(57)【要約】  微生物ベースの組成物を用いて特定の植物病原体を処置するための組成物及び方法が提供される。特に、本発明は、有益な微生物及び／又はその成長副生成物を用いた、モザイクウイルスをはじめとする植物病原体ウイルス及び植物病原体バクテリアの処置に関する。特定の実施形態において、成長副生成物は、生物界面活性剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のウイルス及びバクテリア植物病原性疾患を処置する組成物であって、有益な微生物及び／又はその成長副生成物を含み、前記微生物は、非病原性生物界面活性剤生成酵母又はバクテリアであり、前記成長副生成物は、生物界面活性剤である、組成物。
【請求項２】
前記酵母は、Starmerella bombicola又はWickerhamomyces anomalusである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
バクテリアは、Bacillus subtilis又はBacillus amyloliquefaciensである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記微生物及び／又は成長副生成物が生成される発酵ブロスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記微生物のない発酵ブロスを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記生物界面活性剤は、グリコリピド又はリポペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記グリコリピドは、ソホロリピド、ラムノリピド、マンノシルエリスリトールリピド及びトレハロースリピドから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記リポペプチドは、サーファクチン、イツリン、リケニシン及びフェンギシンから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記生物界面活性剤は、０．１％〜０．５％の濃度のソホロリピドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
付着物質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記付着物質は、０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度のキサンタンガムから選択される多糖類である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ウイルス及びバクテリア植物病原性疾患を処置する方法であって、有益な微生物及び／又はその成長生成物を含む組成物を、ウイルス又はバクテリア病原体に影響を受けた植物と接触させることを含む、方法。
【請求項１３】
前記ウイルス病原体は、モザイクウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は、植物の葉又は枝葉に適用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記有益な微生物は、生物界面活性剤生成酵母又はバクテリアである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵母は、Starmerella bombicola又はWickerhamomyces anomalusである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バクテリアは、Bacillus subtilis又はBacillus amyloliquefaciensである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は、微生物及び／又は成長副生成物が生成された発酵ブロスを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記有益な微生物から分離された前記発酵ブロスを前記植物と接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記成長副生成物は、グリコリピド生物界面活性剤又はリポペプチド生物界面活性剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリコリピドは、ソホロリピド、ラムノリピド、マンノシルエリスリトールリピド及びトレハロースリピドから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポペプチドは、サーファクチン、イツリン、リケニシン及びフェンギシンから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物界面活性剤は、０．１％〜０．５％の濃度のソホロリピドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
付着物質を、前記組成物と共に前記植物に適用することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記付着物質は、多糖類である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多糖類は、０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度のキサンタンガムである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は、請求項１〜９に記載の組成物である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１７年９月２８日出願の米国仮出願第６２／５６４，５１７号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
モザイクウイルスは、１５０種類を超える異なる植物に影響し、深刻なダメージをもたらす植物病原体の一群である。何百万人もの栽培者が、モザイクウイルスによる作物の一部、或いは全作物の被害を受けてきた。モザイクウイルスが感染する最も一般的な農作物としては、ジャガイモ、瓜類、オクラ、チリペッパー、キュウリ、マスクメロン、パンプキン、トマト、タバコ、バラ、チューリップ、ビーツ、プラム、豆等が挙げられる。
【０００３】
「モザイク」病のカテゴリーに入る多数のウイルスがあり、それぞれ、例えば、Begomovirus（例えば、キャッサバモザイクウイルス）、Potyvirus（例えば、ウメ輪紋ウイルス）、Tobamovirus（例えば、タバコモザイクウイルス）等の様々な属の一つに属している。モザイクウイルス種としては、アルファルファモザイクウイルス、ビートモザイクウイルス、キャッサバモザイクウイルス、ササゲモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、キビ属モザイクサテライトウイルス、ウメ輪紋ウイルス、南瓜モザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、チューリップ破壊ウイルス及びズッキーニ黄斑モザイクウイルスが例示される。これらのウイルスの大半は、ｓｓＲＮＡウイルスと考えられるが、中にはｓｓＤＮＡウイルス又は未分類のウイルスも考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらのウイルスの多くは、実際、特定の植物に「結び」付けられた名前であるが、同じウイルスが数多くの宿主を持つこともある。例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）は、発見された最初の植物（タバコ）で名付けられたが、１５０種類以上の異なる種類の植物に感染する。ＴＭＶにより影響を受けた植物の中には、植物、雑草及び花がある。特に、トマト、コショウ及び多くの観賞植物が、このウイルスに毎年被害を受けている。
【０００５】
モザイクウイルスによるダメージは、まず、まだら、縮れ、歪みの見られる青葉から始まる。典型的に、葉に、黄色味のしみができ、まだらになり、特に、時期始めに感染すると、植物は発育不全になる。ウリ科（パンプキン、瓜類、キュウリ、南瓜）ではまた、例えば、影響を受けた領域はイボで覆われたり、果実の肌が退色したり、平滑になったりする。モザイクウイルスは、植物を枯らしはしないが、植物の成長や全体の健康への影響は、作物により得られる、経済的に貴重な製品の量に大きく影響し得る。例えば、果実は、食するには苦くなりすぎたり、果実の着色、品質又は熟成が損なわれる。
【０００６】
モザイクウイルスは、庭や作物、キャットニップ、ヤマゴボウ、マザーワート、トウワタ及びスズメウリ植物から取り除かれなかった、植物からの残骸を含む様々な植物で越冬する。アブラムシやキュウリカブトムシは、捕食や、感染植物と健全な植物間を移動することにより、疾病を広げる。ウイルスはまた、人間の活動、ツールや機器を通しても広がる。このように、手洗いや、庭道具、杭、タイ、鉢、温室ベンチ等の消毒が、汚染のリスクを減じるために、栽培者には必須である。疾病が広がる時期が早ければ早いほど、モザイクウイルスにより大きなダメージを受ける植物の数が多くなる。さらに、ウイルスは、湿った条件だと特に広がりやすい。
【０００７】
ウイルス植物病原体に加えて、バクテリア植物病原体も、重大かつ経済的にダメージを与える疾病を生じる。しかし、宿主細胞内に感染するウイルスとは対照的に、バクテリアは、細胞に入り込むというよりは、細胞間の空間で成長する。大半の植物病原体バクテリアは、次に挙げる属に属する。Erwinia、Pectobacterium、Pantoea、Agrobacterium、Pseudomonas、Ralstonia、Burkholderia、Acidovorax、Xanthomonas、Clavibacter、Streptomyces、Xylella、Spiroplasma及びPhytoplasma。これらの害虫による感染の症状としては、葉や果実のシミ、モザイクパターンやイボ、臭いのある塊茎の腐敗、虫えい、異常繁殖、萎れ、斑点病、スペック、胴枯れ病、赤カビ病、根瘤病や、さらには、枯死が挙げられる。
【０００８】
ある植物病原体バクテリアは、毒素を生成する、又は、宿主細胞の死につながる特別なタンパク質を注入したり、栄養細胞及びその壁の主要構造成分を壊す酵素を生成する。これら害虫は、様々な方法で広がり、遠方まで移動する、例えば、雨に含まれて、風、鳥、昆虫等に運ばれて、ウイルスは、人間の活動によって広がる。しかしながら、拡散の仕方に関わりなく、バクテリア病原体は、傷や気孔といった開口を有していて、植物内部に浸透する。
【０００９】
植物がいったん感染すると、モザイクウイルスのようなウイルス疾患は治癒しない。バクテリア疾患と同様、疾患を治癒することでなく、完全の防止や広がりが重視される。例えば、植物と接触する病害虫の数を減じたり、作物やプロットに隣接する多年草やその他植物の数を減じるのが、有効な防止策であるが、強い化学農薬や除草剤の使用が必要とされることが多い。抗生物質を用いて、特定のバクテリアをコントロールすることはできるが、菌株抵抗性につながる。これまでで最も有効な方法は、特定の害虫類に対して抵抗性のある組み換え植物を用いることである。それでも、植物に感染する膨大な数の異なるウイルスやバクテリア種があるため、この方法を用いて、多数の病原体に対して保護するのは難しい。
【００１０】
広範囲にわたる経済的損害は、庭、作物、温室に広がる特定の植物の疾病から広がる植物や作物の感染の結果生じ得る。これはまた、消費者に入手可能な食用作物にも劇的に影響し得る。このように、モザイクウイルス及び植物病原体バクテリアをはじめとする、植物病原体ウイルスを処置する安全で環境に優しい方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、特定の植物病原体感染を処置するのに用いられる、微生物及びその成長副生成物、例えば、生物界面活性剤を提供する。特に、本発明は、有益な微生物及び／又はその成長副生成物を用いた、モザイクウイルス及び植物病原体バクテリアをはじめとする植物病原体ウイルスの処置に関する。利点を挙げると、本発明の微生物ベースの生成物及び方法は、環境に優しく、非毒性で、費用対効果が高い。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物を含む、微生物ベースの組成物を提供する。組成物はまた、有益な微生物及び／又は成長副生成物が生成された発酵培地もさらに含む。微生物成長副生成物は、組成物の微生物により生成されたもの、又は、他の場所で生成されて、組成物に添加されたものとすることができる。
【００１３】
一実施形態において、組成物は、有益な微生物無しで、微生物成長副生成物のみを含む。例えば、一実施形態において、組成物は、有益な微生物が培養された発酵ブロスのみを含む。
【００１４】
微生物成長副生成物は、精製又は粗形態とすることができる。好ましい実施形態において、成長副生成物は、グリコリピド（例えば、ソホロリピド、ラムノリピド、トレハロースリピド又はマンノシルエリスリトールリピド）及びリポペプチド（例えば、サーファクチン、イツリン、リチェニシンやフェンギシン）から選択される生物界面活性剤である。一例の実施形態において、成長副生成物は、ソホロリピド（ＳＬＰ）である。
【００１５】
ある実施形態において、粗形態生物界面活性剤は、生物界面活性剤堆積物及び生物界面活性剤生成微生物の培養から得られる発酵ブロスを含む液体混合物の形態を採り得る。この粗形態生物界面活性剤及びブロス溶液は、約０．００１％〜約７５％、約２０％〜約７０％、約３５％〜約６５％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、又は約５０％の純粋な生物界面活性剤を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明による有益な微生物は、生物界面活性剤生成微生物である。特定の実施形態において、微生物は、生物界面活性剤生成酵母、例えば、Starmerella bombicolaである。他の実施形態において、微生物は、生物界面活性剤生成キラー酵母、例えば、Pichia anomala（Wickerhamomyces anomalus）である。これらの酵母は、グリコリピド生物界面活性剤を生成することができる。
【００１７】
一実施形態において、有益な微生物は、非病原性生物界面活性剤生成バクテリア、例えば、Bacillus subtilis又はBacillus amyloliquefaciensである。これらの種は両者共、特定のリポペプチド生物界面活性剤を効果的に生成する。
【００１８】
微生物ベースの生成物は、単体で、又はモザイクウイルスやバクテリア植物病原体の処置を向上するのに役立つ他の化合物と組み合わせて用いることができる。
【００１９】
特定の実施形態において、付着物質を処置に加えて、生成物の植物の葉への付着を延長することができる。例えば、多糖類ベースの物質、例えば、キサンタンガム、を、本組成物の付着物として用いることができる。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、精製微生物代謝物のみよりも利点を有する。利点としては、次のうち１つ以上を挙げることができる。すなわち、酵母細胞壁の外側表面の一部としての高濃度のマンノタンパク質（乳化剤）、酵母細胞壁におけるベータグルカン（乳化剤）の存在、培養物における生物界面活性剤の存在、及び培養物における溶剤とその他代謝物（例えば、乳酸、エタノール、酢酸エチル等）の存在。
【００２１】
本発明は、微生物ベースの組成物を培養する方法をさらに提供する。組成物は、小規模から大規模の培養プロセスにより得られる。培養プロセスとしては、これらに限られるものではないが、液内培養／発酵、固体状発酵（ＳＳＦ）、混成（例えば、液内マトリックスシステム）、変形及び／又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
本発明は、様々な独特な設定に用いることができる。というのは、例えば、活性代謝物の入った新鮮な発酵ブロス、細胞、微生物繁殖体及び／又は細胞成分と発酵ブロスの混合物、生細胞の入った組成物、生細胞を含む高密度の細胞の入った組成物、即時に得られる微生物ベースの生成物、及び遠隔地における微生物ベースの生成物を効率的に分配及び使用する能力によるものである。
【００２３】
ある実施形態において、モザイクウイルス及び／又はバクテリア植物病原体を処置する方法が提供され、本方法は、有益な微生物及び／又は微生物の成長副生成物を、病原体に関連した植物の一部と接触させることを含む。特定の実施形態において、本方法は、本記載に従って、微生物ベースの組成物を、植物に適用することを含む。
【００２４】
微生物ベースの組成物は、植物及び／又は植物の周囲の環境と直接接触させることができる。特定の実施形態において、組成物は、感染した植物の葉又は枝葉と接触させる。他の実施形態において、組成物は、影響を受けた植物の任意の部分、例えば、根、種、茎、花又は果実と接触する。さらに、組成物を、植物全体及び／又は土壌のような植物周囲の環境と接触させることができる。
【００２５】
微生物は、適用時、生きている（又は生存可能）か、不活性化のいずれかである。生きた微生物を用いるときは、微生物は、その場で成長し、現場で活性化合物を生成することができる。従って、高濃度の微生物を、処理場所（例えば、庭）で容易に連続して得ることができる。このように、本方法は、材料を添加して、適用中、微生物の成長を向上することをさらに含む。一実施形態において、添加される材料は、栄養素源、例えば、窒素、硝酸塩、リン、マグネシウム及び／又は炭素の源を含むことができる。
【００２６】
ある実施形態において、本方法は、影響を受けた植物を、微生物及び／又は成長副生成物と、それらが生成された発酵培地中で、接触させることを含む。ある実施形態において、本方法は、発酵培地及び／又は微生物成長副生成物を植物に単に適用することを含む。成長副生成物は、精製する、又は粗形態とすることができる。好ましい実施形態において、成長副生成物は、生物界面活性剤、例えば、グリコリピド又はリポペプチドである。例示の一実施形態において、生物界面活性剤は、ソホロリピドである。
【００２７】
本方法は、さらに、１つ以上の物質を適用して、病原体抑制効果を向上する、例えば、付着物質を適用して、生成物の植物への付着を延長する、ことをさらに含む。
【００２８】
利点を挙げると、本発明は、大量の無機化合物を環境に放出することなく、用いることができる。さらに、本組成物及び方法は、生物分解性で毒物学的に安全な成分を用いる。このように、本発明は、ウイルス及びバクテリア植物病原体の処置に、「グリーンな」処置として、用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、特定の植物病原体感染の処置に用いられる、微生物、その成長副生成物、例えば、生物界面活性剤を提供する。特に、本発明は、有益な微生物及び／又はその成長副生成物を用いて、モザイクウイルスを含む植物病原体ウイルス、及び植物病原体バクテリアの処置のための組成物及び方法を提供する。利点を挙げると、本発明の微生物ベースの生成物及び方法は、環境に優しく、非毒性で、費用対効果が高い。
【００３０】
選択された定義
本明細書で用いる、「微生物ベースの組成物」とは、微生物やその他細胞培養物の成長の結果生成された成分を含む組成物を意味する。このように、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物成長副生成物を含む。微生物は、植物状態、胞子の形態、菌糸形態、微生物散布体のその他の形態、又はこれらの混合物であってよい。微生物は、プランクトン、又はバイオフィルム形態、又は両方の混合物であってよい。成長副生成物は、例えば、代謝物（例えば、生物界面活性剤）、細胞膜成分、発現タンパク質やその他細胞成分である。微生物は、無傷又は溶解していてもよい。細胞は全くなくても、存在していてもよく、存在している場合は、例えば、組成物１ミリリットル当たり、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２又は１×１０１３以上の細胞又は散布体である。本明細書で用いる、散布体は、新たな及び／又は成熟した生物が発現する微生物の一部であり、これらに限られるものではないが、細胞、分生子、嚢胞、胞子（例えば、再生胞子、芽胞、外生胞子）、菌糸体、つぼみ及び種を発現することができる。
【００３１】
本発明は、所望の結果を得るために、実際適用されるべき生成物である、「微生物ベースの生成物」をさらに提供する。微生物ベースの生成物は、微生物培養プロセスから収穫された単純な微生物ベースの組成物である。或いは、微生物ベースの生成物は、添加された成分をさらに含む場合もある。追加された成分としては、例えば、安定剤、緩衝剤、担体（例えば、水や塩溶液）、さらなる微生物成長をサポートする添加栄養素、適用される環境において微生物及び／又は組成物の追跡を促す非栄養素成長因子及び／又は栄養素成長剤が挙げられる。微生物ベースの生成物は、微生物ベースの組成物の混合物であってもよい。微生物ベースの生成物はまた、これらに限られるものではないが、ろ過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等、何らかの方法で、処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分を含んでいてもよい。
【００３２】
a.   本明細書で用いる、「収穫」とは、微生物ベースの組成物の一部又は全てを、成長容器から取り出すことを指す。
【００３３】
b.   本明細書で用いる、「バイオフィルム」は、バクテリアのような微生物の複雑な塊であり、細胞が互いに接合している。バイオフィルムの細胞は、同じ有機体のプランクトン様細胞とは生理的に異なり、液体媒体中で浮遊したり泳ぐ単一細胞である。
【００３４】
本明細書で用いる、「単離」又は「精製」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、小分子等の有機化合物（例えば、以下に挙げるようなもの）又はその他化合物は、自然状態で結合した細胞材料等の他の化合物を実質的に含まない。例えば、精製又は単離ポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）やデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、自然発生状態で側鎖の遺伝子やシーケンスは含まない。精製又は単離ポリペプチドは、自然発生状態で側鎖のアミノ酸やシーケンスは含まない。精製又は単離微生物菌株は、自然に存在する環境から取り出される。このように、単離菌株は、担体と結合した、例えば、生物学的に純粋な培養物として、又は芽胞（又は菌株のその他の形態）として存在する。
【００３５】
本明細書で用いる「生物学的に純粋な培養物」は、自然状態で結合した材料から単離されたものである。好ましい実施形態において、培養物は、他の全ての生きた細胞から単離されている。さらに好ましい実施形態において、生物学的に純粋な培養物は、自然に存在するのと同じ微生物の培養物と比べて利点のある特徴を有している。利点のある特徴は、例えば、１つ以上の望ましい成長副生成物生成の向上である。
【００３６】
ある実施形態において、精製化合物は、少なくとも６０重量％（乾燥重量）の当該化合物である。好ましくは、製剤は、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも９０重量％、最も好ましくは、少なくとも９９重量％の当該化合物である。例えば、精製化合物は、少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％又は１００重量％（ｗ／ｗ）の所望の化合物である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄膜クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析等、適切な標準的な方法により測定される。
【００３７】
c.   「代謝物」とは、代謝により生成された物質（すなわち、成長副生成物）又は特定の代謝プロセスに参加する必要のある物質を指す。代謝物は、代謝の出発材料（例えば、グルコース）、中間体（例えば、アセチル−ＣｏＡ）又は最終生成物（例えば、ｎ−ブタノール）である有機化合物である。代謝物としては、これらに限定されるものではないが、酵素、毒素、酸、溶剤、アルコール、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、微量元素、アミノ酸、ポリマー及び界面活性剤が例示される。
【００３８】
ここに示す範囲は、範囲に含まれる値の全てについて簡潔にしたものである。例えば、１〜２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０からなる群からの任意の数字、数字の組み合わせ、又は下位範囲を含むものとして、また、同じく、上述した整数間の途中の小数点の値、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９も含むものと考えられる。例えば、１〜５０の例示範囲の入れ子の下位範囲は、一方向に１〜１０、１〜２０、１〜３０及び１〜４０、他方向に５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０及び５０〜１０である。
【００３９】
本明細書で用いる、「減じる」とは、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％のマイナスの変更を意味する。
【００４０】
d.   本明細書で用いる、「標準」とは、スタンダード又は対照条件を意味する。
【００４１】
本明細書で用いる、「界面活性剤」は、２つの液体間、液体と固体間の表面張力（又は界面張力）を下げる表面活性物質を指す。界面活性剤は、例えば、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤及び／又は分散剤として作用する。生存生物により生成された表面活性物質は、「生物界面活性剤」と呼ばれる。
【００４２】
本明細書で用いる、「農業」は、食品、繊維、バイオ燃料、薬剤、化粧品、サプリメント、軟膏用やその他の用途についての植物及び／又は菌の培養や生育を意味する。本発明によれば、農業にはまた、園芸、造園、ガーデニング、樹木保全、果樹園芸や樹芸も含まれる。さらに、ここで農業に含まれるのは、土壌のケア、モニタリングや管理である。
【００４３】
本明細書で用いる、「病原体」生物は、他の生物に疾病を引き起こす生物である。典型的に、病原体生物は、感染因子であり、例えば、バクテリア、ウイルス、菌類、カビ、原虫、プリオン、寄生虫、蠕虫や藻が挙げられる。
【００４４】
本明細書で用いる、「害虫」は、人間や人間が関わること（例えば、農業、園芸、家畜生産、養殖）にとって、破壊的、有毒な、及び／又は害になる、人間以外の生物である。中には、全ての場合についてではないが、害虫は、病原体生物である。害虫は、感染、侵入及び／又は疾病を引き起こしたり、媒介となったり、単に、生物組織を餌にしたり、その他物理的な害を生じたりする。害虫は、単細胞又は多細胞生物であり、これらに限られるものではないが、ウイルス、菌、バクテリア、寄生虫及び／又は線虫が挙げられる。
【００４５】
本明細書で用いる、「処置」は、疾病、症状や不具合のサインや兆候の、根絶、改善、減少、好転を意味する。処置は、必要ではないが、疾病、症状や不具合の完全な治癒が含まれ、すなわち、処置により、部分的に、根絶、改善、減少や好転がなされる。さらに、処置には、疾病、症状や不具合のサインや兆候の開始を遅らせたり、疾病、症状や不具合がより深刻な疾病、症状や不具合へ進行するのを遅らせることが含まれる。
【００４６】
本明細書で用いる、病原体や害に関して用いる「コントロール」するという用語は、病原体及び／又は害虫を殺す、無効なものとする、固定する、その数を減らす、あるいは、病原体及び／又は害虫が、疾病その他害を及ぼすことが実質的にできないようにする行為まで広がる。
【００４７】
移行句「含む」は、「有する」、「含有する」と同義であり、包括的で、制限がなく、追加の、列挙されていない、要素や方法ステップを排除しない。対照的に、移行句「からなる」は、請求項で指定していない要素、ステップや成分を排除する。移行句「から実質的になる」は、請求項の範囲を、指定した材料やステップ、そして請求した発明の、「基本かつ新規な特徴に実質的に影響しないもの」に限定する。
【００４８】
特に断りのない限り、本明細書で用いる「又は」という用語は、包括的と考えられる。特に断りのない限り、本明細書で用いる「１つの」は単数又は複数と考えられる。
【００４９】
特に断りのない限り、本明細書で用いる「約」は、通常の許容範囲と考えられ、例えば、平均の２標準偏差以内である。「約」は、表示値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内と考えられる。
【００５０】
本明細書の可変要素の定義において、化学基の列挙には、単一の基又は列挙した基の組み合わせとしての可変要素の定義が含まれる。本明細書の可変基や態様についての実施形態の列挙には、単一の実施形態や他の実施形態やその一部との組み合わせとしての実施形態が含まれる。
【００５１】
本明細書に示した組成物や方法は、本明細書に示した他の組成物や方法の１つ以上と組み合わせることができる。
【００５２】
微生物ベースの組成物
本発明は、１つ以上の有益な微生物及び１つ以上の微生物成長副生成物を含む微生物ベースの組成物を提供する。組成物は、微生物及び／又は成長副生成物が生成された発酵培地を含んでいてもよい。微生物成長副生成物は、組成物の微生物により生成したり、他の場所で生成されて、組成物に添加することができる。
【００５３】
利点を挙げると、本発明による微生物ベースの組成物は、非毒性（例えば、摂取毒性は、体重の５ｇ／ｋｇを超える）、例えば、人間や動物の皮膚や消化管に刺激を与えることなく、高濃度で適用することができる。このように、本発明は、微生物ベースの組成物の適用が、生存生物、例えば、農業従事者や栽培者の存在によりなされると、特に有用である。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明は、生物界面活性剤生成微生物を利用する。有益な微生物は、活性又は不活性形態にある、又は組成物は、活性と不活性微生物の組み合わせを含有していてもよい。
【００５５】
特定の実施形態において、微生物は、生物界面活性剤生成酵母、例えば、Starmerella bombicolaである。他の実施形態において、微生物は、生物界面活性剤生成キラー酵母、例えば、Pichia anomala（Wickerhamomyces anomalus）である。これらの酵母は、グリコリピド生物界面活性剤を効果的に生成する。
【００５６】
一実施形態において、有益な微生物は、生物界面活性剤生成バクテリア、例えば、Bacillus subtilisやBacillus amyloliquefaciensである。これらの種は、特定のリポペプチド生物界面活性剤を効果的に生成する。
【００５７】
特定の実施形態において、組成物は、生きた及び／又は不活性培養物を含む発酵ブロス、及び／又は微生物やその他残余の栄養素により生成された微生物代謝物を含む。発酵生成物は、抽出や精製することなく直接用いてよい。所望であれば、抽出や精製は、標準的な抽出精製方法や文献に記載された技術を用いて容易に行うことができる。
【００５８】
さらに、組成物は、例えば、少なくとも、重量基準で、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％ブロスである。発酵ブロスのバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上、０％〜１００％であり、間の全てのパーセンテージが含まれる。
【００５９】
一実施形態において、組成物は、微生物成長副生成物のみを含み、精製又は粗（例えば、未精製）形態とすることができる。
【００６０】
ある実施形態において、本組成物の成長副生成物は、生物界面活性剤である。生物界面活性剤は、例えば、ソホロリピド（ＳＬＰ）、マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）、ラムノリピド（ＲＬＰ）及び／又はトレハロースリピド（ＴＬ）をはじめとするグリコリピド生物界面活性剤である。生物界面活性剤はまた、例えば、サーファクチン、イツリン、フェンギシン及び／又はリチェニシン等のリポペプチドとすることもできる。
【００６１】
特定の実施形態において、グリコリピドは、ＳＬＰ、ＭＥＬ又はこれらの組み合わせである。ＭＥＬは、例えば、Pseudozyma aphidisにより、大量に生成される。ＳＬＰは、例えば、Starmerella酵母及びPichia酵母により生成される。
【００６２】
特定の実施形態において、生物界面活性剤はＳＬＰである。少なくとも８つの構造的に異なるソホロリピドが存在する。化学組成物ＳＬＰは、ソロホースと脂肪酸又はエステル基により形成される。マクロラクトンと遊離酸構造を、ソロホース環の１級ヒドロキシル位置で、様々な程度までアセチル化する。ソホロリピドの主成分は、１７−ヒドロキシオクタデカン酸と、その対応のラクトンである。さらに、オレイン酸の不飽和Ｃ−１８脂肪酸は、変化することなく、ソホロリピドに移してもよい。
【００６３】
ある実施形態において、ソホロリピドの天然混合物は、S. bombicolaの発酵により合成することができる。
【００６４】
ある実施形態において、粗形態生物界面活性剤は、生物界面活性剤生成微生物の培養から得られる発酵ブロス中の生物界面活性剤沈殿物を含む液体混合物の形態を採り得る。この粗形態生物界面活性剤溶液は、約０．００１％〜約７５％、約３０％〜約７０％、約３５％〜約６５％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、又は約５０％の純粋な生物界面活性剤を含む。
【００６５】
特定の実施形態において、本組成物中の生物界面活性剤、例えば、ＳＬＰの濃度は、０．００１％〜５．０％、好ましくは、０．１％〜０．５％又は０．２％である。
【００６６】
本発明の有益な微生物及び微生物ベースの組成物は、モザイクウイルスを含む、ウイルス及びバクテリア植物病原性疾患を処置するのに有用な数多くの特性を有している。例えば、本発明による生物界面活性剤は、様々な表面への微生物の接合を抑制し、バイオフィルムの形成を防ぎ、強力な乳化及び解乳化特性を有する。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、精製微生物代謝物のみよりも利点を有する。利点としては、次のうち１つ以上を挙げることができる。すなわち、酵母細胞壁の外側表面の一部としての高濃度のマンノタンパク質（乳化剤）、酵母細胞壁におけるベータグルカン（乳化剤）の存在、培養物における生物界面活性剤の存在、及び培養物における溶剤とその他代謝物（例えば、乳酸、エタノール等）の存在。
【００６８】
さらなる成分を、微生物ベースの組成物に添加して、抗病原性活性を向上することができる。好ましくは、これらの添加剤は、有機又は環境に優しいと考えられる。例えば、付着物質、人間／動物抗ウイルス化合物、抗菌性化合物、エッセンシャルオイル、テルペン、乳化剤、キレート化剤又はその他抗病原性物質を組成物に含めることができる。
【００６９】
添加剤としては、例えば、緩衝剤、担体、同じ又は異なる設備で生成されたその他微生物ベースの組成物、粘度調節剤、保存料、微生物成長のための栄養素、追跡剤、殺虫剤、その他微生物、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、溶解度制御剤、ｐＨ調節剤、安定剤、紫外線防止剤も挙げられる。
【００７０】
一実施形態において、組成物は、ｐＨを好ましい値近くに安定化するために、有機及びアミノ酸又はその塩を含む緩衝剤をさらに含んでいてもよい。好適な緩衝剤としては、これらに限られるものではないが、クエン酸、グルコン酸、酒石酸、マレイン酸、酢酸、乳酸、シュウ酸、アスパラギン酸、マロン酸、グルコヘプトン酸、ピルビン酸、ガラクタル酸、グルカル酸、タルトロン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン及びこれらの混合物が挙げられる。リン酸及び亜リン酸又はその塩も用いることができる。合成緩衝剤は、用いるのに好適であるが、有機及びアミノ酸やその塩のような天然緩衝剤を用いるのが好ましい。
【００７１】
更なる実施形態において、ｐＨ調節剤としては、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸又は重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸及びこれらの混合物が挙げられる。
【００７２】
微生物ベースの組成物のｐＨは、対象の微生物に好適なものとすればよい。特定の実施形態において、微生物ベースの組成物のｐＨは、５．０〜９．０、６．０〜８．０、好ましくは、７．０〜７．５である。
【００７３】
一実施形態において、例えば、重炭酸又は炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムや二リン酸ナトリウムといった塩水溶液のような追加の成分を微生物ベースの組成物に含めることができる。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物は、さらに担体を含む。担体は、酵母又は酵母副生成物を、ターゲットの植物及び／又は土壌分配できる、業界で公知の好適な担体であればよい。
【００７５】
さらなる実施形態において、酵母生成物は、例えば、液体懸濁液、乳化剤、凍結又はスプレー乾燥粉末、ペレット、顆粒やゲルとして処方することができる。
【００７６】
微生物ベースの組成物は、生成後は、さらに、安定化させたり、保存したり、保管することなく用いられる。利点を挙げると、微生物ベースの組成物の直接使用によって、微生物の高い生存率を保ち、異物や望ましくない微生物からの汚染の可能性を減じ、微生物成長の副生成物の活性を維持する。
【００７７】
微生物及び／又は微生物成長の結果得られるブロスは、成長容器から取り出し、例えば、管を通して移し、すぐに使用することができる。
【００７８】
他の実施形態において、組成物（微生物、ブロス又は微生物とブロス）は、例えば、意図する用途、適用の考えられる方法、発酵タンクのサイズや、微生物成長設備から使用地への搬送形式を考慮に入れて、適切なサイズの容器に入れることができる。このように、微生物ベースの組成物を入れる容器は、例えば、１ガロン〜１，０００ガロン以上である。特定の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン以上である。
【００７９】
成長容器から微生物ベースの組成物を収穫し、収穫生成物を容器に入れ、管に通す（その他使用のために搬送する）際に、さらなる成分を添加することができる。添加剤としては、本明細書に記載されたもの、その他、例えば、プレバイオティクス、土壌改良剤、及び意図する用途に特化されたその他成分がある。
【００８０】
任意で、組成物は、使用前、保管することができる。保管時間は短い方が好ましい。従って、保管時間は、６０日、４５日、３０日、２０日、１５日、１０日、７日、５日、３日、２日、１日又は１２時間未満とする。好ましい実施形態において、生成物中に生存細胞が存在する場合には、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃又は５℃未満といった低温で保管する。一方、生物界面活性剤組成物は、典型的に、周囲温度で保管することができる。
【００８１】
微生物菌株
本発明による有益な微生物は、例えば、非病原性バクテリア、酵母及び／又は菌類である。これらの微生物は、天然又は遺伝子組換え微生物であってよい。例えば、微生物は、特異的遺伝子により微生物を変形して、特定の特徴を示すようにしてもよい。微生物はまた、所望の菌株の変異体であってもよい。本明細書で用いる「変異体」は、菌株、遺伝子変異体又は標準微生物のサブタイプを意味し、変異体は、標準微生物に比べて、１つ以上の遺伝的変異（例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ノンセンス突然変異、欠失、複製、フレームシフト突然変異又はリピート伸長）を有している。変異体を生成する手順は、微生物業界において周知されている。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、これまで広く用いられている。
【００８２】
好ましい実施形態において、微生物は、例えば、生物界面活性剤及び／又はその他有用な代謝物を生成することのできる生化学生成微生物である。
【００８３】
一実施形態において、微生物は、酵母又は菌類である。本発明に従って用いるのに好適な酵母及び菌類種としてはAureobasidium（例えば、A. pullulans）、Blakeslea、Candida（例えば、C. albicans、C. apicola）、Entomophthora、Saccharomyces（S. boulardii sequela、S. cerevisiae、S. torula）、Issatchenkia、Mortierella、Mycorrhiza、Penicillium、Phycomyces、Pseudozyma（例えば、P. aphidis）、Starmerella（例えば、S. bombicola）及び／又はTrichoderma（例えば、T. reesei、T. harzianum、T. hamatum、T. viride）が挙げられる。
【００８４】
特定の実施形態において、微生物は、「キラー酵母」として知られた酵母であり、菌株自体が免疫である毒性タンパク質又は糖タンパク質の分泌を特徴とする。例えば、Candida（例えば、C. nodaensis）、Cryptococcus、Debaryomyces（例えば、D. hansenii）、Hanseniaspora、（例えば、H. uvarum）、Hansenula、Kluyveromyces（例えば、K. phaffii）、Pichia（例えば、P. anomala、P. guielliermondii、P. occidentalis、P. kudriavzevii）、Saccharomyces（例えば、S. cerevisiae）、Torulopsis、Ustilago（例えば、U. maydis）、Wickerhamomyces（例えば、W. anomalus）、Williopsis（例えば、W. mrakii）、Zygosaccharomyces（例えば、Z. bailii）等が挙げられる。
【００８５】
一実施形態において、微生物は、ソホロリピド生物界面活性剤を効果的に生成するStarmerella bombicola、である。他の実施形態において、本発明は、キラー酵母、例えば、Wickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）を用いる。例えば、Starmerella、Wickerhamomyces及び／又はPichiaクレードのような他の属である、他の関連種も考えられる。
【００８６】
特定の実施形態において、有益な微生物は、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアをはじめとするバクテリアである。バクテリアは、例えば、Agrobacterium（例えば、A. radiobacter）、Azotobacter（A. vinelandii、A. chroococcum）、Azospirillum（例えば、A. brasiliensis）、Bacillus（例えば、B. amyloliquifaciens、B. firmus、B. laterosporus、B. licheniformis、B. megaterium、B. mucilaginosus、B. subtilis）、Frateuria（例えば、F. aurantia）、Microbacterium（例えば、M. laevaniformans）、Pantoea（例えば、P. agglomerans）、Pseudomonas（例えば、P. aeruginosa、P. chlororaphis subsp. aureofaciens（Kluyver）、P. putida）、Rhizobium spp.、Rhodospirillum（例えば、R. rubrum）及び／又はSphingomonas（例えば、S. paucimobilis）である。
【００８７】
一実施形態において、微生物は、リポペプチド生物界面活性剤を生成可能なBacillusの菌株、例えば、B. subtilis又はB. amyloliquefaciensである。
【００８８】
一実施形態において、B. subtilisの菌株は、B. subtilis var. locusesＢ１又はＢ２であり、例えば、サーファクチン及びその他生物界面活性剤、また、バイオポリマーを効果的に生成する。本明細書は、国際公開ＷＯ第２０１７／０４４９５３  Ａ１号をその開示された教示に一致する範囲まで参照により組み込む。
【００８９】
その他微生物菌株、例えば、大量の生物界面活性剤、マンノタンパク質、ベータグルカン及び／又はその他有用な代謝物を蓄積可能なその他菌株を、本発明に従って用いることができる。
【００９０】
本発明による微生物の成長
本発明は、微生物を培養する方法、並びに微生物代謝物及び／又は他の微生物成長副生成物を生成する方法を利用する。本発明は、所望の規模での微生物の培養と微生物代謝物の生成に好適な培養プロセスをさらに利用する。培養プロセスは、これらに限られるものではないが、液内培養／発酵、固定状態発酵（ＳＳＦ）、変形、混成（例えば、液内マトリックス）及び／又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９１】
本明細書で用いる「発酵」とは、コントロールされた条件下での細胞の培養又は成長を指す。成長は、好気性又は嫌気性とすることができる。
【００９２】
一実施形態において、本発明は、バイオマス（例えば、生細胞材料）、細胞外代謝物（例えば、小分子及び排泄タンパク質）、残余栄養素及び／又は細胞内成分（例えば、酵素及びその他タンパク質）の生成のための材料及び方法を提供する。
【００９３】
本発明に従って用いる微生物成長容器は、工業用の任意の発酵槽又は培養リアクターとすることができる。一実施形態において、容器は、機能制御／センサを有している、又は機能制御／センサに接続されて、ｐＨ、酸素、圧力、温度、撹拌軸動力、湿度、粘度及び／又は微生物密度及び／又は代謝物濃度といった培養プロセスにおいて重要な因子を測定する。
【００９４】
さらなる実施形態において、容器はまた、容器内の微生物の成長をモニターすることもできる（例えば、細胞数及び成長段階）。あるいは、デイリーサンプルを容器から取り出して、希釈平板法等、業界で公知の方法により数える。希釈平板は、サンプル中の微生物の数を推定するのに用いる単純な方法である。この方法はまた、異なる環境や処理を比べる指標も提供する。
【００９５】
方法は、増殖培養物を酸素化する。一実施形態は、緩慢な動きの空気を利用して、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を導入するものである。酸素化空気は、液体を機械的に撹拌するためのインペラと、酸素を液体に溶解するために液体に気泡を供給するための空気スパージャを含む機構により毎日補充される周囲空気である。
【００９６】
一実施形態において、本方法は、培養物に窒素源を補充することを含む。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素及び／又は塩化アンモニウムとすることができる。これらの窒素源は、独立に、又は２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９７】
本方法は、培養物に炭素源を補充することをさらに含む。炭素源は、典型的に、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール及び／又はマルトース、有機酸、例えば、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸及び／又はピルビン酸、アルコール、例えば、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール及び／又はグリセロール、油脂、例えば、大豆油、米糠油、オリーブ油、コーン油、ごま油及び／又は亜麻仁油等である。これらの炭素源は、独立に、又は２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９８】
一実施形態において、微生物の成長因子及び微量栄養素が培地に含まれる。必要な全てのビタミンを生成できない微生物を成長させるときはこれは特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトといった微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含めてよい。さらに、ビタミン、必須アミノ酸および微量元素の源を、例えば、小麦粉やミール、例えば、コーンスターチの形態で、又は、エキス、例えば、酵母エキス、ポテトエキス、ビーフエキス、大豆エキス、バナナピールエキス等の形態で、又は精製した形態で含めることができる。アミノ酸、例えば、タンパク質の生合成に有用なものを含めることもできる。
【００９９】
一実施形態において、無機塩を含めてもよい。有用な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム及び／又は炭酸ナトリウムである。これらの無機塩は、単体または２つ以上の組み合わせで用いてよい。
【０１００】
ある実施形態において、培養方法は、培養プロセスの前及び／又は後に、追加の酸や抗菌剤を、液体培地に添加することをさらに含む。抗菌剤や抗生物質は、培養物を汚染から守るのに用いることができる。
【０１０１】
さらに、培養中にガスが生成されるときは、泡の形成や堆積を防ぐために、消泡剤も添加してよい。
【０１０２】
混合物のｐＨは、対象の微生物に好適なものとする。緩衝剤、ｐＨ調節剤、例えば、炭酸塩やリン酸塩を用いて、好ましい値近くにｐＨを安定化する。金属イオンが高濃度で存在しているときは、液体培地中のキレート化剤の使用が必要となる。
【０１０３】
微生物の培養及び微生物副生成物の生成のための方法及び機器は、バッチ、準連続又は連続プロセスで実行することができる。
【０１０４】
微生物は、プランクトン形態又はバイオフィルムとして成長し得る。バイオフィルムの場合は、微生物がバイオフィルム状態で成長する基質を容器の中に入れる。このシステムはまた、例えば、バイオフィルム成長性を促し、改善する刺激（例えば、せん断応力）を加えることのできるものであってもよい。
【０１０５】
一実施形態において、微生物の培養方法は、約５℃〜約１００℃、好ましくは、１５℃〜６０℃、より好ましくは、２５〜５０℃で実施される。さらなる実施形態において、培養は、一定の温度で連続して行われる。他の実施形態において、培養は温度を変えて行われる。
【０１０６】
一実施形態において、本方法及び培養プロセスで用いる機器は、無菌である。リアクター／容器等の培養機器は、殺菌ユニット、例えば、オートクレーブから離れているが、接続されている。培養機器はまた、接種を開始する前に、現場で殺菌する殺菌ユニットも有していてよい。空気は、業界に公知の方法により殺菌される。例えば、周囲空気は、容器に入れる前に、少なくとも１つのフィルタを通過させる。他の実施形態において、培地は、殺菌し、任意で、熱を全く加えなくてもよい。そうすると、低水分活性と低ｐＨが、バクテリアの成長をコントロールするのに役立つ。
【０１０７】
一実施形態において、本発明は、本発明の微生物菌株を、成長及び代謝物生成に適した条件下で培養し、任意で、代謝物を精製することにより、例えば、生物界面活性剤、酵素、タンパク質、エタノール、乳酸、ベータグルカン、ペプチド、代謝中間体、多価不飽和脂肪酸及びリピド等の微生物代謝物を生成する方法をさらに提供する。本方法により生成される代謝物含量は、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である。
【０１０８】
発酵ブロスのバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上である。一実施形態において、ブロスの固体含量は、１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌである。
【０１０９】
細胞濃度は、例えば、最終生成物１グラム当たり、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２又は１×１０１３、の細胞又は胞子である。
【０１１０】
対象の微生物により生成された微生物成長副生成物は、微生物に保持されたり、液体培地に分泌されてもよい。培地は、微生物成長副生成物の活性を安定化する化合物を含有していてよい。
【０１１１】
一実施形態において、微生物培養組成物は全て、培養完了時に（例えば、所望の細胞密度やブロス中の特定の代謝物の密度が得られたら）取り出す。このバッチ手順において、第１のバッチの収穫時に全く新しいバッチを開始する。
【０１１２】
他の実施形態において、培養生成物の一部のみを任意の時点で取り出す。本実施形態において、生存可能な細胞、胞子、分生子、菌糸及び／又は菌糸体によるバイオマスは、新たな培養バッチのための接種として容器に残る。取り出された組成物は、細胞を含まない培地としたり、細胞、胞子又はその他再生散布体、及び／又はその組み合わせを含むことができる。このようにして、準連続システムが形成される。
【０１１３】
利点を挙げると、本方法は、複雑な機器や高エネルギー消費を必要としない。対象の微生物は、現場で小規模又は大規模に培養でき、培地と混合したままで用いることができる。同様に、微生物代謝物も必要な現場で対象に生成することもできる。
【０１１４】
利点を挙げると、微生物ベースの生成物は、遠隔地で生成することができる。微生物成長設備は、例えば、太陽、風及び／又は水力発電を利用して、オフグリッドで操業してもよい。
【０１１５】
微生物ベースの生成物の調製
本発明の１つの微生物ベースの生成物は、単に、微生物を含む発酵ブロス及び／又は微生物により生成された微生物代謝物及び／又は残余の栄養素である。発酵生成物は、抽出や精製なしで直接使用される。所望であれば、抽出や精製は、文献に記載された標準的な抽出及び／又は精製方法や技術を用いて容易に行うことができる。
【０１１６】
微生物ベースの生成物の微生物は、活性か不活性形態であってよい。微生物ベースの生成物は、活性と不活性微生物の組み合わせを含有していてもよい。
【０１１７】
微生物成長により得られた微生物、微生物成長副生成物及び／又はブロスを、成長容器から取り出し、例えば、管を通して移し、すぐに使用することができる。
【０１１８】
他の実施形態において、組成物（微生物、代謝物及び／又はブロス）は、例えば、意図する用途、適用の考えられる方法、発酵タンクのサイズや、微生物成長設備から使用地への搬送形式を考慮に入れて、適切なサイズの容器に入れることができる。このように、微生物ベースの組成物を入れる容器は、例えば、１ガロン〜１，０００ガロン以上である。特定の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン以上である。
【０１１９】
微生物ベースの組成物を成長容器から収穫するにあたり、収穫生成物を容器に入れ、管に通す（その他使用のために搬送する）際に、さらなる成分を添加することができる。添加剤としては、例えば、本明細書に記載されたものやその他、例えば、乳化剤、潤滑剤、溶解度制御剤、ｐＨ調節剤、プレバイオティクス、土壌改良剤、及び意図する用途に特化されたその他成分がある。
【０１２０】
一実施形態において、組成物は、有機及びアミノ酸又はその塩をはじめとする緩衝剤をさらに含む。好適な緩衝剤としては、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコヘプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタル酸塩、グルカル酸塩、タルトロン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン、リシン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン及びこれらの混合物が挙げられる。リン酸及び亜リン酸又はそれらの塩を用いてもよい。合成緩衝剤は、用いるのに好適であるが、上記の有機及びアミノ酸又はその塩のような天然緩衝剤を用いるのが好ましい。
【０１２１】
さらなる実施形態において、ｐＨ調節剤としては、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸又は重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１２２】
一実施形態において、重炭酸又は炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムや二リン酸ナトリウムといった塩水溶液のような追加の成分を微生物ベースの組成物に含めることができる。
【０１２３】
利点を挙げると、微生物ベースの生成物は、微生物が成長したブロスを含む。生成物は、例えば、少なくとも、重量基準で、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％ブロスである。組成物中のバイオマスの量は、重量基準で、例えば、０％〜１００％であり、間の全てのパーセンテージが含まれる。
【０１２４】
任意で、組成物は、使用前、保管することができる。保管時間は短い方が好ましい。従って、保管時間は、６０日、４５日、３０日、２０日、１５日、１０日、７日、５日、３日、２日、１日又は１２時間未満とする。好ましい実施形態において、生成物中に生存細胞が存在する場合には、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃又は５℃未満といった低温で保管する。一方、生物界面活性剤組成物は、典型的に、周囲温度で保管することができる。
【０１２５】
さらなる成分を、微生物ベースの組成物に添加して、抗病原性活性を向上することができる。好ましくは、これらの添加剤は、有機又は環境に優しいと考えられる。例えば、付着物質、人間／動物抗ウイルス化合物、抗菌性化合物、エッセンシャルオイル、テルペン、乳化剤、キレート化剤又はその他抗病原性物質を組成物に含めることができる。極端な場合だと、例えば、特定の作物、抗生物質及び／又は抗ウイルス薬の大規模破壊を、本処置と共に用いることもできる。
【０１２６】
特定の実施形態において、付着物質を処置に加えて、生成物の植物の葉への付着を延長することができる。ポリマー、例えば、帯電ポリマー、又は多糖類ベースの物質、例えば、キサンタンガム、グアーガム、レバン、キシリナン、ゲランガム、カードラン、プルラン、デクストラン等を、用いることができる。
【０１２７】
好ましい実施形態において、商用グレードのキサンタンガムを付着物質として用いる。ガムの濃度は、市販の製品におけるガムの濃度を基準にして選択する。キサンタンガムは、高純度で、０．００１％（ｗ／ｖ−キサンタンガム／溶液）で十分である。
【０１２８】
特定の実施形態において、例えば、処置が、グラム陰性バクテリアに対して、所望通りほどには効果的でない場合には、キレート化剤を添加することによって、本処置の生成物で、植物病原体グラム陰性バクテリア疾病の処置を向上することができる。
【０１２９】
本明細書で用いる、「キレート化剤」又は「キレーター」は、錯体を形成することにより、系から金属イオンを除去して、金属イオンが酸素ラジカル形成に容易に関与したり、触媒しないようにすることのできる活性剤を意味する。利点を挙げると、キレート化剤は、界面活性剤による処理に影響を受けやすい、例えば、グラム陰性バクテリアの細胞壁を変性することにより、抗菌性生物界面活性剤の効能を向上する。このように、グラム陰性バクテリアを透過できるため、本発明における処置性の範囲が拡大される。
【０１３０】
本発明に好適なキレート化剤としては、これらに限られるものではないが、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、アルファリポ酸（ＡＬＡ）、テトラヒドロフルフリルジスルフィドチアミン（ＴＴＦＤ）、ペニシラミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びクエン酸が例示される。好ましい実施形態において、キレート化剤は、濃度０．１〜１．０％（ｖ／ｖ）のＥＤＴＡである。
【０１３１】
ウイルス及びバクテリア植物病原体を処置する方法
本発明を用いて、例えば、農業、園芸、温室、造園等における植物や作物の感染、侵入及び／又は疾病を処置することによって、植物の培養を向上することができる。利点を挙げると、本方法を用いて、病原体を制御したり、及び／又はこのような生物の植物から植物への伝播を防ぐことができる。
【０１３２】
ある実施形態において、有益な微生物及び／又は微生物の成長副生成物を、病原体に感染した植物の一部と接触させることを含む、病原体モザイクウイルス及び／又はバクテリア植物病原体を処置する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、本発明による微生物ベースの組成物を、植物に適用することを含む。利点を挙げると、組成物は、植物病原体を殺す、減じる、その増殖を競合的に抑制し、何等かの手段によりコントロールする。さらに、本方法は、強い化学薬品や抗生物質を用いずに、植物の免疫及び／又は病原体防御を改善することができる。
【０１３３】
本明細書で用いる、本方法の「適用」には、微生物ベースの生成物を、植物及び／又はその周囲環境と直接接触させることが含まれる。微生物生成物は、液体や乾燥粉末としてスプレーしたり、ゲルやペーストとして、植物に適用することができ。土は、例えば、灌漑システムにより、溶液や可溶顆粒又はペレットとして、生成物の液体又は乾燥処方により処置することができる。
【０１３４】
微生物ベースの組成物は、植物及び／又は植物の周囲環境と直接接触させることができる。特定の実施形態において、適用には、微生物ベースの生成物を、感染した植物の葉、枝葉と接触させることが含まれる。他の実施形態において、組成物は、影響を受けた植物の任意の部分、例えば、根、茎、花又は果実と接触させることができる。さらに、組成物を植物全体及び／又は土壌のような植物の周囲環境と接触させることができる。
【０１３５】
一実施形態において、本方法は、Starmerella bombicola酵母及び／又はその成長副生成物を含む微生物ベースの生成物を、植物又は植物の一部に適用することを含む。他の実施形態において、有益な微生物は、Wickerhamomyces anomalusである。さらに他の実施形態において、有益な微生物は、リポペプチド生成バクテリア、例えば、Bacillus subtilis又はBacillus amyloliquefaciensである。
【０１３６】
微生物は、適用時、生きている（又は生存可能）か、不活性化のいずれかである。生きた微生物を用いるときは、微生物は、その場で成長し、現場で活性化合物を生成することができる。従って、高濃度の微生物を、処理場所（例えば、庭）で容易に連続して得ることができる。このように、本方法は、材料を添加して、適用中、微生物の成長を向上することをさらに含む。一実施形態において、添加される材料は、栄養素源、例えば、窒素、硝酸塩、リン、マグネシウム及び／又は炭素の源を含むことができる。
【０１３７】
ある実施形態において、本方法は、影響を受けた植物を、微生物及び／又は成長副生成物と、それらが生成された発酵培地中で、接触させることを含む。ある実施形態において、本方法は、発酵培地及び／又は微生物成長副生成物を植物に単に適用することを含む。成長副生成物は、精製する、又は粗形態とすることができる。好ましい実施形態において、成長副生成物は、生物界面活性剤、例えば、グリコリピド又はリポペプチドである。例示の一実施形態において、生物界面活性剤は、ソホロリピドである。
【０１３８】
本方法は、さらに、１つ以上の物質を適用して、病原体抑制効果を向上する、例えば、付着物質を適用して、生成物の植物への付着を延長する、ことをさらに含む。一実施形態において、付着物質は、キサンタンガムである。組成物と共に適用できるその他物質としては、例えば、環境に優しい、又は抗ウイルス性及び／又は抗菌性を持つ有機物質、エッセンシャルオイル、テルペン、乳化剤、キレート化剤又はその他抗病原性物質が挙げられる。極端な場合だと、例えば、特定の作物、抗生物質及び／又は抗ウイルス薬の大規模破壊を、本処置と共に用いることもできる。
【０１３９】
対象病原体
全ての形態のモザイクウイルスに加えて、本発明が有用なウイルス感染に影響される植物としては、これらに限られるものではないが、Carlavirus、Abutilon、Hordeivirus、Potyvirus、Mastrevirus、Badnavirus、Reoviridae、Fijivirus、Oryzavirus、Phytoreovirus、Mycoreovirus、Rymovirus、Tritimovirus、Ipomovirus、Bymovirus、Cucumovirus、Luteovirus、Begomovirus、Rhabdoviridae、Tospovirus、Comovirus、Sobemovirus、Nepovirus、Tobravirus、Benyvirus、Furovirus、Pecluvirus、Pomovirus、アルファルファモザイクウイルス、ビートモザイクウイルス、キャッサバモザイクウイルス、ササゲモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、キビ属モザイクサテライトウイルス、ウメ輪紋ウイルス、南瓜モザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、チューリップ破壊ウイルス及びズッキーニ黄斑モザイクウイルスが例示される。
【０１４０】
本発明が有用なバクテリア感染に影響される植物としては、これらに限られるものではないが、Pseudomonas（例えば、P. savastanoi、Pseudomonas syringae pathovars）、Ralstonia solanacearum、Agrobacterium（例えば、A. tumefaciens）、Xanthomonas（例えば、X. oryzae pv. oryzae、X. campestris pathovars、X. axonopodis pathovars）、Erwinia（例えば、E. amylovora）、Xylella（例えば、X. fastidiosa）、Dickeya（例えば、D. dadantii及びD. solani）、Pectobacterium（例えば、P. carotovorum及びP. atrosepticum）、Clavibacter（例えば、C. michiganensis及びC. sepedonicus）、Candidatus Liberibacter asiaticus、Pantoea、Ralstonia、Burkholderia、Acidovorax、Streptomyces、Spiroplasma及びPhytoplasmaが挙げられる。
【０１４１】
微生物ベースの生成物は、単体か、又はモザイクウイルスやバクテリア等のウイルスをはじめとする病原害虫の効率的な処置のために、他の化合物と組み合わせて用いることができる。ＳＬＰ処置は、他の害虫及び／又は微生物に対するよりも、グラム陰性バクテリアに対してあまり効果的ではないが、本処置生成物により、植物病原体グラム陰性バクテリア疾病の処置を向上することができる。これは、キレート化剤を生成物に添加することによりなされる。
【０１４２】
対象植物
本明細書で用いる、「植物」は、本明細書に定義された通り、農業で用いる植物を指す。植物は、例えば、庭で自立したものや、例えば、果樹園や農園作物の一部として、多くの植物の１つとすることができる。本発明が有用な植物としては、これらに限られるものではないが、穀物や草（例えば、小麦、大麦、ライ、オーツ、米、トウモロコシ、モロコシ、コーン）、ビーツ（例えば、マンゲルワーゼルやテンサイ）、果物（例えば、グレープ、ストロベリー、ラズベリー、ブラックベリー、仁果類、核果、ソフトフルーツ、リンゴ、梨、プラム、桃、アーモンド、サクランボや液果類）、マメ科作物（例えば、豆、レンズ豆、エンドウ豆や大豆）油料作物（例えば、アブラナ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナツ、ひまし油、ココアや落花生）、ウリ科（例えば、パンプキン、キュウリ、南瓜やメロン）、繊維植物（例えば、綿、亜麻、麻やジュート）、柑橘類（例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツやタンジェリン）、野菜（例えば、ほうれん草、レタス、アスパラガス、キャベツ、ニンジン、玉ねぎ、マト、ジャガイモやピーマン）、クスノキ科（例えば、アボカド、ニッケイ属や樟脳、また、同様に、タバコ、ナッツ、ハーブ、スパイス、薬草、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、ペッパー、ブドウの木、ホップ、オオバコ、ラテックス植物、切り花及び鑑賞木が例示される。
【０１４３】
本発明の生成物及び方法の適用から利益の得られる植物の種類としては、これらに限られるものではないが、畝作物（例えば、コーン、大豆、モロコシ、落花生、ジャガイモ、等）、農作物（例えば、アルファルファ、小麦、穀物等）、樹木作物（例えば、クルミ、アーモンド、ピーカン、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ等）、柑橘作物（例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等）、果物作物（例えば、リンゴ、梨、イチゴ、ブルーベリー、ブラックベリー等）、ターフ作物（例えば、芝）、鑑賞作物（例えば、花、つる等）、野菜（例えば、トマト、ニンジン等）、つる作物（例えば、ブドウ等）、林業（例えば、松、トウヒ、ユーカリ、ポプラ等）、管理牧草地（放牧家畜をサポートするのに用いられる植物を混ぜたもの）が挙げられる。
【０１４４】
本発明の生成物及び方法から利益の得られるさらなる植物としては、上科緑色植物亜界に属する全ての植物、特に、単子葉植物や双子葉植物、例えば、飼料やマメ科牧草、鑑賞植物、食用作物、木や低木が挙げられ、Acer spp.、Actinidia spp.、Abelmoschus spp.、Agave sisalana、Agropyron spp.、Agrostis stolonifera、Allium spp.、Amaranthus spp.、Ammophila arenaria、Ananas comosus、Annona spp.、Apium graveolens、Arachis spp、Artocarpus spp.、Asparagus officinalis、Avena spp.（例えば、A. sativa、A. fatua、A. byzantina、A. fatua var. sativa、A. hybrida）、Averrhoa carambola、Bambusa sp.、Benincasa hispida、Bertholletia excelsea、Beta vulgaris、Brassica spp.（例えば、B. napus、B. rapa ssp.［キャノーラ、セイヨウアブラナ、アブラナ］）、Cadaba farinosa、Camellia sinensis、Canna indica、Cannabis sativa、Capsicum spp.、Carex elata、Carica papaya、Carissa macrocarpa、Carya spp.、Carthamus tinctorius、Castanea spp.、Ceiba pentandra、Cichorium endivia、Cinnamomum spp.、Citrullus lanatus、Citrus spp.、Cocos spp.、Coffea spp.、Colocasia esculenta、Cola spp.、Corchorus sp.、Coriandrum sativum、Corylus spp.、Crataegus spp.、Crocus sativus、Cucurbita spp.、Cucumis spp.、Cynara spp.、Daucus carota、Desmodium spp.、Dimocarpus longan、Dioscorea spp.、Diospyros spp.、Echinochloa spp.、Elaeis（例えば、E. guineensis、E. oleifera）、Eleusine coracana、Eragrostis tef、Erianthus sp.、Eriobotrya japonica、Eucalyptus sp.、Eugenia uniflora、Fagopyrum spp.、Fagus spp.、Festuca arundinacea、Ficus carica、Fortunella spp.、Fragaria spp.、Ginkgo biloba、Glycine spp.（例えば、G. max、Soja hispida又はSoja max）、Gossypium hirsutum、Helianthus spp.（例えば、H. annuus）、Hemerocallis fulva、Hibiscus spp.、Hordeum spp.（例えば、H. vulgare）、Ipomoea batatas、Juglans spp.、Lactuca sativa、Lathyrus spp.、Lens culinaris、Linum usitatissimum、Litchi chinensis、Lotus spp.、Luffa acutangula、Lupinus spp.、Luzula sylvatica、Lycopersicon spp.（例えば、L. esculentum、L. lycopersicum、L. pyriforme）、Macrotyloma spp.、Malus spp.、Malpighia emarginata、Mammea americana、Mangifera indica、Manihot spp.、Manilkara zapota、Medicago sativa、Melilotus spp.、Mentha spp.、Miscanthus sinensis、Momordica spp.、Morus nigra、Musa spp.、Nicotiana spp.、Olea spp.、Opuntia spp.、Ornithopus spp.、Oryza spp.（例えば、O. sativa、O. latifolia）、Panicum miliaceum、Panicum virgatum、Passiflora edulis、Pastinaca sativa、Pennisetum sp.、Persea spp.、Petroselinum crispum、Phalaris arundinacea、Phaseolus spp.、Phleum pratense、Phoenix spp.、Phragmites australis、Physalis spp.、Pinus spp.、Pistacia vera、Pisum spp.、Poa spp.、Populus spp.、Prosopis spp.、Prunus spp.、Psidium spp.、Punica granatum、Pyrus communis、Quercus spp.、Raphanus sativus、Rheum rhabarbarum、Ribes spp.、Ricinus communis、Rubus spp.、Saccharum spp.、Salix sp.、Sambucus spp.、Secale cereale、Sesamum spp.、Sinapis sp.、Solanum spp.（例えば、S. tuberosum、S. integrifolium又はS. lycopersicum）、Sorghum bicolor、Spinacia spp.、Syzygium spp.、Tagetes spp.、Tamarindus indica、Theobroma cacao、Trifolium spp.、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、Triticum spp.（例えば、T. aestivum、T. durum、T. turgidum、T. hybernum、T. macha、T. sativum、T. monococcum又はT. vulgare）、Tropaeolum minus、Tropaeolum majus、Vaccinium spp.、Vicia spp.、Vigna spp.、Viola odorata、Vitis spp.、Zea mays、Zizania palustris、Ziziphus spp等から選択される。
【０１４５】
対象植物のさらなる例としては、これらに限られるものではないが、コーン（Zea mays）、Brassica sp.（例えば、B. napus、B. rapa、B. juncea）、特に、種子油の源として有用なBrassica種、アルファルファ（Medicago sativa）、米（Oryza sativa）、ライ（Secale cereale）、モロコシ属（Sorghum bicolor、Sorghum vulgare）、ヒエ（例えば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana）、ヒマワリ（Helianthusannuus）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、落花生（Arachis hypogaea）、綿（Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Ipomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Coffea spp.）、ココナツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、citrus trees（Citrus spp.）、ココア（Theobroma cacao）、茶（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、いちじく（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum spp.）、オーツ、大麦、野菜、鑑賞用植物及びコニファーが例示される。
【０１４６】
野菜としては、トマト（Lycopersicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuca sativa）、サヤインゲン（Phaseolus vulgaris）、リマ豆（Phaseolus limensis）、豆（Lathyrus spp.）、キュウリ等のCucumis属に属するもの（C. sativus）、カンタロープ（C. cantalupensis）及びマスクメロン（C. melo）が挙げられる。鑑賞用植物としては、ツツジ（Rhododendron spp.）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（Hibiscus rosasanensis）、バラ（Rosa spp.）、チューリップ（Tulipa spp.）、スイセン（Narcissus spp.）、ペチュニア（Petunia hybrida）、カーネーション（Dianthuscaryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）及び菊が挙げられる。実施形態を実施するのに用いられるコニファーとしては、例えば、テーダマツのようなマツ（Pinus taeda）、スラッシュパイン（Pinus elliotii）、ポンデローザマツ（Pinus ponderosa）、ロッジポールパイン（Pinus contorta）、ラジアータパイン（Pinus radiata）、ダグラスモミ（Pseudotsuga menziesii）、アメリカツガ（Tsuga canadensis）、シトカトウヒ（Picea glauca）、レッドウッド（Sequoia sempervirens）、ヨーロッパモミのようなモミ属（Abies amabilis）及びバルサムモミ（Abies balsamea）及びベイスギのようなスギ（Thuja plicata）及びアラスカイエロースギ（Chamaecyparis nootkatensis）が挙げられる。実施形態の植物としては、作物植物（例えば、コーン、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、大豆、綿、ベニバナ、モロコシ、小麦、ヒエ、タバコ等）、例えば、コーンや大豆植物が挙げられる。
【０１４７】
ターフグラスとしては、これらに限られるものではないが、スズメノカタビラ（Poa annua）、ネズミムギ（Lolium multiflorum）、カナダブルーグラス（Poa compressa）、チューイングフィスク（Festuca rubra）、コロニアルベントグラス（Agrostis tenuis）、クリーピングベントグラス（Agrostis palustris）、クレストウィートグラス（Agropyron desertorum）、フェアウェイウィートグラス（Agropyron cristatum）、ハードフェスク（Festuca longifolia）、ケンタッキーブルーグラス（Poa pratensis）、オーチャードグラス（Dactylis glomerate）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne）、レッドフェスク（Festuca rubra）、レッドトップ（Agrostis alba）、オオスズメノカタビラ（Poa trivialis）、ウシノケグサ（Festuca ovine）、スムーズブロムグラス（Bromus inermis）、トールフェスク（Festuca arundinacea）、ティモシー（Phleum pretense）、ベルベットベントグラス（Agrostis canine）、アレチタチドジョウツナギ（Puccinellia distans）、ヒメカモジグサ（Agropyron smithii）、バミューダグラス（Cynodon spp.）、セントオーガスチングラス（Stenotaphrum secundatum）、ノシバ（Zoysia spp.）、バヒアグラス（Paspalum notatum）、メイワダレソウ（Axonopus affinis）、ムカデシバ（Eremochloa ophiuroides）、キクユグラス（Pennisetum clandesinum）、サワスズメノヒエ （Paspalum vaginatum）、メダカスゲ（Bouteloua gracilis）、バッファローグラス（Buchloe dactyloids）、サイドオーツグラマ（Bouteloua curtipendula）が挙げられる。
【０１４８】
対象植物としては、対象の種子の得られる穀物植物、油料種子植物、及びマメ科植物が挙げられる。対象種子としては、穀物の種、例えば、コーン、小麦、大麦、米、ソルガム、ライ、キビ等が挙げられる。油料種子植物としては、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナツ、亜麻、ヒマシ、オリーブ等が挙げられる。マメ科植物としては、豆及びエンドウ豆が挙げられる。豆としては、グアー、イナゴマメ、フェネグリーク、大豆、空豆、ササゲ、ヤエナリ、ライ豆、ソラマメ、レンズ豆、ひよこ豆等が挙げられる。
【０１４９】
微生物ベースの生成物の現地生成
本発明の特定の実施形態において、微生物成長設備では、所望の規模で、対象の新鮮な高密度微生物及び／又は微生物成長副生成物を生成する。微生物成長設備は、適用場所又はその近くに配置される。設備は、バッチ、半連続又は連続培養で、高密度微生物ベースの組成物を生成する。
【０１５０】
本発明の微生物成長設備は、微生物ベースの生成物が用いられる（例えば、養魚場）場所に配置される。例えば、微生物成長設備は、使用場所から３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０、５、３又は１マイル未満であるか、又は、使用場所に直接配置することができる。
【０１５１】
微生物ベースの生成物は、従来の生成物の安定化、保存、長期保管や長い搬送プロセスを必要とすることなく、適用現場又はその近くで生成されるため、高密度の生きた微生物を生成することができ、現場適用で用いるのに必要とされる微生物ベースの生成物の容積をかなり小さくすることができる。これによって、スケールダウンしたバイオリアクター（例えば、小さな発酵タンク、小容積の出発材料、栄養素、ｐＨ調節剤、消泡剤等）が可能となり、システムを効率的なものとする。さらに、現地生成だと、生成物の可搬性も促される。
【０１５２】
微生物生成物の現場生成によってまた、生成物に成長ブロスを含めるのも促される。ブロスは、現場使用に特に向いた発酵中に生成される溶剤を含んでいる。
【０１５３】
現場生成される高密度で、頑健な微生物培養物は、栄養細胞安定化をしたり、サプライチェーンにしばらく置かれたものよりも、現場においてより有効である。本発明の微生物ベースの生成物は、発酵成長培地に存在する代謝物や栄養素から細胞が分離された、従来の生成物に比べて、特に有利である。搬送時間が減じたことにより、現場の要求により必要とされる時間と量で、微生物及び／又はその代謝物の新鮮なバッチの生成と分配が可能となる。
【０１５４】
本発明の微生物成長設備は、微生物それ自体、微生物代謝物及び／又は微生物が成長するブロスの他の成分を含む新鮮な微生物ベースの組成物を生成する。所望であれば、組成物は、高密度の栄養細胞、不活性細胞、あるいは、植物細胞、不活性細胞、再生胞子、菌糸体及び／又は他の微生物散布体の混合物を含む。利点を挙げると、組成物は、特定の場所での使用に合わせることができる。一実施形態において、微生物成長設備は、微生物ベースの生成物を用いる場所又はその近くに配置される。
【０１５５】
微生物成長設備は、遠方の工業規模の生産者に頼っている現在の問題に対する解決策を提供する点で有利である。その問題とは、上流処理遅延、サプライチェーンボトルネック、不適切な保管、タイムリーな配達や、例えば、生きた細胞及び／又は散布体の数の多い生成物や、微生物が元々成長した関連ブロスや代謝物の適用の妨げとなるその他不測の事態の影響を、製品品質が受けることである。
【０１５６】
利点を挙げると、好ましい実施形態において、本発明のシステムは、自然発生の現場微生物及びその代謝副生成物の力を抑えて、植物病原体バクテリアを処置することができる。現場微生物は、例えば、耐塩性、高温での成長能力及び／又は特定の代謝物を生成する能力に基づいて識別することができる。さらに、微生物成長設備は、行先の地理との相乗効果を改善するために、微生物ベースの生成物をそれに合わせて調整できることにより、製造汎用性を与える。
【０１５７】
個々の容器の培養時間は、例えば、１日〜２週間以上である。培養生成物は、数多くの異なるやり方のいずれかにより収穫することができる。
【０１５８】
例えば、発酵の２４時間以内の現場生成と分配の結果、純粋な高細胞密度の組成物と実質的に低い運搬コストとなる。より効率的で強力な微生物接種の開発における急速な発展が見込まれることを考慮すると、消費者は、即時に微生物ベースの生成物を分配するという恩恵が受けられる。
【０１５９】
実施例
本発明及びその利点の理解を広げるために、例示としての以下の実施例を示す。以下の実施例は、本発明の方法、応用、実施形態及び変形のいくつかを示すものであり、本発明を限定しようとするものではない。数多くの変更及び修正を、本発明に関して行うことができる。
【０１６０】
実施例１−ソホロリピド発酵
本発明のために、１０００ｍｌの水中、１００ｇのグルコース、５ｇの酵母エキス、１ｇの尿素及び１００ｇのキャノーラ油を含む発酵培地における、S. bombicolaの発酵により、ソホロリピドの天然混合物を合成する。５〜７日の発酵後、ソホロリピドを沈殿により集める。追加量の同じ栄養培地添加後、発酵をさらに３日間続けた後、さらに得られたＳＬＰを集める。
【０１６１】
２つの異なる生成物が、この発酵プロセスから生成される。１つは純粋なＳＬＰ、もう１つは、ＳＬＰを含むS. bombicola培養物を含むものである。
【０１６２】
実施例２−葉の処置のためのＳＬＰ溶液の調製
S. bombicola発酵により得られた沈殿ＳＬＰを用いて、あらゆる種類のモザイクウイルスに対して、植物を処置する生成物を生成することができる。沈殿ＳＬＰは、通常、５０％まで水を含むが、この種の処置生成物を調製するのに、さらなる濃度は必要でない。処置生成物は、０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）の未精製ＳＬＰを含有している。
【０１６３】
実施例３―葉の処置のためのS. BOMBICOLA細胞を含有するＳＬＰ溶液の調製
他の種類の処置生成物は、S. bombicola培養物を用いて、モザイクウイルス、その他微生物病原体、例えば、病原体グラム陽性バクテリアを処置することができる。培養物は、ポータブルな分配可能なリアクターで生成することができ、適用場所のごく近くでの生成物の現場生成ができる。
【０１６４】
培養プロセスにより、４ｇ／ＬのＳＬＰを含む２５０ガロンの純粋なS. bombicola培養物が生成される。得られた培養物を少なくとも１０回希釈して、少なくとも２，５００ガロンの処置生成物を生成する。
【０１６５】
実施例４−モザイクウイルスに感染したキュウリ植物の処置
本発明を用いて、モザイクウイルスに感染したキュウリ植物を処置した。キュウリ植物の葉を０．２％のＳＬＰを含む組成物で処置した。ＳＬＰ組成物を、３日間にわたって、葉の表面にスプレーした。
【０１６６】
処置開始後５日以内に、葉にあったモザイクのしみが消え、葉は健全に見えた。
【０１６７】
実施例５−グラム陽性バクテリアのＳＬＰ処置
グラム陽性バクテリアBacillus subtilisを広げたシャーレを、ＳＬＰ０．５％溶液で処置した。処置後２日で、培養物成長のないハロー（直径０．５インチ以上）が観察された。
【国際調査報告】
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