(57)【要約】本開示は、天然に存在しないコラーゲンおよびエラスチン分子を提供する。天然に存在しないコラーゲンおよびエラスチンは、短縮型コラーゲン、短縮型エラスチンおよびそれらの融合タンパク質を含む。天然に存在しないコラーゲンおよびエラスチンは、食品、化粧品ならびに多くの他の製品および用途において有用である。一態様では、宿主細胞により産生された天然に存在しないコラーゲンが提供される。天然に存在しないコラーゲンは、クラゲ（ヒドロ虫綱）コラーゲン、ヒトコラーゲン、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）コラーゲンまたはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）コラーゲンである。
2020535812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラゲコラーゲン、ヒト、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）およびＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）からなる群より選択される、天然に存在しないコラーゲン。
【請求項２】
短縮されている、請求項１に記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項３】
５０アミノ酸〜３００アミノ酸の内部短縮により短縮されている、請求項２に記載の天然に存在しない短縮型コラーゲン。
【請求項４】
前記コラーゲンのアミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号配列番号１０８、配列番号１１０および配列番号１１２からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項５】
分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位およびベータラクタマーゼタンパク質からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項６】
前記分泌タグがＤｓｂＡである、請求項５に記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項７】
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項８】
２〜５０個のアミノ酸トリマーリピートを含む、請求項７に記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項９】
クラゲコラーゲンである、請求項１〜８のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
【請求項１０】
０．００５％〜３０％ｗ／ｗの請求項１〜９のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンを含む組成物であって、線維芽細胞の成長を刺激し、および／またはプロコラーゲンの合成を刺激し、および／またはチミン−チミン（ＴＴ）ダイマー形成の形成を減少させる、組成物。
【請求項１１】
０．００５％〜１％の天然に存在しないコラーゲンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
０．０１％〜１％の天然に存在しないコラーゲンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
０．０２％〜０．５％の天然に存在しないコラーゲンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
局所用担体および／または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含む局所用組成物である、請求項１０〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記局所用組成物がマスクである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記局所用担体が、リポソーム、生分解性マイクロカプセル、ローション、スプレー、エアロゾル、ダスティングパウダー、生分解性ポリマー、鉱油、トリグリセリドオイル、シリコーンオイル、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、アルコール、乳化剤、流動石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ワックス、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、シクロメチコン、シクロペンタシロキサンおよび水からなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の局所用組成物。
【請求項１７】
前記保存剤が、トコフェロール、ジヨードメチル−ｐ−トリルスルホン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、シス異性体１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド、グルタルアルデヒド、４，４−ジメチルオキサゾリジン、７−エチルビシクロオキサゾリジン、メチルパラベン、ソルビン酸、ＧｅｒｍａｂｅｎＩＩ、ローズマリーエキスおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項１４〜１６のいずれかに記載の局所用組成物。
【請求項１８】
皮膚損傷を低減するか、損傷皮膚の修復を促進するか、ＵＶ損傷から皮膚を保護するか、または皮膚細胞の生存度を増加させる方法であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物を被験体の皮膚または皮膚細胞に適用する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞の生存度を増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞によるプロコラーゲンの合成を増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
クラゲエラスチン、ヒトエラスチン、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）エラスチンまたはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓエラスチンからなる群より選択される、天然に存在しないエラスチン。
【請求項２２】
短縮されている、請求項２１に記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項２３】
少なくとも５０アミノ酸の短縮により短縮されている、請求項２２に記載の天然に存在しない短縮型エラスチン。
【請求項２４】
前記エラスチンのアミノ酸配列が、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号９８および配列番号１００からなる群より選択される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項２５】
分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位およびベータラクタマーゼタンパク質からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項２６】
前記分泌タグがＤｓｂＡである、請求項２５に記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項２７】
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをさらに含む、請求項２１〜２６のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項２８】
２〜５０個のアミノ酸トリマーリピートを含む、請求項２７に記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項２９】
ヒトのものである、請求項２１〜２８のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
【請求項３０】
０．００５％〜３０％ｗ／ｗの請求項２１〜２９のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチンを含む組成物であって、線維芽細胞の成長を刺激し、および／またはプロコラーゲンの合成を刺激する、組成物。
【請求項３１】
０．００５％〜１％の天然に存在しないエラスチンを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
０．０１％〜１％の天然に存在しないエラスチンを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
０．０２％〜０．５％の天然に存在しないエラスチンを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
局所用担体および／または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含む局所用組成物である、請求項３０〜３３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
前記局所用組成物がマスクである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記局所用担体が、リポソーム、生分解性マイクロカプセル、ローション、スプレー、エアロゾル、ダスティングパウダー、生分解性ポリマー、鉱油、トリグリセリドオイル、シリコーンオイル、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、アルコール、乳化剤、流動石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ワックス、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、シクロメチコン、シクロペンタシロキサンおよび水からなる群より選択される、請求項３４または３５に記載の局所用組成物。
【請求項３７】
前記保存剤が、トコフェロール、ジヨードメチル−ｐ−トリルスルホン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、グルタルアルデヒド、４，４−ジメチルオキサゾリジン、７−エチルビシクロオキサゾリジン、メチルパラベン、ソルビン酸、ＧｅｒｍａｂｅｎＩＩ、ローズマリーエキスおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項３４〜３６のいずれかに記載の局所用組成物。
【請求項３８】
皮膚損傷を低減するか、損傷皮膚の修復を促進するか、またはＵＶ損傷から皮膚を保護する方法であって、請求項２１〜３７のいずれかに記載の組成物を被験体の皮膚に適用する工程を含む、方法。
【請求項３９】
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞またはケラチノサイトの生存度を増加させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞によるプロコラーゲンの合成を増加させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
天然に存在しないコラーゲンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３および配列番号１０５からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
ベクターである、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
分泌タグをコードする核酸、ヒスチジンタグをコードする核酸、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸およびベータラクタマーゼタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される核酸をさらに含む、請求項４１または４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４１〜４３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項４１または４５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項４６】
天然に存在しないコラーゲンを宿主細胞のペリプラズム空間に輸送する、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
クラゲコラーゲンを産生する、請求項４５または４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
グラム陰性細菌である、請求項４５〜４７のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項４９】
大腸菌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記大腸菌がスイッチ大腸菌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
天然に存在しないコラーゲンを生産する方法であって、
ａ．培養培地中で、請求項４５〜５０のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程；および
ｂ．前記宿主細胞から前記天然に存在しないコラーゲンを単離する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
天然に存在しないエラスチンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号９９および配列番号１０１からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
ベクターである、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５４】
分泌タグをコードする核酸、ヒスチジンタグをコードする核酸、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸およびベータラクタマーゼタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される核酸をさらに含む、請求項５２または５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５２〜５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項５２〜５５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項５７】
天然に存在しないコラーゲンを前記宿主細胞のペリプラズム空間に輸送する、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
クラゲコラーゲンを産生する、請求項５６または５７に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
グラム陰性細菌である、請求項５６〜５８のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項６０】
大腸菌である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記大腸菌がスイッチ大腸菌である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
天然に存在しないエラスチンを生産する方法であって、
ａ．培養培地中で、請求項５６〜６１のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程；および
ｂ．前記宿主細胞から前記天然に存在しないエラスチンを単離する工程
を含む、方法。
【請求項６３】
皮膚細胞による炎症性サイトカインの産生を減少させる方法であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物を前記皮膚細胞に適用する工程を含む、方法。
【請求項６４】
前記炎症性サイトカインがＩＬ−１ａである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記皮膚細胞がケラチノサイトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
皮膚細胞の生存度を増加させる方法であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物を被験体の皮膚または皮膚細胞に適用する工程を含む、方法。
【請求項６７】
前記被験体の皮膚中に存在するケラチノサイトの生存度を増加させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞の生存度を増加させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
アーバンダストへの曝露の影響から皮膚細胞を保護する方法であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物を皮膚細胞に適用する工程を含み、ここで前記皮膚細胞の生存度が増加される、方法。
【請求項７０】
前記皮膚細胞がケラチノサイトまたは線維芽細胞である、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照および参照により組み込まれる出願
本出願は、２０１７年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，９６４号および２０１８年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５７，５９１号（これらは両方とも、「ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＣＯＬＬＡＧＥＮ  ＡＮＤ  ＥＬＡＳＴＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という表題である）の３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）に基づく利益を主張する「ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＣＯＬＬＡＧＥＮ  ＡＮＤ  ＥＬＡＳＴＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という表題の２０１８年９月２７日に出願された米国特許出願第１６／１４４，９１４号の優先権を主張し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、天然に存在しない全長および短縮型コラーゲン分子ならびに全長および短縮型エラスチン分子ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
コラーゲンおよび類似タンパク質は、生物圏で最も豊富なタンパク質である。コラーゲンおよびエラスチンは、動物および他の組織の皮膚、結合組織および骨に見られる構造タンパク質である。ヒトでは、体内に存在するコラーゲンの量は総タンパク質の約３分の１であり、皮膚の乾燥重量の約４分の３を占める。エラスチンは、結合組織および他のタイプの組織に見られる高弾性タンパク質である。
【０００４】
コラーゲンの構造は、３つのポリペプチド鎖がヘリカルコイルを一緒に形成する三重ヘリックスである。個々のポリペプチド鎖は、ＧＬＹ−Ｘ−Ｙと表記される反復トリプレットアミノ酸配列から構成される。ＸおよびＹは任意のアミノ酸であり得、３番目のアミノ酸はグリシンである。コラーゲンでは、アミノ酸のプロリンおよびヒドロキシプロリンが高濃度で見られる。最も一般的なトリプレットはプロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）であり、コラーゲンにおけるトリプレットの約１０．５％を占める。
【０００５】
ゼラチンは、コラーゲンの部分的な加水分解により得られる生成物である。典型的には、ゼラチンは、酸加水分解、アルカリ加水分解および酵素加水分解により、または水溶液中でコラーゲンを熱に曝露すること（例えば、動物の骨および皮膚を煮ること、魚の鱗を煮ることなど）により生産される。
【０００６】
ゼラチンは、化粧品、食品、医薬品、医療デバイス、写真フィルム、接着剤、バインダーなどを含む多くの製品において使用される。ゼラチンの物理的および化学的特性は、特定の適用に調整される。これらの物理的／化学的特性としては、ゲル強度、融点温度、粘度、色、濁度、ｐＨ、等電点などが挙げられる。
【０００７】
エラスチンは、動脈、肺、腱、靭帯、皮膚および他の組織の適切な機能に重要な弾性タンパク質である。エラスチンは、伸びてその元の形状に戻る能力を組織に提供する。タンパク質のトロポエラスチンは、エラスチンの構成成分である。遺伝子のファミリーを含むコラーゲンとは対照的に、ヒトでは、１つのトロポエラスチン遺伝子がある。発現されると、単一のエラスチン遺伝子がスプライシングされ、異なる形態のトロポエラスチンタンパク質が産生される。多くのトロポエラスチン分子が互いに会合して、エラスチンを形成する。
【０００８】
Ｌ型細菌、すなわちＬ型は、細胞壁欠損（スフェロプラストタイプ）細胞としてまたは無細胞壁（プロトプラストタイプ）細胞として成長することができる親種（Ｎ型）に由来する細菌株である。Ｍａｄｏｆｆ  Ｓ（Ｅｄ）：Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌ−Ｆｏｒｍｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９８６；Ｍａｔｔｍａｎｎ  ＬＨ（Ｅｄ）：Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｏｒｍｓ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１９９３；およびＧｕｍｐｅｒｔ  Ｊ，Ｔａｕｂｅｎｅｃｋ  Ｕ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｔｙｐｅ  Ｌ−ｆｏｒｍｓ．Ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｌｅｃｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ｂａｓｅｌ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９８３，４６（ｓｕｐｐｌ）：２２７−２４１を参照のこと。
プロトプラストタイプＬ型は無細胞壁状態で培養され、細胞壁、莢膜、鞭毛、線毛、芽胞およびメソソームの形成不能、変化したコロニーおよび細胞形態、細胞膜の脂質およびタンパク質成分の質的および量的な変化、細胞外タンパク分解活性の非存在、バクテリオファージに対する耐性、ならびに実験室条件以外における繁殖不能を含む極めて多面的な変化を示す遺伝的に安定な変異体である。Ｇｕｍｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｔａｕｂｅｎｅｃｋ（前掲）；およびＨｏｉｓｃｈｅｎら、Ｌｉｐｉｄ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｔｙｐｅ  Ｌ−ｆｏｒｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９７，１７９：３４３０−３４３６を参照のこと。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｉｓｃｈｅｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９７）１７９：３４３０〜３４３６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、宿主細胞により産生された天然に存在しないコラーゲンが提供される。天然に存在しないコラーゲンは、クラゲ（ヒドロ虫綱）コラーゲン、ヒトコラーゲン、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）コラーゲンまたはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）コラーゲンである。一実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、全長または短縮型コラーゲンである。一実施形態では、コラーゲンは、５０アミノ酸〜５００アミノ酸の内部短縮により短縮されている。別の実施形態では、短縮は、コラーゲンポリペプチドのＣ末端またはＮ末端にある。天然に存在しないコラーゲンは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０または配列番号１１２である。
【００１１】
別の態様では、天然に存在しないコラーゲンは、分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、プロテアーゼ切断部位、ベータラクタマーゼならびに／またはＧＥＫアミノ酸トリマーリピートおよび／もしくはＧＤＫアミノ酸トリマーリピートを含むアミノ酸配列をさらに含む。天然に存在しないコラーゲンが、配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートを含む場合、ＧＥＫおよび／またはＧＤＫトリマーリピートの数は、２〜５０個のトリマーリピートの範囲であり得る。一態様では、分泌タグは、ＤｓｂＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡもしくはＨｙｌＡであるか、または第２の分泌タグの部分に融合された１つの分泌タグの部分を含むハイブリッド分泌タグである。例示的な分泌タグはＤｓｂＡである。
【００１２】
一態様では、０．００５％〜３０％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンを含む組成物が提供される。組成物は、局所用担体または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含み得る。
【００１３】
一態様では、天然に存在しないコラーゲンを含む組成物は、皮膚に適用するための局所用組成物である。局所用組成物は、皮膚損傷を低減するかまたは損傷皮膚の修復を促進するために使用される。
【００１４】
一態様は、皮膚損傷を低減するかまたは損傷皮膚の修復を促進するための方法を提供する。前記方法は、エラスチンを含む組成物を被験体の皮膚に適用することを含む。前記方法は、被験体の皮膚の線維芽細胞またはケラチノサイトの生存度を増加させる。別の態様では、組成物の適用は、被験体の皮膚の線維芽細胞によるプロコラーゲンの合成を増加させる。別の態様では、組成物の局所適用は、ＵＶ損傷から皮膚またはケラチノサイトを保護する。さらに別の実施形態では、チミン−チミン（ＴＴ）ダイマー形成は、本明細書に開示されるコラーゲンまたはエラスチンにより減少される。
【００１５】
本明細書で提供される別の態様は、皮膚細胞の生存度を増加させる方法である。前記方法は、コラーゲンまたはエラスチン分子を皮膚または皮膚細胞に適用することを含む。提供されるコラーゲンまたはエラスチンは、ＵＶ照射、アーバンダスト（urban  dust）もしくは他の損傷刺激に曝露された際のケラチノサイトおよび／または線維芽細胞の生存度を増加させる。
【００１６】
本明細書で提供される別の態様は、皮膚細胞における炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法である。一実施形態では、皮膚細胞はケラチノサイトである。前記方法は、コラーゲンまたはエラスチン分子を皮膚細胞に適用することを含む。ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８およびＴＬ−ＩＲＡを含む炎症性サイトカインの産生。
【００１７】
別の態様では、アーバンダストへの曝露の影響から皮膚細胞を保護する方法が提供される。前記方法は、本明細書に開示されるコラーゲンまたはエラスチンを皮膚細胞に適用する工程を含む。コラーゲンまたはエラスチンへの皮膚細胞の曝露は、皮膚細胞の生存度を増加させる。一実施形態では、皮膚細胞はケラチノサイトまたは線維芽細胞である。
【００１８】
一態様では、宿主細胞により産生された天然に存在しないエラスチンが提供される。天然に存在しないエラスチンは、クラゲエラスチン、ヒトエラスチン、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）エラスチンまたはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓのエラスチンである。一実施形態では、天然に存在しないエラスチンは、全長または短縮型エラスチンである。一実施形態では、エラスチンは、５０アミノ酸〜５００アミノ酸の内部短縮により短縮されている。別の実施形態では、短縮は、エラスチンポリペプチドのＣ末端またはＮ末端にある。天然に存在しないエラスチンは、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号９８または配列番号１１０である。
【００１９】
別の態様では、天然に存在しないエラスチンは、分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、プロテアーゼ切断部位、ベータラクタマーゼならびに／またはＧＥＫアミノ酸トリマーリピートおよび／もしくはＧＤＫアミノ酸トリマーリピートを含むアミノ酸配列をさらに含む。天然に存在しないコラーゲンが、配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートを含む場合、ＧＥＫおよび／またはＧＤＫトリマーリピートの数は、２〜５０個のトリマーリピートの範囲であり得る。一態様では、分泌タグは、ＤｓｂＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡもしくはＨｙｌＡであるか、または第２の分泌タグの部分に融合された１つの分泌タグの部分を含むハイブリッド分泌タグである。例示的な分泌タグはＤｓｂＡである。
【００２０】
別の実施形態では、０．００５％〜３０％ｗ／ｗの天然に存在しないエラスチンを含む組成物が提供される。組成物は、局所用担体または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含み得る。
【００２１】
一態様では、天然に存在しないエラスチンを含む組成物は、皮膚に適用するための局所用組成物である。局所用組成物は、皮膚損傷を低減するかまたは損傷皮膚の修復を促進するために使用される。
【００２２】
一実施形態は、皮膚損傷を低減するかまたは損傷皮膚の修復を促進するための方法を提供する。前記方法は、エラスチンを含む組成物を被験体の皮膚に適用することを含む。前記方法は、被験体の皮膚の線維芽細胞の生存度を増加させる。別の態様では、組成物の適用は、被験体の皮膚の線維芽細胞によるプロコラーゲンの合成を増加させる。別の態様では、組成物の局所適用は、ＵＶ損傷から皮膚またはケラチノサイトを保護する。さらに別の実施形態では、チミン−チミン（ＴＴ）ダイマー形成は、本明細書に開示されるコラーゲンまたはエラスチンにより減少される。
【００２３】
別の実施形態は、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、クラゲ、ヒト、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）またはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ由来のコラーゲンまたはエラスチンをコードする。コードされるコラーゲンまたはエラスチンは、全長または短縮型であり得る。一実施形態では、コラーゲンまたはエラスチンは、５０アミノ酸〜５００アミノ酸の内部短縮により短縮されている。
【００２４】
一実施形態では、コラーゲンまたはエラスチンと一緒に分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、プロテアーゼ切断部位、ベータラクタマーゼならびに／またはＧＥＫアミノ酸トリマーリピートおよび／もしくはＧＤＫアミノ酸トリマーリピートを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは、配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートを含み得、ＧＥＫおよび／またはＧＤＫトリマーリピートの数は、２〜５０個のトリマーリピートの範囲であり得る。一態様では、分泌タグは、ＤｓｂＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡもしくはＨｙｌＡであるか、または第２の分泌タグの部分に融合された１つの分泌タグの部分を含むハイブリッド分泌タグである。例示的な実施形態の分泌タグはＤｓｂＡである。
【００２５】
ポリヌクレオチドおよびベクターは、宿主細胞を形質転換し、ポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る。天然に存在しないコラーゲンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３または配列番号１０５であるポリヌクレオチドが提供される。天然に存在しないエラスチンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２、配列番号９９または配列番号１０１であるポリヌクレオチドが提供される。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞が開示される。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、および外因性ポリヌクレオチドを発現させるために使用される任意の他の細胞を含む任意の宿主細胞であり得る。
【００２７】
細胞分裂を阻害するように改変され、ペリプラズム空間が増加した細菌宿主細胞が提供される。例示的な宿主細胞は大腸菌である。
【００２８】
一実施形態は、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンを生産する方法を提供する。前記方法は、コラーゲンまたはエラスチンをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養培地に接種する工程、前記宿主細胞を培養する工程、および前記宿主細胞から前記天然に存在しないコラーゲンまたは前記天然に存在しないエラスチンを単離する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、スイッチ細胞と非スイッチ細胞との間の生理学的状態差異を示す。Ａ）非スイッチ大腸菌細胞。Ｂ）生理学的スイッチを受けた以外は図Ａと同じ大腸菌集団。Ｃ）細胞質ＲＦＰおよびペリプラズムＧＦＰを含有するスイッチ大腸菌細胞の位相差。Ｄ）図Ｃの細胞の蛍光画像はターゲティングされたタンパク質の局在を示す。
【００３０】
【図２】図２は、スイッチ細胞におけるタンパク質産生の増強を示す。Ａ〜Ｂ）Ｔ７誘導性タンパク質産生の標的タンパク質は、大腸菌ＢＬ２１において産生されるペリプラズム発現ＧＦＰである。同じ細胞集団を使用し、ＯＤ１．１で誘導した。Ａ）タンパク質ラダー（レーン１）、ＩＰＴＧ誘導タンパク質産生（レーン２）、生理学的スイッチをともなうＩＰＴＧ誘導タンパク質産生（レーン３）。Ｂ）ＩＰＴＧのみ（左）およびＩＰＴＧ＋スイッチ（右）をともなう細胞ＧＦＰ誘導培養物の２つのバイアル。Ｃ）タンパク質ラダー（レーン１）、タンパク質産生後の上清（レーン２）、細胞ペレット（レーン３）を示す、スイッチ細胞を使用した２２ｋＤａコラーゲンの発現。
【００３１】
【図３】図３は、時間をわたりスイッチする大腸菌細胞のタイムラプスを示す。
【００３２】
【図４】図４は、生理学的スイッチを受けている他の生物を示す。Ａ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの通常の生理学。Ｂ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのスイッチ生理学。Ｃ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１の通常の生理学。Ｄ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のスイッチ生理学。Ｅ）Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａの通常の生理学。Ｆ）Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａのスイッチ生理学。Ｇ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの通常の生理学。Ｈ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのスイッチ生理学。
【００３３】
【図５】図５は、短縮型コラーゲンによるヒトケラチノサイトの処理によるＴＴダイマー形成の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下の説明では、特定の具体的な詳細は、本開示の様々な実施形態の十分な理解を提供するために記載されている。しかしながら、当業者は、これらの詳細を用いずに、本開示が実施され得ることを理解するであろう。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【００３６】
「からなる」という用語は、「限定されないが、〜を含む」を意味する。
【００３７】
「から本質的になる」という用語は、さらなる成分、工程および／または部分が、特許請求されている組成物、方法または構造の基本的な新規特徴を実質的に変化させない場合にのみ、組成物、方法または構造が、さらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【００３９】
本出願を通して、本開示の様々な実施形態は範囲形式で示され得る。範囲形式による記載は単に利便性および簡潔性のためであり、本開示の範囲に対する不変の制限として解釈されるべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されるすべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲ならびにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００４０】
数範囲が本明細書に示される場合は常に、それは、示されている範囲内の任意の引用される数（分数または整数）を含むことを意味する。第１の示されている数と第２の示されている数と「の間の範囲の／範囲」ならびに第１の示されている数「から」第２の示されている数「までの範囲／範囲」という語句は本明細書では互換的に使用され、第１および第２の示されている数ならびにその間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、限定されないが、化学、薬学、生物学、生化学および医学の分野の実施者に公知の、または公知の方式、手段、技術および手順から前記実施者により容易に開発される方式、手段、技術および手順を含む、所定の課題を達成するための方式、手段、技術および手順を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「コラーゲン」または「コラーゲン様」という用語は、１つまたはそれを超えるコラーゲンまたはコラーゲン様ポリペプチドと会合して、四次構造を形成し得るモノマーポリペプチドを指す。コラーゲンは、ゼラチンを調製するために、酸、塩基または熱で処理され得る。天然コラーゲンの四次構造は、典型的には３つのポリペプチドから構成される三重ヘリックスである。天然コラーゲンを形成する３つのポリペプチドのうち、２つは通常は同一であり、アルファ鎖と表記される。第３のポリペプチドはベータ鎖と表記される。したがって、典型的な天然コラーゲンはＡＡＢと表記され得、コラーゲンは、２つのアルファ（「Ａ」）鎖および１つのベータ（「Ｂ」）鎖から構成される。本明細書で使用される場合、「プロコラーゲン」という用語は、細胞により産生されるポリペプチドであって、天然に存在するコラーゲンにプロセシングされ得るポリペプチドを指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「エラスチン」という用語は、伸縮してその元の形状に戻るように機能する弾性のポリペプチドを指す。エラスチンは、結合組織に天然で見られる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」または「ベクター」という用語は、外因性遺伝子の発現を指令することができる核酸アセンブリを指す。発現ベクターは、外因性遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ部位、１つまたはそれを超える選択マーカーをコードする核酸、および組換え技術の実施において有用な他の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「線維芽細胞」という用語は、プロコラーゲンおよび他の構造タンパク質を合成する細胞を指す。線維芽細胞は体内に広く分布し、皮膚、結合組織および他の組織に見られる。
【００４６】
「蛍光タンパク質」という用語は、外因性ポリヌクレオチドの発現のレポーターとして使用される遺伝子工学技術において一般的に使用されるタンパク質である。タンパク質は、紫外線または青色光に曝露されると蛍光を発し、明るい可視光を放出する。緑色を発するタンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、赤色を発するタンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ゼラチン」という用語は、酸、塩基または熱への曝露によりさらに加工されたコラーゲンを指す。理論または機構に縛られるものではないが、酸、塩基または熱によるコラーゲンの処理は、コラーゲンポリペプチドを変性させると考えられる。水性変性コラーゲン溶液は、食品、化粧品、医薬品、工業製品、医療製品、実験室培養成長培地および他の多くの適用において使用される可逆性ゲルを形成する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指し、コード領域のみを指し得るか、またはコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含み得る。
【００４９】
「ヒスチジンタグ」という用語は、組換えポリペプチド上の２〜３０個の連続する一連のヒスチジン残基である。
【００５０】
「宿主細胞」という用語は、導入外因性ポリヌクレオチドを発現するように操作された細胞である。
【００５１】
「ケラチノサイト」という用語は、皮膚の表皮層に見られるケラチンを産生する細胞である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ラクタマーゼ」という用語は、ラクタム（環状アミド）部分を含有する抗生物質を加水分解する酵素を指す。「ベータラクタマーゼ」または「β−ラクタマーゼ」は、β−ラクタム部分を含有する抗生物質を加水分解する酵素である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」という用語は、天然において通常見られないコラーゲンまたはエラスチンを指す。天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは組換え的に調製される。天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは、組換えコラーゲンまたは組換えエラスチンである。一実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは短縮型コラーゲンである。他の天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、キメラコラーゲンを含む。キメラコラーゲンは、コラーゲンポリペプチドの１つの部分が第２のコラーゲンポリペプチドの部分と隣接するポリペプチドである。例えば、ヒトコラーゲンの部分と隣接するクラゲコラーゲンの部分を含むコラーゲン分子は、キメラコラーゲンである。別の実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、さらなるアミノ酸、例えば分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位、ＧＥＫリピート、ＧＤＫリピートおよび／またはベータラクタマーゼを含む融合ポリペプチドを含む。一実施形態では、天然に存在しないエラスチンは短縮型エラスチンである。他の天然に存在しないエラスチンポリペプチドは、キメラエラスチンを含む。キメラエラスチンは、エラスチンポリペプチドの１つの部分が第２のエラスチンポリペプチドの部分と隣接するポリペプチドである。例えば、ヒトエラスチンの部分と隣接するクラゲエラスチンの部分を含むコラーゲン分子は、キメラエラスチンである。別の実施形態では、天然に存在しないエラスチンは、さらなるアミノ酸、例えば分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位および／またはベータラクタマーゼを含む融合ポリペプチドを含む。キメラゼラチンまたはキメラエラスチンは、さらなるアミノ酸、例えば分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位、ＧＥＫリピート、ＧＤＫリピートおよび／またはベータラクタマーゼを含み得る。
【００５４】
「プロテアーゼ切断部位」という用語は、特定のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列である。
【００５５】
「分泌タグ」または「シグナルペプチド」という用語は、宿主細胞の細胞機構を動員して、発現タンパク質を宿主細胞の特定の位置または細胞小器官に輸送するアミノ酸配列を指す。
【００５６】
「短縮型コラーゲン」という用語は、全長コラーゲンよりも小さなモノマーポリペプチドであって、全長コラーゲンの１つまたはそれを超える部分が存在しないモノマーポリペプチドを指す。コラーゲンポリペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端において短縮されているか、または全長コラーゲンポリペプチドの内部部分の除去により短縮されている。
【００５７】
「短縮型エラスチン」という用語は、全長エラスチンよりも小さなモノマーポリペプチドであって、全長エラスチンの１つまたはそれを超える部分が存在しないモノマーポリペプチドを指す。エラスチンポリペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端において短縮されているか、または全長エラスチンポリペプチドの内部部分の除去により短縮されている。
【００５８】
参照により組み込まれる共同出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／２４８５７では、細胞分裂が阻害され、ペリプラズム空間の成長が大きく増強された改変細菌細胞（スイッチ細胞）を使用する発現系が開示された。この発現系では、発現タンパク質は、ペリプラズム空間にターゲティングされる。これらのスイッチ細胞における組換えタンパク質産生は、非スイッチ細胞におけるものと比較して劇的に増加する。構造的には、細胞は内膜および外膜の両方を含むが、機能的ペプチドグリカン細胞壁を欠く一方、細胞形状は球状であり、時間をわたって体積が増加する。特に、ペリプラズム空間は、通常、総細胞体積のわずか１０〜２０％を構成する一方、本明細書に記載されるスイッチ状態のペリプラズム区画は、総細胞体積の２０％、３０％、４０％または５０％超かつ最大６０％、７０％、８０％または９０％を構成し得る。
【００５９】
ＰＣＴ／ＵＳ１７／２４８５７の改変細菌細胞は、例えば、ガンマプロテオバクテリアおよびアルファプロテオバクテリアから選択されるグラム陰性細菌に由来する。いくつかの実施形態では、細菌は、大腸菌、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａから選択される。特定の実施形態では、細菌は、大腸菌、例えば株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００６０】
別の態様では、宿主細菌細胞は、マグネシウム塩を含む培養培地中で拡大したペリプラズム空間を有し、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約３、４、５または６ｍＭである。さらなる実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約７、８、９または１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、約５ｍＭ〜２５ｍＭ、約６ｍＭおよび／または約２０、１５または１０ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、マグネシウム塩は、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムから選択される。
【００６１】
他の実施形態では、培養培地は、例えば、糖（例えば、アラビノース、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ガラクトース、サッカロース、マルトトリオースエリトリトール、リビトール、ペンタエリスリトール、アラビトール、ガラクチトール、キシリトール、イジトール、マルトトリオースなど）、ベタイン（例えば、トリメチルグリシン）、プロリン、塩化ナトリウムを含む浸透圧安定剤（osmotic  stabilizer）をさらに含み、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約４％、５％、６％または７％（ｗ／ｖ）である。さらなる実施形態では、浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約８％、９％または１０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、約５％〜約２０％（ｗ／ｖ）である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、アミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび酵母抽出物をさらに含み得る。
【００６３】
宿主細菌細胞は、バッチプロセス、フェドバッチプロセスまたは反復フェドバッチプロセスで連続的または非連続的に培養され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、抗生物質は、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタム）、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド系抗生物質ならびにグリコペプチド系抗生物質から選択される。特定の実施形態では、抗生物質は、アラホスファリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルベニシリン、セファマンドール、セフォタキシム、セフスロジン、セファロチン、ホスミドマイシン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ホスホマイシン、プリマキシンおよびバンコマイシンから選択される。
【００６５】
理論に縛られるものではないが、組換えタンパク質産生を促進して細胞分裂を阻害する細胞形態は、上述の培地条件下で細胞壁の除去により駆動されると思われる。いくつかの実施形態では、細胞壁合成の除去／阻害のための方法は、ペプチドグリカン合成を阻害する抗生物質（例えば、アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリンまたはホスホマイシン）の使用または当技術分野で公知の他の方法によるものであり得る。
【００６６】
適切なペリプラズムターゲティングシグナル配列を有する場合、組換え的に生産されたポリペプチドは、細菌細胞のペリプラズム空間に分泌され得る。Ｊｏｌｙ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｌａｉｒｄ，Ｍ．Ｗ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｐｌａｓｍ  ｅｄ．Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，（２００７）３４５−３６０。ペリプラズムの化学的酸化環境では、ジスルフィド結合の形成およびそれによるポリペプチドの機能的に正確なフォールディングが促される。
【００６７】
一般に、シグナル配列は、発現ベクターの構成要素であり得るか、またはそれは、ベクターに挿入される外因性遺伝子の部分であり得る。選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものであるべきである。外因性遺伝子のネイティブシグナル配列を認識およびプロセシングしない細菌宿主細胞については、シグナル配列は、任意の一般的に公知の細菌シグナル配列で置換される。いくつかの実施形態では、組換え的に生産されたポリペプチドは、ＤｓｂＡシグナル配列を使用してペリプラズム空間にターゲティングされ得る。Ｄｉｎｈ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，Ｓｅｐｔ．２０１１，４９８４−４９８７。
【００６８】
一態様では、宿主細胞により産生された天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンが提供される。天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは、クラゲコラーゲンもしくはエラスチン、ヒトコラーゲンもしくはエラスチン、またはＣｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）コラーゲンもしくはエラスチン、またはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンもしくはエラスチンである。天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは、短縮型コラーゲンである。短縮は、内部短縮、コラーゲンもしくはエラスチンのＮ末端部分における短縮、またはコラーゲンもしくはエラスチンのＣ末端部分における短縮である。コラーゲンまたはエラスチンは、５０アミノ酸〜１０００アミノ酸、５０アミノ酸〜９５０アミノ酸、５０アミノ酸〜９００アミノ酸、５０アミノ酸〜８５０アミノ酸、５０アミノ酸〜８００アミノ酸、５０アミノ酸〜８５０アミノ酸、５０アミノ酸〜８００アミノ酸、５０アミノ酸〜７５０アミノ酸、５０アミノ酸〜７００アミノ酸、５０アミノ酸〜６５０アミノ酸、５０アミノ酸〜６００アミノ酸、５０アミノ酸〜６５０アミノ酸、５０アミノ酸〜５００アミノ酸、５０アミノ酸〜４５０アミノ酸、５０アミノ酸〜４００アミノ酸、５０アミノ酸〜３５０アミノ酸、５０アミノ酸〜３００アミノ酸、５０アミノ酸〜２５０アミノ酸、５０アミノ酸〜２００アミノ酸、５０アミノ酸〜１５０アミノ酸または５０アミノ酸〜１００アミノ酸の短縮により短縮されている。別の実施形態では、コラーゲンまたはエラスチンは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００アミノ酸だけ短縮されている。天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列の部分またはポリヌクレオチド配列全体によりコードされる。
【００６９】
天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンは、分泌タグを含むアミノ酸配列をさらに含む。分泌タグは、コラーゲンまたはエラスチンを宿主細胞のペリプラズム空間に指向させる。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＤｓｂＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡもしくはＨｙｌＡに由来するか、または第２の分泌タグの部分に融合された１つの分泌タグの部分を含むハイブリッド分泌タグに由来する。一態様では、分泌タグは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに付着される。別の態様では、分泌タグは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから切断される。
【００７０】
天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンは、ヒスチジンタグをさらに含む。ヒスチジンタグまたはポリヒスチジンタグは、コラーゲンまたはエラスチンに付着された２〜２０個のヒスチジン残基の配列である。ヒスチジンタグは、２〜２０個のヒスチジン残基、５〜１５個のヒスチジン残基、５〜１８個のヒスチジン残基、５〜１６個のヒスチジン残基、５〜１５個のヒスチジン残基、５〜１４個のヒスチジン残基、５〜１３個のヒスチジン残基、５〜１２個のヒスチジン残基、５〜１１個、５〜１０個のヒスチジン残基、６〜１２個のヒスチジン残基、６〜１１個のヒスチジン残基または７〜１０個のヒスチジン残基を含む。ヒスチジンタグは、ニッケル系クロマトグラフィー媒体を利用したクロマトグラフィー法によるタンパク質の精製において有用である。例示的な蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が挙げられる。蛍光タンパク質は当技術分野で周知である。一実施形態では、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンは、ＧＦＰおよび／またはＲＦＰを含む。一実施形態では、スーパーフォルダー（superfolder）ＧＦＰは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに融合される。スーパーフォルダーＧＦＰは、不十分にフォールディングされたポリペプチドに融合された場合であっても適切にフォールディングするＧＦＰである。一態様では、ヒスチジンタグは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに付着される。別の態様では、ヒスチジンタグは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから切断される。
【００７１】
天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンは、プロテアーゼ切断部位をさらに含む。プロテアーゼ切断部位は、組換え的に生産されたコラーゲンまたはエラスチンを切断してポリペプチドの部分を除去するために有用である。除去され得るポリペプチドの部分としては、分泌タグ、ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質タグおよび／またはベータラクタマーゼが挙げられる。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼを含む。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロペプチダーゼおよびライノウイルス３Ｃプロテアーゼにより切断されるアミノ酸が挙げられる。一態様では、切断タグは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに付着される。別の態様では、切断タグは、適切なプロテアーゼにより、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから除去される。
【００７２】
天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンは、ベータラクタマーゼである酵素をさらに含む。ベータラクタマーゼは選択マーカーとして有用である。一態様では、ベータラクタマーゼは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに付着される。別の態様では、ベータラクタマーゼは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから切断される。
【００７３】
天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンは、ＧＥＫアミノ酸トリマーリピートおよび／またはＧＤＫアミノ酸トリマーリピートをさらに含む。ＧＥＫおよびＧＤＫトリマーリピートは、コラーゲンおよび／またはゼラチンのゲル化を促進する。一実施形態では、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンは、２〜５０個のＧＥＫおよび／もしくは２〜５０個のＧＤＫトリマーリピート、２〜４０個のＧＥＫおよび／もしくは２〜４０個のＧＤＫトリマーリピート、２〜３０個のＧＥＫおよび／もしくは２〜３０個のＧＤＫトリマーリピート、２〜２０個のＧＥＫおよび／もしくは２〜２０個のＧＤＫトリマーリピート、２〜１５個のＧＥＫおよび／もしくは２〜１５個のＧＤＫトリマーリピート、２〜１０個のＧＥＫおよび／もしくは２〜１０個のＧＤＫトリマーリピート、２〜９個のＧＥＫおよび／もしくは２〜９個のＧＤＫトリマーリピート、２〜８個のＧＥＫおよび／もしくは２〜８個のＧＤＫトリマーリピート、２〜７個のＧＥＫおよび／もしくは２〜７個のＧＤＫトリマーリピート、２〜６個のＧＥＫおよび／もしくは２〜６個のＧＤＫトリマーリピート、２〜５個のＧＥＫおよび／もしくは２〜５個のＧＤＫトリマーリピートまたは２〜４個のＧＥＫおよび／もしくは２〜４個のＧＤＫトリマーリピートを含む。一態様では、ＧＥＫトリマーリピートまたはＧＤＫトリマーリピートは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに付着される。別の態様では、ＧＥＫトリマーリピートまたはＧＤＫトリマーリピートは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから切断される。
【００７４】
０．００５％〜３０％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／または天然に存在しないエラスチンを含む組成物が本明細書で提供される。組成物は、０．００５％〜２０％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチン、０．００５％〜１０％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチン、０．００５％〜５％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチン、０．００５％〜２％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチン、０．００５％〜１％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチン、０．００５％〜０．５％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチンならびに０．００５％〜０．２％ｗ／ｗの天然に存在しないコラーゲンおよび／もしくは天然に存在しないエラスチンを含む。
【００７５】
天然に存在しないコラーゲンおよび／または天然に存在しないエラスチンを含む組成物は、パーソナルケア製品である。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与のために製剤化される。組成物は、ヒトにおける使用に適切な他の化粧品成分を含有し得る。パーソナルケア製品は、ヒト皮膚または毛髪への紫外線損傷を予防または処置するために有用である。パーソナルケア製品は、皮膚または毛髪に適用される。組成物としては、例えば、マスク、スキンクリーナー、例えば石鹸、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、クレンジングパッド、洗顔剤、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナーおよびボディシャンプーが挙げられる。
【００７６】
天然に存在しないコラーゲンおよび／または天然に存在しないエラスチンを含む組成物は、局所用担体または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含み得る。局所用担体は、リポソーム、生分解性マイクロカプセル、ローション、スプレー、エアロゾル、ダスティングパウダー（dusting  powder）、生分解性ポリマー、鉱油、トリグリセリドオイル、シリコーンオイル、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、アルコール、乳化剤、流動石油（liquid  petroleum）、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ワックス、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、シクロメチコン、シクロペンタシロキサンおよび水からなる群より選択される局所用担体を含む。保存剤は、トコフェロール、ジヨードメチル−ｐ−トリルスルホン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、シス異性体１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド、グルタルアルデヒド、４，４−ジメチルオキサゾリジン、７−エチルビシクロオキサゾリジン、メチルパラベン、ソルビン酸、ＧｅｒｍａｂｅｎＩＩ、ローズマリーエキスおよびＥＤＴＡからなる群より選択される保存剤を含む。
【００７７】
皮膚損傷を低減するか、損傷皮膚の修復を促進するか、ＵＶ損傷から皮膚を保護するか、アーバンダストへの曝露の影響から皮膚細胞を保護する方法が提供される。前記方法は、天然に存在しないコラーゲンおよび／または天然に存在しないエラスチンを含む組成物を被験体の皮膚に適用する工程を含む。特定の理論または機構に縛られるものではないが、組成物中のコラーゲンおよび／またはエラスチンは、ＵＶ損傷から保護することにより皮膚損傷を低減し、ならびに／または皮膚に適用された場合には、細胞の生存度を増加させおよび／もしくはプロコラーゲン合成を増加させることにより損傷皮膚の修復を促進し、ならびに／または皮膚細胞の生存度を促進する。一態様におけるコラーゲンおよびエラスチンは、チミン−チミン（ＴＴ）ダイマー形成の形成を減少させる。
【００７８】
一態様は、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、クラゲ、ヒト、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）またはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ由来のコラーゲンまたはエラスチンをコードする。ポリヌクレオチドは、全長または短縮型のコラーゲンまたはエラスチンをコードする。
【００７９】
別の態様は、コラーゲンまたはエラスチン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。エラスチンまたはコラーゲン融合タンパク質は、コラーゲンまたはエラスチンと一緒に、分泌タグ、ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質タグ、プロテアーゼ切断部位、ベータラクタマーゼならびに／またはＧＥＫアミノ酸トリマーリピートおよび／もしくはＧＤＫアミノ酸トリマーリピートを含む。
【００８０】
一態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞を形質転換し、ポリヌクレオチドを発現させるために使用されるベクターである。ポリヌクレオチドは、選択剤の存在下で宿主生物が成長することを可能にする酵素をコードする核酸をさらに含む。選択剤としては、ガラクトース含有糖を含む特定の糖、またはアンピシリン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８などを含む抗生物質が挙げられる。選択剤に対する耐性を付与するために使用される酵素としては、β−ガラクトシダーゼまたはβ−ラクタマーゼが挙げられる。
【００８１】
一態様では、本発明のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞、グラム陽性細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または外因性ポリヌクレオチドを発現させるために使用される任意の他の細胞を含む任意の宿主細胞であり得る。例示的なグラム陰性宿主細胞は大腸菌である。
【００８２】
細胞分裂を阻害するように改変され、ペリプラズム空間が増加した細菌宿主細胞が教示される。本明細書で議論され、実施例１に教示されているように、ベータラクタム抗生物質は、野生型細菌細胞を、細胞複製が阻害され、ペリプラズム空間が増加した改変細菌細胞に変換するためのスイッチとして有用である。例示的なベータラクタム抗生物質としては、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタムが挙げられる。
【００８３】
細菌のスイッチ形態（Ｌ型）は、特定の塩および他の栄養素を含む培養培地中で培養される。試験された生理学的スイッチ生理学を支援する塩および培地組成は、Ｍ６３塩培地、Ｍ９塩培地、ＰＹＥ培地、およびＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地である。炭素、窒素および無機リン酸源以外の任意の必要なサプリメントも単独で、または別のサプリメントもしくは培地、例えば複合的な窒素源との混合物として適切な導入濃度で含められ得る。特定の実施形態では、培地は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、カザミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび酵母抽出物から選択される１つまたはそれを超える成分をさらに含む。
【００８４】
ベータラクタマーゼは、原核細胞におけるラクタム抗生物質に対する耐性を付与する酵素である。典型的には、細菌宿主細胞においてベータラクタマーゼが発現されると、発現されたベータラクタマーゼタンパク質はまた、ベータラクタマーゼタンパク質をペリプラズム空間に指向させるターゲティング配列（分泌タグ）を含む。ベータラクタマーゼは、それらがペリプラズム空間に輸送されない限り機能しない。酵素をペリプラズム空間にターゲティングする独立した分泌タグの使用を伴わずにペリプラズムにターゲティングされるベータラクタマーゼが提供される。ＧＦＰ、コラーゲンまたはＧＦＰ／コラーゲンキメラなどのタンパク質のＮ末端にペリプラズム分泌タグが付加された融合タンパク質を作製することにより、ネイティブ分泌タグを欠くベータラクタマーゼの機能は、Ｎ末端融合タンパク質の完全な翻訳および分泌について選択するために使用され得る。このアプローチを使用して、本発明者らは、ＤｓｂＡ−ＧＦＰ−コラーゲン−ベータラクタマーゼ融合物を使用して、翻訳および分泌に有利な標的コラーゲン中の短縮産物を選択した。
【００８５】
別の実施形態は、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンを生産する方法を提供する。前記方法は、コラーゲンまたはエラスチンをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養培地に接種する工程、前記宿主細胞を培養する工程、および前記宿主細胞から前記天然に存在しないコラーゲンまたは前記天然に存在しないエラスチンを単離する工程を含む。
【００８６】
タンパク質の発酵調製のためのプロセスが提供される。前記プロセスは、
ａ）マグネシウム塩を含む培地中で組換えグラム陰性細菌細胞を培養する工程であって、前記培地中のマグネシウムイオンの濃度が少なくとも約６ｍＭであり、前記細菌細胞が、タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、工程；
ｂ）抗生物質を前記培地に添加する工程であって、前記抗生物質が、前記細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成を阻害する、工程；および
ｃ）前記培地から前記タンパク質を回収する工程
を含む。
【００８７】
標的タンパク質を生産する目的のために、細菌は、例えば国際公開第０５／０２１７７２号に記載されているように連続的に、またはバッチプロセス（バッチ培養）でまたはフェドバッチもしくは反復フェドバッチプロセスで非連続的に培養され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質生産は大規模に行われる。組換えタンパク質の生産のために、様々な大規模発酵手順が利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１，０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は撹拌機インペラを使用して、酸素および栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる。小規模発酵は、一般に、約２０リットルを超えない体積容量の発酵槽における発酵を指す。
【００８８】
標的タンパク質の蓄積のために、宿主細胞は、標的タンパク質の蓄積に十分な条件下で培養される。このような条件は、例えば、細胞によるタンパク質発現および蓄積を可能にする温度、栄養素および細胞密度条件を含む。また、当業者に公知であるように、このような条件は、転写、翻訳、および分泌タンパク質の場合にはある細胞区画から別の区画へのタンパク質の通過という基本的な細胞機能を細胞が実行し得る条件である。
【００８９】
細菌細胞は、適切な温度で培養される。大腸菌成長では、例えば、典型的な温度は、約２０℃〜約３９℃の範囲である。一実施形態では、温度は、約２０℃〜約３７℃である。別の実施形態では、温度は、約３０℃である。一実施形態では、非スイッチ状態またはスイッチ状態の宿主細胞をある温度で培養し、異なる温度にスイッチして、タンパク質産生を誘導する。最初に、宿主細胞をある温度で培養して細胞を増殖させ、次いで、タンパク質産生を誘導するために、細胞をより低い温度で培養する。第１の温度は、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃または３７℃である。第２の温度は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃または３６℃である。第２の温度における培養は、１時間〜１００時間、５時間〜９０時間、５時間〜８０時間、５時間〜８０時間、５時間〜７０時間、１０時間〜７０時間、１５時間〜７０時間、１５時間〜６５時間、１５時間〜６０時間、２０時間〜６０時間、２０時間〜５５時間、２０時間〜５０時間、２４時間〜５０時間、２４時間〜４８時間、３０時間〜５０時間、３０時間〜４５時間または３０時間〜４０時間行われる。
【００９０】
培養培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜９の任意のｐＨであり得る。大腸菌の場合、ｐＨは、約６．８〜約７．４または約７．０である。
【００９１】
遺伝子発現の誘導では、典型的には、特定の光学密度、例えば約１．１のＯＤ６００が達成されるまで細胞を培養し、この時点で、（例えば、インデューサーの添加により、リプレッサー、サプレッサーまたは培地構成要素の枯渇により）誘導を開始して、標的タンパク質をコードする外因性遺伝子の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、外因性遺伝子の発現は、例えば、イソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ラクトース、アラビノース、マルトース、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、バブリシン、キシロース、銅、亜鉛などから選択されるインデューサーにより誘導可能である。遺伝子発現の誘導はまた、発酵中に溶存酸素レベルを減少させることにより達成され得る。細胞増殖中の発酵の溶存酸素レベルは、１０％〜３０％である。遺伝子発現を誘導するために、溶存酸素レベルは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満に減少される。生理学的状態またはスイッチ状態のいずれかの宿主細胞では、タンパク質産生は、本明細書に開示されるように発酵の温度を低下させることにより誘導され得る。
【００９２】
産物蓄積後、組換えタンパク質の溶解および放出を誘導するために、細胞をボルテックスおよび遠心分離する。タンパク質の大部分は上清に見られるが、界面活性剤（例えば、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用して、あらゆる残存する膜結合タンパク質を放出させ得る。
【００９３】
その後の工程では、産物との細胞残屑の同時回収を最小化する方式で、細胞マトリクスから放出された可溶性または不溶性産物として標的タンパク質を回収する。回収は任意の手段により行われ得るが、一実施形態では、ニッケルカラムによるヒスチジンタグ精製を含み得る。例えば、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．２０００；３２６：２４５−２５４を参照のこと。
【実施例】
【００９４】
実施例１：発現系
材料および方法：
株：
試験した生理学的スイッチおよびタンパク質産生：
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＮＥＢ，製品＃ｃ２５２７より
大腸菌Ｋ１２ＮＣＭ３７２２−Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＣＧＳＣ＃１２３５５より
【００９５】
試験した生理学的スイッチ：
ガンマプロテオバクテリア：
Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ−ＡＴＣＣ，製品＃１４０４８より
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ−ＡＴＣＣ，製品＃３１９４８より
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１−ＡＴＣＣ，製品＃ＢＡＡ−４７より
【００９６】
アルファプロテオバクテリア：
Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ−ＡＴＣＣ，製品＃１９０８９より
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ／Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ−ＡＴＣＣ，製品＃３３９７０より
Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ−ＡＴＣＣ，製品＃１３１８４より
【００９７】
培地組成：
１リットル５×ｍ６３塩：
１０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４−Ｐ２１２１２１，製品＃７７８３−２０−２より
６８ｇのＫＨ２ＰＯ４−Ｐ２１２１２１，製品＃７７７８−７７−０より
２．５ｍｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，製品＃Ｆ７００２より
容量をｍｉｌｌｉＱ水で最大１リットルにする。
ＫＯＨ（Ｐ２１２１２１，製品＃１３１０−５８−３より）でｐＨ７に調整する。
混合物をオートクレーブする。
【００９８】
１リットルの１Ｍ  ＭｇＳＯ４：
２４６．５ｇのＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ−Ｐ２１２１２１，（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，製品＃１００３４−９９−８）より
容量をｍｉｌｌｉＱ水で最大１リットルにする。
混合物をオートクレーブする。
【００９９】
１リットルのスイッチ培地１：
１３３．４ｍＬの５×ｍ６３塩
１０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４
３８．６ｇのグルコース−Ｐ２１２１２１，製品＃５０−９９−７より
６６．６ｇのスクロース−Ｐ２１２１２１，製品＃５７−５０−１より
８．３３ｇのＬＢｍｉｘ−Ｐ２１２１２１，製品＃ｌｂ−ｍｉｌｌｅｒより
容量をｍｉｌｌｉＱ水で最大１リットルにする。
混合物を０．２２μＭ細孔真空フィルタ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，製品＃ＣＬＳ４３０５１７）で濾過滅菌する。
【０１００】
１リットルのスイッチ培地２：
１３３．４ｍＬの５×ｍ６３塩
１０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４
３８．６ｇのグルコース−Ｐ２１２１２１，製品＃５０−９９−７より
６６．６ｇのスクロース−Ｐ２１２１２１，製品＃５７−５０−１より
１０ｇの酵母抽出物−ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ．ｃｏｍ，製品＃Ｊ６０２８７  Ａｌより
容量をｍｉｌｌｉＱ水で最大１リットルにする。
混合物を０．２２μＭ細孔真空フィルタ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，製品＃ＣＬＳ４３０５１７）で濾過滅菌する。
【０１０１】
バイオリアクター成長について：
５リットルのバイオリアクター培地ＭＧＺ１２：
１）１Ｌの、ＤＩ水中濃度５００ｇ／Ｌグルコースをオートクレーブする。（ＶＷＲ，製品＃９７０６１−１７０）。
２）１Ｌの、ＤＩ水中濃度５００ｇ／Ｌスクロースをオートクレーブする。（Ｇｅｎｅｓｅｅｓｃｉ．ｃｏｍ，製品＃６２−１１２）。
３）３９４６ｍＬのＤＩ水中：
２０ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４．（ＶＷＲ，製品＃９７０６１−９３２）．
６６．５ｇのＫＨ２ＰＯ４．（ＶＷＲ，製品＃９７０６２−３４８）．
２２．５ｇのＨ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７．（ＶＷＲ，製品＃ＢＤＨ９２２８−２．５ＫＧ）．
２．９５ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ．（ＶＷＲ，製品＃９７０６２−１３４）．
１０ｍＬの微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ），１０００ｘ．（Ｔｅｋｎｏｖａ，製品＃Ｔ１００１）．
をオートクレーブする。
オートクレーブ後、４００ｍＬの（１）を（３）に添加し、６５ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨ（ＶＷＲ，製品＃９７０６４−４８０）を（３）に添加し、６６６ｍＬの（２）を（３）に添加する。
必要に応じて発酵実行中に、５００ｇ／Ｌのグルコースのフィードを使用し得る。
誘導時に、
５０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを５Ｌバイオリアクターに添加し、
濃度１〜１０ｍＭのＩＰＴＧに添加する。（ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ．ｃｏｍ，製品＃ＥＩ０５９３１）．
ホスホマイシン（５０μｇ／ｍＬまたはそれを超える）およびカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬまたはそれを超える）を添加する。
【０１０２】
生理学的スイッチ：
最大１Ｌの容量の振盪フラスコにおける成長のために、大腸菌について１〜１．１のＯＤ６００で生理学的スイッチを最適に切り替える。試験した他の種については、培養物をスイッチ培地中で成長させ、培養物が最大ＯＤ６００に達したら継代培養した。すべての場合において、１００〜２００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン（Ｐ２１２１２１，製品＃４８００−９４−６より）および５０〜１００ｕｇ／ｍＬホスホマイシン（Ｐ２１２１２１，製品＃２６０１６−９９−９より）の添加により、生理学的スイッチを切り替える。集団の大部分は、数時間以内にスイッチ状態になる。細胞が生理学的スイッチを受けたことを確認するために、完全焦点システム、Ｎｉｋｏｎ  ＣＦＩ６０  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  １００Ｘ  ＮＡ  １．４５対物レンズ、Ｐｒｉｏｒ自動フィルタホイールおよびステージ、ＬＥＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙおよびＬＥＤ−ＤＡ／ＦＩ／ＴＸフィルタセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）、Ｌｕｍｅｎｃｏｒ  Ｓｏｌａ  ＩＩ  ＳＥ  ＬＥＤ照明システムならびにＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｆｌａｓｈ  ４．０  Ｖ２  ＣＭＯＳカメラを備えるＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅにより、細胞をイメージングした。
【０１０３】
生理学的スイッチの画像分析：
ＩｍａｇｅＪを使用して画像を分析して、寸法を測定した。スイッチ状態では、外膜の球状輪郭を球として処理して、総体積を計算する（Ｖ＝（４／３）７πｒ３）。球内に存在する楕円体として、細胞質体積を計算する（Ｖ＝（４／３）π＊（最長半径）＊（短半径）２）。ペリプラズム体積を計算するために、細胞の総体積から細胞質体積を差し引く。
【０１０４】
タンパク質発現および定量：
ＧＦＰまたはコラーゲン誘導体を有するｐＥＴ２８ａ（ｅｍｄ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  製品＃６９８６４）およびその誘導体を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ  製品＃ｃ２５２７）を、振盪インキュベーターにおいて、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン（ｐ２１２１２１  製品＃２２５１１８０）を含有するスイッチ培地中、３７℃で一晩成長させた。翌日、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する新鮮スイッチ培地に一晩培養物の１：１０希釈物を入れて、継代培養を開始する。次いで、培養物を生理学的にスイッチし、タンパク質産生を１〜１．１のＯＤ６００で同時に誘導する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーによる読み取り）。１００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン、５０ｕｇ／ｍＬホスホマイシンおよび１００ｕｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧ（ｐ２１２１２１  製品＃３６７−９３−１）の添加により、生理学的スイッチおよびタンパク質産生を切り替える。オービタルシェーカー上で、タンパク質発現をスイッチ状態で室温（約２２℃）で８時間〜一晩継続する。総タンパク質レベルを定量するために、培養物の混合部分に対してＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーにより標準曲線を定量した。タンパク質集団の残りに対する標的タンパク質産生の相対強度を定量するために、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲル上で培養物の混合部分を泳動させ、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クマシー染色により染色した。
【０１０５】
タンパク質産生の誘導：
標準的な手順にしたがって、生理学的状態でタンパク質産生を誘導した。本発明者らは、組換えタンパク質のＩＰＴＧ／ラクトース誘導性産生を駆動するプラスミドｐＥＴ２８ａを含有し、ＤｓｂＡシグナル配列を使用してそれらをペリプラズム空間にターゲティングする株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用した。上記ペリプラズム空間にターゲティングされるＧＦＰタンパク質を使用して、本発明者らは、同じ時間量にわたって同じ光学密度で誘導された非スイッチ細胞集団と比較した場合に、タンパク質産生を増大させて５倍増加させる能力を実証した（図）。誘導は１．１のＯＤ６００で最適であり、誘導は１０時間継続し、この時点で、産生されたタンパク質を約２００ｍｇ／ｍＬと測定した。
【０１０６】
実施例２：全長コラーゲンの生産
本明細書の実施例１で議論されている発現系を使用して、全長クラゲコラーゲンを生産した。Ｐｏｄｏｃｏｒｙｎａ  ｃａｒｎｅａ（クラゲまたはヒドロ虫綱）コラーゲンの野生型全長アミノ酸配列は、配列番号１に提供されている。
【化１】
2020535812.tif 000003
【０１０７】
全長クラゲコラーゲンをコードする非コドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号２に開示されている。
【化２】
2020535812.tif 000004
【０１０８】
野生型全長クラゲコラーゲンをコードする２つの異なるコドン最適化ポリヌクレオチド配列を合成した。わずかに異なるコドン最適化方法により、２つのポリヌクレオチド配列はわずかに異なっていた。非短縮型全長クラゲコラーゲンに加えて、ポリヌクレオチドはまた、分泌タグ、９アミノ酸ｈｉｓタグ、短いリンカーおよびトロンビン切断部位をコードしていた。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７１によりコードされる。９つのヒスチジン残基を含むヒスチジンタグはヌクレオチド７３〜９９によりコードされ、アミノ酸２５〜３３をコードする。リンカーはヌクレオチド１００〜１１１によりコードされる。トロンビン切断タグはヌクレオチド１１２〜１３５によりコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする。短縮型コラーゲンはヌクレオチド１３６〜１４２２によりコードされる。２つのポリヌクレオチドは、以下の配列番号３および４に開示されている。
【化３】
2020535812.tif 000005
【化４】
2020535812.tif 000006
【０１０９】
配列番号３および配列番号４のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列は、以下の配列番号５に開示されている。配列番号５では、ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７１によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする；９つのヒスチジン残基を含むヒスチジンタグはヌクレオチド７３〜９９によりコードされ、アミノ酸２５〜３３をコードする；リンカーはヌクレオチド１００〜１１１によりコードされ、アミノ酸３４〜３７をコードする；トロンビン切断タグはヌクレオチド１１２〜１３５によりコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする；全長コラーゲンはヌクレオチド１３６〜１４２２によりコードされ、アミノ酸４６〜４７４をコードする。
【化５】
2020535812.tif 000007
【０１１０】
ＤｓｂＡ分泌タグ、ヒスチジンタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない全長クラゲコラーゲンは、配列番号８９に開示されている。
【化６】
2020535812.tif 000008
【０１１１】
Ｇｅｎ９  ＤＮＡ（現在はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ内部合成）により、配列番号３および配列番号４のポリヌクレオチドを合成した。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号３および配列番号４との間の重複を３０〜４０ｂｐの長さに設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＵＳ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣＲ／ＧＣ＿Ｒｉｃｈ／ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ＿ＧＸＬ＿ＤＮＡ＿Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ？ｓｉｔｅｘ＝１００２０：２２３７２：ＵＳ）を用いてＰＣＲを使用して追加した。次いで、開裂ｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートＤＮＡ（配列番号３または配列番号４）を、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ．ｖｗｒ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１７６１３８５７／ｇｉｂｓｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｈｉｆｉ−ｌ−ｓｔｅｐ−ｋｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｉｎｃ）を使用して最終的なプラスミドに一緒にアセンブリした。次いで、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）によるサンガーシーケンシングにより、プラスミドの配列を検証した。
【０１１２】
形質転換細胞を最小培地中で培養し、５０：５０の細胞対グリセロール比でグリセロールを含む１．５アリコートで凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩回復させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６〜９時間成長させて５〜１０のＯＤ６００を達成した。
【０１１３】
この実施例および本出願を通して使用した最小培地は、以下のように調製される。最小培地（表１）をいくつかの個別の画分、塩混合物（リン酸二アンモニウム、リン酸二水素カリウム  、無水クエン酸、硫酸マグネシウム七水和物）、５００ｇ／Ｌのスクロース、５５％のグルコース、微量金属ＴＭ５（表２）および水酸化ナトリウム１０Ｍでオートクレーブした。次いで、最小培地を、フード内でオートクレーブ後の上記濃度で一緒に混合した。
【表１】
2020535812.tif 000009
【表２】
2020535812.tif 000010
【０１１４】
回収した細胞を、ホモジナイザーにより１４，０００ｐｓｉの圧力で２回破砕した。得られたスラリーは、他のタンパク質と一緒にコラーゲンタンパク質を含有していた。
【０１１５】
均一化細胞ブロスの酸処理により、コラーゲンを精製した。６Ｍ塩酸を使用して、均一化スラリーのｐＨを３に低下させた。酸性化細胞スラリーを混合しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて、遠心分離した。酸性化スラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験したところ、開始ペレットと比較して比較的多量にコラーゲンを含有することが見出された。このようにして得られたコラーゲンスラリーは塩が多かった。体積および塩の減少を達成するために、各０．１ｍ２の限外濾過カセットを有するＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濾過システムを使用して、濃縮およびダイアフィルトレーション工程を実施した。濾過の総面積は、並行して２つのカセットを使用して０．２ｍ２であった。ＴＦＦ段階では、1/５の体積減少および1/１９の塩減少を達成した。最終的なコラーゲンスラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、コラーゲンの存在を確認した。マルチトレイ凍結乾燥機を使用してこのスラリーを３日間乾燥させ、白色の綿毛状コラーゲン粉末を得た。
【０１１６】
精製コラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、４２キロダルトンの予想サイズで、厚い明確なバンドが観察された。また、質量分析により精製コラーゲンを分析したところ、４２キロダルトンのタンパク質がクラゲコラーゲンであったことが確認された。
【０１１７】
発酵を２５℃〜２８℃の範囲の様々な温度で実施した。いくつかの発酵では、発酵の温度を一定温度に維持し、発酵の完了後直ぐに（５〜１０のＯＤ６００）コラーゲンを精製した。他の発酵では、発酵の温度を所望の期間維持し、５〜１０のＯＤ６００の細胞密度に達したら、温度を低下させてタンパク質産生を誘導した。典型的には、温度を２８℃から２５℃に低下させた。２５℃における発酵を４０〜６０時間継続した後、コラーゲンを単離した。
【０１１８】
さらなる全長クラゲコラーゲン
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない全長クラゲコラーゲンは、以下に開示されている。このコラーゲンをコードする２つのコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号６および配列番号７に提供されている。ヌクレオチド配列の差異は、異なるコドン最適化戦略によるものであるが、同じタンパク質をコードする。アミノ酸配列は配列番号８に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。コラーゲン配列はヌクレオチド７３〜１３５９によりコードされ、アミノ酸２５〜４５３をコードする。
【化７】
2020535812.tif 000011
【化８】
2020535812.tif 000012
【化９】
2020535812.tif 000013
【０１１９】
実施例３：短縮型コラーゲンの生産
大腸菌における発現に最適化されたコドン最適化ＤＮＡ配列であって、２４０個の内部アミノ酸の短縮を有するクラゲコラーゲンをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を合成し、発現させた。ＤＮＡ配列は以下の配列番号９に示されている。配列番号９では、ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸１〜２４をコードする。９個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグはヌクレオチド７３〜９９によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸２５〜３３をコードする。リンカーはヌクレオチド１００〜１１１によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸３４〜３７をコードする。トロンビン切断部位はヌクレオチド１１２〜１３５によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸３８〜４５をコードする。短縮型コラーゲンはヌクレオチド１３６〜８２２によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸４６〜２７４をコードする。
【化１０】
2020535812.tif 000014
【０１２０】
短縮型コラーゲンは全長コラーゲンの約５４％であり、以下の配列番号１０に開示されている。
【化１１】
2020535812.tif 000015
【０１２１】
ＤｓｂＡ分泌タグ、ヒスチジンタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型クラゲコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８５に開示されている
【化１２】
2020535812.tif 000016
【０１２２】
ＤｓｂＡ分泌タグ、ヒスチジンタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型クラゲコラーゲンは、配列番号８６に開示されている
【化１３】
2020535812.tif 000017
【０１２３】
配列番号９のポリヌクレオチドをコドン最適化し、Ｇｅｎ９  ＤＮＡ（現在はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ内部合成）により合成した。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号９との間の重複を３０〜４０ｂｐの長さに設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＵＳ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣＲ／ＧＣ＿Ｒｉｃｈ／ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ＿ＧＸＬ＿ＤＮＡ＿Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ？ｓｉｔｅｘ＝１００２０：２２３７２：ＵＳ）を用いてＰＣＲを使用して追加した。次いで、開裂ｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートＤＮＡ（配列番号９）を、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ．ｖｗｒ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１７６１３８５７／ｇｉｂｓｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｈｉｆｉ−ｌ−ｓｔｅｐ−ｋｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｉｎｃ）を使用して最終的なプラスミドに一緒にアセンブリした。次いで、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）によるサンガーシーケンシングにより、プラスミドの配列を検証した。
【０１２４】
形質転換細胞を最小培地中で培養し、５０：５０の細胞対グリセロール比でグリセロールを含む１．５アリコートで凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩回復させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６〜９時間成長させて５〜１０のＯＤ６００を達成した。
【０１２５】
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースで調製し、５〜１０のＯＤ６００の３００ｍｌの培養物を添加して、開始容量を３Ｌにした。撹拌、空気および酸素を含有するカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持して、細胞を２８℃、ｐＨ７で成長させた。２８％ｗ／ｗ水酸化アンモニウム溶液を使用して、ｐＨを制御した。４０ｇ／Ｌの初回ボーラスが約１３時間で枯渇したら、ＤＯスタットベースの供給アルゴリズムを使用して、フェドバッチモードで発酵を実行した。初期成長の２４〜２６時間後、ＯＤ６００は１００超に達した。この時点で、３００ｍＬの５００ｇ／Ｌスクロースを添加し、温度を２５℃に低下させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用するタンパク質産生のために高密度培養物を誘導した。発酵をさらに２０〜２４時間継続し、ベンチトップ遠心機を９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間使用して、細胞を回収した。遠心分離から回収した細胞ペレットを、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するｐＨ８のバッファーに、２×バッファー対１×細胞の重量比で再懸濁した。
【０１２６】
回収した細胞を、ホモジナイザーにより１４，０００ｐｓｉの圧力で２回破砕した。得られたスラリーは、他のタンパク質と一緒にコラーゲンタンパク質を含有していた。
【０１２７】
発酵を２５℃〜２８℃の範囲の様々な温度で実施した。いくつかの発酵では、発酵の温度を一定温度に維持し、発酵の完了後直ぐに（５〜１０のＯＤ６００）コラーゲンを精製した。他の発酵では、発酵の温度を所望の期間維持し、５〜１０のＯＤ６００の細胞密度に達したら、温度を低下させてタンパク質産生を誘導した。典型的には、温度を２８℃から２５℃に低下させた。２５℃における発酵を４０〜６０時間継続した後、コラーゲンを単離した。
【０１２８】
均一化細胞ブロスの酸処理により、コラーゲンを精製した。加えて、遠心分離および上記バッファーへの再懸濁後、バイオリアクターから回収した非均一化全細胞に対して、酸処理も実施した。６Ｍ塩酸を使用して、再懸濁全細胞の均一化スラリーのいずれもｐＨを３に低下させた。酸性化細胞スラリーを混合しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて、遠心分離した。酸性化スラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験したところ、開始ペレットと比較して比較的多量にコラーゲンを含有することが見出された。このようにして得られたコラーゲンスラリーは塩が多かった。体積および塩の減少を達成するために、各０．１ｍ２の限外濾過カセットを有するＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濾過システムを使用して、濃縮およびダイアフィルトレーション工程を実施した。濾過の総面積は、並行して２つのカセットを使用して０．２ｍ２であった。ＴＦＦ段階では、1/５の体積減少および1/１９の塩減少を達成した。最終的なコラーゲンスラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、コラーゲンの存在を確認した。マルチトレイ凍結乾燥機を使用してこのスラリーを３日間乾燥させ、白色の綿毛状コラーゲン粉末を得た。
【０１２９】
均一化細胞ブロスまたは非均一化細胞から得られた精製短縮型コラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、２７キロダルトンの予想サイズで、厚い明確なバンドが観察された。また、質量分析により精製コラーゲンを分析したところ、２７キロダルトンのタンパク質がクラゲコラーゲンであったことが確認された。
【０１３０】
全長および短縮型コラーゲンの代替精製方法は、以下に示されている。
【０１３１】
発酵ブロスを０．３〜０．５％ｗ／ｖのポリエチルイミン（ＰＥＩ）と混合した。ＰＥＩと共に１５分間インキュベートした後、発酵ブロスを９０００ｒｃｆで１５分間遠心分離して、コラーゲンタンパク質を含有する上清を回収した。細胞を含有するペレットを廃棄し、ＰＥＩ処理コラーゲン含有上清をナトリウムベントナイト（最終０．２％ｗ／ｖ）（Ｗｙｏｐｕｒｅ（登録商標），Ｗｙｏｍｉｎｇ  Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）と混合し、遠心分離した。ベントナイト含有ペレットを廃棄し、上清を回収した。
【０１３２】
５ｋＤａカセットを使用して接線流濾過システム（ＴＦＦ）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、ベントナイト処理上清を３〜６倍に濃縮した。透過液流の喪失をほとんど伴わずに、コラーゲンを保持した。塩を除去するために、同じＴＦＦ設定を使用して、濃縮工程からの保持液をダイアフィルトレーションした。タンパク質溶液の最終導電率は１０ミリジーメンス未満であった。典型的な導電率は、４００マイクロジーメンス〜１．５ミリジーメンスであった。高濃縮コラーゲン溶液は、４ミリジーメンスに近いより高い導電率を有していた。当業者は、コラーゲンの濃度に応じて、１０ミリジーメンスを超える導電率が観察され得ることを理解するであろう。次に、脱塩および濃縮タンパク質を、Ｗ−Ｌ  ９０００  １０ｘ４０顆粒状樹脂（Ｃａｒｂｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用した活性炭処理に供した。５％ｗ／ｖの炭素樹脂をコラーゲン含有タンパク質フィードと混合し、穏やかに撹拌しながら４５〜５０℃で混合した。珪藻土（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）などの濾過助剤の存在下または非存在下で、Ｅｒｔｅｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐａｄ  Ｍ−９５３（Ｅｒｔｅｌ  Ａｌｓｏｐ）を敷いたブフナー漏斗を使用して、炭素処理スラリーを濾過した。濾過後、コラーゲン溶液を０．２ミクロンフィルタで濾過し、続いて、ベントナイトナトリウム（最終０．２％ｗ／ｖ）（Ｗｙｏｐｕｒｅ（登録商標），Ｗｙｏｍｉｎｇ  Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）で１〜数時間処理し、９０００ｒｃｆで１５〜３０分間遠心分離して、高純度の透明な無粒子コラーゲン溶液を得た。エンドトキシンタンパク質の除去が望まれる場合、タンパク質をＳａｒｔｏｂｉｎｄ−Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ）のようなクロマトグラフィーフィルタに通して、エンドトキシンタンパク質を特異的に除去した。
【０１３３】
精製コラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、３０キロダルトンで、厚い明確なバンドが観察された。サイズのアップシフトは、コラーゲン分子の構造および高グリシン／プロリンアミノ酸含有量によるものである。また、質量分析により精製コラーゲンを分析したところ、３０キロダルトンのタンパク質が短縮型コラーゲンであったことが確認された。
【０１３４】
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣを使用してＨＰＬＣにより、短縮型コラーゲンをさらに分析した。カラムは、４．６ｍｍの内径、μＭ粒径および１０００オングストロームの孔径を有する５０ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓ逆相カラムであった。
【０１３５】
ＨＰＬＣグレード水中０．０４％アジ化ナトリウム溶液で１：１希釈することにより、サンプルを調製した。希釈後、得られた混合物を０．４５ｕｍフィルタで濾過して、ＨＰＬＣカラムを詰まらせ得るあらゆる大きな粒子を除去した。分析のために、約４．５のｐＨのＨＰＬＣグレード水中２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーでサンプルを適切に希釈する。サンプルを混合した後、それを３００μｌマイクロバイアルに移し、次いで、それをオートサンプラーに入れた。ＨＰＬＣを操作するソフトウェアであるＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用して、サンプル流量、カラム温度、移動相流量、移動相組成などの分析パラメータを変化させ得る。例示的だが非限定的な１つの分析では、パラメータは、１ｍＬ／分のサンプル流量、８０℃のカラム温度、６０〜７０ｂａｒのカラム圧力、９７．９％水／１．９％アセトニトリルと０．２％トリフルオロ酢酸の移動相組成；２１４．４ｎｍの分析用ＵＶ波長、１０μｌの注入量および１０分のサンプルランタイムであった。
【０１３６】
これらの条件下で、配列番号９１の短縮型クラゲコラーゲン（collation）は、約５．４分の溶出時間を有する。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎは溶出ピークのピーク面積を定量し、ピーク面積をタンパク質濃度に直接関連付ける検量線を使用してタンパク質濃度を計算する。０．０６ｍｇ／ｍＬ〜１．００ｍｇ／ｍＬのコラーゲン濃度範囲を含有するように系列希釈した既知のコラーゲン溶液を使用して、検量線を作成する。
【０１３７】
Ｈｉｓタグリンカー−トロンビン切断部位を有しない短縮型コラーゲン
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型クラゲコラーゲンは、以下に開示されている。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１１に提供されている。アミノ酸配列は配列番号１２に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド７３〜６３９によりコードされ、アミノ酸２５〜２１３をコードする。
【化１４】
2020535812.tif 000018
【０１３８】
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型クラゲコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９０に開示されている。
【化１５】
2020535812.tif 000019
【０１３９】
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型クラゲコラーゲンは、配列番号９１に開示されている。
【化１６】
2020535812.tif 000020
【０１４０】
ＧＥＫリピートを有する短縮型コラーゲン
ＧＥＫリピートを有するクラゲコラーゲンは、以下に開示されている。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１３に提供されている。アミノ酸配列は配列番号１４に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、ヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。ＧＥＫリピートはヌクレオチド７３〜１２６によりコードされ、アミノ酸２５〜４２のＧＥＫリピートをコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド１２７〜６９３によりコードされ、アミノ酸４３〜２３１をコードする。
【化１７】
2020535812.tif 000021
【０１４１】
配列番号１３のポリヌクレオチドをコドン最適化し、Ｇｅｎ９  ＤＮＡ（現在はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ内部合成）により合成した。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号１３との間の重複を３０〜４０ｂｐの長さに設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＵＳ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣＲ／ＧＣ＿Ｒｉｃｈ／ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ＿ＧＸＬ＿ＤＮＡ＿Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ？ｓｉｔｅｘ＝１００２０：２２３７２：ＵＳ）を用いてＰＣＲを使用して追加した。次いで、開裂ｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートＤＮＡ（配列番号１３）を、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ．ｖｗｒ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１７６１３８５７／ｇｉｂｓｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｈｉｆｉ−ｌ−ｓｔｅｐ−ｋｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｉｎｃ）を使用して最終的なプラスミドに一緒にアセンブリした。次いで、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）によるサンガーシーケンシングにより、プラスミドの配列を検証した。
【０１４２】
形質転換細胞を最小培地中で培養し、５０：５０の細胞対グリセロール比でグリセロールを含む１．５アリコートで凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩回復させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６〜９時間成長させて５〜１０のＯＤ６００を達成した。
【０１４３】
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースで調製し、５〜１０のＯＤ６００の３００ｍｌの培養物を添加して、開始容量を３Ｌにした。撹拌、空気および酸素を含有するカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持して、細胞を２８℃、ｐＨ７で成長させた。２８％ｗ／ｗ水酸化アンモニウム溶液を使用して、ｐＨを制御した。４０ｇ／Ｌの初回ボーラスが約１３時間で枯渇したら、ＤＯスタットベースの供給アルゴリズムを使用して、フェドバッチモードで発酵を実行した。初期成長の２４〜２６時間後、ＯＤ６００は１００超に達した。この時点で、３００ｍＬの５００ｇ／Ｌスクロースを添加し、温度を２５℃に低下させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用するタンパク質産生のために高密度培養物を誘導した。発酵をさらに２０〜２４時間継続し、ベンチトップ遠心機を９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間使用して、細胞を回収した。遠心分離から回収した細胞ペレットを、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するｐＨ８のバッファーに、２×バッファー対１×細胞の重量比で再懸濁した。
【０１４４】
回収した細胞を、ホモジナイザーにより１４，０００ｐｓｉの圧力で２回破砕した。得られたスラリーは、他のタンパク質と一緒にコラーゲンタンパク質を含有していた。
【０１４５】
遠心分離および上記バッファーへの再懸濁後、バイオリアクターから回収した全細胞の酸処理により、コラーゲンを精製した。６Ｍ塩酸を使用して、均一化スラリーまたは再懸濁した懸濁物のいずれもｐＨを３に低下させた。酸性化細胞スラリーを混合しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて、遠心分離した。酸性化スラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験したところ、開始ペレットと比較して比較的多量にコラーゲンを含有することが見出された。このようにして得られたコラーゲンスラリーは塩が多かった。体積および塩の減少を達成するために、各０．１ｍ２の限外濾過カセットを有するＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濾過システムを使用して、濃縮およびダイアフィルトレーション工程を実施した。濾過の総面積は、並行して２つのカセットを使用して０．２ｍ２であった。ＴＦＦ段階では、1/５の体積減少および1/１９の塩減少を達成した。最終的なコラーゲンスラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、コラーゲンの存在を確認した。マルチトレイ凍結乾燥機を使用してこのスラリーを３日間乾燥させ、白色の綿毛状コラーゲン粉末を得た。
【０１４６】
精製コラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、見掛けの分子量３５キロダルトンに泳動することが観察された。３５キロダルトンのバンドは、２２キロダルトンの予想サイズに対応しない。予想サイズと見掛けのサイズとの間のアップシフトは、ゲルマトリクスと相互作用するＧＥＫリピートによるものであると考えられる。質量分析により３５ｋＤａのバンドは、ＧＥＫリピートを有する正しいコラーゲンであることが確認された。
【０１４７】
ＧＤＫリピートを有する短縮型コラーゲン
ＧＤＫリピートを有するクラゲコラーゲンは、以下に開示されている。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１５に示されている。アミノ酸配列は配列番号１６に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。ＧＤＫリピートはヌクレオチド７３〜１２６によりコードされ、アミノ酸２５〜４２のＧＤＫリピートをコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド１２７〜６９３によりコードされ、アミノ酸４３〜２３１をコードする。
【化１８】
2020535812.tif 000022
【０１４８】
配列番号１５のポリヌクレオチドをコドン最適化し、Ｇｅｎ９  ＤＮＡ（現在はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ内部合成）により合成した。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号１５との間の重複を３０〜４０ｂｐの長さに設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＵＳ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣＲ／ＧＣ＿Ｒｉｃｈ／ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ＿ＧＸＬ＿ＤＮＡ＿Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ？ｓｉｔｅｘ＝１００２０：２２３７２：ＵＳ）を用いてＰＣＲを使用して追加した。次いで、開裂ｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートＤＮＡ（配列番号１５）を、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ．ｖｗｒ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１７６１３８５７／ｇｉｂｓｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｈｉｆｉ−ｌ−ｓｔｅｐ−ｋｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｉｎｃ）を使用して最終的なプラスミドに一緒にアセンブリした。次いで、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）によるサンガーシーケンシングにより、プラスミドの配列を検証した。
【０１４９】
形質転換細胞を最小培地中で培養し、５０：５０の細胞対グリセロール比でグリセロールを含む１．５アリコートで凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩回復させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６〜９時間成長させて５〜１０のＯＤ６００を達成した。
【０１５０】
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースで調製し、５〜１０のＯＤ６００の３００ｍｌの培養物を添加して、開始容量を３Ｌにした。撹拌、空気および酸素を含有するカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持して、細胞を２８℃、ｐＨ７で成長させた。２８％ｗ／ｗ水酸化アンモニウム溶液を使用して、ｐＨを制御した。４０ｇ／Ｌの初回ボーラスが約１３時間で枯渇したら、ＤＯスタットベースの供給アルゴリズムを使用して、フェドバッチモードで発酵を実行した。初期成長の２４〜２６時間後、ＯＤ６００は１００超に達した。この時点で、３００ｍＬの５００ｇ／Ｌスクロースを添加し、温度を２５℃に低下させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用するタンパク質産生のために高密度培養物を誘導した。発酵をさらに２０〜２４時間継続し、ベンチトップ遠心機を９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間使用して、細胞を回収した。遠心分離から回収した細胞ペレットを、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するｐＨ８のバッファーに、２×バッファー対１×細胞の重量比で再懸濁した。
【０１５１】
回収した細胞を、ホモジナイザーにより１４，０００ｐｓｉの圧力で２回破砕した。得られたスラリーは、他のタンパク質と一緒にコラーゲンタンパク質を含有していた。
【０１５２】
遠心分離および上記バッファーへの再懸濁後、バイオリアクターから回収した全細胞の酸処理により、コラーゲンを精製した。６Ｍ塩酸を使用して、均一化スラリーのいずれもｐＨを３に低下させた。酸性化細胞スラリーを混合しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて、遠心分離した。酸性化スラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験したところ、開始ペレットと比較して比較的多量にコラーゲンを含有することが見出された。このようにして得られたコラーゲンスラリーは塩が多かった。体積および塩の減少を達成するために、各０．１ｍ２の限外濾過カセットを有するＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濾過システムを使用して、濃縮およびダイアフィルトレーション工程を実施した。濾過の総面積は、並行して２つのカセットを使用して０．２ｍ２であった。ＴＦＦ段階では、1/５の体積減少および1/１９の塩減少を達成した。最終的なコラーゲンスラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、コラーゲンの存在を確認した。マルチトレイ凍結乾燥機を使用してこのスラリーを３日間乾燥させ、白色の綿毛状コラーゲン粉末を得た。
【０１５３】
精製コラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、見掛けの分子量３５キロダルトンに泳動することが観察された。３５キロダルトンのバンドは、２２キロダルトンの予想サイズに対応しない。予想サイズと見掛けのサイズとの間のアップシフトは、ゲルマトリクスと相互作用するＧＤＫリピートによるものであると考えられる。質量分析により３５ｋＤａのバンドは、ＧＤＫリピートを有する正しいコラーゲンであることが確認された。
【０１５４】
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合物を有する短縮型コラーゲン（バージョン１）：
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合物を有するクラゲコラーゲンは、以下に開示されている。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１７に示されている。アミノ酸配列は配列番号１８に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。Ｈｉｓタグはヌクレオチド７３〜９９によりコードされ、アミノ酸２５〜３３の９つのヒスチジンタグをコードする。リンカーはヌクレオチド１００〜１１１によりコードされ、アミノ酸３４〜３７をコードする。トロンビン切断部位はヌクレオチド１１２〜１３５によりコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする。リンカーを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はヌクレオチド１３６〜８７３によりコードされ、アミノ酸４６〜２９１をコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド８７４〜１４４０によりコードされ、アミノ酸２９２〜４８０をコードする。リンカーを有するベータラクタマーゼはヌクレオチド１４４１〜２２３２によりコードされ、アミノ酸４８１〜７４４をコードする。ポリペプチドが独立した分泌タグを有しない場合であっても、ベータラクタマーゼはペリプラズム空間に適切にターゲティングされた。ＤｓｂＡ分泌タグは、転写産物全体（ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合タンパク質を有する短縮型コラーゲン）をペリプラズム空間に指向させ、ベータラクタマーゼは適切に機能した。
【化１９】
2020535812.tif 000023
【化２０】
2020535812.tif 000024
【０１５５】
いくつかのＤＮＡ断片をアセンブリすることにより、配列番号１７のポリヌクレオチドを構築した。コラーゲン含有配列をコドン最適化し、Ｇｅｎ９  ＤＮＡ（現在はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ内部合成）により合成した。Ｇｅｎ９により、ＧＦＰも合成した。酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＵＳ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣＲ／ＧＣ＿Ｒｉｃｈ／ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ＿ＧＸＬ＿ＤＮＡ＿Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ？ｓｉｔｅｘ＝１００２０：２２３７２：ＵＳ）を用いてＰＣＲを使用して、プラスミドｐＫＤ４６（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ２．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／Ｓｔｒａｉｎ．ｐｈｐ？ＩＤ＝６８０９９）からベータラクタマーゼをクローニングした。ｐＥＴ２８ベクターとＧＦＰとコラーゲンとベータラクタマーゼとの間の重複を３０〜４０ｂｐの長さに設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼを用いてＰＣＲを使用して追加した。次いで、開裂ｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートを、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ．ｖｗｒ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１７６１３８５７／ｇｉｂｓｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｈｉｆｉ−ｌ−ｓｔｅｐ−ｋｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｉｎｃ）を使用して最終的なプラスミドに一緒にアセンブリした。次いで、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）によるサンガーシーケンシングにより、プラスミドの配列を検証した。
【０１５６】
形質転換細胞を最小培地中で培養し、５０：５０の細胞対グリセロール比でグリセロールを含む１．５アリコートで凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩回復させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６〜９時間成長させて５〜１０のＯＤ６００を達成した。
【０１５７】
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースで調製し、５〜１０のＯＤ６００の３００ｍｌの培養物を添加して、開始容量を３Ｌにした。撹拌、空気および酸素を含有するカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持して、細胞を２８℃、ｐＨ７で成長させた。２８％ｗ／ｗ水酸化アンモニウム溶液を使用して、ｐＨを制御した。４０ｇ／Ｌの初回ボーラスが約１３時間で枯渇したら、ＤＯスタットベースの供給アルゴリズムを使用して、フェドバッチモードで発酵を実行した。初期成長の２４〜２６時間後、ＯＤ６００は１００超に達した。この時点で、３００ｍＬの５００ｇ／Ｌスクロースを添加し、温度を２５℃に低下させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用するタンパク質産生のために高密度培養物を誘導した。発酵をさらに２０〜２４時間継続し、ベンチトップ遠心機を９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間使用して、細胞を回収した。遠心分離から回収した細胞ペレットを、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するｐＨ８のバッファーに、２×バッファー対１×細胞の重量比で再懸濁した。
【０１５８】
回収した細胞を、ホモジナイザーにより１４，０００ｐｓｉの圧力で２回破砕した。得られたスラリーは、他のタンパク質と一緒にコラーゲンタンパク質を含有していた。
【０１５９】
遠心分離および上記バッファーへの再懸濁後、バイオリアクターから回収した非均一化全細胞の酸処理により、コラーゲンを精製した。６Ｍ塩酸を使用して、再懸濁した懸濁物のｐＨを３に低下させた。酸性化細胞スラリーを混合しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて、遠心分離した。次いで、１０Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを９に上昇させ、スラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験したところ、開始ペレットと比較して比較的多量にコラーゲンを含有することが見出された。このようにして得られたコラーゲンスラリーは塩が多かった。体積および塩の減少を達成するために、各０．１ｍ２の限外濾過カセットを有するＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濾過システムを使用して、濃縮およびダイアフィルトレーション工程を実施した。濾過の総面積は、並行して２つのカセットを使用して０．２ｍ２であった。ＴＦＦ段階では、1/５の体積減少および1/１９の塩減少を達成した。最終的なコラーゲンスラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、コラーゲンの存在を確認した。マルチトレイ凍結乾燥機を使用してこのスラリーを３日間乾燥させ、白色の綿毛状コラーゲン粉末を得た。
【０１６０】
精製コラーゲン−ＧＦＰ−ベータラクタマーゼ融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、９０キロダルトンの見掛けの分子量に泳動することが観察された。融合タンパク質の予想サイズは８５ｋｄである。質量分析により、９０ｋＤａのバンドは、正しいコラーゲン融合タンパク質であることが確認された。
【０１６１】
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合物を含む短縮型コラーゲン（バージョン２）：
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合物を有するクラゲコラーゲンは、以下に開示されている。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１９に提供されている。アミノ酸配列は配列番号２０に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。Ｈｉｓタグはヌクレオチド７３〜９９によりコードされ、アミノ酸２５〜３３の９つのヒスチジンタグをコードする。リンカーはヌクレオチド１００〜１１１によりコードされ、アミノ酸３４〜３７をコードする。トロンビン切断部位はヌクレオチド１１２〜１３５によりコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする。リンカーを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はヌクレオチド１３６〜８７３によりコードされ、アミノ酸４６〜２９１をコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド８７４〜１４４０によりコードされ、アミノ酸２９２〜４８０をコードする。リンカーを有するベータラクタマーゼはヌクレオチド１４４１〜２２３２によりコードされ、アミノ酸４８１〜７４４をコードする。
【化２１】
2020535812.tif 000025
【化２２】
2020535812.tif 000026
【化２３】
2020535812.tif 000027
【０１６２】
実施例４：全長エラスチンの生産
以下に記載されているように、全長ヒトエラスチンを発現させた。ヒトエラスチンの野生型全長アミノ酸配列は、以下に提供されている。
【化２４】
2020535812.tif 000028
【０１６３】
全長エラスチンをコードする非コドン最適化ポリヌクレオチド配列は、以下に開示されている。配列番号２２では、ヌクレオチド１〜７８はＤｓｂＡ分泌タグをコードし、ヌクレオチド７９〜２３５８は全長ヒトエラスチンをコードする。
【化２５】
2020535812.tif 000029
【化２６】
2020535812.tif 000030
【０１６４】
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位を有するコドン最適化エラスチン
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位を有する全長ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、以下に開示されている。配列番号２３では、ヌクレオチド１〜７２はＤｓｂＡ分泌タグをコードし、配列番号２４のアミノ酸１〜２４をコードする；ヌクレオチド７３〜９９は９つのＨｉｓタグをコードし、配列番号２４のアミノ酸２５〜３３をコードする；ヌクレオチド１００〜１１１はリンカーをコードし、配列番号２４のアミノ酸３４〜３７をコードする；ヌクレオチド１１２〜１３５はトロンビン切断タグをコードし、配列番号２４のアミノ酸３８〜４５をコードする；ヌクレオチド１３６〜２４１５は、配列番号２４の全長ヒトエラスチンのアミノ酸４６〜８０５をコードする。
【化２７】
2020535812.tif 000031
【化２８】
2020535812.tif 000032
【化２９】
2020535812.tif 000033
【０１６５】
ネイティブ配列タグを有しない全長ヒトエラスチンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８７に開示されている。
【化３０】
2020535812.tif 000034
【化３１】
2020535812.tif 000035
【化３２】
2020535812.tif 000036
【０１６６】
ネイティブ配列タグを有しない全長ヒトエラスチン配列は、配列番号８８に開示されている。
【化３３】
2020535812.tif 000037
【０１６７】
ＤｓｂＡ分泌タグを有するコドン最適化エラスチン
ＤｓｂＡ分泌タグを有する全長ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号２５に開示されている。配列番号２５では、ヌクレオチド１〜７２はＤｓｂＡ分泌タグをコードし、配列番号２６のアミノ酸１〜２４をコードする；ヌクレオチド７３〜２３５５は、配列番号２６の全長ヒトエラスチンのアミノ酸２５〜７８５をコードする。
【化３４】
2020535812.tif 000038
【化３５】
2020535812.tif 000039
【化３６】
2020535812.tif 000040
【０１６８】
配列番号２２のポリヌクレオチドをコドン最適化し、Ｇｅｎ９  ＤＮＡ（現在はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ内部合成）により合成した。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号２２との間の重複を３０〜４０ｂｐの長さに設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＵＳ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰＣＲ／ＧＣ＿Ｒｉｃｈ／ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ＿ＧＸＬ＿ＤＮＡ＿Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ？ｓｉｔｅｘ＝１００２０：２２３７２：ＵＳ）を用いてＰＣＲを使用して追加した。次いで、開裂ｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートＤＮＡ（配列番号２２）を、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ．ｖｗｒ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１７６１３８５７／ｇｉｂｓｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｈｉｆｉ−ｌ−ｓｔｅｐ−ｋｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｉｎｃ）を使用して最終的なプラスミドに一緒にアセンブリした。次いで、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）によるサンガーシーケンシングにより、プラスミドの配列を検証した。
【０１６９】
形質転換細胞を最小培地中で培養し、５０：５０の細胞対グリセロール比でグリセロールを含む１．５アリコートで凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩回復させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６〜９時間成長させて５〜１０のＯＤ６００を達成した。
【０１７０】
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースで調製し、５〜１０のＯＤ６００の３００ｍｌの培養物を添加して、開始容量を３Ｌにした。撹拌、空気および酸素を含有するカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持して、細胞を２８℃、ｐＨ７で成長させた。２８％ｗ／ｗ水酸化アンモニウム溶液を使用して、ｐＨを制御した。４０ｇ／Ｌの初回ボーラスが約１３時間で枯渇したら、ＤＯスタットベースの供給アルゴリズムを使用して、フェドバッチモードで発酵を実行した。初期成長の２４〜２６時間後、ＯＤ６００は１００超に達した。この時点で、３００ｍＬの５００ｇ／Ｌスクロースを添加し、温度を２５℃に低下させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用するタンパク質産生のために高密度培養物を誘導した。発酵をさらに２０〜２４時間継続し、ベンチトップ遠心機を９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間使用して、細胞を回収した。遠心分離から回収した細胞ペレットを、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するｐＨ８のバッファーに、２×バッファー対１×細胞の重量比で再懸濁した。
【０１７１】
発酵を２５℃〜２８℃の範囲の様々な温度で実施した。いくつかの発酵では、発酵の温度を一定温度に維持し、発酵の完了後直ぐに（５〜１０のＯＤ６００）エラスチンを精製した。他の発酵では、発酵の温度を所望の期間維持し、５〜１０のＯＤ６００の細胞密度に達したら、温度を低下させてタンパク質産生を誘導した。典型的には、温度を２８℃から２５℃に低下させた。２５℃における発酵を４０〜６０時間継続した後、エラスチンを単離する。
【０１７２】
回収した細胞を、ホモジナイザーにより１４，０００ｐｓｉの圧力で２回破砕した。得られたスラリーは、他のタンパク質と一緒にコラーゲンタンパク質を含有していた。
【０１７３】
均一化細胞からの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析したところ、６８キロダルトンの予想サイズに対応する約７０キロダルトンで、明確なバンドが観察された。質量分析により、精製エラスチンを分析する。
【０１７４】
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合物を有する全長エラスチン
ＤｓｂＡ分泌タグ−Ｈｉｓタグ−リンカー−トロンビン切断部位およびＧＦＰベータラクタマーゼ融合物を有するヒトエラスチンは、以下に開示されている。このエラスチンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号２７に提供されている。アミノ酸配列は配列番号２８に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。Ｈｉｓタグはヌクレオチド７３〜９９によりコードされ、アミノ酸２５〜３３の９つのヒスチジンタグをコードする。リンカーはヌクレオチド１００〜１１１によりコードされ、アミノ酸３４〜３７をコードする。トロンビン切断部位はヌクレオチド１１２〜１３５によりコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする。リンカーを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はヌクレオチド１３６〜８７３によりコードされ、アミノ酸４６〜２９１をコードする。全長エラスチン配列はヌクレオチド８７４〜３１５３によりコードされ、アミノ酸２９２〜１０５１をコードする。リンカーを有するベータラクタマーゼはヌクレオチド３１５４〜３９４５によりコードされ、アミノ酸１０５２〜１３１５をコードする。
【化３７】
2020535812.tif 000041
【化３８】
2020535812.tif 000042
【化３９】
2020535812.tif 000043
【化４０】
2020535812.tif 000044
【０１７５】
実施例５：短縮型エラスチンの生産
実施例４に記載されている発現系を使用して、短縮型ヒトエラスチンを生産する。ネイティブ分泌タグを欠く全長アミノ酸配列は、配列番号２９に開示される。
【化４１】
2020535812.tif 000045
【０１７６】
ネイティブ分泌タグを欠く全長ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号３０に開示されている。
【化４２】
2020535812.tif 000046
【化４３】
2020535812.tif 000047
【０１７７】
Ｃ末端が短縮された６０．７ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号３１に開示されている。６０．７ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸７０６〜７６１が欠失している。
【化４４】
2020535812.tif 000048
【０１７８】
短縮型６０．７ｋＤａヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号３２に開示されている。
【化４５】
2020535812.tif 000049
【化４６】
2020535812.tif 000050
【化４７】
2020535812.tif 000051
【０１７９】
Ｎ末端が短縮された５８．８ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号３３に開示されている。５８．８ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜８５が欠失している。
【化４８】
2020535812.tif 000052
【０１８０】
５８．８ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号３４に開示されている。
【化４９】
2020535812.tif 000053
【化５０】
2020535812.tif 000054
【０１８１】
Ｃ末端が短縮された５７ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号３５に開示されている。５７ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸６６１〜７６１が欠失している。
【化５１】
2020535812.tif 000055
【０１８２】
５７ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号３６に開示されている。
【化５２】
2020535812.tif 000056
【化５３】
2020535812.tif 000057
【０１８３】
Ｃ末端が短縮された５３．９ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号３７に開示されている。５３．９ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸６２４〜７６１が欠失している。
【化５４】
2020535812.tif 000058
【０１８４】
５３．９ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号３８に開示されている。
【化５５】
2020535812.tif 000059
【化５６】
2020535812.tif 000060
【０１８５】
Ｃ末端が短縮された４５．３ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号３９に開示されている。４５．３ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸５２９〜７６１が欠失している。
【化５７】
2020535812.tif 000061
【０１８６】
４５．３ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号４０に開示されている。
【化５８】
2020535812.tif 000062
【０１８７】
Ｎ末端が短縮された４４．４ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号４１に開示されている。４４．４ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜２４６が欠失している。
【化５９】
2020535812.tif 000063
【０１８８】
４４．４ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号４２に開示されている。
【化６０】
2020535812.tif 000064
【０１８９】
Ｎ末端が短縮された４０．４ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号４３に開示されている。４０．４ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜２９５が欠失している。
【化６１】
2020535812.tif 000065
【０１９０】
４０．４ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号４４に開示されている。
【化６２】
2020535812.tif 000066
【０１９１】
Ｃ末端が短縮された３９．８ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号４５に開示されている。３９．８ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸４６２〜７６１が欠失している。
【化６３】
2020535812.tif 000067
【０１９２】
３９．８ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号４６に開示されている。
【化６４】
2020535812.tif 000068
【０１９３】
Ｃ末端が短縮された３６．１ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号４７に開示されている。３６．１ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸４１８〜７６１が欠失している。
【化６５】
2020535812.tif 000069
【０１９４】
３６．１ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号４８に開示されている。
【化６６】
2020535812.tif 000070
【０１９５】
Ｎ末端が短縮された３４．９ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号４９に開示されている。３４．９ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜３６０が欠失している。
【化６７】
2020535812.tif 000071
【０１９６】
３４．９ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号５０に開示されている。
【化６８】
2020535812.tif 000072
【０１９７】
Ｃ末端が短縮された３２ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号５１に開示されている。３２ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸３７３〜７６１が欠失している。
【化６９】
2020535812.tif 000073
【０１９８】
３２ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号５２に開示されている。
【化７０】
2020535812.tif 000074
【０１９９】
Ｃ末端が短縮された２９．９ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号５３に開示されている。６０．７ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸３４７〜７６１が欠失している。
【化７１】
2020535812.tif 000075
【０２００】
２９．９ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号５４に開示されている。
【化７２】
2020535812.tif 000076
【０２０１】
Ｎ末端が短縮された２９．４ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号５５に開示されている。２９．４ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜４２５が欠失している。
【化７３】
2020535812.tif 000077
【０２０２】
２９．４ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号５６に開示されている。
【化７４】
2020535812.tif 000078
【０２０３】
Ｎ末端が短縮された２５．３ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号５７に開示されている。２５．３ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜４７３が欠失している。
【化７５】
2020535812.tif 000079
【０２０４】
２５．３ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号５８に開示されている。
【化７６】
2020535812.tif 000080
【０２０５】
Ｃ末端が短縮された２４．１ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号５９に開示されている。２４．１ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２７７〜７６１が欠失している。
【化７７】
2020535812.tif 000081
【０２０６】
２４．１ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号６０に開示されている。
【化７８】
2020535812.tif 000082
【０２０７】
Ｃ末端が短縮された２０．３ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号６１に開示されている。２０．３ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２２９〜７６１が欠失している。
【化７９】
2020535812.tif 000083
【０２０８】
２０．３ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号６２に開示されている。
【化８０】
2020535812.tif 000084
【０２０９】
Ｎ末端が短縮された１９．６ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号６３に開示されている。１９．６ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜５４２が欠失している。
【化８１】
2020535812.tif 000085
【０２１０】
１９．６ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号６４に開示されている。
【化８２】
2020535812.tif 000086
【０２１１】
Ｎ末端が短縮された１１ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号６５に開示されている。１１ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜６３５が欠失している。
【化８３】
2020535812.tif 000087
【０２１２】
１１ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号６６に開示されている。
【化８４】
2020535812.tif 000088
【０２１３】
Ｎ末端が短縮された７．９ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号６７に開示されている。７．９ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜６７４が欠失している。
【化８５】
2020535812.tif 000089
【０２１４】
７．９ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号６８に開示されている。
【化８６】
2020535812.tif 000090
【０２１５】
Ｃ末端が短縮された６．３ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号６９に開示されている。６．３ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸７４〜７６１が欠失している。
【化８７】
2020535812.tif 000091
【０２１６】
６．３ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号７０に開示されている：
【化８８】
2020535812.tif 000092
【０２１７】
Ｎ末端が短縮された４．３ｋＤａヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号７１に開示されている。４．３ｋＤａ短縮型エラスチンは、全長エラスチンからアミノ酸２〜７１７が欠失している。
【化８９】
2020535812.tif 000093
【０２１８】
４．３ｋＤａ短縮型ヒトエラスチンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号７２に開示されている。
【化９０】
2020535812.tif 000094
【０２１９】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトエラスチン１
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトエラスチン１のアミノ酸配列は、配列番号９８に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号９９のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号９８のアミノ酸１〜１９である。エラスチンヌクレオチド配列は配列番号９９のヌクレオチド５８〜６５７であり、アミノ酸配列は配列番号９８のアミノ酸２０〜２１９である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号９９のヌクレオチド６５８〜６８４であり、アミノ酸配列は配列番号９８のアミノ酸２２０〜２２８である。
【化９１】
2020535812.tif 000095
【０２２０】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトエラスチン１の核酸配列は、配列番号９９に開示されている。
【化９２】
2020535812.tif 000096
【０２２１】
配列番号９９のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型エラスチンを精製した。精製エラスチンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約２５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０２２２】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトエラスチン２
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトエラスチンタイプ２のアミノ酸配列は、配列番号１００に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１０１のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１００のアミノ酸１〜１９である。エラスチンヌクレオチド配列は配列番号１０１のヌクレオチド５８〜６５７であり、アミノ酸配列は配列番号１００のアミノ酸２０〜２１９である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１０１のヌクレオチド６５８〜６８４であり、アミノ酸配列は配列番号１００のアミノ酸２２０〜２２８である。
【化９３】
2020535812.tif 000097
【０２２３】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトエラスチン２の核酸配列は、配列番号１０１に開示されている。
【化９４】
2020535812.tif 000098
【０２２４】
配列番号１０１のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型エラスチンを精製した。精製エラスチンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約２５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０２２５】
実施例６：線維芽細胞の生存度、プロコラーゲン合成およびエラスチン合成に対する短縮型コラーゲンの効果
ヒト線維芽細胞培養物を使用して、実施例２の短縮型クラゲコラーゲン分子の能力を評価し、プロコラーゲンおよびエラスチン合成に対するその効果を決定した。また、ヒト線維芽細胞培養物を使用して、短縮型クラゲコラーゲンへの曝露後のヒト線維芽細胞の生存度の増加を決定した。
【０２２６】
実施例３のヒスチジンタグ付き短縮型コラーゲンから、２％ｗ／ｗ短縮型コラーゲンのストック溶液を調製した。次いで、２％ストック短縮型コラーゲン溶液からのアリコートを下記実験において使用した。
【０２２７】
線維芽細胞の調製
線維芽細胞を、０．５ｍｌの線維芽細胞成長培地（ＦＧＭ）中で２４ウェルプレートの個々のウェルに播種し、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、吸引により培地を除去してあらゆる非接着細胞を除去し、０．５ｍｌの新鮮ＦＧＭと交換した。細胞をコンフルエントまで成長させ、培地を４８〜７２時間ごとに交換した。コンフルエンシーに達したら、１．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで細胞を２４時間処理して、通常培養培地に含まれる成長因子からのいかなる効果もウォッシュアウトした。２４時間のウォッシュアウト期間の後、１．５％ＦＢＳを含むＦＧＭに溶解させた特定の濃度の短縮型クラゲコラーゲンで細胞を処理した。コラーゲンおよびエラスチン合成の陽性対照として形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）（２０ｎｇ／ｍｌ）を使用した。無処理細胞（陰性対照）は、１．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭのみを受けた。細胞を４８時間インキュベートし、インキュベーション期間の終了時に細胞培養培地を収集し、凍結保存（−７５℃）するかまたは直ぐにアッセイした。材料を三連で試験した。
【０２２８】
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール）アッセイは、細胞の代謝活性を測定するために使用される比色アッセイである。ＭＴＴアッセイにより、細胞数の変化を評価した。細胞がＭＴＴに曝露されると、生存細胞におけるミトコンドリアによるＭＴＴの還元は、紫色の不溶性ホルマジン結晶（これは、イソプロパノールを用いて細胞から抽出され、分光光度的に定量される）の形成をもたらす。非生存細胞はＭＴＴを還元できないので、紫色のホルマジン結晶を産生し得ない。紫色の強度は、生細胞（代謝的に活性な細胞）の数に正比例する。紫色の強度は細胞の代謝活性に正比例し、試験材料の毒性に反比例する。
【０２２９】
上記２日間のインキュベーションの後、細胞培養培地を除去し（上記を参照のこと）、線維芽細胞をＰＢＳで２回洗浄して、あらゆる残存クラゲグリコーゲン分子を除去した。最後の洗浄後、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを補充した５００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加し、細胞を３７±２℃および５±１％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＤＭＥＭ／ＭＴＴ溶液を除去し、細胞をＰＢＳで再び１回洗浄し、次いで、０．５ｍｌのイソプロピルアルコールをウェルに添加して、紫色のホルマジン結晶を抽出した。２００マイクロリットルのイソプロピル抽出物を９６ウェルプレートに移し、ブランクとしてイソプロピルアルコールを使用して、プレートを５４０ｎｍで読み取った。
【０２３０】
陰性対照細胞の平均ＭＴＴ吸光度値を計算し、１００％細胞生存度を表すために使用した。次いで、様々な処理を受けている細胞からの個々のＭＴＴ吸光度値を陰性対照細胞の平均値で割り、パーセントとして表して、各処理により引き起こされる細胞生存度の変化を決定した。
【０２３１】
この実施例の表１、２および３では、アッセイにおいて２％ストック短縮型コラーゲン溶液の指定のアリコートを使用することにより、実験を実施した。例えば、「１０％コラーゲン溶液」を試験したサンプルでは、アッセイ容量の１０％を提供するために十分な量の２％短縮型コラーゲンのアリコートを使用した。１．０ｍｌの総アッセイ容量では、１００μｌの２％ストック短縮型コラーゲン溶液を使用した。表１、２および３では、「１０％コラーゲン溶液」は０．２％コラーゲンであり、「５％コラーゲン溶液」は０．１％コラーゲンであり、「１％コラーゲン溶液」は０．０２％コラーゲンであり、「０，５％コラーゲン溶液」は０．０１％コラーゲンであり、「０，１％コラーゲン溶液」は０．００２％コラーゲンであり、「０．０５％コラーゲン溶液」は０．００１％コラーゲンであり、「０．０１％コラーゲン溶液」は０．０００２％コラーゲンであり、「０．００５％コラーゲン溶液」は０．０００１％コラーゲンである。
【０２３２】
ＭＴＴアッセイの結果は、表３に示されている。値は、平均％生存度±平均からの偏差として示されている。
【０２３３】
【表３】
2020535812.tif 000099
【０２３４】
ヒスチジンタグ付き短縮型クラゲコラーゲンは、ヒト線維芽細胞の細胞生存度を増加させることにより、保護効果を示した。表３において見られ得るように、線維芽細胞を０．０２％〜０．２％の短縮型クラゲコラーゲンに曝露した場合に、ＭＴＴアッセイの最高値が観察された。
【０２３５】
プロコラーゲン合成
線維芽細胞は、構造タンパク質であるコラーゲンおよびエラスチンを含む細胞外マトリクスペプチドの主な供給源である。プロコラーゲンは、皮膚の皮層（dermal  layer）における線維芽細胞により合成される大きなペプチドであり、コラーゲンの前駆体である。前記ペプチドがプロセシングされて成熟コラーゲンタンパク質が形成され、プロペプチド部分が切断される（タイプＩ  Ｃペプチド）。次いで、成熟コラーゲンタンパク質およびタイプＩ  Ｃペプチド断片は両方とも、細胞外環境に放出される。コラーゲンが合成されると、タイプＩ  Ｃペプチド断片は組織培養培地に蓄積する。プロコラーゲンペプチドの２つの部分の間の化学量論比は１：１であるので、タイプＩ  Ｃペプチドのアッセイは、合成されたコラーゲンの量を反映するであろう。ＥＬＩＳＡベースの方法により、タイプ１  Ｃペプチドをアッセイし得る。
【０２３６】
一連のタイプＩ  Ｃペプチド標準を０ｎｇ／ｍｌ〜６４０ｎｇ／ｍｌの範囲で調製した。次に、プレートフレームからあらゆる不要なストリップを除去し、続いて、アッセイにおいて使用した各ウェルに１００μｌのペルオキシダーゼ標識抗プロコラーゲンＩ−Ｃペプチド抗体を添加することにより、ＥＬＩＳＡマイクロプレートを調製した。次いで、２０μｌのサンプル（収集した組織培養培地）または標準のいずれかを適切なウェルに添加し、マイクロプレートをカバーし、３７℃で３±０．２５時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを吸引し、４００μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（過酸化水素＋色素源としてのテトラメチルベンジジン）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１５±５分間インキュベートした。インキュベーションの後、１００μｌの停止溶液（１Ｎ硫酸）を各ウェルに添加し、マイクロプレートリーダーを使用してプレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０２３７】
存在する各物質の量を定量するために、既知濃度の各物質を使用して、標準曲線を作成した。回帰分析を実施して、これらのデータポイントに最も適合する線を確立した。試験材料および無処理サンプルの吸光度値を使用して、各サンプル中に存在する各物質の量を推定した。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、表４に示されている。
【０２３９】
【表４】
2020535812.tif 000100
【０２４０】
短縮型ヒスチジンタグ付きクラゲコラーゲンは、コラーゲン合成に対して二相性効果を有することが観察された。１％、５％および１０％レベルでは、コラーゲン合成は増加した。５％濃度では、短縮型クラゲコラーゲンは、０．０５未満のｐ値で、コラーゲン合成を有意に増加させた。
【０２４１】
エラスチン合成
エラスチンは弾性線維のネットワークの主要な構成要素であり、一過性の伸長後に反跳する能力を組織に与える。このタンパク質は、線維芽細胞（可溶性エラスチン）により細胞外空間に放出され、次いでその場所で他のエラスチンタンパク質と架橋されて、線維およびシート（不溶性エラスチン）の広範なネットワークを形成する。ＥＬＩＳＡベースの方法により、細胞培養培地から可溶性エラスチンを容易に測定し得る。
【０２４２】
可溶性α−エラスチンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）に１．２５μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。次いで、１５０μｌのこの溶液を９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃプレートのウェルに適用し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでウェルを飽和させた。次いで、プレートをこのブロッキング溶液と共に３７℃で１時間インキュベートし、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで２回洗浄した。
【０２４３】
α−エラスチン標準のセットを０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で生成した。次いで、１８０μｌの標準または短縮型クラゲコラーゲンを６５０μｌマイクロ遠心チューブに移した。抗エラスチン抗体溶液を調製し（０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで抗体を１：１００希釈した）、２０μｌの溶液をチューブに添加した。次いで、チューブを４±２℃で一晩インキュベートした。翌日、１５０μｌを各チューブから９６ウェルエラスチンＥＬＩＳＡプレートに移し、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを３回洗浄した。洗浄後、０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ連結二次抗体を含有する２００μｌの溶液を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、２００μｌの基質溶液を添加し、プレートを暗所、室温で１０〜３０分間インキュベートした。この最終インキュベーションの後、プレートリーダーを使用して、プレートを４６０ｎｍで読み取った。
【０２４４】
【表５】
2020535812.tif 000101
【０２４５】
表５に示されているように、０．５％の濃度で使用した場合、短縮型ｈｉｓタグ付きクラゲコラーゲンは、エラスチン産生を有意に増加させた。
【０２４６】
実施例７：ケラチノサイト増殖およびＵＶＢ保護に対する短縮型コラーゲンの効果
ヒトケラチノサイト細胞培養モデルを使用して、細胞増殖に対する効果を発揮する試験材料の能力を評価した。加えて、ＵＶＢへの曝露後の細胞生存度に対する試験材料の影響も評価した。
【０２４７】
実施例１の短縮型コラーゲンから、２％ｗ／ｗ短縮型コラーゲンのストック溶液を調製した。次いで、２％ストック短縮型コラーゲン溶液からのアリコートを下記実験において使用した。
【０２４８】
この研究を２つの部分で行った。第１部では、培養ケラチノサイトを試験材料と共に４８時間インキュベートし、その後、ＭＴＴアッセイを使用して生存細胞の数の変化を評価した。研究の第２部では、ＵＶＢを培養ケラチノサイトに照射し、その後、試験材料で４８時間処理した。４８時間の終了時に、ＭＴＴアッセイにより、生存細胞の数を再び評価した。
【０２４９】
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール）アッセイを使用して、生存細胞の細胞数の変化を決定し得る。ＭＴＴアッセイは、生存細胞の数を反映する細胞の代謝活性の比色分析である。生存細胞におけるミトコンドリアによるＭＴＴの還元は、紫色の不溶性ホルマジン結晶（これは、イソプロパノールを用いて細胞から抽出され、分光光度的に定量される）の形成をもたらす。紫色の強度は、代謝的に活性な細胞の数に正比例する。
【０２５０】
増殖アッセイ
増殖アッセイのために、ケラチノサイトを、成長因子を含まない９６ウェルプレートに播種し、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。この初期インキュベーションの後、培地を、試験材料を補充した培地と交換した。（成長因子を含む）通常培地を陽性対照として使用した。試験材料の添加後、上記のように細胞を４８時間培養した。インキュベーション期間の終了時に、ＭＴＴアッセイを使用して、生存細胞の数の変化を決定した。
【０２５１】
ＵＶＢ保護アッセイ
ＵＶＢ保護アッセイのために、通常培地を使用して、ケラチノサイトを９６ウェルプレートに播種し、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。この初期インキュベーションの後、培地を１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換し、細胞をＵＶＢ（４０ｍＪ／ｃｍ２）に曝露した。ＵＶＢへの曝露後、ＰＢＳを、試験材料を補充した新鮮培地に交換し（１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸は陽性対照として機能した）、細胞を３７±２℃および５±１％ＣＯ２で４８時間培養した。４８時間のインキュベーションの終了時に、ＭＴＴアッセイを使用して、細胞生存度を決定した。
【０２５２】
ＭＴＴアッセイ
４８時間のインキュベーションの後、細胞培養培地を除去し、０．５μｇ／ｍｌ  ＭＴＴを補充した２００μｌの培養培地と交換した。ウェルプレートを３７±２℃および５±１％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＭＴＴ溶液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、次いで、２００μｌのイソプロピルアルコールをウェルに添加して、紫色のホルマジン結晶を抽出した。ブランクとしてイソプロピルアルコールを使用して、９６ウェルプレートを５４０ｎｍで読み取った。
【０２５３】
試験材料で処理されていない（増殖アッセイ：無処理群）またはＵＶＢに曝露されていない（ＵＶＢ保護アッセイ：非ＵＶＢ曝露群）細胞の平均吸光度値を計算し、１００％細胞生存度を表すために使用した。次いで、様々な処理を受けている細胞からの個々の吸光度値を、１００％細胞生存度を表す平均吸光度値で割り、パーセントとして表して、各処理により引き起こされる細胞生存度の変化を決定した。
【０２５４】
ｈｉｓタグ付き短縮型クラゲコラーゲンを使用した増殖アッセイの結果は、表６に示されている。ｈｉｓタグ付き短縮型クラゲコラーゲンを使用したＵＶＢ保護アッセイの結果は、表７に示されている。両アッセイの値は、平均生存度±標準偏差として示されている。
【０２５５】
【表６】
2020535812.tif 000102
【０２５６】
【表７】
2020535812.tif 000103
【０２５７】
増殖アッセイのために、無処理群を使用して、１００％細胞生存度を表した。１００％を超える値は生存細胞の数の増加を反映するので、細胞増殖を示すものである。この研究では、試験材料は、細胞増殖を促進することが観察されなかった。
【０２５８】
加えて、配列番号９１の短縮型コラーゲンを使用して、ケラチノサイト増殖アッセイを実施した。実施例８にしたがって、５％ストック溶液の１％および０．５％コラーゲン溶液を調製し、試験した。配列番号９１の短縮型コラーゲンは、それぞれ１０２±２．９および１０２±２．０のケラチノサイト細胞生存度アッセイ値を有していた。観察された値は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０２５９】
細胞増殖に対するその効果に加えて、同様に試験材料をスクリーニングして、それがＵＶＢ曝露後の細胞回復に対して影響を有していたかを決定した。この研究では、ＵＶＢへの曝露は、曝露４８時間後に生存細胞の数の有意な減少をもたらすことが観察された。しかしながら、試験材料による処理は、細胞生存度のこの減少を防止した。効果は、０．０５％〜５％の濃度範囲内の試験材料で明らかであり、０．０５％の濃度における効果が最適であった。この濃度範囲内では、細胞生存度は無処理群よりも有意に高かったが（１つの例外は０．０１％濃度である）、これは、材料がＵＶＢ保護効果を有することを実証している。ＵＶＢ曝露後にこの材料を添加したので、それは、ＵＶＢ照射の損傷効果を減少させるように作用し得るか、またはそれは、損傷細胞のより迅速な速度での回復を支援し得る。後者に関して、短縮型コラーゲンは、皮膚に局所適用される場合に有益であり、ＵＶＢにより損傷した皮膚細胞に対する再生効果を有する。
【０２６０】
加えて、配列番号９１の短縮型コラーゲンを使用して、ＵＶＢ保護アッセイを実施した。配列番号９１の１％および０．５％コラーゲン溶液は、それぞれ８０±４．６および７８±２．５のケラチノサイト細胞生存度アッセイ値を有していた。観察された値は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０２６１】
実施例８：チミンダイマー形成に対する短縮型コラーゲンの効果
紫外線への曝露により、細胞中に存在するＤＮＡのチミンダイマー（ＴＴダイマー）の含有量は増加する。ＴＴダイマー形成の増加は、皮膚損傷および皮膚がんを含む特定のタイプの細胞増殖性疾患と相関する。
【０２６２】
配列番号１１のポリヌクレオチドを実施例１の発現系で発現させ、この実施例に記載されているように精製した。コードされるポリペプチドはＤｓｂＡ分泌タグを含む。分泌経路を介してポリペプチドがプロセシングされると、ＤｓｂＡタグ（配列番号１２のアミノ酸１〜２４）は、宿主細胞により切断される。ＤｓｂＡ分泌タグを有しない短縮型コラーゲンは、配列番号９１に提供されている。
【０２６３】
配列番号９１の短縮型コラーゲンを試験して、それが、ヒト表皮ケラチノサイトにおけるＴＴダイマー形成を減少させ得るかを決定した。この研究では、細胞をＵＶＢ（２５ｍＪ／ｃｍ２）に曝露した。曝露後、細胞を試験材料またはＴｒｏｌｏｘ（１００ｕｇ／ｍｌ）で処理し、一晩インキュベートした。翌日、細胞ＤＮＡを抽出し、ＥＬＩＳＡベースの方法を使用して、チミンダイマー含有量についてアッセイした。
【０２６４】
通常培地を使用して、ヒトケラチノサイトを１２ウェルプレートに播種し、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。この初期インキュベーションの後、培地を１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換し、細胞をＵＶＢ（２５ｍＪ／ｃｍ２）に曝露した。ＵＶＢへの曝露後、ＰＢＳを、試験材料またはＴｒｏｌｏｘ（１００μｇ／ｍｌ、これは陽性対照として機能した）を補充した新鮮培地に交換し、細胞を３７±２℃および５±１％ＣＯ２で一晩培養した。インキュベーションの終了時に、細胞ＤＮＡを抽出した。
【０２６５】
一晩のインキュベーションの後、細胞培養培地をウェルから除去し、２００μｌのＰＢＳおよび２０μｌのプロテイナーゼＫと交換した。プレートを回転させてＰＢＳおよびプロテイナーゼＫを混合した後、２００μｌのバッファーＡＬを各ウェルに添加した。プレートを再び回転させて試薬を混合した後、プレートを５５±２℃で１０分間インキュベートした。プレートを室温に冷却した後、２００μｌの１００％エタノールの添加により、ＤＮＡを沈殿させた。次いで、沈殿したＤＮＡ混合物を２ｍｌコレクションチューブ中のＤＮＥａｓｙスピンカラムに移し、８，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。フロースルーおよびコレクションチューブを廃棄し、５００μｌの洗浄バッファー１をスピンカラムに添加し、カラムを新たなコレクションチューブに入れ、８，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。フロースルーおよびコレクションチューブを再び廃棄し、５００μｌの洗浄バッファー２をスピンカラムに添加し、カラムを新たなコレクションチューブに入れ、１４，０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。次いで、スピンカラムを新たな１．５ｍｌ遠心チューブに入れ、１１０μｌの超純水をカラムに添加した。カラムを室温で１分間インキュベートし、次いで、８，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。
【０２６６】
蛍光定量的アッセイにより、抽出ＤＮＡを定量した。２μｌアリコートのＤＮＡサンプルを、９６ウェルプレート中で１００μｌのＴＥバッファーと混合した。また、一連のＤＮＡ標準を９６ウェルプレートのウェルに移した（二連で）。最後に、１００μｌの希釈Ｃｙｑｕａｎｔ  Ｇｒｅｅｎ色素を各ウェルに添加し、４８０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を使用して、各ウェルの蛍光強度を決定した。
【０２６７】
ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）ＵＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）を使用して、チミンダイマー検出を決定した。
【０２６８】
サンプルを９５℃で１０分間インキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡサンプルまたは標準のアリコートを一本鎖ＤＮＡに変換し、氷上で冷却した。１００μｌの各サンプルまたは標準をＤＮＡ結合ＥＬＩＳＡプレートに移し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを１００μｌのＰＢＳで１回リンスし、次いで、１５０μｌのアッセイ希釈剤で室温で１時間ブロッキングした。アッセイ希釈剤を除去した後、１００μｌの抗ＣＰＤ抗体を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートを１ウェル当たり２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、次いで１５０μｌのブロッキング試薬をプレートに添加した。プレートを室温で再び１時間ブロッキングし、次いで、前述のように３回洗浄する。次いで、１００μｌの二次抗体を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄した後、１００μｌの基質を各ウェルに添加し、プレートを５〜２０分間インキュベートして、プレートにおける発色を可能にした。１００μｌの停止溶液の添加により発色反応を停止させ、プレートリーダーを使用して、プレートを４６０ｎｍで読み取った。
【０２６９】
存在するＤＮＡの量を定量するために、既知濃度のＤＮＡおよび（ＲＦＵまたは相対蛍光単位で測定した）それらの各蛍光強度を使用して、標準曲線を作成した。回帰分析を実施して、これらのデータポイントに最も適合する線を確立した。次いで、未知の各サンプルの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を使用して、ＤＮＡの量を推定した。
【０２７０】
既知量のチミンダイマー含有量を有する一連のＤＮＡ標準を使用して、標準曲線を作成した。この標準曲線を使用して、サンプルＤＮＡのＤＮＡ損傷の量を決定した。各処理群の平均を計算し、ＡＮＯＶＡを使用して比較した。表８および図５では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、標準５％コラーゲン溶液（９５ｍｌの脱イオン水中の５ｇの短縮型コラーゲン）を示されている％溶液にさらに希釈した。
【０２７１】
【表８】
2020535812.tif 000104
【０２７２】
表８は、５％および１％短縮型コラーゲン溶液がＴＴダイマー形成を統計的に有意に減少させることを示す（ｐ＜０．０５）。データは、図５においてグラフで示されている。
【０２７３】
異なるロットの短縮型コラーゲン（配列番号９１）を用いて、実験を繰り返した。非ＵＶＢ曝露細胞におけるＴＴダイマーの量（ｎｇ／ｍｌ単位）は１．３±１．２であり、無処理細胞は１８．１±０．４であり、１００μｇ／ｍｌ  Ｔｒｏｌｏｘ処理細胞は７．９±０．３であり、５％コラーゲンは１３．１±０．２であり、１％コラーゲンは１７．４±０．７であった。非ＵＶＢ曝露細胞、Ｔｒｏｌｏｘ処理細胞、５％コラーゲン処理細胞および１％コラーゲン処理細胞のＴＴダイマー形成の減少は、無処理細胞と比較して統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０２７４】
実施例９：ヒトコラーゲン
短縮型ヒトコラーゲンタイプ２１アルファ１
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ２１アルファ１は、以下に開示されている。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に開示されている。配列番号７３および７４では、ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。配列番号７３および７４では、短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド７３〜６３３によりコードされ、アミノ酸２５〜２１１をコードする。
【０２７５】
このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号７３に提供されている。
【化９５】
2020535812.tif 000105
【０２７６】
アミノ酸配列は配列番号７４に開示されている。
【化９６】
2020535812.tif 000106
【０２７７】
ＤｓｂＡ分泌タグコラーゲンを有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ２１アルファ１をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号７５に提供されている。
【化９７】
2020535812.tif 000107
【０２７８】
ＤｓｂＡ分泌タグを有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ２１アルファ１のアミノ酸配列は、配列番号７６に開示されている。
【化９８】
2020535812.tif 000108
【０２７９】
短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２（１）
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２は、以下に開示されている。コドン最適化ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に開示されている。配列番号７８および７９では、ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド７３〜６３６によりコードされ、アミノ酸２５〜２１２をコードする。
【０２８０】
このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号７７に提供されている。
【化９９】
2020535812.tif 000109
【０２８１】
アミノ酸配列は配列番号７８に開示されている。
【化１００】
2020535812.tif 000110
【０２８２】
ＤｓｂＡ分泌タグを有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２（１）の核酸配列は、配列番号７９に開示されている。
【化１０１】
2020535812.tif 000111
【０２８３】
ＤｓｂＡ分泌タグを有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２（１）のアミノ酸配列は、配列番号８０に開示されている。
【化１０２】
2020535812.tif 000112
【０２８４】
短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２（２）
Ｈｉｓタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２は、以下に開示されている。コドン最適化ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に開示されている。配列番号８２および８３では、ＤｓｂＡ分泌タグはヌクレオチド１〜７２によりコードされ、アミノ酸１〜２４をコードする。短縮型コラーゲン配列はヌクレオチド７３〜６０９によりコードされ、アミノ酸２５〜２０３をコードする。
【０２８５】
このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号８１に提供されている。
【化１０３】
2020535812.tif 000113
【０２８６】
アミノ酸配列は配列番号８２に開示されている。
【化１０４】
2020535812.tif 000114
【０２８７】
ＤｓｂＡ分泌タグを有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２（２）の核酸配列は配列番号８３に開示されている。
【化１０５】
2020535812.tif 000115
【０２８８】
ＤｓｂＡ分泌タグを有しない短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２（２）のアミノ酸配列は、配列番号８４に開示されている。
【化１０６】
2020535812.tif 000116
【０２８９】
本明細書に記載されるように、配列番号７３、７７または８１のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングして、形質転換ベクターを調製した。実施例２に記載されているように、宿主細胞をベクターで形質転換し、ポリヌクレオチドを発現させた。
【０２９０】
発酵が完了した後、実施例３に開示されている手順を使用して、発酵ブロスから短縮型ヒトコラーゲンを精製した。実施例３に開示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣを使用して、精製短縮型ヒトコラーゲンを分析した。
【０２９１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、３つの短縮型ヒトコラーゲンはすべて、予想分子量に泳動した。ＨＰＬＣを使用した短縮型ヒトコラーゲンの分析では、実施例３のクラゲコラーゲンを使用した標準曲線を利用した。ヒトコラーゲンの保持時間は、クラゲコラーゲンとはわずかに異なっていた。配列番号７６の保持時間は５．６４５分であり、配列番号８０の保持時間は５．６３１分であり、配列番号８４は２つのピークに泳動し、保持時間は５．５３１および５．７分であった。
【０２９２】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮５
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮５のアミノ酸配列は、配列番号９２に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号９３のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号９２のアミノ酸１〜１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号９３のヌクレオチド５８〜６５７であり、アミノ酸配列は配列番号９２のアミノ酸２０〜２１９である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号９３のヌクレオチド６５８〜６８４であり、アミノ酸配列はアミノ酸２２０〜２２８である。
【化１０７】
2020535812.tif 000117
【０２９３】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮５の核酸配列は、配列番号９３に開示されている。
【化１０８】
2020535812.tif 000118
【０２９４】
配列番号９３のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型コラーゲンを精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約１００キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０２９５】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮６
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮６のアミノ酸配列は、配列番号９４に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号９５のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号９４のアミノ酸１〜１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号９５のヌクレオチド５８〜６５７であり、アミノ酸配列は配列番号９４のアミノ酸２０〜２１９である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号９５のヌクレオチド６５８〜６８４であり、アミノ酸配列は配列番号９４のアミノ酸２２０〜２２８である。
【化１０９】
2020535812.tif 000119
【０２９６】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮６の核酸配列は、配列番号９５に開示されている。
【化１１０】
2020535812.tif 000120
【０２９７】
配列番号９４のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型コラーゲンを精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約２５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０２９８】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮７
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮７のアミノ酸配列は、配列番号９６に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号９７のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号９６のアミノ酸１〜１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号９６のヌクレオチド５８〜７５９であり、アミノ酸配列は配列番号９６のアミノ酸２０〜２５３である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号９７のヌクレオチド７６０〜７８６であり、アミノ酸配列は配列番号９６のアミノ酸２５４〜２６２である。
【化１１１】
2020535812.tif 000121
【０２９９】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲンタイプ１アルファ２短縮７の核酸配列は、配列番号９７に開示されている：
【化１１２】
2020535812.tif 000122
【０３００】
配列番号９７のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型コラーゲンを精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約３０キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３０１】
実施例１０：線維芽細胞に対する短縮型ヒトコラーゲンの保護効果
実施例６の方法にしたがって、線維芽細胞生存度、プロコラーゲン合成およびエラスチン合成に対する短縮型ヒトコラーゲンの効果を決定する。
【０３０２】
実施例７の方法にしたがって、ケラチノサイト増殖およびＵＶＢ保護に対する短縮型ヒトコラーゲンの効果を決定する。
【０３０３】
実施例８の方法にしたがって、ＵＶ照射への曝露後のチミンダイマー形成に対する短縮型コラーゲンの効果を決定する。
【０３０４】
本明細書に記載される実施例および実施形態は例示目的にすぎず、それを考慮した様々な改変または変更は当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれると理解されよう。本明細書で引用される刊行物、特許および特許出願はすべて、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０５】
実施例１１：炎症性サイトカインに対する短縮型コラーゲンの効果
ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞は、皮膚の免疫反応において重要な役割を果たす。刺激性化学物質またはＵＶ照射（炎症促進性／刺激促進性（pro-irriation）刺激）に応答して、ケラチノサイトは広範なサイトカインを放出し得る。これらのサイトカインは、炎症部位への免疫細胞の関与を支援すると考えられる。ケラチノサイトにより放出されるサイトカインとしては、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８およびＩＬ−１ＲＡが挙げられる。
【０３０６】
この研究に使用した試験モデルはＭａｔＴｅｋ  ＥｐｉＤｅｒｍであった。この皮膚モデルは、培養されてヒト表皮の高度に分化した多層化モデルを形成した正常ヒト由来表皮ケラチノサイトからなる。超微細構造分析により、ケラトヒアリン顆粒、トノフィラメント束、デスモソーム、およびインビボ表皮に特徴的なパターンで配置された細胞間層状脂質層を含有する多層角質層の存在が明らかになった。このモデルでは、成熟表皮特異的分化のマーカー、例えばプロフィラグリン、Ｋ１／Ｋ１０サイトケラチンペア、被膜およびタイプＩ上皮トランスグルタミナーゼが局在化している。ＭａｔＴｅｋ  ＥｐｉＤｅｒｍはまた、有糸分裂的および代謝的に活性である。
【０３０７】
ＭａｔＴｅｋ  ＥｐｉＤｅｒｍ組織を使用して、炎症性メディエーターＩＬ−１ａの放出を阻害する様々な試験材料の能力を評価した。試験材料を、市販の局所用ヒドロコルチゾン調製物（陽性対照）ならびに無処理組織（陰性対照１）および炎症をおこしていない無処理組織（陰性対照２）と比較した。また、この試験を使用して、試験材料への曝露後の組織の生存度を評価した。
【０３０８】
ＩＬ−１α、ＩＬ−６およびＩＬ−８はケラチノサイトにおいて合成および保存され、皮膚刺激および炎症のメディエーターとして同定されている。これらのサイトカインの放出は、比色分析ベースの酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により、組織培養培地中で直接測定され得る。簡潔に言えば、固体支持体に共有結合的に連結された抗体は、使用済み培養培地サンプル中に存在するＩＬ−１ａ、ＩＬ−６またはＩＬ−８に結合するであろう。次に、アセチルコリンエステラーゼ酵素に共有結合的に付着された二次抗体は、特異的に結合したサイトカインを検出するであろう。適切な色基質の添加により、アセチルコリンエステラーゼ酵素は、分光光度法で測定され得る着色された最終生成物を生成するであろう。
【０３０９】
ＭａｔＴｅｋ  ＥｐｉＤｅｒｍ組織はＭａｔＴｅｋ社から購入し、使用まで４℃で保存した。使用前に、使用すべき組織をアガロース輸送トレイから取り出し、０．９ｍｌのヒドロコルチゾン不含アッセイ培地（３７±２℃）を含有する６ウェルプレートに入れた。組織を３７±２℃および５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。この初期インキュベーションの後、アッセイ培地を、０．９ｍｌの新鮮ヒドロコルチゾン不含培地（３７±２℃）と交換した。各試験材料について、３つの組織を調製した。
【０３１０】
ＵＶ照射（ＵＶＢ）により、組織における炎症反応を開始させた。ＵＶランプを使用して、線量３００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ放射線を組織に与えた。炎症性刺激の適用の直後に、５０μｌまたはｍｇの試験材料を組織の表面に直接適用した。陽性対照として市販のヒドロコルチゾンクリームを使用した。陰性対照のために、組織を炎症性刺激に曝露したが、いかなるタイプの抗炎症性物質でも処理しなかった。サイトカインのベースライン測定値を提供するために、１つのさらなる組織セットを炎症性刺激に曝露せずに放置した。炎症性刺激への曝露後、組織を３７±２℃および５±１％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、細胞培養培地を収集し、サイトカインの分析まで−７５℃で保存した。
【０３１１】
適切な捕捉抗体をＰＢＳで希釈することにより、ＥＬＩＳＡプレートを調製した。次に、１００μｌの希釈捕捉抗体を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、プレートを室温で一晩インキュベートした。翌日、プレートを３００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、次いで、３００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を各ウェルに添加することによりブロッキングした。プレートをブロッキングバッファーと共に少なくとも１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ブロッキングバッファーを除去し、上記のようにプレートを３回洗浄した。
【０３１２】
一連の標準を調製し、１００μｌのこれらの各標準を適切な９６ウェルプレートの２つのウェル（二連で）に分注した。続いて、１００μｌの各サンプルをさらなるウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、上記のようにプレートを３回洗浄した。最後の洗浄液を除去したら、１００μｌのビオチンコンジュゲート検出抗体を添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした後、上記のようにプレートを再び洗浄した。次いで、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジンを各ウェルに添加し、プレートを室温で２０分間インキュベートした。最後の洗浄液を除去したら、１００μｌの基質溶液（過酸化水素＋色素源としてのテトラメチルベンジジン）を各ウェルに添加した。十分なレベルの発色が発生したら、５０μｌの停止溶液（２Ｎ硫酸）を各ウェルに添加し、プレートを４６０ｎｍで読み取った。
【０３１３】
２４時間のインキュベーションの後、組織を少なくとも１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水で２回リンスして試験材料を除去し、次いで、ＭＴＴ（１ｍｇ／ｍｌ）を補充した１．０ｍｌのアッセイ培地を含有する６ウェルプレートに移し、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で３±０．２５時間インキュベートした。インキュベーションの後、組織を１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水で少なくとも２回リンスし、ブロット乾燥し、次いで、１ウェル当たり２ｍｌのイソプロパノールを含有する２４ウェルプレートに入れた。２４ウェルプレートをカバーし、ロッキングプラットフォーム上、室温で少なくとも２時間インキュベートして、組織から還元ＭＴＴを抽出した。抽出後、イソプロパノール／ＭＴＴ混合物の２００μｌサンプルを９６ウェルプレートに移し、ブランクとして２００μｌのイソプロパノールを使用してプレートリーダーを用いて、サンプルの吸光度を５４０ｎｍで読み取った。ＭＴＴアッセイは、本明細書の実施例６に記載されている。ＭＴＴアッセイの細胞生存度の結果は、実施例６で得られた結果と同様であった。
【０３１４】
ＩＬ−１ａアッセイの結果は、以下の表９に示されている。配列番号９１のクラゲコラーゲンの２％ストック溶液はサンプル４であり、サンプル３は、配列番号１０の短縮型クラゲコラーゲンの２％ストック溶液である。以下の表９では、示されているパーセンテージは、試験に使用したストック溶液の希釈％である。例えば、１％サンプル４処理は、２％ストック短縮型コラーゲン溶液の１％溶液である。無処理細胞は、１８．２ｐｇ／ｍｌのＩＩ−１ａを産生した。短縮型コラーゲンによる処理により、すべてのサンプルはＩｌ−１ａ産生の減少を示した。１％サンプル４処理はＩＬ−１Ａ産生を１３．４ｐｇ／ｍｌに減少させたが、これは、０．０５未満のｐ値で有意である。ＩＬ−１ａ産生の減少は、短縮型コラーゲンが抗炎症効果を有することを示す。
【表９】
2020535812.tif 000123
【０３１５】
実施例１２：短縮型コラーゲンによるアーバンダスト保護
ケラチノサイト細胞培養モデルを使用して、アーバンダストへの曝露後の細胞生存を促進することにより保護効果を発揮する短縮型コラーゲンの能力を評価した。
【０３１６】
ヒト表皮ケラチノサイトを試験材料で前処理し、次いで、アーバンダストに曝露した。次いで、処理期間の終了時に、ＭＴＴアッセイにより、細胞生存度の変化を決定した。
【０３１７】
ケラチノサイトを、１００μｌの培地中、９６ウェルプレートの個々のウェルに播種し、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、吸引により培地を除去してあらゆる非接着細胞を排除し、１００μｌの新鮮培地と交換した。細胞をコンフルエントまで成長させ、培地を４８〜７２時間ごとに交換した。
【０３１８】
試験材料による前処理とそれに続くアーバンダスト処理
細胞培養培地中で、試験材料を２×最終所望濃度で調製した。アーバンダスト（Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌｓのＮＩＳＴ１６４９Ｂ）も２×溶液で調製した。前処理のために、５０μｌの２×試験材料を５０μｌの培養培地と合わせ、細胞を２４時間インキュベートした。前処理期間の終了時に、試験材料含有培養培地を除去し、５０μｌの２×アーバンダストおよび５０μｌの培地と交換した。別の細胞セットを培地のみで処理し（非ダスト曝露）、１００％細胞生存度を表すための参照対照として使用した。次いで、細胞を２４時間インキュベートし、次いで、ＭＴＴアッセイに供して、細胞生存度の変化を決定した。
【０３１９】
処理期間の終了時に、細胞培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを補充した１００μｌの細胞培養培地を各ウェルに添加し、細胞を３７＋２℃および５＋１％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、培地／ＭＴＴ溶液を除去し、細胞をＰＢＳで再び１回洗浄し、次いで、１００μｌのイソプロピルアルコールをウェルに添加して、紫色のホルマジン結晶を抽出した。次いで、ブランクとしてイソプロピルアルコールを使用して、９６ウェルプレートを５４０ｎｍで読み取った。
【０３２０】
非ダスト曝露細胞の平均ＭＴＴ吸光度値を計算し、細胞数の１００％値を表すために使用した。次いで、様々な処理を受けている細胞からの個々のＭＴＴ値を非ダスト曝露細胞の平均値で割り、パーセントとして表して、各処理により引き起こされる細胞数の変化を決定した。
【０３２１】
試験材料による前処理、その後のダスト処理のＭＴＴ結果は、表１０に示されている。表１０は、細胞を漸増量のコラーゲンで処理すると、短縮型コラーゲンによる前処理およびその後のアーバンダストへの曝露時の細胞生存度が増加したことを示す。これらの結果は、短縮型コラーゲンが、アーバンダスト曝露に関連する細胞生存度の低下から保護することを示す。
【表１０】
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【０３２２】
実施例１２：短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）コラーゲン
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）線維状コラーゲン１
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ線維状コラーゲン１のアミノ酸配列は、配列番号１０２に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１０３のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１０２のアミノ酸１〜１９である。線維状コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１０３のヌクレオチド５８〜７９２であり、アミノ酸配列は配列番号１０２のアミノ酸２０〜２６４である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１０３のヌクレオチド７９３〜８１９であり、アミノ酸配列は配列番号１０２のアミノ酸２６５〜２７３である。
【化１１３】
2020535812.tif 000125
【０３２３】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ線維状コラーゲン１の核酸配列は、配列番号１０３に開示されている。
【化１１４】
2020535812.tif 000126
【０３２４】
配列番号１０３のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ線維状コラーゲン１を精製した。精製線維状コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約４０キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３２５】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）線維状コラーゲン２
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ線維状コラーゲン２のアミノ酸配列は、配列番号１０４に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１０５のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１０４のアミノ酸１〜１９である。線維状コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１０５のヌクレオチド５８〜１３２３であり、アミノ酸配列は配列番号１０４のアミノ酸２０〜４４１である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１０５のヌクレオチド１３２４〜１３５０であり、アミノ酸配列は配列番号１０５のアミノ酸４４２〜４５０である。
【化１１５】
2020535812.tif 000127
【０３２６】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ線維状コラーゲン２の核酸配列は、配列番号１０５に開示されている。
【化１１６】
2020535812.tif 000128
【０３２７】
配列番号１０５のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ線維状コラーゲン２を精製した。精製線維状コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約５５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３２８】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）非線維状コラーゲン１
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ非線維状コラーゲン１のアミノ酸配列は、配列番号１０６に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１０７のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１０６のアミノ酸１〜１９である。非線維状コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１０７のヌクレオチド５８〜８３１であり、アミノ酸配列は配列番号１０６のアミノ酸２０〜２７７である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１０７のヌクレオチド８３２〜８５８であり、アミノ酸配列は配列番号１０６のアミノ酸２７８〜２８６である。
【化１１７】
2020535812.tif 000129
【０３２９】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ非線維状コラーゲン１の核酸配列は、配列番号１０７に開示されている。
【化１１８】
2020535812.tif 000130
【０３３０】
配列番号１０７のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ非線維状コラーゲン１を精製した。精製非線維状コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約３０キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３３１】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）非線維状コラーゲン２
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ非線維状コラーゲン２のアミノ酸配列は、配列番号１０８に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１０９のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１０８のアミノ酸１〜１９である。非線維状コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１０９のヌクレオチド５８〜１５０９であり、アミノ酸配列は配列番号１０８のアミノ酸２０〜５０３である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１０９のヌクレオチド１５１０〜１５３６であり、アミノ酸配列は配列番号１０８のアミノ酸５０４〜５１２である。
【化１１９】
2020535812.tif 000131
【０３３２】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ非線維状コラーゲン２の核酸配列は、配列番号１０９に開示されている。
【化１２０】
2020535812.tif 000132
【０３３３】
配列番号１０９のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ非線維状コラーゲン２を精製した。精製線維状コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約６０キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３３４】
実施例１３：短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）コラーゲン
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）コラーゲンタイプ１アルファ１短縮１
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ１短縮１のアミノ酸配列は、配列番号１１０に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１１１のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１１０のアミノ酸１〜１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１１１のヌクレオチド５８〜６３０であり、アミノ酸配列は配列番号１１０のアミノ酸２０〜２１０である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１１１のヌクレオチド６３１〜６５７であり、アミノ酸配列は配列番号１１０のアミノ酸２１１〜２１９である。
【化１２１】
2020535812.tif 000133
【０３３５】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ１短縮１の核酸配列は、配列番号１１１に開示されている。
【化１２２】
2020535812.tif 000134
【０３３６】
配列番号１１１のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ１短縮１を精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約２５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３３７】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）コラーゲンタイプ６アルファ１短縮２
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ６短縮２のアミノ酸配列は、配列番号１１２に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１１３のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１１２のアミノ酸１〜１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１１３のヌクレオチド５８〜６８４であり、アミノ酸配列は配列番号１１２のアミノ酸２０〜２２８である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１１３のヌクレオチド６８５〜７１１であり、アミノ酸配列は配列番号１１２のアミノ酸２２９〜２３７である。
【化１２３】
2020535812.tif 000135
【０３３８】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ６短縮２の核酸配列は、配列番号１１３に開示されている。
【化１２４】
2020535812.tif 000136
【０３３９】
配列番号１１３のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ６短縮２を精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約３５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【０３４０】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）コラーゲンタイプ６アルファ１短縮３
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ６アルファ１短縮３のアミノ酸配列は、配列番号１１４に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは配列番号１１５のヌクレオチド１〜５７によりコードされ、アミノ酸配列は配列番号１１４のアミノ酸１〜１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は配列番号１１５のヌクレオチド５８〜７３５であり、アミノ酸配列は配列番号１１４のアミノ酸２０〜２４５である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は配列番号１１５のヌクレオチド７３６〜７６２であり、アミノ酸配列は配列番号１１４のアミノ酸２４６〜２５４である。
【化１２５】
2020535812.tif 000137
【０３４１】
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ６アルファ１短縮３の核酸配列は、配列番号１１５に開示されている。
【化１２６】
2020535812.tif 000138
【０３４２】
配列番号１１５のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ１短縮１を精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約２５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
【図１】
2020535812.tif 000139
【図２】
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【図３】
2020535812.tif 000141
【図４】
2020535812.tif 000142
【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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