(57)【要約】  例えば次世代配列決定などの配列決定のための正規化ライブラリの調製のための方法及び／又はシステムの実施形態は、１又は複数の正規化アンプリコンライブラリを生成すること；１又は複数の正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成すること；及び／又はアンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定に関連した１又は複数の正規化された連結配列ライブラリを生成すること、の内の１又は複数を含むことができる。
2020535121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的及び微生物コミュニティのセットに関連した配列決定のための正規化された連結ライブラリの調製のための方法であって、
微生物コミュニティに由来する微生物に関連した少なくとも１つの試料の標的分子を用いた第１増幅プロセスに基づいてアンプリコン標的分子のセットを生成すること、ここで、前記標的分子は前記標的のセットに対応し；
前記少なくとも１つの試料からの全核酸のセットの処理に基づいて微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること、ここで、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットが、メタゲノム関連核酸フラグメントのセット及びメタトランスクリプトミクス関連核酸フラグメントのセットのうちの少なくとも１つを含み；
前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを用いて第２増幅プロセスに基づいて正規化混合物を生成すること；及び
前記正規化混合物を用いた第３増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了分子のセットを含む正規化された連結ライブラリを生成すること、ここで、前記配列決定準備完了分子のセットが前記標的及び前記微生物コミュニティのセットに関連する；
を含む、標的及び微生物コミュニティのセットに関連した配列決定のための正規化された連結ライブラリの調製のための方法。
【請求項２】
前記正規化混合物を生成することが、前記アンプリコン標的分子のセット、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット並びに前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットに対するアニーリングのための外部定義配列領域を含む正規化プライマーのセットを用いた前記第２増幅プロセスに基づいて前記正規化混合物を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記正規化された連結ライブラリを生成することが、前記正規化混合物と前記配列決定に関連したアダプター領域を含む配列決定プライマーのセットとを用いた前記第３増幅プロセスに基づいて前記正規化された連結ライブラリを生成することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記正規化混合物を生成することが、アンプリコン関連配列決定リード数及び微生物コミュニティ関連配列決定リード数の所望の比に基づいて前記アンプリコン標的分子のセットと前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットとの間の濃度比を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記配列決定準備完了分子のセットにおける追加的正規化プロセスを実施することをさらに含む方法であって、前記追加的正規化プロセスを行うことが、
磁気ビーズを所望の比に希釈すること；
前記磁気ビーズ及び前記配列決定準備完了分子のセットによる結合プロセスに基づいてビーズ−分子複合物のセットを生成すること；
前記ビーズ−分子複合物のセットを磁界システムのインターフェイス板に付着させること；及び
前記ビーズ−分子複合物のセットを前記インターフェイス板から分離すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンプリコン標的分子のセットを生成する前に、
配列決定のための正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリの調製を容易にするために前記試料に由来する微生物ＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；及び
配列決定のための正規化ライブラリの調製を容易にするためにｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換すること；
のうちの少なくとも１つを実施すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
配列決定のための正規化アンプリコンライブラリの調製のための方法であって、
少なくとも１つの試料及び前記少なくとも１つの試料に由来する標的分子に対応する標的のセットに関連したアンプリコン生成プライマーのセットを用いた第１増幅プロセスに基づいてアンプリコン標的分子のセットを生成すること；
前記アンプリコン標的分子のセット及び正規化プライマーのセットを用いた第２増幅プロセスに基づいて正規化標的分子のセットを生成すること；及び
前記正規化標的分子のセット及び配列決定ライマーのセットを用いた第３増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了標的分子のセットを生成すること；
を含む、方法。
【請求項８】
前記アンプリコン生成プライマーのセットが、第１の外部定義配列領域を含み、
前記アンプリコン標的分子のセットを生成することが、前記第１増幅プロセスに基づいて前記第１の外部定義配列領域を前記標的分子に付加することを含み；及び
前記正規化プライマーのセットが、前記第１の外部定義配列領域に関連した第２の外部定義配列領域を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アンプリコン生成プライマーのセットが、前記標的分子の標的配列領域へのアニーリングのための標的関連領域をさらに含み、及び
前記正規化標的分子のセットを生成することが、前記第２増幅プロセスのために、前記第１の外部定義配列領域と前記第２の外部定義配列領域との間のアニーリングのための定義量の前記正規化プライマーのセットを付加することを含む、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンプリコン生成プライマーのセットが、固有分子識別子（ＵＭＩ）領域を含み、各ＵＭＩ領域がランダム「Ｎ」塩基のセットをさらに含み、各ランダム「Ｎ」塩基が、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基及び「Ｃ」塩基のうちのいずれか１つから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンプリコン生成プライマーのセットが、前記配列決定に関連した第１のアダプター領域をさらに含み、
前記アンプリコン標的分子のセットを生成することが、前記第１増幅プロセスに基づいて前記第１のアダプター領域を前記標的分子に付加することを含み、
前記正規化標的分子のセットが、付加された前記第１のアダプター領域を含み、及び
前記配列決定プライマーのセットが、前記正規化標的分子のセットの付加された前記第１のアダプター領域へのアニーリングのための第２アダプター領域を含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１増幅プロセスが第１ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを含み、
前記第２増幅プロセスが第２ＰＣＲプロセスを含み、
前記第３増幅プロセスが第３ＰＣＲプロセスを含み、及び
前記配列決定プライマーのセットが、次世代配列決定システムによる配列決定を容易にするための配列決定アダプター領域を含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記配列決定準備完了標的分子のセットについて追加的正規化プロセスを実施することをさらに含む、請求項７に記載の方法であって、
前記追加的正規化プロセスを実施することが、
磁気ビーズを所望の比に希釈すること；
前記磁気ビーズ及び前記配列決定準備完了標的分子のセットによる結合プロセスに基づいてビーズ−標的分子のセットを生成すること；
前記ビーズ−標的分子のセットを磁界システムのインターフェイス板に付着させること；及び
前記ビーズ−標的分子のセットを前記インターフェイス板から分離すること；
を含む、方法。
【請求項１４】
前記アンプリコン標的分子のセットを生成することが、前記第１増幅プロセスの生成物の精製プロセスを実施して、前記アンプリコン生成プライマーのセットを前記第１増幅プロセスの前記生成物から除去することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成することが、前記第３増幅プロセスの生成物の濃度を増加させることを含み、
前記第３増幅プロセスの生成物の濃度を増加させることが、
前記第３増幅プロセスの生成物及び前記配列決定プライマーのアダプター領域へのアニーリングのための追加的プライマーに基づいて第４増幅プロセスを実施すること；及び
より少ない量の溶出によるシリカカラムへの試料結合実施すること；
のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
アンプリコン標的分子のセットを生成することが、前の工程として、
配列決定のための正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリの調製を容易にするために、前記試料に由来する微生物ＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；
配列決定のための正規化ライブラリの調製を容易にするために、ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換すること；及び
少なくとも１つの試料及び少なくとも１つの試料に由来する標的分子に対応する標的のセットに関連したアンプリコン生成プライマーのセットを用いた第１増幅プロセスに基づいて二本鎖ｃＤＮＡからアンプリコン標的分子のセットを生成すること；
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
配列決定のための正規化微生物コミュニティ関連ライブラリの調製のための方法であって、
試料の全核酸から微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること、ここで、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットは、メタゲノム関連核酸フラグメントのセット及びメタトランスクリプトミクス関連核酸フラグメントのセットのうちの少なくとも１つを含み；
前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及びライゲーションアダプター分子のセットによるライゲーションプロセスに基づいてライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること；
前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び正規化プライマーのセットを用いた第１増幅プロセスに基づいて正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること；及び
前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び配列決定プライマーのセットを用いた第２増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること、ここで、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットは、配列決定準備完了メタゲノム関連フラグメントのセット及び配列決定準備完了メタトランスクリプトミクス関連フラグメントのセットのうちの少なくとも１つを含む；
を含む方法。
【請求項１８】
前記ライゲーションアダプター分子のセットが第１の外部定義配列領域を含み、
前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することが、前記ライゲーションプロセスに基づいて前記第１の外部定義領域を前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットに付加することを含み、及び
前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することが、前記第１増幅プロセスのために、前記正規化プライマーのセットの第１の外部定義配列領域と第２の外部定義配列領域との間のアニーリングのための定義量の前記正規化プライマーのセットを付加することを含む、
請求項１７に記載の方法
【請求項１９】
前記ライゲーションアダプター分子のセットが、前記配列決定に関連した第１のアダプター領域をさらに含み、
前記ライゲーションアダプター分子のセットを生成することが、前記ライゲーションプロセスに基づいて前記第１のアダプター領域を前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットに付加することを含み、
前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットが、付加された前記第１のアダプター領域を含み、及び
前記配列決定プライマーのセットが、正規化標的分子のセットの付加された前記第１のアダプター領域に対するアニーリングのための第２のアダプター領域を含む、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライゲーションアダプター分子のセットが、固有分子識別子（ＵＭＩ）領域を含み、各ＵＭＩ領域が、ランダム「Ｎ」塩基のセットをさらに含み、各ランダム「Ｎ」塩基が、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基及び「Ｃ」塩基のうちのいずれか１つから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットについて追加的正規化プロセスを実施することを含む請求項１７に記載の方法であって、前記追加的正規化プロセスを実施することが、
磁気ビーズを所望の比に希釈すること；
前記磁気ビーズ及び前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる結合プロセスに基づいてビーズ−フラグメントのセットを生成すること；
前記ビーズ−フラグメントのセットを磁界システムのインターフェイス板に付着させること；及び
前記ビーズ−フラグメントのセットを前記インターフェイス板から分離すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
配列決定のための正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリの調製を容易にするために前記試料に由来する微生物ＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；
前記試料の第１の核酸に対応する第１の配列を選択的に富化するために第１の標的捕捉プロセスを実施すること；及び
前記試料の第２の核酸に対応する第２の配列を選択的に欠失させるために第２の標的捕捉プロセスを実施すること、
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
試料の全核酸から微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することが、前の工程として、
配列決定のための正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリの調製を容易にするために前記試料に由来する微生物ＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；
配列決定のための正規化ライブラリの調製を容易にするためにｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換すること；及び
試料の二本鎖ｃＤＮＡから前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること、ここで、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットが、前記メタゲノム関連核酸フラグメントのセット及び前記メタトランスクリプトミクス関連核酸フラグメントのセットのうちの少なくとも１つを含む；
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月８日に出願された米国仮出願第６２／５５５，７８２号、２０１７年１１月６日に出願された米国仮出願第６２／５８２，１６２号、及び２０１８年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／６７１，４１０号の利益を主張するものであり、それらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概してゲノミクス及び分子生物学に関する。
【背景技術】
【０００３】
次世代配列決定（ＮＧＳ）技術（例えば、ＮＧＳプラットフォーム）は、ＤＮＡ配列決定及び／又は他の核配列決定のコストを低下させることが可能であり、得られた情報の質を向上させることが可能であり、且つ／又は配列決定プロセスのスケーラビリティを向上させることが可能である。ＮＧＳ技術は、正確な標的ＤＮＡ配列及び／又は他の適切な配列の検出及び解読を可能にし得る、高い分析深度における少数〜多数のＤＮＡ試料及び／又は他の核酸試料の配列決定を容易にすることが可能である。異なる核酸（例えば、異なるＤＮＡ核酸、など）の混合物を同時に分析することが可能であり、それによって複雑混合物（例えば、微生物を含む複雑な生態学的コミュニティから抽出されるＤＮＡ及び／又は他の核酸など）及び／又は保存配列のプールからのまれなＤＮＡ配列変異体（例えば、大きな組織の少数の細胞内のまれな突然変異の生成など）の組成の分析を容易にすることが可能になる。しかし、ＮＧＳ及び／又は他の配列決定アプローチのための配列決定ライブラリの構築は、様々なバイアス（例えば、ＤＮＡ標的などの異なる標的の方、標的間の比の方など）を導入する可能性があるライブラリ調製プロセス（例えば、ＤＮＡ操作、増幅など）を含む可能性がある。例えば、配列決定ライブラリの過度に多い標的分子によって、過度に少ない他の標的分子の検出が低下する可能性がある。さらに、配列決定されたリード数が、必ずしも（例えば、同じ配列決定操作で配列決定された）ライブラリ中に又は元の混合物中に存在する正比例の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を表しているわけではない可能性があり、このことは、絶対的な定量的データ（例えば、分析対象の元の生物学的試料の組成の正確な数字又は推定値など）を生成することの困難を示すことができる。
【発明の概要】
【０００４】
また、アンプリコン関連配列決定（例えば、生物学的試料中の１又は複数の微生物分類群の同定などのための単一の又は少数の遺伝子領域に関連した分析など）又は微生物コミュニティ関連配列決定（例えば、単一遺伝子アンプリコンの分析とは対照的な、核酸の全コミュニティを含むものなど、生物学的試料の微生物コミュニティ及び／又は他の適切な生態学的コミュニティに関連した分析など）のために、ＮＧＳ技術及び／又は他の適切な配列決定技術を用いることができる。しかし、本明細書に記載されるバイアスは、追加的に又は代替的に、そのような配列決定用途のためのライブラリ調製に関連する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、方法の実施形態の変形例のフローチャート表現を含む。
【図２】図２は、方法の実施形態の変形例のフローチャート表現を含む。
【図３】図３は、方法の実施形態の変形例のフローチャート表現を含む。
【図４】図４は、方法の実施形態の変形例のフローチャート表現を含む。
【図５】図５は、方法の実施形態の変形例のフローチャート表現を含む。
【図６】図６は、正規化された配列決定ライブラリの生成に関連したグラフ表現の具体例を含む。
【図７】図７は、正規化された配列決定ライブラリの生成に関連したグラフ表現の具体例を含む
【図８】図８は、磁気に基づいた正規化プロセスの実施に関連したグラフ表現の具体例を含む。
【図９】図９は、磁気に基づいた正規化プロセスの実施に関連したグラフ表現の具体例を含む。
【図１０】図１０は、磁気に基づいた正規化プロセスの実施に関連した視覚的表現の具体例を含む。
【図１１】図１１は、磁気に基づいた正規化プロセスの実施に関連したグラフ表現の具体例を含む。
【図１２】図１２は、磁気に基づいた正規化プロセスの実施に関連したグラフ表現の具体例を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
実施形態の以下の記載は、実施形態を限定することを意図するものではなく、むしろあらゆる当業者の作製及び使用を可能にするものである。
【０００７】
１．概要
図１に示されるように、方法１００（例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）などの配列決定のための正規化ライブラリの調製のため；例えば微生物核酸の配列決定のための微生物に関連したライブラリの調製のため；などの）の実施形態は、１若しくは複数の正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０、及び／又は１若しくは複数の正規化微生物コミュニティ関連ライブラリ（例えば、正規化メタゲノム関連ライブラリ、正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリなど）を生成することＳ１２０、の内の１又は複数を含むことができる。
【０００８】
具体例において、方法１００（例えば、配列決定のための正規化アンプリコンライブラリの調製のための）は、少なくとも１つの試料及び前記少なくとも１つの試料に由来する標的分子に対応する標的のセットに関連したアンプリコン生成プライマーのセットによる第１増幅プロセスに基づいてアンプリコン標的分子のセットを生成すること、前記アンプリコン標的分子のセット及び正規化プライマーのセットによる第２増幅プロセスに基づいて正規化標的分子のセットを生成すること；及び／又は前記正規化標的分子のセット及び配列決定プライマーのセットによる第３増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｒｅａｄｙ）標的分子のセット（例えば、ＮＧＳのために適切な正規化配列決定準備完了標的分子など）を生成すること、の内の１又は複数を含むことができる。
【０００９】
具体例において、前記方法１００（例えば、配列決定のための正規化微生物コミュニティ関連ライブラリの調製のためなど）は、試料の全核酸から微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することであって、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットが、メタゲノム関連核酸フラグメントのセット及びメタトランスクリプトミクス関連核酸フラグメントのセットの内の少なくとも１つを含む、生成すること；ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及びライゲーションアダプター分子のセットによるライゲーションプロセスに基づいて生成すること；前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び正規化プライマーのセットによる第１増幅プロセスに基づいて正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること；並びに／又は前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び配列決定プライマーのセットによる第２増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、ＮＧＳのために適切な正規化配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントなど）を生成することであって、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットが、配列決定準備完了メタゲノム関連フラグメントのセット及び配列決定準備完了メタトランスクリプトミクス関連フラグメントのセットの内の少なくとも１つを含む、生成すること、の内の１又は複数を含むことができる。
【００１０】
追加的に又は代替的には、図１〜図３に示されるように、方法１００の実施形態は、アンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定（例えば、メタゲノム関連配列決定及びメタトランスクリプトミクス関連配列決定の内の少なくとも１つなど）に関連した（例えば、使用可能な、など）連結配列決定ライブラリなどの連結配列決定ライブラリ（例えば、集積配列決定ライブラリ）を生成することＳ１５０を含むことができる。
【００１１】
図２〜図３に示されるように、前記方法１００の実施形態（例えば、連結配列決定ライブラリを調製することＳ１５０を含む前記方法１００の実施形態の部分など）は、追加的に又は代替的に、前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる正規化プロセス（例えば、アンプリコン標的分子を生成するために第１増幅プロセスを用いることができるものなどの第２ＰＣＲプロセスなどの第２増幅プロセスなど）を行うことに基づいて正規化混合物を生成することＳ１５６；及び／又は前記正規化混合物に基づいて（例えば、前記正規化混合物による第３増幅プロセスに基づいて；前記正規化混合物及び前記配列決定プライマーのセットによる第３ＰＣＲプロセスに基づいて；など）（例えば、配列決定準備完了標的分子のセットなどを含む）正規化された連結ライブラリを生成することＳ１５８、を含むことができる。
【００１２】
具体例において、（例えば、標的及び微生物コミュニティのセットに関連した配列決定のための正規化された連結ライブラリの調製のためなどの）方法１００は、前記微生物コミュニティに由来する微生物に関連した少なくとも１つの試料の標的分子による第１増幅プロセスに基づいてアンプリコン標的分子のセットを生成することであって、前記標的分子が前記標的のセットに対応する、生成すること；少なくとも１つの試料から全核酸のセットの処理を行うことに基づいて微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することであって、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットがメタゲノム関連核酸フラグメントのセット及びメタトランスクリプトミクス関連核酸フラグメントのセットの内の少なくとも１つを含む、生成すること；前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる第２増幅プロセスに基づいて正規化混合物を生成すること；及び／又は前記正規化混合物による第３増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了分子のセットを含む前記正規化された連結ライブラリを生成することであって、前記配列決定準備完了分子のセットが前記標的及び前記微生物コミュニティのセットに関連する、生成すること、の内の１又は複数を含むことができる。
【００１３】
追加的に又は代替的には、前記方法１００の実施形態は、代替的又は追加的な磁気系正規化プロセスを実施することＳ１６０；腸部位（例えば、大便試料等に基づいて分析されるものとしての、など）、皮膚部位、鼻部位、口腔部位、性器部位及び／又は他の適切な生理学的部位の内の１又は複数を含むことができる１又は複数の身体部位から回収された生物学的試料など、１又は複数の使用者（例えば、対象；ヒト；動物；患者；植物；など）に由来する１又は複数の生物学的試料の処理（例えば、回収；前記方法１００の実施形態の部分を容易にするための試料調製；前記方法１００の実施形態の部分の実施；など）を実施すること；正規化結果の向上及び／又は他の適切な目的のためなどの（例えば、本明細書に記載される特定の増幅プロセスのため、などの）プライマーセットのプライマーの他のサブセット（例えば、第２標的を標的とするプライマーのサブセット；など）に対するプライマーの１又は複数のサブセット（例えば、第１標的を標的とするプライマーのサブセット；など）の濃度を調整すること；微生物配列データセット（例えば、前記方法１００の実施形態の部分から生成された配列決定ライブラリによる配列決定に基づいて生成された微生物配列データセット；本明細書に記載されるように調製された配列決定ライブラリの配列決定領域に関連した生物情報分析から生成された微生物配列データセット；など）に基づいてマイクロバイオーム特性（例えば、微生物組成特性；微生物機能特性；診断及び／又は治療に関連したものなど、微生物関連条件に関連した特性；など）を決定すること、を含むことができる。しかし、前記方法１００の実施形態は、追加的に又は代替的に、任意の適切なプロセスも含むことができる。
【００１４】
前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、正規化アンプリコンライブラリの内の１又は複数を含むものなどの１又は複数の正規化配列決定ライブラリ（例えば、核酸標的に関連するものなど、標的の初期入力から独立したものなど、１又は複数の試料からの標的の平衡出力を有する配列決定ライブラリなど）、正規化微生物コミュニティ関連ライブラリ（例えば、正規化メタゲノム関連ライブラリ；正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリ；など）、正規化された連結ライブラリ（例えば、正規化された連結アンプリコンライブラリ及び微生物コミュニティ関連ライブラリ；正規化集積配列決定ライブラリ；など）及び／又は他の適切なライブラリの調製を容易にする；固有分子識別子（ＵＭＩ）系分子（例えば、ＵＭＩ系プライマー；ＵＭＩ領域を含むアンプリコン生成プライマーなどのＵＭＩ領域を含むプライマー；ＵＭＩ領域を含むライゲーションアダプター分子；など）を用いることなどによる、そのようなライブラリのための分子（例えば、標的分子、微生物コミュニティ関連フラグメントなど）の絶対的定量を容易にする；並びに／又は微生物関連配列決定などに関連した他の適切なライブラリ調製関連目標及び／若しくはライブラリ配列決定関連目標を容易にする、機能を果たすことができる。ここで、我々は、アンプリコン型及びメタゲノム／メタトランスクリプトミクス型の両方の平衡次世代配列決定ライブラリの構築におけるそれらの使用のための前記多様なＤＮＡ標的の正規化量を得るための簡便で、多重化可能で、且つ自動化可能なプロトコルを記載する。
【００１５】
追加的に又は代替的には、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、配列決定技術に関連したバイアス（例えば、配列決定ライブラリ調製の従来のアプローチに関連したバイアス；１又は複数の元の生物学的試料に由来する個別の分子及び／又は標的分子の元の比に影響を及ぼすバイアス；ＮＧＳ技術及び／又は他の適切な配列決定技術に関連したバイアス；など）を低下させる；（例えば、特異的多段階増幅プロセスに基づいて分子の量を正規化することなどによって）アンプリコンライブラリ及び／又は微生物コミュニティ関連ライブラリ（例えば、メタゲノム関連ライブラリ；メタトランスクリプトミクス関連ライブラリ；など）に関連した標的（例えば、核酸；ＤＮＡ分子；１又は複数の元の試料中における核酸；など）及び／又は他の適切な成分の定量分析（例えば、絶対量の分析；分子、対立遺伝子、遺伝子変異体及び／又は他の成分の絶対的定量；など）を向上させる；（例えば、ＲＮＡからＤＮＡへの転化の後の；メタトランスクリプトミクス関連ライブラリ調製のための；など）ＲＮＡ転写物の正規化に関連したプロセスを向上させる；（例えば、ライブラリ調製に関連した正規化を容易にするための自動化可能プロセスなどによって）自動化を向上させる；初期鋳型コピー数から独立したものなどの試料内及び／又は試料間の異なる標的のための正規化プロセスを向上させる；複雑混合物中に複数の標的を含むライブラリの調製を同時に向上させる；及び／又はライブラリ調製及び／又はライブラリ配列決定に関連した任意の適切なプロセスを向上させる、機能を果たすことができる。
【００１６】
追加的に又は代替的には、変形例において、前記方法１００及び／又はシステム２００は、磁性粒子及び１又は複数の磁界システム（例えば、標的分子に結合した磁性粒子に磁界を印加するように構成された；など）の適用を向上させることによって、自動化を向上させる、コストを低下させる、及び正規化を容易にする、機能を果たすことができる。
【００１７】
追加的に又は代替的には、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、アンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定の両方の（例えば、欠点を相殺することができる；微生物コミュニティの大量の微生物の方への分析バイアスを低下させ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ｒｐｏＢ及び／又は他のマーカーなどの分類学マーカーに関するなどの標的のための保存領域及び他の分類群からの区別のための可変領域を含むプライマー設計などのための標的の特性決定の程度のための必要性を低下させる新しい長所を容易にすることができる；など）長所（例えば、標的遺伝子及び／又は他の標的を含む微生物コミュニティにおける生物の大きいフラグメントの分析を可能にするなどのアンプリコン関連配列決定の長所；マイクロバイオーム組成、マイクロバイオーム機能、関連する多様性及び／又は他の適切な特性の両方に関連する微生物コミュニティの特性決定を可能にするなどの全コミュニティＤＮＡに基づいた微生物コミュニティのバイアスのない分析を可能にするなどの微生物コミュニティ関連配列決定の長所；など）に影響を及ぼすなど、（例えば、ＮＧＳ技術及び／又は他の適切な配列決定技術による配列決定のための；など）アンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定の実施（例えば、組み合わせることなど）を同時に容易にするためなどの連結配列決定ライブラリの調製を可能にする機能を果たすことができる。
【００１８】
具体例において、前記方法１００は、（例えば、１６Ｓ、１８Ｓ、ＩＴＳなどの分類学関連遺伝子などのための）連結アンプリコン及び（例えば、抗生物質遺伝子、病原性遺伝子、ヒト標識遺伝子などの機能関連遺伝子のメタゲノム検出を可能にするための；ウイルスなどの複数のＲＮＡ生物の検出を可能にするための；ｍＲＮＡにより、生物学的試料に由来する宿主及び微生物転写遺伝子の検出を可能にするための；メタゲノムＤＮＡライブラリ；など）微生物コミュニティ関連ライブラリを生成することを含むことができる。具体例において、前記方法１００は、幅広い標的核酸（例えば、ＤＮＡ）ライブラリを生成することを含むことができる。
【００１９】
追加的に又は代替的には、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、１又は複数の生物学的試料における生物の方向づけられた分類学プロファイリング（及び／又は他の適切な組成関連分析）のためのデータ（例えば、微生物配列データなど）の提供を容易にする、並びに１又は複数の微生物関連状態のための特徴付け（例えば、診断、分析、情報提供など）及び／又は治療上の介入（例えば、治療の提供；治療の推奨の提供；など）を容易にするなどのための、標準的な又は公知のゲノムに基づいた機能関連分析（例えば、マイクロバイオーム機能性特徴の決定など）の実施に対して追加的な又は代替的な方法などにおける、（例えば、メタゲノム関連配列決定及び／又はメタトランスクリプトミクス関連配列決定などの微生物コミュニティ関連アプローチなどによる）生物の遺伝的機能性プロファイリング（及び／又は他の適切な機能関連分析）のためのデータ（例えば、微生物配列データなど）の提供を容易にする、機能を果たすことができる。
【００２０】
追加的に又は代替的には、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、微生物関連検出（例えば、試料の生物の分類学的検出、及び同じ試料において存在する又は発現した遺伝子の検出；方向づけられたやり方における保存分類学的遺伝子を有する生物の検出、及び／又は１若しくは複数の生物学的試料における特徴づけられた又は前もって特徴づけられたわけではないＤＮＡを有する他の真核生物、原核生物、ウイルス生物及び／若しくは他の適切な微生物のバイアスのない検出；低下したバイアスのライブラリ調製を容易にするための正規化を伴う１６Ｓ、１８Ｓ、ＩＴＳなどの特異的標的若しくは領域の増幅又は任意の他の部位特異的系技術などの強化系プロトコルを補完することなどによる新しい、不明な及び／又は同定されていない潜在的核酸標的の検出；富化プロトコル又は欠失プロトコルを補完することなどによる抗生物質耐性、毒性因子分子マーカー及び対象の他の適切な標的に関連したものなどの知られた又は同定された核酸標的のバイアスのない方法における検出；など）を容易にする機能を果たすことができる。しかし、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、任意の適切な機能を含むことができる。
【００２１】
前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、好ましくは、ＮＧＳ（例えば、ＮＧＳ技術）に関連したライブラリ調製を容易にする。ＮＧＳは、ハイスループット配列決定（例えば、ハイスループット配列決定技術によって容易にされるもの；大規模並列符号配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、４５４ピロシーケンス、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子配列決定、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定、ナノ細孔ＤＮＡ配列決定など）、任意の生成数の配列決定技術（例えば、第二世代配列決定技術、第三世代配列決定技術、第四世代配列決定技術など）、アンプリコン関連配列決定（例えば、標的化アンプリコン配列決定）、微生物コミュニティ関連配列決定（例えば、メタトランスクリプトミクス配列決定、メタゲノム配列決定など）、合成による配列決定、トンネル電流配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、質量スペクトロメトリー配列決定、顕微鏡検査系手法及び／又は任意の適切なＮＧＳ技術の内のいずれか１又は複数を含むことができる。
【００２２】
追加的に又は代替的には、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、キャピラリー配列決定、サンガー配列決定（例えば、マイクロ流体サンガー配列決定など）、ピロシーケンス、ナノ細孔配列決定（Ｏｘｆｏｒｄナノ細孔配列決定など）及び／又は任意の適切な配列決定技術によって容易にされる任意の他の適切な型の配列決定の内のいずれか１又は複数を含むことができる任意の適切な配列決定（例えば、任意の適切な配列決定技術など）に関連したライブラリ調製及び／又は他の適切なプロセスを容易にすることができる。
【００２３】
前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、疾患、症候、原因（例えば、トリガーなど）、障害、関連リスク（例えば、傾向スコアなど）、関連重症度、行動（例えば、カフェイン消費、習慣、食事など）及び／又は微生物関連異常に関連した任意の他の適切な態様の内の１又は複数を含むことができる１又は複数の微生物関連異常のための特性決定及び／又は治療を（例えば、配列決定ライブラリの配列決定から誘導された微生物配列データセットに基づいて；など）容易にするための配列決定ライブラリ調製を向上させることができる。微生物関連異常は、胃腸関連異常（例えば、過敏性腸症候群、炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、腹腔疾患、クローン病、鼓脹、痔疾患、便秘、逆流、血便、下痢など）；アレルギー関連異常（例えば、小麦、グルテン、乳製品、ダイズ、ピーナッツ、甲殻類、木ナッツ、卵などに関連したアレルギー及び／又は不耐症）；皮膚関連異常（例えば、座瘡、皮膚筋炎、湿疹、酒さ、皮膚乾燥、乾癬、フケ、光過敏症など）；歩行運動関連異常（例えば、痛風、関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、多発性硬化症、パーキンソン病など）；癌関連異常（例えば、リンパ腫；白血病；芽腫；胚細胞腫瘍；癌腫；肉腫；乳癌；前立腺癌；基底細胞癌；皮膚癌；結腸癌；肺癌；任意の適切な生理学的な領域に関連した癌異常；など）、心臓血管関連異常（例えば、冠動脈性心疾患、炎症性心疾患、弁膜性心疾患、肥満、卒中発作など）、貧血状態（例えば、サラセミア；鎌型赤血球；悪性；ファンコニ；溶血性（ｈａｅｍｏｌｙｉｔｉｃ）；形成不全性；鉄欠乏症；など）、神経関連異常（例えば、ＡＤＨＤ、ＡＤＤ、不安、アスペルガー症候群、自閉症、慢性疲労症候群、うつ病など）、自己免疫関連異常（例えば、スプルー、エイズ、シェーグレン、狼瘡など）、内分泌物関連異常（例えば、肥満、グレーブス病、橋本甲状腺炎、代謝病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病など）、ライム病状態、コミュニケーション関連異常、睡眠関連異常、代謝関連異常、体重関連異常、疼痛関連異常、遺伝子関連異常、慢性疾患及び／又は任意の他の適切な型の疾患関連状態の内のいずれか１又は複数を含むことができる１又は複数の疾患関連状態を含むことができる。追加的に又は代替的には、微生物関連状態は、カフェイン消費、アルコール消費、他の食物品目の消費、食事補助食品の消費、生菌関連行動（例えば、消費、回避など）、他の食事行動、習慣行動（例えば、喫煙；低い運動異常、中程度の運動異常及び／又は極度の運動異常などの運動異常；など）、閉経、他の生物学的プロセス、社会的行動、他の行動及び／又は任意の他の適切なヒト行動異常の内のいずれか１又は複数を含むことができる１又は複数のヒト行動異常を含むことができる。異常は、任意の適切な表現型（例えば、ヒト、動物、植物、真菌体などについて測定可能な表現型）に関連することができる。
【００２４】
前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、１又は複数の使用者に由来する１又は複数の生物学的試料から配列決定ライブラリを調製するために前記方法１００の実施形態の部分を行うことなどに関連して１又は複数の使用者に由来する１又は複数の生物学的試料について実施され得る。追加的に又は代替的には、実施形態は、セットの使用者が（例えば、微生物関連状態、人口動態的特徴行動、マイクロバイオーム組成及び／又は機能などに関連した）任意の適切な型の特性についての任意の他の対象と同様の及び／又は異なる対象を含むことができるセットの使用者（例えば、使用者を含む対象の集団、使用者を含まない対象の集団など）に由来する生物学的試料について実施され得；（例えば、前記方法１００の実施形態の部分に影響を及ぼす特性などの特性を共有する；など）使用者のサブグループについて実施され得；植物、動物、（例えば、環境的微生物コミュニティに由来する；など）微生物及び／又は任意の他の適切な実体について実施され得る。したがって、（例えば、前記方法１００の実施形態の部分を行う際に用いられる実験的パラメータなどに関連した）続く使用者についての追加的見識を提供するために、セットの使用者（例えば、対象の集団、セットの対象、使用者のサブグループなど）に由来する情報を用いることができる。変形例において、集積された生物学的試料のセットは、異なる人口動態（例えば、性別、年齢、配偶者関係、民族、国籍、社会経済状態、性的指向など）、異なる微生物関連状態（例えば、健康状況及び疾患状況；異なる遺伝子的素因；など）、異なる生活状況（例えば、一人暮らし、ペットとの生活、重要な他者との生活、子供との生活、など）、異なる食習慣（例えば、雑食性、菜食主義、絶対菜食主義、砂糖消費、酸消費、カフェイン消費など）、異なる行動傾向（例えば、身体的活動のレベル、薬物使用、アルコール摂取など）、（例えば、所定の期間内に移動した距離に関連した）異なるレベルの移動性、及び／又は、異なる型の使用者、アンプリコン関連特性及び微生物コミュニティ関連の特性（例えば、アンプリコン関連特性及び微生物コミュニティ関連特性が、同時のアンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定のための正規化された連結配列決定ライブラリなどの連結配列決定ライブラリに由来する微生物配列データセットに基づいて決定され得る、など）のための、比較のためなどの、任意の他の適切な特性（例えば、マイクロバイオーム組成及び／又は機能に影響する、相関する、及び／又は、それ以外の場合、関連した特性など）の内の１又は複数の使用者を含むなどの多種多様な使用者に関連する可能性があり、且つ処理され得る。例において、使用者の数が増加すると、使用者のマイクロバイオームに基づいて様々な使用者を特徴づけることなどに関連して（例えば、使用者についての試料についての異なる回収部位などに関連して）前記方法１００の実施形態の部分において実施されるプロセスの予測力が増加する可能性がある。しかし、任意の適切な１又は複数の実体についての任意の適切な方法で、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の部分を実施し、且つ／又は構成することができる。
【００２５】
微生物コミュニティは、以下の内の少なくとも１又は複数を含む任意の適切な型（例えば、細菌、古細菌、真菌、原生動物、藻類、ウイルスなど）及び／又は分類群の任意の適切な微生物を含むことが可能であり、関することが可能であり、且つ／又は、それ以外の場合、関連することが可能である。
【００２６】
本明細書に記載されるデータ（例えば、正規化プロセスに関連したデータ；ＰＣＲプロセスなどの増幅プロセスに関連したデータ；本明細書に記載されるプライマーに関連したデータ；配列決定リード数、微生物配列データセット及び／又は他の適切な配列決定データなどの配列決定に関連したデータ；マイクロバイオーム特性；使用者データ；補足データ；微生物関連状態に関連したデータ；など）は、データがいつ回収されたのかを示す時間的指標（例えば、試料がいつ回収されたのかを示す時間的指標；など）、データがいつ決定されたのかを示す時間的指標（例えば、試料処理作業がいつ開始した、完了したなどを示す時間的指標）、データがいつ伝送されたのかを示す時間的指標、データがいつ受信されたのかを示す時間的指標、及び／又は、それ以外の場合、データがいつ処理されたのかを示す時間的指標；データに記載された内容に対捨て文脈を提供する時間的指標；時間的指標の変化（例えば、ＰＣＲのサイクルにわたる生成物の変化などの経時的な試料処理作業の出力の変化；など）；及び／又は時間に関連する任意の他の適切な指標、の内の１又は複数を含む任意の適切な時間的指標（例えば、秒、分、時間、日、週など）に関連する可能性がある。本明細書に記載される分子及び／又は任意の適切な生体成分は、任意の適切な大きさ（例えば、配列長など）を含むことができる。
【００２７】
追加的に又は代替的には、パラメータ、基準値、入力、出力及び／又は他の適切なデータは、スコア、単一値、集約値、二進値、相対値、分類、信頼度レベル、識別子、スペクトルに沿った値及び／又は任意の他の適切な型の値の内のいずれ１又は複数を含む値の型に関連することができる。本明細書に記載される任意の適切な型のデータ、成分（例えば、生物学的成分）、（例えば、試料処理作業などの）生成物は、（例えば、異なる増幅プロセスなどの異なる試料処理作業；モデル；混合物；配列決定技術；などのための）入力として使用され得、（例えば、異なるモデル；モジュール；試料処理作業の生成物；などの）出力として生成され得、且つ／又は前記方法１００及び／若しくはシステム２００の実施形態に関連した任意の適切な成分のための任意の適切な方法で操作され得る。
【００２８】
本明細書に記載される前記方法１００及び／又はプロセスの実施形態の１又は複数の例及び／又は部分は、本明細書に記載される前記システム２００、成分及び／又は実体の１又は複数の例による及び／又は用いて、任意の適切な時点及び頻度で、非同期的に、（例えば、逐次的に）、並行して（例えば、アンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定に関連した正規化された連結配列決定ライブラリのための並行配列決定；多重化；前記方法１００の実施形態の部分における複数の試料の処理；前記方法１００の実施形態の配列決定分析及び／又は部分に関連した平行データ処理；など）、トリガー事象（例えば、前記方法１００の実施形態の部分の実施）に対する時間的関係（例えば、実質的に並行して、応じて、連続的に、前に、続いて、など）において、及び／又は任意の他の適切な順序で実施され得る。
【００２９】
本明細書に記載されるプライマーは、任意の適切な大きさ（例えば、及び配列長）であることが可能であり、本明細書に記載される任意の適切なプライマー領域を含むことが可能であり、且つ／又は本明細書に記載される任意の適切な増幅プロセスと共に使用され得る。本明細書に記載されるプライマーの任意の適切な数及び型は、本明細書に記載されるプライマー領域の任意の適切な数及び型を含み、且つ／又は、それ以外の場合、関連する。プライマー領域は、（例えば、アニーリング、増幅などを容易にするための）プライマー領域の任意の適切な相補的変種を含むことができる。
【００３０】
追加的に又は代替的には、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の部分は、全体がこの参照によって各々組み込まれる２０１６年８月１８日に出願の米国特許出願第１５／２４０，９１９号、２０１７年７月１３日に出願の米国特許出願第１５／６４９，４９７号、２０１８年７月２７日に出願の米国特許出願第１６／０４７，８４０号、２０１７年１１月１３日に出願の米国特許出願第１５／８１１，５４４号、２０１７年９月１８日に出願の米国特許出願第１５／７０７，９０７号、２０１８年６月２０日に出願の米国特許出願第１６／０１３，８５８号に記載されるものを容易にすることが可能であり（例えば、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の部分の出力を続いて入力として用いることができる；など）、向上させることが可能であり、共に（例えば、連続的に、同時に、など）、使用することが可能であり、（例えば、前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の部分のための入力として；など）使用することが可能であり、任意の適切な時間的関係を有することが可能であり、強化することが可能であり、改変することが可能であり、含むことが可能であり、且つ／又は、それ以外の場合、関連することが可能である。
【００３１】
しかし、前記方法１００及び／又はシステム２００は、任意の適切な方法でも構成され得る。
【００３２】
２．１  正規化アンプリコンライブラリを生成すること。
図１及び図４に示されるように、前記方法１００の実施形態は、アンプリコン配列決定のための正規化ライブラリを調製する機能を果たすことができる１又は複数の正規化アンプリコンライブラリＳ１１０を生成することを含むことが可能である。１又は複数の正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０は、追加的に又は代替的に、第１増幅プロセス（例えば、第１ＰＣＲプロセス；など）に基づいてアンプリコン標的分子のセットを生成することＳ１１２；前記アンプリコン標的分子のセットを用いた第２増幅プロセス（例えば、第２ＰＣＲプロセス；など）に基づいて正規化標的分子のセットを生成することＳ１１４；（例えば、次世代配列決定システムによる配列決定を容易にするための配列決定アダプター領域を含む配列決定プライマーのセットを用いて；など）前記正規化標的分子のセットを用いた第３増幅プロセス（例えば、第３ＰＣＲプロセス；など）に基づいて配列決定準備完了標的分子のセット（例えば、ＮＧＳのために適切な正規化配列決定準備完了標的分子など）を生成することＳ１１６；及び／又は１若しくは複数の正規化アンプリコンライブラリの調製を容易にするための他の適切なプロセス、の内の１又は複数を含むことができる。
【００３３】
正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０の任意の適切な部分を、互いに相対的な任意の適切な順序及び頻度で実施することができる。例えば、アンプリコン標的分子（及び／又は任意の適切なアンプリコン）を生成することＳ１１２は、任意の適切な時点及び頻度（例えば、正規化標的分子を生成する前；反復的生成物生成アプローチ中などの配列決定準備完了標的分子を生成する間又は後；微生物コミュニティ関連ライブラリ及び／又は連結ライブラリの生成のための微生物コミュニティ関連フラグメントの処理の前、同時及び／又は後；並びに／又は任意の適切な時点及び頻度で実施され得る。しかし、任意の適切な順序及び／又は頻度で生成することの任意の適切な部分は、前記方法１００の実施形態の部分に相対的であり、且つ／又は任意の適切な時点及び頻度におけるものである。
【００３４】
正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０は、任意の数の増幅プロセス（例えば、任意の数のＰＣＲプロセス；多段階式ＰＣＲ；など）を含むことができる。
【００３５】
しかし、正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０は、任意の適切な方法で実施され得る。
【００３６】
２．１．Ａ  アンプリコン標的分子のセットを生成すること。
前記方法１００の実施形態は、下流の正規化、他の試料処理及び／又はバイオインフォーマティックス分析を容易にするためのアンプリコン標的分子を得る機能を果たすことができる（例えば、１又は複数の標的などを含む生物学的試料などの１又は複数の標的に関連した１又は複数の生物学的試料に由来する）アンプリコン標的分子のセットを生成することＳ１１２を含むことができる。
【００３７】
アンプリコン標的分子は、好ましくは、アンプリコン生成プライマーの１又は複数の領域に関連した（例えば、付加した；結合した；連結した；など）標的分子（例えば、標的配列領域などを含む全核酸及び／又は核酸フラグメントなどの標的を含む成分）を含むが、追加的に又は代替的には、任意の適切な分子に関連した１又は複数の標的に関連した任意の適切な成分を含むことができる。前記アンプリコン標的分子のセットを生成することは、好ましくは、アンプリコン生成プライマーのセット及び１又は複数の生物学的試料を（例えば、使用すること；処理すること；増幅プロセスを行うこと；など）（例えば、アンプリコン生成プライマーの１又は複数の領域を１又は複数の生物学的試料の核酸などの１又は複数の成分に加えること；など）に基づくが、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分に基づくことができる。
【００３８】
標的（例えば、対象の標的；知られた又は同定された標的；不明な又は前もって同定されていない標的など）は、バイオマーカの内のいずれか１又は複数；遺伝子（例えば、遺伝子発現マーカーなど）；配列領域（例えば、遺伝子配列；遺伝子、染色体、微生物関連状態、保存配列、突然変異、多型を同定する配列；アミノ酸配列；ヌクレオチド配列；など）；核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、細胞質ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡなど）細胞；小分子；タンパク質；ペプチド；１又は複数の微生物関連状態に関連した標的（例えば、１又は複数の微生物関連状態に関連した診断、予後、予測及び／又は治療から情報伝達的な標的；など）；微生物組成に関連した標的（例えば、試料中に存在する微生物の分類学的分類を示す標的；任意の適切な分類群の微生物の存在、存在量及び／又は非存在を示すマーカー；など）及び／又は微生物機能（例えば、微生物に関連した機能的特徴を示す標的；など）；脂質；全核酸；全微生物；代謝産物；炭水化物；及び／又は任意の適切な型の標的を含むことができる。そのような標的分子は、標的分子が１又は複数の標的を含むことが可能であり、ある型の１又は複数の標的であり、及び／又は、それ以外の場合、１又は複数の標的に関連する（例えば、標的核酸分子が標的配列領域を含む；など）１又は複数の標的に対応することができる。前記方法１００の実施形態の部分は、
向上したライブラリ調製（例えば、正規化ライブラリ調製）を容易にして、向上した配列決定（例えば、ＮＧＳ）及び／又は任意の適切な分子の分析を容易にすることが可能である。
【００３９】
前記アンプリコン標的分子のセットを生成することは、好ましくは、１又は複数の増幅プロセスに基づく（例えば、含む；からの出力を用いる；など）。（例えば、前記アンプリコン標的分子のセットを生成することに関連した；正規化分子を生成することに関連した；配列決定準備完了分子を生成することに関連した；前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連した；など）増幅プロセスは、好ましくは、１又は複数のＰＣＲプロセス（例えば、固相ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、多重ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ナノＰＣＲ、ネストＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲなど）を含むが、追加的に又は代替的には、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、自己維持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及び／又は任意の他の適切な増幅プロセスの内の１又は複数を含むことができる。
【００４０】
アンプリコン標的分子を生成することに関連した増幅プロセスは、好ましくは、１又は複数のアンプリコン生成プライマーを使用する。例えば、アンプリコン標的分子のセットを生成することは、少なくとも１つの試料及び少なくとも１つの試料に由来する標的分子に対応する標的のセットに関連したアンプリコン生成プライマーのセットによる増幅プロセス（例えば、正規化ライブラリの調製を容易にするための増幅プロセスのセットの第１増幅プロセス）に基づくことができる。アンプリコン生成プライマーは、外部定義配列領域（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｇｉｏｎ）；アダプター領域（例えば、外部アダプター領域などを含む）；スペーサー領域；標的関連領域；ＵＭＩ領域；及び／又は任意の他の適切な領域（例えば、配列領域など）の内のいずれか１又は複数を含むことができる。
【００４１】
具体例において、前記アンプリコン標的分子のセットを生成することは、「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＸＸＸＸＸＸＸ）−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＰＡＣＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＵＰＳＴ−３’」を含む第１プライマー型構成に対応する第１プライマー、及び「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＹＹＹＹＹＹＹ）−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＰＡＣＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＷＮＳＴ−３’」を含む第２プライマー型構成に対応する第２プライマーを含むアンプリコン生成プライマーのセットによる増幅プロセスに基づくことが可能であり；例えば、「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の外部定義配列領域など）が、前記アンプリコン標的分子のセットの後続の増幅を容易にする限り、ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（及び／又は他の外部定義配列領域）が任意の長さであることが可能であり、任意の定義配列であることができる他の核酸配列を標的とするプライマーにおいて組み込まれたものとは固有で且つ異なる（例えば、第１のプライマー型構成におけるＸＸＸＸＸＸＸ、第２プライマー型構成におけるＹＹＹＹＹＹＹなどによって表される）定義された外部配列に対応することが可能であり；例えば、「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他のアダプター領域など）は、ＮＧＳライブラリ及び／又は他の適切な配列決定ライブラリの構築及び配列決定のために適切な任意のアダプター配列にも対応することが可能であり、用いられる配列決定技術に依存して長さが変化する可能性があり；例えば、「ＳＰＡＣＥＲ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマー領域の任意の他の適切なスペーサー領域など）は、他の領域の間における、標的分子配列領域との相補的な結合に完全に相互作用しない配列領域の任意の延伸に対応することが可能であり；例えば、「ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の適切な標的関連領域など）は、相補的標的核酸配列に対してフランキング上流（ＵＰＳＴ）及びフランキング下流（ＤＷＮＳＴ）をアニールし、ポリメラーゼ酵素が標的核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、例えば、ＤＮＡに複製されるＲＮＡ）、ＲＮＡ及び任意の他の適切な核酸分子；など）を複製し、増幅することを可能にする領域であることが可能であり、例えば、異なる「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」領域を有するＮの数の「ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」領域を標的とするＮの数のプライマーを単一のＰＣＲ反応において組み合わせることができる。
【００４２】
具体例において、標的分子は、例えば、付加されたアダプター領域（例えば、外部アダプター配列など）、外部定義配列領域及び／又はアンプリコン生成プライマーの他の適切な領域を有する各標的分子の複数のコピーを生成することができるサーモサイクラ機械又は同様の機器において、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、２〜４０回のＰＣＲサイクルの間で、アンプリコン生成プライマーを用いた従来のサーマルサイクラにおけるＰＣＲによって増幅され得る。
【００４３】
アンプリコン生成プライマー（及び／又は他の適切な分子、例えば、プライマー、及び／又は本明細書に記載される他の分子）は、好ましくは、１又は複数の外部定義配列領域を含む。外部定義配列領域は、手作業で定義された配列、自動的に（例えば、コンピュータ的に）定義された配列及び／又は任意の適切な配列を含むことができる。外部定義配列領域は、任意の適切な大きさであることができる。同一の、同様な（例えば、相補的な；アニーリング可能な；関連した；など）及び／又は異なる外部定義配列領域は、増幅プロセスのためのプライマーのセット（例えば、アンプリコン生成プライマーのセット）の中で、異なる増幅プロセスのための複数の組のプライマーの間（例えば、アンプリコン生成プライマーのセットと正規化プライマーのセットとの間；など）で；及び／又は任意の適切なプライマーにわたって使用され得る。しかし、アンプリコン生成プライマー、他の適切なプライマー及び／又は任意の適切な分子の外部定義配列領域は、任意の適切な方法でも構成され得る。
【００４４】
アンプリコン生成プライマー（及び／又は他の適切な分子、例えば、本明細書に記載されるプライマー及び／又は他の分子）は、好ましくは、１又は複数の標的関連の領域を含む。標的関連の領域は、好ましくは、配列領域（例えば、遺伝子配列など）を含むが、追加的に又は代替的には、任意の適切な型の成分（例えば、標的に結合可能、連結可能、接続可能、影響する、情報を与える、修飾する、及び／又は標的との任意の適切な関係を有するなど、標的に関連した任意の適切な成分；など）を含むことができる。標的関連領域は、好ましくは、１又は複数の標的（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸標的分子の配列領域；核酸標的の他の適切な成分；他の適切な配列；など）に関連する（例えば、配列相補性を有する；標的とする；増幅可能である；処理可能である；など）。例において、標的関連領域は、（例えば、核酸標的の）相補的標的ＤＮＡ配列とアニーリングが可能なＤＮＡ配列を含むことができる。標的関連領域は、好ましくは、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が核酸標的及び／又は他の適切な成分を複製し且つ増幅するすることを可能にするが、標的関連領域は、任意の適切な機能を含むことができる。標的配列領域は、核酸分子を標的とするためのアニーリングを容易にするための上流変種及び下流変種を含むことができる。標的関連領域は、任意の適切な長さ（例えば、少なくとも１５塩基の長さ；任意の適切な数の塩基；など）を含むことができる。別の場合、アンプリコン生成領域は、標的関連領域を含まない可能性がある。
しかし、アンプリコン生成プライマー、他の適切なプライマー及び／又は任意の適切な分子の標的関連領域は、任意の適切な方法でも構成され得る。
【００４５】
アンプリコン生成プライマー（及び／又は他の適切な分子、例えば、本明細書に記載されるプライマー及び／又は他の分子）は、１又は複数のアダプター領域を含むことができる。アダプター領域は、好ましくは、配列決定ライブラリ調製を容易にするように構成された（例えば、ＮＧＳライブラリの構築及び配列決定を容易にするように構成された；など）配列領域（例えば、配列など）を含むことができる外部アダプター領域を含むことができる（例えば、１つのアダプター領域が１又は複数の外部アダプター領域を含むことができる；など）が、外部アダプター領域は、追加的に又は代替的には、配列決定を容易にするための任意の適切な成分を含むことができる。外部アダプター領域は、配列決定の型（例えば、用いられる配列決定技術の型；など）に基づいて決定され得る任意の適切な長さ（例えば、配列長；任意の適切な数の塩基；など）及び／又は任意の適切な配列領域（例えば、塩基の任意の適切な組み合わせなど）を含むことができる。別の場合、アンプリコン生成プライマー（及び／又は他の適切な分子）は、アダプター領域を含まない可能性がある。しかし、アダプター領域は、任意の適切な方法で構成され得る。
【００４６】
変形例において、アンプリコン生成プライマーは、１又は複数のＵＭＩ領域を含むことができる（例えば、ＵＭＩ系プライマー；アンプリコン生成プライマーがＵＭＩ領域を含むことができる；アンプリコン生成プライマーが複数のＵＭＩ領域を含むことができる；など）。例において、（例えば、アンプリコン生成プライマーの；本明細書に記載される任意の適切なプライマーの；など）ＵＭＩ領域は、各ランダムな「Ｎ」塩基が「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基及び「Ｃ」塩基の内のいずれか１つから選択されるランダムな「Ｎ」塩基（例えば、Ｎデオキシヌクレオチド塩基）のセットを含むことができる。
【００４７】
具体例において、前記アンプリコン標的分子のセットを生成することは、「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＸＸＸＸＸＸＸ）−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＵＰＳＴ−３」を含む第１プライマー型構成に対応する第１プライマー及び「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＹＹＹＹＹＹＹ）−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＷＮＳＴ−３’」を含む第２プライマー型構成に対応する第２プライマーを含むアンプリコン生成プライマーのセットによる増幅プロセスに基づくことが可能であり；例えば、「ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の適切なＵＭＩ領域など）は、定量又は区別することが所望される標的分子及び／又は変異体の量に応じて、連続的であることが可能であるか、又は定義塩基によって分離され得、且つ長さが２〜２０塩基であり得る一連の「Ｎ」デオキシヌクレオチド塩基（例えば、「Ｎ」は「Ａ」核塩基、「Ｃ」核塩基、「Ｔ」核塩基及び「Ｇ」核塩基の間の任意のランダムな塩基などである）を含むことが可能であり、例えば、より長いＵＭＩ領域は、さらに多くのランダムな塩基の組み合わせを可能にし、したがって、より大きい固有の識別子のセットを可能にする。具体例において、増幅プロセスは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ＵＭＩ領域を含むアンプリコン生成プライマー、並びにアンプリコン生成プライマーの付加されたＵＭＩ領域、アダプター領域（例えば、外部アダプター配列など）、外部定義配列領域及び／又は他の適切な領域を有する各標的分子の単一コピーを生成することができるサーモサイクラ機械又は同様の機器における２〜３回のＰＣＲサイクルを用いることができる。
【００４８】
「Ｎ」塩基は、連続的（例えば、一連の「Ｎ」塩基など）である可能性があり、（例えば、定義塩基によって；任意の適切な配列領域によって；など）分離される可能性があり、且つ／又はプライマー及び／又はＵＭＩ系分子の任意の適切な配列位置に位置することが可能である。ＵＭＩ領域は、任意の適切な配列長（例えば、少なくとも２つの「Ｎ」塩基；２１未満の「Ｎ」塩基；任意の適切な数の「Ｎ」塩基；など）を含むことができる。ＵＭＩ領域配列長は、処理（例えば、定量、区別、など）される標的の量及び／又は型に基づいて決定され得、例えば、より長いＵＭＩ領域は、（例えば、区別される標的のさらに多くの型を分析するために用いられる；多数の鋳型及び／又は遺伝子変異体を含む試料を分析するために用いられる；など）さらに多くのランダムな塩基の組み合わせ及びより大きな固有の識別子のセットを容易にすることが可能である。例において、前記ＵＭＩ領域は、４Ｎ  ＵＭＩ領域（例えば、４つの「Ｎ」塩基を含むＵＭＩ領域など）を含むことができる。具体例において、前記ＵＭＩ領域は、１６Ｓ遺伝子の増幅プロセスのためなどの８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むことができる。追加的に又は代替的には、ＵＭＩ領域及び／又はＵＭＩ系プライマーは、全体がこの参照により本明細書に組み込まれる２０１８年６月２０日に出願の米国特許出願第１６／０１３，８５８号に記載されている、及び／又は類似の任意の適切な方法で構成され得る。しかし、ＵＭＩ領域及びＵＭＩ系プライマーは、任意の適切な方法で構成され得る。
【００４９】
しかし、（例えば、前記アンプリコン標的分子のセットを生成することに関連した；前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連した；など）適切なＰＣＲプロセス及び／又は他の増幅プロセスを実施することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００５０】
変形例において、アンプリコン標的分子のセットを生成することは、アンプリコン生成プライマーの１又は複数の領域を核酸標的分子などの１又は複数の標的分子（及び／又は１又は複数の生物学的試料などの他の適切な成分）に付加するなどのために、（例えば、増幅系プロセスなどに加えて又は代替して）１又は複数のフラグメンテーションプロセス、ライゲーションプロセス及び／又は他の適切なプロセスを含むことができる。
【００５１】
変形例において、前記アンプリコン標的分子のセットを生成すること（及び／又は前記方法１００の実施形態の適切な部分）は、（例えば、任意の適切な成分を精製するために；任意の適切な成分を除去するために；など）１又は複数の精製プロセスを実施することを含むことができる。例において、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス）に基づいて前記アンプリコン標的分子のセットを生成することは、増幅プロセスの生成物から前記アンプリコン生成プライマーのセットを除去するために（及び／又は他の適切な成分などを除去するために）増幅プロセスの生成物による精製プロセスを実施することを含むことができる。例において、前記方法１００は、本明細書に記載される任意の適切な増幅プロセスから得られる生成物のための精製プロセスを実施することを含むことができる。精製プロセスは、シリカ系ＤＮＡ結合ミニカラム、（例えば、アップスケーリング及び自動化などのための）固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）磁気ビーズ、（例えば、アルコール系沈殿法を用いた）生物学的試料からの核酸の沈殿、液体−液体系精製手法（例えば、フェノール−クロロホルム抽出）、クロマトグラフィ系精製手法（例えば、カラム吸着）、（例えば、溶出溶液を有する、ｐＨシフトを提供する、温度シフトを提供する、など）溶出環境の存在下で核酸を結合するように構成され且つ核酸を放出するように構成された部分結合粒子（例えば、磁気ビーズ、浮遊ビーズ、径分布を有するビーズ、超音波応答性ビーズなど）の結合の使用を含む精製手法及び／又は任意の適切な精製プロセス、の内のいずれか１又は複数を含むことができる。具体例において、磁気ビーズは、例えばカルボキシルコーティングビーズとのＤＮＡの静電相互作用により、ＰＣＲプロセスの少量の生成物の精製を可能にすることができる。（例えば、代替するものとしての、など）具体例において、磁気ビーズにより精製プロセスを実施することは、ビーズ体積比（例えば、ビーズによる小さいＤＮＡ分子の相互作用が不都合であり、好ましくは１００ｂｐ以下の大きさの非特異的生成物が排除される、など）及び／又は任意の適切な比に対して１：１〜１：０．６の試料を使用することを含むことができる。（例えば、代替するものとしての、など）具体例において、磁気ビーズによる精製プロセスを実施することは、例えば任意の適切なＰＣＲプロセスから得られた生成物に加えるために、例えば（例えば、増幅プロセスから）アンプリコン生成プライマー及び／又は他の適切な成分を選択的に分解するために、５〜１００単位のエキソヌクレアーゼＩ及び／又は任意の他の一本鎖ＤＮＡ分解酵素を使用することを含むことができる。具体例において、磁気ビーズによる精製プロセスを実施することは、例えばＰＣＲ鋳型ＤＮＡ及び／又は他の適切な成分を分解するために、１〜１００単位のＤｐｎＩ制限酵素及び／又は他の適切な酵素を加えることによってプロセスを補充することを含むことができる。具体例において、ＰＣＲ生成物クリーンナップアプローチに加えて又は代替的に、酵素処理及び／又は他の適切なプロセスの両方の組み合わせを使用することができる。追加的に又は代替的には、（例えば、前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連した、など）任意の適切な方法で精製プロセスを実施することができる。
【００５２】
しかし、アンプリコン標的分子を生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００５３】
２．１．Ｂ  正規化標的分子を生成すること。
前記方法１００の実施形態は、配列決定ライブラリにおいて異なる標的の表現を正規化するなどのための正規化配列決定ライブラリの調製を容易にするための正規化標的分子を得る機能を果たすことができる（例えば、アンプリコン標的分子による増幅プロセスから；など）正規化標的分子のセットを生成することＳ１１４を含むことができる。具体例において、正規化標的分子を生成することは、試料において最初に表現される異なる型の標的分子の量の均等化を向上させる（例えば、充分に表現されていない標的の表現を向上させる；など）機能を果たすことができる。
【００５４】
正規化標的分子は、好ましくは、正規化プライマーの１又は複数の領域に関連した（例えば、付加された；結合された；連結された；など）（例えば、第１増幅プロセスなどに基づいて生成された）アンプリコン標的分子を含むが、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分を含むことができる。前記正規化標的分子のセットを生成することは、好ましくは、正規化ベースのプライマーのセット及びアンプリコン標的分子のセットに基づく（例えば、使用する；処理する；増幅プロセスを実施する；など）が、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分に基づくことができる。
【００５５】
前記正規化標的分子のセットを生成することは、好ましくは、１又は複数の増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス；本明細書に記載される他の適切な型の増幅プロセス；など）に基づく（例えば、含む；からの出力を使用する；など）が、追加的に又は代替的には、任意の適切な型の試料処理作業（例えば、ライゲーション作業；精製作業；など）に基づくことができる。
【００５６】
正規化標的分子を生成することに関連した増幅プロセスは、好ましくは、１又は複数の正規化プライマーを使用する。例えば、正規化標的分子のセットを生成することは、アンプリコン標的分子のセット及び正規化プライマーのセットによる増幅プロセス（例えば、正規化ライブラリの調製を容易にするための増幅プロセスのセットの第２増幅プロセス）に基づくことができる。正規化プライマーは、好ましくは、（例えば、外部定義配列領域に関連した本明細書に記載される任意の適切な特性を含む）外部定義配列領域を含むが、追加的に又は代替的には、任意の他の適切なプライマー領域を含むことができる。
【００５７】
具体例において、前記正規化標的分子のセットを生成することは、「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＸＸＸＸＸＸＸ）−３’」を含む第１プライマー型構成に対応する第１プライマー及び「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＹＹＹＹＹＹＹ）−３’」を含む第２プライマー型構成に対応する第２プライマーを含む正規化プライマーのセット（例えば、本明細書に記載される増幅プロセス及び／又は他の適切な増幅プロセスにより用いられるなどのアンプリコン標的分子のセット；など。）による増幅プロセスに基づくことが可能であり；例えば、「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の外部定義配列領域など）は、アンプリコン生成プライマーの定義外部配列領域の配列などの（例えば、第１プライマー型構成におけるＸＸＸＸＸＸＸによって表現される、第２プライマー型構成におけるＹＹＹＹＹＹＹによって表現される、など）定義外部配列に対応する可能性があり、例えば、「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」（及び／又は他の外部定義配列領域）は、任意の長さ及び任意の定義配列であることができる。正規化プライマーの定義数の分子は、正規化標的分子を生成するための１又は複数の増幅プロセスに加えられ得；及び／又はＮ回のサイクルのＰＣＲ（及び／又は増幅プロセスの任意の適切な程度；など）は、全ての付加された正規化プライマーが（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ酵素などにより）完全に用いられることを確保するために実施形態され得；例えば、１又は複数の増幅プロセスから生成され得る（例えば、１又は複数の標的分子の；など）各標的核酸配列に特異的なアンプリコンの数は、（例えば、１又は複数の増幅プロセスのための鋳型として用いられるアンプリコン標的分子の数から独立した、付加された正規化プライマー分子の数に限定され得る。例において、正規化プライマーの外部定義配列領域は、アンプリコン標的分子の外部定義配列領域（例えば、第１増幅プロセスに基づいたものなどの標的分子に付加された外部定義配列領域；など）にアニーリングすることが可能であり、例えば、正規化プライマーの外部定義配列領域は、アンプリコン標的分子の外部定義配列領域；など）に関連する（例えば、共有する配列；相補的；アニーリング可能；など）可能性がある。具体例において、前記のアンプリコン生成プライマーのセットは、前記のアンプリコン標的分子のセットを生成することが、第１増幅プロセスに基づいて第１外部定義配列領域を標的分子に付加することを含むことができる；及び／又は前記正規化プライマーのセットが、第１外部定義配列領域に関連した（例えば、共有する配列；相補的；アニーリング可能；など）第２外部定義配列領域を含むことができる、第１外部定義配列領域を含むことができる。具体例において、前記アンプリコン生成プライマーのセットは、標的分子の標的配列領域へのアニーリングのための標的関連領域を含むことが可能であり；及び／又は前記正規化標的分子のセットを生成することは、第２増幅プロセスのために、第１外部定義配列領域と第２外部定義配列領域との間に��けるアニーリングのための定義量の前記正規化プライマーのセットを付加することを含むことができる。
【００５８】
具体例において、正規化プライマーにより、所定のアンプリコン標的分子（及び／又は試料の標的）が正規化標的分子の生成の前などにおいて充分に表現されているか又は充分に表現されていない場合であっても；生成された正規化標的分子は、使用される（例えば、外部定義配列領域に対応する；など）各特異的プライマー型の量などに基づいて、（例えば、関連したＰＣＲプロセスの完了の際；など）所望の量に達することが可能である。
【００５９】
変形例において、正規化標的分子のセットを生成することは、正規化プライマーの１又は複数の領域を核酸標的分子などの１又は複数の標的分子（及び／又は１若しくは複数の生物学的試料の他の適切な成分など）に付加するなどのために、（例えば、増幅系プロセスなどに加えて又は代替して）１又は複数のフラグメンテーションプロセス、ライゲーションプロセス及び／又は他の適切なプロセスを実施することを含むことができる。
【００６０】
変形例において、前記正規化標的分子のセット（及び／又は前記方法１００の実施形態の適切な部分）を生成することは、（例えば、任意の適切な成分を精製するために；任意の適切な成分を除去するために；など）１又は複数の精製プロセスを実施することを含むことができる。例において、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス）に基づいて前記正規化標的分子のセットを生成することは、増幅プロセスの生成物から前記正規化プライマーのセットを除去するために（且つ／又は他の適切な成分などを除去するために）増幅プロセスの生成物による精製プロセスを実施することを含むことができる。本明細書に記載される任意の適切な精製プロセスを用いることが可能であり、且つ／又は任意の適切な方法で実施することが可能である。
【００６１】
しかし、正規化標的分子を生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００６２】
２．１．Ｃ  配列決定準備完了標的分子を生成すること。
前記方法１００の実施形態は、配列決定（例えば、ＮＧＳなど）のための調製のための標的分子（例えば、正規化標的分子）を処理する機能を果たすことができる、配列決定準備完了標的分子のセット（例えば、ＮＧＳ準備完了正規化標的分子；正規化標的分子のセット及び配列決定プライマーのセットに基づいて；など）を生成することＳ１１６を含むことができる。
【００６３】
配列決定のための分子を調製することは、好ましくは、（例えば、１若しくは複数のアダプター領域及び／又は１若しくは複数の指標領域などを付加することによって）配列決定のための正規化標的分子を調製することを含むが、追加的に又は代替的には、配列決定のための任意の適切な分子を調製することを含むことができる。
【００６４】
前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成することは、好ましくは、（例えば、配列決定プライマー及び／又は配列決定プライマーの任意の適切な領域と前記正規化標的分子のセットとの組み込みのための；配列決定プライマーの領域を前記正規化標的分子のセットに付加するための；など）正規化標的分子のセット及び配列決定プライマーのセットに基づく（例えば、使用する；処理する；増幅プロセスを実施する；など）が、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分に基づくことができる。例において、アンプリコン生成プライマーは、（例えば、アンプリコン生成プライマーに基づいて生成されたアンプリコン標的分子から誘導された；など）前記正規化標的分子のセットが第１外部アダプター領域を含む（例えば、ＮＧＳなどに関連した）第１外部アダプター領域を含むことが可能であり；配列決定準備完了標的分子のセット（例えば、ＮＧＳ準備完了正規化標的分子；など）を生成することが、（例えば、標的分子の初期核酸配列から独立した全ての正規化標的分子に共通であり得る；など）正規化標的分子の外部アダプター領域において正規化標的分子によって（例えば、第１外部アダプター領域などに相補的な外部アダプター領域などの外部アダプター領域を含むアダプター領域を含む）配列決定プライマーのセットのアニーリングを行うことを含む。例において、配列決定プライマーは、１又は複数のアダプター領域（例えば、ＮＧＳなどの配列決定に関連した配列決定アダプター領域；正規化標的分子にアニーリング可能な外部アダプター領域；など）及びＮＧＳに関連した多重化を容易にするように構成された１又は複数の指標領域を含むことが可能であり；設定された配列決定準備完了標的分子を生成することは、正規化標的分子及び前記配列決定プライマーのセットによる増幅プロセス（例えば、第３ＰＣＲプロセス；など）に基づいて前記正規化標的分子のセットに１又は複数の指標領域及び１又は複数のアダプター領域を付加することを含む。配列決定準備完了標的分子を生成することは、好ましくは、正規化標的分子の濃度をＮＧＳ及び／又は他の適切な配列決定のために適切な量に（例えば、２ｐＭ以上の量及び／又は任意の適切な望ましい量；などに）増加させ、例えば、配列決定準備完了標的分子は、所望の量（例えば、正規化量及びＮＧＳのための適切な量など）である。
【００６５】
具体例において、ＰＣＲプロセス（例えば、前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成するための第３ＰＣＲプロセス）を実施することは、１５〜４５サイクルのＰＣＲ（及び／又は任意の適切なサイクル数のＰＣＲ）の間のための、及び／又は、を含むための０．０２〜０．０８単位／ｕＬ（及び／又は他の適切な濃度）のポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用すること及び／又は含むことを含むことができる。具体例において、ＰＣＲプロセス（例えば、第３ＰＣＲプロセスなど）を実施することは、配列決定のための適切なレベル（例えば、ＮＧＳ；少なくとも２ｐＭ及び／又は任意の適切な閾値量）に核酸標的（例えば、標的分子）の濃度を増加させることができる前記正規化標的分子のセットから得られた清浄な正規化核酸生成物（例えば、第２ＰＣＲプロセスの実施から得られた生成物など）の増幅を可能にすることができる。
【００６６】
具体例において、前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成することは、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−３’」を含むプライマー型構成に対応する配列決定プライマーのセット（例えば、並びに本明細書に記載される増幅プロセス及び／又は他の適切な増幅プロセスにより用いられるものなどの正規化標的分子のセット；など）による増幅プロセスに基づくことが可能であり；例えば、「ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の指標領域など）は、配列決定される予定の異なる試料の組み合わせ標識付けを可能にすることができる２〜１０塩基長（及び／又は他の適切な長さ）の定義バーコード配列に対応することが可能であり；例えば、「ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他のアダプター領域など）は、配列決定が起きることを可能にするためのものなどの１又は複数のＮＧＳ技術及び／若しくは他の適切な配列決定技術によって必要とされる並びに／又はそれ以外の場合関連する任意の特異的配列に対応することが可能である。
【００６７】
変形例において、前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成すること（及び／又は実施形態前記方法１００の適切な部分）は、追加的に又は代替的には、１又は複数の補助増幅プロセス（例えば、第４増幅プロセス；第４ＰＣＲプロセス；配列決定準備完了標的分子、第３増幅プロセスの生成物及び／又は任意の他の適切な成分などの濃度を増加させる機能を果たす可能性がある）を実施することを含む。例において、前記方法１００は、例えば、ＰＣＲプロセス（例えば、第２ＰＣＲプロセスなど）及び／又は前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成する際に用いられる他の適切なプロセスによって付加される配列決定アダプター領域においてアニーリングを行うプライマーに基づいて（例えば、使用して、有して、など）、補助ＰＣＲプロセス（例えば、アンプリコン標的分子を生成することが第１ＰＣＲプロセスを実施することを含み、正規化標的分子を生成することが第２ＰＣＲプロセスを実施することを含み、前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成することが第３ＰＣＲプロセスを実施することを含む、第４ＰＣＲプロセス；など）を実施することを含むことができる。具体例において、前記アンプリコン生成プライマーのセットは、配列決定に関連した第１アダプター領域を含むことが可能であり；前記アンプリコン標的分子のセットを生成することは、第１増幅プロセス（例えば、第１ＰＣＲプロセス；など）に基づいて第１アダプター領域を標的分子に付加することを含むことが可能であり；前記正規化標的分子のセットは、付加された第１アダプター領域を含むことが可能であり；及び／又は前記配列決定プライマーのセットは、前記正規化標的分子のセットの付加された第１アダプター領域に対するアニーリングのための第２アダプター領域を含むことができる。
【００６８】
追加的に又は代替的には、アニーリングは、任意の適切なプライマー領域（例えば、任意の適切な増幅プロセスで付加された配列決定アダプター領域；など）で起きる可能性がある。具体例において、補助ＰＣＲプロセスを実施することは、閾値条件（例えば、１ｐＭ未満の濃度など）を満たす濃度（例えば、生成物濃度；前記配列決定準備完了標的分子のセットの生成からの得られた生成物の濃度；第３ＰＣＲプロセスから得られた生成物；など）に基づく（例えば、応答する；開始する；調節される；など）ことができる。変形例において、前記の配列決定準備完了標的分子のセットを生成すること（及び／又は前記方法１００の実施形態の適切な部分）は、追加的に又は代替的には、シリカカラム内における試料結合及び／又はより少ない量の溶出に基づいて配列決定準備完了標的分子及び／又は他の適切な分子の濃度を増加させることを含むことができる。具体例において、前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成することは、（例えば、配列決定準備完了標的分子を生成するための；など）第３増幅プロセスの生成物の濃度を増加させることを含み、第３増幅プロセスの生成物の濃度を増加させることは、第３増幅プロセスの生成物及び配列決定プライマーのアダプター領域に対するアニーリングのための追加的プライマーに基づいて第４増幅プロセスを実施すること；及びより少ない量の溶出によるシリカカラムへの試料結合を実施すること、の内の少なくとも１つを含む。
【００６９】
配列決定プライマー（及び／又は本明細書に記載される他の適切な分子）は、好ましくは、１又は複数のアダプター領域を含む。配列決定プライマーのアダプター領域は、好ましくは、ＮＧＳを促通する配列領域（例えば、配列決定を実施するための１又は複数のＮＧＳ技術によって必要とされる配列領域；用いられる一種のＮＧＳ技術に基づいて決定される配列領域；ＮＧＳ技術の促進；など）及び／又は他の適切な配列決定技術を好ましくは含む１又は複数の配列決定アダプター領域を含むが、配列決定アダプター領域は、任意の適切な方法で構成され得る。追加的に又は代替的には、任意の適切なアダプター領域は、配列決定アダプター領域を含むことができる。（例えば、配列決定プライマーなどの）アダプター領域は、好ましくは、（例えば、アンプリコン生成プライマーなどのアダプター領域などの他のアダプター領域の外部アダプター領域と同じ、同様の、異なる、相補的な）１又は複数の外部アダプター領域を含むが、任意の適切なアダプター領域は、１又は複数の外部アダプター領域を含むことができる。配列決定プライマーのアダプター領域は、好ましくは多重化、異なる試料（及び／又は試料の成分、配列となる成分）の組み合わせ標識付け並びに／又はＮＧＳ及び／若しくは他の配列決定に関連した他の適切な機能を容易にするように構成される１又は複数の指標領域（例えば、配列決定指標領域；など）を好ましくは含む。指標領域は、好ましくは、（例えば、２塩基以上１１塩基未満の長さを含む；任意の適切な数の塩基の長さを含む；など）定義バーコード配列を含むが、追加的に又は代替的には、任意の適切な長さを含む任意の適切な成分を含むことができる。具体例において、配列決定プライマーは、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−３’」を含む構成を含むことができる。アダプター領域は、相対的な外部アダプター領域から分離した、連続した、及び／又は、それ以外の場合、位置する配列決定アダプター領域を含むことができるが、任意の適切な領域は、任意の適切な位置、相対的な他の領域及び／又は任意の適切な位置を含むことができる。追加的に又は代替的には、配列決定プライマーは、（例えば、プライマーなどに関連して本明細書に記載される）任意の適切な領域及び／又は他の適切な成分を含むことができる。しかし、配列決定プライマーは、任意の適切な方法で構成され得る。
【００７０】
具体例において、配列決定準備完了標的分子（及び／又は正規化アンプリコンライブラリの適切な生成物）は、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＰＡＣＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ−ＳＰＡＣＥＲ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−３’」を含む構成を含むことができる。具体例において、例えば、ＵＭＩ領域を含むアンプリコン生成プライマーは、（例えば、アンプリコン標的分子などを生成する際に）使用され、配列決定準備完了標的分子（及び／又は正規化アンプリコンライブラリの適切な生成物）は、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ−ＵＮＩＱＵＥ＿ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ＿ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−３’」を含む構成を含むことができる。
【００７１】
しかし、配列決定プライマーのセットを調製することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００７２】
しかし、前記配列決定準備完了標的分子のセットを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００７３】
２．２  正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成すること。
図１及び図５に示されるように、前記方法１００の実施形態は、メタゲノム関連配列決定及び／又はメタトランスクリプトミクス関連配列決定のための１又は複数の正規化ライブラリを調製する機能を果たすことができる１又は複数の正規化微生物コミュニティ関連ライブラリ（例えば、正規化メタゲノム関連ライブラリ；正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリ；など）を生成することＳ１２０を含むことができる。
【００７４】
１又は複数の正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成することＳ１２０は、追加的に又は代替的には、試料の全核酸から微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２２；前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによるライゲーションプロセスに基づいてライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２４；前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる第１増幅プロセスに基づいて正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２６；前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる第２増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、ＮＧＳなどのために適切な正規化配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメント）を生成することＳ１２８；及び／又は１若しくは複数の正規化微生物コミュニティ関連ライブラリの調製を容易にするための他の適切なプロセス、の内の１又は複数を含むことができる。しかし、正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００７５】
２．２．Ａ  微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること。
前記方法１００の実施形態は、微生物コミュニティ関連配列決定（例えば、メタゲノム関連配列決定及び／又はメタトランスクリプトミクス関連配列決定；など）を促通するフラグメントを生成する機能を果たすことができる（例えば、メタゲノム関連フラグメントのセット及び／又はメタトランスクリプトミクス関連フラグメントのセットなどの内の少なくとも１つを含む）微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２２を含むことができる。例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、１又は複数の試料（例えば、生物学的試料、例えば、任意の適切な生物学的試料は、皮膚部位、生殖器部位、鼻部位、腸部位、生殖部位などの内のいずれか１又は複数を含む１又は複数の身体部位において回収され得る）から全核酸のセット（及び／又は他の適切な成分など）を処理することに基づくことができる。
【００７６】
微生物コミュニティ関連フラグメントは、全核酸の未処理フラグメント（例えば、１又は複数の生物学的試料などの全核酸においてフラグメンテーションプロセスを実施する生成物）、全核酸の処理フラグメント（例えば、任意の適切な試料処理作業により処理された；前処理全核酸の及び／又は他の適切な成分のフラグメント；精製フラグメント；など）並びに／又は１若しくは複数の試料の全核酸の及び／又は他の適切な成分の任意の適切なフラグメントを含むことができる。
【００７７】
微生物コミュニティ関連フラグメントは、好ましくは、１又は複数の微生物コミュニティに関連する。微生物コミュニティは、好ましくは、複数の分類群（例えば、微生物の界、門、綱、目、科、属、種、亜種、株及び／又は任意の他の適切な群を含む分類群；など）に由来する（例えば、使用者の生理学的領域など、使用者の試料回収部位などの一般的生活空間を共有する；など）微生物を含むが、代替的には、単一の分類群に由来する微生物だけを含むことができる。追加的に又は代替的には、微生物コミュニティは、微生物間の相互作用、微生物間の相互作用の生成物、微生物間の関係、微生物及び／又は微生物コミュニティに関連した機能的特徴（例えば、機能的プロファイルなど）、微生物及び／又は微生物コミュニティに関連した組成特徴（例えば、分類学プロファイルなど）並びに／又は微生物及び／若しくは微生物コミュニティに関連した任意の他の適切な成分及び／若しくは特徴を含むことができる。
【００７８】
前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、好ましくは、全核酸のセットを処理することに基づくが、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分（例えば、核酸フラグメント、核酸標的などの標的、他の適切な成分など）を処理することに基づくことができる。
【００７９】
前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること（例えば、前記全核酸のセットを処理すること）は、好ましくは、前記全核酸のセットに由来する全核酸（例えば、１又は複数の試料などに由来する前記全核酸のセットの全て又はサブセット）により１又は複数のフラグメンテーションプロセスを実施すること（例えば、フラグメンテーションを行うこと；フラグメントを生成すること；など）を含むが、追加的に又は代替的には、微生物コミュニティ関連フラグメント生成を容易にするための任意の適切なプロセスを含むことができる。フラグメンテーションプロセスは、（例えば、ランダム化された微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成するための）ランダムフラグメンテーション、セミランダムフラグメンテーション及び／又は（例えば、所望のフラグメントのセットを生成するための；など）特異的フラグメンテーションを含むことができる。（例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することに関連した；前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連した；など）１又は複数のフラグメンテーションプロセスを実施することは、（例えば、ＤＮＡｓｅ  Ｉなどの非配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いた、ＤＮＡニッカーゼ、制限エンドヌクレアーゼの混合物、トランスポザーゼ−型酵素を用いた、など）酵素プロセス、機械的プロセス（例えば、音波処理；噴霧化；剪断（例えば、水力学的剪断）；など）、（例えば、鉄−ＥＤＴＡ及び／又は他の試薬などのヒドロキシルラジカル形成試薬の混合物を用いた；など）化学的プロセス及び／又は任意の適切な型のフラグメンテーションプロセスの内の任意の１又は複数を含むことができる。しかし、１又は複数のフラグメンテーションプロセス（例えば、１又は複数の酵素プロセス；１又は複数の機械的プロセス；など）を実施することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００８０】
前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、追加的に又は代替的に、（例えば、１又は複数のフラグメンテーションプロセスの実施の前、間及び／又は後；フラグメンテーションプロセスの実施と反復的に；など）前記全核酸のセット及び／又は前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを処理することを含むことができる。処理（例えば、前記全核酸のセット；フラグメント；任意の適切な成分）は、核酸を変換すること（例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること）、標的捕捉プロセス（例えば、濃縮プロセス、排除プロセスなど）を実施すること、精製プロセスを実施すること、補足的増幅プロセス、及び／又は任意の適切な処理プロセスを実施することの内のいずれか１又は複数を含むことができる。例において、前記方法１００は、（例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成する前及び／又は後に；など）、（例えば、配列決定のための正規化メタトランスクリプトミクス関連ライブラリの調製を容易にするために；など）試料に由来するＲＮＡ（例えば、微生物ＲＮＡ）をｃＤＮＡに変換すること；試料の第１核酸に対応する第１配列を選択的に強化するために第１標的捕捉プロセス（及び／又は任意の適切な数の標的捕捉プロセス；など）を実施すること；及び／又は試料の第２核酸に対応する第２配列を選択的に欠失させる（例えば、排除する）ために第２標的捕捉プロセス（及び／又は任意の適切な数の標的捕捉プロセス；など）を実施することの内の少なくとも１つを含むことができる。
【００８１】
核酸を変換することは、標的遺伝子及び／若しくは他の標的（例えば、１又は複数の生物学的試料における核酸標的）の発現の検出を容易にするために、且つ／又はウイルス（例えば、ＲＮＡ系ゲノムなどを有するウイルス）の存在及び／若しくは他の適切な特性を検出するために使用され得る。例において、処理は、フラグメンテーションの前及び／又は後に、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって全核酸におけるｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること（例えば、ＲＴ−ＰＣＲは、例えば試料におけるｍＲＮＡの全て又は実質的に全てを逆転写するためにランダムプライマーを用いて；逆転写酵素酵素；ポリＴプライマー；複数の標的特異的プライマー；対象のｍＲＮＡを標的とするプライマー；及び／又は他の適切な構成要素；などを用いて、実施され得る）及び／又はフラグメンテーションプロセスを容易にし、微生物コミュニティ関連ライブラリ内に包含するためなどの他の適切な変換プロセスを含むことができる。標的捕捉プロセスを実施することは、（例えば、フラグメンテーションプロセスなどの前に）、標的配列に対応する核酸を強化すること若しくは排除すること、及び／又は適切な型の標的を強化すること若しくは排除すること（例えば、欠失させること）を含むことが可能であり、例えば、標的捕捉プロセスは、（例えば、オリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡフラグメントなどの標的核酸における配列にハイブリダイズすることができるビーズサービスに固定された又は付着させたオリゴヌクレオチドを用いた、など）オリゴヌクレオチド系プロセスを含むことができる。変形例において、標的核酸生成物の強化及び／又は欠失は、例えば、（例えば、配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成するための増幅プロセスから得られた生成物により実施される；など）前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連して、任意の適切な時点及び頻度で実施され得る。例において、標的核酸生成物の強化及び／又は欠失は、（例えば、フラグメンテーションの後、正規化微生物コミュニティ関連フラグメントを生成した後；など）ハイブリダイゼーションプローブを標的とすることに基づくことができる。例において、プローブは、具体的には、例えば配列特異的方法で相補的化学結合により標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）と相互作用することが可能であり、追加的又は代替的に任意の位置でビオチン標識を含むことが可能な一連の核酸を含むことができる。具体例において、長さが２０〜５００塩基などで、核酸標的の配列と相補的な一本鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡプローブが設計される。具体例において、核酸（例えば、正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成する任意の適切な部分における；など）は、相補鎖を変性し且つ相補鎖の分離を可能にするために、適切な緩衝液中において６０〜９９℃でインキュベートされ、ここで一本鎖核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を用いる場合、このプロセスを省略することができる。具体例において、対象のプローブ及び核酸は、Ｔｍ±１０℃の温度（及び／又は他の適切な温度）で、１０分間、最高で５日間（及び／又は他の適切な時間）、インキュベートされ、ここでＴｍはプローブの融解温度に相当し、このことによっ���、他の非標的化核酸を非結合とすると共に対象の標的へのプローブの結合が可能になる。具体例において、次いで、プローブ内のビオチン標識とのストレプトアビジンタンパク質の特異的相互作用によって核酸プローブハイブリッドを捕捉することが可能であり；ここでストレプトアビジンは、磁気ビーズ、樹脂又は使い捨て可能な実験器具の表面が挙げられるがそれらに制限されるものではない任意の型の固定化表面に繋留され得る。追加的に又は代替的には、（例えば、２０〜５００のヌクレオチドの）ｓｓＤＮＡプローブ又はｓｓＲＮＡプローブは、ハイブリダイゼーションの前に磁気ビーズに共有結合することが可能であり、標的核酸によるインキュベーションのために、この錯体を使用することが可能であり；プローブ−核酸ハイブリッドの捕捉後、上清は、欠失した画分を含み、ビーズは、強化画分を含み；続いて、対象の画分の核酸を回収することができる。
【００８２】
変形例において、処理は、処理されることが所望されるフラグメントの大きさの範囲を限定するために、例えば、下流の処理に干渉し、及び／又は大きさが選択され得るあらゆる分子を除去するために、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを洗浄することを含むことができる。例において、核酸の洗浄及び／又は大きさの選択は、シリカ−樹脂カラム、磁気ビーズ、精製を可能にする他の型の核酸結合材料、及び／又は任意の他の適切な試料処理作業を用いて実施され得る。
【００８３】
変形例において、処理は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、３’エキソヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ及び／又は任意の他の適切な酵素の内の少なくとも１つを含む１又は複数の酵素に基づいて（例えば、用いて、処理して、など）、微生物コミュニティ関連フラグメント（例えば、フラグメント化ＤＮＡ）を修復することを含むことができる。例において、修復プロセスにおける酵素使用を、例えば本明細書に記載される任意の適切な精製プロセスにより除去することが可能であり、（例えば、用いられる酵素が熱安定性でない場合などでは、６０℃超の温度におけるインキュベーションによって）不活性化することが可能であり、及び／又は、それ以外の場合、処理することが可能である。具体例において、（例えば、３’ＥＸＯＮＵＣＬＥＡＳＥ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ酵素及びｄＡＴＰなどを用いて）微生物コミュニティ関連フラグメント（例えば、修復された微生物コミュニティ関連フラグメント）を３’アデニラート化することが可能であり、その後、追加的に又は代替的に、１又は複数の精製プロセス（例えば、本明細書に記載されるもの；など）を行うことが可能である。しかし、修復プロセスは、（例えば、前記方法１００などの任意の適切な部分に関連した任意の適切な時点及び頻度で）任意の適切な方法で実施され得る。
【００８４】
しかし、全核酸及び／又は他の適切な成分のフラグメント化に加えて及び／又は代替的に、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することの任意の適切な部分に加えて及び／又は代替的に；任意の適切な時点及び頻度で前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分において、及び／又は任意の適切な方法で、前記全核酸のセットを処理することを実施することができる。
【００８５】
しかし、微生物コミュニティ関連フラグメントを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００８６】
２．２．Ｂ  ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること。
前記方法１００の実施形態は、下流の正規化、他の試料処理及び／又はバイオインフォーマティックス分析を容易にするためのライゲーションされた分子（例えば、ライゲーションされたアダプター分子；など）を有するフラグメントを得る機能を果たす可能性がある、ライゲーションプロセスに基づいてライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２４を含むことができる。
【００８７】
前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、好ましくは、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、修復された及び３’アデニラート化された微生物コミュニティ関連フラグメント；任意の適切な処理された又は処理されていない形態における微生物コミュニティ関連フラグメント；など）及び／又はライゲーションアダプター分子のセットに基づく（例えば、使用する；処理する；増幅プロセスを実施する；など）。
【００８８】
フラグメンテーションプロセスの出力（例えば、全核酸の微生物コミュニティ関連フラグメント）に付加される（例えば、ライゲーションプロセスなどによりライゲーションされるまど）領域（例えば、配列）は、好ましくは、例えば前記方法１００の実施形態の後続の部分（例えば、後続のＰＣＲプロセス；例えば、配列準備完了微生物コミュニティ関連フラグメント分子を生成することに関連して；など）において（例えば、下流の増幅プロセスにおける；など）プライマー及び／又は他の適切な分子の結合を可能にするアダプター領域などの（例えばライゲーションされたアダプター分子を用いた；など）アダプター領域を含む。しかし、アダプター領域及び／又は他の適切な成分（例えば、ライゲーション分子の領域；プライマー領域に関連した領域；など）は、任意の適切な方法で実施され得る。
【００８９】
（例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントに付加するためのライゲーションプロセスにおいて用いられる；など）ライゲーションアダプター分子は、（例えば、外部定義配列領域に関連して本明細書に記載される任意の特性を含む；など）外部定義配列領域；（例えば、ＮＧＳ及び／又は他の適切な配列決定技術のためのライブラリのための下流の増幅を容易にする別の配列要素を含む異なるアダプター領域型を含む；配列決定に関連した配列決定アダプター領域；など）アダプター領域；（例えば、ＤＮＡ及び／又は他の核酸の両ストランドを繋索するための；など）架橋領域；結合領域（例えば、フラグメントへのイオン結合などのためのアデニン分子；フラグメントへの共有結合などのためのホスフェート分子；及び／又は微生物コミュニティ関連フラグメントへの任意の適切な型の結合を容易にするなどのための他の適切な分子；など）；及び／又は任意の適切な領域の内のいずれか１又は複数を含むことができる。ライゲーションアダプター分子は、二本鎖の形態（例えば、二本鎖ＤＮＡライゲーションアダプター分子；など）及び／又は任意の適切な形態であることができる。具体例において、前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、「３’ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＸＸＸＸＸＸＸ）−ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ａ−ＢＲＩＤＧＥ−ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ５’」を含む第１ライゲーションアダプター分子型の構成に対応する第１ライゲーションアダプター分子；及び「５’ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＹＹＹＹＹＹＹ）−ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ｂ−ＢＲＩＤＧＥ−ＡＤＥＮＩＮＥ３’」を含む第２ライゲーションアダプター分子型の構成に対応する第２ライゲーションアダプター分子を含むライゲーションアダプター分子のセットによるライゲーションプロセスに基づくことが可能であり；例えば、「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」は、（例えば、外部定義配列領域に関連した本明細書に記載される任意の特性を含み；例えば、任意の長さ及び任意の適切な定義配列の、後続の増幅プロセスを促通する；など）外部定義配列領域に対応することが可能であり；「ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ａ」及び「ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ｂ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切な分子の任意の適切なアダプター領域；など）は、ＮＧＳ及び／又は他の配列決定技術のためのライブラリのための下流の増幅を可能にする２つの別の配列要素に対応することが可能であり；「ＢＲＩＤＧＥ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切な分子の他の適切な架橋領域；など）は、二本鎖ライゲーションアダプター分子の両ストランドを繋索する相補領域に対応することが可能であり；「ＡＤＥＮＩＮＥ」分子及び「ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ」分子（及び／又は本明細書に記載される任意の適切な分子の他の適切なアデニン及び／又はホスフェート分子；など）は、微生物コミュニティ関連フラグメントへのそれぞれイオン結合及び共有結合を可能にすることができる。
【００９０】
具体例において、ライゲーションアダプター分子は、例えばリガーゼ酵素（例えば、ＤＮＡリガーゼ酵素；など）の付加によって微生物コミュニティ関連フラグメントの両端（例えば、フラグメント化ＤＮＡの両端；など）にライゲーションされ得る。変形例において、リガーゼ酵素及び／又は他の適切な成分は、例えば６０℃超の温度及び／又は他の適切な温度でインキュベートして不活性化され得る。変形例において、精製プロセスは、（例えば、ＤＮＡ精製のための）ライゲーションプロセスに続いて、並びに／又は任意の適切な時点及び頻度で実施形態され得る。
【００９１】
変形例において、ライゲーションアダプター分子は、１又は複数のＵＭＩ領域を含むことができる。例えば、前記ライゲーションアダプター分子のセットは、ＵＭＩ領域を含むことが可能であり、各ＵＭＩ領域は、ランダム「Ｎ」塩基のセットを含み、各ランダム「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基及び「Ｃ」塩基の内のいずれか１つから選択される。具体例において、ライゲーションアダプター分子（例えば、二本鎖ＤＮＡライゲーションアダプター分子など）は、「３’ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＸＸＸＸＸＸＸ）−ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ａ−ＢＲＩＤＧＥ−ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ５’」及び「５’ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＹＹＹＹＹＹＹ）−ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ｂ−ＢＲＩＤＧＥ−ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＡＤ  ＥＮＩＮＥ３’」を含むライゲーションアダプター分子型の構成に対応することが可能であり、「ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ」は、連続的であり得るか、又は定義塩基によって分離され得、定量化又は分化されることが所望される分子及び／又は変異体の量に応じて２〜２０塩基の長さを有し得る一連の「Ｎ」デオキシヌクレオチド塩基（例えば、「Ｎ」は、「Ａ」核塩基、「Ｃ」核塩基、「Ｔ」核塩基及び「Ｇ」核塩基の間の任意のランダム塩基である）を含むＵＭＩ領域に対応することが可能であり、例えば、より長いＵＭＩ領域は、さらに多くのランダム塩基の組み合わせを可能にし、したがって、より大きい固有の識別子のセットを可能にする。しかし、ＵＭＩ領域を含むライゲーションアダプター分子は、任意の適切な方法で構成され得る。
【００９２】
しかし、ライゲーションアダプター分子は、任意の適切な方法で（例えば、任意の適切な順序で；など）構成された任意の適切な領域を含むことができる。
【００９３】
しかし、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【００９４】
２．２．Ｃ  正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること。
前記方法１００の実施形態は、例えば配列決定ライブラリにおける異なるフラグメント及び／又は他の適切な分子の表現を正規化するための、正規化配列決定ライブラリの調製を容易にするための正規化フラグメントを得る機能を果たすことができる、規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、正規化メタゲノム関連フラグメント；正規化メタトランスクリプトミクス関連フラグメント；など）を生成することＳ１２６を含むことができる。具体例において、正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、試料において最初に表現される異なる型の分子の量の均等化を向上させる（例えば、メタゲノム及び／又はメタトランスクリプトームに関連した充分に表現されていない分子の表現を向上させる；など）機能を果たすことができる。
【００９５】
前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、好ましくは、前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び／又は（例えば、本明細書に記載される任意の特性などを含む）正規化プライマーのセットによる増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス；第１増幅プロセス；本明細書に記載される他の適切な型の増幅プロセス；など）に基づくが、任意の適切な試料処理作業（例えば、ライゲーション作業；精製作業；など）及び／又は任意の他の適切な成分に基づくことができる。
【００９６】
正規化微生物コミュニティ関連フラグメントは、好ましくは、正規化プライマーの１又は複数の領域に関連した（例えば、付加した；結合した；連結した；など）フラグメントを含むが、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分を含むことができる。
【００９７】
具体例において、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＸＸＸＸＸＸＸ）−３’」を含む第１プライマー型構成に対応する第１プライマー及び「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＹＹＹＹＹＹＹ）−３’」を含む第２プライマー型構成に対応する第２プライマーを含む正規化プライマーのセット（例えば、前記増幅プロセス及び／又は本明細書に記載される他の適切な増幅プロセスにより用いられるものなどのライゲーションされた微生物コミュニティ関連分子のセット；など）による増幅プロセスに基づくことが可能であり；「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の外部定義配列領域など）は、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントの定義外部配列領域の配列などの（例えば、第１プライマー型構成におけるＸＸＸＸＸＸＸ、第２プライマー型構成におけるＹＹＹＹＹＹＹなどによって表現される）定義外部配列に対応することが可能であり、例えば、「ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ」（及び／又は他の外部定義配列領域）は、任意の長さ及び任意の定義配列であることができる。正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成するための１又は複数の増幅プロセスに正規化プライマーの定義数の分子を付加することが可能であり；及び／又は（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ酵素などと共に）全ての付加された正規化プライマーを完全に用いることを確保するためにＮサイクル数のＰＣＲ（及び／又は任意の適切な程度の増幅プロセス；など）実施することが可能であり；例えば、１又は複数の増幅プロセスから生成され得る分子の数を（例えば、１又は複数の増幅プロセスのための鋳型として用いられる分子の数から独立した；など）付加された正規化プライマー分子の数に限定することが可能である。例において、正規化プライマーの外部定義配列領域は、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントの外部定義配列領域（例えば、例えばライゲーションプロセスに基づいて微生物コミュニティ関連フラグメントに付加された外部定義配列領域；など）にアニーリングすることが可能であり、正規化プライマーの外部定義配列領域は、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントの外部定義配列領域に関連（例えば、共有配列；相補的；アニーリング可能；など）することが可能である。具体例において、前記ライゲーションアダプター分子のセットは、前記配列決定に関連した第１アダプター領域を含むことが可能であり、前記ライゲーションアダプター分子のセットを生成することは、ライゲーションプロセスに基づいて第１アダプター領域を前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットに付加することを含むことが可能であり、前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットは、付加された第１アダプター領域を含むことが可能であり、及び／又は前記配列決定プライマーのセットは、前記正規化標的分子のセットの付加された第１アダプター領域にアニーリングするための第２アダプター領域を��むことが可能である。
【００９８】
変形例において、前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること（及び／又は前記方法１００の実施形態の適切な部分）は、（例えば、任意の適切な成分を精製するために；任意の適切な成分を除去するために；など）１又は複数の精製プロセスを実施することを含むことができる。例において、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス）に基づいて前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、増幅プロセスの生成物から前記正規化プライマーのセットを除去するために（及び／又は他の適切な成分を除去するために）増幅プロセスの生成物による精製プロセスを実施することを含むことができる。本明細書に記載される任意の適切な精製プロセスを、任意の適切な方法で用いることが可能であり且つ／又は実施することが可能である。
【００９９】
追加的に又は代替的には、（例えば、任意の適切な分子を正規化するための）正規化プライマーによる１又は複数の増幅プロセスに基づいて正規化微生物コミュニティ関連分子を生成することは、正規化プライマーによる本明細書に記載される増幅プロセスに類似した任意の適切な方法で実施され得る。
【０１００】
しかし、正規化微生物コミュニティ関連フラグメントを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１０１】
２．２．Ｄ  配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること。
配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、配列決定準備完了メタゲノム関連フラグメント；配列決定準備完了メタトランスクリプトミクス関連フラグメント；など）を生成することＳ１２８は、配列決定（例えば、ＮＧＳなど）のための調製のための微生物コミュニティ関連フラグメント（例えば、正規化微生物コミュニティ関連フラグメント）を処理する機能を果たすことができる。
【０１０２】
配列決定のための分子を調製することは、好ましくは、例えば増幅プロセス（例えば、第２増幅プロセス；第２ＰＣＲプロセス；など）に基づいて（例えば、１若しくは複数のアダプター領域及び／又は１若しくは複数の指標領域などを付加することによって）配列決定のための正規化微生物コミュニティ関連フラグメントを調製することを含むが、追加的に又は代替的には、配列決定のための任意の適切な分子を調製することを含むことができる。
【０１０３】
前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、好ましくは、（例えば、前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる配列決定プライマー及び／又は配列決定プライマーの任意の適切な領域の組み込みのための；前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットへの配列決定プライマーの領域を付加するための；など）正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び／又は配列決定プライマーのセットに基づく（例えば、使用する；処理する；増幅プロセスを実施する；など）が、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分に基づくことができる。例において、ライゲーションアダプター分子は、（例えば、ＮＧＳに関連した；など）第１外部アダプター領域を含むことが可能であり、（例えば、ライゲーションアダプター分子に基づいて生成されるライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントに由来する；など）前記正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセットは、第１外部のアダプター領域を含み；配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、ＮＧＳ準備完了正規化微生物コミュニティ関連フラグメント；など）を生成することは、正規化微生物コミュニティ関連フラグメントの外部アダプター領域における正規化微生物コミュニティ関連フラグメントによって（例えば、第１外部アダプター領域などに対して相補的な外部アダプター領域などの外部アダプター領域を含むアダプター領域を含む）配列決定プライマーのセットをアニーリングすることを含む。
【０１０４】
配列決定準備完了標的分子を生成することは、好ましくは、正規化微生物コミュニティ関連フラグメントの濃度をＮＧＳ及び／又は他の適切な配列決定のために適切な量に（例えば、２ｐＭ以上の量及び／又は任意の適切な所望の量；などに）増加させ、例えば、配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントは、所望の量（例えば、正規化量及びＮＧＳなどのための適切な量）である。
【０１０５】
具体例において、ＰＣＲプロセス（例えば、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成するための第２ＰＣＲプロセス）を実施することは、５〜４５サイクルのＰＣＲ（及び／又は任意の適切なサイクル数のＰＣＲ）を使用すること及び／又は含むことを含むことができる。
【０１０６】
具体例において、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＡＤ  ＡＰＴＥＲ＿Ａ−３’」を含む第１プライマー型構成に対応する第１配列決定プライマー及び「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＡＤ  ＡＰＴＥＲ＿Ｂ−３’」を含む第２プライマー型構成に対応する第２配列決定プライマーを含む配列決定プライマーのセットによる増幅プロセス（例えば、及び前記増幅プロセス及び／又は本明細書に記載される他の適切な増幅プロセスによって用いられるものなどの正規化微生物コミュニティ関連フラグメントのセット；など）に基づくことが可能であり；例えば、「ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他の指標領域など）は、配列決定されることになる異なる試料の組み合わせ標識付けを可能にすることができる任意の適切な長さ）の定義バーコード配列に対応することが可能であり；例えば、「ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ」（及び／又は本明細書に記載される任意の適切なプライマーの他のアダプター領域など）は、例えば配列決定が起きることを可能にするための１又は複数のＮＧＳ技術及び／若しくは他の適切な配列決定技術に必要とされる、並びに／又は、それ以外の場合、関連した任意の特異的配列にも対応することが可能であり；例えば、「ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ａ」及び「ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ｂ」は、本明細書に記載される「ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ａ」及び／若しくは「ＡＤＡＰＴＥＲ＿Ｂ」並びに／又は任意の適切なアダプター領域の任意の適切な特性を含むことができる。
【０１０７】
変形例において、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成すること（及び／又は実施形態前記方法１００の適切な部分）は、追加的に又は代替的に、１若しくは複数の補助増幅プロセス（例えば、本明細書に記載されるものなど）及び／又は配列決定ライブラリのための分子の濃度を増加させるための他の適切なプロセス（例えば、本明細書に記載されるものなど）を実施することを含むことができる。
【０１０８】
具体例において、配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメント（及び／又は正規化アンプリコンライブラリの適切な生成物）は、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−３’」を含む構成を含むことができる。具体例において、例えば、ＵＭＩ領域を含むライゲーションアダプター分子は、（例えば、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントなどを生成する際に）使用され、配列決定−準備完了微生物コミュニティ関連フラグメント（及び／又は正規化アンプリコンライブラリの適切な生成物）は、「５’−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＵＮＩＱＵＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＴＡＲＧＥＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ−ＵＮＩＱＵＥ＿ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ＿ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮＤＥＸ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＤＡＰＴＥＲ−３’」を含む構成を含むことができる。
【０１０９】
追加的に又は代替的には、（例えば、配列決定プライマーに関連する本明細書に記載される任意の適切な特性を含む；など）配列決定プライマーによる１又は複数の増幅プロセスに基づいて配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントを生成することは、配列決定プライマーによる本明細書に記載される増幅プロセスに類似した任意の適切な方法で実施され得る。
【０１１０】
しかし、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１１１】
２．３  連結配列決定ライブラリを生成すること。
図１〜図２に示されるように、前記方法１００の実施形態は、アンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定の両方に関連した連結配列決定を容易にする機能を果たすことができるアンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定（例えば、メタゲノム関連配列決定及び／又はメタトランスクリプトミクス関連配列決定；など）に関連した連結ライブラリを生成することＳ１５０を含むことができる。例において、前記方法１００の実施形態の部分は、正規化された連結配列決定ライブラリの配列決定から誘導された微生物配列データセットに基づいて微生物コミュニティから特異的微生物を同定すること（並びに／又はマイクロバイオーム組成物、機能及び／若しくは適切な微生物関連態様に関連した適切なマイクロバイオーム特性決定を行うこと）（例えば、１又は複数の微生物分類群の存在量、存在、欠乏などを決定すること）を含むことができる。
【０１１２】
追加的に又は代替的には、連結ライブラリを生成することＳ１５０は、例えば前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる正規化プロセス（例えば、第２ＰＣＲプロセスなどの第２増幅プロセス、例えば、第１増幅プロセスは、アンプリコン標的分子を生成するために使用され得る；など）を実施することに基づいて正規化混合物を生成することＳ１５６；正規化混合物に基づいて（例えば、正規化混合物による第３増幅プロセスに基づいて；正規化混合物及び前記配列決定プライマーのセットによる第３ＰＣＲプロセスに基づいて；など）（例えば、配列決定準備完了標的分子のセットなどを含む）正規化された連結ライブラリを生成することＳ１５８；及び／又は他の適切なプロセスを含むことが可能である。
【０１１３】
追加的に又は代替的には、連結配列決定ライブラリを生成することＳ１５０は、正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０（例えば、アンプリコン標的分子のセットを生成することＳ１１２；など）、正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成することＳ１２０（例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２２；ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットを生成することＳ１２４；など）及び／又は正規化された連結配列決定ライブラリの生成を容易にすることに関連したものなどの前記方法１００の実施形態の他の適切な部分を含む前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分を含むことができる。
【０１１４】
組み合わせた配列ライブラリは、好ましくは、アンプリコン関連配列決定に関連した成分（例えば、配列決定可能な成分、正規化分子、標的分子、全核酸のフラグメント、アンプリコン関連成分、微生物コミュニティ関連成分など）（例えば、アンプリコンを含む成分；微生物コミュニティ関連成分に関連して処理されたものなど、アンプリコン関連成分と微生物コミュニティ関連成分との間の濃度比の釣合いをとることに関連して処理されるものなどの、例えば配列決定のための調製のための処理されたアンプリコン；アンプリコン生成及び／又はアンプリコン処理に関連した出力；など）及び微生物コミュニティ関連配列決定（全核酸のフラグメントを含む成分；例えば配列決定を容易にするための処理されたフラグメント；全核酸自体；など）を含むが、追加的に又は代替的には、任意の適切な成分を含むことができる。連結配列決定ライブラリ（例えば、正規化された連結配列決定ライブラリ；など）は、好ましくは、前記標的のセットに関連した（例えば、アンプリコン関連配列決定などに関連した）配列決定準備完了分子のセット及び（例えば、微生物コミュニティ関連配列決定などに関連した）微生物コミュニティを含む。
【０１１５】
アンプリコン関連配列決定は、好ましくは、例えば生物学的試料における１又は複数の微生物分類群の同定のための単一又は少数の標的（例えば、遺伝子領域）の分析に関連した配列決定を含むが、追加的に又は代替的には、アンプリコンに関連した任意の適切な配列決定を含むことができる。微生物コミュニティ関連配列決定は、好ましくは、単一遺伝子アンプリコンの分析とは対照的に、例えばＤＮＡ（例えば、及び／又はｃＤＮＡに転写されるＲＮＡ；など）の全コミュニティを含む（例えば、１又は複数の生物学的試料内に存在する）微生物コミュニティ及び／又は他の適切な生態学的コミュニティの分析に関連した配列決定を含むが、追加的に又は代替的には、（例えば、組成物関連分析；機能関連分析；などに関連した）微生物コミュニティ、生態学的コミュニティ、微生物の群、メタトランスクリプトミクス関連態様及び／又はメタゲノム関連態様に関連した任意の適切な配列決定を含むことができる。
【０１１６】
連結配列決定ライブラリは、追加的に又は代替的には、１又は複数の集積配列決定ライブラリ（別々の混合物；例えば多重配列決定における異なる区画に用いるための別々のサブライブラリ；など）を含むことができる。
【０１１７】
連結配列決定ライブラリを調製する部分は、前記方法１００の実施形態の部分との任意の適切な関係（例えば、前、後、間、連続的、同時などの時間的関係；入力として用いられる且つ／又は出力として生成される成分に関する関係；など）により実施され得る。
【０１１８】
変形例において、１又は複数の連結配列決定ライブラリを調製する部分は、１又は複数の正規化アンプリコンライブラリを生成することＳ１１０、１又は複数の正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成することＳ１２０の任意の適切な部分及び／又は前記方法１００の実施形態の他の適切な部分に関連して記載される任意の適切なプロセス（及び／又は類似したプロセス）を含むことができる。しかし、連結配列決定ライブラリを調製することＳ１５０は、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１１９】
２．３．Ａ  正規化混合物を生成すること。
前記方法の実施形態は、アンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定を容易にするための前述の処理プロセスに関連した生成物（例えば、アンプリコン標的分子、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントなどの微生物コミュニティ関連フラグメントなど）を組み合わせる（例えば、凝集する）機能を果たすことができる前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる正規化プロセス（例えば、第２ＰＣＲプロセスなどの第２増幅プロセス；など）を行うことに基づいて正規化混合物を生成することＳ１５６を含むことができる。
【０１２０】
正規化混合物を生成することは、好ましくは、増幅プロセス（例えば、第２ＰＣＲプロセスを含む第２増幅プロセス、例えば、アンプリコン標的分子を生成することは、第１ＰＣＲプロセスを含む第１増幅プロセスを含む；アンプリコン標的分子、微生物コミュニティ関連フラグメント及び／又は他の適切な成分の間の濃度比の釣合いをとることを含む増幅プロセス；など）を好ましくは含む１又は複数の正規化プロセスを実施することに基づく（例えば、含む）が、正規化プロセスは、１又は複数の正規化混合物の生成を容易にするための任意の適切なプロセス（例えば、前処理プロセス；など）を含むことができる。例において、正規化プロセスを実施することは、アンプリコン標的分子配列決定準備完了分子のセット、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセット、及び正規化プライマーのセットによるＰＣＲプロセス（例えば、第２ＰＣＲプロセス）を実施することを含むことができる（例えば、前記正規化プライマーのセットは、成分に相補的など、前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットに関連したプライマーを含む；など）。例において、前記正規化プライマーのセット（及び／又は配列決定プライマー及び／又は連結配列決定ライブラリを生成する際に使用可能な他の適切なプライマー；など）は、アンプリコン標的分子に関連した（例えば、配列領域に相補的な配列領域などを含む）アンプリコン関連プライマーのセット；及び微生物コミュニティ関連フラグメント（例えば、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメント；など）に関連した（例えば、配列領域に相補的な配列領域などを含む）微生物コミュニティ関連プライマーのセットを含むことが可能である。具体例において、前記アンプリコン関連プライマーのセットは、第１サブセットの各アンプリコン関連プライマーが、ＮＧＳ及びアンプリコン生成プライマーの第１サブセットに関連した第１アダプター領域（例えば、第１アダプター領域は、アンプリコン生成プライマーなどの第１サブセットのアンプリコン生成アダプター領域に相補的、結合可能、連結可能及び／又は、それ以外の場合、関連する）を含む、アンプリコン関連プライマーの第１サブセット；及び第２サブセットの各アンプリコン関連プライマーが、ＮＧＳ及びアンプリコン生成プライマーの第２サブセットに関連した第２のアダプター領域（例えば、第２アダプター領域は、アンプリコン生成プライマーなどの第２サブセットのアンプリコン生成アダプター領域に相補的、結合可能、連結可能及び／又は、それ以外の場合、関連する）を含み、前記微生物コミュニティ関連プライマーのセットの微生物コミュニティ関連プライマーが、ＮＧＳ及び前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットの付加アダプターに関連した微生物コミュニティ関連アダプター領域（例えば、微生物コミュニティ関連アダプター領域は、前記ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントのセットの付加アダプターなどの付加アダプター領域に相補的、結合可能、連結可能及び／又は、それ以外の場合、関連する；など）を含むことができる、アンプリコン関連プライマーの第２サブセットを含むことが可能である。具体例において、前記正規化プライマーのセットは、「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＡＤＡＰＴＥＲ  Ａ１−３’」＋「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＡＤＡＰＴＥＲ  Ａ２−３’」（例えば、第１の型のプライマー対；など）及び／又は「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＡＤＡＰＴＥＲ  Ｍ１−３’」＋「５’−ＥＸＴＥＲＮＡＬ  ＡＤＡＰＴＥＲ−ＡＤＡＰＴＥＲ  Ｍ２−３’」（例えば、第２の型のプライマー対；など）を含む構成を含むプライマーを含むことが可能であり、「ＡＤＡＰＴＥＲ−Ａ１」領域及び「ＡＤＡＰＴＥＲ−Ａ２」領域は、アンプリコン標的分子の増幅（例えば、アンプリコンＤＮＡの増幅など）を可能することができ、「ＡＤＡＰＴＥＲ−Ｍ１」及び「ＡＤＡＰＴＥＲ−Ｍ２」は、微生物コミュニティ関連フラグメント（例えば、メタゲノムＤＮＡ；メタゲノム関連フラグメント；メタトランスクリプトミクス関連フラグメント；など）の増幅を可能にすることができ、且つ／又は前記正規化プライマーのセットは、任意の適切な構成を含むプライマーを含むことができる。具体例において、正規化混合物を生成することは、前記アンプリコン標的分子のセット（例えば、アンプリコン標的を生成することは、第１増幅プロセスに基づくことができる；など）、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット並びに前記アンプリコン標的分子のセット及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットへのアニーリングのための外部定義配列領域を含む正規化プライマーのセットによる第２増幅プロセスに基づくことができる。しかし、アンプリコン関連プライマー、微生物コミュニティ関連プライマー及び／又は連結配列決定ライブラリを生成する際に使用可能な他の適切なプライマーは、任意の適切な方法で構成され得る。
【０１２１】
正規化混合物を生成することは、アンプリコン標的分子と微生物コミュニティ関連フラグメントとの間の濃度比及び／又は任意の適切な成分の間の濃度比を改変することを含むことができる。濃度比を改変することは、（例えば、アンプリコン標的分子に関連したリード数及び微生物コミュニティ関連フラグメントに関連したリード数などに関連して）濃度比を所望の濃度比に調整するための限定量正規化プライマー（例えば、アンプリコン関連プライマーの第１の対や微生物コミュニティ関連プライマーの第２の対などの正規化プライマーの対；例えば、本明細書に記載される構成を含むプライマー対など）を付加することを含むことができる。変形例において、濃度比を改変することは、ＰＣＲプロセスから独立した濃度比を改変することを含むことができる。例において、濃度比を改変することは、試料（例えば、アンプリコン標的分子を含む試料；微生物コミュニティ関連フラグメントを含む試料；アンプリコン標的分子及び微生物コミュニティ関連フラグメントの両方を含む混合試料；など）を洗浄すること；蛍光定量、分光光度及び／又は他の適切な濃度測定プロセスにより関連核酸（例えば、関連ＤＮＡなど）を測定すること；アンプリコン関連リード数及び微生物コミュニティ関連配列決定リード数の所望の比に基づいて濃度比を改変することを含むことが可能である。例において、正規化混合物を生成することは、前記アンプリコン標的分子のセットと前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットとの間の濃度比の調整に基づいて正規化プロセスを実施することを含み、（例えば、配列決定準備完了標的分子のセットなどを生成するための）配列決定プライマーのセットは、ＮＧＳに関連したアダプター領域、前記アンプリコン生成プライマーのセットのアンプリコン関連アダプター領域、及び前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセットの付加アダプター領域のセット（例えば、付加アダプター；微生物コミュニティ関連フラグメント生成プライマー；など）を含むことができる。具体例において、正規化混合物を生成することは、アンプリコン関連配列決定リード数及び微生物コミュニティ関連配列決定リード数の所望の比に基づいて前記アンプリコン標的分子のセットと前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメント；など）との間の濃度比を調整することを含む。追加的に又は代替的には、濃度比を改変することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１２２】
しかし、１又は複数の正規化混合物を生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１２３】
２．３．Ｃ  正規化された連結ライブラリを生成すること。
前記方法１００の実施形態は、１若しくは複数のアンプリコン標的分子及び／又は微生物コミュニティ関連フラグメント（例えば、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメント；など）及び／又は配列決定（例えば、ＮＧＳ；同時のアンプリコン関連配列決定及び微生物コミュニティ関連配列決定を含む配列決定；など）のための調製のための（例えば、アンプリコン関連成分及び微生物コミュニティ関連成分などの）他の適切な混合物を処理する機能を果たすことができる配列決定準備完了（例えば、ＮＧＳ準備完了）分子のセット（例えば、配列決定準備完了標的分子；配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメント；など）を含む正規化された連結ライブラリを生成することＳ１５８を含むことができる。例において、配列決定準備完了分子を含む正規化された連結ライブラリを生成することは、アンプリコン標的分子のセット、微生物コミュニティ関連フラグメントのセット（例えば、ライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメント；など）及び配列決定プライマーのセットに基づくことができる。
【０１２４】
配列決定準備完了分子は、好ましくは、（例えば、アンプリコンに関連した）１又は複数の標的及び（例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントに関連した；標的が全核酸を含むことができる；標的が微生物の複数の分類群に関連することができる；など）微生物コミュニティに関連するが、追加的に又は代替的には、微生物コミュニティから独立した１又は複数の標的；１又は複数の標的から独立した微生物コミュニティ；及び／又は対象の任意の他の適切な標的に関連することができる。配列決定準備完了分子を生成することは、好ましくは、例えば前記アンプリコン標的分子のセット、前記微生物コミュニティ関連フラグメントのセット及び前記配列決定プライマーのセットによる増幅プロセス（例えば、アンプリコン標的分子を生成することが、第１ＰＣＲプロセスを含む第１増幅プロセスを含むことが可能であり；正規化混合物を生成することが、第２ＰＣＲプロセスを含む第２増幅プロセスを含むことが可能である、第３ＰＣＲプロセスを含む第３増幅プロセス；など）に基づく（例えば、含む）。ＰＣＲプロセスは、好ましくは、限定されたサイクル（例えば、閾値量未満など）を含むが、任意の適切なサイクル数などを含みことができる）。（例えば、配列決定準備完了分子を生成するための；など）増幅プロセスを行うことは、好ましくは、例えばアンプリコン標的分子及び／又は微生物コミュニティ関連フラグメントを含む（例えば、混合物の）成分に（例えば、増幅プロセスにより）１若しくは複数のアダプター領域及び／又は１若しくは複数の指標領域を付加することを含むが、アダプター領域、指標領域及び／又は他の適切な領域（例えば、本明細書に記載されるプライマー領域など）は、任意の適切な方法（例えば、ライゲーションプロセスなど）で付加され得る。例において、配列決定プライマーは、配列決定（例えば、ＮＧＳなど）に関連した多重化を容易にするように構成された（例えば、配列決定指標領域などを含む）指標領域並びに配列決定（例えば、ＮＧＳなど）に関連したアダプター領域並びに１又は複数のプライマー及び／又はアダプター領域（例えば、プライマーのアダプター領域などのアンプリコン標的分子を生成する際に用いられるプライマー；アンプリコン標的分子のアダプター領域；微生物コミュニティ関連フラグメントのアダプター領域；配列決定プライマーは、アンプリコン標的分子のアダプター領域及び／又は微生物コミュニティ関連フラグメントのアダプター領域に相補的な、アニーリング可能な及び／又は、それ以外の場合、関連したアダプター領域を含むことが可能である；及び／又は他の適切な成分；など）を含むことが可能である。変形例において、配列決定プライマーは、アンプリコン標的分子及び／又は微生物コミュニティ関連フラグメント及び／又は（例えば、アンプリコン標的分子及びライゲーションされた微生物コミュニティ関連フラグメントなどを含む混合物に含まれる）他の適切な成分のアダプター領域（例えば、アンプリコン関連アダプター領域；微生物コミュニティ関連アダプター領域；など）とアニーリングするように構成された領域（例えば、アダプター領域など）を含むことができる。例において、配列決定プライマーは、アンプリコン生成プライマーアダプター領域及び／又は他の適切なアダプター領域（例えば、微生物コミュニティ関連フラグメントの微生物コミュニティ関連アダプター領域など）とアニーリングするように構成された領域含むことができる。例において、正規化された連結ライブラリを生成することは、正規化混合物と、配列決定に関連したアダプター領域を含む配列決定プライマーのセットとによる第３増幅プロセスに基づいて正規化された連結ライブラリを生成することを含む。追加的に又は代替的には、Ｓ１５８に関連した配列決定プライマーは、配列決定プライマーに関連した本明細書に記載される任意の適切な特性と同一、同様、異なる及び／又は含むことができる。しかし、配列決定プライマーは、任意の適切な方法で構成され得、配列決定準備完了分子を生成することに関連して増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス）を実施することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１２５】
変形例において、配列決定準備完了分子を生成することは、１又は複数の前処理プロセス及び／又は後処理プロセスを実施することを含むことができる。例において、配列決定準備完了分子を生成することは、アンプリコン標的分子、微生物コミュニティ関連フラグメント及び前記配列決定プライマーのセットによるＰＣＲプロセスを実施すること；並びに洗浄すること、大きさを選択すること、補助増幅プロセスを実施すること、精製すること、強化すること、除外すること、及び／又は（例えば、任意の適切な配列決定技術のために適切な配列決定準備完了標的分子を調製するための；など）増幅プロセスの生成物による任意の適切な処理を実施することを含むことができる。
【０１２６】
しかし、配列決定準備完了分子を含む正規化された連結ライブラリを生成することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【０１２７】
２．４  磁気系正規化プロセス。
前記方法１００の実施形態は、追加的に又は代替的に、前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分を補充し且つ／又は置換するための追加的又は代替的な正規化プロセスを実施する機能を果たすことができる１又は複数の磁気系正規化プロセスを実施することＳ１６０を含むことができる。磁気系正規化プロセスは、追加的に又は代替的には、チップの使用とピペット操作ヘッド用具の変更とから独立した磁性粒子取り扱いのプロセスを行うことが可能な磁界を用いることによって（例えば、前記方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連して本明細書に記載される；など）任意の適切な溶液から対象の磁性粒子を直接引き寄せる機能を果たすことができる。磁気系正規化プロセスは、追加的に又は代替的に、（例えば、試料の成分中の分散を低下させることによって；配列決定などの間に生成されるリード数を平衡させるための）正規化を容易にする機能を果たすことが可能であり；ターンアラウンドタイム及び／又はコストを低下させる機能を果たすことが可能であり；複数の平板への自動化及び／又はスケーラビリティを向上させる機能を果たすことが可能である；など。）
【０１２８】
磁気系正規化プロセスを実施することは、（例えば、所望の比に；など）磁気ビート（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｔｓ）を希釈すること；例えば磁気ビーズ及び適切な分子による結合プロセスに基づいてビーズ−分子複合物のセット（例えば、標的分子、フラグメントなどの１又は複数の分子に結合した磁気ビーズを含む複合物など）を生成すること；磁界システムのインターフェイス板に前記ビーズ−分子複合物のセットを付着させること；前記ビーズ−分子複合物のセットをインターフェイス板から分離すること；及び／又は磁気系正規化に関連した他の適切なプロセスの内のいずれか１又は複数を含むことができる。（例えば、正規化された連結ライブラリを生成することに関連した；など）例において、前記配列決定準備完了分子のセットにおける追加的正規化プロセスを実施することは、所望の比に磁気ビーズを希釈すること；磁気ビーズ及び前記配列決定準備完了分子のセットによる結合プロセスに基づいてビーズ−分子複合物のセットを生成すること；磁界システムのインターフェイス板に前記ビーズ−分子複合物のセットを付着させること；及び／又は前記ビーズ−分子複合物のセットをインターフェイス板から分離することを含むことができる。（例えば、正規化されたアンプリコンライブラリを生成することに関連した；など）例において、前記配列決定準備完了標的分子のセットにおける追加的正規化プロセスを実施することは、所望の比に磁気ビーズを希釈すること；磁気ビーズ及び前記配列決定準備完了標的分子のセットによる結合プロセスに基づいてビーズ−標的分子のセットを生成すること；磁界システムのインターフェイス板に前記ビーズ−標的分子のセットを付着させること；及び前記ビーズ−標的分子のセットをインターフェイス板から分離することを含むことができる。（例えば、正規化微生物コミュニティ関連ライブラリを生成することに関連した；など）例において、前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットにおける追加的正規化プロセスを実施することは、所望の比に磁気ビーズを希釈すること；磁気ビーズ及び前記配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントのセットによる結合プロセスに基づいてビーズ−フラグメントのセットを生成すること；及び磁界システムのインターフェイス板に前記ビーズ−フラグメントのセットを付着させること；及び前記ビーズ−フラグメントのセットをインターフェイス板から分離することを含むことができる。
【０１２９】
具体例において、磁気ビーズは、所望の比（例えば、１：１０、１：２０、１：４０、他の適切な比；など）に適切な緩衝液（例えば、ポリエチレングリコール  ２０％  ２Ｍ  ＮａＣｌ）で希釈され；ビーズを希釈することによって、核酸が結合する利用可能部位の数は、制御された方法で限定され、それによって試料間の分子数が減少し、正規化され；ビーズの表面上の結合部位よりも多い数の核酸分子を有する試料において、追加的な又は代替的な洗浄工程の間に非結合部分を除去することが可能であり；希釈されたビーズを試料（例えば核酸、ＰＣＲアンプリコン、標的分子；微生物コミュニティ関連フラグメントなど）に加えることが可能であり、変化し得る時間、インキュベートすることが可能であり；（例えば、平板が磁界システムと試料との間の清浄な界面として作用し得る）底部において平板（例えば、新しい９６ウェルポリスチレン平板；など）によってカバーされた磁気用具を試料及びビーズを含む平板内に沈めることが可能であり；インキュベーションの後、ビーズは、残りの試料から磁気ビーズ並びに付着した核酸及び／又は他の適切な分子を除去するために持ち上げることができるインターフェイス板の表面に付着することが可能であり；付着したビーズは、洗浄溶液（例えば、エタノール８０％）を含む新しい平板内に２回沈めることが可能であり、それによってさらに核酸分子が洗浄され；次いで、ビーズを数分間乾燥させることが可能であり；及び／又はビーズを水又は任意の適切な溶液に沈めて、（例えば、いくつかの下流の適用、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリ調製、制限酵素分析、ライゲーション、配列決定などのために）前記方法の実施形態の任意の適切な部分において直接使用することができる核酸を放出させる。
【０１３０】
磁気系正規化プロセスを実施することは、任意の適切な入力（例えば、任意の適切な増幅プロセス及び／又は他の適切な試料処理作業内への任意の適切な入力又は生成物；など）を用いて、任意の適切な時点及び頻度で実施され得る。
【０１３１】
しかし、１又は複数の磁気系正規化プロセスを実施することは、任意の適切な方法で実施され得る。
【実施例】
【０１３２】
３．  実施例
正規化アンプリコンライブラリ生成の例において：変化し得る量の細菌ＤＮＡ及びＨＰＶウイルスＤＮＡを含む平衡ＮＧＳライブラリを構築し、次いでｑＰＣＲによって各標的の濃度を測定し；ライブラリをあらゆる混合物中の標的ＤＮＡ濃度の広い変化量及び等量の正規化プライマーで試験し；図６に示されるように、１０１０未満の濃度のプライマー複製／反応による等量の正規化プライマーを用いる場合、初期入力（鋳型混合物Ｂ及びＤ）において１：１００の比で異なる両方の細菌標的コピー数及びＨＰＶ標的コピー数の両方を完全に又は部分的に正規化し（例えば、ｑＰＣＲによる定量を示す図６に示されるように、同じ濃度のＨＰＶ及び１６Ｓプライマーを各反応で使用し、さらに条件の異なる濃度も試験し（１０８、１０９、１０１０及び１０１１の分子の正規化プライマー）；ＨＰＶ１８＋３１及びｇＤＮＡ細菌混合物（緑膿菌（Ｐ．ａｅｕｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌及びエンテロコッカスフェカリス）の合成鋳型に含まれる鋳型を異なるコピー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）数で用いた。ＨＰＶのためのアンプリコンコピー数をより良好に正規化するために１：１０の比で正規化プライマーを用いる同様の例において、図７に示されるように、初期入力の１：１００の差を含む混合物を完全に正規化し（混合物Ｂ及び混合物Ｃ）、初期入力の１：１００００の差異を含む試料を部分的に正規化し（混合物Ａ及び混合物Ｄ）；図７は、ＨＰＶプライマーを１６Ｓに対してより高い濃度で加えた異なる濃度のＨＰＶ及び試験対象の１６Ｓプライマーを示すｑＰＣＲによる定量を示し；プライマーの分子数の１桁〜２桁の差を試験し；試験対象のＨＰＶ／１６Ｓ分子についての異なる濃度は、１０∧７／１０∧６、１０∧７／１０∧５、１０∧６／１０∧５及び１０∧６／１０∧４であり；ＨＰＶ１８＋３１及びｇＤＮＡ細菌混合物（緑膿菌、黄色ブドウ球菌及びエンテロコッカスフェカリス）の合成鋳型を含む鋳型を異なるコピー（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）数で用いた。
【０１３３】
例において、前記方法１００の実施形態の部分は、連結配列決定ライブラリをヒト大便生物学的試料から調製することを含むことが可能であるが、連結配列ライブラリは、追加的に又は交互に、任意の適切な生物学的試料から（例えば、任意の適切な使用者から；任意の適切な回収部位から；など）調製され得る。具体例において、連結配列ライブラリは、単一の使用者に由来する大便試料から構築され得；複数（例えば、数百など）の配列決定操作から得られた試料の細菌性分類群分析は、（例えば、頑健性及び一致性；などを示す）統計学的に有意な再現可能な多様性を示す可能性がある。具体例において、連結配列決定ライブラリは、アンプリコンに焦点を当てたアプローチ（例えば、テネリクテス門など）だけを用いる場合、連結配列決定ライブラリのアンプリコン関連成分において表現される全ての種（及び／又は他の適切な分類群）の包含及び過少に表現されることが示される細菌性分類群のより高い表現を示す結果につながる可能性がある。具体例において、連結配列決定ライブラリを調製することに関連したプロセスは、（例えば、１６Ｓ領域、１８Ｓ領域、ＩＴＳなどを含む、且つ／又は、に基づく）所定の微生物の有無を同定するためのアンプリコン関連プロセスを用いることによる、並びに対象の核酸標的（例えば、抗生物質耐性遺伝子、毒性因子、分泌システムなど）及び／又は他の適切な標的を同定するための微生物コミュニティ関連プロセスを用いることによる対象の異なる生物及び特異的核酸標的の同定のために使用され得る。
【０１３４】
例において、前記方法１００及び／又はシステム２００は、従来のアプローチを超える向上を与える可能性がある。前記方法１００及び／又はシステム２００の具体例は、少なくとも従来のアプローチに関連した課題に対する技術的に定着した解決策を与える可能性がある。例において、前記技術は、実体（例えば、生物学的試料、核酸標的などの標的、プライマー、使用者など）を異なる状態又は物に変換することができる。具体例において、標的分子は、配列決定準備完了標的分子に変換され得、及び／又は微生物コミュニティ関連核酸は、（例えば、低下したバイアス、向上した定量などの向上した分析などに関連した）向上した配列決定のために適合させたものなどの配列決定準備完了微生物コミュニティ関連フラグメントに変換され得る。具体例において、向上した配列決定ライブラリを調製することが可能であり、それによって例えば１又は複数の微生物関連状態に関連した向上した診断及び／又は治療を容易にするための向上したマイクロバイオーム特性決定が生じることによって、１又は複数の使用者が変換される。しかし、例において、前記技術は、任意の適切な方法で実体を変換することができる。
【０１３５】
例において、前記技術は、少なくとも配列決定ライブラリ調製、試料処理、ゲノミクス、分子生物学、微生物学、診断、治療学、デジタル医療、モデリングの技術分野及び／又は他の適切な技術分野を向上させることが可能である。しかし、具体例において、前記技術は、例えば前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の部分を実施することによって、任意の他の適切な向上を提供することが可能である。
【０１３６】
３．Ａ  磁気系正規化の例。
例において、ＰＣＲの後で１６Ｓ遺伝子正規化のために磁気系正規化を実施することが可能であり、口腔試料及び腸試料から抽出されたＤＮＡを鋳型として用いて３０サイクルのＰＣＲにより１６Ｓ遺伝子を増幅し；ＰＣＲ後、３ｕｌの各反応物を得て、磁気ビーズの使用により試料の中でＤＮＡの量を正規化した。（例えば、各ドットが個別の試料を表し、ボックスが中央値及び９５％信頼区間を示す、正規化の前後における１６Ｓ  ＰＣＲの濃度を比較するボックスプロットを含む図８に示されるように；など）正規化の前後の反応物を定量し；正規化試料は、非正規化試料よりも濃度が低く、平均が４３．１８ｎｇ／ｕｌから１．１１ｎｇ／ｕｌに減少し；このことは、ビーズ正規化によってＤＮＡ濃度が効果的に低下する可能性があることを示しており；試料の分布は、正規化の後で著しく減少した。
【０１３７】
例において、ＰＣＲ後にＩＴＳ遺伝子正規化に関連して磁気系正規化を実施することが可能であり：腸試料及び生殖器試料から抽出されたＤＮＡを鋳型として用いてＩＴＳ遺伝子を増幅し；ビーズ正規化の前後でＰＣＲ生成物を定量化したが；そのことは、例えば平均濃度が１０．２９ｎｇ／ｕｌから１．１９ｎｇ／ｕｌに減少したと共に、（例えば、各ドットが個別の反応物を表し、ボックスが中央値及び９５％信頼区間を示す、正規化の前後におけるＩＴＳ  ＰＣＲの濃度を比較するボックスプロットを含む図９に示されるように；など）正規化によってＤＮＡ濃度が減少し、さらに試料間の濃度も平衡したことを示し；試料の分布も正規化の後で著しく減少した。
【０１３８】
配列決定操作における正規化の効果の例において、等量のＩＴＳ  ＰＣＲを１つのライブラリ内に統合し、ｑＰＣＲによって定量し、配列決定装置内にロードし；図１０は、１試料当たりの総リード数と正規化の前後のＤＮＡ濃度に対する比較とを含むことが可能である（例えば、ある種の線は、正規化の前の各試料についての濃度（ｎｇ／ｕｌ  ＤＮＡ）を示し、ある種の線は、正規化の後の濃度を示し、棒は、各試料についての総リード数を示し、試料は、ＰＣＲのために用いられたＩＴＳプライマーによって順序づけられる；など）。
【０１３９】
微生物コミュニティ関連ライブラリ（例えば、メタゲノムライブラリなど）の正規化の例において、１：４０の比のビーズ：ＰＥＧ及び５ｕｌのＤＮＡを用いて、事前に正規化されていないビーズ正規化メタゲノムライブラリから系列希釈物を作製し（原液、１：２、１：４、１：１０、１：１００）；（例えば、磁気系正規化（例えば、ビーズ系正規化）による、又はよらない、希釈されたメタゲノムライブラリ（１：２、１：４、１：１０及び１：１００）の視覚化及び定量化を含む図１１に示されるように；など）ライブラリを定量し、分析し；結果は、開発されたメタゲノムライブラリ構築における磁気ビーズ系正規化プロセスを用いた濃度ライブラリの正規化を示す。前記例において、ビーズ系正規化試料を用いたメタゲノムｓｅｑ操作について、我々の新しいビーズ系方法が１試料（例えば、口腔試料、腸試料；など）当たりのリード数を正規化することができるのかを確かめる目的で配列決定操作によって正規化ライブラリ及び非正規化ライブラリを試験し；１：４０のビーズ：ＰＥＧ比を用いて試料を正規化し、統合し、Ｍｉｓｅｑ配列決定装置内にロードし；図１２は、１試料当たりの総リード数を含み、線は、配列決定された試料からのリード数の平均を示し；結果は、１試料当たりの平均が１５７．７２８．９のリード数の均質なリード数を示す（例えば、図１１〜図１２に示されるように）。
【０１４０】
４．その他
しかし、前記方法１００の実施形態は、対象からの生物学的試料の受け入れを容易にするように構成された任意の他の適切なブロック又は工程、対象からの生物学的試料の処理、生物学的試料から誘導されたデータを分析すること、対象の特異的マイクロバイオーム組成物及び／又は機能的特徴によるカスタマイズされた診断及び／又は生菌系治療法を提供するために使用され得るモデルを生成することを含むことができる。
【０１４１】
前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、本明細書に記載される前記方法１００及び／又はプロセスの実施形態の部分が、本明細書に記載される前記システム２００及び／又は他の実体の１又は複数の例、要素、成分及び／又は他の態様によって、及び／又は、を用いて、非同期（例えば、逐次的に）、並行して（例えば、同時に）又は任意の他の適切な順序で実施され得る、任意の変種（例えば、実施形態、変形例、例、具体例、図など）を含む各種システム成分及び各種方法プロセスのあらゆる組み合わせ及び順列を含むことができる。
【０１４２】
本明細書に記載される変種（例えば、実施形態、変形例、例、具体例、図など）のいずれか及び／又は本明細書に記載される変種のいずれかの部分を、追加的に又は代替的に、組み合わすことが可能であり、集約することが可能であり、除外することが可能であり、使用することが可能であり、連続的に実施することが可能であり、同時に実施することが可能であり、及び／又は、それ以外の場合、適用することが可能である。
【０１４３】
前記方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の部分を、コンピュータ可読命令を記憶するコンピュータ可読媒体を受け入れるように構成された機械として少なくとも部分的に実現すること及び／又は実装することが可能である。命令は、前記システムと統合され得るコンピュータ実行可能構成要素によって実行され得る。コンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＥＥＰＲＯＭ、光学デバイス（ＣＤ又はＤＶＤ）、ハードドライブ、フロッピードライブ又は任意の適切な装置などの任意の適切なコンピュータ可読媒体に記憶され得る。コンピュータ実行可能構成要素は、一般的又は用途特異的なプロセッサであることが可能であり、任意の適切な専用ハードウェア又はハードウェア／ファームウェア組み合わせデバイスは、代替的に又は追加的に命令を実行することができる。
【０１４４】
当業者は、上記で詳細に述べた記載から、並びに図及び請求項から認識する場合、請求項に定義される範囲を逸脱することなく、前記方法１００、システム２００及び／又は変種の実施形態に対する改変及び変更を為すことができる。
【図１】
2020535121.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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