(57)【要約】  核酸分子を配列決定する方法が、ウェル（２０５）上に存在する膜（２１４）内のナノポア（２１６）、ウェルの下部の第１の電極（２０２）、膜上のチャンバ（２１５）内の第２の電極（２１０）、およびウェル（２０５）およびチャンバ（２１５）内の電解質（２０６、２０８）を有する、配列決定セル（２００）を提供することを含む。第１の電極（２０２）は、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され、電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する。第１の電圧信号（１３１０）は、第１と第２の電極（２０２、２１０）とを横断して印加され、それにより、配列決定セル内の核酸分子を、ナノポア（２１６）を通して移動させる力を、生じさせる。第１の電圧信号（１３１０）は、第１の電圧信号の印加中に、第１の電極（２０２）でのキャパシタンスの変化を補償するために、増大する。方法は、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応する、第１の電圧信号の間に測定された信号値を決定することをさらに含む。
2020500296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェル上に存在する膜内のナノポアと、前記ウェルの下部の第１の電極と、前記膜上のチャンバ内の第２の電極と、前記ウェルおよび前記チャンバ内の電解質とを備える、配列決定セルを用いた、核酸分子を配列決定する方法であって、
前記第１の電極は、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され、前記電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する、前記方法において、
第１の電圧信号を、前記第１の電極と前記第２の電極とを横断して印加し、それにより、前記配列決定セル内の核酸分子を、前記ナノポアを通して移動させる力を生じさせるステップであって、前記第１の電圧信号は、前記第１の電圧信号の印加中に、前記第１の電極での前記キャパシタンスの変化を補償する第１の変化率で増大するように構成される前記ステップ、および、
前記第１の電圧信号の間に測定された第１の信号値のセットを決定するステップであって、前記第１の信号値のセットは、前記核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応する前記ステップ、を含む、
前記方法。
【請求項２】
前記第１の電極および前記第２の電極を横断する第２の電圧信号と、前記第１の電圧信号と反対の極性を有する前記第２の電圧信号とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに応じた信号値の測定を可能にするために、前記核酸分子が、前記核酸分子が前記ナノポアを通り移動する速度を変更するように構成された、１つまたは複数のスピードバンプを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の変化率を、任意選択的にＲＣ（抵抗−キャパシタンス）時定数を有する、前記配列決定セルの放電特性から決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の電圧信号が、線形的に増大する振幅、指数関数的に増大する振幅、または振幅を増大させる階段状の信号によって、特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
事前設定された参照電圧と比較して、前記ナノポア全体にかかるナノポア電圧を監視するステップ、
ナノポア電圧の振幅が、前記事前設定された参照電圧より低く降下したことが検出されると、前記第１の電圧信号の振幅を、前記事前設定された参照電圧より高い第２の電圧まで増大するステップ、および、
前記第１の電圧信号の間に測定された第２の信号値のセットを決定するステップであって、前記第２の信号値のセットは、前記核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応するステップ、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノポア全体にかかる電圧の前記振幅を監視するステップが、前記配列決定セルを通る電流を監視するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の電圧信号が、ベース電圧に重畳された複数の電圧パルス信号を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の信号値のセットが、電圧信号を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の信号値のセットが、電流信号を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ウェル上に存在する膜内のナノポアと、前記ウェルの下部の第１の電極と、前記膜上のチャンバ内の第２の電極と、前記ウェルおよび前記チャンバ内の電解質とを備える、配列決定セルを用いた、核酸分子を配列決定する方法であって、
第１の電圧信号を、前記第１の電極と前記第２の電極とを横断して印加し、それにより、前記配列決定セル内の核酸分子を、前記ナノポアを通して移動させる力を生じさせるステップ、
前記第１の電圧信号の間に測定された第１の１つまたは複数の信号値のセットを決定するステップであって、前記第１の信号値のセットは、前記核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応するステップ、
事前設定された参照電圧と比較して、前記ナノポア全体にかかるナノポア電圧の振幅を監視するステップ、
前記ナノポア電圧の振幅が、前記事前設定された参照電圧より低いと判定されると、前記第１の電圧信号の振幅を、前記ナノポア電圧が前記事前設定された参照電圧に等しくまたはそれより高くなるように、第２の電圧まで増大するステップ、および、
前記第１の電圧信号が前記第２の電圧にある間に測定された第２の１つまたは複数の信号値のセットを決定するステップであって、前記第２の信号値のセットは、前記核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記ナノポア全体にかかる電圧の前記振幅を監視するステップが、前記配列決定セルを通る電流を監視するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の電極が、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され、前記電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ウェル上に存在する膜内のナノポアと、前記ウェルの下部の第１の電極と、前記膜上のチャンバ内の第２の電極と、前記ウェルおよび前記チャンバ内の電解質とを備える、配列決定セルを用いた、核酸分子を配列決定する方法であって、
第１の電圧信号を、前記第１の電極と前記第２の電極とを横断して印加し、それにより、前記配列決定セル内の核酸分子を、前記ナノポアを通して移動させる力を生じさせるステップであって、前記第１の電圧信号が、ベース電圧に重畳された複数の電圧パルス信号を含むステップ、
前記第１の電圧信号の間に測定された第１の信号値のセットを決定するステップであって、前記第１の信号値のセットは、前記核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記第１の電極が、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され、前記電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の電圧パルス信号が、前記核酸分子を前記配列決定セル内のナノポアを通して加速させるように構成された、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
信号値の測定を可能にするために、前記核酸分子が、前記核酸分子が前記ナノポアを通り移動する速度を変更するように構成された、１つまたは複数のスピードバンプを備え、
前記複数の電圧パルス信号は、前記スピードバンプを、前記複数の電圧パルス信号がないときより高い変化率で、ナノポアを通して除去されるまたは通過するようにさせる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベース電圧が、時間と共に増大するように構成された、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の電圧信号が、正の部分と負の部分とを有するＡＣスイッチング印加電圧を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の電圧パルス信号の各々が、一定の振幅を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の電圧パルス信号の各々が、増大する振幅を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の電圧パルス信号が、２ミリ秒の周期を有し、各電圧パルスが、０．１ミリ秒の持続時間を有する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]内径が１ナノメートル程度のポアサイズを有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定において見込みを示してきた。電位が導電性流体に浸漬されたナノポア全体に印加されたとき、ナノポア全体のイオンの伝導に起因するわずかなイオン電流が存在し得る。電流の量は、ナノポア内のポアサイズおよび分子の特性に影響される。いくつかの事例では、分子は、特定のヌクレオチドに取り付けられた特定のタグであり得て、それにより核酸の特定の位置にあるヌクレオチドの検出が可能になる。他の事例では、分子は、ポアによって充填され得て、それにより核酸のヌクレオチド配列の検出が可能になる。ナノポアを含む回路内の電圧または他の信号は、分子の抵抗を測定する方法として測定され得て（例えば、積分コンデンサにおいて）、それによりナノポア内の分子の検出が可能になる。
【０００２】
[0002]ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定に用いられ得る。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込み得る。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含み得る。
【０００３】
[0003]測定される信号は、製造のばらつきにより、チップ毎に、かつ同一チップ内のセル毎に変化し得る。そのため、セル内の特定の核酸または他の重合体の中の本当のヌクレオチドに対応し得る、本当の分子を測定することは困難であり得る。加えて、他の時間に依存する測定信号の非理想性が、不正確の原因となり得る。例えば、配列決定セルの電圧は、時間とともに変化し得る。また、これらの回路は、例えば、脂質二重層、ナノポアなどの生化学的な回路素子を利用するので、電気的特性の変動性が、従来の半導体回路より、はるかに高くなり得る。さらに、配列決定プロセスは、本質的に確率的であり、それゆえ、変動性が、ナノポアを使用しない配列決定装置を含めて、多種多様なシステム全体で発生し得る。
【０００４】
[0004]したがって、配列決定プロセスの精度および安定性を向上させる、改善された評価技術が所望される。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]多様な実施形態が、配列決定セルのアレイ内に配置され得る（例えば、チップ上のナノポアのアレイ）、配列決定セル内の核酸の配列測定に関する技術およびシステムを提供する。
【０００６】
[0006]本発明のいくつかの実施形態では、例えば単鎖のＤＮＡ分子などの核酸分子を配列決定する方法が、提供される。方法は、延長された期間にわたり、単鎖の核酸を配列決定するための十分な印加電圧を供給し得る。増大する振幅を有する電圧が、印加電圧の持続時間の間中、配列決定を実行するのに十分な振幅を有するナノポア電圧を維持するために、ナノポアセルに印加され得る。配列決定作業は、電圧がより長い持続時間印加され得ることで、より多くの核酸分子が配列決定されることを可能にすることにより、さらに効果的にされ得る。高められた精度はまた、ナノポア電圧が比較的一定（例えば、指定された期間内のしきい値量より低く減じられた）となる結果として、得られ得る。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態によれば、核酸分子を配列決定する方法は、配列決定セルを提供するステップを含む。配列決定セルは、ウェル上に存在する膜内のナノポア、ウェルの下部の第１の電極、膜上のチャンバ内の第２の電極、およびウェルおよびチャンバ内の電解質を含み得る。第１の電極は、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され得て、電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する。方法は、第１の電圧信号を、第１の電極と第２の電極とを横断して印加するステップをさらに含み得て、それにより、配列決定セル内の核酸分子を、ナノポアを通して移動させる力を、生じさせる。第１の電圧信号は、第１の電圧信号の印加中に、第１の電極でのキャパシタンスの変化を補償するために、第１の変化率で増大するように構成され得る。方法は、第１の電圧信号の間に測定された第１の信号値のセットを決定するステップをさらに含み得て、第１の信号値のセットは、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応する。
【０００８】
[0008]代替の実施形態によれば、核酸分子を配列決定する方法は、配列決定セルを提供するステップを含み得る。配列決定セルは、ウェル上に存在する膜内のナノポア、ウェルの下部の第１の電極、膜上のチャンバ内の第２の電極、およびウェルおよびチャンバ内の電解質を有し得る。第１の電圧信号は、第１の電極と第２の電極とを横断して印加され得て、それにより、配列決定セル内の核酸分子を、ナノポアを通して移動させる力を、生じさせ、第１の電圧信号の間に測定された１つまたは複数の信号値の第１のセットが決定され得る。第１の信号値のセットは、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応し得る。方法は、事前設定された参照電圧と比較して、ナノポア全体にかかるナノポア電圧の振幅を監視するステップを含み得る。ナノポア電圧の振幅が、事前設定された参照電圧より低いと判定されると、第１の電圧信号の振幅は、ナノポア電圧が事前設定された参照電圧に等しくまたはそれより高くなるように、第２の電圧まで増大され得る。１つまたは複数の信号値の第２のセットが、測定されてもよい。第２の信号値のセットは、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応し得る。
【０００９】
[0009]他の実施形態によれば、核酸分子を配列決定する方法は、配列決定セルを提供するステップを含み得る。配列決定セルは、ウェル上に存在する膜内のナノポア、ウェルの下部の第１の電極、膜上のチャンバ内の第２の電極、およびウェルおよびチャンバ内の電解質を有し得る。方法は、第１の電圧信号を、第１の電極と第２の電極とを横断して印加するステップを含み得て、それにより、配列決定セル内の核酸分子を、ナノポアを通して移動させる力を、生じさせる。第１の電圧信号は、ベース電圧に重畳された複数の電圧パルス信号を含み得る。方法は、第１の電圧信号の間に測定された第１の信号値のセットを決定するステップをさらに含み得る。第１の信号値のセットは、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応し得る。
【００１０】
[0010]他の実施形態は、本明細書で説明される方法に関連付けられるシステムおよびコンピュータ可読媒体、ならびにそのようなコンピュータ可読媒体を備える機器に向けられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0011]本発明の実施形態による、ナノポアセルのアレイを備えるナノポアセンサチップの一実施形態の上面図である。
【図２】[0012]本発明の実施形態による、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特徴づけるために使用され得る、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一実施形態である。
【図３】[0013]本発明の実施形態による、ナノポアベースの、合成による配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するナノポアセルの一実施形態である。
【図４】[0014]本発明の実施形態による、ナノポアセル内の電気回路である。
【図５】[0015]本発明の実施形態による、ＡＣサイクルの明期間（部分）および暗期間（部分）中のナノポアセルから取得されたデータポイントの例である。
【図６】[0016]本発明の実施形態による、単鎖のＤＮＡを特徴づけるために使用され得る、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一実施形態である。
【図７】[0017]本発明の実施形態による、ナノポアを通過する単鎖のＤＮＡを有する、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一部の一実施形態である。
【図８】[0018]本発明の実施形態による、ナノポアを通過するスピードバンプを伴う単鎖のＤＮＡを有する、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一部の一実施形態である。
【図９】[0019]本発明の実施形態による、ナノポアを通過する単鎖のＤＮＡを有する、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一実施形態において測定された電気的信号の一例である。
【図１０Ａ】[0020]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、測定された電気的信号の減衰を示すグラフである。
【図１０Ｂ】[0021]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、測定された電気的信号の減衰の別の例を示すグラフである。
【図１１】[0022]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、一定の印加電圧に対するナノポア電圧の減衰を示すグラフである。
【図１２】[0023]本発明の実施形態による、核酸分子を配列決定する方法を示すフローチャートである。
【図１３Ａ】[0024]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、線形的に増大する印加電圧に対するナノポア電圧を示すグラフである。
【図１３Ｂ】[0025]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、階段状の印加電圧に対するナノポア電圧を示すグラフである。
【図１４】[0026]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、指数関数的に増大する印加電圧に対するナノポア電圧を示すグラフである。
【図１５】[0027]本発明の実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、揺動パルスを含む増大する印加電圧に対するナノポア電圧を示すグラフである。
【図１６】[0028]本発明の実施形態による、ナノポアセルの電気回路である。
【図１７】[0029]本発明のいくつかの実施形態による、揺動パルスを伴う印加電圧の降下を示す、ナノポアセルから取得されたデータポイントの例である。
【図１８】[0030]本発明の実施形態による、核酸分子を配列決定する方法を示すフローチャートである。
【図１９】[0031]本発明の実施形態による、フィードバック制御を用いた、非ファラデー性ナノポアセル内の、動的に印加される電圧に対するナノポア電圧を示すグラフである。
【図２０】[0032]本発明の実施形態による、本明細書で説明するシステムおよび方法と共に使用可能な一例のコンピュータシステムのブロック図である。
【００１２】
用語
[0033]別途定義されない限り、本明細書で用いられる技術的および科学的な用語は、当業者によって一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書で説明される方法、装置、および材料と同様のまたは同等のものが、開示された技術の実施で使用され得る。以下の用語は、頻繁に使用される一定の用語の理解を促進するために提供され、本開示の範囲を限定することを意味しない。本明細書で用いられる略語は、化学的および生物学の分野でのその従来の意味を有する。
【００１３】
[0034]「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本または二本鎖の何れかの形態の、その重合体を指し得る。この用語は、合成の、自然発生的、非自然発生的であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の挙動で代謝する、周知のヌクレオチドの類似物または修飾された主鎖の残基または連鎖を含む核酸を包含し得る。そのような類似物の例は、それだけには限らないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、メチルホスホン酸塩、キラルメチルホスホン酸塩、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み得る。別途規定されていない限り、個々の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、従来の方法で修飾されたその変形形態（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列を、暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される、配列を発生させることによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１  （１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に用いられ得る。
【００１４】
[0035]用語「鋳型」は、ＤＮＡ合成のためのＤＮＡヌクレオチドの相補的鎖へ複製される一本鎖核酸分子を示し得る。場合によっては、鋳型は、ｍＲＮＡの合成中に複製されるＤＮＡの配列を示し得る。
【００１５】
[0036]用語「プライマ」は、ＤＮＡ合成の開始点を提供する短い核酸配列を示し得る。ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ合成を触媒する酵素は、新らたなヌクレオチドをＤＮＡ複製用プライマに加え得る。
【００１６】
[0037]「ポリメラーゼ」は、鋳型を用いたポリヌクレオチドの合成を行う酵素を示し得る。この用語は、完全な長さのポリペプチドとポリメラーゼ活性を有する範囲とを両方とも包含する。ＤＮＡポリメラーゼは、当業者によく知られており、それだけに限定されないが、パイロコッカス・フリオサス、サーモコッカス・リトラリス、およびサーモトガ・マリティマから分離もしくは派生したＤＮＡポリメラーゼ、またはその変形版を含む。それらは、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼと、逆転写酵素などのＲＮＡ依存性ポリメラーゼとを両方とも含む。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ほとんどがファミリーＡ、Ｂ、およびＣに分類されるものの、少なくとも５つのファミリーが知られている。多様なファミリー間での、配列の類似性はわずかまたは皆無である。最多のファミリーＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む、複数の酵素機能を含み得る、単鎖のタンパク質である。ファミリーＢポリメラーゼは通常、ポリメラーゼおよび３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する単一の触媒領域、ならびに副次的要素を有する。ファミリーＣポリメラーゼは通常、ポリメラーゼおよび３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するマルチサブユニットのタンパク質である。大腸菌では、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、ＩＩ（ファミリーＢ）、およびＩＩＩ（ファミリーＣ）の、３つのタイプのＤＮＡポリメラーゼが見つかっている。真核細胞では、３つの異なるファミリーＢのポリメラーゼである、ＤＮＡポリメラーゼα、δ、およびεが、核の複製に関与し、ファミリーＡポリメラーゼであるポリメラーゼγが、ミトコンドリアＤＮＡ複製に使用される。他のタイプのＤＮＡポリメラーゼは、ファージポリメラーゼを含む。同様に、ＲＮＡポリメラーゼは通常、ファージおよびウイルスポリメラーゼだけでなく、真核性ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ、ならびにバクテリアＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性であり得る。
【００１７】
[0038]「ナノポア」は、膜内に、形成または配置された、細孔、流路または通路を示す。膜は、脂質二重層などの有機膜、または高分子材料から形成される膜などの合成膜であり得る。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などの、検知回路に結合された検知回路または電極に、隣接または近接して配置され得る。いくつかの実施例では、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの水準の特徴的な幅または直径を有する。いくつかの実施態様では、ナノポアは、タンパク質であり得る。
【００１８】
[0039]用語「ヌクレオチド」は、自然に発生するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単量体を指すことに加えて、状況が明確にそうでないことを示さない限り、ヌクレオチドが使用されている個々の状況（例えば、相補的塩基へのハイブリッド形成法）に関して、機能的に同等である誘導体および類似物を含む、関連するその構造的変形形態を指すと理解され得る。
【００１９】
[0040]用語「タグ」は、原子または分子、あるいは原子または分子の集合であり得る、検出可能な部分を指し得る。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、静電的（例えば、誘導性、容量性）識別特性を提供し得て、その識別特性がナノポアの促進により検出され得る。通常、ヌクレオチドにタグが取り付けられているとき、それは、「タグ付けされたヌクレオチド」と呼ばれる。タグは、リン酸塩部分を介してヌクレオチドに取り付けられ得る。
【００２０】
[0041]用語「明期間」は、通常、タグ付けされたヌクレオチドのタグが、ＡＣ信号を通して印加される電界によってナノポア内に押し込まれる期間を指す。用語「暗期間」は、通常、タグ付けされたヌクレオチドのタグが、ＡＣ信号を通して印加される電界によってナノポア外に押し出される期間を指す。ＡＣサイクルは、明期間および暗期間を含み得る。異なる実施形態では、ナノポアセルを明期間（または暗期間）内に入れるためにナノポアセルに印加される電圧信号の極性は、異なり得る。明期間および暗期間は、参照電圧に対する交流信号の異なる部分に対応し得る。
【００２１】
[0042]用語「信号値」は、配列決定セルからの配列決定信号出力値を指し得る。ある一定の実施形態によれば、配列決定信号は、１つまたは複数の配列決定セルの回路内のある点から測定されたおよび／または出力である、電気的信号であり得て、例えば、信号値は、電圧または電流であり得る（またはそれを表し得る）。信号値は、電圧および／または電流の直接測定の結果を表し得て、かつ／あるいは間接測定値を表し得て、例えば、信号値は、電圧または電流が指定された値に到達するのにかかる測定された持続時間であり得る。信号値は、ナノポアの抵抗率と相関を示しナノポア（充填されたかつ／または未充填の）の抵抗率および／またはコンダクタンスが導出され得る、任意の測定可能な量を表し得る。別の実施例として、信号値は、例えば、揺動されているヌクレオチドに取り付けられた蛍光体からポリメラーゼを有する核酸への、光の強度に対応し得る。
【００２２】
[0043]用語「バルキー構造」は、単鎖の試験ＤＮＡ分子内の前バルキー構造から形成されるヌクレオチド構造を指し得る。前バルキー構造は、本明細書で用いられるように、ある一定の状態下でバルキー構造を形成し得る、ＤＮＡ分子内のオリゴヌクレオチド構造である。前バルキー構造は、単鎖のＤＮＡまたは二本鎖のＤＮＡであり得る。バルキー構造は、試験ＤＮＡ分子を、作用状態が別の状態に変化するまで、作用状態にあるナノポア内に閉じ込め、ここでバルキー構造は、前バルキー構造に、すなわち試験ＤＮＡ分子をもはや閉じ込めることができない他の構造に、変換される。バルキー構造の例は、それだけには限らないが、ＤＮＡ二重鎖構造、ＤＮＡヘアピン構造、多ヘアピン構造、および多アーム構造などの２Ｄおよび３Ｄ構造を含む。
【００２３】
[0044]用語「スピードバンプ」は、試験ＤＮＡ分子の結合部分と複合体を形成する、オリゴヌクレオチド分子を指し得る。試験ＤＮＡ分子が、電位下でナノポアを通過するとき、スピードバンプと結合部分との間に形成された複合体は、試験ＤＮＡ分子を、ナノポア検出器が試験ＤＮＡ分子の構造情報を取得するのに十分な滞留時間中、ナノポア内に閉じ込める。滞留時間後、複合体は解離し、試験ＤＮＡ分子は、ナノポアを通り前方へ移動する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
[0045]理想的には、ナノポアを通過するＤＮＡなどの単鎖（ｓｓ）の核酸の個々のヌクレオチドは、ナノポアを通り流れるイオン電流を固有に変調することになり、電流を記録することで、ＤＮＡ配列情報を提供することを可能にする。しかしながら、ナノポア配列決定の共通の課題は、単鎖の試験ＤＮＡ移動が迅速で、取得される電気的信号が、信頼できるＤＮＡ配列決定用に分析できない。ＤＮＡの二重鎖部分が、より分析可能な電気的信号を適用するために、単鎖の試験ＤＮＡの移動を遅くするために使用されてきた。非ファラデー性配列決定セルでは、ナノポア電圧は、単鎖のＤＮＡを、ナノポアを通して移動させるために必要とされる、使用可能な電圧の下まで、降下し、その結果、非効率的な配列決定作業となることが、観察されている。
【００２５】
[0046]以下の項では、紹介の項が、多様な実施形態で使用され得る多様な生物学プロセスおよび電気的装置を説明する。非ファラデー性セルでの単鎖（ｓｓ）のＤＮＡの配列決定が、説明される。非ファラデー性セルの容量性の特質によるナノポア電圧の損失が、説明される。有効なナノポア電圧を維持する多様な方法が、次に説明される。その結果、単鎖のＤＮＡの配列決定は、延長された期間にわたって実行され得て、配列決定作業の効率を向上させる。
【００２６】
Ｉ．ナノポアベースの配列決定チップ
[0047]図１は、ナノポアセル１５０のアレイ１４０を備えるナノポアセンサチップ１００の一実施形態の上面図である。各ナノポアセル１５０は、ナノポアセンサチップ１００のシリコン基板上に集積化された制御回路を備える。いくつかの実施形態では、側壁１３６は、アレイ１４０に含まれ、ナノポアセル１５０のグループを分離し得て、その結果、各グループは、特徴づけのための異なるサンプルを受け取り得る。各ナノポアセルは、核酸を配列決定するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、カバープレート１３０を備え得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、コンピュータプロセッサなどの他の回路とインタフェースする複数のピン１１０も備え得る。
【００２７】
[0048]いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、例えばマルチチップモジュール（ＭＣＭ）またはシステムインパッケージ（ＳｉＰ）などのように同一のパッケージ内に複数チップを含み得る。チップは、例えば、メモリ、プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、データコンバータ、高速Ｉ／Ｏインタフェースなどを含み得る。
【００２８】
[0049]いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、例えば、脂質懸濁液または他の膜構造化懸濁液、分析物溶液、および／または他の液体、懸濁液、または固体を送達するためのピペット、ロボットアーム、コンピュータプロセッサ、ならびに／あるいはメモリなどの分析物送達メカニズムを含む、本明細書で開示されるプロセスの多様な実施形態を実行する（例えば、自動的に実行する）ための多様な構成要素を含み得るナノチップワークステーション１２０に結合され（例えば、ドッキングされ）得る。複数のポリヌクレオチドが、ナノポアセル１５０のアレイ１４０上で検出され得る。いくつかの実施形態では、各々のナノポアセル１５０は、個別にアドレス可能であり得る。
【００２９】
ＩＩ．ナノポア配列決定セル
[0050]ナノポアセンサチップ１００内のナノポアセル１５０は、多数の異なる方法で実施され得る。例えば、いくつかの実施形態では、異なるサイズおよび／または化学的構造のタグが、配列決定されるために、核酸分子内の異なるヌクレオチドに取り付けられ得る。いくつかの実施形態では、配列決定されることになる核酸分子の鋳型への相補鎖が、別の仕方で重合体がタグ付けされたヌクレオチドを鋳型とハイブリッド形成することによって、合成され得る。いくつかの実施態様では、核酸分子および取り付けられたタグは、両方ともナノポアを通り移動し、ナノポアを通過するイオン電流が、ヌクレオチドに取り付けられたタグの個々のサイズおよび／または構造によって、ナノポア内に存在するヌクレオチドを示し得る。いくつかの実施態様では、タグだけが、ナノポア内へ移動し得る。ナノポア内で異なるタグを検出するために、多数の異なる方法も存在し得る。
【００３０】
Ａ．ナノポア配列決定セル構造
[0051]図２は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特徴づけるために使用され得る、図１のナノポアセンサチップ１００内のナノポアセル１５０のような、ナノポアセンサチップ内のナノポアセル２００の一実施形態を示す。ナノポアセル２００は、誘電体層２０１および２０４から形成されたウェル２０５と、ウェル２０５を覆って形成された脂質二重層２１４と、脂質二重層２１４上の、脂質二重層２１４によってウェル２０５から分離された試料室２１５とを、含み得る。ウェル２０５は、ある体積の電解質２０６を収容し得て、試料室２１５は、例えば、可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）などのナノポア、および対象の分析物（例えば、配列決定されることになる核酸分子）を収容するバルク電解質２０８を保持し得る。
【００３１】
[0052]ナノポアセル２００は、ウェル２０５の底部に作用電極２０２と、試料室２１５内に配置された対電極２１０とを含み得る。信号源２２８は、電圧信号を作用電極２０２と対電極２１０との間に印加し得る。単一のナノポア（例えば、ＰＮＴＭＣ）が、電圧信号による電気穿孔法プロセスによって脂質二重層２１４内へと挿入され、それにより脂質二重層２１４内のナノポア２１６を形成し得る。アレイ内の個々の膜（例えば、脂質二重層２１４または他の膜構造）は、化学的にも電気的にも互いに接続されていないこともある。それゆえ、アレイ内の各ナノポアセルは、独立した配列決定機械であり、対象の分析物に対して作用し、そうでなければ不透過性の脂質二重層を介してイオン電流を調節するナノポアに関連付けられる、単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。
【００３２】
[0053]図２に示すように、ナノポアセル２００は、シリコン基板などの基板２３０上に形成され得る。誘電体層２０１は、基板２３０上に形成され得る。誘電体層２０１を形成するために用いられる誘電体材料は、例えば、ガラス、酸化物、窒化物、その他を含み得る。電気的刺激を制御し、ナノポアセル２００から検出される信号を処理する電気回路２２２は、基板２３０上および／または誘電体層２０１内部に形成され得る。例えば、複数のパタニングされた金属層（例えば、金属１〜金属６）が、誘電体層２０１内に形成され、複数の能動デバイス（例えば、トランジスタ）が、基板２３０上に製造され得る。いくつかの実施形態では、信号源２２８は、電気回路２２２の一部に含まれる。電気回路２２２は、例えば、増幅器、積算器、アナログデジタル変換器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および／または多様な他の構成要素を含み得る。電気回路２２２は、メモリ２２６に結合されたプロセッサ２２４にさらに結合され得て、ここでプロセッサ２２４は、アレイ内に配列されている重合体分子の配列を決定するために、配列決定データを分析することができる。
【００３３】
[0054]作用電極２０２は、誘電体層２０１上に形成され、ウェル２０５の底部の少なくとも一部を形成し得る。いくつかの実施形態では、作用電極２０２は、金属電極である。非ファラデー性伝導のために、作用電極２０２は、腐食および酸化に耐性を示す、例えば、白金、金、チタン窒化物、およびグラファイトなどの金属または他の材料で形成され得る。例えば、作用電極２０２は、電気めっきを用いた白金電極であってもよい。別の実施例では、作用電極２０２は、チタン窒化物（ＴｉＮ）作用電極であってもよい。作用電極２０２は、多孔質であってもよく、それによりその表面積および結果として生じる作用電極２０２に付随するキャパシタンスを増大させ得る。ナノポアセルの作用電極は、別のナノポアセルの作用電極から独立していることもあることから、作用電極は、本開示内でセル電極と呼ばれ得る。
【００３４】
[0055]誘電体層２０４は、誘電体層２０１上に形成され得る。誘電体層２０４は、ウェル２０５を囲む壁を形成する。誘電体層２０４を形成するために用いられる誘電体材料は、例えば、ガラス、酸化物、シリコン一窒化物（ＳｉＮ）、ポリイミド、または他の適切な疎水性の絶縁材料を含み得る。誘電体層２０４の上面は、シラン処理され得る。シラン処理は、誘電体層２０４の上面の上に疎水性層２２０を形成し得る。いくつかの実施形態では、撥水性層２２０は、約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【００３５】
[0056]誘電体層２０４の壁によって形成されるウェル２０５は、作用電極２０２の上の電解質２０６の体積を含む。電解質２０６の体積は、緩衝性を有し、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、電解質２０６の体積は、約３マイクロメートル（μｍ）の厚さを有する。
【００３６】
[0057]図２にも示すように、膜は、誘電体層２０４の上面に形成され、ウェル２０５全体に及ぶ。いくつかの実施形態では、膜は、疎水性層２２０の上面に形成された脂質単一層２１８を含み得る。膜がウェル２０５の開口に達したとき、脂質単一層２１８は、ウェル２０５の開口全体に及ぶ脂質二重層２１４に遷移し得る。脂質二重層は、例えば、ジフィタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル、ＧＭ１ガングリオシド、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはその任意の組合せから選択されるリン脂質を含み、またはそれらから構成され得る。
【００３７】
[0058]示したように脂質二重層２１４には、例えば、単一のＰＮＴＭＣによって形成された単一のナノポア２１６が埋め込まれる。上述のように、ナノポア２１６は、単一のＰＮＴＭＣを脂質二重層２１４内に電気穿孔法によって挿入することによって、形成され得る。ナノポア２１６は、対象の分析物および／または小さなイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−）の少なくとも一部分を脂質二重層２１４の両側間を通過させるのに十分に大きくてもよい。
【００３８】
[0059]試料室２１５は、脂質二重層２１４を覆っており、特徴づける対象の分析物の溶液を保持し得る。溶液は、バルク電解質２０８を含み、最適なイオン濃度への緩衝性を有し、ナノポア２１６を開口状態に維持するために最適なｐＨに維持された水性溶液であり得る。ナノポア２１６は、脂質二重層２１４を横切り、バルク電解質２０８から作用電極２０２へのイオン流のための唯一の経路を提供する。ナノポア（例えば、ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物に加えて、バルク電解質２０８は、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つまたは複数をさらに含み得る。
【００３９】
[0060]対電極２１０は、電気化学的電位センサであり得る。いくつかの実施形態では、対電極２１０は、複数ナノポアセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称され得る。いくつかの場合では、共通の電位および共通電極は、全てのナノポアセルに対して、または少なくとも個々のグループ内の全てのナノポアセルに対して共通であり得る。共通電極は、共通の電位を、ナノポア２１６と接触するバルク電解質２０８に印加するように構成可能である。対電極２１０および作用電極２０２は、脂質二重層２１４を横断する電気的刺激（例えば、電圧バイアス）を供給するための信号源２２８に結合され、脂質二重層２１４の電気的特性（例えば、抵抗、電気容量、およびイオン電流）を検知のために用いられ得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセル２００は、参照電極２１２も含み得る。
【００４０】
[0061]いくつかの実施形態では、多様なチェックが、較正の一部としてナノポアセルの作成中に実施され得る。ナノポアセルが作成された後、さらなる較正ステップが、例えば、所望されるように（例えば、セル中に１ナノポア）実行しているナノポアセルを識別するために、実行されてもよい。そのような較正チェックは、物理的チェック、電圧較正、開放流路較正、および単一のナノポアを有するセルの識別を含み得る。
【００４１】
Ｂ．ナノポア配列決定セルの信号検出
[0062]ナノポアセンサチップ１００内のナノポアセル１５０などのナノポアセンサチップ内のナノポアセルは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にし得る。
【００４２】
[0063]図３は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するナノポアセル３００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、配列決定されることになる鋳型３３２（例えば、ヌクレオチド酸分子または別の対象の分析物）およびプライマは、ナノポアセル３００の試料室内のバルク電解質３０８内に導入され得る。例として、鋳型３３２は、円形状または直線状であり得る。核酸プライマは、４つの別の仕方で重合体がタグ付けされたヌクレオチド３３８が付加され得る、鋳型３３２の一部にハイブリッド形成され得る。
【００４３】
[0064]いくつかの実施形態では、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ３３４）が、鋳型３３２への相補鎖を合成するのに用いるナノポア３１６に関連付けられ得る。例えば、ポリメラーゼ３３４は、ナノポア３１６に共有結合していてもよい。ポリメラーゼ３３４は、ヌクレオチド３３８のプライマ上への、一本鎖核酸分子を鋳型として用いる取り込みを触媒する。ヌクレオチド３３８は、４つの異なるタイプＡ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つであるヌクレオチドを伴うタグ種（「タグ」）を含み得る。タグ付けされたヌクレオチドが、ポリメラーゼ３３４と正しく結合されるとき、タグは、電気的な力、例えば、脂質二重層３１４および／またはナノポア３１６を横断して印加される電圧により生成される電界の存在下で生成される力によってナノポア内に引き込まれ（装填され）得る。タグの尾部は、ナノポア３１６の筒内に位置決めされ得る。ナノポア３１６の筒内に保たれるタグは、タグの別個の化学的な構造および／またはサイズにより、固有のイオン遮断信号３４０を生成し、それにより、タグが取り付けられた付加された塩基を、電子的に同定する。
【００４４】
[0065]本明細書で用いられるとき、「装填された」または「充填された」タグは、認識可能な長さの時間、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１０，０００ミリ秒の間、ナノポア内に位置決めされる、および／または、ナノポア内または近くに留まるタグでもよい。いくつかの場合では、タグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポア内に装填される。いくつかの例では、装填されたタグが、ヌクレオチド組み込み事象の際に放出された後にナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適度に高く、例えば９０％から９９％である。
【００４５】
[0066]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ３３４がナノポア３１６に接続される前に、ナノポア３１６のコンダクタンスは、例えば約３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）のように高いことがあり得る。タグがナノポア内に装填されるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、信号３４０）は、タグの別個の化学構造および／またはサイズにより生成される。例えば、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳまたは１２０ｐＳであり、それぞれは、タグ付けされたヌクレオチドの４つのタイプのうちの１つに対応する。ポリメラーゼは、次に異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子内に組み込み、タグ分子を放出する。
【００４６】
[0067]いくつかの場合では、タグ付けされたヌクレオチドのいくつかは、核酸分子（鋳型）の目下の位置（相補的塩基）と一致し得ない。核酸分子と塩基対合されていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過し得る。これらの対合されていないヌクレオチドは、典型的には、正しく対合されたヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼによって拒絶される。対合されていないヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポアを迅速に通過し、短期間（例えば、１０ｍｓ未満）の間検出され得て、一方、対合したヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポア内に装填され、長期間（例えば、少なくとも１０ｍｓ）の間検出され得る。それゆえ、対合されていないヌクレオチドは、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて、下流のプロセッサによって識別され得る。
【００４７】
[0068]装填された（充填された）タグを含むナノポアのコンダクタンス（または等価的に抵抗）が、ナノポアを通過する電流を介して測定され得て、タグ種の識別、それによる目下の位置にあるヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、直流（ＤＣ）信号が、ナノポアセルに印加され得る（例えば、タグがナノポアを通って移動する方向が反転しないように）。しかし、直流を用いた長期間のナノポアセンサの運転は、電極の組成を変化させ得て、ナノポア全体のイオン濃度を不平衡にさせ、ナノポアセルの寿命に影響し得る他の望ましくない効果を有し得る。交流（ＡＣ）波形を印加することは、電界移動を低減し、これらの望ましくない効果を回避し、下記のある一定の利点を有し得る。タグ付けされたヌクレオチドを利用する本明細書で説明される核酸配列決定方法は、印加されるＡＣ電圧に完全に共存可能であり、それゆえＡＣ波形が、これらの利点を達成するために用いられ得る。
【００４８】
[0069]ＡＣ検出サイクルの間に電極を再充電する能力は、犠牲電極、電流通過反応で分子特性を変化させる電極（例えば、銀を含む電極）が使用されるとき、有益であり得る。電極は、直流信号が使用されるとき、検出サイクル中に消耗し得る。再充電は、電極が小さいとき（例えば、平方ミリメートル当たり少なくとも５００の電極を有する電極アレイに供給するために十分に小さいとき）問題になり得る、電極が完全に枯渇するなどの消耗限界に到達することを防止し得る。電極寿命は、場合によっては、電極の幅および総面積と共に進み、少なくとも部分的に、それに依存する。
【００４９】
[0070]ナノポアを通過するイオン電流を測定する好適な状態は、当技術分野で知られており、例が本明細書で提供される。測定は、膜および細孔を横断して印加される電圧により実行され得る。いくつかの実施形態では、電圧は、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶの範囲にあり得る。用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、および０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、および＋４００ｍＶから別々に選択される上限とを有する範囲にあることが好ましい。用いられる電圧は、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にあることがさらに好ましく、１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にあることが最も好ましい。増大された印加電位を用いたナノポアによって異なるヌクレオチド間の識別能力を増大させることが可能である。ＡＣ波形およびタグ付けされたヌクレオチドを用いた核酸の配列決定は、その全体が引用することにより本明細書に組み込まれる、２０１３年１１月６日に提出された「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ（タグを用いた核酸配列決定）」という名称の米国特許公開第ＵＳ２０１４／０１３４６１６で説明されている。米国２０１４／０１３４６１６で説明されたタグ付けされたヌクレオチドに加えて、配列決定は、例えば、５つの一般的な核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミンの（Ｓ）−グリセロール・ヌクレオシド・三リン酸塩（ｇＮＴＰ）などの糖または非環式の部分を欠く、ヌクレオチド類似物を用いて実行され得る（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５−５３４７［２００６］）。
【００５０】
Ｃ．ナノポア配列決定セルの電気回路
[0071]図４は、ナノポアセル２００などのナノポアセル内の電気回路４００（図２の電気回路２２２の一部分を含み得る）の一実施形態を示す。上述のように、いくつかの実施形態では、電気回路４００は、ナノポアセンサチップ内の複数のナノポアセルまたは全てのナノポアセル間で共有され得、それゆえ、共通電極とも称され得る対電極４１０を含む。共通電極は、電圧源ＶＬＩＱ４２０に接続することによって、共通の電位を、ナノポアセル内の脂質二重層（例えば、脂質二重層２１４）と接触するバルク電解質（例えば、バルク電解質２０８）に印加するように構成されることが可能である。いくつかの実施形態では、ＡＣ非ファラデー性モードが、電圧ＶＬＩＱをＡＣ信号（例えば、方形波）で変調するために利用され、それをナノポアセル内で脂質二重層に接触するバルク電解質に印加し得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＩＱは、±２００〜２５０ｍＶの大きさおよび例えば２５〜４００Ｈｚの周波数を有する方形波である。例えば１００μＦ以上などの大きなコンデンサ４２６によってモデル化される対電極４１０と脂質二重層（例えば、脂質二重層２１４）との間のバルク電解質。
【００５１】
[0072]図４は、作用電極４０２（例えば、作用電極２０２）および脂質二重層（例えば、脂質二重層２１４）の電気特性を表す電気モデル４２２も示す。電気モデル４２２は、脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスをモデル化するコンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ）と、ナノポア内の個々のタグの存在に基づいて変化し得る、ナノポアに関連付けられた可変抵抗をモデル化する抵抗器４２８（ＲＰＯＲＥ）とを含む。電気モデル４２２は、２重層キャパシタンス（ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ）を有し、作用電極４０２およびウェル２０５の電気特性を表すコンデンサ４２４も含む。作用電極４０２は、他のナノポアセル内の作用電極から独立した別個の電位を印加するように構成され得る。
【００５２】
[0073]パスデバイス４０６は、脂質二重層および作用電極を電気回路４００から接続または切断するために使用され得るスイッチである。パスデバイス４０６は、電圧刺激がナノポアセル内の脂質二重層を横断して印加されることを有効化または無効化するために、制御ライン４０７によって制御され得る。脂質が、脂質二重層を形成するために堆積される前では、２つの電極間のインピーダンスは、セルのウェルが封止されていないため、非常に低く、それゆえパスデバイス４０６は、短絡状態を回避するために開路に維持され得る。パスデバイス４０６は、脂質溶媒がナノポアセルに堆積されてナノポアセルのウェルを封止した後、閉じられ得る。
【００５３】
[0074]回路４００は、オンチップ積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ）をさらに含み得る。積分コンデンサ４０８は、リセット信号４０３を使用しスイッチ４０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５に接続されることによって、事前充電され得る。いくつかの実施形態では、電圧源ＶＰＲＥ４０５は、例えば、９００ｍＶの大きさの固定の参照電圧を提供する。スイッチ４０１が閉じられているとき、積分コンデンサ４０８は、電圧源ＶＰＲＥ４０５の参照電圧レベルまで事前充電され得る。
【００５４】
[0075]積分コンデンサ４０８が事前充電された後、リセット信号４０３が使用されスイッチ４０１が開路され、その結果、積分コンデンサ４０８は、電圧源ＶＰＲＥ４０５から切断される。この時点では、電圧源ＶＬＩＱのレベルにより、対電極４１０の電位は、作用電極４０２（および積分コンデンサ４０８）の電位より高いレベルにあるか、その反対でもあり得る。例えば、電圧源ＶＬＩＱからの方形波の正位相の間（例えば、ＡＣ電圧源信号サイクルの明または暗期間）、対電極４１０の電位は、作用電極４０２の電位より高いレベルにある。電圧源ＶＬＩＱからの方形波の負位相の間（例えば、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗または明期間）、対電極４１０の電位は、作用電極４０２の電位より低いレベルにある。したがって、いくつかの実施形態では、積分コンデンサ４０８は、対電極４１０と作用電極４０２との間の電位差により、明期間の間に電圧源ＶＰＲＥ４０５の事前充電された電圧レベルからさらに高いレベルまで充電され、暗期間中により低いレベルに放電され得る。他の実施形態では、充電および放電は、それぞれ暗期間および明期間に発生し得る。
【００５５】
[0076]積分コンデンサ４０８は、１ｋＨｚ、５ｋＨｚ、１０ｋＨｚ、１００ｋＨｚ、またはそれを超え得る、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）４３５のサンプリング速度による固定された期間に、充電または放電され得る。例えば、１ｋＨｚのサンプリング速度で、積分コンデンサ４０８は、約１ｍｓの期間中、充電／放電し、次に、電圧レベルがサンプリングされ、積分期間の終わりにＡＤＣ４３５によって変換され得る。個々の電圧レベルは、ナノポア内の個々のタグ種に対応し、それゆえ、鋳型上の目下の位置でのヌクレオチドに対応し得る。
【００５６】
[0077]ＡＤＣ４３５によるサンプリングされた後、積分コンデンサ４０８は、リセット信号４０３を使用しスイッチ４０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５に再接続されることによって、再び事前充電され得る。積分コンデンサ４０８を事前充電するステップと、積分コンデンサ４０８が充電または放電する一定の期間待機するステップと、積分コンデンサの電圧レベルをＡＤＣ４３５によってサンプリングおよび変換するステップとが、配列決定プロセスの間中サイクルで繰り返され得る。
【００５７】
[0078]デジタルプロセッサ４３０は、例えば、正規化、データバッファリング、データフィルタリング、データ圧縮、データ削減、イベント抽出、またはナノポアセルアレイからのＡＤＣ出力データを多様なデータフレームへのアセンブリングなどのために、ＡＤＣ出力データを処理し得る。いくつかの実施形態では、デジタルプロセッサ４３０は、塩基判定などのさらに下流の処理を実行し得る。デジタルプロセッサ４３０は、ハードウェア（例えば、ＧＰＵ、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの内部の）またはハードウェアとソフトウェアとの組合せとして実装され得る。
【００５８】
[0079]したがって、ナノポアを横断して印加される電圧信号は、ナノポアの個々の状態を検出するために用いられ得る。ナノポアの可能な状態の１つは、タグが取り付けられたポリホスフェートがナノポアの筒に存在しない場合、開放チャネル状態であり、本明細書ではナノポアの未充填状態とも呼ぶ。ナノポアの別の４つの可能な状態は、タグが取り付けられたポリホスフェートヌクレオチドの４つの異なるタイプ（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）のうちの１つがナノポアの筒内に保持されるときの状態に各々対応する。ナノポアのさらに別の可能な状態は、脂質二重層が断裂するときである。
【００５９】
[0080]積分コンデンサ４０８での電圧レベルが、固定された期間後に測定されるとき、ナノポアの異なる状態は、異なる電圧レベルの測定値をもたらし得る。これは、積分コンデンサ４０８（すなわち、時間に対する積分コンデンサ４０８の電圧のグラフの傾きの程度）での電圧減衰率（放電による減少または充電による増大）が、ナノポアの抵抗（例えば、抵抗器ＲＰＯＲＥ４２８の抵抗）に依存するからである。より詳しくは、異なる状態のナノポアに関連付けられた抵抗が、分子（タグ）の別個の化学構造に起因して異なるので、異なる対応する電圧減衰率は、観察され得るようになり、ナノポアの異なる状態を識別するために用いられ得る。電圧減衰曲線は、ＲＣ時定数τ＝ＲＣを有する指数関数曲線であり得て、ここで、Ｒは、ナノポアに関連付けられた抵抗（すなわち、ＲＰＯＲＥ４２８）であり、Ｃは、Ｒに並列の膜に関連付けられたキャパシタンス（すなわち、コンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））である。ナノポアセルの時定数は、例えば、約２００〜５００ｍｓであり得る。減衰曲線は、二重層の詳細な実施により、指数関数曲線に正確に一致し得ないが、減衰曲線は、指数関数曲線に類似し、単調であり得て、それゆえ、タグの検出を可能にする。
【００６０】
[0081]いくつかの実施形態では、開放チャネル状態にあるナノポアに関連付けられた抵抗は、１００ＭΩ〜２０ＧΩまでの範囲内にあり得る。いくつかの実施形態では、タグが、ナノポアの筒内部に存在する状態にあるナノポアに関連付けられた抵抗は、２００ＭΩ〜４０ＧΩまでの範囲内にあり得る。他の実施形態では、積分コンデンサ４０８は、ＡＤＣ４３５へ導く電圧が、電気モデル４２２内の電圧減衰によりやはり変化することになるため、省略され得る。
【００６１】
[0082]積分コンデンサ４０８での電圧の減衰率は、異なる方法で決定され得る。上で説明したように、電圧減衰率は、一定の時間間隔の間の電圧減衰を測定することによって決定され得る。例えば、積分コンデンサ４０８での電圧は、最初に時間ｔ１でＡＤＣ４３５により測定され、次に、電圧は、時間ｔ２でＡＤＣ４３５により再び測定される。時間曲線に対する積分コンデンサ４０８での電圧の傾きがより急であるとき、電圧差はより大きく、電圧曲線の傾きがより緩やかなとき、電圧差はより小さい。このように、電圧差は、積分コンデンサ４０８での電圧の減衰率を、ゆえに、ナノポアセルの状態を決定するための測定基準として用いられ得る。
【００６２】
[0083]他の実施形態では、電圧減衰率は、選択された電圧減衰量のために必要な持続時間を測定することによって決定され得る。例えば、電圧が第１の電圧レベルＶ１から第２の電圧レベルＶ２に降下または増大するのに必要な時間が測定され得る。時間に対する電圧曲線の傾きがより急であるとき、必要な時間はより少なく、時間に対する電圧曲線の傾きがより緩やかなとき、必要な時間はより大きい。このように、必要な測定時間は、積分コンデンサｎｃａｐ４０８での電圧の減衰率を、ゆえに、ナノポアセルの状態を決定するための測定基準として用いられ得る。当業者には、例えば、電流測定技術を含む、ナノポアの抵抗を測定するために必要とされ得る多様な回路を理解されよう。
【００６３】
[0084]いくつかの実施形態では、電気回路４００は、オンチップに、パスデバイス（例えば、パスデバイス４０６）および追加のコンデンサ（例えば、積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ））を含まないことがあり、それによりナノポアベースの配列決定チップのサイズの削減を促進する。膜（脂質二重層）の薄い性質のため、膜に関連付けられたキャパシタンス（例えば、コンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））のみで、追加のオンチップのキャパシタンスを必要とすることなく必要なＲＣ時定数を生み出すのに十分とすることができる。それゆえ、コンデンサ４２６は、積分コンデンサとして使用され得て、電圧信号ＶＰＲＥによって事前充電され、続いて、電圧信号ＶＬＩＱによって放電または充電され得る。そうでなければ電気回路内にオンチップで作製される追加のコンデンサおよびパスデバイスをなくすことにより、ナノポア配列決定チップ内の単一のナノポアセルのフットプリントを著しく減少させることができ、それにより、（例えば、ナノポア配列決定チップ内の数百万ものセルを有する）ますます多くのセルを含むためにナノポア配列決定チップを拡大することが容易になる。
【００６４】
Ｄ．ナノポアセル内でのデータサンプリング
[0085]核酸の配列決定を実行するために、積分コンデンサ（例えば、積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ））またはコンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ）の電圧レベルは、タグ付けされたヌクレオチドが核酸に加えられている間に、ＡＤＣ（例えば、ＡＤＣ４３５）によってサンプリングされ変換され得る。ヌクレオチドのタグは、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低いような印加電圧のとき、対電極および作用電極を介して印加される、ナノポアを横断する電界によって、ナノポアの筒内へと押し入れられ得る。
【００６５】
１．充填
[0086]充填事象は、タグ付けされたヌクレオチドが、鋳型（例えば、核酸断片）に取り付けられ、タグがナノポアの筒の内外に進むときにあたる。これは、充填事象の間に複数回発生し得る。タグが、ナノポアの筒内にあるとき、ナノポアの抵抗は、より高く、より低い電流がナノポアを通り流れ得る。
【００６６】
[0087]配列決定の間、タグは、いくつかのＡＣサイクル状態でナノポア内に存在しないことがあり（開放チャネル状態と呼ぶ）、この場合電流は、ナノポアのより低い抵抗のために、最も高い。タグがナノポアの筒内へと取り付けられるとき、ナノポアは、明モードである。タグがナノポアの筒外へと押し出されるとき、ナノポアは、暗モードである。
【００６７】
２．明および暗期間
[0088]ＡＣサイクルの間、積分コンデンサでの電圧は、ＡＤＣによって複数回サンプリングされ得る。例えば、ある実施形態では、ＡＣ電圧信号が、システム全体に、例えば、約１００Ｈｚで印加され、ＡＤＣの取得速度は、セルあたり約２０００Ｈｚであり得る。このように、ＡＣサイクル（ＡＣ波形のサイクル）毎に取得される約２０のデータポイント（電圧測定値）が存在し得る。ＡＣ波形の１サイクルに対応するデータポイントは、１セットと呼ばれ得る。ＡＣサイクル毎のデータポイントの１セット内には、例えば、明モード（期間）に対応し得る、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低いときキャプチャされるサブセットが存在し得て、このときタグは、ナノポアの筒内へと押し込まれる。別のサブセットは、暗モード（期間）に対応し得て、このときタグは、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより高いとき、印加される電界によってナノポアの筒外へと押し出される。
【００６８】
３．測定電圧
[0089]データポイント毎に、スイッチ４０１が開路のとき、積分コンデンサ（例えば、積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ）またはコンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））における電圧は、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより高いとき、ＶＰＲＥからＶＬＩＱに増大し、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低いとき、ＶＰＲＥからＶＬＩＱに減少するように、ＶＬＩＱによる充電／放電の結果として減衰する挙動で変化していく。最終的な電圧値は、ＶＬＩＱから作用電極の電荷だけずれる。積分コンデンサでの電圧レベルの変化率は、ナノポアを含み、結果としてナノポア内の分子（例えば、タグ付けされたヌクレオチドのタグ）を含み得る、二重層の抵抗の値によって支配され得る。電圧レベルは、スイッチ４０１が開路した後の所定時間に測定され得る。
【００６９】
[0090]スイッチ４０１は、データ収集速度で動作し得る。スイッチ４０１は、通常、ＡＤＣによる測定の直後の２回のデータ取得間の比較的短時間、閉路され得る。スイッチは、複数データポイントがＶＬＩＱの各ＡＣサイクルの各サブ期間（明または暗）中に収集されることを可能にする。スイッチ４０１が開路のままのとき、積分コンデンサでの電圧レベルおよび、それゆえ、ＡＤＣの出力値は、完全に減衰し、そこに留まり得る。代わりに、スイッチ４０１が閉路のとき、積分コンデンサは、再び事前充電され（ＶＰＲＥに）、別の測定の準備がなされる。したがって、スイッチ４０１は、複数データポイントが各ＡＣサイクルの各サブ期間（明または暗）に収集されることを可能にする。そのような複数の測定は、固定されたＡＤＣ（例えば、平均化され得る、より多数の測定による８ビットから１４ビット）を用いたより高い分解能を可能にさせ得る。複数の測定は、ナノポア内に充填される分子に関する動態情報をさらに提供し得る。時間の情報により、どれだけの長さで充填が発生するかの決定を可能にさせ得る。これは、核酸鎖に加えられる複数のヌクレオチドが配列決定されつつあるか否かを判定することを促進することにも用いられ得る。
【００７０】
[0091]図５は、ＡＣサイクルの明期間および暗期間中のナノポアセルから取得されたデータポイントの例を示す。図５では、データポイントでの変化は、図解目的用に強調されている。作用電極または積分コンデンサに印加される電圧（ＶＰＲＥ）は、例えば、９００ｍＶなどの一定のレベルにある。ナノポアセルの対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、方形波として示されるＡＣ信号であり、このときデューティサイクルは、５０％以下、例えば約４０％のような任意の好適な値であり得る。
【００７１】
[0092]明期間５２０の間、対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加される電圧ＶＰＲＥより低く、その結果、タグは、作用電極および対電極に印加される、異なる電圧レベルに起因する電界によって、ナノポアの筒内に押し込まれ得る（例えば、タグ上の電荷および／またはイオンの流れにより）。スイッチ４０１が開路のとき、ＡＤＣの前のノードでの（例えば、積分コンデンサでの）電圧は、減少していく。電圧データポイントが取得された後（例えば、指定された期間の後）、スイッチ４０１は、閉路され得て、測定ノードでの電圧は、ＶＰＲＥへと再び戻るように増大していく。プロセスは、複数の電圧データポイントを測定するために繰り返され得る。このようにして、複数のデータポイントは、明期間の間に取得され得る。
【００７２】
[0093]図５に示すように、ＶＬＩＱ信号の符号の変化の後の明期間内の第１のデータポイント５２２（第１のポイントデルタ（ＦＰＤ）とも呼ばれる）は、後続のデータポイント５２４よりも低いことがあり得る。これは、ナノポア内にタグが存在しないからであり（開流路）、それゆえ、それは低抵抗および高放電率を有するためであり得る。いくつかの例では、第１のデータポイント５２２は、図５に示すようなＶＬＩＱレベルを超え得る。これは、信号をオンチップコンデンサに結合する二重層のキャパシタンスに起因し得る。データポイント５２４は、充填事象が発生した、すなわち、タグがナノポアの筒内に押し込まれた後に取得され得て、この場合ナノポアの抵抗、およびそれゆえの積分コンデンサの放電速度は、ナノポアの筒内に押し込まれるタグの個々のタイプに依存する。データポイント５２４は、以下で説明するように、ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ４２４で生成される電荷により、測定毎にわずかに減少し得る。
【００７３】
[0094]暗期間５３０の間、対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加される電圧ＶＰＲＥより高く、その結果、何れのタグも、ナノポアの筒外に押し出され得る。スイッチ４０１が開路のとき、測定ノードでの電圧は、電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）の電圧レベルがＶＰＲＥより高いので、増大する。電圧データポイントが取得された後（例えば、指定された期間の後）、スイッチ４０１は、閉路され得て、測定ノードでの電圧は、ＶＰＲＥへと再び戻るように減少していく。プロセスは、複数の電圧データポイントを測定するために繰り返され得る。このように、複数のデータポイントは、第１のポイントデルタ５３２および後続のデータポイント５３４を含む暗期間の間に取得され得る。上述のように、暗期間の間に、何れのヌクレオチドタグもナノポアの外に押し出され、それゆえ、任意のヌクレオチドタグに関する最小限度の情報が取得され、さらに正規化に用いられる。
【００７４】
[0095]図５は、明期間５４０の間、対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加される電圧ＶＰＲＥより低いにもかかわらず、充填事象が発生しない（開経路）ことも示す。したがって、ナノポアの抵抗は低く、積分コンデンサの放電速度は高い。結果的に、第１のデータポイント５４２および後続のデータポイント５４４を含む、取得されたデータポイントは、低電圧レベルを示す。
【００７５】
[0096]明または暗期間の間に測定される電圧は、ナノポアの一定の抵抗（例えば、１つのタグがナノポア内にある間に所与のＡＣサイクルの明モードの間に形成される）の測定毎にほぼ同一であると期待され得るが、このことは、電荷が２重層コンデンサ４２４（ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ）で生成する場合であり得ない。この電荷生成は、ナノポアセルの時定数をより長くさせる結果をもたらし得る。結果的に、電圧レベルは移動し、それにより測定値がサイクル内のデータポイント毎に減少するという結果をもたらし得る。このように、サイクル内で、データポイントは、図５に示すように、ある程度データポイントから別のデータポイントへ変化し得る。
【００７６】
[0097]測定に関するさらなる詳細は、例えば、「Ｎａｎｏｐｏｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｔｉｍｕｌｕｓ（電圧刺激を変化させるナノポアベースの配列決定）」という名称の米国特許公開第２０１６／０１７８５７７、「Ｎａｎｏｐｏｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｔｉｍｕｌｕｓ（電圧刺激を変化させるナノポアベースの配列決定）」という名称の米国特許公開第２０１６／０１７８５５４、「Ｎｏｎ−Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｓｔｉｍｕｌｕｓ（電気的刺激に応答した二重層の測定を用いた非破壊二重層モニタリング）」という名称の米国特許出願第１５／０８５，７００、および「Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（二重層形成の電気的促進）」という名称の米国特許出願第１５／０８５，７１３の中で見つけることができ、開示のその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
４．正規化および塩基分類
[0098]ナノポアセンサチップの有効なナノポアセル毎に、生成モードが、核酸を配列決定するために実行され得る。配列決定中に取得されるＡＤＣ出力データは、より高い精度を提供するために、正規化され得る。正規化は、サイクル形状、ゲインドリフト、電荷注入オフセット、およびベースラインシフトなどの偏位効果を引き起こし得る。いくつかの実施態様では、充填事象に対応する明期間サイクルの信号値は、単一の信号値がサイクル毎に取得される（例えば、平均）ように、平坦化され得る、またはサイクル内減衰（一種のサイクル形状効果）を低減するために測定された信号に対して調整がなされ得る。ゲインドリフトは、通常完全な信号を基準の大きさとし、数百から数千秒までのオーダーで変化する。例として、ゲインドリフトは、溶液の変化（ポア抵抗）または二重層キャパシタンスの変化がトリガとなり得る。ベースラインシフトは、約１００ｍｓの時間尺度で発生し、作用電極の電圧オフセットに関係する。ベースラインシフトは、配列決定セル内の電荷バランスを明期間から暗期間へ維持する必要の結果として、充填からの有効調整比の変化によって駆動され得る。
【００７８】
[0099]正規化の後、実施形態は、充填された経路の電圧のクラスタを決定し得て、ここで各クラスタは、異なるタグ種、およびそれゆえの異なるヌクレオチドに対応する。クラスタは、所与のヌクレオチドに対応する所与の電圧の確率を算出するために使用され得る。別の例として、クラスタは、異なるヌクレオチド（塩基）間での差別化のための分離電圧を決定するために用いられ得る。
【００７９】
[0100]単一の測定に基づく核酸の塩基決定の例示の方法が以下に提供される。実施例は、説明のために電圧測定を使用し得るが、例示の技術は、電流測定などの他の信号測定に同様に適用する。
【００８０】
ＩＩＩ．単鎖のＤＮＡの配列決定
[0101]上述の核酸サンプルを配列決定するシステムおよび方法では、タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドは、核酸サンプルから導出された単鎖の核酸分子と相補的な成長している鎖に組み込まれ得る。ナノポアの援助により、個々のタグ付けされたヌクレオチドに関連付けられたタグは、個々のタグ付けされたヌクレオチドの組み込み中に検出され得る。
【００８１】
[0102]以下に説明する実施形態では、スピードバンプまたはあおり丁番などのある種の変形を有するＤＮＡなどの単鎖（ｓｓ）の核酸は、ナノポアを通り移動する。ナノポアを通過する単鎖の核酸の個々のヌクレオチドは、ナノポアを通り流れるイオン電流を固有に変調することになり、電流を記録することで、ＤＮＡ配列情報を提供することを可能にする。
【００８２】
Ａ．ナノポアによる単鎖のＤＮＡ用のナノポア配列決定セル
[0103]図６は、本発明の実施形態による、単鎖のヌクレオチド配列決定を実行するナノポアセル６００を示す。ナノポアセル６００は、図３のナノポアセル３００と同様のセル構造を有する。例えば、ナノポアセル６００は、バルク電解質６０８と、脂質二重層６１４内に配置されたナノポア６１６と、ナノポアの下のウェル内の電解質６０６の体積とを含む、試料室を備える。ナノポアセル６００は、信号源６２８から印加電圧Ｖを受ける作用電極６０２および対電極６１０も備える。
【００８３】
[0104]配列決定されることになる単鎖のヌクレオチド酸分子６３２（または別の対象の分析物）は、ナノポアセル６００の試料室内のバルク電解質６０８内に導入され得る。単鎖のヌクレオチド酸分子６３２は、脂質二重層６１４および／またはナノポア６１６全体に印加される電圧によって生成される電界の存在下で生成される電気的な力によって、ナノポア内に引き込まれ得る。電流計６２９は、ナノポアセルを通る電流を測定するために使用される。別法として、電流源が電気的な力を供給するために用いられる場合、電圧計が測定に使用される。ナノポア６１６の筒内に保持された単鎖のヌクレオチド酸分子６３２の部分は、その部分内の塩基の別個の化学的構造および／またはサイズにより、固有のイオン遮断信号６４０を生成し、それにより分子内の塩基を電子的に識別し得る。塩基は、図６で示したコンダクタンス信号６４０で表されるように、４つの異なるタイプ、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つであり得る。
【００８４】
[0105]装填された（充填された）単鎖のヌクレオチド酸分子を含むナノポアのコンダクタンス（または同等の抵抗）が、ナノポアを通過する電流を介して測定され得て、タグ種の識別、それによる目下の位置にあるヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、直流（ＤＣ）信号が、ナノポアセルに印加され得る（例えば、分子がナノポアを通って移動する方向が反転しないように）。しかし、直流を用いた長期間のナノポアセンサの運転は、セルの容量特性を変化させ得て、ナノポア全体のイオン濃度を不平衡にさせ、ナノポアセルの寿命に影響し得る他の望ましくない効果を有し得る。交流（ＡＣ）波形を印加することは、これらの望ましくない効果を低減し、下記のある一定の利点を有し得る。ナノポアを通過するイオン電流を測定する好適な状態は、図１〜５に関連して上述したものと同様であり得る。
【００８５】
[0106]図７は、本発明の実施形態による、ナノポアを通過する単鎖のＤＮＡを有する、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一部を示す。図７に示したように、単鎖（ｓｓ）のＤＮＡ分子は、印加電位下でナノポアを通過し得る。単鎖の試験ＤＮＡ分子によるナノポアを通るイオン流の簡潔な遮断に応じた一連の電気的信号は、単鎖の試験ＤＮＡ分子がナノポアを通って充填されたときに、検出され得る。スピードバンプまたはバルキー構造がない場合、単鎖の試験ＤＮＡ分子は、ほとんど抵抗を受けずに、ナノポアを過剰に速く通り過ぎるので、電気的信号が単鎖の試験ＤＮＡの配列決定のために、信頼して記録できない。
【００８６】
[0107]図８および９は、単鎖（ｓｓ）の試験ＤＮＡ内のサンプルＤＮＡの配列情報を取得するためにナノポアを使用する方法に関する。方法は、スピードバンプの位置の近傍のサンプル核酸のヌクレオチドの配列情報を取得するために、単鎖の試験核酸をナノポア内に閉じ込めるスピードバンプを使用し、サンプルＤＮＡの配列全体を構成する。方法はさらに、スピードバンプによって促進されるナノポア検出器を用いて、所望の配列を有する試験ＤＮＡの識別および／または分離することに関する。より詳細には、その内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれている、２０１４年８月２８日に提出された米国特許出願公開第２０１５００１１４０２で説明されている。例えば、核酸は、自然発生するヌクレオチドの間に挿入された合成された配列を有し得る。そのような合成された配列によって、スピードバンプ間により大きな間隔をとることが可能になるので、スピードバンプは、各ヌクレオチドの配列決定を可能にするように取り付けられ得る。別の例では、合成された配列は、それ自体を、例えば、特定のヌクレオチドの代理として、検出し得る。
【００８７】
[0108]図８は、本発明の実施形態による、ナノポアを通過するスピードバンプを有する単鎖のＤＮＡを備える、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一部を示す。図８は、２つのバルキー構造８０３および８０４によって、ナノポア８０２内に捕獲された単鎖の試験ＤＮＡ８０１を示す。両端に形成されたバルキー構造を有する単鎖の試験ＤＮＡは、ナノポア内にロックされ、複数のスピードバンプ８０５でスピードバンプと試験ＤＮＡとの複合体を形成する。いくつかの実施形態では、バルキー構造（ＢＳ）は、単鎖の試験ＤＮＡの終端をそれ自体の上で包むことによって、単鎖の試験ＤＮＡの一端において形成される、ヘアピン構造であり得る。スピードバンプは、試験ＤＮＡ分子の結合部分と複合体を形成する、オリゴヌクレオチド分子であり得る。単鎖の試験ＤＮＡは、スピードバンプと単鎖の試験ＤＮＡとの複合体を形成するために、単鎖の試験ＤＮＡと共に貯められた任意のスピードバンプと接触し得る。
【００８８】
[0109]ナノポア検出は、１つまたは複数のより短いＤＮＡ二重鎖部分がスピードバンプと単鎖の試験ＤＮＡとの間に形成され得るように実行される（スピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分）。スピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分は、スピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分、および単鎖の試験ＤＮＡの流動方向でスピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分の第１の塩基対の前側で、単鎖の試験ＤＮＡ部分の配列情報を取得するのに十分な滞留時間の間、単鎖の試験ＤＮＡを閉じ込める。次に、スピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分は、解離し、単鎖の試験ＤＮＡは、別のスピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分によって閉じ込められるまで、または単鎖の試験ＤＮＡの一端のバルキー構造によって停止されるまで、ナノポアを通って前方へ移動する。単鎖の試験ＤＮＡが一端に到達した後、電位は、任意選択で低減された値におかれ、または単鎖の試験ＤＮＡを移動させるために極性が反対方向に反転させられ、所望されるようにプロセスを繰り返し得る。
【００８９】
[0110]単鎖の試験ＤＮＡの一連の電気的信号は、単鎖の試験ＤＮＡが、滞留時間中にナノポア内にスピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分によって、閉じ込められる度に取得され、次に、スピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分は解離し、単鎖の試験ＤＮＡは、次のスピードバンプと試験ＤＮＡとの二重鎖部分によって閉じ込められるまで前方に移動する。この、閉じ込め−検出−解離−閉じ込めのプロセスは、単鎖の試験ＤＮＡが、一端のバルキー構造によって停止されるまで、繰り返される。
【００９０】
[0111]図９は、本発明の実施形態による、ナノポアを通過する単鎖のＤＮＡを有する、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルにおいて測定された電気的信号の一例を示す。説明を容易にするために、電気的信号は、何れのスピードバンプに関するレベルも示さず、塩基に関するレベルのみを示すように簡易化される。スピードバンプと識別子との二重鎖部分は、単鎖の試験ＤＮＡを閉じ込め、一連の電気的信号が取得され、そこでは閉じ込め中に比較的平坦なレベルが見られる。これらの信号は、識別子の存在を示すため、または単鎖の試験ＤＮＡの流動方向で識別子の以前の部分の配列を識別するために、特徴づけられ得る。
【００９１】
[0112]スピードバンプは、配列決定用の電気的信号測定を可能にするために、ナノポアを通る核酸分子の経路を閉じ込める一方向を示す。スピードバンプは、多様な形状を取り得て、一方向であり得ることで、それらは、順方向でナノポアを通過し得るが（小停止した後であっても）、反対方向（例えば、ＡＣサイクルの負の部分の間）ではナノポアを通過し得ない。図２を参照し、いくつかの実施形態によると、脂質二重層２１４（ナノポア２１６を備える）は、トランス側およびシス側を有するとき、さらに定義される。一実施形態では、トランス側は、電解質２０６の体積を備えるウェル２０５である。別の実施形態では、シス側は、バルク電解質２０８を含む試料室２１５である。一実施形態では、一方向のスピードバンプは、ナノポアを通過することになる核酸分子の主鎖に接続された、単鎖の核酸を備える。別の実施形態では、単鎖の核酸は、（ｉ）ナノポアから離れる向きの角度で、または（ｉｉ）脂質二重層２１４（ナノポア２１６を備える）のシス側の方に向くように（およびトランス側から離れる）、一方、核酸分子は、ナノポアを通過するように、核酸分子の主鎖に接続される。単鎖の核酸は、米国特許第９，６０５，３０９号（その全体において参照により本明細書に組み込まれる）の図２０または図３２に示すように、かかりを付けられ得る。別の実施形態では、一方向のスピードバンプは、ゲートが、第２方向でなく第１方向にある核酸分子に調整されたとき、十分薄くナノポア通過できる、核酸分子に取り付けられた丁番式ゲートを備える。一実施形態では、丁番式ゲートは、第２の部分よりも狭い第１の部分を備え、第２の部分は、ナノポアの最も狭い開口よりも小さい幅を有する。他の一実施形態では、丁番式ゲートは、第１の端部および第２の端部を有する重合体の連鎖をさらに備える。他の実施形態では、第１の端部は、第２の部分と隣接する位置で核酸分子に取り付けられ、第２の端部は、核酸分子に取り付けられていない。あおり丁番を有する核酸分子は、重合体の連鎖が第２の部分に隣接するように調整される第１方向で、ナノポアを通り充填されることが可能である。いくつかの事例では、タグ分子は、重合体の連鎖が第２の部分に隣接するように調整されていない第２方向で、ナノポアを通り充填されることが不可能である。一実施形態では、第２方向は、第１方向の反対である。丁番式ゲートは、米国特許第９，６０５，３０９号（その全体において参照により本明細書に組み込まれる）の図３１に示すようであり得る。
【００９２】
Ｂ．ナノポアの電圧降下に起因する非ファラデー性セルの限界
[0113]上述の通り、図６は、非ファラデー性で容量性に結合された測定用に構成されたナノポアベースの配列決定チップ内セルの一実施形態を示す。セルは、非ファラデー性で容量性に結合された測定をするためにアナログ測定回路（図示せず）を備える。測定は、デジタル情報に変換され、セル外部へ送信され得る。いくつかの実施形態では、送信データ速度は、ギガビット毎秒のオーダーにあり得る。いくつかの実施形態では、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が送信データを受信し、データ処理を行い、そのデータをコンピュータに転送する。
【００９３】
[0114]非ファラデー性伝導では、化学反応（化学物質の還元または酸化）が、金属電極の表面で発生しない。金属電極と電解質との間の二重層キャパシタンス全体の電位を変化させることで、イオンは流れる。非ファラデー性伝導のために、金属電極は、腐食および酸化に耐性を示す金属で、例えば、チタンまたは白金もしくは金などの貴金属で、形成され得る。電極と電解質との間の化学的な相互作用の欠如にもかかわらず、印加される電位に応じて、金属−液体界面でのイオン空乏領域の成長および収縮からの電解質内での過渡的なイオンの物理的置換が存在する。このイオン空乏領域は、電気化学で「二重層」と称される。電気工学モデルを用いて、平行平板コンデンサは、金属が一方のプレート、空乏領域が誘電体、液体内のイオン拡散分布がもう一方のプレートである形をとる。非ファラデー性伝導用の小信号回路は、単純な抵抗器として表されるナノポアと、キャパシタとして表される２重層キャパシタンスとを含み得る。
【００９４】
[0115]ファラデー性伝導の場合と異なり、電極に印加される絶対電圧は、ナノポアに印加される電圧と同一でなく、すなわち、二重層の電圧が、ナノポアに印加される電位をバイアスする。図１０Ａは、一実施形態による、二重層の容量性応答の一例を示す。この図は、電解質と作用電極との間に短絡回路を有する二重層の特性を示す。水の粘性は、印加される電界に応じたイオンの流れやすさを妨げ、このことは、二重層の容量性応答における直列抵抗を示す。この抵抗は、図１０Ａに示すように、ピーク電流を制限する。ＲＣ電気化学的接続の直列形状が、ＲＣ時定数を特徴とする応答減衰に見られる。非ファラデー性セルの電気特性は、内容が、その全体において参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第９，５５１，６９７でより詳細に説明されている。
【００９５】
[0116]図１０Ｂは、本発明の実施形態による、配列決定作業中の、非ファラデー性ナノポアセル内の、測定された電気的信号の減衰の一例を示す。上側の図では、１０２０は、配列決定作業の未処理の測定された電気的信号を示す。下側の図では、１０３０は、電気的信号１０２０のタイムスライスを示す。下側の図は、配列決定セル１０３１の電極全体に印加される電圧、測定された開経路電気的信号１０３３、および核酸サンプルがナノポア１０３５内部に存在するときの測定信号を示す。ナノポア電圧は、開経路信号１０３３によって表されるように、一定の印加電圧１０２０を用いても、時間と共に減少し続けることが見られる。
【００９６】
[0117]図１１は、いくつかの実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、印加電圧およびナノポア電圧を示す。この例では、印加電圧信号１１１０は、周期Ｔを有する周期的信号である。各周期Ｔでは、電圧信号１１１０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１１１１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１１１２を有する。持続時間Ｄ１では、印加電圧信号１１１０の振幅は、一定である。持続時間Ｄ２では、印加電圧信号１１１０は、反対の極性を有し、印加電圧信号１１１２の振幅も、一定である。配列決定は、核酸がナノポアを通り移動する持続時間Ｄ１に実行される。持続時間Ｄ２では、印加電圧は、反転される。反対の電圧を印加することにより、キャパシタにかかる有効電圧を減少させる原因となる、２重層キャパシタにおけるイオンが、ナノポアを通り逆流することを可能にし、その結果、セルが初期化され、さらなる配列決定のために開始状態に戻り得るようになる。ＡＣ信号のそのような負の部分は、一方向のスピードバンプと組み合わせて使用され得て（本明細書でさらに説明するように）、その結果、核酸は、ナノポアを通り後方向へ移動しない。図１１の例では、第１の部分１１１１の持続時間Ｄ１は、周期Ｔのおよそ３分の１（３３％）であり、約３３％のデューティサイクルをもたらす。他の例では、デューティサイクルは、４０％、または他の適切な値であり得る。
【００９７】
[0118]図１１では、ナノポア電圧１１２０は、核酸分子を、ナノポアを通して移動させる、ナノポア全体にかかる有効電圧を表す。いくつかの事例では、ナノポア電圧１１２０は、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧１１２０は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。各周期Ｔでは、ナノポア電圧信号１１２０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１１２１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１１２２を有する。持続時間Ｄ１では、非ファラデー性伝導での容量性効果のため、ナノポア電圧信号１１２１の振幅は、時間と共に減少する。減少率は、ナノポアセルの容量性および抵抗性の成分により、指数関数的であり得る。説明を簡単にするために、ナノポア電圧１１２１は、線形的に減少するように示す。同様に、持続時間Ｄ２では、ナノポア電圧信号１１２２は、反対の極性を有し、ナノポア電圧信号１１２２の振幅も、時間と共に減少する。Ｄ１およびＤ２の両方において、減少率は、非ファラデー性ナノポアセル内の、印加電圧１１１１およびキャパシタンスに依存する。
【００９８】
[0119]図１１では、時間ｔ１で、持続時間Ｄ１が開始し、印加電圧１１１１が、ナノポアセルに印加され、ナノポア電圧１１２４は、配列決定作業のためにナノポアを通り核酸分子を移動させるのに要する電圧を表す、参照電圧Ｖｒｅｆより高い。しかしながら、ナノポア電圧の正の部分１１２１は、非ファラデー性ナノポアセル内の容量性効果のため、時間と共に減少する。時間ｔ２では、ナノポア電圧１１２１は、Ｖｒｅｆに等しい１１２５まで降下する。時間ｔ２を越えて、ナノポア電圧１１２１は、Ｖｒｅｆより低く降下し、ナノポアセルは、配列決定作業のためにナノポアを通して核酸分子を移動させることが、もはや不可能になる。結果として、ナノポアセルは、印加電圧持続時間の限られた部分の間のみ動作する。例示として、印加電圧は、約２秒の正の部分を有し、使用可能な部分は、約５００ミリ秒（ｍｓｅｃ）のみであり得る。したがって、ナノポア作業のより効果的な方法が、非常に所望される。
【００９９】
ＩＶ．非ファラデー性セルへの増大する電圧
[0120]本発明のいくつかの実施形態では、例えば単鎖のＤＮＡ分子などの核酸分子を配列決定する方法が、提供される。方法は、延長された期間にわたり、単鎖のＤＮＡを配列決定するための十分な印加電圧を供給する。例えば、増大する振幅を有する電圧が、印加電圧の持続時間の間中、配列決定を実行するのに十分な振幅を有するナノポア電圧を維持するために、ナノポアセルに印加され得る。
【０１００】
[0121]図１２は、いくつかの実施形態による、核酸分子を配列決定する方法を示すフローチャートである。方法は、図１〜６に関連して上述されたセルと組み合わせて使用され得る。
【０１０１】
[0122]ブロック１２１０では、方法１２００は、非ファラデー性伝導用に構成された配列決定セルを提供するステップを含む。配列決定セルは、ウェル上に存在する膜内のナノポアを有する。そのような配列決定セルの一例が、図６に関連して上に示した。配列決定セルは、ウェルの下部の第１の電極、膜上のチャンバ内の第２の電極、およびウェルおよびチャンバ内の電解質を含む。第１の電極は、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され、電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する。
【０１０２】
[0123]ブロック１２２０では、方法は、増大する振幅を有する電圧信号を印加するステップを含む。第１の電圧信号は、第１の電極と第２の電極とを横断して印加され、それにより、配列決定セル内の核酸分子を、ナノポアを通して移動させる力を、生じさせる。上述のように、ナノポア全体にかかる電圧が使用可能な電圧値よりも低く降下する場合、配列決定セルは、ナノポアを通して核酸分子を移動させることを停止する。ナノポア全体にかかる電圧が使用可能な電圧値より低く降下することを避けるために、第１の電圧信号は、第１の電圧信号の印加中に、第１の電極でのキャパシタンスの変化を補償するために、増大するように構成される。
【０１０３】
[0124]ブロック１２３０では、方法は、１つまたは複数のヌクレオチドに対応する第１の信号値のセットを決定するステップをさらに含む。配列決定は、第１の電圧信号の間に測定された第１の信号値のセットを決定するステップによって実行され、第１の信号値のセットは、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応する。
【０１０４】
[0125]本実施形態により、印加電圧信号は、異なる形態で増大され得る。例えば、電圧信号は、所定の変化率で増大され得る。電圧信号が増大する変化率は、配列決定セルの放電特性から決定され得る。配列決定セルの放電特性は、ＲＣ（抵抗−キャパシタンス）時定数によって説明され得る。別法として、配列決定セルの放電特性は、例えば、時間と共に変化する一連の電圧信号によって、数値的に説明され得る。放電特性に基づいて、電圧信号の変化率は、決定され得る。例えば、電圧信号は、線形的に増大する振幅を有し得る。別の例では、電圧信号は、指数関数的に増大する振幅であり得る。さらに別の例では、電圧信号は、フィードバック制御メカニズムを用いて、監視され修正され得る。これらの代替案は、以下の例でより詳細に説明される。
【０１０５】
Ａ．線形的に増大する印加電圧
[0126]図１３Ａは、いくつかの実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、線形的に増大する印加電圧およびナノポア電圧を示す。この例では、印加電圧１３１０は、周期Ｔを有する周期的信号である。各期間では、電圧信号１３１０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１３１１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１３１２を有する。持続時間Ｄ１では、印加電圧信号１３１０の振幅は、非ファラデー性セルでの容量性効果を補償するために、Ｒ１ｍＶ／ｓｅｃの変化率で線形的に増大する。持続時間Ｄ２では、印加電圧信号１３１０は、反対の極性を有し、印加電圧信号１３１２の振幅は、Ｒ２ｍＶ／ｓｅｃの変化率で線形的に増大する。図１３Ａの例では、第１の部分１３１１の持続時間Ｄ１は、周期Ｔのおよそ３分の１（３３％）であり、約３３％のデューティサイクルをもたらす。他の例では、デューティサイクルは、４０％、または他の適切な値であり得る。
【０１０６】
[0127]図１３Ａでは、ナノポア電圧１３２０は、核酸分子を、ナノポアを通り移動させる、ナノポア全体にかかる有効電圧を表す。いくつかの事例では、ナノポア電圧１３２０は、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧１３２０は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。
【０１０７】
[0128]各周期Ｔでは、ナノポア電圧信号１３２０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１３２１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１３２２を有する。持続時間Ｄ１では、ナノポア電圧信号１３２１の振幅は、印加電圧１３１０が容量性効果を克服するのに不十分な場合、時間と共に減少する。同様に、持続時間Ｄ２では、ナノポア電圧信号１３２２は、反対の極性を有し、ナノポア電圧信号１３２２の振幅も、時間と共に減少する。Ｄ１およびＤ２の両方において、減少率は、非ファラデー性ナノポアセル内の、印加電圧１３１１およびキャパシタンスに依存する。なお、持続時間Ｄ１では、ナノポア電圧信号１３２１の振幅は、ナノポアを通して核酸分子を移動させるために要する電圧Ｖｒｅｆより高いことに留意されたい。したがって、期間Ｄ１の間中、ナノポアは、配列決定のために、ナノポアを通して核酸分子を継続的に移動し得る。
【０１０８】
[0129]印加電圧１３１０では、正の部分１３１１の増大率Ｒ１は、ナノポア電圧がナノポアを通して核酸分子を移動させるのに要する電圧Ｖｒｅｆより高く維持することを保証するために、試験的に決定され得る。いくつかの例では、印加電圧の正の部分１３１１の持続時間Ｄ１は、０．５〜２．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１３１１の持続時間Ｄ１は、２．０〜５．０秒であり得る。さらに他の例では、印加電圧の正の部分１３１１の持続時間Ｄ１は、５．０〜２０．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１３１１の持続時間Ｄ１は、２０．０秒より長い、例えば３０秒、５０秒、またはさらに長い時間であり得る。
【０１０９】
Ｂ．階段状に増大する印加電圧
[0130]図１３Ｂは、いくつかの実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、階段状の印加電圧およびナノポア電圧を示す。使用可能なナノポア電圧を維持するために、印加電圧の振幅は、階段状に増大され、その結果、ナノポア電圧は、配列決定作業に使用可能なナノポア電圧を表す事前設定された参照電圧に、またはそれよりも高く、維持される。電圧階段の高さおよび電圧変更のタイミングは、実験によりまたはシミュレーションの促進により、あるいはこれらの方法の組合せにより、決定され得る。
【０１１０】
[0131]図１３Ｂの例では、印加電圧信号１３５０は、周期Ｔを有する周期的信号である。各期間では、電圧信号１３５０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１３５１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１３５２を有する。持続時間Ｄ１では、印加電圧信号１３５０の振幅は、階段状の様式で増大するように構成される。各周期Ｔでは、ナノポア電圧信号１３６０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１３６１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１３６２を有する。ナノポア電圧１３６０は、核酸分子を、ナノポアを通して移動させる、ナノポア全体にかかる有効電圧を表す。いくつかの事例では、ナノポア電圧１３６０は、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧１３６０は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。
【０１１１】
[0132]持続時間Ｄ２では、印加電圧信号１３５０は、反対の極性を有し、印加電圧信号１３５２の振幅は、図１３Ｂで、一定に示されているが、必要ならば時間と共に増大され得る。図１３Ｂの例では、第１の部分１３５１の持続時間Ｄ１は、周期Ｔのおよそ３分の１（３３％）であり、約３３％のデューティサイクルをもたらす。他の例では、デューティサイクルは、４０％、または他の適切な値であり得る。
【０１１２】
[0133]図１３Ｂでは、時間ｔ１で、振幅Ｖ１を有する印加電圧が、配列決定セルに印加され、Ｖｒｅｆよりも大きく配列決定に使用可能なナノポア電圧である、ナノポア電圧Ｖｐをもたらす。非ファラデー性セルの容量性の特質により、ナノポア電圧は、時間と共に降下する。時間ｔ２では、ナノポア電圧は、Ｖｒｅｆまで降下する。この時間に、システムは、印加電圧をＶ２まで増大させ、ナノポア電圧をＶｐに戻す。配列決定作業は、ナノポア電圧が再びＶｒｅｆまで降下するとき、ｔ３まで継続される。この状態により、システムが印加電圧をＶ３まで増大させる。Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３などへの電圧階段の振幅およびｔ１、ｔ２、およびｔ３などへの電圧変更のタイミングは、実験によりまたはシミュレーションの促進により、あるいはこれらの方法の組合せにより、決定され得る。印加電圧の階段状の増大は、ナノポア電圧をＶｒｅｆに、またはそれより高く維持するために、持続時間Ｄ１中継続される。したがって、期間Ｄ１中、ナノポアは、配列決定のために、ナノポアを通して核酸分子を継続的に移動し得る。
【０１１３】
[0134]持続時間Ｄ２では、ナノポア電圧信号１３６２は、反対の極性を有し、ナノポア電圧信号の振幅は、印加電圧が一定の場合、時間と共に減少する。図面を単純化するために、持続時間Ｄ２での印加電圧１３５２およびナノポア電圧信号１３６２の両方が、一定として示されている。いくつかの実施形態では、階段状の印加電圧は、持続時間Ｄ２でも印加され得る。
【０１１４】
[0135]いくつかの例では、印加電圧の正の部分１３５１の持続時間Ｄ１は、０．５〜２．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１３５１の持続時間Ｄ１は、２．０〜５．０秒であり得る。さらに他の例では、印加電圧の正の部分１３５１の持続時間Ｄ１は、５．０〜２０．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１３５１の持続時間Ｄ１は、２０．０秒より長い、例えば３０秒、５０秒、またはさらに長い時間であり得る。
【０１１５】
Ｃ．指数関数的に増大する印加電圧
[0136]図１４は、いくつかの実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、指数関数的に増大する印加電圧およびナノポア電圧を示す。この例では、印加電圧信号１４１０は、周期Ｔを有する周期的信号である。各期間では、電圧信号１４１０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１４１１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１４１２を有する。持続時間Ｄ１では、印加電圧信号１４１０の振幅は、指数関数的に増大する。持続時間Ｄ２では、印加電圧信号１４１０は、反対の極性を有し、印加電圧信号１４１２の振幅は、線形的または指数関数的に増大する。図１４の例では、第１の部分１４１１の持続時間Ｄ１は、周期Ｔのおよそ３分の１（３３％）であり、約３３％のデューティサイクルをもたらす。他の例では、デューティサイクルは、４０％、または他の適切な値であり得る。
【０１１６】
[0137]図１４では、ナノポア電圧１４２０は、核酸分子を、ナノポアを通して移動させる、ナノポア全体にかかる有効電圧を表す。いくつかの事例では、ナノポア電圧１４２０は、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧１４２０は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。
【０１１７】
[0138]各周期Ｔでは、ナノポア電圧信号１４２０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１４２１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１４２２を有する。持続時間Ｄ１では、ナノポア電圧信号１４２１の振幅は、印加電圧１４１０が容量性効果を克服するのに不十分な場合、時間と共に減少する。同様に、持続時間Ｄ２では、ナノポア電圧信号１４２２は、反対の極性を有し、ナノポア電圧信号１４２２の振幅も、時間と共に減少する。Ｄ１およびＤ２の両方において、減少率は、非ファラデー性ナノポアセル内の、印加電圧１４１１およびキャパシタンスに依存する。なお、持続時間Ｄ１では、ナノポア電圧信号１４２１の振幅は、ナノポアを通して核酸分子を移動させるために要する電圧Ｖｒｅｆより高いことに留意されたい。したがって、期間Ｄ１の間中、ナノポアは、配列決定のために、ナノポアを通して核酸分子を継続的に移動し得る。
【０１１８】
[0139]印加電圧１４１０では、正の部分１４１１の増大率は、ナノポア電圧がナノポアを通して核酸分子を移動させるのに要する電圧Ｖｒｅｆより高く維持することを保証するために、試験的に決定され得る。いくつかの例では、印加電圧の正の部分１４１１の持続時間Ｄ１は、０．５〜２．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１４１１の持続時間Ｄ１は、２．０〜５．０秒であり得る。さらに他の例では、印加電圧の正の部分１４１１の持続時間Ｄ１は、５．０〜２０．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１４１１の持続時間Ｄ１は、２０．０秒より長い、例えば３０秒、５０秒、またはさらに長い時間であり得る。
【０１１９】
Ｖ．揺動パルスを伴う印加電圧
[0140]スピードバンプを用いる実施形態に関して、揺動パルス用いることは、スピードバンプが、より迅速にナノポアを通り除去されるまたは通過するようにさせるために、有益であり得る。スピードバンプを有することは、核酸が、過剰に高速に移動し、正確さが得られなくなることの回避を促進し得るが、それにより配列決定処理能力が、過剰に減少し得る。揺動パルスは、トレードオフのバランスをとることを促進し、ナノポアを通る核酸の速度を制御し得る。
【０１２０】
Ａ．印加信号
[0141]図１５は、いくつかの実施形態による、非ファラデー性ナノポアセル内の、揺動パルスを含む増大する印加電圧およびナノポア電圧を示す。これらの実施形態では、印加電圧信号は、ベース電圧上に重畳された、いくつかの狭小な電圧パルスを有し得る。
【０１２１】
[0142]図１５では、印加電圧信号１５１０は、周期Ｔを有する周期的信号である。各期間では、電圧信号１５１０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１５１１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１５１２を有する。持続時間Ｄ１では、印加電圧１５１１は、ベース電圧１５０１と、複数の揺動電圧パルス１５０２とを含む。この例では、ベース電圧信号１５０１の振幅は、線形的に増大するように見えるが、例えば指数関数的に増大するなど、異なる方法で増大することもあり得る。いくつかの事例では、ベース電圧は、一定である。揺動パルス１５０２は、Ｗ１の幅およびＷ２の周期を有し得る。持続時間Ｄ２では、印加電圧信号は、反対の極性を有し、印加電圧信号１５１２の振幅は、例えば線形的または指数関数的など異なる様式で時間と共に増大し得る。持続時間Ｄ２では、印加電圧１５１２は、揺動パルスを有するまたは有さない可能性がある。図１５の例では、第１の部分１５１１の持続時間Ｄ１は、周期Ｔのおよそ３分の１（３３％）であり、約３３％のデューティサイクルをもたらす。他の例では、デューティサイクルは、４０％、５０％、または他の適切な値であり得る。
【０１２２】
[0143]図１５では、ナノポア電圧１５２０は、核酸分子を、ナノポアを通して移動させる、ナノポア全体にかかる有効電圧を表す。いくつかの事例では、ナノポア電圧１５２０は、例えば回路分析またはシミュレーション技術を用いて、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧１５２０は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。図１５に示すように、ナノポア電圧１５２０の正の部分１５２１は、ナノポアを通して核酸分子を移動させるのに要する電圧を表す、参照電圧Ｖｒｅｆより高く留まる。
【０１２３】
[0144]各周期Ｔでは、ナノポア電圧信号１５２０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１５２１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１５２２を有する。持続時間Ｄ１では、ナノポア電圧信号１５２１の振幅は、平坦なベース電圧を有するように見える。しかしながら、ベース電圧は、印加電圧１５１０が容量性効果を克服するのに不十分な場合、時間と共に減少し得る。持続時間Ｄ１のナノポア電圧信号１５２１は、印加電圧に応じた複数の揺動パルスをさらに有し得る。持続時間Ｄ２では、ナノポア電圧信号１５２２は、反対の極性を有し、ナノポア電圧信号１５２２の振幅も、時間と共に減少する。Ｄ１およびＤ２の両方において、ナノポア電圧の変化率は、非ファラデー性ナノポアセル内の、印加電圧１５１１およびキャパシタンスに依存する。なお、持続時間Ｄ１では、ナノポア電圧信号１５２１の振幅は、ナノポアを通して核酸分子を移動させるために要する電圧Ｖｒｅｆより高いことに留意されたい。したがって、期間Ｄ１の間中、ナノポアは、配列決定のために、ナノポアを通して核酸分子を継続的に移動し得る。
【０１２４】
[0145]印加電圧１５１０では、正の部分１５１１の増大率Ｒ１は、ナノポア電圧がナノポアを通して核酸分子を移動させるのに要する電圧Ｖｒｅｆより高く維持することを保証するために、試験的に決定され得る。いくつかの例では、印加電圧の正の部分１５１１の持続時間Ｄ１は、０．５〜２．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１５１１の持続時間Ｄ１は、２．０〜５．０秒であり得る。さらに他の例では、印加電圧の正の部分１５１１の持続時間Ｄ１は、５．０〜２０．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１５１１の持続時間Ｄ１は、２０．０秒より長い、例えば３０秒、５０秒、またはさらに長い時間であり得る。
【０１２５】
[0146]一例として、核酸分子の鎖は、ナノポアを通して引っ張られ、ストッパまたはスピードバンプは、鎖を期間中ナノポアに保持し、二重鎖部分は、デハイブリタイズされ浮き上がる。この時間中、配列決定読取りが、実行され得る。本発明の実施形態では、揺動パルスは、ナノポアを通る配列決定セル内の核酸分子の移動を、高速化し得る。いくつかの実施形態では、揺動パルスＷ１の幅は、約０．１ミリ秒であり得て、揺動パルスＷ２の周期は、約２．０ミリ秒であり得る。いくつかの実施形態では、ベース電圧の振幅は、約１２０ミリボルトであり得て、揺動パルスの高さは、約８０ミリボルトであり得る。いくつかの例では、印加電圧は、４０％のデューティサイクルのため、１．５秒〜２秒の正の部分Ｄ１と、２または３秒の負の部分Ｄ２とを有し得る。この場合、印加電圧の周期Ｔは約５秒であり、２秒のＤ１および３秒のＤ２を有し得る。これらのパラメータは、個別の用途により調整され得る。
【０１２６】
[0147]いくつかの実施形態では、図１５の方法を用いて、配列決定セルは、ＤＮＡ塩基を、１００ミリ秒毎にナノポアを通り移動させるように構成され得る。この配置では、２０の塩基が、２秒毎に配列決定され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの１５０の塩基または２００の塩基が、１分間に配列決定され得て、このことが多くの有用な用途を可能にさせ得る。
[0148]図１５では、揺動パルス１５０２は、一定の振幅を有するように示される。しかしながら、揺動電圧パルスは、異なる形状を有し得る。図１５の挿入図１５３０に示すように、揺動電圧パルス１５０３は、一定の振幅を有し、揺動パルス１５０４は、傾斜した形状を有する。いくつかの例では、揺動パルスの形状は、印加電圧信号のベース部分の形状を反映し得る。他の実施例では、揺動パルスの形状は、独立的に構成され得る。
【０１２７】
Ｂ．ナノポア配列決定セルにおける揺動パルス用電気回路
[0149]図１６は、図２のナノポアセル２００および図６のナノポアセル６００などのナノポアセル内の電気回路１６００（図２の電気回路２２２の部分を含み得る）の一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、電気回路１６００は、図４の電気回路４００と同様であり、同様の構成要素の詳細な説明を、ここでは繰り返さない。例えば、電気回路１６００は、ナノポアセンサチップ内の複数ナノポアセルまたは全てのナノポアセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称され得る対電極１６１０を含む。共通電極は、電圧源ＶＬＩＱ１６２０または電圧源ＶＬＩＱＢ１６２１に接続することによって、共通の電位を、ナノポアセル内の脂質二重層（例えば、脂質二重層６１４）と接触するバルク電解質（例えば、図６のバルク電解質６０８）に印加するように構成され得る。いくつかの実施形態では、ＡＣ非ファラデー性モードが、電圧ＶＬＩＱをＡＣ信号（例えば、方形波）で変調するために利用され、それをナノポアセル内で脂質二重層に接触するバルク電解質に印加し得る。電圧源ＶＬＩＱ１６２０およびＶＬＩＱＢ１６２１は、スイッチ１６４１および１６４２と共に、図１５に関連して上述したように、ベース電圧上に重畳される揺動パルスを印加するために、使用され得る。
【０１２８】
[0150]図１６は、作用電極１６０２および脂質二重層の電気特性を表す電気モデル１６２２をさらに示す。電気モデル１６２２は、脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスをモデル化するコンデンサ１６２６（Ｃ二重層）と、ナノポア内の個々のタグの存在に基づいて変化し得る、ナノポアに関連付けられた可変抵抗をモデル化する抵抗器１６２８（Ｒポア）とを含む。電気モデル１６２２は、２重層キャパシタンス（Ｃ２重層）を有し、作用電極およびウェルの電気特性を表すコンデンサ１６２４をさらに含む。作用電極は、他のナノポアセル内の作用電極から独立した別個の電位を印加するように構成され得る。
【０１２９】
[0151]オペアンプ１６０７およびトランジスタ１６０６は、電圧調整器を形成する。オペアンプ１６０７は、２つの入力ＶＡおよびＶＢを有する。電圧調整器は、ナノポアセル内のナノポア全体に印加されることになる電圧刺激を供給するために、作用電極電圧をＶＡに維持する。回路のそのような任意選択の構成要素は、定電圧を維持するのに要する電流の変化を測定するとき、使用され得る。
【０１３０】
[0152]回路１６００は、オンチップ積分コンデンサ１６０８（ｎｃａｐ）をさらに含み得る。積分コンデンサ１６０８は、リセット信号１６０３を用いてスイッチ１６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ１６０８が電圧源ＶＰＲＥ＿Ａ１６０５またはＶＰＲＥ＿Ｂ１６１５に接続されることによって、予備充電される。いくつかの実施形態では、電圧源は、固定の参照電圧を提供する。スイッチ１６０１が閉じられているとき、積分コンデンサ１６０８は、電圧源ＶＰＲＥ＿Ａ１６０５またはＶＰＲＥ＿Ｂ１６１５の参照電圧レベルまで予備充電され得る。
【０１３１】
[0153]デジタルプロセッサ１６３０は、例えば、正規化、データバッファリング、データフィルタリング、データ圧縮、データ削減、イベント注出、またはナノポアセルアレイからのＡＤＣ出力データを多様なデータフレームへのアセンブリングなどのために、ＡＤＣ出力データを処理し得る。いくつかの実施形態では、デジタルプロセッサ１６３０は、塩基判定などのさらに下流の処理を実行し得る。デジタルプロセッサ１６３０は、ハードウェア（例えば、ＧＰＵ、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの内部の）またはハードウェアとソフトウェアとの組合せとして実装され得る。
【０１３２】
Ｃ．揺動パルスを用いる利点
[0154]図１７は、本発明のいくつかの実施形態による、揺動パルスを伴う印加電圧の効果を示し得る、ナノポアセルから取得されたデータポイントの例を示す。図１７は、ナノポアセルからの出力データポイントを、印加電圧の６つのサイクル１７０１〜１７０６を用いて示す。第１から第３のサイクル１７０１、１７０２、および１７０３の各々では、ベース電圧およびベース電圧に重畳された複数の揺動パルスを各々有する、パルスＤＣ波形が印加された。第４から第６のサイクル１７０４、１７０５、および１７０６の各々では、平坦なＤＣ波形が印加された。
【０１３３】
[0155]第１から第３のサイクル１７０１、１７０２、および１７０３での出力データポイントは、３つ以上のスピードバンプが、通過、または除去され、その結果、配列決定測定値が、核酸の３つの部分のために取得されたことを示す。他方で、第４から第６のサイクル１７０４、１７０５、および１７０６での出力データポイントは、配列決定されつつある核酸の同一の部分のみの、１サイクル全体を示す。
【０１３４】
ＶＩ．フィードバックを伴い動的に印加される電圧
[0156]いくつかの実施形態では、核酸分子を配列決定する方法は、動的に印加される電圧を含み得る。この方法では、印加電圧は、配列決定作業を継続するために、使用可能なナノポア電圧を維持する必要に応じて調整される。
【０１３５】
[0157]図１８は、いくつかの実施形態による、核酸分子を配列決定する方法を示すフローチャートである。方法は、図１〜６に関連して上述されたセルと組み合わせて使用され得る。ブロック１８１０では、方法１８００は、非ファラデー性伝導用に構成された配列決定セルを提供するステップを含む。方法は、ウェル上に存在する膜内のナノポアを有する配列決定セルを提供するステップを含む。そのような配列決定セルの一例が、図６に関連して上に示した。配列決定セルは、ウェルの下部の第１の電極、膜上のチャンバ内の第２の電極、およびウェルおよびチャンバ内の電解質も含む。第１の電極は、イオン電流の非ファラデー性伝導を促進するように構成され、電解質内のイオンでキャパシタンスを形成する。
【０１３６】
[0158]ブロック１８２０では、方法は、電圧信号を配列決定セルに印加するステップを含む。第１の電圧信号は、第１の電極と第２の電極とを横断して印加され、それにより、核酸分子を、ナノポアを通して配列決定セル内に移動させる力を、生じさせる。上述のように、ナノポア全体にかかる電圧が使用可能な電圧値よりも低く降下する場合、配列決定セルは、ナノポアを通して核酸分子を移動させることを停止する。
【０１３７】
[0159]ブロック１８３０では、ナノポア全体にかかる電圧が使用可能な電圧値より低く降下するのを予防するために、方法は、ナノポア電圧信号の振幅を監視するステップを含む。ここで、ナノポア電圧は、例えば回路分析またはシミュレーション技術を用いて、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。
【０１３８】
[0160]ブロック１８４０では、方法は、ナノポア電圧が事前設定された参照電圧よりも低いか否かを判定するステップをさらに含む。参照電圧は、配列決定作業に使用可能なナノポア電圧を表す。上述のように、配列決定中、電気的な力が、ナノポアを通して核酸分子を引っ張るために、ナノポアに印加される。容量性の効果により、ナノポア電圧は、時間と共に減少し得て、配列決定作業に要する電圧より低く降下し得る。事前設定された参照電圧は、実験的に、または回路分析もしくはシミュレーション技術によって、決定され得る。ナノポア電圧は、参照電圧と比較され得て、判断がなされる。
【０１３９】
[0161]ブロック１８５０では、ナノポア電圧の振幅が、事前設定された参照電圧より低く降下する場合、印加電圧は、ナノポア電圧が事前設定された参照電圧よりも高くなるように増大される。
【０１４０】
[0162]ブロック１８６０では、ナノポア電圧が、参照電圧よりも低くない場合、方法は、配列決定を実行するために、前に進む。配列決定は、第１の電圧信号の間に測定された第１の信号値のセットを決定するステップによって実行され得て、第１の信号値のセットは、核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドに対応する。
【０１４１】
[0163]方法は、動的に調整された印加電圧を用いて、核酸分子の配列決定の実行を継続し得る。ナノポア電圧は、ナノポアを通して核酸分子を移動させるのに要する電圧を表す、参照電圧Ｖｒｅｆより高く維持され得る。
【０１４２】
[0164]代替の実施形態では、方法１８００は、ブロック１８２０で、電圧信号を印加する代わりに、電流信号を配列決定セルに印加することによって、実行され得る。印加される電流信号は、ブロック１８４０で判定されたナノポアの電流または電圧に基づいて、調整され得る。
【０１４３】
[0165]図１９は、いくつかの実施形態による、フィードバック制御を用いた、非ファラデー性ナノポアセル内の、印加電圧およびナノポア電圧を示す。使用可能なナノポア電圧を維持するために、ナノポア電圧の振幅は、配列決定作業に使用可能なナノポア電圧を表す事前設定された参照電圧と比較して、監視される。ナノポア電圧の振幅が、事前設定された参照電圧より低く降下する場合、印加電圧は、ナノポア電圧が事前設定された参照電圧よりも高くなるように増大される。
【０１４４】
[0166]この例では、印加電圧信号１９１０は、周期Ｔを有する周期的信号である。各期間では、電圧信号１９１０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１９１１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１９１２を有する。持続時間Ｄ１では、印加電圧信号１９１０の振幅は、ナノポア電圧内の変化に応じて増大する。各周期Ｔでは、ナノポア電圧信号１９２０は、持続時間Ｄ１を有する第１の（正の）部分１９２１および持続時間Ｄ２を有する第２の（負の）部分１９２２を有する。ナノポア電圧１９２０は、核酸分子を、ナノポアを通して移動させる、ナノポア全体にかかる有効電圧を表す。いくつかの事例では、ナノポア電圧１９２０は、ナノポアを通る電流から導出され得る。別法として、ナノポア電圧１９２０は、実験の配置で、探針を用いて直接測定され得る。
【０１４５】
[0167]持続時間Ｄ２では、印加電圧信号１９１０は、反対の極性を有し、印加電圧信号１９１２の振幅は、図１９で、一定に示されているが、必要ならば時間と共に増大され得る。図１９の例では、第１の部分１９１１の持続時間Ｄ１は、周期Ｔのおよそ３分の１（３３％）であり、約３３％のデューティサイクルをもたらす。他の例では、デューティサイクルは、４０％、または他の適切な値であり得る。
【０１４６】
[0168]図１９では、時間ｔ１で、振幅Ｖ１を有する印加電圧が、配列決定セルに印加され、Ｖｒｅｆよりも大きく配列決定に使用可能なナノポア電圧である、ナノポア電圧Ｖｐをもたらす。非ファラデー性セルの容量性の特質により、ナノポア電圧は、時間と共に降下する。時間ｔ２では、ナノポア電圧は、Ｖｒｅｆまで降下する。この時間に、システムは、印加電圧をＶ２まで増大させ、ナノポア電圧をＶｐに戻す。配列決定作業は、ナノポア電圧が再びＶｒｅｆまで降下するとき、ｔ３まで継続される。この状態により、システムが印加電圧をＶ３まで増大させる。フィードバック制御サイクルは、ナノポア電圧をＶｒｅｆに、またはそれより高く維持するために、持続時間Ｄ１中継続される。したがって、期間Ｄ１中、ナノポアは、配列決定のために、ナノポアを通して核酸分子を継続的に移動し得る。
【０１４７】
[0169]持続時間Ｄ２では、ナノポア電圧信号１９２２は、反対の極性を有し、ナノポア電圧信号の振幅は、印加電圧が一定の場合、時間と共に減少する。図面を単純化するために、持続時間Ｄ２での印加電圧１９１２およびナノポア電圧信号１９２２の両方が、一定として示されている。いくつかの実施形態では、フィードバック方法は、持続時間Ｄ２でも印加され得る。
【０１４８】
[0170]いくつかの例では、印加電圧の正の部分１９１１の持続時間Ｄ１は、０．５〜２．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１９１１の持続時間Ｄ１は、２．０〜５．０秒であり得る。さらに他の例では、印加電圧の正の部分１９１１の持続時間Ｄ１は、５．０〜２０．０秒であり得る。他の例では、印加電圧の正の部分１９１１の持続時間Ｄ１は、２０．０秒より長い、例えば３０秒、５０秒、またはさらに長い時間であり得る。
【０１４９】
ＶＩＩ．コンピュータシステム
[0171]本明細書で説明したコンピュータシステムの任意のものは、任意の適切な数のサブシステムを利用し得る。そのようなサブシステムの例は、図２０のコンピュータシステム１０内で示した。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、ここでサブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態では、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部に構成要素を有する、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯機器を含み得る。
【０１５０】
[0172]図２０で示したサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続されている。プリンタ７４、キーボード７８、記憶デバイス７９、ディスプレイアダプタ８２に結合されているモニタ７６、およびその他などの付加的なサブシステムを示す。Ｉ／Ｏ制御装置７１に結合された外付けおよび入出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、Ｆｉｒｅ  Ｗｉｒｅ（登録商標））などの当技術分野で知られている任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インタフェース８１（例えば、イーサネット（登録商標）、Ｗｉ−Ｆｉ、など）は、コンピュータシステム１０をインターネットなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナに接続するために用いられ得る。システムバス７５を介した相互接続により、サブシステム間での情報交換を可能にするだけでなく、セントラルプロセッサ７３が、各サブシステムと通信すること、システムメモリ７２または記憶デバイス７９（例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令実行を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶デバイス７９は、コンピュータ可読媒体を含み得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計、その他などのデータ収集デバイス８５である。本明細書で説明したデータの任意のものは、ある構成要素から別の構成要素へ出力され得て、ユーザに出力され得る。
【０１５１】
[0173]コンピュータシステムは、例えば、外部インタフェース８１によって、内部インタフェースによって、またはある構成要素から別の構成要素へ接続および取り外しされ得る取り外し可能な記憶デバイスを介して、共に接続される、複数の同一の構成要素またはサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワークを通して通信し得る。そのような事例では、あるコンピュータは、クライアント、別のコンピュータは、サーバと考えることができ、ここで各々は、同一のコンピュータシステムの一部であり得る。クライアントおよびサーバは、各々複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含み得る。
【０１５２】
[0174]実施形態の態様は、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を用いて、および／またはモジュラーまたは統合された様式の一般にプログラム可能なプロセッサを伴う、コンピュータソフトウェアを用いて、制御ロジックの形態で実施され得る。本明細書で使用されるとき、プロセッサは、専用のハードウェアだけでなく、同一の集積チップ上のシングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、または単一の回路基板上のマルチプロセシングユニット、あるいはネットワーク接続されたプロセッサを含み得る。本開示および本明細書で提供された教示に基づいて、ハードウェアならびにハードウェアおよびソフトウェアの組合せを用いて、本発明の実施形態を実施するための他の方法および／または方法が、当業者には、知られ、かつ理解されよう。
【０１５３】
[0175]本出願で説明されるソフトウェアの構成要素または機能の任意のものは、例えばＪａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、または例えば、従来のまたはオブジェクト指向の技術を用いたＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を用いてプロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実装され得る。ソフトウェアコードは、一連の命令または指令として、保存および／または伝送用の、コンピュータ可読媒体上に格納され得る。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ、フロッピーディスクなどの磁気媒体、コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）などの光学的媒体、またはフラッシュメモリ、などを含み得る。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶または伝送デバイスの任意の組合せであり得る。
【０１５４】
[0176]そのようなプログラムは、さらにエンコードされ、インターネットを含む、多様なプロトコルに従う有線、光学、および／または無線ネットワークを介した伝送に適応された、搬送波信号を用いて伝送され得る。そのように、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムを用いてエンコードされたデータ信号を使用して作成され得る。プログラムコードを用いてエンコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスを用いて包装され得て、または別個に他のデバイスから供給され得る（例えば、インターネットでのダウンロード）。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、個々のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、または完全なコンピュータシステム）上にまたは内部に備えられ得て、また、システムまたはネットワーク内部の異なるコンピュータ製品上にまたは内部に存在し得る。コンピュータシステムは、本明細書で説明した成果の任意のものをユーザに提供するための、モニタ、プリンタ、または他の好適なディスプレイを含み得る。
【０１５５】
[0177]本明細書で説明した方法の任意のものは、ステップを実行するように構成され得る１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて、全体的にまたは部分的に実行され得る。したがって、各ステップまたはステップの各グループを実行する異なる構成要素を潜在的に有する、本明細書で説明した方法の任意のもののステップを、実行するように構成されたコンピュータシステムに、実施形態は、向けられ得る。番号を付されたステップが提示されたが、本明細書の方法のステップは、同時に、もしくは異なる時間で、または異なる順序で実行され得る。さらに、これらのステップの部分は、他の方法からの他のステップの部分と共に用いられ得る。また、ステップの全てまたは部分は、任意選択的であり得る。さらに、任意の方法の任意のステップは、モジュール、ユニット、回路、またはこれらのステップを実行するためのシステムの他の手段を用いて、実行され得る。
【０１５６】
[0178]個々の実施形態の個別の詳細が、本発明の実施形態の技術概念および範囲から逸脱することのなく、任意の好適な方法で組み合わされ得る。しかし、本発明の他の実施形態は、各々の個別の態様に関する特定の実施形態に、またはこれらの個別の態様の特定の組合せに、向けられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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