(57)【要約】  本発明は、ミトコンドリア遺伝子疾患を処置するための方法に関する。本発明者らは、患者及び対照個体に由来する初代線維芽細胞を用いて研究し、ウェスタンブロット用のタンパク質溶解液を回収した。重要なことには、本発明者らは、ミトコンドリア遺伝子異常が、対照の線維芽細胞と比較してリボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）のリン酸化の有意な増加を示すことを観察し、これは過剰に活性化されたｍＴＯＲシグナル伝達を示す。ミトコンドリア異常を有する患者及び対照細胞を、ＤＭＳＯ又はＢＹＬ７１９を用いて４８時間処置した。ミトコンドリア病を有する患者の全ての株が、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）染色強度によって決定される低下した膜電位、並びにミトコンドリアの異常な形態、断片化、及び脱分極した（ＴＭＲＥの染色度が低い）ミトコンドリアの存在を示す。ＢＹＬ７１９を用いての処置は、全てのミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ＭＥＬＡＳ）線維芽細胞におけるこれらの表現型を減弱したが、対照細胞に対しては明白な影響を全く及ぼさなかった。フローサイトメトリーを使用した類似の実験は、ＭＥＬＡＳ線維芽細胞におけるＢＹＬ７１９による処置による、膜電位（ＴＭＲＥ）の救出を確認した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に治療有効量のＰＩ３Ｋ阻害剤を投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるミトコンドリア遺伝子疾患を処置するための方法。
【請求項２】
ＰＩ３Ｋ阻害剤が低分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＰＩ３Ｋ阻害剤がＢＹＬ７１９（アルペリシブ）である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＰＩ３Ｋ阻害剤がＧＤＣ−００３２（タセリシブ）である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ミトコンドリア遺伝子疾患がリー症候群である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ミトコンドリア遺伝子疾患が運動失調である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ミトコンドリア遺伝子疾患が小脳形成不全である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ミトコンドリア遺伝子疾患がカーンズ・セイヤー症候群である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ｉ）試験化合物を提供する工程、及びｉｉ）該試験化合物のＰＩ３Ｋ活性抑制能を決定する工程を含む、ミトコンドリア遺伝子疾患の処置に適した薬物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ミトコンドリア細胞症などのミトコンドリア遺伝子疾患の処置のための方法及び組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
ミトコンドリア病は、ミトコンドリア機能障害の結果として生じる臨床的かつ遺伝子的に不均一な異常のグループである１。遺伝性ミトコンドリア病は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の突然変異、又はミトコンドリアタンパク質をコードしている核内遺伝子の突然変異によって引き起こされる可能性があり、全罹患率はおよそ１/５，０００であると推定されている１。ミトコンドリア異常に罹った患者の臨床表現型はかなり不均一である２。ｍｔＤＮＡの突然変異から生じたミトコンドリア異常を有する個体は、各細胞内に突然変異型ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡの混合物を有し得る。突然変異ｍｔＤＮＡの比率は個体間で、並びに同じ個体内の臓器間及び組織間で異なり、異なる臨床表現型の原因となる３。
【０００３】
現在、あらゆる病因のミトコンドリア病の効果的な処置方法は全くなく、管理は主に支持的である。小規模な無比較試験では、ビタミンＣ及びＫ、チアミン、リボフラビン、及びユビキノンが、個々の症例において様々な程度の効果を示している４。近年の実験研究は、カロリー制限又は遺伝子操作を通して減少したｍＴＯＲシグナル伝達が、ミトコンドリアタンパク質をコードしている遺伝子に突然変異を有している酵母の寿命を救出することを実証している５。さらに、本発明者らは近年、ｍＴＯＲ６の薬理学的阻害を使用した、ヒトミトコンドリア病であるリー症候群のマウスモデル（Ｎｄｕｆｓ４−/−マウス）における、疾患の頑強な減弱を報告した７。本発明者らは、Ｎｄｕｆｓ４−/−マウスが、代謝異常及び進行的な神経疾患を伴う罹患組織（脳）において、増加した組織内ｍＴＯＲ活性化を示すことを観察した。重要なことには、本発明者らは、ｍＴＯＲの特異的阻害剤であるラパマイシンが、神経症状及び神経病変の発症を実質的に遅延させ、Ｎｄｕｆｓ４−/−マウスの寿命を延長したことを発見した６。
【０００４】
ラパマイシンは、実質臓器移植後に同種移植片拒絶を防ぐために使用される免疫抑制薬であるが８、９、深刻な副作用を頻繁に伴い、それにより使用は制限される１０。他の治療薬が実際に必須であり得る。したがって、ミトコンドリア遺伝子疾患を処置するための新規な治療戦略を発見することが必要である。
【０００５】
発明の要約：
本発明は、被験者に治療有効量のＰＩ３Ｋ阻害剤を投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるミトコンドリア遺伝子疾患を処置するための方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００６】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、患者及び対照個体に由来する初代線維芽細胞を用いて研究し、ウェスタンブロット用のタンパク質溶解液を回収した。重要なことには、本発明者らは、ミトコンドリア遺伝子異常が、対照の線維芽細胞と比較してリボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）のリン酸化の有意な増加を示すことを観察し、これはｍＴＯＲシグナルが過剰に活性化されていることを示す。ミトコンドリア異常を有する患者及び対照細胞を、ＤＭＳＯ又はＢＹＬ７１９を用いて４８時間処置した。ノバルティス社によって合成されたＢＹＬ７１９は、進行固形腫瘍の第ＩＩ相/第ＩＩＩ相臨床試験中である。ミトコンドリア病を有する患者の全ての株が、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）の染色強度によって決定される低下した膜電位、並びにミトコンドリアの異常な形態、断片化、及び脱分極した（ＴＭＲＥの染色度が低い）ミトコンドリアの存在を示す。ＢＹＬ７１９を用いての処置は、全てのミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ＭＥＬＡＳ）線維芽細胞におけるこれらの表現型を減弱したが、対照細胞に対しては明白な影響を全く及ぼさなかった。フローサイトメトリーを使用した類似の実験は、ＭＥＬＡＳ線維芽細胞におけるＢＹＬ７１９による処置による、膜電位（ＴＭＲＥ）の回復を確認した。
【０００７】
したがって、本発明は、被験者に治療有効量のＰＩ３Ｋ阻害剤を投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるミトコンドリア遺伝子疾患を処置するための方法に関する。
【０００８】
本明細書において使用する「処置する」又は「処置」という用語は、予防的処置又は防止的処置、並びに、治癒的処置又は疾患修飾的処置（疾患に罹るリスクがあるか又は疾患に罹っていることが疑われる被験者、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態を患っていると診断されている被験者の処置を含む）の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいは、このような処置を行なわなかった時に予想される生存期間を超えて被験者の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか又は最終的に障害に罹る可能性のある被験者に処置が投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に被験者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は、（部分的に又は全体に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、被験者が長期間（数か月又は数年間）にわたり寛解を保つために、病気の処置中に被験者の維持のために使用される、治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、定期的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば、疼痛、疾患の徴候など］）の到達時の処置を使用し得る。
【０００９】
本明細書において使用する「ミトコンドリア遺伝子疾患」という用語は、ミトコンドリア機能障害の結果として生じる臨床的かつ遺伝子的に不均一な異常のグループを指す１。ミトコンドリア遺伝子異常は、ミトコンドリアＤＮＡ又は核内ＤＮＡのいずれかの突然変異によって引き起こされ、これによりミトコンドリアの機能障害及びエネルギーの不適切な発生がもたらされる。ミトコンドリア遺伝子異常の例：ミトコンドリア細胞症、アミドグリコシド系薬剤により誘発される難聴；慢性進行性外眼筋麻痺；枯渇症候群；カーンズ・セイヤー症候群；レーバー遺伝性視神経症；リー症候群；小脳形成不全；ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ＭＥＬＡＳ）；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん；母性遺伝リー症候群；神経原性衰弱、運動失調、及び網膜色素変性症；ピアソン症候群；小頭症、視神経萎縮症、乳酸アシドーシス、視覚神経萎縮症、痙性対麻痺、フリードライヒ運動失調症、運動失調症伴う鉄芽球性貧血、鉄芽球性貧血、脳筋症、細尿管症、運動失調症、肥大型心筋症（長軸方向）、又はアルパース症候群。
【００１０】
本明細書において使用する「被験者」という用語は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類を指す。特に、本発明において、被験者は、上記のようなミトコンドリア遺伝子異常疾患の少なくとも１つに罹患しているか又は罹患していることが疑われるヒトである。
【００１１】
本明細書において使用する「ＰＩ３Ｋ」という用語は、ホスファチジルイノシチド３−キナーゼとも呼ばれるホスホイノシチド３−キナーゼを指す。ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のイノシトール環の３’ヒドロキシル基をリン酸化する酵素ファミリーに属する。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路は活性化され得、これにより、ＰＩＰ２からＰＩＰ３が合成される。
【００１２】
本明細書において使用する「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋの活性又は発現を抑制する生物学的作用を有する、天然化合物又は合成化合物を指す。より特定すると、このような化合物は、ＰＩ３Ｋファミリーの少なくとも一員、例えばクラスＩのＰＩ３Ｋの少なくとも一員のキナーゼ活性を抑制することができる。特定の実施態様では、該ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラスＩのＰＩ３Ｋ（ｐ１１０として知られる）又はアイソフォーム、特にクラスＩのＰＩ３Ｋアイソフォーム（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０γ、又はｐ１１０δの４種類のアイソフォームの中の）のパン（ｐａｎ）阻害剤であり得る。
【００１３】
特定の実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ペプチド、ペプチド模倣体、小有機分子、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「ペプチド模倣体」という用語は、ペプチドを模倣するように設計された小タンパク質様の鎖を指す。特定の実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物を代表するクラスの分子である。アプタマーは、高い親和性及び特異性で標的分子の実質的にどのようなクラスも認識することのできるオリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。
【００１４】
特定の実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、小有機分子である。「小有機分子」という用語は、医薬品に一般的に使用される有機分子と同等なサイズの分子を指す。該用語は、生体巨大分子（例えばタンパク質、核酸など）を除外する。好ましい小有機分子のサイズの範囲は、最大約５０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、最も好ましくは最大約１０００Ｄａである。
【００１５】
特定の実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、以下の化合物の中から選択されたＰＩ３Ｋのアイソフォームに選択的な阻害剤である低分子である：ＢＹＬ７１９（アルペリシブ、ノバルティス社）、ＧＤＣ−００３２（タセリシブ、ジェネンテック社／ロシュ社）、ＢＫＭ１２０（ブパリシブ）、ＩＮＫ１１１７（ミレニアム社）、Ａ６６（オークランド大学）、ＧＳＫ２６０３０１（グラクソスミスクライン社）、ＫＩＮ−１９３（アストラゼネカ社）、ＴＧＸ２２１（モナシュ大学）、ＴＧ１２０２、ＣＡＬ１０１（イデラリシブ、ギリアド・サイエンシズ社）、ＧＳ−９８２０（ギリアド・サイエンシズ社）、ＡＭＧ３１９（アムジェン社）、ＩＣ８７１１４（アイコス社）、ＢＡＹ８０−６９４６（コパンリシブ、バイエル・ヘルスケア社）、ＧＤＣ０９４１（ピクチリシブ、ジェネンテック社）、ＩＰＩ１４５（デュベリシブ、インフィニティ社）、ＳＡＲ４０５（サノフィ社）、ＰＸ−８６６（オンコセリオン社）、又はそれらの薬学的に許容される塩。このようなＰＩ３Ｋ阻害剤は当技術分野において周知であり、例えば、Wang et al Acta Pharmacological Sinica (2015) 36: 1170-1176に記載されている。
【００１６】
特定の実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＢＹＬ７１９である。本明細書において使用する「ＢＹＬ７１９」という用語は、突然変異ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によって活性化されるｐ１１０αアイソフォームに選択的なＡＴＰ競合的経口用ＰＩ３Ｋ阻害剤である（Furet P., et al. 2013; Fritsch C., et al 2014）。この分子はアルペリシブとも呼ばれ、当技術分野において以下の式Ｃ１９Ｈ２２Ｆ３Ｎ５Ｏ２Ｓ及び構造を有する：
【化１】
2020515588.tif 000002
【００１７】
特定の実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はロシュ社によって開発されたＧＤＣ−００３２である。タセリシブとも呼ばれるこの分子は、当技術分野において以下の式Ｃ２４Ｈ２８Ｎ８Ｏ２及び構造を有する：
【化２】
2020515588.tif 000003
【００１８】
いくつかの実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は抗体である。本明細書において使用する「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示す限りにおける抗体断片を網羅する。該用語は、抗原結合ドメインを含む抗体断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、タンデム抗体ダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、鎖状抗体、ミニボディーズ、ダイアボディーズ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（それぞれ二重特異性又は三重特異性ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合物）；ｓｃ−ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディーズ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体、Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（小型イムノプロテイン、一種のミニ抗体）；ＳＭＩＰ（「小型モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃダイマー）；ＤＡＲＴ（二本鎖安定化ダイアボディ「デュアル親和性再標的化」）；１つ以上のＣＤＲを含む小型抗体模倣体などを含む。様々な抗体をベースとした構築物及び断片を調製及び使用するための技術は当技術分野において周知である（Kabat et al., 1991を参照、これは本明細書に参照により具体的に組み入れられる）。ダイアボディーズは、特に、欧州特許第４０４，０９７号及び国際公開公報第９３／１１１６１号にさらに記載され；一方、鎖状抗体は、Zapata et al.（1995）にさらに記載されている。抗体は、従来の技術を使用して断片化されていてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ'）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって作製され得る。結果として得られたＦ（ａｂ'）２断片を、ジスルフィド橋を還元するように処理することにより、Ｆａｂ’断片を作製することができる。パパインによる消化により、Ｆａｂ断片を形成することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓ、ＴａｎｄＡｂｓ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディーズ、ダイアボディーズ、二重特異性抗体断片、及び他の断片はまた組換え技術によって合成されても、又は化学合成されてもよい。抗体断片を作製するための技術は、当技術分野において周知であり記載されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001 ; Reiter et al., 1996；及びYoung et al., 1995はそれぞれ、効果的な抗体断片の作製をさらに記載し、その作製を可能としている。いくつかの実施態様では、抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような「キメラ」抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、米国特許第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号に記載のようなヒト化抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はヒト抗体である。米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号に記載のような「ヒト抗体」。いくつかの実施態様では、抗体は、欧州特許第０３６８６８４号、国際公開公報第０６/０３０２２０号及び国際公開公報第０６/００３３８８号に記載のような単一ドメイン抗体である。特定の実施態様では、阻害剤はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、連続的な細胞株の培養による抗体分子の作製をもたらす任意の技術を使用して調製及び単離され得る。作製及び単離のための技術としては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶハイブリドーマ技術が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
特に、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋに対して特異性を有する細胞内抗体である。本明細書において使用する「細胞内抗体」という用語は一般的に、細胞内の抗体又は抗体断片を指す。抗体、特に一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）は、細胞内局在化のために改変されていてもよい。このような改変は、例えば、安定な細胞内タンパク質、例えばマルトース結合タンパク質への融合、又は、例えば小胞体への保持などの、細胞内輸送／局在化ペプチド配列の付加を包含し得る。いくつかの実施態様では、細胞内抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施態様では、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、天然状態で軽鎖を欠失しているラクダ化哺乳動物に認められ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは特にラクダのｓｄＡｂである。
【００２０】
いくつかの実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＵＳＰ１４の発現を阻害する、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施態様では、ＵＳＰ１４の発現の阻害剤はｓｉＲＮＡである。短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、堅いヘアピンターンを作るＲＮＡ配列であり、これはＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンス状態とするために使用することができる。ｓｈＲＮＡは一般的に、細胞内に導入されたベクターを使用して発現され、ここでのベクターは、ｓｈＲＮＡが常に発現されることを確保するためにＵ６プロモーターを使用する。このベクターは通常、娘細胞に継代され、これにより、遺伝子サイレンシングは遺伝することが可能となる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞内機序によって切断されてｓｉＲＮＡとなり、これは次いで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、それが結合したｓｉＲＮＡに適合するｍＲＮＡに結合し、切断する。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、時に短い干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られるが、これは生物学において様々な役割を果たす、２０〜２５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。中でも注目すべきは、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、これによりｓｉＲＮＡは特定の遺伝子の発現に干渉する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含み、標的ｍＲＮＡに結合し、これにより、タンパク質の翻訳を妨げるか又はｍＲＮＡの分解を増加させ、これにより標的化タンパク質のレベルを減少させ、よって細胞内の活性を低下させることによって、標的化ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用するだろう。例えば、少なくとも約１５塩基で、ｍＲＮＡ転写物配列の特有の領域に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のホスホジエステル技術によって合成することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照）。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、インビボにおいて単独で又はベクターと結合させて送達され得る。その最も広い意味における「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸の、細胞及び典型的には肥満細胞への導入を促進することのできる任意のビヒクルである。典型的には、ベクターは、ベクターの非存在下で起こるであろう分解度と比較して低い分解度で、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸配列の挿入又は組込みによって操作されている、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス起源又は細菌起源に由来する他のビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、これには、以下のウイルスに由来する核酸配列を含むがこれらに限定されない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプシュタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターも容易に使用することができる。
【００２１】
いくつかの実施態様では、ＰＩ３Ｋ発現阻害剤は、エンドヌクレアーゼである。ここ数年間、シークエンス技術における圧倒的な進歩は、がんの複数の遺伝子異常についての先例のない詳細な概要を提供した。新規な発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の候補のリストをかなり増やすことによって、これらの新規なデータは、これらの遺伝子の正常な機能及び病的な機能を特徴付け、かつそれらの役割を、特に発癌発生最中の駆動因子としての役割を評価するための、迅速かつ信頼性のある戦略の必要性を強く強調する。ｃＤＮＡの過剰発現又はＲＮＡ干渉によるダウンレギュレーションなどのより慣習的なアプローチの代替法として、新規な技術は、ゲノムの直接操作を通してがんに観察される実際の突然変異を再構築する手段を提供する。実際に、天然の及び工学操作されたヌクレアーゼ酵素は、近年、かなりの注目を集めている。エンドヌクレアーゼに基づいたゲノム不活性化の背後にある機序は一般的に、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡの切断という第一工程を必要とし、これはその後、ＤＮＡ不活性化のために活用することのできる、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度の相同性指向修復（ＨＤＲ）というＤＮＡ修復のための２つの明確に異なる細胞機序をトリガーし得る。
【００２２】
特定の実施態様では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓである。本明細書において使用する「ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、原核細胞ＤＮＡを含有している短い反復塩基配列のセグメントである、クラスター化して規則的に配置された短い回分構造反復配列に結合したエンドヌクレアーゼを指す。
【００２３】
いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系は、米国特許出願第８６９７３５９Ｂ１号及び米国特許出願第２０１４／００６８７９７号に記載されている。元来、原核細胞における獲得免疫系（Barrangou and Marraffini, 2014）であるＣＲＩＳＰＲは近年、ゲノム編集のための新規で強力なツールへと工学操作されている。ヒト（Mali et al., 2013, Science, Vol. 339 : 823-826）、細菌（Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671）、ゼブラフィッシュ（Hwang et al., 2013,  PLoS One, Vol. 8:e68708）、カエノラブディティス・エレガンス（C.elegans）（Hai et al., 2014 Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11）、細菌（Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671）、植物（Mali et al., 2013, Science, Vol. 339 : 823-826）、アフリカツメガエル（Guo et al., 2014, Development, Vol. 141 : 707-714）、酵母（DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res., Vol. 41 : 4336-4343）、ショウジョウバエ（Gratz et al., 2014 Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713）、サル（Niu et al., 2014, Cell, Vol. 156 : 836-843）、ウサギ（Yang et al., 2014, J. Mol. Cell Biol., Vol. 6 : 97-99）、ブタ（Hai et al., 2014, Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11）、ラット（Ma et al., 2014, Cell Res., Vol. 24 : 122-125）、及びマウス（Mashiko et al., 2014, Dev. Growth Differ. Vol. 56 : 122-129）を含む、多くの細胞株及び生物における重要な遺伝子を標的化するために、それは成功裡にすでに使用されている。いくつかのグループが今日、単一のｇＲＮＡを介して、特定の標的遺伝子内に単一点突然変異（欠失又は挿入）を導入するためにこの方法を利用している。一対のｇＲＮＡ指向性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを代わりに使用して、大きな欠失、又は逆位若しくは転座などのゲノム再編成を導入することも可能である。近年のエキサイティングな進展は、転写調節、エピジェネティック修飾、及び特定のゲノム座の顕微鏡による可視化のためにタンパク質ドメインを標的化するためのｄＣａｓ９バージョンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用である。
【００２４】
いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１であり、これは、つい最近特徴付けられた、Zetsche et al.（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13）におけるプロボテラとフランシセラ１に由来するＣＲＩＳＰＲ（CRISPR from Provotella and Francisella 1）（Ｃｐｆ１）である。
【００２５】
本明細書において使用する「投与している」又は「投与」という用語は、体外に存在しているような物質（例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤）を、例えば粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達、及び／又は本明細書に記載されているか若しくは当技術分野において公知である任意の他の物理的送達法によって、被験者に注射するか若しくは他の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状を治療する場合、該物質の投与は典型的には、該疾患又はその症状の発症後に行なわれる。疾患又はその症状を予防する場合、該物質の投与は典型的には、該疾患又はその症状の発症前に行なわれる。
【００２６】
「治療有効量」は、被験者に治療的利点を付与するのに必要とされる最小量の活性薬剤を意図する。例えば、被験者に対する「治療有効量」は、病的症状、疾患の進行、又は障害に負けることを伴う若しくは障害に負けることに対する抵抗性を伴う生理学的容態の改善を誘導するか、寛解するか、又は別様に引き起こすような量である。本発明の化合物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決断されるであろうことが理解されるであろう。任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成；被験者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的な化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知である同様な因子をはじめとする、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることは、十分に当業者の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、成人１人あたり１日あたり０．０１〜１，０００mgの広い範囲におよび変更されてもよい。典型的には、該組成物は、処置される予定の被験者への症状による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含有している。薬物の有効量は通常、０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）/日、特に約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）/日の用量レベルで供給される。
【００２７】
上記のようなＰＩＫ３ＣＡ阻害剤を、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせることにより、医薬組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又はあらゆる種類の製剤化助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性成分を単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。典型的には、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防御されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。該ポリペプチド（又はそれをコードする核酸）は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に組み込み、その後、ろ過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前にろ過滅菌されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。製剤化時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のようなタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下点滴療法用の液体１０００mlに加えるか又は提案された注入部位に注射し得る。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、ｉ）試験化合物を準備する工程、及びｉｉ）該試験化合物のＰＩ３Ｋ活性抑制能を決定する工程を含む、ミトコンドリア遺伝子疾患の処置に適した薬物をスクリーニングする方法に関する。
【００２９】
当技術分野において周知である任意の生物学的アッセイが、ＰＩ３Ｋの活性を阻害する試験化合物の能力を決定するのに適し得るだろう。いくつかの実施態様では、アッセイはまず、試験化合物がＰＩ３Ｋに結合する能力を決定する工程を含む。いくつかの実施態様では、次いで、細胞集団を接触させて活性化させ、これにより、試験化合物のＰＩ３Ｋ活性阻害能を決定する。特に、試験化合物によってトリガーされる効果は、試験化合物の非存在下又は対照薬剤の存在下（これはいずれも陰性対照条件と類似している）において平行してインキュベートされた免疫細胞集団の効果と比較して決定される。本明細書において使用する「対照物質」、「対照薬剤」又は「対照化合物」という用語は、生物学的活性又は発現を調節する能力に関して、不活性であるか又は活性を全く有さない分子を指す。本明細書に記載のインビトロでの方法を使用して決定されるような、ＰＩ３Ｋの活性を阻害することのできる試験化合物は、インビボでの適用においても類似した調節能を示すようであることを理解されたい。典型的には、試験化合物は、ペプチド、ペプチド模倣体、小有機分子、アプタマー、又は核酸からなる群より選択される。例えば、本発明による試験化合物は、以前に合成された化合物ライブラリー、又はその構造がデータベースにおいて決定されている化合物ライブラリー、又は新規に合成された化合物ライブラリーから選択され得る。いくつかの実施態様では、試験化合物は、小有機分子から選択され得る。
【００３０】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ミトコンドリア異常を有する患者に由来する初代線維芽細胞株におけるｍＴＯＲ活性化及びミトコンドリア障害。Ａ）主なＭＥＬＡＳ患者及び対照線維芽細胞株に由来する溶解液のウェスタンブロットであり、これはＭＥＬＡＳ患者におけるｍＴＯＲＣ１の過剰活性化を示す。細胞を、ＤＭＳＯ、ＢＹＬ７１９、又はシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を用いて４８時間処置し、リン酸化されたリボソームタンパク質Ｓ６、全ｒｐＳ６、及びＧＡＰＤＨ、並びに定量のためにプローブした。ＢＹＬ７１９を用いての４８時間の処置によりＳ６のリン酸化は阻害され、一方、シクロスポリンＡを用いての処置は、有意な影響を全く及ぼさなかった。Ｂ）他のミトコンドリア異常及び対照線維芽細胞株に由来する溶解液のウェスタンブロットであり、これは、ＭＥＬＡＳ患者におけるｍＴＯＲＣ１の過剰活性化を示す。細胞を、ＤＭＳＯ又はＢＹＬ７１９を用いて４８時間処置し、リン酸化されたリボソームタンパク質Ｓ６、全ｒｐＳ６、及びＧＡＰＤＨ、並びに定量のためにプローブした。ＢＹＬ７１９を用いての４８時間の処置によりＳ６のリン酸化は阻害された。Ｃ）ＤＭＳＯ又はＢＹＬ７１９を用いて４８時間処置され、ミトコンドリア膜電位（テトラメチルローダミンエチルエステル、ＴＭＲＥ、赤色）、ミトコンドリア質量（１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ、１０−ＮＡＯ、緑色）、及びＤＮＡ（ヘキスト３３３４２、青色）について染色された、初代線維芽細胞株の代表的な共焦点顕微鏡画像。
【図２】１日１回のＢＹＬ７１９の投与は、動物の生存率を劇的に改善した。２１日令のＮｄｕｆｓ４−/−マウスを、ＰＩ３ＫＣＡ阻害剤であるＢＹＬ７１９（MedChem Express社；０．５％カルボキシメチルセルロース（シグマアルドリッチ社）中５０mg/kg、１日１回の経口投与）（ｎ＝９）又はビヒクル（０．５％カルボキシメチルセルロース（シグマアルドリッチ社）、１日１回の経口投与）（ｎ＝８）を用いて処置した。
【００３２】
実施例：
実施例１：ＢＹＬ７１９による短期間の処置による、ミトコンドリアの形態及び膜電位の救出
材料及び方法
患者
ミトコンドリア遺伝子異常を有する９人の患者（ＭＥＬＡＳ ｎ＝４、リー症候群ｎ＝３、運動失調及び小脳形成不全ｎ＝１、及びカーンズ・セイヤー症候群ｎ＝１）及び４人の健康な対照個体は、皮膚生検を受け、皮膚線維芽細胞が単離された。皮膚パンチ生検材料を、標準的な方法を使用して回収した。
【００３３】
初代皮膚線維芽細胞培養液の作製
皮膚線維芽細胞培養液を作製するために、生検材料を細かく切り刻み、室温で、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（サーモフィッシャー社２５３０００５４）溶液中で３０分間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。細胞を、７００ｇで１０分間の遠心分離によって回収し、２５％ＦＢＳを含有している細胞培養培地中に再懸濁し、２４ウェルプレート上に蒔いて株を確立した。線維芽細胞培養液を、１００ＩＵペニシリン及び５００μg/mLのストレプトマイシンの最終濃度となるまで２５％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（コーニング社３０−００１−ＣＩ）の補充された１×ＭＥＭ（コーニング社１０−０１０−ＣＶ）中で増殖させて維持した。
【００３４】
ミトコンドリア膜電位及び形態の分析
集密な培養液からの類似した集団倍加（ＰＤは約１０＋/−２）の細胞を、カバーガラスチャンバースライド上に１：４で蒔き、約８０％の集密度となるまで増殖させた。培地を交換し、ＤＭＳＯ（フィッシャー社ＢＰ３２１−１）中５μmol/LのＢＹＬ７１９（ChemExpress社）、又は等容量のＤＭＳＯを４８時間かけて補充した。細胞を、１００nMのテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、フィッシャー社ＢＤＢ５６４６９６）及び５μg/mLのヘキスト３３３４２（Biotium社８９１３９−１２６）を含む培地で１５分間かけて染色し、ライカ社のＳＰ５共焦点顕微鏡で画像撮影した。試料を処理し、同一のイメージングパラメーターを使用して１つのセッションにおいて画像撮影した。細胞をＴＭＲＥのみ又は１０−Ｎ−ノニルアクリジンオレンジ（１０−ＮＡＯ）で染色し、トリプシン−ＥＤＴＡを含有している色素を用いて室温で１０分間かけて解離し、遠心分離、冷ＰＢＳ中への再懸濁、並びにそれぞれＴＭＲＥ及び１０−ＮＡＯについて５８５/４２バンドパスフィルタ及び５３０/３０バンドパスフィルタを用いた４８８nmの励起を使用したBD Canto IIフローサイトメーターでの分析によって、細胞を回収することによって、フローサイトメトリー分析が実施された。シングルゲートを、前方散乱及び側方散乱を使用してセルに設定し、全ての設定はデータ回収の初めから終わりまで不変であった。各試料について１０，０００回以上のイベントを回収した。
【００３５】
ウェスタンブロットによるＳ６リン酸化の分析
コンフルエントな培養液からの類似した集団倍加（ＰＤは約１０＋/−２）の細胞を１：４で蒔き、約８０％のコンフルエントとなるまで増殖させた。培地は、ＤＭＳＯ中５μmol/LのＢＹＬ７１９（Chem Express社）又は等容量のＤＭＳＯを含有している培地と４８時間で交換した。培養液を１×ＰＢＳで濯ぎ、０．０５％トリプシンで１０分間処理し、４℃での遠心分離によって回収し、ペレットをドライアイス上で急速凍結した。タンパク質溶解液を、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤（ピアス社ＰＩ７８４４１）を含有している１×ＲＩＰＡ緩衝液（ピアス社８９９００）を細胞ペレットに直接添加し、最大出力でＸＬ−２０００（QSonica社）を用いて１０回の１秒間バーストで氷上で超音波処理し、遠心分離にかけて細胞片を除去することによって回収した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（ピアス社ＰＩ２３２２８）によって決定し、等量のタンパク質を４〜１２％ビス−トリス２６ウェルNuPageミディゲル（フィッシャー社ＷＧ１４０３）に流し、ニトロセルロースブロット（フィッシャー社ＩＢ２３００１）に転写した。ブロットをライコア社Odyssey遮断緩衝液（ライコア社４２７−４０１００）で遮断し、一次抗体を、抗ｐＳ６抗体、抗Ｓ６抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（それぞれ、セルシグナリング社の４８５８Ｐ、２２１７Ｓ、及び２１１８Ｓ）を用いて、次いで、二次抗体ＩＲＤｙｅ８００ロバ抗ウサギ抗体（ライコア社９２５−３２２１３）を用いてプローブし、以前に記載のように９、ライコア社Odyssey Clx走査イメージャーを使用して画像撮影した９。データを、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪを使用して定量した１１。
【００３６】
統計分析
全てのデータを、平均値＋/−標準誤差として提示した。グループ間の比較を、両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。Ｐ＜０．０５を有意と判断した。容積曲線の統計的比較を、示されているようなログランク検定を使用して実施した。
【００３７】
結果
ミトコンドリア病を有する患者の線維芽細胞の初代培養液中における過剰活性ｍＴＯＲシグナル伝達
本発明者らの以前の研究において本発明者らは、リー症候群マウスモデルの全脳溶解液中でｍＴＯＲが過剰活性化されていることを発見した６。ｍＴＯＲ経路が、ミトコンドリア遺伝子異常においても過剰活性であるかどうかを調べるために、本発明者らは、患者及び対照個体に由来する初代線維芽細胞を培養し、ウェスタンブロット用のタンパク質溶解液を回収した。重要なことには、本発明者らは、ミトコンドリア遺伝子異常が、対照線維芽細胞と比較してリボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）のリン酸化の有意な増加を示すことを観察し、これは、過剰活性化されたｍＴＯＲシグナル伝達を示す（図１Ａ）。本発明者らはまた、ミトコンドリア異常を有する全ての細胞株において同じ所見を観察した（図１Ｂ）。
【００３８】
次いで、ミトコンドリア異常を有する患者及び対照細胞を、ＤＭＳＯ又はＢＹＬ７１９を用いて４８時間処置した。ＢＹＬ７１９による４８時間の処置により、全ての細胞株においてｐＳ６のレベルは減少した（図１Ａ及び１Ｂ）。
【００３９】
ＢＹＬ７１９による短期間の処置による、ミトコンドリアの形態及び膜電位の救出
ミトコンドリア機能の一般的指標である、ミトコンドリアの形態及び膜電位に対するｍＴＯＲ阻害の影響を調べるために、本発明者らは、皮膚線維芽細胞をＢＹＬ７１９又はＤＭＳＯで処置した。細胞を、ミトコンドリア膜電位のマーカーであるＴＭＲＥ、及び膜電位不感受性のミトコンドリア質量マーカーとして作用するミトコンドリア内膜のマーカーである１０−ＮＡＯで染色した（図１Ｃ）。ミトコンドリア病を有する患者に由来する全ての株が、ＴＭＲＥ染色強度によって決定される低下した膜電位、並びにミトコンドリアの異常な形態、断片化、及び脱分極した（ＴＭＲＥの染色度が低い）ミトコンドリアの存在を示す。ＢＹＬ７１９による処置は、全てのＭＥＬＡＳ線維芽細胞におけるこれらの表現型を減弱したが、対照細胞に対しては全く明白な影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。フローサイトメトリーを使用した類似の実験により、ＭＥＬＡＳ線維芽細胞におけるＢＹＬ７１９による処置による膜電位（ＴＭＲＥ）救出が確認された。
【００４０】
実施例２：ミトコンドリア異常のマウスモデルにおけるＰＩＫ３ＣＡ阻害
材料及び方法
リー症候群は、およそ４０，０００人中１人の新生児に起こる深刻なミトコンドリア病であり、成長遅滞、筋肉の欠陥（筋症及び呼吸困難を含む）、乳酸アシドーシス、並びに前庭神経核、小脳、及び嗅球の特徴的で進行性の壊死性脳症を伴う（Budde et al., 2002）。Ｎｄｕｆｓ４は、ミトコンドリア電子輸送鎖複合体Ｉのサブユニットをコードし；ＮＤＵＦＳ４遺伝子の突然変異は、ヒトにおいてリー症候群を引き起こし（Budde et al., 2002）、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスは、リー症候群のマウスモデルである（Kruse et al., 2008）。Ｎｄｕｆｓ４−/−マウスは、複数の組織において低下した複合体Ｉのレベル及び活性を有し、ヒトのリー症候群を忠実に写し出すミトコンドリア病の深刻かつ進行的な症状を示す。ヒトにおけるリー症候群により平均６〜７歳の時に死に至り、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスは、同じような早期死亡率を示し、平均寿命は僅か６０日間である。Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＩＡバックグラウンドを有するヘテロ接合型Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスを交雑させて、ホモ接合型ノックアウト動物を産生した。動物に自由に餌を与え、一定の周囲温度で１２時間の明暗サイクルで飼った。動物の手順は「パリ警視庁の獣医部門」部長によって、及びパリ第５大学の倫理委員会によって認可された。
【００４１】
２１日令のＮｄｕｆｓ４−/−マウスを、ＰＩ３ＫＣＡ阻害剤であるＢＹＬ７１９（MedChemExpress社；０．５％カルボキシメチルセルロース（シグマアルドリッチ社）中５０mg/kg、１日１回経口）（ｎ＝９）又はビヒクル（０．５％カルボキシメチルセルロース（シグマアルドリッチ社）、１日１回経口）（ｎ＝８）で処置した。
【００４２】
結果
以前に報告されているように、Ｎｄｕｆｓ４−/−マウスはまず、歩行困難、呼吸困難、盲目を伴う神経症状を示し、最終的には約６０日後に死滅した。
【００４３】
興味深いことに、本発明者らは、１日１回のＢＹＬ７１９の投与が動物の生存率を劇的に改善したことを観察した（図２）。事実、プラセボにより処置された全てのＮｄｕｆｓ４−/−マウスは８０日以内に死滅したが、ＢＹＬ７１９により処置されたＮｄｕｆｓ４−/−マウスは１２０日後も生存し、明らかに正常な外見であった。
【００４４】
これらの結果は、ミトコンドリア異常のマウスモデルにおける、ＰＩＫ３ＣＡ阻害の効果を実証する。
【００４５】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【００４６】
【表１】
2020515588.tif 000004
【図１Ａ】
2020515588.tif 000005
【図１Ｂ】
2020515588.tif 000006
【図１Ｃ】
2020515588.tif 000007
【図２】
2020515588.tif 000008
【国際調査報告】
2020515588.tif 000009
2020515588.tif 000010
2020515588.tif 000011
2020515588.tif 000012