴などを改変するという目的には、非保存的アミノ酸置換、すなわちあるアミノ酸を構造的および/または化学的特性が異なる別のアミノ酸で置き換えることが、特に好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸による置き換え、または20種の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例:4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野において周知の遺伝学的方法または化学的方法を使って生成させることができる。遺伝学的方法としては、部位特異的変異導入法、PCR、遺伝子合成などを挙げることができる。化学修飾など、遺伝子工学以外の方法で、アミノ酸の側鎖基を改変する方法も役立ちうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、さまざまな名称を使用しうる。例えばFcドメインの329番目におけるプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329GまたはPro329Glyと示すことができる。
【００６４】
本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、さまざまな抗体構造、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントを、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、包含する。したがって、本発明との関連において抗体という用語は、完全な免疫グロブリン分子にも、そのような免疫グロブリン分子のパーツにも関係する。さらにまた、この用語は、本明細書において論じるとおり、修飾および/または改変された抗体分子、特に変異型抗体分子にも関係する。この用語は、組換え的にまたは合成的に作製/合成された抗体にも関係する。本発明との関連において、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と相互可換的に使用される。
【００６５】
「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えばscFv）、および単一ドメイン抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントに関する総説としてHudson et al.,Nat Med 9,129-134（2003）を参照されたい。scFvフラグメントの総説として、例えばPlueckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315（1994）を参照されたい。また、WO 93/16185ならびに米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。ダイアボディは、二価であっても二重特異性であってもよい2つの抗原結合部位を持つ抗体フラグメントである。例えばEP 404,097、WO 1993/01161、Hudson et al.,Nat Med 9,129-134（2003）およびHollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448（1993）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson et al.,Nat Med 9,129-134（2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである（Domantis,Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム、例えば米国特許第6,248,516号（B1）を参照されたい）。抗体フラグメントは、本明細書に記載するように、さまざまな技法によって、例えば限定するわけではないがインタクト抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E.coli）またはファージ）による生産などによって作ることができる。
【００６６】
本明細書において使用する用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよびその誘導体、例えばそのフラグメント、ならびに抗原結合受容体およびその誘導体である。
【００６７】
本明細書において使用する用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様において、抗原結合部分は、それが取り付けられている実体（例:免疫グロブリンまたは抗原結合受容体）を、標的部位に、例えば抗原決定基を保持する特定タイプの腫瘍細胞または腫瘍間質に、または腫瘍細胞上の抗原決定基に結合する免疫グロブリンに、向かわせることができる。別の一態様において、抗原結合部分は、その標的抗原によるシグナリングを活性化することができる。例えば、抗原決定基がT細胞上の抗原結合受容体に結合すると、シグナリングが活性化される。本発明との関連において、抗原結合部分は、抗体およびそのフラグメント、ならびに本明細書においてさらに詳しく定義する抗原結合受容体およびそのフラグメントに含まれうる。抗原結合部分は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。一定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに詳しく定義する当技術分野において公知の免疫グロブリン定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域として、5種のアイソタイプ:α、δ、ε、γまたはμのいずれかが挙げられる。有用な軽鎖定常領域として、2種のアイソタイプ:κおよびλのいずれかが挙げられる。
【００６８】
本発明との関連において、用語「抗原結合受容体」は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合分子に関する。抗原結合受容体は、異なる供給源からのポリペプチドパーツで構成されうる。したがって、これを「融合タンパク質」および/または「キメラタンパク質」として理解することもできる。通常、融合タンパク質は、元々は別個のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子（または好ましくはcDNA）を接合することによって作出されるタンパク質である。この融合遺伝子（または融合cDNA）の翻訳は、好ましくは元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を持つ、単一のポリペプチドをもたらす。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療法において使用するための組換えDNA技術によって、人工的に作出される。本発明の抗原結合受容体のさらなる詳細は後述する。本発明との関連において、CAR（キメラ抗原受容体）は、スペーサー配列によってアンカリング膜貫通ドメインに融合された抗原結合部分を含む細胞外部分を含み、アンカリング膜貫通ドメイン自体はCD3zおよびCD28の細胞内シグナリングドメインに融合されている、抗原結合受容体であると理解される。
【００６９】
「抗原結合部位」とは、抗原結合分子のうち、抗原との相互作用を与える部位、すなわち1つまたは複数のアミノ酸残基を指す。例えば抗体または抗原結合受容体の抗原結合部位は、相補性決定領域（CDR）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、2つの抗原結合部位を有し、FabまたはscFv分子は、典型的には、1つの抗原結合部位を有する。
【００７０】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体または抗原結合受容体のうち、抗原の一部または全部に特異的に結合し抗原の一部または全部に相補的である区域を含むパーツを指す。抗原結合ドメインは、例えば1つまたは複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域ともいう）によって与えられうる。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）および免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）を含む。
【００７１】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる。例えばKindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91（2007）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のVHドメインまたはVLドメインで、通常は十分である。
【００７２】
本明細書において使用する用語「ATD」は、細胞の細胞膜と一体化することができるポリペプチドストレッチを規定する「アンカリング膜貫通ドメイン」を指す。ATMは、さらなる細胞外および/または細胞内ポリペプチドドメインに融合することができ、その場合、これらの細胞外および/または細胞内ポリペプチドドメインもまた、細胞膜に拘束されることになる。本発明の抗原結合受容体との関連において、ATMは、本発明の抗原結合受容体の膜付着および膜拘束を与える。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも1つのATMと抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む。加えて、ATMを、さらなる細胞内シグナリングドメインに融合してもよい。
【００７３】
本発明の抗原結合受容体との関連において使用される「に結合する」という用語は、「抗原相互作用部位」と抗原との相互の結合（相互作用）を規定する。「抗原相互作用部位」という用語は、本発明の抗原結合受容体では、特異的抗原または抗原の特異的基（すなわち、変異型Fcドメイン）と特異的に相互作用する能力を示す、ポリペプチドのモチーフを規定する。該結合/相互作用は「特異的認識」を規定するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明では、抗原結合受容体が、本明細書において定義する修飾された分子と特異的に相互作用しかつ/またはそれに結合することができ、一方、修飾されていない分子は認識されないことを意味する。抗原結合受容体の抗原結合部分は、同じ分子上の異なるエピトープを認識し、それらと相互作用しかつ/またはそれらに結合することができる。この用語は、抗原結合受容体の特異性、すなわち、本明細書において定義する、修飾された分子の特異的領域同士、すなわち、変異型Fcドメインを識別するその能力に関係する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原を含むポリペプチドのコンフォメーション変化、抗原を含むポリペプチドのオリゴマー化、抗原結合受容体のオリゴマー化などの誘導により、シグナルの開始をもたらしうる。こうして、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的モチーフと抗原とは、それらの一次、二次または三次構造の結果として、そしてまた該構造の二次修飾の結果として、互いに結合する。したがって、に結合するという用語は、線状エピトープに関係するだけでなく、コンフォメーショナルエピトープ、構造エピトープ、または標的分子もしくはそのパーツのうちの2つの領域からなる不連続エピトープにも関係する。本発明との関連において、コンフォメーショナルエピトープは、一次配列では離れているが、ポリペプチドがネイティブタンパク質に折りたたまれると分子の表面上で集合する、2つ以上の不連続なアミノ酸配列によって規定される（Sela,Science 166（1969）,1365およびLaver,Cell 61（1990）,553-536）。さらにまた、「に結合する」という用語は、本発明との関連においては、「と相互作用する」という用語と相互可換的に使用される。抗原結合受容体または抗体の抗原結合部分（例えばFabまたはscFvドメイン）の、特異的標的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、または当業者によく知られている他の技法、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）技法（BIAcore計器で分析されるもの）（Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329（2000））および従来の結合アッセイ（Heeley,Endocr Res 28,217-229（2002））などのいずれかによって測定することができる。一態様において、無関係なタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、特にSPRで測定した場合に、標的抗原への抗原結合部分の結合の約10％未満である。一定の態様において、標的抗原に結合する抗原結合部分は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例:10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）の解離定数（KD）を有する。本発明において使用する用語「特異的結合」は、本発明の分子が、類似する構造の（ポリ）ペプチドと、すなわち、非変異型親Fcドメイン（本発明の抗原結合受容体は変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる）と、交差反応しないことまたは本質的には交差反応しないことを意味する。したがって、本発明の抗原結合受容体は、変異型Fcドメインと特異的に結合/相互作用する。調査対象である一群の構築物の交差反応性は、例えば、関心対象の変異型Fcドメインおよび非変異型親Fcドメインへの、一群の抗原結合部分の結合を、従来の条件下（例えばHarlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,（1988）およびUsing Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,（1999）参照）で評価することによって、試験しうる。本明細書に提供される方法では、関心対象の変異型Fcドメインには結合するが、非変異型親Fcドメインには結合しないか本質的には結合しない構築物（すなわちFabフラグメント、scFvなど）だけが、関心対象の変異型Fcドメインに特異的であるとみなされ、さらなる研究のために選択される。これらの方法は、なかんずく、構造的および/または機能的に近い関係にあるFcドメインを使った結合研究、遮断および競合研究を含みうる。結合研究は、FACS分析、表面プラズモン共鳴（SPR、例えばBIAcore（登録商標）によるもの）、分析用超遠心法、等温滴定熱量測定、蛍光異方性、蛍光分光法または放射標識リガンド結合アッセイも含む。
【００７４】
本明細書において使用する用語「CDR」は、当技術分野において周知の「相補性決定領域」に関係する。CDRは、免疫グロブリンまたは抗原結合受容体のうち、該分子の特異性を決定し、特異的リガンドと接触するパーツである。CDRは、分子の最も可変的なパーツであり、これらの分子の抗原結合多様性に寄与する。各Vドメインには3つのCDR領域CDR1、CDR2およびCDR3が存在する。CDR-Hは可変重鎖のCDR領域を示し、CDR-Lは可変軽鎖のCDR領域に関係する。VHは可変重鎖を意味し、VLは可変軽鎖を意味する。Ig由来領域のCDR領域は、「Kabat」（Sequences of Proteins of Immunological Interest”,5th edit.NIH Publication no.91-3242 U.S.Department of Health and Human Services（1991）、Chothia J.Mol.Biol.196（1987）,901-917）または「Chothia」（Nature 342（1989）,877-883）に記載されているように決定されうる。
【００７５】
「CD3z」という用語は、「T細胞受容体T3ゼータ鎖」および「CD247」としても知られているT細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖を指す。
【００７６】
「キメラ抗原受容体」または「キメラ受容体」または「CAR」という用語は、スペーサー配列によってCD3zおよびCD28の細胞内シグナリングドメインに融合された抗原結合部分の細胞外部分（例:単鎖抗体ドメイン）で構成された抗原結合受容体を指す。本発明は、抗原結合部分がFabまたはcrossFabフラグメントである、抗原結合受容体も提供する。「CAR」という用語は、その最も広い形態において、CD3zおよびそのフラグメントならびにCD28およびそのフラグメントに、任意で1つまたは数個のペプチドリンカーを介して融合された、抗原結合部分を含む細胞外部分で構成された、抗原結合受容体を含むと理解される。
【００７７】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００７８】
「クロスオーバーFab分子」（「crossFab」または「クロスオーバーFabフラグメント」ともいう）は、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域が交換されているFab分子を意味する。すなわちcrossFabフラグメントは、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されるペプチド鎖とを含む。明確な説明のために、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているcrossFabフラグメントにおいて重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーFab分子の重鎖という。逆に、Fab軽鎖およびFab重鎖の定常領域が交換されているcrossFabフラグメントにおいて重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではcrossFabフラグメントの重鎖という。したがってcrossFabフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成された重鎖または軽鎖（VH-CL）と、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成された重鎖または軽鎖（VL-CH1）とを含む。これとは対照的に、「従来型Fab」分子とは、天然フォーマットのFab分子、すなわち重鎖可変領域および重鎖定常領域で構成される重鎖（VH-CH1）と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成される軽鎖（VL-CL）とを含むFab分子を意味する。
【００７９】
本明細書において使用する用語「CSD」は共刺激シグナリングドメインを指す。
【００８０】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のFc領域に帰することができる生物学的活性を指し、それらは抗体アイソタイプによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）、サイトカイン分泌、免疫複合体が媒介する抗原提示細胞による抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション、およびB細胞活性化が挙げられる。
【００８１】
本明細書において使用する用語「工学的に操作する（engineer）」、「工学的に操作された（engineered）」、「工学的操作（engineering）」は、天然ポリペプチドもしくは組換えポリペプチドまたはそのフラグメントのペプチド主鎖の任意の操作または翻訳後修飾を包含するとみなされる。工学的操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、およびこれらのアプローチの組み合わせが含まれる。
【００８２】
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸要素を持つ、組換え的または合成的に作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、または核酸フラグメントに組み入れることができる。通例、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、転写される核酸配列およびプロモーターその他の配列を含む。一定の態様において、本発明の発現カセットは、本発明の抗原結合分子またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
「Fab分子」とは、抗原結合分子の重鎖のVHドメインおよびCH1ドメイン（「Fab重鎖」）と軽鎖のVLドメインおよびCLドメイン（「Fab軽鎖」）とからなるタンパク質を指す。
【００８４】
「Fcドメイン」または「Fc領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Fc領域および変異体Fc領域を包含する。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに変動する可能性があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端に及ぶと定義される。ただしFc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書に別段の指定がある場合を除き、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載の、EUインデックスとも呼ばれる「EUナンバリング」システムに従う。本明細書において使用するFcドメインのサブユニットとは、二量体型Fcドメインを形成する2つのポリペプチドのうちの一つ、すなわち安定に自己会合することができる免疫グロブリン重鎖のC末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、IgG Fcドメインのサブユニットは、IgG CH2定常ドメインおよびIgG CH3定常ドメインを含む。
【００８５】
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメインFR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがって、HVR配列とFR配列は一般にVH（またはVL）中に、以下の順序で現れる:FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
【００８６】
「完全長抗体」という用語は2つの「完全長抗体重鎖」および2つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を表す。「完全長抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、VH-CH1-HR-CH2-CH3と略記される抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体重鎖定常ドメイン1（CH1）、抗体ヒンジ領域（HR）、抗体重鎖定常ドメイン2（CH2）および抗体重鎖定常ドメイン3（CH3）、ならびに任意で、サブクラスIgEの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン4（CH4）からなるポリペプチドである。好ましくは「完全長抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、VH、CH1、HR、CH2およびCH3からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、N末端からC末端に向かって、VL-CLと略記される抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体軽鎖定常ドメイン（CL）からなるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（CL）はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）であることができる。2本の完全長抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインの間および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間で、ポリペプチド間ジスルフィド結合によって一つに連結されている。典型的な完全長抗体の例は、IgG（例えばIgG1およびIgG2）、IgM、IgA、IgDおよびIgE）のような天然抗体である。本発明に従って使用される完全長抗体は、単一種由来、例えば、ヒト由来であってもよく、またはキメラ化もしくはヒト化抗体であってもよい。いくつかの態様において、本発明に従って使用される完全長抗体、すなわち変異型Fcドメインを含む治療用抗体は、2つとも同じ抗原に特異的に結合する、VHとVLのペアによってそれぞれ形成された2つの抗原結合部位を含む。さらなる態様において、本発明に従って使用される完全長抗体は、VHとVLのペアによってそれぞれ形成された2つの抗原結合部位を含み、ここで、2つの抗原結合部位は異なる抗原に結合し、例えば、抗体は二重特異性である。前記完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端は、前記重鎖または軽鎖のC末端の最後のアミノ酸を指す。
【００８７】
「融合される」とは、構成要素（例:Fabおよび膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合によって、直接的にまたは1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
【００８８】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は、相互可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を包含し、それらは、初代形質転換細胞と、継代数を問わずそこから派生する子孫とを包含する。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、ここに包含される。宿主細胞は、本発明に従って使用される抗体を生成させるために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞としては、ほんの一部を挙げると、培養細胞、例えばCHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞などの哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞などが挙げられ、また、トランスジェニック動物内、トランスジェニック植物内または培養植物組織内もしくは培養動物組織内に含まれている細胞も、宿主細胞に含まれる。
【００８９】
本明細書において使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、配列が超可変でありかつ/または構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、ネイティブ四鎖抗体は6つのHVRを含み、3つはVHにあり（H1、H2、H3）、3つはVLにある（L1、L2、L3）。HVRは、一般的には、超可変ループからのアミノ酸残基および/または相補性決定領域（CDR）からのアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高くかつ/または抗原認識に関与する。VH中のCDR1を例外として、CDRは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（HVR）は相補性決定領域（CDR）ともいい、本明細書では、これらの用語を、可変領域のうち抗原結合領域を形成する部分に関して、相互可換的に使用する。この特定領域は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest（1983）およびChothia et al.,J Mol Biol 196:901-917（1987）に記載されており、これらの定義は、互いに比較すると、アミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それでもなお、抗体および/もしくは抗原結合受容体またはその変異体のCDRに言及するためになされるどちらか一方の定義の適用は、本明細書において定義され使用される用語の範囲内であるものとする。上で言及した参考文献のそれぞれによって定義されるCDRを包含する適当なアミノ酸残基を、下記表1に比較として示す。ある特定CDRを包含する厳密な残基数はCDRの配列およびサイズに依存して変動するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定CDRを構成するかを、常法によって決定することができる。
【００９０】
（表１）CDR定義1
2020515256.tif 000010
1表1におけるすべてのCDR定義のナンバリングは、Kabatらが規定したナンバリング法に従っている（下記参照）。
2表1において使用する、「b」が小文字の「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウェアによって定義されるCDRを指す。
【００９１】
Kabatらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列用のナンバリングシステムも規定した。当業者は、配列そのもの以外には何の実験データにも頼らずに、このKabatナンバリングシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用する「Kabatナンバリング」は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services「Sequence of Proteins of Immunological Interest」（1983）に示されたナンバリングシステムを指す。別段の指定がある場合を除き、抗原結合部分可変領域中の具体的アミノ酸残基位置のナンバリングへの言及は、Kabatナンバリングシステムによる。配列表のポリペプチド配列は、Kabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされているわけではない。しかし、配列表の配列のナンバリングをKabatナンバリングに変換することは、十分に、当業者の通常の技量の範囲内であると考えられる。
【００９２】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例:ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例:ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯類（例:マウスおよびラット）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特に個体または対象はヒトである。
【００９３】
「単離された核酸」分子またはポリヌクレオチドとは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAを意味する。例えば、ベクターに含まれているポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明においては、単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例として、異種宿主細胞中に維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解した状態にある（部分的にもしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドには、そのポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞に含まれているポリヌクレオチド分子であるが、染色体外に存在するか、その自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在するポリヌクレオチド分子が包含される。単離されたRNA分子として、本発明のインビボまたはインビトロRNA転写産物、ならびにプラス鎖型、マイナス鎖型、および二本鎖型が挙げられる。本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に生産されたそのような分子が、さらに含まれる。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素を含んでも含まなくてもよい。
【００９４】
本発明のリファレンスヌクレオチド配列と少なくとも例えば95％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がリファレンスヌクレオチド配列の100ヌクレオチドあたり最大5つの点変異を含みうる点を除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がリファレンス配列と同一であることを意味する。言い換えると、リファレンスヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、リファレンス配列中のヌクレオチドのうちの最大5％を欠失させるか、別のヌクレオチドで置換することができ、あるいはリファレンス配列中の全ヌクレオチドのうちの5％までの数のヌクレオチドをリファレンス配列中に挿入することができる。リファレンス配列のこれらの改変は、リファレンスヌクレオチド配列の5’末端位置もしくは3’末端位置に見いだされるか、またはこれらの末端位置の間のどこにでも、リファレンス配列中の残基の間にバラバラに散在して、またはリファレンス配列内の1つまたは複数の連続群（contiguous group）に散在して見いだされうる。実際問題として、任意の特定ポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチドと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム、例えばポリペプチドに関して後述するもの（例:ALIGN-2）などを従来どおりに使って、決定することができる。
【００９５】
「単離されたポリペプチド」またはその変異体もしくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意味する。特定の精製レベルが要求されることはない。例えば単離されたポリペプチドは、そのネイティブ環境または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え生産ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明では、任意の適切な技法によって分離され、分画され、または部分精製もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドと同様に、単離されているとみなされる。
【００９６】
リファレンスポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、どの保存的置換も配列同一性の一部とはみなさずに、パーセント配列同一性が最大になるように配列を整列し、必要であればギャップを導入した後の、リファレンスポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野における技量の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公に利用できるコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、配列を整列させるための適当なパラメータを、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るのに必要なあらゆるアルゴリズムを含めて、決定することができる。ただし、本明細書における目的には、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、％アミノ酸配列同一性値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech,Inc.によって書かれたものであり、ソースコードは米国著作権局（20559ワシントンD.C.）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech,Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手するか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX V4.0DなどのUNIXオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が使用される場合、所与のアミノ酸配列Bに対する、または所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bと対比した、所与のアミノ酸配列Aの％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Bに対して、または所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bと対比して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、次のように計算される:
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとのアラインメントにおいて、完全一致（identical match）と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性が、Aに対するBの％アミノ酸配列同一性と一致しなくなることは、理解されるであろう。別段の具体的言明がある場合を除き、本明細書において使用する％アミノ酸配列同一性値はすべて、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
【００９７】
「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドに含まれるプリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基の配列に関し、該塩基が核酸分子の一次構造を表す。本明細書において核酸分子という用語には、DNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、合成型DNAおよびこれらの分子のうちの2種以上を含む混合ポリマーが含まれる。また、核酸分子という用語には、センス鎖とアンチセンス鎖がどちらも含まれる。さらにまた、本明細書に記載する核酸分子は、当業者には容易に理解されるであろうように、非天然ヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有しうる。
【００９８】
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれていて、当該治療製品の適応症、用法、投薬量、投与、併用治療、禁忌および/または使用上の注意に関する情報を含んでいる説明書を指すために使用される。
【００９９】
「薬学的組成物」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態にあって、その製剤を投与されることになる対象にとって、許容できないほどに毒性な追加の構成成分を含有しない調製物を指す。薬学的組成物は通常、1種または複数種の薬学的に許容される担体を含む。
【０１００】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０１】
本明細書において使用する用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって線状に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。ポリペプチドという用語は、アミノ酸が2つ以上の任意の鎖を指し、生成物の具体的長さを指すものではない。したがってペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、またはアミノ酸が2つ以上の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、ポリペプチドの定義内に包含され、ポリペプチドという用語は、これらの用語のいずれかの代わりに使用することができ、またはこれらの用語のいずれとも相互可換的に使用することができる。ポリペプチドという用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定するわけではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾などの産物も指すものとする。ポリペプチドは天然の生物学的供給源から得られるか、組換え技術によって生産されうるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。これは化学合成を含む任意の方法で生成させることができる。本発明のポリペプチドは、サイズが、アミノ酸約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上でありうる。ポリペプチドは明確な三次元構造を有しうるが、必ずしもそのような構造を有するわけではない。明確な三次元構造を持つポリペプチドを折りたたまれているといい、明確な三次元構造を持たず、多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドを、折りたたまれていないという。
【０１０２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子または核酸構築物、例えばメッセンジャーRNA（mRNA）、ウイルス由来のRNAまたはプラスミドDNA（pDNA）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例:アミド結合、例えばペプチド核酸（PNA）に見られるもの）を含みうる。核酸分子という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えばDNAフラグメントまたはRNAフラグメントを指す。
【０１０３】
例えばFc受容体への低減した結合などの、「低減した結合」とは、例えばSPRで測定した場合の、それぞれの相互作用に関するアフィニティーの減少を指す。明確な説明のために述べると、この用語は、ゼロ（または分析方法の検出限界未満）へのアフィニティーの低減、すなわち相互作用の完全な消失も包含する。逆に「増加した結合」とは、それぞれの相互作用に関する結合アフィニティーの増加を指す。
【０１０４】
「調節配列」という用語は、それらがライゲートされたコード配列の発現を達成するのに必要なDNA配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主細胞によって異なる。原核生物の場合、制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核生物の場合、一般に制御配列は、プロモーター、ターミネーター、そして場合により、エンハンサー、トランス活性化因子または転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現にとって必要な構成要素をすべて含むものとし、追加の有利な構成要素も含みうる。
【０１０５】
本明細書において使用する用語「単鎖」は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。一定の態様において、抗原結合部分の1つはscFvフラグメント、すなわちペプチドリンカーによって連結されたVHドメインおよびVLドメインである。一定の態様において、抗原結合部分のうちの一つは単鎖Fab分子、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とが単一のペプチド鎖を形成するようにペプチドリンカーによって連結されたFab分子である。特定のそのような態様では、Fab軽鎖のC末端が、単鎖Fab分子中のFab重鎖のN末端に連結されている。
【０１０６】
本明細書において使用する用語「SSD」は刺激シグナリングドメインを指す。
【０１０７】
本明細書において使用する「処置」（およびその文法上の異形、例えば「処置する」または「処置すること」など）は、処置される個体における疾患の自然の過程を改変しようとする臨床的介入を指し、これは、予防のために行うか、または臨床的病変の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状の緩和、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的帰結の縮減、転移の防止、疾患進行速度を減じること、疾患状態の改善または一時的軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗原結合受容体を発現する細胞は、疾患の発達を遅延させ、または疾患の進行を遅くするために、変異型Fcドメインを含む抗体と一緒に使用される。
【０１０８】
本明細書において使用する用語「標的抗原決定基」は、「標的抗原」、「標的エピトープ」、および「標的細胞抗原」と同義であり、ポリペプチド高分子上の一部位（例:連続する一続きのアミノ酸、または不連続なアミノ酸の異なる領域から構成されるコンフォメーション上の配置）であって、そこに抗体が結合して抗原結合部分-抗原複合体を形成するものを指す。有用な抗原決定基は、例えば腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、免疫細胞の表面に見いだされるか、血清中および/または細胞外マトリックス（ECM）中に遊離の状態で見いだされる。本明細書において抗原と呼ぶタンパク質（例:CD20、CEA、FAP、TNC）は、別段の表示がある場合を除き、霊長類（例:ヒト）および齧歯類（例:マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からのタンパク質の任意のネイティブ型であることができる。特定の態様において、標的抗原はヒトタンパク質である。本明細書において具体的標的タンパク質に言及する場合、この用語は、プロセシングされていない「完全長」の標的タンパク質を包含すると共に、標的細胞におけるプロセシングがもたらす任意の形態の標的タンパク質も包含する。この用語は、標的タンパク質の天然変異体、例えばスプライス変異体またはアレル変異体も包含する。抗原として有用な例示的ヒト標的タンパク質としてはCD20、CEA、FAP、TNC、MSLN、FolR1、HER1およびHER2が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特異的標的抗原決定基に結合する抗体の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、または当業者によく知られている他の技法、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）技法（BIAcore計器で分析されるもの）（Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329（2000））および従来の結合アッセイ（Heeley,Endocr Res 28,217-229（2002））などのいずれかによって測定することができる。一態様において、無関係なタンパク質への抗体の結合の程度は、例えばSPRで測定した場合に、標的抗原への抗体の結合の約10％未満である。一定の態様において、抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例:10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）のアフィニティー解離定数（KD）で標的抗原に結合する。
【０１０９】
本発明による「変異型Fcドメインを含む抗体」、すなわち治療用抗体は、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の結合ドメインを有し得、かつ単一特異性、二重特異性、または多重特異性でありうる。抗体は、単一種からの完全長であってもよく、またはキメラ化もしくはヒト化されていてもよい。 2つより多い抗原結合ドメインを有する抗体の場合、いくつかの結合ドメインは同一であり得、かつ/または同じ特異性を有しうる。
【０１１０】
本明細書において使用する「T細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性および活性化マーカーの発現から選択される、Tリンパ球の、特に細胞傷害性Tリンパ球の、1つまたは複数の細胞応答を指す。本発明の抗原結合受容体は、T細胞活性化を誘導することができる。T細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載する技術分野において公知である。
【０１１１】
本発明において、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、当技術分野では一般に公知である。特に、本明細書における用語「T細胞受容体」は、以下の3つの基準が満たされる限り、任意のT細胞受容体を指す:（i）腫瘍特異性、（ii）（大半の）腫瘍細胞の認識、これは、抗原または標的が（大半の）腫瘍細胞において発現していなければならないことを意味する、および（iii）そのTCRが、処置される対象のHLA型と一致すること。これに関連して、上述した3つの基準を満たす適切なT細胞受容体は、NY-ESO-1（配列情報については例えばPCT/GB2005/001924を参照されたい）および/またはHER2neu（配列情報についてはWO-A1 2011/0280894を参照されたい）を認識する受容体など、当技術分野において公知である。
【０１１２】
作用物質の、例えば薬学的組成物の、「治療有効量」とは、必要な投薬量および期間で、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量を指す。作用物質の治療有効量は、例えば、疾患の有害な効果を排除し、減少させ、遅延させ、最小限に抑え、または防止する。
【０１１３】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、それが機能的に関連付けられている特異的遺伝子を標的細胞に導入し、標的細胞におけるその発現を指示するために使用されるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターも包含する。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定mRNAの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞の内部にあれば、その遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質は、細胞の転写および/または翻訳機構によって生産される。一態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗原結合受容体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【０１１４】
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体
本発明は、抗体、すなわちがん細胞を標的とする治療用抗体の変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体に関する。特に本発明は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが親非変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができない少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む、抗原結合受容体に関する。好ましい態様において、変異型Fcドメインは非変異型親Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、変異型FcドメインによるFc受容体結合は、非変異型FcドメインによるFc受容体結合と比較して低減している。特定の態様において、本発明は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む抗原結合受容体に関し、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、親非変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができず、変異型Fcドメインは、L234、L235、I253、H310、P331、P329、およびH435からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、特にアミノ酸変異は非変異型親Fcドメインと比較してL234A、L235A、I253A、N297A、H310A、P329G、および/またはH435Aであり、変異型FcドメインによるFc受容体結合は非変異型FcドメインによるFc受容体結合と比較して低減している。好ましい一態様において、アミノ酸変異はP329Gであり、Fcγ受容体への結合は、25℃におけるSPRによる測定で、低減している。さらなる好ましい態様において、アミノ酸変異はI253A、H310A、およびH435Aであり、新生児型Fc受容体（FcRn）への結合は、25℃におけるSPRによる測定で、低減している。
【０１１５】
本発明はさらに、本明細書に記載の抗原結合受容体の、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD3＋T細胞、γδ型T細胞またはナチュラルキラー（NK）T細胞、好ましくはCD8＋T細胞などのT細胞への形質導入、およびそれら形質導入T細胞の、変異型Fcドメインを含む抗体分子、例えば治療用抗体による、例えば腫瘍への標的指向性動員（targeted recruitment）に関する。一態様において、前記抗体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対して特異的に結合することができる。
【０１１６】
添付の実施例に示すように、本発明概念の実証として、P329G変異を含む治療用抗体（SEQ ID NO ID:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗CD20抗体によって代表されるもの）に対して特異的に結合することができる、アンカリング膜貫通ドメインと細胞外ドメインとを含む本発明の抗原結合受容体pETR17096（SEQ ID NO:19に示すDNA配列によってコードされるSEQ ID NO:7）を構築した。抗P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDタンパク質（SEQ ID NO:19に示すDNA配列によってコードされるSEQ ID NO:7）を発現する形質導入T細胞（Jurkat NFAT T細胞）は、Fcドメイン中にP329G変異を含む抗CD20抗体およびCD20陽性腫瘍細胞との共インキュベーションによって、強く活性化することができた。本発明者らは、本発明の概念実証を裏付けるために、さらに、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合受容体のフォーマットを複数、用意した。
【０１１７】
腫瘍抗原に対する抗体であってP329G変異を含むものと、抗P329G-Fab-ds-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDタンパク質（SEQ ID NO:44（DNA）およびSEQ ID NO:39、41（タンパク質））を発現する形質導入T細胞との組み合わせによる腫瘍細胞の処置は、驚いたことに、抗P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD（SEQ ID NO:19（DNA）およびSEQ ID NO:7（タンパク質））融合タンパク質を発現する形質導入T細胞と比較して、形質導入T細胞の、より強い活性化につながる（例えば図6および図8〜11参照）。
【０１１８】
したがって、驚いたことに、意外にも、本発明の抗原結合受容体が形質導入されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、変異型Fcドメインを含む腫瘍特異的抗体の使用によって特異的に刺激され、腫瘍細胞への連結要素としての腫瘍特異的抗体によって動員されうることが見いだされた。したがって、驚いたことに、意外にも、変異型Fcドメインを含む腫瘍特異的抗体、すなわち治療用抗体を、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む/からなる抗原結合受容体が形質導入されたT細胞とペアにすると、T細胞の特異的活性化と、それに続く腫瘍細胞の溶解とがもたらされることが、本発明において示された。このアプローチには、従来のT細胞に基づくアプローチと比べて、安全上著しい利点がある。T細胞は変異型Fcドメインを含む抗体が存在しなければ不活性であると考えられ、それらの利用可能性は、選ばれた抗体分子フォーマット（すなわち、短い半減期には小さな分子、長い半減期には大きな分子）によって制御しうるからである。したがって本発明は、T細胞のための誘導装置として腫瘍細胞をマーキングまたは標識するためにIgG型抗体を使用することができ、IgG型抗体の変異型Fcドメインに対する特異性を与えることによって、形質導入T細胞を宿主細胞に特異的に向かわせる、汎用性のある治療プラットフォームを提供する。腫瘍細胞の表面で抗体の変異型Fcドメインに結合した後、本明細書に記載の形質導入T細胞は活性型になり、続いて腫瘍細胞は溶解されるであろう。本プラットフォームは、多様な（既存のまたは新たに開発される）標的抗体の使用、または抗原特異性は異なるがFcドメイン中に同じ変異を含む複数の抗体の同時適用を可能にすることにより、融通が利き、かつ特異的である。T細胞活性化の程度は、同時適用される治療用抗体の投薬量を調整することによって、または異なる抗体特異性もしくは異なる抗体フォーマットに切り換えることによって、さらに調整することができる。本明細書に記載するFcドメインの変異は、天然の免疫グロブリン、すなわち非変異型免疫グロブリンには存在しないので、本発明の形質導入T細胞は、変異型Fcドメインを含むターゲティング抗体の同時適用がなければ不活性である。したがって一態様において、変異型Fcドメインは、野生型免疫グロブリンに天然には存在しない。
【０１１９】
したがって本発明は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む抗原結合受容体であって、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、親非変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができず、変異型Fcドメインは非変異型親Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインによるFc受容体結合および/または変異型Fcドメインによって誘導されるエフェクター機能は、非変異型FcドメインによるFc受容体結合および/または非変異型Fcドメインによって誘導されるエフェクター機能と比較して低減している、抗原結合受容体に関する。エフェクター機能は、本明細書にさらに記載するように、抗体に基づく腫瘍治療の重篤な副作用につながりうるので、がん治療では低減したエフェクター機能を持つ治療用抗体を使用することが特に望ましい場合がある。
【０１２０】
本発明との関連において、抗原結合受容体は、T細胞中またはT細胞上に天然には見いだされない細胞外ドメインを含む。したがって抗原結合受容体は、本発明の抗原結合受容体を発現する細胞にテーラーメードの結合特異性を与えることができる。本発明の抗原結合受容体が形質導入された細胞、例えばT細胞は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるようになるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない。特異性は、抗原結合受容体の細胞外ドメインの抗原結合部分によって与えられ、そのような抗原結合部分は、本明細書において定義される変異型Fcドメインに特異的であるとみなされる。本発明との関連において、そして本明細書において説明するように、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分は、変異型Fcドメインに結合し/変異型Fcドメインと相互作用するが、非変異型親Fcドメインに結合し/非変異型親Fcドメインと相互作用することはない。
【０１２１】
抗原結合部分
本発明の例示的態様では、概念実証として、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む抗原結合受容体であって、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、変異型Fcドメインは非変異型親Fcと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１２２】
一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも1つは、従来のFabフラグメント、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とからなるFab分子である。一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも1つは、crossFabフラグメント、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とからなり、Fabの重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のどちらか一方が交換されているFab分子である。一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも1つはscFvフラグメントである。そのような特定の態様では、scFv分子において、可変重鎖（VH）のC末端が可変軽鎖（VL）のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して連結される。一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも一つは単鎖Fab分子、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とが単一のペプチド鎖を形成するようにペプチドリンカーによって連結されているFab分子である。そのような特定の態様では、単鎖Fab分子において、Fab軽鎖のC末端がFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して連結される。
【０１２３】
したがって本発明との関連において、抗原結合部分は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、変異型Fcドメインは非変異型親Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。
【０１２４】
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分は、例えば哺乳動物免疫系などの免疫化によって作製されうる。そのような方法は当技術分野では公知であり、例えばMethods in Molecular Biology 295:1-12（2005）にBurnsが記載している。あるいは、本発明の抗原結合部分は、1つまたは複数の所望の活性を持つ抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されうる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法については、例えばNature Reviews 16:498-508（2016）にLernerらの総説がある。例えば当技術分野では、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を持つ抗原結合部分についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための方法が、種々公知である。そのような方法については、例えばmAbs 8:1177-1194（2016）にFrenzelらの総説、Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828（2012）にBazanらの総説、Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289（2016）にZhaoらの総説、そしてMethods in Molecular Biology 178:1-37（O’Brienら編、Human Press、ニュージャージー州トトワ、2001）にHoogenboomらの総説があり、また例えばMcCafferty et al.,Nature 348:552-554、Clackson et al.,Nature 352:624-628（1991）、Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597（1992）、Marks and Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175（Lo編、Human Press、ニュージャージー州トトワ、2003）、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338（2）:299-310（2004）、Lee et al.,J.Mol.Biol.340（5）:1073-1093（2004）、Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101（34）:12467-12472（2004）およびLee et al.,J.Immunol.Methods 284（1-2）:119-132（2004）にも、さらに記載されている。一定のファージディスプレイ法では、WinterらがAnnual Review of Immunology 12:433-455（1994）に記載しているように、VH遺伝子とVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって個別にクローニングし、それらをファージライブラリーでランダムに組換えてから、抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、抗体フラグメントを、一本鎖Fv（scFv）フラグメントとして、またはFabフラグメントとして、ディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対する高アフィニティー抗原結合部分を与える。あるいは、GriffithsらがEMBO Journal 12:725-734（1993）に記載しているように、免疫化を一切行わずに、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることで、広範な非自己抗原に対する、そしてまた自己抗原に対する、抗原結合部分の単一の供給源とすることもできる。最後に、HoogenboomおよびWinterがJournal of Molecular Biology 227:381-388（1992）に記載しているように、幹細胞から非再編成V遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変なCDR3領域をコードするためおよびインビトロで再編成を行うためにランダム配列を含有するPCRプライマーを使用することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば米国特許第5,750,373号、同第7,985,840号、同第7,785,903号および同第8,679,490号、ならびに米国特許出願公開第2005/0079574号、同第2007/0117126号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号および同第2009/0002360号がある。1つまたは複数の所望の活性を持つ抗体についてコ���ビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野において公知の方法のさらなる例としては、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞上での抗体ディスプレイおよび抗体選択のための方法が挙げられる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えばMethods in Molecular Biology 503:135-56（2012）にSchollerらの総説が、またMethods in Molecular Biology 1319:155-175（2015）にCherfらの総説があり、さらにMethods in Molecular Biology 889:73-84（2012）にもZhaoらの総説がある。リボソームディスプレイのための方法は、例えばHeらがNucleic Acids Research 25:5132-5134（1997）に、またHanesらがPNAS 94:4937-4942（1997）に記載している。
【０１２５】
本発明との関連において、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む抗原結合受容体が、本明細書に提供される。したがって、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入細胞、すなわちT細胞は、抗体の、すなわち治療用抗体の、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる。Fcドメインは、抗体に、すなわち治療用抗体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清中半減期を含む有利な薬物動態特性および有利な組織血液分布比を付与する。しかしそれは同時に、好ましい抗原保持細胞ではないFc受容体発現細胞への治療用抗体の望ましくないターゲティングにもつながりうる。さらにまた、Fc受容体シグナリング経路の同時活性化は、サイトカイン放出につながる場合があり、それは、治療用抗体の全身性投与時に、サイトカイン受容体の過剰な活性化および重篤な副作用をもたらす。T細胞以外の（Fc受容体保持）免疫細胞の活性化は、免疫細胞の潜在的破壊により、治療用抗体の有効性を低減する場合さえある。したがって当技術分野において公知の治療用抗体は、例えばネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低減した結合アフィニティーおよび/または低減したエフェクター機能を呈するように、工学的に操作し、または変異させることができる。本発明の抗原結合受容体は、本発明の抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞、例えばT細胞を、インビトロおよび/またはインビボで、標的細胞に対して特異的に結合することができかつ本明細書に記載の改変型および/または変異型Fcドメインを含む抗体で標識された標的細胞に、すなわち腫瘍細胞に、ターゲティングするために使用することができる。
【０１２６】
本発明の例示的態様では、概念実証として、アミノ酸変異P329Gを含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体、および該抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞が提供される。P329G変異はFcγ受容体への結合および関連エフェクター機能を低減する。したがってP329G変異を含む変異型Fcドメインは、非変異型Fcドメインと比較して低減または消失したアフィニティーで、Fcγ受容体に結合する。上記に代わる本発明の例示的位置態様では、概念実証として、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合受容体が提供される。AAA変異はFcRnへの結合を本質的に消失させる。
【０１２７】
しかし、変異型Fcドメインを含み、Fc受容体（FcR）への結合および/またはエフェクター機能が低減し、改良され、または減少している抗体は、当技術分野において広く使用されている。したがって本明細書では、変異型Fcドメインを含む抗体に対して特異的に結合することができる抗原結合受容体が提供され、そのような抗体を本明細書では標的抗体ともいう。したがって一態様において、本発明の抗原結合受容体は、Fc受容体への低減した結合アフィニティーおよび/または低減したエフェクター機能を持つ変異型Fcドメインを含む標的抗体に対して特異的に結合することができる。低減したエフェクター機能を持つ標的抗体として、Fc領域の238、265、269、270、297、327、および329番目の残基のうちの1つまたは複数の変異を持つものが挙げられる（米国特許第6,737,056号）。そのようなFc変異種として、265および297番目の残基のアラニンへの変異を持ついわゆる「DANA」Fc変異種を含む、265、269、270、297、および327番目のアミノ酸のうちの2つ以上に変異を持つFc変異種が挙げられる（米国特許第7,332,581号）。FcRへの結合が改良されまたは減少している抗体変異体はいくつか記載されている。（例えば米国特許第6,737,056号、WO 2004/056312およびShields et al.,J.Biol.Chem.9（2）:6591-6604（2001）参照。）一定の態様では、ADCCを改良する1つまたは複数のアミノ酸変異を持つFc領域、例えばFc領域の298、333および/または334番目（EU残基ナンバリング）に変異を持つFc領域を含む抗体変異体に対して特異的に結合することができる抗原結合受容体が提供される。一定の態様において、標的抗体変異体は、FcRn結合を低減しまたは減少させる1つまたは複数のアミノ酸変異を持つ、例えばFc領域の253番目および/または310番目および/または435番目（EU残基ナンバリング）に変異を持つ、Fc領域を含む。一定の態様において、標的抗体変異体は、253番目、310番目および435番目にアミノ酸変異を持つFc領域を含む。一態様において、変異は、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域中のI253A、H310A、およびH435Aである。例えばGrevys,A.,et al.,J.Immunol.194（2015）5497-5508を参照されたい。
【０１２８】
一定の態様では、FcRn結合を低減しまたは減少させる1つまたは複数のアミノ酸変異を持つ、例えばFc領域の310番目および/または433番目および/または436番目（EU残基ナンバリング）のうちの1つに変異を持つ、Fc領域を含む抗体変異体に対して特異的に結合することができる抗原結合受容体が提供される。一定の態様では、標的抗体変異体が310番目、433番目および436番目にアミノ酸変異を持つFc領域を含む。一態様において、変異は、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域におけるH310A、H433AおよびY436Aである。一定の態様では、標的抗体変異体は、FcRn結合を増加させた1つまたは複数のアミノ酸変異を持つ、例えばFc領域の252番目および/または254番目および/または256番目（EU残基ナンバリング）に変異を持つ、Fc領域を含む。一定の態様において、標的抗体変異体は、252番目、254番目および256番目にアミノ酸変異を持つFc領域を含む。一態様において、変異は、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域におけるM252Y、S254TおよびT256Eである。一定の態様では、FcγR結合を減少させるアミノ酸変異を持つ、例えばFc領域の234番目、235番目および329番目（EU残基ナンバリング）に変異を持つ、Fc領域を含む抗体変異体に対して特異的に結合することができる抗原結合受容体が提供される。一態様において、変異はL234AおよびL235A（LALA）である。一定の態様では、標的抗体変異体はさらに、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域におけるD265Aおよび/またはP329Gを含む。一態様において、変異はヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域におけるP329G（「PG」）である。別の態様において、変異はヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域におけるI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）である。
【０１２９】
一態様において、抗原結合部分は、安定に会合することができる第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成される変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる。一態様において、FcドメインはIgG Fcドメイン、具体的にはIgG1またはIgG4 Fcドメインである。一態様において、FcドメインはヒトFcドメインである。一態様において、変異型Fcドメインは、ネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低減した結合アフィニティーおよび/または低減したエフェクター機能を呈する。一態様において、Fcドメインは、Fc受容体への結合および/またはエフェクター機能を低減する1つまたは複数のアミノ酸変異を含む。
【０１３０】
好ましい一態様において、前記1つまたは複数のアミノ酸変異は、L234、L235、およびP329（Kabatナンバリング）の群から選択される1つまたは複数の位置にある。一特定態様において、Fcドメインの各サブユニットは、活性化Fc受容体への結合および/またはエフェクター機能を低減する3つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異はL234A、L235A、およびP329Gである。一特定態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。一態様において、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）である。
【０１３１】
特定の態様において、変異型FcドメインはP329G変異を含む。したがってP329G変異を含む変異型Fcドメインは、非変異型Fcドメインと比較して低減または消失したアフィニティーで、Fcγ受容体に結合する。一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、
（a）RYWMN（SEQ ID NO:1）の重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列、
（b）
2020515256.tif 000011
のCDR H2アミノ酸配列、および
（c）
2020515256.tif 000012
のCDR H3アミノ酸配列
のうちの少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む。
【０１３２】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、
（d）
2020515256.tif 000013
の軽鎖（CDR L）1アミノ酸配列、
（e）GTNKRAP（SEQ ID NO:5）のCDR L2アミノ酸配列、および
（f）
2020515256.tif 000014
のCDR L3アミノ酸配列
のうちの少なくとも1つを含む軽鎖可変領域を含む。
【０１３３】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０１３４】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3の重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDRとを含む。
【０１３５】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、
（a）RYWMN（SEQ ID NO:1）の重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列、
（b）
2020515256.tif 000015
のCDR H2アミノ酸配列、
（c）
2020515256.tif 000016
のCDR H3アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（d）
2020515256.tif 000017
の軽鎖（CDR L）1アミノ酸配列、
（e）GTNKRAP（SEQ ID NO:5）のCDR L2アミノ酸配列、および
（f）
2020515256.tif 000018
のCDR L3アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１３６】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:32から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:33から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１３７】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:32から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:33から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１３８】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１３９】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１４０】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、scFv、Fab、crossFab、またはscFabフラグメントである。一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分はFabフラグメントである。
【０１４１】
好ましい態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、そこではFabフラグメントがSEQ ID NO:40の重鎖とSEQ ID NO:41の軽鎖とを含む。
【０１４２】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFvフラグメントであって、可変ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VH-リンカー-VLまたはb）VL-リンカー-VH。好ましい態様において、scFvフラグメントはVH-リンカー-VLという構成を有する。
【０１４３】
好ましい態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、そこではscFvフラグメントがSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
代替の特定態様において、変異型Fcドメインは、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む。AAA変異は新生児型Fc受容体（FcRn）への結合を低減する。したがってAAA変異を含む変異型Fcドメインは、非変異型Fcドメインと比較して低減または消失したアフィニティーで、FcRnに結合する。
【０１４５】
したがって一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、
（a）SYGMS（SEQ ID NO:53）の重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列、
（b）SSGGSY（SEQ ID NO:54）のCDR H2アミノ酸配列、および
（c）
2020515256.tif 000019
のCDR H3アミノ酸配列
のうちの少なくとも1つを含む重鎖可変領域を含む。
【０１４６】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、
（d）
2020515256.tif 000020
の軽鎖（CDR L）1アミノ酸配列、
（e）KVSNRFS（SEQ ID NO:57）のCDR L2アミノ酸配列、および
（f）
2020515256.tif 000021
のCDR L3アミノ酸配列
のうちの少なくとも1つを含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４７】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54およびSEQ ID NO:55からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57およびSEQ ID NO:58の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０１４８】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54およびSEQ ID NO:55の重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57およびSEQ ID NO:58の軽鎖CDRとを含む。
【０１４９】
好ましい態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、
（a）SYGMS（SEQ ID NO:53）の重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列、
（b）SSGGSY（SEQ ID NO:54）のCDR H2アミノ酸配列、
（c）
2020515256.tif 000022
のCDR H3アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と、
（d）
2020515256.tif 000023
の軽鎖（CDR L）1アミノ酸配列、
（e）KVSNRFS（SEQ ID NO:57）のCDR L2アミノ酸配列、および
（f）
2020515256.tif 000024
のCDR L3アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１５０】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:61のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:62の選択されたアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１５１】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分は、SEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１５２】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分は、scFv、Fab、crossFab、またはscFabフラグメントである。一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、少なくとも抗原結合部分はFabフラグメントである。特定の態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、そこではFabフラグメントがSEQ ID NO:64の重鎖とSEQ ID NO:65の軽鎖とを含む。
【０１５３】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分はscFvフラグメントである。特定の態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含み、そこではscFvフラグメントがSEQ ID NO:60のアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
本発明のさらなる態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は単鎖Fabフラグメント、すなわちscFabである。
【０１５５】
FabフラグメントおよびscFabフラグメントは、CLドメインとCH1ドメインの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。重鎖可変ドメイン（VH）と軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む抗原結合部分、例えば本明細書に記載のFabフラグメント、crossFabフラグメント、scFvフラグメントおよびscFabフラグメントは、VHドメインとVLドメインとの間に鎖間ジスルフィド架橋を導入することによって、さらに安定化されうる。したがって一態様において、本発明の抗原結合受容体に含まれるFabフラグメント、crossFabフラグメント、scFvフラグメントおよび/またはscFabフラグメントは、システイン残基の挿入（例えばKabatナンバリングで可変重鎖の44番目と可変軽鎖の100番目）による鎖間ジスルフィド結合の生成で、さらに安定化されうる。そのような安定化抗原結合部分を、添付の実施例および図では、「ds」という用語で表す。
【０１５６】
アンカリング膜貫通ドメイン
本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼのための切断部位を有しないことを特徴としうる。本発明との関連において、プロテアーゼとは、プロテアーゼのための切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解することができるタンパク質分解酵素を指す。プロテアーゼという用語はエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼをどちらも包含する。本発明との関連において、膜貫通タンパク質、なかんずくCD命名法によって規定されるもののアンカリング膜貫通ドメインはいずれも、本明細書に定義する変異型Fcドメインに結合したときにT細胞、好ましくはCD8＋T細胞を活性化する本発明の抗原結合受容体を作製するために使用しうる。
【０１５７】
したがって本発明との関連において、アンカリング膜貫通ドメインは、ネズミ/マウス（murine/mouse）膜貫通ドメインのパーツ、または好ましくはヒト膜貫通ドメインのパーツを含みうる。そのようなアンカリング膜貫通ドメインの一例は、例えば本明細書ではSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:24に示すDNA配列によってコードされるもの）を有するCD28の膜貫通ドメインである。本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体の膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:24に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む/からなることができる。
【０１５８】
本発明の例示的態様では、概念実証として、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列（SEQ ID NO:22に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む抗原結合部分と、本明細書ではSEQ ID NO:71（SEQ ID NO:70に示すDNA配列によってコードされるもの）として示されるCD28（ヒトCD28のUniprotエントリー番号はP10747（バージョン番号173、配列のバージョン1）である）のフラグメント/ポリペプチドパーツとを含む、抗原結合受容体が提供される。あるいは、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質、なかんずくCD命名法によって与えられるものは、本発明の抗原結合受容体タンパク質のアンカリング膜貫通ドメインとして使用しうる。上述のとおり、本明細書に提供される抗原結合受容体は、SEQ ID NO:71に示すヒト完全長CD28タンパク質（SEQ ID NO:70に示すcDNAによってコードされるもの）153〜179、154〜179、155〜179、156〜179、157〜179、158〜179、159〜179、160〜179、161〜179、162〜179、163〜179、164〜179、165〜179、166〜179、167〜179、168〜179、169〜179、170〜179、171〜179、172〜179、173〜179、174〜179、175〜179、176〜179、177〜179または178〜179番目のアミノ酸に位置する、CD28のアンカリング膜貫通ドメインを含みうる。したがって、本発明との関連において、アンカリング膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:24に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む/からなることができる。
【０１５９】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:64のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:65のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６０】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:49から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:50から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６１】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６２】
好ましい一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:49のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:50のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６３】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、I253A、H310A、およびH435A変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:60のアミノ酸を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６４】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:34から選択されるアミノ酸配列を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６５】
好ましい一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、C末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１６６】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、P329G変異を含むFcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含む抗原結合受容体であって、scFvフラグメントがC末端においてSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:17のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。
【０１６７】
刺激シグナリングドメイン（SSD）および共刺激シグナリングドメイン（CSD）
好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインを含む。したがって本明細書に提供される抗原結合受容体は、好ましくは、T細胞活性化をもたらす刺激シグナリングドメインを含む。本明細書に提供される抗原結合受容体は、ネズミ/マウスまたはヒトCD3z（ヒトCD3zのUniProtエントリーはP20963（バージョン番号177、配列番号2）であり;ネズミ/マウスCD3zのUniProtエントリーはP24161（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9D3G3（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号143、配列番号1である）、FCGR3A（ヒトFCGR3AのUniProtエントリーはP08637（バージョン番号178、配列番号2）である）またはNKG2D（ヒトNKG2DのUniProtエントリーはP26718（バージョン番号151、配列番号1）であり;ネズミ/マウスNKG2DのUniProtエントリーはO54709（バージョン番号132、配列番号2）である）のフラグメント/ポリペプチドパーツである刺激シグナリングドメインを含みうる。
【０１６８】
したがって、本明細書に提供される抗原結合受容体に含まれる刺激シグナリングドメインは、完全長CD3z、FCGR3A、およびNKG2Dのフラグメント/ポリペプチドパーツでありうる。ネズミ/マウス完全長CD3zまたはNKG2Dのアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:96（CD3z）、100（FCGR3A）、または104（NKG2D）（ネズミ/マウス、SEQ ID NO:97（CD3z）、101（FCGR3A）、または105（NKG2D）に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。ヒト完全長CD3z、FCGR3A、またはNKG2Dのアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:94（CD3z）、98（FCGR3A）、または102（NKG2D）（ヒト、SEQ ID NO:95（CD3z）、99（FCGR3A）、または103（NKG2D）に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも1つのシグナリングドメインが含まれるのであれば、CD3z、FCGR3AまたはNKG2Dのフラグメントを、刺激ドメインとして含みうる。特に、CD3z、FCGR3AまたはNKG2Dのパーツ/フラグメントはいずれも、少なくとも1つのシグナリングモチーフが含まれるのであれば、刺激ドメインとして適切である。しかし、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源由来のポリペプチドを含む。したがって、より好ましくは、本明細書に提供される抗原結合受容体は、本明細書にSEQ ID NO:94（CD3z）、98（FCGR3A）、または102（NKG2D）として示すアミノ酸配列（ヒト、SEQ ID NO:95（CD3z）、99（FCGR3A）、または103（NKG2D）に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む。例えば、本発明の抗原結合受容体に含まれうるヒトCD3zのフラグメント/ポリペプチドパーツは、SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:26に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。したがって、一態様において抗原結合受容体は、SEQ ID NO:13に示す配列を含むか、SEQ ID NO:13と比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29または30個の置換、欠失または挿入を有する配列であって、刺激シグナリング活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む抗原結合受容体の具体的構成は以下に記載すると共に、実施例および図面に記載する。刺激シグナリング活性は、例えば、ELISAによって測定されるサイトカイン放出の強化（IL-2、IFNγ、TNFα）、増殖活性の強化（細胞数の増加によって測定されるもの）、またはLDH放出アッセイによって測定される溶解活性の強化などによって決定することができる。
【０１６９】
さらにまた、本明細書に提供される抗原結合受容体は、好ましくは、T細胞に追加の活性を与える少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインを含む。本明細書に提供される抗原結合受容体は、ネズミ/マウスまたはヒトCD28（ヒトCD28のUniProtエントリーはP10747（バージョン番号173、配列番号1）であり;ネズミ/マウスCD28のUniProtエントリーはP31041（バージョン番号134、配列番号2）である）、CD137（ヒトCD137のUniProtエントリーはQ07011（バージョン番号145、配列番号1）であり;ネズミ/マウスCD137のUniProtエントリーはP20334（バージョン番号139、配列番号1）である）、OX40（ヒトOX40のUniProtエントリーはP23510（バージョン番号138、配列番号1）であり;ネズミ/マウスOX40のUniProtエントリーはP43488（バージョン番号119、配列番号1）である）、ICOS（ヒトICOSのUniProtエントリーはQ9Y6W8（バージョン番号126、配列番号1）であり;ネズミ/マウスICOSのUniProtエントリーはQ9WV40（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9JL17（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号102および配列バージョン2である）、CD27（ヒトCD27のUniProtエントリーはP26842（バージョン番号160、配列番号2）であり;ネズミ/マウスCD27のUniprotエントリーはP41272（バージョン番号137、配列バージョン1）である）、4-1-BB（ネズミ/マウス4-1-BBのUniProtエントリーはP20334（バージョン番号140、配列バージョン1）であり;ヒト4-1-BBのUniProtエントリーはQ07011（バージョン番号146、配列バージョン）である）、DAP10（ヒトDAP10のUniProtエントリーはQ9UBJ5（バージョン番号25、配列番号1）であり;ネズミ/マウスDAP10のUniProtエントリーはQ9QUJ0（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9R1E7（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号101および配列番号1である）またはDAP12（ヒトDAP12のUniProtエントリーはO43914（バージョン番号146および配列番号1）であり;ネズミ/マウスDAP12のUniProtエントリーはO054885（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9R1E7（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号123および配列番号1である）のフラグメント/ポリペプチドパーツである共刺激シグナリングドメインを含みうる。本発明の一定の態様において、本発明の抗原結合受容体は、本明細書において定義する共刺激シグナリングドメインのうちの1つまたは複数、すなわち1、2、3、4、5、6または7つを含みうる。したがって、本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体は、ネズミ/マウスCD28または好ましくはヒトCD28のフラグメント/ポリペプチドパーツを第1の共刺激シグナリングドメインとして含むことができ、第2の共刺激シグナリングドメインは、ネズミ/マウスのまたは好ましくはヒトのCD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12またはそれらのフラグメントからなる群より選択される。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源由来の共刺激シグナリングドメインを含む。したがって、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体に含まれる共刺激シグナリングドメインは、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:25に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。
【０１７０】
したがって、本明細書に提供される抗原結合受容体に任意で含まれうる共刺激シグナリングドメインは、完全長CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12のフラグメント/ポリペプチドパーツである。ネズミ/マウス完全長CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、CD27、DAP10、またはDAP12のアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:69（CD27）、73（CD28）、77（CD137）、81（OX40）、85（ICOS）、89（DAP10）、または93（DAP12）（ネズミ/マウス、SEQ ID NO:68（CD27）、72（CD28）、76（CD137）、80（OX40）、84（ICOS）、88（DAP10）、または92（DAP12）に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。しかし、本発明との関連においてはヒト配列が最も好ましいので、本明細書に提供される抗原結合受容体タンパク質に任意で含まれうる共刺激シグナリングドメインは、ヒト完全長CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、またはDAP12のフラグメント/ポリペプチドパーツである。ヒト完全長CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、またはDAP12のアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:67（CD27）、71（CD28）、75（CD137）、79（OX40）、83（ICOS）、87（DAP10）、または91（DAP12）（ヒト、SEQ ID NO:66（CD27）、70（CD28）、74（CD137）、78（OX40）、82（ICOS）、86（DAP10）、または90（DAP12）に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。
【０１７１】
好ましい一態様において、抗原結合受容体は、CD28またはそのフラグメントを共刺激シグナリングドメインとして含む。本明細書に提供される抗原結合受容体は、少なくとも1つのCD28のシグナリングドメインが含まれるのであれば、CD28のフラグメントを共刺激シグナリングドメインとして含みうる。特に、CD28のパーツ/フラグメントはいずれも、CD28のシグナリングモチーフのうちの少なくとも1つが含まれる限り、本発明の抗原結合受容体にとって適切である。例えば、本発明の抗原結合受容体タンパク質に含まれるCD28ポリペプチドは、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:25に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。本発明において、共刺激シグナリングドメインとして機能するCD28の細胞内ドメインは、配列YMNM（SEQ ID NO:106）および/またはPYAP（SEQ ID NO:107）を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含みうる。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源由来のポリペプチドを含む。例えば、本発明の抗原結合受容体に含まれうるヒトCD28のフラグメント/ポリペプチドパーツは、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:25に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。したがって、本発明との関連において、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:12に示す配列を含むか、SEQ ID NO:12と比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の置換、欠失または挿入を有する配列であって、共刺激シグナリング活性を有することを特徴とする配列を含む。共刺激シグナリングドメイン（CSD）を含む抗原結合受容体の具体的構成は以下に記載すると共に、実施例および図面に記載する。共刺激シグナリング活性は、例えば、ELISAによって測定されるサイトカイン放出の強化（IL-2、IFNγ、TNFα）、増殖活性の強化（細胞数の増加によって測定されるもの）、またはLDH放出アッセイによって測定される溶解活性の強化などによって決定することができる。
【０１７２】
上述のように、本発明の態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、ヒトCD28遺伝子（Uni Protエントリー番号:P10747（アクセッション番号、エントリーバージョン:173および配列のバージョン1））に由来することができ、形質導入T細胞のような本明細書に記載の形質導入細胞のサイトカイン生産、増殖および溶解活性として定義されるCD28活性を与える。CD28活性は、ELISAによるサイトカインの放出またはインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）またはインターロイキン2（IL-2）などのサイトカインのフローサイトメトリー、例えばki67測定などによって測定されるT細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞定量、または標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価される溶解活性（例えばThakur et al.,Biosens Bioelectron.35（1）（2012）,503-506、Krutzik et al.,Methods Mol Biol.699（2011）,179-202、Ekkens et al.,Infect Immun.75（5）（2007）,2291-2296、Ge et al.,Proc Natl Acad Sci USA.99（5）（2002）,2983-2988、Duewell et al.,Cell Death Differ.21（12）（2014）,1825-1837、Erratum in:Cell Death Differ.21（12）（2014）,161などに記載されているようにICELLligence計器などを使用ことによる）によって測定することができる。共刺激シグナリングドメインPYAP（SEQ ID NO:107のAA208〜211）およびYMNM（SEQ ID NO:106のAA191〜194）は、CD28ポリペプチドの機能および上に列挙した機能的効果にとって有益である。YMNMドメインのアミノ酸配列をSEQ ID NO:106に示し、PYAPドメインのアミノ酸配列をSEQ ID NO:107に示す。したがって、本発明の抗原結合受容体において、CD28ポリペプチドは、好ましくは、配列YMNM（SEQ ID NO:106）および/またはPYAP（SEQ ID NO:107）を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む。本発明との関連において、配列YMNM（SEQ ID NO:106）および/またはPYAP（SEQ ID NO:107）を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインは、形質導入T細胞のような本明細書に記載する形質導入細胞のサイトカイン生産、増殖および溶解活性として定義されるCD28活性を特徴とする。したがって、本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、SEQ ID NO:12のアミノ酸配列（ヒト）（SEQ ID NO:25に示すDNA配列によってコードされるもの）を有する。しかし、本発明の抗原結合受容体では、これらのドメインの一方または両方を、それぞれFMNM（SEQ ID NO:108）および/またはAYAA（SEQ ID NO:109）に変異させてもよい。これらの変異はどちらも、抗原結合受容体を含む形質導入細胞のサイトカイン放出能力をその増殖能には影響を及ぼすことなく低減し、形質導入細胞の生存率を、したがってその治療ポテンシャルを長引かせるために有利に使用することができる。すなわち、言い換えると、そのような非機能的変異は、好ましくは、本明細書に提供される抗原結合受容体が形質導入された細胞のインビボでの残留性を高める。ただし、これらのシグナリングモチーフは本明細書に提供される抗原結合受容体の細胞内ドメイン内の任意の部位に存在しうる。
【０１７３】
リンカーおよびシグナルペプチド
さらにまた、本明細書に提供される抗原結合受容体は、少なくとも1つのリンカー（または「スペーサー」）を含みうる。リンカーは、通常、最大20アミノ酸の長さを有するペプチドである。したがって、本発明との関連において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20アミノ酸の長さを有しうる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインの間に、リンカーを含みうる。そのようなリンカーには、それらが抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメイン）が独立して折りたたまれて予想どおりに挙動する確率を増加させるという利点がある。したがって本発明との関連において、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼのための切断部位を有しないアンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインが、単鎖多機能ポリペプチドに含まれうる。単鎖融合構築物は、例えば、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインを含むポリペプチドからなりうる。代替の態様において、抗原結合受容体は、単鎖融合構築物ではない抗原結合部分を含む。すなわち、抗原結合部分はFabまたはcrossFabフラグメントである。そのような態様では、抗原結合受容体は、1本のポリペプチド鎖のみを含む単鎖融合構築物ではない。好ましくは、そのような構築物は、本明細書に記載するように、免疫グロブリンの軽鎖と組み合わされた単鎖重鎖融合ポリペプチドを含むと考えられる。例えば重鎖融合ポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインを含み、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされる。したがって、抗原結合部分、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインは、本明細書に記載するとおり、1つまたは複数の同一のまたは異なるペプチドリンカーによって連結されうる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体において、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカリング膜貫通ドメインとの間のリンカーは、SEQ ID NO:17に示すアミノおよびアミノ酸配列を含むか、またはそれからなりうる。したがって、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激ドメインは互いに、ペプチドリンカーによって連結されるか、またはドメインの直接的融合によって連結されうる。
【０１７４】
本発明によるいくつかの態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は単鎖可変フラグメント（scFv）であり、これは10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された抗体重鎖の可変領域（VH）と抗体軽鎖の可変領域（VL）との融合タンパク質である。リンカーは通常、可動性のためにグリシンに富むと共に、溶解性のためにセリンまたはスレオニンに富み、VHのN末端をVLのC末端と連結するか、それらを逆に連結することができる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体において、リンカーはSEQ ID NO:16に示すアミノおよびアミノ酸配列を有しうる。本明細書に記載のscFv抗原結合部分は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持している。 scFv抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。
【０１７５】
本発明のいくつかの態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は単鎖Fabフラグメント、すなわちscFabであり、これは、重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであって、抗体ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、次の順序:a）VH-CH1-リンカー-VL-CL、b）VL-CL-リンカー-VH-CH1、c）VH-CL-リンカー-VL-CH1またはd）VL-CH1-リンカー-VH-CL、のうちの1つを有し、リンカーは少なくとも30アミノ酸、好ましくは32〜50アミノ酸のポリペプチドである。単鎖Fabフラグメントは、CLドメインとCH1ドメインの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。
【０１７６】
本発明のいくつかの態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分はクロスオーバー（crossover）単鎖Fabフラグメントであり、これは、重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであって、抗体ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、次の順序:a）VH-CL-リンカー-VL-CH1およびb）VL-CH1-リンカー-VH-CL、のうちの1つを有し、VHとVLは全体として抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、リンカーは少なくとも30アミノ酸のポリペプチドである。
【０１７７】
本明細書に提供される抗原結合受容体またはそのパーツはシグナルペプチドを含みうる。そのようなシグナルペプチドはタンパク質をT細胞膜の表面に導くと考えられる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体において、シグナルペプチドは、SEQ ID NO:110に示すアミノおよびアミノ酸配列（SEQ ID NO:111に示すDNA配列によってコードされるもの）を有しうる。
【０１７８】
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるT細胞活性化抗原結合受容体
本明細書に記載する抗原結合受容体の構成要素を、さまざまな構成で互いに融合することで、T細胞活性化抗原結合受容体を作製することができる。
【０１７９】
いくつかの態様において、抗原結合受容体は、重鎖可変ドメイン（VH）とアンカリング膜貫通ドメインに連結された軽鎖可変ドメイン（VL）とで構成される細胞外ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。別の態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインおよび/または共刺激シグナリングドメインをさらに含む。具体的なそのような態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーによって連結された、VHドメインおよびVLドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、および任意で刺激シグナリングドメインからなり、ここで、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に融合され、VLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。任意で、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメインをさらに含む。そのような具体的態様の一つにおいて、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、VHドメインおよびVLドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、刺激シグナリングドメインおよび共刺激シグナリングドメインからなり、ここで、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に融合され、VLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、刺激シグナリングドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。代替の態様では、共刺激シグナリングドメインが、刺激シグナリングドメインにではなくアンカリング膜貫通ドメインに連結される。好ましい態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、VHドメインおよびVLドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインからなり、ここで、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に融合され、VLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。
【０１８０】
好ましい態様において、結合部分のうちの1つはFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントである。好ましい一態様において、抗原結合部分はFabまたはcrossFab重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。代替の態様において、抗原結合部分はFabまたはcrossFab軽鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。別の態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインおよび/または共刺激シグナリングドメインをさらに含む。具体的なそのような態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、FabまたはcrossFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、および任意で刺激シグナリングドメインからなり、ここで、FabまたはcrossFabフラグメントは重鎖または軽鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。好ましくは、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメインをさらに含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、FabまたはcrossFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、刺激シグナリングドメインおよび共刺激シグナリングドメインからなり、ここで、FabまたはcrossFabフラグメントは重鎖または軽鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、刺激シグナリングドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。好ましい態様では、共刺激シグナリングドメインが、刺激シグナリングドメインにではなくアンカリング膜貫通ドメインに連結される。最も好ましい態様において、抗原結合受容体は、本質的に、FabまたはcrossFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインからなり、ここで、FabまたはcrossFabフラグメントは重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端にペプチドリンカーを介して融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。
【０１８１】
抗原結合部分、アンカリング膜貫通ドメインおよび刺激シグナリングおよび/または共刺激シグナリングドメインは、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーであって1つまたは複数のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むものを介して、互いに融合されうる。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であり、本明細書にも記載する。適切な非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば（G4S）n、（SG4）n、（G4S）nまたはG4（SG4）nペプチドリンカーが挙げられ、ここで、「n」は一般的には数字1〜10、典型的には2〜4である。抗原結合部分とアンカリング膜貫通部分とを連結するための好ましいペプチドリンカーは、SEQ ID NO:17のGGGGS（G4S）である。可変重鎖（VH）と可変軽鎖（VL）とを連結するのに適した例示的ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:16の
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である。
【０１８２】
加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部分）を含みうる。特に、抗原結合部分がアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される場合は、それを、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部分を介して、追加のペプチドリンカーありまたはなしで、融合することができる。
【０１８３】
本明細書に記載するように、本発明の抗原結合受容体は少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。標的細胞抗原に対して特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を持つ抗原結合受容体は有用であり、特に、抗原結合受容体の高発現が必要な場合には好ましい。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な抗原結合部分が2つ以上存在すると、それによって、抗原結合受容体の発現効率が制限されうる。しかし他の場合には、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するために、または標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な抗原結合部分を2つ以上含む抗原結合受容体があれば有利であると考えられる。
【０１８４】
一特定態様において、抗原結合受容体は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して、特にIgG1 Fcドメインに対して、特異的に結合することができる抗原結合部分を1つ含む。一態様において、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合部分は、scFv、FabまたはcrossFabである。
【０１８５】
一態様において、抗原結合部分は、scFvフラグメントのC末端またはFab重鎖もしくはcrossFab重鎖のC末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:16）を含む。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい一態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
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のアミノ酸配列を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の各細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
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を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3AおよびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
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を含むか、または同配列からなる。
【０１８６】
一態様において、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端においてeGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーはSEQ ID NO:18の
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である。
【０１８７】
特定の態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvフラグメントであり、前記変異型FcドメインはP329G変異を含む。P329G変異はFcγ受容体結合を低減する。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はscFv-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はscFv-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:17の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０１８８】
特定の態様において、抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFvフラグメントであって、抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０１８９】
好ましい態様において、抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFvであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列RYWMN（SEQ ID NO:1）、CDR H2アミノ酸配列
2020515256.tif 000030
CDR H3アミノ酸配列
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軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
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CDR L2アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:5）およびCDR L3アミノ酸配列
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を含む。
【０１９０】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域（VH）とを含む、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFvフラグメントである、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０１９１】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:32から選択される重鎖可変ドメイン（VH）とSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:33から選択される軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０１９２】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）重鎖可変ドメイン（VH）SEQ ID NO:8と軽鎖可変ドメイン（VL）SEQ ID NO:9とを含む、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０１９３】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０１９４】
特定の態様において、抗原結合部分はP329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができ、抗原結合受容体はSEQ ID NO:31のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１９５】
好ましい態様において、抗原結合部分はP329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができ、抗原結合受容体はSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む。
【０１９６】
好ましい態様において、抗原結合部分はFabフラグメントである。一態様において、抗原結合部分はFab重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020515256.tif 000034
である。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020515256.tif 000035
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3AおよびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020515256.tif 000036
を含むか、または同配列からなる。
【０１９７】
一態様において、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端においてeGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーはSEQ ID NO:18の
2020515256.tif 000037
である。
【０１９８】
特定の態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないFabフラグメントであり、前記変異型FcドメインはP329G変異を含み、P329G変異はFcγ受容体結合を低減する。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:17の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０１９９】
特定の態様において、抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができ、抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含むFabフラグメントである。
【０２００】
好ましい態様において、抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列RYWMN（SEQ ID NO:1）、CDR H2アミノ酸配列
2020515256.tif 000038
CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000039
軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000040
CDR L2アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:5）およびCDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000041
を含む。
【０２０１】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3、SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFab分子である抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２０２】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２０３】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:8の重鎖可変ドメイン（VH）、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:9の軽鎖可変ドメイン（VL）と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２０４】
一態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:49のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:50のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むFabフラグメントである。好ましい態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むFabフラグメントである。
【０２０５】
特定の態様において、抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:48の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:50の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２０６】
好ましい態様において、抗原結合部分は、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２０７】
代替の態様において、抗原結合受容体は、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）の変異を含む変異型Fcドメイン対して、特にIgG1 Fcドメイン対して、特異的に結合することができる抗原結合部分を1つ含む。一態様において、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合部分は、scFv、FabまたはcrossFabである。
【０２０８】
一態様において、抗原結合部分は、scFvフラグメントのC末端またはFab重鎖もしくはcrossFab重鎖のC末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:16）を含む。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい一態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020515256.tif 000042
のアミノ酸配列を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の各細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020515256.tif 000043
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3AおよびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020515256.tif 000044
を含むか、または同配列からなる。
【０２０９】
一態様において、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端においてeGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーはSEQ ID NO:18の
2020515256.tif 000045
である。
【０２１０】
特定の態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvフラグメントであり、前記変異型FcドメインはI253A、H310A、およびH435A変異を含む。I253A、H310A、およびH435A変異はFcRn受容体結合を低減する。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はscFv-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はscFv-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:17の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２１１】
特定の態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFvフラグメントであって、抗原結合部分は、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54およびSEQ ID NO:55からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０２１２】
好ましい態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFvであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列SYGMS（SEQ ID NO:53）、CDR H2アミノ酸配列SSGGSY（SEQ ID NO:54）、CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000046
軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000047
CDR L2アミノ酸配列KVSNRFS（SEQ ID NO:57）およびCDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000048
を含む。
【０２１３】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:53の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:54の重鎖CDR2、SEQ ID NO:55の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:56の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:57の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:58の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域（VH）とを含む、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFvフラグメントである、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２１４】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:61の重鎖可変ドメイン（VH）とSEQ ID NO:62の軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２１５】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:60のアミノ酸配列を含む、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２１６】
特定の態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができ、抗原結合受容体はSEQ ID NO:59のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２１７】
好ましい態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができ、抗原結合受容体はSEQ ID NO:595のアミノ酸配列を含む。
【０２１８】
好ましい態様において、抗原結合部分はFabフラグメントである。一態様において、抗原結合部分はFab重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい一態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。一特定態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020515256.tif 000049
である。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020515256.tif 000050
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3AおよびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定の態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020515256.tif 000051
を含むか、または同配列からなる。
【０２１９】
一態様において、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端においてeGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーはSEQ ID NO:18の
2020515256.tif 000052
である。
【０２２０】
特定の態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないFabフラグメントであり、前記変異型FcドメインはI253A、H310A、およびH435A変異を含み、I253A、H310A、およびH435A変異はFcRn受容体結合を低減する。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい一態様において、抗原結合受容体はFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:17の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２２１】
特定の態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができ、抗原結合部分は、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54およびSEQ ID NO:55からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含むFabフラグメントである。
【０２２２】
好ましい態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列SYGMS（SEQ ID NO:53）、CDR H2アミノ酸配列SSGGSY（SEQ ID NO:54）、CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000053
軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000054
CDR L2アミノ酸配列KVSNRFS（SEQ ID NO:57）およびCDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000055
を含む。
【０２２３】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:53の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:54の重鎖CDR2、SEQ ID NO:55の重鎖CDR3、SEQ ID NO:56の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:57の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:58の軽鎖CDR3を含む、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFab分子である抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２２４】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:53の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:54の重鎖CDR2、SEQ ID NO:55の重鎖CDR3を含む重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:56の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:57の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:58の軽鎖CDR3を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２２５】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:61の重鎖可変ドメイン（VH）、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:17のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:11のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:12の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:13の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:62の軽鎖可変ドメイン（VL）と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２２６】
一特定態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:64のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:65のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むFabフラグメントである。
【０２２７】
特定の態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:63のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:65のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２２８】
好ましい態様において、抗原結合部分は、I253A、H310A、およびH435A変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:63のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:65のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２２９】
一定の代替の態様において、本発明の抗原結合受容体、Fab軽鎖ポリペプチドおよびFab重鎖融合ポリペプチドは、任意でリンカーペプチドを介して、互いに融合される。Fabの重鎖と軽鎖の融合はFabの重鎖と軽鎖のペアリングを改良することができ、またいくつかの本発明の抗原結合受容体の発現に必要なプラスミドの数を低減する。抗原結合受容体の発現に必要なプラスミドの数を低減するための代替の戦略は、例えば図2において説明するように、重鎖構築物と軽鎖構築物の両方を同じプラスミドから発現させることができるように、配列内リボソーム進入サイド（internal ribosomal entry side）を使用することである。
【０２３０】
一定の態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分のFab軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分のFab重鎖定常領域と共有しているポリペプチドを含み（すなわち抗原結合部分は重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられたcrossFab重鎖を含む）、そしてそのポリペプチドはカルボキシ末端ペプチド結合をアンカリング膜貫通ドメインと共有する（VL（1）-CH1（1）-ATD）。いくつかの態様において、抗原結合受容体は、第1の抗原結合部分のFab重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第1の抗原結合部分のFab軽鎖定常領域と共有しているポリペプチド（VH（1）-CL（1））を、さらに含む。一定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合で連結される。代替の態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分のFab重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分のFab軽鎖定常領域と共有しているポリペプチドを含み（すなわち抗原結合部分は重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられたcrossFab重鎖を含む）、そしてそのポリペプチドはカルボキシ末端ペプチド結合をアンカリング膜貫通ドメインと共有する（VH（1）-CL（1）-ATD）。いくつかの態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分のFab軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分のFab重鎖定常領域と共有しているポリペプチド（VL（1）-CH1（1））をさらに含む。一定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合で連結される。
【０２３１】
上記の態様のいずれかでは、抗原結合受容体の構成要素（例:VHおよびVL、抗原結合部分、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメイン、刺激シグナリングドメイン）を直接的に融合するか、さまざまなリンカー、特に、本明細書に記載する、または当技術分野において公知の、1つまたは複数のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合することができる。適切な非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば（G4S）n、（SG4）n、（G4S）nまたはG4（SG4）nペプチドリンカーが挙げられ、ここで、nは概して数字1〜10、好ましくは1〜4である。
【０２３２】
例示的なT細胞活性化抗原結合受容体
添付の実施例および図1Aに例示するように、本発明の概念実証として、FcドメインにP329G変異を含む抗体に結合し/同抗体を指向し/同抗体とまたは同抗体において相互作用する安定化scFv抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17096」（SEQ ID NO:7）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗体結合分子「抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17096」の配列（アミノ酸およびcDNA）を表2および表3に示す。
【０２３３】
さらにまた、図1Bにおいて説明するように、本発明のさらなる概念実証として、FcドメインにP329G変異を含む抗体に結合し/同抗体を指向し/同抗体とまたは同抗体において相互作用する安定化Fab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17100」（SEQ ID NO:39、41）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17100」の配列（アミノ酸およびDNA）を表4および表5に示す。
【０２３４】
本発明のさらなる概念実証として、FcドメインにP329G変異を含む抗体に結合し/同抗体を指向し/同抗体とまたは同抗体において相互作用するFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17594」（SEQ ID NO:48、50）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17594」の配列（アミノ酸およびDNA）を表6および表7に示す。
【０２３５】
本発明のさらなる概念実証として、FcドメインにI253A、H310A、およびH435A変異を含む抗体に結合し/同抗体を指向し/同抗体とまたは同抗体において相互作用するscFv抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗AAA scFv」（SEQ ID NO:59）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗体結合分子「抗AAA scFv」の配列（アミノ酸およびcDNA）を表8よび表9に示す。
【０２３６】
本発明のさらなる概念実証として、FcドメインにI253A、H310A、およびH435A変異を含む抗体に結合し/同抗体を指向し/同抗体とまたは同抗体において相互作用するFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗AAA Fab」（SEQ ID NO:63、65）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗体結合分子「抗AAA scFv」の配列（アミノ酸およびcDNA）を表10よび表11に示す。
【０２３７】
本発明は、本明細書に記載の本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子も提供する。また、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子、および本明細書においてさらに記載する本発明の核酸分子を含むキットも、本発明に包含される。
【０２３８】
キット
本発明のさらなる局面は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸および/または本発明の抗原結合受容体が形質導入された細胞、好ましくはT細胞、ならびに任意で、変異型Fcドメインを含む1種または複数種の抗体を含むか、それらからなるキットであって、抗原結合受容体が変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる、キットである。
【０２３９】
したがって、
（A）本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キットが提供される。
【０２４０】
さらに、
（A）本発明の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドおよび/またはベクターと、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
抗原結合受容体は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キットが提供される。
【０２４１】
本発明との関連において、本発明のキットは、形質導入T細胞、単離されたポリヌクレオチドおよび/またはベクター、ならびに変異型Fcドメインを含む1種または複数種の抗体を含みうる。特定の態様において、抗体は治療用抗体、例えば腫瘍特異的抗体である。腫瘍特異的抗原は当技術分野において公知であり、本明細書にも記載する。本発明との関連において、抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される。本発明のキットは形質導入T細胞または形質導入T細胞を作製するためのポリヌクレオチド/ベクターを含む。この場合、形質導入T細胞は、所与の腫瘍に特異的であるわけではなく、変異型Fcドメインを含む治療用抗体次第で任意の腫瘍に向かわせることができるので、汎用のT細胞である。変異型Fcドメインを含む抗体の例は本明細書に掲載するが、本明細書に記載の変異型Fcドメインを含む抗体はどれでも、本明細書に提供されるキットに含めることができる。特定の態様において、抗体の変異型Fcドメインは、ネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低減した結合アフィニティーおよび/または低減したエフェクター機能を呈する。そのような態様の一つにおいて、変異型Fcドメイン（または該Fc変異型ドメインを含む抗体）は、ネイティブIgG1 Fcドメイン（またはネイティブIgG1 Fcドメインを含む抗体）と比較して、Fc受容体に対して50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満の結合アフィニティー、および/またはネイティブIgG1 Fcドメイン（またはネイティブIgG1 Fcドメインを含む抗体）と比較して、50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満のエフェクター機能を呈する。一態様において、変異型Fcドメイン（または該変異型Fcドメインを含む抗体）は、実質的に、Fc受容体に結合せず、かつ/またはエフェクター機能を誘導しない。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。一態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。一態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。具体的一態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRIまたはFcγRIIa、最も具体的にはヒトFcγRIIIaである。一態様において、エフェクター機能は、CDC、ADCC、ADCPおよびサイトカイン分泌の群から選択される1つまたは複数である。特定の態様において、エフェクター機能はADCCである。一態様において、変異型Fcドメインは、ネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、新生児型Fc受容体（FcRn）に対して、実質的に改変された結合アフィニティーを呈する。一態様において、変異型Fcドメインを含む抗体は、非改変Fcドメインを含む抗体と比較して、Fc受容体に対して、20％未満、特に10％未満、特に5％未満の結合アフィニティーを呈する。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。いくつかの態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。いくつかの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。具体的態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRIまたはFcγRIIa、最も具体的にはヒトFcγRIIIaである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が低減する。いくつかの態様において、補体成分に対する結合アフィニティー、特にC1qに対する結合アフィニティーも低減する。
【０２４２】
一定の態様において、抗体のFcドメインは、非変異型Fcドメインと比較して低減したエフェクター機能を有するように変異している。エフェクター機能の低減は、以下のうちの1つまたは複数を含みうるが、それらに限定されるわけではない:補体依存性細胞傷害（CDC）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の低減、抗体依存性細胞貪食（ADCP）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体介在性抗原取り込みの低減、NK細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナリングの低減、標的に結合した抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、またはT細胞プライミングの低減。一態様において、低減したエフェクター機能は、低減したCDC、低減したADCC、低減したADCPおよび低減したサイトカイン分泌の群から選択される1つまたは複数である。特定の態様において、低減したエフェクター機能は低減したADCCである。一態様において、低減したADCCは、非改変Fcドメイン（または非改変Fcドメインを含む抗体）によって誘導されるADCCの20％未満である。
【０２４３】
一態様において、Fc受容体に対するFcドメインの結合アフィニティーおよび/またはエフェクター機能を低減するアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様において、Fcドメインは、E233、L234、L235、N297、P331、およびP329の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、Fcドメインは、L234、L235、およびP329の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Fcドメインはアミノ酸置換L234AおよびL235Aを含む。そのような態様の一つにおいて、FcドメインはIgG1 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。一態様において、Fcドメインは位置P329にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換はP329AまたはP329G、特にP329Gである。一態様において、Fcドメインは、位置P329にアミノ酸置換を含み、E233、L234、L235、N297、およびP331から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、前記さらなるアミノ酸置換は、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sである。特定の態様において、Fcドメインは、位置P329、L234、およびL235にアミノ酸置換を含む。一態様において、Fcドメインはアミノ酸変異L234A、L235A、およびP329G（「P329G LALA」）を含む。そのような態様の一つにおいて、FcドメインはIgG1 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。アミノ酸置換の組み合わせ「P329G LALA」は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 2012/130831に記載されているとおり、ヒトIgG1 FcドメインのFcγ受容体（および補体）結合をほとんど完全に消失させる。WO 2012/130831には、そのような変異種Fcドメインを調製する方法、およびその性質、例えばFc受容体結合またはエフェクター機能を決定するための方法も記載されている。
【０２４４】
一特定態様において、ネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低減した結合アフィニティーおよび/または低減したエフェクター機能を呈するFcドメインは、アミノ酸変異L234A、L235A、および任意でP329Gを含むヒトIgG1 Fcドメイン、またはアミノ酸変異S228P、L235Eおよび任意でP329Gを含むヒトIgG4 Fcドメインである。
【０２４５】
一定の態様では、FcドメインのN-グリコシル化が排除されている。そのような態様の一つにおいて、Fcドメインは位置N297にアミノ酸変異を含み、特にアスパラギンをアラニン（N297A）またはアスパラギン酸（N297D）で置き換えるアミノ酸変異を含む。
【０２４６】
上述のFcドメインおよびPCT公開番号WO 2012/130831に記載のFcドメインの他に、低減したFc受容体結合および/または低減したエフェクター機能を持つFcドメインとして、Fcドメインの238、265、269、270、297、327、および329番目の残基のうちの1つまたは複数の変異を持つもの（米国特許第6,737,056号）も挙げられる。そのようなFc変異種として、265および297番目の残基のアラニンへの変異を持ついわゆる「DANA」Fc変異種を含む、265、269、270、297、および327番目のアミノ酸のうちの2つ以上に変異を持つFc変異種が挙げられる（米国特許第7,332,581号）。
【０２４７】
変異種Fcドメインは、当技術分野において周知の遺伝学的方法または化学的方法を使用し、アミノ酸の欠失、置換、挿入または修飾によって調製することができる。遺伝学的方法としては、コードDNA配列の部位特異的変異導入、PCR、遺伝子合成などを挙げることができる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
【０２４８】
Fc受容体への結合は、例えばELISAによって、またはBIAcore計器（GE Healthcare）などの標準的計測手段を用いる表面プラズモン共鳴（SPR）によって、容易に決定することができ、Fc受容体は組換え発現によって得ることができる。あるいは、Fc受容体に対するFcドメインの、またはFcドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、結合アフィニティーは、FcγIIIa受容体を発現するヒトNK細胞などといった特定のFc受容体を発現することが公知の細胞株を使って評価しうる。
【０２４９】
Fcドメインの、またはFcドメインを含む抗体の、エフェクター機能は、当技術分野において公知の方法によって測定することができる。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第5,500,362号、Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063（1986）およびHellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502（1985）、米国特許第5,821,337号、Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361（1987）に記載されている。あるいは、非放射性のアッセイ方法を使用してもよい（例えばフローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology,Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）、およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が挙げられる。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656  （1998）に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。
【０２５０】
いくつかの態様では、補体成分への、特にC1qへの、Fcドメインの結合が低減する。したがって、低減したエフェクター機能を有するようにFcドメインが工学的に操作されているいくつかの態様では、低減したエフェクター機能として、低減したCDCが挙げられる。抗体がC1qに結合することができ、それゆえにCDC活性を有するかどうかを決定するために、C1q結合アッセイを実行することができる。例えばWO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するためにCDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163（1996）、Cragg et al.,Blood 101,1045-1052（2003）およびCragg and Glennie,Blood 103,2738-2743（2004）を参照されたい）。
【０２５１】
一態様では、新生児型Fc受容体（FcRn）に対する結合アフィニティーが低減する。特定の態様において、本発明の変異型Fcドメインは、ネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、FcRn受容体に対して低減した結合アフィニティーを呈する。そのような態様の一つにおいて、Fcドメイン（または該Fcドメインを含む抗体）は、ネイティブIgG1 Fcドメイン（またはネイティブIgG1 Fcドメインを含む抗体）と比較して、新生児型Fc受容体に対して50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満の結合アフィニティー、および/またはネイティブIgG1 Fcドメイン（またはネイティブIgG1 Fcドメインを含む抗体）と比較して、50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満のエフェクター機能を呈する。一態様において、変異型Fcドメイン（または該変異型Fcドメインを含む抗体）は、実質的に、新生児型Fc受容体に結合しない。特定の態様において、Fc受容体はFcRn受容体である。一態様において、Fc受容体はヒトFcRn受容体である。特定の態様において、Fcドメインは、位置I253、H310、およびH435にアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、FcドメインはI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含む。そのような態様の一つにおいて、FcドメインはIgG1 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。アミノ酸置換の組み合わせ「AAA」はヒトIgG1 FcドメインのFcRn受容体結合をほとんど完全に消失させる。
【０２５２】
具体的態様において、変異型Fc領域を含む抗体はCD20に対して特異的に結合することができ、SEQ ID NO:112の重鎖配列とSEQ ID NO:113の軽鎖配列とを含む。一態様において、変異型Fc領域を含む抗体はFAPに対して特異的に結合することができ、SEQ ID NO:114の重鎖配列とSEQ ID NO:115の軽鎖配列とを含む。一態様において、変異型Fc領域を含む抗体はCEAに対して特異的に結合することができ、SEQ ID NO:116の重鎖配列とSEQ ID NO:117の軽鎖配列、SEQ ID NO:118の重鎖配列とSEQ ID NO:119の軽鎖配列、SEQ ID NO:120の重鎖配列とSEQ ID NO:121の軽鎖配列、またはSEQ ID NO:122の重鎖配列とSEQ ID NO:123の軽鎖配列を含む。さらなる態様において、変異型Fc領域を含む抗体はテネイシン（TNC）に対して特異的に結合することができ、SEQ ID NO:124の重鎖配列とSEQ ID NO:125の軽鎖配列とを含む。
【０２５３】
さらなる態様において、変異型Fc領域を含む抗体は、二重特異性抗体、例えばT細胞活性化二重特異性抗体である。そのような態様の一つにおいて、二重特異性抗体は、T細胞活性化標的に対して、特にCD3に対して、特異的に結合することができる第1の結合部分と、本明細書に記載の腫瘍抗原に対して特異的に結合することができる第2の結合部分とを含む。
【０２５４】
一態様において、変異型Fc領域を含む抗体は二重特異性であって、Her2に対して特異的に結合することができ、この二重特異性抗体は、SEQ ID NO:126の第1の重鎖配列、SEQ ID NO:127の第1の軽鎖配列、SEQ ID NO:128の第2の重鎖配列およびSEQ ID NO:129の第2の軽鎖配列を含む。
【０２５５】
本発明の例示的態様では、概念実証として、SEQ ID NO:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗体と組み合わされた、SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列（「抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:19に示すDNA配列によってコードされるもの））を含むキットが提供される。あるいは、キットは、SEQ ID NO:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗体と組み合わされた、SEQ ID NO:31に示すアミノ酸配列（「抗P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:35に示すDNA配列によってコードされるもの））を含みうる。さらにまた、本発明との関連において、キットは、SEQ ID NO:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗体と組み合わされた、SEQ ID NO:39に示すアミノ酸配列（「抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:44に示すDNA配列によってコードされるもの））を含みうる。あるいは、キットは、SEQ ID NO:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗体と組み合わされた、SEQ ID NO:48に示すアミノ酸配列（「抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:51に示すDNA配列によってコードされるもの））を含みうる。あるいは、キットは、SEQ ID NO:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗体と組み合わされた、SEQ ID NO:59に示すアミノ酸配列（「抗AAA-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」）を含みうる。さらにまた、本発明との関連において、キットは、SEQ ID NO:112の重鎖とSEQ ID NO:113の軽鎖とを含む抗体と組み合わされた、SEQ ID NO:63に示すアミノ酸配列（「抗AAA-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」）を含みうる。さらにまた、本発明との関連において、キットは、SEQ ID NO:112およびSEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114およびSEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116およびSEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118およびSEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120およびSEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122およびSEQ ID NO:123、ならびにSEQ ID NO:124およびSEQ ID NO:125からなる群より選択される重鎖および軽鎖を含む抗体分子を少なくとも1つは含みうる。さらにまた、本発明との関連において、キットは、二重特異性抗体分子、特にSEQ ID NO:128の第1の重鎖、SEQ ID NO:129の第1の軽鎖、SEQ ID NO:130の第2の重鎖およびSEQ ID NO:131の第2の軽鎖を含む二重特異性抗体を含みうる。
【０２５６】
さらにまた、本発明のキットのパーツは、バイアルもしくは瓶に個別に包装するか、または組み合わせて容器もしくは多容器ユニットに包装することができる。加えて、本発明のキットは、GMP（欧州委員会がhttp://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index＿en.htmに公表している適正製造規範に関するガイドラインに記載されている適正製造規範）条件下で患者の細胞、好ましくは本明細書に記載のT細胞に、本発明の抗原結合受容体を形質導入し、それをインキュベートすることができる、（閉鎖型）バッグ細胞インキュベーションシステムも含みうる。さらにまた、本発明のキットは、単離/取得された患者のT細胞に、GMP下で、本発明の抗原結合受容体を形質導入し、それをインキュベートすることができる（閉鎖型）バッグ細胞インキュベーションシステムを含む。さらにまた、本発明との関連において、キットは本明細書に記載の抗原結合受容体をコードするベクターも含みうる。本発明のキットは、なかんずく本発明の方法を実行するために有利に使用することができ、本明細書において言及するさまざまな応用において、例えば研究ツールとしてまたは医用ツールとして使用できる。キットの製造は、好ましくは、当業者にとって公知の標準的な手順に従う。
【０２５７】
これに関連して、患者由来の細胞、好ましくはT細胞には、上述のキットを使って、本明細書に記載する変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる本発明の抗原結合受容体を形質導入することができる。変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインは、T細胞中またはT細胞上に天然には見いだされない。したがって、本発明のキットを使って形質導入された患者由来細胞は、抗体、例えば治療用抗体の変異型Fcドメインに対して特異的に結合する能力を獲得し、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって腫瘍細胞の表面に天然に存在する（すなわち内在的に発現される）腫瘍特異的抗原に結合することができる治療用抗体との相互作用を介して、標的細胞の排除/溶解を誘導することができるようになるであろう。本明細書に記載の抗原結合受容体の細胞外ドメインの結合は、当該T細胞を活性化すると共に、それを、変異型Fcドメインを含む治療用抗体を介して腫瘍細胞と物理的に接触させる。非形質導入T細胞、すなわち内在性T細胞（例えばCD8＋T細胞）は、変異型Fcドメインを含む治療用抗体の変異型Fcドメインに結合することができない。変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる細胞外ドメインを含む抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞が、本明細書に記載のFcドメイン中の変異を含まない治療用抗体による影響を受けることはない。したがって、本発明の抗原結合受容体分子を発現するT細胞は、インビボおよび/またはインビトロで、標的細胞を、本明細書に記載するようにFcドメイン中に変異を含む抗体の存在下で溶解する能力を有する。対応する標的細胞は、本明細書に記載の治療用抗体の少なくとも1つの、好ましくは2つの、結合ドメインによって認識される、腫瘍細胞の表面に天然に存在する表面分子、すなわち腫瘍特異的抗原を発現する細胞を含む。そのような表面分子を本明細書では後で特徴づける。
【０２５８】
標的細胞の溶解は当技術分野において公知の方法によって検出することができる。したがってそのような方法は、なかんずく、生理学的インビトロアッセイを含む。そのような生理学的アッセイは、例えば細胞膜完全性の喪失（例:FACSに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光的酵素放出アッセイ（LDH）、放射測定的51Cr放出アッセイ、蛍光測定的ユーロピウム放出およびカルセインAM放出アッセイ）によって、細胞死をモニターしうる。さらなるアッセイは、例えば測光的MTT、XTT、WST-1およびalamarBlueアッセイ、放射測定的3H-Thd組み込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクロノジェニックアッセイ、およびミトコンドリア膜内外勾配を測定する蛍光測定的ローダミン123アッセイによる、細胞生存率のモニタリングを含む。また、例えばFACSに基づくホスファチジルセリン露出アッセイ、ELISAに基づくTUNEL試験、カスパーゼ活性アッセイ（測光的アッセイ、蛍光測定的アッセイまたはELISAに基づくアッセイ）によって、または変化した細胞形態（萎縮、膜の小胞化）を分析することによって、アポトーシスをモニターすることもできる。
【０２５９】
本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞
本発明のさらなる局面は、本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞である。本明細書に記載の抗原結合受容体は、本来はT細胞の中および/または表面に含まれず、正常な（非形質導入）T細胞の中または上に（内在性には）発現しない分子に関する。したがって、T細胞の中および/または上の本発明の抗原結合受容体は、T細胞に人工的に導入される。本発明との関連において、T細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、本明細書に定義する処置されるべき対象から単離/取得されうる。したがって、T細胞の中および/または表面上に人工的に導入され、次いで提示される本明細書記載の抗原結合受容体は、（Ig由来）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のFcドメインに（インビトロまたはインビボで）アクセスできる1つまたは複数の抗原結合部分を含むドメインを含む。本発明との関連において、人工的に導入されるこれらの分子は、後述する（レトロウイルスまたはレンチウイルス）形質導入後に、T細胞の中および/または表面上に提示される。したがって、形質導入後の本発明のT細胞は、免疫グロブリン、好ましくは本明細書に記載のFcドメインに特定の変異を含む（治療用）抗体によって、活性化することができる。
【０２６０】
本発明は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞にも関係する。したがって本発明との関連において、形質導入細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子または本発明の抗原結合受容体を発現する本発明のベクターを含みうる。
【０２６１】
本発明との関連において、「形質導入T細胞」という用語は、遺伝子修飾されたT細胞（すなわち核酸分子が故意に導入されたT細胞）に関する。本明細書に提供される形質導入T細胞は本発明のベクターを含みうる。好ましくは、本明細書に提供される形質導入T細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子および/または本発明のベクターを含む。本発明の形質導入T細胞は、外来DNA（すなわちT細胞中に導入された核酸分子）を一過性または安定に発現するT細胞でありうる。特に、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子は、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入を使って、T細胞のゲノム中に安定に組み込むことができる。mRNA形質導入を使って、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を一過性に発現させてもよい。好ましくは、本明細書に提供される形質導入T細胞は、ウイルスベクター（例:レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を介してT細胞中に核酸分子を導入することにより、遺伝子修飾されている。したがって、抗原結合受容体の発現は恒常的であることができ、抗原結合受容体の細胞外ドメインは細胞表面上に検出可能でありうる。抗原結合受容体のこの細胞外ドメインは、本明細書に定義する抗原結合受容体の細胞外ドメイン全体を含みうるが、そのパーツを含むこともできる。必要な最低限のサイズは、抗原結合受容体中の抗原結合部分の抗原結合部位である。
【０２６２】
抗原結合受容体が誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターの制御下でT細胞に導入される場合、発現は条件付きまたは誘導性であることもできる。そのような誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーターおよび転写活性化因子タンパク質AlcRを含有する転写系であることができる。alcAプロモーターに連結された関心対象の遺伝子の発現を制御するには、さまざまな農業アルコール系製剤が使用される。さらにまた、テトラサイクリン応答性プロモーター系は、テトラサイクリンの存在下で遺伝子発現系を活性化または抑制するように機能することができる。この系の要素をいくつか挙げると、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetR）、テトラサイクリンオペレーター配列（tetO）、およびTetRと単純ヘルペスウイルスタンパク質16（VP16）活性化配列の融合物であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（tTA）がある。さらに、ステロイド応答性プロモーター、金属調節性プロモーターまたは病原性関連（PR）タンパク質関連プロモーターを使用することができる。
【０２６３】
発現は使用する系に応じて、恒常的（constitutive）または構成的（constitutional）であることができる。本発明の抗原結合受容体は、本明細書に提供される形質導入T細胞の表面に発現されうる。抗原結合受容体の細胞外部分（すなわち、抗原結合受容体の細胞外ドメインは細胞表面に検出することができ、一方、細胞内部分（すなわち共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメイン）は、細胞表面には検出することができない。抗原結合受容体の細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使うことによって、または細胞外ドメインが結合することのできる変異型Fcドメインによって、実行することができる。細胞外ドメインは、これらの抗体またはFcドメインを使用し、フローサイトメトリーまたは顕微鏡法によって検出することができる。
【０２６４】
本発明の形質導入細胞は任意の免疫細胞でありうる。これには、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）T細胞、γδ型T細胞、自然リンパ系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、または好中球などがあるが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、該免疫細胞はリンパ球、好ましくはNK細胞またはT細胞である。該T細胞にはCD4 T細胞およびCD8 T細胞が含まれる。白血球表面における本発明の抗原結合受容体のトリガリングは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体と併用して、その細胞が由来する系譜とは無関係に、その細胞を、標的細胞に対して細胞傷害性にすると考えられる。細胞傷害性は、抗原結合受容体のために選んだ刺激シグナリングドメインまたは共刺激シグナリングドメインとは関係なく生じ、追加サイトカインの外からの供給に依存しない。したがって、本発明の形質導入細胞は、例えばCD4＋T細胞、CD8＋-T細胞、γδ型T細胞、ナチュラルキラー（NK）T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、腫瘍浸潤性（TIL）細胞、骨髄性細胞、または間葉系幹細胞でありうる。好ましくは、本明細書に提供される形質導入細胞はT細胞（例えば自家T細胞）であり、より好ましくは形質導入細胞はCD8＋T細胞である。したがって、本発明との関連において、形質導入細胞はCD8＋T細胞である。さらに、本発明との関連において、形質導入細胞は自家T細胞である。したがって、本発明との関連において、形質導入細胞は好ましくは自家CD8＋T細胞である。対象から単離された自家細胞（例えばT細胞）の使用に加えて、本発明は同種異系細胞の使用も包含する。したがって、本発明との関連において、形質導入細胞は同種異系細胞、例えば同種異系CD8＋T細胞であることもできる。同種異系細胞の使用は、特異的応答細胞集団、すなわちT細胞集団が拘束されるMHC分子クラスIまたはクラスIIを、外来抗原提示細胞（APC）が、T細胞によって認識される抗原エピトープと共に発現するのであれば、細胞、好ましくはT細胞はAPCによって提示された特異的抗原エピトープを認識することができるという事実に基づく。したがって同種異系という用語は、例えば本明細書に記載する抗原結合受容体発現形質導入細胞によって処置される予定の個体/対象とヒト白血球抗原（HLA）適合性である非血縁ドナー個体/対象から得られる細胞を指す。自家細胞とは、本明細書に記載の形質導入細胞で処置される対象から上述のように単離/取得される細胞を指す。
【０２６５】
本発明の形質導入細胞には、さらなる核酸分子、例えばT細胞受容体をコードする核酸分子を、共形質導入することができる。
【０２６６】
本発明は、T細胞に本発明のベクターを形質導入する工程、形質導入T細胞を該形質導入細胞の中または上での抗原結合受容体の発現が可能な条件下で培養する工程、および該形質導入T細胞を回収する工程を含む、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の生産方法にも関係する。
【０２６７】
本発明との関連において、本発明の形質導入細胞は、好ましくは、以下のプロセスによって生産される:細胞（例:T細胞、好ましくはCD8＋T細胞）を対象（好ましくはヒト患者）から単離/取得する。患者またはドナーから細胞（例:T細胞、好ましくはCD8＋T細胞）を単離/取得するための方法は当技術分野において周知であり、本発明との関連において、患者またはドナーからの細胞（例:T細胞、好ましくはCD8＋T細胞）は採血または骨髄採取によって単離することができる。患者の試料として細胞を単離/取得した後、細胞（例:T細胞）を試料の他の成分から分離する。細胞（例:T細胞）を試料から分離するための方法はいくつか公知であり、これには、例えば患者またはドナーの末梢血から細胞を得るための白血球アフェレーシス、FACSort装置を使用することによる細胞の単離/取得、生細胞を内包する新鮮生検試料において生細胞を死細胞から手作業でまたはマイクロマニピュレーターを使って取り出すことなどがあるが、それらに限定されるわけではない（例えばDudley,Immunother.26（2003）,332-342、Robbins,Clin.Oncol.29（2011）,917-924またはLeisegang,J.Mol.Med.86（2008）,573-58参照）。単離/取得された細胞、例えばT細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、次に、例えば抗CD3抗体を使用することによって、抗CD3モノクローナル抗体および抗CD28モノクローナル抗体を使用することによって、かつ/または抗CD3抗体、抗CD28抗体およびインターロイキン2（IL-2）を使用することによって培養され、増殖させる（例えばDudley,Immunother.26（2003）,332-342またはDudley,Clin.Oncol.26（2008）,5233-5239参照）。
【０２６８】
次の工程では、当技術分野において公知の方法により、細胞（例:T細胞）に、人工的/遺伝子的な修飾/形質導入を行う（例えばLemoine,J Gene Med 6（2004）,374-386参照）。細胞（例:T細胞）に形質導入する方法は、当技術分野において公知であり、これには、核酸または組換え核酸が形質導入される場合であれば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法またはリポソーム法があるが、それらに限定されるわけではない。形質導入される核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えばLipofectamine（Invitrogen製、カタログ番号:11668027）を使用することにより、従来法で高効率に形質導入されうる。ベクターを使用する場合、そのベクターがプラスミドベクター（すなわちウイルスベクターではないベクター）である限り、ベクターは上述の核酸と同じ方法で形質導入することができる。本発明との関連において、細胞（例:T細胞）に形質導入するための方法には、レトロウイルスT細胞形質導入またはレンチウイルスT細胞形質導入、非ウイルスベクター（例:スリーピング・ビューティーミニサークルベクター）ならびにmRNAトランスフェクションが含まれる。「mRNAトランスフェクション」とは、本件の場合であれば本発明の抗原結合受容体のような関心対象のタンパク質を、形質導入される細胞において一過性に発現させるための、当業者に周知の方法を指す。簡単に述べると、本発明の抗原結合受容体をコードするmRNAを、エレクトロポレーションシステム（例えばGene-Pulser、Bio-Radなど）を使って、細胞にエレクトロポレートした後、上述の標準的細胞（例:T細胞）培養プロトコールによって培養することができる（Zhao et al.,Mol Ther.13（1）（2006）,151-159参照）。本発明の形質導入細胞はT細胞、最も好ましくはCD8＋T細胞であり、レンチウイルスT細胞形質導入、または最も好ましくはレトロウイルスT細胞形質導入によって作製される。
【０２６９】
これに関連して、T細胞に形質導入を行うための適切なレトロウイルスベクターは、SAMEN CMV/SRa（Clay et al.,J.Immunol.163（1999）,507-513）、LZRS-id3-IHRES（Heemskerk et al.,J.Exp.Med.186（1997）,1597-1602）、FeLV（Neil et al.,Nature 308（1984）,814-820）、SAX（Kantoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83（1986）,6563-6567）、pDOL（Desiderio,J.Exp.Med.167（1988）,372-388）、N2（Kasid et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87（1990）,473-477）、LNL6（Tiberghien et al.,Blood 84（1994）,1333-1341）、pZipNEO（Chen et al.,J.Immunol.153（1994）,3630-3638）、LASN（Mullen et al.,Hum.Gene Ther.7（1996）,1123-1129）、pG1XsNa（Taylor et al.,J.Exp.Med.184（1996）,2031-2036）、LCNX（Sun et al.,Hum.Gene Ther.8（1997）,1041-1048）、SFG（Gallardo et al.,Blood 90（1997）、およびLXSN（Sun et al.,Hum.Gene Ther.8（1997）,1041-1048）、SFG（Gallardo et al.,Blood 90（1997）,952-957）、HMB-Hb-Hu（Vieillard et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94（1997）,11595-11600）、pMV7（Cochlovius et al.,Cancer Immunol.Immunother.46（1998）,61-66）、pSTITCH（Weitjens et al.,Gene Ther 5（1998）,1195-1203）、pLZR（Yang et al.,Hum.Gene Ther.10（1999）,123-132）、pBAG（Wu et al.,Hum.Gene Ther.10（1999）,977-982）、rKat.43.267bn（Gilham et al.,J.Immunother.25（2002）,139-151）、pLGSN（Engels et al.,Hum.Gene Ther.14（2003）,1155-1168）、pMP71（Engels et al.,Hum.Gene Ther.14（2003）,1155-1168）、pGCSAM（Morgan et al.,J.Immunol.171（2003）,3287-3295）、pMSGV（Zhao et al.,J.Immunol.174（2005）,4415-4423）、またはpMX（de Witte et al.,J.Immunol.181（2008）,5128-5136）など、当技術分野において公知である。本発明との関連において、細胞（例:T細胞）に形質導入を行うための適切なレンチウイルスベクターは、例えばPL-SINレンチウイルスベクター（Hotta et al.,Nat Methods.6（5）（2009）,370-376）、p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI（Campeau et al.,PLoS One 4（8）（2009）,e6529）、pCMVR8.74（Addgeneカタログ番号:22036）、FUGW（Lois et al.,Science 295（5556）（2002）,868-872、pLVX-EF1（Addgeneカタログ番号:64368）、pLVE（Brunger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 111（9）（2014）,E798-806）、pCDH1-MCS1-EF1（Hu et al.,Mol Cancer Res.7（11）（2009）,1756-1770）、pSLIK（Wang et al.,Nat Cell Biol.16（4）（2014）,345-356）、pLJM1（Solomon et al.,Nat Genet.45（12）（2013）,1428-30）、pLX302（Kang et al.,Sci Signal.6（287）（2013）,rs13）、pHR-IG（Xie et al.,J Cereb Blood Flow Metab.33（12）（2013）,1875-85）、pRRLSIN（Addgeneカタログ番号:62053）、pLS（Miyoshi et al.,J Virol.72（10）（1998）,8150-8157）、pLL3.7（Lazebnik et al.,J Biol Chem.283（7）（2008）,11078-82）、FRIG（Raissi et al.,Mol Cell Neurosci.57（2013）,23-32）、pWPT（Ritz-Laser et al.,Diabetologia.46（6）（2003）,810-821）、pBOB（Marr et al.,J Mol Neurosci.22（1-2）（2004）,5-11）、またはpLEX（Addgeneカタログ番号:27976）である。
【０２７０】
形質導入T細胞/本発明のT細胞は、好ましくは、制御された条件において、それらの自然環境外で生育される。特に「培養する」という用語は、多細胞真核生物（好ましくはヒト患者）に由来する細胞（例えば本発明の形質導入細胞）がインビトロで生育されることを意味する。細胞の培養は、それぞれの元の組織供給源から分離された細胞を生かし続ける実験技法である。ここでは、本発明の形質導入細胞が、該形質導入細胞の中または上での本発明の抗原結合受容体の発現が可能な条件下で培養される。移入遺伝子の（すなわち本発明の抗原結合受容体の）発現が可能な条件は当技術分野では一般に公知であり、これには、例えばアゴニスト性の抗CD3抗体および抗CD28抗体、ならびにインターロイキン2（IL-2）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン12（IL-12）および/またはインターロイキン15（IL-15）などのサイトカインの添加が含まれる。培養形質導入細胞（例:CD8＋T）における本発明の抗原結合受容体の発現後に、形質導入細胞を培養から（すなわち培養培地から）回収（すなわち再抽出）する。
【０２７１】
したがって、本発明には、本発明の方法によって得ることができる本発明の核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する形質導入細胞、好ましくはT細胞、特にCD8＋Tも包含される。
【０２７２】
核酸分子
本発明のさらなる局面は、1つまたは数個の本発明の抗原結合受容体をコードする核酸およびベクターである。本発明の抗原結合受容体をコードする例示的核酸分子をSEQ ID NO:19、30、35、38、44、47、51および52に示す。本発明の核酸分子は調節配列の制御を受けうる。例えばプロモーター、転写エンハンサーおよび/または本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にする配列を使用しうる。本発明との関連において、核酸分子は恒常性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で発現する。適切なプロモーターは、例えばCMVプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、UBCプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、PGK（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、EF1Aプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、CAGGプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、SV40プロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、COPIAプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、ACT5Cプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、TREプロモーター（Qin et al.,PLoS One.5（5）（2010）,e10611）、Oct3/4プロモーター（Chang et al.,Molecular Therapy 9（2004）,S367-S367（doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904））、またはNanogプロモーター（Wu et al.,Cell Res.15（5）（2005）,317-24）である。それゆえに本発明は、本発明に記載の核酸分子を含むベクターにも関係する。本明細書においてベクターという用語は、それが導入された宿主細胞において（すなわち形質導入細胞において）自律的に複製することができる環状または線状の核酸分子に関する。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者には公知であって、その選択は所望する機能に依存し、これには、遺伝子工学において従来使用されてきたプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を使ってさまざまなプラスミドおよびベクターを構築することができる。例えば、Sambrook et al.（前掲書）およびAusubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.（1989）,（1994）に記載の技法を参照されたい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを、標的細胞への送達のために、リポソーム中に再構成することもできる。以下にさらに詳述するように、クローニングベクターを使って個々のDNA配列を単離した。特定ポリペプチドの発現が必要な場合は、関連する配列を発現ベクターに移入することができる。典型的クローニングベクターには、pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322、pGA18およびpGBT9がある。典型的発現ベクターには、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CATがある。
【０２７３】
本発明は、本明細書において定義する抗原結合受容体をコードする核酸分子に機能的に連結された調節配列である核酸分子を含むベクターにも関係する。本発明との関連において、ベクターはポリシストロニックであることができる。そのような調節配列（制御要素）は当業者には公知であり、それは、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳、およびベクターにインサートを導入するための挿入部位を含みうる。本発明との関連において、核酸分子は、真核細胞または原核細胞における発現を可能にする発現制御配列に、機能的に連結される。ベクターは、本明細書において定義する抗原結合受容体をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが考えられる。機能的に連結されるとは、そのように記載された複数の構成要素が、それらの意図どおりに機能できるような関係にある並置を指す。コード配列に機能的に連結された制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされている。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましく使用されることは当業者にとって自明である。
【０２７４】
本発明との関連において、具陳するベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができる構築物であり、選択された細胞におけるコード配列の発現をもたらす。発現ベクターは、例えばクローニングベクター、バイナリーベクターまたは組み込み型ベクターであることができる。発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの、核酸分子の転写を含む。原核生物および/または真核細胞における発現を保証する調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは、通常、転写の開始を保証するプロモーター、および任意で、転写の終結と転写産物の安定化を保証するポリAシグナルを含む。原核宿主細胞における発現を可能にする考えうる調節要素は、例えば大腸菌におけるPL、lac、trpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるAOX1もしくはGAL1プロモーター、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
【０２７５】
転写の開始を担う要素の他に、そのような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流にあるSV40ポリA部位またはtkポリA部位などの転写終結シグナルも含みうる。さらにまた、使用する発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントに向かわせるかポリペプチドを培地中に分泌させることができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列を、具陳する核酸配列のコード配列に付加することができ、それらは当技術分野において周知である。例えば添付の実施例も参照されたい。
【０２７６】
リーダー配列は、適当な段階で、翻訳、開始および終結配列、ならびに好ましくは細胞周辺腔または細胞外培地への翻訳されたタンパク質またはその一部分の分泌を指示することができるリーダー配列と組み立てられる。任意で、異種配列は、所望の特徴、例えば発現した組換え産物の安定化または簡略化された精製を与えるN末端同定ペプチドを含む抗原結合受容体をコードすることができる。上記参照。これに関連して、適切な発現ベクターは、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（In-vitrogene）、pEF-DHFR、pEF-ADAまたはpEF-neo（Raum et al.Cancer Immunol Immunother 50（2001）,141-150）またはpSPORT1（GIBCO BRL）など、当技術分野において公知である。
【０２７７】
本発明との関連において、発現制御配列は、真核細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うことができるベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核細胞用の制御配列も使用しうる。適当な細胞にベクターが組み込まれたら、その細胞を、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で、所望どおりに維持する。追加の調節要素は転写および翻訳エンハンサーを含みうる。上述の本発明ベクターは選択可能および/またはスコア化可能（scorable）マーカーを含むと有利である。形質転換された細胞ならびに例えば植物組織および植物の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は当業者には周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Reiss,Plant Physiol.（Life Sci.Adv.）13（1994）,143-149）、アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシンに対する耐性を付与するnpt（Herrera-Estrella,EMBO J.2（1983）,987-995）およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Marsh,Gene 32（1984）,481-485）に関する選択の根拠として、代謝拮抗物質耐性を含む。さらなる選択可能遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することができるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用することができるようにするhisD（Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85（1988）,8047）、細胞がマンノースを利用することができるようにするマンノース-6-リン酸イソメラーゼ（WO 94/20627）およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を付与するODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue,1987,In:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.）またはブラストサイジンSに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59（1995）,2336-2338）も、記載されている。
【０２７８】
有用なスコア化可能マーカーも当業者には公知であり、市販されている。該マーカーはルシフェラーゼ（Giacomin,Pl.Sci.116（1996）,59-72、Scikantha,J.Bact.178（1996）,121）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes,FEBS Lett.389（1996）,44-47）またはβ-グルクロニダーゼ（Jefferson,EMBO J.6（1987）,3901-3907）をコードするマーカーであれば、有利である。この態様は、具陳するベクターを含有する細胞、組織および生物の簡単かつ迅速なスクリーニングにとって、特に有用である。
【０２７９】
上述のとおり、具陳する核酸分子は、単独でまたはベクターの一部として、例えば養子T細胞治療のために、また遺伝子治療目的でも、細胞中で本発明の抗原結合受容体を発現させるために使用することができる。本明細書に記載する抗原結合受容体のいずれか1つをコードするDNA配列を含有する核酸分子またはベクターを細胞中に導入すると、その細胞が関心対象のポリペプチドを生産する。エクスビボ技法またはインビボ技法による細胞への治療遺伝子の導入に基づく遺伝子治療は、遺伝子移入の最も重要な応用の一つである。インビトロ遺伝子治療またはインビボ遺伝子治療のための適切なベクター、方法または遺伝子送達システムは文献に記載があり、当業者には公知である。例えばGiordano,Nature Medicine 2（1996）,534-539、Schaper,Circ.Res.79（1996）,911-919、Anderson,Science 256（1992）,808-813、Verma,Nature 389（1994）,239、Isner,Lancet 348（1996）,370-374、Muhlhauser,Circ.Res.77（1995）,1077-1086、Onodera,Blood 91（1998）,30-36、Verma,Gene Ther.5（1998）,692-699、Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.811（1997）,289-292、Verzeletti,Hum.Gene Ther.9（1998）,2243-51、Wang,Nature Medicine 2（1996）,714-716、WO 94/29469、WO 97/00957、US 5,580,859、US 5,589,466、またはSchaper,Current Opinion in Biotechnology 7（1996）,635-640を参照されたい。具陳する核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用に、またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）による細胞への導入用に、設計することができる。本発明との関連において、細胞は、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD3＋T細胞、γδ型T細胞またはナチュラルキラー（NK）T細胞などのT細胞、好ましくはCD8＋T細胞である。
【０２８０】
上記に従い、本発明は、本明細書において定義する抗原結合受容体のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子工学において従来使用されてきたベクター、特にプラスミド、コスミドおよびバクテリオファージを得るための方法に関する。本発明との関連において、ベクターは発現ベクターおよび/または遺伝子移入ベクターもしくは遺伝子ターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的とする細胞集団への具陳するポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用しうる。
【０２８１】
組換えベクターの構築には当業者に周知の方法を使用することができる。例えばSambrook et al.（前掲書）、Ausubel（1989、前掲書）または他の標準的教科書に記載の技法を参照されたい。あるいは、具陳する核酸分子およびベクターを、標的細胞への送達のために、リポソーム中に再構成することができる。本発明の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに依存してさまざまである周知の方法によって、宿主細胞中に移入することができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるのに対し、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用されうる。上記Sambrook参照。具陳するベクターは、なかんずく、pEF-DHFR、pEF-ADAまたはpEF-neoでありうる。ベクターpEF-DHFR、pEF-ADAおよびpEF-neoは、当技術分野では、例えばMack et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）,7021-7025およびRaum et al.Cancer Immunol Immunother 50（2001）,141-150に記載されている。
【０２８２】
本発明は、本明細書に記載のベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けたT細胞も提供する。該T細胞は、上述のベクターのうちの少なくとも1つまたは上述の核酸分子のうちの少なくとも1つをT細胞またはその前駆細胞中に導入することによって生産されうる。T細胞における該少なくとも1つのベクターまたは少なくとも1つの核酸分子の存在は、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む上述の抗原結合受容体をコードする遺伝子の発現を媒介しうる。本発明のベクターはポリシストロニックであることができる。
【０２８３】
T細胞またはその前駆細胞に導入される記載の核酸分子またはベクターは、細胞のゲノムに組み込まれうるか、染色体外に維持されうる。
【０２８４】
腫瘍特異的抗原
上述のように、変異型Fcドメインを含む本明細書に記載の抗体の（Ig由来）ドメインは、腫瘍細胞の表面に天然に存在する細胞表面分子、すなわち腫瘍特異的抗原に対する特異性を持つ抗原相互作用部位を含みうる。本発明との関連において、そのような抗体は、本発明の抗原結合受容体を含む本明細書に記載の形質導入T細胞を腫瘍細胞と物理的に接触させることになり、そこでは形質導入T細胞が活性型になる。本発明の形質導入T細胞の活性化は、本明細書に記載するように、腫瘍細胞の溶解をもたらすことができる。
【０２８５】
腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍マーカーの例を以下に挙げる。これには、FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）、CEA（がん胎児性抗原）、p95（p95HER2）、BCMA（B細胞成熟抗原）、EpCAM（上皮細胞接着分子）、MSLN（メソテリン）、MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、HER-1（ヒト上皮成長因子1）、HER-2（ヒト上皮成長因子2）、HER-3（ヒト上皮成長因子3）、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、葉酸受容体1（FOLR1）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）がん抗原12-5（CA-12-5）、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、MUC-1（ムチン-1）、A33抗原、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、炭酸脱水酵素（carbon anhydrase）IX（CA-IX）、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２８６】
したがって本発明との関連において、本明細書に記載の抗原結合受容体は、抗体の変異型Fcドメインに、すなわち、下記のものに対して特異的に結合することができる治療用抗体に、結合する：FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）、CEA（がん胎児性抗原）、p95（p95HER2）、BCMA（B細胞成熟抗原）、EpCAM（上皮細胞接着分子）、MSLN（メソテリン）、MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、HER-1（ヒト上皮成長因子1）、HER-2（ヒト上皮成長因子2）、HER-3（ヒト上皮成長因子3）、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、葉酸受容体1（FOLR1）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）がん抗原12-5（CA-12-5）、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、MUC-1（ムチン-1）、A33抗原、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、炭酸脱水酵素IX（CA-IX）、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドからなる群より選択される腫瘍細胞表面に天然に存在する抗原/マーカー。
【０２８７】
A33抗原、BCMA（B細胞成熟抗原）、がん抗原12-5（CA-12-5）、炭酸脱水酵素IX（CA-IX）、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA（がん胎児性抗原）、EpCAM（上皮細胞接着分子）、FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、葉酸受容体1（FOLR1）、HER-1（ヒト上皮成長因子1）、HER-2（ヒト上皮成長因子2）、HER-3（ヒト上皮成長因子3）、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、MSLN（メソテリン）、MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、MUC-1（ムチン-1）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、p95（p95HER2）、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）の（ヒト）メンバーの配列はUniProtKB/Swiss-Protデータベースに見いだすことができ、http://www.uniprot.org/uniprot/?query＝reviewed％3Ayesで検索することができる。これらの（タンパク質）配列は注釈付きの変更された配列（annotated modified sequence）にも関係する。本発明は、本明細書に提供されるコンサイス配列（concise sequence）の相同配列および遺伝的アレル変異体などを使用する技法および方法も提供する。好ましくは、本明細書におけるコンサイス配列のそのような変異体などが使用される。好ましくは、そのような変異体は遺伝的変異体である。当業者は、ゲノムDNAおよびmRNA/cDNAのエントリーも含みうるこれらのデータバンクエントリーにおいて、これらの（タンパク質）配列の関連コード領域を容易に推定することができる。（ヒト）FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ12884（エントリーバージョン168、配列バージョン5）から得ることができ、（ヒト）CEA（がん胎児性抗原）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP06731（エントリーバージョン171、配列バージョン3）から得ることができ、（ヒト）EpCAM（上皮細胞接着分子）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP16422（エントリーバージョン117、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）MSLN（メソテリン）の配列はUniProtエントリー番号Q13421（バージョン番号132、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP36888（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ13414（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号165および配列バージョン2から得ることができ、（ヒト）MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列はUniProtエントリー番号Q6UVK1（バージョン番号118、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）葉酸受容体1（FOLR1）の配列はUniProtエントリー番号P15328（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ53EW2（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号153および配列バージョン3から得ることができ、（ヒト）栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）の配列はUniProtエントリー番号P09758（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ15658（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号172および配列バージョン3から得ることができ、（ヒト）PSCA（前立腺幹細胞抗原）の配列はUniProtエントリー番号O43653（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ6UW92（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号134および配列バージョン1から得ることができ、（ヒト）HER-1（上皮成長因子受容体）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP00533（エントリーバージョン177、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）HER-2（受容体チロシンプロテインキナーゼerbB-2）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP04626（エントリーバージョン161、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）HER-3（受容体チロシンプロテインキナーゼerbB-3）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP21860（エントリーバージョン140、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）CD20（Bリンパ球抗原CD20）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP11836（エントリーバージョン117、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）CD22（Bリンパ球抗原CD22）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP20273（エントリーバージョン135、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）CD33（Bリンパ球抗原CD33）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP20138（エントリーバージョン129、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）CA-12-5（ムチン16）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ8WXI7（エントリーバージョン66、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）HLA-DRの配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ29900（エントリーバージョン59、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）MUC-1（ムチン-1）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP15941（エントリーバージョン135、配列バージョン3）から得ることができ、（ヒト）A33（細胞表面A33抗原）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ99795（エントリーバージョン104、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）PSMA（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ04609（エントリーバージョン133、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）トランスフェリン受容体の拝謁はSwiss-ProtデータベースエントリーQ9UP52（エントリーバージョン99、配列バージョン1）およびP02786（エントリーバージョン152、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）TNC（テネイシン）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP24821（エントリーバージョン141、配列バージョン3）から得ることができ、（ヒト）CA-IX（炭酸脱水酵素IX）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ16790（エントリーバージョン115、配列バージョン2）から得ることができる。
【０２８８】
治療的使用および処置方法
本明細書に提供される分子または構築物（すなわち抗原結合受容体、形質導入T細胞およびキット）は、医療の場で、とりわけ悪性疾患の処置に、特に有用である。例えば、腫瘍細胞に特異的でありかつ変異型Fcドメインを含む治療用抗体と併用して、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞を用いて、腫瘍を処置することができる。したがって一定の態様では、抗原結合受容体、形質導入T細胞またはキットが、悪性疾患の処置において使用され、特に悪性疾患は、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される。
【０２８９】
処置の腫瘍特異性は、変異型Fcドメインを含む治療用抗体によって提供され、抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される。この場合、形質導入T細胞は、所与の腫瘍に特異的であるわけではなく、本発明に従って使用される変異型Fcドメインを含む治療用抗体次第で任意の腫瘍に向かわせることができるので、汎用のT細胞である。
【０２９０】
これに関連して、悪性疾患は上皮、内皮、または中皮起源のがん/がん腫または血液のがんでありうる。本発明との関連において、がん/がん腫は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭がん、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、卵巣のがん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがんおよび甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０２９１】
例えば、腫瘍性疾患および/またはリンパ腫は、これらの医学的適応に向けられた特異的構築物で処置しうる。変異型Fcドメインを含む治療用抗体と組み合わされた本発明の形質導入T細胞の適応は、腫瘍抗原に対する治療用抗体の特異性によって与えられる。例えば、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む抗体であって（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）（ヒト）EpCAMに対する抗体で、処置しうる。
【０２９２】
胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、HER1に対する、好ましくはヒトHER1に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。さらにまた、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、MCSPに対する、好ましくはヒトMCSPに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、FOLR1に対する、好ましくはヒトFOLR1に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、Trop-2に対する、好ましくはヒトTrop-2に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、PSCAに対する、好ましくはヒトPSCAに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、  EGFRvIIIに対する、好ましくはヒトEGFRvIIIに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、MSLNに対する、好ましくはヒトMSLNに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃がん、乳がんおよび/または子宮頸がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、HER2に対する、好ましくはヒトHER2に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃がんおよび/または肺がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、HER3に対する、好ましくはヒトHER3に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫は、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、CD20に対する、好ましくはヒトCD20に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫は、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、CD22に対する、好ましくはヒトCD22に対す��治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。骨髄性白血病は、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、CD33に対する、好ましくはヒトCD33に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。卵巣がん、肺がん、乳がんおよび/または胃腸がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、CA12-5に対する、好ましくはヒトCA12-5に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、白血病および/または鼻咽頭がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、HLA-DRに対する、好ましくはヒトHLA-DRに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。大腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がんおよび/または膵がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、MUC-1に対する、好ましくはヒトMUC-1に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。大腸がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、A33に対する、好ましくはヒトA33に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。前立腺がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、PSMAに対する、好ましくはヒトPSMAに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、トランスフェリン受容体に対する、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。膵がん、肺がんおよび/または乳がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、トランスフェリン受容体に対する、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。腎がんは、変異型Fcドメインを含む治療用抗体であって、CA-IXに対する、好ましくはヒトCA-IXに対する治療用抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本発明の形質導入T細胞で処置しうる。
【０２９３】
したがって本発明は、疾患、悪性疾患、例えば上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび/または血液のがんの処置方法にも関係する。本発明との関連において、対象はヒトである。
【０２９４】
本発明との関連において、疾患を処置するための一特定方法は、以下の工程を含む:
（a）T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、対象から単離する工程、
（b）単離されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程、および
（c）形質導入されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、該対象に投与する工程。
【０２９５】
本発明との関連において、形質導入されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞、および/または1種もしくは複数種の治療用抗体は、静脈内注入によって対象に共投与される。
【０２９６】
さらにまた、本発明との関連において、本発明は、以下の工程を含む、疾患の処置方法を提供する:
（a）T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、対象から単離する工程、
（b）単離されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程、
（c）任意で、該単離されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞に、T細胞受容体を共形質導入する工程、
（d）抗CD3抗体および抗CD28抗体によって、前記T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を増殖させる工程、および
（e）形質導入された前記T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、該対象に投与する工程。
【０２９７】
上述の工程（d）（抗CD3抗体および/または抗CD28抗体によるTILなどのT細胞の増殖工程という）は、インターロイキン2および/またはインターロイキン15（IL-15）などの（刺激性）サイトカインの存在下で行うこともできる。本発明との関連において、上述の工程（d）（抗CD3抗体および/または抗CD28抗体によるTILなどのT細胞の増殖工程という）は、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン7（IL-7）および/またはインターロイキン21（IL-21）の存在下で行うこともできる。
【０２９８】
本処置方法は、本発明に従って使用される抗体の投与を、さらに含む。抗体は、形質導入T細胞が投与される前に、形質導入T細胞の投与と同時に、または形質導入T細胞が投与された後に、投与することができる。本発明との関連において、形質導入T細胞の投与は静脈内注入によって行われる。本発明との関連において、形質導入を受けるT細胞は処置される対象から単離/取得される。
【０２９９】
組成物
さらにまた、本発明は、変異型Fcドメインを持つ抗体分子、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子およびベクターを含む、組成物（医薬）、ならびに/または該組成物のうちの1つまたは複数を含むキットを提供する。本発明との関連において、組成物は、任意で担体、安定剤および/または賦形剤の適切な製剤をさらに含む、薬学的組成物である。したがって、本発明との関連において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞および/または該形質導入T細胞を含む組成物と組み合わせて投与される、本明細書において定義する変異型Fcドメインを含む抗体分子を含む薬学的組成物（医薬）が提供され、該抗体分子は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される。
【０３００】
本発明によれば、「薬学的組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。さらにまた、本発明との関連において、患者は疾患を患っており、該疾患は悪性疾患、とりわけ上皮、内皮、または中皮起源のがん/がん腫または血液のがんである。本発明との関連において、がん/がん腫は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭がん、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがんおよび甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３０１】
好ましい態様において、薬学的組成物/医薬は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、静脈内、髄腔内投与、または組織へのもしくは腫瘍への直接注射のための、本明細書において定義する抗体および/または形質導入T細胞を含む。本発明との関連において、組成物/医薬は、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される、本明細書において定義する変異型Fcドメインを含む抗体を含む。本発明との関連において、本明細書において定義する抗体を含む薬学的組成物/医薬は、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞を含む組成物/医薬と組み合わせて投与され、該T細胞は処置される対象から得られたものである。
【０３０２】
「組み合わせて」という用語の使用は、処置レジメンの構成要素が対象に投与される順序を制限しない。したがって、本明細書に記載する薬学的組成物/医薬は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後の、本明細書において定義する抗体の投与を包含する。本明細書において使用する「組み合わせて」は、本明細書において上に定義した抗体の投与と、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞の投与との間のタイミングも制限しない。したがって、2つの構成要素が同時に投与されない場合、投与の間には、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間もしくは72時間、または当業者によって容易に決定されるおよび/もしくは本明細書に記載する任意の適切な時間差を置くことができる。
【０３０３】
本発明との関連において、「組み合わせて」という用語は、本明細書において定義する抗体と本発明の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞とが、対象への投与前に、一緒にプレインキュベートされる状況も包含する。したがって2つの構成要素は、投与前に、例えば1分、5分、10分、15分、30分、45分もしくは1時間、または当業者によって容易に決定される任意の適切な時間にわたって、プレインキュベートすることができる。本発明は、別の好ましい態様において、本明細書において定義する抗体と、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞とが、同時に投与される処置レジメンに関する。本発明との関連において、本明細書において定義する抗体は、抗原結合受容体を含む形質導入T細胞が投与された後に、投与されうる。
【０３０４】
さらに、本明細書において使用する「組み合わせて」は、本明細書において定義する抗体と、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞、好ましくはCD8＋T細胞との、隣り合った逐次的投与（すなわち2つの構成要素のうちの一方の投与後（一定の時間間隔後に）、間に他のいかなる処置プロトコールの投与および/または実施も挟まずに行われる他方の投与）に限定されない。それゆえに、本処置レジメンは、本明細書において定義する抗体分子と、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞、好ましくはCD8＋T細胞の別々の投与であって、それらの投与が、疾患またはその症状を処置しまたは防止するのに必要なおよび/または適した1つまたは複数の処置プロトコールによって隔てられるものも包含する。そのような介在処置プロトコールの例として、鎮痛薬の投与、化学療法薬の投与、疾患またはその症状の外科的取扱いが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。したがって、本明細書に開示する処置レジメンは、本明細書において定義する抗体と、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞、好ましくはCD8＋T細胞とを、本明細書に記載するまたは当技術分野において公知の疾患またはその症状の処置または防止に適した1つまたは複数の処置プロトコールと一緒に投与することを包含する。
【０３０５】
薬学的組成物/医薬が注入または注射によって患者に投与されるものであることは、特に考えられる。本発明との関連において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞は、注入または注射によって患者に投与されるものである。適切な組成物/医薬の投与は、さまざまな方法、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、外用投与または皮内投与によって達成されうる。
【０３０６】
本発明の薬学的組成物/医薬は薬学的に許容される担体をさらに含みうる。適切な薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルション、例えば油/水型エマルション、さまざまなタイプの湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投薬レジメンは主治医および臨床因子によって決定される。医学分野では周知のとおり、任意の一患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるその化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、および併用投与される他の薬物など、多くの因子に依存する。一般に、薬学的組成物の定期的投与としてのレジメンは、1日あたり1μg〜5gの範囲内にあるべきである。しかし、持続注入にとってより好ましい投薬量は、1時間あたり体重1キログラムあたり、0.01μg〜2mg、好ましくは0.01μg〜1mg、より好ましくは0.01μg〜100μg、さらに好ましくは0.01μg〜50μg、最も好ましくは0.01μg〜10μg単位の範囲にありうる。特に好ましい投薬量は後述する。進行は定期的評価によってモニターすることができる。投薬量はさまざまであるが、DNAの静脈投与の場合、好ましい投薬量はおよそ106〜1012コピーのDNA分子である。
【０３０７】
本発明の組成物は局所的にまたは全身性に投与することができる。投与は、一般的には非経口投与、例えば静脈内投与であり、形質導入T細胞は、標的部位に向けて、例えば動脈内の一部位へのカテーテルなどによって投与することもできる。非経口投与用の調製物としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられる。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール/水溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、水分栄養補充剤、電解質補充剤（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート材および不活性ガスなどといった、保存剤その他の添加剤も存在しうる。また、本発明の薬学的組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンのような、タンパク質性の担体を含みうる。本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の使用目的に応じて、タンパク質性抗体構築物またはそれをコードする核酸分子もしくはベクター（本発明に記載の）および/または細胞の他に、生物学的に活性なさらなる作用物質を含みうると考えられる。そのような作用物質は、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を防止する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、循環系に作用する薬物、および/または当技術分野において公知のT細胞共刺激分子もしくはサイトカインなどの作用物質でありうる。
【０３０８】
本発明の組成物/医薬の投与に関する考えうる適応は、悪性疾患、例えば上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがん、とりわけ上皮がん/がん腫、例えば乳がん、大腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば卵巣のがん、精巣がん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、肺がん、胃がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患である。
【０３０９】
本発明では、他の化合物、例えば免疫エフェクター細胞、細胞増殖または細胞刺激のための活性化シグナルを提供することができる分子との共投与プロトコールが、さらに考えられる。該分子は、例えば、T細胞にとってのさらなる一次活性化シグナル（例えばさらなる共刺激分子:B7ファミリーの分子、Ox40L、4.1 BBL、CD40L、抗CTLA-4、抗PD-1）またはさらなるサイトカイン・インターロイキン（例えばIL-2）であってもよい。
【０３１０】
上述した本発明の組成物は、任意で検出手段および検出方法をさらに含む診断組成物であってもよい。
【０３１１】
したがって好ましい態様では、医薬としての使用のための、本明細書に記載のキット、抗原結合受容体または形質導入T細胞が提供される。本発明との関連において、医薬としての使用のための本発明の抗原結合受容体が提供され、ここで、本明細書に記載の変異型Fcドメインを含む1つまたは複数の抗体は、本明細書において定義する抗原結合受容体を含みかつ/または発現する形質導入T細胞、好ましくはCD8＋T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与されるものであり、該T細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、処置される対象から得られたものである。該医薬は、悪性疾患、とりわけ上皮、内皮もしくは中皮起源のまたは血液のがん/がん腫の処置方法において使用されうる。本発明との関連において、がん/がん腫は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭がん、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、卵巣のがん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３１２】
さらにまた、本発明との関連において、変異型Fcドメインを含む本明細書に記載の抗体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合し、該抗体分子は、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む、該対象からの形質導入T細胞、好ましくはCD8＋T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される。本発明との関連において、がん/がん腫は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭がん、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、卵巣のがん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３１３】
さらにまた、本発明によれば、（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）好ましくはヒト腫瘍抗原である腫瘍抗原を指向し/腫瘍抗原に結合し/腫瘍抗原と相互作用する1つまたは2つの結合ドメインを含み、かつ変異型Fcドメインを含む分子または構築物（すなわち本明細書に記載する抗体分子）であって、本発明の抗原結合受容体の本明細書に定義する細胞外ドメインが前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用するものが、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんの処置のために提供される。したがって本発明との関連において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒト腫瘍抗原である腫瘍抗原を指向し/腫瘍抗原に結合し/腫瘍抗原と相互作用する2つの結合ドメインを含み、かつ変異型Fcドメインを含む抗体分子であって、抗原結合受容体の本明細書に定義する細胞外ドメインが前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する抗体分子が提供される。
【０３１４】
一態様において、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんの処置における使用のための、（i）好ましくはヒト腫瘍抗原である腫瘍抗原を指向し/腫瘍抗原に結合し/腫瘍抗原と相互作用する2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３１５】
一態様において、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんの処置における使用のための、（i）HER1に対する、好ましくはヒトHER1に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３１６】
一態様において、胃がん、乳がんおよび/または子宮頸がんの処置における使用のための、（i）HER2に対する、好ましくはヒトHER2に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３１７】
一態様において、胃がんおよび/または肺がんの処置における使用のための、（i）HER3に対する、好ましくはヒトHER3に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３１８】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）CEAに対する、好ましくはヒトCEAに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３１９】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）p95に対する、好ましくはヒトp95に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２０】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）BCMAに対する、好ましくはヒトBCMAに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２１】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）MSLNに対する、好ましくはヒトMSLNに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２２】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）MCSPに対する、好ましくはヒトMCSPに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２３】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）CD19に対する、好ましくはヒトCD19に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２４】
一態様において、B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫の処置における使用のための、（i）CD20に対する、好ましくはヒトCD20に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２５】
一態様において、B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫の処置における使用のための、（i）CD22に対する、好ましくはヒトCD22に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２６】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）CD38に対する、好ましくはヒトCD38に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２７】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）CD52Flt3に対する、好ましくはヒトCD52Flt3に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２８】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）FolR1に対する、好ましくはヒトFolR1に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３２９】
一態様において、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんの処置における使用のための、（i）Trop-2に対する、好ましくはヒトTrop-2に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３０】
一態様において、卵巣がん、肺がん、乳がんおよび/または胃腸がんの処置における使用のための、（i）CA-12-5に対する、好ましくはヒトCA-12-5に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３１】
一態様において、胃腸がん、白血病および/または鼻咽頭がんの処置における使用のための、（i）HLA-DRに対する、好ましくはヒトHLA-DRに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３２】
一態様において、大腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がんおよび/または膵がんの処置における使用のための、（i）MUC-1に対する、好ましくはヒトMUC-1に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３３】
一態様において、大腸がんの処置における使用のための、（i）A33に対する、好ましくはヒトA33に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３４】
一態様において、前立腺がんの処置における使用のための、（i）PSMAに対する、好ましくはヒトPSMAに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３５】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）PSCAに対する、好ましくはヒトPSCAに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３６】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）トランスフェリン受容体に対する、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３７】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、（i）テネイシンに対する、好ましくはヒトテネイシンに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３８】
一態様において、腎がんの処置における使用のための、（i）CA-IXに対する、好ましくはヒトXA-IXに対する1つまたは2つの結合ドメインと変異型Fcドメインとを含む抗体、および（ii）前記変異型Fcドメインを指向し/前記変異型Fcドメインに結合し/前記変異型Fcドメインと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３３９】
例示的態様
1.アンカリング膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合受容体であって、該抗原結合部分が、変異型結晶性フラグメント（fragment crystallizable）（Fc）ドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該変異型Fcドメインが、非変異型親Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、抗原結合受容体。
2. 変異型FcドメインのFc受容体結合が、非変異型親FcドメインのFc受容体結合と比較して低減しており、特にFc受容体がFcγ受容体または新生児型Fc受容体（FcRn）である、態様1の抗原結合受容体。
3. Fc受容体結合が25℃における表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される、態様1または態様2のいずれか一つの抗原結合受容体。
4. 抗原結合部分がscFv、Fab、crossFab、またはscFabである、態様1〜3のいずれか一つの抗原結合受容体。
5. アンカリング膜貫通ドメインが、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである、態様1〜4のいずれか一つの抗原結合受容体。
6. アンカリング膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインであり、特にアンカリング膜貫通ドメインがSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、態様1〜5のいずれか一つの抗原結合受容体。
7. 少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインをさらに含む、態様1〜6のいずれか一つの抗原結合受容体。
8. 少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメイン、FCGR3Aの細胞内ドメイン、およびNKG2Dの細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される、態様1〜7のいずれか一つの抗原結合受容体。
9. 少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に少なくとも1つの刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、態様1〜8のいずれか一つの抗原結合受容体。
10. 少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD27の細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、CD137の細胞内ドメイン、OX40の細胞内ドメイン、ICOSの細胞内ドメイン、DAP10の細胞内ドメイン、およびDAP12の細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される、態様1〜9のいずれか一つの抗原結合受容体。
11. 少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む、態様1〜10のいずれか一つの抗原結合受容体。
12. CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの刺激シグナリングドメインを含み、かつCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの共刺激シグナリングドメインを含む、態様1〜11のいずれか一つの抗原結合受容体。
13. 刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含み、かつ共刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む、態様12の抗原結合受容体。
14. 細胞外ドメインが、アンカリング膜貫通ドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜13のいずれか一つの抗原結合受容体。
15. ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:17）を含む、態様14の抗原結合受容体。
16. アンカリング膜貫通ドメインが、共シグナリングドメインまたはシグナリングドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜15のいずれか一つの抗原結合受容体。
17. シグナリングドメインおよび/または共シグナリングドメインが、任意で少なくとも1つのペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜16のいずれか一つの抗原結合受容体。
18. 抗原結合部分がscFvフラグメントであり、該scFvフラグメントが、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜17のいずれか一つの抗原結合受容体。
19. 抗原結合部分がFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントであり、該FabフラグメントまたはcrossFabフラグメントが、重鎖のC末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜17のいずれか一つの抗原結合受容体。
20. 抗原結合受容体が1つの共シグナリングドメインを含み、共シグナリングドメインが、N末端において、アンカリング膜貫通ドメインのC末端へと連結されている、態様7〜19のいずれか一つの抗原結合受容体。
21. 共刺激シグナリングドメインのC末端へとN末端において連結されている1つの刺激シグナリングドメインをさらに含む、態様20の抗原結合受容体。
22. 非変異型親FcドメインがIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである、態様1〜21のいずれか一つの抗原結合受容体。
23. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うL234、L235、I253、H310、P331、P329、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異を含み、特に該アミノ酸変異がL234A、L235A、I253A、N297A、H310A、P329G、および/またはH435Aである、態様1〜22のいずれか一つの抗原結合受容体。
24. 変異種Fcドメインが、ヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:130）の117、118、136、180、193、212、214、および318番目の残基からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、特に該アミノ酸変異がL117A、L118A、I136A、N180A、H193A、P212G、P214G、および/またはH318Aである、態様1〜23のいずれか一つの抗原結合受容体。
25. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うL234、L235、およびP329からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にL234A、L235A、およびP329G（「PGLALA」）のアミノ酸変異を含む、態様1〜24のいずれか一つの抗原結合受容体。
26. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うP329Gのアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインのFcγ受容体結合が、非変異型親FcドメインのFcγ受容体結合と比較して低減しており、特にFcγ受容体がヒトFcγRIIIaおよび/またはFcγRIIaである、態様1〜25のいずれか一つの抗原結合受容体。
27. 変異種FcドメインがヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:130）の212番目にアミノ酸置換を含み、特に該アミノ酸変異がP212Gである、態様1〜26のいずれか一つの抗原結合受容体。
28. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うI253、H310、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含み、変異型FcドメインのFcRn結合が、非変異型親FcドメインのFcRn結合と比較して低減している、態様1〜24のいずれか一つの抗原結合受容体。
29. 変異種FcドメインがヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:130）の136、193、および318番目にアミノ酸置換を含み、特に該アミノ酸変異がI136A、H193A、およびH318A（「AAA」）である、態様1〜24または態様28のいずれか一つの抗原結合受容体。
30. 少なくとも1つの抗原結合部分が、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列RYWMN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020515256.tif 000056
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000057
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000058
（e）CDR L2アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000059
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜27のいずれか一つの抗原結合受容体。
31. 少なくとも1つの抗原結合部分が、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該抗原結合部分が、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:32からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:33からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜27または態様30のいずれか一つの抗原結合受容体。
32. 少なくとも1つの抗原結合部分がSEQ ID NO:8の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:9の軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜27、態様30、または態様31のいずれか一つの抗原結合受容体。
33. 少なくとも1つの抗原結合部分が、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvであり、抗原結合受容体が、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、態様1〜27または態様30〜32のいずれか一つの抗原結合受容体。
34. SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、態様33の抗原結合受容体。
35. 少なくとも1つの抗原結合部分が、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、
a）SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:48からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:50からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖ポリペプチドと
を含む、態様1〜27または態様30〜32のいずれか一つの抗原結合受容体。
36. a）SEQ ID NO:39の重鎖融合ポリペプチドと
b）SEQ ID NO:41の軽鎖ポリペプチドと
を含む、態様35の抗原結合受容体。
37. 少なくとも1つの抗原結合部分が、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列SYGMS（SEQ ID NO:53）、
（b）CDR H2アミノ酸配列SSGGSY（SEQ ID NO:54）、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020515256.tif 000060
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020515256.tif 000061
（e）CDR L2アミノ酸配列KVSNRFS（SEQ ID NO:57）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列
2020515256.tif 000062
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜24または態様28〜29のいずれか一つの抗原結合受容体。
38. 少なくとも1つの抗原結合部分が、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができず、該抗原結合部分が、SEQ ID NO:61のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:62のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜24、態様28、態様29、または態様37のいずれか一つの抗原結合受容体。
39. 少なくとも1つの抗原結合部分が、
a）SEQ ID NO:61の重鎖可変領域（VH）と
b）SEQ ID NO:62の軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜24、態様28、態様29、または態様37〜38のいずれか一つの抗原結合受容体。
40. 少なくとも1つの抗原結合部分が、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないscFvであり、抗原結合受容体が、SEQ ID NO:59のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、態様1〜24、態様28、態様29、または態様37〜39のいずれか一つの抗原結合受容体。
41. SEQ ID NO:59のアミノ酸配列を含む、態様40の抗原結合受容体。
42. 少なくとも1つの抗原結合部分が、P329G変異を含む変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができないFabフラグメントであり、抗原結合受容体が
a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖ポリペプチドと
を含む、態様1〜27または態様30〜32のいずれか一つの抗原結合受容体。
43. a）SEQ ID NO:39の重鎖融合ポリペプチドと
b）SEQ ID NO:41の軽鎖ポリペプチドと
を含む、態様42の抗原結合受容体。
44. 態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
45. 態様1〜32、態様35〜39、および態様42〜43のいずれか一つの抗原結合受容体の重鎖融合ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
46. 重鎖融合ポリペプチドをコードする第1の単離されたポリヌクレオチドと、軽鎖ポリペプチドをコードする第2の単離されたポリヌクレオチドとを含む、態様1〜32、態様35〜39、および態様42〜43のいずれか一つの抗原結合受容体をコードする組成物。
47. 態様44または態様45のいずれか一つのポリヌクレオチドまたは態様46の組成物によってコードされる、ポリペプチド。
48. 態様44のポリヌクレオチドまたは態様45のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
49. 態様44のポリヌクレオチド、態様46の組成物、または態様48のベクターを含む、形質導入T細胞。
50. 態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体を発現することができる、形質導入T細胞。
51. 標的抗原について特異的に結合することができるT細胞受容体（TCR）が共形質導入されている、態様49または態様50のいずれか一つの形質導入T細胞。
52. （A）態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キット。
53. （A）態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キット。
54. （A）態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体をコードする、態様46の組成物または態様48のベクターと、
（B）変異型Fcドメインを含む抗体と
を含む、キットであって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
キット。
55. 非変異型親FcドメインがIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである、態様52〜54のいずれか一つのキット。
56. 変異型FcドメインのFc受容体結合が、非変異型親FcドメインのFc受容体結合と比較して低減しており、特にFc受容体がFcγ受容体または新生児型Fc受容体（FcRn）である、態様52〜55のいずれか一つのキット。
57. Fc受容体結合が25℃における表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される、態様56のキット。
58. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うL234、L235、I253、H310、P331、P329、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異を含み、特に該アミノ酸変異がL234A、L235A、I253A、N297A、H310A、P329G、および/またはH435Aである、態様52〜57のいずれか一つのキット。
59. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うL234、L235、およびP329からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にL234A、L235A、およびP329G（「PGLALA」）のアミノ酸変異を含む、態様52〜58のいずれか一つのキット。
60. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うP329Gのアミノ酸変異を含む、態様52〜59のいずれか一つのキット。
61. 変異型Fcドメインが、EUナンバリングに従うI253、H310、およびH435からなる群より選択される位置に少なくとも1つのアミノ酸変異、特にI253A、H310A、およびH435A（「AAA」）のアミノ酸変異を含む、態様52〜60のいずれか一つのキット。
62. 変異型Fcドメインを含む抗体が、腫瘍細胞の表面にある抗原に対して、特にFAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、およびCA-IXからなる群より選択される抗原に対して、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して、特異的に結合することができる、態様52〜61のいずれか一つのキット。
63. 変異型Fcドメインを含む抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、がん胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合することができる、態様52〜62のいずれか一つのキット。
64. 医薬としての使用のための、態様52〜63のいずれか一つのキット。
65. 変異型Fcドメインを含む抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に、
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合受容体
を発現する形質導入T細胞が、投与される、
医薬としての使用のための、態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体または態様49〜51のいずれか一つの形質導入T細胞。
66. 疾患の処置における使用のための、特に悪性疾患の処置における使用のための、態様52〜63のいずれか一つのキット。
67. 変異型Fcドメインを含む抗体の投与の前、該投与と同時、または該投与の後での、
変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない抗原結合受容体
を発現する形質導入T細胞の投与を含む、悪性疾患の処置
における使用のための、態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体または態様49〜51のいずれか一つの形質導入T細胞。
68. 悪性疾患が、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される、態様66または態様67に記載の使用のための抗原結合受容体、形質導入T細胞、またはキット。
69. 変異型Fcドメインを含む抗体が、腫瘍細胞の表面にある抗原に対して、特にFAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、およびCA-IXからなる群より選択される抗原に対して、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して、特異的に結合することができる、態様66〜68に記載の使用のための抗原結合受容体、形質導入T細胞、またはキット。
70. 変異型Fcドメインを含む抗体が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、がん胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合することができる、態様66〜69に記載の使用のための抗原結合受容体、形質導入T細胞、またはキット。
71. 形質導入T細胞が、処置される対象から単離された細胞に由来する、態様66〜70のいずれか一つに記載の使用のための抗原結合受容体、形質導入T細胞、またはキット。
72. 形質導入T細胞が、処置される対象から単離された細胞に由来しない、態様66〜70のいずれか一つに記載の使用のための抗原結合受容体、形質導入T細胞、またはキット。
73. 態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞を対象に投与する工程と、
前記形質導入T細胞の投与の前、該投与と同時、または該投与の後に、変異型Fcドメインを含む抗体の治療有効量を投与する工程と
を含む、対象における疾患を処置する方法であって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
方法。
74. 対象からT細胞を単離する工程、および単離されたT細胞に態様44のポリヌクレオチド、態様の組成物、または態様48のベクターを形質導入することによって、形質導入T細胞を生成する工程をさらに含む、態様73の方法。
75. T細胞が、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター構築物で、または非ウイルスベクター構築物で、形質導入される、態様74の方法。
76. 非ウイルスベクター構築物がスリーピング・ビューティーミニサークルベクターである、態様75の方法。
77. 形質導入T細胞が静脈内注入によって対象に投与される、態様73〜76のいずれか一つの方法。
78. 対象への投与に先だって、形質導入T細胞を抗CD3抗体および/または抗CD28抗体と接触させる、態様73〜77のいずれか一つの方法。
79. 対象への投与に先だって、形質導入T細胞を、少なくとも1つのサイトカイン、好ましくはインターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、および/もしくはインターロイキン-21、またはそれらの変異体と接触させる、態様73〜78のいずれか一つの方法。
80. 疾患が悪性疾患である、態様73〜79のいずれか一つの方法。
81. 疾患が上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される、態様73〜79のいずれか一つの方法。
82. 標的細胞を、態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体を発現することができる形質導入T細胞と、変異型Fcドメインを含む抗体の存在下で接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法であって、
該抗原結合受容体が、変異型Fcドメインに対して特異的に結合することができるが、非変異型親Fcドメインに対して特異的に結合することができない、
方法。
83. 標的細胞ががん細胞である、態様82の方法。
84. 標的細胞が、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、およびCA-IXからなる群より選択される抗原を発現する、態様82または態様83のいずれか一つの方法。
85. 標的細胞が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、がん胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原を発現する、態様82〜84のいずれか一つの方法。
86. 医薬の製造のための、
態様1〜43のいずれか一つの抗原結合受容体、態様44および態様45のいずれか一つのポリヌクレオチド、または態様49〜51のいずれか一つの形質導入T細胞
の使用。
87. 医薬が悪性疾患の処置のためのものである、態様86の使用。
88. 医薬が疾患の処置のためのものである、態様86の使用。
89. 悪性疾患が上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択されることを特徴とする、態様87の使用。
90. 疾患が上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択されることを特徴とする、態様88の使用。
【０３４０】
これらの態様および他の態様は、本発明の説明および実施例によって開示され、包含される。本発明に従って使用される抗体、方法、使用および化合物のいずれか1つに関するさらなる文献は、公共の図書館およびデータベースで、例えば電子デバイスを使って検索することができる。例えばインターネット上の公共データベース「Medline」は、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://www.fmi.ch/biology/research＿tools.html、http://www.tigr.org/などといった他のデータベースおよびアドレスも当業者には公知であり、例えばhttp://www.lycos.comを使って入手することもできる。
【実施例】
【０３４１】
以下は本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的説明を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施しうることは理解される。
【０３４２】
組換えDNA技法
Sambrook et al,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているように、標準的方法を使ってDNAを操作した。分子生物学的試薬は製造者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat,E.A.,et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０３４３】
DNA配列決定
DNA配列は両鎖シークエンシングによって決定した。
【０３４４】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは適当なテンプレートを使ってPCRで作製するか、または合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から自動遺伝子合成により、Geneart AG（ドイツ・レーゲンスブルク）によって合成された。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントを標準的なクローニング/シークエンシングベクターにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、濃度をUV分光法によって決定した。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列はDNAシークエンシングによって確認した。遺伝子セグメントは、各発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を持つように設計した。構築物はすべて、真核細胞における分泌のためにタンパク質を対象にするリーダーペプチドをコードする5’末端DNAを持つように設計した。
【０３４５】
タンパク質精製
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインA Sepharoseカラム（GE healthcare）に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後は直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSにおける、または20mMヒスチジン、150mM NaCl、pH6.0における、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200、GE Healthcare）によって、単量体型抗体から分離した。単量体型抗体画分をプールし、（必要であれば）例えばMILLIPORE Amicon Ultra（30MWCO）遠心濃縮器を使って濃縮し、凍結し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）などによる、後続のタンパク質分析および分析的特徴づけに供した。
【０３４６】
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen）を製造者の指示に従って使用した。具体的には、10％または4-12％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRIS Pre-Castゲル（pH6.4）およびNuPAGE（登録商標）MES（還元ゲル、NuPAGE（登録商標）酸化防止ランニング緩衝液添加剤入り）ランニング緩衝液またはMOPS（非還元ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０３４７】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）はHPLCクロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、プロテインA精製した抗体を、Agilent HPLC 1100システムで、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、Dionex HPLCシステムで、2×PBS中のSuperdex 200カラム（GE Healthcare）に適用した。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRadゲル濾過標準151-1901を標準とした。
【０３４８】
抗体生産
国際特許出願公開番号WO2012/130831A1に記載の方法に従って、Fcガンマ受容体への結合を消失させるために、Pro329Gly、Leu234AlaおよびLeu235Ala変異を定常領域に導入した。同様に、FcRnへの結合を消失させるために、I253A、H310A、およびH435A（「AAA」）変異を定常領域に導入した。各抗体は、ポリエチレンイミンを使ってHEK293-EBNA細胞に哺乳類発現ベクターを共トランスフェクトすることによって生産した。細胞には、重鎖用および軽鎖用の対応する発現ベクターを1:1の比でトランスフェクトした。
【０３４９】
Jurkat NFAT T細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターを生産するために、抗原結合受容体の正しいアセンブリのための各DNA配列を、レンチウイルスポリヌクレオチドベクターの恒常的に活性なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の下に、インフレームでクローニングした。レトロウイルスベクターはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（WPRE）、セントラルポリプリントラクト（cPPT）要素、pUC複製起点ならびに細菌における増殖および選択を容易にする抗生物質耐性をコードする遺伝子を含有した。
【０３５０】
機能的ウイルス粒子を生産するために、60〜70％コンフルエントのHek293T細胞（ATCC CRL3216）ならびに比が3:1:1:1のCAR含有ベクターおよびpCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV移入ベクターを使って、Lipofectamine LTX（商標）に基づくトランスフェクションを行った。48時間後に上清を収集し、細胞片を除去するために250gで5分間遠心分離し、0.45または0.22μmポリエーテルスルホンフィルターで濾過した。濃縮されたウイルス粒子（Lenti-x-Concentrator、タカラ）を使って、Jurkat NFAT細胞（Signosis）への形質導入を行った。FACSARIAソーター（BD Bioscience）を使って、陽性形質導入細胞をプールとしてまたは単一クローンとして選別した。適当な密度への細胞増殖後に、Jurkat NFAT T細胞を実験に使用した。
【０３５１】
実施例1
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプール（図6A）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のプール（図6B）を標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。P329G LALA変異を持つGA101 IgGを、IgGとして使用した。このIgGは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では形質導入Jurkat NFAT T細胞によって認識される。陽性対照として、96ウェルプレート（Cellstar Greiner-bio-one、カタログ番号655185）を、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、4℃で一晩または37℃で少なくとも1時間、コーティングした。CD3コートウェル（CD3 coated well）をPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、成長培地中、生細胞1×106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1または1:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つGA101の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０３５２】
標的細胞とエフェクター細胞とを5:1（ドット）または1:1（四角形）の比で20時間共培養した場合、グラフは、P329G LALA変異を持つGA101 IgGを抗体として使用したときに、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞および抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の用量依存的活性化を示す（図6Aおよび図6B、黒色で表示）。P329G LALA変異を持たないGA101 IgG（図6Aおよび図6B、灰色で表示）を使用した場合、形質導入Jurkat NFAT T細胞の活性化は検出することができなかった。各ポイントは、それぞれを技術的な二回の反復実験として行った生物学的反復実験の平均値を表す。値はすべてベースライン補正された値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３５３】
実施例2
ここでは、CD20を発現するSUDHDL4腫瘍細胞（図7Cおよび図7D）またはWSUDLCL2腫瘍細胞（図7Aおよび図7B）を標的細胞として使用し、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDを発現する単一クローンJurkat NFAT細胞を標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。P329G LALA変異を持つGA101 IgGをIgGとして使用した。このIgGは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では、Jurkat NFAT T細胞によって認識される。Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、成長培地中、生細胞1×106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を10:1、5:1または1:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つGA101の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０３５４】
標的細胞とエフェクター細胞とを10:1（ドット）、5:1（四角形）または1:1（三角形）の比で20時間共培養した場合、グラフは、P329G LALAを持つGA101 IgGの用量に依存する、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化を示す（図7A〜D、黒色で表示）。P329G LALA変異を持たないGA101 IgG（図7A〜D、灰色で表示）を使用した場合は、1μg/mlの最高抗体濃度で、形質導入Jurkat NFAT T細胞のわずかな活性化を検出できたにすぎなかった。各ポイントは技術的な二回の反復実験の平均値を表す。値はすべてベースライン補正された値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３５５】
実施例3
ここでは、標的細胞として付着性FAP発現NIH/3T3-huFAP cl 19腫瘍細胞を使って行われるJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。エフェクター細胞としては、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図8A）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図8C）の選別されたプールを使用した。P329G LALA変異を持つFAP 4B9 IgGをIgGとして使用した。このIgGは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では、Jurkat NFAT T細胞によって認識される。P329G LALA変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。陽性対照として、96ウェルプレート（Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、37℃で少なくとも1時間、コーティングした。CD3コートウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。付着性NIH/3T3-huFAP cl 19標的細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシンを使って剥離した。剥離した細胞を、DMEM＋4.5g LD-グルコース＋L-グルタミン＋25mM HEPES＋10％FCSおよび1％Glutamaxに再懸濁した。Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型T細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、成長培地中、生細胞1×106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つ抗体の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０３５６】
図8Bおよび図8Dは、どちらも標的細胞および1μg/mlのFAP 4B9抗体と共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図8D）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図8B）のデータを、さまざまな対照条件と比較して表している。
【０３５７】
1μg/ml FAP 4B9 P329G LALAと共にインキュベートした場合、Jurkat NFAT T細胞（図8Bおよび図8D、黒い三角形）と、標的細胞のみ（図8Bおよび図8D、下向きの黒い三角形）は、検出可能なルミネセンスシグナルを何も示さない。
【０３５８】
また、Jurkat NFAT T細胞は、標的細胞および1μg/mlのFAP 4B9抗体と共培養した場合に、ルミネセンスシグナルを示さない（図8Bおよび図8D、黒い菱形）。一方、標的細胞および1μg/mlのFAP 4B9抗体と共培養されたJurkat NFAT細胞のCD3依存的活性化は、検出可能なルミネセンスシグナルによって、それらの機能性を証明している（白いドット）。
【０３５９】
標的細胞および1μg/mlのFAP 4B9抗体と共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のCD3依存的活性化（図8B、白い四角形）および抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のCD3依存的活性化（図8D、白い四角形で表示）は、CAR媒介活性化とCD3媒介活性化とを併せ持つので、全体の中で最も高いルミネセンスシグナルを示す。CD3媒介ルミネセンスシグナルは、CARを標的細胞および1μg/mlのDP47/vk3抗体と共にインキュベートした場合にも見られる（図8Bおよび図8D、下向きの白い三角形）。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。値はすべてベースライン補正された値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３６０】
実施例4
ここでは、付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。エフェクター細胞としては、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図9A）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図9C）の選別されたプールを使用した。どちらもP329G LALA変異を持つCEA A5B7 IgGまたはCEA T84 LCHA IgGのいずれかを使用した。さらにP329G LALA変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。
【０３６１】
陽性対照として、96ウェルプレート（Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、37℃で1時間、コーティングした。CD3コートウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。
【０３６２】
付着性MKN45標的細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシンを使って剥離した。剥離した細胞を、DMEM＋4.5g LD-グルコース＋L-グルタミン＋25mM HEPES＋10％FCSおよび1％Glutamaxに再懸濁した。
【０３６３】
Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。
【０３６４】
関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、RPMI-1640＋10％FCS＋1％Glutamax中、生細胞1×106個/mlに調整した。
【０３６５】
96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。
【０３６６】
次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つ抗体の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。
【０３６７】
20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０３６８】
標的細胞とエフェクター細胞とを5:1の比（図9Aおよび図9C、ドット）で20時間共培養した場合、グラフは、P329G LALA変異を持つCEA A5B7を抗体として使用したときに、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞および抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の用量依存的活性化を示す（図9Aおよび図9C、灰色のドット）。P329G LALA変異を持つCEA T84 LCHAの使用は、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞についてのみ、用量依存的活性化を示した（図9A、黒いドット）。一方、前記P329G LALA変異を持つ抗体を使用した場合、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化は、最も高い1μg/mlの抗体濃度だけで検出された。
【０３６９】
対照抗体P329G LALA変異を持つDP47/vk3 IgG（図9Aおよび図9C、黒い三角形）を使用した場合、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD Jurkat NFAT T細胞の活性化も、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化も、検出できなかった。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３７０】
図9Bおよび図9Dは、どちらも標的細胞および1μg/mlのCEA T8 LCHA P329G LALA抗体またはCEA A5B7 P329G LALA抗体と共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図9B）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図9D）のデータを、さまざまな対照条件と比較して表している。
【０３７１】
1μg/ml CEA T8 LCHA P329G LALAと共にインキュベートした場合、Jurkat NFAT CAR T細胞のみ（図9Bおよび図9D、黒い菱形）と、標的細胞のみ（図9Bおよび図9D、白い丸）は、検出可能なルミネセンスシグナルを何も示さない。
【０３７２】
また、Jurkat NFAT T細胞は、標的細胞および1μg/ml IgGと共培養した場合に、検出可能なルミネセンスシグナルを示さない（図9Bおよび図9D、白い四角形および白い菱形）。一方、標的細胞および1μg/ml IgGと共培養されたJurkat NFAT T細胞のCD3依存的活性化は、検出可能なルミネセンスシグナルによって、それらの機能性を証明している（図9Bおよび図9D、灰色の×印）。
【０３７３】
標的細胞および1μg/ml IgGと共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD Jurkat NFAT T細胞のCD3依存的活性化（図9B、黒い星印および灰色の星印）および抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞のCD3依存的活性化（図9D、黒い星印および灰色の星印）は、CAR媒介活性化とCD3媒介活性化とが組み合わされるので、全体の中で最も高いルミネセンスシグナルを示す。CD3媒介ルミネセンスシグナルは、CARを標的細胞および1μg/mlのDP47/vk3抗体と共にインキュベートした場合にも見られる（図9Bおよび図9D、灰色の＋記号）。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３７４】
実施例5
ここでは、付着性CEA発現MKN45腫瘍細胞を標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。エフェクター細胞としては、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jukat NFAT T細胞（図10C）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図10A）の選別されたプールを使用した。どちらもP329G LALA変異を持つCH1A1A 98 99 IgGまたはCEA hMN14 IgGのいずれかを使用した。さらにP329G LALA変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。
【０３７５】
陽性対照として、96ウェルプレート（Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、37℃で1時間、コーティングした。CD3コートウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。
【０３７６】
付着性MKN45標的細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシンを使って剥離した。剥離した細胞を、DMEM＋4.5g LD-グルコース＋L-グルタミン＋25mM HEPES＋10％FCSおよび1％Glutamaxに再懸濁した。
【０３７７】
Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。
【０３７８】
関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、RPMI-1640＋10％FCS＋1％Glutamax中、生細胞1×106個/mlに調整した。
【０３７９】
96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。
【０３８０】
次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つ抗体の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。
【０３８１】
20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０３８２】
標的細胞と抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞とを5:1の比で20時間共培養した場合（図10A、黒および灰色のドット）、CEA hMN14抗体またはCH1A1A 98 99抗体を使用したときに、活性化は検出できなかった（図9Aおよび図9B、灰色のドット）。抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞は、CEA hMN14抗体またはCH1A1A 98 99抗体のどちらでも、0.1μg/mlおよび1μg/mlにおいて、活性をほとんど示さない（図10C、黒および灰色のドット）。
【０３８３】
対照抗体P329G LALA変異を持つDP47/vk3 IgG（図10Aおよび図10C、黒い三角形）を使用した場合、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化も、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化も、検出できなかった。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。値はすべてベースライン補正された値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３８４】
図10Bおよび図10Dは、どちらも標的細胞および1μg/mlのCEA hMN14抗体またはCH1A1A 98 99抗体と共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図D）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現NFAT T細胞（図9D）のデータを、さまざまな対照条件と比較して表している。
【０３８５】
行われた対照実験は、CD3を活性化刺激として使用したものを除けばいずれも、検出可能なルミネセンスシグナルを示さない。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３８６】
実施例6
ここでは、付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。エフェクター細胞としては、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図11C）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図11A）の選別されたプールを使用した。P329G LALA変異を持つTNCA2B10をIgGとして使用した。さらにP329G LALA変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。
【０３８７】
陽性対照として、96ウェルプレート（Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、37℃で1時間、コーティングした。CD3コートウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。
【０３８８】
付着性CT26TNC cl 19標的細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシンを使って剥離した。剥離した細胞をRPMI-1630＋10％FCSおよび1％Glutamax＋15μg/mlピューロマイシンに再懸濁した。
【０３８９】
Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型T細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。
【０３９０】
関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、RPMI-1640＋10％FCS＋1％Glutamax中、生細胞1×106個/mlに調整した。
【０３９１】
96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。
【０３９２】
次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つ抗体の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。
【０３９３】
20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０３９４】
標的細胞とエフェクター細胞とを5:1の比（図11Aおよび図11C、黒いドット）で20時間共培養した場合、グラフは、P329G LALA変異を持つTNC A2B10を抗体として使用したときに、抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞および抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の用量依存的活性化を示す。対照抗体P329G LALA変異を持つDP47/vk3 IgG（図11Aおよび図11C、黒いドット）を使用した場合は、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化も抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化も、検出できなかった。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。値はすべてベースライン補正された値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３９５】
図11Bおよび図11Dは、どちらも標的細胞および1μg/mlのTNC A2B10と共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図11D）または抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図11B）のデータを、さまざまな対照条件と比較して表している。
【０３９６】
Jurkat NFAT T細胞は、標的細胞および1μg/ml IgGと共培養した場合に、検出可能なルミネセンスシグナルを何も示さない（図11Bおよび図11D、白い三角形）。一方、標的細胞および1μg/ml IgGと共培養されたJurkat NFAT細胞のCD3依存的活性化は、検出可能なルミネセンスシグナルによって、それらの機能性を証明している（図11Bおよび図11D、白い四角形）。
【０３９７】
標的細胞および1μg/ml IgGと共培養された抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のCD3依存的活性化（図11B、白い丸）および抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のCD3依存的活性化（図11D、白い丸）は、CAR媒介活性化とCD3媒介活性化とが組み合わされるので、全体の中で最も高いルミネセンスシグナルを示す。CD3媒介ルミネセンスシグナルは、CARを標的細胞および1μg/mlのDP47/vk3抗体と共にインキュベートした場合にも見られる（図11Bおよび図11D、黒い菱形）。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０３９８】
実施例7
ここでは、付着性TNC発現CT26TNC cl 19腫瘍細胞を標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。エフェクター細胞としては、抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図12A）の選別されたプールを使用した。P329G LALA変異を持つTNCA2B10をIgGとして使用した。さらにP329G LALA変異を有するIgG DP47/vk3をアイソタイプ対照として含めた。
【０３９９】
陽性対照として、96ウェルプレート（Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、37℃で1時間、コーティングした。CD3コートウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。
【０４００】
付着性CT26TNC cl 19標的細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシンを使って剥離した。剥離した細胞をRPMI-1630＋10％FCSおよび1％Glutamax＋15μg/mlピューロマイシンに再懸濁した。
【０４０１】
Cedex HiResを使って、エフェクター細胞またはJurkat NFAT野生型細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。
【０４０２】
関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、RPMI-1640＋10％FCS＋1％Glutamax中、生細胞1×106個/mlに調整した。
【０４０３】
96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。
【０４０４】
次の工程として、関心対象の抗原を標的とするP329G LALA変異を持つ抗体の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200ulの最終体積で1μg/ml〜0.0001μg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。
【０４０５】
20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100ulのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０４０６】
標的細胞とエフェクター細胞とを5:1の比（図12A、黒いドット）で20時間共培養した場合、グラフは、0.01μg/mlのP329G LALA変異を持つTNC A2B10から始まる抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の用量依存的活性化を示す。対照抗体P329G LALA変異を持つDP47/vk3 IgG（図12Aおよび図12C、灰色のドット）を使用した場合、抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化は検出できなかった。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。値はすべてベースライン補正された値として示されている。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０４０７】
図12Bは、標的細胞および1μg/mlのTNC A2B10抗体と共培養された抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のデータを、さまざまな対照条件と比較して表す。
【０４０８】
抗体なしで標的細胞と共にインキュベートした抗P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞（図12B、黒い四角形）ならびに標的細胞および1μg/mlのTNC A2B10抗体と共にインキュベートしたJurkat NFAT細胞（図12B、白いドット）は、検出可能なルミネセンスシグナルを示さない。一方、CD3コートウェルにプレーティングして標的細胞および1μg/mlのTNC A2B10と共培養したJurkat NFAT細胞は、明白なルミネセンスシグナルを示す。
【０４０９】
さらに、CD3コートウェル中で標的細胞と1μg/mlのTNC A2B10または1μg/ml DP47/vk3抗体のどちらか一方と共にインキュベートした抗P329G--CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD Fab発現Jurkat NFAT T細胞は、高いルミネセンスシグナルを示す。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０４１０】
実施例8
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD（図13A）または抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD（図13B）を発現するJurkat NFAT細胞のプールをエフェクター細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。P329G LALA変異を持つ、D265A P329G変異を持つ、もしくはLALA変異のみを持つ、または変異を全く持たない、GA101 IgGを、IgGとして使用した。このIgGは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では、Jurkat NFAT T細胞によって認識される。Cedex HiResを使って、エフェクター細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamaxに再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、成長培地中、生細胞1×106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。次の工程として、関心対象の抗原を標的とするさまざまな抗体の段階希釈液を、2ml深底プレート（Axygen（登録商標））を使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり200μlの最終体積で1μg/ml〜10pg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を50μlずつ各ウェルにピペッティングした。96ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明平底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100μlのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。グラフは、P329G変異を有するかP329G変異とLALA変異とを有する抗体を使用した場合にのみ、標的細胞の用量依存的活性化を示し、LALA変異のみの場合は、そのような活性化を示さない。さらに、GA101野生型抗体を使用した場合には、エフェクター細胞の活性化は検出できない。
【０４１１】
実施例9
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、抗P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD（図14A）または抗P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD（図14B）を発現するJurkat NFAT細胞のプールをエフェクター細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる。P329G LALA変異を持つ、P329G変異のみを持つ、もしくはLALA変異のみを持つ、または変異を全く持たない、GA101 IgGを、IgGとして使用した。このIgGは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では、Jurkat NFAT T細胞によって認識される。Cedex HiResを使って、エフェクター細胞を計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1×106個/mlに調整した。細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamaxに再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、エフェクター細胞について記述したように、成長培地中、生細胞1×106個/mlに調整した。384ウェルプレートに、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、3つ組でプレーティングした。次の工程として、関心対象の抗原を標的とするさまざまな抗体の段階希釈液を、96ウェルプレートを使って、成長培地中に調製した。1ウェルあたり30μlの最終体積で1μg/ml〜10pg/mlの範囲の最終濃度を得るために、異なる希釈液を10μlずつ各ウェルにピペッティングした。384ウェルプレートを、190g、室温で2分間遠心分離した。Parafilm（登録商標）で封止したプレートを、恒湿雰囲気下、37℃および5％CO2でインキュベートした。20時間のインキュベーション後に、6μlのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加え、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、直ちに読出しを行った。グラフは、P329G変異を有するかP329G変異とLALA変異とを有する抗体を使用した場合にのみ、標的細胞の用量依存的活性化を示し、LALA変異のみの場合は、そのような活性化を示さない。さらに、GA101野生型抗体を使用した場合には、エフェクター細胞の活性化は検出できない。
【０４１２】
例示的配列
（表２）抗P329G-ds-scFvアミノ酸配列
2020515256.tif 000063
2020515256.tif 000064
【０４１３】
（表３）抗P329G-ds-scFv DNA配列
2020515256.tif 000065
2020515256.tif 000066
2020515256.tif 000067
2020515256.tif 000068
【０４１４】
（表４）抗P329G-scFvアミノ酸配列
2020515256.tif 000069
【０４１５】
（表５）抗P329G-scFv DNA配列
2020515256.tif 000070
2020515256.tif 000071
2020515256.tif 000072
【０４１６】
（表６）抗P329G-ds-Fabアミノ酸配列
2020515256.tif 000073
【０４１７】
（表７）抗P329G-ds-Fab DNA配列
2020515256.tif 000074
2020515256.tif 000075
2020515256.tif 000076
2020515256.tif 000077
【０４１８】
（表８）抗P329G-Fabアミノ酸配列
2020515256.tif 000078
【０４１９】
（表９）抗P329G-Fab DNA配列
2020515256.tif 000079
2020515256.tif 000080
2020515256.tif 000081
2020515256.tif 000082
【０４２０】
（表１０）抗AAA-scFvアミノ酸配列
2020515256.tif 000083
【０４２１】
（表１１）抗AAA-Fabアミノ酸配列
2020515256.tif 000084
【０４２２】
（表１２）
2020515256.tif 000085
2020515256.tif 000086
2020515256.tif 000087
2020515256.tif 000088
2020515256.tif 000089
2020515256.tif 000090
2020515256.tif 000091
2020515256.tif 000092
2020515256.tif 000093
2020515256.tif 000094
2020515256.tif 000095
2020515256.tif 000096
【図１】
2020515256.tif 000105
【図２】
2020515256.tif 000106
【図３】
2020515256.tif 000107
【図４】
2020515256.tif 000108
【図５】
2020515256.tif 000109
【図６】
2020515256.tif 000110
【図７】
2020515256.tif 000111
【図８Ａ】
2020515256.tif 000112
【図８Ｂ】
2020515256.tif 000113
【図８Ｃ】
2020515256.tif 000114
【図８Ｄ】
2020515256.tif 000115
【図９Ａ】
2020515256.tif 000116
【図９Ｂ】
2020515256.tif 000117
【図９Ｃ】
2020515256.tif 000118
【図９Ｄ】
2020515256.tif 000119
【図１０Ａ】
2020515256.tif 000120
【図１０Ｂ】
2020515256.tif 000121
【図１０Ｃ】
2020515256.tif 000122
【図１０Ｄ】
2020515256.tif 000123
【図１１Ａ】
2020515256.tif 000124
【図１１Ｂ】
2020515256.tif 000125
【図１１Ｃ】
2020515256.tif 000126
【図１１Ｄ】
2020515256.tif 000127
【図１２Ａ】
2020515256.tif 000128
【図１２Ｂ】
2020515256.tif 000129
【図１３Ａ】
2020515256.tif 000130
【図１３Ｂ】
2020515256.tif 000131
【図１４Ａ】
2020515256.tif 000132
【図１４Ｂ】
2020515256.tif 000133
【配列表】
2020515256000001.app
【国際調査報告】
2020515256.tif 000134
2020515256.tif 000135