(57)【要約】  水中の魚から外寄生生物を除去する方法が、魚から外寄生生物を除去するためにネオニコチノイドを魚に投与するステップと、ネオニコチノイド及び除去された外寄生生物を含む水を交換水と交換し、その結果、除去された外寄生生物及び魚を分離するステップと、を含み得る。当該方法は、例えば、除去された外寄生生物を含む水の試料をメッシュフィルタに通すことによって、環境への除去された外寄生生物の放出を防ぐさらなるステップを含んでもよい。ネオニコチノイドが、魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用されてもよく、さらに、魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用するための組成物が、１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬を含んでもよく、１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬のうちの１つがネオニコチノイドである。ネオニコチノイドは、イミダクロプリドであってもよい。使用中、投与計画は、致死未満的及び／又は致死的であってもよい。
2020500545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中の魚から外寄生生物を除去する方法であって、
（ｉ）  前記魚から前記外寄生生物を除去するためにネオニコチノイドを前記魚に投与するステップと、
（ｉｉ）  除去された前記外寄生生物を含む水を交換水と交換し、その結果、前記除去された外寄生生物及び前記魚を分離するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記外寄生生物は、運動性のライフサイクル段階にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外寄生生物は、非運動性のライフサイクル段階にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ネオニコチノイドは、１〜５００ｐｐｍ、１〜２００ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、１〜６４ｐｐｍ、１０〜６４ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ以上、１００ｐｐｍ以上、又は２００ｐｐｍ以上のｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ネオニコチノイドは、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、６４、１００、２００、２００又は５００ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ネオニコチノイドは、１５ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ネオニコチノイドは、２０ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ネオニコチノイドは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は全ての外寄生生物が前記魚から除去されるのに十分な時間与えられる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ネオニコチノイドは、１８０分以下、１２０分以下、６０分以下、３０分未満、２０分未満、１５分以下、１０分未満、又は５分以下与えられる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記魚は、サケ、マス、チャー、又はクリーナーフィッシュである、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ネオニコチノイドは、致死未満量及び／又は致死未満時間与えられる、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ネオニコチノイドは、致死量及び／又は致死時間与えられる、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ネオニコチノイドは、４〜１８℃、４〜１６℃、５〜１５℃、１０〜１４℃又は１２〜１４℃の温度で与えられる、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ネオニコチノイドは、投与される唯一の外寄生生物撲滅薬である、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ネオニコチノイドは、イミダクロプリド、アセタミプリド、クロチアニジン、ニテンピラム、ニチアジン、チアクロプリド若しくはチアメトキサム、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルである、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ネオニコチノイドは、イミダクロプリド、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉｉｉ）  環境への前記除去された外寄生生物の放出を防ぐステップ
をさらに含む、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記除去された外寄生生物の放出を防ぐステップは、前記除去された外寄生生物を含む水の試料から前記外寄生生物を収集することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
外寄生生物除去剤及び外寄生生物を含む水を除染する方法であって、
（ｉ）  水の試料を収集するステップと、
（ｉｉ）  前記試料から前記外寄生生物を収集するステップと、
を含む方法。
【請求項２０】
前記水の試料から外寄生生物を収集することは、前記試料をメッシュフィルタに通すことを含む、請求項１８又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記メッシュフィルタは、少なくとも６０μｍ又は少なくとも１５０μｍのギャップサイズを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記外寄生生物はウオジラミである、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
任意選択で前記外寄生生物を濃縮した後に、生きているままの除去された外寄生生物を死滅させるステップをさらに含む、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
生きているままの外寄生生物は、任意選択で外寄生生物撲滅薬を与えることによって死滅させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用するためのネオニコチノイドであって、１８０分以下、１２０分以下、６０分以下、３０分未満、２０分未満、１５分以下、１０分未満、又は５分以下前記魚に投与される、ネオニコチノイド。
【請求項２６】
前記外寄生生物は、運動性のライフサイクル段階にある、請求項２５に記載のネオニコチノイド。
【請求項２７】
前記外寄生生物は、非運動性のライフサイクル段階にある、請求項２５に記載のネオニコチノイド。
【請求項２８】
１〜５００ｐｐｍ、１〜２００ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、１〜６４ｐｐｍ、１０〜６４ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ以上、１００ｐｐｍ以上、又は２００ｐｐｍ以上のｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項２５乃至２７のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項２９】
１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、６４、１００、２００、又は５００ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項２５乃至２８のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３０】
１５ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項２５乃至２９のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３１】
２０ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で前記魚に投与される、請求項２５乃至２９のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３２】
前記外寄生生物はウオジラミである、請求項２５乃至３１のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３３】
前記魚は、サケ、マス、チャー、又はクリーナーフィッシュである、請求項２５乃至３２のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３４】
イミダクロプリド、アセタミプリド、クロチアニジン、ニテンピラム、ニチアジン、チアクロプリド若しくはチアメトキサム、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルである、請求項２５乃至３３のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３５】
イミダクロプリド、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルである、請求項３４に記載のネオニコチノイド。
【請求項３６】
致死未満量及び／又は致死未満時間与えられる、請求項２５乃至３５のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３７】
致死量及び／又は致死時間与えられる、請求項２５乃至３５のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３８】
４〜１８℃、４〜１６℃、５〜１５℃、１０〜１４℃又は１２〜１４℃の温度で与えられる、請求項２５乃至３７のいずれか一項に記載のネオニコチノイド。
【請求項３９】
１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬を含む、魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用するための組成物であって、前記１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬のうちの１つが、請求項２５乃至３８のいずれか一項に記載のネオニコチノイドである、組成物。
【請求項４０】
１つの外寄生生物撲滅薬を含む、請求項３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネオニコチノイドを使用して水中の魚から外寄生生物を除去する方法、及び、魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用するためのネオニコチノイド、１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬を含む、魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用するための組成物であって、１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬のうちの１つはネオニコチノイドである組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水産養殖における外寄生生物感染は、商業上重大な懸念事項である。加えて、養殖魚における感染は、野生の漁業資源に影響を及ぼす恐れがある。しかし、商業的に実行可能な処理の数は、例えば、環境への化学療法剤の放出、及び、外寄生生物が薬剤に対する耐性を発達させること又は薬剤に対する他の感受性の低下に関連する懸念事項のため、制限される。
【０００３】
ネオニコチノイドは、ニコチンに化学的に類似した向神経活性の殺虫剤のクラスである。ネオニコチノイドのファミリーには、アセタミプリド、クロチアニジン、イミダクロプリド、ニテンピラム、ニチアジン、チアクロプリド、及びチアメトキサムが含まれる。有機リン酸系殺虫剤及びカルバメート系殺虫剤と比較して、ネオニコチノイドは、昆虫よりも鳥類及び哺乳類において引き起こされる毒性が少ない。
【０００４】
特許文献１は、ニコチン性アセチルコリン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストを魚に投与することによって、魚類寄生虫と闘う方法に非常に広範に関する。特許文献１における唯一の例は、水槽中の分離されたウオジラミに対して、１ｐｐｍ又は１００ｐｐｍのイミダクロプリドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験している。しかし、特許文献１は、実験室以外の商業的環境での魚の分離されるウオジラミに対してｉｎ  ｖｉｖｏで使用するのに適した用量に関するガイダンスを提供しない。
【０００５】
実際、水浸型の投与に依存する商業的に実行可能な処理の開発は、環境及び安全上の懸念の観点から挑戦である。特に、ネオニコチノイドは、特に陸生の昆虫に悪影響を及ぼすと考えられるため、環境一般へのネオニコチノイドの放出を最小限に抑えることが重要であると考えられてきた。
【０００６】
特許文献２は、カルバメート又は有機リン酸塩、ピレスロイド又はピレトリン、及び任意選択で、以下のクラスの分子：クロロニコチニル；フェニルピラゾール；オキサジアジン；ピラゾール；又は有機塩素；から選択される別の殺生物剤を含む組み合わせ処理を提案している。しかし、魚類処理の実施例は開示されていない。
【０００７】
特許文献３は、ピレスロイド、有機リン酸塩、及び任意選択で、以下のクラスの分子：クロロニコチニル；フェニルピラゾール；オキサジアジン；ピラゾール；又は有機塩素；から選択される別の殺生物剤を含む組み合わせ処理を提案している。しかし、魚類処理の実施例は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ０５９０４２５
【特許文献２】ＷＯ２００９／０１０７５５
【特許文献３】ＷＯ２０１０／１０９１８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、安全性、環境、及び処理耐性の問題を考慮することができる魚の外寄生生物に対する商業的に実行可能な浸漬処理が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の一態様は、魚の外寄生生物感染を処理することにおいて使用するためのネオニコチノイドを提供する。好ましくは、ネオニコチノイドは、１２０分以下、６０分以下、３０分未満、２０分未満、１５分以下、１０分未満、又は５分以下、魚に投与される。
【００１１】
好ましくは、ネオニコチノイドは、浸漬によって投与するように構成又は処方される。
【００１２】
好ましくは、ネオニコチノイドは、飼料内投与のために構成又は処方されない。
【００１３】
本発明者等は、ネオニコチノイドが、そのライフサイクルのうち運動性の段階の外寄生生物に対してより効果的であることを見出した。従って、本発明の実施形態において、外寄生生物は、運動性のライフサイクル段階にある。本発明の他の実施形態において、外寄生生物は、非運動性のライフサイクル段階にある。外寄生生物の集団内では、外寄生生物は、運動性のライフサイクル段階にあっても、非運動性のライフサイクル段階にあってもよい。従って、本発明の実施形態において、処理は、運動性のライフサイクル段階に対しても、非運動性のライフサイクル段階に対しても効果的であり得る。
【００１４】
本発明の実施形態において、ネオニコチノイドは、１〜５００ｐｐｍ、１〜２００ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、１〜６４ｐｐｍ、１０〜６４ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ以上、１００ｐｐｍ以上、又は２００ｐｐｍ以上のｗ／ｖの濃度で魚に投与される。
【００１５】
本発明の例となる実施形態において、ネオニコチノイドは、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、６４、１００、２００、又は５００ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で魚に投与される。
【００１６】
典型的には、ネオニコチノイドは、１５ｐｐｍ  ｗ／ｖ又は２０ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で魚に投与される。
【００１７】
特定の実施形態では、ネオニコチノイドは、５〜１５分間１００ｐｐｍ  ｗ／ｖ以上の濃度で、好ましくは、５〜１５分間２００ｐｐｍ  ｗ／ｖ以上の濃度で魚に投与される。
【００１８】
このように、ネオニコチノイドは、例えば活魚運搬船（ｗｅｌｌ  ｂｏａｔ）であり得る現場の魚から外寄生生物を除去するための安全で効果的な手段を提供する。
【００１９】
活魚運搬船の環境は、処理のための空間及び時間が制限され、処理されたウオジラミが環境中に放出されないということを確実にすることに関するさらなるリスクがあるという点で、独特の課題を提示している。これらの課題にもかかわらず、本発明は、有利に、現場でウオジラミをうまく処理し、例えば、処理水からウオジラミを除去するために、活魚運搬船が岸に戻る、又は、処理のためにその水を別の船へと船外に汲み出す又は岸まで運ぶ必要性を回避する。
【００２０】
本発明は、いかなる収容エリアにおいても適切に使用又は実行することができ、外寄生生物撲滅薬又は除去されたウオジラミの環境への放出を回避する。本発明の実施形態は、活魚運搬船上で実行される。
【００２１】
驚くべきことに、本発明者等は、ネオニコチノイドの使用が、アザメチホス又はデルタメトリンよりも外寄生生物の除去に効果的であることを見出した。
【００２２】
ネオニコチノイドは、全ての外寄生生物に対して効果的であると信じられている。しかし、本発明の一実施形態において、外寄生生物はウオジラミである。特定の実施態様では、ウオジラミは、サケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）である。特定の実施態様では、ウオジラミは、Ｃ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ又はＣ．ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ等のＣａｌｉｇｕｓ種である。
【００２３】
ネオニコチノイドは、全ての魚の外寄生生物感染に対して効果的であると信じられている。本発明の一実施形態では、魚は、サケ、マス、チャー、又はクリーナーフィッシュである。
【００２４】
本明細書において記載される本発明の全ての態様及び実施形態において、「クリーナーフィッシュ」という用語は、壊死した皮膚及び／又は外寄生生物等の望ましくない物質を除去することによって、他の魚種にサービスを提供する魚の種を指す。本発明のいかなる実施形態においても、クリーナーフィッシュは：ランプフィッシュ／ランプサッカー（Ｃｙｃｌｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｕｍｐｕｓ）；Ｌａｂｒｉｄａｅ科のベラ；ｃｕｎｎｅｒ（Ｔａｕｔｏｇｏｌａｂｒｕｓ  ａｄｓｐｅｒｓｕｓ）；及びｐａｔａｇｏｎｉａｎ  ｂｌｅｎｎｉｅ（Ｅｌｅｇｉｎｏｐｓ  ｍａｃｌｏｖｉｎｕｓ）；を含む群から選択される１つ又は複数の魚であり得る。Ｌａｂｒｉｄａｅ科のベラは：ｂａｌｌａｎ  ｗｒａｓｓｅ（Ｌａｂｒｕｓ  ｂｅｒｇｙｌｔａ）；ｃｏｒｋｗｉｎｇ  ｗｒａｓｓｅ（Ｓｙｍｐｈｏｄｕｓ  ｍｅｌｏｐｓ）；ｒｏｃｋ  ｃｏｏｋ  ｗｒａｓｓｅ（Ｃｅｎｔｒｏｌａｂｒｕｓ  ｅｘｏｌｅｔｕｓ）；ｇｏｌｄｓｉｎｎｙ  ｗｒａｓｓｅ（Ｃｔｅｎｏｌａｂｒｕｓ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）；及びｃｕｃｋｏｏ  ｗｒａｓｓｅ（Ｌａｂｒｕｓ  ｍｉｘｔｕｓ）を含む群から選択される１つ又は複数の魚であってもよい。本発明の特定の実施形態では、クリーナーフィッシュは、ランプフィッシュ又はベラである。
【００２５】
本発明の特定の実施形態において、ネオニコチノイドは、イミダクロプリド、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルである。本発明の他の実施形態では、ネオニコチノイドは、アセタミプリド、クロチアニジン、ニテンピラム、ニチアジン、チアクロプリド、若しくはチアメトキサム、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルであり得る。
【００２６】
本発明の実施形態は、外寄生生物が最初にネオニコチノイドによって死滅させられるということを要求しない。代わりに、外寄生生物は、魚を解放するか又は魚から離れるように誘導され、それぞれの除去された外寄生生物は、以下の状態：生きている状態、瀕死の状態、及び死滅させられた状態のいずれかの状態になる。例えば、使用される外寄生生物撲滅薬に対して異なる感受性を有し得るウオジラミの混合集団に外寄生された魚を処理する場合、除去されたウオジラミの集団は、２つ以上の状態の混合状態にある可能性が高い。従って、これらの実施形態は、外寄生生物が最初に死滅させられることを要求しないけれども、その一部又は全てが、処理中に死滅させられることになる。外寄生生物の放出は要求するが、死滅は要求しない実施形態において、ネオニコチノイドは、致死未満量及び／又は致死未満時間与えられてもよい。この実施形態は、有利に、外寄生生物撲滅薬に対してある程度の耐性を示す外寄生生物の集団を除去するのに有用であり、そのような集団は、外寄生生物を死滅させるのに要求される用量を、達成するには非実用的又は高すぎるレベルまで増加させる恐れがある。この点に関して、本発明は、処理耐性に対する解決策を提供する。
【００２７】
他の実施形態において、ネオニコチノイドは、致死量及び／又は致死時間与えられる。
【００２８】
致死未満的処理では、調節因子及び優れた実践が、除去された外寄生生物の環境への放出を回避するための対策が講じられることを要求し得る。従って、本発明の実施形態は、除去された外寄生生物の環境への放出を防ぐ最終段階を含む。
【００２９】
本発明の実施形態において、ネオニコチノイドは、４〜１８℃、４〜１６℃、５〜１５℃、１０〜１４℃又は１２〜１４℃の温度で与えられる。
【００３０】
本発明の別の態様は、１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬を含む、魚の外寄生生物感染の処理において使用するための組成物を提供し、ここで、１つ又は複数の外寄生生物撲滅薬のうちの１つは、本発明に従って使用するためのネオニコチノイドである。
【００３１】
本発明の特定の実施形態において、組成物は、１つの外寄生生物撲滅薬を含む。すなわち、組成物はネオニコチノイドのみを含み、他の形態の外寄生生物撲滅薬を排除する。
【００３２】
従って、例えば、本発明の実施形態は、ネオニコチノイドを含む組成物を提供するが：カルバメート；有機リン酸塩；ピレスロイド；ピレトリン；クロロニコチニル；フェニルピラゾール；オキサジアジン；ピラゾール；又は有機塩素；から選択される薬剤のうち１つ又は複数の薬剤を排除する。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、水中の魚から外寄生生物を除去する方法を提供し、当該方法は：（ｉ）魚から外寄生生物を除去するためにネオニコチノイドを魚に投与するステップ；及び、（ｉｉ）ネオニコチノイド及び除去された外寄生生物を含む水を交換水と交換し、その結果、除去された外寄生生物及び魚を分離するステップ；を含む。
【００３４】
好ましくは、上記の処理は、浸漬処理である。
【００３５】
好ましくは、上記の処理は、飼料内処理ではない。
【００３６】
このように、ネオニコチノイドが魚のウオジラミを死滅させるか、さもなければ不動化するだけでは不十分である。代わりに、生きていようが死んでいようが、任意選択で、死滅しているものを分離するために、ウオジラミは魚から分離させてウオジラミの収集を可能にしなければならない。従って、この方法は、化学的処理を使用して外寄生生物を死滅させることを要求することはないが、外寄生生物を捕獲することができるように外寄生生物及び魚を分離することを要求した外寄生生物感染の処理を可能にする。この方法によって除去されたそれぞれの外寄生生物は、以下の：生きている状態、瀕死の状態、及び死滅した状態のうちいずれかの状態である。これは、魚から除去する前に外寄生生物を死滅させる処理が、死滅した外寄生生物を除去するための、結果として、しばしば、しっかりと固定された外寄生生物を魚から除去するためのさらなる処理を魚に受けさせることを要求するため、特に有利である。水産養殖の状況において、当該方法は、ウオジラミ汚染が比較的ない、実質的にない、又は完全にない魚製品も提供する。
【００３７】
従って、本発明の方法は、有利に、外寄生生物撲滅薬に対してある程度の耐性を示す外寄生生物の集団を除去するのに有用であり、そのような集団は、外寄生生物を死滅させるのに要求される用量を、達成するには非実用的又は高すぎるレベルまで増加させる恐れがある。この点に関して、本発明は、処理耐性に対する解決策を提供する。
【００３８】
本発明の実施形態において、外寄生生物は、運動性のライフサイクルの段階にある。本発明の他の実施形態では、外寄生生物は、非運動性のライフサイクルの段階にある。外寄生生物の集団内で、外寄生生物は、運動性のライフサイクルの段階にあっても、非運動性のライフサイクルの段階にあってもよい。従って、本発明の実施形態では、処理は、運動性のライフサイクルの段階に対しても、非運動性のライフサイクルの段階に対しても効果的であり得る。
【００３９】
本発明の実施形態において、ネオニコチノイドは、１〜５００ｐｐｍ、１〜２００ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、１〜６４ｐｐｍ、１０〜６４ｐｐｍ、１０〜５０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ以上、１００ｐｐｍ以上、又は２００ｐｐｍ以上のｗ／ｖの濃度で魚に投与される。
【００４０】
本発明の例となる実施形態において、ネオニコチノイドは、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、６４、１００、２００、又は５００ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で魚に投与される。
【００４１】
典型的には、ネオニコチノイドは、１５ｐｐｍ  ｗ／ｖ又は２０ｐｐｍ  ｗ／ｖの濃度で魚に投与される。
【００４２】
特定の実施形態では、ネオニコチノイドは、５〜１５分間１００ｐｐｍ  ｗ／ｖ以上の濃度で、好ましくは、５〜１５分間２００ｐｐｍ  ｗ／ｖ以上の濃度で魚に投与される。
【００４３】
本発明の実施形態において、ネオニコチノイドは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は全ての外寄生生物が魚から除去されるのに十分な時間与えられる。
【００４４】
従って、当該方法は、適切且つ効果的な時間が推定されることを可能にするステップを含んでもよい。従って、当該方法は、ネオニコチノイドの投与後にウオジラミをモニターして、許容可能な除去レベル（例えば、除去率）を評価するステップ、従って、その許容可能な除去レベルを達成するために要求される用量及び時間を得るステップを含み得る。次に、これらのパラメータは、許容可能な除去レベルが達成される可能性が高いということを知り除去レベルをモニターすることなく、現場で当該方法を適用する際に使用することができる。
【００４５】
典型的には、ネオニコチノイドは、１８０分以下、１２０分以下、６０分以下、３０分未満、２０分未満、１５分以下、１０分未満、又は５分以下与えられる。
【００４６】
本発明の実施形態において、魚は、サケ、マス、又はクリーナーフィッシュである。
【００４７】
ネオニコチノイドは、致死未満量及び／又は致死未満時間与えられてもよい。
【００４８】
「致死未満」は、処理の用量及び／又は時間に関連させられてもよく、外寄生生物を死滅させるのに要求される用量及び／又は時間の知識に関して定義され得る。一部の実施形態では、「致死未満」は、外寄生生物撲滅薬に対してある程度の耐性を発達させた外寄生生物を死滅させるのに要求される用量及び／又は時間に関連させられる。好ましい実施形態において、近致死性は、集団中の全ての外寄生生物を死滅させない処理であり、任意選択で、４〜１８℃の温度である。
【００４９】
このように、本発明の実施形態は、外寄生生物が最初にネオニコチノイドによって死滅させられるということを要求しないが、正しくは、外寄生生物は、魚を解放するか又は魚から離れるように誘導される。これは、現場においておそらく危険な薬剤の使用を最小限にする。施術時間を最小限に抑えることは、処理空間が周囲の環境から完全には隔離されておらず、従って、活性物質の漏れが生じ得る現場において有用である。そのような状況において濃度は、処理時間を通して維持されなければならず、従って、処理時間を短縮することにより、環境への薬剤の喪失を最小限に抑えることができる。
【００５０】
ネオニコチノイドは、致死量及び／又は致死時間与えられてもよい。
【００５１】
本発明の実施形態において、ネオニコチノイドは、４〜１８℃、４〜１６℃、５〜１５℃、１０〜１４℃又は１２〜１４℃の温度で与えられる。
【００５２】
本発明の実施形態において、ネオニコチノイドは、処理中に投与される唯一の外寄生生物撲滅薬である。これは、組み合わせ処理がより多くの非標的効果のためにより環境へ悪影響を及ぼし、さらに、耐性の発達の可能性を増加させると予想されるため、組み合わせ処理よりも有利である。
【００５３】
本発明の特定の実施形態において、ネオニコチノイドは、イミダクロプリド、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルである。本発明の他の実施形態では、ネオニコチノイドは、アセタミプリド、クロチアニジン、ニテンピラム、ニチアジン、チアクロプリド、若しくはチアメトキサム、又はその薬学的に効果的な塩若しくはエステルであり得る。
【００５４】
本発明の実施形態において、当該方法は：（ｉｉｉ）除去された外寄生生物の環境への放出を防ぐステップをさらに含む。これは、除去された外寄生生物を含む水の試料から外寄生生物を収集する形態をとり得る。
【００５５】
好ましくは、水の試料は、当該方法において使用される水の全てである。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、生きている、死んでいる、及び／又は瀕死の状態であるかにかかわらず、存在する場合その卵の列（ｅｇｇ  ｓｔｒｉｎｇｓ）を含む外寄生生物は、試料をメッシュフィルタに通すことによって収集される。当業者は、この適用に対して適切に規定されたメッシュフィルタを取得及び使用することができる。メッシュフィルタは、少なくとも３０μｍ、少なくとも６０μｍ又は少なくとも１５０μｍ、例えば約１５０、６０又は３０μｍのギャップサイズを有してもよい。例として、ウオジラミに適したメッシュフィルタは、約１５０μｍのギャップサイズを有するであろう。
【００５７】
本発明の実施形態において、当該方法は、除去された外寄生生物を収集し、任意選択で外寄生生物を濃縮し、生きたまま残るあらゆる寄生虫を死滅させるステップをさらに含む。これは、ネオニコチノイドが外寄生生物を死滅させると推定される場合、又は、ネオニコチノイドの投与計画が外寄生生物を死滅させず、単に除去すると知られている場合、外寄生生物が死滅しているということを確実にするために有利である。これは、ネオニコチノイドに対する外寄生生物又は外寄生生物集団の脱感作に関する問題を引き起こすのを回避するのに寄与する。生きたまま残るあらゆる寄生虫の死滅は、機械的又は化学的手段等のいかなる適した手段によっても、典型的には外寄生生物撲滅薬を与えることによって達成することができる。
【００５８】
本発明の実施形態において、活魚運搬船等の収容環境において処理された魚は、シーペン等の環境に戻される。
【００５９】
次に、本発明が、付随の図面を参照して例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】５つの濃度（０、１０、１５、２０、及び２５ｍｇ／ｌ）のイミダクロプリドを用いた浸漬処理によってサケから除去したシラミの割合を示した図である。
【図２】１０ｍｇ／ｌ及び２０ｍｇ／ｌのイミダクロプリドで処理した場合の分で表された処理時間（ｎ＝１０；ｔ≦５６分）の関数として、感染した魚の割合のカプラン・マイヤープロットを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６１】
１０、３０、及び５０ｐｐｍのイミダクロプリドを用いた処理
１．１  ウオジラミの曝露
それぞれ１５匹の魚を含有する８つのフロースルー処理タンクを設置した。魚は、約２７０ｇの平均重量を有する、性別が混在したサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）であった。卵のあるメスのＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓから除去した卵の列を収集し、感染性コペポディドが生産されるまで養殖した。約３３０〜３５０のコペポディドを含有する８つのボトルを、（魚１匹あたり平均２２匹のシラミを提供するために）処理タンクにそれぞれ無作為に割り付けた。
【００６２】
曝露に備えて、タンク内の流水を止め、光レベルを低下させた。次に、シラミをそれぞれのタンクに添加し、タンクを全暗所に６時間維持した後、光レベルを上げて、流水を再開した。
【００６３】
１週間又は６週間ウオジラミに魚を曝露させた。
【００６４】
１．２  処理
１．２．１  曝露から１週間後の処理
ウオジラミ曝露の１週間後、３つのタンクの魚を１０ｐｐｍ  ｗ／ｖ、３０ｐｐｍ  ｗ／ｖ、又は５０ｐｐｍ  ｗ／ｖのイミダクロプリドで処理した。１つのタンクを０．０３％  ＤＭＳＯで処理し、別のタンクを、対照として海水で偽処理した。
【００６５】
それぞれの処理タンクに対して、適切な量のイミダクロプリド（表１を参照）を１００ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、実験タンクからの約９００ｍｌの海水と混ぜ合わせて、処理溶液を得た。実験タンクの水流を無効にし、次に、処理溶液を添加した。
【００６６】
魚を全曝気で静水において６０分間曝露し、曝露期間中に観察した。曝露期間の終了時には、タンク内でのフローを再開する前に、水を約１／３の量まで急速に排出した。
【００６７】
【表１】
2020500545.tif 000003
１．２．２  曝露から６週間後の処理
魚をウオジラミに曝露した６週間後、３つの残りの処理タンク内の魚を、１０ｐｐｍ  ｗ／ｖ、３０ｐｐｍ  ｗ／ｖ、又は５０ｐｐｍ  ｗ／ｖのイミダクロプリドで処理した。処理は、曝露後１週間の処理タンクに対するものと同じ方法で実行した（１．２．１を参照）。それぞれの処理タンクに添加したイミダクロプリドの量は表１において示されている。
【００６８】
−  ５０ｐｐｍ  ｗ／ｖでの観察
イミダクロプリド添加の２から６分後に行った観察中には、５０ｐｐｍ  ｗ／ｖ処理グループの水柱においてシラミは観察されなかった。
【００６９】
１２分の処理時間の後、約１０匹のシラミが宿主から離れ、水柱において遊離しているのを観察した。１８分の処理時間後、約２０匹のシラミが水柱において観察された。これらのシラミでは活発な動きは記録されなかった。イミダクロプリド添加の４４分後、シラミはタンクの底に非活動のまま残っていることが認められた。加えて、５匹の魚だけが感染していると認められ、それぞれが１匹のシラミを有していた。イミダクロプリド添加の５３分後、２〜３匹の魚だけが１匹のシラミによる感染をしているように見えた。イミダクロプリド添加の５８分後には、１匹のシラミのみが１匹の魚で見られた。イミダクロプリド添加の８１分後、魚にシラミは見られなかった。
【００７０】
処理の２日後、シラミの提供及び付着に以前関連していた病変はほぼ完全に回復したということが認められた。
【００７１】
−  ３０ｐｐｍ  ｗ／ｖでの観察
約１〜２匹のシラミを、添加の１０分後に、３０ｐｐｍ  ｗ／ｖのイミダクロプリドで処理した魚を含有するタンクの水柱において観察した。添加の１８分後、約１０匹のシラミが水柱において存在した。添加の２５分後、約２０匹のシラミが水中に認められ、６匹未満の魚が、１匹の魚あたり推定１〜２匹のシラミに感染していると思われた。イミダクロプリド添加の３３分後、ほとんどの魚はいかなるシラミ感染に対しても陰性であると考えられた。宿主から離れたシラミは全て不動であった。添加の４７分後、３匹の魚だけが感染しているように見え、それぞれが１匹のシラミを有していた。イミダクロプリド添加の５９分後、シラミに感染したように見える魚はなかった。イミダクロプリド添加の７８分後、個々のシラミが４匹の魚に再付着したように見え、１匹のシラミが４匹の魚で観察された。その６分後、これらの魚にはシラミは観察されず、タンク内のシラミは全て不動であった。
【００７２】
処理の２日後、シラミの提供及び付着に以前関連していた病変はほぼ完全に回復したということが認められた。
【００７３】
−  １０ｐｐｍ  ｗ／ｖでの観察
イミダクロプリド添加後最初の１９分以内には、水柱においてシラミは観察しなかった。添加の２１分後、数匹のシラミが水柱において活発に泳いでいるのを観察した。４分後、これらのシラミの大部分は不動であった。添加の５４分後、２匹の感染した魚が認められ、それぞれ１匹の卵のあるメスによって寄生されていた。添加の８６分後、１匹のメスのシラミがその宿主から離れるのを観察した。直接観察されなかったけれども、残りの卵のあるメスはその宿主から離れたことが認められた。添加の９１分後、１匹のオスのシラミを、その宿主の頭部において観察した。このシラミは、処理後少なくとも５日間その宿主において観察された。
【００７４】
１．２．３  終了
魚をウオジラミに曝露してから８週間後に試験を終了した。魚をＭＳ２２２（トリカインメタンスルホナート）で麻酔し、Ｉｋｉ  Ｊｉｍｅツールを使用して延髄穿刺した。それぞれの魚の長さ及び重量、並びに、外部症状を記録した。全てのシラミをそれぞれの魚から除去し、性別及び発育段階を書き留めた。シラミをエタノールにおいて保存し、性別及び段階を、立体顕微鏡を使用して確かめた。
【００７５】
最終的なシラミの計数を盲検法で行い、結果が表２において示されている。データは、有病率及び存在量として表されている。有病率は、寄生虫種のより多くの個体のうちの１つに感染した宿主の数を、検査した宿主の数（感染した宿主及び感染していない宿主を含む）で割ったものとして定義され、パーセンテージとして表されている。
【００７６】
【表２】
2020500545.tif 000004
＊この処理群から２匹の魚を取り除いた。魚１：尾叉長３１６ｍｍ、総重量４５２ｇ。３匹の成体オス及び６匹の成体メスを回収した。魚２：尾叉長２９０ｍｍ、総重量３７９ｇ。１匹の生体オス及び１匹の生体メスを回収した。
【００７７】
８週目に検査した魚における全てのシラミの段階の感染の有病率は、２つの対照グループ間で、及び、曝露後１週間の１０、３０又は５０ｐｐｍ  ｗ／ｖのイミダクロプリドで処理した魚において異なるとは考えられなかった。しかし、上述のように、ウオジラミ曝露後６週間の１０、３０又は５０ｐｐｍ  ｗ／ｖのイミダクロプリドで処理した魚からシラミは回収されなかった。この処理は、運動性の寄生段階のシラミに対して全ての処理用量で１００％効果的であると考えられた。
【００７８】
シラミの総存在量において有意な差は、ＤＭＳＯ対照と比較して曝露後１週間の処理した魚において観察されず；シラミの存在量におけるわずかな差は海水対照と比較した場合に明らかであり、これは、有意であるとは考えられなかった。同様に、曝露後１週間の処理した魚から回収したオスシラミの存在量と、対照群から回収したオスシラミの存在量との間には、限られた差が観察された。曝露後１週間の処理した魚からの卵のあるメスの存在量と、対照群からの卵のあるメスの存在量とにおいて有意な差は認められなかった。
【実施例２】
【００７９】
処理濃度の最適化
２．１  ウオジラミの曝露
１２０匹のサケの魚（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）を５つのフロースルー処理タンクにわたって分け、寄生虫の曝露に先立ち２４時間気候順化した。
【００８０】
卵のあるメスのＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓから除去した卵の列を収集し、感染性コペポディドが生産されるまで養殖した。次に、そのコペポディドを、海水を含有する５つのボトルに均等に分配し、〜１０℃で一晩保存した。曝露に備えて、処理タンク内の流水を止め、光レベルを低下させた。６５０±２０のコペポディド（１つの宿主あたり〜２７）を静水に添加し、タンクを全暗所において７時間維持した後、光レベルを上げて、流水を再開した。
【００８１】
２．２相対効果研究
表３において示されるように、魚を１０匹の魚の１０のグループに無作為に分け、３０Ｌの水及び高曝気を含有する静的な「処理バケツ」において保持した。
【００８２】
【表３】
2020500545.tif 000005
８つのグループ（３〜１０）を、要求された濃度のイミダクロプリドで６０分間処理し：イミダクロプリドは、ＤＭＳＯにおいて溶解し、処理バケツへの添加に先立ち、〜１Ｌのタンク水に添加していた。残りのグループ及びその反復（１＆２）は、０．０３％のＤＭＳＯ対照であった。
【００８３】
実験動物を、有害反応及び寄生虫感染の状態について入念にモニターした。可能であれば、全ての寄生虫が分離したと考えられる時間を記録した。処理は静的システムにおいて行ったため、手順を通して温度及び溶存酸素を定期的にモニターし、必要に応じて曝気を調整した。
【００８４】
処理期間の後、試験動物を処理溶液から取り除き、人間の力で安楽死させた。それぞれの魚の重量及び大きさを測定し、個々の寄生虫量を評価した。処理溶液中の寄生虫の数も数え：性別及び成熟度、ネオニコチノイド中毒の明らかな徴候、及び／又はあり得る回収について定性的に評価した。
【００８５】
結果
０．０３％のＤＭＳＯ濃度と組み合わせた４つの処理濃度１０、１５、２０、及び２５ｍｇ／ｌのイミダクロプリドでのシラミの総除去率が、表４及び図１において示されている（ｎ＝２、ｔ＝６０分、エラーバーは±ＳＥＭを示す）。
【００８６】
【表４】
2020500545.tif 000006
４つの処理用量全てが、６０分間の処理の間に８０〜１００％の寄生虫感染を除去した。
【００８７】
ロジスティック回帰分析を使用して、処理後の寄生虫排除を濃度のそれぞれと比較した。ロジスティック回帰分析は、Ｒ  ｖ．２．１３．０においてｇｌｍ関数を使用して行い、（最大逸脱度の自由度との比較を介して決定した）二項又は準二項エラー分布を仮定した。
【００８８】
全ての処理濃度での寄生虫排除を、０ｍｇ／ｌの寄生虫排除より有意に大きいと決定した（ｐ＜０．０１）。排除は、１０ｍｇ／ｌ（８０±１１％）よりも２５ｍｇ／ｌ（９７±３％）で有意に大きい（ｐ＜０．０５）けれども、有効性における有意な差を、１５ｍｇ／ｌ（９２±４％）以上の濃度間で決定することはできなかった（ｐ＞０．４）。宿主動物を２０ｍｇ／ｌで処理した場合の寄生虫排除は、９２±７％であった。要約すると、イミダクロプリドは、試験した全ての濃度で、Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓをその宿主から効果的に除去した。
【００８９】
２．３  率決定研究
１０ｍｇ／ｌのイミダクロプリドに曝露したウオジラミは、３０ｍｇ／ｌに曝露したウオジラミと比較した場合に、宿主から落ちるのにより時間がかかるように思われるということを観察した。
【００９０】
効果をもたらす濃度と時間との関係を定量化するために、２０匹の宿主動物を、１０ｍｇ／ｌ又は２０ｍｇ／ｌのイミダクロプリドの処理濃度に（１つの濃度当たり１０匹の魚）無作為に割り付けた。率決定研究のロジスティックは、魚を処理溶液から取り除き、全寄生虫排除が生じたらすぐに安楽死させ、その結果、手順下の時間及び関連する動物愛護の懸念を最小限に抑えたことを除いて、相対効果研究と本質的に同じであった。
【００９１】
結果
１０ｍｇ／ｌ及び２０ｍｇ／ｌのイミダクロプリドによる処理は、宿主からの全寄生虫排除を結果としてもたらした。実験動物は手順を通して入念にモニターし、全排除までの時間を最も近い分まで記録した。この事象は実験のエンドポイントを表し、この時点で動物を取り除き、安楽死させた。生存分析を使用して、寄生虫排除までの時間が１０ｍｇ／ｌと２０ｍｇ／ｌとの間で有意に異なるかどうかを決定した。図２は、カプラン・マイヤーグラフとして率を視覚的に表し、さらに、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログランク検定）が、両者の間に有意差はないと決定している（ｐ＝０．４８、ｎ＝１０、ｔ≦５６分）。イミダクロプリドの濃度は、寄生虫排除までの時間に影響を及ぼさず、いずれの濃度に対しても〜２７．５分の致死時間５０％（ＬＴ５０）を推定するということを結果が示している。
【００９２】
この研究によって、１５ｍｇ／ｌが試験した範囲での最適濃度であると決定され；この濃度を超えると、有効性における統計学的に有意な増加は観察されなかった。加えて、効果をもたらす濃度と時間との関係を確立することはできず、すなわち、いかなる時点（≦５６分）においても、個々の宿主に対する全寄生虫排除の確率は、１０ｍｇ／ｌ又は２０ｍｇ／ｌのイミダクロプリドで有意に異なってはいなかった。
【００９３】
２．４  ウオジラミの回復
相対効果研究に対するサンプリング時点（２．２を参照）では、多くの寄生虫が、その宿主に付着したままであった（１０ｍｇ／ｌに曝露したものの２０％、１５及び２０ｍｇ／ｌに曝露したものの８％、及び２５ｍｇ／ｌに曝露したものの３％）。
【００９４】
相対効果研究及び率決定研究両方からのイミダクロプリドに曝露した寄生虫（処理後にその宿主から手動で除去されたもの、及び、処理中に分離したもの）は、きれいな海水に浸漬し、回復の徴候を観察した。
【００９５】
最初の観察時には、曝露した個体は死んでいるか又は依然として活発であると決定された。それらの依然として活発であるもののうち、筋肉の興奮は非協調的であり、制御されず、制限されていた。これらの個体は、明らかに、その基本的な機能（宿主への付着及び標的にされた運動）を実行することができず、処理後にその宿主に付着したままの寄生虫は、その後、下流で分離したかもしれないということを示唆している。
【００９６】
曝露後の期間中（６時間まで）に、いかなる濃度のイミダクロプリドに曝露した寄生虫のいずれにおいても、機能回復の明らかな徴候は認められなかった。
【実施例３】
【００９７】
活魚運搬船におけるウオジラミ感染の処理
処理されることになるサケは、標準的な水産養殖ケージにおいて群がり、次に、活魚運搬船の酸素添加したいけす内に汲み出し、それぞれのいけすにおいて、水１立方メートル当たり９０又は１２０ｋｇの魚の密度を得た。予め混合したイミダクロプリドを、２０ｐｐｍ  ｗ／ｖの用量までいけすに添加した。次に、魚を６０分間処理した。処理期間の終了時に、魚をいけすから汲み出し水を取り除き、処理水がいけすに戻るのを確実にした。これをするために、魚を格子又はグレードバー上に動かし、未処理の海水で洗浄をして、魚の外側からいかなる処理水の残りも除去した後、シーペンに戻した。全てのすすぎ水を使用後に保持した。
【００９８】
この水を、約５０μｍ又は約１５０μｍのメッシュサイズを有するメッシュフィルタに通して、瀕死状態及び死んだウオジラミ及びその卵の列を含む有機物を除去した。
【実施例４】
【００９９】
現場でのウオジラミのＬ．ｓａｌｍｏｎｉｓ及びＣａｌｉｇｕｓ種の処理
養殖のタイセイヨウサケにおける幼若成虫及び成体段階のＬ．ｓａｌｍｏｎｉｓ及びＣａｌｉｇｕｓ種の感染に対するイミダクロプリドの有効性を、イミダクロプリドでの処理を経験するサケにおける処理前及び処理後のウオジラミの計数を行うことによって調査した。この試験は、ノルウェーの商業用サケ養殖場で行った。サケを活魚運搬船上に汲み出し、２０ｐｐｍのイミダクロプリドに６０分間曝露した。サケの平均重量は３．５ｋｇであり、１つの囲い当たりのサケの平均数は１８０，０００であった。１つの囲い当たり３０匹の魚を、Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ及びＣａｌｉｇｕｓ種について評価し、発見した各Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓライフステージの数を記録した。これは、処理に先立ち２４時間以内、及び、処理後２４時間以内に行った。
【０１００】
これらの評価は、合計４つの囲いのサケに対して行った。処理に先立ち、魚は、囲いの中で群がっており、処理前のウオジラミの評価を行った活魚運搬船内に汲み出されるのを可能にしていた。処理後のウオジラミの評価は、活魚運搬船の流出管から魚を取り除くことによって行った。
【０１０１】
全ての時点で、３匹の魚を取り除き、麻酔薬の槽内に置いた。これを、３０匹の魚を評価するまで１０回繰り返した。
【０１０２】
ウオジラミのライフサイクル段階に従い、４つの試験した囲いのそれぞれに対して、この試験で１匹の魚当たり観察した、投与前又は投与後の活発なウオジラミの数が、表５において示されている。全ての魚を、処理を通して観察したが、有害な行動は見られなかった。
【０１０３】
【表５】
2020500545.tif 000007
このように、イミダクロプリド処理は、ウオジラミのＬ．ｓａｌｍｏｎｉｓ及びＣａｌｉｇｕｓ種に対して現場において効果的である。
【実施例５】
【０１０４】
ウオジラミに対するイミダクロプリドの効果のタイムスケール
イミダクロプリドの効果のタイムスケールを決定するために、幼若成虫及び成体のウオジラミに感染したサケを、貯蔵タンクから取り除き、頭部への鋭い一撃を使用して死滅させた。魚を、０、２０、５０、１００、２００、又は５００ｐｐｍのイミダクロプリドの存在下で３０リットルの水中で浮遊させ、ウオジラミを３０〜６０分間観察し、ウオジラミがその宿主から出るかどうか及びいつ出るかをモニターした。
【０１０５】
０ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露した魚（陰性対照）に対しては、観察を６０分間行った。６０分間観察した、５００ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露した１匹の魚を除いて、他の全ての処理した魚を３０分間観察した。１つの処理グループに当たり３匹の魚を試験した。
【０１０６】
シラミが宿主を離れた時間に対する観察、並びに、ウオジラミの性別及び段階を書き留めた。宿主を離れたいかなるシラミも、直ちにきれいな海水に移した。さらに、曝露期間の終了時に宿主に残っているいかなるシラミも宿主から除去し、きれいな海水に移した。
【０１０７】
シラミを、曝露期間の終了直後にも、曝露期間終了の約２時間後にも観察した。
【０１０８】
オスのウオジラミとメスのウオジラミとの比は、約５０：５０であった。水温は約１２℃であった。
【０１０９】
未処理の海水において保持した死んだ魚のシラミは、６０分間の観察期間にわたって宿主を離れず、ペトリ皿に移されると正常な動きを示した。これらの動きには、泳ぎと、付属肢の典型的な制御された動きが含まれていた。
【０１１０】
イミダクロプリドを投与して間もなく、シラミは２つの注目すべき変化を経験することを観察した。第一に、背甲の外側縁が内側に引っ張られ、シラミにせむし様の外見を与え、その際、シラミの下側を魚から持ち上げ、第二に、冒された個体の腹部を魚の表面に対して約４５°の角度で持ち上げた。
【０１１１】
宿主を離れる前に、シラミは一般的に非常に活発になり、しばしば円形のパターンで魚の表面にわたって移動した。魚を離れると、試験タンクの底で不動になる前に、広いらせん状の下向きの動きで移動した。
【０１１２】
２０から２００ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露したグループにおいては、シラミの約５０％が最初の１５分以内に宿主を離れた。５００ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露した魚では、シラミの約７０％が最初の９分以内に宿主を離れた。残りのシラミは曝露期間の終わりまで宿主に留まった。宿主上のシラミは、処理中に背甲の側方圧迫を経験し、シラミのせむし様の外見を生じさせた。
【０１１３】
このように、シラミの大部分が、処理した宿主を１５分以内に離れた。
【０１１４】
オスのシラミは、メスと比較して宿主を離れる可能性がより高いようであった。イミダクロプリドに曝露したシラミは、典型的には、運動性の全損失及び付属肢の急速な攣縮を示した。メスのシラミは、オスと比較してより少ない付属肢の動きを示したが、オスと比較して腸の蠕動運動を示した。
【０１１５】
（きれいな海水における）宿主を離れたシラミの観察
陰性対照−イミダクロプリドに曝露していないシラミは、その宿主から除去されたシラミに特有である行動を示した。これには、活発な泳ぎ及び腸の蠕動運動が含まれた。付属肢の動きは、系統的且つ制御されていると考えられた。シラミは物理的な刺激に反応し、活発に立ち去った。
【０１１６】
２０ｐｐｍ−２０ｍｇ／Ｌのイミダクロプリドに曝露した４９匹のシラミのうち、２匹が、曝露後（ｐ．ｅ．）３０分で死んでいると考えられた。一組のピンセットで触れると、シラミはペトリ皿の側から落ち、ひっくりかえり、短い距離泳いだ。しかし、泳ぎは一定せず、大部分の付属肢の過剰な運動によって引き起こされているようであった。残りのシラミは、脚、第２小顎、及び第１触角（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｅｎｎａ）を含むその付属肢の急速な攣縮を伴う瀕死状態であると考えられた。腸の蠕動運動が、２０ｐｐｍのイミダクロプリドに３０分間曝露したメスにおいて認められた。４９匹のうち１２匹が、生きており、反応性があり、刺激なしで活発に泳いでいると見なされた。３０分間曝露したシラミは回復の徴候を示さなかった。
【０１１７】
５０ｐｐｍ−５０ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露した２１匹のシラミのうち、４匹が３０分後に死んでいると考えられた。主要な付属肢の攣縮が、３０分間曝露した２匹の成体のメスにおいて認められた蠕動運動を除いて、残りのシラミにおいて認められた。ｐ．ｅ２時間で検査した１４匹のシラミは、死亡したと考えられ、動きは検出されなかった。２匹の個体が脚の攣縮を有し、４匹の成体のメスが腸の蠕動運動を示した。
【０１１８】
１００ｐｐｍ−１００ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露した２８匹のシラミのうち、４匹が曝露期間の終了時に死んでいると考えられた。シラミは、典型的には、第２触角（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｅｎｎａｅ）及び第２小顎の攣縮を示した。さらに１１匹のシラミが、腸の蠕動運動を示した。背甲の側方圧迫が多くの個体において認められた。ｐ．ｅ２時間で、１７／２８匹のシラミが死んでいると考えられた。腸の蠕動運動は、ｐ．ｅ２時間で２８匹中９匹のシラミにおいて認められ；いずれも成体のメスであった。最後に、１匹のシラミの触角及び別のシラミの脚４が、ｐ．ｅ２時間で限られた攣縮運動を示した。
【０１１９】
２００ｐｐｍ−２００ｐｐｍのイミダクロプリドに曝露した２６匹のシラミのうち、４匹が曝露期間の終了時に死んでいると考えられた。残りのシラミは、典型的には、第２触角の攣縮の他に動きはなく、腸の蠕動運動が、４匹の成体のメスのシラミにおいて認められた。１匹のシラミの肛門の攣縮がｐ．ｅ３０分で認められた。６匹のシラミが曝露の２時間後に死んでいると考えられた。さらに、限られた攣縮が、残りの動物において記録され、主に３匹の成体のメスにおける第１触角及び第２触角の攣縮及び腸の蠕動運動から成っていた。
【０１２０】
５００ｐｐｍ−２０匹のシラミのうち６匹がｐ．ｅ３０分で死んでいると考えられた。このうち２匹は、２時間後に腸の蠕動運動又は微量な攣縮を示すものとして記録した。ｐ．ｅ３０分で検査した残りのシラミは、第１及び第２の触角の急速な攣縮によって典型的に表され、４匹の個体においてはいくらかの顎脚の攣縮及び腸の蠕動運動があった。ｐ．ｅ２時間で、１５／２０匹のシラミが死んでいると考えられた。３匹のシラミが第２触角の攣縮を示し、腸の蠕動運動を２匹のシラミにおいて記録した。
【実施例６】
【０１２１】
分離したウオジラミにおけるアザメチホス及びデルタメトリンとの比較
両性の幼若成虫段階も成体段階（移動性段階）も使用し、それらをグループ間で均等に分配した。ウオジラミを６０分間イミダクロプリドに、６０分間アザメチホスに、３０分間デルタメトリンに、１リットルの槽において、ある濃度範囲（表６、７及び８）で曝露した。処理後、ウオジラミをきれいな曝気海水に移した。実験中の海水の温度は１２℃であったが、曝露中、温度を、６０分間曝露する計画（イミダクロプリド及びアザメチホス）において約１４℃まで、３０分間曝露する計画（デルタメトリン）において１３℃まで上げた。
【０１２２】
各計画における生存シラミ及び不動化シラミ（死滅したシラミを含む）の数を、曝露終了の約２０時間後に記録した。各シラミを個々に調査した。
【０１２３】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験におけるイミダクロプリド、アザメチホス及びデルタメトリンの比例効果が、表６、７及び８において示されている。
【０１２４】
【表６】
2020500545.tif 000008
【０１２５】
【表７】
2020500545.tif 000009
【０１２６】
【表８】
2020500545.tif 000010
イミダクロプリドの推定ＥＣ５０値は７．６ｐｐｍであり、イミダクロプリドの推定ＥＣ９０値は１４．４ｐｐｍであった。アザメチホス及びデルタメトリンのＥＣ５０値及びＥＣ９０値は計算されなかった。
【実施例７】
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのイミダクロプリド処理の濃度依存性及び時間依存性
ｉｎ  ｖｉｖｏでのイミダクロプリド処理の濃度依存性及び時間依存性を決定するために、タイセイヨウサケ（平均３２０．９ｇ）を、１２℃で海水（３２．５‰塩分）中のイミダクロプリドに曝露した。タンク内の水位を下げ、活性物質の投与中に曝気を行った。サケジラミのコペポディドの培養を数え、各曝露時点における曝露タンク内の１匹の魚当たり約４０のコペポディドの目標レベルを得るように調整した。
【０１２８】
魚のサケジラミを、標準的な方法を使用して数えた。えら及び口腔／頬側口腔を含まない魚の外表面のシラミのみを調べた。
【０１２９】
タンク水における解離したシラミ又はタンクの壁に付着したシラミの数を記録した。タンク水中のシラミを収集し、（あり得る回復を評価するために）処理直後及び再度３０〜６０分後の滑らかなプラスチック表面への吸引によって付着する能力について評価した。生存シラミ及び生存可能なシラミもニセの処理の対照群から参考のために収集し、システムを評価するために同じ時間、回復チャンバーにおいて保持した。
【０１３０】
各試験中、魚の行動／外見をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。死亡率を含む行動及び／又は外見のいかなる変化も記録した。試験中に死んだ魚はなく、検死解剖も行わなかった。
【０１３１】
活性物質の（海水を加え均質化した）試験溶液を調製し、４０リットルの処理容積に投与した。
【０１３２】
保持タンクから３匹のウオジラミに感染した魚を無作為に集め、バレル内に注意深く導いた。バレルは、タンクに浸漬した内部分画（直径＝３４．５〜４０ｃｍ；高さ＝５４ｃｍ）を形成し、その底部を、９ｍｍ２の正方形の穴を有するプラスチックメッシュスクリーンと交換した。
【０１３３】
各試験の開始から３分以内に魚を内部分画に移した。内部分画は、処理を未決定にしていた保持タンク内に浮遊／浸漬させた。処理及びニセの処理を、魚を有する内部分画の排水を行い、試験溶液を有するバレルに移すことによって実行した。処理／ニセの処理を、曝気／酸素添加した静水において行った。曝気を調整して、酸素飽和度を７０〜１００％に設定した。
【０１３４】
処理を終えるために、処理した魚を有する内部分画を表面まで持ち上げて排水を行い、次に、魚を直接且つ水なしで、致死量の麻酔薬を有する第２のたらいまで移し、死ぬまで放置した。これらの魚に残っているシラミ及び麻酔薬の槽内に落ちたシラミ全てを記録した。
【０１３５】
処理槽内の残っているシラミを、きれいな海水を有する水槽において浮遊させたプランクトンメッシュ（２ｍｍの孔径）に通して濾した。この収集装置内のシラミをプラスチックビーカー（１リットル）に移し、次に、回復チューブ（５ｃｍの直径、１０ｃｍの長さ）内に再度移した。各試験の完了後３分以内に処理タンク又はビーカーの壁に付着することができるシラミを、生存可能としてスコア化した。壁に付着しなかったシラミを、回復チューブにおいて３０〜６０分間モニターした。３０〜６０分後に回復チューブにおいて生存可能であると思われたシラミ、及び、そうでないシラミを、別のカテゴリーにおいてスコア化した。
【０１３６】
ニセの処理の対照を類似の様式で行った。
【０１３７】
それぞれの魚は、処理前に１匹の魚あたり平均１１匹のシラミを有した。イミダクロプリドへの曝露時間は３から６０分に及び、用量は２０ｐｐｍから２００ｐｐｍに及んだ。
【０１３８】
この試験において死んだ魚はなかった。
【０１３９】
表９は、イミダクロプリド処理によって魚から除去されたシラミの割合を示している。
【０１４０】
【表９】
2020500545.tif 000011
表９は、シラミの総数に対する、処理後の魚から除去したシラミの割合を示している。３分及び６０分にて陰性対照のグループを繰り返した。上付きの番号は、各試験における３匹の魚のシラミの総数を示している。
【０１４１】
このように、イミダクロプリドは、処理の期間を使用してシラミを除去するのに効果的であった。
【０１４２】
表１０は、処理によって魚から離れることになったウオジラミ、及び、処理中は付着したままであったがその後収集したウオジラミの割合を示しており、処理の３０〜６０分後も活発なままであった。
【０１４３】
【表１０】
2020500545.tif 000012
このように、ウオジラミは、離れるようになることによってイミダクロプリドに応答する。処理したウオジラミの一部は、生存可能のままのようである。おそらく生存可能な離れた（及び死んだ）ウオジラミは、処理水の濾過を使用して除去される。
【０１４４】
比較として、同じ供給源からのウオジラミに感染した魚を、勧められた投与計画によって、０．１ｍｇ／ｌのアザメチホス及び０．２μｌ／ｌのデルタメトリンで３０分間処理した。処理は、イミダクロプリドで処理したものと類似の条件下で行った。ニセの処理の対照も施行した。各処理条件を二度繰り返して施行した。この比較試験の結果が、表１１において示されている。
【０１４５】
【表１１】
2020500545.tif 000013
表１１は、シラミの総数に対する、処理後の魚から除去したシラミの割合を示している。上付きの番号は、各試験における３匹の魚のシラミの総数を示している。
【０１４６】
このように、ウオジラミが魚から離れることになるイミダクロプリドで見られる効果に比べると、ウオジラミは、デルタメトリン又はアザメチホスに応答して魚に実質的に付着したままである。
【実施例８】
【０１４７】
イミダクロプリドの安全性
魚に対するイミダクロプリド処理の安全性を評価した。２７１．８Ｌの海水を有するフロースルータンクにおいて保持した魚を、６５ｐｐｍ  ｗ／ｖの有効成分イミダクロプリドに曝露した。１７．６７ｇのイミダクロプリドを１００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において溶解し、この溶液を約９００ｍｌの海水に添加して混ぜ合わせた。スルータンク上の流れを無効にし、イミダクロプリドの溶液を添加した。
【０１４８】
魚を静水中６５ｐｐｍのイミダクロプリドに１時間曝露し、５〜１０分間隔で行動変化を観察した。次に、終了前に魚をさらに７日間保持した。曝露期間中、魚の行動において観察可能な変化は認められなかった。魚をさらに７日間モニターしたが、有害反応は認められなかった。終了時には、外部異常は認められなかった。
【図１】
2020500545.tif 000014
【図２】
2020500545.tif 000015
【国際調査報告】
2020500545.tif 000016
2020500545.tif 000017