(57)【要約】  ＣＤ３結合及びＣＤ３３結合部分を含む有利な二重特異性結合分子が提供される。ＣＤ３結合部分は、Ｃ１ｑ及びＦｃガンマ受容体に対する結合の低減を有するＦｃ領域における変異を有する抗体を含む。二重特異性結合分子は、癌の治療において使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子であって、
配列番号３６又は配列番号３８を含むＣＤ３３結合ポリペプチドであって、これが、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合し、その抗体が、番号付けがＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なるＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含むＣＤ３３結合ポリペプチドを含む、二重特異性結合分子。
【請求項２】
ｉ．２６５位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｉｉ．２９７位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ
ｉｉｉ．３２９位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）である、請求項１に記載の二重特異性結合分子。
【請求項３】
前記ＣＤ３３結合ポリペプチドが、配列番号３８を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性結合分子。
【請求項４】
前記ＣＤ３３結合ポリペプチドが、好ましくは配列番号４０を含むペプチドリンカーを介して前記抗体の前記軽鎖のＣ末端に共有結合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項５】
前記抗体の前記Ｆｃ領域が、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のＮ及び３２９位のＰが、他のアミノ酸により置き換えられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項６】
配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、及び配列番号２４又は配列番号２２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１４又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項８】
配列番号１４及び配列番号２４を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項９】
配列番号１４及び配列番号２２を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項１０】
以下の特性：
（ａ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、好ましくはＦｃγＲＩに対する結合の低減；
（ｂ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、同様の親和性を有するヒトＦｃＲｎに対する結合；
（ｃ）次の二重特異性ＣＤ３／３３  ＦｙｎｏｍＡｂ：ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６５；軽鎖配列番号１６）；ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号６７）；ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６９；軽鎖配列番号１６）；ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号７１；軽鎖配列番号１６）；及びｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号７５；軽鎖配列番号１６）のいずれかと比較して、インビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおけるより良好な生物活性（より低いＥＣ５０値として測定される）；
（ｄ）ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号７３）より良好な温度安定性；
（ｅ）マウスにおける静脈内注射後１０日を超える終末半減期；及び
（ｆ）ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性結合分子ＣＯＶＡ４６３（配列番号７７）の等モル用量の同じ経路を介する１日１回の投与と比較して、３日当たり１回の静脈内注射を介する投与後のインビボマウスモデルにおける向上した抗腫瘍活性のうちの１つ以上を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子をコードする１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド又は請求項１２に記載の１つ以上のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
必要とする患者に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、請求項１２に記載の１つ以上のベクター、又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項１６】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組換え体二重特異性結合分子を作製するための方法であって、宿主細胞中で請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチドを発現させること及び前記組換え体ポリペプチドを回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で提供される開示は、ＦｃＲｎ結合は保持されるが、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑに特異的に結合する能力が失われるように変異したヒト抗体ＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ領域）を含むＣＤ３結合抗体部分を含む、ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞上のＣＤ３及び表面抗原の両方を認識する二重特異性結合分子は、当該技術分野で知られる。これらは通常、Ｔ細胞受容体特異性、同時刺激又はペプチド抗原提示とは独立して、任意の種類の細胞傷害性Ｔ細胞を癌細胞に結合させることが可能である。このような分子のいくつかの形式が記載されており、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーに関する）は、現在までクリニックにおいて最大の成功を示してきた。この形式は、ペプチドリンカーにより共有結合された２つの一本鎖抗体に基づいて、二重特異性ｓｃＦｖ抗体断片形式をもたらす。国際公開第２０１４／１７００６３号パンフレットは、このようなＢｉＴＥ形式を超える利点を有するＦｙｎｏｍＡｂ形式を記載している。
【０００３】
ＣＤ３３又はＳｉｇｌｅｃ−３は、骨髄系列の細胞上に発現される膜貫通受容体である。ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病の治療標的として使用され得る。ヒトＣＤ３３は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７６３．３）により表され、当該技術分野において記載されている。
【０００４】
国際公開第２０１４／１７００６３号パンフレットは、ＣＤ３３に結合するフィノマー部分とＣＤ３に結合する抗体部分を有するＦｙｎｏｍＡｂを開示する（例えば、その中でＣＯＶＡ４６７は好ましいＣＤ３及びＣＤ３３結合分子である）。
【０００５】
ＣＯＶＡ４６７におけるＣＤ３抗体部分は、ＩｇＧ１のＦｃ領域中のいわゆる「ＬＡＬＡ」変異（「Ａｌａ−Ａｌａ」、又は「ＬＡＬＡ」とも呼ばれるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合のようなＥＵインデックスに従う）を含む。これらの変異は、Ｃ１ｑ及びＦｃγＲ結合を低減し、結果としてエフェクター機能を低減した。
【０００６】
しかしながら、ＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１は、依然として残留性のＦｃＲ結合活性を有し、不完全なサイレンシングを有すると思われる。したがって、ＣＯＶＡ４６７分子は、望ましくないＦｃＲ依存性Ｔ細胞活性化のリスクを有し得る。
【０００７】
ＩｇＧ１分子のエフェクター機能を低減する他の変異が当該技術分野において記載されているが、これらの大部分もまた、ＦｃγＲ結合及びＣ１ｑ結合を完全には抑制しない。加えて、ＩｇＧ１のＦｃγドメインはまた、新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎと相互作用し、この相互作用は、抗体の長い半減期にとって重要である。したがって、ＩｇＧ１のＦｃγドメインにおける変異は、予測不可能な様式において抗体の薬物動態特性に潜在的に負の影響を与える可能性がある。実際に、マウスにおけるより速いクリアランスが、Ｆｃγドメイン中の変異の組合せを有する大部分の抗体に関して国際公開第２０１４／１０８４８３号パンフレットにおいて報告された。
【０００８】
したがって、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合親和性を有しないか又は最小限に有するが長い半減期を保持する、新たに設計されたＦｃγ配列が必要とされている。
【０００９】
特に、ＣＤ３及びＣＤ３３に結合できる改善された二重特異性結合分子が必要とされている。好ましくは、このような分子は、ＦｃＲ依存性Ｔ細胞活性化のリスクを低減する一方で、良好な薬物動態プロファイルを保持する。ＣＤ３３に対する改善された親和性を有するこのような分子を提供することもまた好ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書では、Ｆｃ領域を含むものなど、抗体又は抗体様治療薬の設計に有用な改変免疫グロブリン定常ドメインを含む組成物が提供される。また、提供される改変定常ドメインをコードできる関連するポリヌクレオチド、提供される改変定常ドメインを発現する細胞、及び関連するベクターが記載される。加えて、提供される改変定常ドメインを使用する方法が記載される。
【００１１】
記載される組成物は、ＦｃγＲ結合能の減少を呈するがＦｃＲｎ結合が保たれるＩｇＧ１  Ｆｃ変異体である。これらのＩｇＧ  Ｆｃ変異体は、可溶性又は細胞表面抗原を標的化する治療薬を可能にする一方で、免疫エフェクター細胞のＦｃ関連結合及び補体媒介性細胞障害を最小化する。一態様では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．の場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられるＣＨ２ドメインを含む。
【００１２】
一実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子の２６５位のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）で置き換えられ、２９７位のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）で置き換えられ、且つ３２９位のアミノ酸は、アラニン、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）で置き換えられる。
【００１３】
特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体組成物は、適応症において使用され、治療抗体（又はＦｃ融合体）の半減期の維持は、ＦｃＲｎとの相互作用により保たれるが、免疫細胞と関連するＣ１ｑ及びＦｃγＲの結合及び／又は活性化並びにｉ）抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、ｉｉ）補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、ｉｉｉ）抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、ｉｖ）ＦｃγＲ媒介性細胞活性化、ｖ）ＦｃγＲ媒介性血小板活性化／枯渇、及び／又はｖｉ）結合標的のＦｃγＲ媒介性架橋などのエフェクター機能に由来する望ましくない作用が、最小化又は排除される。
【００１４】
一態様では、ＩｇＧ１  Ｆｃ変異は、治療抗体又は多価結合剤、癌に関与する細胞上の標的化リガンド、及びＴ細胞などの結合剤のＦｃ融合体に組み込まれる。
【００１５】
特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体は、医薬組成物中に含まれる。特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体は、薬学的に活性な分子の一部である。ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体又は活性ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体を含む分子を含む医薬組成物は、疾患又は障害、例えば、癌の治療に有用である。
【００１６】
本明細書ではまた、野生型Ｆｃドメインを有するＦｃ含有分子と比較してＣ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対して親和性が低減した組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子であって、残基の番号付けがＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌの場合のようなＥＵインデックスにより示されるとおりであるアミノ酸２６５位、２９７位、及び３２９位で変異を含む組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子が提供される。
【００１７】
本明細書ではさらに、（ａ）少なくとも１つの標的分子に結合できる１つ以上の結合ドメイン；及び（ｂ）アミノ酸２６５位、２９７位、及び３２９位で変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む組換え体ポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、補体依存性溶解、標的分子の細胞媒介性破壊、及び／又は結合標的のＦｃγＲ媒介性架橋などの重大なＦｃγ媒介性作用を誘発することなく標的分子に結合できる。
【００１８】
特に、配列番号３６又は配列番号３８を含むＣＤ３３結合ポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子が提供され、これは、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合し、その抗体は、番号付けがＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なるＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、（ｉ）２６５位のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、（ｉｉ）２９７位のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ（ｉｉｉ）３２９位のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）で置き換えられる。特定の実施形態では、２６５位のアミノ酸はアラニン（Ａ）であり、２９７位のアミノ酸はアラニン（Ａ）であり、且つ３２９位のアミノ酸はアラニン（Ａ）である。
【００２０】
好ましい実施形態では、ＣＤ３３結合ポリペプチドは、配列番号３８を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、ＣＤ３３結合ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合される。特定の好ましい実施形態では、前記リンカーは、配列番号４０を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、抗体のＦｃ領域は、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のＮ及び３２９位のＰは、他のアミノ酸により置き換えられる。
【００２３】
特定の実施形態では、ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子は、配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、及び配列番号２４又は配列番号２２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１４又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２５】
特定の好ましい実施形態では、二重特異性結合分子は、配列番号１４及び配列番号２４を含む。他の好ましい実施形態では、二重特異性結合分子は、配列番号１４及び配列番号２２を含む。
【００２６】
二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も提供される。
【００２７】
前述の請求項のいずれか１つの二重特異性結合分子をコードする１つ以上の組換え体ポリヌクレオチドも提供される。前記１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターも提供される。１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のベクターを含む宿主細胞がさらに提供される。
【００２８】
組換え体二重特異性結合分子を作製するための方法であって、宿主細胞中で１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド又は１つ以上のベクターを発現すること及び組換え体ポリペプチドを回収することを含む方法がさらに提供される。
【００２９】
癌を治療する方法であって、必要とする患者に本発明の二重特異性結合分子、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド、本発明の１つ以上のベクター、又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法も提供される。癌を治療する際の使用のための、本発明の二重特異性結合分子も提供される。癌の治療のための医薬品の製造における本発明の二重特異性結合分子の使用も提供される。特定の実施形態では、癌は、ＣＤ３３を発現する癌、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、又は多発性骨髄腫である。特定の実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、固形腫瘍からＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ；固形腫瘍を浸潤させ、且つ抗腫瘍免疫応答を抑制する細胞型）を枯渇させるために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ｍＡｂ１  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。
【図２】ＣＤ３＋ジャーカット細胞に対する変異Ｆｃを有する抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ１変異体の結合。
【図３−１】図３：Ａ）ＣＤ６９表面染色によって決定された変異Ｆｃγ１を有するｍＡｂ１変異体によるヒトＰＢＭＣにおけるリンパ球活性化の誘導。点線は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを含有する陽性対照ウェルにおいて得られたＣＤ６９陽性細胞のパーセンテージを表す。Ｂ）ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡによって決定された変異Ｆｃγ１を有するｍＡｂ１変異体によるヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン放出の誘導。点線は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを含有する陽性対照ウェルにおいて得られたＩＦＮγのレベルを表す。
【図３−２】（上記のとおり。）
【図４−１】図４：Ａ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイの略図。Ｂ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対するＦｃ変異ｍＡｂ１変異体の結合。Ｃ、Ｄ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ヒトＦｃγＲＩ（Ｃ）及びヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｄ）に対するＦｃ変異ｍＡｂ１変異体の結合。
【図４−２】（上記のとおり。）
【図４−３】（上記のとおり。）
【図４−４】（上記のとおり。）
【図５】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対するＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１形式における各種抗体の結合。
【図６】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩに対するＤ２６５位、Ｎ２９７位及びＰ３２９位で各種置換を有するｍＡｂ１の結合。
【図７】表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ヒトＣ１ｑに対するｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の結合。
【図８】表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対するｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の結合。
【図９】それぞれ１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１又はｍＡｂ１  ＩｇＧ１の静脈内投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体血漿濃度。データは、平均±標準偏差として示される（ｎ＝５）。
【図１０】ヒトＵ９３７細胞に対するＣＤ３３特異的フィノマーＢ３、Ｇ１及びＤ５の結合。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ｘ軸上のフィノマー濃度に対してｙ軸上にプロットされる。ＰＢＳ群は、フィノマーの代わりにＰＢＳを含有するウェルを表す。
【図１１−１】図１１：（Ａ）ｍＡｂ４  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１並びにＣＤ３３特異的フィノマーＤ５及びＧ１に基づく新規のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂのヒトＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞に対するインビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害を示す。データは、平均生存率±標準偏差として示される（上段のグラフに関してｎ＝２、下段のグラフに関してｎ＝３）。（Ｂ）ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１並びにＣＤ３３特異的フィノマーＤ５及びＧ１に基づくさらに最適化されたＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂのヒトＫＧ−１細胞に対するインビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害を示す。
【図１１−２】（上記のとおり。）
【図１２】マウスにおける静脈内注射後のｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の血漿濃度。データは、平均±標準偏差として示される（ｎ＝５）。
【図１３−１】図１３：（Ａ）ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧで３日毎に静脈内治療されたか、又は等モル用量のＣＤ３／ＣＤ３３（ｓｃＦｖ）２で毎日治療されたマウスの平均腫瘍体積。０日目は、腫瘍／Ｔ細胞接種の日である。データは、平均±ＳＥＭとして示される（ｎ＝５〜６）。０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１用量で治療された群は、プロットの明瞭さを向上させるため示されない。ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１治療の効果は、これらの２つの群において観察されなかった。図１３Ｂもまた参照されたい。（Ｂ）治療群当たりの単一のマウス腫瘍体積。「注射」は、治療群における動物の総数であり、「腫瘍増殖」は、５０日の観察期間の間に腫瘍増殖を示す群におけるマウスの数である。
【図１３−２】（上記のとおり。）
【図１３−３】（上記のとおり。）
【図１４】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する各種ＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂの結合。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
ＩｇＧ抗体は、それらのＦａｂアームを介する抗原特異的結合を除いて、それらのＦｃγドメインを介してＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と結合することができる（Ｗｏｏｆ  ＪＭ  ａｎｄ  ＤＲ  Ｂｕｒｔｏｎ（２００４）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４（２）：８９−９９）。ＩｇＧに関して異なる親和性を有する、Ｆｃγに関する３種類の受容体ＦｃγＲＩ〜ＦｃγＲＩＩＩがある（Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｂｌｏｏｄ  １１３（１６）：３７１６−３７２５）。ＦｃγＲは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃγ媒介性免疫エフェクター機能を媒介する種々の細胞型上で発現される。抗体Ｆｃγドメインはまた、補体因子Ｃ１ｑに結合し、それにより補体経路を活性化して、最終的に補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を引き起こし得る。
【００３２】
ＦｃγＲ発現免疫細胞を介する作用を誘導することに加えて、ＦｃγＲの結合は、抗体Ｆａｂにより結合される細胞膜抗原の高次のクラスタリング、又は架橋をもたらす抗体の高次クラスターを形成し、それにより下流シグナル伝達を誘発する（Ｓｔｅｗａｒｔ  ＲＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２９））。例として、ＣＤ４０特異的抗体は、ＦｃγＲ依存的な様式においてＣＤ４０の下流シグナル伝達を活性化することが示されている（Ｗｈｉｔｅ  ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７（４）：１７５４−１７６３）。
【００３３】
多くの治療抗体の適用のために、強力なＦｃγ媒介性エフェクター機能を有することが望ましいが、ある種の適用は、エフェクター機能を必要としない作用様式に依存するか又はＦｃγ媒介性作用を誘導しない不活性抗体を必要とする。この理由のために、エフェクター機能が低減したＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）又はＦｃγＲに対する親和性を低減するＦｃγ−ＦｃγＲ界面における変異を有する操作されたＦｃγ配列が、このような抗体において利用される。
【００３４】
当該技術分野では、開始点としてＩｇＧ１を使用して、Ｆｃ受容体結合及びエフェクター機能が減少しているが、ＦｃＲｎ結合、長期間の安定性、及び低い免疫原性を保持するＦｃ含有分子を生成するための試みがなされている。これらの種類の分子は、例えば、より良好な安全性プロファイルを有する改善された抗体治療薬を提供し得る。
【００３５】
本分野では、抗体Ｆｃγドメインにおける標的化変異の導入によってＦｃγＲに対する親和性が低減されたＦｃγを発見する技術的課題に対するいくつかの解決策が見出されている。Ｎｏｓｅ及びＷｉｇｚｅｌｌは、Ｎ２９７でのＮ結合糖を有しない抗体が、ＦｃγＲ発現細胞に結合せず、且つＡＤＣＣ活性を欠いたことを記載した（Ｎｏｓｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｈ  Ｗｉｇｚｅｌｌ（１９８３）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８０（２１）：６６３２−６６３６）。Ｔａｏ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、及びＢｏｌｔらは、Ｎ２９７位で部位特異的変異誘発を実施して、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合が低減されたアグリコシル化抗体をもたらした（Ｔａｏ  ＭＨ  ａｎｄ  ＳＬ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３（８）：２５９５−２６０１；Ｂｏｌｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３（２）：４０３−４１１）。いくつかの臨床ステージの抗体又はＦｃγ融合タンパク質は、Ｎ２９７で変異を有する（例えば、抗ＰＤＬ１  ｍＡｂアテゾリズマブ、抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ  ＴＲＸ５１８、抗ＣＤ３  ｍＡｂオテリキシズマブ又はペプチド−Ｆｃγ融合タンパク質ロミプロスチム）（Ｓｔｒｏｈｌ  ＷＲ（２００９）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（６）：６８５−６９１；Ｓｔｅｗａｒｔ  ＲＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２９））。
【００３６】
ＣＤ３特異的抗体は、ＦｃＲ依存性Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導する（Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８（３）：６９５−７０１；Ｘｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００（１）：１６−２６）。ＦｃγにおいてＮ２９７Ａ変異を有するＣＤ３特異的ＩｇＧ１抗体は、Ｎ２９７ＡがＦｃγＲ発現細胞に対して結合が検出されないと記載されてきた事実にも関わらず（Ｂｏｌｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３（２）：４０３−４１１）、依然としてＴ細胞活性化を引き起こすことが観察された（国際公開第２０１２１４３５２４号パンフレット）。これらの観察は、ＣＤ３特異的抗体によるインビトロＴ細胞活性化アッセイが、残留性のＦｃγＲ結合に対して非常に敏感であることを示唆する。したがって、ＣＤ３抗体によるインビトロＴ細胞アッセイは、ＦｃγＲに対する結合親和性を有しないか又は最小限に有する操作されたＦｃγ配列を同定するための最適な機能的アッセイとなる。
【００３７】
Ｃａｎｆｉｅｌｄ及びＭｏｒｒｉｓｏｎは、ＩｇＧのヒンジ領域が高親和性ＦｃγＲＩに対する結合に寄与することを記載した（Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ＳＭ  ａｎｄ  ＳＬ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７３（６）：１４８３−１４９１）。Ｘｕらは、下方ヒンジにおける二重変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「Ａｌａ−Ａｌａ」、又は「ＬＡＬＡ」とも称される）を含有するヒト化抗ＣＤ３抗体ｈＯＫＴ３が、Ｃ１ｑ及びＦｃγＲ結合の低減を示して、インビトロでのＦｃγＲ媒介性Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出の抑制をもたらすことを示した（Ｘｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００（１）：１６−２６）。ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）又はテプリズマブと称されるこの抗体は、その後臨床試験において調査されたが、ここで、ＬＡＬＡ変異の導入は、有害なサイトカイン放出の発生の低減をもたらすことが見出された（Ｈｅｒｏｌｄ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（６）：１７６３−１７６９）。
【００３８】
（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（９）：６５９１−６６０４）は、ＦｃγＲ結合に寄与する残基を同定するために抗体Ｆｃγ全体に対するアラニンスキャニング変異誘発法を実施した。その著者らは、Ｄ２６５の変異が全てのＦｃγ受容体に対する親和性を低減することを見出した。加えて、Ｐ３２９位での変異が、Ｆｃγ受容体に対する結合を低減することを示した。Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、リツキシマブ、キメラＩｇＧ１抗体のＣ１ｑ結合部位をマッピングし、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９又はＰ３３１での変異が、Ｃ１ｑに対する結合を低減することを見出した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４（８）：４１７８−４１８４）。Ｗｉｌｓｏｎらは、「ＤＡＮＡ」と称されるＤ２６５とＮ２９７のアラニンへの変異の組合せを記載した。これらの組み合わされた変異は、ＦｃγＲに対する結合を低減したことが主張されたが、マウスＦｃγＲＩＩＩに対する残留性の結合が検出された（Ｗｉｌｓｏｎ  ＮＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９（１）：１０１−１１３）。Ｇｏｎｇらは、「ＤＡＮＡ」変異が、補体活性化における部分的な低減を呈することを記載した（Ｇｏｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４（２）：８１７−８２６）。
【００３９】
他の報告は、抗体のＦｃ部分におけるある種のアミノ酸の変異を記載したが（例えば、Ｄ２６５Ｎ及びＤ２６５Ｅ：Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４；Ｎ２９７Ｑ：Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：８８８２−８８９０；Ｎ２９７Ｄ：Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２０１６７−２０１７２，Ｋｅｌｔｏｎ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２１：１６０３−１６０９；Ｐ３２９Ｇ：Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２９：４５７−４６６）、これらの全ての研究がＦｃ機能性の障害に関連しているわけではなかった。
【００４０】
ＦｃγＲに対する結合を低減するいくつかのＦｃγ変異が記載されたが、上記のもののうちでＦｃγＲ結合及びＣ１ｑ結合を完全に抑制するものはなかった。Ｓｈｉｅｌｄｓらは、上記の「ＬＡＬＡ」又は「ＤＡＮＡ」の組合せ変異の根底にもある発想である個々の変異を組み合わせることによって（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（９）：６５９１−６６０４）、ＦｃγＲ結合をさらに低減する可能性について記載した。
【００４１】
しかしながら、最適にＦｃγＲ結合の低減をもたらし、且つ重要なこととして、製造性、安定性、薬物動態、又は抗原性などの医薬製品にとって重要な他の重要な特性に負の影響を及ぼさない変異の組合せを同定するという課題が残っている。
【００４２】
例えば、国際公開第２０１４／１０８４８３号パンフレットは、低減したＦｃγＲ結合を有する変異の組合せを含有するいくつかのＦｃγ配列を記載している。Ｆｃγ変異抗体の大部分は、マウスにおいて対応する非改変ＩｇＧ１抗体より速いクリアランスを有した。したがって、Ｆｃγドメインにおいて変異を導入することは、薬物動態特性に対して潜在的に影響を及ぼすことが知られる。
【００４３】
Ｆｃγドメインはまた、新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎと相互作用する（Ｋｕｏ  ＴＴ  ａｎｄ  ＶＧ  Ａｖｅｓｏｎ（２０１１）．ＭＡｂｓ  ３（５）：４２２−４３０）。この相互作用は、抗体再利用、リソソーム分解からの救出、及びしたがってＩｇＧ１抗体の長い半減期に関与する。ＦｃＲｎ結合部位は、Ｆｃγ１のＣＨ２−ＣＨ３界面に位置する（Ｍａｒｔｉｎ  ＷＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７（４）：８６７−８７７）。したがって、ＣＨ２ドメインにおいて変異を有する新たに設計されたＦｃγドメインは、ＦｃＲｎ親和性を減少させ、及びしたがって、薬物動態特性を減少させることができた（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（９）：６５９１−６６０４）。
【００４４】
本出願がより完全に理解され得るように、いくつかの定義を下に記載する。このような定義は、文法的同義語を包含するものとする。
【００４５】
本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、参照により本明細書に明示的に組み込まれるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合のようなＥＵインデックスに従う免疫グロブリン重鎖のものである。本明細書で「Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。この番号付けは、当業者によく知られており、当該分野において使用されることが多い。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味する。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」は、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１個又は特定の限定された位置で存在し得る任意の非天然アナログを意味する。
【００４８】
「２６５位、２９７位及び３２９位で置換（又は「変異」、若しくは「置き換え」）を有するＦｃ含有分子」は、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なる分子を意味し、Ｆｃ領域における全ての番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．におけるＥＵインデックスに従う。
【００４９】
本明細書の「アミノ酸変化」は、ポリペプチド配列における置換、挿入、及び／又は欠失などのアミノ酸変異を含む。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ポリペプチド配列における特定の位置のアミノ酸の別のアミノ酸による置き換えを意味する。例えば、置換Ｐ３２９Ａは、この場合、変異体ポリペプチドのＦｃ変異体を指し、ここで３２９位のプロリンは、アラニンで置き換えられる。
【００５０】
アミノ酸変異の組合せの場合、好ましい形式は、次の：Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ／Ｐ３２９Ａである。それは、親ポリペプチドと比較して変異体のＦｃ領域において３個のアミノ酸変異：２６５位のもの（アラニン（Ａ）で置き換えられたアスパラギン酸（Ｄ））、２９７位のもの（アラニンで置き換えられたアスパラギン（Ｎ））、及び３２９位のもの（アラニンで置き換えられたプロリン（Ｐ））が存在することを意味する。
【００５１】
用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用される。「抗体」は、（ｉ）Ｆｃ領域及び（ｉｉ）免疫グロブリンの可変領域に由来する結合ポリペプチドドメインを少なくとも含む任意のポリペプチドを指す。したがって、抗体としては、全長免疫グロブリン、多重特異性抗体、少なくとも１つの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質、合成抗体（本明細書で「抗体ミメティック」と称される場合がある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト型抗体、ヘテロ二量体抗体、抗体融合タンパク質、抗体コンジュゲート及びそれぞれ各々の断片が挙げられるが、これらに限定されない。下により詳細に記載されるとおりの「ＦｙｎｏｍＡｂ」はまた、抗体を含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「全長抗体」又は「免疫グロブリン」は、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。「全長抗体」は、モノクローナル全長抗体、野生型全長抗体、キメラ全長抗体、ヒト化全長抗体、完全ヒト全長抗体を包含し、このリストは限定的なものではない。
【００５３】
ヒト及びマウスを含む大部分の哺乳動物において、全長抗体の構造は一般に四量体である。前記四量体は、各対が１つの「軽」鎖（通常、約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（通常、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成される。一部の哺乳動物、例えば、ラクダ及びラマでは、全長抗体は、各重鎖がＦｃ領域に連結された可変ドメインを含む２つの重鎖のみからなり得る。
【００５４】
各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与し且ついわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。本発明によれば、この部分がＣＤ３を認識する。
【００５５】
各鎖のカルボキシ末端部分は、通常主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。
【００５６】
ヒト免疫グロブリンの場合、軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、且つヒト免疫グロブリンライブラリー又は１つ以上のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入し且つ内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「ＩｇＧ」は、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、サブクラス又はアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。全長ＩｇＧは、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、且つ各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１（ＣＨ１とも呼ばれる）、Ｃγ２（ＣＨ２とも呼ばれる）、及びＣγ３（ＣＨ３とも呼ばれる）を含む。ヒトＩｇＧ１の文脈において、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従って、「ＣＨ１」は１１８〜２１５位を指し、ＣＨ２ドメインは２３１〜３４０位を指し、且つＣＨ３ドメインは３４１〜４４７位を指す。ＩｇＧ１はまた、ＩｇＧ１の場合において２１６〜２３０位を指すヒンジドメインを含む。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く全長免疫グロブリンの定常領域を意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、且つこれらのドメインの可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関して、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでもよい。ＩｇＧに関して、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間の下方ヒンジ領域を含む。ＩｇＧ１のＦｃ領域は、アミノ酸Ｃ２２６からカルボキシ末端のドメインを含み、番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従う。例えば、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、限定されないが、配列番号４３及び５２〜５８（これらの各々は、ヒト野生型ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列の例である）のうちのいずれか１つを含むか、又は配列番号４３若しくは配列番号５２〜５８のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一な配列を含むＩｇＧ１のＦｃ領域を含み得る。好ましい実施形態では、２２６位（Ｋａｂａｔ番号付け）以降の本発明によるＦｃ領域は、配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一な配列を含み、２６５位のアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸はアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸はプロリン（Ｐ）と異なる。他のＩｇＧサブクラスに関する類似のドメインは、前記ＩｇＧサブクラスの重鎖又は重鎖断片とヒトＩｇＧ１のそれとのアミノ酸配列アラインメントから決定され得る。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ＣＨ２ドメイン」は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にあり、且つ配列番号７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。本明細書で記載されるとおりのヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の「ＣＨ３ドメイン」は、配列番号７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ含有分子」は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃ含有分子としては、抗体、Ｆｃ融合体、単離Ｆｃ、Ｆｃコンジュゲート、抗体融合体、ＦｙｎｏｍＡｂなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書の「野生型」又は「ＷＴ」は、天然に見出される、すなわち、対立遺伝子の変異を含んで天然に存在するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、変異誘発などの分子生物学的手法によって意図的に改変されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。例えば、「野生型Ｆｃ領域」は、限定されないが、配列番号４３の配列を含むＩｇＧ１のＦｃ領域を含んでもよく、これはヒト野生型ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列、又は配列番号５２〜５８の配列のいずれか１つを含むＩｇＧのＦｃ領域の例であり、これらの各々はまた、ヒト野生型ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列の例でもある。
【００６３】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、Ｆｃ領域（例えば、抗体のＦｃ領域）に結合する受容体を記載するために使用される。
【００６４】
用語「Ｆｃガンマ受容体」、「Ｆｃγ受容体」又は「ＦｃγＲ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するヒト受容体を指す。本明細書で使用する場合、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）サブクラスであって、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的にスプライシングされた形態を含むサブクラスを含む。
【００６５】
これらのＦｃγＲはまた、それらが免疫機能を誘発するか又は抑制するため、活性化受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ／ｂ）又は抑制性受容体（ＦｃγＲＩＩｂ）のいずれかとして定義される。
【００６６】
ＦｃγＲＩファミリーは、３つの遺伝子（ＦＣＧＲＩＡ、ＦＣＧＲＩＢ及びＦＣＧＲＩＣ）から構成されるが、ＦＣＧＲＩＡの産物のみが全長表面受容体として同定されている。前記産物、すなわちＦｃγＲＩは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、また活性化好中球によって発現される。
【００６７】
ＦｃγＲＩＩファミリーは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦＣγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩｃタンパク質をコードする３つの遺伝子（ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ及びＦＣＧＲ２Ｃ）から構成される。ＦｃγＲＩＩａは、単球、ある種の樹状細胞及び好中球上で発現される。ＦｃγＲＩＩｃは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される。ＦｃγＲＩＩｂは、広く発現されるＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩｂは、ＮＫ細胞及びＴ細胞を除く全ての白血球上に実質的に存在する。
【００６８】
ＦｃγＲＩＩＩファミリーは、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂをコードする２つの遺伝子ＦＣＧＲ３Ａ及びＦＣＧＲ３Ｂから構成される。ＦｃγＲＩＩＩａタンパク質は、単球、組織特異的マクロファージ、樹状細胞、γδＴ細胞、及びナチュラルキラー細胞上の幕貫通タンパク質として発現される。ＦｃγＲＩＩＩｂは、好中球及び好塩基球の表面上で発現されるＧＰＩアンカー型受容体である。
【００６９】
ＦｃγＲＩＩａをコードする遺伝子の２つの対立遺伝子は、１３１位で異なる２つの変異体（低応答物ＦｃγＲＩＩａＲ１３１及び高応答物ＦｃγＲＩＩａＨ１３１）を生成する。同様に、ＦｃγＲＩＩＩａをコードする遺伝子の２つの対立遺伝子は、１５８位で異なる２つの変異体（低応答物ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８及び高応答物ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８）を生成する。
【００７０】
顕著には、抗体依存性細胞障害の非常に重要なメディエーターであると考えられるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｃのみを発現し、他のＦｃγＲ、特に、抑制性ＦｃγＲＩＩｂを発現しない。
【００７１】
各ＦｃγＲタンパク質は、ＩｇＧサブクラスに対する異なるリガンド結合の優先度及びＩｇＧサブクラスに対する異なる親和性を有する。
【００７２】
活性化ＦｃγＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による貪食、呼吸性バースト及びサイトカイン産生（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）並びに好中球及びＮＫ細胞による脱顆粒などの種々の免疫応答を誘発する。活性化ＦｃγＲはまた、免疫複合体のクリアランスにおいて重要な役割を果たす。他方では、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞恒常性における非常に重要な調節要素である。それは、細胞活性化の閾値及び程度を制御する。
【００７３】
Ｆｃガンマ受容体及びそれらの機能は、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，８，３４−４７において概説される。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「Ｃ１ｑ」は、およそ４６０，０００の分子量を有し、６つのコラーゲン性の「軸」が６つの球状ヘッド領域に連結されているチューリップの花束に例えられる構造を有する六価分子である。Ｃ１ｑと２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒ及びＣ１ｓは、補体カスケード経路の第１成分である複合体Ｃ１を形成する。
【００７５】
Ｃ１ｑ及びその機能は、例えば、Ｋｉｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０００，４９：１５９−１７０及びＳｊｏｅｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  ３０（２）：８３−９０において概説される。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、且つＦＣＲＮ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質を意味する。当該技術分野で知られるとおり、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる場合が多い２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦＣＲＮ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質は、α−鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ヒトにおいて、ＦｃＲｎをコードする遺伝子は、ＦＣＧＲＴと呼ばれる。ＦｃＲｎは、母親から胎児への受動液性免疫の移送に関与し、またＩｇＧのクリアランスの制御にも関与する。
【００７７】
ＦｃＲｎ及びその機能は、例えば、Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，７，７１５−７２５において概説される。
【００７８】
本明細書で使用する場合、分子は、それが、ＫＤがｐＨ６．０で測定される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定される際に５倍より低い、好ましくは４倍より低い、より好ましくは３倍より低い、さらにより好ましくは２倍より低い、アミノ酸置換を有しない親Ｆｃ含有分子（例えば、野生型ＩｇＧ１）のＫＤであるＫＤでＦｃＲｎに結合するとき、「ＦｃＲｎに対する結合を保持する」。特定の実施形態では、ＫＤは、親分子のＫＤの約１〜２倍、例えば、約１．５倍、又は親分子のＫＤとほぼ同じ（すなわち、１倍）であり、また特定の実施形態では、ＫＤはまた、親分子のＫＤより低い場合もある。
【００７９】
「結合の低減」は、アミノ酸置換を有しない親Ｆｃ含有分子の結合と比較したとき、例えばＣ１ｑ及び／又はＦｃγＲ受容体に対する、本明細書に記載されるＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する本発明のＦｃ含有分子の結合の低減を指す。「結合の低減」は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、又は少なくとも約１００倍の結合の低減であり得る。Ｆｃ含有分子の結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含むがこれに限定されない当該技術分野で知られる種々の手法を用いてアッセイされ得る。ＳＰＲ測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）機器を用いて実施され得る。実際に、特定のＦｃγＲに対して「結合の低減」を呈するＦｃ含有分子は、特定のＦｃγＲによって媒介されるエフェクター機能を著しく低減又は抑制したＦｃ含有分子を指す。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「組換え体」は、組換え手段によって作製、発現、創出又は単離される抗体及び他のタンパク質を含む。
【００８１】
「ベクター」は、生物システム内で複製することができ、且つそのようなシステム間で移動できるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは通常、生物システムにおいてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するために機能する複製開始点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含有する。このような生物システムの例としては、ベクターを複製できる生物学的構成要素を利用する細胞、ウイルス、動物、植物、及び再構成された生物システムを挙げてもよい。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってもよい。本発明は、一態様において、本発明の二重特異性結合分子をコードする１つ以上の組換え体ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、１つ以上の分子であってもよく、例えば、抗体軽鎖フィノマー融合体は、１つの分子（例えば、第１のベクター）上にコードされ得るが、抗体重鎖は、別個の分子（例えば、第２のベクター）上にコードされるか、又は他の実施形態では、抗体軽鎖フィノマー融合体及び抗体重鎖の両方が、単一の分子（例えば、単一のベクター）上にコードされ得る。
【００８２】
「ポリヌクレオチド」は、糖リン酸骨格又は他の同等の共有結合性の化学によって共有結合されたヌクレオチドの鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡがポリヌクレオチドの典型的な例である。
【００８３】
Ｃ１ｑ及びＦｃγＲに対する結合が低減したＦｃ変異体
本発明は、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従うＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）の２６５位、２９７位、及び３２９位における組み合わされた置換の最初の実証である。複数の残基置換の特異的な選択は予想外に、抗体操作における使用及び融合ポリペプチドとしての使用のための機能的Ｆｃドメイン並びに測定可能なエフェクター機能を欠く治療薬の実体をもたらす可能性を提供した。
【００８４】
したがって、本発明は、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のアミノ酸Ｎ、及び３２９位のアミノ酸Ｐが他のアミノ酸により置き換えられるＣＨ２ドメインを含む、組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を提供する。
【００８５】
好ましいＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子としては、２６５位、２９７位及び３２９位でアミノ酸置換を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。下で述べられるとおり、このようなポリペプチドは、Ｆｃ領域内で１つ以上の追加の欠失、付加、又は置換を有し得る。したがって、２６５位でのアミノ酸置換（すなわち、この位置でＤとは異なるアミノ酸を有する）、２９７位でのアミノ酸置換（すなわち、この位置でＮとは異なるアミノ酸を有する）及び３２９位でのアミノ酸置換（すなわち、この位置でＰとは異なるアミノ酸を有する）を有するＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は本発明の範囲内であり、同時に２２６位（Ｋａｂａｔ番号付け）以降のＦｃ領域は、配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である。
【００８６】
用語「配列同一性のパーセント（％）」又は「％同一性」は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上の整列させたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、配列が当該技術分野において既知である配列比較アルゴリズムを使用して測定される際に最大限の一致に対して比較され整列させる場合、又は手動で整列させ視覚的に検証される場合、アラインメントを使用して、２つ以上の配列について、同一のものである（例えば、９０％、９５％、９７％又は９８％の同一性）アミノ酸残基の百分率が決定されてもよい。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なってもよい。タンパク質配列を整列させるための好適なプログラムは、当業者に知られている。タンパク質配列のパーセント配列同一性は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又は例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴなどのプログラムにより決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【００８７】
例えば、アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当該術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより、又は目視により決定され得る。特定の実施形態では、同一性のパーセントは、以下のパラメータに基づきＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
【００８８】
有用なアルゴリズムの別の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から多重配列アラインメントを生成する。これにより、アラインメントの生成に使用されたクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトのギャップ加重が３．００、デフォルトのギャップ長加重が０．１０であり、加重エンドギャップを含む。
【００８９】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７において記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。
【００９０】
その他の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたギャップ付きＢＬＡＳＴである。
【００９１】
多置換ＩｇＧ１変異体は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイ及びＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって評価されるヒトＦｃＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎ）に対するそれらの相対的な親和性に基づいて選択された。これらの変異体はさらに、ＰＢＭＣによりサイトカイン放出を誘導するそれらの能力に関して適切な細胞系において試験され、且つ分類された。本明細書で提供される実験データのセットにおいて、ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較された。いくつかのインビトロでのバイオアッセイにおけるこれらの変異体のさらなる分析は、軽微から検出限界以下のレベルの活性及び著しく除去されたＦｃγＲに対する結合親和性を実証した。これらの選別に基づいて、組み合わされた３つ全てのアミノ酸２６５位、２９７位及び３２９位での置換を含むＩｇＧ１  Ｆｃ変異体は、驚くべきことに、ＦｃγＲに対して親和性がないか又は最小の検出可能な親和性を有することが同定され、且つ種々の前述のエフェクター／免疫賦活性バイオアッセイにおける活性を大部分又は完全に欠く。本発明のＩｇＧ１  Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲに結合するか、エフェクター機能を媒介するか、又はＦｃ媒介性サイトカイン放出を保証する能力がないか又はその最小の能力を有する点で実際に「サイレンシングされた」Ｆｃと考えられ得る。
【００９２】
本発明に基づいて、アミノ酸２６５位、２９７位及び３２９位での置換は、他のアミノ酸変異と任意選択により組み合わされ得るか、又はその置換は、本明細書で教示されるとおりのエフェクター機能の類似の又は選択的なサイレンシングを達成するために別のＩｇＧアイソタイプにおいて使用され、且つ当該技術分野で知られるものと組み合わされ得る。２６５位、２９７位及び３２９位での変異のこの組合せは、驚くべきことに、各々が最小の残留性のＦｃγＲ相互作用が望まれる臨床ステージの治療抗体／Ｆｃ含有タンパク質において使用されてきた以前に記載されたＦｃ変異Ｎ２９７Ａ、又はＦｃ二重変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａと比較して著しく向上したサイレンシングをもたらした（Ｈｅｒｏｌｄ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（６）：１７６３−１７６９）。
【００９３】
本発明によるＤ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９三重変異体は、その野生型対応物と比較して第１補体成分Ｃ１ｑに対する結合の低減を呈する。言い換えると、Ｃ１ｑに対する変異体の親和性は、野生型のものより低い。
【００９４】
本発明によるＤ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９三重変異体はまた、その親ポリペプチドのものより低い少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する親和性を呈する。本明細書で使用する場合、Ｆｃγ受容体としては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体が挙げられる。好ましくは、少なくとも１つのＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａからなる群から選択される。
【００９５】
Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９三重変異体は、その野生型対応物と比較してＣ１ｑとＦｃγ受容体の両方に対する結合の低減を呈する。
【００９６】
特定の実施形態では、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、その野生型対応物と比較してＣ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の低減を呈する。
【００９７】
Ｃ１ｑ又はＦｃ受容体のいずれか１つに対する結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当該技術分野のよく知られた方法によって評価され得る。
【００９８】
例えば、目的のタンパク質（Ｃ１ｑ又はＦｃγＲなど）に対する本発明の変異体の結合強度は、実施例４において記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイによって得られるそれらの特定のＩＣ５０値の比を計算することによって、その野生型対応物のものと比較され得る。ハイスループットなスクリーニングにおいて使用されるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）は、結合などの分子現象の検出を可能にするホモジニアスアッセイ技術である。コーティングされた「ドナー」及び「アクセプター」ビーズがこのアッセイ技術の基盤である。ビーズ系アッセイとして、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）は、近接しているビーズの相互作用を通して機能して、非常に増幅されたシグナルを生成するように作用する化学反応のカスケードをもたらす。直接的又は間接的、例えば、競合的結合測定は、タンパク質間の相対的な親和性及び結合力を評価するために適用され得る。
【００９９】
代替として、目的のタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲ）に対する変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子及びその野生型対応物の結合は、適切なＥＬＩＳＡアッセイによるＥＣ５０の測定を通して比較され得る。ＥＣ５０は、変異体の濃度の対数に対する結合された目的のタンパク質のパーセンテージに関する曲線の５０％の飽和を表すシグナルをもたらす変異体の濃度を指す。一般的に、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、そのＥＣ５０が、その野生型対応物のそれより少なくとも１．５倍高い場合、その野生型対応物と比較して、目的のタンパク質（Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲなど）に対する結合の低減を示すと考えられる。
【０１００】
目的のタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲ）に対する変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子の結合親和性はまた、解離定数（Ｋｄ）の測定を通してＳＰＲにより評価され得る。一般的に、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、そのＫｄが、その親ポリペプチドのそれより少なくとも１．５倍高い場合、その野生型対応物と比較して、目的のタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲ）に対する結合の低減を示すと考えられる。
【０１０１】
Ｃ１ｑ又はＦｃγＲに対する変異体の親和性は、非常に弱いためＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイによる特定のシグナル及びＳＰＲによるＫｄ又はＥＬＩＳＡアッセイによるＥＣ５０でさえ、その結合シグナルがバックグラウンドノイズ中にあるか又は検出の閾値の下であるため正確に決定できない。そのような場合、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、Ｃ１ｑ及び／又は対応するＦｃγＲに結合していないと考えられる。
【０１０２】
例えば、本発明による三重変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は少なくとも１つのＦｃγＲに結合しない場合があり、且つＣ１ｑに対する結合の低減を示すか又はそれに対する結合を示さない。そのような変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、本出願の実施例において明確に示される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合しない。
【０１０４】
本出願人は、Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９での変異の導入が、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体に対する結合を著しく減少させるのに十分であることを示した。言い換えると、Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９以外での変異は、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγ受容体に対する適切な結合の低減を有する変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を得るために、ＩｇＧ１野生型対応物のＩｇＧ１  Ｆｃ領域内に導入される必要がない。それにもかかわらず、例えば、分子の他の機能性を変更するために、所望される場合には本発明のＦｃ含有分子に対してさらなる変異を加えることが任意選択により可能であろう。
【０１０５】
いかなる理論によっても束縛されることなく、本出願人は、本発明によってもたらされるアミノ酸置換がＩｇＧ１  Ｆｃ領域における主要な構造的再編成を著しく引き起こすことはなく、その結果、いくつかの場合において、Ｃ１ｑ及びＦｃγＲに対する結合によって媒介されない他の機能が親ポリペプチドのものと比較して著しく変更されないと考えている。顕著には、本出願人は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域における位置Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９での置換変異の導入が、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するそれらの親和性を著しく減少させないことを示した。例えば、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ及びＰ３２９ＡのＩｇＧ１  Ｆｃ置換（ＤＡＮＡＰＡ）を含むｍＡｂ１に関する解離定数、ＫＤは５００ｎＭであり、その野生型対応物に関しては４７０ｎＭである（実施例８を参照のこと）。言い換えると、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子及び本発明による変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、ＦｃＲｎに対して近い結合特性を示す。
【０１０６】
本明細書で上に言及されるとおり、野生型のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域、その断片及び変異体からなる群から選択され得る。
【０１０７】
本明細書で上に示されるとおり、本発明のＦｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃにおける少なくとも３つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み得る。注意のために、野生型Ｆｃ領域としては、配列番号４３を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が挙げられるが、これに限定されない。ヒトＦｃ領域の対立遺伝子変異体が知られており、本発明による変異の組合せを導入するための親分子として使用することもできる。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの対立遺伝子変異体は、３５６位（グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））、及び／又は３５８位（メチオニン（Ｍ）又はロイシン（Ｌ））及び／又は４３１位（アラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ））で互いに異なる。対立遺伝子変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体及び非天然の対立遺伝子変異体を含む。非天然の対立遺伝子変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体において発生するが、天然に見出されない組合せにおいて発生する残基を含有する。Ｊｅｆｆｅｒｉｓらは、当業者が天然に存在し且つ非天然のＦｃ配列の対立遺伝子変異体を導き出すことを可能にするヒトＩｇＧ対立遺伝子変異体に対する概要を提供する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍ−Ｐ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）ｍＡｂｓ  １：１−７）。特定の実施形態では、本発明による変異の組合せ（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる２６５位、２９７位及び３２９位での変異）の導入のための親分子は、したがって、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、及び５８からなる群から選択されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列を含む分子である。したがって、特定の実施形態における本発明は、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、及び５８のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有ポリペプチドを提供し、これらは、（ｉ）２６５位のアミノ酸Ｄが別のアミノ酸により置き換えられており、（ｉｉ）２９７位のアミノ酸Ｎが別のアミノ酸により置き換えられており、且つ（ｉｉｉ）３２９位のアミノ酸Ｐが別のアミノ酸により置き換えられていることを特徴とし、この番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される。
【０１０８】
野生型又は親Ｆｃ領域と比較した本発明によるＦｃ領域は、２６５位、２９７位及び３２９位のアミノ酸残基がそれぞれ、Ｄ、Ｎ及びＰとは異なるような変異の組合せを有し、番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．におけるＥＵインデックスに従う。特定の実施形態では、２６５位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｎ又はＥである。特定の実施形態では、２９７位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｄ又はＱである。特定の実施形態では、３２９位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ又はＳである。当業者は、他のアミノ酸がこれらの位置で置換されてもよく（例えば、２６５位でＲ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ；２９７位でＲ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ；３２９位でＲ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ）、２６５位、２９７位及び３２９位で指定されたアミノ酸を有する得られたＦｃ変異体を、Ｆｃ受容体及びＣ１ｑに対する結合において本明細書の実用的な実施例において例示される実施形態と実質的に同じ特性を有することに関して通例の方法によって試験することができ、且つそのような変異体が本発明に含まれることを理解することになる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｐ３２９Ａを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｄ２６５Ｎ、Ｎ２９７Ｄ、Ｐ３２９Ｇを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｄ２６５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３２９Ｓを含む。
【０１１２】
特定の実施形態では、変異体が野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較してタンパク質Ｃ１ｑ及び少なくとも１つの受容体ＦｃγＲに対する結合の低減を示す変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、
１．２６５位のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン又はグルタミン酸で置き換えられ、
２．２９７位のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン酸、又はグルタミンで置き換えられ、且つ
３．３２９位のアミノ酸が、アラニン、グリシン、又はセリンで置き換えられることを特徴とし、
アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスによって示される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、それぞれＤ、Ｎ及びＰ以外のアミノ酸で置き換えられるＣＨ２ドメインを含む組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を作製する方法は、
（ａ）親ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする核酸を提供する工程、
（ｂ）組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする核酸を得るために工程（ａ）において提供される核酸を改変する工程であって、２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、得られたコードされたＦｃ含有分子において、これらの位置のアミノ酸がＤ（２６５位）、Ｎ（２９７位）及びＰ（３２９位）とは異なるように置き換えられる工程、及び
（ｃ）宿主細胞において工程（ｂ）において得る核酸を発現させ、前記変異体を回収する工程を含む。
【０１１４】
当然、親分子が既に２６５位でＤ、２９７位でＮ、又は３２９位でＰとは異なるアミノ酸を含有する場合、これらの３つの位置のうちの他の１つ又は２つのみが依然として本発明によるＦｃ含有分子を生成するために改変される必要がある。
【０１１５】
このような工程は、分子生物学の従来の慣例により実施され得る。本発明の組換え体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を作製する方法を実行するために、当業者は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇから簡約したプロトコル：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００６）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００４）において見出され得る当該技術分野において記載されたよく知られる手順を参照してもよい。
【０１１６】
野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子の核酸は市販されている場合があるか、又は分子生物学又は化学合成の古典的な手順によって得てもよい。工程（ｂ）において言及されるとおりの変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする核酸を、化学合成、又は当該技術分野で知られる種々の方法を用いて親ポリペプチドの核酸を改変することによって得てもよい。これらの方法としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及びカセット変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする核酸分子は、宿主細胞中でのその発現のための発現ベクターに組み込まれ得る。
【０１１８】
発現ベクターは通常、作動可能に連結された、すなわち、プロモーターなどの制御又は調節配列との機能的関連性において置かれ、且つ選択可能マーカー、任意の融合パートナー、及び／又は追加の要素を任意選択により含む配列をコードするタンパク質を含む。本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、核酸、好ましくは、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、適切な条件下で培養して、タンパク質の発現を誘導するか又は引き起こすことによって産生され得る。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、及び酵母を含むがこれらに限定されない多種多様な適切な宿主細胞株が使用され得る。
【０１１９】
例えば、使用され得る種々の哺乳動物細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なＡＴＣＣ細胞株カタログにおいて記載される。宿主細胞は、ＹＢ２／０（ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．ＧＩＩ．ＩＧＡｇ．２０細胞、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託、ＡＴＣＣｎ°ＣＲＬ−１６６２）、ＳＰ２／０、ＹＥ２／０、１Ｒ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ細胞株、特に、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ０、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、不死化羊膜細胞株（ＣＡＰ）、ＥＢ６６、ＫＧＨ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ  １４、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｃ１２７、ＪＣ、ＬＡ７、ＺＲ−４５−３０、ｈＴＥＲＴ、ＮＭ２Ｃ５、ＵＡＣＣ−８１２などであり得るが、これらに限定されない。宿主細胞に外来性核酸を導入する方法は、当該技術分野でよく知られており、使用される宿主細胞により異なり得る。
【０１２０】
宿主細胞は、任意選択により、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物に属し得る。したがって、この場合、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子はトランスジェニック生物から得られる。
【０１２１】
トランスジェニック非ヒト動物は、所望の遺伝子を直接的に受精卵に注入することによって得ることができる（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．；７７：７３８０−４）。トランスジェニック非ヒト動物としては、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、雌ウシ、ウシ又は家禽などが挙げられる。所望の遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物は、所望の遺伝子を胚性幹細胞に導入し、アグリゲーションキメラ法又は注入キメラ法によって動物を作製することによって得ることができる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３））。胚性幹細胞の例としては、マウス（Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ；２９２：１５４−１５６）、ラット、ヤギ、ウサギ、サル、家禽、ウシなどの胚性幹細胞が挙げられる。加えて、トランスジェニック非ヒト動物はまた、所望の遺伝子が導入される核が除核卵に移植されるクローン技術を用いて作製され得る（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７８：８７３−８７６；Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−１２５８）。変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードするＤＮＡを上記の方法によって作製された動物に導入することによって、動物中において変異体分子を形成し且つ蓄積させた後、動物から変異体タンパク質を回収することによって生成され得る。変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、動物の乳、卵などの中で形成され且つ蓄積されるように作製されてもよい。
【０１２２】
上記の全ての実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、天然に存在するポリペプチド（野生型ポリペプチド）、天然に存在するポリペプチドの変異体若しくは操作された型、又は合成ポリペプチドであり得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質、ＩｇＧ１  Ｆｃコンジュゲート、及び抗体からなる群から選択される。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、Ｆｃ融合タンパク質及びＦｃコンジュゲートは、パートナーに連結されたＦｃ領域からなる。Ｆｃ領域は、リンカーとも呼ばれるスペーサーにより又はそれによらずにそのパートナーに連結され得る。
【０１２５】
好適なリンカーは、当業者の裁量に委ねられる。リンカーは、例えば、１〜３０個の炭素原子を有するアルキル、１〜２０個のエチレン部分を有するポリエチレングリコール、１〜２０個の残基を有するポリアラニン、カプロン酸、置換又は非置換のポリ−ｐ−フェニレン及びトリアゾールからなる群から選択され得る。ペプチド性リンカー、より具体的には１〜３０個のアミノ酸長を有するオリゴペプチドが好ましい。好ましい長さの範囲は５〜１５個のアミノ酸である。
【０１２６】
少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％の、グリシン、セリン及びアラニンなどの小さいアミノ酸からなるペプチドであるリンカーが特に好ましい。グリシン及びセリンのみからなるリンカーが特に好ましい。好適なリンカーの非限定的な例は、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号４０）である。
【０１２７】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に共有結合されたタンパク質、ポリペプチド又は小ペプチドを含むタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、任意選択により、上記のとおりのペプチドリンカーを含む。
【０１２８】
好ましい実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、「フィノマー」を含む。フィノマーは、ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメイン（Ｆｙｎ  ＳＨ３、Ｆｙｎキナーゼのａａ  ８３〜１４５：
【化１】
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）に由来する小型の７ｋＤａ球状タンパク質である。上記に示されるとおりの配列番号５９において、ＲＴ及びｓｒｃループの配列はそれぞれ下線及び二重の下線が引かれ、そのような分子は、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインにおける他の選択された位置の変異と任意選択により組み合わされたＦｙｎ  ＳＨ３ドメインの表面上の２つのループ（ＲＴ及びｓｒｃループ）のランダムな変異を介する選択の任意の標的に対して実質的に抗体様親和性及び特異性を有して結合するために操作され得る（例えば、国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレットを参照のこと）。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチド又はフィノマーは当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４；国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０（２）：５７−６８；及びＧｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５に記載されている。本明細書で用語「フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）」と互換的に使用される用語「Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチド」は、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５に記載されるとおり、いわゆる足場）を指す。フィノマーは、抗体などの他の分子に遺伝的に融合されて、二重特異性を有するように操作され得るいわゆるＦｙｎｏｍＡｂを生成する（例えば、Ｓｉｌａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１６，ｍＡｂｓ  ８：１，１４１−１４９；Ｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １３（８）：ｐ．２０３０−９；国際公開第２０１４／０４４７５８Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１４／１７００６３Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１５／１４１８６２Ａ１号パンフレット）。
【０１２９】
記載されるとおり、用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用される。本発明によれば、「抗体」は、（ｉ）Ｆｃ領域及び（ｉｉ）免疫グロブリンの可変ドメインに由来する結合ポリペプチドドメインを少なくとも含む任意のポリペプチドを指す。前記結合ポリペプチドドメインは、所与の標的抗原又は標的抗原の群に特異的に結合できる。免疫グロブリンの可変領域に由来する結合ポリペプチドドメインは、少なくとも１つ以上のＣＤＲを含む。本明細書において、抗体としては、全長抗体、多重特異性抗体、少なくとも１つの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質又は合成抗体（本明細書で「抗体ミメティック」と称される場合がある）、抗体融合タンパク質、抗体コンジュゲート及びそれぞれ各々の断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によるＦｙｎｏｍＡｂはまた、Ｆｃ領域を有する抗体を含む。したがって、本発明はまた、ＦｙｎｏｍＡｂ、すなわち、本発明による変異を有するＦｃ領域を含む、すなわち、２６５位でＤとは異なるアミノ酸、２９７位でＮとは異なるアミノ酸、及び３２９位でＰとは異なるアミノ酸を有する抗体に結合されたフィノマーの１つ以上の複製物を提供し、番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌの場合のようなＥＵインデックスに従う。フィノマーは、リンカーペプチドを介して抗体に共有結合されてもよいし、抗体に直接的に融合されてもよい。特定の実施形態におけるフィノマーは、抗体の重鎖のＣ末端の下流、又は抗体の重鎖のＮ末端の上流、又は抗体の軽鎖のＮ末端の上流に置かれてもよいが、本発明に関して、抗体の軽鎖のＣ末端の下流に置かれることが最も好ましい。好ましくは、フィノマーの２つの複製物は、抗体の２つの鎖における対応する末端に対して各々のうちの１つ、例えば、抗体の第１の片方の軽鎖のＮ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の軽鎖のＮ末端で１つの複製物（抗体の「片方」は本明細書において結合領域をともに含む重鎖及び軽鎖を意味する）、又は抗体の第１の片方の重鎖のＮ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の重鎖のＮ末端で１つの複製物、又は抗体の第１の片方の重鎖のＣ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の重鎖のＣ末端で１つの複製物が抗体に結合されるが（ＩｇＧ抗体の４つの末端でのフィノマーの様々な位置の例については、例えば、Ｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １３：２０３０−２０３９、及び国際公開第２０１３／１３５５８８号パンフレットの図８を参照のこと）、本発明のための最も好ましい実施形態においては、抗ＣＤ３抗体の第１の片方の軽鎖のＣ末端で１つのＣＤ３３結合フィノマー複製物及び抗ＣＤ３抗体の第２の片方の軽鎖のＣ末端で１つのＣＤ３３結合フィノマー複製物を含む。このような融合体は、遺伝子改変、フィノマー部分をコードする核酸のクローニング及び単一の融合分子を形成するためのインフレームの対応する抗体鎖によって生成され得る。細胞内での抗体の他の鎖（例えば、フィノマーが軽鎖に融合される場合の重鎖）との共発現は、機能的なＦｙｎｏｍａｂの発現をもたらすことになる。フィノマー部分は、抗体部分とは異なる標的分子に結合し得る（非限定的な例に関して、例えば、Ｓｉｌａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１６，ｍＡｂｓ  ８：１，１４１−１４９；国際公開第２０１４／０４４７５８Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１４／１７００６３Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１５／１４１８６２Ａ１号パンフレットを参照されたい）。本発明のＦｙｎｏｍＡｂは、ＣＤ３に結合する抗体部分及びＣＤ３３に結合するフィノマー部分を有する。
【０１３０】
国際公開第２０１４／１７００６３号パンフレットは、抗ＣＤ３×抗ＣＤ３３二重特異性抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４６７を開示する。本発明の分子は、ＣＯＶＡ４６７を超える利点、例えば、（ａ）前臨床安全性試験を可能にする、カニクイザルを含むいくつかの非ヒト霊長類に対するＣＤ３交差反応性；（ｂ）ＦｃＲ依存性ＣＤ３架橋及びＴ細胞活性化のリスクを低減する、Ｆｃ部分のサイレンシングの向上；及び（ｃ）ＣＤ３３に対する親和性の向上を含む。
【０１３１】
少なくとも１つの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質は、（ｉ）Ｆｃ領域及び（ｉｉ）免疫グロブリンの可変ドメインに由来する結合ポリペプチドドメインを含む操作されたタンパク質を意味する。特に興味深いのは、（ａ）本発明のＩｇＧ１  Ｆｃ変異体、及び（ｂ）免疫グロブリンの可変領域に由来する以下の結合ポリペプチドドメイン（すなわち、少なくとも１つのＣＤＲを含む）：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖ）連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することが可能となるペプチドリンカーにより連結される単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ並びに（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価断片又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」（このリストは限定的なものではない）のうちの１つを含む抗体である。特定の好ましい実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、全長抗体である。
【０１３２】
本明細書において「全長抗体」は、可変及び定常領域を含む抗体の天然に存在する生物学的形態を有する抗体を意味する。全長抗体は、野生型抗体、野生型抗体の変異体（例えば、既存の改変を含む）、野生型抗体の操作された型（例えば、キメラ、ヒト化抗体又は完全ヒト型抗体、下をさらに参照のこと）であってもよく、このリストは限定的なものではない。よく知られているとおり、全長抗体の構造は一般に、一部の免疫グロブリンが二量体であるラマ及びラクダなどの一部の哺乳動物を除いて、四量体である。
【０１３３】
全長抗体の足場部分は、異なる種からの混合物であってもよい。このような抗体変異体は、キメラ抗体及び／又はヒト化抗体であり得る。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせている抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、慣例上、非ヒト動物、一般にマウス（又はいくつかの場合においてはラット）由来の可変領域及びヒト由来の定常領域を含む。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体の全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、又はそのＣＤＲの範囲内を除くヒト抗体と同一である。一部又は全てが非ヒト生物に起源をもつ核酸によってコードされるＣＤＲがヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植されて抗体を生成し、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。このような抗体を作製するための方法はよく知られており、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット；Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ））において記載される。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「完全ヒト型抗体」又は「完全ヒト抗体」は、ヒト遺伝子に起源をもつ配列を全体的に含む抗体を指す。いくつかの場合において、これは、本明細書で概説された改変を有するヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体であってもよい。或いは、抗体の構成要素はヒトであり得るが、１つの遺伝子に由来しない場合がある。したがって、例えば、１つの抗体に由来するヒトＣＤＲは、１つ以上のヒト抗体からの足場配列などの配列と組み合わされ得る。例えば、種々の生殖系列配列が組み合わされて、ヒト抗体又はヒト足場を形成し得る。
【０１３５】
共有結合性の改変を含む全長抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような改変としては、グリコシル化、標識化及びコンジュゲーションが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
標識化は、検出可能な標識と全長抗体の結合を指す。本明細書で使用する場合、標識としては、ａ）放射性又は重同位体であり得る同位体標識；ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）酸化還元活性のある部分；ｄ）発色団、蛍光体及びフルオロフォアなどの光学色素；酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；及びｆ）第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
コンジュゲーションは、フィノマーなどのポリペプチド、受容体の標識結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、又は薬物などの非ペプチド分子、細胞傷害性薬物（例えば、化学療法剤）又は毒素と全長抗体の結合を指す。
【０１３８】
特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、キメラ免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、完全ヒト型免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの中から選択される免疫グロブリン、及び任意選択によりコンジュゲート又は標識化されたものからなる群から選択される。
【０１３９】
変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子の特性は一般に、変異体のＣ１ｑ及びＦｃγＲへの結合は２６５位、２９７位、及び３２９位でのアミノ酸改変により制御されるため、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体に対する結合に関するもの以外の野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子のものから推定され得る。これらの非常に関連する相違の他に、本発明のＦｃ含有分子とそれらの対応する野生型の特性においては、わずかな相違、例えば、Ｎ結合グリコシル化の欠如による熱安定性の軽微な低下がある。
【０１４０】
本発明のさらなる対象は、本明細書において上で定義されるとおりの変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする単離核酸である。本発明はまた、変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子をコードする核酸を含むベクター及び前記ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、前記ベクターをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれている。本発明はまた、前記核酸又はゲノムに安定して組み込まれる前記ベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【０１４１】
ＣＤ３３への特異的な結合は、本発明のポリペプチドがＣＤ３３に特異的に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃファミリーの他のメンバーなどの他の関連タンパク質には特異的に結合しないことを意味する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定されるとおり１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜
１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＥＣ５０値でＣＤ３３に結合する。
【０１４２】
本発明による方法及び変異体の使用
本出願人は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸２６５、２９７、及び３２９の置換が、Ｃ１ｑ並びにＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａなどのＦｃγＲに対するＦｃ変異体の親和性を徹底的に減少させることを示した。これらのエフェクター分子に対する親和性の減少は非常に顕著であるため、いくつかの場合において、Ｃ１ｑ及び／又は特定のＦｃγＲに対するＦｃ変異体の結合を、従来のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）／ＳＰＲアッセイによってインビトロで観察することができない。Ｃ１ｑに対するＩｇＧ１  Ｆｃ領域の結合は、インビボでのＣＤＣの誘導に必須である。同様に、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧ１  Ｆｃ領域の結合は、インビボでのＡＤＣＣ及びＡＤＣＰの誘導のための重要なステップである。ＦｃγＲに対する結合は同種受容体のクラスター化を誘導することができ、これは、その受容体を介してアゴニストシグナルを標的細胞にもたらし得る。
【０１４３】
したがって、Ｃ１ｑに対する親和性が低いため、本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、ＣＤＣ活性を有しないか、又はそれらの野生型対応物（すなわち、２６５位でアミノ酸Ｄ、２９７位でＮ、及び３２９位でＰを有するＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含むＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスを基準とする）と比較して著しく低いＣＤＣ応答をインビボで誘導すると予測される。同様に、特定のＦｃγＲ（特に、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａ）に対する親和性が低いため、本発明の変異体は、ＡＤＣＣ活性を有しないか、又はそれらの野生型対応物と比較して著しく低いＡＤＣＣ応答をインビボで誘導すると予測される。同様に、本発明の変異体は、インビボでのＦｃγＲ結合を介する受容体のクラスター化又はアゴニズムを誘導しないと予測される。同じ結果はまた、インビトロでのＣＤＣアッセイ、ＡＤＣＣアッセイ及び受容体クラスター化アッセイに関しても予想される。
【０１４４】
それらのエフェクター活性プロファイルのために、本発明の変異体は、広範な科学的分野において有用であり得る。特に、本発明の変異体は、研究用試薬、診断用薬又は治療薬として使用され得る。
【０１４５】
例えば、変異体は、フルオロフォア又はインジウム−１１１若しくはテクネチウム−９９ｍなどの同位体により標識されてもよいし、またインビボイメージングのために使用されてもよいが、これは、そのような適用においてはＡＤＣＣ又はＣＤＣの活性化が必要とされないためである。
【０１４６】
治療薬として使用されるとき、変異体は、標的細胞、例えば、癌細胞に放射性核種、毒素、サイトカイン又は酵素などの治療剤を運ぶために使用され得る。この場合、変異体は、抗体と細胞傷害性薬物の間のコンジュゲートであってもよく、その治療活性は、細胞傷害性薬物に依存する（例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８０，７７，４５３９−４５４３）。
【０１４７】
本発明のＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子はまた、標的分子の遮断薬又は中和薬として機能し得る。それはまた、標的分子を刺激するか、アンタゴナイズするか又は阻害する。
【０１４８】
本発明のＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、ＦｃγＲを介する受容体のクラスター化又はアゴニズムを誘導することなく受容体を標的化するために使用され得る。
【０１４９】
本発明による分子のＩｇＧ１  Ｆｃ含有抗体部分の標的分子はＣＤ３である。
【０１５０】
したがって、ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、抗ＣＤ３抗体を含む。特に、本発明の分子は、ＣＤ３に結合する抗体、及び別の標的であるＣＤ３３に結合するフィノマーである別の結合部分を含み、すなわち、それは二重特異性結合活性を有する。このような分子は、癌を標的化するために使用されるアゴニストｍＡｂであってもよく、例えば、本明細書の実施例においてより詳細に記載される。
【０１５１】
Ｃ１ｑ及びいくつかのＦｃγＲに対する低い結合のために、本発明の変異体は、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを介する免疫系の動員、又は同種受容体のクラスター化若しくはＦｃγＲを介するアゴニズムが治療効率のために非常に重要でない状態の治療のために使用されることに特に適切である。
【０１５２】
いくつかの場合、本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子の投与は、それらのＩｇＧ１  Ｆｃ領域におけるアミノ酸２６５位、２９７位、及び３２９位で変異を含まない大部分の抗体及びイムノアドヘシンより少ない副作用及びＩｇＧ媒介性細胞障害を誘導すると予測される。
【０１５３】
したがって、本発明のさらなる対象は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ応答の誘導を含むＦｃＲ媒介性作用、又はＦｃγＲを介する同種受容体のクラスター化が望ましくない病態を予防又は治療するための本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子の使用である。
【０１５４】
ＡＤＣＣ及びＣＤＣ応答の誘導は、変異体の治療効果がエフェクター細胞の活性化又はＣＤＣ活性化を必要としないときには望ましくない。このような変異体としては、例えば、遮断抗体又は中和抗体が挙げられる。
【０１５５】
ＦｃγＲを介する受容体のクラスター化の誘導は、変異体の治療効果が治療効果のためのＦｃγＲ媒介性の受容体のクラスター化を必要としないときには望ましくない。このような変異体としては、例えば、厳密に腫瘍抗原依存的な様式においてＣＤ３受容体のクラスター化を必要とするが、ＦｃγＲ依存的な様式においてはそれを必要としない、ＣＤ３／腫瘍抗原二重特異性分子が挙げられる。
【０１５６】
本発明は、ＣＤ３に結合する抗体部分及びＣＤ３３に結合するフィノマー部分を有する本発明によるＦｙｎｏｍＡｂ（すなわち、２６５位のアミノ酸がＤではなく、２９７位のアミノ酸がＮではなく、且つ３２９位のアミノ酸がＰではないＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含み、番号付けはＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従う）を提供する。
【０１５７】
本発明の別の対象は、医薬組成物を調製するための本発明の変異体の使用である。
【０１５８】
本発明のさらなる対象は、前記変異体を含む医薬組成物を提供することである。変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は抗体であり、モノクローナル又はポリクローナル抗体の形態で存在し得るが、モノクローナル抗体が好ましい。医薬組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、所望の純度を有するポリペプチド変異体と任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を混合することによって調製される。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｔｗｅｎｔｙ  ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５）において記載されるものなどの標準的な方法に従って製剤化され得る。
【０１６０】
使用され得る薬学的に許容される賦形剤は、特に、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；６ｔｈ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）において記載される。
【０１６１】
必要とする患者を治療するために、治療有効用量の本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子が投与され得る。本明細書における「治療有効用量」は、投与の目的となる効果をもたらす用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に依存することになり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である。投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の範囲であり得るが、例えば、０．００１、０．０１、０．１、１．０、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当該技術分野において知られるとおり、タンパク質分解、全身対局所送達、及び新たなプロテアーゼ合成の速度、並びに年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重症度に対する調整が必要となる場合があり、これは、当業者によって慣習的な実験を用いて確認可能となる。
【０１６２】
本発明の変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、非経口、鼻腔内、皮質内（ｉｎｔｒａｏｒｔｉｃａｌｌｙ）、眼内、直腸、膣、経皮、局所（例えば、ゲル）、腹腔内、筋肉内、肺内を含むがこれらに限定されない種々の方法においてなされ得る。
【０１６３】
本明細書に記載される変異体ＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子は、任意選択により、他の治療薬と同時に投与されてもよく、すなわち、本明細書に記載される治療薬は、任意選択により、例えば小分子、他の生物製剤、放射線療法、外科手術などを含む他の療法又は治療薬と同時投与されてもよい。
【０１６４】
記載される主題の例示的な実施形態
本明細書における主題をより十分に且つより完全に説明するために、本節は、示される主題の列挙された例示的な実施形態を提供する。
【０１６５】
列挙された実施形態：
実施形態
１．ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子であって、配列番号３６又は配列番号３８を含むＣＤ３３結合ポリペプチドであって、これが、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合し、その抗体が、番号付けがＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なるＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含むＣＤ３３結合ポリペプチドを含む、二重特異性結合分子。
【０１６６】
２．
ｉ．２６５位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｉｉ．２９７位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ
ｉｉｉ．３２９位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）である、実施形態１の二重特異性結合分子。
【０１６７】
３．ＣＤ３３結合ポリペプチドが、配列番号３８を含む、実施形態１又は２の二重特異性結合分子。
【０１６８】
４．ＣＤ３３結合ポリペプチドが、好ましくは配列番号４０を含むペプチドリンカーを介して抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合される、実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１６９】
５．抗体のＦｃ領域が、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のＮ及び３２９位のＰが、他のアミノ酸により置き換えられる、実施形態１〜４のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７０】
６．配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、又は１００％同一であるアミノ酸配列、及び配列番号２４又は２２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜５のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７１】
７．抗体が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１４又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１〜６のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７２】
８．配列番号１４及び配列番号２４を含む、実施形態１〜７のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７３】
９．配列番号１４及び配列番号２２を含む、実施形態１〜７のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７４】
１０．配列番号６３及び配列番号２４を含む、実施形態１〜７のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７５】
１１．配列番号６３及び配列番号２２を含む、実施形態１〜７のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７６】
１２．分子が、２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じ分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合の低減を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７７】
１３．少なくとも１つのＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂである、実施形態１２の二重特異性結合分子。
【０１７８】
１４．分子がＦｃＲｎに対する結合を保持する、実施形態１〜１３のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１７９】
１５．以下の特性：
（ａ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、好ましくはＦｃγＲＩに対する結合の低減（好ましくは、少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍）；
（ｂ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、同様の親和性（好ましくは５倍未満の差、より好ましくは２倍未満の差）を有するヒトＦｃＲｎに対する結合；
（ｃ）次の二重特異性ＣＤ３／３３  ＦｙｎｏｍＡｂ：ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６５；軽鎖配列番号１６）；ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号６７）；ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６９；軽鎖配列番号１６）；ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号７１；軽鎖配列番号１６）；及びｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号７５；軽鎖配列番号１６）のいずれかと比較して、インビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおけるより良好な生物活性（より低いＥＣ５０値として測定される）（例えば、実施例１１において記載されるとおりの条件下でのインビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおいて５０ｐＭ未満のＥＣ５０値を有する）；
（ｄ）ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号７３）より良好な温度安定性；
（ｅ）マウスにおける静脈内注射後１０日を超える終末半減期；及び
（ｆ）ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性結合分子ＣＯＶＡ４６３（配列番号７７）の等モル用量の同じ経路を介する１日１回の投与と比較して、３日当たり１回の静脈内注射を介する投与後のインビボマウスモデルにおける向上した抗腫瘍活性のうちの１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、又は６つ全てを有する、実施形態１〜１４のいずれか１つの二重特異性結合分子。
【０１８０】
１６．実施形態１〜１５のいずれか１つの二重特異性結合分子をコードする１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド。
【０１８１】
１７．実施形態１６の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター。
【０１８２】
１８．実施形態１６の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド又は実施形態１７の１つ以上のベクターを含む宿主細胞。
【０１８３】
１９．実施形態１〜１５のいずれか１つの二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１８４】
２０．必要とする患者に、実施形態１〜１５のいずれか１つの二重特異性結合分子、実施形態１６の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１７の１つ以上のベクター、又は実施形態１９による医薬組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
【０１８５】
２１．癌が、ＣＤ３３を発現する癌である、実施形態２０の方法。
【０１８６】
２２．癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、実施形態２０又は２１の方法。
【０１８７】
２３．癌を治療する際の使用のための実施形態１〜１５のいずれか１つの二重特異性結合分子、実施形態１６の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１７の１つ以上のベクター、又は実施形態１９の医薬組成物。
【０１８８】
２４．癌が、ＣＤ３３を発現する癌である、実施形態２３の二重特異性結合分子、１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、１つ以上のベクター、又は医薬組成物。
【０１８９】
２５．癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、実施形態２３又は２４の二重特異性結合分子、１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、１つ以上のベクター、又は医薬組成物。
【０１９０】
２６．癌の治療のための医薬品の製造における実施形態１〜１５のいずれか１つの二重特異性結合分子、実施形態１６の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１７の１つ以上のベクター、又は実施形態１９の医薬組成物の使用。
【０１９１】
２７．癌が、ＣＤ３３を発現する癌である、実施形態２６による使用。
【０１９２】
２８．癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、実施形態２６による使用。
【０１９３】
２９．組換え体二重特異性結合分子を作製するための方法であって、宿主細胞中で実施形態１６の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチドを発現させること及び組換え体ポリペプチドを回収することを含む方法。
【実施例】
【０１９４】
以下の実施例は、前の開示を補い、且つ本明細書に記載される主題のより適切な理解をもたらすために提供される。これらの実施例は、記載される主題を限定するものと考えられるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的としており、それを考慮した様々な変形形態又は変更が、当業者に明らかであり、且つ本発明の真の範囲に含まれ、且つ本発明の真の範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
【０１９５】
実施例１．  Ｆｃ変異抗体の発現及び精製
ヒトＣＤ３に特異的なｍＡｂ、ヒトＩｇＧ１抗体に基づくいくつかの抗体は、ＣＨ２ドメインにおける各種変異を有して産生された。変異は：
−  ｉ）Ｎ２９７Ａ、
−  ｉｉ）Ｄ２６５とＰ３２９Ａ（ＤＡＰＡ）
−  ｉｉｉ）Ｄ２６５とＮ２９７ＡとＰ３２９Ａ（ＤＡＮＡＰＡ）、及び
−  ｉｖ）Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）
であった
（Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９９１）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，１９９１に従うＥＵ番号付け）。
【０１９６】
抗体の発現に関して、切断され且つ分泌産物においてもはや存在しないリーダー配列が通常存在する。本明細書に記載される実施例における発現のために使用されるリーダー配列の例は、配列番号４２において提供され、それをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号４１において提供される。
【０１９７】
各種Ｆｃ変異を有する抗体をコードする発現ベクターは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過的にトランスフェクトされ、無血清／動物成分不含培地中で６日間発現された。ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号８９９２８）により、抗ＣＤ３抗体を上清から精製し、ＰＢＳに対して透析した。２８０ｎｍでの吸光度測定により濃度を決定した。
【０１９８】
ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２６０システム上でＳＥＣ−５カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、５μｍ粒径、３００Å）を用いて実施された。１０μｌの精製タンパク質をカラムにロードし、溶出をＯＤ２８０測定によって記録した。
【０１９９】
Ｆｃ変異抗体変異体を、シングルステップのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって良好な収量及び高純度で精製できた。収量を表１に列挙する。
ＳＥＣによって見出されるとおり、全てのタンパク質はおよそ９５％単量体であった。ｍＡｂ１  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１のＳＥＣプロファイルを図１に示す。
これらの結果は、ヒトＩｇＧ１配列に挿入されたＤＡＮＡＰＡ三重変異が、両者が医薬品の重要な判定基準である良好な発現及び単分散度を保持することを実証している。
【０２００】
【表１】
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【０２０１】
実施例２：Ｆｃ変異抗体は、非改変抗体と同一の親和性でＣＤ３発現細胞に結合する
各種Ｆｃ変異ｍＡｂ１を、ＣＤ３＋ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２（商標））に対してタイトレーションして、ヒトＣＤ３に対する結合親和性を評価した。５０ｎＭと０．１３ｐＭ濃度の間でのＦｃ変異抗体の段階希釈物を、ジャーカット細胞に加え、結合した抗体を、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体で検出した。サイトメーター上で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、対数目盛上の抗体濃度に対してプロットした。
【０２０２】
ＣＤ３＋ジャーカット細胞に対して得られた結合曲線を図２に示す。
【０２０３】
Ｆｃ変異抗体変異体は、同一の親和性でＣＤ３に結合したが、これは、Ｆｃ変異が標的細胞結合に対してなんら影響を及ぼさないことを示している。
【０２０４】
実施例３：ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１はリンパ球活性化を誘導しない
免疫細胞活性化に対するＦｃ変異ｍＡｂ１の効果を調査するために、新鮮な単離ヒトＰＢＭＣを、Ｆｃ変異ｍＡｂ１の存在下でインキュベートした。免疫細胞活性化を、ｉ）１４時間のインキュベーション後のＣＤ６９表面染色、又はｉｉ）３日のインキュベーション後の上清におけるＩＦＮγの定量化によって検出した。
ヒトＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ単離の１日前にＢｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって収集されたバフィーコート調製物から単離した。ＰＢＭＣを、Ｐａｎｃｏｌｌチューブ（Ｐａｎ−ＢｉｏＴｅｃｈ）を用いて、製造業者の指示書に従って密度遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ単離の後、残留している赤血球細胞を１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で溶解した。
【０２０５】
１００，０００個の新鮮な単離ＰＢＭＣを、９６ウェルＵ底プレートのウェル中において１０％熱不活性化ＦＢＳで補充された２００μｌの総量のＲＰＭＩ１６４０中で段階希釈（３００ｎＭと０．１５ｐＭの間の濃度）のｍＡｂ１の種々のＦｃ変異体と混合した。陽性対照として、ＰＢＭＣを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入したヒトＴ細胞活性化／増殖キットに含有される抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ＭＡＣＳｉｂｅａｄｓの存在下でインキュベートした。
【０２０６】
ＣＤ６９の表面発現は、１４時間のインキュベーション後に測定された。アッセイウェルの内容物を混合し、各ウェルの１００μｌを、後のＣＤ６９染色のために９６ウェルＵ底プレートに移した。細胞をペレット化し、１％ＦＢＳ及び０．２％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中の４０μｌの抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で再懸濁した。氷上での４５分のインキュベーションの後、未結合抗体を洗い落とし、試料を、５０μｌの１．８％ホルマリン中において氷上で１５分間固定し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｅＣｙｔｅ  ８ＨＴフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で分析した。ＣＤ６９陽性のリンパ球のパーセンテージを、対数目盛上の抗体濃度に対してプロットした。
【０２０７】
上清中のＩＦＮγレベルは、３日間のインキュベーション後、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造業者の指示書に従ってサンドウィッチＥＬＩＳＡにより測定された。ＩＦＮγ濃度を、対数目盛上の抗体濃度に対してプロットした。
【０２０８】
予想外に、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ＰＢＭＣ上のＣＤ６９発現の誘導（図３Ａ）、及び培養上清中のＩＦＮγ（図３Ｂ）の欠如によって示されるとおり、リンパ球活性化を誘導しなかった唯一のコンストラクトであった。対照的に、以前にＦｃＲ結合を低減すると報告された単一又は組合せのＦｃ変異を含有する他の全ての変異体は、依然として著しいリンパ球活性化を誘導した。重要なこととして、ＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃ配列は、最小限のＦｃＲ相互作用が望ましいいくつかの臨床ステージの治療薬であるＦｃ含有タンパク質において使用される両方ともにサイレンシングされたＦｃ配列である、Ｎ２９７Ａ  Ｆｃ配列又はＬＡＬＡ  Ｆｃ配列より良好なサイレンシングをもたらした。これらの結果は、ＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃ配列が、ヒトＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導するための潜在力を強力に低減することを示唆する。
【０２０９】
実施例４：ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１はヒトＦｃγ受容体に対して最小の結合を示す
ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイによって特徴付けられた（Ｖａｆａ，Ｏ．，Ｇ．Ｌ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｂ．Ｓｔｒａｋｅ，Ｔ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．Ｌａｃｙ，Ｂ．Ｓｃａｌｌｏｎ，Ａ．Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ  ａｎｄ  Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（１）：１１４−１２６）。このアッセイを、図４Ａにおいて概略的に示す。ビオチン化対照抗体は、ストレプトアビジンドナービーズ上で捕捉され；Ｈｉｓタグ付きＦｃγ受容体は、Ｎｉ２＋アクセプタービーズ上で捕捉され；目的のＦｃを有する非標識抗体の段階希釈物が競合物としてアプライされる。この形式は、競合物の受容体結合が起こるときにシグナルの低減をもたらす。
【０２１０】
呼吸器多核体ウイルスに特異的であり且つ健常哺乳動物における任意の標的に特異的に結合しないと考えられるＢ２１Ｍ、ヒトＩｇＧ１対照抗体（Ｖａｆａ，Ｏ．，Ｇ．Ｌ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｂ．Ｓｔｒａｋｅ，Ｔ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．Ｌａｃｙ，Ｂ．Ｓｃａｌｌｏｎ，Ａ．Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ  ａｎｄ  Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ  （２０１４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（１）：１１４−１２６）は、ビオチンで標識化された（ＳｕｒｅＬＩＮＫ発色団ビオチン標識化キット、ＫＰＬ）。０．２μｇ／ｍｌのビオチン化Ｂ２１Ｍ  ＩｇＧ１対照抗体、Ｆｃ変異試験抗体（４００μｇ／ｍｌ、及びその８段階３倍希釈）、Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃγ受容体（Ｒ＆Ｄ、無担体製剤）、Ｎｉ２＋−アクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１：２５０希釈）、及びストレプトアビジンドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１：２５０希釈）を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２）中において上に示される順に混合した。ヒトＦｃγ受容体は、次の濃度で使用された：２００ｎｇ／ｍｌのＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡ；１０ｎｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＡ；１４ｎｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＢ。
【０２１１】
ＦｃγＲＩに対する結合評価に関して、ビオチン化Ｂ２１Ｍ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１を、アッセイの感受性を増大させるためにＢ２１Ｍ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号１８；軽鎖配列番号３２）の代わりに使用した。Ｂ２１Ｍ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号３０；軽鎖配列番号３２）は、Ｌ２３４及びＬ２３５で２つのアラニン置換を有し（実施例１もまた参照のこと）、これはＦｃγＲＩに対する結合親和性を低減する。
【０２１２】
３０分のインキュベーション後、プレートを、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて分析した。
％最大シグナルは、以下の式を使用する最小及び最大シグナルに対する標準化により未加工のＥｎＶｉｓｉｏｎデータから得た：
％最大＝（Ｅｘｐ−最小）／（最大−最小）＊１００
式中、
Ｅｘｐ＝ＥｎＶｉｓｉｏｎの未加工のウェルシグナル
最小＝プレート上の全ての試験競合物の中で最高の競合物濃度で得られた最小のシグナル。
最大＝最大シグナル（すなわち、通常、競合物の非存在下）。
【０２１３】
％最大値を、ｙ軸上の平均±標準偏差（ｎ＝３）、及びｘ軸上の対数（阻害剤）としてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいてプロットした。データを、可変ヒル勾配による応答モデルに対する４つのパラメータ対数（阻害剤）を用いて、非線形回帰によってフィットさせた。
【０２１４】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイの結果を確認するために、高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）及び低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対するＦｃ変異ｍＡｂ１変異体の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップを、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１４００ＲＵのヒト組換え体ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は１５００ＲＵのヒト組換え体ＦｃγＲＩ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。２０００ｎＭと３１ｎＭの間の濃度の段階２倍希釈のＦｃ変異ｍＡｂ１を調製し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充されたＰＢＳ  ｐＨ７．４中において３０μｌ／分でＦｃＲでコーティングされたチップ表面及びコーティングされていない基準表面上に注入した。注入と注入の間に、１０ｍＭ  ＮａＯＨでチップ表面を再生した。得られた結合曲線は、リファレンスが差し引かれ、続いて緩衝液が差し引かれ、得られた二重リファレンスの曲線を、動力学的結合定数及び解離定数、ｋｏｎ及びｋｏｆｆを得て、それから熱力学的解離定数ＫＤがｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される１：１のラングミュア動力学モデル、又は熱力学的解離定数、ＫＤを直接的に得るための定常状態親和性モデルのいずれかを用いるＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して評価した。
【０２１５】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイの結果を、図４Ｂ及び表２に示す。ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、非改変ＩｇＧ１と比較して４００倍を超えて低減されるＦｃγＲＩに対する最小の競合（ＩＣ５０＞１０００ｎＭ）を示したが、これは、このＦｃ配列が、最小の残留性のＦｃγＲ結合活性を有することを示している。予想外に、ＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃは、最小のＦｃＲ相互作用が望ましい臨床ステージの抗体において使用されるＬＡＬＡ  Ｆｃ又はＮ２９７Ａ  Ｆｃ配列と比較してＦｃγＲＩに対して結合の著しい低減を示した。ｍＡｂ１  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ１  Ｎ２９７Ａ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＤＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１よりもヒトＦｃγＲＩに対して低減されるが依然として３７倍を超えて強力な結合を示した（ＩＣ５０＝２７ｎＭ、２４ｎＭ及び１８ｎＭ）。
【０２１６】
いずれの他のヒトＦｃγＲに対する結合も、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ１  ＤＡＰＡ  ＩｇＧ１、及びｍＡｂ１  Ｎ２９７Ａ  ＩｇＧ１に関して見出されなかった。ｍＡｂ１  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、且つＦｃγＲＩＩＢに対して非常に弱く結合することが観察された。
【０２１７】
ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの結果を、図４Ｃ及び表３（ＦｃγＲＩ結合）、並びに図４Ｄ及び表４（ＦｃγＲＩＩＩＡ結合）に示す。予想外に、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩに対して完全に抑制された結合を示す。ｍＡｂ１  ＤＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ１  Ｎ２９７Ａ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩに対する残留性の結合活性を保持するが、ｍＡｂ１  ＩｇＧ１と比較して低減した親和性を有する。ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を示さない。同様に、ｍＡｂ１  ＤＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  Ｎ２９７Ａ  ＩｇＧ１はＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を示さない一方で、ｍＡｂ１  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する残留性の結合を示すが、ｍＡｂ１  ＩｇＧ１と比較して低減した活性を有する。
【０２１８】
結論的に、これらの結果は、ＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃ配列が、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対して結合の著しい低減を有することを実証している。ＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃ配列がＦｃＲ結合活性を低減した程度は、ＦｃγＲ結合活性の低減をもたらす以前に知られる他の単一又は組み合わさされたＦｃ変異と比較して格段に優れている。これらの結果はさらに、本明細書で試験されたＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃと他のＦｃの間の主な相違が、ＦｃγＲＩに対する結合の著しい低減にあることを示唆している。
【０２１９】
【表２】
2020535819.tif 000004
【０２２０】
【表３】
2020535819.tif 000005
【０２２１】
【表４】
2020535819.tif 000006
【０２２２】
実施例５：ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１  Ｆｃは、異なる抗体配列の文脈においてＦｃγＲ結合の低減を示す
前の上記実施例において提示されるｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１に加えて、異なるＦａｂ配列及び異なる同種標的を有する３種類の抗体が、ｍＡｂ１に関して実施例１に記載されるとおりのＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１形式において作製された：抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ２（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号１６）、抗ＨＥＲ２抗体（重鎖配列番号１０；軽鎖配列番号１２）、及び抗ＰＤ１抗体（重鎖配列番号６；軽鎖配列番号８）。ＦｃγＲ結合活性は、実施例４に記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイにおいてｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１と比較された。
【０２２３】
結果を図５に示す。ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１形式におけるＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ２、ＨＥＲ２特異的抗体及びＰＤ−１特異的抗体は全て、ＦｃγＲＩに対して最小限の結合を示し（ＩＣ５０＝６００ｎＭ以上）、他の試験ＦｃＲに対しては結合しない。これらのデータは、ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１配列が、Ｆａｂ配列又は同種標的とは無関係にＦｃＲ結合を強力に低減し、且つ実質的にいずれの抗体に対しても最小限のＦｃγＲ結合を潜在的に付与することを示す。
【０２２４】
実施例６：Ｄ２６５、Ｎ２９７、及びＰ３２９で置換を有するｍＡｂ１はヒトＦｃγＲ１に対する結合の低減を示す
ＤＡＮＡＰＡ  ＦｃのＦｃ受容体に対して結合する能力の強力な低減が、アラニンとは異なるアミノ酸により同じセットの残基（すなわち、Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９）を置換することによって反映され得るかどうかを決定するために、以下の置換を有するｍＡｂ１を実施例１に記載されるとおりに作製した：
ａ）Ｄ２６５Ｎ、Ｎ２９７Ｄ、Ｐ３２９Ｇ（ＤＮＮＤＰＧと称される）
（重鎖配列番号１８；軽鎖配列番号４）
ｂ）Ｄ２６５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３２９Ｓ（ＤＥＮＱＰＳと称される）
（重鎖配列番号２０；軽鎖配列番号４）。
ＦｃγＲＩ結合活性は、実施例４に記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイにおいてｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１と比較された。
【０２２５】
結果を図６に示す。３種類全ての抗体が、ＦｃγＲＩに対する最小限の結合を示し、その相互作用は明らかに、Ｆｃ操作により抑制する最大の課題である（実施例４を参照のこと）。これらの結果は、ＦｃγＲＩ相互作用が、３つの残基Ｄ２６５、Ｎ２９７、及びＰ３２９を、単にアラニンによる置換ではなく異なるアミノ酸残基で置換することにより低減され得ることを示す。
【０２２６】
実施例７：ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１はＣ１ｑ結合を抑制する
抗体Ｆｃに対するＣ１ｑの結合は、抗体媒介性補体活性化及びその後の補体媒介性標的細胞溶解の誘導における第１段階である。ヒトＣ１ｑに対するｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置上でのＳＰＲ結合アッセイにおいて測定された。抗体は、アミンカップリングを介して５０００ＲＵのコーティング密度でＣＭ５チップ上にコーティングされた。ヒトＣ１ｑ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、ランニング緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）中において２００ｎＭ及びその３倍段階希釈にて３０μｌ／分の流速で注入された。結合が記録され、ＫＤが、定常状態親和性モデルを用いるＢＩＡｃｏｒｅソフトウェアを使用してカーブフィッティングすることによって決定された。
【０２２７】
実験の結果を図７に示す。ｍＡｂ１  ＩｇＧ１は、見かけ上３０ｎＭのＫＤを有してＣ１ｑに対する強力な結合を示し、このことは、この相互作用に関する公開された親和性値と一致し、アッセイ機構を確証する（Ｍｏｏｒｅ  ＧＬ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｍａｂｓ  ２（２）：１８１−１８９）。
【０２２８】
ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、Ｃ１ｑに対する任意の検出可能な結合を示さなかった。
【０２２９】
注目すべきことに、ＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃγ１中に存在するＤ２６５ＡとＮ２９７Ａ変異を組み合わせるがＰ３２９Ａ変異を欠く、類似のＦｃγ１配列であるＤＡＮＡ  Ｆｃγ１は、文献中に記載されており、残留性のＣ１ｑ結合を示す（Ｇｏｎｇ，Ｑ，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４（２）：８１７−８２６）。
【０２３０】
ＤＡＮＡ  Ｆｃγ１と対照的に、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、Ｃ１ｑに対する結合の完全な消失を著しく実証した。
【０２３１】
実施例８：ＤＡＮＡＰＡ変異はヒトＦＣＲＮに対する結合を減少させない
ＩｇＧ  ＦｃのＦｃＲｎとの相互作用は、抗体の代謝回転において重要な役割を果たす（Ｋｕｏ  ＴＴ  ａｎｄ  ＶＧ  Ａｖｅｓｏｎ（２０１１），ＭＡｂｓ  ３（５）：４２２−４３０）。ピノサイトーシスを介して細胞により吸収されたＩｇＧは、エンドソームの酸性環境中においてＦｃＲｎ受容体と結合する。ＦｃＲｎはＩｇＧを再循環させて細胞表面に戻し、そこで抗体は、中性又は塩基性ｐＨでＦｃＲｎから解離することにより、リソソームによる分解から救出される。この機構は、ＩｇＧの長い血清半減期に関する説明を与える。したがって、長い血中半減期を有するために、Ｆｃ中に置換を有する抗体は、酸性ｐＨでＦｃＲｎと十分な結合を保持し、中性ｐＨで容易に解離することが重要である。
【０２３２】
ヒトＦｃγＲは、ＩｇＧ抗体の下方ヒンジ中の残基及びＣＨ２ドメインに結合するが（Ｗｏｏｆ  ＪＭ  ａｎｄ  ＤＲ  Ｂｕｒｔｏｎ（２００４），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４（２）：８９−９９）、ヒトＦｃＲｎは、ＣＨ２−ＣＨ３界面中のいくつかの残基と相互作用する（Ｍａｒｔｉｎ  ＷＬ，  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７（４）：８６７−８７７）。したがって、ＦｃＲ結合を低減するために導入される変異は、Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用に影響を及ぼし得る。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓらは、ＦｃγＲ結合の低減をもたらした下方ヒンジ又はＣＨ２ドメイン中のいくつかの変異はまた、ＦｃＲｎ結合の低減も引き起こしたことを観察した（例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｑ２９５Ａ）。したがって、ＦｃＲｎ結合に対するＤＡＮＡＰＡ変異の影響を評価することが特に重要である。
【０２３３】
ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１のＦｃＲｎに対する結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析された。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップを、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて６００ＲＵのヒト組換え体ＦｃＲｎ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。２０００ｎＭと３１ｎＭの間の濃度の段階２倍希釈のＤＡＮＡＰＡ  Ｆｃ変異ｍＡｂ１及び未変異のｍＡｂ１  ＩｇＧ１を調製し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充されたＰＢＳ  ｐＨ６．０中において３０μｌ／分でＦｃＲｎでコーティングされた表面及びコーティングされていない基準表面上に注入した。注入と注入の間に、ＰＢＳ  ｐＨ７．４でチップ表面を再生した。得られた結合曲線は、リファレンスが差し引かれ、続いて緩衝液が差し引かれ、得られた二重リファレンスの曲線を、定常状態親和性モデルを用いるＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して評価して、熱力学的解離定数ＫＤを得た。
【０２３４】
ヒトＦｃＲｎに対する結合アッセイの結果を図８に示す。解離定数ＫＤは、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１に関しては５００ｎＭ、及びｍＡｂ１  ＩｇＧ１に関しては４７０ｎＭであったが、このことは、ヒトＦｃＲｎに対する結合において差がないことを示している。ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ｍＡｂ１  ＩｇＧ１と本質的に同一の解離動態を有して中性ｐＨで迅速な解離を示す。これらの結果は、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１が、ＦｃγＲに対する結合の抑制にも関わらずＦｃＲｎに対するＩｇＧ１様結合を保持することを示唆する。
【０２３５】
実施例９：ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ＩｇＧ１様薬物動態プロファイルを呈する
良好な薬物動態特性、すなわち、血中の長い半減期は、抗体に基づく医薬品が満たさなければならない重要な判定基準の１つである。抗体Ｆｃ配列の操作は、薬物動態プロファイルに対して予想外の効果を有する場合がある。例えば、Ｆｃ受容体結合を低減する５つの変異を含有するＦｃ配列を有する抗体（「ＬＦＬＥＤＡＮＱＰＳ」［注記：最後のＰからＳまでの変異はＫａｂａｔ番号付けによる３３１位であり、すなわち、本開示における変異とは異なる位置］）は、野生型ＩｇＧ１と比較して３〜５倍増大したクリアランスを有し、対応する野生型ＩｇＧ１より短い終末半減期をもたらした（国際公開第２０１４１０８４８３号パンフレット）。
【０２３６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）におけるｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の薬物動態プロファイルを調査し、ｍＡｂ１  ＩｇＧ１と比較した。５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１又はｍＡｂ１  ＩｇＧ１で静脈内注射した。１０分、６、２４、４８、９６、１２０、１４４、及び２１６時間後、ＥＤＴＡでコーティングしたｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に血液を回収し、９３００ｇで１０分間遠心分離し、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＩｇＧ１の血清レベルをＦｃ特異的サンドウィッチＥＬＩＳＡにより決定した。透明なマキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、４４０倍希釈したＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧ１捕捉抗体（Ｉ２１３４  Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。ＰＢＳ中２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした後、４０μｌのＰＢＳ及び適切な希釈度の１０μｌの血漿をアプライした。１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合したｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１又はｍＡｂ１  ＩｇＧ１を、１０，０００倍希釈されたＦｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１検出抗体（Ａ０１７０、Ｓｉｇｍａ）で検出した。アッセイをＱｕａｎｔａＲｅｄ蛍光発生基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させ、５４４ｎｍ（励起）及び５９０ｎｍ（発光）で２〜４分後に蛍光強度を測定した。ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＩｇＧ１の血漿レベルを、対応する抗体の検量線を用いて決定した。血漿中の抗体暴露量は、２１６時間にわたる片対数プロットにおいて示される。
【０２３７】
ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ１  ＩｇＧ１の薬物動態プロファイルを図９に示す。本発明に対して重要であり且つ予想外なこととして、ｍＡｂ１  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、ｍＡｂ１  ＩｇＧ１と本質的に同一である薬物動態特性を有する。
【０２３８】
実施例１０：フィノマーＧ１及びＤ５はＣＤ３３に対してフィノマーＢ３より高い親和性で結合する
ＣＤ３３特異的フィノマーＢ３（配列番号６１）、Ｇ１（配列番号３６）及びＤ５（配列番号３８）の結合を、ＣＤ３３発現Ｕ９３７細胞に対して評価した。Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１５９３．２）を懸濁培養物中で増殖させた。細胞を洗浄し、フィノマーの添加の前にＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の５％ヒト血清アルブミン及び０．２％アジ化ナトリウム）中において４℃でインキュベートした。
【０２３９】
Ｃ末端ｍｙｃ−ヘキサ−ヒスチジンタグ（配列番号８０として開示される「ヘキサ−ヒスチジン」）を有するフィノマーをコードする遺伝子を細菌発現ベクターにクローン化し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によりフィノマーを精製した。精製されたフィノマーを、ＦＡＣＳ緩衝液中において１００ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び１．５６ｎＭ濃度でＵ９３７細胞とインキュベートした。結合したフィノマーの検出を、フィノマーより４倍低いモル濃度で加えられたｍｙｃ−タグ特異的マウス抗体クローン９Ｅ１０により実施した。細胞に結合したフィノマー／９Ｅ１０複合体の検出を、２μｇ／ｍｌのロバ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により実施した。平均蛍光シグナルを、Ｇｕａｖａ  ８ＨＴ装置上でのフローサイトメトリーにより測定した。
【０２４０】
結果を図１０に示す。フィノマーＤ５は、最も高いシグナルをもたらし、フィノマーＧ１及びフィノマーＢ３がそれに続く。これは、フィノマーＤ５がＣＤ３３に対して最も高い親和性を有し、フィノマーＧ１及びフィノマーＢ３がそれに続くことを示す。結論的に、フィノマーＧ１及びＤ５は、それらのより高い親和性のためにＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂの作製に関してフィノマーＢ３を超える好ましいフィノマーとなる。
【０２４１】
実施例１１：イヌ交差反応性ＣＤ３抗体に基づき且つサイレントなＦＣ領域を有する新規の改善されたＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦＹＮＯＭＡＢは、Ｄ５  Ｎ−ＬＣ、Ｄ５  Ｃ−ＬＣ及びＧ１  Ｃ−ＬＣ構造において良好なインビトロ生物活性を示す
国際公開第２０１４１７００６３号パンフレットにおいて開示されるとおり、ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ  ＣＯＶＡ４６７は、インビトロで腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞障害を強力に誘導する。ＣＯＶＡ４６７は、残留性のＦｃＲ結合活性及び不完全なサイレンシングを有するため、ＦｃＲ依存性Ｔ細胞活性化のリスクを有するＬＡＬＡ  ＩｇＧ１と称されるＦｃ部分を保有する（本明細書の実施例３及び４を参照のこと）。さらに、ＣＯＶＡ４６７はヒト化ＣＤ３特異的抗体ｈＯＫＴ３に基づき、これはヒトＣＤ３に特異的であるが、非ヒト霊長類及び齧歯類との交差反応性を欠き、前臨床安全性試験を妨害する（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ．ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｈ．，Ｒｅｖ  Ｄｉａｂｅｔ  Ｓｔｕｄ．２０１２：９（４）：３７２−３８１）。ＣＤ３特異的抗体ＳＰ３４は、ｈＯＫＴ３と異なるＣＤ３エピトープに結合し、カニクイザルを含むいくつかの非ヒト霊長類種と交差反応性である（Ｃｏｎｒａｄ，Ｍ．Ｌ．，Ｗ．Ｃ．Ｄａｖｉｓ，ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｋｏｏｐ，  ＴＣＲ  ａｎｄ  ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ４４  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ，２００７．７１（１１）：ｐ．９２５−３３）。ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、他の抗体Ｆｃ変異体よりもサイレントであり、したがって、ＦｃＲ依存性ＣＤ３架橋及びＴ細胞活性化のリスクの低減のためにＣＤ３二重特異性標的化薬剤にとってより好適である（本明細書の実施例３及び４を参照のこと）。
【０２４２】
加えて、ＣＤ３３特異的フィノマーＧ１及びＤ５は、それらのより高い親和性のためにＣＯＶＡ４６７の設計において使用されるフィノマーＢ３よりも好ましいＣＤ３３特異的フィノマーとして同定された（本明細書の実施例１０を参照のこと）。
【０２４３】
上で強調されたＣＯＶＡ４６７の制約を克服する最適化されたＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂを作製するために、新規のＦｙｎｏｍＡｂが、サイレントなＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１形式におけるヒト化ＳＰ３４抗体ｍＡｂ４に基づいて設計された（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号１６）。ＣＤ３３特異的フィノマーＧ１及びＤ５は、（Ｇ４Ｓ）３ペプチドリンカー（配列番号４０）を介して抗体末端の各々に融合されて、以下の８種類のコンストラクトを得た：
・ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４重鎖のＮ末端に対するフィノマーＧ１の融合体）（重鎖配列番号６５；軽鎖配列番号１６）
・ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４軽鎖のＮ末端に対するフィノマーＧ１の融合体）（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号６７）
・ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４軽鎖のＣ末端に対するフィノマーＧ１の融合体）（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号２２）
・ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４重鎖のＣ末端に対するフィノマーＧ１の融合体）（重鎖配列番号６９；軽鎖配列番号１６）
・ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４重鎖のＮ末端に対するフィノマーＤ５の融合体）（重鎖配列番号７１；軽鎖配列番号１６）
・ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４軽鎖のＮ末端に対するフィノマーＤ５の融合体）（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号７３）
・ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４軽鎖のＣ末端に対するフィノマーＤ５の融合体）（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号２４）
・ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ４重鎖のＣ末端に対するフィノマーＤ５の融合体）（重鎖配列番号７５；軽鎖配列番号１６）
【０２４４】
ＦｙｎｏｍＡｂは、一過性ＣＨＯ−Ｓ培養物中で発現され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製され、インビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおいて試験された。リダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイは、エフェクター細胞としてＣＤ８＋Ｔ細胞及び標的腫瘍細胞としてＯＣＩ−ＡＭＬ５（ＤＳＭＺ；ＡＣＣ２４７）を用いて実施した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０−０９８−１９４）を用いて製造業者の推奨に従って、ネガティブ選択により健常ドナーのバフィーコートから調製した。バフィーコートは、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ  Ｂｅｒｎから得た。単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を等分し、液体窒素中で保存した。実験の日にエフェクター分子を１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｐ／Ｓ中において２００ｎＭの最大濃度に希釈し、１／１０希釈の希釈系列を調製した。標的細胞を、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｐ／Ｓ中においてウェル当たり１０，０００個の細胞密度で丸底９６ウェルプレートに播種した。凍結されたＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、回収し、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｐ／Ｓ中で再懸濁させた。次に、適切な量のエフェクター分子及びエフェクター細胞を標的細胞に加えた。最終的なエフェクター細胞と標的細胞の比は２：１であった（２０，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞と１０，０００個のＯＣＩ−ＡＭＬ−５標的細胞）。エフェクター分子の最終最大濃度は、５０ｎＭであった。最終的なアッセイ体積は、０．２ｍｇ／ｍＬの精製された組換え体ヒトＦｃγ１断片を含有する１００μＬ／ウェルであった。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で４２時間インキュベートした。
【０２４５】
ＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞の細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７２）を用いて製造業者の推奨に従って評価された。各データ点のために、三つ組のウェルを調製した。０％の生存率対照として、Ｔ細胞のみを含有するウェルが含まれ、自然溶解に関する値は、標的細胞をエフェクター細胞のみで処理することによって得られた（「自然溶解」、１００％生存率）。発光は、１０分のインキュベーション後に５００ｍｓの積分時間で測定された。
【０２４６】
細胞生存率のパーセントは、以下の式を用いて計算された：
％生存率＝（Ｅｘｐ−０％生存率）／（自然溶解−０％生存率）＊１００
式中、
Ｅｘｐ＝実験ウェル中の発光未加工シグナル
０％生存率＝０％生存率対照、上記参照
自然溶解＝自然溶解対照、上記参照
【０２４７】
％生存率を、片対数プロットにおいてエフェクター分子濃度に対してプロットし、ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びヒル勾配＝１による３パラメータシグモイド用量−反応モデルを用いて非線形曲線フィッティングにより決定した。
【０２４８】
リダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイの結果を図１１Ａに示し、ＥＣ５０値を表５に示した。
【０２４９】
【表５】
2020535819.tif 000007
【０２５０】
陰性対照として使用されるＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ４  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、予想されるとおりいずれの生物活性も示さなかった。３種類のＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、高濃度でさえ非効率的な標的細胞殺傷を引き起こすことが観察された。ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、高濃度で良好な効果を示すが、１００ｐＭを超えるＥＣ５０を有し、且つ最も高いインビトロ生物活性を有する３種類のＦｙｎｏｍＡｂより強力ではない。
【０２５１】
３種類のＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、最も高いインビトロ生物活性及び３０ｐＭ未満のＥＣ５０値を示す。
【０２５２】
ｉ）非ヒト霊長類ＣＤ３と交差反応性のＣＤ３特異的抗体、ｉｉ）全てのヒトＦｃＲに対して結合の強力な低減又は抑制を有する新規のサイレントＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、及びｉｉｉ）より高い親和性のＣＤ３３特異的フィノマーを含むいくつかの改善された設計を組み込むことは、ＣＯＶＡ４６７と比較して特色をなすが、これらの新規のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂは、インビトロで良好な活性及び高い効力を示すため、さらなる発展のための改善されたＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂとなる。
【０２５３】
ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂはさらに、ＣＤ３特異的骨格の抗体ｍＡｂ４の可変重鎖（ＶＨ）ドメインの配列を改変することによって最適化された。
【０２５４】
タンパク質の脱アミドのリスクの増大と関連するモチーフ「Ａｓｎ−Ｓｅｒ」（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＮＥ，ＰＮＡＳ（２００２）９９（８）：５２８３−８）は、ｍＡｂ４のＶＨ  ＣＤＲ３内で同定された。ｍＡｂ４  ＶＨ中の１０６位のアスパラギン残基をアスパラギン酸と置き換えて、脱アミドのリスクを軽減した。
【０２５５】
加えて、ｍＡｂ４  ＶＨ３の８２Ｂ位のアスパラギン（Ａｓｎ）からセリン（Ｓｅｒ）への変異が導入されたが（Ｋａｂａｔ番号付け）、これはこの位置でのヒトＶＨ３生殖系列遺伝子配列との類似性を増大させる。
【０２５６】
ｍＡｂ４  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１にＡｓｎ８２ＢＳｅｒ及びＡｓｎ１０６Ａｓｐの両方の変異を導入することにより作製された抗体は、ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号１６）と称される。ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１はヒト及びイヌＣＤ３に対するその親和性を保持したことが検証された（データは示さず）。
【０２５７】
上記で同定された最良のインビトロ生物活性を有する３種類のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ構造は、ＣＤ３３特異的フィノマーを抗体ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１に融合することによって作製された：
・ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ２軽鎖のＣ末端に対するフィノマーＧ１の融合体）（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号２２）
・ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ２軽鎖のＮ末端に対するフィノマーＤ５の融合体）（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号７３）
・ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（ｍＡｂ２軽鎖のＣ末端に対するフィノマーＧ１の融合体）（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号２４）
【０２５８】
ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂは、一過性ＣＨＯ−Ｓ培養物中で発現され、精製され、インビトロＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおいて評価された。アッセイは、上のｍＡｂ４に基づくＦｙｎｏｍＡｂに関して記載されたとおりに実施されたが、ヒトＫＧ−１細胞（ＤＳＭＺ；ＡＣＣ  １４）を標的細胞として使用した。加えて、アッセイは、２ｍｇ／ｍｌの精製された組換え体ヒトＦｃγ１断片の存在下及びウェル当たり１８０μｌ体積で実施された。ＫＧ−１細胞の細胞生存率はフローサイトメトリーにより決定された。フローサイトメーターに基づくアッセイにおいて標的とエフェクター細胞を識別するために、ＫＧ−１標的細胞を、Ｔ細胞及び試験化合物とのインキュベーションの前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃ３４５５７）で標識化した。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、続いて抗ヒトＣＤ８  ＰＥ、抗ヒトＣＤ２５ＦＩＴＣ及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能な近ＩＲ（ＬＤｎｒ）染料の混合物を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）中において暗所にて４℃で２０分間染色した。単一染色及び非染色対照が含まれた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、ＰＢＳ及び０．５％ＦＢＳ中の１．８５％ホルマリン中において４℃で１５分間固定し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。染色された試料を、ＦＡＣＳ分析まで４℃で一晩保存した。ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０上で、ウェル当たり４９μＬのフローサイトメトリー取得を実施した。単一染色対照を用いて補正を調整した。ＦＡＣＳデータ分析のためにＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、Ｘ  １０．０．７ｒ２）ソフトウェアを使用した。残りの腫瘍細胞生存率を評価するために、「細片なし」ゲートをＦＳＣ  Ａ対ＳＳＣ−Ａドットプロット上に設定して、細胞片を除外した。このゲートから、「単一細胞」ゲートをＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈドットプロット上に設定して、ダブレット及び細胞クラスターを除外した。「単一細胞」ゲートから、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び腫瘍細胞（ＣＴＶ＋細胞）を分離した。腫瘍細胞の相対的な生存を決定するために、腫瘍細胞集団における生存細胞（ＬＤｎｒ−／ＣＴＶ＋）のパーセンテージを決定した。以下の式を使用して、各プレート上に存在し、且つ１００％生存率として定義された自然溶解対照ウェルの生存細胞（化合物を含まない腫瘍細胞及びＴ細胞；三つ組）の平均のパーセンテージに対して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ中においてデータを標準化した。
％生存率＝（ＬＤｎｒ−／ＣＤＶ＋腫瘍細胞の％）／（自然溶解対照（ｎ＝３）中のＬＤｎｒ−／ＣＤＶ＋腫瘍細胞の平均％）＊１００
【０２５９】
％生存率を、片対数プロットにおいてエフェクター分子濃度に対してプロットし、ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びヒル勾配＝１による３パラメータシグモイド用量−反応モデルを用いて非線形曲線フィッティングにより決定した。
【０２６０】
リダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイの結果を図１１Ｂに示し、ＥＣ５０値を表６に示した。
【０２６１】
【表６】
2020535819.tif 000008
【０２６２】
３種類のＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、４０ｐＭ未満のＥＣ５０値を有してインビトロで高度に活性である。陰性対照として使用されるＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、いずれの活性も示さなかった。これらの結果は、ＣＤ３特異的抗体の抗原結合ドメイン中に導入される２つの変異が、インビトロ生物活性に負の影響を及ぼさなかったことを示す。
【０２６３】
実施例１２：新規の改善されたＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦＹＮＯＭＡＢの生物物理学的特性及び安定性評価
最良のインビトロ生物活性を示した３種類のＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂ−ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１−の生物物理学的特性及び安定性を特徴付けるために、単分散度に関してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、粒径、多分散及び質量分布に関して動的光散乱（ＤＬＳ）、並びに熱安定性に関して示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって、コンストラクトを評価した。さらに、１０ｍｇ／ｍｌの化合物濃度で化合物を４０℃の熱ストレスに２週間暴露した後、ＳＥＣ分析を行うことによって、安定性を評価した。
【０２６４】
ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ  ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、０．７ｍＬ／分の流速でＴＳＫｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｇ３ＳＷｘＬカラム（ＴＯＳＯＨ）及びガードカラム上で実施し、吸光度を２８０ｎｍでモニターした。データ分析を、Ｅｍｐｏｗｅｒ  ３ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）で実施した。単量体ピーク前に溶出するピークは、凝集体として定義された。
【０２６５】
ＤＬＳを、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーＤＬＳ装置（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で実施した。試料を、透明な平底の３８４ウェル黒色ポリスチレンプレート中において２３℃で分析した。測定を、三つ組において各ウェル当たり２０回の取得で実施して、流体力学的半径Ｒｈ、多分散（％Ｐｄ）及び質量分布（％質量）を決定した。
【０２６６】
ＤＳＣを、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ａｕｔｏ  ＶＰ−キャピラリーＤＳＣシステム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施した。各分析を、１５分の前スキャン時間、１０秒のフィルタリング期間及び１℃／分の速度で２５℃〜９５℃の温度勾配にて実施した。データを、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  ７ソフトウェアを使用して分析した。
【０２６７】
３種類のＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂ及び親ＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１は、＞９６％の高い単量体含量及び４％以下のわずかな凝集体含量を有することがＳＥＣにより観察された（表７）。
【０２６８】
【表７】
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【０２６９】
ＤＬＳ分析は、全ての試験された化合物が、予測された範囲内の流体力学的半径（Ｒｈ）、多分散（％Ｐｄ）及び質量分布を有し、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１についてのＲｈ及び％Ｐｄに関しては若干の上昇があったが依然として正常な範囲であったことを示した（表８）。
【０２７０】
【表８】
2020535819.tif 000010
【０２７１】
同様の推移が、３種類のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ及び親ＣＤ３特異的抗体に関してＤＳＣにより観察された。ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１に関して決定された総エンタルピー（ΔＨ）（ΔＨ＝４５７０８５ｃａｌ／ｍｏｌ）は、他の２種類のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ（ΔＨ＝５５８７６５及び５９１３００ｃａｌ／ｍｏｌ）又は親ＣＤ３  ｍＡｂ（ΔＨ＝５１００３０ｃａｌ／ｍｏｌ）より低かったが、このことは、ｍＡｂ２軽鎖のＮ末端上へのフィノマーＤ５の融合が構造を不安定化し、それにより他の２種類のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂより低い熱安定性を有するＦｙｎｏｍＡｂもたらしたことを示している（表９）。
【０２７２】
【表９】
2020535819.tif 000011
【０２７３】
熱ストレス（４０℃で２週間）への暴露後のＳＥＣ分析は、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１に関して、熱ストレス後に％凝集体含量が３．９％から２８．９％に増大したことを実証した。他の２種類のＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂ又は親ＣＤ３特異的ｍＡｂに関しては、熱ストレス後の著しい変化は観察されなかった。
【０２７４】
結論的に、ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１が良好な生物学的特性及び安定性を示した一方で、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の詳細な分析により、予想外且つ他の２種類の分析されたＦｙｎｏｍＡｂと比較して非常に類似した組成及び高い配列同一性であるにもかかわらず、このＦｙｎｏｍＡｂが熱ストレス下で凝集する傾向を有することが明らかになった。この発見はさらに、これらの生体分子に関する特性のセットの予測不能性を例証し、且つさらなる発展のためのｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の可能性に負の影響を及ぼす。
【０２７５】
実施例１３：新規の改善されたＣＤ３／ＣＤ３３  ＦＹＮＯＭＡＢはマウスにおいて抗体様ＰＫを有する
ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１、ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧの薬物動態プロファイルを、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて調査した。群当たり５頭のマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ化合物で静脈内注射した。１０分、６時間、２４時間、２、４、７、１０、１４、２１、及び２８日後に、伏在静脈からＥＤＴＡでコーティングしたｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に血液を回収し、９３００ｇで１０分間遠心分離し、化合物の総血漿濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２７６】
マキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした後、５０μｌの試験血漿（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中において１：２５００で希釈）をアプライした。１時間のインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、結合した化合物を、Ｆｃ特異的抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。アッセイをＱｕａｎｔａＲｅｄ蛍光発生基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で２分間発色させ、５５２ｎｍ（励起）及び６０７ｎｍ（発光）で蛍光強度を測定した。血清濃度を、３種類の化合物（０．０４％マウス血漿を含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ中において３００〜０．４１ｎｇ／ｍｌに希釈された）の各々に関する検量線を用いて決定した。濃度を、ソフトウェアのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおける４パラメータロジスティック回帰分析を用いて計算し、ｘ軸上の注射後時間に対して対数のｙ軸上にプロットした。終末半減期の値を、「二相減衰」モデルを使用してソフトウェアのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて計算した。
【０２７７】
結果：
図１２は、マウスにおける静脈内ボーラス注射後のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂの血漿濃度を示す。終末期排出相から決定された半減期の値を表１０に示す。
【０２７８】
【表１０】
2020535819.tif 000012
【０２７９】
結果は、ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１が予想外にも、他の２種類のＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂより短い半減期及び低い暴露量を有し、それによってより悪い薬物動態プロファイルを有することを示す。結果はまた、ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１が、通常のＩｇＧ抗体と同様の好ましい薬物動態プロファイルを示すことを示す。
【０２８０】
実施例１４：新規の改善されたＣＤ３／ＣＤ３３  ＦＹＮＯＭＡＢはインビボで強力な抗腫瘍活性を示す
二重特異性ＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂのｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１の抗腫瘍効果を、雌ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｉｄ（ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ）マウスにおけるＨＬ−６０異種移植モデルにおいて調査した。基準分子として、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体と同様の形式におけるＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性タンデム単鎖Ｆｖ、ＣＤ３／ＣＤ３３（ｓｃＦｖ）２（ＣＯＶＡ４６３：配列番号７７）を使用した。親ＣＤ３特異的抗体であるｍＡｂ２  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１を、陰性対照として使用した。マウスＮＫ細胞は、腫瘍接種の１日前に抗ＧＭ１抗体を使用してマウスにおいて枯渇させられた。群当たり５〜６頭のマウスに、乳房脂肪体に近い右側腹部において、１×１０６個の増殖し、事前に活性化されたヒト全Ｔ細胞と混合された２×１０６個のＨＬ−６０  ＡＭＬ細胞を皮下注射した。腫瘍接種後１日目から開始して、マウスを、３種の異なる用量レベル、５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇでボーラス静脈内注射によってＦｙｎｏｍＡｂ又は親抗体により３日毎に治療した。合計５回の注射が施された。ＣＤ３／ＣＤ３３（ｓｃＦｖ）２治療は、０．５又は０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＦｙｎｏｍＡｂ用量と等モル用量である０．１６ｍｇ／ｋｇ又は０．０１６ｍｇ／ｋｇで合計１５回の注射のために静脈内注射により毎日施された。ＣＤ３／ＣＤ３３（ｓｃＦｖ）２は、ＦｙｎｏｍＡｂと比較して半減期が短いためより頻繁に投与された。腫瘍サイズは、１週間に３回のキャリパー測定により決定され、腫瘍体積は、式：長さ×幅２×０．５に従って計算された。
【０２８１】
結果：
図１３Ａは、ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ治療マウスの平均腫瘍体積＋／−平均についての標準誤差（ＳＥＭ）を示す。図１３Ｂは、治療毎にグループ化された個々のマウスの腫瘍増殖曲線を示す。
【０２８２】
結果は、ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１が、全ての試験用量レベルで強力な抗腫瘍活性を有することを示す。腫瘍増殖は、３倍頻繁な投与により治療されたＣＤ３／ＣＤ３３（ｓｃＦｖ）２マウスにおけるものよりもＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂで治療されたマウスにおいて、より少ない頻度で観察された。
【０２８３】
実施例１５：ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有するＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂは、ＦｃγＲ結合の低減を示す
ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１のＦｃγＲ結合を、実施例４において記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイにおいて決定した。
【０２８４】
ＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂのＦｃγＲ結合は、ＣＯＶＡ４６７（重鎖配列番号２６；軽鎖配列番号２８）であって、ＣＤ３３特異的フィノマーＢ３をＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ３軽鎖のＣ末端に融合することによって作製された、ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  Ｆｃ（すなわち、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃ）を有する以前に記載されたＣＤ３／ＣＤ３３  ＦｙｎｏｍＡｂと比較された（国際公開第２０１４１７００６３号パンフレットを参照のこと）。Ｂ２１Ｍ  ＩｇＧ１は、陽性対照として機能した（実施例４を参照のこと）。
【０２８５】
結果を図１４に示す。ＣＯＶＡ４６７が、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩに対して残留性の結合を示した一方で（それぞれ、ＩＣ５０＝３９０ｎＭ及び２９ｎＭ）、ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有する２種類のＦｙｎｏｍＡｂは、ＣＯＶＡ４６７と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡに対していかなる結合も示さず、且つＦｃγＲＩに対する結合を強力に低減した（それぞれ、ＩＣ５０＝２０６ｎＭ又は８００ｎＭ）。ＦｃγＲＩＩＡ及びＢに対する著しい結合は、これらのコンストラクトについては見出されなかった。
【０２８６】
これらの結果は、ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有するＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂ  ｍＡｂ２  Ｇ１  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１及びｍＡｂ２  Ｄ５  Ｃ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１が、ＣＯＶＡ４６７と比較してＦｃγＲ結合の低減を示すことを実証する。したがって、それらは、望ましくないｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ  Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導する可能性を低減し、ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂの改善された変異体となる。
【０２８７】
【表１１】
2020535819.tif 000013
【０２８８】
【表１２】
2020535819.tif 000014
【０２８９】
【表１３】
2020535819.tif 000015
【０２９０】
【表１４】
2020535819.tif 000016
【０２９１】
【表１５】
2020535819.tif 000017
【０２９２】
【表１６】
2020535819.tif 000018
【０２９３】
【表１７】
2020535819.tif 000019
【０２９４】
【表１８】
2020535819.tif 000020
【０２９５】
【表１９】
2020535819.tif 000021
【０２９６】
【表２０】
2020535819.tif 000022
【０２９７】
【表２１】
2020535819.tif 000023
【０２９８】
【表２２】
2020535819.tif 000024
【０２９９】
【表２３】
2020535819.tif 000025
【０３００】
【表２４】
2020535819.tif 000026
【０３０１】
【表２５】
2020535819.tif 000027
【０３０２】
【表２６】
2020535819.tif 000028
【０３０３】
【表２７】
2020535819.tif 000029
【０３０４】
【表２８】
2020535819.tif 000030
【０３０５】
【表２９】
2020535819.tif 000031
【０３０６】
【表３０】
2020535819.tif 000032
【０３０７】
【表３１】
2020535819.tif 000033
【０３０８】
【表３２】
2020535819.tif 000034
【０３０９】
【表３３】
2020535819.tif 000035
【０３１０】
【表３４】
2020535819.tif 000036
【０３１１】
【表３５】
2020535819.tif 000037
【０３１２】
【表３６】
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【図１】
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【図２】
2020535819.tif 000040
【図３−１】
2020535819.tif 000041
【図３−２】
2020535819.tif 000042
【図４−１】
2020535819.tif 000043
【図４−２】
2020535819.tif 000044
【図４−３】
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【図４−４】
2020535819.tif 000046
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月20日(2020.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子であって、
配列番号３６又は配列番号３８を含むＣＤ３３結合ポリペプチドを含み、これが、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合し、その抗体が、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なるＣＨ２ドメインを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含み、ここで番号付けはＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される、二重特異性結合分子。
【請求項２】
ｉ．２６５位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｉｉ．２９７位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ
ｉｉｉ．３２９位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）である、請求項１に記載の二重特異性結合分子。
【請求項３】
前記ＣＤ３３結合ポリペプチドが、配列番号３８を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性結合分子。
【請求項４】
前記ＣＤ３３結合ポリペプチドが、ペプチドリンカー、好ましくは配列番号４０を含むペプチドリンカーを介して前記抗体の前記軽鎖のＣ末端に共有結合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項５】
前記抗体の前記Ｆｃ領域が、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のアミノ酸Ｎ及び３２９位のアミノ酸Ｐが、他のアミノ酸により置き換えられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項６】
配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、及び配列番号２４又は配列番号２２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１４又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項８】
配列番号１４及び配列番号２４を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項９】
配列番号１４及び配列番号２２を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項１０】
以下の特性：
（ａ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、好ましくはＦｃγＲＩに対する結合の低減；
（ｂ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、同様の親和性を有するヒトＦｃＲｎに対する結合；
（ｃ）次の二重特異性ＣＤ３／３３ＦｙｎｏｍＡｂ：重鎖配列番号６５及び軽鎖配列番号１６を有するｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１；重鎖配列番号６３及び軽鎖配列番号６７を有するｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１；重鎖配列番号６９及び軽鎖配列番号１６を有するｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１；重鎖配列番号７１及び軽鎖配列番号１６を有するｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１；並びに重鎖配列番号７５及び軽鎖配列番号１６を有するｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１のいずれかと比較して、インビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおけるより良好な生物活性（より低いＥＣ５０値として測定される）；
（ｄ）重鎖配列番号１４及び軽鎖配列番号７３を有するｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１より良好な熱安定性；
（ｅ）マウスにおける静脈内注射後１０日を超える終末半減期；及び
（ｆ）配列番号７７を有するＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性結合分子ＣＯＶＡ４６３の等モル用量の同じ経路を介する１日１回の投与と比較して、３日当たり１回の静脈内注射を介する投与後のインビボマウスモデルにおける向上した抗腫瘍活性のうちの１つ以上を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子をコードする１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド若しくは請求項１２に記載の１つ以上のベクターを含む、インビトロの又はトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物に属する、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
癌を治療するのに用いるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、又は請求項１２に記載の１つ以上のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組換え体二重特異性結合分子を作製するための方法であって、インビトロの又はトランスジェニック非ヒト動物若しくはトランスジェニック植物における宿主細胞中で請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチドを発現させること、及び組換え体ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項１８】
癌を治療するのに用いるための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌を治療するための医薬品の製造のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、請求項１１に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、請求項１２に記載の１つ以上のベクター、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、請求項２０に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１２】
【表３６】
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以下の態様を包含し得る。
［１］  ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する二重特異性結合分子であって、
配列番号３６又は配列番号３８を含むＣＤ３３結合ポリペプチドであって、これが、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合し、その抗体が、番号付けがＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なるＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含むＣＤ３３結合ポリペプチドを含む、二重特異性結合分子。
［２］  ｉ．２６５位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｉｉ．２９７位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ
ｉｉｉ．３２９位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）である、上記［１］に記載の二重特異性結合分子。
［３］  前記ＣＤ３３結合ポリペプチドが、配列番号３８を含む、上記［１］又は［２］に記載の二重特異性結合分子。
［４］  前記ＣＤ３３結合ポリペプチドが、好ましくは配列番号４０を含むペプチドリンカーを介して前記抗体の前記軽鎖のＣ末端に共有結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［５］  前記抗体の前記Ｆｃ領域が、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のＮ及び３２９位のＰが、他のアミノ酸により置き換えられる、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［６］  配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、及び配列番号２４又は配列番号２２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［７］  前記抗体が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１４又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［８］  配列番号１４及び配列番号２４を含む、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
［９］  配列番号１４及び配列番号２２を含む、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［１０］  以下の特性：
（ａ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、好ましくはＦｃγＲＩに対する結合の低減；
（ｂ）２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有する同じＩｇＧ１  Ｆｃ含有分子と比較して、同様の親和性を有するヒトＦｃＲｎに対する結合；
（ｃ）次の二重特異性ＣＤ３／３３  ＦｙｎｏｍＡｂ：ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６５；軽鎖配列番号１６）；ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６３；軽鎖配列番号６７）；ｍＡｂ４  Ｇ１  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号６９；軽鎖配列番号１６）；ｍＡｂ４  Ｄ５  Ｎ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号７１；軽鎖配列番号１６）；及びｍＡｂ４  Ｄ５  Ｃ−ＨＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号７５；軽鎖配列番号１６）のいずれかと比較して、インビトロでリダイレクトされたＴ細胞媒介性細胞障害アッセイにおけるより良好な生物活性（より低いＥＣ５０値として測定される）；
（ｄ）ｍＡｂ２  Ｄ５  Ｎ−ＬＣ  ＤＡＮＡＰＡ  ＩｇＧ１（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号７３）より良好な温度安定性；
（ｅ）マウスにおける静脈内注射後１０日を超える終末半減期；及び
（ｆ）ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性結合分子ＣＯＶＡ４６３（配列番号７７）の等モル用量の同じ経路を介する１日１回の投与と比較して、３日当たり１回の静脈内注射を介する投与後のインビボマウスモデルにおける向上した抗腫瘍活性のうちの１つ以上を有する、上記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［１１］  上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子をコードする１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド。
［１２］  上記［１１］に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター。
［１３］  上記［１１］に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド又は上記［１２］に記載の１つ以上のベクターを含む宿主細胞。
［１４］  上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
［１５］  必要とする患者に、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、上記［１１］に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、上記［１２］に記載の１つ以上のベクター、又は上記［１４］に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
［１６］  前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若しくは多発性骨髄腫（ＭＭ）、又はＣＤ３３を発現する骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む固形腫瘍である、上記［１５］に記載の方法。
［１７］  組換え体二重特異性結合分子を作製するための方法であって、宿主細胞中で上記［１１］に記載の１つ以上の組換え体ポリヌクレオチドを発現させること及び前記組換え体ポリペプチドを回収することを含む方法。
【国際調査報告】
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2020535819.tif 000062
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