(57)【要約】本発明において、多標的キメラ抗原受容体を開示する。本発明において、主ペプチド鎖および補助ペプチド鎖からなる多標的キメラ抗原受容体であって、主ペプチド鎖が、抗原結合ドメインＡ、補助ペプチド鎖連結ドメインＢ、膜貫通ドメインＣおよび細胞内シグナル伝達ドメインＤを含み；補助ペプチド鎖が、主ペプチド鎖連結ドメインＦを含み；抗原結合ドメインＡが、抗原結合機能を有するポリペプチドであり；補助鎖連結ドメインＢおよび主ペプチド連結ドメインＦが、互いに組み合わせることができ；膜貫通ドメインＣが、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインであり；細胞内シグナル伝達ドメインＤが、一次シグナル伝達領域を含む、多標的キメラ抗原受容体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主ペプチド鎖および補助ペプチド鎖で構成される多標的キメラ抗原受容体であって、前記主ペプチド鎖が、抗原結合ドメインＡ、補助ペプチド鎖連結ドメインＢ、膜貫通ドメインＣおよび細胞内シグナル伝達構造ドメインＤからなり；前記補助ペプチド鎖が、主ペプチド鎖連結ドメインＦを含み；前記抗原結合ドメインＡが、抗原と結合する能力を有するポリペプチドであり；前記補助ペプチド鎖連結ドメインＢが、互いに前記主ペプチド鎖連結ドメインＦと結合することができ；前記補助ペプチド鎖連結ドメインＢおよび前記主ペプチド鎖連結ドメインＦが、互いに結合することができる、サイトカインおよび完全長の対応するサイトカイン受容体、またはサイトカインおよび対応するサイトカイン受容体断片であり；前記膜貫通ドメインＣが、任意の膜結合性タンパク質の膜貫通領域または膜貫通タンパク質の膜貫通領域であり；前記細胞内シグナル伝達ドメインＤが、一次シグナル伝達領域を含む、多標的キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記補助ペプチド鎖が、抗原結合ドメインＥをさらに含み；前記抗原結合ドメインＥが、抗原結合機能を有するポリペプチドであり；前記抗原結合ドメインＥおよび前記抗原結合ドメインＡが、同一または相違し得る、請求項１に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記細胞内シグナル伝達ドメインＤが、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項１または２に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項４】
抗原結合能力を有する前記ポリペプチドが、抗原と結合することが可能な抗体、抗原と結合することが可能なリガンドまたは抗原と結合する能力を有する受容体である、請求項２または３に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項５】
抗原と結合することが可能な前記抗体が、完全長抗体、抗体のＦａｂ、抗体のＦｃ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、抗体のＶＨ、抗体のＶＬの完全長ポリペプチドまたは抗体のＶＬの部分断片であり；前記抗原結合リガンドまたは前記抗原結合受容体が、リガンドまたは受容体の完全長ポリペプチドまたは部分断片である、請求項４に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記抗原結合ドメインＡまたは前記抗原結合ドメインＥによって結合される前記抗原が、細胞表面抗原またはペプチドを有するＭＨＣ分子のいずれかである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記抗原が、がん関連抗原であるか；あるいは、前記抗原が、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がんまたはこれらの任意の組合せに関する抗原である、請求項６に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインＡおよび前記抗原結合ドメインＥによって結合される前記抗原が、以下：ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥＡ３、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、１ＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＷＴ１、ＣＤ６８、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、ＥｐＣＡＭ、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ  １８、ＮＢ／７０Ｋ、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＰＳ、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、またはこれらの組合せであるか；あるいは前記抗原結合ドメインＡおよび前記抗原結合ドメインＥによって結合される前記抗原が、ＭＨＣおよび上述のいずれか１つの抗原の短いペプチドの複合体である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記抗原結合ドメインＡおよび前記抗原結合ドメインＥによって結合される前記抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＷＴ１、またはこれらの任意の組合せであるか；あるいは前記抗原結合ドメインＡおよび前記抗原結合ドメインＥによって結合される前記抗原が、ＭＨＣおよび上記の抗原の１つの短いペプチドの複合体である、請求項８に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記サイトカインおよび前記対応するサイトカイン受容体が、γｃサイトカインファミリーにおけるサイトカインおよび対応するサイトカインならびにその受容体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１１】
γｃサイトカインファミリーにおける前記サイトカインおよび前記対応するサイトカイン受容体が、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα、ＩＬ４およびＩＬ４Ｒα、またはＩＬ２およびＩＬ２Ｒαであるか；あるいはγｃサイトカインファミリーにおける前記サイトカインおよび前記対応するサイトカイン受容体が、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα、ＩＬ４およびＩＬ４Ｒα、ＩＬ２またはＩＬ２Ｒαと７５％より高い相同性を有するポリペプチドである、請求項１０に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記一次シグナル伝達領域が、以下のタンパク質の１つ、または複数の以下のタンパク質の任意の組合せのシグナル伝達領域：ＣＤ３−ζ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄであるか；あるいは前記一次シグナル伝達領域が、配列６で示されるＣＤ３−ζシグナル伝達領域のアミノ酸配列を有するＣＤ３−ζシグナル伝達領域、または配列６で示されるＣＤ３−ζシグナル伝達領域と７５％より高い相同性を有するポリペプチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記共刺激シグナル伝達領域が、以下：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するシグナル伝達領域の分子のうちの１つまたは複数の任意の組合せであるか、あるいは前記共刺激シグナル伝達領域が、特に、アミノ酸配列７のＣＤ２８シグナル伝達領域またはアミノ酸配列８の４−１ＢＢシグナル伝達領域の１つまたは両方の組合せであるか；あるいは、前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８シグナル伝達領域および４−１ＢＢシグナル伝達領域のそれぞれと７５％より高い相同性を有する２つのポリペプチドの１つまたは組合せである、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記多標的キメラ抗原受容体において、前記抗原結合ドメインＡまたはＥが、抗ＣＤ１９−ＳｃＦｖ、抗ＭＨＣ／ＧＰ１００−ＶＨＨ、抗ＭＨＣ／ＷＴ１−ＶＨ、抗ＣＤ２０−ＳｃＦｖ、抗ＣＤ２２−ＳｃＦｖまたはＰＤ１細胞外領域の１つまたは両方の組合せであり；前記補助ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉ、ＩＬ４Ｒα−Ｎ−ＦＮ３、ＩＬ１５またはＩＬ４であり；前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８の膜貫通領域またはＣＤ２８の膜貫通領域であり；前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達領域、ＣＤ３ζシグナル伝達領域および４−１ＢＢシグナル伝達領域が融合することによって得られるポリペプチド、またはＣＤ３ζシグナル伝達領域がＣＤ２８シグナル伝達領域と融合することによって得られるポリペプチドであり；前記主ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５、ＩＬ４、ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉまたはＩＬ４ＲαもしくはＮ−ＦＮ３であるか；あるいは、前記多標的キメラ抗原受容体において、前記抗原結合ドメインＡが、抗ＣＤ１９−ＳｃＦｖであり；前記補助ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉであり；前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８の膜貫通領域であり；前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達領域が４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達領域と融合することによって得られるポリペプチドであり；前記抗原結合ドメインＥが、ＰＤ１の細胞外領域であり；前記主ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記抗ＣＤ１９−ＳｃＦｖのアミノ酸配列が、配列１であり；前記抗ＭＨＣ／ＧＰ１００−ＶＨＨのアミノ酸配列が、配列１５であり；抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１−ＶＨＨのアミノ酸配列が、配列１６であり；前記抗ＣＤ２０−ＳｃＦｖのアミノ酸配列が、配列１７であり；前記抗ＣＤ２２−ＳｃＦｖのアミノ酸配列が、配列１８であり；前記抗ＭＨＣ／ＷＴ１−ＶＨのアミノ酸配列が、配列１９であり；ＰＤ１の細胞外領域のアミノ酸配列が、配列２であり；ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列が、配列４であり；前記ＩＬ４Ｒα−Ｎ−ＦＮ３のアミノ酸配列が、配列２０であり；ＣＤ８の膜貫通領域のアミノ酸配列が、配列５であり；ＣＤ２８の膜貫通領域のアミノ酸配列が、配列２２であり；前記ＣＤ３ζシグナル伝達領域のアミノ酸配列が、配列６であり；４−１ＢＢシグナル伝達領域のアミノ酸配列が、配列８であり；ＣＤ２８シグナルのアミノ酸配列が、配列７であり；ＩＬ１５のアミノ酸配列が、配列３であり；ＩＬ４のアミノ酸配列が、配列２１である、請求項１４に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１６】
前記多標的キメラ抗原受容体の前記主ペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列９、配列２３、配列２４、配列２５、配列２６、配列２７、配列２８または配列２９の１つであり；前記受容体の前記補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列３、配列４、配列１０、配列３０、配列３１、配列３２、配列３３または配列３４の１つである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体。
【請求項１７】
主ペプチド鎖をコードする核酸分子および補助ペプチド鎖をコードする核酸分子で構成される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体をコードする核酸分子。
【請求項１８】
組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞または組換えウイルスに含まれる、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記細胞が、原核細胞、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞であるか；または前記哺乳動物細胞が、特に、ヒト細胞であるか；または前記ヒト細胞が、特に、免疫細胞であるか；あるいは前記免疫細胞が、特に、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１６、１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞または組換えウイルス、組換えプラスミドを含む、キット。
【請求項２１】
免疫療法の適用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換えプラスミド、細胞もしくは組換えウイルスまたは請求項２０に記載のキットの使用；あるいは、免疫療法製品の調製のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルス、または請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２２】
免疫細胞を培養するため、および／または免疫細胞の増殖を促進するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換えプラスミド、細胞もしくは組換えウイルスまたは請求項２０に記載のキットの使用；あるいは、免疫細胞の培養の調製の製品のため、および／または免疫細胞の増殖を促進するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルス、または請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２３】
イムノアッセイの適用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換えプラスミド、細胞もしくは組換えウイルスまたは請求項２０に記載のキットの使用；あるいは、免疫検出製品の調製のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルス、または請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２４】
腫瘍の処置または検出のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルスまたは請求項２０に記載のキットの使用；あるいは、腫瘍治療製品または腫瘍検出製品の調製のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルス、または請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２５】
腫瘍細胞を阻害または死滅させる適用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルス、請求項２０に記載のキットの使用；あるいは、腫瘍細胞を阻害または死滅させるための製品の調製のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、細胞もしくは組換えウイルス、または請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２６】
言及した抗原を発現する標的細胞を阻害または死滅させるための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、トランスジェニック細胞もしくは組換えウイルス、請求項２０に記載のキットの使用；あるいは、前記抗原を阻害または死滅させるための標的細胞製品の調製における使用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多標的キメラ抗原受容体、請求項１７に記載の核酸分子、請求項１８に記載の組換えベクター、発現カセット、組換え微生物株、トランスジェニック細胞、もしくは組換えウイルス、または請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２７】
前記免疫療法が、免疫細胞によって腫瘍細胞を阻害または死滅させるためであるか；あるいは前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であるか；あるいは前記抗原が、がん関連抗原であるか；あるいは前記抗原が、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がんに関する抗原またはこれらの任意の組合せであるか；前記腫瘍が、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がん、またはこれらの１つもしくは任意の組合せであるか；あるいは前記標的細胞が、原核細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞であるか；あるいは特に、前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞であるか；あるいは特に、ヒト細胞が、前記免疫細胞であるか；あるいは免疫細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に、多標的キメラ抗原受容体に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、通常、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインから主になる膜貫通融合タンパク質である（特許ＣＮ１０５３９２８８８Ａ）。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、キメラ抗原受容体の発現の際に、抗原特異性をもたらす。
【０００３】
ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、免疫細胞の特異的な標的化を決定する。最も典型的なＣＡＲは、しばしば、抗体の重鎖の可変領域およびリンカーによって結合される軽鎖可変領域からなるその抗原結合ドメインとして単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を使用する。その単純な構造のために、たった１本のペプチド鎖が存在し、これは、融合タンパク質の部分としてＣＡＲ分子への組み込みに適切である。腫瘍抗原それ自体が受容体である場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインはまた、受容体に特異的なそのリガンドによって置き換えられ得る。
【０００４】
ＣＡＲ分子の第２の単位構造は、細胞表面から膜にわたってＣＡＲ分子が発現することを可能にする、膜貫通型（ＴＭ）である。通常、ＣＡＲ分子は、腫瘍の処置のためのＴ細胞上で武装されており、したがって、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８などのＴ細胞発現タンパク質の多くの膜貫通領域は、ＣＡＲ膜貫通ドメインとして使用され得る。ＣＤ２８の膜貫通領域を有するＣＡＲの発現レベルがＣＤ３ζの膜貫通領域を有するものよりも高いことが文献に報告されている。加えて、一部のＣＡＲ分子構造では、スペーサー／ヒンジ領域が、抗原ドメインおよび膜貫通ドメインの間に挿入され得、これは、抗原構造および標的化された抗原の立体障害を低減し得る。ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤおよびＣＤ８の断片ペプチドは、しばしば、このような目的のために使用される。
【０００５】
細胞内シグナル伝達領域は、ＣＡＲ分子の最も重要な部分である。これは、細胞内シグナルを伝達し、免疫細胞の活性化および増殖を担う。第１世代ＣＡＲとしても公知である、初期の設計の細胞内シグナル伝達ドメインは、１種のＣＤ３ζ刺激シグナルのみを使用していた。ＣＤ３ζ分子と同じく、共刺激の第２のシグナルなしの３つのＩＴＡＭのみが存在する。したがって、第１世代のＣＡＲは、Ｔ細胞が腫瘍の抗原と結合したときに第２のシグナルを欠くことに起因してＴ細胞は増殖が困難であるので、弱い抗腫瘍効果しか有さず、臨床適用においてあまり有効ではない。これに基づいて、ＣＡＲは、ＣＡＲ中に第２のシグナルを伝達するＣＤ２８分子の活性ドメインを組み込むように改変され、それ故、第２世代のＣＡＲと呼ばれている。ＣＡＲ−Ｔ細胞への共刺激シグナルの付加は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲ−Ｔ細胞の生存を増強することができ、細胞が、増殖を維持しながらこれらの腫瘍細胞を死滅させることを可能にし、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能を改善する。したがって、第２世代のＣＡＲは、臨床適用において良好な抗腫瘍効果を示した。例えば、Alvavez-VallinaおよびHawkinsらは、ＣＡＲ分子に共刺激分子のＣＤ２８シグナル断片を挿入し、Ｔ細胞が対応する抗原によって刺激を受け得ることを実証した（Alvarezvallina  L、Hawkins  R  E.、１９９６年）。したがって、第２世代のＣＡＲは、臨床適用において良好な抗腫瘍効果を示した。しかしながら、外因性の共刺激分子の欠如で、すべての第２世代のＣＡＲがＴ細胞の増殖を促進するのに十分なＩＬ−２を産生できなかった。しかしながら、トランスジェニックＢ７共刺激分子を与えると、これらのトランスジェニックＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ−２を産生して、それら自体の増殖を促進することができた。これに基づいて、第３世代のＣＡＲが生み出され、これは、細胞内シグナル領域が、ＣＤ２８分子に加えて、別の共刺激分子、通常、ＯＸ４０または４−１ＢＢを有する（Till  BG、Jensen  MC、Wang  Jら、２０１２年）。第２世代のＣＡＲと比較して、第３世代のＣＡＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖し、サイトカインを産生する能力が良好である一方、相当の細胞毒性を有する（Pule  MA、Straathof  KC、Dotti  Gら、２００５年）。しかしながら、最近の研究は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能活性が、これらの細胞内シグナル配列に加えて標的細胞によって提供される細胞内受容体に関連していることを示している。第３世代のＣＡＲが第２世代のＣＡＲより優れているか否かは、臨床的に検証されていないままである。
【０００６】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞由来腫瘍において良好な結果を達成している。ＣＡＲＴ１９に基づくマウス抗体（「ＣＴＬ０１９」）による処置の臨床転帰は、ＣＬＬの患者および小児ＡＬＬについて、完全奏効の確立において、有望な結果を示している。軽減（Kalos  M、Levine  BL、Porter  DLら、２０１１年；Porterら、２０１１年；Gruppら、２０１３年）は、がんの適合処置の新たな時代を開いた。
【０００７】
キメラ抗原受容体−免疫細胞療法のＴ細胞またはＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大増殖は、ＩＬ−２刺激に依拠しており、したがって、ある程度の量のＩＬ−２を、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の培養培地に添加しなければならない（Bodnarら、２００８年；Grundら、２００５年）。ＮＫ細胞の培養を平易にするため、および臨床適用におけるＩＬ−２による毒性の副作用を考慮して、研究者らは、ＩＬ−２を安定的に発現させるためにＩＬ−２依存ＮＫ９２細胞を遺伝子操作し、これは、培養培地中へのＩＬ−２の添加を不必要にする（Shigeki  Nagashima、１９９８年；Y.K.  TAM、１９９９年）。ＩＬ−１５はＩＬ−２と機能的に類似しており、同じベータおよびガンマ受容体単位を共有している。研究は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５が、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖のために必要であることを示している（Boymanら、２００７年）。したがって、研究者らは、ＩＬ−１５発現ＮＫ細胞株を構築し、ＩＬ−１５発現ＮＫ９２細胞が、培地中で必要なＩＬ−２の量を大幅に低減し得ることを見出した（JIAN  ZHANG、２００４年；Jiangら、２００８年；０３１５２９６８．２）。ＩＬ−１５およびＩＬ−２は同じβγ受容体単位を共有するが、それぞれ、特異的なα受容体を有し、ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（ＩＬ−１５受容体αのｓｕｓｈｉドメイン）がＩＬ−１５のスーパーアゴニストであることが見出された。アゴニストは、ＩＬ−１５の機能を大いに増強することができ（Hanら、２０１１年；Mortierら、２００６年）（特許：２０１２８００３７１１４．２；２０１５１０３５８５４０．１）、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの複合体は、Ｔ／ＮＫ細胞の成長のサポートにおいてＩＬ−２の役割に代わって完全に使用することができ（Peter  S.  Kim  1、２０１６年；Rosarioら、２０１６年）、ＮＫ／ＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化され、腫瘍を死滅させるそれらの細胞毒性が増加する。したがって、細胞の免疫療法の有効性を改善するために、ＣＡＲ構築物において、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ複合体または他の機能性サイトカインならびに受容体複合体の融合を使用する傾向がある。
【０００８】
同時に、腫瘍は単一の標的によって処置され、腫瘍細胞はこの標的の発現レベルをダウンレギュレーションすることによって回避し、２つの標的によって腫瘍を処置することは、この問題を緩和するだろう（特許：２０１７１０００５３９５．８；２０１５１０７３３５８５．２；２０１７１０６４０６０９；２０１６１０３５３１１８．１）。例えば、研究者は、Ｃａｒ−Ｔ細胞が２つの標的を認識することを可能にする、キメラ抗原受容体の細胞外部分として、２つの異なる抗体または抗原リガンドの配列を一緒に連結するリンカーを使用することができ、これは、腫瘍免疫回避に起因する有効性の減少を止める（Hegde  M、Mukherjee  M、Grada  Zら、２０１６年；Schneider  D、Xiong  Y、Wu  Dら、２０１７年）。さらにまた、研究者らは、ＣＡＲ−Ｔの細胞外ドメインとして５Ｂ９タグという名称のバイオマーカーに対する抗体を使用し、異なる腫瘍標的を標的化する抗体の群を５Ｂ９タグに融合した。Ｃａｒ−Ｔは、それぞれの抗原への異なる抗体の結合によって異なる標的を認識する能力を得ることができる（Cartellieri  M、Feldmann  A、Koristka  Sら、２０１６年）。
加えて、キメラ抗原受容体の１つが免疫チェックポイント関連部位になる場合、免疫細胞の活性は、免疫学的チェックポイントによって伝達される負のシグナルを遮断することによって大きく増強され得る。例えば、ＰＤ−１（プログラム細胞死１）およびその受容体のＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞の活性の重要な調節因子である（OkazakiおよびHonjo、２００７年）。他の細胞におけるＰＤ−Ｌ１／２に対して、Ｔ細胞の表面におけるＰＤ−１の結合は、Ｔ細胞の阻害を引き起こし、これは、ヒトにおける自己免疫疾患の回避および免疫寛容を生じさせるプロセスにおいて重要な役割を果たすが、病原微生物に感染した一部の細胞およびがん細胞は、これらのＰＤ−Ｌ１／２のアップレギュレーション、次いで、またはＴ細胞におけるＰＤ−１発現によってＴ細胞の監視から逃れることもでき、疾患をもたらす（Freemanら、２０００年；Keirら、２００８年；Parryら、２００５年）。したがって、研究者らは、このシグナル伝達経路を遮断するために、抗原と結合するＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体を探索し、これは、Ｔ細胞の活性を有意に改善し、病原微生物およびがんに対する身体の抵抗性を増強することができる（Topalianら、２０１２年；Yanan  Guo1、２０１６年）。ＭＳＬＮを標的とするＣＡＲ−Ｔ療法とＰＤ１抗体の組合せは、この組合せが腫瘍細胞を死滅させるＣＡＲ−Ｔ細胞の能力を向上させることを示している（Cherkassky  L、Morello  A、Villenavargas  Jら、２０１６年）。さらにまた、研究者らは、免疫チェックポイント分子であるＰＤ１またはＣＴＬＡ−４を細胞内シグナル領域と連結させることによって、いわゆるキメラ抗原受容体スイッチングシステムを構築した。この方法では、腫瘍細胞および腫瘍内微小環境からの免疫チェックポイントによる負のシグナルが変化して、処置する腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を向上させ、オフターゲット効果の危険性を低減する（Liu  X、Ranganathan  R、Jiang  Sら、２０１６年；Fedorov  VD、Themeli  M、Sadelain  M．、２０１３年）。多くの臨床試験は、メラノーマ（Choら、２０１６年；Hamidら、２０１３年）、多発性骨髄腫（Badrosら、２０１５年）、白血病（Porkkaら、２０１４年）の処置のためのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体が良好な治療効果を有することを実証している（特許番号：２００３８０１０９９２９．８、２０１３１０２５８２８９．２、２０１１８００１９６２９．５）。したがって、複数の標的を認識するＣＡＲ分子の改変は、細胞の免疫療法において重要な役割を果たす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】中国特許出願公開２００３８０１０９９２９号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開２０１３１０２５８２８９号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開２０１１８００１９６２９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、多標的キメラ抗原受容体（図１）を提供することである。
【００１１】
本発明によって提供される多標的キメラ抗原受容体は、主ペプチド鎖および補助ペプチド鎖からなり；
【００１２】
主ペプチド鎖は、抗原結合ドメインＡ、補助ペプチド鎖連結ドメインＢ、膜貫通ドメインＣおよび細胞内シグナル伝達ドメインＤを含み；
【００１３】
補助ペプチド鎖は、主ペプチド鎖連結ドメインＦを含み；
【００１４】
抗原結合ドメインＡは、抗原と結合する機能を有するポリペプチドであり；
【００１５】
補助ペプチド鎖連結ドメインＢおよび主ペプチド鎖連結ドメインＦは、互いに組み合わされ；
【００１６】
補助ペプチド鎖連結ドメインＢおよび主ペプチド鎖連結ドメインＦは、互いに結合することができる、サイトカインおよび対応するサイトカイン受容体、またはサイトカインおよび対応するサイトカイン受容体断片であり；
【００１７】
膜貫通ドメインＣは、任意の膜結合性タンパク質の膜貫通領域または膜貫通タンパク質の膜貫通領域であり；
【００１８】
細胞内シグナル伝達ドメインＤは、一次シグナル伝達領域を含む。
【００１９】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００２０】
補助ペプチド鎖が、抗原結合ドメインＥをさらに含み；
【００２１】
抗原結合ドメインＥが、抗原と結合する機能を有するポリペプチドであり；
【００２２】
抗原結合ドメインＥおよび抗原結合ドメインＡが、同一または相違する。
【００２３】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００２４】
細胞内シグナル伝達ドメインＤが、共刺激シグナル伝達領域も含む。
【００２５】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００２６】
抗原と結合する機能を有するポリペプチドが、抗原と結合することが可能な抗体、抗原と結合することが可能なリガンドまたは抗原と結合する能力を有する受容体である。
【００２７】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００２８】
抗原と結合することが可能な抗体が、インタクト抗体、抗体のＦａｂ、抗体のＦｃ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、抗体のＶＬまたはＶＨの完全長ポリペプチドまたは部分断片であり；
【００２９】
抗原結合リガンドまたは抗原結合受容体が、リガンドまたは受容体の完全長ポリペプチドまたは部分断片である。
【００３０】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００３１】
抗原結合ドメインＡおよび抗原結合ドメインＥと結合することができる抗原が、細胞表面抗原またはＭＨＣ分子とポリペプチドの複合体である。
【００３２】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００３３】
抗原が、がん関連抗原であるか；
【００３４】
あるいは、一実施形態では、抗原が、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がんの関連抗原またはこれらの任意の組合せである。
【００３５】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００３６】
抗原結合ドメインＡおよび抗原結合ドメインＥによって結合される抗原が、以下：ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥＡ３、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン（Ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、１ＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＷＴ１、ＣＤ６８、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、ＥｐＣＡＭ、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ  １８、ＮＢ／７０Ｋ、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＰＳ、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６およびＥ７、またはこれらの任意の組合せであるか；
【００３７】
あるいは、抗原結合ドメインＡおよび抗原結合ドメインＥによって結合される抗原が、ＭＨＣおよび上記の抗原の短いペプチドの複合体であり、抗原は、結合ドメインＡおよび抗原結合ドメインＥを結合することができる抗原である。
【００３８】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００３９】
抗原結合ドメインＡおよび抗原結合ドメインＥによって結合される抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、Ｈｅｒ２、ＰＤＬ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＰ１００、Ｍａｒｔ１、ＷＴ１、またはこれらの任意の組合せであるか；
【００４０】
あるいは、抗原結合ドメインＡおよび抗原結合ドメインＥによって結合される抗原が、ＭＨＣおよび抗原の上記の短いペプチドの複合体である。
【００４１】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００４２】
サイトカインおよび対応するサイトカイン受容体が、ガンマ鎖サイトカインファミリーにおけるサイトカインおよび対応するサイトカイン受容体である。
【００４３】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００４４】
γｃサイトカインファミリーにおけるサイトカインおよび対応するサイトカイン受容体が、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα、ＩＬ４およびＩＬ４Ｒα、またはＩＬ２およびＩＬ２Ｒαであるか；
【００４５】
あるいは、γｃサイトカインファミリーにおけるサイトカインおよび対応するサイトカイン受容体が、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα、ＩＬ４およびＩＬ４Ｒα、またはＩＬ２およびＩＬ２Ｒαと７５％より高い相同性を有するポリペプチドである。
【００４６】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００４７】
一次シグナル伝達領域が、ＣＤ３−ζ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄのシグナル伝達領域、または上記シグナル伝達領域の組合せであるか；
【００４８】
あるいは、一次シグナル伝達領域が、配列６のタンパク質配列を有するＣＤ３−ζシグナル伝達領域、またはＣＤ３−ζシグナル伝達領域と７５％より高い相同性を有するポリペプチドである。
【００４９】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００５０】
共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３シグナル伝達領域、もしくはＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのシグナル伝達領域、または上記の１つもしくは複数の任意の組合せであるか；
【００５１】
あるいは、共刺激シグナル伝達領域が、特に、ＣＤ２８シグナル伝達領域および４−１ＢＢシグナル伝達領域の１つまたは両方の組合せであるか；
【００５２】
あるいは、共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８シグナル伝達領域、４−１ＢＢシグナル伝達領域と７５％より高い相同性を有する２つのポリペプチドの１つまたは両方の組合せである。
【００５３】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００５４】
多標的キメラ抗原受容体において、抗原結合ドメインＡまたはＥが、抗ＣＤ１９−ＳｃＦｖ、抗ＭＨＣ／ＧＰ１００−ＶＨＨ、抗ＭＨＣ／ＷＴ１−ＶＨ、抗ＣＤ２０−ＳｃＦｖ、抗ＣＤ２２−ＳｃＦｖまたはＰＤ１細胞外ドメインの１つまたは２つの組合せであり；
【００５５】
補助ペプチド連結ドメインが、ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉ、ＩＬ４Ｒα−Ｎ−ＦＮ３、ＩＬ１５またはＩＬ４であり；
【００５６】
膜貫通ドメインが、ＣＤ８の膜貫通領域またはＣＤ２８の膜貫通領域であり；
【００５７】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達領域が４−１ＢＢシグナル伝達領域と、またはＣＤ３ζシグナル伝達領域がＣＤ２８シグナル伝達領域と融合することによって得られるポリペプチドであり；
【００５８】
主ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５、ＩＬ４、ＩＬ１５ＲαｓｕｓｈｉまたはＩＬ４Ｒα−Ｎ−ＦＮ３であるか；
【００５９】
あるいは、多標的キメラ抗原受容体において、抗原結合ドメインＡが、抗ＣＤ１９−ＳｃＦｖであり；
【００６０】
補助ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉであり；
【００６１】
膜貫通ドメインが、ＣＤ８の膜貫通領域であり；
【００６２】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達領域が４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達領域と融合することによって得られるポリペプチドであり；
【００６３】
抗原結合ドメインＥが、ＰＤ１の細胞外領域であり；
【００６４】
主ペプチド鎖連結ドメインが、ＩＬ１５である。
【００６５】
補助ペプチド鎖ドメインおよび主ペプチド鎖ドメインは、最も好ましくは、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉである。ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉが、補助ペプチド鎖ドメイン（Ｂ）および主ペプチド鎖ドメイン（Ｆ）として使用される場合、これらは、ＮＫ細胞またはＴ細胞の増殖を刺激して、ＮＫ細胞またはＴ細胞におけるこの多標的キメラ受容体の発現を可能にする。
【００６６】
共刺激シグナル伝達領域は、以下のタンパク質の１つのシグナル伝達領域に由来するのが特に好ましい：ＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）または両方の組合せ。
【００６７】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００６８】
抗ＣＤ１９−ＳｃＦｖのアミノ酸配列が、配列１として記載され；
【００６９】
抗ＭＨＣ／ＧＰ１００−ＶＨＨのアミノ酸配列が、配列１５として記載され；
【００７０】
抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ１−ＶＨＨのアミノ酸配列が、配列１６として記載され；
【００７１】
抗ＣＤ２０−ＳｃＦｖのアミノ酸配列が、配列１７として記載され；
【００７２】
抗ＣＤ２２−ＳｃＦｖのアミノ酸配列が、配列１８として記載され；
【００７３】
抗ＭＨＣ／ＷＴ１−ＶＨのアミノ酸配列が、配列１９として記載され；
【００７４】
ＰＤ１の細胞外ドメインの配列が、配列２として記載され；ＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列は、配列４として記載され；
【００７５】
ＩＬ４Ｒα−Ｎ−ＦＮ３のアミノ酸配列が、配列２０として記載され；
【００７６】
ＣＤ８の膜貫通領域のアミノ酸配列が、配列５として記載され；
【００７７】
ＣＤ２８の膜貫通領域のアミノ酸配列が、配列２２として記載され；
【００７８】
ＣＤ３ζシグナル伝達領域のアミノ酸配列が、配列６として記載され；
【００７９】
４−１ＢＢシグナル伝達領域のアミノ酸配列が、配列８として記載され；
【００８０】
ＣＤ２８シグナルのアミノ酸配列が、配列７として記載され；
【００８１】
ＩＬ１５のアミノ酸配列が、配列３として記載され；
【００８２】
ＩＬ４のアミノ酸配列が、配列２１として記載される。
【００８３】
上記の多標的キメラ抗原受容体の中で、
【００８４】
多標的キメラ抗原受容体の主ペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列９、配列２３、配列２４、配列２５、配列２６、配列２７、配列２８または配列２９のいずれか１つであり；
【００８５】
受容体の補助ペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列３、配列４、配列１０、配列３０、配列３１、配列３２、配列３３または配列３４のいずれか１つである。
【００８６】
本発明の別の目的は、上記に記載の多標的キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を提供することである。
【００８７】
本発明によって提供される多標的キメラ抗原受容体をコードする核酸分子は、主ペプチド鎖をコードする核酸分子または補助ペプチド鎖をコードする核酸分子を含む。
【００８８】
受容体分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが公知のベクターから遺伝子を得ることによって、または遺伝子を含有する細胞および組織から直接単離するための標準的技術もしくは化学的にポリヌクレオチドの合成を利用することによってなどの本技術分野における公知の組換え方法を使用して得ることができる。
【００８９】
上記の核酸分子を含有する、組換えベクター、発現カセット、組換えバクテリア、細胞または組換えウイルスも本発明の範囲内である。
【００９０】
上記の組換えベクターは、上記の核酸配列または組合せを含む。一実施形態では、主ペプチド鎖（Ｘ）または補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードする核酸は、プロモーターにライゲーションされ、構築物は、主ペプチド鎖（Ｘ）または補助ペプチド鎖（Ｙ）を発現させるために、発現ベクターに組み込まれる。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するために使用することができる、転写および翻訳ターミネーター、初期配列およびプロモーターを含む。例えば、レンチウイルスベクターは、これらが長期間の安定な遺伝子の組み込みおよび娘細胞におけるこれらの複製を可能にするので、遺伝子の長期間の安定な遺伝を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、これらが肝細胞などの非分裂細胞に形質導入することができるので、マウス白血病ウイルスなどの発がん性レトロウイルスに由来するベクターを超える追加の利点を有する。これらはまた、低免疫原性という追加の利点を有する。本発明によって提供されるキメラ抗原受容体は、限定されるものではないが、主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードするそれぞれのベクターの共トランスフェクション、または、主ペプチド鎖（Ｘ）をコードする核酸配列および補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードする核酸配列を有する発現フレームワークの２つのセットを含有する発現ベクター、または主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）をコードする核酸配列が発現フレームワークにタンデムでライゲーションされること、ならびに両方のペプチド鎖が、主ペプチド鎖（Ｘ）および補助ペプチド鎖（Ｙ）の核酸配列の間のリボソーム結合部位を挿入することによって発現されることを含む、公知の手法で、同じ細胞中で発現することができる２つのペプチド鎖を含む。
【００９１】
上述の細胞が、原核細胞、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞であるか；
【００９２】
または、哺乳動物細胞が、特に、ヒト細胞であるか；
【００９３】
または、ヒト細胞が、特に、免疫細胞であるか、
【００９４】
あるいは、免疫細胞が、特に、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞である。
【００９５】
免疫療法における、上記に記載の多標的キメラ抗原受容体、上記の核酸分子、または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え株、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護の範囲内であり；
【００９６】
あるいは、免疫療法製品を調製するための、上記に記載の多標的キメラ抗原受容体、上記の核酸分子、または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え株、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護の範囲内である。
【００９７】
免疫細胞の培養および／または免疫細胞の増殖の促進のための、上記の多標的キメラ抗原受容体、上記の核酸分子、または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え株、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用は、本発明の範囲であり；
【００９８】
免疫細胞の培養および／または免疫細胞の増殖を促進するための製品の調製における、上述の多標的キメラ抗原受容体、上記の核酸分子、または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え株、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の範囲内である。
【００９９】
イムノアッセイのための、上記に記載の多標的キメラ抗原受容体、上記の核酸分子、または上記の組換えベクター、発現カセット、組換え株、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護の範囲内であり；
【０１００】
あるいは、本発明において、免疫検出キットを作成するための、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクターおよび発現カセット、組換えバクテリア、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護範囲であり；
【０１０１】
あるいは、腫瘍の診断のための、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクターおよび発現カセット、組換えバクテリア、細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護の範囲内であり；
【０１０２】
腫瘍の処置または診断のための製品の調製における、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクター、発現カセットおよび組換えバクテリア、組換え細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護範囲であり；
【０１０３】
腫瘍細胞の阻害または死滅における、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクター、発現カセットおよび組換えバクテリア、組換え細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護範囲であり；
【０１０４】
腫瘍細胞を阻害または死滅させるための製品の調製における、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクター、発現カセットおよび組換えバクテリア、組換え細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護範囲であり；
【０１０５】
抗原を発現する標的細胞の阻害または死滅における、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクター、発現カセットおよび組換えバクテリア、組換え細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護範囲であり；
【０１０６】
抗原を有する標的細胞を阻害または死滅させるための標的細胞製品の調製における、多標的キメラ抗原受容体、核酸分子、または組換えベクター、発現カセットおよび組換えバクテリア、トランスジェニック細胞もしくは組換えウイルス、あるいはキットの使用も、本発明の保護範囲である。
【０１０７】
免疫療法が、免疫細胞によって腫瘍細胞を阻害または死滅させるために使用されるか；
【０１０８】
あるいは、免疫細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などであるか：
【０１０９】
あるいは、抗原が、がん関連抗原であるか；
【０１１０】
あるいは、抗原が、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝臓がんおよび腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫および神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫および肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がん、またはこれらの任意の組合せの関連抗原であるか；
【０１１１】
あるいは、腫瘍が、以下：脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肝臓がんおよび腎臓がん、リンパ腫、白血病、肺がん、メラノーマ、転移性メラノーマ、中皮腫および神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、胸腺腫および肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ならびに子宮がん、または上記の組合せのいずれか１つであるか；
【０１１２】
あるいは、標的細胞が、原核細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞であるか；
【０１１３】
あるいは、哺乳動物細胞が、特に、ヒト細胞であるか；
【０１１４】
あるいは、ヒト細胞が、免疫細胞であるか；
【０１１５】
あるいは、免疫細胞が、特に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０１１６】
抗原を発現する標的細胞中の抗原は、多標的キメラ抗原受容体によって結合され得る抗原である。
【０１１７】
本発明におけるＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉは、ＩＬ１５受容体のアルファ鎖のｓｕｓｈｉ断片、略してＩＬ１５Ｒαｓｕｓｈｉであり、ＩＬ１５と結合する能力を有する。
【０１１８】
本発明において、ＩＬ４Ｒα−Ｎ−ＦＮ３は、ＩＬ４と結合する機能を有する、ＩＬ４受容体のアルファ鎖由来の断片である。
【０１１９】
本発明の主ペプチド鎖の抗原結合ドメイン（Ａ）および補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｅ）は、抗原と結合する機能を有する。抗原結合ドメインによって結合される抗原は、免疫応答、特に、Ｔ細胞介在免疫応答を引き起こす腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合ドメインの選択は、処置される疾患の具体的な種類に依存する。腫瘍抗原は、本分野において周知である。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書で言及される腫瘍抗原としては、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胚抗原（ＣＥＡ）、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよびアルファ−胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ／ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、エンテロカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、前立腺酵素、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、中性白血球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメソテリンが挙げられる。
【０１２１】
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つまたは複数の抗原がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として使用することができる多くのタンパク質を発現する。これらの分子としては、限定されるものではないが、メラノーマにおけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異抗原が挙げられる。他の標的分子は、がん遺伝子であるＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／Ｅｒｂ−２などの形質転換関連分子の群に属する。他の群の標的抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの胎児性のがん抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的な個体の遺伝子型の免疫グロブリンは、個体の腫瘍に固有の、真の腫瘍特異免疫グロブリン抗原を形成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、個体の遺伝子型）の一部は、モノクローナル抗体を使用する受動的療法のための標的として成功裏に使用されている。
【０１２２】
一実施形態では、本発明において言及される腫瘍抗原はまた、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に対して固有であり、身体の他の細胞において生じない。対照的に、ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に対して固有ではなく、抗原の免疫寛容状態が誘導され得ない条件下で正常細胞において発現することもできる。腫瘍における抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することができる疾患の状態下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できない場合に、胚発生の間に現れ、正常細胞において発現する抗原であり得るか、またはこれらは、腫瘍細胞においてより高いレベルで発現する一方で、正常細胞において極めて低いレベルで正常に存在する抗原であり得る。
【０１２３】
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２；腫瘍特異多系統抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過剰発現した胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現した発がん性遺伝子および変異した腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座によって発生した固有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、１ＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他のタンパク質抗原は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−胎児性タンパク質、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３／ＣＡ、２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼輪状親和性タンパク質Ｃ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＰＳおよびＴＬＰを含む。
【０１２４】
一実施形態では、本明細書において言及される腫瘍抗原は、ＭＨＣと前記抗原ペプチド断片の複合体であり得、限定されるものではないが、ＨＬＡ−ＧＰ１００複合体、ＨＬＡ−Ｍａｒｔ−１複合体およびＨＬＡ−ＷＴ１複合体などが挙げられる。
【０１２５】
一実施形態では、前記主ペプチド鎖中の抗原結合ドメイン（Ａ）または補助ペプチド鎖中の抗原結合ドメイン（Ｅ）は、抗原、リガンド、受容体、抗原結合能を有するポリペプチドまたはこれらの任意の組合せと組み合わせることができる抗体である。
【０１２６】
抗体は、完全ペプチド鎖、もしくはＩｇ、ＦａｂおよびｓｃＦｖのペプチド断片、またはこれらの任意の組合せであり得る。リガンドまたは受容体は、完全ペプチド鎖、ペプチド断片、またはこれらの任意の組合せであり得る。
【０１２７】
補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｂ）および主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｆ）は、相互結合機能を有するペプチド断片のペアである。相互結合機能を有するペプチド断片は、互いと組み合わせられ得る受容体およびリガンドのペア、または互いと組み合わせられ得る抗体および抗原のペアであり得る。相互に組み合わされる受容体およびリガンドとしては、限定されるものではないが、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒアルファ、ＩＬ４およびＩＬ４Ｒ、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒアルファ、ＣＤ１６およびＩｇＧ  Ｆｃ、ＣＤ３２およびＩｇＧ  Ｆｃ、ＣＤ６４およびＩｇＧ  Ｆｃが挙げられる。
【０１２８】
ここで、膜貫通ドメイン（Ｃ）は、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の膜貫通領域に由来し得る。膜貫通ドメインに関して、一部の例では、構造ドメインが、立体障害を低減するために、表面で発現する膜タンパク質の同一または相違する膜貫通領域と結合することを防止することができるように、膜貫通ドメインが選択されてもよく、または改変がアミノ酸置換によって行われる。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源に由来し得る。天然供給源において、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、限定されるものではないが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびＩＣＯＳを含むものに由来し得る。
【０１２９】
ここで、細胞内シグナル伝達ドメイン（Ｄ）は、シグナル伝達領域を含み、共刺激シグナル伝達領域またはこれらの組合せも含んでいてもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能のシグナルを伝達し、細胞が特異的な機能を実行するのを導く、タンパク質断片を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカイン分泌による細胞の溶解活性または補助的活性であり得る。細胞内シグナル伝達構造ドメイン全体を使用することができるが、多くの例では、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断型は、これが伝達エフェクターの機能シグナルを有する限り、鎖全体に代えて使用することができる。
【０１３０】
一次細胞血漿シグナル伝達配列は、刺激の様式または阻害の様式で免疫細胞の一次活性化を刺激する。刺激の様式で作用する一次細胞シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフすなわちＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。
【０１３１】
本発明において一次細胞質シグナル伝導を有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、またはこれらの組合せが挙げられる。好ましくは、本発明によって開示されるＣＡＲ構築物の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ζに由来する。
【０１３２】
本発明における共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子を含む細胞内ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に対するが、抗原受容体またはそのリガンドに対してではない、リンパ球の有効な応答によって必要とされる細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。したがって、本発明は、共刺激シグナル分子として４−１ＢＢおよびＣＤ２８を主に使用するが、他の共刺激要素も本発明の範囲内である。
【０１３３】
多標的キメラ抗原受容体の細胞シグナル伝達部分の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の配列で、互いと連結され得る。
【０１３４】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３−ゼータ、および４−１ＢＢのシグナル断片を含む。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達構造は、ＣＤ３−ゼータのシグナル部分およびＣＤ２８のシグナル伝達構造を含む。
【０１３５】
短いオリゴペプチドまたはポリペプチドは、多標的キメラ抗原受容体の機能に影響を与え得ないように、多標的キメラ抗原受容体中のモジュールの間を連結するペプチドとして使用することができ、好ましくは、連結するペプチドの長さは、２〜１０アミノ酸の間であり、連結するペプチドのアミノ酸は、好ましくは、グリシンおよびセリンである。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、多標的キメラ抗原受容体の模式図である。多標的キメラ抗原受容体は、主ペプチド鎖および補助ペプチド鎖からなり、主ペプチド鎖は、抗原結合ドメインＡ、補助ペプチド鎖連結ドメインＢ、膜貫通ドメインＣおよび細胞内シグナル伝達ドメインＤを含み、補助ペプチド鎖は主ペプチド鎖連結ドメインＦを含み、これは抗原結合ドメインＥを含むこともできる。
【０１３７】
【図２】図２は、ＲａｃｅＣａｒ−１発現カセットの模式図である。本発明は、プロモーターおよびＲａｃｅＣａｒ−１をコードする遺伝子で構成されるＲａｃｅＣａｒ−１発現カセットを開示する。
【０１３８】
【図３−１】図３は、異なるＲａｃｅＣａｒ発現カセットの模式図である。他のＲａｃｅＣａｒ発現カセットは、プロモーターおよびＲａｃｅＣａｒをコードする遺伝子で構成される。
【図３−２】同上
【０１３９】
【図４−１】図４は、細胞表面で発現するＲａｃｅＣａｒを検証するためのＦＡＣＳ分析である。図中の水平の座標はＩＬ１５のレベルを表し、Ｔ細胞およびＮＫ９２細胞は、影響を受けず、陰性対照として使用され、表面でのＩＬ１５の発現は検出されなかった。ＩＬ１５の異なるレベルの発現は、ＲａｃｅＣａｒウイルスで感染したＴ細胞およびＮＫ９２細胞の表面で検出することができる。ＩＬ１５は、ＲａｃｅＣａｒ（ＲａｃｅＣａｒ−８、ＲａｃｅＣａｒ−１２およびＲａｃｅＣａｒ−１３を除く）の補助ペプチド鎖中のドメイン分子であるので、ＩＬ−１５は、これが細胞の表面で発現した主ペプチド鎖のドメインと結合した場合に、細胞の表面でのみ検出することができ、これは、ＲａｃｅＣａｒが、Ｔ細胞およびＮＫ９２細胞の表面で発現することができ、発現したＩＬ１５が免疫学的活性を有することを実証した。その一方で、ＩＬ１５は、ＲａｃｅＣａｒ−１２およびＲａｃｅＣａｒ−１３における主ペプチド鎖にあり、直接的に検出することができる。
【図４−２】同上
【０１４０】
【図５】図５は、ウエスタンブロットによって実証されたＲａｃｅＣａｒ発現である。ＲａｃｅＣａｒ−１−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−２−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−６−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−７−２９３ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−１０−２９３Ｔの試料を、それぞれ、レーン１〜５にロードした。第６レーンは、陰性対照として使用したトランスフェクションなしの２９３Ｔ細胞である。下側のストリップは、ベータ−アクチン参照である。ＰＤ１の特異的ストリップは、レーン１〜レーン５において見ることができ、これは、ＲａｃｅＣａｒがトランスフェクトされた細胞で発現していることを示す。
【０１４１】
【図６−１】図６は、ＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２細胞の実証された死滅能力である。グラフの水平の座標は、エフェクター細胞の標的細胞に対する比であり、垂直の座標は、死滅効率である。ＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−３−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−４−ＮＫ９２およびＲａｃｅＣａｒ−５−ＮＫ９２はすべて、３ｍ−ＣＤ１９−ｌｕｃ細胞を死滅させることができ、死滅効率は、ＮＫ９２の死滅効率よりも高く、これは、ＣＤ１９およびＰＤ−Ｌ１を標的にする多標的キメラ抗原受容体のＲａｃｅＣａｒ−１がＮＫ９２細胞で発現し、生物学的機能を有していることを実証する。これらは、ＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２に対する抗ＣＤ１９抗体の添加を伴う実験群の死滅能力を低減する一方で、抗ＣＤ１９抗体がＲａｃｅＣａｒ−１の標的細胞への結合を遮断するので、ＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２の死滅能力は、変化せず、その結果、標的細胞におけるラセマーゼ−１−ＮＫ９２の死滅能力が阻害され、これは、ＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２が３ｍ−ＣＤ１９−ｌｕｃ細胞の死滅に対する特異性を有することを証明する。
【図６−２】同上
【０１４２】
【図７】図７は、ＲａｃｅＣａｒ−Ｔ細胞およびＣａｒ−Ｔ細胞の間の標的細胞に対する死滅効率の比較である。グラフの水平の座標は、エフェクター細胞の標的細胞に対する比であり、垂直の座標は、死滅効率である。ＲａｃｅＣａｒ−１−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−４−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−５−Ｔ細胞は、ｋ５６２−ｃｄ１９−ｌｕｃ細胞を死滅させることができ、これは、ＲａｃｅＣａｒ−１、ＲａｃｅＣａｒ−４およびＲａｃｅＣａｒ−５が、Ｔ細胞において発現し、生物学的機能を有すること、ならびにＲａｃｅＣａｒ−Ｔ細胞の死滅能力が、通常のＣａｒ−Ｔ細胞の死滅能力よりも高いことを実証する。
【０１４３】
【図８】図８は、ＭＨＣ／ＷＴ−１複合体を標的にするＲａｃｅＣａｒ−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２の異なる形態の機能確認である。グラフの水平の座標は、エフェクター細胞の種類であり、垂直の座標は、死滅効率である。ＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２細胞およびＲａｃｅＣａｒ−Ｔ細胞は両方ともＢＶ１７３−ｌｕｃ細胞を死滅させることができ、死滅効率は、未感染Ｔ細胞またはＮＫ９２細胞の死滅効率よりも高く、ＲａｃｅＣａｒ−６、ＲａｃｅＣａｒ−７、ＲａｃｅＣａｒ−８、ＲａｃｅＣａｒ−９、ＲａｃｅＣａｒ−１０、ＲａｃｅＣａｒ−１１、ＲａｃｅＣａｒ−１２、ＲａｃｅＣａｒ−１３およびＲａｃｅＣａｒ−１４が、Ｔ細胞およびＮＫ９２細胞の両方で発現することができ、対応する標的細胞についての死滅を誘導する生物学的機能を有することを実証する。
【０１４４】
【図９】図９は、免疫細胞の増殖を誘導するＲａｃｅＣａｒの能力についてのＦＡＣＳ分析である。０日目では、４群の細胞の蛍光シグナルはほぼ同じである。Ｔ細胞群は陰性対照群であり、５日目のその蛍光強度は、０日目のものと比較して、基本的に変化していない。５日目の陽性対照としてのＴ細胞＋ＩＬ−２群のＦＡＣＳ分析は、図において見られ得、蛍光シグナルが、０日目のものと比較して弱くなり、細胞は異なる蛍光染色を示し、細胞が、分裂および増殖の表現型を示すことを実証する。ＲａｃｅＣａｒ−１−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−２−Ｔの蛍光シグナルの分布は、陽性対照群のものと同様であり、ＲａｃｅＣａｒ−１−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−２−Ｔが、ＩＬ２なしでも培養培地中で増殖することができ、ＲａｃｅＣａｒがＴ細胞などのような免疫細胞の増殖を促進する能力を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４５】
以下の実施例において使用される実験方法は、特に記載がなければ、従来の方法である。
【０１４６】
本発明の実施形態で使用される材料、試薬などは、特に説明がなければ、市販の供給業者から入手することができる。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１  多標的キメラ抗原受容体の構造および発現ベクターの構築）
１．  多標的キメラ抗原受容体（ＲａｃｅＣａｒ）タンパク質を、主ペプチド鎖Ｘおよび補助ペプチド鎖Ｙを複合体化することによって得る。
【０１４８】
主ペプチド鎖（Ｘ）は、抗原結合ドメイン（Ａ）、補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｂ）および膜貫通ドメイン（Ｃ）、ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（Ｄ）を含み、補助ペプチド鎖（Ｙ）は、抗原結合ドメイン（Ｅ）および主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｆ）を含む。補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｂ）および主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｆ）は、互いに相補的に結合し、主ペプチド鎖Ｘおよび補助ペプチド鎖Ｙが重合して多標的キメラ抗原受容体（ＲａｃｅＣａｒ）を形成することを可能にする。
【０１４９】
ＣＤ１９およびＰＤ−Ｌ１の陽性細胞の両方を標的にする多標的キメラ抗原受容体（ＲａｃｅＣａｒ−１）は、主ペプチド鎖Ｘ１および補助ペプチド鎖Ｙ１を重合することによって得られる。
【０１５０】
ＲａｃｅＣａｒ−１において、抗ＣＤ１９のＳｃＦｖ（配列１）を、主ペプチド鎖Ｘ１の抗原結合ドメイン（Ａ１）として選択し、補助ペプチド鎖連結ドメイン（Ｂ）は、ＩＬ１５Ｒ［アルファ］のｓｕｓｈｉ断片（配列４）を採用し、膜貫通のＣＤ８（配列５）を膜貫通ドメイン（Ｃ）として選択し、細胞内シグナル伝達ドメイン（Ｄ）を、４１ＢＢシグナル伝達ドメイン（配列８）をＣＤ３ゼータシグナル伝達領域（配列６）に連結させることによって構築し、補助ペプチド鎖Ｙ１の抗原結合ドメイン（Ｅ）は、ＰＤＬ１の受容体であるＰＤ１の細胞外領域（配列２）を採用する。ＩＬ１５（配列３）は、主ペプチド鎖連結ドメイン（Ｆ）として使用される。最後に、補助ペプチド鎖Ｙ１（配列１０）と連結した主ペプチド鎖Ｘ１（配列９）を作成する。
【０１５１】
２．  分泌性シグナルペプチド（配列１１）を、主ペプチド鎖Ｘ１のＮ末端の前に挿入し、これを、コード核酸のＤＮＡ−Ｘ１（配列１３）として人工的に合成し、同様に、２Ａシグナルペプチド（配列１２）を、補助ペプチド鎖Ｙ１のＮ末端の前に追加し、コード配列を、配列ＤＮＡ−Ｘ２（配列１４）として合成する。
【０１５２】
３．  Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＤＮＡ−Ｘ１の各末端に追加し、Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断して、ＤＮＡ−Ｘ１の断片を得、同様に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＤＮＡ−Ｘ２配列の５’末端に追加し、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を追加し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって切断して、ＤＮＡ−Ｘ２の核酸断片を得る。
【０１５３】
４．  ３で得られた２つの核酸断片を、同じ酵素の組合せによって切断されたベクターｐＦＵＧＷ（ａｄｄｇｅｎｅ、ＵＳＡ）に挿入し、ライゲーションされた生成物をｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換し、個々のコロニーを取り出し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分析を使用してスクリーニングし、最後に、組換えベクターであるｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１を得る。組換えベクターのｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１を、ｐＦＵＧＷベクターのＢａｍＨＩ切断部位およびＥｃｏＲＩ切断部位の間の断片について、ＲａｃｅＣａｒ−１（コード核酸は、配列１３、ＡＡＧＣＴＴおよび配列１４で構成され、配列１３の最後のヌクレオチドは、ＡＡＧＣＴＴの最初の塩基に隣接し、配列１４の最初のヌクレオチドは、ＨｉｎｄＩＩＩのための消化部位であるＡＡＧＣＴＴの最後の塩基に隣接する）を発現させるための核酸と置き換える。ＲａｃｅＣａｒ発現カセットを、ＲａｃｅＣａｒ−１のコード核酸およびｐＦＵＧＷ中のプロモーターによって形成する（図２）。
【０１５４】
５．  同じ方法での他の多標的キメラ抗原受容体の設計を表１に示す。
【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
表１において、抗ＭＨＣ／ＧＰ１００−ＶＨＨのアミノ酸配列を配列１５に記載し、抗ＭＨＣ／Ｍａｒｔ−１−ＶＨのアミノ酸配列を配列１６に記載し、抗ＣＤ２０−ＳｃＦｖのアミノ酸配列を配列１７に記載し、抗ＣＤ２２−ＳｃＦｖのアミノ酸配列を配列１８に記載し、抗ＭＨＣ／ＷＴ１−ＶＨのアミノ酸配列を配列１９に記載し、ＩＬ４Ｒアルファ−Ｎ−ＦＮ３アミノ酸配列の配列を配列２０に示し、ＩＬ４の配列を配列２１に記載し、ＣＤ２８膜貫通領域の配列を配列２２に記載する。
【０１５７】
異なる主ペプチド鎖Ｘの配列は、以下の通り記載する：主ペプチド鎖Ｘ２（アミノ酸配列は配列２３である）；主ペプチド鎖Ｘ３（アミノ酸配列は配列２４である）；Ｘ４（アミノ酸配列は配列２５である）；Ｘ５（アミノ酸配列は配列２６である）；Ｘ６（アミノ酸配列は配列２７である）；Ｘ７（アミノ酸配列は配列２８である）；Ｘ８（アミノ酸配列は配列２９である）；ならびに、補助ペプチド鎖Ｙ２（アミノ酸配列は配列３０である）；Ｙ３（アミノ酸配列は配列３１である）；Ｙ４（アミノ酸配列は配列３２である）；Ｙ５（アミノ酸配列は配列３３である）；Ｙ６（アミノ酸配列はＩＬ１５の配列であり、配列３に記載する）；Ｙ７（ＩＬ１５Ｒアルファ−ｓｕｓｈｉ、アミノ酸配列は配列４である）；Ｙ８（アミノ酸配列は配列３４である）；およびＹ９（アミノ酸配列は配列３９である）。
【０１５８】
ここで、
【０１５９】
ＲａｃｅＣａｒ−２は、主ペプチド鎖Ｘ２および補助ペプチド鎖Ｙ１で構成され；
【０１６０】
ＲａｃｅＣａｒ−３は、主ペプチド鎖Ｘ２および補助ペプチド鎖Ｙ２で構成され；
【０１６１】
ＲａｃｅＣａｒ−４は、主ペプチド鎖Ｘ１および補助ペプチド鎖Ｙ３で構成され；
【０１６２】
ＲａｃｅＣａｒ−５は、主ペプチド鎖Ｘ１および補助ペプチド鎖Ｙ４で構成され；
【０１６３】
ＲａｃｅＣａｒ−６は、主ペプチド鎖Ｘ３および補助ペプチド鎖Ｙ１で構成され；
【０１６４】
ＲａｃｅＣａｒ−７は、主ペプチド鎖Ｘ４および補助ペプチド鎖Ｙ１で構成され；
【０１６５】
ＲａｃｅＣａｒ−８は、主ペプチド鎖Ｘ５および補助ペプチド鎖Ｙ９によって形成され；
【０１６６】
ＲａｃｅＣａｒ−９は、主ペプチド鎖Ｘ６および補助ペプチド鎖Ｙ１で構成され；
【０１６７】
ＲａｃｅＣａｒ−１０は、主ペプチド鎖Ｘ７および補助ペプチド鎖Ｙ５で構成され；
【０１６８】
ＲａｃｅＣａｒ−１１は、主ペプチド鎖Ｘ３および補助ペプチド鎖Ｙ６で構成され；
【０１６９】
ＲａｃｅＣａｒ−１２は、主ペプチド鎖Ｘ８および補助ペプチド鎖Ｙ７で構成され；
【０１７０】
ＲａｃｅＣａｒ−１３は、主ペプチド鎖Ｘ８および補助ペプチド鎖Ｙ８で構成され；
【０１７１】
ＲａｃｅＣａｒ−１４は、主ペプチド鎖Ｘ３および補助ペプチド鎖Ｙ５で構成される。
【０１７２】
ＲａｃｅＣａｒ１と同じく、他のＲａｃｅＣａｒについての発現ベクターを構築する場合、分泌リーダー配列（配列１１）が、他のＲａｃｅＣａｒの主ペプチド鎖のＮ末端配列の前に追加することが必要であり、ここで、２Ａシグナルペプチドが、補助ペプチド鎖のアミノ酸配列の前に追加され、特異的なコード核酸配列は以下の通りである。
【０１７３】
ＲａｃｅＣａｒ２を発現する核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ２（配列４０）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ１（配列１４）で構成され；
【０１７４】
ＲａｃｅＣａｒ３を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ２（配列４０）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ２（配列４７）で構成され；
【０１７５】
ＲａｃｅＣａｒ４を発現する核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ１（配列１３）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ３（配列４８）で構成され；
【０１７６】
ＲａｃｅＣａｒ５を発現する核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ１（配列１３）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ４（配列４９）で構成され；
【０１７７】
ＲａｃｅＣａｒ６を発現する核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ３（配列４１）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ１（配列１４）で構成され；
【０１７８】
ＲａｃｅＣａｒ７を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ４（配列４２）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ１（配列１４）からなり；
【０１７９】
ＲａｃｅＣａｒ８を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ５（配列４３）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ９（配列５０）からなり；
【０１８０】
ＲａｃｅＣａｒ９を発現する核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ６（配列４４）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ１（配列１４）で構成され；
【０１８１】
ＲａｃｅＣａｒ１０を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ７（配列４５）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ５（配列５１）で構成され；
【０１８２】
ＲａｃｅＣａｒ１１を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ３（配列４１）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ６（配列５２）で構成され；
【０１８３】
ＲａｃｅＣａｒ１２を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ８（配列４６）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ７（配列５３）で構成され；
【０１８４】
ＲａｃｅＣａｒ１３を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ８（配列４６）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ８（配列５４）で構成され；
【０１８５】
ＲａｃｅＣａｒ１４を発現するための核酸配列は、ＤＮＡ−Ｘ３（核酸配列４１）、ＡＡＧＣＴＴおよびＤＮＡ−Ｙ５（配列５１）で構成される。
【０１８６】
他の多標的キメラ抗原受容体を発現するための核酸配列は、同様の方法で得られ、ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−２からｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１４の範囲の組換えベクターが構築される。組換えベクターにおいて、他の個々の多標的キメラ抗原受容体ＲａｃｅＣａｒに対する発現カセットが存在する（図３）。
【０１８７】
ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−２からｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１４の範囲の組換えベクターは、ｐＦＵＧＷベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位の間の断片の、それぞれ、ＲａｃｅＣａｒ２からＲａｃｅＣａｒ１４を発現するための核酸配列による置き換えに由来する。
【０１８８】
（実施例２  細胞におけるＲａｃｅＣａｒ発現を確認するためのＦＡＣＳ分析）
【０１８９】
１．  実施例４で得られたＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−３−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−４−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−５−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−６−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−７−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−９−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１０−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１１−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１２−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１３−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１４−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−２−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−３−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−４−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−５−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−６−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−７−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−９−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１０−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１１−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１２−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１３−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１４−Ｔ細胞を、それぞれ、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に懸濁させ、細胞の濃度を、１×１０Ｅ６／ｍｌの範囲になるように制御する。
【０１９０】
２．  １．５μｌの抗ｈＩＬ−１５ＰＥコンジュゲート（Ｒ＆Ｄ、ＩＣ２４７１Ｐ）を、２００μｌの処理細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートする。上清を遠心分離によって除去し、細胞を、等量のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を添加することによって再懸濁する。
【０１９１】
３．  細胞表面で発現するＲａｃｅＣａｒを検証するためのＦＡＣＳ分析（図４）。図中の水平の座標はＩＬ１５のレベルを表し、Ｔ細胞およびＮＫ９２細胞は、感染せず、陰性対照として使用され、表面でのＩＬ１５の発現は検出されなかった。ＩＬ１５の異なるレベルの発現は、ＲａｃｅＣａｒウイルスで感染したＴ細胞およびＮＫ９２細胞の表面で検出することができる。ＩＬ１５は、ＲａｃｅＣａｒ（ＲａｃｅＣａｒ−８、ＲａｃｅＣａｒ−１２およびＲａｃｅＣａｒ−１３を除く）の補助ペプチド鎖中のドメイン分子であるので、ＩＬ−１５は、これが細胞の表面で発現した主ペプチド鎖のドメインと結合した場合に、細胞の表面でのみ検出することができ、これは、ＲａｃｅＣａｒが、Ｔ細胞およびＮＫ９２細胞の表面で発現することができ、発現したＩＬ１５が免疫学的活性を有することを実証した。その一方で、ＩＬ１５は、ＲａｃｅＣａｒ−１２およびＲａｃｅＣａｒ−１３における主ペプチド鎖にあり、直接的に検出することができる。
【０１９２】
（実施例３  ウエスタンブロットによって実証されたＲａｃｅＣａｒの発現）
【０１９３】
１．  １．２×１０Ｅ６のＬｅｎｔｉ−Ｘ−２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、６３２１８０、本明細書の以下で、略して、２９３Ｔと称する）を６ウェルプレートに入れ、３７℃の温度および５％のＣＯ２で、終夜培養する。
【０１９４】
２．  上記１に記載の２９３Ｔ細胞を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、実施例１に列挙したｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１、ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−２、ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−６、ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−７およびｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１０のベクターで、それぞれトランスフェクトし、ＲａｃｅＣａｒ−１−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−２−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−６−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−７−２９３ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−１０−２９３Ｔと名付け、３７℃の温度で、５％のＣＯ２で４８時間培養する。
【０１９５】
３．  ５×１０Ｅ６のＲａｃｅＣａｒ−１−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−２−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−６−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−７−２９３ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−１０−２９３Ｔを取り、１５００Ｒで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【０１９６】
４．  ２００μｌの細胞溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｐ００１３Ｂ）をそれぞれの細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を８０００ｇで５分間遠心分離した。それぞれの試料について２０μｌの上清を５倍のタンパク質電気泳動緩衝液と混合し、９５℃で５分間インキュベーションして、電気泳動試料として使用した。
【０１９７】
５．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ゲルを、１００Ｖ、２００ｍＡで１時間、膜に移した。
【０１９８】
６．  タンパク質を移したＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜を、５％のＰＢＳのスキムミルクで終夜ブロッキングした。膜を、シェーカーでＰＢＳＴを用いて各回１５分間で、３回洗浄した。
【０１９９】
７．  移したタンパク質を有するＰＶＤＦを、１％のスキムミルクのＰＢＳ溶液に溶解した０．１％の抗ＰＤ１抗体（Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ１０８６−１００）とともに、振とう条件で１時間、インキュベートした。膜を、ＰＢＳＴを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄した。
【０２００】
８．  洗浄した膜を、１％のスキムミルクのＰＢＳ溶液に溶解した０．１％のＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ａ０２１６）とともに、振とう条件で１時間、インキュベートした。膜を、ＰＢＳＴを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄した。
【０２０１】
９．  膜をＷ−ＴＭＢキット（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃ５１００２５−０００５）で可視化し、結果を図５に示す。第１〜第５レーンの試料は、それぞれ、ＲａｃｅＣａｒ−１−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−２−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−６−２９３Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−７−２９３ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−１０−２９３Ｔに属し、トランスフェクションなしの陰性対照の２９３Ｔ細胞は第６レーンに位置する。下部の染色ラインは、ベータ−アクチン参照である。図５に示されるように、ＰＤ１染色としての特異的なラインをレーン１〜レーン５で見ることができ、ＲａｃｅＣａｒがトランスフェクトされた細胞の表面で十分に発現していたことを実証する。
【０２０２】
（実施例４  ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒを有するレンチウイルスのパッケージングおよび細胞感染）
【０２０３】
１．  例としてＲａｃｅＣａｒ−１を挙げ、２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションのために７０〜８０％の密度まで終夜培養した。ウイルス殻タンパク質を提供するｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ｇ、ｐＣＭＶ−デルタＲ８．９１（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ＧおよびｐＣＭＶ−デルタＲ８．９１はＡｄｄｇｅｎｅの製品であった）を、実施例１で調製したｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１と、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ｇ：ｐＣＭＶ−デルタＲ８．９１：ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１＝１：３：４の比に従って混合して、４０μｇの共トランスフェクションプラスミドを得た。
【０２０４】
２．  チューブ１と印をつけた１５ｍｌの遠心分離チューブに、上記１に記載の共トランスフェクションプラスミドを添加し、無血清ＤＭＥＭを１．５ｍｌまで添加し、チューブ２と印をつけた別の１５ｍｌの遠心分離チューブに、１２０μｌのＰＥＩ溶液（Ｓｉｇｍａ、ＧＦ７０２１５８２５、１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、無血清ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ）を１．５ｍｌまで添加した。チューブ１およびチューブ２の両方の試薬を、それぞれ、適切に混合した。次いで、チューブ１をボルテックスし、チューブ２中のＰＥＩをチューブ１に１滴ずつ添加して、プラスミド−ＰＥＩ混合物溶液を得て、溶液を、３０分間室温に保ち、混合物を、細胞を懸濁させていないトランスフェクション用の２９３Ｔ培養物に添加した。トランスフェクトされた細胞を、３７℃／ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。次いで、細胞の培養培地を廃棄し、２０ｍｌの新たな１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを補充した。最後に、酪酸ナトリウムを、酪酸ナトリウムの最終濃度が１０ｍＭまで、添加した。細胞を、５％ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で４８時間さらに培養した。
【０２０５】
３．  細胞培養上清を４０００ｇ／分で１５分間遠心分離することによって収集し、上清を０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過して、１×１０６ＴＵ／ｍｌのウイルス溶液を得た。元のウイルス溶液に、１／３容積の４０％ＰＥＧ溶液（ｇ／ｇ）を添加し、混合後、４℃の温度で終夜静置する。翌日、ウイルスの沈殿物を１８００ｇ、４℃で４５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ウイルス沈殿物を元の容積の１／１０の培養培地（Ｔ細胞についてＸ−ＶＩＶＯ１５、ＮＫ９２細胞についてＭＥＭ−Ａｌｐｈａ）で再懸濁して、１０倍濃縮のウイルス懸濁物を得た。
【０２０６】
４．  ３×１０５のＮＫ９２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２４０７）および１×１０６のＴ細胞（健康な血液ドナーからのＴ細胞、勾配遠心分離によって分離、ＯＫＴ３を使用することによって刺激および培養）を、それぞれ、１×１０７のウイルス粒子で感染させ、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ、Ｈ９２６８−５Ｇ）を添加した。感染細胞を２４ウェルプレートの１つのウェルに移し、１５００Ｒ、３２℃で４５分間遠心分離した。プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で３時間インキュベートし、培地を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｔ細胞のために、１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３が必要であった）を含有する培地で交換し、プレートを上記と同じ条件でインキュベートして、以下の実験のためのＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２およびＲａｃｅＣａｒ−１−Ｔを得た。
【０２０７】
５．  上記の記載の方法と同じく、ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１ベクターのみを、ｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−２からｐＦＵＧＷ−ＲａｃｅＣａｒ−１４のうちの１つとそれぞれ置き換えて、対応する、ＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−３−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−４−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−５−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−６−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−７−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−８−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−９−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１０−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１１−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１２−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１３−ＮＫ９２細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１４−ＮＫ９２細胞、ならびにＲａｃｅＣａｒ−２−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−３−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−４−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−５−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−６−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−７−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−８−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−９−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１０−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１１−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１２−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−１３−Ｔ細胞およびＲａｃｅＣａｒ−１４−Ｔ細胞を得た。
【０２０８】
（実施例５  ＮＫ９２におけるＲａｃｅＣａｒの発現およびＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２の標的化死滅の確認）
【０２０９】
１．  標的細胞の３ｍ−ＣＤ１９−ｌｕｃを、ＣＤ１９（配列３６）およびルシフェラーゼ（配列３７）の導入遺伝子をＭａｌｍｅ−３Ｍ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−６４）のゲノムに組み込むことによって調製した。実験群を以下の通り分けた：１、実施例４を使用することによって調製した、エフェクター細胞として働くＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２；２、実施例４を使用することによって調製した、エフェクター細胞として働くＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２；３、実施例４を使用することによって調製した、エフェクター細胞として働くＲａｃｅＣａｒ−３−ＮＫ９２；４、実施例４を使用することによって調製した、エフェクター細胞として働くＲａｃｅＣａｒ−４−ＮＫ９２；５、実施例４を使用することによって調製した、エフェクター細胞として使用されるＲａｃｅＣａｒ−５−ＮＫ９２；６、エフェクター細胞として使用されるＮＫ９２；７、エフェクター細胞として使用されるＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２；８、エフェクター細胞としてのＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２。抗ＣＤ１９抗体（ビオチン標識化マウス抗ヒトＣＤ１９抗体、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ｂｉｏｄｒａｇｏｎｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、ＢＤＬＳ−１９６８−１００）を群７および８に添加した後に、細胞毒性アッセイを行った。標的細胞のみを陰性対照群として使用した。
【０２１０】
２．  エフェクター細胞を、９６ウェルプレート中で、１００μｌ中の１×１０４標的細胞と、１０：１、５：１、１：１の比で混合し、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベーター中、２４時間インキュベートした。５０μｌの１％のＴｒｉｔｏｎ溶解物と１μｌの基質（３：１の容積比での３００μｇ／ｍＬのＬｕｃ溶液および２ｍｇ／ｍＬのＡＴＰ溶液の混合物）をそれぞれのウェルに添加し、細胞を５分間溶解し、ルシフェラーゼの蛍光強度を検出した。死滅効率を以下の通り計算した。死滅効率＝｛（陰性対照の蛍光値−実験群の蛍光値）／陰性対照の蛍光値｝×１００％。
【０２１１】
３．  結果を図６に示す。ＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−３−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−４−ＮＫ９２およびＲａｃｅＣａｒ−５−ＮＫ９２は、ＮＫ９２よりも効率的に３ｍ−ＣＤ１９−ｌｕｃ細胞を死滅させることができ、これは、ＣＤ１９およびＰＤ−Ｌ１を標的にする多標的キメラ抗原受容体のＲａｃｅＣａｒ−１がＮＫ９２細胞で発現し、生物学的機能を有していることを実証した。ＣＤ１９抗体を添加した実験群では、標的細胞に対する抗ＣＤ１９抗体がエフェクター細胞におけるＣＡＲの標的細胞への結合を遮断し、それによって死滅を阻害するので、ＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２の死滅能力が減少した一方、ＲａｃｅＣａｒ−２−ＮＫ９２の死滅能力はほとんど変化しなかった。標的細胞に対するＲａｃｅＣａｒ−１−ＮＫ９２の死滅能力は、ＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２が３ｍ−ＣＤ１９−ｌｕｃ細胞の死滅に対して特異的であることを実証した。
【０２１２】
（実施例６  Ｔ細胞におけるＲａｃｅＣａｒの発現およびＲａｃｅＣａｒ−ＴおよびＣａｒ−Ｔの間の標的化死滅の比較）
【０２１３】
１．  ｋ５６２−ｃｄ１９−ｌｕｃ細胞株を、ＣＤ１９抗原およびルシフェラーゼを発現させるために、ＣＤ１９抗原をコードする核酸配列（配列３６）およびルシフェラーゼをコードする核酸配列（配列３７）をｋ５６２細胞株（ＡＴＣＣ）のゲノムに組み込むことによって得て、標的細胞として使用した。使用したエフェクター細胞は、実施例４で得られたＲａｃｅＣａｒ−１−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−４−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−５−Ｔであり、使用した対照のエフェクター細胞は、従来の抗ＣＤ１９ＳｃＦｖ−ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体を発現するように上記に従ってＴ細胞へのウイルストランスフェクションによって得られたＣａｒ−Ｔ細胞（抗ＣＤ１９ＳｃＦｖ−ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体、配列３８）であり、エフェクター細胞の添加なしの標的細胞のみを細胞死滅実験のための陰性対照として使用した。
【０２１４】
２．  ｋ５６２−ｃｄ１９−ｌｕｃ細胞を、１×１０４細胞／ウェルで蒔き、エフェクター細胞を、エフェクター細胞の標的細胞に対する比が、それぞれ、５：１、１０：１および２０：１で添加した。２４時間後、５０μｌの１％のＴｒｉｔｏｎ溶解物と１μｌの基質（３：１の容積比での３００μｇ／ｍＬのＬｕｃ水溶液および２ｍｇ／ｍＬのＡＴＰ水溶液の混合物）を細胞に添加し、５分間溶解した。ルシフェラーゼのルミネセンスを、マイクロプレートリーダーによって検出して、死滅を計算した。効率＝｛（陰性対照の蛍光値−実験群の蛍光値）／陰性対照の蛍光値｝×１００％。
【０２１５】
結果を図７に示す。図において、横軸は、エフェクター細胞の標的細胞に対する比であり、縦軸は死滅効率である。ＲａｃｅＣａｒ−１−Ｔ細胞、ＲａｃｅＣａｒ−４−Ｔ細胞およびＲａｃｅＣａｒ−５−Ｔ細胞は、ｋ５６２−ｃｄ１９−ｌｕｃ細胞を死滅させることができることが分かり、これは、ＲａｃｅＣａｒ−１、ＲａｃｅＣａｒ−４−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−５−Ｔが、Ｔ細胞において発現し、生物学的機能を有すること、ならびにＲａｃｅＣａｒ−Ｔ細胞の死滅能力が、通常のＣａｒ−Ｔ細胞の死滅能力よりも高いことを実証する。
【０２１６】
（実施例７  ＭＨＣ／ＷＴ１を標的とする異なる種類のＲａｃｅＣａｒ−Ｔ細胞およびＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２細胞の細胞死滅）
【０２１７】
１．  ＢＶ１７３−ｌｕｃ細胞株を、ルシフェラーゼ（配列番号３７）をコードする核酸配列を、ＧＰ１００／ＭＨＣ分子複合体を表面で発現し、かつ標的細胞としてのＢＶ１７３細胞株（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ２０）のゲノムに組み込むことによって得た。使用したエフェクター細胞株は、実施例４で得られたＲａｃｅＣａｒ−６−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−７−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−８−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−９−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−１０−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−１１−ＮＫ９２およびＲａｃｅＣａｒ−１２−ＮＫ９２であった。ＲａｃｅＣａｒ−１３−ＮＫ９２、ＲａｃｅＣａｒ−１４−ＮＫ９２およびＲａｃｅＣａｒ−６−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−７−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−８−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−９−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−１０−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−１１−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−１２−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−１３−Ｔ、ＲａｃｅＣａｒ−１４−Ｔ、対照のエフェクター細胞は、未感染のＮＫ９２細胞またはＴ細胞であり、細胞死滅実験を、陰性対照としてエフェクター細胞の添加なしで行った。
【０２１８】
２．  ＢＶ１７３−ｌｕｃ細胞を、１×１０４細胞／ウェルで蒔き、エフェクター細胞を、５：１の比で標的細胞に添加した。２４時間後、５０μｌの１％のＴｒｉｔｏｎ溶解物と１μｌの基質（３００μｇ／ｍＬのルシフェリン溶液および２ｍｇ／ｍＬのＡＴＰを３：１の容積比で混合した）を細胞に添加し、５分間溶解した。ルシフェラーゼのルミネセンスを、マイクロプレートリーダーによって検出した。死滅効率＝｛（陰性対照の蛍光値−実験群の蛍光値）／陰性対照の蛍光値｝×１００％。
【０２１９】
結果を図８に示す。図において、横軸は、異なるエフェクター細胞であり、縦軸は死滅効率である。ＲａｃｅＣａｒ−ＮＫ９２細胞およびＲａｃｅＣａｒ−Ｔ細胞は両方ともＢＶ１７３−ｌｕｃ細胞を死滅させることができ、効率は、未感染Ｔ細胞またはＮＫ９２細胞による効率よりも高いことが分かり、これは、ＲａｃｅＣａｒ−６、ＲａｃｅＣａｒ−７、ＲａｃｅＣａｒ−８、ＲａｃｅＣａｒ−９、ＲａｃｅＣａｒ−１０、ＲａｃｅＣａｒ−１１、ＲａｃｅＣａｒ−１２、ＲａｃｅＣａｒ−１３およびＲａｃｅＣａｒ−１４が、ＮＫ９２細胞またはＴ細胞において発現することができ、標的細胞を死滅させるために、エフェクター細胞を媒介する生物学的機能を有することを実証する。
【０２２０】
（実施例８  免疫細胞の増殖に対するＲａｃｅＣａｒの効果）
【０２２１】
１．  実施例４で得られた１×１０６のＲａｃｅＣａｒ−１−Ｔ細胞およびＲａｃｅＣａｒ−２−Ｔ細胞を２．５ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ培地に置き、１×１０６のＴ細胞を２．５ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ培地に陰性対照として置いた。別の１×１０６のＴ細胞を、最終濃度１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充した２．５ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ培地に陽性対照として置いた。４群の細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２２２】
２．  作業用溶液を、ＣＳＦＥ染料をＤＭＳＯに５μｍｏｌ／Ｌ溶液として溶解することによって調製した。培養の開始および培養の５日目に、１×１０４細胞を４群の細胞から取り出し、ＣＳＦＥ染料を、ＣＳＦＥ作業用溶液：培地の容積比が１：２０００の比に従って、各群の細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２２３】
３．  上清を、１０００ｇで５分間の遠心分離によって廃棄し、細胞を、等容量のＸ−ＶＩＶＯ培地を使用して再懸濁させた。この手順を２回繰り返した。
【０２２４】
４．ＣＳＦＥで染色された細胞は、緑色の蛍光を有し、緑色の蛍光の強度は細胞の分裂につれて減少する。異なる世代の細胞は異なる蛍光シグナルを示す。ＦＡＣＳスペクトルを使用して、細胞の蛍光を分析した。図９において、０日目では、４群の細胞の蛍光シグナルは基本的に同じであることが分かった。Ｔ細胞群は陰性対照群であった。５日目のフロー検出の蛍光強度は、０日目の蛍光強度と比較して、基本的に変化していなかった。Ｔ細胞＋ＩＬ２は陽性対照群であり、細胞は、５日目と０日目の間で異なる蛍光シグナルを示し、これにより、培養の５日の間に細胞が増殖したことを確認した。図に示されるように、ＲａｃｅＣａｒ−１−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−２−Ｔの蛍光シグナルの分布は、５日目に、ＩＬ−２を有する陽性対照群のものと同様であり、ＲａｃｅＣａｒ−１−ＴおよびＲａｃｅＣａｒ−２−ＴがＩＬ２なしの培地中で正常に増殖することができることも実証する。全体の結果は、ＲａｃｅＣａｒがＴ細胞などの免疫細胞の増殖を促進する能力を有することを証明する。
【産業上の利用可能性】
【０２２５】
本発明の実験は、本発明の多標的キメラ抗原受容体が、その２つの抗原結合ドメインによって異なる抗原と結合することができ、特異的な細胞の死滅を媒介することができ、治療標的化の精度を改善することもでき、単一の標的の発現のダウンレギュレーションによって引き起こされる疾患の再発を回避することができることを証明し；本発明の多標的キメラ抗原受容体は、その２つの抗原結合ドメインによって異なる抗原と結合することができ、免疫抑制シグナルを遮断することができ、抗原結合ドメインの１つが免疫チェックポイントタンパク質と関連する抗原と結合する場合、腫瘍を死滅する能力を改善することができる。本発明の多標的キメラ抗原受容体は、サイトカインおよびサイトカイン受容体の複合体を導入し、これは、サイトカインの機能を生じさせることができ、例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの複合体の導入は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激し、これらをサイトカイン依存性活性化から免除する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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