(57)【要約】  本開示は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対する耐性又は抵抗性を有するバナナ植物を生産するための方法及びそのような植物を提供する。この方法は、（ａ）１又は複数の繁殖周期にある１つ又は複数のバナナ分裂組織を、脱メチル化剤を含む培地に曝露するステップ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異生成）であって、これによって、発現を呈する１つ又は複数のバナナ分裂組織を提供し、これによって、サザンブロットハイブリダイゼーション分析により決定される、それらの植物ゲノム中のレトロ転移因子の増幅を提供するステップ、及び（ｂ）増幅を呈した分裂組織を発根させ、これから１つ又は複数の再生バナナ植物、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有する再生バナナ植物の少なくとも１つ、を再生させるステップを備える。【選択図】図１
2020534824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対する耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）又は抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を有するバナナ植物を生産するための方法であって、当該方法が：
（ａ）１つ又は複数の繁殖周期にある１つ又は複数のバナナ分裂組織を、脱メチル化剤を含む培地に曝露させるステップであって、これによって、発現を呈する１つ又は複数のバナナ分裂組織を提供し、これによって、サザンブロットハイブリダイゼーション分析により決定される、それらの植物ゲノム中のレトロ転移因子の増幅を提供するステップ、
（ｂ）前記増幅を呈した前記分裂組織を発根させ、これから１つ又は複数の再生バナナ植物、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有する前記再生バナナ植物の少なくとも１つ、を再生させるステップ
を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記脱メチル化剤が、ＤＮＡメチル転移酵素阻害剤であること特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記脱メチル化剤が、アザシチジン及びデシタビンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記脱メチル化剤が、デシタビンであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法において、２以上の繁殖周期中に、前記１つ又は複数の分裂組織を前記脱メチル化剤に曝露するステップを備えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の方法において、前記脱メチル化剤に曝露するステップが、前記増幅が平坦になるまでであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記サザンブロットハイブリダイゼーションが、ＲＴに特異的なプローブとともに行われることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記プローブが、Ｂａｎ−１であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記１つ又は複数の分裂組織が、これを脱メチル化剤に曝露させる前に、１−ｐｈｅｎｙｌ−３−（１，２，３−ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌ）ｕｒｅａ（ＴＤＺ）によるマイクロ繁殖の１つ又は複数の周期に置かれることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、前記再生されたバナナ植物の少なくとも１つが、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、前記耐性又は抵抗性が、葉の萎凋化、葉の黄色化、バナナ植物の維管束系の黒色化の１つ又は複数の欠如によって決定されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対する植物の耐性又は抵抗性に関連する少なくとも１つのゲノムマーカーを含むバナナ植物であって、前記耐性又は抵抗性が、バナナ植物がＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４への曝露後に無症状のままであることによって呈されることを特徴とするバナナ植物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のバナナ植物において、前記少なくとも１つのゲノムマーカーが、Ｂａｎ−１を用いたサザンブロット分析によって検出されることを特徴とするバナナ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、植物の抵抗性、特に、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有する植物の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本開示の主題の背景として関連があると考えられる文献を以下に示す。
−Ｃｈａｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｂａｎａｎａ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．”  Ｂａｎａｎａ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ−ｃｅｌｌｕｌａｒ，  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｅｎｆｉｅｌｄ，  ＮＨ，  ＵＳＡ：  ＦＡＯ／ＩＡＥＡ／ＩＮＩＢＡＰ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ，  ２００４，  ５９−７７．
−Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｋｅｉｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ．”  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｂｏｔａｎｙ  １００．２  （２００７）：  ２０５−２１７．
−Ｌｕｉｓ  Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｃｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｗｉｌｔ  （Ｐａｎａｍａ  ｄｉｓｅａｓｅ）  ｏｆ  ｂａｎａｎａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ  ｓｐ．  ｃｕｂｅｎｓｅ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｒａｃｅ  ４  （ＴＲ４）”  ＦＯＯＤ  ＡＮＤ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＲＧＡＮＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＮＩＴＥＤ  ＮＡＴＩＯＮＳ，  Ｍａｙ  ２０１４．
−Ｄｉｔａ，  Ｍ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｒａｃｅ  ４  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｎａｎａ  ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｗｉｌｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．”  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５９．２  （２０１０）：  ３４８−３５７．
【０００３】
本明細書における上記の文献への謝辞は、これらが本開示の主題の特許性にどのような形でも関連しているという意味に推定されるものではない。
【０００４】
背景
全世界的なバナナの生産は、萎凋病（立ち枯れ病、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｗｉｌｔ）の再来によって深刻な脅威にさらされている。土壌伝播性菌類Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  Ｃｕｂｅｎｓｅ（ＦＯＣ）によって引き起こされるこの病害は、「パナマ病」としても知られ、２０世紀の中頃には、中央アメリカ及びカリブ海地域におけるＧｒｏｓ  Ｍｉｃｈｅｌ種のバナナ産業を一掃してしまった。ＦＯＣ  Ｒａｃｅ  １の影響は、現在ではバナナ輸出の９９％の源である、抵抗性を有するＣａｖｅｎｄｉｓｈ栽培品種へのシフトによって解決した。全世界のバナナ及びプランテーション生産の８０％超は、ＴＲ４感受性生殖質に基づいていると考えられている。ＦＯＣのこの株は、亜熱帯地域において報告されたより重症でない感染とは異なる、熱帯地域におけるＣａｖｅｎｄｉｓｈの疫病流行を引き起こした。［Ｌｕｉｓ  Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｃｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｗｉｌｔ  （Ｐａｎａｍａ  ｄｉｓｅａｓｅ）  ｏｆ  ｂａｎａｎａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｃｕｂｅｎｓｅ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｒａｃｅ  ４  （ＴＲ４）”  ＦＯＯＤ  ＡＮＤ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＲＧＡＮＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＮＩＴＥＤ  ＮＡＴＩＯＮＳ，  Ｍａｙ  ２０１４］
【０００５】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  Ｃｕｂｅｎｓｅの胞子は、土壌中で３０年も休眠状態でいることができる。この胞子は、感受性のある植物の根を通じて感染させ、植物の木質部管で群生し、水及び栄養素の流れを阻害する。この状態は、萎凋病と呼ばれる症状を生じる。萎凋病の特徴的な症状は、植物の幹中の黒化し、変色し、弱体化した維管束組織である。変色は、初期段階の薄い黄色から、後期段階の暗赤色及び黒色へと変化する。内部の症状は、最初は細根及びリゾームで、その後は植物の偽茎において発症する。
【０００６】
現在のところ、これらは殺菌剤に対して抵抗性があり、どのような化学処理によっても土壌から除去することはできない。したがって、これまで、畑における萎凋病を制御又は治療するための、土壌又は植物の生存可能で完全に効果的な治療は存在しない。
【０００７】
Ｃｈａｉ，  Ｍ．らは、バナナ栽培品種を導入変異によって改良するためのプログラムを開始した。Ｐｉｓａｎｇ  Ｂｅｒｒａｎｇａｎ（ＡＡＡ）バナナ植物は、さまざまな用量でガンマ線照射された。萎凋病に対して耐性を有する変異体が選択された。［Ｃｈａｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｂａｎａｎａ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．”  Ｂａｎａｎａ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ−ｃｅｌｌｕｌａｒ，  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｅｎｆｉｅｌｄ，  ＮＨ，  ＵＳＡ：  ＦＡＯ／ＩＡＥＡ／ＩＮＩＢＡＰ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ，  ２００４，  ５９−７７］
【０００８】
Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｋｅｉｋｏらは、コメ植物において脱メチル化が病害抵抗性遺伝子を活性化したことを示した。［Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｋｅｉｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ．”  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｂｏｔａｎｙ  １００．２  （２００７）：  ２０５−２１７］
【０００９】
Ｌｕｉｓ  Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｃｅｎｔｅらは、萎凋病の主な側面を精査し、サンプリング、抽出、及び分離貯蔵、バナナ接種、分子抽出、診断ツールに関する異なったプロトコルを開示した。［Ｌｕｉｓ  Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｃｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｗｉｌｔ  （Ｐａｎａｍａ  ｄｉｓｅａｓｅ）  ｏｆ  ｂａｎａｎａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｃｕｂｅｎｓｅ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｒａｃｅ  ４  （ＴＲ４）”  ＦＯＯＤ  ＡＮＤ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＲＧＡＮＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＮＩＴＥＤ  ＮＡＴＩＯＮＳ，  Ｍａｙ  ２０１４］
【００１０】
Ｄｉｔａ，  Ｍ．  Ａ．らは、ＰＣＲに基づき、植物体に適用できる、迅速なＴＲ４検出方法を開示している。［Ｄｉｔａ，  Ｍ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｒａｃｅ  ４  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｎａｎａ  ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｗｉｌｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．”  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５９．２  （２０１０）：  ３４８−３５７］
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、その第１の側面に従い、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性を有するバナナ植物の生産するための方法であって、当該方法が：
（ａ）１つ又は複数の繁殖周期にある１つ又は複数のバナナ分裂組織を、脱メチル化剤を含む培地に曝露させるステップであって、これによって、発現を呈する１つ又は複数のバナナ分裂組織を提供し、これによって、サザンブロットハイブリダイゼーション分析により視覚化される、それらの植物ゲノム中のレトロ転移因子の増幅を提供するステップ；
（ｂ）増幅を呈した分裂組織を発根させ、これから１つ又は複数の再生バナナ植物、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓに対して耐性又は抵抗性を有する再生バナナ植物の少なくとも１つ、を再生させるステップ
を備えることを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
第２の側面に従い、本開示は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対する植物の耐性又は抵抗性に関連する少なくとも１つのゲノムマーカーを含むバナナ植物であって、耐性又は抵抗性が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４への曝露後に無症状のままであるバナナ植物によって呈されることを特徴とするバナナ植物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本明細書に開示の主題をより良く理解し、実際にどのように実施され得るかを例示するため、非限定的な実施例のみによって、図面を参照しつつ、実施形態を以下に記載する。
【図１】図１は、本開示の実施形態に従った、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有するバナナ植物を生産する方法を記述するブロックダイヤグラムである。
【図２】図２Ａ―２Ｅは、菌類病原体による接種から１３週間後の植物の画像であり、図２Ａが病害の顕著な症状はないことを示す一方で、図２Ｂ−２Ｅは病害の典型的で進行した症状を示す。
【図３】図３は、２００ｍｌの接種材料（１×１０６胞子／ｍｌの濃度）による接種から９週間後の接種バナナ植物が１２個入ったトレイの画像である。
【図４】図４は、接種から１３週間後の無症状植物の画像である。
【図５】図５Ａ−５Ｈは、抵抗性バナナ植物（図５Ａ−５Ｄ，５Ｇ）及び感受性バナナ植物（図５Ｅ−５Ｆ，５Ｈ）の画像であり、抵抗性植物は本開示によって得られたものであり、抵抗性植物（図５Ｇ）及び感受性植物（図５Ｈ）の茎中の維管束組織間の直接的比較である。
【図６】図６Ａ−６Ｇは、本開示に従って生産した抵抗性バナナ植物の異なったステージにおける画像であり、図６Ｄ−６Ｇは、異なったシブリング（ｓｉｂｌｉｎｇ）からのバナナ果実を示す。
【図７】図７は、Ｂａｎ−Ｒｅｔｒｏ  １プローブによってプローブされたサザンブロットハイブリダイゼーションであり、「前」及び「後」は、それぞれ、脱メチル化剤への曝露前又は曝露後を示す。
【図８】図８は、５’長い末端反復、３’長い末端反復、ＧＡＧタンパク質、プロテアーゼ（ｐｒｏｔ．）、インテグラーゼ（Ｉｎｔｅｇ．）、逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮＡ  Ｈ  （ＲＮ  Ｈ）をコードする遺伝子を含むＣｏｐｉａ様レトロ転移因子の推定構造である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、バナナ植物の分裂組織を栽培品種のマイクロ繁殖段階の１乃至２の繁殖周期中に脱メチル化剤に曝露させると、複数の変異Ｃａｖｅｎｄｉｓｈバナナ植物が生産され、これらのいくつかがＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４病原体に対する抵抗性を呈したという知見に基づいている。
【００１５】
上記の知見から、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ、具体的には、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対する耐性又は抵抗性を有するＣａｖｅｎｄｉｓｈバナナ植物の生産方法が確立された。
【００１６】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓは、萎凋病と呼ばれる多様な症状を起こす、典型的な維管束病害（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｗｉｌｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）である。症状は，内的症状と外的症状とに分けられる。
【００１７】
萎凋病の特徴的な内的症状は、維管束の変色であり、これは、初期の薄い黄色から後期の暗赤色又はほぼ黒色へと変化する。内的症状は、最初は、初期感染部位である細根において発症する。菌はリゾームへと拡散し、その後は偽茎へと拡散する。
【００１８】
外的症状は、古い葉の縁の周りの萎凋化及び黄色化を含む。黄色の葉は立ったままか、葉柄（ｐｅｔｉｏｌｅ）の部分で折れるであろう。最終的には、全ての葉は落葉し、乾燥してしまう。もう１つの共通の症状は、偽茎の基部（ｂａｓｅ）の分裂である。他の症状は、新しい葉の不規則で薄い色の縁及び葉身の皺と捻れを含む。
【００１９】
したがって、本開示の文脈では、「耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」に言及するとき、植物は、菌類に感染したが、果実の収穫という意味では生存しかつ生産性があると理解される。これに関して、植物は、病害の症状の１つ又は複数を示してよく、又は、示さなくてよい。いくつかの実施形態では、植物は、病害の外的症状を示さないが、病害の内的症状を呈する。いくつかの他の実施形態では、植物は、病害の穏和な症状（外的及び／又は内的）を示すが、依然として生存可能のままである。
【００２０】
さらに、本開示の文脈では、「抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」に言及するとき、植物は、病害の特徴的症状の何れも示していない、無症状のままであると理解される。
【００２１】
本明細書で開示される方法は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有する１つ又は複数の変異バナナ植物を生産するためのものである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、耐性又は抵抗性は、病害の１つ又は複数の症状の不在によって決定される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の症状は、葉の萎凋化、葉の黄色化及び植物の維管束系の黒色化の少なくとも１つ、時には、これらの組み合わせを含む。
【００２３】
具体的には、本明細書に開示される、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有するバナナ植物を生産するための方法は、
（ａ）１つ又は複数の繁殖周期にある１つ又は複数のバナナ分裂組織を、脱メチル化剤を含む培地に曝露させるステップであって、これによって、発現を呈する１つ又は複数のバナナ分裂組織を提供し、これによって、サザンブロットハイブリダイゼーション分析により決定される、それらの植物ゲノム中のレトロ転移因子の増幅を提供するステップ、
（ｂ）増幅を呈した分裂組織を発根させ、これから１つ又は複数の再生バナナ植物、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有する前記再生バナナ植物の少なくとも１つを再生させるステップ、
を備える。
【００２４】
本開示の方法で用いられるバナナ分裂組織の外植体は、典型的には茎頂分裂組織であるが、これに限られない。バナナ分裂組織の外植体は、培地中に置かれ、繁殖される。
【００２５】
理解されるように、繁殖は、同じ単一の外植体からの細胞数を増やすために必要である。増幅プロセスは、複数のマイクロ繁殖周期をともない、各サイクルは、培地の交換をともなう。典型的には、培地は、最低限として無機塩、栄養素、生長調節因子（オーキシン及びサイトキニン）、複雑な天然調製物、及び不活性な支持材料を含む。各サイクルは、必ずしも以前のものと同一の培地を用いず、培地の型又は培地に追加される任意の付加物は、分裂組織の繁殖の特定の段階に依存する。
【００２６】
バナナ分裂組織は、典型的には、複数の繁殖周期を用いて培養される。本開示によれば、脱メチル化剤を含む培地には、少なくとも１つ、時には、１乃至３の繁殖周期が存在する。脱メチル化剤を含む培地への曝露は、培養物において分裂組織細胞が十分に増幅した後に行われる。
【００２７】
本開示の文脈において、「脱メチル化剤」に言及するとき、これは、核酸メチル化を阻害する複数の化合物の１つ又はこれらの組み合わせを含む試薬であると理解される。いくつかの実施形態では、化合物は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の非限定的リストは、アザシチジン及び５−アザ−２’デオキシシチジン（デシタビン）を含む。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、デシタビンを含む。いくつかの実施形態では、デシタビンの量は０．１乃至５０μＭである。
【００２９】
いくつかの好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、デシタビンを含む。いくつかの実施形態では、デシタビンの量は１、１０、１５、３０、又は４５μＭの何れかであり、各量は本発明の異なった実施形態を表す。
【００３０】
いくつかの好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、デシタビンを含む。いくつかの実施形態では、デシタビンの量は３０μＭである。
【００３１】
繁殖分裂組織の脱メチル化剤への曝露は、典型的には、少なくとも１０の繁殖周期後に行われる。いくつかの実施形態では、脱メチル化剤が添加された培地への曝露は、少なくとも１５の繁殖周期後である。
【００３２】
脱メチル化剤への曝露は、単一の繁殖周期中であってよく、しかし、複数の繁殖周期中であってもよい。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の分裂組織の脱メチル化剤への曝露は、少なくとも２つの、典型的には、逐次的な繁殖周期中で行われる。以下で議論する通り、脱メチル化剤の存在下でいくつの周期が必要であるかの決定は、発現のレベル、これによって、サザンブロットハイブリダイゼーション分析で決定される、それらの植物ゲノム中のレトロ転移因子の増幅に基づいてよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、繁殖段階中、典型的には脱メチル化剤への曝露前に、分裂組織は、サイトキニン様物質を含む培地中で、少なくとも１つの繁殖周期中で繁殖される。サイトキニン様物質は、公知であり、非限定的例は、ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ａｄｅｎｉｎｅ（２ｉＰ）、ｋｉｎｅｔｉｎ（ＫＩＮ）、６−Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎ（ＢＡ）及び６−Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（ＢＡＰ）、１−ｐｈｅｎｙｌ−３−（１，２，３−ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌ）ｕｒｅａ（ＴＤＺ）を含む。
【００３４】
１つの好ましい実施形態では、サイトキニン様物質は、最善の増幅速度を与えると見出されたＴＤＺである。
【００３５】
培地中のＴＤＺは、非常に少ない量、典型的には、０．１ｐｐｍの範囲で存在する。この量は、所望の細胞分裂を誘起するのに十分である。
【００３６】
本開示の方法の次の段階は、所望のレベルのレトロ転移因子の発現を呈する分裂組織の発根をともなう。上記の通り、発現のレベルは、サザンブロットハイブリダイゼーション分析によって決定できる。実施形態の１つでは、発現及び増幅は、レベルが平坦になったときに十分であると決定される。
【００３７】
知られているように、レトロ転移因子（又はレトロトランスポゾン、又はＲＴ）は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列であり、これは次いで逆にＤＮＡ配列に変換され、逆にゲノムに挿入される。レトロ転移因子の発現（増幅）の増加は、逆にゲノムに挿入される配列のコピー数の増加を示す。
【００３８】
レトロトランスポゾンの発現及び増幅は、様々なＤＮＡ検出技術、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーションによって決定される。
【００３９】
レトロトランスポゾンのサザンブロットハイブリダイゼーション分析には、様々なプローブを用いることができる。これらは、例えば、レトロトランスポゾンに特異的なプローブ、例えば、Ｃｏｐｉａ  １レトロ転移因子の逆転写酵素をコードする遺伝子の一部であるＢａｎ−１を含む。
【００４０】
Ｂａｎ−１の配列を以下に示し、これを配列番号：１とする。
2020534824.tif 000003
【００４１】
サザンブロット分析を行うために、培地からＤＮＡの試料を採取する。発現がいつ所望のレベルに達したかを確認するため、試料を逐次的な増殖周期から採取し、各時点でサザンブロット分析に供し、所望のレベルを決定したら、本方法は次の段階に進むことができる。
【００４２】
繁殖及び発根のための方法は公知であり、例えば、Ｃｒｏｎａｕｓｅｒ  Ｓ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ａｎｎｕｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ５３  （１９８４）  ３２１−３２８に記載されている通りである。一般的に、植物は、発根及び再生培地、任意選択的に、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（ＭＳ）培地中に、再生植物を得るのに十分な時間だけ置かれる。［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｆ．  Ｓｋｏｏｇ．  １９６２．  Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５：  ４７３−４９７．］
【００４３】
植物（従前の周期の同一の植物に由来する植物、典型的には、シブリングのクラスター当たり５乃至８植物）のクラスターが生長したら、これらはハードニング及びプランティングのために分けられる。知られているように、ハードニングとは、植物を組織培養後に、植物が「過酷な」周囲条件に曝される際にショックを受けないように、植物を高湿度及び温和な温度に保つ環境条件に曝す過程である。さらに知られているように、プランティングは、野外で又はグリーンハウス中で行うことができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性である植物が選択される。これは既知の選択技術によって行うことができる。
【００４５】
典型的には、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性である再生植物の選択及びスクリーニングは、植物をＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４胞子を有する接種物に接種（曝露）し、植物をさらなる成長後に視覚的に分析することで行われる。無症状であると同定された植物は、さらに、次の耐性／抵抗性植物の生成（組織培養及び植物再生）を確立するために用いることができる。
【００４６】
図１は、本開示の実施形態の１つによるバナナ植物を得るための工程のブロックダイアグラムを示す。具体的には、バナナ分裂組織由来のクローンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異生成のための出発点として用いられる。クローンは、典型的には、商業的関心のあるバナナ（例：多い果実収穫量等）の分裂組織から生産される。次いで、クローンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異生成工程に供され、ここでは、クローンは、脱メチル化剤を含む培地に曝露され、これによっていくつかのシブリング（シブリング１乃至Ｎ）が提供され、これらのいくつかは発現を呈し、これによって、それらの植物ゲノム中のレトロ転移因子の増幅（サザンブロットハイブリダイゼーション分析により決定できる）を呈する。この段階では、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ＣｕｂｅｎｓｉｓのＴＲ４株への抵抗性についての選択は、本明細書中の記載通りに行われ、その後、公知技術によって決定される通り、特に収穫量に加えて商業的関心のある任意の他の表現型的特徴を含む圃場評価が行われる。
【００４７】
本明細書中に開示されるバナナ植物は、分子レベルでも同定される固有な特徴を有する。具体的には、バナナ植物は、植物のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対する耐性又は抵抗性に関連した少なくとも１つの遺伝子マーカーを含む。したがって、本明細書中では、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｃｕｂｅｎｓｉｓ  ＴＲ４に対して耐性又は抵抗性を有するバナナ植物を同定する方法であって、当該方法が植物の耐性又は抵抗性に関連した遺伝子マーカーを同定する工程を備える方法も開示される。
【００４８】
以下に示す、本開示の一部を構成する非限定的な実施例において、２つのバッチを試験し、ここで、第１のバッチでは、約４５００個の変異体バナナ植物の順応に成功し、次いで、これらをＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ＣｕｂｅｎｓｉｓのＴＲ４株によって接種した。これらを、３つの試験群に分けた。変異バナナ植物の総数のうち、少なくとも１５３個の植物（３．４％）が菌の胞子の接種に対して無症状であると決定した；第２のバッチでは、５２００個の変異植物のうち、２６２個（５．０％）が菌の胞子の接種に対して無症状であると決定した。
【実施例】
【００４９】
詳細な説明及び非限定的例
分裂組織培養物の調製
畑において、高い能力を有するＧＡＬ栽培品種のクローン２０個を選択し、各クローンは、アクセッション・ナンバーを受けた。外植体は、標準的方法に従って培養物中に置いた。
【００５０】
繁殖の第７周期において、０．１ｐｐｍのチジアズロン（Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ）（ＴＤＺ）を培地に添加した。周期２０及び２１では、３０μＭの５−アザ―２−デオキシシチジン（５−Ａｚａ−２−Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）（脱メチル化化合物）をフィルター滅菌し、固化後に培地に加えた。
【００５１】
発根及び再生
周期２２において、植物を発根及び再生培地に置いた。
【００５２】
ＤＮＡ単離及びサザンブロット分析
周期０、５、２１、２２において、ＤＮＡ試料を採取し、Ｂａｎ−１でプローブするサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。
【００５３】
完全に伸長した葉身組織の試料（２．５ｇ）を採取し、乳棒及び乳鉢ですりつぶした。試料を、４パーセント（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１．４Ｍ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍｌの抽出緩衝液中で均一化した。抽出物を、３０分間、摂氏６５度に置いた。室温に冷却後、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２０：１）を加え、室温での１５分間のインキュベーションの後、混合物を５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を５層のチーズクロス（寒冷紗）を通して濾過し、濾過物に等量の氷冷イソプロパノールを加えた。ＮａＣｌを最終濃度が０．１Ｍになるまで加えた後、試料を１時間、摂氏−２０度に保ち、次いで、摂氏４０度、１５分間、１１，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られたペレットを３ｍｌの７０％エチルアルコール中に再懸濁し、混合物を上記の通り遠心分離し、得られたペレットを、０．５ｍｌの蒸留水中に再懸濁した。１０マイクロｇ  ＤＮＡの分注物をＥｃｏＲＩで消化し、１．２パーセントのアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、Ｎｙｔｒａｎメンブレン上にブロットした。ＤＮＡのトランスファー及びハイブリダイゼーションは、［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，  Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ］に従って行った。
【００５４】
２４周期後、植物のクラスター（従前の周期の同一の植物に由来する植物）（シブリングのクラスター当たり約５乃至８植物）を２つのバッチに分割した。１つのバッチはイスラエルにおける商業的プランテーションでの評価に用い、第２のバッチはＷａｇｅｎｉｎｇｅｎ大学（オランダ）で抵抗性に関してスクリーニングするために送付した。
【００５５】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ＣｕｂｅｎｓｉｓのＴＲ４株に対して抵抗性を有するバナナ植物の選択
植物の第１のバッチは、イスラエルの畑において植え、その後、果実の第２周期の開花時の植物の高さ、果叢（ｂｕｎｃｈ）上の果指（ｆｉｎｇｅｒ）の数、果叢の重量、果指の長さ等を含む農耕学的特性について評価した。
【００５６】
一般的外観、偽茎（ｐｓｅｕｄｏｓｔｅｍ）及び吸枝（ｓｕｃｋｅｒｓ）、葉柄（ｐｅｔｉｏｌｅ）、中肋（ｍｉｄｒｉｂ）、葉（ｌｅａｆ）、花序（ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）及び雄蕾（ｍａｌｅ  ｂｕｄ）、花序の葉（ｆｌｏｗｅｒ  ｂｒａｃｔ）、雄花（ｍａｌｅ  ｆｌｏｗｅｒ）並びに果実（ｆｒｕｉｔ）を含む植物の詳細な栽培学的な記述を以下に開示する。この記載は、プランティングから２０か月後の、イスラエル、西ガリラヤで生育された検体の観察に基づいている。プランテーションは、海抜３０ｍ、地中海から約１２００ｍ東側であって、Ｓｈｌｏｍｉ町に隣接したところにある。この記載は、商業的プランテーションにおいて生育された約５０の植物の観察に基づいている。データは、２０１２年／２０１３年に取得した。本明細書に示す記載は、ＣＩＲＡＤ／ＩＮＩＢＡＰ／ＩＰＧＲＩによって精巧になされた“Ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｂａｎａｎａ  （Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）”に見られる１１７の国際的基準の全てに従い、これらを含んでいる。色用語は、Ｔｈｅ  Ｕ．Ｋ．’ｓ  Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ’ｓ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｃｈａｒｔ，  ２００１．  Ｐｌｏｉｄｙ：  Ｔｒｉｐｌｏｉｄ（ＡＡＡ）．  Ｌｅａｆ  ｈａｂｉｔ：  Ｄｒｏｏｐｉｎｇに従っている。
【００５７】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ＣｕｂｅｎｓｉｓのＴＲ４株に関連したゲノムマーカーの選択及び同定
第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ植物は、標準的ハードニングプロトコルに従い、オランダのグリーンハウスにおいてハードニングした。６週間後、植物を、ミズゴケに基づく培地の不活性培地を含む１０００ｃｃポットに移した。６週間後、植物を、オランダのＷａｇｅｎｉｎｇｅｎ大学で抵抗性選択のために日常的に用いられている手法に従って、接種した。およそ９，０００のクローン（１クローン当たり１乃至３植物）を、１×１０６胞子ｍＬ−１の濃度の２００ｍＬの接種物で接種した。試験は、変異植物に加えて、接種された１００の対照植物も含み、各クローンからの植物は接種されずにおかれた。植物を全てポット中で１５週にわたって生育した。植物を、接種から１３乃至１５週間後に、症状について試験した。植物を視覚的に分析した（球茎を地上から４乃至５ｃｍのところで切った後の、古い葉の黄色化及び萎凋化、並びに内部維管束系の黒色化）。第１のバッチ（４１００クローン）からは、１５３のクローンが無症状であると判明した。無症状のクローンは、組織培養に置き、圃場試験のため、１クローン当たり１００植物の数までに再繁殖した。
【００５８】
図１は、上述のバナナ植物の生産方法のブロックダイアグラムを提供する。
【００５９】
図２Ａ−２Ｅは、接種から１３週間後の例示的植物を示す。具体的には、図２Ａは、病害の顕著な症状を有さない植物の画像である（この植物は、従って、内部のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｃｕｂｅｎｓｅ（ＦＯＣ）の確認及び圃場試験のために選択された）。図２Ｂ−２Ｅは、６０％超の外部黄色化又は割れ（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）を示す植物の画像である。これらの植物は、よって、廃棄された。
【００６０】
図３は、２００ｍｌの接種物（１×１０６胞子／ｍｌの濃度）による接種から９週間後の、１２の接種されたバナナ植物が入ったトレイの画像である。この図は、具体的に、接種された植物が病害に対して感受性が高かったことを示している。症状は、古い葉の黄色化及び萎凋化である。
【００６１】
図４は、接種から１３週間後の無症状の植物の画像である。植物は、病害の視覚的症状を示していない。
【００６２】
図５Ａ−５Ｈは、抵抗性バナナ植物（図５Ａ−５Ｄ）及び感受性バナナ植物（図５Ｅ−５Ｆ、５Ｈ）の画像であり、抵抗性植物は本開示に従って得られた。図５Ｇ及び５Ｈは、本開示に従って得られた抵抗性植物（図５Ｇ）と感受性植物（図５Ｈ）との比較を示し、茎の維管束組織の黒色化は、図５Ｈには示されているが、図５Ｇには示されていない。
【００６３】
図６Ａ−６Ｇは、本明細書に開示の方法に従って生産されたバナナ植物を示す。示されている通り、病害の症状がないのは明らかであり、植物は高い収穫量及び商業性のある果実を生産する。
【００６４】
図７は、Ｂａｎ−Ｒｅｔｒｏ  １プローブでプローブされたサザンブロットハイブリダイゼーションである。レトロ転移因子の活性化の前（「前」と示されたレーン１、２）及び活性化の後（「後」と示されたレーン３−１０）に組織培養植物の葉から抽出されたバナナのゲノムＤＮＡ。レーン２、４、６、８、及び１０は、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断されたゲノムＤＮＡを表し、レーン１、３、５、７、及び９は、未切断ＤＮＡを表す。ＤＮＡ断片は、３２Ｐ標識Ｂａｎ−Ｒｅｔｒｏ  １プローブによってハイブリダイズされた。各レーンは、１０μｇのＤＮＡを含む。図に示す全ての試料は、同一の外植体の組織培養の逐次的周期から回収された。図中のバンドパターンは、レトロ転移因子の活性化及び特定の遺伝子座における因子の増強を明確に表す。
【００６５】
最後に、図８は、５’長い末端反復、３’長い末端反復、ＧＡＧタンパク質、プロテアーゼ（ｐｒｏｔ．）、インテグラーゼ（Ｉｎｔｅｇ．）、逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮＡ  Ｈ（ＲＮ  Ｈ）をコードする遺伝子を含むＣｏｐｉａ様レトロ転移因子の推定上の構造を提供する。
【図１】
2020534824.tif 000004
【図２Ａ−２Ｅ】
2020534824.tif 000005
【図３】
2020534824.tif 000006
【図４】
2020534824.tif 000007
【図５Ａ】
2020534824.tif 000008
【図５Ｂ】
2020534824.tif 000009
【図５Ｃ】
2020534824.tif 000010
【図５Ｄ】
2020534824.tif 000011
【図５Ｅ】
2020534824.tif 000012
【図５Ｆ】
2020534824.tif 000013
【図５Ｇ】
2020534824.tif 000014
【図５Ｈ】
2020534824.tif 000015
【図６Ａ】
2020534824.tif 000016
【図６Ｂ】
2020534824.tif 000017
【図６Ｃ】
2020534824.tif 000018
【図６Ｄ】
2020534824.tif 000019
【図６Ｅ】
2020534824.tif 000020
【図６Ｆ】
2020534824.tif 000021
【図６Ｇ】
2020534824.tif 000022
【図７】
2020534824.tif 000023
【図８】
2020534824.tif 000024
【配列表】
2020534824000001.app
【国際調査報告】
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2020534824.tif 000026
2020534824.tif 000027
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