(57)【要約】    第一態様では、本発明はFcRn受容体を過剰発現する癌型の同定に関する。第二態様では、前記癌型の治療に関する。別の態様では、本発明は炎症性疾患の亜型の同定とその治療に関する。追加の態様では、本発明はFcRn受容体を過剰発現する癌の生体内イメージングに関する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を亜型分類し、癌を病期診断し、そして／または癌を発症するリスクを予測する方法であって、
a) 対象由来の生物学的試料を提供し；
b) 前記試料中のFcRnレベルを決定し；そして
c) 前記決定されたレベルを参照レベルと比較する
ことを含み、
ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常の亜型／病期またはFcRnが下方制御された亜型／病期を示し；
そして／または
ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、癌を発症するリスクが高いことを示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、癌の発症の増加したリスクを示さない、
前記方法。
【請求項２】
FcRn結合剤による処置に対して感受性である癌を亜型分類／同定するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRn結合剤による処置に対して感受性である亜型／病期を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌型が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎明細胞癌、卵巣癌、頸癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌および耳鼻咽喉癌から成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、乳癌または結腸直腸癌を亜型分類するための方法であって、
1) 対象由来の乳癌試料または結腸直腸癌試料を提供し；
2) 前記試料中のFcRnレベルを測定し；
3) 前記測定されたレベルを参照レベルと比較する
ことを含み、
ここで前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常のまたはFcRnが下方制御された亜型を示す、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌型が乳癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌型が結腸直腸癌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が転移性癌組織、例えば転移性組織生検標本である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記参照レベルが、同型の１つの正常試料（非癌性）のFcRnレベルであるかまたは複数の正常試料からの平均レベルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記正常試料が前記生物学的試料の近隣組織に由来するか、または前記生物学的試料から遠位の組織に由来するものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的試料が、組織生検材料、血液、排せつ物（糞便）、尿、胸膜液、唾液、胆汁、気管支液、洗口液、腹水、膿、脳脊髄液、卵胞液、組織および粘液から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的試料が癌標本、例えば癌組織生検標本である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レベルがFcRn結合剤を用いて決定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記FcRn結合剤がWTアルブミン、アルブミン変異体、FcRn抗体、IgG類、ペプチドまたはタンパク質、および核酸、例えばアプタマーから成る群より選択され、好ましくは結合剤がアルブミンであり、より好ましくはアルブミン変異体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルブミン変異体が、アルブミンのWT型（配列番号１）よりも高いFcRnへの結合親和性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合剤が検出可能な標識を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な標識が放射性同位体、検出可能生成物をもたらす酵素、フルオロフォア、化学発光化合物、磁性粒子、ミクロ粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノスフェア、ビオチン、ストレプトアビジンおよびジゴキシンから選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌を亜型分類し、癌を病期診断し、そして／または癌を発症するリスクを予測することに使用するためのFcRn結合剤を含む組成物であって、
参照レベルと比較して生物学的試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常の亜型／病期またはFcRnが下方制御された亜型／病期を示し；
そして／または
参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、癌を発症するリスクが高いことを示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、癌の発症の増加したリスクを示さない、
前記組成物。
【請求項１９】
FcRn結合剤による処置に対して感受性である癌を亜型分類／同定するための、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRn結合剤による処置に対して感受性である亜型／病期を示す、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、結腸直腸癌または乳癌の亜型分類のために使用され、
ここで前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常の亜型を示す、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
FcRnを過剰発現している癌の治療に使用するための、治療薬に連結されたFcRn結合剤を含む組成物。
【請求項２３】
前記癌が乳癌および／または結腸直腸癌である、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
前記FcRn結合剤が融合、接合または会合により治療薬に連結される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
前記FcRn結合剤が、WTアルブミン、アルブミン変異体、FcRn抗体、IgG類、ペプチドまたはタンパク質、および核酸、例えばアプタマーから成る群より選択され、好ましくは結合剤がアルブミンであり、より好ましくはアルブミン変異体である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２６】
前記変異型HSAが、野生型HSAに比較して改善された１つ以上の薬物動態特性を有する、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
前記変異型HSAが、野生型HSAよりも長い半減期を有する、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２８】
前記アルブミン変異体が、WT型のアルブミンよりも高いFcRnに対する結合親和性を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２９】
前記アルブミン変異体が配列番号４と５から成る群より選択される、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３０】
前記治療薬が、放射性核種、抗癌剤、例えばアクチノマイシンＤ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アルカンスルホネート、アルケラン、アムサクリン、アナストロゾール、アントラシクリン、代謝拮抗物質、Ara-C、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ゲラン桿菌（Bacillus Calmette-Guerin：ＢＣＧ）、ビカルタミド（Bicalutamide）、BiCNU、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチナム、カルムスチン、CCNU、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムフェニコール、絨毛膜、シクロスポリン、シドフォビル、シスプラチン、クラドリビン、コールタール含有製品、コルチシン、CPT-11、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダナゾール、ダサチニブ、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ジエチルスチルベストロール、ジノプロストン、ジトラノール含有製品、ドセタキセル、ドキソルビシン、DTIC、デュタステリド、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エチレンイミン、エトポシド、エキセメスタン、フィナステリド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸類似体、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゴナドトロピン、ゴセレリン、ヘルセプチン、ヘキサメチルアミン、ホルモン剤、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシル酸塩、インターフェロン含有製品（ペグインターフェロンを含む）、イリノテカン、レフルノミド、レトロゾール、リュープロレリン酢酸塩、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メノトロピン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メフェプリストン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、メトトレキサート（MTX）、ミコフェノール酸モフェチル、ナファレリン、ナイトロジェンマスタード、ノトロソウレア、オストロゲン含有製品、オキサリプラチン、オキシトシン、パクリタキセル、パミドロネート、ペンタミジン、ペントスタチン、白金化合物、プリカマイシン、ポドフィリン、プロカルバジン、プロゲステロン含有製品、プリン類似体、ピリミジン類似体、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、リババリン、リツキシマブ、シロリムス、ステロイド、STI-571、ストレプトゾシン、シントシノン、シントメトリン、タクロリムス、タモキシフェン、タキサン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、テトラジン、タリドミド、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポイソメラーゼ阻害剤、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレオスルファン、トリフルリジン、トリメトレキサート、トリプトレリン、バルガンシクロビル、ビダラジン、ビンブラスチン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、キセロダおよびジドブジンから成る群より選択される、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３１】
医薬上許容される担体および／または希釈剤を更に含む、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３２】
対象におけるFcRnが上方制御された癌の生体内イメージング方法に使用するための、検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を含む組成物であって、前記方法が
a) 前記対象に、前記検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を投与し；そして
b) 前記対象をイメージングし、FcRnが上方制御された癌に結合している前記検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を検出する
ことを含む、前記組成物。
【請求項３３】
前記検出可能成分が、PETまたはSPECTを使ったイメージングに適当な放射性検出可能成分であるか、または例えば光学的もしくはMRIを使ったイメージングに有用な非放射性検出可能成分である、請求項３２に記載の使用のための組成物。
【請求項３４】
前記検出可能成分が、11Ｃ、15Ｏ、18Ｆ標識フルデオキシグルコース、64Ｃｕ、68Ｇａ、66Ｇａ、60Ｃｕ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、89Ｚｒ、124Ｉ、76Ｂｒ、86Ｙ、94mＴｃ、131Ｉ、G67Ｇａ、111Ｉｎ、123Ｉおよび99mＴｃからなる群より選択される放射性核種である、請求項３２または３３に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Fc受容体を過剰発現する腫瘍の同定に関する。特に、本発明はそのような腫瘍亜型の治療に関する。更に、本発明は、FcRn受容体を過剰発現している組織、例えば腫瘍または炎症組織の生体内（in vivo）イメージングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（HSA）は、血漿半減期約19日間を有する、多重リガンド結合部位をもつ天然の担体タンパク質であり、それはヒト新生児Fc受容体との相互作用により促進され、非常に魅力的な薬物送達（ドラッグデリバリー）技術として推奨される。HSAは哺乳類の血漿中に天然に見つかり、哺乳類において最も豊富なタンパク質である。それは血液の望ましい浸透圧を維持する上で重要な役割を担い、血流中の様々な物質の輸送においても重要な役割を果たしている。
【０００３】
新生児Fc受容体（FcRn）である「ブランベル（Brambell）」は、哺乳類の血清中の高レベルの免疫グロブリンイソタイプＧ（IgGs）とアルブミンを維持することに寄与する二官能性分子である。FcRnは、アルブミンとIgGをpH依存性機序により細胞内分解から救済し、それによってそれらの半減期を延長させることが認められている。野生型ヒト血清アルブミン（HSA）の血漿半減期はおよそ19日間であると知られている。
【０００４】
ドラッグデリバリー（DD）におけるアルブミンの使用は十分に記載されている。例えば治療薬をアルブミンに接合することができ（WO 2000/69902）または治療活性ポリペプチドをアルブミンに遺伝子融合し、キメラタンパク質として発現させることができ（WO 2001/79271およびWO 2003/59934）、または小型の酸性もしくは疎水性治療活性剤をアルブミンに可逆的に結合することができる（Kragh-Hansen他、2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695およびWO 2000/71079）。ほとんどまたは全くアルブミン結合性をもたない医薬上有用な化合物を、アルブミン結合性を有する成分に結合させることにより、そのような化合物にアルブミン可逆結合性を獲得させることもできる（Kurtzhals他、1997, J.PPharm. Sci. 86: 1365およびWO 2010/065959）。Kratz, 2008, J. Controlled Release 132, 171-183は、それらの技術全ての概説を提供する。ドラッグデリバリーにアルブミンを利用する利点は、治療薬の半減期の長期化および／または制御放出および／または選択的な組織もしくは臓器へのターゲティングである。
【０００５】
多数の天然アルブミン変異体が記載されている。Otagiri他、2009, Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534は、77の既知アルブミン変異体を開示している。多数の他の天然変異体が同定されており、そのいくつかがFcRn結合について分析されている（Andersen他(2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372; Galliano他(1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32; Minchiotti他(1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418; Takahashi他(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417; Carlson他(1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229; Peach, R.J. & Brennan, S.O. (1991) Biochim Biophys Acta.1097: 49-54）。マウスモデルにおける天然のヒトアルブミン変異体の半減期は、Iwao他(2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590中に記載された。更に、改変された結合親和性を有する改変型アルブミン変異体がWO 2011/051489, WO 2011/124718, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2011/103076, WO 2012/112188, WO 2013/075066, WO 2014/072481およびWO 2015/63611に記載されている。WO 2015/036579は、ドメインIIの中に１以上の（例えば数個の）変異を有するアルブミン変異体を開示している。要するに、幾つかのアルブミン変異体が当業者に公知である。
【０００６】
Cianga他（Human Immunology 64, 1152-1159 (2003)）は、乳癌腫瘍細胞がFcRn受容体を発現することを開示している。
【０００７】
癌の亜型分類における目下の制約は、特定の亜型に最適化された治療プロトコルにより治療することができる関連する癌亜型の同定である。よって、癌を亜型分類するための改善方法が有利であり、そして特に、そのような癌亜型のより有効なおよび／または信頼できる治療プロトコルが有利であろう。
発明の概要
【０００８】
腎臓、肺、胎盤および腸のモデルとなるインビトロ（in vitro）システムにおける多種多様な極性化上皮細胞でのFcRn発現により、FcRn発現がIgGを双方向でトランスサイトーシスする能力を細胞に授けることを示した。FcRnが再生利用またはトランスサイトーシスに入るかどうかは、IgGとアルブミンの両方についてまだ依然として検討中であるが、本発明者らは患部組織上に過剰発現されたFcRnを治療計画のターゲットとすることができることを主張する。
【０００９】
上述したように、Cianga他は、乳癌腫瘍細胞がFcRn受容体を発現することを開示している。しかしながら、FcRn受容体の発現レベルが「維持される」（従って増加されない）ことを記載している。
【００１０】
本発明は、一態様において新たに同定された癌の亜型であって、FcRn受容体の上方制御（アップレギュレート）レベルを有する亜型に関する。癌細胞上の上方制御された接近可能な（例えば表面の）受容体の存在が、そのような亜型を、治療薬、診断薬またはイメージング剤（造影剤）に結合されたFcRn結合剤のための有望なターゲットにする。実施例１は、そのような亜型の同定を示す。実施例２〜４は、マウスへの静脈注射後の、ヒト異種移植片における改変型アルブミン変異体の蓄積／ターゲティングを示す。
【００１１】
本発明の目的は、癌亜型の同定方法の提供に関する。特に、本発明の目的は、上記で同定した癌亜型の治療プロトコルを提供することである。
【００１２】
本発明の更なる観点は、癌を亜型分類し、癌を病期診断し、そして／または癌を発症するリスクを予測する方法であって、
・生物学的試料（例えば以前に得られたもの）を対象から入手し；
・前記試料中のFcRnレベルを決定し；そして
・前記決定されたレベルを参照レベルと比較する
ことを含み、
ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常の亜型／病期またはFcRnが下方制御された亜型／病期を示し；
そして／または
ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、癌を発症するリスクが高いことを示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、癌の発症の増加したリスクを示さない
方法に関する。
【００１３】
この方法はインビボ（生体内）またはインビトロ（生体外）、好ましくはインビトロで実施することができる。
【００１４】
好ましい態様では、該方法が乳癌または結腸直腸癌を亜型分類する方法であり、生物学的試料が乳癌標本または結腸癌標本であり、参照レベルと比較して前記標本中の高FcRnレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常またはFcRnが下方制御された亜型を示す。別の好ましい実施形態では、前記方法が、FcRn結合剤による治療に感受性の、または高感受性の癌を亜型分類／同定するための方法である。
【００１５】
本発明の別の態様は、癌を亜型分類し、癌を病期診断し、そして／または癌を発症するリスクを予測することに用いられるFcRn結合剤を含む組成物であって、
参照レベルと比較して生物学的試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常の亜型／病期またはFcRnが下方制御された亜型／病期を示し；
そして／または
ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが癌を発症するリスクが高いことを示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、癌の発症の増加したリスクを示さない、組成物に関する。前記参照レベルと同等のまたは低いFcRnレベルは、癌を発症するリスクが低いこと、非常に低いこと、または実質的にゼロであることの指標であることができる。別の形で表現すれば、前記参照レベルと同等のまたはより低いレベルが正常の標本であることを示す。
【００１６】
好ましい態様では、該組成物は乳癌または直腸癌を亜型分類するための組成物であり、生物学的試料が乳癌標本または結腸直腸癌標本であり、そして前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型を示し；そして前記参照レベルと同等のまたは低いFcRnレベルが、FcRnが正常またはFcRnが下方制御された亜型を示す。別の好ましい実施形態では、前記組成物がFcRn結合剤による治療に感受性である癌を亜型分類／同定するための組成物である。
【００１７】
本発明の更に別の態様は、癌の治療に用いられる治療薬に結合されたFcRn結合剤を含む組成物であって、前記癌が、参照レベルと比較して上方制御されたFcRnレベルを有する。好ましくは前記癌が乳癌または結腸直腸癌である。
【００１８】
更に別に態様では、本発明は、対象における（FcRn陽性）癌の画像を取得する方法であって、次の工程：
a) 対象の動物またはヒトに、検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を含む医薬上許容される組成物を投与し；
b) 前記対象の動物またはヒトをイメージングして、該対象中の検出可能成分に連結されたFcRn結合剤からの検出可能シグナルを同定し、それにより前記対象の動物またはヒトにおいて（FcRn陽性）癌の画像を取得し；
c) 前記検出可能シグナルの画像を作成し、それにより前記対象の動物またはヒトにおいて（FcRn陽性）癌の画像を取得する
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、対応する健全な隣接組織に比較した癌型のFcRn過剰発現を示す。拡大写真は癌組織を示し、挿入画像は健全な隣接組織を示す。Ａ）結腸癌。目盛り線は腫瘍組織と正常隣接組織（小さい挿入写真）とも250μｍに相当する。Ｂ）乳癌。目盛り線は腫瘍組織については250μm、正常隣接組織（小さい挿入写真）については100μmに相当する。
【図２】図２は、ヒト細胞系マウス異種移植片におけるFcRn発現を示す。Ａ左）PXBC-3膵臓癌；Ａ中央）HT29ヒト結腸直腸腺癌細胞；Ａ右）MCF-7ヒト乳癌細胞。Ｂ）qPCRにより調査したFcRn発現。得られたデータは膵臓癌PXBC-3に対して正規化した。
【図３】図３Ａ）は、マウス（N=3）におけるFcRn低結合剤（LB）、野生型（WT）またはFcRn高結合剤（HBI）のAlexa Fluor（登録商標）680標識アルブミンの生体内血中半減期を示す。蛍光強度はIVISバイオイメージャーを使って測定し、データは１分後のシグナルに対し正規化した。Ｂ）は注射後４〜72時間目の計算半減期を示す。
【図４】図４は、処置群の選択した臓器（肺、腎臓、脾臓、腸、心臓、肺、皮膚および筋肉）および腫瘍についての蛍光強度（photons／sec／cm2／sr）生体外（ex vivo）測定（photon＝光子；sr＝ステラジアン）。PBS（N=3）、FcRn低結合剤（LB）（N=3）、野生型（WT）（N=3）およびFcRn高結合剤（HBI）（N=3）。関心領域（ROI）については全組織を選んだ。
【図５】図５は、処置群の選択した臓器（肺、腎臓、脾臓、腸、心臓、肺、皮膚および筋肉）および腫瘍についての蛍光強度（光子／秒／cm2／sr）生体外（ex vivo）測定。PBS （N=3）、FcRn低結合剤（LB）（N=3）、野生型（WT）（N=3）およびFcRn高結合剤（HBI）（N=3）。関心領域（ROI）については一定領域を選び、全ての臓器と腫瘍に利用した。
【図６】図６は、試験の終了日にルシフェリンＤを72時間注射した後の、異なる治療群のマウスの体全体の走査画像を示し、PBS（N=3）、FcRn低結合剤（LB）(N=3)、野生型（WT）(N=3)、FcRn高結合剤（HBI）（N=3）。スペクトル・アンミキシング後の生物発光画像を上のパネルに示し、蛍光画像を下のパネルに示す。
【図７】図７は、PBS（N=3）、FcRn低結合剤（LB）(N=3)、野生型（WT）(N=3)、FcRn高結合剤（HBI）（N=3）で処置したマウスにおいて生体外（ex vivo）で測定した腫瘍の組織１g当たりの蛍光強度（（photons／sec／cm2／sr）／g）を示す。ROIには、全組織を選択した。
【図８】図８は、生物発光ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞の尺度として生物発光を使用し、そして蛍光強度（photons／sec／cm2）を生物発光強度（photons／sec／cm2）で割ることにより求めた、腫瘍における生存細胞あたりの蛍光値を示す。腫瘍は次の治療群から生体外で測定した：ＰＢＳ（N=3）、FcRn低結合剤（LB）(N=3)、野生型（WT）(N=3)、FcRn高結合剤（HBI）（N=3）。ROIについては、全臓器を選択した。
【図９】図９Ａ）４時間、24時間、48時間および72時間の時点でのマウスにおけるFcRn低結合剤（LB、N=6)、野生型（WT、N=6)、またはFcRn高結合剤II（HBII、N=7）のAlexa Fluor 680標識アルブミンの生体内血中半減期を示す。IVISバイオイメージャーを使って蛍光強度を測定し、１分後のシグナルに対して正規化されたMFIとしてデータを報告する。Ｂ）24時間までの初期段階におけるマウスのFcRn低結合剤（LB、N=6)、野生型（WT、N=6)またはFcRn高結合剤（HBI、N=7）のAlexa Fluor 680標識アルブミンの血中半減期を示す。各アルブミン変異体について指数回帰曲線をプロットした。データは１分後のシグナルに対して正規化されたMFIとして報告する。Ｃ）24〜72時間の時点におけるマウスのFcRn低結合剤（LB、N=6)、野生型（WT、N=6)またはFcRn高結合剤II（HBII、N=7）のAlexa Fluor 680標識アルブミンの血中半減期を示す。各アルブミン変異体について指数回帰曲線をプロットした。データは１分後のシグナルに対して正規化されたMFIとして報告する。Ｄ）指数曲線適合法より計算したFcRn低結合剤（LB、N=6)、野生型（WT、N=6)またはFcRn高結合剤（HBI、N=7）のAlexa Fluor 680標識アルブミン変異体についての血中半減期。半減期は時間で与えられ、Ｒ2値は曲線のフィット（適合度）から与えられる。
【図１０】図10は、臓器および腫瘍におけるPBSとFcRn低結合剤（LB、N=6)、野生型（WT、N=6)またはFcRn高結合剤II（HBII）（N=7）のアルブミン変異体の生体内分布を示す。スペクトルアンミキシング後の蛍光が、一定の大きさの関心領域（ROI）の平均放射輝度（photons／sec／cm2／sr）として与えられる。
【図１１】図11は、腫瘍のみ生体外測定された腫瘍におけるFcRn低結合剤（LB）（N=6)、野生型（WT）（N=6)およびFcRn高結合剤II（HBII）（N=7）のAlexa Fluor 680標識アルブミン変異体の蓄積を示し、データはPBSで処置したマウス（N=3）の腫瘍からのシグナルに対して正規化されたMFIとしておよび一定の大きさの関心領域（ROI）で報告する。ｐ＜0.05、対応のないｔ検定により計算。
【図１２】図12は、PBS（N=3）、FcRn低結合剤（LB）（N=6)、野生型（WT）（N=6)およびFcRn高結合剤II（HBII）(N=7)で処置したマウスにおいて生体外で単独で測定された腫瘍の組織１ｇあたりの蛍光強度（（photons／sec／cm2／sr）／ｇ）を示す。全腫瘍のROIを全ての腫瘍に適用し、PBS処置マウス（N=3）の腫瘍からのシグナルに対して正規化したMFIとしてデータを報告する。
【図１３】PBS（N=3）、FcRn低結合剤(LB)(N=6)、野生型(WT)(N=6)およびFcRn高結合剤II(HBII)(N=7)で処置されたマウスにおいて生体外で単独で測定された腫瘍の組織１ｇあたりの蛍光強度（（photons／sec／cm2／sr）／ｇ）を示す。全腫瘍のROIを全ての腫瘍に適用し、PBS処置マウス（N=3）の腫瘍からのシグナルに対して正規化したMFIとしてデータを報告する。
【図１４】Ａ）PBS（N=3）、FcRn低結合剤(LB)(N=6)、野生型(WT)(N=6)またはFcRn高結合剤II(HBII)(N=7)で処置したマウスの21時間スキャンを示す。この時点では自家蛍光が非常に低かったのでスペクトル・アンミキシングは行わなかった。写真は675 nmでの励起波長と720 nmでの発光波長からのものである。Ｂ）PBS（N=3）、FcRn低結合剤(LB)(N=6)、野生型(WT)(N=6)またはFcRn高結合剤II(HBII)(N=7)で処置したマウスの72時間スキャンを示す。スペクトル・アンミキシングを実施した。
【図１５】図15は、４例の関節リウマチ検体におけるFcRn発現の写真を示す。Ａ）、Ｂ）およびＣ）の目盛り線は250μmであり、Ｄ）のは100μmである。
【図１６】図16：異なる癌組織と対応する正常組織におけるFcRn発現。生検標本は癌患者における腫瘍部位からのものである。切片をhFcRnに対する抗体で染色し、専門の病理学者により陰性から高発現までのスコアを付けた。患者数（n）は各癌型ごとに異なる。Ａ）結腸直腸癌、Ｂ）ルミナルＢ亜型乳癌、トリプルネガティブ亜型乳癌、Ｄ）腎臓癌、Ｅ）膵臓癌、Ｆ）頸癌、Ｇ）頭頸部癌、Ｈ）肺癌、Ｉ）卵巣癌、Ｊ）膀胱癌。
【図１７】図17は、ルシフェリンＤを注射した後の72時間目の試験終了日における異なる治療群のマウスの体全体のスキャンを示す：PBS、野生型（WT）、FcRn高結合剤（HBI）。スペクトル・アンミキシング後、Alexa Fluor 680標識アルブミンの蛍光が上のパネルに示され、細胞の生物発光が下のパネルに示される。画像は図６に与えられた画像の選択画像である。
【図１８】図18は、ヒトFcRnを発現しているHT-29（黒いバー）とHt-29ヒトFcRnノックアウト（白いバー）細胞におけるAlexa Fluor 488標識アルブミン変異体の取り込みを示す。HBSS中のAlexa Fluor 488標識組換えアルブミン変異体への２時間の暴露後のフローサイトメトリーにより検出された平均蛍光強度；FcRn低結合剤(LB)、野生型(WT)、FcRn高結合剤I(HBI)およびFcRn高結合剤II(HBII)。データは、未処置の細胞（NT）に対して正規化した。エラーバーは標準偏差として表す。挿入部分はHT-29 WTとHT-29 FcRnノックアウトについてのFcRn発現のウエスタンブロット分析を示す。FcRnバンドは、矢印により示された〜40 kDaの所に検出される。
【図１９】MDAMB231／Luc細胞系とHT-29細胞系のウエスタンブロット。FcRn発現は矢印により示された〜40 kDaの所に検出される。
【００２０】
本発明を下記に更に詳細に説明する。
発明の詳細な説明
定義
本発明を更に詳細に説明する前に、次の用語と表現法をまず定義することにする：
【００２１】
結腸直腸癌
結腸直腸癌（CRC）は、大腸癌としても知られ、結腸または直腸（大腸の一部）からの癌の発生である。それは体の他の部位を侵略するまたは他の部位に広がる能力を有する細胞の異常増殖による。
乳癌
【００２２】
乳癌は、胸部から発症する癌である。乳癌の兆候としては、胸部のしこり、胸部の形状の変化、皮膚のえくぼ形成、乳頭から分泌する液、または皮膚のうろこ状の紅斑が挙げられる。乳癌亜型の例は、ルミナルＢ（Luminal B）亜型とトリプルネガティブ（Triple Negative）亜型である。ルミナルＢ型乳癌はホルモン受容体陽性（エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体陽性）であり、かつ高レベルKi-67を有するHER2陽性またはHER2陰性のいずれかである。ルミナルＢ型癌は一般にルミナルＡ型癌よりもわずかに速く増殖し、それらの予後はわずかに良くない。トリプルネガティブ（Triple Negative）型／基底細胞様乳癌は、ホルモン受容体陰性（エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陰性）でHER2陰性である。この癌型はBRCA1遺伝子変異を有する女性により頻繁に見られる。
【００２３】
アルブミン
用語「アルブミン」は、ヒト血清アルブミン（HSA、配列番号１）と同一および／または非常に類似した三次元構造または１以上のHSAドメインを有し、かつHSAまたは関連する１以上のドメインに類似した性質を有するタンパク質を意味する。類似した三次元構造は、例えば、HSA構造である。アルブミンの主要な性質の例はi) 血漿体積を調節する能力（膨張活性）、ii) 約19日±５日の長期血漿半減期、iii) FcRnへの結合、iv) リガンド結合、例えば内因性分子、例えば酸性、親水性化合物、例えばビリルビン、脂肪酸、ヘミンおよびチロキシンの結合、v) 酸性または電気陰性を有する小有機化合物、例えばワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェンおよびパクリタキセルのような薬剤の結合である。タンパク質または断片をアルブミンとして特徴づけるためにそれらの性質の全てを満たす必要はない。例えば、断片がある種のリガンドまたは有機化合物の結合に反応性であるドメインを含まない場合、そのような断片の変異体は、それらの性質のいずれも持たないと予想されるだろう。好ましくは、アルブミンは、配列番号１に対して少なくとも60％の配列同一性、例えば配列番号１に対して少なくとも65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98.2, 98.4, 98.6, 98.8, 99, 99.2, 99.4, 99.6または99.8％同一性を有する。配列同一性はWO 2015/036579に従って計算することができ、特に第11頁に記載されるようなNeedleman-Wunsch演算法を使うことにより計算することができる。
【００２４】
HSA変異体
用語「HSA変異体」または「変異体HSA」は、１つ以上の（数個の）位置に変異、すなわち置換、挿入および／または欠失を含む、ヒト血清アルブミンに由来するポリペプチドを意味する。置換は、１つの位置を占有するアミノ酸の、異なるアミノ酸による置き換えを意味する；欠失は１つの位置を占有するアミノ酸の除去を意味する；そして挿入は、１つの位置を占有するアミノ酸に隣接の１〜３アミノ酸を付加することを意味する。変異体はHASの機能性断片であってもよい。断片は、アルブミンに由来する１つの連続した配列からなるか、またはアルブミンの異なる部分から誘導された２以上の配列を含むことができる。本発明にかかる断片は、約100アミノ酸残基より大きいサイズを有し、好ましくは150アミノ酸残基より大きいサイズを有することができ、好ましくは150アミノ酸残基より大きいサイズ、より好ましくは300アミノ酸残基より大きいサイズ、更により好ましくは400アミノ酸残基より大きいサイズ、最も好ましくは500アミノ酸より大きいサイズを有することができる。
【００２５】
WT HSAに関して、変異体はFcRnに対して高い結合親和性を有するかまたは弱い結合親和性を有してもよい。好ましくは、FcRnはヒトFcRn（hFcRn）であり、より好ましくは可溶性ヒトFcRn（shFcRn）である。本発明に有用なアルブミン変異体の例は次のものである：
・HSA（配列番号１）に対して少なくとも70％同一性を有しかつ配列番号１のK537に相当する位置に変異を有するアルブミン、例えばHSA-K573P（高結合剤Ｉ）（HIB）（配列番号４）
・HSA（配列番号１）に対して少なくとも70％同一性を有しかつ配列番号１のE492、K537、K574およびQ580に相当する位置に変異を有するアルブミン、例えばHSA-E992G,K573P,K574HおよびQ580K（高結合剤II；HBII）（配列番号５）
・HSA（配列番号１）に対して少なくとも70％同一性を有しかつ配列番号１のK500に相当する位置に変異を有するアルブミン、例えばHSA-K500A（低結合剤；LB）（配列番号６）。
【００２６】
加えて、ある場合には空結合剤（null-binder）が有用である。一例は
・HSA（配列番号１）に対して少なくとも70％同一性を有しかつ配列番号１のK500とH464に相当する位置に変異を有するアルブミン、例えばHSA-K500A,H464Q（空結合剤）（配列番号７）
【００２７】
実施例の項目で使用するアルブミン変異体の例は次のものである：
・HSA-K573P（高結合剤Ｉ）(HBI)（配列番号４）
・HSA−E492G,K573P,K574H,Q580K（高結合剤II）(HBII)（配列番号５）
・HSA-K500A（低結合剤）(LB)（配列番号６）
【００２８】
加えて、ある場合には空結合剤が関連しうる。一例は次のものである：
・HSA-K500A,H464Q（空結合剤）（配列番号７）
【００２９】
抗体
用語「抗体」または「抗体分子」は、完全抗体〔例えば免疫グロブリンＧ（IgG）、免疫グロブリンＡ（IgA）、免疫グロブリンＥ（IgE）、免疫グロブリンＭ（IgM）、または免疫グロブリンＤ（IgD）〕および抗体断片、例えばFab, F(ab’)2, Fab3, scFv, Fv, dsFv, ds-scFv, Fd, dAbs, TandAbs, ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、vHドメイン、vLドメイン、vHHドメイン、ナノボディ、アフィボディ、IgNAR可変単一ドメイン（v-NARドメイン）、それらの断片およびそれらの多量体、並びに二特異性抗体断片を含む。抗体はモノクローナル抗体（「mAb」）、ポリクローナル抗体およびキメラ抗体を含む。
【００３０】
FcRn
新生児Fc受容体（FcRn）は、Brambell受容体としても知られ、それはヒトではFCGRT遺伝子によりコードされるタンパク質である。ヒト新生児Fc受容体は、β２−ミクログロブリン（配列番号３）と結合するFc受容体（配列番号２）を含む。Fc受容体はMHCクラスＩ分子と構造上類似している。よって、検出され、標的とされ、そして／またはイメージングされるFcRnは、好ましくはヒトFcRnである。
【００３１】
哺乳類
用語「哺乳類」には、ヒト、家禽動物および家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ）並びに動物園の動物、スポーツ用動物（例えばイヌまたはウマ）またはペット動物（例えばイヌ、ネコ、ウサギ）が含まれる。好ましくは、哺乳類はヒトである。本発明の生物学的試料は好ましくはヒトから提供される。
【００３２】
参照レベル
本発明の範囲において、用語「参照（リファレンス）」は、他の値または特徴に対して比較することができる品質、量またはタイプに関する標準（例えば検量線）に関する。
【００３３】
本発明では、参照値は、FcRnの発現レベルでありうる。参照データのセットは、多数の標本についての参照値を集めることにより作ることができる。当業者に明確であるように、参照データのセットは、増加した数の参照値を含めることにより改善することができる。
【００３４】
本発明の１つの好ましい実施形態では、参照手段は内部参照手段および／または外部参照手段である。本範囲では、用語「内部参照手段」は、各々の測定のためにユーザーが直接取り扱わず、FcRnの濃度／レベルの測定用の装置の中に組み込まれており、それにより「最終結果」または「最終測定値」のみが提示される参照に関する。用語「最終結果」または「最終測定値」は、参照値を考慮に入れるときにユーザーに提供される結果に関する。本範囲では、用語「外部参照手段」は、「最終結果」を獲得する前に、FcRnの濃度／レベルを決定するためにユーザーが直接取り扱う参照である。本発明の更に別の態様では、外部参照手段は、ユーザーが測定シグナルを特定の参照手段と比較することができるような一覧表、図形および類似の参照手段からなる群より選ばれる。対象がFcRn過剰発現亜型を有するかどうかを決定するために、カットオフ値を確立しなければならない。このカットオフは、研究室、医師または各患者について症例ごとに（ケースバイケースで）確立してよい。カットオフレベルは、以下のものを含む多数の方法を使って確立することができる：百分位数、平均±標準偏差値；メジアン値の倍数；患者特異的リスクまたは当業者に既知の他の方法。
【００３５】
多変量判別分析および他のリスク評価は、市販のコンピュータプログラム統計学パッケージStatistical Analysis System（SAS Institute Inc.により製造・販売されている）あるいは当業者に既知である多変量統計分析の別法または他の統計ソフトウェアパッケージもしくはスクリーニングソフトウェアにより実装することができる。当業者に明白な通り、上記に論じた実施形態のいずれにおいても、カットオフレベルの変更は、各患者についての判別分析の結果を変更しうる。
【００３６】
FcRnの発現レベルを参照レベルに比較した時、それらは異なる（参照値より上または下）こともでき同一であることもできる。しかしながら、今日の検出技術を用いて、異なる結果であるか同一結果であるかの正確な定義は困難である。その理由は、異なる標本（試料）より得られる発現レベルにおいてノイズや変動があるためである。よって、２以上の発現レベルが異なるか同じかを評価するための通常の方法は統計分析を含む。
【００３７】
統計分析は、有意に異なる発現レベルと有意に同等の発現レベルの評価を可能にする。統計法は、関数／統計演算法を１組のデータに当てはめることを伴う。統計理論は、標本の一関数として統計を定義し、ここでその関数それ自体は標本の分布とは独立関係である。すなわち、該用語は、所定の標本についての関数と関数の値の両方に用いられる。汎用される統計的検定またはデータセットに適当される方法としては、ｔ検定、ｆ検定またはより高次の検定およびデータ比較法が挙げられる。そのような検定または方法の使用により、２以上の標本が有意に異なるか有意に同じかどうかの結論が可能になる。
【００３８】
有意性は、当業者に既知の標準的な統計方法により求めることができる。選択される参照レベルは、検定を実施する哺乳類に依存して変更することができる。選択される参照レベルは、当業界で既知のような別の特異性または感受性を所望する場合には変更することができる。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、感受性とは、診断検査と同様に、正しく判定される実際に検査陽性である比率の尺度、すなわち、FcRnを過剰発現している哺乳類またはヒトの比率を指す。通常、検査の感度は、全数の中の真陽性の比率として説明することができる。本明細書中で用いる場合、特異性とは、正しく判定される、検査陰性の比率の尺度、すなわち標準と同じまたは低いFcRnレベルを有する哺乳類の比率を指す。理想的な診断検査は、100％特異性を有する試験、すなわち、FcRnを過剰発現する哺乳類のみを検出し、従って偽陽性結果が全くなく、かつ100％感受性を有する検査である。
【００４０】
いずれの検査でも、一般に各測定間にはトレードオフ（矛盾）がある。例えば、ある者が欠陥検査をしている製造設定において、ほぼ全ての不完全成分を同定する可能性を増加させるために（高感受性）、機能性成分を切り捨てるリスク（低特異性）を進んで受け入れるかもしれない。このトレード・オフは、受信者動作特性（ROC）曲線を使ってグラフ表示することができる。
【００４１】
よって、一実施形態では、本発明の亜型は、参照組織に比較して少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも10倍のFcRnの上方制御レベル（過剰発現）を有する。FcRn発現の好ましい測定方法は、実施例の項目において使用する方法である。
【００４２】
実施例の項目から分かるように、「カットオフ値」は、異なる発現レベルをいかに分類するかにも依存しうる。例えば図16において、FcRnの発現レベルは陰性、低、中、または高に分類される。しかしながら、別の分類法も当業者により選択することができる。
【００４３】
結合親和性
用語「結合親和性」は、一般にある分子（例えばIgGまたはアルブミン）の単一結合部位とそれの結合相手（例えば抗原またはFcRn）間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。異なって指摘しない限り、本明細書中で用いる「結合親和性」とは、結合ペアの構成要素（例えばアルブミンとFcRn）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子（Ｘ）のその結合相手に対する親和性は、一般に、ｋoff／ｋon（ｋd／ｋa）平衡解離定数（KD）により表すことができる。結合親和性は当業者に既知の方法により測定することができる。好ましい方法は、例えば本明細書中に例示されるようなBiacore（GE Healthcare）機器を使った表面プラズモン共鳴（SPR）である。FcRnとアルブミンの内因性ペア（例えばHSA対hFcRn、イヌアルブミン対イヌFcRnなど）の結合親和性は一般に、0.2〜3.2マイクロモル（μM）である。
【００４４】
結合親和性は、（一例として）FcRn（例えばshFcRn）に対するKDが、HSAに対する対応するKDよりも低い（高親和性、すなわちより強い結合を有する）アルブミンまたは接合／融合体／会合体として表すことができる。よって、一実施形態では、本発明にかかる「FcRn結合剤」（例えばアルブミン、アルブミン変異体またはそれの接合／融合体／結合体）のKDは、FcRnに対するHSAの0.9×（倍）KD未満、より好ましくはFcRnに対するHSAの0.5×KD未満、より好ましくはFnRnに対するHSAの0.1×KD未満、更により好ましくはFcRnに対するHSAの0.05×KD未満、更により好ましくはFcRnに対するHSAの0.02×KD未満、更により好ましくはFcRnに対するHSAの0.01×KD未満、最も好ましくはFcRnに対するHSAの0.001×KD未満である（ここで×は「乗じる」を意味する）。好ましくは、「FcRn結合剤」は本発明のアルブミンまたはアルブミン変異体である。
【００４５】
あるいは、FcRnのKDは、対応するHSAのFcRnに対するKDよりも高い値（低い結合性）であってもよい。かくして、一実施形態では、「FcRn結合剤」のKDが、FcRnに対するHSAの２×KD超、更により好ましくはFcRnに対するHSAの２×KD超、より好ましくはFcRnに対するHSAの５×KD超、更により好ましくはFcRnに対するHSAの10×KD超、更により好ましくはFcRnに対するHSAの25×KD超、最も好ましくはFnRnに対するHSAの50×KD超である。好ましくは「FcRn結合剤」は本発明のアルブミンまたはアルブミン変異体である。
【００４６】
大部分の場合、FcRnに対して高結合親和性を有する変異体を本発明の態様に用いるのが好ましい。
【００４７】
KDを測定および／または比較する際、次のパラメータの１または複数（例えば数個）（好ましくは全部）を使用することができる：
機器：Biacore 3000機器（GE Healthcare）
フローセル：CM5センサーチップ
FcRn：ヒトFcRn、好ましくは可溶性ヒトFcRn、所望によりグルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）またはヒスチジン（His）のようなタグ、最も好ましくはβ2-ミクログロブリンのＣ末端の６ヒスチジン残基のようなHisタグにカップリングされたもの。
FcRnの量：1200-2500 RU
【００４８】
カップリング化学：アミンカップリング化学（例えば機器の製造業者により提供されたプロトコルに記載の通り）。
カップリング法：カップリングは、10 mM酢酸ナトリウム pH 5.0 (GE Healthcare)中20μg/mLのタンパク質を注入することにより実施することができる。リン酸緩衝液（67 mMリン酸緩衝液、0.15 mM NaCl、0.005％Tween 20）をランニング緩衝液および希釈緩衝液として使用することができる。表面の再生はHBS−EP緩衝液（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005％界面活性剤P20）pH 7.4（Biacore AB）の注入を使って行うことができる。
検査分子（例えばHSAまたは変異体）の注入量：20〜0.032μM。
注入の流速：一定、例えば30μL／mL
注入温度：25℃
データ評価ソフトウェア：BIAevalution 4.1ソフトウェア（BIAcore AB）。
【００４９】
pH依存性の尺度である「pH依存率」は、[pH 7.4での平衡]／[pH5.5での平衡]×100の反応率として評価した。
【００５０】
改変または修飾
アルブミンに関しての用語「改変」または「修飾」は、アルブミンのアミノ酸配列に無関係の分子を付加または除去することによりアルブミンを変更すること、例えば脂肪酸を除去することまたはパートナー分子を付加することを意味する。アルブミンは特に、パートナーの結合、融合または会合により改変することができる。アルブミンのアミノ酸配列（例えば配列番号１）への変更は「変異体」と呼称され、改変とはみなされない。
【００５１】
接合（コンジュゲーション）
アルブミンに関連して下記に例示される用語「接合化（conjugated)」、「接合する（conjugate)」または「接合（conjugation)」は、有益な剤、例えば治療薬および／または診断薬のような接合相手に結合されている、WT HSAもしくは変異型HSAまたはそれの断片を言う。接合はアルブミンのＮ末端および／またはＣ末端に実施することができるが、その代わりにまたは加えて、アルブミン中の１以上の（例えば数個の）適当なアミノ酸位置に行うこともできる。特に、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基が接合に適当である。WO 2009/126920、WO 2010/059315およびWO 2010/092135（参考により本明細書に組み込まれる）公報は、接合に適当な追加のシステイン残基を有する変異型アルブミンを記載している。接合相手をアルブミンまたはその断片に接合する技術は、当業界で既知である。WO 2009/019314公報は、接合相手、例えば治療薬を、ポリペプチドに接合するのに適する技術の例を開示しており、その技術を本発明にも適用することができる。更に、WO 2009/019314公報の第37〜44頁（参考により本明細書に組み込まれる）は、トランスフェリンに接合することができる化合物や成分の例を開示しており、それらの化合物と成分を本発明のアルブミン変異体にも接合することができる。上記は、本発明に係るアルブミンとは異なる別のFcRn結合相手の場合でもそうであることを理解すべきである。
【００５２】
融合
アルブミンに関連して下記に記載する用語「融合した」または「融合体」は、有益な剤、例えば治療用ポリペプチドおよび／または診断用ポリペプチドのような融合相手に遺伝子的に融合されているWT HSAもしくは変異型HSAまたはそれの断片を指す。融合は通常、アルブミンのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに行われるが、時々両末端に行われる。融合は理論上、代替的にまたは付加的に、アルブミン分子の内部に行われ、その場合、アルブミンのドメイン間に融合相手を位置させることが好ましい。例えば、融合相手はドメインＩとドメインIIの間および／またはドメインIIとドメインIIIの間に配置させることができる。アルブミンまたはその断片の融合に関する教示は当業界で公知であり、当業者はそのような教示を本発明にも適用できることを理解するだろう。WO 2001/79271の表１、WO 2001/79258の表１（第11頁）、WO 2001/79442の表１（第11頁）、WO 2001/79443の表１（第12頁）、WO 2001/79443の表１（第11頁）、WO 2003/060071の表１、WO 2003/59934の表１、WO 2005/003296の表１、WO 2007/021494の表１およびWO 2009/058322の表１（全ての表は参考により本明細書中に援用される）は、融合相手、例えば治療用ポリペプチドの例を含み、これらはアルブミンまたはその断片に融合させることができ、そしてそれらの例は本発明にも適用できる。上記は、本発明のアルブミンとは異なる別のFcRn結合相手の場合もそうであることを理解すべきである。
【００５３】
会合
本項目でアルブミンに関連して例示される用語「会合した」、「会合する」または「会合」は、WT HSAもしくは変異型HSAまたはその断片と、非共有結合によりアルブミンまたはその断片に結合したまたは会合した会合相手、例えば治療薬および／または診断薬、とを含んでなる組成物を指す。そのような会合体の一例は、アルブミンと該アルブミンに疎水性相互作用により会合された脂質である。そのような会合体は当業界で既知であり、それらは周知の技術を使って調製することができる。アルブミンとの会合に適当である分子は公知であり、好ましくはそれらは酸性、親油性および／または電気陰性の特徴を有する。そのような分子の例は、Kragh-Hansen他、2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１（参考により本明細書に援用される）に与えられている。更に、WO 2000/071079公報は、パクリタキセルとアルブミンとの会合を記載しており、パクリタキセルは本発明に包含される。
【００５４】
会合相手は、ミクロ粒子またはナノ粒子を通して治療薬および／または診断薬に会合されてもよく、その場合、治療薬および／または診断薬は前記粒子に付着されるかまたは中に封入される。上記は、本発明のアルブミンとは異なる別のFcRn結合相手の場合もそうであることを理解すべきである。
【００５５】
野性型（WT）
例えばアルブミンやFcRnに関連した用語「野生型（WT）」は、動物またはヒトにおいて天然に見つかるアルブミンまたはFcRnと同じアミノ酸配列（動物またはヒトの内因性遺伝子配列）を有するアルブミンまたはFcRnを指す。WTアルブミンまたはWT FcRnは、トランスジェニック動物の産生におけるような遺伝子ノックアウト／ノックインによる等のヒトの介入により作製される遺伝子変異を含まないと理解される。配列番号１はヒト（Homo sapiens）からの成熟WTアルブミンである。
【００５６】
治療薬
用語「治療薬」、「治療用化合物」、「治療用分子」または「薬」は、相互に交換可能に用いられ、それらは化合物、化合物の混合物、あるいは生物学的巨大分子（例えばペプチド、タンパク質、脂質、核酸（例えばDNAやRNA）、ウイルス）または化合物と共同した生物学的巨大分子を指す。治療薬としては、病状を予防、改善または治癒させることができる剤が挙げられる。治療薬は精製、実質的に精製、または部分的に精製されることが可能である。本発明の「剤」は、放射線療法剤やワクチンも包含する。
【００５７】
試料（標本）
試料は限定されないが、組織切片または生検標本（バイオプシー）、例えば治療しようとする腫瘍の一部分であることができ、またはそれは正常組織の周辺部分であってよい。
試料は血液、排せつ物（糞便）、尿、胸膜液、胆汁、気管支液、洗口液、組織生検標本、腹水、膿、脳脊髄液、卵胞液、組織または粘液であることができるが、それに限定されない。試料はアッセイする前に処理することができる。例えば試料は希釈、濃縮または精製されてよく、そして／または少なくとも１つの化合物、例えば内部標準が試料に添加されてもよい。様々な試料を取り扱う方法は当業者に既知である。好ましくは、試料は組織生検標本である。更により好ましくは、試料は癌組織標本である。好ましくは試料はヒト由来である。
【００５８】
試料は本発明の方法の開始前に既に入手されていることを理解すべきである。よって、該方法は、試料を入手した対象との何ら相互作用なしに実施することができる。従って、該方法は生体外（インビトロ）で実施することができる。
【００５９】
癌の亜型分類、病期診断および癌を発症するリスクの予測の方法
本発明は、FcRn受容体の上方制御レベルを有する癌の亜型の同定に関する。発明者チームによるそのような亜型の意外な発見は、癌細胞表面上にある上方制御された接近可能な受容体の存在により、治療薬、診断薬またはイメージング薬（造影剤）に連結されたFcRn結合剤を使ったターゲティングが可能になるために、臨床的観点から重要であると考えられる。よって、第一の態様において、本発明は癌を亜型分類する、癌を病期診断する、および／または癌を発症するリスクを予測する方法に関し、該方法は
・対象から生物学的試料（以前に入手したもの）を提供し；
・前記試料中のFcRnレベルを測定し；そして
・前記測定レベルを参照レベルと比較する
ことを含み、ここで前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnレベルが高いことがFcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同等または低いことがFcRnが正常の亜型／病期またはFcRnが下方制御された亜型／病期を示し；そして／または
ここで前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnレベルが高いことが、癌を発症するリスクが高いことを示し；そして前記参照レベルと同等または低いことが、癌を発症するリスクが高くないことを示す。別の方法で表現すれば、前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルは正常試料であることを示す。実施例１では、上方制御されたFcRnレベルを有する癌型の例が示される。実施例２〜４では、マウスへの静脈注射後のヒト異種移植片中の改変型アルブミン高結合剤の蓄積／ターゲティングが示される。
【００６０】
理論に縛られることなく、より大きなコホートをスクリーニングすると、他の癌型においても同様な亜型が同定できると思われる。よって、本発明の方法は、そのような癌亜型の亜型分類およびその後の治療に関連する。
【００６１】
同定されたFcRn陽性（上方制御）亜型の１つの技術的利点は、そのような亜型が治療薬に連結されたFcRn結合剤で治療できる可能性があるということである。よって、一実施形態では、該方法は、FcRn結合剤による処置に感受性である癌を亜型分類する／同定するための方法である。更に別の実施形態では、参照レベルと比較して前記試料中のFcRnレベルが高いことが、FcRn結合剤による処置に対して（改善した）感受性である亜型／病期を示す。本文脈中、「改善」は、FcRnの発現が低い試料に比較して認知できるものである。
【００６２】
上述したように、FcRn上方制御は、別の癌型においても同定することができると考えられる。よって、一実施形態では、癌型が肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、頸癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、結腸直腸癌、乳癌および耳鼻咽喉癌から成る群より選択される。別の実施形態では、前記癌型は乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、例えば腎明細胞癌、卵巣癌、子宮頸癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌および耳鼻咽喉癌から成る群より選択される。実施例６は、対応する正常／健常組織に比較した様々な癌型における過剰発現を示す。
【００６３】
好ましい実施形態では、当該方法は乳癌または結腸直腸癌を亜型分類する方法であって、該方法は
・対象から生物学的乳癌試料または結腸直腸癌試料（以前に入手したもの）を提供し；
・前記試料中のFcRnレベルを測定し；そして
・前記測定レベルを参照レベルと比較する
ことを含み、ここで前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnレベルが高いことが、FcRnが上方制御された亜型を示し；そして前記参照レベルと同等または低いことが、FcRnが正常のまたはFcRnが下方制御された亜型を示す。
【００６４】
上述したように、そのようなFcRnが上方制御された癌亜型は、例えばアルブミンで促進される治療（詳細は下記参照）に対してより感受性であると考えられる。よって、一実施形態では、該方法はFcRn結合剤による処置（例えば「アルブミン療法」）に対して感受性である癌を亜型分類／同定するための方法である。
【００６５】
実施例１において、FcRnが上方制御された亜型が乳癌組織で同定された。よって、一実施形態では、前記癌型が乳癌である。好ましくは、該方法が癌を亜型分類する方法である。更に別の実施形態では、乳癌がルミナルＢ（Luminal B）型乳癌またはトリプルネガティブ（Triple Negative）型／基底細胞様乳癌である。
【００６６】
実施例１において、FcRnが上方制御された亜型が結腸直腸癌組織においても同定された。よって、一実施形態では、前記癌型が結腸直腸癌である。好ましくは、該方法が癌を亜型分類する方法である。
【００６７】
癌組織は良性でも悪性でもよい。加えて、癌型は異なる病期診断プロトコルに従って病期診断することができる。一実施形態では、前記試料が転移性癌組織（非良性）、例えば転移性組織生検標本である。別の実施形態では、前記試料が良性癌組織（非悪性）、例えば組織生検標本である。病期は本発明による亜型と見なしてもよい。
【００６８】
本発明の参照レベルは、癌の診断／亜型分類／病期診断の技術分野の当業者により一般的に用いられる様々な種類の参照レベルから選択することができる。よって、一実施形態では、前記参照レベルは、同じ癌型の正常試料（非癌）のFcRnレベルまたは数個の正常試料の平均レベルである。更に別の実施形態では、前記正常試料は、前記生物学的試料と隣接する組織から、または前記生物学的試料から遠位の組織からのものである。
【００６９】
生物学的試料の源は、様々な起源から得ることができる。よって、追加の実施形態では、前記生物学的試料は組織生検標本、血液、排せつ物（糞便）、尿、胸膜液、胆汁、気管支液、洗口液、腹水、膿、脳脊髄液、卵胞液、組織および粘液から成る群より選択され、好ましくは組織生検である。実施例１において、癌組織標本／生検標本が試験される。
【００７０】
癌亜型分類に関連して、特定の試料が好ましい。よって、追加の実施形態では、生物学的試料が癌標本、例えば癌組織生検標本である。
【００７１】
FcRnレベルは様々な手段により決定／確証することができる。よって、一実施形態では、前記レベルはFcRn結合剤を用いて決定される（タンパク質レベル）。更に別の実施形態では、前記FcRn結合剤がWTアルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合剤、FcRn抗体、IgG類、ペプチドまたはタンパク質、および核酸、例えばアプタマーから成る群より選択され、好ましくは結合剤がアルブミンであり、より好ましくはアルブミン変異体である。更に好ましい実施形態では、前記アルブミン変異体が、アルブミンのWT型（配列番号１）よりも高い、FcRnへの結合親和性を有する。
【００７２】
WT HSAに比較して、変異体はFcRnに対する高い結合親和性を有してもよくまたはより弱いFcRn結合親和性を有してもよい。好ましくは、FcRnがヒトFcRn（hFcRn）であり、より好ましくは可溶性ヒトFcRn（shFcRn）である。アルブミン変異体は天然型変異体または組換え変異体であることができる。
【００７３】
アルブミン変異体は、WO 2011/124718（参考により本明細書中に援用される）に開示されたような、アルブミンドメインIIIまたはその変異体と、少なくとも１つの（例えば数個の）追加のアルブミンドメインまたはその断片、例えば第二のアルブミンドメインIIIまたはその変異体と、を含むまたはから成っていてもいなくてもよい。適当であるのは、アルブミン変異体は少なくとも１つの（例えば数個の）アルブミンドメインIIIまたはその変異体または断片を含むかまたはから成り、ここで前記少なくとも１つの（例えば数個の）アルブミンドメインIIIは、WO 2011/051489中に開示されるような（参考として本明細書中に援用される）次の位置：573, 500, 550, 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582および584から選択された配列番号１中の位置に相当する位置に１つ以上の（例えば数個の）置換を含む。適当な置換としては、次のもの：K573Y, W, P, H, F, V, I, T, N, S, G, M, C, A, E, Q, R, L, D, K500E, G, D, A, S, C, P, H, F, N, W, T, M, Y, V, Q, L, I, R, Q417A, H440A, H464Q, E492G, D494N,Q,A, E495Q,A, T496A, D494E+Q417H, D494N+T496A, E492G+V493P, P499A, E501A,Q, N503H,K, H510Q, H535Q, K536A, P537A, K538A, K541G,D, D550E,N, E492G+K573P,A,またはE492G/N503H/K573Pから選択された配列番号１中の位置に相当する位置に１つ以上の（例えば数個の）置換を含む。
【００７４】
アルブミン変異体は、WO 2014/072481（参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、配列番号１中の次の位置：(a) 492と580；(b) 492と574；(c) 492と550；(d) 550と573；(e) 550と574；(f) 550と580に相当する位置から選択された２以上の（複数の）位置に変更を含むことができる。
【００７５】
アルブミン変異体は、(i) ヒトアルブミン変異体である第一のアルブミンを含むＮ末端領域であって、Ｃ末端の2〜30アミノ酸を除くヒトアルブミン変異体の全アミノ酸を含む前記第一のアルブミンのＮ末端と；(ii) 第二のアルブミンのＣ末端領域であって、マカクアルブミン、マウスアルブミン、ウサギアルブミン、ヒツジアルブミン、ヒトアルブミン、ヤギアルブミン、チンパンジーアルブミン、ハムスターアルブミン、モルモットアルブミン、ラットアルブミン、ウシアルブミン、ウマアルブミン、ロバアルブミン、イヌアルブミン、ニワトリアルブミンもしくはブタアルブミン、またはその変異体から選択され、前記第二のアルブミンまたはアルブミン変異体のＣ末端の２〜30アミノ酸を含む前記第二のアルブミンまたはアルブミン変異体のＣ末端領域、とを含んで成り、ここで前記ポリペプチドが(i) WO 2012/059486（参考として本明細書中に援用される）中に開示されたようなヒトアルブミン変異体と比較して改変された血漿中半減期および／または(ii) 前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変された結合親和性を有する。
【００７６】
アルブミン変異体は、配列番号１の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインＩ中に１以上の（例えば数個の）変異；および配列番号１の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインIII中に１以上の（例えば数個の）変異を含んでもよく、ここで前記１以上の（例えば数個の）変異は、WO 2013/135896（参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、該ポリぺプチドをFcRnに対して改変された結合親和性を有するようにする。好ましくは、ドメインＩ中の変異が、配列番号１の78〜120位のいずれかに相当する位置、例えば78〜88位のいずれかから；および／または105〜120位のいずれかから選択され、そしてドメインIII中の変異が配列番号１の位置：425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 573, 575位のいずれかから選択される。適当であるのは、位置78〜120位または425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 573および／または575位に相当する位置の変異が置換であり；そして前記変異が所望により(i) 83N, KまたはS；(ii) 111D,G,H,R,QまたはE；または(iii) 573P,Y,W,H,F,T,IまたはVから選択された置換である。
【００７７】
当該アルブミン変異体はWO 2015/036579公報（参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、配列番号１中の位置：349, 342, 381, 345, 384, 198, 206, 340, 341, 343, 344, 352, 382, 348および／または383に相当する位置からなる群より選択された配列番号１の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインII中に１以上の（例えば数個の）変異を含んでもよく、ここで前記１以上の（例えば数個の）変異が、該アルブミン変異体に(i) 改変された血漿中半減期および／または(ii)FcRnへの改変された結合親和性を有するようにする。好ましくは、349, 342, 381, 345, 384, 198, 206, 340, 341, 343, 344, 352, 382, 348および／または383に相当する位置の変異が置換であり；そして該変異が場合により、(1) 349F,W,Y,H,P,KまたはQ、好ましくはF；(ii) 342Y,W,F,H,T,N,Q,A,C,I,L,P,V,好ましくはY；(iii) 381GまたはA、好ましくはG；あるいは(iv) 345E,H,IまたはQ、から選択された置換である。
【００７８】
アルブミン変異体は、配列番号１のV418, T420, V424, E505およびV547に相当する１つ以上の（数個の）位置に変異、例えば置換を含む、アルブミンの変異体ドメインIIIまたはその断片を含むことができる。それらの変異体は、WO 2013/075066公報（参考により本明細書中に援用される）に開示されている。置換は、V418, T420, V424, E505およびV547に相当する位置のうちの１または２箇所以上（複数、例えば２，３，４または５箇所）であることができ；例えば、V418M, T420A, V424I, E505(R/K/G)およびV547Aから選択された１以上の（例えば数個の）置換であることができる。特定の実施形態では、アルブミンが置換V418M, T420AおよびE505R；またはV418M, T420A, E505GおよびV547Aを含む。該アルブミンはN429, M446, A449, T467およびA552から選択された位置に１つ以上の（例えば数個の）追加の置換、例えばN429D, M446V, A449V, T467MおよびA552Tから選択された置換を含んでもよい。
【００７９】
アルブミン変異体は、WO 2011/103076公報（参照により本明細書中に援用さ得る）に開示されるように、該ポリペプチドのFcRn親和性と血清半減期の一方または両方を増加させるために１〜18個のアミノ酸置換を含む、アルブミンの変異体ドメインIIIまたはその断片を含むことができる。置換は、配列番号１の381, 383, 391, 401, 402, 407, 411, 413, 414, 415, 416, 424, 426, 434, 442, 445, 447, 450, 454, 455, 456, 457, 459, 463, 495, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 517, 519, 521, 523, 524, 525, 526, 527, 531, 535, 538, 539, 541, 557, 561, 566または569位に相当する位置のいずれか１つ以上（例えば数個）の位置にあることができる。
適当な置換は、下記のものから選択することができる：
【００８０】
【化１】
2020500306.tif 000003
【００８１】
アルブミン変異体は、配列番号１の次の位置に相当する位置にアミノ酸置換を含む、アルブミンの変異体ドメインIIIまたはその断片を含むことができる：(a)残基383と413；(b) 残基401と523；(c) 残基407と447；(d) 残基407と447と539；(e) 残基407と509；(f) 残基407と526；(g) 残基411と535；(h) 残基414と456；(i) 残基415と569；(j) 残基426と526；(k) 残基442と450と459；(l) 残基463と508；(m) 残基508と519と525；(n) 残基509と527；(o) 残基523と538；(p) 残基526と557；(q) 残基541と561；(r) 残基463と523；(s) 残基508と523；(t) 残基508と524；(u) 残基463と508と523；(v) 残基463と508と524；(w) 残基508と523と524；(x) 残基463と508と523と524；(y) 残基463と524；(z) 残基523と524；および(aa) 残基463と523と524；ここでこれらの置換は、WO 2012/112188公報（参照として本明細書中に援用される）に記載の通り、該ポリペプチドのFcRn親和性および血清半減期の一方または両方を増大させる。適当な置換は(a) L463C,F,G,H,I,N,SまたはQ；(b) T508C,E,I,K,RまたはS；(c) I523A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,WまたはY; (d) K524A,F,G,H,I,L,M,Q,TまたはV；(e) L463FまたはN；(f) T508RまたはS；(g) I523D,E,F,G,KまたはR；および(h) K524Lから選択することができる。
【００８２】
アルブミン変異体は配列番号１中の位置V418, T420, V424, E505, V547, K573に相当する位置から成る群より選択された配列番号１の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列中に１以上の（例えば数個の）変異を含むことができ；ここで前記１以上の（数個の）変異が該アルブミン変異体を(i) 改変された血漿半減期および／または(ii) 改変されたFcRn結合親和性を有するようにする。
【００８３】
アルブミン変異体は、次の群から選択された配列番号１の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列中に１以上の（例えば数個の）変異を含んでもよい：配列番号１中の、V381位、好ましくはV381NまたはQ；E383位、好ましくはE383A,G,I,LまたはV；N391位、好ましくはN391A,G,IまたはV；Y401位、好ましくはY401DまたはE；K402位、好ましくはK402A,G,I,LまたはV；L407位、好ましくはL407F,N,Q,WまたはY；Y411位、好ましくはY411QまたはN；K413位、好ましくはK413C,SまたはT；K414位、好ましくはK414SまたはT；V415位、好ましくはV415C,SまたはT；Q416位、好ましくはQ416HまたはP；V424位、好ましくはV424A,G,I,L,NまたはQ；V426位、好ましくはV426D,E,HまたはP；G434位、好ましくはG434C,SまたはT；E442位、好ましくはE442KまたはR；R445位、好ましくはR445F, WまたはY；P447位、好ましくはP447SまたはT；E450位、好ましくはE450DまたはE；S454位、好ましくはS454C,MまたはT；V455位、好ましくはV455NまたはQ；V456位、好ましくはV456NまたはQ；L457位、好ましくはL457F,WまたはY；Q459位、好ましくはQ459KまたはR；L463位、好ましくはL463NまたはQ；E495位、好ましくはE495D；T506位、好ましくはT506F,WまたはY；T508位、好ましくはT508K,RまたはS；F509位、好ましくはF509C,I,L,M,V,WまたはY；A511位、好ましくはA511F,WまたはY；D512位、好ましくはD512F,WまたはY；T515位、好ましくはT515C,H,N,P,QまたはS；L516位、好ましくはL516F,S,T,WまたはY；S517位、好ましくはS517C,F,M,T,WまたはY；K519位、好ましくはK519A,G,I,LまたはV；R521位、好ましくはR521F,WまたはY；I523位、好ましくはI523A,D,E,F,G,K,L,N,Q,R,V,WまたはY；K524位、好ましくはK524A,G,I,LまたはV；K525位、好ましくはK525A,G,I,LまたはV；Q526位、好ましくはQ526C,M,S,TまたはY；T527位、好ましくはT527F,WまたはY；E531位、好ましくはE531A,G,I,LまたはV；H535位、好ましくはH535D,EまたはP；K538位、好ましくはK538F,WまたはY；A539位、好ましくはA539I,LまたはV；K541位、好ましくはK541F,WまたはY；K557位、好ましくはK557A,G,I,LまたはV；A561位、好ましくはA561F,WまたはY；T566位、好ましくはT566F,WまたはY；A569位、好ましくはA569HまたはP；ここで、前記１以上の（例えば数個の）変異は、アルブミン変異体を(i) 改変された血漿半減期および／または(ii) 改変されたFcRnへの結合親和性を有するようにする。
【００８４】
アルブミン変異体は、配列番号１中のV547位、好ましくはV457A；K573位、好ましくはK573PまたはY；I523位、好ましくはI523AまたはG；T527位、好ましくはT527M；K500位、好ましくはK500A；またはE505位、好ましくはE505Qに相当する位置から成る群より選択された、配列番号１の成熟アルブミンポリペプチド配列中に１以上の（例えば数個の）変異を含むことができる；ここで前記１以上の（数個の）変異が該アルブミン変異体を(i) 改変された血漿半減期および／または(ii) 改変されたFcRn結合親和性を有するようにする。
【００８５】
アルブミン変異体は、配列番号１の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列中に、配列番号１の573, 523, 527または505位に相当する位置から成る群から選択された１以上の（例えば数個の）変異を含んでもよい：好ましくは、K573Y；I523G；I523A；T527M；E505Q；もしくはK573P；例えばK573YとI523G；K573YとI523GとT527M；K573YとE505QとT527M；K573YとT527M；K573PとI523G；K573PとI523GとT527M；K573PとE505QとT527M；K573PとT527M；V547A；V547AとK573P；V547AとE505QとK573PとT527M；またはK500AとH510Q。
【００８６】
第一の結合剤は様々な方法で検出することができ、例えば第一の結合剤に結合する第二の結合剤を使ったサンドイッチアッセイを利用することにより検出することができる。当業者は、表面分子を検出する様々な方法を知っている。
【００８７】
一実施形態では、結合剤は検出可能標識を含む。更に別の実施形態では、検出可能標識が放射性同位体、検出可能生成物をもたらす酵素、蛍光団（フルオロフォア）、化学発光化合物、磁性粒子、ミクロ粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノスフェア、ビオチン、ストレプトアビジンおよびジゴキシンから選ばれる。
【００８８】
ある場合には、FcRnレベルはFcRnの発現レベル（RNA）から推定することもできる。よって、一実施形態では、FcRnレベルが試料中のFcRnのRNAレベルを測定することにより決定される。非限定的方法の例は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、qPCR（定量的PCR）、FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）、RCA（ローリングサークル型増幅）等である。
【００８９】
ある実施形態では、本発明の方法が、必要とする対象に、該対象がFcRnが上方制御された癌亜型を有すると考えられる場合に、本発明に従って定義されるような（癌治療用の）組成物を投与するおよび／または処方するおよび／または投与を推奨することを更に含む。
【００９０】
癌の亜型分類、病期診断および発症リスクの予測に用いられる組成物
本発明の第二の態様は、癌の亜型分類、癌の病期診断および／または癌の発症リスクの予測に用いられる、FcRn結合剤を含む組成物であって、
ここで参照レベルと比較して生物学的試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；前記参照レベルと同等もしくは低いレベルが、FcRnが正常の亜型／病期を示し；そして／または
前記参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが癌の発症リスクが高いことを示し；そして前記参照レベルと同等もしくは低いレベルが癌の発症リスクが高いことを示さない
ことを特徴とする組成物に関する。
【００９１】
本発明の第一態様の実施形態は、この第二態様と相互に交換可能に組み合わせることができる。
【００９２】
好ましい実施形態では、該組成物は結腸直腸癌または乳癌の亜型分類（診断）に用いられ、ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのより高いレベルが、FcRnが上方制御された亜型を示し；そして前記参照レベルと同等もしくは低いレベルが、FcRnが正常の亜型を示す。
【００９３】
上述した通り、一実施形態では、該組成物は、FcRn結合剤による治療に対して感受性の癌を亜型分類／同定するための組成物である。更に別の実施形態では、参照レベルと比較して前記試料中のFcRnのレベルが高いことがFcRn結合剤による治療に対して感受性である亜型／病期を示す。
【００９４】
癌の治療
上述したように、発明チームは驚くべきことに、高レベルのFcRn受容体を発現する癌亜型を同定した。そのような亜型は、FcRn結合剤を使った治療のための関連する亜型と考えられる。
【００９５】
よって、本発明の第三の態様は、癌の治療、予防または緩和に用いられる、治療薬に結合させたFcRn結合剤を含む組成物であって、前記癌が参照レベルと比較してFcRnの上方制御レベルを有する前記組成物に関する。別の形で表現すれば、本発明は、FcRnを過剰発現する癌の治療、予防または緩和に用いられる、治療薬に結合されたFcRn結合剤を含む組成物に関する。別の実施形態では、前記癌型が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、例えば腎明細胞癌、卵巣癌、頸癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌、および耳鼻咽喉癌から成る群より選択される。実施例６は、対応する正常健常組織に比較した様々な癌型における過剰発現を示す。実施例８は、FcRn高結合剤がFcRn発現細胞に結合すること（および／または該細胞により取り込まれること）を示し、一方でFcRnがノックダウンされた細胞（FcRn陰性細胞）はずっと低い結合／取り込みを有する。別の実施形態では、前記癌が乳癌および／または結腸直腸癌である。マウスへの静脈注射後のヒト異種移植片中の改変型アルブミン高結合剤の蓄積／ターゲティングが実施例２〜４と７に示される。ここで、Alexa Fluor（登録商標）680で標識されたアルブミン変異体を、薬剤および／またはイメージング剤に連結されたFcRn結合剤のターゲティング／蓄積の確証のためのin vivoモデル系として使用した。
【００９６】
FcRn結合剤は様々な方法で治療薬に連結させることができる。例えば、一実施形態では、FcRn結合剤が融合、接合または会合により治療薬に連結される。
【００９７】
更に別の実施形態では、前記FcRn結合剤はWTアルブミン、アルブミン変異体、FcRn抗体、IgG類、ペプチドまたはタンパク質、および核酸、例えばアプタマー、から成る群より選択され、好ましくは結合剤はアルブミンであり、さらにより好ましくはアルブミン変異体である。更に別の実施形態では、変異体HSAは、野生型と比較して１以上の（例えば数個の）改善された薬物動態的性質を有し、例えば変更された半減期、例えば増加または減少した半減期を有する。更に別の実施形態では、変異体HSAが、野生型HSAに比較してFcRnへの高い結合性および／または長い半減期を有する。
【００９８】
一実施形態では、前記アルブミン変異体が、野生型のアルブミン（配列番号１）よりも高いFcRn結合親和性を有する。好ましい実施形態では、該変異体が配列番号４または配列番号５である。
【００９９】
様々な治療薬をFcRn結合剤に融合／接合／会合させることができる。例えば、一実施形態では、前記治療薬が放射性核種、抗癌剤、例えばアクチノマイシンＤ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アルカンスルホネート、アルケラン、アムサクリン、アナストロゾール、アントラシクリン、代謝拮抗物質、Ara-C、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ゲラン桿菌（Bacillus Calmette-Guerin：ＢＣＧ）、ビカルタミド（Bicalutamide）、BiCNU、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチナム、カルムスチン、CCNU、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムフェニコール、絨毛膜、シクロスポリン、シドフォビル、シスプラチン、クラドリビン、コールタール含有製品、コルチシン、CPT-11、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダナゾール、ダサチニブ、ダウノルビシン、デクスラゾキサン（Dexrazoxane）、ジエチルスチルベストロール、ジノプロストン、ジトラノール含有製品、ドセタキセル、ドキソルビシン、DTIC、デュタステリド、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エチレンイミン、エトポシド、エキセメスタン、フィナステリド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸類似体、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゴナドトロピン、ゴセレリン、ヘルセプチン、ヘキサメチルアミン、ホルモン剤、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシル酸塩、インターフェロン含有製品（ペグインターフェロンを含む）、イリノテカン、レフルノミド、レトロゾール、リュープロレリン酢酸塩、ロムスチン、メクロレタミン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メノトロピン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メフェプリストン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ミコフェノール酸モフェチル、ナファレリン、ナイトロジェンマスタード、ノトロソウレア、オストロゲン含有製品、オキサリプラチン、オキシトシン、パクリタキセル、パミドロネート、ペンタミジン、ペントスタチン、白金化合物、プリカマイシン、ポドフィリン、プロカルバジン、プロゲステロン含有製品、プリン類似体、ピリミジン類似体、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、リババリン、リツキシマブ、シロリムス、ステロイド、STI-571、ストレプトゾシン、シントシノン、シントメトリン、タクロリムス、タモキシフェン、タキサン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、テトラジン、タリドミド、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポイソメラーゼ阻害剤、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレオスルファン、トリフルリジン、トリメトレキサート、トリプトレリン、バルガンシクロビル、ビダラジン、ビンブラスチン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、キセロダおよびジドブジンから成る群より選択される。
【０１００】
更に別の実施形態では、FcRn結合剤は下記に詳述するようなイメージング剤と更に連結される。
【０１０１】
癌の生体内イメージング
上述した通り、本発明者らは、驚くべきことに同じ型の正常組織に比較して高レベルのFcRnを発現する癌亜型を同定した。そのような亜型は検出可能な成分に連結されたFcRnターゲティング剤／結合剤を使って生体内でイメージングすることができる。
【０１０２】
よって、本発明の更なる態様は、癌の生体内イメージングに用いられる検出可能成分（イメージング成分）に連結されたFcRn結合剤を含む組成物であって、前記癌が参照レベルと比較して上方制御されたレベルのFcRnを有することを特徴とする組成物に関する。別の形で表現すれば、本発明は、FcRnを過剰発現している癌の生体内イメージングに用いられる、イメージング剤に連結されたFcRn結合剤を含有する組成物に関する。実施例３，４および７（および対応する図４〜14＋17）はマウスのイメージングデータを提供する。
【０１０３】
ここで、より特定の態様では、本発明は対象における（FcRn陽性／FcRn上方制御）癌の生体内画像を取得する方法であって、該方法は次の工程：
a) 対象動物またはヒトに、検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を含む医薬上許容される組成物を投与し；
b) 前記対象動物またはヒトをイメージングして、該対象において検出可能成分に連結されたFcRn結合剤からの検出可能シグナルを同定し；そして
c) 前記検出可能シグナルの画像を作成し、それにより対象動物またはヒトにおける（FcRn陽性／FcRn上方制御）癌の画像を取得する
を含む。
【０１０４】
更なる態様では、本発明は、対象における（FcRn陽性）癌の診断／イメージング法に用いられる、前記検出可能成分に連結されたFcRn結合剤に関し、前記方法が
a) 対象に前記検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を投与し；そして
b) 前記対象をイメージングし、（FcRn陽性／FcRn上方制御）癌に結合している検出可能成分に連結した前記FcRn結合剤を検出する
ことを含む。
【０１０５】
特定の実施形態では、それはPETまたはSPECTに有用なイメージング用の放射性検出可能成分であってよい。別の実施形態では、それは例えば光学的イメージングまたはMRIイメージングに有用な非放射性検出可能成分であってよい。
【０１０６】
様々な放射性標識組成物が、SPECTおよびPETイメージング用の様々な抗原の部位特異的ターゲティングのために開発されている。一般的理論は、特定抗原に対して高特異性を有するペプチドおよび／またはタンパク質に（陽電子）放射核種を取り付け、SPECTおよびPETイメージングを使って発現レベルを可視化しそして定量することを伴う。この研究分野は、腫瘍診断、病期診断および治療経過観察のための特定の適用性を有することが示されている。一実施形態では、放射性核種は11Ｃ、15Ｏ、18Ｆ標識フルデオキシグルコース、64Ｃｕ、68Ｇａ、66Ｇａ、60Ｃｕ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、89Ｚｒ、124Ｉ、76Ｂｒ、86Ｙ、94mＴｃ、131Ｉ、G67Ｇａ、111Ｉｎ、123Ｉおよび99mＴｃからなる群より選ばれる。
【０１０７】
一実施形態では、MRIに特に適当な、ガドリニウムキレートのような常磁性粒子、および超常磁性酸化鉄粒子を使用することができる。一実施形態では、光学的イメージングに特に適当な、量子ドット、蛍光および生物発光剤、並びにFRET分子を使用できる。
【０１０８】
他の実施形態では、生体内で可視化することのできる癌は、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、例えば腎明細胞癌、卵巣癌、頸癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、頭頸部癌、および耳鼻咽喉癌からなる群より選ばれる。
【０１０９】
他の実施形態では、対象がヒトまたは動物、好ましくはヒトである。
好ましくは、FcRn結合剤は、本明細書中に記載されるような高結合性アルブミンである。
【０１１０】
上記に様々な態様で記載した通り、本発明の組成物は、例えば癌を治療するためまたは癌をイメージングするために使用することができる。事実、それらの態様は、組成物を治療とイメージングに（同時に）使用できることを意味する、「セラノスティクス（治療と診断の組み合わせ）」と呼ばれるものに組み合わせることができる。よって、一態様では、本発明は１つ以上のセラノスティクス剤に連結されたFcRn結合剤を含む組成物に関する。これは、様々な剤をFcRn結合性分子と連結させることにより、例えば検出可能成分＋治療薬を連結することにより達成することができる。よって、一実施形態では、FcRn結合性分子が、検出可能成分と治療薬の両方を含む。更なる実施形態では、検出可能成分と治療薬が同一分子であり、例えば放射性核種である。セラノスティクスは、個別化医療の分野の中でも特に新しい分野である。
【０１１１】
炎症性疾患の亜型の同定
FcRnを過剰発現する癌亜型の同定の他に、本発明者らのチームは炎症性疾患の中にもそのような亜型を同定した。そのような亜型は、臨床的見地から重要と考えられる。何故なら、炎症性細胞および／または損傷細胞上の、上方制御された接近可能な（表面の）受容体の存在ゆえに、治療薬、診断薬またはイメージング剤（造影剤）に連結されたFcRn結合剤を使用する注目のターゲットになるからである。実施例５は、炎症性疾患（慢性関節リウマチ（RA））におけるFcRnの存在を示す。
【０１１２】
よって、本発明の一態様は、炎症性疾患を亜型分類する方法であって、
・生物学的試料（例えば以前に得られたもの）を対象から入手し；
・前記試料中のFcRnレベルを決定し；そして
・前記決定されたレベルを参照レベルと比較する
ことを含み、
ここで参照レベルと比較して前記試料中のFcRnの高レベルが、FcRnが上方制御された亜型を示し；そして前記参照レベルと同じかまたはより低いレベルが、FcRnが正常の亜型またはFcRnが下方制御された亜型を示す
方法に関する。
【０１１３】
一実施形態では、前記試料が生検標本、例えば関節生検標本、例えば膝関節、肘関節または指関節からのからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、組織が滑膜組織である。より特別な実施形態では、組織が滑膜表面組織である。
【０１１４】
ある実施形態では、本発明に係る方法は更に、対象がFcRnが上方制御された炎症疾患亜型を有すると考えられる場合、必要とする患者に、本発明に従って定義されるような組成物（例えば炎症性疾患の治療用の組成物）を投与することおよび／または処方することおよび／または投与を推奨することを更に含む。
【０１１５】
炎症性疾患を亜型分類または病期診断するのに用いられる組成物
本発明の更なる態様は、炎症性疾患の亜型分類または病期診断に用いられるFcRn結合剤を含む組成物であって、参照レベルと比較して生物学的試料中のFcRnの高レベルが、FcRnが上方制御された亜型／病期を示し；そして前記参照レベルと同等またはそれより低いレベルが、FcRnが正常の亜型／病期を示すことを特徴とする組成物に関する。
本発明の上記の態様の実施形態は本態様と相互に交換可能に組み合わせることができることに留意すべきである。
【０１１６】
炎症性疾患の治療
上述したように、接近可能なFcRn受容体を発現している（例えば表面上に発現している）炎症性疾患亜型が同定された。そのような亜型は、FcRn結合剤を使用する治療に関連のある亜型と考えられる。
【０１１７】
よって、本発明の更なる態様は、抗炎症薬に連結されたFcRn結合剤を含む、例えば炎症性疾患の治療用の組成物であって、ここで前記炎症性疾患がFcRn受容体の上方制御レベルを有することを特徴とする組成物に関する。
【０１１８】
一実施形態では、前記炎症性疾患または障害が、関節炎、喘息、潰瘍性結腸炎、炎症性腸症候群、アレルギー、アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー、蕁麻疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、薬物アレルギー、昆虫アレルギー、肥満細胞症、変形性関節症、関節リウマチ、脊椎関節症、炎症を原因とする心血管疾患、動脈硬化症、移植片拒絶反応、および移植片対宿主病から成る群より選択され、好ましくは関節炎である。
【０１１９】
更に別の実施形態では、前記抗炎症薬がNSAID（非ステロイド系抗炎症薬）剤、例えばロルノキシカム、ジクロフェナク、ニメスリド、イブプロフェン、ピロキシカム、ピロキシカム（ベタシクロデキストリン）、ナプロキセン、ケトプロフェン、テノキシカム、アセクロフェナク、インドメタシン、ナブメトン、アセメタシン、モルニフルメート、メロキシカム、フルビプロフェン、チアプロフェン酸、プログルメタシン、メフェナム酸、フェンブフェン、エトドラク、トルフェナム酸、スリンダク、フェニルブタゾン、フェノプロフェン、トルメチン、アセチルサリチル酸、デクスイブプロフェン、サイトカイン遮断薬、例えばTNFα、および医薬上許容される塩、複合体および／またはプロドラッグ、並びにそれらの混合物から成る群より選択される。
【０１２０】
更に別の実施形態では、本発明に従って用いられる組成物は、医薬上許容される担体および／または希釈剤を更に含んでもよい。
【０１２１】
炎症性疾患、例えば関節リウマチの生体内イメージング
上述した通り、本発明者らは驚くべきことに、同じ型の正常組織に比較して高レベルのFcRn受容体を発現している炎症性疾患（例えば関節リウマチ）亜型も同定した。そのような亜型は、検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を使って生体内でイメージングすることができる。
【０１２２】
よって、本発明の更なる態様は、炎症性疾患、例えば関節リウマチの生体内イメージングに用いられる、検出可能成分（イメージング成分）に連結されたFcRn結合剤を含む組成物であって、前記炎症性疾患（例えば関節リウマチ）が参照レベルと比較して上方制御されたFcRnレベルを有することを特徴とする組成物に関する。別の形で表現すれば、本発明は、FcRnを過剰発現している炎症性疾患（例えば関節リウマチ）の生体内イメージング用の、イメージング剤に連結されたFcRn結合剤を含む組成物に関する。
【０１２３】
より特定の態様では、本発明は、対象においてFcRn陽性（および／またはFcRn上方制御）炎症性疾患、例えば関節リウマチの画像を取得する方法であって、該方法は次の工程：
a) 対象動物またはヒトに、検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を含む医薬上許容される組成物を投与し；
b) 前記対象動物またはヒトをイメージングして、該対象において検出可能成分に連結されたFcRn結合剤からの検出可能シグナルを同定し；そして
c) 前記検出可能シグナルの画像を作成し、それにより前記対象動物またはヒトにおけるFcRn陽性（および／またはFcRn上方制御）炎症性疾患の画像を取得する
を含む。
【０１２４】
更なる態様では、本発明は、対象におけるFcRn陽性（および／またはFcRn上方制御）炎症性疾患、例えば関節リウマチの診断／イメージング法に用いられる、検出可能成分に連結されたFcRn結合剤に関し、前記方法が
a) 対象に前記検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を投与し；そして
b) 前記対象をイメージングし、前記（FcRn陽性／上方制御）炎症性疾患に結合した、前記検出可能成分に連結されたFcRn結合剤を検出する
ことを含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、それはPETまたはSPECTに有用なイメージング用の放射性検出可能成分であってよい。別の実施形態では、それは例えば光学的またはMRIイメージングに有用な非放射性検出可能成分であってよい。
【０１２６】
様々な放射性標識組成物が、SPECTおよびPETイメージング用の様々な抗原の部位特異的ターゲティングのために開発されている。一般的理論は、特定抗原に対する高特異性を有するペプチドおよび／またはタンパク質に（陽電子）放射核種を取り付け、SPECTおよびPETイメージングを使って発現レベルを可視化しそして定量することを伴う。この研究分野は、腫瘍診断、病期診断および治療経過観察のための特有の適用性が示されている。一実施形態では、放射性核種は11Ｃ、15Ｏ、18Ｆ標識フルデオキシグルコース、64Ｃｕ、68Ｇａ、66Ｇａ、60Ｃｕ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、89Ｚｒ、124Ｉ、76Ｂｒ、86Ｙ、94mＴｃ、131Ｉ、G67Ｇａ、111Ｉｎ、123Ｉおよび99mＴｃからなる群より選ばれる。
【０１２７】
一実施形態では、MRIに特に適当な、ガドリニウムキレートのような常磁性物質、および超常磁性酸化鉄粒子を使用することができる。一実施形態では、光学的イメージングに特に適当な、量子ドット、蛍光および生物発光剤、並びにFRET分子を使用できる。
【０１２８】
本発明の態様の１つに関して記載された実施形態や特徴は、本発明の別の態様にも当てはまることに留意すべきである。
本出願明細書に引用された全ての特許および非特許参考文献は、その全内容が参照により本明細書に援用される。
【０１２９】
本発明を特定の実施形態に関連して記載してきたが、決して提示された例に限定されると解釈してはならない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に照らして解釈すべきである。特許請求の範囲では、用語「含んでいる」または「含む」は、他の可能な構成要素または工程を排除しない。また、「a」または「an」（ある１つの）等のような参照の言及は、複数を除外するものであると見なしてはならない。更に、他の請求項に言及される個々の特徴はおそらく有利に組み合わせることができ、他の請求項におけるそれらの個々の特徴の言及は、特徴の組み合わせが可能・有利であるということを排除しない。
本発明を以下の非限定例により更に詳細に説明する。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：患者の生検標本におけるFcRn発現
研究目的
癌組織と健常組織においてFcRnレベルを同定すること。
【０１３１】
材料と方法
材料
２種類の癌型を調べた（癌型あたり５標本）。それらは結腸癌と乳癌であった。健全な隣接組織を対照（コントロール）として使用した。ヒト癌組織標本は、デンマーク国オルフス市8000にあるオルフス大学病院の病理学研究所（The Pathology Institute, Aarhus University Hospital）により提供された。
【０１３２】
ヒト癌組織標本の免疫組織化学的分析
ヒト組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した（FFPE）。FFPEヒト組織切片をTissue Clearキシレン代替品（Tek/Sakura Finetek社製）で処理し、スライドを脱パラフィンした。次に、エタノール溶液を100％から75％に徐々に減らすことによりスライドを再水和し、最後に冷水道水に移した。
【０１３３】
抗原回復は、クエン酸緩衝液pH 6.0中で800 Wで８分間マイクロ波オーブン中で加熱し、次いで560 Wで14分間×２回加熱し、最後に20分間冷ますことにより行った。
染色手順はAutostainer Link 48装置（Dako社）上で実施した。タンパク質ブロッキング剤（Dako社）を使ってスライドをブロックし、次いで一次ポリクローナル・ウサギ抗ヒトFCGRT抗体（HPA012122、Sigma社）を使って1：200希釈で染色した。
【０１３４】
可視化には、Dako EnVisionTM（商標）（キットK8023）検出システムを使用した。このシステムは、過酸化水素を含む内因性ペルオキシダーゼブロッキング剤（EnVisionTM FLEX Peroxydase-blocking Reagent, SM801）、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）およびウサギ免疫グロブリンに対するヤギ第二抗体が連結されたポリマー（EnVisionTM FLEX/HRP, SM802）、DAB色原体（EnvisionTM FLEX DAB＋Chromogen, DM827）および最後にヘマトキシリン（EnVisionTM FLEX Hematoxylin, K8008）を含んだ。
【０１３５】
結果
図１に与えた結果は、対応する健常組織に比較して高いFcRn発現レベルを示すと同定された乳癌亜型と結腸癌亜型の代表例を示す。
【０１３６】
結論
FcRn受容体を過剰発現している乳癌と結腸癌が存在することが発見された。そのような亜型が同定されたため、FcRn受容体はそれらの特定の亜型のターゲット癌療法のための結合剤としても使用することができると思われる。
【０１３７】
実施例２：マウスにおけるヒト癌細胞系異種移植片でのFcRn発現
研究目的
マウスにおけるヒト癌異種移植片でのFcRn過剰発現の同定
【０１３８】
材料と方法
癌モデル
・PXBC-3膵臓癌細胞
・HT-29ヒト結腸直腸腺癌細胞
・MCF-7ヒト乳癌細胞
【０１３９】
結果
図２に与えた結果は、PXBC-3膵臓癌細胞に比較した、ヒト結腸直腸腺癌細胞（HT-29）とヒト乳癌細胞（MCF-7）における高いFcRn発現を示す。
【０１４０】
結論
FcRnを過剰発現する癌がマウス異種移植片において同定され、それは生体内FcRn結合剤試験または癌治療に利用することができる。
【０１４１】
実施例３：マウスへの静脈内注射後のヒト異種移植片における改変型アルブミン高結合剤の蓄積／ターゲティング
【０１４２】
研究目的
アルブミン変異体の生体内分布と半減期および腫瘍蓄積を調べること。
【０１４３】
材料と方法
アルブミン変異体
Alexa Fluor 680で標識された改変アルブミン変異体はAlbumedix Ltd. (ノッティンガム、UK)より提供された。
・HSA-K573P (高結合剤Ｉ)（HBI）（配列番号４）
・HSA-K500A（低結合剤）（LB）（配列番号６）
【０１４４】
生体内試験
全ての動物実験は、オルフス大学の生物臨床医学衛生研究所（the Institute of Biomedicine at Health）の動物施設内で実施した。全ての実験は、デンマーク国実験動物調査団（Danish Experimental Animal Inspectorate）により承認された。
【０１４５】
細胞培養
ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞系のヒト癌細胞系（MDA-MB-231/Luc）を本実験に使用した。細胞を、10％ウシ胎仔血清（FBS）（Gibco, Life Technologies, #10270-106）、0.1 mM MEM非必須アミノ酸（Gibco, Life Technologies, #11140-035）、2 mM L-グルタミン（Lonza, #BE17-605E）および１％ペニシリンとストレプトマイシン（Gibco, Life Technologies, #15140-122）を含むDMEM（4500 mg/L D-グルコース、L-グルタミン）（Gibco, Life Technologies, #41965-039）中に維持した。
【０１４６】
腫瘍異種移植片の生物発光
乳癌MDA-MB231/Luc細胞〔PBSとマトリゲル(Matrigel)のゲルトレックス（GeltrexTM；LDEV不含有の成長因子低減基底膜抽出物(Gibco, Life Technologies)）の１：１溶液400μL中の４×106細胞〕を、各マウス（11週齢、雌、Balb/cAnRj-Foxn1-nu、Janvier）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞の接種のための麻酔薬としてイソフルランを使用した。可視できるまで（11日間）腫瘍を増殖させた後、それらのマウスを各群（処置群Ｎ＝４、対照群Ｎ＝３）でほぼ同じ総腫瘍体積を有する４つの群に無作為に割り付けた。処置群には10 mg/kgの蛍光アルブミン、対照群には150μLのPBSを使って処置を行った。処置後各日において、腫瘍の最大縦径（長さ）と幅径を使ったキャリパー測定により腫瘍の大きさを測定した。腫瘍体積は次の式により算出した：
腫瘍体積＝1/2（長さ×幅2）。
【０１４７】
実験期間の終わりに、マウスを麻酔下で頸椎脱臼により犠牲にし、腫瘍と臓器を回収した。血液と臓器をIVIS（登録商標）Spectrum Bioimager (PerkinElmer, Waltham, MA)を使って分析した。スペクトル・アンミキシングを使ってバックグラウンド自家蛍光を削除し、続いてLiving Imageソフトウェア、バージョン4.3.1 (PerkinElmer)を使ってデータ解析を行った。
【０１４８】
腫瘍、肝臓および腎臓をRNA単離のため急速凍結(snap freeze)させ、免疫組織化学的試験用に保存するため中性緩衝化ホルマリン液（10％）中で固定した。72時間後、一連の段階的エタノール浴を使って水を置換することにより組織を脱水し、次いでワックス（蝋）で浸潤させた。浸潤組織をワックスブロック中に包埋した。
【０１４９】
生物発光データのイメージングと定量
マウス体重１kgあたり300 mgでルシフェリン（D-ルシフェリン、Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA）を皮下注射した後、マウスを3.5％イソフルランで麻酔した。D-ルシフェリン注射の10分後、Xenogen IVIS Spectrumイメージングプラットフォーム（PerkinElmer、MA）を使って、3.5％イソフルラン麻酔薬を連続的に投与しながら全身スキャンを行った。関連のある領域に渡って関心領域（ROI）を手動で選択した。測定された強度を１ROIの中の表面放射輝度（photons／sec／cm2／sr）（sr＝ステラジアン）として与えた。
【０１５０】
実験の終了は、D-ルシフェリン注射の10分後の頸椎脱臼により行い、生体外（ex vivo）生物発光の評価を可能にした。着目の腫瘍と臓器を回収し、IVISスキャナーを使って40分間生体外イメージングした。
【０１５１】
アルブミン注射と試料調製
Alexa Fluor 680標識アルブミン変異体を、マウスの尾静脈に2 mg/mLで静注した。注射後、舌から（１分目の試料）並びに、尾に切り目を付けることにより４時間、24時間、48時間および72時間目に、ヘパリン被覆毛細管（HirschmannR（登録商標）Laborgerate GmbH & Co.）中に血液試料を採取した。それらの試料を遠心管に移し、遠心分離して血清から血液細胞を分画した。試料はスキャンを実施するまで４℃で保存した。
【０１５２】
結果
図３Ａに描写した結果は、アルブミン変異体の半減期と、対応する指数傾向曲線を示す。傾向曲線は、低結合剤の場合は最も急勾配であり、高結合剤の場合はより水平であると観察され、高結合剤では半減期がより長いことを意味する。この結果は、全てのアルブミン型についての計算半減期値に関する図３Ｂにおいても示される。最長の半減期は高結合剤の場合に観察された。
【０１５３】
図４に示される結果は、臓器と腫瘍の生体外での蛍光強度を示し、全組織と腫瘍が選択される。最高の蛍光強度は、全てのアルブミン変異体について、他の臓器に比較して腫瘍に観察された。
【０１５４】
代わりの比較法では、全臓器と腫瘍について一定の関心領域（ROI）が選択され、その結果が図５に示される。ここでは臓器に比較して腫瘍にアルブミン変異体が蓄積することが明らかに観察され、高結合剤を使用した場合に最高の程度に蓄積することが観察された。
【０１５５】
図６は、生物発光を測定することによる腫瘍の局在化を示し（上のパネル）、これはスペクトル・アンミキシング後の蛍光により測定されたアルブミン変異体の存在（下のパネル）と一致し、腫瘍におけるアルブミン変異体の蓄積の可視的表示（ビジュアル表示）を与える。
【０１５６】
図７に与えられる結果は、腫瘍の重量に対して調整されたアルブミン変異体の蛍光強度を示す。腫瘍は壊死と浮腫組織から成ることがあるので、図８に示される生物発光を利用して、ルシフェラーゼを発現している生存腫瘍細胞に対する調整を行った。ここでは、他のアルブミン変異体よりも多く、高結合剤ルブミン変異体が蓄積することが観察される。
【０１５７】
結論
腫瘍における最大の蓄積は、生物発光を利用して生存腫瘍細胞について補正すると、高結合剤ルブミン変異体を使った場合に観察される。
【０１５８】
実施例４
マウスにおける静脈内注射後のヒト異種移植片での改変型アルブミン高結合剤の蓄積／ターゲティング。異種移植片モデル２：乳癌異種移植片（無蛍光細胞）
【０１５９】
研究目的
無蛍光の腫瘍異種移植片におけるアルブミンの生体内分布と半減期を調べること。
【０１６０】
材料と方法
アルブミン変異体
Alexa Fluor 680標識改変型アルブミン変異体はAlbumedix Ltd.より提供された。
・HSA-E492G, K573P, K574H, Q580K（高結合剤II）（HBII）（配列番号５）
・HSA-K500A（低結合剤）(LB)（配列番号６）
【０１６１】
生体内試験
全ての動物実験は、オルフス大学の生物臨床医学衛生研究所（the Institute of Biomedicine at Health）の動物施設内で実施した。全ての実験は、デンマーク国実験動物調査団（Danish Experimental Animal Inspectorate）により承認された。
【０１６２】
細胞培養
ヒト乳癌細胞系MCF-7を、5％CO2を有する加湿空気雰囲気下で37℃にて培養した。MCF-7細胞を、10％ウシ胎仔血清（Gibco, Life Technologies, #10270-106）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Life Technologies, #15140-122）および10μg/mLインシュリン（Sigma, #I9278）が補足されたDMEM（Gibco, Life Technologies, #61965-026）培地中で増殖させた。
【０１６３】
ヒト腫瘍異種移植片
細胞接種の３日前に、β-エストラジオールペレット（0.5 mg、60日リリース；Innovative Research of America, Sarasota, FL, USA）をマウスの頸部に皮下移植し、腫瘍成長を維持した。MCF-7細胞〔PBSとマトリゲル(Matrigel)のゲルトレックス（GeltrexTM；LDEV不含有の成長因子低減基底膜抽出物(Gibco, Life Technologies)）との１：１溶液400μL中の7.5×106細胞〕を、各マウス（11〜16週齢、雌、Balb/cAnRj-Foxn1-nu、Janvier）の右脇腹に皮下注射した。ペレットの導入と腫瘍細胞の接種のために麻酔薬としてイソフルランを使用した。腫瘍の大きさは、一週間に２〜３回、長さと幅のキャリパー測定により測定し、腫瘍体積を算出した。15日間の腫瘍増殖後にアルブミン変異体の注射を行った。予め、各群がほぼ同じ総腫瘍体積（腫瘍体積＝ｎ／６×Ｌ×Ｗ2）を有するようにマウスを無作為に割り付けることにより、マウスを異なる処置群に割り当てた（HBII、Ｎ＝７；ＷＴ、Ｎ＝６；ＬＢ、Ｎ＝６；ＰＢＳ、Ｎ＝３）。
【０１６４】
マウスの頸椎脱臼により実験を終了し、臓器と腫瘍を回収し、IVISスキャナーを使ってスキャンし、RNA単離のために急速凍結させ、そして／または組織学検査のため10％中性緩衝化生理食塩水中に保存した。
【０１６５】
アルブミン注射と試料調製
Alexa Fluor 680標識アルブミン変異体を、マウスの尾静脈に2 mg/mLで静注した。注射後、舌から（１分目の試料）並びに、尾に切り目を付けることにより４時間、24時間、48時間および72時間目に、ヘパリン被覆毛細管（HirschmannR（登録商標）Laborgerate GmbH & Co.）中に血液試料を採取した。それらの試料を遠心管に移し、遠心分離して血清から血液細胞を分画した。試料はスキャンを実施するまで４℃で保存した。
【０１６６】
蛍光データのイメージングと定量
マウスを3.5％イソフルランで連続麻酔し、Xenogen IVIS Spectrumイメージングプラットフォーム（PerkinElmer、MA）を使って全身スキャンを行った。臓器と腫瘍をIVISスキャナー中で生体外スキャンした。１つの励起波長（ex: 675 nm）を使って４つの異なる発光波長（発光: 720 nm、740 nm、760 nm、780 nm）でスペクトル・アンミキシングを実施した。
【０１６７】
比較用にLiving Image 4.3.1ソフトウェアを使って画像をグループとしてロードし、関連のある領域に渡って関心領域（ROI）を手動で選択した。測定された強度を表面平均放射輝度（photons／sec／cm2／sr）として与えた。自家蛍光が非常に低かったため、４時間目と21時間目の全身スキャンにはスペクトル・アンミキシングを実施しなかった。代わりにスキャンの励起波長：675 nmと発光波長：720 nmを使用した。
【０１６８】
結果
図９Ａに描写した結果は、アルブミン変異体の半減期と、対応する指数傾向曲線を示す。傾向曲線は、低結合剤の場合は最も急勾配であり、高結合剤の場合はより水平であると観察され、高結合剤では半減期がより長いことを意味する。
【０１６９】
図９Ｂの結果は、24時間までの半減期の初期段階を示す。高結合剤と野生型が低結合剤よりもずっと水平状態になる。
【０１７０】
24〜72時間の半減期の後期段階が図９Ｃに示され、この図は、傾向曲線がそれほど急勾配でないため高結合剤IIが野生型や低結合剤に比較して長い半減期を有することを示す。
【０１７１】
図９Ｄの表は、全てのアルブミン変異体についての計算半減期値を要約し、これは全時間範囲（Ｒ2＜0.95）と初期（Ｒ2＜0.96）の両者に比較して後期の傾向曲線がより良好な適合（Ｒ2値が約0.99）が観察されることを示す。高結合剤IIは、後期の場合約23時間という最高の半減期を示す。従って、高結合剤IIの半減期が最大であるので、それらのアルブミン変異体は生体内で期待通りに挙動し、よって本研究に有用である。
【０１７２】
図10は、様々な臓器と腫瘍におけるアルブミン変異体の蛍光強度を示す。この図から全てのアルブミン変異体が腫瘍に蓄積し、高結合剤IIが最大の程度に蓄積することが観察される。
図11は、腫瘍の蛍光の結果のみを示し、高結合剤IIで最大量が観察されることを示す。
図12は、腫瘍重量について調整しそして一定の大きさの関心領域（ROI）を有する時の結果を示し、これは図11と同じパターン、すなわち高結合剤IIにより腫瘍中に最大の蓄積が存在することを示す。
【０１７３】
図13では、関心領域として腫瘍全体が選択されたが、これはパターンに顕著な影響を及ぼさなかった。同様に、高結合剤IIが同程度に蓄積する。
図14Ａは、投与21時間後のマウスにおける蛍光アルブミンの分布の視覚的印象を与える。この図ではそれらが全て容易に可視化されている。
図14Ｂは、72時間後のアルブミン変異体分布を示し、全てのアルブミン変異体について腫瘍部位の周辺にまだ蛍光強度が観察される。
【０１７４】
結論
これらの結果は、アルブミンFcRn高結合剤変異体による腫瘍中への最大蓄積が、FcRnにより指令される蓄積であることの示唆であることを示す。
【０１７５】
実施例５
目的
炎症性疾患のFcRnを発現する亜型の同定
【０１７６】
材料と方法
４例の関節リウマチ標本を分析した。
ヒト関節リウマチ組織標本は、デンマーク国オルフス市8000にあるオルフス大学の生物臨床医学部により提供された。
【０１７７】
ヒト組織標本の免疫組織化学分析
ヒト組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した（FFPE）。FFPEヒト組織片をTissue Clearキシレン代替品（Tek/Sakura Finetek社）で処理し、スライドを脱パラフィンした。次に、エタノール溶液を100％から75％に漸減することによりスライドを再水和し、最後に冷水道水流水に移した。
【０１７８】
抗原回復は、クエン酸緩衝液pH 6.0中で800 Wで８分間マイクロ波オーブン中で加熱し、次いで560 Wで14分間×２回加熱し、最後に20分間冷ますことにより行った。
染色手順はAutostainer Link 48装置（Dako社）上で実施した。タンパク質ブロッキング剤（Dako社）を使ってスライドをブロックし、一次ポリクローナルウサギ抗ヒトFCGRT抗体（HPA012122、Sigma社）を使って1：200希釈で染色した。
【０１７９】
可視化には、Dako EnVisionTM（商標）FLEX（キットK8023）検出システムを使用した。このシステムは、過酸化水素を含む内因性ペルオキシダーゼブロッキング剤（EnVisionTM FLEX Peroxydase-blocking Reagent, SM801）、HRPおよびウサギ免疫グロブリンに対するヤギ第二抗体が連結されたポリマー（EnVisionTM FLEX/HRP, SM802）、DAB色原体（EnvisionTM FLEX DAB＋Chromogen, DM827）および最後にヘマトキシリン（EnVisionTM FLEX Hematoxylin, K8008）を含んだ。
【０１８０】
結果
図15に与えられる結果は、関節リウマチ標本の代表例を示し、関節／滑膜組織における高レベルのFcRn発現を示すことが同定された。
【０１８１】
結論
FcRn受容体が関節リウマチ標本の関節／滑膜組織中で発現されることがわかった。
【０１８２】
実施例６
患者の癌生検組織および近隣の正常な健常組織におけるFcRn発現
研究目的
正常な健常組織に比較した多数の癌型におけるFcRn発現の検出
【０１８３】
次の癌型を調べた：
・結腸直腸癌（51例）
・乳癌（ルミナルＢ型（26例）とトリプルネガティブ型（51例））
・腎臓癌（腎明細胞癌（41例））
・膵臓癌（47例）
・頸癌（４例）
・頭頸部癌（10例）
・肺癌（非小細胞肺癌（11例））
・卵巣癌（33例）
・膀胱癌（36例）
標本の数がカッコ内に示される。
【０１８４】
材料と方法
ヒト癌組織標本の免疫組織学的分析
ヒト組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した（FFPE）。FFPEヒト組織片をTissue Clearキシレン代替品（Tek/Sakura Finetek社製）で処理し、スライドを脱パラフィンした。次に、エタノール溶液を100％から75％に徐々に減らすことによりスライドを再水和し、最後に冷水道水に移した。
【０１８５】
抗原回復は、クエン酸緩衝液pH 6.0中で800 Wで８分間マイクロ波オーブン中で加熱し、次いで560 Wで14分間×２回加熱し、最後に20分間冷ますことにより行った。
染色手順はAutostainer Link 48装置（Dako社）上で実施した。タンパク質ブロッキング剤（Dako社）を使ってスライドをブロックし、一次ポリクローナル・ウサギ抗ヒトFCGRT抗体（HPA012122、Sigma社）を使って1：200希釈で染色した。
【０１８６】
可視化には、Dako EnVisionTM（商標）（キットK8023）検出システムを使用した。このシステムは、過酸化水素を含む内因性ペルオキシダーゼブロック剤（EnVisionTM FLEX Peroxydase-blicking Reagent, SM801）、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）およびウサギ免疫グロブリンに対するヤギ第二抗体が連結されたポリマー（EnVisionTM FLEX/HRP, SM802）、DAB色原体（EnvisionTM FLEX DAB＋Chromogen, DM827）および最後にヘマトキシリン（EnVisionTM FLEX Hematoxylin, K8008）を含んだ。
【０１８７】
スコア評価
標本をFcRn発現レベルに基づいて病理学者によりグループ分けし、４つの群に分類した（陰性、低、中および高）。
【０１８８】
結果
図16Ａ〜Ｊに与えられた結果は、次の癌型について、対応する健常組織に比較して高いFcRn発現レベルを示す：結腸直腸癌、乳癌亜型ルミナルＡ型とトリプルネガティブ型、腎臓癌、膵臓癌、頸癌、頭頸部癌、肺癌（非小細胞肺癌）、卵巣癌および膀胱癌。
【０１８９】
結論
結腸直腸癌、乳癌、腎臓癌（腎明細胞癌）、膵臓癌、膀胱癌、頸癌、頭頸部癌、肺癌（非小細胞肺癌）および卵巣癌において、FcRn受容体を過剰発現する（健常／正常組織に比較して）亜型が存在することが発見された。
【０１９０】
そのような亜型が同定された時、FcRn受容体は、それらの特定の亜型のターゲット癌治療のための結合剤として使用することができると思われる。
同様に、本明細書に記載のアルブミンのようなFcRn結合剤に、イメージング剤を連結させることにより、FcRn受容体を癌の生体内イメージング用の結合成分として使用することができる。
更に、FcRn受容体は、本明細書に記載のアルブミンのようなFcRn結合剤に、イメージング剤と治療薬を結合させることにより、癌の生体内イメージングと治療用途のための統合型結合成分として使用することができる。
【０１９１】
実施例７
マウスへの静注後のヒト異種移植片における改変型アルブミン高結合剤の蓄積／ターゲティング
研究目的
アルブミン変異体の腫瘍蓄積を調べること。
【０１９２】
材料と方法
アルブミン変異体：
Alexa Fluor 680標識改変型アルブミン変異体はAlbumedix Ltd. (Nottingham, UK)により提供された。
・HSA-K573P（高結合剤I）(HBI)（配列番号４）
・HSA-K500A（低結合剤）(LB)（配列番号６）
【０１９３】
生体内試験：
全ての動物実験は、オルフス大学の生物臨床医学衛生研究所（the Institute of Biomedicine at Health）の動物施設内で実施した。全ての実験は、デンマーク国実験動物調査団（Danish Experimental Animal Inspectorate）により承認された。
【０１９４】
細胞培養：
ルシフェラーゼ発現乳癌細胞系であるヒト癌細胞系（MDA-MB-231/Luc）を本実験に使用した。細胞を10％ウシ胎仔血清（FBS）（Gibco, Life Technologies, #10270-106）、0.1 mM 35 MEM 非必須アミノ酸（Gibco, Life Technologies, #11140-035）、2 mM L-グルタミン（Lonza, BE17-605E）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Life Technologies, #15140-122）が補足されたDMEM（4500 mg/mL D-グルコース、L-グルタミン）（Gibco, Life Technologies, #41965-039）培地中に維持した。
【０１９５】
生物発光性腫瘍異種移植片
乳癌MDA-MB231/Luc細胞〔PBSとマトリゲル(Matrigel)であるゲルトレックス（GeltrexTM；LDEV不含有の成長因子低減基底膜抽出物(Gibco, Life Technologies)）との１：１溶液400μL中の４×106細胞〕を、各マウス（11週齢、雌、Balb/cAnRj-Foxn1-nu、Janvier）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞の接種のために麻酔薬としてイソフルランを使用した。腫瘍を可視できるまで（11日間）増殖させた後、各群がほぼ同じ総腫瘍体積を有する４つの群（処置群Ｎ＝４、対照群Ｎ＝３）にマウスを無作為に割り付けた。処置は、処置群では10 mg/kg蛍光アルブミン、対照群では150μL PBSを使って行った。処置後各日において、腫瘍の最大縦径（長さ）と幅径を使ったキャリパー測定により、腫瘍の大きさを測定した。腫瘍体積は次の式により算出した：
腫瘍体積＝1/2（長さ×幅2）。
【０１９６】
実験期間の終わりに、マウスを麻酔下で頸椎脱臼により犠牲にし、腫瘍と臓器を回収した。血液と臓器をIVIS（登録商標）Spectrum Bioimager (PerkinElmer, Waltham, MA)を使って分析した。スペクトル・アンミキシングを使ってバックグラウンド自家蛍光を除去し、続いてLiving Imageソフトウェア、バージョン4.3.1 (PerkinElmer)を使ってデータ解析を行った。
【０１９７】
腫瘍、肝臓および腎臓をRNA単離のため急速凍結(snap freeze)させ、免疫組織化学的研究用に保存するため中性緩衝化ホルマリン液（10％）中で固定した。72時間後、一連の段階的エタノール浴を使って水を置換することにより組織を脱水し、次いでワックス（蝋）で浸潤させた。浸潤組織をワックスブロック中に包埋した。
【０１９８】
生物発光データのイメージングと定量
マウス体重１kgあたり300 mgでルシフェリン（D-ルシフェリン、Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA）を皮下注射した後、マウスを3.5％イソフルランで麻酔した。D-ルシフェリン注射の10分後、Xenogen IVIS Spectrumイメージングプラットフォーム（PerkinElmer、MA）を使って、3.5％イソフルラン麻酔薬を連続的に投与しながら全身スキャンを行った。関連のある領域に渡って関心領域（ROI）を手動で選択した。測定された強度を１ROIの中の表面放射輝度（photons／s／cm2／sr）（sr＝ステラジアン）として与えた。
【０１９９】
実験の終了は、D-ルシフェリン注射の10分後の頸椎脱臼により行い、生体外（ex vivo）生物発光の評価を可能にした。着目の腫瘍と臓器を回収し、IVISスキャナーを使って40分間生体外イメージングした。
【０２００】
アルブミン注射と試料調製
Alexa Fluor 680標識アルブミン変異体を、マウスの尾静脈に2 mg/mLで静注した。注射後、舌から（１分目の試料）並びに、尾に切り目を付けることにより４時間、24時間、48時間および72時間目に、ヘパリン被覆毛細管（HirschmannR（登録商標）Laborgerate GmbH & Co.）中に血液試料を採取した。それらの試料を遠心管に移し、遠心分離して血清から血液細胞を分画した。試料はスキャンを実施するまで４℃で保存した。
【０２０１】
結果
図17の上のパネルは、蛍光アルブミン変異体HBIが、腫瘍部位においてWT変異体よりも大量の蓄積を示すことを表す（PBS対照は全く蛍光を示さない）。図17の下のパネルは、ルシフェリン-D注射後のMDAMB231/Luc細胞の細胞性生物発光を示し、PBS、WTおよびHBI処置群の各マウスについての生存腫瘍細胞を描写する。
図17の結果は、高結合性アルブミン変異体が腫瘍部位に高度に結合すること、および蛍光が腫瘍細胞の生物発光と同一場所に局在化されることを示す。
【０２０２】
結論
高結合剤アルブミン変異体を用いた場合に腫瘍における高度のターゲティング／蓄積が観察される。これは、標識されたFcRn結合剤（例えばアルブミン高結合剤）が生体内でのFcRn過剰発現を可視化するために使用できることを明白に示す。
【０２０３】
実施例８
結腸直腸細胞系への蛍光アルブミン変異体のフローサイトメトリーによる細胞結合／取り込みの分析
【０２０４】
研究目的
実験前にHT-29 WTおよびHT-29ノックアウト細胞をウェルプレート（24ウェルまたは48ウェル）中に播種し、周密性に達するまで維持した。細胞を、5％CO2を含む加湿雰囲気下で、1.0 M MES溶液を使って、フェノールレッド不含有のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中のAlexa488で標識された8μM蛍光アルブミンで37℃にて２時間処理した。試料溶液を取り出し、氷冷HBSSを使って３回洗浄を行った。トリプシン処理により細胞を収集し、4℃にて300×ｇで５分間遠心分離し、ついで再洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（BSA）と0.1％NaN3を含む滅菌濾過済PBS 400μL中に再懸濁した。試料をGalliosフローサイトメーター（Beckman Coulter社製）を使って、488 nmレーザーと525/40 nmフィルター（FL1）を用いて分析した。データ処理はKaluza 1.2ソフトウェア（Beckman Coulter）を使って実施した。
【０２０５】
結果
図18に示された結果は、FcRn高結合剤が、FcRnを発現している細胞系に結合する（および／または取り込まれる）ことを明らかに示し、一方でFcRnノックアウト（KO）細胞系への結合はずっと少ない。このことは、高結合性変異体によるFcRn発現細胞中への選択的結合／取り込みを証明する。
【０２０６】
図中の挿入部分は、Ht-29 FcRnノックアウト（KO）細胞系に全くFcRn発現が検出されないこと、およびHT-29 WT細胞系がFcRn陽性であることを証明するウエスタンブロットを示す。
【０２０７】
結論
これらの結果は、薬剤に連結されたFcRn結合剤を、FcRnを過剰発現している癌を選択的にターゲティングするのに利用できることを証明する。連結された蛍光分子は、そのような薬剤のモデルとして機能する。
【０２０８】
実施例９
MDAMB231/LucおよびHT-29細胞系におけるFcRn発現のウエスタンブロット検出
研究目的
MDAMB231/LucおよびHT-29細胞系におけるFcRn発現の検出
【０２０９】
材料と方法
ウエスタンブロット
細胞の収穫は、HALT（カタログ#78438、Thermo Fisher Scientific）を含む冷PBSを使って行い、細胞をかき取り、2500 rpmで８分間遠心分離した。セラミックビーズと混合した0.1％SDSを含むPI3キナーゼ緩衝液を使って、４℃で30分間振盪し、次いで間に規則的な渦動攪拌しながら室温で30分間振盪することにより、細胞を均質化した。試料を13300 rpmで20分間遠心分離し、上清を更なる分析まで-80℃に維持した。Micro BCATM Protein Assay Kit（カタログ#23235, Thermo Scientific）を使ってタンパク質濃度測定を実施した。各試料10μgを加熱せずにLaemmliローディング緩衝液中に調製した。ウエスタンブロットは、4-15％のCriterion Stain-Free勾配ゲル（Bio-Rad, Hercules, Ca, USA）を使って行い、Bio-Rad Chemidoc MPイメージ装置を使って２分間紫外線（UV）暴露により可視化した。Trans-Blot Turbo装置（Bio-Rad）を使って、タンパク質を0.2μm PVDF膜（Trans-Blot Turbo, Bio-Rad, Hercules, CA, USA）に移行した。その膜の全タンパク質定量用にStain-Freeゲル写真を撮影し、ImageLab 4.1ソフトウェア（Bio-Rad）を使って測定した。TBS-T（0.01 M Tris, 0.15 M NaClおよび0.1％Tween 20）中の１％BSAを使って室温で１時間、膜をブロックした。一次抗体を１％BSAと0.01％アジ化ナトリウム中に希釈し、膜を４℃で一晩インキュベートした。使用した一次抗体は、1：500希釈されたAnti-FCGRT（HPA012122, Sigma Aldrich）であった。膜をTBS-T中で３回洗浄し、1：10000希釈された二次抗体のヤギ抗ウサギIgG-HRP（sc-2054, Santa Cruz Biotechnology）と共に室温で1.5時間インキュベートした。次いで膜をTBS-T中で３回洗浄し、Clarity Western ECL基質（Bio-Rad）と共にインキュベートし、ChemiDoc MPイメージ装置を使ってバンドを可視化し、そしてImageLab 4.1ソフトウェアを使って解析した。適当なローディング量の調節は、膜からの全タンパク質分析に基づいた（データは示していない）。
【０２１０】
結果
図19に与えた結果は、MDAMB231/LucとHT-29細胞系がFcRnを発現していることを示す。
【０２１１】
結論
MDAMB231/Luc細胞系とHT-29細胞系は、マウス異種移植片の作製のために、および生体内FcRn結合剤実験または癌治療を実施するために有用な細胞系である。
【図１】
2020500306.tif 000004
【図２】
2020500306.tif 000005
【図３】
2020500306.tif 000006
【図４】
2020500306.tif 000007
【図５】
2020500306.tif 000008
【図６】
2020500306.tif 000009
【図７】
2020500306.tif 000010
【図８】
2020500306.tif 000011
【図９−１】
2020500306.tif 000012
【図９−２】
2020500306.tif 000013
【図１０】
2020500306.tif 000014
【図１１】
2020500306.tif 000015
【図１２】
2020500306.tif 000016
【図１３】
2020500306.tif 000017
【図１４Ａ】
2020500306.tif 000018
【図１４Ｂ】
2020500306.tif 000019
【図１５−１】
2020500306.tif 000020
【図１５−２】
2020500306.tif 000021
【図１６−１】
2020500306.tif 000022
【図１６−２】
2020500306.tif 000023
【図１６−３】
2020500306.tif 000024
【図１６−４】
2020500306.tif 000025
【図１６−５】
2020500306.tif 000026
【図１７】
2020500306.tif 000027
【図１８】
2020500306.tif 000028
【図１９】
2020500306.tif 000029
【配列表】
2020500306000001.app
【国際調査報告】
2020500306.tif 000030
2020500306.tif 000031
2020500306.tif 000032
2020500306.tif 000033