(57)【要約】血清３型肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖を分解する、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と称されるタンパク質が本明細書に提供される。本開示には、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞、及びタンパク質を含む組成物、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、遺伝子改変細胞、又はそれらの組合せが含まれる。Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を使用する方法、例として、ＩＩＩ型莢膜多糖を有する肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）をＰｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させる方法、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法、対象における感染を治療する方法、対象における症状を治療する方法、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による対象の定着を減少させる方法、又はそれらの組合せも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
【請求項２】
コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項５】
真核細胞である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、請求項５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項７】
原核細胞である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項９】
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１０】
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、請求項９に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞を含む組成物。
【請求項１２】
単離成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
【請求項１３】
前記タンパク質が、精製されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項１２又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１２又は１４の組成物。
【請求項１８】
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすること
を含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有し、前記細胞は、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質を単離することをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質を精製することをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、真核細胞である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、原核細胞である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記原核細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含む方法であって、前記接触を、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して低減させる方法。
【請求項３１】
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法であって、
ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含み、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の前記沈着を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して増加させる方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の複製に好適な条件で存在する、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が、単離Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記接触が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、対象中に存在する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３９】
対象における感染を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
【請求項４０】
対象における症状を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
【請求項４１】
対象における定着を減少させる方法であって、
Ｐ３ｎＰアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含み、含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
【請求項４２】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、ヒトである、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
【請求項４６】
医薬品としての使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
【請求項４７】
病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
【請求項４８】
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用。
【請求項４９】
血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項５０】
本明細書に記載の１つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる２０１７年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５４５，０９４号明細書、及び２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５２，０４６号明細書の利益を主張する。
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された１Ｒ０１ＡＩ１２３３８３−０１Ａ１のもと政府支援によりなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、９９キロバイトのサイズを有し、２０１８年８月１０日に作成された表題「２０１８−０８−１０−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ−０２７１０２０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩテキストファイルとして米国特許商標庁にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含有する。配列表に含有される情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）により引き起こされる疾患は長きにわたりヒトの健康に対して大きな脅威であり、驚くべき死亡率を伴う。ある疾患、肺炎は、地球規模で約４億５千万の人々（人口の７％）を冒しており、毎年約４百万人の死亡者をもたらしている。今日、肺炎球菌疾患の予防は、感受性集団のワクチン接種に依存する。肺炎球菌ワクチンは経験的に作製され、特に幼児、高齢者、及び免疫減衰個体間で免疫原性が変動し／不十分である。肺炎球菌疾患のための主力の薬物療法は抗生物質治療であり；しかしながら、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する抗生物質の使用の普及は、薬物耐性肺炎球菌株の拡散をもたらした。２０１５年、ＣＤＣによれば、肺炎球菌細菌は、症例の３０％において１つ以上の抗生物質に対して耐性を示した。
【０００５】
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、９０種超のユニークな莢膜血清型を有し、それぞれ単糖組成及び結合、並びに他の修飾、例えば、アセチル化が異なる。ワクチン中に含まれるほとんどの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型により引き起こされる保菌及び疾患の予防に結合型ワクチンが有効であった一方、血清３型が例外であった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株により発現されるＰｎ３Ｐアーゼ遺伝子の同定及びクローニングが本明細書に記載される。Ｐｎ３Ｐアーゼ酵素は、高い有病率及び死亡率を伴う最もビルレントな血清型の１つである肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清３型の莢膜多糖を分解する。莢膜多糖は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）の主要なビルレンス因子であり、ほとんどの莢膜非形成細菌は感染性でない。この酵素は、生存細菌の表面上の莢膜多糖を良好に分解する。さらに、細菌は、この酵素の存在下で食作用に対して感受性である。
【０００７】
成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞が本明細書に提供される。一実施形態において、遺伝子改変細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。タンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子改変細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞であり得る。一実施形態において、遺伝子改変細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。一実施形態において、タンパク質は、異種アミノ酸配列、例えば、タグを含む。
【０００８】
組成物も本明細書に提供される。一実施形態において、組成物は、遺伝子改変細胞を含む。一実施形態において、組成物は、単離、場合により、精製成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質を含む。一実施形態において、組成物は、単離ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含む。成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００９】
方法も本明細書に提供される。一実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む。細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み得、コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有し、細胞は、好適な条件下で成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する。タンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。細胞は、野生型細胞、例えば、パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株、例えば、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２、又はコードするポリヌクレオチドが外因性ポリヌクレオチドである遺伝子改変細胞であり得る。方法は、タンパク質を単離し、又は精製することをさらに含み得る。一実施形態において、細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞であり得る。一実施形態において、遺伝子改変細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。一実施形態において、タンパク質は、異種アミノ酸配列、例えば、タグを含む。
【００１０】
一実施形態において、方法は、ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させることを含み、接触を、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して低減させる。別の実施形態において、方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法である。一実施形態において、方法は、ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させることを含み得、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して増加させる。タンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の複製に好適な条件で存在する。一実施形態において、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、単離Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質である。一実施形態において、接触は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、対象中に存在する。
【００１１】
一実施形態において、方法は、対象における感染を治療する方法であり、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態において、方法は、対象における症状を治療する方法であり、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態において、方法は、対象における定着を減少させる方法であり、Ｐ３ｎＰアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含み、含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与することを含む。タンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、対象は、ヒトである。
【００１２】
治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質、医薬品としての使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質、及び病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質も提供される。
【００１３】
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用；血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質を含む組成物；及び本明細書に記載の１つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法がさらに提供される。
【００１４】
本明細書において使用される「遺伝子改変細胞」は、外因性ポリヌクレオチド、例えば、発現ベクターが導入された細胞を指す。例えば、細胞は、細胞に対して外来性の外因性ポリヌクレオチドの好適な細胞中への導入に基づく遺伝子改変細胞である。「遺伝子改変細胞」は、内因性ヌクレオチドが変更されるように遺伝子操作された細胞も指す。例えば、細胞は、内因性ヌクレオチドの変更の好適な細胞中への導入に基づく遺伝子改変細胞である。遺伝子改変細胞の一例は、作動可能に結合している内因性コード領域の発現の増加又は減少をもたらすように変更された調節配列、例えば、プロモーターを有する細胞である。
【００１５】
本明細書において使用される用語「タンパク質」は、ペプチド結合により一緒に結合している２つ以上のアミノ酸の重合体を広く指す。用語「タンパク質」には、ジスルフィド結合により結合している２つ以上のタンパク質を含有する分子、又は多量体（例えば、二量体、四量体）として一緒に共有若しくは非共有結合しているタンパク質の複合体も含まれる。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、酵素、及びポリペプチドという用語はタンパク質の定義内に全て含まれ、それらの用語は互換的に使用される。これらの用語は規定の長さのアミノ酸の重合体を示すものではなく、それらは、タンパク質が組換え技術、化学的又は酵素的合成を使用して産生されるか天然に発生するかの意図も区別もしないことを理解すべきである。
【００１６】
本明細書において使用される「成熟タンパク質」は、最終形態をもたらすために翻訳後にプロセシングされたタンパク質と同一であるアミノ酸配列を有し、又はそれと構造的類似性を有するタンパク質を指す。翻訳後プロセシングとしては、Ｎ末端プロセシング又はＣ末端トランケーションを挙げることができる。本明細書において使用される「プレプロセシングタンパク質」は、ｍＲＮＡから翻訳され、成熟タンパク質をもたらすための翻訳後プロセシングを受けなかったタンパク質を指す。
【００１７】
本明細書において使用される「単離」物質、例えば、タンパク質は、その天然環境から取り出され、組換え技術を使用して産生され、又は化学的若しくは酵素的に合成された物質である。例えば、タンパク質又はポリヌクレオチドは、単離されていてよい。好ましくは、物質は、精製されており、すなわち、それらが天然に付随する他の構成成分を少なくとも６０％有さず、好ましくは、少なくとも７５％有さず、最も好ましくは、少なくとも９０％有さない。
【００１８】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指し、それには二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡの両方が含まれる。ポリヌクレオチドは、天然資源から直接得ることができ、又は組換え、酵素的、若しくは化学的技術の補助により調製することができる。ポリヌクレオチドは、トポロジーが線状又は環状であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、ベクター、例えば、発現若しくはクローニングベクターの一部、又は断片であり得る。ポリヌクレオチドは、異なる機能を有するヌクレオチド配列、例として、例えば、コード領域、及び非コード領域、例えば、調節領域を含み得る。
【００１９】
本明細書において使用される「検出可能部分」又は「標識」は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により直接的又は間接的に検出可能な分子である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素及びそれらの基質（例えば、酵素結合免疫アッセイにおいて一般に使用されるもの、例えば、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、タンパク質、例えば、抗体、又はハプテン及び抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が挙げられる。標識又は検出可能部分は、典型的には、共有結合によりリンカー若しくは化学結合を介して、又はイオン、ファンデルワールス若しくは水素結合を介して検出すべき分子に結合している。
【００２０】
本明細書において使用される用語「コード領域」及び「コード配列」は、互換的に使用され、タンパク質をコードし、適切な調節配列の制御下で配置された場合にコードされるタンパク質を発現するヌクレオチド配列を指す。コード領域の境界は一般に、その５’末端における翻訳開始コドン及びその３’末端における翻訳終止コドンにより決定される。「調節配列」は、それが作動可能に結合しているコード配列の発現を調節するヌクレオチド配列である。調節配列の非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳終止部位、及び転写終結因子が挙げられる。用語「作動可能に結合している」は、構成成分がそれらの意図される様式でそれらの機能を許容する関係にあるような構成成分の並置を指す。調節配列は、調節配列と適合性の条件下でコード領域の発現が達成されるようにそれが結合している場合、コード領域に「作動可能に結合している」。
【００２１】
コード領域を含むポリヌクレオチドは、コード領域の片側又は両側をフランキングする異種ヌクレオチドを含み得る。本明細書において使用される「異種ヌクレオチド」は、野生型細胞中に存在するコード領域をフランキングする、通常は存在しないヌクレオチドを指す。したがって、コード領域及び異種ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、天然に発生しない分子である。例えば、野生型微生物中に存在し、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域は、同種配列によりフランキングされており、コード領域をフランキングする任意の他のヌクレオチド配列は、異種であるとみなされる。異種ヌクレオチドの例としては、限定されるものではないが、調節配列が挙げられる。典型的には、異種ヌクレオチドは、当業者に周知の標準的な遺伝子及び／又は組換え法の使用を介して本明細書に記載のポリヌクレオチド中に存在する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、好適なベクター中に含めることができる。
【００２２】
本明細書に記載のタンパク質は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はそれらの組合せにおいて存在する異種アミノ酸を含み得る。本明細書において使用される「異種アミノ酸」は、野生型細胞中に天然に存在するタンパク質をフランキングする、通常は存在しないアミノ酸を指す。したがって、異種アミノ酸を含むタンパク質は、天然に発生しない分子である。例えば、野生型微生物中に存在する天然に発生するＰｎ３Ｐアーゼタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれにおいても追加のアミノ酸を有さず、Ｎ末端又はＣ末端において存在する任意の他のアミノ酸は、異種であるとみなされる。異種アミノ酸配列の例は本明細書に記載され、その例としては、限定されるものではないが、親和性精製タグが挙げられる。典型的には、異種アミノ酸は、当業者に周知の標準的な遺伝子及び／又は組換え法の使用を介して本明細書に記載のタンパク質中に存在する。
【００２３】
本明細書において使用される「外因性ポリヌクレオチド」は、細胞中に通常でも天然にも見出されないポリヌクレオチドを指す。本明細書において使用される用語「内因性ポリヌクレオチド」は、細胞中に通常又は天然に見出されるポリヌクレオチドを指す。「内因性ポリヌクレオチド」は、「天然ポリヌクレオチド」とも称される。
【００２４】
本明細書において使用される用語「相補体」及び「相補的」は、互いに塩基対合する２つの一本鎖ポリヌクレオチドの能力を指し、その場合、ポリヌクレオチドの一方の鎖上のアデニンが第２のポリヌクレオチドの鎖上のチミン又はウラシルと塩基対合し、ポリヌクレオチドの一方の鎖上のシトシンが第２のポリヌクレオチドの鎖上のグアニンと塩基対合する。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列と塩基対合し得る場合、互いに相補的である。例えば、５’−ＡＴＧＣ及び５’−ＧＣＡＴは相補的である。本明細書において使用される用語「実質的相補体」及びその同語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で規定のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、多数のｐＨ、塩、及び温度条件の下で行うことができる。ｐＨは、６〜９、好ましくは、６．８〜８．５で変動し得る。塩濃度は、０．１５Ｍのナトリウム〜０．９Ｍのナトリウムで変動し得、イオン強度がナトリウムについて規定されるものと同等である限り、他のカチオンを使用することができる。ハイブリダイゼーション反応の温度は、３０℃〜８０℃、好ましくは、４５℃〜７０℃で変動し得る。さらに、他の化合物をハイブリダイゼーション反応物に添加してより低温における、例えば、室温における又は室温に向かう規定のハイブリダイゼーションを促進することができる。温度要件の低下が企図される化合物には、ホルムアミドがある。したがって、ポリヌクレオチドは、典型的には、ハイブリダイゼーションがそのポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド間で生じる場合、実質的に第２のポリヌクレオチドと相補的である。本明細書において使用される「規定のハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の２つのポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを指す。
【００２５】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性」パーセントにより言及することができ、又は「類似性」パーセントにより言及することができる。「同一性」は、同一アミノ酸の存在を指す。「類似性」は、同一アミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在も指す。２つのタンパク質間の配列類似性は、２つのタンパク質（例えば、候補アミノ酸配列及び参照アミノ酸配列、例えば、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質、例えば、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５）の残基をアラインしてそれらの配列の長さに沿って同一アミノ酸の数を最適化することにより決定され；アラインメントの作製において一方又は両方の配列中のギャップを許容して共有されるアミノ酸の数を最適化するが、それぞれの配列中のアミノ酸は、なおもそれらの適切な順序のままでなければならない。配列類似性は、例えば、配列技術、例えば、ＧＣＧパッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズム、又はＴａｔｕｓｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９，１７４：２４７−２５０）により記載されており、ワールドワイドウェブを介して、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより維持されるインターネットサイトにおいて利用可能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、２つのアミノ酸配列間の配列類似性は、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して決定される。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ２検索パラメータについてのデフォルト値が使用される。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用する２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性」と称される。したがって、本明細書に記載のタンパク質、例えば、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質、例えば、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５への言及には、参照タンパク質と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質が含まれ得る。或いは、本明細書に記載のタンパク質、例えば、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質、例えば、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５への言及には、参照タンパク質と少なくとも８０％の類似性、少なくとも８１％の類似性、少なくとも８２％の類似性、少なくとも８３％の類似性、少なくとも８４％の類似性、少なくとも８５％の類似性、少なくとも８６％の類似性、少なくとも８７％の類似性、少なくとも８８％の類似性、少なくとも８９％の類似性、少なくとも９０％の類似性、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、又は少なくとも９９％の類似性を有するタンパク質が含まれ得る。
【００２６】
２つのポリヌクレオチド間の配列類似性は、それらの配列の長さに沿って同一ヌクレオチドの数を最適化するように２つのポリヌクレオチド（例えば、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードする候補ヌクレオチド配列及び参照ヌクレオチド配列）の残基をアラインすることにより決定され；アラインメントの作製において一方又は両方の配列中のギャップを許容して共有されるヌクレオチドの数を最適化するが、それぞれの配列中のヌクレオチドは、なおもそれらの適切な順序のままでなければならない。配列類似性は、例えば、配列技術、例えば、ＧＣＧ  ＦａｓｔＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ４．５（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩソフトウェアパッケージ）又は当技術分野において公知の他の好適なシーケンシングプログラム若しくは方法を使用して決定することができる。好ましくは、２つのヌクレオチド配列間の配列類似性は、Ｔａｔｕｓｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０）により記載されており、ワールドワイドウェブを介して、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより維持されるインターネットサイトにおいて利用可能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを使用して決定される。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ２検索パラメータについてのデフォルト値が使用される。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用する２つのヌクレオチド配列の比較において、配列類似性は、「同一性」と称される。配列類似性は、典型的には、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性である。
【００２７】
本明細書において使用される「インビトロ」は、人工的環境、及び人工的環境内で生じるプロセス又は反応を指す。インビトロ環境としては、限定されるものではないが、試験管を挙げることができる。本明細書において使用される用語「インビボ」は、対象の身体内に存在する天然環境を指す。
【００２８】
イベントの発生を「可能とする」条件又はイベントの発生に「好適な」条件、例えば、酵素的反応、又は「好適な」条件は、そのようなイベントの発生を妨害しない条件である。したがって、これらの条件は、イベントを許容し、向上させ、容易にさせ、及び／又はその助けとなる。
【００２９】
用語「及び／又は」は、列記要素の１つ若しくは全て又は列記要素のいずれか２つ以上の組合せを意味する。
【００３０】
語「好ましい」及び「好ましくは」は、ある状況下である利益を付与し得る本開示の実施形態を指す。しかしながら、同一又は他の状況下で他の実施形態も好ましいことがある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないことを示さず、本開示の範囲から他の実施形態を除外するものではない。
【００３１】
用語「含む」及びその変形は、それらの用語が詳細な説明及び特許請求の範囲に出現する限定的意味を有さない。
【００３２】
実施形態が語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを用いて本明細書に記載される場合、「〜からなる」及び／又は「本質的に〜からなる」に関して記載される他の点で同様の実施形態も提供されることが理解される。
【００３３】
特に記載のない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は互換的に使用され、１つ又は２つ以上を意味する。
【００３４】
本明細書においてさらに、終点による数値範囲の引用には、その範囲内に含まれる全ての数（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）が含まれる。
【００３５】
区別されるステップを含む本明細書に記載の任意の方法について、ステップは、任意の実行可能な順序で実施することができる。また適宜、２つ以上のステップの適切な任意の組合せを同時に実施することができる。
【００３６】
本明細書全体にわたり、「一実施形態」、「実施形態」、「ある実施形態」、又は「一部の実施形態」などへの言及は、その実施形態と関連して記載される特定の特徴部、構成、組成、又は特徴が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる種々の箇所におけるこのような語句の出現は、必ずしも本開示の同一の実施形態を指すわけでない。さらに、特定の特徴部、構成、組成、又は特徴は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わせることができる。
【００３７】
本開示の上記の概要は、それぞれの開示される実施形態も、本開示のあらゆる実現も記載するものではない。以下の記載は、説明的な実施形態をより特定して例示する。本出願全体にわたるいくつかの箇所において、実施例の列記を介して、実施例を種々の組合せで使用することができる指針が提供される。それぞれの例において、  引用される列記は、代表的なグループとして機能するにすぎず、排他的な列記と解釈すべきでない。
【００３８】
本明細書の詳細な説明において、特定の実施形態は、明確性のために分離して記載することができる。特定の実施形態の特徴部が別の実施形態の特徴部と不適合性であることが特に明示されない限り、ある実施形態は、１つ以上の実施形態と関連する本明細書に記載の適合性の特徴部の組合せを含み得る。
【００３９】
本開示の説明的実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面と併用して精読する場合に最良に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）血清３型莢膜多糖の反復単位構造を示す。
【図２−１】パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）からの７つのグリコシドヒドロラーゼのアミノ酸アラインメントを示す。ＷＰ＿０７９９１５０２７．１（配列番号２）、ＷＰ＿１１３０１８９０８．１（配列番号４）、ＷＰ＿０６８６６３７３３．１（配列番号５）、ＫＲＥ８２４７６．１（配列番号６）、ＷＰ＿０８２５９３７７６．１（配列番号７）、ＷＰ＿０５６６１７３６７．１（配列番号８）、及びＷＰ＿０２８５５３２２２．１（配列番号９）。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図３Ａ−Ｂ】炭素源としてのＰｎ３Ｐを有する最小培地中のパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２の培養物を示す。（図３Ａ）炭素源としての２％（ｗ／ｖ）のグルコース、Ｐｎ３Ｐ、セルロースと、又は炭素源無使用の最小培地上のパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２（Ｐｂａｃ）の増殖。（図３Ｂ）グルコース（レーン１）又はＰｎ３Ｐ（レーン２）上で増殖させたＰｂａｃの濃縮培養物上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル。（図３Ｃ）Ｒａｐｉｄ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ（Ａｚｉｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９，７５）（ＲＡＳＴ）アノテーションに基づくＰｎ３Ｐ利用組織化の提案される遺伝子座。（図３Ｄ）グルコース培養物に対するＰｎ３Ｐ培養物の発現の変化倍率として示される２％のグルコース又はＰｎ３Ｐ上で増殖させたＰｂａｃ中の推定遺伝子座内の選択遺伝子のリアルタイムＰＣＲ。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図４Ａ】Ｐｎ３Ｐアーゼ同定及び一次アミノ酸配列のドメイン模式図を示す。（図４Ａ）アミノ酸配列（配列番号２）及びＰｎ３Ｐアーゼのアクセッション。（図４Ｂ）それぞれの１ｍｌ分画における毎分カウント数により計測された、サイズ排除クロマトグラフィーによる組換えＰｎ３Ｐアーゼにより脱重合されたトリチウム放射性同位体標識Ｐｎ３Ｐの分離。（図４Ｃ）Ｐｎ３Ｐモノクローナル抗体によりプロービングされた組換えＰｎ３Ｐアーゼにより脱重合された低温Ｐｎ３Ｐのドットブロット。（図４Ｄ）ＩｎｔｅｒＰｒｏによるＰｎ３Ｐアーゼの予測ドメインの模式図。（図４Ｅ）Ｐｎ３Ｐアーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図４Ｂ−Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ−１】同上。
【図４Ｅ−２】同上。
【図５Ａ】エレクトロスプレーイオン化質量分析によるオリゴ糖産物の同定を示す。オリゴ糖産物（図５Ａ）の分離並びに四糖（図５Ｂ）及び六糖（図５Ｃ）の質量スペクトル。実験的分子量及び精度を表１に示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６Ａ】オリゴ糖産物の核磁気共鳴による特徴付けを示す。Ｐｎ３四糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ａ）、２Ｄ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトル（Ｂ）、及び２Ｄ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトル（Ｃ）。Ｐｎ３六糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ）、２Ｄ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトル（Ｅ）、及び２Ｄ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトル（Ｆ）。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６Ｅ】同上。
【図６Ｆ】同上。
【図７ＡＢ】Ｐｎ３Ｐアーゼの活性評価を示す。（図７Ａ）それぞれの１ｍｌ分画における毎分カウント数により計測された、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離された組換えＰｎ３Ｐアーゼにより脱重合されたトリチウム放射性同位体標識Ｐｎ３Ｐのタイムコースアッセイ。（図７Ｂ）生成されたグルクロン酸還元末端の濃度（μｇ／ｍｌ）により計測された、３つの異なる緩衝液条件における組換えＰｎ３Ｐアーゼの最適化。（Ｃ）生成されたグルクロン酸還元末端の濃度（μｇ／ｍｌ）により計測された、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋反応サプリメントを用いた金属依存性の決定。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ｃ】同上。
【図８】生存増殖３型肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＷＵ２株のＰｎ３Ｐアーゼ処理を示す。（図８Ａ）６００ｎｍにおけるＯＤに従う１００ｕｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下のＴＨＹブロス中のＷＵ２の増殖曲線。（図８Ｂ〜８Ｃ）無莢膜ＷＵ２、又はＰｎ３Ｐアーゼ処理ＷＵ２を使用してＰｎ３ＰコートＥＬＩＳＡプレートへのＰｎ３Ｐ特異的抗体結合について競合させた競合ＥＬＩＳＡ。データは、抗体結合の阻害パーセントとして提示する。（図８Ｄ）ＷＵ２（左上）、無莢膜誘導体（右上）、及び代表的なＰｎ３Ｐアーゼ処理ＷＵ２（下段パネル）の透過型電子顕微鏡観察。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】３型Ｓｐｎの生存能に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を示す。（図９Ａ）６００ｎｍにおけるＯＤに従う１００μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下のＴＨＹブロス中のＷＵ２の増殖曲線。（図９Ｂ）１００μｇ／ｍｌの活性又は熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼの存在下のＰＢＳ中のＷＵ２生存率。
【図１０】Ｐｎ３Ｐアーゼ処理による生存３型Ｓｐｎ上の莢膜の枯渇を示す。（図１０Ａ〜Ｂ）無莢膜ＷＵ２、２つの異なる濃度（２μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ）における熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼにより処理されたＷＵ２、又はＰｎ３Ｐアーゼにより処理されたＷＵ２を使用してＰｎ３ＰコートＥＬＩＳＡプレートへのＰｎ３Ｐ特異的抗体結合を競合させた競合ＥＬＩＳＡ。データは、抗体結合の阻害パーセントとして提示する。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を用いて決定した。２μｇ／ｍｌの熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼにより処理されたＷＵ２モック（図１０Ｃ）、無莢膜ＷＵ２株（図１０Ｄ）及び２μｇ／ｍｌの活性Ｐｎ３Ｐアーゼ処理ＷＵ２（Ｅ）の透過型電子顕微鏡画像。下段パネルは、１５０００倍の直接倍率において画像化し、上段パネルは、１００００倍の直接倍率において画像化する（Ｃ〜Ｅ）。
【図１１Ａ−Ｂ】Ｐｎ３Ｐアーゼ処理された３型Ｓｐｎのマクロファージ取り込みを示す。（図１１Ａ）熱不活化（左）又は活性（右）Ｐｎ３Ｐアーゼ活性後の蛍光連鎖球菌を含有するＲＡＷ２６４．７マクロファージ。連鎖球菌、ＣＦＳＥ、緑色。マクロファージ、ビオチン化−ＷＧＡ、ストレプトアビジン−ＡＰＣ、赤色。（図１１Ｂ）フローサイトメトリーにより定量されたＣＦＳＥ標識Ｓｐｎのマクロファージ取り込みに対するＰｎ３Ｐアーゼ処理及び補体の影響。（図１１Ｃ）蛍光食細胞のパーセントに対するＰｎ３Ｐアーゼ用量依存的効果。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定＊＊を用いて決定した、＊Ｐ＜０．００１。
【図１１Ｃ】同上。
【図１２】Ｓｐｎ表面上の補体沈着に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を示す。フローサイトメトリーによるＰｎ３Ｐアーゼ処理又は非処理３型Ｓｐｎ上のマウス補体沈着の分析。ＦＩＴＣ−Ａの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量を、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞のゲーティングから計算した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない。
【図１３】好中球による補体媒介殺傷に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を示す。Ｐｎ３Ｐアーゼ処理Ｓｐｎに対する分化ＨＬ−６０細胞の補体媒介殺傷能。生存パーセントは、対照試料（ＨＬ６０細胞を用いない反応物、１００％の生存率）について得られた平均値に正規化されたそれぞれの２つ組の反応物として計算した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない。
【図１４】３型Ｓｐｎによる鼻腔内定着を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻咽頭中のＳｐｎ定着を低減させるＰｎ３Ｐアーゼ処理の能力。（図１４Ａ）マウスの群に、１０μｌのＰＢＳ中の１０６個の対数増殖期細菌を鼻腔内接種した。全ての接種材料に、５０μｇのＰｎ３Ｐアーゼ又は緩衝液対照（１０μｌ）のいずれかを追加した。０日目（ＷＵ２＋Ｐｎ３Ｐアーゼ＊１）、０及び３日目（ＷＵ２＋Ｐｎ３Ｐアーゼ＊２）、又は０、３、及び７日目（ＷＵ２＋Ｐｎ３Ｐアーゼ＊３）のいずれかにおいて、群に酵素を投与した。細菌負荷を１０日目に定量した。鼻腔洗浄液の連続希釈物を２つ組でプレーティングしてＣＦＵ値を決定した。（図１４Ｂ）鼻腔洗浄液中のＩＬ−６及び（図１４Ｃ）ＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１５】Ｐｎ３Ｐアーゼの保護能を示す。致死チャレンジからＢＡＬＢ／ｃマウスを保護するＰｎ３Ｐアーゼの能力の評価。マウスの群を５×１０３個の対数増殖期のビルレントな３型Ｓｐｎの腹腔内投与により感染させた。不活化群は、熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼである。＊感染の０、１２、又は２４時間後において投与された５μｇ又は０．５μｇの単一用量の効果が示される、１群当たりｎ＝５匹のマウス。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
タンパク質
遺伝子改変細胞及び細胞の使用方法が本明細書に提供される。遺伝子改変細胞は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質を産生し得る。Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質は、本明細書においてＰｎ３Ｐアーゼタンパク質又はＰｎ３Ｐアーゼと称される。Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）のＩＩＩ型莢膜多糖を分解する。この莢膜多糖は、肺炎球菌３型多糖（Ｐｎ３Ｐ）としても公知であり、血清３型（３型とも称される）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により発現される。Ｐｎ３Ｐの構造を図１に示す。
【００４２】
タンパク質がＰｎ３Ｐアーゼ活性を有するか否かは、インビトロアッセイにより決定することができる。一実施形態において、インビトロアッセイは、本明細書に記載のとおり実施される（実施例１参照）。簡潔に述べると、Ｐｎ３Ｐを検出可能部分により標識し、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性について試験されているタンパク質に曝露し、分子量の差異の検出を許容する方法を使用して反応産物を分割することができる。Ｐｎ３Ｐは、当業者に公知の、定型的な方法を使用して得ることができ、又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入することができる。多糖の分子量の変化を検出する方法は、当業者に公知であり、定型的である。
【００４３】
Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は成熟タンパク質であり得、一部の実施形態において、好ましくは、成熟タンパク質である。一実施形態において、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、タンパク質がプロセシングされてＮ末端から１つ以上のアミノ酸が除去されて成熟タンパク質がもたらされた、例えば、タンパク質がシグナル配列を欠く野生型細胞から得られるコード配列によりコードされる。したがって、成熟タンパク質は、野生型細胞から得られるコード配列によりコードされるプレプロセシングＰｎ３Ｐアーゼタンパク質と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、又は少なくとも６３個のアミノ酸をプレプロセシングタンパク質のアミノ末端から欠き得る。別の実施形態において、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、シグナル配列に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドを含まないコード領域によりコードされる。
【００４４】
Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の一例は配列番号２において示され、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質はプレプロセシングタンパク質である。成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の例は、配列番号２のアミノ酸２〜６４から選択されるＮ末端アミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、Ｃ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の他の例としては、配列番号２のアミノ酸配列と配列類似性を有するもの又は配列番号２のアミノ酸のサブセットを含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が挙げられる。配列番号２又はその一部のアミノ酸配列と配列類似性を有するＰｎ３Ｐアーゼタンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する。プレプロセシング又は成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、微生物、例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）のメンバーから単離することができる。微生物の具体例は、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｊｏｒｄａｎ株３２３５２（ＡＴＣＣ１４１７５）である。バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）のヌクレオチド配列の決定からのデータは、この細菌をパエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に再分類すべきことを示す。それというのも、その最近傍がこの分類内に系統発生的に位置するためである。パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、それらが相違すると適切に考えられるまでバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内に既に含まれた（Ａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６４：２５３−２６０）。パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）への分類は、１６ｓリボソームＲＮＡ上の特有の第３グループのバシラス（パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉ））ヌクレオチド配列（ＴＣＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＧＴ、配列番号３）の存在により確認された（Ａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６４：２５３−２６０）。Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、組換え技術を使用して産生し、又は定型的方法を使用して化学的若しくは酵素的に合成することもできる。組換え産生タンパク質は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードする、ｍＲＮＡ転写産物から翻訳可能なアミノ酸配列全体、又はその一部を含み得る。
【００４５】
成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質に対応する配列番号２又はその一部と配列類似性を有するＰｎ３Ｐアーゼタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸の保存的置換を含み得る。保存的置換は、典型的には、あるアミノ酸の、同一のクラスのメンバーである別のアミノ酸での置換である。例えば、特定のサイズ又は特徴（例えば、電荷、疎水性、及び／又は親水性）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸は、一般に、タンパク質の二次及び／又は三次構造を実質的に変更せずに別のアミノ酸で置換され得ることがタンパク質生化学の当技術分野において周知である。本開示の目的のため、保存的アミノ酸置換は、以下の残基のクラスの１つの中からのアミノ酸残基の交換から生じると定義される：クラスＩ：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ（脂肪族側鎖を提供する）；クラスＩＩ：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ（脂肪族及び脂肪族ヒドロキシル側鎖を提供する）；クラスＩＩＩ：Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ（ヒドロキシル側鎖を提供する）；クラスＩＶ：Ｃｙｓ及びＭｅｔ（硫黄含有側鎖を提供する）；クラスＶ：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ及びＧｌｎ（カルボキシル又はアミド基含有側鎖）；クラスＶＩ：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ（塩基性側鎖を提供する）；クラスＶＩＩ：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ及びＭｅｔ（疎水性側鎖を提供する）；クラスＶＩＩＩ：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ（芳香族側鎖を提供する）；並びにクラスＩＸ：Ａｓｎ及びＧｌｎ（アミド側鎖を提供する）。クラスは、天然に発生するアミノ酸に限定されず、人工アミノ酸、例えば、ベータ又はガンマアミノ酸及び非天然側鎖を含有するもの、並びに／又は他の類似の単量体、例えば、ヒドロキシ酸も含む。
【００４６】
どのように表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０）に提供されており、その著者らは、驚くべきことにタンパク質がアミノ酸置換に寛容であることを示している。例えば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．は、変化に対するタンパク質配列の寛容性を研究する２つの主なアプローチが存在することを開示している。第１の方法は、突然変異が自然淘汰により受け入れられ、又は拒絶される進化のプロセスに依存する。第２のアプローチは、クローニングされた遺伝子の規定の位置におけるアミノ酸変化を導入するための遺伝子操作及び機能性を維持する配列を同定するための選択又はスクリーンを使用する。著者らにより記述されるとおり、これらの研究は、驚くべきことにタンパク質がアミノ酸置換に寛容であることを明らかにした。著者らは、タンパク質のある位置においてどの変化が許容される可能性が高いかをさらに示している。例えば、ほとんどの埋め込まれたアミノ酸残基は非極性側鎖を要求する一方、表面側鎖のいくつかの特徴部は一般に保存される。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ、及びそれに引用される参照文献に記載されている。
【００４７】
本明細書に開示のタンパク質のアミノ酸配列をどのように改変するかに関する指針も図２に提供する。図２は、パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）により発現されたグリコシドヒドロラーゼタンパク質のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａアミノ酸アラインメントを示す。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａは、多重配列アラインメントプログラムである（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１１．７５；Ｇｏｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｗ６９５−９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ３１３）。図２において、アスタリスク（＊）は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示し；コロン（：）は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ２５０行列における＞０．５のスコアリングとほぼ同等の強く類似する特性のグループ間の保存を示し；ピリオド（．）は、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ２５０行列における＝＜０．５及び＞０のスコアリングとほぼ同等の弱く類似する特性のグループ間の保存を示す。この図を参照することにより、当業者は、アミノ酸配列のどの変更が酵素活性を改変する可能性が高いか、及びどの変更が酵素活性を改変する可能性が低いかを予測することができる。
【００４８】
Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼ、ファミリー３９ドメイン（配列番号２のアミノ酸１８０〜３５３）、ガラクトース結合ドメイン様（配列番号２のアミノ酸６２１〜７６５）、エンド−１，３−１，４−ベータグルカナーゼと構造的類似性を有する不明機能のドメインＤＵＦ１０８０（配列番号２のアミノ酸７８１〜９５０）、及びコンカナバリンＡ様レクチン／グルカナーゼドメイン（配列番号２のアミノ酸１，２０９〜１，３４８）を含む保存ドメインを含む。一実施形態において、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０よりもｐＨ７．２におけるリン酸ナトリウム緩衝液中でわずかに良好な活性を示し、ｐＨ８．０におけるトリス緩衝液中で有意に不良な活性を示す特徴を有する（実施例１参照）。別の実施形態において、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、それが１０ｍＭのＣａ２＋の存在下でより高濃度の還元末端ＧｌｃＡを産生するため、Ｃａ２＋についての濃度依存的優先性を示す（実施例１参照）。
【００４９】
本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼタンパク質は、本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼタンパク質及び異種アミノ酸を含む融合タンパク質として発現させることができる。例えば、追加のアミノ酸配列は、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製に有用であり得る。精製に有用なアミノ酸配列は、タグと称することができ、それとしては、限定されるものではないが、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。代表例は、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，７０３，００４号明細書）、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，７８２，１３７号明細書）、Ｓｇａｒｌａｔｏ（米国特許第５，９３５，８２４号明細書）、及びＳｈａｒｍａ  Ｓｇａｒｌａｔｏ（米国特許第５，５９４，１１５号明細書）に見出すことができる。タンパク質へのそのような親和性精製部分の追加に種々の方法が利用可能である。場合により、追加のアミノ酸配列、例えば、Ｈｉｓタグを次いで開裂させることができる。
【００５０】
ポリヌクレオチド
Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドも本明細書に提供される。Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書においてＰｎ３Ｐアーゼポリヌクレオチドと称される。Ｐｎ３Ｐアーゼポリヌクレオチドは、配列番号２、又はその一部に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有し得る。このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列のクラスの一例は、配列番号１又はその一部である。配列番号２により表されるＰｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に開示のヌクレオチド配列に限定されず、遺伝子コードの縮重の結果としてそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクラスも含むことを理解すべきである。例えば、天然に発生するヌクレオチド配列の配列番号１は、アミノ酸配列の配列番号２を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列のクラスの１つのメンバーにすぎない。選択されたタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列のクラスは大きいが有限であり、そのクラスのそれぞれのメンバーのヌクレオチド配列は、当業者により異なるヌクレオチドトリプレット（コドン）が同一のアミノ酸をコードすることが公知である標準的な遺伝子コードを参照して容易に決定することができる。
【００５１】
Ｐｎ３Ｐアーゼポリヌクレオチドは、配列番号１又はその一部のヌクレオチド配列、例えば、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチドと配列類似性を有し得る。配列番号１、又はその一部のヌクレオチド配列と配列類似性を有するＰｎ３Ｐアーゼポリヌクレオチドは、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードする。Ｐｎ３Ｐアーゼポリヌクレオチドは、微生物、例えば、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離することができ、又は組換え技術を使用して産生し、若しくは化学的若しくは酵素的に合成することができる。Ｐｎ３Ｐアーゼポリヌクレオチドは、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームをフランキングする異種ヌクレオチドをさらに含み得る。典型的には、異種ヌクレオチドは、コード領域の５’末端、コード領域の３’末端、又はそれらの組合せにおいて存在し得る。異種ヌクレオチドの数は、例えば、少なくとも１０、少なくとも１００、又は少なくとも１０００個であり得る。
【００５２】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ベクター中に存在し得る。ベクターは、別のポリヌクレオチドを付着させて付着ポリヌクレオチドの複製を生じさせることができる複製ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。本開示のポリヌクレオチドを含有するベクターの構築は、当技術分野において公知の標準的なライゲーション技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。ベクターは、さらなるクローニング（ポリヌクレオチドの増幅）（すなわち、クローニングベクター）、又はポリヌクレオチドの発現（すなわち、発現ベクター）を提供し得る。ベクターという用語には、限定されるものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、及び人工染色体ベクターが含まれる。ウイルスベクターの例としては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び単純ヘルペスベクターが挙げられる。典型的には、ベクターは、微生物宿主、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのような微生物中で、又は真核生物宿主、例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、若しくは昆虫細胞中で複製し得る。一実施形態において、ベクターは、プラスミドである。
【００５３】
ベクターの選択は、得られる構築物における種々の所望の特徴、例えば、選択マーカー、ベクター複製速度などに依存する。一部の態様において、本明細書のベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞としては、原核細胞が挙げられる。ベクターは、公知の当業者により定型的に使用される方法を使用して宿主細胞中に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、及びウイルス媒介核酸移行が、核酸を宿主細胞中に導入する一般的な方法である。
【００５４】
Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、微生物、例えば、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような微生物から得、又はインビトロ若しくはインビボで産生することができる。例えば、インビトロ合成の方法としては、限定されるものではないが、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いる化学的合成が挙げられる。合成ポリヌクレオチド及びそのような合成のための試薬の商業的供給業者は、周知である。
【００５５】
発現ベクターは、場合により、コード領域に作動可能に結合している調節配列を含む。本開示は、任意の特定のプロモーターの使用に限定されるものではなく、広範なプロモーターが公知である。プロモーターは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）コード領域の転写を開始させる調節シグナルとして作用する。使用されるプロモーターは、構成的又は誘導性プロモーターであり得る。これは、必ずしもそうである必要はないが、宿主細胞に対して異種であり得る。本明細書に記載の方法において有用なプロモーターは、限定されるものではないが、構成的プロモーター、温度感受性プロモーター、非調節プロモーター、又は誘導性プロモーターであり得る。一実施形態において、プロモーターは、細菌ドメインのメンバーにおいて機能するプロモーターである。一実施形態において、プロモーターは、真核生物中で機能するプロモーターである。
【００５６】
発現ベクターは、場合により、転写されたメッセージの翻訳を開始させてタンパク質を産生するためのリボソーム結合部位及び開始部位（例えば、コドンＡＴＧ）を含み得る。これは、翻訳を終了させるための終結配列も含み得る。終結配列は、典型的には、対応するアミノアセチル−ｔＲＮＡが存在しない、したがって、タンパク質合成を終了させるコドンである。宿主細胞を形質転換させるために使用されるポリヌクレオチドは、場合により、転写終結配列をさらに含み得る。
【００５７】
遺伝子改変細胞をもたらすために宿主細胞中に導入されるベクターは、場合により、典型的には、増殖培地中の化合物を不活化させ、若しくはそうでなければ検出し、又は増殖培地中の化合物により検出される分子をコードする１つ以上のマーカー配列を含む。例えば、マーカー配列の包含は、形質転換細胞を抗生物質耐性とし得、又はそれは、形質転換細胞に化合物特異的代謝を付与し得る。マーカー配列の例としては、限定されるものではないが、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、及びネオマイシンに対する耐性を付与する配列が挙げられる。
【００５８】
本明細書に記載のタンパク質は、組換えＤＮＡ技術、例えば、細胞中に存在する発現ベクターを使用して産生することができる。このような方法は、定型であり、当技術分野において公知である。タンパク質は、インビトロで、例えば、固相ペプチド合成法により合成することもできる。固相ペプチド合成法は定型であり、当技術分野において公知である。組換え技術を使用して、又は固相ペプチド合成法により産生されるタンパク質は、定型的な方法、例えば、免疫親和性若しくはイオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上若しくはアニオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過、又はリガンド親和性によりさらに精製することができる。
【００５９】
遺伝子改変細胞
本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼをコードするポリヌクレオチドを有する遺伝子改変細胞も提供される。遺伝子改変されていない対照細胞と比較して、遺伝子改変細胞は、Ｐｎ３Ｐアーゼの産生を示し得、又はＰｎ３Ｐアーゼの増加した産生を示し得る。Ｐｎ３Ｐアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ベクターとして細胞中に存在し得、又は遺伝子改変細胞のゲノムＤＮＡ、例えば、染色体又はプラスミド中に組み込むことができる。細胞は、真核細胞又は原核細胞、例えば、細菌ドメインのメンバーであり得る。
【００６０】
本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変することができる細菌ドメインのメンバーである宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））が挙げられる。
【００６１】
Ｐｎ３Ｐアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変することができる真核細胞である宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、酵母、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられる。
【００６２】
組成物
本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼタンパク質又はＰｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も提供される。このような組成物は、典型的には、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」としては、医薬投与と適合性である生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などが挙げられる。追加の活性剤を組成物中に取り込むこともできる。
【００６３】
組成物は、薬学分野において周知の方法により調製することができる。一般に、組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように配合することができる。投与は、全身性又は局所性であり得る。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内）、腸内（例えば、経口）、及び局所（例えば、経皮、吸入、経粘膜）投与が挙げられる。本開示の化合物の腸内投与のための適切な剤形としては、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤又は液剤が挙げられる。非経口投与のための適切な剤形としては、静脈内又は腹腔内投与を挙げることができる。局所投与のための適切な剤形としては、限定されるものではないが、鼻腔スプレー、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、又は噴霧によるものが挙げられる。
【００６４】
液剤又は懸濁液剤は、以下の構成成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば、投与用の水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；電解質、例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオン、並びに等張性の調整用薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。
【００６５】
組成物としては、無菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液及び無菌液剤若しくは分散液の即時調製用の無菌粉末を挙げることができる。非経口投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。組成物は典型的には無菌であり、注射的使用に好適な場合、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度で流体であるべきである。これは製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に抗して保存すべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエテイレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）など）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の長期間吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより生じさせることができる。
【００６６】
無菌液剤は、要求量の活性化合物（例えば、本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼタンパク質又はそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を適切な溶媒中で、医薬組成物において定型的に使用される成分の１つ又は組合せと取り込み、必要によりその後に濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒及び任意の他の適切な成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射液剤の調製用の無菌粉末の例において、好ましい調製方法としては、事前に滅菌されたその液剤から活性成分と任意の他の所望の成分との粉末を生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられる。
【００６７】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口治療投与の目的のため、活性化合物は、賦形剤と取り込み、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤及び／又は他の有用な材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、又は類似の性質の化合物のいずれか：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン若しくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、若しくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロース若しくはサッカリン；又は香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジフレーバリングを含有し得る。
【００６８】
吸入による投与（例えば、局所投与）について、活性化合物は、好適な噴射剤、例えば、ガス、例えば、二酸化炭素を含有する加圧容器若しくはディスペンサー、又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達することができる。
【００６９】
全身投与は、経粘膜又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与について、障壁の浸透に適切な浸透剤が配合物において使用される。このような浸透剤は、一般に当技術分野において公知であり、それとしては、例えば、経粘膜投与について、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当技術分野において一般に公知の軟膏剤、膏薬、ゲル剤、又はクリーム剤中に配合される。
【００７０】
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与する実施形態において、ポリヌクレオチド薬剤の投与に好適な任意の方法、例えば、遺伝子銃、バイオインジェクター、及び皮膚パッチ並びに無針法、例えば、マイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，１９４，３８９号明細書）を使用することができる。
【００７１】
活性化合物、例えば、徐放配合物、例として、埋込剤は、身体からの急速な排除から化合物を保護する担体を用いて調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。このような配合物は、標準的な技術を使用して調製することができる。リポソーム懸濁液を薬学的に許容可能な担体として使用することもできる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００７２】
活性化合物の毒性及び治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療有効な用量）の決定のための細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性及び治療効果間の用量比は治療指数であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。高い治療指数を示す組換えタンパク質が好ましい。
【００７３】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投与量の配合において使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内にあり、毒性をほとんど又は全く示さない。投与量は、用いられる剤形及び使用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本明細書に記載の方法において使用される化合物について、治療有効用量は、動物モデルから最初に推定することができる。用量は、動物モデルにおいてＩＣ５０（すなわち、疾患の徴候、例えば、肥満の最大阻害の半数を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように配合することができる。このような情報を使用してヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、定型的な方法を使用して計測することができる。
【００７４】
組成物は、１日１回以上〜週１回以上、例として、２日に１回投与することができる。当業者は、ある因子、例として、限定されるものではないが、病態の重症度、前治療、対象の全身健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患は、対象を有効に治療するために要求される投与量及びタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、有効量の活性化合物による対象の治療としては、単一治療を挙げることができ、又は好ましくは、一連の治療を挙げることができる。
【００７５】
使用方法
方法も提供される。一実施形態において、方法は、本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼタンパク質を作製する方法である。一実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む。細胞は、限定されるものではないが、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を産生する遺伝子改変細胞又は天然発生細胞であり得る。天然発生細胞の一例は、パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株、例えば、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２である。場合により、方法は、宿主細胞中に、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含むベクターを導入することを含む。一実施形態において、方法は、細胞から、又は培地からＰｎ３Ｐアーゼタンパク質を単離し、又は精製することを含む。Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が、タンパク質の単離又は精製に有用な追加のアミノ酸を含む実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質からの追加のアミノ酸の開裂も含み得る。
【００７６】
一実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐ分子を開裂させる方法である。一実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐ分子をＰｎ３Ｐアーゼタンパク質に曝露させることを含む。Ｐ３ｎＰ分子は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物の一部であり得、例えば、Ｐｎ３Ｐ分子は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖であり得、又はＰｎ３Ｐ分子は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物から分離することができ、例えば、Ｐｎ３Ｐ分子は、単離することができる。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。一実施形態において、Ｐｎ３Ｐ分子は、インビボで存在し、別の実施形態において、Ｐｎ３Ｐ分子は、インビトロで存在する。
【００７７】
一実施形態において、方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を低減させる方法である。方法は、表面上に存在するＩＩＩ型莢膜多糖を有する肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させることを含む。Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、単離し、又は精製することができ、組成物中に存在し得る。一実施形態において、接触は、微生物を、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含み得る。接触は、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行うことができる。場合により、低減された量のＩＩＩ型莢膜多糖を有する肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、インビボで存在し、別の実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、インビトロで存在する。
【００７８】
一実施形態において、方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法である。方法は、表面上に存在するＩＩＩ型莢膜多糖を有する肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させることを含む。Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、単離し、又は精製することができ、組成物中に存在し得る。一実施形態において、接触は、微生物を、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含み得る。接触は、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行うことができる。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、インビボで存在し、別の実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、インビトロで存在する。
【００７９】
一実施形態において、方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる対象における感染を治療することを含む。本明細書に記載の方法において使用される対象は、動物、例えば、限定されるものではないが、ネズミ（例えば、マウス又はラット）又はヒトであり得る。方法は、有効量の組成物を、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有する動物に投与することを含む。場合により、方法は、感染を引き起こす肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が減少したか否かを決定することを含み得る。感染が肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされるか否かを決定する方法は定型であり、当技術分野において公知である。感染は、限局性又は全身性であり得る。限局性肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の一例は、鼻腔、例えば、鼻咽頭の定着である。一実施形態において、本明細書に記載の組成物の局所投与を使用して対象における鼻咽頭定着を低減させることができる。肺の限局性肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の別の例は、例えば、肺炎球菌肺炎である。一実施形態において、例えば、エアロゾルによる組成物の局所投与を使用して対象における肺炎球菌肺炎を低減させることができる。全身性肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の一例は、対象の血液中の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の存在である（例えば、菌血症又は敗血症）。一実施形態において、組成物の非経口投与を使用して対象における全身性肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染を低減させることができる。本開示のこの態様において、本開示の組成物の「有効量」は、レシピエントにおける所望の応答、例えば、対象中に存在する肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の量の低減を誘発し得る量である。低減は、対象の鼻咽頭、肺、又は血液中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の数の低減であり得る。低減は、組成物投与前の対象と比較した対象における少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍の減少であり得る。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。
【００８０】
別の実施形態において、方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染により引き起こされ得る動物におけるある病態の１つ以上の症状を治療することを含む。肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染は、侵襲性肺炎球菌疾患を引き起こす。侵襲性肺炎球菌疾患により引き起こされる病態の例としては、肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症及び敗血症が挙げられる。これらの病態に伴う症状としては、寒気、咳嗽、呼吸促迫、呼吸困難、胸痛（肺炎）、斜頸、発熱、頭痛、錯乱及び羞明（肺炎球菌髄膜炎）、及び混乱、息切れ、心拍数上昇、疼痛又は不快感、多汗症、発熱、及び震え（敗血症）が挙げられる。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。
【００８１】
これらの病態の１つ以上の治療は予防的であり得、或いは、本明細書に記載の病態の発症後に開始することができる。予防的であり、例えば、対象が肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる病態の症状を顕在化する前に開始される治療は、本明細書において、その病態を発症する「リスク」がある対象の治療と称される。典型的には、病態を発症する「リスクがある」動物は、その病態を引き起こす肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に曝露される可能性が高い動物である。したがって、組成物の投与は、本明細書に記載の病態の発生前、その間、又はその後に実施することができる。病態の発症後に開始される治療は、病態の１つの症状の重症度の減少、例として、症状の完全な除去をもたらし得る。本開示のこの態様において、「有効量」は、病態の症状の顕在化を予防し、病態の症状の重症度を減少させ、及び／又は症状を完全に除去するために有効な量である。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。
【００８２】
本明細書に記載の組成物の効能は、標準的な方法に従って試験することができる。例えば、ヒトにおける肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染についての実験モデルとしてのマウスの使用が十分に確立されている。
【００８３】
キット
本開示はまた、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を作製するためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含むベクターを、細胞の形質転換に十分な量で含む。一実施形態において、キットは、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含む遺伝子改変細胞を好適な包装材料中で含む。
【００８４】
別の実施形態において、本開示はまた、Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用を対象とするキットを提供する。一実施形態において、キットは、単離され、又は場合により、精製されたＰｎ３Ｐアーゼタンパク質を、好適な包装材料中で含む。
【００８５】
場合により、他の試薬、例えば、緩衝液又は薬学的に許容可能な担体（調製され、又はその構成する構成成分中で存在し、構成成分の１つ以上が予備混合されていてよく、又は構成成分の全てが分離していてよい）なども含まれる。一実施形態において、タンパク質、ベクター、又は遺伝子改変細胞は、緩衝液と存在し得、又は別個の容器中に存在し得る。典型的には、包装される構成成分の使用説明書も含まれる。
【００８６】
本明細書において使用される語句「包装材料」は、キットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理的構造物を指す。包装材料は、好ましくは、無菌で汚染物質不含の環境を提供するように公知の方法により構築される。包装材料は、内容物を細胞の形質転換又はＰｎ３Ｐアーゼタンパク質の産生に使用することができることを示すラベルを有する。さらに、包装材料は、キット内の材料をどのように使用するかを示す説明書を含有する。本明細書において使用される用語「包装」は、ベクター又は遺伝子改変細胞を固定限度内で保持し得る固体マトリックス又は材料、例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどを指す。したがって、例えば、包装は、適切な量のＰｎ３Ｐアーゼタンパク質を含有するために使用されるガラス又はプラスチックバイアルを含み得る。「使用説明書」は、典型的には、試薬濃度又は少なくとも１つの方法パラメータを記載する具体的な表現を含む。
【００８７】
説明的態様
態様１．成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
態様２．コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
態様３．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様１又は２の遺伝子改変細胞。
態様４．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１〜３のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様５．真核細胞である、態様１〜４のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様６．哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、態様１〜５のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様７．原核細胞である、態様１〜６のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、態様１〜７のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様９．前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、態様１〜８のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様１０．前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、態様１〜９にいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様１１．態様１〜１０のいずれか１つの遺伝子改変細胞を含む組成物。
態様１２．単離成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
態様１３．前記タンパク質が、精製されている、態様１〜１２のいずれか１つの組成物。
態様１４．単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
態様１５．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様１２〜１４のいずれか１つの組成物。
態様１６．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１２〜１５のいずれか１つの組成物。
態様１７．薬学的に許容可能な担体を含む、態様１１〜１６のいずれか１つの組成物。
態様１８．Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有し、前記細胞は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する方法。
態様１９．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様１８の方法。
態様２０．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１８〜１９のいずれか１つの方法。
態様２１．前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、態様１８〜２０のいずれか１つの方法。
態様２２．前記タンパク質を単離することをさらに含む、態様１８〜２１のいずれか１つの方法。
態様２３．前記タンパク質を精製することをさらに含む、態様１８〜２１のいずれか１つの方法。
態様２４．前記細胞が、真核細胞である、態様１８〜２１のいずれか１つの方法。
態様２５．前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、態様１８〜２４のいずれか１つの方法。
態様２６．前記細胞が、原核細胞である、態様１８〜２５のいずれか１つに記載の方法。
態様２７．前記原核細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、態様１８〜２６のいずれか１つの方法。
態様２８．前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、態様１８〜２７のいずれか１つの方法。
態様２９．前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、態様１８〜２８のいずれか１つの方法。
態様３０．ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含む方法であって、前記接触を、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して低減させる方法。
態様３１．肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法であって、
ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含み、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の前記沈着を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して増加させる方法。
態様３２．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様３０又は３１の方法。
態様３３．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３０〜３２のいずれか１つの方法。
態様３４．前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の複製に好適な条件で存在する、態様３０〜３３のいずれか１つの方法。
態様３５．前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が、単離Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質である、態様３０〜３４のいずれか１つの方法。
態様３６．前記接触が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む、態様３０〜３５のいずれか１つの方法。
態様３７．前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、態様３０〜３６のいずれか１つに記載の方法。
態様３８．前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、対象中に存在する、態様３０〜３７のいずれか１つの方法。
態様３９．対象における感染を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様４０．対象における症状を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様４１．対象における定着を減少させる方法であって、
Ｐ３ｎＰアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様４２．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様３９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
態様４３．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３９〜４２のいずれか１つの方法。
態様４４．前記対象が、ヒトである、態様３９〜４３のいずれか１つの方法。
態様４５．治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
態様４６．医薬品における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
態様４７．病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
態様４８．肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用。
態様４９．血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐ３ｎＰアーゼタンパク質を含む組成物。
態様５０．本明細書に記載の１つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法。
【実施例】
【００８８】
本発明は、以下の実施例により説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順を、本明細書に記載の本発明の範囲及び主旨に従って広く解釈すべきことを理解すべきである。
【００８９】
実施例１
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３型莢膜特異的グリコシルヒドロラーゼ遺伝子の同定
要約
「バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｊｏｒｄａｎ３２３５２」は、１９３０年代初期にニュージャージー州土壌中の腐敗性有機物から単離された。この土壌生息細菌は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）の３型莢膜多糖（Ｐｎ３Ｐ）を分解し得る酵素を産生した。この酵素（Ｐｎ３Ｐアーゼ）の初期報告は、Ｐｎ３Ｐによるその誘導性、及びそれについての特異性を実証した。それ以降、多数の研究はＰｎ３Ｐアーゼを用いてきた一方、Ｐｎ３Ｐ生合成及びその抗原特性を調査してきた。本発明者らは、組換え発現のためにこの酵素のクローニングを着手した。本発明者らは、最初のこの細菌種のゲノムをシーケンシングし、Ｐｎ３Ｐアーゼ産生細菌を「パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２」として再分類した。ここで、本発明者らは、質量分析法ベースのプロテオミクスを介してＰｎ３Ｐアーゼの遺伝子を同定した。本発明者らは、組換え発現のために遺伝子をクローニングし、Ｐｎ３Ｐの酵素的脱重合時に生成されるオリゴ糖産物を特徴付けした。本発明者らは、生存増殖３型Ｓｐｎに対するＰｎ３Ｐアーゼの効果を試験し、その結果、Ｓｐｎのこのハイパービルレント血清型に対する潜在的な治療剤としてそれを調査することができる。
【００９０】
１９３０年、Ａｖｅｒｙ及びＤｕｂｏｓは、ツルコケモモ湿地から採取された土壌からある生物を単離し、それは、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の３型莢膜多糖（Ｐｎ３Ｐ）、−３）βＧｌｃＡ（１−４）βＧｌｃ（１−の線状ポリマーを脱重合させ得た（１、２）。この酵素（Ｐｎ３Ｐアーゼ）の発現は、Ｐｎ３Ｐの存在下で誘導性であり、細菌は、単一炭素源としてのＰｎ３Ｐを用いて増殖し得た。著者らは、周毛性鞭毛を有する胞子形成グラム陰性好気性バシラスとしてこの細菌を記載した。数年後、Ｓｉｃｋｌｅｓ及びＳｈａｗは、Ｐｎ３Ｐを標的化する同一の酵素的活性を実証する２つの追加の類似株を単離した（３、４）。これらの株は、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）と同義として受け入れられる前は、バシラス・パルストリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）と命名された（４〜６）。Ｐｎ３Ｐアーゼに加え、これらの株は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜血清２及び８型を脱重合させ得る酵素を産生する能力を実証したが、無細胞抽出物中の可溶性タンパク質は、それらの多糖に対して不活性であった（３、７）。これらの株及び酵素についての多数の考えられる現実的な用途が存在する。例えば、調査者らは、Ｓｉｃｋｌｅｓ及びＳｈａｗＰｎ３Ｐアーゼ酵素を適用した一方、Ｐｎ３Ｐ生合成並びにその抗原及び免疫学的特性を試験した（８〜１１）。
【００９１】
本発明者らは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから「バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｊｏｒｄａｎ株３２３５２」（すなわち、Ｓｉｃｋｌｅｓ及びＳｈａｗ株）を入手し、そのゲノムをシーケンシングした（１２）。１６Ｓ  ｒＲＮＡ分析は、この細菌がパエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｅ）に属することを明らかにし、目下、それをパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２（Ｐｂａｃ）として同定する。パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、関心の対象となってきている。それというのも、この属は、１９９１年に確立されたためである（１３）。これらの微生物は、多数の農業及び医療用途における有用性を実証している種々の反応を触媒する細胞外酵素の豊富な資源である（１４〜１９）。パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２ゲノムの炭水化物活性酵素アノテーションについてのデータベース（ｄｂＣＡＮ）は、７２００個の予測遺伝子のうち６６５個の炭水化物活性エントリーを示し、そのうち２５２個は、グリコシルヒドロラーゼ又は多糖リアーゼ様アーキテクチャを示す（２０）。
【００９２】
本発明者らは、Ｐｎ３Ｐアーゼを産生する遺伝子のアイデンティティの決定を着手して酵素の特有のＰｎ３Ｐ特異的活性を発現させ、利用した。本発明者らは、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染のための治療剤としての、この酵素の潜在的な使用を仮定した。莢膜多糖（ＣＰＳ）は、３型株についての主なビルレンス因子である。それというのも、莢膜非形成突然変異体は定着し得ないためである（２１）。ＣＰＳのビルレンス機序は、Ｓｐｎが宿主マクロファージによるその食作用の耐性又は阻害を介して免疫系を回避するのを補助する一方、粘膜媒介クリアランスも制限することである（２２）。現在の１３価ワクチン（ＰＣＶ１３）のＰｎ３Ｐ構成成分は、血清３型に対する変動する免疫応答を誘導する（２３、２４）。ＰＣＶ１３をワクチン接種された個体は、血清３型について他の血清型と比較して高いオプソニン食作用アッセイ血清力価を要求する（２５）。Ｓｐｎに対する現在のワクチン接種プログラムにかかわらず、それは世界の最も致死性の病原体の１つのままである。ワクチン接種及び抗生物質送達に加え、それらの及び他の莢膜形成病原体の撲滅のために代替的な治療アプローチを考慮しなければならない。
【００９３】
Ｐｎ３Ｐが補給された最小培地増殖を用いる培養物上清調製物のプロテオミクスを介するパエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｐｎ３Ｐアーゼの同定が本明細書に記載される。本発明者らは、Ｐｎ３Ｐアーゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で活性酵素を発現させた。本発明者らは、オリゴ糖産物を特徴付けし、Ｐｎ３Ｐ脱重合についての条件を最適化した。本発明者らは、生存ビルレント３型Ｓｐｎ株上の莢膜を分解する酵素の能力を評価して潜在的な治療剤としてのＰｎ３Ｐアーゼの調査を開始した。
【００９４】
結果
Ｐｎ３Ｐ利用は、遺伝子座中に組織化された遺伝子の発現を誘導する
本発明者らは、単一炭素源としての２％のグルコース又はＰｎ３Ｐを有する最小Ｍ９培地中でＰｂａｃを培養することを開始した。Ｐｂａｃ増殖を、ＯＤ６００ｎｍにより１４時間モニタリングして最大Ｐｎ３Ｐアーゼ産生を達成した（図３Ａ）。Ｐｂａｃは増殖し得、Ｐｎ３Ｐ及びグルコースを利用し得たが、セルロースを利用し得なかった。これらの培養物からの上清を２０倍濃縮し、タンパク質をクーマシー染色により可視化した。Ｐｎ３Ｐ増殖条件において、約５５ｋＤａの顕著なバンドが観察された（図３Ｂ）。溶液中トリプシン消化によるこれらの試料のプロテオーム分析及びＬＣ−ＭＳは、両方の試料中に存在する多数のタンパク質を同定した。しかしながら、２つのタンパク質は、表１に強調されるとおり、Ｐｎ３Ｐ増殖条件において有意に濃縮された。
【００９５】
【表１】
2020536490.tif 000002
【００９６】
これら２つのＰｎ３Ｐ誘導Ｐｂａｃタンパク質は、Ｐｎ３Ｐ利用の遺伝子座中に組織化されると考えられ（図３Ｃ）、それは、ＡＢＣ型多糖輸送系、パーミアーゼ構成成分（Ｐｂａｃ＿３５５６）、推定ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼタンパク質ｙｔｃＰ（Ｐｂａｃ＿３５５５）、リポタンパク質（Ｐｂａｃ＿３５５４）、ＤＮＡ結合応答調節因子、ＡｒａＣファミリー（Ｐｂａｃ＿３５５３）、ｓ層ホモロジー領域、ｇｌｕｇモチーフ、ｉｇモチーフを有するマルチドメインタンパク質（Ｐｂａｃ＿３５５２）、及び仮想タンパク質（Ｐｂａｃ＿３５５１）からなる。これらのタンパク質の２つはＰｎ３Ｐ増殖条件下でより豊富であるため、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲにより、グルコース及びＰｎ３Ｐ試料においてこの遺伝子座の３つの遺伝子の転写を、一般に発現される表層タンパク質（Ｐｂａｃ＿１５２１）と比較した。遺伝子３５５１、３５５２、及び３５５４の転写は、Ｐｎ３Ｐ利用について約１３０倍増加する一方、Ｐｂａｃ＿１５２１のｍＲＮＡ発現は、２つの条件間で不変である（図３Ｄ）。
【００９７】
Ｐｎ３Ｐアーゼ同定及びドメイン分析
Ｐｂａｃ＿３５５４、Ｐｂａｃ＿３５５２、及びＰｂａｃ＿３５５１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中でクローニングし、発現させ、どの非調節遺伝子産物がＰｎ３Ｐデポリメラーゼ活性を担うかを決定した。図４Ａに示される一次アミノ酸配列を有する仮想タンパク質Ｐｂａｃ＿３５５１（アクセッションＷＰ＿０７９９１５０２７）は、トリチウム放射性同位体標識Ｐｎ３Ｐの急速で効率的な加水分解を実証し、それは、反応産物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した場合、より低分子量のオリゴ糖への毎分カウント数のシフトにより示される（図４Ｂ）。組換えＰｎ３Ｐアーゼと非標識Ｐｎ３Ｐとの反応を実施し、ＰＶＤＦ膜上にスポットし、Ｐｎ３Ｐモノクローナル抗体によりプロービングした。モノクローナル抗体に対する反応性は、Ｐｎ３ＰのＰｎ３Ｐアーゼ処理の４時間後に完全に停止された（図４Ｃ）。
【００９８】
Ｐｂａｃ＿３５５１の翻訳タンパク質配列は、１，５４５個のアミノ酸である。残基１〜４０からのＳｉｇｎａｌＰ４．１サーバ（２６）によるシグナルペプチドの予測開裂は、１６４．１ｋＤａの成熟タンパク質を生じさせる。ＩｎｔｅｒＰｒｏオンラインソフトウェア（２７）によるタンパク質配列分析及び分類は、アミノ酸１８０〜３５３のグリコシドヒドロラーゼファミリー３９、６２１〜７６５のガラクトース結合ドメイン様、エンド−１，３−１，４−ベータグルカナーゼと構造的類似性を有する７８１〜９５０の不明機能ドメインＤＵＦ１０８０、及び１，２０９〜１，３４８のコンカナバリンＡ様レクチン／グルカナーゼドメインとの相同性を認識した（図４Ｄ）。この酵素のセグメントは膨大な炭水化物活性タンパク質とのいくらかの相同性を示すが、酵素の長さにわたる公知のグリコシルヒドロラーゼファミリーとの全体相同性は存在しない。
【００９９】
オリゴ糖産物の特徴付け
Ｐｎ３Ｐアーゼ加水分解のオリゴ糖産物を、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。この加水分解は、四糖及び六糖に対応する、Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム中で後に溶出する２つの主な産物ピークを生じさせた（図５Ａ〜Ｃ）。これらのピークのアイデンティティは、エレクトロスプレーイオン化質量分析により四糖（図５Ｂ）及び六糖（図５Ｃ）として確認された。質量分析データを表２にまとめる。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
ＮＭＲ分光法によるオリゴ糖産物の特徴付けを図６に提示する。全てのアノマープロトンシグナルを四及び六糖の代表的な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでアサインする（図６）。約４．７０ｐｐｍにおける残基Ａ、Ｃ及びＥのアノマープロトンシグナルはＨＯＤピークと重複した（図６Ａ、４Ｄ）が、２Ｄ  ＨＳＱＣスペクトル中で出現した（図６Ｂ、Ｅ）。Ｂ−１及びＤ−１の３ＪＨＨカップリング定数は８．２２Ｈｚであり、β−結合を実証した。５．１５（３ＪＨＨ＝３．６９）及び４．５８（３ＪＨＨ＝８．０５）ｐｐｍにおけるシグナルは、それぞれ、ＧｌｃＡ残基Ｆのα及びβ立体構造に対応する。ＨＳＱＣ及びＣＯＳＹ実験（図６Ｃ、Ｆ）を組み合わせることにより、本発明者らは、Ｆ−５のプロトンシグナルが高い化学シフト（約４．０５ｐｐｍ）を有することを同定することができ、それは、ＧｌｃＡ残基（Ｆ）が炭水化物鎖の還元末端において存在することを示唆した。これらのデータは、Ｐｎ３Ｐアーゼが多糖鎖中のグルクロン酸及びグルコース間のβ（１−４）結合を開裂させることを実証する。
【０１０２】
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性分析
この酵素的分解がエンド分解（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）開裂を介して進行するか、エキソ分解（ｅｘｏｌｙｔｉｃ）開裂を介して進行するかを理解するため、トリチウム化Ｐｎ３Ｐ及び組換えＰｎ３Ｐアーゼを使用してタイムコース実験を実施した。反応産物を、所与の時間の進行後にサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。低分子量オリゴ糖が反応中で早期に生成される（図７Ａ）。経時的なオリゴ糖溶出容量についてのＣＰＭの増加、及びより高分子量のポリマーについてのＣＰＭの対応する減少の両方が、四糖及び六糖を優先的に生成するエキソ分解型開裂（図７Ａ）を示唆する（図５Ａ）。経時的な左側から右側へのピークの緩やかなシフトは、真のランダムなエンド分解開裂を示す。
【０１０３】
ｐＨ６．０、７．２、及び８．０における３つの異なる緩衝液中で２時間の反応を実施し、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）法（４３）により還元末端グルクロン酸の濃度を検出してＰｎ３Ｐアーゼに最適な反応条件を決定した。Ｐｎ３Ｐアーゼは、ｐＨ６．０のＭＥＳ緩衝液よりもｐＨ７．２におけるリン酸ナトリウム緩衝液中でわずかに良好な活性を示すが、トリス緩衝液ｐＨ８．０中でｐＨ８．０におけるトリス緩衝液中で有意に悪化した活性を呈する（図７Ｂ）。Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を用いて金属イオン依存性にフォーカスするさらなる最適化を実施した。Ｐｎ３Ｐアーゼは、それが１０ｍＭのＣａ２＋の存在下でより高濃度の還元末端ＧｌｃＡを産生するため、Ｃａ２＋についての濃度依存的優先性を示す（図７Ｃ）。
【０１０４】
Ｐｎ３Ｐアーゼは、増殖３型肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から莢膜を除去する
増殖培地に添加された１００μｇ／ｍｌの組換え酵素を用いて３型ＷＵ２株を１０時間培養して増殖３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果の評価を開始した。細胞のＰｎ３Ｐアーゼ処理は、図８Ａに示されるとおり、細菌増殖に対して有害な増殖効果も細胞毒性効果も実証しなかった。さらに、同等のＣＦＵ値が２時間の間隔において得られた（データ示さず）。
【０１０５】
次いで、２μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下で増殖させた細菌細胞を競合ＥＬＩＳＡにより試験して酵素が増殖培養物の効率的な莢膜脱落をもたらすか否かことを決定した。処理後、異なる濃度における固定全細胞を使用してＰｎ３ＰコートプレートへのＰｎ３Ｐ特異的抗体結合について競合させた。無莢膜ＷＵ２突然変異株（ＪＤ９０８）は、その莢膜の欠落に起因して５×１０５ＣＦＵ／ｍｌにおいて最小の阻害を示し、５×１０４ＣＦＵ／ｍＬの濃度において阻害を示さなかった（図８Ｂ）。熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼ処理細胞は、細胞表面がＣＰＳにより完全に装飾されているはずであるため、最大阻害パーセントを実証した（図８Ｂ）。活性Ｐｎ３Ｐアーゼ処理により、抗体結合の阻害はＰｎ３Ｐアーゼ濃度依存的に減少し始め（図８Ｂ）、それは、生存増殖３型肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から莢膜をストリップするために酵素が適切に設計されることを示唆する。
【０１０６】
細菌細胞を対数増殖中期まで増殖させ、ＰＢＳ中で懸濁させ、１μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼにより０、１、２、又は４時間処理するタイムコース実験を実施した。ＷＵ２株がそれらの条件下で活性的に増殖せず、相当量の新たなＣＰＳを産生しないはずであることを考慮して、Ｐｎ３Ｐアーゼ用量はこの実験について低下させた。Ｐｎ３Ｐアーゼの酵素的活性も、ＴＨＹ培養培地中よりもＰＢＳ中でわずかに良好である（データ示さず）。所与の時点において、処理細胞を固定し、上記の競合ＥＬＩＳＡにより試験した。無莢膜ＷＵ２突然変異株（ＪＤ９０８）は、ここでも、その莢膜の欠落に起因して５×１０５ＣＦＵ／ｍｌにおいて最小阻害を示し、５×１０４ＣＦＵ／ｍＬの濃度において阻害を示さなかった（図８Ｃ）。非処理細胞は、最大阻害パーセントを示し、ＣＰＳにより完全に装飾されている細胞表面を示した（図８Ｃ）。Ｐｎ３Ｐアーゼインキュベーション時間が増加するにつれて、抗体結合の阻害が有意に減少し始め（図８Ｃ）、処理の２及び４時間後に本質的に無莢膜となると考えられる。
【０１０７】
Ｐｎ３Ｐアーゼ処理細胞を透過型電子顕微鏡観察により可視化し、非処理及び無莢膜突然変異株の両方と比較した。非処理細胞は、それらの表面にわたる厚い完全なＣＰＳコートを示した（図８Ｄ、左上）。予測されるとおり、無莢膜突然変異体は、ＣＰＳを有さなかった（図８Ｄ、右上）。酵素処理細胞の莢膜層は、ほとんどの場合に最小の厚さを示した（図８Ｄ、左下）一方、一部は、それらが無莢膜のように見えた（図８右下）。
【０１０８】
考察
パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、ラテン語逐語翻訳で「ほぼバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」であり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に関する系統発生分析がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）として既に定義された多数の株について実施されたとき、真性のバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種と区別されて線引きされた（６）。配列分析は、この属にソートされたいくつかの細菌株が、再割り当てを要求することを示した。この属に属する種は、水域（２９）から砂漠環境（３０）までの、及び温泉（３１）から極寒領域（３２）までの多様な生態的ニッチ（２８）から得られた。多くのパエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種が、土壌（３、３３）及び植物根環境（３４）中で見出されるが、いくつかはヒト試料からも単離された（３５）。パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、種々の農業、生物医学、及び工業製品についての豊富な資源である（２８）。膨大な活性を実証する細胞外酵素（３６）は、種々の工業的に重要な材料の製造における用途を有する（２８）。多数のこれらの種は、作物成長を促進するために農業的に適用されている効率的な窒素固定細菌である（３７）。さらに、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉ）から得られた新規の抗菌ペプチド及び化合物の保護作用が実証されている（３８）。
【０１０９】
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２は土壌資源から単離された一方（３）、ヒト病原体Ｓｐｎ  ＣＰＳに対して作用し得る酵素を得る進化圧に疑問を呈することが適切である。早期研究に基づくと、この特定の株は、３つの区別される肺炎球菌ＣＰＳを分解する能力を実証する（３、９）。これらが酵素についての天然基質であるか否か、又は他の土壌生息微生物又は植物物質が類似のグリカン構造及び結合を有するか否かは、依然として調査されていない。
【０１１０】
しかしながら、最初に入手されたパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２は、その代謝において重要な機能的役割を担う本明細書に記載のＰｎ３Ｐアーゼを採用している。この種に関するＴｏｒｒｉａｎｉ及びＰａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒによる早期報告は、増殖培地中のＰｎ３Ｐの添加により培養物上清中でＰｎ３Ｐアーゼ活性を誘導する能力を示した（７）。この「誘導性」は、Ｐｎ３Ｐアーゼ形成が、Ｐｎ３Ｐが単一炭素源として存在する条件下でのみ生じたというＡｖｅｒｙ及びＤｕｂｏｓｅの知見と対照的であった（２）。ここで、本発明者らは、Ｐｎ３Ｐが細菌増殖に要求されない一方、それは単一栄養源として機能し得ることを実証する。さらに、本発明者らのデータは、Ｐｂａｃ培養培地中のＰｎ３Ｐの存在がＰｎ３Ｐアーゼの発現を誘導することを示す。
【０１１１】
この誘導株培養物からマルチミリグラム量の活性で天然のＰｎ３Ｐアーゼを精製する本発明者らの試行は不成功であったが、それらの培養物上清調製物中でＰｎ３Ｐ脱重合活性を検出することができる。この試験において、本発明者らは、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２からＰｎ３Ｐアーゼ遺伝子を同定し、クローニングした。本発明者らはオリゴ糖産物を完全に特徴付けし、本発明者らは、Ｐｎ３Ｐアーゼが生存増殖ＳｐｎからＣＰＳを急速にストリップし得ることを示した。将来的な研究は、血清３型Ｓｐｎ感染の治療としてのこの酵素の有用性を評価する。現在のワクチン接種及び抗生物質投与における非効率性は、それらの及び他の莢膜形成病原体を制御するための代替的な治療アプローチの発見を必要としている。
【０１１２】
実験手順
細菌株及び増殖条件
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２（ＡＴＣＣ  １４１７５）を、５％のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上で、又は１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのビオチン、１ｍＭのチアミン、及び単一炭素源としての２％のグルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）又はＰｎ３Ｐ粉末（ＡＴＣＣ  １７２−Ｘ）を含有する最小培地（Ｍ９  Ｔｅｋｎｏｂａ）培養物中で３７℃において振盪させながら好気的に培養した。Ｍｏｏｎ  Ｎａｈｍ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  ａｔ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）からの寛大な寄贈品である肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３型（ＷＵ２株）及び無莢膜誘導体（ＪＤ９０８）を、５％のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天（ＴＳＡＢ）上で、又はトッドヘヴィットブロスと０．５％の酵母エキス（ＴＨＹ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３７℃において振盪なしで好気的に培養した。
【０１１３】
培養物上清のプロテオミクス
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２を、上記の２％（ｗ／ｖ）の炭素源を含有する５ｍｌの最小培地Ｍ９中で培養した。細菌培養物を対数増殖中期（ＯＤ６００ｎｍ  ０．６）において回収した。培養物上清を０．４５μｍのシリンジフィルターに通し、１０Ｋの分子量カットオフを有するｍｉｃｒｏｓｅｐ  ａｄｖａｎｃｅ遠心分離装置（Ｐａｌｌ）を使用して１／２０の培養物容量に濃縮した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより決定した。溶液中トリプシン消化を既に記載のとおり実施した（３９）。簡潔に述べると、培養物上清タンパク質からの２０μｇのタンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴとのインキュベーションにより５６℃において１時間還元し、次いで５５ｍＭのヨードアセトアミドによりカルボキシアミドメチル化を暗所で室温において４５分間行い、次いで４０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の１□ｇのシーケンシンググレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により３７℃において一晩消化した。トリプシン消化は、１％のトリフルオロ酢酸の添加及び３０分間の氷上のインキュベーションにより停止させた。Ｃ１８スピンカラム（Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して得られたペプチドをクリーンアップし、乾燥させ、０．１％のギ酸中で再構成させた。２００ｎＬ／分の流速における１３０分間にわたる１〜１００％の溶媒Ｂ（８０％のアセトニトリル、０．１％のギ酸）からなる１８０分間の線形勾配を使用して１５ｃｍ  Ａｃｃｌａｉｍ（商標）ＰｅｐＭａｐ（商標）ＲＳＬＣ  Ｃ１８カラム（２μｍの粒子サイズ、７５μｍ  ＩＤ）上でＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００システムを使用してペプチドを分離した。分離したペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のナノスプレーイオン源中に直接溶出させた。ステンレス鋼エミッタースプレー電圧を２２００Ｖに設定し、イオン移動管の温度を２８０℃に設定した。完全なＭＳスキャンは、６０，０００の分解能におけるｍ／ｚ２００から２０００までのＯｒｂｉｔｒａｐ検出を使用して取得し、衝突誘導解離（３８％の衝突エネルギー）による断片化後のＭＳ２スキャンは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｅｔｕｐ３．０を使用して「トップスピード」モードにおける最も強力なイオンについてのイオントラップで取得した。未加工スペクトルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてＳＥＱＵＥＳＴを使用してパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２についてのＲａｐｉｄ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ（４０）（ＲＡＳＴ）アノテートゲノムデータベースに対して検索し、完全なＭＳペプチドトレランスは１０ｐｐｍであり、ＭＳ２ペプチドトレランスは０．３Ｄａであった。＋５７．０２１Ｄａの一定改変（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（システイン残基のカルバミドメチル化）、及び＋１５．９９５Ｄａの動的改変（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（メチオニン残基の酸化）を検索パラメータにお���て可能とした。結果をペプチドアサインメントについて１％の偽発見率においてフィルタリングした。
【０１１４】
遺伝子発現
Ｐｎ３Ｐ誘導遺伝子座からの転写産物発現のレベルの比較を、ＲＴ−ＰＣＲにより実施した。パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２を、上記のとおり２％（ｗ／ｖ）の炭素源を含有する５ｍｌの最小培地中で培養した。３つ組の細菌培養物を対数増殖中期（ＯＤ６００ｎｍ  ０．６）において回収し、Ｅ．Ｎ．Ｚ．Ａ．細菌ＲＮＡキットを使用してＲＮＡを精製し、次いで既に記載のとおり汚染ゲノムＤＮＡからのＲＮＡのＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）抽出を行った（４１）。ＲＮＡ純度をｎａｎｏｄｒｏｐにより評価し、ｉｓｃｒｉｐｔ  ＣＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して１μｇのＲＮＡを逆転写反応に使用した。定量的リアルタイムＰＣＲを、９６ウェルプレート中で、ｉＱ  ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いてＭｙｉＱシステム（ＢｉｏＲａｄ）上で実施した。ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されたプライマーを表３に列記する。反応を２０μｌで実施し、それは、１０μｌのＳＹＢＲグリーンミックス、２０ｎｇのｃＤＮＡ、及び１μＭのプライマーミックスからなるものであった。反応条件は、９５℃で１８０秒間、次いで９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、及び７２℃の３０秒間の４５サイクルであった。データを１６Ｓ  ｒＲＮＡ転写産物レベルに正規化し、発現レベルの変化を、グルコース補給物を有する最小培地の培養物と比較した変化倍率として計算した。
【０１１５】
【表３】
2020536490.tif 000004
【０１１６】
組換えＰｎ３Ｐアーゼの産生
ｐＤＯＮＲ２２１中へのＢＰ反応を介するｇａｔｅｗａｙクローニング（４２）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を容易にするためのＢ部位を含有するオーバーハングを用いて２×ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｓｕｐｅｒｆｉマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰｂａｃ＿３５５１（ｒｅｆ  ｓｅｑ  ＷＰ＿０７９９１５０２７）、Ｐｂａｃ＿３５５２（ｒｅｆ  ｓｅｑ  ＷＰ＿０７９９１５０２８）、及びＰｂａｃ＿３５５４（ｒｅｆ  ｓｅｑ  ＷＰ＿０７９９１５０３０．１）（予測シグナルペプチド及び終止コドンを欠く）のコード領域を、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２ゲノムＤＮＡから増幅させた（ＤＮｅａｓｙ血液組織キット、Ｑｉａｇｅｎ）。クローニング用プライマーを表３に列記する。ＤＨ５α形質転換及びＤＮＡ配列確認後、ＬＲ−ｃｌｏｎａｓｅ反応を実施し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のカルボキシ末端Ｈｉｓ６タグ付き融合タンパク質の発現用ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）デスティネーションベクター中に遺伝子を挿入した。ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２−「Ｐｎ３Ｐアーゼ」プラスミドにより形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補給されたＬＢ培地中で３７℃において増殖させ、細胞密度を６００ｎｍにおける吸光度によりモニタリングした。ＯＤ６００ｎｍが０．６に達したら、細胞を２５℃に移し、１ｍＭの最終濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導し、細胞培養物を８時間インキュベートしておいた（Ａ６００が約１．１に達するまで）。細胞を遠心分離により回収した。次いで、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中で細胞を３０℃において２０分間再懸濁させ、プローブを２分間超音波処理し（２０秒間オン、１０秒間オフの４サイクル）、１７，０００×ｇにおける遠心分離により４℃において１時間澄明化させ、０．４５μｍのシリンジフィルターに通した。組換えＰｎ３Ｐアーゼを、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂により４℃において精製し、３００ｍＭのイミダゾールにより溶出させ、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中に緩衝液交換した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより決定した。ゲルｄｏｃ  ＥＺ撮影装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用してステインフリートリス−グリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）上のタンパク質可視化することにより、純度を評価した。
【０１１７】
酵素アッセイ
トリチウム化Ｐｎ３Ｐアッセイ−３型莢膜多糖に対する組換え酵素活性を、２μｇ／ｍｌの組換えタンパク質、又は熱殺菌対照の、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの３Ｈ−Ｐｎ３Ｐとのインキュベーションによりアッセイした。反応を、１００℃において５分間加熱することにより２時間後に停止させた。反応混合物を、ＮＧＣ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ＦＰＬＣシステム（ＢｉｏＲａｄ）上のｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ）上で分離した。１ｍｌの分画を回収し、それぞれの分画における毎分カウント数をＴｒｉ−Ｃａｒｂ２９１０ＴＲ液体シンチレーション分析装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中でカウントした。タイムコース実験を同一の方法により分析した。
【０１１８】
還元末端糖アッセイ−ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）法を使用して還元末端の増加を計測することにより、組換えＰｎ３Ｐアーゼ加水分解活性を決定した（４３）。２０μｇのＰｎ３Ｐ、及び１μｇの組換えＰｎ３Ｐアーゼを、５０ｍＭのＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、又は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のいずれかで含有する反応混合物（２００μｌ）を３７℃において１時間インキュベートし、次いで１００℃において５分間加熱して停止させた。反応混合物（４０μｌ）を１２０μｌの１％（ｗ／ｖ）のＰＡＨＢＡＨ−ＨＣＬ溶液と混合し、１００℃において５分間加熱した。４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレートリーダー上で透明底９６ウェルマイクロプレート中で計測した。それぞれの緩衝液において同一の方法により作成されたＧｌｃＡ標準曲線に基づき、還元糖の濃度を計算した。金属依存性アッセイを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のＭｇＣｌ２又はＣａＣｌ２の添加により同様に実施した。
【０１１９】
オリゴ糖分析
Ｐｎ３Ｐ粉末（２ｍｇ）を、１００μｇのＰｎ３Ｐアーゼと３７℃において４８時間インキュベートした。反応を１００℃において５分間加熱することにより停止させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００ＧＬカラム（ＧＥ）上にロードした。産物をリン酸緩衝生理食塩水中で１ｍｌ／分の流速において分離し、屈折率によりモニタリングした。分画（０．５ｍｌ）を回収し、オリゴ糖ピークを精製し、充填微細Ｐ２カラム（Ｂｉｏｒａｄ）上で水中に脱塩した。脱塩したオリゴを凍結乾燥させ、質量決定のためにＥＳＩ−ＭＳに供し、構造及び還元末端同定のためにＮＭＲに供した。
【０１２０】
ＮＭＲ−オリゴ糖を４００μＬの２Ｈ２Ｏ（９９．９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で溶解させ、３回凍結乾燥させて交換可能なプロトンを除去した。試料を４００μｌの９９．９６％の２Ｈ２Ｏ中で再溶解させ、ＮＭＲマイクロチューブに移した。１Ｈ分光光度法、１３Ｃ分光光度法、１Ｈ−１Ｈ相関分光光度法（ＣＯＳＹ）、及び１Ｈ−１３Ｃ異核単一量子コヒーレンス分光光度法（ＨＳＱＣ）実験を全て、２９８ＫにおいてＴｏｐｓｐｉｎ２．１．６ソフトウェアを用いるＢｒｕｋｅｒ６００又は８００ＭＨｚ分光光度計上で実施した。
【０１２１】
３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰｎ３Ｐアーゼ処理
ＴＳＡＢプレート上の新鮮肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３型（ＷＵ２）及び無莢膜誘導体（ＪＤ９０８）コロニーを、ＴＨＹブロス中で０．１のＯＤまで接種し、上記のとおり培養した。１００μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下でのＷＵ２増殖を、ＯＤ６００ｎｍの計測により１０時間の経過にわたりモニタリングした。２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、又は１０μ／ｍｌの熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼの存在下で増殖させたＷＵ２を無莢膜菌とともに６時間増殖させ、段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定した。培養物を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド中で氷上で２０分間固定し、さらに１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。タイムコース実験のため、ＷＵ２及び無莢膜株を対数増殖中期（０．６のＯＤ６００ｎｍ）まで増殖させ、遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。１μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼを添加し、３７℃において１、２、又は４時間インキュベートした。処理した細胞を段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定し、２％のパラホルムアルデヒド中で氷上で２０分間固定し、さらに１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。
【０１２２】
競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の５μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐにより室温において一晩コーティングした。Ｂｉｏｔｅｋ４０５／ＬＳマイクロプレートワッシャーを使用してプレートをＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）２０により４回洗浄した。ＰＢＳ中の１％のＢＳＡにより室温において１時間ブロッキングした後、マイクロプレートウェルを、ＰＢＳ−Ｔ中のＰｎ３Ｐ特異的抗血清と３０分間プレインキュベートした固定処理細胞と室温において２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ中のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１０３０−０４）の１：２０００の希釈物と室温において２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを１Ｍのトリス  ０．３ｍＭのＭｇＣｌ２中の２ｍｇ／ｍｌのホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０９４２）と３７℃において約３０分間インキュベートした。４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレートリーダー上で計測した。抗体結合の阻害パーセントを（（非阻害ＯＤ４０５−阻害ＯＤ４０５）／非阻害ＯＤ４０５）×１００により計算した。
【０１２３】
電子顕微鏡観察
電子顕微鏡観察を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＧｅｏｒｇｉａのＧｅｏｒｇｉａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙコア施設により、Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．による修正方法に従って実施した（４４）。処理細胞を、ＰＢＳ緩衝液中の２％のグルタルアルデヒド及び０．１５％のルテニウムレッド中で氷上で１時間固定し、次いで０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液により２回リンスし、１回のリンスにつき１５分間であった。次いで、０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液中の１％の四酸化オスミウム中で細胞を室温において１時間固定し、次いで０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液中で２回リンスし、１回のリンスにつき１５分間であった。ペレットをグレードエタノール系列（３０％、５０％、７５％、９５％、１００％及び１００％）中で脱水し、１００％のアセトン中で２回交換し、それぞれのステップは１５分間であった。次いで、ペレットに２５％のスパー樹脂及び７５％のアセトンを浸潤させ、２時間後に５０％のスパー樹脂及び５０％のアセトン、７５％のスパー樹脂及び２５％のアセトン、１００％のスパー樹脂を連続的に浸潤させ、次いで７０℃のオーブン中で２４時間重合させた。試料をＤｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフにより６０ｎｍにおいて切片化し、スロットグリッド上にピックアップした。グリッドを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛の液滴上で後染めし（それぞれ５分間）、染色の間にＨ２Ｏにより３０秒間リンスした。ＪＥＯＬ  ＪＥＭ１０１１ＴＥＭ（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）を８０ｋＶにおける操作で使用して試料を顕微鏡観察した。
【０１２４】
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１５．Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，Ｋ．（２００３）２−（２’−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｉｎａｔｅ  ｄｅｓｕｌｆｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  Ａ１１−２：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２，３５６−３６１
１６．Ｋｎｏｌｈｏｆｆ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｍ．Ａ．，Ｌｕｏ，Ｙ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｌｅｙ，Ｔ．Ｒ．（２０１５）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２６，１７６８−１７７９
１７．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ａ．，Ｌｅｉｔｅ，Ｍ．，Ｋｌｕｓｋｅｎｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｓａｎｔｏｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｍｅｌｏ，Ｌ．Ｄ．，ａｎｄ  Ａｚｅｒｅｄｏ，Ｊ．（２０１５）Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ（ＰｌｙＰｌ２３）ｗｉｔｈＨｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｍｅｒｉｃａｎ  ｆｏｕｌｂｒｏｏｄ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１３２０９５
１８．Ｇｕｏ，Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｅ．，Ｙｕａｎ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｓｅｆ，Ａ．Ｅ．（２０１２）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，３１５６−３１６５
１９．Ｐａｓａｒｉ，Ｎ．，Ａｄｌａｋｈａ，Ｎ．，Ｇｕｐｔａ，Ｍ．，Ｂａｓｈｉｒ，Ｚ．，Ｒａｊａｃｈａｒｙａ，Ｇ．Ｈ．，Ｖｅｒｍａ，Ｇ．，Ｍｕｎｄｅ，Ｍ．，Ｂｈａｔｎａｇａｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｙａｚｄａｎｉ，Ｓ．Ｓ．（２０１７）Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌｅ−Ｘ２  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ−３  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅＨｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｍａｓｓ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７，３７００
２０．Ｙｉｎ，Ｙ．，Ｍａｏ，Ｘ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｍａｏ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｘｕ，Ｙ．（２０１２）ｄｂＣＡＮ：ａ  ｗｅｂ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．４０，Ｗ４４５−４５１
２１．Ｍａｇｅｅ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｙｏｔｈｅｒ，Ｊ．（２００１）Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９，３７５５−３７６１
２２．Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｒｏｃｈｅ，Ａ．Ｍ．，Ｇｏｕｌｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｉｍ，Ｋ．，Ｒａｔｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｎ．（２００７）Ｃａｐｓｕｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｍｕｃｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７５，８３−９０
２３．Ｄａｇａｎ，Ｒ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｊｕｅｒｇｅｎｓ，Ｃ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．，Ｇｉｖｏｎ−Ｌａｖｉ，Ｎ．，Ｐｏｒａｔ，Ｎ．，Ｇｕｒｔｍａｎ，Ａ．，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．（２０１３）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  １３−ｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ７−ｖａｌｅｎｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５７，９５２−９６２
２４．Ｇｒｕｂｅｒ，Ｗ．Ｃ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｅｍｉｎｉ，Ｅ．Ａ．（２０１２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｅｖｎａｒ  １３，ａ  １３−ｖａｌｅｎｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｏｃｃａｌ  ＣＲＭ１９７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２６３，１５−２６
２５．Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｕｅｐｅｒ，Ｋ．，Ｓｔｅｕｌ，Ｋ．，Ｊｕｅｒｇｅｎｓ，Ｃ．，Ａｈｌｅｒｓ，Ｎ．，Ｂａｋｅｒ，Ｓ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｋ．Ｕ．，Ｄｅｖｌｉｎ，Ｃ．，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｗ．Ｃ．，Ｅｍｉｎｉ，Ｅ．Ａ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  ｇｒｏｕｐ，ｓ．（２０１０）Ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｎｏｎｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ａ  １３−ｖａｌｅｎｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ａ  ７−ｖａｌｅｎｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｇｉｖｅｎ  ｗｉｔｈ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８，４１９２−４２０３
２６．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｎ．，Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．（２０１１）ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．８，７８５−７８６
２７．Ｆｉｎｎ，Ｒ．Ｄ．，Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｔ．Ｋ．，Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｐ．Ｃ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｂｒｉｄｇｅ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｏｓｚｔａｎｙｉ，Ｚ．，Ｅｌ−Ｇｅｂａｌｉ，Ｓ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．，Ｇｏｕｇｈ，Ｊ．，Ｈａｆｔ，Ｄ．，Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｇ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｔｕｎｉｃ，Ｉ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．，Ｌｕ，Ｓ．，Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  Ａ．，Ｍｉ，Ｈ．，Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．，Ｎａｔａｌｅ，Ｄ．Ａ．，Ｎｅｃｃｉ，Ｍ．，Ｎｕｋａ，Ｇ．，Ｏｒｅｎｇｏ，Ｃ．Ａ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．，Ｐｅｓｓｅａｔ，Ｓ．，Ｐｉｏｖｅｓａｎ，Ｄ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．，Ｒｅｄａｓｃｈｉ，Ｎ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｌ．，Ｒｉｖｏｉｒｅ，Ｃ．，Ｓａｎｇｒａｄｏｒ−Ｖｅｇａｓ，Ａ．，Ｓｉｇｒｉｓｔ，Ｃ．，Ｓｉｌｌｉｔｏｅ，Ｉ．，Ｓｍｉｔｈｅｒｓ，Ｂ．，Ｓｑｕｉｚｚａｔｏ，Ｓ．，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｇ．，Ｔｈａｎｋｉ，Ｎ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｔｏｓａｔｔｏ，Ｓ．Ｃ．，Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｘｅｎａｒｉｏｓ，Ｉ．，Ｙｅｈ，Ｌ．Ｓ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｓ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ａ．Ｌ．（２０１７）ＩｎｔｅｒＰｒｏ  ｉｎ  ２０１７−ｂｅｙｏｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．４５，Ｄ１９０−Ｄ１９９
２８．Ｇｒａｄｙ，Ｅ．，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｒｉｃｈｍａｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｙｕａｎ，Ｚ．（２０１６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ．１５
２９．Ｂａｉｋ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｈｏｅ，Ｈ．Ｎ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｅｏｎｇ，Ｃ．Ｎ．（２０１１）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｏｏｐｏｎｅｎｓｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｗｅｔｌａｎｄ  ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，２７６３−２７６８
３０．Ｌｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｊｅｏｎ，Ｃ．Ｏ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｘｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｊｉａｎｇ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．（２００６）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｎｓｕｅｎｓｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｓｅｒｔ  ｓｏｉｌ  ｏｆ  Ｇａｎｓｕ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，２１３１−２１３４
３１．Ｂｏｕｒａｏｕｉ，Ｈ．，Ｒｅｂｉｂ，Ｈ．，Ｂｅｎ  Ａｉｓｓａ，Ｍ．，Ｔｏｕｚｅｌ，Ｊ．Ｐ．，Ｏ’ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｎａｉ，Ｍ．（２０１３）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｒｉｎｕｍ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍａｒｉｎｅＨｏｔ  ｓｐｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｕｎｉｓｉａ．Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，８７７−８８３
３２．Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｋ．Ｈ．，Ｂｅｇｕｍ，Ｚ．，Ｐａｔｈａｎ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｖａｊｉ，Ｓ．（２０１０）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌａｃｉａｌｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｋａｆｎｉ  ｇｌａｃｉｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅＨｉｍａｌａｙａｓ，Ｉｎｄｉａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６０，１９０９−１９１３
３３．Ｓｈｉｄａ，Ｏ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．，Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｌ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｋｏｍａｇａｔａ，Ｋ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｂｅｎｓｉｓ，ａｎｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  ｅｍｅｎｄｅｄ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４７，２８９−２９８
３４．Ｌｉ，Ｑ．Ｑ．，Ｚｈｏｕ，Ｘ．Ｋ．，Ｄａｎｇ，Ｌ．Ｚ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｈｏｚｚｅｉｎ，Ｗ．Ｎ．，Ｌｉｕ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｕ，Ｑ．，Ｌｉ，Ｗ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｕａｎ，Ｙ．Ｑ．（２０１４）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓａｍｐｌｅ．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  １０６，１１９９−１２０５
３５．Ｌｅａｅｏ，Ｒ．Ｓ．，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．Ｈ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ａ．Ｇ．，Ｌｉｍａ，Ａ．Ｎ．，Ａｌｂａｎｏ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｅ．Ａ．（２０１０）Ｆｉｒｓｔ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｎｅｒｉｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６６，１０１−１０３
３６．Ｈｏｎｇ，Ｔ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｍｅｎｇ，Ｍ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｄｏ−１，３−ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇａｒｄｅｎ  ｓｏｉｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１，４７２−４７８
３７．Ｘｉｅ，Ｊ．Ｂ．，Ｄｕ，Ｚ．，Ｂａｉ，Ｌ．，Ｔｉａｎ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｘｉｅ，Ｊ．Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｑ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｌｉ，Ｊ．（２０１４）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎ２−ｆｉｘｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｎ２−ｆｉｘｉｎｇ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．：ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．１０，ｅ１００４２３１
３８．Ａｌｌａｒｄ，Ｓ．，Ｅｎｕｒａｈ，Ａ．，Ｓｔｒａｉｎ，Ｅ．，Ｍｉｌｌｎｅｒ，Ｐ．，Ｒｉｄｅｏｕｔ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．（２０１４）Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ  ｉｎ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃａｒｒｉａｇｅ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｎｅｗｐｏｒｔ  ｏｎ  ｗｈｏｌｅ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｌａｎｔｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０，３８４２−３８４９
３９．Ｌｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｈｅｒｌｉｎｇ，Ｄ．，Ｔｅｏ，Ｃ．Ｆ．，Ｈａｕｓｍａｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｎ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｌ．（２００８）Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  ｒｏｄｅｎｔ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｕｐｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍ．Ｒｅｓ．７，１２５１−１２６３
４０．Ａｚｉｚ，Ｒ．Ｋ．，Ｂａｒｔｅｌｓ，Ｄ．，Ｂｅｓｔ，Ａ．Ａ．，ＤｅＪｏｎｇｈ，Ｍ．，Ｄｉｓｚ，Ｔ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｒ．Ａ．，Ｆｏｒｍｓｍａ，Ｋ．，Ｇｅｒｄｅｓ，Ｓ．，Ｇｌａｓｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｕｂａｌ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｆ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｒ．，Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｏｖｅｒｂｅｅｋ，Ｒ．Ａ．，ＭｃＮｅｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ｐａａｒｍａｎｎ，Ｄ．，Ｐａｃｚｉａｎ，Ｔ．，Ｐａｒｒｅｌｌｏ，Ｂ．，Ｐｕｓｃｈ，Ｇ．Ｄ．，Ｒｅｉｃｈ，Ｃ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒ．，Ｖａｓｓｉｅｖａ，Ｏ．，Ｖｏｎｓｔｅｉｎ，Ｖ．，Ｗｉｌｋｅ，Ａ．，ａｎｄ  Ｚａｇｎｉｔｋｏ，Ｏ．（２００８）Ｔｈｅ  ＲＡＳＴ  Ｓｅｒｖｅｒ：ｒａｐｉｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９，７５
４１．Ｒｉｏ，Ｄ．Ｃ．，Ａｒｅｓ，Ｍ．，Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｎｉｌｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．（２０１０）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ＴＲＩｚｏｌ（ＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ）．Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１０，ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４３９
４２．Ｗａｌｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．，Ｔｅｍｐｌｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｂｒａｓｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｏｒｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，ｖａｎ  ｄｅｎＨｅｕｖｅｌ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｖｉｄａｌ，Ｍ．（２０００）ＧＡＴＥＷＡＹ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ  ｏｒ  ＯＲＦｅｏｍｅｓ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８，５７５−５９２
４３．Ｂｌａｋｅｎｅｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｕｔｔｏｎ，Ｌ．（１９８０）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｓ  ｉｎ  ｆｒｕｉｔ  ａｎｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．３１，８８９−８９７
４４．Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．，Ｗｏｌｆｆ，Ｓ．，Ｈｏｃｋｅ，Ａ．，Ｒｏｓｓｅａｕ，Ｓ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｒｏｈｄｅ，Ｍ．（２００５）Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３，４６５３−４６６７
【０１２５】
実施例２
肺炎球菌莢膜多糖の酵素的加水分解は、宿主防御に対して細菌を脆弱にする
要約
一世紀間の調査にもかかわらず、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）は、多数の疾患、例えば、肺炎、髄膜炎、及び中耳炎を引き起こす主要なヒト病原体のままである。多くの莢膜形成病原体と同様、Ｓｐｎの莢膜多糖（ＣＰＳ）は、哺乳動物宿主における定着及びビルレンスに重要な構成成分である。この研究は、最もビルレントな血清型の１つである３型ＳｐｎのＣＰＳを標的化するグリコシドヒドロラーゼ、Ｐｎ３Ｐアーゼの保護的役割を評価することを目的とした。本発明者らは、生存３型株上の莢膜を分解するＰｎ３Ｐアーゼの能力を評価した。インビトロアッセイを介して、本発明者らは、Ｐｎ３Ｐアーゼ処理がマクロファージによる食作用及び好中球による補体媒介殺傷に対する細菌の感受性を増加させることを観察した。本発明者らは、インビボＰｎ３Ｐアーゼ処理が鼻咽頭定着を低減させ、３型Ｓｐｎにより引き起こされる敗血症からマウスを保護することを実証した。血清型分布のシフトの増加、薬物耐性株の上昇、及びワクチンに含まれる血清型に対する不十分な免疫応答に起因して、肺炎球菌感染を撲滅するためのアプローチを調査することが必要である。この研究は、分子、細胞及び全身レベルにおける肺炎球菌ＣＰＳと宿主との相互作用を評価し、ＣＰＳの酵素的加水分解を介してＳｐｎにより引き起こされる疾患のための代替的な治療アプローチを提供する。
【０１２６】
導入
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）は、肺炎、髄膜炎、及び中耳炎の病因であり、ヒトの健康に対して大きな脅威のままである。この細菌は、正常片利共生マイクロフローラの一部としてヒト鼻咽頭に安定的に定着し得る（１〜３）。定着は感染の主な様式であり、無症候性保菌にかかわらず、疾患の開始におけるキーステップである（４、５）。ほとんどのＳｐｎ株の宿主内の生存及び完全な病原性に重要な構成成分は、莢膜多糖（ＣＰＳ）である（６、７）。ＣＰＳは、細菌の表面全体をコーティングする大型の区別される多糖構造である。莢膜は、Ｓｐｎが宿主マクロファージによるその食作用への抵抗又はその阻害を介して宿主免疫系を回避するのを補助する一方、粘膜媒介クリアランスも制限する（８〜１１）。Ｓｐｎは、９０個超のユニークな莢膜血清型を有し、それぞれ、単糖組成及び結合、並びに他の修飾、例えば、アセチル化が異なる（１２）。細菌ビルレンス、表面接近性、及び抗原性におけるＣＰＳの要求により、それは１００年超にわたるワクチン接種研究における標的となった（１２〜１６）。タンパク質担体への結合によるＣＰＳを利用する肺炎球菌ワクチンの免疫原性及び効力の増加において多大な研究がなされてきた（１７、１８）。現在の肺炎球菌ワクチンは、ほとんどの関連臨床血清型の一部のための血清型特異的保護を提供することを目的とする（１２、１３）。７及び１３価の肺炎球菌結合型ワクチンＰＣＶ７及びＰＣＶ１３（Ｐｒｅｖｎａｒ；Ｐｆｉｚｅｒ）の使用は大きな成功をおさめ；ワクチン接種及び非ワクチン接種集団の両方において侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）率を有意に軽減した（１５、１９〜２２）。
【０１２７】
結合型ワクチンは、ほとんどの含まれる血清型により引き起こされる保菌及びＩＰＤの予防に有効であった一方、血清３型が例外であった。現在のＰＣＶ１３の肺炎球菌３型多糖（Ｐｎ３Ｐ）構成成分は、Ｓｐｎ血清３型に対する変動する免疫応答を誘導する（２３〜２５）。Ｐｎ３Ｐは、＞４００ｋＤａ平均分子量を有する−３）βＧｌｃＡ（１−４）βＧｌｃ（１−二糖反復単位の線状ポリマーである（２６、２７）。Ｓｐｎのオプソニン食作用殺傷について、血清３型について他の血清型と比較して有意に高い血清力価が要求されることが留意された（１２、２８、２９）。多数の動物モデル及び疫学研究は、３型株を他の肺炎球菌血清型と比較したビルレンス及び死亡リスクの増加と関連付けた（３０〜３２）。近年の症例報告は、血清３型により引き起こされるＩＰＤの致死例を実証し、この侵襲性血清型に伴う合併症の増加及び一般に不良アウトカムを強調した（３３）。さらに、近年のデータは、Ｓｐｎ株がＩＰＤ症例の３０％において１つ以上の抗生物質に耐性であることを示す（３４）。Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎは、Ｓｐｎの抗生物質耐性特徴の上昇を予測している（３５、３６）。
【０１２８】
ワクチン接種はこの主要なヒト病原体の最も攻撃性の血清型の１つに対する適切な保護を提供し得ないため、３型肺炎球菌感染のための代替的アプローチの緊急の探索が必要とされる。これは、抗生物質耐性株の蔓延の上昇とともに（３７、３８）、Ｐｎ３Ｐを加水分解する酵素を産生する土壌生息細菌を発見したＡｖｅｒｙ及びＤｕｂｏｓによる早期研究の再考をもたらした（３９〜４１）。これまで、本発明者らは、この細菌をパエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種として同定し、その３型特異的グリコシルヒドロラーゼ、Ｐｎ３Ｐアーゼをクローニングし、その分解産物を特徴付けした（２６、４２）。血清３型Ｓｐｎの継続する蔓延性、及び重症度に照らして、本発明者らは、ハイパービルレント血清３型感染のための治療剤としてのこの精製タンパク質の潜在的な使用を仮定した。ここで、本発明者らは、生存ビルレント３型Ｓｐｎ株上の莢膜を分解し、したがって、細菌を宿主免疫クリアランスに対して感受性とするＰｎ３Ｐアーゼの能力を調査した。
【０１２９】
材料及び方法
細菌株及び増殖条件
Ｍｏｏｎ  Ｎａｈｍ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  ａｔ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）からの寛大な寄贈品である肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３型（ＷＵ２株）及び無莢膜誘導体（ＪＤ９０８）（６０、６１）を、５％のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天（ＴＳＡＢ）上で、又はトッドヘヴィットブロスと０．５％の酵母エキス（ＴＨＹ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３７℃において振盪なしで好気的に培養した。
【０１３０】
マウス
８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）から入手し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＧｅｏｒｇｉａのＣｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて飼育した。マウスをマイクロアイソレーターケージ中で保持し、ＢＳＬ−２フード下で取り扱った。
【０１３１】
組換えＰｎ３Ｐアーゼの産生
Ｐｎ３Ｐアーゼを既に記載のとおり、軽微に修正して産生した（２６）。簡潔に述べると、ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２−「Ｐｎ３Ｐアーゼ」プラスミドにより形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補給されたテリフィックブロス中で３７℃において増殖させ、細胞密度を６００ｎｍにおける吸光度によりモニタリングした。ＯＤ６００ｎｍが１．０に達したら、細胞を１８℃に移した。１ｍＭの最終濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導し、細胞培養物を１８時間インキュベートしておいた。細胞を遠心分離により回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中で再懸濁させ、圧力溶解により溶解させた。溶解物を１７，０００×ｇにおける遠心分離により４℃において１時間澄明化し、０．４５μｍのシリンジフィルターに通した。組換えＰｎ３ＰアーゼをＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂により４℃において精製し、３００ｍＭのイミダゾールにより溶出させ、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中に緩衝液交換した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより製造業者の説明書に従って決定した。純度をクーマシー染色により評価した。
【０１３２】
３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰｎ３Ｐアーゼ処理
ＴＳＡＢプレート上の新鮮肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３型（ＷＵ２）及び無莢膜誘導体（ＪＤ９０８）コロニーを、ＴＨＹブロス中で０．１のＯＤ６００ｎｍまで接種し、上記のとおり培養した。１００μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下でのＷＵ２増殖を、ＯＤ６００ｎｍを計測することにより１０時間の経過にわたりモニタリングした。２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、又は１０μｇ／ｍｌの熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼの存在下でＷＵ２を６時間増殖させ、段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定した。培養物を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド中で氷上で２０分間固定し、さらに１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。タイムコース実験のため、ＷＵ２及び無莢膜株を対数増殖中期（０．６のＯＤ６００ｎｍ）まで増殖させ、遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。次いで、１μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼを添加し、３７℃において１、２、又は４時間インキュベートした。処理した細胞を段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定し、２％のパラホルムアルデヒド中で氷上で２０分間固定し、さらに１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。
【０１３３】
競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の５μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐにより室温において一晩コーティングした。Ｂｉｏｔｅｋ４０５／ＬＳマイクロプレートワッシャーを使用してプレートをＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）２０により４回洗浄した。ＰＢＳ中の１％のＢＳＡにより室温において１時間ブロッキングした後、マイクロプレートウェルを、ＰＢＳ−Ｔ中のＰｎ３Ｐ特異的抗血清と３０分間プレインキュベートした固定処理細胞と室温において２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ中のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１０３０−０４）の１：２０００の希釈物と室温において２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを１Ｍのトリス  ０．３ｍＭのＭｇＣｌ２の中の２ｍｇ／ｍｌのホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０９４２）と３７℃において約３０分間インキュベートした。４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレートリーダー上で計測した。抗体結合の阻害パーセントを（（非阻害ＯＤ４０５−阻害ＯＤ４０５）／非阻害ＯＤ４０５）×１００により計算した。
【０１３４】
電子顕微鏡観察
電子顕微鏡観察を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＧｅｏｒｇｉａのＧｅｏｒｇｉａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙコア施設により、Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．による修正方法に従って実施した（６２）。処理細胞を、ＰＢＳ緩衝液中の２％のグルタルアルデヒド、２％のパラホルムアルデヒド、０．０７５Ｍの酢酸リジン及び０．０７５％のルテニウムレッド中で氷上で１時間固定し、次いで０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液により２回リンスし、１回のリンスにつき１５分間であった。次いで、０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液中の１％の四酸化オスミウム中で細胞を室温において１時間固定し、次いで０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液中で２回リンスし、１回のリンスにつき１５分間であった。ペレットをグレードエタノール系列（３０％、５０％、７５％、９５％、１００％及び１００％）中で脱水し、１００％のアセトン中で２回交換し、それぞれのステップは１５分間であった。次いで、ペレットに２５％のスパー樹脂及び７５％のアセトンを浸潤させ、２時間後に５０％のスパー樹脂及び５０％のアセトン、７５％のスパー樹脂及び２５％のアセトン、１００％のスパー樹脂を連続的に浸潤させ、次いで７０□Ｃのオーブン中で２４時間重合させた。試料をＤｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフにより６０ｎｍにおいて切片化し、スロットグリッド上にピックアップした。グリッドを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛の液滴上で後染めし（それぞれ５分間）、染色の間にＨ２Ｏにより３０秒間リンスした。ＪＥＯＬ  ＪＥＭ１０１１ＴＥＭ（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）を８０ｋＶにおける操作で使用して試料を顕微鏡観察した。
【０１３５】
食作用
対数増殖中期のＷＵ２及びＪＤ９０８（無莢膜）培養物を洗浄し、１０μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）により室温において３０分間染色した。ＷＵ２株を２μｇ／ｍｌの活性又は熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼにより同時に処理した。細菌細胞ペレットを広範に洗浄し、１ｍｌの無菌ＰＢＳ中で懸濁させた。１０７個の細菌を、ネズミ白血病ウイルス形質転換マクロファージ系ＲＡＷ２６４．７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）のコンフルエントな単層に、活性又は熱不活化幼ウサギ補体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）と２４ウェルプレート中で添加し、３７℃において１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳにより４回洗浄して細胞外細菌を除去した。マクロファージを２％のパラホルムアルデヒドにより４℃において１５分間固定し、プレートから除去した。顕微鏡観察のため、細胞を、１％のウシ血清アルブミン中のビオチン化コムギ生殖系列アグルチニン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）の１／５００の希釈物と室温において３０分間インキュベートし、次いでストレプトアビジンＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の１／１０００の希釈物と室温において３０分間インキュベートした。細胞を４０倍の対物レンズにより画像化した。フローサイトメトリーをＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｙｔｏｆｌｅｘ  Ｓサイトメーター上で実施し、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。細胞を散布プロットによりマクロファージ集団に対してゲーティングした。非ＣＦＳＥ標識対照は、高蛍光性の細胞集団をゲーティングするために機能した。Ｐｎ３Ｐアーゼ用量依存的実験を活性補体の添加により上記のとおり実施した。
【０１３６】
補体沈着
補体沈着アッセイを既に記載のとおり実施した（６３）。細菌の３型ＷＵ２及び無莢膜（ＪＤ９０８）株をＰＢＳ中の３％のＢＳＡ中で再懸濁させた。アリコート（９６ウェル丸底プレート上の２つ組のウェル中）をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により染色し、５又は５０μｇ／ｍｌにおける不活化又は機能的Ｐｎ３Ｐアーゼにより３７℃において１時間処理した。正常マウス血清（１：１０希釈物）を試料に３７℃において３０分間添加した。細胞を洗浄し、マウス補体に対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体（ＭＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）により４℃において３０分間染色した。試料をＰＢＳ中の３％のＰＢＳにより洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド中で再懸濁させて固定した。次いで、試料をフローサイトメトリーにより分析した。ＦＩＴＣ−Ａの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞のゲーティングから計算した。
【０１３７】
修飾ＯＰＡ
オプソニン食作用殺傷アッセイを既に記載のとおり、修正して実施した（４３）。簡潔に述べると、３型ＷＵ２及び無莢膜（ＪＤ９０８）株を、９６ウェル丸底プレートの２つ組ウェル中で、オプソニン化緩衝液Ｂ（ＯＢＢ、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を有する無菌１×ＰＢＳ、０．１％のゼラチン、及び５％の熱不活化ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ）中でＰｎ３Ｐアーゼ（５又は５０ｕｇ／ｍｌの濃度における不活化又は機能的）を用いて又は用いずに３７℃において１時間又は４時間インキュベートした。ヒト前骨髄球性白血病細胞系、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％の熱不活化ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１％のＬ−グルタミンを有するＲＰＭＩ中で培養した。０．６％のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＨＬ−６０細胞を３日間分化させてからＯＰＡアッセイを実施し、回収し、ＯＢＢ中で再懸濁させた。活性又は熱不活化（補体なし）幼ウサギ補体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）を、ＨＬ−６０細胞に１：５の最終容量において添加した。ＨＬ−６０／補体混合物を血清／細菌に５×１０５個の細胞／ウェルにおいて添加した（対照については、ＨＬ−６０／補体を添加せず；代わりに等容量のＯＢＢ緩衝液を添加した）。最終反応物を３７℃において１時間インキュベートした。試料を氷上で約２０分間インキュベートすることにより反応を停止させた。次いで、１０μｌのそれぞれの反応物を５０μｌの最終容量に希釈し、２つ組で血液寒天プレート上にプレーティングした。プレートを嫌気的条件下で３０℃において一晩インキュベートし、翌日カウントした。生存パーセントを、対照試料（ＨＬ−６０細胞を有さない反応物、１００％の生存率）について得られた平均値に正規化されたそれぞれの２つ組の反応物として計算した。
【０１３８】
ネズミ鼻腔内定着
鼻腔内定着を、本質的にＰｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ（６４）により記載のとおり実施した。対数増殖中期ＷＵ２培養物を無菌ＰＢＳにより洗浄し、１０８ＣＦＵ／ｍｌ又は１０６ＣＦＵ／１０μｌの濃度において懸濁させた。５〜１０匹の無麻酔８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の群に、既に記載のとおり１０６ＣＦＵ／１０μｌを鼻腔内接種した。マウスに、０．３、及び７日目にビヒクルとしての１０μｌのＰＢＳを接種し、又は０、０及び３、若しくは０、３、及び７日目に１０μｌのＰＢＳ中の５０μｇのＰｎ３Ｐアーゼを投与することにより処理した。気管中への２５ゲージ針の挿入により鼻咽頭をＰＢＳにより流出させて鼻孔を介して５００μｌを排出させることにより鼻腔洗浄液を１０日目に得た。鼻腔洗浄液の段階希釈物を、５％のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天（ＴＳＡＢ）上にプレーティングしてコロニー形成単位を計数した。サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄマウスＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ）を製造業者の説明書に従って実施して洗浄液中のＩＬ−６及びＴＮＦαサイトカインレベルを決定した。
【０１３９】
ネズミ敗血症チャレンジ
対数増殖中期ＷＵ２培養物を無菌ＰＢＳにより洗浄し、５×１０３ＣＦＵ／１００μＬの濃度において懸濁させた。４匹の無麻酔８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の群に、５×１０３ＣＦＵを腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射した。対照マウスには、０時間において又は感染直後に１００μＬのＰＢＳ中の５μｇの熱不活化Ｐｎ３ＰアーゼをＩ．Ｐ．注射した。処理マウスには、感染の０、１２、又は２４時間後に１００μＬのＰＢＳ中の０．５μｇ又は５μｇのＰｎ３ＰアーゼをＩ．Ｐ．投与した。動物を１２時間ごとにモニタリングした。
【０１４０】
結果
Ｐｎ３Ｐアーゼは、増殖３型Ｓｐｎから莢膜を除去する
莢膜形成３型ＷＵ２株を、増殖培地に添加された組換え酵素と１０時間培養し、細菌増殖を、６００におけるＯＤを計測することによりモニタリングして増殖３型Ｓｐｎに対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を評価した。細胞のＰｎ３Ｐアーゼ処理は、細菌に対して有害な増殖効果も細胞毒性効果も実証しなかった（図９Ａ）。同一実験において、本発明者らは、２時間間隔において酵素処理及び非処理群の両方について同等のＣＦＵ値を得た（データ示さず）。細菌生存率に対する酵素処理の直接的な影響を評価するため、対数増殖期培養物を単離し、活性、又は熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼを有する栄養素不含緩衝液中で懸濁させた。酵素処理細胞は、８時間のタイムコースにわたり不活化及びＰＢＳ対照と同等のカウント数を示した（図９Ｂ）。
【０１４１】
次いで、Ｐｎ３Ｐアーゼの存在下で増殖させた細菌細胞を競合ＥＬＩＳＡにより試験して酵素が増殖培養物中で効率的な莢膜除去をもたらすか否かを決定した。処理後、固定全細胞を２つの異なる濃度において使用してＰｎ３ＰコーティングプレートへのＰｎ３Ｐ特異的抗体結合について競合させた。無莢膜ＷＵ２突然変異株（ＪＤ９０８）は、その莢膜の欠落に起因して抗体結合の最小〜無阻害を示した。熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼ処理細胞は、細胞表面がＣＰＳにより完全に装飾されているはずであるため、最大阻害パーセントを実証した。活性Ｐｎ３Ｐアーゼ処理により、抗体結合の阻害はＰｎ３Ｐアーゼ濃度依存的に減少し始め（図１０Ａ）、これは、酵素が生存増殖３型Ｓｐｎから莢膜をストリップすることを示唆する。
【０１４２】
細菌細胞を対数増殖中期まで増殖させ、ＰＢＳ中で懸濁させ、Ｐｎ３Ｐアーゼにより０、１、２、又は４時間処理するタイムコース実験を実施した。このアッセイについて、ＷＵ２株がそれらの条件下で活性的に増殖せず、したがって、相当量の新たなＣＰＳを産生しないはずであることを考慮して、Ｐｎ３Ｐアーゼ用量を１μｇ／ｍｌに低下させた。それぞれの時点において、上記のとおり処理細胞を固定し、競合ＥＬＩＳＡにより試験した。無莢膜ＷＵ２突然変異株（ＪＤ９０８）は、ここでも、その莢膜の欠落に起因して最小〜無阻害を示した。非処理細胞は、最大阻害パーセントを示し、ＣＰＳにより完全に装飾されている細胞表面を示した。Ｐｎ３Ｐアーゼインキュベーション時間が増加するにつれ、抗体結合の阻害が有意に減少し始め、処理の２又は４時間後に本質的に無莢膜となると考えられる（図１０Ｂ）。
【０１４３】
Ｐｎ３Ｐアーゼ処理細胞を透過型電子顕微鏡観察により可視化し、熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼにより処理した細胞と比較した。熱不活化酵素処理細胞は、それらの表面にわたる厚い、完全なＣＰＳコートを示し（図１０Ｃ）、明らかに無莢膜突然変異体と区別された（図１０Ｄ）。酵素処理細胞の莢膜層は、莢膜をほとんど〜全く示さず（図１０Ｅ）、無莢膜と考えられた。
【０１４４】
３型ＳｐｎのＰｎ３Ｐアーゼ処理は、食細胞取り込み及び殺傷を可能とする
ＣＰＳの主要なビルレンス機序は、宿主食細胞による食作用に抵抗する能力を細菌に提供することである（１、６）。インビトロでのマクロファージによる取り込みに対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を調査するため、本発明者らは、対数増殖中期細菌培養物をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）により染色し、次いでＰｎ３Ｐアーゼにより処理し、次いでＲＡＷ２６４．７マクロファージとインキュベートした。次いで、マクロファージを広範に洗浄し、蛍光顕微鏡観察により画像化した（図１１Ａ）。マクロファージによる細菌取り込みの程度をフローサイトメトリーにより定量した。酵素により処理した細菌は、莢膜形成株よりも有意に多くマクロファージにより取り込まれた。次いで、本発明者らは、蛍光細菌の食作用を表す蛍光マクロファージの割合を決定した（図１１Ｃ〜Ｄ）。熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼとインキュベートした莢膜形成３型株は、最小の蛍光標識食細胞を有した一方、Ｐｎ３Ｐアーゼ処理細菌は、無莢膜突然変異株と同程度で効率的にマクロファージにより取り込まれた。取り込みは、補体の存在下でのより高度な細菌取り込みにより証明されるとおり、補体に部分的に依存的であった（図１１Ｃ）。Ｐｎ３Ｐアーゼ処理は、用量依存的に細菌をＲＡＷマクロファージによる食作用の飲み込みに対してより感受性とした一方、さらに高用量の不活化酵素は、細菌取り込みに対して有意な効果を有さなかった（図１１Ｄ）。
【０１４５】
肺炎球菌表面上の補体沈着は、効率的な食作用及びクリアランスを補助する重要な機序である（１０、１１）。ＣＰＳは補体回避特性を細菌に提供するため（１０、１１）、本発明者らは、細菌表面上のＣ３ｂ沈着に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理による莢膜除去の効果を調査した。莢膜形成３型ＷＵ２株を、活性又は不活性Ｐｎ３Ｐアーゼにより処理した。非処理３型株及び無莢膜突然変異体を追加の対照として含めた。次いで、細菌を正常マウス血清とインキュベートし、洗浄し、マウス補体に対するＦＩＴＣ結合抗体により染色した。次いで、固定試料をフローサイトメトリーにより分析した。用量依存的に、Ｐｎ３Ｐアーゼ処理は、細菌表面上の補体の沈着を増加させ、無莢膜株上の沈着のレベルに達した。補体は、非処理又は不活化Ｐｎ３Ｐアーゼ処理した細菌への最小の結合を有した（図１２）。
【０１４６】
Ｓｐｎの食作用殺傷を評価するための標準的なインビトロアッセイは、ＨＬ−６０細胞を好中球に分化させて抗体オプソニン化細菌を飲み込ませ、クリアランスさせるオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）である。この方法は、膨大なワクチン研究において抗体応答の質を計測するために広範に使用されている（４３〜４８）。好中球は、肺における病原性細菌に対する先天性免疫の最も重要な構成成分の１つである（４９〜５１）。この研究の焦点は、Ｓｐｎに対する体液性免疫応答ではない一方、本発明者らは、修正ＯＰＡを使用してインビトロでＰｎ３Ｐアーゼにより処理した３型Ｓｐｎの補体媒介好中球殺傷を評価した。莢膜形成３型Ｓｐｎを、活性又は熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼとインキュベートした。分化させたＨＬ−６０細胞を、活性又は熱不活性補体とプレインキュベートした。ＨＬ−６０細胞及び補体の混合物を細菌に添加し、３７℃において１時間インキュベートした。実験群における生存細菌を定量するため、反応混合物をプレーティングし、ＣＦＵを翌日カウントした。生存パーセントを、対照試料として機能する好中球を有さない反応物（１００％の生存率）から得られた平均値に正規化されたそれぞれの２つ組の反応物として計算した。活性補体及び好中球とのインキュベーション時、酵素非処理の莢膜形成３型株は好中球殺傷を回避し、最大生存率を示し得た一方、無莢膜突然変異株はほぼ４０％の生存能まで低減された（図１３）。莢膜を除去するためのＰｎ３Ｐアーゼ処理は、３型株を、無莢膜株と同様に補体依存的好中球殺傷に対して感受性とした（図１３）。
【０１４７】
Ｐｎ３Ｐアーゼは鼻咽頭定着を制限する
インビボで酵素の保護能を調査するため、本発明者らは最初に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる鼻腔内定着実験を実施した。Ｓｐｎによる鼻腔定着は、侵襲性肺炎球菌疾患への移行に不可欠である（４、５）。この株の莢膜は、鼻腔内定着に要求されることが確立されている（６）。したがって、本発明者らは、鼻腔定着モデルを使用し、定着３型株の莢膜の除去を介して鼻咽頭中の細菌定着を低減させるＰｎ３Ｐアーゼの能力を評価した。本発明者らは最初に、無莢膜突然変異体ＪＤ９０８が、鼻咽頭に定着し得ないことを確認した（データ示さず）。次いで、マウスの群に、１０μｌのＰＢＳ中の１０６個の対数増殖期の野生型（ｗｔ）莢膜形成細菌を鼻腔内接種した。全ての接種材料に、Ｐｎ３Ｐアーゼ又は緩衝液対照のいずれかを追加した。群に０日目、０及び３日目、又は０．３、及び７日目のいずれかで酵素を投与して複数回投与の効果を評価した。１０日目にマウスを麻酔し、細菌負荷を定量した。鼻腔洗浄液を得、段階希釈し、プレーティングして細菌負荷を計数した。ビヒクル対照処理マウスは、単一用量のＰｎ３Ｐアーゼのみにより処理したマウスよりも有意に高い細菌負荷で定着された。２回又は３回用量のＰｎ３Ｐアーゼの投与により、動物洗浄液の大多数がいかなる生存細菌コロニーも欠いた（図１４Ａ）。肺ホモジネート及び血清試料は、細菌負荷の証拠を示さなかった（データ示さず）。シグネチャー炎症促進性サイトカインレベルを鼻腔洗浄液中でＥＬＩＳＡにより計測した（５２）。ビヒクル対照マウスは、Ｐｎ３Ｐアーゼ処理動物と比較して有意に増加したサイトカインＩＬ−６及びＴＮＦαのレベルを有し、それはこの群における細菌負荷に対する継続した宿主炎症応答を反映した（図１４Ｂ〜Ｃ）（５２）。ＩＬ−６及びＴＮＦαの有意な低減は、０日目の単一用量のＰｎ３Ｐアーゼの後でも、ほとんどの動物において観察された。単一用量群におけるより高い細菌負荷を有するマウスは、この群における増加したサイトカインレベルに寄与した。
【０１４８】
Ｐｎ３Ｐアーゼは致死チャレンジからマウスを保護する
Ｐｎ３Ｐアーゼをその保護能についてさらに評価し、治療剤としてのＰｎ３Ｐアーゼの有用性を評価するため、本発明者らは、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）敗血症モデルを用いた（５３、５４）。マウスの群に、５×１０３ＣＦＵの対数増殖期のＳｐｎのＷＵ２の３型株を感染させた。本発明者らは、感染の０時間、１２、又は２４時間後に投与された５μｇ又は０．５μｇの単一用量の効果を評価した。熱不活化酵素により処理した対照群は、感染の４８時間以内に死亡した。酵素用量又は投与のタイミングにかかわらず、全ての処理群は疾病の徴候を示さず、Ｉ．Ｐ．チャレンジからの完全な保護が認められた（図１５）。
【０１４９】
考察
この試験は、病原性細菌、血清３型ＳｐｎのＣＰＳを標的化する炭水化物分解酵素（グリコシドヒドロラーゼ）、Ｐｎ３Ｐアーゼの保護的役割を評価することを目的とした。Ｓｐｎにより引き起こされる侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）は、ヒト健康に対して大きな脅威であり、驚くべき死亡率を伴う。世界的なワクチン接種プログラム及び抗生物質の使用にかかわらず、Ｓｐｎは、世界規模で史上最悪の感染因子のままである。肺炎球菌ワクチンは経験的に作製され、特に高齢及び免疫減衰個体間で免疫原性が変動し／不十分である。ＩＰＤに対する抗生物質の広範な使用は、薬物耐性肺炎球菌株の拡散をもたらした（３４、３５）。この研究は、ＩＰＤに対する現行のワクチン及び抗生物質による解決策の欠点に対する代替的な標的化治療アプローチを提供する。
【０１５０】
第１に、本発明者らは、Ｐｎ３Ｐアーゼが、細胞に対して殺菌効果を有さずに生存肺炎球菌から莢膜を効率的に除去させ得ることを実証した。インビトロアッセイを介して、本発明者らは、Ｐｎ３Ｐアーゼ処理がマクロファージ細胞系による食作用に対する細菌の感受性を増加させることを観察した。これらの結果は、有望であった。それというのも、莢膜は、Ｓｐｎの宿主食細胞による飲み込みの耐性を可能とする主要な宿主免疫回避構成成分であるためである（９）。次いで、本発明者らは、酵素処理が好中球による補体媒介殺傷を有意に増加させることを結論付けた。単一用量のＰｎ３Ｐアーゼは、３型Ｓｐｎによるネズミ鼻咽頭定着を有意に低減させ、それは酵素がリスクがある集団におけるこの血清型による定着を制御するための予防的措置として機能し得ることを示した。最後に、腹腔内チャレンジを実施して敗血症モデルにおけるＰｎ３Ｐアーゼの保護能を評価した。とりわけ、感染の２４時間後に投与された０．５μｇの単一低用量は、細菌チャレンジからチャレンジマウスの１００％を保護し得た一方、対照処理動物は、４８時間よりも長く生存しなかった。このモデルにおけるＰｎ３Ｐアーゼの堅牢な保護能は、酵素的活性が、低用量においても莢膜を効率的に分解するために宿主内で十分であることを実証する。
【０１５１】
Ｐｎ３Ｐアーゼが肺炎球菌感染についての治療潜在性を有することを考慮すると、酵素の適用に付随する実際的な問題、例えば、免疫原性、投与経路、及び基質特異性に対処する必要がある（５５）。チャレンジ実験におけるＰｎ３Ｐアーゼに対して生成される抗体力価の本発明者らの予備評価は、有効用量の酵素に対して生成されるＩｇＭ応答もＩｇＧ応答も観察しなかった。将来的な研究は、Ｐｎ３Ｐアーゼに対する体液性及び細胞免疫応答を評価し、菌血症モデルについての代替的な投与経路、例えば、静脈内経路、又は肺炎モデルについてのエアロゾル化スプレーを調査する。エアロゾルスプレーによる気道への酵素送達の有用な例は、嚢胞性線維症患者における分泌ＤＮＡによる気道閉塞を緩和させるために使用されるＰｕｌｍｏｚｙｍｅとして公知の組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼである（５６）。治療剤としてのＰｎ３Ｐアーゼの使用に伴う別の潜在的な問題は、宿主グリカンに対するその活性である。Ｐｎ３Ｐと構造的に類似する哺乳動物グリカンに対するＰｎ３Ｐアーゼの緩和した基質特異性を評価する必要がある。
【０１５２】
治療酵素としてのＰｎ３Ｐアーゼの高い潜在性に加え、このグリコシルヒドロラーゼは、それが現在確立されているグリコシルヒドロラーゼＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅ（ＣＡＺＹ）ファミリーに収まらない点で構造／機能の観点から特有の特性を有する（５７）。このタンパク質の構造的特性のさらなる試験は、他の特有の細菌ＣＰＳに向かう活性を有する構造的に類似する酵素の発見をもたらし得る。将来的な調査は、他の蔓延する肺炎球菌血清型及び他の莢膜形成病原性細菌に対する使用のための酵素の存在を探索する。早期研究に基づくと、Ｐｎ３Ｐアーゼを発現する天然種は、２つの追加の肺炎球菌ＣＰＳを分解する能力を有する（５８、５９）。このＰｎ３Ｐアーゼを発現するパエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種は土壌から単離された一方（２６、４２、５９）、なぜこの種が、ヒト病原体の莢膜を分解し得るそのような酵素を有するように進化するか疑問を呈するのが適切である。それらが共進化関係を示す、酵素についての天然基質であるか否かも、他の土壌生息微生物又は植物が類似のグリカン残基及び結合を発現するか否かも、依然として探索されていない。
【０１５３】
ここで提示される結果は、ＣＰＳの酵素的加水分解が、Ｓｐｎ及び潜在的に他の重要な莢膜形成病原体、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）により引き起こされる疾患に有効な代替的又は補完的治療アプローチであり得ることを示す。まとめると、この研究は、他の致死細菌病原体をその莢膜多糖の標的化を介して衰弱させる、グリコシドヒドロラーゼ、Ｐｎ３Ｐアーゼの保護的役割の最初の包括的評価として機能する。
【０１５４】
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３２．Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｐ，Ｗｏｒｍ  ＳＷ，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  Ｂ，ＫｏｎｒａｄｓｅｎＨＢ，Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  Ｔ．２００４．Ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４：２１．
３３．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｎ，Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｙ，Ｈｉｒａｉ  Ｊ，Ｓａｋａｎａｓｈｉ  Ｄ，ＳｕｅｍａｔｓｕＨ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｎ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｙ，ＭｉｋａｍｏＨ．２０１７．Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｃｏｉｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ．ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ  １０：２１．
３４．Ｋｉｍ  Ｌ，ＭｃＧｅｅ  Ｌ，Ｔｏｍｃｚｙｋ  Ｓ，Ｂｅａｌｌ  Ｂ．２０１６．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎ  Ｐｒｅ−  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｒａｓ：ａ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２９：５２５−５５２．
３５．Ｌｉ  Ｙ，Ｍｅｔｃａｌｆ  ＢＪ，Ｃｈｏｃｈｕａ  Ｓ，Ｌｉ  Ｚ，Ｇｅｒｔｚ  ＲＥ，ＷａｌｋｅｒＨ，Ｈａｗｋｉｎｓ  ＰＡ，Ｔｒａｎ  Ｔ，Ｗｈｉｔｎｅｙ  ＣＧ，ＭｃＧｅｅ  Ｌ，Ｂｅａｌｌ  ＢＷ．２０１６．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  β−ｌａｃｔａｍ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＭＢｉｏ  ７．
３６．Ｍｅｔｃａｌｆ  ＢＪ，Ｇｅｒｔｚ  ＲＥ，Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  ＲＡ，ＷａｌｋｅｒＨ，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ＬＫ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｄ，Ｌｉ  Ｚ，Ｌａｗ  Ｃ，Ｈａｗｋｉｎｓ  ＰＡ，Ｃｈｏｃｈｕａ  Ｓ，Ｓｈｅｔｈ  Ｍ，Ｒａｙａｍａｊｈｉ  Ｎ，Ｂｅｎｔｌｅｙ  ＳＤ，Ｋｉｍ  Ｌ，Ｗｈｉｔｎｅｙ  ＣＧ，ＭｃＧｅｅ  Ｌ，Ｂｅａｌｌ  Ｂ，ｔｅａｍ  ＡＢＣｓ．２０１６．Ｓｔｒａｉｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  １３−ｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳＡ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２２：６０．ｅ６９−６０．ｅ２９．
３７．Ｏｂｏｌｓｋｉ  Ｕ，Ｌｏｕｒｅｎｃｏ  Ｊ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｃ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｒ，Ｇｏｒｉ  Ａ，Ｇｕｐｔａ  Ｓ．２０１８．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｃａｎ  ｄｒｉｖｅ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｍｏｎｇ  ｎｏｎｖａｃｃｉｎｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１５：３１０２−３１０７．
３８．Ｚｈａｏ  Ｃ，Ｌｉ  Ｚ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｊｉ  Ｐ，Ｚｅｎｇ  Ｊ，Ｈｕ  Ｂ，Ｈｕ  Ｚ，Ｌｉａｏ  Ｋ，ＳｕｎＨ，Ｚｈａｎｇ  Ｒ，Ｃａｏ  Ｂ，Ｚｈｕｏ  Ｃ，Ｊｉａ  Ｗ，Ｍｅｉ  Ｙ，Ｃｈｕ  Ｙ，Ｘｕ  Ｘ，Ｙａｎｇ  Ｑ，Ｊｉｎ  Ｙ，Ｆｕ  Ｑ，ＬｉＨ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｎｉ  Ｙ，ＬｉａｎｇＨ，ＷａｎｇＨ．２０１７．Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  １７  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｃｉｔｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ２０１１  ｔｏ  ２０１６．ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７：８０４．
３９．Ａｖｅｒｙ  ＯＴ，Ｄｕｂｏｓ  Ｒ．１９３０．Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｎ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７２：１５１−１５２．
４０．Ｄｕｂｏｓ  Ｒ，Ａｖｅｒｙ  ＯＴ．１９３１．Ｄｅｃｏｍｐｏｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ５４：５１−７１．
４１．Ａｖｅｒｙ  ＯＴ，Ｄｕｂｏｓ  Ｒ．１９３１．Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ５４：７３−８９．
４２．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＤＲ，Ｌｏｒｅｎｚ  Ｗ，Ａｖｃｉ  ＦＹ．２０１７．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｊｏｒｄａｎ  ｓｔｒａｉｎ  ３２３５２．Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ  ５：ｅ００２８９−１７
４３．Ｂｕｒｔｏｎ  ＲＬ，Ｎａｈｍ  ＭＨ．２０１２．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｏｕｒｆｏｌｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２０．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：８３５−８４１．
４４．Ｄａｎｉｅｌｓ  ＣＣ，Ｋｉｍ  ＫＨ，Ｂｕｒｔｏｎ  ＲＬ，Ｍｉｒｚａ  Ｓ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｍ，Ｋｉｎｇ  Ｊ，Ｈａｌｅ  Ｙ，Ｃｏａｎ  Ｐ，Ｒｈｅｅ  ＤＫ，Ｎａｈｍ  ＭＨ，Ｂｒｉｌｅｓ  ＤＥ．２０１３．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：１５４９−１５５８．
４５．Ｆｌｅｃｋ  ＲＡ，Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｓ，Ｎａｈｍ  ＭＨ．２００５．Ｕｓｅ  ｏｆＨＬ−６０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｐｓｏｎｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：１９−２７．
４６．Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｓ，Ｆｒａｓｃｈ  ＣＥ，Ｃａｒｌｏｎｅ  Ｇ，Ｆｌｅｃｋ  ＲＡ，Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ  Ｄ，Ｎａｈｍ  ＭＨ．２００６．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：１６５−１６９．
４７．Ｓｏｎｇ  ＪＹ，Ｍｏｓｅｌｅｙ  ＭＡ，Ｂｕｒｔｏｎ  ＲＬ，Ｎａｈｍ  ＭＨ．２０１３．Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｐｓｏｎｉｃ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９：４１２−４２５．
４８．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＤＲ，Ｓｕｎ  Ｌ，Ｐａｓｃｈａｌｌ  ＡＶ，Ａｖｃｉ  ＦＹ．２０１７．Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄＨｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ３  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９：５９８−６０３．
４９．Ｃｒａｉｇ  Ａ，Ｍａｉ  Ｊ，Ｃａｉ  Ｓ，Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ  Ｓ．２００９．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７：５６８−５７５．
５０．Ｌｕ  ＹＪ，Ｇｒｏｓｓ  Ｊ，Ｂｏｇａｅｒｔ  Ｄ，Ｆｉｎｎ  Ａ，Ｂａｇｒａｄｅ  Ｌ，Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ａ，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  Ａ，Ｆｏｒｔｅ  Ｓ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＭ，Ｈａｒｎｅｙ  ＫＦ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＷ，Ｌｉｐｓｉｔｃｈ  Ｍ，Ｍａｌｌｅｙ  Ｒ．２００８．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ４：ｅ１０００１５９．
５１．Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｃｌａｒｋｅ  ＴＢ，Ｗｅｉｓｅｒ  ＪＮ．２００９．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｔｈ１７−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９：１８９９−１９０９．
５２．Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ−Ｃａｉｎ  Ｋ，Ｈｉｎｏｊｏｓａ  ＣＡ，Ａｋｕｌａ  Ｓｕｒｅｓｈ  Ｂａｂｕ  Ｒ，Ｌｉｚｃａｎｏ  Ａ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｊｕａｒｂｅ  Ｎ，Ｍｕｎｏｚ−Ａｌｍａｇｒｏ  Ｃ，Ｓａｎｃｈｅｚ  ＣＪ，Ｂｅｒｇｍａｎ  ＭＡ，Ｏｒｉｈｕｅｌａ  ＣＪ．２０１３．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ，ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ．ＭＢｉｏ  ４：ｅ００７４５−００７１３．
５３．Ｂｒｉｌｅｓ  ＤＥ，Ｎａｈｍ  Ｍ，Ｓｃｈｒｏｅｒ  Ｋ，Ｄａｖｉｅ  Ｊ，Ｂａｋｅｒ  Ｐ，Ｋｅａｒｎｅｙ  Ｊ，Ｂａｒｌｅｔｔａ  Ｒ．１９８１．Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｒｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ３  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５３：６９４−７０５．
５４．Ｃｈｉａｖｏｌｉｎｉ  Ｄ，Ｐｏｚｚｉ  Ｇ，Ｒｉｃｃｉ  Ｓ．２００８．Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１：６６６−６８５．
５５．Ｆｅｎｔｏｎ  Ｍ，Ｒｏｓｓ  Ｐ，ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ  Ｏ，Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｊ，Ｃｏｆｆｅｙ  Ａ．２０１０．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎｓ  ａｓ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｅｎｇ  Ｂｕｇｓ  １：９−１６．
５６．ＦｕｃｈｓＨＪ，Ｂｏｒｏｗｉｔｚ  ＤＳ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ＤＨ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＥＭ，Ｎａｓｈ  ＭＬ，Ｒａｍｓｅｙ  ＢＷ，Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ  ＢＪ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＬ，Ｗｏｈｌ  ＭＥ．１９９４．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  ｏｎ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｎｄ  ｏｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３１：６３７−６４２．
５７．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ，Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．１９９６．Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌＨｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３１６（Ｐｔ  ２）：６９５−６９６．
５８．Ｓｈａｗ  Ｍ，Ｓｉｃｋｌｅｓ  ＧＭ．１９５０．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉａ  ｔｏ  ｗｈｉｃｈ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｗａｓ  ｎｏｔ  ａｄｄｅｄ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６４：２７−３２．
５９．Ｓｉｃｋｌｅｓ  ＧＭ，Ｓｈａｗ  Ｍ．１９３４．Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｅｒｇａｎｉｓｍｓ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｅ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２８：４１５−４３１．
６０．Ｄｉｌｌａｒｄ  ＪＰ，Ｖａｎｄｅｒｓｅａ  ＭＷ，Ｙｏｔｈｅｒ  Ｊ．１９９５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ３  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８１：９７３−９８３．
６１．Ｄｉｌｌａｒｄ  ＪＰ，Ｙｏｔｈｅｒ  Ｊ．１９９４．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ  ３．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２：９５９−９７２．
６２．Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  Ｓ，Ｗｏｌｆｆ  Ｓ，Ｈｏｃｋｅ  Ａ，Ｒｏｓｓｅａｕ  Ｓ，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｅ，Ｒｏｈｄｅ  Ｍ．２００５．Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３：４６５３−４６６７．
６３．Ｈｙａｍｓ  Ｃ，Ｃａｍｂｅｒｌｅｉｎ  Ｅ，Ｃｏｈｅｎ  ＪＭ，Ｂａｘ  Ｋ，Ｂｒｏｗｎ  ＪＳ．２０１０．Ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７８：７０４−７１５．
６４．Ｐｕｃｈｔａ  Ａ，Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒ  ＣＰ，Ｔｈｕｒｎ  Ｔ，Ｂｏｗｄｉｓｈ  ＤＭ．２０１４．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ：ｅ５０４９０．
【０１５５】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な材料（例えば、例として、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける、例えば、ヌクレオチド配列寄託書、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列寄託書、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるアノテートコード領域からの翻訳物）の完全な開示は、参照により全体として組み込まれる。刊行物において参照される補足材料（例えば、補足表、補足図、補足材料及び方法、並びに／又は補足実験データ）は、同様に参照により全体として組み込まれる。本出願の開示及び参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示間に任意の不一致が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、明確な理解のために挙げられているにすぎない。そこから不要な限定を理解すべきでない。本開示は、示され、記載される厳密な詳細に限定されず、それは当業者に明らかな変動が特許請求の範囲により定義される本開示内に含まれるためである。
【０１５６】
特に示されない限り、構成成分の量、分子量、並びに本明細書及び特許請求の範囲において使用される上記のものを表現する全ての数字は、全ての例において用語「約」により修飾されるものとして理解すべきである。したがって、特に逆の記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本開示により得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、及び特許請求の範囲と均等物の公開主義を限定する試みとしてでなく、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の数字に照らして、及び通常の四捨五入技術を適用することにより解釈すべきである。
【０１５７】
広い範囲の開示を記載する数値範囲及びパラメータが近似値であることにもかかわらず、具体例に記載の数値は、可能な限り厳密に報告される。しかしながら、全ての数値は本質的に、それらのそれぞれの試験計測値に見出される標準偏差から必然的に生じるある範囲を含有する。
【０１５８】
全ての見出しは読者の便宜のためであり、規定のない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用すべきでない。
【図１】
2020536490.tif 000005
【図２−１】
2020536490.tif 000006
【図２−２】
2020536490.tif 000007
【図２−３】
2020536490.tif 000008
【図２−４】
2020536490.tif 000009
【図３Ａ−Ｂ】
2020536490.tif 000010
【図３Ｃ】
2020536490.tif 000011
【図３Ｄ】
2020536490.tif 000012
【図４Ａ】
2020536490.tif 000013
【図４Ｂ−Ｃ】
2020536490.tif 000014
【図４Ｄ】
2020536490.tif 000015
【図４Ｅ−１】
2020536490.tif 000016
【図４Ｅ−２】
2020536490.tif 000017
【図５Ａ】
2020536490.tif 000018
【図５Ｂ】
2020536490.tif 000019
【図５Ｃ】
2020536490.tif 000020
【図６Ａ】
2020536490.tif 000021
【図６Ｂ】
2020536490.tif 000022
【図６Ｃ】
2020536490.tif 000023
【図６Ｄ】
2020536490.tif 000024
【図６Ｅ】
2020536490.tif 000025
【図６Ｆ】
2020536490.tif 000026
【図７ＡＢ】
2020536490.tif 000027
【図７Ｃ】
2020536490.tif 000028
【図８】
2020536490.tif 000029
【図９】
2020536490.tif 000030
【図１０】
2020536490.tif 000031
【図１１Ａ−Ｂ】
2020536490.tif 000032
【図１１Ｃ】
2020536490.tif 000033
【図１２】
2020536490.tif 000034
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2020536490000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月19日(2020.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
【請求項２】
コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項５】
真核細胞である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、請求項５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項７】
原核細胞である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項９】
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１０】
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、請求項９に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞を含む組成物。
【請求項１２】
単離成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
【請求項１３】
前記タンパク質が、精製されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項１２又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１２又は１４の組成物。
【請求項１８】
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすること
を含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有し、前記細胞は、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質を単離することをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質を精製することをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、真核細胞である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、原核細胞である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記原核細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物であって、
前記組成物が、ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で接触させられることを特徴とし、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を、前記組成物と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して低減させる、組成物。
【請求項３１】
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させるための、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物であって、
前記組成物が、ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と接触させられることを特徴とし、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の前記沈着を、前記組成物と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して増加させる、組成物。
【請求項３２】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項３０又は３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の複製に好適な条件で存在する、請求項３０又は３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が、単離Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質である、請求項３０又は３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を含み、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する前記遺伝子改変細胞に曝露されることを特徴とする、請求項３１又は３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記組成物と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、請求項３１又は３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、対象中に存在する、請求項３１又は３２に記載の組成物。
【請求項３９】
血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有するか、又は有するリスクがある対象における感染を治療するための、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項４０】
血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有するか、又は有するリスクがある対象における症状を治療するための、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項４１】
血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しているか、又は定着しているリスクがある対象における定着を減少させるための、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項４２】
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記対象が、ヒトである、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項４６】
医薬品としての使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項４７】
病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項４８】
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用。
【請求項４９】
血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項５０】
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療のための、本願明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
組成物も本明細書に提供される。一実施形態において、組成物は、遺伝子改変細胞を含む。一実施形態において、組成物は、単離、場合により、精製成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む。一実施形態において、組成物は、単離ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含む。成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
一実施形態において、方法は、対象における感染を治療する方法であり、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態において、方法は、対象における症状を治療する方法であり、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態において、方法は、対象における定着を減少させる方法であり、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与することを含む。タンパク質は、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である。一実施形態において、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、対象は、ヒトである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用；血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物；及び本明細書に記載の１つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法がさらに提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１】肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）血清３型莢膜多糖の反復単位構造を示す。
【図２−１】パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）からの７つのグリコシドヒドロラーゼのアミノ酸アラインメントを示す。ＷＰ＿０７９９１５０２７．１（配列番号２）、ＷＰ＿１１３０１８９０８．１（配列番号４）、ＷＰ＿０６８６６３７３３．１（配列番号５）、ＫＲＥ８２４７６．１（配列番号６）、ＷＰ＿０８２５９３７７６．１（配列番号７）、ＷＰ＿０５６６１７３６７．１（配列番号８）、及びＷＰ＿０２８５５３２２２．１（配列番号９）。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図３Ａ−Ｂ】炭素源としてのＰｎ３Ｐを有する最小培地中のパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２の培養物を示す。（図３Ａ）炭素源としての２％（ｗ／ｖ）のグルコース、Ｐｎ３Ｐ、セルロースと、又は炭素源無使用の最小培地上のパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２（Ｐｂａｃ）の増殖。（図３Ｂ）グルコース（レーン１）又はＰｎ３Ｐ（レーン２）上で増殖させたＰｂａｃの濃縮培養物上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル。（図３Ｃ）Ｒａｐｉｄ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ（Ａｚｉｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９，７５）（ＲＡＳＴ）アノテーションに基づくＰｎ３Ｐ利用組織化の提案される遺伝子座。（図３Ｄ）グルコース培養物に対するＰｎ３Ｐ培養物の発現の変化倍率として示される２％のグルコース又はＰｎ３Ｐ上で増殖させたＰｂａｃ中の推定遺伝子座内の選択遺伝子のリアルタイムＰＣＲ。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図４Ａ】Ｐｎ３Ｐアーゼ同定及び一次アミノ酸配列のドメイン模式図を示す。（図４Ａ）アミノ酸配列（配列番号２）及びＰｎ３Ｐアーゼのアクセッション。（図４Ｂ）それぞれの１ｍｌ分画における毎分カウント数により計測された、サイズ排除クロマトグラフィーによる組換えＰｎ３Ｐアーゼにより脱重合されたトリチウム放射性同位体標識Ｐｎ３Ｐの分離。（図４Ｃ）Ｐｎ３Ｐモノクローナル抗体によりプロービングされた組換えＰｎ３Ｐアーゼにより脱重合された低温Ｐｎ３Ｐのドットブロット。（図４Ｄ）ＩｎｔｅｒＰｒｏによるＰｎ３Ｐアーゼの予測ドメインの模式図。（図４Ｅ）Ｐｎ３Ｐアーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図４Ｂ−Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ−１】同上。
【図４Ｅ−２】同上。
【図５Ａ】エレクトロスプレーイオン化質量分析によるオリゴ糖産物の同定を示す。オリゴ糖産物（図５Ａ）の分離並びに四糖（図５Ｂ）及び六糖（図５Ｃ）の質量スペクトル。実験的分子量及び精度を表１に示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６Ａ】オリゴ糖産物の核磁気共鳴による特徴付けを示す。Ｐｎ３四糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ａ）、２Ｄ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトル（Ｂ）、及び２Ｄ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトル（Ｃ）。Ｐｎ３六糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ）、２Ｄ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトル（Ｅ）、及び２Ｄ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトル（Ｆ）。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６Ｅ】同上。
【図６Ｆ】同上。
【図７ＡＢ】Ｐｎ３Ｐアーゼの活性評価を示す。（図７Ａ）それぞれの１ｍｌ分画における毎分カウント数により計測された、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離された組換えＰｎ３Ｐアーゼにより脱重合されたトリチウム放射性同位体標識Ｐｎ３Ｐのタイムコースアッセイ。（図７Ｂ）生成されたグルクロン酸還元末端の濃度（μｇ／ｍｌ）により計測された、３つの異なる緩衝液条件における組換えＰｎ３Ｐアーゼの最適化。（Ｃ）生成されたグルクロン酸還元末端の濃度（μｇ／ｍｌ）により計測された、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋反応サプリメントを用いた金属依存性の決定。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ｃ】同上。
【図８】生存増殖３型肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＷＵ２株のＰｎ３Ｐアーゼ処理を示す。（図８Ａ）６００ｎｍにおけるＯＤに従う１００ｕｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下のＴＨＹブロス中のＷＵ２の増殖曲線。（図８Ｂ〜８Ｃ）無莢膜ＷＵ２、又はＰｎ３Ｐアーゼ処理ＷＵ２を使用してＰｎ３ＰコートＥＬＩＳＡプレートへのＰｎ３Ｐ特異的抗体結合について競合させた競合ＥＬＩＳＡ。データは、抗体結合の阻害パーセントとして提示する。（図８Ｄ）ＷＵ２（左上）、無莢膜誘導体（右上）、及び代表的なＰｎ３Ｐアーゼ処理ＷＵ２（下段パネル）の透過型電子顕微鏡観察。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】３型Ｓｐｎの生存能に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を示す。（図９Ａ）６００ｎｍにおけるＯＤに従う１００μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下のＴＨＹブロス中のＷＵ２の増殖曲線。（図９Ｂ）１００μｇ／ｍｌの活性又は熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼの存在下のＰＢＳ中のＷＵ２生存率。
【図１０】Ｐｎ３Ｐアーゼ処理による生存３型Ｓｐｎ上の莢膜の枯渇を示す。（図１０Ａ〜Ｂ）無莢膜ＷＵ２、２つの異なる濃度（２μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ）における熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼにより処理されたＷＵ２、又はＰｎ３Ｐアーゼにより処理されたＷＵ２を使用してＰｎ３ＰコートＥＬＩＳＡプレートへのＰｎ３Ｐ特異的抗体結合を競合させた競合ＥＬＩＳＡ。データは、抗体結合の阻害パーセントとして提示する。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を用いて決定した。２μｇ／ｍｌの熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼにより処理されたＷＵ２モック（図１０Ｃ）、無莢膜ＷＵ２株（図１０Ｄ）及び２μｇ／ｍｌの活性Ｐｎ３Ｐアーゼ処理ＷＵ２（Ｅ）の透過型電子顕微鏡画像。下段パネルは、１５０００倍の直接倍率において画像化し、上段パネルは、１００００倍の直接倍率において画像化する（Ｃ〜Ｅ）。
【図１１Ａ−Ｂ】Ｐｎ３Ｐアーゼ処理された３型Ｓｐｎのマクロファージ取り込みを示す。（図１１Ａ）熱不活化（左）又は活性（右）Ｐｎ３Ｐアーゼ活性後の蛍光連鎖球菌を含有するＲＡＷ２６４．７マクロファージ。連鎖球菌、ＣＦＳＥ、緑色。マクロファージ、ビオチン化−ＷＧＡ、ストレプトアビジン−ＡＰＣ、赤色。（図１１Ｂ）フローサイトメトリーにより定量されたＣＦＳＥ標識Ｓｐｎのマクロファージ取り込みに対するＰｎ３Ｐアーゼ処理及び補体の影響。（図１１Ｃ）蛍光食細胞のパーセントに対するＰｎ３Ｐアーゼ用量依存的効果。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定＊＊を用いて決定した、＊Ｐ＜０．００１。
【図１１Ｃ】同上。
【図１２】Ｓｐｎ表面上の補体沈着に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を示す。フローサイトメトリーによるＰｎ３Ｐアーゼ処理又は非処理３型Ｓｐｎ上のマウス補体沈着の分析。ＦＩＴＣ−Ａの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量を、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞のゲーティングから計算した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない。
【図１３】好中球による補体媒介殺傷に対するＰｎ３Ｐアーゼ処理の効果を示す。Ｐｎ３Ｐアーゼ処理Ｓｐｎに対する分化ＨＬ−６０細胞の補体媒介殺傷能。生存パーセントは、対照試料（ＨＬ６０細胞を用いない反応物、１００％の生存率）について得られた平均値に正規化されたそれぞれの２つ組の反応物として計算した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない。
【図１４】３型Ｓｐｎによる鼻腔内定着を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻咽頭中のＳｐｎ定着を低減させるＰｎ３Ｐアーゼ処理の能力。（図１４Ａ）マウスの群に、１０μｌのＰＢＳ中の１０６個の対数増殖期細菌を鼻腔内接種した。全ての接種材料に、５０μｇのＰｎ３Ｐアーゼ又は緩衝液対照（１０μｌ）のいずれかを追加した。０日目（ＷＵ２＋Ｐｎ３Ｐアーゼ＊１）、０及び３日目（ＷＵ２＋Ｐｎ３Ｐアーゼ＊２）、又は０、３、及び７日目（ＷＵ２＋Ｐｎ３Ｐアーゼ＊３）のいずれかにおいて、群に酵素を投与した。細菌負荷を１０日目に定量した。鼻腔洗浄液の連続希釈物を２つ組でプレーティングしてＣＦＵ値を決定した。（図１４Ｂ）鼻腔洗浄液中のＩＬ−６及び（図１４Ｃ）ＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１５】Ｐｎ３Ｐアーゼの保護能を示す。致死チャレンジからＢＡＬＢ／ｃマウスを保護するＰｎ３Ｐアーゼの能力の評価。マウスの群を５×１０３個の対数増殖期のビルレントな３型Ｓｐｎの腹腔内投与により感染させた。不活化群は、熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼである。＊感染の０、１２、又は２４時間後において投与された５μｇ又は０．５μｇの単一用量の効果が示される、１群当たりｎ＝５匹のマウス。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
組成物としては、無菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液及び無菌液剤若しくは分散液の即時調製用の無菌粉末を挙げることができる。非経口投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。組成物は典型的には無菌であり、注射的使用に好適な場合、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度で流体であるべきである。これは製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に抗して保存すべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の長期間吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより生じさせることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
一実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐ分子を開裂させる方法である。一実施形態において、方法は、Ｐｎ３Ｐ分子をＰｎ３Ｐアーゼタンパク質に曝露させることを含む。Ｐｎ３Ｐ分子は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物の一部であり得、例えば、Ｐｎ３Ｐ分子は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖であり得、又はＰｎ３Ｐ分子は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物から分離することができ、例えば、Ｐｎ３Ｐ分子は、単離することができる。一実施形態において、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物は、血清３型である。一実施形態において、Ｐｎ３Ｐ分子は、インビボで存在し、別の実施形態において、Ｐｎ３Ｐ分子は、インビトロで存在する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
説明的態様
態様１．成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
態様２．コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
態様３．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様１又は２の遺伝子改変細胞。
態様４．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１〜３のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様５．真核細胞である、態様１〜４のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様６．哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、態様１〜５のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様７．原核細胞である、態様１〜６のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、態様１〜７のいずれか１つの遺伝子改変細胞。態様９．前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、態様１〜８のいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様１０．前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、態様１〜９にいずれか１つの遺伝子改変細胞。
態様１１．態様１〜１０のいずれか１つの遺伝子改変細胞を含む組成物。
態様１２．単離成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
態様１３．前記タンパク質が、精製されている、態様１〜１２のいずれか１つの組成物。態様１４．単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
態様１５．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様１２〜１４のいずれか１つの組成物。
態様１６．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１２〜１５のいずれか１つの組成物。
態様１７．薬学的に許容可能な担体を含む、態様１１〜１６のいずれか１つの組成物。
態様１８．Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有し、前記細胞は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する方法。
態様１９．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様１８の方法。
態様２０．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１８〜１９のいずれか１つの方法。
態様２１．前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、態様１８〜２０のいずれか１つの方法。
態様２２．前記タンパク質を単離することをさらに含む、態様１８〜２１のいずれか１つの方法。
態様２３．前記タンパク質を精製することをさらに含む、態様１８〜２１のいずれか１つの方法。
態様２４．前記細胞が、真核細胞である、態様１８〜２１のいずれか１つの方法。
態様２５．前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、態様１８〜２４のいずれか１つの方法。
態様２６．前記細胞が、原核細胞である、態様１８〜２５のいずれか１つに記載の方法。態様２７．前記原核細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、態様１８〜２６のいずれか１つの方法。
態様２８．前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、態様１８〜２７のいずれか１つの方法。
態様２９．前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、態様１８〜２８のいずれか１つの方法。
態様３０．ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含む方法であって、前記接触を、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して低減させる方法。
態様３１．肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法であって、
ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含み、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の前記沈着を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して増加させる方法。
態様３２．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様３０又は３１の方法。
態様３３．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３０〜３２のいずれか１つの方法。
態様３４．前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の複製に好適な条件で存在する、態様３０〜３３のいずれか１つの方法。態様３５．前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が、単離Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質である、態様３０〜３４のいずれか１つの方法。
態様３６．前記接触が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む、態様３０〜３５のいずれか１つの方法。
態様３７．前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、態様３０〜３６のいずれか１つに記載の方法。
態様３８．前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、対象中に存在する、態様３０〜３７のいずれか１つの方法。
態様３９．対象における感染を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様４０．対象における症状を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様４１．対象における定着を減少させる方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様４２．前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、態様３９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
態様４３．前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３９〜４２のいずれか１つの方法。
態様４４．前記対象が、ヒトである、態様３９〜４３のいずれか１つの方法。
態様４５．治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
態様４６．医薬品における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
態様４７．病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
態様４８．肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用。
態様４９．血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
態様５０．本明細書に記載の１つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
ｐＨ６．０、７．２、及び８．０における３つの異なる緩衝液中で２時間の反応を実施し、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）法（４３）により還元末端グルクロン酸の濃度を検出してＰｎ３Ｐアーゼに最適な反応条件を決定した。Ｐｎ３Ｐアーゼは、ｐＨ６．０のＭＥＳ緩衝液よりもｐＨ７．２におけるリン酸ナトリウム緩衝液中でわずかに良好な活性を示すが、ｐＨ８．０におけるトリス緩衝液中で有意に悪化した活性を呈する（図７Ｂ）。Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を用いて金属イオン依存性にフォーカスするさらなる最適化を実施した。Ｐｎ３Ｐアーゼは、それが１０ｍＭのＣａ２＋の存在下でより高濃度の還元末端ＧｌｃＡを産生するため、Ｃａ２＋についての濃度依存的優先性を示す（図７Ｃ）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
培養物上清のプロテオミクス
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２を、上記の２％（ｗ／ｖ）の炭素源を含有する５ｍｌの最小培地Ｍ９中で培養した。細菌培養物を対数増殖中期（ＯＤ６００ｎｍ  ０．６）において回収した。培養物上清を０．４５μｍのシリンジフィルターに通し、１０Ｋの分子量カットオフを有するｍｉｃｒｏｓｅｐ  ａｄｖａｎｃｅ遠心分離装置（Ｐａｌｌ）を使用して１／２０の培養物容量に濃縮した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより決定した。溶液中トリプシン消化を既に記載のとおり実施した（３９）。簡潔に述べると、培養物上清タンパク質からの２０μｇのタンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴとのインキュベーションにより５６℃において１時間還元し、次いで５５ｍＭのヨードアセトアミドによりカルボキシアミドメチル化を暗所で室温において４５分間行い、次いで４０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の１μｇのシーケンシンググレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により３７℃において一晩消化した。トリプシン消化は、１％のトリフルオロ酢酸の添加及び３０分間の氷上のインキュベーションにより停止させた。Ｃ１８スピンカラム（Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して得られたペプチドをクリーンアップし、乾燥させ、０．１％のギ酸中で再構成させた。２００ｎＬ／分の流速における１３０分間にわたる１〜１００％の溶媒Ｂ（８０％のアセトニトリル、０．１％のギ酸）からなる１８０分間の線形勾配を使用して１５ｃｍ  Ａｃｃｌａｉｍ（商標）ＰｅｐＭａｐ（商標）ＲＳＬＣ  Ｃ１８カラム（２μｍの粒子サイズ、７５μｍ  ＩＤ）上でＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００システムを使用してペプチドを分離した。分離したペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のナノスプレーイオン源中に直接溶出させた。ステンレス鋼エミッタースプレー電圧を２２００Ｖに設定し、イオン移動管の温度を２８０℃に設定した。完全なＭＳスキャンは、６０，０００の分解能におけるｍ／ｚ２００から２０００までのＯｒｂｉｔｒａｐ検出を使用して取得し、衝突誘導解離（３８％の衝突エネルギー）による断片化後のＭＳ２スキャンは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｅｔｕｐ３．０を使用して「トップスピード」モードにおける最も強力なイオンについてのイオントラップで取得した。未加工スペクトルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてＳＥＱＵＥＳＴを使用してパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３２３５２についてのＲａｐｉｄ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ（４０）（ＲＡＳＴ）アノテートゲノムデータベースに対して検索し、完全なＭＳペプチドトレランスは１０ｐｐｍであり、ＭＳ２ペプチドトレランスは０．３Ｄａであった。＋５７．０２１Ｄａの一定改変（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（システイン残基のカルバミドメチル化）、及び＋１５．９９５Ｄａの動的改変（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（メチオニン残基の酸化）を検索パラメータにお��て可能とした。結果をペプチドアサインメントについて１％の偽発見率においてフィルタリングした。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰｎ３Ｐアーゼ処理
ＴＳＡＢプレート上の新鮮肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３型（ＷＵ２）及び無莢膜誘導体（ＪＤ９０８）コロニーを、ＴＨＹブロス中で０．１のＯＤまで接種し、上記のとおり培養した。１００μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼの存在下でのＷＵ２増殖を、ＯＤ６００ｎｍの計測により１０時間の経過にわたりモニタリングした。２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、又は１０μｇ／ｍｌの熱不活化Ｐｎ３Ｐアーゼの存在下で増殖させたＷＵ２を無莢膜菌とともに６時間増殖させ、段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定した。培養物を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド中で氷上で２０分間固定し、さらに１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。タイムコース実験のため、ＷＵ２及び無莢膜株を対数増殖中期（０．６のＯＤ６００ｎｍ）まで増殖させ、遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。１μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐアーゼを添加し、３７℃において１、２、又は４時間インキュベートした。処理した細胞を段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定し、２％のパラホルムアルデヒド中で氷上で２０分間固定し、さらに１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の５μｇ／ｍｌのＰｎ３Ｐにより室温において一晩コーティングした。Ｂｉｏｔｅｋ４０５／ＬＳマイクロプレートワッシャーを使用してプレートをＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）２０により４回洗浄した。ＰＢＳ中の１％のＢＳＡにより室温において１時間ブロッキングした後、マイクロプレートウェルを、ＰＢＳ−Ｔ中のＰｎ３Ｐ特異的抗血清と３０分間プレインキュベートした固定処理細胞と室温において２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ中のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１０３０−０４）の１：２０００の希釈物と室温において２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを１Ｍのトリス  ０．３ｍＭのＭｇＣｌ２の中の２ｍｇ／ｍｌのホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０９４２）と３７℃において約３０分間インキュベートした。４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレートリーダー上で計測した。抗体結合の阻害パーセントを（（非阻害ＯＤ４０５−阻害ＯＤ４０５）／非阻害ＯＤ４０５）×１００により計算した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
電子顕微鏡観察
電子顕微鏡観察を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＧｅｏｒｇｉａのＧｅｏｒｇｉａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙコア施設により、Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．による修正方法に従って実施した（６２）。処理細胞を、ＰＢＳ緩衝液中の２％のグルタルアルデヒド、２％のパラホルムアルデヒド、０．０７５Ｍの酢酸リジン及び０．０７５％のルテニウムレッド中で氷上で１時間固定し、次いで０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液により２回リンスし、１回のリンスにつき１５分間であった。次いで、０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液中の１％の四酸化オスミウム中で細胞を室温において１時間固定し、次いで０．１５％のルテニウムレッドを含有する緩衝液中で２回リンスし、１回のリンスにつき１５分間であった。ペレットをグレードエタノール系列（３０％、５０％、７５％、９５％、１００％及び１００％）中で脱水し、１００％のアセトン中で２回交換し、それぞれのステップは１５分間であった。次いで、ペレットに２５％のスパー樹脂及び７５％のアセトンを浸潤させ、２時間後に５０％のスパー樹脂及び５０％のアセトン、７５％のスパー樹脂及び２５％のアセトン、１００％のスパー樹脂を連続的に浸潤させ、次いで７０℃のオーブン中で２４時間重合させた。試料をＤｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフにより６０ｎｍにおいて切片化し、スロットグリッド上にピックアップした。グリッドを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛の液滴上で後染めし（それぞれ５分間）、染色の間にＨ２Ｏにより３０秒間リンスした。ＪＥＯＬ  ＪＥＭ１０１１ＴＥＭ（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）を８０ｋＶにおける操作で使用して試料を顕微鏡観察した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
全ての見出しは読者の便宜のためであり、規定のない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用すべきでない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
（項目２）
コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
（項目３）
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
（項目４）
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３に記載の遺伝子改変細胞。
（項目５）
真核細胞である、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
（項目６）
哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、項目５に記載の遺伝子改変細胞。
（項目７）
原核細胞である、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
（項目８）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、項目７に記載の遺伝子改変細胞。
（項目９）
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
（項目１０）
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、項目９に記載の遺伝子改変細胞。
（項目１１）
項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞を含む組成物。
（項目１２）
単離成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
（項目１３）
前記タンパク質が、精製されている、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する組成物。
（項目１５）
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、項目１２又は１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
薬学的に許容可能な担体を含む、項目１２又は１４の組成物。
（項目１８）
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすること
を含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有し、前記細胞は、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する方法。
（項目１９）
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記タンパク質を単離することをさらに含む、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記タンパク質を精製することをさらに含む、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞が、真核細胞である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が、原核細胞である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記原核細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させること
を含む方法であって、前記接触を、ＩＩＩ型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上のＩＩＩ型莢膜多糖の量を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して低減させる方法。
（項目３１）
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の沈着を増加させる方法であって、
ＩＩＩ型莢膜多糖を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を含む成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させることを含み、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面上の少なくとも１つの補体構成成分の前記沈着を、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較して増加させる方法。
（項目３２）
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、項目３０又は３１に記載の方法。
（項目３３）
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の複製に好適な条件で存在する、項目３０又は３１に記載の方法。
（項目３５）
前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質が、単離Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質である、項目３０又は３１に記載の方法。
（項目３６）
前記接触が、前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、前記成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む、項目３１又は３２に記載の方法。
（項目３７）
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、前記Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、項目３１又は３２に記載の方法。
（項目３８）
前記肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、対象中に存在する、項目３１又は３２に記載の方法。
（項目３９）
対象における感染を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
（項目４０）
対象における症状を治療する方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
（項目４１）
対象における定着を減少させる方法であって、
Ｐｎ３Ｐアーゼ活性を有する成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
（項目４２）
前記タンパク質が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号２の残基２〜６４のいずれか１つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２の残基１５４５である、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４１〜１５４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が、ヒトである、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
（項目４６）
医薬品としての使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
（項目４７）
病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質。
（項目４８）
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質の使用。
（項目４９）
血清３型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Ｐｎ３Ｐアーゼタンパク質を含む組成物。
（項目５０）
本明細書に記載の１つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法。
【国際調査報告】
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