(57)【要約】  二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合する抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体、および抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の重鎖のＣＨ３ドメインに融合したＴ細胞標的化ドメインを含み、Ｔ細胞標的化ドメインは、Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合し、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体が減少したエフェクター機能を有するように、エフェクター結合部位において突然変異を含む。Ｔ細胞標的化ドメインは、抗ＣＤ３抗体からのＳｃＦｖまたはＦａｂである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体であって、
Ｇｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合する抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体、および
前記抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の重鎖のＣＨ３ドメインに融合したＴ細胞標的化ドメインを含み、
前記Ｔ細胞標的化ドメインは、Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合し、
前記抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、前記二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体が減少したエフェクター機能を有するように、エフェクター結合部位において突然変異を含む
二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項２】
前記Ｔ細胞標的化ドメインは、ＳｃＦｖまたはＦａｂである
請求項１に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項３】
前記ＳｃＦｖまたはＦａｂは、抗ＣＤ３抗体に由来する
請求項２に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項４】
前記エフェクター結合部位における前記突然変異は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含む
請求項１に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項５】
前記エフェクター結合部位における前記突然変異は、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異を含む
請求項１に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項６】
第１の重鎖のＣＨ３ドメイン中のノブ構造および第２の重鎖のＣＨ３ドメイン中のホール構造をさらに含む
請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項７】
前記ノブ構造は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異により形成されており、かつ、前記ホール構造は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異により形成されている
請求項６に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項８】
前記抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、ＨＣＤＲ１（ＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ、配列番号：１）、ＨＣＤＲ２（ＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ、配列番号：２、Ｘは任意のアミノ酸である）、およびＨＣＤＲ３（ＧＥＴＦＤＳ、配列番号：３）からなる３つの相補性領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１（ＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ、配列番号：４、Ｘ’は、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、Ｚは、Ｃ、Ｇ、ＳまたはＴである）、ＬＣＤＲ２（ＷＡＳＤＲＳＦ、配列番号：５）、およびＬＣＤＲ３（ＱＱＨＬＤＩＰＹＴ、配列番号：６）からなる３つの相補性領域を有する軽鎖可変ドメインを含み得る
請求項６に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体。
【請求項９】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈの過剰発現と関連付けられるがんを治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を含む
医薬組成物。
【請求項１０】
前記がんは、上皮起源のがんである
請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記がんは、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、または前立腺がんである
請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体操作、特に、がん療法のための非対称ヘテロ二量体二重特異的抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、六糖（Ｆｕｃ−α１→２Ｇａｌ−β１→３Ｇａｌ−ＮＡｃ−β１→３Ｇａｌ−α１→４Ｇａｌ−β１→４Ｇｌｃβ１−）であり、乳がん、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、および前立腺がん細胞などの様々な上皮がん細胞の表面上で過剰発現される。したがって、Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、有望な診断／治療標的である。
【０００３】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対する抗体は有用であるが、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用する改善された治療剤の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、Ｔ細胞標的化（例えば、抗ＣＤ３）ドメインを含有する二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体およびがん療法におけるそれらの使用に関する。
【０００５】
本発明の一態様は、二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体に関する。本発明の一実施形態による二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合する抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体；および抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の重鎖のＣＨ３ドメインに融合したＴ細胞標的化ドメインを含み、Ｔ細胞標的化ドメインは、Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合し；かつ、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体が減少したエフェクター機能を有するように、エフェクター結合部位において突然変異を含む。
【０００６】
本発明の一部の実施形態によれば、二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、Ｔ細胞標的化ドメインを有してよく、Ｔ細胞標的化ドメインは、ＳｃＦｖまたはＦａｂであってよく、ＳｃＦｖまたはＦａｂは、抗ＣＤ３抗体に由来してよい。
【０００７】
本発明の一部の実施形態によれば、エフェクター結合部位における突然変異は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異またはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異を含み得る。
【０００８】
二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体はまた、ＣＨ３ドメインにおける突然変異により生成されるノブ−アンド−ホール構造を有する非対称ヘテロ二量体重鎖を含み得る。これらの突然変異は、ノブアームについてＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、ならびにホールアームについてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み得る。
【０００９】
本発明の他の態様は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施形態によるＳｃＦｖ抗ＣＤ３融合物を含有する非対称二量体二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の例を説明する構成図を示す。
【００１１】
【図２】図２は、本発明の実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有するホールアームのヌクレオチド配列を示す。
【００１２】
【図３】図３は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有するホールアームのヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
【図４】図４は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突然変異を有するノブアームのヌクレオチド配列を示す。
【００１４】
【図５】図５は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有するノブアームのヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
【図６】図６は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有するホールアームのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
【図７】図７は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有するノブアームのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
【図８】図８は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有するホールアームのアミノ酸配列を示す。
【００１８】
【図９】図９は、本発明の一実施形態による抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有するノブアームのアミノ酸配列を示す。
【００１９】
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態によるリンカーのヌクレオチド配列を示す。
【００２０】
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態による抗ＣＤ３  ＳｃＦｖのヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態によるリンカーのアミノ酸配列を示す。
【００２２】
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態による抗ＣＤ３  ＳｃＦｖのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
【図１４】図１４は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、本発明の実施形態にしたがってヒトＰＢＭＣの存在下でＧｌｏｂｏ  Ｈ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
【００２４】
【図１５】図１５は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、本発明の実施形態にしたがってヒトＴ細胞の存在下でＧｌｏｂｏ  Ｈ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
【００２５】
【図１６】図１６は、ＣＨ２ドメイン中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７ＡのＦｃ突然変異が、本発明の実施形態にしたがって抗体媒介性補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を完全に阻害したことを示す。
【００２６】
【図１７】図１７は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導される非特異的Ｔ細胞活性化およびＩＬ−２産生が、本発明の一実施形態にしたがってＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異体において完全に減少したことを示す。
【００２７】
【図１８】図１８は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導される非特異的Ｔ細胞活性化およびＴＮＦ−α産生が、本発明の一実施形態にしたがって完全に減少したＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異体であったことを示す。
【００２８】
【図１９】図１９は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導される非特異的Ｔ細胞活性化およびＩＦＮ−γ産生が、本発明の一実施形態にしたがってＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異体において完全に減少したことを示す。
【００２９】
【図２０】図２０は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導される非特異的Ｔ細胞活性化およびパーフォリン産生が、本発明の一実施形態にしたがってＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異体において完全に減少したことを示す。
【００３０】
【図２１】図２１は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導される非特異的Ｔ細胞活性化およびグランザイムＡ産生が、本発明の一実施形態にしたがってＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異体において完全に減少したことを示す。
【００３１】
【図２２】図２２は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導される非特異的Ｔ細胞活性化およびグランザイムＢ産生が、本発明の一実施形態にしたがってＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異体において完全に減少したことを示す。
【００３２】
【図２３】図２３は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、本発明の一実施形態にしたがって腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつＩＬ−２産生を誘導することを示す。
【００３３】
【図２４】図２４は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、本発明の一実施形態にしたがって腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつＴＮＦ−α産生を誘導することを示す。
【００３４】
【図２５】図２５は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、本発明の一実施形態にしたがって腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつＩＦＮ−γ産生を誘導することを示す。
【００３５】
【図２６】図２６は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、本発明の一実施形態にしたがって腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつパーフォリン産生を誘導することを示す。
【００３６】
【図２７】図２７は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、本発明の一実施形態にしたがって腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつグランザイムＡ産生を誘導することを示す。
【００３７】
【図２８】図２８は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、本発明の一実施形態にしたがって腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつグランザイムＢ産生を誘導することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の実施形態は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対する二重特異的非対称抗体およびがんの治療におけるこれらの抗体の使用に関する。非対称抗体は、同一でない２つの重鎖を含有する。重鎖の１つはノブアームとして機能し、他の重鎖は、ノブを収容できるホールアームとして機能する。ノブおよびホール構造は、重鎖の第３の定常ドメインＣＨ３において（例えば、部位特異的突然変異生成により）操作され得る。ノブおよびホールの相補性は、非対称抗体の形成を促進する。（Ａ．Ｍ．  Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ，”  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９８，  １６：６７７−８１；  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０７９８−６７７）。
【００３９】
本発明の非対称ヘテロ二量体二重特異的抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合する可変ドメインを含有する。加えて、これらの抗体はそれぞれ、Ｔ細胞上の抗原を標的化する抗体（例えば、抗ＣＤ３）のＳｃＦｖまたはＦａｂ断片を含有する。したがって、本発明の抗体は、二重特異的抗体であり、すなわち、１つのドメインはＧｌｏｂ  Ｈに特異的に結合し、他のドメインはＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合する。Ｔ細胞を特異的に標的化する結合ドメイン（例えば、ＳｃＦｖまたはＦａｂ断片）を有することにより、これらの抗体は、Ｔ細胞動員能力を備えて、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を促進する。これらの抗体はＧｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合するので、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が上皮起源のがんのようなＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原を発現する細胞に方向付けられることを確実にすることができる。
【００４０】
さらには、Ｔ細胞の細胞傷害性がＧｌｏｂｏ  Ｈ発現細胞に特異的に方向付けられることを確実にするために、これらの抗体のエフェクター機能は、サイレンシングまたは低減され得る。抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のような抗体エフェクター機能は免疫療法において望ましいが、これらのエフェクター機能は、本発明の二重特異的抗体では望ましくない。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、本発明の二重特異的抗体は、Ｔ細胞に方向付けられた結合ドメイン（図１のＳｃＦｖ  ｏｐｔＦ１）を含有するとともに、抗体可変ドメインは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈを発現する細胞（例えば、がん細胞）に特異的に結合する。同じ分子上の２つの特異的結合ドメインは、Ｔ細胞がＧｌｏｂｏ  Ｈを発現する標的細胞に運ばれることを確実にする。本発明の二重特異的抗体のエフェクター機能がインタクトな場合、ＮＫ細胞は、（ＮＫ細胞上のＦｃＲを介して）抗体のＦｃ部分のエフェクター機能部位（ヒンジおよびＣＨ２ドメインに位置する）に結合できるとともに、抗ＣＤ３ドメイン（例えば、ＳｃＦｖまたはＦａｂ）は、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する。これが起こる場合、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞に対する細胞傷害性を媒介し得る。これは逆向きの効果となる。加えて、エフェクター機能は、エフェクター機能を有しない本発明の二重特異的抗体により誘導される細胞傷害性より特異性が低いＡＤＣＣまたはＣＤＣを生じさせ得る。
【００４２】
エフェクター機能を低減させるためのいくつものアプローチが先行技術において開示されており、これには、グリカン修飾、エフェクター細胞上の受容体とあまり相互作用しないＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４サブタイプの使用、二重特異的抗体のエフェクター相互作用部位（すなわち、下部ヒンジまたはＣＨ２ドメイン）における突然変異が含まれる。
【００４３】
本発明の実施形態によれば、抗体は、エフェクト結合部位において部位特異的突然変異生成によりＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を低減または減少させるように改変され得る。一例では、ノブアームおよび／またはホールアームのＣＨ２ドメイン中の位置２３４および２３５におけるアミノ酸残基は、ロイシンからアラニンへと改変される。別の例では、ノブアームおよび／またはホールアームのＣＨ２ドメイン中の位置２３５および２３７におけるアミノ酸残基は、ロイシンおよびグリシンからアラニンへと改変される。
【００４４】
突然変異したエフェクター結合部位を有する場合、そのような抗体は、エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）を動員する可能性がより低くなり、したがって、そのような二重特異的抗体は、それ自体でＡＤＣＣまたはＣＤＣ応答を誘発しない（または誘発する可能性が低い）。代わりに、Ｔ細胞エンゲージメントおよび活性化は、標的細胞の表面上に発現される抗原への本発明の抗体の結合に依存し、それにより、標的化療法の効率を増加させかつ望ましくない副作用を低減させる。
【００４５】
本発明の実施形態によれば、非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ融合抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体（すなわち、そのＦｃドメインが抗ＣＤ３  ｓｃＦｖまたはＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２に連結した抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体）は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体重鎖の分子操作により生成され得る。非対称二量体を作製するために、重鎖のＣＨ３ドメインは、ノブ構造またはホール構造を生成するように改変され得る。ノブおよびホール構造の相補性は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する。そのようなノブおよびホール構造の生成方法は、当該技術分野において公知である。
【００４６】
本発明の実施形態によれば、Ｆｃヘテロ二量体化を増進させるために、位置３５４および３６６におけるノブアームのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからシステインおよびトリプトファンへとそれぞれ改変されてよく、かつ、位置３４９、３６６、３６８および４０７におけるホールアームのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、チロシン、スレオニン、ロイシンおよびチロシンからシステイン、セリン、アラニンおよびバリンへとそれぞれ改変されてよい。（Ａ．Ｍ．  Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ，”  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９８，  １６：６７７−８１；  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０７９８−６７７）。この例は、ヘテロ二量体抗体へ向けたノブ−イントゥー−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）のアプローチを説明するが、当該技術分野において公知の他の方法もまた本発明の範囲から離れることなく使用することができる。（例えば、Ａ．  Ｔｕｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  
ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｖｉｄｉｔｙ，”  ＭＡｂｓ，  ２０１６  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；  ８（４）：８２８−８３８；  ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１１６０１９２．を参照。）
【００４７】
加えて、Ｔ細胞標的化ドメイン（例えば、ＳｃＦｖまたはＦａｂ断片）は、Ｃ末端において重鎖のノブアームまたはホールアームのいずれかに融合され得る。そのような融合タンパク質は、ＰＣＲのような当該技術分野において公知の分子クローニング技術を使用して容易に生成することができる。Ｔ細胞標的化ドメインは、ＣＤ３のようなＴ細胞の抗原（または表面マーカー）に特異的に結合する抗体に由来し得る。本発明の実施形態によれば、Ｔ細胞標的化ドメインは、抗ＣＤ３抗体に由来するＳｃＦｖまたはＦａｂ断片であり得る。
【００４８】
さらには、ノブアームおよびホールアームの両方のＣＨ２ドメインにおいてエフェクター結合に関与するアミノ酸残基は、エフェクター結合を除去または低減させ、それによりＡＤＣＣまたはＣＤＣを最小化または防止するように改変され得る。例えば、位置２３４および２３５における残基は、ロイシンからアラニンへと改変されてよく、または位置２３５および２３７におけるアミノ酸残基は、ロイシンおよびグリシンからアラニンへと改変されてよく、それにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび非特異的エフェクター細胞機能を減少させ得る。
【００４９】
ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの操作の組合せを用いて、本発明の抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ発現標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞にエンゲージメントして活性化させて（ａｃｔｉｖｅ）、免疫細胞によるサイトカインの他にパーフォリンおよびグランザイムの産生を誘導することができる。したがって、Ｔ細胞にエンゲージメントして非対称ヘテロ二量体抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂにより腫瘍を標的化することの治療的安全性のウインドウは有意に増加する。
【００５０】
図１は、従来のノブ−イントゥー−ホールヘテロ二量体抗体と比較して本発明のヘテロ二量体二重特異的抗体を説明する構成図を示す。図１に示すように、本発明の実施形態によれば、Ｆｃヘテロ二量体化を増進させるために、位置３５４および３６６におけるノブアームＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからシステインおよびトリプトファンへとそれぞれ改変されてよく、かつ、位置３４９、３６６、３６８および４０７におけるホールアームＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、チロシン、スレオニン、ロイシンおよびチロシンからシステイン、セリン、アラニンおよびバリンへとそれぞれ改変される。
【００５１】
本発明の実施形態は、図１に示されるＳｃＦｖ  ｏｐｔＦ１（抗ＣＤ３抗体に由来する）のような、その１つがＴ細胞を特異的に標的化する２つの異なる抗原結合ドメインを含有する非対称抗体（ヘテロ二量体抗体）を含む二重特異的抗体である。
【００５２】
本発明の実施形態は、非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ（ＡＨＦＳ）または非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−Ｆａｂ（ＡＨＦＦ）融合抗体フォーマットの形態の二重特異的抗体であり得る。本発明の実施形態によれば、ＳｃＦｖまたはＦａｂ断片は、抗体のノブアームおよび／またはホールアームのいずれかと融合され得る。図１において、ＫＴは、Ｔ細胞標的化ドメインがノブアームにテザー連結されていることを指し示すとともに、ＨＴは、Ｔ細胞標的化ドメインがホールアームにテザー連結されていることを指し示す。本発明の一部の実施形態によれば、二重特異的抗体は、ノブおよびホールアームの両方にＴ細胞標的化ドメインを有し得る、すなわち、ＫＴ＋ＨＴである。
【００５３】
本発明の抗体は、様々な発現コンストラクト（ベクター）を用いて得られ得る。発現ベクターは、ＣＨＯ細胞、２９３細胞などのような抗体発現のための任意の好適な細胞にトランスフェクトされ得る。抗体の発現および精製の方法は、当該技術分野において公知である。
【００５４】
本発明の実施形態を以下の特定の実施例により説明する。当業者は、これらの実施例は、説明のために過ぎず、本発明の範囲から離れることなく他の改変およびバリエーションが可能であることを理解する。様々な分子生物学技術、ベクター、発現系、タンパク質精製、抗体−抗原結合アッセイなどは、当該技術分野において周知であり、詳細に繰り返さない。
【実施例】
【００５５】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の調製
本発明の二重特異的抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するモノクローナル抗体から開始して生成することができる。本発明の実施形態によれば、モノクローナル抗体の生成のための一般的方法は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることを含む。
【００５６】
モノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野において公知であり、ここでは詳細に述べない。簡潔に述べれば、マウスを適切なアジュバントと共に抗原（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ）に負荷する。次に、免疫化マウスの脾臓細胞を回収し、骨髄腫と融合させた。ＥＬＩＳＡのような任意の公知の方法を使用して、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに結合する能力について陽性クローンを同定することができる。
【００５７】
本発明の実施形態によれば、抗体の配列が決定され、該配列が、ノブおよびホール構造を生成するための突然変異の他に、エフェクター機能を低減させまたはサイレンシングするための突然変異の基礎として使用される。簡潔に述べれば、例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して、ハイブリドーマのトータルＲＮＡを単離した。次に、例えば、第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）およびオリゴ（ｄＴ）２０プライマーまたはＩｇ−３’定常領域プライマーを使用して、トータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。免疫グロブリン遺伝子の重鎖および軽鎖配列を次にｃＤＮＡからクローニングした。クローニングでは、適切なプライマー、例えばＩｇ−５’プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するＰＣＲを使用することができる。ＣｌｏｎｅＪｅｔ（商標）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してＰＣＲ生成物を直接的に好適なベクター（例えば、ｐＪＥＴ１．２ベクター）中にクローニングすることができる。ｐＪＥＴ１．２ベクターは致死性の挿入を含有し、所望の遺伝子がこの致死性領域にクローニングされた時にのみ選択条件を生き延びる。これは組換えコロニーの選択を促進する。最後に、組換えコロニーを所望のクローンについてスクリーニングし、それらのクローンのＤＮＡを単離し、シークエンシングした。ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＩＧＭＴ）のウェブサイトにおいて免疫グロブリン（ＩＧ）ヌクレオチド配列を解析することができる。ＣＤＲ配列の解析は、Ｋａｂａｔのアプローチ、または類似のアプローチに基づくことができる。
【００５８】
ｍＡｂが得られたら、マウスｍＡｂをヒト化するか、または完全ヒト抗体にすることができる。ヒト化抗体およびヒト抗体の製造手順は当該技術分野において公知である。加えて、部位特異的突然変異生成により抗体をさらに最適化することができる。例えば、アラニンスキャニングを行って、抗体−抗原結合のために必須または非必須のＣＤＲ中のアミノ酸残基を同定することができる。ＣＤＲ配列および／またはフレームワーク領域中の突然変異体をスクリーニングすることにより結合のさらなる最適化を行うことができる。これらの実験を行うことにより、高いアビディティでＧｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合できるいくつもの抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を我々は同定した。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、ＨＣＤＲ１（ＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ、配列番号：１）、ＨＣＤＲ２（ＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ、配列番号：２、Ｘは任意のアミノ酸である）、およびＨＣＤＲ３（ＧＥＴＦＤＳ、配列番号：３）からなる３つの相補性領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１（ＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ、配列番号：４、Ｘ’は、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、Ｚは、Ｃ、Ｇ、ＳまたはＴである）、ＬＣＤＲ２（ＷＡＳＤＲＳＦ、配列番号：５）、およびＬＣＤＲ３（ＱＱＨＬＤＩＰＹＴ、配列番号：６）からなる３つの相補性領域を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。
ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの突然変異生成
【００６０】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体配列は、ＰＣＲを使用するもののような当該技術分野において公知の技術を使用する部位特異的突然変異生成の基礎として使用される。所望の突然変異体クローンは、シークエンシング解析を用いて確認することができる。
【００６１】
上記のように、本発明の二重特異的抗体は、好ましくは、非対称二量体である。好ましくは、これらの非対称二量体は、ノブ−イントゥー−ホールのアプローチに基づく。例えば、ホールアームを生成するために、重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を含むように改変することができる。あるいは、重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列を、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を含むように改変することができる。
【００６２】
図２は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有する例示的なホールアームのヌクレオチド配列を示し、図３は、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有する例示的なホールアームのヌクレオチド配列を示す。これらの突然変異体は、ＣＨ３ドメイン中のノブ−イントゥー−ホール突然変異（残基３４９、３６６、３６８、および４０７）の他に、ＣＨ２ドメイン中のエフェクター結合部位突然変異（残基２３４、２３５、および２３７）の突然変異を含有する。これらは例示的なものに過ぎないことに留意されたい。当該技術分野において公知の類似の突然変異もまた、本発明の範囲から離れることなく使用できることを当業者は理解する。
【００６３】
例えば、追加の突然変異体としては、以下を挙げることができる。ノブアームを生成するために、重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を含むように改変することができる。あるいは、重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列を、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を含むように改変することができる。
【００６４】
図４は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有する例示的なノブアームのヌクレオチド配列を示し、図５は、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有する例示的なノブアームのヌクレオチド配列を示す。
【００６５】
当業者は、ＣＨ２およびＣＨ３中の突然変異をスワッピング、すなわち、ミックス−アンド−マッチしてもよいことを理解する。例えば、図６は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有する例示的なホールアームのアミノ酸配列を示し、図７は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有する例示的なノブアームのアミノ酸配列を示す。あるいは、図８は、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有する例示的なホールアームのアミノ酸配列を示し、図９は、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有する例示的なノブアームのアミノ酸配列を示す。
二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３抗体の生成
【００６６】
本発明の二重特異的抗体はそれぞれ、Ｔ細胞標的化ドメインを含有する。例えば、Ｔ細胞標的化ドメインは、ＣＤ３を標的化し得る。例えば、本発明の二重特異的抗体を調製するために、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ（またはＦａｂ）を抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体のＣ末端に融合させることができる。抗ＣＤ３  ＳｃＦｖと抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体のＣＨ３ドメインとの間にリンカーを使用することができる。短いペプチドリンカー（例えば、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ；配列番号：７）のような任意の好適なリンカーを本発明の実施形態と共に使用することができる。
【００６７】
図１０は、リンカーの一例のヌクレオチド配列を示し、図１１は、抗ＣＤ３（ＯＫＴＦ１）のＳｃＦｖのヌクレオチド配列を示し、図１２および図１３は、対応するアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００６８】
これらの抗体の生成は、常用の分子生物学技術のみを必要とする。一例として、（１）ＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩ消化と共に、ＰＣＲ増幅した、合成ノブアーム遺伝子、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、ならびにホールアーム遺伝子、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体発現ベクターへのサブクローニングにより、ノブアームおよびホールアームを生成した。
【００６９】
（２）リンカー−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ遺伝子断片を用いる合成ノブアーム−リンカーまたはホールアーム−リカー（ｌｉｋｅｒ）遺伝子断片のアセンブリーＰＣＲにより抗ＣＤ３  ＳｃＦｖと融合したノブアームまたはホールアームを生成し、アセンブルしたＤＮＡを、ＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩ消化後に抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体発現ベクターにサブクローニングした。
【００７０】
（３）例えば、２３４Ａおよび２３５Ａ突然変異または２３５Ａおよび２３７Ａ突然変異を有する合成遺伝子断片のアセンブリーＰＣＲによりＣＨ２ドメインの突然変異を生成し、アセンブルしたＤＮＡを、ＮｈｅＩおよびＭｆｅＩ消化後に抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体発現ベクターにサブクローニングした。
抗体の発現および精製
【００７１】
抗体産生のために、ＣＨＯまたはＦ２９３細胞のような任意の好適な細胞中で様々なクローンを発現させることができる。一例として、Ｆ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ｍＡｂ発現プラスミドをトランスフェクトし、７日間培養した。プロテインＡ親和性カラム（ＧＥ）を使用して培養培地から抗Ｇｏｂｏ  Ｈ抗体を精製することができる。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を決定し、当該技術分野において公知の手順を使用してまたは製造業者の説明書にしたがって１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析することができる。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣのような当該技術分野において公知の技術を用いて本発明の様々な抗体を分析することができる。例えば、４〜１２％の非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルならびにその後のクマシーブリリアントブルー染色を使用することにより二重特異的抗体試料の溶液を分析することができる。
結合親和性
【００７３】
Ｂｉａｃｏｒｅのような当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて本発明の抗体の結合親和性を評価することができる。
【００７４】
簡潔に述べれば、結合速度論試験のために抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈのフロー溶液を調製した。リガンドＧｌｏｂｏ  ＨをＣＭ５チップに固定化した。最初に、リガンド（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−アミン）を固定化緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中に６μｇ／ｍＬまで希釈した。５μＬ／分の流速を使用する２５℃での一般の固定化。固定化用の試薬はアミンカップリングキット中に提供される。活性化：ＥＤＣ／ＮＨＳ、７分。固定化：フロー時間７２０秒。失活：１．０Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．５、７分。この手順は、センサーチップＣＭ５上の応答結合レベル約２００ＲＵを結果としてもたらすはずである。
【００７５】
次に、単一サイクル速度論アッセイを以下の通りに行った：Ｂｉａｃｏｒｅ単一サイクル速度論（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｙｃｌｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ；ＳＣＫ）法は速度論データを得るためのソフトウェアを備える。Ｒｕｎ：Ｍｅｔｈｏｄを選択する。パラメーターを以下の通りに設定する：データ収集速度：１Ｈｚ、検出モード：デュアル、温度：２５℃、濃度単位：ｎＭ、緩衝液Ａ：ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液。Ｓｔａｒｔ  ｕｐを選択し、複製数を３に変更する。Ｓｔａｒｔｕｐ  ｃｙｃｌｅを選択し、パラメーターを以下の通りに設定する：種類：低試料消費、接触時間：１５０秒、解離時間：４２０秒、流速：５０μＬ／分、流路：両方。Ｓａｍｐｌｅ  ｃｙｃｌｅを選択し、パラメーターを以下の通りに設定する：種類：単一サイクル速度論、濃度／サイクル：５、接触時間：１５０秒、解離時間：４２０秒、流速：５０μｌ／分、流路：両方。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを選択し、パラメーターを以下の通りに設定する：再生溶液：１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０／１．５（ｖ／ｖ＝１）、接触時間：４５秒、流速：３０μＬ／分、流路：両方。Ｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅを選択し、パラメーターを上記のように設定する。試料を調製する：アナライト抗体をランニングバッファー中に２００ｎＭまで希釈する。２００ｎＭの試料から濃度系列を調製する：２００ｎＭの溶液（２００μＬ）を２００μＬのランニングバッファーと混合して１００ｎＭの溶液を得る。希釈系列を続けて以下を得る：２００、１００、５０、２５および１２．５ｎＭ。試料を調製し、Ｒａｃｋ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓにしたがって試料を位置決めする。Ｐｒｅｐａｒｅ  Ｒｕｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌにしたがって全てが正しいことを確実にし、Ｓｔａｒｔをクリックして実験を開始する。予め定義されたモデル（１：１の結合）を使用する親和性結合曲線フィットはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０により提供される。
抗体媒介性ＡＤＣＣアッセイ：
【００７６】
当該技術分野において公知の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のための任意のプロトコールを本発明の実施形態と共に使用することができる。例えば、エフェクター細胞、例えばヒトＰＢＭＣ細胞をＧｌｏｂｏ  Ｈ過剰発現ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１４２８−ＧＦＰ上のＢｓＡｂと１０：１のＥ／Ｔ比（エフェクター対標的比）で７２時間インキュベートした。ＢｓＡｂの陰性対照としてＰＢＳを使用した。細胞のＧＦＰ面積（μｍ２）により細胞生存能力を測定し、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６０００（ＧＥ）によるＤｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．９．２を用いて解析した。実験では、健常ボランティアからのＰＢＭＣ細胞を使用した。実験プロトコールは以下の通りである。
【００７７】
ＨＣＣ１４２８−ＧＦＰ細胞を好適な培養培地中、加湿インキュベーター中３７℃で５％のＣＯ２の雰囲気下で前培養した。全ての細胞株を少なくとも３継代数にわたり継代培養し、細胞を９６ウェル黒色平底プレートにプレーティングし（全ての細胞株について１０，０００細胞／１００μｌ／ウェル）、５％のＣＯ２の湿潤雰囲気下３７℃で終夜接着させた。
【００７８】
抗ＣＤ３二重特異的抗体を含むＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈの溶液を調製し、細胞播種の２４時間後に適切な作用濃度に希釈する。ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３溶液のアリコートを細胞培養物に加えて、２０ｎＭおよび１００ｎＭを達成し、細胞を７２時間インキュベートした。ＰＢＭＣまたはＴ細胞を標的細胞に対して１０：１の比でエフェクター細胞として使用する。０時間および７２時間の時点で緑色蛍光について細胞を調べる。細胞のＧＦＰ面積（μｍ２）により細胞生存能力を測定した。
【００７９】
図１４は、エフェクター細胞としてＰＢＭＣを使用したこの実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体がＰＢＭＣの存在下でＧｌｏｂｏ  Ｈ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。予想される通り、野生型（すなわち、エフェクター機能をサイレンシングするための突然変異を有しない）ＡＨＦＳは、抗ＣＤ３融合物ありまたはなしで、がん細胞を殺傷することができるが、抗ＣＤ３を有するものはより効果的である。これらの野生型抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能を保持する。
【００８０】
対照的に、エフェクター部位突然変異体（エフェクター機能を有しない）は、抗ＣＤ３ドメインなしでがん細胞を殺傷することができず、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能が損なわれたことを指し示す。他方、抗ＣＤ３ドメインを有する抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能の非存在下でさえもがん細胞を殺傷することができる。すなわち、ｍｕｔ２３４−２３５またはｍｕｔ２３５−２３７を有する場合、テザー連結された抗ＣＤ３（Ｋ＋ＨＴおよびＫＴ＋Ｈ）を有する抗体はがん細胞の殺傷において効果的であるが、（Ｋ＋Ｈ）を有しないものはそうではない。
【００８１】
図１４に示される結果は、最小のエフェクター機能を有するか、またはエフェクター機能を有しないように本発明のＡＨＦＳを操作することにより、望ましくないＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能を回避できることを明確に示す。しかしながら、Ｔ細胞標的化ドメインを有する場合、これらの抗体は、Ｔ細胞特異的細胞傷害性によりがん細胞を殺傷する能力を有する。本発明の実施形態は、非特異的なＡＤＣＣまたはＣＤＣ細胞傷害性を有しないが、Ｔ細胞特異的細胞傷害性を保持するようにＧｌｏｂｏ  Ｈに対する二重特異的抗体を操作できることを明確に実証する。
【００８２】
図１５は、エフェクター細胞としてＴ細胞を使用した類似の実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体がＧｌｏｂｏ  Ｈ発現乳がん細胞ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。対照的に、Ｔ細胞標的化ドメインの非存在下で、野生型（すなわち、エフェクター機能をサイレンシングするための突然変異を有しない）およびエフェクター部位突然変異体（ｍｕｔ２３４−２３５またはｍｕｔ２３５−２３７）ＡＨＦＳの両方は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させることができず、したがって、それらはがん細胞を殺傷することができない。
【００８３】
図１５に示される結果は、本発明のＡＨＦＳ抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が特異的な方式でＴ細胞にエンゲージメントして活性化させ、それにより非特異的なＡＤＣＣを回避できることを明確に示す。
抗体媒介性ＣＤＣアッセイ
【００８４】
当該技術分野において公知の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のための任意のプロトコールを本発明の実施形態と共に使用することができる。例えば、補体、４０％のＮＨＳ（ｖ：ｖ）を、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ過剰発現ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１４２８−ＧＦＰ上の本発明の二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）と１２時間インキュベートした。ＢｓＡｂの陰性対照としてＰＢＳを使用した。詳細な細胞培養条件は、上記に概要を述べた通りであった。細胞のＧＦＰ面積（μｍ２）により細胞生存能力を測定し、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６０００（ＧＥ）によるＤｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．９．２を用いて解析した。実験は、健常ボランティアからのＮＨＳを使用して行った。
【００８５】
図１６は、この実験からの結果を示す。野生型抗体（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をサポートすることができる。対照的に、エフェクター機能をサイレンシングするための突然変異をエフェクター結合部位に有するエフェクター部位突然変異体（ｍｕｔ２３４／２３５およびｍｕｔ２３５／２３７）は、Ｔ細胞標的化ドメインが存在するか否かにかかわらず、ＣＤＣをサポートすることができない。これらの結果は、本発明の抗体（エフェクター結合部位に突然変異を有する）は非特異的なＣＤＣを有しないことを指し示す。
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性
【００８６】
上記の結果は、エフェクター機能が損なわれた本発明の抗体は、（ＡＤＣＣまたはＣＤＣにかかわらず）非特異的な細胞傷害性をサポートしないことを示す。代わりに、これらの抗体は、特異的Ｔ細胞細胞傷害性をサポートする。Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は、様々なサイトカインの他に、細胞傷害性に寄与するパーフォリンおよびグランザイムの産生を誘導する。Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を確認するために、これらの因子の産生についてアッセイすることができる。
【００８７】
エフェクター細胞であるヒトＴ細胞を、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ過剰発現ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１４２８−ＧＦＰ上のＢｓＡｂと１０：１のＥ／Ｔ比で７２時間インキュベートした。ＢｓＡｂの陰性対照としてＰＢＳを使用した。細胞のＧＦＰ面積（μｍ２）により細胞生存能力を測定し、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６０００（ＧＥ）によるＤｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．９．２を用いて解析した。実験は、健常ボランティアからのＴ細胞を使用して行った。
サイトカインアッセイ
【００８８】
エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣ細胞またはＴ細胞をＧｌｏｂｏ  Ｈ過剰発現ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１４２８−ＧＦＰ上のＢｓＡｂと１０：１のＥ／Ｔ比で２４、４８、および７２時間インキュベートした。上清を回収し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を６つのサイトカイン（ＩＦＮγ、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびパーフォリン）についてＭｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｐａｎｅｌ、６プレックスプレートにより測定した。
【００８９】
図１７は、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合の非存在下で非特異的なＴ細胞活性化およびＩＬ−２産生を誘導できない一方、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）はＩＬ−２産生を誘導できることを示す。
【００９０】
図１８は、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合の非存在下で非特異的なＴ細胞活性化およびＴＮＦ−α産生を誘導できない一方、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）はＴＮＦ−α産生を誘導できることを示す。
【００９１】
図１９は、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合の非存在下で非特異的なＴ細胞活性化およびＩＮＦ−γ産生を誘導できない一方、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）はＩＮＦ−γ産生を誘導できることを示す。
【００９２】
図２０は、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合の非存在下で非特異的なＴ細胞活性化およびパーフォリン産生を誘導できない一方、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）はパーフォリン産生を誘導できることを示す。
【００９３】
図２１は、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合の非存在下で非特異的なＴ細胞活性化およびグランザイムＡ産生を誘導できない一方、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）はグランザイムＡ産生を誘導できることを示す。
【００９４】
図２２は、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合の非存在下で非特異的なＴ細胞活性化およびグランザイムＢ産生を誘導できない一方、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）はグランザイムＢ産生を誘導できることを示す。
【００９５】
図２３は、腫瘍細胞上のＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合後、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させ、かつＩＬ−２産生を誘導できることを示す。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下で本発明の抗体により誘導される特異的Ｔ細胞細胞傷害性およびＩＬ−２産生は、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）により誘導されるものとほぼ同等に強力である。これらの結果は、本発明の抗体により誘導される細胞傷害性は腫瘍標的細胞依存的であることを指し示す。
【００９６】
図２４は、腫瘍細胞上のＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合後、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させ、かつＴＮＦ−α産生を誘導できることを示す。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下で本発明の抗体により誘導される特異的Ｔ細胞細胞傷害性およびＴＮＦ−α産生は、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）により誘導されるものとほぼ同等に強力である。これらの結果は、本発明の抗体により誘導される細胞傷害性は腫瘍標的細胞依存的であることを指し示す。
【００９７】
図２５は、腫瘍細胞上のＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合後、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させ、かつＩＮＦ−γ産生を誘導できることを示す。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下で本発明の抗体により誘導される特異的Ｔ細胞細胞傷害性およびＩＮＦ−γ産生は、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）により誘導されるものとほぼ同等に強力である。これらの結果は、本発明の抗体により誘導される細胞傷害性は腫瘍標的細胞依存的であることを指し示す。
【００９８】
図２６は、腫瘍細胞上のＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合後、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させ、かつパーフォリン産生を誘導できることを示す。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下で本発明の抗体により誘導される特異的Ｔ細胞細胞傷害性およびパーフォリン産生は、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）により誘導されるものとほぼ同等に強力である。これらの結果は、本発明の抗体により誘導される細胞傷害性は腫瘍標的細胞依存的であることを指し示す。
【００９９】
図２７は、腫瘍細胞上のＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合後、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させ、かつグランザイムＡ産生を誘導できることを示す。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下で本発明の抗体により誘導される特異的Ｔ細胞細胞傷害性およびグランザイムＡ産生は、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）により誘導されるものとほぼ同等に強力である。これらの結果は、本発明の抗体により誘導される細胞傷害性は腫瘍標的細胞依存的であることを指し示す。
【０１００】
図２８は、腫瘍細胞上のＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原への結合後、エフェクター結合部位における突然変異を有する本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させ、かつグランザイムＢ産生を誘導できることを示す。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下で本発明の抗体により誘導される特異的Ｔ細胞細胞傷害性およびグランザイムＢ産生は、野生型（エフェクター結合部位における突然変異を有しない）により誘導されるものとほぼ同等に強力である。これらの結果は、本発明の抗体により誘導される細胞傷害性は腫瘍標的細胞依存的であることを指し示す。
【０１０１】
合わせると、以上の結果は、エフェクター結合部位に突然変異を有する本発明の実施形態（抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ×抗ＣＤ３二重特異的抗体）は、非特異的なＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導しないことを明確に示す。代わりに、本発明の実施形態は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の存在下でのみ（Ｔ細胞上のＣＤ３への結合後に）特異的なＴ細胞活性化を誘導して、（サイトカインならびにＴ細胞活性化および腫瘍細胞殺傷に寄与する因子（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）の産生をもたらすことができる。したがって、本発明の抗体は、患者に対して使用された時に、低減した副作用を有し、治療効果を達成するためにより少ない抗体を必要とする。
【０１０２】
本発明の一部の実施形態は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈの発現と関連付けられるがんを治療する方法に関する。そのようながんとしては、乳がん、前立腺がん、肺がんなどのような上皮起源のがんが挙げられる。本発明の実施形態による、Ｇｌｏｂｏ  Ｈの過剰発現と関連付けられるがんを治療する方法は、それを必要とする対象に上記されるような有効量の二重特異的抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を投与することを含む。対象は、ヒトまたは動物であり得る。
【０１０３】
本発明の実施形態を限られた数の実施例を用いて説明したが、当業者は、他の改変およびバリエーションが本発明の範囲から離れることなく可能であることを理解する。したがって、本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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