(57)【要約】ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー、その調製方法、及びその使用。抗体ＩｇＧ１定常領域を改変した新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー配列において、抗体工学技術によりヒト抗体ＩｇＧ１定常領域Ｆｃを改変することで、そのＦｃ二量体をＦｃモノマーに変換し、且つＦｃＲｎ結合機能を維持し、非関連タンパク質に対する非特異的結合特性を極めて低くし、Ｆｃモノマーの主な特徴は、抗体定常領域のＣＨ３領域のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｐ３９５、Ｋ４０９位置に突然変異が存在し、且つ原核細胞で効率的に発現されており、特別なｐＨ依存的結合モードでＦｃＲｎを結合することができ、さらに極めて低い非特異的結合特性を有することにある。このＦｃモノマーを利用すると、さまざまなターゲットに対する各種のタンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸などと融合又はコンジュゲートし、融合又はコンジュゲート対象となる分子にｐＨ依存的にＦｃＲｎと結合可能な特性を付与できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃモノマーペプチド鎖であって、
ペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含有し、Ｘ１はＲ／Ｔ、Ｘ２はＬ／Ｈ、Ｘ３はＰ／Ｋ、Ｘ４はＫ／Ｔであり、
Ｆｃはモノマーであり且つ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合可能である、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーペプチド鎖。
【請求項２】
ペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含有し、Ｘ１はＲ、Ｘ２はＨ、Ｘ３はＫ、Ｘ４はＴである、請求項１に記載のＩｇＧ１  Ｆｃモノマーペプチド鎖。
【請求項３】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列における第３４１−４４７位のアミノ酸、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列における第３４１−４４７位のアミノ酸を含む、請求項１に記載のＣＨ３ドメイン。
【請求項４】
請求項１−２のいずれか１項に記載のＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチド、又は請求項３に記載のＣＨ３ドメイン、及び異種タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項５】
前記異種タンパク質は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、且つ目標抗原に特異的に結合可能である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記異種タンパク質は病原体の抗原に由来する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記病原体はウイルス又は細菌である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記異種タンパク質は腫瘍抗原である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌又は腎臓細胞癌である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記異種タンパク質は自己免疫又は炎症性疾患抗原である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は毒素を含む、請求項４−１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記異種タンパク質はサイトカイン、可溶性受容体、成長因子又はマーカーである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記異種タンパク質は、ヒトインターフェロン、エリスロポエチン、可溶性腫瘍壊死因子受容体、ＣＴＬＡ−４、可溶性ＩＬ−４受容体又はファクターＩＸである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１−２のいずれか１項に記載のＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチド、請求項３に記載のＣＨ３ドメイン、及び／又は請求項５−１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含有するプラスミド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のプラスミドを含有する宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１−２のいずれか１項に記載のＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチド、請求項３に記載のＣＨ３ドメイン、又は請求項４−１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を予防／治療有効量で含有する医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の核酸分子、又は請求項１６に記載のプラスミド、及び薬学的に許容される担体を予防／治療有効量で含有する医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１−２のいずれか１項に記載のＩｇＧ１  ＦｃモノマーＦｃポリペプチド、請求項３に記載のＣＨ３ドメイン、及び／又は請求項４−１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を予防／治療有効量で含有し、検出可能なマーカーにコンジュゲートされている医薬組成物。
【請求項２１】
検出可能なマーカーは蛍光標識、放射性標識、アビジン、ビオチン、又は酵素である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、癌又は病原体感染の治療方法であって、
請求項４−１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１５に記載の核酸分子、又は請求項１６に記載のプラスミドを治療有効量で前記被験者に投与することを含む治療方法。
【請求項２３】
被験者は病原体を感染しており、融合タンパク質は病原体に特異的に結合可能であり、且つ前記方法は感染被験者における病原体を治療する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
病原体がウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスが免疫不全ウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
組換えモノマーＦｃライブラリーの構築方法であって、
（ａ）突然変異を請求項１−７のいずれか１項に記載のＩｇＧ１  ＦｃモノマーポリペプチドＣＨ２又はＣＨ３ドメインの１つ又は複数のβ鎖に導入すること、又は
（ｂ）ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインの一部の代わりとして、異種免疫グロブリンの可変領域のうち特異的結合抗原が保留された相補決定領域（ＣＤＲ）又は機能的断片を利用すること、又は
（ｃ）上記の両方を含むことを含む方法によってライブラリーを構築する組換えモノマーＦｃライブラリーの構築方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法によって組換えモノマーＦｃライブラリーを構築し、
前記組換えモノマーＦｃライブラリーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ライブラリーにおける各ＩｇＧ１  Ｆｃ  モノマーポリペプチドは、
（ａ）モノマー形態であり、
（ｂ）分子量が３０ＫＤ未満であり、
（ｃ）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合可能であり、
（ｄ）含まれるアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは少なくとも９５％の相同性を有する、ことを特徴とする組換えモノマーＦｃライブラリー。
【請求項２８】
ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ライブラリーにおいてコードされる各Ｆｃポリペプチドは、
（ａ）モノマーであり、
（ｂ）分子量が３０ＫＤ未満であり、
（ｃ）ＦｃＲｎと結合可能であり、
（ｄ）含まれるアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは少なくとも９５％の相同性を有する、ことを特徴とする核酸分子によりコードされるモノマーＦｃポリペプチドライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、具体的には、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー、その調製方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究によれば、現在、タンパク質医薬品の長時間作用化技術には、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾技術、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）融合技術、及びＦｃ（ヒト抗体Ｆｃ領域）融合技術という３つの主要な技術がある。これらの３つの技術のいずれにもそれなりの欠点があるが、共通の主な欠点は、融合又は修飾対象となるタンパク質薬の分子量を大幅に増加させ、且つ、融合対象となるタンパク質薬の収率及び臨床効果を大幅に低減させる場合が多いことであり、たとえば、ヒト抗体定常領域Ｆｃはホモ二量体であり、その自体の分子量が６０ｋＤａであり、且つ融合対象となるタンパク質は二量体化形態にしかならないため、融合タンパク質の分子量はしばしば数倍に増加し、また二量体化された薬物分子は互いに干渉して薬物の効果に影響を与える恐れがある。長い間、関連する研究者は、Ｆａｂ、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）などを含む、分子量がより小さく原核細胞で可溶性発現させた「抗体断片」（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を、生産コストが低く、組織への浸透が強い新世代の抗体薬として使用することを検討してきたが、これらの抗体断片は、分子量を減らすためには、ＩｇＧのＦｃ領域を捨てる必要があり、その結果、ＦｃＲｎに結合できないため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は非常に短くなり（２時間未満）、そのため、現在の小分子量抗体断片は、疾患の臨床治療薬として使用されるのが困難である。
【０００３】
従来技術は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域がホモ二量体であることを開示している。本発明の以前の研究では、多機能スクリーニングである新方法を使用してヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を改変し、１０億（１０９）個の異なるＦｃ変異体分子に対してドラッガブル、ＦｃＲｎ結合活性などについてのスクリーニングを行い、分子量がＩｇＧ１  Ｆｃ領域の半分しかなく、抗体Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合特性、ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ／  Ｇ結合特性を完全に保持し、大腸菌で高度に可溶性発現させるという優れた特性を有し、動物のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が最大約２日間に達するＦｃモノマー分子（ｍＦｃ）を構築し、その後、研究中に、該Ｆｃモノマー分子（ｍＦｃ）は、非常に強力な非特異的結合特性を有することを見出し、この特性により、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するとき、ｍＦｃは非関連タンパク質に非特異的に結合し、それにより、その臨床使用が大幅に制限される。したがって、本発明は、以前の研究に基づいて、突然変異部位を変更し、スクリーニングステップを最適化することで（図１参照）、新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーであるｓＦｃ（ｓｍａｌｌ−ｓｉｚｅｄ  Ｆｃ）を取得し、このＩｇＧ１  Ｆｃモノマーは従来のモノマーＦｃの優れた特性を維持することに加えて、非特異的結合が大幅に改善された。
【０００４】
本発明に関連する技術は、以下のとおりである。
[1]HOLLIGER P,HUDSON P J.Engineered antibody fragments and the rise of single domains[J].Nat Biotechnol,2005,23(9):1126-1136.
[2]SAERENS D,GHASSABEH G H,MUYLDERMANS S.Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics[J].Curr Opin Pharmacol,2008,8(5):600-608.
[3]YING T,FENG Y,WANG Y,et al.Monomeric IgG1 Fc molecules displaying unique Fc receptor interactions that are exploitable to treat inflammation-mediated diseases[J].  MAbs,2014,6(5):1201-1210.
[4]YING   T,  CHEN W,  GONG R,  et al.Soluble monomeric IgG1 Fc[J].J Biol Chem,2012,287(23):19399-19408.
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、従来技術に基づいて、抗体工学により改変された非特異性の低い新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーを提供することにあり、具体的には、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー及びその使用に関し、
具体的には、本発明は、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーをコードする核酸を開示しており、いくつかの実施形態では、これら核酸を含むベクター、及びこれらベクターを含む宿主細胞を開示している。
【０００６】
ＩｇＧ１定常領域Ｆｃがホモ二量体であるので、特別なｐＨ依存的結合モードＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、新生Ｆｃ受容体）を利用することによって、ＩｇＧ１のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を長くすることができ、本発明では、抗体ＩｇＧ１定常領域を改変した新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー配列において、抗体工学技術によりヒト抗体ＩｇＧ１定常領域Ｆｃを改変することで、そのＦｃ二量体をＦｃモノマーに変換し、且つＦｃＲｎ結合機能を維持し、非関連タンパク質に対する非特異的結合特性を極めて低くし、Ｆｃモノマーの主な特徴は、抗体定常領域のＣＨ３領域のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｐ３９５、Ｋ４０９位置に突然変異が存在し、且つ原核細胞で効率的に発現されており、本発明では、特別なｐＨ依存的結合モードでＦｃＲｎを結合し、さらに極めて低い非特異的結合特性を有することにある。
【０００７】
本発明で調製された新規Ｆｃモノマーは、さまざまなターゲットに対する各種のタンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸などと融合又はコンジュゲートし、融合又はコンジュゲート対象となる分子にｐＨ依存的にＦｃＲｎと結合可能な特性を付与できる。
【０００８】
本発明の目的は、下記技術案によって実現される。
【０００９】
１、新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）のスクリーニング及び判断（図１参照）
本発明では、ＩｇＧ１定常領域で突然変異を行い、この突然変異のうち、モノマー形成に関するものとして４つの部位特異的突然変異部位と１つのランダム突然変異部位（Ｌｅｕ−３５１、Ｔｈｒ−３６６、Ｌｅｕ−３６８、Ｐｒｏ−３９５、Ｌｙｓ−４０９）を含み、ＦｃＲｎ結合に関するものとして２つのランダム突然変異部位（Ｍｅｔ−４２８、Ａｓｎ−４３４）を含み、それに基づいて、容量１．２８×１０５のＩｇＧ１  Ｆｃ突然変異抗体ライブラリーを構築し、
ビオチン標識可溶性ＦｃＲｎタンパク質に対して新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーをスクリーニングし、ビオチン標識可溶性ＦｃＲｎをストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズ上に固定し、１０１２個のファージでディスプレイされたＦｃを常温で第１、２ラウンドにおいてｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇとインキュベートし、第３、４、５ラウンドでは、それぞれ５、４、２ｍｇのＦｃＲｎ抗原と２時間インキュベートし、各ラウンドのスクリーニングには、ファージを１０１２個用い、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡにより抗体の濃縮を検出し、第３、４、５ラウンドのファージを被覆されるタンパク質とインキュベートし、抗ファージＨＲＰ結合抗体を用いてファージとタンパク質との結合を検出し、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ結果から、第４、５ラウンドのスクリーニング後には、濃縮が極めて顕著であり、
本発明では、このように２ラウンドのスクリーニングで得られたファージを用いて、ＴＧ１細胞を感染し、クローンをランダムに選択してモノクローナルファージＥＬＩＳＡを行い、さらにシーケンシングをして、濃縮されたＩｇＧ１  Ｆｃを同定し、ＳＥＣを利用してモノマーを判断し、その結果（図１参照）から、ｓＦｃ、及びスクリーニングされた別のタンパク質１−Ｂ１０−９（ｓＦｃに比べてＭ４２８Ｌ突然変異を有する）はいずれもモノマーであることが示された。
【００１０】
２、新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）の安定性検出
本発明では、ｓＦｃ、１−Ｂ１０−９、ｍＦｃ及びＦｃをすべて濃度０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、器具Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５  ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、２１６ｎｍでタンパク質の安定性を検出し、結果を図２に示し、すなわち、ｓＦｃ、１−Ｂ１０−９、ｍＦｃ及びＦｃのＴｍ値は、それぞれ、６２．４±０．１℃、６４．０±０．１℃、５８．４±０．２℃、８０．６±０．３℃である。
【００１１】
３、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）のＦｃＲｎへの結合能の検出
本発明では、ＳＡ（ビオチンアビジン）チップを用いて新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーのＦｃＲｎへの結合能を検出し、ここで、新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーを可溶性発現可能に調製することは、ほぼ文献に従って行われ、検出中に、タンパク質を２倍希釈し（ＩｇＧ１  Ｆｃは２００ｎＭから６．２５ｎＭへ希釈、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーは４００ｎＭから１２．５ｎＭへ希釈する）、ｐＨ６．０の条件下で結合と解離を検出して親和定数を取得し、結果を図３に示し、すなわち、Ｆｃ、ｍＦｃと比較し、新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃ及び１−Ｂ１０−９のＦｃＲｎへの結合能はほぼ一致している。
【００１２】
４、新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）の非特異性結合の検出
本発明では、Ｆｃを真核生物で発現させ、ｍＦｃ及び新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃを原核生物で発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製し、ウイルス及び癌関連タンパク質（ｇｐ１４０、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＺＩＫＶ  ＥＤＩＩ、ＺＩＫＶ  ＥＤＩＩＩ、５Ｔ４、ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０、ＴＩＭ−３）を用いて１ウェルあたり１００ｎｇでプレート（＃３６９０）を被覆して４℃で一晩放置し、１ウェルあたり３％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ＋３％ｍｉｌｋ）１００μｌを加えて３７℃で１ｈブロックし、次に、０．０５％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて洗浄し、Ｆｃ、ｍＦｃ、新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃ及び１−Ｂ１０−９を２μＭから３倍希釈し、３７℃で抗原と１．５ｈインキュベートし、０．０５％ＰＢＳＴで洗浄した後、１：１０００でａｎｔｉ−ＦＬＡＧ−ＨＲＰを加えて３７℃で４５ｍｉｎインキュベートした後、ＡＢＴＳを加えて吸光値４０５ｎｍで発色させ、３つの間の非特異性結合を比較したところ、新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーはｍＦｃよりもはるかに良好であり、図４に示されるＥＬＩＳＡ結果として、新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃと１−Ｂ１０−９との非特異性結合が極めて低い。
【００１３】
本発明では、前記ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーペプチド鎖は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ペプチド鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含有し、Ｘ１はＲ／Ｔ、Ｘ２はＬ／Ｈ、Ｘ３はＰ／Ｋ、Ｘ４はＫ／Ｔであり、Ｆｃはモノマーであり且つ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合可能であり、
前記ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーペプチド鎖では、ペプチド鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含有し、Ｘ１はＲ、Ｘ２はＨ、Ｘ３はＫ、Ｘ４はＴである。
【００１４】
本発明では、前記ＣＨ３ドメインは、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列における第３４１−４４７位のアミノ酸と、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列における第３４１−４４７位のアミノ酸と、を含む。
【００１５】
本発明は、上記ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチド、又は前記ＣＨ３ドメイン、及び異種タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
【００１６】
前記異種タンパク質は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、且つ目標抗原に特異的に結合可能であり、本発明の実施例では、前記異種タンパク質は病原体の抗原に由来し、前記病原体はウイルス又は細菌であり、前記ウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から選ばれる。
【００１７】
前記異種タンパク質は、また腫瘍抗原から選ばれ、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌又は腎臓細胞癌である。
【００１８】
前記異種タンパク質は、また自己免疫又は炎症性疾患抗原から選ばれる。
【００１９】
本発明の前記融合タンパク質は毒素を含む。
【００２０】
本発明の前記融合タンパク質において、異種タンパク質はサイトカイン、可溶性受容体、成長因子又はマーカーから選ばれる。
【００２１】
本発明の前記融合タンパク質において、前記異種タンパク質は、また、ヒトインターフェロン、エリスロポエチン、可溶性腫瘍壊死因子受容体、ＣＴＬＡ−４、可溶性ＩＬ−４受容体又はファクターＩＸから選ばれる。
【００２２】
本発明は、請求項に記載のＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチド、前記ＣＨ３ドメイン、及び／又は前記融合タンパク質をコードする核酸分子をさらに提供する。
【００２３】
本発明は、前記核酸分子を含有するプラスミドをさらに提供する。
【００２４】
本発明は、前記プラスミドを含有する宿主細胞をさらに提供する。
【００２５】
本発明は、前記ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチド、前記ＣＨ３ドメイン、又は前記融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を予防／治療有効量で含有する医薬組成物をさらに提供する。
【００２６】
本発明は、前記核酸分子、又は前記プラスミド、及び薬学的に許容される担体を予防／治療有効量で含有する医薬組成物をさらに提供する。
【００２７】
本発明は、前記ＩｇＧ１  ＦｃモノマーＦｃポリペプチド、前記ＣＨ３ドメイン、及び／又は前記融合タンパク質を予防／治療有効量で含有し、検出可能なマーカーにコンジュゲートされている医薬組成物をさらに提供し、検出可能なマーカーは、蛍光標識、放射性標識、アビジン、ビオチン、又は酵素である。
【００２８】
本発明は、前記融合タンパク質、前記核酸分子、又は前記プラスミドを治療有効量で前記被験者に投与することを含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、癌又は病原体感染の治療方法をさらに提供し、被験者は病原体を感染しており、融合タンパク質は病原体に特異的に結合可能であり、且つ前記方法は、感染被験者の病原体を治療し、病原体はウイルスであり、前記ウイルスは特に免疫不全ウイルスである。
【００２９】
本発明は、組換えモノマーＦｃライブラリーの構築方法をさらに提供し、
（ａ）突然変異を前記ＩｇＧ１  ＦｃモノマーポリペプチドＣＨ２又はＣＨ３ドメインの１つ又は複数のβ鎖に導入すること、又は
（ｂ）ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインの一部の代わりとして、異種免疫グロブリン可変領域のうち特異的結合抗原が保留された相補決定領域（ＣＤＲ）又は機能的断片を利用すること、又は
（ｃ）上記の両方を含むことを含む方法によってライブラリーを構築する。
【００３０】
本発明では、上記方法によって組換えモノマーＦｃライブラリーを構築し、組換えモノマーＦｃライブラリーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ライブラリーにおける各ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーポリペプチドは、
（ａ）モノマー形態であり、
（ｂ）分子量が３０ＫＤ未満であり、
（ｃ）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合可能であり、
（ｄ）含まれるアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは少なくとも９５％の相同性を有する。
【００３１】
本発明では、核酸分子によりコードされるモノマーＦｃポリペプチドライブラリーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ライブラリーにおいてコードされる各Ｆｃポリペプチドは、
（ａ）モノマーであり、
（ｂ）分子量が３０ＫＤ未満であり、
（ｃ）ＦｃＲｎと結合可能であり、
（ｄ）含まれるアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは少なくとも９５％の相同性を有する。
【００３２】
本発明に係る新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）は、小分子量の長時間作用モノマーモジュールとして、抗体断片と融合して新規遺伝子組み換え抗体を構築することができ、抗体医薬品の開発のボトルネックを解消するために重要な理論的基礎及び解決策を提供し、あるいは、さまざまなターゲットに対する各種のタンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸などと融合又はコンジュゲートし、融合又はコンジュゲート対象となる分子にｐＨ依存的にＦｃＲｎと結合可能な特性を付与し、それによって、潜在的により優れたドラッガブル、及びより長いｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＥＣによる新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）と従来のモノマーＦｃ（ｍＦｃ）及びＩｇＧ１  Ｆｃとの検出・比較である。
【図２】本新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーの安定性検出である。
【図３】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）のＦｃＲｎへの結合能の検出である。
【図４】本新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）の非特異性検出、及び従来のモノマーＦｃ（ｍＦｃ）及びＩｇＧ１Ｆｃとの比較である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
実施例１  新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）のスクリーニングおよび判断
ＩｇＧ１定常領域で突然変異を行い、この突然変異のうち、モノマー形成に関するものとして４つの部位特異的突然変異部位と１つのランダム突然変異部位（Ｌｅｕ−３５１、Ｔｈｒ−３６６、Ｌｅｕ−３６８、Ｐｒｏ−３９５、Ｌｙｓ−４０９）を含み、ＦｃＲｎ結合に関するものとして２つのランダム突然変異部位（Ｍｅｔ−４２８、Ａｓｎ−４３４）を含み、それに基づいて、容量１．２８×１０５のＩｇＧ１  Ｆｃ突然変異抗体ライブラリーを構築した。ビオチン標識可溶性ＦｃＲｎタンパク質に対して新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーをスクリーニングし、ビオチン標識可溶性ＦｃＲｎをストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズ上に固定し、１０１２個のファージでディスプレイされたＦｃを常温で第１、２ラウンドにおいてｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇとインキュベートし、第３、４、５ラウンドでは、それぞれ５、４、２ｍｇのＦｃＲｎ抗原と２時間インキュベートし、各ラウンドのスクリーニングには、ファージを１０１２個用い、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡにより抗体の濃縮を検出した。第３、４、５ラウンドのファージを被覆されるタンパク質とインキュベートし、抗ファージＨＲＰ結合抗体を用いてファージとタンパク質との結合を検出し、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ結果から、第４、５ラウンドのスクリーニング後には、濃縮が極めて顕著であり、したがって、このように２ラウンドのスクリーニングで得られたファージを用いて、ＴＧ１細胞を感染し、クローンをランダムに選択してモノクローナルファージＥＬＩＳＡを行い、さらにシーケンシングをして、濃縮されたＩｇＧ１  Ｆｃを同定し、ＳＥＣを利用してモノマーを判断し、その結果（図１参照）から、ｓＦｃ、及びスクリーニングされた別のタンパク質１−Ｂ１０−９（ｓＦｃに比べてＭ４２８Ｌ突然変異を有する）はいずれもモノマーであることが示された。
【００３５】
安定性検出
ｓＦｃ、１−Ｂ１０−９、ｍＦｃ及びＦｃをすべて濃度０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、器具Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、２１６ｎｍでタンパク質の安定性を検出し、結果を図２に示し、すなわち、ｓＦｃ、１−Ｂ１０−９、ｍＦｃ及びＦｃのＴｍ値は、それぞれ、６２．４±０．１℃、６４．０±０．１℃、５８．４±０．２℃、８０．６±０．３℃であった。
【００３６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による新規ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）のＦｃＲｎへの結合能の検出
ＳＡ（ビオチンアビジン）チップを用いて新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーのＦｃＲｎへの結合能を検出した。ここで、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーを可溶性発現可能に調製することは、ほぼ文献に従って行われ、検出中に、タンパク質を２倍希釈し（ＩｇＧ１  Ｆｃは２００ｎＭから６．２５ｎＭへ希釈、ＩｇＧ１  Ｆｃモノマーは４００ｎＭから１２．５ｎＭへ希釈する）、ｐＨ６．０の条件下で結合と解離を検出して親和定数を取得し、結果（図３参照）から、Ｆｃ、ｍＦｃと比較し、新規ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃ及び１−Ｂ１０−９のＦｃＲｎへの結合能はほぼ一致していることを示した。
【００３７】
ＩｇＧ１  Ｆｃモノマー（ｓＦｃ）の非特異性結合の検出
Ｆｃを真核生物で発現させ、ｍＦｃ及び前記ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃを原核生物で発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製し、ウイルス及び癌関連タンパク質（ｇｐ１４０、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＺＩＫＶ  ＥＤＩＩ、ＺＩＫＶ  ＥＤＩＩＩ、５Ｔ４、ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０、ＴＩＭ−３）を用いて１ウェルあたり１００ｎｇでプレート（＃３６９０）を被覆して４℃で一晩放置し、１ウェルあたり３％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ＋３％ｍｉｌｋ）１００μｌを加えて３７℃で１ｈブロックし、次に、０．０５％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて洗浄し、Ｆｃ、ｍＦｃ、前記ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃ及び１−Ｂ１０−９を２μＭから３倍希釈し、３７℃で抗原と１．５ｈインキュベートし、０．０５％ＰＢＳＴで洗浄した後、１：１０００でａｎｔｉ−ＦＬＡＧ−ＨＲＰを加えて３７℃で４５ｍｉｎインキュベートした後、ＡＢＴＳを加えて吸光値４０５ｎｍで発色させ、３つの間の非特異性結合を比較したところ、前記ＩｇＧ１  ＦｃモノマーはｍＦｃよりもはるかに良好であり、図４に示されるＥＬＩＳＡ結果として、前記ＩｇＧ１  ＦｃモノマーｓＦｃと１−Ｂ１０−９との非特異性結合が極めて低い。
【００３８】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ｍｕｔａｔｅｄ  Ｆｃのアミノ酸配列である。
【００３９】
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【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、ｓＦｃのアミノ酸配列である。
【００４１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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