(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−１５又は機能的断片を含む１つのドメインと、ＩＬ−１２又はＩＬ−１８に特異的な結合ドメインとを有する多重特異的融合タンパク質複合体を特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
第１可溶性タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、及び第２可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、
前記第１又は第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片をさらに含み、
前記第１又は第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２結合ドメイン又はその機能的断片をさらに含み、
前記第１可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、前記第２可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項２】
前記ＩＬ−１５ポリペプチドは、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３】
前記ＩＬ−１２結合ドメインは、ＩＬ−１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項４】
ＩＬ−１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、可撓性ポリペプチドリンカーによって一本鎖フォーマット内に連結されている、請求項３に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項５】
前記第１可溶性タンパク質は、配列番号２又は６の１つに規定されたアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項６】
前記第２可溶性タンパク質は、配列番号４又は８の１つに規定されたアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項７】
請求項１に記載の第２可溶性融合タンパク質複合体に共有結合されている、請求項１に記載の第１可溶性融合タンパク質複合体を含む可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項８】
前記第１可溶性融合タンパク質複合体は、前記第１可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを前記第２可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインに連結するジスルフィド結合によって前記第２可溶性融合タンパク質複合体に共有結合されている、請求項７に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項９】
前記第１又は第２可溶性タンパク質は、疾患抗原及び／又は免疫チェックポイント若しくはシグナル伝達分子に結合する結合ドメインをさらに含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１０】
前記疾患抗原は、新生物又は感染性疾患に関連している、請求項９に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１１】
請求項５に記載の第１可溶性タンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号１又は５の１つに規定された配列を含む核酸配列。
【請求項１２】
前記可溶性タンパク質をコードする前記配列に機能的に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む、請求項１１に記載の核酸配列。
【請求項１３】
請求項６に記載の第２可溶性タンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号３又は７の１つに規定された配列を含む核酸配列。
【請求項１４】
前記可溶性タンパク質をコードする前記配列に機能的に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む、請求項１３に記載の核酸配列。
【請求項１５】
請求項１１及び／又は請求項１３に記載の核酸配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項１６】
免疫機能を増強するための方法であって、
ａ）複数の細胞を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、前記複数の細胞は、前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインに結合するＩＬ−１５Ｒ鎖、前記ＩＬ−１２ドメインに結合するＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又は前記ＩＬ−１８ドメインに結合するＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、
ｂ）前記ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して前記免疫細胞を活性化する工程と
を含む方法。
【請求項１７】
標的細胞を殺傷するための方法であって、
ａ）複数の細胞を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、前記複数の細胞は、前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインに結合するＩＬ−１５Ｒ鎖、前記ＩＬ−１２ドメインに結合するＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又は前記ＩＬ−１８ドメインに結合するＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞と、標的疾患細胞とをさらに含む、工程と、
ｂ）前記ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して前記免疫細胞を活性化する工程と、
ｃ）前記活性化免疫細胞によって前記標的疾患細胞を殺傷する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
前記標的細胞は、腫瘍細胞又は感染細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象における免疫応答を増強する方法であって、
ａ）複数の細胞を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、前記複数の細胞は、前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインに結合するＩＬ−１５Ｒ鎖、前記ＩＬ−１２ドメインに結合するＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又は前記ＩＬ−１８ドメインに結合するＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、
ｂ）前記ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して前記免疫細胞を活性化する工程と、
ｃ）前記活性化免疫細胞を患者に投与する（又は養子移入する）工程と、
ｄ）前記患者における免疫応答を増強する工程と
を含む方法。
【請求項２０】
患者における疾患を予防又は治療する方法であって、
ａ）複数の細胞を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、前記複数の細胞は、前記ＩＬ−１５ドメインに結合するＩＬ−１５Ｒ鎖、前記ＩＬ−１２ドメインに結合するＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又は前記ＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、
ｂ）前記ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して前記免疫細胞を活性化する工程と、
ｃ）有効量の前記活性化免疫細胞を前記患者に投与する（又は養子移入する）工程と、
ｄ）前記患者における前記疾患を予防又は治療するために十分な前記活性化免疫細胞を介して疾患細胞を損傷又は殺傷する工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記疾患は、新生物又は感染性疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象における免疫応答を増強する方法であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２３】
新生物又は感染性疾患の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより前記新生物又は感染性疾患を治療する工程を含む方法。
【請求項２４】
前記新生物は、膠芽腫、前立腺癌、血液学的癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び扁平上皮頭頚部癌からなる群から選択される、請求項２１又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫細胞は、ＮＫ細胞又はサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記活性化免疫細胞の前記有効量は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０１０細胞／ｋｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞は、少なくとも週１回投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記有効量は、前記融合タンパク質複合体の約１〜１００μｇ／ｋｇである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記融合タンパク質複合体は、少なくとも週１回投与される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質複合体は、免疫細胞増殖、活性化マーカー、標的細胞に対する細胞傷害性及び／又はＩＦＮ−γを含む前炎症性サイトカインの産生を増加させる、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
第１及び第２可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
前記第１可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、
前記第２可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されており、及び
前記第１可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、前記第２可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３２】
ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含む単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３３】
前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である、請求項３２に記載の単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３４】
免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されている、単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３５】
第１及び第２可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
前記第１可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に融合されており、
前記第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１８ドメインに融合されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、
前記第１可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、前記第２可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３６】
第１及び第２可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
前記第１可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２結合ドメイン又はその機能的断片に融合されており、
前記第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２ドメインに融合されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、
前記第１可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、前記第２可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３７】
前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である、請求項３５又は３６に記載の単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３８】
インターロイキン−１５ポリペプチドドメイン、第１及び第２可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
前記第１可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されており、
第２可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されており、
前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、前記第１及び／又は第２可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質。
【請求項３９】
免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）、第１及び第２可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質であって、
前記第１可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５ポリペプチドドメインを含み、及び
第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５ポリペプチドドメインを含み、
前記第１及び／又は第２可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質。
【請求項４０】
前記ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である、請求項３８又は３９に記載の単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１７年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，６２３号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、概して、多量体融合分子の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載した本発明以前には、免疫応答を増強して新生物又は感染性疾患を有する患者に治療利益を提供するための新たな戦略を開発することが急務であった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、少なくとも一部には、多重特異的インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）系融合タンパク質複合体が免疫細胞の刺激を強化し、疾患細胞に対するその活性を促進し、それにより結果として疾患の低減又は予防を生じさせるという驚くべき発見に基づく。これらのＩＬ−１５系融合タンパク質複合体は、疾患及び標的抗原への結合の増加も示し得る。本明細書では、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８結合ドメインを含む多重特異的ＩＬ−１５系融合タンパク質複合体が提供される（図１Ａ、１Ｂ）。詳細には、本明細書で記載するのは、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃスカフォールド（骨格）を含む融合タンパク質複合体である。下記で詳細に記載するように、ヒト免疫細胞を使用して特性解析すると、これらの融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８サイトカインのそれぞれの結合活性及び生物活性を示す。さらに、これらの融合タンパク質複合体は、活性化マーカーの上昇、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増加及びＩＦＮ−γの産生の増強を伴ってサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を誘導する。
【０００５】
したがって、単一分子としての融合タンパク質複合体は、以前には複数の個別サイトカインの組み合わせを用いた場合にのみ観察された応答を提供するために、ＮＫ細胞上の複数のサイトカイン受容体に結合して、それらを介してシグナルを発する。さらに、これらの融合タンパク質複合体は、可溶性マルチポリペプチド複合体を提供し、精製の目的でプロテインＡを結合し、ＮＫ細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体と相互作用するために二量体を形成できるＩｇ分子のＦｃ領域を含み、それにより個別サイトカインの組み合わせ中に存在しない利点を融合タンパク質複合体に提供する。本明細書では、臨床グレード物質を大規模生産するために好適なこれらの融合タンパク質複合体を作成するための哺乳動物細胞発現に基づく方法が記載される。本発明の融合タンパク質複合体によって誘導されるＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を作成及び使用するための追加の方法も提供される。
【０００６】
したがって、少なくとも２種の可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体が提供される。例えば、第１タンパク質は、ＩＬ−１５ポリペプチド、例えばＮ７２Ｄ突然変異を含む変異ＩＬ−１５ポリペプチド（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含む。第２タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）に融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む。単離された可溶性融合タンパク質複合体の第３成分は、ＩＬ−１２の結合ドメインを含み、ここで、ＩＬ−１２結合ドメインは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質のいずれかに融合されている。単離された可溶性融合タンパク質複合体の第４成分は、ＩＬ−１８の結合ドメインを含み、ここで、ＩＬ−１８結合ドメインは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質のいずれかに融合されている。一部の場合、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８結合ドメインは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質の両方に融合されている。他の場合、ＩＬ−１２又はＩＬ−１８結合ドメインのいずれかは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質に融合されており、別の結合ドメインは、他のタンパク質に融合されている。他の場合、この複合体は、ＩＬ−１２を含まないＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃスカフォールドに融合されたＩＬ−１８結合ドメイン又はＩＬ−１２を含まないＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃスカフォールドに融合されたＩＬ−１８結合ドメインを含む。融合は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端で作成され得る。ＩＬ−１２タンパク質は、ｐ４０及びｐ３５のＩＬ−１２サブユニットのヘテロ二量体を含み得る。代わりに、ＩＬ−１２タンパク質は、ｐ４０及びｐ３５のサブユニットが可撓性ポリペプチドリンカーによって連結されている一本鎖フォーマットを含み得る。一本鎖ＩＬ−１２は、ｐ３５のＮ末端に連結されたｐ４０のＣ末端又はｐ４０のＮ末端に連結されたｐ３５のＣ末端のいずれかを含み得る。典型的な融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄに共有結合されたＩＬ−１８ポリペプチド及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質に共有結合された一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドを含む。代わりに、融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄに共有結合された一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチド及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質に共有結合されたＩＬ−１８ポリペプチドを含む（図１Ａ、１Ｂ）。
【０００７】
典型的な第１タンパク質は、配列番号２及び配列番号６に規定されたアミノ酸配列を含む。典型的な第２タンパク質は、配列番号４及び配列番号８に規定されたアミノ酸配列を含む。第１タンパク質をコードする典型的な核酸配列は、配列番号１及び配列番号５に規定された配列を含む。第２タンパク質をコードする典型的な核酸配列は、配列番号３及び配列番号７に規定された配列を含む。１つの態様では、核酸配列は、融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。また、本明細書に記載した核酸配列を含むＤＮＡベクターが提供される。例えば、その核酸配列は、複製、発現又はその両方のためのベクター内にある。
【０００８】
また、第２可溶性融合タンパク質複合体に共有結合された第１可溶性融合タンパク質複合体を含む可溶性融合タンパク質複合体が提供される。例えば、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、多量体化、例えば二量体化、三量体化又はさもなければ多量体化されている（例えば、四重複合体、五重複合体など）。例えば、多量体は、ホモ多量体又はヘテロ多量体である。可溶性融合タンパク質複合体は、共有結合、例えばジスルフィド結合、化学的架橋剤によって接合される。一部の場合、１種の可溶性融合タンパク質は、第１可溶性タンパク質のＦｃドメインを第２可溶性タンパク質のＦｃドメインに連結するジスルフィド結合によって別の可溶性融合タンパク質に共有結合されている。
【０００９】
Ｆｃドメイン又はその機能的断片には、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、ＩｇＡ  Ｆｃドメイン、ＩｇＤ  Ｆｃドメイン、ＩｇＥ  Ｆｃドメイン及びＩｇＭ  Ｆｃドメイン；マウスＩｇＧ２Ａドメイン又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦｃドメインが含まれる。任意選択的に、Ｆｃドメインには、変化した補体若しくはＦｃ受容体結合特性又は変化した二量体化若しくはグリコシル化プロファイルを備えるＦｃドメインを生じさせるアミノ酸変化が含まれる。変化した補体若しくはＦｃ受容体結合特性又は変化した二量体化若しくはグリコシル化プロファイルを備えるＦｃドメインを生成するアミノ酸変化は、当該技術分野において公知である。例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２の２３４位及び２３５位（抗体コンセンサス配列に基づくナンバリング）でのロイシン残基（すなわち．．．Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｇ  Ｇ．．．）のアラニン残基（すなわち．．．Ｐ  Ｅ  Ａ  Ａ  Ｇ  Ｇ．．．）との置換は、Ｆｃガンマ受容体結合の損失を生じさせる一方、ＩｇＧ１  ＣＨ２の３２２位（抗体コンセンサス配列に基づくナンバリング）でのリシン残基（すなわち．．．Ｋ  Ｃ  Ｋ  Ｓ  Ｌ．．．）のアラニン残基（すなわち．．．Ｋ  Ｃ  Ａ  Ｓ  Ｌ．．．）との置換は、補体活性化の損失を生じさせる。一部の例では、そのような突然変異は、組み合わされる。
【００１０】
一部の態様では、ＩＬ−１２又はＩＬ−１８結合ドメインは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５ポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合されている。同様に、ＩＬ−１２又はＩＬ−１８結合ドメインは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合されている。任意選択的に、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）は、ポリペプチドリンカー配列によってＦｃドメイン（又はその機能的断片）に共有結合されている。各ポリペプチドリンカー配列は、独立して選択され得る。任意選択的に、ポリペプチドリンカー配列は、同一である。代わりに、それらは、異なる。
【００１１】
任意選択的に、本発明の可溶性融合タンパク質複合体が提供され、ここで、可溶性融合タンパク質の少なくとも１つは、１つ以上の結合ドメイン又は検出可能な標識を含む。そのような結合ドメインは、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、リガンド、可溶性受容体ドメイン又はその機能的断片を含み得る。そのような結合ドメインを含むＩＬ−１５系融合タンパク質複合体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４９２，１１８号明細書に以前に記載されている。検出可能な標識には、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素若しくは触媒的に活性なその断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン若しくは蛍光分子、燐光分子若しくは化学発光分子又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【００１２】
本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を作成するための方法を提供する。本方法は、ａ）第１宿主細胞内に第１タンパク質をコードする適切な制御配列を備えるＤＮＡベクターを導入する工程と、ｂ）細胞又は培地中で第１タンパク質を発現させるために十分な条件下で培地中において第１宿主細胞を培養する工程と、ｃ）宿主細胞又は培地から第１タンパク質を精製する工程と、ｄ）第２宿主細胞内に第２タンパク質をコードする適切な制御配列を備えるＤＮＡベクターを導入する工程と、ｅ）細胞又は培地中で第２タンパク質を発現させるために十分な条件下で培地中において第２宿主細胞を培養する工程と、ｆ）宿主細胞又は培地から第２タンパク質を精製する工程と、ｇ）第１タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２タンパク質可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの結合を可能にするために十分な条件下で第１及び第２タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する工程とを含む。
【００１３】
一部の場合、本方法は、第１及び第２タンパク質を、発現ベクターから発現したポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするために十分な条件下で混合する工程をさらに含む。
【００１４】
代わりに、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を作成するための方法は、ａ）宿主細胞内に第１タンパク質をコードする適切な制御配列を備えるＤＮＡベクター及び第２タンパク質をコードする適切な制御配列を備えるＤＮＡベクターを導入する工程と、ｂ）細胞又は培地中でタンパク質を発現させ、第１タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２タンパク質可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能にするために十分な条件下で培地中において宿主細胞を培養して可溶性融合タンパク質複合体を形成する工程と、ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製する工程とによって実施される。
【００１５】
１つの態様では、本方法は、第１及び第２タンパク質を、発現ベクターから発現したポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするために十分な条件下で混合する工程をさらに含む。
【００１６】
また、可溶性融合タンパク質複合体を作成するための方法であって、ａ）宿主細胞内に第１及び第２タンパク質をコードする適切な制御配列を備えるＤＮＡベクターを導入する工程と、ｂ）細胞又は培地中でタンパク質を発現させ、第１タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能にして可溶性融合タンパク質複合体を形成するため、及びポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするために十分な条件下で培地中において宿主細胞を培養する工程と、ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製する工程とを含む方法も提供される。
【００１７】
任意選択的に、本方法は、第１及び第２タンパク質を、発現ベクターから発現したポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするために十分な条件下で混合する工程をさらに含む。
【００１８】
一部の場合、本方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又は臨床用試薬若しくは治療薬として使用するために好適な十分に純粋な融合タンパク質複合体を生成するために十分な他の標準方法（ウイルス不活化及び／又は濾過を含む）による融合タンパク質複合体の精製をさらに含む。
【００１９】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体の所定の態様では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書では、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）と称され、その変異体は、天然のアミノ酸、成熟配列におけるその位置及び変異アミノ酸を使用して称される。例えば、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄは、７２位でのＮからＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を指す。１つの態様では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の増加によって実証されるように、ＩＬ−１５アゴニストとして機能する。代わりに、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の減少によって実証されるように、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。
【００２０】
免疫機能を増強する方法は、ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程とによって実施される。１つの態様では、免疫機能を増強する方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒの少なくとも２つ又は全部の組み合わせのシグナル伝達を介した免疫細胞の活性化をさらに含む。免疫機能を増強するための典型的な方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介したＮＫ細胞の活性化を含む。そのような方法は、増加した活性化マーカー（すなわちＣＤ２５、ＣＤ６９）、罹患細胞の細胞傷害性の上昇又はＩＦＮ−γの産生の増加を生じさせるＮＫ細胞の活性化を含む。一部の態様では、方法には、本発明の可溶性融合タンパク質複合体によるＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の誘導が含まれる。
【００２１】
標的細胞を殺傷するための方法は、ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞及び標的疾患細胞をさらに含む、工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程と、ｃ）活性化免疫細胞によって標的疾患細胞を殺傷する工程とによって実施される。１つの態様では、本方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒの少なくとも２つ又は全部の組み合わせのシグナル伝達を介した免疫細胞の活性化を含む。典型的な方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介したＮＫ細胞、特にＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の活性化を含む。そのような方法は、活性化マーカー（すなわちＣＤ２５、ＣＤ６９）、標的細胞に対する細胞傷害性の上昇を生じさせるＮＫ細胞の活性化を含む。
【００２２】
本発明は、患者における疾患を予防又は治療するための方法であって、ａ）ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と混合する工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程と、ｃ）活性化免疫細胞を患者に投与する（又は養子移入する）工程と、ｄ）患者における疾患を予防又は治療するために十分な活性化免疫細胞を介して疾患細胞を損傷又は殺傷する工程とを含む方法も提供する。１つの態様では、本方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒの少なくとも２つ又は全部の組み合わせのシグナル伝達を介した免疫細胞の活性化を含む。典型的な方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介したＮＫ細胞、特にＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の活性化を含む。本方法の他の態様は、不死化免疫細胞、例えば移入前に照射され得る例えばＮＫ−９２、ａＮＫ、ｈａＮＫ又はｔａＮＫ細胞の使用を含む。本発明の一部の実施形態では、患者は、養子移入された細胞の移植又は生存を促進するために前治療又は予備状態調節される。予備状態調節の例には、シクロホスファミド及びフルダラビンを用いた治療が含まれる。さらに、患者は、細胞移入前及び／又は細胞移入後の養子移入された細胞の活性化、生存又は残存を促進する物質を用いて治療され得る。そのような治療の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＡＬＴ−８０３又は他の免疫賦活剤の使用が挙げられる。養子細胞療法の分野において公知の他の治療的アプローチ（すなわち同種細胞療法、自家細胞療法、半分一致（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）療法、ＤＬＩ療法、幹細胞療法、ＣＡＲ  Ｔ療法、ＮＫ９２系療法及びＣＡＲ  ＮＫ療法）も本明細書に記載の方法において使用され得る。
【００２３】
また、患者における疾患を予防又は治療するための方法であって、ａ）本発明の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与する工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して患者における免疫細胞を活性化する工程と、ｃ）患者における疾患を予防又は治療するために十分な活性化免疫細胞を介して疾患細胞を損傷又は殺傷する工程とを含む方法も提供される。
【００２４】
本発明の融合タンパク質複合体の投与は、患者において免疫応答を誘導する。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の投与は、新生物又は感染性疾患に関連する細胞に対する免疫応答を誘導する。１つの態様では、本発明の融合タンパク質複合体は、免疫細胞増殖、活性化マーカー、標的細胞に対する細胞傷害性及び／又は前炎症性サイトカインの産生を増加させる。
【００２５】
本発明は、哺乳物における免疫応答を、有効量の本発明の可溶性融合タンパク質複合体を哺乳動物に投与する工程によって刺激する方法を提供する。本発明は、哺乳物における免疫応答を、有効量の本発明の任意の１つの可溶性融合タンパク質複合体を哺乳動物に投与する工程によって抑制する方法も提供する。
【００２６】
新生物又は感染性疾患の治療を、それを必要とする対象において行うための方法は、本明細書に記載した可溶性融合タンパク質複合体を含む有効量の活性化免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与する工程によって実施される。例えば、固形悪性腫瘍又は血液学的悪性腫瘍の治療を、それを必要とする対象において行うための方法は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体によってエクスビボで活性化された有効量のＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を対象に投与し、それにより悪性腫瘍を治療する工程によって実施される。典型的な可溶性融合タンパク質複合体は、配列番号２及び配列番号６並びに配列番号４及び配列番号８に規定されたアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本明細書に記載した方法を用いた治療のために好適な新生物には、膠芽腫、前立腺癌、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃食道癌、頭頚部癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び頭頚部扁平上皮癌が含まれる。
【００２８】
本明細書に記載した方法を用いた治療にとって典型的な感染症には、ヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）による感染症が含まれる。本明細書に記載した方法は、細菌感染症（例えば、グラム陽性菌又はグラム陰性菌）を治療するためにも有用である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＯｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６：１２４−３１を参照されたい）。
【００２９】
本発明の細胞療法は、有効量の活性化免疫細胞の投与を含む。例えば、活性化ＮＫ細胞の有効量は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０１０細胞／ｋｇ、例えば１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０細胞／ｋｇであるか、又は白血球搬出法によって単離され得るような量である。代わりに、活性化免疫細胞は、一定量として又は体表面積（すなわち１ｍ２当たり）に基づいて投与される。細胞は、エクスビボ活性化後に投与され得るか、又は極低温で保存して解凍（及び必要に応じて洗浄）後に投与され得る。
【００３０】
融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、有効量で投与される。例えば、医薬組成物の有効量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、例えば１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００μｇ／ｋｇである。代わりに、融合タンパク質複合体は、一定量として又は体表面積（すなわち１ｍ２当たり）に基づいて投与される。
【００３１】
融合タンパク質複合体を含む養子移入された細胞又は医薬組成物は、少なくとも月に１回、例えば月に２回、週に１回、週に２回、１日１回、１日２回、８時間毎、４時間毎、２時間毎又は毎時間投与される。養子移入された免疫細胞のための好適な投与様式には、全身性投与、静脈内投与又は局所投与が含まれる。医薬組成物のための好適な投与様式には、全身性投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋内投与、腫瘍内投与、吸入及び腹腔内投与が含まれる。
【００３２】
１つの態様では、本開示は、少なくとも２種の可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体を提供し、ここで、第１可溶性タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、及び第２可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、第１又は第２可溶性タンパク質の一方は、ＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片をさらに含み、第１又は第２可溶性タンパク質の一方は、ＩＬ−１２結合ドメイン又はその機能的断片をさらに含み、第１可溶性タンパク質のＩＬ−１５ドメインは、第２可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性タンパク質複合体を形成する。
【００３３】
１つの実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。
【００３４】
１つの実施形態では、ＩＬ−１２結合ドメインは、ＩＬ−１２のｐ４０及びｐ３５のサブユニットを含む。１つの実施形態では、ＩＬ−１２のｐ４０及びｐ３５のサブユニットは、可撓性ポリペプチドリンカーによって一本鎖フォーマット内に連結される。
【００３５】
１つの実施形態では、第１可溶性タンパク質は、配列番号２又は６の１つに規定されたアミノ酸配列を含む。
【００３６】
１つの実施形態では、第２可溶性タンパク質は、配列番号４又は８の１つに規定されたアミノ酸配列を含む。
【００３７】
１つの実施形態では、第１可溶性融合タンパク質複合体は、第２可溶性融合タンパク質複合体に共有結合され得る。
【００３８】
１つの実施形態では、第１可溶性融合タンパク質複合体は、第１可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを第２可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインに連結するジスルフィド結合によって第２可溶性融合タンパク質複合体に共有結合されている。
【００３９】
１つの実施形態では、第１又は第２可溶性タンパク質は、疾患抗原を認識する結合ドメインをさらに含む。
【００４０】
１つの実施形態では、第１又は第２可溶性タンパク質は、免疫チェックポイント又はシグナル伝達分子を認識する結合ドメインをさらに含む。
【００４１】
１つの実施形態では、疾患抗原は、新生物又は感染性疾患と関連している。
【００４２】
１つの実施形態では、第１可溶性タンパク質は、配列番号１又は５に規定された配列によってコードされる。１つの実施形態では、核酸配列は、可溶性タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。
【００４３】
１つの実施形態では、第２可溶性タンパク質は、配列番号３又は７に規定された核酸配列によってコードされ得る。１つの実施形態では、核酸配列は、可溶性タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。
【００４４】
１つの実施形態では、ＤＮＡベクターは、上記に列挙した核酸配列のいずれかを含み得る。
【００４５】
１つの実施形態では、免疫機能を増強する方法であって、ａ）複数の細胞を上記の可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させる工程であって、複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程とを含む方法である。
【００４６】
１つの態様では、本開示は、標的細胞を殺傷するための方法であって、ａ）複数の細胞を上記の可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させる工程であって、複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞及び標的疾患細胞をさらに含む、工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程と、ｃ）活性化免疫細胞によって標的疾患細胞を殺傷する工程とを含む方法を提供する。
【００４７】
１つの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞又は感染細胞である。
【００４８】
１つの態様では、本開示は、対象における免疫応答を増強する方法であって、ａ）複数の細胞を上記の可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させる工程であって、複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程と、ｃ）活性化免疫細胞を患者に投与する（又は養子移入する）工程と、ｄ）患者における免疫応答を増強する工程とを含む方法を提供する。
【００４９】
１つの態様では、本開示は、患者における疾患を予防又は治療する方法であって、ａ）複数の細胞を可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−１２ドメインによって認識されるＩＬ−１２Ｒ鎖及び／又はＩＬ−１８ドメインによって認識されるＩＬ−１８Ｒ鎖を含む免疫細胞をさらに含む、工程と、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及び／又はＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞を活性化する工程と、ｃ）有効量の活性化免疫細胞を患者に投与する（又は養子移入する）工程と、ｄ）患者における疾患を予防又は治療するために十分な活性化免疫細胞を介して疾患細胞を損傷又は殺傷する工程とを含む方法を提供する。
【００５０】
１つの実施形態では、疾患は、新生物又は感染性疾患である。
【００５１】
１つの態様では、本開示は、対象における免疫応答を増強する方法であって、有効量の上記の可溶性融合タンパク質複合体の任意のものを患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００５２】
１つの態様では、本開示は、新生物又は感染性疾患の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、上記の可溶性融合タンパク質複合体のいずれかを含む有効量の医薬組成物を前記患者に投与し、それにより前記新生物又は感染性疾患を治療する工程を含む方法を提供する。
【００５３】
１つの実施形態では、新生物は、膠芽腫、前立腺癌、血液学的癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌及び食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び頭頚部扁平上皮癌からなる群から選択される。
【００５４】
１つの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞又はサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である。
【００５５】
１つの実施形態では、活性化免疫細胞の有効量は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０１０細胞／ｋｇである。
【００５６】
１つの実施形態では、免疫細胞は、少なくとも週に１回投与される。
【００５７】
１つの実施形態では、有効量は、前記有効タンパク質複合体の１〜１００μｇ／ｋｇである。
【００５８】
１つの実施形態では、融合タンパク質複合体は、少なくとも週に１回投与される。
【００５９】
１つの実施形態では、融合タンパク質複合体は、免疫細胞増殖、活性化マーカー、標的細胞に対する細胞傷害性及び／又はＩＦＮ−γを含む前炎症性サイトカインの産生を増加させる。
【００６０】
好ましくは、融合タンパク質複合体は、対象における疾患細胞又は腫瘍細胞を殺傷するためにインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血清中レベルを増加させ、且つ／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞並びにＮＫ細胞を刺激する。
【００６１】
他に特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。下記の参考文献は、本発明において使用する多数の用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特に規定しない限り、下記に帰せられる意味を有する。
【００６２】
「（薬）剤」は、ペプチド、核酸分子又は低分子化合物を意味する。
【００６３】
「ＴｘＭ」は、結合ドメインに連結されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃスカフォールドを含む融合タンパク質複合体を意味する（図１Ａ、１Ｂ）。典型的なＴｘＭは、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８サイトカインへの融合を含むＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ融合タンパク質複合体である。
【００６４】
「改善する」は、疾患の発症又は進行を低減させるか、抑制するか、弱めるか、縮小するか、阻止するか又は安定化させることを意味する。
【００６５】
「類似体」は、同一ではないが類似する機能的又は構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然型ポリペプチドの生物活性を保持する一方、天然型ポリペプチドと比較して類似体の機能を増強する所定の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えば、リガンド結合を変化させることなく類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性又は半減期を増加させ得る。類似体は、非天然アミノ酸を含み得る。
【００６６】
本発明は、抗体又はそのような抗体の断片が所望の生物活性を示す限りそれらを含む。また、本発明に含まれるのは、キメラ抗体、例えばヒト化抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該技術分野において記載された方法を使用して、齧歯類相補性決定領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域と置換する工程によって実施することができる。
【００６７】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を包含することが意図されている。好ましい抗体は、抗原と反応性のモノクローナル抗体である。用語「抗体」は、抗原と反応性である２種以上の抗体の混合物（例えば、抗原と反応性である様々なタイプのモノクローナル抗体のカクテル）を包含することも意図されている。用語「抗体」は、抗体全体、その生物学的に機能的な断片、一本鎖抗体及び２つ以上の種に由来する部分を含むキメラ抗体などの遺伝子改変抗体、二官能性抗体、抗体コンジュゲート、ヒト化抗体及びヒト抗体を包含することも意図されている。同様に使用できる生物学的官能性抗体断片は、抗原に十分に結合することができる、抗体に由来するそのペプチド断片である。本明細書で使用する「抗体」は、抗体全体及び関心対象のエピトープ、抗原又は抗原断片に結合することができる任意の抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むことが意図されている。
【００６８】
分子に「結合する」は、その分子に対する生理化学的親和性を有することを意味する。
【００６９】
用語「結合ドメイン」は、抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン又は当該技術分野において公知である他の抗原特異的ポリペプチドを包含することが意図されている。
【００７０】
本明細書で使用する用語「生物活性ポリペプチド」又は「エフェクター分子」は、本明細書で考察する所望の作用を生成できるアミノ酸配列、例えばタンパク質、ポリペプチド又はペプチド；糖又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質又はリポタンパク質を意味する。エフェクター分子には、化学薬品も含まれる。また、企図されるのは、生物活性若しくはエフェクタータンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするエフェクター分子核酸である。したがって、好適な分子には、調節因子、酵素、抗体又は薬物並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドが含まれる。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は、天然型であり得るか、又は公知の成分から例えば組み換え合成若しくは化学合成によって合成され得、異種成分を含み得る。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は、例えば、遠心分離又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの標準の分子サイジング技術によって判定されるように、一般に、約０．１〜１００ＫＤ以上〜約１，０００Ｋｄまで、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０〜５０ＫＤである。本発明の所望の作用には、限定されないが、例えば、増加した結合活性を備える本発明の融合タンパク質複合体を形成すること、例えば細胞増殖又は細胞死を誘導するために標的細胞を殺傷すること、疾患を予防又は治療する際に免疫応答を開始させるか又は診断目的で検出分子として作用することが含まれる。そのような検出のために、アッセイ、例えば細胞を増殖させるために細胞を培養する工程と、細胞を本発明の融合タンパク質複合体と接触させる工程と、次に融合タンパク質複合体が細胞の発達をさらに阻害するかどうかを評価する連続工程とを含むアッセイを使用し得る。
【００７１】
本発明に従ったエフェクター分子を本発明の融合タンパク質複合体に共有結合させる工程は、多数の有意な利点を提供する。公知の構造のペプチドを含む単一エフェクター分子を含有する本発明の融合タンパク質複合体を生成することができる。さらに、類似のＤＮＡベクター内で極めて様々なエフェクター分子を生成できる。すなわち、感染細胞及び疾患細胞を認識するために１ライブラリーの異なるエフェクター分子を融合タンパク質複合体に連結させることができる。さらに、治療適用のために、対象への本発明の融合タンパク質複合体の投与ではなく、融合タンパク質複合体のインビボ発現のために融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ発現ベクターを投与することができる。そのようなアプローチは、組み換えタンパク質の調製と典型的に関連する費用を要する精製工程を回避し、従来型アプローチに関連する抗原取り込み及びプロセッシングの複雑性を回避する。
【００７２】
上述のように、本明細書に開示した融合タンパク質の成分、例えばエフェクター分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は他の生物活性分子及び任意のペプチドリンカーは、融合タンパク質が、それが意図される機能を有することを前提として、ほぼ任意の方法で組織化することができる。特に、融合タンパク質の各成分は、必要に応じて、少なくとも１つの好適なペプチドリンカー配列によって別の成分から間隔を空けて配置することができる。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の修飾、同定及び／又は精製を促進するためにタグを含み得る。より特定の融合タンパク質について下記の実施例で記載する。
【００７３】
「検出する」は、検出対象の検体の存在、非存在又は量を同定することを意味する。
【００７４】
「疾患」は、細胞、組織又は臓器の正常機能を損傷又は妨害する任意の状態又は障害を意味する。疾患の例としては、新生物及びウイルス感染症が挙げられる。
【００７５】
製剤又は製剤の成分の用語「有効量」及び「治療的有効量」は、単独又は組み合わせて、製剤又は成分の所望の効果を提供するのに十分な量を意味する。例えば、「有効量」は、単独又は組み合わせて、未治療の患者と比較して疾患の症状を改善するために必要とされる化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重及び全体的な健康状態に応じて変化する。最終的に、主治医又は獣医が適正量及び投与レジメンを決定するであろう。そのような量が「有効」量と称される。
【００７６】
「断片」は、ポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子又は参照ポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含有する。例えば、断片は、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個又は１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個又は１，０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含有し得る。しかしながら、本発明は、全長ポリペプチド及び全長核酸の所望の生物活性をそれらがそれぞれ示す限り、ポリペプチド及び核酸の断片を含む。ほとんどあらゆる長さの核酸断片が利用される。例えば、長さが約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の（全ての中間の長さを含む）塩基対の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。同様に、ほとんどあらゆる長さのポリペプチド断片が利用される。例えば、長さが約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００又は約５０の（全ての中間の長さを含む）アミノ酸長を有する例示的なポリペプチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。
【００７７】
用語「単離（された）」、「精製（された）」又は「生物学的に純粋な」は、様々な程度まで、その天然の状態で見られるような通常伴う成分を含まない材料を指す。「単離体」は、本来の起源又は環境からの分離の程度を意味する。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を意味する。
【００７８】
「精製（された）」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的特性に物質的に影響を与えないか、又は他の不利な結果をもたらさないように十分に他の材料を含まない。すなわち、本発明の核酸又はペプチドは、それが実質的に細胞物質、ウイルス物質若しくは組み換えＤＮＡ技術によって生成された場合には培養培地を、又は化学合成された場合には化学的前駆物質若しくは他の化学薬品を実質的に含んでいなければ精製されている。純度及び均質性は、典型的には、分析的化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製（された）」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル内で本質的に１つのバンドを生じさせることを意味し得る。修飾、例えばリン酸化又はグリコシル化を受けさせることのできるタンパク質に対して、様々な修飾は、別個に精製することのできる様々な単離されたタンパク質を生じさせ得る。
【００７９】
同様に、「実質的に純粋」は、それに自然に付随する成分から分離されているヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチド及びポリペプチドは、それらが自然に結び付いているタンパク質及び天然型有機分子を少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％又はさらに９９重量％含まない場合に実質的に純粋である。
【００８０】
「単離された核酸」は、核酸がそれに由来する生体の天然型ゲノム内でそれに隣接する遺伝子を全く含まない核酸を意味する。この用語は、例えば、（ａ）天然型ゲノムＤＮＡ分子の一部であるが、その中でそれが自然に発生する生体のゲノム内の分子のその部分に隣接する両方の核酸分子によって隣接されていないＤＮＡ、（ｂ）生じた分子が任意の天然型ベクター又はゲノムＤＮＡと同一ではない方法でベクター内又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた核酸、（ｃ）例えばｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片又は制限断片などの別個の分子、及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列に及ぶ。本発明による単離された核酸分子は、合成により生成された分子及び化学的に変化されており且つ／又は修飾された骨格を有する任意の核酸をさらに含む。例えば、単離された核酸は、精製ｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドである。単離された核酸分子は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子も含む。
【００８１】
「単離されたポリペプチド」は、それに自然に付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが自然に結び付いているタンパク質及び天然型有機分子を少なくとも６０重量％含まない場合に単離されている。好ましくは、調製物は、本発明の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％及び最も好ましくは少なくとも９９重量％のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然起源からの抽出により、そのようなポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現により、又はタンパク質を化学的に合成することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００８２】
「マーカー」は、疾患又は障害と結び付いている発現レベル又は活性における変化を有する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。
【００８３】
「新生物」は、過剰な増殖又はアポトーシスの減少によって特徴付けられる疾患又は障害を意味する。本発明が使用され得る例示的な新生物には、限定されないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症、重鎖病及び例えば肉腫及び癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）が含まれる。特定の実施形態では、新生物は、多発性骨髄腫、β細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌又は黒色腫である。本明細書で使用するような「薬剤を得ること」における「得ること」は、その薬剤を合成すること、購入すること、又はさもなければ取得することを含む。
【００８４】
「減少する」は、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変化を意味する。
【００８５】
「参照」は、標準又は対照の条件を意味する。
【００８６】
「参照配列」は、配列比較のための基準として使用される規定配列である。参照配列は、特定配列のサブセット又は全体；例えば、全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント又は完全ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドについて、参照ポリペプチド配列の長さは、一般的には、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、より一層好ましくは３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸又は約１００個のアミノ酸であろう。核酸について、参照核酸配列の長さは、一般的には、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、より一層好ましくは１００個のヌクレオチド若しくは約３００個のヌクレオチド又はおよそ若しくはそれらの間の任意の整数である。
【００８７】
「特異的に結合する」は、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、試料中、例えば自然に本発明のポリペプチドを含む生物学的試料中の他の分子を実質的に認識して結合することがない化合物又は抗体を意味する。
【００８８】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列との「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列との「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」は、様々なストリンジェンシーの条件下において、相補性ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載した遺伝子）間で二本鎖分子を形成する対又はその部分を意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。
【００８９】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムとなるであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの不在下で得ることができる一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃及び最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度及び担体ＤＮＡの包含又は除外などの様々な追加のパラメーターは、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより遂行される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び１％のＳＤＳ中において３０℃で行われるであろう。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中において３７℃で行われるであろう。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド及び２００μｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ中において４２℃で行われるであろう。これらの条件に対する有用な変化は、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００９０】
ほとんどの用途について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーが異なるであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって規定され得る。上述のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少又は温度の上昇によって増加され得る。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムとなるであろう。洗浄工程に対するストリンジェントな温度条件として、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、より一層好ましくは少なくとも約６８℃の温度が挙げられる。好ましい実施形態では、洗浄工程は、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳにおいて、２５℃で行われるであろう。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳにおいて、４２℃で行われるであろう。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳにおいて、６８℃で行われるであろう。これらの条件に対する追加の変化は、当業者に容易に明らかとなるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えばＢｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００９１】
「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載したアミノ酸配列のいずれか１つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載した核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較に使用される配列に対するアミノ酸レベル又は核酸レベルで少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％又はさらに９９％同一である。
【００９２】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，７７５  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒｉｖｅ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ；Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３１７５  Ｓｔａｌｅｙ  Ｒｄ．Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失及び／又は他の修飾に対するホモロジーの程度を割り当てることによって同一又は類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。同一性の程度を特定するための例示的なアプローチでは、ｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアが密接に関連する配列を示すＢＬＡＳＴプログラムを使用することができる。
【００９３】
「対象」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコなどを含むが、それらに限定されない哺乳動物を意味する。対象は、好ましくは、そのような治療を必要とする哺乳動物、例えばＢ細胞リンパ腫又はそれに対する素因があると診断されている対象である。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ並びに家畜又は食用のために成長させた動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ及びヤギである。１つの好ましい実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００９４】
本明細書に提供した範囲は、範囲内の全数値についての省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ又は部分範囲を含むと理解される。
【００９５】
本明細書で使用する用語「治療する」及び「治療」は、症状の重症度及び／若しくは頻度の低減に影響を及ぼし、症状及び／若しくはその根本的な原因を排除し、且つ／又は損傷の改善若しくは矯正を促進するために、有害な状態、障害又は疾患に悩まされる臨床的症候性の個体への薬剤又は製剤の投与を指す。除外されないが、疾患又は状態を治療することは、障害、それに関連する状態又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。治療において使用される薬剤又は製剤は、細胞又は組織を含み得る。
【００９６】
新生物を有する患者の治療は、下記のいずれかを含み得る：公知の腫瘍が初期療法（例えば、手術）によって除去された後に存在する可能性がある遺残細胞を破壊し、それにより可能性のある癌再発を防止するためのアジュバント療法（補助療法又は付加療法とも呼ばれる）；癌を収縮させるために外科手技前に行われる新補助療法；典型的には急性白血病のための寛解を誘発する誘導療法；寛解を維持するために寛解が達成された後に行われる地固め療法（強化療法とも呼ばれる）；寛解を延長させることを補助するためにより低用量又は低頻度で行われる維持療法；第一線療法（標準療法とも呼ばれる）；第二線（又は第三線、第四線など）療法（救済療法とも呼ばれる）は、第一線療法後に疾患が応答しなかったか又は再発した場合に行われる；及び癌を有意に低減させることを期待せずに症状管理に対応するための緩和療法（対症療法とも呼ばれる）。
【００９７】
用語「予防する工程」及び「予防」は、特定の有害な状態、障害若しくは疾患に罹患し易いか、又は素因のある臨床的無症候性の個体への薬剤若しくは組成物の投与に関するため、したがって症状の発生及び／又はその根本的原因の予防に関する。
【００９８】
詳細に規定しない限り又は前後関係から明白でない限り、本明細書で使用する用語「又は」は、包括的であると理解される。詳細に規定しない限り又は前後関係から明白でない限り、本明細書で使用する用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、単数又は複数であると理解される。
【００９９】
詳細に規定しない限り又は前後関係から明白でない限り、本明細書で使用する用語「約」は、当該技術分野における通常の容認範囲内、例えば平均値の２標準偏差内であると理解される。「約」は、標準値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％内であると理解され得る。前後関係から他のことが明白でない限り、本明細書に提供した全数値は、用語「約」によって修飾される。
【０１００】
本明細書の変量のいずれかの定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一基又は列挙した基の組み合わせとしてのその変量の定義を含む。本明細書での変量又は態様についての実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としての又は任意の他の実施形態若しくはその部分と組み合わせた実施形態を含む。
【０１０１】
本明細書に提供した任意の組成物又は方法は、本明細書に提供した他の組成物のいずれか及び方法の１つ以上と組み合わせることができる。
【０１０２】
「含む」、「含有する」又は「を特徴とする」と同義である移行用語「含む」は、包含的又は無制限であり、追加の列挙されなかった要素又は方法の工程を排除しない。対照的に、移行句「〜からなる」は、特許請求の範囲で指定されていないいかなる要素、工程又は成分も排除する。「〜から本質的になる」の移行句は、特許請求の範囲を本発明の特許請求の範囲の指定された材料又は工程「及び基本的な新規の特徴に物質的に影響を与えないもの」に限定する。
【０１０３】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明及び特許請求項から明白であろう。他に特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載したものに類似しているか又は均等である方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、以下では適切な方法及び材料を記載する。本明細書で言及した全ての刊行された外国の特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
本明細書で引用したアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの寄託は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全ての他の公開された参照文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法及び実施例は、例示することのみを意図しており、限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】ＩＬ−１２及びＩＬ−１８結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃスカフォールドを含む様々なＴｘＭ融合タンパク質複合体を例示する概略図である。一部の場合、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、１種又は２種のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む。
【図１Ｂ】ＩＬ−１８結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃスカフォールドを含む様々なＴｘＭ融合タンパク質複合体を例示する概略図である。
【図２Ａ】プロテインＡ樹脂上の結合及び溶出後のｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭタンパク質含有細胞培養上清のクロマトグラフィープロファイルを示す線グラフである。
【図２Ｂ】分取サイズ排除カラム上での溶出後のプロテインＡ精製ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭタンパク質のクロマトグラフィープロファイルを示す線グラフである。
【図２Ｃ】タンパク質凝集体からの単量体マルチタンパク質ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の分離を証明する、分析的サイズ排除カラム上での溶出後のプロテインＡ／ＳＥＣ精製ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭタンパク質のクロマトグラフィープロファイルを示す線グラフである。
【図３】ジスルフィド結合減少後のｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（４〜１２％）電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す写真である。左のレーン：ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２マーカー、右のレーン：プロテインＡ精製ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ。
【図４Ａ】ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに対して特異的な抗体へのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の結合活性を示す線グラフである。
【図４Ｂ】ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに対して特異的な抗体へのｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の結合活性を示す線グラフである。
【図４Ｃ】ヒトＩＬ−１５及びヒトＩＬ−１８に対して特異的な抗体への双頭型（ｔｗｏ  ｈｅａｄｅｄ）ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の結合活性を示す線グラフである。コントロールには、アッセイフォーマットに依存して、抗ＣＤ２０  ＴｘＭ（２Ｂ８Ｔ２Ｍ）、ＡＬＴ−８０３及びｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭが含まれる。
【図５】ＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を例示する線グラフである。
【図６】ＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖をさらに例示する線グラフである。
【図７】ＩＬ−１８と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたＩＬ−１８感受性ＨＥＫ１８受容体細胞の活性化をさらに例示する線グラフである。
【図８】ＩＬ−１２と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたＩＬ−１２感受性ＨＥＫ１２受容体細胞の活性化をさらに例示する線グラフである。
【図９Ａ−９Ｂ】ＮＫ細胞中でのＳＴＡＴ４のリン酸化を刺激することについて培地コントロール（黒線）と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（図９Ａ）又は組み換えＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３（ｒＩＬ１２＋ｒＩＬ１８＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせ（図９Ｂ）（赤線）のＩＬ−１２生物活性を示す線グラフである。
【図９Ｃ−９Ｄ】精製ヒトＮＫ細胞中でのｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化を刺激することについて培地コントロール（黒線）と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（Ａ）又は組み換えＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３（ｒＩＬ１２＋ｒＩＬ１８＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせ（Ｂ）（赤線）のＩＬ−１８生物活性を示す線グラフである。
【図９Ｅ−９Ｆ】ａＮＫ細胞中でのＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激することについて培地コントロール（黒線）と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（Ａ）又は組み換えＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３（ｒＩＬ１２＋ｒＩＬ１８＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせ（Ｂ）（赤線）のＩＬ−１５生物活性を示す線グラフである。
【図１０Ａ】ａＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導することについてサイトカイン単独又は組み合わせと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の結合サイトカイン免疫賦活活性を例示する棒グラフである。
【図１０Ｂ】ａＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導することについてＡＬＴ−８０３又はｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭと比較した、双頭型ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のサイトカイン免疫賦活活性を例示する線グラフである。
【図１１Ａ−１１Ｂ】精製ヒトＮＫ細胞によってＣＤ２５を誘導することについて培地コントロール（黒線）と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（図１１Ａ）又は組み換えＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３（ｒＩＬ１２＋ｒＩＬ１８＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせ（図１１Ｂ）（赤線）の生物活性を示す線グラフである。
【図１１Ｃ−１１Ｄ】精製ヒトＮＫ細胞によってＣＤ６９を誘導することについて培地コントロール（黒線）と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（図１１Ａ）又は組み換えＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３（ｒＩＬ１２＋ｒＩＬ１８＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせ（図１１Ｂ）（赤線）の生物活性を示す線グラフである。
【図１１Ｅ−１１Ｆ】精製ヒトＮＫ細胞によって細胞内ＩＦＮ−γを誘導することについて培地コントロール（黒線）と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（Ａ）又は組み換えＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３（ｒＩＬ１２＋ｒＩＬ１８＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせ（Ｂ）（赤線）の生物活性を示す線グラフである。
【図１２Ａ】ＩＬ−１８＋ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたヒトＮＫ細胞の表面上の活性化マーカーＣＤ２５の誘導を例示する線グラフである。
【図１２Ｂ】ＩＬ−１８＋ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたヒトＮＫ細胞中の細胞内ＩＦＮ−γの誘導を例示する線グラフである。
【図１３Ａ】ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体（ＡＬＴ−８０３と比較して）を用いてプライミングし、その後、ＡＬＴ−８０３中で静止させることによって誘導されるヒトＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の表面上でのＣＤ２５の維持を例示する棒グラフである。
【図１３Ｂ】ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体（ＡＬＴ−８０３と比較して）を用いてプライミングし、その後、ＡＬＴ−８０３中で静止させ、且つＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３又はＫ５６２白血病標的を用いた再刺激によって誘導されたヒトＣＩＭＬ  ＮＫ細胞中の細胞内ＩＦＮ−γのレベル増強を例示する棒グラフである。
【図１４Ａ】再刺激なしと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、個々のサイトカイン又はＩＬ−１８＋ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３を用いてプライミングし、その後、ＩＬ−１５中で静止させ、ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３を用いた再刺激によって誘導されたヒトＣＩＭＬ  ＮＫ細胞中の増殖（ＣＴＶ希釈）及びＩＦＮ−γ発現を例示する輪郭プロットを示す。
【図１４Ｂ】再刺激なしと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、個々のサイトカイン又はＩＬ−１８＋ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３を用いてプライミングし、その後、ＡＬＴ−８０３中で静止させ、ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３を用いた再刺激によって誘導されたヒトＣＩＭＬ  ＮＫ細胞中の増殖（ＣＴＶ希釈）及びＩＦＮ−γ発現を例示する輪郭プロットである。
【図１５】ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、個々のサイトカイン又はＩＬ−１８＋ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３を用いてプライミングし、その後、ＩＬ−１５又はＡＬＴ−８０３中で静止させ、ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３を用いた再刺激によって誘導されたヒトＣＩＭＬ  ＮＫ細胞中の増殖（ＣＴＶ希釈）を例示するヒストグラムプロットを示す。
【図１６】ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体又はＡＬＴ−８０３（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ複合体）によって誘導されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞に対するヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を例示する棒グラフである。
【図１７Ａ】ＡＬＴ−８０３又は治療なしと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたヒトＮＫ細胞中の細胞内グランザイムＢの誘導を例示する棒グラフである。
【図１７Ｂ】培地単独又はＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を用いたプライミング後の組織因子陽性ＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞に対するヒトＮＫ細胞の直接的細胞傷害性（ビヒクル棒）又は抗体依存性細胞傷害性（αＴＦ抗体棒）を例示する棒グラフである。
【図１７Ｃ】培地単独又はＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を用いたプライミング後の抗ＴＦ抗体又は培地単独（ビヒクル）を用いたＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞と共にインキュベートしたヒトＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの発現の増加を例示する棒グラフである。
【図１８Ａ】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（２０ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳの投与後の脾臓重量における変化を示す棒グラフである。
【図１８Ｂ】ＰＢＳコントロールと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（２０ｍｇ／ｋｇ）の投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓中のＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞数における変化を示す棒グラフである。
【図１８Ｃ】ＰＢＳコントロールと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（２０ｍｇ／ｋｇ）の投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの血液中の絶対ＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞のパーセンテージにおける変化を示す棒グラフである。
【図１８Ｄ】ＰＢＳコントロールと比較した、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（２０ｍｇ／ｋｇ）の投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの血液中のＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞のパーセンテージにおける変化を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞を利用する療法は、これらの細胞が疾患細胞を殺傷して前炎症性サイトカインを放出する能力に起因して、癌及びウイルス感染症に対する将来性のある治療として出現してきた（例えば、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ＴＡ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＡ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；３７：８７７−８８８；及びＣｅｒｗｅｎｋａ  Ａ  ａｎｄ  Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  １６：１１２−２３を参照されたい）。特に関心が高いのは、持続性の非抗原特異的ＮＫ細胞エフェクター機能を示すサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。これらの細胞は、飽和量のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２、１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いた精製ＮＫ細胞の一晩の刺激後にエクスビボで誘導することができる。これらのプライミングされたＮＫ細胞は、例えば、１）増殖の増強、２）ＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５）、パーフォリン、グランザイム及び他の活性化マーカーの発現、及び３）再刺激後の増加したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生などのメモリー様特性を示す。
【０１０７】
ヒト初回投与試験の第１相臨床試験におけるＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の初期治療的評価は、シクロホスファミド及びフルダラビンを用いて予備状態調節されていた再発性又は難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者への同種半分一致ＮＫ細胞のエクスビボでのＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１８刺激、その後のＣＩＭＬ  Ｎｋ細胞の養子移入を利用した。移入後、患者は、インビボで細胞を支持するために低用量ＩＬ−２を摂取した。これらの移入されてプライミングされたＮＫ細胞は、注入の７〜１４日後に頻度がピークに達し、移入７日後には血液中に９０％超の全ＮＫ細胞が含まれていた。雑誌刊行時に評価可能であった患者９例中、形態学的白血病を有していない状態を有する患者１例に加えて４例が完全緩解を有し、これは、養子移入されたＣＩＭＬ  ＮＫ細胞によって媒介された前途有望な治療活性を示唆している（参照により本明細書に組み込まれるＲｏｍｅｅ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８：３５７ｒａ１２３を参照されたい）。
【０１０８】
本明細書に記載した本発明以前には、ＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を生成するための最適な方法は、十分に解明されていなかった。本明細書に記載した本発明以前には、戦略は、哺乳動物細胞精製サイトカインと比較してグリコシル化及び潜在的に他の翻訳後修飾が異なる組み換えヒトＩＬ−１２（昆虫細胞中で生成された）、ヒトＩＬ−１８（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で生成された）及びヒトＩＬ−１５（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で生成された）を利用していた。組み換えサイトカインは、異なる純度及び安定性も有する可能性があり、一般に臨床用材料として利用可能ではない。さらに、各サイトカインは、固有の受容体結合、内在化及び再循環特性を有すると期待されている。
【０１０９】
したがって、本明細書では、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８結合ドメインを含む多重特異的ＩＬ−１５系融合タンパク質複合体が提供される（図１Ａ、１Ｂ）。詳細には、本明細書で記載するのは、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃスカフォールドを含む融合タンパク質複合体である。ヒト免疫細胞を使用して特徴付けた場合、これらの融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８サイトカインのそれぞれの結合活性及び生物活性を示す。さらに、これらの融合タンパク質複合体は、活性化マーカーの上昇、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増加及びＩＦＮ−γの産生の増強を伴ってＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を誘導するように作用する。したがって、単一分子としての融合タンパク質複合体は、ＮＫ細胞上の複数のサイトカイン受容体に結合して、それらを介してシグナルを発し、以前には複数の個別サイトカインの組み合わせを用いた場合にのみ観察された相乗作用性応答を提供する。さらに、これらの融合タンパク質複合体は、可溶性マルチポリペプチド複合体を提供し、精製の目的でプロテインＡを結合し、ＮＫ細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体と相互作用するために二量体を形成できるＩｇ分子のＦｃ領域を含むため、それにより個別サイトカインの組み合わせ中に存在しない利点を融合タンパク質複合体に提供する。本明細書では、臨床用物質を大規模生産するために好適なこれらの融合タンパク質複合体を生成するための哺乳動物細胞発現に基づく方法が記載される。本発明の融合タンパク質複合体によって誘導されるＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を作成及び使用するための追加の方法も提供される。
【０１１０】
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、エフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞の発生、増殖及び活性化に重要なサイトカインである。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）に結合し、エフェクター細胞上のＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β共通γ鎖（ＩＬ−１５Ｒβγｃ）複合体に対してトランスで提示される。ＩＬ−１５及びＩＬ−２は、ＩＬ−１５Ｒβγｃへの結合並びにＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴＳ経路を通してのシグナルを共有する。しかしながら、ＩＬ−２と異なり、ＩＬ−１５は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持を支持することも、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞死を誘導することもないため、これは、多発性骨髄腫に対するＩＬ−２の治療活性を限定する可能性がある作用である。さらに、ＩＬ−１５は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に対して抗アポトーシスシグナルを提供することが知られている唯一のサイトカインである。ＩＬ−１５は、単独又はＩＬ−１５Ｒαとの複合体のいずれかとして投与され、実験動物モデルにおいて明確に樹立された固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示すため、したがって癌を潜在的に治療し得る最も前途有望な免疫療法薬の１つであると同定されている。
【０１１１】
ＩＬ−１５系癌治療薬の臨床開発を促進するため、ＩＬ−１５と比較して増加した生物活性を有するＩＬ−１５突然変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）が同定された（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７，２００９）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の薬物動態及び生物活性は、このスーパーアゴニスト複合体がインビボで天然サイトカインの少なくとも２５倍の活性を有するようにＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合複合体（ＡＬＴ−８０３）を作成することによってさらに改善された（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０，２０１１）。
【０１１２】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒαタンパク質複合体
上述したように、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体は、天然ＩＬ−１５Ｒαの可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインに非共有的に結合したＩＬ−１５を有する複合体を意味し得る。一部の場合、可溶性ＩＬ−１５Ｒαは、生物活性ポリペプチド及び／又はＩｇＧ  Ｆｃドメインに共有結合されている。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５又は第２生物活性ポリペプチドに共有結合されたＩＬ−１５のいずれかであり得る。ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒαタンパク質複合体の結晶構造は、本明細書に参照により組み込まれるＣｈｉｒｉｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，１００１−１００７に示されている。
【０１１３】
本明細書に描出した本発明の上記の態様又は任意の他の態様の様々な実施形態では、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、可溶性ＩＬ−１５Ｒα、例えば生物活性ポリペプチドに共有結合されたＩＬ−１５Ｒα（例えば、ＩｇＧの重鎖定常ドメイン、ＩｇＧの重鎖定常ドメインのＦｃドメイン又はサイトカイン）を含む。上記の態様の本発明の他の実施形態では、ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５、例えば第２生物活性ポリペプチドに共有結合されたＩＬ−１５、例えばサイトカインを含む。他の実施形態では、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を精製する工程は、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体に特異的に結合する親和性試薬上にＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を捕捉する工程を包含している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含有し、親和性試薬は、Ｆｃドメインに特異的に結合する。他の実施形態では、親和性試薬は、プロテインＡ又はプロテインＧである。他の実施形態では、親和性試薬は、抗体である。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製する工程は、イオン交換クロマトグラフィーを含む。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製する工程は、サイズ排除クロマトグラフィーを含む。
【０１１４】
他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む。他の実施形態では、ＩＬ−１５は、変異ＩＬ−１５（例えば、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体のＩＬ−１５結合部位は、完全に占有されている。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体の両方のＩＬ−１５結合部位は、完全に占有されている。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体は、融合タンパク質複合体の電荷又はサイズ特性に基づいて精製される。他の実施形態では、完全に占有されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、融合タンパク質複合体の電荷特性に基づいてアニオン交換クロマトグラフィーによって精製される。他の実施形態では、完全に占有されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、低イオン強度中性ｐＨバッファーを使用する結合条件及びイオン強度を増加させながらバッファーを利用する溶出条件を備える第４級アミン系樹脂を用いて精製される。
【０１１５】
所定の実施形態では、可溶性融合タンパク質複合体は、第１及び第２可溶性タンパク質を含み、第１可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、及び第２可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されており、及び第１可溶性タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、第２可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。
【０１１６】
所定の実施形態では、単離された可溶性融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含む。所定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。
【０１１７】
所定の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されている、単離された可溶性融合タンパク質複合体である。
【０１１８】
単離されたタンパク質融合複合体は、「双頭型」融合タンパク質複合体であり得る。これらの複合体は、例えば、ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ、インターロイキンのそれらの組み合わせにおいて変動し得る（図１Ｂ）。同様に、これらの融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む。これらの組み合わせ及び変異体、突然変異体、同族体、類似体、修飾分子などを含む分子のタイプは、変動し得る。
【０１１９】
したがって、所定の実施形態では、単離された可溶性タンパク質複合体は、第１及び第２可溶性タンパク質を含み、ここで、第１可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に融合されており、第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１８ドメインに融合されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、第１可溶性タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、第２可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。
【０１２０】
他の実施形態では、単離された可溶性融合タンパク質複合体は、第１及び第２可溶性タンパク質を含み、ここで、第１可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２結合ドメイン又はその機能的断片に融合されており、第２可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２ドメインに融合されたインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、第１可溶性タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、第２可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。
【０１２１】
所定の実施形態では、単離された可溶性融合タンパク質は、インターロイキン−１５ポリペプチドドメイン、第１及び第２可溶性タンパク質を含み、第１可溶性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片並びに免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む第２可溶性タンパク質に連結されており、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されており、ＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、第１及び／又は第２可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。
【０１２２】
別の実施形態では、単離された可溶性融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたインターロイキン−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）、第１及び第２可溶性タンパク質を含み、ここで、第１可溶性タンパク質は、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５ポリペプチドドメイン並びにＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はその機能的断片に連結されたインターロイキン−１５ポリペプチドドメインを含む第２可溶性タンパク質を含み、第１及び／又は第２可溶性タンパク質のＩＬ−１５ポリペプチドドメインは、ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。
【０１２３】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体の所定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書では、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）と称され、その変異体は、天然のアミノ酸、成熟配列におけるその位置及び変異アミノ酸を使用して称される。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位でのＮからＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を指す。所定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の増加によって実証されるように、ＩＬ−１５アゴニストとして機能する。所定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の減少によって実証されるように、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。所定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合親和性の増加又は結合活性の減少を有する。所定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然ＩＬ−１５配列と比較して少なくとも１つ（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の）アミノ酸変化を有する。アミノ酸変化は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はＩＬ−１５ＲγＣと相互作用するＩＬ−１５ドメイン内での１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を含み得る。所定の実施形態では、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８、６１、６５、７２、９２、１０１、１０８又は１１１位での１つ以上のアミノ酸置換又は欠失である。例えば、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８位でのＤからＮ又はＡへの置換、６１位でのＤからＡ、６５位でのＮからＡ、７２位でのＮからＲ若しくは１０８位でのＱからＡへの置換又はこれらの置換の任意の組み合わせである。所定の実施形態では、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の７２位でのＮからＤへの置換である。
【０１２４】
ＡＬＴ−８０３
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−２Ｒβγに結合する増加した能力及び増強された生物活性を有するＩＬ−１５突然変異体を含む（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５０７，２２２号明細書を参照されたい）。ＩＬ−１５のこのスーパーアゴニスト突然変異体について、刊行物（参照により本明細書に組み込まれるＺｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７）に記載された。可溶性ＩＬ−１５α受容体融合タンパク質と組み合わせたこのＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）は、インビトロ及びインビボでの高度に強力なＩＬ−１５活性を有する融合タンパク質複合体を生じさせる（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０；Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：３０７５−８６，Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：ｅ２６４４２）。ＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体は、「ＡＬＴ−８０３」と呼ばれる、ＩＬ−１５受容体α／ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質に結合したＩＬ−１５突然変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）融合タンパク質（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）を含む。
【０１２５】
薬物動態分析は、融合タンパク質複合体がマウスにおけるｉ．ｖ．投与後に２５時間の半減期を有することを示した。ＡＬＴ−８０３は、免疫適格マウスにおいて進行性固形腫瘍及び血液学的腫瘍モデルに対する印象的な抗腫瘍活性を示す。ＡＬＴ−８０３は、週２回又は週１回のｉ．ｖ．投与レジメンを使用する単剤療法として、抗体を用いた組み合わせ療法として投与され得る。ＡＬＴ−８０３抗腫瘍応答は、永続的である。ＡＬＴ−８０３治療後に治癒した腫瘍担持マウスは、同一の腫瘍細胞を用いた再挑戦に対しても高度に抵抗性であり、これは、ＡＬＴ−８０３が再導入された腫瘍細胞に対する効果的な免疫学的メモリー応答を誘導することを示した。
【０１２６】
ＡＬＴ−８０３（二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と会合したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の配列は、配列番号９を含む。
ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質配列（リーダーペプチドを含む）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ−
［リーダーペプチド］
【化１】
2020508691.tif 000003
【０１２７】
ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質配列（リーダーペプチドを含む）
ＭＤＲＬＴＳＳＦＬＬＬＩＶＰＡＹＶＬＳ−
［リーダーペプチド］
【化２】
2020508691.tif 000004
【化３】
2020508691.tif 000005
【０１２８】
ＩＬ−１２
ＩＬ−１２は、様々な機能を有し、前炎症性応答及び抗炎症性応答の両方において重要な役割を果たす、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７及びＩＬ−３５からなるサイトカインファミリーのメンバーである。ＩＬ−１２は、典型的には、活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現する。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞によるＴｈ１分化及びＩＦＮ−γ産生を促進し、抗腫瘍応答の誘導において重要な役割を果たす。本明細書に記載するように、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８と組み合わせたＩＬ−１２は、ＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を誘導し得る。
【０１２９】
ＩＬ−１２は、αサブユニット（ｐ３５）及びβサブユニット（ｐ４０）からなるジスルフィド結合ヘテロ二量体であり、ここで、αサブユニットは、４ヘリックスバンドルの長鎖サイトカインからなり、βサブユニットは、ＩＬ−６ファミリーの非シグナル伝達受容体と相同である。ＩＬ−１２の結晶構造及び突然変異誘発分析は、サブユニット相互作用のために重要なｐ３５／ｐ４０界面でのアミノ酸残基を規定した（Ｙｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．．２０００，ＥＭＢＯ  Ｊ．９，３５３０−３５４）。例えば、ｐ３５における重要なアルギニン残基（Ｒ１８９）は、Ｒ１８９側鎖がｐ４０上の親水性ポケット内に埋め込まれるようにｐ４０内のアスパラギン酸（Ｄ２９０）と相互作用する。さらに、ｐ４０における構造変化は、これらの相互作用を最適化する際に重要な可能性がある。この情報に基づき、改善されたサブユニット相互作用を示すアミノ酸変化を含有するＩＬ−１２変異体を生成し得る。さらに、ｐ４０のＮ末端に連結したｐ３５のＣ末端を通して又はその逆を通してのいずれかで可撓性リンカーによってｐ４０サブユニットに連結されたｐ３５サブユニットからなるＩＬ−１２の一本鎖形を生成し得る。そのような変異体は、ＩＬ−１２結合ドメインの発現、サブユニット相互作用及び／又は安定性を最適化するために本発明の融合タンパク質複合体中に組み込まれ得る。同様に、遺伝子発現、翻訳、翻訳後修飾及び／又は分泌を改善するためにＩＬ−１２遺伝子及び発現構築物を修飾し得る（すなわちコドン最適化、二次構造の除去）。
【０１３０】
ＩＬ−１２の作用は、２つのサブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−１２Ｒβ２）から構成される膜貫通受容体への結合によって媒介される。受容体の各サブユニットは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及びヤーヌス（Ｊａｎｕｓ）ファミリーのチロシンキナーゼの結合を媒介する細胞質ドメインから構成される。ＩＬ−１２結合は、β１及びβ２のヘテロ二量体化並びにシグナル伝達を可能にする高親和性受容体複合体の生成を生じさせると考えられている。このモデルでは、受容体の二量体化は、細胞質ドメインの並置並びに引き続いてのチロシンリン酸化及び受容体関連ヤーヌス（Ｊａｎｕｓ）ファミリーキナーゼであるＪａｋ２及びＴｙｋ−２の活性化をもたらす。これらの活性化キナーゼは、順にチロシンをリン酸化し、シグナル伝達物質及び転写の活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリーの幾つかのメンバー（ＳＴＡＴ−１、−３及び−４）を活性化する。ＳＴＡＴは、核に転座して、ＩＦＮ−γを含む複数の免疫応答性遺伝子の転写を活性化する。ＩＬ−１２：ＩＬ−１２Ｒ複合体の結晶構造は、依然として決定されていないが、増加した受容体結合／シグナル伝達活性を有するＩＬ−１２変異体は、標準のスクリーニングアッセイによって単離され得る（Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３，ＰＮＡＳ  １００：１１６３−１１６８）。ｐ３５サブユニットのみを含むＩＬ−１２ヘテロ二量体の断片は、生物活性を示し得る。ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ表面滞留時間、代謝回転及び／又は再循環を修飾するＩＬ−１２変異体も単離し得る。さらに、ＩＬ−１２変異体は、免疫細胞応答、特にＣＩＭＬ  ＮＫ細胞活性を誘導する結合されたサイトカイン活性を最適化及び／又は平衡させるために本発明の融合タンパク質複合体中に組み込まれ得る。
【０１３１】
ＩＬ−１８
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、先天性及び後天性免疫応答の調節に包含される多面発現性ＩＬ−１スーパーファミリーサイトカインである。ＩＬ−１２又はＩＬ−１５の環境内では、ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞及びＣＤ４  Ｔヘルパー（Ｔｈ）Ｉリンパ球内でＩＦＮ−γの強力な誘導因子である。しかしながら、ＩＬ−１８は、宿主微小環境依存方法でＴｈ２及びＴｈ１７細胞応答並びにＣＤ８細胞傷害性細胞及び好中球の活性も調節する。ＩＬ−１８の生物活性は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球及び内皮細胞上で発現したヘテロ二量体ＩＬ−１８Ｒα／β複合体へのＩＬ−１８の結合によって媒介され、ＮＦ−κＢの活性化をもたらす下流シグナルを誘導する。さらに、ＩＬ−１８の活性は、ＩＬ−１８について細胞表面受容体と競合してＩＬ−１８活性を中和する高親和性の構成的に発現させた循環中ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）のレベルによって調節することができる。ＩＬ−１８ＢＰとの相互作用を低減させ、且つ／又はＩＬ−１８Ｒα／β複合体の結合／シグナル伝達を増加させるＩＬ−１８の変異体（例えば、アミノ酸突然変異／欠失を有する）は、ＩＬ−１８活性を増強する際に有用であり得る。そのような変異体は、標準スクリーニングアッセイによって同定することができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００１，ＰＮＡＳ  ９８：３３０４−３３０９）。ＩＬ−１８の断片は、生物活性を示し得る。ＩＬ−１８／ＩＬ−１８Ｒ表面滞留時間、代謝回転及び／又は再循環を修飾するＩＬ−１８変異体も単離し得る。そのようなＩＬ−１８変異体は、免疫細胞応答、特にＣＩＭＬ  ＮＫ細胞活性を誘導するためにＩＬ−１８活性を最適化し、且つ／又は結合されたサイトカイン活性を平衡させるために本発明の融合タンパク質複合体中に組み込まれ得る。さらに、ＩＬ−１８変異体は、ＩＬ−１８結合ドメインの発現及び／又は安定性を最適化するために本発明の融合タンパク質複合体中に組み込まれ得る。同様に、ＩＬ−１８遺伝子及び発現構築物は、遺伝子発現、翻訳、翻訳後修飾及び／又は分泌を改善するために修飾され得る（すなわちコドン最適化、二次構造の除去）。
【０１３２】
抗原特異的結合ドメイン
抗原特異的結合ドメインは、疾患細胞上の標的に特異的に結合するポリペプチドからなる。代わりに、これらのドメインは、例えば、腫瘍増殖を支持するストローマ細胞上の標的又は疾患媒介性免疫抑制を支持する免疫細胞上の標的などの疾患状態を支持する他の細胞上の標的に結合し得る。抗原特異的結合ドメインとしては、当該技術分野において公知である抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ペプチボディ又は様々な他の抗体模倣物（例えば、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アトリマー、ＣＴＬＡ４系分子、アドネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン系タンパク質、アビマー、ノッチン、フィノマー、ダーピン（ｄａｒｐｉｎ）、アフィボディ、アフィリン、モノボディ及びアルマジロ反復タンパク質系タンパク質（Ｗｅｉｄｌｅ，ＵＨ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１５５−１６８））が挙げられる。
【０１３３】
所定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインに対する抗原は、細胞表面受容体又はリガンドを含む。別の実施形態では、抗原は、ＣＤ抗原、サイトカイン若しくはケモカイン受容体若しくはリガンド、増殖因子受容体若しくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性共刺激受容体若しくはリガンド、細胞死受容体若しくはリガンド、腫瘍関連抗原又は抗原をコードするウイルスを含む。
【０１３４】
好ましくは、抗原特異的結合ドメインは、腫瘍細胞上の抗原に結合することができる。腫瘍特異的結合ドメインは、癌を有する患者の治療に対して承認された抗体に由来し得、リツキシマブ、オファツムマブ及びオビヌツズマブ（抗ＣＤ２０抗体）；トラスツズマブ及びペルツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）；セツキシマブ及びパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）；並びにアレムツズマブ（抗ＣＤ５２抗体）が挙げられる。同様に、ＣＤ２０（９０Ｙ標識化イブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ標識化トシツモマブ）、ＨＥＲ２（アド−トラスツズマブ  エムタンシン）、ＣＤ３０（ブレンツキシマブベドチン）及びＣＤ３３（ジェムツツマブオゾガミシン）に対して特異的な承認された抗体エフェクター分子コンジュゲートに由来する結合ドメインを使用し得る（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ，Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ．２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１１９２）。
【０１３５】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインは、当該技術分野で知られている様々な他の腫瘍特異的抗体ドメインを含み得る。癌を治療するための抗体及びその各標的としては、ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体）、ＴＡ９９（抗ｇｐ７５）、３Ｆ８（抗ＧＤ２）、８Ｈ９（抗Ｂ７−Ｈ３）、アバゴボマブ（ＣＡ１２５（模倣体））、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（抗ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（抗ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（抗ＣＥＡ）、アマツキシマブ（抗メソセリン）、ＡＭＥ−１３３（抗ＣＤ２０）、アナツモマブマフェナトクス（抗ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（抗ＣＥＡ）、バビツキシマブ（抗フォスファチジルセリン）、ベクツモマブ（抗ＣＤ２２）、ベリムマブ（抗ＢＡＦＦ）、ベシレソマブ（抗ＣＥＡ関連抗原）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（抗ＣＤ４４  ｖ６）、ブリナツモマブ（抗ＣＤ１９）、ＢＭＳ−６６３５１３（抗ＣＤ１３７）、ブレンツキシマブベドチン（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、カンツズマブメルタンシン（抗ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（抗ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（抗前立腺癌細胞）、カルルマブ（抗ＭＣＰ−１）、カツマキソマブ（抗ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合体（抗ルイスＹ抗原）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、セデリズマブ（抗ＣＤ４）、Ｃｈ．１４．１８（抗ＧＤ２）、ｃｈ−ＴＮＴ（抗ＤＮＡ関連抗原）、シタツズマブボガトクス（抗ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、クリバツズマブテトラキセタン（抗ＭＵＣ１）、コナツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＰ−８７０８９３（抗ＣＤ４０）、ダセツズマブ（抗ＣＤ４０）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、ダロツズマブ（抗インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボース加水分解酵素））、デムシズマブ（抗ＤＬＬ４）、デツモマブ（抗Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（抗ＤＲ５）、デュリゴツマブ（抗ＨＥＲ３）、デュシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）（抗ＩＬＧＦ２）、エクロメキシマブ（抗ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）、エルシリモマブ（抗ＩＬ−６）、エナバツズマブ（抗ＴＷＥＡＫ受容体）、エノチクマブ（抗ＤＬＬ４）、エンシツキシマブ（抗５ＡＣ）、エピツモマブシツキセタン（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（抗インテグリンαｖβ３）、ファラリモマブ（抗インターフェロン受容体）、ファルレツズマブ（抗葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（抗ＨＧＦ）、フィギツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（抗ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５））、フレソリムマブ（抗ＴＧＦβ）、フツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ガリキシマブ（抗ＣＤ８０）、ガニツマブ（抗ＩＧＦ−Ｉ）、ジェムツズマブオゾガミシン（抗ＣＤ３３）、ギレンツキシマブ（抗炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレンバツムマブベドチン（抗ＧＰＮＭＢ）、グセルクマブ（抗ＩＬ���３）、イバリズマブ（抗ＣＤ４）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、イクルクマブ（抗ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、ＩＭＡＢ３６２（抗ＣＬＤＮ１８．２）、ＩＭＣ−ＣＳ４（抗ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（ＴＧＦβＲＩＩ）、イムガツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、インクラクマブ（抗セレクチンＰ）、インダツキシマブラブタンシン（抗ＳＤＣ１）、イノツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ２２）、インテツムマブ（抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗ＣＤ１５２）、イラツムマブ（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、ＫＭ３０６５（抗ＣＤ２０）、ＫＷ−０７６１（抗ＣＤ１９４）、ＬＹ２８７５３５８（抗ＭＥＴ）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡ）、ランブロリズマブ（抗ＰＤＣＤ１）、レクサツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リンツズマブ（抗ＣＤ３３）、リリルマブ（抗ＫＩＲ２Ｄ）、ロルボツズマブメルタンシン（抗ＣＤ５６）、ルカツムマブ（抗ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体））、マパツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マルゲツキシマブ（抗ｃｈ４Ｄ５）、マツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、マブリリムマブ（抗ＧＭＣＳＦ受容体α鎖）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ミンレツモマブ（抗ＴＡＧ−７２）、ミツモマブ（抗ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（抗ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（抗ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（抗Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（抗５Ｔ４）、ナルナツマブ（抗ＲＯＮ）、ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ネスバクマブ（抗アンジオポエチン２）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（抗ＩｇＧ４）、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（抗ＣＤ２０）、オララツマブ（抗ＰＤＧＦ−Ｒα）、オナルツズマブ（抗ｃ−ＭＥＴ）、オンツキシズマブ（抗ＴＥＭ１）、オポルツズマブモナトクス（抗ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、オトレルツズマブ（抗ＣＤ３７）、パンコマブ（ＭＵＣ１の抗腫瘍特異的グリコシル化）、パルサツズマブ（抗ＥＧＦＬ７）、パスコリズマブ（抗ＩＬ−４）、パトリツマブ（抗ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（抗ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピディリズマブ（抗ＰＤ−１）、ピナツズマブベドチン（抗ＣＤ２２）、ピンツモマブ（抗腺癌抗原）、ポラツズマブベドチン（抗ＣＤ７９Ｂ）、プリツムマブ（抗ビメンチン）、ＰＲＯ１３１９２１（抗ＣＤ２０）、クイリズマブ（抗ＩＧＨＥ）、ラコツモマブ（抗Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（抗フィブロネクチンエキストラドメイン−Ｂ）、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（抗ＨＧＦ）、ロバツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、ロレデュマブ（抗ＲＨＤ）、ロベリズマブ（抗ＣＤ１１＆ＣＤ１８）、サマリズマブ（抗ＣＤ２００）、サツモマブペンデチド（抗ＴＡＧ−７２）、セリバンツマブ（抗ＥＲＢＢ３）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（抗ＣＤ１９）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（抗ＣＤ３３）、シブロツズマブ（抗ＦＡＰ）、シルツキシマブ（抗ＩＬ−６）、ソリトマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、ソンツズマブ（抗エピシアリン）、タバルマブ（抗ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（抗��−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（抗ＣＤ１９）、テリモマブアリトクス、テナツモマブ（抗テナシンＣ）、テネリキシマブ（抗ＣＤ４０）、テプロツムマブ（抗ＣＤ２２１）、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８）、チシリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、チガツズマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（抗ＩＬ−１３）、トシツモマブ（抗ＣＳ２０）、トベツマブ（抗ＣＤ１４０ａ）、ＴＲＢＳ０７（抗ＧＤ２）、トレガリズマブ（抗ＣＤ４）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＴＲＵ−０１６（抗ＣＤ３７）、ツコツズマブセルモロイキン（抗ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（抗ＣＤ２０）、ウレルマブ（抗４−１ＢＢ）、バンチクツマブ（抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体）、バパリキシマブ（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１））、バテリズマブ（抗ＩＴＧＡ２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ベセンクマブ（抗ＮＲＰ１）、ビシリズマブ（抗ＣＤ３）、ボロシキシマブ（抗インテグリンα５β１）、ボルセツズマブマホドチン（抗ＣＤ７０）、ボツムマブ（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（抗ＣＤ４）、ザツキシマブ（抗ＨＥＲ１）、ジラリムマブ（抗ＣＤ１４７（ベイシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）））、ＲＧ７６３６（抗ＥＴＢＲ）、ＲＧ７４５８（抗ＭＵＣ１６）、ＲＧ７５９９（抗ＮａＰｉ２ｂ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＲＧ７４５０（抗ＳＴＥＡＰ１）及びＧＤＣ−０１９９（抗Ｂｃｌ−２）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３６】
本発明に有用な他の抗体ドメイン又は腫瘍標的結合タンパク質（例えば、ＴＣＲドメイン）としては、これらに限定されないが、以下の抗原に結合するものが挙げられる（表示した癌の適応は、非限定的な例を表すことに留意されたい）：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アネキシンＡｌ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６、様々な癌）、ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５−３（癌腫）、ＣＡ１９−９（癌腫）、Ｌ６（癌腫）、ルイスＹ（癌腫）、ルイスＸ（癌腫）、αフェトプロテイン（癌腫）、ＣＡ２４２（結腸直腸癌）、胎盤アルカリフォスファターゼ（癌腫）、前立腺特異抗原（前立腺）、前立腺酸性フォスファターゼ（前立腺癌）、表皮増殖因子（癌腫）、ＣＤ２（ホジキン病、ＮＨＬリンパ腫、多発性骨髄腫）、ＣＤ３ε（Ｔ細胞リンパ腫、肺癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、自己免疫疾患、悪性腹水）、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞新生物、自己免疫疾患）、ＣＤ２１（Ｂ細胞リンパ腫）、ＣＤ２２（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ＳＬＥ）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫）、ＣＤ３３（白血病、自己免疫疾患）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５１（転移性黒色腫、肉腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ５６（小細胞肺癌、卵巣癌、メルケル細胞癌及び液体腫瘍、多発性骨髄腫）、ＣＤ６６ｅ（癌腫）、ＣＤ７０（転移性腎細胞癌及び非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ７４（多発性骨髄腫）、ＣＤ８０（リンパ腫）、ＣＤ９８（癌腫）、ＣＤ１２３（白血病）、ムチン（癌腫）、ＣＤ２２１（固形腫瘍）、ＣＤ２２７（乳癌、卵巣癌）、ＣＤ２６２（ＮＳＣＬＣ及び他の癌）、ＣＤ３０９（卵巣癌）、ＣＤ３２６（固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ３（結腸直腸癌、胃癌）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅ）（乳癌、結腸直腸癌及び肺癌）、ＤＬＬ４（Ａ−ｌｉｋｅ−４）、ＥＧＦＲ（様々な癌）、ＣＴＬＡ４（黒色腫）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４、血液腫瘍学、固形腫瘍）、エンドグリン（ＣＤ１０５、固形腫瘍）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子、膀胱癌、頭部癌、頚部癌、結腸癌、ＮＨＬ、前立腺癌及び卵巣癌）、ＥＲＢＢ２（肺癌、乳癌、前立腺癌）、ＦＣＧＲ１（自己免疫疾患）、ＦＯＬＲ（葉酸受容体、卵巣癌）、ＦＧＦＲ（癌腫）、ＧＤ２ガングリオシド（癌腫）、Ｇ−２８（細胞表面抗原糖脂質、黒色腫）、ＧＤ３イディオタイプ（癌腫）、熱ショックタンパク質（癌腫）、ＨＥＲ１（肺癌、胃癌）、ＨＥＲ２（乳癌、肺癌及び卵巣癌）、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＮＨＬ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ（ＮＨＬ、Ｂ細胞白血病）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（癌腫）、ＩＧＦ１Ｒ（固形腫瘍、血液癌）、ＩＬ−２受容体（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫）、ＩＬ−６Ｒ（多発性骨髄腫、ＲＡ、カストルマン病、ＩＬ６依存性腫瘍）、インテグリン（ανβ３、α５β１、α６β４、α１１β３、α５β５、ανβ５、様々な癌に対して）、ＭＡＧＥ−１（癌腫）、ＭＡＧＥ−２（癌腫）、ＭＡＧＥ−３（癌腫）、ＭＡＧＥ４（癌腫）、抗トランスフェリン受容体（癌腫）、ｐ９７（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通型４−ドメインサブファミリーＡメンバー１、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、白血病）、ＭＵＣ１（乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、���管支癌及び消化器癌）、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）（卵巣癌）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ｇｐ１００（黒色腫）、ＭＡＲＴＩ（黒色腫）、ＭＰＧ（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通型４−ドメインサブファミリーＡ、小細胞肺癌、ＮＨＬ）、ヌクレオリン、Ｎｅｕ癌遺伝子産物（癌腫）、Ｐ２１（癌腫）、ネクチン−４（癌腫）、抗（Ｎ−グリコリルノイラミン酸、乳癌、黒色腫癌）の抗原結合部位、ＰＬＡＰ様精巣アルカリフォスファターゼ（卵巣癌、精巣癌）、ＰＳＭＡ（前立腺腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺）、ＲＯＢ０４、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２、ＡＭＬ、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌）、Ｔ細胞膜貫通型タンパク質（癌）、Ｔｉｅ（ＣＤ２０２ｂ）、組織因子、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ、癌腫）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ、多発性骨髄腫、ＮＨＬ、他の癌、ＲＡ及びＳＬＥ）、ＴＰＢＧ（栄養膜糖タンパク質、腎細胞癌）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（腫瘍壊死アポトーシス誘導性リガンド受容体１、リンパ腫、ＮＨＬ、結腸直腸癌、肺癌）、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６、黒色腫）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−２（ＣＤ３０９）（様々な癌）。一部の他の腫瘍関連抗原標的は、概説されている（Ｇｅｒｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ，ｍＡｂｓ  ２００９  １：２４７−２５３；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  ５４：１８７−２０７，Ｆｒａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００，１５：４５９−７６、Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１１９：４２１−４７５，Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  １７８：１９７５−９）。これらの抗原の例としては、分化の群が挙げられる（ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗｌ８６、ＣＤ１９５、ＣＤ２０２（ａ、ｂ）、ＣＤ２０９、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４）、アネキシンＡｌ、ヌクレオリン、エンドグリン���ＣＤ１０５）、ＲＯＢ０４、アミノペプチダーゼＮ、−ｌｉｋｅ−４（ＤＬＬ４）、ＶＥＧＦＲ−２（ＣＤ３０９）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、Ｔｉｅ２、Ｂ７−Ｈ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非突然変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＰＬＡＣｌ、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２及びＦｏｓ関連抗原１。
【０１３７】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインには、当該技術分野において公知である、感染細胞に関連する抗原及びエピトープ標的に対して特異的である結合ドメインが含まれる。そのような標的としては、それらに限定されないが、下記の感染性因子に由来するものが挙げられ、興味深いものは下記である：ＨＩＶウイルス（特にＨＩＶエンベロープスパイク及び／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１のエピトープに由来する抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、インフルエンザ菌Ｂ型（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、トレポネーマ・パリヅム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トリパノソーマ・ランゲリ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ロデシエンセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａ��ｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、エルメリア・テネラ（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回施糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、ヒツジ条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、メソセストイド・コルチ（Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、Ｍ．サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）及びマイコプラズマ肺炎（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
【０１３８】
免疫チェックポイント阻害剤及び免疫アゴニストドメイン
他の実施形態では、結合ドメインは、免疫チェックポイント又はシグナル伝達分子若しくはそのリガンドに対して特異的であり、免疫チェックポイント抑制活性の阻害剤又は免疫賦活活性のアゴニストとして作用する。そのような免疫チェックポイント及びシグナル伝達分子及びリガンドには、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４７、ＣＩＳ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１５５，ＴＩＧＩＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ−１、シグレック（Ｓｉｇｌｅｃ）及びＡ２ａＲが含まれる（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４，Ｔｈａｖｅｎｔｈｉｒａｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓ１２：００４）。さらに、本発明の好ましい抗体ドメインは、イピリムマブ及び／又はトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＴＳＲ−０４２、ＡＮＢ０１１、ＡＭＰ−５１４及びＡＭＰ−２２４（リガンドＦｃ融合）（抗ＰＤ１）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＥＤＩ０６８０並びにＢＭＳ−９３６５５６９（抗ＰＤＬ１）、ＭＥＤＩ６４６９（抗ＯＸ４０アゴニスト）、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１、ＩＭＰ３２１（抗ＬＡＧ３）及びＧＩＴＲリガンドを含み得る。
【０１３９】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞は、他の免疫細胞型（多形核細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と共に免疫系の細胞成分を構成する細胞のサブグループである。生理学的条件下では、Ｔ細胞は、免疫監視及び外来抗原の排除において機能する。しかしながら、病理学的条件下では、Ｔ細胞が疾患の原因及びその伝播において主な役割を果たしているという有力な証拠が存在する。これらの疾患では、中枢性又は末梢性いずれかのＴ細胞の免疫寛容の崩壊が自己免疫疾患の因果関係における基本的なプロセスである。
【０１４０】
ＴＣＲ複合体は、少なくとも７種の膜貫通タンパク質で構成される。ジスルフィド結合した（αβ又はγδ）ヘテロ二量体は、単一型抗原認識単位を形成する一方、ε鎖、γ鎖、δ鎖、ζ鎖及びη鎖からなるＣＤ３の不変鎖は、Ｔ細胞の活性化及び細胞性免疫応答の発生をもたらすシグナル伝達経路に結合するリガンドのカップリングについての責任を担う。ＴＣＲ鎖の遺伝子の多様性にもかかわらず、２つの構造特徴は、公知のサブユニット全てに共通する。第一に、それらは、おそらくαへリックス型の単一の膜貫通全域ドメインを有する膜貫通タンパク質である。第二に、全てのＴＣＲ鎖は、予測された膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を有するという珍しい特徴を有する。不変鎖は、マウスとヒトとの間で保存された単一の負の電荷を有し、可変鎖は、１つ（ＴＣＲ−β）又は２つ（ＴＣＲ−α）の正電荷を有する。ＴＣＲ−αの膜貫通配列は、多数の種において高度に保存されているため、系統発生学的に重要な機能的役割を果たす可能性がある。親水性アミノ酸であるアルギニン及びリジンを含有するオクタペプチド配列は、これらの種間で同一である。
【０１４１】
Ｔ細胞応答は、ＴＣＲに結合する抗原によって調節される。ＴＣＲの１つの型は、免疫グロブリンの可変（Ｖ）領域及び定常（Ｃ）領域に類似するα鎖及びβ鎖からなる膜結合型ヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖は、共有結合されたＶ−α鎖及びＣ−α鎖を含むが、β鎖は、Ｃ−β鎖に共有結合されたＶ−β鎖を含む。Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（ヒトではＨＬＡ複合体として公知である）と関連して超抗原又は抗原を結合することができるポケット又は間隙を形成する。Ｄａｖｉｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：５３７（１９８５）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｐａｕｌ  Ｅｄ．Ｒｓｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＴＤ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい。
【０１４２】
ＴＣＲ鎖の細胞外ドメイン（αβ又はγδ）も細胞表面での発現のため、異種性膜貫通領域に融合するように操作され得る。そのようなＴＣＲは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ及び／又はキメラ活性化受容体（ＣＡＲ）膜貫通ドメイン若しくは活性化ドメインへの融合を含み得る。ＴＣＲは、αβ鎖又はγδ鎖の１つ以上の抗原結合ドメインを含む可溶性タンパク質でもあり得る。そのようなＴＣＲは、ＴＣＲ定常ドメインを含むか又は含まないＴＣＲ可変ドメイン又はその機能的断片を含み得る。可溶性ＴＣＲは、ヘテロ二量体又は一本鎖分子であり得る。
【０１４３】
Ｆｃドメイン
本発明の融合タンパク質複合体は、Ｆｃドメインを含有し得る。例えば、ｈＩＬ−１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは、ＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を含む。ＩｇＧのＦｃ領域を別のタンパク質のドメイン、例えば様々なサイトカイン及び可溶性受容体と結び付ける融合タンパク質について報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１，１９８９；Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：５２−６０，１９９６）；米国特許第５，１１６，９６４号明細書及び同第５，５４１，０８７号明細書を参照されたい）。プロトタイプ融合タンパク質は、重鎖可変ドメイン及びＣＨｌドメイン並びに軽鎖のないＩｇＧ分子に類似する分子を生じさせる、ＩｇＧ  Ｆｃのヒンジ領域中のシステイン残基を通して連結されるホモ二量体タンパク質である。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体の性質は、他の分子との高次相互作用（すなわち二価又は二重特異性結合）の提供において有利となり得る。構造の相同性に起因して、Ｆｃ融合タンパク質は、同様のアイソタイプを有するヒトＩｇＧのそれに匹敵するインビボ薬物動態学プロファイルを示す。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ヒト血液中で最も豊富なタンパク質の１つであり、その循環半減期は、２１日間という長さに達し得る。本明細書では、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５融合タンパク質の循環半減期を延長させるため、及び／又はその生物活性を増加させるために、ヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分に共有結合されたＩＬ−１５Ｒαに非共有結合によって結合されたＩＬ−１５ドメインを含有する融合タンパク質複合体が記載される。
【０１４４】
「Ｆｃ」の用語は、Ｆｃ受容体と称される細胞表面受容体及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体の定常領域である断片結晶化可能領域を指す。そのような「Ｆｃ」は、二量体形態である。天然Ｆｃの本来の免疫グロブリン起源は、好ましくは、ヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれでもあり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ’は、共有結合（すなわちジスルフィド結合）会合及び非共有結合会合によって二量体又は多量体の形態に結合され得る単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて１〜４個の範囲内である。天然Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照されたい）。本明細書で使用する用語「天然Ｆｃ」は、単量体、二量体及び多量体の形態の総称である。プロテインＡ、プロテインＧ、様々なＦｃ受容体及び補体タンパク質に対する結合部位を含有するＦｃドメインである。一部の実施形態では、融合タンパク質複合体のＦｃドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を媒介するためにＦｃ受容体と相互作用することができる。他の用途では、融合タンパク質複合体は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰを効果的に媒介することができないＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃ）を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから修飾されているが、それでもサルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位を含む分子又は配列を指す。国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び同第９６／３２４７８号パンフレットは、典型的なＦｃ変異体並びにサルベージ受容体との相互作用について記載しており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴又は生物活性を提供するために除去され得る部位を含む。したがって、所定の実施形態では、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞との不適合（３）選択された宿主細胞での発現によるＮ末端不均質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、又は（８）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）に影響を及ぼすか又は関与する１つ以上の天然Ｆｃ部位又は残基を変化させる分子又は配列を含む。そのような変化は、これらのＦｃ特性の任意の１つ以上を増加又は減少させ得る。Ｆｃ変異体について以下でさらに詳細に記載する。
【０１４６】
用語「Ｆｃドメイン」は、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子並びに上に定義した配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃと同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、抗体全体から消化されたか、又は組み換え遺伝子発現又は他の手段によって産生されたかにかかわらず、単量体又は多量体の形態の分子を含む。
【０１４７】
リンカー
一部の場合、本発明の融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８結合ドメイン又はＩＬ−１２サブユニットとの間に挿入された可撓性リンカー配列も含む。リンカー配列は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインの両方の機能的活性を可能にするため、それらに関してポリペプチドの有効な配置を可能にしなければならない。代わりに、リンカーは、機能的ＩＬ−１２結合ドメインの形成を可能にしなければならない。
【０１４８】
所定の場合、可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、ここで、第１ポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５（又はその機能的断片）に共有結合されている。他の態様では、本明細書に記載した可溶性融合タンパク質複合体は、リンカーを有し、ここで、第２ポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合されている。
【０１４９】
リンカー配列は、好ましくは、提示抗原を認識するためのＴＣＲ分子の結合溝又は抗原を認識するための抗体分子の結合ドメインを効果的に配置できるペプチドを生じさせるヌクレオチド配列によってコードされている。本明細書で使用する語句「生物活性ポリペプチドをＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに対して効果的に配置すること」又は他の同様の語句は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物活性ポリペプチドが、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインが互いに相互作用してタンパク質複合体を形成することができるように配置されることを意味することが意図される。例えば、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインは、免疫応答を開始若しくは阻害するため又は細胞発生を阻害若しくは刺激するための免疫細胞との相互作用を可能にするように効果的に配置される。
【０１５０】
本発明の融合タンパク質複合体は、好ましくは、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと免疫グロブリンＦｃドメインとの間に挿入された可撓性リンカー配列も含む。リンカー配列は、各ドメインの機能的活性を可能にするため、Ｆｃドメイン、生物活性ポリペプチド及びＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインの効果的な配置を可能にしなければならない。例えば、Ｆｃドメインは、オプソニン作用、細胞溶解、肥満細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒並びに他のＦｃ受容体依存性プロセス；補体経路の活性化；並びに融合タンパク質複合体のインビボ半減期の増強を含むＦｃ媒介性作用を刺激するために、適正な融合タンパク質複合体の形成及び／又は免疫細胞上のＦｃ受容体若しくは補体系のタンパク質との相互作用を可能にするように効果的に配置される。
【０１５１】
リンカー配列は、所望の機能的活性を有する一本鎖分子を生成するために、生物活性ポリペプチドの２つ以上のポリペプチドを連結させるために使用することもできる。
【０１５２】
好ましくは、リンカー配列は、約７〜２０個のアミノ酸，より好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸を含む。リンカー配列は、好ましくは、単一の望ましくない立体配座に生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子を保持することがないように可撓性である。リンカー配列は、例えば、認識部位を融合分子から間隔を空けるために使用できる。詳細には、ペプチドリンカー配列は、例えば、同一物を化学的に架橋結合するため及び分子可撓性を提供するために生物活性ポリペプチドとエフェクター分子との間に配置され得る。リンカーは、好ましくは、主として、可撓性を提供するために、グリシン、アラニン及びセリンなどの短い側鎖を有するアミノ酸を含む。好ましくは、リンカー配列の約８０又は９０％以上がグリシン、アラニン又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。
【０１５３】
抗体可変領域を一緒に接合するために使用されるのに成功してきた多数の可撓性リンカー設計のいずれかを含む様々なリンカー配列を使用し得る（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：９７−１０５を参照されたい）。
【０１５４】
養子細胞療法
養子細胞療法（ＡＣＴ）（同種及び自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）及び組み換え細胞（すなわちＣＡＲ  Ｔ）療法）は、多数の悪性腫瘍障害にとって最適な療法である（ＨＳＣＴ及び養子細胞療法アプローチの総説については、Ｒａｇｅｒ＆Ｐｏｒｔｅｒ，Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２０１１）２（６）４０９−４２８；Ｒｏｄｄｉｅ＆Ｐｅｇｇｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１１）１１（４）：４７３−４８７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：（２０１５）１３６，１７５１−１７６８；及びＣｈａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ａｎｄ  Ｘ．Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ，２０１３．２７（１）：５５−６２を参照されたい）。そのような養子細胞療法には、同種及び自家造血幹細胞移植、ドナー白血球（若しくはリンパ球）輸注（ＤＬＩ）、腫瘍浸潤リンパ球の養子移入又はＴ細胞若しくはＮＫ細胞（組み換え細胞、すなわちＣＡＲ  Ｔ、ＣＡＲ、ＮＫ、遺伝子編集Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞を含む、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ（２０１８）３９：１６７−１７６，Ｉｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１７）８：２６７を参照されたい）の養子移入が含まれるが、これらに限定されない。ドナー由来細胞が放射線療法及び化学療法後の造血の再構成が必要である以上に、残存腫瘍細胞を排除するために転移細胞からの免疫学的再構成が重要である。悪性腫瘍に対する治療選択肢としてのＡＣＴの有効性は、ドナー細胞の起源、組成及び表現型（リンパ球サブセット、活性化状態）、基礎疾患、移植前状態調節レジメン及び移植後免疫支持（すなわちＩＬ−２療法）並びに移植片内でドナー細胞によって媒介される移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を含む多数の因子による影響を受ける。さらに、これらの因子は、典型的には、状態調節レジメン及び／又は宿主内のドナー細胞の過剰な免疫活性（すなわち移植片対宿主疾患、サイトカイン放出症候群など）から生じる移植関連死亡率に対して平衡されなければならない。
【０１５５】
養子ＮＫ細胞療法を利用するアプローチに対して関心が大きく高まってきた。自家ＨＳＣＴを受容している患者では、血中ＮＫ細胞数は、移植後に極めて早期に回復し、ＮＫ細胞のレベルは、プラスの転帰と相関する（Ｒｕｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０，８９６−８９９）。自家ＮＫ細胞移入を用いる治療戦略は、多くの因子に起因して成功が限定されてきたが、癌に対する前途有望な免疫療法戦略としてエクスビボ活性化同種（又は半数一致）ＮＫ細胞の養子移入が出現してきた（Ｇｕｉｌｌｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０２５−１０３６）。これらの細胞の活性は、自家ＮＫ細胞と比較して自己ＭＨＣ分子によって抑制される可能性が低い。多くの研究は、腫瘍細胞に対する同種応答性を発揮する半数一致ＮＫ細胞を用いた養子療法が安全であり、ＡＭＬ患者において有意な臨床的活性を媒介できることを証明してきた。これらの所見をさらに取り入れて、近年の研究は、ＮＫ細胞又はＮＫ前駆体（すなわち幹細胞）のためのエクスビボ活性化／増殖法、移植前状態調節及び移植後免疫支持戦略を最適化すること；ＮＫ細胞系又は組み換え腫瘍標的化ＮＫ細胞の使用；例えば治療用抗体、免疫調節剤（レナリドミド）並びに抗ＫＩＲ抗体及びチェックポイント抗体などの他の作用物質との併用療法の評価に焦点を当ててきた。各場合において、これらの戦略は、ＮＫ細胞増殖及び活性化を増強する能力を有する本発明の融合タンパク質複合体によって補完され得る。本明細書で指示したように、ＮＫ細胞と本発明の融合タンパク質複合体とのエクスビボインキュベーションは、活性化マーカーの上昇、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増加及びＩＦＮ−γの産生増強を示すＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の誘導を生じさせる。さらに、本発明の融合タンパク質複合体は、ヒトＮＫ細胞系を活性化することができる。さらに、本発明の融合タンパク質複合体の直接投与又は本発明の融合タンパク質複合体によって活性化免疫細胞の投与により、免疫応答を増強して新生物及び感染性疾患を治療するための方法が提供される。
【０１５６】
医薬治療薬
本発明は、治療薬として使用するための融合タンパク質複合体を含む医薬組成物を提供する。１つの態様では、本発明の融合タンパク質複合体は、例えば、生理学的塩水などの医薬上許容されるバッファー中で製剤化されて、全身性で投与される。好ましい投与経路には、例えば、患者における組成物の連続的、維持的又は有効レベルを提供する膀胱内への点滴注入、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内又は皮内注射が含まれる。ヒト患者又は他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の治療有効量の本明細書に同定した治療薬を使用して実施される。好適な担体及びその製剤化は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。投与すべき治療薬の量は、投与方法、患者の年齢及び体重に依存して且つ新生物の臨床症状に伴って変動する。一般に、量は、新生物又は感染性疾患に関連する他の疾患の治療において使用される他の作用物質のために使用される量の範囲内に含まれるであろうが、所定の場合、化合物の特異性が増加するために必要となる量は、より少量になるであろう。化合物は、当業者に公知である方法によって決定されるように、対象の免疫応答を増強するか、又は新生物若しくは感染細胞の増殖、生存若しくは侵襲性を減少させる用量で投与される。
【０１５７】
医薬組成物の製剤化
新生物又は感染性疾患を治療するための本発明の融合タンパク質複合体の投与は、他の成分と組み合わせて、前記新生物又は感染性疾患を改善、減少又は安定化させることに効果的である治療薬の濃度を生じさせる任意の好適な手段によって行われる。本発明の融合タンパク質複合体は、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有され得、一般には組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。本組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、膀胱内、腫瘍内又は腹腔内）投与経路のために好適である剤形で提供され得る。例えば、医薬組成物は、従来型の製薬実践に従って製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１５８】
ヒトの投与量は、最初に、マウス又は非ヒト霊長類で使用された化合物の量から外挿することによって決定され、これは、当業者であれば、動物モデルと比較してヒトのための用量を修正することが当該技術分野における日常作業であることを認識しているからである。例えば、用量は、約１μｇ（化合物）／ｋｇ（体重）〜約５，０００ｍｇ（化合物）／ｋｇ（体重）；又は約５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約４，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）又は約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約３，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）；又は約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）；又は約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）；又は約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）で変動し得る。例えば、用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，２００、１，２５０、１，３００、１，３５０、１，４００、１，４５０、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００又は５，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。代わりに、用量は、約５ｍｇ（化合物）／ｋｇ（体重）〜約２０ｍｇ（化合物）／ｋｇ（体重）の範囲内である。別の実施例では、用量は、約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／ｋｇ（体重）である。好ましくは、融合タンパク質複合体は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．５、１、３、５、１０ｍｇ／ｋｇ）で投与される。当然ながら、この投与量は、初期臨床試験の結果及び特定患者の必要に応じて、そのような治療プロトコルにおいて日常的に実施されるように上方又は下方に調整することができる。
【０１５９】
医薬組成物は、医薬組成物中に投与後に制御された方法で治療薬を放出する適切な賦形剤を用いて製剤化される。例には、単一又は複数の単位錠剤又はカプセル組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ及びリポソームが含まれる。好ましくは、融合タンパク質複合体は、非経口投与のために好適な賦形剤中で製剤化される。
【０１６０】
非経口組成物
本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、従来型の無毒性の医薬上許容される担体及びアジュバントを含有する剤形、製剤中又は好適な送達器具又はインプラントを介して注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、膀胱内、腹腔内）によって非経口投与される。そのような組成物の製剤化及び調製は、製剤処方の分野の当業者に周知である。製剤化は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙに見出すことができる。
【０１６１】
非経口使用するための本発明の融合タンパク質複合体を含む組成物は、単位剤形（例えば、単回投与用アンプル中）で提供される。代わりに、本組成物は、数回分の用量を含有し、且つ好適な保存剤が添加され得る（下記を参照されたい）バイアルで提供される。本組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、注入器具若しくは移植のための送達器具の形態であるか、又は使用前に水若しくは別の好適なビヒクルを用いて再構成すべき乾燥粉末として提示される。新生物又は感染性疾患を低減又は改善する活性物質とは別に、本組成物は、好適な非経口的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む。活性治療薬は、制御放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム中に組み込むことができる。さらに、本組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調製剤、張度調製剤及び／又は分散剤を含み得る。
【０１６２】
上記に示したように、本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、無菌注射のために好適な形態であり得る。そのような組成物を調製するために、好適な活性治療薬は、非経口的に許容される液体ビヒクル中に溶解又は懸濁化される。使用され得る特に許容されるビヒクル及び溶媒は、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウム又は好適なバッファー、１，３−ブタンジオール、リンガー液、等張性塩化ナトリウム溶液及びデキストロース液の添加によって好適なｐＨに調整された水である。水性調製物は、１種以上の保存剤（例えば、メチル、エチル又はｎープロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート）を含有し得る。これらの化合物の１つが水にほとんど溶解しないか又はわずかにのみ溶解する場合、溶解促進剤又は可溶化剤を添加し得るか、又は溶媒が１０〜６０重量／重量％のプロピレングリコールを含み得る。
【０１６３】
本発明は、新生物又は感染性疾患又はその症状を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の式の化合物を含む医薬組成物を対象（例えば、哺乳動物、例えばヒト）に投与する工程を含む方法を提供する。したがって、１つの実施形態は、新生物又は感染性疾患又はその症状に苦しんでいるか又は罹患し易い対象を治療する方法である。本方法は、疾患若しくは障害又はその症状を治療するために十分な本明細書に記載の化合物の量の治療量を、疾患又は障害が治療されるような条件下で哺乳動物に投与する工程を含む。
【０１６４】
本明細書に記載の方法は、そのような効果を生成するために有効量の本明細書に記載の化合物又は本明細書に記載の組成物を対象（そのような治療を必要とすると同定された対象を含む）に投与する工程を含む。そのような治療を必要とする対象を同定することは、対象又はヘルスケアの専門家の判断であり得、主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば、検査若しくは診断法によって測定可能）であり得る。
【０１６５】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、一般に、本明細書に記載の治療有効量の化合物、例えば本明細書に記載の式の化合物の、哺乳動物、特にヒトを含むそれを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）への投与を含む。そのような治療は、新生物、感染性疾患、障害又はその症状に苦しんでいるか、それらを有するか、罹患し易いか、又はリスク状態にある対象、特にヒトに好適に投与されるであろう。「リスク状態にある」それらの対象は、対象又はヘルスケア提供者の診断検査又は意見（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、（本明細書に規定された）マーカー、家族歴など）による任意の客観的又は主観的決定によって決定することができる。本発明の融合タンパク質複合体は、免疫応答の増加が望ましい任意の他の障害の治療において使用され得る。
【０１６６】
本発明は、治療の進行を監視する方法も提供する。本方法は、対象が、疾患若しくはその症状を治療するために十分な治療量の本明細書に記載の化合物が投与されていた新生物に関連する障害若しくはその症状に苦しんでいるか、又は罹患し易い対象における診断マーカー（マーカー）（例えば、本明細書に記載の化合物、タンパク質若しくはそのインジケーターなどによって調節される本明細書で描出した任意の標的）のレベル又は診断的測定（例えば、スクリーン、アッセイ）を決定する工程を含む。本方法で決定されたマーカーのレベルは、対象の疾患状態を確定するために健常正常コントロール又は他の罹患患者のいずれかにおけるマーカーの公知のレベルと比較することができる。一部の場合、対象におけるマーカーの第２レベルが第１レベルの決定より後の時点に決定され、疾患の経過又は療法の有効性を監視するために、それらの２つのレベルが比較される。所定の態様では、対象におけるマーカーの治療前レベルは、本発明による治療を開始する前に決定される。マーカーのこの治療前レベルは、治療の有効性を決定するために治療開始後に対象におけるマーカーのレベルと比較され得る。
【０１６７】
併用療法
任意選択的に、本発明の融合タンパク質複合体又は本発明の融合タンパク質複合体を用いて治療された免疫細胞は、任意の他の標準療法と組み合わせて投与される。そのような方法は、当業者に公知であり、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。必要に応じて、本発明の融合タンパク質複合体又は本発明の融合タンパク質複合体を用いて治療された免疫細胞は、免疫療法、養子細胞療法、ワクチン、治療用抗体及びチェックポイント阻害剤抗体、標的化療法、手術、放射線療法又は化学療法を含むが、それらに限定されない任意の従来型の抗新生物療法と組み合わせて投与される。
【０１６８】
キット又は製剤系
本発明の融合タンパク質複合体又は本発明の融合タンパク質複合体を用いて治療された免疫細胞を含む医薬組成物は、新生物又は感染性疾患を改善する際に使用するためにキット又は製剤系に組み立てることができる。本発明のこの態様に従ったキット又は製剤系は、輸送手段、例えば厳重にその中に封じ込められる１つ以上の容器手段、例えばバイアル、チューブ、アンプル、瓶などを有する箱、カートン、チューブを含む。本発明のキット又は製剤系は、本発明の融合タンパク質複合体を使用するための関連する使用説明書も含み得る。１つの実施形態では、キットは、本発明の融合タンパク質複合体を使用する免疫細胞のエクスビボ治療及び／又はそのような細胞の患者への投与を可能にするための適切な容器、例えばバッグ、瓶、チューブを含む。キットは、本発明の融合タンパク質複合体を含む医療器具も含み得る。
【０１６９】
組み換えタンパク質の発現
一般に、本発明の融合タンパク質複合体（例えば、ＴｘＭ複合体の成分）の調製は、本明細書に開示した手順及び認定された組み換えＤＮＡ技術によって実施され得る。
【０１７０】
一般に、組み換えポリペプチドは、好適な発現ビヒクル中での全部又は一部のポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片を用いた好適な宿主細胞の形質転換によって生成される。分子生物学における当業者であれば、極めて広範な発現系のいずれかを使用して組み換えタンパク質を提供できることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、本発明にとって決定的に重要ではない。組み換えポリペプチドは、実質的に任意の真核生物宿主（例えば、サッカロミセス・エレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えばＳｆ２１細胞又は哺乳動物細胞、例えばＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨｅＬａ又は好ましくはＣＯＳ細胞）中で生成され得る。そのような細胞は、広範囲の供給源（例えば、メリーランド州ロックランドのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７も参照されたい）から入手できる。トランスフェクションの方法及び発現ビヒクルの選択は、選択される宿主系に依存するであろう。形質転換法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記を参照されたい）に記載されている。発現ビヒクルは、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｕｐｐ．１９８７）に提供されたものの中から選択され得る。
【０１７１】
組み換えポリペプチドを生成するために、様々な発現系が存在する。そのようなポリペプチドを生成するために有用な発現ベクターには、限定なしに、染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体要素由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター並びにそれらの組み合わせに由来するベクターが含まれる。
【０１７２】
組み換えポリペプチドが発現すると、組み換えポリペプチドは、例えば、親和性クロマトグラフィーを使用して単離される。１つの例では、ポリペプチドに対して立てられた（例えば、本明細書に記載したように生成した）抗体は、カラムに付着され、組み換えポリペプチドを単離するために使用され得る。親和性クロマトグラフィー前にポリペプチドを有する細胞の溶解及び分別は、標準方法によって実施され得る（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。単離されると、組み換えタンパク質は、必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製され得る（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０を参照されたい）。
【０１７３】
本明細書で使用するように、本発明の生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメインなどの因子又は他の例えば酵素などの生物活性タンパク質を含み得る。また、生物活性ポリペプチドは、例えば、非タンパク質毒素、細胞傷害剤、化学療法薬、検出可能な標識、放射性物質などの他の化合物へのコンジュゲートを含み得る。
【０１７４】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響を及ぼし、細胞免疫の多数の多重効果のいずれかに対して責任を担う細胞によって生成される任意の因子によって規定される。サイトカインの例には、ＩＬ−２ファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＴＧＦ及びＴＮＦサイトカインファミリー並びにＩＬ−１〜ＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦβが含まれるが、それらに限定されない。
【０１７５】
本発明の１つの態様では、第１タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能的断片に共有結合された第１生物活性ポリペプチドを含む。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の活性化及び増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞の活性化及び増殖に影響を及ぼすことにおけるＩＬ−１５活性は、幾つかの点でＩＬ−２に類似するが、基本的な相違が明確に特徴付けられている（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ  Ａ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５９５−６０１）。
【０１７６】
本発明の別の態様では、第１タンパク質は、ＩＬ−１５変異体（本明細書ではＩＬ−１５突然変異体とも呼ばれる）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含む。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、天然（又は野生型）ＩＬ−１５タンパク質と異なるアミノ酸配列を含む。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドに結合し、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する。好ましくは、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体は、スーパーアゴニスト活性を有する。ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５Ｒαとの関連とは無関係に、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能し得る。ＩＬ−１５アゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比較して匹敵するか又は増加した生物活性によって例示される。ＩＬ−１５アンタゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比較して減少した生物活性又はＩＬ−１５媒介性応答を阻害する能力によって例示される。一部の例では、ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に増加又は減少した活性で結合する。一部の場合、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然ＩＬ−１５配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば置換又は欠失を有し、そのような変化は、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニスト活性を生じさせる。好ましくは、アミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメイン内にある。より好ましくは、アミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドへの結合又はＩＬ−１５変異体を生成する能力に影響を及ぼさない。ＩＬ−１５変異体を生成するために好適なアミノ酸の置換／欠失は、推定又は公知のＩＬ−１５構造、ＩＬ−１５と同族分子、例えば公知の構造を有するＩＬ−２との比較に基づいて、本明細書に提供した合理的又はランダム突然変異誘発及び機能的アッセイ又は他の経験的方法を通して同定することができる。さらに、好適なアミノ酸置換は、保存的又は非保存的変化及び追加のアミノ酸の挿入であり得る。好ましくは、本発明のＩＬ−１５変異体は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の６、８、１０、６１、６５、７２、９２、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１１又は１１２位で１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換／欠失を含有する。特に、Ｄ８Ｎ（「Ｄ８」は、天然成熟ヒトＩＬ−１５配列内のアミノ酸及び残基の位置に関し、「Ｎ」は、ＩＬ−１５変異体内のその位置で置換されたアミノ酸残基を意味する）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａ置換は、アンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体を生じさせ、Ｎ７２Ｄ置換は、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体を生じさせる。
【０１７７】
ケモカインは、サイトカインに類似して、他の細胞に曝露されると、細胞免疫の多数の多重効果のいずれかに対して責任を担う任意の化学的因子又は分子であると規定されている。好適なケモカインには、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ及びＣＸ３Ｃケモカインファミリー並びにＣＣＬ−１〜ＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１〜ＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−ｌｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＲａｎｔｅｓが含まれ得るが、それらに限定されない。
【０１７８】
増殖因子には、特定の細胞に曝露されると、罹患細胞の増殖及び／又は分化を誘導する任意の分子が含まれる。増殖因子には、タンパク質及び化学的分子が含まれ、その一部にはＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト増殖因子及び幹細胞増殖因子が含まれる。追加の増殖因子も、本明細書に記載した使用のために好適な可能性がある。
【０１７９】
毒素又は細胞傷害剤には、細胞に曝露されると致死的作用又は増殖への阻害作用を有する任意の物質が含まれる。より詳細には、エフェクター分子は、例えば、植物又は細菌起源の細胞毒素、例えばジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質又はゲロニンであり得る。そのような毒素の生物活性断片は、当該技術分野において周知であり、例えばＤＴ  Ａ鎖及びリシンＡ鎖などが含まれる。さらに、毒素は、細胞表面上で活性な物質、例えばホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）であり得る。
【０１８０】
さらに、エフェクター分子は、化学療法薬、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン又はシスプラスチンであり得る。
【０１８１】
さらに、エフェクター分子は、診断又はイメージング研究に好適な検出可能に標識された分子であり得る。そのような標識としては、ビオチン若しくはストレプトアビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子若しくは結晶、酵素若しくはその触媒活性断片、蛍光標識、例えば緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、シコム（ｃｙｃｈｏｍｅ）、テキサスレッド若しくは量子ドット；放射性核種、例えばヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８若しくはビスマス−２１２；リン光分子若しくは化学発光分子又はＧｄ若しくは常磁性金属イオンに基づく造影剤などのＰＥＴ、超音波若しくはＭＲＩによって検出可能な標識が挙げられる。エフェクター又はタグを含むタンパク質の作成及び使用に関する開示については、例えば、Ｍｏｓｋａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４７，６４１，１９８６；Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，３３１，（１９９２）；“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ”Ｏｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５，３５５（１９８２）；公開ＰＣＴ出願の国際公開第９４／２９３５０号パンフレット；同第９４／０４６８９号パンフレット；同第２００５０４６４４９号パンフレット及び米国特許第５，６２０，９３９号明細書を参照されたい。
【０１８２】
本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、アミノ酸配列において天然型ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子、例えばヒト、マウス若しくは他の齧歯類又は他の哺乳動物のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子に好適に対応する。これらのポリペプチド及びコードする核酸の配列は、ヒトインターロイキン（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕｌ４４０７．１（参照により本明細書に組み込まれる）、ハツカネズミインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４３３２．ｌ（参照により本明細書に組み込まれる）、ヒトインターロイキン−１５受容体アルファ鎖前駆体（ＩＬ１５ＲＡ）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３１６２８．１（参照により本明細書に組み込まれる）、ハツカネズミインターロイキン１５受容体、アルファ鎖−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１（参照により本明細書に組み込まれる）を含む文献において公知である。
【０１８３】
一部の状況では、例えば、ｓｃ抗体の結合価を増加させるため、本発明のタンパク質融合複合体又はコンジュゲート複合体を多価にすることが有用な可能性がある。特に、融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインとＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の相互作用は、多価複合体を生成する手段を提供する。さらに、例えば、標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識技術を使用することにより、又はラテックスビーズなどの好適な固体支持体に接合させることにより、１種のタンパク質と（同一の又は異なる）４種のタンパク質との間を共有結合的又は非共有結合的に連結することにより、多価融合タンパク質を作成することができる。化学的架橋タンパク質（例えば、デンドリマーへの架橋）も好適な多価種である。例えば、タンパク質は、ビオチン化ＢｉｒＡタグなどの修飾可能なタグ配列又はＣｙｓ若しくはＨｉｓなどの化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を含めることによって改変され得る。そのようなアミノ酸タグ又は化学反応性アミノ酸は、融合タンパク質中の様々な位置、好ましくは生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位から遠位に配置され得る。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ末端は、タグ又はそのような反応性アミノ酸を含む他の融合タンパク質に共有結合させることができる。２種以上の融合タンパク質を好適なデンドリマー又は他のナノ粒子に化学的に結合させて多価分子を得るために好適な側鎖を含めることができる。デンドリマーは、その表面の多数の様々な官能基のいずれか１つを有することができる合成化学ポリマーである（Ｄ．Ｔｏｍａｌｉａ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２６：９１：１０１（１９９３））。本発明による使用に対する例示的なデンドリマーとしては、例えば、Ｅ９スターバーストポリアミンデンドリマー及びＥ９コンバスト（ｃｏｍｂｕｓｔ）ポリアミンデンドリマーが挙げられ、これらは、システイン残基を結合することができる。例示的なナノ粒子としては、リポソーム、コアシェル粒子又はＰＬＧＡ系粒子が挙げられる。
【０１８４】
別の態様では、融合タンパク質複合体の一方又は両方のポリペプチドは、免疫グロブリンドメインを含む。代わりに、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質は、免疫グロブリンドメインに連結され得る。好ましい免疫グロブリンドメインは、他の免疫グロブリンドメインと相互作用して、上記に提供した多重鎖タンパク質を形成させる領域を含む。例えば、免疫グロブリン重鎖領域、例えばＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３は、安定して相互作用してＦｃ領域を作り出すことができる。Ｆｃドメインを含む好ましい免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体又は補体タンパク質の結合活性を含むエフェクター機能及び／又はグリコシル化部位を有する領域も含む。一部の態様では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体の結合活性又はグリコシル化若しくは二量体化を減少又は増強する突然変異を含有し、それにより生じたタンパク質の生物活性に影響を及ぼす。例えば、Ｆｃ受容体に対する結合を減少させる突然変異を含有する免疫グロブリンドメインを使用すると、Ｆｃ受容体を有する細胞に対して結合活性のより低い本発明の融合タンパク質を生成することができ、これは、特定の抗原を認識又は検出するように設計された試薬にとって有利な可能性がある。
【０１８５】
核酸及びベクター
本発明は、本発明の融合タンパク質（例えば、ＴｘＭの成分）をコードする核酸配列及び特にＤＮＡ配列をさらに提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、例えば、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームなどの染色体外での複製に適したベクターによって運ばれる。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用すると、本明細書に記載した調製法を促進し、有意な量の融合タンパク質を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入され得る。タンパク質コーディング配列を発現させるために、様々な宿主−ベクター系を利用することができる。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌などが含まれる。利用される宿主−ベクター系に応じて、多くの好適な転写要素及び翻訳要素のいずれか１つを使用することができる。上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０１８６】
本発明に含まれるのは、可溶性融合タンパク質複合体を作成するための方法であって、宿主細胞内に第１タンパク質及び第２タンパク質をコードする本明細書に記載したＤＮＡベクターを導入する工程と、細胞又は培地中で融合タンパク質を発現させ、第１タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能にして可溶性融合タンパク質複合体を形成するために十分な条件下で培地中において宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製する工程とを含む方法である。
【０１８７】
一般に、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、エフェクター分子をコードする配列に機能的に連結された生物活性ポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列を導入するための第１クローニング部位を５’から３’の方向に含む、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド配列を含む。
【０１８８】
ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分は、カセット形式で提供され得る。用語「カセット」は、各成分が標準的組み換え方法によって別の成分に容易に置換され得ることを意味する。特に、カセット形式で構成されたＤＮＡベクターは、コードされた融合タンパク質複合体が血清型を生じさせる能力を有し得るか又はそれを有する病原体に対して使用しなければならない場合に特に望ましい。
【０１８９】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作成するために、好適なリガーゼを使用して、生物活性ポリペプチドをコードする配列がエフェクターペプチドをコードする配列に連結される。提示ペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、好適な細胞系などの天然起源からＤＮＡを単離するか、又は公知の合成方法、例えばリン酸トリエステル法によって得ることができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドも、市販で入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。生物活性ポリペプチドをコードする遺伝子は、単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野において公知の他の手段によって増幅させることができる。生物活性ポリペプチド遺伝子を増幅させるために好適なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限酵素認識部位を付加することができる。ＰＣＲ産物は、エフェクターペプチドのためのスプライス部位及び生物活性ポリペプチド−エフェクター融合タンパク質の適正な発現及び分泌のために必要なリーダー配列を含むことが好ましい。ＰＣＲ産物は、リンカー配列をコードする配列又はそのような配列をライゲーションするための制限酵素部位も含むことが好ましい。
【０１９０】
本明細書に記載した融合タンパク質は、好ましくは、標準的組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、生物活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されると、エフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子に配列をライゲートすることができる。生物活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列に直接接合され得、より典型的には、本明細書で検討したリンカー配列をコードするＤＮＡ配列が生物活性ポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列との間に挿入され、好適なリガーゼを使用して接合され得る。生じたハイブリッドＤＮＡ分子は、好適な宿主細胞中で発現して、融合タンパク質複合体を生成することができる。ＤＮＡ分子は、ライゲーション後にコードされたポリペプチドの翻訳フレームが変更されないように、５’から３’の方向で互いにライゲートされる（すなわちＤＮＡ分子が互いにインフレームでライゲートされる）。生じたＤＮＡ分子は、インフレームの融合タンパク質をコードする。
【０１９１】
他のヌクレオチド配列を遺伝子構築物に含めることもできる。例えば、エフェクターペプチドに融合された生物活性ポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列又は細胞表面若しくは培養培地に向けて融合タンパク質を方向付けるリーダー配列は、構築物に含められるか又はその中に構築物が挿入される発現ベクター中に存在し得る。免疫グロブリン又はＣＭＶのプロモーターが特に好ましい。
【０１９２】
変異生物活性ポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインのコーディング配列を得る際、当業者であれば、ポリペプチドが、生物活性を消失又は減少することなく所定のアミノ酸置換、付加、欠失及び翻訳後修飾によって改変され得ることを認識するであろう。特に、保存的アミノ酸置換、すなわち１個のアミノ酸の同様のサイズ、電荷、極性及び立体配座を備える別のアミノ酸との置換は、タンパク質機能を有意に変化させる可能性が低いことが周知である。タンパク質の構成要素である２０種の標準的なアミノ酸は、大まかには以下の４つの群の保存的アミノ酸に分類される。非極性（疎水性）群は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを含み、極性（非荷電、中性）群は、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン及びチロシンを含み、正荷電（塩基性）群は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンを含み、且つ負帯電（酸性）群は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。タンパク質において同じ群内の別のアミノ酸との１個のアミノ酸置換は、そのタンパク質の生物活性に有害な作用を有する可能性が低い。他の例では、アミノ酸位置への修飾を行うと、タンパク質の生物活性を減少又は増強することができる。そのような変化は、無作為に又は標的とされる残基の公知若しくは推定される構造的若しくは機能的な特性に基づく部位特異的突然変異によって導入され得る。変異タンパク質の発現に続いて、結合アッセイ又は機能性アッセイを使用して、修飾に起因する生物活性の変化を容易に評価することができる。
【０１９３】
ヌクレオチド配列間の相同性は、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定され得、ここで、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は、発生する塩基対合の程度に左右される。高温及び／又は低塩含有量の条件は、ハイブリッドの安定性を減少させ、選択される程度よりも低い相同性を有する配列のアニーリングを防止するために変化させることができる。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含有量を有する配列に対して、４０℃〜５０℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムバッファー）及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、約６０％〜７０％の相同性を示し、５０℃〜６５℃、１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、約８２％〜９７％の相同性を示し、５２℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、約９９％〜１００％の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸の配列を比較するため（及び相同性の程度を測定するため）の広範囲のコンピュータープログラムが利用可能であり、市販で入手可能及び無料の両方のソフトウェアの供給元を提供するリストは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）に見出せる。容易に入手可能な配列比較及び多重配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷは、２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．で利用可能である。
【０１９４】
融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を実施できる限りに、ほぼ任意の順序で構成することができる。例えば、１つの実施形態では、生物活性ポリペプチドは、エフェクター分子のＣ末端又はＮ末端に置かれる。
【０１９５】
本発明の好ましいエフェクター分子は、そのドメインに意図される機能に資するサイズを有するであろう。本発明のエフェクター分子は、周知の化学的架橋方法を含む多様な方法によって作成し、生物活性ポリペプチドと融合させることができる。例えば、Ｍｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．（１９７４）ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙを参照されたい。Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓも参照されたい。しかしながら、一般には、組み換え操作を使用してインフレーム融合タンパク質を作成することが好ましい。
【０１９６】
上述のように、融合分子又はコンジュゲート分子は、本発明に従って数種の方法で構成可能である。例示的な立体配置では、生物活性ポリペプチドのＣ末端は、エフェクター分子のＮ末端に機能的に連結される。その連結は、必要に応じて組み換え方法で達成され得る。しかしながら、別の立体配置では、生物活性ポリペプチドのＮ末端は、エフェクター分子のＣ末端に連結される。
【０１９７】
代わりに又は加えて、１つ以上の追加のエフェクター分子を必要に応じて生物活性ポリペプチド又はコンジュゲート複合体に挿入することができる。
【０１９８】
ベクター及び発現
本発明の融合タンパク質複合体（例えば、ＴｘＭ）の構成成分を発現させるために多数の戦略を用いることができる。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の１つ以上の成分をコードする構築物は、構築物を挿入するためのベクター内に制限酵素を使用して切り込みを作り、その後、ライゲーションを行うことで適切なベクターに組み込みことができる。次に、遺伝子構築物を含有するベクターは、融合タンパク質を発現させるために好適な宿主内に導入される。概して、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。好適なベクターは、クローニングプロトコルに関連する因子に基づいて経験的に選択することができる。例えば、ベクターは、使用されている宿主と適合し、これに適正なレプリコンを有していなければならない。ベクターは、発現対象の融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列に順応できなければならない。好適な宿主細胞としては、真核細胞及び原核細胞、好ましくは容易に形質転換されて培養培地中で迅速な増殖を示す細胞が含まれる。詳細には、好ましい宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）などの原核生物並びに例えば動物細胞及び酵母株（例えば、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））などの真核細胞が挙げられる。哺乳動物細胞、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯが一般に好ましい。他の好適な宿主としては、例えば、Ｓｆ９のような昆虫細胞が含まれる。従来の培養条件が使用される。上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。その後、安定性で形質転換又はトランスフェクトされた細胞系を選択できる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞は、公知の手順によって決定され得る。例えば、免疫グロブリンに連結した融合タンパク質複合体の発現は、連結した免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡ及び／又は免疫ブロット法によって決定され得る。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結した生物活性ポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を検出するための他の方法は、実施例において開示する。
【０１９９】
上記で概して言及したように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を増殖させるための調製目的で使用することができる。したがって、宿主細胞は、その中で融合タンパク質の生成が特異的に意図される原核細胞又は真核細胞を含み得る。したがって、宿主細胞としては、詳細には、融合をコードする核酸を増殖させることができる酵母、ハエ、蠕虫、植物、カエル、哺乳動物の細胞及び器官が挙げられる。使用され得る哺乳動物細胞系の非限定的な例としては、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））又はＳＰ２若しくはＮＳＯなどの骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３（Ｂ）：３（１９８１））が挙げられる。
【０２００】
所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を増殖させることができる宿主細胞は、昆虫（例えば、フルギペルダ（ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）種）、酵母（Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（５）：４８６４９６（１９９２）によって総説されたように、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンべ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、真菌細胞及び植物細胞を含む非哺乳動物真核細胞を同様に包含する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの所定の原核生物も企図されている。
【０２０１】
所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするための標準的技術によって宿主細胞内に導入され得る。用語「トランスフェクトする」又は「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルス形質導入法及び／又はウイルス組み込み法を含む、核酸を宿主細胞内に導入するための全ての従来技術を包含することが意図されている。宿主細胞をトランスフェクトするために好適な方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及び他の実験室用教科書に見出すことができる。
【０２０２】
様々なプロモーター（転写開始調節領域）が本発明によって使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存する。異種起源に由来するプロモーターは、それらが選択された宿主において機能的である限り使用され得る。
【０２０３】
プロモーターの選択は、ペプチド又はタンパク質の生成の所望の効率及びレベルにも依存する。例えば、ｔａｃなどの誘導性プロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるために使用されることが多い。タンパク質の過剰発現は、宿主細胞にとって有害な場合がある。結果として、宿主細胞増殖が制限される可能性がある。誘導性プロモーター系の使用は、宿主細胞が遺伝子発現の誘導に先立って許容可能な密度で培養されることを可能にし、それにより生成物のより高い収率が促進される。
【０２０４】
様々なシグナル配列が本発明に従って使用され得る。生物活性ポリペプチドコーディング配列に相同性のシグナル配列が使用され得る。代わりに、発現宿主における効率的な分泌及びプロセッシングのために選択又は設計されているシグナル配列も使用され得る。例えば、好適なシグナル配列／宿主細胞対には、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における分泌に対する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓａｃＢシグナル配列及びサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子又はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）分泌に対するＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酸性フォスファターゼｐｏｈＩシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、シグナルペプチターゼ切断部位をコードする配列を通して、又は架橋が下流のＴＣＲ配列の正確なリーディングフレームを保証する、通常１０個よりも少ないコドンからなる短いヌクレオチド架橋によってタンパク質コーディング配列に直接的に接合され得る。
【０２０５】
転写及び翻訳を増強する要素は、真核生物のタンパク質発現系において同定されてきた。例えば、異種プロモーターのいずれかの側にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１，０００ｂｐを配置すると、植物細胞における転写レベルを１０倍〜４００倍上昇させ得る。発現構築物は、適切な翻訳開始配列も含むはずである。正確な翻訳開始のためコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を含むように発現構築物を修飾すると、翻訳のレベルを１０倍増加させることができる。
【０２０６】
マーカーが関心対象の遺伝子と異なる部位で組み込まれ得るように、発現構築物の一部又はそれからの分離体であり得る（例えば、発現ベクターによって運ばれる）選択マーカーが使用されることが多い。例としては、抗生物質に耐性を付与する（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にアンピシリン耐性を付与するｂｌａ、広範囲の原核細胞及び真核細胞にカナマイシン耐性を付与するｎｐｔＩＩ）又は宿主が最少培地上で増殖することを可能にする（例えば、ＨＩＳ４は、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はＨｉｓ−Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がヒスチジン不在下で増殖することを可能にする）マーカーが挙げられる。選択性マーカーは、マーカーの独立した発現を可能にするために、それ自体の転写及び翻訳の開始領域並びに停止調節領域を有する。抗生物質耐性がマーカーとして使用される場合、選択のための抗生物質の濃度は、抗生物質に応じて変化するが、一般には培地１ｍＬ当たり抗生物質１０μｇ〜６００μｇの範囲内である。
【０２０７】
発現構築物は、公知の組み換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を利用することによって構築される。制限酵素の消化及びライゲーションは、ＤＮＡの２つの断片を連結するために使用される基本的な工程である。ＤＮＡ断片の端部は、ライゲーションに先立って修飾を必要とする場合があり、これは、オーバーハングの充填、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）を用いた断片の末端部分の欠失、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲによる新規な塩基対の付加によって遂行され得る。ポリリンカー及びアダプターを使用すると、選択された断片の接合を促進できる。発現構築物は、典型的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の制限、ライゲーション及び形質転換の繰り返しを使用する段階で組み立てられる。発現構築物を構築するために好適な多数のクローニングベクターは、当該技術分野において公知であり（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９で言及されたλＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ、ｐＥＴ，Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、特定の選択は、本発明にとって重要ではない。クローニングベクターの選択は、宿主細胞内への発現構築物の導入のために選択された遺伝子移入系による影響を受ける。各段階の終了時、生じた構築物は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析によって分析され得る。
【０２０８】
発現構築物は、直鎖状若しくは環状のいずれかのクローニングベクター構築物として宿主に形質転換され得るか、又はクローニングベクターから除去されて、そのまま使用されるか若しくは送達ベクター上に導入され得る。送達ベクターは、選択された宿主細胞型において発現構築物の導入及び維持を促進する。発現構築物は、多数の公知の遺伝子移入系（例えば、天然コンピテンス、化学的に媒介された形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、微粒子銃形質転換、トランスフェクション又はコンジュゲーション）によって宿主細胞に導入される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。選択される遺伝子移入系は、使用される宿主細胞及びベクター系に依存する。
【０２０９】
例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換法又はエレクトロポレーション法により、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞内に導入され得る。Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエレクトロポレーション法は、容易に遂行され、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率をもたらす。
【０２１０】
本発明は、関心対象の融合タンパク質を単離するための生産方法をさらに提供する。この方法では、その中へ調節配列に機能的に連結された関心対象のタンパク質をコードする核酸が導入されている宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）が、関心対象の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するため、培養培地において生産規模で増殖される。続いて、関心対象の融合タンパク質は、採取された宿主細胞又は培養培地から単離される。標準的なタンパク質精製技術を使用すると、培地又は採取された細胞から関心対象のタンパク質を単離することができる。特に、精製技術を使用すると、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター又は発酵槽を含む様々な実装から大規模で（すなわち少なくともミリグラム量で）所望の融合タンパク質を発現させて精製することができる。
【０２１１】
発現したタンパク質融合複合体は、公知の方法によって単離及び精製することができる。典型的には、培養培地は、遠心分離又は濾過され、次に上清が親和性若しくは免疫親和性クロマトグラフィー、例えばプロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー又は発現した融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコルによって精製される。本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組み合わせによって分離及び精製され得る。これらの方法としては、例えば、塩沈澱法及び溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、親和性クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法並びに等電点電気泳動法、Ｎｉ−ＮＴＡなどの金属親和性カラムにおける等電点の差を利用する方法が挙げられる。これらの方法に関連する開示については、一般に、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０２１２】
本発明の融合タンパク質は、実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、融合タンパク質が好ましくは少なくとも８０％又は９０％〜９５％の均一性（重量／重量）で存在するように、自然界でそれに付随する細胞置換物質から単離されている。少なくとも９８％〜９９％の均一性（重量／重量）を有する融合タンパク質が多くの医薬、臨床及び研究の用途のために最も好ましい。実質的に精製されると、融合タンパク質は、治療適用に対して汚染物質を実質的に含まないはずである。部分的又は実質的純度に精製されると、可溶性タンパク質は、治療に使用され得るか、又は本明細書に開示したインビトロ若しくはインビボアッセイを実施する際に使用され得る。実質的な純度は、クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの様々な標準的な技術によって特定され得る。
【０２１３】
本発明の融合タンパク質複合体は、癌性若しくは感染しているか、又は１種以上の疾患に感染する可能性のある様々な細胞と共にインビトロ又はインビボで使用するために好適である。
【０２１４】
ヒトインターロイキン−１５（ｈｕＩＬ−１５）は、抗原提示細胞上で発現したヒトＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）によって免疫エフェクター細胞にトランス提示される。ＩＬ−１５Ｒαは、主として細胞外ｓｕｓｈｉドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ）を通して高い親和性（３８ｐＭ）でｈｕＩＬ−１５に結合する。本明細書で記載するように、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、マルチドメイン融合複合体を構築するためのスカフォールドとして使用され得る。
【０２１５】
ＩｇＧドメイン、特にＦｃ断片は、承認された生物学的薬物を含む、多数の治療用分子のための二量体のスカフォールドとして使用されて成功を収めてきた。例えば、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに連結された可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）の二量体である。この二量体化は、エタネルセプトが単量体ｓＴＮＦＲよりもＴＮＦ−α活性を阻害することにおいて最大１，０００倍強力になることを可能にし、単量体形態よりも５倍長い血清半減期を有する融合体を提供する。その結果として、エタネルセプトは、インビボでのＴＮＦ−αの炎症促進活性の中和に効果的であり、多数の異なる自己免疫適応についての患者の転帰を改善する。
【０２１６】
その二量体化活性に加えて、Ｆｃ断片は、補体活性化及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、食細胞及び樹状細胞上で提示されるＦｃγ受容体との相互作用を通して細胞傷害性エフェクター機能も提供する。抗癌性治療用抗体及び他の抗体ドメインＦｃ融合タンパク質の状況において、これらの活性は、動物腫瘍モデル及び癌患者において観察される有効性に重要な役割を果たす可能性が高い。しかしながら、これらの細胞傷害性エフェクター応答は、多数の治療用途で十分でない可能性がある。したがって、Ｆｃドメインのエフェクター活性に対する改善及び拡大並びに標的化治療分子による疾患部位に対する、Ｔ細胞活性を含む細胞溶解性免疫応答を動員する他の手段の開発に相当に大きい関心が寄せられてきた。ＩｇＧドメインは、従来のハイブリドーマ融合テクノロジーによって生成される製品の質及び量を改善するため、二重特異性抗体を形成するためのスカフォールドとして使用されてきた。これらの方法は、他のスカフォールドの欠点を回避するが、臨床的開発及び使用を支持するのに十分なレベルで哺乳動物細胞中において二重特異性抗体を生成するのは困難であった。
【０２１７】
ヒト由来免疫賦活性多量体スカフォールドを開発する試みでは、ヒトＩＬ−１５（ｈｕＩＬ−１５）及びＩＬ−１５受容体ドメインが使用された。ｈｕＩＬ−１５は、高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）約１０−１１Ｍ）でｈｕＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）と会合する、サイトカインの小さい４αヘリックスバンドルファミリーのメンバーである。生じた複合体は、次に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面上で提示されたヒトＩＬ−２／１５受容体β／共通γ鎖（ｈｕＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体にトランス提示される。このサイトカイン／受容体相互作用は、ウイルス感染細胞及び悪性細胞を根絶するのに重要な役割を果たすエフェクター細胞及びＮＫ細胞の増殖及び活性化をもたらす。通常、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒαが引き続いて分泌され、細胞表面上でヘテロ二量体分子として提示される複合体を細胞内で形成するために樹状細胞内で同時生成される。したがって、ｈｕＩＬ−１５とｈｕＩＬ−１５Ｒαとの相互作用の特徴は、これらの鎖間結合ドメインがヒト由来免疫賦活性スカフォールドとして機能し、標的特異的結合が可能な可溶性二量体分子を作成できたことを示唆している。
【０２１８】
本発明の実施は、他に特に指示しない限り、当業者の知識の範囲内に明確に含まれる分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来型技術を使用する。そのような技術は、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの生成に適用することができ、したがって本発明を生成及び実施する際に考慮に入れることができる。下記のセクションでは、特定の実施形態のために特に有用な技術について考察する。
【０２１９】
下記の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニング及び治療方法の作成方法及び使用方法についての詳細な開示及び説明を提供できるように提示するものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０２２０】
実施例１：ＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８ドメインを含む融合タンパク質複合体の生成及び特性解析
癌又は感染性疾患を治療するための重要な治療アプローチは、疾患細胞に対する免疫細胞活性を増強することに依存する。この戦略は、免疫細胞をエクスビボで刺激し、その後の養子移入及び／又は患者におけるインビボでの免疫細胞のレベル又は活性を増加させることを含む。これらのアプローチに包含される免疫細胞は、天然（すなわちＮＫ細胞）又は適応的（すなわちＴ細胞）免疫系の細胞であり得る。
【０２２１】
免疫活性を増強するための１つのアプローチは、免疫細胞に免疫賦活性サイトカインを提供することである。そのようなサイトカインは、当該技術分野において公知であり、単独で又は他のサイトカイン若しくは薬剤と組み合わせて使用することができる。下記で詳細に説明するように、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃスカフォールドを含む融合タンパク質複合体を生成した（図１Ａ及び図１Ｂ）。これらの融合タンパク質複合体は、ＮＫ細胞に結合すること及びサイトカイン受容体のそれぞれを介して細胞応答をシグナル伝達することに利点を有する。Ｉｇ分子のＦｃ領域は、可溶性マルチポリペプチド複合体を提供するための二量体を形成し、精製の目的でプロテインＡを結合し、ＮＫ細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体と相互作用することができるため、それにより個別サイトカインの組み合わせ中に存在しない利点を融合タンパク質複合体に提供する。さらに、ＩＬ−１５Ｎ７２ＤドメインとＩＬ−１５ＲαＳｕドメインとの間の相互作用は、単一免疫賦活性融合タンパク質複合体中にＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８（及び場合により他のタンパク質ドメイン又は薬剤）を連結するための手段を提供する。
【０２２２】
詳細には、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８ドメインをＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖に連結する構築物を作成した。ＩＬ−１２の場合、成熟サイトカインは、活性一本鎖形を生成するために可撓性リンカーを介して連結され得る２つのポリペプチドサブユニット（ｐ４０及びｐ３５）からなる。一部の場合、ＩＬ−１２又はＩＬ−１８ポリペプチドのいずれかがＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＮ末端に連結されている。他の場合、ＩＬ−１２又はＩＬ−１８ポリペプチドは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＮ末端に連結されている。ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃスカフォールドを含む特異的融合タンパク質複合体について下記で記載する。
【０２２３】
１）ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む融合タンパク質複合体を生成した。ヒトＩＬ−１２サブユニット配列及びヒトＩＬ−１８配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ社のウェブサイトから入手し、これらの配列のＤＮＡは、Ｇｅｎｅｗｉｚ社によって合成された。詳細には、ＩＬ−１２の一本鎖バージョンを生成するためにＩＬ−１２サブユニットβ（ｐ４０）をＩＬ−１２サブユニットα（ｐ３５）に連結し、その後、ＩＬ−１２配列をＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖に直接的に連結する構築物を作成した。合成されたＩＬ−１２配列は、オーバーラッピングＰＣＲによってＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＮ末端コーディング領域に連結させた。ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＮ末端に連結したＩＬ−１２を含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列を下記に示す。
【０２２４】
ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は、下記の通りである（配列番号１）。
（シグナルペプチド）
ａｔｇａａｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットβ（ｐ４０））
【化４】
2020508691.tif 000006
（リンカー）
ｇｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇａｇｔ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットα（ｐ３５））
【化５】
2020508691.tif 000007
（ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン）
【化６】
2020508691.tif 000008
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
【化７】
2020508691.tif 000009
【０２２５】
ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は、下記の通りである（配列番号２）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットβ（ｐ４０））
【化８】
2020508691.tif 000010
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットα（ｐ３５））
【化９】
2020508691.tif 000011
（ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン）
【化１０】
2020508691.tif 000012
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
【化１１】
2020508691.tif 000013
【０２２６】
一部の場合、リーダーペプチドは、可溶性であるか又は分泌され得る成熟形を生成するために無傷ポリペプチドから切断される。
【０２２７】
オーバーラッピングＰＣＲにより、合成したＩＬ−１８配列をＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端コーディング領域に連結させる構築物も作成した。ＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端に連結したＩＬ−１８を含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列を下記に示す。
【０２２８】
ＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は、下記の通りである（配列番号３）。
（シグナルペプチド）
ａｔｇａａｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−１８）
【化１２】
2020508691.tif 000014
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化１３】
2020508691.tif 000015
【０２２９】
ＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は、下記の通りである（配列番号４）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ−１８）
【化１４】
2020508691.tif 000016
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化１５】
2020508691.tif 000017
【０２３０】
一部の場合、リーダーペプチドは、可溶性であるか又は分泌され得る成熟形を生成するために無傷ポリペプチドから切断される。
【０２３１】
ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物は、以前に記載されたように発現ベクター内にクローニングし（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５０７，２２２号明細書、実施例１）、且つ発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞中の２つの構築物の共発現は、可溶性ＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体（ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭと呼ばれる）の形成及び分泌を可能にした。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭタンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってＣＨＯ細胞培養上清から精製すると、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ二量体及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質からなる可溶性（非凝集化）融合タンパク質複合体をもたらした（図２Ａ〜２Ｃ）。
【０２３２】
プロテインＡ精製ＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体の還元状態下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示す。約９０ｋＤａ及び約３０ｋＤａでの可溶性ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質に対応するバンドがそれぞれ観察された（図３）。
【０２３３】
２）第２アプローチのために、ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む類似の融合タンパク質複合体を生成した。詳細には、構築物は、ＩＬ−１８をＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖に直接的に結合させることによって作成した。合成されたＩＬ−１８配列は、オーバーラッピングＰＣＲによってＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＮ末端コーディング領域に連結されている。ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＮ末端に連結したＩＬ−１８を含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列を下記に示す。
【０２３４】
ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は、下記の通りである（配列番号５）。
（シグナルペプチド）
ａｔｇａａｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−１８）
【化１６】
2020508691.tif 000018
（ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン）
【化１７】
2020508691.tif 000019
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
【化１８】
2020508691.tif 000020
【０２３５】
ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は、下記の通りである（配列番号６）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ−１８）
【化１９】
2020508691.tif 000021
（ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン）
【化２０】
2020508691.tif 000022
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
【化２１】
2020508691.tif 000023
【０２３６】
一部の場合、リーダーペプチドは、可溶性であるか又は分泌され得る成熟形を生成するために無傷ポリペプチドから切断される。
【０２３７】
オーバーラッピングＰＣＲにより、合成したＩＬ−１２配列をＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端コーディング領域に連結させる構築物も作成した。上述のように、ＩＬ−１２の一本鎖バージョン（ｐ４０−リンカー−ｐ３５）を使用した。ＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は、下記の通りである（配列番号７）。
（シグナルペプチド）
ａｔｇａａｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットβ（ｐ４０））
【化２２】
2020508691.tif 000024
（リンカー）
ｇｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇａｇｔ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットα（ｐ３５））
【化２３】
2020508691.tif 000025
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化２４】
2020508691.tif 000026
【０２３８】
ＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は、下記の通りである（配列番号８）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットβ（ｐ４０））
【化２５】
2020508691.tif 000027
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（ヒトＩＬ−１２サブユニットα（ｐ３５））
【化２６】
2020508691.tif 000028
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化２７】
2020508691.tif 000029
【０２３９】
一部の場合、リーダーペプチドは、可溶性であるか又は分泌され得る成熟形を生成するために無傷ポリペプチドから切断される。
【０２４０】
ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物は、以前に記載されたように発現ベクター内にクローニングし（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５０７，２２２号明細書、実施例１）、且つ発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞中の２つの構築物の共発現は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及び他のクロマトグラフィー法によって精製され得る可溶性ＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体（ｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭと呼ばれる）の形成及び分泌を可能にした。
【０２４１】
３）ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含むか、又はＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む類似の融合タンパク質複合体を生成し得る。ＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む「双頭型」融合タンパク質複合体を生成し得る（図１Ｂ）。同様に、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む「双頭型」融合タンパク質複合体を生成し得る。そのような複合体は、上記に記載したように生成した。
【０２４２】
実施例２：ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ及びｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の活性のインビトロ特性解析
ＥＬＩＳＡに基づく方法は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ及びｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の形成を確証した。図４Ａでは、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの培養上清中のＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体が、捕捉抗体である抗ヒトＩＬ−１５抗体（ＭＡＢ６４７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びホースラディッシュペルオキシダーゼに抱合した検出抗体を用いるｈｕＩｇＧ１／ＩＬ１５特異的ＥＬＩＳＡを使用して検出された。これを、公知の濃度を有する類似の抗体ＴｘＭ融合タンパク質複合体（２Ｂ８Ｔ２Ｍ）と比較した。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体からのシグナルを２Ｂ８  Ｔ２Ｍコントロールのシグナルと比較すると、融合タンパク質濃度を推定することができる。ｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体から類似の結果が得られた（図４Ｂ）。精製「双頭型」ＩＬ−１８／ＴｘＭ複合体について、抗ＩＬ−１８捕捉抗体及び抗ＩＬ−１５検出抗体を用いるＥＬＩＳＡにより、融合タンパク質複合体の形成が立証された（図４Ｃ）。これらのアッセイからの結果は、可溶性ＩＬ−１８／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１８／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質がＣＨＯ細胞中で生成できること、並びにｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ及びｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭ融合タンパク質複合体が形成されて培養培地中に分泌され得ることを証明している。
【０２４３】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のＩＬ−１５免疫賦活活性を評価するために、マウス造血細胞系であるＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を評価した。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのレベルを増加させながら２００μＬのＲＰＭＩ：１０％のＦＢＳ培地中の３２Ｄβ細胞（１０４細胞／ウエル）に添加し、細胞を３７℃で２日間インキュベートした。次に、ＷＳＴ−１増殖試薬（１０μＬ／ウエル）を添加した。４時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、代謝的に活性な細胞によるＷＳＴ−１の可溶性ホルマザン色素への切断に基づいて細胞増殖を決定した。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）の生物活性は、陽性コントロールとして評価した。図５に示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは、３２Ｄβ細胞の細胞増殖を促進することができたため、これによりＩＬ−１５活性が証明された。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭの活性は、おそらくＩＬ−１８のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインへの連結に起因して、ＡＬＴ−８０３の活性と比較して減少した。
【０２４４】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのＩＬ−１５活性をさらに評価するため、濃度を増加させながらｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを２００μＬのＩＭＤＭ：１０％のＦＢＳ培地中の３２Ｄβ細胞に添加し、３７℃で３日間インキュベートした。次に、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存性判定試薬（２０μＬ／ウエル）を添加した。４時間後、５７０ｎｍ（正規化のために６００ｎｍの参照波長を用いる）で吸光度を測定し、代謝的に活性な細胞によるレザズリン系溶液であるＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅの減少に基づいて細胞増殖を決定した。次に、吸光度とタンパク質濃度との関係に基づいて、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭに対するＩＬ−１５生物活性の５０％有効濃度（ＥＣ５０）を決定した。ＡＬＴ−８０３の生物活性は、陽性コントロールとして評価した。図６に示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは３２Ｄβ細胞の細胞増殖を促進することができたため、これによりＩＬ−１５活性が証明された。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭの活性は、おそらくＩＬ−１８のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄへの連結に起因して、ＡＬＴ−８０３の活性と比較して減少した。
【０２４５】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのＩＬ−１８活性を評価するために、ＩＬ−１８レポーターＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１８（ＨＥＫ１８）細胞の活性化を評価した。濃度を増加させながらｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを２００μＬのＩＭＤＭ：１０％のＦＢＳ  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ培地中のＨＥＫ１８細胞（５×１０４細胞／ウエル）に添加し、３７℃で２０〜２２時間インキュベートした。次に、培養上清（２０μＬ／ウエル）をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（１８０μＬ／ウエル）に添加した。２０時間後、吸光度を６５０ｎｍで測定し、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）検出試薬であるＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅの減少に基づいて細胞活性化を決定した。次に、吸光度とタンパク質濃度との関係に基づいて、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのＩＬ−１８生物活性の５０％有効濃度（ＥＣ５０）を決定した。組み換えＩＬ−１８の生物活性は、陽性コントロールとして評価した。図７に示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは、ＨＥＫ１８細胞を活性化することができたため、これによりＩＬ−１８活性が証明された。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭの活性は、おそらくＩＬ−１８のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄへの連結に起因して、組み換えＩＬ−１８の活性と比較して減少した。
【０２４６】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのＩＬ−１２活性を評価するために、ＩＬ−１２レポーターＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２（ＨＥＫ１２）細胞の活性化を評価した。濃度を増加させながらｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを２００μＬのＩＭＤＭ：１０％のＦＢＳ  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ培地中のＨＥＫ１２細胞（５×１０４細胞／ウエル）に添加し、３７℃で２０〜２２時間インキュベートした。次に、培養上清（２０μＬ／ウエル）をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（１８０μＬ／ウエル）に添加した。２０時間後、吸光度を６５０ｎｍで測定し、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）検出試薬であるＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅの減少に基づいて細胞活性化を決定した。次に、吸光度とタンパク質濃度との関係に基づいて、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭのＩＬ−１２生物活性の５０％有効濃度（ＥＣ５０）を決定した。組み換えＩＬ−１２の生物活性は、陽性コントロールとして評価した。図８に示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは、組み換えＩＬ−１２と同様に、ＨＥＫ１２細胞を活性化することができたため、これによりＩＬ−１２活性が証明された。
【０２４７】
各サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＩＬ−１５）の個々の活性をさらに証明するために、各サイトカインによる受容体シグナル伝達（ＩＬ−１２：ＳＴＡＴ４、ＩＬ−１８：ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＩＬ−１５：ＳＴＡＴ５）に応答して独自にリン酸化されるタンパク質を利用して、フローサイトメトリーに基づく細胞内リンタンパク質アッセイが開発された。ＮＫ９２（ａＮＫ）細胞又は精製ヒトＮＫ細胞（＞９５％のＣＤ５６＋）の１μｇ／ｍＬのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いた短時間（５〜１５分間）の刺激後、組み換えＩＬ−１２（ｌ０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＴ−８０３（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５活性）の任意選択的組み合わせを用いて見られる応答と類似の応答が生じた（図９Ａ〜Ｆ）。これらの結果は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のサイトカインドメインの各々がその特異的な免疫賦活性生物活性を維持していることを証明している。
【０２４８】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＩＬ−１５活性の組み合わせがこれらのサイトカインいずれかの単独よりもＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導することに有効であることは公知である。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ複合体の結合サイトカイン活性を評価するために、ａＮＫ細胞をｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ複合体（５０ｎＭ）、ＩＬ−１２（０．５ｎＭ）、ＩＬ−１８（３ｎＭ）及びＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）の組み合わせ又は各サイトカイン単独と共にインキュベートした。２日後、培養上清中のＩＦＮ−γレベルを、ＥＬＩＳＡ法を用いて決定した。図１０Ａに示したように、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３単独は、ａＮＫ細胞にほとんど作用を示さなかったが、ＩＬ−１２＋ＡＬＴ−８０３及びＩＬ−１８＋ＡＬＴ−８０３の組み合わせは、ａＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの低レベルの産生を誘導した。しかしながら、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体単独並びにＩＬ−１２＋ＩＬ−１８及びＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＡＬＴ−８０３の組み合わせは、ａＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの高レベルの産生を示した。これらの結果は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体が結合ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＩＬ−１５サイトカインの予想された免疫賦活活性を示すことを立証している。２つの「双頭型」ＩＬ−１８／ＴｘＭ複合体を用いた類似の研究は、この複合体がａＮＫ細胞によるＩＦＮ−γを誘導する能力を証明したが、その度合いは、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体より低かった（図１０Ｂ）。
【０２４９】
実施例３：ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によるＮＫ細胞様のサイトカイン誘導性メモリーの誘導
以前の研究は、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞が、飽和量のＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いた精製ＮＫ細胞の一晩の刺激後にエクスビボで誘導できることを証明している。これらの細胞は、例えば、１）増殖の増強、２）ＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５）及び他の活性化マーカーの発現、及び３）ＩＦＮ−γ産生の増加などのメモリー様特性を示す。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭがサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の生成を促進する能力を評価するために、精製ヒトＮＫ細胞（＞９５％のＣＤ５６＋）（５×１０６細胞／ｍＬ）を、１８時間にわたり１μｇ／ｍＬのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又は組み換えＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＴ−８０３（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５活性）の最適組み合わせを用いて刺激した。サイトカイン誘導性メモリー様細胞の誘導は、抗体染色及びフローサイトメトリー法によって決定される増加した細胞表面ＣＤ２５及びＣＤ６９（刺激マーカー）発現及び細胞内ＩＦＮ−γレベルとして評価した。結果は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体がヒトＮＫ細胞との一晩のインキュベーション後、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＩＬ１５の最適な組み合わせと類似する程度までＣＤ２５、ＣＤ６９及び細胞内ＩＦＮ−γを誘導できることを示した（図１１Ａ〜図１１Ｆ）。したがって、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体との一晩のインキュベーションは、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を生成することができる。
【０２５０】
以前の研究は、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞が、飽和量のＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いた精製ＮＫ細胞の一晩の刺激後にエクスビボで誘導され得ることを証明している。これらの細胞は、例えば、１）増殖の増強、２）ＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５）の発現、３）ＩＦＮ−γ産生の増加、及び４）パーフォリン及びグランザイムによって媒介された細胞傷害性の増強などのメモリー様特性を示す。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭがサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の生成を促進する能力を評価するために、濃度を増加させながらｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又は組み換えＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＴ−８０３（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５、３．８８ｎＭ）の最適組み合わせを用いて１２〜１８時間にわたって精製ヒトＮＫ細胞（＞９５％のＣＤ５６＋）（５×１０６細胞／ｍＬ）を刺激した。活性化前サイトカイン誘導性メモリー様細胞表現型の誘導は、抗体染色及びフローサイトメトリー法によって決定されるような増加した細胞表面ＣＤ２５の発現及び細胞内ＩＦＮγレベルとして評価した。図１２Ａ及び１２Ｂに示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは、ヒトＮＫ細胞との一晩のインキュベーション後、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＡＬＴ−８０３の最適な組み合わせと類似する程度までＣＤ２５及び細胞内ＩＦＮ−γを誘導することができた。
【０２５１】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭによるサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の生成を証明するために、一次ヒトＮＫ細胞（２×１０６／ｍＬ）を、１６時間にわたり上述のようにｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（３８．８ｎＭ）を用いてプライミングし、プライミングされたＮＫ細胞がサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞に分化することを可能にするために低用量ＡＬＴ−８０３（７７．６ｐＭ、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と同等）中で洗浄して静止させた。サイトカイン（ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＴ−８０３（５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１５と同等））又は白血病標的（Ｋ５６２細胞、５：１の比率）を用いた６時間の再刺激後のＣＤ２５発現の維持及びＩＦＮ−γ産生の増強は、ブレフェルジンＡ及びモネンシンの存在下において、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を生成するための相関物として評価した。全ての場合、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いたプライミングは、コントロールとしての低用量ＩＬ−１５（７７．６ｐＭのＡＬＴ−８０３）と比較して、サイトカイン及び白血病標的を用いた再刺激後にＣＤ２５のレベルの増強を生じさせた（図１３Ｂ）。
【０２５２】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又は異なるサイトカインの組み合わせを用いる短時間のプライミングが、その後、低用量ＡＬＴ−８０３又はＩＬ−１５中で静止させ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５を用いて再刺激された場合にヒトＮＫ細胞に及ぼす影響をさらに比較するために、類似の研究を実施した。これらの試験について、ＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の増殖及びＩＦＮ−γ産生を免疫活性化の尺度として評価した。図１４Ａ及びＢに示したように、ヒトＮＫ細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔを用いて標識し、上述のように培地単独、ＩＬ−１２（０．５ｎＭ）、ＩＬ−１８（３ｎＭ）、ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）、ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）＋ＩＬ−１８（３ｎＭ）、ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）＋ＩＬ−１８（３ｎＭ）＋ＩＬ−１２（０．５ｎＭ）又はｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（１０ｎＭ）を用いてプライミングした。プライミング後、細胞を洗浄し、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（図１４Ａ）又は７５ｐＭのＡＬＴ−８０３（図１４Ｂ）を含有する培地中で維持し、再刺激しないままか又は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を用いて再刺激した。ＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識の希釈率によって決定し、細胞内ＩＦＮ−γ発現は、細胞内染色及びフローサイトメトリーによって決定した。プライミングなし又は個別サイトカイン、ＡＬＴ−８０３＋ＩＬ−１８又はＡＬＴ−８０３＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−１２を用いたプライミングと比較して、ＮＫ細胞は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いたプライミング及びその後のＩＬ−１５又はＡＬＴ−８０３中での静止、その後のＩＬ−１２＋ＩＬ−１５を用いた再刺激によってより高レベルのＩＦＮ−γを発現した。詳細には、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いたプライミングによって生成されたＣＩＭＬ  ＮＫ細胞は、標準のｈＩＬ１８＋ＩＬ１２＋ＡＬＴ−８０３の組み合わせを用いてプライミングされたＮＫ細胞の約７４％及び個別サイトカインを用いてプライミングされたＮＫ細胞の５０〜６０％と比較して、＞８３％がＩＦＮ−γを発現することが見出された。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いてプライミングされたＣＩＭＬ  ＮＫ細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈率によって測定した場合、ｈＩＬ１８＋ＩＬ１２＋ＡＬＴ−８０３又は個別サイトカインを用いてプライミングされたＮＫ細胞より大きい増殖も示した（図１５）。これらの結果は、ヒトＮＫ細胞のｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いた短時間プライミングが、ｈＩＬ１８＋ＩＬ１２＋ＩＬ−１５を用いたプライミングと同等又はそれより良好なＣＩＭＬ  ＮＫ細胞（すなわち増加した増殖及び免疫活性化（ＣＤ２５、ＩＦＮ−γ発現））を生じさせ得ることを確証している。
【０２５３】
さらに、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体がヒト腫瘍細胞に対するヒトＮＫ細胞の細胞傷害性に及ぼす作用についても研究した。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ標識）を精製ヒトＮＫ細胞（２例の独立ドナー；ＮＫ１及びＮＫ２）（Ｅ：Ｔ比；１：１）と共に、コントロールとしてのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ複合体（１０ｎＭ）又はＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）の存在下でインキュベートした。２日後、死滅腫瘍細胞（Ｖｉｏｌｅｔ＋ＰＩ＋）のパーセンテージは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた染色後にフローサイトメトリーによって評価した。図１６に示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭは、ＡＬＴ−８０３と比較して、乳癌細胞に対してより効果的なヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を有意に誘導した。これらの結果は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＩＬ−１５の併用治療が抗腫瘍ＮＫ細胞活性を増強する能力と一致している。
【０２５４】
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体は、ＡＬＴ−８０３又は治療なしと比較して、ヒトＮＫ細胞中でのグランザイムＢの発現を増強することもできた（図１７Ａ）。さらに、これらのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ活性化ＮＫ細胞は、ＩＦＮγの産生増強（図１７Ｃ）を含む、ヒト腫瘍標的に対する直接又は抗体媒介性細胞傷害性アッセイ（図１７Ｂ）でもより効果的であった。したがって、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭとの一晩のインキュベーションは、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞に関連する表現型を生成することができる。
【０２５５】
実施例４：ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって刺激された免疫細胞の抗腫瘍活性
ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体が、インビボ抗腫瘍活性を有するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を誘導する能力についても評価される。脾臓ＮＫ細胞は、マウスから標準方法によって単離され、１μｇ／ｍＬのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ、組み換えＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＴ−８０３（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５活性）の組み合わせ及びＡＬＴ−８０３単独（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５活性）を用いて１８時間にわたり５×１０６細胞／ｍＬで刺激される。細胞は、その後、洗浄され、皮下ＲＭＡ−Ｓリンパ腫を担持し、細胞移入前の３時間にわたり５Ｇｙの全身照射を受容したＣ５７ＢＬ／６マウスにｉ．ｖ．で養子移入される（１×１０６細胞／マウス）。マウスの生存が監視される。ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＡＬＴ−８０３活性化ＮＫ細胞（ＣＩＭＬ  ＮＫ細胞）を用いて治療された腫瘍担持マウスは、ＡＬＴ−８０３活性化ＮＫ細胞を用いて治療されたマウスより長期間生存すると予想される（Ｎｉ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２  ２０９：２３５１−２３６５）。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ活性化ＮＫ細胞を受容した腫瘍担持マウスの長期間の生存は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭが免疫細胞のインビボ抗腫瘍活性を増強するエクスビボ薬として機能し得るという証拠を提供するであろう。
【０２５６】
同様に、精製ヒトＮＫ細胞は、１μｇ／ｍＬのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ、組み換えＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＴ−８０３（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５活性）の組み合わせ又はＡＬＴ−８０３単独（５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５活性）を用いて１８時間にわたり５×１０６細胞／ｍＬで刺激される。細胞は、その後、洗浄され、Ｋ５６２白血病細胞を担持し、細胞移入後に低用量ｒｈＩＬ−２を受容したＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で養子移入される（１×１０６細胞／マウス）。マウスの生存が監視される。ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＡＬＴ−８０３活性化ＮＫ細胞（ＣＩＭＬ  ＮＫ細胞）を用いて治療された腫瘍担持マウスは、ＡＬＴ−８０３活性化ＮＫ細胞を用いて治療されたマウスより長期間生存すると予想される（Ｒｏｍｅｅ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８：３５７ｒａ１２３）。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ活性化ヒトＮＫ細胞を受容した腫瘍担持マウスの長期間の生存は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭが免疫細胞のインビボ抗腫瘍活性を増強するエクスビボ薬として機能し得るという証拠を提供するであろう。
【０２５７】
例えば、再発性又は難治性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの悪性腫瘍を有する患者を治療するために（Ｒｏｍｅｅ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８：３５７ｒａ１２３）、患者は、シクロホスファミド及びフルダラビンを用いて前状態調節により治療され、その後、１６〜２４時間にわたりｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又はｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭと共にエクスビボでインキュベートされた同種半分一致ＮＫ細胞から精製されたＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を用いて治療される。細胞移入後、患者は、インビボでの細胞を支持するために低用量ＩＬ−２を受容することができる。抗腫瘍応答（客観的応答、無病生存、全生存、再発までの時間など）が評価され、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又はｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭが、悪性腫瘍を有する患者におけるヒト免疫細胞の抗腫瘍活性を増強するためのエクスビボ薬として機能し得るという証拠を提供するであろう。類似の研究は、他の血液学的又は固形腫瘍又は感染性疾患を有する患者において実施されるであろう。
【０２５８】
これらの研究の各々では、ＮＫ細胞の残存及び機能性を移入後に評価することができる。例えば、ＰＢＭＣは、患者から移入の７〜１４日後に単離することができ、Ｋｉ６７陽性（増殖マーカー）ドナーＮＫ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定することができる。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を用いて再刺激し、ＩＦＮ−γ産生のレベルは、フローサイトメトリーによって評価することもできる。これらの研究の結果は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又はｈＩＬ１２／ＩＬ１８／ＴｘＭを用いたエクスビボでの移入前治療がインビボでのそれらのその後の免疫応答を増強するかどうかを示すであろう。
【０２５９】
実施例５：ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のマウスへの投与後の免疫賦活作用
上記に示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体は、インビトロの免疫細胞の増殖及び応答を刺激することに高度に有効であった。これらの複合体のインビボでの活性を評価するために、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２０ｍｇ／ｋｇのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ又はコントロールとしてのＰＢＳを腹腔内注射した。３日後、マウスを犠死させ、血液及び脾臓試料を採取して、ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ８）、ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ４）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）及びＮＫ細胞（ＮＫｐ４６）に対する抗体を用いた染色後にフローサイトメトリーによって測定されるような免疫細胞サブセットにおける変化を決定した。図１８Ａに示したように、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ治療は、ＰＢＳコントロール治療マウスと比較して、脾臓の重量における２．５倍の増加を生じさせた。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇのｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ治療を用いた臨床的傷害性の徴候は見られなかった。ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭの投与も、ＰＢＳコントロールと比較して、治療されたマウスの脾臓においてＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージにおける２倍を超える増加及びＮＫ細胞のパーセンテージにおける５．５倍の増加を生じさせた（図１８Ｂ）。さらに、ＰＢＳと比較して、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭを用いたマウスの治療後、血液中の絶対細胞数は、ＣＤ８  Ｔ細胞について６．４倍及びＮＫ細胞について２３倍に増加し、血球パーセンテージは、ＣＤ８  Ｔ細胞について３．９倍及びＮＫ細胞について１３倍に増加した（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）。この研究の結果は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭの投与が、マウスにおいて過剰な傷害性を誘発することなく、免疫細胞、特にＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞に免疫賦活作用を提供することを明確に示す。
【０２６０】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と結び付けて記載してきたが、上記の説明は、例示することを意図しており、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点及び修飾形態は、以下の請求項の範囲内に含まれる。
【０２６１】
本明細書で言及した特許文献及び学術文献は、当業者であれば利用可能な知識を確立する。本明細書中に引用した米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中に引用される公開された外国特許及び外国特許出願の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用したアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの寄託は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用した他の公開された文献、文書、原稿、学術文献の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。  
【０２６２】
本発明をその好ましい実施形態を参照して具体的に示すと共に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱しない限り、様式及び詳細について多様な変更形態が可能であることが当業者に理解されるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｆ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｆ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｃ】
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【図１８Ａ−１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020508691.tif 000054
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