(57)【要約】本出願は、抗体軽鎖のＣ末端に融合した血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を含む抗体融合タンパク質を提供する。また、これらの抗体融合タンパク質を作製及び使用する方法も提供される。本出願の一態様は、１）軽鎖を含む抗体と、２）ＶＥＧＦＲコンポーネントであって、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。
2020536967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）軽鎖を含む抗体と、２）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）コンポーネントであって、前記抗体軽鎖のＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質。
【請求項２】
第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、請求項１に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと前記第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが同じである、請求項２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと前記第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが異なっている、請求項２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ１の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン２（Ｆｌｔ１ｄ２）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１のＩｇ様ドメイン３（Ｆｌｋ１ｄ３）を更に含む、請求項５に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＶＥＧＦＲコンポーネントと前記抗体軽鎖のＣ末端が、リンカーによって連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項９】
前記リンカーが、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗体が軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）を含み、前記ＶＥＧＦＲコンポーネントが前記抗体ＣＬドメインのＣ末端に融合されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗体が完全長抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗体が免疫チェックポイント分子を特異的に認識する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１３】
前記免疫チェックポイント分子がＰＤ−１である、請求項１２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖の重鎖−ＣＤＲ１（ＨＣ−ＣＤＲ１）、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖の軽鎖−ＣＤＲ１（ＬＣ−ＣＤＲ１）、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項１３に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項１３に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１６】
前記免疫チェックポイント分子がＰＤ−Ｌ１である、請求項１２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項１６に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１８】
前記抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項１６に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項１９】
前記免疫チェックポイント分子がＣＴＬＡ−４である、請求項１２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項１９に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２１】
前記抗体が腫瘍抗原を特異的に認識する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２２】
前記腫瘍抗原がＨＥＲ２である、請求項２１に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２３】
前記抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項２２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２４】
前記腫瘍抗原がＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である、請求項２１に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２５】
前記抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項２４に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２６】
前記抗体が血管新生因子を特異的に認識する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２７】
前記血管新生因子がアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）である、請求項２６に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２８】
前記抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項２７に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項２９】
前記血管新生因子がＴＮＦαである、請求項２６に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項３０】
前記抗体が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項２９に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項３１】
前記血管新生因子がＩＬ−１７Ａである、請求項２６に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、請求項３１に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
癌を有する個体を治療する方法であって、有効量の請求項３３に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記癌が、肺癌、肝癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は膀胱癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
非腫瘍性疾患を有する個体を治療する方法であって、有効量の請求項３３に記載の医薬組成物を個体に投与することを含み、前記非腫瘍性疾患がＶＥＧＦ過剰発現と関連する、方法。
【請求項３７】
前記非腫瘍性疾患が、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性炎症、又は眼内新生血管障害から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記非腫瘍性疾患が眼内新生血管障害である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記眼内新生血管障害が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）又は糖尿病性網膜症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記医薬組成物が硝子体内注入によって投与される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１７年１０月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／５７１，７７３号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７５４３９２０００２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１８年９月２４日、サイズ：１０５ＫＢ）。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、抗体軽鎖のＣ末端に融合した血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）コンポーネントを含む抗体融合タンパク質、並びにその作製及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦの、血管内皮細胞上に発現したそのチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）への結合は、血管内皮細胞増殖及び新たな血管の成長に関与する細胞応答を引き起こす。しかしながら、ＶＥＧＦの過剰発現は疾患に寄与する。腫瘍組織は、高いＶＥＧＦ発現レベルを有する傾向があり、これは腫瘍血管新生を刺激して、増殖中の固形腫瘍に栄養を提供する。血管新生はまた、腫瘍が宿主の血管床と接触することを可能にし、腫瘍細胞の転移のための経路を提供し得る。ＶＥＧＦの過剰発現はまた、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性炎症、及び眼内新生血管障害（例えば、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、新生血管緑内障、及び加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ））などの非腫瘍性疾患を引き起こす場合がある。したがって、新生物性腫瘍及び非腫瘍性疾患（眼内新生血管障害など）の有効な治療における１つの考えられ得る機構は、ＶＥＧＦタンパク質の内皮増殖及び血管新生活性を阻害又は実質的に低減することである。
【０００５】
リガンドとその受容体との間の相互作用は、多くの場合、高い親和性を有し、ナノモル〜ピコモル範囲に達する。受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、又はＥＣＤの機能性部分は、治療目的のため「リガンドトラップ」としての使用が成功している（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ  Ｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００８  Ｎｏｖ；１４（１１）：１１４７−１１４８；Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９７  Ｎｏｖ  ２８；９１（５）：６９５−７０４；Ｈａｒｄｉｎｇ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｍａｒ  ２７；５（１７８）：１７８ｒａ３９）。
【０００６】
ＶＥＧＦＲコンポーネントを含む組み換え融合タンパク質は、癌及びＡＭＤなどのＶＥＧＦ発現に関連する疾患を治療するために開発されてきた。これらの融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲフラグメントを免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントの一部に融合させることによって生成され、「ＶＥＧＦトラップ」として認識されている。例えば、米国特許第６１０００７１号、同第７０８７４１１号、及び同第７５２１０４９号を参照されたい。ＶＥＧＦＲフラグメントは、内因性ＶＥＧＦに結合して不活化することにより、内因性ＶＥＧＦ活性を低減又は阻害し、ひいては内皮細胞の増殖及び血管新生を低減又は阻害するための手段を提供する。ＶＥＧＦ−トラップ（アフリベルセプト）は、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ中和抗体、５０ｐＭ）よりも高い親和性（０．５ｐＭ）でＶＥＧＦを捕捉することができる。
【０００７】
本明細書で参照した全ての出版物、特許、特許出願、及び特許出願公開の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６１０００７１号明細書
【特許文献２】米国特許第７０８７４１１号明細書
【特許文献３】米国特許第７５２１０４９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ  Ｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００８  Ｎｏｖ；１４（１１）：１１４７−１１４８
【非特許文献２】Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９７  Ｎｏｖ  ２８；９１（５）：６９５−７０４
【非特許文献３】Ｈａｒｄｉｎｇ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｍａｒ  ２７；５（１７８）：１７８ｒａ３９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを含む抗体融合タンパク質、並びにその作製及び使用方法に関する。
【００１１】
本出願の一態様は、１）軽鎖を含む抗体と、２）ＶＥＧＦＲコンポーネントであって、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。
【００１２】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ１の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン２（Ｆｌｔ１ｄ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１のＩｇ様ドメイン３（Ｆｌｋ１ｄ３）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第３のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１のＩｇ様ドメイン４（Ｆｌｋ１ｄ４）を更に含む。
【００１３】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。
【００１４】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。
【００１５】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカー、例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００１６】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、及び細胞内抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントは抗体ＣＬドメインのＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体などのＩｇＧ抗体である。
【００１７】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。
【００１８】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、抗体は多重特異性（例えば、二重特異性）である。
【００１９】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、抗体は、具体的には免疫チェックポイント分子を認識する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は刺激性免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は阻害性免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＣＤ７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子はＰＤ−１である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖の重鎖−ＣＤＲ１（ＨＣ−ＣＤＲ１）、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖の軽鎖−ＣＤＲ１（ＬＣ−ＣＤＲ１）、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子はＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子はＣＴＬＡ−４である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【００２０】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、抗体は、具体的には腫瘍抗原を認識する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【００２１】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、抗体は、具体的には血管新生因子を認識する。いくつかの実施形態では、血管新生因子は、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＴＮＦαである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＩＬ−１７αである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【００２２】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つと、任意の医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物が更に提供される。
【００２３】
本出願の別の態様は、有効量の上記医薬組成物又は抗体融合タンパク質のいずれか１つを個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、肝癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は膀胱癌である。いくつかの実施形態では、この方法は、個体を追加の癌療法に供することを更に含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物又は抗体融合タンパク質は、静脈内（ｉ．ｖ．）など全身的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物又は抗体融合タンパク質は、腫瘍内など局所的に投与される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【００２４】
本出願の別の態様は、有効量の上記医薬組成物又は抗体融合タンパク質のいずれか１つを個体に投与することを含む、非腫瘍性疾患を有する個体を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、非腫瘍性疾患は、ＶＥＧＦ過剰発現と関連する。いくつかの実施形態では、非腫瘍性疾患は、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性炎症、及び眼内新生血管障害から選択される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内（ｉ．ｖ．）など全身的に投与される。いくつかの実施形態では、非腫瘍性疾患は、ＡＭＤ又は糖尿病性網膜症などの眼内新生血管障害である。いくつかの実施形態では、眼内新生血管障害は、脈絡膜新血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫と関連する。いくつかの実施形態では、医薬組成物又は抗体融合タンパク質の投与は、点眼、結膜下注入、結膜下移植、硝子体内注入、硝子体内移植、テノン嚢下注入、及びテノン嚢下移植のうちの１つから選択され、例えば硝子体内注入である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【００２５】
上記の抗体融合タンパク質のいずれか１つをコードする単離された核酸、上記の単離された核酸のうちいずれか１つを含むベクター、上記の単離された核酸又はベクターのうちいずれか１つを含む単離された宿主細胞、上記の抗体融合タンパク質、単離された核酸、ベクター、又は単離された宿主細胞のうちいずれか１つを含むキットが更に提供される。
【００２６】
本出願の別の態様は、コードされた抗体融合タンパク質の発現に有効な条件下で、上記の単離された核酸又はベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を培養すること、又は、上記の単離された宿主細胞のいずれか１つを培養することと、発現した抗体融合タンパク質を当該宿主細胞から得ることと、を含む、上記の抗体融合タンパク質のうちいずれか１つの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、上記の単離された核酸又はベクターのうちいずれか１つを含む宿主細胞を産生することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】単一特異性全長抗体及び２つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含む例示的なＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を示し、各ＶＥＧＦＲコンポーネントは、抗体軽鎖の各軽鎖のＣ末端に融合されている。代替的な形式では、２つのＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっていてもよく、３つ以上のＩｇ様ドメインを含んでもよく、及び／又は、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの任意のＩｇ様ドメインを含んでもよい。
【００２８】
【図２】二重特異性全長抗体及び２つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含む例示的なＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を示し、各ＶＥＧＦＲコンポーネントは、抗体軽鎖の各軽鎖のＣ末端に融合されている。代替的な形式では、２つのＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっていてもよく、３つ以上のＩｇ様ドメインを含んでもよく、及び／又は、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの任意のＩｇ様ドメインを含んでもよい。
【００２９】
【図３】それぞれ単一特異性全長抗体及び抗体の１つの軽鎖のＣ末端に融合した１つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含む、例示的な２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を示す。ＶＥＧＦ二量体への結合により、２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が近接する。代替的な形式では、２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は異なっていてもよく、それぞれ３つ以上のＩｇ様ドメインを含んでもよく、及び／又は、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの任意のＩｇ様ドメインを含んでもよい。
【００３０】
【図４】それぞれ二重特異性全長抗体及び抗体の１つの軽鎖のＣ末端に融合した１つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含む、例示的な２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を示す。ＶＥＧＦ二量体への結合により、２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が近接する。代替的な形式では、２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は異なっていてもよく、それぞれ３つ以上のＩｇ様ドメインを含んでもよく、及び／又は、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの任意のＩｇ様ドメインを含んでもよい。
【００３１】
【図５】それぞれＦａｂ及びＦａｂの軽鎖のＣ末端に融合した１つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含む、例示的な２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を示す。ＶＥＧＦ二量体への結合により、２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が近接する。代替的な形式では、２つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は異なっていてもよく、それぞれ３つ以上のＩｇ様ドメインを含んでもよく、及び／又は、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの任意のＩｇ様ドメインを含んでもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、抗体軽鎖のＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを含む抗体融合タンパク質（以下、「ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質」と称する）、その製造方法、並びに、癌及び非腫瘍性疾患（眼内新生血管障害、例えば、糖尿病性網膜症及びＡＭＤなど）などの疾患を治療するためのその使用を提供する。
【００３３】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、実質的に凝集することのない高い安定性を有し、血清半減期及び皮下投与による生物学的利用能が向上し、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を保持することができ、これにより、例えば、重鎖上のＣ末端融合を有する抗体と比較して、抗体融合タンパク質の、より効率的かつより低用量での送達を可能にする。本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質はまた、ＶＥＧＦ及び親抗体によって認識される抗原の両方に対する高い結合親和性を保持することもできる。
【００３４】
したがって、本出願の一態様は、１）軽鎖を含む抗体と、２）ＶＥＧＦＲコンポーネントであって、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質を提供する。
【００３５】
また、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を含む組成物（医薬組成物など）、キット、及び製品、その製造方法、並びに、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を使用して疾患（癌、非腫瘍性疾患、例えば眼内新生血管障害など）を治療する方法も提供される。
Ｉ．定義
【００３６】
本明細書で使用するとき、「血管新生」、「血管新生性」、又は「新血管新生」は、新たな血管の形成、成長、及び／又は発達を指す。
【００３７】
本明細書で使用される用語「新生血管障害」は、発癌性又は腫瘍性形質転換を伴うもの、すなわち癌以外の、変化した又は未制御の血管新生によって特徴付けられる障害を指す。新生血管障害の例としては、乾癬、関節リウマチ、並びに糖尿病性網膜症及びＡＭＤなどの眼内新生血管障害が挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「眼内新生血管障害」は、患者の眼における変化した又は未制御の血管新生によって特徴付けられる障害を指す。例示的な眼内新生血管障害としては、視神経乳頭新血管新生、虹彩新血管新生、網膜新血管新生（ＲＮＶ）、脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）、角膜新血管新生、硝子体新血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ＡＭＤ、血管性網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患、及び増殖性硝子体網膜症が挙げられる。
【００３９】
「脈絡膜新血管新生」（ＣＮＶ）は、脈絡毛細管から生じる血管の異常な発達、増殖、及び／又は成長を指す。血管は、典型的には、ブルッフ膜、ＲＰＥ層、及び／又は網膜下腔を通って延在する。
【００４０】
「黄斑変性症関連状態」とは、黄斑が変性し、又は機能的活性を失っている多くの障害及び状態のいずれかを指す。変性又は機能活性の損失は、例えば、細胞死、細胞増殖の減少、及び／又は正常な生物学的機能の喪失の結果として生じ得る。黄斑変性症は、網膜黄斑の細胞及び／若しくは細胞外マトリックスの構造的完全性における変化、正常な細胞及び／若しくは細胞外マトリックス構造の変化、並びに／又は、黄斑細胞の機能喪失に至る、並びに／又はこれらとして発現し得る。細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容細胞、及び／又は毛細血管内皮細胞を含む、黄斑内又はその付近に通常存在する任意の細胞型であってよい。ＡＭＤは、主要な黄斑変性症関連状態である。他には、ベスト病、ソースビー眼底変性症、Ｍａｌｌａｔｉａ  Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ、及びＤｏｙｎｅ蜂巣状網膜ジストロフィーが挙げられる。
【００４１】
「眼用インプラント」は、適切な寸法、形状、及び／又は構成を有し、適切な材料で作製され、それによって眼の生理又は機能と許容不可能な干渉を起こすことなく眼内に配置され得る、デバイス又は構造体を指す。好ましくは、眼用インプラントの配置は、視界を著しく妨害しない。眼用インプラントは、典型的には、固体又は半固体の製品であり、典型的には巨視的であり、すなわち肉眼で見ることができる。
【００４２】
用語「血管新生阻害剤」及び「抗血管新生剤」は、本明細書において互換的に使用され、内皮細胞増殖、内皮細胞生存、内皮細胞遊走、前駆細胞の内皮細胞への分化、及び毛細血管形成が挙げられるが、これらに限定されない、血管新生に関連する１つ以上のプロセスを阻害又は低減することができる薬剤を指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「免疫チェックポイント阻害剤」は、Ｔ細胞の活性化及び機能を阻害できる、１つ以上の阻害性免疫チェックポイント分子を完全又は部分的に低減、阻害、又は干渉する分子を指す。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「刺激性免疫チェックポイント分子の活性化因子」は、刺激性免疫チェックポイント分子によって媒介される免疫応答の強度を刺激、活性化、又は増大させる分子を指す。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含めて有益な又は所望の結果を得るための方法である。本発明の目的で、有益な又は所望の臨床結果としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：疾患から生じる１つ以上の症状を軽減する、疾患の程度を減弱する、疾患を安定化する（例えば、疾患の悪化を防止する若しくは遅らせる）、疾患の拡散（例えば、転移）を防止する若しくは遅らせる、疾患の再発を防止する若しくは遅らせる、疾患の進行を遅らせる若しくは減速させる、疾患状態を回復させる、疾患の（部分又は完全）寛解をもたらす、疾患を治療するために必要な１つ以上の他の薬物療法の用量を減らす、疾患の進行を遅らせる、生活の質を増大若しくは改善する、体重を増加させる、及び／又は生存期間を延長する。また「処置」には癌又は眼内新生血管障害の病理学的帰結の縮小も包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか１つ以上を企図する。
【００４６】
用語「予防する」、及び同様の単語、例えば、「予防された」、「予防している」などは、疾患又は状態、例えば、癌、新生血管障害（例えば、眼内新生血管障害）の再発の可能性を予防、抑制、又は低減するためのアプローチを示す。また、疾患若しくは状態の再発を遅延させること、又は疾患若しくは状態の症状の再発を遅延させることも指す。本明細書で使用するとき、「予防」及び同様の単語はまた、疾患又は状態の再発前の疾患又は状態の強度、効果、症状及び／又は負荷を低減することも含む。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、癌又は新生血管障害（例えば、眼内新生血管障害）の発症を「遅延させる」とは、その疾患の発症を遅らせる、妨げる、遅くする、抑制する、安定化する、及び／又は先送りにすることを意味する。この遅延は、病歴及び／又は治療されている個体により、様々な期間であり得る。癌又は新生血管障害（例えば、眼内新生血管障害）の発症を「遅延」させる方法は、その方法を使用しないときと比較して、疾患が発症する確率を一定期間低下させる、及び／又は、疾患の程度を一定期間低下させる方法である。このような比較は、典型的には、統計学的に有意な個体数を用いる臨床試験に基づいている。癌の発症は、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影、又は生検が挙げられるが、これらに限定されない、標準的な方法を用いて検出できる。発症は、初期には検出できない癌又は新生血管障害（例えば、眼内新生血管障害）の進行も指す場合があり、発生、再発、及びオンセットを含む。
【００４８】
本明細書で使用する用語「有効量」は、症状のうちの１つ以上を寛解させる、和らげる、軽減する、及び／又は遅らせるなど、指定された障害、容態又は疾患を処置するのに十分な薬剤又は薬剤の組み合わせの量を指す。癌に関連しては、有効量は、腫瘍を縮小させる及び／若しくは腫瘍の増殖速度を低下させる（腫瘍増殖を抑制するなど）又は他の望まれない細胞増殖を防止若しくは遅らせるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、進行を遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を防止する又は遅らせるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。薬物又は組成物の有効量によって、（ｉ）癌細胞の数を減少させること、（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小させること、（ｉｉｉ）末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）こと、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）こと、（ｖ）腫瘍成長を阻害すること、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／若しくは再発を予防若しくは遅延させること、並びに／又は（ｉｖｖ）癌に関連する症状のうちの１つ以上をある程度緩和することができる。眼内新生血管障害に関して、有効量は、新生血管障害又はその症状を治療、抑制、及び／又は予防するのに十分な量、例えば、（ｉ）ドルーゼン形成を阻害又は予防すること、（ｉｉ）ドルーゼン数及び／又はサイズの減少（ドルーゼン軽減）を起こすこと、（ｉｉｉ）リポフスチン沈着物の減少又は予防を起こすこと、（ｉｖ）視力低下を抑制若しくは防止すること、又は、視力低下速度を低下させること、（ｖ）脈絡膜新血管新生を阻害すること、又は、脈絡膜新血管新生速度を低下させること、（ｖｉ）脈絡膜新血管新生によって特徴付けられる病変のサイズ及び／又は数を減少させること、（ｖｉｉ）脈絡膜新血管新生を阻害すること、又は、網膜新血管新生速度を低下させること、（ｖｉｉｉ）網膜新血管新生によって特徴付けられる病変のサイズ及び／又は数を減少させること、（ｉｘ）視力及び／又はコントラスト感度を改善すること、（ｘ）黄斑浮腫を減少させること、及び／又は、異常な黄斑厚さを低下させること、（ｘｉ）光受容体若しくはＲＰＥ細胞の萎縮若しくはアポトーシスを阻害若しくは予防すること、又は、光受容体若しくはＲＰＥ細胞の萎縮若しくはアポトーシスの速度を低下させること、（ｘｉｉ）非滲出型黄斑変性症の滲出型黄斑変性症への進行を阻害又は予防すること、のうち、１つ以上を達成するのに十分な量を含む。
【００４９】
本明細書で使用するとき、「個体」又は「被検体」は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類又は霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、哺乳類を指す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【００５０】
用語「抗体」又は「抗体部分」は広義で用いられ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体、及びそれらの抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００５１】
基本となる４本鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と、２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、ヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、基本ヘテロ四量体ユニットと共に、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドの５つから構成され、１０個の抗原結合部位を含有し、一方ＩｇＡ抗体は、重合し、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成できる基本４本鎖ユニットのうち、２〜５つを備えている。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは一般的には約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプによって１つ又は２つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。また、各Ｈ及びＬ鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＨ）を、続けて、α及びγ鎖のそれぞれには３つの定常ドメイン（ＣＨ）を、μ及びεアイソタイプには４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＬ）を、続けて別の末端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと並び、ＣＬは重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と並ぶ。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の境界部を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬの対形成は、共に単一の抗原結合部位を形成する。異なる種類の抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１及びＣｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。任意の脊椎動物由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２種類の明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なる種類、つまりアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと指定される重鎖を有する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５種類がある。γ及びαクラスは、ＣＨの配列及び機能における比較的わずかな違いに基づいて、更にサブクラスに分類され、例えば、ヒトは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスを発現している。
【００５２】
「単離」抗体（又は構築物）は、その産生環境（例えば、天然又は組み換え）の構成要素から、同定され、分離され、及び／又は回収されているものである。好ましくは、単離ポリペプチドは、その産生環境由来の他の全ての成分と会合しない。産生環境の混入成分、例えば、組み換えトランスフェクション細胞に起因するものは、典型的には、抗体の研究、診断又は治療用途を干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含む場合がある。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、ローリー法によって測定されるとき、９５重量％超の抗体、いくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用による、少なくとも１５残基のＮ末端若しくは内部のアミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、又は、（３）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いる非還元若しくは還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで生成される。単離抗体（又は構築物）は、工程の天然環境のうち少なくとも１つの構成要素が存在しないため、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体を含む。しかし、通常は、単離ポリペプチド、抗体、又は構築物は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００５３】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称される場合がある。これらのドメインは、一般に、（同じクラスの別の抗体に対して）抗体の最も可変である部分であり、抗原結合部位を含む。
【００５４】
用語「可変」は、可変ドメインのあるセグメントが抗体間で配列が広範囲に異なることを指す。Ｖドメインは、抗体結合に関与し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を特徴付ける。しかし、可変性は、可変ドメイン全体にわたって均一に分布されていない。その代わり、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちより良く保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分がβシート構造を採用しており、３つのＣＤＲによって接続されて、βシート構造に連結する、場合によっては構造の一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により近接して保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００５５】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対するものであり、高特異性である。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物に比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語である「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を様々な手法で作製でき、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）参照）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、及び、ヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は前部を有する動物中でヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号、国際公開第１９９６／３４０９６号、国際公開第１９９６／３３７３５号、国際公開第１９９１／１０７４１号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照）が挙げられる。
【００５６】
「完全長抗体」「無傷抗体」又は「全抗体」は、互換的に使用され、抗体フラグメントに対して実質的に完全な形の抗体を指す。具体的には、完全長４本鎖抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。いくつかの場合において、無傷抗体は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を有してよい。
【００５７】
「抗体フラグメント」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合及び／又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）参照）、抗体フラグメントから形成される一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）及び多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメント（この呼称は容易に結晶化できることを反映している）をもたらす。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）を伴うＬ鎖全体と、１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して１価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシンで処理すると、異なる抗原結合活性を有する２箇所でジスルフィド結合したＦａｂフラグメントにほぼ相当し、依然として抗原の架橋が可能な、１つの大きなＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、少数の追加の残基を有することによって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を生じるＦａｂ’に対する表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、従来、これらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。また、抗体フラグメントのその他化学的結合も既知である。
【００５８】
Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって共に保持される両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体エフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域は、ある種の細胞に見いだされるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される。
【００５９】
用語「定常ドメイン」は、免疫グロブリンの他の部分（抗原結合部位を含有する可変ドメイン）と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（集合的にＣＨ）、及び軽鎖のＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含有する。
【００６０】
任意の哺乳類由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２種類の明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００６１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識かつ抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、強く非共有結合的に会合している、１本の重鎖及び１本の軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインが折り畳まれると、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（Ｈ及びＬ鎖それぞれに３つのループ）が延びる。しかし、結合部位全体よりも親和性は低いものの、単一可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的なＣＤＲを３つだけを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００６２】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、接続されて単一のポリペプチド鎖内になるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む、抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これによって、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖに関する総説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００６３】
本明細書に記載される抗体の「機能性フラグメント」は、一般に、無傷抗体の抗原結合若しくは可変領域、又は、ＦｃＲ結合能を維持若しくは改変された結合能を有する抗体のＦｃ領域を含む、無傷抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例として、線状抗体、単鎖抗体分子、及び、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００６４】
用語「ダイアボディ」は、ＶＨとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するＦｖフラグメント（上記パラグラフ参照）を構築することによって調製される小さい抗体フラグメントを指し、Ｖドメイン鎖内ではなく鎖間の対形成が達成されることによって、二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られる。二重特異性ダイアボディは、２つの「クロスオーバー」するｓＦｖフラグメントのヘテロに量体であり、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが、異なるポリペプチド鎖に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）で詳細に説明されている。
【００６５】
本明細書のモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、これは、所望の生物活性を示す限りにおいて、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、一方鎖の残部は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、並びに、このような抗体のフラグメントである（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００６６】
非ヒト（例えば、ラマ又はラクダ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含有するキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでは、レシピエントのＣＤＲ（以下で定義される）の残基が、所望の特異性、親和性及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、アルパカ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲの残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体内にない残基を含んでもよい。結合親和性などの抗体の性能を更に改善するため、これらの修飾がなされる場合がある。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全て又は実質的に全ての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリン配列のものと一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものであり、ただし、ＦＲ領域は、抗体の性能、例えば結合親和性、異性化、免疫原性などを改善する、１つ以上の個々のＦＲ残基の置換を含んでもよい。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換の数は、典型的にはＨ鎖では６以下であり、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は、任意に、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう。更なる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）、並びに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照されたい。
【００６７】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体の配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／又は、本明細書に開示されるヒト抗体を作製するためのいずれかの手法を用いて作製された抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を、具体的に排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリなどの当該技術分野において既知の様々な手法を用いて作製できる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される方法も使用可能である。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答して、かかる抗体を産生するように改変されているが、内因性の遺伝子座が無効になっている、トランスジェニック動物、例えば、免疫化したｘｅｎｏｍｉｃｅに抗原を投与することによって調製できる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって発生するヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、配列が超可変であり、及び／又は、構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ（又はＣＤＲ）：ＨＶＲ１（又はＣＤＲ１）、ＨＶＲ２（又はＣＤＲ２）、及びＨＶＲ３（又はＣＤＲ３）を含む。ＨＶＲ３（又はＣＤＲ３）では、３つのＨＶＲのうち最も多様性を示し、抗体に対する精密な特異性を与えるのに独自の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００６９】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔシステムによって定義される超可変領域を指すために使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。
【００７０】
多くのＨＶＲの記述が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列多様性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは構造ループの位置を参照している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの間の妥協策を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」ＨＶＲは、利用可能な複合結晶構造の解析に基づくものである。以下の表１に、これらＨＶＲそれぞれに由来する残基を記す。
【表１−１】
2020536967.tif 000003
【００７１】
ＨＶＲは、ＶＬ中の２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）、並びにＶＨ中の２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）である、「伸長されたＨＶＲ」を含んでよい。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、Ｋａｂａｔｅｔ  ａｌ（上記）に従ってナンバリングされる。
【００７２】
「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基のナンバリング」又は「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位置ナンバリング」という表現及びその変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）における抗体の編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ中の短縮、又は挿入に対応して、より少ない又は追加的なアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによると残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入残基（Ｋａｂａｔによると、例えば８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含む場合がある。ある抗体について、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントによって、残基のＫａｂａｔナンバリングを決定することができる。
【００７３】
本明細書で別途記載のない限り、免疫グロブリン重鎖中の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）にあるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００７４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７５】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」又は「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も共通に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択肢は、可変ドメイン配列のサブグループである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にあるようなサブグループである。例として、ＶＬについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）にあるような、サブグループκＩ、κＩＩ、κＩＩＩ又はκＩＶであってよい。また、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにあるような、サブグループＩ、サブグループＩＩ又はサブグループＩＩＩであってよい。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、例えば、ドナーフレームワーク配列を様々なヒトフレームフレーム配列の集合とアライメントすることによって、ドナーフレームワークとの相同性に基づいてヒトフレームワーク残基を選択するときなど、特定の残基において、上記のもの由来である場合がある。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来である」アクセプターヒトフレームワークは、それらと同じアミノ酸配列を含んでよく、又は、予め存在するアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、予め存在するアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。
【００７６】
「親和性成熟した」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を伴うものであり、その変更により、それらの変更を持たない親抗体と比較して、抗体の抗原に対する親和性の改善がもたらされる。いくつかの実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度又は更にはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野において既知の手順によって作製される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ−及びＶＬ−ドメインのシャッフリングによる親和性成熟について述べている。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００７７】
本明細書で使用するとき、用語「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、又は「特異的」は、標的と抗原結合タンパク質との間の結合などの、測定可能かつ再現性のある相互作用を指し、これは、生物学的分子などの分子の異種集団の存在下での、標的の存在を判定する。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、別の標的に結合するよりも、この標的に、より高い親和性で、より強い結合活性で、より容易に、及び／又はより長時間結合する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、無関係の標的への抗原結合タンパク質の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定するとき、標的に対する抗原結合タンパク質の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質、つまり、ＶＥＧＦに特異的に結合するＶＥＧＦＲコンポーネントは、解離定数（Ｋｄ）が、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、又は≦１０−１２Ｍである。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、異種由来のタンパク質間で保存されているタンパク質のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は排他的結合を含んでよいが、それは必須ではない。
【００７８】
用語「特異性」は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質の選択的認識を指す。例えば、天然の抗体は単一特異性である。本明細書で使用するとき、用語「多重特異性」は、抗原結合タンパク質がポリエピトープ特異性を有することを示す（すなわち、１つの生体分子上の２つ、３つ、若しくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合可能である、又は、２つ、３つ、若しくはそれ以上の異なる生体分子上のエピトープに特異的に結合可能である）。本明細書で使用するとき、「二重特異性」は、抗原結合タンパク質が、２つの異なる抗原結合特異性を有することを意味する。別途記載のない限り、列挙された二重特異性抗体によって結合される抗原の順序は任意である。本明細書で使用するとき、用語「単一特異性」は、１つ以上の結合部位を有し、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質を意味する。
【００７９】
本明細書で使用するとき、用語「価」は、抗原結合タンパク質内に、特定の数の結合部位が存在していることを意味する。例えば、天然抗体、つまり完全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。このように、用語「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」は、抗原結合タンパク質内に、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位が存在していることを意味する。
【００８０】
「抗体エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因するこれらの生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、Ｂ細胞活性化が挙げられる。抗体エフェクター機能の「低下又は最小化」は、野生型又は未修飾の抗体から、少なくとも５０％（あるいは６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）低下することを意味する。抗体エフェクター機能の決定は、当業者によって容易に判定可能かつ測定可能である。好ましい実施形態では、抗体エフェクター機能である補体結合、補体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害が影響を受ける。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グリコシル化を排除した定常領域における変異、例えば、「エフェクターレス変異」によって解消される。一態様では、エフェクターレス変異は、ＣＨ２領域におけるＮ２９７Ａ又はＤＡＮＡ（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）変異である。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）。あるいは、エフェクター機能の低下又は解消をもたらす追加の突然変異として、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）が挙げられる。あるいは、エフェクター機能は、製造手法によって低下又は解消されることがあり、例えば、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、大腸菌）又は、エフェクター機能の促進に無効であるか若しくは効果が低い、改変された変更されたグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３（２００３）中での発現である。
【００８１】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」つまりＡＤＣＣは、細胞傷害の一形態を指し、分泌されたＩｇが特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合すると、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原提示標的細胞に特異的に結合し、続いてその標的細胞を細胞毒で死滅することを可能にする。細胞傷害性細胞の抗体「アーム」は、このメカニズムによる標的細胞の死滅に必要である。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページ表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性の評価には、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されるものなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又は更に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルで評価してもよい。
【００８２】
本明細書の用語「Ｆｃ領域」を用いて、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義し、天然配列のＦｃ領域と変異Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０のアミノ酸残基位置から、そのカルボキシル末端にかけて延びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の製造若しくは精製時、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え的に操作することによって、除かれてもよい。したがって、無傷抗体の構成は、全てのＫ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基がある抗体とない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでよい。本明細書に記載される抗体での使用に好適な天然配列Ｆｃ領域として、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００８３】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的細胞を溶解することを指す。従来の補体経路の活性化は、補体系の第１の要素（Ｃ１ｑ）の、その同種抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施してよい。Ｆｃ領域のアミノ酸配列が変更されており、Ｃ１ｑ結合能が増加又は低下している抗体変異体が、米国特許第６，１９４，５５１（Ｂ１）号及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。これらの特許公報の内容は、具体的に参照することにより本明細書に組み込まれる。また、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照されたい。
【００８４】
「結合親和性」は一般に、分子（例えば、抗体、ＶＥＧＦＲ）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原、ＶＥＧＦ）との間の非共有性相互作用の強度の総和を指す。別途記載のない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー間の１対１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。結合親和性は、Ｋｄ、Ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ、又はＫａによって示すことができる。本明細書で使用するとき、用語「Ｋｏｆｆ」は、動態学的選択設定により判定され、ｓ−１の単位で表される、抗体／抗原複合体から抗体（又は抗原結合ドメイン）の解離（又は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ複合体からＶＥＧＦＲの解離）に関する、解離速度定数を指すことを意図する。本明細書で使用するとき、用語「Ｋｏｎ」は、Ｍ−１ｓ−１の単位で表される、抗体／抗原複合体の形成のための抗体（又は抗原結合ドメイン）の抗原への会合（又は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ複合体の形成のためのＶＥＧＦＲのＶＥＧＦへの会合）に関する、会合速度定数を指すことを意図する。本明細書で使用するとき、用語、平衡解離定数「ＫＤ」又は「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用（又はＶＥＧＦＲＶＥＧＦ相互作用）の解離定数を指し、平衡状態で抗体分子溶液中に存在する全抗体結合ドメインの半分を占有するのに必要とされる抗原の濃度（又は、平衡状態でＶＥＧＦＲ溶液中に存在する全ＶＥＧＦＲの半分を占有するのに必要とされるＶＥＧＦの濃度）を表したものであり、Ｍの単位で表されるＫｏｆｆ／Ｋｏｎに等しい。Ｋｄの測定は、全ての結合する薬剤が溶液中にあることを前提としている。例えば酵母発現系のように、抗体が細胞壁に繋ぎ止められている場合、対応する平衡速度定数はＥＣ５０として表され、これはＫｄの優れた近似値を与える。親和定数Ｋａは、解離定数Ｋｄの逆数であり、Ｍ−１の単位で表される。
【００８５】
解離定数（ＫＤ又はＫｄ）は、抗体の抗原に対する（又は、ＶＥＧＦＲのＶＥＧＦに対する）親和性を示す指標として使用される。例えば、様々なマーカー剤で標識された抗体を使用するＳｃａｔｃｈａｒｄ法によって、並びに、市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）又は類似のキットを、キット付属のユーザーマニュアル及び実験操作法に従って使用することにより、容易な分析が可能である。これらの方法を使用して導き出すことができるＫＤ値は、Ｍ（モル）単位で表される。標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（又は、ＶＥＧＦに特異的に結合する本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネント）は、解離定数（Ｋｄ）が、例えば、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、又は≦１０−１２Ｍであってよい。
【００８６】
抗体又は抗体結合ドメイン（又は本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネント）の結合特異性は、当該技術分野において既知の方法によって実験的に決定することができる。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する物質（抗体又はＶＥＧＦＲなど）の有効性の尺度である。特定の薬物又は他の物質（抗体又はＶＥＧＦＲなどの阻害剤）が、ある生物学的プロセス、又はプロセスの構成要素、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、又は微生物）を半分阻害するために必要とされる量を示す。この値は、典型的にはモル濃度として表される。ＩＣ５０は、アゴニスト薬又は他の物質（抗体など）におけるＥＣ５０に相当する。ＥＣ５０はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで最大効果の５０％を得るために必要な血漿濃度を表す。本明細書で使用するとき、「ＩＣ５０」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗原の生物活性の５０％を中和するのに必要な抗体の有効濃度（又は、ＶＥＧＦの生物活性の５０％を中和するのに必要なＶＥＧＦＲコンポーネントの有効濃度）を示すために使用される。ＩＣ５０又はＥＣ５０は、ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害（競合結合アッセイ）、細胞系サイトカイン放出アッセイ、又は化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）などのバイオアッセイによって測定できる。
【００８８】
ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、必要に応じて、最大割合の配列同一性を達成するため、配列をアライメントし、かつギャップを導入した後、配列同一性の部分としていかなる保存的置換を考慮せずに、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義する。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的においてアライメントは、当該技術分野における様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメント測定用の適切なパラメータを決定することができる。
【００８９】
本明細書に記載される構築物、抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードする「単離された」核酸分子は、通常は産生された環境に関係する少なくとも１つの混入核酸分子から、単離され、かつ分離される核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関係する全ての成分と会合しない。本発明に記載されるポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、自然に見いだされる形態又は状況以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内で天然に存在する本明細書に記載されるポリペプチド及び抗体をコードする核酸と区別される。単離された核酸は、通常核酸分子を含有する細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外、つまり、その天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００９０】
用語「コントロール配列」は、特定の宿主生物における操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適したコントロール配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００９１】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されるとき、「操作可能に連結」される。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、その配列の転写に影響する場合、コード配列に操作可能に連結され、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するために配置される場合、コード配列に操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、読まれるときに近接していることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合がいい制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来の方法によって合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００９２】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、それが連結される別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに、導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結される核酸の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【００９３】
本明細書で使用するとき、用語「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」は、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【００９４】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、かかる細胞の子孫を含む、外因性の核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫を継代数に関係なく含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫は、本明細書に含まれる。
【００９５】
「アジュバント設定」は、個体が癌の既往歴を有し、かつ同個体に通常は（必ずしもそうなったとは限らないが）治療の効果があった臨床設定を指し、これには、外科治療（例えば、外科切除）、放射線療法、及び化学療法などが挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、癌の既往のため、これらの個体は疾患の発症のリスクがあると考えられる。「アジュバント設定」としての治療及び投与は、後に続く治療の機序を指す。リスクの程度（例えば、アジュバント療法において個体が「高リスク」又は「低リスク」であると考えられるとき）は、いくつかの要因、多くは、最初に治療されたときの疾患の程度に依存する。
【００９６】
「ネオアジュバント設定」は、方法が一次／根治治療の前に行われる臨床設定を指す。
【００９７】
「生体適合性」とは、使用される量及び場所においてレシピエントの細胞に対して実質的に非毒性であり、使用される場所において、レシピエントの身体に対して顕著に有害な又は好ましくない影響、例えば、許容不可能な免疫学的又は炎症性反応、許容不可能な瘢痕組織形成などを誘発しない、又は引き起こさない材料を指す。例えば、眼と生体適合性である材料は、眼の生理又は機能に実質的に干渉しない。
【００９８】
「生体内分解性」又は「生分解性」とは、材料が、対象の細胞内又は体内で、例えば、生理学的条件下での加水分解によって、及び／又は、細胞内若しくは体内に存在する酵素の作用などの天然の生物学的プロセスによって、及び／又は、溶解、分散などのプロセスによって、物理的及び／又は化学的に分解され、典型的には代謝され、任意に身体によって使用され、及び／又は排泄されるか、ないしは別の方法で廃棄され得る、より小さい化学種を形成可能であることを意味する。好ましくは、生分解性化合物は生体適合性である。分子量が、モノマー数の減少によりｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に減少するポリマーは、生分解性と考えられる。
【００９９】
用語「医薬組成物」の「製剤処方」は、有効成分の生物活性が有効となることを可能にするような形態であり、その製剤が投与される被検体に許容されないほど毒性がある追加の成分を含まない、製剤を指す。このような製剤は無菌である。「無菌」製剤は無菌性であり、つまり、全ての生微生物及びその芽胞を含まない。
【０１００】
本明細書に記載される本発明の実施形態（例えば「含む」実施形態）は、実施形態「からなる」及び／又は「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【０１０１】
本明細書における「約」のついた値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体に対するばらつきを含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、ある値又はパラメータ「ではない」への言及は、一般的に、その値又はパラメータ「以外」を意味し、記載する。例えば、「方法は、タイプＸの癌を治療するのに使用されない」は、「方法は、Ｘ以外のタイプの癌を治療するのに使用される」を意味する。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「約Ｘ〜Ｙ」は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同一の意味を有する。
【０１０４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、特に文脈から明確に指定されていない限り、複数の参照対象を含む。
ＩＩ．抗体軽鎖のＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを含む抗体融合タンパク質
【０１０５】
本明細書に記載される抗体融合タンパク質は、１）軽鎖を含む抗体と、２）ＶＥＧＦＲコンポーネントであって、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗体（例えば完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ−１の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン２（Ｆｌｔ１ｄ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン３（Ｆｌｋ１ｄ３）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第３のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１のＩｇ様ドメイン４（Ｆｌｋ１ｄ４）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３から本質的になり、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４から本質的になり、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、及び細胞内抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントは抗体ＣＬドメインのＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー��を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（二重特異性など）である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は刺激性免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、阻害性免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＣＤ７３）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））と競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））と競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録��標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））と競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））と競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））と競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））と競合的にＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）であ��。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））と競合的にＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、血管新生因子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＡｎｇ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂと競合的にＡｎｇ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＴＮＦαである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、
抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））と競合的にＴＮＦαに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＩＬ−１７Ａである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））と競合的にＩＬ−１７Ａに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、１つのＶＥＧＦＲコンポーネントのみを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３から本質的になり、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４から本質的になり、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントのうち少なくとも１つ、及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫チェックポイント分子（例えば、阻害性免疫チェックポイント分子）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する（例えば、アテゾリズマブ又はデュルバルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する（例えば、イピリムマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＨＥＲ２を特異的に認識する（例えば、トラスツズマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）を特異的に認識する（例えば、セツキシマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、血管新生因子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ａｎｇ２を特異的に認識する（例えば、ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＮＦαを特異的に認識する（例えば、アダリムマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する（例えば、イキセキズマブ）。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合されており、第１及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントがそれぞれ、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｒ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントのうち少なくとも１つ、及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫チェックポイント分子（例えば、阻害性免疫チェックポイント分子）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する（例えば、アテゾリズマブ又はデュルバルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する（例えば、イピリムマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＨＥＲ２を特異的に認識する（例えば、トラスツズマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）を特異的に認識する（例えば、セツキシマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、血管新生因子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ａｎｇ２を特異的に認識する（例えば、ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＮＦαを特異的に認識する（例えば、アダリムマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する（例えば、イキセキズマブ）。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１〜７及び４４のいずれか１つ）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＥＧＦＲコンポーネント及び２つの抗体軽鎖のＣ末端のうち少なくとも１つは、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、両方のＶＥＧＦＲコンポーネント及び２つの抗体軽鎖のＣ末端は、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、２つのリンカーは同じである。いくつかの実施形態では、２つのリンカーは異なっている。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、刺激性免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害性免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＣＤ７３）を特異的に認識する（以下、この抗体を、「免疫チェックポイント阻害剤」又は「阻害性免疫チェックポイント分子の阻害剤」と称する）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する（例えば、アテゾリズマブ又はデュルバルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する（例えば、イピリムマブ）。
【０１１２】
例えば、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、免疫チェックポイント分子（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＣＴＬＡ−４など）を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、免疫チェックポイント分子（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＣＴＬＡ−４など）を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する（例えば、アテゾリズマブ又はデュルバルマブ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する（例えば、イピリムマブ）。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｒ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブと競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブと競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブと競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、腫瘍抗原（ＨＥＲ２、ＥＧＦＲなど）を特異的に認識する抗体を含む。
【０１２０】
したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、腫瘍抗原（ＨＥＲ２、ＥＧＦＲなど）を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２である。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブと競合的にＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブと競合的にＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、腫瘍抗原（ＨＥＲ２、ＥＧＦＲなど）を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２である。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブと競合的にＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＨＥＲ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＥＧＦＲを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブと競合的にＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、血管新生因子を特異的に認識する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ａｎｇ２を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＮＦαを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する。
【０１２３】
したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、血管新生因子（Ａｎｇ２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａなど）を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、血管新生因子（Ａｎｇ２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａなど）を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各Ｖ��ＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、Ａｎｇ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、Ａｎｇ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、Ａｎｇ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂと競合的にＡｎｇ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＴＮＦαを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＴＮＦαを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末��へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＴＮＦαを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブと競合的にＴＮＦαに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されている、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは同じである。いくつかの実施形態では、リンカーＸ及びリンカーＹは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含み、抗体が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、抗体融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブと競合的にＩＬ−１７Ａに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
抗体融合タンパク質の特性
抗体融合タンパク質の安定性
【０１２７】
本発明のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、高いレベルの安定性を示し得る。
【０１２８】
ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質について本明細書で使用するとき、用語「安定」は、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が、既定された条件下で保存後、許容可能な程度の化学構造又は生物学的機能を保持していることを意味する。ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、既定の期間保存後に、その化学構造又は生物学的機能の１００％を維持していない場合であっても安定であり得る。いくつかの実施形態では、規定された時間保存後に、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の構造又は機能の約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％を維持していることを、「安定」とみなし得る。
【０１２９】
安定性は、特に、規定された温度で規定された時間保存後に、製剤（液体、つまり再溶解したもの）中に残存する未変性（凝集又は分解されていない）ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の割合を決定することによって測定できる。未変性ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の割合は、特に、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ−ＨＰＬＣ］）によって決定することができ、そのため、未変性とは非凝集及び非分解を意味する。いくつかの実施形態では、未変性形態のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の少なくとも約９０％（少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％など）が、ある温度で規定された時間保存後、製剤中に検出され得る。いくつかの実施形態では、未変性形態のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の少なくとも約９０％（少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％など）が、室温（約２５℃）下で、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間後に、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、又は少なくとも約４８時間後、製剤中に検出され得る。
【０１３０】
安定性は、特に、規定された温度で規定された時間保存後に、製剤（液体、つまり再溶解したもの）中の凝集形態のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の割合を決定することによって測定でき、安定性は、形成される凝集体の百分率に反比例する。凝集したＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の割合は、特に、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ−ＨＰＬＣ］）によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ある温度で規定された時間保存後に、約１０％未満（好ましくは約５％未満）のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が製剤中に凝集体として存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、実質的に凝集体を有さず、例えば、最大で約６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．１％のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が、ある温度で規定された時間保存後、例えば、室温（約２５℃）下で、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間後に、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、又は少なくとも約４８時間後、製剤中に凝集して検出され得る。
【０１３１】
また、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の標的（抗体抗原及び／又はＶＥＧＦ）に対する結合親和性の測定も、安定性の評価に使用できる。例えば、本発明のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、例えば、室温（約２５℃）で規定された時間（例えば、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間）保存後、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質内に含まれる抗体及びＶＥＧＦＲコンポーネントの両方が、当該保存前の抗体に対する結合親和性の少なくとも８４％、９０％、９５％、又は更にはそれ以上の親和性で抗体抗原及びＶＥＧＦ（それぞれ）に結合する場合、安定とみなし得る。結合親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はプラズモン共鳴などの任意の方法によって決定できる。生物活性は、ＶＥＧＦを発現する細胞をＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質と接触させることによるものなど、抗原又はＶＥＧＦ活性アッセイによって決定できる。このような細胞へのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の結合は、ＦＡＣＳ分析などを介して直接測定することができる。あるいは、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の存在下でＶＥＧＦ系の下流活性を測定し、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の非存在下でのＶＥＧＦ系の活性と比較してもよい。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦは、細胞に内因性であってもよい。他の実施形態では、ＶＥＧＦは、細胞内で異所的に発現（すなわち、異種発現）されてもよい。
抗体融合タンパク質の薬物動態
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の血清半減期は、対応する抗体よりも長く、例えば、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質のｐＫは、対応する抗体よりも長い。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の血清半減期は、対応する抗体と同様である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の血清半減期は、生物に投与されるとき、少なくとも約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約７日、約６日、約５日であり、約４日間、約３日間、約２日間、約２４時間、約２４時間、約２０時間、約１８時間、約１６時間、約１４時間、約１２時間、約１０時間、約８時間、約６時間、約４時間、約３時間、約２時間、又は約１時間である。
抗体融合タンパク質の臨床特性
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、重鎖のＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを有する抗体を含むＶＥＧＦＲ−抗体融合タンパク質、及び／又は、重鎖のＮ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを有する抗体を含むＶＥＧＦＲ−抗体融合タンパク質、及び／又は、軽鎖のＮ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを含むＶＥＧＦＲ−抗体融合タンパク質に対して、改善された臨床特性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に結合した嵩高いＶＥＧＦＲコンポーネントの存在にもかかわらず、抗体のＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能の両方を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、対応する抗体と比較して、改善された抗体のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣエフェクター機能を示す。
【０１３４】
ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質のＡＤＣＣは、実施例２に記載するように試験できる。簡潔には、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質によって認識され得る抗原を発現している癌細胞株（例えば、ＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２軽鎖融合タンパク質内の抗ＨＥＲ２抗体部分によって認識され得るＨＥＲ２を発現しているＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞株）及びエフェクター細胞（例えば、ＣＤ１６＋ＮＫ９２細胞）を、９６ウェルプレート内で一緒に混合する。癌細胞株は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現するよう遺伝子操作することができる。様々な濃度のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を各ウェルに添加する。インキュベーション後、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）活性を、マイクロプレートリーダーを使用して測定することができる。次に、ＥＣ５０（ＡＤＣＣ活性を表す）を計算することができる。
【０１３５】
可撓性ペプチドリンカーが使用される場合であっても、Ｃ末端重鎖融合によりＦｃ領域の構造が変わることがある。その結果、重鎖融合を有する抗体融合タンパク質は、完全な抗体に対して低いＣＤＣを示す。加えて、重鎖融合は、抗原結合非存在下での高Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合を特徴とする。この結果、比較的短い半減期が生じる。重鎖融合のこれらの特性を変更し、例えば、融合部分を脱グリコシル化することによってＦｃＲ結合を低減若しくは排除、及び／又は、リンカーを修飾することによって細胞内タンパク質分解を防止することができる。しかしながら、脱グリコシル化の結果、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが損失し、リンカーを修飾した構築物は、依然として、比較的低いＣＤＣと、最適ではない薬物動態特性を有する。
【０１３６】
大きい部分（例えば、ＶＥＧＦＲコンポーネント）を抗体軽鎖のＣ末端に融合させると、嵩高い部分、並びに抗体軽鎖自体の折り畳みが影響を受け、抗体融合タンパク質の３Ｄ構造の予測が不可能になり、その結果、抗体の標的抗原への結合特異性、及び嵩高い部分の生物活性（例えば、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦに対する結合特異性）が低減又は消滅し得る。しかしながら、驚くべきことに、本発明では、２つの嵩高いＶＥＧＦＲコンポーネントが両方の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合される場合であっても、ＶＥＧＦＲのＶＥＧＦに対する結合特異性と、抗体のその抗原標的に対する結合特異性を依然として維持しつつ、嵩高いＶＥＧＦＲコンポーネント（例えば、約２３．２ｋＤａ）を抗体軽鎖のＣ末端に融合できることが見いだされた。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、対象とする標的細胞（例えば、ＶＥＧＦを過剰発現している癌細胞又は組織）に結合していないときに抗体活性を低下させることによって、抗体細胞特異性を増加させることができる。この特徴は、抗体融合タンパク質の細胞毒性を選択的にマスク又は低減し、それによって、標的細胞（例えば、ＶＥＧＦを過剰発現している癌細胞又は組織）のみを曝露させながら、非標的細胞又は正常細胞を毒性効果から保護するのに特に有用であろう。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントを含むＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、同じ抗体融合タンパク質内でＶＥＧＦ二量体結合を安定化させることができる（図１及び図２に示す例参照）。いくつかの実施形態では、１つのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、隣接する別の１つと対を形成でき、２つの部分からなるＶＥＧＦＲコンポーネントの二量体を形成し、ＶＥＧＦ結合を安定化させることができる（図３〜図５に示す例参照）。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、リンカーペプチドの有無にかかわらず、完全な抗体及びＶＥＧＦＲコンポーネントの機能（例えば、ＶＥＧＦに対する結合）を保持する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、抗体Ｆｃ領域の構造に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、抗体のＦｃ部分のＦｃ受容体（ＦｃγＲ及びＦｃＲｎなど）への結合、又は抗体のそれぞれの標的への結合に干渉しない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、抗体部分と免疫系（エフェクター機能）との間の相互作用に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、重鎖の歪みを回避することによって、ＦｃＲ担持細胞による取り込み後の分解と、その後の細胞からのリサイクルを低下させる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＶＥＧＦと親ＩｇＧによって認識される抗原の両方に対する高い結合親和性を保持する。
ＶＥＧＦＲコンポーネント
ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ
【０１３９】
新血管新生プロセスにおける多くの主要な因子が特定されており、ＶＥＧＦファミリーは主要な役割を有する。ヒトＶＥＧＦファミリーは、６つのメンバーである、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、及び胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）からなる。加えて、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰＩＧＦの複数のアイソフォームは、代替的なＲＮＡスプライシングによって生成される（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ，２００２，２（２）：１６５−７５）。ＶＥＧＦ−Ａは、血管新生に関与する主要因子であり、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２の両方に結合する。ＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達の阻害による血管新生を阻害する戦略は、特定の癌、並びに網膜新生血管障害及び虚血性疾患の治療に成果がある治療法を確立した（Ｍａｊｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｎ，１９９７，２８３（１）：４０２−１０；Ｗｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４，１０：１４５−７；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０１２，１５（２）：１７１−８５；Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９５，９２：１０４５７−６１）。
【０１４０】
血管形成のプロセスに寄与する他の成長因子と比較して、ＶＥＧＦは、血管系内の内皮細胞に対する高い特異性を特徴とする。
【０１４１】
血管新生及び脈管形成における血管新生因子であることに加えて、ＶＥＧＦは、多面的成長因子として、内皮細胞の生存、血管透過性及び血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入などの他の生理学的プロセスにおいて複数の生物学的効果を呈する（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８：４−２５）。更に、ＶＥＧＦはまた、網膜色素上皮細胞、膵管細胞、及びシュワン細胞などの数種の非内皮細胞型に対する分裂促進効果を有することも報告された。例えば、Ｇｕｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５−３９４；Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５−１３２；Ｓｏｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１−５７４０を参照されたい。
【０１４２】
実質的証拠はまた、病的血管新生を伴う状態又は疾患の発症においてＶＥＧＦの重要な役割も示唆している。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、調査したヒト腫瘍の大部分で過剰発現されている（Ｂｅｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１：１５３−１５９（１９９３）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２６：８６−９１（１９９５）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４７２７−４７３５（１９９３）；Ｍａｔｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７３：９３１−９３４（１９９６）；及びＤｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９（１９９５））。また、眼内の液体中のＶＥＧＦの濃度は、糖尿病及びその他虚血関連網膜症患者における血管の活性増殖の存在と高く相関している（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７（１９９４））。更に、研究により、ＡＭＤ患者における脈絡膜新生血管膜におけるＶＥＧＦの局在化が実証された（Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８（１９９６））。
【０１４３】
抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、固形腫瘍及び様々な眼内新生血管障害の治療のための有望な候補である。ＶＥＧＦ分子は腫瘍細胞内で上方調節され、その受容体は腫瘍が浸潤した血管内皮細胞において上方調節されるが、ＶＥＧＦ及びその受容体の発現は、血管新生に関連しない正常細胞において低いままである。抗ＶＥＧＦ抗体としては、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ、Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ（ＲＧ７２２１）、及びラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
ＶＥＧＦは、約４６ｋＤａの見かけ分子量を有する二量体であり、各サブユニットは約２３ｋＤａの見かけの分子量を有する。ＶＥＧＦの内皮増殖活性は、血管内皮細胞の表面上にのみ存在する、２つの高親和性チロシンキナーゼ受容体、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）によって媒介されることが知られている。ＤｅＶｒｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：９８９−９９１（１９９２）及びＴｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６７７−１６８３（１９９１）。Ｆｌｔ−１及びＫＤＲチロシンキナーゼ受容体の両方は、受容体の細胞外リガンド結合領域を形成する７つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインと、発現する細胞の表面上に受容体を固定する役割を果たす膜貫通ドメインと、「キナーゼインサート」によって介在される細胞内触媒性チロシンキナーゼドメインとを有する。ＫＤＲ受容体は、高い親和性でＶＥＧＦタンパク質のみに結合するが、Ｆｌｔ−１受容体は、ＶＥＧＦと顕著な構造的相同性を有する分子である、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）にも結合する。細胞外リガンド結合領域内に７つのＩｇ様ドメインを有する受容体型チロシンキナーゼの追加のメンバーは、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）であり、ＶＥＧＦ又はＰＬＧＦのいずれかに対する受容体ではないが、代わりに異なるリガンドであるＶＨ１．４．５に結合する。ＶＨ１．４．５リガンドは、ＶＥＧＦ関連タンパク質（ＶＲＰ）又はＶＥＧＦ−Ｃとして文献で報告されている。
【０１４５】
内皮細胞特異的分裂促進因子として知られていることに加えて、ＶＥＧＦは、血管新生成長因子の中でも、巨大分子に対する一過性の血管透過性増加の誘発能を特徴とする（したがって、その元の別名は、血管透過性因子、ＶＰＦである）（Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：１６６−１７４；Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：９８３−９８５；Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：５６２９−５６３２参照）。血管透過性の増加、及び結果として生じる血管外空間への血漿タンパク質の堆積は、内皮細胞の遊走のための暫定的マトリックスを提供することによって新たな血管形成を支援する（Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。実際に、高い透過性は、腫瘍に関連するものを含む新しい血管の特徴である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントは、ＶＥＧＦタンパク質への結合を媒介する、Ｆｌｔ−１又はＫＤＲ受容体（又はＫＤＲ受容体のマウスホモログであるＦｌｋ−１）の細胞外リガンド結合領域のいずれかに由来するＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ受容体（又はＫＤＲ受容体のマウスホモログであるＦｌｋ−１）の両方の細胞外リガンド結合領域に由来するＩｇ様ドメイン、又はそれらの機能的等価物を含み、「キメラＶＥＧＦＲ」コンポーネントを形成する。
【０１４７】
用語、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−４、又はＦｌｋ−１の「Ｉｇ様ドメイン」は、完全な野生型ドメインだけでなく、完全なドメインの機能特性を実質的に保持する挿入、欠失、及び／又は置換による変異体も包含することを意図する。当業者には、野生型ドメインと実質的に同じ機能特性を保持するＩｇドメインの多くの変異体を得ることができることは、当業者には容易に明らかであろう。
【０１４８】
用語「機能的等価物」は、Ｉｇ様ドメイン「Ｘ」を参照して使用される場合、少なくとも１つの改変、例えば、欠失、付加、及び／又は置換を有し、野生型Ｉｇドメイン「Ｘ」と実質的に同じ機能特性、すなわち、ＶＥＧＦに対する実質的に同等の結合を保持している、Ｉｇ様ドメイン「Ｘ」を包含することが意図される。ＶＥＧＦに結合して不活化するこれらの受容体コンポーネントの能力に関して本発明の趣旨から逸脱することなく、様々なアミノ酸置換がＩｇドメイン「Ｘ」中でなされ得ることが理解されよう。したがって、ＶＥＧＦＲコンポーネントがＶＥＧＦに結合し、その活性を阻害する能力に実質的に影響しない興味深い特性を付与するために、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン内に、点変異又はその他様々な変異を行ってもよい。本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントの機能特性は、所望の特性を測定するための当該技術分野において既知の任意の好適なスクリーニングアッセイによって決定することができる。他のアッセイ、例えば、ＶＥＧＦへの特異的結合能の変化を、競合型ＶＥＧＦ結合アッセイによって測定することができる。熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、又は凝集傾向などのタンパク質特性の変化は、当業者に既知の方法によって測定することができる。「Ｖ．調製方法」の「１．アミノ酸配列変異体」も参照されたい。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン１（以下、Ｆｌｔ１ｄ１と称する）、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｔ１ｄ３、Ｆｌｔ１ｄ４、Ｆｌｔ１ｄ５、Ｆｌｔ１ｄ６、Ｆｌｔ１ｄ７、Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン１（以下、Ｆｌｋ１ｄ１と称する）、Ｆｌｋ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、Ｆｌｋ１ｄ４、Ｆｌｋ１ｄ５、Ｆｌｋ１ｄ６、又はＦｌｋ１ｄ７を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの１、２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１由来のＩｇ様ドメインの混合物を含む、２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ−１由来の１つのＩｇ様ドメインと、Ｆｌｔ−１由来の２つのＩｇ様ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、全てＦｌｔ−１由来の２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、全てＦｌｋ−１由来の２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、互いに直接連結されたＦｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれか由来の２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれか由来のものなどのドメインリンカー、例えば、Ｆｌｔ１ｄ２とＦｌｔ１ｄ３を連結するドメインリンカーを介して連結されたＦｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれか由来の２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント内のＩｇ様ドメインは、ペプチドリンカー（例えば、以下のペプチドリンカーの項参照）例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４）（式中、ｎは１〜８の整数であり、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）、又は（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号７））によって連結される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント内のＩｇ様ドメインは、チオエステルなどの非ペプチドリンカー（例えば、以下の非ペプチドリンカーの項参照）によって連結される。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの１、２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインからなる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの１、２、３、４、５、６、又は７つのＩｇ様ドメインから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれか由来のＩｇ様ドメインではない部分を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントは、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（Ｆｌｔ１ｄ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン３（Ｆｌｋ１ｄ３）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第３のＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメイン、及び／又は第４のＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを更に含み、このときＩｇ様ドメインは、Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン４（Ｆｌｋ１ｄ４）、Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン１（Ｆｌｋ１ｄ１）、Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン５（Ｆｌｋ１ｄ５）、Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン４（Ｆｌｔ１ｄ４）、及びＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン５（Ｆｌｔ１ｄ５）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、第３のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ−１のＩｇ様ドメイン４（Ｆｌｋ１ｄ４）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２及びＦｌｋ１ｄ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２及びＦｌｋ１ｄ３から本質的になる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２及びＦｌｋ１ｄ３からなる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、及びＦｌｋ１ｄ４を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、及びＦｌｋ１ｄ４から本質的になる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、及びＦｌｋ１ｄ４からなる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端へ）以下の構成の軽鎖−ＶＥＧＦＲコンポーネント融合タンパク質を含み（及びいくつかの実施形態では、これらからなり、又はこれらから本質的になり）、Ｌは、任意のリンカー（非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーなど）である。
ＦＰ１：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ２
ＦＰ２：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｋ１ｄ４−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ２
ＦＰ３：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ１
ＦＰ４：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ４−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ２
ＦＰ５：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｋ１ｄ５−Ｆｌｋ１ｄ４−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ２
ＦＰ６：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ５−Ｆｌｔ１ｄ４−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ２
ＦＰ１’：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３
ＦＰ２’：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４
ＦＰ３’：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｋ１ｄ１−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３
ＦＰ４’：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ４
ＦＰ５’：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４−Ｆｌｋ１ｄ５
ＦＰ６’：軽鎖−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ４−Ｆｌｔ１ｄ５
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＦｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかのＩｇ様ドメインは、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２及びＦｌｋ１ｄ３は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、及びＦｌｋ１ｄ４は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｋ１ｄ１、Ｆｌｔ１ｄ２、及びＦｌｋ１ｄ３は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、及びＦｌｔ１ｄ４は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、及びＦｌｔ１ｄ４は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、Ｆｌｋ１ｄ４、及びＦｌｋ１ｄ５は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ１ｄ２、Ｆｌｋ１ｄ３、Ｆｌｔ１ｄ４、及びＦｌｔ１ｄ５は、ＶＥＧＦＲコンポーネントの唯一のＩｇ様ドメインである。
【０１５６】
ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖が、それらの最適な三次構造をとり、及び／又はその標的分子と適切に相互作用できるように、リンカー配列は、立体障害を減少させるために提供され得る。いくつかの実施形態では、リンカーＬはペプチドリンカーである（以下の「ペプチドリンカー」の項参）。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含み、式中、ｎは、１〜８の整数、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）、又は（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号７）である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントはそれぞれ、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントはそれぞれ、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ１ｄ２及び第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１ｄ３を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントはそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントはそれぞれ、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ１ｄ２、第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１ｄ３、及び第３のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１ｄ４を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントはそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの２つのＩｇ様ドメインを含み、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの３つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの３つのＩｇ様ドメインを含み、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの４つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの４つのＩｇ様ドメインを含み、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１のいずれかの５つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、異なる配列を有する同じ数のＩｇ様ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｋ１ｄ１−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｔ１ｄ４を含む。
ＶＥＧＦＲコンポーネントのサイズ
【０１５８】
本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａである。いくつかの実施形態では、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントは、約４ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約５５ｋＤａ、約５５ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約６０ｋＤａ〜約６５ｋＤａ、約６５ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約７０ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約８０ｋＤａ〜約８５ｋＤａ、約８５ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約９０ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約４３ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約５６ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約６９ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約４３ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約５６ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約６９ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約４３ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約５６ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約６９ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約５６ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約６９ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約６９ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約６５ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約６５ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、約６５ｋＤａ〜約９５ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜約８２ｋＤａ、又は約７５ｋＤａ〜約９５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、約２３．２ｋＤａである。
【０１５９】
本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約３６アミノ酸（ａａ）の長さである。いくつかの実施形態では、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントは、約３６ａａ〜約８６４ａａ、約３６ａａ〜約９１ａａ、約９１ａａ〜約１３６ａａ、約１３６ａａ〜約１８２ａａ、約１８２ａａ〜約２２７ａａ、約２２７ａａ〜約２７３ａａ、約２７３ａａ〜約３１８ａａ、約３１８ａａ〜約３６４ａａ、約３６４ａａ〜約４０９ａａ、約４０９ａａ〜約４５５ａａ、約４５５ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約５４５ａａ、約５４５ａａ〜約５９１ａａ、約５９１ａａ〜約６３６ａａ、約６３６ａａ〜約６８２ａａ、約６８２ａａ〜約７２７ａａ、約７２７ａａ〜約７７３ａａ、約７７３ａａ〜約８１８ａａ、約８１８ａａ〜約８６４ａａ、約３６ａａ〜約１３６ａａ、約３６ａａ〜約２７３ａａ、約３６ａａ〜約３９１ａａ、約３６ａａ〜約５０９ａａ、約３６ａａ〜約６２７ａａ、約３６ａａ〜約７４５ａａ、約３６ａａ〜約７４５ａａ、約１３６ａａ〜約２７３ａａ、約１３６ａａ〜約３９１ａａ、約１３６ａａ〜約５０９ａａ、約１３６ａａ〜約６２７ａａ、約１３６ａａ〜約７４５ａａ、約１３６ａａ〜約８６４ａａ、約２２７ａａ〜約３９１ａａ、約２２７ａａ〜約５０９ａａ、約２２７ａａ〜約６２７ａａ、約２２７ａａ〜約７４５ａａ、約２２７ａａ〜約８６４ａａ、約３６４ａａ〜約５０９ａａ、約３６４ａａ〜約６２７ａａ、約３６４ａａ〜約７４５ａａ、約３６４ａａ〜約８６４ａａ、約４５５ａａ〜約６２７ａａ、約４５５ａａ〜約６８２ａａ、約４５５ａａ〜約７４５ａａ、約４５５ａａ〜約８６４ａａ、約５９１ａａ〜約６８２ａａ、約５９１ａａ〜約７４５ａａ、約５９１ａａ〜約８６４ａａ、約６８２ａａ〜約７４５ａａ、又は約６８２ａａ〜約８６４ａａの長さである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、約２１１ａａの長さである。
ＶＥＧＦＲの結合親和性
【０１６０】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦに対する結合特異性は、当該技術分野において既知の方法によって実験的に決定することができる。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
【０１６１】
ＥＬＩＳＡ系結合アッセイを、実施例２に記載されるように実施することができる。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ（又は試験される抗原、例えばＰＤ−１など）でコーティングでき、その後、様々な濃度のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（又は試験される任意の抗体）を各ウェルに添加する。インキュベーション及び洗浄後、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体などの二次抗体を添加し、ＶＥＧＦ（又は試験される抗原）に結合したＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（又は試験される任意の抗体）を検出することができる。ＨＲＰの基質を各ウェルに添加する。各ウェルの吸光度（ＯＤ）を、４５０ｎｍのマイクロプレートリーダーを使用して測定できる。次いで、ＥＣ５０を計算できる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤ又はＥＣ５０は、約１０−５Ｍ〜約１０−１５Ｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−５Ｍ〜約１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１３Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−８Ｍ、１０−６Ｍ〜約１０−８Ｍ、又は１０−５Ｍ〜約１０−７Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、約０．５ｐＭの親和性でＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、約１０ｎＭ〜約４０ｎＭのＥＣ５０でＶＥＧＦに結合する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）の両方に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、類似の結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは、異なる結合親和性を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤよりも大きい。例えば、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの結合のＫＤより、約１〜１０倍、約１０〜２０倍、約２０〜３０倍、約３０〜４０倍、約４０〜５０倍、約５０〜６０倍、約６０〜７０倍、約７０〜８０倍、約８０〜９０倍、約９０〜１００倍、約１００〜５００倍、又は約５００〜１０００倍であり得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントの抗体軽鎖のＣ末端への融合は、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦに対する結合親和性に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントの抗体軽鎖のＣ末端への融合は、融合したＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤが、融合していないＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの結合のＫＤより、約１〜１０倍、約１０〜２０倍、約２０〜３０倍、約３０〜４０倍、約４０〜５０倍、約５０〜６０倍、約６０〜７０倍、約７０〜８０倍、約８０〜９０倍、約９０〜１００倍、約１００〜５００倍、又は約５００〜１０００倍であり得るように、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦへの結合親和性を低減する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントの抗体軽鎖のＣ末端への融合は、抗体のその標的抗原に対する結合親和性に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントの抗体軽鎖のＣ末端への融合は、ＶＥＧＦＲに融合した抗体とその標的抗原との間の結合のＫＤが、融合していない抗体とその標的抗原との間の結合のＫＤより、約１〜１０倍、約１０〜２０倍、約２０〜３０倍、約３０〜４０倍、約４０〜５０倍、約５０〜６０倍、約６０〜７０倍、約７０〜８０倍、約８０〜９０倍、約９０〜１００倍、約１００〜５００倍、又は約５００〜１０００倍であり得るように、抗体のその標的抗原への結合親和性を低減する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントの抗体軽鎖のＣ末端への融合は、ＶＥＧＦＲに融合した抗体とその標的抗原との間の結合のＫＤが、融合していない抗体とその標的抗原との間の結合のＫＤより、約１〜１０倍、約１０〜２０倍、約２０〜３０倍、約３０〜４０倍、約４０〜５０倍、約５０〜６０倍、約６０〜７０倍、約７０〜８０倍、約８０〜９０倍、約９０〜１００倍、約１００〜５００倍、又は約５００〜１０００倍低くなり得るように、抗体のその標的抗原への結合親和性を（例えば、同一細胞においてＶＥＧＦＲ−ＶＥＧＦの結合を介して抗体−抗原の結合を安定化させることにより）低減する。
【０１６８】
したがって、いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲが融合した抗体と抗体標的抗原との間の結合のＫＤは、約１０−５Ｍ〜約１０−１３Ｍである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲが融合した抗体と抗体標的抗原との間の結合のＫＤは、約１０−５Ｍ〜約１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−８Ｍ、又は約１０−６Ｍ〜約１０−８Ｍである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲが融合した抗体と抗体標的抗原との間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１６Ｍである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲが融合した抗体と抗体標的抗原との間の結合のＫＤは、約１０−５Ｍ〜約１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１５Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−１３Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−１４Ｍ〜約１０−１６Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−１３Ｍ〜約１０−１５Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−１２Ｍ〜約１０−１４Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、又は約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲが融合した抗体と抗体標的抗原との間の結合のＥＣ５０は、約１ｎＭ〜約３０ｎＭである。
抗体プラットフォーム
【０１６９】
本発明のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質である抗体は、任意の可能な形態であり得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、抗体は、単一のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、２本以上（例えば、２本、３本、４本、又はそれ以上のうち任意の数）のポリペプチド鎖を含む。ポリペプチド鎖は、任意の長さ、例えば、少なくとも約１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００個、又はそれ以上のうち任意のアミノ酸長であってよい。多鎖抗体の場合、ポリペプチド鎖をコードする核酸配列は、同じプロモーター又は異なるプロモーターに操作可能に連結され得る。
【０１７１】
モノクローナル抗体などの天然抗体は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子である。いくつかの実施形態では、抗体はアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はアンタゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、軽鎖定常ドメインを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、及び、完全長抗体のその他の抗原結合部分配列、又は、これらの遺伝子操作済み組み合わせからなる群から選択される、抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は一価抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、二価抗体又は四価抗体などの多価抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。
【０１７２】
本発明の抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ａｎｇ２抗体、抗ＴＮＦα抗体、又は抗ＩＬ−１７Ａ抗体）は、重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖はＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、１つ以上の定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はこれらの任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、軽鎖はＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、ＣＬなどの定常ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖は、複数のジスルフィド結合を介して互いに連結される。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ、例えばＦｃフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃフラグメントを含まない。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂである抗原結合フラグメントである。
抗体の形態
【０１７３】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の抗体は、軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬドメインを含む軽鎖）を含む任意の抗体又は抗体フラグメント形態、例えば、完全長抗体、ＩｇＧ−ＩｇＧ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイレクト−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、細胞内抗体、及び、完全長抗体のその他の抗原結合部分配列、又は、これらの遺伝子操作済み組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、軽鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖を含む抗体フラグメントは、ＶＬ−Ｌ−ＣＬ（Ｌは任意のリンカーである）を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖を含む抗体フラグメントは、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ２−ＣＬ（Ｌ１及びＬ２は任意のリンカーである）を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖を含む抗体フラグメントは、ＶＬ１−Ｌ１−ＣＬ−Ｌ２−ＶＬ２−Ｌ３−ＶＨ２、又はＶＬ１−Ｌ１−ＣＬ−Ｌ２−ＶＨ２−Ｌ３−ＶＬ２（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は任意のリンカーである）を含む。特定の抗体フラグメントについての総説は、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント（サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が向上している）についての考察は、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。多重特異性抗体についての総説は、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０（１）：１−１８，２０１３；Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９，２０１５；Ｓｔａｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１（２）：１７２−１９８，２０１２を参照されたい。抗体フラグメントは、本明細書に記載されるように、完全な抗体のタンパク質分解消化、並びに、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生が挙げられるが、これらに限定されない、様々な手法によって作製することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は免疫グロブリン誘導体などの完全長抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域を有する）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（二重特異性など）である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原又はエピトープに対する結合特異性を有する（例えば、二重特異性抗体は、２つの抗原又はエピトープに対する結合特異性を有する）。
多価及び／又は多重特異性抗体
【０１７５】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の抗体は、当該技術分野において既知の任意の形態であり得る（例えば、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０（１）：１−１８，２０１３；Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９，２０１５；Ｓｔａｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１（２）：１７２−１９８，２０１２；Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５  Ｏｃｔ；６７（２  Ｐｔ  Ａ）：９５−１０６参照）。抗体は、Ｆｃ領域を含む「ＩｇＧ由来分子」の種類の形態であってもよい。例えば、抗体は、ＩｇＧ−ＩｇＧ、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ、Ｃｏｍｍｏｎ  ＬＣ（軽鎖）、ＤＡＦ（進化した二重特異性を有するＦｖｓを含む、二重作用性Ｆａｂ）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤｕｔａＭａｂ（商標）、Ｔｒｉｏｍａｂ（登録商標）、ＬＵＺ−Ｙ、Ｆｃａｂ、カッパ−ラムダボディ、Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｆａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ（二重標的化ＩｇＧ）、ＩｇＧ−ｄｓｓｃＦｖ２（ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ２）、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ＤＶＤ（二重可変ドメイン）、ＩｇＧ−ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｆｖ）、加工ＩｇＧ−ｄｓＦｖ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、ｃｈａｒｇｅ  ｐａｉｒ、Ｆａｂ−アーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ（鎖交換操作したドメイン）、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ（一本鎖Ｆａｂ）、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ（商標）、又はＤＶＩ−ＩｇＧが挙げられるが、これらに限定されない、形態であってよい。Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術は、例えば、ｃｏｍｍｏｎ  ＬＣ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＩｇＧ−ｄｓＦｖ、又はＩｇＧ−ｓｃＦａｂにおいて異なるＨ鎖のヘテロ二量化に使用することができる。抗体はまた、通常は、リンカーを介して共に融合された異なる特異性の個々のＦａｂを含む、「未Ｆｃ二重特異性」の種類の形態であってもよい。例えば、抗体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＤＮＬ−Ｆ（ａｂ）３（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ三価Ｆａｂ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（例えばＢｉＴＥ（登録商標））、ダイアボディ、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化分子）、ＴａｎｄＡｂ（四価タンデム抗体）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ダイアボディ−ＣＨ３、Ｆａｂ−ｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない、形態であってよい。二価又は三価のＦａｂ−ｓｃＦｖ又はＦａｂ−ｓｃＦｖ２形態は、ＶＨ−ＣＨ１及び／又はＬ鎖のｓｃＦｖｓへの融合によって生成される。本開示に従って使用される抗体は、前述の抗体形態のいずれかの化学修飾誘導体であってもよく、又はリガンド、ペプチド、若しくはこれらの組み合わせを含んでもよい。本開示に従って使用される抗体は、当該技術分野において既知の従来技術を使用して、例えば、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、及び／又は組み換え、及び／又は当該技術分野において既知の任意の他の修飾（例えば、グリコシル化及びリン酸化などの、翻訳後かつ化学的修飾）を単独で又は組み合わせて使用することによって、更に修飾することができる。このような修飾のための化学的／生化学的又は分子生物学的方法は、当該技術分野において既知であり、特に、実験室マニュアルに記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８９  ａｎｄ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ；ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７；Ｇｏｌｅｍｉｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２参照）。
【０１７６】
多重特異性抗体を作製するための手法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））、国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）参照）、及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号）が挙げられるが、これらに限定されない。また、多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電的ステアリング効果の操作（国際公開第２００９／０８９００４（Ａ１）号）、２つ以上の抗体又はフラグメントの架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）、二重特異性抗体産生のためのロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）参照）、及び、例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるような三重特異性抗体の調製によっても作製できる。「オクトパス抗体」などの、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する遺伝子操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６（Ａ１）号参照）。
リンカー
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲコンポーネントと抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）との間にリンカーを含んでもよい。ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質に使用されるリンカーの長さ、可撓性の程度、及び／又は他の特性は、１つ以上の特定の抗原又はエピトープ並びにＶＥＧＦＲコンポーネントに対する親和性、特異性、又は結合活性を含むがこれらに限定されない、特性に対する何らかの影響を有し得る。例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを保証するために、より長いリンカーを選択してよい。いくつかの実施形態では、リンカー（ペプチドリンカーなど）は、隣接するドメインが互いに対して自由に移動するように、可撓性残基（グリシン及びセリンなど）を含む。例えば、グリシン−セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。
【０１７８】
他のリンカーの考慮事項としては、溶解性、親油性、親水性、疎水性、安定性（より高い又はより低い安定性、及び計画された分解）、剛性、可撓性、免疫原性、抗体の結合の調節、ミセル又はリポソームに組み込まれる能力などの、得られる化合物の物性又は薬物動態特性に対する影響が挙げられる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、２つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含み、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端は、第１のリンカーによって連結され、第２のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）は、第２のリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のリンカーは同じである。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のリンカーは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、２つのＶＥＧＦＲコンポーネントを含み、１つのＶＥＧＦＲコンポーネントと１つの抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）のみがリンカーによって連結される。
非ペプチドリンカー
【０１８０】
抗体及びＶＥＧＦＲコンポーネントがそれぞれの活性を保持する、すなわち特定の抗原及びＶＥＧＦに結合する限り、ＶＥＧＦＲコンポーネントと抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）の結合は、２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成され得る。この結合は、多くの化学的機構、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、及び錯化を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合又は外部架橋分子の組み込みのいずれかによって達成することができる。多くの二価又は多価の連結剤は、本発明の抗体にＶＥＧＦＲコンポーネントなどのタンパク質分子をカップリングさせるのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤としては、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、及びヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を挙げることができる。このリストは、当該技術分野において既知の様々な種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例示である（Ｋｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５−２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６２：１８５−２１６（１９８２）；及びＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）参照）。
【０１８１】
本出願に適用できるリンカーは、文献に説明されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について説明しているＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４）参照）。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される非ペプチドリンカーとして、（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−プリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ＃２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピアナアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ＃２１６５−Ｇ）；及び、（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートしたスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ＃２４５１０）が挙げられる。
【０１８２】
上記のリンカーは、異なる属性を有する構成要素を含有しているので、異なる物理化学的特性を有するＶＥＧＦＲ−抗体融合タンパク質が得られる。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ−エステル含有リンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも可溶性が低い。更に、リンカーＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を含有し、安定性の増大した抗体融合タンパク質を形成することができる。ジスルフィド結合は、一般に、ジスルフィド結合がｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されて、利用可能な抗体融合タンパク質が少なくなるので、他の結合よりも安定性が低い。スルホ−ＮＨＳは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強することができる。スルホ−ＮＨＳと併用した場合、カルボジイミドカップリング（ＥＤＣなど）によって、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対する耐性が高いエステルが形成される。
ペプチドリンカー
【０１８３】
ペプチドリンカーは、天然配列又は非天然配列を有してよい。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域由来の配列をリンカーとして使用してよい。例えば、国際公開第１９９６／３４１０３号を参照されたい。
【０１８４】
ペプチドリンカーは任意の好適な長さであってよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、又はそれ以上のうちいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、又はそれ未満のアミノ酸長のいずれか以下である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸長、約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、又は約１個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸のうちいずれかである。
【０１８５】
このようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、上記ペプチドリンカーが重合活性を全く含まないことである。二次構造の促進がないペプチドリンカーの特性は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３），Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。「ペプチドリンカー」に関連して特に好ましいアミノ酸は、Ｇｌｙである。更に、二次構造をなにも促進しないペプチドリンカーが好ましい。ドメインの相互結合は、例えば、遺伝子操作によって提供され得る。融合及び動作可能に連結された二重特異性一本鎖構築物を調製し、それを哺乳類細胞又は細菌で発現させる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、国際公開第９９／５４４４０号、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．１９８９  ａｎｄ  １９９４、又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）。
【０１８６】
ペプチドリンカーは安定なリンカーであってよく、これはプロテアーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって切断可能ではない。
【０１８７】
またリンカーは、可撓性リンカーであってもよい。例示的な可撓性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号１）、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）（式中、ｎは少なくとも１の整数である）を含む）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野において既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、構成要素間の中性テザー（tether）として機能することができる。グリシンは、アラニンよりも著しく多くのｐｈｉ−ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限されない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１  １７３−１４２（１９９２）を参照）。当業者であれば、所望の抗体融合タンパク質構造を提供するために、リンカーが、可撓性リンカー部分に加えてより可撓性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含むことができるように、抗体融合タンパク質の設計が、全て又は部分的に可撓性であるリンカーを含んでいてもよいことを認識するであろう。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、十分な長さを有するリンカーによって一緒に連結され、ＶＥＧＦ、並びに抗体によって特異的に認識される抗原への結合を可能にするように、ＶＥＧＦＲコンポーネント−軽鎖の折り畳みを可能にする。この実施形態に加えて、このようなリンカーは、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎなどのアミノ酸配列を含んでよく、式中、ｎは１〜８の整数であり、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６、以下、「（Ｇ４Ｓ）３」又は「ＧＳ３」と称される）、又は（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号７、以下、「（Ｇ４Ｓ）６」又は「ＧＳ６」と称される）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳ）ｎ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含み、式中、ｎは１〜３の整数である。
免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ−４完全長抗体）と、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体は、本明細書において「免疫チェックポイント調節因子」と互換的に呼ばれる。
【０１９０】
免疫チェックポイントは、シグナルを増強（刺激性分子）するかシグナルを低下（阻害性分子）するかのいずれかである、免疫系の分子である。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容と、生理学的免疫応答の持続時間及び振幅を調節し、維持する。刺激性チェックポイント分子としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属するＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ及びＣＤ１３７、並びにＢ７−ＣＤ２８スーパーファミリーに属するＣＤ２８及びＩＣＯＳが挙げられるが、これらに限定されない。阻害性チェックポイント分子としては、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３、ＨＡＶＣＲ２）、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ５）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７−Ｈ７）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）及びこれらのリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＴＬＡ−４とそのリガンドのＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６、並びにＰＤ−１（ＣＤ２７９）とそのリガンドのＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）などの多数のチェックポイントタンパク質が、広くに研究されてきた（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４（２０１２）参照）。
【０１９１】
本発明の免疫チェックポイント分子特異的に認識する抗体、つまり「免疫チェックポイント調節因子」は、免疫チェックポイント阻害剤（阻害性免疫チェックポイント分子の阻害剤）又は刺激性免疫チェックポイント分子の活性化剤であり得る。ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３（ＨＡＶＣＲ２）、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７−Ｈ５）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７−Ｈ７）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ７３、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＲ、又はＩＤＯの阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤（阻害性免疫チェックポイント分子の阻害剤）が、本発明において特に興味深い。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体は、アゴニスト抗体、例えば、抗ＣＤ２８、抗ＯＸ４０、抗ＩＣＯＳ、抗ＧＩＴＲ、抗４−１ＢＢ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ３、及び抗ＨＶＥＭなどの刺激性免疫チェックポイント分子の活性化剤である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞を標的とする。例えば、場合によっては、腫瘍細胞は、特定のＴ細胞受容体に付着すると、活性化Ｔ細胞の働きを無効にする場合がある。しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞がＴ細胞に付着することを防止し、Ｔ細胞の活性化を保つことができる（例えば、Ｈｏｗａｒｄ  Ｗｅｓｔ，ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌ．１（１）：１１５（２０１５）参照）。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、抗−ＬＡＧ−３、抗ＫＩＲ、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＤ７３、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＣＤ４７、抗ＢＴＬＡ、抗ＶＩＳＴＡ、抗Ａ２ＡＲ、抗Ｂ７−１、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＣＤ５２、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−３５、及び抗ＴＧＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない、阻害性免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体（アンタゴニスト抗体など）である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＨＨＬＡ２、ＣＤ１６０、ＣＤ７３、ＢＬＴＡ、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、及びＶＩＳＴＡからなる群から選択される、阻害性チェックポイント分子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、少なくとも２つの異なる阻害性免疫チェックポイント分子を特異的に認識する抗体（例えば、二重特異性抗体）である。
ＣＴＬＡ−４
【０１９４】
細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、又はＣＤ１５２）は、ＣＤ２８のホモログであり、活性化Ｔ細胞上で上方制御される阻害性免疫チェックポイント分子として知られている。ＣＴＬＡ−４はまた、Ｂ７−１及びＢ７−２にも結合するが、ＣＤ２８よりも高い親和性を有する。Ｂ７とＣＴＬＡ−４との間の相互作用はＴ細胞の活性化を弱め、腫瘍免疫逃避の重要な機構を構成している。抗ＣＴＬＡ−４抗体療法（イピリムマブ、例えば、ヤーボイ（登録商標）など）は、黒色腫などの多くの癌において効果を発揮している。
【０１９５】
本出願に適用され得る例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））、及びＴｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（旧称、ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ、ＣＰ−６７５，２０６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））は、Ｔ細胞活性化の下方制御を阻止する、完全ヒト抗ＣＴＬＡ−４免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４経路によって誘導されるＴ細胞阻害性シグナルを阻止するＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント阻害剤であり、腫瘍反応性Ｔエフェクター細胞の数を増加させる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＣＴＬＡ−４抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかと競合してＣＴＬＡ−４に結合する。
ＰＤ−１
【０１９８】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化及び寛容性を調節する共刺激分子のＢ７／ＣＤ２８群の一部であり、したがって、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体は、寛容性を克服するのに有用であり得る。ＰＤ−１は、Ｂ７−４に対する受容体として定義されている。Ｂ７−４は、免疫細胞上の抑制性受容体に結合すると、免疫細胞活性化を阻害することができる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の会合は、Ｔ細胞エフェクター機能、サイトカイン分泌及び増殖の阻害をもたらす。（Ｔｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（７）：１１７２−１１７４，２０１２）。高レベルのＰＤ−１は、消耗した又は慢性的に刺激されたＴ細胞と関連する。更に、増大したＰＤ−１発現は、癌患者の減少した生存期間と互いに関係がある。ＰＤ−１、Ｂ７−４、及び免疫細胞内でのＢ７−４とＰＤ−１抑制シグナルとの間の相互作用を下方制御するための薬剤は、免疫応答の強化をもたらし得る。本出願に適用され得る例示的な抗ＰＤ−１抗体としては、キイトルーダ（登録商標）（ペンブロリズマブ、ＭＫ−３４７５）及びオプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
ペンブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））は、癌免疫療法で使用されるヒト化抗体である。これは、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体を標的とする。この薬物は、転移性黒色腫の治療において最初に使用された。２０１４年９月４日、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＦＤＡのファストトラック開発プログラム下でキイトルーダ（登録商標）を承認した。進行性黒色腫における使用が承認されている。２０１５年１０月２日に、米国ＦＤＡは、キイトルーダ（登録商標）を、その腫瘍がＰＤ−Ｌ１を発現しており、別の化学療法剤による治療に失敗した患者における転移性非小細胞肺癌の治療に対して承認した。
【０２００】
ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））は、ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体である。イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））と組み合わせて使用し、非ヒト霊長類におけるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４受容体の同時阻害の効果が調べられた。オプジーボ（登録商標）は、腎細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、及び一部のリンパ腫などのいくつかの腫瘍型の治療において、単剤療法として、又はイピリムマブとの組み合わせのいずれかにおいて、臨床効果が確認されている。最近、ＢＭＳは、黒色腫治療に対するオプジーボ（登録商標）とイピリムマブの免疫併用療法の治療結果について発表した。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＰＤ−１抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載される抗ＰＤ−１抗体のいずれかと競合してＰＤ−１に特異的に結合する。
ＰＤ−Ｌ１
【０２０２】
ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死−リガンド１）はまた、クラスタ分類２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）のとしても知られる。ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、組織同種移植（tissue allographs）、自己免疫疾患、並びに肝炎及び癌などの他の疾患状態といった特定の事象中での免疫系の抑制において主要な役割を果たすために、ＰＤ−１に対するリガンドとして機能する。ＰＤ−１受容体／ＰＤ−Ｌ１リガンド複合体の形成は、リンパ節でのＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を減少させる抑制シグナルを伝達する。本出願に適用され得る例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））及びデュルバルマブ（例えば、ＭＥＤＩ４７３６、イミフィンジ（商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））は、ＰＤ−Ｌ１に対するＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト化遺伝子操作モノクローナル抗体である。これは、プラチナ製剤による化学療法後の進行性切除不能尿路上皮癌（例えば膀胱癌）と、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に対し、ＦＤＡに承認されている免疫療法である。
【０２０４】
デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（商標））は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１及びＣＤ８０（Ｂ７．１）分子との相互作用を遮断する、ヒト免疫グロブリンＧ１κ（ＩｇＧ１κ）モノクローナル抗体である。局所進行性又は転移性の尿路上皮癌に対し、ＦＤＡに承認されている免疫療法である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかと競合してＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。
腫瘍抗原を特異的に認識する抗体
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、腫瘍抗原を特異的に認識する抗体（例えば、抗ＨＥＲ２又は抗ＥＧＦＲ完全長抗体）と、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、抗体によって特異的に認識される抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）である。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、癌細胞上に発現している。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、血液癌細胞上に発現している。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、固形腫瘍の細胞上に発現している。固形腫瘍癌の特定の形態としては、非限定例として、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、非小細胞肺癌以外の肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、肝癌、結腸直腸癌、胃癌、脾臓の癌、皮膚癌（黒色腫など）、神経膠芽腫以外の脳癌、腎臓癌、甲状腺癌、頭頸部腫瘍、膀胱癌、食道癌などが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸レセプターａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、λ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＦＲ２、癌胎児抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦレセプター、及びその他、腫瘍の細胞外マトリックス、例えばフィブロネクチン、テネイシンの癌胎児変異体、又は腫瘍の壊死性領域内に存在する代表的な抗原のうち、１つ以上である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、抗体によって特異的に認識される腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、又はＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である。
ＨＥＲ２
【０２０９】
受容体型チロシンキナーゼであるＨＥＲファミリーは、細胞成長、分化、及び生存の重要なメディエータである。受容体ファミリーは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む、４つの別個のメンバーを含む。
【０２１０】
ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２、受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、ｐ１８５ｎｅｕ）は、ヒトにおける癌原遺伝子ＥＲＢＢ２によりコードされるタンパク質である。これは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び多くのシグナル伝達分子と相互作用し、リガンド依存性及びリガンド非依存性活性の両方を示すことができる細胞内ドメインを含有する。ＨＥＲ２は、他の３つの受容体、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４のいずれかとヘテロ二量体を形成でき、他のＥｒｂＢ受容体の好ましい二量体化パートナーであると考えられる。二量体化は、受容体の細胞質ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化をもたらし、細胞増殖を促進し、アポトーシスに対向する、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、及びホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）経路などの、様々なシグナル伝達経路を開始する。
【０２１１】
ｐ１８５ｎｅｕは、元々、化学的に処理されたラットの神経芽腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。ｎｅｕ癌原遺伝子の活性化形態は、コード化タンパク質の膜貫通領域における点変異（バリンからグルタミン酸）によって生じ、リガンドの非存在下でのこのタンパク質の構成的二量体化をもたらす。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳癌及び卵巣癌においてみられ、予後不良と相関する（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７−１８２（１９８７）；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７−７１２（１９８９）；及び米国特許第４，９６８，６０３号）。今日まで、ｎｅｕ癌原遺伝子に類似した点変異は、ヒト腫瘍において報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（頻繁であるが、遺伝子増幅により均一ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、及び膀胱の癌などの他の癌においても観察されている。特に、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）；Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５−７６７（１９８６）；Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：９５５−９５８（１９８６）；Ｇｕｅｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，３：２１−３１（１９８８）；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：８１−８８（１９８９）；Ｙｏｎｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１０３４（１９９１）；Ｂｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，３８：３６４（１９９０）；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：４２１−４２５（１９９０）；Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：５１８４（１９９０）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：６６０５（１９８９）；Ｚｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３：２５４−２５７（１９９０）；Ａａｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８−３６３（１９８８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６−５２（１９９１）；及び、ＭｃＣａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８−９２（１９９０）を参照されたい。ＨＥＲ２は、前立腺癌で過剰発現されている場合もある（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９９：１８５−９（１９９６）；Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７−３３（１９９７）；Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９：２１６２−７０（１９９７）；及びＳａｄａｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１２６−３１（１９９３））。
【０２１２】
本出願に適用され得る例示的なＨＥＲ２抗体としては、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標））、Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標））、及びペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
最も良く売れている５大治療用抗体の１つであるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の生存率を有意に増加させている、ヒト化抗ＨＥＲ２受容体モノクローナル抗体である。ＨＥＲ受容体は、細胞膜に埋め込まれており、細胞外由来の分子シグナル（ＥＧＦと称される分子）を細胞内に伝え、遺伝子のオンオフを行うタンパク質である。ＨＥＲタンパク質、つまりヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ヒト上皮成長因子に結合し、細胞増殖を刺激する。一部の癌、特にある種の乳癌では、ＨＥＲ２が過剰発現しており、癌細胞の無制限な複製の原因となる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＨＥＲ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＨＥＲ２抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、本明細書に記載される抗ＨＥＲ２抗体のいずれかと競合してＨＥＲ２に特異的に結合する。
ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）
【０２１５】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、又はＥｒｂＢ−１）は、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーの膜貫通受容体である。ＥＧＦＲは、受容体である、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）からなるＥｒｂＢのメンバーであり、細胞成長、分化、及び生存を媒介する受容体型チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲ発現又は活性に影響を及ぼす突然変異は、癌をもたらし得る。ＥＧＦＲは、その特異的リガンド、例えばＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）の結合によって活性化され得る。活性化の際、ＥＧＦＲの二量体化は、その内因性細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激し、ＥＧＦＲのＣ末端ドメインにおける自己リン酸化は、一連のシグナル伝達カスケード、主にＭＡＰＫ、Ａｋｔ、及びＪＮＫ経路につながり、ＤＮＡを合成し、細胞を増殖させる。
【０２１６】
本出願に適用され得る例示的な抗ＥＧＦＲ抗体としては、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））、及びパニツムマブ（例えば、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ベクティビックス（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））は、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的に結合する、組み換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。セツキシマブは、ヒトＩｇＧ１重鎖及びκ軽鎖定常領域を有するマウス抗ＥＧＦＲ抗体のＦｖ領域から構成される。アービタックス（登録商標）は、放射線療法と併用する、頭頸部の局所進行性扁平上皮細胞癌の初期治療に適応とされる。アービタックス（登録商標）はまた、Ｋ−Ｒａｓ野生型ＥＧＦＲ発現型転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）の治療についても適応とされる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＥＧＦＲを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＥＧＦＲ抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかと競合してＥＧＦＲに特異的に結合する。
血管新生因子を特異的に認識する抗体
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、血管新生因子を特異的に認識する抗体（例えば、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子を特異的に認識する抗体は、血管新生因子の機能を阻害又は拮抗し、本明細書では互換的に「血管新生阻害剤」と呼ぶ。
【０２２０】
先に述べたように、血管新生は、既存の脈管構造から新しい血管を成長させるプロセスである。これは、胚発生、並びに組織及び創傷修復などのいくつかの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７；２３５：４４２−７）。血管新生の生理学的工程の特徴はよく理解されており、細胞外マトリックスのタンパク質分解、増殖、遊走、並びに、内皮細胞の管状チャネルへのアセンブリ、壁細胞動員及び分化、並びに、細胞外マトリックス産生に関与する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７３：２９８−３０７）。病的血管新生は、腫瘍形成、眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫又は黄斑変性症）、関節炎、乾癬、線維性疾患、炎症性疾患、及び動脈硬化症で生じ得る（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９９５；６（３）：２３０−４７）。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明の血管新生因子は、アンジオポエチン（ＡＮＧ、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３）、エフリン（Ｅｐｈ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ニューロピリン（ＮＲＰ）、プラスミノーゲン活性化因子（例えばｕＰＡ、ｔＰＡ）、アンジオゲニン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−α、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、Ｄｅｌ−１、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２０（ＩＬ−２０）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）、走化性因子、例えば、Ｃ−Ｃモチーフリガンド（ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、免疫細胞表面タンパク質、例えば、表面抗原分類（ＣＤ）、及びこれらの受容体を含む。これらの因子は過剰発現され、血管新生関連疾患において重要な役割を果たすことが報告されている（Ｅｌｓｈａｂｒａｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（２０１５）１８：４３３−４４８；Ｂｒｉａｎ  Ｐ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００１  Ｄｅｃ  ７；８９（１２）：１１０４−１０）。
【０２２２】
血管新生は、様々な成長因子及びシグナル伝達受容体が関与する複雑な生物学的プロセスであり、シグナル伝達カスケードにおける単一分子の標的化は、癌などの疾患における非制御状態の血管新生には有効な臨床治療を提供しない場合がある。したがって、本出願に提供されるように、疾患の血管新生及び進行を効果的に阻害するため、いくつかの主要な血管新生因子に協力して結合可能な革新的治療薬を開発する必要性が高まりつつある。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、血管新生因子を特異的に認識する抗体、つまり血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦリガンドに結合する抗ＶＥＧＦ抗体であってもよい（例えば、米国特許第５，７３０，９７７号、同第６，８８４，８７９号、及び同第８，９７５，３８１号参照）。いくつかの実施形態では、血管新生阻害剤は、抗Ａｎｇ２抗体であってもよい（例えば、米国特許第６，１６６，１８５号、同第７，５２１０，５３号、及び同第７，９７３，１４０号参照）。
アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）
【０２２４】
アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）は、血管内皮細胞に存在する受容体Ｔｉｅ２の拮抗的リガンドである。Ｔｉｅ２のアゴニストであるアンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）と競合することによって、Ｔｉｅ２によるシグナル伝達を抑制し、Ｔｉｅ２に結合すると考えられる。Ｔｉｅ２受容体を活性化するリガンドであるＡｎｇ１は、血管内皮細胞のバリア機能を維持することによって血管の安定化を維持する重要な調節因子として機能する。ＶＥＧＦ又は炎症の過剰発現によって示される、血管内皮細胞が活性化すると、血管透過性が増加する。Ａｎｇ１は、血管内皮細胞の安定化を誘発し、血管内皮細胞の結合部の完全性を促進することによって血管透過性を低下させるが、活性化した血管内皮細胞内で増加するＡｎｇ２は、Ａｎｇ１と競合することによって、Ａｎｇ１による血管内皮細胞の安定化を抑制する役割を果たすと考えられる。したがって、血管内皮細胞の安定性とそれによるシグナル伝達を維持し、それによって血管の動的再構成を介して最終的に血管新生を促進するＡｎｇ１−Ｔｉｅ２結合を、Ａｎｇ２は阻害する。
【０２２５】
健康な成人において、血管新生の３つの主要部位は、卵巣、胎盤、及び子宮であり、これらは、Ａｎｇ２のｍＲＮＡが検出された正常な（すなわち、非癌性）組織における主要な組織である。多くの発表された研究により、血管新生に関連する病態における血管選択的Ａｎｇ２の発現が意図的に示されている。これらの病的状態としては、例えば、乾癬、黄斑変性症、及び癌が挙げられる（Ｂｕｎｏｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６（１９９９）；Ｅｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５−２１５３（２００１）；Ｈａｎｇａｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５（２００１）；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５（１９９９）；Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０（２００１）；Ｏｔａｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０（１９９９）；Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６（１９９８）；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３：３４−３４５（１９９９）；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５（１９９９）；Ｙｕａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１（２０００）；Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００（１９９９））。これらの研究の大部分は、多くの腫瘍タイプが血管のＡｎｇ−２発現を示していると思われる、癌に焦点を当てている。病的血管新生における発現とは対照的に、正常組織におけるＡｎｇ−２発現は極めて限定されている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５−６０（１９９７）；Ｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６０：４９２−４９８（１９９９））。様々な公表は、抗癌療法の考え得る標的として、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、及び／又はＴｉｅ−２を示唆している。
【０２２６】
本出願に適用され得る例示的な抗Ａｎｇ２抗体としては、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ及びＶａｎｕｃｉｚｕｍａｂ（ＲＧ７２２１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ（例えば、ＲＥＧＮ９１０）は、Ａｎｇ２を標的とする、当初は癌治療のために設計された研究用モノクローナル抗体である。２０１７年５月時点で、糖尿病性黄斑浮腫の治療に対する第ＩＩ相臨床試験中である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、Ａｎｇ２を特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗Ａｎｇ２抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗Ａｎｇ２抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗Ａｎｇ２抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗Ａｎｇ２抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗Ａｎｇ２抗体は、本明細書に記載される抗Ａｎｇ２抗体のいずれかと競合してＡｎｇ２に特異的に結合する。
ＴＮＦα
【０２２９】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、ＴＮＦα、ｃａｃｈｅｘｉｎ、又はカケクチン）は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を起こすサイトカインのうちの１つである。これは、主に活性化マクロファージによって、また、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞、好酸球、及びニューロンなどの他の細胞型によっても産生される。ＴＮＦαは、主に免疫細胞の調節に関与する。これは、発熱、アポトーシス細胞死、悪液質、炎症を誘発し、腫瘍形成及びウイルス複製を阻害し、ＩＬ１及びＩＬ６産生細胞を介する敗血症に応答することができる。ＴＮＦ−αは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を促進することができる。角膜において、ＴＮＦαは、血管成長を刺激しているように思われる。
【０２３０】
本出願に適用され得る例示的な抗ＴＮＦα抗体としては、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））、インフリキシマブ（例えば、レミケード（登録商標）、Ｒｅｍｓｉｍａ（登録商標）、Ｉｎｆｌｅｃｔｒａ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（例えば、シムジア（登録商標））、ゴリムマブ（例えば、ＣＮＴＯ１４８、シンポニー（登録商標））、及びエタネルセプト（例えば、エンブレル（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３１】
アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎、プラーク乾癬（Ｐｓ）、化膿性汗腺炎、及び若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）の治療に使用される、ＴＮＦαに特異的な組み換えＤＮＡ由来ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＴＮＦαを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＴＮＦα抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、アダリムマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、本明細書に記載される抗ＴＮＦα抗体のいずれかと競合してＴＮＦαに特異的に結合する。
ＩＬ−１７Ａ
【０２３３】
インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７、ＣＴＬＡ８）は、活性化Ｔ細胞によって産生される炎症促進性サイトカインであり、ＮＦ−κＢ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性を調節する。高レベルのＩＬ−１７Ａは、関節リウマチ、乾癬、及び多発性硬化症を含むいくつかの慢性炎症性疾患に関連する。ＩＬ−１７Ａ産生とぜんそくの重症度との間の正の相関関係も見いだされている。ＩＬ−１７Ａは、ＩＬ−６の誘導によってｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を促進でき、これにより発癌性転写因子であるＳＴＡＴ３を活性化し、腫瘍の生存及び血管新生を促進する。例えば、ＩＬ−１７Ａは、癌細胞からのＶＥＧＦ産生を促進することによって血管新生を促し、それにより、結腸直腸癌の発生を促進すると考えられる。
【０２３４】
本出願に適用され得る例示的な抗ＩＬ−１７Ａ抗体としては、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））、及びセクキヌマブ（例えば、コセンティクス（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））は、ＩＬ−１７Ａを遮断し炎症を減少させるヒト化モノクローナル抗体である。中程度から重度の尋常性乾癬の治療について承認されている。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、ＩＬ−１７Ａを特異的に認識する抗体（完全長抗体など）を含む（以下、抗ＩＬ−１７Ａ抗体と称する）。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１７Ａ抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１７Ａ抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１７Ａ抗体は、イキセキズマブ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１７Ａ抗体は、本明細書に記載される抗ＩＬ−１７Ａ抗体のいずれかと競合してＩＬ−１７Ａに特異的に結合する。
抗体変異体
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が想到される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善するのに望ましい場合がある。抗体をコードしている核酸配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は当該残基への挿入及び／又は当該残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を有する限り、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを施して最終構築物に到達させることができる。
ａ）置換、挿入、欠失、及び変異体
【０２３８】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象となる部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換を、「好ましい置換」という見出しで以下の表１に示す。「代表的な置換」の見出しで、かつアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載されるように、より大きな変化が提供される。対象となる抗体にアミノ酸置換を導入し、生成物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングしてよい。「Ｖ．調製方法」の「１．アミノ酸配列変異体」も参照されたい。
【表１−２】
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【０２３９】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って、（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン；（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（４）塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；（５）鎖の配向に影響を与える残基：グリシン、プロリン；（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、に分類できる。
【０２４０】
非保存的置換は、これらの分類のうち１つのメンバーを別の分類に交換することを伴う。
【０２４１】
置換変異体の１つの種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般的に、更なる研究のために選択された結果得られる変異体は、親抗体に対して、特定の生物学的特性の変化（例えば、向上）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は、親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイをベースにした親和性成熟法を使用して簡便に生成することができる。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージにディスプレイさせ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２４２】
例えば、抗体の親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて改変（例えば、置換）を行ってよい。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされている残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）参照）及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行ってよく、得られる変異体ＶＨ又はＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリを構築及び再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、誤りがちなＰＣＲ、チェインシャフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって成熟のために選択されたバリアブル遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリを作製する。次いで、ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化する、ＨＶＲを対象とするアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを用いて特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は、特に標的化されることが多い。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、このような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内に存在していてよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない同類変更（例えば、本明細書で提供される同類置換）を、ＨＶＲにおいて行ってよい。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＣＤＲの外側であってもよい。
【０２４４】
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基又は領域を同定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されているとおり、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基の群（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、及びグルタミン酸などの荷電残基）を同定し、中性又は負荷電アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置換して、抗体と抗原との相互作用に影響を及ぼすかどうかを判定する。初期置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、更なる置換を導入してもよい。あるいは又は更に、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基を、置換の候補として標的化してもよく、排除してもよい。変異型をスクリーニングして、所望の特性を有するかどうかを判定することができる。
【０２４５】
アミノ酸配列挿入として、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまで長さに幅がある、アミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに、単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入変異体として、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えば、ＡＤＥＰＴ向け）又は、抗体の血清半減期を延長するポリペプチドが挙げられる。
ｂ）グリコシル化変異体
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質内の抗体を修飾して、抗体のグリコシル化の程度を増加又は減少させる。グリコシル化部位の抗体への付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が生成又は除去されるように、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成され得る。
【０２４７】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物を変更してもよい。哺乳類細胞によって生成されるネイティブ抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般的に結合されている分枝状二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾を行ってよい。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する、抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、又は２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定したとき、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ付番）に位置するアスパラギン残基を指す。しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体におけるわずかな配列多様性に起因して、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、２９４位と３００位との間に位置していてもよい。このようなフコシル化変異型は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）；同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「デフコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異型に関する刊行物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、同第２００４／０１１０７０４号、同第２００４／０１１０２８２号、同第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、同第２００３／０８４５７０号、同第２００５／０３５５８６号、同第２００５／０３５７７８号、同第２００５／０５３７４２号、同第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。デフコシル化抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８（Ａ１）号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）；及び国際公開第２００４／０５６３１２（Ａ１）号（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．特に実施例１１））、及びノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号参照）が挙げられる。
【０２４９】
抗体変異体には、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖が更に提供される。このような抗体変異体は、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、同第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び同第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質内の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入し、それによってＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本出願は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を保有しており、これによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）は不必要であるか又は有害である用途にとって望ましい候補となる、抗体変異体を想到する。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低減／枯渇を確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施してよい。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを保証するために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施してよい。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）参照）及び同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又は更に、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価してもよい。また、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認するためにＣ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）参照）。当該技術分野において既知の方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定を実施してもよい（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６））。
【０２５２】
エフェクター機能の低減した抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２５３】
ＦｃＲに対する結合が改善又は減少した特定の抗体変異型が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。）
【０２５４】
いくつかの実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵ付番）の置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域が変更され、その結果、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているとおり、Ｃ１ｑ結合及び／又はＣＤＣが変化する（すなわち、改善又は減少のいずれか）。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、抗体変異体は、半減期を増加させる及び／又はＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体Ｆｃ領域を含む。半減期が増加し、胎児への母体ＩｇＧの移動に関与するＦｃＲｎへの結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４（Ａ１）号（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４のうちの１つ以上に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが挙げられる。
【０２５７】
Ｆｃ領域変異体の他の例については、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，６２４，８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
【０２５８】
本明細書に記載されるＦｃ変異体のいずれか、又はこれらの組み合わせを含む、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（完全長抗体に融合されたＶＥＧＦＲコンポーネントなど）が想到される。
ｄ）システイン操作抗体変異体
【０２５９】
いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書で更に説明するように、抗体を薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分に複合体化させて、免疫複合体を作製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）の残基のうちの任意の１つ以上が、システインで置換されてもよい。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成され得る。
ＩＩＩ．医薬組成物
【０２６０】
本出願によって更に提供されるのは、本明細書に記載される抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントを含む抗体融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−１、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−抗ＣＴＬＡ−４、ＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ−抗ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−抗Ａｎｇ２、ＶＥＧＦＲ−抗ＴＮＦα、又はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−１７Ａ抗体軽鎖融合タンパク質）のうちいずれか１つと、任意に医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物である。医薬組成物は、所望の程度の純度を有する本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を、任意の医薬的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合し、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態にすることによって調製できる。
【０２６１】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が安定であり、保存時にその物理的及び化学的安定性、並びに完全性を本質的に保持していることが好ましい。当該技術分野において、タンパク質の安定性の測定には様々な分析法があり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）で論説されている。安定性は、選択された期間にわたって選択された温度で測定してよい。迅速スクリーニングのため、製剤を４０℃で２週間〜１ヶ月保管し、その期間での安定性を測定してもよい。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般に、３０℃又は４０℃で少なくとも１ヶ月間安定であり、及び／又は、２〜８℃で少なくとも２年間安定でなければならない。製剤が３０℃で保管される場合、一般に、３０℃で少なくとも２年間安定であり、及び／又は、４０℃で少なくとも６ヶ月間安定でなければならない。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の安定製剤は、製剤中に凝集体として存在するＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を約１０％未満（好ましくは約５％未満）含むことができる。
【０２６２】
許容されるキャリア、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度においてレシピエントに毒性がないものであり、緩衝剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）及び／又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２６３】
生理学的に許容されるキャリアの例として、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及びその他有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びその他炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩生成対イオン、例えばナトリウム金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は、非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０２６４】
緩衝剤は、特に安定性がｐＨ依存的である場合、治療有効性を最適化する範囲内のｐＨに制御するために使用される。緩衝剤は、好ましくは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本出願での使用に好適な緩衝剤として、有機酸及び無機酸の両方、並びにそれらの塩が挙げられる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。また、緩衝剤は、ヒスチジン及び、Ｔｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を含んでもよい。
【０２６５】
保存剤は、微生物の増殖を遅らせるために添加され、典型的には、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。保存剤の添加により、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にできる。本出願での使用に好適な保存剤として、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）；塩化ベンゼトニウム；チメロサール；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。
【０２６６】
「安定剤」として知られる場合がある等張化剤は、組成物中の液体の浸透圧を調整又は維持するために存在する。タンパク質及び抗体などの大型で帯電している生体分子と共に使用されると、これらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用でき、それによって分子間及び分子内相互作用の可能性を低下させるため、「安定剤」と呼ばれることが多い。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１％〜２５重量％、好ましくは１％〜５％の間の任意の量で存在してよい。好ましい等張化剤として、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
【０２６７】
追加の賦形剤として、（１）充填剤、（２）溶解性増強剤、（３）安定剤、及び（４）変性や容器壁への付着を防止する剤のうち、１つ又は２つ以上として作用できる剤が挙げられる。このような賦形剤として、多価糖アルコール（上記）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ、ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ、ガラクトース、ガラクチトール、グリセリン、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖又は糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；及びデキストリン又はデキストランなどの多糖類が挙げられる。
【０２６８】
非イオン性界面活性剤又は洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を助け、並びに、治療用タンパク質を撹拌による凝集に対して保護するために存在し、更には、活性治療用タンパク質、つまり抗体の変性を起こすことなく、製剤を表面せん断応力に曝露可能にもする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。
【０２６９】
好適な非イオン性界面活性剤として、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロクサマー（polyoxamers）（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用できるアニオン性洗剤として、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。陽イオン性洗剤として、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【０２７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物のためには、それらは無菌でなければならない。医薬組成物は、無菌濾過膜を通す濾過によって無菌化されてよい。本明細書の医薬組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈輸液バッグ又はバイアル内に入れられる。
【０２７１】
投与経路は、好適な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、動脈内若しくは関節内経路による注射若しくは注入、局所投与、吸入、又は、持続放出若しくは長期間放出手段において、長期間にわたる単回又は複数回のボーラス又は持続など、既知の許容される方法に従う。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内、硝子体内など、局所的に投与される。
【０２７２】
持続放出性製剤を調製してもよい。好適な持続放出性製剤の例として、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２７３】
また、本明細書の医薬組成物は、治療される特定の適応に対して必要な、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する２種類以上の活性化合物も含有してよい。あるいは、又は追加的に、組成物は、細胞傷害性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、又は成長阻害剤を含んでよい。このような分子は、意図する目的に有効な量の組み合わせで好適に存在する。
【０２７４】
また活性成分は、例えば、コアセルベーション法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションで閉じ込められてもよい。このような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０２７５】
本明細書に開示される抗体融合タンパク質は、イムノリポソームとして製剤化され得る。抗体融合タンパク質を含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；並びに、米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されている、当該技術分野において既知の方法によって調製される。改善された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２７６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを、既定の孔径のフィルターを通って押し出し、所望の直径のリポソームを得る。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物を、１回使用バイアル、例えば１回使用密封バイアルに入れる。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、複数回使用バイアルに入れる。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、容器中にバルクで入れる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結保存される。
眼内新生血管障害を治療するための医薬組成物
【０２７８】
特に、糖尿病性網膜症及びＡＭＤなどの眼内新生血管障害を治療するには、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−抗Ａｎｇ２、ＶＥＧＦＲ−抗ＴＮＦα、又はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−１７Ａ抗体軽鎖融合タンパク質）を含む医薬組成物は、例えば、局所的に眼に直接投与される。局所的投与方法としては、点眼、結膜下注入、結膜下移植、硝子体内注入、硝子体内移植、テノン嚢下注入、又はテノン嚢下移植が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質と、任意に医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物は、硝子体内注入によって投与される。
【０２７９】
局所投与に好適な組成物は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５９６３９号参照）。様々な実施形態では、本発明の組成物は、溶液、懸濁液、又はその両方に活性剤を含む液体を含むことができる。本明細書で使用するとき、液体組成物は、ゲルを含む。好ましくは、液体組成物は水性である。あるいは、組成物は軟膏の形態をとることができる。好ましい実施形態では、組成物は、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化可能な水性組成物であり、より好ましくは、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化可能な水溶液である。このような組成物は、目、つまり目の外部にある涙液との接触時にゲル化を促進するのに有効な濃度で、ゲル化剤を含むことができる。本発明の水性組成物は、眼科的に適合されるｐＨ及び浸透圧を有する。組成物は、結膜下投与用の活性剤を含む眼用デポー製剤を含むことができる。活性剤を含む微小粒子は、生体適合性の医薬的に許容されるポリマー又は脂質封入剤中に埋め込まれ得る。デポー製剤は、長期間にわたって全て又は実質的に全ての活性物質を放出するように適合されてもよい。存在する場合、ポリマー又は脂質マトリックスは、全て又は実質的に全ての活性剤の放出後に、十分に分解して投与部位から輸送されるのに適合され得る。デポー製剤は、医薬的に許容可能なポリマーと、溶解又は分散された活性剤と、を含む、液体製剤であり得る。注入時に、ポリマーは、例えばゲル化又は沈殿によって注入部位にデポーを形成する。組成物は、物品が活性剤を放出する眼内の好適な位置、例えば眼と眼瞼との間、若しくは結膜嚢内、眼房内、例えば前眼房若しくは後眼房に挿入できる、又は、強膜、脈絡膜腔、若しくは硝子体外部の非血管領域に埋め込みできる固形物品を含んでよい。このような方法で眼内に移植するのに好適な固形物品は、一般にポリマーを含み、生体内分解性又は非生体内分解性であってよい。インプラントは、活性剤に対して透過性又は不透過性であってもよい。いくつかの実施形態では、インプラントを、強膜上などの非血管領域に位置付け、所望の治療部位、例えば眼内腔及び黄斑への薬物の経強膜拡散を可能にしてよい。更に、経強膜拡散の部位は、黄斑の近位の部位など、血管新生の部位に近接していてもよい。
【０２８０】
持続放出を提供するための多数のポリマー送達ビヒクルが眼科において使用されており、本発明の組成物の投与に使用することができる。生分解性であり得る様々なポリマー、例えば生体適合性ポリマーを使用することができる。ポリマーは、ホモポリマー、コポリマー（ブロックコポリマーを含む）、直鎖、分岐鎖、又は架橋であってもよい。有用なポリマーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、エチレンビニルアセテート、ポリオルトエステル、ポリエーテル、及びポリ（βアミノエステル）が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、コラーゲン又はアルブミンなどのタンパク質、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸（又はこれらのいずれかの誘導体）などの多糖類、及びデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭデンドリマー）も使用される。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。特定の材料はまた、例えばＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手することもできる。本発明の様々な実施形態では、これらのポリマーのいずれか、又はこれらの組み合わせを使用してよい。
【０２８１】
更なる例示的なポリマーとしては、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリカルバメート、又はポリ尿素、架橋ポリ（ビニルアセテート）など、エステル含有量が４〜８０％のエチレン−ビニルエステルコポリマー、例えば、エチレン−ビニルアセテート（ＥＶＡ）コポリマー、エチレン−ビニルヘキサノエートコポリマー、エチレン−ビニルプロピオネートコポリマー、エチレン−ビニルブチレートコポリマー、エチレン−ビニルペンタノートコポリマー、エチレン−ビニルトリメチルアセテートコポリマー、エチレン−ビニルジエチルアセテートコポリマー、エチレン−ビニル３−メチルブタノエートコポリマー、エチレン−ビニル３−３−ジメチルブタノエートコポリマー、及びエチレン−ベンゾエートコポリマー、又はこれらの混合物が挙げられる。
【０２８２】
ポリ（オルトエステル）は眼内で使用されており、眼内持続放出薬物送達において好ましい特性を示している（Ｅｉｎｍａｈｌ，Ｓ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４３（５），２００２）。粒子懸濁液の硝子体内注入後、網膜及びＲＰＥに薬剤を標的化するために、ポリラクチド粒子が使用されている（Ｂｏｕｒｇｅｓ，Ｊ−Ｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４４（８），２００３）。
【０２８３】
持続放出性製剤を作製する方法は、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をポリマー成分と組み合わせるか又は混合して、混合物を形成することを含む。次いで、混合物の押出成形、圧縮、成形などを行い、単一の組成物を形成してもよい。所望により、熱及び／又は圧力を使用することができる。次いで、単一の組成物を処理して、患者の眼内に配置するのに好適な個々のインプラント又は粒子を形成してもよい。治療的活性剤をポリマーマトリックスに組み込むための更なる方法は、当該技術分野において既知である。ポリマーマトリックスは、様々な範囲の寸法（例えば、長さ、幅など）及び体積を有し得る、棒状、皿状、ウェハ状などの様々な形状に形成することができる。例示的な形状としては、球形、円筒形、螺旋形、コイル形又は螺旋形、ねじ形、立方体形、円錐形、楕円形、両凸形、半球形、又は近半球形などが挙げられる。
ＩＶ．疾患の治療方法
【０２８４】
ある特定の状況下では血管内皮増殖が望ましいが、血管内皮増殖及び血管新生は、腫瘍成長及び転移、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、新生血管緑内障、ＡＭＤ、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、並びに慢性炎症を含む、様々な疾患及び障害の重要な構成因子でもある。
【０２８５】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−１、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−抗ＣＴＬＡ−４、ＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ−抗ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−抗Ａｎｇ２、ＶＥＧＦＲ−抗ＴＮＦα、又はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−１７Ａ抗体軽鎖融合タンパク質）、及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、診断、分子アッセイ、及び治療などの様々な用途に有用である。
【０２８６】
本発明の一態様は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質と、任意に医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む、疾患又は状態の治療を必要とする個体における、その方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、疾患は、非腫瘍性疾患又は新生血管障害である。いくつかの実施形態では、疾患は、ＡＭＤ又は糖尿病性網膜症などの眼内新生血管障害である。
【０２８７】
本発明は、一部において、単独で又は別の治療と任意に組み合わせて、少なくともいくつかの態様では、医薬的に許容される担体又は賦形剤と共に投与され得る、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質、それをコードしている核酸分子及び／又はベクター、それをコードしている核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞を想到する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の投与に先立ち、当該技術分野において周知の好適な医薬担体及び賦形剤と組み合わせることができる。本開示に従って調製された組成物は、癌又は眼内新生血管障害の治療又は悪化の遅延に使用することができる。
癌
【０２８８】
いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、固形腫瘍、又は異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／又はシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗��ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、固形腫瘍、又は異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／又はシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、及び細胞内抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、刺激性免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害性免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブと競���的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブと競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形���では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブと競合的にＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブと競合的にＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、血管新生因子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＡｎｇ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂと競合的にＡｎｇ２に結合する
。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＴＮＦαである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブと競合的にＴＮＦαに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＩＬ−１７Ａである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブと競合的にＩＬ−１７Ａに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍（例えば、肺癌、肝癌、皮膚癌（黒色腫など）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は膀胱癌）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身的（静脈内など）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的（腫瘍内など）に投与される。いくつかの実施形態では、この方法は、個体を追加の癌療法（例えば、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、又はこれらの組み合わせ）に供することを更に含む。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、癌を治療する方法は、以下の生物学的活性のうちの１つ以上を有する：（１）癌細胞を殺傷する（バイスタンダー殺傷を含む）；（２）癌細胞の増殖を阻害する；（３）腫瘍における免疫応答を誘導する；（４）腫瘍サイズを縮小する；（５）癌を有する個体における１つ以上の症状を緩和する；（６）腫瘍転移を阻害する；（７）生存期間を延長する；（８）癌進行までの期間を延長する；（９）癌の再発可能性を防ぐ、阻害する、又は低減する；及び（１０）腫瘍血管新生を減少又は阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物によって媒介される癌細胞を殺傷する方法は、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７��％、約８０％、約９０％、約９５％、又はそれ以上のうちいずれかの腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物によって媒介される腫瘍サイズを縮小する方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は１００％のうちいずれかなど）を縮小することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物によって媒介される腫瘍転移を阻害する方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は１００％のうちいずれかなど）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物によって媒介される個体（ヒトなど）の生存期間を延長する方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、又は２４ヶ月のうち、任意の期間、個体の生存期間を延長することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物によって媒介される癌進行までの期間を延長する方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週間のうち、任意の期間、癌進行までの期間を延長することができる。
【０２８９】
本明細書に記載される方法は、固形癌及び液性癌の両方を含む様々な癌の治療に好適である。この方法は、早期癌、非転移性癌、原発癌、進行癌、局所進行性癌、転移癌、又は寛解期の癌を含む、全てのステージの癌に適用可能である。本明細書に記載される方法を、アジュバント療法又はネオアジュバント療法中の、第１の療法、第２の療法、第３の療法、又は、当該技術分野において既知である別の種類の癌療法、例えば、化学療法、手術、ホルモン療法、放射線、遺伝子治療、免疫療法（Ｔ細胞療法など）、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、低温療法、超音波療法、光線力学的療法、高周波アブレーションなどとの併用療法として用いることができる（すなわち、この方法は、一次／根治治療前に行うことができる）。いくつかの実施形態では、この方法は、以前に治療された個体の治療に使用される。いくつかの実施形態では、癌は、前治療に対して抵抗力があったものである。いくつかの実施形態では、この方法は、以前に治療されていない個体の治療に使用される。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、乳房、肺、食道、胃組織、結腸、直腸、肝臓、卵巣、子宮頸部、子宮内膜の細胞癌、莢膜細胞腫、男化腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頸部癌、上咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、シュワン腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路細胞癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、異常血管増殖（母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメグズ症候群に関連する）が挙げられる。いくつかの実施形態では、この方法は、肺癌、肝癌、皮膚癌（黒色腫など）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は膀胱癌の治療に好適である。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、黒色腫、前立腺癌、肺癌、結腸癌、胃癌、卵巣癌、乳癌、及び神経膠芽腫が挙げられる。
【０２９２】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、異常なＣＴＬＡ−４又はＢ７−１／Ｂ７−２発現、活性、及び／又はシグナル伝達を伴う癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、異常なＣＴＬＡ−４又はＢ７−１／Ｂ７−２発現、活性、及び／又はシグナル伝達を伴う癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブと競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、血液癌及び／又は固形腫瘍が挙げられる。本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得るいくつかの癌には、典型的に免疫療法に応答する癌が挙げられる。治療に対する他の癌の非限定例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、乳癌、結腸癌、及び肺癌（例えば、非小細胞肺癌）が挙げられる。更に、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る難治性又は再発性悪性腫瘍を含む。本発明の抗体を使用して治療され得る他の癌の例としては、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚又は眼球内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の細胞癌、子宮内膜の細胞癌、子宮頸部の細胞癌、膣の細胞癌、外陰部の細胞癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂の細胞癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性癌（アスベストによって誘発されるものを含む）、及びこれらの癌の組み合わせが挙げられる。本発明はまた、転移性癌、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌の治療にも有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【０２９４】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＨＥＲ２発現、活性及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、唾液腺癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、及び子宮頸癌が挙げられる。
【０２９６】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗ＨＥＲ２抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＨＥＲ２発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＨＥＲ２発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブと競合的にＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＥＧＦＲ発現、活性、及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適である。ＥＧＦＲ陽性腫瘍は、細胞癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、及びリンパ系悪性腫瘍などの癌に関連する。ＥＧＦＲ陽性癌として、非限定例として、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌及び子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、及び頭頸部癌が挙げられる。
【０２９８】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＥＧＦＲ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＥＧＦＲ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブと競合的にＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＡｎｇ２発現（高度に血管新生されている腫瘍など）、活性及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、神経膠腫、肝細胞癌、胃癌、甲状腺腫瘍、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌など）、結腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、黒色腫、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、中皮腫、肉腫、胆管細胞癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍及び類表皮癌が挙げられる。
【０３００】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗Ａｎｇ２抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＡｎｇ２発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗Ａｎｇ２抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＡｎｇ２発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂと競合的にＡｎｇ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＴＮＦα発現、活性及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、白血病、卵巣癌、乳癌、及び結腸癌が挙げられる。
【０３０２】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗ＴＮＦα抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＴＮＦα発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗ＴＮＦα抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＴＮＦα発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブと競合的にＴＮＦαに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＩＬ−１７Ａ発現、活性及び／又はシグナル伝達を伴う癌の治療に好適であり、非限定例として、乳癌、結腸癌、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌が挙げられる。
【０３０４】
したがって、いくつかの実施形態では、１）軽鎖を含む抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えば、完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＩＬ−１７Ａ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えば、完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、癌（例えば、細胞癌又は腺癌、固形腫瘍、異常なＶＥＧＦ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達、並びに／又は、異常なＩＬ−１７Ａ発現、活性、及び／若しくはシグナル伝達を伴う癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブと競合的にＩＬ−１７Ａに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、肺癌、肝癌、皮膚癌（黒色腫など）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は膀胱癌の治療に好適である。
【０３０６】
本出願の医薬組成物の投与量及び所望の薬物濃度は、想定される特定用途に応じて変わり得る。適切な投与量又は投与経路の決定は、当業者において周知である。動物実験は、ヒトの治療に対する有効量の決定において、信頼性のある指標を提供する。有効量の外挿は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６に著される原則に従って実施できる。
【０３０７】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ投与が用いられるとき、通常の投与量は、投与経路に応じて、約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ哺乳類体重／日以上、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば約１〜３ｍｇ／ｋｇ／日、約２〜４ｍｇ／ｋｇ／日、約３〜５ｍｇ／ｋｇ／日、約４〜６ｍｇ／ｋｇ／日、約５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜８ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜６．５ｍｇ／ｋｇ／日、約６．５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約７〜９ｍｇ／ｋｇ／日、又は約８〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で、変化し得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる疾患に有効であり、特定の器官又は組織の治療に意図された投与が、他の器官又は組織とは異なる方法での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。更に、投与量を、１回又は２回以上の別々の投与によって、又は持続的注入によって投与できる。数日以上にわたる繰り返し投与において、その状態に応じて、疾患症状の所望される抑制が生じるまで、治療を継続する。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってよい。治療の進行は、従来技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回投与（例えば、ボーラス注射）される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回（例えば２、３、４、５、６、又はそれ以上の回数のいずれか）投与される。複数回投与の場合、同じ又は異なる経路によって行われてもよく、同じ部位又は別の部位で行われてもよい。医薬組成物は、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、毎日、連続的に毎日、週に１回、連続的に毎週、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１０ヶ月に１回、１１ヶ月に１回、又は年に１回、投与されてよい。投与間の間隔は、約２４時間〜約４８時間、約２日〜約３日、約３日〜約５日、約５日〜約１週間、約１週間〜約２週間、約２週間〜約１ヶ月、約１ヶ月〜約２ヶ月、約２ヶ月〜約３ヶ月、約３ヶ月〜約６ヶ月、又は約６ヶ月〜約１年のうちのいずれか１つであってよい。間隔はまた、不規則であってもよい（例えば、腫瘍の進行後）。いくつかの実施形態では、投薬スケジュールに途切れは存在しない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、４日毎に４回投与される。特定の患者に対する最適な投与量及び治療レジメンは、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医療分野における当業者によって容易に決定できる。
【０３０９】
再溶解製剤又は液体製剤などが挙げられるが、これらに限定されない本出願の医薬組成物は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質による治療を必要とする固体、好ましくはヒトに、既知の方法、例えば、単回又は一定時間にわたる持続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、又は吸入経路によって投与される。再溶解製剤は、本明細書に記載される凍結乾燥ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を希釈剤に溶解し、タンパク質を全体的に分散させることによって調製することができる。本出願での使用に好適な例示的な医薬的に許容される（ヒトへの投与に安全かつ非毒性な）希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液若しくはデキストロース溶液、又は塩及び／若しくは緩衝液の水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下（すなわち、皮膚下）投与によって個体に投与される。このような目的のため、注射器を用いて医薬組成物を注入してよい。しかし、医薬組成物の投与には、注入装置、インジェクターペン、オートインジェクター装置、無針装置、及び皮下パッチ送達システムなどの他の装置が存在する。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、固体の静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点滴静注などの注入によって固体に投与される。免疫療法に対する注入法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）参照）。
非腫瘍性疾患
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本発明によって治療され得る非腫瘍性疾患は、ＶＥＧＦ発現に関連しない。いくつかの実施形態では、本発明によって治療され得る非腫瘍性疾患は、ＶＥＧＦ発現に関連する（ＶＥＧＦ過剰発現など）。
【０３１３】
ＶＥＧＦの過剰発現は、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性炎症、及び眼内新生血管障害（例えば、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、新生血管緑内障、及びＡＭＤ）などの非腫瘍性疾患を引き起こす場合がある。
【０３１４】
したがって、いくつかの実施形態では、１）抗体軽鎖を含む抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、非腫瘍性疾患（眼内新生血管障害、例えば、糖尿病性網膜症及びＡＭＤなど）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、��体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、非腫瘍性疾患（眼内新生血管障害、例えば、糖尿病性網膜症及びＡＭＤなど）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、及び細胞内抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、刺激性免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害性免疫チェックポイント分子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態で���、抗体は、ニボルマブと競合的にＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アテゾリズマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、デュルバルマブと競合的にＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブと競合的にＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ���を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブと競合的にＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブ（例えば、アービタックス（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、セツキシマブと競合的にＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、血管新生因子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＡｎｇ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂと
競合的にＡｎｇ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＴＮＦαである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブと競合的にＴＮＦαに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＩＬ−１７Ａである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブと競合的にＩＬ−１７Ａに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍性疾患は、ＶＥＧＦ過剰発現と関連する。いくつかの実施形態では、非腫瘍性疾患は、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性炎症、及び眼内新生血管障害（例えば、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、新生血管緑内障、及びＡＭＤ）から選択される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身的（静脈内など）に投与される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、本発明によって治療される疾患は、関節リウマチである。関節リウマチは、様々な全身症状を呈し得る慢性疾患である。この疾患の病因は未知であり、通常は対称分布性の末梢関節を含む持続的な炎症性滑膜炎を特徴的に呈する。軟骨破壊、骨浸食、及び最終的に関節の変形を引き起こす補体媒介性炎症が、この疾患の最も重要な特徴である。したがって、本明細書に提供される方法は、関節リウマチの治療に有用である。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、本発明によって治療される疾患は、乾癬である。乾癬（尋常性乾癬）は、赤い鱗状の盛り上がったプラークを特徴とする慢性炎症性皮膚疾患である。この疾患プロセスは、Ｔ細胞浸潤と関連するサイトカインレベルの上昇によって引き起こされ、細胞分裂及び異常分化の増加につながり、乾癬性の表現型をもたらす。尋常性乾癬の全世界における有病率は２〜３％であり、様々な重症度を有する慢性の再発性皮膚疾患である。乾癬は、患者の生活の質に大きな影響を及ぼし、２型糖尿病、高血圧症、心筋梗塞、うつ病、及び関節炎などの他の主な疾患に匹敵する身体的及び精神的機能の障害を引き起こす可能性があり、また、乾癬性関節炎、うつ病、悪性腫瘍、メタボリックシンドロームなどの重篤な併存症、心血管罹患率及び死亡率、並びに炎症性腸疾患（ｉＢＤ）などの自己免疫疾患にも関連する。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、本発明によって治療される疾患は、アテローム性動脈硬化症である。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の層が厚くなって、血管の狭窄を引き起こすことにより、血流が損なわれる疾患である。アテローム性動脈硬化症は、体内のあらゆる領域で生じ得るが、心臓、脳、又は脳幹につながる血管内で発生した場合、対象への障害が最も大きい可能性がある。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の肥厚及び硬化、又は、脂肪、コレステロール、及び粥腫若しくはプラークを形成する他の物質の蓄積を含む。アテローム性動脈硬化症は、石灰化、出血、潰瘍形成、血栓症、及び／又は外傷からも生じ得る。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本発明によって治療される疾患は、血管腫である。血管腫は、血管の異常な集積に起因して形成される非癌性腫瘍である。これらは、皮膚又は内臓、特に肝臓に見られることが多く、通常は先天性である。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本発明によって治療される疾患は、喘息、慢性消化性潰瘍、結核症、関節リウマチ、慢性歯周炎、潰瘍性大腸炎及びクローン病、慢性副鼻腔炎、及び慢性活動性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない慢性炎症である。慢性炎症は、原因が何であっても、急性炎症、自己抗原に対する自己免疫応答、又は持続する強度が低い慢性的な刺激の排除を失敗したことに起因し得る。
眼内新生血管障害
【０３２０】
いくつかの実施形態では、１）抗体軽鎖を含む抗体（例えば、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、眼内新生血管障害（例えば、糖尿病性網膜症及びＡＭＤ）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは同じである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントは異なっている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｔ１ｄ２を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ３を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｆｌｋ１ｄ４を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−Ｆｌｋ１ｄ４を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＮ末端は、抗体軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントは、少なくとも約４ｋＤａ（例えば、少なくとも約４ｋＤａ、約８ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２７ｋＤａ、又は約３０ｋＤａのうちいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント−抗体軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ−Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３（Ｌは任意のリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤは、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲコンポーネント及び抗体軽鎖のＣ末端は、リンカー（例えば、配列番号６又は７のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって連結される。したがって、いくつかの実施形態では、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗体（例えば、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号��又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することを含む、眼内新生血管障害（例えば、糖尿病性網膜症及びＡＭＤ）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、及び細胞内抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、抗体は、血管新生因子を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＡｎｇ２である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂと競合的にＡｎｇ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＴＮＦαである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブ（例えば、ヒュミラ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、アダリムマブと競合的にＴＮＦαに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、血管新生因子はＩＬ−１７Ａである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブ（例えば、トルツ（登録商標））又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、イキセキズマブと競合的にＩＬ−１７Ａに結合する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、眼内新生血管障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、眼内新生血管障害は、脈絡膜新血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫と関連する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点眼、結膜下注入、結膜下移植、硝子体内注入、硝子体内移植、テノン嚢下注入、及びテノン嚢下移植など、局所的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、硝子体内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、この方法は、個体を追加の眼科治療に供することを更に含む。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、眼内新生血管障害を治療する方法は、以下の生物学的活性のうちの１つ以上を有する：（１）ドルーゼン形成を阻害又は予防する、（２）ドルーゼン数及び／又はサイズの減少（ドルーゼン軽減）を起こす、（３）リポフスチン沈着物の減少又は予防を起こす、（４）視力低下を抑制若しくは防止する、又は、視力低下速度を低下させる、（５）脈絡膜新血管新生を阻害する、又は、脈絡膜新血管新生速度を低下させる、（６）脈絡膜新血管新生によって特徴付けられる病変のサイズ及び／又は数を減少させる、（７）脈絡膜新血管新生を阻害する、又は、網膜新血管新生速度を低下させる、（８）網膜新血管新生によって特徴付けられる病変のサイズ及び／又は数を減少させる、（９）視力及び／又はコントラスト感度を改善する、（１０）黄斑浮腫を減少させる、及び／又は、異常な黄斑厚さを低下させる、（１１）光受容体若しくはＲＰＥ細胞の萎縮若しくはアポトーシスを阻害若しくは予防する、又は、光受容体若しくはＲＰＥ細胞の萎縮若しくはアポトーシスの速度を低下させる、（１２）非滲出型黄斑変性症の滲出型黄斑変性症への進行を阻害又は予防する。
【０３２１】
いくつかの眼疾患は、血管新生の変化を伴う。本発明の方法によって治療され得る眼内新生血管障害の非限定例としては、滲出型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、網膜色素線条症（angiod streaks）、変性近視、眼ヒストプラスマ症候群、ブルッフ膜の破壊、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を含む）、サルコイドーシス、及びブドウ膜炎が挙げられる。開示される方法によって治療され得る疾患の更なる例としては、萎縮型ＡＭＤ、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍、角膜移植後拒絶反応、角膜損傷、血管新生緑内障、角膜潰瘍、角膜瘢痕、増殖性硝子体網膜症、未熟児網膜症、網膜変性、慢性緑内障、網膜剥離、及び鎌状赤血球網膜症が挙げられる。
【０３２２】
成人の失明の第３の原因（米国における失明のほぼ７％を占める）である糖尿病性網膜症は、幅広い血管由来性の事象に関連する。非増殖性網膜症は、網膜内の周皮細胞の選択的な損失を伴い、それらの損失は、関連する毛細血管拡張の拡張をもたらし、その結果、血流が増加する。拡張された毛細血管内では、内皮細胞が増殖し、嚢を形成して微細動脈瘤となり、隣接する毛細血管が遮断されることになるため、これらの微細動脈瘤を取り囲む網膜の領域が灌流されない。最終的に、微細動脈瘤の隣接領域間にシャント血管が現れ、微細動脈瘤と灌流されていない網膜領域を有する初期の糖尿病性網膜症の臨床像が見られる。微小動脈瘤が漏れ、毛細血管が出血し得ることが、滲出液及び出血の原因となる。基礎環境である糖尿病性網膜症の初期段階が確立されると、この症状は年単位にわたって進行して増殖性糖尿病性網膜症を発症し、約５％の症例で失明を起こす。増殖性糖尿病性網膜症は、網膜の一部の領域が毛細血管を失い続け、非灌流状態になると発症し、網膜上の円盤及びその他の場所に新しい血管の外観をもたらす。これらの新しい血管は硝子体内に成長し、容易に出血し、網膜前出血をもたらす。進行した増殖性糖尿病性網膜症では、広範囲の硝子体出血が硝子体腔の主な部分を満たし得る。加えて、新しい血管は、牽引性網膜剥離をもたらし得る線維組織の増殖を伴う。
【０３２３】
糖尿病性網膜症は、主に真性糖尿病の期間と関連するため、高齢化が進み、糖尿病患者が長生きするにつれて、糖尿病性網膜症の有病率が増加する。レーザー療法は、非増殖性及び増殖性糖尿病性網膜症の両方に対して現在使用されている。黄斑部を取り囲む漏出している微小動脈瘤の焦点レーザー治療は、臨床的に重大な黄斑浮腫患者の５０％において失明を低下させる。増殖性糖尿病性網膜症では、汎網膜光凝固により、網膜全体に数千個の小さい火傷を点在させ（黄斑部以外）、この治療が、失明率を６０パーセント低下させる。黄斑浮腫及び増殖性糖尿病性網膜症の早期治療は、患者の９５％において５年間年失明を予防するのに対し、治療が遅くなると、失明の予防は５０パーセントのみである。したがって、早期診断及び治療が重要である。
【０３２４】
新血管新生に関与する別の眼疾患はＡＭＤであり、６５歳以上のアメリカ人の約１０人に１人に影響を及ぼす疾患である。ＡＭＤは、網膜の中央領域である黄斑の一連の病理学的変化によって特徴付けられ、視力の減少を伴い、特に中心視野に影響を及ぼす。ＡＭＤは、感覚網膜の直下にある網膜色素上皮と呼ばれる単層の細胞に関係する。これらの細胞は、それらと接触している網膜の部分、すなわち、視覚色素を含有する光受容細胞に栄養を与え、支持する。網膜色素上皮は、ＡＭＤにおいて肥厚して硬化する、基底膜複合体のブルッフ膜である。新しい血管は、豊富な血管床を含む下層の脈絡膜からブルッフ膜を通って侵入できる。次に、これらの血管は、網膜色素上皮の下、及び網膜色素上皮と感覚網膜との間においても、流体を漏出させる、つまり出血し得る。その後の線維性瘢痕化により、光受容細胞の栄養供給が妨害されて、死滅に至らせ、中心視野の喪失をもたらす。この種の加齢性黄斑症は、血管の漏出と網膜下浮腫又は血液のよって、「ウェット」型と呼ばれる。ウェット型は、加齢性黄斑症例の１０％を占めるにすぎないが、高齢者における黄斑変性症による法的盲症例の９０％をもたらす。「ドライ」型の加齢性黄斑症は、上層の光受容細胞の損失と共に網膜色素上皮の崩壊を伴う。ドライ型は視力を低下させるが、通常は０．４（２０／５０）〜０．１（２０／１００）の視力にしかならない。
【０３２５】
ＡＭＤは、中心視野の歪みを伴い、物体がより大きく若しくはより小さく見え、直線が歪んで屈曲して見え、又は中央部分が見えない。ウェット型のＡＭＤでは、黄斑部内に感覚網膜のわずかな剥離が認められる場合があるが、網膜下新生血管膜の確定診断は、蛍光眼底造影を必要とする。ドライ型では、ドルーゼンが黄斑部の色素沈着パターンを妨害し得る。ドルーゼンは、細胞内に突出し、前方に膨らませる網膜色素上皮の基底膜の突起物であり、加齢性黄斑症におけるリスク因子としてのそれらの役割は不明である。ドライ型加齢性黄斑症の治療は現在存在しない。レーザー治療は、ウェット型加齢性黄斑変性症で使用され、初期には、新生血管膜を除去し、１８ヶ月時点で患者の約５０％において、更なる視力低下を予防する。しかしながら、６０ヶ月後まで実質的な利益を持続的に有しているのは２０％のみである。
【０３２６】
黄斑浮腫は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、前部又は後部ブドウ膜炎などの炎症性状態を含む様々な眼疾患に関連する。網膜黄斑は、弱くなった、ないしは別の異常血管から近くの組織へと漏出する流体の蓄積の結果として肥厚する。血液又は他の流体の漏出と、その結果として生じる黄斑厚の増加は、視力、色知覚などの急性変化をもたらし得る。したがって、黄斑浮腫は、ＡＭＤ及び様々なその他眼障害に罹患している個体が経験する視覚障害及び視力低下に寄与し得る。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、１）抗体軽鎖を含む抗体（例えば、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）抗体軽鎖のＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することによる、新血管新生（例えば、脈絡膜新血管新生、ＣＮＶ）、血管漏出、及び／又は網膜浮腫、眼ドルーゼンの形成、眼又は眼組織における炎症、光受容細胞の損失、視力（例えば、視力及び視野を含む）の低下、及び網膜剥離を非限定的に含む、ＡＭＤ又は糖尿病性網膜症の１つ以上の側面又は症状を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、１）第１の軽鎖と、第２の軽鎖と、を含む、抗体（例えば、抗Ａｎｇ２、抗ＴＮＦα、又は抗ＩＬ−１７Ａ完全長抗体）と、２）第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントであって、第１のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＸ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２の抗体軽鎖のＣ末端（例えば、抗体ＶＬ−ＣＬドメインのＣ末端）に、任意にリンカーＹ（配列番号６又は７のペプチドリンカーなど）を介して融合されており、各ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、第１のＶＥＧＦＲコンポーネント及び第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、抗体融合タンパク質と、任意に、医薬的に許容される担体と、を含む、有効量の医薬組成物を、個体に投与することによる、ＡＭＤ又は糖尿病性網膜症の１つ以上の側面又は症状を治療又は予防する方法を提供する。光受容体の変性、ＲＰＥ変性、網膜変性、脈絡網膜性変性、錐体変性、網膜機能不全、光曝露（一定光曝露など）に対する網膜損傷、ブルッフ膜の損傷、ＲＰＥ機能の喪失、正常な黄斑の細胞及び／又は細胞外マトリックスの組織構ＲＰＥ変性、網膜変性、亜オレフィン変性、錐体変性、網膜機能不全、光曝露（一定光曝露など）に応答した網膜損傷、ブルッフ膜の損傷、ＲＰＥ機能の喪失、正常な黄斑の細胞及び／又は細胞外マトリックスの組織構造の完全性の喪失、黄斑内細胞の機能の喪失、光受容体ジストロフィー、ムコ多糖症、杆体−桿体ジストロフィー、錐体−杆体ジストロフィー、前部及び後部ブドウ膜炎、並びに糖尿病性ニューロパシーなどの、ＡＭＤの別の側面の治療も想到される。
【０３２８】
新生血管障害の抑制は、血管新生が鈍化又は減少しているかどうかを測定する任意の一般的な方法によって評価することができる。これは、自覚症状又は客観的な生理学的指標を評価することによるものなど、直接的観察及び間接的評価を含む。治療有効性は、例えば、新血管新生、微小血管症、血管漏出若しくは血管性水腫、又はこれらの任意の組み合わせの予防又は改善に基づいて評価することができる。眼内新生血管障害の抑制を評価するための治療有効性はまた、視力の固定又は改善の観点から定義されてもよい。
【０３２９】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも片方の目に視覚障害を有するヒト被験者を、硝子体内注入によって本明細書に記載される約２５〜４０００μｇのＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質で治療する。臨床症状の改善は、当該技術分野において既知の１つ以上の方法、例えば、間接検眼法、眼底撮影法、蛍光眼底造影（fluorescein angiopathy）、網膜電図検査、外部眼検査、細隙灯検査、圧平眼圧測定、角膜厚測定、及び自動屈折計（autorefaction）測定によって監視される。その後、毎週又は毎月、例えば、２〜８週間又は１〜１２ヶ月離した頻度で投与されてもよい。
Ｖ．調製方法
【０３３０】
本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（完全長抗体ＣＬドメインのＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントなど）は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、又は本明細書に記載されるように調製することができる。
【０３３１】
単離されたＤＮＡは、本明細書において、３’−及び／又は５’隣接領域を含む又は含まない、化学合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、又は染色体外ＤＮＡを意味すると理解される。好ましくは、本明細書に記載される所望のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、組み換え細胞培養での合成によって作製される。
【０３３２】
このような合成には、最初に、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントをコードする核酸を固定することが必要である。Ｆｌｔ−１、ＫＤＲ、又はＦｌｔ−４受容体をコードするＤＮＡは、（ａ）これらの細胞からｃＤＮＡライブラリを調製し、（ｂ）Ｆｌｔ−１又はＫＤＲ受容体又はその断片（長さが最大１００塩基対又はそれ以上）をコードする標識ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーション分析を行い、相同配列を含有するライブラリ中のクローンを検出し、（ｃ）制限酵素分析及び核酸配列決定によってクローンを解析して、全長クローンを同定することによって、血管内皮細胞から得ることができる。全長クローンがｃＤＮＡライブラリに存在しない場合、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ受容体について既知の核酸及びアミノ酸配列情報を使用して、様々なクローンから適切な断片を回収し、クローンに共通の制限部位でライゲーションして、Ｆｌｔ−１又はＫＤＲドメインをコードする全長クローンを構築することができる。あるいは、ゲノムライブラリが、所望のＤＮＡを提供する場合がある。
【０３３３】
このＤＮＡがライブラリから同定され単離されると、このＤＮＡを、適切な制御配列に操作可能に連結された適切な発現ベクター内にライゲーションしてもよい。更に、適切なベクター内にクローニングされると、ＤＮＡを上記のような多くの方法で改変し、機能的に同等な変異体を産生できる。更に、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は種々Ｉｇ様ドメインなどの様々なドメインをコードするＤＮＡを、他の受容体由来の対応するドメインをコードするＤＮＡによって欠失及び／又は置換させてもよい。また、免疫グロブリン分子の軽鎖などの抗体アミノ酸配列をコードするＤＮＡも、ＶＥＧＦＲの一部又は全てをコードするＤＮＡにインフレームで融合させてよく、それによってＶＥＧＦＲ−軽鎖Ｃ末端融合分子（以下、「ハイブリッド軽鎖」と称する）を産生できる。
【０３３４】
多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用する宿主細胞に一部依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物又は真核生物（通常は哺乳類）由来のいずれかである。一般に、当然のことながら、本発明において有用なＤＮＡ配列の初期クローニング及びベクターの構築には、原核生物が好ましい。
１．アミノ酸配列変異体
【０３３５】
ＶＥＧＦＲコンポーネントの、ＶＥＧＦ結合能及びＶＥＧＦ活性阻害能に関して本発明の趣旨から逸脱することなく、様々なアミノ酸置換が本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン内でなされ得ることが理解されよう。したがって、ＶＥＧＦＲコンポーネントがＶＥＧＦに結合し、その活性を阻害する能力に実質的に影響しない興味深い特性を付与するために、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン内に、点変異又はその他様々な変異を行ってもよい。様々なアミノ酸置換は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の抗体部分においても行われ、所望の活性（「抗体変異体」の項も参照）を産生することもできる。これらの変異体は、当該技術分野において一般に周知の手段によって作製できる。
ａ）共有結合的修飾
【０３３６】
共有結合的修飾は、ＶＥＧＦＲコンポーネント中に存在するＩｇ様ドメインの様々なアミノ酸残基に対して作製することができ、それにより、ＶＥＧＦに結合し、不活化する能力を損なわずに、そのＩｇ様ドメインに新たな特性を付与する。共有結合的修飾はまた、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の抗体部分にも行うことができ、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣをもたらす。
【０３３７】
例えば、システイニル残基を、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのａ−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、ａ−ブロモ−ｂ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、２−クロロ第二水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０３３８】
ヒスチジン残基は、この剤がヒスチジン側鎖に対して比較的特異的であるため、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。パラブロモフェノシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で実施される。
【０３３９】
リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応される。これらの剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。ａ−アミノ含有残基の誘導体化のための他の好適な試薬としては、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシル酸とのトランスミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０３４０】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンのうち、１つ又はいくつかの従来の試薬との反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応をアルカリ性条件で行うことが必要である。更に、これらの試薬は、リジン基、並びにアルギニンイプシロンアミノ基と反応し得る。
【０３４１】
チロシル残基自体の特定の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって、スペクトル標識をチロシル残基に導入することに特に関心を集めており、広く研究されている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロシン残基を、１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてヨウ素化し、ラジオイムノアッセイで使用する標識タンパク質を調製するが、上記のクロラミンＴ法が好適である。
【０３４２】
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド、又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミル残基に変換される。
【０３４３】
二官能性剤による誘導体化は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を、複合体混合物からＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を精製するための方法で使用される非水溶性支持マトリックス又は表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及び、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成できる、光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、シアノゲンブロミド活性化炭水化物、並びに、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、及び同第４，３３０，４４０号に記載される反応性基材などの反応性非水溶性マトリックスは、タンパク質不動化のために用いられる。
【０３４４】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミドされる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内にある。
【０３４５】
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のａ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び場合によっては、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
ｂ）ＤＮＡ突然変異
【０３４６】
本発明のＶＥＧＦＲコンポーネント中に存在するＩｇ様ドメインのアミノ酸配列変異体、又は本発明に存在する抗体部分のアミノ酸配列変異体はまた、それぞれＶＥＧＦＲコンポーネント又は抗体をコードするＤＮＡに変異を作成することによって調製することもできる。このような変異体としては、例えば、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン又は抗体のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、又は挿入又は置換が挙げられる。最終構築物が所望の活性を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換のいずれかの組み合わせを施して最終構築物に到達させてもよい。明らかに、変異体をコードしているＤＮＡ内に作製される突然変異は、その配列を読み枠の外に配置してはならず、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生成できる相補的領域をもたらさない（欧州特許第７５，４４４（Ａ）号参照）。
【０３４７】
遺伝子レベルにおいて、本発明のＶＥＧＦＲコンポーネント中に存在するＩｇ様ドメインの変異体（又は本発明の抗体変異体）は、通常、Ｉｇ様ドメイン（又は抗体）をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により調製され、それにより、変異体をコードするＤＮＡを作製し、その後、組み換え細胞培養物中でＤＮＡを発現させる。ＶＥＧＦＲコンポーネント変異体は、典型的には、未改変のキメラタンパク質と同様に、ＶＥＧＦリガンドへの結合に対する同一の定性的能力を示す。抗体変異体は、典型的には、標的抗原への結合に対する同一の定性的能力、より良好な抗原結合能力、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善を示す。
【０３４８】
ＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン内にアミノ酸配列変異を導入するための部位は既定であるが、変異自体は既定である必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を最適化するために、標的コドン又は領域でランダム変異誘発を行うことができ、発現されたキメラタンパク質変異体を、ＶＥＧＦリガンドに特異的に結合する能力、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期などの所望の属性の最適な組み合わせについてスクリーニングしてもよい。本明細書に記載される融合たんぱく質の抗体部分にアミノ酸配列変異を導入するための部位は、例えば、ＨＶＲ（例えば、抗体−抗原結合親和性を変化させるため）、Ｆｃフラグメント（例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを改善するため）、又は抗体の任意のアクセス可能部位（例えば、複合体化のためシステインに置換される残基）であり得る。また、「抗体変異体」の項も参照されたい。既知の配列を有するＤＮＡ中の既定の部位で置換変異を作製する手法は周知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発である。
【０３４９】
本明細書に記載され、本明細書による、ＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン、又は融合たんぱく質内の抗体部分における変異体の調製は、好ましくは、先に調製されたキメラタンパク質又は抗体をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって達成される。部位特異的突然変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列、並びに、十分なサイズと配列複雑性のプライマー配列を提供して、挿入される欠失移行部の両側に安定な二本鎖を形成させるための、十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド配列の使用により、Ｉｇ様ドメイン変異体又は抗体変異体の産生を可能にする。典型的には、約２０〜２５ヌクレオチドの長さのプライマーが好ましく、変化を受ける配列の接合部の両側に約５〜１０個の残基を有する。一般に、部位特異的突然変異誘発の手法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＡｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ２，１８３（１９８３）などの刊行物によって例示されるように、当該技術分野において周知である。
【０３５０】
理解されるように、部位特異的突然変異誘発法は、典型的には、一本鎖及び二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベクターとしては、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＭｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｉｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｅｄｉｔｏｒ  Ａ．Ｗａｌｔｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）に開示されるような、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。これらのファージは容易に市場から入手でき、その使用は、当業者には一般的に周知である。あるいは、一本鎖ファージの複製起点を含むプラスミドベクター（Ｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３，３［１９８７］）を使用して、一本鎖ＤＮＡを得ることができる。
【０３５１】
一般に、本明細書による部位特異的突然変異誘発は、最初に、関連するＶＥＧＦＲコンポーネント、抗体、又はＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることによって実施される。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｃｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７５，５７６５（１９７８）の方法によって、一般的に合成的に調製される。その後、このプライマーを一本鎖キメラタンパク質配列含有ベクターとアニーリングし、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウ断片などのＤＮＡ重合酵素に供して、変異導入鎖の合成を完了させる。したがって、一方の鎖が元の変異していない配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを使用して、ＪＭ１０１細胞などの適切な細胞を形質転換し、変異配列を有する組み換えベクターを含む及びクローンを選択する。
【０３５２】
このようなクローンが選択された後、本明細書に記載される変異体ＶＥＧＦＲコンポーネント、抗体変異体、又はＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードする変異ＤＮＡを取り出し、タンパク質産生のための適切なベクター、一般的には、適切な宿主の形質転換に使用できる種類の発現ベクターに配置することができる。
ｃ）変異の種類
【０３５３】
アミノ酸配列の欠失は、一般に、約１〜１５残基、より好ましくは１〜７残基の範囲であり、典型的には近接している。
【０３５４】
アミノ酸配列挿入として、１つの残基から本質的に長さに制限がないポリペプチドの、アミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに、単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入（すなわち、Ｉｇ様ドメイン配列内の挿入）は、一般に約１〜１０個の残基、より好ましくは１〜５個の範囲であり得る。末端挿入の例としては、抗体軽鎖−ＶＥＧＦＲコンポーネント融合タンパク質のＮ末端へのシグナル配列（宿主細胞と異種又は同種であるかは問わない）の融合を含み、組み換え宿主からの分泌を促進させる。
【０３５５】
ＶＥＧＦＲコンポーネント中に存在するＩｇ様ドメイン内に導入され得る第３の変異の種類は、Ｉｇ様ドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは１つのみが除去され、その位置に異なる残基が挿入されているものである。このような置換は、Ｉｇ様ドメインの特性を微調整することが望まれる場合、好ましくは、以下の表２に従って行われる。
【表２】
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【０３５６】
機能又は免疫学的同一性の実質的な変更は、表２のものよりも保存性が低い置換基を選択すること、すなわち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシート若しくはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は、（ｃ）側鎖の大きさ、を維持することについて、その効果がより顕著に異なる置換を選択することによってなされる。一般に、Ｉｇ様ドメインの特性に最大の変化をもたらすことが予想される置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリン（Ｐ）が別のアミノ酸で置換されるか、又は欠失若しくは挿入される；（ｂ）親水性残基、例えば、セリル又はスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、又はアラニルで（又はこれらによって）置換される；（ｃ）システイン残基が、任意の他の残基で（又はこれらによって）置換される；（ｄ）正電荷側鎖、例えば、リシル、アルギニル、又はヒスチジンを有する残基が、負電荷、例えば、グルタミル又はアスパルチルを有する残基で（又はこれらによって）置換される；（ｅ）負電荷側鎖を有する残基が、正電荷を有する残基で（又はこれらによって）置換される；又は、（ｆ）嵩高い側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、そのような側鎖ではないもの、例えばグリシンで（又はこれらによって）置換される、ものであろう。
【０３５７】
抗体変異体に対して推奨される置換については、表１及び「抗体変異体」の項を参照されたい。
【０３５８】
特に、ほとんどの欠失及び挿入、並びに置換は、本明細書に記載されるＶＥＧＦＲコンポーネントのＩｇ様ドメイン又は融合たんぱく質の抗体部分の特性において、根本的な変化をもたらすことを想定していない。しかしながら、そうすることに先立って置換、欠失、又は挿入の正確な影響を予測することが困難である場合、当業者は、この効果が所定のスクリーニングアッセイによって評価されると理解するであろう。例えば、Ｉｇ様ドメイン変異体は、典型的には、完全なＶＥＧＦＲコンポーネントをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、組み換え細胞培養における変異体核酸の発現、細胞培養物からの抗体軽鎖−変異体ＶＥＧＦＲコンポーネント融合タンパク質の精製、及び、変異体ＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦリガンドに対する特異的結合能の検出によって作製される。Ｉｇ様ドメインにおける特定の改変がＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦに対する結合能及びその活性の阻害能に影響を及ぼすかどうかを判定するために、通常使用できる結合アッセイは、実施例２と、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．による論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６−２５６５４（１９９４）（参照により本明細書に明示的に組み込まれる）の両方に記載されている。抗体又は抗体結合ドメイン、又はＶＥＧＦＲコンポーネントの結合特異性も、当該技術分野において既知の方法によって実験的に決定することができる。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
【０３５９】
したがって、本明細書に記載される変異体ＶＥＧＦＲコンポーネント、又は抗体変異体、又はＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の活性は、所望の特性に対する好適なスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得る。例えば、ＶＥＧＦリガンドへの特異的結合能の変化を、競合型ＶＥＧＦ結合アッセイによって測定することができる。酸化還元若しくは熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する脆弱性、又は担体との若しくは多量体への凝集傾向といった、タンパク質特性の改変は、当業者に周知の方法によって測定される。
２．原核細胞での組み換え産生
ａ）ベクター構築
【０３６０】
本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え技術を用いて得ることができる。所望のポリ核酸配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離され、配列決定できる。別の方法としては、ヌクレオチド合成装置やＰＣＲ法を用いてポリヌクレオチドを合成できる。得られた後、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製かつ発現できる組み換えベクターに挿入する。本発明の目的において、当該技術分野において利用可能かつ既知である多くのベクターを使用できる。適切なベクターの選択は、主にはベクターに挿入される核酸の大きさと、ベクターによって形質転換される特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現、又はその両方）、存在する特定の宿主細胞との適合性によって、様々な構成要素を含む。ベクターの構成要素としては、一般には、複製開始点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６１】
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常は複製部位、並びに、形質転換細胞中での表現型選択が可能であるマーキング配列を含む。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含むため、形質転換細胞同定の簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の微生物プラスミド若しくはバクテリオファージは更に、内因性タンパク質発現のために微生物によって使用できるプロモーターを含んでも、又は含むように修飾されてもよい。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳述されている。
【０３６２】
加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及びコントロール配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用できる。例えば、ＧＥＭ（商標）−１１などのバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性のある宿主細胞の形質転換に使用できる組み換えベクターの作製に利用してよい。
【０３６３】
本出願の発現ベクターは、それぞれのポリペプチド要素をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する、未翻訳の制御配列である。原核生物のプロモーターは、典型的には、誘導性及び恒常性の２種類に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無、又は温度の変化に応答して、その制御下でシストロンの転写レベルの増加を開始するプロモーターである。
【０３６４】
様々な可能性のある宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によって元のＤＮＡからプロモーターを除去し、本出願のベクターに単離したプロモーター配列を挿入することによって、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに操作可能に連結できる。標的遺伝子の直接増幅及び／又は発現に、天然のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用できる。いくつかの実施形態では、一般に、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、転写率が高く、発現した標的遺伝子の収率を高くできるため、異種プロモーターを利用する。
【０３６５】
原核宿主での使用に好適なプロモーターとして、ＰｈｏＡプロモーター、ガラクタナーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかし、細菌で機能する他のプロモーター（例えば、他の既知の細菌プロモーター又はファージプロモーター）も同様に好適である。これらの核酸配列は公表されているため、当業者は、任意の必要とする制限部位を含めるためのリンカー又はアダプターを用いて、標的とする軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに操作可能にライゲーションできる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０３６６】
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、膜を介して発現したポリペプチドを移動させる、分泌シグナル配列要素を含む。一般に、シグナル配列はベクターの要素であってよく、又は、ベクター内に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識されて処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものでなくてはならない。異種ポリペプチド由来のシグナル配列を認識せず、処理しない原核宿主細胞において、そのシグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｅＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される、原核シグナル配列で置換する。本出願のいくつかの実施形態では、発現系の両シストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はその変化型である。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、本出願によるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の産生は、宿主細胞の細胞質内で起こることができ、そのため、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド要素、例えば、抗体重鎖をコードするポリペプチド、及びＶＥＧＦＲコンポーネントと融合した抗体軽鎖をコードするポリペプチドは、発現され、折り畳まれ、集合して、細胞質内で機能性抗体融合タンパク質を形成する。ある宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ−株）は、細胞質をジスルフィド結合形成に適した条件にするため、発現したタンパク質サブユニットの適切な折り畳みと集合を可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０３６８】
本発明は、分泌され、適切に集合した本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の収率を最大にするための、発現したポリペプチド要素の量的収率を調節できる発現系を提供する。このような調節は、ポリペプチド要素の翻訳強度を同時調節することによって、少なくとも部分的に達成される。翻訳強度を調節するための１つの手法は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８４０，５２３号に開示されている。これは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異を利用するものである。あるＴＩＲについて、ある翻訳強度の範囲を伴う一連のアミノ酸又は核酸配列変異体を作製することによって、所望の発現レベルの特定の鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供できる。ＴＩＲ変異は、アミノ酸配列を変更し得るコドン変化をもたらすための従来の変異誘発手法によって生じさせることができるが、核酸配列中のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲ中の変更として、例えば、シグナル配列の変更を伴うシャイン・ダルガーノ配列の数又はスペーシングの変更が挙げることができる。変異シグナル配列を生じるための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コーディング配列の始めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの３つ目のヌクレオチド位置を変化させることによって達成でき、また、ロイシン、セリン、アルギニンなどの一部のアミノ酸は、バンク作製を複雑にし得る複数の１つ目及び２つ目の位置を有する。この変異誘発法は、Ｙａｎｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳述されている。
【０３６９】
好ましくは、中に含まれる各シストロンについてある範囲のＴＩＲ強度を有する、ベクターセットを生じさせる。この限定セットにより、様々なＴＩＲ強度の組み合わせ下における、各鎖の発現レベル並びに所望のタンパク質産物の収率を比較する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，８４０，５２３号に詳述されるように、レポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって測定できる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが選択され、本出願の発現ベクター構築物に結合される。
ｂ）原核宿主細胞
【０３７０】
本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の発現に好適な原核宿主細胞として、グラム陰性菌又はグラム陽性菌などの古細菌及び真正細菌が挙げられる。有用な細菌の例として、大腸菌類（例えば、大腸菌）、桿菌類（例えば、枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス属（例えば、緑膿菌）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス、クレブシェラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌、ビトレオシラ属、又はパラコッカス属が挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。いくつかの実施形態では、大腸菌細胞が、本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７）、ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその派生株、例えば、遺伝子型Ｗ３１１０  ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ＡｏｍｐＴ  Ａ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲを有する３３Ｄ３株（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）などの他の株及びその派生株も適している。これらの例は、限定的なものではなく例示である。確定した遺伝子型を有する上記細菌のうち任意のものの派生株を構築する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。一般的には、細菌細胞内のレプリコンの複製力を考慮して、適切な細菌を選択する必要がある。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを用いてレプリコンを与えるとき、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ属を宿主として好適に使用できる。
【０３７１】
典型的には、宿主細胞は、タンパク質分解酵素の分泌量が最小限でなくてはならず、望ましくは、追加的にプロテアーゼ阻害剤を細胞培養内に加える場合がある。
ｃ）タンパク質の産生
【０３７２】
宿主細胞を、上記発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養する。形質転換は、ＤＮＡが染色体外要素として、又は染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能であるように、原核宿主内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞によって、当該細胞に適した標準的手法を用いて形質転換を行う。一般的に、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理が、実質的に細胞壁バリアを含む細菌細胞に対して使用される。別の形質転換方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される更に別の手法は、電気穿孔法である。
【０３７３】
本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の産生に使用される原核細胞は、当該技術分野において既知であり、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。好適な培地の例として、必要な栄養素を加えたＬ培地（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターの構築物に基づいて選択された選択剤も含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に可能にする。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖には、アンピシリンを培地に添加する。
【０３７４】
単独で、又は複合窒素源などの別の添加物若しくは培地との混合物として投入される、炭素、窒素、無機リン酸塩源以外の任意の必要な添加物も、適切な濃度で含めてもよい。任意に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される、１つ又は２つ以上の還元剤を含有してよい。原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。大腸菌の増殖では、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲であり、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであってよい。大腸菌では、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０３７５】
本出願の発現ベクター中で誘導性プロモーターを用いる場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本出願の一態様では、ポリペプチドの転写を制御するため、ＰｈｏＡプロモーターを用いる。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。好ましくは、リン酸制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７）。当該技術分野において既知であるように、使用したベクター構築物に応じて、様々な別の誘導因子を使用できる。
【０３７６】
発現した本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を宿主細胞のペリプラズム内に分泌させ、そこから回収する。タンパク質の回収は、典型的には、浸透圧刺激、超音波処理、又は細胞溶解などの一般的な手段によって微生物を破壊することを含む。細胞が破壊されると、細胞残屑又は細胞全体を、遠心分離又は濾過によって除去できる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製できる。あるいは、タンパク質を培地中に移し、そこで単離してもよい。産生したタンパク質を更に精製するために、細胞を培養及び培養上清から取り出し、それを濾過して濃縮してもよい。発現したポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなどの一般的な既知の方法を用いて、更に単離し、同定できる。
【０３７７】
別の方法としては、タンパク質産生を発酵法によって大容量で実施する。様々な大規模流加発酵法が、組み換えタンパク質の製造に利用できる。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容積、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容積を有する。これらの発酵槽は、攪拌用インペラーを用いて、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配させる。小規模発酵は一般に、容積が約１００リットル以下の発酵槽での発酵を指し、約１リットル〜約１００リットルの範囲であってよい。
【０３７８】
発酵プロセスの間、典型的には、細胞を好適な条件下で、所望の吸光度、例えば、細胞が初期静止期にある段階のＯＤ５５０が約１８０〜２２０まで増殖させた後に、タンパク質発現の誘導が開始される。当該技術分野において既知であり、上記されるように、使用したベクター構築物に応じて、様々な誘導因子を使用できる。細胞は、誘導に先立ってより短い期間増殖させてよい。細胞は、通常は約１２〜５０時間誘導されるが、より長い又はより短い誘導時間を使用してもよい。
【０３７９】
本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の製造収率及び品質を向上させるため、様々な発酵条件を変更してもよい。例えば、分泌されるポリペプチドの適切な集合と折り畳みを向上するため、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランスイソメラーゼ）を過剰発現する追加のベクターを用いて、宿主原核細胞を同時形質転換してもよい。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で産生された異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解性を促進することが証明されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０３８０】
発現した異種タンパク質（特に、タンパク質分解しやすいもの）のタンパク質分解を最小限にするため、タンパク質分解酵素が欠損した特定の宿主株を本発明に使用できる。例えば、宿主細胞株を改変し、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩなど既知の細菌プロテアーゼ、及びこれらの組み合わせをコードする遺伝子中に遺伝的変異を起こしてもよい。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２７７３−２７７７（１９９８）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０３８１】
タンパク質分解酵素を欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株を、本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードする発現系において宿主細胞として使用できる。
ｄ）タンパク質の精製
【０３８２】
本明細書で産生されるＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を更に精製し、実質的に均質な調製物を更なるアッセイ及び用途のために得る。当該技術分野において既知の標準的なタンパク質精製法を利用できる。以下の方法、すなわち、イムノアフィニティカラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲル濾過は、好適な精製法の例である。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、固相に固定化したプロテインＡを、本出願のＦｃ領域を含むＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質のイムノアフィニティ精製に使用する。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌由来の４１１（Ｄの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡが固定化された固相は、好ましくはガラス又はシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは細孔が制御されたガラスカラム又はケイ酸カラムである。いくつかの用途において、カラムは、混入物質の非特異的付着を防止するために、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。続いて、固相を洗浄し、固相に非特異的に結合している混入物質を除去する。最後に、溶出することによってＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を固相から回収する。
３．真核細胞での組み換え産生
【０３８４】
真核発現には、ベクターの要素は、一般的には、シグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、及びエンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうち、１つ以上を非限定的に含む。
ａ）シグナル配列要素
【０３８５】
真核宿主で使用するベクターは、シグナル配列、又は、成熟タンパク質、つまりポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する別のポリペプチドをコードするインサートも含んでよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって認識されて処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳類細胞発現では、哺乳類のシグナル配列並びにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスウイルスのｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ（ｇＤ）シグナルを利用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される重鎖及び／又はＶＥＧＦＲ−軽鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端にシグナルペプチドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４１、４２又は４３のアミノ酸配列を含む。
【０３８６】
このような前駆領域のＤＮＡを、本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡに、読み枠でライゲーションする。
ｂ）複製開始点
【０３８７】
一般的に、複製開始点コンポーネントは、哺乳類発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０開始点が初期プロモーターに含まれるため、典型的にはそれのみを使用できる）。
ｃ）選択遺伝子要素
【０３８８】
発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有してもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又はその他トキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに対する体制を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、桿菌類のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０３８９】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を利用するものである。異種遺伝子によって形質転換が成功したこれらの細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生することによって、選択レジメンで生存する。このような優性選択の例は、薬剤であるネオマイシン、ミコフェノール酸及びヒグロマイシンを使用するものである。
【０３９０】
哺乳類細胞に好適な選択マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチン脱炭酸酵素などの、本出願の抗体をコードする核酸を取り込む能力を有する細胞の同定を可能にするものである。
【０３９１】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全形質転換体を培養することによって識別される。野生型ＤＨＦＲを利用するときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０３９２】
あるいは、ＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーをコードするポリペプチドによって、形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８などの選択剤を選択マーカーとして含有する培地中での細胞増殖によって選択できる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
ｄ）プロモーター要素
【０３９３】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含む。実質的に全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位よりも約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点よりも７０〜８０塩基上流にある別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核の３’末端は、コード配列の３’末端にポリアデニン鎖を付加するシグナルであり得る、ＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全てを、真核発現ベクターに挿入してよい。
【０３９４】
原核宿主での使用に好適な他のプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知の細菌性プロモーターが好適である。細菌系で使用するプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに操作可能に連結されるシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含むであろう。
【０３９５】
哺乳類宿主細胞中でのベクター由来のポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、得られるプロモーターによって制御されるが、これらのプロモーターが宿主細胞系に適合していることを条件とする。
【０３９６】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点も含むＳＶ４０制限酵素断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限酵素断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用する哺乳類宿主中でＤＮＡを発現する系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの変法が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下における、マウス細胞中でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。別の方法としては、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復を、プロモーターとして使用できる。
ｅ）エンハンサー構成要素
【０３９７】
高等真核生物による本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が、現在では既知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例として、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化に対するエンハンサー要素については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーを、ポリペプチドコード配列の５’又は３’の位置でベクター内にスプライスしてよいが、好ましくはプロモーターの５’側に位置付ける。
ｆ）転写終結要素
【０３９８】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含むであろう。このような配列は、通常は５’に、時折３’に存在する、真核生物又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの非翻訳領域である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中に、ポリアデニル化フラグメントとして翻訳されたヌクレオチド部分を含む。１つの有用な転写終結コンポーネントは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びその明細書に開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
【０３９９】
本明細書のベクター中でＤＮＡをクローニング又は発現するために好適な宿主細胞として、脊椎動物宿主細胞などの本明細書に記載される高等真核生物細胞が挙げられる。培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は、一般的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児性腎臓株（２９３、又は懸濁培養での増殖に対してサブクローンされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及び、ヒト幹細胞種株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０４００】
宿主細胞を、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質産生のための上記発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養する。
ｈ）宿主細胞の培養
【０４０１】
本出願のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の産生に使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてよい。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。更に、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；又は同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；同第８７／００１９５号；又は米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号に記載される培地のうち任意のものを、宿主細胞の培養培地として使用してよい。これらの培地のうち任意のものに、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常はマイクロモルオーダーの最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を添加してもよい。任意のその他必要とされる添加物を、当業者に既知である適切な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞においてこれまで使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
ｉ）タンパク質の精製
【０４０２】
組み換え手法を用いる場合、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質は、細胞内、ペリプラズム領域内で産生されても、又は、培地中に直接分泌されてもよい。ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を細胞内で産生する場合、第１の工程として、微粒子残渣、宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれかを、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌のペリプラズム領域に分泌された抗体を単離する方法を説明している。簡潔に言うと、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分かけて細胞ペーストを解凍する。細胞残渣を、遠心分離によって除去してよい。ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が培地中に分泌される場合、通常はまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いて、その発現系の上清を濃縮する。タンパク質分解を阻害するため、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の工程のいずれかに含めてよく、外来混入生物の増殖を阻害するため、抗生物質を含めてもよい。
【０４０３】
細胞から調製されたタンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製法である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、１、２、又は４本の重鎖を含むヒト免疫グロブリン系の抗体を精製できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが添加されているマトリックスは、ほとんどアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔が制御されたガラス又はポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速と、短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．））が精製に有用である。回収する抗体に応じて、タンパク質精製のためのその他手法、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も利用できる。
【０４０４】
任意の予備的精製工程に続いて、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質及び混入物質を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶出バッファーを用い、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてよい。
ＶＩ．製品及びキット
【０４０５】
ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−１融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗ＣＴＬＡ−４融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗Ａｎｇ２融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗ＴＮＦα融合タンパク質、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−１７Ａ融合タンパク質）、これらをコードする単離された核酸若しくはベクター、又は、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質をコードする単離された核酸若しくはベクターを含む単離された宿主細胞のうちいずれかを含む、キット及び製品が更に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物のうち任意の１つを含み、好ましくは使用説明書を提供するキットが提供される。
【０４０６】
本発明のキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージには、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージ（例えば、密閉Ｍｙｌａｒ又はプラスチック袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、場合により、緩衝材及び解釈的情報など追加構成要素を提供してよい。したがって、本願はまた、バイアル（密閉バイアルなど）、ボトル、ジャー、可撓性パッケージなどを含む製品を提供する。
【０４０７】
製品は、容器と、この容器上にある又はこの容器に付随したラベル又は添付文書と、を含むことができる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてよい。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患又は障害（例えば、癌）を治療するのに有効な組成物を保持するものであり、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈輸液バッグ又はバイアルであってよい）。ラベル又は添付文書は、組成物が、個体内の特定の状態を治療するために使用されることを表示する。ラベル又は添付文書は、組成物を個体に投与するための説明書を更に含むことになる。ラベルは、再溶解及び／又は使用に関する指示が示され得る。医薬組成物を保持する容器は、再溶解された製剤の繰り返し投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする、多回使用バイアルであってよい。添付文書は、治療用製品の商品パッケージに習慣的に含まれている、このような治療用製品の使用に関しての指示、使用法、投薬量、投与、禁忌及び／又は警告に関する情報を記載している説明書を参照する。加えて、製品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びブドウ糖液など、医薬上許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含んでよい。これは、他の緩衝液、希釈液、濾過器、針、及び注射器を含めて、商業上及び利用者の立場からの他の好ましい材料を更に含んでよい。
【０４０８】
本発明のいくつかの実施形態では、製品は、医薬組成物を眼に投与するための１つ以上の装置又は器具を更に含んでもよい。例えば、製品は、１本以上の針（例えば、２２、２５、２７、又はゲージ針）及び／又は１本以上の注射器（例えば、０．３、０．５、又は１．０ｍＬシリンジ）を含んでもよい。針又はシリンジ、又はその両方のいずれかは、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の単位用量形態を含む１つ以上の組成物を含有してもよい。例えば、製品は、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を含む組成物の所定の体積及び／又は量を含有する針又は注射器を含んでもよい。製品は、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の持続放出製剤（例えば、眼インプラント）を含有する針又は注射器を含んでもよい。針及び注射器は、互いに取り付けられてもよいが、必須ではない。針及び／又は注射器は、取り外し可能なキャップを備えてもよい。薬剤を投与するために使用される装置に予め充填された組成物のうちの１つ以上を提供することにより、信頼性、安全性、及び利便性を高めることができる。
【０４０９】
キット又は製品は、医薬組成物の複数回の単位用量と、使用説明書と、を含んでよく、例えば、院内薬局及び調剤薬局など薬局での保管及び使用に十分な量でパッケージ化される。
例示的な実施形態
【０４１０】
実施形態１．１）軽鎖を含む抗体と、２）ＶＥＧＦＲコンポーネントであって、抗体軽鎖のＣ末端に融合したＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む。抗体融合タンパク質。
【０４１１】
実施形態２．第１の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと、第２の抗体軽鎖のＣ末端に融合した第２のＶＥＧＦＲコンポーネントと、を含む、実施形態１に記載の抗体融合タンパク質。
【０４１２】
実施形態３．第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが同じである、実施形態２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４１３】
実施形態４．第１のＶＥＧＦＲコンポーネントと第２のＶＥＧＦＲコンポーネントが異なっている、実施形態２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４１４】
実施形態５．ＶＥＧＦＲコンポーネントが、第１のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ１のＩｇ様ドメイン２（Ｆｌｔ１ｄ２）を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４１５】
実施形態６．ＶＥＧＦＲコンポーネントが、第２のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１のＩｇ様ドメイン３（Ｆｌｋ１ｄ３）を更に含む、実施形態５に記載の抗体融合タンパク質。
【０４１６】
実施形態７．ＶＥＧＦＲコンポーネントが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載の抗体融合タンパク質。
【０４１７】
実施形態８．ＶＥＧＦＲコンポーネントが、第３のＶＥＧＦＲ  Ｆｌｋ１のＩｇ様ドメイン４（Ｆｌｋ１ｄ４）を更に含む、実施形態６又は７に記載の抗体融合タンパク質。
【０４１８】
実施形態９．ＶＥＧＦＲコンポーネントが少なくとも約４ｋＤａである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４１９】
実施形態１０．ＶＥＧＦＲコンポーネントとＶＥＧＦとの間の結合のＫＤが、約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４２０】
実施形態１１．ＶＥＧＦＲコンポーネントと抗体軽鎖のＣ末端がリンカーによって連結されている、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４２１】
実施形態１２．リンカーがペプチドリンカーである、実施形態１１に記載の抗体融合タンパク質。
【０４２２】
実施形態１３．リンカーが配列番号６又は７のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４２３】
実施形態１４．抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ由来分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｏｃｋ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−ＣＨ３、及び細胞内抗体からなる群から選択される、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４２４】
実施形態１５．抗体が軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）を含み、ＶＥＧＦＲコンポーネントが抗体ＣＬドメインのＣ末端に融合されている、実施形態１４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４２５】
実施形態１６．抗体が完全長抗体である、実施形態１４又は１５に記載の抗体融合タンパク質。
【０４２６】
実施形態１７．抗体がＩｇＧ抗体である、実施形態１６に記載の抗体融合タンパク質。
【０４２７】
実施形態１８．抗体が、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体、又はその変異体である、実施形態１７に記載の抗体融合タンパク質。
【０４２８】
実施形態１９．抗体が単一特異性である、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４２９】
実施形態２０．抗体が多重特異性である、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４３０】
実施形態２１．抗体が免疫チェックポイント分子を特異的に認識する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４３１】
実施形態２２．免疫チェックポイント分子が刺激性免疫チェックポイント分子である、実施形態２１に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３２】
実施形態２３．免疫チェックポイント分子が阻害性免疫チェックポイント分子である、実施形態２１に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３３】
実施形態２４．阻害性免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＣＤ７３からなる群から選択される、実施形態２３に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３４】
実施形態２５．阻害性免疫チェックポイント分子がＰＤ−１である、実施形態２４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３５】
実施形態２６．抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態２５に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３６】
実施形態２７．抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態２５又は２６に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３７】
実施形態２８．抗体融合タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態２７に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３８】
実施形態２９．抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態２５に記載の抗体融合タンパク質。
【０４３９】
実施形態３０．抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態２５又は２９に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４０】
実施形態３１．抗体融合タンパク質が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態３０に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４１】
実施形態３２．阻害性免疫チェックポイント分子がＰＤ−Ｌ１である、実施形態２４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４２】
実施形態３３．抗体が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態３２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４３】
実施形態３４．抗体が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態３２又は３３に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４４】
実施形態３５．抗体融合タンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態３４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４５】
実施形態３６．抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態３２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４６】
実施形態３７．抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態３２又は３６に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４７】
実施形態３８．抗体融合タンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態３７に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４８】
実施形態３９．阻害性免疫チェックポイント分子がＣＴＬＡ−４である、実施形態２４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４４９】
実施形態４０．抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態３９に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５０】
実施形態４１．抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態３９又は４０に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５１】
実施形態４２．抗体融合タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態４１に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５２】
実施形態４３．抗体が腫瘍抗原を特異的に認識する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４５３】
実施形態４４．腫瘍抗原がＨＥＲ２である、実施形態４３に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５４】
実施形態４５．抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態４４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５５】
実施形態４６．抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態４４又は４５に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５６】
実施形態４７．抗体融合タンパク質が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６、２７、又は２８のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態４６に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５７】
実施形態４８．腫瘍抗原がＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）である、実施形態４３に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５８】
実施形態４９．抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態４８に記載の抗体融合タンパク質。
【０４５９】
実施形態５０．抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態４８又は４９に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６０】
実施形態５１．抗体融合タンパク質が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態５０に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６１】
実施形態５２．抗体が血管新生因子を特異的に認識する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質。
【０４６２】
実施形態５３．血管新生因子がアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）である、実施形態５２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６３】
実施形態５４．抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態５３に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６４】
実施形態５５．抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態５３又は５４に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６５】
実施形態５６．抗体融合タンパク質が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態５５に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６６】
実施形態５７．血管新生因子がＴＮＦαである、実施形態５２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６７】
実施形態５８．抗体が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態５７に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６８】
実施形態５９．抗体が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態５７又は５８に記載の抗体融合タンパク質。
【０４６９】
実施形態６０．抗体融合タンパク質が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態５９に記載の抗体融合タンパク質。
【０４７０】
実施形態６１．血管新生因子がＩＬ−１７Ａである、実施形態５２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４７１】
実施形態６２．抗体が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む、実施形態６１に記載の抗体融合タンパク質。
【０４７２】
実施形態６３．抗体が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、実施形態６１又は６２に記載の抗体融合タンパク質。
【０４７３】
実施形態６４．抗体融合タンパク質が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、を含む、実施形態６３に記載の抗体融合タンパク質。
【０４７４】
実施形態６５．実施形態１〜６４のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０４７５】
実施形態６６．癌を有する個体を治療する方法であって、有効量の実施形態６５に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
【０４７６】
実施形態６７．癌が固形腫瘍である、実施形態６６に記載の方法。
【０４７７】
実施形態６８．癌が、肺癌、肝癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は膀胱癌である、実施形態６７に記載の方法。
【０４７８】
実施形態６９．追加の癌療法を個体に供することを更に含む、実施形態６６〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４７９】
実施形態７０．医薬組成物が全身的に投与される、実施形態６６〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０４８０】
実施形態７１．医薬組成物が静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される、実施形態７０に記載の方法。
【０４８１】
実施形態７２．医薬組成物が局所的に投与される、実施形態６６〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０４８２】
実施形態７３．医薬組成物が腫瘍内に投与される、実施形態７２に記載の方法。
【０４８３】
実施形態７４．非腫瘍性疾患を有する個体を治療する方法であって、有効量の実施形態６５に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
【０４８４】
実施形態７５．非腫瘍性疾患がＶＥＧＦ過剰発現と関連する、実施形態７４に記載の方法。
【０４８５】
実施形態７６．非腫瘍性疾患が、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管腫、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性炎症、及び眼内新生血管障害から選択される、実施形態７４又は７５に記載の方法。
【０４８６】
実施形態７７．医薬組成物が全身的に投与される、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０４８７】
実施形態７８．医薬組成物が静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される、実施形態７７に記載の方法。
【０４８８】
実施形態７９．非腫瘍性疾患が眼内新生血管障害である、実施形態７４〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０４８９】
実施形態８０．眼内新生血管障害が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）又は糖尿病性網膜症である、実施形態７９に記載の方法。
【０４９０】
実施形態８１．眼内新生血管障害がＡＭＤである、実施形態８０に記載の方法。
【０４９１】
実施形態８２．眼内新生血管障害が、脈絡膜新血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫と関連する、実施形態８０又は８１に記載の方法。
【０４９２】
実施形態８３．医薬組成物の投与が、点眼、結膜下注入、結膜下移植、硝子体内注入、硝子体内移植、テノン嚢下注入、及びテノン嚢下移植のうちの１つから選択される、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０４９３】
実施形態８４．医薬組成物が硝子体内注入によって投与される、実施形態８３に記載の方法。
【０４９４】
実施形態８５．個体がヒトである、実施形態６６〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０４９５】
実施形態８６．実施形態１〜６４のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質をコードしている、単離された核酸。
【０４９６】
実施形態８７．実施形態８６に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【０４９７】
実施形態８８．実施形態８６に記載の単離された核酸、又は実施形態８７に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【０４９８】
実施形態８９．実施形態１〜６４のいずれか１つに記載の抗体融合タンパク質、実施形態８６に記載の単離された核酸、実施形態８７に記載のベクター、又は実施形態８８に記載の単離された宿主細胞を含む、キット。
【０４９９】
実施形態９０．抗体融合タンパク質の製造方法であって、（ａ）実施形態８６に記載の単離された核酸若しくは実施形態８７に記載のベクターを含む宿主細胞、又は、実施形態８８に記載の単離された宿主細胞を、抗体融合タンパク質の発現に有効な条件下で培養することと、（ｂ）当該宿主細胞から発現した抗体融合タンパク質を得ることと、を含む、方法。
【０５００】
実施形態９１．工程（ａ）が、実施形態８６に記載の単離された核酸又は実施形態８７に記載のベクターを含む、宿主細胞を産生することを更に含む、実施形態９０に記載の方法。
【実施例】
【０５０１】
以下の実施例は、本発明の純粋な例示であると意図されるものであり、したがって、本発明をいかなる方法でも制限しないと見なすべきである。以下の実施例及び詳細な説明は例証のために提供され、それらには限定されない。
実施例１：ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質の構築
【０５０２】
ＶＥＧＦ−トラップ（アフリベルセプト）は、ＶＥＧＦＲ−１のＩｇ様ドメイン２−ＶＥＧＦＲ−２の−Ｉｇ様ドメイン３（Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３）キメラ融合を、ＩｇＧのＦｃフラグメントのＮ末端に含む（以下、「ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ」と称する）。このＶＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質は、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ中和抗体、５０ｐＭ）よりも高い親和性（０．５ｐＭ）でＶＥＧＦを捕捉することができる。
【０５０３】
ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を構築するために、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３融合アミノ酸配列（２１１ａａ）をアフリベルセプトから誘導し、任意のペプチドリンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６；「（Ｇ４Ｓ）３」又は「ＧＳ３」）、又は（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号７；「（Ｇ４Ｓ）６」又は「ＧＳ６」）を介して、表３に記載される様々な抗体の軽鎖のＣ末端に融合させた。次いで、この構築物をＣＨＯ細胞で発現させ、精製した。
【表３】
2020536967.tif 000006
実施例２：ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質における結合親和性及びＡＤＣＣの試験
材料
【０５０４】
６×Ｈｉｓタグを有するヒトＶＥＧＦ１２１／ＶＥＧＦ−Ａタンパク質（ヒトＶＥＧＦ  １２１アイソフォーム（Ｐ１５６９２−９）（１２１アミノ酸、Ａｌａ２７−Ａｒｇ１４７））（カタログ＃１０００８−ＨＮＡＢ）、及び、Ｃ末端に融合したポリヒスチジンタグを有するヒトＨＥＲ２タンパク質（ヒトＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン（ＮＰ＿００４４３９．２）、６４１アミノ酸、Ｔｈｒ２３−Ｔｈｒ６５２）（カタログ＃１０００４−Ｈ０８Ｈ）を、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＴＮＦα、Ａｎｇ２、及びＩＬ−１７Ａタンパク質は全て購入した。Ｈｉｓタグ抗体（捕捉抗体）をＱｉａｇｅｎから購入した。ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体（二次抗体）は、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈから購入した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（免疫等級（商標））をＢｒａｎｄＴｅｃｈから購入した。
ＥＬＩＳＡ系結合アッセイ
【０５０５】
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、室温（ＲＴ）にて一晩、１００μＬのＨｉｓタグ抗体（捕捉抗体、０．４μｇ／ｍＬ）でコーティングした。コーティングされたプレートを洗浄緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で３回洗浄し、洗浄緩衝液中３％ＢＳＡを用いて、ＲＴで２時間ブロッキングした。３回洗浄した後、これらのプレートを、ＶＥＧＦ１２１タンパク質（０．４μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ１２１を含有する洗浄緩衝液中３％ＢＳＡ）、又は、完全長抗体によって認識され得る標的タンパク質（０．４μｇ／ｍＬの標的タンパク質、例えば、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ−４、又はＰＤ−１などを含有する洗浄緩衝液中３％ＢＳＡ）でコーティングし、ＲＴで２時間インキュベートした。３回洗浄後、３％ＢＳＡを含有する洗浄緩衝液中の様々な濃度のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質を、コーティングされたプレートに添加し、ＲＴで２時間インキュベートさせた。アフリベルセプト（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質）及び対応する親完全長抗体を陽性対照として含めた。例えば、トラスツズマブ（例えば、ハーセプチン（登録商標））を、Ｈｅｒ２／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１、Ｈｅｒ２／ＬＣ−ＧＳ３−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１、及びＨｅｒ２／ＬＣ−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１に対する陽性抗ＨＥＲ２抗体対照として使用し、ペンブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））を、ｍＰＤ−１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４に対する陽性抗ＰＤ−１抗体対照として使用し、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））を、ｔＰＤ−Ｌ１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ｎＩｇＧ１等の陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として使用した。３回洗浄後、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体（二次抗体）を添加し（洗浄緩衝液中３％ＢＳＡで１：６０００に希釈）、ＲＴで２時間インキュベートした。４回洗浄後、各ウェルに１００μＬのＨＲＰ基質を添加した。２０分間進行させた後、各ウェルに停止緩衝液を添加した。各ウェルの吸光度（ＯＤ）を、４５０ｎｍのマイクロプレートリーダーを使用して直ちに測定した。ＯＤ＞２．０の場合、ＥＣ５０を計算したが、そうでなければ、ＥＣ５０を計算しなかった。
【０５０６】
表４から分かるように、ＶＥＧＦＲコンポーネントと軽鎖との間のリンカーを有するＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２軽鎖融合タンパク質（Ｈｅｒ２／ＬＣ−ＧＳ３−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１、Ｈｅｒ２／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１）は、陽性対照である抗ＨＥＲ２のハーセプチン（登録商標）と同様のＨＥＲ２への結合と、陽性対照であるアフリベルセプト（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ）と同様のＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ１２１）への結合を示した。より長いリンカー（ＧＳ６とＧＳ３を比較）は、ＶＥＧＦＲコンポーネントと完全長抗体との間の豊富な空間が、各結合部分を適切に機能させることに恐らくは起因して、ＶＥＧＦと、親完全長抗体（ＨＥＲ２）によって認識される抗原の両方に対するより良好な結合を付与すると思われる。リンカーを含まないＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２軽鎖融合タンパク質（Ｈｅｒ２／ＬＣ−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１）は、ハーセプチン（登録商標）と同様のＨＥＲ２に対する結合親和性を依然として維持していたが、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ１２１）への結合は有意に減少し（「検出されず」）、リンカー（及び／又はリンカー長）がＶＥＧＦＲコンポーネントのＶＥＧＦへの適切な結合に重要であることを示す。
【表４】
2020536967.tif 000007
【０５０７】
ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合が、ハーセプチン（登録商標）以外の他のＩｇＧ１治療用抗体に適用されるかどうかを判定するために、いくつかのＩｇＧ１系モノクローナル抗体を、軽鎖のＣ末端でＦｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３と融合させた（親抗体及び構築物名については実施例１参照）。アフリベルセプト（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ）を陽性ＶＥＧＦ結合対照として使用した。表５から分かるように、全てのＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ１抗体軽鎖融合タンパク質は、親ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（アフリベルセプト）と同様のＶＥＧＦに対する結合親和性を示し、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合が、異なるＩｇＧ１系治療用抗体に適用されることを示唆している。
【表５】
2020536967.tif 000008
【０５０８】
ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合が、ＩｇＧ４系治療用抗体、例えば、抗ＰＤ−１（ペンブロリズマブ、例えば、キイトルーダ（登録商標）、又はニボルマブ、例えば、オプジーボ（登録商標））及び抗ＩＬ−１７Ａ（イキセキズマブ、例えば、トルツ（登録商標））に適用されるかどうかを判定するために、ＩｇＧ４系モノクローナル抗体を、軽鎖のＣ末端でＦｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３と融合させた（親抗体及び構築物名については実施例１参照）。表６から分かるように、ｍＰＤ−１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４、ｂＰＤ−１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４、及びＩＬ−１７Ａ／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４は全て、アフリベルセプト（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ）と同様のＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ１２１）に対する結合親和性を示した。ｍＰＤ−１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４及びｂＰＤ−１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４は、親完全長抗体である、それぞれペンブロリズマブ及びニボルマブと同様のＰＤ−１に対する結合親和性を示した。ＩＬ−１７Ａ／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ４は、親完全長抗体であるイキセキズマブと同様のＩＬ−１７Ａに対する結合親和性を示した。
【表６】
2020536967.tif 000009
【０５０９】
治療用ＩｇＧは、Ｆｃエフェクター機能、例えばＡＤＣＣを低減するためにＦｃ領域内で突然変異することがある。例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））がＮ−グリコシル化部位（Ｎ２１９Ａ）で変異し、脱グリコシル化ＩｇＧ１が得られる一方で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体デュルバルマブ（例えば、イミフィンジ（商標））の３つのアミノ酸（Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３４Ａ及びＦ２８９Ａ）が変異し、Ｆｃエフェクター機能が最小化する。これらのＩｇＧ突然変異のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質への影響を試験するため、Ｆｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３を、アテゾリズマブ（ｔＰＤ−Ｌ１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ｎＩｇＧ１）又はデュルバルマブ（ａＰＤ−Ｌ１／ＬＣ−ＧＳ６−ＶＥＧＦＲ−ｍＩｇＧ１）のいずれかの軽鎖のＣ末端に融合した。表７から分かるように、Ｆｃ領域における変異は、ＶＥＧＦＲ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖融合タンパク質のＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ１２１）又はＰＤーＬ１のいずれかへの結合に影響を与えなかった（ＶＥＧＦ−Ｆｃ及び対応する親抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較）。
【表７】
2020536967.tif 000010
ＡＤＣＣ試験
【０５１０】
次に、ＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質が、それらの親完全長抗体と同様のＦｃエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣを示すかどうかを調べた。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持するよう開発された、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞株（Ｈｅｒ２陽性）を標的細胞として使用した。ＣＤ１６＋ＮＫ９２細胞をエフェクター細胞として使用した。ＮＫ９２細胞（〜６，０００個の細胞）及びＳＫＢＲ３細胞（〜２，０００個の細胞、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む）の混合物５０μＬを、Ｖ字形の９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。混合物を遠心分離して、３Ｄ腫瘍（乳癌）の形成を可能にできる。次に、様々な濃度のＶＥＧＦＲ−抗体軽鎖融合タンパク質又は対照（アフリベルセプト又はハーセプチン（登録商標））を含有する５０μＬの培養培地を各ウェルに添加し、ＲＴで２４時間インキュベートした。次いで、マイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルのルシフェラーゼ活性（ＯＤ）を測定した。抗体又はＶＥＧＦＲ−Ｆｃを添加していない細胞混合物のルシフェラーゼ活性を対照として提供した（１００％細胞生存率）。ＥＣ５０（ＡＤＣＣ活性を表す）を計算した。表８から分かるように、このアッセイにおけるハーセプチンのＥＣ５０（８．６ｎＭ）は、他の研究で報告されたもの（３７３．９ｎＭ）よりも１０倍低く、このＡＤＣＣ試験の感度が高いこと示している。全てのＶＥＧＦＲ−抗ＨＥＲ２軽鎖融合タンパク質は、親ハーセプチン（登録商標）抗体と同様のＡＤＣＣ活性を保持した（表８）。
【表８】
2020536967.tif 000011
【０５１１】
要約すると、上記実施例は、ＶＥＧＦＲコンポーネントをＩｇＧの軽鎖のＣ末端に融合でき、ＶＥＧＦ及び親ＩｇＧによって認識される抗原の両方に対して高い結合親和性を保持できることを実証した。
配列表
配列番号１（リンカーアミノ酸配列、ｎは少なくとも１の整数）
（Ｇ）ｎ
配列番号２（リンカーアミノ酸配列、ｎは少なくとも１の整数）
（ＧＳ）ｎ
配列番号３（リンカーアミノ酸配列、ｎは少なくとも１の整数）
（ＧＳＧＧＳ）ｎ
配列番号４（リンカーアミノ酸配列、ｎは少なくとも１の整数）
（ＧＧＧＧＳ）ｎ
配列番号５（リンカーアミノ酸配列、ｎは少なくとも１の整数）
（ＧＧＧＳ）ｎ
配列番号６（ＧＳ３リンカーアミノ酸配列）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号７（ＧＳ６リンカーアミノ酸配列）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号８（ＶＥＧＦＲコンポーネントアミノ酸配列）
ＴＧＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＰＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＦＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＬＳＰＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫ
配列番号９（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＴＧＷＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１０（イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）軽鎖アミノ酸配列）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＴＹＧＡＦＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化１】
2020536967.tif 000012
配列番号１２（ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＲＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１３（ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）軽鎖アミノ酸配列）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化２】
2020536967.tif 000013
配列番号１５（ニボルマブ（抗ＰＤ−１）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＷＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＲＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１６（ニボルマブ（抗ＰＤ−１）軽鎖アミノ酸配列）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化３】
2020536967.tif 000014
配列番号１８（アテゾリズマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１９（アテゾリズマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）軽鎖アミノ酸配列）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化４】
2020536967.tif 000015
配列番号２１（デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＧＷＦＧＥＬＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２２（デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）軽鎖アミノ酸配列）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化５】
2020536967.tif 000016
配列番号２４（トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２５（トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）軽鎖アミノ酸配列）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化６】
2020536967.tif 000017
【化７】
2020536967.tif 000018
【化８】
2020536967.tif 000019
配列番号２９（セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３０（セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）軽鎖アミノ酸配列）
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＴＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化９】
2020536967.tif 000020
配列番号３２（アダリムマブ（抗ＴＮＦα）重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３３（アダリムマブ（抗ＴＮＦα）軽鎖アミノ酸配列）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化１０】
2020536967.tif 000021
配列番号３５（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ（抗Ａｎｇ２）重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＤＩＨＷＶＲＱＡＴＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＰＡＧＤＴＹＹＰＧＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＧＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＩＴＦＧＧＬＩＡＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ（抗Ａｎｇ２）軽鎖アミノ酸配列）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＴＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＹＤＮＳＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化１１】
2020536967.tif 000022
配列番号３８（イキセキズマブ（抗ＩＬ−１７Ａ）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＨＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＭＹＧＴＴＤＹＮＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＤＹＦＴＧＴＧＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号３９（イキセキズマブ（抗ＩＬ−１７Ａ）軽鎖アミノ酸配列）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＲＳＬＶＨＳＲＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＩＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【化１２】
2020536967.tif 000023
配列番号４１（シグナルペプチドアミノ酸配列）
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ
配列番号４２（シグナルペプチドアミノ酸配列）
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ
配列番号４３（シグナルペプチドアミノ酸配列）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号４４（リンカーアミノ酸配列、ｎは少なくとも１の整数）
（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳ）ｎ
【図１】
2020536967.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2020536967000001.app
【国際調査報告】
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