(57)【要約】  本発明は、薬物送達における改善と、例えば、ｉ）２つのアミノ酸をステープルしてステープルＣＰＰ（ＳｔａＰ）を形成するか、又はｉｉ）３つ以上のアミノ酸をステッチしてステッチＣＰＰ（ＳｔｉＰ）を形成することによって安定化されている細胞透過剤（ＣＰＡ）又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用とに関する。より詳細には、生物活性化合物（ＢＡＣ）及び細胞透過剤（ＣＰＡ）を含む薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）であって、ＢＡＣ及びＣＰＡは、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して連結される、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）が提供される。ＣＰＡは、安定化ペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチド（ＣＰＰ）である。ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、そのペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及びクロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する。環化は、アルデヒド若しくはケトンのヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；チオール−エンマイケル付加；ジスルフィド形成；ヒュスゲン１，３双極子環化付加；アミンとカルボン酸との間の反応；一重項若しくは三重項に基づくカルビン反応；又は鈴木若しくは薗頭カップリングの１つ以上によって達成され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．生物活性化合物（ＢＡＣ）と、
ｉｉ．細胞透過剤（ＣＰＡ）であって、ＢＡＣ及びＣＰＡは、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して連結される、細胞透過剤（ＣＰＡ）と
を含む薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）であって、前記ＣＰＡは、安定化ペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチド（ＣＰＰ）であり、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）。
【請求項２】
環化は、
ｉ．アルデヒド若しくはケトンとヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；
ｉｉ．チオール−エンマイケル付加；
ｉｉｉ．ジスルフィド形成；
ｉｖ．ヒュスゲン１，３双極子環化付加；
ｖ．アミンとカルボン酸との間の反応；
ｖｉ．一重項若しくは三重項に基づくカルビン反応；又は
ｖｉｉ．鈴木若しくは薗頭カップリング
の１つ以上によって達成される、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３】
ｉｖ）において、トリアゾールは、アジド又は電子欠損型ニトリル含有アミノ酸とプロピジル含有アミノ酸との間で形成される、請求項２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項４】
前記アジドは、アジドリジンである、請求項３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項５】
前記プロピジル含有アミノ酸は、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸である、請求項３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項６】
ｖ）において、ラクタムは、遊離アミン含有アミノ酸とカルボン酸含有アミノ酸との間で形成される、請求項２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項７】
前記ラクタムは、リジンとグルタミン酸又はアスパラギン酸とをクロスリンクさせることによって形成される、請求項６に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項８】
各クロスリンクは、２〜２０原子の名目上の連続長さを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項９】
前記安定化ペプチドは、少なくとも１つのαヘリックス、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１０】
前記安定化ペプチドは、少なくとも１つのβシート、又はヘアピン、又はターンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１１】
前記安定化ペプチドは、少なくとも１つのαヘリックス、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスと、１つのβシート、ターン又はヘアピンとを含む、請求項９又は１０に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１２】
前記ＢＡＣは、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１３】
前記ＯＮは、電気的に低い電荷を保有するＯＮである、請求項１２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１４】
前記ＯＮは、電気的に中性の電荷を保有するＯＮである、請求項１３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１５】
前記ＯＮは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその変異体である、請求項１３又は１４に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１６】
前記ＯＮは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１７】
前記ＯＮは、ハイブリッド化学物質を有するＯＮを含む、表４の化合物から選択される化学物質を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１８】
前記ＢＡＣは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である、請求項１２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１９】
前記ＢＡＣは、内因性又は外因性遺伝子の発現を改変する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２０】
前記内因性遺伝子は、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患又は後天性ウイルス感染症を標的にする、請求項１９に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２１】
前記ＢＦＬは、表６の化学物質から選択される化学物質を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２２】
シクロヘキサンスペーサーによって分離されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレミド反応基を含有するアミンからスルフヒドリルへのクロスリンカーを含む、請求項２１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２３】
前記ＢＦＬは、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）である、請求項２１又は２２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２４】
前記ＢＦＬは、ＨＮＡであり、且つ前記ＣＰＰの末端に組み込まれている、請求項２１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２５】
前記ＢＦＬは、ＨＮＡであり、且つ前記ＯＮは、共有結合による複合を促進するため、４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾されている、請求項２４に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２６】
前記ＳＭＣＣは、ＰＥＧ化される、請求項２３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２７】
前記ＨＮＡは、ＰＥＧ化される、請求項２４又は２５に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２８】
前記ＣＰＡは、前記ＢＦＬの第１の末端に共有結合により連結される、請求項２１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２９】
前記ＢＡＣは、前記ＢＦＬの第２の末端に共有結合により連結される、請求項２１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３０】
１．５ＫＤａより大きいサイズを有する、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３１】
生物活性化合物（ＢＡＣ）の細胞への取り込みを、安定化ペプチドであって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）への前記生物活性化合物の複合によって促進する方法であって、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を形成し、且つ前記ＤＣＣＰＭを前記細胞に好適な媒体内で提示するため、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、方法。
【請求項３２】
内因性又は外因性遺伝子の発現の改変を必要とする疾患の治療に用いられる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３３】
神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患又は後天性ウイルス感染症の治療に用いられる、請求項３２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３４】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に用いられる、請求項３２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３５】
前記ジストロフィン遺伝子を標的にするＡＯを含む、請求項３４に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３６】
薬剤又はＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法であって、前記薬剤又はＢＡＣを、安定化ペプチドであって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結することを含み、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、方法。
【請求項３７】
薬剤又はＢＡＣを、部位であって、その天然状態で前記薬剤又はＢＡＣに対して難治性である部位に導入する方法であって、前記薬剤又はＢＡＣを、安定化ペプチドであって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結することであって、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、連結することと、それを対象に投与することとを含む方法。
【請求項３８】
前記組織は、心臓、脳、筋肉又は肝臓の１つである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
内因性又は外因性遺伝子の発現を改変するように対象を治療する方法であって、請求項１〜３０又は３２〜３５のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭを投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
請求項１〜３０又は３２〜３５のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ及び１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物。
【請求項４１】
経口的、非経口的、静脈内又は局所的投与に適応されている、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達における改善に関する。
【０００２】
より詳細には、細胞透過剤（ＣＰＡ）の使用、より詳細にはさらに、例えば、ｉ）２つのアミノ酸をステープルしてステープルＣＰＰ（ＳｔａＰ）を形成するか、又はｉｉ）３つ以上のアミノ酸をステッチしてステッチＣＰＰ（ＳｔｉＰ）を形成することによって安定化されている細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用に関する。
【０００３】
それは、ペプチドを安定化させるため、オレフィンメタセシスに対する異なる化学を用いる場合の、本出願人の早期の特許出願ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書と異なる。これらの化学は、ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を提供し、及びクロスリンク又は架橋は、少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する。これらの代替化学では、環化は、
ｉ．アルデヒド若しくはケトンとヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；
ｉｉ．チオール−エンマイケル付加；
ｉｉｉ．ジスルフィド形成；
ｉｖ．ヒュスゲン１，３双極子環化付加；
ｖ．アミンとカルボン酸との間の反応；
ｖｉ．一重項若しくは三重項に基づくカルビン反応；又は
ｖｉｉ．鈴木若しくは薗頭カップリング
の１つ以上によって達成される。
【０００４】
これらのＳｔａＰ又はＳｔｉＰは、単一又は複数のステープル又はステッチから構成され得、ペプチド配列に沿って隣接していても又は隣接していなくてもよい。
【０００５】
これらの安定化されたＣＰＰは、薬剤又は生物活性化合物（ＢＡＣ）に直接的に又は二機能リンカー（ＢＦＬ）を介して複合され、それにより、ＢＡＣは、ＣＰＰによって細胞膜を通して運搬され得る。得られる分子は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）と称される。
【０００６】
この様式で送達される好ましいＢＡＣは、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）、より好ましくはさらに電気的に低い電荷を有するオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３）、最も好ましくは電気的に中性のオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−１〜＋１）、例えば、限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその修飾誘導体である。
【０００７】
代わりに、安定化されたＣＰＰは、ＯＮに複合されるとき、直接的に又はＢＦＬを介して、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質分子のいずれかであるＢＡＣと共有結合的又は非共有結合的に会合し、それにより、ＢＡＣは、ＣＰＰ複合ＯＮによって細胞膜を通して運搬され得る。得られる分子は、薬剤標的化細胞透過分子（ＤＴＣＰＭ）と称される。
【０００８】
好ましいＢＦＬは、アミン基などの修飾を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含むようにＰＥＧ化されるか、又はスペーサー、例えばβ−アラニンを組み込み得る。これらの修飾は、可溶化を改善するか又は機能的部分間の適切なスペーシングを提供し得る。
【０００９】
本発明は、ＢＡＣの細胞への取り込みを促進する方法、内因性又は外因性遺伝子の改変を要求する疾患の治療におけるＤＣＣＰＭの使用、薬剤又はＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法、薬剤又はＢＡＣを、部位であって、その天然状態で薬剤又はＢＡＣに対して抵抗性がある部位に導入する方法、対象を治療する方法であって、本発明のＤＣＣＰＭを投与するステップを含む方法、及びＤＣＣＰＭと、その薬学的塩と、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
【００１０】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質分子のいずれかであるＢＡＣの細胞への取り込みを促進する方法、内因性又は外因性遺伝子の改変を要求する疾患の治療におけるＤＴＣＰＭの使用、薬剤又はＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法、薬剤又はＢＡＣを、部位であって、その天然状態で薬剤又はＢＡＣに対して難治性である部位に導入する方法、対象を治療する方法であって、本発明のＤＴＣＰＭを投与することを含む方法、及びＤＴＣＰＭと、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
【００１１】
さらに、さらなる態様が詳細な説明から明らかになるであろう。
【背景技術】
【００１２】
すべての疾患の治療において、薬剤又はＢＡＣを身体、より好ましくは標的部位での細胞に、最小毒性で最大効果を保証する様式で送達することが望ましい。これは、困難な課題であり得る。
【００１３】
標的化様式で送達される薬剤又はＢＡＣの例は、ＯＮ類似体を含む用語のオリゴヌクレオチド（ＯＮ）である。
【００１４】
ＯＮは、必須ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質配列を標的にし得、（ｉ）ＲＮＡスプライシング、（ｉｉ）タンパク質翻訳、又は（ｉｉｉ）他の核酸：核酸若しくは核酸：タンパク質相互作用を抑制するための立体的遮断を含むいくつかの方法で遺伝子発現を調節し得る。
【００１５】
詳細には、ＯＮの特異的なＲＮＡ配列モチーフへのハイブリダイゼーションにより、スプライソソームの正確なアセンブリが阻止され、それによりプレｍＲＮＡ中の標的エクソンを認識することができず、したがって成熟遺伝子転写物中のこれらのエクソンが除去される。インフレームエクソンの除去により、切断されても機能的である遺伝子産物がもたらされ得；フレーム外エクソンの除去により、転写物のフレームシフトがもたらされ、潜在的に中途での停止コドン及び標的遺伝子発現レベルにおける低下がもたらされる。同様に、ＯＮは、遺伝子の特定のエクソンを成熟ｍＲＮＡ転写物から排除するため、ＲＮＡスプライシングを調節することを介して細胞タンパク質含量を改変し得る。まとめると、これにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（エクソン排除）及び脊髄性筋萎縮（エクソン包含）１，２などの状態に対する翻訳プログラム並びにその後の市場承認が得られている。
【００１６】
加えて、ＯＮは、翻訳機構の結合を阻止するため、ウイルス遺伝子転写物の５’翻訳開始部位を標的にするように設計され得る。ウイルス翻訳を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）の使用は、十分に確立された技術であり３、マールブルグ及びエボラなどのウイルス出血熱に対する臨床試験まで進んでいる４，５。しかしながら、ＡＯは、内因性発現遺伝子の５’翻訳開始部位を標的にするように設計可能である。
【００１７】
また、ＯＮは、転写物の核外輸送、翻訳及び安定性を改変する内因性転写物の３’非翻訳領域を標的にするように設計可能である。かかる標的は、限定はされないが、転写物のポリアデニル化及び／又は切断部位を含む。
【００１８】
また、ＯＮは、二次及び三次構造がタンパク質又は他の細胞標的に結合し、それにより特定の遺伝子発現レベル又は他の細胞プロセス（例えば、翻訳後修飾）に影響し得るようなアプタマーを形成するように設計され得る。
【００１９】
ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体のｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉに基づくリボヌクレアーゼＨの誘導の利点を上回る立体的遮断に基づく抑制の利点は、オフターゲット副作用の可能性低下である。
【００２０】
負荷電骨格を作製するためのＯＮの修飾により、安定性が改善される６〜９が、これらの骨格化学、例えば２’Ｏ−メチルホスホチオエート類似体は、膜毒性の問題を誘発し、血小板減少症及び臨床解釈時の注射部位の問題を引き起こすことから１０、投与プロトコルが次第に断続的になるときでも有効性が毒性の問題により妨げられる１１。
【００２１】
確かに、国際公開第２０１３／１５０３３８号パンフレット及び国際公開第２０１４／０５３６２２号パンフレットの両方は、小型の（典型的には１．５ＫＤａより小さい）負荷電ＯＮを、１５以上のアミノ酸及び１５〜２７の範囲内のアミノ酸の正電荷の線状又はステープルペプチドと複合体を形成することにより、送達することを開示している。
【００２２】
ＪＡＣＳ，Ｖｏｌ  １３６，２０１４，ＧＪ  Ｈｉｌｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌは、細胞を透過できるステープル及びステッチペプチドを記載している。これらのペプチドであれば、オリゴヌクレオチドを送達するため、おそらく上に開示される国際出願中に開示される場合と同様に、すなわち複合体形成により用いることができるという可能性について言及されている。はるかに大型の（１．５ＫＤａ超〜２．５ＫＤａ、５ＫＤａ、７．５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１２．５ＫＤａ又はそれを超える）新しい実体を、任意選択的にＢＦＬを介してＢＡＣをＣＰＡと共有結合により連結することにより作出することを示唆することはなく、確かに、先行的な方法は、複合体形成を促進するため、各々の成分が反対電荷を有することを必要とする。
【００２３】
直接的に又はＢＦＬを用いて間接的に（共有結合により）複合される、電気的に低い電荷を有するオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３）、最も好ましくは電気的に中性のオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−１〜＋１）、例えば、限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の使用は、明白でも明確でもなかったが、ＯＮ上の電荷を制限することは、担体としてのより小さいペプチド（１５アミノ酸長未満、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６〜わずか５又は４）の使用をさらに可能にする。
【００２４】
非荷電ＯＮ骨格、例えばホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の使用は、前臨床及び臨床状況において欠点のない安全性の記録を有することから、興味深いＢＡＣを表す２，４、１２〜１４。
【００２５】
しかし、細胞を透過し、それらの標的に接近するそれらの能力は、それらの非荷電性に起因して損なわれる１５。
【００２６】
したがって、ＯＮの細胞への侵入を促進するという課題を克服することが望ましい。
【００２７】
標的化された様式で送達される薬剤又はＢＡＣの他の例として、ＤＮＡ分子（直鎖状及び環状化分子を含む）、ＲＮＡ分子及びペプチドが挙げられる。
【００２８】
タンパク質増強及びウイルス媒介性の遺伝子増強方法を含むかかる方法は、多くの医学的発展の礎石となっているが、カーゴ送達の標的化の課題及び効率は、多くの問題を構成し得る。
【００２９】
再度、かかるＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチドに基づくＢＡＣの細胞への侵入を促進するという課題を克服することも望ましく、例えば感染性ビリオンへのパッケージングの不在下でのウイルスゲノムの環状化が挙げられる。
【００３０】
過去２０年にわたり、薬剤及びＢＡＣの生物学的作用部位への送達を促進するＣＰＡを開発することに多くの研究が注力されてきた。
【００３１】
その手法は、一般に、ＢＡＣの細胞侵入を促進するため、荷電ペプチドを非共有結合複合体として用いることであった。複合についても試みられている。
【００３２】
国際公開第２０１４／０６４２５８号パンフレットは、既存の複合技術の例である。負荷電ＯＮは、標的化ペプチドにリンカーを介してカップリングされる。標的化ペプチドは、受容体標的化部分であり、ステープル又はステッチペプチドでなく、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が受容体標的化部分を用いて細胞侵入できるか否かに関して、負荷電ＯＮがかかる部分に結合されると、非共有結合相互作用がその立体構造を改変することから、当然ながら多くの疑問が生じる１６。
【００３３】
国際公開第８９／０３８４９号パンフレットは、オリゴヌクレオチド−ポリアミド複合体を開示している。ステッチ又はステープルペプチドの使用に関する開示はない。その記載される方法では、オリゴヌクレオチドは、本質的に、ペプチドの鎖伸長のためのスキャフォールドとして用い、ＯＮなどのＢＡＣ送達のための複合体として用いない。
【００３４】
国際公開第２０１１／１３１６９３号パンフレットは、所与の標的遺伝子に特異的な核酸及び神経伝達物質トランスポーターの選択的阻害剤を含有する核酸構築物を記載している。送達剤としてのステッチ又はステープルペプチドの使用に関する開示はない。
【００３５】
国際公開第２０１７／０１１８２０号パンフレットは、ペプチドを安定化するために用いられるクロスリンク基について記載している。
【００３６】
ペプチド媒介性細胞送達を生じさせる能力があるペプチドは、細胞送達ペプチド（ＣＤＰ）とも称され得る。例として、ポリアルギニン、ペネトラチン（アンテナペディアホメオドメインに基づく）又はＰＭＯ内在化ペプチド（ＰＩＰ）が挙げられる。
【００３７】
しかし、それらの第１の記述１７以降、また多数のＣＰＰが複数のアルギニン、β−アラニン及び６−アミノヘキサン酸残基（例えば、ポリ−Ａｒｇ１２、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｐｉｐ６ａ）を有することを考慮すると［ｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／で維持されるデータベース］１８、臨床試験のすべての相を通して進行しているＣＰＰ送達剤が存在しないことは、意外である。部分的には、これは、大部分のＣＰＰを有効にする一般的なアルギニンリッチコアが膜変形も引き起こし１９、より高等な哺乳類では、これが禁止された有毒な副作用、例えば腎臓の尿細管変性として現れる２０ためであり得る。
【００３８】
生理学的ｐＨでは、またアミノ酸Ｒ基のｐＫａに基づき、形式電荷（ＦＣ）は、式：
【数１】
2020525462.tif 000002
（式中、Ｖ＝孤立中性原子の価電子；Ｎ＝規定される原子上の非結合価電子の数；Ｂ＝結合で共有される電子の総数である）
に基づいて算出され得る。
【００３９】
確かに、これに基づき、典型的には今日まで用いられるＣＰＰは、多数の正電荷残基を有する。この正電荷と膜毒性との間に相関があることが示されている２１。ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書では、本出願人は、８つのアミノ酸ペプチドの形式電荷における＋３から＋２、＋１及び０への低下が、チャージバリアントの低下により細胞侵入特性が保持されるというような興味深い特性を有するという証拠を提供した。本出願人は、ここで、閉環メタセシスにより環化されているＣＰＰのチャージバリアントの低下が、＋３の形式電荷を有する元のＣＰＰと比べて毒性学的特性を改善しているというデータを提出する。
【００４０】
したがって、生物学的膜を通過する能力を保持する一方、アミノ酸配列内部により少量の陽性荷電残基を有するＣＰＰは、より臨床的に重要となる。本出願人は、ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書に開示のように、この課題を克服し、また本願は、その拡張であり、代替的な安定化ペプチドを提供するさらなるケミストリーが利用される。
【００４１】
以前、本出願人は、ジストロフィンを生成する遺伝子を修復するように標的化されたＯＮを送達することにより、このことを例示している。ＯＮを用いて特定遺伝子を標的化することは、例えば、国際公開第２００９／０５４７２５号パンフレット及び国際公開第２０１０／１２３３６９号パンフレットによって例示のように、当然ながら本質的に公知である。しかし、これらの公表物では、負荷電骨格が用いられ、カーゴが直接的に又は複合体形成を用いて送達される。
【００４２】
ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書は、ステープル及びステッチペプチド、すなわち２つ連結されたアミノ酸（ステープル）又は３つ以上連結されたアミノ酸（ステッチ）を、アミノ酸を、例えばオレフィン（アルケン）基を有するように修飾されたペプチドに組み込む（固相ペプチド合成中、規定された相対的位置に組み込まれ得る）ことによって調製することを教示した。例えば、次に、ペプチドが、典型的には、αヘリックスは本質的ではないが、安定化構造をとるように誘導する、１つ（ステープル［本明細書中でＳｔａＰとして表される］）又は２つ以上（ステッチ［本明細書中でＳｔｉＰとして表される］）の全炭化水素クロスリンクを閉じるように樹脂上の閉環メタセシスが用いられる。ＳｔａＰでは、立体化学的配置に応じて、Ｓ５（Ｓ−ペンテニルアラニン）若しくはＲ５（Ｒ−ペンテニルアラニン）又はＳ８（Ｓ−オクテニルアラニン）若しくはＲ８（Ｒ−オクテニルアラニン）と称される、非天然アミノ酸の鏡像異性体の一方又は両方のいずれかを用いることが好ましい。ＳｔｉＰでは、さらなる非天然オレフィン含有α，α−ジ置換アミノ酸（Ｂ５又はＢ８）が用いられる。しかし、クロスリンキング法は、非天然オレフィン含有α，α−ジ置換アミノ酸の閉環メタセシスに制限されない。ペプチドを安定化させるため、他のクロスリンキング化学、例えばＯ−アリルセリン類似体（Ｓ−ＯＡＳ又はＲ−ＯＡＳ）間の閉環メタセシスが用いられ得る。
【００４３】
さらに、ＯＮが一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子（又はその類似体）にハイブリダイズするように設計可能であり、それによりハイブリダイズされたＤＮＡ又はＲＮＡ分子が標的細胞に送達され得ることが想定される。これらのＤＮＡ及びＲＮＡは、直鎖状であるか、分岐状であるか、環状化されているか、又は任意の安定な立体構造をとるかのいずれでもあり得る。これらのＤＮＡ及びＲＮＡは、合成、改変又は天然分子、例えばエピソームを生成するウイルスゲノム複製中に生成される環状ＤＮＡ分子であり得る。
【００４４】
ペプチドの安定化は、ペプチド配列中の規定された相対的位置に組み込まれたアミノ酸を固相合成中にクロスリンクすることにより又は既存のアミノ酸を化学修飾することにより実施可能である。２つの特定のアミノ酸（ステープル）のクロスリンク又は３つ以上のアミノ酸（ステッチング）のクロスリンクを用いることで様々な長さのペプチドを安定化することができる２２，２３。特異的に組み込まれたアミノ酸は、通常、特異的且つ効率的なクロスリンク反応がペプチドの切断後に樹脂上又は溶液中に生じることを可能にする直交性官能基を有する。オレフィン含有アミノ酸の閉環メタセシス樹脂に基づくクロスリンク反応の例は、ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書に開示されている。
【００４５】
本発明は、少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供するクロスリンク又は架橋を導入する代替的なステープリング又はステッチング技術に基づき、さらなるＣＰＰを導入する。これらは、限定はされないが、次を含む。
ａ）ヒュスゲン１，３双極子環化付加における官能基、典型的にはアジドリジン及びプロパルギル官能基、例えばα−プロパルギルアラニンを有するアミノ酸の組み込み又は誘導体化。典型的には、これらの反応は、銅又はルテニウムに基づく触媒を用いる環化により、５員環複素環、例えば１，４又は１，５のいずれかの好ましい各置換を伴う１，２，３トリアゾールを得ることができる。アジド及びプロパルギル官能基に加えて、電子欠損型ニトリル及び又はジアゾアルカンなどの他の基質であっても用いることができる２４；及び
ｂ）例えば、固相合成中での保護基の慎重な選択を利用して、そのペプチド内のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するリジンを環化することによる、ラクタム形成のためのタンパク新生アミノ酸の使用２５。
【００４６】
当業者について、ステープルＣＰＰは、他の環化技術に基づいて開発され得る。単一の方法又はいくつかの異なる架橋環化方法に基づくステープル環化の組み合わせを利用すれば、単一又は複数のステープルのいずれかを用いて、ペプチドに沿って非近接又は近接のいずれかで分布するようにＣＰＰを形成することができる。さらに、当業者は、同様に、限定はされないが、異なる直交性の環化化学でのモジュラーペプチド成分を含む、１つ以上の環化技術からなるＳｔｉＰを形成することができる。
【００４７】
既存の線状ＣＰＡ並びにＳｔｉＰ及びＳｔａＰの細胞侵入動態は、異なる。従来のＣＰＰは、エネルギーに依存しない直接的な原形質膜転位を介して、又はエネルギー依存性のクラスリン及びカベオリン介在性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入するが、本発明において用いられるＳｔｉＰ及びＳｔａＰは、エネルギー依存性であるが、クラスリン及びカベオリンに依存しない機構を介して侵入する２２，２６。ＳｔｉＰ及びＳｔａＰの取り込みがヘパリン硫酸の低下した細胞装飾とともに抑制されると仮定すると２２、マクロピノサイトーシス侵入機構が推測され２７、この改変された侵入機構は、最新式と比べて増強された細胞取り込み及び生体分布を可能にすることが示唆される。
【００４８】
それらの非修飾ペプチド前駆物質と比較して、ＳｔａＰ及びＳｔｉＰは、一般に、強固な細胞取り込み、タンパク分解性分解に対する顕著な抵抗性及び非ヒト霊長類において１２時間を超える半減期を支持し得るインビボ安定性を示す２８。薬剤類におけるこうした増強は、安定化された構造及び例えばα−ヘリックスのコアにおける骨格アミド結合の埋没に由来する可能性が高い。この構造的な強固さは、主要組織適合性複合体の設計ではペプチドが提示されるための拡張された立体構造をとる必要があることから、ＳｔｉＰ及びＳｔａＰが免疫原性を示す可能性も低下させる。
【００４９】
設けられた立体構造を有する安定化ＣＰＰの重要性は、設けられた立体構造が部分的に細胞取り込みへの傾向が高まる原因であることから見逃されるべきでない。膜毒性及び免疫原性の潜在的な低下又は欠乏は、薬剤及びＢＡＣ、例えばＯＮに複合されるときのこれらの化合物の臨床解釈可能性を高める。
【００５０】
ＢＡＣ及びＣＰＰは、直接的に共有結合により複合され得るか、又はＢＦＬを介して共有結合により複合され得る。複合反応では、多数の官能基が用いられ得る。
【００５１】
ＯＮは、ヒト、動物及びより下等な生物における任意の遺伝子に対して立体的遮断を誘導するように用いることができ、したがってヒト及び動物における自然疾患（遺伝性及び加齢性疾患を含む）又は後天性疾患に適用され得る。さらに、ＯＮは、特にＳｔａＰ又はＳｔｉＰ  ＣＰＰに複合されるとき、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子（又は類似体）、例えばエピソームにハイブリダイズし、その送達を促進することを意図して用いることもできる。
【００５２】
例として、ウイルス出血熱（ＶＨＦ）は、遷延性の炎症性サイトカイン応答が静脈及び動脈の漸進的破壊をもたらすという動物由来の疾病である。ＶＨＦの原因は、エボラ及びマールブルグウイルス並びにいくつかのアレナウイルスを含み；これらの疾患は、現在、治療不能と考えられている。ウイルス出血熱は、高熱及び出血障害によって特徴付けられ、ショック及び臓器不全により死をもたらし得る。ＡＯは、翻訳機構の結合を阻止するため、ウイルス遺伝子転写物の５’翻訳開始部位を標的にするように設計され得る。ＡＯを用いてウイルス翻訳を抑制することは、十分に確立された技術であり３、マールブルグ及びエボラなどのウイルス出血熱に対する臨床試験まで進んでいる４，５。１つのＰＭＯであるＡＶＩ−７５３７は、２０１４〜１５年の西アフリカでのエボラ大流行において、ヒト使用について評価された。
【００５３】
ＡＯの使用は、他のＲＮＡ立体的遮断方法を意図して採用されている。ＡＯは、ＲＮＡスプライシングを改変し、最終のプロセシングされたｍＲＮＡからエクソンを除く（ここでは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーがリード指標である）２又は最終のプロセシングされたｍＲＮＡからエクソンを含める（ここでは、脊髄筋萎縮がリード指標である）１のいずれかを行うことができる。両方のＡＯは、２０１６年にＦＤＡの承認を得るに至った一方、各ＡＯの全身送達は、依然として大きい障害である。
【００５４】
一部の組織、例えば心臓は、ネイキッドＰＭＯの遺伝子導入に特に抵抗性であり、それは、異なる小胞媒介性ＰＭＯ取り込み機構を反映し得る２６。事実、ネイキッドＰＭＯの直接的な心臓内注射は効率的遺伝子導入をもたらすこともなく２９、抵抗性組織は、反復投与又は高用量の方法を要求する傾向がある３０〜３２。しかし、ＣＰＰのコンジュゲーションは、ＰＭＯ生体分布及び血清安定性を改善するが３３〜３５、これら直鎖状のアルギニンリッチペプチドに関連した毒性は、依然としてパイプラインの開発にとっての主要な障害である２０。
【００５５】
国際公開第２０１６／１８７４２５号パンフレットは、架橋を形成するため、単独でシステインアリール化を受けているペプチドに複合されたＡＯを開示しているが、他の技術は、開示されていない。システインアリール化架橋技術は、環化技術でない。なぜなら、それは、架橋部分として強固な芳香環を導入し、したがってその上に設けられた安定化された立体構造を有することが想定されないからである。それを別にして、その構造は、架橋を遊離させることになるチオール結合の還元に起因し、全身投与後に安定とならない。さらに、国際公開第２０１６／１８７４２５号パンフレットは、アルギニンリッチペプチドのみを開示している。したがって、この技術について、かなりの膜毒性の懸念が残る。
【００５６】
窒素のアリール化は、環化技術として開発されている３６。かかるペプチドをＢＡＣに複合することが可能であるが、これらのペプチドであれば、安定化構造を形成することが想定されず、重要なことに、従来の直鎖状ペプチドよりも細胞に侵入しないことになる３６。
【００５７】
立体的遮断をするＡＯの有効な臨床解釈として、ＣＰＰは、ＢＡＣを細胞質又は核質に有効に送達する一方、細胞侵入に関連した任意の毒性を制限する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５８】
したがって、薬剤又はＢＡＣを標的部位により効率的に又はより低い毒性及び免疫原性で送達することができるＤＣＣＰＭ又はＤＴＣＰＭを提供する場合、非常に望ましいことになる。
【課題を解決するための手段】
【００５９】
本発明の第１の態様によると、
ｉ．生物活性化合物（ＢＡＣ）と、
ｉｉ．細胞透過剤（ＣＰＡ）であって、ＢＡＣ及びＣＰＡは、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して連結される、細胞透過剤（ＣＰＡ）と
を含む薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）であって、ＣＰＡは、安定化ペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチド（ＣＰＰ）であり、ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及びクロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）が提供される。
【００６０】
環化は、ステープル又はステッチが、立体構造的に隣接するアミノ酸間において、分かれた「架橋分子」、例えばアリール基、例えば芳香環又はパーフルロアリール基などの導入による場合と異なり、直接的に形成されることを意味する。この直接的環化は、
ｉ．アルデヒド若しくはケトンとヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；
ｉｉ．チオール−エンマイケル付加；
ｉｉｉ．ジスルフィド形成；
ｉｖ．ヒュスゲン１，３双極子環化付加；
ｖ．アミンとカルボン酸との間の反応；
ｖｉ．一重項若しくは三重項に基づくカルビン反応；又は
ｖｉｉ．鈴木若しくは薗頭カップリング
の１つ以上によって達成され得る。
【００６１】
特に好ましい環化は、ｉｖ）及びｖ）の化学から得られる。
【００６２】
ｉｖ）を用いて、５員複素環は、アジドと電子欠損型ニトリル含有アミノ酸又はプロピジル含有アミノ酸との間で形成される。
【００６３】
ｖ）を用いて、ラクタムは、遊離アミン含有アミノ酸とカルボン酸含有アミノ酸との間で形成される。
【００６４】
ＳｔａＰは、例えば、２つの立体構造的に隣接したアミノ酸を一緒にステープルすることによって形成され得、及びＳｔｉＰは、例えば、少なくとも３つの立体構造的に隣接したアミノ酸をステッチすることによって形成され得る。
【００６５】
ステープル又はステッチする結果、ペプチドの２つの立体構造的に隣接したアミノ酸間に環化を提供するクロスリンク又は架橋が形成される。
【００６６】
ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書では、クロスリンク又は架橋は、２つの成分、炭化水素架橋及び末端メチル基を含む。炭化水素架橋は、二重炭化水素結合又は一重炭化水素結合からなり得る。
【００６７】
本発明は、図１（ステープルペプチド）及び図２（ステッチペプチド）に図示の通り、２つの官能基間に１又は複数の共有結合を形成可能である２つの直交性官能基からなるクロスリンク又は架橋を開示する。
【００６８】
ＣＰＰは、好ましくは、以下：非天然アミノ酸、タンパク新生アミノ酸又は下の表１に例示のような官能基を有する修飾タンパク新生アミノ酸の少なくとも２つを含む。
【００６９】
【表１】
2020525462.tif 000003
【００７０】
好ましいステープル又はステッチＣＰＰは、表１で定義される官能基の１つ以上を組み込み、組み込まれたアミノ酸構造は、図３の通りである。図１、２及び３では、Ｘ又はＸ１は、官能基、例えば表１中のものを図示する。Ｒは、α−炭素からの基の幾何学を立体的に制約するように設計された水素又はメチル若しくはイソブチルなどの部分であり得るか、又はＲは、表１で定義されるように、Ｘ又はＸ１であり得る。
【００７１】
ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書では、ＣＰＰは、好ましくは、全炭化水素テザーを有する少なくとも２つの非天然アミノ酸（例えば、α−メチル、α−ペンテニルグリシン）を含み、好ましいステープル又はステッチＣＰＰは、（Ｓ）−ペンテニルアラニン（Ｓ５）若しくはその鏡像異性体（Ｒ５）、Ｓ−オクテニルアラニン（Ｓ８）若しくはその鏡像異性体（Ｒ８）又はそれらの組み合わせ（例えば、Ｒ−オクテニルアラニン／Ｓ−ペンテニルアラニン（Ｒ８／Ｓ５）又はＳ−オクテニルアラニン／Ｒ−ペンテニルアラニン（Ｓ８／Ｒ５）の１つ以上を組み込む。
【００７２】
代替的なＣＰＰ及びその作製方法は、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１４及びそれに関連した補足情報に開示され、参照により援用される２２。
【００７３】
例示される安定化ペプチドは、対応する化学により共有結合的に結合される、下の表２中で強調された２つ以上の直交性官能基を含む。
【００７４】
【表２】
2020525462.tif 000004
【００７５】
安定化された立体構造は、典型的には少なくとも１つのαヘリックス、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを含む。しかし、それは、選択肢の中に、少なくとも１つのターン（例えば、限定はされないが、α、β、γ、δ又はπ）、βシート若しくはヘアピンを形成するためのいくつかのターン又はαヘリックス、延長された３１０ヘリックス若しくはポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス、ターン、βシート若しくはヘアピンの１つ以上の組み合わせを含み得る。
【００７６】
ＣＰＰの形式電荷は、生理学的ｐＨ（約７．５）で算出され、アミノ酸Ｒ基のｐＫａに基づく。これらの値（ｐＫｘ）は、以下の表３で表される。
【００７７】
【表３】
2020525462.tif 000005
【００７８】
典型的には現在まで用いられるＣＰＰは、多数の正電荷残基を有する。アミノ酸配列内の正電荷残基の量を低減する一方、生体膜を通過する能力を保持することは、より臨床的に重要となる。
【００７９】
したがって、ペプチド配列に対する電荷を低減することが可能である。
【００８０】
好ましいＢＡＣは、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）、さらにより好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）である。様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド化学物質は、以下の表４中に例示され、ここで、低電荷又は中性電荷化学物質、例えばホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の使用が好ましい。
【００８１】
【表４】
2020525462.tif 000006
【００８２】
ＢＡＣは、内因性又は外因性遺伝子の発現を標的にし、改変し得る。内因性遺伝子標的は、限定はされないが、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患に関連する遺伝子を含み、また外因性遺伝子標的は、後天性疾患、例えばウイルス感染症のものを含む。
【００８３】
ＢＡＣがＣＰＰに直接的に連結され得る（図４）一方、本出願人は、ＢＦＬの使用が望ましいことを見出している。例示的で非限定的なＢＦＬ化学物質が以下の表５中に例示される。
【００８４】
【表５】
2020525462.tif 000007
【００８５】
表５に対する脚注として、以下に注意すべきである。
【００８６】
図５ａ及び５ｂ並びに図５ｃ及び５ｄは、以下、限定はされないが以下の規定される原子又は基が好ましい場合のＤＣＣＰＭの一般構造を強調する。
【００８７】
図５ａに図示される好ましい実施形態では、Ｙ１＝窒素、Ｙ２＝水素、Ｙ３＝スペーサー、例えば（ＰＥＧ）ｎ（ｎ＝５）（限定はされないが、表５中の同定されたもの）、Ｚ＝硫黄含有部分、例えばシステイン及びＬ＝ＳＭＣＣなどのＢＦＬである（図５ｂ）。
【００８８】
他の実施形態では、図５ｂに示される構造のバリエーションが利用され得る。例えば、別の実施形態が図５ｃに図示のようにＢＦＬのＣＰＡへの複合のためにチオールを要求しない場合、Ｚ＝Ｙ３である（ここで、Ｙ３は、表５中のスペーサーである）。ＢＡＣ及びＣＰＡの複合のために硫黄を要求しない（例えば、表５中のエントリー９〜１１に限定されない）ＢＦＬの場合、Ｚ＝ａ（ＬとＹ３との間の共有結合）である。
【００８９】
他の実施形態では、スペーサー、ＢＦＬの使用が要求されなくてもよく、そのような場合、図４に示されるＤＣＣＰＭの形成のためのチオール基、次いで以下が適用される。ペプチドの固相合成において利用される樹脂であれば、リンクアミド又はリンクアミドＭＢＨＡから２−クロロトリチル樹脂への改変により、ペプチドが生成され、遊離カルボン酸が標準のペプチドカップリング条件を介してカップリングを受けることができる。
【００９０】
表１中で強調される直交性官能基もバイオコンジュゲーション反応において使用可能である。これらの官能基は、ＤＣＣＰＭに望ましい特性を提供するため、分子をＤＣＣＰＭに複合するのに使用可能である。これらは、限定はされないが、アセチル、コレステロール、脂肪酸、ポリエチレングリコール、多糖、アミノグリカン、糖脂質、リン脂質、ポリフェノール、核局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体及び標的化分子を含むことになる。
【００９１】
好ましいリンカー化学では、図７ａ〜ｄに例示されるＢＦＬと、ＣＰＰと、ＢＦＬと、ＢＡＣとの間で共有結合を形成するため、シクロヘキサンスペーサー、すなわち４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）によって分かれたＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル及びマレミド反応基を有するアミン−スルフヒドリルクロスリンカーが用いられる。
【００９２】
特に好ましい実施形態では、リンカーは、単一又は複数の単位の（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎ＝１〜１０個のＰＥＧ分子である）でポリエチレングリコールを組み込み得る。
【００９３】
上記のいずれかの好ましい実施形態では、ＣＰＡ、例えば（図７ａ）は、必要に応じて、そのペプチドのＮ末端に連結され、且つ硫黄含有分子、例えばシステインで終結された（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎ＝１〜１０である）を優先的に組み組み、ＢＦＬに共有結合的に連結され得る（図７ｂ）。これは、（ＳＭＣＣ）などの二官能性反応性分子を伴うＢＦＬのさらなる延長を可能にする（図７ｃ）。これは、次にＢＡＣ上の官能基、好ましい実施形態では一次アミンに共有結合的に連結され、したがってＤＣＣＰＭを生成する（図７ｄ）。
【００９４】
ＣＰＰへの共有結合は、例えば、限定はされないが、βアラニン又はいずれかの当業者について、複数のＢＡＣ又はＣＰＰの複合を可能にする分岐又はデンドリマー様構造を含み得る任意の他の好適な部分を介し得る。
【００９５】
いずれかの特定の実施形態では、クロスリンクアミノ酸の相対的位置は、Ｃ末端が１位と称される第１のアミノ酸であり、且つ後続するアミノ酸がＮ→Ｃ末端様式における番号である場合の配列内でのそれらの位置決めにより参照される。官能性の記述子は、表２中に定義される。例えば、従来の配列ＲＫＦ−［Ｅ−ＲＬＦ−Ｋ］（配列番号７）内でのリジン残基（Ｋ）とグルタミン酸残基（Ｅ）との間のクロスリンクは、Ｋ１Ｅ５−８Ｍ（８Ｍは、８ｍｅｒアミノ酸を指す）と称されることになり、その配列内の括弧は、ペプチドの環状部分を表す。同様に、閉環メタセシスによりＳ５単量体間でクロスリンクされた配列ＲＫＦ−［Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５］（配列番号８）について、ＲＣＭ１，５−８Ｍと称される。
【００９６】
いずれかの特定の実施形態では、ＲＫＦ−Ｅ−ＲＬＦ−Ｋの配列（配列番号９）は、従来、Ｋ１Ｅ５−８Ｍ−ＮＣと称される、リジンとグルタミン酸残基との間で環化されていないＫ１Ｅ５−８Ｍの配列となる。
【００９７】
いずれかの特定の実施形態では、クロスリンクアミノ酸間の相対的間隔が減少する場合、例えば、配列ＲＫＦＲ−［Ｅ−ＬＦ−Ｋ］（配列番号１０）は、Ｋ１Ｅ４−８Ｍと称され；又はクロスリンクアミノ酸間の相対的間隔が増加する場合、かかるＲＫ−［Ｅ−ＦＲＬＦ−Ｋ］（配列番号１１）は、Ｋ１Ｅ６−８Ｍと称される。
【００９８】
以降、ＣＰＰがＰＥＧ化配列ＲＫＦ−［Ｅ−ＲＬＦ−Ｋ］を含み、且つＢＦＬがＳＭＣＣである場合、得られる化合物は、Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍと称される（図７ｃ）。
【００９９】
本発明の第２の態様によると、生物活性化合物（ＢＡＣ）の細胞への取り込みを、安定化ペプチドであって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）への生物活性化合物のコンジュゲーションによって促進する方法であって、ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及びクロスリンク又は架橋は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を形成し、且つ前記ＤＣＣＰＭを好適な媒体中で前記細胞に提示するため、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して、オレフィンメタセシスによって形成されない少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、方法が提供される。
【０１００】
上記ＣＰＡ、例えば（図８ａ）のいずれかの別の実施形態では、（ＰＥＧ）ｎは、ペプチドのＮ末端に連結され、ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結される（図８ｂ）。これは、ＢＦＬの適切に修飾されたＢＡＣとのコンジュゲーションを可能にし、この場合、ＢＡＣは、芳香族アルデヒド、優先的には４−ホルミル安息香酸で終結される（図８ｃ）。これは、次いで、ＤＣＣＰＭを形成するため、ＢＡＣ上の官能基に共有結合的に連結される（図８ｄ）。
【０１０１】
ＣＰＰが配列ＲＫＦ−［Ｅ−ＲＬＦ−Ｋ］を含み、且つＢＦＬがＰＥＧ化ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）である場合、得られる化合物は、Ｋ１Ｅ５−ＨＰ８Ｍと称される（図８ｂ）。
【０１０２】
ＣＰＰが配列ＲＫＦ−［Ｅ−ＲＬＦ−Ｋ］を含み、且つＢＦＬがペグ化を包含しないＳＭＣＣである場合、得られる化合物は、Ｋ１Ｅ５−Ｃ８Ｍと称される（図６ｄ）。
【０１０３】
いずれかの特定の実施形態では、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基によるリジンの環化から得られるＣＰＰは、ＢＡＣ、例えばＡＯに直接的に複合され得る（図９）。
【０１０４】
いずれかの特定の実施形態では、修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸という２つのアミノ酸間でクロスリンクを形成する方法は、限定はされないが、表１中に定義されるいずれかの官能基であり得る。
【０１０５】
別の好ましい実施形態では、クロスリンクを形成するために用いられる直交性官能基は、組み込まれるアジド残基及びアルキン残基である。
【０１０６】
詳細には、アジド及びアルキンを用いたクロスリンクでは、組み込まれる残基は、アルキンを有する（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（２’−プロピニル）アラニン及びアジドを有する（２Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アジド−ヘキサン酸である。
【０１０７】
修飾アミノ酸の不適合な合成又は好ましくない切断条件の場合、いくつかの残基が原位置で変換され、例えばリジンのＮ−ジアゾ−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（ＴｆＮ３）による処理によりアジド官能基が得られるか、又は１，３−ベンゼンジカルボニルジアジド若しくは類似の置換ジアジドなどのジアジド分子の使用により、アミノ酸を有する２つのプロパルギル間が架橋される。
【０１０８】
いずれかの特定の実施形態では、クロスリンクアミノ酸の相対的位置は、その配列内でのそれらの位置決めにより参照され、官能性の記述子は、表１中で使用及び定義される。例えば、配列ＲＫＦ−［Ｋ（Ｎ３）−ＲＬＦ−Ｂ］内での（２Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アジド−ヘキサン酸（Ｋ（Ｎ３）と略記される）と（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（２’−プロピニル）アラニン（Ｂと略記される）との間のクロスリンクは、Ｂ１Ｋ（Ｎ３）５−８Ｍと称されることになる（配列内の括弧は、ペプチドの環状部分を表す）。
【０１０９】
いずれかの特定の実施形態では、ＲＫＦ−Ｋ（Ｎ３）−ＲＬＦ−Ｂの配列は、アジドリジン残基とプロピルギル残基との間で環化されていないＢ１Ｋ（Ｎ３）５−８Ｍの配列となり、以降、Ｂ１Ｋ（Ｎ３）５−８Ｍ−ＮＣと称されることになる。
【０１１０】
いずれかの特定の実施形態では、そのアミノ酸間の相対的間隔が変更される場合、これは、減少の場合にＢ１Ｋ（Ｎ３）４−８Ｍと称される（配列ＲＫＦＲ−［Ｋ（Ｎ３）−ＬＦ−Ｂ］など）（配列番号１２）又は増加の場合にはＢ１（ＫＮ３）６−８Ｍと称される（ＲＫ−［Ｋ（Ｎ３）−ＦＲＬＦ−Ｂ］など（配列番号１３））。
【０１１１】
以降、ＣＰＰが配列ＲＫＦ−［Ｋ（Ｎ３）−ＲＬＦ−Ｂ］（配列番号２）を含み、且つＢＦＬがＰＥＧ化ＳＭＣＣである場合、得られる化合物は、Ｂ１Ｋ（Ｎ３）５−ＣＰ８Ｍと称される（図１０ｃ）。
【０１１２】
ＣＰＰが配列ＲＫＦ−［Ｋ（Ｎ３）−ＲＬＦ−Ｂ］を含み、且つＢＦＬがＰＥＧ化ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）である場合、得られる化合物は、１（ＫＮ３）５−ＨＰ８Ｍと称される（図１１ｂ）。
【０１１３】
ＣＰＰが配列ＲＫＦ−［Ｋ（Ｎ３）−ＲＬＦ−Ｂ］を含み、且つＢＦＬがペグ化を包含しないＳＭＣＣである場合、得られる化合物は、Ｂ１Ｋ（Ｎ３）５−Ｃ８Ｍと称される。
【０１１４】
図５ｄに強調されるように、ＳｔａＰ又はＳｔｉＰ複合ＯＮ（ＢＦＬの存在下又は不在下のいずれか）は、他のＢＡＣ用の送達媒体を構成し得る。ＯＮは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質分子を含むＢＡＣとハイブリダイズ又は会合し得る。得られた分子は、薬剤標的化細胞透過分子（ＤＴＣＰＭ）と称される。注目すべきことに、ＤＴＣＰＭは、特にウイルスパッケージングシグナルがもたらされず、成熟感染性ウイルス粒子を形成するためのウイルスゲノムがパッケージングされないとき、ウイルスゲノム複製中に天然に生成される環状ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子（エピソーム）又は直鎖状ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子にハイブリダイズし得る。
【０１１５】
本発明の第３の態様によると、内因性又は外因性遺伝子の発現の改変を要求する疾患の治療において用いるための本発明の第１の態様のＤＣＣＰＭ又はＤＴＣＰＭが提供される。
【０１１６】
ＤＣＣＰＭは、例えば、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患の治療において又は後天性感染症を治療するために用いられ得る。
【０１１７】
ＤＴＣＰＭは、例えば、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患の治療において又は後天感染を治療するために用いられ得る。
【０１１８】
一実施形態では、ＤＣＣＰＭは、筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において用いられるが、当業者は、本発明が広範囲の遺伝子を標的にするために用い得ることを容易に理解するであろう。
【０１１９】
ＤＭＤの場合、ＤＣＣＰＭは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１を標的化するＡＯＮを含み得る。
【０１２０】
本発明の第４の態様によると、薬剤又はＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法であって、薬剤又はＢＡＣを、安定化ペプチドであって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結することを含み、ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及びクロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない少なくとも２つのアミノ酸間に環化を提供する、方法が提供される。
【０１２１】
安定化によって設けられた形状は、自由エネルギーが最小化された立体構造を伴う構造を生成することがある。
【０１２２】
本発明の第５の態様によると、薬剤又はＢＡＣを、部位であって、その天然状態で薬剤又はＢＡＣに対して難治性である部位に導入する方法であって、薬剤又はＢＡＣを、安定化ペプチドであって、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結することを含む方法が提供される。ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、そのペプチドの少なくとも２つのアミノ酸間にクロスリンク又は架橋を含み、及びクロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない環化を提供し、それを対象に投与する。
【０１２３】
薬剤又はＢＡＣを、例えば心臓、脳又は筋肉などの標的組織に投与するため、本発明のＤＣＣＰＭを用いることができる。
【０１２４】
本発明の第６の態様によると、内因性又は外因性遺伝子の発現を改変するように対象を治療する方法であって、本発明のＤＣＣＰＭ又はＤＴＣＰＭを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１２５】
本発明の第７の態様によると、本発明のＤＣＣＰＭ又はＤＴＣＰＭと、組成物が経口的に、非経口的に、静脈内に又は局所的に投与されることを可能にする１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０１２６】
本発明の実施形態は、以下の貼付の図面を参照して以下にさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１ａ】非環化ＣＰＰ（左）及びそれから形成可能な得られる安定化構造の一部（右）の例を図示する。
【図１ｂ】非環化ＣＰＰ（左）及びそれから形成可能な得られる安定化構造の一部（右）の例を図示する。
【図１ｃ】非環化ＣＰＰ（左）及びそれから形成可能な得られる安定化構造の一部（右）の例を図示する。
【図２ａ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ａは、ペプチド配列内に連続的に配置される直交性アミノ酸の２セットを環化することにより形成される。
【図２ｂ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ｂは、ペプチド配列内に連続的に配置されない直交性アミノ酸の異なる２セットを環化することにより形成されるステッチＣＰＡを図示する。
【図２ｃ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ｃは、クロスリンク対象のアミノ酸の２セットが１つのアミノ酸に由来する場合のステッチＣＰＡを図示する。
【図２ｄ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ｄは、連続的ステッチＣＰＡを形成するためにクロスリンク可能な１つのアミノ酸に由来する２つの代替的なアミノ酸セットを図示する。
【図３】表１に定義されるような異なる官能基を有するＣＰＰ中に組み込まれ得るアミノ酸の構造を図示する。Ｘ及びＸ１によって表される官能基は、ＣＰＡを形成するため、クロスリンク可能であるとともに、バイオコンジュゲーションにおいて使用可能である。
【図４】ＢＦＬの使用を伴わない安定化ＣＰＰのＢＡＣへの直接コンジュゲーションを図示する。
【図５ａ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。ＢＡＣがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）又はオリゴヌクレオチド（ＯＮ）である場合の、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＣＣＰＭの概略図である。
【図５ｂ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。ＢＡＣがＡＯ又はＯＮである場合、ＣＰＡが１，４置換又は１，５置換のいずれかの１，２，３トリアゾールによって安定化されている場合における、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＣＣＰＭの概略図である。
【図５ｃ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。ＢＡＣがＡＯ又はＯＮである場合、ＣＰＡが１，４置換又は１，５置換のいずれかの１，２，３トリアゾールによって安定化されている場合における、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＣＣＰＭの概略図である。
【図５ｄ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。オリゴヌクレオチドが送達分子の一部を構成する場合の、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＴＣＰＭの概略図であり；この技術によって送達されるＢＡＣの非限定的リストとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質分子が挙げられる（事実上、ＯＮは、ＢＦＬの一部であり、ＢＡＣに接続する）。
【図６ａ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ＤＣＣＰＭの一般的概略図であり、限定はされないが、表５に定義されるＢＦＬの結合性を図示する。
【図６ｂ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。チオール含有分子（システイン）で終結され、ヘテロ二官能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いてＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図６ｃ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヒドリジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸で修飾されているＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図６ｄ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。チオール含有分子（システイン）で終結され、ヘテロ二官能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いてＢＡＣに複合された、ラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図７ａ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。２つのタンパク新生アミノ酸間の環化によりラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図７ｂ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ＣＰＡのＮ末端へのＰＥＧ５の組み込み及びチオール含有分子（システイン）でのその終結を図示する。
【図７ｃ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヘテロ二官能性リンカーＳＭＣＣのＤＣＣＰＭへの組み込みを図示する。
【図７ｄ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。チオール含有分子（システイン）で終結され、次いでヘテロ二官能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いてＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うＫ−Ｅ安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図８ａ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。２つのタンパク新生アミノ酸間の環化によりラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図８ｂ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図８ｃ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣの概略図である。
【図８ｄ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヒドリジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸で修飾されているＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図９】ＢＡＣに直接的に複合されたラクタム含有ＣＰＰの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図１０ａ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図１０ｂ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。組み込まれたＰＥＧ５を伴い、チオール含有分子（システイン）で終結される、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図１０ｃ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰの概略図であり、ヘテロ二機能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）の組み込みを図示する。
【図１０ｄ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。ＤＣＣＰＭの一部としての１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰを図示する概略図である。１，２，３トリアゾールは、他の異性体、例えば１，５置換トリアゾールを有し得ることが注目されるべきである。
【図１１ａ】１，４置換トリアゾールを含有するＣＰＰの結合性を図示する。
【図１１ｂ】ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルムル安息香酸修飾ＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うトリアゾールで安定化されたＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図１１ｃ】４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣの概略図である。
【図１１ｄ】ヒドリジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸で修飾されているＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴う１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図１２ａ】Ｄ２Ｏにブランク化され、室温で３通りに収集されたＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ、ＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍ及びＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍの円二色性スペクトルである。ＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ及びＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍは、ランダムコイルを示し、ＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、αらせん度を示す。
【図１２ｂ】Ｄ２Ｏにブランク化され、室温で３通りに収集されたＫ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ、Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍ及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍの円二色性スペクトルである。Ｋ１Ｅ５は、ランダムコイルを示す一方、Ｋ１Ｅ４及びＫ１Ｅ６は、伸長されたＰｉヘリックスを示す。
【図１３ａｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞のＫ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。データは、Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣが環化されたとき、ＦＬ１陽性細胞の数において有意差がなかったことを図示する。
【図１３ａｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞のＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。データは、Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣが環化されたとき、ＦＬ１陽性細胞の数において有意差がなかったことを図示する。
【図１３ａｉｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞のＫ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。データは、Ｋ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣが環化されるとき、所与の濃度でのＦＬ１陽性細胞の数において有意な増加があることを図示する。
【図１３ｂｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。
【図１３ｂｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。
【図１３ｂｉｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。Ｋ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表す。
【図１３ｃ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。（ｉ）Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ対Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣ、（ｉｉ）Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ対Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣ、及び（ｉｉｉ）Ｋ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ対Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の陰性対照と比べた、ゲート細胞によって判断される％生細胞比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。データは、未処置対照に正規化されるとき、回収された細胞の％における有意差がないことを示す。
【図１４】Ｋ１Ｅ４、Ｋ１Ｅ５又はＫ１Ｅ６  ＣＰ８Ｍのいずれかに複合されたＰＭＯで処置されたＰＣ３−７０５細胞の顕微鏡写真である。細胞は、トランスフェクション試薬なしに４時間処置され、次に画像が取得された。画像は、ＦＩＴＣ標識ＰＭＯを示すため、明視野対物レンズ又は落射蛍光顕微鏡のいずれかを用いて取得された。その後、画像は、細胞局在化を示すため、マージされた。Ｋ１Ｅ４、Ｋ１Ｅ５又はＫ１Ｅ６  ＣＰ８Ｍ単独のいずれかに複合されたＰＭＯで処置されたＰＣ３−７０５細胞内で細胞内ＰＭＯシグナルが有意であることが明白である。非複合ＰＭＯは、細胞内シグナルを生成しない。
【図１５ａ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞の、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞との比較である。ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋とすべての他の基との間の相互作用を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とすべての他の基との間の相互作用を表す。データは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋が、他の処置と比べて、種々の濃度にわたり、ＦＬ１＋細胞内での有意な減少を有することを示す。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、他の処置と比べて、種々の濃度にわたり、ＦＬ１＋細胞の数における増加を示す。
【図１５ｂ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。所与の濃度のＲＣＭ，１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋、１＋及び２＋間でのＭＦＩにおいて有意差がない。しかし、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋は、より高い濃度＞１μＭでのＭＦＩにおける増加を示す。
【図１５ｃ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋［ＲＫＦ（Ｓ５ＲＬＦＳ５）］、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋［ＲＩＦ（Ｓ５ＲＬＦＳ５）］、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋［ＩＩＦ（Ｓ５ＲＬＦＳ５）］、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋［ＩＩＦ（Ｓ５ＩＬＦＳ５）］とともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の陰性対照と比べた、ゲート細胞によって判断される％生細胞比較である。ｎ＝３、エラーバーは、標準偏差を示す。＊は、ｐ＜０．０５を表す。＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋との間の差異を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋との間の差異を表し、＊ｃは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋との間の差異を表す。データは、最も高い濃度１００μＭにおいて、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋からＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋を比べるときの回収された生細胞の数における有意な減少及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋からＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋を比べるときの細胞の数における増加を示す。同様に、３３μＭにおいて、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋をＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋と比べると、％生細胞における減少が示された。他のすべての濃度で、他の有意な効果は、０．０５μＭ以外で認められなかった。０．０５μＭのＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２を上回る生細胞における増加を示した。
【図１６】ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の、４時間のＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−３＋−ＦＩＴＣからＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣでの処置と比べるときの％細胞生存度を図示する。ｎ＝３〜４、エラーバーは、標準偏差を示す。＊は、ｐ＜０．００１を表す。Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣからＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋を比べるとき、すべての濃度で生存度における増加が認められた。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
本発明は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を作製するため、（本出願人の早期の出願ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書に開示されるものに対して）異なるステープリング及びステッチング化学を用い得ることと、これらの安定化ペプチドが、異なる上に潜在的に有益な効果、例えばより低い毒性などを与え得ることとを示す。
【０１２９】
細胞取り込みを実証するため、例示的な薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）がＦＩＴＣ標識を用いて作製された。
【０１３０】
例示的なＤＣＣＰＭは、
ｉ）生物活性化合物（ＢＡＣ）と、
ｉｉ）安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）と、
ｉｉｉ）二官能性リンカー（ＢＦＬ）と
を含む。
【０１３１】
ＤＣＣＰＭを形成する３つの成分は、以下により具体的に記述され、特に好ましい実施形態は、図７ａ〜ｄ及び図８ａ〜ｄを参照することにより例示される。
【０１３２】
１．生物活性化合物
生物活性化合物は、生体細胞内で生物学的効果を発揮し得る任意の化合物である。好ましくは、本質的ではないが、ＢＡＣは、１つ以上の内因性又は外因性遺伝子の発現に対して影響するものである。例として、核酸、ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタマー及び医薬品が挙げられる。本発明で用いられる好ましい生物活性化合物は、小さい電荷（正又は負のいずれか）を与え得るペプチド核酸（ＰＮＡ）又はＰＭＯ又はそれらの修飾誘導体などの電気的に中性のオリゴヌクレオチド（生理学的ｐＨが約７．５で電荷−１〜＋１）を含む。
【０１３３】
生物活性化合物は、ｉ）ＲＮＡスプライシング；ｉｉ）タンパク質翻訳、又はｉｉｉ）他の核酸：核酸又は核酸：タンパク質相互作用（内因性又は外因性（病原体由来）遺伝子の遺伝子発現を改変する）を抑制又は増強するための立体的遮断化合物として用いられ得る。
【０１３４】
ＯＮの特異的なＲＮＡ配列モチーフへのハイブリダイゼーションにより、スプライソソームの正確なアセンブリが阻止され、それによりプレｍＲＮＡ中の標的エクソンを認識することができず、したがって成熟遺伝子転写物中のこれらのエクソンが除去される。インフレームエクソンの除去により、切断されても機能的である遺伝子産物がもたらされ得；フレーム外エクソンの除去により、転写物のフレームシフトがもたらされ、潜在的に中途での停止コドン及び標的遺伝子発現レベルにおける低下がもたらされる。
【０１３５】
加えて、ＯＮは、翻訳機構の結合を阻止するため、内因性又はウイルス遺伝子転写物の５’翻訳開始部位を標的にするように設計され得る。ウイルス翻訳を抑制するためのＡＯの使用は、十分に確立された技術であり、マールブルグ及びエボラなどのウイルス出血熱に対する臨床試験まで進んでいる。
【０１３６】
また、ＯＮは、転写物の核外輸送、翻訳及び安定性を改変する内因性転写物の３’非翻訳領域を標的にするように設計され得る。かかる標的は、限定はされないが、転写物のポリアデニル化及び／又は切断部位を含む。
【０１３７】
また、ＯＮは、二次及び三次構造がタンパク質又は他の細胞標的に結合し、それにより特定の遺伝子発現レベルに影響し得るようなアプタマーを形成するように設計され得る。
【０１３８】
非限定例のＯＮ化学物質が表４中に例示される。
【０１３９】
例示される非限定例では、標的は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１であり、配列：
配列番号１：５’ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ３’
を含む。
【０１４０】
２．安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）
本発明の細胞透過剤は、安定化ペプチドである。
【０１４１】
そのペプチドは、修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸といった２つのアミノ酸のクロスリンクによりステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又は３つ以上の残基のクロスリンクによりステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することによって安定化され得る。
【０１４２】
ステープリング及びステッチングによるクロスリンクは、ある特性、例えば溶媒和的立体構造、例えば、限定はされないが、αヘリックス、延長された３１０ヘリックス若しくはポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス、ターン（例えば、限定はされないが、α、β、γ、δ又はπ）、βシート若しくはヘアピンを形成するためのいくつかのターン又はαヘリックス、延長された３１０ヘリックス若しくはポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス、ターン若しくはβシートの１つ以上の組み合わせ、溶媒和環境、例えば原形質膜との相互作用、細胞浸透性及び生物学的活性にエネルギー依存的な立体構造上のバイアスを付与することがある。
【０１４３】
ＳｔａＰ及びＳｔｉＰを作製するための、ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書における記載に対して代替的な化学の非限定例が表６に例示され、Ｘで図示され、且つ限定はされないが、表１に定義される官能基に対して判定中である、修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸といったアミノ酸によるクロスリンクのための名目上の位置を有するペプチド配列を含む。
【０１４４】
ペプチドの安定化、例えばステッチング又はステープリングは、ペプチド中に組み込まれる官能基に依存する種々の手段により実施可能である。官能基の非限定例が表２に示される。いくつかの反応は、触媒を必要とするか又は安定化のための優先的な試薬を有し、下の表６に例示される。
【０１４５】
【表６】
2020525462.tif 000008
【０１４６】
すべてのペプチド成分（アミノ酸、非天然アミノ酸、非ステープル／非ステッチ、部分的ステープル／ステッチ及びステープル／ステッチペプチド）は、特定の幾何又は立体異性形態で存在し得る。すべての化合物は、シス及びトランス異性体、（Ｒ）−及び（Ｓ）−鏡像異性体、ジアステレオ異性体並びにそれらのラセミ混合物を含む。
【０１４７】
好ましい異性体／鏡像異性体は、濃縮され、より高い割合の１つの特定の異性体又は鏡像異性体を生じることになる。その実施形態は、重量を基準として９０％超、９５％、９８％若しくは９９％の好ましい異性体／鏡像異性体からなり得る。
【０１４８】
ペプチド構造の安定化に用いられる非天然アミノ酸の非限定例が表１中に例示される。
【０１４９】
ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書では、本出願人は、全炭化水素テザーを有するα、α−２置換非天然アミノ酸（例えば、α−メチル、α−ペンテニルグリシン）を用いた。
【０１５０】
本発明では、本出願人は、代替的には表６に開示される化学を利用する。
【０１５１】
好ましい一実施形態では、配列ＲＫＦ−［Ｅ−ＲＬＦ−Ｋ］（配列番号４）における２つの天然に存在するアミノ酸（例えば、リジン及びグルタミン酸）をカップリングすることにより、クロスリンクが形成される。代わりに、これらの天然に存在するアミノ酸は、リジン及びアスパラギン酸であり得る。
【０１５２】
さらに別の実施形態では、本出願人は、修飾天然アミノ酸（Ｎ６−ジアゾリシン）と非天然アミノ酸（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、例えば配列ＲＫＦ−［Ｋ（Ｎ３）−ＲＬＦ−Ｂ］（配列番号２）（式中、Ｂは、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸を表し、Ｋ（Ｎ３）は、Ｎ６−ジアゾリシンを表す）との間のクロスリンクを利用する。
【０１５３】
一実施形態では、細胞透過剤は、配列ＲＦＫ−Ｘ−ＲＬＦ−Ｘ（配列番号３）（式中、Ｘは、クロスリンク可能なアミノ酸を表す）を含むステープル又はステッチペプチドを有する。
【０１５４】
別の実施形態では、配列ＲＦＫ−［Ｘ−ＲＬＦ−Ｘ］（配列番号４）は、移動した架橋残基、例えば、限定はされないが、ＲＦ−［Ｘ−ＫＲＬＦ−Ｘ］（配列番号５）又はＲＦＫＲ−［Ｘ−ＬＦ−Ｘ］（配列番号６）との相対的位置を有し得る。
【０１５５】
別の実施形態では、ペプチドは、分岐ステープルペプチドである。分岐ステープルペプチドは、ペプチドの２以上の鎖からなる。分岐ペプチドは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて形成され得、一実施形態では、２つのペプチド鎖を分岐するのにリジン残基が用いられる。
【０１５６】
開示されるペプチド配列の機能的誘導体を用いることができる。機能的誘導体は、元のペプチドへの挿入を含む代表的な断片又は相同体又はペプチドを有し得る。典型的な誘導体であれば、元のペプチド配列の７０％、８０％、９０％若しくはそれより多くを有することになり、元のペプチドのアミノ酸の数の最大２００％を有し得る。生物活性化合物の送達を増強するのであれば、誘導体が用いられることになる。
【０１５７】
ペプチド配列は、他の部分の付加を可能にする官能基を含むように修飾アミノ酸（表１）を含み得る。かかる部分の非限定例として、アセチル、コレステロール、脂肪酸、ポリエチレングリコール、多糖、アミノグリカン、糖脂質、リン脂質、ポリフェノール、核局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体及び標的化分子が挙げられる。
【０１５８】
３．二機能リンカー
ＢＡＣをＣＰＡに連結するため、二機能リンカーが用いられ得る。
【０１５９】
好ましいリンカーは、例えば、ＢＡＣ上のアミン基とＣＰＡ末端上のスルフヒドリル（チオール）基（通常、システイン残基）との間を連結することになる。これを達成するための基質の例として、限定はされないが、表５中に例証されるような、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）、ＡＭＡＳ（Ｎ−α−マレイミドアセト−オキシスクシンイミドエステル、ＢＭＰＳ（Ｎ−β−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−アレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル）、ＤＭＶＳ（Ｎ−□−マレイミドバレリル−オキシスクシンイミドエステル、ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレミドカプロイル−オキシスクシンイミドエステル）及びＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸）が挙げられる。
【０１６０】
別の好ましいリンカーシステムは、ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）であるが、ＢＡＣがＰＭＯである場合、ＰＭＯは、４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾される。
【０１６１】
ＤＳＧ（グルタル酸ジスクシンイミジル）及びＤＳＣＤＳ（ジスクシンイミジル−シクロヘクスル−１，４−ジエステル）などの他のリンカーは、ＢＡＣの５’−アミノ基をＣＰＡのＮ末端に連結する能力を含むことになる（表５、エントリー９及び１０）。
【０１６２】
リンカーは、ＤＣＣＰＭに対して望ましい特性を与える他の要素、例えばＯＮとＣＰＡとの間のスペーサー又は溶解度を高めることになる要素、例えばＰＥＧ化配列を含み得る。非限定例が表５に示される。
【０１６３】
生物活性化合物は、キメラ細胞送達ペプチドに共有結合により付着される。さらに、これは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。好ましくは、細胞送達ペプチドは、ジスルフィド架橋又はチオールマレイミドリンカー、例えばＳＭＣＣを用いて生物活性化合物に付着され；その付着は、アミドリンカー又はオキシムリンカー又はチオエーテルリンカーを用い得る。
【実施例】
【０１６４】
本明細書に記載の代替化学に対する比較対照として役立つＰＭＯ  ＣＰ８Ｍ及びＰＭＯ  ＨＰ８ＭがＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書中で提供される主要な証拠
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療におけるＲＮＡの立体的遮断を増強するためのＤＣＣＰＭ
導入
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、世界中で最も一般的な遺伝性致死性小児疾患であり、世界的な発生率は、出生数で約４０００の１である３７。この重篤な筋消耗障害は、大半の家族では、リーディングフレームの破壊及びタンパク質ジストロフィンの中途での切断を招く遺伝子突然変異により引き起こされる３８，３９。
【０１６５】
ＤＭＤ転写物のＲＮＡスプライシング抑制は、特別な見込みを有する。ＡＯの特異的なＲＮＡ配列モチーフへのハイブリダイゼーションにより、スプライソソームの正確なアセンブリが阻止され、それによりプレｍＲＮＡ中の標的エクソンを認識することができず、したがって成熟遺伝子転写物中のそれらが除去される。切断されても機能的であるジストロフィンタンパク質の再発現をもたらすＡＯ媒介性ＲＮＡスプライシング抑制は、インビトロで前臨床ｍｄｘマウスモデルにおいて実証されており３２、４０〜４５、それにより臨床的開発プログラムが得られた。２，１０
【０１６６】
静脈内投与されたＰＭＯがジストロフィンの再発現における用量依存的増加を示しており、いくらかの機能的利益を伴うが２，４６、骨格筋ジストロフィンの回復は、多数の複数回投与後、患者間で依然として非常に変化しやすい。重要なことに、多数の他の標的組織（例えば、脳及び心臓）は、反復投与又は高用量の手法が用いられるときでも、ＰＭＯ遺伝子導入に対する抵抗性を維持する３０〜３２。
【０１６７】
現在まで、非修飾ＣＰＡの複合により、ＰＭＯの体内分布及び血清安定性が改善されているが３３〜３５、パイプラインの開発にとって依然として毒性が主要な障害である２０。
【０１６８】
本出願人は、ＤＭＤ転写物のＲＮＡスプライシング抑制を引き起こすことで知られるＰＭＯに複合される、安定化される、例えばＳｔａＰ（又はＳｔｉＰ）に基づくＣＰＡが、ネイキッドＰＭＯに対して抵抗性がある組織内において、ＣＰＡ関連毒性の可能性を伴わずにより高レベルのジストロフィン回復及びジストロフィンの再発現をもたらすことになると仮定した。本発明者らは、これらの新規なＤＣＣＰＭ又はＤＴＣＰＭが臨床的に重要であるように、新規なＣＰＡが魅力的な生物学的及び毒性学的特性を有することを実証するフォワードデータを提供する。
【０１６９】
材料及び方法
一般的なペプチド合成手順
閉環メタセシスにおけるペプチドについて、すべてのペプチドを、リンクアミドＭＢＨＡ樹脂に関する標準のＦｍｏｃペプチド化学を用いる確立されたプロトコルに従って合成した。カップリング反応は、ＮＭＰ中のアミノ酸の１０の均等物、ＨＣＴＵの９．９の均等物及びＤＩＰＥＡの２０の均等物（リンクアミドＭＢＨＡ樹脂の初期負荷に対する均等物）の混合物の添加により実施した。反応を少なくとも１時間進行させておいた。非天然アミノ酸（Ｒ／Ｓ５、Ｒ／Ｓ８又はＢ５）のカップリングを、ＮＭＰ中のアミノ酸の４の均等物、ＨＣＴＵの３．９の均等物及びＤＩＰＥＡの１０の均等物を用いて２時間実施した。オレフィン含有非天然アミノ酸の閉環メタセシス反応を、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）に窒素通気下で２時間かけて約１０ｍｇ／ｍＬまで溶解したグラブスＩ触媒（ベンジリデン−ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ジクロロルテニウム）で促進した。その後、余分な触媒をＤＣＥ−樹脂から洗浄し、次にＮ末端ＦＩＴＣにカップリングした。完了時、ペプチドを樹脂から同時に切断し、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ及び２．５％水を含有する切断カクテルを用いて脱保護した。粗ペプチドを５０％アセトニトリル／水に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルターを通過させ、Ｃ−１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。化合物の同定及び純度について、ＬＣ／ＭＳカップリング（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて評価した。精製画分をプールし、蒸発させてアセトニトリルを除去し、ＴＦＡをＳｐｅｅｄｖａｃにより追跡し、次に乾燥まで凍結乾燥させた。非閉環ペプチドも対照として生成された。
【０１７０】
すべてのペプチドは、遊離酸変異体についてのリンクアミドＭＢＨＡ樹脂又は２−クロロトリチル樹脂に関する標準のＦｍｏｃペプチド化学を用いる確立されたプロトコルに従って合成した。カップリング反応は、ＮＭＰ中のアミノ酸の１０の均等物、ＨＣＴＵの９．９の均等物及びＤＩＰＥＡの２０の均等物（リンクアミドＭＢＨＡ樹脂の初期負荷に対する均等物）の混合物の添加により実施した。反応は、少なくとも１時間進行させておいた。
【０１７１】
修飾アミノ酸及び非天然アミノ酸を有するペプチドの合成
一時的なＦｍｏｃ基の脱保護を樹脂結合ペプチドのＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンでの２回の２０分処理により行った。ＤＭＦでの徹底的なフロー洗浄後、各連続アミノ酸のカップリングを、適切な予備活性化されたＮＲ−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体との１回の３０分のインキュベーションにより行った。すべての保護アミノ酸（１ミリモル）を、反応容器への送達直前のシンセサイザープログラムの一部として、ＤＭＦ中０．２５Ｍ  ＤＥＰＢＴ３．８ｍＬを有するカートリッジに溶解した。次いで、ＤＩＥＡ１ｍＬをカートリッジに直接添加し、カップリング溶液のＮＲ脱保護された樹脂結合ペプチドへの導入前、２分以下の活性化を引き起こした。カップリングの完了後、次の脱保護／カップリングサイクルにおける調製において樹脂を徹底的にフロー洗浄した。
【０１７２】
ラクタム含有アミノ酸（例えば、Ｋ１Ｅ５）における合成
グルタミン酸及びリジンの側鎖保護は、それぞれＦｍ及びＦｍｏｃ基から構成された。アミノ末端の、任意の他のＮＲ−Ｂｏｃ−アミノ酸と類似する様式でのＡｃ２Ｏ／ＮＭＭ（それぞれ２ミリモル、それぞれ１１４及び１８９μＬ）によるアセチル化後、Ｆｍｏｃ及びＦｍ側鎖保護基を２０％ピペリジンで除去し、樹脂結合ペプチドをＤＭＦで洗浄し、次に１．９ミリモルのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中、３．８ｍＬ×０．５Ｍ）及び１．９ミリモルのＤＩＥＡで２時間処理し、ラクタム形成をもたらした。
【０１７３】
リジンのＮ６−ジアゾリシンへの選択的形質転換
形質転換に対する標的リジン残基をＭｔｔ保護基で保護し、ここで、形質転換を必要としない他のリジン残基のようにＢｏｃ保護基で保護される。この例の配列ＲＫ（Ｂｏｃ）Ｆ−Ｋ（Ｍｔｔ）−ＲＬＦ−Ｂ（式中、Ｂは、組み込まれた非天然アミノ酸（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（２’−プロピニル）アラニンである）における樹脂結合ペプチド（０．３１ミリモル／ｇ、３００ｍｇ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中１％ＴＦＡ溶液に懸濁し、３分間撹拌した。溶液は、瞬時に黄色になる。次に、樹脂をＤＣＭ（２回）、ＭｅＯＨ（１回）及びＤＣＭ（２回）で洗浄した。プロセスは、溶液が無色を維持するまで８回反復した。樹脂結合ペプチドを、さらなる操作を行わずに次のステップに移した。トリフリン酸無水物（Ｔｆ２Ｏ、３１６μＬ、１．８７ミリモル）を、０℃でのＨ２Ｏ（１．５ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中のＮａＮ３（６００ｍｇ、９．２ミリモル）の勢いよく撹拌した混合物に液滴添加した。得られた混合物を室温まで加温しておき、２時間撹拌した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出し、組み合わせた有機層を飽和水性Ｎａ２ＣＯ３で洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２中のＴｆＮ３の得られた溶液を、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２ｍｇ、８ミリモル）及びＫ２ＣＯ３（５ｍｇ、３６ミリモル）の溶液に懸濁した樹脂結合ペプチドに徐々に添加した。この反応混合物を室温で１８時間回旋した。ジアゾ移動の完了後、カイザー試験を行うことができたが、無色の樹脂ビーズは、アミノ基のアジド官能性への変換が完了していることを意味した。次いで、樹脂をＤＣＭ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ及びＤＣＭで順次洗浄した。
【０１７４】
ペプチドの切断及び脱保護
アジド／アルキニルを有する樹脂結合ペプチドをＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５  ｖ／ｖ）での室温で４時間の処理により脱保護し、固体支持体から切断した。樹脂の濾過後、ＴＦＡ溶液を低下した圧力下で濃縮し、エーテルに沈殿させ、所望される生成物を固体として得て、次にそれを逆相クロマトグラフィーにより精製した。
【０１７５】
高分解能質量分析
高分解能質量スペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＱＴ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬで、電子スプレーイオン化条件（ＥＳＩ）下又は指定がある場合には大気圧イオン化（ＡＰＩ）条件下で記録した。
【０１７６】
円二色性（ＣＤ）分光
ＣＤ分析をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｃｈｉｒａｓｃａｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ分光計で実施した。試料を最大０．１２５Ｗ／Ｗ％でＤ２Ｏに溶解し、データを室温で３通りに取得し、その後、ビルトインｑＣＤソフトウェアを用いて平均化し、平滑化した。ブランク補正を得るため、ブランクＤ２Ｏスペクトルを取得データから差し引くことにより、グラフをプロットした。
【０１７７】
ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの合成
ＰＭＯ（９１．６４ｍｇ、１０μモル）をＰＢＳ（５ｍＬ、ｐＨ７．２）に溶解し、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ）に溶解したＳＭＣＣリンカー（２７．２ｍｇ、５０μＭ、５倍過剰）の添加後、室温でインキュベートした。３０分後、複合緩衝液（ＰＢＳ１×、ｐＨ６．８）で水和したｓｅｐｈａｄｅｘ  ｇ２５を用いて混合物を脱塩し、溶出剤としても用いた。
【０１７８】
Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ（１７．８ｍｇ、１１．４μモル）をミリＱ水（４ｍＬ）及びＥＤＴＡ溶液（０．１ｍＬ、１００ｍＭ）に溶解し、固定化ＴＣＥＰ（２．５ｍＬ）と１時間予備混合した。ＥＤＴＡの最終濃度は、２ｍＭであった。
【０１７９】
新たに脱塩したＳＭＣＣ修飾ＰＭＯにＭｅＣＮ（８ｍＬ）及びＥＤＴＡ溶液（０．１ｍＬ、１００ｍＭ）をペプチドの添加前に添加した。減少したペプチドを、固定化ＴＣＥＰからＳＭＣＣ修飾ＰＭＯを有するチューブに溶出し、室温で２時間撹拌した。
【０１８０】
溶液を３×５６０ｍｇのＨＬＢカラムに負荷し、ミリＱ水で洗浄し、塩をいずれも除去し、次に水中１０％ＭｅＣＮで洗浄した。２０％ＭｅＣＮで洗浄したとき、若干のＰＭＯがカラムから除去された。２０％ＭｅＣＮは、非複合ＰＭＯをＨＬＢカラムから除去するのに十分であった。カラムは、溶出剤が排除されるまで２０％ＭｅＣＮで洗浄した。最後に、ＰＭＯ複合体を水中５０％ＭｅＣＮで溶出させた。次に、溶出した生成物は、溶出剤としても使用したミリＱ水に水和したｓｅｐｈａｄｅｘ  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ  ｇ２５を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。
【０１８１】
ＰＭＯ−ＨＰ８Ｍの合成及びＰＭＯのＰＭＯ−４ＦＢへの修飾
４−ＦＢ（２５０ｍｇ、１．５ｍＭ）を、ＣＯＭＵ（１．２ｇ、２．６ｍＭ）及びＮＨＳ（２３０ｍｇ、２．０ｍＭ）を有するＤＭＦに溶解し、数分間撹拌した。４−ＦＢは、ＤＩＥＡを添加するまで完全には溶解しなかった。次に、ＤＩＥＡ（０．５４ｍＬ、３．０ｍＭ）を添加し、そのとき、反応混合物は、無色から淡黄色／オレンジに変化した。反応混合物を１時間撹拌し、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨを用いてＴＬＣにより監視した。混合物をＤＣＭで分離し、ＤＭＦを除去し、次にＤＭＣを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、２，４ＤＮＰで陽性染色している上部スポットを溶出した。生成物をオフホワイト固体１１２ｍｇ（３０％）として収集した。
【０１８２】
ＰＭＯ（３０．４ｍｇ、３μＭ）を４−ＦＢの溶液に添加し、１０炭酸塩緩衝液：ＭｅＣＮ（５０％ＭｅＣＮ）に溶解し、ＮＨＳ活性化４−ＦＢ（１０ｍｇ、３２μＭ）を添加し、一晩撹拌した。次に、混合物を、溶出剤として水：ＭｅＣＮを伴うセファデックスＧ２５  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅを用いて脱塩した。ＭｅＣＮを回転蒸発により除去し、次に残存する溶出剤を凍結乾燥した。凍結乾燥生成物が２４ｍｇ、８３％の収率で得られた。
【０１８３】
ＰＭＯ−４ＦＢのＨＰ８Ｍへの複合
ＨＰ８ＭをミリＱ超純水（１００μＬ）に溶解し、１２ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。アルデヒド修飾ＰＭＯ（７ｍｇ、０．７６μＭ）を水／ＭｅＣＮ（３００μＬ、１：１）に溶解し、セファデックスＧ２５  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ及び溶出剤として水／ＭｅＣＮ（１：１）を用いて脱塩した。次に、収集した画分を水：ＭｅＣＮ混合物（１：１）で全容量１ｍＬに希釈し、ＰＭＯ含量はＵＶ／ｖｉｓにより分析し、６．５ｍｇ／ｍＬ又は７０５μＭであることが判明した。次に、ＨＮＡペプチド及びＡｎａｌｉｎｅ（最終濃度１０ｍＭ）を添加し、ＵＶ／ｖｉｓをＡ３５４の証拠について監視し、ＰＭＯのペプチドへの複合を算出するために用いた。
【０１８４】
細胞培養及び遺伝子導入
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞を、８％ＣＯ２／９２％空気雰囲気下、３７℃で、１０％胎児子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。
【０１８５】
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞を、完全培地に希釈した、ＦＩＴＣ標識ペプチド又はＦＩＴＣ標識ＰＭＯ複合のいずれかの試験化合物の適切な希釈物（最大１００μＭ）を有する９６ウェルプレート内で設定した。次に、細胞をトリプシン処理し、４×１０５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬを各ウェルに添加し、各ウェルにおいて２００μＬの最終体積を得た。次に、細胞を４又は３７℃のいずれかで４又は２４時間のいずれかにわたってインキュベートした。
【０１８６】
フローサイトメトリー
蛍光標識ＰＭＯ及びペプチドの取り込みを、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いるフローサイトメトリーにより判定した。細胞を、２．５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中での分析前、ＰＢＳ及びグリシン緩衝液で洗浄し、トリプシンで遊離させ、氷上で維持した。適切なゲーティング後、単一の生細胞における細胞蛍光を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて測定した。未処置細胞を用いて、％フルオレセイン陽性細胞を判定するためのゲーティング設定を確立し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も算出した。取り込みは、細胞の一時的死を除去可能である細胞のゲーティングにより判定したが（Ｔｏ−ｐｒｏ−３）、細胞の膜完全性を保持する能力が示される。
【０１８７】
ＨＰＬＣ分析
試料は、Ｋｉｎｅｔｅｘ、２．６μＭの粒子サイズ、１００Åの孔で修飾されたＸＢ−Ｃ１８上で試験した。試料を０〜８０％ＭｅＣＮの勾配、６０℃、１．５ｍＬ／分の流速で８分にわたり試験した。
【０１８８】
統計分析
すべてのデータを、示す通り、平均値±平均値の標準誤差又は標準偏差として報告する。処置群と対照群との間の統計学的差異をＳｉｇｍａＳｔａｔ（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＫ）により評価し、スチューデントｔ検定又は二元配置分散分析を適用した。ボンフェローニ事後分析を用いて、有意性をＰ値＜０．０５において認めた。
【０１８９】
結果
安定化ペプチドＫ１Ｅ４／５／６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ、及び非環化均等物Ｋ１Ｅ４／５／６−Ｐ８Ｍ−ＮＣ−ＦＩＴＣ、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ、及び均等な非環化ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣ、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ、及び均等な非環化ＲＣＭ−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ及びＲＣＭ１，５−ＨＰ８Ｍの固相合成を、リンクアミド樹脂上での標準のＦｍｏｃ化学を用いて実施し、下の表７におけるＬＣ−ＭＳにより同定した所望生成物を得た。
【０１９０】
【表７】
2020525462.tif 000009
【０１９１】
非環化ペプチドＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣのＨＰＬＣ分析により、８分にわたる０〜８０％勾配を用いて、６．２２〜６．２９分の溶出時間が示された。
【０１９２】
環化ペプチドＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣのＨＰＬＣ分析により、溶出時間における非環化ペプチドを上回る増加が示された（表８）。
【０１９３】
ＲＣＭ１，５−ＣＰ８ＭのＨＰＬＣ分析により、環化生成物の保持時間における非環化生成物と比べての減少が示され、保持時間は、下の表８に例示されるようなＫ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍペプチドと類似した。
【０１９４】
【表８】
2020525462.tif 000010
【０１９５】
円二色性データは、Ｋ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍペプチドの溶媒和構造が、帯電した蛍光色素の存在又はクロスリンクの位置の両方によって影響され得ることを示す（図１２ａ及び１２ｂ）。
【０１９６】
Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍは、２１９ｎｍにおける最大であり、１９６ｎｍの最小である延長された３１０ヘリックス／ポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを示す。Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、類似の特徴的な最大及び最小を示す（図１２）。
【０１９７】
Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍは、ランダムコイル又は不規則構造の特徴を呈し、それは、２１０ｎｍ超で約８の低い楕円率であり、且つ最低で約１９６ｎｍであることによって示される（図１２）。
【０１９８】
Ｋ１Ｅ４／５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ及びＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、安定化ペプチド対不安定化ペプチドの取り込みにおいて差異を示さなかった（図１３ａｉ〜ａｉｉ）。意外にも、Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、取り込みにおいて不安定化ペプチドと比べて有意差を示した（図１３ａｉｉｉ；ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す）。Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣを非環化対照と比べるとき、ＦＬ１＋細胞における２２％の増加が１１．１μＭで認められた。ＦＬ１＋細胞における差異は、３．７μＭで４３％の差異にさらに増加し（１．２３μＭで６５％の最大差異）、すべての試験濃度で常に高めの値を維持した。これは、細胞取り込みに影響するクロスリンクの位置が、ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書において、ペプチド内のアミノ酸の１位と５位との間での閉環メタセシスが細胞侵入時に効率的であることが示されることから、異なる環化技術間で直感的なものでないことを示す。
【０１９９】
Ｋ１Ｅ４／５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ及びＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、平均蛍光強度における２ｌｏｇにわたる有意な増加が、１０μＭを超える濃度でＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣペプチドに限って（その非環化対照と比べて）認められることを示した；図１３ｂｉ〜ｂｉｉｉ；ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表す）。
【０２００】
Ｋ１Ｅ４／５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ及びＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、あらゆる濃度範囲にわたり有害な細胞毒性を示さない（０．０５□Ｍ〜１００□Ｍ；図１３ｃｉ〜ｉｉｉ）。
【０２０１】
Ｋ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ複合ＰＭＯの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、非複合ＰＭＯと比べて、細胞内取り込みにおける増強を示した（図１４）。
【０２０２】
ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ標識ペプチドの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣペプチドに対して類似のレベルでペプチドの用量依存的取り込みを示す。
【０２０３】
ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣの電荷変異体（図１４ａ；すなわちＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  ３＋、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  ２＋、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  １＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  ０＋）に基づいてＦＩＴＣ標識ペプチドの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞である。図１５ａは、ペプチド用量及び細胞生存度に対する差次的応答を示した。データは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋が、ＦＬ１陽性細胞の２％差〜６０％差の範囲である、３３μＭ未満のすべての濃度でのＦＬ１＋細胞における他の処置と比べての有意な減少を有することを示す。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、１０％の増加から４０％の増加の範囲である種々の濃度にわたってのＦＬ１＋細胞の数における他の処置と比べての増加（０．４１μＭで最大の差異）を示す（ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋とすべての他の基との間の相互作用を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とすべての他の基との間の相互作用を表す）。
【０２０４】
ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣの電荷変異体に基づいてＦＩＴＣ標識ペプチドの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、差次的平均蛍光強度を有した（図１５ｂ）。所与の濃度のＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋、１＋及び２＋の間でのＭＦＩにおける有意差は認められない。しかし、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋は、より高い濃度＞１μＭでＭＦＩにおける増加（最大で約１ｌｏｇの増加）を示す（ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す）。
【０２０５】
図１５ｃは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とともに４時間インキュベートした、ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の陰性対照と比べた、ゲーティング細胞によって判断された％生細胞の比較である（ｎ＝３、エラーバーは、標準偏差を示し、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋との間の相互作用を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋との間の相互作用を表し、＊ｃは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋との間の相互作用を表す）。データは、最高濃度１００μＭでの、回収された生細胞の数におけるＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋をＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋と比較するときの有意な減少（３２％の減少）及び細胞の数におけるＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋をＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋と比較するときの増加（２０％の増加）を示す。同様に、３３μＭでのＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋は、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋と比べて％生細胞における２０％の減少を示した。０．０５μＭを除くあらゆる他の濃度において、他の有意な効果は認められなかった。０．０５μＭでのＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、生細胞におけるＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋を２３％上回る増加を示した。これは、電荷が減少したＲＣＭに基づくＣＰＰ変異体の臨床解釈において重要な意味を有する。
【０２０６】
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋又はペプチドのＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣシリーズのいずれかとともにインキュベートするときの生存度の比較によると、０．０５〜１００□Ｍの用量範囲でＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣが細胞生存度に対する負の影響を全く有しないことが示される（図１６）。Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣペプチドに対するＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣの比較によると、生存度における、濃度の範囲を７０〜９９％上回る増加が示される。これは、ラクタム化に基づくＣＰＰの臨床解釈において重要な意味を有する。
【０２０７】
結論
生成したデータから、本出願人がＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書に開示したものに対して代替的なクロスリンク技術を介してステープリングによって安定化されたＣＰＡは、インビトロでの細胞侵入時に有効であることを認めることができる。
【０２０８】
ペプチド配列内のクロスリンクの位置の重要性が特定の化学として例示されており、フローサイトメトリーによる測定によると、安定化ペプチドの溶媒和的立体構造及びそれに続く細胞取り込みに多大な影響を及ぼし得る。したがって、意外にも、その配列に直交性である、異なる化学的環化技術に基づくクロスリンクにより、同じ立体構造又は同じ細胞侵入特性のいずれかを有するペプチドが作製されることは、直感的とはいえない。これは、他の環化化学について該当し得る。
【０２０９】
ラクタム化の環化化学によって安定化されたＣＰＡは、らせん構造に安定化し、その構造は、□ヘリックスでない。Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、延長された３１０ヘリックス／ポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス構造を呈する。
【０２１０】
ラクタム化の環化化学によって安定化されたＣＰＡは、インビトロで細胞死を引き起こさない。これは、この技術に基づくＤＣＣＰＭについての重要な臨床解釈上の意味を有する。
【０２１１】
環化及び非環化Ｋ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８ＭペプチドのＨＰＬＣ分析によると、６．２２分の非環化ペプチドと類似した保持時間が示された（表８）が、環化プロセス及び結果的に得られる安定化ペプチドは、保持時間における増加を示した（表８）。３１０ヘリックス／ポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスの推定上の立体構造を有するペプチドは、Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ＝６．６２分及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍ＝６．５７分という幅広く類似した保持時間を有し、立体構造における変化を同定するためのＨＰＬＣの潜在的使用が強調される。
【０２１２】
ラクタム化の環化化学によって安定化されたＣＰＡは、ＰＭＯに複合されるとき、ＰＭＯの細胞侵入を促進する。
【０２１３】
閉環メタセシスの環化化学によって安定化されたＣＰＡの減少した電荷変異体は、効率的な細胞侵入ペプチドであり、インビトロで改善された毒性学的特性を有する。これは、この技術に基づくＤＣＣＰＭについての重要な臨床解釈上の意味を有する。
【０２１４】
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２２  Ｃｈｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ  ６，１１１−１１９，ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ４ＭＤ００１３１Ａ（２０１５）．
２３  Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｉｔｃｈｅｄ  α−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖｉａ  Ｂｉｓ  Ｒｉｎｇ−Ｃｌｏｓｉｎｇ  Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６，１２３１４−１２３２２，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ５０５１４１ｊ（２０１４）．
２４  Ｃａｎｔｅｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｖｉａ  ｉ  ｔｏ  ｉ＋４  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｔｏ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  １，３−ｄｉｐｏｌａｒ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７３，５６６３−５６７４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｏ８００１４２ｓ（２００８）．
２５  Ｂｒａｃｋｅｎ，Ｃ．，Ｇｕｌｙａｓ，Ｊ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．＆Ｂａｕｍ，Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ．ａｌｐｈａ．−Ｈｅｌｉｃａｌ，Ｂｉｃｙｃｌｉｃ，Ｌａｃｔａｍ−ＢｒｉｄｇｅｄＨｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１６，６４３１−６４３２，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０００９３ａ０５２（１９９４）．
２６  Ｌｅｈｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｐ６ａ−ＰＭＯ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２，３２０７−３２１７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２０（２０１４）．
２７  Ｎａｋａｓｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｉｓ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，４９２−５０１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ０６１２８２４（２００７）．
２８  Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＭＤＭ２  ａｎｄ  ＭＤＭＸ  ｆｏｒ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０，Ｅ３４４５−３４５４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０３００２１１０（２０１３）．
２９  Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｓ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  １８，５９７−６０５，ｄｏｉ：Ｓ０９６０−８９６６（０８）００１４１−７［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｎｍｄ．２００８．０５．０１１［ｄｏｉ］（２００８）．
３０  Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．，Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．，Ｋｏｌｅ，Ｒ．＆Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．Ｓ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ８５，４４４−４５３，ｄｏｉ：ｃｖｐ３３５［ｐｉｉ］１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｐ３３５［ｄｏｉ］（２０１０）．
３１  Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｅ−ｙｅａｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １９，５７６−５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２８８（２０１１）．
３２  Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，１４８１４−１４８１９，ｄｏｉ：０８０５６７６１０５［ｐｉｉ］１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０５６７６１０５［ｄｏｉ］（２００８）．
３３  Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６，１６２４−１６２９，ｄｏｉ：ｍｔ２００８１２０［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｍｔ．２００８．１２０［ｄｏｉ］（２００８）．
３４  Ｂｅｔｔｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｉｐ６−ＰＭＯ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｅｘｏｎ  Ｓｋｉｐｐｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ＤＭＤ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  １，ｅ３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１２．３０（２０１２）．
３５  Ｉｖａｎｏｖａ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＮＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６，６４１８−６４２８（２００８）．
３６  Ｌａｕｔｒｅｔｔｅ，Ｇ．，Ｔｏｕｔｉ，Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｇ．，Ｄａｉ，Ｐ．＆Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ，Ｂ．Ｌ．Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｒｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３８，８３４０−８３４３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ０３７５７（２０１６）．
３７  Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７１，３０４−３１３，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２３５２８（２０１２）．
３８  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｊｒ．＆Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｌｏｃｕｓ．Ｃｅｌｌ  ５１，９１９−９２８．（１９８７）．
３９  Ｍｏｎａｃｏ，Ａ．Ｐ．，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｉｅｃｈｔｉ−Ｇａｌｌａｔｉ，Ｓ．，Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．＆Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．Ａｎ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｐａｒｔｉａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＭＤ  ｌｏｃｕｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２，９０−９５（１９８８）．
４０  Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｘ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＤＭＤ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２，９０７−９１４（２００３）．
４１  Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｏｄｙｗｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，１７５−１７７（２００６）．
４２  Ｋｉｎａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｃａｌ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ＡＶＩ−４６５８  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ８，９１８−９２８，ｄｏｉ：Ｓ１４７４−４４２２（０９）７０２１１−Ｘ［ｐｉｉ］１０．１０１６／Ｓ１４７４−４４２２（０９）７０２１１−Ｘ［ｄｏｉ］（２００９）．
４３  Ｌｕ，Ｑ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｏｄｙ−ｗｉｄｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，１９８−２０３（２００５）．
４４  ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｃａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＰＲＯ０５１．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５７，２６７７−２６８６，ｄｏｉ：３５７／２６／２６７７［ｐｉｉ］１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０７３１０８［ｄｏｉ］（２００７）．
４５  Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １７，１３２−１４０，ｄｏｉ：ｇｔ２００９１２０［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｇｔ．２００９．１２０［ｄｏｉ］（２０１０）．
４６  Ｃｉｒａｋ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ  ２，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７８，５９５−６０５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０１４０−６７３６（１１）６０７５６−３（２０１１）．
【図１ａ】
2020525462.tif 000011
【図１ｂ】
2020525462.tif 000012
【図１ｃ】
2020525462.tif 000013
【図２ａ】
2020525462.tif 000014
【図２ｂ】
2020525462.tif 000015
【図２ｃ】
2020525462.tif 000016
【図２ｄ】
2020525462.tif 000017
【図３】
2020525462.tif 000018
【図４】
2020525462.tif 000019
【図５ａ】
2020525462.tif 000020
【図５ｂ】
2020525462.tif 000021
【図５ｃ】
2020525462.tif 000022
【図５ｄ】
2020525462.tif 000023
【図６ａ】
2020525462.tif 000024
【図６ｂ】
2020525462.tif 000025
【図６ｃ】
2020525462.tif 000026
【図６ｄ】
2020525462.tif 000027
【図７ａ】
2020525462.tif 000028
【図７ｂ】
2020525462.tif 000029
【図７ｃ】
2020525462.tif 000030
【図７ｄ】
2020525462.tif 000031
【図８ａ】
2020525462.tif 000032
【図８ｂ】
2020525462.tif 000033
【図８ｃ】
2020525462.tif 000034
【図８ｄ】
2020525462.tif 000035
【図９】
2020525462.tif 000036
【図１０ａ】
2020525462.tif 000037
【図１０ｂ】
2020525462.tif 000038
【図１０ｃ】
2020525462.tif 000039
【図１０ｄ】
2020525462.tif 000040
【図１１ａ】
2020525462.tif 000041
【図１１ｂ】
2020525462.tif 000042
【図１１ｃ】
2020525462.tif 000043
【図１１ｄ】
2020525462.tif 000044
【図１２ａ】
2020525462.tif 000045
【図１２ｂ】
2020525462.tif 000046
【図１３ａｉ】
2020525462.tif 000047
【図１３ａｉｉ】
2020525462.tif 000048
【図１３ａｉｉｉ】
2020525462.tif 000049
【図１３ｂｉ】
2020525462.tif 000050
【図１３ｂｉｉ】
2020525462.tif 000051
【図１３ｂｉｉｉ】
2020525462.tif 000052
【図１３ｃｉ】
2020525462.tif 000053
【図１３ｃｉｉ】
2020525462.tif 000054
【図１３ｃｉｉｉ】
2020525462.tif 000055
【図１４】
2020525462.tif 000056
【図１５ａ】
2020525462.tif 000057
【図１５ｂ】
2020525462.tif 000058
【図１５ｃ】
2020525462.tif 000059
【図１６】
2020525462.tif 000060
【配列表】
2020525462000001.app
【国際調査報告】
2020525462.tif 000061
2020525462.tif 000062
2020525462.tif 000063
2020525462.tif 000064