(57)【要約】  本発明は、ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。本発明はまた、それを必要とする対象におけるＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナル伝達を阻害する方法、疾患及び障害に罹患している対象におけるＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか又は関連する疾患及び／又は障害を治療する方法、腫瘍に罹患している対象における腫瘍を治療する方法、それを必要とする対象における内皮細胞の細胞増殖を阻害する方法、並びに試料中のヒト血管内皮増殖因子受容体を検出する方法に関する。【選択図】  図４
2020525470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
前記ヒト血管内皮増殖因子受容体２が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記エピトープが、
配列番号１の６０６位のロイシン残基、６０７位のアスパラギン酸残基、６４７位のアルギニン残基、６４８位のリジン残基、及び６４９位のトレオニン残基、又は、
配列番号１の７１１位のセリン残基、７１６位のリジン残基、７１７位のアスパラギン酸残基、並びに７２５位及び７２６位のアルギニン残基
を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
哺乳動物抗体である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、
前記重鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み、
前記ＣＤＲＨ１領域が配列番号４のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ２領域が配列番号５のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ３領域が配列番号６のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ１領域が配列番号７のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ２領域が配列番号８のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ３領域が配列番号９のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
重鎖可変領域の相補性決定領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、
前記重鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み、
前記ＣＤＲＨ１領域が配列番号１０のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ２領域が配列番号１１のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ３領域が配列番号１２のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ１領域が配列番号１３のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ２領域が配列番号１４のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ３領域が配列番号１５のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
配列番号１７のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
重鎖可変領域が配列番号１６の核酸配列によってコードされており、
軽鎖可変領域が配列番号１８の核酸配列によってコードされている、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
配列番号２１のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域をと含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
重鎖可変領域が配列番号２０の核酸配列によってコードされており、
軽鎖可変領域が配列番号２２の核酸配列によってコードされている、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
配列番号２５のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
重鎖可変領域が配列番号２４の核酸配列によってコードされており、
軽鎖可変領域が配列番号２６の核酸配列によってコードされている、請求項９に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
治療薬とコンジュゲートされている、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
前記治療薬が代謝拮抗剤、アルキル化剤、アルキル化様薬剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリチアマイシン、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射性同位元素からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
細胞の表面で発現される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１３に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
それを必要とする対象におけるＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１６】
ＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか又は関連する疾患及び／又は障害を前記疾患及び／又は障害に罹患している対象において治療する方法であって、
請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
腫瘍に罹患している対象における腫瘍を治療する方法であって、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、又は黒色腫からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
それを必要とする対象における内皮細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
試料中のヒト血管内皮増殖因子受容体２を検出する方法であって、
前記試料を請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させるステップを含む方法。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦＲ−２のドメイン６〜７を検出するためのものである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
[0001]本発明は、ヒト血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）に特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメント、及びその使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
[0002]血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）によるシグナル伝達経路の機能は、血管新生を促進している。血管新生とは、元の血管から新しい毛細血管を形成することを意味する。血管新生調節の異常は、多くの疾患の病因機序に関係しており、また多くのタイプのがんの特徴でもある。シグナル伝達経路に関与する主要な役割は、血管内皮増殖因子ファミリー及びそれらの受容体に属するタンパク質である。このシグナル伝達経路の活性化は、下流の複合ネットワークを活性化し、血管内皮細胞の増殖、移動、及び生存を促進する。このシグナル伝達経路は、腫瘍血管新生に密接に関係していると思われため、シグナル伝達経路の阻害が腫瘍血管新生の調節にとって重要である。
【０００３】
[0003]血管内皮増殖因子ファミリーは、高度に保存された配列を有する相同二量体糖タンパク質の群を含む。血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーは、ジスルフィド結合を介して２つの２４ｋＤａ一本鎖分子を連結することにより活性化される。血管内皮増殖因子ファミリーの公知のメンバーとしては、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及び胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）が挙げられ、最初にＶＥＧＦ−Ａが発見されて最も詳細に研究されており、血管新生における重要な役割を果たしている。
【０００４】
[0004]血管内皮増殖因子が血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ）に結合した場合、血管内皮増殖因子受容体は二量体を形成し、相互リン酸化する。血管内皮増殖因子受容体の細胞外領域に位置している７つのＩｇ様ドメインがある。一般的に、ドメイン１〜３はリガンドとの結合に関与し、ドメイン４〜７は二量体化、リン酸化、及び下流シグナル伝達に関与する。
【０００５】
[0005]血管内皮増殖因子受容体はチロシンキナーゼ（ＴＫ）ファミリーに属し、シグナル伝達経路の重要なメンバーである。細胞の成長（cell growth）、増殖（proliferation）、抗アポトーシスを誘導する細胞外シグナルを細胞に伝達する。３種類の血管内皮増殖因子受容体：ＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１としても知られる）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／ｆｌｋ−１としても知られる）、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４としても知られる）がある。ＶＥＧＦ−ＡはＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２に結合し、これら２つの受容体は、血管内皮細胞で両方とも発現され、血管内皮細胞のシグナルはＶＥＧＦＲ−２を介して主として伝達される。ＶＥＧＦＲ−１とリガンドの間の結合親和性は、ＶＥＧＦＲ−２とリガンドの間の結合親和性よりも１０倍強いが、ＶＥＧＦＲ−１のキナーゼ活性はより弱い。別の態様において、ＶＥＧＦＲ−３は、リンパ管内皮細胞で主として発現される。
【０００６】
[0006]本来の末梢血管内皮細胞増殖によるものに加えて、腫瘍血管新生は、血管内皮前駆細胞を引き寄せ、ＶＥＧＦＲ−２の調節下で腫瘍又はその周辺領域に移動させることにより形成され、次いで血管内皮前駆細胞が血管内皮細胞に分化することも知られている。血管内皮増殖因子受容体に関する血管新生は、生理的状態では、創傷修復及び正常な女性の月経周期においてのみ生じるので、血管内皮増殖因子受容体によるシグナル伝達経路の遮断の影響は、正常な生理機能に限定される。その結果、血管内皮増殖因子受容体によるシグナル伝達経路の阻害は、腫瘍血管新生の阻害の重要な調節ポイントとなり、腫瘍細胞死を結果的にもたらす。血管内皮増殖因子が様々な固形腫瘍で、例えば、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、及び肺がんなどで過剰発現していることは報告されている。
【０００７】
[0007]したがって、血管内皮増殖因子受容体によるシグナル伝達経路を遮断するための新しい方法を開発することが必要とされている。
【０００８】
［発明の概要］
[0008]本発明は、ヒト血管内皮増殖因子受容体２又はヒト血管内皮増殖因子受容体２フラグメントに結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明による抗体は、ＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナル伝達を阻害し、ＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか、或いは関連する疾患及び障害を治療するのに有用である。また、本発明の抗体は内皮細胞の細胞増殖を阻害するのにも有用である。
【０００９】
[0009]本発明は、それを必要とする対象におけるＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
[0010]本発明は、疾患及び／又は障害に罹患している対象におけるＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか又は関連する疾患及び／又は障害を治療する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
[0011]本発明は、腫瘍に罹患している対象における腫瘍を治療する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
[0012]本発明は、それを必要とする対象における内皮細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
[0013]本発明は、試料のヒト血管内皮増殖因子受容体を検出する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントと前記試料を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１４】
[0014]本発明は、以下の項目において詳細に説明されている。本発明の他の特徴、目的及び有利な点は、詳細な説明及び特許請求の範囲中に見いだすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0015]本発明の抗体のマウスＶＥＧＦＲ−２、ヒトＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−３に対する結合親和性アッセイのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図２】[0016]本発明の抗体の結合ドメインマッピング（ドメイン１〜３及びドメイン４〜７）のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図３】[0017]本発明の抗体の結合ドメインマッピングのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図４】[0018]本発明の抗体のエピトープマッピングのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図５】[0019]本発明の抗体のＨＵＶＥＣ増殖阻害アッセイを示す図である。
【図６】[0020]フローサイトメトリーによる本発明の抗体のＨＵＶＥＣへの抗体内部移行の結果を示す図である。
【図７】[0021]DeltaVision Microscopy ImagingSystemで観察された抗体内部移行の結果を示す図である。
【図８】[0022]本発明による抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図９】[0023]本発明による抗体−薬物複合体の電気泳動分析の結果を示す図である。
【図１０】[0024]本発明によるＡＤＣのＨＵＶＥＣへのフローサイトメトリーによる抗体内部移行の結果を示す図である。
【図１１】[0025]本発明のＡＤＣのＨＵＶＥＣ増殖阻害アッセイを示す図である。
【図１２】[0026]本発明によるキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）のフローサイトメトリーによる定量アッセイを示す図である。
【図１３】[0027]本発明によるキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞毒性アッセイを示す図である。
【図１４】[0028]本発明による抗体を放射性同位体で標識する効率を示す図である。
【図１５】[0029]本発明による放射標識抗体によるＨＴ−２９異種移植マウスのＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴにおける腫瘍検出の結果を示す図である。
【図１６】[0030]ヒト化抗体、マウス抗体、及びヒト抗体のＶＬセグメントのアラインメントを示す図である。Ｍ：３２２Ａ６；Ｈｄ：Ｈｕ３２２Ｂ１ＨｄＨ。
【図１７】[0031]ヒト化抗体、マウス抗体、及びヒト抗体のＶＨセグメントのアラインメントを示す図である。Ｍ：３２２Ａ６；Ｈｕ：ヒトテンプレートＩＧＨＶ１−４６＊０１Ｆ；ＨｕＢ１：Ｈｕ３２２Ｂ１ＨｄＨ。
【００１６】
［発明の詳細な説明］
[0032]本発明は、ヒト血管内皮増殖因子受容体２又はヒト血管内皮増殖因子受容体２フラグメントに結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００１７】
[0033]特に、本発明による抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒト血管内皮増殖因子受容体２のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する、ここで、ヒト血管内皮増殖因子受容体２は配列番号１のアミノ酸配列を有し、エピトープは以下を含む：配列番号１の６０６位のロイシン残基、６０７位のアスパラギン酸残基、６４７位のアルギニン残基、６４８位のリジン残基、及び６４９位のトレオニン残基、又は配列番号１の７１１位のセリン残基、７１６位のリジン残基、７１７位のアスパラギン酸残基、及び７２５位及び７２６位のアルギニン残基。
【００１８】
[0034]本発明による抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体）であってもよく、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、必要に応じて機能性に影響するように改変されていてもよい。
【００１９】
[0035]本発明による抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒトＶＥＧＦＲ−２に特異的に結合する。ＶＥＧＦＲ−２は、ＫＤＲ又はｆｌｋ−１としても知られるが、血管内皮増殖因子の受容体であり、そのリガンドに結合する際に二量体を形成し、二量体を相互リン酸化することにより活性化される。ＶＥＧＦＲ−２は、細胞外領域に位置している７つのＩｇ様ドメインを含み、ドメイン１〜３はリガンドとの結合に関与し、ドメイン４〜７は二量体化、リン酸化及び下流シグナル伝達に関与する。本発明による抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外領域のドメイン６〜７に結合することが好ましい。
【００２０】
[0036]本発明は、単量体又は二量体ＶＥＧＦＲ−２分子と高親和性で結合する抗ＶＥＧＦＲ−２抗体及びその抗原結合性フラグメントを包含する。
【００２１】
[0037]本発明の好ましい一実施形態において、ＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外領域のドメイン６は、配列番号２のアミノ酸配列を有する、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外領域のドメイン７は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
[0038]当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ又は複数のアミノ酸に特異的に結合する」かどうかを判定することができる。例示的な技術としては、例えば、Antibodies,Harlow and Lane（Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harb., N.Y.）に記載されているような慣用のクロス・ブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析（Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463）、及びペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ除去、エピトープ抽出、化学修飾などの方法を使用することができる（Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496）。抗体が特異的に結合するポリペプチド内のアミノ酸の同定に使用することができる別の方法は、マススペクトルメトリーによって検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質の重水素標識、その後の重水素標識タンパク質への抗体の結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体（重水素標識されたままである）によって保護されている残基を除いたすべての残基で水素−重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及びマススペクトルメトリー分析に供することにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識した残基が明らかになる。例えば、Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2): 252-59、Engen及びSmith(2001) Anal. Chem. 73: 256A-265Aを参照されたい。
【００２３】
[0039]本発明の好ましい一実施形態において、ＶＥＧＦＲ−２のエピトープは、配列番号１の６０６位のロイシン残基、６０７位のアスパラギン酸残基、６４７位のアルギニン残基、６４８位のリジン残基、及び６４９位のトレオニン残基を含む。
【００２４】
[0040]本発明の別の好ましい一実施形態において、ＶＥＧＦＲ−２のエピトープは、配列番号１の７１１位のセリン残基、７１６位のリジン残基、７１７位のアスパラギン酸残基、並びに７２５位及び７２６位のアルギニン残基を含む。
【００２５】
[0041]本発明は、同じエピトープに特異的に結合する抗ＶＥＧＦＲ抗体をさらに含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかとＶＥＧＦＲ−２への結合に対して競合する抗ＶＥＧＦＲ−２抗体も含む。
【００２６】
[0042]抗体が基準の抗ＶＥＧＦＲ−２抗体と同じエピトープに特異的に結合するかどうか、又は結合に対して競合するかどうかは、当技術分野で公知の慣用の方法を使用することにより容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の基準抗ＶＥＧＦＲ−２抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、基準抗体はＶＥＧＦＲ−２タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメイン又は細胞表面で発現されたＶＥＧＦＲ−２の可溶性部分）に結合させる。次に、試験抗体がＶＥＧＦＲ−２分子に結合する能力が評価される。試験抗体が基準抗ＶＥＧＦＲ−２抗体との飽和結合後にＶＥＧＦＲ−２に結合することができる場合、試験抗体は基準抗ＶＥＧＦＲ−２抗体とは異なるエピトープに結合すると結論され得る。一方、試験抗体が基準抗ＶＥＧＦＲ−２抗体との飽和結合後にＶＥＧＦＲ−２分子に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の基準抗ＶＥＧＦＲ−２抗体が結合しているエピトープと同じエピトープに結合し得る。次いで、さらなる慣用の実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠如が実際に基準抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、又は立体上の遮断（若しくは別の現象）が観察された結合の欠如に関与するものであるかどうかを確認するために行なうことができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、又は当技術分野で利用可能な他のいずれかの定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、競合的結合アッセイで測定した場合に１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍過剰の１つの抗体が他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、さらには９９％まで阻害する場合、２つの抗体は同じ（又は重複）エピトープに結合する。或いは、１つの抗体の結合を低減又は除去する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は除去する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると考えられる。１つの抗体の結合を低減又は除去するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の抗体の結合を低減又は除去する場合、２つの抗体は「重複エピトープ」を有するものと考えられる。
【００２７】
[0043]抗体が基準抗ＶＥＧＦＲ−２抗体との結合に対して競合するかどうかを判定するために、上記の結合方法は２方向から実施される。第１の方向では、基準抗体を飽和条件下でＶＥＧＦＲ−２タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメイン又は細胞表面発現ＶＥＧＦＲ−２の可溶性部分）に結合させ、その後、試験抗体のＶＥＧＦＲ−２分子への結合が評価される。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でＶＥＧＦＲ−２分子に結合させ、その後、基準抗体のＶＥＧＦＲ−２分子への結合が評価される。両方向において、第１の（飽和）抗体だけがＶＥＧＦＲ−２分子と結合することができる場合、試験抗体と基準抗体はＶＥＧＦＲ−２への結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解されるように、基準抗体との結合に対して競合する抗体は、基準抗体と同じエピトープに必ずしも結合する必要はないが、重複エピトープ又は隣接エピトープに結合することにより基準抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【００２８】
[0044]本明細書で使用される場合の用語「抗体」とは、特定の抗原（例えばＶＥＧＦＲ−２）に特異的に結合又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、並びにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと簡略化）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと簡略化）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに再分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本発明の異なる実施形態において、抗ＶＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってもよく、又は天然若しくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００２９】
[0045]本明細書において使用される場合の用語「抗体」はまた、完全な抗体分子の抗原結合性フラグメントも含む。本明細書において使用される場合の抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然の、酵素によって取得することができる、合成の又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を包含する。抗体の抗原結合性フラグメントは、任意の適切な標準的技術、例えばタンパク質分解消化など、又は抗体の可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術を使用して、例えば、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知であり、及び／又は、例えば販売元、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）などから容易に入手することができるか、又は合成することができる。ＤＮＡをシークエンシングし、化学的に又は分子生物学技術を使用して操作して、例えば、１つ又はそれ以上の可変ドメイン及び／又は定常ドメインを適切な形状に整列させるため、又はコドンを導入するため、システイン残基を作製するため、アミノ酸を改変、付加、若しくは欠失させることができる。
【００３０】
[0046]抗原結合性フラグメントの非制限的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、又は束縛されたＦＲ３−ＣＤＲ４−ＦＲ４ペプチド、が挙げられる。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異性抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価のナノボディ、二価のナノボディなど）、低分子モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどもまた、本明細書において使用される場合の「抗原結合断片」という表現内に包含される。
【００３１】
[0047]抗体の抗原結合性フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであってもよく、一般的に、１つ又は複数のフレームワーク配列に隣接するか、又はインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと会合しているＶＨドメインを有する抗原結合性フラグメントにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインは、互いに対して任意の適切な配置で配置され得る。例えば、可変領域は二量体であってもよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＬ二量体を含有していてもよい。或いは、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体のＶＨ又はＶＬドメインを含有していてもよい。
【００３２】
[0048]ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合されている少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合性フラグメント内に見いだされ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非制限的な例示的構成としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ、が挙げられる。上で列挙した例示的構成のいずれかを含む可変ドメイン及び定常ドメインの任意の構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、又は完全な若しくは部分的なヒンジ若しくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間で可動性又は半可動性連結が生じる、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個又はそれ以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、互いに、及び／又は１つ若しくは複数の一価のＶＨ若しくはＶＬドメインに非共有結合により会合した（例えば、ジスルフィド結合によって）、上で列挙した可変ドメイン及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
【００３３】
[0049]完全な抗体分子と同様に、抗原結合性フラグメントは、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合性フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、異なる抗原に、又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示されている例示的な二重特異性抗体形式を含む任意の多重特異性抗体形式は、当技術分野で利用可能な慣用の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントの状況で使用するために適合され得る。
【００３４】
[0050]本発明による抗体又はその抗原結合性フラグメントは、哺乳動物抗体であることが好ましい。
【００３５】
[0051]用語「哺乳動物抗体」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来した可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明の哺乳動物抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に、哺乳動物生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異、又はインビボでの体細胞突然変異により導入された変異）を含んでいてもよい。
【００３６】
[0052]用語「組換え哺乳動物抗体」は、本明細書において使用される場合、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させる抗体（以下にさらに説明する）、組換えコンビナトリアル哺乳動物抗体ライブラリーから単離された抗体（以下にさらに説明する）、哺乳動物免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、又は哺乳動物免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、若しくは単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製、若しくは単離された全ての哺乳動物抗体を含むことが意図される。そのような組換え哺乳動物抗体は、哺乳動物生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来した可変及び定常領域を有する。しかし、特定の実施形態において、そのような組換え哺乳動物抗体は、インビトロ変異誘発（又はヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連しているが、インビボでの哺乳動物抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然には存在しない可能性がある配列である。
【００３７】
[0053]哺乳動物抗体、例えばヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する２つの形態で存在する可能性がある。１つの形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合した軽鎖及び重鎖から構成される約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、アフィニティー精製の後でさえ、分離するのが非常に困難であった。
【００３８】
[0054]本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦＲ−２抗体は、抗体が由来した対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域に１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって、容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されているいずれかのアミノ酸配列に由来する抗体及びその抗原結合性フラグメントを含み、ここで１つ又は複数のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又は複数のアミノ酸は、抗体が由来した生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、又は別の哺乳動物生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、又は対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異される（このような配列の変化は、本明細書においては総称して「生殖細胞系列変異」と呼ぶ）。当業者は、本明細書に開示されている重鎖及び軽鎖可変領域配列から開始して、１つ若しくは複数の個々の生殖細胞系列変異又はそれらの組合せを含む多くの抗体及び抗原結合性フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のすべては、抗体が由来した元の生殖細胞系列配列内に見いだされる残基へと復帰変異される。他の実施形態において、特定の残基だけが、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内若しくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見いだされる変異残基だけが、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内に見いだされる変異残基だけが、元の生殖細胞系配列に復帰変異される。他の実施形態において、１つ又は複数のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基（複数可）は、異なる生殖細胞系配列（すなわち、抗体が元々由来した生殖細胞系配列とは異なる生殖細胞系配列）の対応する残基（複数可）へと変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系変異の任意の組合せを含有していてもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系配列の対応する残基へと変異され、一方、元の生殖細胞系配列とは異なる特定の他の残基は維持されるか、又は異なる生殖細胞系配列の対応する残基へと変異される。一度得られたならば、１つ又は複数の生殖細胞系列変異を含有する抗体及び抗原結合性フラグメントは、１つ又は複数の所望の特性、例えば、改善された結合特異性、増加した結合親和性、（場合に応じて）改善された若しくは増強されたアンタゴニスト性又はアゴニスト性生物学的特性、減少された免疫原性などの１つ又は複数について容易に試験することができる。この一般的な手段で得られた抗体及び抗原結合性フラグメントは、本発明に包含される。
【００３９】
[0055]本発明はまた、１つ又は複数の保存的置換を有する本明細書に開示されているＶＨ、ＶＬ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗−ＶＥＧＦＲ−２抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されているＶＨ、ＶＬ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下などの保存的アミノ酸置換を含むＶＨ、ＶＬ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗−ＶＥＧＦＲ−２抗体を包含する。
【００４０】
[0056]用語の「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」とは、核酸又はその断片に言及する場合、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を用いて別の核酸（又はその相補鎖）と共に最適に整列させた場合に、任意の周知の配列同一性アルゴリズム、例えば後述するようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰなどによって測定した際、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。基準核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合において、基準核酸分子によってコードされているポリペプチドと同一の又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【００４１】
[0057]ポリペプチドに適用される場合、用語の「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」とは、２つのペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ加重を使用してＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適に整列させた場合に、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換がある点が異なることが好ましい。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されることである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なっている場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を修正するために上方に調整され得る。この調整を実施する手段は、当業者に周知である。類似の化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに、７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。或いは、保存的置き換えは、参照により本明細書に組み込まれる、Gonnetら (1992) Science 256: 1443-1445に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
【００４２】
[0058]配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドに対する配列類似性は、通常、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列のマッチングを行う。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧＡＰ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有し、これをデフォルトパラメーターと共に使用し、密接に関係したポリペプチド間の、例えば、異なる生物の種由来の相同なポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異体との間の配列相同性又は配列同一性を決定することができる。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである、デフォルト又は推奨パラメーターを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Pearson(2000)上掲）。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410及びAltschulら (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
[0059]本発明の好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域の相補性決定領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、重鎖可変領域の相補性決定領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み、
ＣＤＲＨ１領域は、配列番号４のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＨ２領域は、配列番号５のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＨ３領域は、配列番号６のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＬ１領域は、配列番号７のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＬ２領域は、配列番号８のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＬ３領域は、配列番号９のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００４４】
[0060]本発明の別の好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域の相補性決定領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、重鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変領域の相補性決定領域はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み、
ＣＤＲＨ１領域は、配列番号１０のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＨ２領域は、配列番号１１のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＨ３領域は、配列番号１２のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＬ１領域は、配列番号１３のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＬ２領域は、配列番号１４のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含み、
ＣＤＲＬ３領域は、配列番号１５のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００４５】
[0061]本発明の好ましい一実施形態において、抗体３２２Ａ６又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号１７のアミノ酸配列又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は、配列番号１６の核酸配列によってコードされていることが好ましい。３２２Ａ６又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、配列番号１８の核酸配列によりコードされていることが好ましい。
【００４６】
[0062]本発明の好ましい一実施形態において、抗体１２Ａ６又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号２１のアミノ酸配列又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は、配列番号２０の核酸配列によりコードされていることが好ましい。１２Ａ６又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号２３のアミノ酸配列又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、配列番号２２の核酸配列によりコードされていることが好ましい。
【００４７】
[0063]別の態様において、本発明による抗体は、好ましくはヒト化抗体である。「ヒト化抗体」は、ある種由来の抗体、例えばげっ歯動物抗体由来のＣＤＲが、げっ歯動物抗体の重可変鎖及び軽可変鎖から、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含むヒト重可変ドメイン及び軽可変ドメインに移される、組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。
【００４８】
[0064]本発明によるヒト化抗体の結合親和性を改善するため、ヒトフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸残基は、ＣＤＲの種、例えばげっ歯動物の対応するアミノ酸残基に置き換えられる。ヒト化抗体Ｈｕ３２２Ｂ１ＨｄＨ又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。重鎖可変領域は、配列番号２４の核酸配列によりコードされていることが好ましい。Ｈｕ３２２Ｂ１ＨｄＨ又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号２７のアミノ酸配列又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、配列番号２６の核酸配列によりコードされていることが好ましい。
【００４９】
[0065]本発明による抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００５０】
[0066]本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってよく、又は２つ以上の標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合性ドメインを含有していてもよい。本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−２抗体は、別の機能的分子、例えば別のペプチド若しくはタンパク質に連結され得るか、又はそれと同時発現され得る。例えば、抗体又はそのフラグメントは、１つ又は複数の他の分子的実体、例えば別の抗体若しくは抗体フラグメントに、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、又は他の方法で）機能的に連結され、第２の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトＶＥＧＦＲ−２又はそのフラグメントに特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的には特異的であるか、又は治療部分にコンジュゲートされている、二重特異性抗体を包含する。
【００５１】
[0067]本発明の１つの好ましい実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは治療薬とコンジュゲートされている。
【００５２】
[0068]本明細書で使用される場合、「治療薬」とは、細胞増殖阻害剤若しくは細胞毒性剤、又は対応する放射性同位元素を含む同位体キレート剤を表す。細胞増殖阻害剤又は細胞毒性剤の例としては、限定するものではないが、代謝拮抗剤（例、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、カペシチビン（capecitibine）、アザチオプリン、シトシンメトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、又はペメトレキセド）、アルキル化剤（例：メルファラン（cmelphalan）、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、ジブロモマンニトール、テトラニトレート、プロカルバジン、アルトレタミン、ミトゾロミド、又はテモゾロミド）、アルキル化様薬剤（alkylating-like agents）（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、又はトリプラチン）、ＤＮＡ副溝アルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５などのデュオカルマイシン、及び任意のその類似体又は誘導体、ピロロベンゾジアザペン、又は任意のその類似体又は誘導体）、アントラサイクリン（例：ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、又はバルルビシン）、抗生物質（例、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ストレプトゾトシン、グラミシジンＤ、マイトマイシン（例えばマイトマイシンＣ）、カリチアマイシン、有糸分裂阻害剤（例えば、マイタンシノイド（ＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４など）、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む）、ドラスタチン、クリプトフィシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、又は新規タキサン）、ツブリシン及びコルヒチンを含む）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、又はミトキサントロン）、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、キダミド、パノビノスタット、又はベリノスタット）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ペプチジルボロン酸）、並びにＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２若しくは２１３、Ｐ３２などの放射性同位元素、及びＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体が挙げられる。同位体キレート剤の例としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタアセテート（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−テトラアセテート（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラキ���（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＴＨＰ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ヘキサアセテート（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−テトラキス（メチレンホスホナート）（ＤＯＴＰ）、及びメルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）が挙げられる。
【００５３】
[0069]本発明の好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、原核生物及び真核生物の発現系を含む任意の数の発現系を使用して産生することができる。いくつかの実施形態において、発現系は、哺乳動物細胞発現、例えばハイブリドーマ、又はＣＨＯ細胞発現系である。多くのそのような系は、販売元から広く市販されている。抗体がＶＨ及びＶＬ領域の両方を含む実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、単一のベクターを使用して、例えば、ジシストロン性発現ユニットで、又は様々なプロモータの制御下で発現させることができる。他の実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、別々のベクターを使用して発現させることができる。本明細書に記載されているＶＨ又はＶＬ領域は、任意選択で、Ｎ末端にメチオニンを含んでいてもよい。
【００５４】
[0070]対象の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子はハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーもまた、ハイブリドーマ又は形質細胞から作製することができる。重鎖及び軽鎖遺伝子産物のランダムな組合せは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Kuby, Immunology（3.sup.rd ed.1997）を参照されたい）。
【００５５】
[0071]一本鎖抗体又は組換え抗体の産生に関する技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適合させることができる。また、トランスジェニックマウス又は他の生物、例えば他の哺乳動物を使用して、ヒト化抗体又はヒト抗体を発現させることができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、Marksら, Bio/Technology 10: 779-783(1992)、Lonbergら, Nature 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature 368: 812-13 (1994)、Fishwildら, Nature Biotechnology 14:845-51(1996)、Neuberger,Nature Biotechnology 14: 826(1996)及びLonberg&Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93(1995)を参照されたい）。
【００５６】
[0072]本発明の好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞の表面で発現される。細胞がＴ細胞であることがより好ましい。
【００５７】
[0073]本発明は、本発明の抗ＶＥＧＦＲ−２抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、改善された移行、送達、耐性などを提供する適切な担体、賦形剤及び他の薬剤と共に製剤化される。多くの適当な製剤は、すべての薬剤師に知られている処方集：Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton,Paにおいて見いだすことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性又は陰イオン性）を含有する小胞（例えば、LIPOFECTIN（商標）Life Technologies, Carlsbad, Calif.）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。また、Powellら「Compendium of excipients forparenteral formulations」 PDA(1998) J Pharm Sci Technol52: 238-311も参照されたい。
【００５８】
[0074]患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には、体重又は体表面積によって計算される。本発明の抗体が成人患者におけるＶＥＧＦＲ−２活性に関連する状態又は疾患の治療に使用される場合、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内投与することが有利であり得る。状態の重症度に応じて、頻度及び治療期間を調整することができる。抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を投与するための有効な投与量及びスケジュールは、経験的に決定することができる。例えば、患者の進行を定期的な評価によってモニタリングし、それにしたがって用量を調整することができる。さらに、用量の種間スケーリングは当技術分野で周知の方法を使用して実施することができる（例えば、Mordentiら, 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351）。
【００５９】
[0075]様々な送達系、例えば、リポソームカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスの発現が可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが公知であり、それらを使用して本発明の医薬組成物を投与することができる（例えば、Wuら, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432を参照されたい）。導入の方法としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられる。組成物は、任意の都合のよい経路によって、例えば、点滴又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜の内壁（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、また他の生物活性のある薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的又は局所的であり得る。
【００６０】
[0076]本発明の医薬組成物は、標準の針及び注射器を用いて皮下又は静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関しては、ペン状送達器具（pen delivery device）が本発明の医薬組成物の送達において容易に適用される。そのようなペン状送達器具は、再使用可能又は使い捨てが可能である。再使用可能なペン状送達器具は、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内のすべての医薬組成物が投与され、カートリッジが空になったならば、空のカートリッジは速やかに廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと置き換えることができる。その後、ペン状送達器具は、再使用することができる。使い捨てのペン状送達器具で、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てのペン状送達器具は、器具内の貯蔵部に保持される医薬組成物で予め充填されている。貯蔵部の医薬組成物が空になると、器具全体が廃棄される。
【００６１】
[0077]ある特定の状況においては、医薬組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる（Langer、上掲；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed.Eng. 14: 201を参照されたい）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる、MedicalApplications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), 1974, CRC Pres., BocaRaton, Fla.を参照されたい。さらに別の実施形態において、徐放系は、組成物の標的の近位に置くことができ、それにより、全身用量の一部分のみが必要とされる（例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release、上掲、vol.2, 115-138ページを参照されたい）。他の制御系は、Langer, 1990,Science 249: 1527-1533による総説で議論されている。
【００６２】
[0078]注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴注入などのための投与剤形を包含し得る。これらの注射可能な調製物は、公知の方法により調製することができる。例えば、注射可能な調製物は、例えば、上記の抗体又はその塩を注射用に通常使用される滅菌水性媒体又は油性媒体に溶解、懸濁、又は乳化させることによって調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶液などがあり、これらは、適切な溶解剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などと組み合わせて使用することができる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、これらは、溶解剤、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと組み合わせて使用することができる。このように調製された注射剤は、適切なアンプルに充填されることが好ましい。
【００６３】
[0079]上記の経口使用又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量の投与剤形で調製することが有利である。そのような単位用量の投与剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有されている前述の抗体の量は、一般には、単位用量で、投与剤形当たり約５〜約５００ｍｇである、特に注射剤の形態においては、前述の抗体が約５〜約１００ｍｇで、他の投与剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【００６４】
[0080]本発明による抗体は、ＶＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を阻害し、ＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達により引き起こされるか、或いは関連する疾患及び障害を治療するのに有用である。本発明の抗体はまた、内皮細胞の細胞増殖を阻害するのにも有用である。
【００６５】
[0081]本発明は、それを必要とする対象におけるＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６６】
[0082]本発明は、疾患及び／又は障害に罹患している対象におけるＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか、或いは関連する疾患及び／又は障害を治療する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６７】
[0083]本発明は、腫瘍に罹患している対象における腫瘍を治療する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６８】
[0084]本発明は、それを必要とする対象における内皮細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６９】
[0085]本明細書で使用される場合の用語「治療する」及び「治療」とは、重篤度及び／若しくは頻度の低下を達成し、病状及び／若しくはそれらの根本的な原因を除去し、並びに／又は損傷の改善若しくは修復を促進するように、有害な状態、障害、又は疾患に罹患している臨床的に徴候性のある個体に対して薬剤又は製剤を投与することを意味する。用語の「予防する」及び「予防」とは、特定の有害な状態、障害、又は疾患にかかりやすい臨床的に無徴候性の個人に対して薬剤又は組成物を投与することを意味し、したがって、症状及び／又はそれらの根本的な原因の発生の予防に関係する。当業者によって理解されるように、予防又は予防するとは状態の絶対的な（完全な）阻止又は回避を達成する必要はない。むしろ、予防は、予防しようとする疾患又は状態の実質的な（例えば、約５０％を超える）低下又は回避を達成し得る。本明細書で明示的又は意味合い的に別段の指示がない限り、用語の「治療」（又は「治療する」）が予防の可能性に言及することなく使用される場合、同様に予防が包含されることが意図される。
【００７０】
[0086]「がん」、「腫瘍」、「悪性転換化（transformed）」などの用語は、前がん性、新生物性、悪性転換化、及びがん性の細胞を包含し、固形腫瘍又は非固形がんを意味し得る（例えば、Edgeら AJCC Cancer Staging Manual(7th ed. 2009)、Cibas and Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinicalcorrelates (3rd ed.2009)を参照されたい）。がんは、良性及び悪性新生物（異常増殖）の両方を包含する。「悪性転換」とは、自然発生的又は誘導された表現型の変化、例えば、細胞の不死化、形態学的変化、異常細胞増殖、接触抑制及び足場の減少、及び／又は悪性腫瘍を意味する（Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rded. 1994)を参照されたい）。悪性転換は、悪性転換ウイルスによる感染及び新しいゲノムＤＮＡの組み込み、又は外因性ＤＮＡの取り込みから発生する可能性があるが、自然発生的に又は発がん物質への暴露後に発生する可能性もある。
【００７１】
[0087]本発明の抗体は、とりわけ、ＶＥＧＦＲ−２の発現又は活性に関連するか又は媒介される任意の疾患又は障害の治療、予防及び／又は回復に有用であり、或いはＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−２リガンドとの間の相互作用を遮断することにより、又は他の場合にはＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達を阻害することにより、及び／又は受容体内部移行を促進することにより、及び／又は細胞表面受容体の数を低減することにより治療可能である。例えば、本発明の抗体及び抗原結合性フラグメントは、高レベルのＶＥＧＦＲ−２を発現する腫瘍の治療に有用である。本発明の抗体及び抗原結合性フラグメントは、例えば、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、胃腸管、男性及び女性の生殖器官、筋肉、骨、皮膚及び付属器官、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、並びに眼などの特別な感覚器官において発生する原発性及び／又は転移性腫瘍を治療するために使用することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体及び抗原結合性フラグメントは、以下のがんのうちの１つ又は複数を治療するために使用される：腎細胞癌、膵臓癌、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（例、ＶＥＧＦＲ−２依存性非小細胞肺がん）、滑膜肉腫、甲状腺がん、又は黒色腫。
【００７２】
[0088]本発明は、試料中のヒト血管内皮増殖因子受容体を検出する方法であって、前記試料を上記の抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させるステップを含む方法を提供する。
【００７３】
[0089]また本発明の抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を使用して、例えば診断目的のために、試料のＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−２発現細胞を検出及び／又は測定することもできる。例えば、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体又はそのフラグメントを使用して、ＶＥＧＦＲ−２の異常発現（例えば、過剰発現、発現低下、発現欠如など）を特徴とする状態又は疾患を診断することができる。ＶＥＧＦＲ−２についての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から取得した試料を本発明の抗ＶＥＧＦＲ−２抗体と接触させることを含み得るが、ここで抗ＶＥＧＦＲ−２抗体は検出可能な標識又はレポーター分子で標識されている。或いは、非標識抗ＶＥＧＦＲ−２抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断用途に使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ、蛍光又は化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、又はローダミン、又は酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼであってよい。試料のＶＥＧＦＲ−２を検出又は測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイとしては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００７４】
[0090]本発明によるＶＥＧＦＲ−２診断アッセイにおいて使用することができる試料としては、正常状態又は病的状態下で、検出可能な量のＶＥＧＦＲ−２タンパク質又はそのフラグメントを含有する患者から取得可能な任意の組織又は体液試料が挙げられる。一般的には、健康な患者（例えば、異常なＶＥＧＦＲ−２レベル又は活性を伴う疾患又は状態に罹患していない患者）から取得した特定試料のＶＥＧＦＲ−２のレベルが、最初に、ＶＥＧＦＲ−２のベースライン又は基準のレベルを確立するために測定される。次いで、ＶＥＧＦＲ−２のこのベースラインレベルを、ＶＥＧＦＲ−２関連疾患又は状態を有することが疑われる個体から取得した試料で測定されたＶＥＧＦＲ−２のレベルと比較することができる。
【００７５】
[0091]以下の実施例は、本発明を実施する際、当業者に対する一助となるよう提供される。
【実施例】
【００７６】
ｓｃＦｖ／Ｆａｂ抗体ライブラリーの構築
[0092]配列番号１の配列を含有する融合タンパク質のＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ−Ｈｉｓを抗原として使用し、マウスを２週間毎に６回免疫した。免疫後、マウスを安楽死させ、脾臓を得た。ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬを含有する抗体フラグメントを構築するためのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ手順で、脾臓の全ＲＮＡを抽出し、逆転写した。抗体フラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応でｓｃＦｖフラグメントへとアセンブルし、ｓｃＦｖライブラリーが構築された。まず、第１に、Ｆａｂライブラリーを、ＶＬ−ＣＬライブラリーを使用してＶＬ−ＣＬフラグメントからプラスミドへ構築した。次に、ＶＨ−ＣＨ１フラグメントを、ＶＬ−ＣＬフラグメント含有のプラスミドに構築して、最終的なＦａｂライブラリーを生成した。
【００７７】
バイオパニング用のｓｃＦｖ／Ｆａｂファージの調製
[0093]得られたライブラリーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％グルコースを含有する２ｘＹＴ培地（２ＹＴＡＧ）に接種し、３７℃で振盪しながら、６００ｎｍのＯＤが０．５に達するまでインキュベートした。培養物にヘルパーファージを感染させ、次いで、振盪せずに３７℃の水浴で３０分間培養した。細胞を回収し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘＹＴ培地（２ＹＴＡＫ）に懸濁し、振盪しながら３０℃で一晩さらにインキュベートした。培養物の上清を回収し、１／５容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）と混合し、４℃で１時間以上静置した。遠心分離後、ペレットを回収し、４０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、再度遠心して上清を回収した。
【００７８】
ＥＬＩＳＡ法を使用した選択
[0094]ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を１つのウェル当たり１μｇ／１００μＬの抗原でコーティングし、ｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液に４℃で一晩静置した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１つのウェル当たり３００μＬのＰＢＳ−５％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で３７℃にて１．５時間遮断した。ＰＢＳで３回洗浄した後、５％ＭＰＢＳ中のファージ１００μＬをｈｉｓ−タグを含有する融合タンパク質と共に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で１０回、ＰＢＳで１０回洗浄した後、１００μＬの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加することによりファージを溶出させ、３７℃で３０分間反応させた。１００μＬの溶出ファージを５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で中和した。指数関数的な増殖段階で１０ｍｌのＴＧ１を１５０μｌの溶出ファージに添加した。培養物は、感染のために振盪することなく３７℃で３０分間インキュベートした。感染したＴＧ１細菌を遠心して回収し、次いで２ｘＹＴに懸濁し、２ｘＹＴ−ＡＧプレートに播種した。細菌を３０℃で一晩インキュベートした。
【００７９】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ法を使用した選択
[0095]プレクリーンファージステップにおいて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１ｍｌのＰＢＳで３回予備洗浄し、ＰＢＳに懸濁した。次いで、０．３ｍＬのファージを０．５ｍｌの５％ＭＰＢＳ、ｈｉｓ−タグを含む融合タンパク質と混合し、ローテーターで３０分間インキュベートした後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去した。
【００８０】
[0096]Ｄｙｎａｂｅａｄｓをビオチン標識したＶＥＧＦＲ２−Ｈｉｓと９０分間反応させた。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、５％ＭＰＢＳに懸濁し、９０分間インキュベートし、次いで１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。プレクリーンファージを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを含むＶＥＧＦＲ２−Ｈｉｓに添加し、さらに３０分間ローテーターでインキュベートした。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１ｍｌの０．０５％ＰＢＳＴ、０．２％ＭＰＢＳ、及びＰＢＳで洗浄した。結合したファージを１ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡで溶出した。速やかな中和のため、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を溶出ファージに添加した。次いで、指数関数的に増殖するＴＧ１の培養物６ｍｌを取り、ＴＥＡ溶出ファージを添加した。培養物を、振盪することなく３０分間３７℃（水浴）でインキュベートした。感染したＴＧ１細菌をプールし、ペレットを回収するため遠心した。ペレット化細菌を１ｍｌの２ｘＹＴに懸濁し、大きな２ｘＹＴ−ＡＧプレートに播種した。細菌を３０℃で一晩インキュベートした。
【００８１】
次ラウンドのファージの調製
[0097]５〜６ｍｌの２ｘＹＴ、１５％グリセロールを細菌プレートに添加し、コロニーをガラス製スプレッダーでほぐした。次いで、１０μｌの掻き取った細菌を１０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧに添加し、細菌を３７℃で振盪しながら６００ｎｍのＯＤが０．５に達するまで増殖させた。ヘルパーファージを１：２０の割合で添加することにより、１０ｍｌの培養物にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、感染させた培養物を振盪することなく３７℃の水浴で３０分間インキュベートした。培養物を遠心してペレットを回収し、ペレットを５０ｍＬの２ｘＹＴ−ＡＫで懸濁し、次いで３０℃で一晩培養した。さらに、４０ｍｌの一晩培養物を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を回収し、１／５容量（８ｍｌ）のＰＥＧ／ＮａＣｌを上清に添加した。ウェルを混合し、４℃で１時間以上静置した。混合物を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心しペレットを回収し、２ｍｌのＰＢＳに懸濁した。懸濁液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、残っている細菌の細片の大部分を除去した。
【００８２】
ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦＲ２陽性ファージのスクリーニング
[0098]プレートの個々のコロニーを２００μｌの２ｘＹＴ−ＡＧ  ９６ウェルプレートに接種し、振盪しながら３７℃で一晩増殖させ、次いで３７℃で２時間振盪するために１つのウェル当たり２００μｌの２ｘＹＴ−ＡＧを含有する第２の９６ウェルプレートに５０μｌ移した。次いで、１０９ｐｆｕ  Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを含む５０μｌの２ｘＹＴ−ＡＧを第２のプレートのそれぞれのウェルに加えた。混合物を３０分間３７℃で静置し、次いで１時間３７℃で振盪した。４０００ｒｐｍで３０分間遠心した後、上清を吸引除去し、ペレットを３００μｌの２ｘＹＴ−ＡＫに懸濁し、３０℃で一晩振盪しながら増殖させた。培養物を４０００ｒｐｍで３０分間遠心し培養上清１００μｌをファージＥＬＩＳＡ用に得た。
【００８３】
[0099]ＥＬＩＳＡプレートを、１つのウェル当たり１μｇ／ｍＬのタンパク質抗原でコーティングし、次いでＰＢＳで３回すすぎ、１つのウェル当たり３００μｌの２％ＭＰＢＳで２時間３７℃遮断した。さらにＰＢＳで３回すすいだ後、上記で詳述した１００μｌのファージ培養上清を添加し、９０分間３７℃でインキュベートした。ファージ溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで６回洗浄した後、５％のＭＰＢＳ中のＨＲＰ−抗Ｍ１３抗体の適切な希釈液を添加した。混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで６回洗浄した。ウェルを基質溶液（ＴＭＢ）で展開し、５０μｌの１Ｍ硫酸を添加することにより反応を停止させた。色が黄色に変化し、６５０ｎｍ及び４５０ｎｍのＯＤをアッセイした。
【００８４】
[0100]スクリーニング後、合計３７９のクローンと６６種類のＣＤＲＨ３が同定される。
【００８５】
完全長抗体の発現
[0101]抗ＶＥＧＦＲ２抗体のＶＨ及びＶＬ鎖をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入した。Free-style 293細胞に構築したベクターをトランスフェクトした。３０ｍｌ容量の懸濁されたFreeStyle（商標）293細胞にトランスフェクトするためには以下の方法に従う。トランスフェクションの約２４時間前に、FreeStyle（商標）293細胞を２×１０６細胞／ｍｌで１５ｍｌに通す。フラスコ（複数可）を３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーターに置く。次いで、３７．５μｇのプラスミドＤＮＡを１．５ｍｌの滅菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌに希釈し１．５ｍｌの総量とする。別のチューブにおいて、１．５ｍｌの滅菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌで３７．５μＬのＰＥＩ（２．０ｍｇ／ｍｌ）を希釈する。ＤＮＡ及びＰＥＩ溶液を室温で５分間静置し、チューブを反転させて穏やかに混合し、室温で約１０〜２０分間静置する。ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物をＦ２９３細胞に直ちに添加し、トランスフェクションした細胞を、４時間３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーターで１３５〜１５０ｒｐｍにて回転するオービタルシェーカープラットフォームでインキュベートする。次いで、等量の新鮮な培地を総量３０ｍｌまで加え、５〜７日間培養する。細胞をタンパク質の精製及び定量のために回収した。
【００８６】
[0102]３２２Ａ６及び１２Ａ６を含む、合計７８のコロニーが同定される。
【００８７】
結合親和性アッセイ
[0103]ＥＬＳＡプレートは、１つのウェル当たり１００μＬのヒトＶＥＧＦＲ−２、マウスＶＥＧＦＲ２、ヒトＶＥＧＦＲ１又はヒトＶＥＧＦＲ３で一晩４℃にてコーティングし、次いで、ＰＢＳで３回すすぎ、１つのウェル当たり３００μＬの５％ＭＰＢＳで２時間３７℃にて遮断した。ウェルをＰＢＳで３回すすぎ、２倍段階希釈の１００μＬの抗ＶＥＧＦＲ２抗体を添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。試験溶液は廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。５％ＭＰＢＳ中のＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ抗体の適切な希釈液（１：１００００）を添加し、３７℃で６０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。ウェルは１００μＬの基質溶液ＴＭＢで展開され、反応は５０μＬの１Ｍ硫酸を添加することにより停止させた。色が黄色に変化し、６５０ｎｍ及び４５０ｎｍのＯＤをアッセイした。
【００８８】
[0104]いくつかの抗体の結合親和性の結果を図１及び表１に示す。１２Ａ６及び３２２Ａ６抗体がヒトＶＥＧＦＲ−２に対して結合親和性を有することを示している。３２２Ａ６抗体はマウスＶＥＧＦＲ−２に対して結合親和性を有するが、ヒトＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−３に対しては親和性を有していない。したがって、３２２Ａ６はＶＥＧＦＲ−２に特異的である。
【表１】
2020525470.tif 000003
【００８９】
[0105]３２２Ａ６及び１２Ａ６のＣＤＲの配列を表２に示す。３２２Ａ６は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号１６の核酸配列によりコードされている。３２２Ａ６は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号１８の核酸配列によりコードされている。１２Ａ６は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号２０の核酸配列によりコードされている。１２Ａ６は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号２２の核酸配列によってコードされている。
【表２】
2020525470.tif 000004
【００９０】
ドメインマッピングアッセイ
[0106]ヒトＶＥＧＦＲ−２のフラグメントを構築した。フラグメントを上記の結合親和性アッセイに利用した。ドメインマッピングの結果を図２及び図３と表３及び表４に示す。
【表３】
2020525470.tif 000005
【表４】
2020525470.tif 000006
【００９１】
エピトープマッピング
[0107]ヒトＶＥＧＦＲ−２のドメイン６（配列番号２）及び７（配列番号３）において、いくつかの点変異体を構築した。変異体は上記の結合親和性アッセイに利用した。変異部位の位置を図４に示す。１２Ａ６のエピトープは６０６位にロイシン残基、６０７位にアスパラギン酸残基、６４７位にアルギニン残基、６４８位にリジン残基、及び６４９位にトレオニン残基を含む。３２２Ａ６のエピトープは、７１１位にセリン残基、７１６位にリジン残基、７１７位にアスパラギン酸残基、並びに７２５位及び７２６位にアルギニン残基を含む。
【００９２】
抗VEGF R2 Ab-HUVEC増殖阻害アッセイ
[0108]材料：ＨＵＶＥＣ（CascadeBiologies、Cat No.C-003-5C）、Medium200（Cascade Biologies, Cat No.M-200-500）、ハイブリドーマ培地（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）、ＦＢＳ（Hyclone, #SH30071.03）、ＤＭＥＭ（GIBCO, #11995）、ヒトＣＨＯ  ＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦ（PROSPEC, Cat No.CYT-260）、抗ＶＥＧＦＲ２、ＷＳＴ−１（Roche,Cat No.11644807001）。
【００９３】
[0109]１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中の１００μＬの抗体試料を９６ウェルプレートの各ウェルに接種し、すべての試料を複製した。細胞を回収し、Ｍｅｄｉｕｍ２００に８×１０４細胞／ｍｌで懸濁し、３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ｈＶＥＧＦをＭｅｄｉｕｍ２００に５０ｎｇ／ｍｌで希釈し、５０μＬの標準ｈＶＥＧＦをプレートに加え、９６時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、２０μＬのＷＳＴ−１を各ウェルに添加し、４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。吸光度（ＯＤ４５０〜６５５ｎｍ）はＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定した。
【００９４】
[0110]増殖アッセイの結果を図５に示す。図５に示したように、抗体の濃度がより高い場合、ＶＥＧＦＲ−２シグナル阻害の効果がより強くなり、ＨＵＶＥＣの数値（ＯＤ４５０〜６５５ｎｍ）はより低くなる。抗体の中で、１２Ａ６が最も強い効果を有しており、ＩＣ５０＝３．９μｇ／ｍｌであった。
【００９５】
抗ＶＥＧＦＲ−２抗体のＨＵＶＥＣへの内部移行
[0111]抗体のＨＵＶＥＣへの内部移行をフローサイトメトリーで分析した。
フローサイトメトリー（CytoFLEX）
細胞株：ＨＵＶＥＣ
１次抗体：３２２Ａ６
２次抗体：ヤギ抗ヒトκ軽鎖、Ｂｅｔｈｙｌ、Cat.A80-115F
Ｍｅｄｉｕｍ  ２００（Ｍ２００）、Ｔｈｅｒｍｏ、Cat. C-003-25P-A、低血清増殖用添加物（ＬＳＧＳ）．  Cat.S00310
ＦＢＳ（Gibco, Cat. 10082-147）、ＦＡＣＳ緩衝液（１ＸＰＢＳ、１％ＦＢＳ、０．０２％  ＮａＮ３）
１５ｍＬ  ファルコンチューブ（Corning, Cat. CS352096）
Ｔ１５０：組織培養フラスコ（TPP、90150）
【００９６】
[0112]ＨＵＶＥＣの細胞数を計測し、３２２Ａ６と混合し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を遠心することにより回収し、１０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。２×１０５細胞／ｒｘｎ／ウェル（２４ウェルプレート）をＲＰＭＩ培地ｗ／２％ＦＢＳに播種し、次いで、示した期間、３７℃又は４℃でインキュベートした。各時点で、細胞を１０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２次抗体（α−ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液により１：２００希釈）を氷上で添加し１時間おいた。１０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を播種し（ＦＡＣＳ緩衝液により２＊１０５細胞／ｒｘｎ／チューブ）、３７℃又は４℃で示した期間インキュベートした。各時点で、細胞を懸濁させ、フローサイトメトリー及びＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェアで分析した。
【００９７】
[0113]結果を表５及び図６に示す。抗体の内部移行が起こる前（０分）、抗体と結合したＨＵＶＥＣ細胞はフローサイトメトリーで検出される。抗体の内部移行が起こった後、抗体は細胞の表面から細胞内のエンドソームに移動し、フローサイトメトリーのシグナルは消失する。したがって、抗体が強い抗体の内部移行傾向を有する場合、標的細胞との相対的結合はより低くなる。表５及び図６に見られるように、３２２Ａ６はより強い抗体の内部移行傾向を有する。
【表５】
2020525470.tif 000007
【００９８】
[0114]また抗体の内部移行は、DeltaVisionMicroscopy Imaging Systemを備えた顕微鏡下でも観察され、それを図７に示した。Ｒａｂ５ａを陽性対照とし、ＤＡＰＩを核の標識化に使用した。３２２Ａ６とエンドソームを同時に標識することにより、３２２Ａ６が細胞内に順調に内部移行されたことを示す。
【００９９】
抗ＶＥＧＦＲ２抗体とロミデプシンのコンジュゲーション
[0115]３２２Ａ６（Ｃ４５）抗体を、以下のスキームに従って、イストダックスとしても知られる抗癌剤のロミデプシンとコンジュゲートさせた：
【化１】
2020525470.tif 000008
【０１００】
[0116]コンジュゲーションの状態を表６に列挙する。
【表６】
2020525470.tif 000009
【０１０１】
[0117]得られた抗体−医薬複合体（ＡＤＣ）（11-0151-00-01）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分析した：
カラム：Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE)
試料：ＩｇＧ  ＆  ＩｇＧ−ＡＤＣ、０．３ｍｇ／ｍＬ
試料容量：１００μＬ
流速：０．５ｍＬ／分
緩衝液：１ｘＰＢＳ
システム：ＡＫＴＡ
【０１０２】
[0118]クロマトグラフィーの結果を図８及び表７に示す。またＡＤＣを電気泳動にかけたが、それを図９に示す。
【表７】
2020525470.tif 000010
【０１０３】
[0119]図８に示したように、得られた抗体−薬物複合体は、９５．４％の単量体及び９５％の純度を有する。
【０１０４】
[0120]またＡＤＣの内部移行も上記のようにアッセイした。結果を図１０に示すが、３２２Ａ６のＡＤＣにおける内部移行の傾向は、３２２Ａ６抗体単独（ｃ４５）と類似している。
【０１０５】
[0121]またＡＤＣのＨＵＶＥＣ増殖の阻害も上記のようにアッセイした。結果を図１１に示す。ＨＵＶＥＣ増殖の阻害における３２２Ａ６抗体単独（ｃ４５）の効果は軽度であった。これは、ＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達における３２２Ａ６抗体の遮断効果があまり強くないことを意味する。しかし、ロミデプシンとコンジュゲートした３２２Ａ６（ｃ４５−ＡＤＣ）による処理の場合、ＨＵＶＥＣの相対的細胞生存率は有意に低下した。理論により限定されるものではないが、ＨＵＶＥＣの相対的細胞生存率の低下は、ＨＵＶＥＣ増殖の阻害からのものではなく、３２２Ａ６抗体のＡＤＣの細胞毒性によるものと考えられる。
【０１０６】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫療法
[0122]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナーから単離し、１０％ＦＢＳ（ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１００Ｕ／ｍＬ組換えインターロイキン２（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＰＭＩ中のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28（Ｇｉｂｃｏ）で４８時間刺激した。活性化Ｔ細胞は、製造元のプロトコルに従って、Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キット、ヒト（Miltenyi Biotec）を使用して回収した。レンチウイルスベクターは、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体の単鎖可変フラグメント、４−１ＢＢ及びＣＤ３−ｚのシグナル伝達ドメインを含有していた。ウイルス上清は、トランスファーゲノムプラスミド及びレンチウイルスパッケージングヘルパープラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びｐＣＭＶΔＲ８．９１を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって産生され、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティングプレート（TaKaRa Bio Inc.）上のヒトＴ細胞の形質導入に使用した。形質導入効率は、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１０７】
[0123]結果を図１２に示す。定量分析は、１２１１、１２Ａ６及び３２２Ａ６  ＣＡＲの５．１％、１０．４％、及び７．７９％がそれぞれＴ細胞で発現したことを示している。
【０１０８】
抗原受容体Ｔ細胞の細胞毒性アッセイ
[0124]細胞毒性活性は、製造元の指示に従って細胞毒性検出キット（Roche, Indianapolis, IN, USA）を使用して測定した。抗ＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＶＥＧＦＲ２陽性細胞株と共に、示したＥ：Ｔ比で、１６時間３７℃でインキュベートした。特異的細胞溶解のパーセントは次式を使用して計算した：（試験−エフェクターコントロール−低コントロール／高コントロール−低コントロール）＊１００。高コントロールは、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で標的細胞をインキュベートした後に計算する、エフェクター対照は、Ｔ細胞単独の自発的なＬＤＨ放出値である、低コントロールは、標的細胞単独の自発的なＬＤＨ放出値である。エフェクター細胞：抗ＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲで形質導入された初代Ｔ細胞（最初の形質導入後５日）。標的細胞：ＦＳ２９３（過剰発現ＶＥＧＦＲ−２）。エフェクター細胞及び標的細胞を１６時間共培養した。
【０１０９】
[0125]また、ＣＤ１９のｓｃＦｖフラグメントは、コントロール（ＣＤ１９）としてＣＡＲ−Ｔの製造にも使用した。また、Ｔ細胞単独もコントロール（Ｔ）とした。１１２１抗体は、ＶＥＧＦＲ−２の細胞膜から遠く離れているＶＥＧＦＲ−２のドメイン２及び３に特異的に結合する公知の抗ＶＥＧＦＲ−２抗体であった。１１２１のＣＡＲ−Ｔを比較のためにアッセイで使用した。結果を図１３に示す。１２Ａ６及び３２２Ａ６のＣＡＲ−Ｔは、両方とも１１２１のＣＡＲ−Ｔよりも強い細胞毒性を有する。理論により限定されるものではないが、１２Ａ６及び３２２Ａ６抗体は、ＶＥＧＦＲ−２の細胞膜に近いＶＥＧＦＲ−２のドメイン６及び／又は７に特異的に結合すると考えられる。
【０１１０】
放射性のヨウ素結合抗体の産生
[0126]１ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．４Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液をＩＯＤＯ−ｇｅｎチューブに加え、次いで廃棄した。１００μｌの緩衝液をチューブに加え、次いで１μｌのＩ−１２３又はＩ−１３１を加え、室温で６分間、穏やかに振盪しながら反応させた。穏やかに振盪しながら室温で６〜９分間反応させるため、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を加えた。反応物を新しいエッペンドルフチューブに移すことにより、反応を終了させた。標識プロセスの効率は、８５％メタノールの展開溶液及びＩＴＬＣ／ＳＧ紙を用いたラジオ−ＴＬＣによって分析した。
【０１１１】
[0127]１３１Ｉ−抗ＶＥＧＦＲ−２−クローン４５（３２２Ａ６）の標識プロセスの効率を図１４に示す。抗体の９６．８％超が標識された。
【０１１２】
血清中の放射性ヨウ素結合抗体の安定性
[0128]ヒト又はラット由来の標識抗体及び血清を１：１９の体積比で混合し、３７℃で反応させた。０．２５、０．５、１、４、８、２４、４８、及び７２時間の時点で、８００μｌの１０％ＴＣＡを１０μｌの試料に添加し、混合した。試料に含有されていたタンパク質を１５分間氷浴により沈殿させた。上清を０．４５μｍＰＶＤＦ膜で濾過し、解離したＩ−１３１を示す液体の比活性をカウントした。安定性＝（濾過前の活性−濾過後の活性）／濾過前の活性。
【０１１３】
[0129]結果を表８に示すが、１３１Ｉ−抗ＶＥＧＦＲ−２−クローン−４５は７２時間で血清において分解しないことが明らかである。
【表８】
2020525470.tif 000011
【０１１４】
放射性ヨウ素結合抗体による腫瘍の検出
[0130]ＳＰＥＣＴ／ＣＴを、本発明による放射性結合抗体による腫瘍の検出に利用した。ＨＴ−２９異種移植マウスに４〜８μＣｉ／μｇの放射活性でｉ．ｖ．注射した。各マウスに、１〜２ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ．１３１Ｉ又は１２３Ｉ標識した抗ＶＥＧＦＲ２抗体を投与した。１、４、２４、及び４８時間目に、マウスをＳＰＥＣＴ／ＣＴでスキャンした。
【０１１５】
[0131]結果を図１５に示す。結果は、放射性結合抗体３２２Ａ６がＨＴ−２９異種移植腫瘍に特異的に結合することができ、放射性シグナルが腫瘍に蓄積されることを明らかにしている。最も強いシグナルは腫瘍において１８時間目に出現する。抗体は１８時間後に分解され、ほとんどすべての抗体が４８時間後に分解される。
【０１１６】
併用療法
[0132]６〜８週齢のオスのＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ）マウスを動物モデルとした。マウスに１２時間の明暗サイクル下で給餌し、ＰＭＩ飼料（RMH3000-5P76）及び水を自由に取らせた。マウスを以下のように分類した：
第１群：ＩｇＧ（Ｍｕ）（非機能性ＩｇＧ抗体）、１５ｍｐｋ／ｉ．ｖ．、週２回、ｎ＝６
第２群：αＣＴＬＡ−４（Ｍｕ）、５ｍｐｋ／ｉ．ｖ．＋ＩｇＧ（Ｍｕ）、１０ｍｐｋ／ｉ．ｖ．、週２回、ｎ＝６
第３群：αＣＴＬＡ−４（Ｍｕ）、５ｍｐｋ／ｉ．ｖ．＋３２２Ａ６、１０ｍｐｋ／ｉ．ｖ．、週２回、ｎ＝６
第４群：ＩｇＧ（Ｍｕ）、５ｍｐｋ／ｉ．ｖ．＋３２２Ａ６、１０ｍｐｋ／ｉ．ｖ．、週２回、ｎ＝６
【０１１７】
[0133]腫瘍の大きさを測定し、表９に列挙した。抗ＣＴＬＡ４抗体と抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（３２２Ａ６）の併用は相乗効果を有する。
【表９】
2020525470.tif 000012
【０１１８】
[0134]また体重も測定し、表１０に列挙したが、すべての群の体重が実質的に同じであることが明らかである。
【表１０】
2020525470.tif 000013
【０１１９】
抗体のヒト化
[0135]ヒトＶ領域フレームワークの選択：３２２Ａ６フレームワーク領域と最も高い相同性を有するヒトＶ領域フレームワーク配列ヒト生殖細胞系ＶＬ及びＶＨ配列の配列選択は、ＩＭＧＴデータベース（http://www.imgt.org/）及び一般的に使用されているＶＨ３／Ｖｋ１（４Ｄ５）から同定した。最終的に、ＶＨ３及びＶｋ１のフレームワーク配列が、それぞれＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークに選択された。Ｈｕとしてマークしたヒト化フレームワークはＩＭＧＴデータベースからのものであり、Ｈｄ系列は４Ｄ５フレームワークからのものであった。
【０１２０】
[0136]完全長ＣＤＲ移植Ａｂ構築物：３２２Ａ６（ＨＨ）は、６つの完全なマウスＣＤＲ配列を有する完全なヒトフレームワーク（ＶＬκサブグループＩ及びＶＨサブグループＩＩＩ）で構成されていた。３２２Ａ６（ＨＨ）及び半ヒト化（ＭＨ又はＨＭ）抗体構築物は、修飾抗体発現ベクターｐＴＣＡＥ８．３へ方向性をもってサブクローニングするためのＰＣＲ及び制限酵素消化によりアセンブルした。このプラスミドには、ヒトカッパ軽鎖及びヒトＩｇＧ１  Ｃ領域をコードするＤＮＡ断片を含有する。完全長抗体は、Free-style 293細胞で発現された。
【０１２１】
[0137]復帰突然変異：クローン３２２Ａ６（ＨｕＢ１−Ｈｄ）は、結合活性回復用のＣＤＲ移植フレームワークから１〜３回実行の復帰突然変異に対し選択された。簡単に説明すると、本発明者らは、５Åの近接、上部コア領域、インターフェースエリアにより検査するコンピューターモデリングによってＣＤＲ移植フレームワーク分析を実行し、また成功事例で最も一般的に使用されている以前の経験も適用する。本発明者らは３回実行で５〜１１個の可能性のあるアミノ酸復帰突然変異を選択した。これらの部位は、ＣＤＲ結合及び構造に関して重要な部位として認識された。クローニング及び抗体の発現後、結合活性をＥＬ１ＳＡ及びＢＩＡｃｏｒｅによって決定した。７個のアミノ酸復帰突然変異（７＋０）を有する重鎖（ＨｕＢ１）と軽鎖（Ｈｄ）の組合せクローンは、ＶＥＧＦＲ２結合の適切な候補であった。
【０１２２】
[0138]ヒト化抗体Ｈｕ３２２Ｂ１ＨｄＨは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を用いて構築された。重鎖可変領域は配列番号２４の核酸配列によりコードされており、軽鎖可変領域は配列番号２６の核酸配列によりコードされている。ＶＬセグメントのアラインメントは図１６に示しており、ＶＨセグメントのアラインメントは図１７に示している。
【０１２３】
[0139]本発明を上述の特定の実施形態と併せて説明したが、それに対する多くの代替及びその修正及び変更は当業者には明らかであろう。そのようなすべての代替、修正及び変更は本発明の範囲内にあると考える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
前記ヒト血管内皮増殖因子受容体２が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記エピトープが、
配列番号１の６０６位のロイシン残基、６０７位のアスパラギン酸残基、６４７位のアルギニン残基、６４８位のリジン残基、及び６４９位のトレオニン残基、又は、
配列番号１の７１１位のセリン残基、７１６位のリジン残基、７１７位のアスパラギン酸残基、並びに７２５位及び７２６位のアルギニン残基
を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
哺乳動物抗体である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、
前記重鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み、
前記ＣＤＲＨ１領域が配列番号４のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ２領域が配列番号５のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ３領域が配列番号６のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ１領域が配列番号７のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ２領域が配列番号８のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ３領域が配列番号９のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
重鎖可変領域の相補性決定領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、
前記重鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域の前記相補性決定領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み、
前記ＣＤＲＨ１領域が配列番号１０のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ２領域が配列番号１１のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＨ３領域が配列番号１２のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ１領域が配列番号１３のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ２領域が配列番号１４のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含み、前記ＣＤＲＬ３領域が配列番号１５のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
配列番号１７のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
前記重鎖可変領域が配列番号１６の核酸配列によってコードされており、
前記軽鎖可変領域が配列番号１８の核酸配列によってコードされている、請求項１、２、３及び５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
配列番号２１のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域をと含む、請求項１、２及び４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
重鎖可変領域が配列番号２０の核酸配列によってコードされており、
軽鎖可変領域が配列番号２２の核酸配列によってコードされている、請求項１、２、４及び７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
配列番号２５のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
重鎖可変領域が配列番号２４の核酸配列によってコードされており、
軽鎖可変領域が配列番号２６の核酸配列によってコードされている、請求項１又は９に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
治療薬とコンジュゲートされており、好ましくは前記治療薬が代謝拮抗剤、アルキル化剤、アルキル化様薬剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリチアマイシン、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射性同位元素からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
細胞の表面で発現され、好ましくは前記細胞がＴ細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントと、任意の薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
【請求項１４】
それを必要とする対象におけるＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナル伝達を阻害するため、
ＶＥＧＦＲ−２活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか又は関連する疾患及び／又は障害を前記疾患及び／又は障害に罹患している対象において治療するため、
腫瘍に罹患している対象における腫瘍であって、好ましくは前記腫瘍が固形腫瘍であり、より好ましくは前記腫瘍が、腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、又は黒色腫からなる群から選択される、腫瘍を治療するため、或いは、
それを必要とする対象における内皮細胞の細胞増殖を阻害するために用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント又は請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
試料中のヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）、好ましくはＶＥＧＦＲ−２のドメイン６〜７を検出する方法であって、
前記試料を請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させるステップを含む、方法。
【国際調査報告】
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