(57)【要約】  本明細書には、精度が改善された生物試料における生物活性の領域を検出且つ視覚化するための、レシオメトリック蛍光画像化試薬、並びに、蛍光比率及び輝度の閾値を使用する画像処理方法が開示される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料における生物活性の領域を検出する方法であって、該方法は：
ａ）前記生物試料を前記生物活性のレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；
ｂ）第１の発光波長にて前記生物試料の第１の蛍光輝度画像を、及び第２の発光波長にて前記生物試料の第２の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；
ｃ）蛍光比率画像を作成するために前記第１の蛍光画像及び前記第２の蛍光画像を組み合わせる工程；
ｄ）生物活性の領域を検出するための画像分析アルゴリズムを使用して、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程
を含み、前記画像分析アルゴリズムは：
ｉ）前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、
ｉｉ）２つ以上のマスク画像が工程（ｉ）で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、及び前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像から成る群から選択された２つ以上の画像上でＡＮＤ論理演算を実行し、及び
ｉｉｉ）前記生物活性に対し陽性又は陰性の何れかとして生物試料の分類を提供し、前記分類は、工程（ｉ）に使用された前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの組み合わせ内の関心領域の検出に基づき、該関心領域は、工程（ｉ）に使用された前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの組み合わせの値を超える蛍光比率値又は蛍光輝度値を示すものであり、及び前記画像分析アルゴリズムは更に
ｉｖ）コンピュータメモリーに分類結果を随意に記憶する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせ内の関心領域を表示する工程を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物試料はインビトロの生物試料又はインビボの生物試料である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物試料は、細胞サンプル、エクスビボ組織サンプル、又はインビボの組織サンプルである、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検出される前記生物活性は疾患と相関する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患は、関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、前癌、又は炎症である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌は乳癌である、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検出される前記生物活性は、悪性組織又は凝結（血液凝固）と相関する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）〜（ｄ）は、経時的に生物活性の変化をモニタリングするために、一連の第１の蛍光輝度画像、第２の蛍光輝度画像、及び蛍光比率画像を提供するべく定められた時間間隔で２回以上繰り返される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記関心領域の表示はリアルタイムで提供される、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記関心領域の表示は、外科手術を誘導するための手術時の設定で外科医によって使用される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は内視鏡を使用してキャプチャされ、前記関心領域の表示が内視鏡の位置決めを誘導するために使用される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシオメトリック蛍光表示体は、切断可能なリンカーにより分離される蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光ドナー部分及び前記蛍光アクセプター部分はそれぞれＣｙ５及びＣｙ７である、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断可能なリンカーはプロテアーゼによって切断可能なペプチド結合を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼである、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レシオメトリック蛍光表示体は、式（Ｉ）の分子を含み：
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−［ｃＢ−ＤＢ］式（Ｉ）
式中、
Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり、
Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、
Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸残基を含み、
Ｍは高分子であり、及び
ＤＡ及びＤＢは、その他との蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及びここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＢの任意のアミノ酸残基に結合される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ａは５〜９つの酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドである、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｂは７〜９つの塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドである、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
Ａは５又は９つの連続するグルタミン酸塩残基を含むペプチド配列であり、Ｂは８又は９つの連続するアルギニン残基を含むペプチド配列である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又はγ−アミノ酸から選択される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸、Ｎ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸、及び、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸から選択される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−システイン、Ｄ−グルタミン酸塩、リジン、及びパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンから選択される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
Ｘは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＲＰＬＡＬＷＲＳ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、ＤＰＲＳＦＬ、ＰＰＲＳＦＬ、ＲＬＱＬＫＬ、及びＲＬＱＬＫ（Ａｃ）Ｌから選択されたアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
Ｘは、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼにより切断可能である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＣｙ７である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＩＲ  Ｄｙｅ７５０である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＩＲ  Ｄｙｅ８００である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＩＣＧである、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
式（Ｉ）の分子はＳＤＭ−２５である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
マスクファイルを作成するために蛍光比率閾値のみが使用される、ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は、前記蛍光比率画像の作成前に画像露光時間によって標準化される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
関心領域内の平均蛍光比率又は平均蛍光輝度値は、前記関心領域における生物活性の質的又は定量的な測定を提供する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記画像処理アルゴリズムは更に、検出された関心領域が特定の最小サイズより大きいことをチェックする工程を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
生物試料のレシオメトリック蛍光画像における生物活性の領域を検出するために使用される、蛍光比率及び蛍光輝度閾値の自動最適化のための方法であって、該方法は：
ａ）複数の生物試料を提供する工程；
ｂ）前記生物試料の各々を生物活性のレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；
ｃ）前記生物試料の各々に対して、第１の発光波長で第１の蛍光輝度画像を、及び第２の発光波長で第２の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；
ｄ）前記生物試料の各々に対して蛍光比率画像を作成するために前記第１の蛍光画像及び前記第２の蛍光画像を組み合わせる工程；
ｅ）第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、蛍光比率閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対する出発値を提供する工程；及び
ｆ）前記生物試料の各々に対して：
ｉ）画像分析アルゴリズムを使用して、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程であって、前記画像分析アルゴリズムは：
前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、
２つ以上のマスク画像が先の工程で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、及び前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像から成る群から選択された２つ以上の画像上でＡＮＤ論理演算を実行し、及び
随意に、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせ内の検出された関心領域が特定の最小サイズよりも大きいことをチェックし、前記検出された関心領域は、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの値を超える、蛍光比率値又は蛍光輝度値を示す領域であり、及び
前記画像分析アルゴリズムは更に、関心領域が検出されている場合に前記生物活性に対し陽性として前記生物試料の分類を提供し、又は関心領域が検出されていない場合に前記生物活性に対し陰性として前記生物試料の分類を提供する、工程；
ｉｉ）前記分類が、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性であるかを判定するために、前記画像分析アルゴリズムによって提供される分類を、前記生物試料に対する病理実験室試験結果と比較する工程；
ｉｉｉ）コンピュータメモリーに、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性の結果を記憶させる工程；及び
ｇ）以下：
ｉ）前記第２の蛍光輝度閾値及び前記蛍光比率閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記第１の蛍光輝度閾値の漸増的に増加した値、又は
ｉｉ）前記第１の蛍光輝度閾値及び前記蛍光比率閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記第２の蛍光輝度閾値の漸増的に増加した値、又は
ｉｉｉ）前記第１の蛍光輝度閾値及び前記第２の蛍光輝度閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記蛍光比率閾値の漸増的に増加した値
により、工程（ｆ）を繰り返す工程；
ｈ）蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、及び第２の蛍光輝度閾値の各セットに対する記憶された分類結果を使用して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を算出する工程；及び
ｉ）前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対する最適な設定を決定するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、及び第２の蛍光輝度閾値の各セットに対する前記ＲＯＣ曲線下の面積を比較する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３６】
前記生物試料は、細胞サンプル、エクスビボ組織サンプル、又はインビボの組織サンプルである、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
検出される前記生物活性は疾患と相関する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患は、関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、前癌、又は炎症である、ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
検出される前記生物活性は、悪性組織又は凝結（血液凝固）と相関する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
癌は乳癌である、ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記レシオメトリック蛍光表示体は、切断可能なリンカーにより分離される蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分を含む、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記蛍光ドナー部分及び前記蛍光アクセプター部分はそれぞれＣｙ５及びＣｙ７である、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記切断可能なリンカーはプロテアーゼによって切断可能なペプチド結合を含む、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼである、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
レシオメトリック蛍光表示体はＣｙ５及びＣｙ７で標識されたＳＤＭ−２５である、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
癌に対してレシオメトリック蛍光画像化に基づく診断試験を行う方法であって、該方法は：
ａ）生物試料をレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；
ｂ）第１の励起波長の励起光で前記生物試料を照らす工程；
ｃ）第１の発光波長で前記生物試料の第１の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；
ｄ）第２の発光波長で前記生物試料の第２の蛍光輝度画像を引き続き又は同時にキャプチャする工程；及び
ｅ）前記生物試料の蛍光比率画像を作成するべく前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像を組み合わせるための画像化ソフトウェアを提供する工程であって、ここで、癌性の生物活性と相関される生物試料の蛍光比率画像内の関心領域を検出又は表示するために画像処理アルゴリズムが使用される、工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４７】
前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は、前記蛍光比率画像の作成前に画像露光時間によって標準化される、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記画像処理アルゴリズムは、癌性の生物活性と相関される関心領域を検出するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの使用を含む、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記画像処理アルゴリズムは更に、（ｉ）前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用する工程、（ｉｉ）２つ以上のマスク画像が工程（ｉ）で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせの上でＡＮＤ論理演算を実行する工程、（ｉｉｉ）検出された関心領域が特定の最小サイズより大きいことを随意にチェックする工程、及び（ｉｖ）関心領域が検出されている場合に前記癌性の生物活性に対し陽性として前記生物試料の分類を提供し、又は関心領域が検出されていない場合に前記癌性の生物活性に対し陰性として前記生物試料の分類を提供する工程を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記レシオメトリック蛍光表示体は、式（Ｉ）の分子であり：
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−［ｃＢ−ＤＢ］式（Ｉ）
式中、
Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり、
Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、
Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸残基を含み、
Ｍは高分子であり、及び
ＤＡ及びＤＢは、その他との蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及び
ここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＢの任意のアミノ酸残基に結合される
ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記レシオメトリック蛍光表示体はＣｙ５及びＣｙ７で標識されたＳＤＭ−２５である、ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌性の生物活性は、黒色腫、非黒色腫性の皮膚癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頸部癌、頭頚部癌、リンパ節、甲状腺癌、神経膠腫、胃腸癌、又は肉腫に関連付けられる、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
患者はレシオメトリック蛍光表示体を注入され、前記方法が切除後の外科試料における乳癌を検出するために使用される、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
癌の診断のための臨床的感度は７０％を超える、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
癌の診断のための臨床的特異性は７０％を超える、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
患者はレシオメトリック蛍光表示体を注入され、前記方法が外科手術を誘導するために手術中に使用される、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法は、診断又は処置の決定を下すために医師又は医療サービス提供者によって使用される試験結果を提供する、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記試験結果は、前記方法が実行される位置から、前記医師又は医療サービス提供者の位置へと送信される、ことを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記癌のマージン状況は手術中に評価される、ことを特徴とする請求項１乃至５８の何れか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年４月７日出願の米国仮特許出願第６２／４３８，００４号の利益を主張し、該仮出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００２】
本明細書には、生物試料における生物活性の領域を検出且つ視覚化するために蛍光比率及び輝度の閾値を使用する方法が開示され、該方法は：ａ）前記生物試料を前記生物活性のレシオメトリック蛍光表示体（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）と接触させる工程；ｂ）前記生物試料に対して、第１の発光波長で第１の蛍光輝度画像を、及び第２の発光波長で第２の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；ｃ）蛍光比率画像を作成するために前記第１の蛍光画像及び前記第２の蛍光画像を組み合わせる工程；ｄ）画像分析アルゴリズムを使用して、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程であって、前記画像分析アルゴリズムは：ｉ）前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、ｉｉ）２つ以上のマスク画像が工程（ｉ）で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせの上でＡＮＤ論理演算を実行し、及びｉｉｉ）前記生物活性に対し陽性又は陰性の何れかとして生物試料の分類を提供し、前記分類は、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの値を超える蛍光比率値又は蛍光輝度値を示す、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせ内の関心領域の検出に基づく、工程；及びｅ）ユーザーに対して前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、又は前記第２の蛍光輝度画像内の関心領域を表示し、且つコンピュータメモリーに分類結果を随意に記憶する工程を含む。
【０００３】
幾つかの実施形態において、前記生物試料は、細胞サンプル、エクスビボ組織サンプル、又はインビボの組織サンプルである。幾つかの実施形態において、検出且つ視覚化される生物活性は疾患と相関される。幾つかの実施形態において、前記疾患は、関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、前癌、炎症、又はそれらの任意の組み合わせである。幾つかの実施形態において、癌は乳癌である。幾つかの実施形態において、検出且つ視覚化される生物活性は、悪性組織又は凝結（血液凝固）と相関される。幾つかの実施形態において、工程（ｂ）〜（ｅ）は、経時的に生物活性の変化をモニタリングするために、一連の第１の蛍光輝度画像、第２の蛍光輝度画像、及び蛍光比率画像を提供するべく定められた時間間隔で２回以上繰り返される。幾つかの実施形態において、関心領域の表示はリアルタイムで提供される。幾つかの実施形態において、前記関心領域の表示は、外科手術を誘導するための手術時の設定で外科医によって使用される。幾つかの実施形態において、前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は内視鏡を使用してキャプチャされ、前記関心領域の表示が内視鏡の位置決めを誘導するために使用される。幾つかの実施形態において、前記レシオメトリック蛍光表示体は、切断可能なリンカーにより分離される蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分を含む。幾つかの実施形態において、蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分はそれぞれＣｙ５及びＣｙ７である。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーはプロテアーゼによって切断可能なペプチド結合を含む。幾つかの実施形態において、前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼである。幾つかの実施形態において、レシオメトリック蛍光表示体は式（Ｉ）の分子を含み、
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−［ｃＢ−ＤＢ］式（Ｉ）
式中、Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり、Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸を含み、Ｍは高分子であり、及びＤＡ及びＤＢは、その他との蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及びここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＢの任意のアミノ酸残基に結合される。幾つかの実施形態の実施形態において、式（Ｉ）の分子はＳＤＭ−２５である。幾つかの実施形態において、マスクファイルを作成するために蛍光比率閾値のみが使用される。
【０００４】
本明細書にはまた、生物試料のレシオメトリック蛍光画像における生物活性の領域を検出するために使用される、蛍光比率及び蛍光輝度閾値の自動最適化のための方法が開示され、該方法は：ａ）複数の生物試料を提供する工程；ｂ）前記生物試料の各々を生物活性のレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；ｃ）前記生物試料の各々に対して、第１の発光波長で第１の蛍光輝度画像を、及び第２の発光波長で第２の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；ｄ）前記生物試料の各々に対して蛍光比率画像を作成するために前記第１の蛍光画像及び前記第２の蛍光画像を組み合わせる工程；ｅ）第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、蛍光比率閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対する出発値を提供する工程；及びｆ）前記生物試料の各々に対して：ｉ）画像分析アルゴリズムを使用して、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程であって、前記画像分析アルゴリズムは：前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせを作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、２つ以上のマスク画像が先の工程で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせの上でＡＮＤ論理演算を実行し、随意に、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせ内の検出された関心領域が特定の最小サイズよりも大きいことをチェックし、前記検出された関心領域は、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの値を超える、蛍光比率値又は蛍光輝度値を示す領域であり、及び、前記画像分析アルゴリズムは更に、関心領域が検出されている場合に前記生物活性に対し陽性として前記生物試料の分類を提供し、又は関心領域が検出されていない場合に前記生物活性に対し陰性として前記生物試料の分類を提供する、工程；ｉｉ）前記分類が、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性であるかを判定するために、前記画像分析アルゴリズムによって提供される分類を、前記生物試料に対する病理実験室試験結果と比較する工程；ｉｉｉ）コンピュータメモリーに、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性の結果を記憶させる工程；及びｇ）以下：ｉ）前記第２の蛍光輝度閾値及び前記蛍光比率閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記第１の蛍光輝度閾値の漸増的に増加した値、又はｉｉ）前記第１の蛍光輝度閾値及び前記蛍光比率閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記第２の蛍光輝度閾値の漸増的に増加した値、又はｉｉｉ）前記第１の蛍光輝度閾値及び前記第２の蛍光輝度閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記蛍光比率閾値の漸増的に増加した値で工程（ｆ）を繰り返す工程；ｈ）蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、及び第２の蛍光輝度閾値の各セットに対する記憶された分類結果を使用して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を算出する工程；及びｉ）前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対する最適な設定を決定するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、及び第２の蛍光輝度閾値の各セットに対する前記ＲＯＣ曲線下の面積を比較する工程を含む。
【０００５】
幾つかの実施形態において、前記生物試料は、細胞サンプル、エクスビボ組織サンプル、又はインビボの組織サンプルである。幾つかの実施形態において、検出される生物活性は疾患と相関される。幾つかの実施形態において、前記疾患は、関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、前癌、炎症、又はそれらの任意の組み合わせである。幾つかの実施形態において、癌は乳癌である。幾つかの実施形態において、検出且つ視覚化される生物活性は、悪性組織又は凝結（血液凝固）と相関される。幾つかの実施形態において、前記レシオメトリック蛍光表示体は、切断可能なリンカーにより分離される蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分を含む。幾つかの実施形態において、蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分はそれぞれＣｙ５及びＣｙ７である。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーはプロテアーゼによって切断可能なペプチド結合を含む。幾つかの実施形態において、前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼである。幾つかの実施形態において、レシオメトリック蛍光表示体はＣｙ５及びＣｙ７で標識されたＳＤＭ−２５である。
【０００６】
本明細書には、生物試料における生物活性の領域を検出するためのレシオメトリック蛍光画像化方法であって、該方法は：ａ）前記生物試料を前記生物活性のレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；ｂ）第１の励起波長の励起光で前記生物試料を照らす工程；ｃ）第１の発光波長で前記生物試料の第１の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；ｄ）第２の発光波長で前記生物試料の第２の蛍光輝度画像を引き続き又は同時にキャプチャする工程；及びｅ）前記生物試料の蛍光比率画像を作成するべく前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像を組み合わせるための画像処理ソフトウェアを提供する工程を含み、ここで、生物活性を示す生物試料の蛍光比率画像内の関心領域を検出又は表示するために画像処理アルゴリズムが使用され、ここで、関心領域は、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、蛍光比率閾値、又はそれらの任意の組み合わせの値を超える、蛍光比率値、第１の蛍光輝度値、第２の蛍光輝度値、又はそれらの任意の組み合わせを示す比率画像の領域を含む。
【０００７】
幾つかの実施形態において、インビトロの生物試料の第１及び第２の蛍光輝度画像がキャプチャされる。幾つかの実施形態において、インビボの生物試料の第１及び第２の蛍光輝度画像がキャプチャされる。幾つかの実施形態において、前記生物試料は、細胞サンプル、エクスビボ組織サンプル、又はインビボの組織サンプルである。幾つかの実施形態において、レシオメトリック蛍光表示体は式（Ｉ）の分子であり、
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−［ｃＢ−ＤＢ］式（Ｉ）
式中、Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり、Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸を含み、Ｍは高分子であり、及びＤＡ及びＤＢは、その他との蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及びここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＢの任意のアミノ酸残基に結合される。
【０００８】
幾つかの実施形態において、Ａは、５〜９つの酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドである。幾つかの実施形態において、Ａは、５又は９つの連続するグルタミン酸塩残基を含む配列を有するペプチドである。幾つかの実施形態において、Ｂは、７〜９つの塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドである。幾つかの実施形態において、Ｂは、８又は９つの連続するアルギニン残基を含む配列を有するペプチドである。幾つかの実施形態において、Ａは５又は９つの連続するグルタミン酸塩残基を含むペプチド配列であり、Ｂは８又は９つの連続するアルギニン残基を含むペプチド配列である。幾つかの実施形態において、Ａは５つの連続するグルタミン酸塩残基を含むペプチド配列であり、Ｂは８つの連続するアルギニン残基を含むペプチド配列である。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、自然発生のアミノ酸又は非自然発生のアミノ酸から選択される。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−アミノ酸、Ｌアミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又はγ−アミノ酸から選択される。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸、Ｎ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸、及び、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸から選択される。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−システイン、Ｄ−グルタミン酸塩、リジン、及びパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンから選択される。幾つかの実施形態において、ｃＢは遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＢはＤ−システインである。幾つかの実施形態において、ｃＡはＮ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＡはＤ−グルタミン酸塩である。幾つかの実施形態において、ｃＡはリジンである。幾つかの実施形態において、ｃＭは、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＭはパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンである。幾つかの実施形態において、Ｘはペプチド結合を含む。幾つかの実施形態において、Ｘは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＲＰＬＡＬＷＲＳ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、ＤＰＲＳＦＬ、ＰＰＲＳＦＬ、ＲＬＱＬＫＬ、及びＲＬＱＬＫ（Ａｃ）Ｌから選択されたアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、Ｘはメタロプロテアーゼにより切断可能である。幾つかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＡＤＡＭメタロプロテイナーゼ、アダマリシン、パッパリシン、マトリリシン、ネプリライシン（中性エンドペプチダーゼ）、アンギオテンシン転換酵素、金属カルボキシペプチダーゼ、又はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼである。幾つかの実施形態において、Ｘは、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、又はＭＭＰ１４によって切断可能なアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、Ｘはセリン又はトレオニンのプロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、セリンプロテアーゼは、エラスターゼ、凝固因子（トロンビン、因子ＶＩＩａ、因子ＩＸａ、又は因子Ｘａ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、テスチシン、コリン、組織又は血漿カリクレイン、トリプターゼ、又はジペプチジルペプチダーゼである。幾つかの実施形態において、Ｘはシステインプロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、システインプロテアーゼは、カテプシンＢ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＬ、カスパーゼ、又はレグマインである。幾つかの実施形態において、ＤＡ及びＤＢは、一方から他方への蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能な蛍光アクセプター部分及び蛍光ドナー部分の対である。幾つかの実施形態において、ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＣｙ７である。幾つかの実施形態において、第１の励起波長は約６１０ｎｍ〜約６５０ｎｍである。幾つかの実施形態において、第１の発光波長は約６６０ｎｍ〜約７２０ｎｍである。幾つかの実施形態において、第２の発光波長は約７６０ｎｍ〜約８３０ｎｍである。幾つかの実施形態において、ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＩＲ  Ｄｙｅ７５０である。幾つかの実施形態において、ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＩＲ  Ｄｙｅ８００である。幾つかの実施形態において、ＤＡ及びＤＢはＣｙ５及びＩＣＧである。幾つかの実施形態において、工程（ｃ）〜（ｅ）は、経時的に生物活性の変化をモニタリングするために、一連の蛍光比率画像を提供するべく定められた時間間隔で２回以上繰り返される。幾つかの実施形態において、前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は、前記蛍光比率画像の作成前に画像露光時間によって標準化される。幾つかの実施形態において、前記画像処理アルゴリズムは、関心領域を検出するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの使用を含む。幾つかの実施形態において、画像処理アルゴリズムは更に、（ｉ）前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用する工程、（ｉｉ）２つ以上のマスク画像が工程（ｉ）で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせの上でＡＮＤ論理演算を実行する工程、及び（ｉｉｉ）関心領域が検出されている場合に前記生物活性に対し陽性として前記生物試料の分類を提供し、又は関心領域が検出されていない場合に前記生物活性に対し陰性として前記生物試料の分類を提供する工程を含む。幾つかの実施形態において、関心領域内の平均蛍光比率又は平均蛍光輝度値は、前記関心領域における生物活性の質的な測定を提供する。幾つかの実施形態において、関心領域内の平均蛍光比率又は平均蛍光輝度値は、前記関心領域における生物活性の定量的な測��を提供する。幾つかの実施形態において、検出された関心領域は癌性の生物活性と相関される。幾つかの実施形態において、蛍光比率画像は、癌性組織と正常組織との間の少なくとも１．５：１のコントラスト比を提供する。幾つかの実施形態において、前記画像処理アルゴリズムは更に、検出された関心領域が特定の最小サイズより大きいことをチェックする工程を含む。
【０００９】
本明細書には、癌に対してレシオメトリック蛍光画像化に基づく診断試験を行うための方法が開示され、該方法は：ａ）生物試料をレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；ｂ）第１の励起波長の励起光で前記生物試料を照らす工程；ｃ）第１の発光波長で前記生物試料の第１の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；ｄ）第２の発光波長で前記生物試料の第２の蛍光輝度画像を引き続き又は同時にキャプチャする工程；及びｅ）前記生物試料の蛍光比率画像を作成するべく前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像を組み合わせるための画像化ソフトウェアを提供する工程であって、ここで、癌性の生物活性と相関される生物試料の画像内の関心領域を検出又は表示するために画像処理アルゴリズムが使用される、工程を含む。
【００１０】
幾つかの実施形態において、前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は、前記蛍光比率画像の作成前に画像露光時間によって標準化される。幾つかの実施形態において、前記画像処理アルゴリズムは、癌性の生物活性と相関される関心領域を検出するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの使用を含む。幾つかの実施形態において、画像処理アルゴリズムは更に、（ｉ）前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用する工程、（ｉｉ）２つ以上のマスク画像が工程（ｉ）で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像、又はそれらの任意の組み合わせの上でＡＮＤ論理演算を実行する工程、（ｉｉｉ）検出された関心領域が特定の最小サイズより大きいことを随意にチェックする工程、及び（ｉｖ）関心領域が検出されている場合に前記癌性の生物活性に対し陽性として前記生物試料の分類を提供し、又は関心領域が検出されていない場合に前記癌性の生物活性に対し陰性として前記生物試料の分類を提供する工程を含む。幾つかの実施形態において、レシオメトリック蛍光表示体は式（Ｉ）の分子であり、
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−［ｃＢ−ＤＢ］式（Ｉ）
式中、Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり、Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸を含み、Ｍは高分子であり、及びＤＡ及びＤＢは、その他との蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及びここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＢの任意のアミノ酸残基に結合される。幾つかの実施形態において、レシオメトリック蛍光表示体はＣｙ５及びＣｙ７で標識されたＳＤＭ−２５である。幾つかの実施形態において、前記癌性の生物活性は、黒色腫、非黒色腫性の皮膚癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頸部癌、頭頚部癌、リンパ節、甲状腺癌、神経膠腫、胃腸癌、又は肉腫に関連付けられる。幾つかの実施形態において、患者はレシオメトリック蛍光表示体を注入され、前記方法が切除後の外科試料における乳癌を検出するために使用される。幾つかの実施形態において、癌の診断のための臨床的感度は８０％を超える。幾つかの実施形態において、癌の診断のための臨床的特異性は８０％を超える。幾つかの実施形態において、患者はレシオメトリック蛍光表示体を注入され、前記方法が外科手術を誘導するために手術中に使用される。幾つかの実施形態において、前記方法は、診断又は処置の決定を下すために医師又は医療サービス提供者によって使用される試験結果を提供する。幾つかの実施形態において、前記試験結果は、前記医師又は医療サービス提供者の位置に対して前記方法が実行される位置から送信される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】Ｃｙ５蛍光ドナー及びＣｙ７蛍光消光剤を含む、選択的な送達分子（ＳＤＭ）（又は活性化可能な細胞膜透過ペプチド（ＡＣＰＰ））の一実施形態の構造を例示する。図１に示される構造はＳＤＭ−２５分子である。
【図２】ＳＤＭ−２５、即ち、Ｃｙ７部分に抱合され、且つＣｙ５部分に抱合されるポリカチオン系ドメインに切断可能なリンカーを介して接続されるポリアニオン系ドメインを含むレシオメトリックＡＣＰＰ（ＲＡＣＰＰ）に対する吸収度及び蛍光発光スペクトルを例示する。図２のＡ：５００−８００ｎｍの８０％／２０％のＰＢＳ／アセトニトリルにおける１７．５μｇ／ｍＬのＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）の吸収度スペクトル。図２のＢ：６３０ｎｍの励起波長及び６２０−８５０ｎｍの発光波長を使用するＴＣＮＢ緩衝液におけるＳＤＭ−２５蛍光発光スペクトル。２つのサンプルは、ＭＭＰ９でのプレインキュベーションを用いて、又は用いることなく調製された。代表的なスペクトルが示される（６つの実験から）。蛍光発光スペクトルは、ＭＭＰ９プロテアーゼでの処置の前（赤色）及びその後（青色）に６３０ｎｍの励起光を使用してキュベット分光蛍光計において測定された。切断の前に、Ｃｙ５はＣｙ７によってクエンチされ、これは７８０ｎｍで吸収された励起光を再発光する。切断後、Ｃｙ７はこれ以上Ｃｙ５をクエンチせず、結果として６７０ｎｍのＣｙ５発光ピークの増加、及び７８０ｎｍのＣｙ７再発光の減少がもたらされる。７１０ｎｍ〜８４０ｎｍの残存する肩部（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）の大部分はＣｙ５発光によるものである。
【図３】ヒト乳癌腫瘍組織及び正常組織におけるＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）に対して観察された異なる切断割合を例示するデータ、及び、ヒト乳癌組織のレシオメトリック蛍光画像化ベースの検出におけるＳＤＭ−２５の使用に対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の例を提供する。図３のＡ：２５の対になったヒト乳癌患者組織ホモジネートにおけるＳＤＭ−２５の切断割合（毎分切断されたｎＭ）。癌陽性の腫瘍組織（赤色の菱形）及び癌陰性の隣接組織（青色の三角形）が示される。対になったサンプルは線によって接続される。対応のあるｔ検定は、腫瘍と標準との間の有意差に対してＰ＜０．０００１をもたらす。図３のＢ：平均±９５％の信頼水準と同じデータの散布図。図３のＣ：腫瘍対正常組織のＳＤＭ−２５切断割合検出のためのＲＯＣ曲線を示す。
【図４】非悪性の乳房組織及び腫瘍ホモジネートにおけるＭＭＰ活性の定量化に対するＳＤＭ−２５の使用を例示するデータの例を提供する。図４のＡ：データが図３Ａ−図３Ｃに示される２５の患者から選択される、３つの代表的なヒト乳癌サンプル及び対になった正常組織からのホモジネートが、１０％のゼラチンザイモグラム上で分析された。組み換え体の活性ＭＭＰ２及びＭＭＰ９は標準（１つのレーン当たり２ｎｇ）として示された。図４のＢ：図４のＡに示される３つの対を含む、５つの代表的なヒト乳癌サンプル（（１）として標識）及び対になった正常組織（（２）として標識）における６つのＭＭＰのＥＬＩＳＡ定量化。エラーバーは標準偏差である。ＮＤ＝検出不能。
【図５】２つの異なるカメラ上への２つの異なる波長での蛍光発光を画像化するために画像スプリッターを利用する、レシオメトリック蛍光画像化システムの１つの非限定的な例を概略的に例示する。
【図６】ハードウェア（例えば、画像取得ハードウェア、プロセッサ、及びコンピュータメモリーを画像化する）及びソフトウェアコンポーネント（例えばオペレーティングシステム、及び画像取得、画像処理、並びに画像表示ソフトウェアモジュール）を含む、レシオメトリック画像化システムの概略図を提供する。
【図７】蛍光比率画像内の高い蛍光比率及び／又は蛍光輝度値を示す関心領域（ＲＯＩ）を同定するために使用される画像処理アルゴリズムを例示する。
【図８Ａ】ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０とも称される）を注入された、ヒト用量漸増研究からの生物試料の画像に対する蛍光輝度データの例を示す。
【図８Ｂ】ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０とも称される）を注入された、ヒト用量漸増研究からの生物試料の画像に対する蛍光輝度データの例を示す。
【図９】ＳＤＭ−２５を使用するレシオメトリック蛍光画像化が乳癌患者の悪性（陽性）と非悪性（陰性）とを区別可能であることを示すデータの例を示す。原発性腫瘍及びリンパ節からのデータが提供される。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１０】関心領域（ＲＯＩ）を同定し、且つレシオメトリック蛍光表示体、例えばＳＤＭ−２５を注入された生物試料における生物活性（例えば、増強された酵素活性）の予測を提供するために使用される、画像処理アルゴリズムを例示する。陽性又は陰性のスコアの予測は、蛍光輝度比率閾値（例えばＣｙ５／Ｃｙ７蛍光輝度比率閾値）及び／又は蛍光輝度閾値（例えばＣｙ５蛍光輝度閾値）の与えられた組み合わせに対して生成される。
【図１１】レシオメトリック蛍光表示体、例えばＳＤＭ−２５を注入された生物試料における生物活性（例えば、増強された酵素活性）の陽性又は陰性の予測を判定するために使用される、画像処理アルゴリズムを例示する。陽性又は陰性の活性の判定は、蛍光比率閾値（例えばＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率閾値）及び／又は蛍光輝度閾値（例えばＣｙ５蛍光輝度閾値）の与えられた組み合わせに対して生成される。
【図１２】レシオメトリック蛍光表示体、例えばＳＤＭ−２５を注入された生物試料における生物活性（例えば増強された酵素活性）の存在を判定するための蛍光比率閾値及び／又は輝度閾値の最も正確な組み合わせを同定するために使用される、画像処理アルゴリズムの１つの非限定的な例を例示する。この例において、１つの閾値（即ち、蛍光比率閾値又は蛍光輝度閾値）が変動し、一方で他方の閾値は、生物試料のセットに関する画像化データと病理研究所データ（又は生物活性の他の独立した判定）との比較に基づいて最も正確な閾値を生成するべく固定されたまま保持されている。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、異なる蛍光比率閾値及び／又は輝度閾値での画像分析からの予測を、例えば病理研究所結果と比較することによって生成される。
【図１３Ａ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入されたヒト患者からの原発性腫瘍試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１３Ｂ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入されたヒト患者からの原発性腫瘍試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１３Ｃ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入されたヒト患者からの原発性腫瘍試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１４Ａ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入されたヒト患者からのリンパ節試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１４Ｂ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入されたヒト患者からのリンパ節試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１５Ａ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入された個々の患者試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１５Ｂ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入された個々の患者試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１５Ｃ】蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の異なる組み合わせを使用して生成される、ＳＤＭ−２５を注入された個々の患者試料に関するＲＯＣ曲線の例を提供する。
【図１６】８ｍｇの用量のＳＤＭ−２５を投与した患者からの横断された原発性腫瘍試料画像の例を提供し、画像化は注入後の日に実行された。白色は、Ｒ≧１２０のＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率閾値及びＩ≧５０のＣｙ５輝度閾値を示す。閾値は記載された方法を使用して判定された。
【図１７】転移性のリンパ節モデル及びインビボの画像診断プロトコルの概略図を提供する。乳癌細胞はマウスの耳に埋め込まれ、頸リンパ節に転移する（図１７のＡ）。リンパ節状態を評価するために、ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）を、尾静脈注射を介して投与し、３−６時間後、頚部の領域を外科的に露出し（図１７のＢ）、リンパ節を画像化する。蛍光比率画像を獲得し、ＲＧＢスケールを使用しては白色光画像の上に重ねて表示し、そこでは、高い蛍光比率が赤色であり、低い比率は青色である−（図１７のＣ）に示される例。その後、リンパ節はＨ＆Ｅ組織病理学解析のために外科摘出され且つ処理される（図１７のＤ）。赤色が高い比率に等しいＲＧＢスケールを使用して、病理結果を画像比率値と直接比較する。赤色矢印は、ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）によって蛍光標識された転移性（癌陽性）頸リンパ節を示す。シアンで着色された矢印は、組織病理学によって判定されるような癌陰性頸リンパ節を示す。
【図１８】マウス４Ｔ１乳房転移性リンパ節モデルを使用する蛍光比率画像化及び組織病理学の比較を示す。図１８のＡ：マウスの耳の原発性腫瘍における高い蛍光比率を示す、重ねられた蛍光比率画像を伴う（右）、及びそれを伴わない（左）、代表的な黒色及び白色の背側のマウス画像。図１８のＢ：ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）は、Ｈ＆Ｅ組織病理学から判定されるような癌状態によって分類された頸リンパ節に対する蛍光比率値を生成した。癌陽性のリンパ節（赤色の菱形）及び癌陰性の（青色の三角形）リンパ節が示される。黒い線は平均±９５％の信頼水準を示す。図１８のＣ：ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）投与の６時間後に得られる、反射光画像と混合される露出されたリンパ節の代表的な蛍光比率画像。この比率は、高い比率が赤色により示され且つ低い比率が青色により示されるＲＧＢスケールを使用して、表示される。Ｈ＆Ｅ染色によって判定されるように、赤色及びシアンの矢印はそれぞれ癌陽性及びリンパ節陰性を示す。図１８のＤ：インビボの診断上の蛍光シグナルにおけるＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）の発達のための動力学が示される。画像化は、投与後１〜４８時間に及ぶ時点で実行された。癌陽性のリンパ節（赤色の菱形）及び癌陰性の（青色の三角形）リンパ節が示される。１つのデータポイント当たりの測定の数（Ｎ）は３〜２４に及び、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１９Ａ】８ｍｇの用量のＳＤＭ−２５を投与した患者からの原発性乳腺腫瘤摘出試料画像の表面マージン（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｇｉｎｓ）の第１の例を提供し、画像化は注入後の日に実行された。
【図１９Ｂ】８ｍｇの用量のＳＤＭ−２５を投与した患者からの原発性乳腺腫瘤摘出試料画像の表面マージンの第２の例を提供し、画像化は注入後の日に実行された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
レシオメトリック蛍光検出及び単一輝度蛍光検出は、インビトロ及びインビボの画像化用途に使用される方法である。幾つかの例において、単一波長での蛍光発光の測定は、異なる形態、厚み、細胞組成、及び細胞外マトリックスを持つ異なる組織が原因で混乱させられる。レシオメトリック蛍光検出は、特異的な生物活性に応じて２つの異なる波長でレシオメトリック変化を生成する、蛍光性薬剤又は表示体の組み合わせを利用する。場合によっては、この方法は、例えば、フルオロフォア濃度の差異、被験体の動作、及び、異なる蛍光検出器及び器機に対する励起光輝度及び／又は蛍光発光収集及び検出の効率における変異性を含む、様々な実験因子が原因のアーチファクトを減らすと示されている。
【００１３】
本明細書には、特定の実施形態において、インビボ及びエクスビボの生物試料における生物活性を検出且つ視覚化するためのレシオメトリック蛍光画像化方法が開示される。場合によっては、本明細書に記載されるレシオメトリック蛍光画像化方法は、当該技術で記載される画像化方法に比べて精度が改善している。幾つかの例において、精度の改善は、特異的なレシオメトリック蛍光表示体の使用を介して達成され、これは、対象の生物活性を示す生物試料の領域と、それを示さない領域とのより高度な区別を提供する。例えば、以下に詳しく記載されるように、幾つかの例において、生物活性（例えば、増強されたプロテアーゼ活性）の領域の検出及び視覚化の精度の改善は、蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分を含む、レシオメトリックの活性化可能な細胞膜透過ペプチド（ＲＡＣＰＰ）の使用を介して達成される。以下に詳しく記載されるように、後者の１つの非限定的な例は、ＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０とも称される）である。
【００１４】
幾つかの例において、生物活性の領域の検出及び視覚化の精度の改善は、対象の特異的な生物活性又は構造を示す、画像化されている生物試料内の領域に相当する蛍光比率画像及び関心領域（ＲＯＩ）を生成及び表示するための、本明細書に開示される画像処理アルゴリズムの使用を介して達成される。幾つかの例において、ＲＯＩは蛍光比率画像から生成される。幾つかの例において、ＲＯＩは、蛍光比率画像及び／又は蛍光輝度画像の組み合わせから生成される。
【００１５】
幾つかの例において、生物活性の領域の検出及び視覚化の精度の改善は、より高度な区別を提供する特異的なレシオメトリック蛍光表示体、並びに、蛍光比率画像及びＲＯＩを生成し且つ表示するための開示された画像処理アルゴリズムの両方の使用を介して達成される。
【００１６】
開示されたレシオメトリック画像処理技術を使用して検出且つ視覚化される生物活性の例は、限定されないが、イオン濃度の変化（例えば、Ｃａ２＋イオンの蓄積又は放出、或いは局所的なｐＨの変化）、又は興奮性細胞、増強されたプロテアーゼ活性の領域、或いはそれらの任意の組み合わせの膜間電圧の変化を含む。幾つかの例において、検出且つ視覚化される生物活性は、様々な疾患状態、例えば関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、乳癌、前癌、悪性組織、凝結（血液凝固）、炎症、又はそれらの任意の組み合わせと相関される。
【００１７】
幾つかの例において、開示された画像化及び画像処理方法は、リアルタイムでＲＯＩを視覚化するために使用される。幾つかの例において、これらの方法は手術中に使用される。幾つかの例において、これらの方法は、組織の外科切除を誘導するために使用される。幾つかの例において、切除される組織は癌組織である。幾つかの例において、これらの方法は内視鏡処置中に使用される。幾つかの例において、これらの方法は、内視鏡の位置決めを誘導するために、或いは、最小限に侵襲的な外科手術において組織の外科切除を誘導するために使用される。幾つかの例において、これらの方法はエクスビボでＲＯＩを視覚化するために使用される。上述のように、幾つかの例において、これらの方法は、蛍光ドナー及び蛍光アクセプター（即ち、レシオメトリックＡＣＰＰ）を含む、活性化可能な細胞膜透過ペプチド（ＡＣＰＰ）と共に使用される。幾つかの例において、これらの方法はＳＤＭ−２５と共に使用される。幾つかの例において、これらの方法は、乳癌患者において、又はこれらの患者から除去された組織と共に使用される。
【００１８】
定義
【００１９】
別段の定めのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書及び添付の請求項で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に指示されない限り、複数の言及も含む。「又は」への任意の言及は、別段の定めがない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００２０】
本明細書で使用されるように、用語「生物試料」は、限定されないが、培養細胞サンプル、初代細胞サンプル（例えば、個々の細胞を懸濁液へと放出されるために細胞外マトリックスが消化又は溶解された組織サンプル）、血液サンプル又はその分画、エクスビボ組織サンプル（例えば、生検サンプル、又は外科切除サンプル）、インビボの組織サンプル（例えば、外科手術中に露出された腫瘍組織又は周辺組織）などを含む。生物試料は、様々な生物体、例えば原核生物、真核生物、菌類、植物、動物、又はヒトの何れかから集められてもよい。幾つかの例において、生物試料は患者サンプルである。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語「生物活性」は、限定されないが、イオン濃度又は輸送活性の変化（例えば、Ｃａ２＋イオンの蓄積又は放出、又は局所的なｐＨの変化）、興奮性細胞の膜間電圧の変化、増強されたプロテアーゼ活性の領域、レシオメトリック蛍光表示体を使用してモニタリングされ得る他の生化学物質又は生理学的プロセスの変化、或いはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「レシオメトリック蛍光表示体」（又は「レシオメトリック蛍光プローブ」）及び「レシオメトリック蛍光画像化」という用語は、従来のレシオメトリック表示体（例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースのプローブ）及び関連する画像化技術の使用だけでなく、例えば２つ以上のフルオロフォアの組み合わせが使用される例（例えばＦＲＥＴペアリングが可能でないフルオロフォア）を含むように、広く使用され、１つのフルオロフォア内部統制として機能し、及び少なくとも１つの他のフルオロフォアは対象の生物活性に対する表示体として機能する。幾つかの例において、レシオメトリック蛍光表示体は、例えばインビボの画像化用途に使用するための造影剤である。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「励起波長」は、蛍光表示体（例えばフルオロフォア又は色素分子）を励起し且つ蛍光を生成するために使用される、光の波長を指す。励起波長は典型的に単一波長（例えば６２０ｎｍ）として特定されるが、本明細書は特定波長で集中される波長帯又は励起フィルタバンドパスを指すと、当業者によって理解される。幾つかの例において、特定の励起波長の光は、±２ｎｍ、±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±２０ｎｍ、±４０ｎｍ、±８０ｎｍ、又はそれ以上の特定の波長の光を含む。幾つかの例において、使用される励起波長は、蛍光表示体の最大吸収ピークと一致する、又は一致しない場合がある。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「発光波長」は、適切な波長の光による励起に際して蛍光表示体（例えばフルオロフォア又は色素分子）により発せられた光の波長を指す。発光波長は典型的に単一波長（例えば６７０ｎｍ）として特定されるが、本明細書は特定波長で集中される波長帯又は発光フィルタバンドパスを指すと、当業者によって理解される。幾つかの例において、特定の発光波長の光は、±２ｎｍ、±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±２０ｎｍ、±４０ｎｍ、±８０ｎｍ、又はそれ以上の特定の光を含む。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「リアルタイム」は、例えば罹患組織の除去を誘導するために外科手術中に外科医によって情報が使用されるように、蛍光画像データが処理され、獲得され、及び／又は表示される割合を指す。一般的に、用語「リアルタイム」は、本明細書で使用されるように、少なくとも０．５Ｈｚ、少なくとも１Ｈｚ、少なくとも５Ｈｚ、少なくとも１０Ｈｚ、少なくとも２０Ｈｚ、少なくとも３０Ｈｚ、少なくとも４０Ｈｚ、少なくとも５０Ｈｚ、少なくとも６０Ｈｚ、少なくとも７０Ｈｚ、少なくとも８０Ｈｚ、少なくとも９０Ｈｚ、又は少なくとも１００Ｈｚの画像の取得、処理、及び／又は表示に対する更新レートを指す。
【００２６】
本明細書で使用されるような用語「手術」は、物理的介入により組織中の効果を調べ、操作し、変化させ、又は引き起こすために使用される任意の方法を指す。これらの方法は、限定されないが、観血手術、内視鏡手術、腹腔鏡手術、低侵襲性手術、ロボットによる手術、及び、腫瘍切除、癌組織アブレーション、癌進行度分類、癌診断、リンパ節病期分類、前哨リンパ節検出、又は癌処置などの、癌組織に影響を与える任意の処置を含む。
【００２７】
本明細書に使用されるような用語「誘導された手術」は、外科医が手術を誘導するために造影剤を利用する任意の外科手術を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるような用語「癌」は、人体における細胞の制御できない成長又は増殖に関与する任意の疾患を指す。癌は更に、細胞が元の部位から遊走して離れた部位に拡散する（即ち、転移）能力によって特徴づけられる。癌は、肉腫、細胞腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、又は胚細胞腫瘍であり得る。癌は、肺、乳房、卵巣、大腸、食道、直腸、骨、前立腺、脳、膵臓、膀胱、腎臓、肝臓、血液細胞、リンパ節、及び胃を含むがこれらに限定されない様々な組織に生じる場合がある。
【００２９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、自然発生のアミノ酸ポリマーの他、１つ以上のアミノ酸残基が非自然発生のアミノ酸（例えばアミノ酸アナログ）であるアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語は、完全長のタンパク質（即ち、高原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含しており、アミノ酸残基は共有結合のペプチド結合によって結合される。
【００３０】
アミノ酸配列が本明細書で提供される場合、配列のＬ−、Ｄ−、又はβ−アミノ酸の変形も、レトロアイソフォーム、逆位アイソフォーム、及びレトロ−逆位アイソフォームと同様に考慮される。ペプチドはまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する自然発生のアミノ酸の人工的な化学薬品アナログであるアミノ酸ポリマーの他、自然発生のアミノ酸ポリマーを含む。加えて、この用語は、ペプチド結合、又は他の修飾結合によって結合されたアミノ酸に適用される（例えば、ペプチド結合は、α−エステル、β−エステル、チオアミド、ホスホンアミド、カルバマート、ヒドロキシラートなどにより置換され（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，  （１９８３）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：２６７−３５７を参照）、アミドは飽和アミンで置換される（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｋｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，４９６，５４２号、及びＫａｌｔｅｎｂｒｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｐ．  ９６９−９７０  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  １１ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，  ＥＳＣＯＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓなどを参照））。
【００３１】
用語「アミノ酸」は、自然発生及び合成のアミノ酸の他、自然発生のアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣薬を指す。自然発生のアミノ酸は、後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、Ｏ−リン酸化セリンと同様に、遺伝子コードによってコードされるものである。アミノ酸は、疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、無極性アミノ酸、及び荷電アミノ酸として分類される。疎水性アミノ酸は、小さな疎水性アミノ酸及び大きな疎水性アミノ酸を含む。小さな疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、及びそれらのアナログであり得る。大きな疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及びそれらのアナログであり得る。極性アミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、及びそれらのアナログであり得る。無極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、及びそれらのアナログであり得る。荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、又はそれらのアナログであり得る。アミノ酸アナログは、自然発生のアミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素を指し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドである。こうしたアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣薬は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが自然発生のアミノ酸と同様の様式で機能する構造を有する化学化合物を指す。アミノ酸はＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸の何れかである。
【００３２】
場合によっては、そのような保存的に修飾された変異体は、多形性変異体、異種間ホモログ、及び本発明のアレルを加えられ、且つそれらを除外しない。
【００３３】
レシオメトリック蛍光画像化
【００３４】
レシオメトリック蛍光画像化は、リアルタイムでの細胞内イオン濃度、細胞膜電圧、及び細胞内ｐＨ動態の測定を含む、様々な測定のために広範囲で使用されている。上述のように、レシオメトリック画像化技術は、蛍光発光波長の推移を観察すること、或いは、輝度の単純な変化のモニタリングではなくフルオロフォアの組み合わせの発光輝度を比較することにより、定量化に対する蛍光輝度測定の使用に固有の制限（例えば、蛍光表示体濃度の変動、励起光輝度又は異なる器機間の蛍光発光の収集及び検出の効率の変動、並びに、異なる形態、厚み、細胞組成、及び細胞外マトリックスを有する組織が原因のインビボの画像化に対する更なる困難など）の幾つかを解消する。
【００３５】
幾つかの例において、レシオメトリック蛍光表示体は、単一励起波長で励起され、且つ、特異的な生物活性の感知に際して、例えばイオンの結合又はプロテアーゼによる切断に際して蛍光発光波長の推移を示す、分子を含む。これらの例において、関連するレシオメトリック蛍光画像化技術は、単一励起波長の光で表示体を注入された生物試料を照らす工程、及び、蛍光比率画像を作成するために２つの異なる発光波長で（連続的に又は同時に）蛍光画像をキャプチャする工程を含む。
【００３６】
幾つかの例において、レシオメトリック蛍光表示体は、単一発光波長で蛍光を放ち、且つ、特異的な生物活性の感知に際して、例えばイオンの結合又はプロテアーゼによる切断に際して最大吸収における推移を示す、分子を含む。これらの例において、関連するレシオメトリック蛍光画像化技術は、２つの異なる励起波長の光で表示体を注入された生物試料を照らす工程、及び、蛍光比率画像を作成するために単一発光波長で蛍光画像をキャプチャする工程を含む。
【００３７】
幾つかの例において、「レシオメトリック蛍光表示体」は、２つ以上のフルオロフォアのセットを含み、そのうち１つは（例えば、染料濃度又はベースライン生物学的プロセスのモニタリングのための）内部統制として機能し、その他１つ以上は対象の生物活性の表示体として機能する。これらの例において、関連するレシオメトリック蛍光画像化技術は、２つ以上の異なる励起波長の光で２つ以上のフルオロフォアのセットを注入された生物試料を照らす工程、及び、１つ以上の蛍光比率画像を作成するために２つ以上の異なる発光波長で蛍光画像を連続的にキャプチャする工程を含む。
【００３８】
レシオメトリック蛍光表示体
【００３９】
様々なレシオメトリック蛍光表示体が、細胞内イオン濃度、細胞膜電圧、プロテアーゼ活性、及び他の生物学的プロセスをモニタリングするために開発されている。例は、限定されないが、カルシウム表示体Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−４Ｆ、Ｆｕｒａ−６Ｆ、Ｆｕｒａ−ＦＦ、及びＦｕｒａ−Ｒｅｄ（又は併用して使用されるＦｌｕｏ−３及びＦｕｒａ−Ｒｅｄ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）；ｐＨ表示体ＳＮＡＲＦ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、及びＢＣＥＣＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）；細胞膜偏光表示体Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−２−ＡＮＥＰＥＱ、ＪＣ−１、及びＪＣ−９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｊ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．Ｙ．  （１９９７），  “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈａｔ  ｕｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ”，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２６９−２７７も参照）；及び蛍光ドナーと蛍光アクセプターで標識されたレシオメトリック酵素基質、例えば、ＨＩＶ−１プロテアーゼ活性に対するレシオメトリック表示体（Ｊｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１），  “Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＦＲＥＴ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ”，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２７（４）：  １１０７−１１１４）、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−７及び他のマトリックスメタロプロテイナーゼ活性（Ｔ．  Ｊｉａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：１７８６７−１７８７２；  Ｓｃｈｅｒｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−７  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｎａｎｏｂｅａｃｏｎ”，  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ７（３）：１１８−１３１；  Ｏｌｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｉｎｔｅｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  １：３８２−３９３）、エラスターゼ活性（Ｗｈｉｔｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８５：２２５３２−２２５４１）、トロンビン活性（Ｗｈｉｔｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３），  “Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｒｅａｄｏｕｔ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５２，  ３２５−３３０）、及びカスパーゼ−３活性化（Ｍｉｚｕｋａｍｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  “Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅＬａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  Ｕｓ��ｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ”，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５３，  ３５６−３６０）を含む。
【００４０】
蛍光共鳴エネルギー転移に基づくレシオメトリック蛍光表示体
【００４１】
幾つかのレシオメトリック蛍光表示体は、対象の特異的な生物活性への応答性を与えるために蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）機構に依存する。プロテアーゼ活性をモニタリングするための蛍光発生酵素基質は、例えば、ＦＲＥＴベースの機構に頻繁に依存し、且つ、一端ではフルオロフォア（例えば蛍光ドナー）で、及び他端では蛍光消光剤（例えば蛍光アクセプター）で標識される短いペプチド配列又はリンカー（例えば、特定のプロテアーゼに対する固有の基質配列の全て又は一部に相当するペプチド配列）を典型的に含む、蛍光表示体の１つのクラスである。蛍光消光剤は、それ自体でフルオロフォアである、又はそうではない場合もある。無傷のＦＲＥＴベースのプローブにおいて、蛍光ドナー及び蛍光消光剤は、互いに隣接した状態、例えば、典型的には約１００Å未満を離間されて保持される。蛍光ドナーの発光スペクトルが実質的に蛍光消光剤の吸収スペクトルと重複することを要求するのに加えて、蛍光共鳴エネルギー転移プロセスの効率は、分離距離Ｉに対して極めて敏感であり、１／Ｒ６に比例する。プロテアーゼによりドナー及び消光剤を分離するリンカーの切断は、エネルギー転移プロセスの効率を抑え、その結果、蛍光ドナー発光輝度の増加、及び蛍光アクセプター発光の減少又は削減がもたらされる（レシオメトリックプローブに典型的であるように、アクセプターがフルオロフォアである場合）。蛍光輝度の変化はモニタリングされ（レシオメトリックプローブに関するドナー及びアクセプターの両方に対する発光波長にて）、プロテアーゼ活性に相関される。
【００４２】
レシオメトリック活性化可能な細胞膜透過ペプチド（ＲＡＣＰＰ）
【００４３】
活性化可能な細胞膜透過ペプチド（ＡＣＰＰ；「選択的な送達分子」（ＳＤＭ）とも称される）は、インビボでプロテアーゼ活性の部位への蛍光染料又は他の造影剤を含む様々なカーゴ（ｃａｒｇｏｓ）の標的送達が可能な分子である（Ｗｈｉｔｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３），  “Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｒｅａｄｏｕｔ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５２，  ３２５−３３０；  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ２０１３／０１９６８１  Ａ２）。ＡＣＰＰは、カーゴに結合されるポリカチオン系細胞膜透過ペプチド、及びプロテアーゼ切断可能なリンカーを有するポリアニオン系抑制ドメインから成る。プローブ活性化及びカーゴの取込みは、プローブを接着形態に変換するポリアニオン及びポリカチオン系ドメインを接続する、リンカー配列の局所的なタンパク質分解に依存する。この方法は、切断されたプローブの蓄積を介した生組織における空間に局所的な酵素活性の検出を提供する。ＡＣＰＰは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、腫瘍におけるエラスターゼ、及びアテローム性動脈硬化及び脳損傷のトロンビン活性化を標的とすると以前に報告されている。
【００４４】
レシオメトリック活性化可能な細胞膜透過ペプチド（ＲＡＣＰＰ）は、リアルタイムでプロテアーゼ活性をモニタリングするためにＦＲＥＴ依存性発光のレシオメトリックな読み出しを提供するべく蛍光ドナー部分及び蛍光アクセプター部分を更に含み（Ｗｈｉｔｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３），  “Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｒｅａｄｏｕｔ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５２，  ３２５−３３０）、且つ、インビボの画像化に対して単一発光波長プローブを超える著しい利点を提供する、ＡＣＰＰである。例えば、ＡＣＰＰ内でのＣｙ５からＣｙ７へのＦＲＥＴは、切断の部位での対比を生成するためにウォッシュアウトの必要性を排除する他、単一波長発光帯域での輝度測定を混乱させる多くの非酵素的な因子を排除することによって、輝度に基づくＡＣＰＰ又は蛍光脱消光（ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブにわたる有意な改善を提供する。他の利点は、プローブの酵素的切断に際して生じる大きな分光学的な推移、及び、改善された空間分解能を与えるために切断の部位にて局在化されたままである接着性生成物への拡散性の基質の転換を含む。ヘアピン構造は、効率的なＦＲＥＴを隔日にする距離でＣｙ５及びＣｙ７（又は他の蛍光ドナー−アクセプターの対）を保持する。プローブの切断は、感知されている基質配列又は酵素にかかわらず、発光比率における大きな変化を引き起こす（Ｗｈｉｔｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）により報告される、Ｃｙ５／Ｃｙ７で標識されたトロンビン活性化ＲＡＣＰＰの場合に、およそ４０倍）。
【００４５】
幾つかの実施形態において、本開示の画像化方法に利用されたＲＡＣＰＰ（又はレシオメトリックＳＤＭプローブ）は、以下の構造を持つ式（Ｉ）の分子を含み：
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−［ｃＢ−ＤＢ］式（Ｉ）
式中、
Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり；
Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり；
Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり；
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸を含み；
Ｍは高分子であり；及び
ＤＡ及びＤＢは、蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及びここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＢの任意のアミノ酸残基に結合される。
【００４６】
幾つかの実施形態において、本開示の画像化方法に利用されたＲＡＣＰＰ（又はレシオメトリックＳＤＭプローブ）は、以下の構造を持つ式（ＩＩ）の分子を含み：
［ＤＡ−ｃＡ］−Ａ−［ｃＭ−Ｍ］−Ｘ−Ｂ−Ｙ−［ｃＢ−ＤＢ］式（ＩＩ）
式中、
Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーであり；
Ｙはリンカーであり；
Ａは、５〜２０の酸性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり；
Ｂは、５〜２０の塩基性アミノ酸残基を含む配列を有するペプチドであり；
ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１つのアミノ酸を含み；
Ｍは高分子であり；及び
ＤＡ及びＤＢは、蛍光共鳴エネルギー転移を受けることが可能なアクセプター蛍光部分及びドナー蛍光部分の対であり；及びここで、［ｃＭ−Ｍ］はＡ又はＸ上の任意の位置に結合され、［ＤＡ−ｃＡ］はＡの任意のアミノ酸残基に結合され、［ｃＢ−ＤＢ］はＹに結合される。
【００４７】
部分Ａ
【００４８】
幾つかの実施形態において、Ａは、２〜２０の酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドである。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約２〜約２０の酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約５〜約２０の酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜９の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜８の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜７の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、６の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、７の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、８の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、９の酸性アミノ酸を含む配列を有する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約２〜約２０の連続する酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約５〜約２０の連続する酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜９の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜８の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜７の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、６の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、７の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、８の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、９の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。
【００５０】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、約２〜約２０の酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、約５〜約２０の酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５〜９の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５〜８の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５〜７の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、６の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、７の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、８の酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、９の酸性アミノ酸を含む配列を有する。
【００５１】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、約２〜約２０の連続する酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、約５〜約２０の連続する酸性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５〜９の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５〜８の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５〜７の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、５の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、６の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、７の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、８の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩から選択される、９の連続する酸性アミノ酸を含む配列を有する。
【００５２】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約２〜約２０のグルタミン酸塩を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約５〜約２０のグルタミン酸塩を含む。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜９のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜８のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜７のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、６のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、７のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、８のグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、９のグルタミン酸塩を含む配列を有する。
【００５３】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約２〜約２０の連続するグルタミン酸塩を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ａは約５〜約２０の連続するグルタミン酸塩を含む。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜９の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜８の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５〜７の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、５の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、６の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、７の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、８の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、Ａは、９の連続するグルタミン酸塩を含む配列を有する。
【００５４】
幾つかの実施形態において、部分Ａは、５の連続するグルタミン酸塩（即ち、ＥＥＥＥＥ又はｅｅｅｅｅ）を含む。幾つかの実施形態において、部分Ａは、９の連続するグルタミン酸塩（即ち、ＥＥＥＥＥＥＥＥＥ又はｅｅｅｅｅｅｅｅｅ）を含む。
【００５５】
酸性部分Ａは、酸性でないアミノ酸を含み得る。酸性部分Ａは、負電荷を帯びた部分などの他の部分を含み得る。本明細書に開示される選択的な送達分子の実施形態において、酸性部分Ａは、アミノ酸を含まない生理的ｐＨにて約２〜約２０の負電荷を好ましくは有している、負電荷を帯びた部分である。
【００５６】
幾つかの実施形態において、部分Ａの負電荷の量は、部分Ｂの正電荷の量とほぼ同じである。幾つかの実施形態において、部分Ａの負電荷の量は、部分Ｂの正電荷の量と同じではない。幾つかの実施形態において、組織取込みの改善は、部分Ａの負電荷の量が部分Ｂの正電荷の量と同じでない選択的な送達分子において見られる。幾つかの実施形態において、溶解度の改善は、部分Ａの負電荷の量が部分Ｂの正電荷の量と同じでない部分選択的な送達分子において観察される。幾つかの実施形態において、より速い組織取込みは、部分Ａの負電荷の量が部分Ｂの正電荷の量と同じでない選択的な送達分子において見られる。幾つかの実施形態において、より大きな組織取込みは、部分Ａの負電荷の量が部分Ｂの正電荷の量と同じでない選択的な送達分子において見られる。
【００５７】
部分ＡはＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸の何れかである。本発明の実施形態において、Ｄ−アミノ酸は、バックグラウンドのペプチダーゼ又はプロテアーゼによる免疫原性及び非特異性の切断を最小化するために好ましい。
【００５８】
部分Ａは、例えばヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、又は他の非標準アミノ酸などの、非標準アミノ酸を含み得ることが理解される。部分Ａは、例えばメチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化形態など）、アセチル化アミノ酸、アミノ化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は他の修飾アミノ酸などの、翻訳後修飾されたアミノ酸を含む、修飾アミノ酸を含み得る。部分Ａはまた、非ペプチド結合により結合される部分、及び非アミノ酸部分により、又は非アミノ酸部分へと結合されるアミノ酸を含む、ペプチド模倣部分を含み得る。
【００５９】
本明細書に開示される選択的な送達分子は、Ａがアミノ末端にある、又はＡがカルボキシ末端にある、即ちペプチド結合の何れかの配向が許容可能である場合に、有効である。
【００６０】
部分Ｂ
【００６１】
幾つかの実施形態において、Ｂは、５〜１５の塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドである。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約２０の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約１２の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約９の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約８の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは９の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは８の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは７の塩基性アミノ酸を含む。
【００６２】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約２０の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約１２の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約９の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約８の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは９の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは８の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは７の連続する塩基性アミノ酸を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約５〜約２０の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約５〜約１２の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約７〜約９の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約７〜約８の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、９の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、８の塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、７の塩基性アミノ酸を含む。
【００６４】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約５〜約２０の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約５〜約１２の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約７〜約９の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、約７〜約８の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、９の連続する塩基性アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンから選択される、８の連続する塩基性アミノ酸を含む。
【００６５】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約２０のアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約１２のアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約９のアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約８のアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは９のアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは８のアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは７のアルギニンを含む。
【００６６】
幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約２０の連続するアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約５〜約１２の得アルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約９の連続するアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは約７〜約８の連続するアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは９の連続するアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは８の連続するアルギニンを含む。幾つかの実施形態において、ペプチド部分Ｂは７の連続するアルギニンを含む。
【００６７】
塩基性部分Ｂは、塩基性でないアミノ酸を含み得る。塩基性部分Ｂは、正電荷を帯びた部分などの他の部分を含み得る。実施形態において、塩基性部分Ｂは、アミノ酸を含まない、生理的ｐＨで約５〜約２０の正電荷を好ましくは有している、正電荷を帯びた部分である。幾つかの実施形態において、部分Ａの負電荷の量は、部分Ｂの正電荷の量とほぼ同じである。幾つかの実施形態において、部分Ａの負電荷の量は、部分Ｂの正電荷の量と同じではない。
【００６８】
部分ＢはＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸の何れかである。本発明の実施形態において、Ｄ−アミノ酸は、バックグラウンドのペプチダーゼ又はプロテアーゼによる免疫原性及び非特異性の切断を最小化するために好ましい。オリゴ−Ｄ−アルギニン配列の細胞取込みは、オリゴ−Ｌ−アルギニンのもの以上に優れていると知られている。
【００６９】
部分Ｂは、例えばヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、又は他の非標準アミノ酸などの、非標準アミノ酸を含み得ることが理解される。部分Ｂは、例えばメチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化形態など）、アセチル化アミノ酸、アミノ化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は他の修飾アミノ酸などの、翻訳後修飾されたアミノ酸を含む、修飾アミノ酸を含み得る。部分Ｂはまた、非ペプチド結合により結合される部分、及び非アミノ酸部分により、又は非アミノ酸部分へと結合されるアミノ酸を含む、ペプチド模倣部分を含み得る。
【００７０】
Ｘがプロテアーゼによって切断可能なペプチドである実施形態において、Ｘの切断により作成された新たなアミノ末端が、Ｂに既に存在している正電荷に添加される追加の正電荷に寄与するように、ＢのＮ末端にＸのＣ末端を結合することが好ましい。
【００７１】
抱合基（ｃ）
【００７２】
幾つかの実施形態において、カーゴ（例えばＤＡ及びＤＢ）及び高分子担体（Ｍ）は、Ａ−Ｘ−Ｂに間接的に結合される。
【００７３】
幾つかの実施形態において、カーゴ（例えばＤＡ及びＤＢ）及び高分子担体（Ｍ）は、抱合基（ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭ）によってＡ−Ｘ−Ｂに間接的に結合される。幾つかの実施形態において、カーゴ（例えばＤＡ及びＤＢ）及び高分子担体（Ｍ）は、反応型抱合基（ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭ）によってＡ−Ｘ−Ｂに間接的に結合される。幾つかの実施形態において、カーゴ（例えばＤＡ及びＤＢ）及び高分子担体（Ｍ）は、直交性反応型抱合基（ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭ）によってＡ−Ｘ−Ｂに間接的に結合される。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭ各々は独立してアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して０〜１０のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して１つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して２つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して３つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して４つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して５つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して６つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して７つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して８つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して９つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して１０のアミノ酸を含む。
【００７４】
幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して誘導体化アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、多数のカーゴ（Ｄ）は誘導体化アミノ酸抱合基に結合される。
【００７５】
幾つかの実施形態において、抱合基は受容体リガンドを含む。
【００７６】
幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、自然発生のアミノ酸又は非自然発生のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−アミノ酸、Ｌアミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又はγ−アミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸、遊離アミン基を含有する任意のアミノ酸、Ｎ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸、及び、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−システイン、Ｄ−グルタミン酸塩、リジン、及びパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンを含む。幾つかの実施形態において、ｃＢは遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＢはＤ−システインを含む。幾つかの実施形態において、ｃＡはＮ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡはＤ−グルタミン酸塩を含む。幾つかの実施形態において、ｃＡはリジンを含む。幾つかの実施形態において、ｃＭは、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｃＭはパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンを含む。
【００７７】
幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、自然発生のアミノ酸又は非自然発生のアミノ酸から選択される。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−アミノ酸、Ｌアミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又はγ−アミノ酸から選択される。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸、遊離アミン基を含有する任意のアミノ酸、Ｎ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸、及び、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＡ、ｃＢ、及びｃＭは各々独立して、Ｄ−システイン、Ｄ−グルタミン酸塩、リジン、及びパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンから選択される。幾つかの実施形態において、ｃＢは遊離チオール基を持つ任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＢはＤ−システインである。幾つかの実施形態において、ｃＡはＮ末端アミン基を持つ任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＡはＤ−グルタミン酸塩である。幾つかの実施形態において、ｃＡはリジンである。幾つかの実施形態において、ｃＭは、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンの基との反応に際してオキシム又はヒドラゾンの結合を形成可能な側鎖を有する任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、ｃＭはパラ−４−アセチルＬ−フェニルアラニンである。
【００７８】
造影剤（カーゴ）
【００７９】
幾つかの実施形態において、選択的な送達分子のカーゴ部分（Ｄ）は、造影剤、例えばフルオロフォア又は染料を含む。幾つかの実施形態において、造影剤は蛍光部分である。幾つかの実施形態において、蛍光部分は、蛍光タンパク質、蛍光ペプチド、蛍光染料、蛍光体、又はそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態において、造影剤は、同じ選択的な送達分子に結合される蛍光部分（例えばＤＡ及びＤＢ）の組み合わせを含む。
【００８０】
全ての蛍光部分は、用語「蛍光部分」内に包含される。本明細書で提供される蛍光部分の特異的な例は例示的なものであり、本明細書に開示される標的分子との使用のために蛍光部分を限定するものと意味するものではない。
【００８１】
蛍光染料の例は、限定されないが、キサンテン（例えばローダミン、ロドール、及びフルオレセイン、並びにそれらの誘導体）；ビマン；クマリン及びそれらの誘導体（例えばウンベリフェロン及びアミノメチルクマリン）；芳香族アミン（例えばダンシル；スクアリン酸染料）；ベンゾフラン；蛍光シアニン；インドカルボシアニン（ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅｓ）；カルバゾール；ジシアノメチレンピラン；ポリメチン；オキサベンズアントラン；キサンテン；ピリリウム；カルボスチル（ｃａｒｂｏｓｔｙｌ）；ペリレン；アクリドン；キナクリドン；ルブレン；アントラセン；コロネン；フェナントレセン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｃｅｎｅ）；ピレン；ブタジエン；スチルベン；ポルフィリン；フタロシアニン；ランタニド金属キレート錯体；希土類金属キレート錯体；及びそのような染料の誘導体を含む。
【００８２】
フルオレセイン染料の例は、限定されないが、５−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアン酸塩、フルオレセイン−６−イソチオシアン酸塩、及び６−カルボキシフルオレセインを含む。
【００８３】
ローダミン染料の例は、限定されないが、テトラメチルローダミン６−イソチオシアン酸塩、５−カルボキシテトラメチルローダミン、５−カルボキシロドール誘導体、テトラメチル及びテトラエチルローダミン、ジフェニルジメチル及びジフェニルジエチルローダミン、ジナフチルローダミン、ローダミン１０１スルホニルクロリド（ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）の商品名で販売）を含む。
【００８４】
シアニン染料の例は、限定されないが、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ  Ｄｙｅ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＩＲ  Ｄｙｅ８００ＣＷ、ＩＣＧを含む。
【００８５】
蛍光ペプチドの例は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はＧＦＰの誘導体（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、Ｙｐｅｔ）を含む。
【００８６】
幾つかの実施形態において、造影剤は、近赤外線（近ＩＲ）画像化用の近赤外線フルオロフォア、ルシフェラーゼ（ホタル、細菌、又は腔腸動物）、又は生物発光イメージング用の他の発光分子、或いは超音波用のペルフルオロカーボン充填ベシクルである。
【００８７】
好ましい実施形態において、本開示のＲＡＣＣＰ又はレシオメトリックＳＤＭは、蛍光ドナー−アクセプターの対で標識される。適切な蛍光ドナー−アクセプターの対の例は、限定されないが、フルオレセイン／ローダミン、フルオレセイン／Ｃｙ５、ローダミン／Ｃｙ５、Ｃｙ５／Ｃｙ７、Ｃｙ５／ＩＲ  Ｄｙｅ７５０、Ｃｙ５／ＩＲ  Ｄｙｅ８００、Ｃｙ５／ＩＣＧなどを含む。Ｃｙ５及びＣｙ７の長波長がインビボの画像化に理想的であることから、Ｃｙ５及びＣｙ７は、好ましい蛍光ドナー−アクセプターの対の一例を提供し、そこでは、励起及び発光波長が、内因的なヘムの強い吸収度を回避するべく十分に６００ｎｍより上でなければならない。Ｃｙ５／Ｃｙ７ドナー−アクセプターの対に対して、例えば、（Ｃｙ５励起に対して）約６１０ｎｍ〜６３０ｎｍの波長帯での光による励起、（Ｃｙ５発光に対して）約６６０ｎｍ〜７２０ｎｍ及び（Ｃｙ７発光に対して）約７６０ｎｍ〜８３０ｎｍの蛍光発光の収集は、正確なレシオメトリック測定の実行を可能としつつ、内因的なヘムによる干渉を回避する。
【００８８】
高分子担体（Ｍ）
【００８９】
用語「担体」は、血漿内半減期、溶解度、又は生体分布を調節する不活性分子を意味する。幾つかの実施形態において、担体は、本明細書に開示される選択的な送達分子の血漿内半減期を調節する。幾つかの実施形態において、担体は、本明細書に開示される選択的な送達分子の溶解度を調節する。幾つかの実施形態において、担体は、本明細書に開示される選択的な送達分子の生体分布を調節する。
【００９０】
幾つかの実施形態において、担体は、非標的細胞又は組織によって選択的な送達分子の取込みを減少させる。幾つかの実施形態において、担体は、軟骨への選択的な送達分子の取込みを減少させる。幾つかの実施形態において、担体は、標的組織に比べて関節への選択的な送達分子の取込みを減少させる。
【００９１】
幾つかの実施形態において、担体は、標的細胞又は組織によって選択的な送達分子の取込みを増大させる。幾つかの実施形態において、担体は、標的組織に比べて肝臓への選択的な送達分子の取込みを減少させる。幾つかの実施形態において、担体は、腎臓への選択的な送達分子の取込みを減少させる。幾つかの実施形態において、担体は癌組織への取込みを増強する。幾つかの実施形態において、担体はリンパ管及び／又はリンパ節への取込みを増強する。
【００９２】
幾つかの実施形態において、担体は糸球体濾過の減少により血漿内半減期を増大させる。幾つかの実施形態において、担体は、代謝又はプロテアーゼ分解の増加又は減少により血漿内半減期を調節する。幾つかの実施形態において、担体は、腫瘍脈管構造の増強された浸透性及び保持（ＥＰＲ）により腫瘍取込みを増大させる。幾つかの実施形態において、担体は選択的な送達分子の水溶解度を増大させる。
【００９３】
幾つかの実施形態において、任意のＭが独立して、Ａ、Ｂ、又はＸに直接又は間接的に（例えばｃＭを介して）結合される。幾つかの実施形態において、任意のＭが独立して、ｎ−末端ポリグルタミン酸塩にてＡに結合される。幾つかの実施形態において、任意のＭが独立して、共有結合によってＡ（又はｎ−末端ポリグルタミン酸塩）に結合される。幾つかの実施形態において、任意のＭが独立して、ｃ−末端ポリアルギニンにてＢに結合される。幾つかの実施形態において、任意のＭが独立して、共有結合によってＢ（又はｃ−末端ポリアルギニン）に結合される。幾つかの実施形態において、任意のＭが独立して、ＸとＡの間、ＸとＢの間、ＢとＣ／Ｎ末端の間、又はＡとＣ／Ｎ末端のリンカーに直接又は間接的に結合される。幾つかの実施形態において、共有結合は、エーテル結合、チオエテール結合、アミン結合、アミド結合、オキシム結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、又は炭素−硫黄結合を含む。
【００９４】
幾つかの実施形態において、Ｍは、タンパク質、合成又は天然高分子、又はデンドリマーから選択される。幾つかの実施形態において、Ｍは、デキストラン、ＰＥＧポリマー（例えばＰＥＧ  ５ｋＤａ、ＰＥＧ  １２ｋＤａ、ＰＥＧ  ２０ｋＤａ、ＰＥＧ  ３０ｋＤａ、及びＰＥＧ  ４０ｋＤａ）、アルブミン、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００９５】
幾つかの実施形態において、ＭはＰＥＧポリマーである。幾つかの例において、ＰＥＧは多分散又は単分散化合物である。幾つかの例において、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズと分散度を特徴として、材料の様々な分子量の分散分布を含む。他の例において、ＰＥＧは、分子の１つのサイズを含む単分散化合物である。
【００９６】
幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、又は１００，０００Ｄａである。
【００９７】
幾つかの実施形態において、Ｍは、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、又は１００，０００Ｄａの分子重量を有する。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約６００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約７００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約８００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約９００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１１００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１２００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１３００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１４００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１４５０Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１６００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１７００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１８００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１９００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２１００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２２００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２３００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２４００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２６００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２７００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２８００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２９００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３２５０Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３３５０Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３７５０Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４２５０Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４６００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４７５０Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約５０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約５５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約６０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約６５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約７０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約７５００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約８０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１００００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１２０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約２００００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約３５０００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約４００００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約５００００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約６００００Ｄａである。幾つかの例において、Ｍの分子量は約１０００００Ｄａである。
【００９８】
幾つかの実施形態において、Ｍの平均分子量は５０〜７０ｋＤである。
【００９９】
幾つかの実施形態において、Ｍは別個のＰＥＧであり、ここで、別個のＰＥＧは１より多くの繰り返しエチレンオキシド単位を含む高分子ＰＥＧである。幾つかの例において、別個のＰＥＧ（ｄＰＥＧ）は、２〜６０、２〜５０、又は２〜４８の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４２、４８、又は５０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約２つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約３つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約４つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約５つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約６つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約７つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約８つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約９つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１１以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１２以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１３以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１４以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１５以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１６以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１７以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１８以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約１９以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約２０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約２２以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約２４以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約２６以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約２８以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約３０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約３５以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約４０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約４２以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約４８以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。幾つかの例において、ｄＰＥＧは約５０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ｄＰＥＧは、段階的な方法において純粋な（例えば、約９５％、９８％、９９％、又は９９．５％）出発材料から単一の分子量化合物として合成される。場合によっては、ｄＰＥＧは、平均分子量ではなく特定の分子量を有する。場合によっては、本明細書に記載されるｄＰＥＧは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，  ＬＭＤからのｄＰＥＧである。
【０１００】
幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はアルブミンに抱合する。特定の例において、アルブミンは、標準生理条件下で糸球体濾液から除外される。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子は、アルブミンとの共有結合の抱合体を形成可能なマレイミドなどの反応基を含む。アルブミンを含む選択的な送達分子は結果として、切断依存性様式で腫瘍中の切断された選択的な送達分子の蓄積の増強をもたらす。幾つかの実施形態において、アルブミン抱合体には良好な薬物動態特性がある。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ５００Ｄａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ１ｋＤａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ２ｋＤａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ５ｋＤａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ１０ｋＤａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ１２ｋＤａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はＰＥＧ２０ｋＤａポリマーに抱合する。幾つかの実施形態において、３０ｋＤのＰＥＧ抱合体には遊離ペプチドと比較して長い半減期があった。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子は、肝臓及び腎臓のクリアランスを有する２０−４０ｋＤのＰＥＧポリマーに抱合する。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はデキストランに抱合する。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子は７０ｋＤａのデキストランに抱合する。幾つかの実施形態において、分子量の混合物であるデキストラン抱合体は、再生可能に合成及び精製するのが困難である。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、選択的な送達分子はストレプトアビジンに抱合する。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、選択的な送達分子は、第５世代のＰＡＭＡＭデンドリマーに抱合する。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、担体はキャッピングされる。幾つかの実施形態において、担体のキャッピングは、薬物動態学を改善し、親水性の追加によって担体の細胞毒性を減少する。幾つかの実施形態において、キャップは、アセチル、スクシニル、３−ヒドロキシプロピオニル、２−スルホベンゾイル、グリシジル、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−１２から選択される。
【０１０６】
部分Ｘ（リンカー）
【０１０７】
幾つかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸から成るリンカーは、ペプチド配列Ａ（即ち、ペプチドＢの送達活性を阻害するよう設計された配列）及びペプチド配列Ｂを結合するために使用される。一般的に、ペプチドリンカーは、分子を結合する、或いは幾つかの最小距離又はそれらの他の空間的関連性を保存する以外に特異的な生物活性を持たない。しかし、リンカーの構成的アミノ酸は、フォールディング、総電荷、又は疎水性などの分子の幾つかの特性に影響を及ぼすように選択され得る。
【０１０８】
生細胞において、本明細書に開示される無傷の選択的な送達分子は、部分Ａの存在により細胞に入ることができない場合もある。故に、Ｘを切断するための厳密に細胞内のプロセスは、細胞への取込みを妨げる部分Ａが正常細胞における内酵素によって効果的に切断され、拾い上げられず且つそのような内酵素へのアクセスを得なかったため、正常細胞におけるＸを切断するのに効果がない。しかし、細胞が傷つけられ又は罹患される場合（例えば癌細胞、低酸素細胞、虚血性細胞、アポトーシス細胞、壊死細胞）、そのような内酵素は細胞から漏出し、Ａの切断が行われ、これにより部分Ｂ及び／又はカーゴの細胞への侵入が可能と成り、近隣の細胞への部分Ｂ及び／又はカーゴＤの標的送達を達成できる。幾つかの実施形態において、Ｘは細胞外液腔において切断される。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、毛細管が多くの場合に腫瘍及び他の損傷部位のまわりで漏出しやすいという事実は、高分子量の分子（例えば、約３０ｋＤａ以上の分子量）が間質区画に到達する能力を増強させる。幾つかの実施形態において、Ｘリンカーの切断が典型的に細胞外であるので、関連プロテアーゼを発現しないが発現細胞にすぐ隣接する細胞は、選択的な送達分子からカーゴを拾い上げる。幾つかの実施形態において、細胞表現型の異質性、及び可能な限り高い疑わしい細胞のパーセンテージを排除するという希望により、そのようなバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）標的化は、腫瘍の処置に有益である。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、Ｘは切断可能なリンカーである。幾つかの実施形態において、Ｘはプロテアーゼによって切断可能なリンカーである。幾つかの実施形態において、Ｘは細胞外プロテアーゼによって切断可能なリンカーである。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、リンカーは可撓性である。幾つかの実施形態において、リンカーは剛性である。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、リンカーは線形構造を含む。幾つかの実施形態において、リンカーは非線形構造を含む。幾つかの実施形態において、リンカーは分枝構造を含む。幾つかの実施形態において、リンカーは環状構造を含む。
【０１１３】
リンカーは、限定されないが、直鎖又は分枝鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、ペプチドリンカー、及びポリエーテルリンカーを含む。このようなリンカーには、アミド結合、スルフヒドリル結合、又はヘテロ機能性結合が随意にある。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約５〜約３０の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約６の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約８の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約１０の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約１２の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約１４の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約１６の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約１８の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約２０の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約２５の原子である。幾つかの実施形態において、Ｘは長さが約３０の原子である。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、リンカーは、共有結合によってペプチド部分Ａ（即ち、細胞取込みを妨げるペプチド配列）をペプチド部分Ｂ（即ち、送達配列）に結合する。幾つかの実施形態において、共有結合は、エーテル結合、チオエテール結合、アミン結合、アミド結合、オキシム結合、炭素−炭素結合、ヒドラゾン結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、又は炭素−硫黄結合を含む。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、Ｘはペプチド結合を含む。ペプチド結合はＬ−アミノ酸及び／又はＤ−アミノ酸を含む。本発明の実施形態において、Ｄ−アミノ酸は、バックグラウンドのペプチダーゼ又はプロテアーゼによる免疫原性及び非特異性の切断を最小化するために好ましい。オリゴ−Ｄ−アルギニン配列の細胞取込みは、オリゴ−Ｌ−アルギニンのもの以上に優れていると知られている。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、Ｘリンカーは、特定条件の存在下、又は特定の環境での切断のために設計されている。好ましい実施形態において、Ｘリンカーは生理学的条件下で切断可能である。そのようなＸリンカーの切断は、例えば、特定の病理学的シグナル、又は、カーゴ送達が望ましい細胞に関連する特定の環境によって増強され、或いはそれにより影響を受ける場合がある。特異的な酵素などの特異的な条件による切断のためのＸリンカーの設計は、そのような条件が得る特異的な位置への細胞取込みの標的化を可能にする。故に、選択的な送達分子が所望の細胞、組織、又は領域への細胞取込みの特異的な標的化を提供する、１つの重要な方法は、そのような標的細胞、組織、又は領域に近い条件によって切断されるリンカー部分Ｘの構想による。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、ＸはｐＨ感受性リンカーである。幾つかの実施形態において、Ｘは塩基性ｐＨ条件下で切断される。幾つかの実施形態において、Ｘは酸性ｐＨ条件下で切断される。幾つかの実施形態において、Ｘは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、又はそれらの組み合わせによって切断される。幾つかの実施形態において、Ｘは還元剤によって切断される。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、ＸはＭＭＰにより切断される。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の加水分解活性は、転移性腫瘍細胞の侵略的移動に関与する。特定の例において、ＭＭＰは炎症の部位の付近に見出される。特定の例において、ＭＭＰは、脳卒中（即ち、血流の減少後の脳損傷を特徴とする障害）の部位の付近に見出される。故に、本発明の特徴を持つ分子の取込みは、細胞外環境において活性ＭＭＰを有する特異的な細胞、組織、又は領域へのカーゴ（少なくとも１つのＤ部分）の細胞取込みを方向付けることが可能である。幾つかの実施形態において、Ｘリンカーは、アミノ酸配列ＰＬＧ−Ｃ（Ｍｅ）−ＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＰＬＧＬＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含み、これらはメタロプロテイナーゼ酵素ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−７（癌及び炎症に関与するＭＭＰ）によって切断される。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、癌細胞付近に見出されるように、Ｘは、タンパク分解酵素により、又は環境の減少によって切断される。そのような環境、又はそのような酵素は典型的に、正常細胞の付近には見出されない。
【０１２１】
幾つかの実施形態において、Ｘは、トロンビン及びカテプシンを含むがこれらに限定されないセリンプロテアーゼによって切断される。幾つかの実施形態において、Ｘは、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＷ、カテプシンＦ、カテプシンＡ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＺ、又は任意のそれらの組み合わせによって切断される。幾つかの実施形態において、ＸはカテプシンＫ及び／又はカテプシンＳによって切断される。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、Ｘは、低酸素症に苦しむ組織、又はその付近にて切断される。幾つかの実施形態において、低酸素症組織又はその付近での切断は、癌細胞及び癌組織、梗塞領域、及び他の低酸素症領域の標的化を可能とする。幾つかの実施形態において、Ｘはジスルフィド結合を含む。幾つかの実施形態において、ジスルフィド結合を含むリンカーは、低酸素症領域において優先的に切断され、それにより、そのような領域における細胞へのカーゴ送達を標的とする。低酸素症は、癌細胞に発光線及び化学療法への耐性を増加させ、血管新生を開始させると考えられている。例えば、漏出細胞又は壊死細胞の存在下での低酸素症の環境において、遊離チオール及び他の還元剤は、細胞外で利用可能になり、一方で、通常は細胞外の環境を酸化したまま維持するＯ２は、除去された定義による。幾つかの実施形態において、酸化還元反応の均衡におけるこの推移は、Ｘリンカー内のジスルフィド結合の減少及び切断を促進する。チオール−ジスルフィドの平衡を利用するジスルフィド結合に加えて、ヒドロキノンへの還元時に崩壊するキノンを含む結合は、低酸素症環境において切断されるよう設計されたＸリンカーにおいて使用される。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、Ｘは、壊死環境において切断される。壊死は多くの場合、Ｘリンカーの切断を誘発するために使用され得る酵素又は他の細胞含有物の放出を引き起こす。幾つかの実施形態において、壊死酵素（例えばカルパイン）によるＸの切断は、罹患細胞により、及び未だ完全に漏出していない近隣細胞によりカーゴの取り上げを可能にする。
【０１２４】
幾つかの実施形態において、Ｘは酸不安定性リンカーである。幾つかの実施形態において、Ｘはアセタール又はビニルエーテルの結合を含む。アシドーシスは、酸化的リン酸化反応から嫌気的解糖及び乳酸産生へのＷａｒｂｕｒｇシフトが原因で、損傷した又は低酸素症の組織の部位に観察される。幾つかの実施形態において、アシドーシスは、ヒスチジンによりＢ内のアルギニンの一部を置換することによりカーゴ取込みのトリガーとして使用され、これは単にｐＨ７より下のカチオンになる。
【０１２５】
本明細書に開示されるリンカーは、例えばヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、又は他の非標準アミノ酸などの、非標準アミノ酸を含み得ることが理解される。本明細書に開示されるリンカーは、例えばメチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化形態など）、アセチル化アミノ酸、アミノ化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は他の修飾アミノ酸などの、翻訳後修飾されたアミノ酸を含む、修飾アミノ酸を含み得る。本明細書に開示されるリンカーはまた、非ペプチド結合により結合される部分、及び非アミノ酸により、又は非アミノ酸部分へと結合されるアミノ酸を含む、ペプチド模倣部分を含み得る。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、リンカーＸは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＲＰＬＡＬＷＲＳ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、ＤＰＲＳＦＬ、ＰＰＲＳＦＬ、ＲＬＱＬＫＬ、及びＲＬＱＬＫ（Ａｃ）から選択されたアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＰＬＧＬＡＧを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＰＬＧ−Ｃ（Ｍｅ）−ＡＧを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＰＬＧｘＡＧを含み、ｘは任意のアミノ酸（自然発生又は非自然発生）である。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＲＰＬＡＬＷＲＳを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＥＳＰＡＹＹＴＡを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＤＰＲＳＦＬを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＰＰＲＳＦＬを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＲＬＱＬＫＬを含む。幾つかの実施形態において、リンカーＸはアミノ酸配列ＲＬＱＬＫ（Ａｃ）を含む。
【０１２７】
幾つかの実施形態において、リンカーＸは、以下から選択されたペプチドを含む：ＰＲ（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｉ）（Ｓ／Ｔ）、ここで、括弧中の文字は、示されたアミノ酸の何れか１つが配列のその位置にあることを示す；ＧＧＡＡＮＬＶＲＧＧ；ＳＧＲＩＧＦＬＲＴＡ；ＳＧＲＳＡ；ＧＦＬＧ；ＡＬＡＬ；ＦＫ；ＰＩＣ（Ｅｔ）Ｆ−Ｆ、ここで、Ｃ（Ｅｔ）は、Ｓ−エチルシステイン（チオールに結合されるエチル基を有するシステイン）を示し、「−」はこの配列及び続く配列の典型的な切断部位を示す；ＧＧＰＲＧＬＰＧ；ＨＳＳＫＬＱ；ＬＶＬＡ−ＳＳＳＦＧＹ；ＧＶＳＱＮＹ−ＰＩＶＧ；ＧＶＶＱＡ−ＳＣＲＬＡ；ｆ（Ｐｉｐ）Ｒ−Ｓ、ここで、「ｆ」はＤ−フェニルアラニンを示し、「Ｐｉｐ」はピペリジン−２−カルボン酸（ピペコリン酸、６員環を持つプロリンアナログ）を示す；ＤＥＶＤ；ＧＷＥＨＤＧ；ＲＰＬＡＬＷＲＳ、或いはそれらの組み合わせ。
【０１２８】
幾つかの実施形態において、Ｘは低酸素症条件下で切断される。幾つかの実施形態において、Ｘはジスルフィド結合を含む。幾つかの実施形態において、Ｘはキニンを含む。
【０１２９】
幾つかの実施形態において、Ｘは壊死条件下で切断される。幾つかの実施形態において、Ｘはカルパインによって切断可能な分子を含む。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、Ｘは６−アミノヘキサノイル、５−（アミノ）−３−オキサペンタノイル、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、Ｘはジスルフィド結合を含む。
【０１３１】
幾つかの実施形態において、リンカーはアルキルである。幾つかの実施形態において、リンカーはヘテロアルキルである。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、リンカーはアルキレンである。幾つかの実施形態において、リンカーはアルケニレンである。幾つかの実施形態において、リンカーはアルキニレンである。幾つかの実施形態において、リンカーはヘテロアルキレンである。
【０１３３】
「アルキル」基は、脂肪族炭化水素基を表す。アルキル基の部分は飽和アルキル又は不飽和のアルキルかもしれない。アルキル基は、構造によって、モノラジカル又はジラジカル（つまりアルキレン基）であり得る。
【０１３４】
「アルキル」部分は、１〜１０個の炭素原子を有し得る（本明細書ではいかなる場合も、「１〜１０」などの数的範囲は、指定された範囲の各々の整数を指し、例えば「１〜１０個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子、及び最大１０個の炭素原子から成り得ることを意味するが、本定義はまた、数の範囲が指定されない用語「アルキル」の発生を包含する）。アルキル基は１〜６の炭素原子を有する「低級アルキル」でもあり得る。本明細書に記載される化合物のアルキル基は、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」又は類似の名称として指定され得る。ほんの一例として、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、１〜４つの炭素原子がアルキル鎖に存在することを示し、即ち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、又はｔ−ブチルから選択される。典型的なアルキル基は、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニルなどを含む。
【０１３５】
特定の実施形態において、リンカーは環構造（例えばアリール）を含む。本明細書で使用されるように、用語「環」は、任意の共有結合性閉構造を指す。環は、例えば、炭素環（例えば、アリール及びシクロアルキル）、複素環（例えば、ヘテロアリール及び非芳香族複素環）、芳香族（例えば、アリール及びヘテロアリール）、並びに非芳香族（例えば、シクロアルキル及び非芳香族複素環）を含む。環は、随意に置換され得る。環は、単環式又は多環式であり得る。
【０１３６】
本明細書で使用されるように、用語「アリール」は、環を形成する原子の各々が炭素原子である芳香環を表す。アリール環は、５、６、７、８、９、又は９より多い炭素原子によって形成され得る。アリール基は、随意に置換され得る。アリール基の例は、フェニル、ナフタレニル、フェナントレニル、アントラセラニル、フルオレニル、及びインデニルを含むが、これらに限定されない。構造によっては、アリール基は、モノラジカル又はジラジカル（即ち、アリーレン基）となり得る。
【０１３７】
用語「シクロアルキル」は単環式又は多環式の非芳香族ラジカルを指し、ここで、環を形成する原子（即ち、骨格原子）の各々は炭素原子である。シクロアルキルは飽和されているか、又は部分的に不飽和でもよい。シクロアルキル基は、３〜１０の環原子を有する基を含む。シクロアルキルは、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルを含む。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、環はシクロアルカンである。幾つかの実施形態において、環はシクロアルケンである。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、環は芳香環である。「芳香族」という用語は平面環を指し、該平面環は、非局在化π−電子系を有し、このπ−電子系には４ｎ＋２πの電子が含まれ、ここでｎは整数である。芳香環は、５、６、７、８、９、又は９より多い原子から形成され得る。芳香族は、随意に置換され得る。用語「芳香族」は、炭素環式アリール（例えばフェニル）及び複素環式アリール（又は「ヘテロアリール」或いは「ヘテロ芳香族」）の基（例えばピリジン）の両方を含む。前記用語は、単環式又は縮合環の多環式（即ち、隣接する炭素原子の対を共有する環）の基を含む。
【０１４０】
幾つかの実施形態において、環は複素環である。用語「複素環」は、Ｏ、Ｓ、及びＮから各々が選択された１〜４のヘテロ原子を包含しているヘテロ芳香族及びヘテロ脂環式基を指し、ここで、各複素環基は、その環系の中に、前記基の環が２つの隣接したＯ又はＳ原子を包含していないという条件付きで、４〜１０の原子を有している。非芳香族複素環基は、それらの環系に３つの原子のみを有する基を含むが、芳香族複素環基は、それらの環系に少なくとも５つの原子を有していなければならない。複素環基は、ベンゾ縮合した環系を含む。３員複素環式基の例はアジリジニルである。４員環複素環式基の例は、アゼチジニル（アゼチジン由来）である。５員環複素環式基の例は、チアゾリルである。６員環複素環式基の例は、ピリジルであり、１０員環複素環式基の例は、キノリニルである。非芳香族複素環基の例は、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアセピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、３Ｈ−インドリル、及び、キノリジニルである。芳香族複素環基の例は、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。前述の基は、それらが可能な場合にＣ−付加又はＮ−付加であり得る。例えば、ピロール由来の基は、ピロール−１−イル（Ｎ−付加）又はピロール−３−イル（Ｃ−付加）である。更に、イミダゾールに由来する基は、イミダゾール−１−イル又はイミダゾール−３−イル（共にＮ付加）、或いはイミダゾール−２−イル、イミダゾール−４−イル、又はイミダゾール−５−イル（全てＣ付加）である。複素環基は、ベンゾ融合環系と、ピロリジン−２−オンなどの１又は２つのオキソ（＝Ｏ）部分で置換された環系とを含む。構造により、複素環基は、一端遊離基又は二端遊離基（即ち、ヘテロシクレン基）であり得る。
【０１４１】
幾つかの実施形態において、環は縮合される。用語「縮合」は、２つ以上の環が１つ以上の結合を共有する構造を指す。幾つかの実施形態において、環は二量体である。幾つかの実施形態において、環は三重体である。幾つかの実施形態において、環は置換される。
【０１４２】
用語「炭素環式」又は「炭素環式化合物」は、環を形成する原子の各々が炭素原子である、環を表す。炭素環は、アリールとシクロアルキルを含む。この用語は故に、炭素環を、環のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）が、炭素とは異なる少なくとも１つの原子（即ちヘテロ原子）を包含している複素環（「複素環式」）と区別する。複素環は、ヘテロアリールとヘテロシクロアルキルを含む。炭素環と複素環は、随意に置換され得る。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、リンカーＸはヘテロアルキルである。用語「随意に置換した」又は「置換した」は、言及された基が、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ６ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホン、アリールスルホン、シアノ、ハロ、Ｃ２−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８アシルオキシ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６フルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノを含むアミノ、及びそれらの保護誘導体から個々に及び独立して選択される、１以上の追加の基（複数可）により置換され得ることを意味する。例として、随意の置換基はＬｓＲｓであり、ここで各Ｌｓは単結合、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、又は−（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）−から独立して選択され、及び各Ｒｓは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、（Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル）、ヘテロアリール、アリール、及びＣ１−Ｃ６へテロアルキルから独立して選択される。随意に置換された非芳香族基は、１以上のオキソ（＝Ｏ）により置換され得る。上述の置換基の保護誘導体を形成する保護基は、当業者に既知である。
【０１４４】
幾つかの実施形態において、リンカーＸはゼロリンカーを含む。幾つかの例において、ゼロリンカーは共有結合を含む。幾つかの実施形態において、共有結合は、エーテル結合、チオエテール結合、アミン結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、又は炭素−硫黄結合を含む。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、リンカーＸは更に二機能性リンカーを含む。幾つかの例において、二機能性リンカーは、第１の分子（例えば選択的な送達分子）上の基と反応する１つの官能基、及び第２の分子（例えば画像化カーゴ）上の基と反応する第２の官能基を有する。場合によっては、二機能性リンカーは、ホモ二機能性リンカー又はヘテロ二機能性リンカーである。代替的に、幾つかの実施形態において、誘導体化が官能基を提供するために実行される。故に、例えば、ペプチド上の遊離スルフヒドリル基の生成の手順も知られている（米国特許第４，６５９，８３９号を参照）。リンカーＸは代替的に、選択的な送達分子と相互作用可能な複素環を形成する２つ以上の異なる反応基を含む、ヘテロ二機能性クロスリンカーを含み得る。例えば、システインなどのヘテロ二機能性クロスリンカーはアミン反応基を含み、チオール反応基は、誘導体化された選択的な送達分子上でアルデヒドと相互作用することができる。ヘテロ二機能性クロスリンカーに適している反応基の追加の組み合わせは、例えば、アミン−及びスルフヒドリル反応基；カルボニル及びスルフヒドリル反応基；アミン及び光反応基；スルフヒドリル及び光反応基；カルボニル及び光反応基；カルボン酸塩及び光反応基；並びにアルギニン及び光反応基を含む。
【０１４６】
典型的なホモ二機能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔ試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル）プロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタートレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピペリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオナミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３，３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド又はＮ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）を含む。
【０１４７】
典型的なヘテロ二機能性リンカーは、限定されないが、アミン反応性クロスリンカー及びスルフヒドリルクロスリンカー、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサネート（スルホ−ＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢｓ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル（ｉｏｄｏａｃｔｅｙｌ））アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨード）アミノベンゾエート（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢｓ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性クロスリンカー及びスルフヒドリル反応性クロスリンカー、例えば４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロビオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル���４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４−（ρ−アジドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えば１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミド、カルボニル反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えばρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシラート反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えば４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、及びアルギニン反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えばρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。
【０１４８】
幾つかの例において、リンカーＸは更に反応性官能基を含む。幾つかの実施形態において、反応性官能基は、リンカーＸを本明細書に記載されるカーゴに抱合する。場合によっては、反応性官能基は、親電子基に反応する求核基を含む。典型的な親電子基は、カルボニル基、例えばアルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、酸ハロゲン化物、又は酸無水物を含む。幾つかの実施形態において、反応性官能基はアルデヒドである。典型的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、及びアリールヒドラジドを含む。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、リンカーＸは、マレイミド基、ハロゲン化アルキルき、又はヨードアセトアミド基を含む。
【０１５０】
幾つかの実施形態において、リンカーＸはマレイミド基を含む。幾つかの例において、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。幾つかの例において、マレイミド基は更に、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成するカプロン酸を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例において、マレイミド基は、上述のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）又はスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。幾つかの例において、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用を提供するべくマレイミドに隣接する塩基性アミノ基を組み込むジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それにより、マレイミドがレトロマイケル反応を介して脱離反応を受けることを排除する。幾つかの例において、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｅｌｆ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２（１０）：１０５９−１０６２  （２０１４）に記載されるマレイミド基である。幾つかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。幾つかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドである。
【０１５２】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される選択的な送達分子は単一のリンカーを含む。後の治療量が標的組織において正確に濃縮しそうかどうか試験するために非傷害性トレーサー量での画像化が使用され得るので、画像化及び治療カーゴ両方の取込みを媒介するための単一機構の使用が特に有益である。
【０１５３】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される選択的な送達分子は複数のリンカーを含む。本明細書に開示される選択的な送達分子が多数のＸ結合を含んでいる場合、分子の他の部分からの部分Ａの分離は、全てのＸ結合の切断を必要とする。多数のＸのリンカーの切断は同時又は連続的でもよい。１より多くの条件又は環境（例えば、「シグナル」又は「細胞外シグナル」）が分子に遭遇することを、分子の他の部分からの部分Ａの分離が要求するように、多数のＸ結合は、異なる特異性を持つＸ結合を含み得る。多数のＸリンカーの切断は故に、そのようなシグナル又は細胞外のシグナルの組み合わせの検出器として役立つ。例えば、選択的な送達分子は、塩基性部分Ｂを酸性部分Ａに結び付ける２つのリンカー部分Ｘａ及びＸｂを含み得る。酸性部分Ａが塩基性部分Ｂから分離され、それにより部分Ｂ及びカーゴ部分Ｃ（必要に応じて）が細胞に侵入するのを可能とする前に、Ｘａ及びＸｂリンカーの両方が切断されなければならない。リンカー領域は、存在し得る他のリンカーとは無関係に塩基性部分Ｂ又はカーゴ部分Ｃの何れかに結合することができ、及び、望ましくは、２より多くのリンカー領域Ｘが含まれ得ることが、理解される。
【０１５４】
２つ以上のＸリンカーの組み合わせは、所望の細胞、組織、又は領域への分子の標的化及び送達を更に調節するために使用され得る。シグナル又は細胞外シグナルの組み合わせは、望ましい場合にＸリンカーの切断の特異性を広げる又は狭くするために使用される。多数のＸリンカーが平行して結合される場合、部分Ａが分子の残りから分離される前に各Ｘリンカーが切断されなければならないため、切断の特異性は狭くなる。多数のＸリンカーが連続して結合される場合、何れか１つのＸリンカー上での切断が分子の残りからの部分Ａの分離可能とするので、切断の特異性は広げられる。例えば、プロテアーゼ又は低酸素症を検出するために（即ち、プロテアーゼ又は低酸素症の何れかの存在下でＸを切断すること）、Ｘリンカーは、何れかの切断が酸性部分Ａの分離を可能とするのに十分となるように、縦一列でプロテアーゼ感受性及び還元感受性部位を配するように設計される。代替的に、プロテアーゼと低酸素症の両方を検出するために（即ち、何れか一方のみの存在下ではなくプロテアーゼと低酸素症の両方の存在下でＸを切断すること）、Ｘリンカーは、互いにジスルフィド結合されるシステインの少なくとも１つの対の間にプロテアーゼ感受性部位を配するように設計される。その場合、プロテアーゼ切断及びジスルフィド還元の両方は、部分Ａの分離を可能にするために必要とされる。
【０１５５】
部分Ｙリンカー
【０１５６】
幾つかの実施形態において、Ｙは１つ以上のアミノ酸から成るリンカーであり、ＳＤＭの残りにカーゴ（Ｄ）を結合するために使用される。幾つかの実施形態において、Ｙは１つ以上のアミノ酸から成るリンカーであり、部分Ｂにカーゴ（Ｄ）を結合するために使用される。一般的に、ペプチドリンカーは、分子を結合する、或いは幾つかの最小距離又はそれらの他の空間的関連性を保存する以外に特異的な生物活性を持たない。しかし、リンカーの構成的アミノ酸は、フォールディング、総電荷、又は疎水性などの分子の幾つかの特性に影響を及ぼすように選択され得る。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは、共有結合によってＤのカーゴ部分をＢのペプチド部分（即ち、送達配列）に結合する。幾つかの実施形態において、共有結合は、エーテル結合、チオエテール結合、アミン結合、アミド結合、オキシム結合、炭素−炭素結合、ヒドラゾン結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、又は炭素−硫黄結合を含む。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは可撓性である。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは剛性である。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは線形構造を含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは非線形構造を含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは分枝構造を含む。幾つかの実施形態において、リンカーは環状構造を含む。
【０１５９】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはペプチド結合を含む。ペプチド結合はＬ−アミノ酸及び／又はＤ−アミノ酸を含む。実施形態において、Ｄ−アミノ酸は、バックグラウンドのペプチダーゼ又はプロテアーゼによる免疫原性及び非特異性の切断を最小化するために好ましい。オリゴ−Ｄ−アルギニン配列の細胞取込みは、オリゴ−Ｌ−アルギニンのもの以上に優れていると知られている。
【０１６０】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは非切断可能なリンカーである。
【０１６１】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは、特定条件の存在下、又は特定の環境での切断のために設計されている。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは細胞内プロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、Ｙは細胞内プロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームプロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、細胞内プロテアーゼはシステインプロテアーゼである。幾つかの実施形態において、細胞内プロテアーゼはアスパルチルプロテアーゼである。幾つかの実施形態において、プロテアーゼはセリンプロテアーゼである。幾つかの実施形態において、システインプロテアーゼは、カスパーゼ、カテプシン、カルパイン、パパイン、又はレグマインである。幾つかの実施形態において、細胞内プロテアーゼはイニシエーターカスパーゼである。幾つかの実施形態において、細胞内プロテアーゼはエフェクターカスパーゼである。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは、カテプシンＢ、カテプシンＬ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＷ、カテプシンＣ、カテプシンＦ、カテプシンＶ、カテプシンＸ、カテプシンＳ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、ＨＣＰ−１、ＨＣＰ−２、ジペプチジル−ペプチダーゼＩ、ＭＥＲＯＰＳ  Ｃ１３、ＣＥＤ−３ペプチダーゼ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１；カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、及びカスパーゼ１４の中から選択されるプロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは、カテプシンＢ、カテプシンＬ、カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、及びカスパーゼ９の中から選択されたプロテアーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは、カテプシンＢ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼによって切断可能である。幾つかの実施形態において、リンカーは、Ｐ１位置にリジン、シトルリン、又はアルギニンの残基、及びＰ１’位置に大きな疎水性残基を有する。
【０１６２】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは酸性の感受性化学リンカーを含む。幾つかの実施形態において、酸性の感受性化学リンカーはヒドラゾン又はその誘導体である。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは自己犠牲型スペーサーを含む。幾つかの実施形態において、自己犠牲型スペーサーは、ＳＤＭのＢ部分と治療カーゴとの間の立体障害の発生を妨げるのに十分な長さである。幾つかの実施形態において、Ｙはｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢＯＨ）スペーサー又はその誘導体を含む。幾つかの実施形態において、Ｙはｐ−アミノベンジルカルボニル（ＰＡＢＣ）スペーサー又はその誘導体を含む。幾つかの実施形態において、Ｙは、分枝したビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）スペーサー又はその誘導体を含む。幾つかの実施形態において、Ｙは、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体、或いはオルト又はパラ−アミノベンジルアセタールスペーサーを含む。幾つかの実施形態において、Ｙは、２，６−ビスヒドロキシメチル−ｐ−クレソール（ｃｒｅｓｏｌ）又はヘミチオアミナール（ｈｅｍｉｔｈｉｏａｍｉｎａｌ）誘導体を含む。
【０１６３】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは二機能性リンカーを含む。幾つかの例において、二機能性リンカーは、第１の分子（例えば選択的な送達分子）上の基と反応する１つの官能基、及び第２の分子（例えば画像化カーゴ）上の基と反応する第２の官能基を有する。場合によっては、二機能性リンカーは、ホモ二機能性リンカー又はヘテロ二機能性リンカーである。代替的に、幾つかの実施形態において、誘導体化が官能基を提供するために実行される。故に、例えば、ペプチド上の遊離スルフヒドリル基の生成の手順も知られている（米国特許第４，６５９，８３９号を参照）。リンカーは代替的に、選択的な送達分子と相互作用可能な複素環を形成する２つ以上の異なる反応基を含む、ヘテロ二機能性クロスリンカーを含み得る。例えば、システインなどのヘテロ二機能性クロスリンカーはアミン反応基を含み、チオール反応基は、誘導体化された選択的な送達分子上でアルデヒドと相互作用することができる。ヘテロ二機能性クロスリンカーに適している反応基の追加の組み合わせは、例えば、アミン−及びスルフヒドリル反応基；カルボニル及びスルフヒドリル反応基；アミン及び光反応基；スルフヒドリル及び光反応基；カルボニル及び光反応基；カルボン酸塩及び光反応基；並びにアルギニン及び光反応基を含む。
【０１６４】
典型的なホモ二機能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔ試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル）プロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタートレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピペリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオナミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３，３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド又はＮ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）を含む。
【０１６５】
典型的なヘテロ二機能性リンカーは、限定されないが、アミン反応性クロスリンカー及びスルフヒドリルクロスリンカー、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサネート（スルホ−ＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢｓ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル（ｉｏｄｏａｃｔｅｙｌ））アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨード）アミノベンゾエート（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢｓ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性クロスリンカー及びスルフヒドリル反応性クロスリンカー、例えば４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロビオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジ���−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４−（ρ−アジドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えば１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミド、カルボニル反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えばρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシラート反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えば４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、及びアルギニン反応性クロスリンカー及び光反応性クロスリンカー、例えばρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。
【０１６６】
幾つかの実施形態において、リンカーＹはマレイミド基を含む。幾つかの例において、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。幾つかの例において、マレイミド基は更に、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成するカプロン酸を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例において、マレイミド基は、上述のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）又はスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
【０１６７】
幾つかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。幾つかの例において、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用を提供するべくマレイミドに隣接する塩基性アミノ基を組み込むジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それにより、マレイミドがレトロマイケル反応を介して脱離反応を受けることを排除する。幾つかの例において、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｅｌｆ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２（１０）：１０５９−１０６２  （２０１４）に記載されるマレイミド基である。幾つかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。幾つかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドである。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームで切断可能なペプチドを含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームで切断可能なジペプチドＰｈｅ−Ａｒｇを含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームで切断可能なジペプチドＰｈｅ−Ｌｙｓを含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームで切断可能なジペプチドＶａｌ−Ｃｉｔ（ｌ−シトルリン）を含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームで切断可能なテトラペプチドＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含む。幾つかの実施形態において、Ｙリンカーはリソソームで切断可能なテトラペプチドＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含む。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、Ｙリンカーは、リソソームで切断可能なペプチド及び自己犠牲型スペーサーを含む。
【０１７０】
幾つかの実施形態において、ＹはｐＨ感受性リンカーである。幾つかの実施形態において、Ｙは酸性ｐＨ条件下で切断される。幾つかの実施形態において、Ｙは酸性リソソームのｐＨ条件下で切断される。
【０１７１】
本明細書に開示されるＹリンカーは、例えばヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、又は他の非標準アミノ酸などの、非標準アミノ酸を含み得ることが理解される。本明細書に開示されるリンカーは、例えばメチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化形態など）、アセチル化アミノ酸、アミノ化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は他の修飾アミノ酸などの、翻訳後修飾されたアミノ酸を含む、修飾アミノ酸を含み得る。本明細書に開示されるリンカーはまた、非ペプチド結合により結合される部分、及び非アミノ酸により、又は非アミノ酸部分へと結合されるアミノ酸を含む、ペプチド模倣部分を含み得る。
【０１７２】
追加の修飾
【０１７３】
幾つかの実施形態において、本開示の選択的な送達分子は、標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）の多重原子価及び結合活性を増大させる高分子量の分子に随意に抱合する。幾つかの実施形態において、高分子量の分子は水溶性高分子である。適切な水溶性高分子の例は、限定されないが、ペプチド、サッカライド、ポリ（ビニル）、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などを含む。幾つかの実施形態において、水溶性高分子は、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、デンプン、又はヒドロキシエチルデンプンである。任意の適切な方法が、水溶性高分子にペプチドを共役するために使用される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  ２００８を参照）。
【０１７４】
レシオメトリック画像化のための典型的な選択的な送達分子
【０１７５】
図１は、開示されたレシオメトリック蛍光画像化方法で使用される選択的な送達分子の１つの非限定的な例の構造を示す（即ち、ＳＤＭ−２５又はＡＶＢ−６２０）。ＳＤＭ−２５は、対象の組織への蛍光共鳴エネルギー転移を受けることができる蛍光ドナー及びアクセプター部分（即ち、造影剤）の対（例えばＣｙ５及びＣｙ７）を送達するための蛍光画像化方法に使用され、該方法は、（ａ）対象の組織をＳＤＭ−２５と接触させる工程（例えば、個体にＳＤＭ−２５を静脈内投与する）、及び（ｂ）造影剤の少なくとも１つを視覚化する工程を含む。
【０１７６】
図２のＢは、ドナー及びアクセプターを近接して保持するリンカーの切断に際して、Ｃｙ５／Ｃｙ７ドナー−アクセプターの対で標識されたレシオメトリックＳＤＭ−２５に対する蛍光発光スペクトルでの推移を例示する。無傷のプローブに関して、６２０ｎｍの光によるＣｙ７アクセプター分子への励起時にＣｙ５ドナー分子によって吸収される、ＦＲＥＴに基づくエネルギー伝達は結果として、およそ７８０ｎｍの強い蛍光発光をもたらす。切断に際して、２つのフルオロフォアの分離は、ＦＲＥＴに基づくエネルギー伝達を排除し、その結果、７８０ｎｍのＣｙ７蛍光発光の減少、及び６７０ｎｍのＣｙ５蛍光発光の増加がもたらされる。
【０１７７】
図３のＡ−Ｃは、ヒト乳癌腫瘍組織及び正常組織におけるＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）に対して観察された異なる切断割合を例示するデータ、及び、ヒト乳癌組織のレシオメトリック蛍光画像化ベースの検出におけるＳＤＭ−２５の使用に対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の例を提供する。図３のＡ：２５の対になったヒト乳癌患者組織ホモジネートにおけるＳＤＭ−２５の切断割合（毎分切断されたｎＭ）。癌陽性の腫瘍組織（赤色の菱形）及び癌陰性の隣接組織（青色の三角形）が示される。対になったサンプルは線によって接続される。対応のあるｔ検定は、腫瘍と標準との間の有意差に対してＰ＜０．０００１をもたらす。図３のＢ：平均±９５％の信頼水準と同じデータの散布図。図３のＣ：腫瘍対正常組織のＳＤＭ−２５切断割合検出のためのＲＯＣ曲線を示す。
【０１７８】
図３のＡ−Ｂに示されるように、Ｃｙ５／Ｃｙ７で標識されたＳＤＭ−２５による正常ヒト乳房組織及び癌ヒト乳房組織ホモジネートのインキュベーションに際して、酵素活性及びＳＤＭ−２５の切断は、正常ヒト乳房組織と比較して癌性ヒト乳房組織においてかなり大きくなることが見出された。
【０１７９】
図４のＡ−Ｂは、非悪性の乳房組織及び腫瘍ホモジネートにおけるＭＭＰ活性の定量化に対するＳＤＭ−２５の使用を例示するデータの例を提供する。図４のＡ：データが図３のＡ−Ｃに示される２５の患者から選択される、３つの代表的なヒト乳癌サンプル及び対になった正常組織からのホモジネートが、１０％のゼラチンザイモグラム上で分析された。組み換え体の活性ＭＭＰ２及びＭＭＰ９は標準（１つのレーン当たり２ｎｇ）として示された。図４のＢ：図４のＡに示される３つの対を含む、５つの代表的なヒト乳癌サンプル（赤色）及び対になった正常組織（青色）における６つのＭＭＰのＥＬＩＳＡ定量化。エラーバーは標準偏差である。ＮＤ＝検出不能。
【０１８０】
幾つかの例において、Ｃｙ５／Ｃｙ７で標識されたＳＤＭ−２５（又は他のレシオメトリック表示体）を有する生物試料の注入は、高画像コントラスト比率で対象の生物活性を示す領域と生物活性を示さない領域との区別を可能にする。例えば、Ｃｙ５／Ｃｙ７で標識されたＳＤＭ−２５（又は他のレシオメトリック表示体）を有する生物試料の注入は、癌に相関されるプロテアーゼ活性を示す領域と示さない領域との、少なくとも１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、２０：１、又はそれ以上のより高い蛍光比率画像又は蛍光輝度画像コントラスト比率を提供し得る。
【０１８１】
使用の方法
【０１８２】
上述のように、開示されたレシオメトリック蛍光表示体及び画像化方法は、対象の生物活性を示す生物試料内の領域を検出及び／又は視覚化するために使用され得る。「生物試料」の例は、限定されないが、培養細胞サンプル、初代細胞サンプル（例えば、個々の細胞を懸濁液へと放出されるに細胞外マトリックスが消化又は溶解された組織サンプル）、血液サンプル又はその分画、エクスビボ組織サンプル（例えば、生検サンプル、又は外科切除サンプル）、インビボの組織サンプル（例えば、外科手術中に露出された腫瘍組織又は周辺組織）などを含む。生物試料は、様々な生物体、例えば原核生物、真核生物、菌類、植物、動物、又はヒトの何れかから集められてもよい。幾つかの例において、生物試料は患者サンプルである。「生物活性」の例は、限定されないが、イオン濃度又は輸送活性の変化（例えば、Ｃａ２＋イオンの蓄積又は放出、又は局所的なｐＨの変化）、興奮性細胞の膜間電圧の変化、増強されたプロテアーゼ活性（例えば、細胞外プロテアーゼ活性）の領域、レシオメトリック蛍光表示体を使用してモニタリングされる他の生化学物質又は生理学的プロセスの変化、或いはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの例において、検出且つ視覚化される生物活性は、様々な疾患状態、例えば関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、乳癌、前癌、悪性組織、凝結（血液凝固）、炎症、又はそれらの任意の組み合わせと相関される。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、開示されたレシオメトリック蛍光表示体は、エクスビボ組織サンプル（例えば生検サンプル又は切除された外科サンプル）において癌を検出且つ診断するために使用される。
【０１８４】
幾つかの実施形態において、開示されたレシオメトリック蛍光表示体及び画像化方法は、必要とする個体（例えば患者）における対象の組織を視覚化するために使用される。幾つかの実施形態において、レシオメトリック画像化方法は、（ａ）レシオメトリック蛍光表示体、例えば、Ｃｙ５／Ｃｙ７ドナー−アクセプターの対で標識されたＳＤＭ−２５などのレシオメトリックＡＣＰＰを個体に投与する工程、及び（ｂ）蛍光種の少なくとも１つを視覚化する工程を含む。
【０１８５】
幾つかの実施形態において、細胞又は組織へのレシオメトリック蛍光表示体の標的送達は、医療従事者が特異的な組織（例えば癌組織）を視覚化／画像化することを可能にする。幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が対象の組織（例えば癌組織）を視覚化／画像化することを可能にする。幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、外科的マージンの減少により医療従事者が対象の組織（例えば癌組織）を除去（即ち、外科切除）することを可能にする。幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が腫瘍／癌組織を除去（即ち、外科切除）することを可能にし、腫瘍／癌細胞の一部が除去されない可能性を減らす。幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が腫瘍／癌組織を最大限に減量させることを可能にする。幾つかの実施形態において、癌乳房組織の造影剤の標的送達は、不必要な操作及び再操作の可能性を減らす。幾つかの実施形態において、癌マージン状態（ｃａｎｃｅｒ  ｍａｒｇｉｎ  ｓｔａｔｕｓ）は手術時に評価される。
【０１８６】
幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が対象の組織（例えば癌組織）をより正確にサンプリングする（例えば、切除生検、切開生検、吸引生検、又は針生検）を可能にする。幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が正常な組織を含有する切除組織内の特異的な組織（例えば癌組織）を視覚化／画像化することを可能にする。標的組織（例えば癌組織）の同定を可能とすることで、病理学評価のために組織サンプルを区分する場所を病理学者に誘導し、病理学者が不健康な組織（例えば癌組織）を除外し且つ偽陰性をもたらす正常組織をサンプリングする可能性を減らすことができる。幾つかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物又は式（ＩＩ）の化合物の使用後で除去された組織（例えば癌組織）は、病理セクション又はスライドを調製するために使用される。幾つかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物又は式（ＩＩ）の化合物の使用後に除去される癌組織は、悪性又は良性として組織を診断するために使用される病理セクション又はスライドを調製するために使用される。
【０１８７】
幾つかの実施形態において、癌乳房組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が癌を正確にステージ分けするのを可能にし、医学的処置決定を可能にする。幾つかの実施形態において、癌組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が腫瘍（癌組織）のサイズ又は癌組織の拡散（例えば転移巣）を観察することを可能にする。幾つかの実施形態において、細胞又は組織への造影剤の標的送達は、医療従事者が有効な処置レジメンを設計することを可能にする。
【０１８８】
幾つかの実施形態において、造影剤を含む式（Ｉ）の選択的な送達分子（例えば、蛍光ドナー−アクセプターの対で標識された選択的な送達分子）は、誘導された手術において利用される。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子は、アップレギュレートされたプロテアーゼ活性を持つ癌性又は他の病理学的組織（例えば、炎症反応を受ける組織）へと優先的に局在化される。幾つかの実施形態において、造影剤を含む式（Ｉ）の選択的な送達分子は、癌組織、例えば大腸癌を除去するために誘導された手術において利用される。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子を利用する誘導された手術は、外科医が正常な（即ち、非癌性）組織を可能な限り切除しないことを可能にする。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子を利用する誘導された手術は、外科医が、選択的な送達分子の存在なしに切除可能なより多くの癌組織を視覚化及び切除することを可能にする。幾つかの実施形態において、手術は蛍光誘導された手術である。
【０１８９】
幾つかの実施形態において、造影剤を含む式（ＩＩ）の選択的な送達分子（例えば、蛍光ドナー−アクセプターの対で標識された選択的な送達分子）は、誘導された手術において利用される。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子は、アップレギュレートされたプロテアーゼ活性を持つ癌性又は他の病理学的組織（例えば、炎症反応を受ける組織）へと優先的に局在化される。幾つかの実施形態において、造影剤を含む式（ＩＩ）の選択的な送達分子は、癌組織、例えば大腸癌を除去するために誘導された手術において利用される。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子を利用する誘導された手術は、外科医が正常な（即ち、非癌性）組織を可能な限り切除しないことを可能にする。幾つかの実施形態において、選択的な送達分子を利用する誘導された手術は、外科医が、選択的な送達分子の存在なしに切除可能なより多くの癌組織を視覚化及び切除することを可能にする。幾つかの実施形態において、手術は蛍光誘導された手術である。
【０１９０】
幾つかの実施形態において、対象の組織は、乳癌組織、結腸癌組織、扁平上皮癌組織、前立腺癌組織、黒色腫組織、肉腫組織、甲状腺癌組織、大腸癌組織、皮膚癌組織、卵巣癌組織、癌性のリンパ節組織、子宮頚癌組織、肺癌組織、膵臓癌組織、頭頚部癌組織、又は食道癌組織である。幾つかの実施形態において、対象の組織は乳癌組織である。幾つかの例において、対象の組織は結腸癌組織である。幾つかの例において、対象の組織は肺癌組織である。場合によっては、対象の組織は前立腺癌組織である。
【０１９１】
幾つかの実施形態において、癌は、ＡＩＤＳ関連癌（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、肛門癌、基底細胞癌、胆管癌（例えば、肝外）、膀胱癌、骨癌（骨肉腫及び悪性線維性組織球腫）、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌（例えば子宮癌）、上衣腫、食道癌、眼癌（例えば眼球内黒色腫及び網膜芽細胞腫）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  （ｓｔｏｍａｃｈ）  ｃａｎｃｅｒ）、胚細胞腫（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣）、頭頚部癌、白血病、唇及び口腔の癌、肝臓癌、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、卵巣癌、膵臓癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌、肉腫、皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、精巣癌、喉頭癌、甲状腺癌、尿道癌、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）である。
【０１９２】
幾つかの実施形態において、癌は乳癌である。幾つかの例において、乳癌は、侵襲性腺管癌（ＩＤＣ）、侵襲性小葉癌（ＩＬＣ）、非浸潤性乳癌（ＤＣＩＳ）、炎症性乳癌、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、男性乳房癌、乳癌の分子亜型、乳頭のパジェット病、乳房の葉状腫瘍、及び転移性乳癌を含む。場合によっては、ＩＤＣは、乳房の管状腺癌、乳房の髄様癌、乳房の粘液性癌腫、乳房の乳頭状癌、及び乳房の篩状癌へと更に細分される。場合によっては、乳癌の分子亜型は、管腔Ａ、管腔Ｂ、三種陰性／基底様、ＨＥＲ２−富化、又は正常様の乳癌を含む。
【０１９３】
幾つかの実施形態において、癌はリンパ系の癌（例えばリンパ腫）である。
【０１９４】
幾つかの実施形態において、癌はＢ細胞癌である。幾つかの実施形態において、癌は、Ｂ前駆細胞癌（例えば、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫）及び末梢性Ｂ細胞癌（例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、小胞中心リンパ腫、濾胞性リンパ腫（例えば、細胞学等級：Ｉ（小細胞）、ＩＩ（小細胞と大細胞の組み合わせ）、ＩＩＩ（大細胞）、及び／又は亜型：びまん性及び優勢的に小さな細胞型）、低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、中級／濾胞性ＮＨＬ、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、結節外（例えばＭＡＬＴ型＋／−単細胞様Ｂ細胞）及び／又は結節（例えば＋／−単細胞様Ｂ細胞））、脾辺縁帯リンパ腫（例えば、＋／−有毛リンパ球）、有毛細胞白血病、形質細胞腫／プラスマ細胞骨髄腫（例えば、骨髄腫及び多発性骨髄腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（例えば、一次縦隔洞（胸腺）Ｂ細胞リンパ腫）、中級のびまん性ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、高度Ｂ細胞リンパ腫、バーキット様、高度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高度リンパ芽球ＮＨＬ、高度小非分割細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症である。
【０１９５】
幾つかの実施形態において、癌はＴ細胞及び／又は推定ＮＫ細胞癌である。幾つかの実施形態において、癌は、Ｔ前駆細胞癌（前駆体Ｔ−リンパ芽球性リンパ腫／白血病）及び末梢性Ｔ細胞及びＮＫ細胞癌（例えば、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病、及び大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）（例えばＴ細胞型及び／又はＮＫ細胞型）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば菌状息肉腫／セザリー症候群）、不特定の一次Ｔ細胞リンパ腫（例えば、細胞学カテゴリー（例えば、中型細胞、中型と大型の細胞の組み合わせ）、大細胞、リンパ上皮腫様細胞、亜型肝脾型γδＴ細胞性リンパ腫、及び皮下脂肪織炎Ｔ細胞性リンパ腫）、免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＬＤ）、血管中枢性リンパ腫、腸Ｔ細胞性リンパ腫（例えば、＋／−腸疾患関連）、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＡＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）（例えば、ＣＤ３０＋、Ｔ細胞型及びヌル細胞型）、未分化大細胞リンパ腫、及びホジキン様）である。
【０１９６】
幾つかの実施形態において、癌はホジキン病である。
【０１９７】
幾つかの実施形態において、癌は白血病である。幾つかの実施形態において、癌は、慢性骨髄球Ｉ型（顆粒白血球）白血病、慢性骨髄性、及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、及び急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球性、単球、及び赤白血症）である。
【０１９８】
幾つかの実施形態において、癌は液状腫瘍又は形質細胞腫である。幾つかの実施形態において、癌は髄外の形質細胞腫、孤立性骨髄腫、及び多発性骨髄腫である。幾つかの実施形態において、形質細胞腫は多発性骨髄腫である。
【０１９９】
幾つかの実施形態において、癌は肺癌である。
【０２００】
幾つかの実施形態において、癌は前立腺癌である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は腺癌である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、肉腫、神経内分泌腫瘍、小細胞癌、腺管癌、又はリンパ腫である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、ステージＡの前立腺癌である（癌は、直腸試験中には感じられない場合がある）。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、ステージＢの前立腺癌である（即ち、腫瘍は、前立腺内のより多くの組織に関与し、直腸の試験中に感じられる場合があり、或いは、高いＰＳＡのレベルにより行われる生検により見出される）。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、ステージＣの前立腺癌である（即ち、癌は前立腺の外側で近くの組織へと拡散する）。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、ステージＤの前立腺癌である。幾つかの実施形態において、前立腺癌はアンドロゲン非依存性前立腺癌（ＡＩＰＣ）である。幾つかの実施形態において、前立腺癌はアンドロゲン依存性前立腺癌である。幾つかの実施形態において、前立腺癌はホルモン療法に耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌はホルモン療法にほぼ耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は化学療法に耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は転移性前立腺癌である。幾つかの実施形態において、個体は、前立腺癌に関連付けられる遺伝子、遺伝子突然変異、又は多形性（例えば、ＲＮＡＳＥＬ／ＨＰＣ１、ＥＬＡＣ２／ＨＰＣ２、ＳＲ−Ａ／ＭＳＲ１、ＣＨＥＫ２、ＢＲＣＡ２、ＰＯＮ１、ＯＧＧ１、ＭＩＣ−１、ＴＬＲ４、及びＰＴＥＮ）を持つ、或いは前立腺癌に関連付けられる遺伝子の１つ以上の余剰の複製物を持つヒトである。幾つかの実施形態において、前立腺癌はＨＥＲ２陽性である。幾つかの実施形態において、前立腺癌はＨＥＲ２陰性である。
【０２０１】
幾つかの実施形態において、癌は転移し、循環腫瘍細胞により特徴づけられる。
【０２０２】
幾つかの実施形態において、対象の組織は、アップレギュレートされたプロテアーゼ活性を持つ組織（例えば炎症反応を受ける組織）である。
【０２０３】
医薬組成物
【０２０４】
本明細書には、特定の実施形態において、本明細書に記載されるようなＳＤＭの何れかを含む医薬組成物が開示される。幾つかの実施形態において、ＳＤＭを含む医薬組成物は、式１又は式ＩＩの何れかのＳＤＭ及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【０２０５】
本明細書中の医薬組成物は、活性薬剤を薬学的に使用される調製物へと処理するのを促進する賦形剤及び助剤を含む、１以上の生理学的に許容可能な担体を使用して、製剤され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に左右される。本明細書に記載される医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９９）に見出される。
【０２０６】
特定の実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、又は担体を更に含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、他の医療薬剤又は医薬品、担体、アジュバント、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、及び／又は緩衝液を含む。加えて、医薬組成物は、他の治療上価値のある物質も含む。
【０２０７】
特定の実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、非経口（静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、脊髄腔内、硝子体内、点滴、又は局所（ｌｏｃａｌ））の投与を含むが、これらに限定されない任意の適切な投与経路によって被験体に投与される。
【０２０８】
筋肉内、皮下、腫瘍周辺、又は静脈内の注射に適した製剤は、生理学的に許容可能な無菌の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液、或いはエマルジョン、及び無菌注射剤溶液又は分散液へと再構成される無菌の粉末を含む。適切な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、クレモフォールなど）、それらの適切な混合物、植物油（オリーブオイルなど）、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合に必要とされた粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって、維持される。皮下注射に適した製剤は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分配剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などの随意の添加剤も含む。
【０２０９】
静脈内注射について、活性薬剤は、水溶液中で、好ましくはハンク溶液、リンガー溶液、又は緩衝生理食塩水などの生理学的に互換性を持つ緩衝剤中で製剤される。
【０２１０】
非経口注入は随意に大量注射又は持続注入を含む。注射のための製剤は随意に、単位「剤形、例えば、アンプル又は複数回用量の容器において、加えられた防腐剤と共に提供される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、油性又は水溶性のビヒクル中の滅菌した懸濁液、水溶液、又はエマルジョンとして、非経口注射に適切な形態であり、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの、調合剤を含有する。非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態の活性薬剤の水溶液を含む。加えて、懸濁液は、適切な油性の注入懸濁液として随意に調製される。
【０２１１】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形である。単位剤形において、製剤は、本明細書に開示される活性薬剤の適量を含む単位用量に分割される。単位用量は、製剤の離散量を含有するパッケージ形状である。非限定的な例は、包装された錠剤又はカプセル、及びバイアル又はアンプルの中にある粉末剤である。幾つかの実施形態において、水性懸濁組成物は、単回用量用の再密閉できない容器に包装される。代替的に、複数回用量用の再密閉可能な容器が使用され、この場合、組成物中に保存料を含むことが典型的である。ほんの一例として、非経口的注入のための製剤は、限定されないがアンプルを含む単位剤形で、或いは、追加の保存料と共に複数回投与量容器で提供される。
【０２１２】
幾つかの実施形態において、与えられたＳＤＭの量は、特定の化合物、被験体の同一性（例えば重量）、投与経路、及び、化合物の視覚化に必要な期間に依存して変動する。典型的な投与量は、限定されないが、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１５ｍｇ、１８ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、又は３０ｍｇを含む。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は１ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は２ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は４ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は６ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は８ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は１０ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は１２ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は１５ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は２０ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は２５ｍｇである。場合によっては、被験体に投与されるＳＤＭの投与量は３０ｍｇである。
【０２１３】
幾つかの例において、ＳＤＭは、手術の約３０分〜約２４時間前に投与される。幾つかの例において、ＳＤＭは、手術の約１時間〜約２２時間前、約１時間〜約２０時間前、約２時間〜約２２時間前、約２時間〜約２０時間前、約２時間〜約１８時間前、約２時間〜約１６時間前、約２時間〜約１４時間前、約２時間〜約１２時間前、約２時間〜約１０時間前、約２時間〜約８時間前、約４時間〜約１８時間前、約４時間〜約１６時間前、約４時間〜約１２時間前、約４時間〜約８時間前、約６時間〜約２０時間前、約６時間〜約１８時間前、約６時間〜約１２時間前、約８時間〜約１８時間前、又は約８時間〜約１２時間前に投与される。場合によっては、ＳＤＭは、手術の約３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、又は２４時間前に投与される。
【０２１４】
幾つかの実施形態において、ＳＤＭは注入を介して被験体に投与される。幾つかの例において、注入の長さは、約２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、又はそれ以上である。場合によっては、注入の長さは約２０分である。場合によっては、注入の長さは約３０分である。場合によっては、注入の長さは約４０分である。場合によっては、注入の長さは約５０分である。場合によっては、注入の長さは約１時間である。場合によっては、注入の長さは約５０分である。場合によっては、注入の長さは約１．５時間である。場合によっては、注入の長さは約５０分である。場合によっては、注入の長さは約２時間である。場合によっては、注入の長さは約５０分である。場合によっては、注入の長さは約４時間である。場合によっては、注入の長さは約５０分である。場合によっては、注入の長さは約６時間である。
【０２１５】
蛍光検出及び画像化システム
【０２１６】
様々な蛍光検出器機及び画像化システムの何れかが、造影剤、例えばレシオメトリック蛍光表示体、即ち本開示の画像化方法と共に使用されてもよい。例えば、インビトロの試験に対して、従来の分光蛍光計は、細胞に基づくアッセイを実行するために使用され得る。エクスビボでの組織サンプルの画像化に対して、適切な励起及び発光フィルターのセットを搭載した落射蛍光顕微鏡、及び１つ以上のＣＣＤカメラが利用され得る。インビボの画像化用途に対して、より高度な画像化システムが利用され得る。専門的なインビボの画像化用途、例えば結腸内視鏡検査において、蛍光画像が２（又はそれ以上）の発光波長で集められるのを可能にする改変された内視鏡が利用され得る。
【０２１７】
一般的に、これら蛍光検出及び画像化システムは、（ｉ）１つ以上の励起光源、（ｉｉ）励起及び発光フィルターのセット（或いは、波長設定及びバンドパスを調整するための他の構成要素）、（ｉｉｉ）１つ以上の検出器、及び（ｉｖ）光学システムを横断するにつれて光線の経路を操作するための他の光学部品を含む。幾つかの例において、蛍光検出及び画像化システムは更に、１つ以上のプロセッサ、コンピュータデータストレージ（メモリ）コンポーネント、オペレーティングシステムソフトウェア、器機制御ソフトウェア（例えば、画像取得ソフトウェア）、及び／又は、データ処理及び表示ソフトウェア（例えば、画像処理及び表示ソフトウェア）を含む。
【０２１８】
図５は、２つの異なるカメラ上へと２つの異なる波長で蛍光発光を画像化するために画像スプリッター光学部品（例えば、二色の反射体）を利用するレシオメトリック蛍光画像化システムの、１つの非限定的な例を概略的に例示する。例えば顕微鏡対物レンズを取り囲むリングライトによって提供された励起光は、特定の励起波長で組織サンプルを照らすために使用される。発光された蛍光は、光画像化システムによって集められ、画像スプリッター構成要素へと向けられ、そこで画像は、画像スプリッターの発光波長カットオフに従い２つの構成要素画像に分離され、２つの異なるカメラの画像センサーチップ上へと別々に画像化される。幾つかの実施形態において、２つの画像は同時にキャプチャされる。幾つかの実施形態において、２つの画像は連続してキャプチャされる。
【０２１９】
当業者に既知の様々な光源の何れかが、アーク灯、ハロゲン電球、レーザー（例えば、アルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レーザーなど）、ダイオードレーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ライトエンジンなど、或いはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、励起光源として使用され得る。幾つかの実施形態において、蛍光検出又は画像化システムは、少なくとも１つの光源、少なくとも２つの光源、少なくとも３つの光源、少なくとも４つの光源、少なくとも５つの光源、又はそれ以上を含む。
【０２２０】
励起及び発光フィルターのセットは、光ガラスフィルター（例えば、Ｓｃｏｔｔ光学フィルター）、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター、干渉フィルター、二色の反射体、ノッチフィルターなど、或いはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、当業者に既知の様々な光学フィルターの何れかを含む。幾つかの例において、励起及び／又は発光波長（又はバンドパス）は、システムの光学経路における１つ以上の光学フィルターの変更によって設定及び／又は調節される。幾つかの実施形態において、励起及び／又は発光波長（およびバンドパス）は、回折格子、モノクロメーター、音響光学変調器、調整可能な液晶フィルターなどの他の構成要素を使用して設定及び／又は調節される。
【０２２１】
幾つかの例において、蛍光検出又は画像化システムに対する励起又は発光波長の設定は独立して調節され、約３５０ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲に及ぶ。幾つかの例において、励起又は発光波長は、約３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍ、４７５ｎｍ、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、７２５ｎｍ、７５０ｎｍ、７７５ｎｍ、８００ｎｍ、８２５ｎｍ、８５０ｎｍ、８７５ｎｍ、又は９００ｎｍに設定される。当業者は、励起又は発光波長がこの範囲内の任意の値、例えば約６２０ｎｍに設定され得ることを認識する。
【０２２２】
幾つかの例において、特定の励起及び発光光の帯域幅は独立して調節され、±２ｎｍ、±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±２０ｎｍ、±４０ｎｍ、±８０ｎｍ、又はそれ以上の特定の励起波長又は発光波長として特定される。当業者は、励起又は発光の帯域幅がこの範囲内の任意の値、例えば約±５５ｎｍに設定され得ることを認識する。
【０２２３】
当業者に既知の様々な検出器及び画像センサーの何れかが使用され、限定されないが、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、フォトダイオードアレイ、光電子増倍管、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ画像センサー及びカメラなど、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。幾つかの例において、蛍光検出又は画像化システムは、少なくとも１つの検出器、少なくとも２つの検出器（例えば、２つの異なる発光波長での蛍光画像の同時のキャプチャ用）、少なくとも３つの検出器、少なくとも４つの検出器、少なくとも５つの検出器、又はそれ以上を含む。幾つかの光学設計において、蛍光検出又は画像化システムは、例えば、画像捕捉工程間の蛍光発光フィルターの変更によって、２つの（又はさらに）異なる発光波長に蛍光輝度画像を連続してキャプチャするように構成される。いくつかの光設計において、蛍光検出又は画像化システムは、例えば、発光光学経路において適切な二色の反射体を含めること、及び各発光波長に対し異なる検出器を利用することによって、２（又はそれ以上）の異なる発光波長で蛍光輝度画像を同時に集めるように構成される。
【０２２４】
蛍光検出及び画像化システム中で利用され得る他の光学部品の例は、限定されないが、レンズ又はレンズシステム、プリズム、ビームスプリッター、ミラー、光ファイバー、色収差の補正のための回折光学素子などを含む。これら構成要素は、当業者に既知の多数の光構成のいずれかにおいて、光源、励起及び発光フィルター（又は、波長設定及びバンドパスを調整するための他の構成要素）、及び検出器と共に構成される。
【０２２５】
画像処理アルゴリズム
【０２２６】
本明細書にはまた、画像化された生物試料内の生物活性の領域を検出且つ視覚化する精度を改善するためにレシオメトリック蛍光画像化方法と共に使用される画像処理アルゴリズムが開示される。中に蛍光比率画像及び関心領域（ＲＯＩ）を生成且つ表示するための開示されたアルゴリズムは、対象の特異的な生物活性又は構造を示す、生物試料内の領域に相当するＲＯＩの自動的、半自動的、又は手動の同定を可能とする。幾つかの例において、ＲＯＩは蛍光比率画像から生成される。幾つかの例において、ＲＯＩは、蛍光比率画像及び／又は蛍光輝度画像の組み合わせから生成される。
【０２２７】
図６は、ハードウェア構成要素及びソフトウェアユニットの両方を含む蛍光画像化システムの概略図を提供する。上述のように、幾つかの例において、システムのハードウェア構成要素は、画像取得ハードウェア（例えば、上述のような光源、励起及び発光フィルター又は同等物、検出器）の他、１つ以上のプロセッサ、コンピュータストレージ（メモリ）コンポーネント（画像表示コンポーネント）、他の器機制御モジュール（例えば温度調節器）、及び／又は通信ハードウェアを含む。幾つかの例において、システムのソフトウェアユニットはオペレーティングシステムを含み、その中で、１つ以上の画像取得、画像処理、及び／又は画像表示ソフトウェアモジュールの他、他の随意の器機制御及び通信ソフトウェアモジュールに対しプログラムされた命令が実行される。
【０２２８】
上述のように、開示されたレシオメトリック蛍光画像化方法の幾つかの実施形態において、画像処理ソフトウェアモジュールの命令セット内でコードされる、１つ以上の画像処理アルゴリズムは、対象の特異的な生物活性又は構造を示す生物試料内の領域に相当する、分析される画像内でＲＯＩの自動的、半自動的、又は手動の同定を可能にする。
【０２２９】
図７は、蛍光比率画像及び／又は対応する蛍光輝度画像内の高い蛍光比率値及び／又は蛍光輝度値を示す関心領域（ＲＯＩ）を同定するために使用される画像処理アルゴリズムを例示する。２つの異なる発光波長（輝度１及び輝度２）での蛍光輝度画像が、蛍光比率画像を算出するために使用される。幾つかの例において、輝度画像はバックグラウンド控除され、及び／又は、比率の算出前に画像をキャプチャするために使用される露光時間へと標準化される。蛍光比率画像及び蛍光輝度画像の各々に対し、比率又は輝度の閾値は、マスク画像（即ち、対応するする２値画像ファイルであり、そこでは、元の画像が閾値以下である比率又は輝度の値を持つ各ピクセルが、０の値に設定され、元の画像が閾値より大きい比率又は輝度の値を持つ各ピクセルが１の値に設定される）を生成するために使用される。ＲＯＩは、３つのマスク画像を組み合わせるために論理的なＡＮＤ操作を実行することにより検出される。幾つかの実施形態において、結果として生じるＲＯＩは、それらが最小規模要件を満たすことを確実にする（即ち、生物学的な関連性であることを確実にするように単一のピクセルノイズ又は他の検出アーチファクトを排除する）と随意に評価される。最小のＲＯＩ設定は、画像化システムの光学解像度に関連し、偽陽性の同定を回避するために画像化システムの分解能を超えるように選択される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは完全に自動の様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは半自動様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは手動様式で実行される。幾つかの例において、ＲＯＩ内の蛍光比率及び／又は蛍光輝度に対する平均値の測定は、生物活性の質的測定を提供する。幾つかの例において、ＲＯＩ内の蛍光比率及び／又は蛍光輝度に対する平均値の測定は、生物活性の量的測定を提供する。
【０２３０】
図１０は、（ｉ）蛍光比率画像及び／又は対応する蛍光輝度画像内の高い蛍光比率値及び／又は蛍光輝度値を示す関心領域（ＲＯＩ）を同定する、及び（ｉｉ）画像を調製するのに使用されるレシオメトリック蛍光表示体によって生物活性の陽性又は陰性の予測を行うために使用される画像処理アルゴリズムを例示する。２つの異なる発光波長（Ｆ１及びＦ２）での蛍光輝度画像が、蛍光比率画像を算出するために使用される。幾つかの例において、輝度画像はバックグラウンド控除され、及び／又は、比率の算出前に画像をキャプチャするために使用される露光時間へと標準化される。幾つかの例において、蛍光比率画像はＲＯＩの検出のために使用される。幾つかの例において、蛍光比率画像、及び２つの蛍光輝度画像の１つは、ＲＯＩの検出のために使用される。幾つかの例において、蛍光比率画像、及び両方の蛍光輝度画像は、ＲＯＩの検出のために使用される。選択される蛍光比率画像及び／又は蛍光輝度画像の各々に対し、比率及び／又は輝度の閾値は、マスク画像（即ち、対応するする２値画像ファイルであり、そこでは、元の画像が閾値以下である比率又は輝度の値を持つ各ピクセルが、０の値に設定され、元の画像が閾値より大きい比率又は輝度の値を持つ各ピクセルが１の値に設定される）を生成するために使用される。両方の蛍光比率画像及び少なくとも１つの蛍光輝度画像が使用される例において、ＲＯＩは、２つ以上のマスク画像を組み合わせるために論理的なＡＮＤ操作を実行することにより検出される。幾つかの実施形態において、結果として生じるＲＯＩは、それらが最小規模要件を満たすことを確実にする（即ち、生物学的な関連性であることを確実にするように単一のピクセルノイズ又は他の検出アーチファクトを排除する）と随意に評価される。最小のＲＯＩ設定は、画像化システムの光学解像度に関連し、偽陽性の同定を回避するために画像化システムの分解能を超えるように選択される。検証されたＲＯＩの存在は、研究の下で生物試料内の特定の生物活性に対して陽性の予測を行うために使用される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは完全に自動の様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは半自動様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは手動様式で実行される。幾つかの例において、ＲＯＩ内の蛍光比率及び／又は蛍光輝度に対する平均値の測定は、生物活性の質的測定を提供する。幾つかの例において、ＲＯＩ内の蛍光比率及び／又は蛍光輝度に対する平均値の測定は、生物活性の量的測定を提供する。
【０２３１】
図１１は、画像を調製するのに使用されるレシオメトリック蛍光表示体により示される生物活性の陽性又は陰性の予測を行うためにユーザー選択されたＲＯＩが使用される、画像処理アルゴリズムを例示する。２つの異なる発光波長（Ｆ１及びＦ２）での蛍光輝度画像が、蛍光比率画像を算出するために使用される。幾つかの例において、輝度画像はバックグラウンド控除され、及び／又は、比率の算出前に画像をキャプチャするために使用される露光時間へと標準化される。幾つかの例において、蛍光比率画像は、ユーザー選択されたＲＯＩを同定するために使用される。幾つかの例において、蛍光比率画像、及び２つの蛍光輝度画像の１つは、ユーザー選択されたＲＯＩを同定するために使用される。幾つかの例において、蛍光比率画像、及び両方の蛍光輝度画像は、ユーザー選択されたＲＯＩを同定するために使用される。ユーザー選択されたＲＯＩが同定される蛍光比率画像及び／又は蛍光輝度画像の各々に対し、ユーザー選択されたＲＯＩ内の比率値及び／又は輝度値の平均値は、マスク画像（即ち、対応するする２値画像ファイルであり、そこでは、元の画像が閾値以下である比率又は輝度の値を持つ各ピクセルが、０の値に設定され、元の画像が閾値より大きい比率又は輝度の値を持つ各ピクセルが１の値に設定される）を生成するために算出され、且つ蛍光比率及び／又は輝度の閾値と比較される。２つ以上のマスク画像が生成される場合、その後、マスク画像は、全ての閾値が超過しているそれらのＲＯＩを同定するために論理的なＡＮＤ操作の実行によって組み合わせられる。幾つかの例において、結果として生じるＲＯＩは、それらが最小規模要件を満たすことを確実にする（即ち、生物学的な関連性であることを確実にするように単一のピクセルノイズ又は他の検出アーチファクトを排除する）と随意に評価される。最小のＲＯＩ設定は、画像化システムの光学解像度に関連し、偽陽性の同定を回避するために画像化システムの分解能を超えるように選択される。検証されたＲＯＩの存在は、研究の下で生物試料内の特定の生物活性に対して陽性の予測を行うために使用される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは完全に自動の様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは半自動様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは手動様式で実行される。幾つかの例において、ＲＯＩ内の蛍光比率及び／又は蛍光輝度に対する平均値の測定は、生物活性の質的測定を提供する。幾つかの例において、ＲＯＩ内の蛍光比率及び／又は蛍光輝度に対する平均値の測定は、生物活性の量的測定を提供する。
【０２３２】
図１２は、レシオメトリック蛍光表示体を注入された生物試料における生物活性（例えば、癌に相関される増強された細胞外酵素活性）の存在を判定するための蛍光比率閾値及び／又は輝度閾値の最も正確な組み合わせを同定するために使用される、画像処理アルゴリズムの１つの非限定的な例を例示する。２つの異なる発光波長での蛍光輝度画像が、複数の生物試料、即ち、レシオメトリック蛍光表示体を注入された組織標本の各々に関する蛍光比率画像を算出するために使用される。幾つかの例において、輝度画像はバックグラウンド控除され、及び／又は、比率の算出前に画像をキャプチャするために使用される露光時間へと標準化される。出発値は、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、蛍光比率閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対して；及び生物試料の各々に対して提供され、ｉ）画像分析アルゴリズム（例えば、図７、図１０又は図１１に例示されるアルゴリズム）を使用して蛍光比率画像、第１の蛍光輝度画像、第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程であって、該画像分析アルゴリズムは、蛍光比率画像及び蛍光輝度画像のマスク画像を作成するために蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、２つ以上のマスク画像が作成されている場合にマスク画像上でＡＮＤ論理演算を実行し、特定の蛍光比率閾値又は蛍光輝度閾値を超える蛍光比率値又は蛍光輝度値を示す検出された関心領域が特定の最小のサイズよりも大きいことを随意にチェックし、且つ、特定の生物活性（例えば癌）に対して陽性又は陰性としての生物試料の分類を提供する、工程；ｉｉ）前記分類が、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性であるかを判定するために、前記画像分析アルゴリズムによって提供される分類を、前記生物試料に対する病理実験室試験結果と比較する工程；及びｉｉｉ）真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性の結果を記憶する工程が、繰り返される。その後、これら工程は、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、又は蛍光比率閾値の値の増加を使用して繰り返され、一方で、生物試料の全てが画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで、他の閾値は固定されたまま保持される。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、（１−臨床的特異性）（又は「無病誤診率」）に対して臨床的感度（又は「有病正診率」）をプロットするものであり、且つ、診断試験の感度及び特異性を判定するために慣例的に使用される。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、蛍光比率及び輝度閾値の各セットに関する記憶された分類結果を使用して算出され；前記ＲＯＣ曲線下の面積は、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、第２の閾値蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの値に対する最適な設定を決定するために、蛍光比率閾値及び蛍光輝度閾値の各セットに対して比較される。
【０２３３】
この例において、１つの閾値（即ち、蛍光比率閾値又は蛍光輝度閾値）が一度に変動し、一方で他の閾値は、生物試料のセットに関する画像化データと病理研究所データ（又は生物活性の他の独立した判定）との比較に基づいて最も正確な閾値を生成するべく固定されたまま保持されている。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、異なる蛍光比率閾値及び／又は輝度閾値での画像分析からの予測を、例えば病理研究所結果と比較することによって生成される。
【０２３４】
幾つかの実施形態において、閾値最適化アルゴリズムは完全に自動の様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは半自動様式で実行される。幾つかの実施形態において、アルゴリズムは手動様式で実行される。
【０２３５】
本明細書に記載されるアルゴリズムは、レシオメトリック蛍光表示体を使用して対象の生物活性を検出するための開示されたレシオメトリック画像化方法の、臨床的（又は非臨床的）感度（又は「有病正診率」）、特異性（又は「無病正診率」）、及び全体的な予測精度を改善するために、個々に又は組み合わせで使用される。幾つかの例において、感度は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。幾つかの例において、特異性は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。当業者は、感度及び特異性が各々、これら範囲内の任意の値を個別に有し得ること、例えば、感度は９２％であり且つ特異性は９４％であり得ることを、認識する。幾つかの例において、感度及び／又は特異性は、検出される生物活性（又は相関された疾患状態）の型に依存する。例えば、感度及び／又は感度は、検出されている癌の特定の型に応じて変動し得る。
【０２３６】
後述の実施例において、本明細書に開示される画像処理アルゴリズムは、国立衛生研究所により開発されたオープンソースのＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施されているが、当業者によって認識されるように、これらは他の様々なプログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｌｕａ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃなどを含むがこれらに限定されない）、及びソフトウェアパッケージ（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、Ｉｃｙ、ＬａｂＶＩＥＷ、ＭａｔＬａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ）などを含むがこれらに限定されない）の何れかを使用しても実施される。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される画像処理アルゴリズムは、それらがより迅速に実行され、コンピュータメモリーをあまり使用せず、且つ安価なプロセッサ上で実行されるように、アルゴリズムのパフォーマンスを促進するカスタムソフトウェアコードを使用して潜在的に実施され得る。
【０２３７】
コンピュータシステム
【０２３８】
１つ以上のプロセッサが、本明細書に開示される画像処理方法及びアルゴリズムを実施するために使用される。１つ以上のプロセッサは、中央処理装置（ＣＰＵ）、映像処理ユニット（ＧＰＵ）、汎用処理装置、又はコンピューティングプラットフォームなどのハードウェアプロセッサを含み得る。１つ以上のプロセッサは、様々な適切な集積回路、マイクロプロセッサ、論理回路などの何れかで構成され得る。本開示はプロセッサに対する言及と共に記載されるが、他のタイプの集積回路及び論理回路も適用可能であり得る。プロセッサは任意の適切なデータ演算能力を有し得る。例えば、プロセッサは、５１２ビット、２５６ビット、１２８ビット、６４ビット、３２ビット、又は１６のビットのデータ演算を実行することができる。１つ以上のプロセッサは、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、或いは並列処理用に構成された複数のプロセッサでもよい。
【０２３９】
１つ以上のプロセッサ、或いは蛍光画像化システム自体は、より大きなコンピュータシステムの一部であり、及び／又は、画像データ及び予測結果の送信と共有を促進するために通信インターフェースの補助によりコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に動作可能に接続され得る。ネットワークは、ローカルエリアネットワーク、イントラネット、及び／又はエクストラネット、インターネットと通信するイントラネット及び／又はエクストラネット、或いはインターネットであり得る。場合によってはネットワークは、電気通信及び／又はデータのネットワークである。ネットワークは、場合によってはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする、１つ以上のコンピュータサーバーを含み得る。ネットワークは、場合によってはコンピュータシステムの補助により、ピアツーピア・ネットワークを実施することができ、これは、コンピュータシステムに連結されたデバイスが、クライアント又はサーバーとして作動することを可能にし得る。
【０２４０】
コンピュータシステムはまた、メモリ又はメモリ場所（例えばランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置（例えばハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース（例えばネットワークアダプタ）、及び、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、及び／又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺機器も含み得る。メモリ、記憶装置、インターフェース、及び周辺機器は、例えば、マザーボード上で見出されるように、通信バスを介して、１つ以上のプロセッサ、例えばＣＰＵと通信することができる。記憶装置は、データを記憶するためのデータ記憶装置（又はデータリポジトリ）であり得る。
【０２４１】
１つ以上のプロセッサ、例えばＣＰＵは、一連の機械可読命令を実行し、これはプログラム（又はソフトウェア）で具体化される。この命令はメモリ場所に記憶される。命令は、本開示の方法を実行するようにＣＰＵを引き続きプログラムする或いはそのように構成する、ＣＰＵに向けられる。ＣＰＵによって実行される操作の例は、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを含む。ＣＰＵは集積回路などの回路の一部であり得る。システムの１つ以上の他のコンポーネントを回路に含めてもよい。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０２４２】
記憶装置は、ドライバ、ライブラリ、及び保存されたプログラムなどのファイルを記憶する。記憶装置は、ユーザーデータ、例えばユーザー指定の嗜好性、及びユーザー指定のプログラムを記憶する。コンピュータシステムは、場合によっては、イントラネット又はインターネットを通じてコンピュータシステムと通信状態にあるリモートサーバー上に位置付けられるなど、コンピュータシステムの外部にある１つ以上の追加のデータ記憶装置を含み得る。
【０２４３】
開示された画像処理アルゴリズムなどの、本明細書に提供される画像処理方法の幾つかの態様は、例えばメモリ又は電子記憶装置など、コンピュータシステムの電子記憶場所に記憶された機械（例えばプロセッサ）実行可能なコードとして実施される。機械実行可能又は機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供される。使用中に、コードは１つ以上のプロセッサによって実行される。場合によっては、コードは記憶装置から検索され、１つ以上のプロセッサによる即時のアクセスのためにメモリに記憶される。場合によっては、電子記憶装置は排除され、機械実行可能な命令がメモリに記憶される。コードは、コードを実行するように適合された１つ以上のプロセッサを有する機械との使用のために事前にコンパイルされ且つ構成され、或いは実行時にコンパイルされ得る。コードは、事前にコンパイルされた又はアズコンパイルされた（ａｓ−ｃｏｍｐｉｌｅｄ）様式でのコードの実行を可能にするために選択される、プログラミング言語で供給され得る。
【０２４４】
この技術の様々な態様が、典型的に一種の機械可読媒体に記憶される機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形で、「製品」又は「製造用品」として考慮され得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）などの電子記憶装置に、又はハードディスクに記憶される。「記憶」型の媒体は、様々な半導体メモリチップ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、コンピュータやプロセッサの有形メモリ、或いはその関連するモジュールの何れか又は全てを含み、これらは、本明細書に開示される画像処理方法及びアルゴリズムをコードするソフトウェアに対して任意の時点で非一時的な記憶を提供することができる。
【０２４５】
ソフトウェアコードの全て又は一部が時折、インターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを介して通信される。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータ又はプロセッサから別のものへのソフトウェアのローディング、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にする。故に、ソフトウェアでコードされた命令を伝えるために使用される媒体の他のタイプは、有線及び光地上通信線ネットワークを介した、及び様々な大気リンク（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｌｉｎｋ）上での、ローカルデバイス間の物理インターフェースにわたって使用されるものなどの、光波、電波、及び電磁波を含む。有線又は無線リンク、光リンクなどの、そのような波を運ぶ物理要素も、本明細書に開示される方法を実行するためのソフトウェアでコードされた命令を伝える媒体として考慮される。本明細書で使用されるように、非一時的で有形の「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する媒体を指す。
【０２４６】
コンピュータシステムは典型的に、例えば画像化装置によりキャプチャされた画像を提供するための電子ディスプレイを含むか、或いはそれと通信状態にあってもよい。ディスプレイは典型的に、ユーザーインターフェースを提供することもできる。ＵＩの例は、限定されないが、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）、ウェブベースユーザーインターフェースなどを含む。
【実施例】
【０２４７】
これら実施例は例示目的のためだけに提供され、本明細書に提供される請求の範囲を制限するものではない。
【０２４８】
実施例１−ヒトにおけるレシオメトリック画像化
研究設計：レシオメトリック画像化を、手術を受ける原発性で非再発性の乳癌を患う女性において、第１相の非盲検の用量漸増研究の一部として実行した。研究は、１ｍｇの投与量で始まる３＋３のコホート拡張設計を使用する用量漸増相に対して５の投与コホート、その後、投与群の各々に観察される蛍光及び安全性のデータの特徴に基づいて第６の追加のコホートを含んでいた。追加のコホートを、手術及び画像化の前の異なるＳＤＭ−２５（ＡＶＢ−６２０）投与時間にて蛍光特徴と比較した。患者は、乳腺腫瘤摘出／乳房切除術及びセンチネルリンパ節生検／腋窩切開処置を受ける２〜２０時間前にＳＤＭ−２５の注入を受けた。手術野から得られた画像、同様に、露出された原発性腫瘍を含む切除後の外科試料に対し、画像解析を行った。画像化結果を組織病理学データと相関させるために病理報告を得た。ＳＤＭ−２５を、静脈内（ＩＶ）注入を介して投与し、その後、標準の生理食塩溶液で流した。コホート１〜４へと登録された被験体は、外科手術の１２〜２０時間前（前日）に腹腔内（ＩＰ）注射を受けた。拡張コホートの被験体は、外科手術を受ける２〜１２時間前（同日）或いは１２〜２０時間前（前日）にＳＤＭ−２５を受けた。
【０２４９】
画像キャプチャ：研究スポンサーから画像化システムを得て、３つの空間的に登録された画像を同時に記録する三眼カメラシステム（ｔｈｒｅｅ−ｃａｍｅｒａ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用した。１つ目はカラーカメラであり、その他２つのカメラは蛍光を画像化するために使用される。画像化システムは４つのリアルタイム画像を表示する：色が鮮明な視野画像、Ｃｙ５染料蛍光画像、Ｃｙ７染料蛍光画像、及び、２つの蛍光画像から生成されたＣｙ５／Ｃｙ７比率画像。背景画像（励起光が消される）を試料の画像化前に取得した。画像露光時間は投与量により変動し、カメラセンサのダイナミックレンジを満たすように調整された。初期の手術野、残存腫瘍ベッド、及び腋窩の内容物からインビボ画像を得た。外科切除の後、多数の角度から、原発性腫瘍、マージン試料、及び全てのリンパ節の多くの画像を集めた。
【０２５０】
画像分析：記憶された切除組織の画像を手術後に解析した。Ｃｙ５及びＣｙ７の画像をバックグラウンド控除し、これを使用してＣｙ５／Ｃｙ７比率画像を生成した。腫瘍領域（即ち、関心領域（ＲＯＩ））を、高い蛍光比率を示す領域として同定した。対象の組織を含む画像の領域のみが分析されるように、ＲＯＩを引いた。コホートにわたる定量化及び比較のために、蛍光輝度の読み取り値を曝露長さにより標準化した。ＲＯＩからの曝露補正蛍光輝度値（ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｖａｌｕｅｓ）を使用して、最終のＲＯＩ比率画像を生成した。
【０２５１】
図７に示されるようにユーザー定義の閾値に基づいてＲＯＩを自動的に生成する。代替的に、ユーザーは、Ｃｙ５／Ｃｙ７蛍光比率及び／又は輝度に基づいてＲＯＩを手動で選択する。
【０２５２】
ヒト組織サンプルの病理学解析：異なる研究場所にある病理部が、地方部門のプロトコルに従って外科切除された組織を検査した。組織学的分類（例えば、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、腺管癌など）を含む腫瘍サイズ、等級、結節点状態の他、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びＨＥＲ２受容体状態に関するデータを集めた。最終の病理報告のデータを上述の画像解析から導かれた結果に一致させることにより、画像化及び病理学的相関を行った。
【０２５３】
結果：Ｃｙ５及びＣｙ７両方の蛍光輝度は、図８Ａ−図８Ｂに示されるように、切除された乳腺腫瘤摘出組織及びリンパ節の両方におけるＳＤＭ−２５の投与により増大した。図８Ａ：原発性乳腺腫瘤摘出試料；投与量に対する切除された原発性試料組織に関する平均Ｃｙ５及びＣｙ７輝度のプロット。全体の切除試料から値を生成した。図８Ｂ：陰性のリンパ節パケット；研究における各コホートの陰性のリンパ節に関する平均のＣｙ５及びＣｙ７輝度のプロット。全体の切除試料から値を生成した。エラーバーは標準偏差を示す。蛍光比率データのみを使用すると、悪性原発性腫瘍に関する蛍光比率データは、ＳＤＭ−２５の同日及び前日の投与の両方に関する隣接組織のデータとは大きく異なっていた（図９）。
【０２５４】
実施例２−蛍光閾値に基づく診断法
癌が生じ得る場所の画像解析に基づく予測を、Ｃｙ５／Ｃｙ７蛍光比率及びＣｙ５輝度が実施例１に記載されているように集められた原発性試料の画像に対して高かった領域を選択することによって行った。閾値より高い領域に関する最小規模判定と組み合わせたＣｙ５／Ｃｙ７比率閾値及び／又はＣｙ５輝度閾値の使用に基づく自動予測を、国立衛生研究所により開発されたオープンソースＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して生成した。図１０にプロセスは、画像解析を使用してＲＯＩを生成する。代替的に、ユーザー選択されたＲＯＩを使用して、図１１に示されるようなＣｙ５／Ｃｙ７蛍光及び／又はＣｙ５輝度に基づく予測を生成することができた。Ｃｙ５／Ｃｙ７比率及び／又はＣｙ５輝度の所定の閾値に関して、陽性又は陰性の予測を行う。図１１は、蛍光比率画像及び個別の輝度画像からＲＯＩを生成するためのプロセスを概説するフロースキームを示す。前記方法は、蛍光比率閾値、及び／又は、蛍光比率閾値及び個別の蛍光輝度閾値の組み合わせに基づいて、画像マスクを作成する。その後、画像マスクを組み合わせて適用することでＲＯＩを生成する。
【０２５５】
実施例３−蛍光比率値及び蛍光輝度値の両方を使用した診断パフォーマンスの改善
ＲＯＣ曲線解析：最適なＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率閾値、個々の蛍光輝度閾値、及び予測精度を改善するための蛍光輝度及び比率の閾値の組み合わせを判定するために、受信者操作曲線（ＲＯＣ）解析を使用した。ＲＯＣ曲線は、（１−臨床的特異性）（又は「無病誤診率」）に対して臨床的感度（又は「有病正診率」）をプロットするものであり、且つ、診断試験の臨床的感度及び特異性を判定するために慣例的に使用される。図１２のフロースキームに示されるように、画像化された組織サンプルが癌に対し陽性又は陰性であることを試験する上述の画像解析予測を使用して、ＲＯＣ曲線を生成した。
【０２５６】
原発性腫瘍の例：図１１及び図１２に示されるように、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色された組織切片の病理学者評価を含んでいたゴールドスタンダードの病理試験結果を伴うユーザー選択されたＲＯＩを使用して、原発性試料画像の画像解析からの予測を比較することにより、ＲＯＣ曲線を生成した。ＲＯＩにおけるＣｙ５／Ｃｙ７比率及びＣｙ５輝度を異なる閾値と比較し、病理予測を生成した。高い蛍光比率及び高い輝度領域の組み合わせ（陽性と仮定−真陽性又は偽陰性の何れかを予測）並びに原発性試料の領域に隣接する低いＣｙ５／Ｃｙ７比率及び低いＣｙ５輝度（陰性と仮定−真陰性又は偽陽性の何れかを予測）に対する、閾値に基づく病理予測から、ＲＯＣ曲線を生成した。これらの仮定は病理研究所試験と一致していた。結果を図１３Ａ−図１３Ｃに示し、そこでは、最高の予測精度（ＲＯＣ曲線に対する最高の「曲線下面積」（ＡＵＣ））がＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率及びＣｙ５輝度の両方を利用したことが示されている（図１３Ｃ）。図１３Ａ：蛍光比率閾値の変動により算出されたＲＯＣ曲線。全ての投与時間（即ち、同日、前日）の画像データをまとめて解析した。曲線下面積（ＡＵＣ）＝０．８６。図１３Ｂ：蛍光比率閾値の変動により算出されたＲＯＣ曲線、一方で蛍光輝度閾値は、値Ｉ＝８０で固定されたまま保持された；ＡＵＣ＝０．９８。元の８ビットの輝度画像を１６ビットの画像に拡大し、５００ｍｓの露光に対し輝度を標準化した。図１３Ｃ：蛍光輝度閾値の変動により算出されたＲＯＣ曲線、一方で蛍光比率閾値は、（０〜２５５の８ビットの画像データ規模上で）値Ｒ＝６０で固定されたまま保持された；ＡＵＣ＝０．９９。この場合、蛍光比率及び輝度閾値の組み合わせを使用して最高の精度が達成された。
【０２５７】
リンパ節の例：図７、図１０、及び図１２に例示される画像解析プロセスを使用してリンパ節サンプルについて図１４Ａ−図１４Ｂに示されるＲＯＣ曲線を生成し、組織が所定の閾値に対し陽性又は陰性であったかを予測した。図１４Ａ：変動される蛍光比率閾値の変動により算出されたＲＯＣ曲線；Ｉ≧１０に設定された輝度閾値；ＡＵＣ＝０．８３。図１４Ｂ：蛍光比率閾値の変動により算出されたＲＯＣ曲線；Ｉ≧６０に設定された輝度閾値；ＡＵＣ＝０．９５。この場合、蛍光比率及び輝度閾値の組み合わせを使用して最高の精度が達成された。
【０２５８】
ＲＯＣ曲線を、個々の患者レベルでも生成する。図７、図１０、及び図１２に例示される画像解析プロセスのワークフローを使用して図１５Ａ−図１５Ｃに示される個々の患者のＲＯＣ曲線を生成し、組織が所定の閾値に対し陽性又は陰性であったかを予測した。画像化されたエクスビボ組織サンプルは、原発性試料、リンパ節、及びマージンを含んでいた。図１５Ａ：個々の患者に対する蛍光比率閾値ＲＯＣ曲線（Ｉ≧５の蛍光輝度閾値設定）、ＡＵＣ＝０．８５。図１５Ｂ：蛍光輝度閾値ＲＯＣ曲線（Ｒ≧５に設定される蛍光比率閾値）、ＡＵＣ＝０．８３。図１５Ｃ：個々の患者に対する蛍光比率及び蛍光輝度のＲＯＣ曲線の組み合わせ；蛍光輝度閾値をＩ＝８５で固定されたまま保持されるにつれ蛍光比率閾値が増大、ＡＵＣ＝１．００。この場合、蛍光比率及び輝度閾値の組み合わせを使用して最高の精度が再び達成された。
【０２５９】
臨床研究：手術の前日（ＤＢＤ）に８ｍｇのＳＤＭ−２５を患者に投与した。画像化及び解析の方法は上述の方法に基づいた。
【０２６０】
臨床研究からの乳腺腫瘤摘出表面及びマージン切除（Ｓｈａｖｅｓ）の例：図７、１０、及び１２に例示される画像解析プロセスを使用して外科的腔から得られる、切除された乳腺腫瘤摘出表面及び切除マージンサンプルに対してＲＯＣ曲線を生成し、組織が所定の閾値に対して陽性又は陰性であったかどうかを予測した。全ての試料及び表面データを病理結果と相関させた。精度の測定値である、曲線下面積（ＡＵＣ）結果を、以下の表１に示す。
【０２６１】
【表１】
2020519851.tif 000003
【０２６２】
表１に例示されるこれら組織試料の両方において、最高の診断パフォーマンス又は精度が、蛍光比率及び輝度閾値の組み合わせを使用して達成された。
【０２６３】
実施例４−ＳＤＭ−２５を投与した患者から切除されたヒト乳癌における予測された癌性活性を表示する画像
本方法の目的は癌の手術中又は周術期の存在を視覚的に示すことであった。研究からの画像の例を図１６に示す。Ｃｙ５／Ｃｙ７比率及びＣｙ５輝度が特定の閾値より上である画像の領域を、上述の方法を使用して判定し、緑色に着色する。注入後の日に得られた画像に対し使用されるものと異なるＣｙ５／Ｃｙ７比率閾値を、注入と同じ日に得られた画像に対して使用した。比率及び輝度の閾値の両方は、カメラから生成された０〜２５５のピクセル値の８ビットの画像表示に基づく。表示ソフトウェアにおけるＣｙ５閾値スライダーを移動させることにより変換させることなく、Ｃｙ５輝度閾値が入力され得る。比率閾値（８ビット）をパーセンテージ（１００×（閾値／２５５））に変換し、ソフトウェアビューアーにおいてスライダー標識されたバックグラウンドを移動させることにより入力した。Ｃｙ５輝度閾値は、露光又は輝度の差異について補正されなかった。
【０２６４】
実施例５−ＳＤＭ−２５を投与した患者から切除された原発性乳腺腫瘤摘出試料における予測された癌性活性を表示する画像
陽性の乳腺腫瘤摘出表面マージンの例。癌に対し陽性であると病理学によって実証される、外科切除された原発性乳腺腫瘤摘出試料の表面の画像の例を、図１９Ａ−図１９Ｂに示す。Ｃｙ５／Ｃｙ７比率及びＣｙ５輝度が特定の閾値より上である画像の領域を、上述の方法を使用するＩｍａｇｅＪソフトウェアして判定し、再び薄い灰色に着色する。矢印は、病理学により実証された癌を有する表面に相当する閾値より上の領域を指し示す。この実施例において、Ｃｙ５輝度閾値を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して露光について調整した。
【０２６５】
図１９Ａと図１９Ｂは、８ｍｇの用量のＳＤＭ−２５を投与した患者からの原発性試料画像の表面マージンの例を提供し、画像化は注入後の日に実行された。薄い灰色の領域は、Ｒ≧１７０のＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率閾値及びＩ≧５０のＣｙ５輝度閾値を示す。矢印は、病理学により実証された癌を有する表面に相当する閾値より上の領域を指し示す。閾値は記載された方法を使用して判定された。
【０２６６】
実施例６−乳癌のマウスモデルにおけるレシオメトリック画像化
インビボのマウスモデル：造影剤評価のために使用されるリンパ性転移及び頸部リンパ節転移のマウスの耳の腫瘍モデルを、黒色腫モデルについて記載された方法の改変に基づいて発達させた（Ｈｏｓｈｉｄａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  “Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｃ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅｓ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６：８０６５−７５）。ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２５３９（商標））からの転移性４Ｔ１腫瘍細胞を成長させ、ＤＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（１：１ｖｏｌ）に懸濁させ、その後、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ケタミン−キシラジン麻酔の下で耳介軟骨より上の右耳耳介上に皮下注射した（４×１０５腫瘍細胞／５０ｍＬ／マウス）。耳の腫瘍の成長は、癌細胞のリンパ節への移動による頸部リンパ節転移に従った。耳の腫瘍細胞移植の１７〜２０日後（４Ｔ１腫瘍モデル）、耳に腫瘍のあるマウスを使用してＳＤＭ−２５を試験した。腫瘍のあるマウスを無作為に選択し、回転尾部注射器を使用して拘束し（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  ＭＡ）、ＳＤＭ−２５溶液（６０μＭのＳＤＭ−２５；１００μＬ／〜２０グラムのマウス、即ち、体重１ｋｇにつき１．８ｍｇ）を静脈内（尾静脈）投与した。投与後、腫瘍のあるマウスを各々、その割り当てられた収容ケージに戻し、研究前に制御された環境条件（自由裁量で食物と水）下で保存した。３０  ４Ｔ１腫瘍のあるマウスの合計を、ＳＤＭ−２５投与の３時間（Ｎ＝９）及び６時間（Ｎ＝２１）後に検査した。
【０２６７】
画像化手順及びハードウェア：原発性腫瘍及び頸リンパ節を、ケタミンＨＣｌ／キシラジンＨＣｌ（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン−１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン）の混合物の腹腔内投与で末期に麻酔された腫瘍のあるマウスにおいてインビボで画像化した。各マウスは、同側性（腫瘍のある耳側）及び対側性の頸リンパ節の鈍的剥離を受けた。手術後、６つの主要な目視可能な表面の頸リンパ節（同側性及び対側性の節を含む）を同定し、生理食塩水（０．９％の塩化ナトリウム灌注ＵＳＰ、Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）により湿らせて、以下を含む様々なシステムを使用して画像化した：Ｈａｍａｍａｔｓｕ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｓｈｉｚｕｏｋａ−Ｐｒｅｆ，  Ｊａｐａｎ）からの画像取得用のＨＣＩｍａｇｅソフトウェアシステムに連結されたＳＺＸ１０蛍光立体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ，  ＣＯ，  Ｌｔｄ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）；及び、画像取得用のＳｐｏｔソフトウェア５．０（ＳＰＯＴ（商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＭＩ）にインターフェースされる、カスタマイズされたＮａｖｉｔａｒ画像化システム（Ｎａｖｉｔａｒ  Ｉｎｃ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）。上述の蛍光画像化システムの全てが、Ｃｙ５フルオロフォアを励起するために〜６３０＋／−２０ｎｍで発行するＬＥＤ光源、及び同じ視野のＣｙ５及びＣｙ７の輝度画像を別々にキャプチャするための２つの発光フィルターを備えていた。
【０２６８】
診断上の蛍光画像解析：耳に腫瘍のあるマウスへのＳＤＭ−２５投与後に、頸リンパ節を画像化し、解析した。腫瘍のあるマウス各々について、同側性及び対側性の頸リンパ節両方を含んでいるＣｙ５及びＣｙ７の蛍光画像を集め、これを使用してＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率画像を作成した。画像化処理プログラムＩｍａｇｅＪを使用してＣｙ７画像でＣｙ５画像を割ることによって比率画像を作成した。場合によっては、輝度重み付き擬色比率画像（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｌｏｒ  ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｅ）を、表示目的のために反射光画像と組み合わせた。楕円又は多角形の関心領域（ＲＯＩ）を各頸リンパ節のために引き、ＲＯＩにおける個々の平均された蛍光輝度を測定された。比率が検査されたリンパ節において均一であった場合、全体のリンパ節をＲＯＩに使用した。画像化された頸リンパ節上に、（リンパ節領域の＞５％であることを要求される）高い蛍光比率の明確に定められた領域として定められる「ホットスポット」があった場合、その後、より小さなホットスポットＲＯＩを解析のために選択した。平均Ｃｙ５／Ｃｙ７蛍光比率を各ＲＯＩから算出した。
【０２６９】
比率画像の表示のために、露光補正したＣｙ５波長蛍光画像を、露光補正したＣｙ７発光波長で割り、１５を掛けると、比率画像に関する値は、後述のように８ビットの範囲を満たし、０〜２２５の間に存在する。その後、各輝度レベルに対し割り当てられたＲＧＢ値を含むルックアップテーブルを使用し、比率画像を疑似着色した。色調又は色が比率を表し且つ明るさが蛍光輝度を表わす画像を結果としてもたらすＣｙ５又はＣｙ７の波長の蛍光画像に、疑似着色画像を掛けることによって、疑似着色比率画像を蛍光輝度に対しスケーリングした。
表示比率画像値＝１５＊（ＩＣｙ５／ＴＣｙ５）／（ＩＣｙ７／ＴＣｙ７）
式中：
ＩＣｙ５＝Ｃｙ５波長蛍光画像輝度
ＩＣｙ７＝Ｃｙ７波長蛍光画像輝度
ＴＣｙ５＝Ｃｙ５露光時間
ＴＣｙ７＝Ｃｙ７露光時間
【０２７０】
染色された頸リンパ節セクションのＨ＆Ｅ解析から判定されるような、算出された蛍光発光比率とリンパ節の病理学的状態（癌細胞の存在／不在）との比較を使用して、臨床的感度及び特異性を評価した。その後、陰性（無病誤診率）の偽陽性分画に対して陽性（有病正診率）の真陽性分画をプロットする、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築して、ＳＤＭ−２５の臨床的感度及び特異性を判定した。ＲＯＣ曲線解析のために、データを、蛍光発光比率の閾値に基づいて陽性及び陰性の二通りの分類へと分割した。
【０２７１】
画像化された頚部前哨リンパ節からの蛍光発光比率データ及び閾値に基づく予測をと比較することによって、真陽性、偽陽性、真陰性、及び偽陰性を判定し、癌細胞の存在（陽性）及び不在（陰性）は、画像化された頸リンパ節のＨ＆Ｅ染色した組織切片を使用して病理学者により判定される。
【０２７２】
閾値を、低い値から高い値へと徐々に調節して、（１，１）又は全ての陽性から（０，０）又は全ての陰性までの完全なＲＯＣ曲線を得た。実際、データを選別し、且つ、検査されたリンパ節の各々に対する実際の比率値より直ぐ上の閾値を使用することにより、ＲＯＣ曲線を生成した。ブール論理を使用するエクセルスプレッドシートを使用して、ＲＯＣ曲線における各点の真陽性、偽陰性、真陰性、及び偽陽性を算出した。感度は有病正診率として算出された一方、特異性は無病誤診率を引いたものとして算出された。
【０２７３】
組織病理学：画像化の後、各マウスを末期に麻酔をかけ、頸リンパ節を採取し、１０％の中性ホルマリンに固定した。末期に麻酔をかけられたマウスを、心臓内のケタミン−キシラジンの過剰投与によって直ちに屠殺した。一晩のホルマリン固定後、頸リンパ節を組織学のために処理して、蛍光／癌の相関を評価した。頚部前哨リンパ節のパラフィン切片（５μｍ）を得て、Ｚｙａｇｅｎ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）及びＨｉｓｔｏＴｏｘ  Ｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｂｏｕｌｄｅｒ，  ＣＯ）によって行われる慣例的なヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理した。頸リンパ節組織における転移性癌細胞の存在／不在の古典的判定である外科病理学評価を、ＶＡ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）の公認解剖学者及び臨床病理学者によって実施した。Ｈ＆Ｅ染色した頸リンパ節切片を検査し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  （Ｔｏｃｈｉｇｉ  Ｎｉｋｏｎ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  Ｔｏｃｈｉｇｉ，  Ｊａｐａｎ）を使用して盲検した。Ｈ＆Ｅ切片における転移性癌細胞の有無を、標準の組織病理学基準の適用により判定した。
【０２７４】
実施例７−マウス転移性リンパ節モデルにおけるインビボの画像診断
インビボで活性化され且つリンパ節において乳癌を視覚化するＳＤＭ−２５の能力を評価するために、リンパ節モデルにおけるマウス転移性乳癌を使用した。実験プロトコルの概要を図１７Ａ−図１７Ｄに示す。癌細胞を免疫応答性マウスの耳に移植し、〜２週間後に頸リンパ節に転移させた（図１７Ａ）。ＳＤＭ−２５を投与し、３−６時間後、マウスに麻酔をかけ、頸リンパ節を外科的にさらし、画像化した（図１７Ｂ−図１７Ｃ）。最後に、画像化されたリンパ節を除去し、Ｈ＆Ｅ病理学的評価のために処理し、画像化及び病理学の結果を比較した（図１７Ｄ）。第１のモデルにおいて、耳介上に転移性４Ｔ１乳癌腫瘍がある３０匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＳＤＭ−２５（６ｎｍｏｌ）を、尾静脈注射を介して静脈内投与した。画像化投与量を、２〜２４ｎｍｏｌ／マウスの研究に及ぶ投与量からに確立させた。６ｎｍｏｌの投与量が悪性と非悪性のリンパ節間の最大のＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率の差異をもたらしたが、Ｃｙ５及びＣｙ７両方の画像において許容可能な蛍光輝度シグナル−バックグラウンド比を今なおもたらしている。マウスの背側の前面像及び外科的にさらされた頸リンパ節の、手術前の蛍光画像化を、３−６時間後に実行した。手術前の画像は、耳に移植された原発性腫瘍を示す。重ねられた蛍光比率画像を含む、及びそれを含まない、代表的な白黒画像を、図１８Ａに示す。画像は、病理学的に確認された原発性腫瘍に、露出された身体の残りの部分と比較して高いＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率及び輝度があることを示している。手術後、６０のリンパ節の蛍光比率画像を解析し、ゴールドスタンダードＨ＆Ｅ組織病理学試験の結果と比較し、画像化精度を評価して、結果を図１８Ｂに示す。診断の感度及び特異性はそれぞれ、９８％の最高精度をもたらした６．７−７．４からの比率閾値を使用して、９６％及び１００％であった。１匹のマウスの代表的な画像を図１８Ｃに示す。
【０２７５】
癌のないリンパ節と転移性のリンパ節との間のＣｙ５／Ｃｙ７蛍光比率の差異の、動力学及び安定性を、ＳＤＭ−２５の投与の１〜４８時間後に評価した。結果を図１８Ｄに示す。有意な蛍光比率の差異を１時間で観察した（ｐ＜０．０２、ｔ検定）が、３−６時間で最大になり、２４時間で安定した。この有用な時間窓は、０．２４時間のマウスにおけるＳＤＭ−２５血漿内半減期よりもかなり大きい。４８時間で、比率の差異は今なお著しい（ｐ＜０．０１、ｔ検定）が、主として非関与のリンパ節におけるＣｙ５／Ｃｙ７比率の増加が原因で減少する。この結果は、ｒ９ｅ９レシオメトリックＡＣＰＰに対し観察されたものと大きく異なり、これは、２時間で最大コントラストを備え、２４時間で悪性組織と非悪性組織との差異を示さないと考えられる。
【０２７６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において任意の組み合わせで利用される得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１】
2020519851.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2020519851.tif 000011
【図８Ｂ】
2020519851.tif 000012
【図９】
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【図１０】
2020519851.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【国際調査報告】
2020519851.tif 000030
2020519851.tif 000031