(57)【要約】  抗ＩＦＮ−γ抗体が提供される。前記抗体を含む組成物およびＩＦＮ−γ媒介症候群の治療における前記抗体の医薬用途が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離抗体であって、
配列番号：１２０、１２３、１２６、１２９、１４４、１４７、１５０、または１５３から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ１と、
配列番号：１２１、１２４、１２７、１３０、１４５、１４８、１５１、または１５４から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ２と、
配列番号：１２２、１２５、１２８、１３１、１４６、１４９、１５２、または１５５から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ３と、
配列番号：１３２、１３５、１３８、１４１、１５６、１５８、１６０、または１６２から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ１と、
配列番号：１３３、１３６、１３９、１４２、１５７、１５９、１６１、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ２と、
配列番号：１３４、１３７、１４０、または１４３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ３と、を含む単離抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の単離抗体であって、ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１２０、配列番号：１２１、および配列番号：１２２であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１３２、配列番号：１３３、および配列番号：１３４である単離抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１４４、配列番号：１４５、および配列番号：１４６であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１５６、配列番号：１５７、および配列番号：１３４である単離抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１２３、配列番号：１２４、および配列番号：１２５であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１３５、配列番号：１３６、および配列番号：１３７である単離抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１４７、配列番号：１４８、および配列番号：１４９であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１５８、配列番号：１５９、および配列番号：１３７である単離抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１２６、配列番号：１２７、および配列番号：１２８であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１３８、配列番号：１３９、および配列番号：１４０である単離抗体。
【請求項７】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１５０、配列番号：１５１、および配列番号：１５２であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１６０、配列番号：１６１、および配列番号：１４０である単離抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１２９、配列番号：１３０、および配列番号：１３１であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１４１、配列番号：１４２、および配列番号：１４３である単離抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１５３、配列番号：１５４、および配列番号：１５５であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１６２、配列番号：１６３、および配列番号：１４３である単離抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１２０、配列番号：１２１、および配列番号：１２２であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１３５、配列番号：１３６、および配列番号：１３７である単離抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１４４、配列番号：１４５、および配列番号：１４６であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１５８、配列番号：１５９、および配列番号：１３７である単離抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１２３、配列番号：１２４、および配列番号：１２５であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１３２、配列番号：１３３、および配列番号：１３４である単離抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載の単離抗体であって、前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１４７、配列番号：１４８、および配列番号：１４９であり、前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号：１５６、配列番号：１５７、および配列番号：１３４である単離抗体。
【請求項１４】
請求項１に記載の単離抗体であって、ＶHが配列番号：１０９、１１０、１１１、または１１２に対して少なくとも９０％の同一性を有し、ＶLが配列番号：１１３、１１４、１１５または１１６に対して少なくとも９０％の同一性を持つ配列を含む単離抗体。
【請求項１５】
ＶHがＮ結合型グリコシル化部位を含まない、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離抗体であって、ＶHが配列番号：１６４に対して少なくとも９０％の同一性を有する、７６位の前記アミノ酸がＡである配列、または配列番号：１６５に対して少なくとも９０％の同一性を有する、７６位の前記アミノ酸がＱである配列を含み、ＶLが配列番号１１３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む単離抗体。
【請求項１７】
前記抗体がマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１８】
前記抗体がヒトおよびアカゲザル／カニクイザルからのＩＦＮ−  γと交差反応する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープと特異的に結合する単離抗体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離抗体であって、前記抗体が、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３０〜５２または３６〜４８、およびアミノ酸７８〜９２または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、前記アミノ酸３０〜５２が配列番号：１６７のアミノ酸を含み、前記アミノ酸３６〜４８が配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記７８〜９２が配列番号：１６８のアミノ酸を含み、前記８２〜９２が配列番号：１７２のアミノ酸を含む単離抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の単離抗体であって、前記抗体が、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３６〜４８または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、前記アミノ酸３６〜４８が配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記８２〜９２が配列番号：１７２のアミノ酸を含む単離抗体。
【請求項２２】
単離抗体であって、前記抗体が、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３０〜５２または３６〜４８、およびアミノ酸７８〜９２または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、前記アミノ酸３０〜５２が配列番号：１６７のアミノ酸を含み、前記アミノ酸３６〜４８が配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記７８〜９２が配列番号：１６８のアミノ酸を含み、前記８２〜９２が配列番号：１７２のアミノ酸を含む単離抗体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離抗体であって、前記抗体が、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３６〜４８または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、前記アミノ酸３６〜４８が配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記８２〜９２が配列番号：１７２のアミノ酸を含む単離抗体。
【請求項２４】
ヒトＩＦＮ−γのエピトープに特異的に結合する単離抗体であって、前記エピトープがヒトＩＦＮ−γのＫ４３、Ｑ４８、およびＫ８６を含み、前記ヒトＩＦＮ−γが配列番号：１６６を含む単離抗体。
【請求項２５】
前記エピトープがヒトＩＦＮ−γのＫ３７、Ｅ３８、Ｋ４３、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ８６、およびＲ８９を含み、前記ヒトＩＦＮ−γが配列番号：１６６を含む、請求項２４に記載の単離抗体。
【請求項２６】
前記単離抗体が、１×１０-8Ｍ未満、１×１０-9Ｍ未満、１×１０-10Ｍ未満、１×１０-11Ｍ未満、またはさらに小さい結合値ＫDでヒトＩＦＮ−γに特異的に結合する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２７】
前記特異的ＩＦＮ−γ結合値ＫDがバイオレイヤー干渉法解析によって測定される、請求項２６に記載の単離抗体。
【請求項２８】
前記単離抗体が、５０ｎｇ／ｍＬ未満、２５ｎｇ／ｍＬ未満、または１０ｎｇ／ｍＬ未満のＩＣ50値でヒトＩＦＮ−γ媒介性活性を阻害する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２９】
前記ＩＣ50値がＨＬＡ−ＤＲ発現解析によって測定される、請求項２８に記載の単離抗体。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：１７３、１７５、１７６、１７７、１７９、または１８１に対して少なくとも９０％の同一性を有し、前記抗体のＶHをコードしている第一の配列、および配列番号：１７４、１７８、１８０または１８２に対して少なくとも９０％の同一性を有し、前記抗体のＶLをコードしている第二の配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞の前記抗体の最適な発現のために選択された１つまたは複数のコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、およびＣＯＳ細胞である、請求項３１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体を発現する単離宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、大腸菌、昆虫、酵母、または哺乳動物細胞から成る群から選択される、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
インターフェロン−γの活性を中和するための組成物であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離抗体、および
担体を含む組成物。
【請求項３８】
ＩＦＮ−γ媒介性症候群を治療するための医薬組成物であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離抗体の有効量、および
薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３９】
前記「ＩＦＮ−γ媒介性症候群」が、炎症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、糖尿病（１型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、エリスロポエチン抵抗性、移植片対宿主病、移植拒絶反応、自己免疫性肝炎誘発性肝障害、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変を含むアルコール性肝障害、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、強直性脊椎炎、川崎病、ドライアイ疾患、血球貪食性リンパ組織球症、マクロファージ活性化症候群、甲状腺炎、血管炎、またはその組み合わせを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ＩＦＮ−γ媒介性症候群を治療するための方法であって、
それを必要とする被験者に、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離抗体の有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項４１】
前記投与が注射、注入、点滴、および吸入によって実行される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記投与が注射によるものであり、前記注射が静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、硝子体内、経気管、皮下、表皮下、関節内、眼窩下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、ならびに胸骨内注射および注入から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記「ＩＦＮ−γ媒介性症候群」が、炎症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、糖尿病（１型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、エリスロポエチン抵抗性、移植片対宿主病、移植拒絶反応、自己免疫性肝炎誘発性肝障害、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変を含むアルコール性肝障害、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、強直性脊椎炎、川崎病、ドライアイ疾患、血球貪食性リンパ組織球症、マクロファージ活性化症候群、甲状腺炎、血管炎、またはその組み合わせを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
環境中のインターフェロン−γを検出するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離抗体を前記環境に適用する工程と、
（ｂ）前記環境を抗ＩｇＧ抗体と共にインキュベートする工程であって、前記抗ＩｇＧ抗体が検出可能な標識と結合している工程と、
（ｃ）前記検出可能な標識を検出する工程と、を含む方法。
【請求項４５】
前記抗ＩｇＧ抗体がＦｃ特異的抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出可能な標識がアルカリホスファターゼを含み、前記方法が、工程（ｂ）の後かつ工程（ｃ）の前に、前記環境をｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液と共にインキュベートする工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）の前記検出が、ＯＤ405での前記環境の吸光度を決定することによって実施される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年５月５日に出願された米国仮出願番号第６２／５０１，９５２号の優先権を主張し、その仮出願はすべての目的に対して、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）に対する新しい組換え抗体またはその任意の抗原結合フラグメントに関する。本開示は、ＩＦＮ−γ媒介性疾患の改善、治療または予防における、前記抗体またはその任意の抗原結合フラグメントの使用法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）は、先天免疫および適応免疫の両方に重要な役割を果たすサイトカインである。ＩＦＮ−γは炎症および自己免疫疾患に関連することが当技術分野で知られている。例えば、Ｋｉｎｅ  Ｅｄｖａｒｄｓｅｎらは、大量のＩＦＮ−γを生産する自己反応性２１  ＯＨ特異的Ｔ細胞はアジソン病患者にも多く見られることを発表した（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  ２０１５  Ｏｃｔ  １；  ３５（１０）：  ７５９−７７０）。Ｂｉｓｐｉｎｇ  Ｇらは、炎症性腸疾患患者は、疾患の非活動状態にあっても、腸上皮細胞によって媒介されるＣＤ８＋リンパ球のＩＦＮ−γ誘導に対する能力増加を示す、と結論付けた（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１  Ｊａｎ；１２３（１）：１５−２２）。
【０００４】
前述の炎症誘発機能とは対照的に、特定の状況では、ＩＦＮ−γ発現はＴ細胞活性の抑制につながり得る。例えば、Ｂｅｎｃｉ  ＪＬらは、腫瘍ＩＦＮ−γシグナル伝達が、免疫チェックポイント阻害に対する多重遺伝子耐性プログラムを制御する可能性があることを示した（Ｃｅｌｌ，  ２０１６，  Ｄｅｃ  １６７：１５４０−１５５４）。彼らのデータは、ＩＦＮ−γのを阻害するまたは中和することによって、特有の疲弊したＴ細胞サブセットの機能を改善する可能性があることを示した。従って、抗ＩＦＮ−γの中和薬剤も、Ｔ細胞免疫性を増強するために使用することができる。
【０００５】
炎症関連疾患の治療に対する抗ＩＦＮ−γ薬剤の医薬用途の可能性を考慮すると、工業的および医薬的用途に有用な抗ＩＦＮ−γ抗体に対するニーズが引き続き存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の目的の一つは、インターフェロン−γ媒介性活性を中和するための、新しい抗ＩＦＮ−γ抗体およびこれを含む組成物を提供することである。本開示の別の目的は、ＩＦＮ−γ媒介症候群を治療するための、前記抗ＩＦＮ−γ抗体を含む医薬組成物を提供することである。
【０００７】
前記目的を達成するために、本開示は以下を含む単離抗体を提供する：配列番号：１２０、１２３、１２６、１２９、１４４、１４７、１５０、または１５３から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ１；配列番号：１２１、１２４、１２７、１３０、１４５、１４８、１５１、または１５４から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ２；配列番号：１２２、１２５、１２８、１３１、１４６、１４９、１５２、または１５５から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ３；配列番号：１３２、１３５、１３８、１４１、１５６、１５８、１６０、または１６２から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ１；配列番号：１３３、１３６、１３９、１４２、１５７、１５９、１６１、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ２；配列番号：１３４、１３７、１４０、または１４３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ３。
【０００８】
本開示は、前記抗体と同じエピトープに特異的に結合する単離抗体も提供する。一部の実施形態では、前記抗体は、下記および本明細書のその他の場所に記述されるようなエピトープ結合特性をさらに含む。
【０００９】
次に本開示は単離抗体を提供し、ここで抗体は、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３０〜５２または３６〜４８およびアミノ酸７８〜９２または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、前記アミノ酸３０〜５２は配列番号：１６７のアミノ酸を含み、前記アミノ酸３６〜４８は配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記７８〜９２は配列番号：１６８のアミノ酸を含み、前記８２〜９２は配列番号：１７２のアミノ酸を含む。
【００１０】
本開示は単離抗体をさらに提供し、ここで抗体は、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３６〜４８または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、前記アミノ酸３６〜４８は配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記アミノ酸８２〜９２は配列番号：１７２のアミノ酸を含む。
【００１１】
本開示は、ヒトＩＦＮ−γのエピトープに特異的に結合する単離抗体も提供し、ここで前記エピトープはヒトＩＦＮ−γのＫ４３、Ｑ４８、およびＫ８６を含み、前記ヒトＩＦＮ−γは配列番号：１６６を含む。
【００１２】
次に本開示は前記単離抗体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは抗体をコードし、ここで抗体は、配列番号：１２０、１２３、１２６、１２９、１４４、１４７、１５０、または１５３から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ１；配列番号：１２１、１２４、１２７、１３０、１４５、１４８、１５１、または１５４から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ２；配列番号：１２２、１２５、１２８、１３１、１４６、１４９、１５２、または１５５から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ３；配列番号：１３２、１３５、１３８、１４１、１５６、１５８、１６０、または１６２から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ１；配列番号：１３３、１３６、１３９、１４２、１５７、１５９、１６１、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ２；配列番号：１３４、１３７、１４０、または１４３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ３、を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号：１７３、１７５、１７６、１７７、１７９、または１８１に対して少なくとも９０％の同一性を有し、抗体のＶHをコードしている第一の配列、および配列番号：１７４、１７８、１８０または１８２に対して少なくとも９０％の同一性を有し、抗体のＶLをコードしている第二の配列を含む。
【００１４】
本開示は前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
【００１５】
本開示は前記ベクターを含む単離宿主細胞も提供する。
【００１６】
次に本開示は前記単離抗体を発現する単離宿主細胞を提供する。
【００１７】
本開示は、前記単離抗体および担体を含む、インターフェロン−γ活性を中和するための組成物も提供する。
【００１８】
次に本開示は、前記単離抗体の有効量および薬学的に許容可能な担体を含む、ＩＦＮ−γ媒介性症候群を治療するための組成物を提供する。
【００１９】
本開示はさらに、単離抗体の有効量を必要とする被験者に投与することを含む、ＩＦＮ−γ媒介性症候群の治療方法を提供する。
【００２０】
本開示は、環境中のインターフェロン−γを検出するための方法も提供し、方法は、（Ａ）前記単離抗体を前記環境中に適用する工程、（Ｂ）前記環境を抗ＩｇＧ抗体と共に培養する工程であって、前記ＩｇＧ抗体が検出可能な標識と結合している工程、および（Ｃ）前記検出可能な標識を検出する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１の抗体２Ａ６のＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化分析の結果を示す。「−」は未処理群を表し、「＋」はＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理された群を表す。矢印はＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理後のバンドのシフトを示す。
【図２】実施例１の抗体２Ａ６、２Ａ６＿Ａおよび２Ａ６＿ＱのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図３】実施例２のＡＨＣバイオセンサーに固定された抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ上に異なる濃度（０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０ｎＭ）の組換えヒトＩＦＮ−γを通すことによって得られた結合曲線を示す。
【図４】実施例２のＡＨＣバイオセンサーに固定された抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ上に異なる濃度（０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０ｎＭ）の組換えヒトＩＦＮ−γを通すことによって得られた結合曲線を示す。ＡＭＧ８１１は、米国特許第７，３３５，７４３号に記述された抗ＩＦＮ−γ抗体であり、それに記述されたように調製された。コントロールＡｂはヒトＩｇＧ１イソタイプコントロール抗体である（Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ；ＢＰ０２９７）。
【図５】ＩＦＮ−γ誘導性ＨＬＡ−ＤＲ発現が本開示の抗体によって用量依存性的に、且つ効果的に阻害され得ることを示す。
【図６】本開示の抗体のＩＦＮ−γ結合親和性を表す、実施例２のＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】本開示の抗体のヒトＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ２８５−ＩＦ−１００）結合親和性を表す、実施例３のＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８】本開示の抗体のアカゲザル／カニクイザルＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ９６１−ＲＭ−０２５）結合親和性を表す、実施例３のＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図９】本開示の抗体のＩＦＮ−γに対する中和活性を示す。
【図１０】実施例３で実施された抗ＩＦＮ−γ抗体の全血分析におけるＣＸＣＬ９産生の阻害を示す。
【図１１】実施例３で実施された抗ＩＦＮ−γ抗体の全血分析におけるＣＸＣＬ１０産生の阻害を示す。
【図１２】ＨＬＡ−ＤＲのＩＦＮ−γ誘導性発現に対する本開示の抗体の阻害効果を示す。
【図１３】ＰＤ−Ｌ１のＩＦＮ−γ誘導性発現に対する本開示の抗体の阻害効果を示す。
【図１４】実施例４で実施されたエピトープビニング実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書および添付の請求項の説明については、文脈により明らかにそうでないことが示されていない限り、単数形「ａ」、および「ａｎ」には複数の対象物が含まれる。従って、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及には複数のたんぱく質が含まれ、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ｝」への言及は複数の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は互換的であり、制限することを意図しない。さまざまな実施形態の説明で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、一部の特定例では、実施例は「実質的に〜から成る」または「〜から成る」という言い回しを使用して代替的に記述され得ることを、当業者であれば理解することをさらに理解すべきである。
【００２３】
値の範囲が提供されている場合、文脈により明らかにそうでないことが示されていない限り、その範囲の上限と下限の間の値のそれぞれの介在整数、および値のそれぞれの介在整数の１０分の１、および言明された範囲内の言明された値または介在値が本発明に包含されることが理解される。言明された範囲中の特に除外される限度に制限される、これらのより小さな範囲の上限および下限は、そのより小さな範囲に独立して含まれる可能性があり、本発明内にも包含される。言明された範囲には、限度の一つまたは両方を含み、これらの含まれた限度の（ｉ）いずれか、または（ｉｉ）両方を除く範囲も本発明に含まれる。例えば、「１〜５０」は「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」などを含む。
【００２４】
本開示に言及されたすべての出版物、特許、特許出願、およびその他の文書は、各個別の出版物、特許、特許出願またはその他の文書が、すべての目的に対して参照により本明細書に組み込まれるものとするとあたかも個別に示されたかのように、すべての目的に対してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
図面を含む前述の一般的説明、および以下の詳細説明の両方は例示的であり、例示のみであり、本開示を制限しないことを理解すべきである。
【００２６】
他に特に定義されていない限り、本明細書の記述に使用された技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を持つものとする。
【００２７】
「抗体」という用語は本明細書で使用される場合、インタクト抗体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶHと略される）および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶLと略される）および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬから成る。ＶHおよびＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。ＶHおよびＶLのそれぞれは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００２８】
フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９９１を参照）およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：２０７−９，  ２００１およびオンラインｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇを参照）によって定義されている。
【００２９】
本開示の文脈においての「Ｋａｂａｔシステム」は、Ｋａｂａｔ（１９９１；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔ．，  ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ）およびＣｈｏｔｈｉａ（１９８７；  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６，  ９０１−９１７）による一貫した方法で残基に付番する基準を意味する。この付番方式は当業者によって広く使用されており、配列多様性および、抗原結合活性において重要な可変ドメイン領域の三次元ループに基づいている。軽鎖または重鎖のすべての残基は、Ｋａｂａｔシステムでは別個の位置を持つ。すなわち、Ｋａｂａｔ方式はＣＤＲに適用され、フレームワーク領域にも適用される。任意の抗体の特定残基の位置はＫａｂａｔシステムによって付番され得る。Ｋａｂａｔシステムに従ってＶHおよびＶL鎖のＣＤＲ領域を特定するための規則は、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓに示されている。
【００３０】
ＩＭＧＴ特別な付番方式はＫａｂａｔシステムの代替方式であり、抗原受容体、鎖のタイプ、または種に限らずに可変ドメインを比較することができる［Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １８，  ５０９  （１９９７）／Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．，  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，  ７，  １３２−１３６  （１９９９）／Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．，  Ｐｏｍｍｉｅ，  Ｃ．，  Ｒｕｉｚ，  Ｍ．，  Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，  Ｖ．，  Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｔｒｕｏｎｇ，  Ｌ．，  Ｔｈｏｕｖｅｎｉｎ−Ｃｏｎｔｅｔ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２７，  ５５−７７  （２００３）］。ＩＭＧＴ特別な付番方式では、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などの保存されたアミノ酸は必ず同じ位置にある。ＩＭＧＴ特別な付番方式は、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：位置１〜２６、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８）ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７）の標準化限界を提供する。切れ目は占有されていない位置を表すため、ＣＤＲ−ＩＭＧＴの長さ（括弧の間に、点で分離されて示される、例えば、［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ特別な付番方式は、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ  ［Ｒｕｉｚ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５３，  ８５７−８８３  （２００２）／Ｋａａｓ，  Ｑ．  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２，  ２１−３０  （２００７）］と表される２Ｄグラフィック表示、およびＩＭＧＴ／３Ｄ構造−ＤＢの３Ｄ構造［Ｋａａｓ，  Ｑ．，  Ｒｕｉｚ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．，  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＭＨＣ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄａｔａ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  ３２，  Ｄ２０８−Ｄ２１０  （２００４）］で使用される。
【００３１】
「抗原結合フラグメント」という用語は本明細書で使用される時、例えば、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）2、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−  ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化二重特異性抗体（ｄｓ二重特異性抗体）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価二重特異性抗体）、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成された多重特異性抗体、または抗原には結合するが、完全もしくはインタクト抗体構造を含まない任意のその他の抗体フラグメントなどの、抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体または親抗体フラグメント（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合するのと同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、１つまたは複数の異なるヒト抗体からのフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体からの１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。
【００３２】
上述の抗原結合フラグメントのうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖第一定常領域（ＣＨ１）および１つの抗原結合部位を持つ。Ｆａｂ’は、Ｆａｂ’が重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端にある少なくとも１つのシステイン残基を含むヒンジ領域を持つという点で、Ｆａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ’）2は、Ｆａｂ’のヒンジ領域にあるシステイン残基がジスルフィド結合で連結される時に生産される。
【００３３】
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを持つ最小抗体フラグメントである。Ｆｖフラグメントを生産するための組換え技術は当技術分野でよく知られている。「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、互いに直接にまたはペプチドリンカー配列を介して接続された軽鎖可変領域および重鎖可変領域から成る改変抗体を指す。二本鎖Ｆｖは、重鎖可変領域が非共有結合によって軽鎖可変領域に連結されている構造を持ち得る。一本鎖Ｆｖは一般的に、二本鎖Ｆｖように二量体構造を形成することができ、ここで重鎖可変領域はペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合されているか、または重鎖および軽鎖可変領域は、そのＣ末端で互いに直接に連結されている。リンカーは任意の１〜１００個または２〜５０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーであってよく、そのために有用な適正配列は当技術分野でよく知られている。
【００３４】
抗原結合フラグメントは、プロテアーゼを使用して取得する（例えば、全抗体をパパインで消化してＦａｂフラグメントを得るか、ペプシンで消化してＦ（ａｂ’）2フラグメントを得ることができる）か、または遺伝子組換え技術によって調製することができる。
【００３５】
「単離抗体」は本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性（例えば、ＩＦＮ−γを特異的に結合する単離抗体は、ＩＦＮ−γ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を持つその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する。しかし、ＩＦＮ−γに特異的に結合する単離抗体は、その他の種からのＩＦＮ−γ分子など、その他の抗原に対して交差反応性を持ち得る。さらに、単離抗体はその他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００３６】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は本明細書で使用される場合、同種分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す。
【００３７】
「ヒト抗体」という用語は本明細書で使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を持つ抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲがヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。
【００３８】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を持ち、単一結合特異性を示す抗体を指す。
【００３９】
「組換えヒト抗体」という用語は本明細書で使用される場合、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマ（下記でさらに説明する）から単離された抗体、（ｂ）例えばトランスフェクトーマからなど、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組換え、組み合わせヒト抗体ライブラリから単離された抗体、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列をその他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する任意のその他の手段によって調製、発現、作成または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作成または単離されたすべてのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を持つ。しかし特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する時は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を受けさせることができ、そのため組換えヒト抗体のＶHおよびＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶHおよびＶL配列に由来しこれに関連するものの、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に本来存在しない可能性がある配列である。
【００４０】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種から作られ、ヒトで本来生成される抗体バリアントに対する類似性を増すように改変されたタンパク質配列を含む抗体を指す。ヒト化プロセスは、非ヒト起源抗体をヒトに適用する時、望ましくない免疫原性効果を回避するために必要となる可能性がある。比較すると、「キメラ抗体」という用語は本明細書で言及される場合、１つの種からの抗原結合領域（すなわち、ＶHおよびＶL）を別の定常ドメインと融合することによって作られる抗体である。
【００４１】
「Ｋassoc」または「Ｋa」という用語は本明細書で使用される場合、特定の抗原抗体相互作用の会合速度を指すことを意図する一方、「Ｋdis」または「Ｋd」という用語は本明細書で使用される場合、特定の抗原抗体反応の解離速度を指すことを意図する。「ＫD」という用語は本明細書で使用される場合、ＫdのＫaに対する比率（すなわち、Ｋd／Ｋa）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図する。抗体のＫD値は、本技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、特異抗体によって認識され結合される抗原の一部を指し、抗原の抗原特異性を決定する。エピトープは抗原決定基としても知られる。特に、本開示では、エピトープはヒトＩＦＮ−γの特異ドメインまたはドメインの組み合わせであり得る。本開示の一部の実施形態では、特異ドメインまたはドメインの組み合わせは、配列番号：１６６のアミノ酸配列を含むヒトＩＦＮ−γのものである。
【００４３】
本開示の一実施形態では、ＩＦＮ−γは配列番号：１６６を含み、本開示の抗体は、配列番号：１６６のアミノ酸３０〜５２または３６〜４８および配列番号：１６６のアミノ酸７８〜９２または８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合する。本開示の特定実施形態では、本開示の抗体は、配列番号：１６６のアミノ酸３０〜５２およびアミノ酸７８〜９２でＩＦＮ−γに特異的に結合する。この特定実施形態では、配列番号：１６６の前記アミノ酸３０〜５２およびアミノ酸７８〜９２が本開示の抗体のエピトープを形成する。別の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号：１６６のアミノ酸３６〜４８およびアミノ酸８２〜９２でＩＦＮ−γに特異的に結合する。この特定実施形態では、配列番号：１６６の前記アミノ酸３６〜４８およびアミノ酸８２〜９２が本開示の抗体のエピトープを形成する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ＩＦＮ−γに特異的に結合する」抗体は、１×１０-8Ｍ未満、１×１０-9  Ｍ未満、１×１０-10Ｍ未満、１×１０-11Ｍ未満またはさらに小さい結合値ＫDでＩＦＮ−γに結合する抗体を指すことを意図する。
【００４５】
本開示の第一の態様。
【００４６】
本開示の第一の態様では、単離抗体または任意の抗原結合部分が提供される。前記単離抗体または任意の抗原結合部分は：
（ａ）配列番号：１２０、１２３、１２６、１２９、１４４、１４７、１５０、または１５３から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１２１、１２４、１２７、１３０、１４５、１４８、１５１、または１５４から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１２２、１２５、１２８、１３１、１４６、１４９、１５２、または１５５から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：１３２、１３５、１３８、１４１、１５６、１５８、１６０、または１６２から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：１３３、１３６、１３９、１４２、１５７、１５９、１６１、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：１３４、１３７、１４０、または１４３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ３を含む。
【００４７】
特定実施形態では、抗体２Ａ６が提供される。前記抗体２Ａ６の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１２０、配列番号：１２１、および配列番号：１２２のアミノ酸配列を含み、前記抗体２Ａ６の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１３２、配列番号：１３３、および配列番号：１３４のアミノ酸配列を含む。あるいは、前記抗体２Ａ６の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１４４、配列番号：１４５、および配列番号：１４６のアミノ酸配列を含み、前記抗体２Ａ６の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１５６、配列番号：１５７、および配列番号：１３４のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
特定実施形態では、抗体２Ｂ６が提供される。前記抗体２Ｂ６の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１２３、配列番号：１２４、および配列番号：１２５のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体２Ｂ６の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１３５、配列番号：１３６、および配列番号：１３７のアミノ酸配列を含む。あるいは、前記抗体２Ｂ６の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１４７、配列番号：１４８、および配列番号：１４９のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体２Ｂ６の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１５８、配列番号：１５９、および配列番号：１３７のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
特定実施形態では、抗体１Ｅ８が提供される。前記抗体１Ｅ８の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１２６、配列番号：１２７、および配列番号：１２８のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体１Ｅ８の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１３８、配列番号：１３９、および配列番号：１４０のアミノ酸配列を含む。あるいは、前記抗体１Ｅ８の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１５０、配列番号：１５１、および配列番号：１５２のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体１Ｅ８の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１６０、配列番号：１６１、および配列番号：１４０のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
特定実施形態では、抗体２Ｆ２が提供される。前記抗体２Ｆ２の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１２９、配列番号：１３０、および配列番号：１３１のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体２Ｆ２の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１４１、配列番号：１４２、および配列番号：１４３のアミノ酸配列を含む。あるいは、前記抗体２Ｆ２の前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１５３、配列番号：１５４、および配列番号：１５５のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体２Ｆ２の前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１６２、配列番号：１６３、および配列番号：１４３のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
特定実施形態では、抗体ＡＢが提供される（「ＡＢ」は、２Ａ６のＶH  ＣＤＲおよび２Ｂ６のＶL  ＣＤＲを含み、「ＶＨ２Ａ６／ＶＬ２Ｂ６」とも呼ばれる）。前記抗体ＡＢの前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１２０、配列番号：１２１、および配列番号：１２２のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体ＡＢの前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１３５、配列番号：１３６、および配列番号：１３７のアミノ酸配列を含む。あるいは、前記抗体ＡＢの前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１４４、配列番号：１４５、および配列番号：１４６のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体ＡＢの前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１５８、配列番号：１５９、および配列番号：１３７のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
特定実施形態では、抗体ＢＡが提供される（「ＢＡ」は、２Ｂ６のＶH  ＣＤＲおよび２Ａ６のＶL  ＣＤＲを含み、「ＶＨ２Ｂ６／ＶＬ２Ａ６」とも呼ばれる）。前記抗体ＢＡの前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１２３、配列番号：１２４、および配列番号：１２５のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体ＢＡの前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１３２、配列番号：１３３、および配列番号：１３４のアミノ酸配列を含む。あるいは、前記抗体ＢＡの前記ＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、およびＶH  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１４７、配列番号：１４８、および配列番号：１４９のアミノ酸配列を含み、ここで前記抗体ＢＡの前記ＶL  ＣＤＲ１、ＶL  ＣＤＲ２、およびＶL  ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号：１５６、配列番号：１５７、および配列番号：１３４のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書のその他の場所に記述された配列のいずれかを持つＶH  ＣＤＲおよびＶL  ＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１０９、１１０、１１１、または１１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH領域、および配列番号：１１３、１１４、１１５、または１１６に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL領域を含む、単離抗体または抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００５４】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示された実施形態のいずれかによる単離抗体を提供し、ここで抗体は重鎖および軽鎖をさらに含む。一部の実施形態では、前記重鎖は、配列番号：１０９、１１０、１１１、または１１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH配列を含み、前記軽鎖は配列番号：１１３、１１４、１１５、または１１６に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL領域を含む。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００５５】
特定実施形態では、本開示は抗体２Ａ６のＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１０９に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH領域配列および配列番号：１１３に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL領域配列を含む、抗体を提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００５６】
特定実施形態では、本開示は抗体２Ｂ６のＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH配列および配列番号：１１４に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL配列を含む、抗体を提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００５７】
特定実施形態では、本開示は抗体１Ｅ８のＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１１１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH配列および配列番号：１１５に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL配列を含む、抗体を提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００５８】
特定実施形態では、本開示は抗体２Ｆ２のＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH配列および配列番号：１１６に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL配列を含む、抗体を提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００５９】
特定実施形態では、本開示は抗体ＡＢのＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１０９に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH配列および配列番号：１１４に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL配列を含む、抗体を提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００６０】
特定実施形態では、本開示は抗体ＢＡのＣＤＲを含み、さらに、配列番号：１１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶH配列および配列番号：１１３に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶL配列を含む、抗体を提供する。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００６１】
本開示の抗体のいずれかの別の実施形態では、前記抗体はその可変領域にＮ結合型グリコシル化部位を含まないように改変される。例えば、一部の実施形態では、前記抗体は、そのＶH領域の７６位（Ｎ７６）にあるアスパラギンアミノ酸の点突然変異によって改変される。一実施形態では、Ｎ７６はアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンに変異している。本明細書に開示された単離抗体の特定の実施形態では、抗体はそのＶH領域の位置７６（Ｎ７６）にあるアスパラギンアミノ酸の点突然変異によって改変され、ここでＮ７６位はアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）に変異している。
【００６２】
可変領域にＮ結合型グリコシル化部位を含まない抗体の特定の実施形態では、本開示は抗体２Ａ６＿Ａおよび２Ａ６＿Ｑを提供し、ここで重鎖の前記Ｎ７６  はそれぞれアラニンおよびグルタミンに変異している。よって、一実施形態では、本開示は、配列番号：１６４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列をＶHが含む単離抗体「２Ａ６＿Ｑ」を提供し、ここで７６位のアミノ酸はＡ、または配列番号：１６５であり、７６位のアミノ酸はＱであり、ＶLは配列番号１１３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００６３】
別の実施形態では、前記単離抗体は、１×１０-8Ｍ未満、１×１０-9Ｍ未満、１×１０-10Ｍ未満、１×１０-11Ｍ未満、またはさらに小さい結合値ＫDでヒトＩＦＮ−γに特異的に結合する。ＩＦＮ−γの前記結合値ＫDはバイオレイヤー干渉解析で測定することが好ましい。
【００６４】
別の実施形態では、前記単離抗体は、５０ｎｇ／ｍＬ未満、２５ｎｇ／ｍＬ未満、または１０ｎｇ／ｍＬ未満のＩＣ50値でヒトＩＦＮ−γ媒介性活性を阻害する。前記ＩＣ50値はＨＬＡ−ＤＲ発現解析で測定することが好ましい。
【００６５】
別の実施形態では、本開示の前記抗体は、さまざまな目的のための使用、または異なる動物モデルの研究者が使用する際に便利であるように、種と種の間の交差反応性を持つ可能性がある。例えば、一部の実施形態では、前記抗体は、ヒト、アカゲザル／カニクイザルからなど、異なる哺乳類からのＩＦＮ−γと交差反応し得る。
【００６６】
別の実施形態では、本明細書に記述した前記単離抗体（例えば、２Ａ６、２Ｂ６、２Ａ６＿Ａ、２Ａ６＿Ｑ、１Ｅ８、２Ｆ２、ＡＢ、ＢＡ、およびその抗原結合フラグメント）はさらに、配列番号：１６６のヒトＩＦＮ−γの１つまたは複数のアミノ酸不連続アミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する特性を備える。一実施形態では、抗体は、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３０〜５２および７８〜９２を含むエピトープに特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体は、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３６〜４８および８２〜９２を含むエピトープに特異的に結合することができる。
【００６７】
本開示の第二の態様。
【００６８】
本開示の第二の態様では、別の単離抗体が提供される。抗体は、本開示の第一の態様に記述された抗体と同じエピトープに特異的に結合する。
【００６９】
特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３０〜５２および７８〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、ここでアミノ酸３０〜５２は配列番号：１６７のアミノ酸を含み、前記アミノ酸７８〜９２は配列番号：１６８のアミノ酸を含む。別の実施形態では、抗体は、ヒトＩＦＮ−γのアミノ酸３６〜４８および８２〜９２内の１つまたは複数のアミノ酸残基に特異的に結合し、ここでアミノ酸３６〜４８は配列番号：１７１のアミノ酸を含み、前記アミノ酸８２〜９２は配列番号：１７２のアミノ酸を含む。
【００７０】
代替的実施形態では、前記エピトープはヒトＩＦＮ−γのＫ４３、Ｑ４８、およびＫ８６を含み、ここで前記ヒトＩＦＮ−γは配列番号：１６６を含む。別の実施形態では、前記エピトープはヒトＩＦＮ−γのＫ３７、Ｅ３８、Ｋ４３、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ８６、およびＲ８９を含み、ここで前記ヒトＩＦＮ−γは配列番号：１６６を含む。
【００７１】
本開示の第三の態様。
【００７２】
本開示の第三の態様では、抗体をコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。特に、前記ポリヌクレオチドは、本開示の第一の態様および第二の態様の前記抗体をコードする。特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは前記２Ａ６、２Ａ６＿Ａ、２Ａ６＿Ｑ、２Ｂ６、１Ｅ８、２Ｆ２、ＡＢ、またはＢＡをコードする。例えば、一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは抗体をコードし、ここで抗体は、配列番号：１２０、１２３、１２６、１２９、１４４、１４７、１５０、または１５３から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ１；配列番号：１２１、１２４、１２７、１３０、１４５、１４８、１５１、または１５４から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ２；配列番号：１２２、１２５、１２８、１３１、１４６、１４９、１５２、または１５５から選択されるアミノ酸配列を含むＶH  ＣＤＲ３；配列番号：１３２、１３５、１３８、１４１、１５６、１５８、１６０、または１６２から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ１；配列番号：１３３、１３６、１３９、１４２、１５７、１５９、１６１、または１６３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ２；配列番号：１３４、１３７、１４０、または１４３から選択されるアミノ酸配列を含むＶL  ＣＤＲ３、を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、前記抗体２Ａ６をコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７３および配列番号：１７４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体２Ａ６＿Ａをコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７５および配列番号：１７４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体２Ａ６＿Ｑをコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７６および配列番号：１７４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体２Ｂ６をコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７７および配列番号：１７８に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体１Ｅ８をコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７９および配列番号：１８０に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体２Ｆ２をコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１８１および配列番号：１８２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体ＡＢをコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７３および配列番号：１７８に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記抗体ＢＡをコードしている前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７４および配列番号：１７７に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、前記同一性は９５％である、前記同一性は９８％である、または前記同一性は９９％である。
【００７４】
別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞の抗体の最適な発現のために選択された１つまたは複数のコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む。これは生成物の精度および効率を改善するためのもう一つの特徴である。特定の実施形態では、前記哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、およびＣＯＳ細胞である。
【００７５】
本開示の第四の態様。
【００７６】
本開示の第四の態様では、ベクターおよびこれを含む単離宿主細胞が提供される。前記ベクターは、本開示の第三の態様に記述されたポリヌクレオチドを含み、任意の種類の宿主細胞によって保持されるかまたは発現されて、その結果、本開示の抗体が生成され得るように設計されている。前記宿主細胞は、大腸菌、昆虫、酵母、または哺乳動物細胞から成る群から選択される。
【００７７】
本開示の第五の態様。
【００７８】
本開示の第五の態様では、本開示の抗体を含む組成物が提供される。実施形態で、前記組成物はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γの活性を中和するために使用される。別の実施形態では、前記組成物は、ＩＦＮ−γ媒介性症候群を治療するための医薬組成物である。前記「ＩＦＮ−γ媒介性症候群」には、炎症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、糖尿病（１型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、エリスロポエチン抵抗性、移植片対宿主病、移植拒絶反応、自己免疫性肝炎誘発性肝障害、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変を含むアルコール性肝障害、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、強直性脊椎炎、川崎病、ドライアイ疾患、血球貪食性リンパ組織球症、マクロファージ活性化症候群、甲状腺炎、血管炎、またはその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。「ＩＦＮ−γ媒介性症候群」という用語は、ＩＦＮ−γのレベルの増加またはＩＦＮ−γに対する感受性の増加と関連する任意の医学的状態も包含する。
【００７９】
実施形態では、前記組成物は本開示の前記抗体および担体を含む。前記抗体は、前記組成物の目的に対する有効量で含有され得る。前記「有効量」は本明細書で使用される場合、単独でまたは１つもしくは複数のその他の活性薬剤と併用して、望ましい効果（例えば、本開示のＩＦＮ−γ媒介性症候群を治療する）を被験者に与えるために必要な各活性薬剤の量を指す。当業者であれば認識するように、有効量は治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、体形、性別および体重を含む個別の患者パラメータ、治療の期間、（存在する場合）併用療法の性質、特定の投与経路および医療関係者の知見および専門知識内の因子に応じて変動する。これらの因子は当業者にはよく知られており、日常的な実験だけで対応することができる。個別の成分またはその組み合わせの最大用量、つまり賢明な医学的判断に従った最大安全量を使用することが一般的に好ましい。しかし、患者は、医学的理由、精神的理由、または実質的にその他任意の理由で、より低い用量または耐えられる用量を要求し得ることが、当業者には理解されるであろう。
【００８０】
このような抗体組成物は、望ましい純度を持つ本開示の抗ＩＦＮ−γ抗体を、１つまたは複数の担体と混合することによって調製することができる。典型的には、このような抗体組成物は、水溶液（例えば、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８を参照）として、または凍結乾燥製剤（例えば、米国特許第６，２６７，９５８号を参照）として調製することができる。
【００８１】
本開示の抗体組成物に有用な担体は、薬学的に許容可能な担体とすることができ、これには生理的に適合性のバッファー、賦形剤、安定剤、保存剤、溶媒、分散媒、コーティング、抗生剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが一般的に含まれるが、これらに限定されない。担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適していることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は一般的に、用いられる投薬量および濃度では投与される被験者に対して無毒である。
【００８２】
幅広いこのような薬学的に許容可能な担体が当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）を参照）。本開示の抗体組成物に有用である例示的な薬学的に許容可能な担体には、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性表面活性剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００８３】
本開示の抗体組成物に有用である薬学的に許容可能な担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）（例えば、米国特許公報第２００５／０２６０１８６号および第２００６／０１０４９６８号）など、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（例えば、ｒＨｕＰＨ２０またはＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．）などの間質薬物分散剤も含むことができる。
【００８４】
前記組成物は、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、保存剤、またはその組み合わせなどの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含むことができる。
【００８５】
本開示の第六の態様。
【００８６】
本開示の第六の態様では、ＩＦＮ−γ媒介性症候群を治療するための方法が提供される。前記方法は、本開示の抗体の有効量を、それを必要とする被験者に投与する工程を含む。必要としている前記被験者は、ＩＦＮ−γ媒介性症候群を患う患者（すなわち、人間）であり得る。前記ＩＦＮ−γ媒介性症候群は、上述のように解釈することができるが、上述に列挙された状態または疾患に限定されない。よって、一部の実施形態では、本開示の抗体は医薬組成物として投与するために製剤化され、ここで前記組成物は本明細書に開示された抗体および薬学的に許容可能な担体を含む。抗体と使用するための本技術分野で知られている薬学的に許容可能な担体のいずれかを本開示の子の態様で使用することができ、これには水、ＰＢＳ、塩類溶液、ゼラチン、オイル、アルコール、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
当技術分野で知られている、抗体を含む医薬組成物を投与するための方法のいずれかを使用して、本開示の医薬組成物を投与できることが企図されている。よって、本開示の第六の態様の一部の実施形態では、前記投与は、抗体を被験者に全身的に、または望ましい標的組織に送達する任意の様式によって行われる。全身投与は一般的に、望ましい標的部位、組織、または器官に直接投与することを除き、抗体またはその製剤が被験者の循環系に入り、従って代謝およびその他のプロセスを受けるように、被験者の部位への抗体投与の任意の様式を指す。
【００８８】
よって、本開示の治療方法に有用な投与の様式には、注射、注入、点滴、および吸入が含まれ得るが、これらに限定されない。注射による投与には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、硝子体内、経気管、皮下、表皮下、関節内、眼窩下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、ならびに胸骨内注射および注入が含まれ得る。
【００８９】
前記抗体は、薬学的に許容可能な担体と共に投与することができる。前記薬学的に許容可能な担体には、水、ＰＢＳ、塩類溶液、ゼラチン、オイル、アルコール、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
本開示の第七の態様。
【００９１】
本開示の第七の態様では、環境中のＩＦＮ−γを検出するための方法が提供される。前記方法は、サンプル中のＩＦＮ−γの存在を検出するために実験室で使用し得る。別の実施形態では、前記方法はサンプル中のＩＦＮ−γの定量のために使用し得る。前記方法は、（Ａ）本開示の抗体を適用する工程、（Ｂ）前記環境を抗ＩｇＧ抗体と共に培養する工程であって、前記ＩｇＧ抗体が検出可能な標識と結合している工程、および（Ｃ）前記検出可能な標識を検出する工程を含む。特定の実施形態では、前記方法はウェスタンブロットまたは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の部分である。特定の実施形態では、前記抗ＩｇＧ抗体はＦｃ特異的抗体である。
【００９２】
特定の実施形態では、前記環境はサンプルを含む容器、膜、プレートである。前記検出可能な標識は、検出目的のために前記抗ＩｇＧ抗体と結合した分子を指す。前記検出可能な標識には、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、蛍光標識またはその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、前記検出可能な標識はペルオキシダーゼであり、前記方法は、工程（Ｂ）の後かつ工程（Ｃ）の前に、前記環境をｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（別の実施形態では、ＴＭＢ溶液が使用される）と共に培養する工程をさらに含む。この特定の実施形態では、呈色反応により、ＯＤ405で観察することによってＩＦＮ−γを検出・定量することができる。
【実施例】
【００９３】
本開示のさまざまな特徴および実施形態が、以下の代表的実施例に示されており、これは例示的であり制限的であることを意図しない。当業者であれば、特定の実施例は、後述の請求項をより詳細に説明する本発明の例証のみであることを、容易に理解するであろう。本明細書に記述された各実施形態および特徴は、その中に含まれる各実施形態と互換性があり組み合わせ可能であることが理解されるべきである。
［実施例１］組換え抗ＩＦＮ−γ抗体の調製。
【００９４】
蛍光活性化セルソーティングによる単一ヒトＢ細胞の単離。
【００９５】
治験審査委員会（ＩＲＢ）審査済みプロトコルに従って、インフォームドコンセント署名後に、マイコバクテリア疾患を有する患者から末梢静脈血サンプルを採取した。製造業者の使用説明に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離法により精製した後、患者の末梢静脈血から単核細胞を単離した。精製した単核細胞を、５％正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中１％  ＦＢＳ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＮａＮ3）中に１×１０7細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、３０分間氷冷した。その間に、２０  μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を細胞に加えた。次に、１×１０6細胞のアリコートをＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１×１０6細胞内の組換えＩＦＮ−γタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）１  μｇを、氷冷しながら２０分間で加えた。ソーティング過程前に、ＤＮＡマーカーとして、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＩｇＤ  ＡＰＣ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎｅ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ）、抗ヒトＣＤ１９  ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＩＦＮ−γ  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および７−Ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（Ｓｉｇｍａ）で、氷冷下３０分間、細胞を染色した。ＩＦＮ−γに結合している個別の単一Ｂ細胞をＣＤ１９+ＩｇＧ+ＣＤ３-ＩｇＤ-ＦＩＴＣ+でゲート制御し、１８μＬ／ウェルのＲＴ−ｌｙｓｉｓバッファー（２００  ｎｇのランダムヘキサマープライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１μＬのｄＮＴＰ−ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５％  ｖ／ｖのＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ）、および４０ＵのＲｉｂｏｌｏｃｋ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む）を含む９６ウェルプレートの個別ウェルにソートし、それにより、単一Ｂ細胞のトータルＲＮＡを有するライセート混合物を得た。９６ウェルプレートをアルミニウムシーリングテープ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で密封し、−８０℃で直ちに保存した。
【００９６】
シングルセルＲＴ−ＰＣＲおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子増幅。
【００９７】
各ウェルのＤＥＰＣ処理水中に２μＬ（５０  Ｕ）のＭａｘｉｍａ  Ｈマイナス逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む上記の９６ウェルプレート中、合計容量２０μＬ／ウェルでｃＤＮＡを合成した。ＩＦＮ−γに結合した各Ｂ細胞のトータルＲＮＡを逆転写（ＲＴ）反応にかけた。この反応のアニーリング工程は４２℃で１０分間、プライマー前の伸長工程は２５℃で１０分間、重合工程は５０℃で４５分間、酵素不活性化工程は８５℃で５分間実施した。こうして形成されたファーストストランドｃＤＮＡを−２０℃で保存した。
【００９８】
各Ｂ細胞のＩｇＨ、Ｉｇλ、Ｉｇκ  Ｖ遺伝子転写物をネステッドＰＣＲで増幅した。各ネステッドＰＣＲには、上記で得られたファーストストランドｃＤＮＡをテンプレートとして２．５μＬから開始した第一ラウンドＰＣＲ、次にテンプレートとして、第一ラウンドＰＣＲから得られた未精製の第一ラウンドＰＣＲ生成物の２．５μＬを使用した第二ラウンドＰＣＲが含まれた。すべてのＰＣＲ反応は、０．５μｍのプライマーミックス（プライマーミックスの詳細は表１に記載（プライマー一覧表を参照））、２００μｍの各ｄＮＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．５  ＵのＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、反応あたり２５μＬの合計容量で実施した。すべてのＰＣＲ反応はＤＥＰＣ処理水を使用して実施した。ネステッドＰＣＲ反応の第一および第二ラウンドのそれぞれは３５サイクル実施され、変性工程は９８℃で１０分間、アニーリング工程は６５℃で１５秒間、伸長工程は７２℃で３０秒間行なった。
【表１】
2020519562.tif 000002
【００９９】
Ｉｇ  Ｖ遺伝子配列解析。
【０１００】
各Ｂ細胞のＶH、ＶκおよびＶλ鎖のＰＣＲ生成物（前述の第二ＰＣＲから取得された）のアリコートを、製造業者の使用説明に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、それぞれ配列番号：６４、配列番号：６６および配列番号：６９によって特定されたプライマーで配列決定した（「プライマー一覧表」を参照）。取得した配列をＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｙ．ｏｒｇ）で解析し、高い同一性を持つ生殖細胞系Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントを特定した。
【０１０１】
取得されたＩｇ  Ｖ配列によってコードされた重鎖可変領域（ＶH）および軽鎖可変領域（ＶL）のアミノ酸配列が示され、ＩＭＧＴまたはＫａｂａｔ方式で決定された「プライマー一覧表」においてのフレームワーク領域およびその相補性決定領域と互いに整合された。
【０１０２】
発現ベクターのクローニング。
【０１０３】
配列決定後、ネステッドＰＣＲと類似の反応条件下でさらなるＰＣＲ反応を行うために、最も高い同一性を持つＶまたはＪセグメント（表２を参照）により、遺伝子特異的プライマー（「プライマー一覧表」を参照）を選択した。反応では（上述の第二ラウンドＰＣＲから得られた）各Ｂ細胞のＶH、ＶκおよびＶλ鎖のＰＣＲ生成物をテンプレートとして使用した。「２Ａ６」、「２Ｂ６」、「２Ｆ２」および「１Ｅ８」として特定される４つの抗体に対する４つの発現ベクターを得るために、得られたＰＣＲ生成物を上述のように精製し、ヒトＩｇＧ1λ発現ベクター（台湾、中央研究院のＤｒ．  Ｔｓｅ−Ｗｅｎ  Ｃｈａｎｇからの寄贈）にクローン化した。
【表２】
2020519562.tif 000003
【０１０４】
上記の４つの発現ベクター以外に、２Ａ６  ＶH重鎖および２Ｂ６  ＶL軽鎖の組み合わせ（ＶＨ２Ａ６／ＶＬ２Ｂ６と示され、「ＡＢ」と呼ばれる）ならびに２Ｂ６  ＶH重鎖および２Ａ６  ＶL軽鎖の組み合わせ（ＶＨ２Ｂ６／ＶＬ２Ａ６と示され、「ＢＡ」と呼ばれる）の発現のためのベクターも作製した。
【０１０５】
ＡＭＧ８１１のＶHおよびＶLのＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｓｈｅｒ）を使用して合成した。ＡＭＧ８１１の発現のためのベクターは、上述のＰＣＲベースクローニングを使用して作製した。
【０１０６】
組換えは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行なった。コンピテントＥ．  ｃｏｌｉは、５μＬ組換え生成物を使用して４２℃で形質転換した。形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉのコロニーを、ｐＩｇＧ1κ−ｓｃｒｅｅｎ＋（配列番号：１１７）またはｐＩｇＧ1λ−ｓｃｒｅｅｎ＋（配列番号：１１８）をフォワードプライマーとして、ｐＩｇＧ１−ｓｃｒｅｅｎ−（配列番号：１１９）をリバースプライマーとしてそれぞれ使用したＰＣＲでスクリーニングした（「プライマー一覧表」を参照）。予測されるサイズ（約１，８００  ｂｐｓ）のＰＣＲ生成物が、元のＰＣＲ生成物との同一性の確認のために配列決定された。形質転換したＥ．  ｃｏｌｉを、１００  μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３７℃で１６時間培養した細菌培養物３ｍＬから、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。
【０１０７】
組換え抗体の生産。
【０１０８】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒ７９００７）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、１２３３８０１８）を含む２５０−ｍＬフラスコ中、標準条件下、１×１０6細胞の濃度で培養した。平均分子量２５  ｋＤａの直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州、ウォリントン）をトランスフェクション試薬として、および合計８８  μｇのプラスミドＤＮＡを使用して、指数関数的に増殖しているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（１．５〜２×１０6細胞／ｍｌ）の一過性トランスフェクションを行なった。トランスフェクション後、細胞を３日間培養して培地を採取した。培地を３０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞の破片を除去し、その後、結果として生じる上清を収集して０．４５μｍフィルターでろ過した。
【０１０９】
組換え抗体の精製。
【０１１０】
組換え抗体を得るために、上述で得られた結果として生じる上清をその後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１２７９−０１）で精製した。手短に言えば、８０ｍＬの上清を８０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズに加え、２本の５０−ｍｌ試験管に同等に分割し、これを回転しながら４℃で２４時間インキュベートした。次に、試験管を３０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後、結果として生じる上清を除去して、ビーズをＰＢＳで平衡化した。組換え抗体を得るために、平衡化したビーズを０．１  Ｍグリシン（ｐＨ  ３．０）で溶出し、溶出液を１  Ｍトリス（ｐＨ  ８．０）を含む試験管に収集して、PBS緩衝液に対して透析した。
【０１１１】
明確にするために、モノクローナル抗体のそれぞれのＶH鎖およびＶL鎖上のＣＤＲが、表３および表４にそれぞれ要約されている。ＣＤＲはＫａｂａｔ方式およびＩＭＧＴ方式の両方に基づいて、配列アノテーションおよびインターネットベースの配列解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によって特定された。以下の表３および４では、「Ｋ：」に続くＣＤＲは  Ｋａｂａｔ方式が使用されたことを示し、「Ｉ：」に続くＣＤＲは  ＩＭＧＴ方式が使用されたことを示す。
【表３】
2020519562.tif 000004
【表４】
2020519562.tif 000005
【０１１２】
単一部位グリコシル化変異体のクローン化および解析。
【０１１３】
抗体２Ａ６が哺乳動物細胞で発現された時、重鎖の２つのバンドが観察された（図１、レーン１）。これは翻訳後修飾によって可能である。Ｎ結合型グリコシル化に対するコンセンサス配列はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒであり、まれにはＡｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓであることもある。モノクローナル抗体は、Ｎ２９７位のＦｃ部分に１つの保存されたＮ結合型グリコシル化を有する。抗体２Ａ６は、その可変領域に１つのＮ結合型グリコシル化部位を含むことが認められた（その重鎖の７６番目のアミノ酸）。
【０１１４】
Ｎ結合型グリコシル化部位の存在は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化分析で確認された。簡潔には、３．５μｇの抗体、１μｌのＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）およびＨ2Ｏ（必要な場合）を混合して、１５μｌの合計反応容量にした。抗体を、変性目的のため１００℃で１０分間加熱した。次に変性した抗体を氷上で冷却し、１０秒間遠心分離した。合計反応混合物（３０μｌ）は、３μｌのＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ  ２（１０×）、３μｌの１０％  ＮＰ−４０および９μｌのＨ2Ｏを加えることにより調製した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。抗体の脱グリコシル化は、移動度シフトによって判断された。
【０１１５】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化の後、抗体２Ａ６はサイズが減少しており、Ｎ結合型炭化水素が除去されたことを示した。低めの見掛け分子質量を持つ重鎖の明確な単一バンドのみが検出された（図１、レーン２）。これは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理前に観察された重鎖の低めのバンドは、Ｎ結合型グリコシル化部位の部分的グリコシル化によるものであることを示唆する。
【０１１６】
Ｎ結合型グリコシル化部位は部分的グリコシル化部位と見なされ、抗体２Ａ６の大量生産を行った場合、分子均一性のないものにするであろう。抗体２Ａ６の商業的有用性を促進するために、点変異を設計・実施して前述のＮ結合型グリコシル化部位を除去した。
【０１１７】
部位特異的グリコシル化変異体プラスミドを生成するために、ＮＥＢからのＱ５ポリメラーゼを使用して部位特異的変異導入を実施した。各構成物の変異導入に使用されたオリゴヌクレオチドは以下の通りである（センス配列）：ｃ２Ａ６＿Ｑ  ５’−ＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号：１６９）およびｃ２Ａ６＿Ａ  ５’−ＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１７０）。次に変異体配列を、各構成物のＤＮＡ配列決定で確認した。前述の点変異の後、抗体２Ａ６の重鎖可変領域の７６番目のアミノ酸はアスパラギンからグルタミンまたはアラニンに変異し、抗体２Ａ６＿Ｑ（重鎖にＮ７６Ｑ変異を有する）および抗体２Ａ６＿Ａ（重鎖にＮ７６Ａ変異を有する）と命名された。その結果、抗体２Ａ６＿Ｑおよび抗体２Ａ６＿Ａの重鎖はそれぞれ、配列番号：１６５および配列番号：１６４を含む。
【０１１８】
抗体２Ａ６＿Ａおよび抗体２Ａ６＿Ｑを見てみると、２Ａ６の重鎖は２つのバンドを示したのに対し、２Ａ６＿Ａまたは２Ａ６＿Ｑの重鎖は低めの分子質量を持つ鮮明な単一バンドを示したことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で示された（図２）。これらのデータは、２Ａ６＿Ｑおよび２Ａ６＿ＡではＮ結合型グリコシル化部位が破壊されたことを示す。２Ａ６、２Ａ＿Ｑおよび２Ａ６＿Ａのグリコシル化状態を、質量分析を用いてさらに調査した。ＵＰＬＣシステムは、クオータナリーＵＰＬＣポンプ（ＱＳＭ）、５０  ｕｌのサンプルループを備えた自動サンプル注入装置（ＳＭ）およびフォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）を有するＡｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−ｃｌａｓｓ  バイオシステムで構成された。クロマトグラムはＭａｓｓｌｙｎｅｘソフトウェア（Ｖ４．１、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して処理した。２Ａ６のＮ結合型グリコシル化Ａｓｎ−７６が確認された。Ａｓｎ−７６をＡｌａ（２Ａ６＿Ａ）またはＧｌｎ（２Ａ６＿Ｑ）で置換すると、このグリコシル化シグナルが失われた。
［実施例２］組換え抗ＩＦＮ−γ抗体の活性の決定。
【０１１９】
実験手順：
【０１２０】
Ａ．バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）解析。
【０１２１】
抗体結合動力学的速度定数（ｋaおよびｋd）をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６）で測定した。ＢＬＩアッセイは、ＡＨＣ（Ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してそれぞれの抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂｓ（７５０  ｎｇ／ｍＬ）を捕捉して０．５  ｎｍのシフトを取得し、次にバイオセンサーを、滅菌水中に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4および１．８  ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4を含む泳動バッファー中の組換えヒトＩＦＮ−γタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５−ＩＦ−１００）の異なる濃度（すなわち、０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０および４０  ｎＭ）に浸漬した。速度定数は、５分間の会合および１５分間の解離相互作用時間における結合反応のカーブフィッティング解析（１：１ラングミュアモデル）により計算した。
【０１２２】
Ｂ．ＨＬＡ−ＤＲ発現。
【０１２３】
２×１０5  ＴＨＰ−１細胞（ＢＣＲＣ  ６０４３０）を、１０％  ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した１００μＬのＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、１１８７５−０９３）で培養し、次に２Ａ６、２Ｂ６、１Ｅ８および２Ｆ２  ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ  ｍＡｂの異なる濃度（すなわち、０．０１７、０．０５、０．１５、０．４５、１．３７、４．１１、１２．３４、３７．０３、１１１．１、３３３．３、１０００、３０００、５０００および１００００  ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。処理されたＴＨＰ−１細胞を２  ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮ−γタンパク質で刺激し、インキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ2）で２４時間培養した。未刺激ＴＨＰ−１細胞を対照として使用した。その後、刺激済みおよび未刺激ＴＨＰ−１細胞をＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｇｅｎＴＭ）で染色し、暗所で３０分間氷冷した。染色細胞を２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＰＢＳで再懸濁した。染色細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターで取得し、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアで解析した。各抗体のＨＬＡ−ＤＲ発現の阻害パーセントを、以下の式で取得した：
［数１］
Ａ  ＝  （Ｂ／Ｃ）×１００
【０１２４】
式中、Ａ＝ＨＬＡ−ＤＲ発現の阻害パーセント；Ｂ＝刺激細胞の蛍光強度の中央値；Ｃ＝未刺激細胞の蛍光強度の中央値
【０１２５】
Ｃ．抗ＩＦＮ−γ抗体のＥＬＩＳＡアッセイ。
【０１２６】
透明ポリスチレン製９６ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ）を、ウェルあたり１００μＬの重炭酸塩バッファー（ｐＨ  ９．６）中の組換えヒトＩＦＮ−γタンパク質（２  μｇ／ｍＬ）またはＢＳＡ（２  μｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用してプレートを３回洗浄し、次にＰＢＳ中の５％ヒト正常血清アルブミン（Ａｖｅｎｔｉｓ）を用いて２５℃で２時間ブロックした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳでプレートを再び洗浄し、その後、組換えヒトＩＦＮ−γタンパク質と結合させるために、１  μｇ／ｍＬおよび０．１  μｇ／ｍＬの２つの異なる濃度で１Ｅ８、２Ｆ２、２Ａ６、２Ｂ６、ＡＢおよびＢＡ  ｍＡｂのそれぞれをプレートのウェルに加え、２５℃で２時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳを使用してプレートを徹底的に洗浄した後、Ｆｃ特異的アルカリホスファターゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ）を１：２５００の希釈率で加えた。プレートを３７℃で９０分間放置した後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳを使用して５回洗浄した。ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液（１００μＬ／ウェル）を加えた後、プレートを３７℃で３０分間放置した。吸光度は、ＶＩＣＴＯＲ  Ｘ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＯＤ405  ｎｍで測定した。
【０１２７】
結果：
【０１２８】
Ａ．バイオレイヤー干渉法解析。
【０１２９】
図３は、ＡＨＣバイオセンサーに固定された抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ上に組換えヒトＩＦＮ−γ（０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０ｎＭ）の異なる濃度を通すことによって得られた結合曲線を示す。抗体結合動力学的速度定数（ＫaおよびＫd）に加えて平衡解離定数（ＫD  ＝  Ｋd／Ｋa）が表５に示されている。
【０１３０】
表５を参照すると、組換え２Ａ６、２Ｂ６、１Ｅ８および２Ｆ２抗体は低いＫD値を持つことがわかり、本開示の組換え抗体がヒトＩＦＮ−γに対して高い親和性を持つことを示す。
【表５】
2020519562.tif 000006
【０１３１】
ＡＭＧ８１１（ＡＭＧ８１１は米国特許第７，３３５，７４３号に記述された抗ＩＦＮ−γ抗体であり、その明細書に記述されたように調製された）、２Ａ６、２Ｂ６、２Ａ６＿Ａ、２Ａ６＿Ｑ、ＡＢ、およびＢＡ抗体を含む別の実験は、本開示の抗体がＡＭＧ８１１と同等またはそれ以上の抗ＩＦＮ−γ活性を呈したことを示した（図４および表６）。
【表６】
2020519562.tif 000007
【０１３２】
Ｂ．ＨＬＡ−ＤＲ発現。
【０１３３】
図５は、ＩＦＮ−γ誘導性ＨＬＡ−ＤＲ発現が用量依存性であり、本開示の抗体によって効果的に阻害され得ることを示す。２Ａ６、２Ｂ６、１Ｅ８、および２Ｆ２抗ＩＦＮ−γ抗体のそれぞれの濃度が増加すると、阻害パーセントが増加したことが、図５から分かる。
【０１３４】
２Ｆ２、１Ｅ８、２Ａ６、および２Ｂ６抗ＩＦＮ−γ抗体のＩＣ50（ｎｇ／ｍＬ）は、それぞれ３６．１、８．６、３．４、および３．５であった。２Ｆ２、１Ｅ８、２Ａ６、および２Ｂ６抗ＩＦＮ−γ抗体のＩＣ90（ｎｇ／ｍＬ）は、それぞれ５０７．７、４８．６、３８５１．３、および１０２０．５であった。上記の結果は、本開示の抗体がＩＦＮ−γ媒介性活性を効果的に阻害することができ、ＩＦＮ−γ媒介性症候群の治療に使用され得ることを示した。
【０１３５】
Ｃ．抗ＩＦＮ−γ抗体のＥＬＩＳＡアッセイ。
【０１３６】
ヒト抗ＩＦＮ−γ抗体の検出に対して４０５  ｎｍ（ＯＤ405）の光学密度で表されたプレートウェルの吸光度が、図６に示されている。高い濃度（１  μｇ／ｍＬ）のｍＡｂは、低い濃度（０．１  μｇ／ｍＬ）よりも強い吸光度を示したことが、図６から分かる。さらに、ｍＡｂはＢＳＡに結合しておらず、本開示の抗体がヒトＩＦＮ−γに特異的に結合できることを示す。
［実施例３］組換え抗ＩＦＮ−γ抗体の活性の決定。
【０１３７】
この実施例では、本開示の抗体２Ａ６、２Ａ６＿Ａ、２Ａ６＿Ｑ、２Ｂ６、ＡＢおよびＢＡを、ＩＦＮ−γとの結合親和性（ＥＬＩＳＡ）および中和活性（細胞ベースアッセイおよび全血分析）について試験した。それに加えて、ＡＭＧ８１１は正の対照および比較例としても使用された。
【０１３８】
Ａ．ビオチン化ＩＦＮ−γを使用した抗ＩＦＮ−γ抗体のＥＬＩＳＡアッセイ。
【０１３９】
組換えヒトＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ２８５−ＩＦ−１００）およびカニクイザルＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ９６１−ＲＭ−０２５）をキットマニュアル（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  ＃  ２１３３６）に従ってビオチン化し、それぞれをストレプトアビジンをコートしたプレートに結合させた。室温で１〜２時間インキュベートした後、プレートを３００μＬ洗浄バッファーで３回洗浄した。抗ＩＦＮ−γ抗体の段階希釈をウェルに加えた。室温で１〜２時間インキュベートした後、プレートを３００μＬ洗浄バッファーで３回洗浄した。室温で各ウェルにＨＲＰ抗ヒトＩｇＧを適用し、１時間インキュベーションした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で培養し、ＯＤ450~650で解析した。
【０１４０】
結果を図７および図８に示す。試験された本開示の抗ＩＦＮ−γ抗体すべてがヒトＩＦＮ−γとの良好な結合親和性を示したことが認められた。さらに、それらの結合親和性はＡＭＧ８１１の親和性と有意な差がないことを示した（図７）。試験された本開示の抗ＩＦＮ−γ抗体は、アカゲザル／カニクイザルＩＦＮ−γとの交差反応性も示したが、ヒトＩＦＮ−γとの親和性の方が高かった。ＡＭＧ８１１が、本開示の抗ＩＦＮ−γ抗体による交差反応性を示さなかった（図８）ことは本開示の抗体の顕著な利点であり注目に値した。
【０１４１】
Ｂ．抗ＩＦＮ−γ抗体の細胞ベースアッセイ。
【０１４２】
ｐＧＬ４［ｌｕｃ２Ｐ／ＧＡＳ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏを発現しているＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７９３０１）を使用して抗ＩＦＮ−γ抗体の中和活性を測定した。簡潔には、ＨｅＬａ細胞株を８×１０3細胞／ウェルで９６ウェル白色プレートに蒔いた。１  ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γおよび異なる濃度の抗ＩＦＮ−γ抗体で、細胞を１８時間処理した。ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ６１１０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を解析した。
【０１４３】
結果は、試験された抗体すべてがＩＦＮ−γの活性を中和できたことを示す（図９）。試験されたすべての抗体は、工業用または医薬用途に対して十分な中和活性を持つと見なされた。
【０１４４】
Ｃ．抗ＩＦＮ−γ抗体の全血分析。
【０１４５】
カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）のワクチン接種を受けている健康ボランティアからの全血を、１０−ｍｌヘパリン添加試験管に採取した。全血の２０−μｌサンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレートの丸底ウェル中、ＢＣＧ  ＋  ＩＬ１２（２０  ｎｇ／ｍｌ）添加または無添加のＲＰＭＩ  １６４０培地８０μＬに加えた。マイクロタイタープレートを３７℃、５％  ＣＯ2で４８時間インキュベートした。インキュベート後、ＣＸＣＬ９  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＣＸ９００）を使用してＣＸＣＬ９を測定した。ＣＸＣＬ１０はＣＸＣＬ１０  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ４３９９０５）を使用して測定した。希釈係数での補正後にサイトカインレベルが示された。実験では、負の対照としてヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールを使用した。
【０１４６】
予想通り、ヒト全血サンプルは高いレベルのＩＦＮ−γ、およびＣＸＣＬ９に加えてＣＸＣＬ１０を生産し、これらの生産はＩＦＮ−γによって制御されることが知られている。内因性ＩＦＮ−γを阻害することにより、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０のＩＦＮ−γ依存性生産を阻止することになる。
【０１４７】
本開示の抗ＩＦＮ−γ抗体は、内因性ＩＦＮ−γを中和することにより、ＣＸＣＬ９および  ＣＸＣＬ１０の生産を効果的に阻害することが、結果によって確認された（図１０および図１１）。
【０１４８】
Ｄ．抗ＩＦＮ−γ抗体によるＴ細胞阻害性受容体リガンドの阻害。
【０１４９】
ＴＨＰ−１細胞をＡＴＣＣの指示に従って培養した。中和アッセイについては、５００μｌのＲＰＭＩ−１６４０中の４０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γを、異なる量の抗ＩＦＮ−γ抗体と共に１０分間インキュベートし、混合物を４×１０5細胞（５００μｌ）に加えた。ＩＦＮ−γ抗体の最終濃度は０、４０、２００または１０００  ｎｇ／ｍｌであった。３７℃のインキュベータで７２時間インキュベートした後、細胞を、ＰＥ抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３２９７０６）またはＦＩＴＣ抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３２７００６）で染色し、暗所で氷上３０分間インキュベートした。細胞を２ｍＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、３００μｌのＦＡＣＳ中で再懸濁した。データはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで取得した。
【０１５０】
本開示の抗ＩＦＮ−γ抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ（図１２）およびＰＤ−Ｌ１（図１３）のＩＦＮ−γ誘導性発現を用量依存的に阻害できたことが、結果により確認された。上記の細胞ベースアッセイおよび全血分析のデータを併せると、本開示の抗体はＩＦＮ−γとの結合親和性を示しただけでなく、ＩＦＮ−γの活性を阻害することもできる。
［実施例４］本開示の抗体のエピトープ決定。
【０１５１】
Ａ．エピトープビニング実験。
【０１５２】
どの抗ＩＦＮ−γ抗体がＩＦＮ−γへの結合について競合し、従ってＩＦＮ−γと同じまたは類似のエピトープに結合するかを決定するために、エピトープビニング実験を実施した。簡潔には、ストレプトアビジンをコートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、本開示の４つの抗ＩＦＮ−γ抗体：１Ｅ８、２Ｆ２、２Ａ６および２Ｂ６のセットでエピトープを調べた。初めに、２  μｇ／ｍＬのビオチン化組換えヒトＩＦＮ−γをストレプトアビジンセンサーチップに充填し、０．５  ｎｍシフトを取得した。１００秒の安定および１２０秒ベースライン過程に続いて、一次抗ＩＦＮ−γ抗体を会合過程において６００秒間、５  μｇ／ｍＬでチップに個別充填した。さらに、二次抗ＩＦＮ−γ抗体はバイオセンサーチップともインキュベートし、５  μｇ／ｍＬで６００秒間会合させた。シグナルがチップへの質量蓄積を示した場合、それは異なるエピトープに結合したと見なされた。
【０１５３】
本開示の４つの抗ＩＦＮ−γ抗体２Ａ６、２Ｂ６、１Ｅ８、および２Ｆ２に対するエピトープビニング実験の結果は、図１４に提供されている。これらの４つの抗ＩＦＮ−γ抗体は２つのエピトープ群に分けられる：１Ｅ８および２Ｆ２を含むグループＩ、ならびに２Ａ６および２Ｂ６を含むグループＩＩ。つまり、１Ｅ８および２Ｆ２は類似／同一のＩＦＮ−γエピトープを持ち、２Ａ６および２Ｂ６は類似／同一のＩＦＮ−γエピトープを持つ。
【０１５４】
Ｂ．ＨＤＸを使用したヒトＩＦＮ−γ上のエピトープのマッピング。
【０１５５】
ＩＦＮ−γの水素重水素交換  （ＨＤＸ）は、抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下および不在下、ＨＤＸ  ＭＳ法を使用して、ペプシン処理済みフラグメントで測定した。組換えタンパク質（１５  ｐｍｏｌ）およびタンパク質・抗体複合体（１５  ｐｍｏｌ  ：  １０  ｐｍｏｌ）を交換バッファー（ＰＢＳ中９９．９％  Ｄ2Ｏ、ｐＨ  ７．４）中、１：１０の比率で希釈し、室温でＨＤ交換を開始した。７時点（１０秒、４０秒、８０秒、１８０秒、６００秒、１８００秒、３６００秒）で、アリコート（標的タンパク質の１．５  ｐｍｏｌ）を吸引し、（１．５  Ｍ塩酸グアニジン、１５０  ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、０．８％ギ酸の最終濃度になるように）事前冷却されたクエンチングバッファーと混合した。混合物をＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で解析した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ自動利得制御は、最大累積時間またはイオンに対して、それぞれ１，０００  ｍｓ（フルスキャン）および１２０  ｍｓ  （ＭＳ／ＭＳ）、または２×１０6イオン（フルスキャン）および３×１０3イオン（ＭＳ／ＭＳ）に設定された。交換時間中の平均重水素導入の１０％より大きな変化は、我々の解析では有意であると見なされた。
【０１５６】
ＨＤＸ−ＭＳエピトープマッピングデータに基づくと、抗体２Ａ６＿Ｑおよび抗体２Ｂ６に対するヒトＩＦＮ−γ上の提案されるエピトープは、２つの不連続アミノ酸セグメント：配列番号：１６６のアミノ酸３０〜５２およびアミノ酸７８〜９２の残基を含む。より具体的には、抗体２Ａ６＿Ｑおよび抗体２Ｂ６に対するヒトＩＦＮ−γ上の提案されるエピトープは、２つの不連続アミノ酸セグメント：配列番号：１６６のアミノ酸３６〜４８およびアミノ酸８２〜９２の残基を含む。抗ＩＦＮ−γ抗体２Ａ６＿Ｑおよび２Ｂ６に対するＨＤＸエピトープが表７に提供されている。
【０１５７】
Ｃ．アラニンスキャニング変異導入。
【０１５８】
アラニンスキャニング変異導入を使用して、結合のために重要なこれらの領域の特定残基を特定した。配列番号：１６６のアミノ酸３６〜４８および８２〜９２がそれぞれアラニンに変異した。すべての変異体のうち、１１の置換（残基３９、４１、４２、４４、４５、４７、８５、８８、９１、９２）はＩＦＮ−γの生物学的活性を減少させた（ｐＧＬ４［ｌｕｃ２Ｐ／ＧＡＳ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏを発現しているＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７９３０１）を使用して決定した）ので、アラニン置換の結果としての構造変化の可能性のためにＥＬＩＳＡアッセイから除外された。
【０１５９】
２Ａ６＿Ｑまたは２Ｂ６の、ＩＦＮ−γ変異体タンパク質の残りへのＥＬＩＳＡ結合を野生型ＩＦＮ−γと比較した。最大ＥＬＩＳＡ結合シグナルの野生型の２０％以下への減少によって示されるような、結合の減少を起こす変異変異は、ＩＦＮ−γと抗体との結合に有意に影響すると見なされた。結果を表７に示す。結合アッセイデータは、ＨＤＸ  ＭＳによってマッピングされた結合領域と十分一致した。
【０１６０】
さらに、ＨＤＸ解析からのデータを時間対Ｈ交換の減少としてプロットした。これらのデータプロットとＭＳデータと併せた解析では、抗体が、少なくとも配列番号：１６６のアミノ酸３６〜４８および８２〜９２を含む非連続エピトープに結合することが示された。より長い領域のＨＤＸ解析では、エピトープはさらに延長し、配列番号：１６６のＩＦＮ−γ配列の非連続アミノ酸３０〜５２および７８〜９２を含むことが示された。
【０１６１】
上述を考慮すると、抗体２Ａ６、２Ｂ６および２Ａ６＿Ｑは、ＩＦＮ−γのＫ３７、Ｅ３８、Ｋ４３、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ８６、およびＲ８９（配列番号：１６６）を認識し、ＩＦＮ−γのＫ４３、Ｑ４８、およびＫ８６（配列番号：１６６）に対してより強い結合親和性を示したと結論付けられる。
【表７】
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［プライマー一覧表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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