(57)【要約】  本発明は、単一細胞型由来の複数の核の遺伝子およびタンパク質発現のプロファイリング方法および細胞集団間、異なる対象由来の試料間、および疾患表現型を発現している細胞間の変化を決定するためにプロファイルを比較する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核の遺伝子発現のプロファイリング方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、組織試料中の少なくとも１つの細胞型の核に特有の核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料由来の少なくとも１つの核を標識することであって、前記核酸転写物またはタンパク質が、表１９〜２４から選択される遺伝子によりコードされること、
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること、および
（ｄ）前記標識された核に対する核酸転写物および／またはタンパク質発現データを収集し、それにより、前記核の遺伝子発現をプロファイリングすること
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞型が、小脳組織に起源を持ち、顆粒細胞、プルキンエ細胞、グリア、バーグマングリア、ドーパミン作動性神経、バスケット／星状細胞、星状膠細胞、脳幹運動ニューロン、乏突起膠細胞、上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、および小脳深部核からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、前記核内に局在化した転写因子である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞型が、大脳基底核組織に起源を持ち、線条体黒質系中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）、線条体淡蒼球系ＭＳＮ、線条体コリン作動性介在ニューロン、視床下核、ドーパミン作動性神経、および分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞型が、視床組織に起源を持ち、視床皮質ニューロン、視床線条体ニューロン、および視床網様核ニューロンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞型が、皮質組織に起源を持ち、皮質線条体ニューロン、嗅内皮質層２／３ニューロン、高速発火型皮質介在ニューロン、および前頭前野皮質組織由来の層２／３錐体細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞型が、松果体の内側手綱組織由来コリン作動神経系投射ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞型が、海馬組織に起源を持ち、アンモン角領域１（ＣＡ１）、アンモン角領域２（ＣＡ２）、アンモン角領域３（ＣＡ３）、および歯状回細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞型が、脳組織、脳幹組織、および脊髄組織からなる群より選択される少なくとも１つの組織に起源を持つ、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
顆粒細胞を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、遺伝子Ｉｔｐｒ、ＮｅｕＮ、Ｃｄｈ１５、Ｃａｌｂ２、Ｒｂｆｏｘ３、Ｎｅｕｒｏｄ１、およびＲｅｌｎの内の１つによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、前記核酸転写物またはタンパク質は、前記顆粒細胞の核に特有であること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの標識された核が、Ｏｌｉｇ２によりコードされる核酸転写物を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
プルキンエ細胞を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、遺伝子Ｐｃｐ２、Ｐｖａｌｂ、Ｃａｂｌ１、およびＩｔｐｒ１の内の１つによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離すること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１３】
プルキンエ細胞を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、遺伝子Ｌｙｐｄ６、Ｐｖａｌｂ、Ｋｉｔ、ＮｅｕＮ、Ｉｔｐｒ、およびＳｏｒｃｓ３の内の１つによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離すること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１４】
星状膠細胞および乏突起膠細胞を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、遺伝子Ｏｌｉｇ２、Ｐｄｇａ、Ｃｓｐｇ４、Ｍａｇ、Ｍｂｐ、およびＭｏｇの内の１つによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離すること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１５】
星状膠細胞を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、遺伝子Ａｌｄｈ１ａ１、Ｇｆａｐ、Ｓ１１０ｂ、およびＳｌｃ１ａ３の内の１つによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離すること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１６】
バスケット細胞を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、Ｓｏｒｃｓ３、およびＮｅｕＮによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、Ｓｏｒｃｓ３によりコードされる前記核酸転写物またはタンパク質の組み合わせが、前記バスケット細胞の核に特有であること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１７】
ドーパミン作動性神経を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、ＦｏｘＡ１、Ｓｌｃ６ａ３、ＴＨ、ＦｏｘＡ２、またはＤｒｄ２によりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、核酸転写物またはタンパク質が、前記ドーパミン作動性神経の核に特有であること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１８】
脳幹運動ニューロンを単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、ＶａＣｈＴまたはＥｒｒＢによりコードされる、核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、核酸転写物またはタンパク質が、前記脳幹運動ニューロンの核に特有であること、および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること
を含む、方法。
【請求項１９】
前記親和標識が、抗体、ＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブからなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｄ）前記標識された核に対する核酸転写物および／またはタンパク質転写物データを収集し、それにより、前記核の遺伝子発現をプロファイリングすること、をさらに含む、請求項１０または１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｅ）前記核の遺伝子発現と、異なる組織試料由来の細胞型の少なくとも１つの核中の遺伝子発現とを比較して、遺伝子発現の変化を特定することにより薬物標的を得ることをさらに含む、請求項１〜９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
（ｅ）前記核の遺伝子発現と、異なる細胞型の少なくとも１つの核中の遺伝子発現とを比較して、遺伝子発現の変化を特定することにより、薬物標的を得ることをさらに含む、請求項１〜９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記親和標識が、蛍光タグをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、前記核が精製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織試料が、哺乳動物由来である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、マウス、ヒト、ラット、および別の非ヒト霊長類からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織試料または前記異なる組織試料が、前記核の単離の前に凍結された、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織試料または前記異なる組織試料が、前記核の単離の前に新しい、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織試料または前記異なる組織試料が、雌由来である、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織試料または前記異なる組織試料が、雄由来である、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核が小胞体に隣接している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が膜タンパク質である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記膜タンパク質が、前記小胞体中で合成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質が、前記小胞体中に局在化している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸転写物が、前記核中に局在化している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡプローブが、染色体関連転写物（ＣＡＴ）またはポリＡ転写物に特異的に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡプローブが、トランスポーター遺伝子に特異的に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３８】
前記親和標識が、２つ以上の抗体、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３９】
各親和標識が、異なる因子に結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記組織試料が、死後である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組織試料または前記異なる組織試料が、病気の対象由来である、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組織試料または前記異なる組織試料が、健康な対象由来である、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記病気の対象が、運動失調、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびにハンチントン病からなる群より選択される少なくとも１つの状態に罹患している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞型が、運動失調に関連し、プルキンエ細胞、顆粒細胞、バーグマングリア、バスケット／星状細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、および小脳深部核からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞型が、パーキンソン病に関連し、黒質およびＶＴＡドーパミン作動性神経からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞型が、アルツハイマー病に関連し、層２／３嗅内皮質、ＣＡ１海馬、およびＣＡ２／３海馬から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞型が、ＡＬＳに関連し、脳幹、皮質運動ニューロン、および脊髄運動ニューロンからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記病気の対象が疾患表現型を発現している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記病気の対象が疾患表現型を発現していない、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
病気の対象由来の組織試料と、健康な対象由来の組織試料のプロファイリングを比較することをさらに含む、請求項１〜９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも２人の異なる健康な対象由来の組織試料のプロファイリングを比較することをさらに含む、請求項１〜９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記２つ以上の抗体、ＲＮＡプローブ、またはＤＮＡプローブが、同じ因子に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子発現のプロファイリングが、単一細胞型由来の複数の核に対し実施される、請求項１〜９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子発現のプロファイリングが、異なる細胞型由来の複数の核に対し実施される、請求項１〜９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
（ｅ）疾患表現型を発現している病気の対象由来の組織試料のプロファイリングと、疾患表現型を発現していない病気の対象由来の組織試料のプロファイリングとを比較することにより、疾患ステージ間の変化を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
（ｅ）２つ以上の、異なる対象由来の組織試料のプロファイリングを比較することにより、異なる対象間の変化を特定することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬物標的が、表１９〜２４から選択される遺伝子によりコードされる、請求項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
核のエピジェネティックな発現のプロファイリング方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織を、少なくとも１つの細胞型に特有の因子に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、前記親和標識が抗体、ＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブからなる群より選択されること、
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること、および
（ｄ）ヒストン修飾、転写因子の結合、および前記核に対するＤＮＡ修飾に関する情報を収集して、それにより、前記エピジェネティックな発現をプロファイリングすること
を含む、方法。
【請求項５９】
核の核構造のプロファイリング方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織を、少なくとも１つの細胞型に特有の因子に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、前記親和標識が抗体、ＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブからなる群より選択されること、
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製すること、および
（ｄ）前記標識された核に対する染色体構造に関する情報を収集し、それにより、前記核構造をプロファイリングすること
を含む、方法。
【請求項６０】
核の核構造のプロファイリング方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織を、少なくとも１つの細胞型に特有の因子に結合する親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、前記親和標識が抗体であること、
（ｃ）前記核からｇＤＮＡを単離すること、
（ｄ）酸化的亜硫酸水素塩配列決定法を実施すること、
（ｅ）前記標識された核に対する染色体構造を収集し、それにより、前記核構造をプロファイリングすること
を含む、方法。
【請求項６１】
単一細胞型から核を単離する方法であって、
（ａ）複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること、
（ｂ）前記処理組織試料を、核酸転写物および／またはタンパク質の前記細胞型に対する特有の組み合わせに特異的な３つ以上の親和標識と接触させることにより、前記処理組織試料から核を単離することであって、各親和標識が、配列番号１〜２８，８１５から選択される配列を含む核酸転写物に特異的に結合すること、または前記親和標識が、配列番号２８，８１６〜３８，６４３から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合すること；および
（ｃ）少なくとも１つの標識された核を精製することにより、前記細胞型由来の前記核を単離すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月１０日出願の米国仮特許出願第６２／４５７，４２０号、および２０１７年９月１４日出願の同第６２／５５８，３９６号の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、「長い」配列表を含み、これは、紙の印刷物の代わりにＣＤ−Ｒにより提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このＣＤ−Ｒは、新規に出願された主題の一部として、次の配列表テキストファイルを含む：ファイル名：２１１１＿１０００ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔ；ファイルサイズ：１２３，４７３，９２０バイト；作成日付：２０１８年２月９日。これらのＣＤ−Ｒは、それぞれ「ＣＲＦ」、「コピー１」および「コピー２」と標識され、それぞれ、すぐ上の文で記載の１個の同一ファイルのみを含む。各ＣＤ−Ｒの機械可読フォーマットは、ＩＢＭ−ＰＣフォーマットであり、各コンパクトディスクのオペレーティングシステムは、マイクロソフト−ウィンドウズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、薬物標的を特定するための、単一細胞型由来の複数の核の遺伝子およびタンパク質発現のプロファイリングに関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）は、数百の異なる入り混ざった細胞型を含む複雑な器官である。特定の細胞型を遺伝子標的とする（Ｇｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，９１７−９２５）および分子プロファイリングする（Ｈｅｉｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５，７３８−７４８）能力は、一世紀以上前のラモン・イ・カハルの基盤研究（Ｒａｍｏｎ  ｙ  Ｃａｊａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１８９９）．Ｔｅｘｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｍａｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ（Ｗｅｉｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ））で発見された哺乳動物脳の本質的な特徴に対する洞察を可能とし始めている。それぞれの解剖学的に別々の、古典的に定義された細胞型は、一連の特徴的遺伝子を発現し（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，４２１８−４２３０  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５，７４９−７６２）、これらの遺伝子は、特殊な細胞機能に不可欠の特性を付与する（Ｋｉｍ，Ｉ．−Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５２，４７８−４８２；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９，２９５−３０５）。これらの遺伝子の発現は、核機能を組織化する細胞特異的エピジェネティック状態の維持に依存する（Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，９２９−９３０；Ｍｅｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５１，１４１７−１４３０）。また、マウスモデルにおける本プロファイリング技術の適用により、環境の影響（Ｈｅｉｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５，７３８−７４８；Ｓｈｒｅｓｔｈａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ｅＬｉｆｅ  ４，２８９）、内部の生理学的きっかけ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １４９，１１５２−１１６３）、および遺伝子障害を引き起こす疾患（Ｆｙｆｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎｅｕｒｏｎ  ５９，９４７−９５８；Ｉｎｇｒａｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｅｕｒｏｎ  ８９，１１９４−１２０７）が影響を受けた細胞型の遺伝子発現を変えるという認識に至った。実験系の進捗のペースにもかかわらず、ヒト脳の複雑さという基本的な問題は、未解決のまま残されている。例えば、どの程度多くの別々の細胞型がヒト脳中に存在するのか、これらの細胞型は、個体間または種間で、どのように変化するのか、脳老化の過程は、細胞型間で同等であるのかどうか、および広範に発現している遺伝子の変異がなぜに１つのまたは少数の選択細胞型で壊滅的な結果になり得るのかは、明らかになっていない。
【０００５】
精神的および神経変性疾患に冒された回路に関する多くの情報が存在するが、これらの回路を特異的に調節する能力は、回路のニューロン中に限って見出される標的の知識を必要とする。
【０００６】
翻訳リボソーム親和性精製法（ＴＲＡＰ）と呼ばれる方法は、目的の細胞型中で発現した全ての遺伝子の特定を可能とするように以前に開発された。ＴＲＡＰプロファイリング研究は、臨床試験が行われているいくつかの薬物の開発に繋がった。ＴＲＡＰ技術は、いくつかの薬物開発を可能としたが、ＴＲＡＰの主たる制限は、標的特定が最初に、遺伝子導入マウスを用いて実施されることである。マウスおよびヒトは類似しているが、２つの種のＣＮＳ回路の既知の差異が存在し、また、オルソロガス細胞型間の遺伝子発現の差異も同様に存在する可能性がある。さらに、特定の細胞中で、どのくらい多くの遺伝子発現が、個別の対象間で変化するのか、およびこれらの差異が発病または治療に対する反応に影響を与えるのかどうかについては明らかになっていない。ＴＲＡＰでは、ＢＡＣベクターを使って、遺伝子導入マウス株が作製される。Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３５：７４９−７６２（２００８）ａｎｄ  Ｈｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３５：７３８−７４８（２００８）を参照されたい。この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このため、この方法は、ｂａｃＴＲＡＰと呼ばれる。
【０００７】
本方法では、ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａリボソーム融合タンパク質が目的の細胞型、例えば、プルキンエ細胞を標的にする。親和性精製は、Ｈｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．に示されたように、抗ＥＧＦＰコート磁気ビーズを用いて、細胞特異的ポリソームＲＮＡに対し実施される。マイクロアレイを使って、精製試料を分析してもよい。ＢＡＣは、ロックフェラー大学のＤｒ．Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  Ｈｅｉｎｔｚにより開発された遺伝子発現神経系地図（ＧＥＮＳＡＴ）プロジェクト（ｗｗｗ．ｇｅｎｓａｔ．ｏｒｇ）から選択される場合が多い。場合によっては、導入遺伝子は、２種以上の細胞型で発現され得る。例えば、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．の免疫蛍光法は、ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａが、小脳分子層Ｐｖａｌｂの陽性およびＮｅｕＮ陰性両方の介在ニューロン中で発現することを示し、これは、星状細胞およびバスケット細胞の両方が標的とされた証拠である。ｍＲＮＡは免疫沈降され、ゲノムワイド転写プロファイリングがｍＲＮＡ試料に対し実施される。これらの結果、非免疫沈降試料のプロファイリングと比較して、細胞型特異的なマーカーが特定された。
【０００８】
より効率的で特異的な薬物を開発するためには、遺伝子導入マウスではなく、ヒトおよびヒト組織から直接に候補標的が特定される必要があり、これらの標的が個体間で変化する程度が決定される必要がある。したがって、野性型動物およびヒトにおいて、一定の細胞型の分子的研究を可能にする一般化可能な方法を開発することに対する長年にわたるニーズがある。さらに、モデル系における神経細胞型および回路の特異的特徴の発見を補完し、ヒト神経系の潜在的な特有の性質に対する洞察力を得るために、非遺伝的技術が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書の本発明の種々の実施形態は、核の遺伝子発現のプロファイリング方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、組織試料中に含まれる少なくとも１つの細胞型の核に特有の、表１９〜２４から選択される遺伝子によりコードされる核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料由来の少なくとも１つの核を標識すること；少なくとも１つの標識された核を精製すること；および標識された核に対する核酸転写物および／またはタンパク質発現データを収集し、それにより、核の遺伝子発現をプロファイリングすることを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、細胞型は、小脳組織に起源を持ち、顆粒細胞、プルキンエ細胞、グリア、バーグマングリア、ドーパミン作動性神経、バスケット／星状細胞、星状膠細胞、脳幹運動ニューロン、乏突起膠細胞、上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、および小脳深部核からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、核内に局在化した転写因子である。いくつかの実施形態では、細胞型は、大脳基底核組織に起源を持ち、線条体黒質系中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）、線条体淡蒼球系ＭＳＮ、線条体コリン作動性介在ニューロン、視床下核、ドーパミン作動性神経、および分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞型は、視床組織に起源を持ち、視床皮質ニューロン、視床線条体ニューロン、および視床網様核ニューロンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞型は、皮質組織に起源を持ち、皮質線条体ニューロン、嗅内皮質層２／３ニューロン、高速発火型皮質介在ニューロン、および前頭前野皮質組織由来の層２／３錐体細胞からなる群より選択される。細胞型は、松果体の内側手綱組織由来コリン作動神経系投射ニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞型は、海馬組織に起源を持ち、アンモン角領域１（ＣＡ１）、アンモン角領域２（ＣＡ２）、アンモン角領域３（ＣＡ３）、および歯状回細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞型は、脳組織、脳幹組織、および脊髄組織からなる群より選択される少なくとも１つの組織に起源を持つ。
【００１１】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、顆粒細胞を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子Ｉｔｐｒ、ＮｅｕＮ、Ｃｄｈ１５、Ｃａｌｂ２、Ｒｂｆｏｘ３、Ｎｅｕｒｏｄ１、およびＲｅｌｎの内の１つによりコードされる、顆粒細胞の核に特有の核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標識された核は、Ｏｌｉｇ２によりコードされる核酸転写物を含まない。
【００１２】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、プルキンエ細胞を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子Ｐｃｐ２、Ｐｖａｌｂ、Ｃａｂｌ１、およびＩｔｐｒ１の内の１つによりコードされる核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１３】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、プルキンエ細胞を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子Ｌｙｐｄ６、Ｐｖａｌｂ、Ｋｉｔ、ＮｅｕＮ、Ｉｔｐｒ、およびＳｏｒｃｓ３の内の１つによりコードされる核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１４】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、星状膠細胞および乏突起膠細胞を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子Ｏｌｉｇ２、Ｐｄｇａ、Ｃｓｐｇ４、Ｍａｇ、Ｍｂｐ、およびＭｏｇの内の１つによりコードされる核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１５】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、星状膠細胞を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子Ａｌｄｈ１ａ１、Ｇｆａｐ、Ｓ１１０ｂおよびＳｌｃ１ａ３の内の１つによりコードされる核酸転写物またはタンパク質に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１６】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、バスケット細胞を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、Ｓｏｒｃｓ３およびＮｅｕＮによりコードされる核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離することであって、核酸転写物またはタンパク質の組み合わせがＳｏｒｃｓ３によりコードされ、バスケット細胞の核に特有であること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１７】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、ドーパミン作動性神経を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子ＦｏｘＡ１、Ｓｌｃ６ａ３、ＴＨ、ＦｏｘＡ２、またはＤｒｄ２によりコードされる、ドーパミン作動性神経の核に特有の核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１８】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、脳幹運動ニューロンを単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、遺伝子ＶａＣｈＴまたはＥｒｒＢによりコードされる、脳幹運動ニューロンの核に特有の核酸転写物またはタンパク質に結合する少なくとも１つの親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離すること；および少なくとも１つの標識された核を精製することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、親和標識は、抗体、ＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、方法は、標識された核に対する核酸転写物および／またはタンパク質転写物データを収集し、それにより、核の遺伝子発現をプロファイリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、その核での遺伝子発現と、異なる組織試料由来の細胞型の少なくとも１つの核での遺伝子発現とを比較して、遺伝子発現の変化を特定することにより薬物標的を得ることをさらに含む。あるいは、いくつかの実施形態では、方法は、その核での遺伝子発現と、異なる細胞型の少なくとも１つの核での遺伝子発現とを比較して、遺伝子発現の変化を特定することにより薬物標的を得ることをさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、親和標識は、蛍光タグをさらに含む。いくつかの実施形態では、核の精製は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により実施される。いくつかの実施形態では、組織試料は、哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウス、ヒト、ラット、および別の非ヒト霊長類からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、組織試料または異なる組織試料は、核の単離の前に凍結された。いくつかの実施形態では、組織試料または異なる組織試料は、核の単離の前に未使用であった。いくつかの実施形態では、組織試料または異なる組織試料は、雌由来である。いくつかの実施形態では、組織試料または異なる組織試料は、雄由来である。いつかの実施形態では、核は、小胞体に隣接している。いくつかの実施形態では、タンパク質は、膜タンパク質である。いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、小胞体中で合成される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、小胞体中に局在化している。いくつかの実施形態では、核酸転写物は、核中に局在化している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡプローブは、染色体関連転写物（ＣＡＴ）またはポリＡ転写物に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、トランスポーター遺伝子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、親和標識は、２つ以上の抗体、ＲＮＡプローブ、またはＤＮＡプローブである。いくつかの実施形態では、各親和標識は、異なる因子に結合する。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗体、ＲＮＡプローブ、またはＤＮＡプローブは、同じ因子に結合する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組織試料は、死後のものである。いくつかの実施形態では、組織試料または異なる組織試料は、病気の対象由来である。いくつかの実施形態では、組織試料または異なる組織試料は、健康な対象由来である。いくつかの実施形態では、病気の対象は、運動失調、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびにハンチントン病からなる群より選択される少なくとも１つの状態に罹患している。いくつかの実施形態では、細胞型は、運動失調に関連し、プルキンエ細胞、顆粒細胞、バーグマングリア、バスケット／星状細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、および小脳深部核からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞型は、パーキンソン病に関連し、黒質およびＶＴＡドーパミン作動性神経からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、細胞型は、アルツハイマー病に関連し、層２／３嗅内皮質、ＣＡ１海馬、およびＣＡ２／３海馬から選択される。いくつかの実施形態では、細胞型は、ＡＬＳに関連し、脳幹、皮質運動ニューロン、および脊髄運動ニューロンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、病気の対象は、疾患表現型を発現している。いくつかの実施形態では、病気の対象は、疾患表現型を発現していない。いくつかの実施形態では、方法は、病気の対象由来の組織試料と、健康な対象由来の組織試料のプロファイリングを比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２人の異なる健康な対象由来の組織試料のプロファイリングを比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、疾患表現型を発現している病気の対象由来の組織試料のプロファイリングと、疾患表現型を発現していない病気の対象由来の組織試料のプロファイリングとを比較することにより、疾患ステージ間の変化を特定することをさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、方法は、単一細胞型由来の複数の核に対し行われた遺伝子発現のプロファイリングをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、異なる細胞型由来の複数の核に対し行われた遺伝子発現のプロファイリングをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の、異なる対象由来の組織試料のプロファイリングを比較することにより、異なる対象間の変化を特定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬物標的は、表１９〜２４から選択される遺伝子によりコードされる。
【００２３】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、核のエピジェネティック発現のプロファイリング方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織を、少なくとも１つの細胞型に特有の因子に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離することであって、親和標識が抗体、ＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブからなる群より選択されること；少なくとも１つの標識された核を精製すること；およびヒストン修飾、転写因子の結合、および核に対するＤＮＡ修飾に関する情報を収集し、それにより、エピジェネティック発現をプロファイリングすることを含む。
【００２４】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、核の核構造のプロファイリング方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織を、少なくとも１つの細胞型に特有の因子に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離することであって、親和標識が抗体、ＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブからなる群より選択されること；少なくとも１つの標識された核を精製すること；および標識された核の染色体構造に関する情報を収集し、それにより、核構造をプロファイリングすることを含む。
【００２５】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、核の核構造のプロファイリング方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織を、少なくとも１つの細胞型に特有の因子に結合する親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離することであって、親和標識が抗体であること；核からｇＤＮＡを単離すること；酸化的亜硫酸水素塩配列決定（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施すること；および標識された核に対する染色体構造を収集し、それにより、核構造をプロファイリングすることを含む。
【００２６】
本明細書で記載の本発明の種々の実施形態は、単一細胞型から核を単離する方法を提供し、該方法は、複数の細胞型を含む組織試料を処理して核を露出させること；処理組織試料を、核酸転写物および／またはタンパク質の細胞型に対する特有の組み合わせに特異的な３つ以上の親和標識と接触させることにより、処理組織試料から核を単離することであって、各親和標識は、配列番号１〜２８，８１５から選択される配列を含む核酸転写物に特異的に結合すること、または親和標識は、配列番号２８，８１６〜３８，６４３から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合すること；および少なくとも１つの標識された核を精製し、それにより、細胞型由来の核を単離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本明細書に記載の細胞プロファイリング技術で使用し得る選別方法の実施形態を示す。「Ａ」は、目的の細胞型の核を表し、「Ｂ」は、別の細胞型の核を表す。
【図２Ａ】Ｉｔｐｒ１およびＮｅｕＮを用いた、小脳由来の３つの細胞型のフローサイトメトリー選別結果を示す。Ｉｔｐｒ１とＮｅｕＮの組み合わせを用いて、３つの集団：プルキンエ細胞、顆粒細胞、およびグリアを単離した。ｘ軸はＩｔｐｒ１であり、ｙ軸はＮｅｕＮである。Ｉｔｐｒ１＋集団は、プルキンエ細胞の核であり、ＮｅｕＮ＋集団は、グリアの核であった。ＮｅｕＮ＋／Ｉｔｐｒ１−核（最大群）は、顆粒細胞を表す。
【図２Ｂ】遺伝子導入動物由来のプルキンエ核ＲＮＡの選別（ＧＦＰ選別）と、Ｉｔｐｒ１＋核とを比較したＲＮＡｓｅｑデータ由来の遺伝子発現プロファイリングを示す。Ｐｃｐ４は、プルキンエマーカーであり（小脳無選別核に比べて、選別プルキンエ核中に濃縮されている）、Ｃａｌｂ２は、顆粒細胞マーカーである（プルキンエに比べて無選別核中に濃縮されている）。
【図３Ａ】ドーパミン作動性神経核の核染色および選別のフローサイトメトリー選別結果を示す。
【図３Ｂ】無選別中脳核と、選別ドーパミン作動性由来のＲＮＡｓｅｑの記録の比較を示す。
【図４】マウス、ラット、およびヒトの種特異的および細胞型特異的差異を明らかにする、３つの記録−顆粒細胞由来の核ＲＮＡレベル、全小脳由来の細胞質ＲＮＡレベル、および全小脳からのＡＴＡＣｓｅｑ  ＤＮＡアクセシビリティ−を示すゲノムブラウザの図である。
【図５Ａ−Ｂ】２つの異なるヒト対象由来の核のフローサイトメトリー選別結果を示す。
【図６】前方散乱光（ＦＳＣ）および側方散乱光（ＳＳＣ）の組み合わせにより核のサイズを近似するフローサイトメトリー選別結果を示す。
【図７Ａ−Ｄ】ヒト小脳核に対する４種の異なる染色方法のフローサイトメトリー結果を示す。
【図８】異なる個体に対する細胞型内および細胞型間のペアワイズピアソン相関係数を示すボックスプロットである。
【図９】各試料の細胞型および種別に分類されるペアワイズピアソン相関係数を示すドットプロットである。
【図１０】５〜約２５時間の自己融解時間中の顆粒、バスケット、およびグリア細胞中のＦｏｓＢの発現の変化を示すグラフである。
【図１１Ａ−Ｃ】３種の細胞型に特異的な、加齢による発現低下遺伝子の経年的遺伝子発現を示す散布図である。図１１Ａは、Ａｑｐ７の結果を示す。図１１Ｂは、Ａｓｉｃ１の結果を示し、および図１１Ｃは、Ｒｏｂｏ２の結果を示す。
【図１２】Ｆｏｓ＋およびＦｏｓ−個体中の３種の細胞型間の３つの個体におけるストレス応答および前初期遺伝子の発現を示す。遺伝子記録は、３つのＦｏｓ＋および３つの年齢および性適合Ｆｏｓ−個体からの併合発現を示す。
【図１３Ａ】顆粒細胞、星状細胞、およびグリア中のｆｏｓ遺伝子および前初期遺伝子の遺伝子発現を示す。
【図１３Ｂ】これらの細胞中の長期ストレス応答遺伝子の遺伝子発現を示す。
【図１３Ｃ】より長期ストレスのマーカーとは別の、グリア中の、活性化星状膠細胞マーカーＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、エキスポーチン１（Ｘｐｏ１、ロイシンリッチ核外移行シグナル（Ｎｅｓ）としても知られる）、およびＭｕｓａｓｈｉ  ＲＮＡ結合タンパク質１（Ｍｓｉ１）などのストレス関連遺伝子の発現を示す。
【図１４】細胞型特異的染色体関連転写物（ＣＡＴ）のＲＮＡｓｅｑデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｉ．緒言
複雑な組織は、多くの細胞型からできている。これまで、翻訳リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）法が、単一組織中の多様な細胞型の分子サインを特定するために使用されてきた。ＴＲＡＰ法は、遺伝子導入動物の使用を必要とし、このことが、多くの難題をもたらしている。例えば、一部の疾患モデルは、動物として育種するのが困難であり、さらに、動物モデルは必ずしもヒトニューロンに対する影響などのヒト疾患の全ての側面を再現するとは限らない。さらに、加齢の研究を行う場合には、特定の遺伝子導入系統を数年間にわたり維持することが必要となる。加えて、ＴＲＡＰ法は、正確な分析のためには、高品質のＲＮＡを含む新しい試料を必要とする。
【００２９】
遺伝子による標的細胞型の分子特性の決定は、マウス脳機能および機能障害への基本的な洞察をもたらした。本明細書に記載の細胞プロファイリング技術の実施形態は、各細胞型または状態に対するマーカーを特定することを目的とした、徹底的で再現可能な遺伝子発現の研究のための、多様な種中の特定の細胞型における遺伝子発現事象の探索方法を提供する。本明細書では、マウス、ラット、およびヒトニューロンおよびグリアに対する結果が示され、相同ヒト細胞型の特徴が明らかにされている。古典的に定義された相同ニューロンおよびグリア細胞型は、数百のオルソロガス、細胞特異的遺伝子の発現により、げっ歯類とヒトとの間で異なることが示されている。エピジェネティックマッピング、ＲＮＡｓｅｑ、定量的ＰＣＲ、および免疫蛍光法局在化の組み合わせを用いて、これらの遺伝子が差次的に活性であるという証拠が得られた。１６人のヒト死後脳に研究は、加齢に対する細胞特異的分子応答を示した。ヒトニューロンおよびグリアの加齢に対する応答は、細胞型特異的であることが観察され、また、死後ヒト脳組織の分析は、１６人のドナーの内の３人により経験された未知の外部事象に対する共通の、堅牢な応答の誘導も明らかにした。本明細書に記載の組成物および方法は、多種多様のヒト状態における特定の経路および細胞型に関連する特有の分子事象の分析のための包括的手法を構築する。
【００３０】
ヒトゲノム配列決定および分析の技術における最近の進歩により、ヒト精神疾患および神経疾患の複雑な遺伝的原因に関する知識が増大してきた（Ｂｕｒｇｕｉｅｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ３０，５９−６５；Ｈｉｎｚ，Ｆ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．ＰｕｂＭｅｄ−ＮＣＢＩ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９，ａ０２３７０５；Ｖｏｒｓｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １８，３６２−３７６、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの事例では、マウスゲノム中の原因となる変異の再現は、障害の分子的機序の研究にとって充分に正確な実験モデルをもたらし（Ｌｏｍｂａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５，２９１４−２９２３；Ｌｙｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １６，２６１−２７５；Ｏｒｒ，Ｈ．Ｔ．（２０１２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９７，１６７−１７７、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、また、これらのモデルにより、疾患の予想外の特徴の発見がもたらされた（Ｇｕｙ，ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，１１４３−１１４７、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の事例では、情報価値のある動物モデルは、捕らえどころがない状態のままであり（Ｌａｖｉｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１３）．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  １２，６１２−６１９、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、疾患の分子機序の研究は困難なまま残されている（Ｂｉｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ７，１０２８−１０３８；Ｍｅｄｉｎａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５，２７０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３１】
本明細書に記載の細胞プロファイリング技術の開発の前に、ヒトの特定の細胞型のゲノム全体でのプロファイリングを試みるために使用された技術には、レーザーキャプチャー法および単細胞配列決定技術が含まれる。どの技術も特定された細胞型の信頼性の高い深いプロファイルを生成できない。レーザーキャプチャー法は、専用装置および訓練を必要とし、結果は、正確な切開方法および組織解剖学に大きく依存し、従って、試料全体にわたり、結果の大きな変化が存在する。
【００３２】
単細胞ＲＮＡｓｅｑ由来のデータもまた、個別の細胞間で大きく変化する。単細胞ＲＮＡｓｅｑはまた、神経系では問題がある。理由は、神経系は、相互にニューロンを分離させるのが困難なためである。ニューロンを分離させる研究では、細胞体のみが捕捉され、神経突起（軸索および樹状突起）が失われる。ニューロン中の突起は、細胞体の大きさに比べて極めて大きく、それら自身の局所翻訳機構も有することは、当該技術分野において周知である。従って、細胞体のみの遺伝子発現分析は、ニューロンの独自性を決定するのに最も重要な遺伝子の一部である神経突起で発現される遺伝子を欠いている。細胞の全てのＲＮＡを合成する核中の遺伝子発現をプロファイリングすることにより、この偏りを回避できる。任意の個別の細胞からのデータの深さは、包括的プロファイルを達成するのには十分ではないので、この方法は、細胞のプロファイリングの技術分野における多くの人に受け入れられていない。
【００３３】
ヒト疾患は、全体細胞集団にわたり経験される問題である。単細胞分析由来の細胞型は、事後的に決定されなければならず、この分析は、病状により覆い隠される場合がある。さらに、単細胞ＲＮＡｓｅｑから得た配列決定は、疾患に伴い発生し得るわずかな変化を検出するには十分な深さではない。この理由で、細胞型は、集団として考えるべきである。そうするためには、単細胞方法は、数千の個別の細胞の配列決定を必要とし、いくつかの細胞型が極めて希なため、これらの希な細胞型のみに影響を与える疾患を調査するためには濃縮が必要である。技術的変化と生物学的変化の区別は、濃縮をしないとほとんど不可能であろう。
【００３４】
ヒト特異的標的の特定を可能とするために、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、特定の細胞型の死後ヒト組織の分子プロファイリングを目的として開発された。本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、薬物または他の治療法の標的を特定するための遺伝子発現およびエピジェネティック変化の研究を含む多様な用途を有する。
【００３５】
ＣＮＳ中の細胞は、複雑な形態を有し、相互に効果的に分離できないので、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、細胞全体ではなく核を選別する。方法のいくつかの実施形態では、脳の対象領域から核を単離した後、核は、目的の細胞型を特異的に標識する転写因子または転写物に特異的な抗体で免疫染色され得る。免疫蛍光法は、核が膜タンパク質に対する抗体を用いて標識できるかどうかを明確にする。染色は、核の周りの小胞体（ＥＲ）で観察された。あるいは、ＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブを用いて目的の細胞型を標識してもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて標識集団を精製後、単離核は、遺伝子発現プロファイリングに使用され得る。図１は、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術と共に用い得る選別方法の実施形態を提供する。「Ａ」は、目的の細胞型の核を表し、「Ｂ」は、別の細胞型由来の核を表す。
【００３７】
特定の実施形態では、アルゴリズムを用いて、単一細胞型に対し、細胞特異的および濃縮された遺伝子発現を特定し得る。例えば、複数の細胞集団全体の細胞特異的および濃縮ｍＲＮＡを特定し、定量化する１つの分析方法は、特異性指数（ＳＩ）と呼ばれ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１３）：４２１８−４２３０に記載されている。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。遺伝子発現は、複数の細胞型で測定された。これらの値は、最初に、反復処理群中で正規化され、その後、細胞型全体で正規化された。非特異的バックグラウンドは、陰性対照を用いて濾過除去した。濾過値をデータセット中の他の非濾過試料と反復して比較し、各セットの試料に対し、比率を計算した。このセットを最高から最低まで順位付けして、極端な外れ値がその後の分析を歪ませるのを防ぎ、正規化困難なデータセットの分析をよりロバストにした。これらのランクは、ＳＩを得るために平均化される。並べ替え試験を用いて、ｐ値を各ＳＩ値に割り付け、目的の細胞型中で顕著に濃縮された遺伝子のリストを得た。ＳＩが低いほど、遺伝子のその細胞型に対する特異性が高い。
【００３８】
本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、治療薬のためのヒト標的の特定、人の間でのどのような変化が、治療薬の可変浸透率をもたらすのかの理解、ヒト変性疾患で発生する初期変化の調査、薬物標的の特定、および脆弱で、助かった細胞集団の比較分析に基づく治療薬の開発、を含む、一連の用途を有する。本明細書に記載の細胞プロファイリング技術を用いて、目的とするいずれの細胞型もプロファイリングできる。例えば、推定薬物標的を特定するために、遺伝子発現を、異なる細胞型に対して比較して、目的の細胞型中で特異的に発現する遺伝子を特定し得る。異なる患者間の不均一性を比較することにより、症状が現れる前に患者を特定するために、または治療的介入がより効果的であると思われる一部の患者を選択するために使用し得る疾患のバイオマーカーを明らかにし得る。
【００３９】
他の実施形態では、種間（例えば、マウスとヒト間）の遺伝子発現を、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術を用いて比較して、共通の、種特異的遺伝子が特定される。この情報はまた、薬物発見を活気づける。理由は、マウス特異的標的は、商業的に価値が小さいためである。さらに、種共通標的は、ヒトに変換できる可能性がより高い、マウスの基礎的研究を可能とする。最終的に、ヒト特異的標的は、ヒトがいくつかの疾患を発症するが、マウスに同じ疾患を発症させるのが困難な理由であり得る。共通の標的の追跡により、マウスのみでは特定され得ない新規薬物標的が提供され得る。
【００４０】
本明細書に記載の細胞プロファイリング技術の別の用途は、異なる個体全体の同じ組織中の同じ細胞型間での遺伝子発現を比較して、個体全体での変化を特定することである。現時点では、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）が、ＤＮＡレベルでの個体間の変化を調べるために用いられるが、これらの技術は、ＤＮＡの変化が遺伝子発現および機能に影響を与えるかどうかを示さない。本明細書に記載の細胞プロファイリング技術により生成されたデータは、患者層別化に使用でき、また、ＧＷＡＳデータと組み合わせて、個体全体にわたる治療に対する応答の変化がある理由を決定できる。
【００４１】
ＴＲＡＰ法とは対照的に、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、遺伝子導入動物の使用を必要としない。本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、ヒトおよび他の霊長類などの非モデル生物を含む任意の種由来の死後組織と共に使用できる。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、組織試料は処理され、目的の細胞型中で発現するタンパク質に特異的な抗体を試料に添加した。抗体の蛍光標識をその後、試料に加えた。目的の細胞型由来の核を、蛍光により組織試料から単離した。例えば、ＦＡＣＳを用いて、蛍光強度に基づいて核を単離した。核に局在化している転写因子（例えば、Ｍａｔｅｖｏｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（１３），ｅ７１７，ｄｏｉ：１０．３７９１／７１７，（２００８）、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に特異的な抗体を用いて、または小胞体（ＥＲ）に局在化しているタンパク質に特異的な抗体を用いて選別を実施し得る。多くのニューロンが膜マーカーに基づいて特定されているので、ＥＲ中で合成される膜タンパク質に特異的な抗体を用いて、神経系を調査し得る。さらに、小胞体の一部は、単離核に結合したままであることが観察された。
【００４３】
特定の細胞型由来の核の標識および選別のために使用される抗体は、我々の目的の細胞型中で特異的に発現する因子を特定するための、前に記載のＴＲＡＰ法調査から選択し得る。抗体の代わりに、目的の細胞型の核またはＥＲ中に局在化している核酸転写物に特異的なＲＮＡまたはＤＮＡプローブが使用される。例えば、Ｍｏら、（Ｎｅｕｒｏｎ，８６：１３６４−１３８４（２０１５）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、遺伝子導入マウスの興奮性神経細胞、ＰＶ介在ニューロン、およびＶＩＰニューロンを、それぞれＣａｍｋ２ａ、ＰＶ、およびＶＩＰを標的として用いて、分析した。上記Ｍｏらによると、約５０％の皮質核がＣａｍｋ２ａ陽性であり、約３％がＰＶ陽性であり、約２％がＶＩＰ陽性であった。
【００４４】
本明細書に記載の方法は、ヒト神経変性疾患における細胞の脆弱性の研究、強迫性障害、薬物中毒、自閉症スペクトラム障害、および年齢依存認知障害に関与する細胞型の回路に基づく分子キャラクタリゼーションを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術の目標は、ヒトＣＮＳ細胞型データを得て、重要なヒト神経障害および神経変性疾患に関与する脳回路または経路のキャラクタリゼーションを確立することである。例えば、マウス由来の細胞特異的データが、核濃縮、完全処理、ポリＡ＋  ＲＮＡおよび染色体の関連転写物（ＣＡＴ）から特定されたタンパク質に特異的な抗体を用いて得られた。追加の標識および選別のための、これらに対するＲＮＡ／ＤＮＡプローブを設計し得る。具体的には、ＴＲＡＰ方法用として開発された遺伝子導入動物由来の精製ＧＦＰ＋  核および単離ＲＮＡが、成熟ＲＮＡであるポリＡ＋  ＲＮＡを捕捉するポリＤＴビーズを用いて分析された。核膜と隣接している、ＥＲ中でＲＮＡの濃縮が観察された。これらのデータは、核に近接したＥＲ中で濃縮され、本明細書に記載の細胞プロファイリング技術の選別ステップを実施するために使用し得る抗体およびＲＮＡ／ＤＮＡプローブの推定標的である転写物についての詳細を提供する。本明細書で記載の方法は、ヒト組織試料中で新規に発見された細胞特異的マーカーのインサイツハイブリダイゼーションまたは免疫蛍光法による、高度に再現可能な細胞型特異的データの生成、および細胞特異的発現プロファイルの確証をもたらす。このデータにより、脳由来などのバルク組織由来の転写物プロファイルを使って、新規細胞特異的プローブを特定することができるという確証が得られる。
【００４５】
ＩＩ．遺伝子命名法
本明細書では、遺伝子記号をアンサンブル遺伝子ＩＤと共に用いて、マウス、ラット、およびヒト由来の遺伝子に言及する。他に断らない限り、各遺伝子記号に対応する遺伝子名は、表１に示すものである。
【表１】
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【００４６】
マウスに関しては、表２および表２ｂに、本明細書の実験で分析されたマウス遺伝子（ＭＵＳＧ）、転写物（ＭＵＳＴ）、およびタンパク質（利用可能な場合）（ＭＵＳＰ）に対応する特有のアンサンブル識別子が提供される。各アンサンブル項目に対する特有の識別子は、ＥＮＳＭＵＳＧ、ＥＮＳＭＵＳＴ、およびＥＮＳＭＵＳＰ標識の次の識別子の最初の５個の先頭にあるゼロ（０）を除くように修正した。アンサンブル転写物またはタンパク質識別子が利用できない場合、ジェンバンク転写物（核酸またはタンパク質）を含める。
【表２】
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【００４７】
表２ｂには、マウスの追加の遺伝子を含める。この表では、本明細書の実験で分析されたマウス遺伝子（ＭＵＳＧ）、転写物（ＭＵＳＴ）、およびタンパク質（利用可能な場合）（ＭＵＳＰ）に対応する特有のアンサンブル識別子が特定される。各アンサンブル項目に対する特有の識別子は、ＥＮＳＭＵＳＧ、ＥＮＳＭＵＳＴ、およびＥＮＳＭＵＳＰ標識の次の識別子の最初の５個の先頭にあるゼロ（０）を除くように修正した。アンサンブル転写物またはタンパク質識別子が利用できない場合、ジェンバンク転写物（核酸またはタンパク質）を含める。
【表３】
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【００４８】
ラットに関しては、表３に、本明細書の実験で分析されたラット遺伝子（ＭＵＳＧ）、転写物（ＭＵＳＴ）、およびタンパク質（利用可能な場合）（ＭＵＳＰ）に対応する特有のアンサンブル識別子が提供される。各アンサンブル項目に対する特有の識別子は、ＥＮＳＭＵＳＧ、ＥＮＳＭＵＳＴ、およびＥＮＳＭＵＳＰ標識の次の識別子の最初の５個の先頭にあるゼロ（０）を除くように修正した。
【表４】
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【００４９】
ヒト試料に関しては、表４に、本明細書の実験で分析されたヒト遺伝子（ＥＮＳＧ）、転写物（ＥＮＳＴ）、およびタンパク質（利用可能な場合）（ＥＮＳＰ）に対応する特有のアンサンブル識別子が提供される。各アンサンブル項目に対する特有の識別子は、ＥＮＳＧ、ＥＮＳＴ、およびＥＮＳＰ標識の次の識別子の最初の５個の先頭にあるゼロ（０）を除くように修正した。
【表５】
2020508652.tif 000188
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【００５０】
ＩＩＩ．細胞型から核の単離、およびプロファイリング方法
一定の細胞集団において、ヒト生物学の多くの問題が生産的に研究され得る。例えば、ヒト神経変性事象に関連する分子事象の理解は、これらの状態の遺伝的複雑性（Ｂｕｒｇｕｉｅｒｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ３０，５９−６５．；Ｈｉｎｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９，ａ０２３７０５；Ｖｏｒｓｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １８，３６２−３７６、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、神経細胞減少の確率的性質（Ｃｌａｒｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，１９５−１９９  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ６５，５９−６７、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、および疾患発症と進行の両方に対し変化する加齢の影響（Ｃｏｒｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６７，１１４−１２１  ａｎｄ  Ｎｉｃｃｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２，Ｒ７４１−Ｒ７５２、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のために、ヒト試料由来のかなりの数の種々の細胞型の長期にわたる研究により得ることが可能である。これらを考慮して、本明細書の方法は、特定の脳細胞型の分子特性を正確に決定するように開発した。この方法は、遺伝子導入動物を必要とせずに、一般的な脳組織バンク由来の死後組織を採用するのに充分に堅牢である。
【００５１】
本明細書に記載の細胞プロファイリング技術は、哺乳動物脳の特定の細胞型の堅牢で再現可能な研究を可能とするように、各細胞型内の核局在化および核関連タンパク質の特有の相補体を利用する細胞型特異的分析のための手法として開発した。本明細書で記載の細胞プロファイリング技術は、マウス、ラット、およびヒトの死後脳の細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングを可能とし、これらの方法は、任意の器官または組織試料まで拡張可能である。
【００５２】
げっ歯類およびヒト脳細胞型からの、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術由来のデータの比較試験は、古典的手法で決定された高度に保存的小脳細胞型から遺伝子発現プロファイルの進化的分岐を明らかにする（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ，Ｅ．（２０１３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ），ｐｐ．７６５−７９１；Ｅｃｃｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．（１９６７）Ｔｈｅ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ａｓ  ａ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｌｌｉｎａｓ，Ｒ．Ｒ．（１９６９）．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃｈｉｃａｇｏ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。データはまた、脳老化の分子機序が、各ヒト細胞型において、異なった形で明らかになる。最終的に、データは、共通の外部事象が対照死後ヒト脳において特定され得ることを示す、明確な、分子表現型を示す。本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いた、ヒト遺伝的および臨床的データと、発現およびエピジェネティック調査との比較試験は、追加であるが、認識されていないヒト脳機能および機能障害の分子特性に対する洞察をもたらすであろう。
【００５３】
細胞型特異的促進因子の制御下にあるＥＧＦＰ−Ｌ１０ａリボソームタンパク質融合体を発現している遺伝子導入マウスは、以前に、Ｄｏｙｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５，７４９−７６２およびＨｅｉｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５，７３８−７４８において開発された。このそれぞれの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＴＲＡＰ法で使用するために開発された、これらの５種の遺伝子導入動物株を用いて、ＥＧＦＰ＋核（Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，９２９−９３０およびＭｅｌｌｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５１，１４１７−１４３０、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）がＴＲＡＰ法を用いて遺伝子発現により、または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）の使用後のエピジェネティック特性により、特定の細胞型から精製された。以前の調査は、核ＲＮＡプロファイルはまた、各細胞型に対し特有であり、また、それらは、細胞機能に関して情報価値があることを確認した（Ｄｅａｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ６，５６−６８；Ｈｅｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｏｃｔ；４０（１９）：９６９１−７０４；Ｍｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｅｕｒｏｎ  ８６，１３６９−１３８４；Ｓｔｅｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２，７６６−７７７；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５４】
本明細書で記載の細胞プロファイリング技術より以前に開発された細胞型特異的分子プロファイリング方法の重要な制限は、それらが、目的の細胞型を遺伝子標的とするために、遺伝子導入動物の使用を必要とするということである。この制限を克服するために、ヒト死後脳試料を含む、多様な種中の特定の細胞型から核を精製し、特徴付けるように、核および小胞体タンパク質の細胞型特異的発現を詳細に調査した。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態では、核を野性型または遺伝子導入組織から調製し、ホルムアルデヒドを用いて固定し、脳関心領域の所定の細胞型に特異的な蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）により選別し、その後種、細胞型、または環境特異的発現プロファイル特性を明らかにするために、ＲＮＡｓｅｑを用いて分析した。
【００５６】
本明細書で記載の細胞プロファイリング技術は、特定の疾患、障害、または状態に関連する任意の細胞型または組織由来の核に適用し得る。例えば、線条体黒質系中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）、線条体淡蒼球系ＭＳＮ（尾状および側坐核）、線条体コリン作動性介在ニューロン、視床下核、ドーパミン作動性神経、および分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロンを含む、大脳基底核組織に起源を持つ細胞型由来の核に適用し得る。例えば、視床皮質ニューロン、視床線条体ニューロン、および視床網様核ニューロンを含む、視床組織に起源を持つ細胞型由来の核に適用し得る。例えば、嗅内皮質層２／３ニューロン、高速発火型皮質介在ニューロン、および前頭前野皮質組織由来の層２／３錐体細胞を含む、皮質組織に起源を持つ細胞型由来の核に適用し得る。例えば、アンモン角領域１（ＣＡ１）、アンモン角領域２（ＣＡ２）、アンモン角領域３（ＣＡ３）、および歯状回細胞を含む、海馬組織に起源を持つ細胞型由来の核に適用し得る。
【００５７】
細胞型はまた、次の組織に関連し得る：内側手綱（コリン作動神経系投射ニューロン、脚間核へ投射）、脳幹（上位運動ニューロン）、脊髄（下位運動ニューロン）、または全ての組織（種々の種類の介在ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞）。ヒト脳の細胞型はまた、運動失調、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性状態と関連し得る。例えば、細胞型は、運動失調に関連する、プルキンエ細胞、顆粒細胞、バーグマングリア、バスケット／星状細胞、および小脳深部核がプロファイル解析される。パーキンソン病に関連する黒質腹側被蓋野（ＶＴＡ）ドーパミン作動性神経またはアルツハイマー病に関連する層２／３嗅内皮質、ＣＡ１海馬、ＣＡ２／３海馬ニューロンもプロファイル解析される。あるいは、ＡＬＳに関連する脳幹および脊髄運動ニューロンがプロファイル解析される。
【００５８】
Ａ．核トランスクリプトームを用いた細胞型選別
核は、小胞体（ＥＲ）タンパク質、ＥＲ中で合成した膜タンパク質、または核転写物に特異的な、抗体、ＲＮＡプローブ、またはＤＮＡプローブを用いて選別し得る。核膜の近くで翻訳されたＥＲ転写物を濃縮するために、核転写物のポリＡプルダウン法を実施し得る。いくつかの実施形態では、目的の細胞型由来の核は、それぞれの技術から得られた細胞の独自性を比較するために、以前にＴＲＡＰ法を用いてプロファイル解析された遺伝子導入マウスの組織から単離された。ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入動物のプロファイリング結果は、ＧＦＰタグリボソームサブユニットが核小体中に組み込まれているという事実に基づいた。あるいは、選別される核の起源である組織は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、またはラットなどの野性型哺乳動物に由来する。
【００５９】
図１は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術で使用し得る選別方法の実施形態を提供し、この方法は、ＮＥＴＳｓｅｑ（商標）技術またはＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ（商標）とも呼ばれる。「Ａ」は、目的の細胞型を表し、「Ｂ」は、図１の目的の細胞型の核を表す。
【００６０】
いくつかの実施形態では、マウス中の小脳から３つの細胞型を単離する方策は、試料中のこれらの細胞型の存在を確認するために、Ｉｔｐｒ１（イノシトール  １，４，５−三リン酸受容体１型；小胞体（ＥＲ）の細胞内受容体）をプルキンエ細胞を標識するための標的として、ＮｅｕＮ（ＲＮＡ結合Ｆｏｘタンパク質ファミリーのメンバーによりコードされる遺伝子；ＮｅｕＮは、ニューロンのバイオマーカーとしてよく使われる神経抗原である）を顆粒細胞を標識するための標的として、およびＧｆａｐ（グリア線維酸性タンパク質；グリア細胞から星状膠細胞を識別するために使用される成熟星状膠細胞の主要中間径フィラメントタンパク質の１つ）をグリアを標識するための標的として用いる抗体結合を含む。その後、Ｉｔｐｒ１およびＮｅｕＮの結果の組み合わせを用いて、３つ全ての集団を単離し得る。あるいは、野性型マウスの顆粒細胞由来の核を、Ｉｔｐｒに対し陽性（Ｉｔｐｒ＋）およびＮｅｕＮ（ＮｅｕＮ＋）として、およびＯｌｉｇ２に対して陰性（Ｏｌｉｇ２−）およびＳｏｒｃｓ３（Ｓｏｒｃｓ３−）として選別し得る。プルキンエ細胞由来の核は、Ｉｔｐｒ１＋およびＮｅｕＮ＋として選別し得る。バスケット細胞由来の核は、Ｓｏｒｃｓ３＋および中程度ＮｅｕＮ−として特定し得る。星状膠細胞由来の核は、Ｓｏｒｃｓ３−およびＮｅｕＮ−として特定し得る。
【００６１】
あるいは、ニューロン分化１またはＮｅｕｒｏｄ１（Ｎｅｕｒｏｄ１＋）を用いて、顆粒細胞を選別し得る；プルキンエ細胞タンパク質２またはＰｃｐ２（Ｐｃｐ２＋）を用いて、プルキンエ細胞を選別し得る；セプチン４またはＳｅｐｔ４（Ｓｅｐｔ４＋）を用いて、バーグマングリアを選別し得る；コラーゲンベータ（１−Ｏ）ガラクトシルトランスフェラーゼ２またはＧｌｔ２５ｄ２、Ｃｏｌｇａｌｔ２としても知られる、（Ｇｌｔ２５ｄ２＋）を用いてコルチコポンチン錐体細胞を選別した；およびニューロテンシン受容体１またはＮｔｓｒ１（Ｎｔｓｒ＋）を用いて皮質視床錐体細胞を選別した。いくつかの実施形態では、次の核転写物を用いて、各細胞型の核を特定し得る：Ｓｅｐｔ４陽性細胞（バーグマングリア）に対してアルファ−２−マクログロブリン（Ａ２ｍ）、Ｃｏｌｇａｌｔ２陽性細胞（コルチコポンチン錐体）に対してＰｄｅ１ａおよびＣｏｌｇａｌｔ２、Ｅｘｃｉｔ陽性細胞（興奮性神経細胞）に対してＰｄｅ１ａおよびヘパラン硫酸−グルコサミン３−スルホトランスフェラーゼ４（Ｈｓ３ｓｔ４）、Ｎｔｓｒ１陽性細胞（皮質視床錐体）に対してＰｄｅ１ａおよびＨｓ３ｓｔ４、ＰＶ陽性細胞（パルブアルブミン介在ニューロン）に対してアリスタレス関連ホメオボックス（Ａｒｘ）およびパルブアルブミン（Ｐｖａｌｂ）、ＶＩＰ陽性細胞（ＶＩＰ介在ニューロン）に対して血管活性腸管ペプチド（Ｖｉｐ）、Ｐｃｐ２陽性細胞（プルキンエ）に対して溶質輸送体ファミリー９メンバーＡ３（Ｓｌｃ９ａ３）、およびＮｅｕｒｏｄ１陽性細胞（顆粒）に対してＧｒｉｎ２ｃ。
【００６２】
いくつかの実施形態では、マウス由来のドーパミン作動性神経の核は、フォークヘッドボックスＡ１（ＦｏｘＡ１）およびドーパミントランスポーター溶質輸送体ファミリー６メンバー３（Ｄａｔ、Ｓｌｃ６ａ３としても知られる）を用いて選別された。ドーパミン作動性神経は、ＦｏｘＡ１およびＤａｔの両方に対し陽性であることが観察されている。いくつかの実施形態では、選別に使用され得るドーパミン作動性神経の追加のマーカーには：チロシン加水分解酵素（ＴＨ）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）、およびドーパミン受容体２（Ｄｒｄ２）が含まれる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、選別された核集団中で下方制御された遺伝子はまた、核の細胞型特定の証拠として使用し得る。例えば、ドーパミン受容体Ｄ１（Ｄｒｄ１）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（Ｇａｄ）は、ドーパミン作動性神経中で発現することは知られておらず、したがって、ドーパミン作動性神経由来の核の選別された集団中では下方制御されているはずである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ウォルフラミンＥＲ膜貫通型糖タンパク質（Ｗｆｓ１）およびＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ｂ（Ｃｔｉｐ２、Ｂｃｌ１１ｂとしても知られる）を使って、マウス由来の皮質細胞型層２／３錐体ニューロンおよび層５および６錐体ニューロンの核をそれぞれ選別し得る。いくつかの実施形態では、ＥＴＳバリアント１（Ｅｔｖ１、ＥＲ８１としても知られる）を使って、層５錐体ニューロンの核を選別し得る。Ｅｔｖ１は、以前に、皮質の層５中の、皮質線条体ニューロン、コルチコポンチンニューロンの両方、および可能な他のものを標識することが観察された。いくつかの実施形態では、Ｗｆｓ１を炭酸脱水酵素１（ＣＡ１）陽性ニューロンのマーカーとして用い得、およびプルキンエ細胞タンパク質４（Ｐｃｐ４）を炭酸脱水酵素１（ＣＡ２）陽性歯状回のマーカーとして用い得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、溶質輸送体ファミリー１８メンバーＡ３（ＶａＣｈＴ、Ｓｌｃ１８ａ３としても知られる）、コンドロレクチン（Ｃｈｏｄｌ）、およびエストロゲン関連受容体ベータ（ＥｓｒｒＢ）をマウスの脳幹運動ニューロン由来の核のマーカーとして使用し得る。ＶａＣｈＴおよびＥｒｒＢに特異的な親和標識は、運動ニューロンを特異的に標識し、Ｃｈｏｄｌは、これらのニューロン以外の全てを標識する。Ｃｈｏｄｌに特異的な抗体は、脳幹運動ニューロンを直接的に標識するものと置換してよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ラット核は、少なくとも１つの膜タンパク質または核関連転写物を用いて選別される。例えば、顆粒細胞由来の核は、Ｉｔｐｒ陰性（Ｉｔｐｒ−）、Ｏｌｉｇ２陰性（Ｏｌｉｇ２−）、Ｓｏｒｃｓ陰性（Ｓｏｒｃｓ−）、およびＮｅｕＮ陽性（ＮｅｕＮ＋）として特定し得る。プルキンエ細胞由来の核は、Ｉｔｐｒ陽性（Ｉｔｐｒ＋）およびＮｅｕＮ＋として特定し得る。バスケット細胞由来の核は、Ｉｔｐｒ＋および中程度のＮｅｕＮ陰性（ｍｅｄ  ＮｅｕＮ−）として特定し得る。星状膠細胞由来の核は、Ｓｏｒｃｓ３陽性（Ｓｏｒｃｓ３＋）およびｍｅｄ  ＮｅｕＮ−として特定し得る。成熟乏突起膠細胞由来の核は、Ｓｏｒｃｓ３−およびＮｅｕＮ−として特定し得る。成熟乏突起膠細胞とＯＰＣの組み合わせ由来の核は、Ｏｌｉｇ２陽性（Ｏｌｉｇ２＋）および高度ＮｅｕＮ陰性（ｈｉｇｈ  ＮｅｕＮ−）として特定し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ヒト試料に由来するプルキンエ細胞由来の核は、Ｉｔｐｒ＋およびＩｄ２陽性（Ｉｄ２＋）またはＦｏｘＰ４陽性（ＦｏｘＰ４＋）およびＩｔｐｒ１＋として特定し得る。いくつかの実施形態では、ヒト試料由来の顆粒細胞の核は、ＦｏｘＰ４＋およびＮｅｕＮ＋として特定された。いくつかの実施形態では、成熟乏突起膠細胞およびＯＰＣ由来の核は、Ｏｌｉｇ２の発現レベルで識別され得る。例えば、低レベルのＯｌｉｇ２発現（Ｏｌｉｇ２＋低）により核が成熟乏突起膠細胞として特定され、また、高レベルのＯｌｉｇ２発現（Ｏｌｉｇ２＋高）により核がＯＰＣとして特定される。
本明細書で記載の核選別方策は、どの種にも適用し得る。
【００６８】
Ｂ．異なる種の選別された核中の細胞型のプロファイリング
各細胞型で発現した遺伝子は、それらの機能、内部および外部キューに対するそれらの応答、および種全体におけるそれらの発生を規定する。本明細書で記載の細胞プロファイリング技術は、マウス、ラット、およびヒト脳由来のニューロンおよびグリアの精度の高い細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングに有用であることが実証された。
【００６９】
Ｍｏらの、（２０１５）Ｎｅｕｒｏｎ  ８６，１３６９−１３８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムによりタグ付き核膜タンパク質を発現している遺伝子導入マウス由来の核がＲＮＡｓｅｑを用いてプロファイル解析された。遺伝子導入動物と、異なる起源の野生型動物の細胞型から単離された核のＲＮＡｓｅｑプロファイルの比較により、核ＲＮＡプロファイルを用いて、細胞の独自性を決定および異なる細胞型の関連性を測定し得るという証拠が得られる。いくつかの実施形態では、遺伝子導入動物は、標的細胞型中で増大したＧＦＰ（ＥＧＦＰ／Ｌ１０ａ融合タンパク質）を発現し得る。いくつかの実施形態では、Ｍｏらで選別および特徴付けされた核から、ＲＮＡｓｅｑ由来の階層型クラスタリングがもたらされ、また、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いて、介在ニューロン（例えば、ＶＩＰ介在ニューロンおよびパルブアルブミン介在ニューロン）対錐体細胞（例えば、皮質錐体、皮質視床、および刺激性）などの細胞型によるグループ化が可能となる。
【００７０】
伝統的な方法で定義された、均一な小脳細胞型でも、数百のオルソロガス遺伝子の発現により、種間で異なることが観察され、ヒト顆粒細胞発現遺伝子の連続的発現も、マウス脳の他の領域でよく観察されていた。実際に、核ＲＮＡプロファイルは、成熟乏突起膠細胞（コルチコポンチン錐体ニューロンとも呼ばれる）、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞またはＯＰＣ（皮質視床錐体ニューロンとも呼ばれる）などの異なるニューロンサブタイプの間で区別するのに十分な感受性がある。
【００７１】
１．マウス由来の選別核のＲＮＡプロファイルの差異
いくつかの実施形態では、遺伝子発現をＲＮＡｓｅｑで分析し、ＲＮＡプロファイルを生成した。いくつかの実施形態では、結果を正規化し、各遺伝子の試料全体にわたる発現を平均化した。例えば、顆粒細胞、プルキンエ細胞、バーグマングリア、乏突起膠細胞、およびＯＰＣのＦＡＣＳにより精製された核由来のＲＮＡｓｅｑのｌｏｇ２倍率変化の結果を、全ての細胞型由来の核全体の２５０個の最も変化する遺伝子の正規化ＲＮＡｓｅｑ結果に対し比較し得る。マウスでは、最も変化する遺伝子は、次記から選択し得る：１７０００４７Ｍ１１Ｒｉｋ、３１１００３９Ｍ２０Ｒｉｋ、２４１０１２４Ｈ１２Ｒｉｋ、８０３０４５１Ｏ０７Ｒｉｋ、９５３００５９Ｏ１４Ｒｉｋ、Ａ２３００７７Ｈ０６Ｒｉｋ、Ａ２ｍ、Ａ７３００３６Ｉ１７Ｒｉｋ、Ａａｓｓ、Ａｃｓｍ５、Ａｃｔｂｌ２、Ａｄｒａ２ｂ、Ａｆｐ、Ａｑｐ４、Ａｒｈｇａｐ２５、Ａｒｘ、Ａｔｐ１３ａ４、Ａｔｐ１ａ２、Ａｔｐ２ａ３、Ｂ２３０２０９Ｅ１５Ｒｉｋ、Ｂ３ｇｎｔ５、Ｂａｒｈｌ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｂｔｂｄ１７、Ｃａｃｎｇ３、Ｃａｍｋ１ｇ、Ｃａｍｋｖ、Ｃａｒ８、Ｃａｓｐ１２、Ｃａｓｑ２、Ｃｂｌｎ２、Ｃｂｌｎ３、Ｃｃｋｂｒ、Ｃｄ７０、Ｃｄ９、Ｃｄｃ４２ｅｐ１、Ｃｄｈ１９、Ｃｈｒｍ１、Ｃｈｒｍ３、Ｃｈｓｙ３、Ｃｌｉｃ６、Ｃｍｌ５、Ｃｎｐｙ１、Ｃｏｂｌ、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ４ａ５、Ｃｏｌ６ａ１、Ｃｏｌｇａｌｔ２、Ｃｏｒｉｎ、Ｃｏｒｏ６、Ｃｐｎｅ７、Ｃｒｙｍ、Ｃｓｔａ１、Ｃｔｘｎ３、Ｃｘｃｌ１４、Ｃｘｃｌ５、Ｃｘｃｒ４、Ｃｙｐ２７ａ１、Ｃｙｐ２ｊ９、Ｄ４３００１９Ｈ１６Ｒｉｋ、Ｄｄｎ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｄｌｇａｐ２、Ｄｌｘ４ｏｓ、Ｄｌｘ６ｏｓ１、Ｄｍｐ１、Ｅ０３０００３Ｅ１８Ｒｉｋ、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、Ｅｄｎｒｂ、Ｅｇｆｒ、Ｅｇｒ３、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｅｌｆｎ１、Ｅｍｐ２、Ｅｎ２、Ｅｎｃ１、Ｅｔｎｐｐｌ、Ｅｖａ１ａ、Ｆ３、Ｆａｍ１０７ｂ、Ｆａｍ１９ａ１、Ｆａｔ２、Ｆｂｌｎ２、Ｆｅｚｆ２、Ｆｇｄ３、Ｆｌｒｔ２、Ｆｏｌｈ１、Ｆｏｘｇ１、Ｆｒｅｍ１、Ｇａｂｒａ６、Ｇａｌｎｔ１４、Ｇａｓ１、Ｇｄａ、Ｇｄｆ１０、Ｇｊａ１、Ｇｊｂ６、Ｇｊｃ３、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ３、Ｇｌｔ２５ｄ２、Ｇｍ１１５４９、Ｇｍ２６６、Ｇｍ５０８３、Ｇｍ５０８９、Ｇｍ５４６８、Ｇｍ５６０７、Ｇｍ８１７９、Ｇｐｒ３７ｌ１、Ｇｒｉｋ１、Ｇｒｍ５、Ｈｅｐａｃａｍ、Ｈｅｓ３、Ｈｓ３ｓｔ２、Ｈｓ３ｓｔ４、Ｈｔｒ２ａ、Ｉｃａｍ５、Ｉｃｏｓｌ、Ｉｌ２２、Ｉｌｔｉｆｂ、Ｉｒｘ１、Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ５、Ｉｔｉｈ３、Ｉｔｐｒｉｐｌ２、Ｋａｎｋ１、Ｋｃｎｃ２、Ｋｃｎｆ１、Ｋｃｎｊ１０、Ｋｃｎｊ１６、Ｋｃｎｊ４、Ｋｃｎｑ５、Ｋｃｎｔ２、Ｋｃｎｖ１、Ｋｃｔｄ１２ｂ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｌａｍａ２、Ｌａｍｐ５、Ｌｃａｔ、Ｌｄｂ２、Ｌｆｎｇ、Ｌｇｒ６、Ｌｈｘ１、Ｌｈｘ１ｏｓ、Ｌｈｘ５、Ｌｉｎｃ−ｍｄ１、Ｌｒｒｃ７、Ｌｙｚｌ４、Ｍａｌ２、Ｍａｒｃｈ１、Ｍｅｇｆ１０、Ｍｅｉｓ２、Ｍｅｒｔｋ、Ｍｅｔｒｎ、Ｍｇｓｔ１、Ｍｉａｔ、Ｍｌｃ１、Ｍｍｐ１４、Ｍｐｐｅｄ１、Ｍｓｘ２、Ｍｙｂｐｃ１、Ｍｙｈ６、Ｎｅｔｏ１、Ｎｉｄ１、Ｎｋｘ２−２、Ｎｐｒ３、Ｎｐｙ１ｒ、Ｎｒｇｎ、Ｎｒｋ、Ｎｔｓｒ２、Ｎｕｐ６２ｃｌ、Ｏｐｒｄ１、Ｐ２ｒｙ１、Ｐａｑｒ６、Ｐａｘ３、Ｐｃｓｋ６、Ｐｄｅ１ａ、Ｐｄｅ５ａ、Ｐｄｇｆｄ、Ｐｄｚｐｈ１、Ｐｉｈ１ｈ３ｂ、Ｐｋｐ３、Ｐｌａ２ｇ７、Ｐｌｅｋｈｄ１、Ｐｌｅｋｈｏ２、Ｐｌｐｐ３、Ｐｌｓｃｒ１、Ｐｌｓｃｒ４、Ｐｐｐ１ｒ１７、Ｐｒｋａｇ３、Ｐｒｏｃｒ、Ｐｒｒ５、Ｐｔｋ２ｂ、Ｐｔｐｎ５、Ｐｔｐｒｚ１、Ｒａｂ１１ｆｉｐ１、Ｒａｂ２７ｂ、Ｒｏｂｏ３、Ｒｔｎ４ｒｌ２、Ｒｘｆｐ１、Ｓ１ｐｒ１、Ｓｃｕｂｅ１、Ｓｄｃ４、Ｓｅｒｐｉｎｈ１、Ｓｋｏｒ２、Ｓｌｃ１４ａ１、Ｓｌｃ１ａ３、Ｓｌｃ２４ａ４、Ｓｌｃ２ａ１０、Ｓｌｃ２ａ４、Ｓｌｃ３０ａ３、Ｓｌｃ３９ａ１２、Ｓｌｃ６ａ７、Ｓｌｃ７ａ１０、Ｓｌｃ９ａ３、Ｓｌｃｏ４ｃ１、Ｓｍｐｘ、Ｓｏｄ３、Ｓｐａｒｃ、Ｓｔａｃ、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｓｔｋ３２ａ、Ｓｙｃｐ１、Ｓｙｔ１０、Ｔｂｒ１、Ｔｅｘ３６、Ｔｌｃｄ１、Ｔｌｒ３、Ｔｍｅｍ１３２ｂ、Ｔｍｅｍ１７９、Ｔｍｅｍ２００ａ、Ｔｎｃ、Ｔｏｘ３、Ｔｒｉｌ、Ｔｒｉｍ３０ａ、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、Ｔｔｐａ、Ｕｔｙ、Ｖｉｐ、Ｖｓｉｇ２、Ｖｓｔｍ２ｂ、Ｗｉｆ１、Ｚｆｐ３８５ｃ、Ｚｆｐ８３１、Ｚｉｃ１、Ｚｉｃ２、Ｚｉｃ３、Ｚｉｃ４、およびＺｉｃ５または本明細書で特定されたその他のもの。
【００７２】
マウスでは、その発現をマーカーとして使用して、顆粒細胞またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、２５１０００３Ｂ１６Ｒｉｋ、４９３０４４９Ｅ１８Ｒｉｋ、６４３０５４８Ｍ０８Ｒｉｋ、６５３０４０３Ｈ０２Ｒｉｋ、９２３０１１２Ｊ１７Ｒｉｋ、Ａｂｌｉｍ１、Ａｂｌｉｍ３、Ａｃｋｒ１、Ａｄａｍｔｓ１８、Ａｄｃｙ１、Ａｉｒｎ、Ａｋ４、Ａｌｓ２、Ａｔｐ１ａ１、Ａｔｐ２ｂ３、Ｂａｒｈｌ２、Ｂｃｌ２ｌ１５、Ｂｏｃ、Ｂｒｉｎｐ１、Ｂｓｎ、Ｂｔｇ１、Ｃ１３００３０Ｋ０３Ｒｉｋ、Ｃａｃｎａ１ｃ、Ｃａｃｎａ１ｅ、Ｃａｃｎａ２ｄ１、Ｃａｄｍ３、Ｃａｄｐｓ２、Ｃａｌｂ２、Ｃａｌｎ１、Ｃａｍｋ４、Ｃａｍｋｋ２、Ｃａｒ１０、Ｃａｒ１５、Ｃａｒ４、Ｃｂｌｎ１、Ｃｂｌｎ３、Ｃｃｄｃ１２０、Ｃｄ３００ａ、Ｃｄｈ１５、Ｃｄｈ７、Ｃｄｈ８、Ｃｅｌｆ４、Ｃｅｒｋｌ、Ｃｅｒｓ６、Ｃｈｇｂ、Ｃｈｎ２、Ｃｈｒｄ、Ｃｎｋｓｒ２、Ｃｎｎｍ４、Ｃｎｔｎ６、Ｃｎｔｎａｐ１、Ｃｎｔｎａｐ４、Ｃｐｌｘ２、Ｃｒｈｒ１、Ｃｒｔａｍ、Ｄａｂ２ｉｐ、Ｄｅｓ、Ｄｇｋｄ、Ｄｉｒａｓ２、Ｄｌｇａｐ３、Ｄｐｐ６、Ｄｐｙｓｌ４、Ｄｕｓｐ５、Ｅｉｆ４ｅ３、Ｅｐｂ４１、Ｅｐｂ４１ｌ４ｂ、Ｅｐｈａ３、Ｅｒｃ１、Ｅｔｓ２、Ｅｔｖ１、Ｅｘｐｈ５、Ｆａａｐ２０、Ｆａｍ１３５ｂ、Ｆａｔ２、Ｆｇｆ１４、Ｆｚｄ７、Ｇａｂｒａ６、Ｇａｂｒｂ３、Ｇａｂｒｄ、Ｇａｌｎｔ１３、Ｇａｐ４３、Ｇｇａｃｔ、Ｇｍ２６９４、Ｇｍ７８５４、Ｇｍ９８９９、Ｇｍ９９６、Ｇｏｌｇａ７ｂ、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｇｒｉｋ２、Ｇｒｉｎ２ａ、Ｇｒｉｎ２ｃ、Ｇｒｍ４、Ｉｃａ１ｌ、Ｉｇｆｂｐ５、Ｉｌ１６、Ｉｌ２０ｒｂ、Ｉｎａｄｌ、Ｉｔｇａ７、Ｊｐｈ３、Ｊｐｈ４、Ｋａｎｋ２、Ｋｂｔｂｄ１１、Ｋｃｎｃ１、Ｋｃｎｄ２、Ｋｃｎｈ１、Ｋｃｎｉｐ４、Ｋｃｎｊ１２、Ｋｃｎｊ６、Ｋｃｎｋ１、Ｋｃｎｋ１０、Ｋｃｎｋ１２、Ｋｃｎｋ３、Ｋｃｎｋ９、Ｋｃｎｔ１、Ｋｈｎｙｎ、Ｋｉｆ２６ｂ、Ｌｇｉ１、Ｌｈｆｐ、Ｌｉｎ７ａ、Ｌｒｒｃ３ｂ、Ｌｕｒａｐ１、Ｍａｍｌ３、Ｍａｐｋ１１、Ｍａｐｋ１２、Ｍａｒｖｅｌｄ２、Ｍｃｔｐ１、Ｍｉｒ６７０、Ｍｍｐ２４、Ｍｐｐ４、Ｍｓｒａ、Ｎｄｒｇ３、Ｎｄｓｔ３、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｎｅｇｒ１、Ｎｅｔｏ２、Ｎｅｕｒｌ１ａ、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｎｈｓｌ２、Ｎｒｅｐ、Ｎｒｉｐ２、Ｎｒｎ１、Ｎｔｎ４、Ｎｘｎ、Ｏｌｆｍ１、Ｏｌｆｍ３、Ｐａｇｒ１ａ、Ｐａｎｘ２、Ｐｃｌｏ、Ｐｃｓｋ２、Ｐｄｅ１０ａ、Ｐｄｅ３ｂ、Ｐｇｍ２ｌ１、Ｐｋｉｂ、Ｐｌｃｈ２、Ｐｌｃｌ２、Ｐｌｃｘｄ３、Ｐｌｄ５、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｐｐｆｉａ４、Ｐｑｌｃ３、Ｐｒｋｃｅ、Ｐｒｒ１６、Ｐｒｓｓ５２、Ｐｔｃｈｄ１、Ｐｔｐｎ２２、Ｐｘｙｌｐ１、Ｒａｂ１５、Ｒａｂ３７、Ｒａｌｙｌ、Ｒａｐｇｅｆ４、Ｒｂｆｏｘ１、Ｒｂｆｏｘ３、Ｒｃａｎ３、Ｒｅｌｎ、Ｒｉｍｓ１、Ｒｉｍｓ２、Ｒｉｍｓ３、Ｒｎｆ１１２、Ｒｎｆ１５２、Ｒｏｒ１、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｒｔｎ４ｒ、Ｒｔｎ４ｒｌ１、Ｒｙｒ２、Ｓｃｎ２ａ１、Ｓｅｌ１ｌ３、Ｓｅｍａ４ｆ、Ｓｅｒｇｅｆ、Ｓｇｐｐ２、Ｓｇｓｍ１、Ｓｈ３ｇｌ２、Ｓｈｆ、Ｓｈｉｓａ８、Ｓｉｄｔ１、Ｓｌｃ１６ａ１０、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｓｌｃ２５ａ２２、Ｓｌｃ２９ａ４、Ｓｌｃ２ａ１３、Ｓｌｃ３５ｆ３、Ｓｌｃ８ａ２、Ｓｌｃ９ａ５、Ｓｌｉｔ３、Ｓｌｉｔｒｋ４、Ｓｎａｐ２５、Ｓｎｒｋ、Ｓｐｅｃｃ１、Ｓｐｅｇ、Ｓｐｈｋａｐ、Ｓｐｔｂ、Ｓｔ３ｇａｌ５、Ｓｔａｐ２、Ｓｔｍｎ２、Ｓｔｘｂｐ１、Ｓｔｘｂｐ５ｌ、Ｓｖ２ｂ、Ｓｖｅｐ１、Ｓｖｏｐ、Ｓｙｎｄｉｇ１ｌ、Ｓｙｔ１、Ｓｙｔ１２、Ｓｙｔ４、Ｔａｓ２ｒ１４３、Ｔｂａｔａ、Ｔｂｃ１ｄ８、Ｔｅｎｍ１、Ｔｅｓｃ、Ｔｉａｍ１、Ｔｌｌ１、Ｔｍｅｍ１６３、Ｔｍｅｍ１７８、Ｔｍｅｍ１８１ｃ−ｐｓ、Ｔｍｅｍ２６６、Ｔｍｅｍ５６、Ｔｍｅｍ６３ｃ、Ｔｍｔｃ４、Ｔｒｈｄｅ、Ｕｂｔｄ２、Ｕｎｃ１３ｃ、Ｕｎｃｘ、Ｕｓｐ３、Ｖａｔ１ｌ、Ｖｓｎｌ１、Ｗｓｃｄ２、Ｘｋｒ６、Ｘｋｒ７、Ｚｄｈｈｃ２、Ｚｆｐ３８５ｂ、およびＺｉｃ２を含む、無選別核中の正規化発現に比べて、発現の最大の変化を有する遺伝子が挙げられる。
【００７３】
マウスでは、その発現をマーカーとして使用して、プルキンエまたはそれらの核を特定し得る遺伝子には、１１９０００２Ｎ１５Ｒｉｋ、１７００００８Ｏ０３Ｒｉｋ、１７００１２４Ｌ１６Ｒｉｋ、２４１０１２４Ｈ１２Ｒｉｋ、９５３００５２Ｅ０２Ｒｉｋ、９５３００５９Ｏ１４Ｒｉｋ、Ａ３３００５０Ｆ１５Ｒｉｋ、Ａｂｈｄ３、Ａｄａｍ２３、Ａｄａｍｔｓ３、Ａｄｇｒｌ２、Ａｆｆ１、Ａｎｋ１、Ａｎｋｒｄ３３ｂ、Ａｎｋｒｄ５３、Ａｎｋｓ１ｂ、Ａｐｉｐ、Ａｒａｐ１、Ａｒｈｇａｐ２０、Ａｒｈｇａｐ２６、Ａｒｈｇｅｆ３３、Ａｒｎｔｌ、Ａｔｌ２、Ａｔｐ２ａ３、Ａｔｐ２ｂ２、Ａｔｐ６ａｐ１ｌ、Ａｔｐ６ｖ１ｂ１、Ａｔｒｎｌ１、Ａｕｔｓ２、Ｂ３ｇｎｔ５、Ｂａｉａｐ２、Ｂｃｌ１１ａ、Ｂｅａｎ１、Ｂｒｉｎｐ２、Ｂｚｒａｐ１、Ｃａｃｎａ１ａ、Ｃａｃｎａ１ｇ、Ｃａｃｎａ２ｄ２、Ｃａｌｂ１、Ｃａｍｋ２ａ、Ｃａｒ７、Ｃａｒ８、Ｃａｓｑ２、Ｃｃｄｃ１０７、Ｃｃｄｃ８５ａ、Ｃｃｋ、Ｃｄｓ１、Ｃｅｐ１２６、Ｃｅｐ７６、Ｃｌｅｃ２ｌ、Ｃｌｉｃ６、Ｃｌｓｔｎ３、Ｃｎｔｎ３、Ｃｎｔｎａｐ５ｂ、Ｃｎｔｎａｐ５ｃ、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｒｉｎ、Ｃｐｅｂ１、Ｃｐｎｅ９、Ｃｓｔａ１、Ｃｙｔｈ３、Ｄ４３００３６Ｊ１６Ｒｉｋ、Ｄａｃｈ１、Ｄａｇｌａ、Ｄｅｆｂ２３、Ｄｇｋｇ、Ｄｇｋｈ、Ｄｇｋｚ、Ｄｌｇ２、Ｄｌｘ４ｏｓ、Ｄｍｄ、Ｄｎｅｒ、Ｄｏｃ２ｂ、Ｄｐｐ１０、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｃｅ１、Ｅｔｌ４、Ｆａｍ１０７ｂ、Ｆａｍ１１７ａ、Ｆａｍ１７４ｂ、Ｆａｍ１８４ｂ、Ｆａｍ２１、Ｆａｍ７８ｂ、Ｆａｒ２、Ｆｂｘｌ２１、Ｆｇｄ３、Ｆｈｌ５、Ｆｌｔ３、Ｆｍｎｌ１、Ｆｏｘｐ２、Ｆｏｘｐ４、Ｆｒｍｐｄ３、Ｇａｂｂｒ２、Ｇａｒｎｌ３、Ｇｆｒａ２、Ｇｍ１４１６９、Ｇｍ５０８３、Ｇｍ５８０３、Ｇｎｇ１３、Ｇｐｒ６３、Ｇｒｉｄ２、Ｇｒｉｄ２ｉｐ、Ｇｒｉｋ１、Ｇｒｉｐ１、Ｇｒｍ１、Ｈ２−Ｄ１、Ｈｅａｔｒ５ａ、Ｈｅｓ３、Ｈｏｍｅｒ３、Ｈｐｃａｌ１、Ｈｒｈ２、Ｈｓｐａ１２ａ、Ｈｔｒ１ｂ、Ｉｃｍｔ、Ｉｄ２、Ｉｆｎｇｒ２、Ｉｌ２２、Ｉｌｔｉｆｂ、Ｉｎｐｐ４ａ、Ｉｎｐｐ５ａ、Ｉｔｇａ３、Ｉｔｐｋａ、Ｉｔｐｒ１、Ｋａｌｒｎ、Ｋｃｎａｂ１、Ｋｃｎａｂ２、Ｋｃｎｈ７、Ｋｃｎｉｐ１、Ｋｃｎｍａ１、Ｋｃｔｄ１２、Ｋｉｔｌ、Ｋｓｒ２、Ｌ３ｍｂｔｌ１、Ｌａｒｇｅ、Ｌｄｈｄ、Ｌｈｘ１、Ｌｈｘ１ｏｓ、Ｌｈｘ５、Ｌｉｎｃ−ｍｄ１、Ｌｐｃａｔ４、Ｌｒｆｎ５、Ｌｒｐ８、Ｌｒｒｆｉｐ１、Ｌｓｍｅｍ１、Ｍａｇｏｈ、Ｍｃｅｍｐ１、Ｍｄｆｉ、Ｍｉｒ１２４ａ−１ｈｇ、Ｍｉｒ１３８−１、Ｍｉｒ３４７０ｂ、Ｍｔｓｓ１、Ｍｙｈ１０、Ｍｙｏ１０、Ｎｅｆｈ、Ｎｅｆｍ、Ｎｅｋ２、Ｎｅｌｌ１、Ｎｅｘｎ、Ｎｉｎｌ、Ｎｋｉｒａｓ２、Ｎｐｒ１、Ｎｒ２ｆ２、Ｎｒｋ、Ｎｓｇ１、Ｎｕｐ９３、Ｏｃｉａｄ２、Ｏｒａｉ２、Ｐａｘｂｐ１、Ｐｃｐ２、Ｐｃｐ４、Ｐｄｅ２ａ、Ｐｄｅ５ａ、Ｐｄｅ９ａ、Ｐｉｈ１ｈ３ｂ、Ｐｌｃｂ３、Ｐｌｅｋｈｄ１、Ｐｌｅｋｈｄ１ｏｓ、Ｐｌｐｐ６、Ｐｌｘｄｃ１、Ｐｎｐｌａ３、Ｐｏｌｒ１ｂ、Ｐｐｐ１ｒ１７、Ｐｐｐ４ｒ４、Ｐｒｋａｇ３、Ｐｒｋｃｇ、Ｐｒｋｇ１、Ｐｒｍｔ８、Ｐｓｄ２、Ｐｔｃｈｄ４、Ｐｔｐｒｒ、Ｒａｂ４３、Ｒｂｍｓ１、Ｒｅｅｐ２、Ｒｅｔｎ、Ｒｇｓ８、Ｒｍｄｎ３、Ｒｎｆ１９ｂ、Ｒｒｅｂ１、Ｒｔｅｌ１、Ｒｙｒ１、Ｓｃｎ４ｂ、Ｓｅｒｉｎｃ２、Ｓｅｓｔｄ１、Ｓｈ２ｄ４ｂ、Ｓｈａｎｋ１、Ｓｈｉｓａ６、Ｓｋｏｒ２、Ｓｌｃ１６ａ９、Ｓｌｃ１ａ６、Ｓｌｃ２０ａ１、Ｓｌｃ９ａ３、Ｓｍｐｘ、Ｓｎｈｇ１１、Ｓｏｒｌ１、Ｓｏｓ１、Ｓｏｘ５ｏｓ３、Ｓｐｔａｎ１、Ｓｐｔｂｎ２、Ｓｔａｃ、Ｓｔｅａｐ２、Ｓｔｉｌ、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｓｔｒｉｐ２、Ｓｔｒｎ３、Ｓｔｘｂｐ２、Ｓｖｉｌ、Ｓｙｃｐ１、Ｓｙｎｄｉｇ１、Ｓｙｔ７、Ｔｅｎｍ４、Ｔｅｘ２６１、Ｔｈｙ１、Ｔｍ６ｓｆ１、Ｔｍｅｍ２５５ａ、Ｔｒａｂｄ２ｂ、Ｔｒｐｃ３、Ｔｓｐａｎ１１、Ｔｔｌｌ５、Ｔｕｂａ８、Ｕｎｃ５ｄ、Ｖａｘ２、Ｖｗａ５ｂ２、Ｙｗｈａｈ、Ｚｂｔｂ４６、Ｚｆａｎｄ４、Ｚｆｐ３８５ａ、Ｚｆｐ３８５ｃ、およびＺｎｈｉｔ１を含む、無選別核中の正規化発現に比べて、発現の最大の変化を有する遺伝子が挙げられる。
【００７４】
マウスでは、その発現をマーカーとして使用して、バスケット細胞またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、１７０００２４Ｆ１３Ｒｉｋ、１７０００８０Ｎ１５Ｒｉｋ、９５３００２６Ｐ０５Ｒｉｋ、Ａ５３００５８Ｎ１８Ｒｉｋ、Ａｃｏｔ１０、Ａｄａｍｔｓ１５、Ａｄａｍｔｓ１６、Ａｄａｍｔｓ２、Ａｄａｒｂ２、Ａｄｇｒｌ３、Ａｄｒｂ２、Ａｇｌ、ＡＩ５０４４３２、Ａｌｄｈ１８ａ１、Ａｌｄｈ１ｌ２、Ａｌｄｏｂ、Ａｎｋｒｄ１３ｂ、Ａｒ、Ａｒｌ４ａ、Ａｒｌ４ｃ、Ａｒｒｄｃ１、Ａｓｇｒ１、Ａｓｉｃ２、Ａｓｌ、Ａｓｎｓ、Ａｔｐ１ｂ１、Ａｔｐ２ｂ１、Ｂｅｘ１、Ｂｈｌｈｅ２２、Ｂｔｂｄ１１、Ｂｚｗ２、Ｃ１ｑｔｎｆ４、Ｃａｂｐ１、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｃａｃｎａ１ｄ、Ｃａｃｎａ２ｄ３、Ｃａｃｎｇ２、Ｃａｍｋ１ｇ、Ｃａｍｋ２ｎ１、Ｃａｒｓ、Ｃｃｄｃ１３６、Ｃｃｄｃ７４ａ、Ｃｄ５９ａ、Ｃｄｋｌ１、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｅｐ７０、Ｃｇｎ、Ｃｈａｃ１、Ｃｈｃｈｄ７、Ｃｈｄ３ｏｓ、Ｃｈｓｔ１、Ｃｈｓｔ９、Ｃｌｍｐ、Ｃｎｐｙ１、Ｃｎｒ１、Ｃｎｔｎ４、Ｃｏｒｏ６、Ｃｒｙｂａ２、Ｃｓｍｄ１、Ｃｓｒｎｐ３、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｃｙｌｄ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｃｙｐ７ｂ１、Ｄｎａｈ１１、Ｄｏｃｋ７、Ｅｆｎａ５、Ｅｌａｖｌ４、Ｅｌｍｏｄ１、Ｅｍｌ５、Ｅｎｐｐ１、Ｅｐｈｂ２、Ｅｒｃ２、Ｅｓｒｒｇ、Ｆａｍ８４ａ、Ｆｅｖ、Ｆｇｆ１３、Ｆｌｒｔ２、Ｆｒｍｄ３、Ｆｕｃａ２、Ｇａｂｒａ１、Ｇａｂｒｇ２、Ｇａｄ１、Ｇａｄ２、Ｇａｌｎｔ１８、Ｇａｒｓ、Ｇｄｐｄ５、Ｇｆｒａ４、Ｇｊｄ２、Ｇｌｃｅ、Ｇｌｄｃ、Ｇｍ１１７８０、Ｇｍ１４２０４、Ｇｍ１５６３１、Ｇｍ１５６６３、Ｇｍ２７６２、Ｇｐｒ１２、Ｇｐｒａｓｐ２、Ｇｒｂ１０、Ｇｒｉａ３、Ｇｒｉｄ１、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｉｎ２ｄ、Ｇｒｍ８、Ｈ２ａｆｚ、Ｈ２−Ｂｌ、Ｈａｕｓ４、Ｈｃｎ１、Ｈｅｃｗ１、Ｈｎｒｎｐａ０、Ｈｐｃａ、Ｈｐｃａｌ４、Ｈｕｎｋ、Ｉｇｓｆ３、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｐｐ４ｂ、Ｋｃｎａ２、Ｋｃｎａｂ３、Ｋｃｎｓ２、Ｋｉｒｒｅｌ、Ｋｉｒｒｅｌ３、Ｋｉｔ、Ｋｌｈｌ３３、Ｌａｍｂ１、Ｌｒｒｃ３８、Ｌｓｍ１１、Ｌｙ６ｅ、Ｌｙｐｄ６、Ｍａｇｅｄ１、Ｍａｎ２ａ１、Ｍａｒｃｈ１１、Ｍｇａｔ４ｃ、Ｍｇａｔ５、Ｍｉｒ１９３ｂ、Ｍｉｒ３８４、Ｍｋｘ、Ｍｐｐ７、Ｍｓａｎｔｄ４、Ｍｔｆｐ１、Ｍｔｈｆｄ２、Ｍｙｏ１６、Ｍｙｒｉｐ、Ｍｙｔ１ｌ、Ｎａｐ１ｌ２、Ｎａｒｓ、Ｎｄｎ、Ｎｅｆｌ、Ｎｅｕｒｏｄ２、Ｎｅｕｒｏｄ６、Ｎｌｎ、Ｎｍｔ２、Ｎｏｓ１、Ｎｏｓ１ａｐ、Ｎｒｘｎ３、Ｎｔｎ１、Ｏｓｂｐｌ１０、Ｏｓｂｐｌ５、Ｐａｍ、Ｐａｒｍ１、Ｐｅｎｋ、Ｐｆｋｐ、Ｐｇｒｍｃ１、Ｐｈａｃｔｒ２、Ｐｈｆ２４、Ｐｈｙｈｉｐ、Ｐｊａ１、Ｐｋｐ４、Ｐｌａ２ｇ４ｅ、Ｐｌｃｈ１、Ｐｌｃｘｄ２、Ｐｌｐｐｒ４、Ｐｌｖａｐ、Ｐｌｘｎａ４、Ｐｌｘｎｃ１、Ｐｎｃｋ、Ｐｐｐ１ｃｃ、Ｐｒｄｍ８、Ｐｒｋｃｄ、Ｐｒｒｇ３、Ｐｔｃｈｄ２、Ｐｕｒｂ、Ｒａｂ１０ｏｓ、Ｒａｂ３ｃ、Ｒａｉ２、Ｒａｓｇｒｆ１、Ｒａｓｌ１０ｂ、Ｒｅｃ８、Ｒｅｔ、Ｒｍｓｔ、Ｒｏｒａ、Ｒｐｈ３ａ、Ｒｐｌ１５、Ｓｃｎ９ａ、Ｓｄｋ２、Ｓｅｍａ３ｅ、Ｓｅｒｐｉｎｉ１、Ｓｅｓｎ２、Ｓｅｚ６、Ｓｇｋ１、Ｓｇｔｂ、Ｓｈａｎｋ３、Ｓｋｏｒ１、Ｓｌｃ１２ａ５、Ｓｌｃ１９ａ２、Ｓｌｃ１ａ４、Ｓｌｃ２４ａ３、Ｓｌｃ２ａ３、Ｓｌｃ３２ａ１、Ｓｌｃ４ａ８、Ｓｌｃ６ａ７、Ｓｌｃ７ａ１、Ｓｌｃ７ａ３、Ｓｎｐｈ、Ｓｏｃｓ２、Ｓｏｄ２、Ｓｏｒｂｓ２、Ｓｏｒｃｓ３、Ｓｐ５、Ｓｔａｃ２、Ｓｔａｒｄ５、Ｓｔｃ２、Ｓｙｔ１３、Ｔｂｃ１ｄ３０、Ｔｂｃ１ｄ４、Ｔｆａｐ２ａ、Ｔｆａｐ２ｂ、Ｔｍｅｍ１１７、Ｔｍｅｍ１３２ｅ、Ｔｍｅｍ１５１ｂ、Ｔｍｅｍ１６９、Ｔｍｅｍ２５、Ｔｒａｍ１ｌ１、Ｔｒｉｂ３、Ｔｒｉｍ６７、Ｔｒｏ、Ｔｒｐｃ５、Ｔｒｐｃ７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｔｔｃ３９ｂ、Ｔｔｃ９、Ｕｎｃ５ｃ、Ｕｓｐ１、Ｖｍｎ２ｒ２、Ｗａｓｆ１、Ｗｂｓｃｒ１７、Ｗｆｓ１、Ｘｋｒ４、Ｚｂｔｂ１８、Ｚｃｃｈｃ１６、およびＺｆｐ４２３を含む、無選別核中の正規化発現に比べて、発現の最大の変化を有する遺伝子が挙げられる。
【００７５】
マウスでは、その発現をマーカーとして使用して、星状膠細胞またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、１７０００６６Ｏ２２Ｒｉｋ、２８１００３２Ｇ０３Ｒｉｋ、３１１００８２Ｊ２４Ｒｉｋ、９３３０１８８Ｐ０３Ｒｉｋ、Ａ２ｍ、Ａ３３００３３Ｊ０７Ｒｉｋ、Ａｂｉ３ｂｐ、Ａｃｏｔ１１、Ａｃｓｂｇ１、Ａｃｔｒ３ｂ、Ａｄｒａ１ａ、ＡＩ４６４１３１、Ａｋｔ２、Ａｌｄｈ１ｌ１、Ａｌｍｓ１−ｐｓ２、Ａｐｏｅ、Ａｑｐ４、Ａｒｒｂ１、Ａｔｐ１３ａ４、Ａｔｐ１ａ２、Ａｔｐ１ｂ２、ＡＵ０２２７５１、Ａｘｌ、Ｂａａｌｃ、Ｂｃａｒ３、Ｂｔｂｄ１７、Ｃａｂｌｅｓ１、Ｃａｃｎｂ１、Ｃａｃｎｇ５、Ｃａｃｎｇ８、Ｃａｍｋ１、Ｃａｍｋ２ｇ、Ｃａｓｋｉｎ１、Ｃｂｓ、Ｃｃｄｃ１９０、Ｃｃｄｃ７８、Ｃｄ７０、Ｃｄｃ４２ｅｐ１、Ｃｄｃ４２ｅｐ４、Ｃｄｈ２２、Ｃｄｈ４、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｌｃｎ２、Ｃｌｕ、Ｃｍｌ５、Ｃｍｙａ５、Ｃｎｎ３、Ｃｐｎｅ２、Ｃｔｘｎ３、Ｃｘｃｌ１４、Ｃｙｐ２ｄ２２、Ｃｙｐ４ｆ１４、Ｄ３３００５０Ｇ２３Ｒｉｋ、Ｄａｏ、Ｄｄａｈ１、Ｄｄｏ、Ｄｍｐ１、Ｅ０３０００３Ｅ１８Ｒｉｋ、Ｅｄｎｒｂ、Ｅｆｈｄ２、Ｅｆｎｂ２、Ｅｇｆｒ、Ｅｌｍｏ２、Ｅｌｏｖｌ２、Ｅｍｉｄ１、Ｅｒｉｃｈ５、Ｅｔｎｐｐｌ、Ｅｔｖ４、Ｅｖａ１ａ、Ｆ８３００４５Ｐ１６Ｒｉｋ、Ｆａｄｓ２、Ｆａｍ１０７ａ、Ｆａｍ１７３ａ、Ｆａｍ２０ａ、Ｆａｍ４３ａ、Ｆａｍ９２ｂ、Ｆｇｄ６、Ｆｇｆｒ３、Ｆｒｅｍ１、Ｆｒｍｐｄ１、Ｆｘｙｄ１、Ｆｘｙｄ７、Ｆｚｄ１、Ｇａｂｒａ２、Ｇａｂｒａ４、Ｇａｂｒｂ１、Ｇａｒｅｍｌ、Ｇａｓ２ｌ３、Ｇｄｆ１０、Ｇｊａ１、Ｇｊｂ６、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉｐｒ２、Ｇｍ５０８９、Ｇｍ６２７７、Ｇｐｒ１５３、Ｇｒｅｂ１ｌ、Ｇｒｉａ１、Ｇｓａｐ、Ｇｓｔｍ１、Ｈｉｆ３ａ、Ｈｋ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｈ１、Ｈｔｒａ３、Ｉｃｏｓｌ、Ｉｄ４、Ｉｇｄｃｃ３、Ｉｇｄｃｃ４、Ｉｔｉｈ３、Ｉｔｐｋｂ、Ｋｉｆｃ３、Ｋｌｆ１５、Ｌａｍａ２、Ｌｃａｔ、Ｌｆｎｇ、Ｌｇｉ４、Ｌｇｒ６、Ｌｒｉｇ１、Ｌｒｐ３、Ｌｒｒｃ８ａ、Ｍａｎ１ｃ１、Ｍａｐ２ｋ６、Ｍｅｒｔｋ、Ｍｅｔｒｎ、Ｍｆｇｅ８、Ｍｉｃａｌｃｌ、Ｍｉｒ３０９３、Ｍｉｒ６３７５、Ｍｉｒ６３９０、Ｍｌｃ１、Ｍｍｄ２、Ｍｐｐ６、Ｍｒｏ、Ｍｓｉ１、Ｍｓｘ２、Ｍｔ１、Ｍｔ２、Ｍｔ３、Ｍｘｒａ８、Ｍｙｂｐｃ１、Ｎ４ｂｐ３、Ｎａｔ８、Ｎｂｌ１、Ｎｄｒｇ２、Ｎｈｓｌ１、Ｎｋａｉｎ４、Ｎｒ１ｄ１、Ｎｔｓｒ２、Ｎｕｄｔ１４、Ｎｗｄ１、Ｏｐｌａｈ、Ｐａｑｒ６、Ｐａｑｒ８、Ｐａｘ３、Ｐｂｘｉｐ１、Ｐｄｅ８ｂ、Ｐｄｌｉｍ４、Ｐｈｆ２１ｂ、Ｐｈｋａ１、Ｐｈｋｇ１、Ｐｈｙｈｄ１、Ｐｉｔｐｎｃ１、Ｐｉｔｐｎｍ２、Ｐｌａ２ｇ７、Ｐｌｃｅ１、Ｐｌｅｋｈｏ２、Ｐｌｐｐ３、Ｐｌｓｃｒ４、Ｐｌｔｐ、Ｐｌｘｎｂ１、Ｐｎｋｙ、Ｐｎｐｌａ７、Ｐｏｒ、Ｐｐｍ１ｍ、Ｐｒｅｘ２、Ｐｒｏｃａ１、Ｐｒｏｄｈ、Ｐｒｒ５、Ｐｔｃｈ１、Ｐｔｃｈ２、Ｐｘｍｐ２、Ｐｙｒｏｘｄ２、Ｒａｂ３４、Ｒａｂ３６、Ｒａｍｐ２、Ｒａｓｌ１１ａ、Ｒｂｍ２４、Ｒｄｈ５、Ｒｆｘ２、Ｒｆｘ４、Ｒｇｌ１、Ｒｇｍａ、Ｒｐｐｈ１、Ｒｐｕｓｄ３、Ｒｒａｓ、Ｓ１ｐｒ１、Ｓｄｃ４、Ｓｆｘｎ１、Ｓｆｘｎ５、Ｓｈ３ｐｘｄ２ｂ、Ｓｈｉｓａ９、Ｓｉｒｐａ、Ｓｌｃ１２ａ４、Ｓｌｃ１３ａ５、Ｓｌｃ１ａ２、Ｓｌｃ１ａ３、Ｓｌｃ２５ａ１８、Ｓｌｃ２７ａ１、Ｓｌｃ３８ａ１、Ｓｌｃ３８ａ３、Ｓｌｃ３９ａ１２、Ｓｌｃ４１ａ１、Ｓｌｃ４ａ４、Ｓｌｃ７ａ１０、Ｓｌｃ８ｂ１、Ｓｌｃｏ４ａ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍｉｍ２３、Ｓｎｅｄ１、Ｓｏｄ３、Ｓｏｘ９、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｓｔｋ３２ａ、Ｓｙｎｐｏ２、Ｓｙｔ１０、Ｔａｐｂｐｌ、Ｔｃｆ７ｌ１、Ｔｍｅｍ１９８ｂ、Ｔｎｃ、Ｔｏｍ１ｌ１、Ｔｒａｆ１、Ｔｒｉｂ２、Ｔｒｉｌ、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、Ｔｔｌｌ３、Ｔｔｌｌ８、Ｔｔｙｈ１、Ｔｔｙｈ３、Ｕｃｐ２、Ｖｉｍ、Ｗｗｃ１、Ｚｆｐ４６７、Ｚｆｐ６４１、Ｚｉｃ１、Ｚｉｃ４、およびＺｉｍ１を含む、無選別核中の正規化発現に比べて、発現の最大の変化を有する遺伝子が挙げられる。
【００７６】
マウスでは、その発現をマーカーとして使用して、乏突起膠細胞またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、１５０００１５Ｌ２４Ｒｉｋ、１７０００６３Ｄ０５Ｒｉｋ、４９３０４７４Ｇ０６Ｒｉｋ、４９３３４１３Ｇ１９Ｒｉｋ、５０３１４１０Ｉ０６Ｒｉｋ、５０３１４３９Ｇ０７Ｒｉｋ、５４３０４３１Ａ１７Ｒｉｋ、９３３０１１１Ｎ０５Ｒｉｋ、９３３０１１７Ｏ１２Ｒｉｋ、Ａ２３０００１Ｍ１０Ｒｉｋ、Ａ３３００４９Ｎ０７Ｒｉｋ、Ａａｔｋ、Ａｂｃａ８ａ、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ａｄａｐ１、Ａｄｉｐｏｒ２、Ａｇｐａｔ４、Ａｎｋｕｂ１、Ａｎｏ４、Ａｐｏｄ、Ａｒｃ、Ａｒｈｇａｐ２３、Ａｒｈｇｅｆ１０、Ａｒｌ４ｄ、Ａｒｒｄｃ２、Ａｒｒｄｃ３、Ａｒｓｇ、Ａｓｐａ、Ａｓｐｈｄ１、Ｂ３ｇａｌｔ５、Ｂｃｈｅ、Ｂｃｌ２ｌ１、Ｂｉｃｄ２、Ｂｉｎ１、Ｂｐｇｍ、Ｃ０３００２９Ｈ０２Ｒｉｋ、Ｃ６３００４３Ｆ０３Ｒｉｋ、Ｃａｒ１４、Ｃａｒ２、Ｃａｒｎｓ１、Ｃｃｄｃ１５２、Ｃｃｐ１１０、Ｃｄｈ１９、Ｃｄｋ１８、Ｃｄｋ１９、Ｃｅｐ９７、Ｃｅｒｓ２、Ｃｈｄｈ、Ｃｌｄｎ１１、Ｃｎｐ、Ｃｎｔｎ２、Ｃｐｍ、Ｃｐｏｘ、Ｃｒｅｂ５、Ｃｒｙａｂ、Ｃｙｐ２ｊ１２、Ｄ１６Ｅｒｔｄ４７２ｅ、Ｄ１Ｅｒｔｄ６２２ｅ、Ｄ７Ｅｒｔｄ４４３ｅ、Ｄａａｍ２、Ｄｄｉｔ４、Ｄｄｒ１、Ｄｅｇｓ１、Ｄｅｐｄｃ７、Ｄｎａｊｂ２、Ｄｏｃｋ１０、Ｄｏｃｋ５、Ｄｐｙ１９ｌ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｉｌ３、Ｅｆｎｂ３、Ｅｌｏｖｌ７、Ｅｎｄｏｄ１、Ｅｎｐｐ２、Ｅｎｐｐ４、Ｅｒｂｂ２ｉｐ、Ｅｒｂｂ３、Ｅｒｍｎ、Ｆａ２ｈ、Ｆａｍ１３４ｂ、Ｆａｍ４６ａ、Ｆｂｘｏ３２、Ｆｂｘｗ１５、Ｆｏｌｈ１、Ｆｒｍｄ４ｂ、Ｆｔｈ１、Ｇａｂ１、Ｇａｌｎｔ５、Ｇａｌｎｔ６、Ｇａｔｍ、Ｇｂｐ１１、Ｇｊｂ１、Ｇｊｃ２、Ｇｌｕｌ、Ｇｍ１０４７１、Ｇｍ１９７９、Ｇｍ２１６７１、Ｇｍ５５３５、Ｇｍ５８６２、Ｇｍ７３６１、Ｇｍ９８９５、Ｇｎｇ１１、Ｇｎｇ８、Ｇｐｒ３７、Ｇｐｔ、Ｇｒｍ３、Ｇｓｔｍ７、Ｈａｐｌｎ２、Ｈｅｂｐ１、Ｉ７３００３０Ｊ２１Ｒｉｋ、Ｉｌ３３、Ｉｎｆ２、Ｉｎｓｃ、Ｊｏｓｄ２、Ｋｃｎｊ２、Ｋｃｎｋ１３、Ｋｃｔｄ１３、Ｋｃｔｄ３、Ｋｉｆ１３ｂ、Ｋｌｈｌ２、Ｋｌｋ６、Ｋｎｄｃ１、Ｌａｐ３、Ｌａｒｐ６、Ｌｉｐａ、Ｌｉｔａｆ、Ｌｒｒｃ８ｂ、Ｌｚｔｓ２、Ｍａｇ、Ｍａｌ、Ｍａｐ６ｄ１、Ｍａｐ７、Ｍａｓｔ３、Ｍａｓｔ４、Ｍｂｏａｔ１、Ｍｂｐ、Ｍｃａｍ、Ｍｏｂｐ、Ｍｏｇ、Ｍｙｏ１ｄ、Ｍｙｒｆ、Ｎｄｒｇ１、Ｎｅａｔ１、Ｎｆｅ２ｌ３、Ｎｈｌｒｃ４、Ｎｉｐａｌ４、Ｎｋａｉｎ１、Ｎｋａｉｎ２、Ｎｍｒａｌ１、Ｏｌｆｍｌ１、Ｏｐａｌｉｎ、Ｏｓｂｐｌ７、Ｐａｃｒｇ、Ｐａｃｓ２、Ｐａｋ７、Ｐｄｅ４ｂ、Ｐｄｅ８ａ、Ｐｅｘ５ｌ、Ｐｈｌｐｐ１、Ｐｉｇａ、Ｐｉｇｚ、Ｐｉｋ３ｃ２ｂ、Ｐｉｍ３、Ｐｉｐ４ｋ２ａ、Ｐｋｄ２ｌ１、Ｐｌａ２ｇ１６、Ｐｌｃｌ１、Ｐｌｅｋｈｇ３、Ｐｌｅｋｈｈ１、Ｐｌｐ１、Ｐｌｓ１、Ｐｌｘｎｂ３、Ｐｐｆｉｂｐ２、Ｐｐｐ１ｒ１４ａ、Ｐｒｉｃｋｌｅ２、Ｐｒｉｍａ１、Ｐｒｏｘ１、Ｐｒｒ１８、Ｐｒｒ５ｌ、Ｐｒｒｇ１、Ｐｓａｔ１、Ｐｓｔｐｉｐ２、Ｐｔｇｄｓ、Ｐｔｍａ、Ｐｔｐｒｄ、Ｑｄｐｒ、Ｒａｓｇｒｐ３、Ｒｃｂｔｂ１、Ｒｆｆｌ、Ｒｈｏｂ、Ｒｈｏｕ、Ｒｎｆ２２０、Ｒｎｆ７、Ｒｔｎ４、Ｓ１ｐｒ５、Ｓａｌｌ１、Ｓｃｃｐｄｈ、Ｓｅｃ１１ｃ、Ｓｅｃ１４ｌ５、Ｓｅｒｐｉｎｂ１ａ、Ｓｅｚ６ｌ２、Ｓｇｋ２、Ｓｈ３ｔｃ２、Ｓｈｉｓａ４、Ｓｈｔｎ１、Ｓｌａｉｎ１、Ｓｌｃ１２ａ２、Ｓｌｃ２５ａ１３、Ｓｌｃ３８ａ２、Ｓｌｃ４８ａ１、Ｓｌｃ７ａ１５、Ｓｍａｄ７、Ｓｏｘ２ｏｔ、Ｓｐｅｅｒ４ａ、Ｓｐｇ２０、Ｓｔ１８、Ｓｔ６ｇａｌｎａｃ３、Ｓｔｍｎ１、Ｓｔｍｎ４、Ｓｔｘｂｐ６、Ｓｙｎｊ２、Ｓｙｔｌ２、Ｔｂｃ１ｄ５、Ｔｈｕｍｐｄ１、Ｔｍｅｆｆ１、Ｔｍｅｆｆ２、Ｔｍｅｍ１２５、Ｔｍｅｍ１５１ａ、Ｔｍｅｍ２２９ａ、Ｔｍｅｍ２５８、Ｔｍｅｍ６３ａ、Ｔｍｅｍ８８ｂ、Ｔｍｅｍ９８、Ｔｍｐｒｓｓ５、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｔｎｎｉ１、Ｔｐｐｐ、Ｔｒｆ、Ｔｒｉｍ３６、Ｔｒｉｍ５９、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｔｌｌ７、Ｔｕｂｂ４ａ、Ｕｇｔ８ａ、Ｕｓｐ３１、Ｕｓｐ５４、Ｖｍｐ１、Ｘａｆ１、およびＺｄｈｈｃ２０を含む、無選別核中の正規化発現に比べて、発現の最大の変化を有する遺伝子が挙げられる。
【００７７】
マウスでは、その発現をマーカーとして使用して、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、１７０００８６Ｌ１９Ｒｉｋ、１８１００４１Ｌ１５Ｒｉｋ、５７３０５５９Ｃ１８Ｒｉｋ、６３３０４０３Ｋ０７Ｒｉｋ、８０３０４５１Ｏ０７Ｒｉｋ、Ａ２３００７７Ｈ０６Ｒｉｋ、Ａ７３００１７Ｃ２０Ｒｉｋ、Ａｂｃｇ２、Ａｂｈｄ２、Ａｂｔｂ２、Ａｄａｍ１２、Ａｄｍ、Ａｌｃａｍ、Ａｍｚ１、Ａｒｈｇａｐ２４、Ａｓａｐ３、Ａｓｃｌ１、Ｂ３ｇａｔ２、Ｂ９ｄ１、Ｂａｓｐ１、Ｂｃａｓ１、Ｂｍｐ４、Ｂｒｉｎｐ３、Ｃ１ｑｌ１、Ｃ１ｑｌ２、Ｃａｃｎｇ４、Ｃａｌｃｒｌ、Ｃａｖ１、Ｃａｖ２、Ｃｃｎｄ１、Ｃｄ２００、Ｃｄｈ１３、Ｃｄｈ２４、Ｃｄｏ１、Ｃｆａｐ２０、Ｃｈａｄｌ、Ｃｈｓｔ１１、Ｃｈｓｔ２、Ｃｈｓｔ３、Ｃｈｓｔ５、Ｃｏｂｌ、Ｃｏｌ１１ａ２、Ｃｏｌ２７ａ１、Ｃｓｇａｌｎａｃｔ１、Ｃｓｎｋ２ａ２、Ｃｓｐｇ４、Ｃｓｐｇ５、Ｃｔｘｎ１、Ｃｙｓｒｔ１、Ｄｂｐｈｔ２、Ｄｃｃ、Ｄｐｍ３、Ｄｐｙｓｌ３、Ｄｓｃａｍ、Ｅｂｆ４、Ｅｉｄ２ｂ、Ｅｌｆｎ１、Ｅｌｆｎ２、Ｅｎｐｐ６、Ｅｐｂ４１ｌ２、Ｅｐｎ２、Ｅｙａ１、Ｆａｍ１９ａ２、Ｆａｍ３ｃ、Ｆａｍ８９ａ、Ｆｂｎ２、Ｆｄｐｓ、Ｆｈｌ３、Ｆｒｒｓ１、Ｆｔｓｊ２、Ｆｚｄ９、Ｇ０ｓ２、Ｇａｌｎｔ３、Ｇｆｐｔ２、Ｇｆｒａ１、Ｇｎｇ４、Ｇｒｍ５、Ｇｓｘ１、Ｈ２−Ｋ１、Ｈａｓ２、Ｈｉｐ１ｒ、Ｈｒｋ、Ｉｃｋ、Ｉｆｉｔｍ７、Ｉｇｆｂｐ３、Ｉｔｇａ９、Ｉｔｐｒ２、Ｋｃｎｈ５、Ｋｃｎｈ８、Ｋｈｄｒｂｓ３、Ｋｌｈｌ５、Ｌｂｈ、Ｌｈｆｐｌ３、Ｌｉｍｄ１、Ｌｉｍｓ２、Ｌｍｃｄ１、Ｌｐｃａｔ２、Ｌｒｆｎ２、Ｌｒｒｃ４ｃ、Ｌｒｒｔｍ４、Ｍａｒｃｋｓ、Ｍａｔｎ１、Ｍａｔｎ４、Ｍｅｘ３ｂ、Ｍｆｓｄ２ａ、Ｍｉａｔ、Ｍｉｒ１７、Ｍｍｐ１５、Ｍｍｐ１６、Ｍｍｐ２、Ｍｙｃｌ、Ｍｙｔ１、Ｎｃａｎ、Ｎｅｔｏ１、Ｎｅｕ４、Ｎｏｖａ１、Ｎｘｐｈ１、Ｏｌｆｍ２、Ｏｌｉｇ２、Ｏｐｃｍｌ、Ｏｐｒｌ１、Ｐｃｄｈ１５、Ｐｃｄｈ１７、Ｐｃｄｈ７、Ｐｄｇｆｒａ、Ｐｄｚｄ２、Ｐｆｎ２、Ｐｈｌｄａ１、Ｐｍｅｐａ１、Ｐｐｆｉｂｐ１、Ｐｐｐ２ｒ２ｂ、Ｐｒｒ３６、Ｐｒｓｓ２３、Ｐｒｓｓ４８、Ｐｔｇｆｒｎ、Ｐｔｐｒｏ、Ｐｘｄｃ１、Ｑｐｃｔ、Ｒａｐｇｅｆ３、Ｒａｓｇｅｆ１ｂ、Ｒｃｎ１、Ｒｅｐ１５、Ｒｇｃｃ、Ｒｉｎ２、Ｒｌｂｐ１、Ｒｎｄ２、Ｒｎｆ１２２、Ｒｐｌ１３、Ｒｐｒｍ、Ｓ１００ａ３、Ｓ１００ａ４、Ｓ１ｐｒ２、Ｓａｐｃｄ２、Ｓｃｅｌ、Ｓｃｒｇ１、Ｓｅｍａ３ｄ、Ｓｅｍａ５ａ、Ｓｅｍａ５ｂ、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｅｒｔｍ１、Ｓｈ３ｂｐ４、Ｓｈ３ｒｆ１、Ｓｌｃ１ａ１、Ｓｌｃ２２ａ２３、Ｓｌｃ３５ｆ１、Ｓｌｃ４４ａ５、Ｓｌｉｔｒｋ３、Ｓｌｉｔｒｋ５、Ｓｌｉｔｒｋ６、Ｓｎｈｇ５、Ｓｎｘ１、Ｓｎｘ２２、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ６、Ｓｐｒｙ４、Ｓｓｔｒ１、Ｓｕｌｆ２、Ｓｕｓｄ５、Ｔａｃ１、Ｔｅｓ、Ｔｇｆａ、Ｔｍｅｍ１００、Ｔｍｅｍ１３２ｂ、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｔｎｒ、Ｔｎｓ３、Ｔｏｘ３、Ｔｓｐａｎ６、Ｖａｓｈ１、Ｖｃａｎ、Ｖｍｎ１ｒ５５、Ｖｐｒｅｂ１、Ｖｓｔｍ２ｂ、Ｖｗｃ２、Ｘｙｌｔ１、Ｚｃ３ｈａｖ１ｌ、Ｚｄｈｈｃ２３、Ｚｆｐ３６５、およびＺｆｐ４８８を含む、無選別核中の正規化発現に比べて、発現の最大の変化を有する遺伝子が挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、１、２、３個またはそれを超え、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０個またはそれを超えるセット、サブセットを含む記載マーカーを用いて、ヒト、マウス、ラット、または非ヒト霊長類のいずれか由来の顆粒細胞、バスケット細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣのいずれか１個または複数の核を特定し得る。階層型クラスタリングを用いて、ＲＮＡｓｅｑプロファイル中の類似性の程度を可視化し得る。
【００７９】
２．ラット由来の選別核中のＲＮＡプロファイルの差異
いくつかの実施形態では、ラット組織由来の核は、顆粒細胞、プルキンエ細胞、バスケット細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞およびＯＰＣ由来の核のグループに選別される。顆粒細胞、プルキンエ細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣの全体にわたり正規化した発現と比較して差次的に発現した遺伝子をマーカーとして使用し得る。例えば、ＡＡＢＲ０７００１６２３．１、ＡＡＢＲ０７００１７３４．１、ＡＡＢＲ０７００６３１０．１、ＡＡＢＲ０７００６７１３．１、ＡＡＢＲ０７００６７１３．２、ＡＡＢＲ０７００６７２７．１、ＡＡＢＲ０７０１３１４０．１、ＡＡＢＲ０７０２６０３２．２、ＡＡＢＲ０７０３０４７３．１、ＡＡＢＲ０７０３０８８０．１、ＡＡＢＲ０７０４６９６１．１、ＡＡＢＲ０７０４７８２３．１、ＡＡＢＲ０７０４９４９１．１、ＡＡＢＲ０７０５２８９７．１、ＡＡＢＲ０７０５８６５８．１、ＡＡＢＲ０７０６１４２８．１、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．１、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．６、ＡＡＢＲ０７０７０５７８．１、Ａｂｉ３、Ａｑｐ９、Ａｒｈｇｅｆ２６、Ａｒｈｇｅｆ３３、Ａｒｌ４ａ、Ｂ３ｇｎｔ５、Ｂｇｎ、Ｃ１ｑｌ１、Ｃ１ｑｌ２、Ｃａｃｎｇ５、Ｃａｄｐｓ２、Ｃａｌｂ１、Ｃａｌｂ２、Ｃａｒ４、Ｃａｒ８、Ｃａｖ１、Ｃｂｌｎ１、Ｃｃｎｄ１、Ｃｄｈ１５、Ｃｄｋ２、Ｃｅｐ７６、Ｃｌｄｎ１１、Ｃｌｍｐ、Ｃｏｌ１２ａ１、Ｃｏｌ５ａ３、Ｃｓｐｇ４、Ｃｙｐ２ｄ５、Ｅｎｐｐ１、Ｅｒｍｎ、Ｆａｍ１０７ｂ、Ｆａｍ８９ａ、Ｆａｔ２、Ｇａｂｒａ６、Ｇａｂｒｄ、Ｇｄｆ１０、Ｇｊｄ２、Ｇｌｄｃ、Ｇｌｉ１、Ｇｐｒ３７、Ｇｐｒ６３、Ｇｒｍ８、Ｈａｐｌｎ２、Ｈｐｃａｌ４、Ｉｄ４、Ｉｌ１６、Ｉｔｇａ７、Ｉｔｇａ９、Ｉｔｉｈ３、Ｉｔｐｒ１、Ｋｃｎｈ１、Ｋｃｎｊ１２、Ｋｌｋ６、Ｌａｍａ３、Ｌｆｎｇ、Ｌｇｉ４、Ｌｉｍｓ２、Ｌｙｐｄ６、Ｍａｇ、Ｍａｌ、Ｍａｒｃｈ１１、Ｍｏｂｐ、Ｍｏｇ、Ｍｓｘ２、Ｍｔ２Ａ、Ｎｋａｉｎ４、Ｏｐａｌｉｎ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｐｌｃｈ１、Ｐｌｋ２、Ｐｌｘｄｃ１、Ｐｍｅｌ、Ｐｏｕ３ｆ２、Ｐｐｆｉｂｐ１、Ｐｐｐ１ｒ１７、Ｐｒｒ５ｌ、Ｐｒｒｔ２、Ｑｄｐｒ、Ｒａｓｇｒｐ３、Ｒｂｆｏｘ３、ＲＧＤ１５６１５５７、ＲＧＤ１５６１８４９、Ｒｌｂｐ１、Ｒｙｒ１、Ｓ１ｐｒ１、Ｓｃａｒａ３、Ｓｅｌｐｌｇ、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｌｃ１ａ６、Ｓｌｃ２５ａ１８、Ｓｌｃ５ａ１１、Ｓｌｃ７ａ１０、Ｓｌｃ９ａ３、Ｓｎｘ２２、Ｓｏｒｃｓ３、Ｓｖ２ｂ、Ｔｅｓｃ、Ｔｍｅｍ２５５ｂ、Ｔｍｅｍ６３ａ、Ｔｍｅｍ８８ｂ、Ｔｎｃ、およびＺｆｐ３８５ｃから選択される差次的に発現した遺伝子の少なくとも１つの発現または発現の欠如を、種特異的および細胞型特異的マーカーとして用い得る。
【００８０】
ラットでは、その発現をマーカーとして使用して、顆粒細胞またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、無選別核中の正規化発現と比較して、Ｆａｔ２およびＲｂｆｏｘ３の有意に濃縮された発現が含まれる。マーカーとして使用して、プルキンエ細胞またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、Ｃａｒ８およびＣａｌｂ１の有意に濃縮された発現が含まれる。マーカーとして使用して、バーグマングリアまたはそれらの核を特定し得る遺伝子には、Ａｌｄｈ１Ｌ１およびＳｌｃ１ａ３の有意に濃縮された発現が含まれる。マーカーとして使用して、乏突起膠細胞（コルチコポンチン錐体細胞）またはそれらの核を特定し得る遺伝子には、Ｃｏｌｇａｌｔ２の有意に濃縮された発現が含まれる。マーカーとして使用して、バーグマングリアまたはそれらの核を特定し得る遺伝子には、Ｈｓ３ｓｔ４の有意に濃縮された発現が含まれる。Ｈｓ３ｓｔ４は、皮質視床錐体細胞に特異的であることが観察されたが、Ｐｄｅ１ａおよびＣｓｍｄ１は、乏突起膠細胞およびＯＰＣ（両方とも、皮質錐体細胞型）中で発現されることが観察された。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ｉｔｉｈ３の発現を、小脳の星状膠細胞型のバーグマングリア、および小脳の非バーグマングリア星状膠細胞型の両方のマーカーとして使用し得る。６つの細胞型の核に対する追加のマーカーには、次記を含み得る：顆粒細胞核に対するテスカルシン（Ｔｅｓｃ）、プルキンエ細胞核に対する炭酸脱水酵素８（Ｃａｒ８）、バスケット細胞核に対するＭａｒｃｈ１１、星状膠細胞核に対するインター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖３（Ｉｎｔｅｒ−Ａｌｐｈａ−Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ３）（Ｉｔｉｈ３）、オリゴデンドロサイト核に対するＭｏｇ、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞核に対する血小板由来増殖因子受容体アルファ（Ｐｄｇｆｒａ）。
【００８２】
いくつかの実施形態では、Ａｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓインサイツハイブリダイゼーションデータベースを用いて、マーカーの局在化を分析して細胞型を確認した。
【００８３】
いくつかの実施形態では、１、２、３個またはそれを超え、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０個またはそれを超えるセット、サブセットを含む記載マーカーを用いて、ヒト、マウス、ラット、または非ヒト霊長類のいずれか由来の顆粒細胞、バスケット細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣのいずれか１個または複数の核を特定し得る。階層型クラスタリングを用いて、ＲＮＡｓｅｑプロファイル中の類似性の程度を可視化し得る。
【００８４】
３．ヒト由来の選別核中のＲＮＡプロファイルの差異
１６人のヒト死後脳由来の試料の分析により、加齢、性別、組織試料の自己融解時間、およびストレスについての特定の分子的結果は、細胞型間で異なるが、それぞれの場合でシナプス発生および維持に関与する遺伝子の発現は減少したことが明らかになった。堅牢で、細胞型特異的な分子経路は、１６人のドナーの内の３人の脳で発生した病態生理学的応答を示した。３人の脳試料の小脳顆粒細胞は、多くの前初期遺伝子を含む一連の２２４個の遺伝子の堅牢な誘導を示すことが観察され、ＧＯカテゴリー（タンパク質折り畳み／リフォールディング、アポトーシス、ストレスに対する転写性応答、外部刺激に対する応答、ＡＴＰアーゼ活性、など）に関し濃縮されて、いくつかの外部影響に対する急性応答を示したが、これらのドナーの共通の臨床的状態はまだ、明らかにならなかった。実施例で述べたように、脳卒中または脳損傷を示す、自己融解時間との無相関およびグリアマーカーの非誘導が明らかになった。培養マウス顆粒細胞中で活性依存性遺伝子発現変化が広範に特徴付けられたが、これらの３人のヒト試料中で特定された応答は、重なり合っていても、明確に区別できるものであった。本明細書の結果は、ヒト脳におけるこれらの応答を誘発するシグナルの特定を目的とするモデル系またはｉＰＳ細胞の実験的研究のための道しるべとなる。本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いた分子プロファイリングは、任意の種に適用でき、ヒト細胞型機能および機能障害に関連する分子事象の研究のための手段を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、Ｒｂｆｏｘ３およびＦａｔ２の増大した発現をヒトの顆粒細胞由来の核のマーカーとして用い得る。あるいは、Ｍａｒｃｈ１１の増大した発現をヒトのバスケット／星状細胞由来の核のマーカーとして用い得る。あるいは、Ａｌｄｈ１ａ１およびＳｌｃ１ａ３の増大した発現をヒトの星状膠細胞の核のマーカーとして用い得る。あるいは、Ｍｏｇの増大した発現を成熟乏突起膠細胞のマーカーとして用い得る。あるいは、Ｐｄｇｆｒａおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（Ｃｓｐｇ４）の増大した発現をＯＰＣのマーカーとして用い得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、１、２、３個またはそれを超え、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０個またはそれを超えるセット、サブセットを含む記載マーカーを用いて、ヒト、マウス、ラット、または非ヒト霊長類のいずれか由来の顆粒細胞、バスケット細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣのいずれか１個または複数の核を特定し得る。階層型クラスタリングを用いて、ＲＮＡｓｅｑプロファイル中の類似性の程度を可視化し得る。
【００８７】
Ｃ．ヒト細胞型の直接決定
本明細書で記載の細胞プロファイリング技術はまた、マウスで特徴付けられている細胞型とは無関係に使用し得る。理由は、マウスおよびヒト由来のニューロンの間では、差異があり、ヒト特異的ニューロンサブタイプが存在し得るためである。関心領域由来の無選別核の転写プロファイルの試験により、選別のための推定細胞型特異的遺伝子を特定した。マウスでは、無選別核中で低レベルで発現していることが観察された染色体関連転写物（ＣＡＴ）およびポリＡ＋転写物は、多くの場合、１つまたはいくつかの細胞型で高レベルに発現していた。種間の差異を異なる細胞型に対し探求し、その知見は、インサイツハイブリダイゼーションおよび免疫蛍光法により裏付けられた。特定の細胞型由来のヒト核ＲＮＡは、本明細書で記載の細胞プロファイリング法と同じ方策を用いてプロファイル解析された。
【００８８】
ＩＶ．核プロファイルの比較分析
マウス、ラット、およびヒト由来の複数の細胞型の核の単離と転写プロファイリングが本明細書で記載される。例えば、細胞型は、大脳基底核、視床、小脳、または海馬組織に起源を持つ。小脳に起源を持つ細胞型には、プルキンエ細胞、顆粒細胞、バーグマングリア、バスケット／星状細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、および小脳深部核細胞が挙げられる。これらの試料は、個々間および種全体間の差異を決定する分析のために、配列決定された。いくつかの実施形態では、結果が組織切片を用いたインサイツハイブリダイゼーションにより確認される。
【００８９】
特定のＣＮＳ細胞型の分子特性の特徴付けを行う正確で効率的な非遺伝的方法の開発のための推進力は、ヒト生物学の直接調査を可能とすることである。主要な差異は、マウスとヒトとの間の同じ細胞型中の遺伝子発現の間で観察される。ヒト疾患の遺伝的原因を特定する研究の爆発的な増加およびこれらが遺伝子量の単純な変化を伴う病変を含み得るという動物モデルおよびヒト両方における驚くべき実証実験を考慮すると、正常脳および罹患脳における細胞型の詳細の探求が必須である。したがって、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いた実験系で得られたヒト細胞型特異的特性を示すデータの比較分析は、ＣＮＳ回路に影響を与える多岐にわたるヒト障害の理解を前進させるであろう。
【００９０】
最近の進化モデル（Ａｒｅｎｄｔ，Ｄ．（２００８）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ９，８６８−８８２およびＡｒｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １７，７４４−７５７、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いて生成したデータの考察に役立つ細胞型のコンセンサス定義であった。このモデルによると、相同細胞型の特定の特性は、それらが特有の共通調節装置により定義されたままである限り、変化し得る。例えば、プルキンエ細胞、顆粒細胞、または星状膠細胞遺伝子発現プロファイルは、種間で、あるいは個々の細胞型中で、それらの細胞型独自性を失うことなく、変化できる。この定義は、種間の細胞型の機能的変化およびシス調節配列の変異による細胞型内で変化した遺伝子の発現の両方に適合する。本明細書でデータは、げっ歯類とヒト脳との間の各細胞型におけるオルソロガス遺伝子の発現の主要な差異を実証する。これらの数百の差異は、細胞型特異的であり、顆粒ニューロンでは、これらの遺伝子のほとんどは、脳の他の領域で発現したまま残される。これらのデータは、相同ヒトおよびマウスＣＮＳ細胞型の微調整された生化学が顕著に異なることを示す。
【００９１】
ここで提供した結果は、哺乳動物脳の進化に対する２つの大きな洞察をもたらす。第１に、その結果は、以前に発表された進化の機序としてのシス調節配列分岐の例（Ｍａｒｉｃｉｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３０，８４４−８５２；Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，１０５０−１０５３；Ｗｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．２０１６  Ｆｅｂ；３３（２）：３１６−３２２，２０１５；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）と一致するが、ほとんどの本明細書で実証された細胞特異的事象に対する高度に濃縮されたＧＯカテゴリーの欠如は、調節の変化は、哺乳動物脳の相同細胞型間の表現型変化の主要な促進要因であることを強く示唆する。これは、上記で提示の進化モデルと一致する。理由は、それが、細胞の機能特性の実質的な進化を可能とするが、同時に、所定の細胞型を規定するコア調節複合体（ＣｏＲＣ）を維持しているためである（Ａｒｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １７，７４４−７５７、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。第２に、本明細書で実証された発現差異は大きく、分析は高信頼性オルソロガス遺伝子に限定された。このデータは、マウスオルソログを欠くヒト遺伝子の発現のかなりの変化を報告した前駆細胞の以前の研究を補完する（Ｆｌｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５  Ｍａｒ  ２７；３４７（６２２９）：１４６５−７０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。まとめると、これらのデータセットは、マウスとヒト細胞型間の発現差異は、完全に細胞型特異的であり、表現型の観点から重要である。
【００９２】
本明細書で方法を用いたヒト試料のプロファイリングの特定の実施形態では、相関係数は、試料間で（ｒ＝０．９８〜１．０）であり、結果は極めて再現性があり、自己融解時間の核ＲＮＡの発現プロファイルに与える影響は小さいことを示している。性別および年齢が、ＣＮＳ細胞型における遺伝子発現に異なった影響を与えるという最初の指摘は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術が、性的二型のヒト行動および特異的脳回路の加齢の両方の詳細な調査にとって、充分に正確であることを示す。例えば、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術によるヒト脳の比較分析は、晩期発症型のヒト障害に選択的に弱い細胞型に対する加齢の影響についての洞察を可能とする。
【００９３】
Ａ．種間で異なる細胞型特異的機能の特定
小脳における細胞の組織化は、マウスとヒト間で類似であるが、多くの差異が残されている。例えば、マウス細胞に比べて、ヒト細胞中で、プルキンエ細胞は、遙かに広く分布しており、ＮｅｕＮ細胞はプルキンエ層中に広がっており、これは、ヒト小脳は、マウスに比べて、異なる組織化を有しているという証拠である。さらに、プルキンエ細胞体および核のサイズは、マウス中に比べて、ヒト中でより大きい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅｑを用いて、種間の遺伝子発現を比較して種特異的マーカーを特定し得る。例えば、顆粒、星状、およびグリア細胞由来の、プロテインチロシンキナーゼ２ベータ（Ｐｔｋ２ｂ）、溶質輸送体ファミリー４３メンバー２（Ｓｌｃ４３ａ２）、グルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット３（Ｇｒｉｋ３）、Ｉｔｐｒ１、プロトカドヘリン９（Ｐｃｄｈ９）、およびＲＡＳグアニル放出タンパク質１（Ｒａｓｇｒｐ１）核を使用して、ヒトとマウス核とを識別し得る。小脳は、種全体で最も保存された脳構造の１つであるので、その他の脳領域では、より多くの構造的および分子的差異が観察される可能性がより高い。
【００９４】
同じ種由来の試料間で不均一性が示される場合があるが、異なる種の各細胞型に最も特異的な遺伝子がその細胞型に特有のマーカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝子の発現を用いて、特定の細胞型を特定し得る。顆粒細胞、プルキンエ細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣなどの細胞型全体の正規化発現に比較して、差次的に発現した遺伝子は、目的の細胞型に対する少なくとも１つのマーカーを特定する分析から除かれ得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、最も特異的遺伝子は、本明細書に記載の特異性指数（ＳＩ）のアルゴリズムを用いて計算される。例えば、ヒト試料に由来の顆粒細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｃａｄｐｓ２、Ｒｅｌｎ、Ｓｙｎｐｒ、Ｇａｌｎｔ５、Ｃｃｍ２ｌ、Ｓｒｒｍ４、Ｔｍｅｍ２６６、Ｃｃｋｂｒ、Ｃｅｒｋｌ、Ｃｈｎ２、Ｇｒｉｋ２、Ｍａｌ２、Ｆａｔ２、Ａｄａｍｔｓ１６、Ｌｃｎ８、Ｆｓｔｌ５、Ｔｌｌ１、Ｖｓｎｌ１、Ｒｉｔ２、Ｓｌｃ８ａ２、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｚｐ２、Ｔｓｐａｎ１８、Ｆｇｆ５、Ｐｒａｇ１、Ｓｌｃ６ａ７、Ｒｉｍｓ１、Ｃｄｈ７、Ｌ１ｃａｍ、Ｍｉｃａｌ２、Ｐｔｋ２ｂ、Ｋｃｎｈ１、Ａｒｈｇａｐ２９、Ｃｄｋ１５、Ｐｄｅ３ｂ、Ｉｔｇａ４、Ｅｔｖ１、Ｔｍｅｍ１７８、Ｃｈｇｂ、Ｃｏｌ１３ａ１、Ｒｎｆ１５２、Ｋｃｎｋ１、Ｉｌ１６、Ｓｓｔｒ２、Ａｌｓ２、Ｂａｒｈｌ１、Ｓｃｎ２ａ、Ｃｂｌｎ１、Ｄｕｓｐ５、Ｎｄｓｔ３、Ｌｕｒａｐ１ｌ、Ｋｃｎｊ１２、Ｓｎａｉ２、Ｉｆｎｌｒ１、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｃｄｙｌ２、Ｐｐｐ１ｒ１ｃ、Ｊｋａｍｐ、Ｎｅｕｒｌ１ａ、Ｔｒｈｄｅ、Ｍｆｓｄ９、Ｘｋｒ７、Ｂａｒｈｌ２、Ｃｂｌｎ３、Ｕｎｃｘ、Ｐｔｃｈｄ１、Ｃｂｌｂ、Ｒｕｎｘ１ｔ１、Ｓｐｈｋａｐ、Ｇａｂｒａ６、Ｃｏｒｏ２ａ、Ｂｍｐｅｒ、Ｄｋｋ４、Ｃａｍｋ４、Ｕｎｃ１３ｃ、Ｔｒｐ５３ｉ１１、Ｅｐｈｂ１、Ｇｌｂ１ｌ３、Ｍｄｇａ１、Ｋｃｎｃ１、Ｔｍｅｍ２５２、Ｍｐｐ７、Ｈｉｐｋ４、Ｔｍｅｍ５１、Ｃａｃｎｂ３、Ｃｙｂ５ａ、Ｔｍｅｍ２、６４３０５７３Ｆ１１Ｒｉｋ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｒａｂ３７、Ａｄａｒｂ１、Ｓｖｏｐ、Ｐｇｍ５、Ｍｔｈｆｄ１ｌ、Ｃｄｈ１５、Ｖｗｃ２、Ｄｉｓｐ２、Ｔｓｐａｎ１５、Ｓｌｃ２６ａ５、およびＬｈｆｐである。例えば、マウス試料に由来の顆粒細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｇａｂｒａ６、Ｇｒｉｎ２ｃ、Ｆａｔ２、Ｃａｄｐｓ２、Ｐｔｐｎ２２、Ｃｈｎ２、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｃａｌｂ２、Ｔｒｈｄｅ、Ｉｌ１６、Ｐｐｆｉａ４、Ｃｂｌｎ１、Ｓｉｄｔ１、Ｔｍｅｍ２６６、Ｇａｂｒｄ、Ｒｅｌｎ、Ｋｃｎｊ１２、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｒｉｍｓ３、Ｔｌｌ１、Ｃｂｌｎ３、Ｏｌｆｍ３、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｃｈｇｂ、Ｋｃｎｈ１、Ｃｄｈ１５、Ｂａｒｈｌ２、Ｄｕｓｐ５、Ｋｃｎｃ１、Ｃａｍｋ４、Ｄｅｓ、Ｃｅｒｋｌ、Ｓｖｅｐ１、Ｕｎｃｘ、Ｓｌｃ８ａ２、Ｃａｃｎａ２ｄ１、Ｐｘｙｌｐ１、Ｐｔｃｈｄ１、Ｓｅｌ１ｌ３、Ｒｔｎ４ｒ、Ｃａｃｎａ１ｅ、Ｐａｔｊ、Ａｔｐ２ｂ３、Ｍａｒｖｅｌｄ２、Ｋｃｎｋ１０、Ｒａｂ１５、Ｒａｐｇｅｆ４、Ｒｉｍｓ１、Ｔｍｅｍ１７８、Ａｋ４、Ｌｉｎ７ａ、Ｉｇｆｂｐ５、Ｔｅｓｃ、Ｎｅｕｒｌ１ａ、Ｖａｔ１ｌ、Ｍｓｒａ、Ｖｓｎｌ１、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｌｈｆｐ、Ｋｃｎｋ３、Ｒｙｒ２、Ｅｘｐｈ５、Ｋｉｆ２６ｂ、Ａｄａｍｔｓ１８、Ｃｎｔｎａｐ４、Ｔｓｐａｎ１８、Ｍｍｐ２４、Ｃｄｈ８、Ａｂｌｉｍ３、Ｃａｄｍ３、Ｎｔｆ３、Ｐｌｄ５、Ｓｙｎｄｉｇ１ｌ、Ｇａｌｎｔ１５、Ｅｔｖ１、Ｓｈ２ｄ１ａ、Ｓｃｎ２ａ、Ｐａｎｘ２、Ｓｐｅｇ、Ｂｓｎ、Ｒｎｆ１１２、Ｉｌ２０ｒｂ、Ｓｌｃ１６ａ１０、Ｎｔｎ４、Ａｄｃｙ１、Ｍａｐｋ１２、Ｂｏｃ、Ｓｙｔ１２、Ｆｓｔｌ５、Ｔｅａｄ４、Ｃｌｃｎ１、Ｐｄｅ３ｂ、Ｐｇｍ２ｌ１、Ｔｍｔｃ４、Ａｂｃｃ８、Ｏｌｆｍ１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｌｕｒａｐ１、Ｋｒｔ２４、およびＡｌｓ２である。例えば、ラット試料に由来の顆粒細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｔｅｓｃ、Ｉｔｇａ７、Ｒｂｆｏｘ３、ＡＡＢＲ０７０１３１４０．１、Ｃａｌｂ２、Ｋｃｎｈ１、Ｃｄｈ１５、ＡＡＢＲ０７０３０８８０．１、Ｐｒｒｔ２、Ｇａｂｒｄ、Ｉｌ１６、Ｓｃａｒａ３、Ｃｂｌｎ１、ＡＡＢＲ０７０２６０３２．２、Ｃａｄｐｓ２、Ｓｖ２ｂ、Ｆａｔ２、Ｇａｂｒａ６、Ｃａｒ４、Ｋｃｎｊ１２、Ｎｒｅｐ、ＡＡＢＲ０７０４３０９８．３、Ｒｔｎ４ｒ、Ｓｈｉｓａ８、Ｓｅｌ１ｌ３、Ｇｒｂ７、Ｒｇｌ３、Ｄｕｓｐ５、Ｃｈｎ２、Ｌａｍｐ５、Ｐａｇｒ１、Ｃｅｍｉｐ、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｓｈｆ、Ｗｄｒ６６、Ｔｍｅｍ４４、Ｒｅｌｎ、Ｔｌｌ１、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｐａｘ６、Ｃａｐｎ１、Ｃａｌｈｍ３、ＡＡＢＲ０７０４３０９８．１、Ｃａｍｋ４、Ｓｅｌｍ、Ｓｅｍａ３ｇ、ＬＯＣ１００３６０４９１、Ｄｉｒａｓ２、Ａｇｂｌ２、Ｍｃｔｐ１、Ｍｖｐ、Ｔｍｅｍ５１、Ｖｓｎｌ１、Ｐｌｋ５、Ｍｒｇｐｒｆ、ＬＯＣ１００９１０４０１、Ａｋ４、Ｗｓｃｄ２、Ｇｒｉｎ２ａ、Ｃｆａｐ７４、Ｒｎｆ３９、Ｃｂｌｎ３、Ｆｚｄ７、Ｇｏｌｇａ７ｂ、ＡＡＢＲ０７０３３６７９．１、Ｐｔｐｎ２２、Ｇｒｉｎ２ｃ、Ａｂｌｉｍ１、Ｋｃｎｋ１、Ａｒｐｐ２１、Ｃ１ｒｌ、Ｚｓｃａｎ３０、Ｍａｆ、Ｒｔｎ４ｒｌ１、Ｂａｒｈｌ２、Ｋｃｎｋ１２、Ａｃｔｌ６ｂ、ＡＡＢＲ０７０５３８５０．１、Ｓｄｃ１、Ｃａｍｋｋ２、Ｎｕｄｃｄ３、Ｃｃｄｃ１５５、Ｃｂｆａ２ｔ３、ＡＡＢＲ０７０３７１５１．１、Ｅｔｖ１、Ｊｐｈ３、Ｉｔｇａ１１、Ｒｎｆ１８２、ＲＧＤ１５６０７８４、Ｐｌｃｘｄ３、Ａｂｌｉｍ３、Ｒｉｍｓ１、Ｎｙｘ、Ｕｎｃｘ、ＡＡＢＲ０７０３４４４５．１、ＡＡＢＲ０７０２５０５１．３、Ｋｃｎｋ１０、Ｋｃｎｋ３、Ｎｏｌ３、およびＡｌｓ２である。
【００９６】
例えば、マウス試料に由来のプルキンエ細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｃａｒ８、Ｃａｌｂ１、Ａｒｈｇｅｆ３３、Ａｔｐ２ａ３、Ｉｔｐｒ１、Ｐｐｐ１ｒ１７、Ｓｌｃ１ａ６、Ｓｌｃ９ａ３、Ｔｒｐｃ３、Ｃａｓｑ２、Ｃｌｉｃ６、Ｐｌｅｋｈｄ１、Ｒｙｒ１、Ｃａｃｎａ１ｇ、Ｐｃｐ２、Ｓｙｃｐ１、Ｐｄｅ５ａ、Ｔｓｐａｎ１１、Ｇｐｒ６３、Ｎｅｌｌ１、Ｃｅｐ７６、Ｂｃｌ１１ａ、Ｇｒｉｄ２ｉｐ、Ｈｔｒ１ｂ、Ｐｅｔ１００、Ｓｔｒｉｐ２、Ｐｌｘｄｃ１、Ｓｋｏｒ２、Ｄａｇｌａ、Ｇａｒｎｌ３、Ｉｔｐｋａ、Ｍｙｏ１０、Ｇｎｇ１３、Ｋｃｎｉｐ１、Ｔｒａｂｄ２ｂ、Ｒｎｆ２０７、Ｓｃｎ４ｂ、Ａｒｈｇａｐ２０、Ｇｒｉｐ１、Ｐｄｅ９ａ、Ｐｐｐ４ｒ４、Ｃｃｋ、Ｅｂｆ１、Ｂｅａｎ１、Ｔｕｂａ８、Ｓｍｐｘ、Ｅｂｆ２、Ｓｌｃ１９ａ１、Ｃｃｄｃ８５ａ、Ｆｌｔ３、Ｃａｍｋ２ａ、Ｓｈ２ｄ４ｂ、Ｈｏｍｅｒ３、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｃｌｅｃ２ｌ、Ｈｒｈ２、Ｋｓｒ２、Ｃｈｔｆ１８、Ｖａｘ２、Ｆｏｘｐ４、Ａｎｋｒｄ３３ｂ、Ｃｐｎｅ９、Ｃｏｒｉｎ、Ｉｌ２２、Ｐｒｋａｇ３、Ｃｅｐ１２６、Ｓｌｃ２０ａ１、Ａｋａｉｎ１、Ｎｒｋ、Ｐｉｈ１ｈ３ｂ、Ｉｎｐｐ５ａ、Ｌｈｘ１、Ｓｐｔｂｎ２、Ｐａｘｂｐ１、Ｄｎｅｒ、Ｄｏｃ２ｂ、Ｔｓｐｏａｐ１、Ｇｆｒａ２、Ｆｈｌ５、Ｄｍｄ、Ｋｃｎａｂ２、Ｓｅｒｉｎｃ２、Ｃａｒ７、Ｄｎａｈ６、Ｐｒｍｔ８、Ｐｒｋｃｇ、Ｍｄｆｉ、Ｄｇｋｈ、Ｆａｍ１１７ａ、Ｎｅｋ２、Ｆｍｎｌ１、Ａｔｌ２、Ｃｆａｐ１６１、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｃａｃｎａ２ｄ２、Ｐｔｃｈｄ４、Ｐｋｐ３、Ｓｈａｎｋ１、Ｇｒｉｄ２、Ｎｅｆｈである。例えば、ラット試料に由来のプルキンエ細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ａｒｈｇｅｆ３３、Ｃａｒ８、Ｓｌｃ１ａ６、Ｃａｌｂ１、Ｐｐｐ１ｒ１７、Ｉｔｐｒ１、Ｚｆｐ３８５ｃ、Ｒｙｒ１、ＡＡＢＲ０７０３０４７３．１、Ｓｌｃ９ａ３、ＡＡＢＲ０７００６７１３．１、ＡＡＢＲ０７００６７１３．２、ＲＧＤ１５６１５５７、Ｇｐｒ６３、ＡＡＢＲ０７０４９４９１．１、ＡＡＢＲ０７００６７２７１．１、Ｐｌｘｄｃ１、Ｃｅｐ７６、Ｆａｍ１０７ｂ、Ｂ３ｇｎｔ５、Ｆａｒ２、ＡＣ１０８２６１．１、Ｇｒｉｄ２ｉｐ、ＡＡＢＲ０７０７２６２８．１、Ｋｃｎｉｐ１、ＡＡＢＲ０７００６７２４．１、Ｔｒｐｃ３、Ｐｈｋａ２、Ｃａｒ７、Ｆａｍ１１７ａ、Ｈｅｓ３、Ｃａｓｑ２、Ｄｇｋｈ、Ａｒｈｇａｐ２６、Ｔｒａｂｄ２ｂ、Ｎｅｌｌ１、Ｂｃｌ１１ａ、Ｃｏｌ１８ａ１、ＬＯＣ１００１２５３６２、Ｐｔｃｈｄ４、Ｃａｍｋ２ａ、Ｄｙｒｋ４、Ｋｉｔｌｇ、Ｋｃｎａｂ１、Ｎｘｎｌ２、Ｌｔｋ、ＬＯＣ６８９９２７、ＡＡＢＲ０７０５６１５６．１、Ｃｐｎｅ８、Ｈｔｒ１ｂ、ＡＡＢＲ０７０３３５７０．１、Ｉｃｍｔ、ＡＡＢＲ０７０４７５９８．１、Ｃｓｔｆ２ｔ、Ｇｒｉｋ１、Ｉｔｐｋａ、ＬＯＣ１００９１０９９６、Ｈｐｃａｌ１、Ｅｆｎａ５、Ｍｙｏ１０、Ｒｇｓ８、Ｓｋｏｒ２、Ｉｌ２２、Ｓｌｃ１２ａ３、Ｃｐｎｅ９、ＡＡＢＲ０７００７９８０．２、Ｃａｃｎａ１ｇ、Ｄｏｃ２ｂ、Ｓｐｔｂｎ２、ＬＯＣ１０８３５１７０５、ＡＡＢＲ０７０３５９２６．１、ＡＡＢＲ０７０３７９４３．１、Ｐｃｐ２、ＡＡＢＲ０７０６１８６０．１、ＡＡＢＲ０７０２４８２０．１、Ｉｍｐｇ１、Ｎｋｉｒａｓ２、Ｋｒｔａｐ１２−２、Ｔｍｅｍ１２３、ＡＡＢＲ０７０４４００９．１、Ｐｔｐｒｒ、Ｈｏｍｅｒ３、Ｇａｒｎｌ３、Ｓｏｓ１、Ｋｃｎａｂ１、Ｃｎｔｎ３、ＬＯＣ３０４７２５、Ｓｔｋ１７ｂ、ＡＡＢＲ０７０４７６０４．１、Ｚｄｈｈｃ２３、Ｓｃｎ４ｂ、ＡＣ１２６６４０．１、Ｐｄｅ９ａ、Ｐｔｐｒｂ、Ｐｒｋｃｇ、Ｐｃｐ４、ＡＡＢＲ０７０５６３７４．１、Ｆｓｔｌ４、Ｐｐｐ４ｒ４、およびＮｕｐ９３である。
【００９７】
例えば、ヒト試料に由来のバスケット細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｂｈｌｈｅ２２、Ｍａｒｃｈ１１、Ｋｉｔ、Ｔｆａｐ２ｂ、Ｃｌｍｐ、Ｌｂｘ１、Ｓｌｃ３８ａ５、Ｆｒｍｄ３、Ｂｔｂｄ１１、Ｌｉｐｇ、Ｒａｂ３ｂ、Ｌｒｒｃ３８、Ｇａｌｎｔ１４、Ｃｎｒ１、Ｔｃｅｒｇ１ｌ、Ｃｂｌｎ２、Ｓｉａｈ３、Ｓｔａｃ２、Ｓｃｇｎ、Ｒｓｐｏ１、Ｌｍｃｄ１、Ｌｐｌ、Ａｄｒａ１ｂ、Ｇａｄ２、Ｃｈｒｎａ３、Ｓｏｃｓ２、Ｔｒｐｃ６、Ｋｃｎａ３、Ｓｙｎ３、Ｅｍｌ５、Ｎｅｆｌ、Ｆａｍ８４ａ、Ｔｒｐｃ５、ＫＩＡＡ１６４４、Ｈｒｈ３、Ｄｉｓｐ３、Ｔｆａｐ２ａ、Ｇｊｄ２、Ａｄａｍｔｓ２、Ｓｏｒｃｓ３、Ｐｔｐｒｋ、Ｔｉｍｐ３、Ｇｊｂ４、Ｅｈｄ３、Ｃｘｃｌ１２、Ａｃｔｃ１、Ｐｎｍａ２、Ｆａｍ４３ａ、Ａｄａｍ１１、Ｄａｃｔ２、Ｒｇｓ１６、Ｓｌｃ５ａ８、Ｅｘｐｈ５、Ｃｆａｐ２２１、Ｍｙｏ１６、Ｍｅｇｆ１０、Ｃａｃｎａ１ｄ、Ｐａｘ２、Ｅｆｎａ５、Ｐｌｃｈ１、Ｇａｂｒｇ２、Ｐｒｒｔ４、Ｉｔｇａ５、Ｓｐ５、Ｎｅｆｍ、Ｇｒｉｋ３、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｆｂｘｏ２４、Ｌｅｃｔ２、Ｎｅｆｈ、Ｅｆｎｂ３、Ｇｒｋ３、Ｍｐｚ、Ｓｙｔ２、Ｓｃｒｔ１、Ｃｄｃ４２ｅｐ３、Ｔｒｉｍ６７、Ｇｒｉｎ２ｂ、Ｒａｂ３ｃ、Ｐｌｘｎａ４、Ｆｚｄ８、Ｅｌｍｏｄ１、Ｓｍｉｍ１７、Ｓｌｃ８ａ３、Ｎｒｉｐ３、Ｐｌｅｋｈｇ５、Ａｒｌ４ａ、Ｇｒｍ８、Ｃｎｔｎａｐ５ａ、Ｍａａｔｓ１、Ｌｏｘｌ２、Ａｒａｐ３、Ｄｃｘ、Ｎｙａｐ２、Ｓｋｏｒ１、Ｐｖａｌｂ、Ｐｐｍ１ｊ、Ｓｌｃ５ａ４ａ、Ｔｍｅｍ１３２ｅ、およびＣｙｇｂである。例えば、マウス試料に由来のバスケット細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ａｄａｍｔｓ１５、Ｍａｒｃｈ１１、Ｔｆａｐ２ｂ、Ｓｏｃｓ２、Ｐｅｎｋ、Ｂｈｌｈｅ２２、Ｐｌｃｈ１、Ａｄａｍｔｓ１６、Ａｄｒｂ２、Ｆｒｍｄ３、Ｃｌｍｐ、Ｃａｃｎａ２ｄ３、Ｔｒｐｃ７、Ｇａｌｎｔ１８、Ｔｂｃ１ｄ４、Ａｓｇｒ１、Ｋｉｔ、Ｔｆａｐ２ａ、Ｆａｍ８４ａ、Ｇｊｄ２、Ｇｒｉｋ３、Ｌｒｒｃ３８、Ｃｈｓｔ９、Ｆｌｒｔ２、Ｃｈａｃ１、Ｇｒｍ８、Ｅｓｒｒｇ、Ｓｌｃ６ａ７、Ｐｌａ２ｇ４ｅ、Ｓｔａｃ２、Ｃａｂｐ１、Ｐｈｆ２４、Ｃａｍｋ１ｇ、Ｂｔｂｄ１１、Ｓｔｃ２、Ｓｏｒｃｓ３、Ｌａｍｂ１、Ｔｒｐｃ５、Ｃｏｒｏ６、Ｓｌｃ３２ａ１、Ｋｉｒｒｅｌ、Ｃｄｋｌ１、Ｃｈｓｔ１、Ａｓｎｓ、Ｓｐ５、Ｃｒｙｂａ２、Ａｌｄｈ１ｌ２、Ｋｃｎａｂ３、Ｔｇ、Ｐｌｘｎａ４、Ｐｒｋｃｄ、Ｃｇｎ、Ｔｃｔｅ１、Ｔｒｉｍ６７、Ｏｓｂｐｌ１０、Ｓｅｒｐｉｎｉ１、Ｓｌｃ７ａ１、Ｇｐｒ２２、Ｃｎｔｎ４、Ｓｋｏｒ１、Ｓｌｃ７ａ３、Ａｔｐ１ｂ１、Ｋｃｎａ２、Ｃｅｂｐｂ、Ｐａｒｍ１、Ｄｏｃｋ７、Ｅｍｌ５、Ｃｎｉｈ３、Ａｓｉｃ２、Ｈｐｃａｌ４、Ａｄａｍｔｓ２、Ｍａｓｐ１、Ｐｌｘｎｃ１、Ｇａｂｒｇ２、Ｍｔｆｐ１、Ｎｔｎ１、Ｒｅｔ、Ｚｆｐ４２３、Ｎｌｎ、Ｍａｎ２ａ１、Ｎｅｕｒｏｄ６、Ｇｒｉｎ２ｄ、Ａｎｇｐｔｌ３、Ｃｎｒ１、Ｔｍｅｍ１３２ｅ、Ａｐｃｄｄ１、Ｒａｓｇｒｆ１、Ｈｃｎ１、Ｓｃｎｎ１ｇ、Ｌｙ６ｅ、Ｐａｘ２、Ｒａｂ３ｃ、Ｒｐｈ３ａ、Ｒａｉ２、Ｇａｄ２、Ｍｐｐ７、Ａｒｌ４ａ、Ｉｇｓｆ３、Ｔｍｅｍ１７９、およびＳｏｒｂｓ２である。例えば、ラット試料に由来のバスケット細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｐｌｃｈ１、ＡＡＢＲ０７００１７３４．１、Ｌｙｐｄ６、Ｌａｍａ３、Ｍａｒｃｈ１１、Ｇｌｄｃ、Ｇｒｍ８、ＡＡＢＲ０７０４７８２３．１、ＡＡＢＲ０７００１６２３．１、Ｇｊｄ２、Ａｒｌ４ａ、ＡＡＢＲ０７０７０５７８．１、Ｈｐｃａｌ４、ＡＡＢＲ０７０６１４２８．１、Ｃｏｌ１２ａ１、Ｅｎｐｐ１、Ｓｏｒｃｓ３、Ｃｌｍｐ、Ｐｌｋ２、Ａｒｈｇｅｆ２６、ＲＧＤ１５６１６６７、Ａｓｉｃ２、ＡＡＢＲ０７０２６４７２．１、ＡＣ１２４８９６．１、Ｔｒｐｃ５、ＡＡＢＲ０７０５２０８４．１、ＡＡＢＲ０７０５９４７８．１、Ｋｉｔ、Ｎｔ５ｄｃ２、ＡＡＢＲ０７０４１８８５．１、Ｈｃｎ１、Ｓｋｏｒ１、Ｐｒｄｍ８、Ｐｈｆ２４、Ｅｓｒｒｇ、Ｇｒｉｋ３、Ｂｈｌｈｅ２２、Ｍｉｒ３４６、Ｔｍｅｍ２００ａ、ＡＡＢＲ０７００３６００．７、Ｓｃｎ９ａ、Ｉｎｐｐ４ｂ、Ａｃｅ、Ｋｃｎａ２、Ａｄｒａ１ｄ、Ｓｌｃ３２ａ１、Ｃｎｔｎａｐ４、Ｇｒｉｄ１、Ｔｒｐｃ７、Ｂｅｇａｉｎ、ＡＡＢＲ０７０４９５３５．３、Ｆｒｍｐｄ４、Ｔｆａｐ２ｂ、Ｃｎｒ１、ＡＡＢＲ０７０５４０８８．３、Ｚｃｃｈｃ１６、Ｔｒｐｖ６、Ｇｒｂ１０、Ｐａｘ２、Ｎｒｘｎ３、Ｔｙｍｓ、Ｇｒｉｄ１、Ｍｙｔ１ｌ、Ｄｉｓｐ３、ＡＡＢＲ０７０６３３５９．１、Ｂｔｎ１ａ１、Ｒｎ６０＿１０＿０５６５．６、ＡＡＢＲ０７０４１９７２．１、Ｏｓｂｐｌ１０、Ｓｉｘ４、Ｍｉｒ３８４、Ｔｂｃ１ｄ４、Ｃａｂｐ１、ＡＡＢＲ０７００３６００．２、ＡＡＢＲ０７０５７５９０．１、Ａｄｒｂ２、Ｃａｃｎａ１ｄ、Ｐｌｘｎｃ１、Ｄｕｓｐ２２、Ｈｅｃｗ１、Ｇｄｐｄ４、ｒｎｏ−ｍｉｒ−３４４ａ−１、Ｌｇｉ２、ＡＡＢＲ０７０６０２９１．２、Ａｄａｒｂ２、Ａｎｇｐｔ１、Ｒｓｐｏ４、Ｒｎ５０＿７＿１１５８．３、Ｄｃｘ、ＡＡＢＲ０７０６５５３１．３１、Ｏｎｅｃｕｔ１、Ｍｋｘ、Ｒｇｓ４、Ｋｃｎｃ２、Ｈｇｆ、Ｆｇｆ１３、Ｉｔｇａ８、ＡＡＢＲ０７０７０５７８．２、Ａｐｃｄｄ１、およびＴｒｉｍ１５である。
【００９８】
例えば、ヒト試料に由来の星状膠細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｓ１ｐｒ１、Ｇｊａ１、Ｌｇｉ４、Ｅｆｅｍｐ１、Ｅｔｎｐｐｌ、Ａｑｐ４、Ｒｇｍａ、Ｌｇｒ６、Ｌｃａｔ、Ｔｒｉｌ、Ｓｅｒｐｉｎｉ２、Ｐｇｇｈｇ、Ｓｌｃ１ａ３、Ｇｆａｐ、Ａｌｄｈ１ａ１、Ｐｌａ２ｇ５、Ｆｘｙｄ１、Ｗｄｒ４９、Ｇｌｉ１、Ｎｆａｔｃ４、Ｓｃａｒａ３、Ｓｌｃ４ａ４、Ｌａｍａ２、Ｃｄｃ４２ｅｐ４、Ｇａｂｒｇ３、Ｐ２ｒｙ１、Ｇａｂｒａ２、Ｃｏｌｅｃ１２、Ｍｌｃ１、Ｓｌｃ７ａ１１、Ａｌｄｈ１ｌ１、Ｓｏｘ９、Ｌｇａｌｓ３、Ｍｇｓｔ１、Ｇａｔｓｌ３、Ａｈｎａｋ、Ｐｉｐｏｘ、Ｒｈｏｊ、Ａｒｈｇｅｆ２６、Ａｒｈｇｅｆ２８、Ｓｒｐｘ、Ｍｔ３、Ａｔｐ１ａ２、Ｆｘｙｄ７、Ｌｆｎｇ、Ｌａｍｂ２、Ｇｄｆ１０、Ｆ３、Ｓｄｃ４、Ｈｓｐｂ１、Ｈｅｓ１、Ｓｌｃ１２ａ４、Ｍｅｒｔｋ、Ｃ３、ＡＩ４６４１３１、Ｉｄ４、Ｖｉｔ、Ｆｊｘ１、Ｃｃｄｃ８０、Ａｄｏｒａ２ｂ、Ｒｙｒ３、Ｍｆｇｅ８、Ｐｌｅｋｈｏ２、Ｅｌｏｖｌ２、Ｆａｍ１７９ａ、Ｃｅｂｐｂ、Ａｃｓｓ１、Ｓｌｃ１３ａ５、Ｅｄｎｒｂ、Ｐｌｔｐ、Ｉｌ３３、Ｔｌｒ４、Ｆａｍ１９８ｂ、Ｉｓｙｎａ１、Ｇｌｉｓ３、Ｄａｏ、Ｆｇｆｒ３、Ｎｃａｎ、Ｍｓｘ２、Ｓｐａｔｃ１、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｔｕｂｂ２ｂ、Ｆａｔ３、Ｆａｍ１６７ａ、Ｃｏｌ２２ａ１、Ｔｃｆ７ｌ１、Ｎｄｒｇ２、Ｎｈｓｌ１、Ｄｄｉｔ４ｌ、Ｐｂｘｉｐ１、Ｒａｓｌ１２、Ｓｈ３ｂｐ２、Ａｐｌｎｒ、Ｒｏｂｏ３、Ｒｕｂｃｎｌ、Ｒａｂ３４、Ｇｔｆ２ａ１ｌ、Ｆｇｆｒ２、Ｋａｎｋ２、およびＲｆｘ４である。例えば、マウス試料に由来の星状膠細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｇｄｆ１０、Ｓｌｃ１ａ３、Ｆｘｙｄ１、Ｄａｏ、Ａ２ｍ、Ｌｆｎｇ、Ｌｇｉ４、Ｍｙｂｐｃ１、Ｃｄｃ４２ｅｐ４、Ｓｌｃｏ４ａ１、Ｆａｍ２０ａ、Ｌｃａｔ、Ａｃｏｔ１１、Ｖｉｍ、Ｎｗｄ１、Ｓ１ｐｒ１、Ｔｎｃ、Ｒｂｍ２４、Ａｃｓｂｇ１、Ｎｔｓｒ２、Ｐｒｅｘ２、Ｃａｂｌｅｓ１、Ｇｌｉ１、Ｅｔｎｐｐｌ、Ｐｌａ２ｇ７、Ｐｈｋｇ１、Ｎｈｓｌ１、Ｓｌｃ１４ａ１、Ｐｌｅｋｈｏ２、Ｇｊｂ６、Ｐｌｃｅ１、Ｉｔｉｈ３、Ｓｄｃ４、Ｍｅｒｔｋ、Ｐｒｒ５、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｉｄ４、Ｍｌｃ１、Ｐａｘ３、Ｇｐｒ１５３、Ａｂｉ３ｂｐ、Ｐｌｔｐ、Ｆｘｙｄ７、Ｒｐｕｓｄ３、Ａｑｐ４、Ｉｇｄｃｃ３、Ｆｇｆｒ３、Ｍｔ３、Ａｔｐ１ａ２、Ｇａｂｒｂ１、Ｎｄｒｇ２、Ｕｃｐ２、Ｐｌｐｐ３、Ｆｒｅｍ１、Ｅｌｏｖｌ２、Ｇｌｉ２、Ｅｆｈｄ２、Ｚｉｃ４、Ｏｐｌａｈ、Ｃｘｃｌ１４、Ｍｆｇｅ８、Ｓｏｘ９、Ａｔｐ１３ａ４、ＡＩ４６４１３１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｒｆｘ４、Ｔｒａｆ１、Ｄｍｐ１、Ｇａｂｒａ４、Ｇｊａ１、Ｅｔｖ４、Ｍａｐ２ｋ６、Ｗｗｃ１、Ｓｙｔ１０、Ｓｐａｒｃ、Ｔｒｉｌ、Ｓｌｃ２５ａ１８、Ａｌｄｈ１ｌ１、Ｅｖａ１ａ、Ｍｘｒａ８、Ｌｇｒ６、Ｒｇｍａ、Ｅｇｆｒ、Ｓｌｃ３９ａ１２、Ｓｌｃ８ｂ１、Ｇｌｉｐｒ２、Ａｘｌ、Ａａｓｓ、Ｈｋ２、Ｉｔｐｋｂ、Ｒａｍｐ２、Ｐｙｒｏｘｄ２、Ｇａｂｒａ２、Ｔｃｆ７ｌ１、Ｇａｒｅｍ２、Ｗｎｔ６、Ｄｆｎａ５、Ｆａｍ９２ｂ、Ｐｌｘｎｂ１、およびＶａｍｐ１である。例えば、ラット試料に由来の星状膠細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．１、Ｉｔｉｈ３、Ｇｄｆ１０、Ｇｌｉ１、Ｓｌｃ２５ａ１８、Ｎｋａｉｎ４、Ｔｎｃ、Ｍｓｘ２、Ｓ１ｐｒ１、Ｓｌｃ７ａ１０、Ａｑｐ９、Ｍｔ２Ａ、Ｌｇｉ４、Ｐｏｕ３ｆ２、Ｉｄ４、Ｃａｃｎｇ５、Ｃｙｐ２ｄ５、ＡＡＢＲ０７０５８６５８．１、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．６、Ｌｆｎｇ、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．３、Ｆａｍ１０７ａ、Ｎａｔ８ｆ３、Ｃｔｘｎ３、Ａｌｄｈ１ｌ１、Ｅｎｔｐｄ２、Ｒｂｍ２４、Ｓｌｃ１ａ３、Ｍｌｃ１、Ｃｘｃｌ１４、Ｈｉｆ３ａ、Ｆｘｙｄ１、Ａｃｓｂｇ１、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．７、Ｎｏｔｃｈ３、Ｉｌ３３、Ｎｗｄ１、Ｃｄｃ４２ｅｐ４、Ｓａｍｄ９ｌ、Ｇａｂｒｂ１、Ｐｌｐｐ３、Ｃｘｃｒ４、Ｒｇｍａ、Ｉｔｍ２ａ、Ｅｄｎｒｂ、Ｐｄｌｉｍ４、Ｓｇｃａ、Ｓｎｃａｉｐ、Ｐｒｏｄｈ１、Ａｇｔ、Ｓｌｃ１４ａ１、ＡＡＢＲ０７０３２３４３．１、ＡＡＢＲ０７０３５７８２．１、Ｍａｒｃ１、Ｆｇｆｒ３、ＡＡＢＲ０７０７０１６１．５、ＡＣ１０９８８６．１、Ｐｒｒ５、Ａｑｐ４、Ｐｌｅｋｈｏ２、ＡＡＢＲ０７０３５７８０．２、Ｓｈ２ｂ２、Ｆ３、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｅｖａ１ａ、Ｐｌｔｐ、Ｇｆａｐ、Ｃｙｐ２ｄ４、Ｃｒｌｆ１、Ｓｄｃ４、Ｓｏｄ３、Ｄａｏ、Ｃｈｓｔ１、ＡＡＢＲ０７００１５５５．１、ＡＡＢＲ０７０６３３４６．１、Ｍｐｐ６、Ｐｔｃｈ２、ＡＡＢＲ０７０３１７６７．１、ＡＣ１０５６０４．１、Ｇｒｉｎ２ｂ、Ｐｙｇｍ、Ｅｔｎｐｐｌ、Ｓｌｃ１５ａ２、Ｃａｓｐ４、Ｇｒｉａ１、Ｓｌｃ４ａ４、Ｃａｍｋ２ｇ、Ｃｂｓ、ＡＡＢＲ０７０３５１７５．１、Ｎｔｓｒ２、Ｇｊａ１、Ａｓｐｇ、Ｓｆｘｎ５、Ｃｃｂｅ１、Ａｈｎａｋ、Ｇｒａｍｄ３、Ｎｄｒｇ２、Ｍｔ３、Ｓｈｒｏｏｍ３、およびＭｙｈ１１である。
【００９９】
例えば、マウス試料に由来の乏突起膠細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｋｌｋ６、Ｍｏｇ、Ｇｌｄｎ、Ｃｎｄｐ１、Ｇｍ２０４２５、Ｔｍｅｍ９８、Ｓｌｃ５ａ１１、Ｍａｇ、Ｃａｒｎｓ１、Ｇｐｒ３７、Ｃｄｋ１８、Ｈｈａｔｌ、Ａｎｌｎ、Ｅｎｐｐ２、Ｆｏｌｈ１、Ｓｅｃ１４ｌ５、Ｍｙｒｆ、Ｐｌｐ１、Ｍａｌ、Ｇｊｂ１、Ｉｔｇａ２、Ｃｐｍ、Ｐｌｐｐ２、Ｃｎｔｎ２、Ｅｒｍｎ、Ｏｐａｌｉｎ、Ａｂｃａ８ｂ、Ｌｐａｒ１、Ｐｌｄ１、Ｓａｌｌ１、Ｃｅｒｃａｍ、Ｄｏｃｋ５、Ｐｉ１６、Ｍａｎ２ａ１、Ｐｅｘ５ｌ、Ｔｍｅｍ６３ａ、Ｔｍｅｍ１２５、Ｇｉｐｒ、Ｓｈ３ｔｃ２、Ｄ７Ｅｒｔｄ４４３ｅ、Ｋｅｌ、Ｌｄｂ３、Ｃｃｄｃ１５２、Ｃｌｄｎ１１、Ｓｙｎｊ２、Ｌｒｐ２、Ｎｉｎｊ２、Ｐｓｒｃ１、Ｎｄｒｇ１、Ａｃｔｎ２、Ｓｇｋ２、Ｔｒｉｍ５９、Ｐｌｅｋｈｇ３、Ｌａｒｐ６、Ｓｌｃ４５ａ３、Ｃｎｐ、Ｃｏｌ４ａ５、Ｐｄｅ８ａ、Ｒｈｏｂｔｂ１、Ｄ１６Ｅｒｔｄ４７２ｅ、Ｑｄｐｒ、Ｅｎｐｐ６、Ｒｈｏｕ、Ｓｅｍａ３ｃ、Ｇｓｎ、Ｃｙｒ６１、Ｃａｐｎ３、Ｈｏｘｄ１、Ｆｒｍｄ４ｂ、Ｔｍｅｍ１４４、Ｇａｌｎｔ６、Ｐｋｍｙｔ１、Ｆｂｘｏ３２、Ｐｌａ２ｇ１６、Ｄｐｙｄ、Ｓｈ３ｇｌ３、Ｐｒｉｍａ１、Ｒａｓａｌ１、Ｆａ２ｈ、Ｆａｍ１２４ａ、Ｔｒｅｈ、Ｐａｑｒ４、Ａｚｇｐ１、Ｐｌｅｋｈｈ１、Ｄａｐｋ２、Ｋｎｏｐ１、Ｓｅｍａ３ｂ、Ｅｌｏｖｌ１、Ｓｈｒｏｏｍ４、Ｃａｒ２、Ｎｅｃａｂ１、Ａｓｐａ、Ｇａｂ１、Ｋｉｆ６、Ｈｈｉｐ、Ｕｇｔ８ａ、Ｉｑｇａｐ１、Ｍａｐ６ｄ１、Ｅｌｎ、およびＰｌｌｐである。例えば、マウス試料に由来の乏突起膠細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｇｐｒ３７、Ｐｅｘ５ｌ、Ｈａｐｌｎ２、Ａｐｏｄ、Ｅｒｍｎ、Ｐｒｒ５ｌ、Ａｓｐａ、Ｅｆｎｂ３、Ａｎｌｎ、Ｍｏｇ、Ｐｌｐ１、Ｐｌｅｋｈｈ１、Ｔｍｅｍ６３ａ、Ｉｌ３３、Ｄ７Ｅｒｔｄ４４３ｅ、Ｓｅｃ１４ｌ５、Ｃａｒｎｓ１、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｇａｌｎｔ６、Ｇａｌｎｔ５、Ｎｄｒｇ１、Ｃｌｄｎ１１、Ｇｊｃ２、Ｐｌａ２ｇ１６、Ｆｔｈ１、Ｏｐａｌｉｎ、Ｃａｒ２、Ｄｏｃｋ５、Ｇｍ２０４２５、Ｓａｌｌ１、Ｐｋｄ２ｌ１、Ｋｃｎｋ１３、Ｐｐｐ１ｒ１４ａ、Ｇａｔｍ、Ｓｅｒｐｉｎｂ１ａ、Ｐｄｅ８ａ、Ｔｎｎｉ１、Ｇｌｕｌ、Ｔｍｐｒｓｓ５、Ｎｉｐａｌ４、Ｔｒｉｍ５９、Ｍａｌ、Ｓｌｃ１２ａ２、Ｑｄｐｒ、Ｌｉｔａｆ、Ｇｊｂ１、Ｅｄｉｌ３、Ｐｌｓ１、Ｍｂｏａｔ１、Ｓｔ６ｇａｌｎａｃ３、Ｇｎｇ１１、Ｅｎｐｐ２、Ｃｐｍ、Ｐｓｔｐｉｐ２、Ｔｒｉｍ３６、Ｋｌｋ６、Ｍｙｏ１ｄ、Ｔｍｅｍ９８、Ｓｙｎｊ２、４９３３４１３Ｇ１９Ｒｉｋ、Ｍａｇ、Ｉｎｓｃ、Ｐｉｇｈ、Ｐｉｋ３ｃ２ｂ、Ｎｉｎｊ２、Ｔｒｐｖ３、Ｃａｒ１４、Ｔｍｅｍ１２５、Ｍａｐ７、Ｃｄｋ１８、Ｄｅｐｄｃ７、Ａａｔｋ、Ｍｙｒｆ、Ｃｎｐ、Ｓｔｍｎ４、Ｃｈｄｈ、Ｎｅｋ４、Ｆｒｍｄ４ｂ、Ｕｇｔ８ａ、Ｐａｌｍ２、Ａｒｓｇ、Ｃｃｄｃ１５２、Ｅｆｅｍｐ１、Ｐｉｇａ、Ｒｆｔｎ１、Ｉｔｇｂ４、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｅｎｐｐ４、Ｎｋａｉｎ２、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｈｃｎ２、Ｐｌｘｎｂ３、Ｄｐｙ１９ｌ１、Ａｒｈｇａｐ２３、Ｐｒｉｍａ１、Ｇｉｐｒ、Ｓｈ３ｔｃ２、Ｔｕｂｂ４ａ、Ｍａｐ６ｄ１、およびＫｃｔｄ１３である。例えば、ラット試料に由来の乏突起膠細胞の核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｇｐｒ３７、Ｐｅｘ５ｌ、Ｈａｐｌｎ２、Ａｐｏｄ、Ｅｒｍｎ、Ｐｒｒ５ｌ、Ａｓｐａ、Ｅｆｎｂ３、Ａｎｌｎ、Ｍｏｇ、Ｐｌｐ１、Ｐｌｅｋｈｈ１、Ｔｍｅｍ６３ａ、Ｉｌ３３、Ｄ７Ｅｒｔｄ４４３ｅ、Ｓｅｃ１４ｌ５、Ｃａｒｎｓ１、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｇａｌｎｔ６、Ｇａｌｎｔ５、Ｎｄｒｇ１、Ｃｌｄｎ１１、Ｇｊｃ２、Ｐｌａ２ｇ１６、Ｆｔｈ１、Ｏｐａｌｉｎ、Ｃａｒ２、Ｄｏｃｋ５、Ｇｍ２０４２５、Ｓａｌｌ１、Ｐｋｄ２ｌ１、Ｋｃｎｋ１３、Ｐｐｐ１ｒ１４ａ、Ｇａｔｍ、Ｓｅｒｐｉｎｂ１ａ、Ｐｄｅ８ａ、Ｔｎｎｉ１、Ｇｌｕｌ、Ｔｍｐｒｓｓ５、Ｎｉｐａｌ４、Ｔｒｉｍ５９、Ｍａｌ、Ｓｌｃ１２ａ２、Ｑｄｐｒ、Ｌｉｔａｆ、Ｇｊｂ１、Ｅｄｉｌ３、Ｐｌｓ１、Ｍｂｏａｔ１、Ｓｔ６ｇａｌｎａｃ３、Ｇｎｇ１１、Ｅｎｐｐ２、Ｃｐｍ、Ｐｓｔｐｉｐ２、Ｔｒｉｍ３６、Ｋｌｋ６、Ｍｙｏ１ｄ、Ｔｍｅｍ９８、Ｓｙｎｊ２、４９３３４１３Ｇ１９Ｒｉｋ、Ｍａｇ、Ｉｎｓｃ、Ｐｉｇｈ、Ｐｉｋ３ｃ２ｂ、Ｎｉｎｊ２、Ｔｒｐｖ３、Ｃａｒ１４、Ｔｍｅｍ１２５、Ｍａｐ７、Ｃｄｋ１８、Ｄｅｐｄｃ７、Ａａｔｋ、Ｍｙｒｆ、Ｃｎｐ、Ｓｔｍｎ４、Ｃｈｄｈ、Ｎｅｋ４、Ｆｒｍｄ４ｂ、Ｕｇｔ８ａ、Ｐａｌｍ２、Ａｒｓｇ、Ｃｃｄｃ１５２、Ｅｆｅｍｐ１、Ｐｉｇａ、Ｒｆｔｎ１、Ｉｔｇｂ４、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｅｎｐｐ４、Ｎｋａｉｎ２、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｈｃｎ２、Ｐｌｘｎｂ３、Ｄｐｙ１９ｌ１、Ａｒｈｇａｐ２３、Ｐｒｉｍａ１、Ｇｉｐｒ、Ｓｈ３ｔｃ２、Ｔｕｂｂ４ａ、Ｍａｐ６ｄ１、Ｋｃｔｄ１３、Ｍｏｇ、Ｏｐａｌｉｎ、Ｍｏｂｐ、Ｔｍｅｍ６３ａ、ＡＡＢＲ０７００６３１０．１、Ｈａｐｌｎ２、Ｋｌｋ６、Ｑｄｐｒ、Ｓｅｌｐｌｇ、Ｃｌｄｎ１１、Ｍａｌ、Ｅｒｍｎ、ＡＡＢＲ０７０４６９６１．１、Ａｂｉ３、Ｇｐｒ３７、Ｔｍｅｍ８８ｂ、Ｒａｓｇｒｐ３、Ｐｒｒ５ｌ、Ｓｌｃ５ａ１１、Ｍａｇ、ＬＯＣ１００３６２９０９、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、ＬＯＣ１００３０２４６５、Ｃｘ３ｃｒ１、Ｃｔｓｓ、Ｃａｒｎｓ１、Ｔｍｅｍ１２５、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｓｅｃ１４ｌ５、Ｔｆ、Ｃ１ｑｂ、Ａｐｏｄ、Ｓ１ｐｒ５、Ｒｎ６０＿５＿１３７４．５、Ｐｌｐ１、Ｉｎｓｃ、Ｍｂｐ、Ｐｌｓ１、Ｔｍｅｍ９８、Ａｎｌｎ、Ｎｄｒｇ１、Ｐａｆａｈ１Ｂ１、Ｐｅｘ５ｌ、ＬＯＣ３６１０１６、Ｇａｌｎｔ６、Ｔｒｉｍ３６、ＡＡＢＲ０７０１７６９３．１、Ｇｐａｔｃｈ４、Ｐｌｅｋｈｇ３、Ｈａｍｐ、Ｃｓｆ１ｒ、Ｇｊｃ２、Ｃａｒ１４、Ｔｒｉｍ５９、ＡＡＢＲ０７０５３８７０．１、Ｇｐｒ８４、Ｐｌｅｋｈｈ１、Ｇｈｒ、Ｋｎｄｃ１、Ｓｌｃｏ２ｂ１、Ｃｄ７４、Ａｓｐａ、Ｔｒｐｖ３、ＡＡＢＲ０７００８０３０．１、Ａｐｌｐ１、Ｔｇｆｂｒ２、Ｇｊｂ１、Ｐｔｐ４ａ３、Ｐｒｉｍａ１、Ｐｉｋ３ｃ２ｂ、ＡＡＢＲ０７０３６０３５．１、Ｓａｌｌ１、Ｐｌｐｐ２、Ｐｌｄ４、Ｆａｍ１０２ｂ、Ｃｄ３３、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｎｋｄ１、Ｅｌｏｖｌ７、Ｐｉｇａ、Ｉｎｆ２、Ｂｌｎｋ、Ｅｎｐｐ４、Ｉｌ１８、Ｓｐａｔａ１３、Ｍｅｔｔｌ７ａ、Ｉｎｐｐ５ｄ、Ｍｙｒｆ、Ｇｊｃ３、Ｔｒｉｍ２、ＡＡＢＲ０７０１２０３９．１、ＡＡＢＲ０７０３３８８７．１、Ｅｎｐｐ２、Ｐａｃｓ２、Ｃ１ｑａ、Ｔｒｅｍ２、Ｓｌｃ４５ａ３、Ｈｈｉｐ、Ａｎｘａ３、およびＡＡＢＲ０７０２２０９８．１である。
【０１００】
例えば、ヒト試料に由来のＯＰＣの核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｆｅｒｍｔ１、Ｌｉｍｓ２、Ｃ１ｑｌ１、Ｓｓｔｒ１、Ｏｌｉｇ１、Ｂａｍｂｉ、Ｕｓｐ４３、Ｂ３ｇｎｔ７、Ｐｄｇｆｒａ、Ｃ１ｑｌ２、Ｏｌｉｇ２、Ｆｍｏ３、Ｃｓｐｇ５、Ｇａｌｒ１、Ｇｐｃ２、Ｆｉｂｉｎ、Ｃｓｐｇ４、Ｃｏｌ１１ａ１、Ｂｃｈｅ、Ｃｏｌ９ａ１、Ａｆａｐ１ｌ２、Ｃｌｄｎ１、Ｐｌｐｐ４、Ｓｏｘ１３、Ｐｌａｔ、Ｎｅｕ４、Ｄ６３００２３Ｆ１８Ｒｉｋ、Ｃｏｌ２０ａ１、Ｐｘｙｌｐ１、Ａｓｉｃ４、Ｓｐｓｂ４、Ｐｒｅｌｐ、Ｇｐｒ３４、Ｂｅｓｔ３、Ｓｔｋ３２ｂ、Ａｋｒ１ｃ１４、Ｓｕｓｄ５、Ｏｐｈｎ１、Ｍｍｐ１６、Ｓｕｌｆ２、Ｐｒｋｇ２、Ｔｎｓ３、Ｂ３ｇａｌｔ４、Ｆｇｆｂｐ３、Ｎｋａｉｎ３、Ｎｔｎ１、Ａｓｃｌ１、Ｓｅｍａ５ａ、Ｈｒａｓｌｓ、Ｇａｌ３ｓｔ４、Ｅｂｆ４、Ｔｍｅｍ１３２ｄ、Ｎｔ５ｅ、Ｊａｇ１、Ｍｅｇｆ１１、Ｉｌｄｒ２、Ｐｌｐｐｒ１、Ｄｃｃ、Ｎｔｎ４、Ｓｏｘ６、Ｃａｃｎｇ４、Ｐｘｄｎ、Ｓａｐｃｄ２、Ｔｎｋ２、Ｓｌｃ４３ａ３、Ａｄａｍｔｓ６、Ｖｓｉｇ８、Ｉｔｍ２ａ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、Ａｌｋ、Ｓｍｏｃ１、Ｃａｃｎａ２ｄ３、Ｔｍ４ｓｆ１、Ｂｇｎ、Ｐｄｇｆｃ、Ａｔｐ２ｃ２、Ａｌｄｈ１ａ３、Ｐｒｒｘ１、Ｍｅｉｓ３、Ｃｘｘｃ４、Ｃｄ２７、Ｓｅｍａ３ｅ、Ａｄａｍｔｓ１７、Ａｋｒ１ｃ２０、Ａｒｈｇａｐ１０、Ｃｒｉｓｐｌｄ２、Ｓｉｐａ１ｌ２、Ｐｐｐ１ｒ３６、Ｇｎｇ１２、Ｓｙｔ１７、Ｍｉｄｎ、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｋｈｄｒｂｓ３、Ｔｈｂｓ４、Ｖｉｐｒ２、Ｃｃｎｄ１、Ｉｆｆｏ１、Ａｔｏｈ８、Ｅｘｏｓｃ４、およびＰｄｅ７ｂである。例えば、マウス試料に由来のＯＰＣの核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｎｅｕ４、Ｃ１ｑｌ１、Ｐｐｆｉｂｐ１、３１１００３５Ｅ１４Ｒｉｋ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｒｇｃｃ、Ｓｕｓｄ５、Ｉｔｇａ９、Ｔｅｓ、Ｒｐｒｍ、Ｒｅｐ１５、Ｃｓｐｇ４、Ｍａｔｎ４、Ａｍｚ１、１８１００４１Ｌ１５Ｒｉｋ、Ｐｘｄｃ１、Ｔｏｘ３、Ｓｈ３ｂｐ４、Ｅｌｆｎ１、Ｇａｌｎｔ３、Ｌｍｃｄ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｃ１ｑｌ２、Ｎｅｔｏ１、Ｇｒｍ５、Ｍｍｐ２、Ｃｏｌ１１ａ２、Ｓｅｍａ３ｄ、Ｌｉｍｓ２、Ｃａｖ１、Ｓａｐｃｄ２、Ｒｃｎ１、Ｐｔｐｒｏ、Ｃｃｎｄ１、Ｐｔｇｆｒｎ、Ｎｃａｎ、５７３０５５９Ｃ１８Ｒｉｋ、Ｌｐｃａｔ２、Ｏｌｉｇ２、Ｆｈｌ３、Ｔｓｐａｎ６、Ｒｉｎ２、Ａｓｃｌ１、Ｂａｓｐ１、Ｐｍｅｐａ１、Ｆｚｄ９、Ｆａｍ１１４ａ１、Ａｂｈｄ２、Ｃｔｘｎ１、Ｃｓｐｇ５、Ｃｆａｐ２０、Ｖｗｃ２、Ｃｄｏ１、Ｃｄｈ１３、Ｍａｒｃｋｓ、Ｇｓｘ１、Ｓｅｒｔｍ１、Ｓｌｃ１ａ１、Ｍａｔｎ１、Ｈａｓ２、Ｌａｍａ４、Ｍｙｃｌ、Ｋｌｈｌ５、Ｋｃｎｈ５、Ｋｃｎｈ８、Ｓｅｍａ５ａ、Ｅｎｐｐ６、Ｓｌｃ５ａ７、Ｃａｖ２、Ｌｂｈ、Ａｄｍ、Ａｄａｍ１２、Ｓ１００ａ４、Ｍｆｓｄ２ａ、Ｉｇｆｂｐ３、Ｍｉｄｎ、Ａｓａｐ３、Ｐｒｋｇ２、Ｒｌｂｐ１、Ａｂｃｇ２、Ｖｓｔｍ２ｂ、Ｄｏｃｋ６、Ｆｂｎ１、Ｆｒｒｓ１、Ｋｈｄｒｂｓ３、Ｓｌｉｔｒｋ６、Ｃｈｓｔ１１、Ｐｔｐｎ１４、Ｄｐｙｓｌ３、Ｓｌｃ４４ａ５、Ｅｙａ１、Ｓｏｘ６、Ｐｈｏｘ２ａ、Ｃｏｌ１１ａ１、Ｓｗａｐ７０、Ｆａｍ８９ａ、Ｍｒｍ２、Ｌｙｐｄ１、Ｓｈｉｓａ７、およびＰｃｄｈ１７である。例えば、ラット試料に由来のＯＰＣの核における最も特異的遺伝子（特異性の減少順）は、Ｆａｍ８９ａ、Ｐｄｇｆｒａ、ＲＧＤ１５６１８４９、Ｒｌｂｐ１、Ｃｃｎｄ１、Ｔｍｅｍ２５５ｂ、Ｃ１ｑｌ１、Ｂｇｎ、Ｉｔｇａ９、Ｐｐｆｉｂｐ１、Ｓｎｘ２２、Ｃｏｌ５ａ３、Ｐｍｅｌ、Ｃａｖ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｃｓｐｇ４、Ｌｉｍｓ２、ＡＡＢＲ０７０５２８９７．１、Ｃ１ｑｌ２、Ｃｄｋ２、ＡＡＢＲ０７０１００２２．１、Ｃａｃｎｇ４、Ｍａｔｎ４、ＡＡＢＲ０７０４９９４８．１、Ｓｕｓｄ５、Ｐｒｋｇ２、Ｐｘｄｃ１、ＲＧＤ１５６６０２９、ＡＡＢＲ０７００３３０４．１、Ｓａｐｃｄ２、Ｃｓｐｇ５、Ｍｍｐ１５、Ｒｇｃｃ、Ｓｌｃ２２ａ６、Ｓｅｍａ５ｂ、Ｑｐｒｔ、Ｐｎｌｉｐ、Ｓｌｃ６ａ１２、ＲＧＤ１３１１８９２、ＡＡＢＲ０７００３３０６．１、ＡＡＢＲ０７０４４６７１．１、Ｒｂｐｊｌ、Ｃｈｓｔ５、Ｔｒａｆ４、Ｓｏｘ６、Ｃｏｘ６ｂ２、Ｐｃｄｈ１５、Ｃｄ１０１、Ｘｙｌｔ１、  ＡＡＢＲ０７００３３０４．２、Ｃａｌｃｒｌ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｌａｍａ４、Ｅｌｆｎ１、Ａｍｐｄ３、Ｆａｍ２１２ｂ、Ｓｌｃ６ａ１３、Ｓｓｔｒ１、Ｓｅｍａ３ｄ、ＡＣ１４１９９７．１、Ｃｐｎｅ７、Ｐｔｇｆｒｎ、Ｗｂｓｃｒ２８、Ｒｙｒ３、Ｇｐｓｍ２、Ｎｅｔｏ１、Ｃｈｓｔ１１、Ｓｌｃ２２ａ８、Ｐｓｔｐｉｐ２、ＡＡＢＲ０７０４４６６８．１、Ｂｃａｓ１、Ｉｇｆ２、Ｌｂｈ、Ｏｌｆｍ２、Ｎｄｎｆ、Ｖｓｔｍ２ｂ、ＡＡＢＲ０７０５８６５６．１、Ｒｅｐ１５、Ｖｔｎ、Ｅｌｎ、Ｒａｍｐ１、Ｐｍｅｐａ１、Ｇｐｎｍｂ、Ｐｔｐｒｏ、Ｌｉｍｄ１、Ｃｄｈ１３、Ｎｒｘｎ２、Ｍｇｐ、Ｍｙｔ１、Ｍａｒｃｋｓ、ＬＯＣ１００３６２２１６、ＡＡＢＲ０７０４３６０１．４、ＬＯＣ１０２５５３０１８、Ｍａｓｐ１、Ｓｕｌｆ２、Ｔｌｅ６、Ｆａｍ１１４ａ１、Ｔｍｅｍ１００、Ｃｃｎｄ２、およびＲａｓｇｅｆ１ｂである。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、特異性ランクが、マウスとヒトとの間より、マウスとラットとの間でより保存されていることが観察された。いくつかの実施形態では、Ｇｅｎｏ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析を各細胞型または種に特異的と見なされる遺伝子に対し実施して、同じ経路で遺伝子が機能するかどうかを判定し得る。いくつかの実施形態では、所定の細胞型における細胞型または種特異的マーカーの発現の変化が、別のファミリーメンバーで観察される。例えば、Ｐｄｅ１ｃを小脳のマウス細胞型またはその核のために使用し得、Ｐｄｅ１ａ発現を小脳のヒト細胞型またはその核のために使用し得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、プロテインチロシンキナーゼ２ベータ（Ｐｔｋ２ｂ）、溶質輸送体ファミリー４３メンバー２（Ｓｌｃ４３ａ２）、グルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット３（Ｇｒｉｋ３）、Ｉｔｐｒ１、プロトカドヘリン９（Ｐｃｄｈ９）、およびＲａＳグアニル放出タンパク質１（Ｒａｓｇｒｐ１）の発現レベルの差異を使用して、ヒトおよびマウスに由来する顆粒、グリア、およびバスケット／星状細胞由来の核の間で、識別される。
【０１０３】
Ｂ．異種間分析による細胞型特異的および種特異的遺伝子発現の分析
いくつかの実施形態では、最も変化する遺伝子が、３つの種全体にわたり正規化ＲＮＡｓｅｑ結果と比較する各細胞型からの選別核由来のＲＮＡｓｅｑ結果の比較から特定される。いくつかの実施形態では、細胞型特異的および種特異的遺伝子は、細胞型中の最大変化および分析した種中の最大変化の片方または両方を有する遺伝子により特定され得る。いくつかの実施形態では、種中で最大の発現の変化を有することが観察された遺伝子は、細胞型によりさらに識別され得る。例えば、核は、細胞型中より、種中で大きな差別化を有し得る。いくつかの実施形態では、階層型クラスタリングを用いて、各変動成分により得られる分離の程度を観察し得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、Ｐｃｓｋ２、Ｐｃｓｋ６、およびＰｃｓｋ８を用いて、細胞型および種の両方により核の分類がなされる。あるいは、Ｐｃｓｋ１およびＰｃｓｋ３を用いて、細胞型により核の分類がなされる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、核構造が、各細胞型全体にわたる遺伝子発現調節または疾患感受性の差異と比較され得る。
【０１０６】
Ｃ．ヒト試料の臨床属性の効果
いくつかの実施形態では、臨床属性による核のプロファイルの差異を分析して、属性のマーカーを特定し得る。例えば、プロファイル差異が異なる期間の自己融解時間、性別、年齢、およびストレスで観察された。
【０１０７】
自己融解は、以前の調査で遺伝子発現に対し僅かな効果しか有さないことが観察された。（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，２６、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、選別核中の少なくとも４つの遺伝子の発現を用いて、自己融解の種々の段階でヒト試料由来の顆粒細胞を特定し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の発現を用いて、自己融解の種々の段階でヒト試料由来のバスケット／星状細胞またはグリアを特定し得る。いくつかの実施形態では、キネシンファミリーメンバー１９（Ｋｉｆ１９）の発現レベルを測定して、自己融解時間を決定し得る。例えば、より高いレベルのＫｉｆ１９の発現は、より長い自己融解時間を示し、より低いレベルのＫｉｆ１９の発現は、より短い自己融解時間を示す。発現レベルは、試料全体にわたる正規化発現と比べられ得る。いくつかの実施形態では、より高い発現レベルのＦｏｓＢ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット（ＦｏｓＢ）は、約５時間〜約２４時間の中間的自己融解時間を示す。
【０１０８】
また、性別特異的および細胞型特異的遺伝子発現を特定して、性別の遺伝子発現に対する効果を決定し得る。Ｘｉｓｔは、Ｘ染色体不活性化に関与し、雌のみに発現されるＸ染色体上の遺伝子である。次に、我々は、性別が特定の細胞型の遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを分析した。Ｘｉｓｔに対しアンチセンスとして作用する遺伝子であるＴｓｉｘは、雌のグリア中のみで発現することが観察された。これは、性別特異的および細胞型特異的遺伝子発現の１例である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、雄および雌試料から単離された核のプロファイルを比較して、性別特異的マーカーを決定し得る。例えば、無選別核全体の正規化発現に比較して、ＫＤＭ５Ｄ、ＲＰＳ４Ｙ１、ＺＦＹ、ＤＤＸ３Ｙ、ＴＴＴＹ１５、ＴＴＴＹ１４、ＵＳＰ９Ｙ、ＵＴＹ、ＧＹＧ２Ｐ１、ＮＬＧＮ４Ｙ、ＴＸＬＮＧＹ、ＬＩＮＣ００２７８、ＰＲＫＹ、および／またはＴＴＴＹ１０の発現の増加は、雄試料由来の核のマーカーとして使用し得る。さらに、ＺＦＸ、ＰＵＤＰ、ＫＤＭ５Ｃ、ＬＯＣ３８９９０６、ＰＩＮ４、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＯＬ４Ａ１、ＤＨＦＲ、ＬＯＣ１０１９２９５４１、ＴＳＩＸ、ＭＩＲ６７２３、および／またはＸＩＳＴの発現の低下は、雌試料由来の核のマーカーとして使用し得る。いくつかの実施形態では、発現結果をさらに分析して、細胞型および性別特異的マーカーが特定される。例えば、長鎖遺伝子間非タンパク質コードＲＮＡ２７８（ＬＩＮＣ００２７８）の増大した発現を用いて、雌試料由来のグリアから、雄試料由来のグリアを識別し得る。さらに、無選別核全体の正規化発現に比べて、配列類似性を有するファミリー８メンバーＡ４、偽遺伝子（Ｆａｍ８ａ４ｐ）、アリールスルファターゼＤ偽遺伝子１（Ａｒｓｄｐ１）、およびＧｙｇ２ｐ１の発現の増大は、雄試料に由来する星状細胞からの核のマーカーとして使用し得る。
【０１１０】
年齢が細胞型に一様に影響を与えるかどうかを判定するために、種々の年齢のヒト由来の試料中で差次的に発現した遺伝子を特定し得る。いくつかの実施形態では、核中の次の遺伝子：ＡＢＣＣ１０、ＡＣＡＰ３、ＡＣＨＥ、ＡＴＦ６Ｂ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ３、ＣＵＬ７、ＤＮＡＪＢ５、ＥＧＲ１、ＦＺＲ１、ＧＢＡＰ１、ＧＰＲ１０７、ＧＲＫ５、ＫＣＴＤ２１−ＡＳ１、ＫＬＨＬ２２、ＬＩＮＣ００４９９、ＬＩＮＧＯ２、ＬＯＣ１００１３２０７７、ＬＯＣ１００５０６９９０、ＬＯＣ１０１９２７５９２、ＭＩＲ９−３ＨＧ、ＭＰＮＤ、ＭＴＲＦ１、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＰＰＰ６Ｒ２、ＰＲＳＳ５５、ＰＴＭＳ、ＲＮＦ１７、ＳＮＡＩ３−ＡＳ１、ＳＰＨＫ２、ＳＴ３ＧＡＬ２、ＴＡＯＫ２、ＴＲＤＮ、ＷＡＳＨ７Ｐ、ＺＦＰＭ１、ＺＮＦ４０４、ＺＮＦ４９６、ＺＮＦ５８０、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ８４、およびＺＳＣＡＮ２９の発現の差異を用いて、試料を得た対象の年齢を決定し得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、プロファイルのさらなる分析により、年齢特異的および細胞型特異的マーカーが提供され得る。例えば、種々の年齢の試料全体の正規化発現に比べて、次の遺伝子：ＫＣＮＱ３、ＳＣＨＬＡＰ１、ＵＧＧＴ２、ＰＬＸＤＣ２、ＩＴＧＢ５、ＤＣＬＫ１、ＡＱＰ７、ＰＴＰＮ３、ＦＡＴ１、ＣＭＴＭ８、ＦＡＲＰ１、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＮＥＤＤ４、ＣＡＴＳＰＥＲＧ、ＬＯＣ１０１９２６、９４１、ＷＷＣ２、ＭＰＰ６、ＳＤＫ１、ＮＡＢ２、ＮＴＮＧ２、ＬＭＮＴＤ２、ＰＬＣＨ２、ＰＴＰＲＪ、ＭＲＡＰ２、ＰＴＭＳ、ＣＤＨ２３、ＳＹＴ７、ＳＰＲＥＤ３、ＰＬＸＮＡ１、ＧＲＫ５、ＺＹＸ、ＦＧＦ３、ＬＩＮＣ０１５４４、ＰＣＹＴ１Ｂ、ＲＨＢＧ、ＨＣＮ２、ＡＣＡＰ３、ＭＧＡＴ３、Ｃ１ｏｒｆ６１、ＳＵＲＦ２、ＡＨＲＲ、ＦＡＭ１３１Ａ、ＣＨＧＢ、ＰＬＸＮＡ４、ＡＣＨＥ、ＤＹＲＫ１Ｂ、ＣＤＫ５Ｒ２、ＧＤＰＤ５、ＺＮＦ７０３、ＦＨＤＣ１、ＬＯＣ１０１９２７、０７８、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＡＰ１Ｓ３、ＤＹＳＦ、ＭＡＭＳＴＲ、ＫＩＡＡ０８９５Ｌ、ＴＰ７３、ＰＤＥ３Ａ、ＬＩＮＣ００９６３、ＥＬＡＶＬ３、ＴＴＹＨ３、ＨＰＮ、ＰＴＰＲＥ、ＳＬＣ１７Ａ７、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＰＸＮ、ＴＭＥＭ１３０、ＬＲＰＡＰ１、ＧＲＭ４、ＳＴＥＡＰ３、ＣＨＲＤ、ＳＢＮＯ２、ＺＤＨＨＣ２３、ＧＡＣＡＴ２、ＭＡＰ６Ｄ１、ＦＡＭ５３Ａ、ＫＩＡＡ１５４９Ｌ、ＳＬＣ３８Ａ７、ＣＤＫ１６、ＣＡＬＹ、ＬＰＣＡＴ４、ＳＬＣ２５Ａ６、ＳＲＣＩＮ１、ＥＬＭＯ１、ＧＲＡＭＤ４、ＲＩＭＳ３、ＣＰＬＸ２、ＰＩＰ５Ｋ１Ｃ、ＳＤＣ３、ＣＢＬＮ３、ＰＤＺＤ７、ＶＷＡ５Ｂ２、ＺＮＦ２１９、ＦＡＭ２１２Ｂ、ＲＡＳＩＰ１、ＧＹＳ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＮＫＤ１、ＳＴ３ＧＡＬ２、ＰＴＫ７、ＡＣＯＴ７、ＡＴＸＮ７Ｌ２、ＤＡＯ、ＳＹＴ１２、ＡＤＡＭ１９、ＨＩＰ１、ＧＡＢＢＲ１、ＳＹＴ３、ＴＰ５３ＩＮＰ２、ＫＣＮＫ３、ＴＰＭ４、ＲＮＦ１５２、ＫＣＮＫ１０、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＡＢＣＣ１０、ＮＡＶ２、ＥＲＧＩＣ１、ＢＡＤ、ＫＩＦ３Ｂ、ＲＡＩ２、ＸＫＲ７、ＰＴＫ２Ｂ、ＣＨＳＴ１２、ＴＲＩＭ６７、ＤＨＤＤＳ、ＮＵＭＢＬ、ＫＣＮＤ３、ＬＲＲＣ１、ＲＡＢ３７、ＫＣＮＩＰ２、ＲＡＢ６Ｂ、ＰＣ、ＴＣＥＡＬ２、ＭＥＧ８、ＦＭＮＬ３、ＭＡＰＫ４、ＤＧＣＲ５、ＲＥＥＰ１、ＧＴＰＢＰ２、ＫＩＦ２６Ｂ、ＮＲＸＮ２、ＺＮＲＦ１、Ｃ１４ｏｒｆ１３２、ＦＬＮＢ、ＥＦＲ３Ｂ、ＲＢＦＯＸ３、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ、ＫＬＨＤＣ４、ＰＩＬＲＡ、ＣＬＳＴＮ３、ＣＡＢＩＮ１、ＮＨＳＬ２、ＬＹＲＭ１、ＫＣＮＡ２、ＳＬＣ３８Ａ１０、ＤＧＫＡ、ＴＭＥＭ２６６、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＡＴＰ２Ｂ２、ＴＭＥＭ１６３、ＵＮＣ５Ｂ、ＴＰＭ３、ＭＩＣＡＬ２、ＧＮＡＯ１、ＧＡＢＢＲ２、ＫＣＮＫ１、ＵＳＰ４、ＴＥＸ２、ＰＲＫＡＧ２、ＡＰＢＡ２、ＳＵＳＤ６、ＨＤＨＤ２、ＮＡＡ２０、ＣＲＩＰＴ、ＫＮＴＣ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＰＨＦ１０、ＰＣＧＦ５、ＤＰＹ１９Ｌ４、ＡＰＨ１Ｂ、ＺＮＦ５４６、ＡＢＣＡ１７Ｐ、ＣＤＨ２６、ＣＢＷＤ６、ＺＮＦ７３６、ＣＦＡＰ７０、ＵＢＥ４Ａ、ＴＴＣ３２、ＣＦＡＰ５３、ＰＸＤＮＬ、ＣＰＶＬ、ＧＬＩＰＲ１、ＣＯＬ２５Ａ１、ＭＴＨＦＤ２Ｌ、ＬＳＭ５、ＬＯＣ１００５０５、７１５、ＮＲ３Ｃ２、ＴＯＭ１Ｌ１、ＡＮＫＲＤ４２、ＳＬＣ８Ａ１、−ＡＳ１、ＡＴＡＤ２、ＧＡＢ１、ＣＣＤＣ１４６、ＥＬＭＯＤ１、ＣＦＡＰ７４、Ｃ１ｏｒｆ１４６、Ｐ４ＨＡ２、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＯＴＵＤ６Ｂ、−ＡＳ１、ＥＹＳ、ＡＬＳ２ＣＲ１１、ＬＥＣＴ１、ＢＨＬＨＥ４０、−ＡＳ１、ＳＴＡＢ２、ＰＸＹＬＰ１、ＬＯＣ１０１９２９、７１０、ＬＩＮＣ００４９９、ＲＨＯＢＴＢ３、ＣＲＹＢＧ３、ＮＰＹ６Ｒ、ＲＧＳ２０、Ｃ２ｏｒｆ７３、ＹＩＰＦ７、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＦＡＰ４３、ＬＯＣ１０２７２４、６２３、ＬＲＲＣ６９、ＳＴＫ３、ＣＬＩＣ５、ＣＡＣＮＡ２Ｄ３、Ｃ２ｏｒｆ２７Ａ、ＬＯＣ１０５３７８、３８５、ＢＥＳＴ３、ＥＰＨＡ６、ＬＯＣ１００５０６、３９３、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＴＳＣＲ１、ＥＬＯＶＬ２、ＳＰＡＴＡ９、ＰＬＳＣＲ４、ＧＣＫ、ＬＩＮＣ０１０３２、ＭＥＦ２Ｃ−ＡＳ１、ＢＭＳ１Ｐ２１、ＣＡＳＰ１２、ＣＬＭＰ、ＥＲＢＩＮ、ＴＭＣ３−ＡＳ１、ＣＸＸＣ４、ＤＣＢＬＤ１、ＧＳＴＯ２、ＰＬＯＤ２、Ｐ４ＨＡ２−ＡＳ１、ＴＴＣ２３Ｌ、ＣＰＬＸ３、ＳＯＸ１３、ＰＲＤＭ１、ＲＳＰＯ２、ＴＳＧ１、ＭＩＲ３１ＨＧ、ＣＴＢ−１２Ｏ２．１、ＰＬＣＨ１、ＪＡＭＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＬＯＣ１０１９２８、２０３、ＧＬＲＡ１、ＳＹＴ１６、ＳＹＮ３、ＡＲＨＧＡＰ３２、ＭＩＲ６４６ＨＧ、ＡＬＣＡＭ、ＳＣＧＮ、ＬＩＮＣ０１５１５、およびＬＯＣ１０１９２９４１５の差次的発現を、顆粒細胞を特定するマーカーとして使用し得る。
【０１１２】
例えば、種々の年齢の試料全体の正規化発現に比べて、次の遺伝子：ＡＣＥＲ３、ＡＣＳＳ３、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＤＤ２、ＡＤＧＲＬ３、ＡＫＡＰ１３、ＡＬＯＸ５、ＡＬＳ２ＣＲ１１、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＳＩＣ１、ＡＳＩＣ２、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＢＭＰ３、ＢＴＢＤ１１、Ｃ１１ｏｒｆ８７、Ｃ１４ｏｒｆ１、Ｃ４ｏｒｆ２２、Ｃ９ｏｒｆ１３５、ＣＡ７、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ３、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＤＭ３、ＣＡＤＰＳ、ＣＡＬＲ、ＣＤＫ１５、ＣＦＡＰ４６、ＣＬＳＴＮ３、ＣＮＴＮ３、ＣＰＮＥ８、ＣＹＹＲ１、ＤＢＨ、ＤＣＣ、ＤＤＯ、ＤＧＫＨ、ＤＩＳＰ３、ＤＬＧ１、ＤＬＧ４、ＤＭＧＤＨ、ＤＮＡＨ６、ＤＮＥＲ、Ｅ２Ｆ３、ＥＣＨＤＣ２、ＥＬＯＶＬ２、ＥＮＰＰ１、ＥＰＨＢ１、ＥＲＣ２、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＢＸＬ２１、ＦＧＦ５、ＦＨＯＤ３、ＦＫＢＰ５、ＦＲＭＰＤ４、ＧＡＢＢＲ２、ＧＡＬＮＴ１８、ＧＡＰ４３、ＧＢＡＰ１、ＧＤＦ１１、ＧＰＲ１６１、ＧＰＲ６３、ＧＲＥＢ１、ＨＣＮ４、ＨＥＣＴＤ２−ＡＳ１、ＩＱＳＥＣ３、ＫＣＮＡ４、ＫＩＦ２６Ｂ、ＫＲＴ２２２、ＬＡＣＴＢ２−ＡＳ１、ＬＨＦＰＬ３、ＬＩＮＣ００４５７、ＬＩＮＣ００４９９、ＬＩＮＣ０１１５８、ＬＯＣ１０５３７７４４８、ＬＯＣ２８５６９２、ＬＯＣ６５３６０２、ＬＰＣＡＴ４、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣＨ１１、ＭＡＳＰ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＴＨＦＳＤ、ＭＹＲＩＰ、ＮＨＳ、ＮＯＳ１、ＮＰＬ、ＮＰＹ６Ｒ、ＮＴＮＧ１、ＮＸＮＬ２、ＰＡＱＲ６、ＰＡＲＭ１、ＰＣＰ４、ＰＥＢＰ４、ＰＨＡＣＴＲ２−ＡＳ１、ＰＨＫＡ１、ＰＬＰＰＲ４、ＰＬＸＮＡ４、ＰＲＫＣＧ、ＲＧＭＢ、ＲＮＦ２１２、ＲＮＦ２１５、ＲＯＲＡ、ＲＰＨ３Ａ、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＳＣＮ２Ｂ、ＳＥＰＳＥＣＳ、ＳＥＰＳＥＣＳ−ＡＳ１、ＳＨＡＮＫ１、ＳＨＡＮＫ２、ＳＬＣ１２Ａ５、ＳＬＣ１７Ａ４、ＳＬＣ２５Ａ２９、ＳＬＣ２６Ａ８、ＳＬＣ３５Ｆ４、ＳＬＣ８Ａ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＳＰＨＫ２、ＳＰＯＮ２、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＫ３３、ＳＶ２Ｃ、ＳＹＴ１７、ＴＥＸ９、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＨＳＤ７Ｂ、ＴＭＥＭ１７８Ｂ、ＴＲＡＦ５、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＣ２３Ｌ、ＴＵＮＡＲ、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＮＣ５Ｄ、ＺＮＦ１２４、およびＺＹＧ１１Ａの差次的発現を、バスケット細胞を特定するマーカーとして使用し得る。
【０１１３】
例えば、種々の年齢の試料全体の正規化発現に比べて、次の遺伝子：ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＮＫＲＤ３３Ｂ、ＡＯＸ１、Ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＧ４、ＣＡＣＮＧ８、ＣＡＰＮ９、ＣＲＴＡＣ１、ＤＡＣＨ１、ＥＦＨＤ２、ＥＧＦ、ＥＴＳ１、ＦＲＡＳ１、ＩＭＰＡ２、ＬＩＮＣ００４９９、ＬＩＮＣ００８４４、ＬＩＮＣ０１２０８、ＬＯＣ１０１９２７０７８、ＬＯＣ１０２７２４３６０、ＰＫＤＣＣ、ＰＬＸＮＡ４、ＰＲＲ５、ＲＨＣＧ、ＲＯＢＯ２、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＨＲＯＯＭ２、ＳＬＩＴ２、ＴＲＤＮ、ＴＸＮＩＰ、ＶＷＡ５Ａ、およびＷＮＴ７Ｂの差次的発現を、グリアを特定するマーカーとして使用し得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、核中の遺伝子発現
【０１１５】
Ｄ．マーカーおよび標的の選択
いくつかの実施形態では、異なる種中の遺伝子オルソログ間で選別核に関連する変化した発現の分析が行われる。例えば、１：１オルソログの発現を比較して、結果が、種中の遺伝子アノテーションの差異ではなく、変化した発現に起因することが保証される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、さらなる分析を実施して、変化した発現が種中のアノテーションの差異に起因しないことを保証し得る。例えば、１：１オルソログを有する遺伝子のみを使用して、発現レベルを決定し得る。分析は、マウス、ラット、およびヒトなどの種中で、１ｋｂ長さより大きい遺伝子、および／または長さの２倍未満の差異を有する遺伝子にさらに限定され得る。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子または種特異的遺伝子は、次記：１８１００４１Ｌ１５Ｒｉｋ、２８１０４５９Ｍ１１Ｒｉｋ、３１１００３５Ｅ１４Ｒｉｋ、Ａ２ｍ、Ａｄａｍｔｓ１５、Ａｄｒａ１ａ、ＡＩ５９３４４２、Ａｌｄｈ１ａ１、Ａｎｌｎ、Ａｐｃｄｄ１、Ａｐｏｄ、Ａｑｐ４、Ａｒｈｇｅｆ３３、Ａｓｃｌ１、Ａｓｇｒ１、Ａｓｐａ、Ａｔｐ１ａ２、Ａｔｐ２ａ３、Ｂ３ｇｎｔ５、Ｂ３ｇｎｔ７、Ｂｃｌ１１ａ、Ｂｈｌｈｅ２２、Ｃ１ｑｌ１、Ｃ１ｑｌ２、Ｃａｃｎａ１ｇ、Ｃａｃｎｇ４、Ｃａｌｂ１、Ｃａｍｋ１ｇ、Ｃａｒ８、Ｃａｒｎｓ１、Ｃａｓｑ２、Ｃｂｌｎ２、Ｃｃｄｃ１５２、Ｃｃｄｃ１８０、Ｃｃｎｄ２、Ｃｄ８２、Ｃｄ９、Ｃｄｈ１９、Ｃｄｈｒ１、Ｃｌｄｎ１１、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｌｍｎ、Ｃｍｔｍ５、Ｃｎｔｎ３、Ｃｎｔｎａｐ５ａ、Ｃｏｂｌ、Ｃｏｌ５ａ３、Ｃｏｌ６ａ１、Ｃｐｍ、Ｃｒｙａｂ、Ｃｓｐｇ４、Ｃｓｒｐ１、Ｄ７Ｅｒｔｄ４４３ｅ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｄｏｃｋ５、Ｄｐｙ１９ｌ２、Ｅｂｆ２、Ｅｃｈｄｃ２、Ｅｆｎａ５、Ｅｎｐｐ２、Ｅｒｂｂ３、Ｅｒｍｎ、Ｅｔｎｐｐｌ、Ｆａ２ｈ、Ｆａｍ４６ａ、Ｆｇｆｒ２、Ｆｌｒｔ２、Ｆｍｏ３、Ｆｏｌｈ１、Ｆｏｘｈ１、Ｆｓｉｐ２、Ｆｘｙｄ１、Ｆｘｙｄ７、Ｇａｄ２、Ｇａｌ３ｓｔ１、Ｇａｌｎｔ５、Ｇａｌｎｔ６、Ｇａｌｒ１、Ｇｄｆ１０、Ｇｆａｐ、Ｇｊａ１、Ｇｊｂ１、Ｇｊｃ２、Ｇｌｄｎ、Ｇｌｉ１、Ｇｌｐ２ｒ、Ｇｌｕｌ、Ｇｍ１３６、Ｇｎｂ３、Ｇｎｇ１１、Ｇｐｒ３７、Ｇｐｒ３７ｌ１、Ｇｐｒ６３、Ｇｐｘ２、Ｇｒａｍｄ３、Ｇｒｂ１４、Ｇｒｉａ３、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｍ１、Ｇｒｍ５、Ｇｓｎ、Ｈａｐｌｎ２、Ｈｅｐａｃａｍ、Ｈｈａｔｌ、Ｈｓｐａ１ｂ、Ｈｔｒ１ｂ、Ｉｄ４、Ｉｇｓｆ１１、Ｉｌ２２、Ｉｌ３３、Ｉｎｓｃ、Ｉｔｇｂ８、Ｉｔｉｈ３、Ｉｔｐｒ１、Ｋｃｎｃ２、Ｋｃｎｊ１０、Ｋｉｆ１９ａ、Ｋｉｔ、Ｋｉｔｌ、Ｋｌｋ６、Ｌｅｎｇ９、Ｌｆｎｇ、Ｌｇｉ４、Ｌｉｍｓ２、Ｍａｇ、Ｍａｋ、Ｍａｌ、Ｍａｒｃｈ１１、Ｍａｒｃｋｓｌ１、Ｍｃａｍ、Ｍｆｆ、Ｍｆｇｅ８、Ｍｌｃ１、Ｍｏｇ、ｍｔ−Ｃｏ１、ｍｔ−Ｎｄ４、Ｍｙｂｐｃ１、Ｍｙｏｔ、Ｍｙｒｆ、Ｎｄｒｇ１、Ｎｅｌｌ１、Ｎｅｔｏ１、Ｎｅｕ４、Ｎｉｎｊ２、Ｎｋｘ２−２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｒｋ、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、Ｏｐａｌｉｎ、Ｐａｘ３、Ｐｃｐ２、Ｐｄｃ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｐｄｚｄ３、Ｐｅｎｋ、Ｐｅｘ５ｌ、Ｐｇｇｈｇ、Ｐｈｙｈｉｐ、Ｐｋｐ３、Ｐｌａ２ｇ１６、Ｐｌｃｈ１、Ｐｌｅｋｈｄ１、Ｐｌｅｋｈｇ３、Ｐｌｌｐ、Ｐｌｐ１、Ｐｌｐｐ３、Ｐｌｐｐ４、Ｐｌｓｃｒ１、Ｐｌｘｎｂ３、Ｐｍｐ２、Ｐｍｐ２２、Ｐｐｆｉｂｐ１、Ｐｐｐ１ｒ１４ａ、Ｐｐｐ１ｒ１７、Ｐｒｅｘ１、Ｐｒｅｘ２、Ｐｒｉｍａ１、Ｐｒｋｃｇ、Ｐｒｒ５、Ｐｒｒｇ３、Ｐｒｒｘ１、Ｐｔｃｈｄ４、Ｐｔｐｒｋ、Ｐｔｐｒｚ１、Ｐｔｔｇ１、Ｐｖａｌｂ、Ｐｘｄｃ１、Ｑｋ、Ｒａｐｇｅｆ３、Ｒａｓｓｆ２、Ｒｂｐ２、Ｒｂｐｊｌ、Ｒｇｃｃ、Ｒｇｍａ、Ｒｙｒ１、Ｓ１００ｂ、Ｓ１ｐｒ１、Ｓａｌｌ１、Ｓｅｃ１４ｌ５、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｈｉｓａ６、Ｓｋｏｒ２、Ｓｌｃ１ａ３、Ｓｌｃ１ａ６、Ｓｌｃ２６ａ３、Ｓｌｃ３２ａ１、Ｓｌｃ４ａ４、Ｓｌｃ５ａ１１、Ｓｌｃ９ａ３、Ｓｌｉｔｒｋ６、Ｓｏｃｓ２、Ｓｏｒｃｓ３、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ８、Ｓｔａｇ３、Ｓｔｋ３２ａ、Ｓｕｌｆ２、Ｓｕｓｄ５、Ｔｃｅａｌ７、Ｔｆａｐ２ｂ、Ｔｈｂｓ２、Ｔｍｅｍ１２５、Ｔｍｅｍ１３２ｄ、Ｔｍｅｍ６３ａ、Ｔｍｅｍ９８、Ｔｎｃ、Ｔｎｆｒｓｆ１３ｃ、Ｔｎｓ３、Ｔｒａｂｄ２ｂ、Ｔｒｉｌ、Ｔｒｐｃ３、Ｔｒｐｃ７、Ｔｓｈｂ、Ｔｓｐａｎ１１、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｕｂａ８、Ｔｕｂｂ２ｂ、Ｔｘｎｉｐ、Ｕｂｅ２ｂ、Ｕｇｔ８ａ、Ｕｐｐ１、Ｖｓｔｍ２ｂ、Ｗｆｄｃ１、Ｘｒｒａ１、Ｚｃｃｈｃ２４、Ｚｅｂ２、およびＺｆｐ３６ｌ１を含むマウス、ラット、およびヒト核全体中の２５０個の最も変化する遺伝子から選択され得る。
【０１１７】
Ｖ．特定された標的の調節
いくつかの実施形態では、表２〜４の１つから選択される少なくとも１つの遺伝子が、少なくとも１つの疾患、障害、または状態と関連付けられる。疾患、障害または状態と関連付けられた遺伝子またはその発現は、疾患標的とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、疾患、障害、状態を治療する方法は、疾患標的の発現を調節するための治療法の使用を含む。いくつかの実施形態では、治療法は、表２〜４から選択される少なくとも１つの転写物を標的とする。いくつかの実施形態では、治療法は、表２〜４から選択される少なくとも１つのタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、治療法は、小分子薬物またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子（ｓｉＲＮＡなど）、遺伝子療法剤、または細胞療法剤などの医薬組成物である。
【０１１８】
ＶＩ．定義
以下は、用語定義の非限定的リストである。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、目的の１個または複数の値に適用される「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、示した基準値に類似の値を意味する。特定の実施形態では、用語の「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、別に定める場合を除き、または文脈から別義が明らかでない限り（このような数字が可能な値の１００％を超えると思われる場合を除き）、示した基準値のいずれかの方向（超または未満）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、またはこれ未満の内に入る値の範囲を意味する。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的に特異的結合できる免疫グロブリン分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質などを意味する。用語の「抗体」は、無処理の（例えば、完全長）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみでなく、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ディアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合により改変された抗体を含む必要とされる特異性の抗原認識部位を含む任意の他の改変された立体配置の免疫グロブリン分子も包含する。抗体は、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）を含み、また、抗体はいずれか特定のクラスのものである必要はない。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「細胞特異的プロファイリング」という用語は、核トランスクリプトームを使用して、細胞の独自性を正確に定義することを意味する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「染色体関連転写物（ＣＡＴ）」という用語は、合成の間に染色体で保持される転写物を意味する。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「患部組織」または「罹患試料」という用語は、疾患状態を経験している対象から採取した試料を意味する。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡプローブ」または「ＲＮＡプローブ」という用語は、プローブの配列に相補的なヌクレオチド配列にハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント（通常１００〜１０００塩基長）を意味する。プローブは、可視化のための、放射、蛍光、または化学（例えば、ビオチン）標識であってよい。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「薬物標的」または「治療のための標的」という用語は、薬物または治療法により作用を受けて細胞型中の遺伝子発現を調節し得るヌクレオチド配列を意味する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「因子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブにハイブリッド形成されて、または抗体により特異的に結合されて、特定の細胞型の核の正確な選別を可能とするヌクレオチド配列を意味する。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」または「発現」という用語は、１つまたは複数の次の事象のレベルを意味する：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写により）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセッシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端処理）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；（４）ポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み；および（５）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「細胞プロファイリング技術」という用語は、死後組織中の細胞型の集団の分子プロファイリングのための非遺伝的方法を意味する。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「ポリＡ転写物」という用語は、分子の安定性を高めるために、ＲＮＡプロセッシング中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加されるアデニンヌクレオチド鎖を意味する。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、別の実体に付着、組み込み、または結合される１個または複数のマーカー、シグナル、または部分を意味し、このマーカー、シグナルまたは部分は、Ｘ線、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度、などを含む当該技術分野において既知の方法により容易に検出される。検出可能な親和標識には、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、酵素、染料、金属イオン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテンなどのリガンド、量子ドット、などが挙げられる。検出可能な親和標識は、標識が付着、組み込みまたは結合する実体中の任意の位置に配置されてよい。例えば、ペプチドまたはタンパク質と付着、組み込みまたは結合する場合、それらは、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質内にあってもよく、またはＮまたはＣ末端に位置してもよい。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「最も特異的遺伝子」という用語は、他の分析された遺伝子の特異性指数（ＳＩ）値に比べて、より低いＳＩ値を有する遺伝子を意味する。このＳＩ値は、実施例１に記載のアルゴリズムを用いて計算される。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「組織試料」という用語は、発生源から採取した一定分量または部分を意味し、分析または処理のために提供される。いくつかの実施形態では、試料は、組織、細胞、または構成部分（例えば、限定されないが血液、粘液、リンパ液、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液、および精液を含む体液）などの生物源由来である。いくつかの実施形態では、試料は、全生物またはその組織のサブセット、細胞もしくは構成部分、またはその画分もしくは部分から調製された、ホモジネート、溶解物、または抽出物であっても、これらを含んでもよく、これらには、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、および尿生殖路の外部部分、引裂、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、栄養素ブロスまたはゲルなどの培地であるかまたはこれを含み、これは、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、１回または複数回の処理（例えば、分離、精製などの）ステップに供されて、分析または他の用途のための試料が調製される。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入動物」という用語は、そのゲノム中に挿入された外部遺伝子を有する動物を意味する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「翻訳リボソーム親和性精製（ＴＲＡＰ）」という用語は、遺伝子導入動物由来の単一組織中の多様な細胞型の分子サインを特定する方法を意味する。
【０１３５】
本明細書で記載されるのは、死後組織中の細胞型の集団の分子プロファイリング方法である。本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の説明で記載する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の材料および方法を本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい材料および方法が以下で記載される。他の本発明の特徴、目的、利点はその記述から明らかであろう。その記述では、文脈から明確に別義が示されない限り、単数形は複数形も含む。特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。何らかの不一致がある場合は、本明細書の記述が優先される。
【０１３６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【０１３７】
実施例
実施例１．実験手順
次の実験手順を用いて、本明細書の実施例２〜２３に記載の実験を実施した。
Ａ．緩衝液の調製
緩衝液は、Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２９）：９２９−９３０（２００９）に記載されているようにして調製した。ＲＮＡを単離するためのプロトコルに関与する緩衝液中に含まれる場合は、ＲＮアーゼ不含離水を使用し、それ以外は、ミリＱ水を使用した。
【０１３８】
本明細書の実施例で使用した緩衝液Ａは、６０％イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｄ１５５６−２５０ＭＬ）である。緩衝液Ａは、使用するまでフォイルで覆って保存した。本明細書の実施例で使用した緩衝液Ｂは、９００ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２、１２０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）を含む。緩衝液ＡおよびＢは、室温（ＲＴ）で保存した。
【０１３９】
本明細書の実施例で使用した緩衝液Ｃには、５０％イオジキサノール（５体積の緩衝液Ａおよび１体積の緩衝液Ｂ）、０．５ｍＭのスペルミジン、０．１５ｍＭのスペルミン、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｒｏｃｈｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯにより配布；カタログ番号１１８３６１７０００１）、１ｍＭのＤＴＴ、および２００単位／ｍＬのＳｕｐｅｒａｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号ＡＭ２６９６）を含めた。本明細書の実施例で使用した緩衝液Ｄには、０．２５Ｍスクロース、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭのスペルミジン、０．１５ｍＭのスペルミン、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤反応混液、５０μＬの１ｍＭのＤＴＴ、２００単位／ｍＬのＳｕｐｅｒａｓｉｎ、および４００単位／ｍＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；カタログ番号Ｎ２５１５）を含めた。
【０１４０】
本明細書の実施例で使用した緩衝液Ｅには、２７％イオジキサノール（１体積の緩衝液Ｄに対し、１．１７４体積の緩衝液Ｃ）を含めた。本明細書の実施例の分析のために使用される洗浄／ブロッキング緩衝液には、０．０５％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡを含めた；ＢＳＡはＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，コード番号００１−０００−１６２から入手した。本明細書の実施例で使用したＲＮＡ用の洗浄緩衝液には、０．０５％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中の５０ｎｇ／ｍＬのＲＮアーゼ不含ＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および１００単位／ｍＬのＳｕｐｅｒａｓｉｎを含めた。本明細書の実施例で使用したＲＮＡ用のブロッキング緩衝液には、追加の５０ｎｇ／ｍＬのＢＳＡで補充したＲＮＡ用洗浄緩衝液を含めた。本明細書の実施例で使用したクッション緩衝液には、５００μＬの緩衝液Ｄ、２５０μＬの５０％グリセロール、および５μＬの１０％ＮＰ−４０を含めた。
【０１４１】
Ｂ．核単離
核単離は、以前の刊行物（Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，９２９−９３０およびＭｅｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５１，１４１７−１４３０、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロトコルから適合させた。マウス実験の場合は、以前に記載のように、皮質および小脳を切開した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ動物由来の全ての組織を、液体窒素を使って急速冷凍した。ｂａｃＴＲＡＰ方法での使用のために開発したマウス由来の組織を新しく切開し、ホモジナイゼーションに直接使用した。ラットおよびヒト組織を凍結して入手した。全ての凍結組織を使用前に、氷上で最低３０分間解凍した。核を単離するために、新しいまたは解凍した組織を５ｍＬのホモジナイゼーション培地（０．２５Ｍスクロース、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  トリシンｐＨ７．８、０．１５ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤反応混液、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０Ｕ／ｍＬ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ  ＲＮアーゼ阻害剤、４０Ｕ／ｍＬ  ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤）に移した。３０ストロークの緩い（Ａ）ガラスダンス型ホモジナイザーとそれに続く３０ストロークのぴったりした（Ｂ）ガラスダンス型ホモジナイザーにより、組織をホモジナイズした。ホモジネートを、４．６ｍＬの５０％イオジキサノール溶液（５０％イオジキサノール／オプティプレップ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  トリシンｐＨ７．８、０．１５ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤反応混液、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０Ｕ／ｍＬ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ  ＲＮアーゼ阻害剤、４０Ｕ／ｍＬ  ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤）で補充し、２７％イオジキサノールクッション上に置いた。Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−７０超遠心分離機のスインギングバケットローター（ＳＷ４１）中、１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離により核をペレット化した。マウス、ラット、およびヒト細胞質画分に対しては、１７５μＬの最上層を１７５μＬのＱＩＡＧＥＮ（登録商標）緩衝液ＲＬＴに加え、−８０℃で保存した。核ペレットをホモジナイゼーション緩衝液中に再懸濁した。
【０１４２】
Ｃ．抗体
一次および二次抗体をブロッキング緩衝液で希釈した。二次抗体はＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、１：５００の希釈で使用した。一次抗体および希釈因子を表５に示す。この表で、ＮｅｕＮはニューロン核抗原を意味し、Ｉｔｐｒはイノシトール  １，４，５−三リン酸受容体１型を意味し、Ｓｏｒｃｓ３はソーティリン関連ＶＰＳ１０ドメイン含有受容体３を意味し、ＥＥＡＴ１は興奮性アミノ酸トランスポーター１を意味し、Ｏｌｉｇ２はオリゴデンドロサイト転写因子２を意味する。
【表６】
2020508652.tif 000392
2020508652.tif 000393
【０１４３】
全ての細胞型を単離するために使用した抗体の細胞型特異性を表６に示す。表示がなければ、ＮｅｕＮはウサギ抗体を意味する。
【表７】
2020508652.tif 000394
【０１４４】
Ｄ．核固定および染色
単離後、ホルムアルデヒド（メタノール不含ホルムアルデヒド；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ；カタログ番号１５７１０）を１％の最終濃度まで添加することにより核を固定し、緩やかな回転を加えながら室温で８分間インキュベートした。グリシンを１２５ｍＭの最終濃度まで加えることによりホルムアルデヒドをクエンチした。試料を緩やかに回転しながら室温で５分間インキュベートした。試料を４℃、１０００ｇで４分間遠心分離し、核をペレット化した。上清を注ぎ出し、ペレットを緩衝液Ｄに再懸濁した。試料を４℃、１０００ｇで４分間かけて、再度遠心分離した。上清を注ぎ出し、ペレットを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％トリトンＸ−１００、５０ｎｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０Ｕ／μＬのＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ  ＲＮアーゼ阻害剤）に再懸濁した。その後、核を新しいチューブに移した後、４℃、１０００ｇで４分間遠心分離した。上清を注ぎ出し、核をブロッキング緩衝液に再懸濁し、緩やかな回転を加えながら室温（ＲＴ）で３０分間ブロッキングさせた。抗体をブロッキング緩衝液中の核に加え、ＲＴで１時間、緩やかな回転を加えながらインキュベートした。あるいは、このインキュベーションステップを４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）実施した。
【０１４５】
少量の一定分量の核をこの段階で採取し、フローサイトメトリー用の未染色対照として使用した。核を１０００ｇ、４℃で３分間ペレット化し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％トリトンＸ−１００、５０ｎｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０Ｕ／μＬのＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ  ＲＮアーゼ阻害剤）で洗浄した。これをさらに２回繰り返した。最後の洗浄後、ブロッキング緩衝液中で１：５００希釈の適切な二次抗体を加えた。核をフォイルで覆って、緩やかな回転を加えながらＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、核を１０００ｇ、４℃で３分間ペレット化し、洗浄緩衝液で洗浄した。これをさらに２回繰り返した。その後、ペレットを分析または選別用として、適切な量のブロッキング緩衝液に再懸濁した。直ぐに分析する計画がない場合、核を氷上で保存した。
【０１４６】
Ｅ．フローサイトメトリー分析／選別
ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｒｕｂｙ（ｄｃＲｕｂｙ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号Ｖ１０２７３）を、マウス小脳試料当たり１〜２μＬ、および２００ｍｇのヒト組織試料に対し５〜７μＬ加えた。この量は、試料中の核数、緩衝液の体積、および核がマウス由来か、ヒト由来かに基づいた。ｄｃＲｕｂｙの濃度の変化は、フローサイトメーターの電圧に応じて許容された。
【０１４７】
フローサイトメトリーの前に、核をＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｒｕｂｙを２０μＭの最終濃度まで用いて共染色した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）フローサイトメーターを用い、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、および６４０ｎｍレーザーにより核を分析した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーターを使い、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、および６３５／６４０ｎｍレーザーにより核を選別した。全ての試料をＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｒｕｂｙを用いて第１ゲーティングによりシングレットを特定した。ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（ＢＤ）またはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を実施した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）緩衝液ＲＬＴ（非固定試料）またはＱＩＡＧＥＮ（登録商標）緩衝液ＰＫＤ（固定試料）を選別核に加え、試料を−８０℃で保存した。
【０１４８】
選別後、核をＲＮＡ単離用として保存した。保存のために、選別核にプロテイナーゼＫ消化緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＦＦＰＥ  ＲＮＡキット、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、カタログ番号８０２３４）を加え、得られた混合物を−８０℃で保存した。
【０１４９】
前方散乱光（ＦＳＣ）の測定値を、側方散乱光（ＳＳＣ）の測定値に対しプロットし、全散乱に対しゲーティングを実施した。ｄｃＲｕｂｙ強度を直線的にプロットし、電圧をシングレットに対し調節した。シングレットをゲーティングした。試料を用いた色を基準にプロットし、集団を予測染色パターンに基づいてゲーティングした。ゲーティング集団のパーセンテージを、目的の細胞型の予測パーセンテージと比較した。
【０１５０】
Ｆ．ＲＮＡおよびＤＮＡ単離および精製
ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＦＦＰＥキットを使用して、同じ試料からＤＮＡおよびＲＮＡ両方を単離した。次の変更：８０℃加熱ステップの前にＲＮＡを６５℃で３０分間インキュベートし、その後７０℃でさらに３０分間インキュベートしたこと、を除いて、キットプロトコルに従って単離を実施した。
【０１５１】
細胞質の画分または新しい核由来のＲＮＡを、オンカラムＤＮアーゼ消化を加えた、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏキットを用いて精製した。固定した核由来のＲＮＡを、プロトコルＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＦＦＰＥキットを用い、このキットに対し、プロテイナーゼＫ消化後、ＲＮＡを最大速度で１５分間遠心分離するという変更を行って、精製した。上清を除去し、６５℃で３０分間、７０℃で３０分間、および８０℃で１５分間、インキュベートした。溶液中ＤＮＡアーゼ消化の代わりに、オンカラムＤＮアーゼ消化を実施した。ＲＮＡ量をＱＵＢＩＴ（登録商標）ＲＮＡ  ＨＳアッセイキットを用いて測定し、ＲＮＡ品質を、ＲＮＡ６０００ピコチップを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。
【０１５２】
精製ＤＮＡおよびＲＮＡをＱＵＢＩＴ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号Ｑ３２８５４およびＱ３２８５５）を用いて定量化した。また、精製されたＲＮＡ試料をＡＧＩＬＥＮＴ（登録商標）Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ；カタログ番号５０６７−１５１３）に供し、定量化およびサイズ決定を実施した。ＤＮＡを−２０℃で保存し、配列決定またはエピジェネティック分析用として使用した。ＲＮＡを−８０℃で保存し、ｃＤＮＡ合成用に使用した。
【０１５３】
Ｇ．Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｓｅｑ  Ｖ２キットを用いたｃＤＮＡ作成およびライブラリー生成
Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｓｅｑ  Ｖ２キットを用いて、キットプロトコルに従って、精製核ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。最終ｃＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（カタログ番号２８２０６）を用いて、Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｓｅｑ  Ｖ２キットプロトコルに従って精製した。ｃＤＮＡ品質を、ＡＧＩＬＥＮＴ（登録商標）ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎおよびＤ１０００  ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ；カタログ番号５０６７−５５８２，ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅカタログ番号５０６７−５５８３）を用いて評価した。ｑＰＣＲ用に、１：４０希釈のｃＤＮＡを調製し、予測マーカーの濃縮または欠乏を調べた。ｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）を用いて定量化した。
【０１５４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＬＴ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓを含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、ライブラリーを調製した。ライブラリーの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステムおよびＤ１０００  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅを用いて評価した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００装置を用いて、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒでライブラリーの配列を決定し、５０ｂｐのシングルエンドリードを取得、またはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００を用いて、７５ｂｐのペアエンドリードを取得した。全てのデータセットは、ＧＥＯ（受入番号未確定）に預託した。
【０１５５】
Ｈ．酸化的亜硫酸水素塩（ｏｘＢＳ）変換反応
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ＴｒｕｅＭｅｔｈｙｌ（登録商標）Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｋｉｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）用のユーザーガイドに記載のようにして、選別核から単離される。
【０１５６】
Ｉ．免疫蛍光法
マウスを深く麻酔し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、続けて、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で経心的に潅流した。脳を切開して、４℃で一晩後固定し、ＰＢＳ中の３０％スクロース中で生体組織の凍害を防ぎ、ＯＣＴ  ＴｉｓｓｕｅＴｅｃｋで包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０  Ｓクライオスタットで２０μｍ切片に切り出して、これを直接スライドに取り付けた。スライドを−２０℃で保存した。スライドをクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％ツイーン２０、ｐＨ６．０）中に９５〜１００℃で浸漬し、マイクロ波中で１０分間沸騰させることにより、抗原検索を実施した。スライドを室温に冷却した後、ＰＢＳで洗浄した。ＩＦブロッキング緩衝液（０．１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）中で３０分間ブロッキングし、一次抗体と一晩インキュベート後、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体と１時間インキュベートして、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ溶液（ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬ）で１５分間染色し、ＰＢＳで２分間洗浄して、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄマウンティングメディアを用いてカバーガラスで覆うことにより、免疫蛍光法を実施した。いくつかの試料に対しては、チラミドシグナル増幅を次のように実施した：スライドを、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体と共にインキュベートして、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＳＡシアニン３検出キット由来の増幅緩衝液中のＣｙ３と共に１０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄後、上述のようにＤＡＰＩ染色した。全ステップを室温で実施した。マウスおよびヒトスライドに対し、同じ画像取得設定を用いて、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡でスライドを撮像した。輝度およびコントラスト調節は、ＩｍａｇｅＪで、取得後に、マウスおよびヒト画像に対し同じ調節を適用して実施した。核染色用の上記抗体に加えて、表７に示す下記一次抗体を免疫染色法に使用した。
【０１５７】
表７では、ＧＦＡＰはグリア線維酸性タンパク質を意味し、Ｍｏｇはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を意味し、Ｍａｇはミエリン関連糖タンパク質を意味し、Ｐｄｅ１ａはホスホジエステラーゼ１Ａを意味し、Ｐｄｅ１ｃはホスホジエステラーゼ１Ｃを意味する。
【表８】
2020508652.tif 000395
【０１５８】
本明細書で記載の抗体は、種々の方法を用いて、生成、試験、および／または特徴付けし得る。このような方法を用いて、限定されないが、抗体親和性；特異性；および活性（例えば、細胞内シグナル伝達経路またはその他の細胞または生物活性の活性化もしくは阻害）を含み得る、種々の特性を決定し得る。
【０１５９】
動物により、細胞株により、化学的合成により、または組換え発現により、本開示の抗体分子が産生されてしまえば、その抗体分子は免疫グロブリンまたはポリペプチド分子の精製のための当該技術分野において既知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性、特に特異的抗原、プロテインＡに対する親和性クロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）により、またはタンパク質の精製のためのいずれか他の標準的技術により、精製（すなわち、単離）することができる。さらに、本開示の抗体またはそのフラグメントを、本明細書で記載の異種ポリペプチド配列に融合して、または当該技術分野において既知の別の方法で、精製を促進することができる。
【０１６０】
抗体と標的またはリガンド（例えば、所定の抗体を生成するために使用される抗原）との間の親和性は、１種または複数の当該技術分野において既知の結合アッセイを用いて、ＫＤに換算して測定し得る。所定の抗体に対する目的の標的に応じて、可変ＫＤ値が望ましい場合がある。高親和性抗体は通常、約１０−５Ｍ以下、例えば、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、または約１０−１２Ｍ以下のＫＤでリガンド結合を形成する。
【０１６１】
Ｊ．ＤＮＡおよびＲＮＡプローブ
代わりに、または抗体と併用して使われる、ＲＮＡおよびＤＮＡプローブを、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，７６９−７７２，２００１に従って、ゲノム中の関心領域のアンチセンスフラグメントを生成するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、設計し、作製し得る。
【０１６２】
Ｋ．リアルタイムＰＣＲおよびプライマーリスト
別々のＲＮＡ試料を、マウスおよびヒト小脳由来の細胞質画分から精製し、精製ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、上述のＮｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２を用いて増幅した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブおよびＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックスを用いて、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ＩＩシステム（Ｒｏｃｈｅ）により定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。マウスおよびヒトの両方に対し、２回の生物学的反復実験を使用し、各生物学的反復実験に対し、３回の技術的反復を実施した。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ソフトウェア中の二次導関数最大法を用いてＣｑ値を計算した。３種のハウスキーピング遺伝子：アクチンベータ（Ａｃｔｂ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＡ（Ｐｏｌｒ２ａ）の幾何平均を用いて、デルタＣｑ法で正規化を実施した。等分散を仮定した両側ｔ検定を用いた統計分析を実施する前に、技術的反復が平均された（相加平均）。プライマーを表８にリストする。表８では、および本明細書で使用される場合、言及される遺伝子は、Ａｃｔｂ、ＧＡＰＤＨ、Ｐｏｌｒ２ａ、フォンウィルブランド因子Ｃドメイン含有２（Ｖｗｃ２）、コイルドコイルドメイン含有１７５（Ｃｃｄｃ１７５）、Ｃｌａｖｅｓｉｎ  ２（Ｃｌｖｓ２）、Ｐｄｅ１ａ、Ｐｄｅ１ｃ、エンドセリン変換酵素１（Ｅｃｅ１）、ＣＮＫＳＲファミリーメンバー３（Ｃｎｋｓｒ３）である。また、この表で与えられるのは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）からのマウスおよびヒトＩＤである。
【表９】
2020508652.tif 000396
【０１６３】
Ｌ．分析に使用されたソフトウェア
データ処理ステップは、カスタムパールスクリプトに加えて、リナックスツールを利用した。標準的リナックスコマンド（例えば、ａｗｋ、ｃｕｔ、ｓｏｒｔ、ｕｎｉｑ）に加えて、次のパッケージを使用した：ＡＴＡＣｓｅｑ試料のアダプタートリミングのためのＴｒｉｍ  Ｇａｌｏｒｅ！（ｖ０．４．１）、ＳＴＡＲ（ｖ２．４．２ａ）およびリードアライメントのためのＢｏｗｔｉｅ２（ｖ２．１．０）、重複物の索引付けと除去のためのＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ０．１．１９−４４４２８ｃｄ）、ブラウザによる可視化用のファイル生成のためのｉｇｖｔｏｏｌｓ（ｖ２．３．３２）、およびリードサマライゼーションのためのｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（ｖ１．５．２）。データ分析は、Ｒ  Ｓｔｕｄｉｏ（ｖ１．０．１４３、Ｒ：ｖ３．４．０）を使用して実施した。ｂａｓｅ  Ｒ（データラングリング、ピアソン相関、階層型クラスタリング、などのために）およびｃｕｓｔｕｍ  Ｒ関数に加えて、次のパッケージを広範囲にわたり使用した：データラングリングと可視化のためのｔｉｄｙｖｅｒｓｅ（ｖ１．１．１、これはｇｇｐｌｏｔ２、ｒｅｓｈａｐｅ２などを含む）、生カウントの正規化、発現差異分析、および主成分分析のためのＤＥＳｅｑ２（ｖ１．１６．１）、ｇｐｌｏｔ（ｖ３．０．１）およびヒートマップのためのｐｈｅａｔｍａｐ（ｖ１．０．８）、カラーパレットのための、ＲＣｏｌｏｒＢｒｅｗｅｒ（ｖ１．１−２）、およびＧＯ分析のためのｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ（ｖ３．４．３）。
【０１６４】
Ｍ．ＡＴＡＣｓｅｑライブラリー構築および配列決定
マウス、ラットおよびヒト小脳由来の核を上述のように単離し、５０，０００個を氷冷ＰＢＳ中で洗浄した。ＡＴＡＣｓｅｑライブラリーを以前に、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，１２１３−１２１８およびＢｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０９，２１．２９．１−．２９．９（両文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして調製し、Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１３（１２）：１０１３−１０２４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に従って次の修正を加えた：核を氷冷リシスバッファー中に再懸濁し、氷上でのインキュベーションステップを省略し、遠心分離を行った。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡライブラリー調製キットを用いてライブラリーを生成した。Ｔｎ５トランスポサーゼを用いて、Ｎｅｘｔｅｒａから転位反応を３７℃で３０分間実施した。２００μＬの逆架橋溶液（５０ｍＭ  トリス−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｎｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）を加え、混合物を、ヒートブロック中で１０００ｒｐｍの振盪下、６５℃で一晩インキュベートした後、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）キットで精製した。ＤＮＡフラグメントを精製し、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いてサイズを選択し、１００〜７００ｂｐフラグメントを得た。マウスおよびヒト小脳由来のＡＴＡＣｓｅｑライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００で配列を決定して５０ｂｐペアエンドリードを取得し、また、ラット小脳から生成したライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００で配列を決定して７５ｂｐペアードエンドリードを取得した。全てのライブラリーを配列決定し、サンプル当たり少なくとも５５Ｍリードを得た。
【０１６５】
Ｎ．ＡＴＡＣｓｅｑリードマッピングおよび可視化
アダプター配列をトリミングし、Ｔｒｉｍ  Ｇａｌｏｒｅ！（ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ  −−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ３  −−ｆａｓｔｑｃ  −−ｐａｉｒｅｄ  ＊＿Ｒ１＿２．ｆａｓｔｑ．ｇｚ  ＊＿Ｒ２＿２．ｆａｓｔｑ．ｇｚ）を用いて、品質に応じて、リードをフィルターにかけた。フィルターを通過したリードを、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，３５７−３５９、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を用いて、ｈｇ３８、ｍｍ１０またはカスタムラットゲノムに整列させた。重複リードは、ＳＡＭｔｏｏｌｓ  （Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，２０７８−２０７９、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を用いて取り除いた。データ可視化のために、ｉｇｖｔｏｏｌｓを用いてｔｄｆファイルを生成した。
【０１６６】
Ｏ．ＲＮＡｓｅｑリードマッピング、可視化、およびリードの要約
ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９，１５−２１、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびアンサンブルからのゲノムアセンブリを用いて、ＲＮＡｓｅｑリードを整列させた。デフォルトのＳＴＡＲパラメーターに加えて、次のパラメーターを使用した：シングルエンドに対し、（−−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ  ９９９  −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ  ０  −−  ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ  ０  −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎ  ３５  −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＬｍａｘ  ０．０５）およびペアードエンドデータに対し、（−−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ  ９９９  −−ａｌｉｇｎＭａｔｅｓＧａｐＭａｘ  １００００００  −−  ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ  ０  −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ  ０  −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎ  ６０  −−  ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＬｍａｘ  ０．０５）。ｉｇｖｔｏｏｌｓを使って可視化するために、整列されたｂａｍファイルをｔｄｆフォーマットに変換した。ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（Ｌｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０，９２３−９３０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使って、生カウントを生成した。全遺伝子に対するＲｅｆｓｅｑまたはアンサンブル遺伝子モデルアノテーションをＵＣＳＣ  Ｔａｂｌｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒツールを用いてダウンロードした。Ｒｅｆｓｅｑ（Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６，９７、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）アノテーションを用いた。アンサンブルは、種内比較のためのアノテーション用として選択した。種全体の比較分析のために、アンサンブルアノテーションを全ての種に対して使用し、アンサンブルから得られたオルソロガス転写物のリストと照合した。ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓのデフォルトパラメーターに加えて、次のパラメーターを用いた：ペアードエンドデータに対しては、リードの代わりにフラグメントをカウントし（−ｐ）、キメラフラグメントはカウントしない（−Ｃ）。種全体の比較分析のために、遺伝子が１つの種ではオーバーラップするが別の種ではそうではない場合の問題を回避するために、リードを、２つ以上の一致メタフィーチャーに割付けることを可能とする（−Ｏ）。種間比較の場合には、２つ以上の一致メタフィーチャーにマッピングするリードは、カウントしない（デフォルト）。アノテーションを表９に示す。
【表１０】
2020508652.tif 000397
【０１６７】
Ｐ．オルソログアノテーションの生成
マウス、ラット、およびヒトオルソログ、ならびにマウス−ヒト高信頼性オルソログのためのアノテーションを生成する方法は、次のようにまとめ得る：１）種全体のオルソログアノテーションをアンサンブルＢｉｏＭａｒｔ（リリース８８）からダウンロードした、２）次記のみを含むように選別した：高信頼性対（アンサンブルオルソログ信頼性＝０）、１：１オルソログ（別の種で２つ以上の転写物にオルソロガスであると注釈された転写物）、全長１ｋｂを超える遺伝子（非翻訳領域を含む）、および種全体で２倍未満の長さの変化をする遺伝子。各遺伝子に対し、最大長のオルソロガス転写物をアノテーションのために使用した。
【０１６８】
ラットゲノムは、不完全な注釈であるため、マウス、ヒト、およびラットの間のオルソロガス遺伝子よりも、マウスとヒトとの間で、ほぼ３，０００個多くの遺伝子がオルソロガスとして特定された。
【０１６９】
Ｑ．遺伝子数正規化、発現差異分析、および主成分分析
生遺伝子数表をＲにロードし、ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，５５０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使って、発現差異分析を実施した。年齢および自己融解時間に対しては、数値共変量をモデル化に用いた。統計的に有意な遺伝子を、０．０１未満の調整ｐ値を有するものと定義した。倍率変化カットオフは、他に断らない限り、使用しなかった。ｒｌｏｇ関数を用いて、下流分析（例えば、ヒートマップ、クラスタリング）のための正規化数を生成した。ｐｌｏｔＰＣＡ関数を用いて、主成分分析を実施した。バッチ効果を除去する方法は使用しなかった。予測生物学に基づくクラスタリングは、全体を通して観察されたが、バッチによるものは観察されなかった。例えば、多数の差異：調製日、組織状態（新鮮ｖｓ急速冷凍＋解凍）、核状態（非固定ｖｓ固定）、核処理（なしｖｓ抗体染色）、ライブラリープレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｖｓ．  ＮＥＢ）、シークエンサー（ＨｉＳｅｑ２５００  ｖｓ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００）、およびリードタイプ（５０ｂｐシングルエンドｖｓ．７５ｂｐペアードエンド）にもかかわらず、ＥＧｆＰ＋と、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いた選別核との間で、細胞型によるクラスタリングが観察された。
【０１７０】
Ｒ．階層型クラスタリング
ＤＥＳｅｑ２からｒｌｏｇ関数により生成した正規化遺伝子数を用いて、階層型クラスタリングを実施した（Ｌｏｖｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，５５０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特に指定しなければ、ｒｏｗＶａｒ関数により計算した、試料全体中の、最上位２５０個の最も変化する遺伝子をクラスタリングに用いた。デフォルトパラメーター（ユークリッド距離および完全な結合）を用いたｄｉｓｔおよびｈｃｌｕｓｔ関数を使用して、クラスターを生成した。
【０１７１】
Ｓ．特異性指数アルゴリズム
特異性指数（ＳＩ）アルゴリズムは、他のデータセットと比較して、目的のデータセット中で特異的な遺伝子を見つけるために、以前に開発した（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，４２１８−４２３０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙのアルゴリズムは、マイクロアレイデータ用として設計されたので、ＲＮＡｓｅｑデータを入力として受け入れるように変更した。計算のために、生物学的反復実験から情報を組み込む機能を加えた。生カウントからＦｐｋｍを計算し、長い遺伝子への偏りを回避し、１ｋｂ未満の遺伝子を除外して極端に短い遺伝子への偏りを回避した。次に、ｆｐｋｍ値を記録し、ｌｏｇ１０（ｆｐｋｍ）の値を−２を最低値にして、長い非発現遺伝子への偏りを回避した。試料の反復数を考慮して、細胞型内で平均および標準偏差を全遺伝しに対し計算した。
【０１７２】
ＳＩ値を前述のように計算したが、平均遺伝子発現値を入力として使用する代わりに、試料を遺伝子発現の平均と標準偏差を有する正規分布からランダムに選択した。このプロセスを１０００回実施し、最終ランクを繰り返し全体で平均した。マウス小脳の高度に特異的な遺伝子の分布を分析するために、Ａｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ（Ｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４５，１６８−１７６、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）から各遺伝子の画像を調査した。分析の時点で、そのＡｔｌａｓ中になかった遺伝子、または脳のどの領域でも染色を示さなかった遺伝子を分析から除外した。細胞型の適切な分布を示す遺伝子のパーセンテージを計算し、本明細書で提示した。
【０１７３】
Ｔ．ＧＯ分析
有意に差次的に発現した遺伝子を発現上昇および発現低下（またはマウス濃縮およびヒト濃縮）遺伝子に分割し、顆粒細胞、バスケット細胞、およびグリアに対し、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，２８４−２８７、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を用いてジーンオントロジー濃縮分析を実施した。有意なオントロジーを、０．０１未満のｑ値を有するものと定義した（デフォルト）。３つのドメイン（生物学的プロセス（ＢＰ）、分子機能（ＭＦ）、細胞の構成要素）に関し、有意なオントロジーを含むＧＯ分析結果を集めた。可視化の単純化のために、生物学的プロセスオントロジーのみを使用した。さらに、多くのオントロジーが見つけられた場合、簡略化機能を用いて可視化の重複項目を除いた。ネットワークベース濃縮マップを、ｅｎｒｉｃｈＭａｐ関数を用いて生成した。濃縮マップの可視化を単純化するために、関連オントロジー群を１つのラベルにまとめた。
【０１７４】
実施例２．核トランスクリプトームを用いた細胞の独自性の定義
核は、構成的小胞体（ＥＲ）タンパク質、ＥＲ中で合成された膜タンパク質に特異的な抗体を用いて選別し得る。最初に、実施例１に記載のように、核ＲＮＡをＧＦＰ＋核から単離した。野性型マウスの核膜の近くで翻訳されたＥＲ転写物を濃縮するために、核転写物のポリＡプルダウン法を実施した。これらの転写物の大部分は、核であると観察されなかったが、ＥＲ周辺の核中で翻訳されている、完全に成熟した核酸転写物であった。膜タンパク質の全ての転写物がこの核ポリＡ＋画分中で見つかるとは限らないが、核の近くで合成されるものの知識が、核標識のための標的にできる因子の数の中で劇的に増加した。免疫蛍光法を実施後、核周辺のＥＲ中で染色が観察され、これにより、核が膜タンパク質に対する抗体を用いて標識され得ることが確認された。
【０１７５】
小脳から３つの細胞型を単離する初期の方策は、試料中のこれらの細胞型の存在を確認するために、Ｉｔｐｒ１（イノシトール  １，４，５−三リン酸受容体１型；小胞体（ＥＲ）の細胞内受容体）を、プルキンエ細胞を標識するための標的として、ＮｅｕＮ（ＲＮＡ結合ＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーによりコードされる遺伝子；ＮｅｕＮは、ニューロンのバイオマーカーとしてよく使われる神経抗原である）を、顆粒細胞を標識するための標的として、およびＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質；グリア細胞から星状膠細胞を識別するために使用される成熟星状膠細胞の主要中間径フィラメントタンパク質の１つ）を、グリアを標識するための標的として用いる抗体結合を含めた。その後、Ｉｔｐｒ１およびＮｅｕＮの結果の組み合わせを用いて、３つ全ての集団を単離した。
【０１７６】
目的の細胞型由来の核を、核トランスクリプトームが細胞の独自性を正確に定義するのに使用され得るかどうかを判定するＴＲＡＰ法を用いて、以前にプロファイル解析した遺伝子導入マウスの組織から単離した。ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入動物のプロファイリング結果は、ＧＦＰタグリボソームサブユニットが核小体中に組み込まれているという事実に基づいた。免疫蛍光法を用いて、ＧＦＰが、プルキンエ細胞中でのみ発現されたプルキンエ細胞タンパク質２（Ｐｃｐ２）−ＧＦＰを有する遺伝子導入動物由来の小脳組織の組織切片の細胞質中に主に分布していることが観察されたが、また、核中の１点（核小体）中でも観察された。さらに、染色結果は、Ｐｃｐ２−ＧＦＰ動物の小脳由来の単離核は、ＤＡＰＩで標識可能なことを示し、７つの核の内の１つは、プルキンエ核（ＧＦＰ＋）であることが観察された。
【０１７７】
実施例３．ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入動物に由来する細胞をプロファイル解析するためのフローサイトメトリーの使用
ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入動物由来のそれぞれ５つの細胞株からのＥＧＦＰ＋核のフローサイトメトリー結果を表１０に示す。
【表１１】
2020508652.tif 000398
【０１７８】
ＴＲＡＰ法を用いて以前にプロファイル解析した５つの異なる遺伝子導入マウス株から単離した核に対し、追加のフローサイトメトリーを実施した。ＴＲＡＰ法により精製した以前のプロファイルから、プルキンエ細胞タンパク質２（Ｐｃｐ２）をプルキンエ細胞由来の核を特定するための標的として、約０．４％の核がＰｃｐ２陽性であることを観察した。Ｎｅｕｒｏｄ１（ニューロン分化１）を、顆粒細胞由来の核を特定するための標的として、約９１％の核がＮｅｕｒｏｄ１陽性であることを観察した。Ｓｅｐｔ４（セプチン４）を、バーグマングリア由来の核を特定するための標的として、約２％の核がＳｅｐｔ４陽性であることを観察した。Ｇｌｔ２５ｄ２またはＣｏｌｇａｌｔ２（コラーゲンベータ（１−Ｏ）ガラクトシルトランスフェラーゼ２）を、層５皮質−脳橋錐体ニューロン由来の核を特定するための標的として、約０．５％の核がＧｌｔ２５ｄ２陽性であることを観察した。ニューロテンシン受容体１（Ｎｔｓｒ１）を、層６皮質視床投射錐体ニューロン由来の核を特定するための標的として、約１．８％の核がＮｔｓｒ１陽性であることを観察した。
【０１７９】
表１０の値は、フローサイトメトリー中の選別のための陽性集団の控え目の（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）ゲーティングに基づき、前の段落のパーセンテージは、やや積極的（ｌｅｓｓ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）なフローデータの分析に基づいた。
【０１８０】
実施例４．ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入動物に由来する細胞株の発現プロファイル
核ＲＮＡプロファイルがニューロンの異なるサブタイプ間を識別するのに十分な感受性を有するかどうかを判定するために、ＲＮＡｓｅｑを使用して、別々に５つの細胞型−小脳プルキンエ細胞、顆粒細胞、バーグマングリア、コルチコポンチン錐体ニューロン、または皮質視床錐体ニューロン−を別々に標的とするＥＧＦＰ−Ｌ１０ａリボソーム融合タンパク質を発現している遺伝子導入マウス株由来のＦＡＣＳ精製ＥＧＦＰ＋核から核発現プロファイルを生成した。Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｐｃｐ２、およびＳｅｐｔ４は、小脳の顆粒細胞、プルキンエ細胞、およびバーグマングリア中で、それぞれ発現を促進することが既知であった。Ｃｏｌｇａｌｔ２（または、Ｇｌｔ２５ｄ２と呼ばれる）およびＮｔｓｒ１は、皮質のコルチコポンチンおよび皮質視床錐体細胞中で発現を促進することが既知であった。既知のマーカーは、各細胞型の核に特異的であることが確認された。
【０１８１】
表１１は、ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入マウス由来の核ＲＮＡｓｅｑデータセットの要約を提供する。
【表１２】
2020508652.tif 000399
【０１８２】
表１１に提示した５つの細胞型の核に対する核ＲＮＡｓｅｑデータの階層型クラスタリングを実施した。さらに、Ｍｏら（Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１５）からの３つの発表された核ＲＮＡｓｅｑデータセット：Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ動物（ｅｘｃｉｔと標識）由来の興奮性神経細胞、ＰＶ−ｃｒｅ動物（ｐｖと標識）由来のＰＶ介在ニューロン、およびＶＩＰ−ｃｒｅ動物（ｖｉｐと標識）由来のＶＩＰ介在ニューロン、をこの階層型クラスタリングに含めた。錐体ニューロンが一緒にクラスター化されていることが観察された。
【０１８３】
各遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果により計算された発現を、試料全体の平均発現に対し正規化した。それぞれ５つの細胞型のＦＡＣＳにより精製された核由来のＲＮＡｓｅｑのｌｏｇ２倍率変化の結果を、２５０個の最も変化する遺伝子の正規化ＲＮＡｓｅｑ結果に比較して、表１２に示す。発現のｌｏｇ２倍率変化は、各細胞型由来の核に対し、３回反復して計算された。負の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析した細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表１３】
2020508652.tif 000400
2020508652.tif 000401
2020508652.tif 000402
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【０１８４】
Ｍｏら（２０１５）Ｎｅｕｒｏｎ  ８６，１３６９−１３８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）からのＲＮＡｓｅｑデータについて、表１２で見出されるものと同じ２５０個の最も変化する遺伝子に対するＲＮＡｓｅｑ結果からの発現のｌｏｇ２倍率変化を、全ての分析された細胞型由来の核の正規化発現と比べて、表１３に示す。負の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析した細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表１４】
2020508652.tif 000408
2020508652.tif 000409
2020508652.tif 000410
2020508652.tif 000411
【０１８５】
追加の細胞型特異的核転写物が、下記の増加した発現を有することが観察された遺伝子から特定された：Ｓｅｐｔ４陽性細胞（バーグマングリア）に対してアルファ−２−マクログロブリン（Ａ２ｍ）、Ｃｏｌｇａｌｔ２陽性細胞（コルチコポンチン錐体）に対してＰｄｅ１ａおよびＣｏｌｇａｌｔ２、Ｅｘｃｉｔ陽性細胞（興奮性神経細胞）に対してＰｄｅ１ａおよびヘパラン硫酸−グルコサミン３−スルホトランスフェラーゼ４（Ｈｓ３ｓｔ４）、Ｎｔｓｒ１陽性細胞（皮質視床錐体）に対してＰｄｅ１ａおよびＨｓ３ｓｔ４、ＰＶ陽性細胞（パルブアルブミン介在ニューロン）に対してアリスタレス関連ホメオボックス（Ａｒｘ）およびパルブアルブミン（Ｐｖａｌｂ）、ＶＩＰ陽性細胞（ＶＩＰ介在ニューロン）に対して血管活性腸管ペプチド（Ｖｉｐ）、Ｐｃｐ２陽性細胞（プルキンエ）に対して溶質輸送体ファミリー９メンバーＡ３（Ｓｌｃ９ａ３）、およびＮｅｕｒｏＤ１陽性細胞（顆粒）に対してＧｒｉｎ２ｃ。本明細書のこの実施例の結果は、核ＲＮＡが細胞型を決定するのに十分であるという証拠を提供する。
【０１８６】
これら８つの細胞型全部の遺伝子を用いて階層型クラスタリングを実施し、核ＲＮＡプロファイルが予測生物学に基づいて試料を分類できるかどうかを判定した。クラスタリングは、細胞型だけではなく、関連細胞型群によっても実施した。例えば、２つのクラスの介在ニューロン（ＶＩＰおよいＰＶ）が相互にクラスター化され、一方、３つの錐体細胞型（本明細書のデータからのコルチコポンチンおよび皮質視床ならびにＭｏらからの全ての興奮性錐体細胞型）が一緒にクラスター化された。このクラスタリングの堅牢さは、異なる方法を用いて調製された試料、および異なる研究室からの試料の全体にわたる場合でも、細胞の独自性を指定するための、および異なる細胞型の関連性を測定するための、核ＲＮＡプロファイルの有用性を示している。
【０１８７】
実施例５．野性型動物から特異的核を単離する方法の開発
以前の細胞プロファイリング技術は、遺伝子導入動物中で疾患モデルの育種が必要であった。いくつかの疾患モデルは、育種することが困難であり、さらに、加齢の研究を行う場合には、特定の遺伝子導入系統を数年間にわたり維持することが必要となる。遺伝子組換えが困難である、またはヒトの場合のように倫理に反する場合、このような方法を生物に適合可能ではない。したがって、野性型動物における特定の細胞型の分子的研究を可能にする一般化可能な方法を開発することに対するニーズがある。
【０１８８】
図２Ａは、実施例２で記載の方策を用いた、マウス小脳由来の核の選別を示す。Ｉｔｐｒ１はｘ軸上にあり、ＮｅｕＮはｙ軸上にある。Ｉｔｐｒ１＋集団は、プルキンエ細胞の核であり、ＮｅｕＮ＋集団は、グリアの核であった。ＮｅｕＮ＋／Ｉｔｐｒ１−核（最大群）は、顆粒細胞を表す。
【０１８９】
図２Ｂは、ＧＦＰ選別からの遺伝子導入動物由来のプルキンエ核ＲＮＡの群を、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術で選別したＩｔｐｒ１＋核に対し比較した、ＲＮＡｓｅｑデータからの遺伝子発現プロファイリングを示す。Ｐｃｐ４はプルキンエマーカーで、これは、小脳無選別核（Ｐｃｐ２無選別およびＷＴ無選別）に比較して、Ｐｃｐ２−ＧＦＰ＋核および野生型（ＷＴ）Ｉｔｐｒ１＋核で濃縮されていることが観察された。Ｃａｌｂ２は、顆粒細胞マーカーで、これは、選別プルキンエ核（Ｐｃｐ２−ＧＦＰ＋またはＷＴ  Ｉｔｐｒ１＋）に比較して、無選別試料（Ｐｃｐ２無選別およびＷＴ無選別）中で濃縮されていることが観察された。
【０１９０】
表１４は、ＧＦＰおよび抗体選別からのプルキンエ核の数が高度に相関する（Ｒ＝０．９９）ことを示すピアソン相関を提供する。
【表１５】
2020508652.tif 000412
2020508652.tif 000413
【０１９１】
これらの因子に特異的な抗体は、単離されるべきこれらの因子を発現している細胞型の数が増加するであろう。
【０１９２】
中脳のドーパミン作動性神経はまた、２つの抗体：１つは転写因子ＦｏｘＡ１に対する抗体、もう一つは膜局在化したドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）に対する抗体、の組み合わせにより染色された。ＦｏｘＡ１に対する染色は、ドーパミン作動性神経の核中で観察された。ＤＡＴに対する染色は、主に軸索中で観察されたが、高度倍率では、おそらく小胞体中で合成されたと思われる、細胞体中でも観察された。
【０１９３】
フローサイトメトリーによるドーパミン作動性神経核の核染色および選別を図３Ａに示す。ダブルポジティブ（ＤＰ）集団（ＦｏｘＡ１とＤＡＴに陽性）をＲＮＡｓｅｑ分析のために単離した。図３Ｂは、無選別中脳核と、選別ドーパミン作動性核由来のＲＮＡｓｅｑの記録の比較を示す。ドーパミン作動性核は、既知のマーカー−溶質輸送体ファミリー６メンバー３（ＤＡＴ、Ｓｌｃ６ａ３としても知られる）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、フォークヘッドボックスＡ１（ＦｏｘＡ１）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）、およびドーパミン受容体Ｄ２（Ｄｒｄ２）に対し陽性であることが観察された。一方、これらのニューロン中で発現されないことが既知の遺伝子（Ｄｒｄ１およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（Ｇａｄ））は、無選別集団中で枯渇していることが観察された。したがって、ドーパミン作動性神経は、マウス中でうまく単離されたことが観察された。この方法は、ヒト試料に対しても使用できる。
【０１９４】
ウォルフラミンＥＲ膜貫通型糖タンパク質（Ｗｆｓ１）およびＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ｂ（Ｃｔｉｐ２、Ｂｃｌ１１ｂとしても知られる）は、染色から、それぞれ、皮質細胞型層２／３錐体ニューロンおよび層５および６錐体ニューロンの推定マーカーであることが観察された。染色から観察された皮質細胞型の別の推定マーカーは、ＥＴＳバリアント１（Ｅｔｖ１、ＥＲ８１としても知られる）で、これは、層５錐体ニューロンを標識する。Ｅｔｖ１は、以前に、皮質の層５中の、皮質線条体ニューロン、コルチコポンチンニューロンの両方、および可能な他のものを標識することが観察された。海馬の２つの推定マーカー：炭酸脱水酵素１（ＣＡ１）陽性ニューロンのためのＷｆｓ１および炭酸脱水酵素１（ＣＡ２）陽性歯状回のためのプルキンエ細胞タンパク質４（Ｐｃｐ４）、も染色により特定された。
【０１９５】
脳幹運動ニューロンのための推定マーカーは、溶質輸送体ファミリー１８メンバーＡ３（ＶａＣｈＴ、Ｓｌｃ１８ａ３としても知られる）、コンドロレクチン（Ｃｈｏｄｌ）、およびＥｓｒｒＢであることが観察された。３つの遺伝子ＶａＣｈＴ、Ｃｈｏｄｌ、およびＥｒｒＢに特異的な抗体は、インサイツハイブリダイゼーションにより、脳幹中のこのニューロン集団を標識することが観察された。Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ遺伝子発現データベースを参照用として使用した。ＶａＣｈＴおよびＥｒｒＢは、運動ニューロンを特異的に標識し、Ｃｈｏｄｌは、これらのニューロン以外の全てを標識する。Ｃｈｏｄｌに特異的な抗体は、脳幹運動ニューロンを直接的に標識するものと置換してよい。
【０１９６】
実施例６．抗体選別方法の野性型由来の核への適用
本明細書で記載の細胞プロファイリング技術が野性型動物における細胞型特異的調査のために生産的に使用し得るかどうかを判定するために、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を、いくつかの古典的に定義された、特有の形態および分布を示すニューロンおよびグリア細胞型で構成される構造であるマウス小脳由来の処理組織に適用した。
【０１９７】
候補の抗体特異性は、ＥＧＦＰ／Ｌ１０ａ融合タンパク質を発現している、ＴＲＡＰ法での使用のために開発された遺伝子導入動物から得られたデータから生成した各細胞型由来の発現プロファイルから選択した（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，４２１８−４２３０およびＤｏｙｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５，７４９−７６２、これら文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。データは、野性型マウスの小脳中の３つのニューロン細胞型（顆粒、プルキンエ、およびバスケット）および２つのグリア細胞型（星状膠細胞および乏突起膠細胞）から収集した。
【０１９８】
遺伝子導入動物由来の細胞に適用したものと類似の方法を用いて、小脳中の５つの別々の細胞型に対し、免疫蛍光染色を実施した。核間の差異を確認するために各細胞型に使用した抗体の特異性は、顆粒細胞に対してはＮｅｕＮ、プルキンエ細胞に対してはＩｔｐｒ１、バスケット細胞に対してはＳｏｒｃｓ３、星状膠細胞の細胞体およびプロセスに対してはＧｆａｐ標識、および乏突起膠細胞の細胞体および突起に対してはＭｏＧ標識であった。
【０１９９】
選別するために、少なくとも２種の抗体の組み合わせを使用した：ＮｅｕＮ（核の内側のユークロマチンに局在化したスプライシング因子）、これは、ニューロン核を標識する、および細胞型特異的抗体：Ｉｔｐｒ１、核膜に局在化した小胞体膜タンパク質、ならびにバスケット細胞マーカーＳｏｒｃｓ３および星状膠細胞マーカーＥｅａｔ１（Ｇｌａｓｔとも呼ばれる）、これは核膜中で標識される２つの細胞膜タンパク質である。オリゴデンドロサイトマーカーおよび転写因子Ｏｌｉｇ２に対する抗体は、ユークロマチン中で標識を示した。
【０２００】
小脳組織中では、ＮｅｕＮは、顆粒ニューロンの核を標識するが、プルキンエおよびバスケットニューロン、またはグリアを標識しないことが当該技術分野で既知である。ＮｅｕＮを用いた組織切片に対する免疫蛍光法結果は、この結果を確証した。しかし、ＮｅｕＮを用いた核の染色は、バスケット細胞、星状膠細胞、および乏突起膠細胞核は、予測されるように、より低いレベルのＮｅｕＮを有するが、プルキンエ核は意外にも、高レベルを有することが観察されることが明らかになった。これは、プルキンエ特異的マーカーのスペクトルオーバーラップによるものではない。理由は、共焦点画像化は、ユークロマチン中のプルキンエ核中で明るいＮｅｕＮの発現−スプライシング因子に対し予測された分布−を示したためである。したがって、ＮｅｕＮエピトープの曝露は、単離核と組織切片では異なることが観察された。
【０２０１】
乏突起膠細胞から核を単離するために、転写因子Ｏｌｉｇ２に対する抗体を使用した。免疫蛍光法を使用して、これらの抗体の有効性を確認した。顆粒細胞から核を単離するために、Ｉｔｐｒ１、Ｓｏｒｃｓ３、およびＯｌｉｇ２の組み合わせに加えて、ＮｅｕＮを使用して、その他の細胞型からの混入核を除去した。核を、ヘテロクロマチンのマーカーでもあるＤＡＰＩで対比染色した。ＦＡＣＳ結果を表１５に示す。
【表１６】
2020508652.tif 000414
【０２０２】
したがって、ＴＲＡＰ法で使用するために開発された遺伝子導入動物からの細胞型中の核の単離に使用される選別方法は、野性型マウス中の同じ細胞型からの核にも効果的であることが観察された。
【０２０３】
実施例７．異なる細胞選別方法からの結果の相関
結果は、ＴＲＡＰ法で使用するために開発された動物由来のＧＦＰ＋選別核試料および本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いて選別された核試料中で、表１６に示すような正規化遺伝子発現のペアワイズピアソンの相関係数（ｒ）を計算することにより、ゲノムワイドレベルで分析された。「．ｇ」試料は、ＴＲＡＰ法で使用するために開発された動物由来のＧＦＰ＋選別された試料であり、「．ａ」試料は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術により選別された。
【表１７】
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【０２０４】
この分析から、小脳中の異なる細胞型間の相関は、高い：ｒ＝０．９１〜０．９４、ことが観察され、生物学的反復間の相関は、極めて高い：ｒ＝０．９８〜１、ことが観察された。顆粒細胞、プルキンエ細胞、およびバーグマングリア由来のＥＧＦＰ−Ｌ１０ａ標識した核からの遺伝子発現プロファイルに対して、遺伝的に特定された細胞型と、細胞プロファイリング特定細胞型との間で、極めて高い相関：顆粒細胞に対しｒ＝０．９８、プルキンエ細胞に対しｒ＝０．９９、およびＳｅｐｔ４／ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａ動物から精製されたバーグマングリアと、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術により精製された星状膠細胞との間でｒ＝０．９６〜０．９７が観察された。バーグマングリアは、小脳星状膠細胞の亜集団であるので、これら２つのデータセットが相互に完全には相関していないのは、道理にかなっている。
【０２０５】
試料の階層型クラスタリングは、既知の生物学によるクラスタリングを明らかにした。例えば、第１の分割では、ニューロンのおよびグリア試料は相互に分離された。第２の分割では、核が遺伝的標識または抗体標識を用いて精製されたかどうかに関係なく、５つの細胞型が相互に分離される。まとめると、本明細書の結果は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術は、遺伝子導入動物を必要とすることなく、マウスの細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングを可能とすることを示す。
【０２０６】
実施例８．ラットにおける細胞型の抗体ベース選別
核をラット小脳から単離し、固定し、マウスで使ったのと同じ抗体を用いて染色し、結果をフローサイトメトリーにより分析した。スプラーグドーリーラット由来の核試料のＦＡＣＳ結果を表１７に示す。
【表１８】
2020508652.tif 000417
【０２０７】
ラット核の染色プロファイルはマウスのものに類似していた。しかし、例えば、ラット小脳中では差異があり、ＮｅｕＮ染色は、マウス小脳中で明らかであったものより、明確な陽性および陰性集団を生じた。結果として、追加の核の集団が、フローサイトメトリー分析により明らかになり、これらは単離され、ＲＮＡｓｅｑで特徴付けされた。核は、バスケット細胞、星状膠細胞、および乏突起膠細胞から、Ｓｏｒｃｓ３およびＮｅｕＮに特異的な抗体で染色することにより、単離された。この柔軟性は、４種の染色法を用いて、６つ全ての細胞型の精製を可能とした。２つ以上の型の染色から単離された細胞型に対し、ＲＮＡｓｅｑにより、既知のマーカーに関し最も濃縮され、その他の小脳細胞型のマーカーに関して枯渇していると特定された集団が選択された。
【０２０８】
それぞれのラット細胞型に特異的な遺伝子群を決定するために、遺伝子発現差異分析（ＤＥＳｅｑ２）を実施例１に記載のように実施して、各細胞型の核発現プロファイルを無選別小脳核と比較した。６つの細胞型の核からの正規化ＲＮＡｓｅｑ結果の間で、１２０個の差次的に発現した遺伝子の発現のｌｏｇ２倍率変化（ｐ＜０．０１、倍率変化＞２に調節）を、各個別の細胞型からの選別核のＲＮＡｓｅｑ結果と比較して、表１８に示す。負の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析した細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。各細胞型由来の核の２回反復試料を分析した。
【表１９】
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【０２０９】
表１８では、各細胞型に対する既知のマーカーの全体的な濃縮、およびその他の全ての細胞型に対するマーカーの枯渇が観察された。Ｆａｔ２およびＲｂｆｏｘ３の核発現は、顆粒細胞中で有意に濃縮されることが観察された。Ｃａｒ８およびＣａｌｂ１の核発現は、プルキンエ細胞に特異的であることが観察された。Ａｌｄｈ１Ｌ１およびＳｌｃ１ａ３の核発現は、バーグマングリアに特異的であることが観察された。Ｃｏｌｇａｌｔ２の核発現は、コルチコポンチン錐体細胞に特異的であることが観察された。Ｈｓ３ｓｔ４の核発現は、皮質視床錐体細胞に特異的であることが観察されたが、Ｐｄｅ１ａおよびＣｓｍｄ１は、両方とも、皮質錐体細胞型で発現されることが観察された。表１８の１２０個の遺伝子に加えて、データはまた、両方のラット細胞型中で有意に濃縮されている７００〜１，６００個の発現遺伝子も特定した。
【０２１０】
最新バージョンの特異性指数（ＳＩ）アルゴリズムを実装することにより、各細胞型に対して最も特異的な遺伝子も特定された（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，４２１８−４２３０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＳＩの利点は、関心領域中で極めて数の多い細胞型（例えば、小脳顆粒細胞）中であっても、特異的に発現した遺伝子を特定できることである。
【０２１１】
細胞型特異的ラットデータおよび最新ＳＩアルゴリズムの両方を検証するために、各細胞型に特異的であると特定された遺伝子の発現は、Ａｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓインサイツハイブリダイゼーションデータベースを用いて確証された。全ての細胞型に関し、実施例１のＳＩアルゴリズムにより計算された最上位２０個の最も特異的な遺伝子に対して、標識が、平均９３％の確率で、決定された細胞型中で特異的に観察された。各細胞型の予測分布を示したＡｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ画像による、最上位２０個のＳＩ遺伝子のパーセンテージは：顆粒９３％、プルキンエ１００％、バスケット８５％、星状膠細胞９３％、オリゴデンドロサイト１００％、およびＯＰＣ８０％であった。星状膠細胞特異的遺伝子Ｉｔｉｈ３の分布はまた、星状膠細胞型のバーグマングリア、および小脳の非バーグマングリア星状膠細胞型の両方の特徴であることが観察された。次の遺伝子が、６つの細胞型の核に対する追加のマーカーとして選択された：顆粒細胞核に対するテスカルシン（Ｔｅｓｃ）、プルキンエ細胞核に対する炭酸脱水酵素８（Ｃａｒ８）、バスケット細胞核に対するＭａｒｃｈ１１、星状膠細胞核に対するインター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖３（Ｉｎｔｅｒ−Ａｌｐｈａ−Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ３）（Ｉｔｉｈ３）、オリゴデンドロサイト核に対するＭｏｇ、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞核に対する血小板由来増殖因子受容体アルファ（Ｐｄｇｆｒａ）。
【０２１２】
これらの結果は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術が、任意の種での使用のために容易に適応させることができる一般化可能な方法であることを示す。
【０２１３】
実施例９．各種における最も特異的遺伝子の特定と比較
種全体にわたり変化した細胞型特異的機能に対する洞察を得るために、各種の全ての遺伝子の特異性指数を計算した。各種の１００個の最も特異的遺伝子は、各細胞型に対して表１９〜２４で示されている。より低いＳＩ値は、１つの種で別の種より特異的に発現する遺伝子を示す。
【０２１４】
表１９は、実施例１で記載のように、ヒト、ラット、およびマウス試料中の顆粒細胞において、特異性指数（ＳＩ）で測定して１００個の最も特異的な遺伝子を提供する。
【表２０】
2020508652.tif 000422
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【０２１５】
表２０は、ヒト、ラット、およびマウス試料中のプルキンエ細胞に対する、特異性指数（ＳＩ）の測定による１００個の最も特異的な遺伝子を提供する。
表２０．プルキンエ細胞中の各種に対するＳＩの測定による１００個の最も特異的な遺伝子
【表２１】
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【０２１６】
表２１は、ヒト、ラット、およびマウス試料中のバスケット細胞に対する、特異性指数（ＳＩ）の測定による１００個の最も特異的な遺伝子を提供する。
【表２２】
2020508652.tif 000428
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【０２１７】
表２２は、ヒト、ラット、およびマウス試料中の星状膠細胞に対する、特異性指数（ＳＩ）の測定による１００個の最も特異的な遺伝子を提供する。
【表２３】
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【０２１８】
表２３は、ヒト、ラット、およびマウス試料中の乏突起膠細胞に対する、特異性指数（ＳＩ）の測定による１００個の最も特異的な遺伝子を提供する。
【表２４】
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【０２１９】
表２４は、ヒト、ラット、およびマウス試料中のＯＰＣに対する、特異性指数（ＳＩ）の測定による１００個の最も特異的な遺伝子を提供する。
【表２５】
2020508652.tif 000437
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【０２２０】
マウス中の各細胞型における１００個の最も特異的遺伝子のランクと、ラットまたはヒトのそれらのランクとを表２５に示すように、比較した。
【表２６】
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【０２２１】
特異性ランクが、マウスとヒトとの間より、マウスとラットとの間でより保存されていることが観察された。
【０２２２】
実施例１０．細胞型特異的遺伝子が種間で変化する程度の決定
細胞型特異的遺伝子が種間で変化する程度をさらに調査するために、比較分析をマウスおよびヒト核試料由来のデータに対し集中的に実施した。理由は、ラットゲノムのアノテーションの完成度が低いからである。ラット遺伝子を排除することにより、比較のために使用し得る高信頼性オルソログの数は、アンサンブルオルソログを選別することにより、１１，４４３から１４，２７３個に増えるであろう。
【０２２３】
さらに、細胞機能に最も影響を与える可能性のある差次的に発現した遺伝子に重点を置くために、０．０１未満の厳密な調節ｐ値カットオフを通過し、種間で少なくとも４倍変化し、および各細胞型で有意なレベル（平均カウント数＞４００およびｆｐｋｍ＞０）で発現している遺伝子を選択した。発現レベル（ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０、ｌｏｇ１０（ｆｐｋｍ）＞０）で選別後に残された数、およびマウスとヒトとの間の細胞型全てにわたり差次的に発現した遺伝子選別後に残された数を、表２６に示すように、ヒトおよびマウス濃縮遺伝子に分解した。
【表２７】
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【０２２４】
表２６によると、これらの細胞型中で、マウスで濃縮またはヒトで濃縮されている４９０〜８２３個の遺伝子が特定された。
【０２２５】
マウスとヒトとの間の一般的差異ではなく、細胞型および種差異を特定するために、分析された全細胞型中で差次的に発現することが観察された遺伝子（ｐ＜０．０１、倍率変化＞２に調節）は、分析から除外された。このような選別により、１３３〜２９３個の細胞型および種特異的差次的に発現した、マウス中で濃縮されたものと、ヒト中で濃縮されたものとの間でほぼ均等に分布した遺伝子が得られた。
【０２２６】
これらのデータを確認するために、小脳中の他の全ての細胞型に比べて豊富な顆粒細胞ニューロンが、存在量が少ない細胞型では得られない２つのタイプの検証を可能とした。第１に、発生期の核ＲＮＡの発現のアッセイに加えて、成熟細胞質ＲＮＡの発現が調査され；第２に、小脳核調製での高い比率の顆粒細胞ゲノムの存在を考慮して、無選別小脳核を用いてクロマチンアクセシビリティが評価された。以前の調査は、ＡＴＡＣｓｅｑピークは通常、プロモーター中および発現遺伝子の遺伝子領域内で見出され、発現されていない遺伝子では大きく減少するかまたは存在しないので（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，１２１３−１２１８；Ｍｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｅｕｒｏｎ  ８６，１３６９−１３８４；Ｓｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，４７６−４８３、これら文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、マウス、ラットおよびヒト小脳核由来のＡＴＡＣｓｅｑデータは、発現データを確認するために使用された。
【０２２７】
予想通り、３つ全ての種由来の本明細書で記載の細胞プロファイリング技術からのデータ中で発現していると特定された遺伝子をコードするタンパク質は、スプライシングされた細胞質のｍＲＮＡの存在に付随して生じ、ＡＴＡＣｓｅｑピークは、それらのプロモーター中および遺伝子の領域内で顕在化した。例えば、ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈおよび顆粒特異的遺伝子Ｅｔｖ１は、マウス、ラット、およびヒトの顆粒細胞中で強く発現している。予想通り、これらの遺伝子を超える核ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、およびＡＴＡＣｓｅｑピークの存在が観察された。ヒト濃縮遺伝子Ｃｌｖｓ２およびＶｗｃ２を別にすると、これらの３つの独立した活性発現の尺度はヒトデータ中では存在するが、マウスデータ中では、発現またはクロマチンアクセシビリティは認められなかった。逆に、マウス濃縮遺伝子Ｃｎｋｓｒ３およびＥｃｅ１に関しては、核および細胞質ＲＮＡ発現およびＡＴＡＣｓｅｑピークは、マウスデータ中では観察されたが、ヒトデータ中では観察されなかった。予想通り、これらの遺伝子のラット中での発現は、マウスに類似であったが、低レベルのヒト濃縮遺伝子Ｃｌｖｓ２およびＶｗｃ２がラット中に存在することが観察された。
【０２２８】
マウスとヒトとの間の発現の２つの追加の特徴が特定された。発現の変化は、所定のゲノム範囲で２つ以上の遺伝子が関与し得る。例えば、Ｇタンパク質共役受容体１３５（Ｇｐｒ１３５）、トランス−Ｌ−３−ヒドロキシプロリンデヒドラターゼ（Ｌ３ｈｙｐｄｈ）、ＪＮＫ１／ＭＡＰＫ８−関連膜タンパク質（Ｊｋａｍｐ）、Ｃｃｄｃ１７５、およびレチクロン１（Ｒｔｎ１）を含む座位では、図４の核および細胞質の遺伝子発現およびＡＴＡＣｓｅｑピークの存在により明らかになるように、５つ全ての遺伝子がヒト顆粒細胞中で発現した。Ｊｋａｍｐ、Ｌ３ｈｙｐｄｈ、およびＧｐｒ１３５はまた、ＡＴＡＣｓｅｑピークにより示されるプロモーターＤＮＡアクセシビリティ部位の存在により裏付けられるように、マウスおよびラット中でも発現していることが観察されたが、それらのヒトオルソログに比べて遙かに低いレベルでの発現であった。Ｒｔｎ１は、ラットおよびヒト中よりマウス中で低いレベルでの発現であることが観察されたが、各試料で、異なるパターンのＡＴＡＣｓｅｑピークが観察された。マウスおよびラットでは、Ｃｃｄｃ１７５が発現していることは観察されず、また、ＡＴＡＣｓｅｑピークは観察されなかった。これは、この領域の遺伝子は、２つの別個のドメイン−１つはＲｔｎ１を含み、もう一つはＧｐｒ１３５、Ｌ３ｈｙｐｄｈ、Ｊｋａｍｐ、およびＣｃｄｃ１７５を含むドメインを形成することを示す。げっ歯類データでは、Ｇｐｒ１３５、Ｌ３ｈｙｐｄｈ、およびＪｋａｍｐは、ＡＴＡＣｓｅｑに均等にアクセス可能である。したがって、これらの遺伝子の低減した核および細胞質のＲＮＡレベルは、おそらく、隣接および非発現遺伝子、Ｃｃｄｃ１７５のクロマチン構造の変化に起因したものであろう。
【０２２９】
マウスとヒトデータ間の発現の第２の特徴は、変化が所定の細胞型中の別のファミリーメンバーの発現を伴うことがあることを示した。例えば、Ｐｄｅ１遺伝子ファミリーは、３つのカルシウムおよびカルモデュリン依存性ホスホジエステラーゼＰｄｅ１ａ、Ｐｄｅ１ｂ、およびＰｄｅ１ｃを含む。これらの酵素は、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの加水分解を触媒し、神経活動の調節に重要な役割を果たす。ＡＴＡＣｓｅｑを使用して、マウス顆粒細胞がＰｄｅ１ｃのみを発現し、一方、ヒト由来の顆粒細胞は、高レベルのＰｄｅ１ａおよび低レベルのＰｄｅ１ｃを発現することが確認された。これらの結果は、Ｐｄｅ１ａはヒト中で発現するが、マウス小脳では発現しないという、Ｌｏｕｇｈｎｅｙ，Ｋ．，＆  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｋ．（１９９６）Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ｐｐ．１−１９）；Ｌｏｕｇｈｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，７９６−８０６；およびＳｏｎｎｅｎｂｕｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８，６４５−６５２（これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中組み込まれる）における以前の知見と一致した。Ｐｄｅ１ａは、ｃＧＭＰを優先的に加水分解するが、Ｐｄｅ１ｃはｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方を等しい効率で加水分解するので（Ｔａｋｉｍｏｔｏ，Ｅ．（２００９）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０５，９３１−９３３、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、これらの差異は、マウスおよびヒト小脳におけるわずかに異なる生化学的結果を生じ得る。
【０２３０】
マウス脳におけるこれらのｍＲＮＡの存在または非存在を確認するために、公的に利用可能なＡｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ＡｔｌａｓおよびＧＥＮＳＡＴプロジェクト（Ｇｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，９１７−９２５；Ｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４５，１６８−１７６、これらのそれぞれの文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）からの遺伝子発現データを分析した。これらのデータは、小脳の顆粒層中の顆粒特異的マーカーＥｔｖ１およびマウス濃縮遺伝子Ｃｎｋｓｒ３、Ｅｃｅ１、およびＰｄｅ１ｃの発現、およびヒト濃縮遺伝子Ｃｃｄｃ１７５、Ｃｌｖｓ２、Ｖｗｃ２、およびＰｄｅ１ａの発現の非存在を確証した。興味深いことに、Ｃｌｖｓ２およびＰｄｅ１ａは小脳には存在しないが、それらはマウス脳の他の領域で発現し、細胞特異的調節配列の変化がこれらの種の差異の根底に存在する可能性があることを示唆する（Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｓ．Ｂ．（２００５）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ３，ｅ２４５；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｓ．Ｂ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３４（１１），２５−３６、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｅｃｅ１発現はまた、小脳のプルキンエ層中でも観察された。ヒト濃縮遺伝子Ｃｃｄｃ１７５、Ｃｌｖｓ２、Ｖｗｃ２、およびＰｄｅ１ａの発現は、マウス脳中で観察された。Ｃｃｄｃ１７５およびＶｗｃ２のいずれの領域中でも染色が検出されなかった。歯状回中でＣｌｖｓ２の強い染色、および層５および６の皮質および海馬のＣＡ１〜３中でＰｄｅ１ａの強い染色が観察された。
【０２３１】
データをさらに検証するために、ｑＰＣＲを用いて、マウス濃縮およびヒト濃縮遺伝子の相対的発現を測定した。ヒトおよびマウス小脳細胞質ｃＤＮＡを用いて、ハウスキーピング、ヒト濃縮、およびマウス濃縮遺伝子に対して遺伝子発現のｑＰＣＲ分析を実施した。各種について、２回の生物学的反復実験、３回の技術的反復実験を用いた。３つのハウスキーピング遺伝子からの発現の相加平均に対して発現を正規化した。ヒトＸＫ試料中の発現に対して倍率変化を計算した。不等分散を仮定して、生物学的反復値（技術的反復値の平均）の平均正規化値で両側スチューデントのｔ検定を用いてｐ値を次のように計算した：１）ハウスキーピング遺伝子−Ａｃｔｂ＝０．３３４、Ｇａｐｄｈ＝０．１４１、およびＰｏｌｒ２ａ＝０．１０９；２）ヒト濃縮遺伝子−Ｃｌｖｓ２＝０．０１９５、Ｖｗｃ２＝０．０１６１、およびＰｄｅ１ａ＝０．０００８６；およびマウス濃縮遺伝子−Ｐｄｅ１ｃ＝０．０６９６。ｐ値は、Ｃｃｄｃ１７５、Ｃｎｋｓｒ３、およびＥｃｅ１に対しては計算しなかった。理由は、少なくとも１つの生物学的反復値の全ての技術的反復値の増幅に失敗したからである。
【０２３２】
１つを除く全ての場合で、ｑＰＣＲ結果は、ＲＮＡｓｅｑおよびＡＴＡＣｓｅｑデータを確証した。外れ値の場合では、Ｐｄｅ１ｃは、マウスとヒトとの間で有意な発現の変化を示さなかった。この差異を理解するために、Ｐｄｅ１ａおよびＰｄｅ１ｃの発現をマウスおよびヒト小脳切片で免疫蛍光法によりアッセイした。２匹の別々のマウスおよび２人のドナー由来の切片を用いて少なくとも各２回の染色を実施した。ＮｅｕＮを顆粒細胞のマーカーとした。ＲＮＡｓｅｑおよびＡＴＡＣｓｅｑデータに合わせて、Ｐｄｅ１ｃおよびＰｄｅ１ａの両方のメンバーが主に顆粒層に局在化していることが観察され、マウス小脳ではＰｄｅ１ｃ発現が優位を占め、ヒト小脳ではＰｄｅ１ａ発現が優位を占めた。マウス小脳は、顆粒細胞およびＰｄｅ１ａを標識するバックグラウンド中で特異的にＰｄｅ１ｃを示したが、ヒト小脳は、顆粒細胞およびＰｄｅ１ｃを標識するバックグラウンド中で特異的にＰｄｅ１ａを示した。
【０２３３】
これらの遺伝子が独立に起こる発現の変化、または種間で変化する転写プログラムを反映し得るかどうかを理解するために、種特異的遺伝子の１０のカテゴリーについて、ジーンオントロジー（ＧＯ）分析を実施した。４つの遺伝子群が有意なＧＯ群を生じた：ヒト濃縮星状膠細胞、ヒト濃縮オリゴデンドロサイト、ヒト濃縮ＯＰＣ、およびマウス濃縮顆粒遺伝子。残りの６つの遺伝子は、有意に関連するＧＯカテゴリーを有することが観察されず、これらの細胞型中の種の差異は、広範囲の経路および機能に寄与していることを示唆している。星状膠細胞、乏突起膠細胞、またはＯＰＣ由来のヒト濃縮遺伝子のＧＯ分析は、これらの遺伝子が細胞構造、サイズ調節、および神経系機能に関与し、マウスおよびヒトグリア細胞間形態の既知の差異を反映している可能性があることを明らかにした。顆粒細胞マウス濃縮遺伝子は、神経系機能および細胞−細胞相互作用に一定の役割を果たし得る多糖類の代謝に関与している。
【０２３４】
まとめると、これらのデータは、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を核で採用して、げっ歯類およびヒト脳の細胞型特異的遺伝子発現、および神経系の遺伝子発現を正確に評価できることを示す。脳での遺伝子発現は、種全体の特定の細胞型で高度に保存的であることが観察された。したがって、特徴がはっきりした細胞型の最も豊富で細胞特異的なマーカーは、げっ歯類およびヒト脳で共有されることが観察された。この共有独自性にもかかわらず、種間で発現が保存されていない各細胞型のかなりの数の遺伝子が存在した。この遺伝子群は通常、既知のＧＯカテゴリーに適合せず、それらの発現は、他の脳領域で見つかることが多い。細胞型および種特異的発現は、座位内の隣接する遺伝子の調節の変化、または所定の遺伝子ファミリーの機能的に関連するが別のメンバーの選択的発現を反映できる。これらの遺伝子発現変化の結果は、将来の研究で照会する必要があるが、本明細書のデータは、特異的ＣＮＳ細胞型における遺伝子発現の機能的に重要な差異が種間で発生し、それらは、げっ歯類およびヒト細胞型の生化学的機能の重要な差異を生じ得ることを示す。
【０２３５】
実施例１１．マウスおよびヒトの核トランスクリプトームの比較
免疫蛍光法を用いて、選別がヒト試料の純粋な集団を生じたかどうかを判定した。核構造は、３つの集団間で全く異なることが観察され、各集団の核のサイズは異なった。ＮＥＵＮ＋顆粒ニューロンは、小さく、高度にヘテロクロマチンであることが観察された。ＮｅｕＮ−核のサイズは、バーグマングリア由来と思われるより大きな核と、乏突起膠細胞由来と思われるより小さい核の混在状態であることが観察された。ＩＴＰＲ１＋核は、その他の２つの群の核より、大きく、より真性染色質であることが観察された。図６は、前方散乱光（ＦＳＣ）と側方散乱光（ＳＳＣ）の組み合わせで核のサイズを近似する、フローサイトメトリー選別結果を示す。（ＤＰ＝ダブルポジティブ）。これらの結果は、異なる細胞型由来の核は、核構造中で明確に異なることを示し、これは、遺伝子発現調節または疾患感受性におけるそれぞれの細胞型全体にわたる差異を生じ得る。
【０２３６】
しかし、２つの異なるヒト対象（人１および人２）から選別した核の不均一性が、それぞれ図５Ａおよび図５Ｂのフローサイトメトリー結果で観察された。種特異的マーカーは、異なる細胞型から核を識別するように特定され得る。
【０２３７】
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、および図７Ｄは、マウスの核を選別するために使用した方法から開発したヒト小脳核の４種の異なる染色方法のフローサイトメトリー結果を提供する。図７Ａは、プルキンエ細胞のＩｔｐｒ１およびＩｄ２のゲーティングによる（すなわち、Ｉｔｐｒ＋およびＩｄ２＋の）フローサイトメトリー結果を示す。図７Ｂは、プルキンエ細胞のフォークヘッドボックスＰ４（ＦｏｘＰ４）およびＩｔｐｒ１によるゲーティング（すなわち、ＦｏｘＰ４＋およびＩｔｐｒ＋）の結果を示す。図７Ｃは、マウスと同じ選別方法を用いた、顆粒細胞のＮｅｕＮおよびＩｔｐｒ１によるゲーティング（すなわち、Ｉｔｐｒ−およびＮｅｕＮ＋）の結果を示す。図７Ｄは、ＦｏｘＰ４およびＮｅｕＮによるゲーティングの結果を示す。４種全ての染色方法中の最も薄い灰色の集団は、表３７に示すＲＮＡｓｅｑから遺伝子発現プロファイリングにより示されたのと同じ核の集団を与える。
【０２３８】
マウスおよびヒト選別核からのＲＮＡｓｅｑ結果による遺伝子発現プロファイルは、実施例１５および１７にそれぞれ示される。実施例１７の表３７の顆粒細胞核集団は、実施例１５の表３１に示すように、マウス由来の顆粒細胞に類似のプロファイルを有することが観察された。表３７のグリア核集団は、マウス由来のグリアに類似のプロファイルを有することが観察された（表３３および３４）。表３７のヒト試料由来のバスケット核集団は、表３２のマウス由来のバスケット／星状細胞に類似のプロファイルを有することが観察された。これらの類似性は、Ｒｂｆｏｘ３（ＮｅｕＮとしても知られる）、Ｆａｔ２、リアノジン受容体１（Ｒｙｒ１）、Ｐｖａｌｂ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼミュー１（Ｇｓｔｍ１）およびプレイオトロフィン（Ｐｔｎ）のＲＮＡｓｅｑ結果で特に顕著であった。
【０２３９】
対照的に、表３１〜３４および３７のＲＮＡｓｅｑデータにおいて、顆粒、バスケット／星状、およびグリア細胞由来の、プロテインチロシンキナーゼ２ベータ（Ｐｔｋ２ｂ）、溶質輸送体ファミリー４３メンバー２（Ｓｌｃ４３ａ２）、グルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット３（Ｇｒｉｋ３）、Ｉｔｐｒ１、プロトカドヘリン９（Ｐｃｄｈ９）、およびＲＡＳグアニル放出タンパク質１（Ｒａｓｇｒｐ１）−陽性核に対して、マウスとヒトとの間で有意な変化が観察された。
【０２４０】
試料間の最大の変化に寄与する、従って、１つの試料を別の試料から最も良く識別する、最上位５００個の遺伝子からの核ＲＮＡｓｅｑデータの階層型クラスタリング（最初は種による、および次に細胞型による）は、細胞型と、種間を識別する他の遺伝子群との間で識別するいくつかの遺伝子群を示した。この分析は、マウスとヒトとの間で、保存されたおよび異なる遺伝子を明らかにした。
【０２４１】
マウスおよびヒト小脳試料の主成分分析法は、細胞型による、および種によるクラスタリングの可視化を可能にする。第１の主成分（ｘ軸）は、試料間の最大変化を表し、第２の主成分は、二番目に大きい試料間の変化源およびそれらがどのように細胞型により分離されるかを表す。本明細書の分析は、細胞型が試料間のＸ％の分散に寄与し、同時に、種が試料間のＹ％の分散に寄与することを示した。
【０２４２】
実施例１２．異種間比較による細胞型および種特異的遺伝子の特定
上記の細胞特異的発現プロファイルの高品質を仮定して、これらの小脳細胞型中の種間の遺伝子発現変化の程度を分析した。結果が、種間のアノテーションの差異ではなく、発現の変化を反映したことを保証するために、分析を、マウス、ラット、およびヒト間の高信頼性１：１オルソログに限定した。マウス、ラット、およびヒト遺伝子のオルソログアノテーションを規定するために、種全体にわたるオルソログアノテーションをアンサンブル（３０４，１４７転写物ｖｓ１９，１９７遺伝子）からダウンロードし、高信頼性対（７６，１７２転写物ｖｓ１４，５４１遺伝子）１：１オルソログ（６７，５２２転写物ｖｓ１３，２４２遺伝子）遺伝子で、全長１ｋｂを超え、全種間で２倍未満の長さ変化の遺伝子（３０，４９７転写物ｖｓ１１，４４３遺伝子）のみを含むように選別した。各遺伝子に対し、最大長のオルソロガス転写物をアノテーションのために使用し、１１，４４３転写物および１１，４４３遺伝子を得た。
【０２４３】
７つの細胞型の核からの正規化ＲＮＡｓｅｑ結果の間で、マウス、ラット、およびヒト核全体の２５０個の最も変化する遺伝子の発現のｌｏｇ２倍率変化を、各個別の細胞型からの選別核のＲＮＡｓｅｑ結果と比較して、表２７に示す。負の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析した細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。各細胞型由来の核の２回反復試料を分析した。
【表２８】
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【０２４４】
７つの細胞型の核からの正規化ＲＮＡｓｅｑ結果の間で、マウス、ラット、およびヒト核全体の２５０個の最も変化する遺伝子の発現のｌｏｇ２倍率変化を、各個別の細胞型からの選別核のＲＮＡｓｅｑ結果と比較して、表２８に示す。負の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析した細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。各細胞型由来の核の２回反復試料を分析した。
【表２９】
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【０２４５】
第１の８つの主成分：プロタンパクコンバターゼスブチリシン／ケキシン１型（ＰＣＳＫ１、ＰＣ１としても知られる）〜プロタンパクコンバターゼスブチリシン／ケキシン８型、（ＰＣＳＫ８、（Ｐｃ１〜Ｐｃ８）としても知られる）、（これは、ひとまとめにして、試料全ての変化の９０．５％を占める）の調査により、Ｐｃ１およびプロタンパクコンバターゼスブチリシン／ケキシン３型（ＰＣＳＫ３、ＰＣ３としても知られる）の発現が、試料を細胞型により分類するが、Ｐｃ２、プロタンパクコンバターゼスブチリシン／ケキシン６型（ＰＣＳＫ６、ＰＣ６としても知られる）およびＰＣ８は、試料を種により分割することが明らかにされた。その他の主成分は、試料を細胞型および種の両方により体系化する。Ｐｃ１およびＰｃ３は、試料全体の変化の４７％を占め、一方で、Ｐｃ２、ＰＣｃ６、およびＰｃ８は変化の２２％のみを占めるので、プロファイル間の最も重要な差異は、種の間で共有される細胞型特異的発現遺伝子から生じるように決定された。しかし、種々の種の所定の細胞型の機能特性を評価する場合には、種間の発現プロファイルにおけるゲノムワイド定量的差異も考慮されるべきであることは明らかである。
【０２４６】
階層型クラスタリングを用いて、２５０個の最も変化する遺伝子以外の、全ての遺伝子の発現に基づく、マウス、ラット、およびヒト細胞型特異的データセットの種全体にわたる類似度および差異を調査し、主として種によるクラスタリングを示した。しかし、クラスタリングが種全体の内の２５０個の最も変化する遺伝子のみを用いて実施した場合には、クラスタリングは、主に、細胞型により行われることが観察された。
【０２４７】
実施例１３．１６個の死後ヒト脳由来の３つの細胞型のプロファイリング
ヒト集団の遺伝的不均一性、ヒト組織の処理時間の変化、およびヒト組織から単離した総ＲＮＡの以前の調査で言及された困難を考慮に入れて（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９９，６２４−６３５．；Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），ｐｐ．３−１４、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、異なる個体由来の試料全体にわたる変化源も、疾患で観察された変化が疾患それ自体に起因するのか、または個体間の変化の結果であるのかを評価するための着目すべき対象とした。この変化源のより良い理解のために、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いて、追加の１４個のヒト脳試料中の細胞型特異的遺伝子発現を分析した。全体としては、試料は、性別間でほぼ均等の（７人の男性および９人の女性）、および年齢全体にわたる（次の年齢群中にそれぞれ４個体：２０〜３０、４０〜５０、６０〜７０、８０〜９０歳）分割をした１６人の対照ドナーから得た。全試料を、「正常な成人脳」の神経病理学的診断を受けた非罹患対象から取得した。表２９は、各ドナーに関する追加の詳細を示す。
【表３０】
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【０２４８】
核を１６個の試料全部から単離し、ＩＴＰＲ１およびＮＥＵＮに対する抗体を用いて染色し、１回の選別で核を３つの異なる細胞型：顆粒細胞、バスケット細胞、および全グリアから精製した。表３０は、核のＦＡＣＳ分析による各細胞型のパーセンテージを示す。
【表３１】
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【０２４９】
染色パターンは試料間で僅かに変化したが、顆粒細胞含有ＩＴＰＲ１−ＮＥＵＮ＋集団、バスケット細胞含有ＩＴＰＲ１＋ＮＥＵＮ−集団、および全グリア含有ＩＴＰＲ１−ＮＥＵＮ−は容易に識別された。唯一の例外は、個体ＷＣおよびＷＯからのグリア集団で、この場合、ＩＴＰＲ１−ＮＥＵＮ−集団は、ＩＴＰＲ１−ＮＥＵＮ＋集団からうまく分離しなかった。これらの２つの試料の遺伝子発現分析により、選別は、グリアから顆粒細胞を効率的に分離するのに失敗し、試料はさらなる分析から除外された。ＲＮＡｓｅｑを使って、４６個のヒトデータセット：顆粒細胞からの１６個、バスケット細胞殻からの１６個、およびグリアからの１４個を分析した。
【０２５０】
本明細書で記載の細胞プロファイリング技術は、細胞型組成物の差異に起因する変化を低減し、これは全体の変化を低減することが観察された。本明細書で分析された試料間で少しの変化が観察された。理由は、全組織の通常の分析では、変化は、組織組成物の差異および各細胞型の変化の両方に起因するためである。
【０２５１】
実施例８〜１４に示すように、各試料は、その細胞型のための適切なマーカーに関して濃縮され、その他の小脳細胞型のマーカーに関し枯渇されているために、これらのデータセットのＲＮＡｓｅｑ分析は、高純度の各核試料を示した。例えば、女性個体由来の試料のみが、Ｘ不活性特異的転写物（ＸＩＳＴ）を発現し、男性由来の試料のみが、Ｙ染色体遺伝子、例えば、リシン脱メチル化酵素５Ｄ（ＫＤＭ５Ｄ）を発現した。さらに、各細胞型の生物学的反復実験間のペアワイズピアソン相関係数が０．９８〜１であることが観察された（図８）。これらのデータは、各細胞型の存在量の個体間の小さい差異にもかかわらず、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術により得た細胞型特異的ヒト発現データは、再現可能であることを示した。
【０２５２】
実施例１４．マウスとヒトとの間の細胞型特異的核ＲＮＡプロファイルの差異のまとめ
マウスおよびヒトのそれぞれ５つの小脳細胞型（顆粒、プルキンエ、バスケット、星状膠細胞、およびオリゴデンドロサイト）に対し、選別核からＲＮＡを単離し、ＲＮＡｓｅｑを実施することにより、遺伝子発現プロファイルが生成された。
【０２５３】
表３１〜３４は、マウスとヒトとの間の遺伝子発現の差異を示す。さらに、細胞機能に最も影響を与える可能性のある差次的に発現した遺伝子に重点を置くために、調節ｐ値＜１０Ｅ−５を有し、種間で少なくとも４倍変化し、および各細胞型で有意なレベル（平均正規化カウント数／ＤＥＳｅｑ２  ｂａｓｅＭｅａｎ＞４００およびｌｏｇ２（ｆｐｋｍ）＞０）で発現している遺伝子を選択した。マウスで濃縮またはヒトで濃縮されている１１９〜４１０個の遺伝子が観察された。マウスとヒトとの間の一般的差異ではなく、細胞型および種差異を特定するために、分析された全細胞型中のマウスとヒトとの間で差次的に発現した遺伝子（ｐ＜１０ｅ−５、倍率変化＞２に調節）は、分析から除外された。このような選別により、６７〜２７７個の細胞型および種特異的差次的に発現した、マウス中で濃縮されたものと、ヒト中で濃縮されたものとの間でほぼ均等に分布した遺伝子が得られた。
【０２５４】
ヒト顆粒細胞由来の選別核中の顆粒細胞のマーカーのｌｏｇ２倍率変化を、マウス由来の顆粒細胞の核からの正規化ＲＮＡｓｅｑ結果と比較して、表３１に示す。負の値は、分析されたマウス由来の顆粒細胞の核の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、分析されたマウス由来の顆粒細胞の核の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表３２】
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【０２５５】
顆粒細胞マーカー、ＲＮＡ結合タンパク質、Ｆｏｘ−１相同体３（Ｒｂｆｏｘ３、ＮｅｕＮとしても知られる）および非定型カドヘリン２（Ｆａｔ２）が顆粒細胞中で高度に発現していることが観察され、他の４っの細胞型中で有意に発現していることは観察されなかった。ヒトとマウスの顆粒細胞の核の間での発現におけるｌｏｇ２倍率変化のより大きい値を有する遺伝子は、ヒト顆粒細胞由来の核のマーカーとして、より効果的であろう。
【０２５６】
ヒトバスケット細胞由来の選別核中の発現のｌｏｇ２倍率変化を、マウスバスケット細胞由来の選別核に対する正規化発現結果と比較して、表３２に示す。負の値は、マウスバスケット細胞由来の核の正規化値と比較して、ヒトバスケット細胞の核中で低減した発現を示し、正の値は、マウスバスケット細胞由来の核の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表３３】
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【０２５７】
バスケット細胞マーカー、Ｓｏｒｃｓ３および膜関連Ｒｉｎｇ−ＣＨ−Ｔｙｐｅフィンガー１１（Ｍａｒｃｈ１１）は、バスケット細胞中で濃縮されていることが観察され、他の４っの細胞型中で有意に発現していることは観察されなかった。
【０２５８】
ヒト星状膠細胞由来の選別核中の発現のｌｏｇ２倍率変化を、マウス星状膠細胞由来の選別核に対する正規化発現結果と比較して、表３３に示す。負の値は、マウス星状膠細胞由来の核の正規化値と比較して、ヒト星状膠細胞の核中で低減した発現を示し、正の値は、マウス星状膠細胞由来の核の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表３４】
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【０２５９】
アルデヒド脱水素酵素１ファミリーメンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）およびＳｌｃ１ａ３は、星状膠細胞中で濃縮されていることが観察され、他の４っの細胞型中で有意に発現していることは観察されなかった。ヒト乏突起膠細胞由来の選別核中の発現のｌｏｇ２倍率変化を、マウス乏突起膠細胞由来の選別核に対する正規化発現結果と比較して、表３４に示す。負の値は、マウス乏突起膠細胞由来の核の正規化値と比較して、ヒト乏突起膠細胞の核中で低減した発現を示し、正の値は、マウス乏突起膠細胞由来の核の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表３５】
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【０２６０】
ヒトＯＰＣ由来の核中で差次的に発現した遺伝子の遺伝子発現のｌｏｇ２倍率変化を、マウス核中のＯＰＣの正規化遺伝子発現と比較して、表３５に示す。負の値は、ヒトＯＰＣの核中の低減した遺伝子発現を示し、正の値は、マウスＯＰＣ由来の核と比較して、ヒトＯＰＣの核中の増大した遺伝子発現を示す。
【表３６】
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【０２６１】
Ｏｌｉｇ２およびＭｏｇは、成熟乏突起膠細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の両方中で濃縮されていることが観察され、他の４つの細胞型中で有意に発現していることは観察されなかった。全ての小脳細胞型由来の核ＲＮＡｓｅｑプロファイルの階層型クラスタリングは、オリゴデンドロサイト系統が２つの群、成熟乏突起膠細胞およびＯＰＣに分割され、成熟乏突起膠細胞を有する全ての乏突起膠細胞クラスタリングセットを含むことを確認した。
【０２６２】
実施例１５．ヒト細胞型特異的遺伝子発現に影響を与える因子の特定
本明細書で記載の細胞プロファイリング技術の開発の主要な理由は、ヒト細胞型特異的発現および細胞機能に影響し得るその生物学的および臨床的因子との関連性の直接試験を可能とすることであった。特徴付ける核は、正常な小脳試料から得られたが、性別、年齢、および死亡と組織保存との間の時間（自己融解時間）の差異が発現データに影響し得る。表３６は、自己融解、性別、および年齢の結果として、核中で有意に変化する（ｐ値＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）ことが観察された遺伝子の数を示す。
【表３７】
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【０２６３】
年齢は、ほとんどの遺伝子の発現で有意な変化を与えることが観察された。
【０２６４】
実施例１６．死後ヒト組織に対する抗体ベース細胞型選別の適用
以前に、近交系動物をこれらのタイプの研究に用いたが、ヒト個体全体にわたり不均質性が観察された。本明細書で記載の細胞プロファイリング技術が、ヒト脳の細胞型の分析に効果的であったかどうかを判定するために、２人のドナー（コードＸＫおよびＰＫ）由来の死後ヒト小脳組織を単離し、以前に決定した細胞型特異的抗体を用いて核を染色した。２人の個体（ＸＫおよびＰＫ）の小脳由来の、顆粒、バスケット、全てのグリア、星状膠細胞、成熟オリゴデンドロサイト、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）核のＦＡＣＳを実施した。各ゲーティングにおける集団のパーセンテージを表３７に示す。
【表３８】
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【０２６５】
表３７の結果からの発現プロファイリングのさらなる分析により、２つの別の集団が明らかになった：成熟乏突起膠細胞由来のＯＬＩＧ２＋低の核、およびオリゴデンドロサイト前駆物質細胞（ＯＰＣ）および成熟乏突起膠細胞の両方由来のＯＬＩＧ２＋高の核。
【０２６６】
オリゴデンドロサイトのさらなるフローサイトメトリー分析の後で、ＯＬＩＧ２＋集団は、そのレベルに基づいて、さらに細かく分割可能であるように思われた。全てのＯＬＩＧ２＋核の約２０％が高レベルのＯＬＩＧ２（高）を有し、８０％がより低レベルのＯＬＩＧ２（低）を有する。
【０２６７】
染色したヒト小脳核のプロファイルは、概ね、げっ歯類データに類似であるが、差異が存在した。例えば、顆粒およびバスケットニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣを選別するのに使用される条件は、ヒト死後組織に直接移行させることが可能であったが、マウスおよびラットプルキンエ細胞核を選別する条件は、ヒトプルキンエ細胞核の単離には成功しなかった。２つの死後ヒト試料間で染色の僅かな差異が観察された：ＸＫでは、オリゴデンドロサイトとＯＰＣの集団がうまく分離されたが、個体ＰＫ中でこれらの細胞を識別するのはより困難である。
【０２６８】
これらの差異がヒト死後試料の細胞型特異的分析を妨害し得るのかどうかを評価するために、５つの細胞型（顆粒、バスケット、星状膠細胞、オリゴデンドロサイト、ＯＰＣ）をこれら２つの個体脳でＲＮＡｓｅｑを用いて分析した。それぞれのこれらの細胞型からの既知のマーカーの試験は、当該細胞特異的マーカーが各細胞型を濃縮し、その他の細胞型を枯渇させたことが立証された。
【０２６９】
マウス、ラット、およびヒト試料由来の無選別核からの正規化ＲＮＡｓｅｑ結果の間でのｌｏｇ２倍率変化を、顆粒細胞、バスケット細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびＯＰＣ細胞由来の選別核に対するＲＮＡｓｅｑ結果と比較して、表３８に示す。負の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、その細胞型の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。表３８は、２つの死後ヒト試料の全種中の２５０個の最も差次的に発現した遺伝子に対するＲＮＡｓｅｑ結果を示す。
【表３９】
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【０２７０】
ＲＢＦＯＸ３（ＮｅｕＮとしても知られる）およびＦＡＴ２は、両試料の顆粒細胞中で有意に濃縮されることが観察された。ＭＡＲＣＨ１１は、両試料のバスケット細胞中で有意に濃縮されることが観察された。ＡＬＤＨ１Ｌ１およびＳＬＣ１Ａ３は、両試料の星状膠細胞中で有意に濃縮されることが観察された。Ｏｌｉｇ２は、両試料の乏突起膠細胞およびＯＰＣ中で有意に濃縮されることが観察された。ＭＯＧは、両試料の乏突起膠細胞中で有意に濃縮されることが観察された。ＰＤＧＦＲＡは、両試料のＯＰＣ中で有意に濃縮されることが観察された。Ｏｌｉｇ２＋高の核のみが、Ｐｄｇｆｒａおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（Ｃｓｐｇ４）などのオリゴデンドロサイト前駆物質細胞（ＯＰＣ）を標識する遺伝子を発現する。Ｏｌｉｇ２＋低の核は、成熟オリゴデンドロサイトに由来し、Ｏｌｉｇ２＋高の核は、成熟乏突起膠細胞および未成熟ＯＰＣの混合物に由来した。いずれの場合も、予測細胞型中のみで、高発現のマーカーが観察された。したがって、Ｏｌｉｇ２（全て乏突起膠細胞）、ＰｄｇｒａおよびＣｓｐｇ４（ＯＰＣ）、ＭａｇおよびＭｏｇ（成熟乏突起膠細胞）が、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を実施するのに効果的であるとして特定された。
【０２７１】
これらの結果は、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を、その高い定量的性質の結果として、予想外の亜集団の特定のために有用であることを強調する。結果の不均質性を用いて、患者のバイオマーカーを特定し得る。例えば、不均質性により、どのようにして異なる個体が薬物に応答するか、または治療標的を特定するか、を予測することが可能である。
【０２７２】
実施例１７．各試料のＲＮＡｓｅｑ結果間の相関
表３９は、２つの死後ヒト試料、ＸＫおよびＰＫの各細胞型に対するピアソン係数を示す。
【表４０】
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【０２７３】
図９は、細胞型で分けて、ヒト、ラット、およびマウス試料の間の結果を比較して示した各サンプルのペアワイズピアソンの相関係数である。１０個のデータセット間のペアワイズピアソン相関係数の計算は、２つのニューロン細胞型（顆粒およびバスケット）が試料間で高度に相関している（両方でｒ＝０．９９）が、グリアデータは僅かに低い相関である（ｒ＝０．９６〜０．９７）ことを明らかにした。さらに、階層型クラスタリングは、細胞型による分離を示し、細胞型全体の変化が個々の試料間の変化より大きいことを示す。全種での同じ細胞型の試料間の相関係数の範囲は、同じ種から単離された細胞型のクラスタリングに類似であることが観察され、両方の細胞型および種が発現プロファイルの重要な性質であることを示唆している。
【０２７４】
実施例１８．ヒト細胞型特異的遺伝子発現に影響を与える自己融解の効果の決定
先行文献は、死亡と組織が凍結されるまでの時間として定義される自己融解時間は、ＲＮＡ品質と相関せず、遺伝子発現に僅かな影響を与えるに過ぎないことを示した（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，２６、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。死後ヒト試料は、以前に、自己融解時間で極めて広範囲に変化することが観察されたので、臨床属性が遺伝子発現に影響を与えるかどうかを判定するために、１６人のヒト対象由来の核試料中の自己融解時間の遺伝子発現に対する影響の特徴付けが以前になされた。
【０２７５】
表４０に示されるように、試料中の最短の自己融解時間は、５．１３時間で、試料中の最長の自己融解時間は、２４時間であった。
【表４１】
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【０２７６】
ほんのわずかの遺伝子の発現が自己融解時間により有意に変化したことが観察された：全死後ヒト組織試料中の１２個が変化し、顆粒細胞が４個、バスケット細胞が１個、およびグリアが１個であった。種々の自己融解時間による全ヒト試料中で差次的に発現した遺伝子のｌｏｇ２倍率変化。表４１は、全試料中で自己融解時間による差次的発現遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）を示す。
【表４２】
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【０２７７】
Ｎｐａｓ４は、同じ試料由来の無選別核の正規化発現に比べて、全核中で最大の倍率変化を有する発現が観察された。
【０２７８】
表４２は、全ヒト試料中で、正規化発現に比べて、種々の自己融解時間により差次的に発現した（ｐ＜０．０１、倍率変化＞２に調節）顆粒細胞中の遺伝子を示す。
【表４３】
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【０２７９】
表４２に示すように、顆粒細胞の核中で差次的に発現したことが観察された４つの遺伝子はまた、全試料由来の無選別核中でも差次的に発現した。
【０２８０】
インヒビンベータＡサブユニット（Ｉｎｈｂａ）は、バスケット細胞の核中の差次的に発現した唯一の遺伝子であることが観察された（ｂａｓｅＭｅａｎ：６．６７３；ｌｏｇ２倍率変化：０．４６６；ｐ値：１．１５Ｅ−０８；ｐ調節：２．１８Ｅ−０４）。
【０２８１】
グリア中でキネシンファミリーメンバー１９（Ｋｉｆ１９）のみが唯一、自己融解時間と共に直線的に変化することが観察された（ｂａｓｅＭｅａｎ：１２６．３１１；ｌｏｇ２倍率変化：−０．１６０；ｐ値：７．７６Ｅ−０９；ｐ調節：１．２５Ｅ−０４）。追加の遺伝子、例えば、ＦｏｓＢ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット（ＦｏｓＢ）（ｐ調節＝３．５１Ｅ−１２）は、３つの細胞型全てで、中程度の自己融解時間で発現が増加したことが観察された（図１０）。
【０２８２】
実施例１９．ヒト細胞型特異的遺伝子発現に対する性別の影響の決定
発現プロファイルに対する性別の影響を試験するために、遺伝子発現を男性および女性由来の試料間で比較し、差次的に発現する（ｐ値＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）遺伝子を特定した。予想通り、本明細書で特定した大部分の性別特異的遺伝子は、ＸまたはＹ染色体上に存在し、Ｘ染色体遺伝子は女性試料中で濃縮され、Ｙ染色体遺伝子は男性試料中で濃縮されている。男性中の性別特異的発現差異を示す２７個の遺伝子（ｐ値＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）を、女性に比較して表４３に示す。
【表４４】
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2020508652.tif 000480
【０２８３】
これらの遺伝子の７つは、Ｘ染色体上に位置し、１４はＹ染色体上に位置し、６つは常染色体上に位置する。いくつかの事例では、性別特異的遺伝子は、いくつかの細胞型で他の細胞型より多く差次的に発現され得る。例えば、長鎖遺伝子間非タンパク質コードＲＮＡ２７８（ＬＩＮＣ００２７８）は、男性で濃縮されることが観察され、また、顆粒またはバスケット細胞中よりグリア中でさらに多く差次的に発現した。さらに、プロテインキナーゼ、Ｙ連鎖偽遺伝子（Ｐｒｋｙ）は、顆粒細胞中で最大レベルであり、グリア中で中程度レベル、およびバスケット細胞中で低レベルであることが観察された。
【０２８４】
対照的に、グリコゲニン２偽遺伝子１（ＧＹＧ２Ｐ１）は、男性で濃縮された遺伝子として特定された（ｐ＝３．７４Ｅ−４２）が、この遺伝子は、顆粒細胞およびグリア中よりバスケット細胞中でさらに多く男性で濃縮された。これは、重複により誤ってマッピングされたリードが原因ではない。なぜなら、グリコゲニン２（ＧＹＧ２）は、グリア中でのみ有意に発現し、性別特異的発現を示していないためである。ＧＹＧ２Ｐ１を含むＹ染色体座位の調査により、ＧＹＧ２Ｐ１および約３００ｋｂ下流の領域を含む大きな領域にわたる男性特異的バスケット細胞発現が明らかになった。近くの遺伝子の精巣特異的転写物Ｙ１５（Ｔｔｔｙ１５）およびユビキチン特異的ペプチダーゼ９、Ｙ連鎖（Ｕｓｐ９ｙ）はまた、男性で濃縮されたが、グリア、バスケット、および顆粒細胞からの結果では、細胞型特異的であることは観察されなかった。さらに、Ｙ連鎖フィンガータンパク質（Ｚｆｙ）およびＫＤＭ５Ｄはまた、男性で濃縮されることが観察されたが、細胞型特異的ではなく、また、ＸＩＳＴは、表４３では女性で濃縮されることが観察されたが、グリア、バスケット、および顆粒細胞の間では、細胞型特異的ではなかった。グリアおよび顆粒細胞の両方中で、性別および細胞型特異的発現を示す遺伝子もまた、明らかである。本明細書の結果は、哺乳動物脳における性的二型細胞特異的機能の潜在的発生源を提供する。
【０２８５】
転写は、遺伝子：配列類似性を有するファミリー８メンバーＡ４、偽遺伝子（Ｆａｍ８ａ４ｐ）、アリールスルファターゼＤ偽遺伝子１（Ａｒｓｄｐ１）、およびＧｙｇ２ｐ１に対して、男性中でのみ、および星状細胞／バスケット細胞中でのみ観察された。
【０２８６】
したがって、性別特異的遺伝子発現は、既知の個体の性別を確証することが観察され、細胞型特異的性別特異的遺伝子発現もまた観察された。
【０２８７】
実施例２０．ヒト細胞型特異的遺伝子発現に対する年齢の影響の決定
加齢研究の基本的な問題は、加齢が脳全体に均一に発生するのかどうか、またはいくつかの細胞型が加齢の影響を他の細胞型より受けやすいのかどうかということである。この問題に対処するために、３つの小脳細胞型のそれぞれにおける、年齢の遺伝子発現に対する影響を調査した。ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，５５０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を実施例１に記載のように用いて、全試料中で、年齢により、または顆粒細胞、バスケット細胞、またはグリア中で特異的に差次的に発現した（ｐ＜０．０１、倍率変化＞２に調節）遺伝子を特定した。発現差異を有する２７４個の遺伝子を顆粒細胞中で、１３９個をバスケット細胞中で、３１個をグリア中で、および４２個を細胞型に関係ない全試料で、特定した。
【０２８８】
年齢により有意に発現が変化した顆粒細胞中の２７４個の遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果を表４４に示す。各ヒト試料由来の顆粒細胞からの選別核のｌｏｇ２倍率変化を、全試料由来の顆粒細胞からの選別核の正規化発現と比較して、表４４に示す。負の値は、全ての試料由来の核全体の正規化値と比較して、対象の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表４５】
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【０２８９】
全試料中の顆粒細胞中の差次的発現遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）のＲＮＡｓｅｑ結果を、表４５に示す。
【表４６】
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【０２９０】
年齢により有意に発現が変化したバスケット細胞中の１３９個の遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果を表４６に示す。各ヒト試料由来のバスケット細胞からの選別核のｌｏｇ２倍率変化を、全試料中の顆粒細胞からの選別核の正規化発現と比較して、表４６に示す。負の値は、全ての試料由来の核全体の正規化値と比較して、対象の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表４７】
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【０２９１】
全試料中のバスケット細胞中の差次的発現遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）のＲＮＡｓｅｑ結果を、表４７に示す。
【表４８】
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【０２９２】
年齢により有意に発現が変化したグリア中の３１個の遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果を表４８に示す。各ヒト試料由来のグリア（星状膠細胞および乏突起膠細胞）からの選別核のｌｏｇ２倍率変化を、全試料由来の選別グリアからの正規化発現データと比較して、表４８に示す。負の値は、全ての試料由来の核全体の正規化値と比較して、対象の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表４９】
2020508652.tif 000505
2020508652.tif 000506
【０２９３】
全試料中のグリア細胞中の差次的発現遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）のＲＮＡｓｅｑ結果を、表４９に示す。
【表５０】
2020508652.tif 000507
【０２９４】
結果は、年齢による発現のより少ない変化を、本明細書で分析した他の臨床属性による発現差異を有する遺伝子と比べて、示した。小脳の加齢の以前の調査は、差次的発現を示すより少ない遺伝子を見つけたが、これは、特定の細胞型の核における遺伝子発現プロファイリングが、バルク組織を使用することに比べて、遙かに高い感受性をもたらすことを示唆している。
【０２９５】
実施例２１．年齢による発現差異におけるオーバーラッピングの変化
表５０に示すように、差次的発現遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）は、年齢により発現が増加するものと、発現が低減するものとの間で、ほぼ均等に分割される。表５０は、８つの群の差次的に発現した加齢遺伝子の間で共通である遺伝子の数を示す。
【表５１】
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【０２９６】
いずれかの細胞型由来の年齢で発現上昇する遺伝子と、いずれか他の細胞型由来の発現低下する遺伝子との間では、オーバーラップは認められなかった。
【０２９７】
２つ以上の細胞型中で、ほんのわずかの遺伝子の発現が、年齢により有意に変化する。例えば、全細胞型中で、年齢により差次的に発現したと特定される４２個の遺伝子は、条件間で不均質に見え、これらの内のほとんどは、各細胞型で別に試験した場合、有意性に達しない（表５１）。
【表５２】
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【０２９８】
３つの細胞型にわたる、年齢により発現差異を有する顆粒細胞中の４２個の遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果を表５２に示す。各ヒト試料由来のグリアからの選別核の発現のｌｏｇ２倍率変化を、全試料中の顆粒細胞からの選別核の正規化発現と比較して、表５２に示す。負の値は、全ての試料由来の核全体の正規化値と比較して、対象の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表５３】
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【０２９９】
バスケット細胞中の、４２個の年齢により最も差次的に発現した遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果を表５３に示す。各ヒト試料由来のバスケット細胞からの選別核のＲＮＡｓｅｑ結果間のｌｏｇ２倍率変化を、全試料由来の無選別核の正規化発現と比較して、表５３に示す。負の値は、全ての試料由来の核全体の正規化値と比較して、対象の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表５４】
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【０３００】
３つの細胞型中で、年齢により有意に発現変化したグリア細胞中の４２個の遺伝子のＲＮＡｓｅｑ結果を表５４に示す。各ヒト試料由来のグリアからの選別核のＲＮＡｓｅｑ結果間のｌｏｇ２倍率変化を、全試料由来の無選別核の正規化発現と比較して、表５４に示す。負の値は、全ての試料由来の核全体の正規化値と比較して、対象の核中で低減した発現を示し、正の値は、全ての分析された細胞型由来の核全体の正規化値と比較して、増加した発現を示す。
【表５５】
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【０３０１】
これらのデータは、少なくとも小脳における特定の分子の加齢の結果が、細胞型により異なることを示唆する。各細胞型中で加齢により影響を受けた遺伝子の差異に関わらず、これらの変化により変わった細胞プロセスが細胞型間で関連するという可能性が残された。
【０３０２】
３つ全ての細胞型中で、年齢と共に発現低下した遺伝子は、異なる特異的遺伝子の含有に関係なく、シナプス遺伝子を濃縮した。例えば、アクアポリン７（Ａｑｐ７）（ｐ調節＝３．７８Ｅ−９）および酸感受性イオンチャネルサブユニット１（Ａｓｉｃ１）（ｐ調節＝４．０７Ｅ−７）は、図１１Ａおよび図１１Ｂにそれぞれ示すように、顆粒細胞中で、年齢と共に発現低下することが観察された。図１１Ｃは、ラウンドアバウトガイダンス受容体２（Ｒｏｂｏ２）は、グリアおよびバスケットの両細胞中で発現低下したことを示した。シナプス成分をコードする遺伝子は、年齢と共に発現が低下するという知見は、以前の高齢の固体の脳中の軸索および樹状突起の萎縮という知見と一致する（Ｂｕｒｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７，ｐａｇｅｓ  ３０−４０（２００６）；Ｄｉｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，２１−３２；Ｆｒｅｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６７，１２０５−１２１２；これらのそれぞれの文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。しかし、本明細書のデータは、この一般的プロセスが各細胞型中の別の遺伝子に影響を与えることを確証するように、これらの観察を拡張する。
【０３０３】
個の仮説を試験するために、年齢と共に発現上昇または発現低下している遺伝子に対して、各細胞型でＧＯ分析を実施した。加齢による発現上昇遺伝子のいずれかの群に対する有意なＧＯカテゴリーは観察されず、「全ての細胞型」群から加齢による発現低下した遺伝子に対し特定された有意なＧＯカテゴリーもなかった。
【０３０４】
実施例２２．ヒト細胞型特異的遺伝子発現に対するストレスの影響の決定
ＦＯＳ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット（Ｆｏｓ、ｃ−ＦＯＳとしても知られる）およびＪｕｎＢ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット（Ｊｕｎｂ）などの前初期遺伝子の転写誘導は、ニューロン活性化に関連し、正常な行動反応または病理学的影響を示すことができる（Ｏｋｕｎｏ，Ｈ．（２０１１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９，１７５−１８６およびＰｅｒｅｚ−Ｃａｄａｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８９，６１−７３、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの事象と関連する前初期の応答遺伝子は多くの場合、共通であり、これらの因子により誘導される標的遺伝子および経路は、細胞または回路により経験される事象の性質を反映する（Ｄｕｃｌｏｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１，７１７、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ストレス応答は、１６個のヒト試料の内の３つで遺伝子群を誘導することが観察され、これは、人種、自己融解時間、性別、または年齢により説明されない。表５５は、全ての細胞型の正規化発現と比較して、全試料中の差次的発現遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）を示す。
【表５６】
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【０３０５】
ｃ−ＦＯＳは、１６人の個体の内の３人（ＷＩ、ＶＭ、およびＺＨ）から得られた顆粒細胞中で強く誘導されることが観察された（図１２）。この差異をさらに調査するために、発現差異（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅＭｅａｎ＞５０に調節）分析を実施し、その他個体に比べて、３人の個体中の有意に発現上昇または発現低下している追加の遺伝子を特定、すなわち、３人のｆｏｓ＋個体ｖｓその他の１３人の試料の間の顆粒細胞の遺伝子発現差異分析を実施した。表５６に示すように、個体ＷＩ、ＶＭ、およびＴＭ由来の顆粒細胞中で、２２４個の遺伝子の誘導および１０個の遺伝子の発現の低下を特徴とする非常に強力な応答が明らかであった。
【表５７】
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【０３０６】
１３６個の差次的に誘導された遺伝子（ｐ＜０．０１、ｂａｓｅ  Ｍｅａｎ＞５０に調節）を含むオーバーラッピングしているが弱い応答がグリア細胞中で存在した。結果を表５７に示す。
【表５８】
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【０３０７】
グリア中でのこれらの遺伝子の誘導は、顆粒細胞による混入に起因するものでない。理由は、顆粒細胞の高度に発現したマーカー（例えば、ＦＡＴ２）は、グリアデータ中には存在しなかったためである。グルタミン酸による誘導ｃ−ＦＯＳ発現は、培養した顆粒ニューロンの活性増加により誘導されること以外の異なる機序を介して起こると考えられた（Ｅｄｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｌｉａ  ５５，３２８−３４０、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）ので、これは興味深い。バスケット細胞データ中では、２つのみの差次的に発現した遺伝子が明らかであった：ヒートショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）メンバー１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）（ｂａｓｅ  Ｍｅａｎ：１０２．３０３、ｌｏｇ２倍率変化：−３．２３４、ｐ値：１．０７Ｅ−１２、ｐ調節：１．０６Ｅ−０８）およびリングフィンガータンパク質１２２（ＲＮＦ１２２）（ｂａｓｅ  Ｍｅａｎ：９６．８１２、ｌｏｇ２倍率変化：−１．５５２、ｐ値：４．２０Ｅ−０６、ｐ調節：０．００８）。
【０３０８】
ストレス応答は、１６個の試料の内の３つで遺伝子群を誘導することが観察され、これは、人種、自己融解時間、性別、または年齢により説明されない。遺伝子発現は、図１３Ａで、活性調節細胞骨格関連プロテイン（Ａｒｃ）、初期増殖応答因子１（Ｅｇｒ１）、ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｊｕｎ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット（Ｊｕｎ）、ＪｕｎＢ、およびＪｕｎＤ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット（ＪｕｎＤ）に対し示された。ｆｏｓ遺伝子およびストレス関連遺伝子の誘導は、主に顆粒細胞中で起こるが、グリア中でも起こるので、わずかに細胞型特異的であることが観察された。星状細胞中では、発現の変化がほとんどないことが観察された。
【０３０９】
約３５５個の遺伝子が、顆粒細胞の３つの試料中で誘導されることが観察されたが、２５個の遺伝子は、発現低下することが観察された。これらの遺伝子の多くは、ニューロン活動を標識する中間初期遺伝子であったが、図１３Ｂに示すように、誘導されている多くの長期ストレス応答遺伝子も存在した。影響を受けた遺伝子群の例には、細胞代謝プロセス、高分子の正の調節、小胞体ストレス応答、形態的に不正確なタンパク質に対する応答、タンパク質折り畳み、タンパク質リフォールディング、熱に対する細胞応答の調節、アポトーシスプロセスの調節、生物学的プロセスの正の調節、および化学的刺激に対する応答に関与するものが挙げられる。
【０３１０】
グリア中の、活性化星状膠細胞マーカーＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＭｕｓａｓｈｉ  ＲＮＡ結合タンパク質１（Ｍｓｉ１）などのストレス応答遺伝子を、図１３Ｃに示す。発現で観察された唯一の有意な変化は、ｆｏｓ核中のＧＦＡＰにおけるものであった。
【０３１１】
試料ＷＩ、ＶＭ、およびＺＨは、グリアおよび顆粒ニューロン中で誘導された、およびより低い程度で、星状ニューロン中で誘導されたｆｏｓおよびストレス応答遺伝子を有することが観察された。ｆｏｓ遺伝子の誘導発現を有することが観察された３人の個体は、彼らの臨床歴で共通点が多いようには見えなかった。データは、このストレス応答経路の再現可能な活性化を示し、これは、疾患に関連する生物学に対して詳細を提供する。
【０３１２】
顆粒細胞データで明らかな堅牢な応答を想定して、ＧＯ分析を実施し、これらのニューロン中の２２４個の誘導遺伝子が特異的機能カテゴリーに濃縮されるかどうかを判定した。有意に濃縮されたＧＯカテゴリーが、ｆｏｓ＋個体中の発現上昇遺伝子に対し特定され、ストレス応答およびタンパク質折り畳みに関与する遺伝子に対する濃縮を示した。表５８に示すように、この分析は、外部刺激に対する応答、タンパク質折り畳み／リフォールディング、アポトーシス、応力に対する転写性応答、ＡＴＰアーゼ活性、およびＲＮＡスプライシング／代謝に関連するカテゴリーを明らかにした。
【表５９】
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【０３１３】
前初期遺伝子発現の分析は、それらの誘導も選択的であることを示した。例えば、ＥＧＲ１、ＦＯＳ、およびＦＯＳＢの誘導が起こるが、ＡＲＣ（特徴がはっきりした前初期遺伝子）の発現の差異がないのは明らかである（図１２）。さらに、ｃ−ＦＯＳなどの前初期遺伝子の発現は、虚血性脳卒中などの損傷に応答して誘導できるが、脳卒中およびその他の脳への損傷に応答して星状膠細胞活性化を標識するＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂなどのグリア遺伝子の誘導に関しては証拠が見つからなかった（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８５，２３４−２４４；Ｄｉｎｇ，Ｓ．（２０１４）Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｅｇｅｎ  Ｒｅｓ  ９，２０４８−２０５２；Ｄｉｒｎａｇｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２，３９１−３９７；Ｋａｊｉｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９０９，９２−１０１；Ｐｅｋｎｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｌｉａ  ５０，４２７−４３４；これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３１４】
最後に、臨床記録の調査は、１３人の他の対照ドナーから、図１２のこれら３人の個体を識別する特徴（性別、年齢、死亡原因）を明らかにできなかった。これらの分子事象の単数または複数の原因は、不明瞭なままであるが、選択死後ヒト脳試料中のこの強力で高度な再現可能なストレス応答の発見は、潜在性臨床的状態の存在を示唆し、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術を用いた特定の細胞型の分析は、ヒトの病態生理学的状態に関連する経路およびバイオマーカーを発見するのに使用できる。
【０３１５】
実施例２３．ＲＮＡまたはＤＮＡプローブによる核の染色および選別
抗体は多くの場合、非特異的標的を有し、本明細書で記載の細胞プロファイリング技術をより多くの細胞型に広げるためには、律速になる場合がある。標識のための抗体の使用に対する代替案は、細胞型特異的核酸転写物に対するＲＮＡプローブを使用することである。ＲＮＡプローブは抗体より高速で、合成が容易である。ＲＮＡプローブは、２つのクラスの転写物に対して設計される。１つ目は、染色体関連転写物（ＣＡＴ）−合成の間に染色体で保持される転写物である。２つ目の核酸転写物のクラスは、核に隣接するＥＲ中に豊富にあるポリＡ＋転写物である。個体間の変化性を特徴付けるために、ヒトの脳のいくつかの領域由来の無選別核に対し遺伝子発現プロファイルを生成した後、候補ＣＡＴおよびポリＡ＋転写物を特定した。組織切片でインサイツハイブリダイゼーションを用いて、特定の細胞型を描写する遺伝子を、解剖学および形態学により特定した。これらの候補に対する抗体またはＲＮＡプローブを用いて、マウスデータからの予備的知識を必要とせず、ヒト細胞型由来の核を標識および選別して、集団間での遺伝子発現の変化の量を決定した。
【０３１６】
ＣＡＴは、２つの染色体合成部位に２つのスポットの特有の標識パターンを有し、これは、インサイツハイブリダイゼーションを使って、低いバックグラウンドで、高度に特異性であることが観察された。図１４は、ＣＡＴのＲＮＡｓｅｑ結果を示す。Ａ２ｍは、バーグマングリアに特異的なＣＡＴであり、Ｉｔｐｒ１は、プルキンエ細胞に特異的なＣＡＴであり、Ｆａｔ２は、顆粒細胞に特異的なＣＡＴである。したがって、細胞型特異的ＣＡＴは、全ての小脳核由来のＲＮＡｓｅｑプロファイルから検出できる。ＲＮＡプローブＲＮＡプローブおよびＦＡＣＳのための核標識の広範な知識を用いて標識したＣＡＴおよびポリＡ＋転写物のインサイツハイブリダイゼーション結果に基づいて、任意の細胞型に対するＲＮＡプローブを設計し得る。
【０３１７】
等価物および範囲
当業者なら、単に定型の実験を使うだけで、本明細書で記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの等価物を認める、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【０３１８】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、特にそれと反対の指示がない限り、または文脈から別義が明らかでない限り、１または２以上を意味してよい。１または複数のグループのメンバーの間で「ｏｒ」を含む特許請求の範囲または記述は、特にそれと反対の指示がない限り、または文脈から別義が明らかでない限り、１、２以上、または全てのグループメンバーがその中に存在する、その中で用いられる、または、所与の製品もしくはプロセスに他の点で関連する場合に満たされると見なされる。本発明は、グループの１メンバーがその中に存在する、その中に用いられる、または、所与の製品もしくはプロセスに他の点で関連する実施形態を含む。本発明は、１以上または全グループメンバーがその中に存在する、その中に用いられる、または、所与の製品もしくはプロセスに他の点で関連する実施形態を含む。
【０３１９】
用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンタームであることが意図されており、追加の要素またはステップを含むことを許容するが、必要とはしないことにも留意されたい。用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語も包含され、開示される。
【０３２０】
範囲が与えられる場合、端点が包含される。さらに、別段の指示がない限り、あるいは文脈および当業者の理解により明らかでない限り、範囲で表される値は、文脈により明確に別義が示されない限り、その範囲の下限値の単位の１０分の１まで、本発明の別の実施形態で示した範囲内の任意の特定の値または部分範囲を取ることができることを理解されたい。
【０３２１】
さらに、先行技術の範囲内に入る本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のいずれか１項または複数から明示的に除外され得ることを理解されたい。このような実施形態は、当業者に既知であると見なされるので、それらは、たとえ本明細書で除外が明示的に記載されない場合であっても、除外され得る。本発明の組成物（例えば、任意の抗生物質、治療薬または有効成分；任意の製造方法；任意の使用方法；など）の任意の特定の実施形態は、何らかの理由により、先行技術の存在に関連のあるなしに関係なく、特許請求の範囲のいずれか１項または複数から除外できる。
【０３２２】
使用されている語句は、限定の語句ではなく、説明用の語句であり、また、変更は、そのより広い態様において、本発明の真の範囲および趣旨からを逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施し得る。
【０３２３】
本発明は、かなり詳しく、また、いくつかの記載実施形態に関してかなり詳細に説明してきたが、いずれかのこのような詳細事項または実施形態に限定されることを意図するものではなく、先行技術を考慮して特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を与えるように、したがって、本発明の意図した範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2020508652.tif 000543
【図５Ｂ】
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【図６】
2020508652.tif 000545
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2020508652.tif 000549
【図８】
2020508652.tif 000550
【図９】
2020508652.tif 000551
【図１０】
2020508652.tif 000552
【図１１Ａ】
2020508652.tif 000553
【図１１Ｂ】
2020508652.tif 000554
【図１１Ｃ】
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【図１２】
2020508652.tif 000556
【図１３Ａ】
2020508652.tif 000557
【図１３Ｂ】
2020508652.tif 000558
【図１３Ｃ】
2020508652.tif 000559
【図１４】
2020508652.tif 000560
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月29日(2018.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2020508652.tif 000561
【図２Ａ】
2020508652.tif 000562
【図２Ｂ】
2020508652.tif 000563
【図３Ａ】
2020508652.tif 000564
【図３Ｂ】
2020508652.tif 000565
【図４】
2020508652.tif 000566
【図５Ａ】
2020508652.tif 000567
【図５Ｂ】
2020508652.tif 000568
【図６】
2020508652.tif 000569
【図７Ａ】
2020508652.tif 000570
【図７Ｂ】
2020508652.tif 000571
【図７Ｃ】
2020508652.tif 000572
【図７Ｄ】
2020508652.tif 000573
【図８】
2020508652.tif 000574
【図９】
2020508652.tif 000575
【図１０】
2020508652.tif 000576
【図１１Ａ】
2020508652.tif 000577
【図１１Ｂ】
2020508652.tif 000578
【図１１Ｃ】
2020508652.tif 000579
【図１２】
2020508652.tif 000580
【図１３Ａ】
2020508652.tif 000581
【図１３Ｂ】
2020508652.tif 000582
【図１３Ｃ】
2020508652.tif 000583
【図１４】
2020508652.tif 000584
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月1日(2019.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020508652000001.app
【国際調査報告】
2020508652.tif 000585
2020508652.tif 000586
2020508652.tif 000587