(57)【要約】  本発明は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体とその使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合する抗体。
【請求項２】
単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて阻害する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて阻害する、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
ＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を阻害する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体であって、ＪＥＧ３細胞に結合し、且つＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を、抗体なしでの結合と比較したとき５０％を超えて阻害する抗体。
【請求項７】
配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない及び／又は配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体。
【請求項１１】
ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む抗体。
【請求項１２】
ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって，
Ａ）
ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
或いは
Ｂ）
ｉ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む抗体。
【請求項１３】
ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって，
ａ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する；又は
ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する
抗体。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体であって、
以下の特性：
ａ）配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない；及び／又は
ｂ）配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない；及び／又は
ｃ）配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない；及び／又は
ｄ）配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない；及び／又は
ｅ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を阻害する；及び／又は
ｆ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて阻害する；及び／又は
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて阻害する；及び／又は
ｈ）ＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を阻害する；及び／又は
ｉ）ＪＥＧ３細胞に結合し、且つＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を阻害する；及び／又は
ｊ）ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合し、且つ単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を６０％を超えて阻害し、二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ４の結合を５０％を超えて阻害する
ことにより独立に特徴付けられる抗体。
【請求項１５】
ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１９】
抗体が生成されるように請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体生成方法。
【請求項２０】
宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
【請求項２２】
医薬としての使用のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
がんの治療における使用のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
医薬の製造における、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２５】
医薬ががんの治療のためのものである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
がんを有する個体を治療する方法であって、個体に対し、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２７】
抗ＨＬＡＧ抗体（例えば請求項１から４のいずれか一項に記載）を選択するための方法であって：
ａ）表面プラズモン共鳴アッセイにより、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対する抗ＨＬＡＧ抗体の結合を決定する工程；
ｂ）それぞれの抗ＨＬＡＧ抗体による、単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合の阻害を決定する工程；並びに
ｃ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、抗体なしでの結合と比較したとき５０％を超えて阻害する抗ＨＬＡＧ抗体を選択する工程、又は単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、抗体なしでの結合と比較したとき５０％を超えて阻害する抗ＨＬＡＧ抗体を選択する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体とその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）としても知られるヒト主要組織適合複合体、クラスＩ、６は、ヒトにおいてＨＬＡ−Ｇ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡの非古典的なクラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖からなるヘテロ二量体（ベータ−２ミクログロブリン）である。重鎖は、膜内に固定されるが、流出／分泌されることがある。
・重鎖は三つのドメイン、即ちアルファ１、アルファ２及びアルファ３からなる。アルファ１及びアルファ２ドメインは、二つのアルファヘリックスが隣接するペプチド結合溝を形成する。小さなペプチド（概ね９−ｍｅｒｓ）は、他のＭＨＣ  Ｉタンパク質と同様にこの溝に結合することができる。
・第２の鎖は、他のＭＨＣ  Ｉタンパク質と同様に重鎖に結合するベータ２ミクログロブリンである。
【０００３】
ＨＬＡ−Ｇの場合、７つのアイソフォームが存在し、そのうちの３つは分泌形態であり、４つは膜結合形態である（図１に模式的に示す）。
【０００４】
ＨＬＡ−Ｇは、機能的に活性の複合オリゴマー構造を形成することができる（Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37（2007）1727-1729）。ジスルフィド結合した二量体は、二つのＨＬＡ−Ｇ分子のＣｙｓ４２間に形成される。（Shiroishi M et al., J Biol Chem 281（2006）10439-10447.三量体及び四量体複合体は、例えばKuroki, K et al. Eur J Immunol. 37（2007）1727-1729, Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268（2002）43-50及びT Gonen-Gross et al., J Immunol 171（2003）1343-1351にも記載されている。）
【０００５】
ＨＬＡ−Ｇは、胎盤の栄養膜細胞層に優勢に発現される。複数の腫瘍（膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃、及び卵巣を含む）は、ＨＬＡ−Ｇを発現する（Lin, A. et al., Mol Med. 21（2015）782-791; Amiot, L., et al., Cell Mol Life Sci. 68（2011）417-431）。この発現はまた、炎症性疾患、ＧｖＨＤ及びがんのような病的状態に関連付けられることが報告されている。ＨＬＡ−Ｇの発現は、がんの予後不良に関連付けられることが報告されている。腫瘍細胞は、ＨＬＡ−Ｇ発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することにより、宿主の免疫監視を逃れる。
2020511112.tif 000002
【０００６】
ＨＬＡ−Ｇは、他のＭＨＣ  Ｉ分子と高い相同性（＞９８％）を共有しており、したがって他のＭＨＣ  Ｉ分子に対する交差活性を有さない真のＨＬＡ−Ｇ特異性抗体は生成し難い。
【０００７】
様々な方法でＨＬＡ−Ｇと相互作用する特定の抗体は、以前にも記載がある：Tissue Antigens, 55（2000）510-518は、モノクローナル抗体、例えば８７Ｇ、及びＭＥＭ−Ｇ／９に関し；Neoplasma 50（2003）331-338は、無傷のＨＬＡ−Ｇオリゴマ複合体（例えば８７Ｇ及びＭＥＭ−Ｇ９）、及びＨＬＡ−Ｇを有さない重鎖（例えば４Ｈ８４、ＭＥＭ−Ｇ／１及びＭＥＭ−Ｇ／２）の両方を認識する特定のモノクローナル抗体に関し；Hum Immunol. 64（2003）315-326は、ＨＬＡ−Ｇ発現ＪＥＧ３腫瘍細胞上で試験される複数の抗体（例えば天然ＨＬＡ−Ｇ１分子のみと反応するＭＥＭ−Ｇ／０９及び−Ｇ／１３）に関する。ＭＥＭ−Ｇ／０１は、（４Ｈ８４  ｍＡｂと同様に）すべてのアイソフォームの変性されたＨＬＡ−Ｇ重鎖を認識し、ＭＥＭ−Ｇ／０４は、選択的に変性されたＨＬＡ−Ｇ１、−Ｇ２、及び−Ｇ５アイソフォームを認識する；Wiendl et al Brain 2003 176-85は、様々なモノクローナルＨＬＡ−Ｇ抗体、例えば８７Ｇ、４Ｈ８４、ＭＥＭ−Ｇ／９に関する。
【０００８】
上記文献は、ヒトＨＬＡ−Ｇ又はヒトＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍ  ＭＨＣ複合体に結合する抗体を報告している。しかしながら、ＨＬＡファミリーの高い多型性及び高い相同性に起因して、多くの抗体は、いずれかの真に特異性のＨＬＡ−Ｇ結合特性を欠き、さらには往々にして他のＨＬＡファミリーメンバー（β２ＭとのＭＨＣ複合体として、又はそのβ２Ｍを有さない形態として）と結合又は交差反応するか、又は単純にＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨ複合体のその受容体ＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４への結合を阻害しない（そして非アンタゴニスト抗体とみなされる）。よって、さらに改善された、受容体遮断特性を有する真にＨＬＡ−Ｇ特異性の抗体を生成及び／又は選択する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、多数の候補の中からＨＬＡ−Ｇ特異性の抗体を同定する（他のＭＨＣクラスＩ複合分子に対する交差反応性を避けると同時にＨＬＡ−Ｇ受容体（例えばＩＬＴ２）遮断抗体を選択する）ための、個別に最適化されたキメラ抗原及び／又はストリンジェントなスクリーニングアッセイを提供する。
【００１０】
本発明は、
・配列番号２５を含む単量体の野生型ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体；及び
・配列番号２６を含む単量体の修飾ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がすべてのＨＬＡ−ＡのＨＬＡコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている）；及び
・ＩＬＴ２
・ＩＬＴ４
のキットを提供し、これは、他のＨＬＡ−Ａファミリータンパク質との交差反応性を示さず、その受容体であるＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４の一つに対するＨＬＡ−Ｇの結合を阻害するヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ複合体特異性の抗体をスクリーニングするためのキットである。
【００１１】
本発明は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体を提供し、この場合抗体はヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合し、抗体は配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合する。
【００１２】
好ましい一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を阻害する。
【００１３】
別の好ましい実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）５０％を超えて阻害する。
【００１４】
一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）７０％を超えて阻害する。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ＪＥＧ３細胞上のヒトＨＬＡ−Ｇに結合し、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−Ｇに対するＩＬＴ２の結合を（抗体なしでの結合と比較したとき）（５０％を超えて）阻害する。
【００１６】
一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）。
【００１７】
一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）及び／又は配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）。
【００１８】
一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）。
【００１９】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【００２０】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【００２１】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、
Ａ）
ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む；或いは
Ｂ）
ｉ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【００２２】
一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【００２３】
一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【００２４】
一実施態様では、本発明による抗ＨＬＡ−Ｇ抗体はモノクローナル抗体である。
【００２５】
一実施態様では、本発明による抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。
【００２６】
一実施態様では、本発明による抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ＨＬＡ−Ｇに結合する抗体断片である。
【００２７】
一実施態様では、本発明による抗ＨＬＡ−Ｇ抗体はＦａｂ断片である。
【００２８】
本発明は、上述のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸を提供する。
【００２９】
本発明は、前記核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００３０】
本発明は、抗体が生成されるように宿主細胞を培養することを含む抗体生成方法を提供する。
【００３１】
本発明は、宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、前記抗体生成方法を提供する。
【００３２】
本発明は、本明細書に記載される抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤を提供する。
【００３３】
本発明は、医薬としての使用のための本明細書に記載される抗体を提供する。
【００３４】
本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書に記載される抗体を提供する。
【００３５】
本発明は、医薬の製造における、本明細書に記載される抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療を目的とする。
【００３６】
本発明は、がんを有する個体に対して本明細書に記載される抗体の有効量を投与することを含む、前記個体の治療方法を提供する。
【００３７】
本発明によるスクリーニング方法により、新規の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が選択される。このような抗体は、ＪＥＧ３細胞上に発現されるＨＬＡ−Ｇに対するＩＬＴ２の結合の強い阻害、又は単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合の阻害のような、高度に有用な特性を示す。さらに、本発明による抗体は、抑制された免疫応答を回復することができる（即ちＨＬＡ−Ｇ発現細胞との共培養における単球によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦａ生成の回復）。加えて、本抗体は、高度に特異性であり、マウス又はラット起源のＨＬＡ−Ａ  ＭＨＣ  Ｉ複合体又はＭＨＣ  Ｉ複合体との交差反応性を示さない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＨＬＡ−Ｇの様々なアイソフォームを示している。
【図２Ａ】β２Ｍと会合した分子を有するＨＬＡ−Ｇの模式図である。
【図２Ｂ】特定の受容体と会合したＨＬＡ−Ｇ分子の構造：ＩＬＴ４及びＫＩＲ２ＤＬ１といった所与の受容体と複合体を形成しているＨＬＡ−Ｇ構造である。ＩＬＴ４構造（ＰＤＢコード：２ＤＹＰ）。ＫＩＲ２ＤＬ１構造は、ＰＤＢコード１ＩＭ９（ＫＩＲ２ＤＬ１：ＨＬＡ−Ｃｗ４複合体構造）から取得され、ＨＬＡ−Ｃｗ４とＨＬＡ−Ｇ構造とを重ね合わせることによりＨＬＡ−Ｇの上に配置された。受容体は、リボンで表されており、ＨＬＡ−Ｇは分子表面で表されている。他のＨＬＡパラログに特有の又はそのようなパラログに保存されているＨＬＡ−Ｇ残基は、それぞれ白及びグレーで示されている。特有の表面残基が、キメラカウンター抗原中のＨＬＡコンセンサス配列よって置き換えられた。
【図３Ａ】ＨＬＡ−Ｇ抗体（ＨＬＡ−Ｇ−００３２及びＨＬＡ−Ｇ−００３３）の、組み換えＨＬＡ−Ｇ（配列番号２５）及びコントロール修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がＨＬＡ−Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝ＨＬＡ−Ｇデグラフト、配列番号２６））に対する結合のＳＰＲセンサーグラムである。
【図３Ｂ】ＨＬＡ−Ｇ抗体（ＨＬＡ−Ｇ−００３６及びＨＬＡ−Ｇ−００３７）の、組み換えＨＬＡ−Ｇ（配列番号２５）及びコントロール修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がＨＬＡ−Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝ＨＬＡ−Ｇデグラフト、配列番号２６））に対する結合のＳＰＲセンサーグラムである。
【図４Ａ】ＨＬＡ−ＧとＩＬＴ２との相互作用／結合を阻害する（又は刺激する）ＨＬＡ−Ｇ抗体である。
【図４Ｂ】ＨＬＡ−ＧとＩＬＴ４との相互作用／結合を阻害する（又は刺激する）ＨＬＡ−Ｇ抗体である。
【図５Ａ】ＪＥＧ３（ＨＬＡ−Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ−３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））にＨＬＡ−Ｇ抗体を用いたＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ−００３２（＃００３２））の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。
【図５Ｂ】ＪＥＧ３（ＨＬＡ−Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ−３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））にＨＬＡ−Ｇ抗体を用いたＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ−００３３（＃００３３））の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。
【図５Ｃ】ＪＥＧ３（ＨＬＡ−Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ−３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））にＨＬＡ−Ｇ抗体を用いたＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ−００３６（＃００３６））の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。
【図５Ｄ】ＪＥＧ３（ＨＬＡ−Ｇを天然に発現する細胞）、ＳＫＯＶ−３細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞（野生型（ｗｔ）対ＨＬＡＧをトランスフェクトされた細胞（ＨＬＡＧ＋））にＨＬＡ−Ｇ抗体を用いたＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ−００３７（＃００３７））の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。
【図６Ａ】抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ＪＥＧ３細胞上に発現されるＨＬＡ−ＧとヒトＩＬＴ２  Ｆｃキメラとの相互作用をブロック／調節する。新規抗ＨＬＡ−Ｇ抗体による細胞表面ＨＬＡ−Ｇの染色を、Ａｌｅｘａ４８８（ａ）にコンジュゲートした抗ラットＩｇＧ二次抗体を用いることにより評価した。ＦＡＣＳヒストグラムに示されているのは、二次抗体のみで染色された細胞（グレーの点線）及び抗ＨＬＡ−Ｇ抗体で染色された細胞（黒の実線）である。下の列（ｂ）には、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−Ｇに結合したヒトＩＬＴ２−Ｆｃ（黒の点線）と二次抗体のみで染色した細胞（グレーの点線）との比較が示されている。ＨＬＡ−Ｇ抗体でＪＥＧ３細胞をプレインキュベートすることがＩＬＴ２  Ｆｃキメラ結合に与えた影響を見ることができる（黒の実線）：ＨＬＡ−Ｇ−００３２及びＨＬＡ−Ｇ−００３７は、ＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２−Ｆｃキメラの結合のほぼ完全な阻害を示している。
【図６Ｂ】ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−ＧへのＩＬＴ２  Ｆｃキメラの結合に対する市販／標準の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の影響が示されている：市販／標準の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体による細胞表面ＨＬＡ−Ｇの染色を、Ａｌｅｘａ４８８（ａ）にコンジュゲートした種特異性の二次抗体を用いることにより評価した。ＦＡＣＳヒストグラムに示されているのは、二次抗体のみで染色された細胞（グレーの点線）及び抗ＨＬＡ−Ｇ抗体で染色された細胞（黒の実線）である。下の列（ｂ）には、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−Ｇに結合したヒトＩＬＴ２−Ｆｃキメラ（黒の点線）と二次抗体のみで染色した細胞（グレーの点線）との比較が示されている。標準の抗体でＪＥＧ３細胞をプレインキュベートすることがＩＬＴ２  Ｆｃキメラ結合に与えた影響を見ることができる（黒の実線）：試験した参照抗体のうち、ＪＥＧ３細胞上の細胞表面ＨＬＡ−ＧとＩＬＴ２  Ｆｃキメラとの相互作用をブロックできたものはなかった。
【図７Ａ】ＴＮＦα生成ドナー＃１の回復に対する阻害性抗ＨＬＡ−Ｇ抗体によるＨＬＡ−Ｇのブロックの影響を示している。
【図７Ｂ】ＴＮＦα生成ドナー＃２の回復に対する阻害性抗ＨＬＡ−Ｇ抗体によるＨＬＡ−Ｇのブロックの影響を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ−Ｇ」、「ヒトＨＬＡ−Ｇ」は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）としても知られるＨＬＡ−Ｇヒト主要組織適合複合体、クラスＩ、Ｇを指す（例示的配列番号１７）。典型的には、ＨＬＡ−Ｇは、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ又はβ２ｍ）と共にＭＨＣクラスＩ複合体を形成する。一実施態様では、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇとβ２ミクログロブリンのＭＨＣクラスＩ複合体を指す。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する」、「ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する」、「ヒトＨＬＡ−Ｇに対して結合する」抗体又は「抗ＨＬＡ−Ｇ抗体」は、ヒトＨＬＡ−Ｇ抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対し、５．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一実施態様では、１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一実施態様では、５．０×１０−８ｍｏｌ／ｌから１．０×１０−１３ｍｏｌ／ｌのＫＤ値の結合親和性で特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えばＨＬＡ−Ｇ細胞外ドメイン（例えばその天然に存在する３次元構造）を含むコンストラクトを用いる表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）といった標準の結合アッセイにより決定される。一実施態様では、結合親和性は、配列番号２５を含むＭＨＣクラスＩ複合体を含む例示的可溶型ＨＬＡ−Ｇを用いる標準の結合アッセイにより決定される。
【００４１】
ＨＬＡ−Ｇは、規則的なＭＨＣ  Ｉの折り畳みを有し、二つの鎖からなる：鎖１は三つのドメイン、即ちアルファ１、アルファ２及びアルファ３からなる。アルファ１及びアルファ２ドメインは、二つのアルファヘリックスが隣接するペプチド結合溝を形成する。小さなペプチド（概ね９ｍｅｒｓ）は、他のＭＨＣＩタンパク質と同様にこの溝に結合することができる。鎖２は、種々の他のＭＨＣＩタンパク質と共有されるベータ２ミクログロブリンである。
【００４２】
ＨＬＡ−Ｇは、機能的に活性の複合オリゴマー構造を形成することができる（Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37（2007）1727-1729）。ジスルフィド結合二量体は、二つのＨＬＡ−Ｇ分子のＣｙｓ４２間に形成される。（Shiroishi M et al., J Biol Chem 281（2006）10439-10447.三量体及び四量体複合体は、例えばKuroki, K et al. Eur J Immunol. 37（2007）1727-1729, Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268（2002）43-50及びT Gonen-Gross et al., J Immunol 171（2003）1343-1351にも記載されている。）ＨＬＡ−Ｇは、他のＭＨＣクラスＩ分子の多くとは異なり、複数の遊離システイン残基を有する。Boyson et al., Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180（2002）は、ＨＬＡ−Ｇ５の組み換え可溶形態が、分子間Ｃｙｓ４２−Ｃｙｓ４２ジスルフィド結合を有するジスルフィド結合した二量体を形成できることを報告した。加えて、ＨＬＡ−Ｇ１の膜結合形態は、Ｊｅｇ３細胞株の細胞表面上にジスルフィド結合した二量体を形成することもでき、これは、内因的にＨＬＡ−Ｇを発現する。ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５のジスルフィド結合した二量体の形態は、トホブラスト細胞の細胞表面にも発見された（Apps, R., Tissue Antigens, 68:359（2006））。
【００４３】
ＨＬＡ−Ｇは、胎盤の栄養膜細胞層に優勢に発現される。複数の腫瘍（膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃、及び卵巣を含む）は、ＨＬＡ−Ｇを発現する（Lin, A. et al., Mol Med. 21（2015）782-791; Amiot, L., et al., Cell Mol Life Sci. 68（2011）417-431）。この発現はまた、炎症性疾患、ＧｖＨＤ及びがんのような病的状態に関連付けられることが報告されている。ＨＬＡ−Ｇの発現は、がんの予後不良に関連付けられることが報告されている。腫瘍細胞は、ＨＬＡ−Ｇ発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することにより、宿主の免疫監視を逃れる。
【００４４】
ＨＬＡ−Ｇの場合、７つのアイソフォームが存在し、そのうちの３つは分泌形態であり、４つは膜結合形態である（図１に模式的に示す）。ＨＬＡ−Ｇの最も重要な機能的アイソフォームには、ｂ２−ミクログロブリン結合ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５が含まれる。しかしながら、これらアイソフォームの免疫寛容原性の免疫学的効果は異なっており、且つリガンドの形態（単量体、二量体）及びリガンド−受容体相互作用の親和性によって変化する。
【００４５】
ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、標準の分子生物学の技術を用いて生成することができる。ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの核酸配列は当技術分野で既知である。例えばＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＹ３５９８１８を参照されたい。
【００４６】
ＨＬＡ−Ｇ異性型は、ＩＬＴ、特にＩＬＴ２、ＩＬＴ４、又はこれらの組み合わせによるシグナル伝達を促進する。
【００４７】
ＩＬＴ：ＩＬＴは、免疫細胞の活性化の調節に関与し、免疫細胞の機能を制御する活性化及び阻害性受容体のＩｇ型を表す（Borges, L., et al., Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136（1999））。ＩＬＴは、以下の三つのグループに分類される：（ｉ）細胞質の免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、阻害性シグナルを伝達する阻害性のもの（ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、及びＬＩＲ８）；（ｉｉ）膜貫通ドメインに短い細胞質尾部と荷電アミノ酸残基とを含み（ＩＬＴ１、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、及びＬＩＲ６アルファ）、Ｆｃ受容体の結合共通ガンマ鎖の細胞質免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を通して活性化シグナルを送達する活性化型のもの；及び（ｉｉｉ）膜貫通ドメインを欠く可溶型分子ＩＬＴ６。最近の研究の多くは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＩＬＴの免疫調節性の役割を強調した。ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、及びＩＬＴ４受容体といった、最も特徴付けの済んだ免疫阻害性受容体は、骨髄及び形質細胞腫ＤＣに優勢に発現される。ＩＬＴ３及びＩＬＴ４は、未成熟ＤＣを、ＩＬ−１０、ビタミンＤ３、又はサプレッサーＣＤ８Ｔ細胞を含む既知の免疫抑制因子に曝露することにより上方制御される（Chang, C. C., et al., Nat Immunol, 3:237-243（2002））。ＤＣ上におけるＩＬＴの発現は、炎症刺激、サイトカイン、及び増殖因子によって厳密に制御され、ＤＣ活性化に続いて下方制御される（Ju, X. S., et al., Gene, 331:159-164（2004））。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体の発現は、ヒストンアセチル化によって高度に調節され、このことは、細胞の骨髄系統に限定的な、厳密に制御された遺伝子発現に寄与する（Nakajima, H., J Immunol, 171:6611-6620（2003））。
【００４８】
阻害性受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４の関与は、単球のサイトカイン及びケモカイン分泌特性を変更し、Ｆｃ受容体のシグナル伝達を阻害することができる（Colonna, M., et al. J Leukoc Biol, 66:375-381（1999））。ＤＣ上でのＩＬＴ３の役割及び機能は、Ｓｕｃｉｕ−Ｆｏｃａグループにより詳細に記載されている（Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5:7-11（2005））。ＩＬＴ３のリガンドは未知であるが、ＩＬＴ４は、ＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−Ｇ）の第３のドメインに結合し、ＭＨＣクラスＩの結合についてＣＤ８と競合することが既知である（Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861（2003））。複数の阻害性ＩＬＴ受容体の優先的リガンドは、ＨＬＡ−Ｇである。ＨＬＡ−Ｇは、母胎胎児間免疫寛容性と、免疫認識及び破壊から腫瘍細胞が逃れる機序とに潜在的な役割を果たす（Hunt, J. S., et al., Faseb J, 19:681-693（2005））。ＨＬＡ−Ｇ−ＩＬＴ相互作用によるＤＣ機能の調節がＤＣの生態学において重要な経路である可能性が極めて高い。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を高度に発現するヒト単球由来のＤＣは、ＨＬＡ−Ｇで処理し、同種異系のＴ細胞で刺激したとき、依然として安定な免疫寛容原性様表現型を維持し（ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６ｌｏｗ、ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ）、Ｔ細胞アネルギーを誘導する能力を有することが決定された（Ristich, V., et al., Eur J Immunol, 35:1133-1142（2005））。さらに、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を高度に発現するＨＬＡ−ＧとＤＣとの相互作用は、ＭＨＣクラスＩＩの提示経路に関与する複数の遺伝子の下方制御をもたらした。リソソームのチオール還元酵素である、プロフェッショナルなＡＰＣにより豊富に発現されるＩＦＮ−ガンマ誘導型リソソームのチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）は、ＨＬＡ−Ｇ−修飾ＤＣにおいて大幅に減少した。選択抗原に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答が、標的遺伝子破壊後にＧＩＬＴを欠く動物において減少したため、プライムされたＣＤ４＋  Ｔ細胞のレパートリーはＧＩＬＴのＤＣ発現により影響されうる（Marie, M., et al., Science, 294:1361-1365（2001））。ＤＣ上でのＨＬＡ−Ｇ／ＩＬＴ相互作用は、細胞表面へのＭＨＣクラスＩＩ分子の集合と輸送を妨害し、このことは、構造的に異常なＭＨＣクラスＩＩ分子の提示又は発現の効率を低下させうる。ＨＬＡ−Ｇが、ＩＬＴ阻害性受容体を高度に発現するヒト単球由来のＤＣ上での不変鎖（ＣＤ７４）、ＨＬＡ−ＤＭＡ、及びＨＬＡ−ＤＭＢ遺伝子の転写を著しく低減することが決定された（Ristich, V., et al; Eur J Immunol 35:1133-1142（2005））。
【００４９】
ＫＩＲ２ＤＬ４はＨＬＡ−Ｇを発現する細胞に結合するため、ＨＬＡ−Ｇの別の受容体はＫＩＲ２ＤＬ４である（米国特許出願公開第２００３２３２０５１号；Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28（1998）1980; Rajagopalan, S. and E. O. Long. ［J Exp Med 191（2000）2027に正誤表］J Exp Med 189（1999）1093; Ponte, M. et al. PNAS USA 96（1999）5674）。ＫＩＲ２ＤＬ４（２ＤＬ４とも呼ぶ）は、活性化受容体及び阻害性受容体の両方と構造的特徴を共有するＫＩＲのファミリーメンバー（ＣＤ１５８ｄとも命名される）である（Selvakumar, A. et al. Tissue Antigens 48（1996）285）。２ＤＬ４は、阻害機能を示唆する細胞質ＩＴＩＭと、活性化ＫＩＲに典型的な特徴である、膜貫通領域において正に荷電したアミノ酸とを有する。クローン性に分配された他のＫＩＲとは異なり、２ＤＬ４はすべてのＮＫ細胞によって転写される（Valiante, N. M. et al. Immunity 7（1997）739; Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28（1998）1980; Rajagopalan, S. and E. O. Long. ［J Exp Med 191（2000）2027］ J Exp Med 189（1999）1093に正誤表）。
【００５０】
本明細書において使用されるとき、配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体；配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体、配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体、配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体「と交差反応しない」又は「に特異的に結合しない」抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、これらカウンター抗原のいずれにも実質的に結合しない抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を指す。一実施態様では、配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体；配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体、配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体、及び／又は配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体「と交差反応しない」又は「に特異的に結合しない」抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、５．０×１０−６ｍｏｌ／ｌ以上のＫＤ値の結合親和性での非特異性の結合しか示さない抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を指す（それ以上の結合親和性が検出不能となるまで）。結合親和性は、それぞれの抗原、即ち、配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体；配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体、配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体、及び／又は配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対して、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）といった標準の結合アッセイを用いて決定される。アッセイの設定並びに抗原の構築／調製は、実施例に記載する。
【００５１】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。（適切である場合は生殖系列を規定する）
【００５２】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００５３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００５４】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」は、 競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックする。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００５５】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００５６】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５７】
本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されるものではないが、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）、及び以下に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤を含む。
【００５８】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【００５９】
本明細書では、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。特に断らない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）, NIH Publication 91-3242に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００６０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００６１】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００６２】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれず、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。
【００６３】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００６４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD（1991）, NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3のサブグループである。一実施態様では、ＶＬのサブグループは上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．にあるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨのサブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループＩＩＩである。
【００６５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００６６】
本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に既定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原に接触する残基（「抗原コンタクト（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｎｔａｃｔ）」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計六つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917（1987））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745（1996））；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
【００６７】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。
【００６８】
「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００６９】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００７０】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman, S., et al., J. Chromatogr. B 848（2007）79-87を参照のこと。
【００７１】
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００７２】
「抗ＨＬＡ−Ｇ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数の核酸分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞の一又は複数の位置に存在するこのような核酸分子が含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 即ち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【００７４】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００７５】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、これには三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これには一つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる二つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００７６】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００７７】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００７８】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００  ×  分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【００７９】
用語「薬学的製剤」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【００８０】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的製剤の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００８２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y.（2007）, page 91参照。）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原−結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に特異的に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150（1993）880-887; Clackson, T. et al., Nature 352（1991）624-628）を参照。
【００８３】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、結合する別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように結合されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００８４】
Ｉ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、本発明の選択された抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が、ＨＬＡ−Ｇの特定のエピトープに結合し、ＨＬＡ−Ｇに対するＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４の結合を阻害する能力を有するという発見に部分的に基づいている。これらは、例えばＨＬＡ−Ｇに対するＩＬＴ２の結合を阻害し、適切な刺激によりＴＮＦアルファのような免疫調節サイトカインの分泌を増大させることにより、ＨＬＡ−Ｇ媒介性の免疫抑制を元に戻す。
【００８５】
特定の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えばがんの診断又は治療に有用である。
【００８６】
Ａ．例示的抗ＨＬＡ−Ｇ抗体
一態様において、本発明は、ヒトＨＬＡ−Ｇ（抗ＨＬＡ−Ｇ抗体）に結合する単離された抗体を提供する。
【００８７】
特定の実施態様では、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（実施例３参照）。
【００８８】
特定の実施態様では、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合し、単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（例えば実施例４ａ及び４ｂ参照）。
【００８９】
特定の実施態様では、ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を５０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（例えば実施例４ｂ参照）。
【００９０】
特定の実施態様では、ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（例えば実施例４ｂ参照）。
【００９１】
特定の実施態様では、ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、６０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害し、二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ４の結合を、５０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（例えば実施例４ｂ参照）。
【００９２】
特定の実施態様では、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合し、ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２及びＩＬＴ４の結合を阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（例えば実施例４参照）。
【００９３】
特定の実施態様では、ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、ＪＥＧ３細胞（上のＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（実施例６参照）。
【００９４】
特定の実施態様では、ＪＥＧ３細胞（上のＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に結合し（実施例５参照）、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−Ｇ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体が提供される（実施例６参照）。
【００９５】
特定の実施態様では、本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）。
【００９６】
特定の実施態様では、本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）及び／又は配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）。
【００９７】
特定の実施態様では、本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）。
【００９８】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、この抗体は、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【００９９】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、この抗体は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１００】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、この抗体は、
Ａ）
ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む；或いは
Ｂ）
ｉ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
【０１０１】
本発明の一実施態様は、本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体であり、この抗体は以下の特性により独立して特徴付けられる：即ち、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、
ａ）ＨＬＡ−Ｇに対する結合について、配列番号７アミノ酸配列を含むＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と競合する、及び／又は
ｂ）配列番号７アミノ酸配列を含むＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と同じエピトープに結合する、及び／又は
ｃ）配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合する；及び／又は
ｄ）配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（に対して特異的に結合しない）；及び／又は
ｅ）配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（に対して特異的に結合しない）；及び／又は
ｆ）配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（に対して特異的に結合しない）；及び／又は
ｇ）配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（に対して特異的に結合しない）；及び／又は
ｈ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害する；及び／又は
ｉ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する；及び／又は
ｊ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する；及び／又は
ｋ）ＪＥＧ３細胞（上のＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（実施例６参照）；及び／又は
ｌ）ＪＥＧ３細胞（上のＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に結合し（実施例５参照）、且つＪＥＧ３細胞（上のＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（実施例６参照）；及び／又は
ｍ）ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、且つ単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、６０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害し、二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ４の結合を、５０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（例えば実施例４ｂ参照）。
【０１０２】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であり、この抗体は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含み、
Ａ）又はＢ）の抗体は、以下の特性により独立して特徴付けられる：即ち、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、
ａ）配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合する；及び／又は
ｂ）配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｃ）配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｄ）配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｅ）配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｆ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害する；及び／又は
ｇ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する；及び／又は
ｈ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する；及び／又は
ｉ）ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−Ｇ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（実施例６参照）；及び／又は
ｊ）ＪＥＧ３細胞上のヒトＨＬＡ−Ｇ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に結合し（実施例５参照）、ＪＥＧ３細胞上のＨＬＡ−Ｇ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（実施例６参照）；及び／又は
ｋ）ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、６０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害し、二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ４の結合を、５０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（例えば実施例４ｂ参照）。
【０１０３】
本発明の一実施態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。本発明の一実施態様では、抗体は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１０４】
さらなる態様において、上記のいずれかの実施態様による抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、以下のセクション１〜７に記載されているようにして、任意の機能を単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
【０１０５】
１．抗体親和性
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。
【０１０６】
好ましい一実施態様では、ＫＤは、〜１０の反応単位（ＲＵ）に固定された抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を２５℃で用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃、及び約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）及び解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｄ／ｋａ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）比として計算する。例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293（1999）865-881を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下において、２５℃、及びＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【０１０７】
２．抗体断片
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片と、下記の他の断片とを含む。特定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9（2003）129-134を参照。scFv断片の総説については、例えば、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore（eds.）, Springer-Verlag, New York（1994）, pp. 269-315を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１０８】
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9（2003）129-134; and Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）6444-6448を参照。トリアホ゛テ゛ィ及びテトラホ゛テ゛ィもHudson, P.J. et al., Nat. Med.9（20039 129-134）に記載されている。
【０１０９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis、Inc.、Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号参照）。
【０１１０】
抗体断片は様々な技術で作製することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生成を含む。
【０１１１】
３．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81（1984）6851-6855）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１１２】
特定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したままヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合によってヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１１３】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法については、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633に総説が、さらに、例えばRiechmann, I. et al., Nature 332（1988）323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36（2005）25-34（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28（1991）489-498（「リサーフェイシング」を記述）；Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36（2005）43-60（「ＦＲシャッフリング」を記述）；並びにOsbourn, J. et al., Methods 36（2005）61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83（2000）252-260（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載がある。
【０１１４】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151（1993）2296-2308を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289; 及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151（1993）2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272（1997）10678-10684 and Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271（19969 22611-22618を参照）を含む。
【０１１５】
４．ヒト抗体
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5（2001）368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20（2008）450-459に概説がある。
【０１１６】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23（2005）1117-1125を参照のこと。また、例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号、Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変されうる。
【０１１７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株が記述されている。（例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133（1984）3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York（1987）, pp. 51-63;及びBoerner, P. et al., J. Immunol. 147（1991）86-95）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体は、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103（2006）3557-3562にも記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26（2006）265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20（2005）927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental及びClinical Pharmacology 27（2005）185-191に記載されている。
【０１１８】
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。このような可変ドメイン配列は、次いで所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に記載される。
【０１１９】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、一又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知既知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178（2001）1-37に総説が、さらに、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348（1990）552-554; Clackson, T. et al., Nature 352（1991）624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222（1992）581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248（2003）161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338（2004）299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340（2004）1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（2004）12467-12472; 及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284（2004）119-132に記載がある。
【０１２０】
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリーにランダムに再結合させ、その後、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12（1994）433-455に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代替的に、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12（1993）725-734に記載されるように、ナイーブなレパートリーを、いかなる免疫感作も無く、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対し、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローニングすることができる。最後に、ナイーブなライブラリーは、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて高度に可変のＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388により記載されるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配置を達成することにより、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１２１】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１２２】
６．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一つはＨＬＡ−Ｇに対するものであり、他は他のいずれかの抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ−Ｇの二つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体は、ＨＬＡ−Ｇを発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるために使用することもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１２３】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305（1983）537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10（1991）3655-3659を参照）及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan, M. et al., Science 229（1985）81-83を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148（1992）1547-1553を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）6444-6448を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152（1994）5368-5374を参照）；及び、例えば、Tutt, A. et al., J. Immunol. 147（1991）60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。
【０１２４】
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む三つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１２５】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＨＬＡ−Ｇ及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
【０１２６】
本明細書における抗体又は断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号、国際公開第２０１１／１１７３３０号、国際公開第２０１２／０２５５２５号、国際公開第２０１２／０２５５３０号、国際公開第２０１３／０２６８３５号、国際公開第２０１３／０２６８３１号、国際公開第２０１３／１６４３２５号、又は国際公開第２０１３／１７４８７３号に記載される多重特異性抗体を含む。
【０１２７】
７．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させるために作ることができる。
【０１２８】
置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。例示的な変更を「例示的置換」と題して表１に示し、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記にさらに説明する。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【０１２９】
2020511112.tif 000003
【０１３０】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１３１】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１３２】
置換変異体の一つの種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的には、結果として得られ、さらなる研究のために選択された変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成される。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１３３】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされた残基（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207（2008）179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178（2002）1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、このライブラリーは、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、複数のＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１３４】
特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、 これらの改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは不変であるか、又は多くとも一つ、二つ又は三つのアミノ酸置換しか含まない。
【０１３５】
変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244（1989）1081-1085により記載されるように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定されて、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされうる又は排除されうる。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。
【０１３６】
アミノ酸配列挿入物は、 １残基から、１００以上の残基を有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ−及び／又はカルボキシル末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を延ばす酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
【０１３７】
ｂ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１３８】
エフェクター機能が低下した抗体は、一又は複数のＦｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の置換を含むものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二以上に置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１３９】
ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604を参照）。
【０１４０】
本発明の一実施態様では、このような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１である。別の実施態様では、このような抗体は、変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ又は／及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４である  （番号付けは、Kabat et al, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵインデックスによる）。
【０１４１】
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117（1976）587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24（1994）2429-2434）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合性が改善された抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの一又は複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を含むものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。
【０１４２】
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関するDuncan, A.R. and Winter, G., Nature 322（1988）738-740；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１４３】
ｃ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを生成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用される。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成されうる。
【０１４４】
ｄ）抗体誘導体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１４５】
他の実施態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱されうる非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提示される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102（2005）11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【０１４６】
Ｂ．組み換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組み換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗−ＨＬＡ−Ｇ抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様では、宿主細胞は：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、同ベクターで形質転換されている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を作製する方法が提供される。
【０１４７】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の組み換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１４８】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で生成されうる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照のこと（大腸菌中の抗体断片の発現を記載しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.（ed.）, Humana Press, Totowa, NJ（2003）, pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体を、可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。
【０１４９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母の株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22（2004）1409-1414;及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24（2006）210-215を参照のこと。
【０１５０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１５１】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１５２】
脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36（1977）59-74）に記載された２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23（1980）243-252）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383（1982）44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）4216-4220）；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.（ed.）, Humana Press, Totowa, NJ（2004）, pp. 255-268を参照。
【０１５３】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が同定されて、当技術分野で既知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされる又は特徴づけられる。
【０１５４】
１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの既知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１５５】
別の態様では、ＨＬＡ−Ｇに対する結合についてＨＬＡ−Ｇ−００３２（配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含む）と競合する抗体を同定するために競合アッセイを使用することができる。本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに対する結合について、配列番号７のＶＨ配列の３つすべてのＨＶＲと配列番号８のＶＬ配列の３つすべてのＨＶＲとを含む抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と競合する抗体である。特定の実施態様では、このような競合抗体は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体ＨＬＡ−Ｇ−００３２によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。一実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ上において配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。別の態様では、ＨＬＡ−Ｇに対する結合についてＨＬＡ−Ｇ−００３７（配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列を含む）と競合する抗体を同定するために競合アッセイを使用することができる。本発明の一実施態様は、ヒトＨＬＡ−Ｇに対する結合について、配列番号１５のＶＨ配列の３つすべてのＨＶＲと配列番号１６のＶＬ配列の３つすべてのＨＶＲとを含む抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と競合する抗体である。特定の実施態様では、このような競合抗体は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体ＨＬＡ−Ｇ−００３７によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。一実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ上において配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む抗体と同じエピトープに結合する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。抗体が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris, G.E.（ed.）, Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ（1996）に提供されている。
【０１５６】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体ＨＬＡ−Ｇ−００３２又はＨＬＡ−Ｇ．００３７）に結合する第１の標識化抗体と、ＨＬＡ−Ｇに対する結合について第１の抗体と競合する能力を試験されている第２の未標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマの上清中に存在しうる。コントロールとして、固定化ＨＬＡ−Ｇが、第１の標識抗体を含むが第二の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＨＬＡ−Ｇへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＨＬＡ−Ｇに結合した標識の量が測定される。固定化ＨＬＡ−Ｇに結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体が、ＨＬＡ−Ｇに対する結合について第１の抗体と競合していることを示す。Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1988）を参照。別の例示的競合アッセイに関し、実施例２（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競合アッセイ）を参照されたい。
【０１５７】
２．活性のアッセイ
一態様において、生物活性を有するその抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性は、例えば、Ｔ細胞を含む様々な免疫細胞の活性化及び／又は増殖を亢進させる能力を含みうる。例えばそれは、免疫調節性サイトカイン（例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及び／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ））の分泌を高める。亢進される又は亢進されうる他の免疫調節性サイトカインは、例えば様々な細胞型に結合するＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２、グランザイムＢなどである。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのような生物活性を有する抗体が提供される。
【０１５８】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、例えば以下の実施例に記載されるような生物活性について試験される。
【０１５９】
Ｄ．イムノコンジュゲート（がんのみ又は標的用に修飾）
本発明はまた、化学療法剤又は薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性の毒素、若しくはその断片）、又は放射性同位体といった一又は複数の細胞傷害性剤にコンジュゲートする本明細書の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１６０】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、同第５４１６０６４号及びＥＰ特許第０４２５２３５号を参照）；アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号、同第５７８０５８８号及び同第７４９８２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、同第７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号及び同第５８７７２９６号；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53（1993）3336-3342;及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58（1998）2925-2928を参照）；アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13（2006）477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16（2006）358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16（2005）717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97（2000）829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12（2002）1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45（20029 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含むがこれらに限定されない一又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０１６１】
他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（エノマイシン）、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含む（ただし、これらに限定されない）酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
【０１６２】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートは、検出用に使用される場合、シンチグラフ検査のための放射性原子、例えばＴＣ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。
【０１６３】
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン  ２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta, E.S. et al., Science 238（1987）1098-1104に記載されているようにして調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52（1992）127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用されうる。
【０１６４】
本明細書に記載のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されるものではないが、市販（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより）のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）などの架橋試薬を用いて調製したものが特に考えらえる。
【０１６５】
Ｅ．診断及び検出のための方法並びに組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のいずれもが、生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇの存在を検出するために有用である。本明細書において使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的試料は、免疫細胞又はＴ細胞浸潤物及び／又は腫瘍細胞といった細胞又は組織を含む。
【０１６６】
一実施態様では、診断又は検出方法に使用される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中におけるＨＬＡ−Ｇの存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、本方法は、生物学的試料を、ＨＬＡ−Ｇに対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合を許容する条件下において本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と接触させること、及び抗ＨＬＡ−Ｇ抗体とＨＬＡ−Ｇとの間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。このような方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの方法とすることができる。一実施態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を用いた療法に適した対象を選択するために使用され、例えばＨＬＡ−Ｇは患者の選択のためのバイオマーカーである。
【０１６７】
特定の実施態様では、標識された抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。標識は、限定されないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識などの）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼを、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化するために過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０１６８】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の薬学的製剤は、所望の度合いの純度を有するこのような抗体を、一又は複数の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.（ed.）（1980））、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度で受容者に対して非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒｈｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１６９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者Ｔ製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１７０】
本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。例えば、さらに提供することが望ましい。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１７１】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.（ed.）（1980）に開示されている。
【０１７２】
持続放出性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌されていなければならない。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０１７４】
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書において提供される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（又は抗原結合タンパク質）はいずれも、治療法に使用することができる。
【０１７５】
一態様において、医薬としての使用のための抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。さらなる態様では、がんの治療における抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又は使用が提供される。特定の実施態様では、治療法における使用のための抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、がんを有する個体の治療方法における使用のための抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を提供し、この方法は、そのような個体に対して有効量の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を投与することを含む。
【０１７６】
さらなる実施態様では、本発明は、免疫調節剤としての使用／例えばＴＮＦアルファ（ＴＮＦａ）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮｇ）のような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員による増殖、活性化を直接的又は間接的に誘導するための使用のための、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における、免疫調節剤の方法／例えばＴＮＦａ及びＩＦＮガンマのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員による、増殖、活性化を直接的又は間接的に誘導するための方法であって、個体に対し、免疫調節のための／又は例えばＴＮＦａ及びＩＦＮガンマのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員により、直接的又は間接的に増殖、活性化を誘導するための、有効量の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を投与することを含む方法における使用のための、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を提供する。
【０１７７】
さらなる実施態様では、本発明は、免疫刺激性剤としての使用／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激するための抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮｇのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員による、増殖、活性化を直接的又は間接的に誘導するための免疫調節方法であって、個体に対し、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮｇのような免疫刺激性サイトカインの分泌又は免疫細胞のさらなる動員により、直接的又は間接的に増殖、活性化を誘導するための、有効量の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体免疫調節を投与することを含む方法における使用のための、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を提供する。
【０１７８】
上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、好ましくはヒトである。さらなる実施態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療を目的とする。さらなる一実施態様では、本医薬は、がんを有する個体に、本医薬の有効量を投与することを含む、がんの治療方法における使用のためのものである。さらなる一実施態様では、医薬は、がん細胞の細胞媒介性溶解を誘導することを目的としている。さらなる一実施態様では、医薬は、がんに罹患した個体に対し、がん細胞にアポトーシスを誘導する／又はがん細胞の増殖を阻害するための有効量の医薬を投与することを含む、前記個体にがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導する方法における使用を目的としている。上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、ヒトであってよい。
【０１７９】
さらなる態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、がんを有する個体に対し、有効量の抗ＨＬＡ−Ｇを投与することを含む。上記いずれの実施態様に記載の「個体」も、ヒトであってよい。
【０１８０】
さらなる態様において、本発明は、がんに罹患した個体にがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、がんに罹患した個体にがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するために、前記個体に対して有効量の抗ＨＬＡ−Ｇを投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０１８１】
さらなる態様において、本発明は、例えば上述の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書において提供される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書において提供される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。
【０１８２】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段により投与することができ、また、局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与であってもよい。非経口点滴は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単回又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。
【０１８３】
本発明の抗体は、医療実施基準に合致した様式で製剤化され、投薬され、投与される。この観点において考慮すべき因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の因子を包含する。本発明の抗体は、必要ではないが任意で、問題の疾患の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の因子によって決まる。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、使用される。
【０１８４】
疾患の予防又は治療に適した本発明の抗体の用量は、（単独で又は一若しくは複数の追加の治療剤との併用で用いられる場合）治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体の投与が予防的目的か治療的目的か、治療歴、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。本発明の抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の個別投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体又はイムノコンジュゲートが患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日あたり用量は、上記因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の一の例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は三週毎に（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６用量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一以上の低用量を投与してよい。例示的投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量に続き、毎週約２ｍｇ／ｋｇの抗体を維持投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易に監視される。
【０１８５】
上記の製剤又は治療方法はいずれも、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができる。
【０１８６】
上記の製剤又は治療方法はいずれも、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを用い、行うことができる。
【０１８７】
ＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物をその中に収容する第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤含む組成物を中に収容する第二の容器を含んでもよい。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
【０１８８】
以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に規定される。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順に改変を加えることが可能である。
【０１８９】
アミノ酸配列の説明
配列番号１    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号２    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号３    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号５    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号６    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号７    重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号８    軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ−Ｇ−００３２
配列番号９    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１０    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１１    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１２    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１３    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１５    重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１６    軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ−Ｇ−００３７
配列番号１７：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ
配列番号１８：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号１９：    例示的ヒトβ２Ｍ
配列番号２０：    修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がＨＬＡ−Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ−Ｇ、図１も参照）のＥＣＤ）
配列番号２１：    例示的ヒトＨＬＡ−Ａ２
配列番号２２：    例示的ヒトＨＬＡ−Ａ２のＥＣＤ
配列番号２３：    例示的マウスＨ２ＫｄのＥＣＤ
配列番号２４：    例示的ラットＲＴ１ＡのＥＣＤ
配列番号２５：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号２６：    例示的な修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がＨＬＡ−Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ−Ｇ）図１も参照）
配列番号２７：    例示的マウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号２８：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワーク上に移植されている）
配列番号２９：    例示的ラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号３０：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ／ラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワーク上に移植されている）
配列番号３１：    リンカー及びｈｉｓタグ
配列番号３２：    ペプチド
配列番号３３：    ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号３４：    ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号３５：    ヒト重鎖定常領域に由来するＩｇＧ１
配列番号３６：    ヒト変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む、ヒト重鎖定常領域に由来するＩｇＧ１
配列番号３７：    ヒト重鎖定常領域に由来するＩｇＧ４
配列番号３８：    重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ−Ｇ−００３３
配列番号３９：    軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ−Ｇ−００３３
【０１９０】
以下に、本発明の特定の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合する抗体。
２．単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を阻害する、実施態様１による抗体。
３．単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、実施態様２による抗体。
４．単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、実施態様２による抗体。
５．ＪＥＧ３細胞（上のヒトＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）（（蛍光標識細胞分取を用いる）フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳアッセイ）において測定した場合）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する、実施態様１から４のいずれか一つによる抗体。
６．ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する単離された抗体であって、ＪＥＧ３細胞（上のヒトＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に結合し、ＪＥＧ３細胞（上のヒトＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を、抗体なしでの結合と比較したとき、５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）（（蛍光標識細胞分取を用いる）フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳアッセイ）において測定した場合）阻害する抗体。
７．配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）実施態様１から６のいずれか一つによる抗体。
８．配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）及び／又は配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）、実施態様１から７のいずれか一つによる抗体。
９．配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）、実施態様１から８のいずれか一つによる抗体。
１０．ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体。
１１．ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
１２．ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって、
Ａ）
ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む；或いは
Ｂ）
ｉ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列；又は
ｉｉ）ｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む抗体。
１３．ヒトＨＬＡ−Ｇに結合する単離された抗体であって，
ａ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する；又は
ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する
抗体。
１４．実施態様１０から１３のいずれか一つによる抗ＨＬＡ−Ｇ抗体であって、以下の特性：
ａ）配列番号２６を含む修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｂ）配列番号２１及び配列番号１９を含むヒトＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｃ）配列番号２７を含むマウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｄ）配列番号２９を含むラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体と交差反応しない（同複合体に特異的に結合しない）；及び／又は
ｅ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を阻害する；及び／又は
ｆ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する；及び／又は  
ｇ）単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する；及び／又は
ｈ）ＪＥＧ３細胞（の上のヒトＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（実施例６参照）；及び／又は
ｉ）ＪＥＧ３細胞（上のヒトＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に結合し（実施例５参照）、ＪＥＧ３細胞（上のヒトＨＬＡ−Ｇ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を（５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて））（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（実施例６参照）；及び／又は
ｊ）ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体（配列番号２５を含む）に結合し、単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、６０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害し、二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ４の結合を、５０％を超えて（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する（例えば実施例４ｂ参照）
ことによって独立に特徴付けられる抗体。
１５．ＩｇＧ１アイソタイプのものである、実施態様１から１４のいずれか一つによる抗体。
１６．変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１アイソタイプのものである、実施態様１５による抗体。
１７．実施態様１から１６のいずれか一つによる抗体をコードする、単離された核酸。
１８．実施態様１７の核酸を含む宿主細胞。
１９．抗体が生成されるように実施態様１８による宿主細胞を培養することを含む、抗体生成方法。
２０．宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、実施態様１９の方法。
２１．実施態様１から１６のいずれか一つによる抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
２２．医薬としての使用のための、実施態様１から１６のいずれか一つによる抗体。
２３．がんの治療における使用のための、実施態様１から１６のいずれか一つによる抗体。
２４．医薬の製造における、実施態様１から１６のいずれか一つによる抗体の使用。
２５．医薬ががんの治療のためのものである、実施態様２４の使用。
２６．がんを有する個体を治療する方法であって、個体に対し、実施態様１、６又は１０から１３の抗体の有効量を投与することを含む方法。
２７． 抗ＨＬＡＧ抗体（例えば実施態様１から４による）を選択するための方法であって：
ａ）表面プラズモン共鳴アッセイにより、配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対する抗ＨＬＡＧ抗体の結合を決定する工程；
ｂ）それぞれの抗ＨＬＡＧ抗体による単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合の阻害を決定する工程；並びに
ｃ）単量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する抗ＨＬＡＧ抗体を選択する工程、又は単量体及び／又は二量体及び／又は三量体ＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対するＩＬＴ２の結合を、５０％を超えて（一実施態様では７０％を超えて）（抗体なしでの結合と比較したとき）阻害する抗ＨＬＡＧ抗体を選択する工程
を含む方法。
２８． 抗ＨＬＡＧ抗体（例えば実施態様６による）を選択するための方法であって：
ａ）（蛍光標識細胞分取を用いる）フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳアッセイ）において、ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対する抗ＨＬＡＧ抗体の結合を決定する工程
ｂ）（蛍光標識細胞分取を用いる）フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳアッセイ）において、それぞれの抗ＨＬＡＧ抗体によるＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の阻害を決定する工程；並びに
ｃ）ＪＥＧ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）細胞に結合し、且つＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）に対するＩＬＴ２の結合を、抗体なしでの結合と比較したとき、５０％を超えて（一実施態様では８０％を超えて）阻害する抗ＨＬＡＧ抗体を選択する工程
を含む方法。
【実施例】
【０１９１】
組み換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
【０１９２】
遺伝子とオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子分節を、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、伝播／増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドを、ｍｅｔａｂｉｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ−Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により集合させた。
【０１９３】
基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、又はＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ−Ｇ、又はペプチド及びベータ−２ミクログロブリンに融合したＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ−Ｇ結合ペプチドに融合したＨＬＡ−Ｇ及び／又はベータ−２ミクログロブリン）の発現のために、以下の機能的要素を含む転写ユニットが使用される：
−イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前早期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン  ５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ），
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列，
−発現される遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖又はＭＨＣクラスＩ分子）、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０１９４】
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
−大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
−大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【０１９５】
タンパク質定量
精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
【０１９６】
実施例１
スクリーニング及びカウンタースクリーニングのためのＨＬＡ−Ｇ  キメラ分子の生成
他のＭＨＣ  Ｉ分子との高い相同性（＞９８％）に起因して、ＨＬＡ−Ｇ分子による免疫化の結果、ＭＨＣ−Ｉ交差反応性抗体と真にＨＬＡ−Ｇ特異性の抗体との混合物から構成されるポリクローナル血清が生成される。
【０１９７】
これまでのところ、他のヒトＭＨＣ−Ｉ（例えばＨＬＡ−Ａ）に対する交差反応性を有さない真にＨＬＡ−Ｇ特異性の抗体を選択し、さらには受容体遮断機能を有するものを選択するためのツールは提供されていない。
【０１９８】
本発明者らは、構造的な整合及び受容体の相互作用に必要な位置と組み合わせて特有のＨＬＡ−Ｇ位置を同定した（ＩＬＴ２／４及びＫＩＲ２ＤＬ４）。
【０１９９】
次いで、ヒトＨＬＡ−Ｇの固有且つ近位の位置を、様々なげっ歯動物の種由来のＭＨＣクラスＩ複合分子（例えばラットＲＴ１Ａ及びマウスＨ２ｋｄ）上に「移植」し、「キメラ」免疫原／スクリーニング抗原を生成した。
【０２００】
生成された抗体は、結合／特異性に関して（及びカウンター抗原に対する結合／特異性がないことに関して）ストリンジェントなスクリーニングに供された。
スクリーニング抗原：
−配列番号２５を含むヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣ複合体として発現されたｒｅｃ．  ＨＬＡ−Ｇ
−ラットＲＴ−１及びマウスＨ２ｋｄ上に移植されたＨＬＡ−Ｇ特異性配列（配列番号２８：ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワーク上に移植されている、ヒトＨＬＡ−Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体、及び配列番号３０：ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワーク上に移植されている、ヒトＨＬＡ−Ｇ／ラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体）
−天然ＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣクラスＩ複合体発現細胞（例えばＪＥＧ３細胞）、又はヒトＨＬＡ−Ｇがトランスフェクトされた細胞株ＳＫＯＶ３であるＨＬＡ−Ｇ＋及びＰＡ−ＴＵ−８９０２  ＨＬＡ−Ｇ＋。
スクリーニングカウンター抗原：
−様々なペプチドと組み合わされた他のＨＬＡ−Ａ配列（ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−ＧＨｌＡ−Ａコンセンサス配列によるデグラフト）を含むカウンター抗原（ＭＨＣクラスＩ複合体）（例えばＨＬＡ−Ｇフレームワーク上の配列番号２２（ＨＬＡ−Ａ２）及び配列番号２６のＨＬＡ−Ａコンセンサス配列参照）
−ラットＲＴ−１及びマウスＨ２ｋｄ（配列番号２７及び配列番号２９）といった他の種由来のカウンター抗原（ＭＨＣクラスＩ複合体）
−ＨＬＡ−Ｇ発現が存在しないことを特徴とする、非修飾腫瘍細胞株であるＳＫＯＶ３及びＰＡ−ＴＵ−８９０２。
【０２０１】
ＨＬＡ特異性の抗体の生成のための免疫化及びスクリーニングにおける使用のためのキメラＨＬＡ−Ｇ抗原の設計（図１参照）：
野生型（ｗｔ）及びトランスジェニックラット、又はウサギ及びマウスなどの免疫化における使用のため、及び／又はスクリーニングアッセイにおける使用のためのＨＬＡ−Ｇ特有の位置（配列番号３０）を担持するキメララットＭＨＣ  Ｉ分子（ＲＴ１−Ａ）の設計：
ＨＬＡ−Ｇ特有の位置を、ＩＭＧＴ（２０１４年２月６日に入手可能であったもの）の２５７９  ＨＬＡ−Ａ、３２８３  ＨＬＡ−Ｂ、２１３３  ＨＬＡ−Ｃ、１５  ＨＬＡ−Ｅ、２２  ＨＬＡ−Ｆ、及び５０  ＨＬＡ−Ｇ配列のアラインメントにより同定した。３つの配列セットＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ＋ＨＬＡ−Ｅ＋ＨＬＡ−Ｆを組み合わせたセットのいずれかの配列の１％未満（多くの場合〜０％）に存在するＨＬＡ−Ｇのそれら残基を、ＨＬＡ−Ｇ特有の位置と呼ぶ。
【０２０２】
４つのコアとなるＨＬＡ−Ｇ特有の位置（アルファ−１に２つ、及びアルファ−３に２つ）は、ＨＬＡ−Ｇ配列のセットに多型を示さず、他のＨＬＡ遺伝子でこれらの位置にＨＬＡ−Ｇ特異性の残基を含むものはない（Ｍ１００の場合１×ＨＬＡ−Ａ、Ｑ１０３の場合１×ＨＬＡ−Ｂ、及びＱ１０３の場合１×ＨＬＡ−Ｃを除く）。
【０２０３】
ラットＲＴ１−Ａの結晶構造（Rudolph, M.G. et al. J.Mol.Biol. 324: 975-990（2002）；ＰＤＢコード：１ＫＪＭ）を、ヒトＨＬＡ−Ｇの結晶構造に重ね合わせた（Clements, C.S. et al. PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 102: 3360-3365（2005）；ＰＤＢコード：１ＹＤＰ）。アルファ鎖の構造及び関連するベータ−２−ミクログロブリンの全体構造は保存されている。
【０２０４】
ＨＬＡ−Ｇ特有の位置を、配列及び構造アラインメンの比較によりＲＴ１−Ａ構造において同定した。第１の工程において、ＨＬＡ−Ｇ及びＲＴ１−Ａの分子表面上に曝露されているために抗体が到達可能である特有のＨＬＡ−Ｇ位置を同定した。折り畳まれたタンパク質の内部に埋設される特有の位置を、エンジニアリングから除外した。第２の工程では、対応する領域「ＨＬＡ−Ｇ様」を作製するため、即ち、人工的であろうＨＬＡ−Ｇ／ラットＲＴ１−Ａキメラエピトープを生成するのではなく、特有の位置を含む本物のＨＬＡ−Ｇエピトープを生成するためにはやはり交換されなければならない、構造的に近位の残基を同定した。変異のためにこのように選択されたすべての位置を、変異時の分子構造の局在的な攪乱の可能性を回避するために、ＨＬＡ−Ｇ由来のそれぞれの残基の構造的な一致について分析した。
【０２０５】
免疫化における使用のため及び／又はスクリーニングアッセイにおける使用のための、ＨＬＡ−Ｇ特有の位置を担持するキメラマウスＭＨＣ  Ｉ分子（Ｈ２Ｋｄ）（配列番号２８）を同様に生成した。
【０２０６】
スクリーニングにカウンター抗原として使用されるＨＬＡ−Ａコンセンサス配列（配列番号２６）に向けてＨＬＡ−Ｇ特有の位置を「デグラフトすること（ｄｅ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）」による、ＨＬＡ−Ａベースのカウンター抗原の設計
複数の配列アラインメント由来の特有の位置を、ヒトＨＬＡ−Ｇ（ＰＤＢコード：１ＹＤＰ）の結晶構造中において分析した。まず、ＨＬＡ−Ｇ表面上に露出しておらず、したがって抗体が到達できない位置を、エンジニアリングのために除外した。次に、表面に露出した残基を、アミノ酸交換の実現可能性について分析した（即ち関連する位置が変異した時の分子構造の局所的攪乱の可能性の排除）。合計で、１４の位置を交換について検証した。検証された位置におけるアミノ酸を、ＩＭＧＴ（２０１４年２月６日に入手可能であったもの）からダウンロードされた、２５７９個のＨＬＡ−Ａ配列の複数の配列アラインメントから誘導されるＨＬＡ−Ａコンセンサス配列へと変異させた。
【０２０７】
可溶型古典的及び非古典的ＭＨＣクラスＩ分子の発現プラスミドの生成
組み換えＭＨＣクラスＩ遺伝子は、それぞれのＭＨＣクラスＩ分子、ベータ−２ミクログロブリン、及びそれぞれのＭＨＣクラスＩ分子が結合することが知られているペプチドからなるＮ末端伸長融合分子をコードする。
【０２０８】
可溶型ＭＨＣクラスＩ分子の一過性発現のための発現プラスミドは、可溶型ＭＨＣクラスＩ分子の発現カセットに加えて、大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。
【０２０９】
可溶型ＭＨＣクラスＩ分子の転写ユニットは、以下の機能的要素を含んでいた：
−イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前早期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン  ５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ），
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列，
−Ｎ末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼＡコード化核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０２１０】
様々な種に由来する成熟可溶型ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列は以下の通りである：
配列番号２５：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号２６：    例示的な修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がＨＬＡコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ−Ｇ、図１も参照））
配列番号２７：    例示的マウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号２８：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ  β２Ｍ  ＭＨＣ複合体（ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワーク上に移植されている）
配列番号２９：    例示的ラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号３０：    例示的ヒトＨＬＡ−Ｇ／ラットＲＴ１Ａ  β２Ｍ  ＭＨＣ複合体（ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワーク上に移植されている）
【０２１１】
スクリーニングに使用される例示的なＨＬＡ−Ａ２  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体のために、以下の成分が使用され、複合体が大腸菌に発現され、精製された。
【０２１２】
ＭＨＣＩ複合体ＨＬＡ−Ａ２／ｂ２Ｍ（配列番号２２及び１９）（共にさらなるＮ末端メチオニンを有する）＋ＶＬＤＦＡＰＰＧＡペプチド（配列番号３２）＋リンカー及びｈｉｓタグ（配列番号３１）
【０２１３】
実施例２
免疫化キャンペーン
ａ．キメラタンパク質（非特異性ＭＨＣ−Ｉ／ＨＬＡに対する耐性及び特有のＨＬＡ−Ｇ位置への方向）
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｐｐｅｒ  Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号５５．２−１−５４−２５３１−１９−１０及び５５．２−１−５４−２５３２−５１−１１）、ドイツ動物保護法及び欧州会議及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。
【０２１４】
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）（週齢６〜８）は、４週間の過程において、キメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ−Ｇ分子（配列番号２８（「ＨＬＡ−Ｇ−０００６」））による５回の免疫化を受けた。マウスは、各免疫化の前に酸素とイソフルランの気体混合物により麻酔した。一回目の免疫化では、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に溶解した１５μｇのタンパク質を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、マウスの背中に沿って、排出リンパ節近位の六つの部位、即ち首筋の二つの部位と鼠径部及び腓腹の両側のそれぞれ二つの部位とに皮下（ｓ．ｃ．）投与した。ＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｓ６３２２）に乳化させたさらに１５μｇのタンパク質を、腹部に沿って並ぶ六つの部位、即ち腋窩、鼠径部、及び大腿部の両側のそれぞれ二つの部位に投与した。追加免疫の抗原を、用量を漸減させながら、７日目（１０μｇ）、１４日目（５μｇ）、２１日目（５μｇ）、及び２８日目（５μｇ）に同じように与え、但し、ＲＩＢＩアジュバントを、全体を通して、腹部に沿ってのみ使用した。最後の免疫化の三日後、マウスを安楽死させ、両側の膝窩、浅鼠径、腋窩、及び鰓器官のリンパ節を無菌的に単離し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、第３及び第５の免疫化の後で、ＥＬＩＳＡによる組み換えヒトＨＬＡ−Ｇ及び免疫原特異性全ＩｇＧ抗体生成のために試験した。
【０２１５】
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５），（週齢６〜８）の別のセットは、３カ月の過程において、キメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ−Ｇ分子（ＨＬＡ−Ｇ−０００６）による三回の免疫化を受けた。一回目の免疫化のために、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌに溶解した１００μｇのタンパク質、１４０のｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。追加免疫が、２８日目と５６日目に同じ方式で、但し完全フロイントアジュバント（ＢＤ  ＤｉｆｃｏからのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）を使用して、実施された。最後の免疫化の四から五週間後、滅菌ＰＢＳ中、約２５μｇの免疫原をマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、組み換えヒトＨＬＡ−Ｇ（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））、及び免疫原特異性のキメラＨ２Ｋｄ／ＨＬＡ−Ｇ分子（配列番号２８（「ＨＬＡ−Ｇ−０００６」））について試験し、三回目の免疫化後、コンセンサスＨＬＡ−Ａ特異性の位置（配列番号２６（「ＨＬＡ−Ｇ−０００７」））及びマウスＨ２ｋｄタンパク質（配列番号２７「ＨＬＡ−Ｇ−０００９」））総ＩｇＧ抗体生成を含む「デグラフト」ヒトＨＬＡ−Ｇを用いて、ＥＬＩＳＡによりカウンタースクリーニングした。
【０２１６】
ｂ．野生型ＨＬＡ−Ｇタンパク質
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＣＤラットを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｐｐｅｒ  Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号５５．２−１−５４−２５３２−５１−１１）、ドイツ動物保護法及び欧州会議及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。
【０２１７】
ＣＤラット（ｎ＝４），（週齢６〜８）は、４カ月の過程において、組み換えヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））による４回の免疫化を受けた。一回目の免疫化のために、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌに溶解した１００μｇのタンパク質、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内投与した。追加免疫が、２８日目、５６日目、及び８４日目に同じ方式で、但し全体を通して完全フロイントアジュバント（ＢＤ  ＤｉｆｃｏからのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）を使用して、実施された。最後の免疫化の三から四週間後、滅菌ＰＢＳ中、約７５μｇの免疫原をラットにｉ．ｖ．投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、三回目及び四回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡにより、組み換えＨＬＡ−Ｇ（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））特異性のＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体生成について試験し、コンセンサスＨＬＡ−Ａに特異性の位置（配列番号２６（「ＨＬＡ−Ｇ−０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ−Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。
【０２１８】
ｃ．ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３６）（天然発現ＨＬＡ−Ｇ）
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＣＤラットを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｐｐｅｒ  Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号ＡＺ．５５．２−１−５４２５３１−８３−１３）、ドイツ動物保護法及び欧州会議及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。
【０２１９】
二組のＣＤラット（ｎ＝２），（週齢６〜８）は、それぞれ五カ月（Ａ）から七カ月（Ｂ）の過程において、ＪＥＧ−３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３６）を用いた５回（Ａ組）又は７回（Ｂ組）の免疫化を受けた。一回目の免疫化のために、滅菌ＰＢＳに溶解した１ｘ１０＾７個の細胞を、等容積のＣＦＡ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内投与した。追加免疫が、２８日目、５６日目、８４日目、１１２日目、１４０日目（Ｂ組のみ）、及び１６８日目（Ｂ組のみ）に、同じ方式で、但し全体を通して完全フロイントアジュバント（ＢＤ  ＤｉｆｃｏからのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）を使用して、実施された。最後の免疫化の三週間後、滅菌ＰＢＳ中、１００μｇの組み換えヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））をラットにｉ．ｖ．投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、それぞれ三回目、五回目及び七回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡにより、組み換えＨＬＡ−Ｇ（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））特異性のＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体生成−特異性のＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体生成について試験し、コンセンサスＨＬＡ−Ａに特異性の位置（配列番号２６（「ＨＬＡ−Ｇ−０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ−Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。
【０２２０】
ｄ．ＪＥＧ３／ＤＮＡ  ＩＭＳ（追加免疫効果のため）
免疫化には、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から取得されたＣＤラットを使用した。動物は、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）の付録Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ」に従って収容した。すべての動物免疫化プロトコール及び実験は、Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｐｐｅｒ  Ｂａｖａｒｉａによって承認され（許可番号ＡＺ．５５．２−１−５４２５３１−８３−１３）、ドイツ動物保護法及び欧州会議及び理事会の指示２０１０／６３に従って実施された。
【０２２１】
ＣＤラット（ｎ＝５）（週齢６〜８）には、三カ月の過程において、プラスミドＤＮＡと細胞ベースの免疫化を交互に実施した。単鎖分子としてヒトＨＬＡ−ＧをコードするプラスミドＤＮＡ  ＨＬＡ−Ｇ−００３０（ｐ１７７４７）と、天然にＨＬＡ−Ｇを発現するＪＥＧ−３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３６）を、それぞれこの目的のために使用した。
【０２２２】
一回目の免疫化のために、動物を、イソフルラン麻酔し、動物の尾部近傍の、背中の毛を剃った一の部位に適用した滅菌Ｈ２Ｏ中１００μｇのプラスミドＤＮＡで皮内（ｉ．ｄ．）免疫した。ｉ．ｄ．適用後、その部位を、ＥＣＭ  ８３０エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に以下のパラメータを使用して、即ち：それぞれ０．１ｍｓにわたり１０００Ｖ／ｃｍで、１２５ｍｓの間隔を空けて二回、続いて１０ｍｓにわたり２８７．５Ｖ／ｃｍで、やはり１２５ｍｓの間隔を空けて四回、電気穿孔した。１４日目における二回目の免疫化のために、動物に、滅菌ＰＢＳに溶解した１ｘ１０＾７個の細胞を投与し、これを等容積のＣＦＡ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、安定なエマルションの生成後、腹腔内投与した。追加免疫が、２８日目（ＤＮＡ）、４２日目（細胞）、５６日目（ＤＮＡ）、７０日目（細胞）に、同じ方式で、但し完全フロイントアジュバント（ＢＤ  ＤｉｆｃｏからのＩＦＡ、＃ＤＩＦＣ２６３９１０）を全体を通して細胞免疫化に使用して、実施された。最後の免疫化から四週間後、滅菌ＰＢＳ中、１００μｇの安定な組み換えヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））をラットにｉ．ｖ．投与し、その７２時間後、脾臓を無菌的に摘出し、ハイブリドーマ生成のために調製した。血清を、それぞれ三回目、五回目及び六回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡにより、安定な組み換えヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））特異性のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ抗体生成について試験し、コンセンサスＨＬＡ−Ａに特異性の位置（配列番号２６（「ＨＬＡ−Ｇ−０００７」））を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ−Ｇを用いてカウンタースクリーニングした。
【０２２３】
すべての免疫化戦略において、高度に他反応性体液性免疫応答が誘導され、免疫化された動物由来のポリクローナル血清を用いてＥＬＩＳＡフォーマットにおいて分析したところ、ＨＬＡ−Ｇ、並びにカウンタースクリーニングに使用されたタンパク質（例えば組み換え「デグラフト」ヒトＨＬＡ−Ｇ、キメラ  Ｈ２Ｋｄ／ＨＬＡ−Ｇ分子又は関連ヒトＨＬＡ−Ａ２分子）を認識した（データは示さない）。
【０２２４】
得られた抗ＨＬＡ−Ｇ特異性の抗体の結合特性及び生物活性を、以下の実施例に記載されるように決定し、既知の参照抗体と比較した。
【０２２５】
実施例３
Ａ）可溶型ヒトＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ａ特異性の配列を有する可溶型デグラフトヒトＨＬＡ−Ｇ、ヒトＨＬＡ−Ａ２、及び／ラットマウスＨ２−Ｋｄに対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合
免疫化により得た抗体を、ヒト、ラット及びマウスＨＬＡ−Ｇ、キメラ、デグラフトＨＬＡ−Ｇ及びＨＬＡ−Ａに対するそれらの結合特性についてスクリーニングした。それぞれのアッセイについて以下に記載する。ヒトＨＬＡ−Ｇの試験のために、単量体と、二量体及び三量体の形態が使用された（以下の調製を参照）。
【０２２６】
ヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣクラスＩタンパク質の二量体化／三量体化
単量体のＨｉｓタグ付き可溶型ヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣクラスＩタンパク質（配列番号２３）を含む上清を、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣを用いて、５ｍｌのＮｉ−セファロースを有するＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃１７−５２４８−０２）に０，２ｍｌ／分の流速で一晩室温でロードした。次いでカラムを０．５Ｍのイミダゾールを含む２％  ＤＰＢＳ（Ｍｅｒｃｋ＃８．１４２２３．０２５）でベースラインに到達するまで洗浄した。次いでカラムを、０．５Ｍのイミダゾールを含む２％  ＤＰＢＳ中１０ｍＭのＤＴＴで平衡化し、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／１０ｍＭのイミダゾールを用いてカラムからＤＴＴを洗い流し、０．５ｍＭのイミダゾールを含む２〜１００％の勾配のＤＰＢＳでタンパク質を溶出した。Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ  １５Ｍ／Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １０Ｋを用いて溶出液を濃縮した後、タンパク質を２４時間室温でインキュベートし、続いて４８時間４℃でインキュベートして、二量体化／多量体化させた。次いで、二量体と三量体の分離をＳｕｐｅｒｄｅｘ    ２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃１７−５１７５−０１）で実施し、０．５ＭのＮａＯＨで一晩洗浄した。カラムをＰＢＳで均衡化し、続いて１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで飽和させた。次いで二量体（画分Ａ９）と三量体（画分Ａ８）とを収集し、分注し、後で使用するまで−８０℃で保存した。
【０２２７】
ヒト野生型ＨＬＡ−Ｇ結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト野生型ＨＬＡ−Ｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）した後、２５μｌの抗ＨＬＡ−Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又は参照抗体（Ｇ２３３、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ＃ＭＡ１−１９４４９、５００ｎｇ／ｍｌ）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのヤギ−抗マウスＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（Ｂｉｏｒａｄ＃１７０−６５６１、ＯＳＥＰ中１：２０００）又はロバ−抗ウサギＩｇＧ  ＰＯＤ（ＧＥ＃ＮＡ９３４０Ｖ、ＯＳＥ中１：５０００）を加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。ラットＩｇＧの検出のために、ヤギ−抗ラットＩｇＧ１−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０６Ｐ）、ヤギ−抗ラットＩｇＧ２ａ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０９Ｐ）及びヤギ−抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１１１Ｐ）をＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器において、３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２２８】
ＨＬＡ−Ａ特異性配列を有するヒトデグラフトＨＬＡ−Ｇ結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトデグラフトＨＬＡ−Ｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌの抗ＨＬＡ−Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又はラット血清（ＯＳＥＰ中で１：６００に希釈）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、ヤギ−抗ラットＩｇＧ１−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０６Ｐ）、ヤギ−抗ラットＩｇＧ２ａ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０９Ｐ）及びヤギ−抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１１１Ｐ）の混合物２５μｌ／ウェルを、ＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器において、３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２２９】
ラットＭＨＣ  Ｉ（ＲＴ１−Ａ）結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ラットＭＨＣ  Ｉ（ＲＴ１−Ａ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌの抗ＨＬＡ−Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又はラット血清（ＯＳＥＰ中で１：６００に希釈）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、ヤギ−抗ラットＩｇＧ１−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０６Ｐ）、ヤギ−抗ラットＩｇＧ２ａ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０９Ｐ）及びヤギ−抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１１１Ｐ）の混合物２５μｌ／ウェルを、ＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器において、３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２３０】
ＨＬＡ−Ａ２結合ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＨＬＡ−Ａ２でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌの抗ＨＬＡ−Ｇ試料（ＯＳＥＰバッファー中で１：３に希釈）又はラット血清（ＯＳＥＰ中で１：６００に希釈）を加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、ヤギ−抗ラットＩｇＧ１−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０６Ｐ）、ヤギ−抗ラットＩｇＧ２ａ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０９Ｐ）及びヤギ−抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１１１Ｐ）の混合物２５μｌ／ウェルを、ＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）の後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器において、３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２３１】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合キネティクス
ヒトＨＬＡ−Ｇ、ヒトＨＬＡ−Ｇデグラフト及びヒトＨＬＡ−Ａ２に対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合キネティクスを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により調査した。すべての実験を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして、及びＰＢＳバッファー（＋  ０，１％  ＢＳＡ）を希釈バッファーとして用いて、２５℃で実施した。抗ヒトＦｃ（ＪＩＲ００９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗ラットＦｃ（ＪＩＲ１１２−００５−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗マウスＦｃ（ＪＩＲ１１５−００５−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）抗体を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを用いることにより、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にｐＨ５．０で固定化した。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は表面上に捕捉され、５０〜２００ＲＵの捕捉応答をもたらした。ＨＬＡ−Ｇ分子を、２．５から８００ｎＭの濃度で（２ｘ１：２及び４ｘ１：３の希釈系列）表面上に１８０秒間にわたって３０μｌ／分で注入した（会合相）。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を３００〜６００秒間監視した。表面を、抗ヒトＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を６０＋３０秒間にわたって注入することにより、抗ラットＦｃ捕捉抗体についてはグリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって及びグリシン（ｐＨ２．０）を６０秒間にわたって注入することにより、抗マウスＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を８０＋６０秒間にわたって注入することにより、再生した。バルク屈折率の差異は、モック面から得られた応答を差し引くことにより修正された。ブランク注入が差し引かれた（二重参照）。   得られた曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした。
【０２３２】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のクロスブロッキング
ヒトＨＬＡ−Ｇに対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合のクロスブロッキング実験を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００又はＢ４０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により調査した。すべての実験を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして用いて、２５℃で実施した。
【０２３３】
抗ヒトＦａｂ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８−９５８３−２５）抗体を、供給者のプロトコールに従ってＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化し、ヒトＣｋドメインを含むＯＭＴラットから抗体を捕捉した。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、１５μｇ／ｍｌの濃度で７０秒間捕捉した。野生型ＨＬＡ−Ｇを、５００又は１０００ｎＭの濃度で６０秒間注入した（３０μｌ／分）。次いで野生型ラット抗体を、３０μｇ／ｍｌの濃度で９０秒間注入した。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を６０又は２４０秒間監視した。グリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって注入し、追加の安定化期間を９０秒間おくことにより、表面を再生した。
【０２３４】
別のアッセイ設定では、抗ヒトＦａｂ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８−９５８３−２５）抗体を、供給者のプロトコールに従ってＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化し、ヒトＣｋドメインを含むＯＭＴラットから抗体を捕捉した。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、３０μｇ／ｍｌの濃度で９０秒間捕捉した。捕捉抗体上の占有されていない結合部位を、４×１２０秒間にわたり濃度５００μｇ／ｍｌ及び流速３０μｌ／分でヒトＩｇＧ（ＪＩＲ００９−０００−００３）を注入することによりブロックした。野生型ＨＬＡ−Ｇを、５００ｎＭの濃度で９０秒間注入した（３０μｌ／分）。次いでＯＭＴラット（ヒトＣｋドメイン）からの第２の抗体を、３０μｇ／ｍｌの濃度で９０秒間注入した。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を２４０秒間監視した。グリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって注入し、追加の安定化期間を９０秒間おくことにより、表面を再生した。
【０２３５】
2020511112.tif 000004
【０２３６】
上の表は、野生型タンパク質ＩＭＳ由来の様々なラット抗ヒトＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の結合をまとめたものである。ＥＬＩＳＡによって評価された、ｒｅｃ野生型単量体、二量体及び三量体のＨＬＡ−Ｇタンパク質に対するそれぞれの結合の相対的なＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］が示されている。ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）プレートにビオチン化野生型ＨＬＡ−Ｇ抗原をコーティングすることにより設定された。インキュベーション及び洗浄工程の後、１：２の希釈工程においてそれぞれの抗体を１０から０μｇの濃度範囲で結合させた。結合した抗体の検出を、抗Ｆｃ−抗体−ＰＯＤ  コンジュゲートにより実施した。その結果得られた結合曲線から、最大半量シグナルを生成する抗体濃度においてＥＣ５０値を決定した。非ビオチン化ＨＬＡ−Ｇ二量体及び三量体抗原の場合、固定化は、アッセイプレート上をランダムにコーティングすることにより実施した。
【０２３７】
ＨＬＡ−Ｇ抗体の、組み換えＨＬＡ−Ｇ（配列番号２５）及びコントロール修飾ヒトＨＬＡ−Ｇ  β２Ｍ  ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ−Ｇ特異性のアミノ酸がＨＬＡ−Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフトＨＬＡ−Ｇ、配列番号２６）に対する結合親和性。（「−」は検出可能な結合が存在しないことを示す）
2020511112.tif 000005
【０２３８】
上の表は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析によって評価された、野生型及びデグラフトＨＬＡ−Ｇに対する抗体親和性及びｔ１／２値をまとめたものである。ヒトＨＬＡ−Ｇ、ヒトＨＬＡ−Ｇデグラフト及びヒトＨＬＡ−Ａ２に対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合キネティクスを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により調査した。すべての実験を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして、及びＰＢＳバッファー（＋  ０，１％  ＢＳＡ）を希釈バッファーとして用いて２５℃で実施した。抗ヒトＦｃ（ＪＩＲ００９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗ラットＦｃ（ＪＩＲ１１２−００５−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）又は抗マウスＦｃ（ＪＩＲ１１５−００５−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ）抗体を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを用いることにより、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にｐＨ５．０で固定化した。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は表面上に捕捉され、５０〜２００ＲＵの捕捉応答をもたらした。ＨＬＡ−Ｇ分子を、２．５から８００ｎＭの濃度で（２ｘ１：２及び４ｘ１：３の希釈系列）表面上に１８０秒間にわたって３０μｌ／分で注入した（会合相）。ランニングバッファーで洗浄することにより、解離相を３００〜６００秒間監視した。表面を、抗ヒトＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を６０＋３０秒間にわたって注入することにより、抗ラットＦｃ捕捉抗体についてはグリシン（ｐＨ１．５）を６０秒間にわたって及びグリシン（ｐＨ２．０）を６０秒間にわたって注入することにより、抗マウスＦｃ捕捉抗体についてはＨ３ＰＯ４（０．８５％）を８０＋６０秒間にわたって注入することにより、再生した。バルク屈折率の差異は、モック面から得られた応答を差し引くことにより修正された。ブランク注入が差し引かれた（二重参照）。得られた曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした（−上の表は、検出可能な結合が存在しなかったことを示している）。
【０２３９】
対応するＳＰＲセンサーグラムを図３に示す。
【０２４０】
さらなる実験において、以下の参照抗体（様々な商業的ベンダーから取得）を、単量体のヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣ  Ｉ（配列番号２３（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））及びコンセンサスＨＬＡ−Ａ特異性の位置を有する「デグラフト」ヒトＨＬＡ−Ｇ（配列番号２４（「ＨＬＡ−Ｇ−０００７」））に対する結合について比較した：
ＭＥＭ／Ｇ９、８７Ｇ、Ｇ２３３、２Ａ１２、４Ｈ８４、５Ａ６Ｇ７、６Ｄ４６３、９−１Ｆ１０、ＭＥＭ−Ｇ／１、ＭＥＭ−Ｇ／１１、ＭＥＭ−Ｇ／２及びＭＥＭ−Ｇ／４（「−」は検出可能な結合が存在しないことを示す）。
2020511112.tif 000006
2020511112.tif 000007
【０２４１】
興味深いことに、測定された抗体の多くは、抗体８７Ｇも含めて、単量体のヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣ  Ｉ（配列番号２５（「ＨＬＡ−Ｇ−０００３」））に対する特異的結合をまったく示さなかった。文献に記載されているようなオリゴマー形態のＨＬＡ−Ｇに対する結合は、オリゴマー形態の結合部位の増加に起因して生じた結合活性でありうる。
【０２４２】
７．７Ｅ−０９Ｍの結合親和性のＫＤ値を有する抗体ＭＥＭ／Ｇ９、２．０Ｅ−０８ＭのＫＤ値を有する抗体Ｇ２３３及び１．２Ｅ−０８Ｍの結合親和性のＫＤ値を有するＭＥＭ−Ｇ／１１のみが、単量体の野生型ヒトＨＬＡ−Ｇ  ＭＨＣ  Ｉ複合体に対する結合を示した。しかしながら、これら抗体の一つであるＭＥＭ−Ｇ／１１は、ＨＬＡ−Ｇデグラフト（配列番号２６）上のＨＬＡ−Ａコンセンサスに対してもいくらかの結合／交差反応性を示した。加えて、別の抗体（ＭＥＭ／Ｇ９）も、ＨＬＡ−Ｇデグラフト（配列番号２６）上のＨＬＡ−Ａコンセンサスに対するより強い非特異的結合を示した。
【０２４３】
実施例４
受容体の遮断（単量体、二量体、及び三量体のＨＬＡ−Ｇによる）
ａ）ＩＬＴ２及び−４の遮断特性に関する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の生化学的比較
ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｎｕｎｃ、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルの、濃度５００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト野生型ＨＬＡ−Ｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌの抗ＨＬＡ−Ｇ試料を８μｇ／ｍｌから濃度を徐々に低下させながら加え、次いで１：３に段階希釈し、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌ／ウェルのｃ−ｍｙｃ−タグ付け組み換えＩＬＴ−２受容体を１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌ／ウェルのヤギ−抗ｃ−ｍｙｃ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１９０−１０４Ｐ、ＯＳＥ中１：７０００）を加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（６ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２４４】
2020511112.tif 000008
【０２４５】
上の表は、ＥＬＩＳＡによって評価した、ｒｅｃＨＬＡ−Ｇタンパク質（単量体及びオリゴマー）とその受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４との間の相互作用の遮断をまとめたものである。ＨＬＡ−Ｇ／受容体の相互作用（ＩＬＴ２及びＩＬＴ４に対する）の  ％阻害と、（単量体（Ｍ）、二量体（Ｄ）又は三量体（Ｔ）のＨＬＡ−Ｇタンパク質が使用された場合の）ＨＬＡ−Ｇ／受容体の相互作用の中和に関する相対的ＩＣ５０値［ｎＭ］が示されている。それほど顕著でないＩＬＴ４の阻害は、この受容体の主要なβ−２Ｍ依存的相互作用によるものである。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）プレートにビオチン化抗原野生型ＨＬＡ−Ｇをコーティングすることにより設定された。インキュベーション及び洗浄工程の後、１：３の希釈工程においてそれぞれの抗体を８から０μｇの濃度範囲で結合させた。Ｃ−ｍｙｃタグ付けＩＬＴ−２又は−４受容体を、ＨＬＡ−Ｇ−抗体複合体に付加した。インキュベーション及び洗浄工程の後、結合した受容体の検出を、抗ｃｍｙｃ−抗体−ＰＯＤコンジュゲートにより実施した。その結果得られた阻害曲線から、最大半量阻害を生成する抗体濃度においてＩＣ５０値を決定した。非ビオチン化ＨＬＡ−Ｇ二量体及び三量体抗原の場合、固定化は、アッセイプレート上をランダムにコーティングすることにより実施した。
【０２４７】
ｂ）様々なアッセイ設定を用いたＩＬＴ２及び−４の遮断特性に関する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の生化学的比較
Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートに対してＦｃタグ付きＩＬＴ２及びＩＬＴ４をそれぞれコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡを設定した。インキュベーション及び洗浄工程の後、それぞれの抗体を１００ｎＭの濃度で加えた。可溶型Ｈｉｓタグ付き単量体、二量体又は三量体のＨＬＡ−Ｇをウェルに加えた。インキュベーション及び洗浄工程の後、結合した受容体の検出を、抗Ｈｉｓ−抗体−ＰＯＤコンジュゲートにより実施した。阻害率（％）は、ＩＬＴ２／４＋ＨＬＡ−Ｇ（単量体、二量体、又は三量体）を含み、抗ＨＬＡ−Ｇ又はＩＬＴ２／４抗体を含まないウェルから得られた値との比較において計算された（１００％結合＝０％阻害）。
【０２４８】
2020511112.tif 000009
【０２４９】
上の表は、ＥＬＩＳＡによって評価した、ｒｅｃＨＬＡ−Ｇタンパク質（単量体及びオリゴマー）とその受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４との間の相互作用の遮断をまとめたものである。ＨＬＡ−Ｇ／受容体の相互作用の％阻害が示されている（ＩＬＴ２及びＩＬＴ４に関して）。それほど顕著でないＩＬＴ４の阻害は、この受容体の主要なβ−２Ｍ依存的相互作用によるものである。
【０２５０】
以下の棒グラフは、グラフに示されるように、市販の抗体との比較において、本明細書に記載の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体によって達成された％阻害を示している。市販のＨＬＡ−Ｇ抗体８７Ｇ、ＭＥＭ／Ｇ０９及びＧ２３３は、本明細書に記載の抗体ほど効率的にはＨＬＡ−Ｇ／ＩＬＴ２又は  ＩＬＴ４の相互作用をブロックしない。さらに、市販の抗体は、場合によっては、結合するとＩＬＴ２又はＩＬＴ４に対するＨＬＡ−Ｇの結合の増大を招く。
【０２５１】
実施例５
細胞に対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合
ａ）細胞表面ＨＬＡ−Ｇ結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＪＥＧ３細胞（ＨＬＡ−Ｇを天然に発現、２００００細胞／ウェル）、Ｓｋｏｖ−３細胞、又は細胞表面上に組み換えＨＬＡ−Ｇを発現するＳｋｏｖ−３細胞（共に１００００個の細胞／ウェル）を、組織培養処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１２．５μｌの抗ＨＬＡ−Ｇ試料（最終希釈１：３）を加え、２時間にわたり４℃でインキュベートした。５０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｇ５８８２；Ｌｏｔ  Ｎｏ．：０５６Ｋ５３１８）になるように加えることにより細胞を固定した。洗浄（３ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌ／ウェルのヤギ−抗マウスＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（Ｂｉｏｒａｄ＃１７０−６５６１、ＯＳＥＰ中１：２０００）又はロバ−抗ウサギＩｇＧ  ＰＯＤ（ＧＥ＃ＮＡ９３４０Ｖ、ＯＳＥ中１：５０００）を加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。ラットＩｇＧの検出のために、ヤギ−抗ラットＩｇＧ１−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０６Ｐ）、ヤギ−抗ラットＩｇＧ２ａ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１０９Ｐ）及びヤギ−抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＰＯＤ（Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ１１０−１１１Ｐ）をＯＳＥＰ中１：１００００で加え、シェーカーで１時間室温でインキュベートした。洗浄（４ｘ９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー）後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器において３７０／４９２ｎｍで行った。
【０２５２】
2020511112.tif 000010
【０２５３】
上の表は、ＦＡＣＳ分析によって評価された、様々な細胞及び細胞株上に発現されたＨＬＡ−Ｇに対する様々なラット抗ヒトＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の結合をまとめたものである。天然にＨＬＡ−Ｇを発現するＪＥＧ３腫瘍細胞又はＳｋｏｖ３若しくはＰＡ−ＴＵ−８９０２トランスフェクタント及びそれぞれの親の、トランスフェクトされていない細胞に対するいずれかの結合が記載されている。
【０２５４】
ｂ）細胞上に発現される天然又は組み換えＨＬＡ−Ｇに対するＨＬＡ−Ｇ抗体の結合（ＦＡＣＳ分析により評価）
フローサイトメトリー分析のために、細胞を、４℃において抗ＨＬＡ−Ｇ  ｍＡｂｓで染色した。簡潔には、２５μｌ／ウェルの各細胞懸濁液（５ｘ１０４細胞／ウェル）を、ポリプロピレンの９６ウェルＶ底プレートに移し、冷蔵庫内において５℃で１０分間事前冷蔵した。抗ＨＬＡ−Ｇ試料を染色バッファーで２倍の開始濃度８０μｇ／ｍｌに希釈した。抗体の４倍の段階希釈を実施し、２５μｌ／ウェルの抗体溶液を調製された細胞に加え、１時間にわたり５℃でインキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色バッファーで二回洗浄し、３００ｇで３間遠心分離した。検出のために、Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃  Ａ１１００６）、又はヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃  Ａ１１００１）にコンジュゲートした蛍光標識抗種抗体（ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を、染色バッファーで２０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞ペレットを５０μｌ／ウェルの検出抗体に再懸濁した。５℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を再び染色バッファーで二回洗浄し、７０μｌの染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで測定した。
【０２５５】
クローンＨＬＡ−Ｇ＃００３２−００３７の例示的ＦＡＣＳ染色が、図５のＦＡＣＳオーバーレイに示されている。
【０２５６】
実施例６
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、組み換えＩＬＴ２と、ＪＥＧ３細胞上に天然に発現されるＨＬＡ−Ｇとの相互作用を阻害／調節する。
分析のために、ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３６）を、様々な抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と共にプレインキュベーションした又はしていないＩＬＴ２−Ｆｃ融合タンパク質で染色した（コントロール＝阻害なし）。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を用いたプレインキュベーションのために、２５μｌ／ウェルの細胞懸濁液をポリプロピレンの９６ウェルＶ底プレートに移し、４℃で１０分間事前冷却した。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又は参照抗体（Ｇ２３３、ＭＥＭ−Ｇ／９又は８７Ｇ）を、染色バッファーで２倍の濃度２０μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌ／ウェルの抗体溶液を調製された細胞に加え、１時間５℃でインキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色バッファーで二回洗浄し、３００ｇで３分間遠心分離して、最後に２５μｌ／ウェルの染色バッファーに再懸濁した。
【０２５７】
ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ  ｍＡｂと共にプレインキュベートしたＪＥＧ３細胞又はｂ）参照としての未処理のＪＥＧ３細胞に対するヒトＩＬＴ２−Ｆｃキメラタンパク質（ＲＤ＃２０１７−Ｔ２−０５０）の検出を、以下のようにして決定した。簡潔には、ＩＬＴ２−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃  ００９−０００−００３）を染色バッファーで（ＩＬＴ２）の２倍の濃度２０μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌ／ウェルのＩＬＴ２−Ｆｃタンパク質溶液を調製された細胞に加え、２時間５℃でインキュベートした。細胞を再び、２００μｌ／ウェル染色バッファーで二回洗浄し、ヒトＩＬＴ２−Ｆｃタンパク質を、染色バッファー中１０μｇ／ｍｌの蛍光標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ特異性抗体（Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異性ＦＩＴＣ、Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃  １０９−０９６−００８）を用いて検出した。細胞ペレットを、５０μｌ／ウェルの検出抗体に再懸濁した。５℃での１時間のインキュベーション後、細胞を染色バッファーで二回洗浄し、７０μｌに再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにおいて測定して、ＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を決定した。
【０２５８】
コントロールとして、ＪＥＧ−３プレインキュベート細胞に結合した抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、抗種抗体（Ａｌｅｘａ  ４８８にコンジュゲートした（ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃  Ａ１１００１）、又はヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃  Ａ１１００６）を濃度１０μｇ／ｍｌで使用することにより検出された。
【０２５９】
図６のグラフは、異なるＨＬＡ−Ｇ抗体の、ＪＥＧ３腫瘍細胞に天然に発現されるＨＬＡ−Ｇに対する組み換えＩＬＴ２の相互作用及び結合を修飾するそれぞれの能力を示す。
【０２６０】
以下の表は、実験結果をまとめたものである。ＪＥＧ３細胞に対する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の結合は、＋（＝弱い結合）〜＋＋＋（＝強い結合）で示されている。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の能力は、ＨＬＡ−Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＩＬＴ２の結合を、阻害／ブロックする又は増大させる。最後のカラムには、細胞に対する組み換えＩＬＴ２の結合又はその阻害／ブロックが示され／定量化されている（抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の非存在下でのＩＬＴ２−Ｆｃの染色を、１００％結合、即ち０％阻害に設定した。負の値は結合の増大を示す。染色シグナルの５％未満の相違は有意でないため「効果なし」に分類した。）：
【０２６１】
2020511112.tif 000011
【０２６２】
実施例７
単球サイトカイン修復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）アッセイ（ＨＬＡ−Ｇ媒介性抑制後）
様々なラット抗ヒトＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の機能的特徴付けのために、単球を用いたＨＬＡ−Ｇ発現細胞の以下の共培養アッセイを使用した。抹消ヒト単球を、健常なドナーの血液から単離した。簡潔には、血液を、抗凝固剤を含む管に収集し、ＰＢＳで１：２に希釈した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、３０ｍｌの混合物を、分離媒体を事前充填した各Ｌｅｕｃｏｓｅｐ管に移した。ＰＢＭＣ特異性のバンドを、１２分の遠心分離（制動なしで１２００ｘｇ）後収集し、ＰＢＳで三回洗浄し、１０分間３００ｘｇで遠心分離した。最後に、細胞ペレットを、ＭｉｌｔｅｎｙｉからのＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、製造者の指示に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉのヒトＭｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（＃１３０−０９１−１５３）による磁気選別を介してヒト単球をＰＢＭＣから単離した（負の選別）。単離された単球を初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳを補充したＰＡＮ＃Ｐ０４−１７５００、Ｇｉｂｃｏ＃１０５００；２ｍＭのＬ−グルタミン、Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７５１３；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０；ＭＥＭ非必須アミノ酸、Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０；０，１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｇｉｂｃｏ＃３１３５０；ＭＥＭビタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１１１２０；ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）に５ｘ１０ｅ５個の細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ＣＤ１４＋  ＣＤ１６＋細胞の濃縮を、フローサイトメトリーにより監視し、細胞のＩＬＴ２及びＩＬＴ４の発現を分析した。ＨＬＡ−Ｇ発現細胞を用いた濃縮単球の共培養アッセイのために、ＪＥＧ−３細胞を、アッセイの前日に、ＪＥＧ−３培養培地（ＥＢＳＳ及びＬ−グルタミンを含むＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ、１０％のＦＣＳを補充したＰＡＮ＃Ｐ０４−００５０９、Ｇｉｂｃｏ＃１０５００；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０；ＭＥＭ非必須アミノ酸  Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）において１００μｌ中８ｘ１０ｅ３個の細胞／ウェルで、９６ウェル平底組織培養プレートに播種し、アッセイ当日に培養密度層を形成しした。接着性のＪＥＧ−３細胞を、初代細胞培養培地において、４倍に段階希釈した抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と共にプレインキュベートした。したがって、接着性ＪＥＧ−３細胞由来の上清を除去し、５０μｌ／ウェルの調製済み抗体溶液を付加し、加湿雰囲気中で１時間にわたり３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。ヒト単球を、５０μｌの初代細胞培養培地中において、２，５ｘ１０ｅ４個のヒト単球／ウェルで、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と共にプレインキュベートしたＪＥＧ−３細胞に加え、共培養物を、加湿雰囲気中で一晩（概ね１８〜２０時間）３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。翌日、５０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳによるＬＰＳ刺激を７時間にわたって実施し、その後共培養物の上清を回収した。共培養物上清のＴＮＦアルファの濃度を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃８８−７３４６−８８）のヒトＴＮＦアルファＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（登録商標）を用いて決定した。
【０２６３】
下の表は、与えられたＨＬＡ−Ｇ抗体候補の機能的特性をまとめたものである。
【０２６４】
機能的抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、抑制された免疫応答を回復することができる（即ち、ＨＬＡ−Ｇ発現細胞との共培養において単球によりＬＰＳ誘導性ＴＮＦａ生成を回復する）。
【０２６５】
2020511112.tif 000012
【図１】
2020511112.tif 000013
【図２Ａ】
2020511112.tif 000014
【図２Ｂ】
2020511112.tif 000015
【図３Ａ】
2020511112.tif 000016
【図３Ｂ】
2020511112.tif 000017
【図４Ａ】
2020511112.tif 000018
【図４Ｂ】
2020511112.tif 000019
【図５Ａ】
2020511112.tif 000020
【図５Ｂ】
2020511112.tif 000021
【図５Ｃ】
2020511112.tif 000022
【図５Ｄ】
2020511112.tif 000023
【図６Ａ】
2020511112.tif 000024
【図６Ｂ】
2020511112.tif 000025
【図７Ａ】
2020511112.tif 000026
【図７Ｂ】
2020511112.tif 000027
【配列表】
2020511112000001.app
【国際調査報告】
2020511112.tif 000028
2020511112.tif 000029
2020511112.tif 000030
2020511112.tif 000031
2020511112.tif 000032