(57)【要約】  本発明は、3,4-ビピリジルピラゾール誘導体、およびその製造方法およびその医療適用に関する。具体的には、本発明は式（I）に示すような新規の3,4-ビピリジルピラゾール誘導体、該誘導体の製造方法、該誘導体を含有する医薬組成物、治療剤としての、具体的にはTGF-β阻害剤としての該誘導体の使用、およびTGF-β過剰発現に媒介された癌を治療、予防または減少させる薬剤の製造における該誘導体の使用に関する。式（I）の置換基は、明細書におけるものと同じ定義を有する。2020500177.tif 000055【選択図】なし
2020500177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）の化合物：
【化１】
2020500177.tif 000048
（式中：
環Aは、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり；
各R1は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、シアノ、アミノ、ニトロ、-S(O)mR5, -C(O)OR5、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから成る群から選択され；
各R2は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、シアノ、アミノ、ニトロ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群から選択され；
各R3は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アミノ、シアノおよびニトロから成る群から選択され；
各R4は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、シアノ、アミノ、ニトロ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
R5は、水素、アルキル、アミノ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
R6およびR7は、それぞれ独立して水素、ルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
ｎは、０，１または２であり；
ｓは、０，１，２，３，４または５であり；
ｐは、０，１，２または３であり；
ｑは、０，１，２，３または４であり；そして
ｍは、０，１または２である。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩。
【請求項２】
式（II）の化合物：
【化２】
2020500177.tif 000049
（式中：
G1は、CH2、NR8またはOであり；
R8は、-S(O)mR5、-C(O)OR5、水素およびアルキルから成る群から選択され；
R2、R4およびR5は、請求項１で定義した通りであり；
ｓは、０，１または２であり；
ｍは、０，１または２であり；そして
ｒは、０，１，２または３である。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩である、請求項１に記載の式（I）の化合物。
【請求項３】
R2がシアノ、-C(O)R5および-S(O)mR5から成る群から選択され、R5がヒドロキシまたはアルキルであり、好ましくはR2がシアノまたはメタンスルホニルであり、そしてｓは１である、請求項１または２に記載の式（I）の化合物。
【請求項４】
R4がアルキルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（I）の化合物。
【請求項５】
【化３】
2020500177.tif 000050
から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
式（I-A）の化合物：
【化４】
2020500177.tif 000051
（式中：
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
環A、R1、R4、ｎおよびｑは、請求項１で定義した通りである。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩。
【請求項７】
【化５】
2020500177.tif 000052
から成る群から選択される、請求項４に記載の式（I-A）の化合物。
【請求項８】
式（I-A）の化合物と式（I-B）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下で鈴木反応に付して式（I）の化合物を得る工程：
【化６】
2020500177.tif 000053
（式中：
G2は、
2020500177.tif 000054
であり；
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
環A、R1〜R4、ｎ、ｓ、ｐおよびｑは、請求項１で定義した通りである。）
を含む、請求項１に記載の式（I）の化合物を製造する方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩の治療有効量、および1以上の薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
薬剤として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
TGF-βレセプターキナーゼ阻害剤としての使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍細胞の転移を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
TGF-β過剰発現に媒介された癌を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
血管損傷、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ループス腎炎、高血圧による腎障害、間質性腎線維症、薬物暴露の合併症による腎線維症、HIV関連腎症、移植後腎障害、全原因による肝線維症、感染に起因しうる肝機能障害、アルコール誘発性肝炎、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、急性肺障害、成人呼吸促迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、感染性または毒剤による肺疾患、塞栓後心臓線維症、うっ血性心不全、拡張型心筋症、心筋炎、内膜肥厚、血管狭窄、高血圧による血管リモデリング、肺動脈性肺高血圧症、冠動脈再狭窄、末梢性再狭窄、頸動脈再狭窄、ステント誘発性再狭窄、アテローム性動脈硬化症、眼部瘢痕、角膜瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障、高眼内圧、外傷または手術創で生じた創傷の治癒中に生じる真皮における過剰のまたは肥厚性の瘢痕またはケロイドの形成、腹膜と皮下の癒着、強皮症、線維性硬化症、進行性全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、関節炎、骨粗しょう症、潰瘍、神経機能障害、男性勃起不全、Peyronie病、Dupuytren拘縮、Alzheimer病、Raynaud症候群、放射線誘発線維症、血栓症、腫瘍転移増殖、多発性骨髄腫、メラノーマ、グリオーマ、神経膠芽腫、白血病、肉腫、平滑筋腫、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、脳癌、皮膚癌、口腔癌、前立腺癌、骨癌、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌および肝臓癌から成る群から選択される疾患を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に属し、新規の3,4-ビピリジルピラゾール誘導体、その製造方法およびそれを含有する医薬組成物、並びに治療剤として、具体的にはTGF-β阻害剤としてのその使用、およびTGF-β過剰発現に媒介された癌を治療、予防または減少させるための薬剤の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換増殖因子β（TGF-β）は、例えばアクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（BMPs）、増殖分化因子（GDFs）およびミュラー管抑制因子（MIS）を含む二量体ポリペプチドのスーパーファミリーの一員である。
【０００３】
TGF-βはTGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3の３つのアイソフォームを持ち、細胞の増殖および分化、創傷治癒、細胞外マトリックス産生、および免疫抑制の制御に関与している。例えば、非特許文献１〜４参照。TGF-βの３つのアイソフォームは、それらのレセプターと共に大抵の細胞に存在している。各TGF-βアイソフォームは、細胞内でC末端領域（潜在関連ペプチド、LAP）とN末端部分に切断され、成熟または活性TGF-βと呼ばれる前駆体タンパク質として合成される。LAPは、細胞からの分泌に先立って成熟TGF-βに通常は非共有結合的に結合する。LAP-TGF-β複合体はTGF-βレセプターに結合することができず、生物学的に活性ではない。TGF-βは、一般に、例えばトロンボスポンジン1またはプラスミンとの相互作用などの種々のメカニズムにより複合体から放出される（そして活性である）。TGF-β1は、２つの高度に保存された1回膜貫通セリン/スレオニンキナーゼ、即ちI型（ALK5）およびII型TGF-βレセプターを通じてシグナルを伝達する。リガンドがオリゴマー形成を誘発すると、II型レセプターがALK5のGS領域にあるセリン/スレオニン残基を高リン酸化して、Smadタンパク質に対する結合部位を創出することによりALK5の活性化に導く。活性化されたALK5は、次にC末端SSXS-モチーフでSmad2とSmad3タンパク質をリン酸化し、それによりレセプターからのそれらの解離とSmad4とのヘテロマー複合体の形成を引き起こす。Smad複合体は核に移動し、特異的DNA結合性コファクターおよびコモジュレーターと会合して最終的に細胞外マトリックス成分の転写とマトリックス分解性プロテアーゼの阻害剤を活性化する。
【０００４】
TGF-βのシグナル経路の機能亢進は、細胞外マトリックスの過剰堆積、異常な高レベルの炎症反応、線維性疾患、および進行性癌などの多くのヒト疾患の原因となる。後期の種々の癌における腫瘍内の腫瘍細胞および間質細胞は、一般にTGF-βを過剰発現する。これが血管新生と細胞運動の刺激、免疫系の抑制、および腫瘍細胞の細胞外マトリックスとの相互作用の亢進に導く（例、非特許文献５）。従って、腫瘍細胞はより浸潤性になり、遠位の臓器に転移する（例、非特許文献６，７）。
【０００５】
近年レビューされているように（例、非特許文献８）、増殖性糸球体腎炎のThy-1ラットモデル、ウサギにおける抗GBM糸球体腎炎、および巣状分節性糸球体硬化症の5/6腎摘出ラットモデルなどの数多くの実験動物研究がTGF-βの糸球体発現と線維症の間の関連を示している。TGF-βに対する中和抗体がThy-1腎炎モデルにおける糸球体組織学を改善する（例、非特許文献９）。
【０００６】
TGF-β1とそのレセプターは、傷害された血管および線維増殖性血管病変において過剰発現して、細胞外マトリックスの過剰産生に導く（例、非特許文献１０，１１）。
【０００７】
TGF-β2レベルは、若年性緑内障の殆んどの目において眼房水で、および原発性開放隅角緑内障（POAG）の目のほぼ半分において増大している（例、非特許文献１２）。TGF-β1とTGF-β2のアイソフォームの両者が、偽落屑緑内障およびPOAGの患者由来の培養したヒトテノン嚢繊維芽細胞において細胞外マトリックスを増加させることが報告されている（例、非特許文献１３）。
【０００８】
それ故、そのようなシグナル経路が関与する疾患を予防および/または治療するためにTGF-βファミリーメンバーの抑制剤を開発することが望ましい。TGF-βファミリーメンバーのレセプターのモジュレーター（例、アンタゴニスト）を開示する特許出願としては、特許文献１〜５が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2004111046
【特許文献２】WO2012000595
【特許文献３】WO2012002680
【特許文献４】WO2013009140
【特許文献５】WO2016106266
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Massague, J. Ann. Rev, Cell. Biol. 6: 594-641(1990)
【非特許文献２】Roberts, A. B. Peptide Growth Factor and Their receptors, 95: 419-472 Berlin: Springer-Verlag (1990)
【非特許文献３】Roberts, A. B. and Sporn M. B. Growth Factor 8: 1-9 (1993)
【非特許文献４】Alexandrow, M. G., Moses, H. L. Cancer Res. 55:1452-1457 (1995)
【非特許文献５】Hojo, M. et al., Nature 397: 530-534 (1999)
【非特許文献６】Maehara, Y. et al., J. Clin. Oncol. 17: 607-614 (1999)
【非特許文献７】Picon, A. et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 7: 497-504 (1998)
【非特許文献８】Bitzer, M. et al., Kidney Blood Press. Res. 21: 1-12 (1998)
【非特許文献９】Border, W. A. et al., Nature 346: 371-374 (1990)
【非特許文献１０】Saltis, J. et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23: 193-200 (1996)
【非特許文献１１】McCaffrey, T. A. et al., J. Clin. Invest. 96: 2667-2675 (1995)
【非特許文献１２】Picht, G. et al., Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 239: 199-207 (2001)
【非特許文献１３】Kottler, U. B. et al., Exp. Eye Res. 80: 121-134 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明者らはより良い治療結果を達成して市場の要求に適合するために、有効性が高くて毒性の低い新世代のTGF-βレセプターキナーゼ阻害剤を開発することを望んでいる。本発明は新規構造のTGF-βレセプターキナーゼ阻害剤を提供し、そのような構造の化合物がALK5に対して良い選択的活性を持つことが判る。毒性試験の結果は、そのような構造の化合物が良い安全性を有することを示す。化合物は優れたTGF-βレセプター抑制活性と抗腫瘍活性を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、式（I）の化合物：
【化１】
2020500177.tif 000003
（式中：
環Aは、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり；
各R1は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、シアノ、アミノ、ニトロ、-S(O)mR5, -C(O)OR5、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから成る群から選択され；
各R2は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、シアノ、アミノ、ニトロ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群から選択され；
各R3は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アミノ、シアノおよびニトロから成る群から選択され；
各R4は、同一または異なって、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、シアノ、アミノ、ニトロ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
R5は、水素、アルキル、アミノ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
R6およびR7は、それぞれ独立して水素、ルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
ｎは、０，１または２であり；
ｓは、０，１，２，３，４または５であり；
ｐは、０，１，２または３であり；
ｑは、０，１，２，３または４であり；そして
ｍは、０，１または２である。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩を提供することである。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様において、式（I）の化合物は、式（II）の化合物：
【化２】
2020500177.tif 000004
（式中：
G1は、CH2、NR8またはOであり；
R8は、-S(O)mR5、-C(O)OR5、水素およびアルキルから成る群から選択され；
R2、R4およびR5は、式（I）で定義した通りであり；
ｓは、０，１または２であり；
ｍは、０，１または２であり；そして
ｒは、０，１，２または３である。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩である。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様において、式（I）の化合物で、R2はシアノ、-C(O)R5および-S(O)mR5から成る群から選択され、R5はヒドロキシまたはアルキルであり、好ましくはR2はシアノおよびメタンスルホニルであり、そしてｓは１である。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、式（I）の化合物で、R4はアルキルである。
【００１６】
本発明の化合物は、全てのそれらの立体構造異性体、例、cis-異性体 and trans-異性体；および全ての光学異性体と立体異性体およびそれらの混合物を含む。本発明の化合物は不斉中心を有し、それ故、異なる鏡像体やジアステレオ異性体がある。本発明は、本発明化合物の使用、それを投与するおよび含有する医薬組成物、その治療方法に関する。本発明は全てのそのような互変異性体およびそれらの混合物の使用に関する。
【００１７】
本発明の代表的化合物としては、限定されないが、
2020500177.tif 000005
2020500177.tif 000006
2020500177.tif 000007
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩が挙げられる。
【００１８】
本発明は、また式（I）の化合物を合成するための中間体である式（I-A）の化合物：
【化３】
2020500177.tif 000008
（式中：
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
環A、R1、R4、ｎおよびｑは、式（I）で定義した通りである。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩に関する。
【００１９】
式（I-A）の化合物としては、限定されないが、
2020500177.tif 000009
2020500177.tif 000010
が挙げられる。
【００２０】
他の態様において、本発明は、工程：
【化４】
2020500177.tif 000011
（式中：
G2は、
2020500177.tif 000012
であり；
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
環A、R1〜R4、ｎ、ｓ、ｐおよびｑは、式（I）で定義した通りである。）
式（I-A）の化合物と式（I-B）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下で鈴木反応に付して式（I）の化合物を得ることを含む、式（I）の化合物を製造する方法に関する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、工程：
【化５】
2020500177.tif 000013
（式中：
G2は、
2020500177.tif 000014
であり；
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
G1、R2、R4、ｒ、ｓおよびｑは、式（I）で定義した通りである。）
式（II-A）の化合物と式（I-B）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下で鈴木反応に付して式（II）の化合物を得ることを含む、式（II）の化合物を製造する方法に関する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩の治療有効量、および1以上の薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物に関する。本発明は、また、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩を1以上の薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合する工程を含む、前記組成物を製造する方法に関する。
【００２３】
本発明は、さらにTGF-βおよび/またはアクチビン（特に、ヒトTGF-βおよび/またはアクチビン）シグナル経路を阻害するための薬剤の製造における式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。
【００２４】
本発明は、さらに腫瘍細胞、特に、ヒト腫瘍細胞の転移を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。
【００２５】
本発明は、さらにTGF-β過剰発現によって媒介された癌を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における、具体的にはヒトTGF-βシグナル経路を阻害することによってTGF-β過剰発現により媒介された癌を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。
【００２６】
本発明は、さらに血管損傷、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ループス腎炎、高血圧による腎障害、間質性腎線維症、薬物暴露の合併症による腎線維症、HIV関連腎症、移植後腎障害、全原因による肝線維症、感染に起因しうる肝機能障害、アルコール誘発性肝炎、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、急性肺障害、成人呼吸促迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、感染性または毒剤による肺疾患、塞栓後心臓線維症、うっ血性心不全、拡張型心筋症、心筋炎、内膜肥厚、血管狭窄、高血圧による血管リモデリング、肺動脈性肺高血圧症、冠動脈再狭窄、末梢性再狭窄、頸動脈再狭窄、ステント誘発性再狭窄、アテローム性動脈硬化症、眼部瘢痕、角膜瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障、高眼内圧、外傷または手術創で生じた創傷の治癒中に生じる真皮における過剰のまたは肥厚性の瘢痕またはケロイドの形成、腹膜と皮下の癒着、強皮症、線維性硬化症、進行性全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、関節炎、骨粗しょう症、潰瘍、神経機能障害、男性勃起不全、Peyronie病、Dupuytren拘縮、Alzheimer病、Raynaud症候群、放射線誘発線維症、血栓症、腫瘍転移増殖、多発性骨髄腫、メラノーマ、グリオーマ、神経膠芽腫、白血病、肉腫、平滑筋腫、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、脳癌、皮膚癌、口腔癌、前立腺癌、骨癌、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌および肝臓癌から成る群から選択される疾患（特にヒトにおける）を治療、予防または減少させるための薬剤の製造における式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。
【００２７】
本発明は、さらに式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ヒト腫瘍細胞の転移を治療、予防または減少させるための方法に関する。
【００２８】
本発明は、さらに式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、TGF-β過剰発現によって媒介された癌を治療、予防または減少させる方法、具体的にはTGF-βシグナル経路を阻害することによってTGF-β過剰発現により媒介された癌を治療、予防または減少させる方法に関する。
【００２９】
本発明は、さらに式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、血管損傷、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ループス腎炎、高血圧による腎障害、間質性腎線維症、薬物暴露の合併症による腎線維症、HIV関連腎症、移植後腎障害、全原因による肝線維症、感染に起因しうる肝機能障害、アルコール誘発性肝炎、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、急性肺障害、成人呼吸促迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、感染性または毒剤による肺疾患、塞栓後心臓線維症、うっ血性心不全、拡張型心筋症、心筋炎、内膜肥厚、血管狭窄、高血圧による血管リモデリング、肺動脈性肺高血圧症、冠動脈再狭窄、末梢性再狭窄、頸動脈再狭窄、ステント誘発性再狭窄、アテローム性動脈硬化症、眼部瘢痕、角膜瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障、高眼内圧、外傷または手術創で生じた創傷の治癒中に生じる真皮における過剰のまたは肥厚性の瘢痕またはケロイドの形成、腹膜と皮下の癒着、強皮症、線維性硬化症、進行性全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、関節炎、骨粗しょう症、潰瘍、神経機能障害、男性勃起不全、Peyronie病、Dupuytren拘縮、Alzheimer病、Raynaud症候群、放射線誘発線維症、血栓症、腫瘍転移増殖、多発性骨髄腫、メラノーマ、グリオーマ、神経膠芽腫、白血病、肉腫、平滑筋腫、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、脳癌、皮膚癌、口腔癌、前立腺癌、骨癌、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌および肝臓癌から成る群から選択される疾患（特にヒトにおける）を治療、予防または減少させるための方法に関する。
【００３０】
本発明は、さらに薬剤としての使用のための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。
【００３１】
本発明は、さらにTGF-βレセプターキナーゼ阻害剤としての使用のための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。
【００３２】
本発明は、さらに腫瘍細胞、特にヒト腫瘍細胞の転移を治療、予防または減少させることに使用するための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。
【００３３】
本発明は、さらにTGF-β過剰発現によって媒介された癌を治療、予防または減少させることに、具体的にはTGF-βシグナル経路を阻害することによってTGF-β過剰発現により媒介された癌を治療、予防または減少させることに使用するための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。
【００３４】
本発明は、さらに血管損傷、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ループス腎炎、高血圧による腎障害、間質性腎線維症、薬物暴露の合併症による腎線維症、HIV関連腎症、移植後腎障害、全原因による肝線維症、感染に起因しうる肝機能障害、アルコール誘発性肝炎、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、急性肺障害、成人呼吸促迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、感染性または毒剤による肺疾患、塞栓後心臓線維症、うっ血性心不全、拡張型心筋症、心筋炎、内膜肥厚、血管狭窄、高血圧による血管リモデリング、肺動脈性肺高血圧症、冠動脈再狭窄、末梢性再狭窄、頸動脈再狭窄、ステント誘発性再狭窄、アテローム性動脈硬化症、眼部瘢痕、角膜瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障、高眼内圧、外傷または手術創で生じた創傷の治癒中に生じる真皮における過剰のまたは肥厚性の瘢痕またはケロイドの形成、腹膜と皮下の癒着、強皮症、線維性硬化症、進行性全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、関節炎、骨粗しょう症、潰瘍、神経機能障害、男性勃起不全、Peyronie病、Dupuytren拘縮、Alzheimer病、Raynaud症候群、放射線誘発線維症、血栓症、腫瘍転移増殖、多発性骨髄腫、メラノーマ、グリオーマ、神経膠芽腫、白血病、肉腫、平滑筋腫、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、脳癌、皮膚癌、口腔癌、前立腺癌、骨癌、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌および肝臓癌から成る群から選択される疾患（特にヒトにおける）を治療、予防または減少させることに使用するための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。
【００３５】
活性成分を含有する医薬組成物は、経口投与に適した形態、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ錠、水性または油性懸濁剤、分散性粉末または顆粒剤、乳剤、ハードまたはソフトカプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤であってもよい。経口用組成物は、医薬組成物の製造の技術分野で公知の方法に従って製造することができる。そのような組成物は、気持ちがよくて美味な医薬製剤を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤および保存剤から成る群から選択される１以上の成分を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬剤的に許容される賦形剤と混合して活性成分を含有している。
【００３６】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合して活性成分を含んでいる。そのような賦形剤は、懸濁剤である。
【００３７】
油性懸濁剤は、活性成分を植物油に懸濁させて製造される。油性懸濁剤は、増粘剤を含んでいてもよい。前述の甘味料や香味料は味の良い製剤を提供するために添加してもよい。これらの組成物は、抗酸化剤を添加することにより保存できる。
【００３８】
分散または湿潤剤、懸濁剤または１以上の保存剤と混合した活性成分は、水を加えることによる水性懸濁剤の調製に適した分散性粉末または顆粒として調製してもよい。適切な分散または湿潤剤および懸濁剤は、既に上述したもので例示される。甘味料、香味料および着色剤などの更なる賦形剤も添加してもよい。これらの組成物は、抗酸化剤を添加することにより保存できる。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、また、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油でもよい。適切な乳化剤は、天然由来のリン脂質である。乳剤は、また甘味料、芳香剤、保存剤および抗酸化剤も含んでいてもよい。そのような製剤は、また、粘滑剤、保存剤、着色剤および抗酸化剤も含んでいてもよい。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、無菌の注射用水溶液の形態でもよい。無菌の注射用製剤は、活性成分が油相に溶解した無菌の注射用水中油型マイクロエマルションであってもよい。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、筋肉内および皮下投与用の無菌の注射用水性または油性懸濁液の形態であってもよい。そのような懸濁液は、前述の適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知技術に従って製造できる。無菌の注射用製剤は、また非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中で調製した無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。さらに、無菌の不揮発性オイルが溶媒または懸濁媒体として容易に用いることができる。
【００４２】
本発明の化合物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与してもよい。これらの医薬組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸では液体であり、それにより直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって製造できる。
【００４３】
薬物の用量は、限定されないが、次の因子：特定化合物の活性、患者の年齢、患者の体重、患者の一般的な健康、患者の挙動、患者の食事、投与時間、投与ルート、排泄速度、併用薬剤などの種々の因子に依存することが当業者によく知られている。さらに、治療様式、式（Ｉ）の化合物の１日量またはその薬剤的に許容される塩のタイプなどの最適の治療が、伝統的な治療計画によって証明できる。
【望ましい実施形態】
【００４４】
他に記載がない限り、本明細書および請求項で使用される用語は以下に記載される意味を有する。
【００４５】
用語「アルキル」とは、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１２個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖基の飽和脂肪族炭化水素基をいう。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、2,3-ジメチルブチル、n-ヘプチル、2-メチルヘキシル、3-メチルヘキシル、4-メチルヘキシル、5-メチルヘキシル、2,3-ジメチルペンチル、2,4-ジメチルペンチル、2,2-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチル、2-エチルペンチル、3-エチルペンチル、n-オクチル、2,3-ジメチルヘキシル、2,4-ジメチルヘキシル、2,5-ジメチルヘキシル、2,2-ジメチルヘキシル、3,3-ジメチルヘキシル、4,4-ジメチルヘキシル、2-エチルヘキシル、3-エチルヘキシル、4-エチルヘキシル、2-メチル-2-エチルペンチル、2-メチル-3-エチルペンチル、n-ノニル、2-メチル-2-エチルヘキシル、2-メチル-3-エチルヘキシル、2,2-ジエチルペンチル、n-デシル、3,3-ジエチルヘキシル、2,2-ジエチルヘキシルおよび各種これらの分岐鎖異性体が含まれる。より好ましくは、アルキル基は１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであり、代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチルおよび2,3-ジメチルブチル等が含まれる。アルキル基は置換されていても、また無置換のものでもよい。置換されている場合には、置換基は任意な結合可能なポイントで置換してもよい。好ましくは、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群より独立して選択される１つまたはそれ以上の基である。
【００４６】
用語「シクロアルキル」とは、３〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１２個の炭素原子、より好ましくは３〜１０個の炭素原子、最も好ましくは３〜６個の炭素原子、例えば、３、４、５または６個の炭素原子を有する飽和または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基をいう。単環式シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタトリエニルおよびシクロオクチル等が含まれ、好ましくはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。多環式シクロアルキルには、スピロ環、縮合環または架橋環を有するシクロアルキルが含まれる。
【００４７】
用語「スピロシクロアルキル」とは、１つの共通の炭素原子(スピロ原子と呼ばれる)を通じてつながっている単環を持つ５〜２０員の多環式基であって、ここで該環が１つまたはそれ以上の環は１つまたはそれ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。スピロシクロアルキルは、好ましくは６〜１４員であり、より好ましくは７〜１０員である。環で共通されるスピロ原子の数によって、スピロシクロアルキルは単環式スピロ環、双環式スピロ環または多環式スピロ環のものに分けられるが、好ましくは単環式スピロシクロアルキルまたは双環式スピロシクロアルキルであり、より好ましくは４員／４員、４員／５員、４員／６員、５員／５員または５員／６員の単環式スピロシクロアルキルである。スピロシクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化６】
2020500177.tif 000015
【００４８】
用語「縮合シクロアルキル」とは、５〜２０員の全炭素多環式基であって、系内の各環が隣接した一対の炭素原子を他の環と共有していて、ここで１つまたはそれ以上の環が１つまたはそれ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。縮合シクロアルキルは、好ましくは６〜１４員であり、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数により、縮合シクロアルキルは二環式、三環式、四環式および多環式縮合シクロアルキルに分けられるが、好ましくは二環式または三環式縮合シクロアルキルであり、より好ましくは５員／５員または５員／６員の二環式縮合シクロアルキルである。縮合シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化７】
2020500177.tif 000016
【００４９】
用語「架橋シクロアルキル」とは、５〜２０員の全炭素多環式基であって、ここで系内のそれぞれ二つの環が２つの連結していない原子を共有していて、これらの環は１つまたはそれ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。架橋シクロアルキルは、好ましくは６〜１４員であり、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数により、架橋シクロアルキルは二環式、三環式、四環式および多環式架橋シクロアルキルに分けられるが、好ましくは二環式、三環式または四環式架橋シクロアルキルであり、より好ましくは二環式または三環式架橋シクロアルキルである。架橋シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化８】
2020500177.tif 000017
前記シクロアルキルの環はアリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの環に縮合していてもよく、ここで親構造と結合する環がシクロアルキルである。代表例としては、これらに限定されないが、インダニル、テトラヒドロナフチル、ベンゾシクロヘプチル等が含まれる。シクロアルキルは任意に置換されていても、または無置換のものでもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群より独立して選択される１つまたはそれ以上の基である。
【００５０】
用語「ヘテロシクリル」とは、３〜２０員の飽和または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基であって、ここで１つまたはそれ以上の環原子はＮ、ＯおよびＳ(Ｏ)ｍ(式中、ｍは０〜２の間の整数である)から成る群より選択されるヘテロ原子であるが、環内に−Ｏ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−はなく、残りの環原子が炭素原子であるものをいう。ヘテロシクリルは、好ましくは３〜１２個の環原子を有し、うち１〜４個の原子、例えば、１、２、３または４個の原子がヘテロ原子であり、より好ましくは３〜１０個の環原子を有し、最も好ましくは３〜６個の環原子、例えば、３、４、５または６個の環原子を有する。単環式ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピロリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペラジニル等が含まれ、好ましくは、オキセタニルおよびテトラヒドロフラニルである。多環式ヘテロシクリルには、スピロ環、縮合環または架橋環を持つヘテロシクリルが含まれる。
【００５１】
用語「スピロヘテロシクリル」とは、１つの共通原子(スピロ原子と呼ばれる)を通じて結合している単環を持つ５〜２０員の多環式ヘテロシクリルであって、ここで１つまたはそれ以上の環原子はＮ、ＯおよびＳ(Ｏ)ｍ(式中、ｍは０〜２の間の整数である)から成る群より選択されるヘテロ原子であるが、残りの環原子は炭素原子であって、環は１つまたはそれ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。スピロヘテロシクリルは、好ましくは６〜１４員であり、より好ましくは７〜１０員のものである。環で共通されるスピロ原子の数により、スピロヘテロシクリルは単環式スピロヘテロシクリル、双環式スピロヘテロシクリルおよび多環式スピロヘテロシクリルに分けられるが、好ましくは単環式スピロヘテロシクリルまたは双環式スピロヘテロシクリルであり、より好ましくは４員／４員、４員／５員、４員／６員、５員／５員または５員／６員の単環式スピロヘテロシクリルである。スピロヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化９】
2020500177.tif 000018
【００５２】
用語「縮合ヘテロシクリル」とは、５〜２０員の多環式ヘテロシクリル基であって、ここで系内の各環が隣接した一対の炭素原子を他の環と共有していて、１つまたはそれ以上の環が１つまたはそれ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たず、該１つまたはそれ以上の環原子はＮ、ＯおよびＳ(Ｏ)ｍ(式中、ｍは０〜２の間の整数である)から成る群より選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素原子であるものをいう。縮合ヘテロシクリルは、好ましくは６〜１４員であり、より好ましくは７〜１０員のものである。構成する環の数により、縮合ヘテロシクリルは二環式、三環式、四環式および多環式縮合ヘテロシクリルに分けられるが、好ましくは二環式または三環式縮合ヘテロシクリルであり、より好ましくは５員／５員または５員／６員の二環式縮合ヘテロシクリルである。縮合ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化１０】
2020500177.tif 000019
【００５３】
用語「架橋ヘテロシクリル」とは、５〜１４員の多環式ヘテロシクリル基であって、ここで系内のそれぞれ二つの環が２つの連結していない原子を共有していて、これらの環は１つまたはそれ以上の二重結合を持っていてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系は持たず、そして、これらの１つまたはそれ以上の環原子はＮ、ＯおよびＳ(Ｏ)ｍ(式中、ｍは０〜２の間の整数である)から成る群より選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素原子であるものをいう。架橋ヘテロシクリルは、好ましくは６〜１４員であり、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数により、架橋ヘテロシクリルは二環式、三環式、四環式および多環式架橋ヘテロシクリルに分けられるが、好ましくは二環式、三環式または四環式架橋ヘテロシクリルであり、より好ましくは二環式または三環式架橋ヘテロシクリルである。架橋ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化１１】
2020500177.tif 000020
ヘテロシクリルの環はアリール、ヘテロアリールまたはシクロアルキルの環に縮合していてもよいが、ここで親構造と結合する環がヘテロシクリルである。代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化１２】
2020500177.tif 000021
ヘテロシクリルは任意に置換されていても、また無置換のものでもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群より独立して選択される１つまたはそれ以上の基である。
【００５４】
用語「アリール」とは、６〜１４員の全て炭素の単環式環または多環式縮合環(即ち、系内の各環が隣り合った炭素原子対を系内の他の環と共有している)であって、完全に共役したπ電子系を持っているものをいい、好ましくは６〜１０員のもの、例えば、フェニルおよびナフチルである。アリールの環は、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルの環に縮合していてもよく、ここで親構造に結合する環がアリール環である。代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化１３】
2020500177.tif 000022
アリールは置換されていても、また無置換のものでもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群より独立して選択される１つまたはそれ以上の基である。
【００５５】
用語「ヘテロアリール」とは、Ｏ、ＳおよびＮから成る群より選択される１〜４個のヘテロ原子を環原子として持つ、５〜１４員のヘテロ芳香族系をいう。ヘテロアリールは、好ましくは５〜１０員であり、より好ましくは５員または６員である。例えば、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、N-アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、テトラゾリル等。ヘテロアリールの環はアリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルの環に縮合してもよく、ここで親構造に結合する環がヘテロアリール環である。代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
【化１４】
2020500177.tif 000023
ヘテロアリールは任意に置換されていても、また無置換のものでもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群から独立して選択される１つまたはそれ以上の基である。
【００５６】
用語「アルコキシ」とは、−Ｏ−(アルキル)または−Ｏ−(無置換のシクロアルキル)基をいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。代表例としては、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシが含まれる。アルコキシは任意に置換されていても、または無置換のものでもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、-OR5、-C(O)R5、-S(O)mR5および-C(O)NR6R7から成る群から独立して選択される１つまたはそれ以上の基である。
【００５７】
用語「ヒドロキシアルキル」とは、ヒドロキシで置換されたアルキル基をいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。
【００５８】
用語「ハロアルキル」とは、１つまたはそれ以上のハロゲンに置換されたアルキル基をいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。
【００５９】
用語「ヒドロキシ」とは、−ＯＨ基をいう。
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素をいう。
用語「アミノ」とは、−ＮＨ２基をいう。
用語「シアノ」とは、−ＣＮ基をいう。
用語「ニトロ」とは、−ＮＯ２基をいう。
【００６０】
「任意の」または「任意に」は、続いて記載した出来事や状況が生じても、生じなくてもよいことを意味する。そのような記載は出来事や状況が生じても、生じなくてもよいことを含んでいる。例えば、「アルキルで任意に置換されたヘテロシクリル基」は、アルキル基が存在しても、しなくてもよいことを意味する。その記載はアルキルで置換されているヘテロシクリルとアルキルで置換されていないヘテロシクリルの場合を含んでいる。
【００６１】
「置換された」とは、基内の１つまたはそれ以上の水素原子、好ましくは５個まで、より好ましくは１〜３個の水素原子が、対応する数の置換基でそれぞれ独立して置換されていることをいう。置換基はそれらの化学的に可能な位置にのみ存在することは言うまでもない。当業者は過剰な努力を払うことなく、実験または理論により置換が可能かどうかを判断することができる。例えば、フリーの水素を持つアミノまたはヒドロキシル基が不飽和結合を持つ炭素原子(例、オレフィン)と結合する場合は不安定となりうる。
【００６２】
「医薬組成物」とは、本発明の１つまたはそれ以上の化合物またはそれらの生理学的/薬学的に許容される塩またはプロドラッグおよび生理学的/薬学的に許容される担体や賦形剤等と他の化学成分を含む混合物をいう。医薬組成物の目的は、生体への化合物の投与を容易にすることであり、これにより活性成分の吸収を助け、生物活性を示すことができる。
【００６３】
「薬学的に許容される塩」とは、哺乳類において安全で有効であり、期待の生物学的活性を有する、本発明の化合物の塩をいう。
【００６４】
ｍおよびＲ５〜Ｒ７は式(I)で定義した通りである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】B16-F1担癌C57マウスの異種移植片体積に対する化合物１の効果を示す。
【図２】C57マウスの体重に対する化合物１の作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
発明の詳細な説明
本発明化合物の合成方法
本発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決法を適用する：
スキームI
以下：
【化１５】
2020500177.tif 000024
（式中：
G2およびG3は、それぞれ独立して
2020500177.tif 000025
から成る群から選択され；
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
環A、R1〜R4、ｎ、ｓ、ｐおよびｑは、式（I）で定義した通りである。）
第１工程において、式（I-1）の化合物と式（I-2）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下で鈴木反応に付して式（I-3）の化合物を得る；
第２工程において、式（I-3）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下でビス(ピナコラート)ジボロンと反応させて式（I-B）の化合物を得る；
第３工程において、式（I-4）の化合物をアルカリ条件下で式（I-5）の化合物と反応させて式（I-6）の化合物を得る；
第４工程において、式（I-6）の化合物をハロゲン化剤と反応させて式（I-A）の化合物を得る；
第５工程において、式（I-A）の化合物と式（I-B）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下で鈴木反応に付して式（I）の化合物を得る；
の工程を含む、本発明の式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩を製造する方法。
【００６７】
アルカリ条件を供給する試薬としては、有機塩基および無機塩基が挙げられる。該有機塩基としては、これらに限定されないが、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、n-ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムビス（トリメチルシリル）アミン、酢酸カリウム、ナトリウムtert-ブトキシドおよびカリウムtert-ブトキシドが挙げられる。該無機塩基としては、これらに限定されないが、水素化ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、酢酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化リチウムが挙げられる。
【００６８】
触媒としては、これらに限定されないが、パラジウム炭素、ラネーニッケル、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、塩化パラジウム（II）、酢酸パラジウム、[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン パラジウム ジクロリドまたはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、そして好ましくは[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウムまたはテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムが挙げられる。
【００６９】
ハロゲン化剤としては、これらに限定されないが、液体臭素、臭化水素、N-ブロモコハク酸イミド（NBS）、PBr3、POBr3、ピリジンヒドロブロミドペルブロミド（PHP）、2,4,4,6-テトラブロモ-2,5-シクロヘキサジエノン(TBCO)、ブロモマロン酸ジエチル、テトラブチルアンモニウムブロミド、N-クロロコハク酸イミド、PCl3およびPOCl3が挙げられる。
【００７０】
上記反応は、好ましくは溶媒中で行われる。使用する溶媒としては、これらに限定されないが、酢酸、メタノール、エタノール、トルエン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、石油エーテル、酢酸エチル、n-ヘキサン、ジメチルスルホキシド、1,4-ジオキサン、水、N,N-ジメチルホルムアミド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００７１】
スキームII
以下：
【化１６】
2020500177.tif 000026
（式中：
G2は、
2020500177.tif 000027
から成る群から選択され；
Xは、ハロゲン、好ましくは臭素であり；
G1、R2、R4、ｒ、ｓおよびｑは、式（I）で定義した通りである。）
式（II-A）の化合物と式（I-B）の化合物を触媒の存在下にアルカリ条件下で鈴木反応に付して式（II）の化合物を得る；
の工程を含む、本発明の式（II）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬剤的に許容される塩を製造する方法。
【００７２】
アルカリ条件を供給する試薬としては、有機塩基および無機塩基が挙げられる。該有機塩基としては、これらに限定されないが、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、n-ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムビス（トリメチルシリル）アミン、酢酸カリウム、ナトリウムtert-ブトキシドおよびカリウムtert-ブトキシドが挙げられる。該無機塩基としては、これらに限定されないが、水素化ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、酢酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化リチウムが挙げられる。
【００７３】
触媒としては、これらに限定されないが、パラジウム炭素、ラネーニッケル、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、塩化パラジウム（II）、酢酸パラジウム、[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン パラジウム ジクロリドまたはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、そして好ましくは[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウムまたはテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムが挙げられる。
【００７４】
上記反応は、好ましくは溶媒中で行われる。使用する溶媒としては、これらに限定されないが、酢酸、メタノール、エタノール、トルエン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、石油エーテル、酢酸エチル、n-ヘキサン、ジメチルスルホキシド、1,4-ジオキサン、水、N,N-ジメチルホルムアミド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００７５】
本発明を以下の実施例を参照して更に詳述するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。
化合物の構造は核磁気共鳴（NMR）および／または質量分析（MS）により同定した。NMRシフト（δ）は、10-6（ppm）で与えた。NMRは、Bruker AVANCE-400装置により測定した。測定溶媒は重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d6）、重水素化クロロホルム（CDCl3）および重水素化メタノール（CD3OD）であり、内部標準はテトラメチルシラン（TMS）であった。
MSは、FINNIGAN LCQAd（ESI）質量分析計（製造者：Thermo、型： Finnigan LCQ advantage MAX）
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、Agilent 1200DAD high pressure liquid chromatography spectrometer (Sunfire C18 150×4.6 mm chromatographic column)、およびWaters 2695-2996 high pressure liquid chromatography spectrometer (Gimini C18 150×4.6 mm chromatographic column)で行った。
キラルHPLCは、LC-10A vp（島津）またはSFC-analytical (Berger Instruments Inc.)で行った。
薄層シリカゲルクロマトグラフィー（TLC）プレートとして、Yantai Huanghai HSGF254 またはQingdao GF254シリカゲルプレートを用いた。TLCに用いたシリカゲルプレートの寸法は0.15 mm〜0.2 mmであり、生成物の精製に用いたシリカゲルプレートの寸法は0.4 mm〜0.5 mmであった。
カラムクロマトグラフィーの担体として、通常Yantai Huanghai 200〜300メッシュシリカゲルを用いた。
Prep Star SD-1 (Varian Instruments Inc.)またはSFC-multigram (Berger Instruments Inc.)をキラル分取カラムクロマトグラフィーに用いた。
用いたCombiflash迅速分取装置はCombiflash Rf200 (TELEDYNE ISCO)であった。
平均キナーゼ阻害率およびIC50値は、NovoStar ELISA (BMG Co., Germany)により測定した。
本発明の公知の物質は技術分野で公知の方法により製造できるか、またはABCR GmbH & Co. KG、Acros Organnics、Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.、またはDari chemical Companyなどから購入することができる。
実施例において、特に明記しない限り、反応は窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下で行った。
“アルゴン雰囲気”または“窒素雰囲気”は、反応フラスコがアルゴンまたは窒素の風船（約１L）を備えていることを意味する。
“水素雰囲気”は、反応フラスコが水素の風船（約１L）を備えていることを意味する。
加圧水素添加反応は、Parr 3916EKX水素化装置および Qinglan QL-500水素発生器またはHC2-SS水素化装置で行った。
水素添加反応において、反応系は、通常、真空にして水素で満たし、この操作を３回繰り返した。
CEM Discover-S 908860型マイクロ波反応装置をマイクロ波反応に用いた。
実施例において、特に明記しない限り、溶液とは水溶液をいう。
実施例において、特に明記しない限り、反応温度は20°C〜30°Cの室温である。
実施例における反応過程は薄層クロマトグラフィーでモニターし、そして反応に用いた展開溶媒、カラムクロマトグラフィーにおける溶出系および化合物の精製のための薄層クロマトグラフィーの展開溶媒系としては：Ａ：ジクロロメタン/メタノール系、Ｂ：n-ヘキサン/酢酸エチル系、Ｃ：石油エーテル/酢酸エチル系、Ｄ：アセトン、Ｅ：ジクロロメタン/アセトン系、Ｆ：酢酸エチル/ジクロロメタン系、Ｇ：酢酸エチル/ジクロロメタン/ n-ヘキサン、Ｈ：酢酸エチル/ジクロロメタン/アセトンが挙げられる。溶媒の容積比率は化合物の極性に従って調節し、トリエチルアミンなどのアルカリ試薬や酢酸などの酸性試薬の少量もまた調節のために添加してもよい。
【実施例１】
【００７６】
4-(1-シクロブチル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン
【化１７】
2020500177.tif 000028
工程１
4-ブロモ-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン 1c
2,4-ジブロモピリジン 1a (6 g, 25.33 mmol)を126 mL のトルエン、エタノールおよび水の混合溶媒(V:V:V=4:2:1)に溶解し、（4-（メタンスルホニル）フェニル）ボロン酸1b (5066.1 mg, 25.33 mmol)、炭酸ナトリウム(5369.1 mg, 50.66 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(2926.7 25 mg, 2.53 mmol)を加え、100℃およびアルゴン雰囲気下で反応溶液を16時間撹拌した。出発原料が消失するまでに反応をLC-MSでモニターし、その後、反応を停止させ、冷却させた。反応溶液に酢酸エチルおよび水を加え、酢酸エチル(80 mL×2)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、溶出液Ｂを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 1c (7.09 g、白色固体、収率:89.79%)を得た。
工程２
2-(4-(メタンスルホニル)フェニル)-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ピリジン 1d
1c (210 mg, 0.67 mmol)、ビス(ピナコラト)ジボロン(205 mg, 0.81 mmol)、酢酸カリウム(131.5 mg, 1.34 mmol)および[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム(49 mg, 0.067 mmol)を10 mLの1,4-ジオキサンに溶解した後、反応溶液を90℃に加熱し、3時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出液Ａを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 1d (130 mg、黒色固体、収率:50%)を得た。
工程３
2-(1-シクロブチル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 1g
2-メチル-6-(1H-ピラゾール-3-イル)ピリジン 1e (2.01 g, 12.6 mmol, “Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2015, 23(6), 1260-1275”に開示された既知の方法に従って調製)を100 mLのＮ，N-ジメチルホルムアミドに溶解した後、シクロブチルトルエン-4-スルホネート1f(4.29 g, 18.9 mmol, 特許出願“WO2009093029”に開示された方法に従って調製)および炭酸セシウム(8.23 g, 25.3 mmol)を加え、反応溶液を60℃に加熱し、16時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却させ、ロータリーエバポレーターでＮ，N-ジメチルホルムアミドを除去した。残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、溶出液Ｂを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 1g (1.81 g、無色の油、収率:67.3%)を得た。
工程４
2-(4-ブロモ-1-シクロブチル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 1h
1g (91 mg, 0.43 mmol)を10 mLのジクロロメタンに溶解した後、N-ブロモスクシンイミド(76 mg, 0.43 mmol)を加え、室温で反応溶液を終夜撹拌した。反応が終了した後、反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出液Ｂを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 1h (110 mg、黄色の油、収率:88%)を得た。
工程５
4-(1-シクロブチル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン 1
1h (540 mg, 1.85 mmol)、1d (563.36 mg, 2.03 mmol)、1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン(102.46 mg, 0.185 mmol)、炭酸カリウム(510.89 mg, 3.7 mmol)および[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム(135.24 mg, 0.185 mmol)を12 mLの1,4-ジオキサンと水の混合溶媒(V:V=10:1)に溶解した後、反応溶液を80℃に加熱し、12時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、生成した残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、生成した残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、表記化合物 1 (400 mg、黄色がかった白色固体、収率:48.7%)を得た。
MS m/z (ESI): 445.5 [M+1]
1H NMR (400MHz, CDCl3)δ8.66 (d, 1H), 8.11 (dd, 4H), 7.98 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.69 (t, 1H), 7.56 (d, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.20 (d, 1H), 4.96-4.92 (m, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.72-2.60 (m, 4H), 2.55 (s, 3H), 2.01-1.94 (m, 2H).
【実施例２】
【００７７】
4-(1-シクロプロピル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン
【化１８】
2020500177.tif 000029
工程１
2-(1-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 2b
1e (700 mg, 4.40 mmol)、シクロプロピルボロン酸 2a (756 mg, 8.80 mmol)、酢酸銅一水和物 (1.76 g, 8.80 mmol)、炭酸ナトリウム(933 mg, 8.80 mmol)および2,2-ビピリジン(1.37 g, 8.80 mmol)を25 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解した後、反応溶液を50℃に加熱し、16時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。溶出液Ｂを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 2b (440 mg、黄色の粘性物質、収率:50.2%)を得た。
工程２
2-(4-ブロモ-1-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 2c
2b (330 mg, 1.66 mmol)を8 mLのジクロロメタンに溶解した後、N-ブロモスクシンイミド(295 mg, 1.66 mmol)を加え、室温で反応溶液を1 時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液に水を加え、ジクロロメタン(10 mL×3)で抽出した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮した。溶出液Ａを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物2c (335 mg、黄色の粘性物質、収率:72.6%)を得た。
工程３
4-(1-シクロプロピル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン 2
2c (40 mg, 0.144 mmol)、1d (103.5 mg, 0.288 mmol)、リン酸カリウム(183.4 15 mg, 0.864 mmol)および[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム(10.5 mg, 0.0144 mmol)を2 mLの1,4-ジオキサンに溶解した後、反応溶液を90℃に加熱し、16時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、生成した残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、生成した残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、表記化合物 2 (10 mg、黄色がかった白色固体、収率:16%)を得た。
MS m/z (ESI): 431.5 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.55 (dd, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.12-8.05 (m, 4H), 25 7.91 (dd, 1H), 7.82 (t, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.37-7.34 (m, 2H), 3.86-3.81 (m, 1H), 3.18 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 1.30-1.26 (m, 2H), 1.18-1.13 (m, 2H).
【実施例３】
【００７８】
4-(1-シクロペンチル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン
【化１９】
2020500177.tif 000030
2020500177.tif 000031
工程１
(2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン-4-イル)ボロン酸 3a
1c (1.6 g, 5.12 mmol)、ビス(ピナコラト)ジボロン(1.56 g, 6.15 mmol)、酢酸カリウム(1 g, 10.24 mmol)および[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(375 mg, 0.512 mmol)を50 mLの1,4-ジオキサンに溶解した後、90℃およびアルゴン雰囲気下で反応溶液を16時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出液Ａを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 3a (1.41 g、褐色固体、収率:100%)を得た。
MS m/z (ESI): 278.4 [M+1]
工程２
2-(1-シクロペンチル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 3c
1e (700 mg, 4.40 mmol)を10 mLのＮ，N-ジメチルホルムアミドに溶解した後、シクロペンチルトルエン-4-スルホネート3b (1.056 g, 4.40 mmol, 特許出願“WO2009062990”に開示された方法に従って調製)および炭酸セシウム(2.87 g, 8.80 mmol)を加え、60℃で反応溶液を2時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却させ、50 mLの水を加え、酢酸エチル(50 mL×3)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、溶出液Ｂを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物 3c (600 mg、淡い黄色の油、収率:60%)を得た。
工程３
2-(4-ブロモ-1-シクロペンチル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 3d
3c (600 mg, 2.64 mmol)を15 mLのジクロロメタンに溶解した後、N-ブロモスクシンイミド(470 mg, 2.64 mmol)を加え、室温で反応溶液を1 時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。溶出液Ｂを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物3d (760 mg、淡い黄色の油、収率:94.0%)を得た。
MS m/z (ESI): 306.3 [M+1]
工程４
4-(1-シクロペンチル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン3
3d (61 mg, 0.2 mmol)、3a (67 mg, 0.24 mmol)、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン(11 mg, 0.02 mmol)、炭酸カリウム(55 mg, 0.4 mmol)および[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(15 mg, 0.02 5 mmol)を5.5 mLの1,4-ジオキサンと水の混合溶媒(V:V=10:1)に溶解した後、反応溶液を80℃に加熱し、アルゴン雰囲気下で6時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、生成した残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、表記化合物 3 (20 mg、白色固体、収率:21.9%)を得た。
MS m/z (ESI): 459.4 [M+1]
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.68 (d, 1H), δ 8.18 (d, 2H), δ 8.08 (d, 2H), 7.84(s, 1H), 7.70 (t, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.35-7.30 (m, 2H), 7.21 (d, 1H), 4.89-4.78 (m, 1H), 3.14 (d, 3H),2.54 (d, 3H), 2.36-2.29 (m,2H), 2.22-2.15 (m, 2H), 2.01-1.92 (m, 2H),1.87-1.78 (m, 2H).
【実施例４】
【００７９】
(S)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン
【化２０】
2020500177.tif 000032
工程１
(S)-2-メチル-6-(1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)ピリジン 4b
1e (328 mg, 2.06 mmol) を10 mLのＮ，N-ジメチルホルムアミドに溶解した後、(R)-テトラヒドロフラン-3-イルトルエン-4-スルホネート 4a (500 mg, 2.06 mmol, 特許出願“WO2016021192”に開示された方法に従って調製)および炭酸セシウム(1.3 g, 4.12 mmol)を加え、60℃で反応溶液を2時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、生成した残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、表記化合物4bの粗生成物(370 mg、無色透明の油)を得た。これを精製せずに次の工程に直接に使用した。
工程２
(S)-2-(4-ブロモ-1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン4c
4bの粗生成物(800 mg, 3.47 mmol)を18 mLのジクロロメタンに溶解した後、N-ブロモスクシンイミド(741.76 mg, 4.16 mmol)を加え、室温で反応溶液を1時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液に水を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、溶出液Ａを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 4c (123 mg、黄色がかった白色固体、収率:11.39%)を得た。
工程３
(S)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン 4
4c (123 mg, 0.4 mmol)を5.5 mLの1,4-ジオキサンと水の混合溶媒(V:V=10:1)に溶解した後、1d (166 mg, 0.6 mmol)、1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン(22 mg, 0.04 mmol)、炭酸カリウム(110 mg, 0.8 mmol)および[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(29 mg, 0.04 mmol)を加え、反応溶液を80℃に加熱し、アルゴン雰囲気下で16時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出液Ａを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 4 (20 mg、黄色固体、収率:10.86%)を得た。
MS m/z (ESI): 461.5 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.54 (d, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.06 (q, 4H), 7.92(s, 1H), 7.79 (t, 1H), 7.55(d, 1H), 7.37-7.31 (m, 2H), 5.17 (m, 1H), 4.18 (q, 30 2H), 4.12 (m, 1H), 3.98 (t, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.57-2.50 (m, 2H), 2.49 (s, 3H).
【実施例５】
【００８０】
(R)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン
【化２１】
2020500177.tif 000033
2020500177.tif 000034
工程１
(R)-2-メチル-6-(1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)ピリジン 5b
1e (637 mg, 4.0 mmol)を20 mLのＮ，N-ジメチルホルムアミドに溶解した後、(S)-テトラヒドロフラン-3-イルトルエン-4-スルホネート5a (1.45 g, 6.0 mmol, 特許出願 “WO2014049133”に開示された方法に従って調製)および炭酸セシウム(2.61 g, 8.0 mmol)を加え、60℃で反応溶液を16時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出液Ｂを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物 5b (610 mg、無色の油、収率:66.5%)を得た。
工程２
(R)-2-(4-ブロモ-1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン5c
5b (600 mg, 2.62 mmol)を30 mLのジクロロメタンに溶解した後、N-ブロモスクシンイミド(466 mg, 2.62 mmol)を加え、室温で反応溶液を16時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。溶出液Ｂを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物 5c (795 mg、黄色の油、収率:98.6%)を得た。
工程３
(R)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(テトラヒドロフラン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン5
5c (100 mg, 0.32 mmol)を15 mLの1,4-ジオキサンと水の混合溶媒(V:V=10:1)に溶解した後、1d (135 mg, 0.49 mmol)、1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン(18 mg, 0.032 mmol)、炭酸カリウム(88 mg, 0.64 mmol)および[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム(23 mg, 0.032 mmol)を加え、反応溶液を80℃に加熱し、アルゴン雰囲気下で16時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。溶出液Ａを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物 5 (58 mg、淡い褐色固体、収率:38.9%)を得た。
MS m/z (ESI): 461.5 [M+1]
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.66-8.65 (d, 1H), 8.16-8.14 (d, 2H),8.06-8.04 (d, 33 2H), 7.92 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.68-7.64 (t, 1H), 7.51-7.49 (d, 1H), 7.36-7.34 (dd, 1H), 7.20-7.18 (d, 1H), 5.19 (m, 1H), 4.19-4.24 (m, 2H), 4.14-4.10 (m, 1H), 4.03-4.01 (m, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.66-2.57 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.51-2.42(m, 1H).
【実施例６】
【００８１】
4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(オキセタン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン
【化２２】
2020500177.tif 000035
工程１
2-メチル-6-(1-(オキセタン-3-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)ピリジン 6b
1e (749 mg, 4.7 mmol)を15 mLのＮ，N-ジメチルホルムアミドに溶解した後、オキセタン-3-イルトルエン-4-スルホネート 6a (1.61 g, 7.05 mmol, 特許出願“WO2013056070”に開示された方法に従って調製)および炭酸セシウム(3.06 g, 9.4 mmol)を加え、60℃で反応溶液を3時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出液Ａを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物 6b (420 mg、淡い黄色の油、収率:41.6%)を得た。
工程２
2-(4-ブロモ-1-(オキセタン-3-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)-6-メチルピリジン 6c
6b (420 mg, 1.95 mmol) を30 mLのジクロロメタンに溶解した後、N-ブロモスクシンイミド(347 mg, 1.95 mmol)を加え、室温で反応溶液を16時間撹拌した。反応が終了した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。溶出液Ａを備えたCombiFlash迅速分取装置で生成した残渣を精製し、表記化合物 6c (479 mg、淡い黄色の油、収率:83.4%)を得た。
工程３
4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(オキセタン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン6
6c (50 mg, 0.17 mmol)を5.5 mLの1,4-ジオキサンと水の混合溶媒(V:V=10:1)に溶解した後、1d (91.6 mg, 0.25 mmol)、1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン(9.42 mg, 0.02 mmol)、炭酸カリウム(46.99 mg, 0.34 mmol)および[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム(12.44 mg, 0.02 mmol)を加え、反応溶液を80℃に加熱し、アルゴン雰囲気下で18時間撹拌した。出発原料が消失するまでに反応をLC-MSでモニターし、その後、反応を停止させた。反応溶液を冷却させ、濃縮し、溶媒をほとんど除去した。残渣に10 mLの水を加え、酢酸エチル(10 mL×3)で抽出した。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液(10 mL×2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、溶出液Ａを備えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成した残渣を精製し、表記化合物 6 (41 mg、黄色固体、収率:52.43%)を得た。
MS m/z (ESI): 447.4 [M+1]
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.65 (d, 1H), 8.07 (dd, 4H), 7.99 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.64 (t, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.18 (d, 1H), 5.64-5.58 (m, 1H), 5.17-5.13 (m, 4H), 3.10 (s, 3H), 2.51 (s, 3H).
【実施例７】
【００８２】
4-(4-(1-シクロプロピル-3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)ピリジン-2-イル)ベンゾニトリル 7
【化２３】
2020500177.tif 000036
実施例２の合成経路に従って、工程３に用いた出発化合物1dの代わりに4-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ピリジン-2-イル)ベンゾニトリル(特許出願“KR20160025776”に開示された方法に従って調製)を用い、表記化合物 7 (10 mg)を調製した。
MS m/z (ESI): 378.4 [M+1]
1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 8.67-8.66 (d, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.25-8.21 (m, 1H),  8.13-8.11 (m, 3H), 7.91-7.89 (d, 2H), 7.75-7.72 (m, 2H), 7.56-7.54 (d, 1H), 3.98-3.92 (m, 1H), 2.77 (s, 3H), 1.35-1.28 (m, 2H), 1.22-1.18 (m, 2H).
【実施例８】
【００８３】
(R)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(1-(メチルスルホニル)ピロリジン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン 8
【化２４】
2020500177.tif 000037
工程１〜３
tert-ブチル (R)-3-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-4-(2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-1-イル)ピロリジン-1-カルボキシレート 8d
実施例３の合成経路に従って、工程２で用いた出発化合物 3bの代わりにtert-ブチル(S)-3-(トシルオキシ)ピロリジン-1-カルボキシレート 8a (特許出願“WO2016034134”に開示された方法に従って調製)を用い、表記化合物 8d (190 mg)を調製した。
工程４
(R)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(ピロリジン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン塩酸塩 8e
化合物8d (190 mg, 0.3395 mmol)を10 mLの酢酸エチルに溶解した後、4M 塩化水素の1,4-ジオキサン溶液(0.42 mL, 1.69 mmol)を加え、反応溶液を4時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、表記化合物8eの粗生成物(200 mg)を得た。これを精製せずに次の工程に直接に使用した。
工程５
(R)-4-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-(1-(メチルスルホニル)ピロリジン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリジン 8
化合物8e の粗生成物(100 mg, 0.2176 mmol)を3 mL のピリジンに溶解した後、塩化メシル(74.8 mg, 0.6528 mmol)を滴加し、反応溶液を16時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、20 mLの硫酸銅の飽和溶液を加え、酢酸エチル(10 mL×3)で抽出した。有機層を合わせ、表記化合物 8 (20 mg、収率:17.1%)を得た。
MS m/z (ESI): 538.5 [M+1]
1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 8.55-8.54 (d, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.12-8.10 (m, 2H), 8.06-8.04 (d, 2H), 7.93 (s, 1H), 7.82-7.78 (m, 1H), 7.56-7.54 (d, 1H), 7.39-7.37 (dd, 1H), 7.33-7.31 (d, 1H), 5.22-5.15 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 2H), 3.76-3.69 (m, 1H), 3.62-3.56 (m, 1H), 3.17 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 2.62-2.57 (m, 2H), 2.45 (s, 3H).
（生物学的試験）
【試験例１】
【００８４】
TGFβRIキナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用の測定
in vitroでのTGFβRIキナーゼ活性の阻害作用を以下の方法により測定した。
TGFβRIキナーゼアッセイキット（V4093, Promega）を用いて酵素活性を測定した。反応バッファー（40 mM Tris pH 7.5, 20 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA）で調製した2 μlの酵素溶液（反応系における酵素の最終濃度は2 ng/μL）、5% DMSOに溶解した化合物の３倍グラジエント希釈液1 μl、および2 μlのATPとTGFβRI基質ペプチドの混合溶液（ATPの最終濃度は50 μMであり、基質の最終濃度は0.2 μg/μLであった）を続けて384穴プレート（4514, Corning）に添加した。27°Cで2.5時間反応した後、キットのADP-Glo溶液5 μlを各ウェルに添加し、次いでプレートを27°Cで40分間置いた。次いで10 μlのキナーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加し、次いでプレートを27°Cで30分間置いた。化学発光シグナル値をVictor 3 (PerkinElmer) multi-functionマイクロプレートリーダーで測定した。酵素阻害に対する化合物のIC50値は、化合物の各濃度とその対応するシグナル値に基づいてGraphpad prism softwareを用いて計算した。
本発明化合物の生物活性を上記試験により測定した。得られたIC50値を下記表１に示す。
【表１】
2020500177.tif 000038
結論：本発明の実施例化合物は、TGFβRIキナーゼALK5活性に対して著しい阻害作用を有している。
【試験例２】
【００８５】
VEGFR2キナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用の測定
in vitroでのVEGFR2キナーゼ活性の阻害作用を以下の方法により測定した。
VEGFR2キナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用を以下の実験方法により測定した：
Z’-LYTE（登録商標） Kinase Assay Kit - Tyrosine 1 Peptide（PV3190, Invitrogen）を用いて酵素活性を測定した。反応バッファー（50 mM HEPES pH7.5, 10mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.05% BRIJ-35）で調製した遺伝子組換えヒトVEGFR2酵素（PV3660, Invitrogen）とVEGFR2基質ポリペプチド（反応系において、酵素の最終濃度は0.14 ng/μLで、基質の最終濃度は2 μMであった）の5 μl、5% DMSOに溶解した化合物の２倍グラジエント希釈液2.5 μl、およびATP溶液（ATPの最終濃度は50 μMであった）の2.5 μlを続けて384穴プレート（4513, Corning）に添加した。25°Cで2時間反応した後、検出試薬5 μlを各ウェルに添加した。プレートを25°Cで1時間置いた後、発光波長445 nmと520 nmで蛍光シグナル値をNOVOstar (BMG) multi-functionマイクロプレートリーダーで測定した。酵素阻害に対する化合物のIC50値は、化合物の各濃度とその対応するシグナル値に基づいてGraphpad prism softwareを用いて計算した。
本発明化合物の生物活性を上記試験により測定した。得られたIC50値を下記表２に示す。
【表２】
2020500177.tif 000039
結論：本発明の実施例化合物はVEGFR2キナーゼ活性に対して弱い阻害作用を有していて、本発明の実施例化合物がTGFβRIキナーゼに対して選択的阻害作用を有することを示している。
【試験例３】
【００８６】
p38αキナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用の測定
in vitroでのp38αキナーゼ活性の阻害を以下の方法により測定した。
p38αキナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用を以下の実験方法により測定した：
p38αキナーゼアッセイキット（V9591, Promega）を用いて酵素活性を測定した。反応バッファー（40 mM Tris pH 7.5, 20 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA）で調製した2 μlの酵素溶液（反応系における酵素の最終濃度は0.5 ng/μL）、5% DMSOに溶解した化合物の３倍グラジエント希釈液1 μl、および2 μlのATPとp38基質ペプチドの混合溶液（ATPの最終濃度は50 μMであり、基質の最終濃度は0.2 μg/μLであった）を続けて384穴プレート（4514, Corning）に添加した。27°Cで2.5時間反応した後、キットのADP-Glo溶液5 μlを各ウェルに添加し、次いでプレートを27°Cで40分間置いた。次いで10 μlのキナーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加し、次いでプレートを27°Cで30分間置いた。化学発光シグナル値をVictor 3 (PerkinElmer) multi-functionマイクロプレートリーダーで測定した。酵素阻害に対する化合物のIC50値は、化合物の各濃度とその対応するシグナル値に基づいてGraphpad prism softwareを用いて計算した。
本発明化合物の生物活性を上記試験により測定した。得られたIC50値を下記表３に示す。
【表３】
2020500177.tif 000040
結論：本発明の実施例化合物はp38αキナーゼ活性に対して弱い阻害作用を有していて、本発明の実施例化合物がTGFβRIキナーゼに対して選択的阻害作用を有することを示している。
【試験例４】
【００８７】
RIPK2キナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用の測定
in vitroでのRIPK2キナーゼ活性の阻害を以下の方法により測定した。
RIPK2キナーゼ活性に対する本発明化合物の阻害作用を以下の実験方法により測定した：
RIPK2キナーゼアッセイキット（V4084, Promega）を用いて酵素活性を測定した。反応バッファー（40 mM Tris pH 7.5, 20 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA）で調製した2 μlのRIPK2酵素溶液（反応系における酵素の最終濃度は0.5 ng/μL）、5% DMSOに溶解した化合物１の３倍グラジエント希釈液1 μl、および2 μlのATPとMBP基質ペプチドの混合溶液（ATPの最終濃度は50 μMであり、基質の最終濃度は0.2 μg/μLであった）を続けて384穴プレート（4514, Corning）に添加した。27°Cで2.5時間反応した後、キットのADP-Glo溶液5 μlを各ウェルに添加し、次いでプレートを27°Cで40分間置いた。次いで10 μlのキナーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加し、次いでプレートを27°Cで30分間置いた。化学発光シグナル値をVictor 3 (PerkinElmer) multi-functionマイクロプレートリーダーで測定した。酵素阻害に対する化合物のIC50値は、化合物の各濃度とその対応するシグナル値に基づいてGraphpad prism softwareを用いて計算した。
本発明化合物の生物活性を上記試験により測定した。得られたIC50値を下記表４に示す。
【表４】
2020500177.tif 000041
結論：本発明の実施例化合物はRIPK2に対して弱い阻害作用を有していて、本発明の実施例化合物がTGFβRIキナーゼに対して選択的阻害作用を有することを示している。
【試験例５】
【００８８】
NIH3T3細胞増殖に対する本発明化合物の阻害の測定
NIH3T3細胞増殖に対する本発明化合物の阻害作用を以下のin vitro試験により測定した。
NIH3T3細胞増殖に対する本発明化合物の阻害作用を以下の実験方法により測定した：
透明な底を持つ96穴白色プレート（3903, Corning）で、各ウェルに100 μLのNIH3T3細胞（GNM6, Cell Bank of Typical Culture Collection Committee of Chinese Academy of Sciences）を10% FBS (SH30243.01, GE)を含むDMEM培地中に播種した。播種密度は2000細胞/ウェルである。細胞は5% CO2中、37°Cで終夜インキュベートした。終夜の培養後、各ウェルは0.5% FBSを含有するDMEM培地90 μLで置換した。次いで0.5% FBSを含有するDMEM培地での化合物の３倍グラジエント希釈液10 μLを添加して、プレートは5% CO2中、37°Cでセルインキュベーター中で72時間インキュベートした。最後に、50 μLのCellTiter-Glo（G7573, Promega）を各ウェルに添加した。室温で10分間の培養後、化学発光シグナル値をVictor 3マイクロプレートリーダー(PerkinElmer)で測定した。化合物のIC50値は、化合物の各濃度とその対応するシグナル値に基づいてGraphpad prism softwareを用いて計算した。
本発明化合物の生物活性を上記試験により測定した。計算したIC50値を下記表４に示す：
【表５】
2020500177.tif 000042
結論：本発明の化合物はNIH3T3細胞増殖に対して著しい阻害活性を有する。
【試験例６】
【００８９】
TGFβRIのSmadシグナル経路に対する本発明化合物の阻害作用の測定
TGFβRIのSmadシグナル経路に対する本発明化合物の阻害作用を以下のin vitro試験により測定した。
TGFβRIのSmadシグナル経路に対する本発明化合物の阻害作用を以下の実験方法により測定した： 
96穴プレートで、各ウェルに100 μLのHepG2細胞（TCHu 72, Cell Bank of Typical Culture Collection Committee of Chinese Academy of Sciences）を10% FBS （42360-099, Gibco）を含有するEMEM培地上に播種した。播種密度は2.5x104細胞/ウェルである。細胞は5% CO2中、37°Cで終夜インキュベートした。各ウェルは10% FBSを含有する新鮮なEMEM培地で置換した。0.1 μgの3TP-lux plasmid (11767, Biovector Science Lab,Inc.)を各ウェルにトランスフェクトした。細胞は、更に5% CO2中、37°Cで24時間インキュベートした。各ウェルは0.5% FBSを含有するEMEM培地90 μLで置換し、次いで細胞は6時間飢餓にした。化合物は20 mMストック溶液として調製し、100% DMSOで400x濃度にグラジエント希釈して、さらに0.5% FBSを含有するEMEMで40倍希釈した。細胞培養プレートを取り出し、次いで10 μlの希釈化合物またはコントロール（0.25% DMSO）を各ウェルにそれぞれ添加した。プレートは穏やかに振とうし、次いで5% CO2中、37°Cでインキュベーター中で18時間インキュベートした。最後に、100 μlの検出試薬ONE-GloTM Luciferase Assay（E6110, Promega）を各ウェルに添加し、プレートは10分間室温で暗所に置いた。化学発光シグナル値をVictor 3.0（PerkinElmer）で測定した。化合物のIC50値は、化合物の各濃度とその対応するシグナル値に基づいてGraphpad prism softwareを用いて計算した。
本発明化合物の生物活性を上記試験により測定した。計算したIC50値を下記表６に示す：
【表６】
2020500177.tif 000043
結論：本発明の化合物はTGFβRIのSmadシグナル経路に対して著しい阻害活性を有する。
薬物動態評価
【試験例７】
【００９０】
本発明化合物の薬物動態試験
１．要約
ラットを試験動物として用いた。異なる時点での血漿中の薬物濃度は、ラットに実施例１および２の化合物を胃内投与した後にLC/MS/MSにより測定した。本発明化合物の薬物動態挙動をラットで研究し、評価した。
２．試験プロトコール
２．１試験化合物
実施例１および２の化合物
２．２試験動物
8匹の健康な成体Sprague-Dawley（SD）ラット（雄半分と雌半分）をSINO-BRITISH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, with Certificate No.: SCXK (Shanghai) 2008-0016から購入し、等しく2群に分割した（1群当たり4ラット）。
２．３薬物の調製
一定量の試験薬物を秤量し、5容量％のDMSO、5容量％のTween 80、および90容量％の生理食塩水を添加して0.2 mg/mLの無色で、澄んだ、透明の溶液を調製した。
２．４投与
一晩絶食後、SDラットに2.0 mg/kgの投与量、且つ10.0 mL/kgの投与容量で試験薬物を胃内に投与した。
３．方法
ラットに、実施例１および２の化合物を胃内に投与した。血液0.2 mLを投与前および投与後0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、11.0および24.0時間で眼窩静脈叢から採取した。サンプルは、ヘパリン処理した試験管に貯蔵し、4°C、3,500rpmで10分間、遠心分離して血漿を分離した。血漿サンプルは-20℃で保存した。ラットは投与後2時間で給餌した。
異なる濃度での試験薬物の胃内投与後のラットの血漿中における試験化合物の含量を測定した：投与後の各時点でラット血漿25 μLを採取し、カンプトテシンの内部標準溶液30 μL (100 ng/mL)およびアセトニトリル225 μLを添加し、5分間渦流混合して、10分間（3600 rpm）遠心分離した。5.0 μLの上澄み液をLC/MS/MS分析のために血漿サンプルから採取した。
４．薬物動態パラメータの結果
本発明化合物の薬物動態パラメータを下記に示す。
2020500177.tif 000044
結論：本発明化合物は良く吸収されて、著しい薬物動態学的利点を有している。
毒性試験
【試験例８】
【００９１】
SDラットに7日間繰り返して胃内投与したTGFβ阻害剤の毒性試験
１．試験目的
SDラットに7日間繰り返して胃内投与したTGFβ阻害剤化合物１の毒性の評価
２．試験薬物
化合物１、純度：100％、白色固体
塩分子量：444.5、フリー塩基分子量：444.5（フリー塩基に基づく）
貯蔵条件：室温
３．試験プロトコールと試験方法
３．１．試験動物と飼育条件
26匹のSPFグレードのSDラット（約180~200 g、6-7週令、雄半分と雌半分）をShanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd.より購入した。
飼育条件：SPFグレード、動物はプラスチックの透明なラットケージに収容した。ケージ当り2-3ラット。室温：20-26°C、相対湿度：40~70%。12時間明／12時間暗を交互に繰り返した。ラットは、ラット用の固形飼料に自由にアクセスさせた。ラットは、飲料ボトルを介して高温滅菌した水に自由にアクセスさせた。
３．２．動物のグループ分け：
動物はランダムに５群、即ち、溶媒コントロール群、化合物１‐30mg/kg群、化合物１‐100mg/kg群、および対応するトキシコキネティクス群に分割した。溶媒コントロール群、化合物１‐30mg/kg群および化合物１‐100mg/kg群には６匹がいて、各対応するトキシコキネティクス群には４匹がいて、雄半分と雌半分であった。
2020500177.tif 000045
３．３．試験方法
ラットにおける７日間毒性試験における試験化合物の用量は、それぞれ、30および100 mg/kg（qd）であり、投与は7日間続けた。投与ルート：胃内投与、投与量：10 ml/kg、投与頻度および投与期間：毎日朝投与、7日間連続投与。
３．４．データ表示と統計処理
種々の指標の結果はコンピュータExcelに入力し、SPSS softwareパッケージに入力して処理した。
臨床症状、食物摂取および解剖学的肉眼観察は統計的に処理せず、プロトコールの観察項目の観察データのみリストした。体重、臓器重量、および臨床試験などの指標はSPSSを用いて統計的に処理した。
４．結果
投与中、化合物1の各用量群で動物の臨床観察において明らかな異常はなかった。溶媒コントロール群に比べて、各用量群で動物の間に体重および体重増加率に有意差（p>0.05）はなく、食物摂取にも明らかな変化はなかった。
各用量群において化合物1の血液の生化学的指標に毒性学的変化は観察されなかった。溶媒コントロール群に比べて、各用量群で動物の血液凝固機能と尿指標に明らかな異常はなかった。
最後の投与後、動物は麻酔後に安楽死させ、そして剖検結果は化合物1の各用量群における動物の肉眼での病理学的解剖に明らかな異常がないことを示した。
溶媒コントロール群に比べて、各薬物投与群の臓器係数の変化における明らかな異常はなかった。心臓の病理組織検査は、各薬物投与群で上行大動脈壁の各層における明らかな損傷、冠動脈壁における損傷、および房室弁における異常がないことを示した。心臓の病理学的検査で明らかな異常は観察されなかった。
５．結論：化合物1は、この試験の条件下で良い安全性を有している。
治療効果アッセイ
【試験例９】
【００９２】
B16-F1異種移植C57マウスに対するTGFβ化合物の治療効果アッセイ
１．試験目的
C57マウスでのマウスのメラノーマ細胞B16-F1異種移植片の増殖に対する実施例1の化合物の阻害作用の評価。
２．試験薬物
化合物１を0.5% CMC-Na+0.25% (v/v) Polysorbate 80を用いて5 mg/ml水溶液に調製した。投与濃度は50 mg/kgであり、胃内投与用の経口容量は10 ml/kgであった。
３．試験方法および試験物質
３．１．試験動物および給餌条件
検査使用用の雌C57BL/6JラットをSINO-BRITISH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO (Shanghai, China, Certificate No.: SCXK (Shanghai) 2008-0016)から購入した。購入時のラットの体重は16〜20 gであった。動物購入後、3日間の適応給餌の後に試験を開始した。給餌条件：SPFグレード。動物給餌方法：12/12時間明/暗サイクル、温度23±1°C、湿度40-50%、動物には標準の滅菌したマウス用の餌を給餌し、食物と水に自由にアクセスさせた。
３．２．動物のグループ分け：
2020500177.tif 000046
注：bidとは、1日2回の投与をいう。
３．３．試験方法
適応給餌後のC57マウスを代謝ケージで一晩絶食し、体重測定後に以下の群にランダムに分けた：ブランク群および化合物1群、群当たり１０マウス。C57マウスの右側腹部の皮膚の準備を1日前に行い、B16-F1細胞を皮下に接種して（マウス当たり1×104細胞）、投与を接種後3日目に開始した。各マウスは化合物１（例、10 ml/kg）を1日2回胃内に投与し、ブランク群は対応する溶媒を胃内に投与した。腫瘍体積は週に２回測定し、体重を秤量してデータを記録した。
３．４．データ統計
Excel統計ソフトウェアを用いた：平均値はavgにより計算した；SD値はSTDEVにより計算した；SEM値はSTDEV/SQRTとして計算した；群間の差P値はTTESTにより計算した。
腫瘍体積（V）の計算式は：V = 1/2 × Llength × Lshort 2
腫瘍阻害率（％）＝ (C-T) / C (%)
ここで、V0とVTは、それぞれ、試験開始時と試験終了時の腫瘍体積である。CとTは、それぞれ、試験終了時点のブランク群と試験群の平均腫瘍体積である。
４．結果
B16-F1ヌードマウス異種移植片に対する化合物１の治療効果データ表４．１および図１に示す。
C57マウスの体重に対する化合物1の効果を図2に示す。
【表４．１】
2020500177.tif 000047
* p<0.05
５．結論
化合物１を、腫瘍細胞移植後4日目に1日２回投与した。化合物１群の腫瘍体積は１９日目でブランクコントロール群のものより著しく小さかった。腫瘍阻害率は71.12%と計算され、投与はマウスの体重に対し何の影響も与えなかった。
【図１】
2020500177.tif 000056
【図２】
2020500177.tif 000057
【国際調査報告】
2020500177.tif 000058
2020500177.tif 000059
2020500177.tif 000060
2020500177.tif 000061