(57)【要約】  水性環境中のレドックス反応においてＮ転移性酸化剤をチオエーテル基質と反応させて共役生成物を形成させることにより、化学選択的な共役がレドックス反応性を通じて達成される。実施形態では、メチオニンベースのタンパク質官能基化のためのレドックス活性化化学的タグ化（ＲｅＡＣＴ）戦略である。オキサジリジン（Ｏｘ）化合物は、メチオニンを対応するスルフィミド共役生成物に変換することにより、直接的な官能基化のための酸化剤媒介性の試薬として役立つ。【選択図】２Ａ
2020500186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学選択的な共役の方法であって、水性環境中でＮ転移性酸化剤をチオエーテル基質と反応させて共役生成物を形成させることを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｎ転移性酸化剤が反応性オキサジリジン基を含み、且つ、前記共役生成物が、結果として生成したスルフィミドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｎ転移性酸化剤が、式：
【化１】
2020500186.tif 000024
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、ヘテロ原子、及び置換されていてもよい、ヘテロであってもよい、環式であってもよいＣ１〜Ｃ１８のヒドロカルビルから独立して選択され、且つ追加の原子又は部分に共有結合的に又は非共有結合的に連結していてもよい。）を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が、指し示したＮに結合したカルボキシル基又はアミド基を含み、且つ、さらに反応してペイロード分子へのリンカーを形成することができる官能基をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１が−Ｃ（Ｏ）ＸＲ８であり、ＸがＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８が、Ｃ２〜６のアルキニル、Ｃ２〜６のアルキニルオキシ、もしくは−Ｎ３で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、又はＣ１〜Ｃ６のハロアルコキシであり、且つ、Ｒ３がフェニル又はヘテロアリールであり、フェニル又はヘテロアリールが、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、及びＣ１〜Ｃ６のハロアルコキシからなる群から独立して選択される１又は複数の置換基で置換されていてもよい、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１が−Ｃ（Ｏ）ＸＲ８であり、ＸがＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８が、Ｃ２〜６のアルキニル、Ｃ２〜６のアルキニルオキシ、又は−Ｎ３で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルであり、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、又はＣ１〜Ｃ６のハロアルキルであり、且つ、Ｒ３がフェニルである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記チオエーテル基質がメチオニンである、請求項１〜７の１つに記載の方法。
【請求項９】
前記メチオニンが、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質中の残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が、酵素、抗原タンパク質、ケモカイン、サイトカイン、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又は抗体もしくはその活性断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
水性環境中でメチオニンを含有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をオキサジリジンと接触させることを含み、前記オキサジリジンが、前記ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の少なくとも１つのメチオニンを対応するスルフィミド共役生成物に変換することにより、前記ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を直接的に機能化する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養中のアミノ酸を用いる安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）又は同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
式Ｉ：
【化２】
2020500186.tif 000025
（式中、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）ＸＲ８であり、ＸはＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８は、Ｃ２〜６のアルキニル、Ｃ２〜６のアルキニルオキシ、又は−Ｎ３で置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキルである。）の化合物。
【請求項１４】
式ＩＩＩａ：
【化３】
2020500186.tif 000026
（式中、Ｐは、メチオニンの硫黄とのスルフィミド結合を介して指し示した窒素に連結されたポリペプチド又はタンパク質を表し、前記ポリペプチド又はタンパク質は、ｎ個のスルフィミド修飾されたメチオニン残基を有し、ｎは１〜２０であり、且つ、ＸはＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８は、Ｃ２〜６のアルキニル、Ｃ２〜６のアルキニルオキシ、又は−Ｎ３で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルである。）の化合物。
【請求項１５】
式ＩＶａ：
【化４】
2020500186.tif 000027
（式中、Ｐは、メチオニンの硫黄とのスルフィミド結合を介して指し示した窒素に連結されたポリペプチド又はタンパク質を表し、前記ポリペプチド又はタンパク質は、ｎ個のスルフィミド修飾されたメチオニン残基を有し、ｎは１〜２０であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｌはリンカー部分であり、且つ、Ｒ９は活性部分である。）のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質コンジュゲート。
【請求項１６】
前記活性部分が、小分子製剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、糖、ポリペプチド、タンパク質、検出可能な標識、ポリ（アルキレン酸化物）部分、スルフヒドリル特異的機能性部分、アミン特異的機能性部分、非選択的反応性部分、又はアルギニン特異的機能性部分である、請求項１５に記載のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質コンジュゲート。
【請求項１７】
Ｐが、酵素、抗原タンパク質、ケモカイン、サイトカイン、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又は抗体もしくはその活性断片である、請求項１５又は１６に記載のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：ＳｈｉＸｉａｎ  Ｌｉｎ、ＸｉａｏＹｕ  Ｙａｎｇ、Ｆ．Ｄｅａｎ  Ｔｏｓｔｅ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｃｈａｎｇ、全員カリフォルニア州バークレー
出願人／譲受人：カリフォルニア大学理事会
優先権：米国特許出願第６２／４２１，８２５号；出願日：２０１６年１１月１４日
米国特許出願第６２／５８３，５１７号；出願日２０１７年１１月９日
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＧＭ１１８１９０及びＧＭ０７９４６５の下で政府の支援により為された。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
序論
硫黄は、その汎用的且つ独特の化学により、生物学において特権的な位置を占める１、２。実際、システイン及びメチオニンは、タンパク質を構成するただ２つの硫黄含有アミノ酸であるが、硫黄は、金属結合への触媒作用からレドックス調節及び他の翻訳後修飾に及ぶ多様な不可欠な役割を中心的に果たす３〜１０。この文脈において、システイン修飾に基づく選択的なタンパク質共役法は、タンパク質機能のプローブ９、１４〜１８から共有結合性小分子阻害剤１９〜２１及び抗体−薬物コンジュゲート２２の合成、そして機能的システインの同定１５、２３、２４及び阻害剤の開発２５のための活性及び反応性ベースのタンパク質プロファイリングまで、広範な基礎的及び応答上の進歩を可能とした１１〜１３。システイン生体共役戦略は、典型的に、チオール／チオレート側鎖の本来的に高い求核性を活用し、該戦略としては、マレイミド並びにハロゲン化アルキル及びアリールなどの求電子性弾頭に基づくエレガントな方法２６〜３０、遷移金属媒介性の生体共役３１及びシステイン・デヒドロアラニン変換２８、２９、３２、３３が挙げられる。
【０００３】
システイン生体共役に関してかなりの量の文献があることとは対照的に、メチオニン標識化のための同様の方法は、その探求について多数の切実な動機付けがあるにもかかわらず、開発が概して充分でない。実際、メチオニンは最も疎水性且つ希少なアミノ酸に含まれ、メチオニン残基の大部分はタンパク質コアの内部に埋もれているという事実１、２と一緒になって、表面で接近可能なメチオニンは限られており、そのようなメチオニンは、天然に存在するアミノ酸側鎖を使用して部位選択的なタンパク質修飾をするための潜在的に貴重なハンドルを与える。加えて、酸化及び／又は金属結合によるものなどのメチオニンの翻訳後修飾３、３４，３５は、細胞及び生物レベルで機能を制御する、シグナル伝達経路における不可欠な中枢として出現してきている。例えば、アクチン内の特定のメチオニン残基の可逆的酸化は、その組立て及び分解を制御して、ナビゲーションシグナルとして役立つことができ３６〜３８、またメチオニンスルホキシドレダクターゼの酸化防止機能は、寿命の調節に関連付けられている３９。加えて、メチオニンの酸化はまた、タンパク質内の芳香族残基との結合相互作用を増加させることもできることが最近の研究により示唆されている４０。
【０００４】
選択的なメチオニン修飾反応の開発における大きな化学的課題はその比較的弱い求核性であり、それが、システイン、リジン、チロシン、又はセリンなどのより強い求核性を持つ競合的なアミノ酸の存在下でその酸−塩基生体共役のための適切なメチオニン特異的求電子性パートナーを同定する伝統的なアプローチを不可能にしている２８、４１，４２。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
チオエーテル基質への化学選択的なレドックス共役のための方法及び組成物、並びに共役された基質を含む化合物及び組成物を提供することが本発明の目的である。本発明の方法をレドックス活性化化学的タグ化（Ｒｅｄｏｘ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔａｇｇｉｎｇ；ＲｅＡＣＴ）と称する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、１又は複数のチオエーテル部分を含む標的分子への化学選択的共役のための方法を提供する。これらの方法は、水性環境中のレドックス反応においてＮ転移性酸化剤をチオエーテル基質と反応させて共役生成物を形成させることを含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、Ｎ転移性酸化剤は、標的分子上の１又は複数のチオエーテル部分の少なくとも１つと反応する反応性オキサジリジン基を含み、且つ、共役生成物は、標的分子上の結果として生じたスルフィミドを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、Ｎ転移性酸化剤は、水性環境中で標的分子上のチオエーテル部分と反応する。好適なＮ転移性酸化剤は、Ｎ−ハロゲン化物結合、Ｎ−Ｏ結合、又はＮ−Ｓ結合を含み、好ましくは、オキサジリジン基を含む。好適な基質はチオエーテルを含む。好ましい実施形態では、酸化剤及びチオエーテルは、式Ｉ及び式ＩＩ：
【化１】
2020500186.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、ヘテロ原子、及び置換されていてもよい、ヘテロであってもよい、環式であってもよいＣ１〜Ｃ１８のヒドロカルビルから独立して選択され、且つ追加の原子又は部分に共有結合的に又は非共有結合的に連結していてもよい。）により表される。一部の実施形態では、Ｒ１は、指し示したＮに結合したカルボキシル基又はアミド基を含み、且つ官能基（例えば、クリック反応において反応できる官能基、例えば、以下に限定されないが、アジド基又はアルキン基）をさらに含み、該官能基は、さらに反応して、対応する官能基を含むペイロード分子（例えば、クリック反応において反応できる官能基、例えば、以下に限定されないが、アジド基又はアルキン基を含むように修飾されたペイロード分子）へのリンカーを形成することができる。一部の実施形態では、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）ＸＲ８であり、ＸはＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８は、Ｃ２〜６のアルキニル、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニルオキシ、又は−Ｎ３で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、又はＣ１〜Ｃ６のハロアルコキシであり、且つ、Ｒ３はフェニル又はヘテロアリールであり、フェニル又はヘテロアリールは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、及びＣ１〜Ｃ６のハロアルコキシからなる群から独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個、好ましくは、１個、２個又は３個）の置換基で置換されていてもよい。一部の実施形態では、式Ｉの化合物について、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）ＸＲ８であり、ＸはＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８は、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニルオキシ、又は−Ｎ３で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルであり、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、又はＣ１〜Ｃ６のハロアルキルであり、且つ、Ｒ３はフェニルである。式ＩＩの化合物の一部の実施形態では、Ｒ４はＣ１〜Ｃ６のアルキルであり、且つ、Ｒ５は置換されたＣ１〜Ｃ６のアルキルであり、それにより、Ｒ４−Ｓ−Ｒ５は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基であり、好ましくは、Ｒ４−Ｓ−Ｒ５は、タンパク質又はポリペプチドのメチオニン残基である。一部の実施形態では、Ｒ４−Ｓ−Ｒ５は、タンパク質又はポリペプチド標的分子のメチオニンチオエーテルを表す。そのようなタンパク質又はポリペプチドとしては、抗体又は抗体断片などの、治療用タンパク質又はポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、タンパク質又はポリペプチドは、式Ｉの化合物との反応においてこれもＮ転移性酸化剤と反応し得る１又は複数の追加のメチオニン残基を含む。一部の実施形態では、式ＩＩの化合物は、１又は複数のメチオニン残基を有するタンパク質又はポリペプチドであり、メチオニン残基の１又は複数は、Ｎ転移性酸化剤と反応する。一部の実施形態では、Ｒ４はメチルであり、且つ、Ｒ５は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨＲ６）Ｃ（Ｏ）Ｒ７であり、Ｒ６は−Ｈであり、又はＮＨＲ６はペプチド結合を形成し、且つ、Ｒ７は−ＯＨであり、又はＣ（Ｏ）Ｒ７はペプチド結合を形成し、但し、ＮＨＲ６及びＣ（Ｏ）Ｒ７の少なくとも１つは、ペプチド結合を形成する。
【００１０】
一部の実施形態では、式ＩＩの化合物は、式ＩＩａ：
【化２】
2020500186.tif 000004
【００１１】
（式中、ＮＨ−Ｒ６及びＣ（Ｏ）−Ｒ７は、タンパク質又はペプチド内のペプチド結合であり、又は、Ｒ６は−Ｈであり、且つ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ７は、タンパク質又はペプチド内のペプチド結合であり、又は、Ｒ７は−ＯＨであり、且つ、ＮＨＲ６は、タンパク質又はペプチド内のペプチド結合である。）の化合物である。
【００１２】
別の態様では、Ｒ１が官能基を含み、前記官能基がさらに反応して、活性部分などのペイロード分子へのリンカーを形成できる式Ｉの化合物が提供される。一部の実施形態では、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）ＸＲ８であり、ＸはＯ又はＮＨであり、且つ、Ｒ８は、Ｃ２〜６のアルキニル、Ｃ２〜６のアルキニルオキシ、又は−Ｎ３で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルであり、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、又はＣ１〜Ｃ６のハロアルコキシであり、且つ、Ｒ３はフェニル又はヘテロアリールであり、フェニル又はヘテロアリールは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、及びＣ１〜Ｃ６のハロアルコキシからなる群から独立して選択される１又は複数（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個、好ましくは、１個、２個又は３個）の置換基で置換されていてもよい。好ましい実施形態では、Ｒ２はＨであり、且つ、Ｒ３はフェニルである。一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、式Ｉａ：
【化３】
2020500186.tif 000005
【００１３】
（式中、Ｘ、Ｒ２、Ｒ３及びＲ８は、式Ｉの化合物について定義される通りである。）の化合物である。一部の実施形態では、ＸはＮＨである。
【００１４】
別の態様では、式ＩＩＩ：
【化４】
2020500186.tif 000006
【００１５】
（式中、Ｒ６及びＲ７は、式ＩＩの化合物について定義される通りであり、且つ、Ｘ及びＲ８は、式Ｉの化合物について定義される通りである。）の化合物が提供される。一部の実施形態では、ＸはＮＨである。
【００１６】
一部の実施形態では、式ＩＩＩの化合物は、式ＩＩＩａ：
【化５】
2020500186.tif 000007
【００１７】
（式中、Ｐは、メチオニンの硫黄とのスルフィミド結合を介して指し示した窒素に連結されたポリペプチド又はタンパク質を表し、ポリペプチド又はタンパク質は、ｎ個のスルフィミド修飾されたメチオニン残基を有し、ｎは、１又は複数、例えば、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１、２、３、４又は５であり、且つ、Ｘ及びＲ８は、式Ｉの化合物について定義される通りである。）の化合物である。一部の実施形態では、ＸはＮＨである。
【００１８】
別の態様では、標的分子コンジュゲートが提供され、標的分子コンジュゲートは、リンカーに結合した少なくとも１つのスルフィミド修飾されたメチオニン残基を含む標的分子を含み、前記リンカーは、ペイロード分子に結合している。一部の実施形態では、ペイロード分子は活性部分である。一部の実施形態では、標的分子はタンパク質又はポリペプチドであり、且つ、コンジュゲートは、式ＩＶ：
【化６】
2020500186.tif 000008
【００１９】
（式中、Ｒ６及びＲ７は式ＩＩにおいて定義される通りであり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｌはリンカー部分であり、且つ、Ｒ９はペイロード分子である。）のタンパク質又はポリペプチドコンジュゲートである。一部の実施形態では、ペイロード分子は活性部分である。一部の実施形態では、ＸはＮＨである。一部の実施形態では、Ｌは、式ＩＩＩの化合物（式ＩＩＩａの化合物など）及び好適に修飾されたペイロード分子のクリック反応の結果として生じるリンカーである。好適に修飾されたペイロード分子は、クリック反応において反応性の置換基を含有し、例えば、以下に限定されないが、アジド基又はアルキン基を含むように修飾されたペイロード分子である（例えば、図３を参照）。
【００２０】
一部の実施形態では、式ＩＶの化合物は、式ＩＶａ：
【化７】
2020500186.tif 000009
【００２１】
（式中、Ｐは、メチオニンの硫黄とのスルフィミド結合を介して指し示した窒素に連結されたポリペプチド又はタンパク質を表し、ポリペプチド又はタンパク質は、ｎ個のスルフィミド修飾されたメチオニン残基を有し、ｎは、１又は複数、例えば、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１、２、３、４又は５であり、ＸはＯ又はＮＨであり、且つ、Ｌ及びＲ９は、式ＩＶの化合物について定義される通りである。）の化合物である。一部の実施形態では、ＸはＮＨである。一部の実施形態では、Ｌは、式ＩＩＩの化合物（式ＩＩＩａの化合物など）及び好適に修飾されたペイロード分子のクリック反応の結果として生じるリンカーである。一部の実施形態では、Ｌは、トリアゾール又はイソオキサゾール環連結基を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、式ＩＶの化合物は、式ＩＶｂ：
【化８】
2020500186.tif 000010
【００２３】
（式中、Ｐは、Ｐ＝Ｌ１がＰのメチオニン残基とリンカーＬ１との間のスルフィミド結合となるように修飾されたポリペプチド又はタンパク質を表し、ポリペプチド又はタンパク質は、ｎ個のスルフィミド修飾されたメチオニン残基を有し、ｎは、１又は複数、例えば、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１、２、３、４又は５であり、且つ、各Ｌ１は、Ｐ内のメチオニンの硫黄へのスルフィミド結合における＝Ｎ−を含むリンカー部分であり、且つ、Ｒ９は、式ＩＶの化合物について定義される通りである。）の化合物である。一部の実施形態では、Ｌ１は、トリアゾール又はイソオキサゾール環連結基を含む。一部の実施形態では、Ｐは、ポリペプチド又はタンパク質、例えば、酵素、抗原タンパク質、ケモカイン、サイトカイン、細胞受容体、細胞受容体のリガンド、又は抗体もしくはその活性断片である。一部の実施形態では、抗体又はその活性断片は、１又は複数の接近可能なメチオニン残基を導入することによる野生型抗体の修飾を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、メチオニンベースの基質の官能基化のためのレドックス活性化化学的タグ化（ＲｅＡＣＴ）法を提供し、該方法は、水性環境中でメチオニンを含有する基質をオキサジリジンと接触させることを含み、オキサジリジンは、基質のメチオニンを対応するスルフィミド共役生成物に変換することにより、基質を直接的に官能基化する。一部の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物（式Ｉａの化合物など）を式ＩＩの化合物（式ＩＩａの化合物など）と反応させて式ＩＩＩの化合物（式ＩＩＩａの化合物など）を形成させることを提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗体又はその活性断片などのタンパク質を式Ｉの化合物（式Ｉａの化合物など）と反応させて式ＩＩＩの化合物（式ＩＩＩａの化合物など）を提供させることを提供する。一部の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩの化合物（式ＩＩＩａの化合物など）を反応させて式ＩＶの化合物（式ＩＶａ又は式ＩＶｂの化合物など）を形成させることをさらに提供する。一部の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩａの化合物を反応させて式ＩＶａ又は式ＩＶｂの化合物の化合物を形成させることをさらに提供し、好ましくは、Ｐは抗体又はその活性断片である。
【００２５】
一部の実施形態では、基質はタンパク質であり、且つ、方法は、タンパク質の修飾を結果としてもたらし、抗体−薬物コンジュゲート並びに関連する生物学的治療剤及びイメージング剤の合成及び特徴付け、ケモプロテオミクス及び阻害剤の設計の他に、タンパク質機能、例えば、溶解性、安定性、及び代謝並びに薬物動態を研究し且つ改良するための修飾において応用を有する。
【００２６】
主題とする方法及びＲｅＡＣＴ法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び質量分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチオニン機能の定量的プロテオミクス解析のために、細胞培養中のアミノ酸を用いる安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）又は同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）と組み合わせることができ、その応用としては、メチオニン反応性の定量的解析、酸化感受性メチオニンの定量的解析、ストレス感受性メチオニンの定量的解析及びメチオニンスルホキシドレダクターゼ基質の定量的解析が挙げられるがこれらに限定されない。別の態様では、本発明は、レドックス活性化化学的タグ化（ＲｅＡＣＴ）法において使用するために適した化合物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物（式Ｉａの化合物など）、式ＩＩの化合物（式ＩＩａの化合物など）、又は式ＩＩＩの化合物（式ＩＩｉａの化合物など）を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、式ＩＶの構造（式ＩＶａ又は式ＩＶｂの構造など）を有するポリペプチド又はタンパク質コンジュゲートを提供し、Ｐは、ポリペプチド又はタンパク質、例えば、酵素、抗原タンパク質、ケモカイン、サイトカイン、細胞受容体、又は抗体もしくはその活性断片である。
【００２８】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態の全ての組合せを、各組合せが逐一記載されたかのように包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】化学選択的なメチオニンの生体共役のためのＲｅＡＣＴ戦略。左パネル：システインベースのタンパク質官能基化のための酸−塩基共役戦略；右パネル：メチオニンベースのタンパク質官能基化のためのレドックス活性化化学的タグ化（ＲｅＡＣＴ）戦略。
【図１Ｂ】化学選択的なメチオニンの生体共役のためのＲｅＡＣＴ戦略。共溶媒中でのＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンメチルエステル（Ｓ１）及び基質としての様々なオキサジリジン化合物によるモデルレドックス共役反応。
【図１Ｃ】化学選択的なメチオニンの生体共役のためのＲｅＡＣＴ戦略。Ｍｅｔ、Ｌｙｓ及びＣｙｓでの独特のレドックス共役保有ペプチドの数。
【図１Ｄ】化学選択的なメチオニンの生体共役のためのＲｅＡＣＴ戦略。共役反応の収率。
【図２Ａ】タンパク質官能基化のためのＲｅＡＣＴ戦略。ＲｅＡＣＴとクリック反応との組合せのメチオニン特異的タンパク質官能基化のための一般的な２ステップ手順。
【図２Ｂ】タンパク質官能基化のためのＲｅＡＣＴ戦略。様々なオキサジリジン（Ｏｘ）化合物とのＣａＭモデルタンパク質のレドックス共役。
【図３】クリック反応を使用する様々なペイロードとのＲｅＡＣＴ標識カルモジュリンタンパク質の官能基化。クリック化学を使用する共役のために好適な反応性基を含むデスチオビオチン、Ｃｙ３及びＰＥＧペイロード。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
反対に指し示すか又は別段の注記がなければ、これらの説明において及び本明細書を通じて、「ａ」及び「ａｎ」という用語は１又は複数を意味し、「又は」という用語は及び／又はを意味し、ポリヌクレオチド配列は反対鎖の他に本明細書に記載される代替的な骨格を包含するものと理解される。
【００３１】
本明細書に記載される例及び実施形態は例示のみを目的とすること、及びそれを考慮して様々な改良又は変更が当業者に示唆され、且つ本出願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に包含される。本明細書中の参照文献などの、本明細書において参照される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照することによりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【００３２】
メチオニン選択的ライゲーション反応は、その本来的に弱い求核性により依然として理解されていない。本明細書において我々は、広範な生体適合性の反応条件下で高度に選択的な、迅速な、及びロバストなメチオニン標識化を達成するための、オキサジリジンベースの試薬を使用する、レドックス反応性を通じた化学選択的なメチオニンの生体共役のための戦略を開示する。治療的抗体などのタンパク質へのペイロードの精密な付加、抗体−薬物コンジュゲートの合成、及び全プロテオームにおける反応性亢進のメチオニン残基の同定を可能とするこの共役方法の広範な有用性を我々は強調する。
【００３３】
本発明は、以下のものなどの多くの商業的応用を提供する：
１．メチオニンの生体共役に基づく治療用タンパク質の官能基化、例えば、治療用タンパク質のＰＥＧ化、抗体−薬物コンジュゲート、イメージング及び診断のためのタンパク質標識化の他に、他のタンパク質翻訳後修飾。
【００３４】
２．メチオニンの生体共役に基づく治療用ポリペプチドの官能基化、例えば、ポリペプチドのＰＥＧ化、ポリペプチド−薬物コンジュゲート及び他のポリペプチド翻訳後修飾。
【００３５】
３．タンパク質機能の活性化及び／又は阻害のためのメチオニンの生体共役に基づく治療的介入。
【００３６】
４．オキサジリジン化合物を使用するチオエーテル生体共役に基づく生体分子の官能基化、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質及び糖の生体共役。
【００３７】
本発明は、システイン、リジン、及びセリンなどのより求核性のアミノ酸の修飾のための酸−塩基共役法の利益を補完する化学選択的メチオニン共役の独特且つ一般的なレドックスベースのアプローチを提供する。本発明の３つの主な有用性の趣旨を以下の通りに列挙する：
１．本発明の１つの有用性は、天然の又は化学修飾もしくは標準的な部位特異的変異生成により容易に導入される天然に存在するメチオニン残基を使用する、タンパク質及びポリペプチド、例えば、抗体及びそれらの断片の他に、他の治療用タンパク質の官能基化を提供することである。この手順は単純且つ直接的であり、全てのタンパク質又はポリペプチドに応用することができ、それにより例えば、ポリ（アルキル酸化物）（例えば、「ＰＥＧ」）部分、フルオロフォア及び他のペイロードもしくはトレーサーを取り付けるため、又は２つのポリペプチドを共役させて一緒にする（例えば、抗体／タンパク質コンジュゲート）ために使用できる化学的ハンドルを提供することができる。
【００３８】
２．より概括的に言えば、本発明は、チオエーテル官能基の導入による、他の生体分子、例えば、以下に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質及び糖への、上記したような様々なペイロードの取付けを提供する。この方法は、単純且つ直接的な手順で任意のチオエーテル含有生体分子の官能基化を可能とする。
【００３９】
３．最後に、Ｎ転移性酸化剤としてのオキサジリジンの選択性は、全プロテオームにおける機能的メチオニン、及び鍵となる残基としてメチオニンを使用して機能タンパク質を同定し且つ研究するための化学的プラットフォームを与え、反応性メチオニンの活性化及び／又は阻害に基づく治療的介入のための手段を提供する。
【００４０】
本発明は、システイン、リジン及びチロシンなどの他の天然に存在するアミノ酸に基づく生体共役方法と比較していくつもの利益を提供することができる。
【００４１】
１．本発明は、タンパク質を標識するために求電子剤を使用することなくレドックスベースの反応性を使用して広範な生体適合性の反応条件下で実行可能な高度に選択的な、迅速な、及びロバストなメチオニン標識化の方法論を提供し、したがって選択性の問題、及びタンパク質薬物における標識化の非一貫性を回避する。
【００４２】
２．高度に類似の配列相同性を示す抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）などの、表面で接近可能な形態のメチオニンの相対的な希少性は、本発明の方法論を使用した時に、一連の治療用タンパク質のバックグラウンドのタンパク質官能基化を大きく低減させる。
【００４３】
３．本発明は、よく定義された位置での、及びオキサジリジン基のチオエーテルとの極めて高い反応性により優れたペイロード−標的分子の共役効率での、タンパク質への様々なペイロードの取付けを可能とすることができる。ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質官能基化は、中性ｐＨ及び生体適合性の条件下で２０分以内に完了することができる。我々の方法の反応速度は、伝統的なタンパク質修飾方法よりもはるかに速い。これは、著しく単純化されたタンパク質官能基化手順を提供する。
【００４４】
４．オキサジリジン共役化学の選択性は、全プロテオームにおける機能的メチオニンの同定及び研究のためのプラットフォームの他に、反応性メチオニンの活性化及び／又は阻害に基づく治療的介入の出発点を提供する。本発明は、新たな薬物設計及び創薬のための新規のタンパク質薬物設計方法を提供する。
【００４５】
５．本明細書に記載される生体共役連結は、１００％のＦＢＳの存在下で少なくとも１４日間安定であり、ｉｎ  ｖｉｖｏの応用のために有益である。タンパク質官能基化は細胞外環境においても安定である。より重要なことに、細胞内などにおいて見られる強いチオール還元条件下で、連結を切断して、取り付けた活性部分（例えば、治療剤）を細胞内に放出させることができる。
【００４６】
本発明はまた、非天然のアミノ酸ベースの生体共役方法に対する大きな利点を提供し得る。本方法は、そのような非天然のアミノ酸を通じてタンパク質中に非天然の機能を持つように操作することなく、指向したメチオニン残基において目的のタンパク質の直接的な官能基化を可能とする。
【００４７】
化学
ヒドロカルビル基は、１〜１５個の炭素原子を含み、その炭素骨格中に１又は複数のヘテロ原子を含んでもよい、置換又は非置換の、直鎖の、分岐した又は環状のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アシル基、アリール基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、アルキルアリール基、アルケニルアリール基又はアルキニルアリール基である。
【００４８】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という用語は、一般に、炭素又は水素以外の任意の原子を意味する。好ましいヘテロ原子としては、酸素（Ｏ）、リン（Ｐ）、硫黄（Ｓ）、窒素（Ｎ）、及びハロゲンが挙げられ、好ましいヘテロ原子の官能基は、ハロホルミル、ヒドロキシル、アルデヒド、アミン、アゾ、カルボキシル、シアニル、トシアニル、カルボニル、ハロ、ヒドロペルオキシル、イミン、アルジミン、イソシアニド、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、ニトライト、ニトロ、ニトロソ、ホスフェート、ホスホノ、スルフィド、スルホニル、スルホ、及びスルフヒドリルである。
【００４９】
「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、別段の言及がなければ、指定された数の炭素原子（すなわち、Ｃｉ＿８は１〜８個の炭素を意味する）を有する、完全に飽和した、直鎖、分岐鎖、もしくは環状の炭化水素ラジカル、又はこれらの組合せを意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどのホモログ及び異性体が挙げられる。
【００５０】
「アルケニル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、指定された数の炭素原子（すなわち、Ｃ２〜８は２〜８個の炭素を意味する）及び１又は複数の二重結合を有する、一又はポリ不飽和であってもよい、直鎖、分岐鎖、もしくは環状の炭化水素ラジカル、又はこれらの組合せを意味する。アルケニル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）並びにこれらのより高級のホモログ及び異性体が挙げられる。
【００５１】
「アルキニル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、指定された数の炭素原子（すなわち、Ｃ２〜８は２〜８個の炭素を意味する）及び１又は複数の三重結合を有する、一又はポリ不飽和であってもよい、直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素ラジカル、又はこれらの組合せを意味する。アルキニル基の例としては、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル並びにこれらのより高級のホモログ及び異性体が挙げられる。
【００５２】
「アルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−に例示されるような、アルキルに由来する二価のラジカルを意味する。典型的に、アルキル（又はアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０又はそれより少ない炭素原子を有する基が本発明において好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、より短鎖のアルキル基又はアルキレン基であり、一般に、８又はそれより少ない炭素原子を有する。
【００５３】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルキル）という用語は、それらの慣用の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して分子の残りの部分に結合したアルキル基を指す。同様に、例えば、「ハロアルコキシ」は、酸素原子を介して分子の残りの部分に結合したハロアルキル基を指す。
【００５４】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の用語と組み合わせて、別段の言及がなければ、記載した数の炭素原子並びにＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子からなる、安定な直鎖、分岐鎖、もしくは環状の炭化水素ラジカル、又はこれらの組合せを意味し、窒素原子、硫黄原子、及びリン原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。（１又は複数の）ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ及びＳは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置にあってよい。ヘテロ原子Ｓｉは、アルキル基が分子の残りの部分に結合した位置などの、ヘテロアルキル基の任意の位置にあってよい。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２，−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、最大２個のヘテロ原子が連続してもよい。
【００５５】
同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−に例示されるような、ヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖の末端のいずれか又は両方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらにはまた、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基について、連結基の方向性は含意されない。
【００５６】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自体で又は他の用語と組み合わせて、別段の言及がなければ、環状型のそれぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」を表す。したがって、シクロアルキル基は、指定された数の炭素原子を有し（すなわち、Ｃ３〜８は３〜８個の炭素を意味する）、１個又は２個の二重結合も有してよい。ヘテロシクロアルキル基は、指定された数の炭素原子並びにＯ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子からなり、窒素及び硫黄原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。さらに、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、複素環が分子の残りの部分に結合した位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００５７】
「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、それら自体で又は別の置換基の一部として、別段の言及がなければ、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、１〜（２ｍ’＋１）個（ｍ’は、アルキル基中の炭素原子の総数である。）に及ぶ数の、同じであってもよいし、異なっていてもよいハロゲン原子で置換されたアルキルを含むことが意図される。例えば、「Ｃ１〜Ｃ４のハロアルキル」という用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことが意図される。したがって、「ハロアルキル」という用語は、モノハロアルキル（１個のハロゲン原子で置換されたアルキル）及びポリハロアルキル（２〜（２ｍ’＋１）個のハロゲン原子（ｍ’は、アルキル基中の炭素原子の総数である。）に及ぶ数のハロゲン原子で置換されたアルキル）を含む。「ペルハロアルキル」という用語は、別段の言及がなければ、（２ｍ’＋１）個のハロゲン原子（ｍ’は、アルキル基中の炭素原子の総数である。）で置換されたアルキルを意味する。例えば、「Ｃ１〜４のペルハロアルキル」という用語は、トリフルオロメチル、ペンタクロロエチル、１，１，１−トリフルオロ−２−ブロモ−２−クロロエチルなどを含むことが意図される。
【００５８】
「アシル」という用語は、酸のヒドロキシ部分を除去することによる有機酸に由来する基を指す。したがって、アシルは、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、デカノイル、ピバロイル、ベンゾイルなどを含むことが意図される。
【００５９】
「アリール」という用語は、別段の言及がなければ、ポリ不飽和の、典型的に芳香族の、炭化水素の置換基であって、単環又は縮合もしくは共有結合的に連結した多環（最大で３環）であってもよいものを意味する。アリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル及び１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンが挙げられる。
【００６０】
「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される０〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（又は環）を指し、窒素及び硫黄原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通じて分子の残りの部分に結合していてもよい。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが挙げられる。
【００６１】
簡潔性のために、「アリール」という用語は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用された時に、上記に定義されるアリール環及びヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子により置換されたアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）などの、アリール基がアルキル基に結合したラジカル（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことが意図される。
【００６２】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）のそれぞれは、指し示したラジカルの置換及び非置換の両方の形態を含むことが意図される。各種類のラジカルの好ましい置換基を以下に提供する。
【００６３】
アルキル及びヘテロアルキルラジカル（並びにアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと称される基）の置換基は、０〜３個に及ぶ数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ、ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、−ＮＲ’−ＳＯ２ＮＲ’’’、−ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される様々な基であってよく、０、１又は２個の置換基を有する基が特に好ましい。Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、それぞれ独立して、水素、非置換のＣ１〜Ｃ８のアルキル及びヘテロアルキル、非置換のアリール、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、非置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、又はアリール−Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基を指す。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と組み合わさって５、６又は７員の環を形成してもよい。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことが意図される。典型的に、アルキル基又はヘテロアルキル基は０〜３個の置換基を有し、２又はそれより少ない置換基を有する基が本発明において好ましい。より好ましくは、アルキル又はヘテロアルキルラジカルは、非置換又は一置換されたである。最も好ましくは、アルキル又はヘテロアルキルラジカルは、非置換である。置換基の上記議論から、「アルキル」という用語はトリハロアルキル（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）などの基を含むことが意図されることを当業者は理解するであろう。
【００６４】
アルキル及びヘテロアルキルラジカルの好ましい置換基は、−ＯＲ’、＝Ｏ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’−ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ２Ｒ’、−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−ＣＮ及び−ＮＯ２（Ｒ’及びＲ’’は上記に定義される通りである。）から選択される。さらなる好ましい置換基は、−ＯＲ、＝Ｏ、−ＮＲ’Ｒ’’、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’−ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される。
【００６５】
同様に、アリール基及びヘテロアリール基の置換基は様々であり、０個から芳香環系の開放原子価の総数までに及ぶ数の、ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、−ＮＲ’−ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、Ｃ１〜Ｃ４のペルフルオロアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のペルフルオロアルキル（Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、水素、Ｃ１〜Ｃ８のアルキル及びヘテロアルキル、非置換のアリール及びヘテロアリール、（非置換のアリール）−Ｃ１〜Ｃ４のアルキル及び（非置換のアリール）オキシ−Ｃ１〜Ｃ4のアルキルから独立して選択される）から選択される。アリール基が１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンである場合、それは置換又は非置換のＣ３〜７のスピロシクロアルキル基で置換されていてもよい。Ｃ３〜７のスピロシクロアルキル基は、「シクロアルキル」について本明細書で定義されるものと同じ様式で置換されていてもよい。典型的に、アリール基又はヘテロアリール基は０〜３個の置換基を有し、２又はそれより少ない置換基を有する基が本発明において好ましい。本発明の一実施形態では、アリール基又はヘテロアリール基は、非置換又は一置換である。別の実施形態では、アリール基又はヘテロアリール基は、非置換である。
【００６６】
アリール基及びヘテロアリール基の好ましい置換基は、ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、Ｃ１〜Ｃ４のペルフルオロアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のペルフルオロアルキル（Ｒ’及びＲ’’は上記に定義される通りである。）から選択される。さらなる好ましい置換基は、ハロゲン、−ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、Ｃ１〜Ｃ４のペルフルオロアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のペルフルオロアルキルから選択される。
【００６７】
本明細書で使用される場合、置換基−Ｃ０２Ｈは、したがって、生物学的等価性置換を含む。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｃ．Ｇ．，Ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；ｐ．２０３を参照。
【００６８】
アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−（式中、Ｔ及びＵは、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−又は単結合であり、ｑは０〜２の整数である。）の置換基で置換されていてもよい。あるいは、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、Ａ及びＢは、独立して、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−又は単結合であり、ｒは１〜３の整数である。）の置換基で置換されていてもよい。そのように形成された新たな環の単結合の１つは、二重結合で置換されていてもよい。あるいは、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式−（ＣＨ２）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔ−（式中、ｓ及びｔは、独立して、０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、又は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。）の置換基で置換されていてもよい。−ＮＲ’−及び−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−における置換基Ｒ’は、水素又は非置換のＣ１〜Ｃ６のアルキルから選択される。
【００６９】
好ましい置換基は本明細書に開示され、表に例示され、構造、実施例、及び特許請求の範囲は、本発明の異なる化合物にわたって適用されてよく、すなわち、任意の所与の化合物の置換基は、他の化合物と組み合わせて使用されてよい。
【００７０】
具体的な実施形態では、適用可能な置換基は、独立して、置換もしくは非置換のヘテロ原子、置換もしくは非置換の、ヘテロ原子でもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル、置換もしくは非置換の、ヘテロ原子があってもよいＣ２〜６のアルケニル、置換もしくは非置換の、ヘテロ原子があってもよいＣ２〜６のアルキニル、又は置換もしくは非置換の、ヘテロ原子があってもよいＣ６〜１４のアリールであり、各ヘテロ原子は、独立して、酸素、リン、硫黄又は窒素である。
【００７１】
より具体的な実施形態では、適用可能な置換基は、独立して、アルデヒド、アルジミン、アルカノイルオキシ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキルオキシ、アルキル、アミン、アゾ、ハロゲン、カルバモイル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシル、シアニル、エステル、ハロ、ハロホルミル、ヒドロペルオキシル、ヒドロキシル、イミン、イソシアニド、イソシアネート、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ニトレート、ニトリル、ニトライト、ニトロ、ニトロソ、ホスフェート、ホスホノ、スルフィド、スルホニル、スルホ、スルフヒドリル、チオール、チオシアニル、トリフルオロメチル又はトリフルオロメチルエーテル（ＯＣＦ３）である。
【００７２】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結した少なくとも２つのアミノ酸を指す。「ポリペプチド」は、ペプチド結合により互いに接続された（５０未満の）アミノ酸の短鎖配列を指す。ペプチド又はポリペプチドは、遊離して存在してもよいし、又は別の部分、例えば、高分子、脂質、オリゴ糖もしくは多糖、及び／もしくはポリペプチドに結合していてもよい。ペプチドがポリペプチド鎖に組み込まれている場合であっても、アミノ酸の短鎖配列を具体的に指すために「ペプチド」という用語が使用されることがある。ペプチド又はポリペプチドは、ペプチド結合又は何らかの他の種類の連結により別の部分に接続することができる。ポリペプチドは、２アミノ酸より長く、一般に約２５アミノ酸未満の長さである。「ペプチド」及び「オリゴペプチド」という用語は、交換可能に使用されることがある。
【００７３】
「タンパク質」は、一般に、５０アミノ酸より長いポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を指す。タンパク質はまた、ポリペプチドの三次元構造を指すこともある。「変性タンパク質」は、一部の残留の三次元構造を有する部分的に変性したポリペプチド、又は本質的にランダムな三次元構造、すなわち完全に変成したものを指す。本発明は、ポリペプチドのバリアント、例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ジスルフィド結合形成、脱アミド、異性化、シグナル又はリーダー配列のプロセシングにおける開裂点、共有結合及び非共有結合的に結合した補因子、酸化されたバリアントなどが関与する試薬、又は該バリアントを使用する方法を包含する。ジスルフィド連結タンパク質の形成が記載されている（例えば、Ｗｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｔａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３を参照）。
【００７４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原又はエピトープに特異的に結合することができる、（１又は複数の）免疫グロブリン遺伝子又はその断片に由来する、それに倣って作られた又は実質的にそれによってコードされるペプチド又はポリペプチドを指す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｗｉｌｓｏｎ（１９９４；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：２６７−２７３；Ｙａｒｍｕｓｈ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：８５−９７を参照。抗体という用語は、抗原結合部分、すなわち、抗原に結合する能力を保持した「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含み、該部分としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。単鎖抗体もまた、参照することにより「抗体」という用語に含まれる。
【００７５】
本明細書で使用される「サイトカイン」という用語」は、細胞の機能に影響し、免疫、炎症又は造血応答において細胞間の相互作用をモジュレートする分子である、任意の分泌されるポリペプチドを意味する。サイトカインとしては、いずれの細胞がそれらを産生するかにかかわらず、モノカイン及びリンホカインが挙げられるがこれらに限定されない。サイトカインの例としては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−ａ）及び腫瘍壊死因子−ベータ（ＴＮＦ−ｂ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される「受容体」という用語は、典型的に、コグネイトリガンドに結合し、細胞、通常は１又は複数の種類の細胞膜に結合し、又は由来し、且つその主な生物学的機能として特定のリガンド又はリガンドの基に結合する能力を有し、リガンドの結合により直接的又は間接的に細胞中にシグナル伝達を媒介する、主にタンパク質から構成される分子を指す。１つの種類の受容体は、３つの部分又はドメイン、すなわち、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、及び膜貫通ドメインを有する。加えて、受容体は、典型的に、受容体を適切な膜に標的化するために役立つ約５〜２５アミノ酸の配列をそのアミノ末端に有する。これらのドメインは、受容体ごとに大きさ及び機能が様々である。典型的に、細胞外ドメインは１又は複数のリガンドに結合し、膜貫通ドメインは受容体を膜に固着させ、細胞内ドメインは、リガンドの結合を感知してシグナルを細胞の内部（細胞内環境）に伝達する。
【００７７】
本明細書で使用される「ケモカイン」という用語は、少なくとも１７の異なる受容体と相互作用する５０を超えるリガンドを含む、４つの異なる構造ファミリーの１つのメンバーを指す。これらのケモカインファミリーは、保存されたシステイン含有モチーフの構造にしたがって名付けられており、タンパク質のアミノ末端におけるＣ、ＣＣ、ＣＸＣ、又はＣ’Ｃのいずれかの存在により定義される。例えば、式ＩＩの化合物（式ＩＩａの化合物など）の記載において使用されるような、「アミノ酸ペプチド」という用語は、タンパク質又はポリペプチド内の結合であって、基質を含有するチオエーテルがアミノ酸ペプチドを含み、例えば、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸残基の一部であり、好ましい実施形態では、チオエーテルがポリペプチド又はタンパク質のメチオニン残基内にあるものを指す。そのため、基質Ｒ４−Ｓ−Ｒ５は、例えば、Ｒ４及びＲ５がアルキル基であり、且つＲ５のアルキル基が１つの炭素においてポリペプチド又はタンパク質内の−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ基及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’基（例えば、Ｒは追加のペプチド鎖又はカルボキシル末端ＯＨであり、Ｒ’は追加のペプチド鎖又はアミノ末端Ｈである。）の両方で置換されているチオエーテルを表す。そのため、例えばアミノ酸ペプチドで置換されているＲ５のアルキル基は、
【化９】
2020500186.tif 000011
【００７８】
として表すことができ、又は基質Ｒ４−Ｓ−Ｒ５がタンパク質又はポリペプチド内のメチオニン残基を表す好ましい実施形態では、
【化１０】
2020500186.tif 000012
【００７９】
として表すことができる。
【００８０】
基質は、追加の修飾を有するポリペプチド又はタンパク質を含んでよく、又は本明細書に記載される発明の方法により反応させることができる追加のメチオニン残基を有していてもよいことも理解される。
【００８１】
「活性部分」は、本発明において説明される通りのペイロード分子であって、例えばタンパク質又はポリペプチドに共役した前記部分は、何らかの活性を提供する。該部分の活性としては、生物学的活性（例えば、薬学活性部分、例えば、小分子製剤又は生体分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質又は糖）、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア、イメージング標識など）、特性修飾部分（例えば、ＰＥＧ化部分）、スルフヒドリル特異的機能性部分、例えば、マレイミド、ハロゲン化アルキルもしくはアリール、α−ハロアシル、又はピリジルジスルフィド、アミン特異的機能性部分、例えばカルボジイミド、非選択的反応性部分、例えば、光親和性基、アルギニン特異的機能性部分、例えばグリオキサールなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
「クリック化学」又は「クリック反応」という用語は、共役の周知の選択的な方法であって、クリック反応性官能基を含む２つの成分を反応させて２つの成分を連結させることを指す。例えば、本明細書に記載されるスルフィミド修飾されたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質について、修飾された基は第１のクリック反応性官能基をさらに含み、ペイロード分子は、好適には、第１のクリック反応性官能基と反応性の第２のクリック反応性官能基を含むように修飾される。クリック反応性官能基としては、アジド基、ニトロン基又はアルキン基が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、クリック化学は、アジド基をアルキン基と反応させて２つの成分を連結するトリアゾール基を形成させること、又はニトロン基をアルキン基と反応させて２つの成分を連結するイソキサゾリン基を形成させることを含む。一部の実施形態では、アルキン基は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基又はジフルオロオクチン（ＤＩＦＯ）基である。一部の実施形態では、クリック化学は、銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）又は歪み促進型アルキン−ニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ）である。Ｊｅｗｅｔｔ，Ｊｏｈｎ  Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃａｒｏｌｙｎ，Ｒ．，Ｃｕ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ．３９（４），１２７２−１２７９（２０１０）；Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ａｚｉｄｅｓ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１（１０），６４４−６４８（２００６）；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｎｉｔｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  ａｌｋｙｎｅｓ−ｒａｐｉｄ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，８１−８８（２０１４）（これらの開示は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）も参照。
【００８３】
実施例；設計：
基質変換及び所望のＮ転移生成物（ＮＴＰ、スルフィミド）と所望しないＯ転移生成物（ＯＴＰ、スルホキシド）との間の反応選択性の１Ｈ  ＮＭＲ解析を使用して、１：１のｄ−ＭｅＯＤ／Ｄ２Ｏ溶媒中、モデル基質としてメチオニン誘導体Ｓ１を用いる様々な硫黄イミド化反応をスクリーニングした（図１Ｂ）。硫黄イミド化試薬としてオキサジリジン１（Ｏｘ１）を使用するメチオニンの歪み推進型硫黄イミド化は、追加の触媒なしで２．５分以内に、５：１のＮＴＰ：ＯＴＰ比でＳ１の９５％の変換を与えた（図１Ｂ）。これを出発点として、カルバメートから尿素にプローブの連結を変化させたところ（Ｏｘ２）、同等の変換と共に増進された選択性（ＮＴＰ：ＯＴＰ＝１２：１）が結果としてもたらされ、電子求引性ＣＦ３基（Ｏｘ３）によるＯｘ２のベンジル水素のさらなる置換は、はるかに低い選択性（ＮＴＰ：ＯＴＰ＝２：１）及び反応変換（５８％）を結果としてもたらした。興味深いことに、溶媒中の水のパーセンテージを０％から９５％に増加させることにより、６：１から１８：１へのＮＴＰ：ＯＴＰ選択性の顕著な向上が観察され（図１Ｂ）、生物学的環境におけるこのライゲーション反応の有用性を予感させた。
【００８４】
他の生物学的に関連するアミノ酸競合物とのオキサジリジンプローブの反応性を評価した。全ての場合に、試験した他のアミノ酸のいずれとも共役生成物は観察されず、メチオニンのみがＲｅＡＣＴ試薬とのライゲート生成物を与える。メチオニン共役についてのＲｅＡＣＴの高い選択性のさらなる実証として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して全プロテオーム内のプローブ標識化の部位を同定した。ＨｅＬａ細胞溶解液をＯｘ４で処理し、トリプシン消化した後、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍプログラム４３を使用して全ての求核性アミノ酸でのプローブ修飾についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。２３５のメチオニン残基及び単一のリジン残基の標識化が見出され、システイン側鎖又は他の求核性アミノ酸において他の修飾は検出されなかった（図１Ｃ）。これらの実験は、穏やかな生体適合性の条件下でのＲｅＡＣＴ戦略の迅速な反応速度の他に、単一のタンパク質から全プロテオームレベルまでのメチオニン残基についての完璧に近い選択性を実証する。最後に、スルフィミドメチオニン共役生成物の化学的安定性を試験したところ、この連結は、酸性及び塩基性条件、温度上昇の他に、トリス（２−カルボキシエチル）ホフィン（ｐｈｏｐｈｉｎｅ）（ＴＣＥＰ）などの強いタンパク質ジスルフィド還元剤での処理に耐性であることが発見された。
【００８５】
図１Ａ左パネル：システインベースのタンパク質官能基化のための酸−塩基共役戦略；右パネル：メチオニンベースのタンパク質官能基化のためのレドックス活性化化学的タグ化（ＲｅＡＣＴ）戦略。オキサジリジン（Ｏｘ）化合物は、メチオニンを対応するスルフィミド共役生成物に変換することにより、直接的な官能基化のための酸化剤媒介性の試薬として役立つ。（Ｂ）共溶媒中での２５μＭのＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンメチルエステル（Ｓ１）及び基質としての２７．５μＭの様々なオキサジリジン化合物によるモデルレドックス共役反応。（Ｃ）１ｍＭの最終濃度のＯｘ４でＨｅＬａ細胞溶解液を１０分間標識することによる、代表的なアミノ酸、すなわちＭｅｔ、Ｌｙｓ及びＣｙｓでの独特のレドックス共役保有ペプチドの数。（Ｄ）共役反応の収率は、ゲル内蛍光イメージングによる測定で、指し示した時点において、タンパク質当たり４つのメチオニンを持つ１５μＭのＢＳＡ及び１００μＭのＯｘ４を用いて行った。
【００８６】
応用：
１．タンパク質へのペイロードの精密な付加
ＲｅＡＣＴをタンパク質の部位選択的なメチオニン共役のための方法として評価した。２ステップの標識化プロトコールを使用し、モデルタンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から開始し、ＢＳＡを最初に、生体直交型のアルキン基を持つオキサジリジンプローブＯｘ４で処理した後、銅触媒によるアジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応を通じてＣｙ３−アジドに連結させた。ＢＳＡに対する得られたレドックス共役の収率をゲル内蛍光イメージングにより解析した。ＲｅＡＣＴは迅速に進行し、１〜２分以内に９５％を超える収率で完了することができ、標識化の５０％は、標準的な反応条件下でＯｘ４をタンパク質に付加した後の最初の５秒以内に起こった（図１Ｄ）。これは、ＲｅＡＣＴ法は目的のタンパク質上の定義されたメチオニン部位において様々なペイロードを取り付けることを可能として、天然に存在するアミノ酸を使用する官能基化のための独特の方法として役立つ可能性があることを示す（図２Ａ）。ＣａＭモデルタンパク質との様々なアルキン含有及びアジド含有オキサジリジンプローブの反応性を評価した（図２Ｂ）。ＬＣ−ＭＳの結果は、ＲｅＡＣＴは室温での１０分間の標識時間内に９つ全ての天然のメチオニン残基へのこれらの生体直交型のハンドルのほぼ定量的な取付けを可能とすることを示し、８個のスルフィミド修飾（ＮＴＰ）及び１個のスルホキシド修飾（ＯＴＰ）を持つ軽微なＣａＭ生成物が他に唯一観察されたのに対し、２５：１の選択性であった（図２Ｂ）。
【００８７】
図２Ａ．ＲｅＡＣＴとクリック反応との組合せのメチオニン特異的タンパク質官能基化のための一般的な２ステップ手順。所与のタンパク質上の指向した位置においてメチオニン共役を通じて様々なペイロードを取り付けることができる。（Ｂ）様々なオキサジリジン（Ｏｘ）化合物（１ｍＭ）とのＣａＭモデルタンパク質（１００μＭ）のレドックス共役。オキサジリジンプローブの化学構造を、対応する修飾について列記した分子量変化（ΔＭ）と共に示す。全タンパク質ピークのデコンボリューションしたＭＳデータを同じ図中にプロットしている。Ｏｘ２標識化タンパク質：予測される質量１７，５６４Ｄａ、検出１７，５６５Ｄａ；Ｏｘ４標識化タンパク質：予測される質量１７，６５４Ｄａ、検出１７，６５４Ｄａ；Ｏｘ５標識化タンパク質：予測される質量１８，０５０Ｄａ、検出１８，０５１Ｄａ；Ｏｘ６標識化タンパク質：予測される質量１８，０５９Ｄａ、検出１８，０６０Ｄａ。
【００８８】
ビオチン、フルオロフォア及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ペイロードを用いるさらなる官能基化は順調に進行する。図３．デスチオビオチン−アジド、Ｃｙ３−アジド及びジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）の化学構造。ＣｕＡＡＣ反応を使用してＯｘ４標識化ＣａＭタンパク質（４０μＭ）をデスチオビオチン−アジド（１００μＭ）（Ｂ）及びＣｙ３−アジド（１００μＭ）（Ｃ）と反応させた。ＢＣＳ（１ｍＭ）を加えることにより反応を停止させ、３回脱塩し、タンパク質ＭＳにより分析した。デコンボリューションしたＭＳは、ＲｅＡＣＴ−クリックを使用するＣａｍタンパク質への１〜３個のビオチン又はＣｙ３の共役を指し示し、また、Ｏｘ６標識化ＣａＭタンパク質（４０μＭ）を指し示した濃度のＤＢＣＯ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）と室温で８時間反応させた。タンパク質ゲルにより反応を解析した。クリック反応パートナーの入手容易性と連結したＲｅＡＣＴの高いメチオニン反応性及び特異性は、この天然に存在するアミノ酸に基づく精密なタンパク質官能基化のための直接的な方法を提供する。
【００８９】
２．抗体−薬物コンジュゲート
出発モデルとして抗緑色蛍光タンパク質抗体断片（ＧＦＰ−Ｆａｂ）を使用して抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成を試験した。Ｆａｂスキャフォールドは軽鎖に１つの天然のメチオニン残基及び重鎖に２つの天然のメチオニン残基を持つが、これらの側鎖のいずれも表面で接近可能でなく、したがって高いオキサジリジンプローブ負荷を用いてさえ、ＲｅＡＣＴによって標識することはできない。そのため、ＲｅＡＣＴは抗体の生体共役のための潜在的に価値のある戦略を与え、これは、これらの天然のメチオニンは疎水性内部コア内に埋もれているので、野生型抗体のバックグラウンド標識化がなく、表面で接近可能なメチオニン部位のその後の操作により、指向した場所での精密な抗体官能基化を可能とし得るためである。ＴＨＩＯＭａｂプラットフォーム４４を使用して、重鎖（ＨＱ−Ａ１１４残基又は軽鎖（ＬＱ−Ｖ２０５残基をメチオニンで置換することによりこのアプローチの実証を行ったところ、ＲｅＡＣＴによる効率的な標識化が示された。加えて、Ｃ末端メチオニンを持つＧＦＰ−Ｆａｂ（ＧＦＰ−Ｆａｂ−ＣＭ）に対するＲｅＡＣＴでの迅速な、ほぼ定量的な、及び部位特異的なＣ末端標識化が実証された。重要なことに、結果として得られたアジド保有ＧＦＰ−Ｆａｂ（ＧＦＰ−Ｆａｂ−Ｎｓ）は、野生型Ｆａｂと比較してＧＦＰリガンドに対する類似の結合親和性を保持した。クリック反応は、ビオチン、フルオロフォア及び薬物ペイロードによるＧＦＰ−Ｆａｂ−Ｎ３のさらなる官能基化を可能とする。さらに、結果として得られるコンジュゲートは、生物学的環境と適合性である。例えば、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処理が細胞表面に局在したＧＦＰの発現を結果としてもたらす、Ｄｏｘ誘導性細胞表面ＧＦＰ発現系を有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を使用した。Ｄｏｘの事前付加とその後のＲｅＡＣＴにより作られたＣｙ３標識化ＧＦＰ−Ｆａｂとのインキュベーションにより、ＨＥＫ−２９３Ｔ生細胞においてＣｙ３及びＧＦＰシグナルの優れた共局在性が観察された。対照的に、Ｄｏｘを加えない対照細胞ではＣｙ３シグナルは観察されなかった。さらには、Ｃｙ３シグナルの強度は、１００％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で少なくとも１４日間にわたって安定であることが分かった。以上を合わせると、これらのデータは、ＲｅＡＣＴは、多様なペイロードを用いて指向した位置での抗体官能基化を可能とすることができると同時に、リガンド結合のためのそれらの機能を保持できることを実証する。
【００９０】
ＲｅＡＣＴを治療用コンジュゲートであるハーセプチン−Ｆａｂ（Ｈｅｒ−Ｆａｂ）にも適用した。野生型Ｈｅｒ−Ｆａｂは表面で接近可能なメチオニンを欠くため、ＲｅＡＣＴは野生型Ｈｅｒ−Ｆａｂを標識しない。Ｃ末端に１個又は２個のメチオニン残基を持つようにＨｅｒ−Ｆａｂプラットフォームを操作することにより、ＲｅＡＣＴはそれぞれ１個又は２個のレドックス修飾による定量的な共役を与える。ＲｅＡＣＴは、システイン又はリジンライゲーションを用いる生体共役方法について依然として大きな課題である、優れた純度での定義された薬物対抗体比（ＤＡＲ）でのＡＤＣの合成を可能とし得ることをデータは確立する。さらに、メチオニン共役により導入される生体直交型のアジド又はアルキンハンドルは、追加のペイロードを用いて容易に官能基化することができる。実際、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）をＨｅｒ−Ｆａｂに連結させることにより合成されるＡＤＣは、野生型Ｈｅｒ−Ｆａｂ又は野生型Ｈｅｒ−Ｆａｂと遊離ＭＭＡＥとの混合物のいずれかと比較してＨｅｒ２陽性ＢＴ４７４乳がん細胞に対する毒性の５倍の増加を呈し、生物学的背景におけるその有用性を実証する（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｄｏｘ−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５５，５９７−６０２（２０１７）を参照；その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９１】
３．反応性メチオニンのプロファイリング
ＲｅＡＣＴは、その高い特異性及び反応性の他に、広範なタンパク質に接近するためのその小ささにより、ケモプロテオミクスへの応用のための独特のメチオニン標的化弾頭として使用することができる。この目的のために、タンデム直交型タンパク質加水分解−活性ベースのタンパク質プロファイリング（ＴＯＰ−ＡＢＰＰ）４５を通じてプロテオームにおけるプローブ反応性メチオニンにＲｅＡＣＴを適用した。低レベル、中レベル、及び高レベルのＲｅＡＣＴプローブＯｘ４による細胞の用量依存的な処理を通じて、低反応性メチオニン部位と共に低用量の標識化で濃縮されるべき反応性亢進のメチオニンを同定することを試みた。ＨｅＬａ細胞溶解液において並行のＴＯＰ−ＡＢＰＰ（３つ全ての群についてｎ＝２）を行うことにより、所望のＲｅＡＣＴｅメチオニン修飾を持つ１１６（低用量）、４５８（中用量）及び１１１８（高用量）のペプチドが同定された。
【００９２】
反応性亢進のメチオニン標的は特に興味深く、それらはメチオニン調節性のタンパク質機能の部位を予測することができる。偏りのないこのＲｅＡＣＴアプローチは、全プロテオーム環境における以前に研究されたレドックス感受性メチオニンの特徴付けを可能とするだけでなく、より重要なことに新たな機能的メチオニン部位も同定する。陽性対照として、アクチン内に３つの反応性亢進のメチオニンが同定され、それらにはＭｅｔ４４及びＭｅｔ４６が含まれ、これらのレドックス活性は、生細胞におけるアクチン重合の制御において中心的役割を果たすことが以前に示されている３６〜３８。検討中のＲｅＡＣＴ法を検証するこれらのデータを用いて、メチオニン依存的な機能を有する新たな標的を同定し且つ特徴付けることを試みた。１つの代表的な例として、ワールブルグ効果を介してがんなどの疾患を調節するのに重要な４７、解糖における古くからの保存された代謝経路における中心的酵素であるエノラーゼ４６において３つの反応性亢進のメチオニン残基が発見された。これには、酵母から哺乳動物まで高度に保存されたＭｅｔ１６９残基（酵母エノラーゼ１におけるＭｅｔ１７１に対応する。）が含まれる。Ｍｅｔ１６９は酵素活性部位に近く、酸化剤処理により哺乳動物のタンパク質中の他のメチオニン残基と共に酸化させることができる。
【００９３】
エノラーゼ中のこの酸化感受性のメチオニンの機能的重要性をより詳細に特徴付けるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学研究のための酵母ホモログをクローニングし、精製した。次亜塩素酸による野生型酵母エノラーゼ１の処理は、タンパク質上のＭｅｔ１７１などのメチオニン残基の随伴的な酸化と共に酵素活性の減少を結果としてもたらした。Ｍ３７１Ｌ変異体の酸化によりタンパク質活性の類似の減少が観察された。対照的に、Ｍ１７１Ｌ変異体の活性は、同じ条件下で酸化剤処理により影響されず、この高度に保存された残基はエノラーゼ機能のレドックス調節のために不可欠であることを示唆する。酸化剤処理のあり及びなしでの野生型及びＭ１７１Ｌ変異体の速度論的測定は、ｋｃａｔ及びＫｍの両方が野生型において酸化により影響されるが、Ｍ１７１Ｌ変異体についてこれらの値は同じままであることを明らかにする。細胞レベルでのこのメチオニンベースのレドックス調節の生理学的帰結を示すために、エノラーゼ１及びエノラーゼ２をダブルノックアウトバックグラウンド４８し、野生型エノラーゼ１又はＭ１７１Ｌ変異体のいずれかを再導入した酵母株を生成した。Ｍ１７１Ｌ変異を持つ株は、野生型エノラーゼ１を有する株と比較して酸化ストレス誘導性の細胞死に対してより耐性であることが分かり、このメチオニン残基は実際にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能的なレドックス活性の役割に役立つことを確立する。
【００９４】
参考文献としては、生物学的プロセスにおける硫黄の中心的役割（５２〜５６）、システインに基づく選択的なタンパク質共役法及びそれらの応用（５７〜６４）、酸−塩基の機構による既存のメチオニン標識化法（６５〜６７）、及びオキサジリジン化学の総説（６８〜６９）が挙げられる。
【００９５】
詳細な方法
タンパク質及び細胞溶解液のＲｅＡＣＴ標識化。タンパク質試料（ＢＳＡ、カルモジュリン及びＦａｂ）をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中の１ｍｇ／ｍＬの溶液になるように希釈した。試料を１．１〜１０当量のオキサジリジンプローブ（ＤＭＦ中の１００×ストック）で標識した。ＲｅＡＣＴ標識化反応は、室温で撹拌と共に１０分間行い、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２回脱塩することにより直ちに停止させた。標識化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳ分析に供した。放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ）中のプロテオーム試料をモデルタンパク質試料のために使用されたものと同じプロトコールで標識した。その後、冷メタノールでのタンパク質沈殿により試料を急冷した。冷メタノールでペレットを２回洗浄し、空気乾燥し、２％のＳＤＳ／ＰＢＳで可溶化した。
【００９６】
クリック反応のための手順。ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬの濃度のアルキンハンドルを持つオキサジリジン標識化タンパク質又はプロテオーム試料をＣｕＡＡＣ反応で標識した。反応は、１ｍＭのＣｕＳＯ４（水中の１００×ストック）、１００μＭのトリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ、ＤＭＳＯ中の１００×ストック）、１００μＭのアジド−ＰＥＧ３−ビオチン又はアジド−Ｃｙ３（ＤＭＳＯ中の１００×ストック、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）及び２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（水中の１００×ストック）を加えることにより行った。次に、反応液を室温で１時間撹拌した後、５ｍＭのバソクプロインジスルホン酸二ナトリウム（ＢＣＳ、水中の１００×ストック）で停止させた。ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬの濃度のアジドハンドルを持つタンパク質試料を、銅なしのクリック反応を使用してジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）含有化合物で標識した。反応は、２〜１０当量のＤＢＣＯ−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｃｙ３、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ又はＤＢＣＯ−ＭＭＡＥを加えることにより行い、室温で８時間反応させた後、タンパク質の脱塩により停止させた。
【００９７】
タンパク質修飾のＬＣ−ＭＳ分析。ＣａＭ及びＨｅｒ−Ｆａｂの質量分析測定は、カリフォルニア大学バークレー校のＱＢ３／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで得た。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）供給源を備えたＬＴＱ  ＦＴ質量分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＣａＭ修飾を分析した。ポジティブイオンモードでＥＳＩを使用して、５μＬ／分の速度の溶液（１：１のアセトニトリル：水、１％のギ酸、Ｖ／Ｖ）中にタンパク質試料を直接的に注ぎ込んだ。Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン２．０．７、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してデータ取得を制御し、ＰｒｏＭａｓｓソフトウェア（バージョン  ２．５  ＳＲ−１、Ｎｏｖａｔｉａ）を使用して質量スペクトルのデコンボリューションを行った。ｉｏｎＫｅｙ  ＥＳＩ供給源及びＣ４  ｉｏｎＫｅｙ（１５０μｍの内径、５０ｍｍの長さ、３００Åの孔径、１．７μｍの粒径）を備え、Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｍ−クラス液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ）に接続されたＳｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓｉ質量分光計でポジティブイオンモードにおいてＨｅｒ−Ｆａｂ修飾を分析した。ＧＦＰ−Ｆａｂの質量分析測定はカリフォルニア大学サンフランシスコ校で得た。ＬｏｃｋＳｐｒａｙ（ＥＳＩ）供給源及びＡｃｑｕｉｔｙ  Ｉ−クラス液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ）に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  Ｃ４カラム（２．１ｍｍの内径、５０ｍｍの長さ、３００Åの孔径、１．７μｍの粒径）を備えたＸｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ質量分光計でポジティブイオンモードにおいてＧＦＰ−Ｆａｂ修飾を分析した。質量スペクトルのデコンボリューションは、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．１、Ｗａｔｅｒｓ）の最大エントロピー（ＭａｘＥｎｔ）アルゴリズムを使用して行った。
【００９８】
反応性メチオニンのプロファイリング。ＲＩＰＡ緩衝液（各１ｍＬ）中の１ｍｇ／ｍＬの濃度のＨｅＬａ細胞溶解液を１０μＭ（低用量、ＤＭＦ中の２００×ストック）、５０μＭ（中用量、ＤＭＦ中の２００×ストック）又は２５０μＭ（高用量、ＤＭＦ中の２００×ストック）のＯｘ４プローブで標識した。ゲル内蛍光イメージングアッセイにより、反応は２５０μＭのプローブで飽和に近かったので、２５０μＭを高用量群として使用し、また先行する文献において反応性亢進のシステインプロファイリングのために１０μＭのプローブが適用されたので、１０μＭのプローブを低用量群として使用した。
【００９９】
ＲｅＡＣＴ標識化反応は室温で１０分間行い、２回脱塩して遊離のオキサジリジンプローブを除去することにより停止させた。ＣｕＡＡＣ反応は、２００μＭの酸切断性ビオチンアジドプローブ（ＤＭＳＯ中の２００×ストック）を使用して上述の方法で標識化タンパク質に対して行った（４０、４１）。試料を沈殿させ、冷メタノールで洗浄し、２５０μＬの２％のＳＤＳ／ＰＢＳ中に溶解させた。１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで溶液を５ｍＬに希釈した。次に、溶液に２ｍｇのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、４℃で終夜撹拌した。磁気ビーズを１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ（５ｍＬ）、ＰＢＳ（５ｍＬ）、６Ｍの尿素（５ｍＬ）及びＰＢＳ（５ｍＬ）で洗浄した。
【０１００】
次に、洗浄したビーズを５ｍＭのＴＣＥＰで１５分間６５℃で還元し、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で３０分間３７℃でアルキル化した。オンビーズでのトリプシン（２μｇの各試料）消化を３７℃で１６時間行った。次に、ビーズをペレット化し、ＰＢＳ（２×２ｍＬ）、水（２×２ｍＬ）で洗浄した。磁気ビーズ上の修飾ペプチドを１％のギ酸／水（２×５００μＬ）を使用して室温で３０分間切断した後、３０分間の撹拌と共に１％のギ酸＋５０％のアセトニトリル／水（２×５００μＬ）で切断した。溶出液を合わせ、真空濃縮機で濃縮した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃ１８  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりペプチド試料を脱塩し、分析まで−２０℃に保った。
【０１０１】
硫黄イミド化の速度論的速度定数の決定。ＵＶ−ｖｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の反応速度モデルの下、２５０ｎｍでのベンズアルデヒドのＵＶ吸光度の経時的な指数関数的増加に従うことにより、ＰＢＳ緩衝液中の５〜４０倍過剰のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを用いて擬一次条件下でＯｘ２の速度定数ｋを測定した。ＰＢＳ緩衝液中のＯｘ２（２００μＭ）及びＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン（１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、及び８ｍＭ）のストック溶液を調製し、水浴により２５℃に保った。等しい体積の調製したストック溶液を混合し、これは５〜４０当量のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンに対応する。以下の機器パラメーター：２５０ｎＭ；１秒当たり１０のデータポイントを使用してスペクトルを記録した。反応速度モデルの下でＵＶ−ｖｉｓによりＵＶ吸光度をモニターした。データに単一指数方程式をフィットさせて、指し示した濃度のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの下での観察された速度ｋ’を得た。異なる濃度のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンから算出された観察された速度ｋ’をＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの濃度に対してプロットしてプロットの傾きから速度定数ｋを得た。
【０１０２】
ペプチド修飾のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  ＩＩ  ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰｒｏｘｅｏｎナノスプレー供給源と組み合わせたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、トリプシン消化したペプチドを分析した。消化したペプチドを１００ミクロン×２５ｍｍのＭａｇｉｃ  Ｃ１８  １００Å  ５Ｕ逆相トラップに入れ、そこでペプチドをオンライン脱塩した後、７５ミクロン×１５０ｍｍのＭａｇｉｃ  Ｃ１８  ２００Å  ３Ｕ逆相カラムで分離した。３００ｎＬ／分の流速で１２０分の勾配を使用してペプチドを溶出させた。３００〜１６００のｍ／ｚ範囲についてＭＳサーベイスキャンを得、ＭＳスペクトルにおける上位１５のイオンを高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）に供するトップ１５法を使用してＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。１．６ｍ／ｚのアイソレーション質量ウインドウを前駆体イオン選択のために使用し、２７％の正規化された衝突エネルギーをフラグメンテーションのために使用した。５秒の継続時間をダイナミックエクスクルージョンのために使用した。
【０１０３】
ペプチド修飾の同定。タンデム質量スペクトルを抽出し、荷電状態をＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりデコンボリューションした。Ｘ！  Ｔａｎｄｅｍ（Ｔｈｅ  ＧＰＭ、ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ；バージョンＴＯＲＮＡＤＯ（２０１３．０２．０１．１））を使用して全てのＭＳ／ＭＳ試料を分析した。Ｕｎｉｐｒｏｔのヒトデータベース（バージョン１１／１４／２０１５、１４０２４８エントリー）、一般的な実験室汚染物のｃＲＡＰデータベース（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ｃｒａｐ；１１４エントリー）に加えて、消化酵素がトリプシンであると仮定して同数の反転タンパク質配列を検索するようにＸ！  Ｔａｎｄｅｍを設定した。Ｘ！  Ｔａｎｄｅｍは、２０ＰＰＭのフラグメントイオン質量許容及び２０ＰＰＭのペアレントイオン許容で検索した。システインのＩＡＡ誘導体は、Ｘ！  Ｔａｎｄｅｍにおいて固定的修飾として特定された。メチオニン及び他の求核性アミノ酸上の＋１９７．０９１３の修飾は、Ｘ！  Ｔａｎｄｅｍにおいて可変的修飾として特定された。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（バージョンＳｃａｆｆｏｌｄ＿４．０．６．１、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用してＭＳ／ＭＳベースのペプチド及びタンパク質の同定を検証した。ペプチドの同定は、それらが特定のデータベース検索エンジンの閾値を超えている場合に許容した。Ｘ！  Ｔａｎｄｅｍでの同定は、５ｐｐｍの質量の正確性で１．２より大きい少なくとも−Ｌｏｇ（予想スコア）のスコアを必要とした。タンパク質の同定は、それらが少なくとも２つの同定されたペプチドを含有した場合に許容した。上記のパラメーターを使用して、デコイ偽発見率（ＦＤＲ）をタンパク質レベルで１．１％、スペクトルレベルで０．０％と算出した（４２）。類似のペプチドを含有し、ＭＳ／ＭＳ分析のみに基づいて分離できなかったタンパク質を最節約原理を満たすように分類した。
【０１０４】
共局在実験。共局在実験を誘導性細胞表面ＧＦＰ発現系を有するＨＥＫ２９３Ｔ生細胞において行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をポリ−リジン被覆チャンバースライド上にプレートした。約２５％の密集度で２４時間１μＭ／ｍＬのＤｏｘ（水中の１０００×ストック）を加えて細胞表面にＧＦＰを発現するように細胞を誘導した。次に、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＧＦＰ−Ｆａｂ−Ｃｙ３（ＰＢＳ中の１００×ストック）で１時間処理した。標識した細胞を１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ（フェノールレッド非含有）で２回洗浄し、Ｚｅｎ  ２００９ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して６３×油浸対物レンズを有するＺｅｉｓｓレーザー走査型顕微鏡７１０を使用してイメージングを行った。５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを使用してＣｙ３を励起し、４８８ｎｍのＡｒレーザーを使用してＧＦＰを励起した。実験の経過全体を通じて３７℃で細胞をイメージングした。画像解析及び定量化はＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所）を使用して行った。
【０１０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣ細胞毒性アッセイ。１ウェル当たり９０μＬの増殖培地を有する黒い側面の透明底９６ウェルプレートにＢＴ４７４細胞をプレートした。ＷＴ−Ｆａｂ、ＷＴ−Ｆａｂ＋遊離薬物及びＡＤＣの１０×濃度のワーキングストックを調製した後、５倍の段階希釈として滴定して８ポイントの用量反応曲線を生成した。約５０％の密集度の各ウェルにタンパク質試料（１０μＬ）を二連で加えた。細胞をさらに７２時間インキュベートした。製造者の使用説明書にしたがってＯｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＭＴＳ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて細胞毒性を測定した。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて細胞生存曲線をプロットした。
【０１０６】
エノラーゼ活性アッセイ。Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｍｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いてＷＴ酵母ＥＮＯ１及びそのバリアントの酵素活性を測定した。５０ｍＭのトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ＝７．８）中のタンパク質試料（０．２ｍｇ／ｍＬ）を二連で１００μＭのＮａＣｌＯで１時間、室温で処理した。Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２回脱塩することにより、酸化反応を停止させた。酸化処理あり又はなしでのタンパク質試料の活性を製造者の使用説明書にしたがってＥｎｏｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）により測定した。
【０１０７】
酵母ゲノムの編集。ゲノム編集のためのＷＴ株としてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１（２０１３８８；ＡＴＣＣ）を使用した。ノックアウト及び変異株は、報告された通りにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性のゲノム編集プロトコールにより生成した（４３）。簡潔に述べれば、ＥＮＯ２ノックアウト株のために、製造者のプロトコールにしたがってＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して酵母コンピテント細胞（５０μＬ）を１．０μｇのｐＣＡＳプラスミド及び２．０μｇの線状修復ＤＮＡで形質転換した。抗生物質を含むＹＰＧプレートに形質転換細胞をプレートした。細胞を３７℃で終夜、その後３０℃でさらに４８時間生育させた。ＤＮＡシークエンシングにより陽性コロニーを確認した。ＥＮＯ１−Ｍ１７１Ｌ（ＥＮＯ２ヌル）株について、その後のエノラーゼ１変異のための母株としてＥＮＯ２ノックアウト株（ｐＣＡＳ９プラスミドを欠く）を使用した。
【０１０８】
酵母増殖曲線の測定。反応速度モデルを使用して３０℃での振とうと共にＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｍｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて酵母増殖曲線を測定した。合成完全（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）を含む酵母窒素基礎培地中で酵母株を静止期まで生育させた。次に、二連で１００μＭのＮａＣｌＯの処理と共に又はそれを伴わずに細胞を新鮮な酵母窒素基礎培地中に１：５０に希釈した。６００ｎｍでの吸光度を３０分ごとに測定した。
【０１０９】
タンパク質の発現及び精製。ＧＦＰ−Ｆａｂｓの生成：ファージディスプレイ法を使用してＧＦＰ−Ｆａｂｓを生成し、以前に記載された通りにｐＳＦＶ４発現ベクター中に構築した（４４）。重鎖Ａ１１４Ｍ、軽鎖Ｖ２０５Ｍ、及び鎖間ジスルフィド後に直接的に軽鎖のＣ末端に部位特異的変異生成によりメチオニン点変異を組み込んだ。以前に記載された通りにＣ４３（ＤＥ３）Ｐｒｏ＋細胞中で組換えＦａｂｓを生成した（４４）。簡潔に述べれば、培養物をＯＤ約０．６まで生育させ、０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で終夜誘導した。プロテインＡクロマトグラフィーによりＦａｂｓを精製し、その後の貯蔵及び検証アッセイのために緩衝液をＰＢＳに交換した。生細胞への応用のために、組換えＦａｂｓ溶液中のエンドトキシンをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により除去した。
【０１１０】
Ｈｅｒ−Ｆａｂｓの生成：Ｈｅｒ−Ｆａｂの軽鎖及び重鎖をコドン最適化し（４５）、以前に記載された通りにｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ発現ベクター中に構築した（４６）。
【０１１１】
軽鎖のＣ末端におけるメチオニンノックイン変異は、鎖間ジスルフィド後に直接的に組み込んだ。組換えＨｅｒ−Ｆａｂｓを生成し、これもプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。ＡＤＣへの応用のために、組換えＦａｂｓ溶液中のエンドトキシンをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により除去した。
【０１１２】
酵母エノラーゼ１の生成：酵母エノラーゼ１を酵母（Ｓ２８８Ｃ）ゲノムＤＮＡから増幅し、Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａ発現ベクターに挿入した。部位特異的変異生成を使用してＭｅｔ１７１又は３７１をＬｅｕに変換した。先行する論文にしたがって組換えタンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）株中で発現させ、精製した（４７、４８）。エノラーゼファミリータンパク質の配列アライメントはＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａプログラムにより行った（４９）。
【０１１３】
Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法結合アッセイ。精製したＧＦＰ−Ｆａｂｓを０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０＋０．２％のＢＳＡ／ＰＢＳで３００ｎＭの濃度に希釈した。ヒトＦａｂのＣＨ１領域に結合する抗Ｆａｂセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にＦａｂ試料を固定化した。Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ３８４システム中の段階希釈した濃度の組換えＧＦＰリガンド（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて、固定化したセンサーをサンプリングした。得られた結果を、製造者により提供されるプロトコールにしたがってフィッティングした。
【０１１４】
オキサジリジンプローブの化学合成。
【０１１５】
Ｎ−エチル−３−フェニル−１，２−オキサジリジン−２−カルボキサミド（Ｏｘ２）
【化１１】
2020500186.tif 000013
【０１１６】
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（１．２１ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）及び１−エチル尿素（８８０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に室温でＴｉ（ＯｉＰｒ）４（３．２ｍＬ、１１ｍＬ）を加えた。終夜の撹拌後、混合物を真空下で濃縮して残留物を得た。飽和Ｋ２ＣＯ３（３０ｍＬ）及びＤＣＭ（３０ｍＬ）の混合溶液に室温でメタクロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ、６．９ｇ、純度７６％、３０ｍｍｏｌ）を加えた。１０分間の撹拌後、ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の上記残留物の溶液を室温で混合物中にゆっくりと加えた。さらに６時間撹拌した後、水（１００ｍＬ）を加え、混合物をＤＣＭで３回抽出した。次に、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して残留物を得、これをカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ、１００：１）により精製して白色固体（８０２ｍｇ、４２％）としてＯｘ２を得た。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  ７．５２−７．３７（ｍ、５Ｈ）、６．１４（ｂｒｓ、１Ｈ）、４．９９（ｓ、１Ｈ）、３．４０−３．２３（ｍ、２Ｈ）、１．１９（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  １６２．２３、１３２．４８、１３１．０６、１２８．６９、１２８．０３、７９．４２、３５．４５、１４．７９．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋１９３．０９７２、Ｃ１０Ｈ１３０２Ｎ２＋は１９３．０９７２を必要とする。
【０１１７】
エチル３−フェニル−１，２−オキサジリジン−２−カルボキシレート（Ｏｘ１）
【化１２】
2020500186.tif 000014
【０１１８】
１−エチル尿素の代わりにエチルカルバメートを使用してＯｘ２の作製に使用したのと同じ手順でＯｘ１を２０％の収率で合成した。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  ７．５２
−７．３８（ｍ、５Ｈ）、５．１０（ｓ、１Ｈ）、４．４３−４．２４（ｍ、２Ｈ）、１．３６（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  １６２．２３、１３２．０７、１３１．２６、１２８．７８、１２８．０６、７８．２９、６４．７８、１４．１９．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋２１６．０６３１、Ｃ１０Ｈ１１Ｏ３ＮＮａ＋は２１６．０６３１を必要とする。
【０１１９】
Ｎ−エチル−３−フェニル−３−（トリフルオロメチル）−１，２−オキサジリジン−２−カルボキサミド（Ｏｘ３）
【化１３】
2020500186.tif 000015
【０１２０】
ベンズアルデヒドの代わりに２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタン−１−オンを使用してＯｘ２の作製に使用したのと同じ手順でＯｘ３を１０％の収率で合成した。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  ７．５８（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．５０（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．４２（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．８２（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．０７−２．９３（ｍ、１Ｈ）、２．９３−２．８０（ｍ、１Ｈ）、０．６２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  １５７．７８、１３１．５１、１２８．５７、１２８．２５、１２４．９１、１２０．９０（ｑ、Ｊ＝２８１．４Ｈｚ）、８２．２９（ｑ、Ｊ＝３８．７Ｈｚ）、３５．１０、１４．１３。１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ−７６．８２．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋２６１．０８４６、Ｃ１１Ｈ１２Ｏ２Ｎ２Ｆ３＋は２６１．０８４５を必要とする。
【０１２１】
３−フェニル−Ｎ−（プロパ−２−イン−１−イル）−１，２−オキサジリジン−２−カルボキサミド（Ｏｘ４）
【化１４】
2020500186.tif 000016
【０１２２】
水性ＨＣｌ溶液（ｓｏｕｌｕｔｉｏｎ）（１．０Ｎ、５０ｍＬ）中のプロパルギルアミン（３．２ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に室温でＫＯＣＮ（１６ｇ、２００ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃での終夜の撹拌後、混合物を０℃に冷却して白色沈殿を得た。濾過後、固体をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）に溶解させ、シリカゲル（２５ｇ）と共に６時間撹拌した。次に、混合物を濾過し、真空下で濃縮して、さらなる精製なしで所望の尿素４ａを白色固体（３．５ｇ、７１％）として得た。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  ３．８８（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．５４（ｔ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  １６１．５５、８１．６３、７１．８０、３０．１８．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋９９．０５５２、Ｃ４Ｈ７Ｎ２Ｏ＋は９９．０５５３を必要とする。
【化１５】
2020500186.tif 000017
【０１２３】
１−エチル尿素の代わりに基質として４ａを使用してＯｘ２の作製に使用したのと同じ手順でＯｘ４を２１％の収率で合成した。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  ７．５２−７．３５（ｍ、５Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）、５．０４（ｓ、１Ｈ）、４．０９（ｄｔ、Ｊ＝５．４、２．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．３１（ｔ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  １６２．０５、１３２．０８、１３１．１４、１２８．６８、１２８．０２、７９．４４、７８．４２、７２．５４、３０．２１．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋２０３．０８１３、Ｃ１１Ｈ１１Ｎ２Ｏ２＋は２０３．０８１５を必要とする。
【０１２４】
３−フェニル−Ｎ−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エチル）−１，２−オキサジリジン−２−カルボキサミド（Ｏｘ５）
【化１６】
2020500186.tif 000018
【０１２５】
文献にしたがってアミン５ａを合成した（５０）。水性ＨＣｌ溶液（ｓｏｕｌｕｔｉｏｎ）（１．０Ｎ、１９ｍＬ）中のアミン５ａ（１．９ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）の溶液に室温でＫＯＣＮ（７．６ｇ、９４ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃での終夜の撹拌後、混合物を０℃に冷却した。混合物を、ＴＬＣ分析により決定される完全な抽出まで繰り返し酢酸エチルで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して残留物を得た。ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の残留物の溶液に室温でシリカゲル（１０ｇ）を加えた。６時間の撹拌後、混合物を濾過し、真空下で濃縮して所望の尿素５ｂを油（１．９ｇ、７１％）として得た。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  ４．１９（ｓ、２Ｈ）、３．５８（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．３５−３．２９（ｍ、２Ｈ）、２．８７（ｓ、１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＣＤＣｈ）δ  １６２．１９、８０．５３、７５．９５、７０．１５、５８．９０、４０．７０．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋１４３．０８１５、Ｃ６Ｈ１１Ｎ２Ｏ２＋は１４３．０８１５を必要とする。
【化１７】
2020500186.tif 000019
【０１２６】
１−エチル尿素の代わりに基質として５ｂを使用してＯｘ２の作製に使用したのと同じ手順でＯｘ５を３３％の収率で合成した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｈ）δ  ７．４８−７．３２（ｍ、５Ｈ）、５．００（ｓ、１Ｈ）、４．１５（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．６７−３．５７（ｍ、２Ｈ）、３．５２−３．４２（ｍ、２Ｈ）、２．４８（ｔ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １６２．４４、１３２．３８、１３１．０１、１２８．６３、１２７．９８、７９．３６、７９．３０、７５．１１、６８．０８、５８．３６、４０．１４．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｎａ］＋２６９．０８９３、Ｃ１３Ｈ１４Ｎ２Ｏ３Ｎａ＋は２６９．０８９７を必要とする。
【０１２７】
Ｎ−（３−アジドプロピル）−３−フェニル−１，２−オキサジリジン−２−カルボキサミド（Ｏｘ６）
【化１８】
2020500186.tif 000020
【０１２８】
１ＮのＨＣｌ（３ｍＬ）中のアミン（２５０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液にＫＯＣＮ（８１０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃での１８時間の撹拌後、混合物を室温に冷却し、ＴＬＣ分析により決定される完全な抽出までＤＣＭで抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して白色固体として尿素を得た。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（３０３μＬ、３．０ｍｍｏｌ）及び上記尿素の溶液に室温でＴｉ（ＯｉＰｒ）４（１．０ｎｉＬ、３．５ｍｍｏｌ）を加えた。４時間の撹拌後、混合物を真空下で濃縮して残留物を得た。飽和Ｋ２ＣＯ３（１５ｎｉＬ）及びＤＣＭ（１５ｍＬ）の混合溶液に室温でｍＣＰＢＡ（２．６ｇ、純度５５％、７．５ｍｍｏｌ）を加えた。１０分間の撹拌後、ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の上記残留物の溶液を室温で混合物中にゆっくりと加えた。１５時間撹拌した後、水（１００ｍＬ）を加え、混合物をＤＣＭで３回抽出した。次に、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して残留物を得、これをカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ、５０：１）により精製してオキサジリジンＯｘ６を油（１３８ｍｇ、２２％）として得た。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  ７．５２−７．３１（ｍ、５Ｈ）、６．４６（ｓ、１Ｈ）、４．９９（ｓ、１Ｈ）、３．４１−３．２５（ｍ、４Ｈ）、１．８５−１．７３（ｍ、２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｂ）δ  １６２．５０、１３２．２８、１３１．０６、１２８．６４、１２７．９４、７９．３７、４９．０６、３８．０３、２８．５５．
メチオニン及びオキサジリジンのカップリングのための一般的手順
【化１９】
2020500186.tif 000021
【０１２９】
ｄ−ＭｅＯＤ／Ｄ２Ｏ（０．２５ｎｉＬ／０．２５ｍＬ）中のメチルアセチル−Ｌ−メチオニネート（Ｓ１、１０．３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に室温でオキサジリジンＯｘ２（１０．６ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を加えた。ＮＴＰ（Ｓ２）とＯＴＰとの間の変換及び比を１Ｈ  ＮＭＲによりモニターした。１０分後、溶媒を真空下で除去して残留物を得、これをカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、５：１）により精製してＳ２（１３．２ｍｇ、９１％）を油として得た。３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  ４．５５（ｔｄ、Ｊ＝８．５、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．５５（ｔｄ、Ｊ＝８．５、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．１４（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．０７−２．９２（ｍ、２Ｈ）、２．６６（ｓ、３Ｈ）、２．３３−２．２１（ｍ、１Ｈ）、２．１２−２．０３（ｍ、１Ｈ）、２．０１（ｓ、１．５Ｈ）、２．００（ｓ、１．５Ｈ）、１．０８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  １７３．４５、１７２．８４、１６８．４７、５３．００、５２．８２、５２．４７、４５．９６、４５．７４、３２．１７、３１．９７、２６．３６、２６．２８、２２．４２、２２．３８、１５．８２．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋２９２．１３２０、Ｃ１１Ｈ２２Ｎ３Ｏ４Ｓ＋は２９２．１３２６を必要とする。
【０１３０】
レドックス共役生成物−スルフィミドの安定性
５ｍＭのＴＣＥＰによるスルフィミドＳ２の処理又は１ＮのＨＣｌ、１ＮのＮａＯＨもしくは共溶媒（ｄ−ＭｅＯＤ／Ｄ２Ｏ＝１：１）中８０℃によるスルフィミドＳ３の処理によりスルフィミドの安定性を試験した。１時間後及び１８時間後にＮＭＲにより反応をモニターし、ＮＭＲデータに基づいて反応変換を算出した。スルフィミドＳ３は、強い酸性条件下でその塩形態Ｓ４にプロトン化されることができ、Ｓ４は水溶液中で安定である。
【０１３１】
Ｎ−エチルカルバミル−Ｓ−メチル−Ｓ−フェニル硫黄イミン（Ｓ３）
【化２０】
2020500186.tif 000022
【０１３２】
３／４  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  ７．８１−７．７５（ｍ、２Ｈ）、７．６２−７．５４（ｍ、３Ｈ）、３．１８（ｑ、Ｊ＝７．２、５．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８６（ｓ、３Ｈ）、１．１０（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ  １６８．０１、１３９．３６、１３３．０１、１３０．９１、１２６．９７、３６．７８、３５．４４、１５．８９．ｍ／ｚ  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）検出［Ｍ＋Ｈ］＋２１１．０９８７、Ｃ１０Ｈ１５Ｎ２ＯＳ＋は２１１．０９００を必要とする。
【化２１】
2020500186.tif 000023
【０１３３】
３／４  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ／Ｄ２Ｏ）δ  ８．０２（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．８４（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７５（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６０（ｓ、３Ｈ）、３．１７（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．０８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）．
参考文献
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５  Ｈｅｓｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．，Ｋｉｍ，Ｓ．−Ｏ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｈ．Ｅ．＆Ｓｔａｍｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ−Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｐｕｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，１５０−１６６，（２００５）．
６  Ｄ’Ａｕｔｒｅａｕｘ，Ｂ．＆Ｔｏｌｅｄａｎｏ，Ｍ．Ｂ．ＲＯＳ  ａｓ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｔｈａｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ＲＯＳ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，８１３−８２４，（２００７）．
７  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｃ．＆Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｒ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，５０４−５１１，（２０１１）．
８  Ｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．＆Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１１，６３４１−６３５８，（２０１１）．
９  Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｃ．Ｅ．＆Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｋ．Ｓ．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１３，４６３３−４６７９，（２０１３）．
１０  Ｋａｂｉｌ，Ｏ．，Ｖｉｔｖｉｔｓｋｙ，Ｖ．＆Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｒ．Ｓｕｌｆｕｒ  ａｓ  ａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｓｕｌｆｉｄｅ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ３４，１７１−２０５，（２０１４）．
１１  Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｍ．Ｂ．Ｃｈｏｏｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，８７６−８８４，（２０１１）．
１２  Ｓｐｉｃｅｒ，Ｃ．Ｄ．＆Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｇ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ５，（２０１４）．
１３  Ｋｒａｌｌ，Ｎ．，ｄａ  Ｃｒｕｚ，Ｆ．Ｐ．，Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ，Ｏ．＆Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ，Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｓｉｔｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，１０３−１１３，（２０１６）．
１４  Ｖｏｌｇｒａｆ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｗｉｔｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，４７−５２，（２００６）．
１５  Ｗｅｅｒａｐａｎａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６８，７９０−７９５，（２０１０）．
１６  Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．Ｊ．，Ａｌｔｅｎｂａｃｈ，Ｃ．＆Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｓｐｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３，７２５−７３３，（２０１３）．
１７  Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｓ．，Ｈｏｒｉ，Ｙ．＆Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｐｒｏｂｅ−Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７，２４７−２５６，（２０１４）．
１８  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｔ．Ｆ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｆ．Ｊ．，Ｏｎａｋ，Ｃ．Ｓ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｋ．Ｓ．＆Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ＮＡＤＰＨ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８４，７６５−７９０，（２０１５）．
１９  Ｓｅｒａｆｉｍｏｖａ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｔｕｎｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４７１−４７６，（２０１２）．
２０  Ｏｓｔｒｅｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｕ．，Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．＆Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．Ｋ−Ｒａｓ（Ｇ１２Ｃ）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＧＴＰ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０３，５４８−５５１，（２０１３）．
２１  Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃｙｓｔｅｉｎｏｍｅ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，１４６−１５９，（２０１３）．
２２  Ａｇａｒｗａｌ，Ｐ．＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｔｈｅ  Ｎｅｘｕｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６，１７６−１９２，（２０１５）．
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２８  Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ，Ｏ．＆Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ，Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１５，２１７４−２１９５，（２０１５）．
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３０  Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．π−Ｃｌａｍｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，１２０−１２８，（２０１６）．
３１  Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖａ，Ｅ．Ｖ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｓｐｏｋｏｙｎｙ，Ａ．Ｍ．，Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ，Ｂ．Ｌ．＆Ｂｕｃｈｗａｌｄ，Ｓ．Ｌ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｐａｌｌａｄｉｕｍ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，６８７−６９１，（２０１５）．
３２  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１６）．
３３  Ｙａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１６）．
３４  Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ，Ｖ．Ｎ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ６：Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓ６−１−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｓ８−Ｓ９，（２０１４）．
３５  Ｋａｙａ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｃ．＆Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ，Ｖ．Ｎ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｓｒＢ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２３，８１４−８２２，（２０１５）．
３６  Ｈｕｎｇ，Ｒ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃａｌ  Ｌｉｎｋｓ  Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ  ｔｏ  Ｆ−Ａｃｔｉｎ  Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，８２３−８２７，（２０１０）．
３７  Ｈｕｎｇ，Ｒ．−Ｊ．，Ｐａｋ，Ｃ．Ｗ．＆Ｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄｏｘ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆ−Ａｃｔｉｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  Ｍｉｃａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４，１７１０−１７１３，（２０１１）．
３８  Ｌｅｅ，Ｂｙｕｎｇ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＭｓｒＢ１  ａｎｄ  ＭＩＣＡＬｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ａｃｔｉｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５１，３９７−４０４，（２０１３）．
３９  Ｍｏｓｋｏｖｉｔｚ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＭｓｒＡ）ｉｓ  ａ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９８，１２９２０−１２９２５，（２００１）．
４０  Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，８６０−８６６，（２０１６）．
４１  Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．＆Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４９，５１４４−５１４６，（２０１３）．
４２  Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｄ．Ａ．＆Ｗｅｅｒａｐａｎａ，Ｅ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｄｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４，１８−２６，（２０１５）．
４３  Ｃｒａｉｇ，Ｒ．＆Ｂｅａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ．ＴＡＮＤＥＭ：Ｍａｔｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０，１４６６−１４６７，（２００４）．
４４  Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｄｒｕｇ  ｔｏ  Ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｄｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，９２５−９３２，（２００８）．
４５  Ｓｐｅｅｒｓ，Ａ．Ｅ．＆Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．Ａ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２７，１００１８−１００１９，（２００５）．
４６  Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ−Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｌ．Ａ．＆Ｍｉｃｈｅｌｓ，Ｐ．Ａ．Ｍ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５９，１０５−２３５，（１９９３）．
４７  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，１０２９−１０３３，（２００９）．
４８  Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ＳＦ２３１２  ｉｓ  ａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｅｎｏｌａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，（２０１６）．
４９  Ｓｚｙｃｈｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｖｉａ  Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３２，１８３５１−１８３６０，（２０１０）．
５０  Ｗｏｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｉａｖａｒｏｎｅ，Ａ．Ｔ．，Ｓｐｉｃｉａｒｉｃｈ，Ｄ．Ｒ．，Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ，Ｋ．Ｋ．＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（ＩｓｏＴａＧ）：Ａ  Ｍａｓｓ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｎ−  ａｎｄ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，５６１−５６７，（２０１５）．
５１  Ｒｙａｎ，Ｏ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｓｙｓｔｅｍ．ｅＬｉｆｅ  ３，ｅ０３７０３，（２０１４）．
５２．Ｄ．Ｔ．Ｈｅｓｓ，Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｏ．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｅ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ｓ．Ｓｔａｍｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｐｕｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６，１５０−１６６（２００５）．
５３．Ｂ．Ｄ’Ａｕｔｒｅａｕｘ，Ｍ．Ｂ．Ｔｏｌｅｄａｎｏ，ＲＯＳ  ａｓ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｈａｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ＲＯＳ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８，８１３−８２４（２００７）．
５４．Ｂ．Ｃ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．Ｃｈａｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，５０４−５１１（２０１１）．
５５．Ｈ．Ｃ．Ｈａｎｇ，Ｍ．Ｅ．Ｌｉｎｄｅｒ，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．
１１１，６３４１−６３５８（２０１１）．
５６．Ｏ．Ｋａｂｉｌ，Ｖ．Ｖｉｔｖｉｔｓｋｙ，Ｒ．Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓｕｌｆｕｒ  ａｓ  ａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆｉｄｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．３４，１７１−２０５（２０１４）．
５７．Ｍ．Ｖｏｌｇｒａｆ，Ｐ．Ｇｏｒｏｓｔｉｚａ，Ｒ．Ｎｕｍａｎｏ，Ｒ．Ｈ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｅ．Ｙ．Ｉｓａｃｏｆｆ，Ｄ．Ｔｒａｕｎｅｒ，Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎ  ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｗｉｔｃｈ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，４７−５２（２００６）．
５８．Ｊ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｙ．Ｙ．Ｌｕ，Ｊ．Ａ．Ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４，７７４−７８０（２０１０）．
５９．Ｎ．Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．Ｂ．Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｃｈｏｏｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，８７６−８８４（２０１１）．
６０．Ｗ．Ｌ．Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．Ａｌｔｅｎｂａｃｈ，Ｚ．Ｙａｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｐｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２３，７２５−７３３（２０１３）．
６１．Ｑ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｓａｂｎｉｓ，Ｚ．Ｚｈａｏ，Ｔ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｂｕｈｒｌａｇｅ，Ｌ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．Ｓ．Ｇｒａｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｏｍｅ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０，１４６−１５９（２０１３）．
６２．Ｃ．Ｓ．ＭｃＫａｙ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ：Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２１，１０７５−１１０１（２０１４）．
６３．Ｏ．Ｋｏｎｉｅｖ，Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４４，５４９５−５５５１（２０１５）．６４．Ｎ．Ｋｒａｌｌ，Ｆ．Ｐ．ｄａ  Ｃｒｕｚ，Ｏ．Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ，Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ，Ｓｉｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．８，１０３−１１３（２０１６）．
６５．Ｐ．Ｊ．Ｖｉｔｈａｙａｔｈｉｌ，Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，２３４３−２３５１（１９６０）．
６６．Ｃ．Ｋｌｅａｎｔｈｏｕｓ，Ｊ．Ｒ．Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１０９３５−１０９３９（１９９０）．Ｍｅｄｌｉｎｅ
６７．Ｊ．Ｒ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｔ．Ｊ．Ｄｅｍｉｎｇ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖｉａ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １３，１７１９−１７２３（２０１２）．
６８．Ｔ．Ｌ．Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．Ｍｏｏｄｙ，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｓｕｌｆｉｌｉｍｉｎｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７７，４０９−４３５（１９７７）．
６９．Ｋ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｔ．Ｐ．Ｙｏｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｏｘａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１４，８０１６−８０３６（２０１４）．
【図１Ａ】
2020500186.tif 000028
【図１Ｂ】
2020500186.tif 000029
【図１Ｃ】
2020500186.tif 000030
【図１Ｄ】
2020500186.tif 000031
【図２Ａ】
2020500186.tif 000032
【図２Ｂ】
2020500186.tif 000033
【図３】
2020500186.tif 000034
【国際調査報告】
2020500186.tif 000035
2020500186.tif 000036
2020500186.tif 000037