(57)【要約】  対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法が開示される。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定することを含む。本方法はまた、対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量に基づいて判定することを含む。
2020515827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）もしくは耐糖能障害（ＩＧＴ）に罹患しているか、又は２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）もしくは耐糖能障害（ＩＧＴ）に罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法であって、
対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定すること、及び
対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量に基づいて判定すること
を含む、上記方法。
【請求項２】
イミダゾールプロピオン酸の量を決定することが、対象からの体液サンプルにおける、好ましくは、対象からの血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、尿サンプル及び便サンプルからなる群から選択される体液サンプルにおける、より好ましくは、対象からの血液サンプル、血漿サンプル及び血清サンプルからなる群から選択される体液サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イミダゾールプロピオン酸の量を決定することが、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の濃度を決定することを含み、かつ、
対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定することが、
イミダゾールプロピオン酸の濃度を１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内の閾値濃度と比較すること、及び
イミダゾールプロピオン酸の濃度が閾値濃度以上であるならば、該対象は２型糖尿病に罹患している、又は２型糖尿病に罹患する危険性を有していると判定すること
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
身体サンプルにおけるウロカニン酸の量を決定することをさらに含み、対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定することが、対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量及びウロカニン酸の決定された量に基づいて、好ましくは、イミダゾールプロピオン酸の決定された量と、ウロカニン酸の決定された量との間における比に基づいて判定することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定することが、
比を０．１５〜０．３２５の区間の範囲内の閾値比と、好ましくは０．１７〜０．３の区間の範囲内の閾値比と、より好ましくは０．２〜０．３の区間の範囲内の閾値比と比較すること、及び
比が閾値比以上であるならば、該対象は２型糖尿病に罹患している、又は２型糖尿病に罹患する危険性を有していると判定すること
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）もしくは耐糖能障害（ＩＧＴ）に罹患しているか、又は２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）もしくは耐糖能障害（ＩＧＴ）に罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法であって、
対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸産生細菌の量を決定すること、及び
対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸産生細菌の決定された量に基づいて判定すること
を含む、上記方法。
【請求項７】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法であって、
薬剤が、少なくとも１つのウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路を阻害し得るかどうかを判定すること、及び
薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の少なくとも１つを阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、上記方法。
【請求項８】
薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がウロカニン酸レダクターゼを阻害し得るかどうかを、好ましくは、ウロカニン酸レダクターゼによるウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換を阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がウロカニン酸レダクターゼを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、ウロカニン酸レダクターゼによるウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換を阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得るかどうかを、好ましくは、ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンのウロカニン酸への転換を阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンのウロカニン酸への転換を阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを、好ましくは、セクエストソーム−１（ｐ６２）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ−１（Ｓ６Ｋ１）、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、及びｐ３８γ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、ｐ６２、Ｓ６Ｋ１、ＩＲＳ１、ＰＫＢ、及びｐ３８γ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを、好ましくは、セクエストソーム−１（ｐ６２）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ−１（Ｓ６Ｋ１）、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、及びｐ３８δ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、ｐ６２、Ｓ６Ｋ１、ＩＲＳ１、ＰＫＢ、及びｐ３８δ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤が代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路を阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤が代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路を阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法であって、
薬剤を、ヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルに加えること、
インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量を測定すること、及び
薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量に基づいて、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、上記方法。
【請求項１４】
薬剤を加えることが、２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患している対象からの便のアリコートが接種されるインビトロ模擬ヒト腸モデルに薬剤を加えることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することが、
イミダゾールプロピオン酸の量を、ヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を薬剤添加後に受けた参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と比較すること（ただし、参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルはウロカニン酸レダクターゼ産生細菌をどれも欠いており、又は、正常な耐糖能を有する対象からの便のアリコートが接種される）、及び
薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸の参照量との比較に基づいて、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することが、
イミダゾールプロピオン酸の量を、薬剤の非存在下であることを除いてヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と比較すること、及び
薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸の参照量との比較に基づいて、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
インビトロ模擬ヒト腸モデルにおいて蓄積されるウロカニン酸の量を測定することをさらに含み、薬剤を、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することが、薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量及びウロカニン酸の量に基づいて、好ましくは、イミダゾールプロピオン酸の量と、ウロカニン酸の量との比に基づいて、２型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのウロカニン酸レダクターゼ阻害剤。
【請求項１９】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤。
【請求項２０】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤。
【請求項２１】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ｐ３８γマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害剤。
【請求項２２】
１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｐ−トリル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）ナフタレン−１−イル］尿素（ＢＩＲＢ７９６）、ピルフェニドン及びＲＮＡｉ分子からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のためのｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤。
【請求項２３】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ｐ３８δマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害剤。
【請求項２４】
１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｐ−トリル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）ナフタレン−１−イル］尿素（ＢＩＲＢ７９６）及びＲＮＡｉ分子からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用のためのｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤。
【請求項２５】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、代替ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化経路の阻害剤。
【請求項２６】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ラパマイシン標的タンパク質複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の阻害剤。
【請求項２７】
ラパマイシン、エベロリムス、ＡＺＤ８０５５、テムシロリムス、ＰＰ２４２（トルキニブ）、トリン１及びＷＹＥ−１２５１３２からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のためのｍＴＯＲＣ１の阻害剤。
【請求項２８】
２型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのイミダゾールプロピオン酸誘導体。
【請求項２９】
クロロイミダゾールプロピオン酸である、請求項２８に記載の使用のためのイミダゾールプロピオン酸誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、一般には代謝性障害、具体的には２型糖尿病及び耐糖能障害、ならびにそのような代謝性障害の診断及び処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝性障害、例えば、肥満、糖尿病及び心臓血管疾患などには、腸内微生物叢の変化した構成及び機能が伴っており、最近のデータは、腸内微生物叢が、摂った食事に対する代謝応答における変動の一因であることを示唆する。腸内微生物叢に対する食事介入の影響を評価する研究はほとんどがこれまで、細菌発酵のための前駆体であって、改善された代謝に関連する代謝産物（例えば、短鎖脂肪酸など）をもたらす食物繊維に集中している。さらに、最近の研究では、トリメチルアミン（ＴＭＡ）Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）が、マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の一因である微生物叢依存性の代謝産物として特定されている。ＴＭＡＯは、微生物のＴＭＡリアーゼと、宿主肝臓のフラビンモノオキシゲナーゼとを伴う２段階プロセスで、食事性の前駆体であるコリン、ホスファチジルコリン及びカルニチンから形成される。微生物のＴＭＡリアーゼをアテローム性動脈硬化症に対する可能性のある治療取り組みとして阻害する試みが現在、進行中である。
【０００３】
腸内微生物叢は非常に大きい影響をアミノ酸代謝に及ぼしており、そして、アミノ酸由来のシグナル伝達分子（例えば、神経伝達物質及びセロトニンなど）のレベルを調節することができるにもかかわらず、微生物産生されたアミノ酸代謝産物の宿主代謝への寄与には、議論の余地がある。腸内微生物叢が肥満又はインスリン抵抗性の個体においては分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の増大した循環濃度の一因であることが報告されており、しかし、いくつかの研究では、改善された代謝的健康状態が食事性ＢＣＡＡ補給の後で明らかにされている。今日に至るまで、微生物叢依存性のアミノ酸由来代謝産物が代謝性障害の一因であることを示す直接的証拠は得られていない。
【発明の概要】
【０００４】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）もしくは耐糖能障害（ＩＧＴ）に罹患している、又は２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）もしくは耐糖能障害（ＩＧＴ）に罹患する危険性を有している対象を特定することが、一般的な目的である。
【０００５】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定し、使用することが、別の一般的な目的である。
【０００６】
これらの目的及び他の目的が、本明細書中において開示される実施形態によって満たされる。
【０００７】
開示される実施形態の１つの局面が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定することを含む。本方法はまた、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量に基づいて判定することを含む。
【０００８】
開示される実施形態の１つの局面が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸産生細菌の量を決定することを含む。本方法はまた、対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸産生細菌の決定された量に基づいて判定することを含む。
【０００９】
開示される実施形態の別の局面が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法に関する。本方法は、薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路のうちの少なくとも１つを阻害し得るかどうかを判定することを含む。本方法はまた、薬剤を、前記薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路のうちの少なくとも１つを阻害し得ると判定されるならば、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００１０】
開示される実施形態のさらなる局面が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法に関する。本方法は、ヒスチジン及び／又はウロカニン酸（ｕｒｏｃａｎａｔｅ）による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルに薬剤を加えることを含む。本方法はまた、インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量を測定することを含む。本方法はさらに、薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量に基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００１１】
開示される実施形態のさらに別の局面が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止する、抑制する、又は処置する方法に関する。本方法は、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤からなる群から選択される阻害剤の効果的な量を対象に投与することを含む。
【００１２】
開示される実施形態のさらなる局面には、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおける使用のためのウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、ラパマイシン標的タンパク質複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の阻害剤、及び／又はイミダゾールプロピオン酸誘導体が含まれる。
【００１３】
開示される実施形態は、微生物産生されたイミダゾールプロピオン酸が、インスリンのシグナル伝達を、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴに罹患しているヒトにおいて、代替ｐ３８  ＭＡＰＫを活性化することによって損なうことを示す実験結果に基づいている。
【００１４】
開示される実施形態はそのさらなる目的及び利点と共に、添付の図面と一緒になる以下の説明を参照することによって最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】イミダゾールプロピオン酸が２型糖尿病罹患の個体では増大し、微生物により調節される。図１ａ、ＧＦマウス及びＣＯＮＶＲマウスの門脈血及び大静脈血におけるイミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）及びグルタミン酸の相対的レベル（ｎ＝６／群）。図１ｂ、ＢＭＩが一致する２型糖尿病非罹患の肥満被験者（非Ｔ２Ｄ、ｎ＝１０）又はＴ２Ｄ罹患の肥満被験者（ｎ＝５）におけるＩｍＰの門脈レベル及び末梢レベル。図１ｃ、Ｔ２Ｄを有しないヒトからの便が接種される場合（左側パネル）、又はＴ２Ｄを有するヒトからの便が接種される場合（右側パネル）のインビトロ腸シミュレーターにおける１０ｍＭヒスチジンからのウロカニン酸及びＩｍＰの産生。図１ｄ、正常な耐糖能（ＮＧＴ）を有するヒト、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）を有するヒト、耐糖能障害（ＩＧＴ）を有するヒト、及び処置未経験のＴ２Ｄを有するヒトにおけるＩｍＰ又はウロカニン酸の末梢レベル。図１ｅ、Ｔ２Ｄ非罹患被験者からの便（ｎ＝５）、及びＴ２Ｄ罹患被験者からの便（ｎ＝５）を使用する回分培養実験における１０ｍＭヒスチジンからのＩｍＰ産生の終点測定。データは、０時間と比較しての３６時間におけるＩｍＰ産生のｌｏｇ変換された変化倍数として示される。図１ｆ、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の予測、及びヒスチジン又はウロカニン酸を基質として使用する実験的検証。ブランクサンプルと比較してのｌｏｇ変換された変化倍数として示されるＩｍＰ産生。図１ａ、図１ｂ及び図１ｄにおけるデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。反復測定による二元配置ＡＮＯＶＡ（図１ａ、図１ｂ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ウィルコクソン順位和検定（図１ｄ）；ウィルコクソン片側検定（図１ｅ）。
【図２】ヒスチジン分解産物としてのイミダゾールプロピオン酸。図はヒスチジン分解経路を示す。
【図３】イミダゾールプロピオン酸は耐糖能及びインスリンシグナル伝達を損なう。図３ａ、イミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）及びウロカニン酸の循環レベル。図３ｂ、腹腔内グルコース負荷試験。図３ｃ、ビヒクル（１％ＤＭＳＯ水溶液；ｎ＝４）又はＩｍＰ（５００μｇ；ｎ＝５）の３日間にわたる１日に２回の腹腔内注射の後でのＧＦマウスにおける糖生成及び脂肪生成に関与する遺伝子の発現。図３ｄ、インスリンシグナル伝達成分に対するビヒクル又はＩｍＰ（５００μｇを１日に２回）による３日間の処置の影響を示す、ＧＦマウスからの肝臓溶解物の免疫ブロット。図３ｅ、初代肝細胞におけるインスリン刺激されたＩＲＳチロシンリン酸化及びＡｋｔ活性化［基礎時及びインスリン（５ｎＭ）刺激時］に対するＩｍＰ（１００μＭ、８時間）の影響。図３ｆ、ビヒクル（１％ＤＭＳＯ水溶液；ｎ＝４）又はＩｍＰ（１００μｇ；ｎ＝４）の３日間にわたる１日に２回の腹腔内注射の後でのＣＯＮＶＲマウスにおけるＩｍＰ及びウロカニン酸の血漿中レベル。図３ｇ、ビヒクル（ｎ＝６）又はＩｍＰ（１００μｇ；ｎ＝５）が注射されるＣＯＮＶＲマウスにおける腹腔内グルコース負荷試験。図３ｈ、初代肝細胞におけるＩＲＳタンパク質レベルに対するＩｍＰ（１００μＭ、２０時間）の影響（ｎ＝７）。図３ａ〜図３ｃにおけるデータは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。対応のない両側スチューデントｔ検定。図３ｆにおけるデータはボックスプロットとして示され、最小値、２５％四分位値、中央値、７５％四分位値及び最大値を示す。反復測定による二元配置ＡＮＯＶＡ、それに引き続いてのシダクの多重比較検定（図３ｆ）、及び対応のない両側スチューデント検定（図３ｅ、図３ｇ、図３ｈ）。
【図４】イミダゾールプロピオン酸はＧＦマウスにおいてＩｒｓのｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさない。ビヒクル（１％ＤＭＳＯ水溶液；ｎ＝４）又はイミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）（５００μｇ；ｎ＝５）の３日にわたる１日に２回の腹腔内注射の後でのＧＦマウスの肝臓におけるＩｒｓ−１及びＩｒｓ−２のｍＲＮＡレベル。
【図５】イミダゾールプロピオン酸によるＪＮＫ非依存的なＩＲＳ低下。初代肝細胞をＪＮＫ阻害剤のＳＰ６００１２５（２０μＭ）又はＢＩ７８Ｄ３（２０μＭ）の非存在下又は存在下においてＩｍＰ（１００μＭ）と２４時間インキュベーションし、その後、インスリン（５ｎＭ）により５分間にわたって刺激した。
【図６】イミダゾールプロピオン酸は、リソソームにおけるアミノ酸感知経路を介してｍＴＯＲＣ１を活性化する。図６ａ、ラパマイシン（２０ｎＭ）は初代肝細胞においてＩＲＳ及びｐＳ６Ｋ１に対するイミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）（１００μＭ、２４時間）の影響を阻害する。図６ｂ、ビヒクル又はＩｍＰ（５００μｇを１日に２回）による３日間の処理は、ｍＴＯＲ  Ｓ２４８１ではなく、ｐＳ６Ｋ１のリン酸化を増大させることを示すＧＦマウスからの肝臓溶解物の免疫ブロット。図６ｃ、図６ｄ、アミノ酸欠乏させた初代肝細胞（図６ｃ）及びＨＥＫ２９３細胞（図６ｄ）におけるｐＳ６Ｋ１に対するＩｍＰ（１００μＭ）の迅速な影響。図６ｅ、インスリン（５ｎＭ）と示された時間にわたってインキュベーションされるアミノ酸欠乏ＨＥＫ２９３細胞におけるインスリンシグナル伝達成分に対するＩｍＰ（１００μＭ）による２時間及び８時間の前処理の影響。図６ｆ、ｍＴＯＲのリソソーム局在化を示す、ＩｍＰとインキュベーションされ（１００μＭ、１時間）、ｍＴＯＲ及びＬＡＭＰ２について共免疫染色されるアミノ酸欠乏ＨＥＫ２９３細胞の画像。スケールバー、１０μｍ。図６ｇ、ＩｍＰは、活性なｐ６２／Ｒａｇ／ＧＴＰアーゼ／ｍＴＯＲＣ１複合体の形成を誘発した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＬＡＧ  ｍＴＯＲ、ＨＡ  Ｒａｐｔｏｒ、及びＭｙｃ  Ｒａｇ  ＧＴＰアーゼにより２４時間コトランスフェクションし、アミノ酸の非存在下においてＩｍＰ（１００μＭ）と１時間インキュベーションした。ＩＰ：免疫沈殿物、ＴＣＬ：全細胞溶解物。図６ｈ、ＩｍＰ誘発のｍＴＯＲＣ１活性化におけるＲａｇ  ＧＴＰアーゼの関与。ＨＥＫ２９３細胞を指示されるようなＭｙｃタグ化構築物により２４時間トランスフェクションし、アミノ酸の非存在下において１００μＭのＩｍＰと１時間インキュベーションした。図６ｉ、ラパマイシン（２０ｎＭ）又はトリン（ｔｏｒｉｎ）１（５０ｎＭ）は初代肝細胞においてＩＲＳ及びｐＳ６Ｋ１に対するイミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）（１００μＭ、１５時間）の影響を阻害する（ｎ＝２）。
【図７】イミダゾールプロピオン酸媒介のシグナル伝達は、代替ｐ３８  ＭＡＰＫに依存している。図７ａ、初代肝細胞におけるｐ６２リン酸化（Ｔ２６９及びＳ２７２）に対する２４時間にわたるイミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）（１００μＭ）及びラパマイシン（２０ｎＭ）の影響。図７ｂ、アミノ酸欠乏ＨＥＫ２９３細胞におけるインスリンシグナル伝達成分に対する（示された濃度での）ＩｍＰによる１時間及び２時間の前処理の影響。図７ｃ、アミノ酸欠乏ＨＥＫ２９３細胞におけるｐ６２リン酸化（Ｔ２６９及びＳ２７２）及びＩＲＳ１に対する、ＩｍＰ、ヒスチジン、ウロカニン酸、グルタミン酸又はインドールプロピオン酸（１００μＭ、１時間）の影響。図７ｄ、ＩｍＰ（１００μＭ、１時間）とインキュベーションされるアミノ酸欠乏ＨＥＫ２９３細胞におけるｐ６２のリン酸化（Ｔ２６９及びＳ２７２）及びＳ６Ｋ１のリン酸化に対する、ＢＩＲＢ７９６（１０μＭ）、ＳＢ２０２１９０（１０μＭ）又はラパマイシン（１００ｎＭ）による３０分間の前処理の影響。図７ｅ、ＩｍＰ誘発のシグナル伝達に対する、代替ｐ３８ノックダウンの影響。ＨＥＫ２９３細胞を、コントロールｓｉＲＮＡ（ｃｏｎ  ｓｉＲＮＡ）、ｐ３８δ  ｓｉＲＮＡ２、又はｐ３８γ  ｓｉＲＮＡ１により２４時間トランスフェクションし、アミノ酸の非存在下においてＩｍＰ（１００μＭ）と１時間インキュベーションした。図７ｆ、インビトロキナーゼアッセイ。ｐ３８γ及びｐ６２をプレインキュベーションし、キナーゼ反応を、ＩｍＰの非存在下又は存在下でＡＴＰを加えることによって開始した。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ＩｍＰを伴わないＡＴＰ（５０μＭ）に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。対応のない両側スチューデントｔ検定。図７ｇ、ＩｍＰ誘発のシグナル伝達の概略図。
【図８】ＩｍＰ媒介のシグナル伝達におけるｐ３８γの役割。ＨＥＫ２９３細胞を、コントロールｓｉＲＮＡ（ｃｏｎ  ｓｉＲＮＡ）、ｐ３８δ  ｓｉＲＮＡ、又はｐ３８γ  ｓｉＲＮＡにより２４時間トランスフェクションし、アミノ酸の非存在下においてＩｍＰ（１００μＭ）と１時間インキュベーションした。図８ａ、ｐ３８δに対する２つの異なった非重複ｓｉＲＮＡの、ＩｍＰ誘発のｍＴＯＲＣ１活性化に対する影響。図８ｂ、ｐ３８γに対する２つの異なった非重複ｓｉＲＮＡの、ＩｍＰ誘発のシグナル伝達に対する影響。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態は、一般には代謝性障害、具体的には２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）及び耐糖能障害（ＩＧＴ）、ならびにそのような代謝性障害の診断及び処置に関する。
【００１７】
本発明の実施形態は、Ｔ２Ｄ及びＩＧＴと、これらの疾患の発症の一因であるかもしれない変化した腸内微生物叢との間における関連に基づいている。具体的には、微生物によりアップレギュレーションされたヒスチジン由来代謝産物のイミダゾールプロピオン酸が、Ｔ２Ｄ及びＩＧＴを有する対象では、正常な耐糖能（ＮＧＴ）を有する健康な対象と比較して、より高濃度で存在する。微生物産生されたイミダゾールプロピオン酸はインスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質レベルを低下させ、インスリンシグナル伝達を、ラパマイシン標的タンパク質複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の代替ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化経路を介して損なう。したがって、微生物代謝産物のイミダゾールプロピオン酸がＴ２Ｄ及びＩＧＴの病理発生の一因となっている。
【００１８】
耐糖能障害（ＩＧＴ）は、インスリン抵抗性と、心臓血管病理の増大した危険性とが伴う高血糖症の前糖尿病状態である。ＩＧＴがＴ２Ｄに何年も先行する場合がある。世界保健機関（ＷＨＯ）及び米国糖尿病協会（ＡＡＤ）の基準によれば、ＩＧＴは、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験での１４０〜１９９ｍｇ／ｄｌ（すなわち、７．８〜１１．０ｍｍｏｌ／ｌ）の２時間グルコースレベルとして定義される。２時間後でのグルコースレベルが中程度に上昇しており、しかし、Ｔ２Ｄについて認定されるであろうレベルよりも低いときには、患者は、ＩＧＴの状態にあると言われる。空腹時血糖が正常であるか、又は穏やかに上昇して、典型的には６．１ｍｍｏｌ／ｌ未満であるかのどちらもあり得る。
【００１９】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、２型真性糖尿病とも呼ばれており、高血糖、インスリン抵抗性、及びインスリンの相対的欠乏によって特徴づけられる長期の代謝性障害である。高血糖から生じる長期の合併症には、心臓疾患、脳卒中、糖尿病性網膜症（これは失明をもたらし得る）、腎不全、及び切断を引き起こす場合がある四肢での血流不良が含まれる。
【００２０】
Ｔ２ＤのＷＨＯの定義は、７．０ｍｍｏｌ／ｌ（１２６ｍｇ／ｄｌ）以上の空腹時血糖値、又は、グルコース負荷試験を用いた場合には、１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄｌ）以上の経口投薬後２時間での血漿中グルコースのどちらかの、症状を伴う１回だけの上昇したグルコース読取り、そうでなければ、２回にわたる上昇した値についてである。
【００２１】
下記の表１には、ＷＨＯの糖尿病診断基準が要約される。
【表１】
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【００２２】
本発明の実施形態の１つの局面が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定することを含む。本方法はまた、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量に基づいて判定することを含む。
【００２３】
この実施形態において、対象からの身体サンプルにおいて決定されるようなイミダゾールプロピオン酸の量又は濃度は、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を少なくとも有しているかどうかを判定するために使用される。本明細書中においてさらに示されるように、ＩＧＴ又はＴ２Ｄに罹患している対象は、正常な対象、すなわち、健康な対象と比較して、加えて、ＩＦＧ対象と比較してもまた、イミダゾールプロピオン酸の有意により高い量及び濃度を有する。
【００２４】
それによって、イミダゾールプロピオン酸が、この実施形態においては、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているかもしれない、又はこれらの代謝性障害に罹患する可能性が高い、すなわち、これらの代謝性障害に罹患する危険性を有している個体を特定するためのバイオマーカーとして使用される。
【００２５】
対象は哺乳動物対象であり、好ましくはヒト対象である。しかしながら、本発明の実施形態はまた、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴに罹患しているかもしれない他の哺乳動物対象に対しても適用される場合がある。したがって、本発明の実施形態はまた、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴに罹患している、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有している動物対象を特定するために獣医学目的のために使用することができる。
【００２６】
１つの実施形態において、方法は、いわゆる意思決定支援法、すなわち、非診断法である。このことは、意思決定支援方法により、意思決定支援情報、例えば、中間結果にすぎないイミダゾールプロピオン酸の量又は濃度によって例示されるような意思決定支援情報がもたらされることになることを意味する。さらなるデータ、及び医師又は獣医師の能力が典型的には、最終的な診断を下すために必要である。さらに、イミダゾールプロピオン酸の量とは異なる他のパラメーターが、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴの進行又は発症に影響する場合がある（例えば、対象の病歴、年齢及び性別、遺伝的要因など）。したがって、本実施形態は、医師又は獣医師が、どの対策が採用されなければならないかについての決定の基礎とすることができる意思決定支援を与える。
【００２７】
そのような実施形態において、意思決定支援情報を得る方法が提供される。本方法は、対象からの身体サンプルにおいて決定されるイミダゾールプロピオン酸の量に基づく意思決定支援情報を得ることを含む。
【００２８】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量が対象からの体液サンプルにおいて決定される。そのような体液サンプルの例示的な、しかし、限定されない例には、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、尿サンプル及び便サンプルが含まれる。特定の実施形態において、体液サンプルが、血液サンプル、血漿サンプル及び血清サンプルからなる群から選択される。
【００２９】
身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量は、様々な実施形態に従って決定することができる。特定の実施形態において、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量が、質量分光（ＭＳ）分析を使用して決定される。例えば、体液サンプルは氷冷アセトニトリルにより抽出され、窒素流下で乾燥され得るであろう。体液サンプルはその後、ｎ−ブタノールにおけるＨＣｌ（例えば、５％ＨＣｌなど）により、例えば、７０℃で１時間にわたって再構成され、これにより、ｎ−ブチルエステルが形成させられる場合がある。この誘導体化の後、サンプルはエバポレーションされ、水：アセトニトリル（例えば、９０：１０など）で再構成される場合がある。サンプルはその後、グラジエントを使用して、例えば、Ａ相としての、例えば、０．１％ギ酸を含む水と、Ｂ相としての、例えば、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルとからなるグラジエントなどを使用して、カラム（例えば、Ｃ１８エチレン架橋型ハイブリッド（ＢＥＨ）カラムなど）に注入される場合がある。イミダゾールプロピオン酸がその後、遷移１９７／８１を使用する多重反応モニタリングによって検出される場合がある。
【００３０】
しかしながら、上記実施形態は、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸のＭＳに基づく決定に限定されない。例えば、イミダゾールプロピオン酸に関してのトレーサーを使用する、例えば、イミダゾールプロピオン酸−アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）コンジュゲート又はビオチン化イミダゾールプロピオン酸（これらは、例えば、エルマン試薬、又は基質としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジンを使用することによってそれぞれ検出することができる）などを使用する競合的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。そのような場合、反応後の色の強度が、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量に反比例するであろう。競合的ＥＬＩＳＡにおいては、標識されたイミダゾールプロピオン酸がそれによってトレーサーとして使用される。
【００３１】
実際、体液サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量又は濃度を直接的もしくは間接的に決定するために、又は少なくとも推定するために使用することができる方法又は技術はどれも、上記実施形態に従って使用することができる。
【００３２】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の濃度が身体サンプルにおいて決定される。イミダゾールプロピオン酸の濃度はその後、閾値濃度と比較され、そして、イミダゾールプロピオン酸の濃度が閾値以上であるならば、対象は、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴに罹患していると判定され、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有していると判定される。
【００３３】
１つの実施形態において、閾値濃度は５ｎＭに等しく、例えば、５．１ｎＭなどに等しい。閾値濃度は好ましくは６ｎＭであり、例えば、７ｎＭなどであり、例えば、７．７ｎＭ又は７．８ｎＭである。特定の実施形態において、閾値濃度は８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭであり、例えば、１０．１ｎＭなどである。
【００３４】
実験データは、正常な耐糖能（ＮＧＴ）を有する被験者が９．１ｎＭの平均イミダゾールプロピオン酸濃度（中央値、７．１ｎＭ）を有したこと、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）を有する被験者が９．１ｍＭの平均イミダゾールプロピオン酸濃度（中央値、７．２ｎＭ）を有したこと、ＩＧＴ被験者が１０．５ｎＭの平均イミダゾールプロピオン酸濃度（中央値、７．７ｎＭ）を有したこと、これに対して、Ｔ２Ｄ被験者が２０．１ｎＭの平均イミダゾールプロピオン酸濃度（中央値、１３．８ｎＭ）を有したことを示す。さらに、ＮＧＴ被験者の７５％が１０．７ｎＭ未満のイミダゾールプロピオン酸濃度を有し、ＩＦＧ被験者の７５％が１１．７ｎＭ未満のイミダゾールプロピオン酸濃度を有し、ＩＧＴ被験者の７５％が１３．１ｎＭ未満のイミダゾールプロピオン酸濃度を有し、Ｔ２Ｄ被験者の７５％が１９．１ｎＭ未満のイミダゾールプロピオン酸濃度を有した。
【００３５】
特定の実施形態において、上記方法は、対象がＴ２Ｄに罹患しているか、又はＴ２Ｄに罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法である。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定することを含む。本方法はまた、対象がＴ２Ｄに罹患しているか、又はＴ２Ｄに罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量に基づいて判定することを含む。
【００３６】
上記実施形態に従って決定される、又は測定されるイミダゾールプロピオン酸は好ましくは微生物由来のイミダゾールプロピオン酸であり、具体的には細菌由来のイミダゾールプロピオン酸である。
【００３７】
イミダゾールプロピオン酸の濃度が閾値濃度未満であるならば、対象は好ましくは、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴに罹患していないとして、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する低い危険性を有しているとして判定され、又は特定される。
【００３８】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の濃度はＩＧＴ閾値濃度及びＴ２Ｄ閾値濃度と比較される。そのような場合、方法は、イミダゾールプロピオン酸の濃度がＩＧＴ閾値濃度以上であり、しかし、Ｔ２Ｄ閾値濃度未満であるならば、対象はＩＧＴに罹患している、又はＩＧＴに罹患する危険性を有していると判定することを含む。それに対応して、方法はまた、イミダゾールプロピオン酸の濃度がＴ２Ｄ閾値濃度以上であるならば、対象はＴ２Ｄに罹患している、又はＴ２Ｄに罹患する危険性を有していると判定することを含む。
【００３９】
この実施形態において、ＩＧＴ閾値濃度はＴ２Ｄ閾値濃度未満である。
【００４０】
１つの実施形態において、ＩＧＴ閾値濃度は５ｎＭに等しく、例えば、５．１ｎＭなどに等しい。ＩＧＴ閾値濃度は好ましくは６ｎＭであり、例えば、７ｎＭなどであり、例えば、７．７ｎＭである。特定の実施形態において、ＩＧＴ閾値濃度は８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭである。
【００４１】
１つの実施形態において、ＩＧＴ閾値濃度は好ましくは７．２ｎＭ以上であり、例えば、９．１ｎＭ以上である。
【００４２】
１つの実施形態において、Ｔ２Ｄ閾値濃度は７ｎＭに等しく、例えば、７．８ｎＭなどに等しい。Ｔ２Ｄ閾値濃度は好ましくは８ｎＭであり、例えば、９ｎＭなどである。特定の実施形態において、Ｔ２Ｄ閾値濃度は、ＩＧＴ閾値濃度＜Ｔ２Ｄ閾値濃度という条件で、１０ｎＭであり、例えば、１０．１ｎＭなどであり、好ましくは１１ｎＭであり、より好ましくは１２ｎＭである。
【００４３】
１つの実施形態において、Ｔ２Ｄ閾値濃度は９．１ｎＭを超えており、しかし、好ましくは２０．１ｎＭ未満である。より好ましくは、Ｔ２Ｄ閾値濃度は１０．７ｎＭを超えており、好ましくは１９．１ｎＭ未満であり、例えば、１３．８ｎＭ未満などである。したがって、Ｔ２Ｄ閾値濃度は好ましくは、１０．７から１３．８ｎＭまでの区間の範囲内で選択され、例えば、１０．７５ｎＭ、１１ｎＭ、１１．２５ｎＭ、１１．５ｎＭ、１１．７５ｎＭ、１２ｎＭ、１２．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、１２．７５ｎＭ、１３ｎＭ、１３．２５ｎＭ、１３．５ｎＭ又は１３．７５ｎＭなどである。
【００４４】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量だけではなく、ウロカニン酸の量もまた、身体サンプルにおいて測定される。そのような実施形態において、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有するかどうかの判定は、イミダゾールプロピオン酸の量及びウロカニン酸の量に基づいており、好ましくイミダゾールプロピオン酸の量と、ウロカニン酸の量との間における比又は商に基づく。
【００４５】
したがって、この実施形態において、方法はまた、身体サンプルにおけるウロカニン酸の量を決定することを含む。方法はまた、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかを、イミダゾールプロピオン酸の決定された量と、ウロカニン酸の決定された量との間における比に基づいて判定することを含む。
【００４６】
実験データは、ＮＧＴを有する被験者が０．１４３３の平均イミダゾールプロピオン酸対ウロカニン酸（ＩｍＰ／Ｕｒｏ）比を有したこと、ＩＦＧ被験者が０．１３３５の平均ＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有したこと、ＩＧＴ被験者が０．１６５７の平均ＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有したこと、Ｔ２Ｄ被験者が０．３４１７の平均ＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有したことを示す。さらに、ＮＧＴ被験者の７５％が０．１６７７未満のＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有し、ＩＦＧ被験者の７５％が０．１６４４未満のＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有し、ＩＧＴ被験者の７５％が０．１８３６未満のＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有した。
【００４７】
それに従えば、０．１５〜０．３２５の区間の範囲内で選択されるＩｍＰ／Ｕｒｏ比閾値が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかを判定するために使用され得るであろう。
【００４８】
特定の実施形態において、ＩｍＰ／Ｕｒｏ比閾値が０．１７〜０．３の区間の範囲内で選択され、好ましくは０．２〜０．３の区間の範囲内で選択され、例えば、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９又は０．３などである。０．２〜０．３の範囲内のＩｍＰ／Ｕｒｏ比閾値が、対象がＴ２Ｄに罹患しているか、又はＴ２Ｄに罹患する危険性を有しているかどうかを判定するときには特に好ましい。
【００４９】
身体サンプルが体液サンプル（例えば、血液サンプル、血漿サンプル又は血清サンプルなど）であるならば、比閾値及び閾値の上記値が特に適用可能である。
【００５０】
Ｔ２Ｄ非罹患の肥満被験者からの便、及びＴ２Ｄ罹患の肥満被験者からの便を使用する回分培養実験から得られるＩｍＰ／Ｕｒｏ比の対応する値が、Ｔ２Ｄ非罹患の肥満被験者については３２．１１５２の平均ＩｍＰ／Ｕｒｏ比であり、Ｔ２Ｄ罹患の肥満被験者については４１３．０４９２の平均ＩｍＰ／Ｕｒｏ比である。それに対応して、肥満の非Ｔ２Ｄ被験者の７５％が１．０２５５未満のＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有し、これに対して、肥満のＴ２Ｄ被験者の７５％が６１５．６９９２未満のＩｍＰ／Ｕｒｏ比を有した。
【００５１】
それに従えば、便を使用する回分培養実験のための好適なＩｍＰ／Ｕｒｏ比閾値が、５０〜４００の区間の範囲内で、好ましくは１００〜４００の区間の範囲内で、より好ましくは２００〜４００の区間の範囲内で、例えば、２００〜３００の区間などの範囲内で選択され得るであろう。
【００５２】
ＩｍＰ／Ｕｒｏ比閾値の上記の例は、イミダゾールプロピオン酸の決定された量と、ウロカニン酸の決定された量との間における比又は商を計算することに基づく。比率又は商がその代わりに、ウロカニン酸の決定された量と、イミダゾールプロピオン酸の決定された量との間においてであるならば、すなわち、Ｕｒｏ／ＩｍＰであるならば、好適なＵｒｏ／ＩｍＰ比閾値を、上記の値によって除されるＵｒｏ／ＩｍＰ比閾値として得ることができる。
【００５３】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の決定された量と、ウロカニン酸の決定された量との間における比が、比閾値と比較され、そして、イミダゾールプロピオン酸の決定された量と、ウロカニン酸の決定された量との間における比が閾値比以上であるならば、対象は、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴに罹患していると判定され、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有していると判定される。
【００５４】
この実施形態は、ウロカニン酸の決定された量と、イミダゾールプロピオン酸の決定された量との間における比を計算し、計算された比をＵｒｏ／ＩｍＰ閾値比と比較することと同等である。そのような場合には、計算された比がＵｒｏ／ＩｍＰ閾値比以下である（例えば、Ｕｒｏ／ＩｍＰ閾値比よりも小さい）ならば、対象は、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴに罹患していると判定され、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有していると判定される。
【００５５】
イミダゾールプロピオン酸の量だけではなく、ウロカニン酸の量もまた決定する上記の実施形態は、意思決定支援法（すなわち、非診断法）の前述の実施形態に適用することができる。
【００５６】
特定の実施形態が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴを有しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるかどうかを判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を測定することを含む。本方法はまた、イミダゾールプロピオン酸の濃度がＩＧＴについての閾値濃度以上であり、しかし、Ｔ２Ｄについての閾値濃度未満であるならば、対象はＩＧＴを有している、又はＩＧＴを発症する危険性があると判定すること、ならびに／又は、イミダゾールプロピオン酸の濃度がＴ２Ｄについての閾値濃度以上であるならば、対象はＴ２Ｄを有している、又はＴ２Ｄを発症する危険性があると判定することを含む。
【００５７】
この特定の実施形態の一例において、ＩＧＴについてのイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度は８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭであり、かつ、Ｔ２Ｄについてのイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度は１０ｎＭであり、好ましくは１１ｎＭであり、より好ましくは１２ｎＭであり、例えば、１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内などである。
【００５８】
特定の実施形態において、方法はさらに、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有していると判定される、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があると判定される対象を処置することを含む。対象のこの処置は好ましくは、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せからなる群から選択される阻害剤の効果的な量、ならびに／あるいはイミダゾールプロピオン酸誘導体の効果的な量を対象に投与することを含む。
【００５９】
イミダゾールプロピオン酸はｐ３８  ＭＡＰＫ活性を直接に調節することができる。したがって、イミダゾールプロピオン酸を、ｐ３８  ＭＡＰＫについての阻害剤を特定するための足場として使用することができる。それに従えば、イミダゾールプロピオン酸の細菌標的及び宿主標的の両方の二重標的化が可能である。ウロカニン酸レダクターゼを細菌において標的とする潜在的な阻害剤は、ウロカニン酸又はイミダゾールプロピオン酸の誘導体である。イミダゾールプロピオン酸はｐ３８γキナーゼ活性を直接に促進させることができる。したがって、イミダゾールプロピオン酸に対する構造類似体は潜在的にｐ３８γガンマを競合的様式で阻害することができる。
【００６０】
さらなる特定の実施形態が、対象を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有しているとして、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるとして判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を測定することを含む。この特定の実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量が少なくとも８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭであり、しかし、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１１ｎＭ未満であり、より好ましくは１２ｎＭ未満である場合、対象は、ＩＧＴを有しているとして、又はＩＧＴを発症する危険性があるとして診断され、また、イミダゾールプロピオン酸の量が少なくとも１０ｎＭであり、好ましくは１１ｎＭであり、より好ましくは１２ｎＭである場合、対象は、Ｔ２Ｄを有しているとして、又はＴ２Ｄを発症する危険性があるとして診断され、このことはそれによって、対象を、Ｔ２Ｄを有しているとして、又はＴ２Ｄを発症する危険性があるとして診断する。
【００６１】
特定の実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量が、１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内にあるＩＧＴ濃度閾値を超えるならば、対象は、ＩＧＴを有しているとして、又はＩＧＴを発症する危険性があるとして診断される。
【００６２】
特定の実施形態において、方法はさらに、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有していると判定される、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があると判定される対象を処置することを含む。対象を処置することは好ましくは、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せからなる群から選択される阻害剤の効果的な量、ならびに／あるいは又はイミダゾールプロピオン酸誘導体の効果的な量を対象に投与することを含む。
【００６３】
さらに別の特定の実施形態が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴを有しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるかどうかを判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量に対応するデータ出力を提供するように構成される代謝産物検出装置を使用して決定すること、及び／又は測定することを含む。本方法はまた、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴを有しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるかどうかをデータ出力に基づいて判定することを含む。
【００６４】
特定の実施形態において、代謝産物検出装置は、質量分析計、分光計（例えば、ＥＬＩＳＡに伴う分光計など）、液体クロマトグラフィー装置、ガスクロマトグラフィー装置、気液クロマトグラフィー装置、高速液体クロマトグラフィー装置、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せ（例えば、質量分析計とクロマトグラフィー装置との組合せなど）から選択される。
【００６５】
代謝産物検出装置は１つの実施形態においては、身体サンプルにおけるウロカニン酸の量に対応するデータ出力を提供するためにもまた構成される。代替において、第１の代謝産物検出器が、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量に対応するデータ出力を提供するために構成され、第２の代謝産物検出器が、身体サンプルにおけるウロカニン酸の量に対応するデータ出力を提供するために構成される。
【００６６】
１つの実施形態が、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸産生細菌の量を決定することを含む。本方法はまた、対象が２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は２型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸産生細菌の決定された量に基づいて判定することを含む。
【００６７】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸産生細菌は、アドレルクロイチア属（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デスルファチバシルム属（Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ）、エガセラ属（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される。方法はまた、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴを有しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるかどうかを身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸産生細菌の決定された量及び／又は測定された量に基づいて判定することを含む。
【００６８】
１つの実施形態において、対象がＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患しているか、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴに罹患する危険性を有しているかどうかの判定は、身体サンプルにおけるどのようなＩｍＰ産生細菌であれ、その検出に基づくことができるであろう。別の実施形態において、判定は、身体サンプルにおけるＩｍＰ産生細菌の決定された量に基づく。さらなる変形が、判定を、ＩｍＰ産生細菌である身体サンプル中の細菌の割合に基づいて実施することである。
【００６９】
本発明の実施形態の別の局面が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法に関する。本方法は、薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路のうちの少なくとも１つを阻害し得るかどうかを判定することを含む。本方法はまた、薬剤が、少なくとも１つのウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路を阻害し得ると判定されるならば、薬剤を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００７０】
ウロカニン酸レダクターゼは、Ｔ２Ｄ及びＩＧＴに罹患している対象の腸内微生物叢において多い酵素である。これらの細菌において、ウロカニン酸レダクターゼは、遺伝子ｕｒｄＡによってコードされており、ウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換に関与する。図２を参照のこと。３０％を超える配列同一性を有するｕｒｄＡホモログがヒトゲノムにおいて特定されていないので、この酵素（ウロカニン酸レダクターゼ）は、本発明者らが知る限りでは、ヒトには存在していない。
【００７１】
したがって、１つの実施形態において、方法は、薬剤がウロカニン酸レダクターゼを阻害し得るかどうかを判定すること、及び、薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼを阻害し得ると判定されるならば、薬剤を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００７２】
特定の実施形態において、方法は、薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼによるウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換を阻害し得るかどうかを判定することを含む。そのような特定の実施形態において、薬剤は、前記薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼによるウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換を阻害し得ると判定されるならば、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴを前記対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定される。
【００７３】
薬剤がウロカニン酸レダクターゼを阻害し得るかどうかの判定を、薬剤の存在下及び非存在下でのウロカニン酸の暴露を受けて産生されるイミダゾールプロピオン酸の量を測定することによって実施することができる。そのような試験において、酵素は、例えば、組換え産生されるか、又は腸内微生物叢から単離されるなどして、実質的に純粋な形態である場合がある。代替において、イミダゾールプロピオン酸産生細菌は、薬剤の存在下又は非存在下でのウロカニン酸及び／又はヒスチジンによる暴露を受けることができるであろう。
【００７４】
ヒスチジンアンモニアリアーゼは、ヒスチジンのウロカニン酸への転換に関与する酵素である。ヒトにおいて、ウロカニン酸はさらに、図２に示されるようにグルタミン酸に転換される。細菌において、ウロカニン酸レダクターゼは、ウロカニン酸を基質として使用することにおいてウロカニン酸ヒドラターゼと競合する。ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害することにより、ウロカニン酸の量が効果的に減少し、それにより、ウロカニン酸レダクターゼの基質が減少する。ヒスチジンアンモニアリアーゼのそのような阻害の結果として、細菌によって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量が有意に減少することになる。
【００７５】
したがって、１つの実施形態において、方法は、薬剤がヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得るかどうかを判定すること、及び、薬剤が、ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得ると判定されるならば、薬剤を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００７６】
特定の実施形態において、方法は、薬剤が細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得るかどうかを判定すること、及び、薬剤を、前記薬剤が、細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得ると判定されるならば、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを前記対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００７７】
したがって、この特定の実施形態において、薬剤は好ましくは、ｈｕｔＨ遺伝子によってコードされる細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害することができ、しかし、好ましくは、ＨＡＬ遺伝子によってコードされるヒト型ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害することはできない、又は、阻害のより低いレベルもしくは程度であることを除いて、少なくとも阻害することはできない。そのような実施形態において、薬剤は、細菌におけるヒスチジンからイミダゾールプロピオン酸への経路を停止させることができ、又は少なくとも低下させることができ、しかし、それでもなお、少なくともある程度又は度合いではあるが、ヒスチジンからのヒト細胞におけるグルタミン酸の形成を可能にする。
【００７８】
特定の実施形態において、薬剤は、ヒト型ヒスチジンアンモニアリアーゼと比較した場合、細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害することにおいてより効果的である。具体的には、薬剤は好ましくは、ヒト型ヒスチジンアンモニアリアーゼと比較した場合、細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害することにおいて１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍又はそれ以上効果的である。
【００７９】
別の特定の実施形態において、薬剤は、非吸収性阻害剤、すなわち、対象の胃腸管によって吸収されない阻害剤である。このことは、阻害剤が胃腸管に存在して、それにより、その阻害効果、例えば、胃腸管における細菌の細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼに対するその阻害効果などを発揮するであろうことを意味する。非吸収性は、本明細書中において使用される場合、阻害剤が大腸（例えば、結腸）及び／又は小腸（例えば、回腸）の腸粘膜によって吸収され得ないことを含意するとは限らない。非吸収性阻害剤は、本明細書中において使用される場合、大腸及び／又は小腸によって容易に吸収される薬剤と比較して、腸粘膜による吸収が有意により低い阻害剤もまた包含する。このことは、非吸収性阻害剤が、ある程度、腸粘膜によって吸収されることがあり、しかし、その場合、容易に吸収される薬剤と比較して、より低い程度で、又はより低い吸収速度論で腸粘膜によって吸収されることがあることを意味する。
【００８０】
薬剤は好ましくは、ヒスチジンアンモニアリアーゼによる、より好ましくは細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンのウロカニン酸への転換を阻害することができる。薬剤はその後、薬剤が、ヒスチジンアンモニアリアーゼによる、より好ましくは細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンのウロカニン酸への転換を阻害し得ると判定されるならば、２型糖尿病又は耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定される。
【００８１】
薬剤がヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得るかどうかの判定を、薬剤の存在下及び非存在下でヒスチジンの暴露を受けて産生されるウロカニン酸の量を測定することによって実施することができる。そのような試験において、酵素は、例えば、組換え産生されるか、又は腸内微生物叢から単離されるなどして、実質的に純粋な形態である場合がある。代替において、イミダゾールプロピオン酸産生細菌は、薬剤の存在下又は非存在下でのヒスチジンによる暴露を受けることができるであろう。
【００８２】
図７ｇは、イミダゾールプロピオン酸誘発のシグナル伝達の概略図である。この図に示されるように、また、本明細書中においてさらに開示されるように、イミダゾールプロピオン酸は、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ及びおそらくはｐ３８δ  ＭＡＰＫに結合し、それらを活性化することができ、又は誘発することができる。ｐ３８γ  ＭＡＰＫ及びｐ３８δ  ＭＡＰＫのこの活性化はその結果として、ＩＲＳの分解をもたらす活性化経路を開始させる。このことは、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ及び／又はｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害が、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴに罹患している対象におけるイミダゾールプロピオン酸の有害な影響を抑制する効果的な方法であろうことを意味する。
【００８３】
したがって、１つの実施形態において、方法は、薬剤がｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを判定すること、及び、薬剤が、ｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、薬剤を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００８４】
特定の実施形態において、方法は、薬剤が、セクエストソーム−１（ｐ６２）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ−１（Ｓ６Ｋ１）、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、及びｐ３８γ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを判定することを含む。方法はまた、この特定の実施形態において、薬剤が、ｐ６２、Ｓ６Ｋ１、ＩＲＳ１、ＰＫＢ、及びｐ３８γ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。ｐ３８γ  ＭＡＰＫは、自己リン酸化プロセスにおいて自身をリン酸化することができる。
【００８５】
薬剤がｐ３８γ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかの判定を、ホスホ−ｐ６２に対する抗体、ホスホ−Ｓ６Ｋ１に対する抗体、ホスホ−ＩＲＳ１に対する抗体、ならびに／あるいはホスホ−ＰＫＢ及び／又はホスホ−ｐ３８γ  ＭＡＰＫに対する抗体を使用するために本明細書中においてさらに記載されるように決定することができるであろう。その後、薬剤の存在下及び非存在下におけるこれらの分子のリン酸化形態の量を決定することができるであろう。
【００８６】
別の実施形態において、方法は、薬剤がｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを判定すること、及び、薬剤が、ｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、薬剤を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００８７】
特定の実施形態において、方法は、薬剤が、ｐ６２、Ｓ６Ｋ１、ＩＲＳ１、ＰＫＢ、及びｐ３８δγ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかを判定することを含む。方法はまた、この特定の実施形態において、薬剤が、ｐ６２、Ｓ６Ｋ１、ＩＲＳ１、ＰＫＢ、及びｐ３８δγ  ＭＡＰＫのうちの少なくとも１つをリン酸化する際にｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得ると判定されるならば、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００８８】
薬剤がｐ３８δ  ＭＡＰＫを阻害し得るかどうかの判定を、ホスホ−ｐ６２に対する抗体、ホスホ−Ｓ６Ｋ１に対する抗体、ホスホ−ＩＲＳ１に対する抗体、ホスホ−ＰＫＢに対する抗体、及び／又はホスホ−ｐ３８δ  ＭＡＰＫに対する抗体を使用するために本明細書中においてさらに記載されるように決定することができるであろう。その後、薬剤の存在下及び非存在下におけるこれらの分子のリン酸化形態の量を決定することができるであろう。
【００８９】
本明細書中において示される実験データは、イミダゾールプロピオン酸が、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を活性化することによってインスリンシグナル伝達を損なうことを示す。この代替ｐ３８  ＭＡＰＫ経路は、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ及び／又はｐ３８γ  ＭＡＰＫの活性化を伴う。この代替ｐ３８  ＭＡＰＫ経路は、ｐ３８α  ＭＡＰＫ及びｐ３８β  ＭＡＰＫの活性化を伴う通常のｐ３８  ＭＡＰＫ経路とは異なっている。
【００９０】
したがって、１つの実施形態において、方法は、薬剤が代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路を阻害し得るかどうかを判定すること、及び、薬剤が、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路を阻害し得ると判定されるならば、薬剤を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む。
【００９１】
代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害を、図７ｇに示されるように、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ及び／又はｐ３８γ  ＭＡＰＫの活性化から、ＩＲＳの分解の最終結果までの経路に関与する分子をどれでもモニターすることによって評価することができ、又は判定することができる。例えば、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ及び／又はｐ３８γ  ＭＡＰＫの標的のリン酸化を、本明細書中に記載されるような抗体を使用して薬剤の存在下及び非存在下でモニターすることができる。
【００９２】
したがって、様々な阻害剤が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤として特定され得るであろう。阻害剤は、胃腸管における細菌によるイミダゾールプロピオン酸の産生の阻害剤である場合がある（例えば、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤又はヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤など）。代替において、阻害剤は、イミダゾールプロピオン酸によって活性化され、そして図７ｇに示されるシグナル経路において活性な阻害剤である場合がある（例えば、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ阻害剤、又は代替ｐ３８  ＭＡＰＫ経路の阻害剤など）。
【００９３】
薬剤を特定する上記の実施形態は好ましくはインビトロ法である。したがって、方法は好ましくはインビトロで実施され、例えば、薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ経路のうちの少なくとも１つを阻害し得るかどうかをインビトロで判定することなどによって実施される。
【００９４】
別の局面において、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤が、本明細書中においてさらに開示されるようなインビトロ模擬されたヒト腸モデル又は他の標的哺乳動物の腸モデルを使用して特定される。そのような局面はそれによって、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法に関する。本方法は、ヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルに薬剤を加えることを含む。インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量が測定される。その後、薬剤は、イミダゾールプロピオン酸の量に基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定される。
【００９５】
１つの実施形態において、薬剤は、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴに罹患している対象からの便のアリコートが接種されるインビトロ模擬ヒト腸モデルに加えられる。そのようなインビトロ模擬ヒト腸モデルの一例がさらに例の節において記載される。
【００９６】
１つの実施形態において、方法は、イミダゾールプロピオン酸の量を、参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と比較することを含む。参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルはウロカニン酸レダクターゼ産生細菌をどれも欠いており、又は、正常な耐糖能を有する対象からの便のアリコートが接種される。その後、薬剤は、イミダゾールプロピオン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸の参照量との比較に基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定される。
【００９７】
したがって、この実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の参照量が決定され、ヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を受け、かつ、薬剤が加えられた後の参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量と比較される。この参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルは、健康なヒト対象（すなわち、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴに罹患していない対象）の胃腸管を模倣する。このことは、薬剤が、インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量を参照量にまで、又は少なくとも参照量の近くにまで低下させることができるならば、薬剤は、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定されることを意味する。
【００９８】
別の実施形態において、方法は、イミダゾールプロピオン酸の量を、薬剤の非存在下であることを除いてヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と比較することを含む。その後、薬剤は、イミダゾールプロピオン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸の参照量との比較に基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定される。
【００９９】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量だけではなく、ウロカニン酸の量もまた測定される。そのような実施形態において、方法は、インビトロ模擬ヒト腸モデルにおいて蓄積されるウロカニン酸の量を測定することを含む。方法はまた、イミダゾールプロピオン酸の量及びウロカニン酸の量に基づいて、例えば、イミダゾールプロピオン酸の量と、ウロカニン酸の量との比などに基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして薬剤を特定することを含む。
【０１００】
１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量と、ウロカニン酸の量との間における比が、薬剤の非存在下であることを除いてヒスチジン及び／又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と、ウロカニン酸の参照量との間における比として計算される参照比と比較される場合がある。その後、薬剤は、比及び参照比の比較に基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定される。
【０１０１】
これらの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸又はウロカニン酸の参照量は、薬剤の非存在下でインビトロ模擬腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量、又は薬剤の非存在下でインビトロ模擬腸モデルにおいて蓄積されるウロカニン酸の量である。このことは、イミダゾールプロピオン酸の量がイミダゾールプロピオン酸の参照量よりも有意に少ない、及び／又は、ウロカニン酸の量がウロカニン酸の参照量よりも有意に多いならば、薬剤は、イミダゾールプロピオン酸又はウロカニン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸又はウロカニン酸の参照量との比較に基づいて、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定されることを意味する。
【０１０２】
本発明の実施形態のさらなる局面が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止する、抑制する、又は処置する方法に関する。本方法は、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、及び代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤からなる群から選択される阻害剤の効果的な量を対象に投与することを含む。
【０１０３】
１つの実施形態において、方法は、イミダゾールプロピオン酸（ＩｍＰ）の誘導体又は類似体の効果的な量の投与することを含む。そのようなイミダゾールプロピオン酸誘導体は、ヒスチジンアンモニアリアーゼのＩｍＰ誘発誘導を阻害することが示されており、しかし、それ自体はこの酵素を誘発しなかった。このことは、そのようなＩｍＰ誘導体がヒスチジンのウロカニン酸への転換及びさらにはイミダゾールプロピオン酸への転換を阻止し得ることを意味する。
【０１０４】
使用され得るそのようなＩｍＰ誘導体の限定されない、しかし、例示的な一例が、クロロイミダゾールプロピオン酸である。
【０１０５】
１つの実施形態において、阻害剤はｍＴＯＲＣ１阻害剤である。図７ｇにおいてさらに示されるように、また、本明細書中においてさらに記載されるように、そのようなｍＴＯＲＣ１阻害剤はＩＲＳのＩｍＰ誘発された低下を阻害する。したがって、ｍＴＯＲＣ１を阻害することにより、ＩＲＳのＩｍＰ誘発された分解が効果的に阻害されることになる。
【０１０６】
そのようなｍＴＯＲＣ１阻害剤の限定されない、しかし、例示的な例には、下記のものが含まれる：ラパマイシン、これはまた、シロリムス又は（７Ｅ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４ａＳ−ヘキサデカヒドロ−９Ｒ，２７−ジヒドロキシ−３Ｓ−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０Ｒ，２１Ｓ−ジメトキシ−６Ｒ，８，１２Ｒ，１４Ｓ，２０，２６Ｒ−ヘキサメチル−２３Ｓ，２７Ｒ−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン（ＣＡＳ  ５３１２３−８８−９）として示される；エベロリムス、これはまた、４２−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン（ＣＡＳ  １５９３５１−６９−６）として示される；ＡＺＤ８０５５、これはまた、ＣＧＩ−１６８又は５−［２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチル−４−モルホリニル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−２−メトキシ−ベンゼンメタノール（ＣＡＳ  １００９２９８−０９−２）として示される；テムシロリムス、これはまた、ＣＧＩ−７７９又は４２−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノアート］ラパマイシン（ＣＡＳ  １６２６３５−０４−３Ｉ）として示される；ＰＰ２４２、これはまた、トルキニブ（ｔｏｒｋｉｎｉｂ）又は２−［４−アミノ−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル］−１Ｈ−インドール−５−オール（ＣＡＳ１０９２３５１−６７−１）として示される；トリン（ｔｏｒｉｎ）１、これはまた、１−［４−［４−（１−オキソプロピル）−１−ピペラジニル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−９−（３−キノリニル）−ベンゾ［ｈ］−１，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）−オン（ＣＡＳ  １２２２９９８−３６−８）として示される；及びＷＹＥ−１２５１３２、これはまた、Ｎ−［４−［１−（１，４−ジオキサスピロ［４．５］デカ−８−イル）−４−（８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタ−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］フェニル］−Ｎ’−メチル−尿素（ＣＡＳ  １１４４０６８−４６−１）として示される。
【０１０７】
１つの実施形態において、阻害剤は、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ阻害剤である。図７ｇにおいてさらに示されるように、また、本明細書中においてさらに記載されるように、そのようなｐ３８γ  ＭＡＰＫ阻害剤は、最終的にはＩＲＳの分解を引き起こす上流側の事象（図７ｇを参照のこと）である、ｐ６２及びＳ６Ｋ１のＩｍＰ誘発リン酸化を阻害する。
【０１０８】
そのようなｐ３８γ  ＭＡＰＫ阻害剤の限定されない、しかし、例示的な例には、１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｐ−トリル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）ナフタレン−１−イル］尿素（ＢＩＲＢ７９６、ＣＡＳ  ２８５９８３−４８−４）、ピルフェニドン（これはまた、ペルフェニドン（ｐｅｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）又は５−メチル−１−フェニル−２（１Ｈ）−ピリジノン（ＣＡＳ  ５３１７９−１３−８）として示される）、ならびにＲＮＡｉ分子（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）など）が含まれる。
【０１０９】
１つの実施形態において、阻害剤は、ｐ３８δ  ＭＡＰＫ阻害剤である。図７ｇにおいてさらに示されるように、また、本明細書中においてさらに記載されるように、そのようなｐ３８δ  ＭＡＰＫ阻害剤は、最終的にはＩＲＳの分解を引き起こす上流側の事象（図７ｇを参照のこと）である、ｐ６２及びＳ６Ｋ１のＩｍＰ誘発リン酸化を阻害する。
【０１１０】
そのようなｐ３８δ  ＭＡＰＫ阻害剤の限定されない、しかし、例示的な例には、ＢＩＲＢ７９６及びＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡなど）が含まれる。
【０１１１】
１つの実施形態において、阻害剤はウロカニン酸レダクターゼ阻害剤である。阻害剤は、ウロカニン酸レダクターゼに結合し、その酵素作用を阻止する、又は少なくとも妨害することによってその阻害効果を達成することができるであろう。代替において、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤は、ウロカニン酸レダクターゼの転写、翻訳及び／又はいずれかの翻訳後プロセシングを阻害すること、又は少なくとも低下させることができるであろう。そのような阻害剤の限定されない例が、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡなど）である。
【０１１２】
１つの実施形態において、阻害剤は細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼの阻害剤である。阻害剤は、細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼに結合し、その酵素作用を阻止し、又は少なくとも妨害することによってその阻害効果を達成することができるであろう。代替において、阻害剤は、細菌型ヒスチジンアンモニアリアーゼの転写、翻訳及び／又はいずれかの翻訳後プロセシングを阻害すること、又は少なくとも低下させることができるであろう。そのような阻害剤の限定されない例が、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡなど）である。
【０１１３】
ＩｍＰ産生細菌の阻害剤には、基質を枯渇させることができるであろうプロバイオティクスが含まれる。コハク酸産生細菌が、基質を枯渇させ、かつ、それにより、細菌によって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量を低下させる潜在的なプロバイオティクスであるかもしれない［４］。使用され得るであろう他のプロバイオティクスには、ラクトバシラス属、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びクロストリジウム属が含まれる。ＩｍＰ産生細菌を標的とし得る具体的な抗生物質には、少なくとも１つのラクトバシラス属、アドレルクロイチア属、クロストリジウム属、デスルファチバシルム属、エガセラ属、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シェワネラ属、ストレプトコッカス属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、フソバクテリウム属及びアエロコッカス属を標的とする抗生物質が含まれ、なお、これらはほとんどがフィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）及びプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する。したがって、これらの種類の細菌の少なくとも１つを標的とする抗生物質が、イミダゾールプロピオン酸の低下を達成するために有用である場合がある。一例には、アモキシシリンが含まれるが、これに限定されない。
【０１１４】
方法は、少なくとも１つのウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、少なくとも１つのヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の少なくとも１つの阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの少なくとも１つの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの少なくとも１つの阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の少なくとも１つの阻害剤、及び／又は代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の少なくとも１つの阻害剤の効果的な量を投与することを含む場合がある。
【０１１５】
本発明の実施形態の阻害剤又は薬剤は、様々な経路に従って投与され得る。例えば、阻害剤又は薬剤は、当業者には知られている適切な投与手段を使用して、胃腸管への直接的（局所的）な送達のために、又は全身送達のために投与され得る。
【０１１６】
１つの実施形態において、本発明の実施形態の阻害剤（例えば、イミダゾールプロピオン酸の誘導体）は、胃腸管における細菌酵素（例えば、細菌のヒスチジンアンモニアリアーゼ及び／又はウロカニン酸レダクターゼなど）を優先的に標的とするために非吸収性阻害剤である。
【０１１７】
別の実施形態において、特に阻害剤が、対象における標的に向けられるならば、例えば、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ又はｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤などについては、阻害剤は吸収性阻害剤であり得るであろう。
【０１１８】
本発明の実施形態によれば、阻害剤又は薬剤は、有効成分を医薬的に許容される投薬形態物において含む医薬用調製物の形態での経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、口腔投与、直腸投与、皮膚投与、鼻腔投与、気管投与、気管支投与、局所的投与、どのような非経口経路であれ、他の非経口経路による投与、又は吸入を介した投与によって投与され得る。
【０１１９】
哺乳動物の治療的処置、とりわけ、ヒトの治療的処置において、阻害剤又は薬剤は単独で投与される場合があり、しかし、一般には、意図された投与経路及び標準的な薬務に対する相応の考慮とともに選択され得る医薬的に許容される補助剤、希釈剤又はキャリアとの混合での医薬配合物として投与されるであろう。
【０１２０】
本明細書中において使用される場合、効果的な量は、上述の状態の１つ（すなわち、Ｔ２Ｄ又はＩＧＴ）の症状を少なくとも改善する、又は防止するために十分である量を意味する。特定の患者のための効果的な量は、処置されている病状の状態、患者の全体的な健康状態、投与方法、及び副作用の重篤度などのような要因に依存して変動する場合がある。
【０１２１】
特定の実施形態が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有している、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性がある対象を処置する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を測定することを含む。本方法はまた、イミダゾールプロピオン酸の濃度がＩＧＴについての閾値濃度以上であり、しかし、Ｔ２Ｄについての閾値濃度未満であるならば、対象はＩＧＴを有している、又はＩＧＴを発症する危険性があると判定すること、ならびに／又は、イミダゾールプロピオン酸の濃度がＴ２Ｄについての閾値濃度以上であるならば、対象はＴ２Ｄを有している、又はＴ２Ｄを発症する危険性があると判定することを含む。
【０１２２】
特定の実施形態において、ＩＧＴについてのイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度は８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭであり、かつ、Ｔ２Ｄについてのイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度は１０ｎＭであり、好ましくは１１ｎＭであり、より好ましくは１２ｎＭである。
【０１２３】
別の特定の実施形態において、Ｔ２Ｄについてのイミダゾールの閾値濃度は、１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内で選択される。
【０１２４】
方法はさらに、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有していると判定される、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があると判定される対象に、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せからなる群から選択される阻害剤の効果的な量、ならびに／あるいは又はイミダゾールプロピオン酸誘導体の効果的な量を投与し、それにより、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有していると判定される、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があると判定される対象を処置することを含む。
【０１２５】
別の特定の実施形態が、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有している、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性がある対象を処置する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を測定することを含む。
【０１２６】
特定の実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量が少なくとも８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭであり、しかし、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１１ｎＭ未満であり、より好ましくは１２ｎＭ未満である場合、対象は、ＩＧＴを有しているとして、又はＩＧＴを発症する危険性があるとして診断され、また、イミダゾールプロピオン酸の量が少なくとも１０ｎＭであり、好ましくは１１ｎＭであり、より好ましくは１２ｎＭである場合、対象は、Ｔ２Ｄを有しているとして、又はＴ２Ｄを発症する危険性があるとして診断され、このことはそれによって、対象を、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有しているとして、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるとして診断する。
【０１２７】
別の特定の実施形態において、イミダゾールプロピオン酸の量が、１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内で選択されるイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度を超える場合、対象は、Ｔ２Ｄを有しているとして、又はＴ２Ｄを発症する危険性があるとして診断される。
【０１２８】
方法はまた、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有しているとして診断される、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるとして診断される対象に、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せからなる群から選択される阻害剤の効果的な量、ならびに／あるいは又はイミダゾールプロピオン酸誘導体の効果的な量を投与し、それにより、Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを有しているとして診断される、又はＴ２ＤもしくはＩＧＴを発症する危険性があるとして診断される対象を処置することを含む。
【０１２９】
さらなる特定の実施形態が、Ｔ２Ｄを有している、又はＴ２Ｄを発症する危険性がある対象を処置する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量が少なくとも１０ｎＭであり、好ましくは１１ｎＭであり、より好ましくは１２ｎＭであり、例えば、１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内で選択されるイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度を超えるなどする対象に、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せからなる群から選択される阻害剤の効果的な量、ならびに／あるいは又はイミダゾールプロピオン酸誘導体の効果的な量を投与することを含む。
【０１３０】
さらに別の特定の実施形態が、ＩＧＴを有している、又はＩＧＴを発症する危険性がある対象を処置する方法に関する。本方法は、対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量が少なくとも８ｎＭであり、好ましくは９ｎＭであり、より好ましくは１０ｎＭであり、しかし、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１１ｎＭ未満であり、より好ましくは１２ｎＭ未満であり、例えば、１０．７ｎＭから１３．８ｎＭまでの区間の範囲内で選択されるイミダゾールプロピオン酸の閾値濃度を超えるなどする対象に、ウロカニン酸レダクターゼ阻害剤、ヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤、及び、どのような組合せであれ、それらの組合せからなる群から選択される阻害剤の効果的な量、ならびに／あるいは又はイミダゾールプロピオン酸誘導体の効果的な量を投与することを含む。
【０１３１】
本発明の実施形態はまた、Ｔ２ＰもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための上記の阻害剤に関する。これらの実施形態はそれによって、以下の使用を規定する。
【０１３２】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのウロカニン酸レダクターゼ阻害剤。
【０１３３】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤。
【０１３４】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤。
【０１３５】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ｐ３８γ  ＭＡＰＫの阻害剤。１つの実施形態において、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ阻害剤は、１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｐ−トリル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）ナフタレン−１−イル］尿素（ＢＩＲＢ７９６）、ピルフェニドン及びＲＮＡｉ分子からなる群から選択される。
【０１３６】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ｐ３８δ  ＭＡＰＫの阻害剤。１つの実施形態において、ｐ３８γ  ＭＡＰＫ阻害剤は、１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｐ−トリル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）ナフタレン−１−イル］尿素（ＢＩＲＢ７９６）及びＲＮＡｉ分子からなる群から選択される。
【０１３７】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、代替ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化経路の阻害剤。
【０１３８】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤。１つの実施形態において、ｍＴＯＲＣ１阻害剤は、ラパマイシン、エベロリムス、ＡＺＤ８０５５、テムシロリムス、ＰＰ２４２（トルキニブ）、トリン１及びＷＹＥ−１２５１３２からなる群から選択される。
【０１３９】
Ｔ２ＤもしくはＩＧＴを対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのイミダゾールプロピオン酸誘導体。１つの実施形態において、イミダゾールプロピオン酸誘導体はクロロイミダゾールプロピオン酸である。
【０１４０】
例
２型糖尿病には、この疾患の発症の一因であるかもしれない変化した腸内微生物叢が伴っている。腸内微生物叢は、アミノ酸由来のシグナル伝達分子のレベルを変化させることが知られており、しかし、アミノ酸代謝の微生物叢依存的調節が宿主代謝に影響しているか、また、どのように影響しているかは明らかでない。本明細書中において、微生物によりアップレギュレーションされたヒスチジン由来代謝産物のイミダゾールプロピオン酸が、２型糖尿病罹患被験者ではより高い濃度で存在することが明らかにされる。２型糖尿病罹患個体及び２型糖尿病非罹患個体からの便微生物叢を使用して、イミダゾールプロピオン酸の劇的に増大した産生が、糖尿病関連の微生物叢が存在する場合にだけインビトロで明らかにされる。イミダゾールプロピオン酸がインスリン受容体基質タンパク質レベルを低下させ、かつ、それにより、ｍＴＯＲＣ１の代替ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ媒介活性化を介してインスリンシグナル伝達を損なうこともまた明らかにされる。まとめると、これらの知見は、微生物代謝産物のイミダゾールプロピオン酸が２型糖尿病の病理発生の一因であることを示している。
【０１４１】
イミダゾールプロピオン酸はヒトにおけるインスリン抵抗性に関連する
腸において産生される細菌代謝産物は門脈を通って肝臓に到達し、その後、体循環に入る。したがって、インスリン抵抗性及び２型糖尿病の一因となっているかもしれない、微生物によりアップレギュレーションされたアミノ酸由来代謝産物を特定するために、５名の２型糖尿病罹患の肥満被験者（ボディーマス指数（ＢＭＩ）＞４０）、及び１０名の２型糖尿病非罹患のＢＭＩ一致被験者の門脈血に対して非標的メタボロミクスを最初に行った。表２を参照のこと。４つのアミノ酸由来代謝産物（硫酸ドパミン、グルタミン酸、イミダゾールプロピオン酸及びＮ−アセチルプトレシン）のみが、２型糖尿病罹患被験者の門脈血では有意により高かった（すなわち、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１）（表３を参照のこと）。
【表２】
2020515827.tif 000004
【表３】
2020515827.tif 000005
【０１４２】
微生物代謝産物のみに集中するために、その後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの無菌（ＧＦ）マウス及び通常飼育（ＣＯＮＶＲ）マウスからの血液の網羅的メタボロミクスプロフィルにおけるこれら４つの代謝産物のレベルを調べた。グルタミン酸ではなく、イミダゾールプロピオン酸がＣＯＮＶＲマウス由来の門脈血及び大静脈血の両方においてより高いレベルで存在し（図１ａを参照のこと）、硫酸ドパミン及びＮ−アセチルプトレシンは検出されないことが示された。次に、イミダゾールプロピオン酸測定のための標的化方法を開発し、マウス血漿におけるピークが、合成参照物質（ＣＡＳ  １０７４−５９−５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と同じ保持時間及び断片化パターンを有することを確認した。初期ヒトコホートからの門脈血及び末梢血におけるイミダゾールプロピオン酸の標的化測定では、（１）イミダゾールプロピオン酸の濃度が２型糖尿病罹患被験者の門脈血ではより高いことが確認され、加えて、（２）イミダゾールプロピオン酸の濃度はまた、２型糖尿病非罹患被験者と比較して、２型糖尿病罹患被験者の末梢血でもより高いことが示された（図１ｂを参照のこと）。
【０１４３】
イミダゾールプロピオン酸が微生物産生の代謝産物であるかどうかを直接的に取り組むために、嫌気性で、還元性の腸環境を模倣するインビトロ腸シミュレーターを使用した。２型糖尿病罹患又は２型糖尿病非罹患の肥満被験者からの微生物群集の１週間の安定化の後、群集への１０ｍＭヒスチジン暴露を行い、イミダゾールプロピオン酸及びその前駆体（ウロカニン酸）のレベルを７時間にわたって測定した（図２を参照のこと）。２型糖尿病非罹患被験者からの細菌群集は、ウロカニン酸を、ヒスチジン補充後３時間でピークに達するレベルに速やかに産生した。イミダゾールプロピオン酸はどの時点でもほとんど検出されなかった（図１ｃ（左側）を参照のこと）。２型糖尿病関連の微生物叢もまた、ウロカニン酸をヒスチジン補充直後に産生し、しかし、より低い速度で産生した。注目すべきことに、イミダゾールプロピオン酸の生成がヒスチジン補充後１．５時間で認められ（図１ｃ（右側）を参照のこと）、このことは、ウロカニン酸と、イミダゾールプロピオン酸との間における前駆体と生成物との関係を反映していた。これらの所見は、２型糖尿病関連の微生物叢はウロカニン酸の代謝を、グルタミン酸を生じさせるための従来のＨｕｔ経路から、イミダゾールプロピオン酸を生じさせるためのあまり知られていない経路に移行させることができることを示唆する（図２を参照のこと）。
【０１４４】
これらの所見を検証するために、回分培養を行い、２型糖尿病罹患被験者及び２型糖尿病非罹患被験者（ｎ＝５／群、再度ではあるが、最初のコホートから）に由来する細菌群集におけるヒスチジンからのイミダゾールプロピオン酸産生を比較した。終点測定により、より高濃度のイミダゾールプロピオン酸が２型糖尿病関連の微生物叢の存在下で産生されることが示された（図１ｅ）。これらの所見は、２型糖尿病関連の微生物叢はウロカニン酸をあまり知られていない経路に分流して、イミダゾールプロピオン酸を産生することを示唆する。
【０１４５】
細菌型ウロカニン酸レダクターゼ（ＵｒｄＡ）は、ウロカニン酸からのイミダゾールプロピオン酸の生成を触媒するものであり、最近になって（シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）において）発見されたばかりである。可能性のあるＵｒｄＡについての大規模スクリーニングをＦＡＤ活性部位に基づいて行い、８１２個のＵｒｄＡホモログを細菌ゲノムにおいて特定した：６３９個が、保存された「Ｈ」を有しており、１７３個は「Ｈ」を有していなかった（「Ｙ」又は「Ｍ」により置換されていた）。次に、「Ｈ」を有する、又は「Ｈ」を有しない細菌はイミダゾールプロピオン酸をヒスチジン又はウロカニン酸から産生することができるかを比較した。「Ｈ」−ＵｒｄＡホモログを有する細菌はイミダゾールプロピオン酸を産生せず、これに対して、「Ｙ」又は「Ｍ」−ＵｒｄＡホモログを有する細菌がイミダゾールプロピオン酸を産生することが明らかにされた（図１ｆ）。このことは、これにより、イミダゾールプロピオン酸を産生する細菌を予測することができるであろうことを示している（すなわち、「Ｙ」又は「Ｍ」−ＵｒｄＡホモログが正真正銘のウロカニン酸レダクターゼである）。
【０１４６】
イミダゾールプロピオン酸濃度が２型糖尿病罹患個体の末梢血では増大しているという本発明者らの所見を検証するために、最初に５８４名の中年個体をスウェーデン人集団から募集し、その後、拡大変形では６４９名の個体を募集し、これらの個体を耐糖能のレベルに従って４つの群に分けた（表４Ａ及び４Ｂを参照のこと）。ＢＭＩ及び性別について補正を行った後、有意により高いレベルのイミダゾールプロピオン酸が、正常な耐糖能を有する個体と比較して、耐糖能障害を有する個体において（Ｐ＝０．０２０）、又は処置を受けたことがない２型糖尿病を有する個体において見出された（Ｐ＝０．００２）（図１ｄを参照のこと）。イミダゾールプロピオン酸は、正常な耐糖能を有する個体と比較して、耐糖能障害を有する個体ではより高いレベルに向かう傾向を示し（Ｐ＝０．０５７）、処置を受けたことがない２型糖尿病を有する個体では有意により高いままであった（Ｐ＝０．０４７）。イミダゾールプロピオン酸のレベルがすべての群にわたって有意により高いこと（Ｐ＜０．０００１）、そして、潜在的な交絡要因（ＢＭＩ、性別及び年齢）について補正を行った後では、処置を受けたことがない２型糖尿病を有する個体は、正常な耐糖能を有する個体と比較して、より高いレベルのイミダゾールプロピオン酸を有することが見出された（Ｐ＜０．０００１）。対照的に、ウロカニン酸のレベルは群間において異なっていなかった（図１ｄを参照のこと）。
【表４Ａ】
2020515827.tif 000006
【表４Ｂ】
2020515827.tif 000007
【０１４７】
イミダゾールプロピオン酸は耐糖能及びインスリンシグナル伝達を損なう
イミダゾールプロピオン酸がグルコース代謝に影響を及ぼし得るであろうかどうかを直接的に調べるために、イミダゾールプロピオン酸を３日間にわたってＧＦマウスに腹腔内注射した。この処置は、およそ１３ｎＭのイミダゾールプロピオン酸の循環濃度を、ウロカニン酸のレベルに影響を与えることなくもたらした（図３ａを参照のこと）。重要なことに、イミダゾールプロピオン酸のこれらの低い濃度は、著しいグルコース不耐性を誘発するために十分であり（図３ｂを参照のこと）、このことは、インビボでの損なわれたグルコース代謝のもっともらしい一因としてイミダゾールプロピオン酸が果たす役割を裏づけていた。Ｇ６ｐアーゼ及びＰｅｐｃｋ（重要な糖生成律速酵素の遺伝子）の肝臓での発現が、コントロールと比較して、イミダゾールプロピオン酸が注射されたＧＦマウスでは有意に増大したこともまた認められた（図３ｃを参照のこと）。しかしながら、イミダゾールプロピオン酸はＳｒｅｂｐ１ｃ及びＦａｓｎ（重要な脂質生成酵素の遺伝子）の肝臓での発現に影響を及ぼさなかった（図３ｃを参照のこと）。
【０１４８】
次に、インスリンシグナル伝達に関与する重要なタンパク質に対するイミダゾールプロピオン酸注射の影響を調べた。イミダゾールプロピオン酸はインスリン受容体（ＩＲ）の肝臓レベルに影響を及ぼさず、しかし、インスリン受容体基質１及びインスリン受容体基質２（ＩＲＳ１及びＩＲＳ２）の肝臓レベルをＧＦマウスにおいて低下させることが見出された（図３ｄを参照のこと）。肝臓でのＩｒｓ１及びＩｒｓ２のｍＲＮＡレベルにおける有意な変化が認められなかったので、これらの低下は転写後のレベルで生じた（図４を参照のこと）。
【０１４９】
次に、イミダゾールプロピオン酸の３日間の注射がＣＯＮＶＲマウス（代謝ケージに収容される）におけるグルコース代謝及びインスリンシグナル伝達に影響を及ぼし得るであろうかどうかを調べた。この処置は、イミダゾールプロピオン酸の循環濃度を、ウロカニン酸のレベルに影響を伴うことなく、およそ４倍増大させることが示された（図３ｆを参照のこと）。注目すべきことに、イミダゾールプロピオン酸処置は、ＣＯＮＶＲマウスにおいて、体重、肝臓重量及びＷＡＴ重量又は食物摂取量に対する有意な影響を何ら与えることなく、耐糖能を損なった（図３ｇ）。初期暗期におけるエネルギー消費が、自発運動活動における低下と並行してイミダゾールプロピオン酸によって有意に低下し、しかしながら、総自発運動活動はイミダゾールプロピオン酸処置によって有意に低下しなかった。
【０１５０】
ＧＦマウスにおける本発明者らの所見とは対照的に、イミダゾールプロピオン酸処置は、ＣＯＮＶＲマウスにおいて、肝臓、筋肉又はＷＡＴにおけるＩＲＳレベルを低下させなかった。したがって、インスリンシグナル伝達に対するイミダゾールプロピオン酸の役割を、初代肝細胞を使用してさらに調べた。イミダゾールプロピオン酸による２０時間にわたる処置は、ＧＦ肝臓におけるイミダゾールプロピオン酸に対する応答と一致して、ＩＲＳを肝細胞において低下させた（図３ｈ）にもかかわらず、イミダゾールプロピオン酸による８時間の処置はＩＲＳに影響を及ぼさなかった（図３ｅ）。しかしながら、この短期間の処置は、ＩＲＳ−１関連ＰＩ３Ｋ及び下流側Ａｋｔのインスリン刺激された活性化のために要求されるインスリン誘発のＩＲＳ１  Ｙ６１２リン酸化を弱らせた（図３ｅ）。Ａｋｔは、残基Ｓ４７３及び残基Ｔ３０８の両方がリン酸化されたときに完全に活性化され２１、しかし、ＡｋｔのＳ４７３リン酸化及びＴ３０８リン酸化は、異なる生理学的役割を媒介することが報告されている。今回、イミダゾールプロピオン酸による８時間の処置が、インスリン誘発のＡｋｔ  Ｔ３０８リン酸化ではなく、インスリン誘発のＡｋｔ  Ｓ４７３リン酸化を低下させることが明らかにされた（図３ｅ）。インスリン刺激されたＡｋｔ  Ｔ３０８リン酸化ではなく、インスリン刺激されたＡｋｔ  Ｓ４７３リン酸化を肝臓又は脂肪において特異的に除くことが、耐糖能を損なうために十分であり、このことは、Ａｋｔ  Ｓ４７３リン酸化が、インスリンの有益な応答を媒介することにおいて重要であることを示唆する。
【０１５１】
注目すべきことに、イミダゾールプロピオン酸による初代肝細胞の８時間の処置は、Ｓ４７３及びＴ３０８の両方での基礎的Ａｋｔリン酸化を誘発し、それにより、インスリンに対するＡｋｔの応答性を低下させた（図３ｅ）。本発明者らは、基礎的Ａｋｔ  Ｓ４７３リン酸化が、ビヒクル処置されたＣＯＮＶＲマウスと比較して、３日間のイミダゾールプロピオン酸注射を受けたＣＯＮＶＲマウスからの肝臓、筋肉及びＷＡＴではより高いことにもまた注目した。基礎的Ａｋｔ活性化が西洋型食餌誘発のインスリン抵抗性動物及び糖尿病性レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおいてしばしば認められており、基礎的Ａｋｔ活性化はインスリン刺激されたグルコース取り込みを阻害し、そして、インスリン感受性を、インスリン刺激されたＩＲＳ１チロシンリン酸化及びＩＲＳ１関連ＰＩ３Ｋ活性を阻害することによって低下させることができる。
【０１５２】
ＩＲＳタンパク質レベルとは対照的に、Ｓ４７３又はＴ３０８のどちらにおいてでも、Ａｋｔリン酸化における低下が、イミダゾールプロピオン酸による処置の後のＧＦマウスからの肝臓では認められなかった（図３ｄを参照のこと）。注目すべきことに、以前の研究では、マウスに高脂肪食を８週間〜１２週間にわたって与えると、耐糖能障害がＩＲＳ１タンパク質の低下したレベルとともに生じ、しかし、Ａｋｔリン酸化は変化しないか、又は増大することが示されている。同様に、イミダゾールプロピオン酸と１４時間インキュベーションされる初代肝細胞では、ＩＲＳ１における劇的低下が、Ｓ４７３及びＴ３０８での基礎的Ａｋｔリン酸化における増大と組み合わさって認められた（図３ｅを参照のこと）。増大した基礎的Ａｋｔ活性化にもかかわらず、インスリン誘発のＡｋｔ  Ｓ４７３リン酸化が、イミダゾールプロピオン酸にさらされる初代肝細胞では低くなっていた（図３ｅを参照のこと）。対照的に、インスリン誘発のＡｋｔ  Ｔ３０８リン酸化が、ビヒクル処置された肝細胞と比較して、イミダゾールプロピオン酸にさらされる初代肝細胞では高くなっていた（図３ｅを参照のこと）。以前の研究では、インスリン誘発のＡｋｔ  Ｔ３０８リン酸化ではなく、インスリン誘発のＡｋｔ  Ｓ４７３リン酸化を肝臓又は脂肪において特異的に除くことが、耐糖能を損なうために十分であることが示されており、このことは、Ａｋｔ  Ｓ４７３リン酸化が、インスリンの有益な応答を媒介することにおいて重要であることを示唆する。
【０１５３】
まとめると、これらのデータは、イミダゾールプロピオン酸は耐糖能を悪化させることを明らかにし、このことは、低下したＩＲＳタンパク質レベル及び低下したインスリン誘発のＡｋｔ  Ｓ４７３リン酸化によって少なくとも部分的には説明され得るであろう。
【０１５４】
したがって、本発明者らの結果は、イミダゾールプロピオン酸は、潜在的には基礎的Ａｋｔ活性化を増大させ、かつ、それにより、インスリン刺激されたチロシンリン酸化を低下させることによって、ＩＲＳのレベルでのインスリンシグナル伝達に対する負の影響を有することが明らかにする。
【０１５５】
イミダゾールプロピオン酸はアミノ酸感知経路を調節する
イミダゾールプロピオン酸をＩＲＳ低下に結びつけることができるであろう潜在的な経路には、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）又はラパマイシン標的タンパク質複合体１（ｍＴＯＲＣ１）を伴う経路が含まれる。最初に、ＪＮＫ阻害剤のＳＰ６００１２５又はＢＩ７８Ｄ３はイミダゾールプロピオン酸誘発のＩＲＳ１低下を初代肝細胞において回復させないことが示され（図５を参照のこと）、これにより、ＪＮＫ経路についての役割が除外された。対照的に、ｍＴＯＲＣ１阻害剤のラパマイシン及びトリン１はこれらの細胞におけるＩＲＳのイミダゾールプロピオン酸誘発低下を阻害することが示された（図６ａ及び図６ｉを参照のこと）。さらに、Ｓ６Ｋ１リン酸化（これはｍＴＯＲＣ１活性化のマーカーである）が、イミダゾールプロピオン酸とインキュベーションされる初代肝細胞において増大し、この応答がラパマイシン及びトリン１によって取り消された（図６ａ及び図６ｉを参照のこと）。これらの結果から、イミダゾールプロピオン酸はＩＲＳタンパク質レベルを、ｍＴＯＲＣ１の上流側のシグナル伝達分子に影響を及ぼすことによって低下させることが示唆される。イミダゾールプロピオン酸によるＧＦマウスの３日間の処置は、肝臓において、ｍＴＯＲＣ１  Ｓ２４８１の自己リン酸化に影響を与えることなく、Ｓ６Ｋ１リン酸化を増大させることもまた示された（図６ｂを参照のこと）。ｍＴＯＲ  Ｓ２４８１の自己リン酸化は、全細胞溶解物で測定されるとき、インスリンによって増大し、しかし、アミノ酸によって増大しないことが知られているので、本発明者らの結果は、イミダゾールプロピオン酸によるアミノ酸感知経路の活性化を示唆する。
【０１５６】
アミノ酸感知経路におけるイミダゾールプロピオン酸の役割をさらに調べるために、アミノ酸欠乏させた初代肝細胞をイミダゾールプロピオン酸とインキュベーションした。アミノ酸の非存在において、イミダゾールプロピオン酸との２時間にわたるインキュベーションはＳ６Ｋ１リン酸化を強く誘発した（図６ｃを参照のこと）。ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）における１時間にわたるイミダゾールプロピオン酸とのインキュベーションは、アミノ酸の存在下で認められるレベルに匹敵するレベルでＳ６Ｋ１リン酸化を誘発することもまた示された（図６ｄを参照のこと）。
【０１５７】
本発明者らのデータは、イミダゾールプロピオン酸はアミノ酸誘発ｍＴＯＲＣ１活性化のシグナル伝達機構を共有することを示唆したにもかかわらず、イミダゾールプロピオン酸は、細胞によって利用され得る典型的なアミノ酸ではない。ｍＴＯＲＣ１活性化におけるイミダゾールプロピオン酸とアミノ酸との間における相違点又は類似点を明確化するために、アミノ酸欠乏させた初代肝細胞をイミダゾールプロピオン酸とインキュベーションした。アミノ酸の非存在において、イミダゾールプロピオン酸との２時間にわたるインキュベーションはＳ６Ｋ１リン酸化を強く誘発した（図６ｃ）。ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）における１時間にわたるイミダゾールプロピオン酸とのインキュベーションは、アミノ酸の存在下で認められるレベルに匹敵するレベルでＳ６Ｋ１リン酸化を誘発することもまた示された。ロイシンは、ｍＴＯＲＣ１を強力に活性化することが知られており、Ｓ６Ｋ１リン酸化をほんの１５分後にＨＥＫ２９３細胞において増大させ、しかし、その影響は一過性であり、その後の時点で認められるイミダゾールプロピオン酸に対する応答ほど強くなかった。しかしながら、イミダゾールプロピオン酸はＳ６Ｋ１リン酸化をアミノ酸の存在下ではほんの３０分後にＨＥＫ２９３において誘発した。これらの結果は、ｍＴＯＲＣ１の活性化における典型的なアミノ酸とイミダゾールプロピオン酸との間における相違点を示唆する。
【０１５８】
免疫沈降実験を行うことによって、ＨＥＫ２９３細胞におけるイミダゾールプロピオン酸との２時間のインキュベーションは、ｍＴＯＲＣ２ではなく、ｍＴＯＲＣ１を特異的に調節することが示された。注目すべきことに、イミダゾールプロピオン酸及びアミノ酸の両方がｍＴＯＲＣ１を類似した程度にリン酸化したにもかかわらず、イミダゾールプロピオン酸のみがＡｋｔリン酸化を誘発した。以前の所見と一致して、イミダゾールプロピオン酸誘発のＡｋｔ活性化とは対照的に、インスリン誘発のＡｋｔ活性化はアミノ酸の非存在下においてｍＴＯＲＣ１を活性化しないことが示された。ｍＴＯＲＣ１及びＡｋｔはアミノ酸の非存在下においてイミダゾールプロピオン酸によって無関係に活性化され、しかし、Ａｋｔはアミノ酸の存在下においてｍＴＯＲＣ１の上流側の調節因子として作用し得るであろうこともまた示された。まとめると、これらの結果は、イミダゾールプロピオン酸はアミノ酸又はインスリンのどちらとも異なる様式でｍＴＯＲＣ１を活性化することを示している。
【０１５９】
ＩＲＳ１タンパク質レベルが、アミノ酸欠乏細胞において、２時間までの短いインキュベーション時間の後ではイミダゾールプロピオン酸によって低下しなかった（図６ｃ及び図６ｄを参照のこと）。以前の研究では、ＩＲＳ１の分解に先立って、ｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋ１の過剰活性化及びそれに続くユビキチン／プロテアソーム媒介分解によって誘発されるＳ６３６及びＳ６３９でのＩＲＳ１のリン酸化が生じることが示されたので、イミダゾールプロピオン酸がアミノ酸欠乏ＨＥＫ２９３細胞においてＩＲＳ１  Ｓ６３６／Ｓ６３９リン酸化を誘発し得るであろうかを次に調べた。イミダゾールプロピオン酸との２時間にわたるインキュベーションは、ＩＲＳ１  Ｓ６３６／Ｓ６３９リン酸化を、ＩＲＳ１タンパク質レベルに影響を及ぼすことなく誘発することが示された。８時間のイミダゾールプロピオン酸はＩＲＳ１レベルを劇的に低下させ、ＩＲＳ１のセリンリン酸化によって引き起こされることが知られている移動度シフトをもたらした（図６ｅを参照のこと）。これらの結果は、イミダゾールプロピオン酸はＩＲＳ１のセリンリン酸化に応答してＩＲＳ１分解を促進させることを示唆する。
【０１６０】
インスリンは、Ａｋｔの活性化を介してｍＴＯＲＣ１を活性化し、これにより、Ｒｈｅｂ−ＧＴＰ（ｍＴＯＲＣ１の強力な活性化剤）に対するＴＳＣの阻害作用が軽減される。対照的に、ｍＴＯＲＣ１の永続的な活性化は、ＩＲＳに向かう負のフィードバックループを介してインスリン誘発のＡｋｔ活性化を阻害する。しかしながら、インスリンはアミノ酸の非存在下においてｍＴＯＲＣ１を活性化することができず、加えて、本発明者らは、インスリン誘発のＡｋｔ活性化が、アミノ酸又はイミダゾールプロピオン酸の非存在下では、Ｓ６Ｋ１リン酸化によって測定されるようなｍＴＯＲＣ１活性化をもたらさないことを明らかにした（図６ｅを参照のこと）。さらに、イミダゾールプロピオン酸による８時間にわたる前処理は、ｍＴＯＲＣ１活性化と、ＩＲＳ１の減少とを、Ａｋｔの増大した基礎的活性化及びインスリンに対するＡｋｔ  Ｓ４７３の低下した応答性と一緒にもたらし（図６ｅを参照のこと）、このことから、インスリンシグナル伝達のｍＴＯＲＣ１媒介阻害がＩＲＳ１分解を介して生じるという考えがさらに裏づけられた。
【０１６１】
イミダゾールプロピオン酸との８時間にわたるインキュベーションはＩＲＳ１のさらなる移動度シフトを促進させ、ＩＲＳ１レベルを劇的に低下させた（図６ｅ）。イミダゾールプロピオン酸による６時間の処置はＩＲＳ１のユビキチン化を促進させることもまた示された。まとめると、これらの結果から、イミダゾールプロピオン酸がｍＴＯＲＣ１依存的経路を介してＩＲＳ分解を促進させることが示唆され、また、ＩＲＳ分解に先立って、ＩＲＳ  Ｓ６３６／Ｓ６３９リン酸化及びユビキチン化が生じるという考えが裏づけられる。
【０１６２】
イミダゾールプロピオン酸はｍＴＯＲＣ１のリソソーム局在化を促進させる
以前の研究では、アミノ酸によるｍＴＯＲＣ１活性化は、アダプタータンパク質ｐ６２（活性なＲａｇヘテロ二量体ＲａｇＢ−ＧＴＰ／ＲａｇＣ−ＧＤＰ）、Ｒａｐｔｏｒ及びｍＴＯＲＣ１の間での複合体の形成によって媒介されるｍＴＯＲＣ１のリソソーム局在化を必要とすることが示されている。今回、イミダゾールプロピオン酸がｍＴＯＲのリソソーム局在化を誘発することが示された（図６ｆを参照のこと）。したがって、イミダゾールプロピオン酸がこの活性複合体の形成を促進し得るであろうかどうかを次に調べた。ＦＬＡＧタグ化されたｍＴＯＲとの免疫沈降を行い、ＨＡタグ化されたＲａｐｔｏｒ、Ｍｙｃタグ化されたＲａｇ  ＧＴＰアーゼ、及びｐ６２との相互作用をモニターすることによって、イミダゾールプロピオン酸はｍＴＯＲＣ１−Ｒａｇヘテロ二量体複合体−ｐ６２の形成を、構成的に活性なＲａｇＢ−ＧＴＰ／ＲａｇＣ−ＧＤＰを発現する細胞において達成されるレベルに匹敵するレベルに誘発することが示された（図６ｇを参照のこと）。次に、イミダゾールプロピオン酸誘発のＳ６Ｋ１活性化におけるＲａｇ  ＧＴＰアーゼの関与が明らかにされた。ＲａｇＡ／Ｂ−ＧＤＰ及びＲａｇＣ／Ｄ−ＧＴＰ（これらは不活性なＲａｇ  ＧＴＰアーゼである）はイミダゾールプロピオン酸誘発のＳ６Ｋ１リン酸化を阻止することが示された（図６ｈを参照のこと）。そのうえ、活性なＲａｇ  ＧＴＰアーゼ（ＲａｇＡ／Ｂ−ＧＴＰ）はＳ６Ｋ１リン酸化をさらに増大させず（図６ｈを参照のこと）、このことから、イミダゾールプロピオン酸はＲａｇ  ＧＴＰアーゼの活性化を介してｍＴＯＲを活性化することが示唆された。
【０１６３】
イミダゾールプロピオン酸はｐ６２リン酸化を誘発するが、他のヒスチジン誘導体はｐ６２リン酸化を誘発しない
Ｔ２６９及びＳ２７２でのアダプタータンパク質ｐ６２のリン酸化は最近、リソソームでのｍＴＯＲＣ１活性化のアミノ酸誘発のために非常に重要であることが示されている。今回、ｐ６２リン酸化がイミダゾールプロピオン酸とのインキュベーションによって初代肝細胞において誘発されることが示された（図７ａを参照のこと）。さらに、この応答はｍＴＯＲＣ１阻害剤のラパマイシンによって影響されず（図７ａを参照のこと）、このことは、ｍＴＯＲＣ１はｐ６２リン酸化の下流側であることを示した。
【０１６４】
イミダゾールプロピオン酸はｐ６２リン酸化における濃度依存的かつ時間依存的な増大をＨＥＫ２９３細胞において促進させ、活性化がアミノ酸の非存在下において１０ｎＭもの低い濃度で認められた（図７ｂを参照のこと）。Ｓ６Ｋ１リン酸化及びＩＲＳ１  Ｓ６３６／Ｓ６３９リン酸化は、イミダゾールプロピオン酸に対して、ｐ６２ほど敏感でなかった（図７ｂを参照のこと）。このことは、ｍＴＯＲＣ１活性化の上流側でｐ６２リン酸化が果たす役割を裏づけている。注目すべきことに、ヒスチジンもしくはその分解生成物（すなわち、ウロカニン酸及びグルタミン酸）、又は構造的に類似する細菌代謝産物のインドールプロピオン酸のどちらも、ｐ６２又はＳ６Ｋ１をリン酸化しなかった（図７ｃを参照のこと、図７ｃでは、イミダゾールプロピオン酸の特異性が強調される）。
【０１６５】
代替ｐ３８  ＭＡＰＫはイミダゾールプロピオン酸誘発のシグナル伝達を促進させる
最近の研究では、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８δが、ｐ６２／ｍＴＯＲＣ１のアミノ酸誘発活性化を媒介するために要求されることが報告された。したがって、ｐ３８δもまた、ｐ６２／ｍＴＯＲＣ１のイミダゾールプロピオン酸誘発活性化に関与するかどうかを調べた。ｐ３８δは、哺乳動物細胞に存在する４つのｐ３８  ＭＡＰＫイソ型の１つであり、これらのイソ型は、ｐ３８α／ｐ３８β及びｐ３８γ／ｐ３８δ（これは代替ｐ３８  ＭＡＰＫとも呼ばれる）の２つのサブセットに分けることができる。ｐ３８γ／ｐ３８δではなく、ｐ３８α／ｐ３８βが、ピリジニルイミダゾール系阻害剤のＳＢ２０２１９０３７によって阻害され、これに対して、ＢＩＲＢ７９６はｐ３８サブファミリー全体を阻害する。今回、ＳＢ２０２１９０ではなくＢＩＲＢ７９６がｐ６２及びＳ６Ｋ１のイミダゾールプロピオン酸誘発リン酸化を阻害することが示され（図７ｄを参照のこと）、このことは、ｐ３８α／ｐ３８βではなく、ｐ３８γ／ｐ３８δがイミダゾールプロピオン酸の下流側標的であることを示した。
【０１６６】
ｐ３８δ又はｐ３８γがイミダゾールプロピオン酸誘発のｐ６２／ｍＴＯＲＣ１活性化に関与しているかどうかを明らかにするために、ｓｉＲＮＡを使用して、これら２つのイソ型を別々にノックダウンした。ｐ３８δのノックダウンは、ｐ６２及びＳ６Ｋ１のリン酸化に対する小さい阻害作用を有しただけであり、イミダゾールプロピオン酸との１時間にわたるインキュベーションによって誘発されるＩＲＳ１リン酸化には影響を与えなかった（図７ｅ及び図８ａを参照のこと）。対照的に、ｐ３８γのノックダウンは、ｐ６２、Ｓ６Ｋ１、ＩＲＳ１  Ｓ６３６／Ｓ６３９、及びＡｋｔのイミダゾールプロピオン酸誘発リン酸化をほぼ完全に阻止した（図７ｅ及び図８ｂを参照のこと）。以前の研究では、ｐ３８γ／ｐ３８δが、リン酸化することによって、したがって、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の阻害剤（ＤＥＰドメイン含有ｍＴＯＲ相互作用タンパク質（ＤＥＰＴＯＲ））の分解を促進させることによって、ｍＴＯＲ活性化を促進させることが報告された。しかしながら、ＤＥＰＴＯＲレベルが、コントロールｓｉＲＮＡ又はｐ３８δ／ｐ３８γ  ｓｉＲＮＡのいずれかによりトランスフェクションされた細胞ではイミダゾールプロピオン酸によって影響されないことが示された（図７ｅを参照のこと）。
【０１６７】
ｐ３８γのノックダウンはイミダゾールプロピオン酸誘発のシグナル伝達を妨げたので、次に、イミダゾールプロピオン酸はｐ３８γのキナーゼ活性を直接に活性化することができるであろうかを検討した。インビトロキナーゼアッセイを行うことによって、Ｔ２６９及びＳ２７２でのｐ６２リン酸化が５０μＭのＡＴＰの存在下においてｐ３８γによって誘発され、このことが２００μＭのＡＴＰによりさらに増大することが示された（図７ｆを参照のこと）。重要なことに、イミダゾールプロピオン酸はｐ６２リン酸化を濃度依存的様式で増強し（図７ｆを参照のこと）、このことは、イミダゾールプロピオン酸はｐ３８γを直接に活性化することができるであろうことを示した。
【０１６８】
ｐ３８γを含むｐ３８ＭＡＰＫの活性化は、上流側のキナーゼによるＴ１８０／Ｙ１８２でのリン酸化によって媒介されることが知られている。ＡＴＰ自体はｐ３８γ自己リン酸化を誘発しなかった。しかしながら、驚くべきことに、イミダゾールプロピオン酸はＡＴＰと一緒になって、ｐ３８γ自己リン酸化を誘発した。上流側のキナーゼにより媒介されたｐ３８リン酸化は、ｐ３８を活性化するための従来の機構であるにもかかわらず、ｐ３８は自己リン酸化することができ、したがって、自身を活性化することができることを裏づける研究が行われてきている。
【０１６９】
Ａｋｔ  Ｓ４７３及びＡｋｔ  Ｔ３０８
Ａｋｔキナーゼは、残基Ｓ４７３及び残基Ｔ３０８の両方がリン酸化されたときに完全に活性化され得る。しかしながら、インスリン刺激されたＡｋｔ  Ｔ３０８リン酸化ではなく、インスリン刺激されたＡｋｔ  Ｓ４７３リン酸化を肝臓又は脂肪において特異的に除くことが、耐糖能を損なうために十分であり、このことは、Ａｋｔ  Ｓ４７３リン酸化が、インスリンの有益な応答を媒介することにおいて重要であることを示唆する。対照的に、Ａｋｔ  Ｓ４７３リン酸化ではなく、Ａｋｔ  Ｔ３０８リン酸化が、急性骨髄性白血病患者の生存、及びヒト非小細胞肺ガンにおけるＡｋｔキナーゼ活性と相関づけられており、このことはおそらくは、細胞成長及び生存を媒介することにおけるそのＡｋｔ  Ｔ３０８を示唆する。イミダゾールプロピオン酸はＳ４７３及びＴ３０８での基礎的Ａｋｔリン酸化を初代肝細胞において増大させた（図３ｅ）。しかしながら、Ｓ４７３でのインスリン誘発のＡｋｔリン酸化は、おそらくは低下したＩＲＳ１チロシンリン酸化のために、イミダゾールプロピオン酸にさらされる初代肝細胞では低くなっていた（図３ｅ）。
【０１７０】
ロイシンとの比較
ロイシンは、アミノ酸感知経路におけるｍＴＯＲＣ１の強力な活性化剤の１つである。ロイシン誘発のｍＴＯＲＣ１活性化はアミノ酸の非存在下において迅速であり（１５分以内）、しかし、一過性であった。対照的に、イミダゾールプロピオン酸誘発のｍＴＯＲＣ１活性化は３０分のインキュベーションまでは認められず、しかし、２時間の処置の後では強くなっていた。アミノ酸の非存在下において、ｍＴＯＲＣ１は細胞質に局在化し、アミノ酸誘発のｍＴＯＲＣ１活性化のためのすべての機構が見出されるリソソームには局在化していない６。アミノ酸の存在下において、イミダゾールプロピオン酸はまた、おそらくはリソソームにおける事前に局在化したｍＴＯＲＣ１に起因して、Ｓ６Ｋ１リン酸化をインキュベーションの３０分以内に誘発した。このことは、イミダゾールプロピオン酸は、ｍＴＯＲＣ１をリソソームに動員することにおいてアミノ酸ほど効率的でないかもしれないことを示唆する。
【０１７１】
ｍＴＯＲＣ１に対するイミダゾールプロピオン酸の特異性及びＡｋｔの調節におけるイミダゾールプロピオン酸の特有の特性
イミダゾールプロピオン酸はアミノ酸感知経路を活性化するので、ｍＴＯＲ調節に対するその影響をさらに調べた。ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲのＳ２４４８及びＳ２４８１のリン酸化は、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２に関連することがそれぞれ知られている７。（Ｒａｐｔｏｒ免疫沈降によって単離される）ｍＴＯＲＣ１におけるｍＴＯＲ  Ｓ２４４８リン酸化がイミダゾールプロピオン酸又はアミノ酸によって強く誘発され、しかし、ｍＴＯＲＣ１におけるｍＴＯＲ  Ｓ２４８１リン酸化のためではなかった。しかしながら、（Ｒｉｃｔｏｒ免疫沈降法によって単離される）ｍＴＯＲＣ２におけるｍＴＯＲのＳ２４４８リン酸化又はＳ２４８１リン酸化はイミダゾールプロピオン酸による影響を受けず、また、Ａｋｔに対するインビトロｍＴＯＲＣ２キナーゼ活性もイミダゾールプロピオン酸によって変化しなかった。これらのデータから、イミダゾールプロピオン酸は、ｍＴＯＲＣ１経路に対する特異性がｍＴＯＲＣ２経路よりも大きいことが示唆される。
【０１７２】
アミノ酸はＡｋｔリン酸化を誘発することができないため、イミダゾールプロピオン酸はアミノ酸とは異なっていた。また、インスリンはアミノ酸の非存在下においてｍＴＯＲＣ１を活性化することができないので、イミダゾールプロピオン酸はインスリンとは異なっていた。Ａｋｔはアミノ酸の存在下ではｍＴＯＲＣ１についての上流側の活性化剤である。したがって、Ａｋｔのイミダゾールプロピオン酸誘発の基礎的活性化がｍＴＯＲＣ１活性化の原因であるかどうかを明らかにした。Ａｋｔの高選択的アロステリック阻害剤（ＭＫ２２０６）は、イミダゾールプロピオン酸誘発のＡｋｔ活性化を効率的に阻止し、しかし、イミダゾールプロピオン酸誘発のＳ６Ｋ１リン酸化には影響しなかった。このことは、ｍＴＯＲＣ１及びＡｋｔがイミダゾールプロピオン酸によって無関係に活性化され得ることを示唆する。しかしながら、アミノ酸の存在下では、Ａｋｔは、イミダゾールプロピオン酸誘発のＳ６Ｋ１リン酸化におけるＭＫ２２０６媒介阻害によって示されるｍＴＯＲＣ１の上流側調節因子として作用することができる。これらのことから、イミダゾールプロピオン酸はそのシグナル伝達において特有の性質を有することが示唆される。
【０１７３】
ＩＲＳに対するイミダゾールプロピオン酸の詳細な作用
ｍＴＯＲＣ１媒介のＩＲＳのセリンリン酸化は十分に研究されているにもかかわらず、ｍＴＯＲＣ１自身又はｍＴＯＲＣ１活性化Ｓ６Ｋ１がこの事象の原因であるかどうかは明らかではなかった。したがって、ｍＴＯＲＣ１又はＳ６Ｋ１を、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｉＲＮＡ又はＳ６Ｋ１  ｓｉＲＮＡを介してそれぞれ枯渇させた。これらは、Ｒａｐｔｏｒサイレンシングが、ＩＲＳ  Ｓ６３６／Ｓ６３９リン酸化の阻害と、ＩＲＳ移動度シフトの部分的阻止とを引き起こしたので、ｍＴＯＲＣ１がＩＲＳのイミダゾールプロピオン酸誘発調節の原因であることを示した。イミダゾールプロピオン酸がＩＲＳ  Ｓ６３６／Ｓ６３９リン酸化及びユビキチン化を引き起こすことが明らかにされたにもかかわらず、このＳ６３６／Ｓ６３９リン酸化がユビキチン化の原因であるかどうかをさらに調べる必要がある。また、イミダゾールプロピオン酸がＩＲＳの他の調節を誘発し得ることも依然として可能である。
【０１７４】
本研究において、本発明者らは、２型糖尿病の患者において増大する、微生物によりアップレギュレーションされたヒスチジン由来代謝産物としてイミダゾールプロピオン酸を特定した。本発明者らはまた、イミダゾールプロピオン酸処置がマウスにおいて耐糖能を損ない、低下したＩＲＳタンパク質レベルをもたらすことを明らかにした。加えて、本発明者らは、可能性のあるシグナル伝達経路を調べ、イミダゾールプロピオン酸が、（１）ＩＲＳタンパク質をリン酸化し、かつ、それによってＩＲＳタンパク質を分解のために標的とする代替ｐ３８  ＭＡＰＫ／ｍＴＯＲＣ１を活性化すること、そして、（２）基礎的Ａｋｔ活性化を、インスリンに対する応答性をさらに低下させるかもしれないｐ３８γを介して促進させることを示すための証拠を提供する（図７ｇを参照のこと）。
【０１７５】
イミダゾールプロピオン酸が門脈血及び末梢血において類似した濃度で存在するという本発明者らの所見は、この代謝産物が代謝されず、したがって、直接的な全身影響を有し得るであろうことを示している。高インスリン血症及びＢＣＡＡが、基礎的Ａｋｔ及びｍＴＯＲＣ１活性化にそれぞれ影響を及ぼすことによってインスリン抵抗性の一因となっていることが示唆されている。しかしながら、インスリンレベルが２型糖尿病の後期段階では低下しており、そして、ＢＣＡＡがインスリン抵抗性及び２型糖尿病の原因因子であるかどうかは依然として不明である（ＢＣＡＡそのものではなく、むしろ、毒性のＢＣＡＡ代謝産物が代謝症候群の一因となっているようである）。本発明者らの研究において特定されるイミダゾールプロピオン酸シグナル伝達経路は、基礎的Ａｋｔ及びｍＴＯＲＣ１の活性化がどのように代謝症候群の発症の一因となり得るであろうかを説明するために役立つ。さらに、イミダゾールプロピオン酸の標的として広範囲の組織発現を有する代替ｐ３８  ＭＡＰＫが特定された。ｐ３８γ及びｐ３８δはともに、耐糖能障害を含む様々な病理学的状態に関係している。イミダゾールプロピオン酸はインビトロにおいてｐ３８キナーゼ活性を変化させたので、イミダゾールプロピオン酸は潜在的には、他の関連したキナーゼに影響を及ぼし、そして、ｍＴＯＲＣ１に加えて下流側のシグナル伝達経路を活性化するであろう。
【０１７６】
ウロカニン酸及びグルタミン酸の生成を引き起こすヒスチジン分解経路が細菌及びヒトの両方において十分に保存されている。しかしながら、細菌型ウロカニン酸レダクターゼ（ｕｒｄＡ）（これはウロカニン酸からイミダゾールプロピオン酸の生成を触媒する）は最近になって特定されたばかりである。配列同一性が３０％を超えるｕｒｄＡホモログがヒトゲノムにおいて何ら特定されず、このことから、イミダゾールプロピオン酸が微生物により産生されるという考えがさらに裏づけられた。８１２個のＵｒｄＡホモログが細菌ゲノムにおいて予測され、そして、保存された「Ｈ」ではなく、「Ｙ」又は「Ｍ」をＦＡＤ活性部位に有する細菌がイミダゾールプロピオン酸を生成し得るであろうことが示された。試験された、「Ｙ」又は「Ｍ」−ＵｒｄＡホモログを有する細菌の中でも、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）及びエガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）が、健常者コントロールと比較して、２型糖尿病罹患被験者では高まっていることが報告されている。注目すべきことに、ラクトバシラス・パラプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）がイミダゾールプロピオン酸産生細菌として特定された。なお、この細菌は、肥満に対するラクトバシラス属の、議論の余地がある役割と、２型糖尿病における増大した存在量とを考慮すると、潜在的な臨床的重要性を有するであろう。
【０１７７】
食物繊維由来の微生物代謝産物（例えば、酪酸及びプロピオン酸など）が腸において大量に産生されるにもかかわらず、それらは末梢血には低濃度で存在するだけであり、したがって、腸におけるホルモン系及び神経系を介して間接的に宿主代謝に対する影響を媒介する可能性が高い。対照的に、コリン由来の微生物代謝産物（ＴＭＡ及びＴＭＡＯ）の循環レベルは、心臓血管疾患をヒトにおいて予測することが示されており、このことは、それらが全身的に直接的影響によって有害な影響を有することを示唆する。しかしながら、微量アミン関連受容体５がＴＭＡの標的として示唆されているにもかかわらず、その発現は嗅覚ニューロンに限定されており、したがって、ＴＭＡ／ＴＭＡＯの直接的な標的は不明のままである。イミダゾールプロピオン酸が門脈血及び末梢血において類似したレベルで存在するという本発明者らの所見は、この代謝産物もまた、直接的な全身影響を有し得るであろうことを示している。さらに、広範囲の組織発現を有する代替ｐ３８  ＭＡＰＫがイミダゾールプロピオン酸の標的として特定された。ｐ３８γ及びｐ３８δはともに、耐糖能障害を含む様々な病理学的状態に関係しており、したがって、本明細書中において示されるようなイミダゾールプロピオン酸によって誘発されるシグナル伝達経路を特定することは、インスリン抵抗性及び２型糖尿病に取り組むための新規な薬物標的を明らかにするための基礎を形成し得るであろう。さらに、微生物ＴＭＡリアーゼの非致死的阻害によってアテローム性動脈硬化を処置するための最近記載された戦略に従うと、本発明者らの知見は、特定のイミダゾールプロピオン酸産生細菌又はイミダゾールプロピオン酸を産生する細菌酵素を標的とすることが２型糖尿病のための可能性のある治療戦略となることを示唆する。
【０１７８】
方法
ヒト研究集団
２つのヒトコホートを本研究において使用した。第１のコホートは、Ｓｌｏｔｅｒｖａａｒｔ病院（アムステルダム、オランダ）で腹腔鏡下Ｒｏｕｘ−ａｎｄ−Ｙ胃バイパス手術を順次受ける５名の２型糖尿病罹患の肥満被験者及び１０名の２型糖尿病非罹患のＢＭＩ一致被験者を含んでいた（表２を参照のこと）。被験者は手術の朝まで一晩絶食させられ、末梢静脈サンプルを、患者が手術室に入る直前に採取した。人体計測測定値及び便サンプルもまた手術前に得た。手術中に、門脈サンプル（静脈穿刺）を前述［１］のように採取した。空腹時血糖（グルコース計（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって）、インスリン（電気化学発光免疫アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）によって）及びＨｂＡ１ｃ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を末梢血において測定した。すべての参加者がインフォームドコンセントを手術前に与え、プロトコルがＳｌｏｔｅｒｖａａｒｔ病院（アムステルダム、オランダ）の医療倫理委員会によって承認された。
【０１７９】
第２のコホートは当初は５８４名の被験者を含んでおり、その後、年齢が５０歳〜６４歳であり、イェーテボリ地域（スウェーデン）に住む成人の無作為選択された集団サンプルからの６４９名の被験者に拡張された。これらの被験者は国勢調査登録簿から募集された。除外基準が、既知の糖尿病、炎症性疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ性疾患など）、ステロイド又は免疫調節薬による処置、ガン（再発が過去５年間にわたってない場合は除く）、認知機能不全であった。７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を一晩の絶食の後での午前中に行い、空腹時及び負荷後２時間の毛細管血中グルコースを測定した。２型糖尿病についての基準を満たす被験者を、ＯＧＴＴを３週間以内に繰り返すことにより再検査した。被験者は、下記の事象を有することが見出された場合に研究に含まれた：空腹時血糖異常（ｎ＝１１９）、耐糖能障害（ｎ＝１４２）又は２型糖尿病（ｎ＝２０／ｎ＝５３）。加えて、およそ５名毎に、正常な耐糖能を有する被験者が含まれた（ｎ＝３０３／ｎ＝３３５）。血液サンプルを参加者の全員から得た。検査をＷａｌｌｅｎｂｅｒｇ研究所（イェーテボリ大学、スウェーデン）で行った。すべての参加者がインフォームドコンセントを与え、研究はイェーテボリ大学倫理委員会によって承認された。
【０１８０】
マウス
１５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪのＧＦマウス又はＣＯＮＶＲマウスを動物実験のすべてのために使用した。ＧＦマウスを、厳密な１２時間の光周期のもと、柔軟な薄膜隔離飼育器において維持した。ＧＦ状態を、プライマー２７Ｆ（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’、配列番号１９）及びプライマー１４９２Ｒ（５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ−３’、配列番号２０）を使用する細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡについてのＰＣＲによって定期的に確認した。ＰＣＲ反応を、９５℃での５分間のプレインキュベーション、続いて、９４℃での３０秒間、５２℃での４５秒間、及び７２℃での９０秒間の３０サイクルにより行い、その後、ＰＣＲ反応を７２℃で７分間保った。すべてのマウスには、オートクレーブ処理された固形飼料（Ｌａｂｄｉｅｔ）を自由に摂らせた。微生物代謝産物を測定するために、血液を４時間の絶食の後でＧＦマウス及びＣＯＮＶＲマウスの門脈及び大静脈から採取した。
【０１８１】
グルコース代謝に対するイミダゾールプロピオン酸の影響を調べるために、１％のＤＭＳＯを含有する２００μｌの水における５００μｇのイミダゾールプロピオン酸、又はビヒクル（１％のＤＭＳＯ水溶液）を３日間にわたって１日に２回、ＧＦマウスに腹腔内注射した。ＣＯＮＶＲマウスについては、ＣＯＮＶＲマウスは微生物代謝産物に継続的にさらされ、また、ＧＦマウスと比較して、有機溶質のより長い滞留時間を有するので、１００μｇのイミダゾールプロピオン酸を使用した。その後、腹腔内ブドウ糖負荷試験（１ｋｇの体重あたり１ｇのグルコースを使用する）を４時間の絶食の後で行った。血中グルコースレベルを、ＨｅｍｏＣｕｅ２０１＋分析計（ＨｅｍｏＣｕｅ、エンゲルホルム、スウェーデン）を使用して尾血から測定した。肝臓及び血漿サンプルを４時間の絶食の後で集めた。マウスをイソフルラン麻酔下に置き、頸椎脱臼によって絶命させた。新鮮な肝臓を採取し、液体窒素で急速凍結し、タンパク質抽出まで−８０℃で貯蔵した。
【０１８２】
ＣＯＮＶＲマウスに対するイミダゾールプロピオン酸の代謝的影響を評価するために、食物摂食量、酸素消費量及び自発運動活動を、ＰｈｅｎｏＭａｓｔｅｒシステム（ＴＳＥ  ｓｙｓｔｅｍｓ、バートホンブルグ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して測定した。マウスを２日間にわたって単独収容し、その後、ＰｈｅｎｏＭａｓｔｅｒケージに移し、さらに２日間を新しいケージに慣れさせ、その後、測定を行った。様々なパラメーターを５日間にわたって１５分毎に自動測定した。測定期間中、マウスは水及び食物を自由に摂った。マウスを無作為に２つの体重一致群に分け、イミダゾールプロピオン酸（１００μｇ）又はビヒクルのどちらかを３日間にわたって１日に２回（午前８時及び午後５時）、腹腔内注射した。酸素消費量（ＶＯ２）を、サンプルケージと比較して、参照ケージにおける酸素濃度及び二酸化炭素濃度の測定値から計算した。酸素消費量及びエネルギー消費の測定値を、ＭＲＩ（ＥｃｈｏＭＲＩ、ヒューストン、ＴＸ州、米国）によって求められる除脂肪体重に対して調節した。
【０１８３】
すべてのマウス実験が本発明者らの動物施設において行われ、イェーテボリ（スウェーデン）における動物管理使用に関する倫理委員会によって承認された。
【０１８４】
代謝産物分析
（１）２型糖尿病罹患の肥満者及び２型糖尿病非罹患の肥満者からの門脈血、ならびに（２）Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＧＦマウス及びＣＯＮＶＲマウスの門脈及び大静脈からの血液に対する包括的代謝産物プロファイリング分析が、超高速液体クロマトグラフィー及び質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用してＭｅｔａｂｏｌｏｎ（ダーラム、ＮＣ州）によって行われた。簡単に記載すると、サンプルが、自動化されたＭｉｃｒｏＬａｂ  ＳＴＡＲ（登録商標）システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して調製された。回収標準物が品質管理のために抽出プロセスにおける最初の工程の前に加えられた。タンパク質が、２分間にわたる激しい振とうのもと（Ｇｌｅｎ  Ｍｉｌｌｓ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０００）、メタノールにより沈殿させられ、その後、遠心分離が行われた。得られた抽出物が５つの画分に分けられた：１つが、陽イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を用いたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析のためであり、１つが、陰イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を用いたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析のためであり、１つがＬＣ極性プラットフォームのためであり、１つがＧＣ−ＭＳによる分析のためであり、そして、１つのサンプルがバックアップのために残された。サンプルは、有機溶媒を除くために短時間、ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）に置かれた。ＬＣのために、サンプルは、分析のための調製の前に窒素下で一晩貯蔵された。ＧＣのために、それぞれのサンプルが、分析のための調製の前に一晩、真空下で乾燥された。
【０１８５】
イミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸の標的化測定のために、血漿サンプルが１．５ｍｌのポリプロピレンチューブにおいて３体積の氷冷アセトニトリルにより抽出され、窒素流下で乾燥させられた。サンプルはその後、５％ＨＣｌ／ｎ−ブタノールにより７０℃で１時間にわたって再構成され、これにより、ｎ−ブチルエステルを形成させた。誘導体化後、サンプルはエバポレーションされ、５０ｎＭの内部標準物（ｄ１０標識化ブタノールを使用する誘導体化から作製される標識されたイミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸）を含有する１００μｌの水／アセトニトリル（９０：１０）において再構成された。サンプル（５μｌ）が、０．１％ギ酸を含む水（Ａ相）と、０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ相）とからなるグラジエントを使用して、Ｃ１８  ＢＥＨカラム（１．７μｍの粒子を含む２．１×１００ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、ＭＡ州）に注入された。質量分光分析が、ＱＴＲＡＰ  ５５００（ＡＢＳｃｉｅｘ、コンコード、カナダ）に連結されるＩｎｆｉｎｉｔｙ  １２９０四連ＵＰＬＣポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、ＣＡ州）を使用して行われた。イミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸が、遷移１９７／８１及び遷移１９５／９３をそれぞれ使用する多重反応モニタリングによって検出された。内部標準物のために、遷移２０６／８１及び遷移２０４／９３が使用された。イミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸の校正曲線が水において作製され、サンプルと同じように処理された。
【０１８６】
インビトロ腸シミュレーター
模擬されたヒト腸レドックスモデル（ＳＨＩＲＭ）を、イミダゾールプロピオン酸が微生物産生の代謝産物であり得るであろうかどうかを直接的に調べるために使用した。ＳＨＩＲＭは、ＣＭＩ−７０００Ｓメンブラン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＮＪ州）によって隔てられ、窒素及び酸素がそれぞれ連続してパージされる嫌気性管腔チャンバー及び酸素供給装置を有する２チャンバー発酵槽である。酸素チャンバーは１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を含有した。管腔チャンバーのための供給物は、（ｇ／ｌで）アラビノガラクタン（１．０）、ペクチン（２．０）、キシロース（１．５）、デンプン（４．０）、グルコース（０．４）、酵母エキス（３．０）、ペプトン（３．０）、ＩＩ型ムチン（４．０）及びシステイン（０．５）からなった。消化過程を模擬するために、供給物を、６Ｍ  ＨＣｌにより２前後のｐＨに酸性化し、模擬膵液［（ｇ／ｌで）ＮａＨＣＯ３（１２．５）、Ｏｘ胆胆汁酸塩（６．０）及びパンクレアチン（０．９）］によりｐＨ６．９に中和した。管腔チャンバーには、ＳＨＩＲＭ供給物（上記で記載される供給物及び膵液の７０：３０混合物）が、２４時間前後の滞留時間を与える速度で連続的に与えられ、ｐＨを、ｐＨ制御装置及び投与ポンプ（Ｂｌａｃｋ  Ｓｔｏｎｅ  ＢＬ７９１２、Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用して６．６〜６．９で維持した。
【０１８７】
ＳＨＲＩＭシステムに、（第１のコホートからの）１名の２型糖尿病罹患の肥満者及び１名の２型糖尿病非罹患者からの便のアリコートを接種した。前培養物を、（ｇ／ｌで）酵母エキス（５）、セロビオース（１）、マルトース（１）、システイン（０．５）及びヘミン（０．０１）を含有する５ｍｌのブレーン・ハート・インフュージョン培地に２％の便物質を加えることによってＣｏｙチャンバーにおいて嫌気的（５％水素、１０％二酸化炭素及び８５％窒素）に調製した。前培養物を３７℃で３時間インキュベーションし、２％の前培養物をＳＨＲＩＭの管腔区画に播種した。管腔群集をヒスチジン暴露前の１週間にわたって安定化させた。サンプルを７時間までの間にわたって集め、イミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸のレベルを上記のように測定した。
【０１８８】
便サンプルの回分培養
（第１のコホートからの）２型糖尿病罹患ドナー及び２型糖尿病非罹患ドナーからの便サンプル（１００ｍｇ）を５ｍｌのＢＨＩ培地（上記の通り）に接種し、Ｃｏｙチャンバーにおける厳密な嫌気性条件のもと、３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、１％（ｖ／ｖ）のそれぞれのＢＨＩ前培養物を、１０ｍＭのヒスチジンが補充されるＳＨＩＲＭ供給物（上記）に接種した。３６時間のインキュベーションの後、上清をイミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸の定量のために使用した。消費されたウロカニン酸のレベルを、産生されたイミダゾールプロピオン酸のレベルを調整するために使用し、０時間に対する対数変換された変化倍数を、これらの調整された値を使用して計算した。
【０１８９】
ＵｒｄＡ含有細菌のコンピューター予測及び実験的検証
ＵｒｄＡは、フマル酸レダクターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アスパラギン酸オキシダーゼのＦＡＤ結合ドメイン及びＦＭＮ結合ドメインに対するその高い配列相同性のために、フマル酸レダクターゼをコードすると以前には予測されていた。しかしながら、ＵｒｄＡからのＦＡＤ結合ドメインの構造モデリングにより、フマル酸レダクターゼにおけるアミノ酸配列からのアミノ酸配列における違いで、ウロカニン酸に対する基質選択性を与える可能性がある違いが特定された。可能性のあるイミダゾールプロピオン酸産生細菌についてスクリーニングするために、シェワネラ・オネイデンシス由来のフマル酸レダクターゼにおいて保存されており、しかし、可能性のあるＵｒｄＡでは置換されているアミノ酸配列に注目した。酵素の活性部位における保存された「Ｈ」は様々な酵素における触媒作用のために重要であるので４〜６、ＵｒｄＡのＦＡＤ活性部位におけるチロシン３７３（Ｙ３７３）に注目した（Ｙ３７３はフマル酸レダクターゼにおけるヒスチジン（Ｈ）に対応する）。広範囲にわたるタンパク質スクリーニング、続いての正確なドメインアラインメントにより、８１２個のＵｒｄＡホモログが６７０種の細菌ゲノムにおいて存在することが確認された。それらのうち、６３９個が、「Ｈ」残基をその活性部位に有することが確認された；これに対して、１７３個が非「Ｈ」残基（例えば、「Ｙ」又は「Ｍ」など）を有する。
【０１９０】
Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１由来のＵｒｄＡに対する高い同一性を有する２７種のシードタンパク質配列（ＫＥＧＧアノテーション７由来の２２種を含む）を、４８９３種の細菌ゲノムから引き出される１６，４０３，８８８個のタンパク質の中での可能性のあるＵｒｄＡホモログをスクリーニングするために使用した。これらのデータをＮＣＢＩのｆｔｐサイト（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／）から２０１６年６月２６日にダウンロードした。６５８個のタンパク質ヒットが、ＢＬＡＳＴＰプログラムを（Ｅ値＝１ｅ−４；同一性＝３０％；カバー範囲＝７０％の設定により）使用して特定され、それらのヒットを、（少なくとも５０％のカバー範囲、及び２００を超えるスコアとともに）２回目のタンパク質ＢＬＡＳＴ及びＨＭＭプロファイリングの両方を行うためのシードとしてさらに使用し、これにより、２２３０個及び２５２６個のタンパク質ヒットがそれぞれもたらされた。すべての特定されたＵｒｄＡ候補に対するさらなるＰｆａｍドメインスキャン１０により、１７７４個の配列がＦＡＤドメインを有することが明らかにされた。このように、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１由来のＵｒｄＡのＦＡＤ活性部位（Ｙ３７３の上流側及び下流側の３０アミノ酸にまで及ぶ）を取り出し、３回目のタンパク質ＢＬＡＳＴを、取り出されたＹ３７３含有ドメインをクエリー配列として使用して、１７７４個のＦＡＤ含有ヒットに対して行った。８１２個のタンパク質ヒットが、最終的なＵｒｄＡホモログとして特定された。さらなるドメインアラインメントを、対応する活性部位に注釈を付けるためにＣｌｕｓｔａｌＸを使用して行った。
【０１９１】
８種の代表的なＵｒｄＡ含有細菌株（これらは保存された「Ｈ」を有していない）をさらに、（保存された「Ｈ」を有する）コントロールとしての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｋ１２及びビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＣＣ２７０５と一緒に純粋培養物における実験的検証に供した。最尤系統樹は、デフォルト設定によるＭＥＧＡ（バージョン７）を使用して１０種すべての細菌からの取り出されたＦＡＤドメインに基づいた。
【０１９２】
純粋細菌培養物のイミダゾールプロピオン酸生成能を評価するために、すべての菌株をＣｏｙチャンバーにおける厳密な嫌気性条件（５％水素、１０％二酸化炭素及び８５％窒素）のもと、３７℃で、ヒスチジン又はウロカニン酸を伴わないＢＨＩ培地（上記の通り）で維持した。イミダゾールプロピオン酸を産生するそれらの潜在能力を調べるために、それぞれの細菌株の単一コロニーをＢＨＩ培地に接種し、一晩のインキュベーションの後、１％の前培養物を、１０ｍＭのヒスチジン又はウロカニン酸が補充されるＢＨＩ培地に接種し、２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、無細胞上清をイミダゾールプロピオン酸の定量のために使用した。
【０１９３】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析
マウス肝臓を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を使用して、β−メルカプトエタノールを含むＲＬＴ緩衝液においてホモジナイズした。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ州、米国）を製造者のプロトコルに従って使用してｃＤＮＡを合成するために逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ州、米国）を使用して行った。
Ｌ３２：５’−ＣＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＡＧＴＴＴ−３’（配列番号２）；
Ｐｅｐｃｋ：５’−ＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号４）；
Ｇ６ｐアーゼ：５’−ＣＴＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡ−３’（配列番号５）及び５’−ＧＡＣＣＡＴＡＡＣＡＴＡＧＴＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号６）；
Ｆａｓｎ：５’−ＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＧＴＣＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＴＣＡＧＡＧＡＣＧＴＧＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号８）；
Ｓｒｅｂｐ１ｃ：５’−ＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＴＧＡ−３’（配列番号９）及び５’−ＣＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＴＣＡ−３’（配列番号１０）；
Ｉｒｓ１：５’−ＧＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＣ−３’（配列番号１１）及び５’−ＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＡＧＴＧＴＣＴ−３’（配列番号１２）；
Ｉｒｓ２：５’−ＴＣＣＣＡＣＡＴＣＧＧＧＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番号１３）及び５’−ＣＴＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＧＣＡ−３’（配列番号１４）。
【０１９４】
タンパク質抽出物の調製
急速凍結された肝臓及び採取された細胞を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭグリセロリン酸、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する緩衝液において溶解した。免疫沈降のために、細胞溶解物を、０．３％のＣＨＡＰＳを含有する溶解緩衝液において得て、超音波処理し、４℃で１５分間にわたって２０，０００ｇで遠心分離し、上清を、穏やかな撹拌のもと、４℃で４時間、２０μｌの抗ＦＬＡＧビーズ（Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションした。
【０１９５】
初代肝細胞
初代肝細胞を、以前に記載されたように（２）、肝臓をＩＶ型コラゲナーゼの灌流により消化することによってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離した。灌流後、１６×１０５個の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１００ｎＭデキサメタゾンが補充されるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２においてコラーゲン被覆の６０ｍｍディッシュに置床した。４時間後、培地を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換した。
【０１９６】
インスリン刺激のために、初代肝細胞を、１００μＭのイミダゾールプロピオン酸を伴う、又は伴わないＤＭＥＭ／Ｆ１２において１４時間〜２４時間培養し、指示された時間にわたって５ｎＭのインスリンにより処理した。アミノ酸欠乏のために、初代肝細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２において２４時間培養し、イーグル平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）により１回すすぎ、その後、ＥＢＳＳにおける１時間のインキュベーションを、１００μＭのイミダゾールプロピオン酸との指示された時間にわたるインキュベーションの前に行った。
【０１９７】
ＨＥＫ２９３細胞
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含む高グルコース（４．５ｇ／ｌのグルコース）ＤＭＥＭにおいて成長させ、維持した。すべてのＨＥＫ２９３細胞実験を血清飢餓かつアミノ酸枯渇の条件で行った。（示されるようなプラスミド又はｓｉＲＮＡによる）トランスフェクションの２４時間後、ポリ−Ｌ−リシン被覆の６０ｍｍディッシュで培養されるＨＥＫ２９３細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭにより２回すすぎ、血清非含有ＤＭＥＭにおいて１８時間インキュベーションした。その後、ＨＥＫ２９３細胞をＥＢＳＳにより１回洗浄し、ＥＢＳＳにおいて１時間インキュベーションした。インスリン刺激のために、血清飢餓かつアミノ酸飢餓のＨＥＫ２９３細胞をＥＢＳＳにおいて２時間又は８時間にわたってイミダゾールプロピオン酸とプレインキュベーションし、ＥＢＳＳにおいて５ｎＭのインスリンにより処理した。
【０１９８】
抗体及び試薬
ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３、Ｔ３０８）、ホスホ−Ｓ６Ｋ１（Ｔ３８９）、ホスホ−ＩＲＳ（Ｓ６３６／Ｓ６３９）、ホスホ−ｐ６２（Ｔ２６９／Ｓ２７２）、ホスホ−ｍＴＯＲ（Ｓ２４８１）、ｍＴＯＲ、ＤＥＰＴＯＲ、ｐ６２、ＩＲ、ＩＲＳ−２、ｐ３８γ、Ａｋｔ、ＧＡＰＤＨ及びアクチンに対する抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ダンバース、ＭＡ州）から購入した。抗ＩＲＳ−１をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ダルムシュタット、ドイツ）から得た。ｐ３８δ、Ｍｙｃ及びＨＡに対する抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ、ＣＡ州、米国）から入手した。抗ＦＬＡＧをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ州、米国）から購入した。抗ＬＡＭＰ２をＡｂｃａｍから得た（ａｂ２５６３１）。イミダゾールプロピオン酸（デアミノヒスチジン、ＣＡＳ  １０７４−５９−５、ｓｃ２９４２７６）、ウロカニン酸（４−イミダゾールアクリル酸、ＣＡＳ  １０４−８９−３、ｓｃ２１４２４６）、ヒスチジン（ＣＡＳ  ７１−００−１、ｓｃ３９４１０１）及びインドールプロピオン酸（ＣＡＳ  ８３０−９６−６、ｓｃ２５５２１５）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。グルタミン酸、インスリン及びＳＰ６００１２５をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ラパマイシン及びＢＩＲＢ７９６をＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから得て、ＢＩ７８Ｄ３をＴｏｃｒｉｓから入手した。
【０１９９】
プラスミド及びｓｉＲＮＡ
ＦＬＡＧ  ｍＴＯＲ及びＨＡ  Ｒａｐｔｏｒは厚意によりＳｕｎｇ  Ｈｏ  Ｒｙｕ博士（浦項工科大学校、浦項、韓国）によって提供された。Ｍｙｃ−Ｒａｇ  ＧＴＰアーゼ構築物はＤｏ−Ｈｙｕｎｇ  Ｋｉｍ博士（ミネソタ大学、ＭＮ州、米国）からの譲渡物であった。ＡｌｌＳｔａｒｓ陰性コントロールｓｉＲＮＡ、ｐ３８δ  ｓｉＲＮＡ１（ＣＣＧＧＡＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡ（配列番号１５）を標的とするＨｓ＿ＭＡＰＫ１３＿５）、ｐ３８δ  ｓｉＲＮＡ２（ＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＧＡＡ（配列番号１６）を標的とするＨｓ＿ＭＡＰＫ１３＿６）、ｐ３８γ  ｓｉＲＮＡ１（ＣＴＧＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴ（配列番号１７）を標的とするＨｓ＿ＭＡＰＫ１２＿５）、ｐ３８γ  ｓｉＲＮＡ２（ＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡ（配列番号１８）を標的とするＨｓ＿ＭＡＰＫ１２＿８）、ｐ３８α  ｓｉＲＮＡ（ＡＡＣＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＴＡＡＡＣＡＴＡ（配列番号２１）を標的とするＨｓ＿ＭＡＰＫ１４＿５）、ｐ３８β  ｓｉＲＮＡ（ＣＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＡ（配列番号２２）を標的とするＨｓ＿ＭＡＰＫ１１＿６）、Ｓ６Ｋ１  ｓｉＲＮＡ（ＧＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴ（配列番号２３）を標的とするＨｓ＿ＲＰＳ６ＫＢ１＿５）、及びＲａｐｔｏｒ  ｓｉＲＮＡ（ＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡ（配列番号２４）を標的とするＨｓ＿ＲＰＴＯＲ＿１）（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ州）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００を製造者の説明書に従って使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。
【０２００】
免疫蛍光
細胞をポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）被覆の４ウエル・チャンバースライドの上で成長させ、４％パラホルムアルデヒドにより３７℃で１５分間、固定処理し、その後、グリシン−ＰＢＳにより洗浄し、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により１０分間にわたって透過処理した。ＰＢＳにおける３％ＢＳＡによるブロッキング処理の後、細胞をｍＴＯＲ及びＬＡＭＰ２について染色した。画像を共焦点顕微鏡によって得た。
【０２０１】
ユビキチン化を検出するためのタンパク質抽出物の調製
細胞を、２％のＳＤＳを含有する１００μｌの緩衝液Ａを用いて変性条件下で溶解し、細胞溶解物を１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに移した。チューブをホットプレートに直ちに９５℃で１０分間置いた。細胞溶解物を超音波処理し、ＳＤＳを含まない７００μｌの緩衝液Ａを加えた。サンプルを４℃で３０分間インキュベーションし、その後、遠心分離を行った（２０，０００ｇ、２０分）。上清を、穏やかな撹拌のもと、４℃で４時間、２０μｌの抗ＦＬＡＧビーズ（Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションした。
【０２０２】
ｍＴＯＲＣ２キナーゼ活性アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞をｍＴＯＲＣ２活性アッセイのために１μｇのＨＡ  Ｒｉｃｔｏｒ及び０．５μｇのＦｌａｇ  ｍＴＯＲによりトランスフェクションし、０．３％のＣＨＡＰＳを含有する溶解緩衝液において溶解し、超音波処理し、４℃で１５分間にわたって２０，０００ｇで遠心分離し、上清を、穏やかな撹拌のもと、４℃で一晩、２μｇの抗ＨＡ抗体とインキュベーションした。その後、免疫複合体をプロテインＡ−セファロースビーズ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ、ニーダム、ＭＡ州）を用いて４℃で２時間にわたって集め、０．３％のＣＨＡＰＳを含有する溶解緩衝液により３回洗浄した。免疫沈降物を、キナーゼアッセイ緩衝液［１２．５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭベータ−グリセロール−リン酸、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ］において４５０ｎｇの不活性Ａｋｔ１（ａｂｃａｍ、ａｂ１１６４１２）と氷上で１０分間プレインキュベーションした。キナーゼ反応を、１００μＭのＡＴＰを３７℃で１５分間加えることによって開始させ、５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を加えることによって停止させた。
【０２０３】
インビトロキナーゼアッセイ
４００ｎｇの組換えｐ６２（Ａｂｃａｍ、ａｂ９５３２０）及び２００ｎｇの組換えｐ３８γ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１２５６５１）を、キナーゼアッセイ緩衝液［２５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１２．５ｍＭベータ−グリセロール−リン酸、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ  ＤＴＴ］において氷上で１５分間インキュベーションした。別個のチューブにおいて、キナーゼアッセイ緩衝液で希釈される１ｍＭのＡＴＰをＤＭＳＯ又はイミダゾールプロピオン酸とインキュベーションした（キナーゼ反応におけるＡＴＰの最終濃度は５０μＭ又は２００μＭであった）。キナーゼ反応を、ＤＭＳＯ又はイミダゾールプロピオン酸を伴うＡＴＰをｐ３８γ及びｐ６２の混合物に３０℃で１０分間加えることによって開始させ、５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を加えることによって停止させた。
【０２０４】
統計学的分析
ウィルコクソン順位和検定を使用して、門脈血における代謝産物は存在量が２型糖尿病罹患被験者と２型糖尿病非罹患被験者との間で異なるかどうかを調べた（非標的化メタボロミクス）。未処理のＰ値を、０．１のＦＤＲを用いてベンジャミニ・ホフバーグ法［３］によって調整した。クラスカル・ウォリス順位和検定、それに続くダネットの多重比較を、大規模なスウェーデン人コホートからの、耐糖能のレベルが異なる群の中におけるイミダゾールプロピオン酸の標的化比較のために使用した。交絡因子（ＢＭＩ、年齢及び性別）についての補正を伴う重回帰及び分散分析をこのより大規模なスウェーデン人コホートのために使用した。マウス及びヒトからの多数の測定値を含むデータセットの分析（門脈血及び大静脈血の血漿における代謝産物が比較される）を、反復測定による二元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を用いて行った。ウィルコクソン片側検定を、２型糖尿病関連の微生物叢がヒスチジンからより多いイミダゾールプロピオン酸を産生するかを確かめるために行った。チューキー検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを、３つ以上の群を比較するときには行った。種々の代謝産物の濃度又は明暗周期に依存するマウスの生理学（エネルギー消費又は自発運動活動）に対するイミダゾールプロピオン酸の影響の分析を、シダクの多重比較検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。それ以外の場合には、示されるように、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用した。
【０２０５】
上記の実施形態は、本発明の少数の例示的な例として理解されなければならない。様々な改変、組合せ及び変化が、本発明の範囲から逸脱することなく、上記の実施形態に対してなされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分解決策を、技術的に可能である場合には他の構成で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付された請求項によって規定される。
参考文献：
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【配列表フリーテキスト】
【０２０６】
配列表１〜１４  ＜２２３＞ＰＣＲプライマー
配列表１９〜２０  ＜２２３＞ＰＣＲプライマー
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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