(57)【要約】  本発明は、核酸のシークエンシングおよび他の応用のための組成物および方法を提供する。シークエンシングバイシンセシスにおいて、非標識リバーシブルターミネーターが、各サイクルにおいてポリメラーゼにより組み込まれ、組込み後に、直接的または間接的に標識された抗体または他の親和性試薬をリバーシブルターミネーターに結合させることにより標識される。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー伸長産物の３’末端における３’−Ｏ−リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの組込みを検出する方法であって、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、前記方法が、
（ａ）（ｉ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む前記プライマー伸長産物および（ｉｉ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬を組み合わせることであって、前記第１の親和性試薬が、前記核酸塩基、前記切断可能なブロッキング基、または両方に結合する、前記組み合わせること、および
（ｂ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の親和性試薬が前記糖部分に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の親和性剤が前記核酸塩基および前記切断可能なブロッキング基に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の親和性試薬が前記核酸塩基および前記糖部分に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸塩基が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）から選択される天然核酸塩基である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第１の親和性試薬が、
ａ）デオキシリボヌクレオチドグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからアデニン（Ａ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｂ）組み込まれたリバーシブルターミネーターＴ、Ｃ、またはＡからＧを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｃ）Ｇ、Ｃ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＴを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｄ）デオキシリボヌクレオチドグアニンＧ、Ｔ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＣを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド
を識別する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸塩基が核酸塩基アナログである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記核酸塩基が、アデニンアナログ（Ａ’）、グアニンアナログ（Ｇ’）、チミンアナログ（Ｔ’）またはシトシンアナログ（Ｃ’）であり、かつ、前記第１の親和性剤が、対応する天然核酸塩基を含む組み込まれたヌクレオチドへの結合と比べて前記アナログを含む組み込まれたヌクレオチドに優先的に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の親和性剤が前記切断可能なブロッキング基に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｄ）において、前記プライマー伸長産物が、異なる結合特異性を有する２〜４つの親和性試薬と組み合わせられ、かつ、１つの親和性試薬が、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する、請求項１または請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つの親和性試薬による結合が前記核酸塩基を同定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｄ）前記切断可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチドを生じさせることをさらに含む、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１３】
プライマー伸長産物の３’末端における３’−Ｏ−リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの組込みを検出する方法であって、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、前記方法が、
（ａ）前記３’末端において３’−Ｏ−リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含むプライマー伸長製造（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｅ）を生じさせること；
（ｂ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記切断可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨ部分を含む３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチド伸長産物を生じさせること；
（ｃ）前記（ｂ）の伸長産物を前記３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチド伸長産物に結合する第１の親和性試薬と組み合わせることであって、前記第１の親和性試薬が前記核酸塩基および３’−ＯＨ部分に結合する、前記組み合わせること、および
（ｄ）前記伸長産物への前記第１の親和性試薬の結合を検出すること
を含む、方法。
【請求項１４】
（ｃ）前記第１の親和性試薬を除去することをさらに含む、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断可能なブロッキング基が、アジドメチル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、メチルカルボノエテニル、アセトカルボノエテニル、アミドエチレニル、メチルアミドエチレニル、ジメチルアミドエチレニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、３−オキソブタ−１−イニル、および３−メトキシ−３−オキソプロパ−１−イニル、または以上のいずれかのアナログからなる群から選択される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の親和性試薬が抗体である、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の親和性試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートまたは結合されており、かつ、工程（ｂ）における前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記親和性試薬の結合を検出することが、前記検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の親和性試薬が標識されておらず、かつ、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出する前記工程が、（ｉ）前記第１の親和性試薬に１つまたは複数の二次親和性試薬を結合させることであって、前記二次親和性試薬が検出可能な標識を含む、前記結合させることを含み、かつ、（ｉｉ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出することが、前記検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の親和性試薬および前記第２の親和性試薬が工程（ａ）の前に組み合わせられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の親和性試薬が、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する一次抗体であり、かつ、前記１つまたは複数の二次親和性試薬が、前記一次抗体に結合する１つまたは複数の二次抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出可能な標識が蛍光または化学発光シグナルを生じさせる、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
シークエンシングバイシンセシス反応を行う方法であって、
（ａ）複数の異なる配列を含む複数の固定化された鋳型核酸を提供する工程；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを前記鋳型核酸にアニールさせる工程であって、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記鋳型核酸上の予め決定された位置にハイブリダイズする、前記アニールさせる工程；
（ｃ）前記鋳型核酸およびそれにアニールしたプライマーをポリメラーゼおよび４つのリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と組み合わせる工程であって、各デオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基（Ｎ）、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、
Ｎが、アデニン（Ａ）またはそのアナログ（Ａ’）、グアニン（Ｇ）またはそのアナログ（Ｇ’）、チミン（Ｔ）またはそのアナログ（Ｔ’）、およびシトシン（Ｃ）またはそのアナログ（Ｃ’）であり、
前記４つのｄＮＴＰの少なくとも１つが非標識であり、
前記組み合わせる工程が、複数の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、単一のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの組込みにより伸長されて複数のプライマー伸長産物を生じさせる条件下で行われ、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＡまたはＡ’を含み、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＴまたはＴ’を含み、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＧまたはＧ’を含み、かつ、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＣまたはＣ’を含む、前記組み合わせる工程；
（ｄ）前記複数のプライマー伸長産物を１つまたは複数の第１の親和性試薬と、前記１つまたは複数の第１の親和性試薬のそれぞれが、前記４つの組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの１つのみに結合する条件下で接触させる工程であって、前記第１の親和性試薬が、４つの組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記１つの、前記核酸塩基、前記糖部分、前記切断可能なブロッキング基またはこれらの組合せに結合する、前記接触させる工程；
（ｅ）前記１つまたは複数の第１の親和性試薬の結合を検出する工程であって、組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含むプライマー伸長産物への第１の親和性試薬の結合が、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記核酸塩基に相補的な前記鋳型ヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の前記核酸塩基に相補的な前記鋳型中の前記組み込まれたリバーシブルターミネーテッドデオキシリボヌクレオチド（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の前記核酸塩基を同定する、前記検出する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ｄＮＴＰの全てが非標識である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｄ）および工程（ｅ）において、２つ、３つ、または４つの第１の親和性試薬が使用される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｆ）前記第１の親和性試薬を除去することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
（ｇ）前記切断可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチドを生じさせることをさらに含む、請求項２２〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）〜（ｇ）を所望の回数のサイクルにわたり繰り返して、前記鋳型中の追加のヌクレオチドを同定することを含み、工程（ｃ）における前記プライマーが、先行するサイクルのプライマー伸長産物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記所望の回数のサイクルが２５回またはそれより多い、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の親和性試薬が抗体である、請求項２２〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
４つのｄＮＴＰが非標識であり、かつ、工程（ｃ）において、４つの第１の親和性試薬が使用され、前記４つの第１の親和性試薬のそれぞれが、前記４つの組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの１つに特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）において、前記第１の親和性試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートまたは結合されており、かつ、工程（ｄ）において、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出することが、前記検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む、請求項２２〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｄ）において、前記第１の親和性試薬が標識されておらず、かつ、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出する前記工程が、（ｉ）１つまたは複数の二次親和性試薬を各第１の親和性試薬に結合させることを含み、各二次親和性試薬が、検出可能な標識を含み、かつ（ｉｉ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出することが、前記検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１および第２の親和性試薬が抗体であり、かつ、各第１の親和性試薬が、組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する一次抗体であり、かつ、各二次親和性試薬が、１つの一次抗体の二次抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対応する組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの各第１の親和性試薬の結合が、区別可能な検出可能なシグナルを結果としてもたらす、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記区別可能な検出可能なシグナルが蛍光または化学発光シグナルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記区別可能な検出可能なシグナルが、色または強度の差異により区別される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の親和性試薬が前記糖部分に結合する、請求項２２〜３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の親和性剤が前記核酸塩基および前記切断可能なブロッキング基に結合する、請求項２２〜３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の親和性試薬が前記核酸塩基および前記糖部分に結合する、請求項２２〜３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸塩基が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）から選択される天然核酸塩基である、請求項２２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の親和性試薬が、
ａ）デオキシリボヌクレオチドグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからアデニン（Ａ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｂ）組み込まれたリバーシブルターミネーターＴ、Ｃ、またはＡからＧを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｃ）Ｇ、Ｃ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＴを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｄ）デオキシリボヌクレオチドグアニンＧ、Ｔ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＣを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド
を識別する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸塩基が核酸塩基アナログである、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸塩基が、アデニンアナログ（Ａ’）、グアニンアナログ（Ｇ’）、チミンアナログ（Ｔ’）またはシトシンアナログ（Ｃ’）であり、かつ、前記第１の親和性剤が、対応する天然核酸塩基を含む組み込まれたヌクレオチドへの結合と比べて前記アナログを含む組み込まれたヌクレオチドに優先的に結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の親和性剤が前記切断可能なブロッキング基に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｄ）において、前記プライマー伸長産物が、異なる結合特異性を有する２〜４つの親和性試薬と組み合わせられ、かつ、１つの親和性試薬が、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する、請求項２２〜３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つの親和性試薬による結合が前記核酸塩基を同定する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が、第１の核酸塩基を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドと第２の核酸塩基を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドとを互いから識別し、
ａ）前記第１の核酸塩基がアデニン（Ａ）であり、かつ、前記第２の核酸塩基が、Ｔと塩基対形成しかつＡとは異なるＡアナログであり；
ｂ）前記第１の核酸塩基がグアニン（Ｇ）であり、かつ、前記第２の核酸塩基が、Ｃと塩基対形成しかつＧとは異なるＧアナログであり；
ｃ）前記第１の核酸塩基がチミン（Ｔ）であり、かつ、前記第２の核酸塩基が、Ａと塩基対形成しかつＴとは異なるＴアナログであり；または
ｄ）前記第１の核酸塩基がシトシン（Ｃ）であり、かつ、前記第２の核酸塩基が、Ｇと塩基対形成しかつＣとは異なるＣアナログである、
請求項２２に記載の方法。
【請求項４８】
前記親和性試薬が、第１の切断可能なブロッキング基と１つまたは複数の第２の切断可能なブロッキング基とを識別し、前記第１および第２の切断可能なブロッキング基が、アジドメチル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、メチルカルボノエテニル、アセトカルボノエテニル、アミドエチレニル、メチルアミドエチレニル、ジメチルアミドエチレニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、およびアミドエチレニルからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、
ａ）デオキシリボヌクレオチドグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからアデニン（Ａ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｂ）組み込まれたリバーシブルターミネーターＴ、Ｃ、またはＡからＧを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｃ）Ｇ、Ｃ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＴを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
ｄ）デオキシリボヌクレオチドグアニンＧ、Ｔ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＣを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド
を識別する、請求項２２に記載の方法。
【請求項５０】
プライマー伸長産物の３’末端においてシークエンシングバイシンセシスデオキシリボヌクレオチドを行う方法であって、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、前記方法が、
（ａ）前記３’末端において３’−Ｏ−リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含むプライマー伸長製造を生じさせること；
（ｂ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記切断可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチド伸長産物を生じさせること；
（ｃ）前記（ｂ）の伸長産物を前記３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチド伸長産物に特異的に結合する第１の親和性試薬と組み合わせることであって、前記第１の親和性試薬が前記核酸塩基および３’ＯＨ部分に特異的に結合する、前記組み合わせること、および
（ｄ）前記伸長産物への前記第１の親和性試薬の結合を検出すること
を含む、方法。
【請求項５１】
（ｅ）前記第１の親和性試薬を除去することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
核酸をシークエンシングする方法であって、
（ａ）前記核酸を含む核酸鋳型、前記鋳型の部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化１】
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（式中、
Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートからなる）の非標識ＲＴを、前記プライマーが伸長されて前記核酸鋳型に相補的な配列に前記非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、前記ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｂ）前記非標識伸長産物を、検出可能な標識を含む親和性試薬と、前記親和性試薬が前記ＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、前記ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせること；および
（ｃ）前記標識された伸長産物中の前記ＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、方法。
【請求項５３】
（ｄ）前記ＲＴから前記除去可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨを生じさせること；および
（ｅ）前記親和性試薬を前記ＲＴから除去すること
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）〜（ｃ）を１回または複数回繰り返すことをさらに含み、前記核酸鋳型の配列の少なくとも一部分が決定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記除去可能なブロッキング基および前記親和性試薬を同じ反応において除去することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記親和性試薬が抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記標識が蛍光標識である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
Ｒ１が、アリル、アジドメチル、アミノアルコキシル、２−シアノエチル、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアルケニル、非置換ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルキニル、非置換ヘテロアルキニル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、アセトエテニル、メチルカルボノエテニル、アミドエテニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、アミノ、シアノエテニル、シアノエチル、アルコキシ、アシル、メトキシメチル、アミノキシル、カルボニル、ニトロベンジル、クマリニル、およびニトロナフタレニルからなる群から選択される、請求項５０または５２に記載の方法。
【請求項５９】
Ｒ２が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）から選択される核酸塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
核酸をシークエンシングする方法であって、
（ａ）（ｉ）複数の鋳型ＤＮＡ分子を含むＤＮＡアレイを提供することであって、各鋳型ＤＮＡ分子が、前記核酸の断片を含み、前記複数の鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれが、前記アレイの位置において取り付けられている、前記提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡアレイを前記鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれの部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化２】
2020508037.tif 000030
（式中、
Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートからなる）の非標識ＲＴと、前記プライマーが伸長されて前記複数の前記鋳型ＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な配列に前記非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、前記ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｃ）前記非標識伸長産物を、検出可能な標識を含む親和性試薬と、前記親和性試薬が前記ＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、前記ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせること；および
（ｄ）前記標識された伸長産物中の前記ＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、方法。
【請求項６１】
（ａ）前記ＤＮＡアレイを、前記鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれの部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、ならびにＲ２がＡである第１のＲＴ、Ｒ２がＴである第２のＲＴ、Ｒ２がＣである第３のＲＴ、およびＲ２がＧである第４のＲＴを含む式Ｉの非標識ＲＴのセットと、前記プライマーが伸長されて前記複数の前記鋳型ＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な配列に前記非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、前記ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｂ）前記非標識伸長産物を親和性試薬のセットと、前記親和性試薬のセットが前記ＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、前記ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせることであって、（ｉ）前記親和性試薬のセットが、前記第１のＲＴに特異的に結合する第１の親和性試薬、前記第２のＲＴに特異的に結合する第２の親和性試薬、前記第３のＲＴに特異的に結合する第３の親和性試薬、および適宜、前記第４のＲＴに特異的に結合する第４の親和性試薬を含み；（ｉｉ）前記第１、第２、および第３の親和性試薬のそれぞれが、検出可能な標識を含む、前記生じさせること；および
（ｃ）前記アレイ上の各々の位置において前記ＲＴに結合した前記親和性試薬の前記標識を同定することにより前記標識された伸長産物中の前記ＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
各ＤＮＡ分子が前記アレイの位置において取り付けられている、複数の鋳型ＤＮＡ分子、
複数の前記位置において前記鋳型ＤＮＡ分子の部分と塩基対を形成した相補的ＤＮＡ配列であって、前記相補的ＤＮＡ配列が、その３’末端において、組み込まれた第１のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む、前記相補的ＤＮＡ配列、および
前記第１のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部に特異的に結合した第１の親和性試薬
を含む、ＤＮＡアレイ。
【請求項６３】
Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣの核酸塩基またはそのアナログを含む３’末端ヌクレオチドを有するプライマー伸長産物、および前記プライマー伸長産物に結合した親和性試薬を含む、請求項６２に記載のＤＮＡアレイ。
【請求項６４】
（ａ）式Ｉ：
【化３】
2020508037.tif 000031
（式中、
Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートを含む）の非標識リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
（ｂ）プライマー伸長産物の３’端に組み込まれたときに前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）のためのパッケージング
を含む、キット。
【請求項６５】
各リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが異なる核酸塩基を含む、複数のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド、および
各第１の親和性試薬が、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの異なる１つに特異的に結合する、複数の第１の親和性試薬
を含む、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
二次親和性試薬をさらに含む、請求項６５または６６に記載のキット。
【請求項６７】
前記第１の親和性試薬が検出可能に標識されており、かつ互いから区別することができる、請求項６４または６５に記載のキット。
【請求項６８】
前記第１の親和性試薬が抗体である、請求項６４〜６７のいずれかに記載のキット。
【請求項６９】
（ｉ）第１の天然に存在する核酸塩基またはそのアナログを含む第１のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬および（ｉｉ）第２の天然に存在する核酸塩基またはそのアナログを含む第２のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬を含み、前記第１および第２の核酸塩基が異なる、キット。
【請求項７０】
（ｉｉｉ）第３の天然に存在する核酸塩基またはそのアナログを含む第３のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬を含み、前記第１、第２および第３の核酸塩基が互いに異なる、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
（ｉｖ）第４の天然に存在する核酸塩基またはそのアナログを含む第４のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬を含み、前記第１、第２、第３および第４の核酸塩基が互いに異なる、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項６９〜７１のいずれかに記載のキット。
【請求項７３】
前記第１、第２、第３および第４の親和性試薬のそれぞれが検出可能な標識を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１、第２、および第３の親和性試薬のそれぞれが異なる検出可能な標識を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１、第２、および第３の親和性試薬のそれぞれが、異なる量または強度において同じ標識を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項７６】
（ｉ）前記親和性試薬（ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｎｔｙ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）を除去する工程；
（ｉｉ）親和性試薬の異なるセットを使用して工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す工程
をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月４日に出願された米国仮出願第６２／４４２，２６３号、および２０１７年４月２６日に出願された米国仮出願第６２／４９０，５１１号に対する優先権を主張する。これらの出願の全内容は、参照することにより全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
核酸シークエンシングおよび再シークエンシングのための低コストでハイスループットの方法の必要性は、「超並列シークエンシング」（ＭＰＳ）技術の開発に繋がった。ＤＮＡをシークエンシングするための１つの一般に使用される方法は「シークエンシングバイシンセシス」（ＳＢＳ）と称され、これは、Ronaghi et al., Science, 281:363-365, 1998；Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:414-419, 2003；Metzker, Nat Rev Genet. 11:31-46, 2010；Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:19635-19640, 2006；Bentley et al., Nature 456:53-59, 2008；ならびに米国特許第６，２１０，８９１号明細書、同第６，８２８，１００号明細書、同第６，８３３，２４６号明細書、および同第６，９１１，３４５号明細書、および米国特許出願公開第２０１６／０１３０６４７号明細書などに開示されている。
【０００３】
ＳＢＳは、シークエンシングされているオリゴヌクレオチドとは反対の正しい相補的ヌクレオチドの制御された（すなわち、１回に１つの）組込みを必要とする。これは、各ヌクレオチド残基が１回に１つシークエンシングされつつ複数のサイクルにおいてヌクレオチドを付加して、制御されない一連の組込みが発生することを防止することにより的確なシークエンシングを可能とする。１つのアプローチでは、ＤＮＡ鋳型の配列を決定するためにリバーシブルターミネーターヌクレオチド（ＲＴ）が使用される。最も一般に使用されるＳＢＳアプローチでは、各ＲＴは、（１）伸長中のＤＮＡコピー鎖の３’末端にＤＮＡポリメラーゼ酵素により単一塩基のみが付加され得ることを確実にするブロッキング基、および（２）カメラにより検出できる蛍光標識を含む修飾ヌクレオチドを含む。最も一般的なＳＢＳ法では、鋳型およびシークエンシングプライマーは固体支持体に固定され、かつ、支持体は４つのＤＮＡヌクレオチドアナログのそれぞれおよびＤＮＡポリメラーゼに曝露され、各ＤＮＡヌクレオチドアナログは、切断可能なリンカーにより含窒素塩基に取り付けられた異なるフルオロフォア、およびデオキシリボースの３’−ＯＨ位における３’−Ｏ−アジドメチル基を含む。正しい相補的な塩基のみが標的にアニールし、その後にプライマーの３’端において組み込まれる。組み込まれなかったヌクレオチドは洗浄除去され、固体支持体は画像化される。リンカーを切断してフルオロフォアを解放させるためおよび３’−Ｏ−アジドメチル基を除去して３’−ＯＨを再生させるためにＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）が導入される。次に、サイクルを繰り返すことができる（Bentley et al., Nature 456, 53-59, 2008）。４つの塩基のそれぞれのために異なる蛍光色標識が使用され、それにより、シークエンシングの各サイクルにおいて、組み込まれるＲＴの素性をその色により同定することができる。
【０００４】
ＳＢＳは広く使用されているにもかかわらず、改善がなおも必要とされる。例えば、現行のＳＢＳ法は、切断可能なリンカーを用いて接続された塩基上の標識（例えば、色素）を有する高価な可逆的に終結した（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ｄＮＴＰ（ＲＴ）を必要とし、これは結果として、ａ）組み込まれた塩基上に標識切断後に残る化学的傷跡、ｂ）効率の低い組込み、ｃ）停止、ｄ）伸長の励起された色素誘導性の終結をもたらし、各シークエンシングサイクルにおけるシグナルを低減させる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、核酸の解析およびシークエンシングのための方法および組成物に関する。ＳＢＳシークエンシング方法が本明細書において開示され、該方法では、最後に組み込まれたヌクレオチド塩基が、最後に組み込まれたヌクレオチド中の塩基、糖、切断可能なブロッキング基またはこれらの構成要素の組合せを認識する親和性試薬［例えば、抗体、アプタマー、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）など］の結合により同定される。結合は、検出可能なシグナルの産生と直接的または間接的に関連付けられる。
【０００６】
一実施形態によれば、本発明は、非標識リバーシブルターミネーター（ＮＬＲＴ）ヌクレオチドを用いるシークエンシングの方法を提供する。リバーシブルターミネーター（ＲＴ）ヌクレオチドは、伸長中のＤＮＡコピー鎖の３’末端にＤＮＡポリメラーゼ酵素により単一塩基のみが付加され得ることを確実にする除去可能なブロッキング基を含有する修飾されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはｄＮＴＰアナログである。周知の通り、ＤＮＡ合成の間の伸長中の鎖の３’末端へのｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド三リン酸）の組込みは、ピロリン酸の解放を伴い、かつｄＮＴＰがＤＮＡ鎖中に組み込まれるときに、組み込まれる部分はヌクレオチド一リン酸（またはより精密には、１つまたは２つの隣接するヌクレオチドモノマーにホスホジエステル結合により連結されるヌクレオチドモノマー）である。リバーシブルターミネーター（ＲＴ）ヌクレオチドは、伸長中のＤＮＡコピー鎖の３’末端にＤＮＡポリメラーゼ酵素により単一塩基のみが付加され得ることを確実にする除去可能なブロッキング基を含有する修飾されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはｄＮＴＰアナログである。非標識ＲＴヌクレオチドは、検出可能な標識を含有しない。シークエンシングの各サイクルにおいて、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログはポリメラーゼにより組み込まれてＤＮＡコピー鎖の３’末端を１塩基伸長させ、組み込まれなかったヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは洗浄除去される。新たに組み込まれたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのエピトープを特異的に認識してそれに結合する親和性試薬が導入される。画像が撮られた後、ブロッキング基および標識された親和性試薬はＤＮＡから除去され、シークエンシングの次のサイクルが始まることを可能とする。一部の実施形態では、親和性試薬により認識されるエピトープは、組み込まれたヌクレオシド自体（すなわち、塩基および糖）またはヌクレオシドおよび３’ブロッキング基により形成される。一部の実施形態では、親和性試薬により認識されるエピトープは、リバーシブルターミネーター自体、デオキシリボースと組み合わせてリバーシブルターミネーター、または核酸塩基もしくは核酸塩基およびデオキシリボースと組み合わせてリバーシブルターミネーターにより形成される。
【０００７】
１つのそのような実施形態によれば、本発明は、核酸をシークエンシングする方法であって、
（ａ）核酸を含む核酸鋳型、前記鋳型の部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化１】
2020508037.tif 000003
［式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）であり；Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつＲ３は、１つまたは複数のホスフェートを含むかまたはからなる］の非標識ＲＴを、プライマーが伸長されて核酸鋳型に相補的な配列に非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、組み込まれたＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；（ｂ）組み込まれたＲＴに親和性試薬が特異的に結合する条件下で非標識伸長産物を親和性試薬と接触させて、ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせること；（ｃ）親和性試薬の結合を検出すること、および（ｄ）標識された伸長産物に組み込まれたヌクレオチドを同定して、前記伸長産物、および、したがって鋳型核酸の配列の少なくとも一部分を同定することを含む、方法を提供する。
【０００８】
シークエンシングバイシンセシスのために一般に使用されるｄＮＴＰアナログにおいて、核酸塩基は、フルオロフォアなどの検出可能な標識に塩基を接続する切断可能なリンカーにコンジュゲートされる。例えば、米国特許出願公開第２００２／０２２７１３１号明細書を参照。対照的に、本発明のｄＮＴＰアナログにおいては、一般に、Ｒ２は、リンカーにより色素または他の検出可能な標識にコンジュゲートされる核酸塩基ではない。
【０００９】
別の実施形態によれば、そのような方法は、（ｄ）ＲＴからリバーシブルブロッキング基を除去して３’−ＯＨを生じさせること；および（ｅ）ＲＴから親和性試薬を除去することをさらに含む。
【００１０】
別の実施形態によれば、そのような方法は、方法の工程を１回または複数回繰り返すこと、すなわち、前記核酸鋳型の配列の少なくとも一部分が決定される複数サイクルのシークエンシングを行うことをさらに含む。
【００１１】
別の実施形態によれば、そのような方法は、同じ反応においてリバーシブルブロッキング基および親和性試薬を除去することを含む。
【００１２】
別の実施形態によれば、そのような方法は、リバーシブルブロッキング基を除去することなく親和性試薬を除去することおよび差異（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）親和性試薬を用いて再プロービングを行うことを含む。
【００１３】
そのような方法では、親和性試薬は、抗体（抗体の結合断片、単鎖抗体、二重特異的抗体などを含む）、アプタマー、ノッティン、アフィマー、または組み込まれたＮＬＲＴに好適な特異性および親和性で結合する任意の他の公知の剤を含んでもよい。一実施形態では、親和性試薬は抗体である。別の実施形態では、親和性試薬は、蛍光標識である検出可能な標識を含む抗体である。
【００１４】
一実施形態によれば、Ｒ１は、アリル、アジドメチル、アミノアルコキシル、２−シアノエチル、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアルケニル、非置換ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルキニル、非置換ヘテロアルキニル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、アセトエテニル、メチルカルボノエテニル、アミドエテニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル（ｖｉｎｙｌｏｅｔｈｅｎｙｌ）、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、アミノ、シアノエテニル、シアノエチル、アルコキシ、アシル、メトキシメチル、アミノキシル、カルボニル、ニトロベンジル、クマリニル、およびニトロナフタレニルからなる群から選択される。
【００１５】
別の実施形態によれば、Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）から選択される核酸塩基である。
【００１６】
別の実施形態によれば、Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートからなるかまたは含む。
【００１７】
非標識リバーシブルターミネーター（ＮＬＲＴ）という用語は、ヌクレオチドアナログの三リン酸形態を指すことがあり、または組み込まれたＮＬＲＴを指すことがある。
【００１８】
本発明の別の実施形態によれば、核酸をシークエンシングする方法であって、（ａ）（ｉ）複数の鋳型ＤＮＡ分子を含むＤＮＡアレイを提供することであって、各鋳型ＤＮＡ分子が、核酸の断片を含み、前記複数の鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれが、アレイの位置において取り付けられている、提供すること、（ｂ）ＤＮＡアレイを、前記鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれの部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化２】
2020508037.tif 000004
（式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり；Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつＲ３は、１つまたは複数のホスフェートからなるかまたは含む）の非標識ＲＴと、プライマーが伸長されて前記複数の前記鋳型ＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な配列に非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；（ｃ）非標識伸長産物を、検出可能な標識を含む親和性試薬と、親和性試薬がＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせること；および（ｄ）標識された伸長産物中のＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定することを含む、方法が提供される。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、そのような方法は、（ｂ）ＤＮＡアレイを、前記鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれの部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、ならびにＲ２がＡである第１のＲＴ、Ｒ２がＴである第２のＲＴ、Ｒ２がＣである第３のＲＴ、およびＲ２がＧである第４のＲＴを含む式Ｉの非標識ＲＴのセットと、プライマーが伸長されて前記複数の前記鋳型ＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な配列に非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；（ｃ）非標識伸長産物を親和性試薬のセットと、組み込まれたＲＴに親和性試薬のセットが特異的に結合する条件下で接触させて、ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせることであって、（ｉ）親和性試薬のセットが、第１のＲＴに特異的に結合する第１の親和性試薬、第２のＲＴに特異的に結合する第２の親和性試薬、第３のＲＴに特異的に結合する第３の親和性試薬、および適宜、第４のＲＴに特異的に結合する第４の親和性試薬を含み；（ｉｉ）前記第１、第２、および第３の親和性試薬のそれぞれが、検出可能な標識を含む、生じさせること；および（ｄ）アレイ上の各々の位置においてＲＴに結合した親和性試薬の標識を同定することにより標識された伸長産物中のＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分（例えば、１サイクル当たり１塩基）を同定することを含む。関連する実施形態によれば、前記第１、第２、第３および第４の親和性試薬のそれぞれは、検出可能な標識を含む。別の関連する実施形態によれば、前記第１、第２、および第３の親和性試薬のそれぞれは、異なる検出可能な標識を含む。別の関連する実施形態によれば、第１、第２、および第３の親和性試薬のそれぞれは、異なる量において同じ標識（例えば、同じフルオロフォア）を含み、異なる強度のシグナルを結果としてもたらす。別の実施形態によれば、組み込まれるＲＴに結合した親和性試薬は直接的に標識されず、二次親和性試薬を使用して間接的に標識される。
【００２０】
本発明の別の実施形態によれば、ＤＮＡアレイが提供される。そのようなアレイは、複数の鋳型ＤＮＡ分子であって、各ＤＮＡ分子がアレイの位置において取り付けられており、相補的ＤＮＡ配列が複数の位置において鋳型ＤＮＡ分子の部分と塩基対を形成し、相補的ＤＮＡ配列が、その３’末端において、組み込まれたＲＴを含む、複数の鋳型ＤＮＡ分子；およびＲＴの少なくとも一部に特異的に取り付けられた親和性試薬であって、それに取り付けられたＲＴを同定する検出可能な標識を含む、親和性試薬を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態によれば、（ａ）式Ｉ：
【化３】
2020508037.tif 000005
（式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり；Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつＲ３は、１つまたは複数のホスフェートからなるかまたは含む）の非標識ＲＴ；（ｂ）ＲＴの１つに特異的に結合する（ｉｓ  ｂｉｎｄｓ）標識された親和性試薬；および（ｃ）ＲＴおよび親和性試薬のためのパッケージングを含む、キットが提供される。別の実施形態によれば、そのようなキットは、各ＲＴが異なる核酸塩基を含む複数のＲＴ、および各親和性試薬がＲＴの１つに特異的に結合する複数の親和性試薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明のシークエンシング方法の例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、図１に示す抗体染色方法の例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、ＮＬＲＴ構造の例を示す：図３Ａは３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニン；図３Ｂは３’−Ｏ−アミノ−２’−デオキシグアニン；図３Ｃは３’−Ｏ−シアノエチレン−２’−デオキシグアニン；図３Ｄは３’−Ｏ−ホスホ；図３Ｅ：３’−エチルジスルフィド−メチレン−２’−デオキシチミンである。
【図４】図４は、本発明の実施において使用できる様々なブロッキング基を示す。図４において、
【化４】
2020508037.tif 000006
は、構造の残りの部分への分子の取付け点を指し示す。
【図５】図５は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニンの活性エステル（Ｇ４）の合成を示す。
【図６】３’−Ｏ−アジドメチル−２’−の活性エステル（Ｃ８）の合成を示す。
【図７】図７は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシアデニンの活性エステル（Ａ１２）の合成を示す。
【図８】図８は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシチミンの活性エステル（Ｔ１６）の合成を示す。
【図９】図９は、免疫原、力価のモニター、およびアフィニティー精製用の基質として使用するためのＢＳＡ、ＫＨＬおよびアガロース樹脂への３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣ−ＮＨＳエステルのコンジュゲーション（３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシシトシンを使用）を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、３つの標識ＲＴおよび１つのＮＬＲＴを使用する５および１０サイクルのシークエンシングについてのＲｈｏを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、３つの標識ＲＴおよび１つのＮＬＲＴを使用する５および１０サイクルのシークエンシングについてのＲｈｏを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃおよび図１０Ｄは、３つの標識ＲＴおよび１つのＮＬＲＴを使用する５および１０サイクルのシークエンシングについてのシグナル−ノイズ比（ＳＮＲ）を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｃおよび図１０Ｄは、３つの標識ＲＴおよび１つのＮＬＲＴを使用する５および１０サイクルのシークエンシングについてのシグナル−ノイズ比（ＳＮＲ）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、５０サイクルのシークエンシングバイシンセシスのために抗３’−アジドメチル−ｄＧウサギ一次抗体および抗ウサギＡＦ６４７断片二次抗体により検出される非標識３’−アジドメチル−ｄＧＴＰを用いてＢＧＩＳＥＱ−１０００  ＤＮＡシークエンサーを使用して得られたシークエンシングデータのメトリクスを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、５０サイクルのシークエンシングバイシンセシスのために抗３’−アジドメチル−ｄＧウサギ一次抗体および抗ウサギＡＦ６４７断片二次抗体により検出される非標識３’−アジドメチル−ｄＧＴＰを用いてＢＧＩＳＥＱ−１０００  ＤＮＡシークエンサーを使用して得られたシークエンシングデータのメトリクスを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、蛍光直接標識抗アジドメチル塩基抗体を使用するＢＧＩＳＥＱ−５００機器によるＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡの２５回のシークエンシングサイクルからの結果を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、蛍光直接標識抗アジドメチル塩基抗体を使用するＢＧＩＳＥＱ−５００機器によるＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡの２５回のシークエンシングサイクルからの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．概要
ある特定の態様では、本発明は、非標識リバーシブルターミネーターヌクレオチドを用いる核酸のシークエンシングバイシンセシス（ＳＢＳ）またはコンビナトリアルプローブアンカーシークエンシング（ｃＰＡＳ）のための方法および組成物を提供する。１つのアプローチでは、ＳＢＳは、アレイ上の位置において固定化された一本鎖鋳型ＤＮＡを製造することにより実行される。ほとんどのアプローチにおいて、各固定化された一本鎖鋳型ＤＮＡは、同様の配列の多数のコピー（例えば、アンプリコン）を有して位置にある。例えば、ブリッジＰＣＲを使用してアレイ上の位置において鋳型配列のクラスターを生成してもよく（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、または、ローリングサークル複製を使用して、鋳型配列の多くのコピーを有して一本鎖コンカテマー、またはＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を生成してもよい（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）。ＳＢＳは、１つまたは複数のプライマーを鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせることおよびプライマーを伸長させて伸長したプライマー、または伸長中のＤＮＡ鎖（ＧＤＳ）を生じさせることにより実行される。プライマーを伸長させることは、それが鋳型にハイブリダイズされたままプライマーＤＮＡ鎖の３’末端においてヌクレオチドを付加すること（「組込み」または「組み込むこと」）を指す。３’端において組み込まれるヌクレオチドは、プライマーの対応するヌクレオチドに相補的であり、それにより、各シークエンシングサイクルにおいて組み込まれたヌクレオチドの素性を決定することにより鋳型のヌクレオチド配列が決定され得る。
【００２４】
１つの先行技術のアプローチでは、標識されたヌクレオチドアナログがＧＤＳに組み込まれる。一般に、標識されたヌクレオチドアナログは、１工程当たり単一のヌクレオチドのみが組み込まれ得ることを確実なものにするブロッキング基および切断可能なリンカーを介してヌクレオチドに取り付けられた色素（典型的には蛍光色素）を含む。シークエンシングの各サイクルは、ＧＤＳの末端において標識されたヌクレオチドアナログを組み込むこと、組み込まれた標識されたヌクレオチドアナログの標識を検出すること、組み込まれたヌクレオチドアナログから標識を除去すること、および組み込まれたヌクレオチドアナログからブロッキング基を除去して、新しい標識されたヌクレオチドアナログの組込みを可能とすることを包含する。対照的に、本発明は、切断可能なリンカーを介して塩基または糖に取り付けられた色素を含む標識されたヌクレオチドアナログを必要としない。
【００２５】
米国特許出願公開第２０１７／０２４０９６１号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）において記載される代替アプローチでは、ヌクレオチドアナログは、組み込まれるときに、リンカーを介してヌクレオチドに取り付けられた親和性タグを含む。親和性タグは特異的結合ペア（ＳＢＰ）の１つのメンバーである。１つのアプローチでは、親和性タグはビオチンである。組込み後、組み込まれたヌクレオチドは、ＳＢＰの第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）および検出可能な標識を含む親和性試薬に曝露される。検出可能な標識は、組み込まれたヌクレオチドを同定するために検出される。検出後、組み込まれたヌクレオチドアナログ−親和性試薬複合体は、リンカーを切断して検出可能な標識を解放させるために処理される。１つのアプローチでは、親和性タグは抗原であり、かつ、親和性試薬は、抗原に特異的に結合する蛍光標識された抗体である。対照的に、本発明は、親和性タグを必要とせず、かつ一部の態様では、親和性タグではなく、核酸塩基、糖部分、切断可能なブロッキング基またはこれらの組合せに結合する親和性試薬を用いる。
【００２６】
本明細書において開示される方法の一態様によれば、非標識リバーシブルターミネーター、すなわち、リバーシブルターミネーターまたはブロッキング基を含むヌクレオチドアナログ（Ｎｏｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、またはＮＬＲＴ）は、ＧＤＳの３’端において組み込まれた後、組み込まれたＮＬＲＴに特異的に結合する（「結合事象」）親和性試薬（例えば、抗体）に曝露される。結合事象の検出後、親和性試薬は除去される。１つのアプローチでは、リバーシブルブロッキング基を含むヌクレオチドアナログは、ＧＤＳの３’端において組み込まれ、かつ結合事象の検出後、リバーシブルブロッキング基および親和性試薬は、適宜同じ工程において、除去される。このアプローチでは、シークエンシングの各サイクルは、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるブロッキング基を含むＮＬＲＴの組込みの後、組み込まれなかったＮＬＲＴの洗浄除去；（ｉｉ）組み込まれたヌクレオチドアナログを、組み込まれたＮＬＲＴを認識して特異的に結合する標識された親和性試薬と接触させること；（ｉｉｉ）親和性試薬の結合の検出；（ｉｖ）追加のヌクレオチドアナログの組込みを可能とする様式でのブロッキング基の除去（例えば、デオキシリボース部分の３’位においてヒドロキシル基を生じさせる）、および（ｖ）親和性試薬の除去を含む。この工程の後に、新しいヌクレオチドアナログが組み込まれて検出される新しい１つまたは複数のサイクルを行ってもよい。親和性試薬（例えば、抗体）は、直接的に標識されてもよく（例えば、蛍光標識された抗体）、または間接的に検出されてもよい（例えば、標識された抗親和性試薬二次親和性試薬の結合による）。したがって、「標識された親和性試薬」は、例えばフルオロフォアへのコンジュゲーションにより、直接的に標識されてもよく、または間接的に標識されてもよいことが理解されるであろう。
【００２７】
別のアプローチでは、リバーシブルブロッキング基を含むヌクレオチドアナログは、ＧＤＳの３’端において組み込まれ、かつ結合事象の検出後、リバーシブルブロッキング基および親和性試薬は除去される。このアプローチでは、シークエンシングの各サイクルは、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるブロッキング基を含むＮＬＲＴの組込みの後、適宜、組み込まれなかったＮＬＲＴの洗浄除去；（ｉｉ）デオキシリボヌクレオチドの３’位（３’  ｐｏｓｉｔｏｎ）においてヒドロキシル（ＯＨ）基を再生させる様式でのブロッキング基の除去；（ｉｉｉ）追加のヌクレオチドアナログの組込みを可能とするブロッキング基の除去（例えば、デオキシリボース部分の３’位においてヒドロキシル基を生じさせる）、組み込まれたヌクレオチドアナログを、組み込まれたＮＬＲＴを認識して特異的に結合する標識された親和性試薬と接触させること；（ｉｉｉ）親和性試薬の結合の検出；および（ｖ）親和性試薬の除去を含む。この工程の後に、新しいヌクレオチドアナログが組み込まれて検出される新しい１つまたは複数のサイクルを行ってもよい。親和性試薬（例えば、抗体）は、直接的に標識されてもよく（例えば、蛍光標識された抗体）、または間接的に標識されてもよい（例えば、標識された抗親和性試薬二次親和性試薬の結合による）。したがって、「標識された親和性試薬」は、例えばフルオロフォアへのコンジュゲーションにより、直接的に標識されてもよく、または間接的に標識されてもよいことが理解されるであろう。
【００２８】
ＳＢＳは、ヌクレオチドが伸長したプライマーの３’端において組み込まれるプライマー伸長の２つまたはそれより多くのサイクルを伴う。本発明は、抗体などの親和性試薬を使用して、（ｉ）伸長したプライマーの３’端において組み込まれたヌクレオチド（「３’末端ヌクレオチド」）を検出し、かつ（ｉｉ）その３’末端ヌクレオチドの核酸塩基を同定しかつ１つの核酸塩基を別の核酸塩基から（例えば、ＡをＧから）区別する。特定の機序により縛られることを意図しないが、これが可能であるのは、各親和性試薬が、伸長したプライマーの他の「内部」ヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを、たとえ３’末端ヌクレオチドおよび内部ヌクレオチドが同じ核酸塩基を含む場合であっても、区別するように設計されているからである。各親和性試薬（または一部の場合には、親和性試薬の組合せ）はまた、３’末端ヌクレオチドに伴う核酸塩基を同定する３’末端ヌクレオチドの特性を検出するように設計される。これらおよび他の工程を実行するために多数の戦略、方法、および材料が提供される。このセクションは、多くのバリエーションが割愛され、いかなる意味でも限定的と考えられるべきではない概要を提供する。
【００２９】
一部のアプローチでは、本発明のＳＢＳ反応は、３’リバーシブルターミネーター部分を有するヌクレオチドを使用して実行される。これらのアプローチでは、組み込まれた３’末端ヌクレオチドは、リバーシブルターミネーター部分の存在に基づいて内部ヌクレオチドとは異なる。したがって、伸長したプライマー中のリバーシブルターミネーター部分に結合する親和性試薬は、３’末端ヌクレオチドに結合し（およびそれによりそれを検出し）、それを内部ヌクレオチドから区別する。異なるアプローチでは、組み込まれた３’末端ヌクレオチドは、内部ヌクレオチド上に存在しない遊離３’−ＯＨ（ヒドロキシル）基の存在に基づいて内部ヌクレオチドとは異なる。したがって、伸長したプライマー中の遊離３’−ＯＨ基に結合する親和性試薬は、３’末端ヌクレオチドに結合し、３’末端ヌクレオチドに結合し（およびそれによりそれを検出し）、それを内部ヌクレオチドから区別する。一部のアプローチでは、遊離３’−ＯＨ基は、組み込まれたヌクレオチドアナログ中のリバーシブルターミネーターの切断により生成される。別のアプローチでは、遊離３’−ＯＨ基は、天然に存在するヌクレオチドなどのリバーシブルターミネーター部分を含まないヌクレオチドの組込みの結果としてもたらされる。上記した２つのアプローチのいずれかと組合せ可能な追加のアプローチでは、組み込まれた３’末端ヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチドに特徴的な他の構造的差異に基づいて内部ヌクレオチドとは異なり、該構造的差異としては、内部ヌクレオチドのデオキシリボースと比べた３’末端ヌクレオチドのデオキシリボース糖への親和性試薬のより大きなアクセス可能性、内部ヌクレオチドのデオキシリボースと比べた親和性試薬への３’末端ヌクレオチドの核酸塩基への親和性試薬のより大きなアクセス可能性、および３’末端ヌクレオチドと内部ヌクレオシドとの間の他の分子的なおよびコンホメーションの差異が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３０】
したがって、本発明の一態様では、以下の実施例に記載されるように、親和性試薬は、伸長したプライマーの３’末端ヌクレオチドと他のヌクレオチドとの間のこれらの構造的差異を検出するために使用される。
【００３１】
３’末端ヌクレオチドの核酸塩基を同定する３’末端ヌクレオチドの特性を検出するための多数の戦略、方法、および材料も提供される。１つのアプローチでは、天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在する核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を含むヌクレオチドアナログがシークエンシング反応において使用され、プライマー伸長産物に組み込まれる。１つの核酸塩基（例えば、Ａ）に特異的に結合し、その核酸塩基をそれが結合しない他の核酸塩基（例えば、Ｔ、ＣおよびＧ）から区別する親和性試薬が３’末端ヌクレオチドの核酸塩基を同定するために使用される。別のアプローチでは、修飾（すなわち、天然に存在しない）核酸塩基を含むヌクレオチドアナログがシークエンシング反応において使用され、プライマー伸長産物に組み込まれる。１つの修飾核酸塩基（例えば、修飾Ａ）に特異的に結合し、その修飾核酸塩基を他の修飾または天然核酸塩基から区別する親和性試薬。修飾核酸塩基に特異的に結合する親和性試薬は、一般に、該修飾を認識し、それにより、修飾核酸塩基への結合は、該修飾を有しない天然に存在する核酸塩基への結合とは異なる。例えば、７位の窒素（Ｎ７）がメチル化炭素により置換されたアデノシンアナログ（下記の構造ＸＶを参照）に結合する親和性試薬は、天然に存在する（非修飾）アデノシン核酸塩基に結合しないことがあり、またはより弱く（ｌｅｓｓ  ａｖｉｄｌｙ）結合することがある。特定の機序により縛られることを意図しないが、修飾部分（この場合、修飾核酸塩基）を特異的に認識する親和性試薬は、修飾された特徴（この場合、メチル化炭素を含む修飾アデノシンの部分）に結合することによりそれを行うと考えられる。言い方を変えれば、親和性試薬は、メチル化炭素を含むエピトープに結合する。親和性試薬は組み込まれたヌクレオチドの他の部分にも結合することが理解されるであろう。
【００３２】
さらに別のアプローチでは、３’リバーシブルブロッキング基を有するヌクレオチド（リバーシブルターミネーターヌクレオチド）がプライマー伸長産物に組み込まれる。ブロッキング基は各シークエンシングサイクルにおいて除去され、それにより、プライマー伸長製造（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｅ）の最後に組み込まれたヌクレオチドのみがブロッキング基を含む。このアプローチでは、ブロッキング基に結合する親和性試薬が使用される。このアプローチでは、シークエンシング反応において使用される少なくとも２つのヌクレオチドアナログ（すなわち、異なる核酸塩基を有する）は、異なるブロッキング基を含む。説明のために、アデニンまたはアデニンアナログを含むヌクレオチドのために第１のブロッキング基（例えば、３’−Ｏ−アジドメチル）、グアニンまたはグアニンアナログを含むヌクレオチドのために第２の異なるブロッキング基（例えば、３’−Ｏ−シアノエチレン）などを使用することにより、親和性試薬の特異性は、会合した核酸塩基を同定する。例えば、上記の説明を拡張すると、３’−Ｏ−シアノエチレンに特異的な親和性試薬により３’末端ヌクレオチドが認識される場合、これは、会合した核酸塩基はグアニンまたはグアニンアナログであること、およびこの位置における鋳型塩基はシトシンであることを指し示す。このアプローチのバリエーションでは、小さい特徴のみにより異なるブロッキング基が使用されてもよく、親和性試薬は、その区別的な小さい特徴を含むエピトープに結合する。
【００３３】
本明細書において以下に記載されるように、本発明の一態様では、構造的特徴の組合せに基づいてヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを認識してそれに特異的に結合する親和性試薬が使用され（例えば、特定のブロッキング基および特定の修飾を有する特定の核酸塩基を認識する親和性試薬）が使用される。この態様では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、特定の親和性試薬により認識されるという特性のために設計されかつ／または該特性について選択される。一部の場合には、複数の構造的特徴に結合する親和性試薬は、より強くかつより特異的な親和性試薬の結合という利点を有する。以下の表Ａは、異なる核酸塩基を有するヌクレオチドを区別するために親和性試薬により認識され得る構造的差異（第２列）および充分な結合効率を提供するように親和性試薬により結合され得るかつ／またはそれらの特徴に基づいて最後に組み込まれたヌクレオチドを内部ヌクレオチドから区別する最後に組み込まれたヌクレオチド中の部分（第３列）の例の非網羅的なコレクションである。
【００３４】
【表Ａ】
2020508037.tif 000007
【００３５】
以下に詳細に論じるように、標識された親和性試薬が結合する組み込まれたヌクレオチドアナログの部分は、例えば非限定的に、核酸塩基およびブロッキング基、またはヌクレオチドアナログの糖部分と組み合わせて核酸塩基および／もしくはブロッキング基を含んでもよい。以下の表Ａを参照。標識された親和性試薬の結合は標的ヌクレオチドの位置に依存することがあり、例えば、ＧＤＳの３’端においてブロッキング基を有するヌクレオチドアナログと、ＧＤＳ内またはＧＤＳの内部に位置する類似のヌクレオチドアナログ（ブロッキング基を欠く）とを区別することがある。標識された親和性試薬の結合はまた、核酸塩基自体に依存するので、親和性試薬は、アレイ上の１つの位置においてＧＤＳの端部において組み込まれた１つの標的ＮＬＲＴ（例えば、ＮＬＲＴ−Ａ）に結合するが、アレイ上の異なる位置においてＧＤＳの末端において組み込まれた他のＮＬＲＴ（例えば、ＮＬＲＴ−Ｃ、−Ｔ、または−Ｇ）に結合しない。
【００３６】
本発明は、他のＳＢＳ法に対して利点を有する。標識された親和性試薬の除去は、リンカーの切断後にｄＮＴＰに取り付けられたままの基の結果としてもたらされる化学的「傷跡」を後に残さない。そのような「傷跡」はポリメラーゼによるｄＮＴＰの組込み効率を低減させることがあるのでこれは有利である。加えて、このアプローチでは、親和性試薬は、複数の蛍光部分を含んでもよく、一般に使用される方法に従ってｄＮＴＰに取り付けられた単一の蛍光色素より強いシグナルを提供し得る。このアプローチはまた、より低い励起強度またはより短い曝露時間が使用され得るので、より少ない光損傷を引き起こし得る。本明細書において開示されるアプローチは、より長いリード（例えば、５００塩基より長い、または１０００塩基より長いリード）および／または５０、１００もしくは２００塩基より長いより的確なリード（例えば、２０００塩基中に１つまたは５０００塩基中に１つより少ない誤り）を可能とすることが期待される。本発明の組成物および方法はまた、ＳＢＳのために一般に使用される標識されたリバーシブルターミネーター（ＲＴ）の方法より経済的であり得る。非標識ＲＴのコストは標識ＲＴより小さい。標識ＲＴを使用する標準的なＳＢＳでは、完了までＲＴの組込みを推進するために高濃度の標識ＲＴが使用され、標識ＲＴのほとんど（７０〜９９％またはそれより多く）はポリメラーゼにより組み込まれず、洗浄除去される。より低コストの非標識ＲＴの使用は、したがって、このコストを低減させる。さらに、標識された親和性試薬が使用される本発明の標識工程では、画像化のために充分なシグナルを得るために、標的鋳型の小さいパーセンテージのみが、複数を有する親和性試薬により結合されて標識されることで充分であり得（例えば、約５％、もしくは約１０％、または約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、もしくは約３０％未満）、１分子の結合物質に対して複数分子の標識を有する効率的に標識された結合物質を用いると３０％でさえ充分であり得、これは特に、親和性試薬が標的ｄＮＴＰに効率的に結合し、かつ複数の標識分子を含む場合に当てはまる。親和性試薬が単一の標識分子のみを有する場合、より高レベルの結合が好ましいことがある（例えば、７０パーセントまたはそれより高い）。
【００３７】
２．定義および用語
ヌクレオチドアナログの文脈において本明細書において使用される場合、「非標識」および「標識されていない」という用語は交換可能に使用される。
【００３８】
本明細書において使用される場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、「標識されていないリバーシブルターミネーター［ヌクレオチド］」、「ＮＬＲＴ」、「リバーシブルターミネーターヌクレオチド」、「リバーシブルターミネーター」、「ＲＴ」などは全て、核酸塩基またはアナログ、デオキシリボースまたはアナログ、および切断可能なブロッキング基を含むシークエンシング試薬を指すために使用される。標識されていないリバーシブルターミネーターヌクレオチドは、プライマー伸長産物中に、最初に３’端において、およびそれがある場合は追加の組込みサイクル後にプライマー伸長産物の「内部」部分において組み込まれたｄＮＴＰ（すなわち、ポリメラーゼの基質）またはリバーシブルターミネーターヌクレオチドを指すことがある。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「ｄＮＴＰ」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびそのアナログ（３’−Ｏで切断可能なブロッキング基を有するアナログなど）の両方を含む。
【００４０】
ヌクレオチドアナログの切断可能なブロッキング基の文脈において本明細書において使用される場合、３’−Ｏ−という指定は明示的ではなく暗示的なことがある。例えば、「アジドメチル」、「３’−Ｏ−アジドメチル」という用語は、文脈から明らかなように、交換可能である。
【００４１】
「アンプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応の生成物、すなわち、１つまたは複数の開始配列から複製されたポリヌクレオチドの集団を意味する。アンプリコンは様々な増幅反応により製造されてよく、該増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リニアポリメラーゼ反応（ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、核酸配列ベースの増幅、ローリングサークル増幅および同様の反応が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，９６５，１８８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８００，１５９号明細書；同第５，２１０，０１５号明細書；同第６，１７４，６７０号明細書；同第５，３９９，４９１号明細書；同第６，２８７，８２４号明細書および同第５，８５４，０３３号明細書；ならびに米国特許出願公開第２００６／００２４７１１号明細書を参照）。
【００４２】
本明細書において使用される「抗原」は、抗体により特異的に結合され得る化合物を意味する。一部の抗原は免疫原である（Janeway, et al., Immunobiology, 5th Edition, 2001, Garland Publishingを参照）。一部の抗原はハプテンであり、これは、抗体により認識されるが、タンパク質にコンジュゲートされない限り、免疫応答を誘発しない。例示的な抗原としては、ＮＬＲＴ、リバーシブルターミネーターブロッキング基、ｄＮＴＰ、ポリペプチド、小分子、脂質、または核酸が挙げられる。
【００４３】
「アレイ」または「マイクロアレイ」は、表面、排他的ではないが好ましくは、平坦または実質的に平坦な表面を有する固体支持体（またはビーズなどの固体支持体の集まり）であって、核酸を含む部位の集まりを有し、集まりの各部位が空間的に定義されており、かつアレイの他の部位と重なり合わないようになっている（すなわち、部位は空間的に離散している）、固体支持体（またはビーズなどの固体支持体の集まり）を意味する。アレイまたはマイクロアレイはまた、ビーズまたはウェルなどの表面を有する平坦でない問合せ可能な構造を含むことができる。アレイのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、共有結合により固体支持体に結合してもよく、または非共有結合により結合してもよい。従来のマイクロアレイ技術は、例えばSchena, Ed. (2000), Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford)において総説されている。本明細書において使用される場合、「ランダムアレイ」または「ランダムマイクロアレイ」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの素性がそれらの位置から少なくとも最初に識別可能でないが、アレイに対する特定の生化学検出技術により決定され得るマイクロアレイを指す。例えば、米国特許第６，３９６，９９５号明細書；同第６，５４４，７３２号明細書；同第６，４０１，２６７号明細書；および同第７，０７０，９２７号明細書；ＰＣＴ国際公開第２００６／０７３５０４号パンフレットおよび同第２００５／０８２０９８号パンフレット；ならびに米国特許出願公開第２００７／０２０７４８２号明細書および同第２００７／００８７３６２号明細書を参照。
【００４４】
ブロッキング基に関する「リバーシブル」、「除去可能」および「切断可能」という用語は同じ意味を有する。
【００４５】
リバーシブルターミネーターヌクレオチドの「リバーシブルブロッキング基」という用語はまた、「除去可能なブロッキング基」、「切断可能なリンカー」、「ブロッキング部分」、「ブロッキング基」、「リバーシブルターミネーターブロッキング基」などと称されることもある。リバーシブルブロッキング基は、通常は糖部分の３’−Ｏ位において、ヌクレオチドの糖（例えば、デオキシリボース）に取り付けられた化学的部分であり、その位置においてポリメラーゼによるヌクレオチドの付加を防止する。リバーシブルブロッキング基は、酵素（例えば、ホスファターゼまたはエステラーゼ）、化学反応、熱、光などにより切断されて、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの３’位においてヒドロキシル基を提供することができ、それにより、ポリメラーゼによるヌクレオチドの付加が起こり得る。
【００４６】
「誘導体」または「アナログ」は、そのコア構造が親化合物と同じ、または非常に似ているが、異なるもしくは追加の側鎖、または２’およびもしくは３’ブロッキング基など、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドが別の分子に連結されることを可能とする化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味する。例えば、塩基はデアザプリンであり得る。誘導体は、ワトソン−クリック塩基対形成ができるべきである。「誘導体」および「アナログ」はまた、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を意味する。そのような誘導体およびアナログは、例えば、Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980)およびUhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990において論じられている。ヌクレオチドアナログはまた、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル−ホスホネート、ホスホロアニリデートおよびホスホロアミデート連結などの修飾ホスホジエステル結合を含み得る。アナログは、ワトソン−クリック塩基対形成ができるべきである。例えば、デオキシアデノシンアナログとしてはジダノシン（ｄｄＩ）およびビダラビンが挙げられ、アデノシンアナログとしてはＢＣＸ４４３０が挙げられ；デオキシシチジンアナログとしては、シタラビン、ゲムシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、ラミブジン（３ＴＣ）、およびザルシタビン（ｄｄＣ）が挙げられ；グアノシンおよびデオキシグアノシンアナログとしては、アバカビル、アシクロビル、およびエンテカビルが挙げられ；チミジンおよびデオキシチミジンアナログとしては、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テルビブジン、およびジドブジン（アジドチミジン、またはＡＺＴ）が挙げられ；デオキシウリジンアナログとしてはイドクスウリジンおよびトリフルリジンが挙げられる。本明細書において使用される「誘導体」、「アナログ」および「修飾された」は交換可能に使用されてよく、本明細書において定義される「ヌクレオチド」および「ヌクレオシド」という用語に包含される。
【００４７】
「組み込む」は、核酸分子の部分となることを意味する。ＳＢＳにおいて、１つのヌクレオチド、すなわち、ＤＮＡ鎖上の３’ヌクレオチドのペントースの３’位と、隣接するヌクレオチド、すなわち、ＤＮＡ鎖に付加されているＲＴ上のペントースの５’位との間のホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル結合の形成を通じて伸長中のＤＮＡ鎖にポリメラーゼがＲＴを付加するときにＲＴの組込みが起こる。
【００４８】
標識された親和性試薬の文脈における「標識」は、検出可能かつ／または定量化可能なシグナルを提供するために使用され得る任意の原子または分子を意味する。好適な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学活性分子、酵素、補因子、および酵素基質が挙げられる。一部の実施形態では、検出標識は、荷電基を含有する分子（例えば、カチオン基を含有する分子またはアニオン基を含有する分子）、蛍光分子（例えば、蛍光色素）、蛍光原分子、または金属である。検出標識は蛍光標識であってもよい。蛍光標識は、非消光形態にある時（例えば、別の剤により消光されていない時）に光を放出できる任意の標識であり得る。蛍光部分は、適切な励起波長により励起されたときに特定の発光波長において光エネルギーを放出する（すなわち、蛍光を発する）。蛍光部分および消光部分が近接している場合、蛍光部分により放出される光エネルギーは消光部分により吸収される。一部の実施形態では、蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フェノキサジン、アクリジン、クマリン、またはこれらの誘導体である。一部の実施形態では、蛍光色素はカルボキシフルオレセインである。好適な蛍光色素のさらなる例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）製品ライン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の下で市販されている蛍光色素が挙げられる。あるいは、非蛍光標識が使用されてもよく、これには、レドックス標識、還元タグ、硫黄またはチオール含有分子、置換または非置換のアルキル、蛍光タンパク質、非蛍光色素、および発光タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。
【００４９】
「核酸塩基」は、鋳型核酸の相補的な含窒素塩基と塩基対形成できる含窒素塩基を意味する。例示的な核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）およびこれらの誘導体が挙げられる。本明細書におけるチミンへの言及は、そうでないことが文脈から明らかでない限り、同等にウラシルを指すことが理解されるべきである。本明細書において使用される場合、「核酸塩基」、「含窒素塩基」、加えて「塩基」という用語は交換可能に使用される。
【００５０】
本明細書において使用される「天然に存在する核酸塩基」は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）を意味する。一部の場合には、天然に存在する核酸塩基は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ（ＤＮＡ中に見出される天然に存在する塩基）を指す。
【００５１】
「ヌクレオチド」は、核酸塩基、糖、および１つまたは複数のリン酸基からなる。それらは核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡにおいて糖はリボースであり、ＤＮＡにおいてデオキシリボース、すなわち、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠いた糖である。含窒素塩基はプリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンはシトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）（またはＲＮＡの文脈ではウラシル（Ｕ））である。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合する。ヌクレオチドはまた、糖のＣ−５に取り付けられたヒドロキシル基においてエステル化が起こったリン酸エステルまたはヌクレオシドである。ヌクレオチドは、通常、一、二または三リン酸塩である。「ヌクレオシド」はヌクレオチドに構造的に類似しているが、ホスフェート部分を含まない。一般的な略語としては、デオキシヌクレオチド三リン酸の「ｄＮＴＰ」が挙げられる。
【００５２】
「核酸」はヌクレオチドモノマーのポリマーを意味する。本明細書において使用される場合、該用語は一本鎖または二本鎖形態を指すことがある。核酸およびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソン−クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、またはフーグスティーンもしくは逆フーグスティーン型の塩基対形成などのモノマー間相互作用の通常のパターンにより天然ポリヌクレオチドに特異的に結合して、デュプレックスまたはトリプレックス形態を形成することができる。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間連結は、天然に存在するものであってもよく、またはそのアナログ、例えば、天然に存在するもしくは天然に存在しないアナログであってもよい。天然に存在しないアナログは、ペプチド核酸、ロックド核酸、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、標識の取付けを可能とする連結基を含有する塩基、例えばフルオロフォア、またはハプテンなどを含んでもよい。核酸は、典型的に、数モノマー単位、例えば５〜４０（その場合、それらは通常、「オリゴヌクレオチド」と称される）から数十万またはそれより多くのモノマー単位までのサイズに及ぶ。核酸またはオリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字（大文字または小文字）の配列により表される場合は常に、別に指し示さない限りまたは文脈から自明でない限り、ヌクレオチドは左から右に５’から３’の順序であることおよび「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｉ」はデオキシイノシンを表し、「Ｕ」はウリジンを表すことが理解されるであろう。別段の記載がなければ、技術用語および原子のナンバリングの慣習は、Strachan and Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999)において開示されているものに従う。通常、核酸は、ホスホジエステル結合により連結された天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについてデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはＲＮＡについてそれらのリボース対応物）を含むが、それらはまた、非天然ヌクレオチドアナログ、例えば、修飾塩基、糖、またはヌクレオシド間連結を含んでもよい。当業者にとって、酵素が活性のために特定のオリゴヌクレオチドまたは核酸基質の要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスなどを有する場合、オリゴヌクレオチドまたは核酸基質のための適切な組成物の選択は充分に、特に、Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)、および同様の参考文献などの学術文献からのガイダンスを有する当業者の知識の範囲内である。
【００５３】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とデュプレックスを形成すると、核酸合成の開始点として作用することができ、かつ鋳型に沿ってその３’末端から伸長されて伸長したデュプレックスを形成することができる天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。プライマーは、通常、９〜４０ヌクレオチド、または一部の実施形態では１４〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」は、「核酸」という用語と交換可能に使用されて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにハイブリッドおよび合成核酸を意味し、一本鎖または二本鎖であり得る。「オリゴヌクレオチド」は、約６〜約３００ヌクレオチドの長さの短いポリヌクレオチドである。「相補的なポリヌクレオチド」は、標的核酸に相補的なポリヌクレオチドを指す。
【００５５】
「固体支持体」および「支持体」は交換可能に使用されて、剛性または半剛性の１つまたは複数の表面を有する材料または材料群を指す。マイクロアレイは、通常、顕微鏡スライドガラスなどの少なくとも１つの平坦な固相支持体を含む。
【００５６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリメラーゼ」（ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）への言及は、１つの作用物質またはそのような作用物質の混合物を指し、「方法」（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）への言及は、当業者に公知の同等の工程および／または方法への言及を含む。
【００５７】
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載される全ての刊行物は、参照することにより、刊行物に記載されるおよび本明細書に記載の発明との関連で使用され得るデバイス、組成物、配合物および方法論を記載および開示する目的のために本明細書に組み込まれる。
【００５８】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在する値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載されたまたは介在する値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、記載された範囲における任意の具体的に除外された限度に応じて、そのより小さい範囲に独立して含まれてもよく、また本発明に包含される。記載された範囲が限度の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限度の両方のいずれかを除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００５９】
以下の説明において、本発明のより徹底的な理解を提供するために多数の特定の詳細が記載される。しかしながら、本発明はこれらの特定の詳細の１つまたは複数を用いずに実施されてもよいことが当業者に明らかであろう。他の場合、当業者に周知の特徴および周知の手順は、本発明を不明瞭にすることを回避するために記載されていない。
【００６０】
本発明が主に特定の実施形態に関して記載されるが、本開示を読んだ当業者に他の実施形態が明らかとなることも想定され、またそのような実施形態が本発明の方法に含まれることが意図される。
【００６１】
本発明の実施は、別に指し示さない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術など）、細胞生物学、生化学、および免疫学の、当該技術の範囲内の従来技術および説明を用い得る。そのような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用するハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。好適な技術の具体的な説明は、本明細書における以下の例を参照することにより得ることができる。しかしながら、他の同等の従来の手順も当然使用することができる。そのような従来技術および説明は、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual、およびMolecular Cloning: A Laboratory Manual (全てCold Spring Harbor Laboratory Press)、Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, N.Y.、Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000)、Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.およびBerg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.（これらの全ては、参照することによりそれらの全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる）などの標準的な実験室マニュアル中に見出すことができる。
【００６２】
３．ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ
様々な実施形態では、本発明によるＳＢＳは、非標識リバーシブルターミネーター（「ＮＬＲＴ」）（例えば、ブロッキング基を有するヌクレオチドアナログ）、標識されていない天然に存在するヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、またはブロッキング基を含まない標識されていないヌクレオチドアナログを使用し得る。
【００６３】
３．１  非標識リバーシブルターミネーター（ＮＬＲＴ）
本発明の非標識リバーシブルターミネーター（「ＮＬＲＴ」）は、デオキシリボースの３’−ＯＨ位において除去可能なブロッキング基を含むヌクレオチドアナログである。多数のリバーシブルターミネーターが記載されてきており、リバーシブルターミネーターはＳＢＳにおいて広く使用されているが、本発明に従って使用される非標識リバーシブルターミネーターは、標識されておらず、かつ本明細書において以下に記載される親和性試薬と組み合わせて使用されるので、商業的使用におけるものとは異なる。一態様では、本発明のＮＬＲＴは標識されていない。一実施形態では、標識されていないは、ＮＬＲＴが蛍光色素を含まないことを意味する。一実施形態では、標識されていないは、ＮＬＲＴが化学発光色素を含まないことを意味する。一実施形態では、標識されていないは、ＮＬＲＴが発光部分を含まないことを意味する。
【００６４】
一部の実施形態では、例示的なＮＬＲＴは、ＤＮＡ鎖へのＮＬＲＴの組込み前に、以下の構造Ｉを有する：
【化５】
2020508037.tif 000008
（式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり、Ｒ２は核酸塩基であるかまたはそれを含み、Ｒ３は少なくとも１つのリン酸基またはそのアナログを含む）。
【００６５】
リバーシブルブロッキング基Ｒ１は、ＤＮＡ鎖へのＮＬＲＴの組込み後に除去されてもよい。ＤＮＡ鎖の３’端におけるアナログの組込み後のブロッキング基の除去は、３’−ＯＨを結果としてもたらす。任意のリバーシブルブロッキング基を使用することができる。例示的なリバーシブルブロッキング基は以下に記載される。
【００６６】
核酸塩基Ｒ２は、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、もしくはイノシン（Ｉ）またはこれらのアナログであってもよい。ＮＬＲＴは核酸塩基に従って称されることがあり、例えば、Ａ核酸塩基を有するＮＬＲＴはＮＬＲＴ−Ａと称される。したがって、対応するＮＬＲＴは、本明細書においてそれぞれ「ＮＬＲＴ−Ａ」、「ＮＬＲＴ−Ｃ」、「ＮＬＲＴ−Ｇ」、「ＮＬＲＴ−Ｔ」、「ＮＬＲＴ−Ｕ」、および「ＮＬＲＴ−Ｉ」と称される。ＮＬＲＴ−ＴおよびＮＬＲＴ−Ｃは、ＮＬＲＴピリミジンと称されることがある。ＮＬＲＴ−ＧおよびＮＬＲＴ−Ａは、ＮＬＲＴプリンと称されることがある。
【００６７】
核酸塩基Ｒ２は、任意の核酸塩基または核酸塩基アナログ（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、またはイノシンのアナログ）であってもよい。例えば、抗体を産生させるときにアナログへの免疫応答を増加させるため、または特定の核酸塩基に対する抗体の特異性を増加させるために、天然に存在する核酸塩基への修飾が為され得る。
【００６８】
Ｒ３は、１〜１０個のリン酸基またはリン酸アナログ基であってもよい。ホスフェートアナログとしては、ホスホロチオエート結合がＤＮＡのリン酸骨格中の非ブリッジ形成性酸素を硫黄原子で代替するホスホロチオエート（ＰＳ）、または当該技術分野において公知の任意の他の好適なホスフェートアナログが挙げられる。一部の場合には、Ｒ３は１〜１０個のリン酸基であってもよい。一部の場合には、Ｒ３は３〜１２個のリン酸基であってもよい。一部の場合には、ヌクレオチドアナログはヌクレオシド三リン酸である。
【００６９】
ある特定の実施形態では、式ＩのＲ１は、１８４未満、多くの場合１７４未満、多くの場合１６４未満、多くの場合１５４未満、多くの場合１４４未満、多くの場合１３４未満、多くの場合１２４未満、多くの場合１１４未満、多くの場合１０４未満、多くの場合９４未満、時に８４未満のＭＷを有する。Ｒ１は、ＫＬＨなどのより大きいキャリア分子にコンジュゲートされたときにハプテンとして作用して免疫応答を誘発してもよい。
【００７０】
組み込まれなかったＮＬＲＴヌクレオチドアナログは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の基質として好適であり、３’端においてＤＮＡ鎖に組み込まれ得ることが理解されるであろう。例えば、リバーシブルブロッキング基は、ＮＬＲＴが少なくとも一部のＤＮＡポリメラーゼの基質であるようなサイズおよび構造を有するべきである。ＮＬＲＴの組込みは、ターミナルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼまたは逆転写酵素を介して達成され得る。シークエンシングにおいて使用される任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができ、該ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、テルモコックス属菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、９°Ｎまたはその突然変異体、例えば、二重突然変異体Ｙ４０９ＶおよびＡ４８５ＬなどのＡ４８５Ｌが挙げられる。当該技術分野において公知のように、ポリメラーゼは、３’ブロッキング基の性質に関して高度に識別力がある。結果として、効率的な組込みを推進するために、ポリメラーゼタンパク質への突然変異が多くの場合に必要とされる。本発明において使用され得る例示的なＤＮＡポリメラーゼおよび方法としては、Chen, C., 2014, “DNA Polymerases Drive DNA Sequencing-By-Synthesis Technologies: Both Past and Present” Frontiers in Microbiology, Vol. 5, Article 305、Pinheiro, V. et al. 2012 “Polymerase Engineering: From PCR and Sequencing to Synthetic Biology” Protein Engineering Handbook: Volume 3:279-302、国際特許出願公開第２００５／０２４０１０号パンフレットおよび同第２００６／１２０４３３号パンフレット（これらのそれぞれは、参照することにより全ての目的のために組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。一部の場合には、ポリメラーゼは、テルモコックス属菌のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、９°Ｎまたはその突然変異体、例えば、二重突然変異体Ｙ４０９ＶおよびＡ４８５ＬなどのＡ４８５Ｌである。他の例としては、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ７またはＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素；Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、およびＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００７１】
ブロッキング基への修飾はリバーシブルターミネーターの機能に干渉するべきではないことが理解されるであろう。すなわち、それらは、３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチドを生じさせるために切断可能であるべきである。
【００７２】
一実施形態では、ＲＴは、ＤＮＡ鎖へのＲＴの組込み前に以下の構造ＩＩを有する：
【化６】
2020508037.tif 000009
（式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり、Ｒ４は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）から選択される核酸塩基であり；かつ、Ｒ３は少なくとも１つ（例えば、１〜１０個）のホスフェートを含む）。一部の場合には、Ｒ３はトリホスフェートである。
【００７３】
一実施形態では、ＲＴは、ＤＮＡ鎖へのＲＴの組込み後に以下の構造ＩＩＩを有する：
【化７】
2020508037.tif 000010
（式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり、Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、もしくはイノシン（Ｉ）またはこれらのアナログなどの核酸塩基であり、かつ、Ｘは、リン酸−糖結合（例えば、１つのヌクレオシド糖分子の３’炭素原子および別のヌクレオシド糖分子の５’炭素原子を連結するホスホジエステル結合）により連結された１０〜１０００個のヌクレオシドを含むポリヌクレオチド（例えば、ＧＤＳ）である）。
【００７４】
別の実施形態では、ＲＴは、リバーシブルブロッキング基の組込みおよび除去の後に構造ＩＶを有する：
【化８】
2020508037.tif 000011
（式中、Ｒ６はＨであり、かつ、Ｒ７は、上記に定義されるリン酸−糖結合により連結された１０〜１０００個のヌクレオシドを含むポリヌクレオチド（例えば、ＧＤＳ）であるか、または上記に定義されるＲ３である）。
【００７５】
構造Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶのある特定の実施形態では、Ｒ２は、塩基の結合特異性を変化させないが（すなわち、ＡアナログはＴに結合し、ＴアナログはＡに結合する、など）、（ｉｉ）アナログを天然に存在する塩基よりも免疫原性とし得る修飾を有する核酸塩基アナログ（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕのアナログ）である。一部の実施形態では、修飾は、３つ以下の炭素を含む基の付加を含んでもよい。付加される基は、それらがＧＤＳに組み込まれた際にヌクレオシドから除去されず、それにより、ＧＤＳは修飾を含む複数のヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、親和性試薬は、修飾を含む末端ヌクレオチドアナログに結合するが、はるかに低い親和性で修飾を有する内部ヌクレオチドに結合する。
【００７６】
所与の末端（例えば、３’末端）において１つより多くの末端ヌクレオチドが存在する応用では、目的としない末端をブロックするために様々な方法を使用することができ、これは例えば、異なるブロッキング基によりまたは支持体に「汚染」末端（“ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ”  ｅｎｄ）を取り付けることにより為される。例えばＤＮＢシークエンシングのために、シークエンシングのために使用される３’末端に加えて３’末端が存在してもよい。ブリッジＰＣＲにより産生されるＰＣＲクラスターでは、シークエンシング鋳型は５’末端により取り付けられ、したがって、鋳型の３’末端は、ＲＴを用いて伸長不可能であるか、または本明細書に記載される分子結合剤との結合を防止するために修飾される。
【００７７】
３．２  リバーシブルターミネーターブロッキング基
本発明において使用されるＮＬＲＴは、任意の好適なブロッキング基を含むことができる。一部の実施形態では、好適なブロッキング基は、化学的または酵素処理により除去されて３’−ＯＨ基を生じ得るものである。化学的処理は、鋳型またはプライマー伸長鎖を有意に劣化させるべきではない。リバーシブルターミネーターの３’ブロッキング基のために、３’−Ｏ−アリル基（Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 19635-19640, 2006）、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰ（Guo et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 9145-9150, 2008）、アミノアルコキシル基（Hutter et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 29:879-895, 2010）および３’−Ｏ−（２−シアノエチル）基（Knapp et al., Chem. Eur. J., 17, 2903 - 2915, 2011）などの様々な分子部分が記載されてきた。例示的なＲＴブロッキング基としては、−Ｏ−アジドメチルおよび−Ｏ−シアノエテニルが挙げられる。限定ではなく説明のために、他の例示的なＲＴブロッキング基を図３および図４に示す。
【００７８】
他の実施形態では、式Ｉ（上掲）のＲ１は、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルケニル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキニルである。一部の例では、Ｒ１は、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、アセトエテニル、メチルカルボノエテニル、アミドエテニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、３−オキソブタ−１−イニル、および３−メトキシ−３−オキソプロパ−１−イニルからなる群から選択することができる。
【００７９】
様々な３’−Ｏリバーシブルブロッキング基（式Ｉ中のＲ１）を本発明の実施において使用することができる。本発明の方法の一実施形態によれば、Ｒ１は、アリル、アジドメチル、アミノアルコキシル、２−シアノエチル、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアルケニル、非置換ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルキニル、非置換ヘテロアルキニル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、アセトエテニル、メチルカルボノエテニル、アミドエテニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、アミノ、シアノエテニル、シアノエチル、アルコキシ、アシル、メトキシメチル、アミノキシル、カルボニル、ニトロベンジル、クマリニル、およびニトロナフタレニルからなる群から選択される。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「アルキル」、「アルケニル」、および「アルキニル」という用語は、直鎖および分岐鎖の一価の置換基を含む。例としては、メチル、エチル、イソブチル、３−ブチニルなどが挙げられる。本明細書において記載される化合物および方法と共に有用なこれらの基の範囲は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、およびＣ２〜Ｃ１０アルキニルを含む。本明細書において記載される化合物および方法と共に有用なこれらの基の追加の範囲は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、およびＣ２〜Ｃ４アルキニルを含む。
【００８１】
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」は、アルキル、アルケニル、およびアルキニルと同様に定義されるが、骨格内にＯ、Ｓ、もしくはＮヘテロ原子またはこれらの組合せを含有することができる。本明細書において記載される化合物および方法と共に有用なこれらの基の範囲は、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ１０ヘテロアルキニルを含む。本明細書において記載される化合物および方法と共に有用なこれらの基の追加の範囲は、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ４ヘテロアルケニル、およびＣ２〜Ｃ４ヘテロアルキニルを含む。
【００８２】
本明細書において使用されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル分子は、置換または非置換であり得る。本明細書において使用される場合、置換されたという用語は、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルの主鎖に取り付けられた位置へのアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基の付加、例えば、これらの分子の１つによる水素の置換を含む。置換基の例としては、ヒドロキシ、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）、およびカルボキシル基が挙げられるがこれらに限定されない。反対に、本明細書において使用される場合、非置換という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルが全必要量の水素を有すること、すなわち、置換を有しない、その飽和レベルに相応しい水素を有すること、例えば、線状ブタン（−（ＣＨ２）３−ＣＨ３）を指し示す。
【００８３】
他の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアミノ含有ブロッキング基（例えば、ＮＨ２−）である。例示的なアミノ含有リバーシブルブロッキング基を記載するHutter et al., 2010, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 29(11)（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアリル含有ブロッキング基（例えば、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）である。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はシアノ基（例えば、シアノエテニルまたはシアノエチル基）を含む。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアジド含有ブロッキング基（例えば、Ｎ３−）である。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアジドメチル（Ｎ３ＣＨ２−）である。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアルコキシ含有ブロッキング基（例えば、ＣＨ３ＣＨ２Ｏ−）である。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基は、１つまたは複数のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含有する。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基は置換または非置換のアルキル（すなわち、置換または非置換の炭化水素）である。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアシルである。米国特許第６，２３２，４６５号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はメトキシメチルであるかまたはそれを含有する。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はアミノキシル（Ｈ２ＮＯ−）であるかまたはそれを含有する。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はカルボニル（Ｏ＝ＣＨ−）であるかまたはそれを含有する。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はエステルまたはリン酸基を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はニトロベンジル（Ｃ６Ｈ４（ＮＯ２）−ＣＨ２−）である。一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はクマリニルであり（すなわち、クマリン部分またはその誘導体を含有する）、例えば、クマリニルリバーシブルブロッキング基のＣＨ炭素のいずれか１つは、ヌクレオチドアナログの３’−Ｏに共有結合により取り付けられている。
【００８５】
一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基はニトロナフタレニルであり（すなわち、ニトロナフタレン部分またはその誘導体を含有する）、例えば、ニトロナフタレニルリバーシブルブロッキング基のＣＨ炭素のいずれか１つは、ヌクレオシドアナログの３’−Ｏに共有結合により取り付けられている。
【００８６】
一部の実施形態では、リバーシブルブロッキング基は、群：
【化９】
2020508037.tif 000012
（式中、Ｒ３およびＲ４はＨまたはアルキルであり、かつ、Ｒ５は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、およびベンジルである）から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ３〜Ｒ５の決定は、本明細書において記載されるＭＷの制限により制約される（例えば、セクション３．２．１を参照）。
【００８７】
本発明において使用するために好適な他のリバーシブルブロッキング基は、標識されたリバーシブルターミネーターのブロッキング基として文献に記載されている。一般に、シークエンシングバイシンセシスにおいて使用される任意の好適なリバーシブルブロッキング基を本発明の実施において使用することができる。
【００８８】
３．２．１  リバーシブルターミネーターブロッキング基およびそれらを含有するヌクレオチドの特性
好ましくは、シークエンシングへの応用のために、ＲＴのブロッキング基は、シークエンシングされているＤＮＡの完全性に干渉しない反応条件下で除去可能である。理想的なブロッキング基は、長期安定性を呈し、ポリメラーゼ酵素により効率的に組み込まれ、二次的またはさらなる組込みの完全なブロックを引き起こし、かつポリヌクレオチド構造への損傷を引き起こさない穏やかな条件下、好ましくは水性条件下で除去される能力を有する。
【００８９】
本発明のある特定の実施形態では、ブロッキング基（デオキシリボースの３’酸素原子を含む）は、２００未満、多くの場合１９０未満、多くの場合１８０未満、多くの場合１７０未満、多くの場合１６０未満、多くの場合１５０未満、多くの場合１４０未満、多くの場合１３０未満、多くの場合１２０未満、多くの場合１１０未満、時に１００未満の分子量（ＭＷ）を有する。言い方を変えれば、ある特定の実施形態では、式ＩのＲ３は、１８４未満、多くの場合１７４未満、多くの場合１６４未満、多くの場合１５４未満、多くの場合１４４未満、多くの場合１３４未満、多くの場合１２４未満、多くの場合１１４未満、多くの場合１０４未満、多くの場合９４未満、時に８４未満のＭＷを有する。
【００９０】
デオキシリボヌクレオチド一リン酸の分子量は、約３０７〜３２２の範囲内である（ｄＡＭＰ  ３３１．２、ｄＣＭＰ  ３０７．２、ｄＧＭＰ  ３４７．２およびｄＴＭＰ  ３２２．２）。ある特定の実施形態では、ＮＬＲＴ部分は、ＧＤＳに組み込まれたときに（すなわち、ｄＮＴＰのピロリン酸を含まない）、５５０未満、多くの場合５４０未満、多くの場合５３０未満、多くの場合５２０未満、多くの場合５１０未満、多くの場合５００未満、多くの場合４９０未満、多くの場合４８０未満、多くの場合４７０未満、時に４６０未満の分子量を有する。
【００９１】
３．３  ホスフェート含有部分
一部の実施形態では、Ｒ３部分は、１つまたは複数のホスフェートおよび／またはホスフェートアナログ部分を含む。一部の実施形態では、Ｒ３部分は、ｎ＝０〜１２（通常、０、１、３、４、５または６）であり、かつ、ＸがＨまたはプライマー伸長反応においてポリメラーゼによる組込みに適合性の任意の構造である以下の構造（構造Ｖ）を有してもよい。例えば、Ｘは、アルキルまたは当該技術分野において記載される様々なリンカーのいずれかであってもよい。例えば、米国特許第９，７０２，００１号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。ＧＤＳへのリバーシブルターミネーターの組込みプロセスにおいて、部分Ｘはヌクレオチドから除去され（アルファリン酸以外の全てと共に）、それにより、Ｘは、組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド中に存在しないことが理解されるであろう。ある特定の実施形態では、Ｘは、検出可能な標識または親和性タグであってよいが、但し、本発明の親和性試薬は、部分Ｘに結合もしないし、部分Ｘの存在、非存在または構造に基づいてリバーシブルターミネーターを識別もせず、かつ、Ｘは、組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド中に存在しない。
【化１０】
2020508037.tif 000013
【００９２】
３．４  ＮＬＲＴセット
一部のアプローチでは、本発明によるＳＢＳシークエンシングは、シークエンシングアレイを複数のＮＬＲＴ（例えば、ＮＬＲＴ−Ａ、ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−ＣおよびＮＬＲＴ−Ｇ）と接触させることを含む。接触させることは、１回に１つのＮＬＲＴで逐次的に実行され得る。あるいは、４つのＮＬＲＴを、最も多くの場合、４つのＮＬＲＴの混合物として、同時にシークエンシングアレイと接触させてもよい。一緒になって、４つのＮＬＲＴは「ＮＬＲＴセット」を構成する。ＮＬＲＴセットのＮＬＲＴは、混合物としてパッケージ化されてもよく、または各異なるＮＬＲＴを別の容器中（ｉｓ  ａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に含むキットとしてパッケージ化されてもよい。４つのＮＬＲＴの混合物は、各塩基を等しい割合で含んでもよく、または等しくない量を含んでもよい。
【００９３】
一実施形態では、ＮＬＲＴセット中の各ＮＬＲＴは同じブロッキング基（例えば、アジドメチル）を含む。一実施形態では、ＮＬＲＴセット中のＮＬＲＴは異なるブロッキング基を含む（例えば、ＮＬＲＴ−Ａはアジドメチルを含みかつＮＬＲＴ−Ｔはシアノエテニルを含む；またはＮＬＲＴ−ＡおよびＮＬＲＴ−Ｇはアジドメチルを含みかつＮＬＲＴ−ＣおよびＮＬＲＴ−Ｔはシアノエテニルを含む）。異なるブロッキング基が使用される場合、そのようなブロッキング基は、異なるブロッキング基が同じ処理により除去され得るように選択されてもよい。あるいは、ブロッキング基は、適宜異なる時点に、異なる処理により除去されるように選択されてもよい。一実施形態では、セット中の１つまたは複数のＮＬＲＴは修飾された（天然に存在しない核酸塩基）を含む。
【００９４】
本明細書において記載されるＮＬＲＴは、混合物の形態において提供または使用され得る。例えば、混合物は、２つ、３つ、または４つ（またはそれより多くの）構造的に異なるＮＬＲＴを含有し得る。構造的に異なるＮＬＲＴは、それらの各々の核酸塩基において異なり得る。例えば、混合物は、それぞれが４つの天然ＤＮＡ核酸塩基（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）の１つ、またはこれらの誘導体を含む４つの構造的に異なるＮＬＲＴを含有し得る。
【００９５】
シークエンシング目的のために、ＮＬＲＴセット中の異なるＮＬＲＴは、別々にパッケージ化された後に、シークエンサー自体により混合されてもよく（例えば、フローセルへのデリバリー前）、または一緒にパッケージ化されてもよい（すなわち、予備混合される）。ＮＬＲＴセット（異なるＮＬＲＴは別々の容器中にパッケージ化されているかまたは同じ容器中の混合物として）を含むキットが提供されてもよい。
【００９６】
３．５  親和性試薬の結合を向上させる基を有する核酸塩基アナログ
一実施形態では、核酸塩基は、伸長中のＤＮＡ鎖の３’端において（すなわち、最後に組み込まれた塩基として）存在するときに核酸塩基に対する親和性試薬の特異性または親和性を増加させるが、プライマー伸長産物の内部のヌクレオチド中の親和性試薬により認識もされず、または該親和性試薬に接近可能でない、除去不可能な化学基を含む。１つのアプローチでは、修飾は、親和性試薬により認識または結合されるが、３’末端ヌクレオチドにおける同じ修飾と比べて低い親和性または低い効率を有する。
【００９７】
限定ではなく説明のために、そのような修飾核酸塩基の例は、
【化１１】
2020508037.tif 000014
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、同じまたは異なってよく、それぞれは、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｆ、構造ＸＩＸ〜ＸＸＶＩＩＩ、または塩基対形成に干渉しない任意の基から選択される）を含む。なお、Ｒ９がメチルの場合、構造ＸＶＩＩＩはチミジンである（ｉｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）。一部の場合には、修飾は、ヌクレオチドの抗原性を増加させるという追加の利益を有する。
【化１２】
2020508037.tif 000015
【００９８】
天然に存在する核酸塩基の分子量は、アデニン１３５；グアニン１５１、チミン１２６およびシトシン１１１である。一部の実施形態では、核酸塩基アナログは、天然塩基より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００Ｄａ大きい分子量を超えない分子量を有する。
【００９９】
３．６  非ブロックｄＮＴＰ
一実施形態では、３’−Ｏ−ブロッキング基を有しない天然ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰ）またはｄＮＴＰアナログがシークエンシングのために使用される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、パイロシークエンシングにおけるようにまたは１塩基の組込み後に停止するポリメラーゼによるように、シークエンシングプロセスにおいて１回に１つ組み込まれる。例示的な方法が文献に記載されており（例えば、Ju et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:19635-40, 2006；Guo, Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 9145-50, 2008、およびRonaghi et al., Science, 281:363-365, 1998を参照）、これらは、標識および／またはＲＴに標識を接続するリンカーの除去により本発明において使用するために改変されてもよい。一部のアプローチでは、異なる核酸塩基を有するｄＮＴＰが逐次的に付加されて組み込まれる（例えば、Ａ、次にＧなど）。通常、核酸塩基は、次のｄＮＴＰの付加の前に別々に画像化される。
【０１００】
３．７  デオキシリボースアナログ
本発明の一部の実施形態では、糖（デオキシリボース）部分は修飾される。例えば、核酸塩基アデニン、ブロッキング基アジドメチル、および糖デオキシリボースを有するＮＬＲＴは、ブロッキング基および糖部分を認識するように親和性試薬を使用して、核酸塩基シトシン、ブロッキング基アジドメチル、および糖修飾デオキシリボースを有するＮＬＲＴから区別され得る。
【０１０１】
３．８  ３’−Ｏリバーシブルターミネーターを有しないヌクレオチド
いくつもの応用において有用な異なる態様では、除去不可能（すなわち、切断不可能）な３’ブロッキング基を有するヌクレオチドがＮＬＲＴの代わりに使用される。１つのアプローチでは、親和性試薬を用いる検出後に、最後に組み込まれた塩基は除去され、その位置は、類似するが切断可能なブロッキング基を有するヌクレオチドによりファイル（ｆｉｌｅｄ）される（Koziolkiewicz et al., FEBS Lett. 434:77-82, 1998）。
【０１０２】
上記に与えたものの例としては、デオキシリボース糖部分の３’−Ｏを介してヌクレオチドに取り付けられたリバーシブルブロッキング基が挙げられる。本発明はまた、デオキシリボース糖の２’−Ｏ−に取り付けられたリバーシブルおよびノンリバーシブルブロッキング基を有するＮＬＲＴを含む。これらの実施形態は、単一塩基検出（単一または数塩基のプライマー伸長）、ＤＮＡ中のギャップおよびニックのモニタリングおよび他の検出方法のために使用され得る。したがって、当業者は、本明細書における方法および情報を、３’ではなく２’ブロッキング基を有するＮＬＲＴに適用できるであろう。
【０１０３】
４．親和性試薬
本発明は、例えば、ＳＢＳの間の伸長中のＤＮＡ鎖の末端へのポリメラーゼによる組込み後に、ＧＤＳの３’末端においてＮＬＲＴに特異的に結合する親和性試薬を使用する。一実施形態では、親和性試薬は構造ＩＩＩのＮＬＲＴに結合する。一実施形態では、親和性試薬は構造ＩＶのＮＬＲＴに結合する。
【０１０４】
４．１  親和性試薬全般
一態様では、本発明は、核酸の３’末端において組み込まれたＮＬＲＴの存在または非存在を検出するために使用される親和性試薬に関する。親和性試薬は、組み込まれたＮＬＲＴの構造的特徴に基づいてＮＬＲＴに特異的に結合する分子または高分子である。例えば、親和性試薬は、例えば、特定の塩基および／または特定のリバーシブルブロッキング基を有するＮＬＲＴに特異的に結合し得る。説明のために、親和性試薬の一例は、ＮＬＲＴが核酸塩基アデノシンおよびアジドメチルリバーシブルブロッキング基を含むときにＤＮＡ鎖の３’末端において組み込まれたＮＬＲＴに高親和性で結合するが、ＮＬＲＴが核酸塩基アデノシンを含むがアジドメチルリバーシブルブロッカーではなく３’ヒドロキシル基を有するときにＤＮＡ鎖の３’末端において組み込まれたＮＬＲＴに高親和性で結合せず、かつ、それぞれがアジドメチルリバーシブルブロッキング基を有するかまたは有しない、核酸塩基シトシン、グアニン、またはチミンを含むＤＮＡ鎖の３’端において組み込まれたＮＬＲＴに高親和性で結合しない、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。親和性試薬は、直接的または間接的に標識されてよい。
【０１０５】
「特異性」は、例えば、分子に対する親和性試薬の相対的な結合親和性により測定される、親和性試薬が異なる分子（例えば、ＮＬＲＴ）を識別する程度である。本発明の親和性試薬に関して、親和性試薬は、他のＮＬＲＴよりも１つのＮＬＲＴ（その標的ＲＴ）に対して実質的により高い親和性を有するべきである（例えば、親和性試薬は、Ｃヌクレオシドアナログに結合するが、Ａ、ＴまたはＧに結合しない）。また、親和性試薬は、伸長中のＤＮＡ鎖の３’末端においてポリメラーゼにより組み込まれたときにポリヌクレオチドの末端においてその標的ヌクレオシドアナログに結合するが、ＤＮＡ鎖上の他の場所ではヌクレオチド塩基に結合しない。ＧＤＳの３’端がＮＬＲＴ−Ａ、ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−Ｃ、ＮＬＲＴ−Ｇ（例えば、アレイ中）を含む複数（例えば、アレイ）の鋳型ポリヌクレオチドの存在下で、親和性試薬が、ＳＢＳシークエンシングにおいて使用される反応条件下でＮＬＲＴ−Ａに優先的に結合する場合、親和性試薬は、ＮＬＲＴ−Ａなどの特定のＮＬＲＴに特異的である。本明細書において使用される場合、第２の構造と比較して第１の構造への親和性剤の「優先的な結合」は、親和性剤が第１の構造に結合するが第２の構造に結合しないか、または第２の構造により弱く（すなわち、より低い親和性で）またはより低い効率で結合することを意味する。
【０１０６】
組み込まれたＮＬＲＴへの親和性試薬の結合の文脈において、「特異的結合」、「特異的に結合する」などの用語は、異なる核酸塩基（ＮＬＲＴ−Ｔ、−Ｃ、または−Ｇ）もしくは異なるブロッキング基を有するか、またはブロッキング基を有しない（例えば、３’−ＯＨを有するデオキシアデノシン）ＮＬＲＴと比較した特定のＮＬＲＴ（例えば、３’−Ｏアジド基を有するＮＬＲＴ−Ａ）との親和性試薬の優先的な会合を指す。親和性試薬とＮＬＲＴとの特異的結合は、少なくとも１０−６Ｍ−１の親和性（すなわち、解離定数Ｋｄにより測定される１０−６Ｍ−１より低い数値を有する親和性）を意味することがある。１０−８Ｍ−１より高い親和性が好ましい。特異的結合は、当該技術分野において公知の結合（例えば、抗体結合）の任意のアッセイを使用して決定することができ、該アッセイとしては、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫組織化学、およびシークエンシング反応において標的ＮＬＲＴに結合した蛍光標識親和性試薬の検出が挙げられる。本明細書において以下に論じるように、結合の特異性は陽性および陰性結合アッセイにより決定することができる。
【０１０７】
抗体などの親和性試薬と組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドとの特異的結合相互作用は、特異性に関与する組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）、または部分（ｍｏｉｅｔｙ）に関するものを含む様々な方法で記載することができる。類例がここでは有用である：ドメイン１およびドメイン２の２つのドメインを有するタンパク質を想像する。２つの異なる抗体が該タンパク質に特異的に結合し得る。しかしながら、それらは異なるエピトープを認識し得る。例えば、１つの抗体はドメイン１中のエピトープに結合し得、第２の抗体はドメイン２中のエピトープに結合し得る。この仮定では、修飾がドメイン１において為された場合、これは、第２の抗体による結合を変化させることなく、第１の抗体によるタンパク質の結合に影響し得る。この場合、第１の抗体によるタンパク質の結合は、ドメイン１に「依存する」と言うことができ、すなわち、ドメイン１における変化（例えば、アミノ酸配列の変化）は、抗体１の結合特性を変化させる（例えば、結合を損なわせる、結合親和性を増加させる、結合親和性を低減させるなど）。同様に、ドメイン１は、抗体１による結合に「関与する」と言うことができる。組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの場合、結合の特異性は、１つの部分（例えば、ブロッキング基）の構造的特徴によることがあり、他の部分による他の部分（例えば、核酸塩基）の構造により影響されないことがある。あるいは、結合の特異性は、複数の部分（例えば、核酸塩基およびブロッキング基の両方）などの構造的特徴によることがある。組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの親和性試薬の結合が部分の特定の構造的特徴の存在を必要とする場合、親和性試薬による結合は、それらの構造的特徴を有する部分に「特異的」または該部分の存在もしくは非存在に「基づく」ことがある。同様に、それらの構造的特徴を有する部分は、親和性試薬による結合に「関与する」ことがあり、または親和性試薬の結合は、それらの構造的特徴を有する部分の存在に「依存する」ことがある。
【０１０８】
「特異性」は環境に依存することがあることも注意されるべきである。例えば、ＡおよびＡ’の両方に結合するが、Ｂ、ＣまたはＤのいずれにも結合しない親和性試薬を想像する。Ａ、Ａ’、ＢおよびＣを含有する反応または試料において、親和性試薬はＡおよびＡ’の両方に結合し得るので、Ａに「特異的に結合する」と考えることはできない。しかしながら、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを含有する反応または試料において、親和性試薬はＡのみに結合し、その環境においてＡに特異的に結合するといわれる。別の例では、Ａ、Ａ’、ＢおよびＣを含有する試料において、親和性試薬は、異なる親和性、または効率でＡおよびＡ’に結合することがあり、それにより、Ａへの結合およびＡ’への結合はそれらの塩基において区別され得る。
【０１０９】
別の関連する用語は「識別する」（または時に「区別する」）である。特定のブロッキング基（例えば、アジドメチル）が存在する場合にのみ組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合するが、いずれの核酸塩基が存在するかによらずにアジドメチルブロッキング基を有する組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する親和性試薬は、アジドメチルブロッキング基を有する組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドとアジドメチルブロッキング基を有しない組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドとを「識別する」と言うことができ、またはより概括的に言えば、「ブロッキング基に基づいて識別する」と言うことができる。
【０１１０】
親和性試薬の特異性は、親和性試薬を調製するために使用された方法の結果である。例えば、アジドメチルブロッキング部分を認識する試薬は、陽性および陰性結合アッセイを用いて経験的に試験されてもよい。説明のために、１つのアプローチでは、試薬は、Ｏ−アジドメチルブロッキング部分の存在に基づいてＮＬＲＴに結合する抗体である。１つのアプローチでは、キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートされたアジドメチルを使用してハプテンＯ−アジドメチルに対する抗体が産生される。３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニンへの結合のためになるが、他のデオキシグアニンヌクレオチド、例えば、３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル−２’−デオキシグアニン；３’−Ｏ−（２−ニトロベンジル）−２’−デオキシグアニン；および３’−Ｏ−アリル−２’−デオキシグアニンへの結合のためにならない；ならびに他のアジドメチルＮＬＲＴ、例えば、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシアデノシン；３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシシトシン；および３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシチミンへの結合のためにならない、所望の抗体を選択することができる。
【０１１１】
抗体−ハプテン相互作用の性質はまた、Al Qaraghuli, 2015, “Defining the complementarities between antibodies and haptens to refine our understanding and aid the prediction of a successful binding interaction” BMC Biotechnology, 15(1)p.1；Britta et al., 2005, “Generation of hapten-specific recombinant antibodies: Antibody phage display technology: A review” Vet Med. 50:231-52；Charlton et al., 2002. “Isolation of anti-hapten specific antibody fragments from combinatorial libraries” Methods Mol Biol. 178:159-71；およびHongtao et al., 2014, “Molecular Modeling Application on Hapten Epitope Prediction: An Enantioselective Immunoassay for Ofloxacin Optical Isomers” J. Agric. Food Chem. 62 (31) pp 7804-7812に記載される方法などの当該技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。ある特定の部分（例えば、核酸塩基および糖部分）に結合するという親和性試薬の記載は、組み込まれたヌクレオチドの他の部分への結合を除外しないことが理解されるであろう。例えば、核酸塩基および糖部分に結合する親和性試薬は、ブロッキング基にも結合してよい。
【０１１２】
有用な親和性試薬の例としては、抗体（抗体の結合断片、単鎖抗体、二重特異的抗体などを含む）、アプタマー、ノッティン、アフィマー、１塩基三重らせん（ｏｎｅ−ｂａｓｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ）を形成する標識ｄＮＴＰ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、または組み込まれたＮＬＲＴに好適な特異性および親和性で結合する任意の他の公知の剤が挙げられる。
【０１１３】
親和性試薬は、標的ＮＬＲＴ中の核酸塩基、糖（例えば、デオキシリボース）、ブロッキング基、もしくは任意の他の部分またはこれらの組合せを特異的に認識し得る。１つのアプローチでは、親和性試薬は、ブロッキング基を含むエピトープを認識する。別のアプローチでは、親和性試薬は、核酸塩基を含むエピトープを認識する。別のアプローチでは、親和性試薬は、核酸塩基およびブロッキング基を含むエピトープを認識する。親和性試薬が部分に接触しない場合であっても、該部分が他の部分の位置を規定することがあると理解されるであろう。例えば、核酸塩基および３’ブロッキング基に基づいてＮＬＲＴを識別する親和性試薬について、デオキシリボース部分は、認識のために核酸塩基および３’ブロッキング基を位置決定するために必要とされる。
【０１１４】
抗体である親和性試薬の場合、特異的結合は、当該技術分野において公知の抗体結合についてのアッセイを使用して決定することができ、該アッセイとしては、ウエスタンブロット、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、またはカラムクロマトグラフィーが挙げられる。１つのアプローチでは、特異的結合は、ＥＬＩＳＡ型アッセイを使用して実証される。例えば、３’−アジドメチル−ｄＣに対して産生された血清抗体は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣ（陽性特異性アッセイ）およびヌクレオチド、例えば、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧもしくは−ｄＡまたは３’−ＯＨ−ｄＣ（陰性特異性アッセイ）の結合した基質に対して連続的に滴定することができる。
【０１１５】
一部の実施形態では、その標的ヌクレオシドに対する親和性試薬の塩基特異的結合は、他のヌクレオシドまたはアナログへの結合より２〜１００倍高い。一部の実施形態では、その標的ヌクレオシドに対する親和性試薬の塩基特異的結合は、他のヌクレオシドへの結合より少なくとも１０倍高いか、または少なくとも３０倍高いか、または少なくとも１００倍高い。
【０１１６】
特定の塩基への好ましい抗体結合効率は、１００ｐＭより低いか、または１ｎＭより低いか、または１０ｎＭより低いか、または１μＭより低い濃度においてである。
【０１１７】
所望の特異性を有する親和性試薬は、当該技術分野において公知の方法を使用して選択することができる。例えば、抗体などの親和性試薬は、複数ラウンドの陽性選択（すなわち、標的分子に結合する）および陰性選択（すなわち、標的分子ではない分子に結合しない）により同定し、選択し、または精製することができる。
【０１１８】
親和性試薬は、溶液中のｄＮＴＰおよびプライマー伸長産物の３’端において組み込まれた対応するヌクレオチドの両方に結合し得る。一部の実施形態では、親和性試薬は、組み込まれなかったＮＬＲＴ（例えば、溶液中のＮＬＲＴ）に結合しないか、または有意により低い特異性で結合する。しかしながら、一般に、親和性試薬による組み込まれなかったＮＬＲＴの結合はシークエンシングのプロセス中には起こらず、その理由は、組み込まれなかったＮＬＲＴは親和性試薬の導入前に除去（洗浄除去）されるためである。あるいは、ＮＬＲＴに結合した親和性試薬により形成された複合体は、画像化前に除去（洗浄除去）される。
【０１１９】
１つのアプローチでは、親和性試薬は、核酸塩基に特異的に結合し、３’−ＯＨ基の存在または非存在に部分的に基づいて異なる塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を区別する。このアプローチでは、親和性試薬は、ＧＤＳの内部（３’末端においてではない）に組み込まれたヌクレオチドから３’−ＯＨを有するＧＤＳの３’末端におけるヌクレオチドを区別する。一部の場合には、特定の核酸塩基を認識する親和性試薬はまた、３’−ＯＨ基の存在または非存在を区別し、それにより、特定の核酸塩基を有する３’末端ヌクレオチドとして組み込まれたＮＬＲＴを認識する。
【０１２０】
１つのアプローチでは、親和性試薬は、ブロッキング基を含むエピトープを認識するが塩基を区別しない。例えば、所与の４つのＲＴブロッキング基［Ａ．アジドメチル、Ｂ．２−（シアノエトキシ）メチル、Ｃ．３’−Ｏ−（２−ニトロベンジル）、およびＤ．３’−Ｏ−アリル］の親和性試薬であって、該４つのブロッキング基を区別する親和性試薬を製造することができる。説明のために、以下のＡ〜Ｄの標識されたデオキシグアニンアナログに対し、１つのＮＬＲＴのみを認識するが他の３つを認識しない親和性試薬を選択することができる。
Ａ．３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニン
Ｂ．３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル−２’−デオキシグアニン
Ｃ．３’−Ｏ−（２−ニトロベンジル）−２’−デオキシグアニン
Ｄ．３’−Ｏ−アリル−２’−デオキシグアニン
【０１２１】
一部の実施形態では、選択された親和性試薬は、異なる核酸塩基を有するヌクレオチドを、それらが同じブロッキング基を共有する限り区別しない。例えば、上記のＢ（３’−Ｏ−−２−（シアノエトキシ）メチル−２’−デオキシグアニン）を認識する親和性試薬は、３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル−２’−デオキシアデニン；３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル−２’−デオキシチミン；および３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル−２’−デオキシシトシンも認識することがある。
【０１２２】
ＲＴブロッキング基を差次的に認識する親和性試薬（例えば、モノクローナル抗体）の生成は、本開示によりガイドされる技術分野の当業者の技術的範囲内である。１つのアプローチでは、ハプテンＯ−アジドメチル（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートされた−Ｏ−アジドメチルまたはアジドメチル）に対する抗体が産生され、ＧＤＳ  ＴＰの３’末端における３’−Ｏ−アジドメチル−２’−ｄＮＭヌクレオチド（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣのそれぞれである）に結合することについて、および３’−Ｏ−Ｘ−２’−ｄＮＭ（Ｏ−Ｘはシークエンシング反応液中に存在する異なるブロッキング基である）に結合しないことについて陽性および陰性スクリーニングされる。他の実施形態では、選択プロセスが所望の特異性を有する親和性試薬を同定する限り、ハプテンは、３’−Ｏブロッキング基を有するデオキシリボース、またはヌクレオチド（例えば、３’−Ｏブロッキング基を有する一リン酸または三リン酸）などであってもよいことが認識されるであろう。
【０１２３】
非常に明確な構造的差異を有する異なるブロッキング基（例えば、アジドメチルに対して２−（シアノエトキシ）メチル  を４つのヌクレオチドが有する実施形態を上記の例は記載したが、本発明の一部の実施形態では、別個の親和性試薬により結合されるブロッキング基間には小さい差異しかない。例えば、ブロッキング基において、水素原子がフッ素原子またはメチル基により置換されて、親和性試薬のセットにより区別できる３つの関連するブロッキング基［ブロッキング基、Ｆ置換ブロッキング基、メチル置換ブロッキング基］を生成してもよい。
【０１２４】
本発明の一部の実施形態では、シークエンシングは、それぞれが３’−Ｏ−ブロッキング基を有する４つのＮＬＲＴを使用して実行され、２つまたはそれより多く、あるいは３つまたはそれより多く、あるいは４つ全てのブロッキング基は、（１）それらが同じ数の原子を有するか、または原子の数が小さい数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）以下だけ異なる；（２）ブロッキング基部分の分子式が１〜１０原子、例えば、１原子、２原子、３原子、４原子、６原子、７原子、８原子、９原子または１０原子異なる（例えば、ＣＨ３により置換された単一のＨは３つの差異；Ｆにより置換されたＨ、Ｓにより置換されたＯ）という意味で構造的に類似している。これらおよび他の実施形態では、ブロッキング基部分は、「リバーシブルターミネーターブロッキング基およびそれらを含有するヌクレオチドの特性」という題名のセクションにおいて本明細書に上記した特性のいずれかを有してもよい。
【０１２５】
一部の実施形態では、親和性試薬は、ＮＬＲＴ（例えば、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニン）に結合するが、対応するブロックされていないヌクレオチド（例えば、３’−ＯＨ−２’−デオキシグアニン）には結合しない。
【０１２６】
一実施形態では、親和性試薬は、ＮＬＲＴ（例えば、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニン）に結合するが、ブロッキング基を除去する処理後（例えば、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を用いた処理後）にヌクレオチドアナログから解離する。
【０１２７】
ＮＬＲＴ−Ａを特異的に認識する親和性試薬は抗Ａと称される。ＮＬＲＴ−Ｔを特異的に認識する親和性試薬は抗Ｔと称される。ＮＬＲＴ−Ｇを特異的に認識する親和性試薬は抗Ｇと称される。ＮＬＲＴ−Ｃを特異的に認識する親和性試薬は抗Ｃと称される。ＮＬＲＴ−Ｕを特異的に認識する親和性試薬は抗Ｕと称される。この技術用語は、免疫グロブリンの特異性を記載するために使用されるものに類似するが、本発明におけるこの技術用語の使用は、親和性試薬が必然的に抗体であると指し示すことを意図しない。上述の通り、
【０１２８】
親和性試薬は直接的に標識されてもよい。あるいは、親和性試薬は、標識された二次親和性試薬を使用して検出可能な非標識の一次親和性試薬であってもよい。例えば、ＮＬＲＴに特異的に結合する非標識の一次親和性試薬は、一次親和性試薬に結合する標識された二次親和性試薬（例えば、一次親和性試薬に結合する標識された抗体）を用いて検出されてもよい。以下のセクション４．５を参照。
【０１２９】
４．２  例示的な親和性試薬
一部の実施形態では、親和性試薬は抗体である。当該技術分野において公知の抗体産生のための任意の方法を用いることができる。
【０１３０】
４．２．１  抗体
本明細書において使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン分子または組成物（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）の他に、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体などの遺伝子操作された形態、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異的抗体）、および抗体断片を意味する。抗体は、組換え供給源からのものであってもよく、かつ／または、非限定的にトランスジェニック動物などの動物において製造されてもよい。本明細書において使用される「抗体」という用語は「抗体断片」を含み、これには、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ナノボディ  ダイアボディ、およびこれらのマルチマーおよび二重特異的抗体断片が含まれる。抗体は、従来技術を使用して断片化させることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシンを用いて抗体を処理することにより生成させることができる。結果として生じるＦ（ａｂ’）２断片を処理してジスルフィド架橋を還元させ、Ｆａｂ’断片を製造することができる。パパイン消化はＦａｂ断片の形成に繋がり得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異的抗体断片および他の断片はまた、組換え技術により合成することができる。抗体は、ＩｇＭならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などのＩｇＧを含む任意の有用なアイソタイプであり得る。一部の実施形態では、親和性試薬はミニボディである。ミニボディは、ヒンジ領域および免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインに融合した天然抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから構成される操作された抗体コンストラクトである。ミニボディは、したがって、抗原結合領域、二価分子へのアセンブリーを許容するＣＨ３ドメインおよびジスルフィド連結による二量体化を受け入れる抗体ヒンジを保持する単一のタンパク質鎖中にコードされた小型の全抗体である。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）もまた使用することができる。単一ドメイン抗体、またはＮＡＮＯＢＯＤＹ（Ａｂｌｙｎｘ）は、概ね、単一モノマー可変抗体ドメインを有する抗体断片である。単一ドメイン抗体は特定の抗原に選択的に結合し、従来の抗体より小さい（ＭＷ  １２〜１５ｋＤａ）。
【０１３１】
４．２．１．１  抗体の製造
ポリクローナル抗体を産生させるための方法は公知であり、ＮＬＲＴ特異的抗体を製造するために使用することができる。１つのアプローチについて以下の実施例２を参照。特定のＮＬＲＴ、例えばＮＬＲＴ−Ａに特異的なポリクローナル抗体を産生させるための１つの方法によれば、ウサギにＮＬＲＴ−Ａ（免疫原にコンジュゲートされている）を注射して抗体を産生させ、ブロッキング基を欠いた同じ構造（例えば、３’−ＯＨを有する）、および他のＮＬＲＴ（ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−Ｇ、およびＮＬＲＴ−Ｃ）に結合しない抗体を選択する。したがって、製造されたポリクローナル抗体は、シークエンシングアレイ上の特定の位置における伸長中のＤＮＡ鎖の３’末端において組み込まれる特定のＮＬＲＴを認識するが、伸長中の鎖の他の内部位置におけるその同じヌクレオシドまたはアレイ上の他の場所において組み込まれ得る他のＮＬＲＴを認識しない。（ポリクローナル抗体はまた、組み込まれなかったＮＬＲＴ−Ａを認識することがあるが、組み込まれなかったＮＬＲＴは、組み込まれたＮＬＲＴが標識された親和性試薬を使用してプロービングされる前に洗浄除去される。
【０１３２】
研究者の必要性に応じて、ＮＬＲＴ全体に対して抗体を産生させる必要は必ずしもないことが認識されるであろう。例えば、ブロッキング基に特異的な抗体が所望される場合、ハプテンは、３’−Ｏ−ブロッキング基を有するデオキシリボース（すなわち、核酸塩基を有しない）または単独で３’−Ｏ−ブロッキング基であってもよい。一部の実施形態では、３’末端における目的のＮＬＲＴを有するポリヌクレオチドに対する抗体が産生される。一部の実施形態では、鋳型分子にアニールしたポリヌクレオチドに対する抗体が産生される。
【０１３３】
モノクローナル抗体を製造するために、ＮＬＲＴを含む免疫原を用いて免疫化された動物から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準的な体細胞融合手順により骨髄腫細胞と融合させ、それによりこれらの細胞を不死化させ、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は当該技術分野において周知である（例えば、元々はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Kohler and Milstein Nature 256:495-497, 1975）により開発されたハイブリドーマ技術の他に、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72）、ヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., 1986, Methods Enzymol, 121:140-67）、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., 1989, Science 246:1275）などの他の技術。ハイブリドーマ細胞は、特定のＲＴに特異的に反応性の抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０１３４】
特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体、または抗体断片はまた、細胞表面コンポーネントを有する細菌中で発現される、免疫グロブリン遺伝子またはその部分をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより生成されてもよい。例えば、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌中で完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域およびＦＶ領域を発現させることができる（例えば、Ward et al., Nature 341:544-546, 1989；Huse et al. Science 246:1275, 1989；およびMcCafferty et al. Nature 348:552-554, 1990を参照）。
【０１３５】
さらに、標的ＮＬＲＴに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に単離される。例えば、抗体ファージライブラリーは、使用して標的ＮＬＲＴに特異的な抗体断片を同定することによりスクリーニングされてもよい。抗体ファージライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野において周知である。
【０１３６】
抗ＮＬＲＴ抗体はまた、無細胞系において製造されてもよい。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44, 2009；Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45, 2004；およびEndo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713, 2003において記載されている。
【０１３７】
４．２．１．２  抗体の精製
抗ＮＬＲＴ抗体は、任意の好適な方法により精製されてもよい。そのような方法としては、親和性マトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が挙げられるがこれらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルまたはフェニルカラムもまた、一部のポリペプチドを精製するために好適なことがある。以下のセクション８．４を参照。ポリペプチドを精製する多くの方法が当該技術分野において公知である。ポリクローナル抗血清からの抗ＮＬＲＴ抗体のアフィニティー精製は、以下の実施例２において記載されている。
【０１３８】
４．２．１．３  抗体の標識化
抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して標識することができる。レポーター分子、例えば、酵素および蛍光／発光タンパク質などのシグナル生成タンパク質への抗体および他の親和性試薬の連結方法は当該技術分野において周知である（Wild, The Immunoassay Handbook, 4th ed.; Elsevier: Amsterdam, the Netherlands, 2013；Kobayashi and Oyama, Analyst 136:642-651, 2011）。
【０１３９】
４．２．２  アプタマー
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。アプタマーは以下の通りに分類することができる：（ａ）オリゴヌクレオチドの（通常、短い）鎖からなるＤＮＡまたはＲＮＡまたはＸＮＡアプタマー；および（ｂ）両方の末端においてタンパク質スキャフォールドに取り付けられた１つ（またはそれより多くの）短鎖可変ペプチドドメインからなるペプチドアプタマー。
【０１４０】
核酸アプタマーは、繰り返しのラウンドのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択またはこれと同等にＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を通じて様々な分子標的、例えばＮＬＲＴに結合するように操作された核酸種である。例えば、標的ＮＬＲＴに対して親和性を有するアプタマーは、非結合性アプタマーが廃棄され、提案される標的に結合するアプタマーが増幅される反復処理であるＳＥＬＥＸを通じて大きいオリゴヌクレオチドライブラリーから選択することができる。初期陽性選択ラウンドの後に陰性選択が行われることがある。これは、結果として得られるアプタマー候補の選択性を向上させる。この処理では、標的ＮＬＲＴを親和性カラムに固定化させる。アプタマーライブラリーを適用し、結合させる。弱い結合物質を洗浄除去し、結合したアプタマーを溶出させ、ＰＣＲを使用して増幅する。次に、増幅されたアプタマーのプールを標的に再び適用する。所望の選択性および親和性のアプタマーが得られるまでストリンジェンシーを増加させて、その方法を複数回繰り返す。例えば、Jayasena, et al., Clinical Chemistry 45:1628-1650, 1999を参照。ペプチドアプタマーの選択は、酵母２ハイブリッド系などの異なる系を使用して行うことができる。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイおよび他の表面ディスプレイ技術、例えば、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイにより構築されたコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択することができる。これらの実験手順はバイオパニングとしても公知である。例えば、Reverdatto et al., 2015, Curr. Top. Med. Chem. 15:1082-1101を参照。
【０１４１】
４．２．３  アフィマー
アフィマーは、抗体に類似した特異性および親和性で標的分子に結合する小さい（１２〜１４ｋＤａ）高度に安定なタンパク質である。これらのタンパク質は、アルファヘリックスが逆平行ベータシートの上に位置する共通の三次構造を共有する。アフィマータンパク質は、モノクローナル抗体と類似の様式において高親和性および特異性で所望の標的タンパク質に結合するように全て無作為化できる２つのペプチドループおよびＮ末端配列を提示する。タンパク質スキャフォールドによる２つのペプチドの安定化は、ペプチドが取ることができる可能なコンホメーションを制約し、遊離ペプチドのライブラリーと比較して結合親和性および特異性を増加させる。
【０１４２】
ＮＬＲＴに特異的なアフィマーは、標的ＮＬＲＴへの高特異性結合および高結合親和性（例えば、ｎＭ範囲）を有するアフィマータンパク質を同定するためにスクリーニングされるファージディスプレイライブラリーの使用により選択することができる。多くの異なる標識、タグおよび融合タンパク質、例えばフルオロフォアが、様々な応用において使用するためにアフィマータンパク質にコンジュゲートされている。例えば、米国特許第８，４８１，４９１号明細書、同第８，０６３，０１９号明細書、および国際公開第２００９／１３６１８２号パンフレット（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。Crawford et al., Brief Funct. Genomic Proteomic, 2:72-79, 2003も参照。
【０１４３】
４．２．４  ノッティン
「ノッティン」または「阻害因子シスチンノット」（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｙｓｔｉｎｅ  ｋｎｏｔ）（ＩＣＫ）は、３つのジスルフィド架橋を含有するタンパク質構造モチーフである。それらの間のポリペプチドのセクションと共に、２つのジスルフィドはループを形成し、該ループを第３のジスルフィド結合（配列中の３つ目および６つ目のシステインを連結する）が通過してノットを形成する。タンパク質操作を使用して新しい結合エピトープを天然ノッティン中に導入することができ、また、ノッティンは、広範な標的を標的化するために操作されている。ＮＬＲＴに特異的なノッティンを製造する１つのアプローチは、酵母表面ディスプレイおよび蛍光活性化細胞選別を使用してノッティンライブラリーを作出およびスクリーニングすることである。標的ＮＬＲＴに対して選択性および高親和性を有するノッティンの製造および本発明との関連において使用するためのそのようなノッティンの標識化に関する情報について、例えば、Kintzing and Cochran, Curr. Opin. Chem. Biol. 34:143-150, 2016；Moore et al., Drug Discovery Today: Technologies 9(1):e3-e11, 2012；およびMoore and Cochran, Meth. Enzymol. 503:223-51, 2012を参照。
【０１４４】
４．３  標識された親和性試薬
標識された親和性試薬は、様々な方法により鋳型核酸をシークエンシングするために使用することができる。それらはまた、当業者に明らかなように、シークエンシング以外の様々な応用において使用することができる。本発明の抗体および他の親和性試薬を標識する任意の方法を使用することができる。
【０１４５】
４．３．１  蛍光検出可能な標識
本明細書において記載される抗体、アプタマー、アフィマー、ノッティンおよび他の親和性試薬などの本発明の実施において使用される親和性試薬は、検出可能に標識され得る。例えば、本明細書において記載される親和性試薬は、蛍光色素またはフルオロフォアを用いて検出可能に標識され得る。「蛍光色素」はフルオロフォア（特定の波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長において光を再放出する化学的化合物）を意味する。蛍光色素は、典型的に、約３００ｎｍ〜約１，０００ｎｍまたは少なくとも約５，０００、より好ましくは少なくとも約１０，０００、最も好ましくは少なくとも約５０，０００ｃｍ−１  Ｍ−１の波長において最大モル消散係数、および少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１、より好ましくは少なくとも約０．５、最も好ましくは約０．１〜約１の量子収量を有する。
【０１４６】
以下の参考文献に例示されるように、親和性試薬に取り付けるための適切な検出可能な標識を選択するための文献において入手可能な多量の実施ガイダンスが存在する：Grimm et al., Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 113:1-34, 2013；Oushiki et al., Anal. Chem. 84:4404-4410, 2012；Medintz & Hildebrandt, editors, 2013, "FRET - Foerster Resonance Energy Transfer: from theory to applications," (John Wiley & Sons)；など。文献はまた、蛍光分子のリスト、およびフルオロフォアまたはレポーター−消光剤ペアを選択するためのそれらの関連する光学的特性を提供する参考文献を含み、これには、例えば、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 2005)などがある。さらに、Ullman et al.、米国特許第３，９９６，３４５号明細書；Khanna et al.、米国特許第４，３５１，７６０号明細書などにより例示されるように、ＲＴまたはその部分に付加され得る一般的な反応性基を介して共有結合のためにレポーター分子を誘導体化するための大規模なガイダンスが文献中に存在する。上述の刊行物のそれぞれは、参照することによりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
例示的な蛍光色素としては、アクリジン色素、シアニン色素、フルオロン色素、オキサジン色素、フェナントリジン色素、およびローダミン色素が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な蛍光色素としては、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７または４８８）、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ５３２または６５５）、およびＣｙ５が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な蛍光色素は、２または４チャネルＳＢＳ化学およびワークフローにおいて使用されるか、またはこれらと適合性の色素をさらに含むことができる。
【０１４８】
例示的な標識分子は、フルオレセインなどのキサンテン色素、およびローダミン色素から選択されてもよい。親和性試薬への連結のための部位として使用できるフェニル部分上の置換基を有するこれらの化合物の多くの好適な形態が広く市販されている。蛍光化合物の別の群は、アルファ位またはベータ位においてアミノ基を有するナフチルアミンである。１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、および２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートがそのようなナフチルアミノ化合物に含まれる。他の標識としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；アクリジン、例えば９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール；スチルベン；ピレンなどが挙げられる。
【０１４９】
一部の実施形態では、標識は、フルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素および適切な連結方法論は、多くの参考文献、例えば、Khanna et al. (上掲)；Marshall, Histochemical J., 7:299-303 (1975)；Menchen et al.、米国特許第５，１８８，９３４号明細書、Menchen et al.、欧州特許出願第８７３１０２５６．０号明細書；およびBergot et al.、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号に記載されている。親和性試薬またはヌクレオシドアナログのための検出可能な標識として使用することができるフルオロフォアとしては、ローダミン、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、フルオレセイン、Ｖｉｃ（商標）、Ｌｉｚ（商標）、Ｔａｍｒａ（商標）、５−Ｆａｍ（商標）、６−Ｆａｍ（商標）、６−ＨＥＸ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  ５２０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１５、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５０】
標識の賢明な選択により、異なる標識が単一の反応液中で異なる波長において励起および／または検出される分析を実行することができる。例えば、Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., Eds.) Marcel Dekker, New York, (1971)；White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970)；Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Press, New York, (1971)；Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976)；Indicators (Bishop, Ed.). Pergamon Press, Oxford, 1972；およびHaugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (2005)を参照。
【０１５１】
４．３．２  酵素標識された親和性試薬
１つのアプローチでは、親和性試薬（例えば、抗体またはアフィマー）は酵素標識され、かつ基質の存在下で、プライマー伸長産物に結合した親和性試薬と会合された酵素は、検出可能なシグナルを生じさせる。非限定的に例えば、酵素としては、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。１つのアプローチでは、酵素はペルオキシダーゼである。１つのアプローチでは、親和性試薬（例えば、抗体またはアフィマー）は、直接的に酵素標識される。１つのアプローチでは、例えば、抗体または他の親和性試薬は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどのホスファターゼを使用して標識される（Beyzavi et al., Annals Clin Biochem 24:145-152, 1987）。１つのアプローチでは、親和性試薬は、ルシフェラーゼまたは化学発光シグナルを生じさせるために使用できる他のタンパク質に連結される（またはそれとの融合タンパク質の部分である）。別のアプローチでは、親和性試薬は、プロトンが例えばイオン半導体シークエンシング（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）により検出され得るｐＨ変化などの、非光学的シグナルを生じさせるために選択される酵素系に連結／融合され得る。酵素標識された親和性試薬の使用は、シグナル増幅の結果としてもたらされる高い感度およびシークエンシング方法を様々な機器に適合させることができる能力などのある特定の利点を有する。酵素レポーター系は、Rashidian et al., Bioconjugate Chem. 24:1277-1294, 2013において総説されている。
【０１５２】
４．３．３  抗体融合親和性試薬
加えて、組換え抗体断片、例えば単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）をレポータータンパク質と直接的に連結させる融合（Skerra and Plueckthun, Science 240:1038-1041, 1988；Bird et al., Science 242:423-426, 1988；Huston et al., Methods Enzymol 203:46-88, 1991；Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol. 2012:1, 2012）が使用されてもよい。例えば、生物発光特性を有する発光タンパク質、例えばルシフェラーゼおよびエクオリンを例えば抗体断片、エピトープペプチドおよびストレプトアビジンとの融合タンパク質におけるレポータータンパク質として使用することができる（Oyama et al., Anal Chem 87:12387-12395, 2015；Wang et al., Anal Chim Acta 435:255-263, 2001；Desai et al., Anal Biochem 294:132-140, 2001；Inouye et al., Biosci Biotechnol Biochem 75:568-571, 2011）。
【０１５３】
４．４  間接的および直接的検出方法
親和性試薬は直接的に標識されてもよく（例えば、例えばフルオロフォアへの共有結合を介した、標識へのコンジュゲーションによる）、または、例えば、３’ＮＬＲＴを有する伸長したプライマーに直接的に結合した一次親和性試薬に結合する標識された二次親和性試薬の結合により、間接的に標識されてもよい。非標識の一次親和性試薬は標的ヌクレオチドに結合し、標識された二次親和性試薬（例えば、抗体、アプタマー、アフィマーまたはノッティン）は一次親和性試薬に結合する。一部のアプローチでは、一次および／または二次親和性試薬は抗体である。例えば、１つのアプローチでは、親和性試薬は「一次」抗体（例えば、ウサギ抗ＮＬＲＴ−Ｃ抗体）であり、かつ、二次結合剤は、標識された抗一次抗体（例えば、色素標識ヤギ抗ウサギ抗体）である。一部のアプローチでは、二次親和性試薬の使用は、有利なシグナル増幅を提供する。
【０１５４】
間接的な検出の場合、アッセイは２つの別個の部分を含む：先ず、非標識の一次抗体とのインキュベーションの期間（通常、１時間）があり、その間に抗体は抗原に結合する（当然、抗原が存在すると仮定している）。次に、過剰な未結合の一次抗体は洗浄除去され、標識された二次試薬が加えられる。インキュベーションの期間（再び１時間）の後、過剰な二次試薬は洗浄除去され、一次抗体と会合（すなわち、二次試薬を介して間接的に）した標識の量が定量化される。抗原が存在する場合、標識は、通常、有色物質の産生またはある特定の波長において放出される光の量の増加を結果としてもたらす。抗原の非存在下では、一次抗体の結合も二次試薬の結合もなく、したがってシグナルはない。直接的な検出を用いる場合、一次抗体への標識の事前の共有結合は、抗原との単一のインキュベーション工程のみが必要とされ、間接的な検出を用いる場合の２ラウンドのインキュベーションおよび洗浄工程とは対照的に、単一ラウンドの洗浄工程のみであることを意味する。
【０１５５】
４．４．１  二次抗体の特異性
一次および二次抗体は、複数の抗原を区別するために選択されてもよい（例えば、ＲＴ−Ａ、ＲＴ−Ｃ、ＲＴ−ＧおよびＲＴ−Ｔを互いから区別するため）。非標識の一次抗体（典型的に、モノクローナル抗体または操作された抗体）は異なるアイソタイプを有してもよく、かつ／または異なる種に特徴的な配列を有してもよい（例えば、異なる動物において産生されたポリクローナル抗体もしくは対応するモノクローナル抗体または他の親和性試薬）。そのような場合、各抗原のための標識された二次（すなわち、抗一次）抗体は、適切なアイソタイプまたは種の配列に特異的である。例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３の一次抗体をアイソタイプ特異的な二次抗体と共に使用することができる。
【０１５６】
４．４．２  予め組み合わせられた一次および二次抗体
一次および二次抗体または他の剤は、シークエンシングアレイに逐次的に、同時に加えられてもよく、二次抗体が一次抗体に結合する条件下で予め組み合わせられて、複合体としてアレイに加えられてもよい。図２および実施例７を参照。
【０１５７】
４．５  １、２、３、または４色シークエンシング
本発明の方法を使用するシークエンシングは、２、３、または４色シークエンシングであってもよい。１つのアプローチでは、（４色シークエンシングの）各親和性試薬は、異なる検出可能な標識（例えば、蛍光色素）または特有のシグナルを生じさせる標識の組合せを用いて直接的または間接的に標識される。単一の抗原が２つまたはそれより多くの色素（または他の標識）を用いて認識される場合、その必要はないが、色素または他の標識の両方（または全て）を用いて単一の親和性試薬分子を標識できることが理解されるであろう。むしろ、単一の抗原に特異的な親和性試薬分子の部分（例えば、５０％）を１つの色素を用いて標識することができ、かつ、単一の抗原に特異的な親和性試薬分子の別の部分（例えば、５０％）を他の色素を用いて標識することができる。
【０１５８】
１つのそのような方法によれば、表面上の位置に配された一本鎖核酸鋳型を含むアレイが提供される。伸長によるシークエンシング、またはＳＢＳは、複数のシークエンシングサイクルにおいて核酸鋳型中の検出位置におけるヌクレオチドの素性を決定するために以下により行われる：（ｉ）非標識の相補的ヌクレオチド（ＮＬＲＴ）を検出位置におけるヌクレオチドに結合させ（または組込み）、（ｉｉ）そのようなＮＬＲＴに特異的に結合する直接的または間接的に標識された親和性試薬をＮＬＲＴに結合させることによりＮＬＲＴを標識し；（ｉｉｉ）検出位置における相補的なＮＬＲＴと関連付けられるシグナルの存在または非存在を検出し、該シグナルは標識の結果としてもたらされるものであり（例えば、蛍光シグナル）；（１）検出位置において第１のシグナルを検出しかつ第２のシグナルを検出しないことは、ＮＬＲＴ−Ａ、ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−ＧおよびＮＬＲＴ−Ｃから選択される相補的なＮＬＲＴを同定し；（２）検出位置において第２のシグナルを検出しかつ第１のシグナルを検出しないことは、（１）において選択されたＮＬＲＴとは異なるＮＬＲＴ−Ａ、ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−ＧまたはＮＬＲＴ−Ｃから選択されるＮＬＲＴとして相補的なＮＬＲＴを同定し；（３）検出位置において第１のシグナルおよび第２のシグナルの両方を検出することは、（１）および（２）において選択されたヌクレオチドとは異なるＮＬＲＴ−Ａ、ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−ＧおよびＮＬＲＴ−Ｃから選択されるＮＬＲＴとして相補的なＮＬＲＴを同定し；かつ（４）該位置において第１のシグナルおよび第２のシグナルのいずれも検出しないことは、（１）、（２）および（３）において選択されたヌクレオチドとは異なるＮＬＲＴ−Ａ、ＮＬＲＴ−Ｔ、ＮＬＲＴ−ＧおよびＮＬＲＴ−Ｃから選択されるＮＬＲＴとして相補的なＮＬＲＴを同定し；かつ（ｉｉｉ）相補的なＮＬＲＴの素性に基づいて核酸鋳型中の検出位置におけるヌクレオチドの素性を推定する。
【０１５９】
別のそのような方法は、複数の核酸鋳型を提供することであって、各核酸鋳型が、プライマー結合部位、およびプライマー結合部位に隣接して、標的核酸配列を含む、提供すること；プライマーをプライマー結合部位にハイブリダイズさせ、かつＮＬＲＴのセットおよび対応する親和性試薬のセットを使用してシークエンシングバイシンセシスの１つまたは複数のサイクルにおいて１サイクル当たり１ヌクレオチドだけ個々のプライマーを伸長させることにより複数の異なる核酸鋳型に対してシークエンシング反応を行うことであって、ＮＬＲＴのセットおよび対応する親和性試薬のセットは、例えば：（ｉ）第１のＮＬＲＴおよび第１のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第１の標識を含む第１の親和性試薬；（ｉｉ）第２のＮＬＲＴおよび第２のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第２の標識を含む第２の親和性試薬；（ｉｉｉ）第３のＮＬＲＴおよび第３のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第１の標識および第２の標識の両方を含む第３の親和性試薬；および（ｉｖ）第４のＮＬＲＴおよび第４のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第１の標識および第２の標識のいずれも含まない第４の親和性試薬であり、第１の標識および第２の標識は互いから区別可能である、シークエンシング反応を行うこと；およびシークエンシングバイシンセシスの各サイクルにおいて、第１の標識の存在または非存在および第２の標識の存在または非存在を検出することにより検出位置におけるＮＬＴＲの素性を決定して標的核酸配列を決定することを含む。以上の方法の代替は、第３のＮＬＲＴに特異的に結合する第３の親和性試薬の混合物であって、その一部が第１の標識を含みかつその一部が第２の標識を含む、混合物（例えば、等量混合物）を使用することである。
【０１６０】
１色シークエンシング方法では、親和性試薬は、区別可能な強度において存在する検出可能な標識を含む。例えば、１つのそのような実施形態によれば、そのような方法は以下を含む：そのような方法は、複数の核酸鋳型を提供することであって、各核酸鋳型が、プライマー結合部位、およびプライマー結合部位に隣接して、標的核酸配列を含む、提供すること；プライマーをプライマー結合部位にハイブリダイズさせ、かつＮＬＲＴのセットおよび対応する親和性試薬のセットを使用してシークエンシングバイシンセシスの１つまたは複数のサイクルにおいて１サイクル当たり１ヌクレオチドだけ個々のプライマーを伸長させることにより複数の異なる核酸鋳型に対してシークエンシング反応を行うことであって、ＮＬＲＴのセットおよび対応する親和性試薬のセットは、例えば：（ｉ）第１のＮＬＲＴおよび第１のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第１の強度において標識を含む第１の親和性試薬；（ｉｉ）第２のＮＬＲＴおよび第２のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第２の強度において標識を含む第２の親和性試薬；（ｉｉｉ）第３のＮＬＲＴおよび第３のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ第３の強度において標識を含む第３の親和性試薬；および（ｉｖ）第４のＮＬＲＴおよび第４のＮＬＲＴに特異的に結合しかつ非標識である第４の親和性試薬（または、代替的に、親和性試薬のセットは、第１、第２および第３の親和性試薬のみを含み、第４のＮＬＲＴに結合する第４の親和性試薬を含まない）、シークエンシング反応を行うこと；および各サイクルのシークエンシングバイシンセシスにおいて、標識の存在および強度（または非存在）を検出することにより検出位置におけるＮＬＴＲの素性を決定して標的核酸配列を決定することを含む。
【０１６１】
別のアプローチでは、１つまたは同じ数の単一の色素の分子を用いて標識されているが、異なる結合効率［すなわち、アレイ上の単一のスポットに結合した親和性試薬の平均数、例えば、ＮＬＲＴ−Ａについて標的ＤＮＡ分子の全てのコピーの１０％、ＮＬＲＴ−Ｔについて３０％、およびＮＬＲＴ−Ｃについて６０％（およびＮＬＲＴ−Ｇについて０パーセントまたは検出可能な結合がほとんどない）］の結果として４つのＮＬＲＴを識別する親和性の親和性試薬が使用される。１つのアプローチでは、標的は同じブロッキング基を有し、かつ、それらの標的に対して異なる親和性を有する親和性試薬が選択される。別の１つのアプローチでは、ブロッキング基は、同じ親和性試薬の結合の効率を調整して、シグナルの塩基特異的レベルを生成するように小さい化学的変化を用いて修飾されてもよい。例えば、非修飾のブロッキング基は最も高いシグナル（１００％のシグナル）を生じさせてもよく、修飾１を有するブロッキング基はより低いレベルのシグナル（例えば、５０％）を生じさせてもよく、修飾２を有するブロッキング基はいっそう低い（２５％）さらにより低いシグナルを生じさせるなどであってもよい。
【０１６２】
関連するアプローチでは、２つの異なるブロッキング基（アジドメチルおよびシアノエトキシメチル）およびそれぞれの１つの化学的変異体（アジドメチル−プライムおよびシアノエトキシメチル−プライム）ならびに２つの抗体の使用を２色シークエンシング（２色×２強度）のために使用することができる。説明のために、
アジドメチル−ｄＡ      親和性剤１、色１、低い強度（０〜４０％）
アジドメチル−プライム−ｄＣ      親和性剤１、色１、高い強度（６０〜１００％）
シアノエトキシメチル−ｄＧ      親和性剤２、色２、低い強度（０〜４０％）
シアノエトキシメチル−プライム−ｄＴ      親和性剤２、色２、高い強度（６０〜１００％）
【０１６３】
一実施形態では、親和性剤１、色１、低い強度は０に近いシグナル強度を有し、かつ、親和性剤２、色２、低い強度は、より高いシグナル強度（２５〜４０％）を有する。
【０１６４】
関連するアプローチの実施形態では、ヌクレオチドの単一の種がヌクレオチドの混合物として使用され、該混合物の部分が１つのブロッキング基を用いて標識されかつ残りの部分が他のブロッキング基を用いて標識される、２色シークエンシングを実行することができる。説明のために：
アジドメチル−ｄＡ      ブロッキング基１
シアノエトキシメチル−ｄＧ      ブロッキング基２
アジドメチル−プライム−ｄＣ      ブロッキング基１を有する７０％のヌクレオチドとブロッキング基２を有する３０％のヌクレオチドとの混合物
シアノエトキシメチル−プライム−ｄＴ      ブロッキング基１を有する３０％のヌクレオチドとブロッキング基２を有する７０％のヌクレオチドとの混合物
【０１６５】
別のアプローチでは、１つの親和性試薬のみが使用される。区別可能なレベルのシグナルを生成するために、親和性試薬により認識される異なる割合のブロッキング基を有するヌクレオチド混合物が使用される。混合物中のヌクレオチドの残余は、対応する親和性試薬を有しないブロッキング基を有する。説明のために：
ｄＡ      ０％のブロッキング基１、１００％のブロッキング基２
ｄＧ      ２５％のブロッキング基１、７５％のブロッキング基２
ｄＣ      ５０％のブロッキング基１、５０％のブロッキング基２
ｄＴ      １００％のブロッキング基１、０％のブロッキング基２
【０１６６】
別の実施形態では、抗体は、下流の塩基が切断可能または切断不可能な基の付加により修飾されている２つの塩基（ヌクレオチドダイマー）を認識してもよい。
【０１６７】
別の実施形態では、最後に組み込まれた塩基は、２つの親和性試薬の組合せの結合により同定され、１つの親和性試薬は核酸塩基を特異的に認識して結合し、かつ、第２の親和性試薬はブロッキング基を特異的に認識して結合する。２つの親和性試薬がそれらの各々の「標識」としてＦＲＥＴドナー−アクセプターペアを含む場合など、両方の親和性試薬が結合しているかつ／または空間的に近接している場合にのみ、末端塩基の素性の決定を行うことができる。あるいは、１つの親和性試薬の結合がコンホメーションの変化をもたらし、それが第２の親和性試薬の結合を可能としまたは増進させてもよい。
【０１６８】
本明細書において記載されるヌクレオシドアナログは、様々なシークエンシング方法において使用することができる。例えば、アナログは、１標識（「標識なし」と呼ばれることもある）、２標識、３標識、または４標識シークエンシング方法において使用することができ、該方法では、非標識のアナログは、１、２、３、または４標識スキームに従って直接的または間接的に標識された親和性試薬と対形成する。
【０１６９】
例示的な１標識シークエンシング方法としては、異なる核酸塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を有するヌクレオシドアナログが連続して送り込まれ、各異なる核酸塩基について同じシグナルまたは標識の存在または非存在を検出することにより組込みが検出される方法が挙げられるがこれに限定されない。したがって、１標識法は１色法として知られることもあり、その理由は、検出シグナルおよび／または標識が、各ヌクレオシドアナログについて異なる強度（または存在しない）であり得るとはいえ、全ての核酸塩基について同じであるからである。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ媒介性の鋳型により導かれる重合によるプライマーへのヌクレオシドの組込みは、ヌクレオシドピロリン酸から切断されたピロリン酸を検出することにより検出され得る。ピロリン酸は、ＡＴＰスルフリラーゼがアデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でピロリン酸をＡＴＰに変換し、そしてそれがルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介性の変換のための基質として作用してＡＴＰ生成に比例した量で可視光を生成する連結アッセイを使用して検出され得る。
【０１７０】
別の実施形態によれば、本明細書において記載されるＲＴおよび親和性試薬を使用し、２つの区別可能なシグナルを組合せの様式で使用して４つの異なるＲＴの組込みを検出する２標識、または２色シークエンシングを行うことができる。例示的な２標識の系、方法、および組成物としては、米国特許第８，６１７，８１１号明細書に記載されているものが挙げられるがこれに限定されず、該文献の内容は、全ての目的のため、特に２標識シークエンシングに関する開示のためにその全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。簡潔に述べれば、２標識シークエンシングでは、第１の標識を含む第１の親和性試薬の特異的結合により新たに組み込まれたＲＴを標識した後、第１の標識の存在を検出することにより第１のＲＴ（例えば、ＲＴ−Ａ）の組込みが検出される。第２の標識を含む第２の親和性試薬の特異的結合により第２のＲＴを標識した後、第２の標識の存在を検出することにより第２のＲＴ（例えば、ＲＴ−Ｃ）の組込みが検出される。第１の標識および第２の標識の両方を含む第３の親和性試薬の特異的結合により第３のＲＴを標識した後、第１の標識および第２の標識の両方の存在を検出することにより第３のＲＴ（例えば、ＲＴ−Ｔ）の組込みが検出され；第１の標識および第２の標識の両方の非存在を検出することにより第４のＲＴ（例えば、ＲＴ−Ｇ）の組込みが検出され、これは、非標識である第４の親和性試薬の結合の結果としてもたらされるのか、それとも使用される親和性試薬セット中に第４の親和性試薬が含まれないという事実の結果としてもたらされるのかによらない。２色シークエンシングでは、第１の標識は第２の標識から区別可能であり、かつ、第１および第２の標識の組合せは、単独での第１および第２の標識から区別することができる。
【０１７１】
別の実施形態によれば、第１の標識を含む第１の親和性試薬の特異的結合により標識された第１のＲＴ、第２の標識を含む第２の親和性試薬の特異的結合により標識された第２のＲＴ、第３の標識を含む第３の親和性試薬の特異的結合により標識された第３のＲＴを使用して３標識シークエンシングを行うことができる。第４のＲＴについて、対応する親和性試薬は、親和性試薬セットから割愛され、または非標識であり、または第１、第２、および第３の標識の２つもしくはそれより多くの組合せ（または標識の異なる１つを用いて標識されかつ第４のＲＴに特異的に結合する親和性試薬の混合物）を含む。第１、第２および第３の標識は、互いから区別可能である。
【０１７２】
同様に、４標識シークエンシングは、第１の標識を含む第１の親和性試薬の特異的結合により標識された第１のＮＬＲＴ、第２の標識を含む第２の親和性試薬の特異的結合により標識された第２のＮＬＲＴ、第３の標識を含む第３の親和性試薬の特異的結合により標識された第３のＮＬＲＴ、および第４の標識を含む第４の親和性試薬の特異的結合により標識された第４のＮＬＲＴを用いることができる。ここでもまた、第１、第２、第３および第４の標識は、互いから区別可能である。
【０１７３】
４．６  組合せで使用される親和性試薬
単一のＮＬＲＴの異なるエピトープを認識する親和性試薬は、組合せで使用されてもよい。例えば、組み込まれたＮＬＲＴの核酸塩基部分を認識する第１の親和性試薬は、ブロッキング基を認識する第２の親和性試薬と共に使用されてもよい。染色は、同時または逐次的に行われてもよい。逐次的な染色では、第２の親和性試薬は、第１の親和性試薬がＮＬＲＴに結合したままである間に適用されてもよく、または再プロービング（以下に論じる）の場合には第１の親和性試薬の除去後に適用されてもよい。
【０１７４】
４．７  親和性試薬セット
ＳＢＳにおいて使用されるＲＴを標識するために「親和性試薬セット」が使用される。例えば、一実施形態では、４つのＲＴ（ＲＴ−Ａ、ＲＴ−Ｔ、ＲＴ−ＣおよびＲＴ−Ｇ）を含むＲＴセットのために、それぞれがＲＴの１つを特異的に認識してそれに結合する４つの親和性試薬の対応する親和性試薬セットがあってもよい（抗Ａ、抗Ｔ、抗Ｃおよび抗Ｇ）。親和性試薬セットは、（ｉ）混合物としてまたは別々の容器中の、キットの形態で提供されることができ、かつ／または（ｉｉ）シークエンシングアレイと接触させまたは組み合わせることができる（例えば、シークエンシングフローセル内において）、親和性試薬の組合せを記載する。
【０１７５】
一実施形態によれば、親和性試薬セットの各メンバーは、４色ＳＢＳにおけるように、異なる区別可能な検出可能な標識を有する。
【０１７６】
別の実施形態によれば、親和性試薬セットの１つのメンバーは非標識であり、かつ他のメンバーは標識されている。あるいは、親和性試薬セットは、非標識の親和性試薬を単に除外して、標識された親和性試薬のみを含んでもよい。
【０１７７】
例えば、一実施形態によれば、１つの親和性試薬は第１の標識（例えば、抗Ａ）を用いて標識され；第２の親和性試薬は第２の標識（例えば、抗Ｔ）を用いて標識され；第３の親和性試薬は第３の標識（例えば、抗Ｃ）を用いて標識され；かつ第４の親和性試薬は非標識であるか、または単に親和性試薬セットから除外される（例えば、抗Ｇ）。そのような親和性試薬セットは、３色シークエンシングのために有用である。
【０１７８】
別の実施形態によれば、１つの親和性試薬（例えば、抗Ａ）は第１の標識を用いて標識され；第２の親和性試薬（例えば、抗Ｔ）は第２の標識を用いて標識され；第３の親和性試薬（例えば、抗Ｃ）は第１の標識および第２の標識の両方を用いて標識され；かつ第４の親和性試薬（例えば、抗Ｇ）は非標識である（または親和性試薬セットから除外される）。あるいは、第３の親和性試薬は、親和性試薬分子の混合物を含んでもよく、それらの全ては特定の塩基に特異的に結合するが（例えば、全てが抗Ｃ）、一部は第１の標識を含みかつ一部は第２の標識を含む。そのような親和性試薬セットは、２色シークエンシングのために有用である。
【０１７９】
別の実施形態によれば、単一の検出可能な標識のみが使用されるが（または２つまたはそれより多くの標識の単一の組合せ）、親和性試薬が異なる量の標識（または、２つもしくはそれより多くの標識の組合せの少なくとも１つの標識）を含む場合など、セットのメンバー間で強度が異なる。例えば、一実施形態では、第１の親和性試薬（例えば、抗Ａ）は第１の強度において標識を用いて標識され；第２の親和性試薬（例えば、抗Ｔ）は第２の強度において同じ標識を用いて標識され；第３の親和性試薬（例えば、抗Ｃ）は同じ標識を用いるが第３の強度において標識され；かつ第４の親和性試薬（例えば、抗Ｇ）は非標識である（または第４の親和性試薬は親和性試薬セットから除外される）。別の実施形態では、第１の親和性試薬（例えば、抗Ａ）は第１の標識を第１の強度においておよび第２の標識を用いて標識され；第２の親和性試薬（例えば、抗Ｔ）は同じ第１の標識を用いるが第２の強度においておよび同じ第２の標識を用いて標識され；第３の親和性試薬（例えば、抗Ｃ）は同じ第１の標識を用いるが第３の強度においておよび同じ第２の標識を用いて標識され；かつ第４の親和性試薬（例えば、抗Ｇ）は非標識であるか、第２の標識のみを用いて標識されるか、または親和性試薬セットから除外される。
【０１８０】
４．８  反応混合物
ヌクレオシドアナログ（例えば、ＮＬＲＴ）およびそのようなヌクレオシドアナログまたはその反応生成物を含有するオリゴまたはポリヌクレオチドは、反応混合物の成分として使用することができる。例えば、そのような成分は、核酸シークエンシング（例えば、ＳＢＳ）のための反応混合物中で使用することができる。例示的な反応混合物としては、（ａ）鋳型核酸；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）オリゴヌクレオチドプライマー；（ｄ）３’−Ｏリバーシブルブロックヌクレオシドアナログ、または構造的に異なる核酸塩基を有する３’−Ｏリバーシブルブロックヌクレオシドアナログの混合物；および（ｅ）標識された親和性試薬を含有するものが挙げられるがこれに限定されない。本発明の例示的なシークエンシング反応混合物は、アレイ上の異なる位置において固定化された複数の異なる鋳型核酸を含むアレイ；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）オリゴヌクレオチドプライマー；（ｄ）およびＮＬＲＴの１つまたは混合物を含むがこれらに限定されない。本発明の例示的なシークエンシング反応混合物は、アレイ上の異なる位置において固定化された複数の異なる鋳型核酸を含むアレイ；（ｂ）伸長中のＤＮＡ鎖（ＧＤＳ）（３’ＮＬＲＴを含んでもよい；および（ｃ）１つまたは複数の親和性試薬（例えば、本明細書において上記される親和性試薬セット）を含むがこれらに限定されない。
【０１８１】
５．鋳型核酸および核酸アレイ
様々な実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、トランスクリプトームまたはマイクロバイオームＤＮＡ、増幅産物など）またはＲＮＡである。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは二本鎖または一本鎖のいずれかである。
【０１８２】
一部の実施形態では、鋳型核酸は、固体表面上に固定化される。一部の実施形態では、鋳型核酸は、基体（例えば、ビーズ、フローセル、パッド、マイクロ流体デバイス中のチャネルなど）上に固定化される。基体は、シリコン、ガラス、金、ポリマー、ＰＤＭＳなどを含んでもよい。
【０１８３】
一部の実施形態では、鋳型核酸は、小滴内に固定化または含有される（小滴内のビーズまたは他の基体上に固定化されてもよい）。
【０１８４】
一部の実施形態では、鋳型核酸は、複数コピーの標的配列を含む固定化されたＤＮＡコンカテマーである。一部の実施形態では、鋳型核酸は、複数コピーの標的配列および「アダプター配列」を含むＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）などの、ＤＮＡコンカテマーとして現れる。ＰＣＴ特許公開第２００７／１３３８３１号（その内容は参照することによりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる）を参照。一部の実施形態では、鋳型は単一のポリヌクレオチド分子である。一部の実施形態では、鋳型は、鋳型分子のクローン集団（例えば、ブリッジ増幅またはＷｉｌｄｆｉｒｅ増幅により製造されたクローン集団）として存在する。
【０１８５】
方法は、鋳型の特定の形態に限定されないこと、および、鋳型は、例えば、ＤＮＡコンカテマー、デンドリマー、鋳型のクローン集団（例えば、ブリッジ増幅またはＷｉｌｄｆｉｒｅ増幅により製造されたものなど）または単一のポリヌクレオチド分子などの、任意の鋳型であり得ることが理解されるであろう。したがって、鋳型への各言及は、コンカテマー鋳型、デンドリマー、例えば短い線状鋳型のクローン集団、単一の分子鋳型（例えば、０モードウェーブガイドにおいて）、および他の形態の鋳型を代替的に指すことができるものとして本明細書は読まれるべきである。
【０１８６】
ＤＮＢ、クラスター、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙｓ）、およびアレイまたはこれらの群などの好適な鋳型核酸は、米国特許第８，４４０，３９７号明細書；同第８，４４５，１９４号明細書；同第８，１３３，７１９号明細書；同第８，４４５，１９６号明細書；同第８，４４５，１９７号明細書；同第７，７０９，１９７号明細書；同第１２／３３５，１６８号明細書、同第７，９０１，８９１号明細書；同第７，９６０，１０４号明細書；同第７，９１０，３５４号明細書；同第７，９１０，３０２号明細書；同第８，１０５，７７１号明細書；同第７，９１０，３０４号明細書；同第７，９０６，２８５号明細書；同第８，２７８，０３９号明細書；同第７，９０１，８９０号明細書；同第７，８９７，３４４号明細書；同第８，２９８，７６８号明細書；同第８，４１５，０９９号明細書；同第８，６７１，８１１号明細書；同第７，１１５，４００号明細書；同第８，２３６，４９９号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１５／０３５３９２６号明細書；同第２０１０／０３１１６０２号明細書；同第２０１４／０２２８２２３号明細書；および同第２０１３／０３３８００８号明細書（これらの全ては参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）においてさらに記載されている。
【０１８７】
一態様では、本発明は、ＤＮＡアレイを提供し、該ＤＮＡアレイは、各ＤＮＡ分子がアレイの位置において取り付けられている複数の鋳型ＤＮＡ分子、複数の該位置において鋳型ＤＮＡ分子の部分と塩基対を形成した相補的ＤＮＡ配列であって、その３’末端において、組み込まれた第１のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む、相補的ＤＮＡ配列；および第１のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部に特異的に結合した第１の親和性試薬を含む。１つのアプローチでは、ＤＮＡアレイは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ核酸塩基またはこれらのアナログを含む３’末端ヌクレオチドを有するプライマー伸長産物、およびプライマー伸長産物に結合した親和性試薬を含む。
【０１８８】
６．キット
本発明を実施するためにキットが提供されてもよい。上記の通り、ＮＬＲＴおよびＮＬＲＴセットはキットの形態で提供されてもよい。これも上記される通り、親和性試薬および親和性試薬セットはキットの形態で提供されてもよい。ＮＬＲＴおよびＮＬＲＴセットならびに親和性試薬または親和性試薬セットの両方を含むキットも想定される。例えば、本発明は、（ａ）１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの異なる個々のＲＴを含むリバーシブルターミネーターヌクレオチド（ＲＴ）またはＲＴセット；（ｂ）１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの親和性試薬を含み、これらのそれぞれがＲＴの１つに特異的である、対応する親和性試薬または親和性試薬セット；および（ｃ）パッケージング材料およびまたは使用のための説明書を非限定的に含むキットを提供する。
【０１８９】
別の実施形態によれば、そのようなキットは、各ＲＴが異なる核酸塩基を含む複数のＲＴ、および各親和性試薬がＲＴの１つに特異的に結合する複数の親和性試薬を含む。
【０１９０】
一例では、本発明は、（ａ）プライマー伸長産物に組み込まれ得る本明細書において記載されるリバーシブルターミネーターヌクレオチド；（ｂ）プライマー伸長産物の３’端において組み込まれたときにリバーシブルターミネーターヌクレオチドに特異的に結合する第１の親和性試薬；ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）のためのパッケージングを含むキットを提供する。１つのアプローチでは、キットは、各リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが異なる核酸塩基を含む複数のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド、および各第１の親和性試薬がリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの異なる１つに特異的に結合する複数の第１の親和性試薬を含有する。一部の実施形態では、第１の親和性試薬は、検出可能に標識され、かつ互いから区別され得る。一部の実施形態では、キットは二次親和性試薬を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２の親和性試薬は抗体である。
【０１９１】
一例では、リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドは、式Ｉ：
【化１３】
2020508037.tif 000016
（式中、Ｒ１は３’−Ｏリバーシブルブロッキング基であり；Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつＲ３は１つまたは複数のホスフェートを含む）の構造を有する。
【０１９２】
７．応用
上記したＳＢＳへの応用に加えて、本明細書において記載される新規の親和性試薬、ＮＬＲＴ、キットおよび方法は、天然にまたは実験的に断片化されたＤＮＡの末端（またはＤＮＡギャップ中）にあるものの検出；特定の修飾を有するかまたは有しない特定の末端塩基（分子の末端または鎖のギャップ内の末端）を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの捕捉などの、多くの他の応用において使用されてもよい。５’または３’末端／ギャップ塩基の両方が検出され得る。親和性試薬は、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、および他の検出のために使用されてもよい。
【０１９３】
本発明の方法は直接的なＲＮＡシークエンシングのためにも使用されてよいことが理解されるであろう。
【０１９４】
８．方法
８．１  ブロッキング基の除去、親和性試薬の除去、および検出
ブロッキング基および親和性試薬の除去は同時に起こることができる。１つのアプローチでは、アレイは、ブロッキング基および親和性試薬が同時に除去される条件に曝露される。１つでは、アレイは、剤の組合せを含む溶液と接触させられ、該組合せの一部は、ブロッキング基を切断する剤と組み合わせて親和性試薬の除去を結果としてもたらす（例えば、高塩、小分子競合物、プロテアーゼなど）。
【０１９５】
一部の場合には、３’ブロッキング基の除去は、親和性試薬の除去を結果としてもたらす。特定の機序により縛られることを意図しないが、これらの場合、ブロッキング部分の除去は、抗体または他の親和性試薬の結合のために必要とされるエピトープを破壊すると考えられる。
【０１９６】
異なるアプローチでは、親和性試薬およびブロッキング基の除去は連結されず、それにより、親和性試薬は除去されるがブロッキング基はヌクレオチド糖から切断されない。これは、再プロービングが所望される場合に有用である。図２、以下のセクション９、および実施例１１を参照。
【０１９７】
親和性試薬および／またはブロッキング基の除去のための除去条件のための条件は、シークエンシングされているＤＮＡの完全性を保つように選択されることが理解されるであろう。
【０１９８】
８．１．１  ブロッキング基の除去
ヌクレオシドアナログまたはＮＬＲＴとしては、３’−Ｏリバースブロックされたものが挙げられる。一部の態様では、ブロッキング基は、プライマーの３’末端において単一の３’−ＯリバースブロックＮＬＲＴ、例えば、先行するシークエンシングサイクルにおいて伸長されたＧＤＳの制御された組込みを提供する。
【０１９９】
一般に、ＮＬＲＴが使用される各シークエンシングサイクルにおいて、ブロッキング基は除去され、かつ親和性試薬はＮＬＲＴから解離される。これらの工程は、並行して行われ（ｃａｒｒｉｅｄ  ｏｕｒ）てもよい。例えば、アジドメチルブロッキング基は、ホスフィンを用いた処理（広く使用される方法）により除去することができ、抗体親和性試薬は、低ｐＨ（例えば、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．８）もしくは高ｐＨ（例えば、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ１０）、高塩、またはカオトロピックストリッピング緩衝液を用いた処理により除去することができる。一実施形態では、ＮＬＲＴおよび親和性試薬の両方を除去するために単一の処理または条件を使用することができる（例えば、高塩緩衝液中のホスフィン）。一部の実施形態では、ブロッキング基の除去は、例えば、ブロッキング基が親和性試薬の結合のために必要とされる場合、親和性試薬の解離を結果としてもたらす。
【０２００】
３’−Ｏリバーシブルブロッキング基は、酵素切断または化学分解（例えば、加水分解）により除去することができる。除去のための条件は、本明細書において提供される説明、切断されるブロッキング基の化学的素性、および当該技術分野において公知の核酸化学の原則に基づいて当業者により選択され得る。一部の実施形態では、ブロッキング基は、リバーシブルブロックヌクレオシドを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）、もしくはトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンなどのホスフィン試薬と接触させることにより除去される。一部の場合には、ブロッキング基は、ホスフィン試薬などの還元剤を使用して組み込まれたヌクレオチドアナログからブロッキング基を洗浄することにより除去される。一部の場合には、ブロッキング基は光解離性であり、ブロッキング基は、例えばＵＶ光の適用により除去することができる。一部の場合には、ブロッキング基は、ヌクレオシドアナログを、例えばパラジウム（Ｐｄ）水溶液を使用する、遷移金属触媒反応液と接触させることにより除去することができる。一部の場合には、ブロッキング基は、ヌクレオシドアナログを水性亜硝酸塩溶液と接触させることにより除去することができる。さらに、またはあるいは、ブロッキング基は、組み込まれたヌクレオチドアナログを含有する溶液または混合物のｐＨを変化させることにより除去することができる。例えば、一部の場合には、ブロッキング基は、ヌクレオシドアナログを酸または低ｐＨ（例えば、４未満）の緩衝水溶液と接触させることにより除去することができる。別の例として、一部の場合には、ブロッキング基は、ヌクレオシドアナログを塩基または高ｐＨ（例えば、１０より高い）の緩衝水溶液と接触させることにより除去することができる。
【０２０１】
ホスフィンなどの還元剤により切断され得る３’−Ｏリバーシブルブロッキング基としては、アジドメチルが挙げられるがこれに限定されない。ＵＶ光により切断され得る３’−Ｏリバーシブルブロッキング基としては、ニトロベンジルが挙げられるがこれに限定されない。Ｐｄ水溶液と接触させることにより切断され得る３’−Ｏリバーシブルブロッキング基としては、アリルが挙げられるがこれに限定されない。酸を用いて切断され得る３’−Ｏリバーシブルブロッキング基としては、メトキシメチルが挙げられるがこれに限定されない。亜硝酸ナトリウムの水性緩衝化（ｐＨ５．５）溶液と接触させることにより切断され得る３’−Ｏリバーシブルブロッキング基としては、アミノアルコキシルが挙げられるがこれに限定されない。
【０２０２】
８．１．２  親和性試薬の除去
抗体ベースの親和性試薬は、低ｐＨ、高ｐＨ、高もしくは低塩、またはカオトロピックストリッピング緩衝液などの変性剤により除去することができる。親和性試薬の他のクラス（例えば、アプタマー）は、当該技術分野において公知の任意の手段により除去することができる。加えて、抗体などの親和性試薬は、例えば以下の実施例１０に示されるように、親和性試薬の結合について結合したエピトープと競合する剤を導入することにより除去することができる。
【０２０３】
加えて、親和性試薬はまた、組み込まれたＮＬＲＴに結合する剤の能力を破壊することにより除去されてもよい。典型的に、これは、組み込まれたヌクレオチドアナログから３’ブロッキング基が切断されるときに行われる。親和性試薬の結合がブロッキング基の存在に依存する場合（例えば、１O抗体により認識されるエピトープがブロッキング基またはその部分を含む場合）、ブロッキング基の除去は、親和性試薬の解放も結果としてもたらす。
【０２０４】
親和性試薬およびブロッキング基の同時の除去はまた、ブロッキング基切断成分（例えば、ホスフィン試薬）および親和性試薬解放剤（例えば、高塩）を含む溶液を加えることにより、同時に行われてもよく、もたらされてもよい。
【０２０５】
あるいは、親和性試薬は、３’ブロッキング基を除去することなく除去されてもよい。このアプローチは、再プロービングが所望される場合に有用である（以下のセクション９に記載されている）。
【０２０６】
８．１．３  検出
結合事象を検出する方法は、使用されている検出可能な標識の性質により異なり、当該技術分野において周知である。検出（例えば、蛍光シグナルの検出）は、一般に、ブロッキング基の除去の前に行われる。しかしながら、検出は、標識された親和性試薬が結合したままである限り、ブロッキング基の除去の前または後のいずれかに行うことができる。
【０２０７】
８．２  抗体の製造
例えば、小さい化合物（薬物またはペプチド）は、免疫応答を誘導するためまたは特異的抗体の産生を誘発する様式で処理されるためにはそれら自体では充分に複雑でない。小さい抗原を用いる抗体製造の成功のために、それらは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性キャリアタンパク質と化学的にコンジュゲートされなければならない。アジュバントを免疫原と混合および注射して、免疫応答の強度を増加させることができる。キャリアタンパク質のコンジュゲーション、アジュバントの使用および注射用試料の調製に関する他の事項は、抗体の製造に関するこのセクションにおいて記載される。抗原特異的なプローブとして使用するために抗体を生成させ、精製しおよび改変するための標準的な手順を使用することができる。例えば、Harlow and Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual” (1988)およびHarlow and Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual” (1999)を参照。
【０２０８】
ハプテン：抗原として使用される小分子はハプテンと称される。それらは、特異的抗体の産生のための認識部位として作用することができるが、必要な免疫応答をそれら自体では刺激することができない。ハプテンは、それらを好適なキャリア分子に連結させることにより免疫原性とすることができる。
エピトープ：エピトープは、抗体が結合する抗原上の特定の部位である。非常に小さい抗原について、実際上、化学構造全体が単一のエピトープとして作用することがある。その複雑性およびサイズに応じて、抗原は、多数のエピトープを標的とする抗体の産生をもたらすことがある。ポリクローナル抗体は血清の免疫グロブリンの混合物であり、集合的に抗原上の複数のエピトープに結合する可能性がある。
【０２０９】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、最も広く使用されているキャリアタンパク質である。
【０２１０】
ウシ血清アルブミン。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；６７ｋＤａ）は、アルブミンと呼ばれる血清タンパク質のクラスに属する。
【０２１１】
８．３  免疫化プロトコール
免疫化プロトコールは周知であり、ここでは一般に記載するのみとする。追加の説明については以下の実施例２を参照。アジュバントと混合する前の免疫原の濃度が、注射当たりに投与されるコンジュゲートの量を最終的に決定する。マウスの免疫化スケジュール：０日目：免疫化後のＥＬＩＳＡスクリーニングを行う時のブランクとして使用するためにマウスから免疫前血清を収集する。凍結貯蔵する。マウス当たり５０〜１００μｇの免疫原（１００〜２００μＬの抗原−アジュバント混合物に等しい）を注射する。典型的な注射の経路としては、腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）が挙げられる。動物当たり１回または２回のそのような注射を行うことができる。１４日目：アジュバント中の同等の量の免疫原を用いてブーストする。２１日目：出血液を試験し、ＥＬＩＳＡにより抗体応答をアッセイする。（典型的に、尾静脈または後眼窩叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｉｓ）を通じた麻酔下でマウスを出血させる。）２８日目：必要であれば再びブーストする。満足のいく応答が観察されるまでブーストおよび出血液の試験を交互に行う類似のスケジュールを続ける。モノクローナル抗体の産生のために、食塩水中に溶解させた免疫原（アジュバントなし）との融合の４〜５日前にｉ．ｐ．または静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかで注射する。
【０２１２】
ウサギの免疫化スケジュール：０日目：免疫化後のＥＬＩＳＡを行う時のブランクとして使用するためにウサギから免疫前血清を収集する。凍結貯蔵する。ウサギの背中の８〜１０の皮下部位のそれぞれに１００μｇの免疫原（約２００μＬの抗原アジュバント混合物に等しい）を注射する。他の注射の経路も使用することができるが、ウサギではこれがはるかに最も容易である。１４日目：同等の量のアジュバントを用いてブーストする。２１日目：出血液を試験し、ＥＬＩＳＡにより抗体応答をアッセイする。（典型的に、麻酔薬なしで耳静脈を通じてウサギを出血させる。）抗体応答を測定するために充分な量より多い５〜１０ｍＬの血液を収集することは難しくない。２８日目：必要であれば再びブーストする。満足のいく応答が観察されるまでブーストおよび出血液の試験を交互に行う類似のスケジュールを続ける。
【０２１３】
免疫グロブリンの一般的精製。抗体は、比較的不変のドメインを含む予測可能な構造を有するので、抗原への抗体の特異性にかかわらず、一般に抗体に結合することができるある特定のタンパク質リガンドを同定することが可能であった。プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬは、その抗体結合特性がよく特徴付けられている３つの細菌タンパク質である。これらのタンパク質は、組換えにより製造されて、様々な種からの鍵となる抗体種のアフィニティー精製のために日常的に使用されている。プロテインＡ／Ｇと呼ばれる、遺伝子操作された組換え型のプロテインＡおよびＧも利用可能である。これらの抗体結合タンパク質は、ビーズ状アガロース樹脂に固定化されて利用可能である。
【０２１４】
８．４  抗体のアフィニティー精製：
粗細胞溶解液または他の試料中の他のタンパク質および成分から目的のタンパク質を濃縮または精製するために様々な方法が使用される。これらの方法のうち最も強力なのは、アフィニティー精製とも呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーであり、それにより、目的のタンパク質は、固定化されたリガンドへのその特異的結合特性により精製される。
【０２１５】
目的のタンパク質および他の高分子は、粗抽出物または他の複雑な混合物から様々な方法により精製することができる。選択的沈殿は恐らく、１つの種類の高分子を別のものから分離する最も簡便な方法である。
【０２１６】
しかしながら、ほとんどの精製方法は、静止した材料（固相）との化学的または物理的相互作用の差異に基づいて溶液（移動相）中の分子が分離される何らかの形態のクロマトグラフィーを伴う。ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィーまたはＳＥＣとも呼ばれる）は、多孔性樹脂材料を使用してサイズに基づいて分子を分離する（すなわち、物理的排除）。イオン交換クロマトグラフィーでは、分子は、固相材料との全体的なイオン性相互作用の強度に従って分離される（すなわち、非特異的相互作用）。
【０２１７】
対照的に、アフィニティークロマトグラフィー（アフィニティー精製とも呼ばれる）は、分子間の特異的結合相互作用を使用する。特定のリガンドが固体支持体に化学的に固定化または「連結」され、それにより、複合体混合物をカラムに通したときに、リガンドへの特異的結合親和性を有する分子は結合する。他の試料成分が洗浄除去された後、結合した分子は支持体から剥がされ、元々の試料からのその精製を結果としてもたらす。
【０２１８】
各特定の親和性システムは、条件のそれ自体のセットを必要とし、所与の研究目的のためにそれ自体の特有の課題を示す。他のタンパク質の方法の論文は、特定の精製システムと関連付けられる要因および条件を記載している。
【０２１９】
８．５  抗体の標識化
抗体の構造および修飾部位。他のタンパク質と同様に、抗体は、特定のアッセイの目的に適するように多くの方法で共有結合により修飾することができる。多くの免疫学的な方法は標識された抗体の使用を伴い、抗体の標識化を可能とするために様々な試薬が作出されている。酵素、ビオチン、フルオロフォアおよび放射活性同位体は全て、生物学的アッセイにおいて検出シグナルを提供するために一般に使用されている。抗体上の利用可能な官能基を理解することは、標識化、架橋または共有結合による固定化のいずれのためであっても、修飾のための最良の方法を選択するための鍵である。ほとんどの抗体標識化戦略は、３つの標的の１つを使用する：（１）第一級アミン（−ＮＨ２）：これらはリシン残基および各ポリペプチド鎖のＮ末端において存在する。それらは多数であり、抗体全体にわたって分布している。（２）スルフヒドリル基（−ＳＨ）：これらはシステイン残基上に存在し、全分子構造を安定化させるジスルフィド結合として存在する。ヒンジ領域のジスルフィドは、標的化された標識化のために利用可能な遊離のスルフヒドリルを作製するために選択的に還元することができる。（３）炭水化物（糖）：グリコシル化は主に抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域において起こる。シス−ジオールを含有するこれらの多糖部分における構成要素の糖は、連結のための活性アルデヒド（−ＣＨＯ）を作出するために酸化させることができる。
【０２２０】
抗体標識化方法。抗体を標識するために任意の公知の方法を本発明の実施において使用することができる。全てのタンパク質と同様に抗体はアミノ酸から構成され、第一級アミン（−ＮＨ２）を末端に持つリシンの側鎖は、抗体分子に標識を共有結合により連結するために一般に使用される。
【０２２１】
抗体標識化のための４つの主な化学的アプローチを以下に要約する：
【０２２２】
１．ＮＨＳエステル。蛍光色素標識の場合、ＮＨＳエステル（「スクシンイミジルエステル」とも呼ばれる）が組み込まれた活性化型の標識を購入することが通常である。活性化された色素は、抗体（それらの全ては複数のリシン基を有する）と適切な条件下で反応することができる。過剰な反応性色素は、標識された抗体をイムノアッセイにおいて使用できる前にいくつもの可能な方法の１つ（多くの場合、カラムクロマトグラフィー）により除去される。
【０２２３】
２．ヘテロ二官能性試薬。標識がタンパク質分子（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、アルカリホスファターゼ、またはフィコエリトリン）の場合、抗体標識化手順は、抗体および標識が複数のアミンを有するという事実により複雑である。この状況では、１分子（例えば、抗体）上のリシンの一部を修飾して新しい反応性基（Ｘ）を作出し、かつ標識上のリシンを修飾して別の反応性基（Ｙ）を作出することが通常である。Ｙ基を導入するために「ヘテロ二官能性試薬」が使用され、Ｙ基はその後に、抗体および標識が混合されたときにＸ基と反応してヘテロダイマーコンジュゲートを作出する。この主題には多くのバリエーションがあり、標識された抗体および他の標識された生体分子を作出するためのヘテロ二官能性試薬の使用に関して文献中に数百もの例が見出されるであろう。
【０２２４】
３．カルボジイミド。アミン含有分子とカルボキシル含有分子との間に共有結合連結を作出するためにこれらの試薬（ＥＤＣは１つの非常に一般的な例である）が使用される。カルボジイミドはカルボキシル基を活性化させ、次に、活性化された中間体はアミン（例えば、抗体上のリシン残基により提供される）により攻撃される。カルボジイミドは、抗体をカルボキシル化粒子（例えば、ラテックス粒子、磁気ビーズ）に、およびマイクロウェルプレートまたはチップ表面などの他のカルボキシル化表面にコンジュゲートさせるために一般に使用される。カルボジイミドは、色素またはタンパク質標識を抗体に取り付けるためにほとんど使用されないが、それらはＮＨＳ活性化色素の製造において重要である（上記を参照）。
【０２２５】
４．過ヨウ素酸ナトリウム。この化学物質は標識の大部分と共に用いることができないが、最も普及した診断酵素であるＨＲＰに適用可能であるという点でかなり重要な試薬である。過ヨウ素酸塩はＨＲＰ分子上の炭水化物鎖を活性化させてアルデヒド基を作出し、このアルデヒド基は抗体分子上のリシンと反応することができる。ＨＲＰ自体が有するリシンは非常に少ないので、有意なＨＲＰ重合なしに抗体−ＨＲＰコンジュゲートを作出することが比較的容易である。
【０２２６】
任意の特定の抗体クローンにおいて、リシン（第一級アミン）は主に抗原結合部位内に存在し得る。したがって、この標識化戦略の唯一の欠点は、抗体の抗原結合活性の有意な減少を時折引き起こすことである。モノクローナル抗体を用いる場合または抗体分子当たりに高密度の標識を加えようとする場合に減少は特に著しいことがある。
【０２２７】
９．再プロービング
上記のセクション８に記載した通り、本発明に従って親和性試薬（例えば、抗体）および３’保護基の除去を連結させないことができる。ブロッキング部分を除去することなく親和性試薬を除去することができるので、有利なことに、塩基コールの正確性を増加させ、チップの完全性を試験し、または他の理由のために、一部または全ての塩基位置を再プロービングすることができる。以下の実施例１１および図２を参照。任意の所与の塩基位置を１回プロービングし、かつ０回、１回、２回または２回より多く再プロービングすることができる。通常、単一ラウンドの再プロービングで充分であると考えられる。単に便宜上、塩基位置が２回プロービングされる場合、第１ラウンドのプロービングを第１の半サイクルと称することができ、第２ラウンドのプロービングを第２の半サイクルと称することができる。
【０２２８】
再プロービングを行うときに、同じ親和性試薬、例えば同じ一次抗体を用いて各位置を２回プロービングすることができる。より多くの場合、異なる抗体調製物（例えば、異なるモノクローナル抗体）、異なるクラスの親和性試薬（例えば、第１の半サイクルでは抗体を用い、第２の半サイクルではアプタマーを用いてプロービングする）、または異なる特異性を有する親和性試薬などの異なる親和性試薬が使用される。例えば、第１の半サイクルにおいて、アレイは、抗Ａ、抗Ｔ、抗Ｃおよび抗Ｇを用いてプロービングされてもよく、かつ第２の半サイクルにおいて、アレイは、抗プリンおよび抗ピリミジンを使用してプロービングされてもよい。
【０２２９】
１つのアプローチでは、４つのＮＬＲＴは、２つのブロッキング基、例えば、アジドメチル−Ｔ、アジドメチル−Ｇ、シアノエテニル−Ｃおよびシアノエテニル−Ａを使用してブロックされ、アレイは、２つの親和性試薬（１つは３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシリボースに特異的であり、他の試薬は３’−Ｏ−シアノエテニル−２’−デオキシリボースに特異的である）を用いて１回プロービングされ、かつ異なるペアの親和性試薬（１つはプリンに特異的であり、１つはピリミジンに特異的である）を用いて２回目にプロービングされる。３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシリボースおよびプリンに特徴的なシグナルを示すアレイ上のアドレスが、グアニン塩基を有するとして同定されるなどである。
【０２３０】
１０．シークエンシング方法
図１および図２は読者に追加のガイダンスを提供するが、限定的なものと解されるべきではない。例えば、親和性試薬を使用して伸長産物の末端３’−ＯＨを検出する場合（上記セクション３．８を参照）、ブロッキング基は、抗体染色（工程５）の前に除去される（工程８ｂ）。
【０２３１】
上記で論じたように、一態様では、本発明は、非標識リバーシブルターミネーターヌクレオチドを使用するシークエンシングバイシンセシス（ＳＢＳ）の方法を対象とする。ＳＢＳ法は周知であり、本明細書において参照される参考文献（これらのそれぞれは参照することにより全ての目的のために組み込まれる）において記載されている方法が挙げられるがこれらに限定されない。典型的に、ＳＢＳは、表面上の位置において固定化された一本鎖核酸鋳型の配列を決定する。当業者の読者に公知の通り、通常、表面上の位置において鋳型の多くのコピーが存在する。限定ではなく説明のために、鋳型コピーは、最も多くの場合、ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）法またはブリッジＰＣＲ法を使用して製造される。ＤＮＢ法は、鋳型（例えば、ゲノムＤＮＡ配列および隣接するプライマー結合部位）の多くのコピーを有する一本鎖コンカテマーを結果としてもたらす。ブリッジＰＣＲ法は、鋳型分子（例えば、プライマー結合部位として働き得るアダプターにより隣接されたゲノムＤＮＡ配列）のクローンクラスターを結果としてもたらす。ブリッジＰＣＲでは、鋳型核酸の両方の鎖が別々の単一の鎖として存在してもよい。「鋳型」核酸（すなわち、文法上の単数形）、または同等の用語への本明細書における言及はまた、基体上の所与の位置における複数コピーの鋳型を指すことが理解されるであろう。鋳型核酸の配列または鋳型核酸配列（すなわち、文法上の単数形）の決定に対する言及が本明細書において為されることがあるが、本発明の方法は、１つまたは複数の鋳型核酸分子を含有する複数（多くの場合、数億）の位置を含むアレイを使用して実行されることが想定されることも認識されるであろう。
【０２３２】
この文脈において使用される場合、「アレイ」は最も広い意味において使用され、別段の規定がなければ、秩序付けられたアレイ（すなわち、領域に結合する鋳型は、秩序付けられた、典型的に直線状の、パターン、例えば、格子、らせん、または他のパターンにおいて並べられている）および不秩序なアレイ（すなわち、領域に結合する鋳型はランダムな位置にある）を含む。１つのアプローチでは、アレイ上の任意の特定の位置（または「アドレス」）における鋳型の素性は、鋳型のシークエンシングの前に既知であってもよい。より多くの場合、アレイは「ランダムアレイ」であり、所与のアドレスにおける鋳型の素性はシークエンシングの前に既知ではない。別段の規定がなければ、本開示において、「アレイ」は平坦な表面上の位置に限定されず、ビーズアレイ、小滴アレイなどを含み得る。
【０２３３】
様々なＳＢＳ法を本発明のヌクレオシドアナログおよび親和性試薬と共に使用することができる。一部の態様では、ＳＢＳ法は、米国特許第６，２１０，８９１号明細書；同第６，８２８，１００号明細書、同第６，８３３，２４６号明細書；同第６，９１１，３４５号明細書；同第６，９６９，４８８号明細書；同第６，８９７，０２３号明細書；同第６，８３３，２４６号明細書；および同第６，７８７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００６４３９８号明細書；同第２００３／００２２２０７号明細書；同第２０１６／０１３０６４７号明細書；およびＰＣＴ国際公開第２０１６／１３３７６４号パンフレット；Margulies et al., 2005, Nature 437:376-380；Ronaghi et al., 1996, Anal. Biochem. 242:84-89；Constans, A, 2003, The Scientist 17(13):36；およびBentley et al., 2008, Nature 456(7218):53-59に記載されているものから選択することができる。シークエンシングバイシンセシスを行うＤＮＡシークエンサーは、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．（サンディエゴ、ＣＡ）から市販されており、ＭｉｎｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ  Ｘ、およびＮｏｖａＳｅｑシークエンシングシステムが挙げられる。本発明の組成物および方法と共に使用できる他のＤＮＡシークエンシングシステムとしては、ＢＧＩＳＥＱ−５０、ＢＧＩＳＥＱ−５００、ＢＧＩＳＥＱ−１０００、ＭＧＩ−２００、およびＭＧＩＳＥＱ−２０００（ＢＧＩ、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ）；およびＧｅｎｅＲｅａｄｅｒシークエンシングプラットフォーム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）が挙げられる。
【０２３４】
一部のＳＢＳの実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組込み時に放出されたプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシークエンシングは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，  Ｃｏｎｎ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ）から市販されている電気検出器および関連する技術または米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書；同第２００９／０１２７５８９号明細書；同第２０１０／０１３７１４３号明細書；もしくは同第２０１０／０２８２６１７号明細書に記載されているシークエンシング方法およびシステムを使用することができる。
【０２３５】
例えばパイロシークエンシングなどの、環状反応を使用する別のシークエンシング手順を本発明の組成物および方法と共に使用することができる。パイロシークエンシングは、新生核酸鎖に組み込まれる特定のヌクレオチドとして無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi et al., Anal Biochem 242:84-89, 1996；Ronaghi, Genome Res. 11:3-11, 2001；Ronaghi et al., Science 281:363, 1998）；ならびに米国特許第６，２１０，８９１号明細書；同第６，２５８，５６８号明細書および同第６，２７４，３２０号明細書。パイロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換されることにより検出することができ、結果として生じたＡＴＰは、ルシフェラーゼにより産生された光子を介して検出することができる。したがって、シークエンシング反応は、ルミネッセンス検出システムを介してモニターすることができる。蛍光ベースの検出システムのために使用される励起放射線供給源は、パイロシークエンシング手順のために必要でない。本開示のアレイへのパイロシークエンシングの適用のために使用できる有用な流体システム、検出器および手順は、例えば、ＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８号明細書、米国特許第７，５９５，８８３号明細書、および米国特許第７，２４４，５５９号明細書に記載されている。
【０２３６】
一部の態様では、ライゲーションによるシークエンシング方法は、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  １９９９／０１９３４１号パンフレット；ＷＯ  ２００５／０８２０９８号パンフレット；ＷＯ  ２００６／０７３５０４号パンフレット；およびShendure et al., 2005, Science, 309: 1728-1739に記載されているものから選択することができる。ＳＢＳ法は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１０５０５２号明細書、同第２００７／０９９２０８号明細書、および同第２００９／０２６４２９９号明細書）ならびにＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  ２００７／１２０２０８号パンフレット、ＷＯ  ２００６／０７３５０４号パンフレット、およびＷＯ  ２００７／１３３８３１号パンフレットに記載されている秩序付けられたＤＮＡナノボールアレイを用いることができる。この段落において列記した上記の特許および非特許文献は、参照することによりそれらの全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
一実施形態によれば、シークエンシングは、ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）の秩序付けられたアレイ上で行われる。ＤＮＢは、環状ライブラリーコンストラクトのローリングサークル複製により製造され、各環状ライブラリーコンストラクトは、目的のゲノムまたは他の標的核酸の断片を含有し、水溶液中で崩壊して小型のボール状構造物を形成する複数コピーの環状コンストラクトを含む線状一本鎖ＤＮＡコンカテマーを結果としてもたらす。ＤＮＢは、二次元の平坦な基体の表面上に配されて、単一分子のランダムアレイを形成する。ＤＮＢは、共有結合および非共有結合などの様々な技術により表面に直接的または間接的に固定することができる。一部の実施形態では、ＤＮＢアレイを製造するために、スポットの２次元アレイを有するパターン化された基体が使用される。スポットは活性化されてＤＮＢを捕捉および保持するが、ＤＮＢはスポットの間の領域中には残らない。一般に、スポット上のＤＮＢは他のＤＮＢに反発し、スポット当たり１つのＤＮＢを結果としてもたらす。ＤＮＢは三次元であるので（すなわち、ＤＮＡの線状の短い断片ではないので）、本発明のアレイは、１平方ナノメートルの結合表面当たりで伝統的なＤＮＡアレイより多くのＤＮＡコピーを結果としてもたらす。この三次元品質は、必要とされるシークエンシング試薬の量をさらに低減させ、より明るいスポットおよびより効率的な画像化を結果としてもたらす。ＤＮＢアレイの占有は多くの場合９０％を上回るが、５０％〜１００％の占有に及び得る。これらの実施形態では、ＤＮＢは表面上に配された後、活性化されたスポットにくっつくので、高密度ＤＮＢアレイは溶液中のＤＮＢから本質的に「自己集合」する。
【０２３８】
そのようなＤＮＢアレイがシークエンシングバイシンセシスにおいて使用される場合、ＤＮＢアレイはプライマーと接触させられ、プライマーは、シークエンシングの各サイクルにおいてポリメラーゼにより１つの相補的な塩基だけ伸長される。アレイ中の各位置においてポリメラーゼにより組み込まれたＲＴの素性は、特定の親和性試薬のその対応するＲＴへの結合の結果として明らかにされる。例えば４色シークエンシングでは、結果は、ＤＮＢのそれぞれが親和性試薬を用いて標識されたＤＮＢのアレイであり、それにより、アレイ上の特定の位置において組み込まれたＲＴの素性は、ＲＴに結合した親和性試薬の部分である蛍光標識（または他の検出可能な標識）により同定可能である。
【０２３９】
リバーシブルターミネーターを使用するＳＢＳ法では、鋳型核酸は表面上に固定化され、オリゴヌクレオチドプライマーは鋳型上の予め決定された位置（すなわち、プライマー結合部位）にハイブリダイズされる。デオキシリボースの３’−ＯＨが除去可能なブロッキング部分、例えば３’−Ｏ−アジドメチルにより置換されたヌクレオチドアナログがプライマー伸長反応中にプライマーの３’端において組み込まれる。組み込まれたヌクレオチドアナログは、鋳型上の対応する位置におけるヌクレオチドに相補的であり、それと塩基対形成する。慣習的に、ヌクレオチドアナログは、組み込まれたヌクレオチドアナログの核酸塩基を同定する検出可能な標識を含み、したがって、鋳型中の相補的ヌクレオチドの塩基も同定する。一般に使用されるＳＢＳ法では、ヌクレオチドアナログは、切断可能なリンカーにより核酸塩基に取り付けられた蛍光標識を含む。
【０２４０】
リバーシブルターミネーターを使用するＳＢＳ法では、ヌクレオチドアナログの組込みが検出された後に、ブロッキング基は、典型的には化学的または酵素的に、除去されて、３’−ＯＨ基を有する組み込まれたヌクレオチドを生じさせる。３’ブロックされたヌクレオチドアナログの組込み、検出、およびブロック除去の追加のラウンドが、追加のプライマー伸長反応において実行されてもよい。プライマー伸長の各ラウンドにおいてヌクレオチドが付加されるが、方法はプライマーの伸長と称されることがある。しかし、先行するラウンドの伸長産物（元々のオリゴヌクレオチドプライマーではない）が伸長されると言うのがより精密であり得る。プライマー伸長鎖は、「伸長中のＤＮＡ鎖（ＧＤＳ）」、「プライマー伸長産物」または「伸長したプライマー」など、様々に称されることがある。
【０２４１】
ｄＮＴＰ（すなわち、ヌクレオシド三リン酸）がプライマーの３’端に付加される場合、ヌクレオシド一リン酸（またはヌクレオチド）が組み込まれるようにピロリン酸が除去されることが理解されるであろう。非標識または標識されていないリバーシブルターミネーターヌクレオチドは、別段の規定がなければ、文脈から明らかなように、いずれかの形態（遊離のヌクレオシド三リン酸または組み込まれたヌクレオチド一リン酸）を指すことができる。非標識の、または標識されていないリバーシブルターミネーター、ヌクレオチドは、ＮＬＲＴと称することができる。
【０２４２】
本発明の一態様では、組み込まれるｄＮＴＰアナログは、検出可能に標識されない。この文脈における「検出可能に標識されない」は、組み込まれるｄＮＴＰが、検出可能な（例えば、蛍光の）シグナルを生じさせる色素または基質の存在下で検出可能な（例えば、化学発光の）シグナルを生じさせる酵素にコンジュゲートされていないことを意味する。本明細書において使用される場合、「リバーシブルターミネーターヌクレオチド」は、天然に存在するヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログであって、デオキシリボースの３’−ＯＨが、除去可能なブロッキング部分、例えば３’−Ｏ−アジドメチルにより置換されているものを指す。
【０２４３】
本発明の一態様では、シークエンシング反応において、組み込まれたＮＬＲＴは、抗体などの親和性試薬により検出され、該親和性試薬により、プライマー伸長産物の３’末端ヌクレオチドが区別され、それにより鋳型の３’末端ヌクレオチドの核酸塩基が同定される。１つのアプローチでは、親和性試薬は、特定の塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ）、または特定の塩基のアナログを含有する組み込まれたＮＬＲＴに、シークエンシング反応液中に存在する他の塩基または他の塩基アナログを有する組み込まれたＮＬＲＴにそれが結合するよりもはるかに高い親和性で特異的に結合する。別のアプローチでは、親和性試薬は、特定の塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ）、または特定の塩基のアナログを含有する組み込まれたＮＬＲＴに、シークエンシング反応液中に存在する他の塩基、または存在する他の塩基アナログにそれが結合する親和性または効率とは異なる特徴的な親和性または効率で結合する。
【０２４４】
本発明によれば、親和性試薬はまた、３’端におけるものではない以前に組み込まれた「内部」ヌクレオチドからプライマー伸長産物の３’端において組み込まれたＮＬＲＴを区別し得る。一般に、プライマー伸長産物の３’端におけるＮＬＲＴは、遊離３’−ＯＨ（これは内部ヌクレオチドにおいてはホスホジエステル連結により置換されている）の存在または３’ブロッキング部分の存在の他に、糖および核酸塩基の差次的なアクセス可能性により以前に組み込まれたヌクレオチドとは異なる。
【０２４５】
本発明によれば、異なる窒素塩基（例えば、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）を有する４つのＮＬＲＴを使用してＳＢＳ反応が実行される。ＳＢＳ反応では、異なる親和性試薬（例えば、２つ、３つまたは４つの異なる親和性試薬）が使用され、親和性試薬のそれぞれは、特定の含窒素塩基を有するＮＬＲＴに結合し、異なる窒素塩基を有するＮＬＲＴに結合しないか、または一部の実施形態では、異なる窒素塩基もしくは非同一のブロッキング基を有するＮＬＲＴに結合するが、それは異なるレベルの効率においてである。
【０２４６】
親和性試薬は、含窒素塩基、糖、切断可能なブロッキング基またはこれらの構成要素の組合せにおける構造的差異に基づいて１つの組み込まれたＮＬＲＴを異なるＮＬＲＴから区別してもよい。一部の場合には、異なるＮＬＲＴは、例えば、含窒素塩基における有意な構造的差異（例えば、アデノシン対グアニン）および／またはブロッキング基における有意な構造的差異（例えば、アジドメチル対シアノエテニル）により区別される。
【０２４７】
加えて、親和性試薬は、好ましくは天然の差異と組み合わせて、小さい構造的差異（例えば、一部の場合には、５つより少ない原子の付加または置換）に基づいて１つの組み込まれたＮＬＲＴを異なるＮＬＲＴから区別してもよい。これらの小さい構造的変化は、含窒素塩基、糖、および／またはブロッキング基において為され得る。異なるＮＬＲＴ間のそのような小さい差異を区別する抗体などの親和性試薬が調製され得る。
【０２４８】
本発明の一態様によれば、親和性試薬のそれぞれは、シークエンシング反応液中に存在する他のものから区別され得るか（例えば、それぞれが異なって標識されるため）、または異なる二次結合剤により結合される。
【０２４９】
本発明によれば、含窒素塩基、糖、および切断可能なブロッキング基のそれぞれの構造上に制約がある。
【０２５０】
例えば、好適な修飾塩基は、通常のワトソン−クリック結合特異性を保持し、ＤＮＡポリメラーゼによる組込みと適合性であるべきである。一部の実施形態では、塩基アナログは蛍光特性を有しない（Renatus et al., 2010, Chem Rev. 110(5): 2579-2619）。
【０２５１】
同様に、ＮＬＲＴの糖部分は修飾されてもよい。そのような修飾ＮＬＲＴを有する核酸は、鋳型鎖にアニールする能力を保持するべきであり、またＤＮＡポリメラーゼによる組込みと適合性であるべきである。
【０２５２】
同様に、わずかにのみ異なるブロッキング基を有するＮＬＲＴが使用されてもよい。例えば、２つ、３つ、または４つの異なるそのようなＮＬＲＴを使用することができる。
【０２５３】
本発明のある特定の実施形態では、ブロッキング基（デオキシリボースの３’酸素原子を含まない）は、１８４未満、多くの場合１７４未満、多くの場合１６４未満、多くの場合１５４未満、多くの場合１４４未満、多くの場合１３４未満、多くの場合１２４未満、多くの場合１１４未満、多くの場合１０４未満、多くの場合９４未満、時に８４未満の分子量（ＭＷ）を有する。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド一リン酸の分子量は、約３００〜３２５の範囲内である（ｄＡＭＰ  ３３１．２、ｄＣＭＰ  ３０７．２、ｄＧＭＰ  ３４７．２およびｄＴＭＰ  ３２２．２）。ある特定の実施形態では、ＮＬＲＴ部分は、プライマー伸長産物に組み込まれたときに（すなわち、リバーシブルターミネーターブロッキング基を含むが、ｄＮＴＰのピロリン酸を含まない）は、７００未満、６００未満、５５０未満、多くの場合５４０未満、多くの場合５３０未満、多くの場合５２０未満、多くの場合５１０未満、多くの場合５００未満、多くの場合４９０未満、多くの場合４８０未満、多くの場合４７０未満、時に４６０未満の分子量を有する。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、１０００ヌクレオチドより長い、時に１０〜５００ヌクレオチド、時に１０〜２５０、時に２５より長い、時に５０ヌクレオチドより長いシークエンシングリードを生成するために使用される。一部の場合には、シークエンシングは、２０００塩基当たり１つの誤り、５０００塩基当たり１つの誤りより少なく実行される。
【実施例】
【０２５６】
１１．実施例
【実施例１】
【０２５７】
１１．１  実施例１．コンジュゲート３’−Ｏ−アジドメチル−２’−ｄＧ、−ｄＣ、−ｄＡおよび−ｄＴ抗原の調製
【０２５８】
３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニンの活性エステルの合成。３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニンのアミノ反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルの合成を図５に示す。化合物Ｇ１（４１６ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（３ｍＬ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１７１ｍｇ、１．０５４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのフラスコに加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。４−アミノ酪酸エチル塩酸塩（３８４ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３００μＬ、２．１５５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で１０時間撹拌した。ほとんどのＤＭＦを真空下でロータリーエバポレーター（またはロトバップ）により除去して粗化合物Ｇ２を得た。
【０２５９】
粗化合物Ｇ２にＥｔＯＨ（５ｍＬ）および１Ｎ  ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ（７ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３日間撹拌した。１Ｎ  ＨＣｌ／Ｈ２Ｏを加えてｐＨを７．４に調整した。ほとんどのＥｔＯＨをロトバップにより除去した後、濾過した。２５ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液（重炭酸トリエチルアミン、ｐＨ８．０、室温）およびＣＨ３ＣＮを使用して分取ＨＰＬＣにより濾液を精製して、白色固体として化合物Ｇ３（３４１ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ：４５２．１（ＭＳ＋）。
【０２６０】
５ｍＬのバイアル中に、化合物Ｇ３（４２ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．６ｍＬ）およびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）（１９ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、生物学的コンジュゲートを調製するために所望の活性化ＮＨＳエステルＧ４を得た。ＬＣＭＳ：５４８（ＭＳ＋）。
【０２６１】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｇの化合物Ｇ４と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（登録商標）  Ｐ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｂｅａｄｓ［Ｐ６ＤＧ  ｂｅａｄｓ］、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２６２】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＫＬＨ（１０ｍｇ／ｍｌ）を７ｍｇの化合物Ｇ４と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｐ−６ＤＧビーズ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２６３】
異なるリンカーが使用される図５に示されるものとは若干異なる合成方法を使用した、ＢＳＡ、ＫＬＨおよびアガロース樹脂への３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣ−ＮＨＳエステルのコンジュゲートを図９に示す
【０２６４】
アミン活性化アガロース樹脂との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧのコンジュゲート。２０ｍｌの湿ったアミン活性化アガロース樹脂（１ｍｌ当たり５μモルの活性化された基）を３０ｍＬの５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）、および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。７０ｍｇの化合物Ｇ４を２０ｍｌの湿ったビーズに加え、反応液を室温（ＲＴ）で２時間インキュベートおよび回転させた。反応後、２６０ｎｍの吸光度が０．０２より低くなるまで樹脂を５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して所望の精製樹脂を得た。
【０２６５】
３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシシトシン（Ｃ８）のアミノ反応性ＮＨＳエステルの合成。３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシシトシン（Ｃ８）のアミノ反応性ＮＨＳエステルの合成を図６に示す。化合物Ｃ５（４１０ｍｇ、１．０６１ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（３ｍＬ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（２１３ｍｇ、１．３１４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのフラスコに加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。４−アミノ酪酸エチル塩酸塩（２２３ｍｇ、１．３３０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２００μＬ、１．４３７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で６時間撹拌した。ほとんどのＤＭＦを真空下でロトバップにより除去して粗化合物Ｃ６を得た。
【０２６６】
粗化合物Ｃ６にＥｔＯＨ（５ｍＬ）および１Ｎ  ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌した。１Ｎ  ＨＣｌ／Ｈ２Ｏを加えてｐＨを７．４に調整し、ＥｔＯＨのほとんどをロトバップにより除去した後、混合物を濾過した。２５ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液およびＣＨ３ＣＮを使用して分取ＨＰＬＣにより濾液を精製して白色固体として化合物Ｃ７（５１８ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ：４１２．１（ＭＳ＋）。
【０２６７】
５ｍＬのバイアル中に、化合物Ｃ７（４９ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（０．８ｍＬ）およびＴＳＴＵ（２７ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、生物学的コンジュゲートを調製するために所望の活性化ＮＨＳエステルＣ８を得た。ＬＣＭＳ：５０９．２（ＭＳ＋）。
【０２６８】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｇの化合物Ｃ８と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｐ６ＤＧビーズ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２６９】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＫＬＨ（１０ｍｇ／ｍｌ）を７ｍｇの化合物Ｃ８と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水で脱塩カラム（Ｐ−６ＤＧビーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２７０】
アミン活性化アガロース樹脂との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣのコンジュゲート。２０ｍｌの湿ったアミン活性化アガロース樹脂（１ｍｌ当たり５μモルの活性化された基）を３０ｍＬの５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。７０ｍｇの化合物Ｃ８を２０ｍｌの湿ったビーズに加え、反応液をＲＴで２時間インキュベートおよび回転させた。反応後、２６０ｎｍの吸光度が０．０２より低くなるまで樹脂を５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して所望の精製樹脂を得た。
【０２７１】
３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシアデニン（Ａ１２）のアミノ反応性ＮＨＳエステルの合成。３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシアデニン（Ａ１２）のアミノ反応性ＮＨＳエステルの合成を図７に示す。化合物Ａ９（１１１ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（７０ｍｇ、０．４３１ｍｍｏｌ）を２５ｍＬのフラスコに加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。４−アミノ酪酸エチル塩酸塩（７８ｍｇ、０．４６５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７５ｕｌ、０．５３９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で１６時間撹拌した。ほとんどのＤＭＦを真空下でロトバップにより除去して粗化合物１０を得た。
【０２７２】
粗化合物Ａ１０に、ＥｔＯＨ（２ｍＬ）および１Ｎ  ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ（４ｍＬ）を加えた。混合物を４０℃で２４時間撹拌した。１Ｎ  ＨＣｌ／Ｈ２Ｏを加えてｐＨを８．５に調整し、ほとんどのＥｔＯＨをロトバップにより除去した後、混合物を濾過した。２５ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液およびＣＨ３ＣＮを使用して分取ＨＰＬＣにより濾液を精製して、白色固体として化合物Ａ１１（１０７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ：４３５．９（ＭＳ＋）。
【０２７３】
５ｍＬのバイアル中に、化合物１１（６１ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）およびＴＳＴＵ（２０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、生物学的コンジュゲートを調製するために所望の活性化ＮＨＳエステルＡ１２を得た。ＬＣＭＳ：５５５．２（ＭＳ＋）。
【０２７４】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｇの化合物Ａ１２と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｐ−６ＤＧビーズ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２７５】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＫＬＨ（１０ｍｇ／ｍｌ）を７ｍｇの化合物Ａ１２と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｐ−６ＤＧビーズ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２７６】
アミン活性化アガロース樹脂との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣのコンジュゲート。２０ｍｌの湿ったアミン活性化アガロース樹脂（１ｍｌ当たり５μモルの活性化された基）を３０ｍＬの５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）、および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。７０ｍｇの化合物Ａ１２を２０ｍｌの湿ったビーズに加え、反応液を室温で２時間インキュベートおよび回転させた。反応後、２６０ｎｍの吸光度が０．０２より低くなるまで樹脂を５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して所望の精製樹脂を得た。
【０２７７】
３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシチミン（Ｔ１６）のアミノ反応性ＮＨＳエステルの合成。３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシチミン（Ｔ１６）のアミノ反応性ＮＨＳエステルの合成を図８に示す。化合物Ｔ１３（１０８ｍｇ、０．３６３ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（７４ｍｇ、０．４５６ｍｍｏｌ）を２５ｍＬのフラスコに加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。４−アミノ酪酸エチル塩酸塩（８０ｍｇ、０．４７７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７５ｕｌ、０．５３９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で６時間撹拌した。ほとんどのＤＭＦを真空下でロトバップにより除去して粗化合物Ｔ１４を得た。
【０２７８】
粗化合物Ｔ１４に、ＥｔＯＨ（２ｍＬ）および１Ｎ  ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。１Ｎ  ＨＣｌ／Ｈ２Ｏを加えてｐＨを７．５に調整した後、ほとんどのＥｔＯＨをロトバップにより除去し、混合物を濾過した。２５ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液およびＣＨ３ＣＮを使用して分取ＨＰＬＣにより濾液を精製して、白色固体として化合物Ｔ１５（２８６ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ：４２６．５（ＭＳ＋）。
【０２７９】
５ｍＬのバイアル中に、化合物１５（１２１ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）およびＴＳＴＵ（４０ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、生物学的コンジュゲートを調製するために所望の活性化ＮＨＳエステルＴ１６を得た。ＬＣＭＳ：５４６．１（ＭＳ＋Ｎａ＋）。
【０２８０】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｇの化合物Ｔ１６と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｐ−６ＤＧビーズ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２８１】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴのコンジュゲート。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ＝９．０）中の２０ｍｇのＫＬＨ（１０ｍｇ／ｍｌ）を７ｍｇの化合物Ｔ１６と反応させた。反応は室温で１時間行い、リン酸緩衝生理食塩水中で脱塩カラム（Ｐ−６ＤＧビーズ）を用いて反応混合物を精製した。コンジュゲートを凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２８２】
アミン活性化アガロース樹脂との３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴのコンジュゲート。２０ｍｌの湿ったアミン活性化アガロース樹脂（１ｍｌ当たり５μモルの活性化された基）を３０ｍＬの５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。７０ｍｇの化合物Ｔ１６を２０ｍｌの湿ったビーズに加え、反応液を室温で２時間インキュベートおよび回転させた。反応後、２６０ｎｍの吸光度が０．０２より低くなるまで樹脂を５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して所望の精製樹脂を得た。
【実施例２】
【０２８３】
１１．２  実施例２．非標識リバーシブルターミネーター（ＮＬＲＴ）に対するポリクローナル抗体の調製
【０２８４】
この実施例は、シークエンシング用の試薬を製造するための免疫化および抗体精製（ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ）使用のためのプロトコールの使用を記載する。このプロトコールは、３’ブロッキング基としてアジドメチルを有するＮＬＲＴ−Ａ、−Ｔ、−Ｇ、および−Ｃに特異的な抗体を用いてポリクローナル抗血清を調製するために使用されている。
【０２８５】
材料：以下の材料をウサギの免疫化のために使用した：３ｍｇのＫＬＨ抗原（ウサギへの注射用）、３ｍｇのＢＳＡ抗原（滴定用）、および２〜３ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ抗原（精製用）。
【０２８６】
２匹のウサギの免疫化：実施例１に記載したＫＬＨ抗原を用いてウサギを免疫化した。
【０２８７】
１つのアプローチでは、７０日の免疫化スケジュールに従った：１回目の免疫化が１日目；２回目の免疫化の日が２０日目；３回目の免疫化の日が４０日目；４回目の免疫化の日が６０日目。１回目の免疫化の前に５ｍｌの免疫前血清を収集し、品質管理のために３回目の免疫化の後に５ｍｌの試験出血液を収集した。最後に、４回目の免疫化の１０日後に２匹のウサギから合計１００ｍｌの抗血清を収集した。
【０２８８】
ポリクローナル抗体の力価：以下のプロトコールを使用して力価をモニターした：
ａ）４℃で終夜または３７℃で２〜３時間１ｕｇ／ウェル（１００μｌ）の濃度の３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニン−ＢＳＡを用いてプレートの各ウェルをコーティングする。
ｂ）免疫化したウサギ身体からの１００ｕｌの段階希釈した抗血清を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
ｃ）過剰の１×ＰＢＳを用いて３回洗浄する。
ｄ）１００ｕｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：４０００）を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
ｅ）過剰の１×ＰＢＳを用いて３回洗浄する。
ｆ）１００ｕｌのＡＢＴＳ基質溶液を各ウェルに加え、室温で２０分間インキュベートする。
ｇ）Ａ４０５ｎｍにおいてプレートを読み取る。
同じプロトコールを使用して、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシ−シトシン、−アデニンおよび−チミンに対する抗血清を生成した。
【０２８９】
精製：以下のプロトコールを使用して血清から抗体を精製した。アミノカプロン酸リンカーを通じてＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂに３’−アジドメチル−２’−デオキシリボ核酸塩基をコンジュゲートさせることによりＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を調製し、精製カラムにＡｆｆｉ−Ｇｅｌを詰め込んだ。１匹または２匹のウサギから収集した抗血清（最大１００ｍｌ）をアジド−ｄＧ、アジド−ｄＣ、アジド−ｄＡ、またはアジド−ｄＴを固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｇの親和性カラムに適用した。３’−アジドメチルＮＬＲＴのそれぞれに特異的な高力価のポリクローナル抗体を得た。
【０２９０】
ポリクローナル抗体を産生させるための５０日および９０日の免疫化プログラムも使用した。例えば、抗原ＫＬＨ−３’−アジド−２’−デオキシグアノシンコンジュゲートを用いて４匹のウサギを免疫化した。免疫化のスケジュールは以下の通りであった：１回目の免疫化、１日目；２回目の免疫化、１４日目；３回目の免疫化、２８日目；および４回目の免疫化、４２日目。１回目の免疫化の前に５ｍｌの免疫前血清を収集し、品質管理のために３回目の免疫化の後に５ｍｌの試験出血液を収集した。最後に、４回目の免疫化の１０日後に２匹のウサギから合計１００ｍｌの抗血清を収集した。
【実施例３】
【０２９１】
１１．３  実施例３．Ｅ．コリＤＮＡライブラリーの調製
【０２９２】
Ｅ．コリゲノムＤＮＡライブラリーのＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）アレイを本実施例に記載するシークエンシング実験において使用した。ＤＮＢおよびＤＮＢアレイは、例えば、Drmanac et al., 2010, “Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays,” Science 327:78-81（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。試料調製中に、Ｅ．コリゲノムＤＮＡの断片から環状ライブラリーコンストラクトを調製し、ライブラリーコンストラクトをローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により増幅させて、隣接するプライマー結合部位を有するゲノムＤＮＡインサートを含むＤＮＢを製造した。ＤＮＢをＤＮＡシークエンシングフローセル（例えば、ＢＧＩＳＥＱ−５００フローセルまたはＢＧＩＳＥＱ−１０００フローセル）中にアレイ化し、ＢＧＩＳＥＱ−５００（ＢＧＩ、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ；Huang et al., 2017, “A reference human genome dataset of the BGISEQ-500 sequencer" Gigascience 6:1-9を参照）またはＢＧＩＳＥＱ−１０００（ＢＧＩ、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）を使用してシークエンシングを実行した。
【実施例４】
【０２９３】
１１．４  実施例４．ＤＮＢアレイにおいて組み込まれたＮＬＲＴを検出するためのｄＮ−アジドメチル特異的ウサギポリクローナル抗体および標識化ヤギ抗ウサギ二次抗体の使用
【０２９４】
実施例２に記載した３’−アジドメチル−ｄＡ、３’−アジドメチル−ｄＣ、３’−アジドメチル−ｄＧ、または３’−アジドメチル−ｄＴのＫＬＨコンジュゲートに対して産生された血清由来抗体をこの実験において使用した。抗ＮＬＲＴ抗体（ａｎｔｉ−ＮＬＲＴ  ａｎｔｂｏｄｉｅｓ）の４つの異なる精製調製物を４つの塩基（すなわち、ＲＴ−Ａ、ＲＴ−Ｃ、ＲＴ−ＧおよびＲＴ−Ｔ）のそれぞれについて調製し、Ａ１〜Ａ４、Ｃ１〜Ｃ４、Ｇ１〜Ｇ４、およびＴ１〜Ｔ４と表される１６個の抗体調製物を結果として得た。実施例４に記載したＥ．コリゲノムＤＮＡインサートを含有するＤＮＢアレイをプライミングし、３’修飾ｄＮＴＰを組み込むように操作された（ｅｎｉｎｇｅｅｒｅｄ）ポリメラーゼであるＢＧ９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＧＩ  Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）および３’−アジドメチルブロッキング基を有する４つの非標識リバーシブルターミネーター（例えば、３’−アジドメチル−ｄＡＴＰ、−ｄＣＴＰ、−ｄＧＴＰおよび−ｄＴＴＰ）を使用してプライマーを伸長させた。１６個の抗体調製物を１０μｇ／ｍＬにおいてＤＮＢアレイ上の別々（ｓｐｅｐａｒａｔｅ）のレーンに個々に適用し、３５℃で５分間インキュベートした（１６の別々のインキュベーション）。インキュベーションの最後にアレイの未結合の一次抗体を３５℃で抗体緩衝液（ＡｂＢ）（ｐＨ７．４のトリス緩衝生理食塩水＋０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いて洗浄することにより除去した。次に、アレイを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）から得られたＡＦ４８８標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｆａｂ断片）と３５℃で５分間インキュベートした。ＡｂＢを用いてアレイを洗浄して未結合の二次抗体を除去し、ＢＧＩＳＥＱ−１０００シークエンシングシステムを使用して画像化した。単一の一次抗体を用いて染色された１６の抗体調製物のそれぞれは、ＤＮＡ部位の約２５％において組み込まれたＮＬＲＴに結合すると期待されることが理解されるであろう。
【０２９５】
ＤＮＢをプライミングし、切断可能なリンカーを介して塩基に取り付けられたフルオロフォアにより標識された４つ全ての３’−アジドメチルｄＮＴＰを使用してプライマーを伸長することによりシークエンシングアレイ中の４つの対照レーンを生成した。ここに示す対照シグナル値はＣ−ＡＦ４８８についてのものである。
【０２９６】
表１は、対照アレイおよび抗体アレイを使用して得られたシグナルを示す。抗体媒介性シグナルの最も高いレベルを太字フォントで示す。シグナル強度のばらつきがアレイ間で観察されたが（使用したウサギポリクローナル抗体の特定の調製に応じて）、この間接的な検出技術を使用して比較的低い抗体濃度において対照シグナル強度と同等またはそれを超えることができることを結果は示す。
【０２９７】
【表１】
2020508037.tif 000017
【実施例５】
【０２９８】
１１．５  実施例５．蛍光標識ＲＴ−Ａ、−Ｃおよび−Ｔおよび非標識ＲＴ−Ｇを使用するＤＮＡシークエンシング
【０２９９】
いずれも３’−アジドメチルブロッキング基を有する、蛍光標識ＲＴ−Ａ、−Ｃおよび−Ｔならびに非標識ＲＴ−Ｇを使用してＤＮＡナノボールＥ．コリゲノムＤＮＡライブラリーをシークエンシングした。シークエンシングはＢＧＩＳＥＱ−５００シークエンサー（ＢＧＩ、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）を使用して行い、シークエンサーにより提供される塩基コール解析レポートを使用してデータを解析した。シークエンシングを５サイクル（図１０Ａおよび図１０Ｃ）または１０サイクル（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）実行した。図１０Ａおよび図１０ＣはＲｈｏ値を示す。（Ｒｈｏ値は、画像解析後に得られたシグナル強度からバックグラウンドを引くことにより算出される。クロストーク補正を含むシグナルの標準化も適用した。）図１０Ｂおよび図１０Ｄはシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を示す。
【０３００】
成功した塩基コールレポートからの強度のＲｈｏおよびＳＮＳ（シグナル対ノイズ比）を含むデータは、非標識ＲＴおよびＲＴに特異的に結合する標識された親和性試薬を用いて成功裏にシークエンシングを行うことができることを指し示す。
【実施例６】
【０３０１】
１１．６  実施例６．４つの非標識ＲＴおよび非標識抗ＮＬＲＴポリクローナル抗体を使用するＤＮＡシークエンシング
【０３０２】
表２は、８レーンチップアレイ（Fehlmann et al., Clin. Epigenetics 8:123, 2016を参照）を用いてＢＧＩＳＥＱ−１０００シークエンサー（ＢＧＩ、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）を使用して生成されたシークエンシングデータを示す。列５は、切断可能なブロッキング部分が３’−Ｏ−アジドメチル（ＮＬＲＴ−Ａ、−Ｔ、−Ｃおよび−Ｇ）である非標識リバーシブルターミネーターおよび４つのＮＬＲＴのそれぞれを標的とするポリクローナル抗体（「１O抗体」）を使用した結果を示す。抗体結合は２O抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得たＡＦ４８８標識ヤギ抗ウサギＦａｂ断片  を使用して検出した。ＦＩＴチャネルにおいてシグナルを測定した。非対照レーン（例えば、表２の欄３〜８  において、各一次抗体を別々に適用し［すなわち、別々のチャネル（ｃｈａｎｅｌ）において適用し］、検出した。未加工のシグナル値を示す。
【０３０３】
表２の行は、リバーシブルブロッキング基として３’切断可能なアジドメチル基を有する１つのＮＬＲＴに対応する。表２の各行は１つの標的ｄＮＴＰに関し、各列はその標的に対する試験を示す。列は以下の通りである：
【０３０４】
列１：列５（陽性対照２）において使用した１O抗体の特異性および濃度（μｇ／ｍＬ）。
【０３０５】
列２および列９：４つの蛍光標識（「ホット」）リバーシブルターミネーターｄＮＴＰ（切断可能なリンカーを介して塩基に取り付けた蛍光色素を有する  を使用して伸長を実行した。（ＤＮＡアレイ用の陽性対照）
【０３０６】
列３：ＢＧ９  ＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長を実行した。４つ全ての１O抗体の濃度は１００μｇ／ｍｌ（陽性対照１）。
【０３０７】
列４：一次抗体を割愛している（陰性対照；二次抗体バックグラウンドのみ）。
【０３０８】
列５：４つの非標識アジドメチルＮＬＲＴを使用して伸長を実行した。列１の濃度において使用した各一次抗体による染色を示す結果。
【０３０９】
列６：標的ＮＬＲＴを割愛したが３つの非標的ＮＬＲＴを含んで伸長を実行した（抗体特異性対照１）；
【０３１０】
列７：ＧＤＳの３’端における標的塩基がアジドメチルブロッキング基ではなく３’−ＯＨを有する陰性対照（抗体特異性対照２）。
【０３１１】
列８：シークエンシングプライマーを使用しない陰性対照（特異性対照３）。
【０３１２】
【表２】
2020508037.tif 000018
【実施例７】
【０３１３】
１１．７  実施例７．非標識ＲＴ−Ｇが抗ＲＴ−Ｇウサギ一次抗体および標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して検出される５０サイクルのシークエンシング
【０３１４】
この実施例は、ＢＧＩＳＥＱ−１０００  ＤＮＡシークエンサーおよびＥ．コリゲノムＤＮＢライブラリーを使用して実行した５０サイクルのシークエンシングバイシンセシス（ＳＢＳ）の結果を示す。ゲノムＤＮＡインサートに隣接する配列に相補的なＤＮＡプライマーをＤＮＢアレイにハイブリダイズさせ、各２μＭの濃度の３’−アジドメチルリバーシブルターミネーター（ＲＴ−Ａ、−Ｃ、−Ｇ、−Ｔ）を使用してプライマー伸長を実行した。３つのリバーシブルターミネーター（アジドメチル−−Ａ、−Ｃ、−Ｔ）は、塩基に取り付けた切断可能なリンカーを介して蛍光標識し（５０％の標識／５０％の非標識の比において使用）、１つのリバーシブルターミネーター（３’−アジドメチル−ｄＧＴＰ）は非標識であった。ＢＧ９  ＤＮＡを使用して３５℃で２分間プライマー伸長を実行した。
【０３１５】
１サイクルのプライマー伸長後にアレイを洗浄して、組み込まれなかったヌクレオチドを除去した。ＡＦ６４７標識ヤギ抗ウサギ蛍光標識Ｆａｂ断片と予め組み合わせた抗３’−アジドメチル−ｄＧウサギ一次抗体とインキュベートすることにより、組み込まれた３’−アジドメチル−ｄＧを検出した。一次抗体および二次抗体（Ｆａｂ断片）を一緒に３５℃で１５分間インキュベートすることによりそれらを予め組み合わせた。この予め組み合わせた複合体をアレイ上で２５μｇ／ｍＬの一次濃度および５０μｇ／ｍＬの二次濃度において３５℃で１０分間インキュベートし、アレイを３回洗浄してあらゆる未結合の抗体を除去した。
【０３１６】
抗体のインキュベーション後、３つの標識ＲＴ（ＲＴ−Ａ、−Ｃ、−Ｔ）をそれらの特有の蛍光標識を使用して検出し、標識されていない塩基（ＲＴ−Ｇ）を、ヤギ抗ウサギ断片二次抗体にコンジュゲートさせた蛍光標識を使用して検出した。蛍光波長の検出を介してＤＮＢ塩基の素性を決定した後、１３ｍＭのＴＨＰＰによる３５℃での２分間の還元により標識（ＲＴ−Ａ、−Ｃ、−Ｔ）へのリンカーおよび３’ブロッキング基（ＲＴ−Ｇ、−Ａ、−Ｃ、−Ｔ）を除去して、３’−ＯＨ基の再生および新生ＤＮＡ鎖をさらに伸長する能力を可能とした。この一連の工程（伸長、抗体インキュベーション、検出、およびブロック除去）を合計５０サイクルの配列同定にわたり繰り返した。
【０３１７】
図１１Ａは、ベースコール情報量(Basecall Information Content)（ＢＩＣ）のパーセントを示す。このグラフは、抗ウサギＡＦ６４７蛍光標識断片二次抗体と予め組み合わせた抗３’−アジドメチル−ｄＧウサギ一次抗体を通じて間接的に検出されたときに非標識塩基の素性は、ベースコール解析および未知のＤＮＡ残基の同定のために充分な情報を提供することを示す。
【０３１８】
図１１Ｂは、特有の蛍光標識のそれぞれについてのシグナル強度およびトレンドを示す。塩基に取り付けられた蛍光標識された切断可能なリンカーを含有する３つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を５０％の標識／５０％の非標識の比において使用し、これらはそれぞれＣｙ３、ＦＩＴＣ、およびＴｘＲに対応する。抗ウサギＡＦ６４７蛍光標識断片二次抗体と予め組み合わせた抗３’−アジドメチル−ｄＧウサギ一次抗体により非標識３’−アジドメチル−ｄＧＴＰを検出した。これらのデータは、非標識３’−アジドメチル−ｄＧ塩基についてのシグナル強度の劣化率は、切断可能なリンカーで標識されたヌクレオチドの率より低いことを示す。シグナル強度のこの低減された劣化は、切断可能なリンカーを使用して標識されたｄＮＴＰを使用する従来法よりも長いリードがこの技術を使用して可能であり得ることを指し示す。
【実施例８】
【０３１９】
１１．８  実施例８．抗体は充分な特異性でＮＬＲＴに結合してベースコール解析のために好適なシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）の値を生成する
【０３２０】
表３、４、５および６のデータは、直接標識された抗アジドメチル塩基抗体を使用するＥ．コリゲノムＤＮＡ上の非標識リバーシブルターミネーターの染色を用いて得られたおよび標識アジドメチル塩基を使用する対照アレイについての、トップシグナル、Ｒｈｏ（バックグラウンドおよびクロストークを引いたシグナル）、バックグラウンドシグナル（「バック」）およびシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）の値を示す。実験は、Ｅ．コリゲノムＤＮＡライブラリーを用いてＢＧＩＳＥＱ−５００フローセルアレイにより行い、ＢＧＩＳＥＱ−５００ＤＮＡシークエンサーによりスキャンした。
【０３２１】
対照値は、４つの標識３’−アジドメチルＲＴ（切断可能なリンカーを介して塩基に接続された標識）を使用したシークエンシングの結果である。３’−アジドメチルＲＴは、表４、５および６において６０％の標識（「ホット」）、４０％の非標識（「コールド」）の比、表３において２５％の標識および７５％の非標識の比において使用した。
【０３２２】
染色前の値は、１ラウンドのプライマー伸長の後、抗体の付加の前にスキャンする。
【０３２３】
染色値は、指し示した濃度の適切な抗アジドメチル塩基抗体とのインキュベーション（２×２分、３５℃）後のスキャンにより得られた。抗アジドメチル塩基抗体は、示したフルオロフォアを用いて直接的に標識した。抗アジドメチル塩基の結合に対応する値を太字としている。
【０３２４】
表３は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシアデニンに対するポリクローナル抗体を使用した結果を示す。表４は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシシトシンに対するポリクローナル抗体を使用した結果を示す。表５は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニンに対するポリクローナル抗体を使用した結果を示す。表６は、３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシチミジンに対するポリクローナル抗体を使用した結果を示す。
【０３２５】
【表３】
2020508037.tif 000019
【０３２６】
【表４】
2020508037.tif 000020
【０３２７】
【表５】
2020508037.tif 000021
【０３２８】
【表６】
2020508037.tif 000022
【実施例９】
【０３２９】
１１．９  標識された抗ＮＬＲＴポリクローナル抗体を使用した２５サイクルのシークエンシング
【０３３０】
Ｅ．コリゲノムＤＮＡライブラリーを実施例２に記載した通りに調製し、ＢＧＩＳＥＱ−５００フローセル上にアレイ化した。プライマーを加え、非標識ヌクレオチド３’−アジドメチルリバーシブルターミネーター（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を使用するプライマー伸長によりシークエンシングバイシンセシスを行った。非標識３’ブロックｄＮＴＰは各１μＭの濃度で存在し、１サイクル当たり１分間５５℃においてＢＧ９  ＤＮＡを使用して組み込んだ。組込みおよび組み込まれなかったヌクレオチドを除去するための洗浄後、表１１に示す濃度（１０〜１００μｇ／ｍＬの範囲）の４つの直接標識された抗３’−アジドメチル塩基抗体の混合物とアレイを接触させることにより４つの３’−アジドメチル塩基ヌクレオチドを検出し、１サイクル当たり２×２分３５℃でアレイ上でインキュベートした。「２×２」は、抗体との２分間のインキュベーションの後、追加の抗体を加えてからさらに２分インキュベーションを行うことを指す。アレイを３回洗浄して、あらゆる未結合の抗体を除去した。表７は、各検出抗体に直接的にコンジュゲートされたフルオロフォアの素性を示す。
【０３３１】
【表７】
2020508037.tif 000023
【０３３２】
フルオロフォアのレーザー励起中に８０ｍｓにわたりスキャンすることによりＤＮＢアレイ上の各位置における蛍光シグナルを決定した。ＤＮＢ塩基の素性を決定した後、ＴＨＰＰ（１３ｍＭ）による３５℃での２分間の還元により３’ブロッキング基を除去して、３’−ＯＨ基の再生および新生ＤＮＡ鎖のさらなる伸長を可能とした。３’ブロッキング基の除去はまた、プライマー伸長産物からの抗体の解離を結果としてもたらした。
【０３３３】
この一連の工程（伸長、抗体インキュベーション、検出、およびブロック除去）を合計２５サイクルのＤＮＡ配列同一性（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）にわたり繰り返した。
【０３３４】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、各シークエンシングサイクルにおける各塩基のＲｈｏおよびシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を示す。表８は、ＤＮＢリードの数の他に、参照Ｅ．コリゲノムと比較した時のマッピングおよび誤り率を示す。
【０３３５】
成功した塩基コールレポートからの強度のＲｈｏおよびＳＮＲを含むこれらのデータは、非標識リバーシブルターミネーターならびにブロッキング基および塩基に結合する抗体を使用して複数サイクルのＤＮＡシークエンシングを実行できることを実証する。
【０３３６】
【表８】
2020508037.tif 000024
【実施例１０】
【０３３７】
１１．１０  実施例１０：異なって標識された抗体セットは同等の結果を与える
【０３３８】
表９および表１０は、直接標識された抗アジドメチル塩基抗体を使用するＥ．コリゲノムＤＮＡ上の非標識リバーシブルターミネーターの染色を用いて得られた、（トップシグナル）、Ｒｈｏ（バックグラウンドおよびクロストークを引いたシグナル）、バックグラウンドシグナルおよびシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）の値を示す。この実験は、Ｅ．コリゲノムＤＮＡライブラリーを用いてＢＧＩＳＥＱ−５００フローセルアレイにより行い、ＢＧＩＳＥＱ−５００ＤＮＡシークエンサーによりスキャンした。固定化されたＤＮＢにプライマーをハイブリダイズさせ、ＢＧ９ポリメラーゼを使用して各１μＭの濃度の４つ全ての標識されていないヌクレオチド３’−アジドメチルＲＴ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下３５℃で２分間伸長させた。組込みおよび組み込まれなかったヌクレオチドを除去するための洗浄後、示した濃度（例えば、「＠３０」は３０ｕｇ／ｍＬを意味する）の４つ全ての標識された抗３’−アジドメチル塩基抗体（抗体セット１）を３５℃で各２分の２回の逐次的なインキュベーションにわたりインキュベートすることにより、組み込まれた３’−アジドメチル塩基ヌクレオチドを同時に検出した。
【０３３９】
第２のアレイは抗体セット２を使用してプロービングした。抗体セット２は同じ抗体調製物を含むが、抗体は異なる標識をされている。表１０は、抗体セット２を適用した後のシグナルを示す。データは、シグナルおよびＳＮＲ値が、直接標識されたフルオロフォアの素性とは独立してベースコール解析のために好適であることを実証する。
【０３４０】
【表９】
2020508037.tif 000025
【０３４１】
【表１０】
2020508037.tif 000026
【実施例１１】
【０３４２】
１１．１１  実施例１１：３’ブロッキング基の除去を伴わない抗ＮＬＲＴ抗体の除去
【０３４３】
本明細書の別の箇所において論じたように、抗体の除去（プライマー伸長産物からの解離）を３’ブロッキング基の切断（ｃｌｅａｖｇｅ）および除去から切り離すことができ、表１１は、抗体が特異的競合により除去される実験の結果を示す。４つの非標識３’−アジドメチル塩基ヌクレオチドを使用してＥ．コリライブラリーを含むＤＮＢアレイ上でプライマー伸長を行った。染色は、色セット１のフルオロフォアを用いて直接標識された４つ全ての抗３’−アジドメチル塩基抗体（実施例１０を参照）を同時にインキュベートすることで行った。５０％のＷＢ１、５０％のＡｂ緩衝液中５７℃で２分間、２０μＭの遊離抗原（３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシグアニン、デオキシアデニン、デオキシシトシン、デオキシチミン；それぞれ三リン酸形態）の存在下でインキュベートすることにより、特異的競合を使用して検出用親和性試薬を除去した。Ａｂ除去手順は、（１）ＷＢ１、５５℃；（２）除去溶液；（３）ＷＢ１、２０℃；（４）ＷＢ２；（５）ＳＲＥであった。ＷＢ１：ＮａＣｌ  ０．７５Ｍ、クエン酸ナトリウム  ０．０７５Ｍ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％、ｐＨ７．０；ＷＢ２  ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ  ｐＨ９  ５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ９．０；ＳＲＥ  ＮａＣｌ  ４００ｍＭ、トリスＨＣｌ  ｐＨ７  １０００ｍＭ、Ｌアスコルビン酸ナトリウム  １００ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％、ｐＨ７．０。
【０３４４】
データは、シグナルおよびＳＮＲが有意に低減されることを示し、ＤＮＢアレイからの親和性検出試薬の大部分の除去を指し示す。
【０３４５】
【表１１】
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【実施例１２】
【０３４６】
１１．１２  実施例１２：抗ＮＬＲＴ抗体の除去および複数サイクルのシークエンシングにおける再プロービング
【０３４７】
本実施例は、（１）第１の位置における塩基の素性が該塩基および３’ブロッキング基に特異的な第１の一次抗体による結合を検出することにより決定され；（２）３’ブロッキング基を除去することなく第１の一次抗体を除去し；（３）該塩基および３’ブロッキング基に特異的な第２の一次抗体を使用して同じ位置を再プロービングする方法を記載する。これらの実験の結果を表１２に要約する（ｓｕｍａｒｉｚｅｄ）。
【０３４８】
表１２は、異なる蛍光色の組合せ（実施例１０に記載）からの２つの独立したリードを合計で２０の位置のリードのための新生シークエンシングバイシンセシス鎖の各位置について組み合わせた時の向上したＤＮＡ配列素性マッピング率を示す。「オッドインデプ」（ｏｄｄ  ｉｎｄｅｐ）は、各シークエンシング位置について「従来色」の初期リードを表す。「イーブンインデプ」（ｅｖｅｎ  ｉｎｄｅｐ）は、表１２に概説する手順を使用した特異的競合による除去後の「代替色」のその後のリードを表す。「コンボ」（ｃｏｍｂｏ）は、２つの独立したリードのそれぞれを比較し、結果を２つのリードのより高い強度、したがってより高い信頼度の値に対して重み付けした結果を表す。結果は、この技術を使用して２つの独立したリードを組み合わせた時の有意により高いマッピング率および有意により低いミスマッチ率を示す。
【０３４９】
【表１２】
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【０３５０】
以上の発明は、理解を明確にする目的から説明および例により一部の詳細において記載したものであるが、ある特定の変更および改良が添付の請求項の範囲内において実施され得ることを当業者は理解するであろう。加えて、本明細書において提供される各参考文献は、参照することにより各参考文献が個々に組み込まれるのと同じ程度まで、参照することによりその全体が組み込まれる。本出願と本明細書において提供される参考文献との間に不一致が存在する場合は本出願が優先される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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