(57)【要約】  本発明は、バチルス・コアギュランス株において胞子形成を誘導する方法に関し、ここで、過剰胞子形成は、109胞子/mlのレベルまで、特定の栄養素およびミネラルの存在によって誘導される。胞子はオタマジャクシのような内生胞子であり、この方法は、バチルス・コアギュランス株の胞子形成を誘導するために使用される成長培地およびインキュベーション条件の特定のパラメーターを開示している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属に属する微生物の株における胞子形成を誘導する方法であって、前記方法は、
a)成長培地中において前記バチルス属に属する微生物の株の接種物を所定量添加する第１のステップであって、前記成長培地は、少なくとも所定量の酵母エキスと、所定量の脱脂粉乳と、所定量の硫酸マンガンと、トマトから得られる所定量のジュースと、ニッケルおよびコバルトに属する微量の塩と、蒸留水と、を含み、
b)前記ステップ１の前記成長培地でバチルス属に属する微生物の株を24時間から48時間の間、30℃から40℃の範囲の温度で、そして6.0のpHでインキュベートする第2のステップであって、前記成長培地は、少なくとも90％の溶存酸素含量を含み、
c)前記第2のステップの終わりにおいてバチルス・コアギュランス種に属する微生物の前記株の胞子を収穫する第3のステップと、を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記バチルス属に属する微生物の菌株が、好ましくはバチルス・コアギュランスに属する菌株である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バチルス・コアギュランス種に属する微生物の前記胞子形成が、少なくとも109胞子／成長培地1ミリリットル以上の量である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記胞子形成がオタマジャクシのような内生胞子を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
接種物が２％ v/vの量で添加される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酵母抽出物の前記所定量が、8-10 g/lであり、前記所定量の脱脂粉乳は最大40 g/lを含み、前記所定量の硫酸マンガンは最大1 mg/lを含み、前記トマトから得られた前記所定量のジュースは少なくとも5-10％ v/vの量である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、好ましくは５リットル以上の容量を有する実験室規模またはパイロット規模の発酵槽で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、物理的または化学的方法の介入を含まない請求項１に記載の方法。
【請求項９】
所定のバチルス・コアギュランス種に属する微生物株の胞子形成を誘導する成長培地用組成物であって、少なくとも所定量の酵母エキスと、所定量の脱脂粉乳と、所定量の硫酸マンガンと、トマトから得られた所定量のジュースと、ニッケルとコバルトに属する微量の塩と、蒸留水とを含むことを特徴とする前記組成物。
【請求項１０】
前記所定量の酵母エキスが8-10 g/lを含み、前記所定量の脱脂粉乳が最大40 g/lまでを含み、硫酸マンガンの所定量は1 mg/lまでを含み、トマトから得られたジュースの所定量は少なくとも5-10％ v/vの量を含む請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願と優先権に関する相互参照
本件出願は、2017年3月8日に出願されたインド国特許出願第201721008146号の優先権を主張する。
本明細書に記載されている主題は、一般に、プロバイオティクス(probiotics)の分野に関し、より具体的には、プロバイオティクス乳酸菌バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)の胞子形成(sporulation)を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、生きた微生物培養サプリメントである。人間や動物によるプロバイオティクスの消費は、腸内微生物（microbiome）バランスの改善、栄養と成長の改善、胃腸障害の予防をもたらす。プロバイオティクスの使用には、予防と治療の2つの方法がある。
【０００３】
ラクトバチルススポロゲン(Lactobacillus sporogene)として以前に知られていたバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）はプロバイオティクスサプリメントである。それは、胃酸の中で生き残り小腸に到達することができる。バチルス・コアギュランスはプロバイオティクスの中でもユニークで、自然に保護コーティングを施しているため、極端な温度や胃や胆汁酸の酸性に耐性がある。これらの特性により、バチルス・コアギュランスの有効期間の安定性が向上し、腸内での生存性に自然な利点がもたらされる。すべてのプロバイオティクスと同様に、バチルス・コアギュランスは一過性のコロニー形成プロバイオティクスである。なぜなら、それは、通常、ヒトの消化管には生息していないからである。胞子形成乳酸菌(Spore-Forming Lactic Acid Bacteria)（SFLAB）の中で、最も有名なものはバチルス・コアギュランスであり、製薬業界で選択されているプロバイオティクスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
実施された調査に基づいて、バチルス・コアギュランスのいくつかの株が観察された。それらは、最大の胞子形成(sporulation)を達成するために不可欠なミネラルが不足している培地を含むペプトン上で成長（増殖）した場合、胞子形成にかなりの変動を示す。そのため、多くの菌株(strains)は胞子を生成できない。したがって、商業レベルに拡張可能な経済的な培地でバチルス・コアギュランスに適切な内生胞子(endospore)を生産することを促進する改善された方法またはプロセスが長年必要とされていた。
【０００５】
本方法またはプロセス、および方法/プロセスを実施するコンポーネント/装置について説明する前に、本開示は、記載された特定の方法/プロセス/装置およびその配置に限定されず、本開示において明示的に示されていないが、特許請求の範囲によって画定される本開示の範囲内で依然として実施可能な複数の実施形態が存在する可能性があることを理解されたい。また、説明で使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態のみを説明するためのものであり、本主題の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。この概要は、主題の本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、また、主題の範囲を検出または制限するために用いられることを意図するものでもない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の態様によれば、バチルス・コアギュランスにおいて109/mlを超える内生胞子（「オタマジャクシ」のような）を作り出す方法が本明細書に記載される。バチルス・コアギュランスの胞子形成を促進するために、本開示は、最適な環境条件でミネラルおよびサプリメントを含む様々な培地成分を使用することを提案しており、内生胞子（「オタマジャクシ」のような）は109/mlを超える。本開示の態様によれば、所望の培地成分および最適条件を得るために、最適条件までバチルス・コアギュランスの株に関する広範な実験を実施することにより、ミネラルおよび環境条件のいくつかの順列および組み合わせが考慮される。それらは、109/mlを超えるバチルス・コアギュランスの胞子の取得を促進する
【発明を実施するための形態】
【０００７】
実施形態の詳細な説明は、添付の図面と併せて参照されることによって、よりよく理解される。本発明の説明の目的のため、本発明の例示的な構成が本明細書に示されているが、本発明は、本明細書および図面に開示される特定のデザインに限定されるものではない。
【０００８】
添付の図面を参照して、本発明の詳細な説明が提供される。添付の図面中の各参照番号の左端の数字は、その参照番号が最初に現れる図番号を表している。各図面において、同様の特徴およびコンポーネントには、同じ参照番号が付されている。
【０００９】
全ての特徴が説明された本発明のいくつかの実施形態が詳細に説明される。以下、「構成する」、「有する」、「含む」、「備える」およびそれらの他の形式は、同等な意味であり、これらの文言のいずれか１つに続く事項または複数の事項のオープンなリストであり、そのような事項に限定されるような排他的でクローズドなリストであるような意味ではなく、また、列挙された事項のみに限定されるという意味ではない。また、単数形“a”、“an”、“the”は、文脈が明確に示していなければ、複数形も含むことを留意されたし。
【００１０】
本明細書に記載され、後でクレームされる例示的な実施形態は、本明細書に具体的に開示されている、または開示されていない特徴、要素、またはステップがない場合でも、適切に実施され得る。例えば、この書面の説明における「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態例」などへの言及は、説明された実施形態が特定の特徴、構造、または特性を含むことができることを示すが、すべての実施形態が必ずしもそれらの特定の機能、構造、または特性を含まなくてもよい。開示された実施形態は、様々な形態または組み合わせの単なる例示である。さらに、そのようなフレーズは、いくつかの実施形態を必ずしも指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が実施形態に関連して記載されている場合、他の実施形態に関連してそのような特性、構造、または特性に影響を与えることは明示的に記述されているかどうかを問わず当業者の知識の範囲内であると考える。
【００１１】
本出願の語句または用語は、クレームされていない要素を必須または重要として示すものと解釈されるべきではない。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例の言葉（例えば、「など」）の使用は、単に例の実施形態をより良くさせることを意図しており、特にクレームされていな限り、本明細書に添付される特許請求の範囲を限定するものではない。
【００１２】
本明細書における値の範囲の引用は、本明細書で特に明記しない限り、当該範囲に入る各個別の値を個々に言及する簡単な方法として役に立つことを単に意図しているものであり、個々の値は、本明細書にあたかも個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。特定の範囲の値が提供される場合、文脈が特に明記しない限り、その範囲の上限と下限と他の述べられたまたは介在する値との間で、下限値の10分の1までの各介在する値が含まれると理解すべきである。すべての小さなサブレンジも含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限もそこに含まれるが、当該範囲内の具体的に除外された制限には支配される。たとえば、「約0.1％から約5％」または「約0.1％から5％」の範囲は、約0.1％から約5％だけでなく、個々の値（1％、 2％、3％、および4％）および示された範囲内のサブ範囲（たとえば、0.1％から0.5％、1.1％から2.2％、3.3％から4.4％）も含むと解釈される。
【００１３】
本発明は、バチルス属に属する微生物の株において胞子形成を生成する方法の使用を含む方法およびプロセスに関する。本発明は、インドの領土全体で一般的に見られる生物学的材料を含む。これらの材料の一般的な知識および使用される抽出物の供給源が本出願で示されている。現在特徴付けられているバチルス属に属する微生物の株は、マハラシュトラ州ナシック  シンナー(Sinnar, Nashik, Maharashtra)のアドバンストエンザイムテクノロジーテクノロジーズリミテッド(Advanced Enzyme Technologies Ltd.)から入手したものであり、誰にでも市販されている。2002年生物多様性法(Biodiversity Act 2002)に基づく本願に関連するすべての必要な手続きは、必要であれば、コンプライアンスのために特許付与前に行われる。
【００１４】
胞子形成乳酸菌（SFLAB）の中で、最も有名なものはバチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)であり、したがって製薬業界で選択されるプロバイオティクスであることが広く認められ、認識されている。しかしながら、既存のシナリオでは、バチルス・コアギュランスのいくつかの株がペプトン上で成長すると胞子形成にかなりの変動が見られることが観察されている。これは主に、最大の胞子形成を得るために不可欠なミネラルとサプリメントの不足によるものである。したがって、本開示は、バチルス・コアギュランスの胞子を得るための簡単な方法またはプロセスを提案する。より具体的には、本開示は、より多くの産生をもたらすバチルス・コアギュランスの胞子形成を誘導する方法/プロセスを提案する。それは、109/mlの内生胞子（「オタマジャクシ」のような/tadpole-like）の形成をもたらす。
【００１５】
本開示の実施形態によれば、バチルス・コアギュランスの胞子形成を誘導するために、異なる培地成分の配列や組み合わせおよび異なる環境条件を採用することにより、多くの利用可能な株を含むいくつかの実験室ベースの実験が行われた。
【００１６】
一実施形態では、ミネラルは特に塩サプリメントにマンガンを含み、サプリメントにはトマトジュース、リンゴ酸などが含まれる。
【００１７】
例示的な実施形態では、成長培地（増殖培地／growth medium）の必須成分としてトマトのジュースを使用することができる。簡単に言うと、完熟トマトを蒸し、ブレンダーでパルプ化し、ジュースをろ過することができる。ジュースは、105℃（5ポンド/平方インチ）で10分間個別に滅菌できる。そして、基礎滅菌培地に無菌的に組み込まれてもよい。
【００１８】
例示的な実施形態では、本発明は、バチルス属に属する微生物の株において胞子形成(sporulation)を誘導する方法に関し、前記方法は、成長培地にバチルス属に属する微生物の株の所定量の接種材料(inoculum)を添加する第１のステップを含む。この成長培地は、少なくとも所定量の酵母エキスと、所定量の脱脂粉乳と、所定量の硫酸マンガンと、トマトから得られた所定量のジュースと、ニッケルとコバルトに属する微量の塩と、蒸留水とを含む。バチルス属に属する微生物の菌株をインキュベートする第2のステップでは、第１のステップの前記成長培地において、24時間から48時間の範囲の間、30℃から40℃の範囲の温度および6.0のpHで、前記成長培地を溶解し、少なくとも90%の溶存酸素含有量となるようにする。さらに、第2のステップの終わりにバチルス・コアギュランス種に属する微生物の前記菌株の胞子を収穫する第3のステップを含む。
【００１９】
別の例示的な実施形態では、バチルス・コアギュランスの前記株の環境条件は、アルカリ性pHおよび30℃の温度などを含み得る。一実施形態において、関与するいくつかの実験は、定常条件下または撹拌条件下で実施され得る。一実施形態において、攪拌条件下での実験は、環境的に制御されたシェーカーおよび発酵槽（例えば、ニューブランズウィックフェーメンタ／New Brunswick Fermenter）を使用して実施され得る。さらに、実験用のさまざまな培地の量は、ベンチスケール（例えば、シェーカーで50ミリリットルから1リットルの範囲内）からパイロットスケール（発酵槽で2リットルから5リットルの範囲内で実施）までの範囲にある。
【００２０】
本開示の一実施形態によれば、複数の異なる環境条件に従って培地成分およびサプリメントの異なる順列および組み合わせで実施されたいくつかの実験に基づいて、アルカリpHや30℃の温度などの最適条件が達成され、109/ml以上のバチルス・コアギュランスの胞子が得られる。胞子の数は、化合物顕微鏡で高倍率（400 X）を用いてNeubaur Cell Counting Chamberを使用して取得できる。わかりやすくするために、スライドは位相差顕微鏡で調べることができる。最終使用のための胞子は、高速遠心分離により「収穫」され、緩衝液で洗浄され、濃縮された体積を得るために再遠心分離される。その後、工業プロセスで凍結乾燥することができる。
【００２１】
一実施形態では、バチルス・コアギュランスの胞子形成を誘導する方法が、上記の最適条件に従って実施された。この実施形態では、バチルス・コアギュランスの菌株を含む基礎培地に1つ以上の特定のミルクベースの成分が含まれていた。さらに、この実施形態では、選択された株におけるバチルス・コアギュランスの成長および成長の変化が観察された。さらに、この実施形態では、24-48時間の間で109/mlを超えるバチルス・コアギュランスの胞子濃度が得られた。前記胞子濃度（24-48時間の間で109/mlを超える）は、前記方法における物理的または化学的介入に頼ることなく得られたことに留意しなければならない。
【００２２】
上述の例示的な実施形態は、特定の利点を提供し得る。本開示のいくつかの実施形態は、他のいくつかの要件の中でも、容易に入手でき、低コストの培地成分に基づき、最小プロセスサイクル時間と組み合わされたバチルス・コアギュランスの胞子形成のための発酵プロセスを可能にし得る。
【００２３】
別の例示的な実施形態では、プロセスは、所定のサイズの発酵槽で特定の培地を滅菌する第1のステップを含むことができ、所定量の接種物を追加する第2のステップを含むことができ、さらに特定の条件で発酵槽をオンにする第3のステップを含むことができ、 pH状態と胞子形成の進行具合を定期的に顕微鏡検査により監視することができる。
【００２４】
本開示のいくつかの実施形態は、生産量での単純な観察によって、バチルス・コアギュランスにおける前記胞子形成プロセスの進行のモニタリング過程を可能にし得る。前記方法/プロセスの進行の監視は、最小限の介入でプロセス/方法をより堅牢にするのに役立つ。つまり、プロセスは、胞子形成を誘導するためのさまざまな温度変化および/またはpHの変化および/または化学添加物の変化を含む物理的または化学的介入を使用しなくてよい。
【００２５】
前述の段落の実施形態、例および代替物、それらの様々な態様またはそれぞれの個々の特徴のいずれかを含む説明は、独立してまたは任意の組み合わせで行ってもよい。一実施形態に関連して説明される機能は、そのような機能に非互換性がない限り、すべての実施形態に適用できる。
【００２６】
本開示は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の多くの形態で実施することができ、または他の方法で実施することができ、本開示の上記実施形態は、例示目的のみで詳細に開示されている。本開示はそれに限定されないが、多数の変更の影響を受けやすく、当業者に知られているような修正、および部品の再配置を含む開示されたシステムのすべてのそのような変形または変更は、本開示の範囲内にある。
【００２７】
前述の説明は、限定的な意味ではなく、例示として解釈されるものとする。当業者であれば、本開示の範囲内で、特定の変更が可能であることを理解するであろう。
【００２８】
実施は、特徴および/またはプロセスに固有の言語で説明されてきたが、本開示は、説明された特定の特徴またはプロセスに必ずしも限定されないことを理解されたい。むしろ、特定の特徴およびプロセスは、バチルス・コアギュランスの胞子形成を誘導するための実施の例として開示されている。
【００２９】
例：バチルス・コアギュランスの胞子形成の誘導
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【００３０】
前述の説明は、限定的な意味ではなく、例示として解釈されるものとする。当業者は、特定の変更が本開示の範囲内に含まれ得ることを理解するであろう。
【国際調査報告】
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