(57)【要約】  本発明は、免疫系の細胞上で発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を特異的に標的化するためのツールとしての改変ウイルス構造タンパク質（ＶＳＰ）に関する。改変ＶＳＰはアセンブルして、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）になることができる。ＶＳＰの露出範囲は、高次構造、例えば、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスなどの表面上に位置する領域に、ＣＡＲに特異的に結合するリガンド（ＬＣＡＲ）を含むように改変される。したがって、本発明は、改変ＶＳＰを提供する。本発明は、前記ＶＳＰをコードする核酸にも関する。さらに、本発明は、少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに関する。さらに、本発明は、少なくとも１つのＶＳＰを含む、ＶＳＰ、核酸、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬における使用のため、特に、免疫応答を減少もしくは制限する使用のため、腫瘍崩壊症候群を処置もしくは防止する使用のため、または患者の免疫疾患を処置する使用のための、ＶＳＰ、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス構造タンパク質（ＶＳＰ）であって、
（ｉ）ＶＳＰが、１つまたは複数のさらなるＶＳＰと適宜一緒に、キャプソメア構造、キャプシド、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスベクターまたはウイルスを形成する能力があり、
（ｉｉ）ＶＳＰが、前記キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの表面上に位置する領域に、キメラ抗原受容体（ＬＣＡＲ）に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを含み、ＬＣＡＲが、ポリペプチドである、ウイルス構造タンパク質。
【請求項２】
ＶＳＰが、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡウイルス、
好ましくは、ミオビリダエ（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホビリダエ（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドビリダエ（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスビリダエ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アデノビリダエ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロビリダエ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマビリダエ（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナビリダエ（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマビリダエ（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスビリダエ（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）；
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡウイルス、
好ましくは、アネロビリダエ（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノビリダエ（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボビリダエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）；
（ｉｉｉ）二本鎖ＲＮＡウイルス、
好ましくは、レオビリダエ（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；
（ｉｖ）一本鎖ＲＮＡウイルス、
好ましくは、コロナビリダエ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナビリダエ（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシビリダエ（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガビリダエ（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビビリダエ（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロビリダエ（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリビリダエ（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘペビリダエ（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）；
（ｖ）マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、
好ましくは、アレナビリダエ（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロビリダエ（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソビリダエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドビリダエ（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤビリダエ（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソビリダエ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナビリダエ（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；
（ｖｉ）一本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、
好ましくは、レトロビリダエ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；
（ｖｉｉ）二本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス、
好ましくは、カリモビリダエ（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナビリダエ（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）
からなる群から選択されるウイルスのＶＳＰである、請求項１に記載のＶＳＰ。
【請求項３】
ＶＳＰが、パルボビリダエのファミリーのウイルスのウイルスコートタンパク質（ＶＣＰ）であり、好ましくは、ＶＳＰが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、好ましくは、ヒトＡＡＶ、ウシＡＡＶ（ｂ−ＡＡＶ）、イヌＡＡＶ（ｃ−ＡＡＶ）、ヤギＡＡＶもしくはトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）；イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）；マウスパルボウイルス；マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）；パルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）；パルボウイルスＨｌ（Ｈ１）；ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）；ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）；またはガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）由来である、請求項１または２に記載のＶＳＰ。
【請求項４】
ＡＡＶが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−２−ＡＡＶ−３ハイブリッド、ＡＡＶ−３ａ、ＡＡＶ−３ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−６．２、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３もしくはＡＡＶｒｈ３２．３３、またはこれらのキメラである、請求項３に記載のＶＳＰ。
【請求項５】
ＶＣＰが、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる群から選択される、請求項３または４のいずれか一項に記載のＶＳＰ。
【請求項６】
１つまたは複数のＬＣＡＲが、
（ｉ）配列番号１に記載のＶＰ１、または配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３もしくはＴ７１６、好ましくはＲ５８８からなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上のアミノ酸位置（挿入部位）で、あるいは異なるＡＡＶ血清型のＶＰ１またはその変異体の類似位置で；好ましくは、Ｒ５８８およびＧ４５３のアミノ酸位置、または異なるＡＡＶ血清型のＶＰ１の類似位置で、あるいは
（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＰ２、または配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体の、Ｍ１、Ａ２、Ｋ２４、Ｓ１２４、Ａ１２９、Ｎ２４４、Ｒ３１０、Ｔ３１１、Ｇ３１６、Ｒ３２２、Ｒ３３４、Ｆ３９７、Ｔ４３６、Ｑ４４７、Ｎ４５０、Ｒ４５１、Ａ４５４、Ｐ５２０、Ａ５２７、Ｔ５７６もしくはＴ５７９、好ましくはＲ４５１からなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上の挿入部位で、あるいは異なるＡＡＶ血清型のＶＰ２またはその変異体の類似位置で；好ましくは、Ｒ４５１およびＧ３１６のアミノ酸位置、または異なるＡＡＶ血清型のＶＰ２の類似位置で、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＶＰ３、または配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体の、Ｓ５９、Ａ６４、Ｎ１７９、Ｒ２４５、Ｔ２４６、Ｇ２５１、Ｒ２５７、Ｒ２６９、Ｆ３３２、Ｔ３７１、Ｑ３８２、Ｎ３８５、Ｒ３８６、Ａ３８９、Ｐ４５５、Ａ４６２、Ｔ５１１またはＴ５１４、好ましくはＲ３８６からなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上の挿入部位で、あるいは異なるＡＡＶ血清型のＶＰ３またはその変異体の類似位置で；好ましくは、Ｒ３８６およびＧ２５１のアミノ酸位置、または異なるＡＡＶ血清型のＶＰ３の類似位置で、
挿入され、
ならびに／あるいは
好ましくは、ＬＣＡＲが、Ｃ末端および／またはＮ末端でリンカー配列と隣接する、
請求項５に記載のＶＳＰ。
【請求項７】
（ｉ）１つ、２つもしくはそれ以上のアミノ酸挿入部位のＶＰ１のＣまたはＮ末端の１つまたは複数のアミノ酸が欠失し、および／あるいは
（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸が、挿入部位のＣ末端またはＮ末端で、好ましくは、挿入部位の１０個のアミノ酸内で、置換される、
請求項６に記載のＶＳＰ。
【請求項８】
（ｉ）ＬＣＡＲが、腫瘍表面露出抗原（ＴＳＥＡ）の少なくとも１つのエピトープを含むかまたはからなり、および／あるいは
（ｉｉ）ＬＣＡＲが、ＣＡＲの細胞外部分に特異的に結合する単鎖抗体または単鎖抗体様タンパク質からなる群から選択される、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＶＳＰ。
【請求項９】
ＴＳＥＡが、がん精巣抗原、好ましくは、ＮＹ−ＢＲ１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＩＬ１３Ｒａ２またはＮＹ−ＥＳＯ−１；がん胎児抗原、好ましくは、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＰＳＣＡまたはＬ１−ＣＡＭ；分化抗原、好ましくは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２，２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＧ７、ＰＳＭＡ、ｇｐ１００、アルファＦＲ、ＣＡＩＸ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、ＢＣＭＡ  Ｉｇｋ、ＲＯＲ−１、ｃＭｅｔまたはＶＥＧＦＲ−ＩＩ；ウイルス抗原または変化糖タンパク質、好ましくは、ＡＣ１３３、ＭＵＣ−１、ＧＤ２またはＬｅｗｉｓ−Ｙからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＶＳＰ。
【請求項１０】
ＬＣＡＲが、６〜５０アミノ酸の長さを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＶＳＰ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＶＳＰをコードする核酸。
【請求項１２】
ウイルスベクターまたはウイルスが、非感染性である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス。
【請求項１３】
医薬における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＶＳＰ、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス。
【請求項１４】
好ましくは養子免疫療法によって誘発される、より好ましくはＣＡＲ細胞療法によって誘発される免疫応答の防止、減少または制限における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＶＳＰ、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス。
【請求項１５】
免疫応答が、細胞免疫応答である、請求項１４に記載の使用のための、ＶＳＰ、核酸、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含むキットオブパーツであって、ウイルスベクターまたはウイルスが、非感染性であり、ＣＡＲを発現する改変細胞に、前記キャプソメア構造、前記キャプシド、前記ＶＬＰ、前記ウイルスベクターまたは前記ウイルスが特異的に結合する、キットオブパーツ。
【請求項１７】
キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスが、１０μＭ未満の親和性で改変細胞に結合する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
好ましくは養子免疫療法によって誘発される免疫応答の防止、減少または制限における、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス使用を記述する使用説明リーフレットをさらに含む、請求項１６または１７に記載のキットオブパーツ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系の細胞上で発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を特異的に標的化するためのツールとしての改変ウイルス構造タンパク質（ＶＳＰ）に関する。改変ＶＳＰは、アセンブルしてウイルス様粒子（ＶＬＰ）になることができる。ＶＳＰの露出範囲は、高次構造、例えば、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスなどの表面上に位置する領域に、ＣＡＲに特異的に結合するリガンド（ＬＣＡＲ）を含むように改変される。したがって、本発明は、改変ＶＳＰを提供する。本発明は、前記ＶＳＰをコードする核酸にも関する。さらに、本発明は、少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに関する。さらに、本発明は、少なくとも１つのＶＳＰを含む、ＶＳＰ、核酸、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬における使用のため、特に、免疫応答を防止、減少もしくは制限する使用のため、特に、患者における、腫瘍崩壊症候群、サイトカイン放出症候群、神経毒性、「ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ」認識、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および／もしくはアナフィラキシーを防止、減少または処置するための、改変ＶＳＰ、あるいはこのような改変ＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法のようなアプローチは、前途有望であるが、何よりも、サイトカイン放出症候群、神経毒性、「ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ」認識、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアナフィラキシーを含む重度の有害反応などのある特定の欠点を伴う。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、患者のＴ細胞が、それらががん細胞を攻撃するように実験室で改変される処置の種類である。Ｔ細胞は、患者の血液から採取される。次いで、患者のがん細胞上のある特定のタンパク質に結合する特殊な受容体をコードする遺伝子が、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で細胞に導入される。特殊な受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる。多数のＣＡＲ  Ｔ細胞は、実験室で増殖され、点滴によって患者に投与される。ＣＡＲ  Ｔ細胞による最初の臨床試験は、Ｂ細胞白血病またはリンパ腫に焦点を合わせていた。これらの疾患は、（何よりも）ＣＤ１９分子を発現する腫瘍細胞の存在によって特徴付けられる。これらの試験におけるＣＡＲは、腫瘍特異的エピトープまたはＬＣＡＲと呼ばれる、ＣＤ１９タンパク質のモチーフに特異的に結合する。ＬＣＡＲ／ＣＡＲのペアの結合の確立は、腫瘍細胞に対するＴ細胞の特異的活性化をもたらし、その後、後者を死滅させる。活性化されたＴ細胞は、他の免疫学的に活性な細胞を引き付ける標的細胞の認識および死滅の後、環境にさまざまなシグナル分子（サイトカイン）を放出する。多数のＣＡＲ  Ｔ細胞が、患者に注入されると、それらは、特に後期の患者において、多くの数の標的細胞に立ち向かう。したがって、これらの腫瘍細胞の根絶の成功は、血流へのサイトカインの大量放出と密接に関連している。この副作用は、サイトカイン放出症候群または腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）と呼ばれ、重篤であり得るか、またはさらに患者の生命を脅かし得る。ＴＬＳは、ＬＣＡＲ／ＣＡＲのペア形成自体に関わらず、がんに対する任意のＣＡＲ処置において観察される。本発明は、ＬＣＡＲ／ＣＡＲ結合軸の形成の妨害に重点的に取り組む。これは、ＶＬＰへのＬＣＡＲの導入によって達成され、これは、次にＣＡＲを活性化することなくＣＡＲに優先的に結合する。本発明は、初めて、ＣＡＲ  Ｔ細胞を無傷のままにするＣＡＲ  Ｔ細胞のための可逆的なインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の制御系を示し、このようにして、ＴＬＳおよび関連作用を防止し得る。このように、本発明は、ＣＡＲ  Ｔ細胞応答を微調整することを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
第１の態様において、本発明は、ＶＳＰであって、（ｉ）ＶＳＰが、１つまたは複数のさらなるＶＳＰおよび適宜リン脂質と適宜一緒に、キャプソメア構造、キャプシド、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスベクターまたはウイルスを形成する能力があり、（ｉｉ）ＶＳＰが、前記キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの表面上に位置する領域に、キメラ抗原受容体（ＬＣＡＲ）に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを含み、ＬＣＡＲが、ポリペプチドである、ＶＳＰに関する。
【０００４】
第２の態様において、本発明は、第１の態様のＶＳＰをコードする核酸にさらに関する。
【０００５】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスにさらに関する。
【０００６】
第４の態様において、本発明は、第１の態様のＶＳＰ、第２の態様の核酸、本発明の第３の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含む医薬組成物に関する。
【０００７】
本発明の第５の態様は、医薬における使用のための、第１、第２および第３の態様に記載の、ＶＳＰ、核酸、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに関する。
【０００８】
本発明の第６の態様は、免疫応答の減少または制限における使用のため、好ましくは養子免疫療法によって誘発される、より好ましくはＣＡＲ細胞療法によって誘発される免疫応答の防止、減少または制限における使用のための、第１、第２または第３の態様に記載の、ＶＳＰ、核酸、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに関する。
【０００９】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含むキットオブパーツであって、ウイルスベクターまたはウイルスが、非感染性であり、ＣＡＲを発現する改変細胞に、前記キャプソメア構造、前記キャプシド、前記ＶＬＰ、前記ウイルスベクターまたは前記ウイルスが特異的に結合する、キットオブパーツに関する。
【００１０】
以下において、本明細書に含まれる図面の内容を記載する。この文脈において、上記および／または下記の本発明の詳細な説明も参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】組換えＡＡＶ粒子のＥＬＩＳＡ。ウェルあたり１×１０８個の野生型およびＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶのウイルス粒子をコーティングし、検出を、２倍連続希釈のＡＡＶ特異的Ａ２０マウスハイブリドーマ上清、続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とのインキュベーションによって行った。ＤＡＢは、基質としての役割を果たし、ＯＤ４５０を測定した。実験は三反復で行った。
【図２】組換えＡＡＶ粒子のＥＬＩＳＡ。ウェルあたり１×１０８個の野生型およびＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶのウイルス粒子を２倍連続希釈でコーティングし、検出を、ＮＹ−ＢＲ１特異的マウス抗体Ｍｏｒａｂ２（１μｇ／ｍｌ）、続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とのインキュベーションによって行った。ＤＡＢは、基質としての役割を果たし、ＯＤ４５０を測定した。実験は三反復で行った。
【図３】組換えＡＡＶ粒子のＥＬＩＳＡ。ウェルあたり１×１０８個のＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶのウイルス粒子をコーティングし、検出を、それぞれ２倍連続希釈のＡＡＶ特異的Ａ２０マウスハイブリドーマ上清またはＮＹ−ＢＲ１特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質のいずれか、続いてそれぞれの抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とのインキュベーションによって行った。ＤＡＢは、基質としての役割を果たし、ＯＤ４５０を測定した。実験は三反復で行った。
【図４】細胞株におけるＣＡＲのダウンレギュレーションの例。ＮＹ−ＢＲ１特異的ＣＡＲを安定的に発現するジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、野生型またはＧＦＰ発現カセットを有するＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶとともに、ＭＯＩ５０００で２４時間インキュベートした。ＣＡＲの発現を、ＧＦＰ導入遺伝子の発現に加えて、抗ヒトＩｇＧ  ＡＰＣ抗体を使用するＦＡＣＳによって検出した。
【図５】実験の経時変化の分析を、導入遺伝子およびＣＡＲの発現に関して、図４に示した。それぞれのＡＡＶ粒子は、経時的に培養培地中に存在した。実験は三反復で行い、エラーバーはＳＥＭを示す。
【図６】図４および５におけるような経時的なＣＡＲの発現のＦＡＣＳ分析であるが、ＡＡＶ粒子は、形質導入の４時間後に培養培地から除去した。実験は三反復で行い、エラーバーはＳＥＭを示す。
【図７】ＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲを発現するジャーカット細胞の活性化アッセイ。活性化マーカーＣＤ６９の発現レベルを、非形質導入細胞およびＰＭＡ−イオノマイシン刺激細胞と比べる、それぞれのＡＡＶ粒子によるＭＯＩ５０００で２４時間の形質導入後に、ＦＡＣＳによって測定した。
【図８】初代ヒトＣＤ３＋細胞（３人のドナー）におけるＣＡＲのダウンレギュレーションの例を、ＦＡＣＳ（図４におけるような実験条件）によって、およびＩＦＮガンマＥＬＩＳＡキットの使用による３人の異なるドナーのＴ細胞活性化の測定によって、評価した。
【図９】ＡＡＶ血清型と無関係のＣＡＲのダウンレギュレーションの例。挿入ＮＹ−ＢＲ１を、ＡＡＶ２における位置５８８で、ならびにＡＡＶ９およびＡＡＶ５における類似位置で、ならびにＡＡＶ８における類似位置の近位にある位置で示した。ＮＹ−ＢＲ１特異的ＣＡＲを安定的に発現するジャーカット細胞を、野生型ＡＡＶ２またはＧＦＰ発現カセットを有するＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶとともに、ＭＯＩ５０００で２４時間インキュベートした。ＣＡＲの発現を、抗ヒトＩｇＧ  ＡＰＣ抗体を使用するＦＡＣＳによって検出した。実験は三反復で行い、エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１０】ＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲの長さの変動の評価。ストレプトアビジン被覆ダイナビーズを、Ａ２０−ビオチンと連結し、続いて、各種の長さのＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲを示すＡＡＶの粗ライセートとともにインキュベーションした。可溶性ＣＡＲとの結合の定量化を、ＮＹ−ＢＲ１特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質および二次抗体の抗ｈｕ−ＩｇＧ−ＰＥを使用するＦＡＣＳ；無傷のＡＡＶ粒子のＥＬＩＳＡによって行った。ＡＡＶ特異的Ａ２０マウスハイブリドーマ上清をコーティングし、続いて、ＡＡＶ粗ライセートとともにインキュベーションした。次いで、ビオチンコンジュゲート化Ａ２０を添加し、続いて、ＳＴＡＶ−ＨＲＰコンジュゲートを添加した。ＤＡＢは、基質としての役割を果たし、ＯＤ４５０を測定した。
【表１】
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【図１１】ＣＡＲ  Ｔ細胞の添加の１０〜２０時間後からのＣＡＲが媒介する死滅の特異的阻害。ＮＹ−ＢＲ１を発現する初代乳がん細胞を、ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ  ＡＡＶ粒子ありまたはなしで、エフェクター対標的の比が１：１で、ＮＹ−ＢＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とともに共培養した（ＭＯＩ５０００）。標的細胞の生存率を、リアルタイムインピーダンス測定装置（ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ、ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）において記録し、ＳＥＭによる平均生存率として示す。
【図１２】一般的なＡＡＶ血清型のＶＰ１配列のアライメントを示す。複数の配列のアライメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａによって行い、ＭＶｉｅｗ  １．６３によって表示した。ＡＡＶ２における好ましい挿入点Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６は、太字および下線によって強調される。すべてのアライメントされた血清型は、互いにほぼ１００％の高い配列相同性の伸展、およびより低い相同性の伸展を示す。高い配列類似性によるアミノ酸伸展またはそのような伸展内の特定のアミノ酸の絶対アミノ酸位置が、異なる血清型の中で異なるという結果により、アライメント中にギャップも存在する。このように、例えば、ＡＡＶ２の絶対位置５８８でのアルギニン、すなわちＲ５８８（ＡＡＶ２  ＶＰ１の最初のＮ末端アミノ酸から数える場合）との類似位置でのＡＡＶのアミノ酸は、ＡＡＶ５における絶対アミノ酸位置Ｔ５７８、ＡＡＶ８における位置Ｔ５９１、ＡＡＶ９における位置Ａ５８９である。実施例６（図９を参照のこと）において試験されたＬＣＡＲ  ＮＹ−ＢＲ１についての実際の挿入点は、灰色の背景によって強調される。アライメントは、本発明の文脈において、すべての１７のアライメントされたＡＡＶ配列に基づくアデノ随伴ウイルス相同位置（ＡＡＨＰ）と称される、アミノ酸１〜７６１の番号付けを示す。例えば、ＡＡＶ２のＲ５８８は、ＡＡＨＰの６１４を有する。ＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲがＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９にそれぞれＣ末端で挿入された後のＶＰ１のアミノ酸を灰色矩形によって示す。したがって、ＡＡＨＰ  ＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲに関して、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９におけるＡＡＨＰ  ６１４のＣ末端、およびＡＡＶ８におけるＡＡＨＰ  ６１３のＣ末端で挿入された。
【図１３】ヘパリンの存在または非存在中、ＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲあり、およびなしで、ジャーカット細胞に結合する野生型およびＮＹＢＲ１  ＡＡＶの例。１Ｅ５キャプシド／細胞のＡＡＶをヘパリンとともにあらかじめインキュベートし、次いで、ジャーカット細胞を添加し、混合物を氷上で１時間インキュベートした。結合ＡＡＶを、ビオチンコンジュゲート化抗キャプシド抗体Ａ２０およびＳＴＡＶ−Ａｌｅｘａ４８８を用いる染色によって定量化した。Ａｌｅｘａ４８８陽性の生細胞をＦＡＣＳ分析によって検出した。実験は三反復で行い、エラーバーはＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列のリスト
配列番号１  ＡＡＶ血清型２のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２  ＡＡＶ血清型２のＶＰ２ウイルスコートタンパク質２
配列番号３  ＡＡＶ血清型２のＶＰ３ウイルスコートタンパク質３
配列番号４  ＡＡＶ２−ＮＹ−ＢＲ１のＶＰ１の配列
配列番号５  ＡＡＶ５−ＮＹ−ＢＲ１のＶＰ１の配列
配列番号６  ＡＡＶ８−ＮＹ−ＢＲ１のＶＰ１の配列
配列番号７  ＡＡＶ９−ＮＹ−ＢＲ１のＶＰ１の配列
配列番号８  挿入ＮＹＢＲ１＿２０の配列
配列番号９  挿入ＮＹＢＲ１の配列
配列番号１０  挿片ＮＹＢＲ１＿１−４の配列
配列番号１１  挿入ＮＹＢＲ１＿３−６の配列
配列番号１２  挿入ＮＹＢＲ１＿５−８の配列
配列番号１３  挿入ＮＹＢＲ１＿７−１０の配列
配列番号１４  挿入ＮＹＢＲ１＿９−１２の配列
配列番号１５  挿入ＮＹＢＲ１＿１１−１４の配列
配列番号１６  挿入ＮＹＢＲ１＿１−８の配列
配列番号１７  挿入ＮＹＢＲ１＿４−１１の配列
配列番号１８  挿入ＮＹＢＲ１＿７−１４の配列
配列番号１９  ＡＡＶ血清型１のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２０  ＡＡＶ血清型３ａのＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２１  ＡＡＶ血清型３ｂのＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２２  ＡＡＶ血清型４のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２３  ＡＡＶ血清型５のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２４  ＡＡＶ血清型６のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２５  ＡＡＶ血清型６．２のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２６  ＡＡＶ血清型７のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２７  ＡＡＶ血清型８のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２８  ＡＡＶ血清型９のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号２９  ＡＡＶ血清型１０のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号３０  ＡＡＶ血清型１１のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号３１  ＡＡＶ血清型１２のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号３２  ＡＡＶ血清型１３のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号３３  ＡＡＶ血清型ｒｈ１０のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
配列番号３４  ＡＡＶ血清型ｒｈ３２．３３のＶＰ１ウイルスコートタンパク質１
【００１３】
本発明を下記で詳細に記載する前に、本発明が、変更が存在し得る本明細書における記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語が、特定の実施形態のみを記載する目的であって、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、これが添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００１４】
いくつかの文献は、本明細書の文章を通して引用される。上記または下記のいずれかで、本明細書において引用されるそれぞれの文献（すべての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、使用説明書などを含む）は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明を理由として、そのような開示に先行する権利を与えられないことの自認として解釈されるべきではない。本明細書において引用されるいくつかの文献は、「参照によって組み込まれる」として特徴付けられる。そのように組み込まれた参照文献の定義または教示および本明細書において列挙された定義または教示の間に矛盾がある場合には、本明細書の文章が優先される。
【００１５】
以下において、本発明の要素を記載する。これらの要素は、特定の実施形態とともにリストされ、しかしながら、それらが追加の実施形態を作り出す任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。各種の記載された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記載された実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、開示の任意の数および／または好ましい要素を有する明確に記載された実施形態を組み合わせる実施形態を裏付け、かつ包含すると理解されるべきである。さらにまた、本出願におけるすべての記載された要素の任意の順列および組み合わせは、文脈が他を指示しない限り、本出願の説明による開示が考慮されるべきである。
【００１６】
定義
本発明を実施するために、他の指示がない限り、本分野における論文において説明される、化学、生化学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法が利用される（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照）。
【００１７】
以下において、この明細書において頻繁に使用されるいくつかの用語の定義を提供する。これらの用語は、その使用のそれぞれの例において、本明細書の残りの部分において、それぞれ定義された意味および好ましい意味を有する。
【００１８】
この明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を記述しない限り、複数形を含む。
【００１９】
本発明の文脈において使用される「ウイルスコートタンパク質」（ＶＣＰ）という用語は、ウイルスの構造ウイルスキャプシドタンパク質を指す。好ましくは、ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、二本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルスである。ＶＣＰは、ＶＰ１、ＶＰ２もしくはＶＰ３単独、または組み合わせなどのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の主要なキャプシドタンパク質を含むことができる。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、一緒に相互作用して、正２０面体対称を有する高次構造を形成する。
【００２０】
「ウイルス構造タンパク質」（ＶＳＰ）という用語は、本発明の文脈において、ウイルスコートタンパク質またはウイルスエンベロープ糖タンパク質を指すために使用される。
【００２１】
「ウイルスエンベロープ糖タンパク質」（ＶＥＧ）という用語は、本発明の文脈において、ウイルスエンベロープの部分であるウイルスタンパク質を指すために使用される。ウイルスエンベロープは、典型的には、宿主の細胞膜の部分に由来し、例えば、リン脂質を含み、加えて、例えば、ウイルスが免疫系を回避するのを助ける、ウイルスの糖タンパク質を含む。エンベロープウイルスは、ＤＮＡウイルス、特に、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびヘパドナウイルス；ＲＮＡウイルス、特に、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、Ｄ型肝炎、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルスおよびレトロウイルスを含む。したがって、ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、好ましくは、これらのウイルスのいずれかに由来する。
【００２２】
本発明の文脈において使用される「キャプシド（Ｃａｐｓｉｄ）」または「キャプシド（Ｃａｐｓｉｄｅｓ）」という用語は、一種類のみ、または二種類、三種類もしくはそれ以上の異なる種類のＶＣＰの多量体と非共有結合した一重または二重のタンパク質殻の三次元構造を指す。ＶＣＰは自己アセンブルしてキャプシドを形成する。通常、ウイルスキャプシドの自己アセンブリーは、以下の２つの基本的なパターンに従う：タンパク質のサブユニットおよび核酸がらせん状に配置される、らせん対称、ならびにタンパク質のサブユニットがアセンブルして、核酸含有コアを覆う対称な殻になる、正２０面体対称。
【００２３】
本明細書において使用される「キャプソメア構造」という用語は、ＶＣＰが由来する特定のウイルスに応じて、一種類のみ、または二種類、三種類もしくはそれ以上の異なる種類のＶＣＰを形成する構造を指す。アデノウイルスのコートは、例えば、ヘキソン、ペントンおよび線維の３つのコートタンパク質を含む。しかしながら、ペントン単独は、独立して発現する場合、キャプソメア構造を形成する能力がある。ＡＡＶのコートは、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の３つのコートタンパク質を含む。しかしながら、ＶＰ３単独は、独立して発現する場合、キャプソメア構造を形成する能力がある。それにもかかわらず、キャプソメア構造は、細胞表面に結合することができ、それらが結合する細胞によって内部移行することができる。キャプソメア構造は、天然に存在していてもよく、または人工物であってもよい。典型的には、キャプソメア構造は、ウイルス核酸を含まず、したがって、非感染性である。
【００２４】
「ベクター」という用語は、本発明の文脈において、適した宿主または標的細胞に、例えば、目的とする遺伝子産物またはＲＮＡ、特に、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むポリヌクレオチド、あるいは目的のタンパク質を輸送するために使用することができるポリヌクレオチドあるいは１つもしくは複数のタンパク質またはその混合物を指すために使用される。ベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が挙げられる。ベクターは、宿主細胞中でベクターの自己複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有していてもよい。外来ＤＮＡは、異種ＤＮＡとして定義され、これは、例えば、ベクター分子を複製するか、選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーをコードするか、または導入遺伝子をコードする、宿主細胞において天然に見出されないＤＮＡである。宿主細胞に入ると、ベクターは、宿主の染色体ＤＮＡと独立してまたは同時に複製され得、ベクターのいくつかのコピーおよびその挿入されたＤＮＡを生じることができる。加えて、ベクターは、ｍＲＮＡ分子に挿入されたＤＮＡの転写を可能にするか、またはそうでなければ複数のＲＮＡのコピーに挿入されたＤＮＡの複製を引き起こす、必要なエレメントを含有することもできる。ベクターは、目的の遺伝子の発現を制御する「発現制御配列」をさらに包含していてもよい。典型的には、発現制御配列は、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターまたはリプレッサーを含む。目的の１つまたは複数の遺伝子産物をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は、１つまたは複数の発現制御配列によって、一緒にまたは別々に制御されてもよい。より詳細には、ベクターに含まれるそれぞれのポリヌクレオチドは別々の発現制御配列によって制御されてもよく、またはベクターに含まれるすべてのポリヌクレオチドは単一の発現制御配列によって制御されてもよい。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクターに含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成してもよい。いくつかの発現ベクターは、発現したｍＲＮＡの半減期を増加させるか、および／またはタンパク質分子へのｍＲＮＡの翻訳を可能にする、挿入されたＤＮＡに隣接する配列エレメントを追加で含有する。挿入されたＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡおよびポリヌクレオチドの多くの分子は、このようにして迅速に合成され得る。
【００２５】
本発明の文脈において使用される「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドまたは所与のタンパク質を標的細胞に導入するために改変されるウイルスを指す。本発明の文脈において、ウイルスベクターの使用が好ましい。
【００２６】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ポリヌクレオチドを含まないが、他のウイルスの性質、例えば、細胞表面受容体と結合する、受容体によって内部移行する、血液中で安定である、および／または糖タンパク質を含むなどを有する、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰおよび／またはＶＥＰの多量体である。ＶＬＰは、典型的には、ＶＣＰおよび／またはＶＥＰ、特にＶＣＰの多量体がアセンブルされたものである。ＶＬＰは、当技術分野において周知であり、パルボビリダエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロビリダエ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ）、フラビビリダエ（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）およびバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含む多くのウイルスから生産される。
【００２７】
本発明の文脈において使用される「ＶＰ１」、「ＶＰ２」および「ＶＰ３」という用語は、ＶＣＰ  ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を指す。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、自己アセンブルして、Ｔ＝１の対称性、約２２ｎｍの直径を有する正２０面体キャプシドを形成する、好ましくは、ＡＡＶのウイルスキャプシドタンパク質である。好ましくは、このようにアセンブルされたキャプシドは、例えば、アデノ随伴ウイルス血清型２由来の、１：１：１０の比でＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の３つのサイズの変異体の６０コピーからなる。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のキャプシドタンパク質の３つのサイズの変異体は、それらのＮ末端で異なる、すなわち、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ１のトランケート型である。キャプシドは、ウイルスに応じて、一本鎖もしくは二本鎖の、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを封入する。天然に存在するＡＡＶにおいて、キャプシドは、一本鎖ＤＮＡを封入する。
【００２８】
ＡＡＶキャプシドタンパク質は、宿主細胞のヘパラン硫酸プロテオグリカンと結合し、αＶβ５インテグリンなどの宿主の共受容体を使用して、標的細胞へのビリオンの付着をもたらす。この付着は、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介してビリオンの内部移行を主に誘導する。宿主の受容体への結合は、ＶＰ１のＮ末端、特に、そのホスホリパーゼＡ２様領域および推定核局在化シグナルの表面露出をもたらすキャプシドの再構成も誘導する。ＶＰ１のＮ末端は、宿主細胞への侵入の間に、エンドソーム膜を破壊する脂肪分解酵素として機能する可能性があり、ウイルスの核への輸送に寄与する可能性がある。
【００２９】
本明細書において使用される「ウイルス」という用語は、小さな偏性細胞内寄生体を指し、これは、定義によって、保護タンパク質コート、すなわちキャプシドによって取り囲まれたＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを含有する。ウイルスのゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡからなっていてもよく、これは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）の、鎖状または環状であってもよい。全ゲノムは、１つの核酸分子（一分節ゲノム）またはいくつかの核酸セグメント（多分節ゲノム）のいずれかを占有し得る。ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくは、ミオビリダエ（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホビリダエ（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドビリダエ（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスビリダエ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アデノビリダエ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロビリダエ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマビリダエ（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナビリダエ（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマビリダエ（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスビリダエ（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくは、アネロビリダエ（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノビリダエ（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボビリダエ；二本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくは、レオビリダエ（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくは、コロナビリダエ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナビリダエ（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシビリダエ（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガビリダエ（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビビリダエ、アストロビリダエ（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリビリダエ（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘペビリダエ（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）；マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくは、アレナビリダエ（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロビリダエ（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソビリダエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドビリダエ（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤビリダエ（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソビリダエ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナビリダエ（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくは、レトロビリダエ；二本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくは、カリモビリダエ（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナビリダエ（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）を含み得る。
【００３０】
「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、パルボウイルス、エリスロウイルス、ディペンドウイルス、アムドウイルスおよびボカウイルスを含むパルボビリナエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）のファミリー、ならびにデンソウイルス、イテラウイルス、ブレビデンソウイルス、ペフデンソウイルス、コントラウイルスを含むデンソビリナエ（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎｉａｅ）のファミリーに細分化することができるいくつかの属を含む、パルボビリダエのファミリーに属するウイルスを指す。ＡＡＶのユニークなライフサイクル、ならびに非分裂細胞および分裂細胞の両方に持続的な発現で感染するその能力は、ＡＡＶを魅力的なベクターにした。野生型ウイルスの追加の魅力的な特徴は、明らかな病原性の欠如である。
【００３１】
本発明の文脈において使用される「特異的に結合する」という用語は、リガンドが、任意の他の標的に対するよりも、より高い親和性でそのそれぞれの標的に結合することを意味する。リガンドは、それらの標的に対してある特定の親和性で結合し、そのそれぞれの標的、例えば、受容体タンパク質へのリガンドの結合は、典型的には、生物学的効果をもたらす。好ましくは、その標的へのリガンドの結合は、特異的、および好ましくは、１０−７未満、１０−８、１０−９、１０−１０またはそれ以下のＫｄを有する高親和性の両方である。このような親和性は、好ましくは、３７℃で測定される。適したアッセイとしては、表面プラズモン共鳴測定（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）、水晶振動子微量天秤測定（例えば、Ａｔｔａｎａ）、および競合アッセイが挙げられる。
【００３２】
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ；キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体としても公知）という用語は、免疫エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞上に任意に特異的に移植された、遺伝子操作された受容体を指す。細胞は、ＣＡＲを遺伝子学的に備え、これは、複合膜受容体分子であり、特異的な標的化およびＴ細胞活性化の両方を提供する。ＣＡＲの最も一般的な形態は、ＣＤ３膜貫通ドメインおよびエンドドメインと融合した、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物である。ＣＡＲは、細胞外部分における抗体由来結合ドメインを通して所望の細胞標的に対してＴ細胞を標的化し、Ｔ細胞活性化は、標的が遭遇したときに、細胞内部分のシグナル伝達ドメインを介して起こる。適した細胞、特に、Ｔ細胞へのこれらの受容体のコード配列の導入は、一般に、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって促進される。受容体は、これらが異なる起源からの部分で構成されるので、キメラと呼ばれる。
【００３３】
本発明の文脈における「キメラ抗原受容体に対するリガンド」（ＬＣＡＲ）という用語は、好ましくは、ＣＡＲが特異的に結合する、少なくとも１つ、２つ、３つもしくはそれ以上のＴＳＥＡの表面に露出したエピトープを含むか、実質的に含むか、またはからなるポリペプチド、あるいはＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ特異的抗体、特に、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合することができるポリペプチドを指す。ＬＣＡＲは、典型的には、ＣＡＲ細胞療法によって標的にされる標的細胞の表面上に到達可能な立体構造エピトープもしくは非立体構造エピトープを形成する、タンパク質または糖タンパク質の部分である。ＣＡＲ療法は、主に、腫瘍疾患に対して標的化されるので、ＬＣＡＲは、好ましくは、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原の１つもしくは複数のエピトープを含む。ポリペプチドは、ＶＳＰ、特に、ＶＣＰまたはＶＥＰに挿入され得る。さらに、ＬＣＡＲのそのＣＡＲへの結合は、細胞表面上のＣＡＲの一時的な利用不可能性という結果をもたらす。ＣＡＲはしばしばｓｃＦｖを含むので、ＬＣＡＲの長さは、好ましくは、少なくともＢ細胞エピトープの長さである。好ましい実施形態において、ＬＣＡＲは、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含まないが、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとの複合体中でＴ細胞応答のみを誘発する。当業者は、所与のタンパク質が、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ提示の文脈において、Ｔ細胞応答を誘発する能力があるか否かを評価する方法を十分に承知している。これらの方法としては、インシリコＴ細胞エピトープ予測（例えば、Desai DV and Kulkarni-Kale U (2014) Methods Mol. Biol. 1184:3333-364およびKosaloglu et al., (2016) Oncoimmunologyを参照のこと）およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色または四量体／五量体の染色と続くフローサイトメトリー等の技術が挙げられる。この方法において、本発明のウイルスに対する望ましくないＴ細胞応答が防止されるので、ＬＣＡＲは、Ｔ細胞免疫応答を誘発しないことが好ましい。ＬＣＡＲは、Ｂ細胞応答を誘発しないことがさらに好ましい。ＣＡＲは、１つまたは複数のＴＳＥＡに特異的に結合する単鎖抗体を含むが、ＬＣＡＲは、ＣＡＲに特異的に結合する能力がある限り、Ｂ細胞応答を誘発する能力があってはならない、すなわち、免疫原性であってはならない。このように、Ｔ細胞応答もＢ細胞応答も誘発しないＬＣＡＲは、患者に投与されたときに、本発明のウイルスに対する望ましくない免疫応答を回避するので、特に好ましい。
【００３４】
「腫瘍表面露出抗原」（ＴＳＥＡ）という用語は、典型的には、胎児組織およびがん体細胞においてのみ発現する、がん胎児遺伝子の産物；腫瘍形成性形質転換ウイルスによってコードされる、がんウイルス遺伝子の産物；新生物において非常に上昇した発現のレベルで、正常および新生物の組織の両方によって発現する、過剰発現／蓄積した遺伝子の産物；がん細胞ならびに精巣および胎盤などの成人の生殖組織によってのみ発現する、がん−精巣遺伝子の産物；単一のがん組織型によって大部分が発現する、系統制限遺伝子の産物；遺伝子突然変異または転写における変化の結果として、がんによってのみ発現する、突然変異した遺伝子の産物、ならびに、例えば、糖タンパク質中の腫瘍関連変化を含む、翻訳後に変化した産物；あるいは、高度に多型であり、かつ腫瘍細胞が、例えば、クローン異常性からもたらされるＢ細胞またはＴ細胞リンパ腫／白血病におけるような、特異的な「クローン型」を発現する場合、イディオタイプ遺伝子の産物を指し、これは、腫瘍細胞の表面上に存在するエピトープを含む。好ましくは、ＴＳＥＡは、腫瘍細胞において、優先的または排他的に発現する。ＣＡＲ療法の標的である、これらの腫瘍表面露出抗原が好ましい。好ましくは、このような抗原は、タンパク質または糖タンパク質である。ＴＳＥＡの上記の定義は、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原の両方を包含する。免疫系の細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＣＡＲで改変された免疫細胞、特に、ＣＡＲ  Ｔ細胞、または抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧもしくはＩｇＥが、腫瘍細胞の表面上のＴＳＥＡのエピトープに結合することによってＴＳＥＡに特異的に結合することができる場合、エピトープは、腫瘍細胞の表面上に存在するか、または「露出」される。
【００３５】
抗原決定基としても公知の「エピトープ」は、本発明の文脈において、免疫系によって、特に、抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識される巨大分子のセグメントを指すために使用される。このようなエピトープは、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合する能力がある巨大分子の部分またはセグメントである。この文脈において、「結合する」という用語は、好ましくは、特異的に結合することに関する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面の集団からなり、通常、特異的な三次元構造特性、および特異的な電荷特性を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、前者は結合するが、後者は変性溶媒の存在中で失われる点で区別される。エピトープは、それ自身において免疫原性であってもよく、例えば、Ｂ細胞応答を引き起こしてもよく、または抗体に特異的に結合する能力だけを有していてもよい。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「立体構造エピトープ」は、前記巨大分子の三次元構造によって形成される鎖状の巨大分子（例えば、ポリペプチド）のエピトープを指す。本出願の文脈において、「立体構造エピトープ」は、「非連続性エピトープ」、すなわち巨大分子（例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列）の一次配列中の少なくとも２つの別々の領域から形成される巨大分子（例えば、ポリペプチド）上の立体構造エピトープである。言い換えれば、エピトープが、ＣＡＲ、例えば、抗体、単鎖抗体またはその抗原結合フラグメントの特異的に結合する部分が同時に結合する一次配列中の少なくとも２つの別々の領域からなる場合、エピトープは、本発明の文脈における「立体構造エピトープ」であると考えられ、ここで、これらの少なくとも２つの別々の領域は、ＣＡＲの特異的に結合する部分が結合しない一次配列中の１つまたは複数の領域によって中断される。特に、このような「立体構造エピトープ」は、ポリペプチド上に存在し、一時配列中の２つの別々の領域は、ＣＡＲの特異的に結合する部分が結合する２つの別々のアミノ酸配列である。
【００３７】
「特異的に結合する」という用語は、結合ペアのメンバーがより高い親和性で、他の結合パートナーよりもその結合パートナーと相互作用するという事実を指す。２つの結合パートナーの間の「結合親和性」は、分子（例えば、ＣＡＲ）およびその結合パートナー（例えば、ＬＣＡＲ）の単一の結合部位の間の非共有結合的相互作用の合計の強度によって決定される。他に指示しない限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸとそのパートナーＹについての親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。「特異的に結合する」とは、結合部分（例えば、抗体）が、別の標的への結合と比べて、特異的であるエピトープなどの標的により強く結合することを意味する。結合部分は、それが、第２の標的に対する解離定数よりも低い解離定数（Ｋｄ）を有する第１の標的と結合する場合、第２の標的と比べて、第１の標的により強く結合する。結合部分が特異的に結合する標的に対する解離定数（Ｋｄ）は、結合部分が特異的に結合しない標的に対する解離定数（Ｋｄ）よりも、１０倍超、好ましくは２０倍超、より好ましくは５０倍超、さらにより好ましくは１００倍超、２００倍、５００倍または１０００倍より低い。
【００３８】
したがって、「Ｋｄ」（「モル／Ｌ」で測定され、時折「Ｍ」と略される）という用語は、結合部分（例えば、抗体またはそのフラグメント）および標的分子（例えば、抗原またはそのエピトープ）の間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すことを意図する。親和性は、限定されないが、表面プラズモン共鳴系アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；水晶振動子微量天秤アッセイ（Ａｔｔａｎａアッセイなど）；酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ’ｓ）を含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は、一般に、ゆっくりと抗原と結合し、直ちに解離する傾向があるが、高親和性の抗体は、一般に、抗原により素早く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定するさまざまな方法は、当技術分野において公知であり、このいずれかは、本発明の目的のために使用することができる。
【００３９】
好ましくは、本発明のＶＳＰは、特に、アセンブルして本発明のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスになる場合、特にＣＡＲがＴ細胞上で発現するなら、エンドサイトーシス、したがって、Ｔ細胞上のＣＡＲの細胞濃度の低減を可能にする結合親和性で、ＣＡＲに結合する。この性質は、そのＶＳＰがアセンブルして、特に、本発明のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスになる場合、本発明のそれぞれのＶＳＰ、および所与のＣＡＲ、すなわち、特異的に結合するＣＡＲについて、実施例における教示に従うことによって、試験することができる。好ましくは、本発明のＶＳＰがアセンブルして、特に、本発明のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスになる場合、本発明のＶＳＰと、特異的に結合するＣＡＲとの間の親和性（Ｋｄ）は、１０μＭ〜１ｐＭの間、好ましくは、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１ｐＭより低い。
【００４０】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合で連結された鎖を指す。本発明において使用可能なタンパク質（タンパク質誘導体、タンパク質変異体、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む）は、化学修飾によってさらに修飾され得る。これは、このような化学修飾されたポリペプチドが、２０の天然に存在するアミノ酸以外の他の化学基を含むことを意味する。このような他の化学基の例としては、限定されないが、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸が挙げられる。ポリペプチドの化学修飾は、親のポリペプチドと比べて、有利な性質、例えば、増強された安定性、増加した生物学的半減期または増加した水溶解度の１つまたは複数を提供し得る。
【００４１】
「アミノ酸」という用語は、一般に、置換または無置換のアミノ基、置換または無置換のカルボキシ基、および１つもしくは複数の側鎖または基、あるいはこれらの基の任意のアナログを含む、任意のモノマー単位を指す。例示的な側鎖としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。他の代表的なアミノ酸としては、限定されるものではないが、光で活性化可能な架橋を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化および／または光異性化可能なアミノ酸、放射活性アミノ酸、ビオチンまたはビオチンアナログを含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物で修飾されたアミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子で置換あれたアミノ酸、化学的に開裂可能および／または光開裂可能なアミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、酸化還元活性なアミノ酸、アミノ酸を含有するアミノチオ酸、ならびに１つまたは複数の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、以下の２０の天然または遺伝子学的にコードされるアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合において、これらは、「任意のアミノ酸」として定義するものとする。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステインおよびピロールリジンなどの追加のアミノ酸も、遺伝子学的にコードされ得る（Stadtman (1996) "Selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100およびIbba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine," Curr Biol. 12(13):R464-R466）。「アミノ酸」という用語は、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、修飾された側鎖および／または主鎖を有する）およびアミノ酸アナログも含む。例えば、Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887、Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571、Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706、Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967、James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991、Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315、Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425、Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328、およびBudisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7):1281-1292を参照のこと。アミノ酸は、まとめてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質にされ得る。
【００４２】
本出願の文脈において称される「挿入部位」という用語は、ＬＣＡＲポリペプチド配列が挿入されるそれぞれのＶＣＰ中の正確なアミノ酸位置を意味し、例えば、挿入されたアミノ酸配列は、構造のＶＣＰの２つの所与のアミノ酸の間に単純に挿入され得、ＶＣＰの元のアミノ酸配列へのアミノ酸の追加をもたらす。異なるシナリオは、元のＶＣＰアミノ酸配列中に存在するアミノ酸の欠失などの２つの所与のアミノ酸の間にポリペプチド配列を挿入することによって付随して起こる場合があり、ＶＣＰの所与のアミノ酸の完全な置換または部分的な置換をもたらす。
【００４３】
「変異体」という用語は、その長さまたは配列における１つもしくは複数の変化によって誘導されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの比較において異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドとして理解されるべきである。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド変異体が誘導されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドとしても公知である。「変異体」という用語は、親分子の「フラグメント」または「誘導体」を含む。典型的には、「フラグメント」は、親分子よりも長さまたはサイズが小さい一方で、「誘導体」は、親分子と比較して、それらの配列中に１つまたは複数の相違を示す。限定されないが、翻訳後に修飾されたタンパク質（例えば、グリコシル化、ビオチニル化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化またはタンパク質分解的に切断されたタンパク質）などの修飾分子、およびメチル化ＤＮＡなどの修飾された核酸も包含される。また、限定されないが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドなどの異なる分子の混合物も、「変異体」という用語に包含される。典型的には、変異体は、好ましくは、遺伝子工学的手段によって、人工的に構築される一方で、親タンパク質または親ポリヌクレオチドは、野生型のタンパク質もしくはポリヌクレオチド、またはそのコンセンサス配列である。しかしながら、天然に存在する変異体も、本明細書において使用される「変異体」という用語によって包含されることが理解されるべきである。さらに、本発明において使用可能な変異体はまた、変異体が、親分子の少なくとも１つの生物学的活性、すなわち、機能的活性を示すならば、親分子のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に構築された変異体に由来するものであってもよい。
【００４４】
特に、「ペプチド変異体」、「ポリペプチド変異体」、「タンパク質変異体」という用語は、アミノ酸配列中の１つもしくは複数の変化によって誘導される、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と比較して相違する、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質として理解されるべきである。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変異体が由来する、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質としても公知である。さらに、本発明において使用可能な変異体はまた、変異体が、親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示すならば、親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に構築された変異体に由来するものであってもよい。アミノ酸配列中の変化は、アミノ酸の交換、挿入、欠失、Ｎ末端トランケーションもしくはＣ末端トランケーション、またはこれらの変化の任意の組み合わせであってもよく、これは、１つまたは複数の部位で起こってもよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変異体は、総数が最大で６０まで（最大で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０まで）のアミノ酸配列中の変化（すなわち、交換、挿入、欠失、Ｎ末端トランケーションおよび／またはＣ末端トランケーション）を示してもよい。アミノ酸交換は、保存的および／または非保存的であってもよい。あるいは、または加えて、本明細書において使用される「変異体」は、それが誘導された親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質に対する配列同一性のある特定の程度によって特徴付けることができる。より正確には、本発明の文脈における変異体は、参照ポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す。好ましくは、本発明の変異体は、示された配列同一性を示し、好ましくは、配列同一性は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０、またはそれ以上のアミノ酸の連続する伸展におよぶ。最も好ましくは、示された同一性は、２つのアミノ酸、すなわち、参照アミノ酸およびその同一性について評価されるアミノ酸の間のアライメントの長さ全体にわたって決定される。このようなアミノ酸配列のアライメントは、いくつかの当技術分野において公知のアルゴリズム、好ましくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877）を用いて、ｈｍｍａｌｉｇｎ（HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/）を用いて、または例えば、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlもしくはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlにおいて利用可能なＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80）を用いて、行うことができる。使用される好ましいパラメーターは、それらがhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlにおける設定であるので、デフォルトのパラメーターである。配列同一性（配列のマッチング）のグレードは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算してもよい。好ましくは、配列マッチング解析は、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62）のような確立された相同性マッピング技術、またはマルコフ確率場によって補ってもよい。配列同一性のパーセンテージが本出願において言及される場合、これらのパーセンテージは、特に他の指示がなければ、より長い配列の全長に対して計算される。
【００４５】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたる２つの最適にアライメントされた配列を比べることによって決定され、比較ウィンドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチする位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で割り、配列同一性のパーセンテージを得るために結果に１００を掛けることによって、計算される。
【００４６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」という用語は、同じ、すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸の同じ配列を含む、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。上記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、もしくは手動のアライメントおよび目視検査によって測定された、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたる最大の対応関係について比較およびアライメントされる場合、それらが、同じ（例えば、特定の領域にわたって、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性）であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する場合、配列は、互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた、試験配列の補完を指す。したがって、「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の比較に関して、本明細書全体にわたって使用される。この表現は、好ましくは、それぞれの参照ポリペプチドまたはそれぞれの参照ポリヌクレオチドに対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を指す。
【００４７】
本発明の文脈において使用されるＶＳＰの「類似位置」という用語は、２つのタンパク質が、アライメントアルゴリズムを使用することによってアライメントされる場合、すなわち、互いにアライメントさせるか、または同じ相対位置を有するアミノ酸の近位にある、別の参照ＶＳＰとＶＳＰ内の同じ相対位置であるアミノ酸を指す。一般に使用されるアライメントアルゴリズムは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブサイト（https://www.ebi.ac.uk /Tools/msa/clustalo/）で公開アクセス可能なＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａである。特に、同じ種、例えば、アデノ随伴ウイルスのウイルスの関連するＶＳＰは、典型的には、高い伸展および低い配列相同性を示す。配列の変動の程度は、典型的には、それぞれの配列がタンパク質のために必須であるか、またはそうではないかに依存する。このように、ＡＡＶ２のＶＰ１が、参照ＶＳＰとして使用され、かつ１つまたは複数の他のＡＡＶ  ＶＳＰが、ＡＡＶ２のＶＰ１とアライメントされる場合、当業者は、他のＡＡＶのＶＰ１と、所与のＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸の類似位置を容易に決定することができる。これは、１７の異なるＡＡＶ血清型のアライメントを示し、本発明の文脈において、ＬＣＡＲの挿入のために特に適していると教示される、太字および下線によってＡＡＶ２のいくつかのアミノ酸を強調する、図１２において例示的に実証される。ＡＡＶ２の強調されたアミノ酸を有するアミノ酸のアライメントは、類似位置である。ＡＡＶ  ＶＰ１タンパク質に関して、アデノ随伴ウイルス相同位置（ＡＡＨＰ）は、ＡＡＶ  ＶＰ１内の挿入点を指すためにも使用される。ＡＡＨＰは、ギャップを含むアライメント全体の長さに基づいて、アライメントされたアミノ酸に与えられる数である。例えば、図１２において、ＡＡＶ２のＲ５８８は、ＡＡＨＰの６１４を有する。この定義に好ましく含まれる近位の位置は、同じ相対位置を有するアミノ酸位置に対して、アミノ酸Ｎ末端の位置１もしくは２、またはアミノ酸Ｃ末端の位置１もしくは２でのアミノ酸であり、例えば、ＡＡＶ８のＮ５９０は、ＡＡＶ８のＴ５９１の近位にあり、したがって、好ましい実施形態において、ＡＡＶ２のＲ５８８（ＡＡＶ８のＴ５９１、ＡＡＶ５のＴ５７８、およびＡＡＶ９のＡ５８９とアライメントされる）に対する類似位置でも考慮される。
【００４８】
本明細書において使用される「フラグメント」という用語は、天然に存在するフラグメント（例えば、スプライス変異体）、および人工的に構築されたフラグメント、特に、遺伝子工学的手段によって得られるものを指す。典型的には、「フラグメント」は、親分子よりも長さまたはサイズが小さい。「フラグメント」は、親分子よりもサイズおよび長さが小さいペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の部分を指すが、これは、タンパク質が示す元の特徴の原因となる必須のアミノ酸の配列または複数の配列から依然としてなるので、親タンパク質と同じように依然として機能する。言い換えれば、フラグメントは、その標的に特異的に結合する能力を保持している。「フラグメント」という用語は、フラグメントが、親ポリペプチド、親ペプチドまたは親タンパク質と、好ましくは、そのＮ末端、そのＮおよびＣ末端、またはそのＣ末端と比べて、そのＮ末端および／またはそのＣ末端および／または内部で、最大で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個のアミノ酸の欠失を有するものとして理解することもできる。
【００４９】
本発明の文脈において使用される「抗原」という用語は、免疫応答の分子、例えば、抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などによって認識される任意の構造を指す。抗原は、身体に対して外来もしくは毒性であってもよく、または特定の疾患に関連する細胞タンパク質であってもよい。抗原は、適応免疫系の高度に可変性の抗原受容体（Ｂ細胞受容体またはＴ細胞受容体）によって認識され、体液性または細胞性免疫応答を誘発し得る。このような応答を誘発する抗原は、免疫原性とも称される。細胞内側のタンパク質の画分は、それらが外来または細胞性であるか否かに関わらず、より小さなペプチドにプロセシングされ、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される。細胞性免疫応答は、小さなペプチドフラグメントがＴ細胞受容体に結合すると、誘発される。細胞表面抗原は、サイトカイン受容体、インテグリン、細胞接着分子、細胞型特異的細胞表面抗原、組織特異的細胞表面抗原、細胞表面で発現する腫瘍関連抗原、腫瘍抗原、一群の分化抗原、または炭水化物の群から選択することができる。
【００５０】
「単鎖抗体」という用語は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）という用語と互換可能に使用され、通常、標的への特異的な結合を促進するポリペプチドである、標的特異的結合ドメインを指す。このような標的特異的結合ドメインの結合は、それが、最も高い親和性でそれぞれの標的に結合し、かつより低い親和性、例えば、少なくとも１０倍低い、好ましくは、少なくとも１００倍低い親和性で、他の標的に、さらに関連するアミノ酸配列を有する標的にのみ結合する場合、所与の標的に対して特異的と考えられる。ｓｃＦｖは、実際には、抗体のフラグメントではないが、軽鎖可変ドメインに短いリンカーペプチドを介して接合された重鎖可変ドメインを含むことが意図される（Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883）。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシン、および溶解性のためにセリンまたはトレオニンがリッチであり、ＶＬのＣ末端で、ＶＨのＮ末端と、どちらかが連結され得、または逆も同様である。このタンパク質は、定常領域およびリンカーの導入の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００５１】
「単鎖抗体様タンパク質」という用語は、遺伝子操作されて（例えば、ループの突然変異誘発によって）、標的分子に特異的に結合するｓｃＦｖタンパク質を指す。典型的には、このような抗体様タンパク質は、タンパク質のスキャフォールドに両端で付着した少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的拘束は、抗体のものと同等のレベルに抗体様タンパク質の結合親和性を大きく増加させる。可変ペプチドループの長さは、典型的には、１０〜２０個のアミノ酸からなる。スキャフォールドタンパク質は、良好な溶解性を有する任意のタンパク質であり得る。好ましくは、スキャフォールドタンパク質は、小さな球状タンパク質である。抗体様タンパク質としては、限定されないが、アフィボディ、アンチカリンおよび設計されたアンキリン反復タンパク質が挙げられる（概説について、Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from non-immunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268を参照のこと）。抗体様タンパク質は、突然変異体、例えば、大きなファージディスプレイライブラリーからパニングし、普通の抗体との類似性で単離することができる突然変異体の大きなライブラリーに由来し得る。また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質において表面に露出した残基のコンビナトリアル突然変異誘発によって得ることができる。抗体様タンパク質は、「ペプチドアプタマー」と称されることもある。
【００５２】
本明細書において使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、すべての公知の生命体のために必須の、ポリマーもしくはオリゴマーの巨大分子、または大きな生物学的分子を含む。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含む、核酸は、ヌクレオチドとして公知のモノマーから作られる。最も天然に存在するＤＮＡ分子は、二重らせんを形成するために互いにコイル状に巻かれた２つの相補的な生体高分子鎖からなる。ＤＮＡ鎖は、ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドとしても公知である。それぞれのヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基、およびデオキシリボースまたはリボースと呼ばれる単糖、およびホスフェート基で構成される。天然に存在する核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの糖および次のホスフェートの間の共有結合によって鎖で互いに接合され、交互の糖−ホスフェート骨格をもたらす。糖がデオキシリボース（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）である場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースである場合、ポリマーはＲＮＡである。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチドモノマーの間のホスホジエステル結合によって形成される。本発明の文脈において、「核酸」という用語は、限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（一本鎖内）などのこれらの混合物、ならびにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む。核酸は、遺伝子全体またはその一部からなっていてもよく、核酸はまた、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよい。ＭｉＲＮＡは、短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり、これは、平均で２２ヌクレオチド長であるが、より長くてもよく、すべての真核細胞、すなわち、植物、動物、およびいくつかのウイルスにおいて見出され、転写および転写後の遺伝子発現の制御において機能する。ＭｉＲＮＡは、標的のメッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）に対して相補的な配列に結合する転写後の制御因子であり、通常、翻訳抑制および遺伝子サイレンシングをもたらす。短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても公知であることがある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、２０〜２５個の間のヌクレオチドの長さの短いリボ核酸（ＲＮＡ分子）である。これらは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、これらは、特異的な遺伝子の発現を妨げる。短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる、タイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。細胞中でのｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドのデリバリーによって、またはウイルスベクターもしくは細菌ベクターによって達成される。ＰｉＲＮＡは、通常、２６〜３１個のヌクレオチドを含み、それらの名称は、それらが結合している、いわゆるｐｉｗｉタンパク質に由来する、短いＲＮＡでもある。核酸はまた、人工核酸であり得る。人工核酸としては、ポリアミドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。これらのそれぞれは、分子の主鎖に対する変化によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。例えば、核酸は、例えば、ホスホトリエステル法（例えば、Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584を参照のこと）に従って、化学的に合成することができる。
【００５３】
「免疫応答」という用語は、抗原ならびに適応免疫系の分子および／または細胞の反応によって引き起こされる免疫系の反応を指す。このような免疫応答は、体液性免疫応答または細胞性免疫応答のいずれかであってもよい。体液性免疫応答は、Ｂ細胞エピトープによって誘発され、細胞性免疫応答は、Ｔ細胞エピトープによって誘発される。
【００５４】
疾患もしくは障害の「処置する」、「処置すること」、「処置」または「治療」という用語は、以下の１つまたは複数を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度を低減させること；（ｂ）処置される障害の症状特性の発生を制限または防止すること；（ｃ）処置される障害の症状特性の悪化を阻止すること；（ｄ）以前に有していた障害を有する個体における障害の再発を制限または防止すること；および（ｅ）以前に障害についての症状を示していた個体における症状の再発を制限または防止すること。したがって、治療効果を有する部分は、上記の指定された効果（ａ）〜（ｅ）の１つまたは複数を達成することによって、疾患または障害の症状を処置する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、疾患もしくは障害の「防止する」、「防止すること」、「防止」または「予防」は、患者において生じるこのような疾患もしくは障害または副作用を防止することを意味する。
【００５６】
「腫瘍崩壊症候群」（ＴＬＳ）という用語は、迅速な細胞死をもたらすがん代謝の緊急事態を指す。腫瘍崩壊症候群は、腫瘍標的化治療の結果として、または自発的に、生じ得る。代謝異常のグループは、がんの処置の間の合併症として生じ得、大量の腫瘍細胞が、処置によって同時に全滅され（可溶化）、それらの内容物が血流に放出される。これは、最も一般的には、リンパ腫および白血病の処置の後に生じる。腫瘍崩壊症候群は、高血中カリウム（高カリウム血症）、高い血中リン（高リン血症）、低い血中カルシウム（低カルシウム血症）、高い血中尿酸（高尿酸血症）、ならびに正常よりも高い血中尿素窒素および他の窒素含有化合物のレベルによって特徴付けられる。血中の電解質および代謝産物におけるこれらの変化は、細胞の破壊から血流への死んだ細胞の細胞内容物の放出の結果である。ＴＬＳにおいて、破壊は、細胞傷害性療法の後、または高い細胞回転および腫瘍増殖速度を有するがんから生じる。腫瘍崩壊症候群において見られる代謝異常は、最終的に、悪心および嘔吐をもたらし得るが、より深刻には、急性尿酸腎症、急性腎不全、発作、心不整脈および死亡をもたらし得る。
【００５７】
実施形態
以下において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義されるそれぞれの態様は、正反対に明確に指示されない限り、任意の他の態様または複数の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましいかまたは有利であると示された任意の特徴を、好ましいかまたは有利であると示された任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせてもよい。
【００５８】
背景技術の項で挙げたように、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、ＴＬＳ、最悪の場合のシナリオにおいて、ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的な活性に起因する副作用として、いわゆるサイトカインストームをもたらす場合がある。サイトカイン放出の増加の結果を削減するために、処置の選択肢は、抗ＩＬ−６抗体の使用、またはコルチコステロイドの投与を含み、このいずれかは、原発性疾患、例えば、がんの不十分な治療をもたらす。このように、一般に、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の間のＴＬＳの可能性を、防止または少なくとも減少させことが望ましい。本発明に至る研究において、驚くべきことに、ＡＡＶ由来の改変ＶＳＰ、特に、そのそれぞれのＣＡＲに特異的に結合するエピトープ（ＬＣＡＲ）を運ぶＶＣＰが、ＣＡＲの内部移行による細胞表面でのＣＡＲの一時的な利用不可能性を示すことが、本発明者らによって示された。好ましくは、ＣＡＲ治療のために使用される細胞は、Ｔ細胞である。さらに、本発明者らは、この利用不可能性が時間制御可能であることを示すことができた。その結果、ＣＡＲの一時的な利用不可能性は、ＴＬＳの減少をもたらすか、またはＴＬＳがなくなるが、しかしながら、Ｔ細胞はアポトーシスを受けず、したがって、依然としてがん治療のために利用可能である。
【００５９】
この驚くべき知見は、とりわけ、当技術分野におよぶ以下の利点を提供し得る：（ｉ）ＴＬＳの低減／防止；（ｉｉ）Ｔ細胞のアポトーシスの防止に起因する患者中の標的特異的Ｔ細胞の保証；（ｉｉｉ）結合モチーフが特定されたら、目的のそれぞれのＣＡＲのために実行することができる；（ｉｖ）本発明のＶＳＰ融合タンパク質の結合によるＣＡＲ  Ｔ細胞の追加の活性化がない。
【００６０】
第１の態様において、本発明は、ＶＳＰであって、
（ｉ）ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、キャプソメア構造、キャプシド、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスベクターまたはウイルスを形成する１つもしくは複数のさらなるウイルスコートタンパク質と適宜一緒になる能力があり、
（ｉｉ）ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、前記キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの表面上に位置する領域に、キメラ抗原受容体（ＬＣＡＲ）に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを含み、ＬＣＡＲがポリヌクレオチドである、ＶＳＰに関する。
【００６１】
多量体構造、キャプソメア構造、キャプシド、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスベクターまたはウイルスを形成する、所与のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの能力は、例えば、電子顕微鏡法、サイズ排除クロマトグラフィーまたは非変性ゲル電気泳動のようないくつかの当技術分野において公知のプロセスによって、評価することができる。当業者は、ＬＣＡＲの挿入によって改変された、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、例えば、天然に存在するＶＳＰ、好ましくはＶＣＰが、依然として、好ましくは、生理学的条件下で、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの同じ種類および／または他の種類の他のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰと非共有結合を形成する能力を有するか否かを容易に評価することができる。ＬＣＡＲが、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの相互作用表面ではない、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの領域に挿入される場合、挿入は、自己アセンブリーを妨げる可能性が最も低い。常に、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの表面は、それぞれの構造のアセンブリーの後に、複合体の周囲の溶液中にあるか、またはＣＡＲのような細胞の表面にある、他のタンパク質と相互作用するために依然として利用可能である、タンパク質複合体の一部である。構造生物学における当業者は、Ｘ線結晶学および／またはＨ１−ＮＭＲ分光法を使用して、個々のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、ならびにキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの三次元構造を決定すること、ならびに表面に位置するその構造を形成するＶＳＰ、好ましくはＶＣＰのアミノ酸を決定することができる。これらのアミノ酸位置は、それらがＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの構造全体を崩壊させる可能性、および／またはＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの自己アセンブリーを妨げる可能性が最も低いので、挿入の好ましい部位である。したがって、「表面上に位置する領域」という語句は、上記に記載の表面に露出した１つまたは複数の隣接アミノ酸を指す。ＬＣＡＲのそのような構造への挿入が、ＶＳＰの二次構造を破壊し得、したがって、自己アセンブリーを妨げ得るので、領域がＶＳＰ、好ましくはＶＣＰのらせん構造および／またはベータシート構造に位置しないことも好ましい。したがって、ＬＣＡＲが、露出した表面に挿入され、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの領域、好ましくは、ループ構造を構造化しないことが好ましい。
【００６２】
本発明の第１の態様の実施形態において、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、１つまたは複数のさらなるＶＳＰ、好ましくはＶＣＰと一緒にアセンブルしてキャプソメア構造になる能力があるウイルス由来コートタンパク質である。キャプソメア構造は、多量体、好ましくは、五量体、六量体であるか、あるいはこれらのサブユニットのいくつかは、アセンブルしてキャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを形成する。任意の理論によって束縛されることを望まないが、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の知見、すなわち、ＣＡＲ療法によって引き起こされる副作用の低減が、少なくとも部分的に、本発明のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰがアセンブルして、特に、キャプソマー、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスになる場合、それぞれのＣＡＲに結合し、次に、Ｔ細胞表面上での前記ＣＡＲの利用可能性を制御するという事実に基づくと考えている。
【００６３】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、１つまたは複数のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰが、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを形成すること、およびＶＳＰ、好ましくはＶＣＰが、前記キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの表面上に位置する領域に、ＣＡＲ（ＬＣＡＲ）に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを含み、これがポリペプチドであることが好ましい。好ましくは、このＬＣＡＲは、５０個のアミノ酸の長さを含むかまたはからなり、より好ましくは、ＬＣＡＲは、５〜５０個、６〜３０個、７〜２０個、８〜１５個のアミノ酸を含むかまたはからなる。より好ましい実施形態において、ＬＣＡＲは、９〜１５個のアミノ酸を含むかもしくはからなり、または１３個のアミノ酸からなる。
【００６４】
本発明者らは、ＬＣＡＲを含むように改変されたＡＡＶ２が、Ｔ細胞上で発現したＣＡＲによって、排他的ではなく、主にＴ細胞に結合し、次いで、エンドサイトーシスを受けることを発見した。任意の理論によって束縛されることを望まないが、本発明者らは、ＣＡＲへの結合が、エンドサイトーシスを引き起こし、Ｔ細胞へのＡＡＶの正常なウイルスの侵入経路と無関係であると考えている。実際に、本発明者らは、ＣＡＲへの改変されたＡＡＶのほぼ排他的な結合を検出している。この観察は、ＶＳＰ中に存在するＬＣＡＲおよびＣＡＲの間の相互作用が、エンドサイトーシスを引き起こす中心であること、ならびにＡＡＶが侵入のために他に相互作用する表面タンパク質と相互作用しないことを強く示す。この観察に基づいて、本発明者らは、他のウイルス、特に、ＶＣＰのＶＳＰが、ＬＣＡＲを含むように改変され得ること、およびそのような改変ＶＳＰもＣＡＲに特異的に結合し、Ｔ細胞の表面上でＣＡＲ濃度を低減する同じエンドサイトーシス経路、したがって、Ｔ細胞応答を引き起こすことは確かであると考えている。エンドサイトーシスはＣＡＲによって媒介されるので、所与のウイルスの自然の侵入経路は、それほど重要ではなく、したがって、エンドサイトーシスまたは細胞膜との融合によって細胞に自然に侵入する、ＶＳＰおよび、このようなＶＳＰを含む、対応するキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを使用することができる。しかしながら、エンドサイトーシスによって細胞に侵入するウイルスを使用することが好ましい。ＡＡＶは、非エンベロープウイルスである。すべての非エンベロープウイルスは、エンドサイトーシスによって細胞に感染する。したがって、ＶＳＰが非エンベロープウイルス由来であることが特に好ましい。
【００６５】
自己アセンブルして、より高次の構造を形成する任意のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、表面に露出したアミノ酸領域を有し、したがって、ＬＣＡＲを含んでいてもよい。したがって、本発明の第１の態様の別の実施形態において、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、二本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくは、ミオビリダエ、シホビリダエ、ポドビリダエ、ヘルペスビリダエ、アデノビリダエ、バキュロビリダエ、パピローマビリダエ、ポリドナビリダエ、ポリオーマビリダエ、ポックスビリダエ；一本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくは、アネロビリダエ、イノビリダエ、パルボビリダエ；二本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくは、レオビリダエ；一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくは、コロナビリダエ、ピコルナビリダエ、カリシビリダエ、トガビリダエ、フラビビリダエ、アストロビリダエ、アルテリビリダエ、ヘペビリダエ；マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくは、アレナビリダエ、フィロビリダエ、パラミクソビリダエ、ラブドビリダエ、ブニヤビリダエ、オルトミクソビリダエ、ボルナビリダエ；一本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくは、レトロビリダエ；二本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス、好ましくは、カリモビリダエ、ヘパドナビリダエからなる群から選択されるウイルスに由来する。
【００６６】
好ましくは、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、エンドサイトーシスによって細胞に侵入するウイルスに由来し、ウイルスは、ミオビリダエ、シホビリダエ、ポドビリダエ、ヘルペスビリダエ、アデノビリダエ、バキュロビリダエ、パピローマビリダエ、ポリオーマビリダエ、ポックスビリダエ、アネロビリダエ、イノビリダエ、パルボビリダエ、レオビリダエ、コロナビリダエ、ピコルナビリダエ、カリシビリダエ、トガビリダエ、フラビビリダエ、アストロビリダエ、アルテリビリダエ、ヘペビリダエ、アレナビリダエ、フィロビリダエ、ラブドビリダエ、ブニヤビリダエ、オルトミクソビリダエ、ボルナビリダエ、カリモビリダエおよびヘパドナビリダエからなる群から選択される。
【００６７】
好ましくは、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、非エンベロープウイルスに由来し、ウイルスは、ミオビリダエ、シホビリダエ、ポドビリダエ、アデノビリダエ、パピローマビリダエ、ポリオーマビリダエ、アネロビリダエ、イノビリダエ、パルボビリダエ、レオビリダエ、ピコルナビリダエ、カリシビリダエ、アストロビリダエ、ヘペビリダエおよびカリモビリダエからなる群から選択される。
【００６８】
好ましくは、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰは、非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスに由来し、ウイルスは、アネロビリダエ、イノビリダエおよびパルボビリダエ、最も好ましくはパルボビリダエからなる群から選択される。
【００６９】
好ましくは、ＶＣＰは、細胞へのウイルスのエンドサイトーシスまたは食作用による取り込みを促進する、宿主細胞表面タンパク質への付着を媒介する能力があり、例えば、ミオビリダエの尾部線維タンパク質、シホビリダエの尾部線維および尾端タンパク質、ポドビリダエの尾部線維タンパク質、ヘルペスビリダエのｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨタンパク質、アデノビリダエのキャプシドタンパク質線維のヘキソン、ペントン、バキュロビリダエの主要エンベロープ糖タンパク質、パピローマビリダエの構造タンパク質Ｌ１およびＬ２、ポリオーマビリダエのキャプシドタンパク質ＶＰ１、イノビリダエ：ｇ３Ｐタンパク質、パルボビリダエのキャプシドタンパク質、レオビリダエのσ１タンパク質、コロナビリダエのＳおよびＨＥタンパク質、ピコルナビリダエのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、カリシビリダエのキャプシドタンパク質ＶＰ１、トガビリダエの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、フラビビリダエのＭおよびＥタンパク質、アストロビリダエのキャプシドタンパク質ＶＰ２５、ＶＰ２７、ＶＰ３４、アルテリビリダエの主要糖タンパク質ＧＰ５、膜タンパク質Ｍ、微量糖タンパク質ＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４、小さい疎水性タンパク質ＥおよびＯＲＦ５ａタンパク質、ヘペビリダエのキャプシドタンパク質、アレナビリダエのＧＰ糖タンパク質、フィロビリダエのＧＰ糖タンパク質、パラミクソビリダエのＨＮ、ＨまたはＧ糖タンパク質、ラブドビリダエのＧ糖タンパク質、ブニヤビリダエの糖タンパク質ＧｎおよびＧｃ、オルトミクソビリダエのＨＡタンパク質、ボルナビリダエのＧＰ糖タンパク質、レトロビリダエのＳＵ糖タンパク質、カリモビリダエのキャプシドタンパク質、ウイルス関連タンパク質（ＶＡＰ）、ヘパドナビリダエの糖タンパク質Ｓ、ＭおよびＬである。より好ましくは、ＶＣＰは、パルボビリダエのファミリー由来であり、好ましくは、アデノ随伴ウイルス由来である。さらにより好ましくは、ＡＡＶは、ヒトＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、トリＡＡＶ、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス；マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）；パルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）；パルボウイルスＨｌ（Ｈ１）；ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）；ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）；またはガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）である。上記に挙げたＶＣＰのそれぞれの場合において、タンパク質の構造は、当業者に周知である。このように、このようなＶＣＰを含むキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの表面上に位置するＶＣＰのそれぞれのアミノ酸領域も、公知であり、したがって、当業者は、ＬＣＡＲの挿入のために適したこれらのＶＣＰ内のアミノ酸位置を決定することができる（例えば、ヘキソンまたは線維の表面露出部分にペプチドを含むように遺伝子操作されたアデノウイルスのＶＬＰに関するＷＯ２０１７／１６７９８８を参照のこと）。
【００７０】
さらにより好ましくは、ＶＣＰは、ある特定のＡＡＶ血清型、好ましくは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−２−ＡＡＶ−３ハイブリッド、ＡＡＶ−３ａ、ＡＡＶ−３ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−６．２、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３またはＡＡＶｒｈ３２．３３由来である。より好ましくは、ＶＣＰは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９由来、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその変異体由来であり、これはアセンブルして、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに、好ましくはＶＬＰになる能力がある。
【００７１】
ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰが、同じ種類の２つ以上の異なるウイルス、例えば、異なる血清型の２つ以上のＡＡＶ、または異なる血清型の２つ以上のアデノウイルス、すなわち、キメラＶＳＰ、好ましくはキメラＶＣＰに由来し得ることも好ましい。
【００７２】
このようなキメラＶＳＰ、好ましくはキメラＶＣＰは、２つ以上のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰの対応する部分の特異的な交換によって作製することができる。例えば、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３のキメラＶＰ１は、ＡＡＨＰ１〜３６０由来のＡＡＶ２のアミノ酸配列およびＡＡＨＰ３６１〜７６１由来のＡＡＶ３のアミノ酸配列を含んでいてもよい（図１２において使用されるＡＡＨＰの番号付けを参照のこと）。あるいは、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＶＳＰのキメラＶＳＰは、例えば、Grimm et al. (2008) J Virol. 82(12):5887-911に記載されているようにして消化されたＤＮＡを使用するランダム法によって作製することができる。このようなランダム法を使用するために、同じもしくは異なる（ｓａｍｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）株または血清型のアミノ酸が互いに対して相同であることが好ましい。好ましくは、ＶＳＰは、アライメントされたＶＳＰの長さ全体にわたって、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有する（図に含まれるそれぞれのＶＣＰが、互いに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するこのような例示的なアライメントについて図１２を参照のこと）。
【００７３】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、ＶＣＰが、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３からなる群から選択されることが好ましい。より好ましくは、ＶＣＰは、ＶＰ１からなる。より好ましくは、ＶＣＰは、配列番号１に記載のＶＰ１、または配列番号１のアミノ酸に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有し、アセンブルして、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス、好ましくはＶＬＰになる能力があるその変異体を含む。
【００７４】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、ＡＡＶ  ＶＣＰ内の１つまたは複数のＬＣＡＲの挿入部位は、配列番号１に記載のＡＡＶに由来するＶＰ１を参照して記載される。このように、配列番号１に記載のＶＰ１内の１つまたは複数のＬＣＡＲについての好ましい挿入部位は、アミノ酸配列のシフトしたオープンリーディングフレームに起因して、異なるＶＰタンパク質内の異なる位置である。好ましくは、１つまたは複数のＬＣＡＲは、配列番号１に記載のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３もしくはＴ７１６、好ましくはＲ５８８、または配列番号１のアミノ酸に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有し、アセンブルして、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス、好ましくはＶＬＰになる能力があるその変異体からなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上のアミノ酸位置（挿入部位）で、あるいは、異なるＡＡＶ血清型のＶＰ１もしくはその変異体の類似位置で挿入され、好ましくは、Ｒ５８８およびＧ４５３のアミノ酸位置で、あるいは異なるＡＡＶ血清型のＶＰ１の類似位置で挿入される。典型的には、上記で概要を述べたようにして改変されたＶＰ１をコードする核酸の発現は、３つの異なるタンパク質、すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の生成をもたらし、ＶＰ２およびＶＰ３は、それぞれ、選択的スプライシング（ＶＰ２）またはリーキースキャニング（ＶＰ３）をもたらすＶＰ１のＮ末端でトランケートされた変異体である。したがって、生じるアセンブルされたキャプソメア構造、ウイルスなどは、異なる位置であるが、挿入されたＬＣＡＲをすべて含む、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。これは、例えば、ＶＰ１のＳ２６１が、ＶＰ２においてＳ１２４の位置に、およびＶＰ３においてＳ５９の位置に、位置するという事実に起因する。あるいは、１つまたは複数のＬＣＡＲの挿入部位は、配列番号２に記載のＶＰ２の、Ｍ１、Ａ２、Ｋ２４、Ｓ１２４、Ａ１２９、Ｎ２４４、Ｒ３１０、Ｔ３１１、Ｇ３１６、Ｒ３２２、Ｒ３３４、Ｆ３９７、Ｔ４３６、Ｑ４４７、Ｎ４５０、Ｒ４５１、Ａ４５４、Ｐ５２０、Ａ５２７、Ｔ５７６もしくはＴ５７９、好ましくはＲ４５１、または配列番号２のアミノ酸に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有し、アセンブルして、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス、好ましくはＶＬＰになる能力があるその変異体からなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上の挿入部位であるか、あるいは、異なるＡＡＶ血清型のＶＰ２もしくはその変異体の類似位置であり、好ましくは、Ｒ４５１およびＧ３１６のアミノ酸位置で、または異なるＡＡＶ血清型のＶＰ２の類似位置であることが好ましい���あるいは、１つまたは複数のＬＣＡＲの挿入部位は、配列番号３に記載のＶＰ３の、Ｓ５９、Ａ６４、Ｎ１７９、Ｒ２４５、Ｔ２４６、Ｇ２５１、Ｒ２５７、Ｒ２６９、Ｆ３３２、Ｔ３７１、Ｑ３８２、Ｎ３８５、Ｒ３８６、Ａ３８９、Ｐ４５５、Ａ４６２、Ｔ５１１もしくはＴ５１４、好ましくはＲ３８６、または配列番号３のアミノ酸に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有し、アセンブルして、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス、好ましくはＶＬＰになる能力があるその変異体からなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上の挿入部位であるか、あるいは、異なるＡＡＶ血清型のＶＰ３もしくはその変異体の類似位置であり、好ましくは、Ｒ３８６およびＧ２５１のアミノ酸位置で、あるいは異なるＡＡＶ血清型のＶＰ３の類似位置であることが好ましい。この文脈において、「挿入部位」という用語は、ＬＣＡＲポリペプチドが、特に示されたアミノ酸残基のＣ末端で挿入されることを意味する。このように、Ｋ２４部位でのアミノ酸配列ＬＬＬＬの挿入は、ＶＣＰ：ＫＬＬＬＬ内の以下のアミノ酸配列をもたらす。挿入がＶＣＰのさらなるアミノ酸配列の欠失によって達成されることも可能である。
【００７５】
このように、特定の実施形態において、ＬＣＡＲは、配列番号１に記載のＡＡ２  ＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６の１つに類似するアミノ酸位置で、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１に含まれる。上記に記載されるように、類似位置という用語は、アライメントされたときに、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸の１とアライメントされた、別の血清型のＡＡＶのＶＰ１におけるアミノ酸を指す（図１２を参照のこと）。したがって、ＬＣＡＲが、配列番号１９に記載のＡＡＶ１のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２０に記載のＡＡＶ３ａのＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２１に記載のＡＡＶ３ｂのＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２２に記載のＡＡＶ４のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２３に記載のＡＡＶ５のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２４に記載のＡＡＶ６のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２５に記載のＡＡＶ６．２のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ���６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２６に記載のＡＡＶ７のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２７に記載のＡＡＶ８のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２８に記載のＡＡＶ９のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号２９に記載のＡＡＶ１０のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号３０に記載のＡＡＶ１１のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号３１に記載のＡＡＶ１２のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号３２に記載のＡＡＶ１３のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号３３に記載のＡＡＶ．ｒｈ．１０のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、���３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；ＬＣＡＲが、配列番号３４に記載のＡＡＶｒｈ３２．３３のＶＰ１の、Ｍ１、Ｐ３４、Ｔ１３８、Ａ１３９、Ｋ１６１、Ｓ２６１、Ａ２６６、Ｎ３８１、Ｒ４４７、Ｔ４４８、Ｇ４５３、Ｒ４５９、Ｒ４７１、Ｆ５３４、Ｔ５７３、Ｑ５８４、Ｎ５８７、Ｒ５８８、Ａ５９１、Ｐ６５７、Ａ６６４、Ｔ７１３またはＴ７１６に類似する位置、好ましくはＲ５８８に類似する位置であること；が好ましい。
【００７６】
特定の実施形態において、ＬＣＡＲは、天然に存在するＶＰ１タンパク質の変異体、好ましくは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３または３４に記載のＶＰ１タンパク質の変異体に含まれる。特定の実施形態において、このような変異体は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に記載のＶＰ１タンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。それぞれの場合において、変異体はアセンブルして、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスに、好ましくはＶＬＰになる能力がある。
【００７７】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、１つまたは複数のＬＣＡＲの１つ、２つもしくはそれ以上の挿入部位へのＶＰ１のＣ末端の１つまたは複数のアミノ酸が欠失することが好ましい。典型的には、ＶＰ１の５〜５０個、６〜３０個、７〜２０個または８〜１５個の間のアミノ酸が欠失する。好ましくは、欠失したアミノ酸の数は、挿入されたＬＣＡＲのアミノ酸の数に対応する。加えて、またはあるいは、１つまたは複数のアミノ酸が、挿入部位のＣ末端またはＮ末端で置換されることも好ましい。より好ましくは、Ｃ末端もしくはＮ末端で置換された１つまたは複数のアミノ酸は、挿入部位の１０個のアミノ酸内で置換される。
【００７８】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、ＶＣＰ配列に挿入されたＬＣＡＲは、リンカーとＮおよび／またはＣ末端で隣接する。リンカーについての例は、例えば、５個、１０個、１５個、２０個および２５個のアミノ酸残基長の短いポリペプチド配列である。好ましいリンカーは、アラニン／グリシン／セリンリンカーを含む。リンカーは、リンカーとＮおよび／またはＣ末端で隣接するＬＣＡＲの柔軟性を増加させ、このようにして、例えば、ＣＡＲに結合するその到達性を増加させる。
【００７９】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰに挿入されたＬＣＡＲは、１つ、２つ、３つもしくはそれ以上の表面に到達可能なＴＳＥＡのエピトープを含むかまたはからなることが好ましい。好ましくは、このＬＣＡＲは、５０個以下の連続するＴＳＥＡのアミノ酸を含むか、実質的に含むか、またはからなり、より好ましくは、ＬＣＡＲは、５〜５０個、６〜３０個、７〜２０個、８〜１５個の間のアミノ酸を含むか、実質的に含むか、またはからなる。より好ましい実施形態において、ＬＣＡＲは、９〜１５個のアミノ酸を含むか、または１３個のアミノ酸からなる。
【００８０】
好ましくは、ＴＳＥＡ、特に、ＬＣＡＲは、Ｂ細胞エピトープを含まず、好ましくは、Ｔ細胞エピトープも含まない。これは、この実施形態において、改変されたＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、またはこのようなＶＳＰ、好ましくはＶＣＰを含む、キャプソマー、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターもしくはウイルスが、免疫応答を誘発しないので、好ましい。このように、抗原のＣおよび／またはＮ末端が欠失した変異体は、それらにＣＡＲが依然として特異的に結合する限り、使用することができる。
【００８１】
好ましくは、ＴＳＥＡは、がん精巣抗原、好ましくは、ＮＹ−ＢＲ１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１；がん胎児抗原、好ましくは、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ；分化抗原、好ましくは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２，２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＧ７、ＰＳＭＡ、ｇｐ１００、アルファＦＲ、ＣＡＩＸ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、ＢＣＭＡ  Ｉｇｋ、ＲＯＲ−１、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦＲ−ＩＩ；ウイルス抗原または変化糖タンパク質、好ましくは、ＡＣ１３３、ＭＵＣ−１、ＧＤ２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙからなる群から選択される。腫瘍関連抗原がＮＹ−ＢＲ１であることがさらにより好ましい。１つまたは複数のＴＳＥＡのエピトープは、腫瘍細胞の表面上に到達可能であり、すなわち、免疫細胞、好ましくは、ＣＡＲを備えたＴ細胞が結合し得る。これは、そうでなければＣＡＲが標的細胞に結合することができないので、ＣＡＲＴ細胞療法のための要件である。このように、好ましいＬＣＡＲは、ＣＡＲＴ細胞療法においてＣＡＲが結合し得る１つもしくは複数のＴＳＥＡのエピトープを含むか、実質的にからなるか、またはからなる。好ましくは、このようなＬＣＡＲは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含まない。
【００８２】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、本発明のＶＳＰに含まれるＬＣＡＲは、ＣＡＲと相互作用する少なくとも１つのエピトープにＣｙｓ残基を含むように改変される。ＬＣＡＲが特異的に結合するそれぞれのＣＡＲが、ＬＣＡＲのＣｙｓ残基のビシナルにＣｙｓ残基を天然に含むか、またはこのようなＣｙｓ残基を含むように遺伝子操作される場合、この２つは、ＬＣＡＲおよびＣＡＲの間の結合親和性を増加させる共有結合的な相互作用を形成することができる。
【００８３】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、ＬＣＡＲは、単鎖抗体または単鎖抗体様タンパク質からなる群から選択される。ＣＡＲ細胞療法の調節において有用であるためには、抗体は、ＣＡＲを発現する免疫細胞上のＣＡＲに特異的に結合する。この実施形態において、抗体が、その標的、例えば、ＣＡＲ自体が単鎖抗体を含む場合において、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲによって形成されるタンパク質の折り畳みに特異的に結合する、ＣＡＲの部分に結合することが特に好ましい。
【００８４】
第２の態様において、本発明は、第１の態様のＶＣＰをコードする核酸にさらに関する。
【００８５】
第３の態様において、本発明は、第１の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰ、好ましくはＶＣＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスにさらに関する。本発明の第３の態様の好ましい実施形態において、ＶＬＰは、本発明の第１の態様の少なくとも１つのＶＣＰを含む。ＶＬＰおよびキャプソメア構造の使用は、それらが、相対的に長い生物学的半減期を有し、かつ少ない頻度の投与が必要であるので好ましく、加えて、それらが、核酸を含まず、非感染性および非複製性であるので、それらは、ウイルスベクターまたはウイルスよりもより良好な安全性プロファイルを有する。
【００８６】
別の好ましい実施形態において、ウイルスベクターまたはウイルスは、非感染性であり、すなわち、疾患を引き起こす生物としてのウイルスは、環境を通じて伝染する恐れはなく、したがって、もはや疾患を引き起こさない。したがって、ウイルスベクターまたはウイルスは、感染症または任意の他の疾患を伝搬しない突然変異体であることが好ましい。ウイルスベクターまたはウイルスが非複製性であることがさらに好ましい。
【００８７】
第４の態様において、本発明は、第１の態様のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、第２の態様の核酸、本発明の第１の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰ、好ましくはＶＣＰを含む第３の態様のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含み、ならびに１つもしくは複数の、薬学的に許容される、担体、希釈剤、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤および／または保存剤をさらに含む医薬組成物に関する。
【００８８】
特定の実施形態において、第４の態様の組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、治療有効量の活性成分、すなわち、本発明の第１または第２の態様のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、または核酸、本発明の第１の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰ、好ましくはＶＣＰを含む第３の態様のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを、好ましくは純粋な形態で、適した量の、担体および／または賦形剤と一緒に含有する。製剤は、投与の様式に適していなければならない。
【００８９】
医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態で摂取され得る。医薬組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに、坐剤として製剤化することができる。
【００９０】
本発明の医薬組成物を調製するためには、薬学的に許容される担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固体形態の組成物としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、カシェ剤、坐剤および分散顆粒剤が挙げられる。固形賦形剤は、希釈剤、香味剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤またはカプセル化材料としても機能し得る、１つまたは複数の物質であり得る。散剤において、賦形剤は、好ましくは、微粉化された固体であり、これは、微粉化された本発明の阻害剤との混合物中にある。錠剤において、活性成分は、必要な結合性を有する担体と適した比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。適した賦形剤は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどである。坐剤を調製するためには、脂肪酸トリグリセリドまたはカカオバターの混合物などの低融点ワックスを、最初に溶融し、活性化合物を、撹拌することによってのように、その中に均一に分散させる。溶融した均一な混合物を、次いで、使い易いサイズの型に注ぎ、冷却し、それによって、凝固させる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびロゼンジ剤は、経口投与のために適した固体剤形として使用することができる。
【００９１】
液体形態の組成物としては、液剤、懸濁剤および乳剤が挙げられ、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール溶液または水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。注射剤（例えば、静脈内、動脈内、骨内注入、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内および髄腔内注射）のためには、液状調製物を、液剤、例えば、ポリエチレングリコール水溶液に製剤化することができる。生理食塩水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に、好ましい担体である。
【００９２】
特定の実施形態において、医薬組成物は単位剤形である。このような形態において、本組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分してもよい。
【００９３】
投与される投薬量は、ＣＡＲ療法の望ましくない副作用の所望の低減を達成するように順応される。副作用の強度は、患者間で変わるので、投薬量は、望ましくない副作用の所望の低減が達成されるまで、個々に順応させることができる。
【００９４】
単位剤形は、包装された組成物であり得、包装体は、バイアルもしくはアンプルに包装された錠剤、カプセル剤および散剤などの、組成物の別々の量を含有する。また、単位剤形は、カプセル剤、注射剤バイアル、錠剤、カシェ剤またはロゼンジ剤自体であり得るか、あるいは適切な数の包装形態中のこれらのいずれかであり得る。
【００９５】
所望により、本組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。
【００９６】
さらにまた、このような医薬組成物はまた、限定されないが、アジュバントおよび／または追加の活性成分などの他の薬理学に活性な物質を含んでいてもよい。本発明の文脈におけるアジュバントとしては、限定されるものではないが、無機アジュバント、有機アジュバント、油系アジュバント、サイトカイン、粒子状アジュバント、ビロソーム、細菌アジュバント、合成アジュバントまたは合成ポリヌクレオチドアジュバントが挙げられる。
【００９７】
本発明の第５の態様において、医薬における使用のための、第１、第２または第３の態様に記載の、ＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、核酸、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルス、および本発明の第４の態様に記載の医薬組成物が提供される。
【００９８】
特定の実施形態において、医薬における使用は、障害もしくは疾患の予防、処置または診断、特に、腫瘍崩壊症候群の予防、処置または診断における使用である。
【００９９】
本発明の第６の態様は、免疫応答の防止、減少または制限における使用のための、第１の態様に記載のＶＳＰ、好ましくはＶＣＰ、第２の態様に記載の核酸、本発明の第３の態様に記載のキャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターもしくはウイルス、または本発明の第４の態様に記載の医薬組成物に関する。
【０１００】
防止、減少または制限される免疫応答は、養子免疫療法によって誘発されることが特に好ましい。好ましい養子免疫療法は、Ｔ細胞療法、好ましくはＣＡＴＲ細胞療法を含む。防止、減少または制限される好ましい免疫応答は、腫瘍崩壊症候群、サイトカイン放出症候群、神経毒性、「ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ」認識、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および／またはアナフィラキシーである。免疫応答が細胞応答であることが特に好ましい。処置することが、それを必要とする対象の状態を改善することを意味することが好ましい。免疫系の過度の反応、例えば、サイトカイン産生の増加が、防止され得るかまたは少なくとも減少され得るかのいずれかであることが好ましい。ＴＬＳは、代謝撹乱および標的臓器機能不全の発生をもたらす多量の腫瘍細胞死によって特徴付けられ、高いサイトカイン放出と一緒に進む。ＴＬＳに関連して放出されるサイトカインは、例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ−６である。
【０１０１】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の少なくとも１つのＶＳＰを含む、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスを含むキットオブパーツであって、ウイルスベクターまたはウイルスが、非感染性であり、ＣＡＲを発現する改変細胞に、前記キャプソメア構造、前記キャプシド、前記ＶＬＰ、前記ウイルスベクターまたは前記ウイルスが特異的に結合する、キットオブパーツに関する。
【０１０２】
好ましくは、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスは、１０μＭ未満の親和性で改変細胞に結合する。
【０１０３】
好ましくは、このキットオブパーツは、好ましくは養子免疫療法によって誘発される免疫応答の防止、減少または制限における、キャプソメア構造、キャプシド、ＶＬＰ、ウイルスベクターまたはウイルスの使用を記述する使用説明リーフレットをさらに含む。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
野生型ＡＡＶおよびＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲ  ＡＡＶの産生および精製
本研究において使用されるＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶキャプシド挿入突然変異体を作製するために、ＬＣＡＲを、以前に記載されたようにして（Michelfelder et al. (2011) PLoS ONE 6(8): e23101.）、ＡＡＶの３倍のスパイク領域に挿入した。詳細には、アミノ酸配列ＬＫＮＥＱＴＬＲＡＤＱＭＦをコードするオリゴヌクレオチドは、ＶＰ１の位置５８８でＡＡＶ２ヘルパープラスミドｐＭＴ−１８７−ＸＸ２（得られる核酸は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する改変ＶＰ１をコードした）に、位置Ｔ５７８でＡＡＶ５ヘルパープラスミドｐＭＴ−ｒｅｐ２ｃａｐ５−ＳｆｉＩ５７８（得られる核酸は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する改変ＶＰ１をコードした）に、位置Ｎ５９０でＡＡＶ８ヘルパープラスミドｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８−Ｓｆｉ５９０（得られる核酸は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する改変ＶＰ１をコードした）に、および位置Ａ５８９でＡＡＶ９ヘルパープラスミドｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／９−Ｓｆｉ５８９（得られる核酸は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する改変ＶＰ１をコードした）に挿入された。得られるプラスミドコンストラクトを、ＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶ産生のための野生型ＡＡＶ２ヘルパープラスミドに代えて、使用した。野生型ＡＡＶ２およびＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶキャプシド挿入突然変異体は、無アデノウイルス産生方法によって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生させた。簡潔には、細胞を、ＰＥＩおよび１５ｃｍのプレートあたり４４μｇのＤＮＡを使用して、等モル比の、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミド、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクタープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパーコンストラクトで、トリプルトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、凍結−解凍サイクルを繰り返すことによって溶解させ、ベンゾナーゼで処理し、イオジキサノール段階勾配遠心分離によってさらに精製した。５５０００ｒｐｍおよび４℃で３時間の遠心分離後、ＡＡＶ粒子を含有する４０％相を収集した。ゲノム粒子の力価を、導入遺伝子特異的プライマーを使用して、プラスミド標準に対するリアルタイムＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲによって決定した。野生型ＡＡＶ２およびＮＹ−ＢＲ１  ＡＡＶ２キャプシドの力価を、製造者の使用説明書（Ｐｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ）に従って、抗キャプシド抗体Ａ２０を使用して、ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１０５】
実施例２
ＥＬＩＳＡによるＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ  ＡＡＶの検出
精製ＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲ  ＡＡＶ粒子を、それらの決定されたゲノム力価に従って、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルアッセイプレート（ハーフウェル）上にコーティングした。コーティングを、５０μｌのＮａＨＣＯ３緩衝液／ウェル中、４℃で終夜行った。開始濃度は、１×１０９ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｍｌであり、続いて、６段階で粒子の２倍連続希釈を行った。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（１×ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で、１５０μｌ／ウェルを使用して、６回洗浄した。プレートのブロッキングを、１５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ中に３％のＢＳＡ、５％のスクロース）を用いて、振動装置における室温で１時間のインキュベーションによって実施した。一次マウス抗体（ＮＹ−ＢＲ−１  Ｎｏ．２−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ注文番号：ＭＡ５−１２６４５）または可溶性ＬＣＡＲ（Ｍｏｒａｂ２ｓｃＦｖ−自家製で産生）を、最終濃度が３０μｌのＰＢＳ−Ｔ中１μｇ／ｍｌでそれぞれのウェルに添加し、続いて、振とう機において室温で１時間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ−Ｔ（１５０μｌ／ウェル）での洗浄を３回行った。二次抗体を一次抗体に対して添加し、ＮＹ−ＢＲ−１  Ｎｏ．２について、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを使用し、可溶性ＬＣＡＲについて、本発明者らは、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート適用した（両方ともＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した、最終濃度：５０μｌ／ウェル中に１μｇ／ｍｌ）。抗体を振とう機において室温で１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。検出を、室温で１５分間ＴＭＢ基質（１００μｌ／ウェル）を添加し、続いて、停止溶液（１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μｌ／ウェル）を添加することによって、行った。ＯＤ４５０での読取りをＥｐｏｃｈマルチプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において行った。内部対照として、標準抗ＡＡＶ  Ａ２０  ＥＬＩＳＡを、Ａ２０  ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ）の製造者の使用説明書に従って、同じプレートにおいて行った。結果を図１〜３に示す。
【０１０６】
実施例３
細胞株におけるＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ  ＡＡＶによるＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲのダウンレギュレーション
ＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲ細胞株を確立するために、１×１０５個のジャーカット細胞を、ＮＹ−ＢＲ１−ＣＡＲ遺伝子発現カセットおよびピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。そのために、ジャーカット細胞を、２４ウェルの細胞培養プレートの１つのウェルにおいて、１ｍｌのＤＭＥＭ培地（１０％のＦＣＳを含有）に播種し、精製レンチウイルス粒子を、１０の感染の多重度（ＭＯＩ）にて添加した。２４時間のインキュベーションを、標準条件（５％のＣＯ２；３７℃、加湿雰囲気）下で続けた。その後、細胞を遠心分離（３００ｇ、４分）によって洗浄し、新たなＤＭＥＭ培地を添加した。形質導入の３日後に、ＣＡＲ＋−細胞の選択を行った。ジャーカット細胞を、洗浄し、ピューロマイシン（最終濃度：２μｇ／ｍｌ）を含有する２０ｍｌのＤＭＥＭ培地で満たし、２００μｌの細胞を、９６ウェルの細胞培養懸濁液プレートのそれぞれのウェルに播種した。耐性のクローンを、播種の後およそ２または３週間、増殖させた。
【０１０７】
得られたクローンを、ピューロマイシン条件下、さらに継代し、ＦＡＣＳによって、ＣＡＲの発現について分析した。これは、分析あたり５×１０４個の細胞を用いて行い、ここで、細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ；１％のＦＣＳ；２ｍＭのＥＤＴＡ）中で、ＡＰＣコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ−フラグメント特異的抗体（１００μｌ中１μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。遠心分離による洗浄の後、４００μｌのＰＢＳをＦＡＣＳチューブに添加し、細胞を、ＤＡＰＩ（３μＭの最終濃度）を用いて生存細胞について対比染色した。ＣＡＲ＋細胞の検出は、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行った。ＣＡＲの発現は、それぞれのクローンの９５〜９９％の細胞において観察された。
【０１０８】
ＬＣＡＲ−ＡＡＶによるＣＡＲのダウンレギュレーションのレベルを決定するために、ＣＡＲ＋ジャーカット細胞を、実施例１の記載のようにして精製したＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶとともにインキュベートした。１×１０５個のＣＡＲ＋ジャーカット細胞を、２４ウェルプレートの１つのウェル中のＲＰＭＩ培地に播種した。直後に、ウェルあたり５×１０８個のＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶ粒子を、５０００のＭＯＩを反映する細胞に添加した。次いで、細胞を、標準条件下、２４時間培養した。その後、ＦＡＣＳ分析を、上記に記載のようにして行った。ＣＡＲのダウンレギュレーションのレベルを、野生型（ｗｔ）ＡＡＶとのインキュベーションと比べて、ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶのインキュベートされたジャーカット細胞中でのＣＡＲの発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変化として記載した（図４〜６）。
【０１０９】
実施例４
細胞株におけるＬＣＡＲのインキュベーション後のＣＡＲの活性化の測定
ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶ粒子によって引き起こされたＮＹ−ＢＲ１−ＣＡＲ＋ジャーカット細胞における活性化のレベルを測定するために、マーカー分子のＣＤ６９の発現を決定した。ＣＡＲ＋ジャーカット細胞を、ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶ粒子および野生型ＡＡＶ粒子とともに、実施例３に記載されたものと同じ条件（ＭＯＩ５０００、２４時間、３７℃）下でインキュベートした。任意のＡＡＶ粒子なしでインキュベートされたＣＡＲ＋ジャーカット細胞は、ベースライン対照としての役割を果たした。陽性対照としての過活性化を、ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）によって誘導した。直後に、培養細胞を、ＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、続いて、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に１μｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ６９−ＰＥＣｙ７抗体コンジュゲート（クローン：ＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とともに氷上で３０分間インキュベーションした。生細胞の染色およびＦＡＣＳ分析を、実施例３に記載のようにして行った。活性化のレベルを、ベースライン対照を上回るＣＤ６９−ＭＦＩの増加として決定した（図７）。
【０１１０】
実施例５
初代ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＬＣＡＲのインキュベーション後のダウンレギュレーションおよびＣＡＲの活性化
初代Ｔ細胞を得るために、およそ５０ｍｌの血液試料を、健康なドナーから、ＥＤＴＡ収集チューブに採取した。新鮮な血液を、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブ中の１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（商標）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；密度：１．０７７）の層上で十分にピペッティングし、ブレーキなしで、７５０ｇで３０分間遠心分離した。その後、形成したリンパ球のリングを取り出し、２０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した（ブレーキありで、３００ｇで４分間遠心分離）。細胞数を、Ｎｅｕｂａｕｅｒ−Ｃｈａｍｂｅｒにおいて計数することによって決定し、ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手したヒトＰａｎ  Ｔ細胞単離キットＩＩを使用して、製造者の使用説明書に従って、行った。Ｔ細胞の数を、選別の後に決定し、１×１０６個の細胞を、１ｍｌの活性化培地中で、１ｃｍ２にて３７℃で２４時間播種した。活性化培地は、３００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＰｒｏＬｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）で補充された、ＸＶＩＶＯ２０（Ｌｏｎｚａ）および１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローン：ＯＫＴ３；Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）で構成した。活性化後、Ｔ細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、培養培地（ＸＶＩＶＯ２０；３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２）中でさらにインキュベートした。Ｔ細胞の単離の４８時間後、レンチウイルスＣＡＲの形質導入を、スピノキュレーション法を使用して行った。そのために、細胞を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）でコーティングされた２４ウェルプレート（１６μｇ／ｍｌのＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）；１×１０６個のＣＤ３＋細胞／ｍｌ／ｃｍ２）に播種し、ＣＡＲ遺伝子発現カセットをコードするレンチウイルス粒子を、１０のＭＯＩにて添加した。プレートを、２０００ｇおよび３２℃で１．５時間遠心分離し、続いて、３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、ウイルス粒子を含有する培地を除去し、通常の培養培地に置き換えた。最初の細胞選別の７２時間後、ＣＤ３＋細胞を発現するＣＡＲの割合を、ここでは、抗ＣＤ３−ＡＰＣおよび抗ヒトＩｇＧ１−Ｆｃフラグメント−ＰＥ（それぞれ１μｇ／ｍｌ）抗体コンジュゲートを検出剤として使用した以外は、実施例３に記載されるようにして、ＦＡＣＳによって決定した。初代ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞におけるＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶ粒子の機能性を決定するために、上記で作製した細胞を、実施例４に記載されるようにして、それらのＡＡＶ粒子のそれぞれとともにインキュベートした。ＣＡＲのダウンレギュレーションの測定を、実施例３におけるようにして行い、ダウンレギュレーションのレベルを、野生型ＡＡＶ粒子とのインキュベーションと比べた（図８）。この実験からの共インキュベートされたＴ細胞の上清を培養物から取り出し、図８にも示される活性化レベルの分析のために保管した。この場合において、活性化を、培養上清中のインターフェロンガンマの量として決定し、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、製造者の使用説明書に従って検出した。
【０１１１】
実施例６
異なるＬＣＡＲ−ＡＡＶ血清型を用いた形質導入後のＣＡＲのダウンレギュレーション
野生型ＡＡＶ２、ならびにＡＡＶ２における位置５８８とＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ５の類似位置とでＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲを示すＡＡＶ血清型２、５、８および９を産生させ、実施例１の記載のようにして精製した。ウェルあたり１×１０５個のＣＡＲ＋ジャーカット細胞を、２４ウェルプレート中のＲＰＭＩ培地に播種した。ウェルあたり５×１０８個のＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶゲノム粒子を、５０００のＭＯＩを反映する細胞に添加した。次いで、細胞を、標準条件下、２４時間培養した。ＣＡＲの発現を、上記に記載の抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ抗体を使用して、ＦＡＣＳによって検出した。図９は、ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶまたは野生型ＡＡＶ２のインキュベートされたジャーカット細胞におけるＣＡＲの発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変化としてのＣＡＲのダウンレギュレーションのレベルを、未処理試料と比べて示す。
【０１１２】
実施例７
ＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲの長さの変動を評価するためのＣＡＲ結合アッセイ
ＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲ配列ＬＫＮＥＱＴＬＲＡＤＱＭＦを、重複する４量体および８量体に分割し、示されるＬＣＡＲの長さを変えるために２０量体までのＣおよびＮ末端アミノ酸によって伸長させた（図１０を参照のこと）。それぞれのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを、ＶＰ１の位置５８８で、ＡＡＶ２ヘルパープラスミドｐＭＴ−１８７−ＸＸ２に挿入した。粗ＡＡＶライセートを、無アデノウイルス産生法によって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生させた。簡潔には、細胞を、ＰＥＩおよび６ウェルプレートのウェルあたり２．６μｇのＤＮＡを使用して、等モル比の、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミド、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクタープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパーコンストラクトで、トリプルトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ中で凍結−解凍サイクルを繰り返すことによって溶解させ、フルスピードで遠沈した。ＡＡＶ粒子を含有する上清（すなわち、粗ＡＡＶライセート）を、注意深く取り出した。ストレプトアビジンでコーティングされたダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の使用説明書に従って、Ａ２０−ビオチンコンジュゲートと連結させ、続いて、等量の各種の長さのＮＹ−ＢＲ１  ＬＣＡＲを示す粗ＡＡＶライセートを添加した。ＬＣＡＲ  ＡＡＶの可溶性ＣＡＲへの結合を定量化するために、ＮＹ−ＢＲ１特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を０．５μｇ／ｍｌにて添加した。二次抗体の抗ｈｕ−ＩｇＧ−ＰＥとのインキュベーション後、ＰＥ陽性のダイナビーズ−ＡＡＶ−抗体複合体を、ＦＡＣＳ分析によって検出した。図１０において、ＰＥ陽性の複合体のパーセンテージを、ＣＡＲ結合（％）として定義する。
【０１１３】
実施例８
粗ライセート中の無傷のＡＡＶ粒子のサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＡＡＶ２特異的Ａ２０マウスハイブリドーマ上清を、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルアッセイプレート（ハーフウェル）上にコーティングした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（１×ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で、１５０μｌ／ウェルを使用して、３回洗浄した。プレートのブロッキングを、１５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ中に３％のＢＳＡ、５％のスクロース）を用いて、振動装置における室温で１時間のインキュベーションによって実施した。洗浄およびブロッキング後、ＡＡＶ粗ライセートまたは野生型ＡＡＶ２標準を、２倍の連続希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。上記のようにして洗浄した後、ビオチンコンジュゲート化Ａ２０を、ブロッキング緩衝液中０．６μｇ／ｍｌにて添加した。その後、洗浄を上記のようにして行い、続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートとともに室温で１時間インキュベーションし、続いて、ＰＢＳ−Ｔを用いて、３回洗浄した。検出を、室温で１５分間ＴＭＢ基質（１００μｌ／ウェル）を添加し、続いて、停止溶液（１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μｌ／ウェル）を添加することによって、行った。ＯＤ４５０での読取りをＥｐｏｃｈマルチプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において行った。キャプシドの力価を、線形回帰によって計算し、図１０に示す。
【０１１４】
実施例９
ＣＡＲ  Ｔ細胞の添加の１０〜２０時間後のＣＡＲが媒介する死滅の特異的阻害
初代乳がん細胞を腹水液から入手し、培養液中で７日間維持し、ＦＡＣＳによってＮＹ−ＢＲ１の発現について分析した（さらに、標的細胞という）。健康なドナーからの初代Ｔ細胞を単離し、実施例５に記載のようにして、ＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲの発現カセットを含有するレンチウイルスを用いて形質導入した（さらに、エフェクター細胞という）。ＮＹ−ＢＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の溶解能およびそれらに対するＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶの効果を分析するために、標的細胞を、Ｅ−プレート９６（２００００細胞／ウェル、条件あたり三反復）に播種した。Ｅ−プレートを、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイムインピーダンス測定装置（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）に置き、読取りを５分ごとに設定した。装置中での１２時間の培養後、標的細胞の数は２倍になり、エフェクター細胞を、エフェクター対ターゲットの比が１：１で添加した（三反復で、４００００個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞／ウェル）。さらに、共培養物を２つの群に分け、一方は未変化のままにし、他方は、ＣＡＲ  Ｔ細胞あたり５０００のＭＯＩのゲノム粒子にて、ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶ粒子によって補充した。インピーダンス測定を、さらに４０時間継続し、細胞インデックスとして、ＲＴＣＡソフトウェアによって記録した。実験の最後に、細胞インデックスを、エフェクター細胞添加の時点に対して正規化し、標的細胞の特異的生存率を、未処理の対照のうちの正規化した細胞インデックスのパーセンテージとして計算した。ＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ−ＡＡＶあり、またはなしのＣＡＲエフェクター細胞に対する標的細胞の平均生存率を、図１１に示すように、経時的にプロットした。
【０１１５】
実施例１０
ヘパリンの存在または非存在中、ＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲあり、およびなしでの、ジャ
ーカット細胞に結合する野生型ＡＡＶおよびＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ  ＡＡＶ
野生型ＡＡＶ２またはＮＹ−ＢＲ１−ＬＣＡＲ  ＡＡＶ２の２Ｅ９のキャプシドを、２５０μｌの２０ＩＵ／ｍｌのヘパリンとともに、室温で３０分間あらかじめインキュベートした。２Ｅ５の野生型ジャーカット細胞またはＮＹ−ＢＲ１  ＣＡＲ＋ジャーカット細胞を、２４ウェルプレートのウェルあたり２５０μｌの氷冷されたＲＰＭＩ培地中に播種した。ヘパリンあり、またはなしのＡＡＶを添加し、混合物を氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳを用いて洗浄し、１００μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させた。Ａ２０−ビオチンコンジュゲート（Ｐｒｏｇｅｎ）を０．６μｇ／ｍｌにて添加し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳを用いて再び洗浄し、１００μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させた。ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートを添加し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を氷冷したＰＢＳを用いて再び洗浄し、死細胞を、ＤＡＰＩを用いて染色し、結合したＡＡＶを、生細胞のＦＡＣＳ分析によって定量化した（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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