(57)【要約】  ＤＮＡ塩基配列決定法が開示される。本発明が提供する該ＤＮＡ塩基配列決定法は、次のステップを順に備える、すなわち、（１）タグ配列を含む塩基配列が決定されるＤＮＡを形成するように、該塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端にタグ配列を付加し、前記タグ配列のヌクレオチド配列はシークエンスプライマーにおけるヌクレオチド配列の逆相補的であり、（２）５’末端二本鎖及び一本鎖主要部分を有する生成物を形成するように、前記タグ配列を含む前記塩基配列が決定されるＤＮＡと前記シークエンスプライマーとを混合し、（３）ステップ（２）完了後、前記生成物とｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰとを別々に混合し、４つの系を取得し、それぞれの系をＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスに別々に添加し、電気信号を読み取る。実験は、本発明が提供する方法がＤＮＡ塩基配列決定を行い、重要な適用価値を有することを検証する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスであって、該単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイスであるか、又は、低次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、前記単一分子デバイスとの結合サイトを有し、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基が、前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、一つの結合サイトのみを介して前記単一分子デバイスに結合され、好ましくは、前記結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、前記ＤＮＡポリメラーゼ中に一度だけ生じる、請求項１又は２に記載のＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、
ｂ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
ｂ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体
である、請求項１乃至３いずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
【請求項５】
前記結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から７９０番目の位置におけるシステイン残基である、請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該ＤＮＡポリメラーゼが、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、前記マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られている、請求項１乃至５いずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
【請求項７】
（１）塩基配列が決定されるＤＮＡとシークエンスプライマー及びｄＮＴＰとを混合して反応系を取得し、
（２）ステップ（１）の反応系と請求項１乃至６いずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスとを接触させ、
（３）ＤＮＡ合成中、経時的に、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおけるソースドレイン間電流の電気信号を検出し、
（４）前記電気信号を解析し、配列結果を得ること、
を備えたＤＮＡ塩基配列決定法。
【請求項８】
ステップ（１）において、前記塩基配列が決定されるＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡであり、且つ、
前記塩基配列が決定されるＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである場合、前記二本鎖ＤＮＡは、初めに変性され、その後前記シークエンスプライマー及びｄＮＴＰと混合される、請求項７に記載のＤＮＡ塩基配列決定法。
【請求項９】
ステップ（１）において、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有するタグ配列が、前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端に結合され、好ましくは、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４に示される配列であり、前記タグ配列のヌクレオチド配列は、配列番号４に示される配列の５’末端から５１〜６８番目の位置における配列である、請求項７又は８に記載のＤＮＡ塩基配列決定法。
【請求項１０】
ステップ（２）において、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該ＤＮＡポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、前記マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られ、ステップ（１）における反応系が、前記マイクロキャビティ内に加えられる、請求項７乃至９いずれか１項に記載のＤＮＡ塩基配列決定法。
【請求項１１】
ステップ（４）が、
前記ソースドレイン間電流のピーク値を統計的に解析し、各ピーク値に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、又は、
高電流状態に対応する高状態時間及び低電流状態に対応する低状態時間を統計的に解析し、平均低状態時間及び平均高状態時間を計算し、各平均低状態時間及び平均高状態時間に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、
を備えた、請求項７乃至１０いずれか１項に記載のＤＮＡ塩基配列決定法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼと単一分子デバイスとを備えるＤＮＡ塩基配列決定のためのキットであって、
前記単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイスであるか、又は、低次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである、キット。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、
ｂ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
ｂ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体
である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼ及び前記単一分子デバイスは、分離された区画に存在しており、使用される際にサイトが結合され、又は、前記ＤＮＡポリメラーゼは前記単一分子デバイスに結合され、好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは前記単一分子デバイスとの結合サイトを有し、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基は前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配され、より好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれている、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
シークエンスプライマー、ｄＮＴＰ及び／又は使用説明をさらに備えている、請求項１２乃至１４いずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年８月３１日に国家知識産権局に出願された、主題を「ＤＮＡ配列決定法」とする中国特許出願第２０１６１０７９８１１３．Ｘ号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特にＤＮＡ塩基配列決定法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡは遺伝情報の担い手であり、ＤＮＡにおける４つの塩基対の特定の順序は遺伝情報の本質である。ＤＮＡにおける塩基対の特定の順序の決定は、ＤＮＡ塩基配列決定と呼ばれ、生命の謎を明らかにし、遺伝プロセスを制御し、病気の診断を推進させ、医療技術を改善することにおいて、根本的な役割を有している。これまでのところ、連続する二世代の塩基配列決定技術の開発が成功しており、広く使用されている。ジデオキシチェーンターミネーション法に基づく第１世代の塩基配列決定技術は、遺伝の謎を明らかにするための人類にとっての扉を開けるとともに、遺伝子工学の重要な基盤を構築した。超並列合成に基づく第２世代の蛍光検出法は、第１世代の塩基配列決定技術を基礎としたＰＣＲ増幅及び蛍光検出を利用しており、塩基配列決定の効率を大幅に改善し、最初のヒトゲノム塩基配列決定の完了に大きく貢献している。先の二世代の塩基配列決定技術の相当な発展にもかかわらず、ＰＣＲ増幅における時間の浪費及び高コスト、蛍光ラベル化及び検出プロセスにおける煩雑さ及び不安定性など、未だ多くの対処されるべき欠点がある。同時に、生命の本質における人間の理解の深まり、及び、医療分野における技術的手段の継続的進歩に伴い、個別の最適治療計画や分子診断が徐々に普及しており、これらはＤＮＡ塩基配列決定に対してより高度な要件を課す。そのため、どのようにしてＤＮＡ塩基配列決定を早く、正確に且つ低コストで行うかが、流行りの研究分野になっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、比較的十分に進展したＤＮＡ塩基配列決定技術は、ナノポア式の電気的試験プラットフォームに基づいている。商業的な試験器の試作品が現れてはいるが、ＤＮＡの移動速度を制御することの困難性、塩基配列決定信号の低分解能、及び塩基配列決定の不正確性などの種々の欠点のために、この方法に基づく塩基配列決定技術の進展が阻まれている。種々の新しいナノ材料の継続的な出現やマイクロナノプロセス技術の継続的な向上に伴い、単一分子の検出能力を備えたデバイスプラットフォームが急速に進展しており、ＤＮＡ塩基配列決定の絶え間ない進歩のための継続的な動機及び機会を提供している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来技術の問題を解決するために、本発明の第１の態様は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスを提供し、該単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイスであり、又は低次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである。
【０００６】
本明細書で用いられる用語「単一分子デバイス」は、単一分子の変化に応答可能な従来技術における任意のデバイスであってもよい。すなわち、当業者は、対応する単一分子デバイスの変化を検出し又は観測することによって、分子が変化したかどうかを知ることができる。好ましくは、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼに電極としてのグラフェン又はシリコンナノワイヤが結合した単一分子デバイスを利用する。単一分子デバイスの電流の変化を検出することによって、ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーションが変化したかどうかを知ることができる。
【０００７】
グラフェン系単一分子デバイス及びシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製プロセスは、文献（Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecule junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32.）記載の方法を参照することができる。
【０００８】
本発明の第１の態様における好ましい一実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、前記単一分子デバイスとの結合サイトを有しており、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基が、前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配されている。
【０００９】
本明細書で用いられるように、「前記結合サイトを提供するアミノ酸残基が、前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配されている」ことは、前記ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成中に一つのｄＮＴＰを受容するごとに、前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーションが特定の領域において変化することを意味する。前記単一分子デバイスとの前記ＤＮＡポリメラーゼの結合に基づいて、前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーションにおける変化が、前記単一分子デバイスにおける電流を変化させる。続いて起こるＤＮＡ塩基配列決定の感度を改善するために、前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配された前記アミノ酸残基は、好ましくは前記単一分子デバイスに結合している。加えて、前記ＤＮＡポリメラーゼにおけるコンフォメーションの変化は、前記単一分子デバイスとの結合サイトを提供する前記アミノ酸残基の結合によって影響を受けない。
【００１０】
本発明の第１の態様における別の好ましい実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、一つの結合サイトのみを介して、前記単一分子デバイスに結合している。好ましくは、前記結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、前記ＤＮＡポリメラーゼ中に一度だけ生じる。
【００１１】
本明細書で用いられるように、「前記ＤＮＡポリメラーゼは、一つの結合サイトのみを介して、前記単一分子デバイスに結合している」とは、一つのアミノ酸残基のみが、前記単一分子デバイスに結合していることを意味する。
【００１２】
本明細書で用いられるように、「結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、前記ＤＮＡポリメラーゼ中に一度だけ生じる」とは、ただ一つの結合サイトを確保するために、結合サイトを提供する前記アミノ酸残基を前記ＤＮＡポリメラーゼ中に一度だけ生じさせる必要があることを意味する。前記ＤＮＡポリメラーゼにおける前記結合サイトに加えて、他の位置において同一のアミノ酸又はアミノ酸配列がある場合、他の位置におけるアミノ酸又はアミノ酸配列が前記単一分子デバイスに結合することを防ぐために、修正又は変更が、他の位置におけるアミノ酸又はアミノ酸配列に必要となる。前記ＤＮＡポリメラーゼにおける単一の結合サイトに加えて、他の位置において同一のアミノ酸又はアミノ酸配列がない場合、修正又は変更は、他の位置におけるアミノ酸又はアミノ酸配列に必要とならない。該修正又は変更は、当業者の従来の知識に従って、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性を変えずに又はコンフォメーションを変化させずに行われることを意味する。例えば、本発明の好ましい一実施形態では、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から９０７番目の位置におけるシステイン残基が、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基に置換されている。
【００１３】
本発明の文脈では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、以下に限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ若しくはＶ、又は、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ若しくはε、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩである。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。さらに好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。
【００１４】
本発明の第１の態様におけるさらに好ましい別の実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、
ｂ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
ｂ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、
である。
【００１５】
本明細書で用いられるように、用語「機能変異体」は、アミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加によって取得されるタンパク質であって、その本来の生物活性、すなわち、ＤＮＡ合成を案内する生物活性を維持しているタンパク質を示す。
【００１６】
本発明の第１の態様における好ましい一実施形態では、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の機能変異体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加によって得られる同じ機能を有するタンパク質である。
【００１７】
本発明の第１の態様における好ましい一実施形態では、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の機能変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から９０７番目の位置のシステイン残基の非システイン残基への置換、及び、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から７９０番目の位置のロイシン残基のシステイン残基への置換によって得られるタンパク質であり、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から９０７番目の位置のシステイン残基のセリン残基への置換、及び、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＮ末端から７９０番目の位置のロイシン残基のシステイン残基への置換によって得られるタンパク質である。
【００１８】
本発明の第１の態様における好ましい一実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記単一分子デバイスに結合するとき、前記ＤＮＡポリメラーゼの前記結合サイトは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から７９０番目の位置におけるシステインである。
【００１９】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、該ＤＮＡポリメラーゼの活性及びコンフォメーションの変化が維持される限り、当業者に知られた任意の結合方法を使用して前記単一分子デバイスに結合され得る。
【００２０】
好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼとグラフェン系単一分子デバイスとは、次のように結合され得る。すなわち、
（１）グラフェン系単一分子デバイスを調製し、
（２）前記グラフェン系単一分子デバイスとｐ−フェニレンジアミンとを混合して、アミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極を取得し、
（３）１，３，５−トリス（４−カルボニルフェニロキシ）ベンゼンとアミノ基で修飾された末端を有する前記グラフェン電極とを混合して、電気回路を取得し、
（４）前記電気回路とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）ナトリウム塩とを混合して、スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路を取得し、
（５）前記スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路とＮ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩とを混合して、処理されたグラフェン系単一分子デバイスを取得し、
（６）前記処理されたグラフェン系単一分子デバイスと過剰量のＤＮＡポリメラーゼとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを取得する。
【００２１】
好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼとシリコンナノワイヤ単一分子デバイスとは、次のように結合され得る。すなわち、
（１）シリコンナノワイヤ単一分子デバイスを調製し、
（２）前記シリコンナノワイヤ単一分子デバイスとＨＦ溶液とを混合して、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得し、ここで、前記ＨＦ溶液は、４０（質量）％ＮＨ４Ｆ水溶液７質量部と４０（質量）％ＨＦ水溶液１質量部とを混合することによって取得され、具体的にはBeijing Chemical Works社の製品であり、
（３）前記エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと１０−ウンデシン酸とを混合して、電気回路を取得し、
（４）ステップ（３）の前記電気回路とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）ナトリウム塩とを混合して、スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路を取得し、
（５）ステップ（４）の前記スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路とＮ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩とを混合して、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得し、
（６）前記処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと過剰量のＤＮＡポリメラーゼとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得する。
【００２２】
本発明の第１の態様における特に好ましい実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該ＤＮＡポリメラーゼが、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、前記マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られる。
【００２３】
好ましくは、各ＤＮＡポリメラーゼが、一つのマイクロキャビティ内に含まれている。
【００２４】
本発明の第１の態様における特定の実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスは、使い捨て可能である。
【００２５】
本発明の第１の態様における別の特定の実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスは、再利用可能である。
【００２６】
本発明の第２の態様は、ＤＮＡ塩基配列決定法を提供し、該ＤＮＡ塩基配列決定法は、
（１）塩基配列が決定されるＤＮＡとシークエンスプライマー及びｄＮＴＰとを混合して反応系を取得し、好ましくは、前記シークエンスプライマーと対をなす配列を前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端に結合するステップ、
（２）ステップ（１）の前記反応系と請求項１乃至５いずれか１項に係るＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスとを混合するステップ、
（３）ＤＮＡ合成中、経時的に、前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおけるソースドレイン間電流の電気信号を検出するステップ、
（４）前記電気信号を解析して配列結果を取得するステップ、を備える。
【００２７】
本発明の第２の態様における好ましい実施形態では、ステップ（１）において、前記塩基配列が決定されるＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡであり、ここで、前記塩基配列が決定されるＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである場合、該二本鎖ＤＮＡは、初めに変性され、その後前記シークエンスプライマー及びｄＮＴＰと混合される。
【００２８】
本発明の第２の態様における別の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有するタグ配列が、前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端に結合し、好ましくは、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４に示される配列であり、前記タグ配列のヌクレオチド配列は、配列番号４に示される配列の５’末端から５１〜６８番目の位置における配列である。
【００２９】
本発明の第２の態様におけるさらに別の好ましい実施形態では、ステップ（２）において、前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該ＤＮＡポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、該マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られ、ステップ（１）の前記反応系が、前記マイクロキャビティ内に加えられる。
【００３０】
本発明の第２の態様におけるさらに別の好ましい実施形態では、ステップ（４）が、
前記ソースドレイン間電流のピーク値を統計的に解析し、各ピーク値に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、又は、
高電流状態に対応する高状態時間及び低電流状態に対応する低状態時間を統計的に解析し、平均低状態時間及び平均高状態時間を計算し、各平均低状態時間及び各平均高状態時間に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、を備える。
【００３１】
本発明の特定の一実施形態では、本発明の塩基配列決定法は、塩基配列が決定される次のＤＮＡ、すなわち、
5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’、
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’、
5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’、
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’、及び、
5’-TGCTAGCTGCTAATTGTCTCCATGTCATGTAGCTAGCTGTCACAGT-3’、
でそれぞれ行われる。
【００３２】
塩基配列決定プロセスは、具体的には次のステップを含む。すなわち、
（１）タグ配列を前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端に結合して、前記タグ配列を含む塩基配列が決定されるＤＮＡを形成し、ここで、前記タグ配列は、シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有する、ステップ、
（２）前記タグ配列を含む前記塩基配列が決定されるＤＮＡと前記シークエンスプライマーとを混合して、５’末端において二本鎖の形態であり且つ主要部分において一本鎖の形態である生成物を形成するステップ、
（３）ステップ（２）完了後、前記生成物とｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰそれぞれとを混合して４つの系を取得し、各系を前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにそれぞれ添加して電気信号を読み取り、ここで、他の３つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系におけるｄＮＴＰは、ａ１）又はａ２）であり、
ａ１）前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端における第１のヌクレオチド、
ａ２）前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端における第１のセグメントのヌクレオチドであり、前記第１のセグメントはＮ個のヌクレオチドからなり、Ｎは２以上の自然数である、ステップ、
（４）前のステップにおける他の３つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系の前記生成物と、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰそれぞれとを混合して４つの系を取得し、各系を前記ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにそれぞれ添加して電気信号を読み取り、ここで、他の３つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系におけるｄＮＴＰは、ｂ１）又はｂ２）であり、
ｂ１）前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端における第２のヌクレオチド、
ｂ２）前記塩基配列が決定されるＤＮＡの３’末端における第２のセグメントのヌクレオチドであり、前記第２のセグメントはＭ個のヌクレオチドからなり、Ｍは２以上の自然数である、ステップ、
（５）前記塩基配列が決定されるＤＮＡの配列結果が取得されるまで、ステップ（４）を繰り返すステップ、を含む。
【００３３】
上記塩基配列決定プロセスでは、ａ２）において、Ｎは、好ましくは５０である。
【００３４】
上記塩基配列決定プロセスでは、ｂ２）において、Ｍは、好ましくは５０である。
【００３５】
上記塩基配列決定プロセスでは、前記塩基配列が決定されるＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡである。前記塩基配列が決定されるＤＮＡが二本鎖である場合、変性が最初に必要となり、その後前記シークエンスプライマーと混合される。
【００３６】
前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号４に示される配列である。
【００３７】
前記タグ配列のヌクレオチド配列は、配列番号４に示される配列の５’末端から５１〜６８番目の位置における配列であってもよい。
【００３８】
本発明の第３の態様は、ＤＮＡ塩基配列決定のためのキットを提供し、該キットは、ＤＮＡポリメラーゼと単一分子デバイスとを備え、前記単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイス、又は、低次元ナノ材料単一分子デバイスであり、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである。
【００３９】
本発明の第３の態様における好ましい一実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、
ｂ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
ｂ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、
である。
【００４０】
本発明の第３の態様における別の好ましい実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼ及び前記単一分子デバイスは、分離された区画に存在しており、使用される際にサイトに結合され、又は、前記ＤＮＡポリメラーゼは前記単一分子デバイスに結合され、好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは前記単一分子デバイスとの結合サイトを有し、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基は前記ＤＮＡポリメラーゼのコンフォメーション変化領域内に配され、より好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれている。
【００４１】
本発明の第３の態様におけるさらに別の好ましい実施形態では、前記キットは、シークエンスプライマー、ｄＮＴＰ及び／又は使用説明をさらに備えている。
【００４２】
本発明により提供される方法は、ＤＮＡ塩基配列決定を行うために使用することができ、塩基配列決定結果は、ＤＮＡ合成速度が先行文献（Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso,  Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment) , Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860）において説明される内容に実質的に一致していることを示している。本発明によって提供されるＤＮＡ塩基配列決定法は、高い適用価値を有している。
【００４３】
本発明に係る、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス、ＤＮＡ塩基配列決定法及びキットは、ＤＮＡ塩基配列決定に広く適用することができ、少なくとも次の利点を有している。すなわち、
本発明における塩基配列決定速度は、ＤＮＡポリメラーゼの本来的な反応速度に依るため、塩基配列決定速度が化学的塩基配列決定法の決定速度よりも早く、
第２世代の塩基配列決定が数百の塩基のみを検出し得る間に、数千の塩基を有するような非常に長い配列が、ＤＮＡポリメラーゼの本来的な連続性のために、一つの反応によって検出され得、
ＰＣＲ増幅がないため、増幅により導入される塩基のエラーがなく、その結果、非常に高度な塩基配列決定の正確性及び分解能が達成される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの調製のフロー図である。
【図２】図２は、低分解能プローブステーションによって検出された電気特性を示し、ここで、Ｖｓｄはソースドレイン間バイアス電圧を示し、Ｉｓｄはソースドレイン間電流を示す。
【図３】図３は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイス及びＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの模式図である。
【図４】図４は、システインが処理されたグラフェン系単一分子デバイスと化学的に反応する反応式である。
【図５】図５は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＣのＤＮＡ塩基配列決定から取得された反応速度データ及びピーク統計結果である。
【図６】図６は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＣのＤＮＡ塩基配列決定から取得された高状態時間及び低状態時間の統計解析結果である。
【図７】図７は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＡのＤＮＡ塩基配列決定から取得された反応速度データ及びピーク統計結果である。
【図８】図８は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＡのＤＮＡ塩基配列決定から取得された高状態時間及び低状態時間の統計解析結果である。
【図９】図９は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＧのＤＮＡ塩基配列決定から取得された反応速度データ及びピーク統計結果である。
【図１０】図１０は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＧのＤＮＡ塩基配列決定から取得された高状態時間及び低状態時間の統計解析結果である。
【図１１】図１１は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＴのＤＮＡ塩基配列決定から取得された反応速度データ及びピーク統計結果である。
【図１２】図１２は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用した鋳型鎖ＴのＤＮＡ塩基配列決定から取得された高状態時間及び低状態時間の統計解析結果である。
【図１３】図１３は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用したランダム鎖のＤＮＡ塩基配列決定から取得された高状態時間及び低状態時間の統計解析結果である。
【図１４】図１４は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の対象、技術的手段及び利点をより明確に説明するために、以下、図面及び実施例を参照して本発明の詳細をさらに説明する。説明される実施例は、本発明の全ての実施例ではなく一部の実施例のみであることは明らかである。創作的な努力をすることなく、本発明の実施例に基づいて当業者によって取得される全ての他の実施例は、本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本発明が、特定の実施形態を参照してさらに詳細に説明される。実施例は本発明を説明するためにのみ与えられ、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００４７】
以下の実施例における実験方法は、別段の明示がない限り、本技術の従来的な方法である。
【００４８】
以下の実施例において使用される材料、試薬等は、別段の明示がない限り、商業的に入手可能である。
【００４９】
ＤＴＴバッファーは、ｐＨ７．８であり、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーである。
【００５０】
ＨＦ溶液は、４０（質量）％ＮＨ４Ｆ水溶液７質量部と４０（質量）％ＨＦ水溶液１質量部とを混合することによって取得される、Beijing Chemical Works社の製品である。
【００５１】
一本鎖ＤＮＡ分子Ｉ：
（配列番号４に示されるような）5’-(C)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’ 。
【００５２】
一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩ：
（配列番号５に示されるような）5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。
【００５３】
一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩＩ：
（配列番号６に示されるような）5’-(A)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
【００５４】
一本鎖ＤＮＡ分子ＩＶ：
（配列番号７に示されるような）5’-(G)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
【００５５】
一本鎖ＤＮＡ分子Ｖ：
（配列番号８に示されるような）5’-(T)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
【００５６】
一本鎖ＤＮＡ分子ＶＩ：
（配列番号９に示されるような）5’-TGCTAGCTGCTAATTGTCTCCATGTCATGTAGCTAGCTGTCACAGTACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
【００５７】
鋳型鎖Ｃは次のように調製する。一本鎖ＤＮＡ分子Ｉ及び一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩを人工的に合成する。その後、一本鎖ＤＮＡ分子Ｉ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子Ｉの濃度は１０μＭ）、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩの濃度は１０μＭ）、及びＤＴＴバッファー９８０μＬを混合し、７０℃で１時間加熱し、室温まで自然に冷却し、（５’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の）鋳型鎖Ｃを取得する。鋳型鎖Ｃは、反応試験前において、３時間の調製を必要とする。
【００５８】
鋳型鎖Ａは次のように調製する。一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩＩ及び一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩを人工的に合成する。その後、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子の濃度は１０μＭ）、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩの濃度は１０μＭ）、及びＤＴＴバッファー９８０μＬを混合し、７０℃で１時間加熱し、室温まで自然に冷却し、（５’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の）鋳型鎖Ａを取得する。鋳型鎖Ａは、反応試験前において、３時間の調製を必要とする。
【００５９】
鋳型鎖Ｇは次のように調製する。一本鎖ＤＮＡ分子ＩＶ及び一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩを人工的に合成する。その後、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＶ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＩＶの濃度は１０μＭ）、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩの濃度は１０μＭ）、及びＤＴＴバッファー９８０μＬを混合し、７０℃で１時間加熱し、室温まで自然に冷却し、（５’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の）鋳型鎖Ｇを取得する。鋳型鎖Ｇは、反応試験前において、３時間の調製を必要とする。
【００６０】
鋳型鎖Ｔは次のように調製する。一本鎖ＤＮＡ分子Ｖ及び一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩを人工的に合成する。その後、一本鎖ＤＮＡ分子Ｖ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子Ｖの濃度は１０μＭ）、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩの濃度は１０μＭ）、及びＤＴＴバッファー９８０μＬを混合し、７０℃で１時間加熱し、室温まで自然に冷却し、（５’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の）鋳型鎖Ｔを取得する。鋳型鎖Ｔは、反応試験前において、３時間の調製を必要とする。
【００６１】
ランダム鎖は次のように調製する。一本鎖ＤＮＡ分子ＶＩ及び一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩを人工的に合成する。その後、一本鎖ＤＮＡ分子ＶＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＶＩの濃度は１０μＭ）、一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩ１０μＬ（一本鎖ＤＮＡ分子ＩＩの濃度は１０μＭ）、及びＤＴＴバッファー９８０μＬを混合し、７０℃で１時間加熱し、室温まで自然に冷却し、（５’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の）ランダム鎖を取得する。ランダム鎖は、反応試験前において、３時間の調製を必要とする。
【００６２】
低分解能プローブステーションは、半導体パラメータメータ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、４１５５Ｃ）及びプローブステーション（Ｋａｒｌ  Ｓｕｅｓｓ社製、ＰＭ５）からなる。
【００６３】
高分解能プローブステーションは、二つのコアコンポーネントであるプリアンプ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＤＬ１２１１）及びロックインアンプ（Ｚｕｒｉｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＨＦ２ＬＩ）からなる。
【００６４】
１，３，５−トリス（４−カルボニルフェニロキシ）ベンゼンは、Ｊｉｎａｎ  Ｈｅｎｇｈｕａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の製品である。
【００６５】
ｄＡＴＰ溶液は、ＤＴＴバッファーにｄＡＴＰを溶解することによって取得する。ｄＣＴＰ溶液は、ＤＴＴバッファーにｄＣＴＰを溶解することによって取得する。ｄＴＴＰ溶液は、ＤＴＴバッファーにｄＴＴＰを溶解することによって取得する。ｄＧＴＰ溶液は、ＤＴＴバッファーにｄＧＴＰを溶解することによって取得する。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰは、全てBeijing SBS Genetech社の製品である。
【実施例】
【００６６】
［実施例１］ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用するＤＮＡ塩基配列決定
Ｉ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの調製
１．グラフェン系単一分子デバイスの調製
グラフェン系単一分子デバイスの調製プロセスは、次の文献を参照することができる：Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecular junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32。グラフェン系単一分子デバイス上にナノギャップを有するグラフェン電極がある（以下、グラフェン電極として言及し、その構造式は図１（１）に示されている）。
【００６７】
次のステップ２〜７は、文献：Yang Cao, Shaohua Dong, Song Liu, Li He, Lin Gan, Xiaoming Yu, Michael L. Steigerwald, Xiaosong Wu, Zhongfan Liu and Xuefeng Guo*, Building High-Throughput Molecular Junctions Using Indented Graphene Point Contacts, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 12228; and Xuefeng Guo, Alon Gorodetsky, Jacqueline K. Barton, James Hone, Colin Nuckolls*, Conductivity of a single DNA duplex bridging a carbon nanotube gap, Nat. Nanotechnol.2008, 3, 163において報告された方法に従い行った。
【００６８】
２．アミノ基での末端修飾
ステップ１完了後、グラフェン系単一分子デバイスとｐ−フェニレンジアミン（図１（２）参照）とを混合し、アミノ基でグラフェン電極の末端を修飾した。アミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極の構造式は、図１（３）に示されている。
【００６９】
３．電気回路の構成
ステップ２完了後、１，３，５−トリス（４−カルボニルフェニロキシ）ベンゼン（図１（４）参照）とアミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極とを混合し、電気回路を取得した。電気回路の電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図２の左上パネルに示す。電気回路の部分構造式を図１（５）に示す。
【００７０】
４．スルホ−ＮＨＳ活性化
ステップ３完了後、電気回路とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ、図１（６）参照）とを混合し、スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路を取得した。スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路の電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図２の右上パネルに示す。スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路の部分構造式を図１（７）に示す。
【００７１】
５．処理されたグラフェン系単一分子デバイスの取得
ステップ４完了後、スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路とＮ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩（図１（８）参照）とを混合し、処理されたグラフェン系単一分子デバイスを取得した。処理されたグラフェン系単一分子デバイスの部分構造式を図１（９）に示す。処理されたグラフェン系単一分子デバイスの電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図２の左下パネルに示す。
【００７２】
図２（１）は、図１におけるデバイス５の伝導率を示し、カルボキシル基を有する分子デバイスの調製が成功したことを示している。図２（１）は、図１のデバイス７の伝導率を示し、活性エステルを有する分子デバイスの調製が成功したことを示している。図２（１）は、図１のデバイス９の伝導率を示し、マレイミドを有する分子デバイスの調製が成功したことを示している。図２（１）は、図１のデバイス１１の伝導率を示し、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾された分子デバイスの調製が成功したことを示している。
【００７３】
６．Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの再構成
（１）再構成の原理
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（以下、ＤＮＡポリメラーゼＩと言う）のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号１及び配列番号２に示す。再構成ＤＮＡポリメラーゼＩは、同時に次の特性を有することが必要となる。すなわち、再構成ＤＮＡポリメラーゼは、（１）ＤＮＡポリメラーゼＩの生物活性、すなわち、ＤＮＡの合成を案内する生物活性を有し、（２）（続いて起こるＤＮＡ塩基配列決定の感度を改善するために）再構成ＤＮＡポリメラーゼＩのコンフォメーション変化領域内に配される必要があるアミノ酸残基（ドナーアミノ酸残基と命名する）によって提供される一つの結合サイトのみを介して、処理されたグラフェン系単一分子デバイスに結合し得、（３）ドナーアミノ酸残基に対応するアミノ酸種と結合サイトを提供しないアミノ酸残基（ノンドナーアミノ酸残基と命名する）に対応するアミノ酸種とが異なる。
【００７４】
（２）再構成ＤＮＡポリメラーゼＩの取得
再構成ＤＮＡポリメラーゼＩを、文献（Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860）に報告された方法を使用した広範な実験によって取得した。再構成ＤＮＡポリメラーゼＩ（そのアミノ酸配列は配列番号３に示される）は、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社によって調製された。再構成ＤＮＡポリメラーゼＩは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（そのアミノ酸配列は配列番号１に示される）のＮ末端から９０７番目の位置のシステイン残基がセリン残基に置換され、且つ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端から７９０番目の位置のロイシン残基がシステイン残基に置換されたアミノ酸配列を有している。配列番号３のＮ末端から７９０番目の位置のアミノ酸残基は、コンフォメーション変化領域に配されている。
【００７５】
７．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの調製
ステップ６完了後、処理されたグラフェン系単一分子デバイスと過剰量の再構成ＤＮＡポリメラーゼＩ（図１（１０）参照）とを混合し、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを取得した（図３の左パネル）。ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの部分構造式を図１（１１）に示す。ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図２の右下パネルに示す。再構成ＤＮＡポリメラーゼＩにおけるシステインが、処理されたグラフェン系単一分子デバイスと反応する反応式を図４に示す。
【００７６】
調製したＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを、低分解能プローブステーション上に置き、伝導率を観察した。伝導率を有するグラフェン系単一分子デバイスを、次の実験のために選択した。具体的なステップは、文献：Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860に報告された方法を参照する。
【００７７】
ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼ修飾グラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＣのＤＮＡ塩基配列決定
１．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを採取し、再構成ＤＮＡポリメラーゼＩを（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作られた）マイクロキャビティ４０μＬに含ませ、マイクロキャビティを含むグラフェン系単一分子デバイスを取得した。
【００７８】
２．ステップ１完了後、マイクロキャビティを含むグラフェン系単一分子デバイスを、高分解能プローブステーション上に置き、反応試験のために５分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図５Ａの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図５Ａの右パネルに示し、図５Ａは、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００７９】
３．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内にＤＴＴバッファー１０μＬを添加し、反応試験のために５分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図５Ｂの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図５Ｂの右パネルに示し、図５Ｂは、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００８０】
４．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ｃを添加し、反応試験のために５分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図５Ｃの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図５Ｃの右パネルに示し、図５Ｃは、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００８１】
５．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ｃ、ｄＡＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、ｄＴＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、及びｄＣＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、反応試験のために１０分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図５Ｄの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図５Ｄの右パネルに示し、図５Ｄは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、塩基が適合していない場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００８２】
６．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ｃ及びｄＧＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、ＤＮＡ合成中の経時的なソースドレイン間電流の変化、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって行われたＤＮＡ重合中の反応速度データを試験するために、１０分間供試した。実験結果を図５Ｅの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図５Ｅの右パネルに示し、図５Ｅは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されたことを示している。
【００８３】
これらの結果は、ステップ６の反応速度データが、他の比較対照の実験データと本質的に明らかに異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖Ｃ及びそれに適合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の４つのグループのデータと異なり得る。
【００８４】
７．ステップ６で取得した反応速度データを拡張し、Ｑｕｂソフトウェアによって、対応する高電流状態（すなわち、高電流）及び低電流状態（すなわち、低電流）を選択した（図６Ａ）。高電流状態に対応する高状態時間（τhi）及び低電流状態に対応する低状態時間（τlow）を統計的に解析した。実験結果をそれぞれ、図６Ｂ及び図６Ｃを示す。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、低状態の数を数えることによって、この系のＤＮＡ合成速度を計算すると、１秒あたり６２．６２ｄＧＴＰヌクレオチドであり（表１参照）、これは、先行文献（Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860）で示された合成速度に実質的に一致している。本明細書で言及される平均は、単なる線形平均ではなく、指数分布に基づくポアソン平均であることに留意されたい。具体的な計算プロセスは、ＭａｔＬａｂソフトウェアによって行われる。
【００８５】
【表１】
2020500002.tif 000003
【００８６】
ＩＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＡのＤＮＡ塩基配列決定
１．本方法は、ステップＩＩ−１と同様である。
【００８７】
２．本方法は、ステップＩＩ−２と同様である。反応速度試験の実験結果を図７Ａの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図７Ａの右パネルに示し、図７は、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００８８】
３．本方法は、ステップＩＩ−３と同様である。反応速度試験の実験結果を図７Ｂの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図７Ｂの右パネルに示し、図７Ｂは、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００８９】
４．本方法は、鋳型鎖Ｃが鋳型鎖Ａに置換されることを除いて、ステップＩＩ−４と同様である。反応速度試験の実験結果を図７Ｃの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図７Ｃに示し、図７Ｃは、鋳型鎖及びバッファーが存在し、且つ、試料のがないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００９０】
５．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ａ、ｄＡＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、ｄＧＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、及びｄＣＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、反応速度試験のために１０分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図７Ｄの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図７Ｄの右パネルに示し、図７Ｄは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、塩基が適合していない場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００９１】
６．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ａ及びｄＴＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、１０分間供試し、ＤＮＡ合成中の経時的にソースドレイン間電流の変化、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって行われたＤＮＡ重合中の反応速度データを試験した。実験結果を図７Ｅの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図７Ｅの右パネルに示し、図７Ｅは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されたことを示している。
【００９２】
これらの結果は、ステップ６の反応速度データが、他の比較対照の実験データと明らかに本質的に異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖Ａ及びそれに整合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の４つのグループのデータと異なり得る。
【００９３】
７．ステップＩＩ−７の方法に従い、高電流状態に対応する高状態時間（τhi）及び低電流状態に対応する低状態時間（τlow）を統計的に解析した。実験結果を図８に示す（左パネルは低状態時間を示し、右パネルは高状態時間を示す）。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、この系のＤＮＡ合成速度を計算すると、１秒あたり１５６．２５ｄＴＴＰヌクレオチドであり（表１参照）、これは、先行文献（Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860）で示された合成速度に実質的に一致している。
【００９４】
ＩＶ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＧのＤＮＡ塩基配列決定
１．本方法は、ステップＩＩ−１と同様である。
【００９５】
２．本方法は、ステップＩＩ−２と同様である。反応速度試験の実験結果を図９Ａの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図９Ａの右パネルに示し、図９Ａは、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００９６】
３．本方法は、ステップＩＩ−３と同様である。反応速度試験の実験結果を図９Ｂの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図９Ｂの右パネルに示し、図９Ｂは、バッファーのみが存在し、且つ、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００９７】
４．本方法は、鋳型鎖Ｃが鋳型鎖Ｇに置換されることを除いて、ステップＩＩ−４と同様である。反応速度試験の実験結果を図９Ｃの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図９Ｃに示し、図９Ｃは、鋳型鎖及びバッファーが存在し、且つ、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００９８】
５．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、１００ｎＭ鋳型鎖Ｇを含むＤＴＴバッファー３０μＬ、ｄＡＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、ｄＧＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、及びｄＴＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、反応速度試験のために１０分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図９Ｄの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図９Ｄの右パネルに示し、図９Ｄは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在するが、塩基が適合していない場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【００９９】
６．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、１００ｎＭ鋳型鎖Ｇを含むＤＴＴバッファー３０μＬ及びｄＣＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、１０分間供試し、ＤＮＡ合成中の経時的にソースドレイン間電流の変化、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって行われたＤＮＡ重合中の反応速度データを試験した。実験結果を図９Ｅの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図９Ｅの右パネルに示し、図９Ｅは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されたことを示している。
【０１００】
これらの結果は、ステップ６の反応速度データが、他の比較対照の実験データと明らかに本質的に異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖Ｇ及びそれに適合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の４つのグループのデータと異なり得る。
【０１０１】
７．ステップＩＩ−７の方法に従い、高電流状態に対応する高状態時間（τhi）及び低電流状態に対応する低状態時間（τlow）を統計的に解析した。実験結果を図１０に示す（左パネルは低状態時間を示し、右パネルは高状態時間を示す）。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、この系のＤＮＡ合成速度を計算すると、１秒あたり１４３．９９ｄＣＴＰヌクレオチドであり（表１参照）、これは、先行文献（Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860）で示された合成速度に実質的に一致している。
【０１０２】
Ｖ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＴのＤＮＡ塩基配列決定
１．本方法は、ステップＩＩ−１と同様である。
【０１０３】
２．本方法は、ステップＩＩ−２と同様である。反応速度試験の実験結果を図１１Ａの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図１１Ａの右パネルに示し、図１１Ａは、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【０１０４】
３．本方法は、ステップＩＩ−３と同様である。反応速度試験の実験結果を図１１Ｂの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図１１Ｂの右パネルに示し、図１１Ｂは、バッファーのみが存在し、且つ、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【０１０５】
４．本方法は、鋳型鎖Ｃが鋳型鎖Ｔに置換されることを除いて、ステップＩＩ−４と同様である。反応速度試験の実験結果を図１１Ｃの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図１１Ｃに示し、図１１Ｃは、鋳型鎖及びバッファーが存在し、且つ、試料がないと、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【０１０６】
５．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ｔ、ｄＣＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、ｄＧＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬ、及びｄＴＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、反応速度試験のために１０分間供試した（すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した）。実験結果を図１１Ｄの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図１１Ｄの右パネルに示し、図１１Ｄは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在するが、塩基が適合していない場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
【０１０７】
６．ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭの鋳型鎖Ｔ及びｄＡＴＰ溶液（濃度５μＭ）５μＬを添加し、１０分間供試し、ＤＮＡ合成中の経時的にソースドレイン間電流の変化、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって行われたＤＮＡ重合中の反応速度データを試験した。実験結果を図１１Ｅの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図１１Ｅの右パネルに示し、図１１Ｅは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、ＤＮＡ合成の振動信号が観測されたことを示している。
【０１０８】
これらの結果は、ステップ６の反応速度データが、他の比較対照の実験データと明らかに本質的に異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖Ｔ及びそれに適合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の４つのグループのデータと異なり得る。
【０１０９】
７．ステップＩＩ−７の方法に従い、高電流状態に対応する高状態時間（τhi）及び低電流状態に対応する低状態時間（τlow）を統計的に解析した。実験結果を図１２に示す（左パネルは低状態時間を示し、右パネルは高状態時間を示す）。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、この系のＤＮＡ合成速度を計算すると、１秒あたり２３２．８３ｄＣＴＰヌクレオチドであり（表１参照）、これは、先行文献（Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860）で示された合成速度に実質的に一致している。
【０１１０】
ＶＩ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用するランダム配列のＤＮＡ塩基配列決定
ステップ１完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、ＤＴＴバッファー３０μＬ中の１００ｎＭのランダム鎖（配列番号９）及び（濃度５μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含む）溶液５μＬを添加し、ＤＮＡポリメラーゼによって行われたＤＮＡ合成中の経時的なソースドレイン間電流の変化、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって行われたＤＮＡ重合中の反応速度データを試験するために、１０分間供試した。実験結果を図１３に示し、図１３は、４つの異なる振動信号を示している。その後、予備的なピーク統計を、ＭａｔＬａｂソフトウェアを使用して行った。実験結果を図１３の表に示す。この表及び表１のデータから、異なる電流に対応する塩基を決定することができ、それによって、電流の変化に従いＤＮＡ配列が決定される。このため、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスは、ＤＮＡ塩基配列決定を行うことに使用することができる。
【０１１１】
［実施例２］ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用するＤＮＡ塩基配列決定
Ｉ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
１．シリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
シリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製は、次の文献を参照することができる：Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecular junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32。シリコンナノワイヤ単一分子デバイス上にナノギャップを有するシリコンナノワイヤ電極がある（以下、シリコンナノワイヤ電極として言及する）。
【０１１２】
次のステップ２〜７は、文献（Gen He, Jie Li, Haina Ci, Chuanmin Qi*, and Xuefeng Guo*, Direct measurement of single-molecule DNA hybridization dynamics with single-base resolution, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 9036）において報告された方法に従い行った。
【０１１３】
２．エッチング
ステップ１完了後、シリコンナノワイヤ単一分子デバイスとＨＦ溶液とを混合し、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得した。エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造の模式図を図１４（１）に示す。
【０１１４】
３．電気回路の構成
ステップ２完了後、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと１０−ウンデシン酸（図１４（２）参照）とを混合し、電気回路を取得した。電気回路の部分構造の模式図を図１４（３）に示す。
【０１１５】
４．スルホ−ＮＨＳ活性化
ステップ３完了後、電気回路とＮ−ヒドロキシスルホスクシシンイミド（スルホ−ＮＨＳ、図１４（４）参照）とを混合し、スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路を取得した。スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路の部分構造式を図１４（５）に示す。
【０１１６】
５．処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの取得
ステップ４完了後、スルホ−ＮＨＳ活性化電気回路とＮ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩（図１４（６）参照）とを混合し、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得した。処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造式を図１４（７）に示す。
【０１１７】
６．Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの再構成
本方法は、実施例１のステップＩ−６と同様である。
【０１１８】
７．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
ステップ６完了後、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと過剰量の再構成ＤＮＡポリメラーゼＩ（図７（８）参照）とを混合した（図３の右パネル参照）。ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造の模式図を図７（７）に示す。
【０１１９】
調製したＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを、低分解能プローブステーション上に置き、伝導率を観測した。伝導率を有するＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを、次の実験に使用した。
【０１２０】
ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＣのＤＮＡ塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例１のステップＩＩに従い、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたＤＮＡ合成速度は、１秒あたり６５．３０ｄＧＴＰヌクレオチドであり、これは、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＣのＤＮＡ塩基配列決定の結果と大きくは異なっていない。
【０１２１】
ＩＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＡのＤＮＡ塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例１のステップＩＩＩに従い、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたＤＮＡ合成速度は、１秒あたり１１７．２７ｄＴＴＰヌクレオチドであり、これは、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＣのＤＮＡ塩基配列決定の結果と大きくは異なっていない。
【０１２２】
ＩＶ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＧのＤＮＡ塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例１のステップＩＶに従い、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたＤＮＡ合成速度は、１秒あたり１５４．５１ｄＣＴＰヌクレオチドであり、これは、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＧのＤＮＡ塩基配列決定の結果と大きく異なっていない。
【０１２３】
Ｖ．ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＴのＤＮＡ塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例１のステップＩＶに従い、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。測定されたＤＮＡ合成の振動信号は、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの測定と一致している。この系において取得されたＤＮＡ合成速度は、１秒あたり２３４．６０ｄＡＴＰヌクレオチドであり、これは、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖ＴのＤＮＡ塩基配列決定の結果と大きく異なっていない。
【０１２４】
従って、ＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスは、ＤＮＡ塩基配列決定を行うことに使用することができる。
【図１】
2020500002.tif 000004
【図２】
2020500002.tif 000005
【図３】
2020500002.tif 000006
【図４】
2020500002.tif 000007
【図５】
2020500002.tif 000008
【図６】
2020500002.tif 000009
【図７】
2020500002.tif 000010
【図８】
2020500002.tif 000011
【図９】
2020500002.tif 000012
【図１０】
2020500002.tif 000013
【図１１】
2020500002.tif 000014
【図１２】
2020500002.tif 000015
【図１３】
2020500002.tif 000016
【図１４】
2020500002.tif 000017
【配列表】
2020500002000001.app
【国際調査報告】
2020500002.tif 000018
2020500002.tif 000019
2020500002.tif 000020
2020500002.tif 000021