(57)【要約】【課題】フェムト秒パルスレーザー変調器、マイクロ２光子顕微鏡装置、生体試料行動撮像システム、及びマイクロ２光子顕微鏡撮像方法であって、該フェムト秒パルスレーザー変調器は、負分散光路及び正分散光路を含み、負分散光路はレーザー入力用光ファイバーを含み、プリチャープによって補償されたレーザーを伝送し、正分散光路はフェムト秒パルスレーザー装置と負分散光路との間に位置し、レーザー入力用光ファイバーから生成される負分散をプリチャープにより補償する。
2020509402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
負分散光路及び正分散光路を含み、
前記負分散光路は、プリチャープによって補償されたレーザーを伝送するためのレーザー入力用光ファイバーを含み、
前記正分散光路は、フェムト秒パルスレーザー装置と前記負分散光路との間に位置し、前記レーザー入力用光ファイバーで生成される負分散をプリチャープにより補償するのに用いられる、
ことを特徴とするフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項２】
前記入力用光ファイバーは中空コアフォトニック結晶ファイバーであり、中心波長９２０ｎｍのフェムト秒パルスレーザーを歪み無しに伝送する、
ことを特徴とする請求項１に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項３】
前記中空コアフォトニック結晶ファイバーのコア材は無汚染シリコンであり、コア直径は８〜９μｍである、
ことを特徴とする請求項２に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項４】
前記正分散光路は分散補償素子を含み、前記分散補償素子は市販製品である、
ことを特徴とする請求項１に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項５】
前記分散補償素子はＨ−ＺＦ６２ガラス管である、
ことを特徴とする請求項４に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項６】
前記正分散光路は、
前記分散補償素子で補償された後のレーザーを受光し、レーザー強度を調整し、前記レーザー入力用光ファイバーに出力する音響光学変調器、
をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項７】
前記正分散光路は、
前記分散補償素子と前記音響光学変調器との間に設置され、前記音響光学変調器の変調効率を調整するレーザー方位調整ユニット、
をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項８】
前記正分散光路は、
音響光学変調器で調整された後のレーザーを少なくとも２つのビームに分岐し、且つ前記レーザー入力用光ファイバーに出力する分光ユニット、
をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器。
【請求項９】
中心波長９２０ｎｍのレーザーを生成するフェムト秒パルスレーザー装置、
前記フェムト秒パルスレーザー装置から出力されたレーザーを受光し、パルスを増幅し、マイクロプローブに出力する請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器、及び
マイクロプローブを含み、
前記マイクロプローブは、
前記フェムト秒パルスレーザー変調器から出力されるレーザーを受光し、前記レーザーで生体試料内部の組織を走査し、前記生体試料内部の生体指示薬を励起して蛍光信号を生成させる走査撮像部、及び
前記蛍光信号を出力するための蛍光出力用光ファイバーを含む、
ことを特徴とするマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記走査撮像部は、
レーザー入射角度を回転しながら変化させることによって、前記生体試料内部の組織を２次元走査するマイクロエレクトロメカニカルスキャナ、
前記マイクロエレクトロメカニカルスキャナからのレーザーを前記生体試料内部に集光する対物レンズ、
前記マイクロエレクトロメカニカルスキャナと対物レンズとの間の光路上に配置され、前記マイクロエレクトロメカニカルスキャナの２次元走査により角度変化されたレーザーを位置変化されたレーザーに変換する走査レンズ、及び
前記走査レンズと対物レンズとの間に設置され、前記レーザーと前記蛍光信号とを分離するダイクロイックミラー、
を含むことを特徴とする請求項９に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１１】
前記対物レンズの開口数は０．８である、
ことを特徴とする請求項１０に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記対物レンズと前記生体試料との間に１．５％の低融点アガロースが充填される、
ことを特徴とする請求項１０に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記対物レンズは薄いフレネルレンズを含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記走査撮像部は、
前記レーザー入力用光ファイバーと前記マイクロエレクトロメカニカルスキャナとの間に配置されるコリメーター、
をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１５】
前記蛍光出力用光ファイバーはフレキシブル光ファイバー束である、
ことを特徴とする請求項９に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１６】
前記フレキシブル光ファイバー束は、７００〜９００本のガラス光ファイバーの両端を溶接してなされ、同時に各ガラス光ファイバーは互いにゆるく分離されるように保たれる、
ことを特徴とする請求項１５に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置、
生体試料の自由移動に制限空間を提供する筐体、
回路実装ユニットであって、前記レーザー入力用光ファイバー及び蛍光出力用光ファイバーは前記回路実装ユニットを介して筐体に対し自由回転可能な形態で筐体に実装されるもの、及び、
前記蛍光出力用光ファイバーから出力される前記蛍光信号を収集するデータ収集ユニット、
を含むことを特徴とする生体試料行動撮像システム。
【請求項１８】
前記回路実装ユニットは、
電気回転ヘッドであって、前記筐体の頂部に貫通設置され、前記レーザー入力用光ファイバー及び蛍光出力用光ファイバーは前記電気回転ヘッドのケーシングを通過するもの、
ブラケットであって、前記電気回転ヘッドのケーシングに被り設置され、前記データ収集ユニットは前記ブラケットに設置されるもの、及び、
軸受であって、前記蛍光出力用光ファイバーは前記軸受を介して前記データ収集ユニットに接続されるもの、
を含むことを特徴とする請求項１７に記載の生体試料行動撮像システム。
【請求項１９】
前記電気回転ヘッドの、筺体の外側における一端は外部電源に接続され、筐体の内側におけるもう一端は電気接続インタフェースとして用いられる、
ことを特徴とする請求項１８に記載の生体試料行動撮像システム。
【請求項２０】
生体試料を固定し、且つベンチトップ型２光子顕微鏡を用いて前記生体試料において被撮像領域を選択することと、
請求項９〜１６のいずれか一項に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置のマイクロプローブを前記生体試料に実装し、生体試料を開放することにより、前記被撮像領域から出力される蛍光信号を採取することと、
を含むことを特徴とするマイクロ２光子顕微鏡撮像方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学撮像技術分野に関し、特に、フェムト秒パルスレーザー変調器及びマイクロ２光子顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経科学の最終目的の１つは、自由に活動する動物から亜細胞、細胞、ループ及びより高次のニューロンの情報処理の基本原理を理解することである。蛍光指示薬を加えることによって、光学顕微鏡は、複数の時間と空間でニューロンの活動を直接観測できるため、この課題における基本的な研究ツールとなっている。１つのシナプスは、情報の伝達、処理及び記憶の基本単位であり、脳機能や疾患メカニズムを理解するのにおいて非常に重要である。シナプス後構造の樹状突起スパインはサブミクロン構造であり、脳内に深く埋め込まれ、ミリ秒レベルで活動する。多光子顕微鏡は、その固有の光学切片及び深層組織への透過機能により、過去二十年に亘って、人体内非侵襲的光脳撮像の最もよく利用される技術となっている。ベンチトップ２光子顕微鏡（英語で「Ｔｗｏ‐Ｐｈｏｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と称し、以下に「ＴＰＭ」と略称する）を使用することにより、生体内で学習及び記憶のニューロン活動のような樹状突起スパインの形態変化を観察できるようになっている。覚醒状態での生体試料頭部の複雑な樹状突起スパインの活動は、高速画像採取（採取周波数>１５Ｈｚ）、高励起及び光電検出効率を備える最先端のベンチトップ多光子顕微鏡で実現できる。しかし、生体試料の頭部はずっと固定され、実験期間中に物理的制約と感情抑制の状態となっており、なおニューロンの外部への応答が仮想現実と自由探索の下で等価であるとは事前に検証されていない。もっと重要なのは、例えば、親子介護、交配、戦闘のような多くの社会的行動は、頭部を固定した実験では検討できない。
【０００３】
これらのチャレンジに対処するために、理想的な解決手段は、自由活動の過程においける生体試料の樹状突起スパインの構造及び機能動態を長時間にわたって観察できるマイクロ顕微鏡を開発することである。Ｄｅｎｋと同僚は、２００１年に光ファイバー先端走査に基づいた初めてのマイクロ２光子顕微鏡（英語で「ｍｉｃｒｏ  Ｔｗｏ‐ＰｈｏｔｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と称し、以下に「ｍＴＰＭ」と略称する）を作り、その後の１０年間にわたって、他の多くの研究チームがそれぞれの方法で試し続けてきた。しかし、これらのｍＴＰＭはその後の生体適用に使用されたのは１つもなかったが、それは主に２つの主な制限があるからである。第１に、試料までのパルスが歪まないような９２０ナノフェムト秒パルスレーザーを伝送するための適切な光ファイバーがないので、ＧＣａＭＰｓのような最も広範な蛍光プローブを撮像に用いることができないからである。第２に、試料採取率が低く、屈折率分布型（英語で「ＧｒａｄｅｄＩｎｄｅｘ  Ｌｅｎｓｅｓ」と称し、以下に「ＧＲＩＮ」と略称する）レンズの収差、マイクロ光学素子の欠陥や動きによる撮像ノイズなどが原因で、ｍＴＰＭの体内実験における解像度は往々それらの理論上の解像度よりも低いからである。現在、ｍＴＰＭはその理論上の横方向解像度が約１μｍであっても、樹状突起スパイン解像度のニューロン構造の活動を碌に解決することができない。
【０００４】
一方、マイクロ単一光子広視野顕微鏡、例えば、Ｇｈｏｓｈが同僚と開発した顕微鏡により、すでに高速採取と大視野（英語で「Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｓｉｏｎ」と総称し、以下に「ＦＯＶ」と略称する）を実現し、動きによるノイズ問題（ニューロン解像度）を解決した。しかし、現在の非侵襲的なマイクロ広視野顕微鏡では細胞解像度のみを得て、且つ画像コントラストは、蓄積された焦点外の背景信号の影響を受けてしまう。現在までに、優れた撮像能力と実験方式を提供でき、神経科学家の日常実験を満足できる強力な新型ｍＴＰＭを完成させる必要がある。
【０００５】
そこで、従来技術に係る上記欠陥のうちの少なくとも１つを克服または少なくとも軽減する技術が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の目的は、従来技術に係る上記欠陥のうちの少なくとも１つを克服または少なくとも軽減するフェムト秒パルスレーザー変調器及びマイクロ２光子顕微鏡装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は、負分散光路及び正分散光路を含むフェムト秒パルスレーザー変調器を提供する。そのうち、前記負分散光路は、プリチャープによって補償されたレーザーを伝送するためのレーザー入力用光ファイバーを含む。前記正分散光路は、フェムト秒パルスレーザー装置と前記負分散光路との間に位置し、前記レーザー入力用光ファイバーで生成される負分散をプリチャープにより補償するのに用いられる。
【０００８】
本発明は、さらにマイクロ２光子顕微鏡装置を提供し、
中心波長９２０ｎｍのレーザーを生成するためのフェムト秒パルスレーザー装置、
前記フェムト秒パルスレーザー装置から出力されたレーザーを受光し、パルスを増幅し、マイクロプローブに出力する上記いずれか一項に記載のフェムト秒パルスレーザー変調器、
及びマイクロプローブを含み、前記マイクロプローブは、
前記フェムト秒パルスレーザー変調器から出力されるレーザーを受光し、前記レーザーで生体試料内部の組織を走査し、前記生体試料内部の生体指示薬を励起して蛍光信号を生成させる走査撮像部、及び
前記蛍光信号を出力するための蛍光出力用光ファイバーを含む。
【０００９】
本発明は、さらに生体試料行動撮像システムを提供し、
上記いずれか一項に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置、
生体試料の自由移動に制限空間を提供する筐体、
回路実装ユニットであって、前記レーザー入力用光ファイバー及び蛍光出力用光ファイバーは前記回路実装ユニットを介して筐体に対し自由回転可能な形態で筐体に実装されるもの、及び、
前記蛍光出力用光ファイバーから出力される前記蛍光信号を収集するデータ収集ユニット、を含む。
【００１０】
本発明は、さらにマイクロ２光子顕微鏡撮像方法を提供し、その特徴は、
生体試料を固定し、且つベンチトップ型２光子顕微鏡を用いて前記生体試料において被撮像領域を選択することと、
上記いずれか一項に記載のマイクロ２光子顕微鏡装置のマイクロプローブを前記生体試料に実装し、生体試料を解放することにより、前記被撮像領域から出力される蛍光信号を採取することと、を含むことである。
【００１１】
本発明に係るフェムト秒レーザー変調器は、慣用の生体指示薬に対し有効な励起を行うように、中心波長９２０ｎｍのフェムト秒パルスレーザーを歪み無しに伝送する。該フェムト秒レーザー変調器を備えたマイクロ２光子顕微鏡装置（以下に、「ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ」と略称する）は、素早く試験や適用ができ、解像度が高いため、自由に活動する動物内の単一の樹状突起スパインの撮像問題を解決することができる。不規則で、頻繁な身体及び頭部運動に関する行動パラダイム（例えば、懸垂試験、高台飛び降り、及び社交行動）において、本発明のマイクロ顕微鏡は、ＧＣａＭＰ６ｆに標識された皮層ニューロンの体細胞、樹状突起、樹状突起スパインについて観測することができる。要するに、ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭは、自由に活動する動物内で高解像度の脳撮像を行う要求を満たす次世代マイクロ顕微鏡の典型例である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係るＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭの１つの好ましい実施の形態を示す構成模式図である。
【図２】図１におけるマイクロプローブをネズミに実装した状態を示す模式図である。
【図３】図１におけるマイクロプローブの光路原理を示す模式図である。
【図４】本発明に係るフェムト秒パルスレーザー変調器の１つの好ましい実施の形態を示す構成模式図である。
【図５（ａ）】図１のマイクロ２光子顕微鏡装置を用いた生体試料行動撮像システムを示す構成模式図である。
【図５（ｂ）】図５（ａ）におけるデータ収集ユニット及び回線実装ユニットを示す分解模式図である。
【図６】ベンチトップ２光子モードにおける、ベンチトップＴＰＭ、マイクロ広視野蛍光顕微鏡及びＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭの各種パフォーマンスの集積プラットフォームの光路を示し、ベンチトップＴＰＭの構成を示す模式図である。
【図７】広視野撮像モードにおける図６の集積プラットフォームの光路を示す模式図である。
【図８】ＦＨＩＲＭ−ＴＰＭ撮像モードにおける図６の集積フラットフォームの光路を示し、図６のベンチトップＴＰＭにおける対物レンズと物体面（生体試料または生体試料）と間の光路に図１のＦＨＩＲＭ−ＴＰＭが設置されていることを示す模式図である。
【図９ａ−９ｆ】ＧＣａＭＰ‐６ｆの８００ｎｍ、９２０ｎｍ及び１０３０ｎｍ励起における２光子励起効率を比較した図である。
【図１０ａ】カスタム設計したＨＣ−９２０光ファイバーの伝送損失及び分散パラメーターを示す図であり、そのうち、上方左側のイラストはＨＣ―９２０の断面写真を示し、上方右側のイラストはＨＣ−９２０から出射され、焦点距離３ｍｍの二重レンズで視準された後の９２０ｎｍレーザーの画像を示す。
【図１０ｂ】異なるレーザーパワーにおける、１ｍのＨＣ‐９２０出口での９２０−ｎｍフェムト秒レーザーパルス幅の自己相関分布を示す図である。
【図１０ｃ】左側図は、ＭＥＭＳ走査装置のｘ（淡灰色）及びｙ（黒色）軸の周波数応答を示す図であり、右側板において、機械的傾斜度はＭＥＭＳ走査装置のｘ（黒色）及びｙ（淡灰色）軸の駆動電圧の関数である。
【図１１ａ−１１ｂ】図４のフェムト秒パルスレーザー変調器における分散補償を説明するための図である。
【図１２ａ−１２ｅ】頭部固定と自由移動条件における暗黒環境下での生体試料Ｖ‐１皮質中の樹状突起の活性を比較して示す図である。
【図１３ａ−１３ｃ】図５における生体試料行動撮像システムの異なる行動パラダイムにおける生体試料の撮像視覚皮層の活動を示す図である。
【図１４ａ−１４ｄ】ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭとベンチトップＴＰＭ、マイクロ広視野顕微鏡のパフォーマンスを比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図面において、同一または類似の標号で、同一または類似の要素もしくは同一または類似の機能を有する素子を示す。以下、図面を結合して本発明の実施例について詳細に説明する。
【００１４】
本発明の記述において、「中心」、「縦方向」、「横方向」、「前」、「後」、「左」、「右」、「垂直」、「水平」、「頂部」、「底」、「内」、「外」などで示される方位または位置関係は、図面に示す方位または位置関係に基づくもので、本発明の説明及び説明の簡略化のためのものに過ぎず、装置または素子が必ず特定の方位を有したり、特定の方位で構成や操作すべきであるようにと指示または暗示せず、その故、本発明の保護範囲を制限すると理解してはならない。
【００１５】
図１に示すように、本実施例に係るマイクロ２光子顕微鏡装置（英文で「Ｆａｓｔ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」と総称し、以下に、「ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ」と略称する）は、フェムト秒パルスレーザー装置（図１に示す）、フェムト秒パルスレーザー変調器１及びマイクロプローブ２を含む。
【００１６】
前記フェムト秒パルスレーザー装置は、中心波長が９２０ｎｍのレーザーを生成するために用いられる。前記フェムト秒パルスレーザー装置は、図には示していないが、関連会社の変色性固体レーザー装置を用い光源としてもよく、中心波長は９２０ｎｍ、出力パワーは１００±１ｍＷである。既存の波長が１０３０ｎｍ及び８００ｎｍのレーザーに比べ、波長が９２０ｎｍのレーザーは、通常の生体指示薬（例えば、Ｔｈｙ１‐ＧＦＰ及びＧＣａＭＰ‐６ｆ、ここでのＧＣａＭＰは最も一般的に使用されるカルシウムイオン指示薬である）を効果的に励起して蛍光を生成させることができる。以下、ＧＣａＭＰ‐６ｆのそれぞれ８００ｎｍ、９２０ｎｍ及び１０３０ｎｍのレーザー励起下での２光子励起効率を比較し、チューニング可能なチタンサファイアフェムト秒レーザー装置（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、ＵＳＡ、Ｖｉｓｉｏｎ‐Ｓ、６８０‐１０８０ｎｍ、８５‐１１０ｆｓ）から異なる波長を選択して励起を行う。
【００１７】
図９ａ〜９ｆに示すように、図９ａは異なる励起波長下で、Ｖ‐１皮質にＧＣａＭＰ‐６ｆを発現させるＡＡＶトランスフェクション生体試料において同じ撮像グループに属する神経細胞体ｃｅｌｌ１、ｃｅｌｌ２及びｃｅｌｌ３であり、図において、左から右へと順次にそれぞれ８００ｎｍ、９２０ｎｍ及び１０３０ｎｍのレーザーで得られた蛍光像である。図９ｂは１０個のグリア細胞のＣａ２＋信号の神経細胞体の周波数である。図９ｃ中のｃは１０個のグリア細胞のＣａ２＋信号の神経細胞体の振幅であり、図９ｃ中のｄは１０個のグリア細胞のＣａ２＋信号の神経細胞体の平均時間経過である。図９ｄは図９ａに示したように、異なる焦点面における撮像ニューロン樹状突起ｄｅｎｄｒｉｔｅ１、ｄｅｎｄｒｉｔｅ２及びｄｅｎｄｒｉｔｅ３であり、図において左から右へと順次にそれぞれ８００ｎｍ、９２０ｎｍ及び１０３０ｎｍのレーザーで得られた蛍光像である。図９ｅは図９ｄに示した１０個の樹状突起Ｃａ２＋信号の周波数である。図９ｆ中のｇは図９ｄに示した１０個の樹状突起Ｃａ２＋信号の振幅であり、図９ｆ中のｈは図９ｄに示した１０個の樹状突起Ｃａ２＋信号の平均時間経過である。これらの実験データから分かるように、８００ｎｍを中心とするフェムト秒レーザーパルスは、神経細胞体または樹状突起からのＧＣａＭＰ６信号を全く励起できず、１０３０ｎｍの励起は９２０ｎｍの励起に比べ、樹状突起カルシウムイオン活性の１／１０にしか記録できず、また記録した蛍光信号の振幅が著しく低下する。実験データでは、波長９２０ｎｍのレーザーがＧＣａＭＰ‐６ｆをより効率的に励起して蛍光を生成させることができることをさらに解明した。
【００１８】
再び図１を参照すれば、フェムト秒パルスレーザー変調器１は、前記フェムト秒パルスレーザー装置から出力されたレーザーを受光し、レーザーの伝送パワーを予め設定された値まで増幅し、且つレーザーパルスの幅の広がりをプリチャープ補償し、そして出力する。例えば、８５ｆｓ、９２０ｎｍを中心としたレーザーパルスは、フェムト秒パルスレーザー変調器１で増幅された後、約１００ｆｓのレーザーパルスに変調され、伝送パワーが５ｍＷ〜２００ｍＷ（該データは実験によりレーザー入力用光ファイバー１１の出口で測定し得られたものである）になる。
【００１９】
マイクロプローブ２は、走査撮像部及び蛍光出力用光ファイバー２１を含み、そのうち、前記走査撮像部はフェムト秒パルスレーザー変調器１から出力されたレーザーを受光し、該レーザーは生体試料内部の組織に対し走査を行うことにより、前記生体試料を励起し蛍光信号を生成させる。蛍光出力用光ファイバー２１は前記走査撮像部から出力される前記蛍光信号を受信し、且つ出力する。
【００２０】
図１及び図２に示すように、蛍光出力用光ファイバー２１には新型のフレキシブル光ファイバー束（ＳＦＢ）を用い、本実施の形態における蛍光出力用光ファイバー２１は、７００〜９００本のガラス光ファイバーを溶接してなされ、同時に、各ガラス光ファイバーが互いにゆるく分離されるように保たれ、これにより、自由に活動する生体試料が軽量顕微鏡プローブを携帯しやすくなり、かつモーションアーチファクトを軽減させ、ひいては光子収集効率を低下しないまま、動物運動によるトルクや張力を最小化することができる。全てのガラス光ファイバーが溶接された両端部は直径１．５ｍｍの円柱体となり、それによりマイクロプローブ２に実装されやすい。下記表１は、本実施例における蛍光出力用光ファイバー２１のパフォーマンスパラメーターであり、マルチモード光ファイバーに比べてより高い収集効率を有し、且つこれまで使用されたプラスチック光ファイバー及び従来の融着型光ファイバー束よりも柔軟性があり、多波長発光検出が可能である。蛍光出力用光ファイバー２１は、マイクロプローブ２における対物レンズからの蛍光信号を遠端のＧａＡｓＰ  ＰＭＴ（１０７７０Ｐ‐４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、日本）に伝達し、その総収集効率は５３２ｎｍで約８０％である。
【００２１】
表１
2020509402.tif 000003
【００２２】
図１及び図２に示すように、マイクロプローブ２は、固定ブラケット２８に集積される。固定ブラケット２８により、マイクロプローブ２は生体試料（図２に示すネズミなどの生体試料）の頭部に取り外し可能（ねじ結合）に実装される。マイクロプローブ２と固定ブラケット２８との総重量は約２．１５ｇであり、体積は１ｃｍ３以下であるため、このシステムは生体試料が携帯するのに十分に小さくてコンパクトで十分に軽い。固定ブラケット２８はアルミニウム材料を用いて形成され、例えば、アルミニウムフレームである。固定ブラケット２８の形状はヘルメット形状に設計してもよく、したがって装着及び取り外しが容易であり、主にマイクロプローブ２を自由に活動する生体試料の頭部に安定して装着することができるため、同一の動物内で数時間撮像を行っても、マイクロ２光子顕微鏡装置の視野（以下、「ＦＯＶ」と略称する）が身体及び頭部の激しい運動下でドリフトしないようにするのに有利である。これ以外にも、本発明により撮像を行う前に、生体試料が頭骨に装着されたマイクロプローブに慣れるようにあらかじめトレーニングし、さらにマイクロプローブ２の対物レンズと生体試料の脳組織との間に充填されるように１．５％の低融点アガロースを滴下し、これらの操作はいずれもマイクロプローブ２と大脳との相対的な運動を著しく低減し、これらの対策は実験の短期的及び長期的安定性を改善し、動物が身体と頭部をたくさん自由に動かす行動検出においての高解像度の撮像を許容する。
【００２３】
一実施例において、図４に示すように、フェムト秒パルスレーザー変調器１は、負分散光路及び正分散光路を有し、そのうち、前記負分散光路は、レーザー入力用光ファイバー１１を含み、レーザー入力用光ファイバー１１はパルス幅の広がりをプリチャープによって補償したレーザーを前記走査撮像部に伝送するのに用いられる。前記正分散光路は、前記フェムト秒パルスレーザー装置と前記負分散光路との間に位置し、前記レーザー入力用光ファイバー１１のレーザー伝送中に生成される負分散を補償するのに用いられる。
【００２４】
材料分散と非線形効果により、単一モード光ファイバーはフェムト秒レーザーパルスの幅を広げる。しかし本実施例で用いたレーザー入力用光ファイバー１１は中空コアフォトニック結晶ファイバー（以下「ＨＣ‐ＰＣＦ」と略称する）であり、すなわち図中または文中に現れたＨＣ‐９２０であり、そのうち、ほとんどのレーザーがＨＣ‐９２０の中の空気コアにより伝播されるため、非線形効果によるパルス幅の広がりが効果的に最小化される。本実施例のレーザー入力用光ファイバー１１は数百ｍＷの９２０ｎｍのフェムト秒レーザーパルスを伝送するのに用いられ、そのパルス幅の非線形広がりは無視してもよい（図１０ａ及び表２）。
【００２５】
表２
2020509402.tif 000004
【００２６】
本実施例のレーザー入力用光ファイバー１１は、９２０ｎｍのフェムト秒レーザーパルスを歪み無しに伝送し、この改善によって、Ｔｈｙ１‐ＧＦＰ及びＧＣａＭＰ‐６ｆのような通常の生体指示薬を効果的に励起することが可能となる。
【００２７】
一実施例において、前記正分散光路は分散補償素子１２及び音響光学変調器１３を含み、そのうち、音響光学変調器１３は分散補償素子１２で補償された後のレーザーを受光し、且つレーザー強度を調整し、そして前記走査撮像部に出力するのに用いられる。音響光学変調器１３は既存の製品を用いて実現できる。
【００２８】
分散補償素子１２は前記フェムト秒パルスレーザー装置に近接して設置されており、レーザー入力用光ファイバー１１のレーザー伝送中に生成される負分散を補償するのに用いられる。
【００２９】
レーザー入力用光ファイバー１１における負分散がより低いため、分散補償素子１２は特定の長さの正分散を有する市販製品を用いてプリチャープ法によれば正確に補償することができる。ここで市販製品とは汎用製品を指し、カスタマイズされたレーザー入力用光ファイバー１１に対応し、すなわちレーザー入力用光ファイバーの負分散を確定した後、材料及び長さの選択により適切に正分散補償、すなわち分散補償素子１２をなす。プリチャープで補償された後、８５ｆｓ、９２０ｎｍを中心としたレーザーパルスは１ｍ長のレーザー入力用光ファイバー１１を介して伝送されて約１００ｆｓのパルスとなり、伝送パワーは５ｍＷ〜２００ｍＷ（該データは実験によりレーザー入力用光ファイバー１１の出口で測定し得られたものである）（図１０ｂ）となる。
【００３０】
好ましくは、分散補償素子１２は波長９２０ｎｍのレーザーにおいて４５８ｐｓ／ｎｍ／ｋｍの正分散を有するＨ‐ＺＦ６２ガラス管を採用する。そのうち、図１１ａはＨ‐ＺＦ６２ガラス管を用いてＨＣ‐９２０の分散を補償する模式図である。図１１ｂはガラスＨ‐ＺＦ６２の分散パラメーターを示す図である。図１１ｃは分散補償のない１ｍのＨＣ‐９２０から出力された９２０ｎｍのフェムト秒レーザーのパルス幅を示す図である。図１１ｄは分散補償あり及び分散補償なしの１ｍのＨＣ―９２０前後における９２０ｎｍのフェムト秒レーザー装置のパルス幅を示す図である。
【００３１】
フェムト秒パルスレーザー変調器１に対し、８５ｆｓ、９２０ｎｍを中心としたレーザーパルスをプリチャープで補償した後に、約１００ｆｓのレーザーパルスとなり、伝送パワーが５ｍＷ〜２００ｍＷとなることについて以下に詳細に説明する。
【００３２】
超高速レーザーパルスの伝送時には、材料の分散及び高レーザーピークパワーの非線形効果の２つの要因によってパルス幅が広がる。レーザー入力用光ファイバー１１において、ほとんどのレーザーが空気コアにより伝播されるため、非線形効果が最小になるはずである。マイクロプローブ２の光路において、レンズやミラーなどの光学部材の中心における光密度は比較的に低いが、それは光束サイズが大きい（直径が２ｍｍ以下である）ため、非線形性がほとんど生じないからである。顕微鏡の前部材と試料内のマイクロ部材の長さが比較的に短いため、無視してもよい。したがって、主な拡張効果は、ベンチトップ光学素子及びレーザー入力用光ファイバーによる材料分散に起因する。簡略化によって、本実施の形態のシステムにおいては２次分散のみを考慮する。したがって、システム全体のパルス幅の広がりは以下になる。
【００３３】
Ｂｓｙｓｔｅｍ＝｜Σｎ｛Ｌｎ∫λ、ΔλＤｎ（λ）ｄλ｝｜（１．１）。そのうち、ｎはシステムにおける光学素子の数量を示し、Ｄｎ（λ）はｎ番目の成分（光学素子）による分散パラメーターであり、Ｌｎはｎ番目の成分（光学素子）の光路長を示し、λとΔλはレーザーの中心波長とスペクトル幅であり、｜｜はレンズからの正分散（負Ｄ（λ））とレーザー入力用光ファイバーからの異常分散（正Ｄ（λ））との和の絶対値を示す。したがって、Δλ＜＜λの場合、本発明のシステム（λ＝９２０ｎｍ、Δλが１５ｎｍ以下である）において、式は以下に簡略化される。
【００３４】
Ｂｓｙｓｔｅｍ＝｜Σｎ｛Ｌｎ・Ｄｎ（λ）・Δλ｝｜（１．２）
【００３５】
最終パルス幅は以下になる。
【００３６】
Ｐｏｕｔｐｕｔ＝Ｐｉｎｐｕｔ＋｜Ｂｓｙｓｔｅｍ｜（１．３）
そのうち、Ｐｉｎｐｕｔ及びＰｏｕｔｐｕｔはレーザー装置の入力および出力のパルス幅を示す。
【００３７】
本実施例に係るシステムで用いられるＨＣ‐９２０の長さは１ｍ（Ｌｈｃ‐９２０）であり、メーカーにより測定し、且つ図１０ａに示す。したがって、ＨＣ‐９２０の拡張は以下になる。
【００３８】
Ｌｈｃ‐９２０・Ｄｈｃ‐９２０（９２０ｎｍ）・Δλ〜１（ｍ）・７５（ｐｓ／ｎｍ／ｋｍ）・１５（ｎｍ）＝１．１２５（ｐｓ）
【００３９】
偏光ビームスプリッター、レンズ及び音響光学変調器などの長さを確定しやすく、且つこれらに用いられるレンズ屈折率情報により算出し、以下のように表示される。
【００４０】
【数０００１】
2020509402.tif 000005
【００４１】
及び
【００４２】
【数０００２】
2020509402.tif 000006
【００４３】
ここで、ＧＶＤは媒質における群速度分散、ｃは光速、ｎは媒質の屈折率を示す。
【００４４】
併せて、これらの成分は約−２００ｆｓの広がりを引き起こすため、８５ｆｓ変換制限パルスのＨＣ‐９２０から出力されたパルス幅を算出すれば、約以下になる。
【００４５】
（０．０８５＋１．１２５−０．２）（ｐｓ）＝１．０１（ｐｓ）
これは実験で測定されたパルス幅（１ｐｓ以下である）（図１１ｃ）と整合しており、且つ有効な２光子への励起が弱すぎる。Ｈ‐ＺＦ６２ガラス管（本実施例における分散補償素子１２はいずれもＨ‐ＺＦ６２ガラス管を採用する）を正分散を有する光路に挿入することにより、本実施例においてＨＣ‐９２０による負分散が予め補償されている。本実施例においてＨ−ＺＦ６２ガラス管を採用する理由は、大きい正分散（波長９２０ｎｍにおける分散が約４５８ｐｓ／ｎｍ／ｋｍで、Ｓｃｏｔｔ社により提供された屈折率情報及び式（１．４）を用い算出し、図１１ｂに示す通りである）を有することにある。所望のＨ‐ＺＦ６２ガラス管の長さは以下の通りに計算する。
【００４６】
（１．１２５‐０．２）（ｐｓ）／４５８（ｐｓ／ｎｍ／ｋｍ）／１５（ｎｍ）＝１３．５（ｃｍ）
【００４７】
顕微鏡先端と試料による小さな正分散を考慮すると、本実施例においては計算値より小さい長さ１２ｃｍ、直径１２．７ｍｍのＨ‐ＺＦ６２ガラス管を用いる。Ｈ‐ＺＦ６２ガラス管（図１１ｂ及び図６）におけるこのような「プリチャープ」の後に、ＨＣ‐９２０からのレーザーパルス幅が測定照明パワーの全範囲内で約１００ｆｓ（図１１ｄ及び１０ｂ）まで圧縮される。本実施例のＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭは独自設計のＨＣ‐ＰＣＦを用いて、パルス幅の非線形広がりが無視してもよいほどの９２０ｎｍのフェムト秒レーザーパルス（名はＨＣ‐９２０である）を伝送し、通常の生体指示薬への撮像を実験でき、且つベンチトップＴＰＭに相当するパフォーマンスが得られた。
【００４８】
一実施例において、前記正分散光路はさらにレーザー方位調整ユニットを含み、前記レーザー方位調整ユニットは分散補償素子１２と音響光学変調器１３との間に設置されており、前記レーザー方位調整ユニットは第1の半波長板１４、第１のミラー１５及び第２のミラー１６を含む。
【００４９】
第1の半波長板１４は分散補償素子１２で補償されたレーザーを受光し、且つレーザー偏光方向を調整することにより、音響光学変調器１３の変調効率を最も高くする。第１のミラー１５は第1の半波長板１４を通過したレーザーを受光し、且つレーザーを反射することにより、レーザーが音響光学変調器１３に入射する位置を調整する。第２のミラー１６は第１のミラー１５を通過したレーザーを受光し、且つレーザーを反射することにより、レーザーが音響光学変調器１３に入射する角度を調整し、さらに音響光学変調器１３に伝送する。
【００５０】
一実施例において、前記正分散光路はさらに分光ユニットを含み、前記分光ユニットはレーザー入力用光ファイバー１１に近接して設置されており、音響光学変調器１３により強度が調節されたレーザーを受光し、該レーザーを少なくとも２つのビームに分岐し、さらにレーザー入力用光ファイバー１１に伝送する。
【００５１】
一実施例において、レーザー入力用光ファイバー１１の数量は少なくとも２本であり、第１のレーザー入力用光ファイバー及び第２のレーザー入力用光ファイバーを含む。
【００５２】
前記分光ユニットは、偏光ビームスプリッター１７、第２の半波長板１８、第３のミラー１９、第１のコリメートレンズ１１０、第３の半波長板１１１、第４のミラー１１２、第２のコリメートレンズ１１３及び第４の半波長板１１４を含む。
【００５３】
偏光ビームスプリッター１７は、音響光学変調器１３により強度が調節されたレーザーを受光し、該レーザーを少なくとも２つのビームに分岐し、それぞれ前記第１のレーザー入力用光ファイバー及び第２のレーザー入力用光ファイバーに伝送する。第２の半波長板１８は偏光ビームスプリッター１７と音響光学変調器１３との間に配置されており、偏光ビームスプリッター１７の分割比を変化させる。第３のミラー１９は偏光ビームスプリッター１７と第２の半波長板１８との間に配置されており、レーザーを反射することにより、レーザーの位置を調整し偏光ビームスプリッター１７の入射面に投射する。第１のコリメートレンズ１１０は偏光ビームスプリッター１７の第一の出射面と第１のレーザー入力用光ファイバー１１との間に配置されており、偏光ビームスプリッター１７から出力されるレーザーを受光し、且つレーザーを第１のレーザー入力用光ファイバー１１に結合させる。第３の半波長板１１１は偏光ビームスプリッター１７の第一の出射面と第１のコリメートレンズ１１０との間に配置されており、偏光ビームスプリッター１７から出力されるレーザーを受光し、且つレーザー偏光方向を調整することにより、レーザーの第１のレーザー入力用光ファイバー１１への結合効率を最高にする。第４のミラー１１２は偏光ビームスプリッター１７の第２の出射面と第２のレーザー入力用光ファイバーとの間に配置されており、偏光ビームスプリッター１７から出力されるレーザーを受光し、レーザーを反射することにより、レーザーの位置を調整して前記第２のレーザー入力用光ファイバーに入射する。第２のコリメートレンズ１１３は第４のミラー１１２と第２のレーザー入力用光ファイバーとの間に配置されており、偏光ビームスプリッター１７から出力されるレーザーを受光し、且つレーザーを第２のレーザー入力用光ファイバーに結合させる。第４の半波長板１１４は第４のミラー１１２と第２のコリメートレンズ１１３との間に配置されており、第４のミラー１１２から反射されたレーザーを受光し、且つレーザー偏光方向を調整することにより、レーザーの第２のレーザー入力用光ファイバーへの結合効率を最高にする。所望により、迷光遮断器１１５は、不要な光の射出を防止する。
【００５４】
図１及び図３に示すように、一実施例において、前記走査撮像部はマイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２、対物レンズ２３、走査レンズ２４、コリメーター２５、ダイクロイックミラー２６及び集光レンズ２７を含む。
【００５５】
マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２（ＭＥＭＳ）はレーザー入射角度を回転しながら変化させることによって前記生体試料内部の組織平面をレーザーにて２次元走査する。好ましくは、マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２の直径が０．８ｍｍ、パッケージサイズが９×９ｍｍ２、第一の共振周波数が６ｋＨｚ以下、その最大光学走査角度が±１０度、支持フレームサイズが２５６×２５６、及び最大視野が１３０×１３０μｍ２である４０Ｈｚ撮像を行うことで、動画のフレームレートの画像を取得する。他の走査形態、例えば、圧電アクチュエーターのスパインラルやＬｉｓｓａｊｏｕｓパターンを用いた光ファイバー走査に比べ、本実施例に係るマイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２は全視野での高速、均一励起及び大きな走査角度、大視野において有利である。マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２の走査中のｘ及びｙ制御信号はＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）カード（ＰＸＩ−７８５３Ｒ）により生成し、該カードはさらに音響光学変調器を駆動することによりレーザー強度を調整し、他の素子（例えば、赤外線カメラによる採取）をトリガーする。光電検出器（Ｈ１０７７０Ｐ‐４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｊａｐａｎ）からの信号は高速前置増幅器（ＤＨＰＣＡ‐１００、ＦＥＭＴＯ  Ｇｍｂｈ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により増幅し、そして１２０ＭＳ／ｓデジタイザアダプターモジュール（ＮＩ５７３４、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）及びＦｌｅｘＲＩＯ  ＦＰＧＡ（ＰＸＩｅ‐７９６１Ｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ.，  Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）に接続することにより、高速にデータを収集する。システム全体はＬａｂＶＩＥＷプラットフォームに基づいたカスタマイズ開発ソフトウェアによって制御される。
【００５６】
対物レンズ２３はマイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２からのレーザーを前記生体試料内部に集光することにより、前記生体試料に前記蛍光信号を生成させるように励起し、且つ前記蛍光信号を出力する。好ましくは、対物レンズ２３の開口数（以下、「ＮＡ」と略称する）は０．８であり、ＮＡがより高く、光学切片も薄く、これはサブミクロン撮像解像度を実現するのに有利であり、さらに自由に活動する試料において樹状突起と樹状突起スパインの構造や機能変化を判別することができる。
【００５７】
本実施例において、対物レンズ２３はＧＲＩＮＴＥＣＨ  ＧｍｂＨ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の高解像度の水浸小型対物レンズ（ＧＴ‐ＭＯ‐０８０‐０１８‐ＡＣ９００‐４５０）を用いており、これは４．７６×の倍率、０．８０の物体側ＮＡ及び０．１７３の像側ＮＡで有限補正を行う。対物レンズ２３の長さは６ｍｍ、直径は１．４ｍｍであり、２００μｍの作動距離を有する。対物レンズ２３は具体的には薄型フレネルレンズ２３１、平凸レンズ２３２、リレーレンズ２３３及びフォーカスレンズ２３４を含み、そのうち、薄型フレネルレンズ２３１と平凸レンズ２３２はいずれもマイクロ屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズである。既存の技術に用いられている対物レンズに比べ、本実施例は、対物レンズ２３に入射された回折成分（フレネルレンズ）により２光子撮像時の励起と発光波長との間の大きな色収差を効果的に補正し、これにより良好なビームフォーカス品質を得、信号収集効率を改善し、したがってサブミクロン撮像解像度を実現するのに有利であり、さらに自由に活動する試料において樹状突起と樹状突起スパインの構造と機能変化を判別できるように有利な条件を提供する。
【００５８】
走査レンズ２４はマイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２と対物レンズ２３との間の光路上に配置されており、マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２の２次元走査により角度変化されたレーザーを位置変化されたレーザーに変換する。走査レンズ２４は非球面レンズ（＃３５５１６０Ｂ、Ｌｉｇｈｔｐａｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ、ＵＳＡ、直径３ｍｍ、等価焦点距離２．７ｍｍ）を走査レンズとし、球面収差を低減する。
【００５９】
コリメーター２５はレーザー入力用光ファイバー１１とマイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２との間に配置されており、レーザー入力用光ファイバー１１から出力されるレーザーをコリメートし、異なる周波数レーザー間の色収差を低減し、走査レンズ２４とともに対物レンズ２３の像側ＮＡとの整合をとる。本実施例のコリメーター２５はアクロマティックコリメートレンズ（＃６５‐２８６、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ、直径２ｍｍ、等価焦点距離３ｍｍ、専用近赤外光）を用いており、レーザー装置の出力をコリメートしてフェムト秒レーザー装置の異なる周波数成分間の色収差を低減させることができ、これは伝送効率（レーザー光源から試料まで５０％を達成）、ビームフォーカス及び励起効率の向上に有利となる。
【００６０】
ダイクロイックミラー２６は走査レンズ２４と対物レンズ２３との間に設けられており、レーザーと蛍光信号とを分離し、前記蛍光信号を出力する。ダイクロイックミラー２６は中国福建Ｓｕｎｌｉｇｈｔ有限会社が製造したサイズ３×３×０．２ｍｍ３、反射帯域７５０〜１１００ｎｍ、透過帯域４００〜６５０ｎｍの製品を採用することにより、走査レンズ２４からのレーザービームを対物レンズ２３に反射させる。集光レンズ２７は蛍光信号を効率的に収集するために用いられる。
【００６１】
本発明は、光学設計ソフトウェア（ＺＥＭＡＸ）を用いて全ての光学素子及びそれらの間の距離をシミュレーションして最適化し、且つ商用ＣＡＤソフトウェア（Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ）を用いて幾何学的な設計を行う。
【００６２】
本発明に係るマイクロプローブ２の解像度の具体的な計算手順は、以下の通りである。
【００６３】
まず、有効励起ＮＡ（ＮＡｅｘ）は励起の全光路により決定される。コリメーター２５の後のレーザービームの直径Ｄ１は以下の通りである。
【００６４】
Ｄ１＝２・ＮＡｈｃ‐９２０・ＥＦＬｃ        （２．１）
ここで、ＮＡｈｃ‐９２０はＨＣ‐９２０のＮＡ（約０．１５）であり、ＥＦＬｃはコリメーター２５の等価焦点距離（３ｍｍ）である。
【００６５】
レーザービームの直径Ｄ１（０．９ｍｍ）がマイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２のサイズ（ｘ方向に対して０．８ｍｍ、ｙ方向に対して約０．６ｍｍ）よりも大きいため、マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２の傾斜度がそのサイズの制限を受けることを考慮して以下の式で算出する。
【００６６】
ＮＡｅｘ＝（１／２・Ｄｍ／ＥＦＬｓ）・ＮＡｏ／ＮＡｉ        （２．２）
ここで、ＥＦＬｓは走査レンズ２４の等価焦点距離（２．７ｍｍ）である。ＮＡｏ、ＮＡｉはそれぞれ対物レンズの物体側ＮＡと像側ＮＡを示し、それぞれ０．８と０．１７３である。
【００６７】
そして、マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２のｘ方向によって確定される最大励起ＮＡは以下の通りである。
【００６８】
ＮＡｅｘ＝（１／２・０．８／２．７）・０．８／０．１７３≒０．６８５
参照文献２における方程式を用いて２光子励起（ＩＰＳＦ２）の点広がり関数の回折限界の横方向（ωｘｙ）と軸方向（ωｚ）１／ｅ半径を計算し、本実施例では以下になる。
【００６９】
【数０００３】
2020509402.tif 000007
【００７０】
【数０００４】
2020509402.tif 000008
【００７１】
ここで、浸漬媒質（生理食塩水）の屈折率は１．３４以下、レーザーの波長は９２０ｎｍである。ＮＡｅｘは０．６８５、ωｘｙ＝０．３０４μｍ、ωｚ＝１．８４０μｍである。
【００７２】
解像度は通常ＰＳＦ２の半値幅（ＦＷＨＭ）として定義されており、本実施例では以下になる。
【００７３】
【数０００５】
2020509402.tif 000009
【００７４】
【数０００６】
2020509402.tif 000010
【００７５】
アガロースに埋め込まれた１００ｎｍの蛍光ビーズの画像を利用した測定結果は以下の通りである。本発明に係るマイクロ２光子顕微鏡装置の横方向解像度は０．６４±０．０２μｍ、軸方向解像度は３．３５±０．３６μｍである。
【００７６】
上記実施例において、本発明の解像度を測定する際に実験試料を作製する方法は以下の通りである。まず、２μＬのＴｅｔｒａＳｐｅｃｋ  １００‐ｎｍの蛍光ビーズ（Ｔ７２７０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｒｅｇｏｎ  ＵＳＡ）を１００μＬ生理食塩水に希釈した後、９００μＬの１．５％低融点アガロースと混合する。またマイクロスフェア蛍光ビーズ（４μＭ）を含んだアガロースをカバーガラス上に滴下し、１０分後に使用する。等価横方向画素サイズは６１ｎｍ、軸方向走査間隔は８０ｎｍであり、両者はいずれもナイキストの標本化定理の条件の５倍以上であり、ひいては顕微鏡の実際の光学解像度を測定するのに十分である。
【００７７】
表３は、本発明に係るＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭと既存技術におけるｍＴＰＭの解像度の対比表であり、２列目は、本発明に係るＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭの解像度及びそのパラメーターの説明であり、３〜６列目は、既存技術におけるｍＴＰＭの解像度及びそのパラメーター説明である。説明すべきことは、表３中の＊は文献からのデータである。既存の実験データから分かるように、既存技術におけるｍＴＰＭは動物の体外では高い空間解像度が得られているものの、多くのｍＴＰＭは動物の体内ではパフォーマンスが悪く、高信号対雑音比（ＳＮＲ）の蛍光画像が得られていない。表３の対比分析から分かるように、本発明に係るＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭの解像度は、既存技術におけるｍＴＰＭの最高解像度の２倍であり、このような高解像度は、自由に活動する動物における単一の樹状突起スパインの撮像問題を解決するのに有利な条件を提供している。
【００７８】
【表３】
2020509402.tif 000011
【００７９】
同一の基準で既存技術におけるベンチトップＴＰＭ及びマイクロ広視野顕微鏡とＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭとの間の機能差異を測定して比較するために、本実施例は１つの集積プラットフォームを構築し、これにより同一試料上でベンチトップＴＰＭモード（図６）、広視野撮像モード（図７）とＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ撮像モード（図８）との間の切替えが許容される。図６〜８に示すように、該集積プラットフォームは、マイクロ型と一般型の対物レンズ、複数の照明源（ＴＰＭ用のレーザー装置と広視野用の高出力水銀ランプ）及び検出装置（ＴＰＭ用のＧａＡｓＰと広視野用のｓＣＭＯＳカメラ）を備えている。異なる撮像モードは同じ焦点面と同心視野、総フレーム収集時間と撮像ＮＡを有するが、平均照明パワーと検出器の感度も細心に選択、整合を行い、以下に図６〜図８を結合して上記集積プラットフォームの構成を説明する。
【００８０】
上記集積プラットフォームはそれぞれベンチトップＴＰＭモード、広視野撮像モード及びＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ撮像モード下で同一試料の同一焦点面について撮像を行う。レーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｖｉｓｉｏｎ‐Ｓ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、ＵＳＡ、中心波長９２０ｎｍ）は、Ｈ‐ＺＦ６２ガラス管を通し、次いで音響光学変調器（ＭＴ１１０‐Ｂ５０Ａ１．５‐ＩＲ‐Ｈｋ、ＡＡＳａ、Ｏｒｓａｙ  Ｃｅｄｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に通した。そして中心波長が９２０ｎｍのレーザーを２つのビームに分岐し、１つのビームはＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭで使用している１本のＨＣ‐９２０に結合させ、もう１つのビームはベンチトップＴＰＭで使用している他のＨＣ‐９２０に結合させる。
【００８１】
図６に示すように、ベンチトップＴＰＭモードにおいて、ＨＣ‐９２０からのコリメートレーザー装置は一対の検流計走査レンズＡ１（６２１５Ｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）により走査され、そして走査レンズＡ２（ＬＭＳ０５‐ＢＢ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、チューブレンズＡ３（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｊａｐａｎ）及び第１のダイクロイックミラーＡ４（ＤＭ１、ＤＭＬＰ６５０Ｒ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を通し、最終的に対物レンズＡ５の後側焦点面（ＢＦＰ）（ＣＦＩＡｐｏ  ４０ＸＷ  ＮＩＲ、Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ、４０×ＮＡ０．８、作動距離３．５ｍｍ）に伝達する。対物レンズＡ５からの蛍光発光信号は第１のダイクロイックミラーＡ４により反射され、集光レンズＡ６（ＬＡ１２１３‐Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）、第２のダイクロイックミラーＡ７（ＤＭ２、＃８７‐２８４、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ、反射帯域３７５〜３９３、４６６〜４９０及び５４６〜５６５ｎｍ、透過帯域４２０〜４６０、５１０〜５３１、５９０〜６２４及び６７７〜７２５ｎｍ）、集光レンズＡ８（ＡＣＬ２５４１６Ｕ‐Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を通し、最後に光電子増倍管Ａ９（ＧａＡｓＰＰＭＴ  ７４２２Ｐ‐４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）により検出する。ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ（０．６８５）と同一の励起ＮＡを実現するために、対物レンズＡ５の後側焦点面（ＢＦＰ）における励起レーザー束の光束サイズを以下のように設定される。
【００８２】
（２×０．６８５×２００）（ｍｍ）／４０＝６．８５（ｍｍ）
ここで、２００ｍｍは該対物レンズＡ５をチューブレンズＡ３に整合するためのＥＦＬであり、４０は対物レンズＡ５の倍率である。
【００８３】
図７〜図８に示すように、広視野撮像モードとＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ撮像モードにおいて、本発明に係るマイクロプローブ２をカスタマイズされたマイクロ三軸手動マイクロマニピュレータ（ＳｉｇｍａＫｏｋｉ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＡＰＡＮ）に接続し、マイクロプローブ２における対物レンズ撮像面は空気対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＮＩＲ  ５Ｘ、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ、５×、ＮＡ０．１４、作動距離３７．５ｍｍ）の焦点面である。高精度の双方向再現性（±２．５μｍ）を有する４ポート対物レンズ回転盤（ＯＴ１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を用いてマイクロプローブ２と４０×ニコン対物レンズとの間を切り替える。ニコン対物レンズとマイクロプローブ２の前のレンズ鏡筒のねじを調整することにより、本発明は、マイクロプローブ２とニコン対物レンズとが同一の焦点面を持つように設定できる。
【００８４】
図７に示すように、マイクロ広視野蛍光構造において，青色光フィルター（ＭＦ４７５‐３５、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ、中心波長４７５ｎｍ、帯域幅４０ｎｍ）を有する蛍光照明器（Ｘ‐Ｃｉｔｅ  １２０Ｑ、Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＡ、ＵＳＡ：３５ｎｍ）を光源Ｂ１とする。ベンチトップＴＰＭ構造における第１のダイクロイックミラーＡ４をダイクロイックミラーＢ２（ＤＭ３、＃８７‐２８４、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ、反射帯域３７５〜３９３、４６６〜４９０及び５４６〜５６５ｎｍ、透過帯域は４２０〜４６０、５１０〜５３１、５９０〜６２４及び６７７〜７２５ｎｍを含む）に変え、照明光をマイクロプローブ２へ反射し、且つマイクロプローブ２からの蛍光発光信号を科学ＣＭＯＳカメラＢ３（８０５０Ｍ‐ＧＥ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）に伝送する。ベンチトップＴＰＭとＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ構成での撮像はターゲットの後で類似の平均パワーを使用し、通常１０〜２５ｍＷである。単一光子と二光子励起の吸収断面の差異により、単一光子撮像で使われる平均パワーは一般的に二光子撮像での平均パワーより遥かに低い。したがって、本発明は、前の報告で用いられている１７０〜６００μＷ照度に類似して、広視野蛍光顕微鏡構成に１００〜５００μＷ照明（マイクロ対物レンズの後ろ）を用いる。
【００８５】
図１４ａの左側画像は，Ｔｈｙ１‐ＧＦＰトランスジェニック生体試料脳のニューロン樹状突起及び樹状突起スパインの３Ｄ形態撮像であり、１ｓの総露出（ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭとマイクロ広視野顕微鏡の８Ｈｚの８フレームの平均値、及びベンチトップＴＰＭの２Ｈｚの２フレームの平均値）下でほぼ同一の焦点面での画像を取得し、図１４ａの右側曲線は、左側画像で示された裁断領域における２対の隣接樹状突起スパインの断面プロファイルである。図１４ｂはＧＣａＭＰ‐６ｆの生体試料を発現させるＰＦＣにおいて神経細胞体が豊富に含まれた平面（‐１３０μｍ）の画像であり、上部画像は同じＲＯＩの３０秒平均画像である。マイクロ広視野画像は正規化のΔＦ／Ｆ（オンライン方法を参照）、下部波線は３つの選択されたニューロンにおけるＣａ２＋の経時変化（持続時間１００秒）（上図において数字で標記）を示す。図１４ｃの左側画像は（図１４ｂ）における同一生体試料の樹状突起と突起スパイン（焦点面‐１２０μｍ）からのＣａ２＋信号であり、判別可能な樹状突起信号が欠如しているため、マイクロ広視野顕微鏡で記録した画像を示していない。図１４ｃの右側上部画像はベンチトップＴＰＭで捕獲された１つの樹状突起軸（Ｄ１）と樹状突起スパイン（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）付きの撮像及びＣａ２＋信号（持続時間１００ｓ）であり、図１４ｃの右側下部画像はＦＨＩＲＭで捕獲された１つの樹状突起軸（Ｄ１）と樹状突起スパイン（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）（左）付きの撮像及びＣａ２＋信号（持続時間１００ｓ）である。図１４ｄは異なる構成で撮像したＣａ２＋信号の平均周波数及び幅、同一グループからの神経細胞体（ｎ＝４）、樹状突起（ｎ＝８）と樹状突起スパイン（ｎ＝６）とを統計したデータである。
【００８６】
形態学的撮像に対し、本発明はＴｈｙ１‐ＧＦＰトランスジェニック生体試料の固定脳におけるＶ１領域（１３０×１３０μｍ２、表面から６０μｍ以下）について撮像を行い、３Ｄの画像データ（図１４ａ）を取得する。ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭとベンチトップＴＰＭとは樹状突起撮像において同一の対比度及び解像度（図１４ａ）を示す。しかし、マイクロ広視野撮像モードにおいて、構造の細部をほとんど判別できず、これは主に焦点外組織からの強い背景信号に起因する。機能撮像の比較において、本発明はアデノ随伴ウイルス感染の方法で生体試料の前額皮層のニューロンにＣａ２＋指示薬ＧＣａＭＰ‐６ｆを表せ、且つ頭部が固定された覚醒生体試料にカルシウム撮像（図１４ｂ〜図１４ｄ）を行う。細胞体（表面以下１３０μｍ）または樹状突起と樹状突起スパイン（表面以下１２０μｍ）の活動を示すために２つの焦点面を選択する。画像正規化及びコントラスト強調（ΔＦ／Ｆ）の後、マイクロ広視野での撮像は類似の周波数で体細胞Ｃａ２＋信号を判別するが、それらの幅（ΔＦ／Ｆは５〜１０％）はベンチトップＴＰＭまたはＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ（ΔＦ／Ｆは約１５０％）で測定した幅より約１桁低い（図１４ｄ）。注目すべきことは、樹状突起構造からのＣａ２＋信号のほとんどがこのような撮像構成において検出されなかった（図１４ｂ及び図１４ｄ）。要するに、これらの基準によるテストは本発明のＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭがベンチトップＴＰＭと同等の機能に達し、同時に覚醒動物における樹状突起と樹状突起スパインの構造及び機能活性を判別する点においてマイクロ広視野顕微鏡より優れていることを証明している。
【００８７】
ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭで使われる高速マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２は、高速ベンチトップＴＰＭで使われる共振スキャナーよりさらに線形の電圧‐傾斜応答及び可制御性を有する。したがって、その撮像により大きな柔軟性を付与し、単一のシステムにおいて高速ラスタ走査撮像、任意に指定した領域（ＲＯＩ）におけるランダム走査撮像及び超高速線形走査撮像を実現できる。特に１２８Ｈｚのランダム走査撮像は、Ｃａ２＋信号の時間的超微細構造を判別するのに有利であり、なおｍＴＰＭに自由に活動する動物において正確な光遺伝学的操作を行う能力を与えることができる。１０ｋＨｚの線形走査撮像能力は遺伝子コーディングを利用した電圧指示薬により活動電位を迅速に観測するために極めて重要である。
【００８８】
樹状突起スパイン活動はニューロン情報処理の基本事件であり、ベンチトップＴＰＭｓを頭に固定した動物での研究により、単一のニューロンの異なる樹状突起スパインは異なる方向の視覚刺激または異なる強度及び周波数の音響刺激により活性化されることが明らかになった。マイクロ広視野顕微鏡により取得された数百個のニューロンの全体活動は、異なる行動条件下でのニューロンネットワークコーディングの特性の検出に役立つものの、本発明のＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭは選択可能でより強力なツールを提供し、頭が固定された動物において実現できない行動パラダイムにおいて、より基本的な神経コーディング単位の時空間特性を観測する。
【００８９】
要するに、新しく開発したＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭは高時空解像度、良好な機械的安定性、及び応用範囲の最も広い指示薬に対した効率的励起をすでに実現した。新世代のｍＴＰＭを用いることにより、本発明は自由に活動する動物における単一シナプスレベルの長時間にわたる撮像という科学者が夢見ていた目標を実現した。将来はもっと多くの改善と拡張ができると見込める。正確に設計したマイクロ高ＮＡ対物レンズを用いると、ＦＯＶと透過深度をさらに拡張できる。深層脳撮像は直接マイクロ対物レンズを脳に挿入するか、もしくは脳にＧＲＩＮレンズを埋め込むことにより実現でき、以前報告された方法に類似する。より大きな動物、例えばラットやマーモセットに対しては、頭骨に複数のＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭを装着することにより、脳における遠隔構造及び機能的接続に関する問題を探索することができる。ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭは神経科学者及び生物医学科学者が動物体内で健康と疾病のメカニズムを探索する重要なツールであることが証明されると、本発明が予期している。
【００９０】
図５ａに示すように、本発明は、さらに生体試料行動撮像システムを提供し、前記生体試料行動撮像システムは筐体３、フェムト秒パルスレーザー装置、フェムト秒パルスレーザー変調器１、マイクロプローブ２、データ収集ユニット７及び回路実装ユニットを含む。
【００９１】
フェムト秒パルスレーザー装置は、波長９２０ｎｍのレーザーを生成するのに用いられる。フェムト秒パルスレーザー変調器１は、前記フェムト秒パルスレーザー装置から出力されたレーザーを受光し、レーザーの伝送パワーを予め設定された値まで増幅し、なおレーザーパルス幅の広がりをプリチャープ補償し、そして出力する。マイクロプローブ２は、生体試料の体に装着し、且つ入力端は前記フェムト秒パルスレーザー変調器におけるレーザー入力用光ファイバーにより前記フェムト秒パルスレーザー装置の出力端に接続され、前記フェムト秒パルスレーザー変調器から出力されたレーザーを受光するのに用いられる。該レーザーは生体試料内部の組織に対し走査を行うことにより、前記生体試料を励起し蛍光信号が生成させ、なお前記走査撮像部から出力された前記蛍光信号を受光し、出力する。フェムト秒パルスレーザー装置、フェムト秒パルスレーザー変調器１及びマイクロプローブ２は上文ですでに詳細に紹介したため、ここでは述べない。
【００９２】
筐体３は、生体試料の自由移動に限定空間を提供し、該限定空間は生体試料の体形よりもずっと大きく、生体試料の自由活動に十分な空間を提供する。データ収集ユニット７は筐体３に実装されており、データ収集ユニット７の入力端は蛍光出力用光ファイバー２１によりマイクロプローブ２の出力端に接続され、マイクロプローブ２から出力された前記蛍光信号を収集する。レーザー入力用光ファイバー１１及び蛍光出力用光ファイバー２１は筐体３に対し自由回転可能な形態で、前記回路実装ユニットを介して筐体３に取り付けられる。回路実装ユニットにより、蛍光出力用光ファイバー２１、レーザー入力用光ファイバー１１とその他の給電線８との間の絡み合いを防止し、生体試料の自由活動に有利な条件を提供することができる。
【００９３】
一実施例において、データ収集ユニット７はプローブ光路を提供し、該プローブ光路には同軸的に配置された光電子増倍管７１、集光器７２、発光フィルター７３、ショートパスフィルター７４及び集光レンズ７５を含み、そのうち、光電子増倍管７１は光信号を電気信号に変換して出力するのに用いられる。集光器７２は蛍光出力用光ファイバー２１から伝送される蛍光信号を集光する。発光フィルター７３は波長９２０ｎｍのレーザーをフィルタリングし除去する。ショートパスフィルター７４は信号光以外の迷光をフィルタリングし除去する。蛍光出力用光ファイバー２１は集光レンズ７５と共軸となっており、且つ蛍光出力用光ファイバー２１は集光レンズ７５の焦点面に位置し、集光レンズ７５は前記蛍光信号を光電子増倍管７１により十分に収集するために用いられる。
【００９４】
好ましくは、前記回路実装ユニットは電気回転ヘッド６及びブラケット１０を含み、そのうち、電気動回転ヘッド６は筐体３の頂部に貫通設置されており、且つ、一端が外部電源に接続され、他端が給電線８に接続されることにより、前記外部電源と給電線８とを電気的に接続させる。ブラケット１０は筐体３の頂部に位置する電気回転ヘッド６の外に被り設置され、レーザー入力用光ファイバー１１及び蛍光出力用光ファイバー２１は電気回転ヘッド６のケーシングを通過し、蛍光出力用光ファイバー２１はデータ収集ユニット７における集光レンズ７５の光信号に接続される。蛍光出力用光ファイバー２１は軸受９を介してデータ収集ユニット７に接続され、これにより、電気回転ヘッド６及び軸受９は蛍光出力用光ファイバー２１及び給電線８を独立に回転させ、同時にプローブ光路の不変を維持し、このような設計は生体試料がその環境を自由に探査する際に接続線の絡み合いの発生を防止し、マイクロプローブ２の安定性を大きく向上させ、生体試料が激しい身体活動を行っても影響を及ぼさず、したがって動物の自由探査期間でのワイヤのねじれ及び絡み合いを最小化する。
【００９５】
一実施例において、前記自由移動生体試料行動撮像装置は、さらに給電線８を含み、マイクロエレクトロメカニカルスキャナ２２に給電する。給電線８は前記筐体に対し自由回転可能な形態で、前記回路実装ユニットにより前記ケースに実装され、これにより給電線８が正常に給電できるように保証し、給電線８とレーザー入力用光ファイバー１１及び蛍光出力用光ファイバー２１との間の絡み合いも回避させ、動物の自由探索期間でのワイヤのねじれと絡み合いを最小化する。
【００９６】
一実施例において、前記自由移動生体試料行動撮像装置は、さらに複数のカメラ４を含み、カメラ４はいずれも筐体３の内壁に実装され、図２に示すように筐体３の側面及頂部に実装され、生体試料の自由移動中の行動をそれぞれ異なる角度で撮影し、記録する。
【００９７】
一実施例において、前記自由移動生体試料行動撮像装置は、さらに照明ランプ５を含み、照明ランプ５は筐体３の内壁に実装され、筐体３の内側を照明するのに用いられる。
【００９８】
図１２ａ〜１２ｅに示すように、図１２ａはＶ‐１皮質Ｌ２／３ニューロンの５０枚の平均ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ（本発明のマイクロ二光子顕微鏡装置）画像を示す図であり、画像中に１、２、３個の樹状突起が丸付けられている。図１２ｂは生体試料の競技場内での２次元軌跡（持続時間１００秒）を示す図であり、そのうちの頂部のカメラから取られた映像記録を利用し軌跡を計算し、なお移動速度をカラーで番号付ける。図１２ｃ及び図１２ｄはそれぞれ頭部固定（１２ｃ）及び自由移動条件（１２ｄ）下で３つの樹状突起（図１２ａで丸付けられている）からのＣａ２＋信号の時間経過（持続時間１００ｓ）を示す図であり、生体試料速度の経時的変化も底部に示されている。図１２ｅは頭部固定と自由移動条件下ですべての樹状突起Ｃａ２＋遷移の平均周波数を示す図であり、データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝１５個の樹状突起を示す。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｔを整合して検出する。以上の実験データにより、生体試料が暗黒で自由に探査する時（軌跡は図１２ａ〜１２ｅに示される）、その視覚皮質のニューロンの樹状突起の活性は生体試料頭部固定の場合よりも顕著に増加（図１２ａ〜１２ｅ）すると発見できる。
【００９９】
図１３ａ〜１３ｃに示すように、図１３ａは３種の異なる行動パラダイムでの視覚皮質において懸垂試験、高台飛び降り、社交行動のようなニューロンの活動を撮像した図である。一番左側の１列目の画像は異なる行動に参加する生体試料を、行動装置の側面上の２つのカメラで撮影したスナップショットである。中間の２列目の画像はＧＣａＭＰ６ｆで標記された神経細胞体、樹状突起及び樹状突起スパインのＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ撮像である。右側の３列目の画像は対応するカルシウム活動分布図（持続時間１００ｓ）である。一番右側の４列目の画像はＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ画像に示された３つのＲＯＩのＣａ２＋信号（持続時間５０秒）である。図１３ｂはＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭ撮像の短期的と長期的安定性を示す図であり、図１３ｂの左側の曲線は各行動パラダイムにおいてフレーム間相関の分析に基づいた横方向変位分布であり、そのうち、ＦＭ（ｆｒｅｅ  ｍｏｖｉｎｇ）は自由移動を示し、ＴＳ（ｔａｉｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）は懸垂を示し、ＳＤ（ｓｔｅｐｐｉｎｇ  ｄｏｗｎ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｓｔａｇｅ）は高台飛び降りを示し、ＳＩ（ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）は社交行動を示す。図１３ｂの右側の曲線は４時間の試験期間中のＦＯＶドリフトである。
【０１００】
この結果は、多部位電気プローブで記録された運動が動物視覚皮質のニューロン活動を増強できることと一致する。次に、ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭのロバスト性を証明するために、本発明は、生体試料の一次視覚皮質中の１３０×１３０μｍ２のＦＯＶに４０Ｈｚの撮像を行うことでそのニューロンの活動を観測し、該生体試料は懸垂試験、高台飛び降り及び社交行動を含んだ３種の行動パラダイムで順次測定される。これらのパラダイムはいずれも頭部固定の実験策略では実現できず、全測定過程は４時間持続する。注意すべきことは、生体試料が懸垂試験で激しく暴れたり、高台から飛び降りたり、もしくは他の仲間と交流したりしても、異なる細胞体、樹状突起及び樹状突起スパインからの活性も安定的に観測できる。異なる行動パラダイムは同一Ｖ１皮質の異なる領域の神経活動に関連している（図１３ａ）と見える。
【０１０１】
本発明に係るマイクロ二光子顕微鏡の短期的と長期的安定性を定量化するために、本発明は、各フレーム間相関及び視野の一定時間から別の時間へのドリフトにより横方向変位を解析する（図１３ｂ）。本発明においては、２０００連続フレーム内で、フレームとフレームとの間の平均変位は高台飛び降り行動パラダイム（０．１９±０．０９μｍ、７５％が０．２４μｍ以下）で一番大きいものの、画素サイズの半分以下である。全４ｈ測定中で、ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭのＦＯＶの全体的ドリフト＜１０μｍであり、多くのドリフトは懸垂試験中で激しく動く１時間目で発生する。注意すべきことは、高い画像採取速度はフレーム内の変位を低減し、このレベルの運動アーチファクトは本発明の樹状突起スパイン構造及び機能の撮像に影響を及ぼさない。本発明に係るマイクロ二光子顕微鏡による単一シナプス活動の撮像能力を示すために、本発明においては、樹状突起スパイン及びその親樹状突起軸上のＣａ２＋活動を追跡することにより、全体と局所活動との関係をさらに解析する。要するに、本発明に係るマイクロ二光子顕微鏡は自然生理環境において自由活動の動物の樹状突起及び樹状突起スパインの活動を安定的に観測することができる。
【０１０２】
本発明は、さらにマイクロ二光子顕微鏡撮像方法を提供し、前記マイクロ二光子顕微鏡撮像方法は以下のステップを含む。
【０１０３】
ステップ１、被撮像領域を選択する。生体試料を固定し、且つベンチトップＴＰＭを利用し前記生体試料において被撮像領域を選択する。ステップ１において、図６に示す撮像プラットフォームを採用し、且つベンチトップＴＰＭモード下で、すなわち、ベンチトップＴＭＰを利用し生体試料において被撮像領域を選択する必要があり、具体的な操作としては、身体固定器を用いて生体試料を固定し、生体試料頭部のウイルス感染の領域をベンチトップＴＰＭで確認する。
【０１０４】
ステップ２、蛍光信号を採取する。レーザー入力用光ファイバーが接続されたマイクロプローブを前記生体試料に実装し、生体試料を解放することにより、ステップ１で選択した被撮像領域から出力される蛍光信号を検出し、前記生体試料内部の組織平面の撮像を完成させる。ステップ２は、具体的には以下のように操作する。
【０１０５】
まず、本発明に係るマイクロプローブ２を生体試料頭部頭蓋骨のブラケットに貼り付け、該ブラケットは開頭手術の準備中にすでに生体試料頭部の頭蓋骨に固定され、歯科用セメントでマイクロプローブ２を生体試料頭部頭蓋骨のブラケットに補強固定する。
【０１０６】
そして、１．５％低融点アガロースを曝露した脳組織領域に被覆する。該方法はプローブと脳との間の相対移動を著しく抑制した。ランダムアクセスにおいて大量のニューロンレーシングを実現するために、ニューロンを標記する過程は以下の通りである。本発明は人工脳脊髄液（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、中国上海、ｍＭ、１２５ＮａＣｌ、４．５ＫＣｌ、２６ＮａＨＣＯ３、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、２０グルコース、９５％のＯ２と５％のＣＯ２で充填した時のｐＨは７．４）で脳の曝露領域を被覆する。５０μｇのＣａｌ‐５２０ＡＭ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ．ＣＡ、ＵＳＡ）を４μｌのＤＭＳＯ（２０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ‐１２７を含む）に溶解し、さらに人工希釈液（ｍＭ、１５０ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、１０Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４３２）で５００μＭまで希釈する。２‐３ＭΩ抵抗のホウケイ酸塩ピペットを用い、圧力パルス（１分間、４００ミリバール）を加えることにより、Ｃａ２＋染料を一次視覚皮質層の２／３層まで注入する。１時間後、ＳＲ‐１０１を皮質表面に滴下することにより、アストロサイトを同定する。生体試料の頭部を固定し、ＦＨＩＲＭ‐ＴＰＭを用いてランダムアクセスモードで撮像を行う。
【０１０７】
最後に、生体試料を固定器から解放し、なお上記実施例の小動物撮像システムの筐体３に入れ、マイクロプローブ２を用いて生体試料に対して懸垂試験や滑り試験（円柱形平ら、５ｃｍ２、５ｃｍ高さ）及び社交行動（３０×３０ｃｍ２の矩形活動場所）を行う。
【０１０８】
ステップ３、前記蛍光信号を処理し、生体試料自由活動の三次元画像を取得する。
【０１０９】
上記ステップの前に、さらに生体試料を作製するステップ４を含み、具体的には以下を含む。
【０１１０】
ステップ４１、生体試料を選ぶ。実験においてＣ５７ＢＬ／６野生型及びＴｈｙ‐１‐ＧＦＰトランスジェニックの生体試料（生後８〜１６週）を用いる。動物育種と実験操作とを始めとするすべてのプロセスはいずれも北京大学の動物使用及び保護委員会と実験動物保護評価及び認証協会の基準に符合する。Ｔｈｙ‐１‐ＧＦＰトランスジェニック生体試料を麻酔して０．９％食塩水を注入し、さらに４％のパラホルムアルデヒドを注入し、脳を摘出する。４°Ｃの４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ中に一夜固定する。
【０１１１】
ステップ４２、生体脳皮質撮像のために骨切り術を行う。これらの実験においてＣ５７ＢＬ／６野生型生体試料を用いる。すなわち、純Ｏ２中の１〜１．５％イソフルランを吸入させて生体試料を麻酔し、且つ立体定位フレーム（６８０２５、ＲＷＤ、中国深セン）に置く。同時に、加熱板（３７．５〜３８°Ｃ）を用いて生体試料の正常温度を維持する。局所にｘｙｌｏｃａｉｎｅを投与して皮膚と筋肉を除去した後、目標皮層の中部に高速スカルドリル（先端直径０．５ｍｍ）で小さな矩形窓（０．５×０．５ｍｍ２）をあける。カルモジュリン依存性キナーゼII（ＣａＭＫII）プロモーター（血清型２／９、＞２×１０１３個のゲノムコピー／ｍｌ、ペンシルベニア大学遺伝子治療プログラムベクターコアより産生）で組換えＡＡＶを用いて、ＧＣａＭＰ‐６ｆを発現する。注射器（Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ２０１０、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＵＳＡ）及びガラスマイクロ電極を用い、２０分以内に総量０．５〜０．８μｌのＡＡＶを生体試料の標的皮質の２／３層（深さ１３０〜４００μｍ）にゆっくりと注入する。発現３週後、イソフルランで生体試料を麻酔し、自製のブラケットをシアノアクリル酸ゲルで頭蓋骨に連結して歯科用セメントで補強固定する。スカルドリルで標的皮質に小さな矩形窓（２．５×２．５ｍｍ２）をあける。硬脳膜を注意深く除去し、小型のガラス製のカバーガラス（３．５×２．５ｍｍ２）を開けた頭に置く。１週間の回復後、生体試料が頭部固定に慣れるように毎日３０分ずつトレーニングすることを３日間継続する。覚醒した生体試料が慣れたら、ステップ１とステップ２を行う。
【０１１２】
最後に、指摘すべきことは、上記実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためのものであり、それを限定するものではない。当業者であれば、前述の各実施例に記載された技術的解決手段を修正し、もしくはその一部の技術的特徴に対し同等置換えを行っても良く、これらの修正や置換えにより、相応の技術的解決手段の本質が本発明の各実施例の技術的解決手段の精神と範囲から逸脱することはない旨を理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【国際調査報告】
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