(57)【要約】  HLA-DRを指向するCAR-T組成物を提供する。提供する特定のHLA-DR CAR組成物は、対象のHLA-DRの多型領域に対して低いアフィニティーを呈する。HLA-DR CAR-Tに関係するさまざまなインビトロ法およびインビボ法ならびに試薬類も提供される。本明細書に記載する方法は、例えばHLA-DR結合の特徴づけ、T細胞の増殖、ならびに本明細書に提供するHLA-DR CAR-T組成物を用いたがんの防止および/または治療的処置を含みうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（CAR）を含むT細胞であって、CARがHLA-DR抗原結合ドメインを含み、T細胞が対象にとって自家であり、HLA-DR抗原結合ドメインが対象由来のT細胞に低いアフィニティーで結合する、T細胞。
【請求項２】
HLA-DR抗原結合ドメインがMVR-scFvまたはその変異体である、請求項1記載のT細胞。
【請求項３】
HLA-DR抗原結合ドメインが、SEQ ID NO:1に示す配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:5に示す配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域を含む、請求項1または2記載のT細胞。
【請求項４】
CARがT細胞受容体ζ（TCR-ζ）の細胞内ドメインをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のT細胞。
【請求項５】
CARがCD8α膜貫通ドメインおよび/または4-1BBシグナリングドメインをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のT細胞。
【請求項６】
EBV LCLに対する前記T細胞の死滅効率の2倍または3倍低い死滅効率を、B細胞に対して有する、請求項1〜5のいずれか一項記載のT細胞。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項記載のT細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれか一項記載のT細胞を含むかまたは送達する組成物を対象に投与する工程
を含む、がんを処置する方法。
【請求項９】
（a）対象由来のHLA-DRに低いアフィニティーで結合するHLA-DR抗原結合ドメインを得る工程、および
（b）対象から得られたT細胞において、該HLA-DR抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現させ、それによって改変された自家T細胞を生成させる工程
を含む、改変された自家T細胞を生成させる方法。
【請求項１０】
対象由来のT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果を用意または取得する工程、および
該結合が閾値より低ければ、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを発現するように、対象由来のT細胞を改変する工程
を含む、改変された自家T細胞を調製する方法。
【請求項１１】
HLA-DR抗原結合ドメインがMVR-scFvまたはその変異体である、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
CARがT細胞受容体ζ（TCR-ζ）の細胞内ドメインをさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
CARがCD8α膜貫通ドメインおよび4-1BBシグナリングドメインの一方または両方をさらに含む、請求項9〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
改変された自家T細胞をインビトロで少なくとも8日間培養する工程をさらに含む、請求項9〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
培養する工程が、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、CARの表面発現が低減している改変された自家T細胞の集団を生成させる、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
培養する工程が、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、正常B細胞に対する毒性が低減している改変された自家T細胞の集団を生成させる、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
培養する工程が、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、非悪性細胞よりも悪性細胞に対する選択性が強化されている改変された自家T細胞の集団を生成させる、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
改変された自家T細胞が、対象由来の正常B細胞への顆粒移動の少なくとも2倍であるレベルの、EBV LCLへの顆粒移動を誘導する、請求項14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
請求項14〜18のいずれか一項記載の方法によって調製される改変された自家T細胞を含むかまたは送達する組成物を対象に投与する工程
を含む、がんを処置する方法。
【請求項２０】
がんが血液がんである、請求項8〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
血液がんが、B細胞性急性リンパ性白血病（「BALL」）、T細胞性急性リンパ性白血病（「TALL」）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症から選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
対象が、電離放射線、化学療法剤、抗体作用物質、および細胞ベースの治療から選択される1種または複数種の追加抗がん治療が施されたか、または施される予定であり、そのため対象が両方による処置を受ける、請求項8および19〜21のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2017年2月21日に出願された米国特許出願第62/461,632号に基づく優先権およびその恩典を主張し、前記特許出願の開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
がんは今なお世界の主要死因のうちの1つである。最近の統計では、世界人口の13％ががんで死亡すると報告されている。国際がん研究機関（International Agency for Research on Cancer）（IARC）の推計によると、2012年には、世界中で1410万例の新規がん症例および820万例のがん死症例があった。世界の負荷は、2030年までに、人口増加および加齢ならびに喫煙、不健康な食事および運動不足などのリスク因子への曝露により、新規がん症例2170万例およびがん死症例1300万例に拡大すると予想されている。さらに、痛みとがん処置の医療費とは、がん患者にとっても、その家族にとっても、生活の質が低減する原因になる。
【０００３】
キメラ抗原受容体で改変されたT細胞（CAR-T）は、がんなどの疾患の処置に関して大きな治療的可能性を有する。CAR-T治療法は、強力なターゲットアフィニティーおよびシグナリング機能を、T細胞に付与する。しかし、CAR-T治療の目覚ましい効力は、しばしば、サイトカイン放出症候群（CRS）などの重篤な副作用を伴う。したがって、副作用が低減したCAR-T治療法およびCAR-T戦略を開発するというアンメットニーズが、今も残されている。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、とりわけ、HLA-DR抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現する改変されたT細胞を提供する。本開示は、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCAR（HLA-DR CAR）を、対象からのT細胞へのHLA-DR結合ドメインの結合特徴に基づいて選択し、改変し、かつ/または最適化することができるという洞察を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR結合ドメインはHLA-DRの多型エピトープに対して特異的である。本開示は、対象からの細胞（例えばT細胞）に低いアフィニティーで結合するHLA-DR CARが、一定の疾患および/または障害を処置するための効果的な治療になりうるという認識を包含する。
【０００５】
いくつかの態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（CAR）を含むT細胞であって、CARはHLA-DR抗原結合ドメインを含み、T細胞は対象にとって自家であり、HLA-DR抗原結合ドメインは対象からのT細胞に低いアフィニティーで結合するT細胞を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR抗原結合ドメインはMVR-scFvまたはその変異体である。
【０００６】
いくつかの態様において、本開示は、本開示のHLA-DR CAR T細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む、がんの処置方法を提供する。
【０００７】
いくつかの態様において、本開示は、改変された自家T細胞を生成させる方法であって、（a）対象からのHLA-DRに低いアフィニティーで結合するHLA-DR抗原結合ドメインを得る工程、および（b）前記対象から得られたT細胞において前記HLA-DR抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現させ、それによって改変された自家T細胞を生成させる工程を含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、改変された自家T細胞を調製する方法であって、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果を用意または取得する工程、および前記結合が閾値より低ければ、前記対象からのT細胞を、前記HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを発現するように改変する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、改変された自家T細胞は、適当な刺激を伴う12日間の培養中に、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍またはそれ以上に拡大する。いくつかの態様において、対象からのT細胞に閾値未満の結合で結合するHLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変された自家T細胞は、適当な刺激を伴う12日間の培養中に、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍またはそれ以上に拡大する。いくつかの態様において、対象からのT細胞に閾値未満の結合で結合するHLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変された自家T細胞は、適当な刺激を伴う12日間の培養中に、少なくとも20倍に拡大する。いくつかの態様において、適当な刺激には、T細胞をCD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞に曝露することが含まれる。
【０００９】
いくつかの態様において、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果は、結合アフィニティー（例えばKD）の直接的測定値である。いくつかの態様において、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果は、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度である。いくつかの態様において、機能的アビディティーは、T細胞応答をトリガーするのに必要な抗原量と逆相関する。いくつかの態様において、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度には、T細胞機能のエクスビボ定量、例えばIFN-γ生産、細胞傷害活性（ターゲット細胞を溶解する能力）または増殖が含まれる。いくつかの態様において、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度には、T細胞の最大半量応答（half-maximum response）を誘導するのに必要なHLA-DR抗原結合ドメインの濃度（EC50）を決定することが含まれる。
【００１０】
いくつかの態様において、提供される方法には、HLA-DR抗原結合ドメインを含むHLA-DR CARを発現する改変された自家T細胞の調製および/または生成が含まれる。
【００１１】
いくつかの態様において、HLA-DR抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:2〜4のいずれか1つに示す重鎖CDR配列を含む1つ、2つまたは3つの重鎖CDRを有する重鎖可変領域と、SEQ ID NO:6〜8のいずれか1つに示す軽鎖CDR配列を含む1つ、2つまたは3つの軽鎖CDRを有する軽鎖可変領域とを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、HLA-DR抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:2に示す重鎖CDR1、SEQ ID NO:3に示す重鎖CDR2およびSEQ ID NO:4に示す重鎖CDR3を有する重鎖可変領域と、SEQ ID NO:6に示す軽鎖CDR1、SEQ ID NO:7に示す軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:8に示す軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域とを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、HLA-DR抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:1に示す配列と80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:5に示す配列と80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、HLA-DR CARは、（i）SEQ ID NO:2に示す重鎖CDR1、SEQ ID NO:3に示す重鎖CDR2およびSEQ ID NO:4に示す重鎖CDR3を有する重鎖可変領域と、SEQ ID NO:6に示す軽鎖CDR1、SEQ ID NO:7に示す軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:8に示す軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域とを含むHLA-DR抗原結合ドメイン、（ii）膜貫通ドメイン、および（iii）抗原がHLA-DR抗原結合ドメインに結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、HLA-DR CARは、（i）SEQ ID NO:1に示す配列と80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:5に示す配列と80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域を含むHLA-DR抗原結合ドメイン、（ii）膜貫通ドメイン、ならびに（iii）抗原がHLA-DR抗原結合ドメインに結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、HLA-DR CARはT細胞受容体ζ（TCR-ζ）の細胞内ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、T細胞受容体ζ（TCR-ζ）はCD3ドメイン（例えばCD3ゼータドメイン）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、HLA-DR CARはCD8α膜貫通ドメインおよび/または4-1BBシグナリングドメインをさらに含む。
【００１７】
いくつかの態様において、HLA-DR CARは、SEQ ID NO:9に示す配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％または99％同一である配列を含む。いくつかの態様において、HLA-DR CARは、SEQ ID NO:9に示す配列を含むか、またはSEQ ID NO:9に示す配列からなる。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示のHLA-DR CARを含むT細胞は、EBV LCLに対する前記T細胞の死滅効率（killing efficiency）の2分の1または3分の1である死滅効率を、B細胞に対して有する。
【００１９】
いくつかの態様において、本開示は、本開示のHLA-DR CAR T細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、本開示は、改変された自家T細胞を生成させる方法であって、（a）対象からのHLA-DRに低いアフィニティーで結合するHLA-DR抗原結合ドメインを得る工程、および（b）前記対象から得られたT細胞において前記HLA-DR抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現させ、それによって改変された自家T細胞を生成させる工程を含み、改変された自家T細胞をインビトロで少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間または12日間培養する工程をさらに含む方法を提供する。
【００２１】
いくつかの態様において、本開示は、改変された自家T細胞を調製する方法であって、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果を用意または取得する工程、および前記結合が閾値より低ければ、前記対象からのT細胞を、前記HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを発現するように改変する工程を含み、改変された自家T細胞をインビトロで少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間または12日間培養する工程をさらに含む方法を提供する。いくつかの態様において、改変された自家T細胞は、適当な刺激を伴う12日間の培養中に、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍またはそれ以上に拡大する。いくつかの態様において、対象からのT細胞に閾値未満の結合で結合するHLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変された自家T細胞は、適当な刺激を伴う12日間の培養中に、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍またはそれ以上に拡大する。いくつかの態様において、対象からのT細胞に閾値未満の結合で結合するHLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変された自家T細胞は、適当な刺激を伴う12日間の培養中に、少なくとも20倍に拡大する。いくつかの態様において、適当な刺激には、T細胞をCD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞に曝露することが含まれる。
【００２２】
いくつかの態様において、提供される方法における培養工程は、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、CARの表面発現が低減している改変された自家T細胞の集団を生成させる。
【００２３】
いくつかの態様において、提供される方法における培養工程は、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、正常B細胞に対する毒性が低減している改変された自家T細胞の集団を生成させる。
【００２４】
いくつかの態様において、提供される方法における培養工程は、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、非悪性細胞との対比で悪性細胞に対する選択性が強化されている改変された自家T細胞の集団を生成させる。
【００２５】
いくつかの態様では、本開示との関連において、改変された自家T細胞は、対象からの正常B細胞への改変されたT細胞の顆粒移動（granual transfer）の少なくとも2倍以上であるEBV LCLへの顆粒移動を呈する。
【００２６】
いくつかの態様において、本開示は、がんを処置および/または防止する方法であって、その必要がある対象に、ここに提供される方法のいずれかによって調製される改変された自家T細胞を含みまたは送達する組成物を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、がん細胞はHLA-DR抗原を発現する。いくつかの態様において、がん細胞は、対象からの非がん細胞と比較して、HLA-DR抗原の発現が増加している。いくつかの態様において、がん細胞は、HLA-DR抗原の発現が、対象からの非がん細胞と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍または6倍である。いくつかの一定の態様において、本開示の組成物および方法による処置に適したがんは、対象からの同じタイプの正常細胞と比較して、HLA-DR抗原の発現が少なくとも2倍高い。
【００２７】
いくつかの態様において、提供される方法は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファロピウス管癌、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵がんおよび前立腺がんから選択されるがんを処置または防止するために使用することができる。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示は、血液がんを処置および/または防止する方法を提供する。いくつかの態様において、血液がんは、B細胞性急性リンパ性白血病（「BALL」）、T細胞性急性リンパ性白血病（「TALL」）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症から選択される。
【００２９】
いくつかの態様において、提供される本開示の処置方法は、対象が、電離放射線、化学療法剤、抗体作用物質、および細胞ベースの治療から選択される1種または複数種の追加抗がん治療が施されたか、または施される予定であり、対象が両方による処置を受けることになる処置方法を含むであろう。
【００３０】
いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARをコードする核酸分子を含むT細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARをコードする核酸分子を含むベクターを含むT細胞を提供する。
【００３１】
いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARを含むT細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。
【００３２】
いくつかの態様において、本開示は、治療調製物を生産する方法であって、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対するアビディティーの分析結果を用意または取得する工程、および前記アビディティーが閾値より低ければ、前記改変されたT細胞を含む治療調製物を生産する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対するアビディティーの分析結果は、機能的アビディティーの分析結果である。いくつかの態様において、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度には、T細胞機能のエクスビボ定量、例えばIFN-γ生産、細胞傷害活性（ターゲット細胞を溶解する能力）または増殖が含まれる。
【００３３】
いくつかの態様において、治療調製物を生産するための方法は、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対する機能的アビディティーの分析結果を用意または取得する工程、および前記機能的アビディティーが閾値より低ければ、前記改変されたT細胞を含む治療調製物を生産する工程を含む。いくつかの態様において、機能的アビディティーの尺度は、適当な刺激と共に少なくとも8日間、10日間、12日間または14日間培養した場合の、改変されたT細胞の増殖である。いくつかの態様において、適当な刺激には、T細胞をCD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞に曝露することが含まれる。いくつかの態様において、機能的アビディティーの閾値は少なくとも15倍、20倍、25倍の増殖である。
【００３４】
いくつかの態様において、治療調製物を生産するための方法は、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対する機能的アビディティーの分析結果を用意または取得する工程、および前記機能的アビディティーが閾値より低ければ、前記改変されたT細胞を含む治療調製物を生産する工程を含み、閾値は、CD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞と共に少なくとも12日間培養した場合の、改変されたT細胞の少なくとも15倍、20倍、25倍の増殖である。
【００３５】
いくつかの態様において、本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、対象はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【００３６】
いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の誘導を必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の誘導を必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、対象はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【００３７】
いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の強化を必要とする対象において免疫応答を強化する方法であって、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の強化を必要とする対象において免疫応答を強化する方法であって、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、対象はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【００３８】
いくつかの態様では、本開示における処置に適したがんとして、例えば血液がんを挙げることができる。いくつかの態様において、血液がんは白血病である。いくつかの態様において、がんは、B細胞性急性リンパ性白血病（「BALL」）、T細胞性急性リンパ性白血病（「TALL」）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症のうちの1つまたは複数からなる群より選択される。
【００３９】
いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を、1種または複数種の追加抗がん治療が施された対象または施される予定の対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を、電離放射線、化学療法剤、抗体作用物質および細胞ベースの治療のうちの1つまたは複数が施された対象または施される予定の対象に、対象が両方による処置を受けるように投与する工程を含む方法を提供する。
【００４０】
いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞を含みまたは送達する組成物を、1種または複数種の追加抗がん治療が施された対象または施される予定の対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞を含みまたは送達する組成物を、電離放射線、化学療法剤、抗体作用物質および細胞ベースの治療のうちの1つまたは複数が施された対象または施される予定の対象に、対象が両方による処置を受けるように投与する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
いくつかの態様において、本開示は、がんの処置または防止を必要とする対象におけるがんを処置または防止するための方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成させたHLA-DR CARを含むT細胞の治療有効量を含む組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも106細胞、少なくとも107細胞、少なくとも108細胞、少なくとも109細胞、少なくとも1010細胞、または1010細胞を上回る、HLA-DR CARを含むT細胞を含む。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞はCD4＋ T細胞および/またはCD8＋ T細胞である。
【００４２】
いくつかの態様において、本開示は、がんの処置または防止を必要とする対象におけるがんを処置または防止するための方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成させたHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞の治療有効量を含む組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも106細胞、少なくとも107細胞、少なくとも108細胞、少なくとも109細胞、少なくとも1010細胞、または1010細胞を上回る、HLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞を含む。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞はCD4＋ T細胞および/またはCD8＋ T細胞である。
【００４３】
とりわけ、本明細書に記載のHLA-DR CARおよび/またはそれを含む組成物を特徴づけるための技術も提供される。いくつかの態様では、対象のT細胞へのHLA-DR CARの結合を特徴づけるための方法が提供される。いくつかの態様では、例えばELISA、フローサイトメトリー（例えばFACs）、免疫組織化学および/またはBiacore結合アッセイなど、対象のT細胞および/またはそれを含む組成物へのHLA-DR CARの結合を特徴づけるための方法が提供される。
【００４４】
本開示は、本明細書に記載のHLA-DR CARおよび/もしくはHLA-DR CARを含むT細胞ならびに/またはそれを含有する組成物の作製または製造に関係するさまざまな技術を提供する。本開示は、本明細書に記載のHLA-DR CARをコードする核酸および/もしくはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞ならびに/またはそれを含有する組成物の作製または製造に関係するさまざまな技術を提供する。
【００４５】
本願において「約」および「およそ」という用語は同義語として使用される。本明細書における刊行物、特許または特許出願への言及はいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本願において使用される数字はいずれも、約/およそが付加されていても付加されていなくても、関連技術分野の当業者が認識する通常の変動をいずれも包含するものとする。
【００４６】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明から明白である。ただし、以下の詳細な説明は、本発明の態様を示してはいるものの、単なる例示であって、限定ではないと理解すべきである。本発明の範囲内でのさまざまな改変および修飾は、以下の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。
【００４７】
本願に含まれる図面は以下の図から構成されるが、その目的は例示であって、限定ではない。本開示の上記のおよび他の目的、局面、特徴および利点は、以下の説明を添付の図面と合わせて参照することによって、より明白になり、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図1は、（A）scFv抗原結合ドメインを持つ例示的な一般CARコンストラクトの略図、および（B）自家CAR T細胞治療に関与する最重要工程を示した一般化された方法の略図である。
【図２Ａ】図2Aは、HLA-DRの多型領域の配列アラインメントを図示し、例示的HLA-DR抗体作用物質MVRにとってのエピトープを表している。
【図２Ｂ】図2Bは、CD19:PE抗体またはHLA-DR:PE-Cy5抗体とFLAG付きMVR-scFv:APC抗体との共染色およびフローサイトメトリーによる決定で、強い結合アフィニティー（DRstr）、中間の結合アフィニティー（DRint）および弱い結合アフィニティー（DRweak）を有すると分類された、異なる対象からのPBMC細胞に対する例示的MVR抗体作用物質の結合パターンを図示している。
【図３】図3Aは、抗CD19または例示的HLA-DR抗体作用物質MVRを使って設計された第2世代CAR構築を図示している。図3Bは、CARタンパク質を測定するためのウェスタンブロット分析によって評価した、3セットの細胞におけるタンパク質発現を図示している:非形質導入（NT）T細胞、CD19 CAR T細胞およびDRweak MVR CAR T細胞。上側のバンドはCARタンパク質であり、下側のバンドはβ-アクチンである。パネルa（上）はウェスタンブロットをトリミングしたものであり、参考に、ブロット全体をすぐ下（パネルb）に示す。
【図４Ａ】図4Aは、DRstr、DRintまたはDRweak PBMCの活性化後の、NT T細胞、CD19 CAR T細胞およびHLA-DR CAR T細胞の成長（左側のパネル）および生存率（右側のパネル）を図示している。非形質導入（NT）T細胞、CD19 CAR T細胞およびMVR CAR T細胞の細胞数の増加倍率（0日目の数との比較）および生存率を、表示の時点で測定した。CD19 CAR T細胞とMVR CAR T細胞はどちらも、2日目に形質導入した。
【図４Ｂ】図4Bは、DRstr、DRint、およびDRweak PBMCから作製されたNT T細胞、CD19 CAR T細胞およびMVR CAR T細胞上でのCARの発現を図示している。形質導入の13日後に細胞をCD8発現およびCAR発現について分析した。
【図５Ａ】図5Aは、15日目におけるCAR発現レベルおよび疲弊マーカー発現レベルのフローサイトメトリー分析を図示している。
【図５Ｂ】図5Bは、図5Aにおいて測定された複数の疲弊マーカー（すなわちLAG-3、Tim-3、CTLA-4およびPD-1）発現を伴うT細胞の頻度の例示的円グラフデータを図示している。CAR陽性細胞でのゲーティングによって各CAR T細胞を分析した。各色の右側の数字は疲弊マーカーの多重度を示している。
【図６Ａ】図6は、（a）DRweak-EBV-LCLまたはDRstr-EBV-LCLによる活性化後に測定された各CAR T細胞の増殖能を図示している。CFSE標識T細胞を、3:1のE:T比で5日間、各EBV-LCLと共インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。
【図６Ｂ】（b）複数のマーカー（すなわちIFN-γ、TNF、IL-2、MIP-1βおよびCD107a）を持つT細胞の頻度の円グラフデータ。各色の右側の数字はマーカーの多重度を示す。
【図６Ｃ】（c）EBV-LCLに対する各CAR T細胞の死滅効力。DRweak-EBV-LCLまたはDRstr-EBV-LCLを、表示したE:T比で4時間、各T細胞と共インキュベートした。インキュベーション後に、誘導された細胞傷害性を測定することで、死滅効力を算出した。各ポイントおよびエラーバーは平均およびSDを示す。技術的二重実験（technical duplicate）として行った。2回の独立した実験の代表。
【図６Ｄ】（d）インビトロオンターゲットアッセイによる各CAR T細胞のターゲット特異的死滅の評価。DRweakドナーまたはDRstrドナーのどちらかからのEBV-LCLおよびPBMCを、6:1:1のT細胞:EBV-LCL:PBMC比で4時間、各CAR T細胞と共インキュベートした。インキュベーション後に、残存生細胞の数をフローサイトメトリーで分析した。各バーおよびエラーバーは平均およびSDを示す。技術的三重実験（technical triplicate）として行った。2回の独立した実験の代表。
【図７Ａ】図7Aは、CD19 CAR T細胞とMVR CAR T細胞との間の表面CAR発現の相違を図示している。DRweak MVR CAR T細胞によって発現されるCARの平均蛍光強度（MFI）をCD19 CAR T細胞のそれで割った。CD4＋ T細胞またはCD8＋ T細胞を別々に分析した。別々に作製されたCAR T細胞調製物からのフローサイトメトリーデータを使用した（n＝8）。水平線は平均を示す。8回の独立した実験の要約。
【図７Ｂ】図7Bは、表面CARの発現のレンチウイルス価依存的変化を図示している。各CARベクターを使って293T細胞およびDRweak T細胞にさまざまな感染多重度で形質導入を行い、フローサイトメトリーにより、CARのMFIについて分析した。293T細胞株およびDRweak T細胞を形質導入のそれぞれ5日後および13日後に分析した。
【図７Ｃ】図7Cは、CD19 CARベクターまたはMVR CARベクターで形質導入されたDRweak T細胞を、表示した形質導入後の時点でCAR発現について分析したものを、図示している。細胞をCD8発現およびCAR発現について分析した。
【図７Ｄ】図7Dは、それぞれqPCRおよびウェスタンブロッティングによってmRNAレベル（左）およびタンパク質レベル（右）で分析したCAR発現を図示している。CD8＋ T細胞を濃縮するために、CD4マイクロビーズ（130-045-101、Miltenyi Biotec, Inc.）を使って、非形質導入（NT）T細胞、CD19 CAR T細胞およびDRweak MVR CAR T細胞をCD4陰性選別に供し、それらを分析に使用した。n＝3の生物学的反復実験。平均±s.e.m.独立両側t検定:ns、有意性なし;＊＊＊、p＜0.001。
【図８】図8は、NT T細胞、CD19 CAR T細胞およびDRweak MVR CAR T細胞の免疫蛍光染色を図示している。
【図９Ａ】図9Aは、形質導入後2日目または12日目（それぞれD2またはD12）のDRweak MVR CAR T細胞のターゲット特異的死滅を図示している。DRweak EBV LCLをD2またはD12 MVR CAR T細胞と共インキュベートした。インキュベーション後に、生存細胞の数を決定し、死滅効力を算出した。
【図９Ｂ】図9Bは、インビトロオンターゲット死滅アッセイで評価した各CAR T細胞タイプのターゲット特異的死滅を図示している。DRweakまたはDRstr HLA-DRB1アレルのどちらかを保因するEBV LCLおよび末梢血単核球を、NT T細胞、CD19 CAR T細胞またはDRweak MVR CAR T細胞と共インキュベートした。インキュベーション後に、生存細胞の数を決定し、死滅効力を算出した。
【図９Ｃ】図9Cは、DRweak EBV LCLまたはDRstr EBV LCLによる活性化後に測定したT細胞の増殖能を図示している。
【図９Ｄ】図9Dは、LPSで処理したB細胞におけるHLA-DR発現を図示している。
【図９Ｅ】図9Eは、形質導入後2日目または12日目におけるDRweak MVR CAR T細胞（それぞれを未調整（untuned）MVR CAR TまたはMVR CAR Tと称する）のターゲット特異的死滅を図示している。リポ多糖で3日間処理したDRweak B細胞、DRstr B細胞およびDRweak B細胞を、未調整MVR CAR T細胞またはMVR CAR T細胞と共インキュベートした。インキュベーション後に、生存細胞の数を決定し、死滅効力を算出した。
【図９Ｆ】図9Fは、T細胞との接触後の、移動した顆粒を含有するB細胞およびEBV LCLの比率を図示している。NT、非形質導入。
【図９Ｇ】図9Gは、T細胞との接触後のアポトーシスEBV LCLのタイムラプス分析を図示している。マゼンタ色を検出することによって同定されたアポトーシス（赤色）を起こしているEBV LCL（青色）（スケールバーは250μmを示す）。
【図９Ｈ】図9Hは、表示の時点におけるアポトーシスEBV LCLの比率を図示している。各試料の3つの異なる領域を分析した。
【図９Ｉ】図9Iは、B細胞表面上およびEBV-LCL表面上のCD19およびHLA-DRの定量的分子分析を図示している。EBV形質転換の前後でCD19数およびHLA-DR数の変化を、Quantum Simply Cellularミクロスフェア（Bangs Laboratories, Inc.）によって測定した。接続線でペアにしたドットは同じドナーを示す（n＝6）。赤色および青色のドットはそれぞれこの研究で使用したDRlowドナーおよびDRhighドナーを示す。
【図９Ｊ】図9Jは、例示された顆粒移動（granule transfer）アッセイの詳細を図示している。
【図９Ｋ】図9Kは、例示された顆粒移動（granule transfer）アッセイの詳細を図示している。
【図９Ｌ】図9Lは、例示された顆粒移動（granule transfer）アッセイの詳細を図示している。
【図１０Ａ】図10は、（a）本明細書において例示されるCAR T細胞の多機能性を評価するためのゲーティング戦略を図示している。それぞれカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）陰性/CD4陽性細胞およびCFSE陰性/CD4陰性細胞でゲーティングすることによって、CD4＋ T細胞およびCD8＋ T細胞を分析した。各サイトカインの発現を、アイソタイプ対照抗体で染色したT細胞の発現と比較して決定した。
【図１０Ｂ】（b）詳細な多機能性分析。サイトカイン発現細胞の組合せをブールゲーティング（Boolean gating）によって分析した。
【図１１】図11は、本開示に例示する一定のHLA-DR CAR T細胞およびターゲット細胞を説明する概略図である。
【図１２Ａ】図12Aは、インビボでのEBV LCL抑制を評価するための手順の略図である。
【図１２Ｂ】図12Bは、非形質導入（NT）T細胞、CD19 CAR T細胞またはDRweak MVR CAR T細胞を注入した後のDRweak EBV LCL抑制の効力を評価するための例示的ルシフェラーゼ活性アッセイからのマウスの画像を示している。ルシフェラーゼ標識DRweak EBV LCLが移植されたマウスにおけるルシフェラーゼ活性を、T細胞注入の0、7、14、21および28日後に測定した。
【図１２Ｃ】図12Cは、インビボオンターゲット死滅アッセイのための手順の略図である。DRweak B細胞/DRweak EBV LCLの異種移植後に、NT T細胞、CD19 CAR T細胞またはDRweak MVR CAR T細胞の注入を行い、次に効力分析を行った。
【図１２Ｄ】図12Dは、14日間観察した、各T細胞の注入後のEBV LCL抑制の効力を図示している。DRweak B細胞およびルシフェラーゼ標識DRweak EBV LCLを移植したマウスにおけるルシフェラーゼ活性を、T細胞注入の-1日後、7日後および14日後に測定した。
【図１２Ｅ】図12Eは、T細胞注入の-1日後、2日後および7日後の、T細胞注入マウスにおけるB細胞の残留を図示している（上側のパネル）。T細胞注入の-1日後、2日後および7日後に、NT T細胞、CD19 CAR T細胞またはDRweak MVR CAR T細胞を注入したマウスにおいて、各マウスの末梢血を抗体のパネルで染色し、分析し、血漿IFN-γレベル（下側のパネル）を測定した。
【図１２Ｆ−１】図12Fは、（a、b）インビボオンターゲットアッセイにおけるB細胞の分析のためのゲーティング戦略を図示している。T細胞注入前日の分析結果がパネルaに示され、注入2日後の分析結果がパネルbに示されている。全血細胞をCD3、CD20、CD45およびHLA-DRの発現について分析した。CD45陽性/CD3陰性/HLA-DR陽性/CD20陽性細胞でのゲーティングによってB細胞集団を決定した。DRweak B細胞のみ（b細胞のみ（またはDR weak EBV LCLのみ（腫瘍のみ）を移植したマウスも、対照として評価した。
【図１２Ｆ−２】（c）は、非形質導入（NT）T細胞、CD19 CAR T細胞およびDRweak MVR CAR T細胞を注入したマウスにおけるDRweak B細胞上のHLA-DRの発現レベルを図示している。比較にはB細胞上のHLA-DRの平均蛍光強度が使用されている。
【図１３】図13は、周知の悪性B細胞株の表面におけるHLA-DRの発現を図示している。細胞をHLA-DR発現について分析した。抗体結合能（ABC）はターゲット分子量の指標である。上下の点線は、それぞれEBV LCLおよびB細胞の平均HLA-DRレベルを示している。
【図１４】図14は、MVR CAR T細胞のEBV LCL特異的死滅の機序の略図である。MVR CARが形質導入されたT細胞はその表面にCARを発現し、MVR CARは、HLA-DRとHLA-DR CAR（例えばMVR CAR）との相互作用によってダウンレギュレートされる。自己調整済（autotuned）HLA-DR CAR（例えばMVR CAR）T細胞はHLA-DRに対して脱感作され、正常B細胞に対して低減した細胞傷害性を呈する。EBV形質転換B細胞はその表面のHLA-DRをアップレギュレートしており、MVR CAR T細胞による死滅に対して感受性である。
【図１５】図15は、本開示のHLA-DR CAR T細胞の一定の性質のベン図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
特定の定義
以下の説明では、生化学、分子生物学、および免疫学において使用されるいくつかの用語が、広く利用される。明細書および特許請求の範囲は、そのような用語に与えられる範囲を含め、より明確にかつ一貫して理解されるように、以下の定義が与えられる。
【００５０】
約:値に関して本明細書において使用する場合、「約」という用語は、言及された値との関連において類似する値を指す。一般に、ある文脈において「約」が包含する妥当な変動の程度は、その文脈に精通している当業者には理解されるであろう。例えばいくつかの態様において、「約」という用語は、言及された値の25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％以内またはそれ未満以内の値の範囲を包含しうる。
【００５１】
投与:本明細書において使用する場合、「投与」という用語は、典型的には、組成物である剤または組成物に含まれる剤の送達を達成するための、対象または系への組成物の投与を指す。当業者は、適当な状況において、対象（例えばヒト）への投与に利用することができるさまざまな経路を知っているであろう。例えばいくつかの態様において、投与は点眼、経口、非経口、外用などであることができる。いくつかの特定態様において、投与は、気管支（例:気管支点滴によるもの）、バッカル、皮膚（例えば皮膚への外用、皮内、皮下（interdermal）、経皮などのうちの1つまたは複数であるか、またはそれらを含みうる）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、室内（intraventricular）、具体的器官内（例えば肝臓内）、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、外用、気管（例:気管内点滴によるもの）、膣、硝子体などでありうる。いくつかの態様において、投与は単回投与だけを伴いうる。いくつかの態様において、投与は固定された投与回数の適用を伴いうる。いくつかの態様において、投与は、間欠的（例:時間を空けて複数回）および/または周期的（同じ時間を隔てた個々の投与）投与である投与を伴いうる。いくつかの態様において、投与は、少なくとも選択されたある期間にわたる連続的投与（例:灌流）を伴いうる。
【００５２】
アフィニティー:当技術分野では公知であるとおり、「アフィニティー」は、ある特定リガンドがそのパートナーに結合する堅固さの尺度である。アフィニティーはさまざまな方法で測定することができる。いくつかの態様において、アフィニティーは定量的アッセイによって測定される。いくつかのそのような態様では、結合パートナー濃度を、生理的条件を模倣するために、リガンド濃度過剰に固定することができる。上記に代えて、または上記に加えて、いくつかの態様では、結合パートナー濃度および/またはリガンド濃度を変化させることができる。いくつかのそのような態様では、アフィニティーを、同等な条件下（例:濃度）で、基準と比較することができる。
【００５３】
動物:本明細書において使用する場合、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの態様において、「動物」とはヒトを指し、その性別および発生段階は問わない。いくつかの態様において、「動物」とは非ヒト動物を指し、その発生段階は問わない。特定の態様において、非ヒト動物は哺乳動物（例:齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類および/またはブタ）である。いくつかの態様において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫および/または虫（worm）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物および/またはクローンでありうる。
【００５４】
抗体作用物質:本明細書において使用する場合、「抗体作用物質」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する作用物質を指す。いくつかの態様において、この用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗体作用物質として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびそれらのフラグメントが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、抗体作用物質は、当技術分野において公知のとおり、ヒト化、霊長類化、キメラなどである1つまたは複数の配列要素を含みうる。多くの態様において、「抗体作用物質」という用語は、抗体の構造的および機能的特徴を代替的表現で利用するための、当技術分野において公知のまたは当技術分野において開発されたコンストラクトまたはフォーマットのうちの1つまたは複数を指すために使用される。例えばいくつかの態様において、本発明に従って利用される抗体作用物質は、以下から選択されるフォーマットであるが、それらに限定されるわけではない:インタクトなIgA、IgG、IgEまたはIgM抗体;二重特異性または多重特異性抗体（例:Zybodies（登録商標）など）;抗体フラグメント、例えばFabフラグメント、Fab'フラグメント、F（ab'）2フラグメント、Fd'フラグメント、Fdフラグメントおよび単離されたCDRまたはそれらのセット;単鎖Fv;ポリペプチド-Fc融合物;単一ドメイン抗体（例:IgNARまたはそのフラグメントなどのサメ単一ドメイン抗体）;ラクダ科抗体;マスク（masked）抗体（例:Probodies（登録商標））;Small Modular ImmunoPharmaceuticals（「SMIPs（商標）」;単鎖またはタンデムダイアボディ（TandAb（登録商標））;VHH;Anticalins（登録商標）;Nanobodies（登録商標）ミニボディ;BiTE（登録商標）;アンキリンリピートタンパク質またはDARPINs（登録商標）;Avimers（登録商標）;DARTs;TCR様抗体;Adnectins（登録商標）;Affilins（登録商標）;Trans-bodies（登録商標）;Affibodies（登録商標）;TrimerX（登録商標）;マイクロプロテイン（MicroProtein）;Fynomers（登録商標）;Centyrins（登録商標）;およびKALBITOR（登録商標）。いくつかの態様において、抗体作用物質は、天然に生産された場合に有するであろう共有結合による修飾（例:グリカンの付加）を欠いてもよい。いくつかの態様において、抗体作用物質は、修飾（例:グリカン、ペイロード［例:検出可能部分、治療部分、触媒部分など］または他のペンダント基［例:ポリエチレングリコールなど］の付加）を含有しうる。多くの態様において、抗体作用物質は、当業者が相補性決定領域（CDR）であると認識する1つまたは複数の構造要素を含むアミノ酸配列を持つポリペプチドであるか、またはそのようなポリペプチドを含み、いくつかの態様において、抗体作用物質は、リファレンス抗体に見いだされるものと実質的に同一である少なくとも1つのCDR（例えば少なくとも1つの重鎖CDRおよび/または少なくとも1つの軽鎖CDR）を含むアミノ酸配列を持つポリペプチドであるか、またはそのようなポリペプチドを含む。いくつかの態様において、含まれるCDRは、その配列が同一であるか、またはそれがリファレンスCDRとの比較で1〜5個のアミノ酸置換を含有するという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、含まれるCDRは、そ���がリファレンスCDRと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を示すという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、含まれるCDRは、それがリファレンスCDRと少なくとも96％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を示すという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、含まれるCDRは、含まれるCDR内の少なくとも1つのアミノ酸が、リファレンスCDRとの比較で欠失し、付加されまたは置換されているものの、含まれるCDRがその他の点ではリファレンスCDRのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、含まれるCDRは、含まれるCDR内の1〜5個のアミノ酸が、リファレンスCDRとの比較で欠失し、付加されまたは置換されているものの、含まれるCDRがその他の点ではリファレンスCDRと同一のアミノ酸配列を有するという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、含まれるCDRは、含まれるCDR内の少なくとも1つのアミノ酸が、リファレンスCDRとの比較で置換されているものの、含まれるCDRがその他の点ではリファレンスCDRのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有するという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、含まれるCDRは、含まれるCDR内の1〜5個のアミノ酸がリファレンスCDRとの比較で欠失し、付加されまたは置換されているものの、含まれるCDRがその他の点ではリファレンスCDRと同一のアミノ酸配列を有するという点で、リファレンスCDRと実質的に同一である。いくつかの態様において、抗体作用物質は、当業者が免疫グロブリン可変ドメインであると認識する構造要素を含むアミノ酸配列を持つポリペプチドであるか、またはそのようなポリペプチドを含む。いくつかの態様において、抗体作用物質は、免疫グロブリン結合ドメインと相同であるかほとんど相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。いくつかの態様において、抗体作用物質は、キメラ抗原受容体（CAR）の少なくとも一部分であるか、またはキメラ抗原受容体（CAR）の少なくとも一部分を含む。
【００５５】
抗原:「抗原」という用語は、本明細書において使用する場合、抗体作用物質に結合する作用物質を指す。いくつかの態様において、抗原は抗体作用物質に結合するが、これは生物において特定の生理学的応答を誘導しても誘導しなくてもよい。一般に抗原は、例えば小分子、核酸、ポリペプチド、糖質、脂質、ポリマー（生体ポリマー［例えば核酸および/またはアミノ酸ポリマー］ならびに生体ポリマー以外の［例えば核酸またはアミノ酸ポリマー以外の］ポリマー）などといった任意の化学的実体であるか、またはそのような化学的実体を含むことができる。いくつかの態様において、抗原はポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。いくつかの態様において、抗原はグリカンであるか、またはグリカンを含む。一般に抗原が単離された形態または純粋な形態で提供されうること、あるいは粗製物の形態で（例えば他の物質と一緒に、例えば細胞抽出物などの抽出物または抗原を含有する供給源の他の比較的粗製な調製物に入っている状態で）提供されうることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの一定の態様において、抗原は、細胞との関連において存在する（例えば抗原は細胞の表面に発現されるか、細胞中で発現される）。いくつかの態様において、抗原は組換え抗原である。
【００５６】
抗原結合ドメイン:本明細書において使用する場合、ターゲット部分またはターゲット実体に特異的に結合する抗体作用物質またはその一部分を指す。通例、抗原結合ドメインとそのターゲットとの間の相互作用は非共有結合的である。いくつかの態様において、ターゲット部分またはターゲット実体は、例えば糖質、脂質、核酸、金属、ポリペプチドまたは小分子を含む任意の化合物クラスであることができる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、ポリペプチド（またはその複合体）であるか、またはポリペプチド（またはその複合体）を含みうる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは融合ポリペプチドの一部である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインはキメラ抗原受容体（CAR）の一部である。
【００５７】
と関連する:2つの事象または2つの実体は、一方の存在、レベルおよび/または形態が他方のそれと相関するのであれば、本明細書において使用される用語として、互いに「関連する」。例えば特定の実体（例えばポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベルおよび/または形態が（例えば適切な母集団における）特定の疾患、障害または状態の発生率および/または罹患率と相関するのであれば、その疾患、障害または状態と関連すると見なされる。いくつかの態様において、2つ以上の実体は、それらが互いの物理的近傍に存在しかつ/または留まるように直接的または間接的に相互作用するのであれば、互いに物理的に「関連する」。いくつかの態様において、互いに物理的に関連する2つ以上の実体は、互いに共有結合で連結され、いくつかの態様において、互いに物理的に関連する2つ以上の実体は、互いに共有結合では連結されていないが、例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気作用およびそれらの組合せなどを使って、非共有結合的に関連する。
【００５８】
結合:本明細書において使用する「結合」という用語が、典型的には、2つ以上の実体間での非共有結合的会合を指すことは理解されるであろう。「直接的」結合は実体間または部分間の物理的接触を伴い、間接的結合は1つまたは複数の中間実体との物理的接触を介した物理的相互作用を伴う。2つ以上の実体間の結合は、典型的には、例えば相互作用する実体または部分を分離して研究する場合や、より複雑な系を背景として（例えば共有結合または他の形で担体実体と関連付けられた状態で、かつ/または生物学的な系もしくは細胞中で）研究する場合を含めて、さまざまな背景のいずれにおいても評価することができる。
【００５９】
がん:「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」および「がん腫」という用語は、本明細書では、相対的に異常な、制御されないおよび/または自律的な成長を示し、その結果、細胞増殖の制御が著しく失われていることを特徴とする異常成長表現型を示す細胞を指すために使用される。いくつかの態様において、腫瘍は、前がん性（例えば良性）、悪性、前転移性、転移性および/または非転移性の細胞であるか、それを含みうる。本開示では、その教示内容が特に関連しうる特定のがんを、具体的に特定する。いくつかの態様において、関連がんは固形腫瘍を特徴としうる。いくつかの態様において、関連がんは血液腫瘍を特徴としうる。一般に、当技術分野において公知のさまざまなタイプのがんの例には、例えば白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性障害を含む造血器がん;肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織のがん、口、のど、喉頭および肺の扁平上皮がん、肝がん、尿生殖器がん、例えば前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、子宮がんおよび子宮内膜がん、ならびに腎細胞がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、頭頸部がん、乳がん、胃腸がんおよび神経系がん、パピローマなどの良性病変などがある。いくつかの態様において、がんは血液がんである。血液がんとしては、例えば急性白血病、例えば限定するわけではないが、B細胞性急性リンパ性白血病（「BALL」）、T細胞性急性リンパ性白血病（「TALL」）、急性リンパ性白血病（ALL）;1種または複数種の慢性白血病、例えば限定するわけではないが、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）;さらなる血液がんまたは血液状態、例えば限定するわけではないが、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および骨髄性血液細胞の無効生産（または異形成）によって一まとめにされる血液学的状態の多様な集まりである「前白血病状態」、ならびに非定型のおよび/または非古典的ながん、悪性疾患および前がん状態または増殖性疾患を挙げることができる。
【００６０】
CDR:本明細書において使用する場合、抗体作用物質の可変領域内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれには3つのCDRがあり、それらは、可変領域のそれぞれについて、CDR1、CDR2およびCDR3と称されている。「CDRのセット」または「CDRセット」とは、抗原結合能を有する単一可変領域に見いだされる、または抗原結合能を有するコグネイト重鎖および軽鎖可変領域のCDRに見いだされる、3つまたは6つのCDRの集まりを指す。当技術分野ではCDRの境界を画定するためにいくつかのシステムが確立されており（例: Kabat、Chothiaなど）、当業者はこれらのシステム間の相違を認識して、本願に係る発明を理解し実施するために必要な程度には、CDRの境界を理解することができる。
【００６１】
化学療法剤:本明細書において使用する「化学療法剤」という用語は、アポトーシス促進性、細胞分裂阻害性および/または細胞傷害性の剤に関して当技術分野で理解されているその意味を有し、例えば特に、望ましくない細胞増殖に関連する1つまたは複数の疾患、障害または状態の処置に利用されかつ/またはそのような処置における使用が推奨されている剤を含む。多くの態様において、化学療法剤はがんの処置に有用である。いくつかの態様において、化学療法剤は、1種または複数種のアルキル化剤、1種または複数種のアントラサイクリン類、1種または複数種の細胞骨格破壊剤（例えばタキサン、メイタンシンおよびそれらの類似体などの微小管標的剤）、1種または複数種のエポチロン、1種または複数種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDAC）、1種または複数種のトポイソメラーゼ阻害剤（例:トポイソメラーゼIおよび/またはトポイソメラーゼIIの阻害剤）、1種または複数種のキナーゼ阻害剤、1種または複数種のヌクレオチド類似体またはヌクレオチド前駆体類似体、1種または複数種のペプチド系抗生物質、1種または複数種の白金ベースの剤、1種または複数種のレチノイド、1種または複数種のビンカアルカロイド、および/または以下に挙げるもの（すなわち抗増殖活性を共通して有するもの）のうちの1つまたは複数の1種または複数種の類似体であるか、それを含みうる。いくつかの特定態様において、化学療法剤は、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アウリスタチン（Auiristatin）、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、クルクミン、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メイタンシンおよび/またはその類似体（例えばDM1）、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メイタンシノイド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらの組み合わせの1つまたは複数であるか、それを含みうる。いくつかの態様では、化学療法剤を抗体-薬物コンジュゲートとの関連において利用しうる。いくつかの態様において、化学療法剤は、hLL1-ドキソルビシン、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-ドキソルビシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、グレンバツモマブ（glembatumomab）ベドチン、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗PSMA ADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、ボルセツズマブマホドチン、およびロルボツズマブメルタンシンからなる群より選択される抗体-薬物コンジュゲートに見いだされるも���である。
【００６２】
併用治療:本明細書において使用する場合、「併用治療」という用語は、対象が2種以上の治療レジメン（例えば2種以上の治療剤）に同時に曝される状況を指す。いくつかの態様において、前記2種以上の治療レジメンを同時に施しうる。いくつかの態様において、前記2種以上の治療レジメンを逐次的に施しうる（例えば、第2レジメンを何らかの用量で施す前に第1レジメンを施す）。いくつかの態様において、前記2種以上の治療レジメンを、オーバーラップした投与レジメンで施す。いくつかの態様において、併用治療の実施は、1種または複数種の治療剤または治療モダリティを、他の剤またはモダリティを受ける対象に施することを伴いうる。
【００６３】
改変された（engineered）:一般に「改変された」という用語は、人間の手によって操作されたという局面を指す。例えばポリペプチドは、ポリペプチド配列が人間の手によって操作されると、「改変された」とみなされる。例えば本発明のいくつかの態様において、改変されたポリペプチドは、人間の手によって基準ポリペプチド配列中に導入された1つまたは複数のアミノ酸変異、欠失および/または挿入を含む配列を含む。いくつかの態様において、改変されたポリペプチドには、人間の手によって1つまたは複数の追加のポリペプチドに融合され（すなわち共有結合され）、インビボでは天然に存在し得ない融合ポリペプチドを形成するポリペプチドが含まれる。同様に、細胞または生物は、その遺伝情報が変化するように操作されている（例えば以前は存在しなかった新しい遺伝物質が、例えば形質転換、交配、体細胞交雑、トランスフェクション、形質導入または他の機序によって導入されているか、以前に存在した遺伝物質が、例えば置換もしくは欠失変異によって、または交配プロトコールによって、改変されまたは除去されている）のであれば、「改変された」とみなされる。当技術分野における慣行どおり、そして当業者には理解されるとおり、改変されたポリペプチドまたは細胞の誘導体および/または子孫も、たとえ実際の操作は先の実体に対して行われたのであっても、依然として「改変された」と呼ばれる。
【００６４】
エピトープ:本明細書において使用する場合、免疫グロブリン（例:抗体作用物質または受容体）結合構成要素によって特異的に認識される任意の部分を包含する。いくつかの態様において、エピトープは、抗原上の複数の原子または化学基から構成される。いくつかの態様において、そのような原子または化学基は、抗原が適切な三次元コンフォメーションをとったときに、表面に露出する。いくつかの態様において、そのような原子または化学基は、抗原がそのようなコンフォメーションをとったときに、空間において互いに物理的に近い。いくつかの態様において、少なくともいくつかのそのような原子または化学基は、抗原が代替的コンフォメーションをとったとき（例えば線状になったとき）に、物理的に互いに離れている。
【００６５】
エクスビボ:本明細書において使用する場合、多細胞生物を背景とせずに起こる生物学的事象を指す。例えば細胞ベースの系との関連では、この用語は、人工的環境において細胞集団内で起こる事象（例:細胞増殖、サイトカイン分泌など）を指すために使用されうる。
【００６６】
フレームワークまたはフレームワーク領域:本明細書において使用する場合、可変領域のうちのCDRを除いた配列を指す。CDR配列は異なるシステムによって決定することができるので、同様にフレームワーク配列も、相応に異なる解釈の対象となる。6つのCDRが、重鎖および軽鎖上のフレームワーク領域を、各鎖上の4つのサブ領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）に分割する。ここで、CDR1はFR1とFR2の間に位置し、CDR2はFR2とFR3の間に位置し、CDR3はFR3とFR4の間に位置する。特定サブ領域をFR1、FR2、FR3またはFR4と指定しない場合、フレームワーク領域とは、他でもいわれるとおり、1本の天然免疫グロブリン鎖の可変領域内のFRを合わせたものを表す。本明細書においてFR（a FR）とは、4つのサブ領域のうちの1つを表し、例えばFR1は、可変領域のアミノ末端に最も近くCDR1に対して5'側にある第1フレームワーク領域を表す。また、複数のFR（FRs）とは、フレームワークを構成するサブ領域のうちの2つ以上を表す。
【００６７】
インビトロ:本明細書において使用する「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、例えば試験管内または反応槽内、細胞培養中などの、人工的環境において起こる事象を指す。
【００６８】
インビボ:本明細書において使用する場合、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞ベースの系との関連では、この用語は（例えばインビトロ系との対比で）生細胞内で起こる事象を指すために使用されうる。
【００６９】
単離された:本明細書において使用する場合、（1）それが最初に生産された時（自然界でのことであるか、かつ/または実験的状況でのことであるかは問わない）に、それに付随していた構成要素の少なくとも一部から分離されており、かつ/または（2）人間の手によって設計され、生産され、調製され、かつ/または製造された、物質および/または実体を指す。単離された物質および/または実体は、それらに最初に付随していた他の構成要素の約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％または約99％超から分離されていることができる。いくつかの態様において、単離された物質は、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％または約99％超純粋である。本明細書において、物質は、それが他の構成要素を実質的に含まなければ、「純粋」である。いくつかの態様において、当業者には理解されるであろうとおり、物質は、特定の他の構成要素、例えば1種または複数種の担体または賦形剤（例:緩衝液、溶媒、水など）などと組み合わされた後でもなお、「単離された」とみなすことができ、さらには「純粋」とさえみなしうる。そのような態様において、物質の単離率または純度は、そのような担体または賦形剤を含めずに算出される。一例を挙げると、いくつかの態様において、自然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーは、a）それが、その起源または派生源ゆえに、自然界でそのネイティブ状態にあるそれに伴う構成成分の一部または全部が付随していない場合、b）それが、自然界でそれを産生する種からの同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質上含まない場合、c）それが、自然界でそれを産生する種のものではない細胞または他の発現系によって発現されるか、他の形でそのような細胞または他の発現系からの構成要素が付随している場合には、「単離された」とみなされる。したがって例えばいくつかの態様において、化学合成されたポリペプチドまたは自然界でそれを産生するものとは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドであるとみなされる。上記に代えて、または上記に加えて、いくつかの態様において、1種または複数種の精製技法に供されたポリペプチドは、a）自然界でそれに付随している他の構成要素および/またはb）最初に生産された時にそれに付随していた他の構成要素から分離されている限り、「単離された」ポリペプチドであるとみなしうる。
【００７０】
KD:本明細書において使用する場合は、結合剤（例:抗体作用物質またはその結合構成要素）の、そのパートナー（例:その抗体作用物質または結合構成要素が結合するエピトープ）との複合体からの解離定数を指す。
【００７１】
機能的に連結された:本明細書において使用する場合、記載した複数の構成要素が意図したように機能することを可能にする関係にある並置を指す。機能要素に「機能的に連結された」制御要素は、制御要素と適合する条件下で機能要素の発現および/または活性が達成されるような関係にある。いくつかの態様では、「機能的に連結された」制御要素は、関心対象のコーディング要素と連続しており（例えば共有結合で連結され）、いくつかの態様では、制御要素は関心対象の機能要素に対してトランスに作用するか、または他の形で関心対象の機能要素から離れた位置において作用する。
【００７２】
薬学的組成物:本明細書において使用する場合、「薬学的組成物」という用語は、活性剤が1種または複数種の薬学的に許容される担体と共に処方されている組成物を指す。いくつかの態様において、組成物はヒト対象または動物対象への投与に適している。いくつかの態様において、活性剤は、適切な集団に投与されたときに予め決定された治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位投与量で存在する。
【００７３】
ポリペプチド:本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、一般に、少なくとも3アミノ酸のポリマーという、当技術分野において認識されているその意味を有する。「ポリペプチド」という用語が、本明細書に詳述する完全配列を有するポリペプチドを包含するだけでなく、そのような完全ポリペプチドの機能的フラグメント（すなわち少なくとも1つの活性を保っているフラグメント）に相当するポリペプチドも包含するほど十分に広義であることが意図されていることは、当業者には理解されるであろう。さらにまた、タンパク質配列が一般に活性を破壊することなく多少の置換に耐えうることも、当業者には理解される。したがって、活性を保っており、同じクラスの他のポリペプチドとの間に、少なくとも約30〜40％の総配列同一性、多くの場合、約50％、60％、70％または80％を上回る総配列同一性を有し、さらに通常は、通常少なくとも3〜4アミノ酸、多くの場合、最大20アミノ酸またはそれ以上を包含する1つまたは複数の高度に保存された領域に、はるかに高い同一性、多くの場合、90％、さらには95％、96％、97％、98％または99％を上回る同一性を持つ領域を少なくとも1つは含む、任意のポリペプチドが、本発明において使用される関連用語「ポリペプチド」に包含される。ポリペプチドはL-アミノ酸、D-アミノ酸またはその両方を含有してよく、当技術分野において公知のさまざまなアミノ酸修飾またはアミノ酸類似体をどれでも含有してよい。有用な修飾として、例えば末端アセチル化、アミド化、メチル化などが挙げられる。いくつかの態様において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸およびそれらの組み合わせを含みうる。「ペプチド」という用語は、一般に、約100アミノ酸未満、約50アミノ酸未満、20アミノ酸未満、または10アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの態様において、タンパク質は、抗体作用物質、抗体フラグメント、生物学的に活性なそれらの部分および/またはそれらの特徴的部分である。
【００７４】
予防するまたは予防:疾患、障害および/または状態の発生に関連して使用される場合、本明細書では、疾患、障害および/または状態を発症するリスクを低減することおよび/または疾患、障害もしくは状態の1つまたは複数の特徴または症状の開始を遅延させかつ/またはその重症度を低減することを指す。いくつかの態様において、予防は集団ベースで評価されるので、ある剤は、ある疾患、障害または状態に陥りやすい集団において、その疾患、障害または状態の1つまたは複数の症状の発生、頻度および/または強さに統計的に有意な減少が観察されるのであれば、その特定の疾患、障害または状態を「予防する」とみなされる。
【００７５】
組換え:本明細書において使用する場合は、組換え手段によって設計され、改変され、調製され、発現され、作出され、製造されかつ/または単離されるポリペプチド、例えば宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使って発現されるポリペプチド;組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されるポリペプチド;当該ポリペプチドまたはその1種もしくは複数種の構成要素、部分、要素もしくはドメインをコードしかつ/またはその発現を指示する1つまたは複数の遺伝子または遺伝子構成要素についてトランスジェニックであるか、または他の形でそれらを発現するように操作されている動物（例:マウス、ウサギ、ヒツジ、魚など）から単離されるポリペプチド;および/または選択された核酸配列要素を互いにスプライスしまたはライゲートすること、選択された配列要素を化学合成することおよび/または他の形で当該ポリペプチドまたはその1種もしくは複数種の構成要素、部分、要素またはドメインをコードしかつ/またはその発現を指示する核酸を生成させることを伴う他の任意の手段によって調製され、発現され、作出されまたは単離されるポリペプチドを指すものとする。いくつかの態様において、そのような選択された配列要素のうちの1種または複数種は、自然界に見いだされる。いくつかの態様において、そのような選択された配列要素のうちの1種または複数種は、インシリコで設計される。いくつかの態様において、1種または複数種のそのような選択された配列要素は、例えば天然源または合成源からの、例えば関心対象の由来生物の（例えばヒト、マウスなどの）生殖細胞系における、公知配列要素の（例えばインビボまたはインビトロでの）変異導入に由来する。
【００７６】
特異的結合:本明細書において使用する場合、「特異的結合」という用語は、結合が起こるべき環境において、考えうる結合パートナー同士を区別する能力を指す。他の潜在的ターゲットも存在する時に、ある特定ターゲットと相互作用する結合剤は、それが相互作用するターゲットに「特異的に結合する」といわれる。いくつかの態様において、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の会合を検出しまたはその程度を決定することによって評価され、いくつかの態様において、特異的結合は、結合剤-パートナー複合体の解離を検出しまたはその程度を決定することによって評価され、いくつかの態様において、特異的結合は、結合剤の、そのパートナーと別の実体との間での二者択一的相互作用において競争する能力を検出しまたは決定することによって評価される。いくつかの態様において、特異的結合は、そのような検出または決定を、ある範囲の濃度にわたって行うことによって評価される。
【００７７】
対象:本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例:ヒト、いくつかの態様では出生前のヒト形態を含む）を指す。いくつかの態様において、対象は、関連する疾患、障害または状態を患っている。いくつかの態様において、対象は、ある疾患、障害または状態に陥りやすい。いくつかの態様において、対象は、ある疾患、障害または状態の1つまたは複数の症状または特徴を示す。いくつかの態様において、対象は、ある疾患、障害または状態の症状または特徴を何も示さない。いくつかの態様において、対象は、疾患、障害または状態への陥りやすさまたはそのリスクに特有の1つまたは複数の特徴を持つ者である。いくつかの態様において、対象は患者である。いくつかの態様において、対象は、診断および/または治療を受けかつ/または受けたことがある個体である。
【００７８】
治療剤:本明細書において使用する場合、「治療剤」という表現は、概して、生物に投与されたときに所望の薬理学的効果を誘発する任意の剤を指す。いくつかの態様において、剤は、それが適当な集団全体に統計的に有意な効果を示すのであれば、治療剤であるとみなされる。いくつかの態様において、前記適当な集団は、モデル生物の集団でありうる。いくつかの態様において、適当な集団は、一定の年齢群、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などといった、さまざまな基準によって定義されうる。いくつかの態様において、治療剤は、ある疾患、障害および/または状態の1つまたは複数の症状または特徴を軽減し、改善し、緩和し、阻害し、予防し、その開始を遅延させ、その重症度を低減し、かつ/またはその発生率を低減するために使用することができる物質である。いくつかの態様において、「治療剤」は、政府機関による承認を得ることでヒトへの投与用に販売することができるようになった剤または政府機関による承認を得なければヒトへの投与用に販売することができない剤である。いくつかの態様において、「治療剤」は、ヒトに投与するには処方箋が必要とされる剤である。
【００７９】
治療有効量:本明細書において使用する場合、「治療有効量」という用語は、ある疾患、障害および/または状態を患っている集団またはある疾患、障害および/または状態に陥りやすい集団に、治療的投与レジメンに従って投与したときに、その疾患、障害および/または状態を処置するのに十分な量を意味する。いくつかの態様において、治療有効量は、疾患、障害および/または状態の1つまたは複数の症状の発生率および/または重症度を低減し、それらの症状の1つまたは複数の特徴を安定化し、かつ/またはそれらの症状の開始を遅延させる量である。「治療有効量」という用語が、ある特定個体において処置の成功が達成されることを、実際に必要としないことは、当業者には理解されるであろう。むしろ、治療有効量は、そのような処置を必要とする患者に投与されたときに、有意な数の対象において、所望する特定の薬理学的応答を与える量でありうる。例えばいくつかの態様において、「治療有効量」という用語は、本発明の治療との関連においてそれを必要とする個体に投与した場合に、該個体において起きているがん支持過程を遮断し、安定化し、減弱し、または逆転させるであろう量、または該個体におけるがん抑制過程を強化または増加させるであろう量を指す。がん処置との関連において、「治療有効量」は、がんと診断された個体に投与した場合に、その個体におけるがんのさらなる発達を予防し、安定化し、阻害し、または低減するであろう量である。本明細書に記載する組成物の特に好ましい「治療有効量」は、膵がんなどの悪性腫瘍の発達を（治療的処置において）逆転させるか、または悪性腫瘍の寛解を達成しもしくは長引かせるのに役立つ。個体におけるがんを処置するために当該個体に投与される治療有効量は、寛解を促進しまたは転移を阻害するために投与される治療有効量と、同じである場合も異なる場合もある。大半のがん治療がそうであるように、本明細書に記載する治療方法は、がんの「治癒（cure）」と解釈されたり、がんの「治癒」に制約されたり、または他の形でがんの「治癒」に限定されたりするべきではなく、むしろ本処置方法は、がんを「処置」するための、すなわちがんを有する個体の健康に望ましい変化または有益な変化をもたらすための、記載の組成物の使用に関する。そのような利益は腫瘍学分野の熟練した医療提供者には認識されており、これには、患者状態の安定化、腫瘍サイズの減少（腫瘍退縮）、生体機能の改善（例: がん性組織またはがん性機関の機能改善）、さらなる転移の減少または阻害、日和見感染の減少、生存性の増加、痛みの減少、運動機能の改善、認知機能の改善、エネルギー感（feeling of energy）の改善（活力、倦怠感の減少）、幸福感の改善、正常な食欲の回復、健康な体重増加の回復およびそれらの組み合わせなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。加えて、（例えば処置の過程において）膵臓腺がんなどの腫瘍の部位からがん細胞の試料を採取し、悪性度の低い表現型へのがん細胞の退縮を分子レベルで検証するために、そのがん細胞を、代謝マーカーおよびシグナル伝達マーカーのレベルについて試験してがん細胞の状態を監視することによって、個体における特定腫瘍の（例えば本明細書に記載する処置の結果として���）退縮を評価してもよい。例えば、本発明の方法を使用することによって誘導される腫瘍退縮は、上述の血管新生促進マーカーのいずれかの減少、本明細書に記載する抗血管新生マーカーの増加、がんと診断された個体において異常な活性を示す代謝経路、細胞間シグナリグ経路または細胞内シグナル伝達経路の正常化（すなわちがんを患っていない正常個体に見いだされる状態への変化）を見いだすことによって示されるだろう。いくつかの態様において、治療有効量を製剤化し、かつ/または単回投与で投与しうることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの態様では、治療有効量を製剤化し、かつ/または複数回投与で、例えば投与レジメンの一部として、投与しうる。
【００８０】
変異体:核酸、タンパク質または小分子などの分子に関連して本明細書において使用する場合、「変異体」という用語は、基準分子とは有意な構造的同一性を示すが、例えば基準実体と比較して1つまたは複数の化学部分の有無またはレベルに関して基準分子と構造的に異なる分子を指す。いくつかの態様において、変異体は、その基準分子とは機能的にも異なる。一般に、ある特定分子が、基準分子の「変異体」であると適正にみなされるかどうかは、その特定分子の、基準分子との構造同一性の程度に基づく。当業者には理解されるであろうとおり、任意の生物学的または化学的基準分子は、一定の特徴的構造要素を有する。変異体は、定義上、1つまたは複数のそのような特徴的構造要素を共通して持つが、少なくとも1つの局面において基準分子とは異なる、別個の分子である。いくつか例を挙げると、ポリペプチドは、線形空間または三次元空間中で互いに対して指定された位置を有しかつ/または特定の構造モチーフにおよび/もしくは生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的配列要素を有しうる。核酸は、線形空間または三次元空間中で互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的配列要素を有しうる。いくつかの態様において、変異体ポリペプチドまたは変異体核酸は、基準ポリペプチドまたは基準核酸とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中の1つまたは複数の相違の結果として、異なりうる。いくつかの態様において、変異体ポリペプチドまたは変異体核酸は、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％または99％である基準ポリペプチドまたは基準核酸との総配列同一性を示す。いくつかの態様において、変異体ポリペプチドまたは変異体核酸は、基準ポリペプチドまたは基準核酸と、少なくとも1つの特徴的配列要素を共有しない。いくつかの態様において、基準ポリペプチドまたは基準核酸は、1つまたは複数の生物学的活性を有する。いくつかの態様において、変異体ポリペプチドまたは変異体核酸は、基準ポリペプチドまたは基準核酸の生物学的活性のうちの1つまたは複数を共有する。
【００８１】
ベクター:本明細書において使用する場合、それに連結された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。ベクターの一タイプは「プラスミド」であり、これは、その中に追加DNAセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは追加DNAセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製する能力を有する（例:細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例:非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後に宿主のゲノム中に組み込まれることができ、その結果、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらにまた、特定のベクターは、ベクターが機能的に連結された遺伝子の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」という。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および形質転換には、標準的技法（例:エレクトロポレーション、リポフェクション）を使用しうる。酵素反応および精製技法は、製造元の仕様書に従って、または当技術分野においてよく行われているとおりに、または本明細書に記載するとおりに行いうる。前記の技法および手順は、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って、本明細書の全体を通して引用し議論するさまざまな一般文献およびより具体的な文献に記載されているように行いうる。例えば、参照によりあらゆる目的で本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual（2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989））を参照されたい。
【００８２】
例示的態様の詳細な説明
本開示は、とりわけ、HLA-DR抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現する改変されたT細胞ならびにその作製方法および使用方法に関する。
【００８３】
キメラ抗原受容体で改変されたT細胞（CAR T細胞）は、がんの処置に関して大きな治療的可能性を有する。例えば、血液悪性疾患に対するCD19標的CAR形質導入T細胞（CD19-CAR T細胞）の最近の臨床治験は、CAR T技術の強い効果を示した。（Kochenderfer, J.N. et al. （2010） Blood 116:4099-4102、Porter, D.L., et al. （2011） N. Engl. J. Med. 365:725-733、Grupp, S.A. et al. （2013） N. Engl. J. Med. 368:1509-1518、Kochenderfer, J.N. et al. （2015） J. Clin. Oncol. 33:540-549、Brown, C.E. et al. （2016） N. Engl. J. Med. 375:2561-2569）。CAR Tの臨床的成功は、少なくとも部分的には、高アフィニティー抗原結合ドメインを複数のシグナリングドメインと人工的に組み合わせることによって作製されるCARの融合構造に、その原因があると考えられる（Maus, M.V. et al. （2014） Blood 123:2625-2635、van der Stegen, S.J. et al. （2015） Nat. Rev. Drug Discov. 14:499-509）。
【００８４】
しかし、CAR T治療の目覚ましい成果は、しばしば、CD19-CAR T細胞で処置された患者におけるサイトカイン放出症候群（CRS）およびB細胞形成不全などの重篤な副作用を伴ってきた。（Kalos, M., et al. （2011） Sci. Transl. Med. 3:95ra73、Davila, M.L., et al. （2014） Sci. Transl. Med. 6:224ra225）。したがって、関連する副作用を低減しかつ/または緩和する新規CAR T戦略を開発するというアンメットニーズがある。
【００８５】
CARは、多くの場合、悪性細胞上だけに発現するのではなく正常細胞上にも発現する抗原を標的とし、場合によっては、T細胞そのものの上にある抗原を標的とする。CARのこれらの性質はT細胞受容体（TCR）とは異なる。T細胞受容体（TCR）はT細胞にとって天然の抗原受容体であって、典型的には低いアフィニティーを呈し、正常細胞上にはまれにしか発現しない抗原を認識する。これらの相違にもかかわらず、CARのいくつかの性質はTCRとも共通している。
【００８６】
CARにもTCRにも共通する性質の1つは、どちらのタイプの受容体も、受容体ダウンレギュレーションを受けうるということである。例えばTCRは、抗原認識後は、過剰なシグナリングを制限してシグナルインテグリティを維持するために、急速にダウンレギュレートされる（Viola, A. ＆ Lanzavecchia, A. （1996） Science 213:104-106、Baniyash, M. （2004） Nat. Rev. Immunol. 4:675-687）。同様に、CARによる抗原認識に続いて直ちにCARダウンレギュレーションが起こることは多く、それがその後の抗原認識および機能に影響を及ぼす（Caruso, H.G. et al. （2015） Cancer Res. 75:3505-3518、Eyquem, J. et al. （2017） Nature 543:113-117）。これらの受容体ダウンレギュレーション事象は、数時間以内に起こりうる。また、回復は数日程度でありうる。短期ダウンレギュレーションとは対照的に、TCRの長期ダウンレギュレーションも、Gallegos et al. （2016） Nat. Immunol. 17:379-386によって報告されている。この研究は、一定の継続的なTCR-ターゲット相互作用が、50日以上にわたって持続しうる長期TCRダウンレギュレーションを誘導しうることを実証した。この研究におけるダウンレギュレーションの程度は、TCR-ターゲットアフィニティーと相関し、重要なことに、総免疫活性化閾値の最終的な増加をもたらした。この現象は、T細胞が抗原感度を調整し、マクロレベルで免疫応答の程度を管理することができるようにしている機序を表す。
【００８７】
CAR T細胞については、CarusoらおよびLiuらが、アフィニティーの低い一定のCARは、抗原密度の高い一定のターゲット細胞を抗原密度の低いターゲット細胞と区別するようにT細胞を感作しうることを実証している（Caruso, H.G., et al. （2015） Cancer Res. 75:3505-3518; Liu, X., et al. （2015） Cancer Res. 75:3596-3607）。これらの研究により、悪性細胞において特異的にアップレギュレートされる腫瘍抗原を標的とするCAR設計戦略が示唆された。しかし、継続的なターゲット認識によって誘導される長期CARダウンレギュレーションとそれに続く機能的変化は、広くは研究されていない。
【００８８】
受容体ダウンレギュレーションはCARにもTCRにも観察されるが、CARの特異的結合特徴は、T細胞上に発現している抗原を標的とすることで、隣接CAR T細胞によって誘導されるT細胞死である「フラトリサイド」（fratricide）と呼ばれる特有の機能的帰結をもたらしうる。興味深いことに、フラトリサイドの程度は、すべてのCARコンストラクトで同じわけではない。例えば、CD5標的CAR T細胞は数週間にわたって正常に拡大するので、CD5標的CAR T細胞ではフラトリサイドは一過性である。Mamonkin, M., et al. （2015） Blood 126:983-992）。これに対し、フラトリサイドはCD7標的CAR T細胞には深刻な損傷を与えて、生存できなくする。（Gomes-Silva, D. et al. （2017） Blood 130:285-296）。しかし、フラトリサイドの程度を許容できるものにすることができる条件は、はっきりしていない。
【００８９】
本開示は、HLA-DR標的CAR T細胞が、隣接CAR T細胞上のHLA-DRを継続的に認識して、フラトリサイドおよびCARダウンレギュレーションを誘導しうるという洞察を提供する。本開示は、HLA-DRの多型領域を認識するHLA-DR標的CARが、異なるHLA-DRB1アレルを持つT細胞をさまざまなアフィニティーで認識しうるという認識を包含する。さらにまた本開示は、フラトリサイドの程度（例えば重度または軽度のフラトリサイドを呈するT細胞）および/またはCARダウンレギュレーションの程度は、HLA-DR抗原（例えばT細胞と関連しているもの）とHLA-DR CAR（例えばMVR CAR）との間の結合の強さに依存するという認識も包含する。本開示は、HLA-DR CAR抗原アフィニティーが低ければ、フラトリサイドは許容できるレベルまで低減されることを実証する。さらにまた本開示は、HLA-DR CAR T細胞（例えばMVR CAR T細胞）に抗原のレベルおよび/またはアフィニティーに基づくターゲット細胞選択性を付与する持続的CARダウンレギュレーションを特徴とする感度調整機序について記載する。
【００９０】
したがって、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCAR（HLA-DR CAR）は、対象からのT細胞へのHLA-DR結合ドメインの結合特徴に基づいて選択し、改変し、かつ/または最適化することができるという洞察を、本開示は提供する。本開示は、対象からの細胞（例えばT細胞）に低いアフィニティーで結合するHLA-DR CARが、一定の疾患および/または障害（例えばがん）を処置するための効果的な治療になりうるという認識を包含する。したがって本開示は、特定のHLA-DR CARポリペプチドおよび/またはそれをコードする核酸を含む改変されたT細胞を提供し、さらにまた、これらのT細胞がインビトロおよびインビボで驚くほど有益な活性を有することを実証する。
【００９１】
HLA-DR
HLA-DR（Human Leukocyte Antigen-antigen D Related）は古典的主要組織適合遺伝子複合体II分子である。（Shackelford, D.A. et al., （1982） Immunol. Rev. 66:133-187）。HLA-DRと、そのリガンドである9アミノ酸長以上のペプチドは、TCRのリガンドを構成する。HLA-DR分子はシグナリングに応答してアップレギュレートされる。感染症の場合、ペプチド（ブドウ球菌エンテロトキシンIペプチドなど）はDR分子中に結合されて、Tヘルパー細胞上に見いだされる極めて多数のT細胞受容体のうちのいくつかに提示される。次に、これらの細胞はB細胞の表面上の抗原に結合して、B細胞増殖を刺激する。
【００９２】
HLA-DRの主要機能は、最終的には同じペプチド抗原に対する抗体の産生をもたらすT（ヘルパー）細胞応答を誘発しまたは抑制するために、外来であるかもしれないペプチド抗原を、免疫系に提示することである。HLA-DRはαβヘテロ二量体の細胞表面受容体であって、それらの各サブユニットは、2つの細胞外ドメイン、貫膜ドメインおよび細胞質テールを含んでいる。α鎖とβ鎖はどちらも膜にアンカリングされている。成熟タンパク質のN末端ドメインは、結合溝の露出部分を構成するアルファヘリックスを形成し、C末端細胞質領域は他方の鎖と相互作用して、結合溝の下に細胞膜にまたがるベータシートを形成している。ペプチド接触位置の大半は各鎖の最初の80残基中にある。
【００９３】
HLA-DRは、その発現が、抗原提示細胞、例えばDC、マクロファージ、単球およびB細胞に限定されている。細胞表面上のDR「抗原」の存在量はしばしば刺激に応答して増加するので、DRは免疫刺激のマーカーでもある。B細胞悪性疾患ではHLA-DRの発現レベルが高く、正常細胞では限定的な発現スペクトルを持つので、HLA-DRに対する抗体が開発され、B細胞悪性疾患について前臨床研究および臨床研究で試験されてきた。（Nagy, Z.A., et al. （2002） Nat. Med. 8:801-807、DeNardo, G.L., et al. （2005） Clin. Cancer Res. 11:7075s-7079s、Ivanov, A., et al. （2009） J. Clin. Invest. 119:2143-2159、Lin, T.S., et al. （2009） Leuk. Lymphoma 50:1958-1963）。第I相/II相治験では、毒性は深刻ではなかったものの、効力が限定的であったため、さらなる研究は中止された（Lin, T.S., et al. （2009） Leuk. Lymphoma 50:1958-1963）。本開示は、抗原特異性を大規模なT細胞応答に組み込むことによってモノクローナル抗体の治療効力を増強するというCAR T細胞の潜在的能力を考慮すれば、HLA-DRにリダイレクトされた（HLA-DR-redirected）CAR T細胞は、B細胞悪性疾患の有用な治療法になりうるという認識を包含する。
【００９４】
HLA-DR CAR
本開示は、少なくとも部分的には、HLA-DR CARポリペプチドを提供する。本明細書において使用する「キメラ抗原受容体（CAR）」という用語は、自然には存在しない受容体を指し、特定の抗原に対する特異性を免疫エフェクター細胞に与える能力を有する。通常、CARは、T細胞にモノクローナル抗体作用物質の特異性を送達するために使用される受容体を指す。一般にCARは細胞外ドメイン（エクトドメイン）、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（エクトドメイン）を含む。本開示による例示的なCARコンストラクトの略図を図1Aに示す。いくつかの態様において、CARの細胞外ドメインは抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは抗体作用物質であるか、または抗体作用物質を含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインはHLA-DRに特異的に結合する抗体作用物質であるか、またはHLA-DRに特異的に結合する抗体作用物質を含む。
【００９５】
最近、本発明者らのグループはHLA-DRの多型領域を認識する抗体作用物質MVRを開発した（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号US 2016-0257762に記載）。いくつかの態様において、HLA-DR CARはHLA-DR抗体作用物質を含む。いくつかの態様において、HLA-DR CARはMVR抗体作用物質を含む。
【００９６】
いくつかの態様において、HLA-DR抗体作用物質はMVR抗体作用物質である。いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:2〜4のいずれか1つに示す重鎖CDR配列と少なくとも80％、85％、90％または95％同一である1つ、2つまたは3つの重鎖CDRを有する重鎖可変領域を含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、および（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【００９７】
いくつかの態様において、HLA-DR抗体作用物質はMVR抗体作用物質である。いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:6〜8のいずれか1つに示す軽鎖CDR配列と少なくとも80％、85％、90％または95％同一である1つ、2つまたは3つの軽鎖CDRを有する軽鎖可変領域を含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、および（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【００９８】
いくつかの態様において、HLA-DR抗体作用物質はMVR抗体作用物質である。いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:2〜4のいずれか1つに示す重鎖CDR配列と少なくとも80％、85％、90％または95％同一である1つ、2つまたは3つの重鎖CDRを有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:6〜8のいずれか1つに示す軽鎖CDR配列と少なくとも80％、85％、90％または95％同一である1つ、2つまたは3つの軽鎖CDRを有する軽鎖可変領域とを含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、ならびに（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【００９９】
いくつかの態様において、HLA-DR抗体作用物質はMVR抗体作用物質である。いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:2〜4のいずれか1つに示す重鎖CDR配列を含むかまたはその重鎖CDR配列からなる1つ、2つまたは3つの重鎖CDRを有する重鎖可変領域と、SEQ ID NO:6〜8のいずれか1つに示す軽鎖CDR配列を含むかまたはその軽鎖CDR配列からなる1つ、2つまたは3つの軽鎖CDRを有する軽鎖可変領域とを含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、および（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【０１００】
いくつかの態様において、HLA-DR抗体作用物質はMVR抗体作用物質である。いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:2に示す重鎖CDR1、SEQ ID NO:3に示す重鎖CDR2およびSEQ ID NO:4に示す重鎖CDR3を有する重鎖可変領域と、SEQ ID NO:6に示す軽鎖CDR1、SEQ ID NO:7に示す軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:8に示す軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域とを含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、および（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
2020508080.tif 000002
【０１０１】
いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:1に示す配列と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:5に示す配列と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域を含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、ならびに（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【０１０２】
いくつかの態様において、本開示は、（i）SEQ ID NO:1に示す配列を含むかまたはSEQ ID NO:1に示す配列からなるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と、SEQ ID NO:5に示す配列を含むかSEQ ID NO:5に示す配列からなるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域とを含む抗体作用物質、（ii）膜貫通ドメイン、および（iii）抗原が抗体作用物質に結合した場合にT細胞活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【０１０３】
SEQ ID NO:1 - MVR重鎖可変領域
2020508080.tif 000003
【０１０４】
SEQ ID NO:5 - MVR軽鎖可変領域
2020508080.tif 000004
【０１０５】
いくつかの態様において、CARは、細胞外ドメインにつながれた（例えば融合された、共有結合で連結された）CARの膜貫通ドメインを含む。CARの膜貫通ドメインは天然または合成膜貫通ドメインに由来しうる。天然に存在するものに由来する場合、それは膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであるか、T細胞受容体のα、βまたはξ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154およびCD8などのさまざまなタンパク質の膜貫通領域に由来するものでありうる。膜貫通ドメインの配列は、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを開示している公表された当技術分野の文献から入手しうるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０６】
加えて、膜貫通ドメインが合成物である場合、それは主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性アミノ酸残基を含むことができ、例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成される膜貫通ドメイン中に存在しうるが、それらに限定されるわけではない。膜貫通ドメインに関する配列情報は、公表された当技術分野の文献から入手しうるが、それらに限定されるわけではない。本開示の例示的一態様では、CD8ヒンジ領域を膜貫通ドメインとして使用した。
【０１０７】
いくつかの態様において、本開示のCARにおける細胞内ドメインはCARドメインの一部であり、膜貫通ドメインにつながれた形態にある。本開示の細胞内ドメインは、抗原がCARの抗原結合領域に結合した場合に、T細胞活性化、そして好ましくはT細胞増殖をもたらすことを特徴とする、細胞内シグナリングドメインを含みうる。
【０１０８】
細胞内シグナリングドメインは、それが、抗原が細胞外に存在する抗原結合領域に結合した場合にT細胞活性をもたらすことのできるシグナリング部分である限り、そのタイプに特に制約はない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、例えば免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含み、ITAMには、CD3ゼータ（ξ）、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66dまたはFcεRIγに由来するものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０９】
加えて、本開示のCARの細胞内ドメインは、好ましくは、細胞内シグナリングドメインと共に共刺激ドメインを含むが、それに限定されるわけではない。
【０１１０】
共刺激ドメインは、少なくとも部分的には、本発明のCARに含まれる細胞内シグナリングドメインによるシグナルに加えてT細胞にシグナルを送達することに関与し、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの細胞内部分を指す。
【０１１１】
共刺激分子は、細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の十分な応答にとって必要な分子を指す。いくつかの態様において、共刺激分子は、例えばCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2CまたはB7-H3であるか、それを含むことができるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、共刺激ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2CまたはB7-H3およびそれらの組合せからなる群より選択される分子の細胞内部分であることができる。
【０１１２】
加えて、いくつかの態様では、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーがCARの細胞内ドメインと膜貫通ドメインとをつないでもよく、リンカーは、例えば（GLY4SER）3と呼ばれる
2020508080.tif 000005
など、それが、細胞外位置に存在する抗原結合ドメインに抗原が結合した場合に細胞内ドメインを介してT細胞活性化を誘導することのできるリンカーである限り、その長さに関して特に制約はないだろう。
【０１１３】
いくつかの態様では、抗MVR抗体作用物質のVH部分とVL部分とを（GLY4SER）3リンカーでつないで、MVR scFvを構築することができる。いくつかの態様において、CARはMVR scFvを含む。いくつかの態様において、MVR CARは膜貫通ドメインとしてCD8ヒンジを含む。いくつかの態様において、MVR CARは4-1BB細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、MVR CARはCD3ξ鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、MVR CARは、MVR scFv、CD8ヒンジ、4-1BB細胞内ドメインおよびCD3ξ鎖の細胞内ドメインを含む。
【０１１４】
いくつかの態様において、本開示は、SEQ ID NO:9に示す配列と少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一である配列を含むキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。いくつかの態様において、本開示は、SEQ ID NO:9に示す配列を含むキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質を提供する。
【０１１５】
SEQ ID NO:9 - 例示的HLA-DR（MVR）CAR
2020508080.tif 000006
【０１１６】
下記の実施例において述べるように、例示的HLA-DR抗体作用物質MVRは、HLA-DRの可変エピトープを認識する。少なくとも部分的には対象間のエピトープ可変性ゆえに、異なる対象（すなわちドナー）からのB細胞は、異なる結合アフィニティーを呈する。例えば、特有のHLA-DRB1アレルを持つ一部の対象（すなわちドナー）は、例示的MVR-scFvによる極めて低い結合を呈した。MVR低結合個体（low binder）（すなわちDRweak）と特徴づけられる対象から単離されたPBMCを使って、フラトリサイドが許容できる程度であるMVR改変（MVR-engineered）CAR T細胞（MVR-CAR T細胞）を作製することに成功した。いくつかの態様において、HLA-DR CAR T細胞は、低結合個体（すなわち低いアフィニティーおよび/またはアビディティーでHLA-DR CARに結合するHLA-DR変異体を発現させる個体）と特徴づけられる対象から、改変される。いくつかの態様において、HLA-DR CARは、対象からのT細胞に対して低いアフィニティーおよび/またはアビディティーを有するように、改変される。いくつかの態様において、HLA-DR CARは、対象からのHLA-DRに対して低いアフィニティーおよび/またはアビディティーを有するように、改変される。いくつかの態様において、HLA-DR CARは、対象からのT細胞に対するHLA-DR抗原結合ドメインのアフィニティーおよび/またはアビディティーが閾値より低ければ、T細胞における発現のために選択される。
【０１１７】
いくつかの態様において、そのようなHLA-DR CAR T細胞は、悪性細胞に対する細胞傷害性を特異的に誘導することができる。以下に実証するように、そのようなHLA-DR CAR T細胞は、正常B細胞を害することなく、エプスタイン・バー・ウイルス誘導リンパ芽球様細胞株（Epstein-Barr virus-induced lymphoblastoid cell line）（EBV-LCL）に対する細胞傷害性を特異的に誘導することができる。EBV-LCLにおけるHLA-DRアップレギュレーションおよびその結果生じる顆粒移動率の増加が、この機序に関与した。下記の実施例は、B細胞リンパ腫におけるHLA-DRにリダイレクトされたMVR-CAR T細胞の悪性疾患特異的死滅の概念証明を実証し、本開示の方法によって生成させたHLA-DR CAR T細胞の治療的利益を浮き彫りにする。
【０１１８】
核酸
本開示は、本開示のHLA-DR CARをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載するHLA-DR CARは、核酸分子から、当技術分野に公知の分子生物学的方法を使って生成させることができる。本開示の核酸として、例えばDNAおよび/またはRNAが挙げられる。
【０１１９】
いくつかの態様において、核酸コンストラクトは、HLA-DR CARをコードする領域を含む。HLA-DR CARは、所望の結合性および/または機能的性質で同定および/または選択することができ、抗体作用物質の可変領域を単離し、増幅し、クローニングしかつ/または配列決定することができる。可変領域ヌクレオチド配列には、アミノ酸をコードするヌクレオチド配列および/または制限部位を保持するヌクレオチド配列の付加、および/またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の置換などといった修飾を加えうる。いくつかの態様において、核酸配列は、イントロン配列を含んでもよく、含まなくてもよい。
【０１２０】
本開示の核酸コンストラクトは、当技術分野に公知の方法によって発現ベクターまたはウイルスベクターに挿入することができ、核酸分子は発現制御配列に機能的に連結することができる。上記の核酸分子またはそれらのフラグメントのいずれかを含むベクターも、本開示によって提供される。上記核酸分子またはそれらのフラグメントはいずれも、任意の適切なベクターにクローニングすることができ、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用することができる。ベクターおよびそれらを構築するための方法の選択は、当業者には一般に公知であり、一般技術文献に記載されている（一般に「Recombinant DNA Part D」Methods in Enzymology, Vol.153, Wu and Grossman, eds., Academic Press （1987）を参照されたい）。
【０１２１】
いくつかの態様において、外来核酸（DNAまたはRNA）を原核宿主細胞または真核宿主細胞に導入するには、従来使用されている技法、例えば電気泳動、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクション、リポフェクションなどを使用しうる。望ましくは、ベクターは、必要に応じて、またそのベクターがDNAであるかRNAであるかを考慮して、そのベクターを導入する宿主（例:細菌、真菌、植物または動物）のタイプに特異的な制御配列、例えば転写および翻訳開始ならびに終止コドンを含みうる。いくつかの態様において、ベクターは、宿主の属に特異的な制御配列を含む。好ましくは、ベクターは、宿主の種に特異的な制御配列を含む。
【０１２２】
核酸コンストラクトは、複製系および挿入された核酸に加えて、形質転換された宿主またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする1つまたは複数のマーカー遺伝子も含むことができる。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例えば抗生物質耐性、重金属などに対する耐性、栄養要求宿主の補完による原栄養性の付与などが挙げられる。
【０１２３】
適切なベクターとして、増殖および拡大のためもしくは発現のためまたはその両方のために設計されたものが挙げられる。例えばクローニングベクターは、pUC系列、pBluescript系列（Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ）、pET系列（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）、pGEX系列（Pharmacia Biotech、スウェーデン国ウプサラ）およびpEX系列（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）からなる群より選択される。λGT10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4およびλNΜ1149などのバクテリオファージベクターも使用することができる。植物発現ベクターの例には、pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121およびpBIN19（Clontech）がある。動物発現ベクターの例には、pEUK-C1、pMAMおよびpMAMneo（Clontech）がある。TOPOクローニングシステム（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）も、製造元の推奨に従って使用することができる。
【０１２４】
発現ベクターは、上述の単離または精製された核酸分子に機能的に連結されたネイティブまたは非ネイティブプロモーターを含むことができる。例えば強い、弱い、誘導性、組織特異的および発達段階特異的などといったプロモーターの選択は、当技術分野における技量内である。同様に、上述の核酸分子またはそのフラグメントをプロモーターと組み合わせることも、当技術分野における技量内である。
【０１２５】
適切なウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、パルボウイルス系ベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（AAV）系ベクター、AAV-アデノウイルスキメラベクターおよびアデノウイルス系ベクター、ならびにレンチウイルスベクター、例えば単純ヘルペス（HSV）系ベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターは、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989）およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley ＆ Sons, New York, N.Y.（1994）に記載されている標準的な組換えDNA技法を使って調製することができる。
【０１２６】
レトロウイルスベクターはレトロウイルスに由来する。レトロウイルスは、多種多様な宿主細胞に感染する能力を有するRNAウイルスである。感染すると、レトロウイルスゲノムはその宿主細胞のゲノムに統合し、宿主細胞DNAと一緒に複製されることにより、ウイルスRNAおよびレトロウイルスゲノム中に組み込まれた任意の核酸配列を、絶えず生産する。したがって、レトロウイルスを使用すれば、治療因子の長期発現を達成することができる。遺伝子治療における使用が想定されるレトロウイルスは、比較的非病原性であるが、病原性レトロウイルスも存在する。病原性レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）またはヒトT細胞リンパ向性ウイルス（HTLV）を使用する場合は、宿主に対する毒性を排除するためのウイルスゲノムの改変に配慮しなければならない。レトロウイルスベクターはさらに、ウイルスを複製欠損性にするように操作することができる。したがってレトロウイルスベクターは、インビボでの安定な遺伝子導入には特に有用であるとみなされている。HIV系ベクターなどのレンチウイルスベクターは遺伝子送達に使用されるレトロウイルスベクターの好例である。他のレトロウイルスとは異なり、HIV系ベクターは、そのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞に組み込むことが知られており、それゆえに、持続型の疾患の処置に役立ちうる。
【０１２７】
そのようなクローニングおよび/または発現配列には、クローニングおよび/または発現におけるそれらの機能を最適化するために、ポリヌクレオチドの単離に役立つように、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を改良するために、追加の配列を付加することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は当技術分野において周知である。（例えばAusubel（前掲）またはSambrook（前掲）を参照されたい）。
【０１２８】
いくつかの態様において、本開示の核酸およびベクターは、単離および/または精製されうる。本開示は、上述の単離または精製された核酸分子（ベクターの形態にあってもよい）を含む組成物も提供する。単離された核酸およびベクターは、例えばアルカリ/SDS処理、CsCl結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野において周知の他の技法を含む当技術分野において公知の標準的な技法を使って、調製することができる。本組成物は本明細書にさらに記載する他の構成要素を含むことができる。
【０１２９】
いくつかの態様において、核酸分子は、適当な宿主細胞に導入された場合にHLA-DR CARを発現することができるベクターに挿入される。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。
【０１３０】
転写/翻訳制御シグナルの制御下にある本開示のHLA-DR CARをコードする発現ベクターを構築するには、DNAフラグメントをベクターに挿入するための当業者に公知の任意の方法を使用しうる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技法およびインビトロ合成技法ならびにインビボ組換えを含めることができる（例えばAusubel（前掲書）またはSambrook（前掲書）を参照されたい）。
【０１３１】
HLA-DR CAR-T細胞の生成
本発明のさらに別の目的は、HLA-DR CARを含むT細胞を生成させるための方法を提供することである。いくつかの態様において、CARが導入される本発明のT細胞は、CD4＋ T細胞（ヘルパーT細胞、TH細胞）、CD8＋ T細胞（細胞傷害性T細胞、CTL）、メモリーT細胞、制御性T細胞（Treg細胞）、アポトーシスT細胞であるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、CARが導入される本発明のT細胞はCD8＋ T細胞である。いくつかの態様において、CARが導入される本発明のT細胞はCD4＋ T細胞である。
【０１３２】
いくつかの態様において、本開示は、本開示の改変された自家T細胞を生成させる方法であって、（a）対象からのHLA-DRに低いアフィニティーで結合するHLA-DR抗原結合ドメインを得る工程、および（b）前記対象から得られたT細胞において前記HLA-DR抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現させ、それによって改変された自家T細胞を生成させる工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本開示の改変された自家T細胞を生成させる方法は、改変された自家T細胞をインビトロで少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間または14日間培養する工程をさらに含む。
【０１３３】
いくつかの態様において、本開示は、本開示の改変された自家T細胞を調製する方法であって、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果を用意または取得する工程、および前記結合が閾値より低ければ、前記対象からのT細胞を、前記HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを発現するように改変する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本開示の改変された自家T細胞を生成させる方法は、改変された自家T細胞をインビトロで少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間または14日間培養する工程をさらに含む。
【０１３４】
いくつかの態様において、提供される方法における培養工程は、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、CARの表面発現が低減している改変された自家T細胞の集団を生成させる。
【０１３５】
いくつかの態様において、提供される方法における培養工程は、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、正常B細胞に対する毒性が低減している改変された自家T細胞の集団を生成させる。
【０１３６】
いくつかの態様において、提供される方法における培養工程は、インビトロで2日間培養された改変された自家T細胞の集団と比較して、非悪性細胞との対比で悪性細胞に対する選択性が強化されている改変された自家T細胞の集団を生成させる。
【０１３７】
いくつかの態様では、本開示との関連において、改変された自家T細胞は、対象からの正常B細胞への改変されたT細胞の顆粒移動の少なくとも2倍以上であるEBV LCLへの顆粒移動を呈する。
【０１３８】
T細胞または抗原への抗原結合ドメインの結合を分析するための、当技術分野において公知の適当な方法はいずれも、本開示との関連において使用しうる。いくつかの態様において、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析は、T細胞アビディティーの評価であることができる。いくつかの態様において、T細胞のアビディティーは、受容体の発現レベルと受容体-抗原アフィニティーとを統合するスケールで評価することができる。（例えばVigano, S. et al. （2012） Clin. Dev. Immunol. 2012:153863参照）。いくつかの態様において、T細胞アビディティーは、最終的にT細胞活性化をもたらすクラスターをTCR-抗原複合体が形成する最低抗原レベルの尺度であることができる。
【０１３９】
いくつかの態様において、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果は、結合アフィニティー（例えばKD）の直接的測定値である。いくつかの態様において、対象からのT細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの結合の分析結果は、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度である。いくつかの態様において、機能的アビディティーは、T細胞応答をトリガーするのに必要な抗原量と逆相関する。いくつかの態様において、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度には、T細胞機能のエクスビボ定量、例えばIFN-γ生産、細胞傷害活性（ターゲット細胞を溶解する能力）または増殖が含まれる。いくつかの態様において、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度には、T細胞の最大半量応答を誘導するのに必要なHLA-DR抗原結合ドメインの濃度（EC50）を決定することが含まれる。
【０１４０】
T細胞においてCARを発現させるための、当技術分野において公知の方法はいずれも、本開示との関連において使用することができる。例えば、当技術分野において公知の発現用核酸ベクターは、例えば線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物が結合しているポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクターなど、種々あるが、本開示はそれらに限定されない。いくつかの態様において、CARをT細胞において発現させるためのベクターは、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスまたはその誘導体であるか、またはそれを含みうる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、レトロウイルスベクターであるレンチウイルスベクターを使用することができる。いくつかの態様において、ベクターは非プラスミドかつ非ウイルス化合物、例えばリポソームなどである。
【０１４１】
いくつかの態様において、リンパ球（例:T細胞）は、少なくとも約25℃、好ましくは少なくとも約30℃、より好ましくは約37℃の温度で培養される。
【０１４２】
本開示は、本明細書に記載の方法によって作製されるHLA-DR CAR T細胞が、治療的に（例えばがんの処置に）役立ちうるという認識を包含する。いくつかの態様において、HLA-DR CAR T細胞は、処置を必要とする患者のHLA-DR変異体に最も合うように、改変される。
【０１４３】
治療的応用
本開示は、HLA-DR CAR T細胞治療の方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CAR T細胞治療は自家CAR T細胞治療である。自家CAR T細胞治療に伴う最重要工程を図解した一般的概略を図1Bに図示する。これらの工程には、CAR T細胞治療を必要とする対象からのT細胞の単離およびバルク刺激（bulk stimulation）、形質導入およびCAR T細胞の拡大、ならびにCAR T細胞を含みまたは送達する組成物の注入が含まれる。
【０１４４】
いくつかの態様において、本開示は、治療調製物を生産する方法であって、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対するアビディティーの分析結果を用意または取得する工程、および前記アビディティーが閾値より低ければ、前記改変されたT細胞を含む治療調製物を生産する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対するアビディティーの分析結果は、機能的アビディティーの分析結果である。いくつかの態様において、T細胞へのHLA-DR抗原結合ドメインの機能的アビディティーの尺度には、T細胞機能のエクスビボ定量、例えばIFN-γ生産、細胞傷害活性（ターゲット細胞を溶解する能力）または増殖が含まれる。
【０１４５】
いくつかの態様において、治療調製物を生産するための方法は、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対する機能的アビディティーの分析結果を用意または取得する工程、および前記機能的アビディティーが閾値より低ければ、前記改変されたT細胞を含む治療調製物を生産する工程を含む。いくつかの態様において、機能的アビディティーの尺度は、適当な刺激と共に少なくとも8日間、10日間、12日間または14日間培養した場合の、改変されたT細胞の増殖である。いくつかの態様において、適当な刺激には、T細胞をCD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞に曝露することが含まれる。いくつかの態様において、機能的アビディティーの閾値は少なくとも15倍、20倍、25倍の増殖である。
【０１４６】
いくつかの態様において、治療調製物を生産するための方法は、HLA-DR抗原結合ドメインを含むCARを含む改変されたT細胞の、対象のHLA-DR抗原に対する機能的アビディティーの分析結果を用意または取得する工程、および前記機能的アビディティーが閾値より低ければ、前記改変されたT細胞を含む治療調製物を生産する工程を含み、閾値は、CD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞と共に少なくとも12日間培養した場合の、改変されたT細胞の少なくとも15倍、20倍、25倍の増殖である。
【０１４７】
いくつかの態様において、本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、対象はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【０１４８】
いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の誘導を必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の誘導を必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、対象はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【０１４９】
いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の強化を必要とする対象において免疫応答を強化する方法であって、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、免疫応答の強化を必要とする対象において免疫応答を強化する方法であって、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞を含みまたは送達する組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、対象はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【０１５０】
いくつかの態様において、本開示の組成物および方法による処置に適した疾患は、がんまたは悪性疾患または前がん状態などの増殖性疾患から選択される。いくつかの態様において、疾患はHLA-DRの発現と関連する。いくつかの態様において、本開示の組成物および方法による処置に適した疾患はがんである。いくつかの態様において、がんはHLA-DR抗原を発現する。いくつかの態様において、がん細胞は、対象からの非がん細胞と比較して、HLA-DR抗原の発現が増加している。いくつかの態様において、がん細胞は、HLA-DR抗原の発現が、対象からの非がん細胞と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍または6倍である。いくつかの一定の態様において、本開示の組成物および方法による処置に適したがんは、対象からの同じタイプの正常細胞と比較して、HLA-DR抗原の発現が少なくとも2倍高い。
【０１５１】
本開示の方法による処置に適したがんとして、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファロピウス管癌、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵がんおよび前立腺がんを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、本開示の方法による処置を受けるがんとして、癌、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫および白血病を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、がんは、扁平上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞癌、胃がん、膵がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、肝細胞癌、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびにさまざまなタイプの頭頸部がんを含みうる。
【０１５２】
いくつかの態様において、本開示の方法による処置に適したがんは血液がんである。いくつかの態様において、血液がんは白血病である。いくつかの態様において、がんは、1種または複数種の急性白血病、例えば限定するわけではないが、B細胞性急性リンパ性白血病（「BALL」）、T細胞性急性リンパ性白血病（「TALL」）、急性リンパ性白血病（ALL）;1種または複数種の慢性白血病、例えば限定するわけではないが、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）;さらなる血液がんまたは血液状態、例えば限定するわけではないが、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および骨髄性血液細胞の無効生産（または異形成）によって一まとめにされる血液学的状態の多様な集まりである「前白血病状態」、ならびにHLA-DR発現に関連する疾患、例えば限定するわけではないが、HLA-DRを発現する非定型のおよび/または非古典的ながん、悪性疾患、前がん状態または増殖性疾患、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【０１５３】
いくつかの態様において、本開示の方法による処置を受けるがんは、B細胞リンパ腫（すなわちB細胞起源の悪性リンパ腫）である。B細胞リンパ腫としては、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫（MCL）、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯B細胞リンパ腫（NMZL）、脾性辺縁帯リンパ腫（SMZL）、血管内大細胞型B細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症およびAIDS関連リンパ腫が挙げられるが、それがB細胞起源のリンパ腫である限り、特に限定されることはない。
【０１５４】
本開示のHLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物などの組成物は、がん細胞またはその転移を処置するために、またはがんの成長を阻害するために、薬学的有効量で投与されうる。治療方法において使用するために、本開示のHLA-DR CARを含むT細胞は、医療実施基準（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、用量決定され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき因子としては、処置されるその障害、処置されるその哺乳動物、個々の患者の臨床状態、患者の年齢、患者の体重、障害の原因、作用物質の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリングおよび医療従事者に公知の他の因子が挙げられる。
【０１５５】
いくつかの態様では、治療方法において使用するためのT細胞が自家（ドナーとレシピエントは同じ）である。いくつかの態様では、治療方法において使用するためのT細胞が同系である（ドナーとレシピエントは異なるが、同一の双生児である）。いくつかの態様では、治療方法において使用するためのT細胞が、レシピエント対象と同種異系である（種は同じであるが異なるドナーに由来する）。
【０１５６】
いくつかの態様において組成物中の細胞の処置有効量は、いくつかの態様において組成物は、少なくとも106細胞、少なくとも107細胞、少なくとも108細胞、少なくとも109細胞、少なくとも1010個または1010個を上回るHLA-DR CARを含むT細胞を含む。細胞の数は、その組成物の最終的用途およびそこに含まれる細胞のタイプに依存するであろう。例えばいくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞の集団は、10％超、15％超、20％超、25％超、30％超または35％超のそのような細胞を含有するだろう。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞の集団は、10％〜50％、15％〜45％、20％〜40％、25％〜35％または20％〜30％のそのようなT細胞を含有するだろう。ここに提供される使用の場合、投与用のT細胞の集団は、一般に、1リットル以下の体積中にある。いくつかの態様において、投与用のT細胞は、500ml未満、250ml未満、または100ml以下の体積中にある。いくつかの態様において、望ましいT細胞の密度は、典型的には106細胞/ml超であり、一般的には107細胞/ml超、一般的には108細胞/ml以上である。臨床的に妥当な数の免疫細胞は、累積的に107細胞以上、108細胞以上、109細胞以上、1010細胞以上、1011細胞以上または1012細胞以上になる複数回の注入に分割することができる。
【０１５７】
いくつかの態様において、組成物は、非経口的に患者に投与されうる。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物は、1回または複数回の投与で患者に非経口投与することができる。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する組成物は、毎日1回、2〜7日ごとに1回、毎週、2週間ごとに1回、毎月1回、3ヶ月ごとに1回または6ヶ月ごとに1回、患者に非経口投与することができる。
【０１５８】
組成物
いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARを含むT細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して、低いアフィニティーを有する。いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、HLA-DR CARをコードする核酸および/またはベクターを含むT細胞は自家T細胞である。いくつかの態様において、HLA-DR CARのHLA-DR結合ドメインは、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有する。
【０１５９】
いくつかの態様において、本開示は、HLA-DR CARを含む改変されたT細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であって、改変されたT細胞が、薬学的組成物を投与される対象からのT細胞に対して低い機能的アビディティーを有する薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、機能的アビディティーは閾値レベル未満である。いくつかの態様において、対象のT細胞に対する改変されたT細胞の機能的アビディティーは、T細胞機能のエクスビボ定量、例えばIFN-γ生産、細胞傷害活性（ターゲット細胞を溶解する能力）または増殖を使って評価される。いくつかの態様において、機能的アビディティーの尺度は、適当な刺激と共に少なくとも8日間、10日間、12日間または14日間培養した場合の、改変されたT細胞の増殖である。いくつかの態様において、適当な刺激には、T細胞をCD3特異的抗体および/またはHLA-DR発現細胞に曝露することが含まれる。いくつかの態様において、機能的アビディティーの閾値は少なくとも15倍、20倍、25倍の増殖である。
【０１６０】
本開示の組成物は、本明細書に開示する方法によって得られるHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞を含む薬学的組成物を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、緩衝剤、希釈剤、賦形剤またはそれらの任意の組合せを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は、所望であれば、1種または複数種の追加治療活性物質も含有することができる。
【０１６１】
いくつかの態様において、本開示のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞は、哺乳動物（例えばヒト）への投与に適している。ここに提供される薬学的組成物の説明は主としてヒトへの要処方投与（ethical administration）に適した薬学的組成物に向けられるが、そのような組成物があらゆる種類の動物への投与に一般に適することは当業者には理解されるであろう。ヒトへの投与に適した薬学的組成物をさまざまな動物への投与に適した組成物にするための、ヒトへの投与に適した薬学的組成物の変更はよく理解されており、通常の技量を有する獣医薬理学者は、そのような変更を、仮に実験が必要だとしても単なる日常的実験だけで、計画しかつ/または実行することができる。
【０１６２】
いくつかの態様において、本開示のT細胞は、まずそれらをその培養培地から収穫し、次に細胞を投与に適した媒質および容器系（「薬学的に許容される」担体）において洗浄および濃縮することにより、処置有効量で製剤化される。適切な注入媒質として、任意の等張性媒質製剤、典型的には生理食塩水、Normosol R（Abbott）またはPlasma-Lyte A（Baxter）を挙げることができるが、5％デキストロース水溶液または乳酸加リンゲルも利用することができる。注入媒質にはヒト血清アルブミンを補足することができる。
【０１６３】
いくつかの態様において、組成物は、非経口投与用に製剤化される。例えばここに提供される薬学的組成物は、無菌の注射可能な形態（例:皮下注射または静脈内注入に適した形態）で提供されうる。例えばいくつかの態様において、薬学的組成物は、注射に適した液状剤形で提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、注射に先だって水性希釈剤（例:水、緩衝液、塩溶液など）で再構成することができる粉末（例:凍結乾燥および/または滅菌されたもの）として、任意で減圧下に提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝食塩水などに希釈および/または再構成される。いくつかの態様において、粉末は、水性希釈剤と穏やかに（例えば振とうせずに）混合すべきである。
【０１６４】
いくつかの態様において、本開示のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞は、薬学的に許容される非経口媒体と共に製剤化される。そのような媒体の例は水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および1〜10％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび固定油などの非水性媒体も使用することができる。媒体または凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例:塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加剤（例:緩衝剤および保存剤）を含有することができる。いくつかの態様において、製剤は、公知の技法または適切な技法によって滅菌される。
【０１６５】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬学分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されうる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を希釈剤もしくは他の賦形剤および/または1種もしくは複数種の他の補助成分と混合し、次に必要であればおよび/または所望であれば、製品を所望の単回投与ユニット（single dose unit）または複数回投与ユニット（multi-dose unit）にパッケージングする工程を含む。
【０１６６】
いくつかの態様において、本開示のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞を含む薬学的組成物は、貯蔵用または投与用の容器、例えばバイアル、シリンジ（例:IVシリンジ）またはバッグ（例:IVバッグ）に含めることができる。本開示による薬学的組成物は、ばらで、単一投薬単位としておよび/または複数の単一投薬単位として、調製され、パッケージングされ、かつ/または販売されうる。本明細書において使用する場合、「投薬単位（unit dose）」とは、予め決定された量の活性成分を含む孤立した量の薬学的組成物である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されることになる活性成分の投薬量に等しく、かつ/またはそのような投薬量の好都合な部分量、例えばそのような投薬量の半量または3分の1量に等しい。
【０１６７】
本開示による薬学的組成物におけるHLA-DR CARおよび/もしくはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞、薬学的に許容される賦形剤ならびに/または任意の追加成分の相対量は、処置される対象の実体、サイズおよび/または状態に依存して、そしてまた組成物の投与経路にも依存して、さまざまであるだろう。一例として、組成物は、HLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞の集団を、少なくとも106細胞、少なくとも107細胞、少なくとも108細胞、少なくとも109細胞、少なくとも1010細胞、または1010細胞を上回る、HLA-DR CARを含むT細胞の量で含みうる。細胞の数は、その組成物の最終的用途およびそこに含まれる細胞のタイプに依存するであろう。例えばいくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞の集団は、10％超、15％超、20％超、25％超、30％超または35％超のそのような細胞を含有するだろう。いくつかの態様において、HLA-DR CARを含むT細胞の集団は、10％〜50％、15％〜45％、20％〜40％、25％〜35％または20％〜30％のそのようなT細胞を含有するだろう。ここに提供される使用の場合、投与用のT細胞の集団は、一般に、1リットル以下の体積中にある。いくつかの態様において、投与用のT細胞は、500ml未満、250ml未満、または100ml以下の体積中にある。いくつかの態様において、望ましいT細胞の密度は、典型的には106細胞/ml超であり、一般的には107細胞/ml超、一般的には108細胞/ml以上である。臨床的に妥当な数の免疫細胞は、累積的に107細胞以上、108細胞以上、109細胞以上、1010細胞以上、1011細胞以上または1012細胞以上になる複数回の注入に分割することができる。
【０１６８】
いくつかの態様において、組成物は、下限とその下限より大きい上限とに挟まれた範囲内の量で、HLA-DR CARを含むT細胞を含みまたは送達する。いくつかの態様において、下限は約106細胞、107細胞、108細胞、109細胞、1010細胞、1011細胞または1012細胞でありうる。いくつかの態様において、上限は約107細胞、108細胞、109細胞、1010細胞、1011細胞、1012細胞、1013細胞または1014細胞でありうる。
【０１６９】
薬学的組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでよく、本明細書にいう薬学的に許容される賦形剤には、所望するその剤形に適したありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤または他の液状媒体、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤などが含まれる。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A.R. Gennaro（Lippincott, Williams ＆ Wilkins、メリーランド州ボルチモア、2006）は、薬学的組成物を製剤化する際に使用されるさまざまな賦形剤およびそれらを調製するための公知の技法を開示している。従来の賦形剤媒質は、それが、例えば何らかの望ましくない生物学的効果を生むか、そうでなければ薬学的組成物の他の何らかの構成要素と有害な形で相互作用することなどによって、ある物質またはその誘導体と不適合でない限り、いずれも、その使用は本開示の範囲内であると考えられる。
【０１７０】
いくつかの態様において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％純粋である。いくつかの態様において、賦形剤はヒトでの使用および獣医学的使用について承認されている。いくつかの態様において、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの態様において、賦形剤は医薬品用である。いくつかの態様において、賦形剤は、米国薬局方（USP）、欧州薬局方（EP）、英国薬局方および/または国際薬局方の規格を満たす。
【０１７１】
薬学的組成物の製造において使用される薬学的に許容される賦形剤として、不活性希釈剤、分散および/または造粒剤、表面活性剤および/または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤および/または油が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。そのような賦形剤は任意で薬学的製剤に含めうる。製剤者の判断次第で、カカオ脂および坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、フレーバーおよび/または芳香剤などの賦形剤が、組成物中に存在しうる。
【０１７２】
いくつかの態様において、提供される薬学的組成物は、1種または複数種の薬学的に許容される賦形剤（例:保存剤、不活性希釈剤、分散剤、表面活性剤および/または乳化剤、緩衝剤など）を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、1種または複数種の保存剤を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は保存剤を含まない。
【０１７３】
いくつかの態様において、本開示のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞の集団を含む組成物は、安定に製剤化される。いくつかの態様において、本開示のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含むT細胞の集団の安定な製剤は、食塩水または選ばれた塩を含むリン酸緩衝液、ならびに保存処理された溶液および保存剤を含有する製剤、ならびに薬学的使用または獣医学的使用に適した多用途の保存処理された製剤を含有しうる。保存処理された製剤は、水性希釈剤中に、少なくとも1つの公知の保存剤、または任意で、少なくとも1つのフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例:六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールまたはそれらの混合物からなる群より選択される保存剤を含有する。当技術分野において公知のとおり、例えば0.001〜5％またはその中の任意の範囲もしくは値、例えば限定するわけではないが0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、またはその中の任意の範囲もしくは値など、任意の適切な濃度または混合物を使用することができる。限定でない例として、保存剤なし、0.1〜2％m-クレゾール（例:0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％）、0.1〜3％ベンジルアルコール（例:0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％）、0.001〜0.5％チメロサール（例:0.005、0.01）、0.001〜2.0％フェノール（例:0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％）、0.0005〜1.0％アルキルパラベン（例:0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％）などが挙げられる。
【０１７４】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、冷蔵および/または冷凍することができる形態で提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、冷蔵および/または冷凍することができない形態で提供される。いくつかの態様において、再構成された溶液および/または液状剤形は、再構成後、一定の期間（例:2時間、12時間、24時間、2日、5日、7日、10日、2週間、1ヶ月、2ヶ月またはそれ以上）にわたって貯蔵することができる。いくつかの態様において、指定された時間を上回る、抗体作用物質を含む組成物の貯蔵は、抗体作用物質の分解をもたらす。
【０１７５】
液状剤形および/または再構成された溶液は、投与前に粒状物を含みかつ/または変色を伴う場合がある。いくつかの態様において、変色しているか濁っている場合かつ/または濾過後も粒状物が残っている場合、その溶液は使用すべきでない。
【０１７６】
製剤および/または医薬品の製造に関する一般論は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2005に見いだしうる。
【０１７７】
キット
本開示は、少なくとも1種の本明細書に記載のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸で満たされた1つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを、さらに提供する。キットは、例えば治療方法、診断方法、細胞増殖および/または細胞単離方法などを含む応用可能な任意の方法において、使用しうる。そのような容器には、任意で、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指定された形式で、（a）ヒト投与のための製造、使用または販売の、当該機関による承認、（b）使用説明、またはその両方を反映した告知を添付することができる。
【０１７８】
いくつかの態様において、キットは、検出（例えばHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸の検出）のための1種または複数種の試薬を含みうる。いくつかの態様において、キットは、検出可能な形態の（例えば検出可能な部分または実体と共有結合で関連づけられた）HLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を含みうる。
【０１７９】
いくつかの態様では、ここに提供される1種または複数種のHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を、対象の処置に使用されるキットに含めてもよい。いくつかの態様では、ここに提供されるHLA-DR CARおよび/またはHLA-DR CARをコードする核酸を、HLA-DR CARを発現する自家T細胞を調製するために使用されるキットに含めてもよい。
【０１８０】
いくつかの態様において、キットは、それぞれがCARコンストラクトへのクローニングに適している1種、2種、3種、4種またはそれ以上のHLA-DR抗体作用物質を提供しうる。いくつかの態様において、キットは、対象から同定または単離されたT細胞またはHLA-DRに対するHLA-DR抗体作用物質（例えばMVR抗体作用物質）および/またはHLA-DR CAR（例えばMVR CAR）および/またはHLA-DR CAR T細胞の結合アフィニティーをアッセイするための他の試薬を提供しうる。いくつかの態様において、キットは、対象のT細胞に対するHLA-DR抗体作用物質（例えばMVR抗体作用物質）および/またはHLA-DR CAR（例えばMVR CAR）および/またはHLA-DR CAR T細胞の機能的アビディティーをアッセイするための他の試薬を提供しうる。
【０１８１】
本願の全体を通して言及される引用文献（参考文献、発行済特許、公表された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は特に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８２】
本発明の他の特徴は、以下の例示的態様の以下の説明において明らかになるであろう。ただし、以下の実施例は本発明を例証するために提供されるに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例には限定されない。
【実施例】
【０１８３】
本開示は、少なくとも部分的には、HL-DR CARを発現する新規な改変されたT細胞およびそれに関係する方法を提供する。HLA-DR CAR-T組成物の作製および特徴づけならびに生産方法および使用方法を、以下の実施例においてさらに詳しく説明する。
【０１８４】
例示的方法
下記の実施例では以下の例示的方法を使用したが、本発明との関連において使用することができる方法は、これに限定されるわけではない。
【０１８５】
プラスミド設計
下記表1に掲載する標準的DNAクローニング技法を使ってVL領域とVH領域をGSリンカーでつなぐことにより、一本鎖可変フラグメント（scFv）型のMVR抗体作用物質（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号US 2016-0257762に記載）をコードするDNAコンストラクトを作製した。タンパク質を分泌させるために、MVR-scFv配列の5'末端にCD8αリーダー配列を挿入した（表1）。精製と検出が容易になるように、下記表1に示す配列を使って、Hisタグ配列およびFLAGタグ配列を、それぞれMVR-scFv配列の5'末端および3'末端に取付けた。
【０１８６】
（表１）例示的コンストラクトの調製における使用に適した配列
2020508080.tif 000007
【０１８７】
次に、MVR-scFvをpcDNA3.1（＋）発現ベクター（V790-20、Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングすることで、pcDNA3.1-MVR-scFvを作製した。MVR CARコンストラクトを作るため、第2世代のCD19 CARコンストラクトをコードする既述のレンチウイルスベクターpELPS-19BBz（Milone, M.C. et al., （2009） Mol Ther. 17:1453-1464、June, C.ら（2012）国際特許公開番号WO/2012/07900）に、MVR-scFv配列を、標準的DNAクローニング技法を使って移植した。CD19 CARおよびMVR CARのCD8αリーダー配列とscFv配列との間にFLAGタグ配列を挿入して、それぞれpELPS-FLAG19BBzおよびpELPS-FLAGMVRBBz（図3）を作製することで、各コンストラクトの発現を抗FLAG抗体で偏りなく検出できるようにした。HLA-DRB1を標的とするsgRNA/Cas9発現ベクターpLCv2-DRB1を作製するために、HLA-DRB1エクソン3ターゲティングスペーサー配列を、標準的DNAクローニング技法を使って、lentiCRISPRv2（52961、Addgene、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）に挿入した（表1）。
【０１８８】
細胞および培地
National Cancer Center Research Instituteにおいて、National Cancer Center治験審査委員会の承認を受けたプロトコールを使って、インフォームドコンセントの下に、健常ボランティアドナーからPBMCを得た。PBMCを密度勾配遠心分離によって単離し、直ちに使用するか、または液体窒素中に保存した。EBVによる形質転換によってPBMCからEBV LCLを作製した。詳しく述べると、指数増殖期のB95-8細胞を37℃で3日間インキュベートした。上清を0.45μmフィルターで濾過し、形質転換に使用した。EBV形質転換のために、培地2.5mL中の107個のPBMCを2.5mLのEBV含有上清と混合し、37℃で2時間インキュベートした。混合した細胞をT75フラスコに移し、1μg/mLシクロスポリンAを含有する培地5mLを加えた。3週間のインキュベーション後に、増殖する（outgrowing）不死化B細胞をCD19発現およびHLA-DR発現についてチェックし、以下の実施例において使用した。pGL4.51ベクター（E132A、Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）の存在下でのDRweak EBV LCLのエレクトロポレーション後に、単一細胞クローニングによってEBV LCL-lucH細胞株を作製した。pLCv2-DRB1をエレクトロポレーションでDRweak EBV LCLに導入することによって、欠陥HLA-DR分子を有するΔDR-EBV LCLを作製した。エレクトロポレーションのために、細胞およびプラスミドを4mmキュベットに入れ、Gene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム（Bio-Rad Laboratories, Inc.、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）で、指数関数的減衰プログラムを使って、250V、975μFでパルス処理した。エレクトロポレーション後に、HLA-DR陰性DRweak EBV LCLを、FACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences、米国ニュージャージー州フランクリンレイク）で選別した。1A2（CRL-8119、ATCC、米国バージニア州マナッサス）、BC-1（CRL-2230、ATCC）、JVM-2（CRL-3002、ATCC）、Daudi（CCL-213、ATCC）、Raji（CCL-86、ATCC）、Ramos（CRL-1596、ATCC）、NALM6（CRL-3273、ATCC）、B95-8（CRL-1612、ATCC）、EBV LCL、EBV LCL-lucHおよびΔDR-EBV LCLは、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（15140-122、Gibco、米国ニューヨーク州グランドアイランド）および10％熱非働化ウシ胎児血清（FBS-BBT-5XM、Rocky Mountain Biologicals, Inc.、米国モンタナ州ミズーラ）を補足したRPMI 1640（LM011-01、Welgene, Inc.、韓国テジョン）で培養した。拡大したT細胞およびPBMCは、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（15140-122、Gibco）および10％熱非働化ウシ胎児血清（FBS-BBT-5XM、Rocky Mountain Biologicals, Inc.）を補足したRPMI1640（LM011-77、Welgene, Inc.）で培養した。Lenti-X293T細胞株（632180、Clontech Laboratories, Inc.、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）および293T細胞株は、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（15140-122、Gibco）および10％熱非働化ウシ胎児血清（FBS-BBT-5XM、Rocky Mountain Biologicals, Inc.）を補足したDMEM（LM001-05、Welgene, Inc.）で培養した。以下の実施例で使用した細胞株はすべて、過去1年以内にZellShield（13-0050、Minerva Biolabs、米国ニュージャージー州ハッケンサック）の存在下で培養し、e-Myco VALiDマイコプラズマPCR検出キット（S25239、iNtRON Biotechnology, Inc.、韓国ソウル）を使って、マイコプラズマを含まないことを確認した。細胞株認証は行わなかった。
【０１８９】
MVR-scFvの生産
精製MVR-scFvタンパク質を生産するために、pcDNA3.1-MVR-scFvを293T細胞にトランスフェクトした。上清に分泌されたMVR-scFvタンパク質をトランスフェクションの48時間後に収集し、Ni-NTA精製システム（R901-10、Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で、製造元のプロトコールに従って精製した。
【０１９０】
フローサイトメトリーの方法および抗体
表面マーカーの発現を分析するために、1×106細胞を、4℃で30分、特異的抗体で染色した。表面受容体へのMVR-scFvの結合を評価するために、1×106細胞を1μgの精製MVR-scFvを使って4℃で30分間染色し、1回洗浄し、PE-またはAPC-コンジュゲート抗FLAG抗体を使って4℃で30分間染色した。細胞を2回洗浄し、分析前に1％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞内抗原を分析するために、Cytofix/Cytoperm固定/透過処理キット（554714、BD Biosciences）を使って、細胞を細胞内抗原特異的抗体で染色した。ターゲット抗原接触後の増殖を評価するために、T細胞をCellTrace Violet細胞増殖キット（C34557、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で標識し、EBV LCLには、Gammacell 3000 137Cs照射装置（Best Theratronics, Ltd.、カナダ・オンタリオ州）を使って、30Gyの線量でγ照射した。次に、合計1.2×106個の細胞を3:1のT細胞:EBV LCL比で混合し、200IU/mLのヒト組換えIL-2の存在下で5日間培養した。5日目に、培養細胞を2回洗浄し、分析前に1％パラホルムアルデヒドで固定した。
CD107a、IFN-γ、IL-2、MIP-1βおよびTNFのレベルを測定することによって多機能性を評価した。EBV LCLをCellTraceカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル細胞増殖キット（C34554、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で標識し、T細胞を活性化するために使用した。合計1.2×106細胞を、48ウェルプレート中、タンパク質輸送阻害剤カクテル（00-4980、Thermo Fisher Scientific, Inc.）およびCD107a特異的抗体の存在下、3:1のT細胞:EBV LCL比で、6時間、共インキュベートした。細胞を抗CD4抗体で染色し、2回洗浄し、IFN-γ特異的抗体、IL-2特異的抗体、MIP-1β特異的抗体およびTNF特異的抗体で細胞内染色した。フローサイトメトリー分析はすべて、FACSCaliburまたはFACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）で行った。以下の実施例において使用される抗体に関するさらなる情報を下記表2に示す。
【０１９１】
（表２）例示的方法における使用に適した例示的抗体
2020508080.tif 000008
2020508080.tif 000009
【０１９２】
レンチウイルス調製
Lenti-X 293Tパッケージング細胞株およびパッケージングプラスミドベクターを使用してレンチウイルスベクターを作製した。トランスフェクションの前日に、Lenti-X 293T細胞を105細胞/cm2の密度で150mm培養ディッシュに播種した。翌日、0日目に、Lipofectamine 3000（L3000075、Thermo Fisher Scientific, Inc.）を使って、CARをコードするレンチウイルスベクターコンストラクト（pELPS-FLAG19BBzおよびpELPS-FLAGMVRBBz）を、パッケージングプラスミドベクターpMDLg/pRRE、pRSV-revおよびpMD.Gと共に、16:7:7:1の比で、Lenti-X 293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後および48時間後に収穫した上清を、Thickwall Polyallomerチューブ（355642、Beckman Coulter, Inc.、米国カリフォルニア州ブレア）中、4℃、16,500×gで90分間の超遠心によって濃縮した。超遠心後に上清を捨て、1mLの新鮮なT細胞培地を各チューブに加えた。封をして4℃で一晩インキュベートしたチューブを、0.45μmフィルターで濾過し、小分けして、使用時まで-70℃で保存した。形質導入単位を算出することによってレンチウイルス価を決定した。0日目にヒトT細胞活性化/拡大キット（130-091-441、Miltenyi Biotec, Inc.,ドイツ・ベルギッシュグラートバッハ）を使ってヒトPBMCを活性化した。2日目に、T細胞を、50μLのT細胞培地の存在下、105細胞/ウェルの密度で、96ウェル平底プレートに播種した。形質導入のために、10μg/mLのポリブレンを含有する100μLの3倍系列希釈レンチウイルスベクターをT細胞を播種したウェルに加え、25℃、1,200×gで2時間のスピノキュレーションに付した。スピノキュレーション後に、プレートを37℃で2日間インキュベートし、形質導入されたT細胞を抗FLAG抗体で染色し、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）によってCAR発現について分析した。0.05〜0.1の形質導入率をもたらした希釈率を決定することにより、次の等式を使ってレンチウイルスの形質導入U/mLを算出した:（形質導入率×105×10）/希釈率。
【０１９３】
CAR T細胞の生成
CARをコードするレンチウイルスによる活性化T細胞のスピノキュレーションで、CAR T細胞を作製した。詳しく述べると、ヒトPBMC、または汎T細胞単離キット（130-096-535、Miltenyi Biotec, Inc.）を使って単離したT細胞を、0日目に、ヒトT細胞活性化/拡大キット（130-091-441、Miltenyi Biotec, Inc.）を使って活性化した。2日目に、10μg/mLのポリブレンを含有する培地中、25℃で2時間、1,200×gのスピノキュレーションにより、3〜5の感染多重度で、レンチウイルスによるT細胞の形質導入を行った。スピノキュレーション後に、形質導入されたT細胞を洗浄し、200IU/mLのヒト組換えIL-2を補足した培地で2週間培養した。14日目に、CAR発現T細胞を、直ちに使用するか、または抗FLAG-ビオチン（130-101-566、Miltenyi Biotec, Inc.）および抗ビオチンマイクロビーズ（130-091-441、Miltenyi Biotec, Inc.）を使って濃縮した。
【０１９４】
定量PCR
CAR mRNA発現を定量PCRによって決定した。1×106個のT細胞から、RNeasyプラスミニキット（74136、QIAGEN、ドイツ・ヒルデン）を使って全RNAを抽出し、SuperScript III第一鎖合成システム（18080-051、Thermo Fisher Scientific, Inc.）を使って逆転写した。次に、逆転写された一本鎖DNAを、FastStartエッセンシャルDNAグリーンマスターキットおよびLightCycler 96システム（06924204001、Roche Molecular Systems, Inc.、スイス・バーゼル）を用いる定量PCRに供した。CD8TM-BB＿Fwd（CD8α膜貫通ドメインと4-1BBシグナリングドメインとの接合部に特異的）とBB-CD3z＿Rev（4-1BBシグナリングドメインとCD3ζシグナリングドメインの接合部に特異的）とを使って、CAR mRNAを定量した（表1）。リファレンス遺伝子発現の検出にはGAPDH＿FwdおよびGAPDH＿Rev（GAPDH mRNAに特異的）を使用した（表1）。GAPDH mRNAレベルを基準とするCAR mRNAレベルを算出し、それを使って、CAR T細胞試料間のCAR発現を比較した。
【０１９５】
ウェスタンブロット分析
CARタンパク質レベルを比較するために、CD247特異的抗体（非コンジュゲート、51-6527GR、BD Biosciences、表2）によるウェスタンブロット分析を行った。詳しく述べると、1×107個のT細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（P3100-001、GenDEPOT, Inc.、米国テキサス州バーカー）を含有するRIPA溶解緩衝液で溶解した。溶解物を4℃、最大速度で10分間、遠心分離し、上清を試料干渉液（5×）と混合し、5分間煮沸した。等量のタンパク質を12％SDS-PAGEゲル上で分離し、フッ化ポリビニリデンメンブレンに転写した。5％無脂乳を使って25℃で1時間、メンブレンをブロッキングし、抗CD247抗体の存在下、4℃で一晩、穏やかに揺動しながらインキュベートした。次にメンブレンをTBS-T緩衝液で3回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗マウスIgG抗体（315-035-045、Jackson ImmunoResearch, Inc.、米国ペンシルバニア州ウェストグローブ）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートβ-アクチン特異的抗体（sc-130656、Santa Cruz Biotechnology, Inc.、米国テキサス州ダラス）と共に、25℃で1時間インキュベートした。メンブレンをTBS-T緩衝液で3回洗浄した。シグナル発光のために、メンブレンを化学発光基質（NCI4080KR、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で発光させ、X線フィルムに露光した。β-アクチンと比較したCARのタンパク質レベルをImageJ v1.50iソフトウェア（NIH、米国メリーランド州ベセスダ）で定量した。
【０１９６】
免疫蛍光イメージング
免疫蛍光イメージングによってCARタンパク質の局在化を評価した。T細胞を、25℃で10分間、PBS（pH7.4）中の4％（w/v）パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞を、25℃で20分間、透過処理-洗浄（perm-wash）緩衝液（0.1％サポニンおよび1％ウシ血清アルブミンを含有するPBS、pH7.4）で洗浄、透過処理し、25℃で20分間、ヒトFc Block（564219、BD Biosciences）でブロッキングした。透過処理-洗浄緩衝液による洗浄後に、細胞を、透過処理-洗浄緩衝液中、Alexa488コンジュゲート抗FLAGタグ抗体（5407、Cell Signaling Technology Inc.、米国マサチューセッツ州ダンバーズ、表2）により、25℃で30分間、染色した。細胞を透過処理-洗浄緩衝液中で洗浄し、DAPIを含有するVectashield封入剤（H-1200、Vector Laboratories, Inc.、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を使ってスライドガラス上に封入し、Zeiss LSM 780レーザー走査共焦点顕微鏡（Carl Zeiss SAS、ドイツ・オーバーコッヘン）を使って画像を取得した。
【０１９７】
細胞傷害性の評価
T細胞によるEBV LCLの細胞傷害性死滅は、CytoTox-Glo細胞傷害性アッセイキット（G9291、Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を使って定量した。詳しく述べると、5×104個のEBV LCLを透明な平底を持つ96ウェルブラックプレート（3904、Corning, Inc.、米国ニューヨーク州コーニング）に播種した。次に、T細胞を1:27、1:9、1:3、1:1または3:1のT細胞:EBV LCL比でウェルに加え、37℃で4時間インキュベートした。EBV LCLだけが入っている対照ウェルを同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後に、発光性AAF-Glo基質を各ウェルに加え、TECAN infinite PRO200（Tecan Group, Ltd.、スイス・メンネドルフ）でルミネセンスを測定した。EBV LCLのみまたはジギトニン処理したEBV LCLが入っているウェルを、それぞれバックグラウンドおよび最大細胞傷害シグナルを検出するための対照として使用した。次の等式を使って細胞傷害性誘導死滅効力（cytotoxicity-induced killing efficacy）を決定した:（試料ウェル中の細胞傷害シグナル-バックグラウンド細胞傷害シグナル）/最大細胞傷害シグナル。
【０１９８】
インビトロオンターゲット死滅の評価
CAR T細胞のターゲット特異的死滅効力を評価するために、フローサイトメトリーベースの死滅アッセイを設計した。詳しく述べると、PBMCおよびEBV LCLを、それぞれCellTrace Violet細胞増殖キット（C34557、Thermo Fisher Scientific, Inc.）およびCellTraceカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル細胞増殖キット（C34554、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で標識した。標識されたPBMCおよびEBV LCLを、6:1:1のT細胞:EBV LCL:PBMC比で4時間、T細胞と共培養した。共培養のために、1.2×106細胞を48ウェルプレートのウェルにおいて1mLの培地中でインキュベートした。対照ウェルは、T細胞非存在下でのターゲット細胞の減少を測定するために、標識されたEBV LCLおよびPBMCだけを含んだ。インキュベーション後、定量的フローサイトメトリー分析のために20μLのFlow-Countフルオロスフェア（7547053、Beckman Coulter, Inc.）を各ウェルに加えた。次に、細胞-ビーズ混合物を12×75mmポリスチレンチューブに移し、固定可能な生存率色素（fixable viability dye）eFluor780（65-0865、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で染色し、HLA-DR、CD14およびCD20に特異的な抗体で染色した。次に試料を1％パラホルムアルデヒドで固定し、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。定量的集団分析のために、すべての試料から一定数の定量ビーズを取得した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル標識EBV LCLおよびViolet標識CD20陽性B細胞に対するT細胞の死滅効力を、次の等式を使って算出した:EBV LCL死滅効力＝（対照ウェル中の生EBV LCL-試料ウェル中の生EBV LCL）/対照ウェル中の生EBV LCL; B細胞死滅効力＝（対照ウェル中の生B細胞-試料ウェル中の生B細胞）/対照ウェル中の生B細胞。
【０１９９】
細胞傷害阻害の評価
細胞傷害阻害アッセイは、インビトロオンターゲット死滅アッセイの場合と同様に、ただしいくつかの変更を加えて行った。簡単に述べると、CellTrace Violet細胞増殖キット（C34557、Thermo Fisher Scientific, Inc.）を使ってEBV LCLを標識し、抗CD178（FasL）抗体（FasL遮断剤、非コンジュゲート、10μg/mL、556371、BD Biosciences、表2）、抗CD253（TRAIL）抗体（TRAIL遮断剤、非コンジュゲート、10μg/mL、550912、BD Biosciences、表2）、コンカナマイシンA（CMA、パーフォリン1遮断剤、1μg/mL、C9705-25UG、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）または組換えヒトBcl-2タンパク質（グランザイムB遮断剤、1μg/mL、827-BC、R＆D Systems、米国ミネソタ州ミネアポリス）の存在下、5:1のT細胞:EBV LCL比で、各タイプのT細胞と4時間、共培養した。1.2×106細胞の試料を、48ウェルプレート中、0.5mLの培地を使って、共培養した。10μg/mLのアイソタイプマウスIgGおよび1μg/mLのメチルスルホキシドを含有するT細胞-EBV LCL混合物を、非阻害対照として使用した。標識EBV LCLのみをバックグラウンド対照として使用した。インキュベーション後、定量的フローサイトメトリー分析のために20μLのFlow-Countフルオロスフェア（7547053、Beckman Coulter, Inc.）を、各ウェルに直接加えた。次に、細胞-ビーズ混合物を12×75mmポリスチレンチューブに移し、固定可能な生存率色素eFluor780（65-0865、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で染色してから、1％パラホルムアルデヒドで固定し、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）を使って分析した。定量的分析のために、すべての試料から一定数の定量ビーズを取得した。EBV LCL死滅の効率は次の等式を使って決定した:（試薬含有試料中のEBV LCL-非阻害対照中のEBV LCL）/（バックグラウンド対照中のEBV LCL-非阻害対照中のEBV LCL）。
【０２００】
表面分子の定量
Quantum Simply Cellular抗マウスIgGキット（814、Bangs Laboratories, Inc.、米国インディアナ州フィッシャーズ）を使って表面分子を定量した。CAR、CD19およびHLA-DRを定量するために、それぞれ、APCコンジュゲートFLAG特異的抗体、PEコンジュゲートCD19特異的抗体およびPE-Cy5コンジュゲートHLA-DR特異的抗体を使用した。フローサイトメトリー分析は、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）を使って行った。
【０２０１】
顆粒移動率の測定
T細胞とB細胞（またはEBV LCL）との間の接触に続く顆粒移動率を、フローサイトメトリーによって測定した。まず、T細胞をCellTrace Violet細胞増殖キット（C34557、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で標識した。EBV LCL、またはB細胞単離キットII（130-091-151、Miltenyi Biotec, Inc.）を使って単離された健常ドナーのPBMCからのB細胞を、ターゲット細胞として使用した。T細胞:ターゲット細胞比が2:1である4.5×105個のT細胞とターゲット細胞の試料を、96ウェル平底プレート中、10、30または90分間インキュベートした。インキュベーション後に、Cytofix/Cytoperm固定/透過処理キット（554714、BD Biosciences）で細胞を固定、透過処理し、移動した顆粒を抗グランザイムA抗体および抗グランザイムB抗体で染色し、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。Violet陰性細胞でのゲーティングによってターゲット細胞を同定した。総ターゲット細胞におけるグランザイムAおよび/またはグランザイムB陽性細胞のパーセンテージから顆粒移動率を算出した。
【０２０２】
アポトーシス細胞のライブイメージング
JuLI Stageリアルタイム細胞履歴レコーダー（NanoEnTek, Inc.、韓国京畿道）でEBV LCLアポトーシスの動態を測定した。ターゲットEBV LCLをCellTrace Violet細胞増殖キット（C34557、Thermo Fisher Scientific, Inc.）で標識した。T細胞:EBV LCL比が1:1である1×105個のT細胞とEBV LCLの試料を、96ウェル平底プレート中、アポトーシスを誘導するためのIncuCyteカスパーゼ3/7試薬（4440、Essen Bioscience、米国ミシガン州アナーバー）の存在下でインキュベートした。DAPIフィルターおよびRFPフィルターをかけた画像を5分ごとに90分間取得した。各ウェルの3つの領域を分析した。Violet標識EBV LCLの青色蛍光ゆえに、アポトーシスEBV LCLは、マージされた画像におけるマゼンタ色の細胞（Violetラベルの青色蛍光とアポトーシス細胞の赤色蛍光が合わさったもの）を観察することによって同定することができる。アポトーシスEBV LCLのパーセンテージは、ImageJ v1.50iソフトウェアおよびJuLI STAT（NanoEnTek, Inc.）で決定し、数値に変換した。アポトーシスEBV LCLの比率を次の等式から算出した:％アポトーシスEBV LCL＝アポトーシスEBV LCL（マゼンタ色）/総EBV LCL（青色またはマゼンタ色）。
【０２０３】
動物モデル
下記実施例で述べる動物実験のために、特定病原体フリー条件下で飼育した免疫不全7〜10週齢C;129S4-Rag2tm1.1FlvIl2rgtm1.1Flv/J雌マウスを使用した。マウスは、腫瘍体積が2,000mm3を超えるか、ルシフェリン処置対象の総ルミネセンスが1×1011光子/秒を超えたら、二酸化炭素曝露によって屠殺した。
【０２０４】
インビボ効力の評価
異種移植片モデルを使ってインビボCAR T細胞効力を評価した。T細胞注入の5日前に、マウスの腹腔内に3×106（100μL）個のルシフェラーゼ発現EBV LCL-lucH細胞を異種移植した。5日後（0日目）に、マウス1匹につき5×106個のT細胞（300μL）を静脈内注射した。4匹のマウスにNT T細胞を注射し、CD19 CAR T細胞およびMVR CAR T細胞をそれぞれ5匹のマウスに注射した。IVIS Luminaインビボイメージングシステム（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）でルシフェラーゼ活性を測定することにより、0、7、14、21および28日目に、異種移植変マウスの腫瘍量を決定した。
【０２０５】
インビボオンターゲット死滅の評価
インビボオンターゲット死滅のアッセイには一過性異種移植片モデルを使用した。詳しく述べると、1mgのクロドロネートリポソーム（ClodLip BV、オランダ・アムステルダム）を、T細胞注入の5日前に、マウスに静脈内注射した。翌日、X-RAD 320（Precision X-Ray, Inc.、米国コネティカット州ノースブランフォード）を使って2Gyの線量でマウスにX線照射し、B細胞単離キットII（130-091-151、Miltenyi Biotec, Inc.）で得たDRweak PBMCからの3×105個（300μL）のDRweak B細胞を静脈内に移植した。T細胞注入の3日前に、6.5×105個（200μL）のルシフェラーゼ発現EBV LCL-lucH細胞を、マウスの腹腔内に注射した。3日後（0日目）に、マウス1匹につき1×107個のT細胞（500μL）を静脈内注射した。NT T細胞およびMVR CAR T細胞をそれぞれ4匹のマウスに注射し、CD19 CAR T細胞は5匹のマウスに注射した。-1日目、7日目および14日目に、IVIS Luminaインビボイメージングシステムでルシフェラーゼ活性を測定することにより、異種移植マウスを腫瘍量について分析した。-1日目、2日目および7日目に、B細胞の残留および血中IFN-γレベルを、眼窩後採血によって収集した血液試料で測定した。血液試料中の残存B細胞を定量するために、CD3-、CD20-、CD45-およびHLA-DR-特異的抗体を、75μLのEDTA処理末梢血に直接加えた。染色後に、赤血球溶解緩衝液を加え、試料を12×75mmポリスチレンチューブに移した。定量的フローサイトメトリー分析のためにFlow-Countフルオロスフェア（7547053、Beckman Coulter, Inc.）を各ウェルに加えた。次に、その細胞-ビーズ混合物を2回洗浄し、1％パラホルムアルデヒドで固定し、FACSVerseフローサイトメトリーで分析した。定量的集団分析のために、すべての試料から一定数の定量ビーズを取得した。遠心分離した血液試料から収集した血漿中のIFN-γレベルは、BD Cytometric Bead ArrayヒトTh1/Th2/Th17サイトカインキット（560484、BD Biosciences）で定量した。
【０２０６】
統計分析
当分野の同様の研究に基づいてデータに適した統計的検定を使用した。別段の明示がある場合を除き、独立両側t検定を使って相違を評価し、p＜0.05を統計的に有意と見なして、有意性をアスタリスクで示した（ns、有意性なし;＊、p＜0.05;＊＊、p＜0.01;＊＊＊、p＜0.001）。すべてのグラフの作成およびすべての統計分析に、Prism v5.01（GraphPad Software, Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ）を使用した。
【０２０７】
実施例1-低いCARアフィニティーは例示的HLA-DR CAR T細胞のフラトリサイドを低減する
この実施例では、異なる対象からのHLA-DR抗原に対してさまざまなアフィニティーを持つHLA-DR CAR T細胞について述べる。さらにまた、この実施例は、ある対象からのT細胞に対して低いアフィニティーを有するHLA-DR CARで改変されたHLA-DR CAR T細胞が、一定の有益な性質を有することを実証する。
【０２０８】
最近、本発明者らのグループは、マウスをB細胞リンパ腫細胞株L3055で免疫化することによって、HLA-DR特異的抗体作用物質MVRを開発した。この例示的HLA-DR抗体作用物質はHLA-DRの多型領域を認識する（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号US 2016-0257762に記載）。興味深いことに、MVR抗体作用物質はHLA-DRの多型領域を認識するので、HLA-DRB1バックグラウンドが異なる個体からのPBMCは、広域にわたるMVR-scFv結合アフィニティーを呈しうる（未公表）。図2Aに掲載するのはHLA-DRの多型領域の配列アラインメントであり、MVRエピトープ領域が示されている。3人のドナーからの例示的CD19＋ B細胞は、例示的HLA-DR-scFvであるMVR-scFvに対して、高い（強い）、中ぐらいの（中間）または低い（弱い）アフィニティーで結合することがわかった（それぞれDRstr、DRintまたはDRweakと名付けた）。さらなる実験には、これらのドナーからの細胞を使用した（図2B）。図2Aの配列アラインメントには、強/中間結合個体および弱結合個体について、HLA-DR多型領域の例示的配列バリエーションも図示されている。
【０２０９】
最近、あるグループが、T細胞上に発現されるCD5にリダイレクトされたCAR T細胞のフラトリサイドを報告した（Mamonkin, M., et al., （2015） Blood 126:983-992）。その研究において、フラトリサイドは、インビトロ培養の初期段階（形質導入後約2週間）で、CD19-CAR T細胞よりも2〜3日遅延する拡大をもたらし、さらなる培養段階（形質導入後2〜4週間）では、CD5low T細胞数の増加を伴う回復が観察された。
【０２１０】
MVR-scFvのターゲット抗原であるHLA-DRは、主として抗原提示細胞（APC）において発現する。しかしT細胞活性化は、これらの細胞におけるHLA-DRのアップレギュレーションを誘導する。活性化T細胞はHLA-DRをその表面に発現させるので、MVR CARなどのHLA-DR CARが形質導入されたT細胞は、HLA-DRを継続的に認識して、フラトリサイドおよびCARダウンレギュレーションを誘導すると仮定された。
【０２１１】
異なるHLA-DRB1変異体を持つT細胞（例えばHLA-DR抗体作用物質またはHLA-DR CARに対して強い、中間のおよび/または弱い結合を有すると特徴づけられる対象からのT細胞）から、HLA-DR標的CAR T細胞を改変した。DRstr、DRintおよびDRweak T細胞に、第2世代MVR CARコンストラクトを形質導入した（図3A）。DRstr、DRintおよびDRweak PBMCと特徴づけられるHLA-DRB1変異体を持つ第2世代MVR-CAR形質導入T細胞のフラトリサイド度（fratricidal degree）を、フラトリサイドおよびCARダウンレギュレーションの程度について、CAR-抗原アフィニティーの関数として評価した。CD19標的CAR T（CD19 CAR T）細胞および非形質導入T（NT T）細胞を対照として作製した。DRstrおよびDRint MVR CAR T細胞の成長速度および生存率を評価した。DRstr-CAR T細胞とDRint-CAR T細胞の成長速度および生存率は、どちらも形質導入の翌日から減少した（図4A）。対照的に、DRweak MVR CAR T細胞は、親NT T細胞と同じように成長し続けた（図4A）。さらにまた、MVR CAR陽性細胞の頻度は、DRstrおよびDRint MVR CAR T細胞では著しく減少した。これは、MVR-CARとHLA-DRの間の相互作用がフラトリサイド細胞死に関与することを暗示している（図4B）。
【０２１２】
TCRが媒介する疲弊と同様に、継続的なCARシグナリングは、T細胞疲弊および関連するT細胞機能障害を引き起こす。（Long, A.H. et al. （2015） Nat. Med. 21:581-590、Frigault, M.J. et al. （2015） Cancer Immunol. Res. 3:356-367）。DRweak-CAR T細胞は最小のフラトリサイドを呈したものの、インビトロ拡大中のMVR-CARとDRweak-HLA-DRとの間の相互作用が、依然としてT細胞疲弊および/または他の関連T細胞機能障害を引き起こすかどうかは不明であった。これらの細胞における疲弊の程度を評価するために、代表的な疲弊マーカーLAG-3、TIM-3、CTLA-4およびPD-1（Wherry, E.J. ＆ Kurachi, M. （2015） Nat. Rev. Immunol. 15:486-499、Blackburn, S.D. et al., （2009） Nat. Immunol. 10:29-37、Speiser, D.E., et al., （2016） Nat. Rev. Immunol. 16:599-611）の発現を、DRintおよびDRweak MVR CAR T細胞において調べた。DRweak MVR CAR T細胞は強い疲弊を示さず、複数の疲弊マーカーを同時に発現することは稀であった（図5Aおよび図5B）。これに対し、大半のDRint MVR CAR T細胞（例えば過半数）は、2種以上の疲弊マーカーを発現した（図5Aおよび図5B）。
【０２１３】
DRint-CAR T細胞は高い比率で2種以上の疲弊マーカーを発現させたが、DRint-PBMCからのCD19-CAR T細胞はそうではなかった（MVR-CAR＝65.8％、CD19-CAR＝7.7％、図5B）。興味深いことに、DRweak-CAR T細胞は、DRweak-PBMCからのCD19-CAR T細胞と比べて、Tim-3のわずかな増加を呈し（MVR-CAR＝60.7％、CD19-CAR＝36.6％）、一方、2つ以上の疲弊マーカーを持つCAR T細胞の頻度は類似していた（MVR-CAR＝9.2％、CD19-CAR＝9.4％）。これらのデータは、MVR-CARとHLA-DRとの相互作用が引き起こすフラトリサイドと疲弊は、DRweak-CAR T細胞ではごくわずかであって、許容できるのに対し、DRstr-CAR T細胞およびDRint-CAR T細胞では、フラトリサイドと疲弊が激しく、本質的に回復不可能であることを示している。これらのデータは、MVR CARとHLA-DRの相互作用が引き起こすフラトリサイドと疲弊は、DRweak MVR CAR T細胞ではごくわずかであるのに対し、DRstr MVR CAR T細胞およびDRint MVR CAR T細胞では、それらが激しいことを示している。
【０２１４】
この実施例は、T細胞の感度選択がフラトリサイドによって模倣されたことを実証している。さらにまた、これらの結果は、DRstr MVR CAR T細胞とは対照的に、DRweak MVR CAR T細胞が軽度のフラトリサイドおよび疲弊を呈したことを実証しており、MVR CARとDRweak HLA-DRとの間の低いアフィニティー相互作用が限定的な免疫応答を誘導しうることを示している。実際、DRweak MVR CAR T細胞はDRweak B細胞に対して細胞傷害性でない一方、それらはDRstr B細胞を死滅させた。これらの結果は、フラトリサイド選択が、潜在的に有害なCAR T細胞を検出し除去するCAR T細胞開発のための有用な戦略になりうることを示唆している。
【０２１５】
以下の実施例項において使用されるMVR CAR T細胞は、別段の明示がある場合を除き、DRweak MVR CAR T細胞である。
【０２１６】
実施例2-CAR-HLA-DR相互作用は表面MVR CARをダウンレギュレートする
この実施例ではT細胞におけるHLA-DR CARの表面発現について述べる。DRstrおよびDRint MVR CAR T細胞は、CARの激しいダウンレギュレーションを呈したが（図4B）、DRweak MVR CAR T細胞はCD19 CAR T細胞のおよそ2分の1の表面CAR発現を呈した（図4B、図7A）。この相違は、さまざまな感染多重度のMVR CARまたはCD19 CARレンチウイルスベクターで形質導入された293T細胞および初代DRweak T細胞において確認された（図7B）。293T細胞株においてMVR CARの表面発現は感染多重度と共に増加したが（左側のパネル）、初代DRweak T細胞における発現は本質的に一定のままであった（右側のパネル）（図7B）。
【０２１７】
CAR発現の縦断的分析により、最も高レベルの表面MVR CARを発現するDRweak T細胞は形質導入の2日後（活性化の4日後）に存在し、MVR CARは、14日間のT細胞活性化サイクルを通して徐々にダウンレギュレートされることが明らかになった（図7C）。DRweak MVR CAR T細胞におけるCAR mRNAレベルおよびCARタンパク質レベルは、CD19 CAR T細胞と比べて同等以上であったことから、表面CARは、翻訳後にダウンレギュレートされることが示された（図7D、図3B）。
【０２１８】
MVR CARのダウンレギュレーションがMVR CARとHLA-DRとの相互作用によって誘導されたかどうかを決定するために、CRISPR-Cas9システムを使ってHLA-DR欠損性MVR CAR T細胞を作製する試みを繰り返した。しかしこれらの試みは繰り返し失敗した。おそらくT細胞においてHLA-DRには未知の生存上の利点があるからだと思われる。悪性B細胞は高いHLA-DR発現プロファイルを示すので、本発明者らは、DRweak-CAR T細胞自身による免疫活性化は許容できるにもかかわらず、モデル悪性細胞EBV-LCLは適正な免疫活性化を誘導しうると考えた。そこで本発明者らは、HLA-DRが欠損しているエプスタイン・バー・ウイルス誘導リンパ芽球様細胞株（ΔDR-EBV LCL）を作製し、これらの細胞にMVR CARレンチウイルスで形質導入を行った。ΔDR-EBV LCLはDRweak EBV LCLより高レベルのMVR CARを発現し、DRweak EBV LCLとの接触後は発現が減少したことから、MVR CAR-HLA-DR相互作用がMVR CARダウンレギュレーションの原因であることが示された（掲載なし）。さらなる免疫蛍光実験により、CARは、DRweak MVR CAR T細胞およびCD19 CAR T細胞では膜に局在していることが示された（図8）。これらのデータは、DRweak MVR CAR T細胞のインビトロ拡大中は、HLA-DRとの相互作用ゆえに、表面MVR CARの持続的ダウンレギュレーションが起こることを示唆している。
【０２１９】
このように、本実施例は、TCRで観察されるものと類似する感度選択が、CAR T細胞ではフラトリサイドによって模倣されうることを実証した。DRstrおよびDRint MVR CAR T細胞は、MVR CARとHLA-DRとの間のアフィニティーが強い免疫活性化を誘導するのに十分なほど高いので、実質的なフラトリサイドに巻き込まれた。強烈な免疫活性化は、DRint MVR CAR T細胞における疲弊レベルの上昇から推論された（図5Aおよび図5B）。対照的に、DRweak MVR CAR T細胞は軽度のフラトリサイドおよび疲弊を呈したことから、MVR CARとDRweak HLA-DRとの間のアフィニティーは免疫応答を制限するのに十分なほど低いことが示された。実際、DRweak MVR CAR T細胞はDRweak B細胞に対して細胞傷害性でない一方、それらはDRstr B細胞を死滅させた。こうして、DRweak MVR CAR T細胞は、フラトリサイド選択に耐えて生き残ることができ、それらの表面のCARをダウンレギュレートさせる。本開示は、フラトリサイド選択が、潜在的に有害なCAR T細胞を検出し除去するCAR T細胞開発のための有用な戦略になりうるという認識を包含する。
【０２２０】
実施例3-HLA-DR CAR T細胞は、正常B細胞を害さずに、悪性細胞を死滅させる
この実施例では、CD19 CAR T細胞とDRweak MVR CAR T細胞の免疫活性化能を比較することによる、フラトリサイド選択およびCARダウンレギュレーションの機能的帰結の分析について述べる。CD19およびHLA-DRを継続的に発現するEBV LCLを活性化に使用した。DRweak MVR CAR T細胞とターゲット細胞のHLA-DRB1アレルを一致させるために、DRweak B細胞のEBV形質転換によってEBV LCLを作製した。したがって、DRweak EBV LCLに対するCD19 CAR T細胞とDRweak MVR CAR T細胞の機能的活性を比較した（図11）。MVR CARに強く結合することで強い免疫活性を誘導するHLA-DRを持つDRstr EBV LCLを、陽性対照とした。
【０２２１】
増殖はT細胞活性化の代表的特徴の1つである。活性化時の接触に続くMVR-CAR T細胞の増殖能を評価するために、HLA-DR CAR T細胞を例示的悪性細胞株と共培養した。具体的に述べると、MVR-CAR T細胞を、結合アフィニティーが異なるHLA-DR変異体を持つエプスタイン・バー・ウイルス誘導リンパ芽球様細胞株（EBV-LCL）細胞であるDRweakr-EBV-LCLまたはDRstr-EBV-LCLと共培養した。興味深いことに、MVR-CAR T細胞は、DRweak-EBV-LCL接触後に、CD19-CAR T細胞と類似する増殖を呈した（図6aおよび図9C）。また、MVR-CAR T細胞とDRstr-EBV-LCLとの間の相互作用のように強いCAR-ターゲット相互作用では、増殖はさらに顕著であった。
【０２２２】
ターゲット抗原認識後に、T細胞は、溶解性顆粒、サイトカインおよび/またはケモカインを分泌することで、ターゲット細胞を直接的に死滅させ、免疫系を活性化する。これらの特徴をすべて同時に呈するT細胞は、病原体および腫瘍を効率よく抑制することができる点で多機能性と見なされる。（Yuan, J., et al. （2008） Proc. Natl. Acad. Sci USA 105:20410-20415、Ding, Z.C., et al. （2012） Blood 120:2229-2239、Chiu, Y.L., et al. （2014） J. Clin. Invest. 124:198-208、Franzese, O., et al. （2016） Oncoimmunology 5:e1114203）。MVR-CARとDRweak-HLA-DRとの間の弱い相互作用を考慮すると、たとえMVR-CAR T細胞がEBV-LCL上のDRweak-HLA-DRを認識した後に適正に増殖したとしても、それがT細胞機能にとって十分であるかどうかは不確かであった。
【０２２３】
多機能性（すなわち同時に起こる脱顆粒ならびにサイトカインおよび/またはケモカイン分泌）を評価するために、MVR-CAR T細胞を、EBV-LCLと6時間共培養した後に、5種の異なるマーカー、すなわちIFN-γ、TNF、IL-2、MIP-1βおよびCD107aの同時発現について評価した（図10）。DRstr-EBV-LCLと共培養した場合、2種以上の多機能性マーカーを持つMVR-CAR T細胞の比率は、CD4＋ T細胞およびCD8＋ T細胞において、CD19-CAR T細胞の場合と同様であった（2種以上のマーカーの頻度;CD4＋ MVR-CAR T＝71.3％、CD4＋ CD19-CAR T＝63.6％、CD8＋ MVR-CAR T＝29.4％、CD8＋ CD19-CAR T＝24.6％;図6bおよび図10）。興味深いことに、DRweak-EBV-LCLとの共培養は、CD4＋ T細胞およびCD8＋ T細胞においてMVR-CAR T細胞の多機能性応答を誘導した。注目すべきことに、CD4＋ MVR-CAR T細胞の多機能性能はCD19-CAR T細胞のそれより低く、一方、CD8＋集団はそうではなかった（2種以上のマーカーの頻度;CD4＋ MVR-CAR T＝31.6％、CD4＋ CD19-CAR T＝65.1％、CD8＋ MVR-CAR T＝26.3％、CD8＋ CD19-CAR T＝25.4％）。要約すると、これらのデータは、DRweak-EBV-LCLが、MVR-CAR T細胞の免疫活性化の閾値を超えるのに十分なシグナルを与えうることを支持している。
【０２２４】
CAR T細胞の重要な機能はターゲット細胞の細胞死を誘導することである。本発明者らは、EBV LCLに対してDRweak MVR CAR T細胞の細胞傷害性死滅効力を評価した。DRweak MVR CAR T細胞は、CD19 CAR T細胞による死滅と同様のDRweak EBV LCLの用量依存的死滅を呈し、一方、それらはDRstr EBV LCLをCD19 CAR T細胞より効率よく死滅させた（図6c）。EBV LCLと活性化T細胞はどちらもDRweak HLA-DRを発現するけれども、DRweak MVR CAR T細胞の初期拡大時に観察された限定的フラトリサイド（図4A）によれば、DRweak HLA-DRとMVR CARとの間の低いアフィニティーを利用することで、EBV LCLと活性化T細胞とは区別できることを、これらの結果は示している。
【０２２５】
CD19 CAR T細胞は、CD19 CAR T細胞が注入された患者において、B細胞形成不全などのオンターゲットオフ腫瘍毒性を引き起こす。DRweak MVR CAR T細胞のオンターゲットオフ腫瘍死滅効力を評価するために、本発明者らは、B細胞とEBV LCLに対する細胞傷害性を同時に評価するためのインビトロオンターゲット死滅アッセイを設計した。CD19 CAR T細胞とDRweak MVR CAR T細胞はそれぞれの死滅効力と一致して、DRstrおよびDRweak EBV LCLに対する細胞傷害活性を示した（図9B）。驚くべきことに、DRweak B細胞は、DRweak MVR CAR T細胞による影響を受けなかったのに対して、DRstr B細胞は死滅した。フラトリサイド選択およびCARダウンレギュレーションがDRweak MVR CAR T細胞の死滅選択性に影響を与えたかどうかを決定するために、本発明者らは、形質導入後2日目および12日目（それぞれ図7CのD2およびD12 MVR CAR T）に、DRweak MVR CAR T細胞を、インビトロオンターゲット死滅アッセイに供した。D2 MVR CAR T細胞は、DRweak B細胞とDRweak EBV LCLのどちらに対しても、D12より有意に高い死滅活性を呈したことから（独立両側t検定;LCL、p＝0.0050;B細胞、p＝0.0285;図9A）、フラトリサイド選択およびCARダウンレギュレーションが細胞傷害性閾値を調節したことが示された。総合すると、これらの観察結果は、DRweak MVR CAR T細胞がDRweak EBV LCLによって活性化され、DRweak EBV LCLを選択的に死滅させることを示唆しており、この死滅はMVR CARのダウンレギュレーションによってさらに改良される。表面CARのダウンレギュレーションはフラトリサイド選択中に自律的に起こり、最終的には感度調整をもたらす。場合により、本発明者らは、このプロセスを「自己調整（autotuning）」という。このように、フラトリサイド選択およびCARダウンレギュレーションを受けるHLA-DR CAR T細胞は、悪性細胞を特異的に標的として死滅させることができる。
【０２２６】
実施例4-特異的ターゲティングは抗原レベルおよびCARレベルに依存する
この実施例では、本開示の例示的HLA-DR CAR T細胞が呈する悪性細胞への特異的ターゲティングの性質の特徴づけについて述べる。DRweak B細胞は、2日間培養したHLA-DR CAR T細胞（D2、「未調整」）と共培養した場合に、12日間培養したHLA-DR CAR T細胞（D12、「自己調整済」）と共培養した場合よりも、細胞死を起こしやすかった（図7Cおよび図9A）。しかし、細胞死の程度は依然として、DRweak EBV LCLのそれよりは低かった。これは、別の因子が、DRweak MVR CAR T細胞によって誘導される細胞傷害性に対するDRweak EBV LCLの感受性を高めていることを示している。考えうる因子の1つはデス受容体の存在である。EBV LCLは、FasLおよびTRAILへの結合後に細胞死を誘導するFasおよびTRAIL-R2を発現するからである（Xiang, Z. et al. （2014） Cancer Cell 26:565-576）。この効果を分析するために、遮断剤を使って、細胞傷害性死滅の4つの主要経路（FasL、TRAIL、パーフォリン1およびグランザイムB）（Martinez-Lostao, L., et al., （2015） Clin. Cancer. Res. 21:5047-5056）を遮断し、CAR T細胞の死滅効力を評価した。遮断剤による死滅の阻害はDRweak MVR CAR T細胞とCD19 CAR T細胞との間で相違しなかった。FasLおよびTRAILの遮断は、死滅効力に対してほとんどまたは全く効果がなく、一方、パーフォリン1またはグランザイムBの阻害は、死滅効力を15〜20％低減させた（掲載なし）。これは、DRweak EBV LCLの細胞死には、デス受容体媒介経路ではなく主に細胞溶解性顆粒媒介経路が関与することを示唆している。
【０２２７】
細胞傷害性死滅に対するDRweak EBV LCLの感受性を高める因子としてもう1つ考えうるのは、HLA-DRのアップレギュレーションである（Zhang, Q. et al. （1994） Eur. J. Immunol. 24:1467-1470）。ターゲット抗原レベルの増加はCAR T細胞による死滅効率を向上させるからである（Caruso, H.G. et al. （2015） Cancer Res. 75:3505-3518、Liu, X. et al. （2015） Cancer Res. 75:3596-3607）。そこで本発明者らは、B細胞およびEBV LCLの表面でのCD19およびHLA-DRの発現の変化を調べた。試験したすべてのドナーにおいて、HLA-DRはEBVによる形質転換後にアップレギュレートされ（B細胞＝42,590±2,458、EBV LCL＝78,513±8,963、平均±s.e.m.、n＝6）、一方、CD19は4人のドナーではダウンレギュレートされ、2人のドナーでのみアップレギュレートされた（図9I）。DRweak MVR CAR T細胞のDRweak EBV LCL特異的死滅への、DRweak HLA-DRアップレギュレーションの寄与を調べるために、本発明者らは、DRweak HLA-DRがアップレギュレートされたB細胞の、死滅に対する感受性を評価した。リポ多糖で刺激された末梢血単核球（PBMC）中に存在するB細胞は、刺激されていないPBMC中のB細胞よりも、高レベルのHLA-DRを発現した（図9D）。B細胞上のHLA-DR発現は刺激の2〜3日後にピークに達し、そのピークレベルはEBV LCLのものと類似していた（リポ多糖刺激B細胞2日目＝86,383±7,217、3日目＝82,945±6,395、平均±s.e.m.、n＝6）。本発明者らは、リポ多糖で3日間刺激されたDRweak PBMCを、死滅アッセイにおけるターゲット細胞として使用すると共に、自己調整済MVR CAR T細胞および未調整MVR CAR T細胞（CAR発現の差は5.6倍）をエフェクター細胞として使用した（図9E、自己調整済＝124,854±2,531、未調整＝698,123±7,458、平均±s.e.m.、n＝4）。リポ多糖で刺激されたDRweak B細胞は、DRweak MVR CAR T細胞誘導死滅に対する感受性が、無刺激のDRweak B細胞よりも高かった（図9E）。さらにまた、未調整DRweak MVR CAR T細胞は、自己調整済細胞よりも死滅効率が高かった。これらの観察結果は、自己調整とHLA-DRアップレギュレーションがどちらも細胞傷害性死滅の増加に寄与していることを示している。
【０２２８】
少なくとも8日間（例えば12日間）培養したHLA-DR CAR T細胞は、強化されたMVR-CAR T細胞の正常/悪性選択性を呈し（図9A）、選択性の原因が自己調整だけにあると考えることには疑問が残る。そこで本発明者らは、ターゲット細胞表面上のHLA-DRの定量的変化を調べることにした。6人の健常ドナーからのPBMCを使ってEBV-LCLを作製して、EBV形質転換中のCD19およびHLA-DRの表面発現の変化を評価した。EBV-LCLは、約2倍のレベルを呈した2人を除いて、正常B細胞と同等かそれ以下のCD19レベルを示した（図9I）。興味深いことに、HLA-DRの量は6人すべてのドナーにおいてEBV形質転換後にアップレギュレートされ、注目すべきことに、DRweak-EBV-LCLではDRweak-B細胞の約2倍であった。前述のとおり、本発明者らは、MVR-CARのアフィニティーが弱い場合には、結合量が免疫シナプスの強さならびに結果として生じるポア形成および顆粒移動率を決定づけると考えた。この仮説を検証するために、CAR T細胞と正常B細胞およびEBV-LCLとの接触後に、移動した顆粒を測定した（図9J）。興味深いことに、MVR-CARは、正常DRweak-B細胞には顆粒を移動させず、一方、DRstr-B細胞では強い顆粒移動率が見られた（図9Fおよび図9K）。これに対して、DRweak-EBV-LCLはMVR-CAR T細胞との接触に続いて顆粒移動率の増加を示し、DRstr-EBV-LCLは2〜3倍高い顆粒移動率を呈して（図9Fおよび図9L）、先の死滅効力データ（図6cおよび図6d）と合致した。
【０２２９】
強いTCRシグナルはT細胞からターゲット細胞への活発な顆粒移動を誘導する30、31。したがって、MVR CARによる顆粒移動の程度はMVR CAR-HLA-DR相互作用の強さに依存しうる。本発明者らは、CAR T細胞とB細胞またはEBV LCLとの間の接触後に経時的に移動する顆粒の量を測定した。B細胞またはEBV-LCLのどちらか一方と各Violet標識T細胞とを、2:1のE:T比で表示の時間、共インキュベートしてから、図9Jのように測定される移動した顆粒の定量を行うために、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析を行った。DRweak MVR CAR T細胞との接触後90分にわたってDRweak B細胞への測定可能な顆粒の流入がなかったのに対し、DRweak EBV LCLへの顆粒の流入は容易に検出され、経時的に増加した。対照的に、DRstr B細胞およびDRstr EBV LCLへの顆粒の流入は、DRweak MVR CAR T細胞との接触後、急速に起こり、CD19 CAR T細胞の場合より2〜4倍大きかった（図9F）。
【０２３０】
T細胞から移動した溶解性顆粒は、ターゲット細胞のアポトーシスを活発に誘導する32。CAR T細胞と接触したカスパーゼ3/7活性化EBV LCLのタイムラプスイメージングは、CD19 CAR T細胞およびDRweak MVR CAR T細胞が、アポトーシスDRstrおよびDRweak EBV LCLの比率を次第に増加させることを明らかにした（図9Gおよび図9H）。相互作用の動態がグランザイム流入の動態と類似していたことから、顆粒移動はDRweak MVR CAR T細胞が誘導する細胞傷害性の主因であることが示唆された。全体として、これらのデータは、自己調整済DRweak MVR CAR T細胞はDRweak HLA-DRのレベルを感知して、溶解性顆粒移動によるターゲット細胞の死を誘導することを示唆している。
【０２３１】
実施例5-MVR CAR T細胞は、インビボで、強化されたHLA-DRレベルを感知する
この実施例では、動物モデルにおける本開示の例示的HLA-DR CAR T細胞のインビボ活性について述べる。DRweak EBV LCL異種移植C;129S4-Rag2tm1.1FlvIl2rgtm1.1Flv/JマウスへのDRweak MVR CAR T細胞の移入は、EBV LCLが誘導する腫瘍の抑制をもたらした（図12Aおよび図12B）。その効力は、CD19 CAR T細胞の方が、DRweak MVR CAR T細胞より高いように見えたが、その差は有意ではなかった（二元配置ANOVA;p＝0.5175）。生理的条件下でのDRweak MVR CAR T細胞の、抗原量に基づくターゲット細胞選択性を確認するために、本発明者らはインビボオンターゲット死滅アッセイを設計した。このアッセイにおいて、本発明者らは、DRweak B細胞およびDRweak EBV LCLが移植されたマウスを使用した。これにより、CAR T細胞注入マウスにおける2種の細胞集団の根絶率を観察することが可能になった（図12C）。予想どおり、DRweak MVR CAR T細胞またはCD19 CAR T細胞を注入したマウスでは腫瘍の退行が観察されたが、NT T細胞を注入したマウスでは観察されなかった（図12D）。注目すべきことに、DRweak MVR CAR T細胞注入マウスでは末梢血DRweak B細胞が残留したのに対し、CD19 CAR T細胞注入マウスでは大半のDRweak B細胞が2日以内に排除された（図12Eならびに図12Faおよび図12Fb）。本発明者らは、腫瘍抑制が活発であるT細胞注入の7日後まで、DRweak MVR CAR T細胞を注入したマウスとCD19 CAR T細胞を注入したマウスとの間で、DRweak B細胞数に相違を観察した。興味深いことに、DRweak MVR CAR T細胞注入マウスからの残存DRweak B細胞によるHLA-DRの発現は、NT T細胞注入マウスによるものより低かったことから（図12Fc）、インビトロで観察されたとおり（図9Dおよび図9E）、異種反応（xeno-reaction）によって活性化されたHLA-DRアップレギュレートDRweak B細胞は、インビボで、DRweak MVR CAR T細胞誘導細胞傷害性に対する感受性が増加していることが示唆された。加えて、DRweak MVR CAR T細胞注入マウスの血漿中IFN-γレベルはCD19 CAR T細胞注入マウスのそれより低く（図12E）、インビトロ結果と合致した（図6bおよび図10b）。総合すると、これらのデータは、DRweak MVR CAR T細胞がDRweak HLA-DRレベルを感知することを示すインビトロ結果を、生理学的条件下で裏付けている。
【０２３２】
以上、実施例を参照して本発明を説明したが、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、本発明をさまざまな形態で改変および変更しうることは、当業者であれば理解することができる。
【０２３３】
等価物
本明細書に記載した本発明の具体的態様の数多くの等価物は、当業者にはわかるか、せいぜい日常的な実験を使って確かめることができるであろう。本発明の範囲を上記の説明に限定する意図はなく、むしろ本発明の範囲は特許請求の範囲に示すとおりである。
【図１】
2020508080.tif 000010
【図２Ａ】
2020508080.tif 000011
【図２Ｂ】
2020508080.tif 000012
【図３】
2020508080.tif 000013
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2020508080.tif 000016
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
2020508080.tif 000027
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
2020508080.tif 000038
【図１０Ａ】
2020508080.tif 000039
【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
2020508080.tif 000046
【図１２Ｆ−１】
2020508080.tif 000047
【図１２Ｆ−２】
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【図１３】
2020508080.tif 000049
【図１４】
2020508080.tif 000050
【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月19日(2019.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020508080000001.app
【国際調査報告】
2020508080.tif 000052
2020508080.tif 000053
2020508080.tif 000054
2020508080.tif 000055