(57)【要約】  本発明は、ヒト誘導性Ｔ細胞共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合し、治療上望ましい機能的性質、例えば、ヒトＩＣＯＳ活性を刺激する能力を示す、単離モノクローナル抗体(例えば、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体)を提供する。本発明の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および本発明の抗体を発現する方法も提供される。本発明の抗体を含む免疫複合体、二重特異性分子および医薬組成物も提供される。本発明の抗体は、例えば、対象における免疫応答、例えば、腫瘍またはウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激または増強するためのアゴニストとして使用され得る。本発明の抗体は、例えば、癌処置のために、他の抗体(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４抗体)と組み合わせて使用し得る。従って、抗体は治療的適用およびＩＣＯＳタンパク質を検出する方法で使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合するヒト化単離抗体であって、ＩＣＯＳリガンドとヒトＩＣＯＳの結合および／または相互作用を遮断し、ここで、
(ａ)インビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイにおいて約０.０１〜約０.１６nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発する；および／または
(ｂ)ＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞共培養アッセイにおいてブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答して約０.００２nM〜約０.４nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ産生を誘発する、
単離抗体。
【請求項２】
次の特性：
(ａ)ヒトＴ細胞に約０.７nMのＥＣ５０で、かつカニクイザルＴ細胞に約０.３nMのＥＣ５０で結合する；
(ｂ)ヒト活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する；
(ｃ)ヒトＣＤ２８またはヒトＣＴＬＡ−４に結合しない；
(ｄ)ＣＤ４＋エフェクターＴ(Ｔｅｆｆ)細胞、濾胞性ヘルパーＴ(Ｔｆｈ)細胞および制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞のような初代Ｔリンパ球の少なくとも一つを活性化する；
(ｅ)インビトロ一次Ｔ細胞シグナル伝達アッセイで約３０nMのＥＣ５０でタンパク質キナーゼＢ(ｐＡｋｔ)のリン酸化を誘発する；
(ｆ)ＴｆｈおよびナイーブＢ細胞共培養アッセイでブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してインターロイキン−１０(ＩＬ−１０)産生を誘発する；
(ｇ)インビトロアッセイで、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔｒｅｇと比較して大きなＣＤ３刺激Ｔｅｆｆの増殖向上を誘発する；
(ｈ)ＴｒｅｇによるＴｅｆｆ抑制を減少させる；
(ｉ)全血細胞アッセイにおいて１０μg／mLでサイトカイン産生を増加させない；
(ｊ)インビトロでＴｆｈ細胞によるＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの少なくとも一方の分泌を増加させる；
(ｋ)ＩＣＯＳ介在シグナル伝達を刺激する；
(ｌ)ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ３２Ａに対する増加した親和性を有する；および／または
(ｍ)ＣＤ１６に対する減少した親和性を有する
の１以上を有する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
ヒトＩＣＯＳとヒトＩＣＯＳ−Ｌの相互作用を遮断する、請求項１または２に記載の単離抗体。
【請求項４】
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＩＣＯＳに結合する、請求項１〜３の何れかに記載の単離抗体。
【請求項５】
(ａ)それぞれ配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号１２、１４および１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｂ)それぞれ配列番号１８、１９および２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｃ)それぞれ配列番号２６、２７および２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号２９、３０および３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｄ)それぞれ配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｅ)それぞれ配列番号４２、４３および４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｆ)それぞれ配列番号４２、４３および４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号４９、５０および５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；または
(ｇ)それぞれ配列番号１９１、１９２および１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号１９４、１９５および１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、ヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合する単離抗体。
【請求項６】
重鎖および軽鎖可変領域が
(ａ)それぞれ配列番号５および６のアミノ酸配列；
(ｂ)それぞれ配列番号１６および１７６のアミノ酸配列；
(ｃ)それぞれ配列番号２４および２５のアミノ酸配列；
(ｄ)それぞれ配列番号３２および３３のアミノ酸配列；
(ｅ)それぞれ配列番号４０および４１のアミノ酸配列；
(ｆ)それぞれ配列番号４０および４８のアミノ酸配列；または
(ｇ)それぞれ配列番号１８６および１８９のアミノ酸配列
を含む、ヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合する単離抗体。
【請求項７】
請求項６に記載の抗体とＩＣＯＳへの結合について競合するまたは同じエピトープに結合する、単離抗体。
【請求項８】
ヒトＩＣＯＳのSIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)の１以上の残基に特異的に結合する、単離抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項９】
ＩＣＯＳエピトープがヒトＩＣＯＳのアミノ酸残基SIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が完全長抗体である、請求項１〜９の何れかに記載の単離抗体。
【請求項１１】
抗体が完全長ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体である、請求項１〜１０の何れかに記載の単離抗体。
【請求項１２】
抗体が配列番号２０６に示すヒトＩｇＧ１配列と比較してＦｃ領域に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１１の何れかに記載の単離抗体。
【請求項１３】
１以上のアミノ酸置換が抗体のＦｃγＲIIｂへの親和性を増強する、請求項１２に記載の単離抗体。
【請求項１４】
１以上のアミノ酸置換がＥＵ方式により２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３９位、２６６位、２６７位、２６８位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位または３３２位であるまたは２３４Ｄ位、２３４Ｅ位、２３４Ｆ位、２３４Ｗ位、２３５Ｄ位、２３５Ｆ位、２３５Ｒ位、２３５Ｙ位、２３６Ｄ位、２３６Ｎ位、２３７Ｄ位、２３７Ｎ位、２３９Ｄ位、２３９Ｅ位、２６６Ｍ位、２６７Ｄ位、２６７Ｅ位、２６８Ｄ位、２６８Ｅ位、３２７Ｄ位、３２７Ｅ位、３２８Ｆ位、３２８Ｗ位、３２８Ｙ位および／または３３２Ｅ位であるかまたはＦｃ領域が２３５Ｙ−２６７Ｅ、２３６Ｄ−２６７Ｅ、２３９Ｄ−２６８Ｄ、２３９Ｄ−２６７Ｅ、２６７Ｅ−２６８Ｄ、２６７Ｅ−２６８Ｅおよび／または２６７Ｅ−３２８Ｆに少なくとも２個の置換を有する、請求項１２に記載の単離抗体。
【請求項１５】
Ｆｃ領域のアミノ酸置換が配列番号２０６に示すヒトＩｇＧ１配列と比較してＳ２６７Ｅである、請求項１２に記載の単離抗体。
【請求項１６】
ＩｇＧ１対照抗体と比較して低減した抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性を有する、請求項１５に記載の単離抗体。
【請求項１７】
抗体が抗体フラグメントである、請求項１〜９または１２〜１６の何れかに記載の単離抗体。
【請求項１８】
抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、(Ｆａｂ’)２、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントである、請求項１７に記載の単離抗体。
【請求項１９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１８の何れかに記載の単離抗体。
【請求項２０】
抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項５〜１９の何れかに記載の単離抗体。
【請求項２１】
重鎖が配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号８に示すアミノ酸配列を含む、ヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合する、単離された完全長、ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２２】
重鎖が配列番号７に示すアミノ酸配列からなり、軽鎖が配列番号８に示すアミノ酸配列からなる、ヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合する、単離された完全長、ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項５または６に記載の抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする、単離核酸分子。
【請求項２４】
核酸がｃＤＮＡである、請求項２３に記載の単離核酸。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の宿主細胞を含む、抗体を産生する方法であって、ここで、該抗体が産生される、方法。
【請求項２８】
抗体を宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第二の機能的部分に連結した請求項１〜２２の何れかに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
【請求項３０】
請求項１〜２２の何れかに記載の抗体または請求項２９に記載の二重特異性分子および薬学的に許容される担体および／または可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を含む、組成物。
【請求項３１】
付加的治療剤をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
付加的治療剤が抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
医薬として使用するための、請求項１〜２２の何れかに記載の抗体。
【請求項３４】
癌の処置に使用するための、請求項１〜２２の何れかに記載の抗体。
【請求項３５】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫またはウイルス関連癌である、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
癌が結腸直腸癌(ＣＲＣ)、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、黒色腫、ＮＳＣＬＣ−腺癌タイプ(ＮＳＣＬＣ−ＡＤ)、ＮＳＣＬＣ−扁平上皮細胞型(ＮＳＣＬＣ−ＳＱＣ)、前立腺の腺癌(ＰＲＣ)、腎細胞癌(ＲＣＣ)または尿路上皮癌(ＵＣＣ)である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
免疫応答に使用するための、請求項１〜２２の何れかに記載の抗体。
【請求項３８】
癌の処置用医薬の製造における、請求項１〜２２の何れかに記載の抗体の使用。
【請求項３９】
ヒト対象に有効量の請求項１〜２２の何れかに記載の抗体または請求項２９に記載の二重特異性分子または請求項３０、３１または３２に記載の組成物を投与することを含む、ヒト対象における癌を処置するまたは進を遅延する方法。
【請求項４０】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫またはウイルス関連癌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ヒト対象に１以上の付加的治療剤を投与することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
付加的治療剤が化学療法剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
付加的治療剤が抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１投与サイクルを含み、ここで、少なくとも１サイクルの各々について、抗体の少なくとも１用量が、約３７５mgの用量で投与される、請求項３９〜４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
ヒト対象に有効量の請求項１〜２２の何れかに記載の抗体または請求項３０、３１または３２に記載の組成物を投与することを含む、ヒト対象における免疫応答を刺激する方法。
【請求項４６】
対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
対象が慢性ウイルス感染を有し、ウイルス感染に対する免疫応答が刺激される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が約８０％未満の受容体占有率の達成および／または維持に十分な量または頻度で投与される、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗誘導性Ｔ細胞共刺激分子(anti-Inducible T Cell COStimulator)(ＩＣＯＳ)アゴニスト抗体およびその医薬組成物ならびに該抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体および医薬組成物の投与により、例えば、癌を処置するための、該抗体を使用する方法に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、米国仮出願６２／４８３,１５８(２０１７年４月７日出願)、６２／５１４,１５１(２０１７年６月２日出願)、６２／５４５,７３２(２０１７年８月１５日出願)および６２／５８１,４１２(２０１７年１１月３日出願)の利益を主張し、これらの出願の内容の全体を、引用により本明細書に包含させる。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、引用によりその全体を本明細書に包含させる。該ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年３月３０日に作成され、MXI-556PC_SL.txtと命名されており、そのサイズは３２１,７５１バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
癌の世界的まん延と戦うためのニーズが存在する。癌は、全世界での疾患の主因の一つであり、死亡原因の第二位である。２０１５年の癌による死亡は８８０万人に達した。世界的に、死亡の１／６近くが、癌が原因である。合衆国では、２０１８年に、１,７３５,３５０人の新たな症例が癌と診断され、６０９,６４０人が癌で死亡したと推定されている。欧州では、２０１２年の新規癌症例が３５０万人、がんによる死亡者が１９０万と推定されている。世界保健機関は、２０１８年に、癌の新規症例数は今後２０年で約７０％増加すると推定している。
【０００５】
従来の癌処置は、手術、放射線療法および化学療法に加えて種々の他の治療を含む。近年、免疫腫瘍学的処置が癌処置の新規選択肢として出現してきた。免疫学的腫瘍処置は、例えば、腫瘍を直接標的としまたは腫瘍への血液供給を阻害することを試みてきた従来の癌処置とは異なる。それらに替えて、免疫腫瘍学的処置は患者自身の免疫応答を癌処置に利用するようにデザインされている。免疫系がどのように癌の進行に影響するか、そして癌処置にそれをどのように利用することができるかは、挑戦的で、複雑な課題である。例えば、患者がある免疫腫瘍学的処置剤に応答しないことがあり得るし、また、特定の白血球細胞であるＴ細胞が適切に機能しなくなるＴ細胞疲弊などの耐性機構を発生させることもあり得る(Dempke et al., Eur. J. of Cancer, 74 55-72 (2017))。
【０００６】
免疫系の重要な役割は、正常細胞と“外来”細胞を区別する能力である。免疫系は、それ故に外来細胞を攻撃し、正常細胞のみを残存させることができる。このために、免疫系は、免疫応答の開始のために活性化または不活性化される必要があり、免疫細胞上の分子である“チェックポイント”を利用する。腫瘍細胞は、場合により、免疫系による攻撃を避けるために、チェックポイントを利用することができる。ある種の免疫腫瘍学的処置剤は、チェックポイント阻害剤として作用することにより、これらのチェックポイントを標的とする。プログラム死タンパク質１(ＰＤ−１)は、一般にＴ細胞が体内で他の細胞を攻撃することを阻止するブレーキとして働くチェックポイント阻害剤である。ＰＤ−１は、ある正常(および癌)細胞上のタンパク質であるプログラム死リガンド１(ＰＤ−Ｌ１)と結合したとき、これを行う。ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１に結合したとき、この相互作用は、Ｔ細胞に他の細胞を攻撃しないよう指示する。ある癌細胞は大量のＰＤ−Ｌ１を有し、これにより、免疫攻撃から逃れる。ニボルマブ(オプジーボ(登録商標))などのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を標的とするモノクローナル抗体である治療剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合の増加を阻止して、体の腫瘍細胞に対する免疫応答を増大させることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
安全かつ効果的に癌および他の疾患または状態を処置するために、単独またはチェックポイント阻害剤と共に作用する、異なる作用機序を指向する薬物に対するニーズが存在する。Ｔ細胞の活性化および機能は、ＣＤ２８スーパーファミリーの共刺激分子(例えば、それぞれＴ細胞受容体シグナルの活性化を促進または阻害する正および負の共刺激分子)を介する自然免疫系により制御される。誘導性共刺激分子(Inducible Co-stimulator Molecule)(ＩＣＯＳ)は、ＣＤ２７８としても知られ、このＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーである免疫チェックポイントタンパク質である。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化後にＴ細胞上に発現され、そのリガンドであるＩＣＯＳ−Ｌ(Ｂ７Ｈ２)との結合後にＴ細胞活性化を共刺激する、５５〜６０kDaのＩ型膜貫通タンパク質である。ＩＣＯＳはＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞および制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)により発現される。ＩＣＯＳはまた濾胞性ヘルパーＴ細胞(Ｔｆｈ)および液性免疫応答の機能におけるキープレーヤーであることも示されている。
【０００８】
Ｔ細胞の免疫応答の強度および質は、部分的にＴ細胞への共刺激シグナルと阻害シグナルの間の複雑なバランスに依存する。免疫療法後の患者の応答率改善および薬剤耐性克服のために、新規免疫腫瘍学的治療に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要約
本発明は、ヒトＩＣＯＳ(配列番号１)に結合する単離モノクローナル抗体(例えば、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体)、すなわち、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を提供し、該抗体は治療上望ましい機能的性質を示す。本発明の抗体は、対象における免疫応答を刺激または増強するための、例えば、ヒトＩＣＯＳ活性を刺激するためおよび／または腫瘍またはウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を提供するためのアゴニストとして使用され得る。本発明の抗体はまた種々の状態、例えば、癌の処置のために、他の抗体(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４抗体)と組み合わせても使用され得る。従って、ここに開示する抗体は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、癌を含む種々の状態または疾患の処置に使用され得る。他の実施態様において、ここに開示する抗体を、ＩＣＯＳタンパク質を検出する方法で使用し得る。
【００１０】
ある態様において、単離抗体は、ヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳとの結合および／または相互作用を遮断し、そして
(ａ)インビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイにおいて約０.０１〜約０.１６nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発し、そして／または
(ｂ)ＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞共培養アッセイにおいてブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答して約０.００２nM〜約０.４nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ産生を誘発する。
【００１１】
他の実施態様において、抗体(またはその抗原結合部分)は、次の特性の１以上を示す：
(ａ)ヒトＴ細胞に約０.７nMのＥＣ５０で、かつカニクイザルＴ細胞に約０.３nMのＥＣ５０で結合する；
(ｂ)ヒト活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する；
(ｃ)ヒトＣＤ２８またはヒトＣＴＬＡ−４に結合しない；
(ｄ)ＣＤ４＋エフェクターＴ(Ｔｅｆｆ)細胞、濾胞性ヘルパーＴ(Ｔｆｈ)細胞および制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞のような初代Ｔリンパ球の少なくとも一つを活性化する；
(ｅ)インビトロ一次Ｔ細胞シグナル伝達アッセイで約３０nMのＥＣ５０でタンパク質キナーゼＢ(ｐＡｋｔ)のリン酸化を誘発する；
(ｆ)ＴｆｈおよびナイーブＢ細胞共培養アッセイでブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してインターロイキン−１０(ＩＬ−１０)産生を誘発する；
(ｇ)インビトロアッセイで、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔｒｅｇより大きいＣＤ３刺激Ｔｅｆｆの増殖向上を誘発する；
(ｈ)ＴｒｅｇによるＴｅｆｆ抑制を減少させる；
(ｉ)全血細胞アッセイにおいて１０μg／mLでサイトカイン産生を増加させない；
(ｊ)インビトロでＴｆｈ細胞によるＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの少なくとも一方の分泌を増加させる；
(ｋ)ＩＣＯＳ介在シグナル伝達を刺激する；
(ｌ)ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ３２Ａに対する増加した親和性を有する；および／または
(ｍ)ＣＤ１６に対する減少した親和性を有する。
【００１２】
他の実施態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてインビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイで約０.０８３nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発する。他の実施態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてインビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイで約０.０１〜約０.１nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発する。
【００１３】
ある態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてインビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイで約０.０１〜約０.１nMのＥＣ５０でブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を誘発する。他の態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞共培養アッセイにおいて約０.０１〜０.１nMのＥＣ５０でブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を誘発する。
【００１４】
他の実施態様において、抗体(またはその抗原結合部分)はヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＩＣＯＳに結合する。
【００１５】
他の態様において、単離抗体はヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合し、
(ａ)それぞれ配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号１２、１４および１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｂ)それぞれ配列番号１８、１９および２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｃ)それぞれ配列番号２６、２７および２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号２９、３０および３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｄ)それぞれ配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｅ)それぞれ配列番号４２、４３および４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；
(ｆ)それぞれ配列番号４２、４３および４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号４９、５０および５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン；または
(ｇ)それぞれ配列番号１９１、１９２および１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインおよびそれぞれ配列番号１９４、１９５および１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン、
をそれぞれ含む。
【００１６】
他の態様において、単離抗体はヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域は、
(ａ)それぞれ配列番号５および６のアミノ酸配列；
(ｂ)それぞれ配列番号１６および１７６のアミノ酸配列；
(ｃ)それぞれ配列番号２４および２５のアミノ酸配列；
(ｄ)それぞれ配列番号３２および３３のアミノ酸配列；
(ｅ)それぞれ配列番号４０および４１のアミノ酸配列；
(ｆ)それぞれ配列番号４０および４８のアミノ酸配列；または
(ｇ)それぞれ配列番号１８６および１８９のアミノ酸配列、
をそれぞれ含む。
【００１７】
他の態様において、ヒト誘導性共刺激分子(ＩＣＯＳ)に結合する、単離された完全長、ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１８】
ある実施態様において、単離抗体は、ヒトＩＣＯＳとヒトＩＣＯＳ−Ｌの相互作用を遮断する抗体とＩＣＯＳへの結合について競合するか、同じエピトープに結合する。他の実施態様において、単離抗体は、ヒトＩＣＯＳのSIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)の１以上の残基に特異的に結合する。他の実施態様において、ＩＣＯＳエピトープは、ヒトＩＣＯＳのアミノ酸残基SIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)を含む。
【００１９】
ある実施態様において、本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体である。他の実施態様において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくは(Ｆａｂ’)２フラグメントなどの結合フラグメントまたは一本鎖抗体である。
【００２０】
ある態様において、抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合部分は、１以上の活性化Ｆｃガンマ受容体(ＦｃγＲ)などのＦｃ受容体に結合する。ある実施態様において、抗体は、ヒトＩｇＧ１配列(配列番号２０６)と比較して、ＥＵ方式により、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および／または３３２の少なくとも一か所を含む位置での１以上のアミノ酸置換、例えば、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび／または３３２Ｅなどの、抗体のＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲIIｂに対する親和性を増強する少なくとも１個のアミノ酸置換をＦｃ領域に含む。他の実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１配列(配列番号２０６)と比較して、２３５Ｙ−２６７Ｅ、２３６Ｄ−２６７Ｅ、２３９Ｄ−２６８Ｄ、２３９Ｄ−２６７Ｅ、２６７Ｅ−２６８Ｄ、２６７Ｅ−２６８Ｅおよび／または２６７Ｅ−３２８Ｆの少なくとも２個の置換を含む。さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸置換は、配列番号２０６に示すヒトＩｇＧ１配列に対してＳ２６７Ｅである。
【００２１】
他の態様において、本発明は、治療剤、例えば、細胞毒性剤または放射性同位体と連結した本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体および本発明の抗体またはその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第二の機能的部分と連結した該抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子を提供する。
【００２２】
本発明の抗体もしくはその抗原結合部分または免疫複合体または二重特異性分子および薬学的に許容される担体を含む組成物(例えば、医薬組成物)も提供される。他の態様において、組成物は、さらに可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を含む。
【００２３】
本発明の抗体(例えば、ｃＤＮＡ)またはその抗原結合部分(例えば、可変領域および／またはＣＤＲ)をコードする核酸分子ならびに該核酸を含む発現ベクターおよび該発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。抗体を該宿主細胞で発現させ、宿主細胞から抗体を単離することによる、抗ＩＣＯＳ抗体を製造する方法も提供される。
【００２４】
ある態様において、単離抗体は、ＩｇＧ１対照抗体と比較して低減した抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性を有する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、本発明の抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合部分を使用する免疫応答を刺激する方法を提供する。ある実施態様において、本方法は、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞と本発明の抗体またはその抗原結合部分を接触させることにより、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することを含む。他の実施態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２産生が刺激される。さらに他の実施態様において、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。他の実施態様において、対象はウイルスを有し、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【００２６】
さらに他の態様において、本発明は、対象における腫瘍の増殖が阻害されるように、対象に本発明の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。他の態様において、本発明は、対象におけるウイルス感染症が処置されるように、対象に本発明の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象におけるウイルス感染症を処置する方法を提供する。このような方法は、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分、組成物、二重特異性分子または免疫複合体を投与することを含む。
【００２７】
さらに他の態様において、本発明は、例えば腫瘍増殖を阻害するまたは抗ウイルス応答を刺激するために対象における免疫応答が刺激されるように、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体などの少なくとも１種の付加的治療剤と組み合わせて、対象に本発明の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法を提供する。ある実施態様において、付加的免疫刺激性抗体は抗ＰＤ−１抗体である。他の実施態様において、付加的免疫刺激剤は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。さらに他の実施態様において、付加的免疫刺激剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。さらに他の実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分をサイトカイン(例えば、ＩＬ−２、修飾ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１)または共刺激抗体(例えば、抗ＣＤ１３７および／または抗ＧＩＴＲ抗体)と共に投与する。ある実施態様において、抗体は、例えば、ヒト、キメラまたはヒト化抗体である。
【００２８】
ある実施態様において、単離抗体を、ヒト対象に１以上の付加的治療剤と共に投与する。他の実施態様において、付加的治療剤は化学療法剤である。
【００２９】
またここで提供されるのは、対象(例えば、ヒト患者)における癌を処置する方法であって、患者に抗ＩＣＯＳ抗体または抗ＩＣＯＳ抗体と少なくとも１種の付加的抗体(例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体)の組み合わせを投与することを含み、ここで、抗ＩＣＯＳ抗体または抗体組み合わせは、特定の投与レジメンに従い(すなわち、特定の投与量でかつ特定の投与スケジュールに従い)投与される。ある態様において、方法は、少なくとも１投与サイクルを含み、該少なくとも１サイクルの各々について、抗体の少なくとも１用量が、約３７５mgの用量で投与される。他の態様において、抗体は、約８０％未満の受容体占有率の達成および／または維持に十分な量または頻度で投与される。他の実施態様において、方法は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、８週に１回、９週に１回、１０週に１回、１１週に１回または１２週に１回の間隔での投与を含む。
【００３０】
ここに開示する方法は、結腸直腸癌(ＣＲＣ)、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌(ＰＲＣ)、尿路上皮癌(ＵＣＣ)、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸癌、腎臓癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫またはウイルス関連癌などの癌の処置を含む。
【００３１】
さらに他の実施態様において、抗体は、静脈内投与用に製剤される。他の実施態様において、抗体は、皮下投与用に製剤される。他の実施態様において、複数抗体は同時に投与される(例えば、単一製剤でまたは別々の製剤で同時に)。あるいは、他の実施態様において、複数抗体は逐次的に投与される(例えば、別々の製剤で)。
【００３２】
ここに提供する処置方法の有効性は、任意の適当な手段を使用して評価され得る。ある実施態様において、処置は腫瘍サイズを減少させる、長期にわたり転移病変数を減少させる、完全応答を生じる、部分的成果を生じるおよび／または疾患を安定させる。
【００３３】
他の態様において、本発明は、前記方法に使用するためまたは前記方法に使用する医薬の製造のための(例えば、種々の状態の処置のための)、本発明の抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合部分および組成物を提供する。
【００３４】
また提供されるのは、ここに記載する方法での使用に適する治療有効量で抗ＩＣＯＳ抗体を含む医薬組成物を含むキットである。他の実施態様において、キットは、ここに記載する方法での使用に適する治療有効量で抗ＩＣＯＳ抗体および他の抗体(例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体)を含む。例えば、キットは：
(ａ)一定用量の抗ＩＣＯＳ抗体；
(ｂ)一定用量の抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体；および
(ｃ)本発明の方法における抗体の使用のための指示
を含む。
【００３５】
他の態様において、抗ＩＣＯＳ抗体は、ここに記載する方法に従い、投与(または他の抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体と共投与)するために提供される。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な記載および実施例から明らかであるが、それらは限定と解釈されてはならない。本出願をとおして引用する全ての刊行物、GenBankエントリー、特許および公開特許出願は、引用により本明細書に明示的に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ヒトＩＣＯＳ配列(配列番号１)を示す。水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)を使用するＩＣＯＳ.４のエピトープ結合分析の結果を、太字および下線によりＩＣＯＳ.４エピトープと共に示す。
【００３８】
【図２】図２は、ここに開示するＦｃ配列バリアントで使用できるヒトＩｇＧ１ｆ定常ドメインの配列の一部(配列番号５２、残基１１８〜４４６として再付番)を示す。太字で示す残基は変更の対象となる残基の例である。変更したアミノ酸を、特定の残基の下に太字で示す。Ｄ２７０Ｅ置換は下線を付す。Ｃ末端リシン(Ｋ)残基は配列番号５２の配列から除かれているが、ある実施態様においては存在する。同様に、ある実施態様において、これらの実施態様をコードする核酸は、核酸の３’末端に余分のリシンをコードするヌクレオチドを含む。
【００３９】
【図３】図３は、親ハムスター抗体(Ｃ３９８.４)のヒト化に使用したヒト重鎖および軽鎖生殖系列配列の配列アライメントを示す。フレームワーク配列相同性に基づき、ＶＨ３−１５を重鎖について選択し、ＶＫＩ  Ｏ１８を軽鎖について選択した。配列相同性に基づき、ヒト生殖系列ＦＷ４、ＪＫ３も軽鎖について選択した。配列類似性に基づき、ヒト生殖系列ＦＷ４、ＪＨ４を重鎖について選択し、それは責任リスク(liability risk)をもたらす可能性のある残基を含まない。アスタリスクおよび下線は、生殖系列配列と親ハムスター抗体配列(Ｃ３９８.４)の間で異なるアミノ酸残基を示す。
【００４０】
【図４】図４は、抗ＩＣＯＳ抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの重鎖および軽鎖可変領域配列を示す。重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域は太字、下線、ラベル付きである。
【００４１】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ細胞の共培養でＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅにより誘発されたインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生および細胞増殖を示すグラフである。
【００４２】
【図６】図６は、ＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞ＥＢ共培養アッセイにおける抗ＩＣＯＳ抗体によるＩＦＮ−γ誘導を示すグラフである。
【００４３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＳＥＢ刺激ＴｆｈおよびナイーブＢ細胞共培養アッセイにおけるＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ誘導を示すグラフである。平均：４.４倍誘導。
【００４４】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、抗ＩＣＯＳ抗体共刺激でのＴｒｅｇによるＴｅｆｆ抑制の消失を示すグラフである。
【００４５】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、２つの異なるドナー(ドナー９および１２)からの細胞を使用する、ＡＤＣＣを誘発するＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥおよびＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１の能力を比較するグラフである。
【００４６】
【図１０】図１０は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥおよびＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１がヒト補体のＣ１ｑ成分に結合する能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフである。
【００４７】
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＩＣＯＳ  Ｆｃバリアント、ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ＳＥ(「ＩＣＯＳ  ｈｇ１  ＳＥ」)およびＩＣＯＳ  ＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ  ｈｇ１」)抗体およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体(「ｈＩｇＧ１」)の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【００４８】
【図１２】図１２Ａ〜Ｅは、処置群による腫瘍増殖曲線を示すグラフである。マウスを、Ｓａ１Ｎ細胞移植後７日目、１０日目および１４日目にアイソタイプ対照ｍＧ１、ＩＣＯＳ.１  ｍｇ１  Ｄ２６５Ａ、ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１、ＩＣＯＳ.４  ｈｇ１またはＩＣＯＳ.４  ｍｇ２ａで処置した。
【００４９】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、処置群による平均および中央腫瘍増殖曲線を示すグラフである。マウスを、Ｓａ１Ｎ細胞移植後７日目、１０日目および１４日目にアイソタイプ対照ｍＧ１、ＩＣＯＳ.１  ｍｇ１  Ｄ２６５Ａ、ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１、ＩＣＯＳ.４  ｈｇ１またはＩＣＯＳ.４  ｍｇ２ａで処置した。
【００５０】
【図１４】図１４Ａ〜Ｄは、１５日目の腫瘍におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである。マウスを、Ｓａ１Ｎ細胞移植後７日目、１０日目および１４日目にアイソタイプ対照ｍＧ１、ＩＣＯＳ.１  ｍｇ１  Ｄ２６５Ａ、ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１、ＩＣＯＳ.４  ｈｇ１またはＩＣＯＳ.４  ｍｇ２ａで処置した。
【００５１】
【図１５】図１５Ａ〜Ｊは、アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ(「ＰＤ−１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１」)抗体の処置群毎に個々のマウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００５２】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍｇ１および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１」)抗体の処置群毎に平均および中央腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００５３】
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、腫瘍におけるＦｏｘｐ３＋、ＣＤ８＋、Ｋｉ−６７およびグランザイムＢの平均(ＳＥＭ)パーセンテージを示すグラフである。マウスをアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍｇ１および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１」)抗体で処置した。
【００５４】
【図１８】図１８Ａ〜Ｉは、アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ(「ＰＤ−１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ」)抗体の処置群毎の個々のマウスについての腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００５５】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ(「ＰＤ−１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ」)抗体の処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００５６】
【図２０】図２０Ａ〜Ｄは、腫瘍におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである。マウスをアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ(「ＰＤ−１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ」)抗体で処置した。
【００５７】
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、腫瘍におけるＫｉ−６７の平均パーセンテージを示すグラフである。マウスをアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ(「ＰＤ−１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ」)抗体で処置した。
【００５８】
【図２２】図２２Ａ〜Ｄは、脾臓およびＰＢＭＣにおけるＢ細胞上のＩＣＯＳ−Ｌの発現を示すグラフである。マウスをアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ(「ＰＤ−１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ」)抗体で処置した。
【００５９】
【図２３】図２３Ａ〜Ｆは、アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＩｇＧ２ｂ(「ＣＴＬＡ−４  ｍｇ２ｂ」)、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａ(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ２ａ」)抗体の処置群毎の個々のマウスについての腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００６０】
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＩｇＧ２ｂ(「ＣＴＬＡ−４  ｍｇ２ｂ」)、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ１」)および／または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａ(「ＩＣＯＳ.４  ｍｇ２ａ」)抗体の処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００６１】
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、ＦＡＣＳを使用して測定して、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスＴ細胞へのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ結合を示すグラフである。
【００６２】
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、ＥＣ５０値により計算して、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ抗体が、２つの競合抗ＩＣＯＳ抗体と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞に大きな結合アビディティーを有することを示すグラフである。
【００６３】
【図２７】図２７は、抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて抗ＩＣＯＳ抗体を使用する、用量漸増臨床試験研究を模式的に説明する。
【００６４】
【図２８】図２８は、マウスモデルにおける抗ＰＤ１抗体と組み合わせた抗ＩＣＯＳ抗体、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの用量増加の影響および腫瘍増殖阻害に対する効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
詳細な記載
本発明は、ヒトＩＣＯＳ(「ｈｕＩＣＯＳ」)に特異的に結合し、免疫応答を刺激するためにアゴニスト活性を有するモノクローナル抗体、例えば、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体などの単離抗体を提供する。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特性を含む。他の実施態様において、抗体は、本発明の抗体とヒトＩＣＯＳタンパク質への結合について競合するかまたは同じエピトープに結合する。
【００６６】
さらにここで提供されるのは、該抗体を製造する方法、該抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫複合体および二重特異性分子および該抗体または抗体フラグメントを含むように製剤された医薬組成物である。またここで提供されるのは、例えば癌および／または感染症を処置するために、免疫応答を増強するために、単独でまたは他の薬剤、例えば、他の免疫刺激剤(例えば、抗体)と組み合わせて、該抗体を使用する方法である。従って、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、例えば、腫瘍増殖阻害を含む、多様な状態の処置に使用し得る。
【００６７】
定義
本発明がより容易に理解されるように、まず一定の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な記載をおいて示される。ここに提供する見出しは、本明細書全体を引用して解釈し得る本発明の多様な態様を限定するものではない。従って、以下に定義する用語は、本明細書全体を参照して、より完全に定義される。
【００６８】
ここで使用するＩＣＯＳは、ヒトでＩＣＯＳ遺伝子によりコードされる「誘導性Ｔ細胞共刺激分子」であるタンパク質をいう。ＩＣＯＳは「誘導性共刺激分子」、「活性化誘導性リンパ球免疫仲介分子」、ＡＩＬＩＭ、ＣＶＩＤ１およびＣＤ２７８としても知られる。ヒトＩＣＯＳはまたGENE ID NO: 29851およびMIM(Mendelian Inheritance in Man): 604558で説明されている。２０アミノ酸シグナル配列を含むヒトＩＣＯＳの配列(NP_036224.1)を配列番号１として提供し、図１に示す。
【００６９】
下記は、２種のヒトＩＣＯＳアイソフォームのアミノ酸配列である。
アイソフォーム１(Ｑ９Ｙ６Ｗ８)
MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL(配列番号１)
アイソフォーム２(Ｑ９Ｙ６Ｗ８−２)
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKM(配列番号２０５)
【００７０】
アイソフォーム１および２のシグナル配列は、アミノ酸１〜２０(上記配列の下線部分)に対応する。したがって、成熟アイソフォーム１および２は、配列番号１のアミノ酸２１〜１９９および配列番号２０５のアミノ酸２１〜１５８からなる。
【００７１】
ＩＣＯＳは、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳ−ＬＧ、ＬＩＣＯＳ、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ−１、ＣＤ２７５およびＧＬ５０としても知られるＩＣＯＳリガンド(ＩＣＯＳ−Ｌ)と相互作用する。ヒトＩＣＯＳ−Ｌは、GENE ID NO: 23308およびMIM: 605717にさらに記載される。１８アミノ酸シグナル配列を含むヒトＩＣＯＳ−Ｌの配列(NP_001269979.1)を、配列番号２に提供する。したがって、成熟形態のＩＣＯＳ−Ｌは、配列番号２のアミノ酸１９〜３０２からなる。
【００７２】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、ここでは相互交換可能に使用され、ジスルフィド結合により相互に接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含むタンパク質をいう。各重鎖は重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域(ここではＣＨと略す)からなる。ある抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体において、重鎖定常領域はヒンジおよび３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。ある抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体において、各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１ドメイン(ここではＣＬと略す)からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む因子への結合に介在できる。重鎖はＣ末端リシンを有しても有しなくてもよい。ここで特に断らない限り、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングシステムを使用してナンバリングし、定常領域はＥＵ方式を使用してナンバリングする。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む既知アイソタイプの何れも免疫グロブリンである。ＩｇＧアイソタイプは、ある種ではサブクラスに分割される：ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４があり、マウスにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３がある。ある実施態様において、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、数アロタイプで存在し、これらは、互いに最大でも数アミノ酸異なるだけである。「抗体」は、例えば、天然に存在するおよび天然に存在しない抗体の両者；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体および完全合成抗体を含む。
【００７３】
ここで使用する「ＩｇＧ抗体」は、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有し、すなわち、同じサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同じ数の重鎖および軽鎖およびジスルフィド結合を有する。例えば、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体は、２個の重鎖(ＨＣ)および２個の軽鎖(ＬＣ)からなり、該２個の重鎖と軽鎖は、それぞれ天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体で生じるのと同じ数および位置のジスルフィド架橋で連結されている(抗体が、ジスルフィド結合を修飾するように変異されていない限り)。
【００７４】
「抗原」は、免疫応答を誘発させる分子または物質であり、それに抗体が結合する。抗体は、一般にその同族抗原に、１０−７〜１０−１１Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)に反映される高親和性で特異的に結合する。約１０−６Ｍより大きいＫＤは、一般に非特異的結合を示すと考えられている。ここで使用する抗原に「特異的に結合する」抗体は、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下または１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ以下のＫＤを有することを意味する高親和性で、該抗原に、ある場合は、実質的に同一の抗原群に、結合するが、無関係の抗原には高親和性で結合しない、抗体をいう。抗原は、ある抗原と高度な配列同一性を示すならば、例えば、ある抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を示すならば、当該ある抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＩＣＯＳに特異的に結合する抗体は、ある実施態様において、ある非ヒト霊長類種(例えば、カニクイザル)のＩＣＯＳ抗原とも交差反応するが、他の種からのＩＣＯＳまたはＩＣＯＳ以外の抗原と交差反応しない。
【００７５】
ここで使用する抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」なる用語は、抗原(例えば、ヒトＩＣＯＳ)と特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上の部分をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントまたは部分により実現され得ることが示されている。抗体、例えば、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」なる用語に包含される結合フラグメントの例は：
(１)ＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント(パパイン消化によるフラグメント)または類似一価フラグメント；
(２)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含むＦ(ａｂ’)２フラグメント(ペプシン消化によるフラグメント)または類似二価フラグメント；
(３)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；
(４)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；
(５)ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)フラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-46)；
(６)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)；および
(７)所望により合成リンカーにより結合され得る２以上の単離ＣＤＲの組み合わせ；
を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、組み換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合されて単一タンパク質鎖として取得することを可能とする合成リンカーにより、結合され得る一価分子(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体は、また抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる慣用技法を使用して得られ、フラグメントはインタクト抗体と同じ方法でその有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技法またはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により産生され得る。
【００７６】
用語「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(ＶＨ)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークをいう。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、天然に存在するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークと同じアミノ酸配列であるか、または野生型天然に存在するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークと比較してアミノ酸配列変化を有し得る。ある実施態様において、アミノ酸変化の数は１０、９、８、７、６、５、４、３または２または１である。ある実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７７】
「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合させ、上部、中央部および下部部分を含む、重鎖定常領域のドメインをいう(Roux et al. (1998) J. Immunol. 161:4083)。そのアミノ酸配列によって、ヒンジは、抗体の抗原結合ドメインとエフェクター領域の間に種々のレベルの柔軟性を提供し、また２重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合部位も提供する。ここで使用するヒンジは、全ＩｇＧアイソタイプでＥ２１６から始まり、Ｇ２３７で終わる(ＥＵナンバリングによる)。同上。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列を、表１に示す。
【００７８】
【表１】
2020515239.tif 000002
＊ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸配列。
【００７９】
用語「ヒンジ」は、野生型ヒンジ(例えば表１に示すもの)およびそのバリアント(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾ヒンジ)を含む。例えば、用語「ＩｇＧ２ヒンジ」は、表１に示す野生型ＩｇＧ２ヒンジおよび１以上の変異、例えば、１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大で５、４、３、２または１変異を有するバリアント(例えば、置換、欠失および／または付加)を含む。ＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、システイン１個、２個、３個または４個全て(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)が他のアミノ酸、例えばセリンに変更されているＩｇＧ２ヒンジを含む。特定の実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジ領域はＣ２１９Ｓ置換を有する。ある実施態様において、ヒンジは、少なくとも２個のアイソタイプからの配列を含む。例えば、ヒンジは、あるアイソタイプからの上部、中央部または下部ヒンジを含み、ヒンジの残りは１以上の他のアイソタイプ由来であり得る。例えば、ヒンジはＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中央部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを含み得る。ヒンジはエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が取り除かれていてもよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジはエフェクター機能を提供する。用語「ＣＨ１ドメイン」は、可変ドメインを重鎖定常ドメインにおけるヒンジに連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ１ドメインはＡ１１８から始まり、Ｖ２１５で終わる。用語「ＣＨ２ドメイン」は、ヒンジを重鎖定常ドメインにおけるＣＨ３ドメインに連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ２ドメインはＰ２３８から始まり、Ｋ３４０で終わる。用語「ＣＨ３ドメイン」は、重鎖定常ドメインにおけるＣＨ２ドメインをＣ末端に連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ３ドメインはＧ３４１から始まり、Ｋ４４７で終わる。
【００８０】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、異なる抗原に対する特異性を有する２つの抗原結合部位を生じる、２つの異なる結合特異性、例えば、２つの異なる重／軽鎖対を有する人工ハイブリッド抗体をいう。二重特異性抗体は、ハイブリドーマ融合またはＦａｂ’フラグメント連結を含む多様な方法により製造され得る。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。
【００８１】
ここで使用する用語「モノクローナル抗体」は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のあるバリアント(該バリアントは、一般に少量存在する)以外、実質的に同種の抗体の集団、すなわち、集団内の個々の抗体は、実質的に類似し、同じエピトープに結合する(例えば、抗体は単一結合特異性および親和性を示す)集団から得た抗体をいう。「モノクローナル」は、抗体の特徴を抗体の実質的に同種の集団から得たとして示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要としない。用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および任意で定常領域を有する実質的に同種の抗体の集団からの抗体をいう。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法を使用して製造する。ハイブリドーマ方法を使用して、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスを抗原に曝し、Ｂ細胞として知られる白血球が該抗原に結合する抗体を産生し、それをトランスジェニック非ヒト動物から採取する。単離Ｂ細胞を不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマと称されるハイブリッド細胞株を産生する。ある実施態様において、ハイブリドーマは、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
【００８２】
該免疫グロブリンの抗原結合フラグメント(ｓｃＦｖを含む)も、ここで使用する用語「モノクローナル抗体」に包含される。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられる。さらに、一般に抗原上の種々のエピトープに対する種々の抗体を含む慣用の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は単一エピトープに向けられる。モノクローナル抗体を、例えば、ハイブリドーマ方法、トランスジェニック動物、組み換えＤＮＡ方法(例えば、米国特許４,８１６,５６７参照)などの、任意の当分野で認識される技法およびここに記載するものを使用して、または、例えば、米国特許７,３８８,０８８およびＰＣＴ公開ＷＯ００／３１２４６)に記載の技法を使用するファージ抗体ライブラリーを使用して、製造し得る。モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体を含み、天然に生じ得るかまたは組み換えにより産生し得る。
【００８３】
ここで使用する用語「組み換えヒト抗体」は、(１)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)から単離された抗体またはそれから調製されたハイブリドーマ、(２)抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(３)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(４)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により製造、発現、創出または単離された抗体などの、組み換え手段により製造、発現、創出または単離された全てのヒト抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を使用するが、その後の、例えば、抗体成熟中に生じる、再配列および変異を含む、可変領域および定常領域を含む。当分野で知られるとおり(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117 - 1125参照)、可変領域は、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配列される種々の遺伝子によりコードされる、抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、複数の一アミノ酸変化(体細胞変異または超変異と称される)によりさらに修飾されて、外来抗原に対する抗体親和性が増加され得る。定常領域は、抗原に応答してさらに変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それ故に、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードするように再配列され、かつ体細胞変異した核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有し得ないが、その代わり実質的に同一または類似(例えば、少なくとも８０％同一性を有する)である。
【００８４】
ここで使用する「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両者がヒト生殖系列免疫グロブリン配列である可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もまたヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、(例えば、インビトロで無作為もしくは部位特異的変異にまたはインビボで体細胞変異により導入された変異により)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの他の非ヒト哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。ここで使用する用語「ヒト」および「完全ヒト」抗体は、相互交換可能に使用される。
【００８５】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト抗体由来の対応するアミノ酸で置き換えられている抗体をいう。ヒト化形態の抗体のある実施態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てはヒト抗体からのアミノ酸で置換されており、一方１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全てが換えられていない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それが抗体の特定抗原への結合を妨げない限り、許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。
【００８６】
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体のような、可変領域がある種に由来し、定常領域が他の種に由来する抗体をいう。「ハイブリッド」抗体は、マウスまたはハムスター(親)重鎖とヒト化軽鎖またはその逆などの、異なるタイプの重鎖および軽鎖を有する抗体をいう。キメラまたはハイブリッド抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、例えば遺伝子操作により構築され得る。
【００８７】
ここで使用する「アイソタイプ」は、抗体の重鎖定常領域遺伝子によりコードされる、抗体クラス(例えば、ＩｇＧ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む)、ＩｇＭ、ＩｇＡ(ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む)、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
【００８８】
「アロタイプ」は、特異的アイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいう(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
【００８９】
用語「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、ここでは用語「抗原に特異的に結合する抗体」と相互交換可能に使用される。
【００９０】
ここで使用する「単離抗体」は、他のタンパク質および細胞物質を実質的に含まない抗体をいう。ここで使用する「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドの相互作用またはそれに起因する生化学的事象をいう。「エフェクター機能」の例は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞食作用(ＡＤＣＰ)などのＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とする。
【００９１】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体をいう。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体(これらの受容体のアレル多型およびオルタナティブスプライシング型を含む)を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化受容体(マウスでのＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトでのＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１つの阻害性受容体(ＦｃγＲIIｂまたは同等にＦｃγＲIIＢ)からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質の例を表２に要約する。生得的エフェクター細胞型の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIｂを共発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、１つの活性化Ｆｃ受容体(マウスでＦｃγＲIIIおよびヒトでＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトで阻害性ＦｃγＲIIｂを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、マウスＩｇＧ２ａと等価であると考えられる。
【００９２】
【表２】
2020515239.tif 000003
【００９３】
ここで使用する「Ｆｃ領域」(フラグメント結晶化可能領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、宿主組織または因子への結合に介在する、抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)以外の抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２個の重鎖の各々にＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含み；ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３個の重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３およびＣγ１とＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の規定は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃ２２６位またはＰ２３０位のアミノ酸残基(またはこれら２アミノ酸間の一つのアミノ酸)から重鎖のカルボキシ末端まで伸延すると定義され、ここで、ナンバリングは、KabatにおけるＥＵ方式に従う(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD)。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３１付近からアミノ酸３４０付近まで伸び、一方ＣＨ３ドメインはＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、それは、ＩｇＧのアミノ酸３４１付近からアミノ酸４４７付近まで伸びる(Ｃ末端リシンを含んで)。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃ領域は、単離された、または「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称される「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドにおけるこの領域をいう。
【００９４】
「Ｆｃ領域」(フラグメント結晶化可能領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、宿主組織または因子への結合に介在する、抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)以外の抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２個の重鎖の第二(ＣＨ２)および第三(ＣＨ３)定常ドメイン由来の２個の同一タンパク質フラグメントを含む。ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３個の重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３およびＣＨ１ならびにＣＨ２ドメインの間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は変わり得るが、ここに定義するとおり、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１についてはアミノ酸残基Ｄ２２１、ＩｇＧ２についてはＶ２２２、ＩｇＧ３についてはＬ２２１およびＩｇＧ４についてはＰ２２４から重鎖のカルボキシ末端まで伸延すると定義され、ナンバリングは、KabatにおけるＥＵ方式に従う(Kabat, et al., 1991)。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３７からアミノ酸３４０まで伸び、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、それはＩｇＧのアミノ酸３４１からアミノ酸４４７または４４６(Ｃ末端リシン残基がない場合)または４４５(Ｃ末端グリシンおよびリシン残基がない場合)まで伸びる。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む、天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた、単離された、または「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称される「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドにおけるこの領域を意味し得る。
【００９５】
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、天然で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域(例えば、配列番号２０６)；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの多様なアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
【００９６】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、ｈｕＩＣＯＳ)上の部位をいう。エピトープは、連続的アミノ酸(通常直線状エピトープ)またはタンパク質の三次元折りたたみにより並置される不連続アミノ酸(通常立体配置エピトープ)の両者から形成され得る。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、しかし常にではなく、変性溶媒への暴露により保持されるが、一方三次元折りたたみにより形成されるエピトープは、変性溶媒での処理により一般に失われる。エピトープは、一般に特有の空間的立体構造で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸を含む。
【００９７】
用語「エピトープマッピング」は、抗体−抗原認識に関与する抗原上の分子決定基を同定する過程をいう。どのエピトープがある抗体により結合されるかを決定する方法は当分野で周知であり、例えば、ＩＣＯＳの重複または連続的ペプチドを、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体との反応性について試験する、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイ；ｘ線結晶学；抗原変異解析、二次元核磁気共鳴；酵母ディスプレイ；および水素／重水素交換−マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)を含む。
【００９８】
２以上の抗体について「同じエピトープに結合する」なる用語は、これら抗体が、ある方法により決定して、アミノ酸残基の同じセグメントに結合することを意味する。抗体がここに記載する抗体と「ＩＣＯＳ上の同じエピトープ」に結合するか否かを決定する技法は、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線解析およびＨＤＸ−ＭＳなどのエピトープマッピング方法を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメント(例えばタンパク分解性フラグメント)または抗原の変異変種への結合のモニターであり、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合消失が、しばしばエピトープ成分の指標であると考えられ、例えばアラニンスキャニング変異誘発(Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)または変異体標的配列バリアントの酵母ディスプレイ(実施例１６参照)である。さらに、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用し得る。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力を利用する。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合することが期待される。
【００９９】
「標的への結合について他の抗体と競合する」抗体は、他の抗体の標的への結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体をいう。２抗体が、標的への結合について互いに競合するか、すなわち、一方の抗体が他方の抗体の標的への結合を阻害するか否かおよびその程度は、既知結合競合実験、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を使用して決定され得る。ある実施態様において、抗体は、他の抗体と競合し、標的への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「遮断抗体」(すなわち、抗原と合わさったとき、抗原との他の免疫反応を遮断する抗体)であるかにより得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc. 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されている。競合抗体は、同じエピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープ(例えば、立体障害により証明される)に結合する。２つの抗体が互いに双方向で少なくとも５０％阻害するならば、すなわち、競合実験で一方または他方の抗体が先に抗原と接触するかに関係なければ、これらの抗体は「交差競合」する。
【０１００】
２つの抗体が結合について競合または交差競合するか否かを決定する競合的結合アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによる、ＩＣＯＳを発現するＴ細胞への結合についての競合を含む。他の方法は、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標))、固相直接的または間接的ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接的または間接的酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)参照)；I−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990)参照)；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))を含む。
【０１０１】
ここで使用する用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープにに対する抗体の結合をいう。一般に、抗体は、(１)例えば、検体として所定の抗原、例えば、組み換えヒトＩＣＯＳおよびリガンドとして抗体を使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００  ＳＰＲ装置におけるＳＰＲテクノロジーまたは抗原陽性細胞への抗体の結合のスキャッチャード分析を使用して決定したとき、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下の平衡解離定数(ＫＤ)で結合し、そして(２)所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合の親和性より、少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原に結合する。従って、「ヒトＩＣＯＳに特異的に結合する」抗体は、可溶性または細胞結合ヒトＩＣＯＳに１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下のＫＤで結合する抗体をいう。「カニクイザルＩＣＯＳと交差反応する」抗体は、カニクイザルＩＣＯＳに１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下のＫＤで結合する抗体をいう。
【０１０２】
ここで使用する用語「ｋassoc」または「ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数をいい、ここで使用する用語「ｋdis」または「ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数をいう。ここで使用する用語「ＫＤ」は、平衡解離定数をいい、これは、ｋｄ対ｋａ比(すなわち、ｋｄ／ｋａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)として表される。抗体のＫＤ値は、当分野で十分確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫＤの決定に利用可能な方法は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤデバイスを使用するようなバイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ系などのバイオセンサー系を使用するＳＰＲまたはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード分析を含む。
【０１０３】
用語「ＥＣ５０」は、抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイの文脈では、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間である応答を誘発する抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度をいう。
【０１０４】
用語「固定化ＩＣＯＳに結合する」は、ここに記載する抗体が、例えば、細胞の表面に発現したまたは固体支持体に結合したＩＣＯＳに結合する能力をいう。
【０１０５】
ここで使用する用語「交差反応」は、ここに記載する抗体が異なる種からのＩＣＯＳに結合する能力をいう。例えば、ヒトＩＣＯＳに結合するここに記載する抗体はまた他の種からのＩＣＯＳ(例えば、カニクイザルＩＣＯＳ)にも結合し得る。ここで使用する交差反応性は、結合アッセイ(例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ)において精製抗原との特定の反応性をまたはＩＣＯＳを生理学的に発現する細胞との結合または他の機能的相互作用を検出することにより決定し得る。交差反応性を決定する方法は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００  ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＳＰＲ分析またはフローサイトメトリー技法による、ここに記載する標準結合アッセイを含む。
【０１０６】
ここで使用する「受容体占有率」または「受容体の占有率」は、免疫刺激性受容体(例えば、ヒトＩＣＯＳ)に結合するアゴニスト抗体(例えば、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体)の量をいう。「受容体占有率％」または「受容体の占有率％」は、次の式を使用して計算できる：([試験のΔＭＦＩ]／[合計のΔＭＦＩ])×１００。ΔＭＦＩ(平均蛍光単位の変化)は、結合アゴニスト抗体からのＭＦＩからアイソタイプ対照抗体で染色した背景のＭＦＩを減じることにより計算する。総受容体レベルは、飽和量のアゴニスト抗体を加え、最大発現を、そして、それにより、特定の免疫刺激性受容体のＭＦＩを決定する。総受容体発現を計算する別の手段は、受容体占有率が計算されているアゴニスト抗体と競合しない同じ免疫刺激性受容体に対する抗体の使用である。
【０１０７】
物質について適用されるここで使用する用語「天然に存在する」は、人により意図的に修飾されていない、天然に存在する物質である。例えば、本質的に源から単離でき、研究室で人により意図的に修飾されていない、生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。
【０１０８】
「ポリペプチド」は、少なくとも２個の連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖長の上限はない。タンパク質の１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合を含むが、これらに限定されない修飾を含み得る。「タンパク質」は１以上のポリペプチドを含み得る。
【０１０９】
ここで使用する用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
【０１１０】
用語「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡから作られたまたはそれに由来する、すなわち、非コード領域が除かれている、天然に存在しない核酸分子をいう。
【０１１１】
用語「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、翻訳中にポリペプチドのアミノ酸配列を特定する核酸中間体である。
【０１１２】
ここで使用する用語「保存的配列修飾」は、該アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾はアミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)介在変異誘発などの当分野で知られる標準技法により、本発明の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基仁尾着替えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更した抗体を、ここに記載する機能的アッセイを使用して、保持機能(すなわち、ここに示す機能)について試験できる。ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体の予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換える。抗原結合を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。
【０１１３】
核酸について、用語「実質的相同性」は、２個の核酸またはその指定配列を、最適にアラインし、比較したとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、少なくとも約９０％〜９５％またはヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下で核酸鎖の相補体とハイブリダイズするとき存在する。
【０１１４】
ポリペプチドについて、用語「実質的相同性」は、２個のポリペプチドまたはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、アミノ酸の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％〜９５％またはアミノ酸の少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。
【０１１５】
２配列間の同一性パーセントは、配列が最適にアラインされたとき、これら配列により共有される同一位置の数の関数(すなわち、％相同性＝(同一位置の数)／(位置の総数)×１００)であり、２配列の最適アライメントのために導入する必要があったギャップの数および各ギャップの長さ考慮に入れる。２配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記のとおり数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１１６】
２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、nwsgapdna.cmpマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して、決定できる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用しても決定できる。さらに、２アミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。
【０１１７】
ここに記載する核酸およびタンパク質配列を、例えば、関連配列を同定するために、公的データベースに対するサーチを実施するための「クエリー配列」としてさらに使用できる。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ここに記載する核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ここに記載するタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施できる。比較目的でギャップ付アライメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用できる(例えば、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用可能なNational Center for Biotechnology Information (NCBI)参照)。
【０１１８】
核酸は、全細胞中、例えば、宿主細胞中に、細胞ライセート中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞の核酸(例えば、染色体の他の部分)またはタンパク質から精製して分離されたとき、単離され、または実質的に純粋にされる(F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照)。
【０１１９】
ここで使用する用語「ベクター」は、それに連結されている他の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。一つのタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る、環状二本鎖ＤＮＡループをいう「プラスミド」である。他のタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。あるベクターは、それが導入された宿主細胞で自己複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入されたら、宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、あるベクターは、それが操作可能に結合された遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、ここでは「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称する。組み換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターはプラスミドを含む。ここで使用する「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般に使用される形態のベクターであるため、相互交換可能に使用され得る。しかしながら、等価な機能を提供するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの他の形態の発現ベクターも包含される。
【０１２０】
用語「宿主細胞」または「組み換え宿主細胞」は、相互交換可能に使用され、該細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞をいい、組み換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る。該用語は特定の対象細胞だけでなく、該細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。変異または環境的影響により後続世代である種の修飾が生じ得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではないこともあり得るが、それでもなおここでいう「宿主細胞」の範囲に入る。
【０１２１】
「免疫応答」は、外来因子、例えば、抗原に対する生物の生物学的応答であり、該生物をこれらの因子およびそれらが原因となる疾患から保護する。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞の何れかまたは肝臓により産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用が介在し、これは、例えば、ヒト細胞または組織を含む、侵入病原体、病原体が感染した細胞または組織、癌細胞または他の異常細胞、または、自己免疫または病的炎症の場合、正常細胞または組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および／または生物体内からの消失をもたらす。免疫反応は、例えば、エフェクターＴ細胞またはＴヘルパー(Ｔｈ)細胞、例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞の、例えば、活性化もしくは阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害もしくは枯渇を含む。「エフェクターＴ」(「Ｔｅｆｆ」)細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞)である。Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞はサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化または指揮するが、これは制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)を含まない。Ｔ制御性(「Ｔｒｅｇ」)細胞は、免疫系を調節し、自己抗原に対する耐容性を維持し、自己免疫疾患を阻止する、Ｔ細胞の亜集団である。記憶Ｂ細胞は、一次感染後に胚中心内で形成されるＢ細胞サブタイプであり、再感染の場合に、加速された、より強固な抗体介在免疫応答(二次免疫応答としても知られる)を発生させるのに重要である。ＮＫ細胞は、自然免疫系に重要な細胞毒性リンパ球の１タイプである。ＮＫ細胞の役割は、脊椎動物適応免疫応答における細胞毒性Ｔ細胞に類似する。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に対する迅速な応答および腫瘍形成への応答を提供する。
【０１２２】
ここで使用する用語「Ｔ細胞介在応答」は、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)が介在する応答である。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞毒性および増殖を含む。
【０１２３】
ここで使用する用語「細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答」は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞により介在される。
【０１２４】
「免疫調節因子(immunomodulator)」または「免疫調整因子(immunoregulator)」は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る因子、例えば、シグナル伝達経路の要素をいう。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」は、免疫系の細胞またはそのような細胞(例えば、Ｔｈ１細胞などのエフェクターＴ細胞)の活性の何らかの変更をいう。このような調節は、種々の細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少および／または免疫系内で生じ得る何らかの他の変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両者の免疫調節因子が同定されており、そのいくつかは、腫瘍微小環境で増強した機能を有し得る。ある実施態様において、免疫調節因子はＴ細胞表面に位置する。「免疫調節標的」または「免疫制御標的」は、物質、薬剤、部分、化合物または分子の結合の標的であり、その活性が結合により変更される免疫調節因子である。免疫調節標的は、例えば、細胞の表面上の受容体(「免疫調節性受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節性リガンド」)を含む。
【０１２５】
「免疫療法」は、免疫応答を誘発、増強、抑制または他に修飾することを含む方法により、疾患を有するかまたは有するもしくは再発するリスクがある対象を処置することをいう。
【０１２６】
「免疫刺激療法」または「免疫刺激治療」は、例えば、癌の処置のために、対象に免疫応答の増加(誘発または増強)をもたらす治療をいう。
【０１２７】
「内因性免疫応答の増強」は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増強を意味する。この有効性および効力の増強は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構の制圧または内因性宿主免疫応答を増強する機構の刺激により達成され得る。
【０１２８】
ここで使用する用語「連結」は、２以上の分子の結合をいう。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。結合は遺伝的(すなわち、組換的融合)でもよい。このような結合は、化学的結合および組み換えタンパク質産生などの当分野で認識される広範な技法を使用して達成され得る。
【０１２９】
ここで使用する「投与する」は、当業者に知られる種々の方法および送達系の何れかを使用する、対象への治療剤、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体を含む組成物の物理的導入をいう。「投与する」は、例えば、ひとり以上の医療供給者など他者による、例えば、ヒト患者への投与およびヒト患者による自己投与を含む。ここに記載する抗体のための種々の投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、注射によるなど、経腸および局所投与以外の投与方式をいい、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路で投与し得る。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１以上の長期にわたり実施し得る。
【０１３０】
ここで使用する「補助的」または「組み合わせ」投与(共投与)は、同一または異なる投与形態での複数化合物の同時投与または複数化合物の別々の投与(例えば、逐次投与)を含む。それ故に、第一抗体、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体および第二、第三またはそれ以上の抗体は、単一製剤で同時に投与され得る。あるいは、第一および第二(またはそれ以上)の抗体は別々の投与にために製材され、同時にまたは逐次的に投与され得る。ここで使用する「組み合わせ」治療は、２以上の治療剤の協調的な方式での投与を意味し、同時の投与を含むが、これに限定されない。具体的に、併用療法は、共投与(例えば共製剤の投与または別々の治療組成物の同時投与)および、一方の治療剤の投与が、他方の治療剤の投与をなんらかの方法で条件づけるが、連続的または逐次的投与の両者を包含する。例えば、ある治療剤を、別の治療剤が投与され、所定の期間作用させた後にしか投与してはならない場合もある(例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423参照)。
【０１３１】
例えば、抗ＩＣＯＳ抗体を最初に投与し、続いて(例えば、直後に)第二抗体を投与するかまたはその逆であり得る。ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体が第二抗体の投与前に投与される。他の実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体が、第二抗体の、例えば、約３０分以内に投与される。このような連続的または逐次的投与は、好ましくは処置患者での両抗体の同時の存在をもたらす。
【０１３２】
ここで使用する用語「阻害」または「遮断」は、相互交換可能に使用され、ここに記載する方法により決定して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の部分的および完全阻害／遮断の両者を包含する。
【０１３３】
ここで使用する「癌」は、体内おける異常細胞の無秩序な増殖により特徴づけられる、広い疾患群をいう。無制御の細胞増殖または分裂は、悪性腫瘍または近隣組織に侵襲し、リンパ系または血流を介して体の遠位部分に転移し得る細胞群の形成をもたらす。
【０１３４】
ここで使用する用語「処置」および「処置する」は、疾患と関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の進行、発展、重症度または再発の反転、軽減、改善、阻害もしくは遅延または阻止を目的とする、対象に実施されるあらゆるタイプの介入または過程または活性剤の投与をいう。対照的に、「予防」または「防止」は、疾患を有していない対象への、疾患発症予防のための投与をいう。「処置」および「処置する」は予防または防止を含まない。
【０１３５】
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成するためにまたは少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。薬物または治療剤の「治療有効量」または「治療有効投与量」は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期の頻度およびその期間の延長または疾患による損傷または障害の阻止により証明される、疾患退縮を促進する薬物の量である。薬物の「予防有効量」または「予防有効投与量」は、疾患を有するまたは疾患を再発するリスクにある対象に単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を予防する薬物の量である。治療剤が疾患退縮をするまたは予防剤が疾患の発症または再発を予防する力量は、臨床試験でのヒト対象で、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系で、またはインビトロでの薬剤活性のアッセイによるなど、当業者に知られる多くの方法を使用して評価され得る。
【０１３６】
ここに提供する方法の何れかによる、抗ＩＣＯＳ抗体単独または抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたもしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせた抗ＩＣＯＳ抗体の有効量の投与は、例えば、腫瘍増殖またはサイズの減少、経時的に出現する転移病変数の減少、完全寛解、部分寛解または疾患安定を含む、少なくとも一つの治療効果をもたらし得る。例えば、本処置方法は、抗ＩＣＯＳ抗体を投与せずに達成されるよりまたは組み合わせ抗体の何れか一つの投与で達成されるより、良好な同等な臨床的有効割合(ＣＢＲ＝≧６カ月間継続する完全寛解(ＣＲ)＋部分寛解(ＰＲ)＋疾患安定(ＳＤ))を提供し、例えば、臨床的有効割合の改善は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上である。
【０１３７】
例として、抗癌剤は、対象における癌進行を減速させるまたは癌退縮を促進する薬物である。ある実施態様において、治療有効量の該薬物は、癌を除去する点まで癌退縮を促進する。「癌退縮を促進」は、有効量の該薬物単独または抗新生物剤との組み合わせの投与が、腫瘍増殖またはサイズの減少、腫瘍壊死、少なくとも一つの疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害または身体障害の阻止または患者における疾患症状のその他の改善をもたらすことを意味する。「薬理学有効性」、「有効性」または「効果」は、該薬物が患者における癌退縮を促進する能力をいう。「生理学的安全性」は、該薬物の投与に起因する、細胞、臓器および／または生物レベルでの許容し得る低レベルの毒性または他の有害生理作用(有害作用)をいう。
【０１３８】
例として、腫瘍処置のために、該薬物の治療有効量または投与量は、未処置対象と比較して腫瘍細胞増殖を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％阻害する。ある実施態様において、該薬物の治療有効量または投与量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。抗体を含む化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ここに記載するアッセイを使用して評価され得る。あるいは、組成物のこの性質は、化合物が細胞増殖を阻害する能力の試験により評価でき、該阻害は、熟練した実施者に知られるアッセイによりインビトロで測定され得る。ある実施態様において、腫瘍増殖阻害は処置直後でない場合があり、一定時間または反復投与後にのみ生じることもある。ここに記載する他の実施態様において、腫瘍退縮が観察され、少なくとも約２０日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間または少なくとも約６０日間またはそれ以上継続する。
【０１３９】
ここで使用する用語「固定用量」、「一定用量」および「一定−固定用量」は、相互交換可能に使用され、患者の体重または体表面関と無関係に患者に投与される用量をいう。固定用量または一定用量は、mg／kg用量としては提供されず、むしろ治療剤の絶対用量として提供される。
【０１４０】
ここで使用する用語「体重に基づく」用量または投与は、患者に投与される用量が患者体重に基づき計算されることを意味する。例えば、６０kgの患者が３mg／kgの抗ＩＣＯＳ抗体を必要とするとき、投与のための適切な量の抗ＩＣＯＳ抗体(すなわち、１８０mg)を計算し、使用できる。
【０１４１】
用語「患者」は、治療または予防的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象をいう。
【０１４２】
用語「対象」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに開示する方法および組成物を使用して、癌を有する対象を処置し得る。非ヒト動物は、全脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む哺乳動物および非哺乳動物を含む。ある実施態様において、対象はヒト対象である。
【０１４３】
ここで使用する単数表現は、特に断らない限り、その１以上を含み、例えば、「ヌクレオチド配列」は１以上のヌクレオチド配列を表すと解釈されるべきである。すなわち、単数表現、「１以上」および「少なくとも一つ」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。
【０１４４】
ここで使用する「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない、２つの特定した特性または要素の各々の特定開示と解釈されるべきである。それ故に、「Ａおよび／またはＢ」などの用語で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」単独および「Ｂ」単独を含む。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの用語で使用される用語「および／または」は、次の各々を包含する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ単独；Ｂ単独；およびＣ単独。
【０１４５】
態様が「含む」との用語を用いてここで記載されるとき、「からなる」および／または「本質的にからなる」の用語で記載されるその他は同様の態様も提供されると理解される。
【０１４６】
単位、接頭辞および記号は、その国際単位系(ＳＩ)が許容する形態で記す。数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に５’から３’方向で記載する。アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向で記載する。
【０１４７】
ここで使用する用語「約」は、おおよそ、大まかに、およそまたはほぼを意味する。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用されるとき、その範囲を境界を示す数値の上下に拡大することにより修飾する。一般に、用語「約」は数値を、例えば、１０パーセント上または下(高いまたは低い)への幅で、記載する値を上下に修飾し得る。
【０１４８】
ここに提供する見出しは、本開示の多様な態様の限定ではなく、本明細書を全体として参照して解釈されるべきである。従って、下に定義する用語は、本明細書全体を参照して、より完全に定義される。ここに記載する種々の態様を、次のサブセクションにさらに詳述する。
【０１４９】
Ｉ. 抗ＩＣＯＳ抗体
本発明は、ある実施態様において、望ましい機能または性質を有する完全ヒト抗体などの抗体を開示する。ここに記載されるのは、癌などの疾患の処置における治療剤として使用するために望ましい性質を有するアゴニスト抗ヒトＩＣＯＳ(抗ｈｕＩＣＯＳ)抗体である。これらの性質は、高親和性でヒトＩＣＯＳに結合する能力、ヒト対象における許容可能に低い免疫原性、ＦｃγＲIIｂ(ＩｇＧ  Ｆｃ受容体の特定のタイプ)に優先的に結合する能力および抗体の化学安定性を低下させる配列脆弱性の欠如の１以上を含む。本発明の抗体はまた、例えば、癌およびＩＣＯＳ発現および／または活性と関連する他の障害の診断にも有用である。
【０１５０】
アミノ酸配列によりここに開示する抗ＩＣＯＳ抗体は、実施例に記載のとおりヒトＩＣＯＳの特異的エピトープに結合する。
【０１５１】
特定の機能的性質を有する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体
本発明の抗体は、特定の機能的特性または性質により特徴づけられる。例えば、該抗体は、高親和性でヒトＩＣＯＳに特異的に結合する。ある実施態様において、該抗体は、ＩＣＯＳ−Ｌが結合するＩＣＯＳ上の部位に特異的に結合する。ヒトＩＣＯＳへの結合は、当分野で十分確立されている１以上の技法を使用して評価され得る。例えば、ある実施態様において、該抗体を、細胞表面にヒトＩＣＯＳを発現するようにトランスフェクトされているＣＨＯ細胞などのヒトＩＣＯＳを発現する細胞株と反応させるフローサイトメトリーアッセイにより試験し得る。これに加えてまたはこれとは別に、結合反応速度(例えば、ＫＤ値)を含む抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイで試験し得る。さらに他の適当な結合アッセイは、例えば、組み換えヒトＩＣＯＳタンパク質を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【０１５２】
ある実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＩＣＯＳタンパク質に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に２×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に４×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、ＩＣＯＳタンパク質に５×１０−１０Ｍ以下で結合しまたはＩＣＯＳタンパク質に１×１０−１０Ｍ以下で結合する。
【０１５３】
他の実施態様において、抗体は、ヒトＩＣＯＳのSIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)の１以上の残基に結合する。他の実施態様において、抗体は、ヒトＩＣＯＳのアミノ酸残基SIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)を含むエピトープに結合する。他の実施態様において、抗体の抗原結合部分は、ヒトＩＣＯＳのアミノ酸残基SIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)を含むエピトープに結合する。
【０１５４】
他の実施態様において、抗体はヒトＩＣＯＳに結合し、免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。抗体が免疫応答を刺激する能力は、インビボ腫瘍移植モデルにおけるような腫瘍増殖の測定により試験し得る(例えば、実施例６、７、８および９参照)。
【０１５５】
他の実施態様において、抗体またはその抗原結合部分はヒトＩＣＯＳに結合し、次の性質の少なくとも一つを示す：
(ａ)ヒトＩＣＯＳのSIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)内の１以上の残基と結合する；
(ｂ)ヒトＩＣＯＳ上の抗体ＩＣＯＳ.３３、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７または２６４４と同じエピトープに結合する；
(ｃ)ヒトＩＣＯＳへの結合について抗体ＩＣＯＳ.３３、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７または２６４４と競合する；
(ｄ)ＩｇＧ１対照抗体と比較してＡＤＣＣ活性を減少させる；
(ｅ)ＦｃγＲIIｂ受容体への結合について特異性を増加させる；
(ｆ)ＩＣＯＳリガンド(ＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合を遮断する；
(ｇ)ヒトＩＣＯＳとヒトＩＣＯＳ−Ｌの相互作用を遮断する；
(ｈ)ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＩＣＯＳに結合する；
(ｉ)活性化ヒトおよびカニクイザルＴ細胞に結合する；
(ｊ)ヒトＴ細胞に約０.７nMのＥＣ５０でおよびカニクイザルＴ細胞に約０.３nMのＥＣ５０で結合する；
(ｋ)ヒトＣＤ２８またはヒトＣＴＬＡ−４に結合しない；
(ｌ)ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｆｈ細胞およびＴｒｅｇ細胞などの少なくとも一つの初代Ｔリンパ球を活性化する；
(ｍ)インビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイにおいて約０.０１〜約０.１６nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発する；
(ｎ)インビトロ一次Ｔ細胞シグナル伝達アッセイで約３０nMのＥＣ５０でタンパク質キナーゼＢ(ｐＡｋｔ)を誘発する；
(ｏ)ＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞共培養アッセイにおいてブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答して約０.００２nM〜約０.４nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ産生を誘発する；
(ｐ)ＴｆｈおよびナイーブＢ細胞共培養アッセイにおいてブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してインターロイキン１０(ＩＬ−１０)産生を誘発する；
(ｑ)インビトロアッセイでＣＤ４５ＲＡ＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔｒｅｇと比較してＣＤ３刺激Ｔｅｆｆの大きな増殖を誘発する；
(ｒ)ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇと比較してＴｅｆｆの増殖を増加させる(例えば、ここで、増殖増加はＣＤ４５ＲＯ＋ＴｒｅｇよりＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇで大きい)；
(ｓ)ＴｒｅｇによるＴｅｆｆ抑制を減少させる；
(ｔ)ここで、約１０μg／mLの抗体は全血細胞アッセイでサイトカイン産生を増加させない；
(ｕ)インビトロでＴｆｈ細胞によるＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの少なくとも一方の分泌を増加させる；および／または
(ｖ)ＩＣＯＳ介在シグナル伝達を刺激する。
【０１５６】
他の実施態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてインビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイで約０.０８３nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発する。他の実施態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてインビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイで約０.０１〜約０.１nMのＥＣ５０でＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)産生を誘発する。
【０１５７】
ある態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてインビトロＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ共培養アッセイで約０.０１〜約０.１nMのＥＣ５０でブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を誘発する。他の態様において、単離抗体はヒト化単離抗体(またはその抗原結合部分)であって、ヒトＩＣＯＳと結合してＩＣＯＳリガンド(例えば、ヒトＩＣＯＳ−Ｌ)のヒトＩＣＯＳへの結合および／または相互作用を遮断し、そしてＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞共培養アッセイにおいて約０.０１〜０.１nMのＥＣ５０でブドウ球菌エンテロトキシンＢに応答してＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を誘発する。
【０１５８】
ある実施態様において、本発明の抗体はヒト化および完全ヒトモノクローナル抗体を含む。他の実施態様において、抗体は、例えば、キメラモノクローナル抗体である。
【０１５９】
モノクローナル抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４
ある実施態様において、本発明の抗体はヒト化およびヒトモノクローナル抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４であり、これらは次の実施例に記載のとおり単離され、構造的に特徴づけされている。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＨアミノ酸配列およびＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＬアミノ酸配列を表３５に示す。
【０１６０】
これらの抗体の各々がヒトＩＣＯＳに結合できることを考えると、ＶＨおよびＶＬ配列は、「混合および整合」させて、本発明の他の抗ｈｕＩＣＯＳ結合分子を作り得る。ある実施態様において、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合および整合されたとき、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列は、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えられる。同様に、ある実施態様において、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列は、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えられる。
【０１６１】
従って、ある態様において、本発明は、
(ａ)配列番号５、１６、２４、３２、４０または１８６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(ｂ)配列番号６、１７、２５、３３、４１、４８または１８９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体はヒトＩＣＯＳに特異的に結合する。
【０１６２】
ある実施態様において、重鎖および軽鎖可変領域組み合わせは
(ａ)配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
(ｂ)配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
(ｃ)配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
(ｄ)配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
(ｅ)配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
(ｆ)配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
(ｇ)配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【０１６３】
他の態様において、本発明は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはこれらの組み合わせを含む抗体を提供する。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９、１８、２６、３４、４２および１９１に示す。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１９、２７、３５、４３および１９２に示す。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１、２０、２８、３６、４４および１９３に示す。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２、２１、２９、３７、４９および１９４に示す。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、２２、３０、３８、５０および１９５に示す。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５、２３、３１、３９、５１および１９６に示す。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ方式(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を使用して区画化する。
【０１６４】
これらの抗体の各々がヒトＩＣＯＳに結合でき、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域により提供されることを考慮して、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を「混合および整合」して(すなわち、異なる抗体からのＣＤＲが混合および整合され得るが、各抗体はＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでいなければならない)、本発明の他の抗ｈｕＩＣＯＳ結合分子を作り得る。このような「混合および整合」抗体のＩＣＯＳ結合を、実施例のもの(例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)分析)を含む、ここに記載する結合アッセイを使用して試験し得る。ある実施態様において、ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合および整合されるとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換えられる。同様に、ある実施態様において、ＶＬ  ＣＤＲ配列が混合および整合されるとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換えられる。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１以上のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４についてここに開示するＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列で置換することにより作成し得ることは、当業者には容易に明らかである。
【０１６５】
従って、他の態様において、本発明は、
(ａ)配列番号９、１８、２６、３４、４２または１９１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号１０、１９、２７、３５、４３または１９２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号１１、２０、２８、３６、４４または１９３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号１２、２１、２９、３７、４９または１９４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号１４、２２、３０、３８、５０または１９５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号１５、２３、３１、３９、５１または１９６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体はヒトＩＣＯＳに特異的に結合する。
【０１６６】
ある実施態様において、抗体は
(ａ)配列番号９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１６７】
他の実施態様において、抗体は、
(ａ)配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１６８】
他の実施態様において、抗体は、
(ａ)配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１６９】
他の実施態様において、抗体は、
(ａ)配列番号３４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１７０】
他の実施態様において、抗体は、
(ａ)配列番号４２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号４３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号４４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１７１】
他の実施態様において、抗体は、
(ａ)配列番号１９１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号１９２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号１９３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号１９４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号１９５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号１９６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１７２】
ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインと独立して、単独で同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定でき、複数の抗体が、共通ＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有して予測どおり産生され得ることは当業者には周知である(例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)参照)。従って、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物由来の抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで、モノクローナル抗体はヒトＩＣＯＳに特異的に結合できる。ある態様において、本発明は、マウスまたはラット抗体などの非ヒト抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで、モノクローナル抗体はヒトＩＣＯＳに特異的に結合できる。ある実施態様内で、非ヒト抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような本発明の抗体は、対応する親非ヒト抗体と(ａ)結合について競合できる；(ｂ)機能的特徴を保持する；(ｃ)同じエピトープに結合する；および／または(ｄ)類似する結合親和性を有する。
【０１７３】
他の態様において、本発明は、非ヒト動物から得たヒト抗体などのヒト抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで、ヒト抗体はヒトＩＣＯＳに特異的に結合できる。他の態様において、本発明は、例えば、非ヒト動物から得たヒト抗体などの第一ヒト抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで、第一ヒト抗体はヒトＩＣＯＳに特異的に結合でき、第一ヒト抗体からのＣＤＲ３ドメインは、ＩＣＯＳへの結合特異性を欠くヒト抗体のＣＤＲ３ドメインに置き換わり、ヒトＩＣＯＳに特異的に結合できる第二のヒト抗体を創出する。ある実施態様において、第一ヒト抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような本発明の抗体は、対応する親非ヒト抗体と(ａ)結合について競合できる(ｂ)機能的特徴を保持する；(ｃ)同じエピトープに結合する；および／または(ｄ)類似する結合親和性を有する。
【０１７４】
本発明はまたここに開示する新規可変ドメイン配列および他のＦｃ受容体に対する親和性と比較してＦｃγＲIIｂに対する親和性が増強された修飾Ｆｃ領域を有する定常ドメインを含む抗ｈｕＩＣＯＳ抗体も提供する。ある実施態様において、ＦｃγＲIIｂ特異性が増強された該アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、癌処置において優れた有効性を示す。他の実施態様において、ＦｃγＲIIｂ特異性が増強された該アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、種々の障害、例えば、癌の処置において優れた有効性を示す。機構論に拘束されることを意図しないが、該ＦｃγＲIIｂ特異的アゴニスト抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体は、樹状細胞の成熟の増加により増強されたアジュバント効果を示し、それ故に、細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増大および活性化を促進し、これが抗腫瘍応答増強に至り得る。理論に拘束されることを意図しないが、本発明の受容体クラスター形成または「交差架橋」増加によるアゴニストＩＣＯＳ抗体のＦｃＲ介在シグナル増強は、治療効果の主要貢献因子であり得る。抗体のＦｃ部分によるＦｃＲ結合によるＩＣＯＳアゴニスト抗体の交差架橋はシグナル強度を増加し、それにより細胞活性化を増強し得る。
【０１７５】
抗体の活性化(Ａ)対阻害性(Ｉ)Ｆｃ受容体に対する相対的結合親和性は「Ａ／Ｉ」比として表すことができ、一般にＩｇＧ抗体のＦｃ領域の構造の機能である。ＷＯ２０１２／０８７９２８参照。阻害性受容体ＦｃγＲIIｂへの結合についての特異性が増強された抗体は低Ａ／Ｉ比を有する。ある実施態様において、ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、５、４、３、２、１、０.５、０.３、０.１、０.０５、０.０３または０.０１未満のＡ／Ｉ比を有する。
【０１７６】
ＦｃγＲIIｂ特異性を増強するための変異を含むヒトＩｇＧ１定常ドメインの例はここに記載され、配列表にも提供される。配列バリアントは、配列番号５２に提供され、図２に示されるヒトＩｇＧ１ｆ定常ドメイン配列を参照して提供される。Ｆｃ領域における変異の位置についての命名法(ナンバリング)は、Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.におけるＥＵ方式に従い、これは、異なる可変ドメイン長の抗体における等価な位置でのＦｃ配列の比較を容易にする。Edelman et al. (1969) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 63:78；ＷＯ２０１２／１３０８３１(同じナンバリングシステムを使用)も参照のこと。表３は、Ｆｃ配列バリアントの概要を提供し、そこから当業者はここに開示する抗体配列における対応する位置を容易に認識できる。ＳＥおよびＳＥＬＦバリアントはChu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926に記載される。Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１１およびＶ１２バリアントはMimoto et al. (2013) Protein Engineering Design & Selection 26:589(例えばその中の表１)に記載られる。
【０１７７】
【表３】
2020515239.tif 000004
【０１７８】
ＦｃγＲIIｂに対する増強した親和性を有するさらなるＦｃ配列バリアントは、Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723(およびＷＯ２０１４／１８４５４５)に開示され、例えば、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆと組み合わせて使用するＶ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅを含む。
【０１７９】
保存的修飾を有する抗体
ある実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、これらのＣＤＲ配列の１以上が、ここに記載する抗体(例えば、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４)に基づき特定したアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、該抗体は本発明の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の所望の機能的性質を保持する。抗原結合を除かないある保存的配列修飾をなし得ることは当分野で理解されている(例えば、Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8参照)。従って、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで：
(ａ)重鎖可変領域は、配列番号１１、２０、２８、３６、４４または１９３に示すアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ３配列を含み；
(ｂ)軽鎖可変領域は、配列番号１５、２３、３１、３９、５１または１９６に示すアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ３配列を含み；そして
(ｃ)該抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩＣＯＳに特異的に結合する。
【０１８０】
これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、ヒトＩＣＯＳへの高親和性結合および／または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力などのここに記載する機能的性質の１以上を有し得る。
【０１８１】
ある実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号１０、１９、２７、３５、４３または１９２に示すアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ２配列を含み；そして軽鎖可変領域は、配列番号１４、２２、３０、３８、５０または１９５に示すアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ２配列を含む。他の実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号９、１８、２６、３４、４２または１９１に示すアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ１配列を含み；そして軽鎖可変領域は、配列番号１２、２１、２９、３７、４９または１９４に示すアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ１配列を含む。
【０１８２】
種々の実施態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１８３】
抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と同じエピトープに結合する抗体
他の実施態様において、本発明は、本発明の抗ｈｕＩＣＯＳモノクローナル抗体の何れかとヒトＩＣＯＳ上の同じエピトープに結合する抗体(すなわち、本発明のモノクローナル抗体の何れかとヒトＩＣＯＳへの結合について交差競合する能力を有する抗体)を提供する。ある実施態様において、交差競合試験のための対照抗体は、モノクローナル抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４である。
【０１８４】
このような交差競合抗体は、標準ヒトＩＣＯＳ結合アッセイにおけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および／または２６４４と交差競合する能力に基づき同定され得る。例えば、組み換えヒトＩＣＯＳタンパク質がプレートに固定化され、抗体の一方が蛍光標識され、そして非標識抗体が標識抗体の結合を競合して離す能力を評価する標準ＥＬＩＳＡアッセイが使用され得る。これに加えてまたはこれとは別に、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して、交差競合する抗体の能力を評価し得る。試験抗体が、例えば、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および／または２６４４の、ヒトＩＣＯＳへの結合を阻害する能力は、試験抗体がヒトＩＣＯＳへの結合についてＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および／または２６４４と競合でき、それ故にヒトＩＣＯＳ上のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および／または２６４４と同じエピトープに結合し得ることを示す。ある実施態様において、ヒトＩＣＯＳ上のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および／または２６４４と同じエピトープに結合する抗体はヒト化またはヒトモノクローナル抗体である。
【０１８５】
実施例１６にさらに記載するとおり、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、３Ｅ８および９Ｄ５のヒトＩＣＯＳへの結合は、ＩＣＯＳの残基１１２〜１２３(配列番号１)またはアミノ酸配列SIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)に位置づけられている。従って、ある実施態様において、本発明は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＩＣＯＳのSIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)の１以上の残基に結合する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を提供する。他の実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ヒトＩＣＯＳのアミノ酸残基SIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)を含むエピトープと結合する。
【０１８６】
このようなヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、ここに記載のとおり製造および単離され得る。例えば、ここに開示する抗体と同じまたは類似エピトープに結合する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、免疫化プロトコール、例えば、ここに記載するものを使用して産生させ得る。得られた抗体を、ヒトＩＣＯＳへの高親和性結合についてスクリーニングし得る。次いで、選択抗体を、例えば、ｈｕＩＣＯＳの配列バリアントが酵母細胞表面に提示される酵母ディスプレイアッセイまたは水素−重水素交換実験により試験して、該抗体による正確なエピトープ結合を決定し得る。
【０１８７】
エピトープ決定は、当分野で知られる任意の方法により行い得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体とここに開示する抗ｈｕＩＣＯＳ  ｍＡｂは、それらがｈｕＩＣＯＳの少なくとも一つ領域内の同じ残基の１以上と接触したならば；それらがｈｕＩＣＯＳの少なくとも一つ領域内の大部分の残基と接触したならば；それらがｈｕＩＣＯＳの各領域内の大部分の残基と接触したならば；それらがｈｕＩＣＯＳの全長にわたる残基の大部分と接触したならば；全てのヒトＩＣＯＳの同じ別個の領域内で接触したならば；それらがヒトＩＣＯＳの任意の一つの領域での残基の全てと接触したならば；またはそれらが全ての同じ領域の全ての同じ残基と接触したならば、同じエピトープに結合すると考えられる。エピトープ「領域」は、一次配列内に沿った、しかし、必ずしも直接隣接していない、残基のクラスターである。
【０１８８】
ここに記載する抗体と「ｈｕＩＣＯＳ上の同じエピトープ」に結合する抗体を決定する技法は、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線解析を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異変種への結合のモニターであり、ここで、抗原配列内のアミノ酸修飾による結合消失がエピトープ成分の指標である。これら方法は、また目的の抗体が、標的タンパク質のコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーまたはプロテアーゼ消化から特異的短ペプチド(天然三次元形態または変性形態何れか)を親和性単離する能力も利用し得る。次いで、ペプチドは、ペプチドライブラリーのスクリーニングに使用する抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングのために、立体構造上不連続なエピトープを位置づけることが示されている、コンピューターアルゴリズムも開発されている。
【０１８９】
エピトープまたはエピトープを含む領域はまたＩＣＯＳにわたる一連の重複ペプチドへの結合をスクリーニングすることによっても同定できる。あるいは、Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899の方法を使用して、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体と同じエピトープを、そしてそれにより類似性質を有する抗体の選択をガイドし得る。ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＩＣＯＳ抗体の重鎖を(例えば、ヒト)軽鎖のレパートリーと対合させてＩＣＯＳ結合抗体を選択し、次いで新規軽鎖を(例えば、ヒト)重鎖のレパートリーと対合させて、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と同じエピトープまたはエピトープ領域を有する(例えば、ヒト)ＩＣＯＳ結合抗体を選択する。あるいは、ここに記載する抗体のバリアントを、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列の変異誘発により得ることができる。
【０１９０】
Cunningham & Wells (1989) Science 244: 1081に記載のアラニンスキャニング変異誘発またはＩＣＯＳにおけるアミノ酸残基のある他の形態の点変異誘発(例えば実施例１６に提供する酵母ディスプレイ方法)も、抗ＩＣＯＳ抗体についての機能的エピトープの決定に使用し得る。
【０１９１】
特異的抗体により結合されるエピトープまたはエピトープ領域(「エピトープ領域」は、エピトープを含むまたはエピトープと重複する領域である)はまた抗体のＩＣＯＳフラグメントを含むペプチドへの結合の評価によっても決定し得る。ＩＣＯＳ配列(例えば、ヒトＩＣＯＳ)を含む一連の重複ペプチドは合成され、結合について、例えば直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ(ここで、ペプチドはマイクロタイタープレートのウェルに結合したＩＣＯＳへの抗体の結合を阻止する能力について評価される)またはチップでスクリーニングされ得る。このようなペプチドスクリーニング方法は、一部不連続機能的エピトープ、すなわち、ＩＣＯＳポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出し得ない可能性がある。
【０１９２】
エピトープは、ＨＤＸ−ＭＳおよびタンパク質の高速光化学酸化(ＦＰＯＰ)などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法によっても同定され得る。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95にさらに記載されるとおり実施でき、その方法を引用により本明細書を明示的に包含させる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057に記載のとおり実施でき、その方法を引用により本明細書に明示的に包含させる。
【０１９３】
抗ＩＣＯＳ抗体によるエピトープ結合は、構造的方法、例えばＸ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３)、分子モデリングおよび、遊離のおよび目的の抗体と複合体で結合したときのＩＣＯＳにおける不安定アミド水素のＨ−Ｄ交換率のＮＭＲ決定を含む核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーによっても決定できる(Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884)。
【０１９４】
特に断らない限りおよび特許請求の範囲を引用した場合、抗体により結合されるエピトープは、ＨＤＸ−ＭＳ方法により決定されるエピトープである。
【０１９５】
ハムスター抗体由来の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体
ここに記載されるのは、ハムスター配列由来のＣＤＲおよび／または抗体重鎖および／または軽鎖可変領域を含むキメラおよびヒト化抗体の例である。ここに記載するキメラまたはヒト化抗体は、当分野で知られる種々の方法により製造した、例えば、マウスまたはハムスターからのモノクローナル抗体の配列である。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のハイブリドーマから得て、標準分子生物学技法を使用してヒト免疫グロブリン配列を含むように操作され得る。例えば、キメラ抗体を作るために、例えば、マウスまたはハムスター抗体の可変領域を、当分野で知られる方法を使用して、ヒト定常領域に連結し得る(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を作るために、ＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに挿入し得る(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
【０１９６】
高親和性で結合する抗ＩＣＯＳ抗体
ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ここに開示する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と同様に高親和性でｈｕＩＣＯＳに結合し、したがって治療剤として有効である。種々の実施態様において、本発明の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、１０nM、５nM、２nM、１nM、３００pMまたは１００pM未満のＫＤでｈｕＩＣＯＳに結合する。他の実施態様において、本発明の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、２nM〜１００pMのＫＤでｈｕＩＣＯＳに結合する。ｈｕＩＣＯＳに対する抗体の結合能を評価する標準アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)およびＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析(実施例１０参照)を含む。
【０１９７】
抗ＩＣＯＳ抗体配列バリアント
ここに開示する抗ＩＣＯＳ抗体配列バリアントは、ここに開示する望ましい機能的性質を維持する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ方式(Kabat, et al., 1991)を使用して区画化する。ある実施態様において、本発明は、さらに、ここに開示する抗体のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣＤＲ配列を含む、ヒトまたはヒト化抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を提供する。本発明はまた、ここに開示する抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む抗ｈｕＩＣＯＳ抗体ならびにここに開示する抗体の重鎖および／または軽鎖配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である完全長重鎖および／または軽鎖配列を含む抗ｈｕＩＣＯＳ抗体も提供する。
【０１９８】
II. 改変および修飾された抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
また提供されるのは、修飾抗体を取得するために出発物質としてここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上を有する抗体を使用して産生され得る改変および修飾された抗体であり、該修飾抗体は、出発抗体から変更された性質を有し得る。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、一方または両者の可変領域(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば、１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾により改変された。これに加えてまたはこれとは別に、ここに記載する抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために定常領域内の残基の修飾により改変された。
【０１９９】
ある実施態様において、可変領域改変は、ＣＤＲ移植を含む。このような移植は、ここに開示する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と結合について競合するおよび／またはここに開示する選択抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と同じエピトープに結合する非ヒト抗ＩＣＯＳ抗体、例えば、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体のヒト化に特に有用である。抗体は、主に重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。ＣＤＲは、配列が超可変であるおよび／または構造的に明確なループ(「超可変ループ」)を形成する。発現ベクターは、異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の参照(「親」とも称される)抗体からのＣＤＲ配列を含むように構築され得る(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許５,２２５,５３９およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。いくつかの例では、得られた組み換え抗体は、親抗体に類似する性質を有する。次いで、改変抗体をさらに修飾して、親抗体と異なる性質を獲得させ得る。他の例において、親ＣＤＲ配列のフレームワークへの移植は、組み換え抗体がもはや親抗体のある特徴を有しないように、これらの特徴を消失させる。特徴の一例は、抗原に対する結合親和性である。このような場合、改変抗体をさらに修飾して、親抗体の所望の特徴を再獲得させるのが有利である。
【０２００】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースならびにKabat, E. A., et al., (1991); Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798;およびCox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage,” Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ、この各々の内容は、引用により本明細書に明示的に包含させる。
【０２０１】
ある実施態様において、ここに記載する抗体に使用するためのフレームワーク配列は、ここに記載する抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子にみられるのと同一配列を有するフレームワーク領域に移植でき、またはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む最大２０アミノ酸置換を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有利であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
【０２０２】
ここに記載する改変抗体は、例えば、抗体の免疫原性低減など、抗体の性質を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾がなされている。例えば、一つの試みは、フレームワーク残基の１以上の対応する生殖系列配列への「復帰変異」である。より具体的に、体細胞変異を受けている抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を有し得る。該残基を、該抗体フレームワーク配列と該抗体が由来する生殖系列配列の比較により同定できる。フレームワーク領域配列を生殖系列配置のものに戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖系列配列に「復帰変異」させ得る。このような「復帰変異」抗体も本発明に包含される。
【０２０３】
他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の免疫原性の可能性を低減するための、フレームワーク領域内または１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基の変異を含む。この試みは「脱免疫化」とも称され、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３にさらに詳述される。
【０２０４】
他のタイプの可変領域修飾は、目的の抗体の結合性質の１以上(例えば、親和性)を改善するためのＣＤＲ領域内のアミノ酸残基の変異である。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発を、変異を導入するために実施し、抗体結合または興味ある他の機能的性質に影響を与え得る。好ましくは、保存的修飾が導入される。変異はアミノ酸付加、欠失または置換であり得る。ある実施態様において、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５を超えない残基が変更される。
【０２０５】
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基を酸化し、潜在的化学分解および結果としての抗体効力減少をもたらし得る。従って、またここに提供されるのは、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基が酸化的分解を受けないアミノ酸残基に置き換えられた、抗ＩＣＯＳ抗体である。同様に、脱アミド化部位を、抗ＩＣＯＳ抗体、特にＣＤＲから除去し得る。またここに提供されるのは、抗原結合ドメイン内の潜在的グリコシル化部位が、抗原結合を妨害し得るグリコシル化を防止するために除去された抗体である。例えば、米国特許５,７１４,３５０参照。
【０２０６】
抗体マスキング
ある実施態様において、ここに開示する抗体は、特定の細胞および／または組織への結合を制限するために修飾される。ある実施態様において、このような抗体は、抗体の抗原結合表面に特異的に結合し、抗原結合を妨害する遮断ペプチド「マスク」を含む。ある実施態様において、マスクは、プロテアーゼ切断可能リンカーにより抗体の結合アームの各々に連結される。例えば、CytomXの米国特許８,５１８,４０４参照。プロテアーゼ切断可能リンカーを有する抗体は、プロテアーゼレベルが、非腫瘍組織と比較して腫瘍微小環境で著しく増加している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における切断可能リンカーの選択的切断は、マスキング／遮断ペプチドの解離を可能とし、抗原結合が望まない副作用を引き起こす末梢組織ではなく、腫瘍における選択的な抗原結合を可能とする。
【０２０７】
他の実施態様において、(二価)抗体の両抗原結合表面に結合し、抗原結合を妨害する２個の抗原結合ドメインを含む二価結合化合物(「マスキングリガンド」)が開発されている。ある実施態様において、２個の結合ドメインマスクは、例えば、ペプチダーゼにより切断可能な、切断可能リンカーにより互いに(しかし抗体ではない)連結される(例えば、Tegopharm CorpのＷＯ２０１０／０７７６４３参照)。マスキングリガンドは、抗体が結合することが意図される抗原を含むかまたはそれに由来してよくまたは独立して産生され得る(例えば、抗イディオタイプ結合フラグメント)。このようなマスキングリガンドは、プロテアーゼレベルが、非腫瘍組織と比較して腫瘍微小環境で著しく増加している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における切断可能リンカーの選択的切断は、抗体の抗原結合表面に対するアビディティーを低減させるものである２個の結合ドメインの互いからの解離を可能とする。マスキングリガンドの抗体からの結果として生じる解離は、抗原結合が望まない副作用を引き起こす末梢組織ではなく、腫瘍における選択的な抗原結合を可能とする。
【０２０８】
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ領域
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、抗体の生物学的活性に基づき選択されたＦｃ領域を含み得る。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。ヒトＩｇＧは、例えば、４サブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類され得る。これらのサブクラスの各々は、Ｆｃγ受容体の１以上(活性化受容体ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＣ(ＣＤ３２ａ,ｃ)；ＦｃγＲIIIＡおよびＦｃγＲIIIＢ(ＣＤ１６ａ,ｂ)および阻害性受容体ＦｃγＲIIＢ(ＣＤ３２ｂ))および補体第一成分(Ｃ１ｑ)への結合について特有のプロファイルを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は全Ｆｃγ受容体に結合し、ＩｇＧ２はＦｃγＲIIＡＨ１３１におよび低親和性でＦｃγＲIIＡＲ１３１  ＦｃγＲIIIＡＶ１５８に結合し、ＩｇＧ４はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ、ＦｃγＲIIＣおよびＦｃγＲIIIＡＶ１５８に結合し、そして阻害性受容体ＦｃγＲIIＢは全ての他のＦｃγ受容体より低い親和性をＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に対して有する(Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716)。ＦｃγＲＩはＩｇＧ２に結合せず、ＦｃγＲIIIＢはＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合しないとの研究がある。同上。一般に、ＡＤＣＣ活性について、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３>>ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２である。ある実施態様において、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが、例えば、ＡＤＣＣが望ましいため、治療組成物における使用のために選択される。他の実施態様において、ＦｃγＲIIIＡ発現ＮＫ細胞、単球またはマクロファージの活性化が望ましいため、ＩｇＧ３が選択される。他の実施態様において、抗体がアレルギー患者の脱感作に使用されるため、ＩｇＧ４が選択される。抗体が全エフェクター機能を欠くように、ＩｇＧ４も選択される。
【０２０９】
ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体可変領域は、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、ＩｇＧ１について：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２について：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３について：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)であり得るＦｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃに連結(例えば、共有結合性に連結または融合)され得る(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。アロタイプの選択は、例えば、抗薬物抗体の形成を最小化するための、懸念される潜在的免疫原性により影響を受け得る。
【０２１０】
ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ本発明の抗体は、ＦｃγＲIIｂに結合するまたは結合が増強されたＦｃ領域を有し、これは増強されたアゴニズムを提供する。例えば、ＷＯ２０１２／０８７９２８；Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754参照。ある実施態様において、ここに記載する可変領域を、例えば、アポトーシス誘発またはアジュバント活性を増強するために、阻害性受容体ＦｃｙＲIIｂに対する親和性が増強されたＦｃバリアントに連結し得る。Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:10966；米国特許出願公開２０１４／００１０８１２。このようなバリアントは、例えば、Ｂ細胞および単球を含む、ＦｃγＲIIｂ＋細胞に関連する免疫調節性活性を抗体に提供する。ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体と比較してＦｃγＲIIｂに対して選択的に増強された親和性を有する。このようなバリアントはまた増強されたＦｃＲ介在交差架橋も示し、治療効果増強をもたらし得る。ＦｃγＲIIｂへの結合を変えるための修飾は、ＥＵ方式により、例えば、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３９位、２６６位、２６７位、２６８位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位または３３２位置での１以上の修飾を含む。ＦｃγＲIIｂ親和性を増強させるための置換の例は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含むが、これらに限定されない。ＦｃγＲIIｂへの結合を増強するための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ−２６７Ｅ、２３６Ｄ−２６７Ｅ、２３９Ｄ−２６８Ｄ、２３９Ｄ−２６７Ｅ、２６７Ｅ−２６８Ｄ、２６７Ｅ−２６８Ｅおよび２６７Ｅ−３２８Ｆを含む。具体的に、Ｓ２６７Ｅ−Ｌ３２８Ｆダブルバリアントを含むＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、ヒトＩｇＧ１のＬ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅバリアントは、阻害性ＦｃγＲIIｂ受容体に対する親和性の特異的増強に特に価値がある。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開２００６／０２４２９８；ＷＯ２０１２／０８７９２８。ＦｃγＲIIｂ(ＦｃγＲIIａＲ１３１と区別されるものとして)に対する特異性の増強は、Ｐ２３８Ｄ置換および他の変異(Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１０)ならびにＶ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅ(Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723およびＷＯ２０１４／１８４５４５の付加により得られ得る。
【０２１１】
ＩｇＧ２ヒンジ領域を有する非ＩｇＧ２重鎖定常ドメイン
ある実施態様において、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体は、少なくとも一部ＦｃγＲIIｂへの結合および／または特異性を増加させる修飾により、増加したアゴニスト活性を有する。別の試みは、アゴニズムのＦｃγＲ非依存的増強を提供するためのＦｃ領域の改変である。このような増強されたアゴニズムを提供する修飾ＩｇＧ２ドメインを有する他の標的に対する抗体の例は、ＷＯ２０１５／１４５３６０およびWhite et al. (2015) Cancer Cell 27:138に記載され、これらの開示を、その全体として引用により本明細書に包含させる。具体的に、ジスルフィド結合は、抗体をより小型の「ｈ２Ｂ」立体構造に「ロック」するよう配置され、増強されたアゴニズムをもたらす。得られた増強されたアゴニズムはＦｃγＲ非依存的である(White et al. (2015) Cancer Cell 27:138参照)。このようなＦｃγＲ非依存的アゴニズムは、数ＦｃγＲ−＋発現細胞(例えば、いくつかのＮＫ細胞またはマクロファージ)を有するような腫瘍の処置に有利である。ある実施態様において、ｈＩｇＧ２ヒンジ領域またはＣＨ１ドメイン配列バリアントを含むそのバリアントを有する非ｈＩｇＧ２重鎖定常領域(例えばＩｇＧ１)に連結された、ここに開示するＣＤＲまたは可変ドメイン配列を含む抗ＩＣＯＳ抗体が提供される。ある実施態様において、これら「ＩｇＧ２ヒンジ」抗体は、完全ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する抗体と比較して増強されたアゴニズムを有し、増強されたアゴニズムはＦｃγ受容体介在交差架橋と無関係である。ある実施態様において、これらのＩｇＧ２ヒンジ抗ＩＣＯＳ抗体は、実質的に変わらない抗原結合親和性を保持する。またここで提供されるのは、非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換えることを含む、非ＩｇＧ２抗ＩＣＯＳ抗体のＦｃγＲ非依存的アゴニズムを増強する方法である。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ(「ＩｇＧ２ヒンジ」)およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有し、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ＩｇＧ２ヒンジは、また増強されたアゴニスト活性に寄与する、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ(例えば、配列番号９６に示すERKCCVECPPCPAPPVAG)またはそのバリアントであり得る。ある実施態様において、このようなＩｇＧ２ヒンジバリアントは、野生型ＩｇＧ２ヒンジに類似する剛性または硬度を有する。ヒンジの剛性は、ヒンジを含む抗体の回転運動の半径を測定または比較するための、例えば、コンピューターモデリング、電子顕微鏡、核磁気共鳴(ＮＭＲ)などのスペクトロスコピー、Ｘ線結晶学(Ｂ−因子)または超遠心分析沈降速度法により決定され得る。ある実施態様において、ヒトＩｇＧ２ヒンジバリアントは、４個のシステイン残基(すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)の１以上の、例えば、セリンでの置換を含む。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジバリアントは、Ｃ２１９Ｓ変異(例えば、配列番号１１０に示すERKSCVECPPCPAPPVAG)を含む。他のＩｇＧ２ヒンジバリアントはＣ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異を含み、この何れもＣ２１９Ｓ変異と組み合わせ得る。
【０２１２】
ＩｇＧ２ヒンジバリアントはまた非ＩｇＧ２ヒンジ配列要素(「キメラヒンジ」)も含み得る。ある実施態様において、キメラヒンジの剛性は、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものと少なくとも類似する。例えば、ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジバリアントは野生型ＩｇＧ１下部ヒンジを含む。表２参照。
【０２１３】
下記表４は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアイソタイプ起源が異なる「ＩｇＧ２ヒンジ」ヒト重鎖定常領域配列の例を提供する。ここで使用する「ＩｇＧ２ヒンジ抗体」は、ＩｇＧ２に由来するヒンジ領域だけでなく、ＩｇＧ２  ＣＨ１に由来するＣＨ１領域も含む抗体をいう。表４のアスタリスク(＊)は、示すドメインが任意のアイソタイプであり得るかまたは完全に存在しないことを示す。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、例えばＡ１１４Ｃおよび／またはＴ１７３Ｃ変異を含む、バリアントＣＨ１ドメインを含む。修飾重鎖定常領域はまた、例えばＡ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ変異を含む、バリアントＣＨ２ドメインも含み得る。
【０２１４】
【表４】
2020515239.tif 000005
【０２１５】
ＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジ配列と他のアイソタイプ配列および選択アミノ酸置換の組み合わせを含む抗体定常ドメインの例を、下記表５に示す。
【０２１６】
【表５】
2020515239.tif 000006
【０２１７】
ＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジ配列と他のアイソタイプ配列および選択アミノ酸置換の組み合わせを含む抗体定常ドメインのさらなる具体例を下記表６に提供する。
【０２１８】
【表６】
2020515239.tif 000007
【０２１９】
ここに開示するＣＤＲおよび／または可変ドメイン配列を含む抗体を含む抗ＩＣＯＳ抗体は、例えばＦｃγＲ非依存的アゴニスト活性を増強するために、ここに開示する「ＩｇＧ２ヒンジ」定常ドメイン配列を取り込み得る。このようなＩｇＧ２ヒンジ定常ドメインの例は、表５(配列番号１０４〜１０８および１１０〜１１９)および表６(配列番号１２０〜１５１)に開示のものおよびまた配列番号１０１〜１０８に開示のものを含む。
【０２２０】
半減期延長
ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体を、生物学的半減期、例えば、血清における抗体の半減期を延長するために修飾し得る。種々の試みが当分野で知られる。例えば、抗体の半減期を、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることにより延長し得る。ある実施態様において、抗体を、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０２２に記載のとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更する。ＦｃＲｎへの結合を増加するおよび／または薬物動態を改善するＦｃバリアントの他の例は、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含み、２５９位、３０８位および４３４位に置換を有する。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加する他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of 免疫logy 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Dall'Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。米国特許８,３６７,８０５参照。
【０２２１】
Ｎ４３４Ａバリアント(Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)のようなＩｇＧ  Ｆｃのある保存残基(Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４)の修飾がＦｃＲｎ親和性を増加させる、それ故に循環する抗体の半減期を延長させる方法として提案されている(例えば、ＷＯ９８／０２３２８９参照)。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組み合わせＦｃバリアントは最大５倍ＦｃＲｎ結合を増加させ、血清半減期を延長することが示されている(Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157)。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組み合わせＦｃバリアントも、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する(Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759)。さらに、Ｍ２５２Ｙ−Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｓバリアントを含む組み合わせＦｃバリアントも半減期を延長することが示されている(ＷＯ２００９／０８６３２０)。
【０２２２】
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組み合わせＦｃバリアントは、半減期を約４倍延長させる(Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514)。ＦｃＲｎ親和性を増加させるが、ｐＨ依存を減少させる関連ＩｇＧ１修飾(Ｍ２５２Ｙ−Ｓ２５４Ｔ−Ｔ２５６Ｅ−Ｈ４３３Ｋ−Ｎ４３４Ｆ)が、他の抗体のＦｃＲｎの結合を阻止する競合剤として使用するためのＩｇＧ１構築物(「ＭＳＴ−ＨＮ  Ａｂｄｅｇ」)を作るために使用されており、内因性ＩｇＧ(例えば自己免疫状況で)または他の外来性(治療的)ｍＡｂ何れかの他の抗体のクリアランスの増加をもたらす(Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４)。
【０２２３】
ＦｃＲｎ結合を増加させる他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；６,２７７,３７５；６,８２１,５０５；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
【０２２４】
ある実施態様において、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプを使用してＦｃＲｎ結合を増加し、潜在的に半減期を延長させ得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ１位置を、２個のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ３からのアミノ酸に置き換えることにより、構築し得る。それ故に、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。ここに記載する他の実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、２個のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ１からのアミノ酸に置き換えることにより、構築し得る。それ故に、１以上の置換、例えば、次のアミノ酸置換の１以上：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位でのグリシン挿入をいう)および３２７Ａを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。米国特許８,６２９,１１３参照。血清半減期が延長し、発現が改善したとされるＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが産生されている。米国特許７,８６７,４９１(その中の配列番号１８)。
【０２２５】
ここに記載する抗体の血清半減期は、ペグ化によっても延長され得る。抗体は、例えば、該抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長するためにペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)試薬、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が該抗体または抗体フラグメントに結合するような条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化を、反応性ＰＥＧ分子(または類似反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により行う。ここで使用する用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる形態のＰＥＧを含む。ある実施態様において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用され得る(例えば、Nishimura et al.のＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４参照)。
【０２２６】
いくつかの例では、抗体の半減期を延長するのではなく、短縮することが望ましいことがある。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、半減期を短縮ための修飾を含む。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ、Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)などの修飾は、例えば、医療用画像処理のためなどの、迅速なクリアランスが好ましい場合に使用するために、ＦｃＲｎ結合を低減させ、それ故に半減期を減少させる(クリアランスを増加させる)(Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622もまた参照)。クリアランスを増強する他の手段は、本発明の抗原結合ドメインを、ＦａｂフラグメントなどのＦｃＲｎと結合する能力を欠く抗体フラグメントとして整形することを含む。このような修飾は、循環抗体の半減期を数週間から数時間に短縮させ得る。次いで、所望であれば、抗体フラグメントの選択的ペグ化を使用して、抗体フラグメントの半減期を延長し得る(Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780)。抗体フラグメントを、例えば融合タンパク質構築物でヒト血清アルブミンと融合させても、半減期を延長させ得る(Yeh et al. (1992) Proc. Nat’l Acad. Sci. 89:1904)。あるいは、二重特異性抗体を、本発明の第一抗原結合ドメインおよびヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する第二抗原結合ドメインを用いて構築し得る(ＷＯ２００９／１２７６９１およびその中に引用される特許引用文献参照)。あるいは、特殊化ポリペプチド配列、例えば「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列を抗体フラグメントに付加して、半減期を延長し得る(Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186；国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２)。
【０２２７】
さらなるＦｃバリアント
ある実施態様において、ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それにより、例えば治療抗体と処置する患者の内在性ＩｇＧ４のＦａｂアーム交換を減少させることにより、ＩｇＧ４分子を安定化させる、置換Ｓ２２を含むのが有利であり得る(Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925)。
【０２２８】
ＩｇＧ１構築物のヒンジにおける潜在的プロテアーゼ切断部位をＤ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾により除去し、抗体の安定性を増加させ得る(ＷＯ２０１４／０４３３４４)。
【０２２９】
Ｆｃバリアントのそのリガンド(Ｆｃ受容体)に対する親和性および結合性質を、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)またはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ))または速度論(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析)および間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などの他の方法を含むが、これらに限定されない多様なインビトロアッセイ方法(例えば、生化学または免疫学に基づくアッセイ)により決定し得る。これらおよび他の方法は、試験される成分の１以上の標識を使用するおよび／または発色性、蛍光性、発光性または同位体性標識を含むが、これらに限定されない種々の検出方法を用いることができる。結合親和性および速度論の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に特化したPaul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。
【０２３０】
さらに他の実施態様において、抗体のグリコシル化を修飾して、エフェクター機能を増加または減少させる。例えば、２９７位の保存アスパラギン残基を変異し(例えばＮ２９７Ａ)、それ故に補体およびＦｃγＲＩ結合が排除された、全エフェクター機能を欠く非グリコシル化抗体が製造され得る(Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao &Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595もまた参照(２９７位でのグリコシル化を除去するためにＩｇＧ１におけるＮ２９７Ｑを使用))。
【０２３１】
非グリコシル化抗体は、一般にエフェクター機能を欠くが、その機能を回復させるために変異を導入し得る。非グリコシル化抗体、例えばＮ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ変異由来のものまたはタンパク質をグリコシル化しない系(例えば大腸菌)で産生させたものをさらに、ＦｃγＲ結合を回復するよう変異でき、例えばＳ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／またはＨ(ＷＯ２００９／０７９２４２)またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al. (2010) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 107:604)である。
【０２３２】
糖鎖改変もまた、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７で結合した炭水化物鎖のα２,６シアリル含量を変えることによるＩｇＧ構築物の抗炎症性性質の修飾に使用でき、ここで、α２,６シアル酸付加形態の比率の増加が、抗炎症性効果増強をもたらす(Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513参照)。逆に、α２,６シアル酸付加炭水化物を有する抗体の比率の減少が、抗炎症性性質が望まれない場合に有用であり得る。例えば、α２,６シアル酸付加形態の選択的精製または酵素修飾により、抗体のα２,６シアル酸付加含量を修飾する方法は、米国特許出願公開２００８／０２０６２４６に提供されている。他の実施態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸配列を、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾の包含により、α２,６シアル酸付加の作用を模倣するように修飾し得る(ＷＯ２０１３／０９５９６６)。
【０２３３】
III. 抗体物理的性質
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に１以上のグリコシル化部位を含む。このようなグリコシル化部位は、抗原結合改変により、抗体の免疫原性増加または抗体薬物動態改変をもたらし得る(Marshall et al (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は可変領域グリコシル化を含まない。このような抗体は、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体の選択によりまたはグリコシル化領域内の残基の変異により得ることができる。
【０２３４】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、アスパラギン異性化部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じ得て、イソアスパラギン酸残基の生成に至り、これはポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を低減させる(イソアスパラギン酸効果として知られる)。
【０２３５】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、６〜９.５のｐＨ範囲に等電点(ｐＩ)を有する。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、７〜９.５または６〜８のｐＨ範囲にｐＩを有する。所望のｐＩ範囲内のｐＩを有する抗体は、候補群からの該ｐＨ範囲のｐＩを有する抗体の選択または特定の抗体の荷電表面残基の変異により得ることができる。
【０２３６】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、６０℃を超える、６５℃を超えるまたは７０℃を超える最初のアンフォールディング温度(ＴＭ１)を有するように選択および／または改変される。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett. 68:47-52)または円二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9)を使用して、測定し得る。
【０２３７】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、有利な分解性質、例えば、インビトロおよび／またはインビボでの遅い分解を有するように選択および／または改変される。抗体分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定され得る(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem. 67:3626-32)。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、好都合な凝集性を有するように選択および／または改変され、例えば、望まれない免疫応答および／または変更したまたは都合悪い薬物動態性質を誘発し得る、インビトロおよび／またはインビボで最小凝集を示す抗体である。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、親抗体の凝集と比較して２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下の凝集を示す。凝集は、サイズ−排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含む数技法により測定され得る。
【０２３８】
IV. 核酸分子および組み換え方法
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、例えば、宿主細胞、細胞ライセートまたは部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で提供され得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、本来単離ＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製して離されたとき、「単離され」または「実質的に純粋にされ」ている(F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照)。ここに記載する核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０２３９】
ここに記載する核酸は、標準分子生物学技法を使用して製造され得る。ハイブリドーマ(例えば、さらに下記のとおりヒト免疫グロブリン遺伝子担持トランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ)により発現される抗体について、該ハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技法により得られ得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ技法を使用して)から得る抗体について、該抗体をコードする核酸はライブラリーから回収され得る。
【０２４０】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを標準組み換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換し得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーなどの他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合される。本明細書で使用する用語「操作可能に結合された」は、２個のＤＮＡフラグメントが、該２個のＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように結合されることを意味する。
【０２４１】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)に操作可能に架橋することにより完全長重鎖遺伝子に変換し得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, et al., 1991参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得られ得る。重鎖定常領域はＩｇＧ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合され得る。
【０２４２】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコード化ＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に架橋することにより完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換し得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, et al., (1991)、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得られ得る。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０２４３】
ｓｃＦｖ遺伝子を作るために、ＶＨおよびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、ＶＨおよびＶＬ配列が連続的一本鎖タンパク質として発現でき、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーにより結合されるように、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする他のフラグメントと操作可能に結合される(例えば, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。
【０２４４】
Ｖ. 抗体産生
種々の本発明の抗体、例えばここに開示する選択抗ヒトＩＣＯＳ抗体と同じエピトープに結合するものは、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)に記載の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法などの多様な既知技法を使用して製造され得る。モノクローナル抗体を製造するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技法も使用し得る。
【０２４５】
ハイブリドーマを製造するための動物系の例はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、十分に確立された方法である。融合のための免疫化脾細胞の免疫化プロトコールおよび技法は当分野で知られる。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順も知られる。
【０２４６】
ここに記載するキメラまたはヒト化抗体は、上記のとおり製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき、製造され得る。標準分子生物学技法を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変され得る。例えば、キメラ抗体を作るために、マウス可変領域を当分野で知られる方法を使用してヒト定常領域に連結させ得る(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を作るために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに挿入し得る(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９ならびにQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
【０２４７】
ある実施態様において、ここに記載する抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトＩＣＯＳに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを使用して産生され得る。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ここでそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称し、集合的にここで「ヒトＩｇマウス」と称するマウスを含む。
【０２４８】
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的化変異と共に、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現が減少し、免疫化に応答して、導入ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチングおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を産生する(Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)。ＨｕＭａｂマウスの製造および使用ならびに該マウスにより担持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載され、これら全ての内容を、全体として引用することにより本明細書に明示的に包含させる。(全てLonbergおよびKayの米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９；Surani et al.の米国特許５,５４５,８０７；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４も参照のこと。)
【０２４９】
ある実施態様において、ここに記載する抗体を、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスなどの導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して産生する。「ＫＭマウス」とここで称するこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳述される。
【０２５０】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系は当分野で入手可能であり、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の産生に使用し得る。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称する別のトランスジェニック系を使用でき；このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１１４,５９８；６,１５０,５８４および６,１６２,９６３に記載される。
【０２５１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソミック動物系は当分野で入手可能であり、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体の産生に使用し得る。例えば、「ＴＣマウス」と称するヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体両者を担持するマウスが使用され得る；このようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の産生に使用され得る。
【０２５２】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の産生のための文献に記載されるさらなるマウス系は、(ｉ)キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスで産生されるように、内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えにより、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置き換えられ、内因性マウス定常領域に操作可能に結合され、続いて標準組み換えＤＮＡ技法を使用して完全ヒト抗体に変換されるＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)；および(ii)マウスが非再配列ヒト重鎖可変領域だけでなく、単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域を含むＭｅＭｏ(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体産生におけるそれらの使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載される。
【０２５３】
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用しても製造できる。ヒト抗体単離のためのこのようなファージディスプレイ方法は、当分野で確立されている(例えば、Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；および５,５７１,６９８；Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７；McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７；およびGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１参照)。
【０２５４】
ここに記載するヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化により産生され得るようにヒト免疫細胞が再構成されている重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)を有するマウスを使用しても産生され得る。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６７に記載される。
【０２５５】
免疫化
ヒトＩＣＯＳに対する完全ヒト抗体を産生するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むマウスまたはトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルマウス(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、他の抗原について、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４により記載のとおり、ＩＣＯＳ抗原および／またはＩＣＯＳ発現細胞の精製または富化調製物で免疫化し得る。あるいは、マウスを、ヒトＩＣＯＳをコードするＤＮＡで免疫化し得る。好ましくは、マウスは、第一注入時６〜１６週齢である。例えば、組み換えヒトＩＣＯＳ抗原の精製または富化調製物(例えば、５μg〜５０μg)を使用して、マウスを腹腔内で免疫化し得る。ＩＣＯＳ抗原の精製または富化調製物を使用する免疫化が抗体をもたらさないならば、マウスをＩＣＯＳ発現細胞、例えば、細胞株で免疫化して、免疫応答を促進し得る。
【０２５６】
ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、最初にＲｉｂｉアジュバント中の抗原で腹腔内または皮下(ＳＣ)に免疫化し、続いて隔週でＲｉｂｉアジュバント中の抗原でＩＰ／ＳＣ免疫化する(計１０まで)。免疫応答を免疫化プロトコールの間モニターでき、血漿サンプルは後眼窩採血により得る。血漿はＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳでスクリーニングでき(下記のとおり)、十分な力価の抗ＩＣＯＳヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用し得る。マウスを抗原で静脈内的にブーストし、３日後に屠殺し、脾臓およびリンパ節を摘出し得る。各免疫化について２〜３個の融合が実施され得る。６〜２４匹のマウスが、各抗原で免疫化され得る。ある実施態様において、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子の両者を、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一マウス(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)に共に生じさせ得る。
【０２５７】
ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生
ここに記載するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を、単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株と融合し得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを用いてＳｐ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC, CRL 1581)に融合し得る。細胞を約２×１０５で平底マイクロタイタープレートに播種し、続いて１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」条件培地、５％  Ｏｒｉｇｅｎ(IGEN)、４mM  Ｌ−グルタミン、１mM  ピルビン酸ナトリウム、５mM  ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM  ２−メルカプトエタノール、５０単位／mlペニシリン、５０mg／mlストレプトマイシン、５０mg／mlゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ(Sigma)を含む選択培地中２週間インキュベーションする。約２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地でインキュベートし得る。次いで、個々のウェルをヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡでスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を通常１０〜１４日後観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングでき、ヒトＩｇＧについてなお陽性であるならば、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローン化し得る。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地で少量の抗体を産生させ得る。
【０２５８】
モノクローナル抗体を生成するために、選択ハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮して、その後プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, N.J.)を行い得る。溶出ＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで試験し、純度を確認する。緩衝液をＰＢＳに交換してよく、吸光係数１.４３を使用するＯＤ２８０により濃度を決定し得る。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃に保存し得る。
【０２５９】
VI. 抗体製造
ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの産生
配列が提供される特定の抗体および他の、関連抗ＩＣＯＳ抗体の両者を含む本発明の抗体を、例えば、当分野で周知の組み換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生させ得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【０２６０】
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、一部または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技法により得て(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に結合されるように発現ベクターに挿入し得る。ここで、用語「操作可能に結合された」は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳の制御の意図する機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性であるように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターに挿入できまたは両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、発現ベクターに、標準方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターの相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないとき平滑断端ライゲーション)により挿入する。ここに記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に結合され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に結合されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作り得る。これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローン化し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であり得る。
【０２６１】
抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を担持し得る。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含む。このような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、数ある因子の中で、トランスフォームする宿主細胞、所望のタンパク質発現レベルの選択のような因子により得ることは当業者に認識される。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御配列を使用し得る。なおさらに、制御要素は、ＳＶ４０早期プロモーターからの配列とヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列を含むＳＲαプロモーター系などの、異なる源からの配列からなり得る(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０２６２】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子などの付加的配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にし得る(例えば、全てAxel et al.の米国特許４,３９９,２１６、４,６３４,６６５および５,１７９,０１７参照)。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞で使用するため)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のため)を含む。
【０２６３】
軽鎖および重鎖発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技法により宿主細胞にトランスフェクトする。種々の形態の用語「トランスフェクション」は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの原核または真核生物宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般に使用される広範な技法を包含する。ここに記載する抗体を原核または真核生物宿主細胞で発現させることは理論的に可能であるが、真核生物細胞および特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適切に折りたたまれかつ免疫学的に活性な抗体を集合させ、分泌する可能性が高いため、このような真核生物細胞および最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核動物発現は、高収量の活性抗体の産生には効果がないことが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本発明の抗体は、酵母のグリコール改変株でも産生され得る(ピキア・パストリス。Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210)。
【０２６４】
ここに記載する組み換え抗体発現のための哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載され、例えば、 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のとおりジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)選択可能マーカーと使用される)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用のために、他の発現系の例は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたら、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現またはより好ましくは宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の分泌をさせるのに十分な時間培養することにより産生される。抗体は、標準タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収され得る。
【０２６５】
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端は、一般に観察される翻訳後修飾により、予測配列と異なり得る。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖からしばしば欠失する(Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132)。Ｎ末端グルタミン残基および程度は少ないがグルタミン酸残基は、治療抗体の軽鎖および重鎖両者でしばしばピログルタミン酸残基に変換され得る(Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211)。
【０２６６】
種々の本発明のアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列は配列表に提供され、これは表３５に要約される。上記理由のため、Ｃ末端リシンは配列表の配列の多くで、重鎖または重鎖定常ドメインに含まれない。しかしながら、別の実施態様において、本発明の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および／またはそのような抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝的構築物の各重鎖は、重鎖Ｃ末端にこの付加的リシン残基を含む。
【０２６７】
VII. アッセイ
ここに記載する抗体は、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、ＩＣＯＳへの結合について試験され得る。例えば、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μg／mlの精製ＩＣＯＳで被覆し、次いでＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンで遮断する。抗体希釈物(例えば、ＩＣＯＳ免疫化マウスからの血漿希釈物)を各ウェルに加え、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合二次試薬(例えば、ヒト抗体またはそうでなければヒト重鎖定常領域を有する抗体について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)と、１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc、製品：ＡＢＴＳ−１０００)で展開し、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計により分析する。次いで、免疫化マウスからの血清をさらにヒトＩＣＯＳを発現する細胞株にするが、ＩＣＯＳを発現しない対照細胞株にはしない結合についてフローサイトメトリーでスクリーニングする。簡潔には、抗ＩＣＯＳ抗体の結合を、ＩＣＯＳ発現ＣＨＯ細胞と、抗ＩＣＯＳ抗体を１：２０希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂで検出する。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施する。好ましくは、最高力価を発生させるマウスを融合に使用する。マウス抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を検出したいならば、抗マウス検出抗体を使用して類似する実験を実施し得る。
【０２６８】
例えば、上記のような、ＥＬＩＳＡを、抗体の、それ故に、ＩＣＯＳ免疫原と陽性反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに使用し得る。次いで、好ましくは高親和性で、ＩＣＯＳに結合する抗体を産生するハイブリドーマをサブクローン化し、さらに特徴づけし得る。次いで、各ハイブリドーマから、親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡで)１クローンを、細胞バンク製造および抗体精製のために選択し得る。
【０２６９】
抗ＩＣＯＳ抗体を精製するために、選択ハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮して、その後プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, NJ)を行い得る。溶出ＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認し、純度を保証し得る。緩衝液をＰＢＳに交換してよく、吸光係数１.４３を使用するＯＤ２８０により濃度を決定し得る。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃に保存し得る。
【０２７０】
選択抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか否かを決定するために、各抗体を市販の試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化し得る。ビオチニル化ＭＡｂ結合をストレプトアビジン標識プローブで検出し得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記のとおりＩＣＯＳ被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して実施し得る。
【０２７１】
精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して実施し得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンで一夜、４℃で被覆し得る。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを１μg／ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブと反応させ得る。プレートを上記のとおり展開し、分析する。
【０２７２】
生存ＩＣＯＳ発現細胞へのモノクローナル抗体の結合を試験するために、フローサイトメトリーを使用できる。すなわち、細胞株発現膜結合ＩＣＯＳ(標準増殖条件下増殖)を、０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中種々の濃度のモノクローナル抗体と、４℃で１時間混合する。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下、フィコエリスリン(ＰＥ)標識抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを、単一細胞をゲーティングするために光および側方散乱性質を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により分析でき、標識抗体の結合が決定される。フローサイトメトリーアッセイ(に加えてまたはその代わりに)、蛍光顕微鏡法を使用する別のアッセイが使用され得る。細胞を正確に上記のとおりに染色し、蛍光顕微鏡法により試験し得る。この方法は個々の細胞の可視化を可能とするが、抗原密度により、感受性が減退し得る。
【０２７３】
抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、ウェスタンブロッティングによりＩＣＯＳ抗原との反応性についてさらに試験し得る。簡潔には、ＩＣＯＳ発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し得る。電気泳動後、分離抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ＩｇＧ結合を抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して試験し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で展開し得る。
【０２７４】
種々の抗ＩＣＯＳ抗体の結合親和性、交差反応性および結合速度論を分析する方法は、当分野で知られる標準アッセイ、例えば、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析およびＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００  ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析を含む。
【０２７５】
ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ヒトＩＣＯＳの細胞外領域に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体は、ＩＣＯＳの細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に結合する。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ヒトＩＣＯＳの細胞外領域およびカニクイザルＩＣＯＳの細胞外領域に特異的に結合する。ある実施態様において、高ｈｕＩＣＯＳ抗体は高親和性でヒトＩＣＯＳに結合する。
【０２７６】
VIII. 多特異的分子
ある実施態様において、ここに記載する抗体は多特異的、例えば、二重特異性または三特異的分子であり得る。多特異的抗体などの多特異的抗原結合分子は、各々異なるエピトープに特異的な２以上の抗原結合部位を含む。異なるエピトープは、同一または異なる抗原の部分であり得る。ある実施態様において、ある抗原結合部位はヒトＩＣＯＳに特異的であり、他は異なる抗原に特異的である。ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生するために、異なる結合特異性を有する他の抗原結合分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、他の抗体もしくは抗体フラグメントまたは受容体に対するリガンド)に連結される。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために、１つを超える他の抗原結合分子で誘導体化されるまたは連結される。従って、ここに提供されるのは、少なくとも一つのＩＣＯＳに対する第一結合特異性および第二の標的エピトープに対する第二結合特異性を含む二重特異性分子である。二重特異性分子が多特異的であるここに記載する実施態様において、分子はさらに第三結合特異性を含み得る。
【０２７７】
ある実施態様において、ここに記載する二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも一つ抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含むその抗体フラグメントを含む。抗体はまた軽鎖または重鎖二量体または、Ladner et al.、米国特許４,９４６,７７８(その内容を引用により明示的に本明細書に包含させる)に記載のＦｖまたは一本鎖構築物などの任意のその最小フラグメントでもあり得る。
【０２７８】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、ここに記載される二重特異性分子に用い得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２７９】
ここに記載する二重特異性分子は、当分野で知られる方法を使用して、構成要素結合特異性をコンジュゲートすることにより製造され得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に産生し、次いで互いにコンジュゲートし得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるならば、多様なカップリングまたは交差架橋剤が共有コンジュゲーションに使用され得る。交差架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を含む(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものを含む。好ましいコンジュゲーション剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両者ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能である。
【０２８０】
結合特異性が抗体であるとき、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により結合され得る。特に好ましい実施態様において、ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に奇数の、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０２８１】
あるいは、両結合特異性が同じベクターにコードされ、同じ宿主細胞で発現および集合され得る。この方法は、二重特異性分子が(ｍＡｂ×ｍＡｂ)、(ｍＡｂ×Ｆａｂ)、(Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２)または(リガンド×Ｆａｂ)融合タンパク質などの結合特異性の組み合わせを有するとき特に有用である。ここに記載する二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および１つの結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子の製造法は、例えば米国特許５,２６０,２０３；米国特許５,４５５,０３０；米国特許４,８８１,１７５；米国特許５,１３２,４０５；米国特許５,０９１,５１３；米国特許５,４７６,７８６；米国特許５,０１３,６５３；米国特許５,２５８,４９８；および米国特許５,４８２,８５８に記載される。
【０２８２】
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイを使用するなどの当分野で認識される方法を使用して確認し得る。これらのアッセイの各々は、一般に特に興味深いタンパク質−抗体複合体を、目的の複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を使用して検出する。
【０２８３】
IX. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と共に製剤された、１以上のここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物、例えば、医薬組成物である。従って、本発明の組成物は、表３５に示すＣＤＲ配列、重鎖および／または軽鎖可変領域配列または完全長重鎖および／または軽鎖配列を有するヒトまたはヒト化抗ｈｕＩＣＯＳ抗体(またはその抗原結合フラグメント)を含む。本発明の組成物はまた、表３５に示す配列のバリアントである配列を有する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体も含む。例えば、このような抗体はまた表３５に示すＣＤＲ配列、重鎖および／または軽鎖可変領域配列または完全長重鎖および／または軽鎖配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列も含む。
【０２８４】
このような組成物はまた、ここに記載する(例えば、２以上の異なる)抗体または免疫複合体または二重特異性分子の一つもしくは組み合わせも含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する、抗体(または免疫複合体または二重特異性抗体)の組み合わせを含み得る。
【０２８５】
ここに記載する医薬組成物はまた併用療法として、すなわち、抗ＩＣＯＳ抗体と他の薬剤と組み合わせで投与し得る。例えば、併用療法は、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体と、少なくとも一つの他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤の組み合わせを含み得る。併用療法に使用し得る治療剤の例は、ここに記載する抗体の使用の部分において後で詳細に記載する。
【０２８６】
ある実施態様において、ここに開示する医薬組成物は、癌の処置に使用される他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、ある癌に対する免疫応答を刺激する化学療法薬物、低分子薬物または抗体を含み得る。ある実施態様において、医薬組成物は、抗ｈｕＩＣＯＳに特異的な第一抗体および第二抗体を含む。
【０２８７】
ある実施態様において、第一抗体および第二抗体は、組成物に固定用量(すなわち、固定比)で存在する。他の実施態様において、この固定用量は少なくとも約１：２００〜少なくとも約２００：１、少なくとも約１：１５０〜少なくとも約１５０：１、少なくとも約１：１００〜少なくとも約１００：１、少なくとも約１：７５〜少なくとも約７５：１、少なくとも約１：５０〜少なくとも約５０：１、少なくとも約１：２５〜少なくとも約２５：１、少なくとも約１：１０〜少なくとも約１０：１、少なくとも約１：５〜少なくとも約５：１、少なくとも約１：４〜少なくとも約４：１、少なくとも約１：３〜少なくとも約３：１または少なくとも約１：２〜少なくとも約２：１  抗ｈｕＩＣＯＳ抗体mg対第二抗体mgである。ある実施態様において、固定用量は少なくとも約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２０、約１：１４０、約１：１６０、約１：１８０または約１：２００  抗ｈｕＩＣＯＳ抗体対第二抗体である。ある実施態様において、固定用量は少なくとも約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１２０：１、約１４０：１、約１６０：１、約１８０：１または約２００：１  第一抗体mg対第二抗体mgである。例えば、ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および第二抗体は、実施例１８に記載のとおり投与される。
【０２８８】
さらなる抗体は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体または抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の１以上を含む。
【０２８９】
ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。ある実施態様において、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴)に適する。ある実施態様において、担体は静脈内投与に適する。他の実施態様において、担体は皮下投与に適する。ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体を含む組成物は、一時的にヒアルロナンを分解する組み換えヒトヒアルロニダーゼ酵素(ｒＨｕＰＨ２０)を含むHalozymeのＥＮＨＡＮＺＥ(登録商標)薬物送達テクノロジーを使用して皮下送達される。ある実施態様において、ＥＮＨＡＮＺＥ(登録商標)薬物送達テクノロジーは、静脈内投与より迅速な組成物の皮下投与を可能にする。他の実施態様において、投与経路により、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、該化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の影響から化合物を保護する物質でコートされ得る。
【０２９０】
ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒性学的効果を何ら付与しない塩をいう(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などならびに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどならびに非毒性有機アミン、例えばＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【０２９１】
ここに記載する医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)水可溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(２)油可溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および(３)金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
【０２９２】
ここに記載する医薬組成物で用い得る適当な水性および非水性担体は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。
【０２９３】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の存在の阻止は、上記滅菌手順および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確実にし得る。組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を包含させるのが望ましいこともある。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によりもたらされ得る。
【０２９４】
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散体および無菌注射溶液または分散体の即座の製造のための無菌粉末を含む。ここでの薬学的に許容される担体の例は、さらに可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(ｓＨＡＳＥＧＰ)、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEXTM、Baxter International, Inc.)を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法のある例は、米国特許公開２００５／０２６０１８６および２００６／０１０４９６８に記載される。ある態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２９５】
薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で知られる。任意の慣用の媒体または薬剤が本活性化合物と不適合性でない限り、ここに記載する医薬組成物におけるそれらの使用は意図される。補助的活性化合物も組成物に包含され得る。
【０２９６】
治療組成物は、一般に製造および保存条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適する他の秩序構造(ordered structure)として製剤され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを包含させることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを包含させることによりもたらされ得る。
【０２９７】
無菌注射溶液は、活性化合物を必要な量で、必要に応じて、上記成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌精密濾過することにより製造され得る。一般に、分散体は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上記からの必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより製造される。無菌注射溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、予め滅菌濾過した溶液からの活性成分と任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
【０２９８】
単一投与形態を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方式により変わる。単一投与形態を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。１００パーセント中、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、活性成分約０.０１パーセント〜約９９パーセント、例えば、活性成分約０.１パーセント〜約７０パーセント、例えば、約１パーセント〜約３０パーセントの範囲であり得る。
【０２９９】
ある実施態様において、組成物は、１０mg／mL濃度でＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体などの抗ＩＣＯＳ抗体を含む。組成物は、静脈内投与用無菌、非発熱性、単回使用、防腐剤無添加、等張水溶液である。組成物は非希釈で投与しても注入前に必要なタンパク質濃度までさらに０.９％塩化ナトリウム注射で希釈してもよい。ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体は、次の添加物：Ｌ−ヒスチン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、スクロース、ペンテト酸(ジエチレントリアミンペンタ酢酸としても既知)、ポリソルベート８０および注射用水を含む。
【０３００】
投与レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調製される。例えば、単回ボーラスで投与してよく、数分割用量を経時的に投与してよくまたは治療状況の必要性により示されるとおり用量を比例的に減らしても増やしてもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経腸組成物を投与量単位形態で製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置する対象のための単位投与量として適する物理的に分離された単位をいい、各単位は必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された所定の量の活性化合物を含む。ここに記載される投与量単位形態の仕様は、(ａ)活性化合物の特有の特徴および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個体の感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合の分野に固有の限界により指示され、かつ直接依存する。
【０３０１】
抗体投与のために、投与量は、約０.０００１〜１００mg／kgおよびより一般に０.０１〜５mg／kg宿主体重の範囲であり得る。例えば、投与量は０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内であり得る。あるいは、抗体の投与は、２mg〜８００mgの範囲、例えば、２５mg、８０mg、２００mgまたは４００mgの用量であり得る一定用量である。処置レジメン例は、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回または６カ月に１回の投与を伴う。ある実施態様において、処置レジメンは、周期的投与間隔で異なる投与量の初期用量、次いで維持用量を含む。
【０３０２】
ある実施態様において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は、示す範囲内に入る。ある実施態様において、治療抗体を、複数回投与する。単独投与間の間隔は、例えば、毎週、３週に１回、４週に１回、毎月、３カ月毎または毎年であり得る。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中濃度の測定に従い、不規則であり得る。ある実施態様において、投与量は、約１〜１０００μg／ml、ある方法においては約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するように調節される。
【０３０３】
ある実施態様において、抗体を徐放製剤として投与し得る。徐放製剤による投与は、必要な投与頻度が少ないはずである。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。投与量および投与頻度は、処置が予防かまたは治療かにより変わり得る。予防的適用の場合、相対的に低投与量が、相対的に低頻度間隔で長期にわたり投与される。一部患者は、生涯にわたって処置を行け続ける。ある実施態様において、治療的処置のために相対的に高投与量が相対的に短間隔で投与される。ある実施態様において、相対的に高投与量が、疾患の進行が減少または停止するまで、例えば、患者が疾患の症状の部分または完全改善を示すまで投与される。ある実施態様において、治療的処置後に患者に予防的処置が投与される。
【０３０４】
ここに記載する医薬組成物の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために変わり得る。選択投与レベルは、ここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴および当分野で周知の同様の因子を含む、多様な薬物動態因子により変わる。
【０３０５】
ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体の「治療有効投与量」は、好ましくは疾患症状の重症度の低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防をもたらす。癌の場合、治療有効用量は、癌と関連するさらなる身体症状の悪化を好ましくは予防する。癌の症状は、当分野で周知であり、例えば、異常な黒子特性、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の外観変化、新たに着色された皮膚領域、異常黒子、爪下の黒ずんだ領域、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力、過度の疲労、摂食困難、食欲不振、慢性咳嗽、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨満感、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉攣縮、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。治療効果は、本発明のアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳモノクローナル抗体の最初の投与直後に観察されるか、一定時間および／または一連の投与後にのみ観察され得る。このような遅延有効性は、処置数カ月、例えば、最大６カ月、９カ月または１２カ月後にのみ観察され得る。
【０３０６】
治療有効用量は、疾患の初期または予備的徴候が存在するときに望まれ得るような、癌の発症を予防または遅延できる。従って、前記の何れかをモニターするあらゆる臨床的または生化学的アッセイを使用して、特定の処置が癌処置のための治療有効用量であるか否かを決定し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択投与経路などの因子に基づき、このような量を決定できる。
【０３０７】
ここに記載する組成物は、多様な当分野で知られる方法の１以上を使用して、１以上の投与経路で投与され得る。当業者に認識されるとおり、投与経路および／または方式は、所望の結果により変わる。ここに記載する抗体の投与経路の例は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。
【０３０８】
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的など、非経腸ではない経路で投与し得る。
【０３０９】
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤などの化合物を迅速な放出から保護する担体と共に調製し得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の多くの製造方法が特許されまたは一般に当業者に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０３１０】
治療組成物を、当分野で知られる医療機器を用いて投与し得る。例えば、好ましい実施態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許５,３９９,１６３；５,３８３,８５１；５,３１２,３３５；５,０６４,４１３；４,９４１,８８０；４,７９０,８２４；または４,５９６,５５６に開示のデバイスなどの無針皮下注射器で投与し得る。ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と共に用いる周知インプラントおよびモジュールは、制御速度で薬を送達するための植込み型微量注入ポンプを開示する米国特許４,４８７,６０３；皮膚から医薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許４,４８６,１９４；正確な注入速度で薬を送達する投薬注入ポンプを開示する米国特許４,４４７,２３３；連続的薬物送達のための可変流速植込み型注入装置を開示する米国特許４,４４７,２２４；多チャンバー区画を有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許４,４３９,１９６；および浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許４,４７５,１９６を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは当業者に知られる。
【０３１１】
ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、インビボでの適切な分布を可能にするように製剤され得る。例えば、血液−脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。ここに記載する治療的化合物がＢＢＢを通ることを確実にするために(所望であるならば)、例えば、リポソームで製剤され得る。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、それ故に標的化薬物送達を増強する１以上の部分を含む(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。ターゲティング部分は葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許５,４１６,０１６参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照のこと。
【０３１２】
またここに記載される範囲内にあるのは、ここに記載する抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性または多特異的分子または免疫複合体)および使用指示を含むキットである。キットは、さらに少なくとも一つのさらなる試薬または１以上のさらなるここに記載するヒト抗体を含み得る。キットは、キットの内容物の意図される使用を指示するラベルを含み得る。用語ラベルは、キット上にまたはキットと共にまたは他の方法でキットに付随されるあらゆる文書または記録媒体を含む。
【０３１３】
Ｘ. 使用方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＩＣＯＳシグナル伝達の刺激による免疫応答増強が関与する、多数のインビトロおよびインビボ用途を有する。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、モノクローナルヒトまたはヒト化抗体である。ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体(例えば、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４)を、インビトロまたはエクスビボで培養細胞にまたはヒト対象に投与して、多様な疾患における免疫を増強し得る。特定の実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体はアゴニスト抗体、すなわち、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体である。ここに提供されるのは、対象における免疫応答が増強、刺激または上方制御されるように、対象にここに記載する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法である。ある実施態様において、ここに記載する方法による抗ｈｕＩＣＯＳ抗体(すなわち、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体)の投与は、Ｔ細胞応答の共刺激を増強する。ある実施態様において、ここに記載する方法による抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の投与は、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御する。腫瘍は固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある実施態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある実施態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陽性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまたウイルス担持対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が増強される。ある実施態様において、ここに記載する方法による抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の投与は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御する。Ｔ細胞はＴｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞およびＴ細胞毒性(Ｔｃ)細胞であり得る。
【０３１４】
ある実施態様において、方法は、ヒト対象における免疫応答の増強をもたらし、ここで、このような増強が望ましい効果を有する。ある実施態様において、ヒト対象は、免疫応答、例えば、Ｔ細胞介在免疫応答増強により処置され得る障害を有するヒト患者である。特定の実施態様において、ヒト患者は癌を有する。ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は目的の抗原と共に投与してよくまたは該抗原は処置対象、例えば、腫瘍担持またはウイルス担持対象に既に存在し得る。ＩＣＯＳに対する抗体を他の薬剤と共に投与するとき、２剤は、別々に投与しても同時に投与してもよい。
【０３１５】
さらに提供されるのは、腫瘍細胞の増殖が対象において阻害されるように、対象にここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法である。また提供されるのは、慢性ウイルス感染が対象において処置されるように、対象にここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、対象における慢性ウイルス感染を処置する方法である。
【０３１６】
ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳアゴニスト抗体は、対象、例えば、ヒト患者に補助的治療、アジュバント治療またはネオアジュバント治療として投与される。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体での癌を有する対象の処置は、現在の標準治療と比較して長期持続性応答、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはそれ以上の長期生存、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年または１０年またはそれ以上の無再発生存をもたらし得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体での癌を有する対象の処置は、例えば、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年または１０年またはそれ以上、癌再発を予防するまたは癌再発を遅延させる。抗ＩＣＯＳ処置は、第一、第二またはそれ以降の選択処置として使用し得る。
【０３１７】
これらおよび他のここに記載する方法を、下にさらに詳述する。
【０３１８】
癌
ここに提供されるのは、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻止または減少されるおよび／または腫瘍が退行するように、対象にここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を単独で使用して、癌性腫瘍の増殖を阻止し得る。あるいは、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、下記のとおり、他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と共に使用し得る。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などのＰＤ−１阻害剤との組み合わせも提供される。抗ＣＴＬＡ−４抗体などのＣＴＬＡ−４阻害剤との組み合わせも提供される。ＰＤ−１阻害剤およびＣＴＬＡ−４阻害剤との組み合わせも提供される。
【０３１９】
ある態様において、ここに提供されるのは、対象に治療有効量のここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体、例えば、ヒト化形態のハムスター抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における癌を処置する方法である。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗ｈｕＩＣＯＳ抗体、例えば、ここに記載するヒト化抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の何れかであり得る。ある実施態様において、ここに記載する癌を処置する方法は、配列番号２０３のヒトＩＣＯＳタンパク質の１以上のアミノ酸残基でヒトＩＣＯＳと接触するヒト化抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を投与することを含む。他の実施態様において、方法は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体を投与することを含む。他の実施態様において、方法は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体を含む組成物を投与することを含む。
【０３２０】
癌の例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌(ＳＣＬＣ)、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、頸部癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫などの転移悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫を含む脳癌、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベスト誘発のものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌(例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)関連腫瘍)および二つの主要血液細胞系譜の何れか、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)由来の血液系腫瘍、例えば全てのタイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ球性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、孤発性顆粒球性肉腫および緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ１＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真正組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽細胞大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも称する)およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)；骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄���)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、へアリー細胞リンパ腫；骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉性起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍、シュワン腫；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉性起源の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、例えばＴ細胞障害、小細胞および大脳様細胞型のものを含む例えばＴ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)を含むが、これらに限定されないＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む他の腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒状リンパ球白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽細胞サブタイプ)；血管中心性(経鼻)Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄リンパ腫、ならびにこれら癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ここに記載する方法はまた転移癌、難治性癌(例えば、遮断ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１抗体での先の免疫療法に、例えば、癌難治性)および再発性癌処置にも使用し得る。
【０３２１】
ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、単剤療法として投与され得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳアゴニスト抗体は唯一の免疫刺激剤として投与される。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、他の薬剤と共に患者に投与される。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は免疫原性剤と投与される。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、癌ワクチンと共に投与される。ある実施態様において、癌ワクチンは、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞を含む(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。ある実施態様において、癌ワクチンはペプチド癌ワクチンであり、これは、ある実施態様において個別化されたペプチドワクチンである。ある実施態様において、ペプチド癌ワクチンは、多価長ペプチド、マルチペプチド、ペプチドカクテル、ハイブリッドペプチドまたはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである(例えば、Yamada et al., Cancer Sci, 104:14-21, 2013参照)。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体を、アジュバントと共に投与し得る。使用し得る腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００のペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞を含む。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が開発されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; see also Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたとき最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている。Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43。
【０３２２】
他の癌ワクチンは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)などのヒト癌と関連付けられているウイルスからのタンパク質を含み得る。ＩＣＯＳ阻害と共に使用し得る他の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質フラグメントを含み、これらＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達に高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
【０３２３】
樹状細胞は、抗原特異的応答の誘発に使用できる強力な抗原提示細胞である。樹状細胞はエクスビボで産生され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を負荷され得る(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。樹状細胞を、これら腫瘍抗原を同様に発現させる遺伝的手段によっても形質導入し得る。ＤＣは、免疫化目的で腫瘍細胞に直接融合され得る(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種の方法として、樹状細胞免疫化を、ＩＣＯＳアゴニズムと効率的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化(解放)し得る。
【０３２４】
ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体を、標準治療、例えば、手術、放射線および／または化学療法と共に投与する。ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体は、化学療法と共に投与され得る。ある実施態様において、抗ＩＣＯＳ抗体は、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ゲムシタビンまたはＦＯＬＦＯＸの１以上と共に投与される。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、カルボプラチンまたはｎａｂ−パクリタキセルと共に投与され得る。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、カルボプラチンおよびパクリタキセルと共に投与され得る。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、シスプラチンおよびペメトレキセドと共に投与され得る。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、シスプラチンおよびゲムシタビンと共に投与され得る。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、ＦＯＬＦＯＸと共に投与され得る。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、ＦＯＬＦＩＲＩと共に投与され得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、黒色腫の処置のためにダカルバジンと組み合わせて投与される。ある実施態様において、シスプラチンは、４週に１回１００mg／ml用量で静脈内投与される。ある実施態様において、抗ヒトＩＣＯＳアゴニスト抗体は、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよび／またはシクロホスファミドヒドロキシ尿素と共に投与され得る。ある実施態様において、アドリアマイシンは、２１日毎に６０mg／ml〜７５mg／ml用量として静脈内投与される。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、少なくとも一つの薬物での処置に耐性であるヒト患者に投与され、ここで、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の投与は、少なくとも一つの薬物に対する耐性を減少、軽減または抑止する。
【０３２５】
上記併用療法は、組み合わせ投与(２以上の治療剤が同じまたは別々の製剤に包含される場合)および別々の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、付加的治療剤および／またはアジュバント投与の前、同時および／または後に行い得る。本発明の抗体は放射線療法と組み合わせても使用し得る。
【０３２６】
このような組み合わせの他の例は、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体とインターロイキン−２(ＩＬ−２)の組み合わせである。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体とＩＬ−２の組み合わせは、腎細胞癌および黒色腫処置を含む、種々の癌の処置のためである。ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、種々の癌を処置するためにＩＬ−２経路アゴニストとの組み合わせである。組み合わせは、内容を全体として引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／０６５０８６(Nektar Therapeutics)およびＷＯ２０１５／１２５１５９(Nektar Therapeutics)に記載のもののような種々のＩＬ−２経路アゴニストを含む。ＷＯ２００６／１３８５７２(Nektar Therapeutics)は、分解可能結合およびコンジュゲートの製造に有用な重合体試薬を有するコンジュゲートならびに重合体試薬およびコンジュゲートの製造方法を提供し、全体を引用により本明細書に包含させる。
【０３２７】
ある実施態様において、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１  Ｓ２６７Ｅなどのここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体とＮＫＴＲ−２１４などのＩＬ−２経路アゴニストの組み合わせは、癌処置のために患者に投与される。下にさらに詳述するとおり、ＮＫＴＲ−２１４は、次の構造(ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｏｍｃ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデート誘導体、２０kDa、(「ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ」)：
【化１】
2020515239.tif 000008
を有する平均約６個のＦＭＯＣ(フルオレニルメチルオキシカルボニルクロライド)ベースのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)試薬を、次の１３２アミノ酸配列：
PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEE  60
ELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW  120
ITFSQSIISTLT  132 (配列番号219)
を有するタンパク質にコンジュゲートすることにより製造される。
【０３２８】
ＷＯ２０１２／０６５０８６は、ＩＬ−２部分およびポリエチレングリコールまたはその誘導体を含む１以上の非ペプチド、水可溶性ポリマーのコンジュゲートを記載する。具体的に、ＷＯ２０１２／０６５０８６の実施例２(パラグラフ２０２〜２０４)は、上記ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ構造を得るためのｒＩＬ−２のｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳでのペグ化を記載する。ＷＯ２０１５／１２５１５９の実施例１(パラグラフ６３〜６６)は、ＲＳＬＡＩＬ−２(ＮＫＴＲ−２１４)をもたらす、ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳでのＩＬ−２ペグ化のスケールアップされた試みを記載する。ＮＫＴＲ−２１４は、ＣＤ１２２を標的とするように設計されたサイトカイン(インターロイキン−２受容体ベータサブユニット、ＩＬ−２Ｒβとしても知られる)であり、ある免疫細胞(例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞)において、それら細胞を増大して抗腫瘍効果を促進することが判明したタンパク質である。
【０３２９】
ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を抗血管形成剤と組み合わせて投与し得る。
【０３３０】
細胞死によりＩＣＯＳアゴニズムと相乗性をもたらし得る他の併用療法は、放射線、手術およびホルモン除去である。
【０３３１】
ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、二重特異性抗体と共に投与され得る。二重特異性抗体は、２つの別々の抗原を標的とするために使用され得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用される(例えば、米国特許５,９２２,８４５および５,８３７,２４３参照)。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性抗体が、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用される。ある実施態様において、これらの応答のＴ細胞アームが、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体でのＩＣＯＳのアゴニズムにより増強される。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によりＤＣに特設送達し得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、腫瘍により発現される免疫抑制性タンパク質、例えば、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＩＬ−１０抗体および抗Ｆａｓリガンド抗体を減少または不活性化する抗体と組み合わせて使用する。
【０３３２】
慢性ウイルス感染
他の態様において、ここに記載する本発明は、対象が感染性疾患が処置されるように、対象に抗ｈｕＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０３３３】
上記の腫瘍へのその適応に類似して、抗体介在ＩＣＯＳアゴニズムは単独でまたはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を増強し得る。この治療法が特に有用であり得る病原体の例は、現在有効なワクチンがない病原体または慣用のワクチンが完全には程遠い有効性である病原体を含む。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア属、マラリア、リーシュマニア、スタフィロコッカス・アウレウス、シュードモナス・エルジノーサを含むが、これらに限定されない。ＩＣＯＳアゴニズムは、感染の経過と共に提示される抗原が変わるヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)などの因子による確立された感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは抗ヒトＩＣＯＳ抗体投与時に外来性として認識され、それ故に強いＴ細胞応答を引き起こす。
【０３３４】
ここに記載する方法により処置し得る感染を引き起こす病原性ウイルスの一部例は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
【０３３５】
ここに記載する方法により処置し得る感染を引き起こす病原性細菌の一部例は、クラミジア、リケッチア性細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス症、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。
【０３３６】
ここに記載する方法により処置し得る感染を引き起こす病原性真菌の一部例は、カンジダ(アルビカンス、クルーセイ、グラブラータ、トロピカリスなど)、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ケカビ目(ムコール、ユミケカビ、クモノスカビ)、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムを含む。
【０３３７】
ここに記載する方法により処置し得る感染を引き起こす病原性寄生虫の一部例は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ種、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、ブルセイトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンディ、ブラジル鉤虫を含む。
【０３３８】
ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を対象に投与する方法は、サイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または二重特異性抗体治療などの他の形態の免疫療法と組み合わせ得る。
【０３３９】
併用療法
ある態様において、ここに提供されるのは、例えば、癌処置のための、併用療法の方法であって、ここで、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体(例えば、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体)が、免疫応答を増強し、それにより対象における免疫応答のさらなる増強、刺激または上方制御に有効である１以上のさらなる薬剤、例えば、抗体と共に投与される。ここに提供されるのは、個体に抗ｈｕＩＣＯＳ抗体(例えば、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４)を他の抗癌剤または癌治療と共に投与することを含む、個体における癌を処置するかまたは進行を遅延する方法である。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、上記化学療法または化学療法剤または放射線療法または放射治療剤と共に投与され得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を化学療法または化学療法剤または放射線療法または放射治療剤と共に投与し得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、標的化治療または標的化治療剤と共に投与され得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、免疫療法または免疫治療剤、例えばモノクローナル抗体と共に投与され得る。
【０３４０】
ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、Ｔ細胞上の(ｉ)他の共刺激受容体のアゴニストおよび／または(ii)阻害性シグナルのアンタゴニストと組み合わせ得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む併用療法は、対象の抗原特異的Ｔ細胞応答の増強をもたらす。ある実施態様において、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体は、免疫応答を増強するための免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである共刺激性および共阻害性分子を標的とする薬剤と共に投与され得る。ある実施態様において、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体(例えば、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７および２６４４)は、共刺激性または共阻害性分子のリガンドを標的とする薬剤と共に投与され得る。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドのファミリーは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含むＢ７ファミリーである。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの他のファミリーは、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンフォトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンフォトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む同族ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合するＴＮＦファミリーの分子である。
【０３４１】
他の態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、例えば、癌などの増殖性疾患処置のために、免疫応答を刺激するために、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ)のアンタゴニストまたは他の「免疫抑制性サイトカイン」またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインと組み合わせて使用し得る。
【０３４２】
ある態様において、Ｔ細胞応答は、ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および１以上の(ｉ)ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４などのＴ細胞活性化を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)のアンタゴニストおよび(ii)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨなどのＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニストの組み合わせにより刺激される。
【０３４３】
上記ンパク質の一つを調節し、癌の処置のために、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体、例えば、ここに記載するものと組み合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイ(登録商標)／イピリムマブまたはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ピディリズマブ／ＣＴ−０１１(ＰＤ−１に対する)、キイトルーダ(登録商標)／ペムブロリズマブ／ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２に対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＣＰ−８７０８９３またはダセツズマブ／ＳＧＮ−４０(ＣＤ４０ − Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３−ＷＯ１１／１０９４００に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ウレルマブ／ＢＭＳ−６６３５１３およびＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する)、バルリルマブ／ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、ＭＥＤＩ−６３８３およびＭＥＤＩ−６４６９(ＯＸ４０に対する)、ＲＧ−７８８８(ＯＸ４０Ｌ−ＷＯ０６／０２９８７９に対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)を含む。従って、ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体(例えばＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ)を抗ＰＤ−１抗体(例えばニボルマブ)および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体(例えばイピリムマブ)と組み合わせる。
【０３４４】
癌処置のためにアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と組み合わせ得る他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ＫＩＲアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせる。
【０３４５】
併用療法のためにさらに他の薬剤は、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９；ＷＯ１３／１６９２６４；ＷＯ１４／０３６３５７)を含むＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含むが、これらに限定されない、マクロファージまたは単球を阻害するまたは枯渇させる薬剤を含む。
【０３４６】
ある実施態様において、ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、１以上の陽性共刺激受容体をライゲートするアゴニスト剤、阻害性受容体によりシグナル伝達を減弱させる遮断剤および１以上の抗腫瘍Ｔ細胞の頻度出現頻度を全身性に増加させる薬剤、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制性経路を克服する薬剤(例えば、阻害性受容体結合(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)遮断、Ｔｒｅｇ枯渇または阻害(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇使用)、ＩＤＯなどの代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは疲弊回復／予防)および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する薬剤と使用する。
【０３４７】
ここに提供されるのは、例えば腫瘍増殖を阻害するまたは抗ウイルス応答を刺激するため、対象における免疫応答が刺激されるように、対象にＩＣＯＳアゴニスト、例えば、抗体および１以上の付加的免疫刺激性抗体、例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／またはＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体を投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法である。ある実施態様において、対象は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体が投与される。ある実施態様において、対象は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体が投与される。ある実施態様において、対象は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体が投与される。ある実施態様において、少なくとも一つの付加的免疫刺激性抗体(例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体)はヒト抗体である。あるいは、少なくとも一つの付加的免疫刺激性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウスまたはハムスター抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製)であり得る。
【０３４８】
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様においては、癌は非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)または結腸直腸癌(ＣＲＣ)である。ある実施態様において、癌は、例えばフローサイトメトリーまたは免疫組織化学(ＩＨＣ)により検出して、(ｉ)ＣＤ３２Ａ／ＣＤ３２Ｂ(ＦｃγＲIIａ／Ｆｃγ)の発現増加および／または(ii−ａ)ＩＣＯＳの発現増加または(ii−ｂ)ＩＣＯＳ−Ｌの発現減少を有する腫瘍により特徴づけられる。中〜高ＩＣＯＳ  ＲＮＡ発現を有する腫瘍タイプは、頭頸部、肺、頸部、腎臓、膵臓、乳房および結腸直腸癌を含み、これらの癌がＩＣＯＳタンパク質発現増加も示すはずであることを示唆する。ある実施態様において、アゴニストは治療量以下の用量で投与される、抗ＰＤ−１抗体は治療量以下の用量で投与されるまたは両者は治療量以下の用量で投与される。またここで提供されるのは、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置に付随する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、方法は、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体はヒトモノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ここに開示する抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などのヒト化モノクローナル抗体である。
【０３４９】
当分野で知られる抗ＰＤ−１抗体がここに記載する方法において使用され得る。高親和性でＰＤ−１に特異的に結合する種々のヒトモノクローナル抗体は、米国特許８,００８,４４９に開示される。米国特許８,００８,４４９に開示される抗ＰＤ−１ヒト抗体は、次の特徴の１以上を示すことが証明されている：(ａ)Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサー系を使用する表面プラズモン共鳴により決定して、ヒトＰＤ−１に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する；(ｂ)ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない；(ｃ)混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を増加させる；(ｄ)ＭＬＲアッセイでインターフェロン−γ産生を増加させる；(ｅ)ＭＬＲアッセイでＩＬ−２分泌を増加させる；(ｆ)ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する；(ｇ)ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を阻害する；(ｈ)抗原特異的記憶応答を刺激する；(ｉ)抗体応答を刺激する；および(ｊ)インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する。本発明で使用可能な抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、前記特徴の少なくとも１つ、ある実施態様において、少なくとも５つを示すモノクローナル抗体である。
【０３５０】
他の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、例えば、米国特許６,８０８,７１０、７,４８８,８０２、８,１６８,７５７および８,３５４,５０９、ＵＳ公開２０１６／０２７２７０８およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２００８／１５６７１２、ＷＯ２０１５／１１２９００、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１４／２０６１０７、ＷＯ２０１５／３５６０６、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１７／０２０２９１、ＷＯ２０１７／０２０８５８、ＷＯ２０１６／１９７３６７、ＷＯ２０１７／０２４５１５、ＷＯ２０１７／０２５０５１、ＷＯ２０１７／１２３５５７、ＷＯ２０１６／１０６１５９、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１７／０４０７９０、ＷＯ２０１７／１３３５４０、ＷＯ２０１７／１３２８２７、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１０６０６１、ＷＯ２０１７／１９８４６、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５およびＷＯ２０１７／１３３５４０に開示され、これら各々を引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０３５１】
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブ(オプジーボ(登録商標)、５Ｃ４、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６およびＯＮＯ−４５３８としても知られる)、ペムブロリズマブ(Merck；キイトルーダ(登録商標)、ランブロリズマブおよびＭＫ−３４７５としても知られる；ＷＯ２００８／１５６７１２参照)、ＰＤＲ００１(Novartis；ＷＯ２０１５／１１２９００参照)、ＭＥＤＩ−０６８０(AstraZeneca；ＡＭＰ−５１４としても知られる；ＷＯ２０１２／１４５４９３参照)、セミプリマブ(Regeneron；ＲＥＧＮ−２８１０としても知られる；ＷＯ２０１５／１１２８００参照)、ＪＳ００１(TAIZHOU JUNSHI PHARMA；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)参照)、ＢＧＢ−Ａ３１７(Beigene；ＷＯ２０１５／３５６０６およびＵＳ２０１５／００７９１０９参照)、ＩＮＣＳＨＲ１２１０(Jiangsu Hengrui Medicine；ＳＨＲ−１２１０としても知られる；ＷＯ２０１５／０８５８４７参照；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017))、ＴＳＲ−０４２(Tesaro Biopharmaceutical；ＡＮＢ０１１としても知られる；ＷＯ２０１４／１７９６６４参照)、ＧＬＳ−０１０(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；ＷＢＰ３０５５としても知られる；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)参照)、ＡＭ−０００１(Armo)、ＳＴＩ−１１１０(Sorrento Therapeutics；ＷＯ２０１４／１９４３０２参照)、ＡＧＥＮ２０３４(Agenus；ＷＯ２０１７／０４０７９０参照)、ＭＧＡ０１２(Macrogenics；ＷＯ２０１７／１９８４６参照)またはＩＢＩ３０８(Innovent；ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５およびＷＯ２０１７／１３３５４０参照)である。
【０３５２】
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブである。ニボルマブは、ＰＤ−１リガンド(ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２)との相互作用を選択的に阻止し、それにより抗腫瘍Ｔ細胞機能の下方制御を遮断する完全ヒトＩｇＧ４(Ｓ２２８Ｐ)ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤抗体である(米国特許８,００８,４４９；Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56)。
【０３５３】
他の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体はペムブロリズマブである。ペムブロリズマブは、ヒト細胞表面受容体ＰＤ−１(計画死−１または計画細胞死−１)に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４(Ｓ２２８Ｐ)抗体である。ペムブロリズマブは、例えば、米国特許８,３５４,５０９および８,９００,５８７に記載される。
【０３５４】
ここに開示する方法において使用可能な抗ＰＤ−１抗体はまた、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、任意のここに開示する抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブとヒトＰＤ−１への結合について交差競合する単離抗体である(例えば、米国特許８,００８,４４９および８,７７９,１０５；ＷＯ２０１３／１７３２２３参照)。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ここに記載する抗ＰＤ−１抗体の何れか、例えば、ニボルマブと同じエピトープに結合する。抗体が抗原への結合について交差競合する能力は、これらのモノクローナル抗体が抗原の同じエピトープ領域に結合し、他の交差競合抗体のその特定のエピトープ領域への結合を立体的に障害することを示す。これらの交差競合抗体は、ＰＤ−１の同じエピトープ領域への結合により、対照抗体、例えば、ニボルマブと極めて類似する機能的性質を有することが予測される。交差競合抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーなどの標準ＰＤ−１結合アッセイで、ニボルマブと交差競合する能力に基づき、容易に同定され得る(例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３参照)。
【０３５５】
ある実施態様において、ヒトＰＤ−１抗体、ニボルマブとヒトＰＤ−１の結合について交差競合するまたは同じエピトープ領域に結合する抗体はモノクローナル抗体である。ヒト対象への投与のために、これらの交差競合抗体はキメラ抗体、改変抗体またはヒト化またはヒト抗体である。このようなキメラ、改変、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、当分野で周知の方法により製造および単離され得る。
【０３５６】
ここに開示する発明の方法において使用可能な抗ＰＤ−１抗体はまた上記抗体の抗原結合部分を含む。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントにより実施されることは広く証明されている。
【０３５７】
ここに開示する方法または組成物における使用に適する抗ＰＤ−１抗体は、高特異性および親和性でＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１およびまたはＰＤ−Ｌ２の結合を遮断し、かつＰＤ−１シグナル伝達経路の免疫抑制性効果を阻止する抗体である。ここに開示する組成物または方法の何れにおいても、抗ＰＤ−１「抗体」は、ＰＤ−１受容体に結合し、リガンド結合阻害および免疫系上方制御に全抗体と類似する機能的性質を示す、抗原結合部分またはフラグメントである。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＰＤ−１への結合についてニボルマブと交差競合する。
【０３５８】
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は治療量以下の用量で投与される、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は治療量以下の用量で投与されるまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置に付随する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ここに開示する抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などのヒト化モノクローナル抗体である。
【０３５９】
当分野で知られる抗ＰＤ−Ｌ１抗体が本発明の方法において使用され得る。本発明の方法において有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例は、米国特許９,５８０,５０７に開示される抗体を含む。米国特許９,５８０,５０７に開示される抗ＰＤ−Ｌ１ヒトモノクローナル抗体は、次の特徴の１以上を示すことが証明されている：(ａ)Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサー系を使用するＳＰＲにより決定して、ヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する；(ｂ)混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を増加させる；(ｃ)ＭＬＲアッセイでインターフェロン−γ産生を増加させる；(ｄ)ＭＬＲアッセイでＩＬ−２分泌を増加させる；(ｅ)抗体応答を刺激する；および(ｆ)Ｔ細胞エフェクター細胞および／または樹状細胞上のＴ制御性細胞の作用を逆転させる。本発明において使用可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、前記特徴の少なくとも１つ、ある実施態様において、少なくとも５つを示すモノクローナル抗体を含む。
【０３６０】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＢＭＳ−９３６５５９(１２Ａ４、ＭＤＸ−１１０５としても知られる；例えば、米国特許７,９４３,７４３およびＷＯ２０１３／１７３２２３参照)、アテゾリズマブ(Roche；テセントリク(登録商標)；ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６としても知られる；ＵＳ８,２１７,１４９参照；Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000もまた参照)、デュルバルマブ(AstraZeneca；イミフィンジTM、ＭＥＤＩ−４７３６としても知られる；ＷＯ２０１１／０６６３８９参照)、アベルマブ(Pfizer；バベンチオ(登録商標)、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃとしても知られる；ＷＯ２０１３／０７９１７４参照)、ＳＴＩ−１０１４(Sorrento；ＷＯ２０１３／１８１６３４参照)、ＣＸ−０７２(Cytomx；ＷＯ２０１６／１４９２０１参照)、ＫＮ０３５(3D Med/Alphamab；Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)参照)、ＬＹ３３０００５４(Eli Lilly Co.；例えば、ＷＯ２０１７／０３４９１６参照)またはＣＫ−３０１(Checkpoint Therapeutics；Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)参照)である。
【０３６１】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１抗体はアテゾリズマブ(テセントリク(登録商標))である。アテゾリズマブは、完全ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０３６２】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１抗体はデュルバルマブ(イミフィンジTM)である。デュルバルマブは、ヒトＩｇＧ１カッパモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０３６３】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１抗体はアベルマブ(バベンチオ(登録商標))である。アベルマブは、ヒトＩｇＧ１ラムダモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０３６４】
他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、２８−８、２８−１、２８−１２、２９−８、５Ｈ１または任意のこれらの組み合わせである。
【０３６５】
ここに開示する方法において使用可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、任意のここに開示する抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブおよび／またはアベルマブとヒトＰＤ−Ｌ１への結合について交差競合する単離抗体も含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ここに記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の何れか、例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブおよび／またはアベルマブと同じエピトープに結合する。抗体が抗原への結合について交差競合する能力は、これらの抗体が抗原の同じエピトープ領域に結合し、他の交差競合抗体のその特定のエピトープ領域への結合を立体的に障害することを示す。これらの交差競合抗体は、ＰＤ−Ｌ１の同じエピトープ領域への結合により、対照抗体、例えば、アテゾリズマブおよび／またはアベルマブと極めて類似する機能的性質を有することが予測される。交差競合抗体、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーなどの標準ＰＤ−Ｌ１結合アッセイで、アテゾリズマブおよび／またはアベルマブと交差競合する能力に基づき、容易に同定され得る(例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３参照)。
【０３６６】
ある実施態様において、アテゾリズマブ、デュルバルマブおよび／またはアベルマブなどのヒトＰＤ−Ｌ１抗体とヒトＰＤ−Ｌ１への結合について交差競合するまたは同じエピトープ領域に結合する抗体はモノクローナル抗体である。ヒト対象への投与のために、これらの交差競合抗体はキメラ抗体、改変抗体またはヒト化またはヒト抗体である。このようなキメラ、改変、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、当分野で周知の方法により製造および単離され得る。
【０３６７】
ここに開示する発明の方法において使用可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた上記抗体の抗原結合部分を含む。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントにより実施されることは広く証明されている。
【０３６８】
ここに開示する方法または組成物における使用に適する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、高特異性および親和性でＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−１の結合を遮断し、ＰＤ−１シグナル伝達経路の免疫抑制性効果を阻止する抗体である。ここに開示する組成物または方法の何れにおいても、抗ＰＤ−Ｌ１「抗体」は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、阻害性受容体結合および免疫系上方制御に全抗体と類似する機能的性質を示す、抗原結合部分またはフラグメントである。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合についてアテゾリズマブ、デュルバルマブおよび／またはアベルマブと交差競合する。
【０３６９】
ある実施態様において、本発明のアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、ＰＤ−１アンタゴニスト(例えば、ＷＯ０６／１２１１６８に記載の、ＭＤＸ１１０６としても知られる、ニボルマブ)などのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達アンタゴニストまたは第三免疫治療剤と組み合わせたＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト(例えば、ニボルマブおよびイピリムマブと組み合わせたＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅなどの抗ＩＣＯＳ抗体)と組み合わせる。ある実施態様において、第三免疫治療剤はＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体である。ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヤーボイ(登録商標)(イピリムマブまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載)またはトレメリムマブ(以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)である。ある実施態様において、第三免疫治療剤は、ＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ−４０アンタゴニスト、例えば、ここに開示する抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０抗体である。ある実施態様において、第三免疫治療剤は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、アゴニストＧＩＴＲ抗体である。適当なＧＩＴＲ抗体は、例えば、ＢＭＳ−９８６１５３、ＢＭＳ−９８６１５６、ＴＲＸ−５１８(ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６)およびＭＫ−４１６６(ＷＯ１１／０２８６８３)を含む。ある実施態様において、第三免疫治療剤はＩＤＯアンタゴニストである。適当なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２)、インドキシモドまたはＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７)を含む。
【０３７０】
ここに提供されるのは、対象にここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は治療量以下の用量で投与される、抗ＣＴＬＡ−４抗体は治療量以下の用量で投与されるまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置に付随する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。
【０３７１】
当分野で知られる抗ＣＴＬＡ−４抗体が本発明方法において使用され得る。本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４とヒトＢ７受容体の相互作用を妨害するようにヒトＣＴＬＡ−４に結合する。ＣＴＬＡ−４とＢ７の相互作用がＣＴＬＡ−４受容体を担持するＴ細胞の不活性化に至るシグナルを伝達するため、該相互作用の妨害は、このようなＴ細胞の活性化を効率的に誘発、状況または延長し、それにより免疫応答を誘発、状況または延長する。
【０３７２】
高親和性でＣＴＬＡ−４と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体は、米国特許６,９８４,７２０に開示されている。他の抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体は、例えば、米国特許５,９７７,３１８、６,０５１,２２７、６,６８２,７３６および７,０３４,１２１および国際公開ＷＯ２０１２／１２２４４４、ＷＯ２００７／１１３６４８、ＷＯ２０１６／１９６２３７およびＷＯ２０００／０３７５０４に開示されており、その各々を、引用により全体として本明細書に包含させる。米国特許６,９８４,７２０に開示の抗ＣＴＬＡ−４ヒトモノクローナル抗体は、次の特徴の１以上を示すことが証明されている：(ａ)Ｂｉａｃｏｒｅ分析により決定して、少なくとも約１０７Ｍ−１または約１０９Ｍ−１または約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１以上の平衡会合定数(Ｋａ)により反映される結合親和性で、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合；(ｂ)少なくとも約１０３、約１０４または約１０５ｍ−１ｓ−１の会合速度定数(ｋａ)；(ｃ)少なくとも約１０３、約１０４または約１０５ｍ−１ｓ−１の解離速度定数(ｋｄ)；および(ｄ)ＣＴＬＡ−４のＢ７−１(ＣＤ８０)およびＢ７−２(ＣＤ８６)への結合阻害。本発明に有用な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、前記特徴の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つを示すモノクローナル抗体を含む。
【０３７３】
ある実施態様において、ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブ(ヤーボイ(登録商標)、ＭＤＸ−０１０、１０Ｄ１としても知られる；米国特許６,９８４,７２０参照)、ＭＫ−１３０８(Merck)、ＡＧＥＮ−１８８４(Agenus Inc.；ＷＯ２０１６／１９６２３７参照)またはトレメリムマブ(AstraZeneca；チシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６としても知られる；ＷＯ２０００／０３７５０４およびRibas, Update Cancer Ther. 2(3): 133-39 (2007)参照)である。具体的な実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブである。
【０３７４】
具体的な実施態様において、ＣＴＬＡ−４抗体は、ここに開示する方法において使用するためのイピリムマブである。イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４のそのＢ７リガンドへの結合を遮断し、それによりＴ細胞活性化を刺激し、進行型黒色腫を有する患者の全生存(ＯＳ)を改善する完全ヒト、ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。
【０３７５】
具体的な実施態様において、ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブである。
【０３７６】
具体的な実施態様において、ＣＴＬＡ−４抗体はＭＫ−１３０８である。
【０３７７】
具体的な実施態様において、ＣＴＬＡ−４抗体はＡＧＥＮ−１８８４である。
【０３７８】
ここに開示する方法において使用可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体はまた、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、任意のここに開示する抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブとヒトＣＴＬＡ−４への結合について交差競合する単離抗体である。ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ここに記載する抗ＣＴＬＡ−４抗体の何れか、例えば、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと同じエピトープに結合する。抗体が抗原への結合について交差競合する能力は、これらの抗体が抗原の同じエピトープ領域に結合し、他の交差競合抗体のその特定のエピトープ領域への結合を立体的に障害することを示す。これらの交差競合抗体は、ＣＴＬＡ−４の同じエピトープ領域への結合により、対照抗体、例えば、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと極めて類似する機能的性質を有することが予測される。交差競合抗体、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーなどの標準ＣＴＬＡ−４結合アッセイで、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと交差競合する能力に基づき、容易に同定され得る(例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３参照)。
【０３７９】
ある実施態様において、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブなどのヒトＣＴＬＡ−４抗体とヒトＣＴＬＡ−４への結合について交差競合するまたは同じエピトープ領域に結合する抗体はモノクローナル抗体である。ヒト対象への投与のために、これらの交差競合抗体はキメラ抗体、改変抗体またはヒト化またはヒト抗体である。このようなキメラ、改変、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、当分野で周知の方法により製造および単離され得る。
【０３８０】
ここに開示する発明の方法において使用可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体はまた上記抗体の抗原結合部分を含む。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントにより実施されることは広く証明されている。
【０３８１】
ここに開示する方法または組成物における使用に適する抗ＣＴＬＡ−４抗体は、高特異性および親和性でＣＴＬＡ−４と結合し、ＣＴＬＡ−４の活性を遮断し、ＣＴＬＡ−４とヒトＢ７受容体の相互作用を妨害する抗体である。ここに開示する組成物または方法の何れにおいても、抗ＣＴＬＡ−４「抗体」は、ＣＴＬＡ−４に結合し、ＣＴＬＡ−４とヒトＢ７受容体の相互作用阻害および免疫系上方制御に全抗体と類似する機能的性質を示す、抗原結合部分またはフラグメントである。ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＴＬＡ−４との結合についてイピリムマブおよび／またはトレメリムマブと交差競合する。
【０３８２】
ある実施態様において、本発明のアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、第三免疫治療剤と組み合わせた抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせる。ある実施態様において、第三免疫治療剤は、ここに開示する抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０抗体などのＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ−４０アンタゴニストである。ある実施態様において、第三免疫治療剤はアゴニストＧＩＴＲ抗体などのＧＩＴＲアゴニストである。適当なＧＩＴＲ抗体は、例えば、ＢＭＳ−９８６１５３、ＢＭＳ−９８６１５６、ＴＲＸ−５１８(ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６)およびＭＫ−４１６６(ＷＯ１１／０２８６８３)を含む。ある実施態様において、第三免疫治療剤はＩＤＯアンタゴニストである。適当なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２)、インドキシモドまたはＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７)を含む。
【０３８３】
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。さらなる実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は治療量以下の用量で投与される、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置に付随する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、ここに開示する抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などのヒト化モノクローナル抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例は、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載される抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６である。使用し得る他の抗ＬＡＧ−３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載のＩＭＰ７３１またはＩＭＰ−３２１である。これら抗体の何れかと競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体も組み合わせ処置に使用し得る。
【０３８４】
ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は５×１０-８ＭのＫＤでヒトＬＡＧ−３に結合する、１×１０-８ＭのＫＤでヒトＬＡＧ−３に結合する、５×１０-９ＭのＫＤでヒトＬＡＧ−３に結合するまたは１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０ＭのＫＤでヒトＬＡＧ−３に結合する。
【０３８５】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体およびＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの１以上の第二標的抗原に対するアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の投与は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強する。本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。ここに記載する併用療法で処置するための癌の例は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体での単剤療法の記載で上に述べたものを含むが、それらに限定されない。
【０３８６】
ある実施態様において、ここに記載する治療抗体の組み合わせを、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時にまたは各抗体が薬学的に許容される担体中にある別々の組成物として同時に投与し得る。他の実施態様において、治療抗体の組み合わせを、逐次的に投与し得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、抗ＣＴＬＡ−４抗体が最初に投与され、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次またはアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初に投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体が次であるように逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、抗ＰＤ−１抗体が最初に投与され、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次またはアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初に投与され、抗ＰＤ−１抗体が次であるように逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が最初に投与され、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次またはアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初に投与され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が次であるように、逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＬＡＧ−３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を、抗ＬＡＧ−３抗体が最初に投与され、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次またはアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初に投与され、抗ＬＡＧ−３抗体が次であるように逐次的に投与し得る。
【０３８７】
さらに、併用療法が１回を超えて逐次的に投与されるならば、逐次投与の順番は、各投与時点で逆でも同じ順番のままでもよく、逐次投与は、同時投与または任意のこれらの組み合わせと組み合わせ得る。例えば、組み合わせ抗ＣＴＬＡ−４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の最初の投与は同時でよく、二回目の投与は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が最初でアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次の逐次であってよく、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初で抗ＣＴＬＡ−４抗体が次などの逐次であってよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の最初の投与は同時でよく、二回目の投与は、抗ＰＤ−１抗体が最初でアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次の逐次であってよく、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初で抗ＰＤ−１抗体が次などの逐次であってよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の最初の投与は同時でよく、二回目の投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が最初でアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次の逐次であってよく、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初で抗ＰＤ−Ｌ１抗体が次などの逐次であってよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＬＡＧ−３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の最初の投与は同時でよく、二回目の投与は、抗ＬＡＧ−３抗体が最初でアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が次の逐次であってよく、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体が最初で抗ＬＡＧ−３抗体が次などの逐次であってよい。他の代表的投与スキームは、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳが最初で抗ＣＴＬＡ−４抗体(および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)が次の最初の投与を含み、その後の投与は同時であり得る。
【０３８８】
ある実施態様において、唯一の免疫治療剤としてのアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体またはアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と１以上のさらなる免疫療法的抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)の組み合わせを、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)などの免疫原性剤とさらに組み合わせ得る。使用し得る腫瘍ワクチンの非限定的は、ｇｐ１００のペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞を含む(さらに下記)。ＩＣＯＳアゴニストおよび１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を、標準癌処置ともさらに組み合わせ得る。例えば、ＩＣＯＳアゴニストおよび１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を化学療法レジメと組み合わせ得る。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳアゴニスト抗体を、黒色腫の処置のためにダカルバジンと組み合わせた抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体と共に患者に投与する。ある実施態様において、抗ｈｕＩＣＯＳアゴニスト抗体を、黒色腫を含む癌の処置のためにインターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせた抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体と共に患者に投与する。理論に拘束されることを願わないが、ＩＣＯＳアゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３拮抗作用と化学療法の組み合わせ使用は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用が抗原提示経路の腫瘍抗原レベルを増加させ得るため、相乗的に機能し得る。細胞毒性により、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３拮抗作用を伴いまたは伴わない組み合わせＩＣＯＳアゴニズムと相乗作用をもたらし得る他の併用療法は、放射線、手術またはホルモン除去を含む。他の実施態様において、血管形成阻害剤を、抗ｈｕＩＣＯＳ抗化学療法または化学療法剤または放射線療法または放射治療剤体およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３拮抗作用と組み合わせ得る。
【０３８９】
ある実施態様において、唯一の免疫治療剤としての抗ｈｕＩＣＯＳ抗体または抗ｈｕＩＣＯＳ抗体とＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組み合わせを、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化させる二重特異性抗体とも組み合わせて使用し得る。例えば、米国特許５,９２２,８４５および５,８３７,２４３参照。二重特異性抗体を２つの別々の抗原を標的化するために使用し得る。これらの応答のＴ細胞アームが、ＩＣＯＳアゴニズムとＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の組み合わせの使用により増強される。
【０３９０】
ある実施態様において、唯一の免疫治療剤としての抗ＩＣＯＳ抗体または抗ＩＣＯＳ抗体とさらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体の組み合わせを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、リンフォシド(登録商標)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などの抗新生物剤と共にも使用し得る。例として、理論に拘束されることを願わないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートした抗癌抗体での処置は癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)をもたらし得て、これは免疫刺激剤、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＬＡＧ−３抗体が介在する免疫応答を増強し得る。ある実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および所望によりさらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体、同時にまたは逐次的にまたは任意のこれらの組み合わせと組み合わせた抗癌剤、例えば、抗体を含んでよく、これは過増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の処置は、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０３９１】
ここに提供されるのは、対象に抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴いまたは伴わずにアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患(例えば、癌)の処置に付随する有害事象を軽減、軽快または抑止する方法である。ある実施態様において、方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与するによる免疫刺激性治療抗体誘発大腸炎または下痢の発生率を減少させる。ここで使用する「非吸収性ステロイド」は、肝臓での代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるように、広範な初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。ここに記載するある実施態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後、主に肝臓で、広範に代謝される局所作用性グルココルチコステロイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発された、ブデソニドのｐＨおよび時間依存的経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、米国で回腸および／または上行結腸が関与する軽度〜中程度クローン病の処置に対して承認されている。クローン病処置のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)の通常の経口投与量は６〜９mg／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、腸で放出され、その後腸粘膜に吸収および保持される。腸粘膜標的組織を通過したら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は肝臓のチトクロムＰ４５０系により、無視できるほどのグルココルチコイド活性を有する代謝物へと広範代謝される。それにより、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低バイオアベイラビリティは、初回通過代謝があまり広範ではない他のグルココルチコイドと比較して、治療可能比を改善する。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドより少ない視床下部−下垂体抑制を含む、少ない有害作用をもたらす。しかしながら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)の慢性投与は、副腎皮質亢進および副腎抑制などの全身性グルココルチコイド効果をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610参照。
【０３９２】
ある実施態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせた、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３アンタゴニスト(すなわち、ＩＣＯＳおよび所望により抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体に対する免疫刺激性治療抗体)を伴うまたは伴わない抗ＩＣＯＳ抗体を、さらにサリチレートと組み合わせ得る。サリチレートは、例えばスルファサラジン(アザルフィジン(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(ＤＩＰＥＮＴＵＭ(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(ＣＯＬＡＺＡＬ(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(アサコール(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ＲＯＷＡＳＡ(登録商標)、Solvay)などの５−ＡＳＡを含む。
【０３９３】
ここに記載する方法と関連して、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴いまたは伴わずに抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と組み合わせて投与されるサリチレートは、免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生率の減少を目的として、サリチレートおよび非吸収性ステロイドのあらゆる重複または逐次投与を含み得る。それ故に、例えば、ここに記載する免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生率を減少する方法は、サリチレートおよび非吸収性を同時にまたは逐次的に(例えば、サリチレートを非吸収性ステロイドの６時間後に投与する)または任意のこれらの組み合わせで投与することを含む。さらに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同じ経路で(例えば、両者は経口投与される)または異なる経路で(例えば、サリチレートは経口投与され、非吸収性ステロイドは直腸投与される)投与されてよく、これは、抗ｈｕＩＣＯＳおよび抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体の投与に使用した経路と異なってよい。
【０３９４】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および組み合わせ抗体治療は、処置される適応症(例えば、癌)に対する特定の有用性により選択される他の周知治療と組み合わせても使用し得る。ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の組み合わせを、薬学的に許容される因子と逐次的に使用し得る。
【０３９５】
ある実施態様において、ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および組み合わせ抗体治療を、照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６×コンボ)を使用)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(低分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ−１(骨髄白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質阻害剤)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、低分子ｓｍａｃ模倣物、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲをターゲティングする抗血管形成剤(例えば、アバスチン(登録商標))、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ−阻害タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる処置と組み合わせて(例えば、同時にまたは別々に)使用し得る。
【０３９６】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体および組み合わせ抗体治療を、さらに１以上の抗増殖性細胞毒性剤と組み合わせて使用し得る。抗増殖性細胞毒性剤として使用し得る化合物群は、次のものを含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサンTM)ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
当分野で知られる他の微小管安定化剤に加えて、アゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体と組み合わせるための適当な抗増殖剤、タキサン類、パクリタキセル(パクリタキセルはタキソールTMとして市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシドＡ、エポチロン類、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(タシドチン塩酸塩)、ハリコンドリンＢ、メシル酸エリブリン(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、Ｃｙｒｐｔｏｈｙｃｉｎｓ、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイド免疫複合体(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１。
【０３９７】
ある実施態様において、例えば、患者に１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスTMなどのホルモンおよびステロイド(合成アナログを含む)を投与することにより、ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体での処置と組み合わせてまたはその前に、異常増殖性細胞を静止状態にするのが望ましいことがある。ここに記載する方法または組成物を用いるとき、制吐剤などの臨床現場で腫瘍増殖または転移の調節に使用される他の薬剤も、所望により投与し得る。
【０３９８】
化学療法剤の安全かつ有効な投与方法は当業者に知られる。さらに、それらの投与は標準的文献に記載される。例えば、化学療法剤の大部分の投与は、例えば、１９９６年版のPhysicians' Desk Reference (PDR)(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)に記載され、その開示を引用により本明細書に包含させる。
【０３９９】
化学療法剤および／または放射線療法を、当分野で知られる治療プロトコールに従い適用し得る。化学療法剤および／または放射線療法の適用は、処置する疾患および該疾患に対する化学療法剤および／または放射線療法の既知効果により変わり得ることは当業者には明らかである。また、当業者の知識に従い、治療プロトコール(例えば、投与量および投与回数)は、患者に対する投与治療剤の観察される効果の観点からおよび治療剤を投与する疾患の観察される応答の観点から変わり得る。
【０４００】
アウトカム
腫瘍応答を、例えば、ＮＣＩにより確立された改変固形癌効果判定基準(ＲＥＣＩＳＴ)により決定する。
【０４０１】
標的病変について、治療への応答は次のものを含み得る。
【表７】
2020515239.tif 000009
【０４０２】
非標的病変について、治療への応答は次のものを含み得る。
【表８】
2020515239.tif 000010
【０４０３】
ここに開示する方法により処置される患者は、好ましくは癌の少なくとも一つの徴候の改善を経験する。ある実施態様において、改善は、測定可能腫瘍病変の数および／またはサイズの減少により測定される。他の実施態様において、病変を胸部ｘ線またはＣＴもしくはＭＲＩフィルムにより測定し得る。他の実施態様において、細胞診断または組織診断を使用して、治療への応答性を評価し得る。
【０４０４】
ある実施態様において、処置患者は、完全寛解(ＣＲ)、部分寛解(ＰＲ)、疾患安定(ＳＤ)、免疫関連完全疾患(ｉｒＣＲ)、免疫関連部分寛解(ｉｒＰＲ)または免疫関連疾患安定(ｉｒＳＤ)を示す。他の実施態様において、処置患者は、腫瘍縮小および／または増加率減少、すなわち、腫瘍増殖抑制を経験する。他の実施態様において、望まれない細胞増殖が減少するまたは阻害される。さらに他の実施態様において、次の１以上が起こり得る：癌細胞数が減少し得る；腫瘍サイズが減少し得る；末梢器官への癌細胞浸潤が阻止、遅延、減速または停止し得る；腫瘍転移が減速または阻害され得る；腫瘍増殖が阻害され得る；腫瘍再発が予防または遅延され得る；癌と関連する症状の１以上がある程度軽減され得る。
【０４０５】
他の実施態様において、ここに提供する方法の何れかによる抗ＩＣＯＳ抗体(または抗ＩＣＯＳ抗体と少なくとも１種の付加的抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせ)の有効量の投与は、腫瘍サイズ減少、経時的に出現する転移病変数の減少、完全寛解、部分寛解または疾患安定を提供する。さらに他の実施態様において、本処置方法は、抗ＩＣＯＳ抗体単独(または組み合わせ抗体の何れか一つ単独)により達成されるより、良好な比較臨床有効率(ＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ≧６カ月)を提供する。他の実施態様において、臨床有効率の改善は、抗ＩＣＯＳ抗体単独(または組み合わせ抗体の何れか一つ単独)と比較して、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上である。
【０４０６】
ワクチンアジュバント
ここに記載する抗ｈｕＩＣＯＳ抗体は、抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の目的の抗原、例えば、ワクチンとの共投与により、抗原特異的免疫応答を増強するために使用し得る。従って、ここに提供されるのは、(ｉ)抗原；および(ii)抗ｈｕＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象における該抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法である。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原である。このような抗原の非限定的例は、上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体からの抗原などの上記のものを含む。
【０４０７】
検出および診断
他の態様において、ここに提供されるのは、サンプルおよび対照サンプルと、ヒトＩＣＯＳに特異的に結合する抗ＩＣＯＳ抗体、例えば、モノクローナル抗ヒトＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合フラグメントを、該抗体またはそのフラグメントとヒトＩＣＯＳの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、サンプル中のヒトＩＣＯＳ抗原の存在を検出するまたはヒトＩＣＯＳ抗原の量を測定する方法である。次いで、複合体の形成を検出し、ここで、サンプルと対照サンプル間の複合体形成の差がサンプルにおけるヒトＩＣＯＳ抗原の存在を示す。さらに、ここに記載する抗ＩＣＯＳ抗体を免疫親和性精製によるヒトＩＣＯＳの精製に使用し得る。
【０４０８】
本発明を、限定と見なすべきではない次の実施例によりさらに説明する。全ての図および本明細書で引用する全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、引用により本明細書明示的に包含させる。
【実施例】
【０４０９】
次は、本発明の抗体、組成物および方法の非限定的例である。種々の他の実施態様が、ここに提供する一般的記載に一致して実施し得ることが理解される。
【０４１０】
実施例１
完全ヒト抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の産生
完全ヒト抗ｈｕＩＣＯＳモノクローナル抗体および該完全ヒト抗ＩＣＯＳ抗体と同じエピトープに結合するおよび／または結合を交差遮断する完全ヒト抗体が、ここに開示される。このような抗体は、次の実施例に記載のとおり、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して産生され得る。
【０４１１】
Ａ. ＨｕＭａｂマウス(登録商標)および／またはＫｕｎｍｉｎｇ(ＫＭ)マウス(登録商標)を使用するハイブリドーマテクノロジー
抗ＩＣＯＳ抗体の産生
ヒト抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体が、ＨｕＭＡｂ(登録商標)トランスジェニックマウスのＨＣ２／ＫＣｏ７系統(「ＨｕＭＡｂ(登録商標)」はMedarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)およびＫＭマウス(ＫＭマウス(登録商標)系統は、ＷＯ０２／４３４７８に記載のとおりＳＣ２０導入染色体を含む)を、１)可溶性ヒトＩＣＯＳ抗原および２)ヒトＩＣＯＳを発現するヒトＩＣＯＳ遺伝子でトランスフェクトしたＨｅｋ２９３Ｔ細胞株、ＩＣＯＳを発現するチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株およびＩＣＯＳを発現する３００−１９細胞株で免疫化することにより産生された。ＨＣ２／ＫＣｏ７  ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスは米国特許５,７７０,４２９および５,５４５,８０６に記載のとおり産生され、それらの全開示を引用により本明細書に包含させる。
【０４１２】
抗原および免疫化
抗原は、抗体Ｆｃドメイン(組み換えヒトＩＣＯＳ−マウスＦｃキメラタンパク質)、ヒトＩＣＯＳの表面発現のためにトランスフェクトされたＨｅｋ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞または３００−１９細胞と融合したＩＣＯＳ細胞外ドメインを含む可溶性融合タンパク質であった。抗原を、免疫化のためのＲＩＢＩモノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)＋ＴＤＭアジュバント系(Sigma)と混合した。１：１でアジュバントと混合したＰＢＳ中の１５〜２５μg  可溶性組み換えＩＣＯＳ抗原またはＰＢＳ中のヒトＩＣＯＳの表面発現のためにトランスフェクトした１×１０７  ＣＨＯ細胞、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞または３００−１９細胞の可溶性ＩＣＯＳタンパク質で上記マウスを免疫化した。マウスに、２００μlの調製抗原を腹腔または皮下または足蹠に２〜１４日毎に注射した。マウスに、ＩＣＯＳ抗原免疫化後、１００〜２００μlの組み換えマウスＩＬ２１をマウスに注射した。抗ＩＣＯＳ力価を生じたマウスは、１０〜２０μg  可溶性組み換えＩＣＯＳ抗原またはヒトＩＣＯＳの表面発現のためにトランスフェクトした５×１０６  ＣＨＯ細胞または３００−１９細胞の静脈内注射および／または足蹠注射または加えて融合３〜２日前に１００μlのＰＢＳ中の１５μg  組み換えマウスＩＬ２１タンパク質の腹腔内注射を受けた。マウスリンパ節および／または脾臓を採取し、単離リンパ節細胞および／または脾細胞をハイブリドーマ製造のために使用した。
【０４１３】
抗ＩＣＯＳ抗体を産生するＨｕＭａｂマウス(登録商標)またはＫＭマウス(登録商標)の選択
ＩＣＯＳ結合抗体を産生するＨｕＭａｂマウス(登録商標)またはＫＭマウス(登録商標)を選択するために、免疫化マウスからの血清を酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)で試験した。簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μg／mlの精製組み換えヒトＩＣＯＳ−マウスＦｃで被覆し；５０μl／ウェルを４℃で一夜インキュベートし、次いで２００μl／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ(０.０５％)中５％ニワトリ血清で遮断した。ＩＣＯＳ免疫化マウスからの血漿希釈物を各ウェルに加え、１時間、環境温度でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体と、１時間、室温でインキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc.、製品：ＡＢＴＳ−１０００)で展開し、分光光度計で４１５〜４９５光学密度(ＯＤ)で分析した。免疫化マウスからの血清を、次いでさらにフローサイトメトリーでヒトＩＣＯＳを発現した細胞株にするが、ＩＣＯＳを発現しなかった対照細胞株にはしなかった結合についてスクリーニングした。簡潔には、抗ＩＣＯＳ抗体の結合を、ＩＣＯＳ発現ＣＨＯ細胞または３００−１９細胞と、抗ＩＣＯＳ抗体を１：２０希釈でインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をフィコエリスリン(ＰＥ)標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎTMフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施した。最高力価の抗ＩＣＯＳ抗体を生じたマウスを融合に使用した。融合は下記のとおり実施した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡおよび蛍光−活性化細胞サイトメトリー(ＦＡＣＳ)により抗ＩＣＯＳ活性について試験した。
【０４１４】
ハイブリドーマの作製
ＨｕＭａｂマウス(登録商標)および／またはＫＭマウス(登録商標)から単離したマウス脾細胞および／またはリンパ球を、Cyto Pulse大チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を使用する電場ベースの電気融合を使用して、マウス骨髄腫細胞株と融合させた。簡潔には、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、同数のＳｐ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１細胞株)と融合させた。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約２×１０４／ウェルで播種し、続いて１０％胎児ウシ血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３)順化培地、３〜５％Ｏｒｉｇｅｎ(IGEN)のＤＭＥＭ溶液(Mediatech、ＣＲＬ  １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム添加)＋５mM  ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM  ２−メルカプトエタノール、５０mg／mlゲンタマイシンおよび１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(ＨＡＴ)培地(Sigma、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５)を含む選択培地で約２週間インキュベーションした。１〜２週間後、細胞をＨＡＴがヒポキサンチンおよびチミジン(ＨＴ)培地に置き換えられた培地で培養した細胞播種。約１０〜１４日後、個々のウェルからの上清を、まずヒトガンマおよびカッパ抗体を含むか否かについてスクリーニングした。ヒトガンマおよびカッパ抗体について陽性と採点された上清を、次いで、ヒト抗ＩＣＯＳモノクローナルＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳでスクリーニングした。抗体分泌ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、再びスクリーニングし、ヒト抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体についてなお陽性であるならば、限界希釈により少なくとも２回サブクローン化した。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地で少量の抗体を産生させた。産生されたヒトモノクローナル抗体を次いでプロテインＡカラムクロマトグラフィーで精製した。特に興味深い単離抗体を、下の表７に記載するとおり、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７−ａおよび１Ｄ７−ｂと名付けた。
【表９】
2020515239.tif 000011
【０４１５】
Ｂ. ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ(登録商標)ｍＲＮＡディスプレイ系
ＫＭマウス＃３３３８１９および＃３３３８２１を、ヒトＩＣＯＳを過発現するＣＨＯ細胞で免疫化し、続いて脾臓およびリンパ節を採取した。総ＲＮＡを脾臓およびリンパ節細胞から抽出し、抗体定常領域に特異的なプライマーを使用して、逆転写した。抗体ｃＤＮＡを使用して、各ｓｃＦｖタンパク質がピューロマイシン結合によりそのコード化ｍＲＮＡに融合したｍＲＮＡディスプレイに発現された、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)ライブラリーを産生した。ライブラリーを１０nM  組み換えヒトＩＣＯＳ−Ｆｃに対して選択し、プロテインＧ磁気ビーズでの捕捉によりすべての結合分子を捕捉し、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)で増幅させて、次ラウンドに進めた。計６ラウンドが終了し、その後顕著なＩＣＯＳ結合シグナルが定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)で観察された。最終集団を配列決定し、特有の可変領域をＩｇＧ発現ベクターにクローン化した。ＩｇＧタンパク質を、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを使用して発現させ、結合および機能的アッセイ用材料を産生した。下の表８に記載する抗体ＩｇＧ−２６４４を選択した。
【表１０】
2020515239.tif 000012
【０４１６】
実施例２
ヒト化抗ＩＣＯＳ抗体の産生
ハムスターＩＣＯＳ抗体Ｃ３９８.４Ａの配列決定
ここでは「親ハムスター抗体」または抗体「Ｃ３９８.４Ａ」と称するハムスター抗ラットＩＣＯＳモノクローナル抗体であるＣ３９８.４Ａ(抗Ｈ４／ＩＣＯＳ)モノクローナル抗体を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ(登録商標)から得た。Ｃ３９８.４Ａ抗体をマススペクトロメトリーを使用して配列決定した。具体的に、Ｃ３９８.４Ａを５.３ＭグアニジンＨＣｌで変性させ、ジチオールスレイトール(４０mM)で還元し、ヨードアセトアミド(８０mM)でアルキル化した。６kDa  ＭＷカットオフＺｅｂａ脱塩カラムで脱塩後、抗体をトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、ＡｓｐＮまたはＧｌｕＣで酵素的に消化させ、マススペクトロメトリーで分析した。ペプチドマッピングおよびＭＳ／ＭＳを使用して、得られたペプチドを同定し、アミノ酸配列を確認した。インタクト重鎖および軽鎖塊を、ＰＮＧａｓｅＦでグリカンを開裂させ、抗体をジチオールスレイトールで還元し、ヨード酢酸でアルキル化することにより産生した。得られた抗体鎖をＬＣ−ＭＳで分析した。
【０４１７】
得られたペプチドフラグメンテーションデータを、ＧｅｎＢａｎｋに存在するタビキヌゲネズミ(Cricetulus migratorius)について３軽鎖および重鎖抗体配列からなる慣習的タンパク質データベースを、アルメニアンハムスター由来のモノクローナル抗体のＲＮＡ配列決定により社内で決定した抗体配列と共にアラインした。データベース検索は、ＧｅｎＢａｎｋ配列遺伝子座位ＣＭＵ１７８７０(Accession U17870)がＣ３９８.４Ａ軽鎖に類似するとして特定した。ＣＭＵ１７８７０軽鎖配列と比較したとき、Ｃ３９８.４Ａ配列においてＣＤＲ３およびフレームワーク領域のアミノ酸置換が観察された。データベース検索は、ＧｅｎＢａｎｋ配列遺伝子座位ＣＭＵ１７１６６(Accession U17166)がＣ３９８.４Ａ重鎖可変領域に類似するとして特定した。Ｊ−領域は内部で特定されたハムスター配列ＨＡ−ＶＨ−７とマッチした。重鎖の定常領域は、抗体ＨＬ４Ｅ１０(Accession HM369133)と同じアイソタイプとマッチした。Ｄ−領域は、新規であるとして決定され、ペプチドフラグメンテーションデータの新規配列決定により同定された。ＣＭＵ１７１６６およびＨＡ−ＶＨ−７重鎖配列と比較したとき、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および可変フレームワーク領域のアミノ酸置換が観察された。
【０４１８】
抗体Ｃ３９８.４Ａに基づくキメラ抗体ＩＣＯＳ.４の産生および評価
Ｃ３９８.４Ａ抗体タンパク質配列を、ｃＤＮＡ配列に逆翻訳した。Ｄ領域(ＣＤＲＨ３)の９６位のイソロイシン／ロイシン(Ｉ／Ｌ)残基を、この位置のイソロイシンまたはロイシンと共に発現させた。可変領域を、シグナル配列およびヒトＩｇＧ１ｆ定常領域を含む発現ベクターにクローニングし、キメラヒト抗体、ＩＣＯＳ.４発現のためにＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。キメラ抗体を、各々ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ上の２５０mLプロテインＡカラムを使用する２Ｌ上清を使用して精製し、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ／ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて活性についてスクリーニングした。ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ／ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイは、低レベルの一本鎖−ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および高レベルのＣＤ３２Ａ(抗体交差架橋のため)でトランスフェクトした照射(増殖停止)ＣＨＯ細胞と、ＣＤ２５枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞の、ＣＨＯ：Ｔ細胞比１：４での共培養であった。ＣＨＯ細胞株を振盪フラスコで増殖させ、アッセイ設定の日に照射した。Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ(登録商標)  ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット(Catalog 15062)を使用して新鮮バフィーコート(Stanford Blood Bank)から選択し、続いてＡｕｔｏＭＡＣＳ(登録商標)の枯渇についてのキット指示に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ(登録商標)ＣＤ２５マイクロビーズ(Catalog 130-092-983)を使用してＣＤ２５＋細胞を枯渇させた。
【０４１９】
ＩＣＯＳ抗体またはアイソタイプ対照を、５倍連続希釈により５μg／mLから力価測定し、各条件をトリプリケートで設定した。培養を平底ＴＣ処理Ｃｏｓｔａｒ(登録商標)９６ウェルプレートで、ウェルあたり２００μL完全培地(ＲＰＭＩ−１６４０(Corning(登録商標)、Catalog 10-040-CM)＋１０％胎児ウシ血清(ＦＢＳ)(Gibco(登録商標)、Catalog 25140)＋１×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ(Corning Catalog 30-002-CL)＋１０mM  ＨＥＰＥＳ(Corning Catalog 25-000-CL)＋１mM  ピルビン酸ナトリウム(Corning Catalog 25-000Cl)＋１ｘＭＥＭ(Corning Catalog 25030-CL)中５×１０４  Ｔ細胞および１.２５×１０４  ＣＨＯ細胞で設定し、３日間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０４２０】
培養上清(５０μL／ウェル)を、均一系時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイ(Ｃｉｓｂｉｏ(登録商標))を使用するインターフェロン−ガンマ濃度分析のために３日目に採取し、Ｒｕｂｙｓｔａｒ(登録商標)マイクロプレートリーダーを使用して読み出し、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ(登録商標)ソフトウェアを使用して標準曲線から濃度を計算した。ＩＣＯＳ.４抗体を、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を使用して機能的Ｔ細胞アッセイで試験し、同時にインターフェロン−ガンマ分泌により測定される用量依存性共刺激の相対的レベルを比較するために、抗体力価測定した。ＩＣＯＳ.４は、０.０１８μg／mLのＥＣ５０値を示した。
【０４２１】
アイソタイプ選択
免疫腫瘍学治療抗体、具体的に、アゴニスト標的のためのアイソタイプ選択は、ＦｃＲへの結合の下流の２つの異なる考慮により影響される。Ravetchおよび同僚(Li and Ravetch, Science 2011;333:1030-4; Otten et al., J Immunol. 2008;181:6829-36)により詳述されるとおり、抗体の活性化受容体への結合は、標的発現細胞の抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)または抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)をもたらし得る。他方で、抗体の阻害性ＦｃＲへの優先的結合は、受容体の多価架橋およびアゴニストシグナル伝達に介在し得る。ＩＣＯＳが腫瘍微小環境におけるＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔｅｆｆで高度に発現されるため、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰに介在し得るアイソタイプの使用は、あまり魅力がない選択肢と考えられた。抗ＩＣＯＳ抗体のインビトロＡＤＣＣ活性は、抗ＩＣＯＳ抗体がＡＤＣＣ介在に高度にコンピテントであり、ＡＤＣＣ誘発アイソタイプが回避されるはずであるとの考えを指示することも示唆された。ＣＤ３２Ｂに対するヒトＩｇＧ１の親和性が増加した抗体は、むしろ別のアイソタイプとして考慮された。考慮されたアイソタイプは、上記表３に示すＩｇＧ１  Ｓ２６７Ｅ変異、ＳＥＬＦ変異およびＶ１２変異であった。これら変異は、全てＣＤ３２Ｂに対するおよび種々の程度でＣＤ３２Ａに対する親和性を増大させ、一方ＣＤ１６に対する親和性を減少させる(表９に示す)。この減少は、これが腫瘍におけるＴ細胞枯渇に介在する可能性のあるＦｃＲため、ＡＤＣＣ活性を低減すると予測された。
【表１１】
2020515239.tif 000013
【０４２２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞を使用するＳＥＢアッセイにおけるインビトロ活性は、上記のとおり、ヒトＩｇＧ１および他のアイソタイプと比較してＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体の優れた活性を示した。これらの機能的実験からのデータに基づき、ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅをリード抗体として選択した。ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの選択の一つの混乱は、このアイソタイプｈｓヒトＩｇＧ１より高い親和性で補体Ｃ１ｑに結合し、これが補体依存性細胞溶解(ＣＤＣ)のリスクを高める可能性をもたらしたことであった。驚くべきことに、ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、インビトロ試験でヒトＩｇＧ１と比較して高いＣＤＣ活性を有しなかった。それにより、Ｓ２６７Ｅ変異はＣＤＣのリスク増加をもたらさなかった。
【０４２３】
抗体ＩＣＯＳ.４のヒト化
抗体ＩＣＯＳ.４を、ハムスターＣＤＲをヒト生殖系列遺伝子に移植することによりヒト化し(図３)、フレームワーク配列相同性に基づきＶＨ３−１５を重鎖について選択し、ＶＫＩ  Ｏ１８を軽鎖について選択した。ヒト生殖系列ＦＷ４、ＪＫ３も配列相同性に基づき軽鎖について選択した。ヒト生殖系列ＦＷ４、ＪＨ４を、配列類似性に基づき重鎖について選択し、それは易罹病性リスクを引き起こす可能性のある残基を含まなかった。一団の２６抗体をＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２Ａ／ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞アッセイで評価し、抗体範囲は０.２μg／mLから開始し、４倍希釈により力価測定し、親ハムスター抗体(Ｃ３９８.４Ａ、すなわち、それぞれ配列番号３および４に示す重鎖および軽鎖領域配列を有する親ハムスター抗体)と類似する結合を保持するヒト化配列を同定した。
【０４２４】
ヒト化ＣＤＲ移植抗体の結合を保持するための１アミノ酸残基置換(Ｔ９４Ａ)が同定され、これは、ＦＲ３とＣＤＲＨ３の接合部に位置した。さらに、Ｄ５６、Ｇ５７配列に責務変異(liability mutation)を有する３キメラ抗体も、ＶＬにおける潜在的異性化部位が活性に影響することなく除去されたかを見るために評価された。残基置換Ｄ５６Ｅを軽鎖の潜在的異性化部位(Ｄ５６、Ｇ５７)を排除するために選択し、ヒト化配列に取り込んだ。ヒト化抗体をＩｇＧ１ｆアイソタイプとスクリーニングしたが、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥがＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅアイソタイプで再発現された。産生された抗体の明細を、下の表１０に示す。
【表１２】
2020515239.tif 000014
【０４２５】
Ｃ３９８.４Ａに基づく一組の４つのヒト化抗体を、実施例３に下記のとおり、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ／ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞機能的アッセイで元のハムスターキメラ抗体と比較して試験した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅをさらなる特徴づけおよび開発のために選択した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの重鎖および軽鎖可変領域配列をそれぞれ配列番号５および６ならびに図４に示す。
【０４２６】
実施例３
抗体選択
ＣＨＯ−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ／ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ
初期機能的アッセイスクリーニングを、ＣＨＯ細胞発現一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)抗ＣＤ３(ＯＫＴ３)および初代ヒトＴ細胞を刺激するためのヒトＣＤ３２Ａを使用して実施した。このアッセイは、低レベルの一本鎖可変フラグメント−ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および高いレベルのＣＤ３２Ａ(抗体交差架橋のため)でトランスフェクトした照射(増殖停止)ＣＨＯ細胞と、ＣＤ２５枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＨＯ：Ｔ細胞比１：４での共培養であった。ＣＨＯ細胞株を振盪フラスコで増殖させ、アッセイ設定の日に照射した。Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを使用して新鮮バフィーコート(Stanford Blood Bank)から選択した。ＣＤ２５＋細胞を、ＡｕｔｏＭＡＣＳの枯渇についてのキット指示に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ２５マイクロビーズを使用して枯渇させた。
【０４２７】
ＩＣＯＳ抗体またはアイソタイプ対照(すなわち、ＩＣＯＳ抗体と同じアイソタイプであるが、任意の天然に存在するヒトタンパク質に結合しない抗体、例えば、とりわけキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、ジフテリア毒素に対する抗体)を、２μg／mLから５倍連続希釈により力価測定し、各条件を２ドナーからのＴ細胞を使用してトリプリケートで設定した。培養を平底ＴＣ処理９６ウェルプレート(Costar)に、ウェルあたり２００μL完全培地中５×１０４  Ｔ細胞および１.２５×１０４  ＣＨＯ細胞で設定し、３日間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０４２８】
培養上清(５０μL／ウェル)を均一系時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイ(Cisbio)を使用するインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)濃度分析のために３日目に採取した。濃度をＲｕｂｙｓｔａｒマイクロプレートリーダーを使用して決定し、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して濃度曲線から軽鎖した。次いでプレートをウェルあたり０.５μCiトリチウム標識チミジンで８時間パルスし、凍結させた。細胞を、増殖を評価するためのトリチウム標識チミジン取り込み分析のためにフィルタープレート(Perkin Elmer)上に採取した。
【０４２９】
ＦｃＲ  ＣＤ３２Ａは、抗体Ｆｃサブタイプにかかわらず抗体の架橋を可能にした。この架橋は、ＩＣＯＳアゴニズムを介するＴ細胞の共刺激をもたらし、アイソタイプ対照処理細胞と比較して増強された増殖およびサイトカイン放出をもたらした。この活性はＣＤ８＋、ＣＤ４＋およびＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞で見られた。枯渇ＣＤ２５−  ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイでの優れたシグナル対ノイズのため、これらの細胞をハイブリドーマスクリーニングに使用した。最良性能の抗体を、サブクローニング、精製およびさらに特徴づけのために選択した。親ハムスターモノクローナル抗体を、一団の抗体の分析に包含させた。上記のとおり、ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２アッセイにおける活性を使用して、リードとなる一団の抗体を選択し、これをヒトＩｇＧ１抗体または他の修飾バージョンのヒトＩｇＧ１として再発現させた。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、図５に示すとおり、ＣＨＯ−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ／ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイでＩＦＮ−γ分泌および増殖の用量依存性誘導を示した。この効果の平均ＥＣ５０は、増殖について０.０８３nM(±０.０６７、ｎ＝６)およびＩＦＮ−γ誘導について０.０８３nM(±０.０７４、ｎ＝６)であった。計６ドナーで試験した３つの最高濃度で、対照と比較して、増殖誘導は２〜５倍の範囲であり、ＩＦＮ−γ誘導は同じ実験で２〜９倍の範囲であった。ＣＨＯ−ｓｃＦｖ−ＣＤ３(無ＣＤ３２Ａ)を使用する先の実験は、全試験ＩＣＯＳ抗体で、アゴニスト活性に交差架橋が必要であることが確認された。
【０４３０】
ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞−ＳＥＢアッセイ
抗ＩＣＯＳ抗体機能的活性のさらなる特徴づけを、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)をＴ細胞受容体(ＴＣＲ)刺激として使用し、共刺激のために抗ＩＣＯＳ抗体を試験に加えて実施した。ヒト末梢血細胞(ＰＢＭＣ)をアッセイに使用したとき、抗ＩＣＯＳ抗体は機能的活性を示さなかった。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞(ＣＤ２５枯渇または総ＣＤ４＋Ｔ細胞の何れか)を精製Ｂ細胞と共に使用して、抗ＩＣＯＳ抗体は、対照抗体と比較してインターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)分泌の増強を示した。
【０４３１】
このアッセイは、自己ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞の共培養を含んだ。ＳＥＢを８５ng／mLの最終固定濃度で加えて、亜最大刺激を提供し、ＩＣＯＳ抗体を力価測定して、用量依存性共刺激効果を示した。このアッセイの目的は、一次活性化シグナル(ＳＥＢ＋Ｂ細胞)状況下で、ＩＣＯＳ抗体が、ＩＦＮ−γ誘導レベルにより証明されるＴ細胞活性化を増強する能力の測定であった。高いレベルのＩＦＮ−γを誘導することは、ＩＣＯＳ受容体のアゴニズムを示す種々の抗体の効力を反映するＴ細胞活性化の指標であり、ＩＦＮ−γが抗腫瘍免疫の既知メディエーターであるため、有利である。
【０４３２】
Ｔ細胞を、２つの新鮮バフィーコートから陽性選択し、続いて非接触ＣＤ４＋Ｔ細胞(Invitrogen)を産生するためにビーズを脱離することにより単離した。次いで、ＣＤ２５＋細胞を、ＡｕｔｏＭＡＣＳを使用する枯渇のキット指示に従い、ＣＤ２５マイクロビーズ(Miltenyi)を使用してＣＤ４＋Ｔ細胞から枯渇させた。次いで、ＣＤ４単離体からの陰性フラクションを使用して、ＡｕｔｏＭＡＣＳを使用する陽性選択のキット指示に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ２０ビーズを使用して自己Ｂ細胞を単離した。
【０４３３】
Ｔ細胞を、９６ウェル平底ＴＣ処理培養プレートに、５×１０４細胞／ウェルで、３〜５×１０４細胞／ウェル(各ドナーからの収量による)自己Ｂ細胞と共に、８５ng／mLの最終濃度で包含されるＳＥＢと播種した。ＩＣＯＳ抗体またはアイソタイプ対照を、５μg／mLから５倍連続希釈により計７点力価測定し、各々トリプリケートで試験した。アッセイを、完全培地に２００μL／ウェル最終体積で設定した。プレートを、３日間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０４３４】
培養上清(５０μL／ウェル)を、ＨＴＲＦアッセイ(Cisbio)を使用するＩＦＮ−γ濃度の分析のために、３日目に採取した。Ｒｕｂｙｓｔａｒマイクロプレートリーダーを使用して濃度を決定し、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して濃度曲線から軽鎖した。
【０４３５】
ＳＥＢ共培養実験は、抗ＩＣＯＳ抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、９Ｄ５  ＩｇＧ１ｆ、９Ｄ５  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ、２６４４  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅおよび対照抗体ＫＬＨ対照Ｉｇ１ｆのＩＦＮ−γ産生を比較した(図６)。Ｓ２６７Ｅ変異を有するヒト化リード抗体ＩＣＯＳ.３３(図６に黒塗り下向き三角であらわされるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ  １ｆ  Ｓ２６７Ｅ)は、野生型Ｆｃ(ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ)を有する同じ抗体より高いレベルのＩＦＮ−γを誘発した。試験した他のコンパレーター抗体、すなわち、９５Ｄ  ＩｇＧ１ｆ、９Ｄ５  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅおよび２６４４  ＩｇＧ１もＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅより低い活性を示した。ＫＬＨ対照Ｉｇ１ｆは何ら活性を示さなかった。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体は、最適以下の用量のＳＥＢで刺激したＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞共培養において、対照抗体と比較してＩＦＮ−γ産生を２.３倍まで、用量依存的様式で増加させた。計２０ドナーをこのアッセイを使用して試験し、全てＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅによる最大アゴニスト活性が示され、０.０２０nM(±０.０１８)のＥＣ５０であった。
【０４３６】
Ｔ濾胞性ヘルパー細胞(Ｔｆｈ)に対するＩＣＯＳ抗体の活性を、この方法で試験した。対照抗体１Ｄ１２と比較して、抗ＩＣＯＳ抗体９Ｄ５およびＩＣＯＳ.４添加後、ＩＬ−１０の増強された分泌が観察された。Ｔｆｈ細胞を、Ａｒｉａ  II  ＦＡＣＳを使用して、ＣＤ４富化細胞をＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１２３で染色し、Ｔｆｈ細胞(ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２３−ＣＤ１４−)をソートすることにより、ＣＤ４選択富化後、ＰＢＭＣから選別した(Invitrogenキット)。ナイーブＢ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットを使用してＣＤ４陰性フラクションから単離した。ＴｆｈおよびナイーブＢ細胞を、各５ｅ４細胞／ウェルで９６ウェル平底ＴＣプレートで共培養し、２日間ＳＥＢで刺激し、そのときＩＬ−１０およびＩＦＮγをＥＬＩＳＡ(ＢＤ)で測定し、ＩＣＯＳ抗体による増強が示された。この増強されたサイトカイン分泌は、外来架橋剤を必要とせず、ヒトＩｇＧ１にＳ２６７Ｅ変異を包含することにより増強された(図７Ａおよび７Ｂ)。
【０４３７】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、ＣＨＯ  ＦｃＲアッセイにおけるＩＦＮ−γ産生刺激および細胞増殖誘発能力(図５)ならびに試験した他の抗ＩＣＯＳ抗体と比較してＳＥＢアッセイにおける高い機能的活性により(図６)、さらなる開発のために選択した。
【０４３８】
実施例４
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅによる制御性Ｔ細胞抑制の逆転
この試験の目的は、エフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)増殖およびＴｒｅｇ介在抑制に対するＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの効果の決定であった。
【０４３９】
Ｕ底プレートを、ＰＢＳ中、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ(１０μg／mL)または、ＩＣＯＳタンパク質に結合しないアイソタイプ対照である抗ＫＬＨ(１０μg／mL)と組み合わせた抗ＣＤ３(３μg／mL)で、３時間、３７℃で被覆した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、RosetteSep製造者の指示に従い、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離と組み合わせたＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ４＋Ｔ富化カクテルを使用して全新鮮バフィーコートから単離した。富化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＦＡＣＳソート緩衝液中ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯに対するフルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体で染色した。次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  II細胞選別機を使用して、Ｔｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏＣＤ１２７ｈｉ)、ＲＡ＋Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ−)およびＲＯ＋Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ４５ＲＯ＋)細胞集団に選別した。選別したＴｒｅｇを、製造業者の指示に従い５μM濃度でＣｅｌｌＴｒａｃｅTMＶｉｏｌｅｔ(ＣＴＶ)増殖色素で標識した。選別したＴｅｆｆを、先の実験で観察された細胞毒性効果を軽減するために、１.２５μMの高希釈で使用した以外、製造業者の指示に従い、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥTM増殖色素(ＣＦＳＥ)で標識した。
【０４４０】
１００μLの完全培地中の５万個のソートされ、ＣＦＳＥ標識されたＴｅｆｆを、抗ＣＤ３およびＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅまたはアイソタイプ対照で被覆した９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。これらを、抗ＣＤ２８を２μg／mL(最終濃度１μg／mLに対して)で添加し、または添加せずに、調製した。次いで、１００μLの完全培地中の力価測定数のソートおよびＣＴＶ標識したＴｒｅｇを、５×１０４  Ｔｒｅｇ(１：１  Ｔｒｅｇ対Ｔｅｆｆ)で開始し、次のウェルは２倍減少(１：２、１：４など)で各ウェルに加えた。
【０４４１】
培養物を６日間、３７℃でインキュベートし、そのとき細胞を固定可能生存能色素Ｇ宿主Ｒｅｄ−７８０で染色して、死細胞を除去した。フローサイトメトリーデータを、BD FACSCanto IIフローサイトメーターを使用して取得した。パーセントＴｅｆｆ増殖をFACSDivaフローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用して決定した。Ｔｅｆｆのパーセント増殖を、少なくとも１ラウンドの分裂後、CellTrace CFSE増殖色素が希釈されているＴｅｆｆでのゲーティングにより決定した。
【０４４２】
この実施例は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ両者が、図８Ａおよび８Ｂに示すとおり、Ｔｒｅｇ介在抑制を逆転させ、Ｔｅｆｆ増殖を増強することを示した。図８Ａおよび８Ｂのレジェンドに示す値はＴｅｆｆ：Ｔｅｇ比である。従って、１の値は、１  Ｔｅｆｆ対１  Ｔｒｅｇを意味し、２の値は２  Ｔｅｆｆ対１  Ｔｒｅｇを意味するなどであり、本質的にＴｒｅｇが下方にタイトレーションされる。１：１比で、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは増殖の約４倍増加とＲＡ＋Ｔｒｅｇ介在抑制の見かけの逆転を示した。分裂Ｔｅｆｆのアイソタイプ対照とＩＣＯＳ抗体間のパーセント差異により測定して、増殖の７倍増加およびＲＯ＋Ｔｒｅｇ介在抑制の見かけの逆転も観察された。Ｔｒｅｇがタイトレーションしてなくなるにつれて、見かけの抑制の比例的減少があり、Ｔｒｅｇ非存在下で、アイソタイプ対照と比較して、分裂Ｔｅｆｆパーセントの約１.５倍増加があった。Ｔｒｅｇ存在下の効果は、Ｔｒｅｇ抑制に対するＴｅｆｆ感受性減少またはＴｒｅｇの抑制能の結果である。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥがＴｒｅｇ介在抑制を逆転し、Ｔｅｆｆ増殖を増強することは、これがＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅが免疫応答を刺激することを示したため、有利である。
【０４４３】
実施例５
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのインビトロＦｃエフェクター機能
この試験の目的は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)および補体Ｃ１ｑ因子結合活性の評価のためであった。
【０４４４】
カルセインＡＭでの標的細胞標識
ドナー２(Stanford Blood ID W070516511239)からのＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、活性化し、カルセインＡＭで標識した。簡潔には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ヘパリン添加バフィーコートから密度勾配遠心分離により単離し、２％ＦＢＳ(HyClone)添加リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ビーズベースの分離キット(StemCell Technologies)および自動化ＲｏｂｏＳｅｐ細胞分離機(StemCell Technologies)を使用して陰性選択により単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離から、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを磁気ビーズベースの分離キット(Miltenyi Biotec)を使用して枯渇させた。精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｒ１０培地に２.５×１０６細胞／mLで再懸濁させ、３日間、３７℃で２細胞あたり１ビーズでＴ細胞活性化／増大キット(Miltenyi Biotec)で活性化させた。３日目、細胞を計数し、ペレット化し、１５mLコニカルチューブにＰＢＳ中１×１０６細胞／mLで再懸濁させた。カルセインＡＭ試薬を、２０μLの超高純度ＤＭＳＯを、５０μgの凍結乾燥試薬を含む試験管に加えることにより調製した。２μL体積の再構成カルセインＡＭを、１mLの体積毎に懸濁細胞に加えた。細胞をボルテックス処理し、３７℃インキュベーターに３０分間入れた。インキュベーション時間後、標識標的細胞をＡＤＣＣアッセイ培地で３回洗浄し、濃度をアッセイ培地で１０５細胞／mLに調節した。
【０４４５】
標的として活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)アッセイ
初代ヒトＮＫエフェクター細胞を、２つの異なるドナー(ＢＤＣドナー９および１２)からの新鮮ＰＢＭＣから精製し、ＩＬ−２で刺激した。簡潔には、ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によりヘパリン添加全血サンプルから精製し、２％ＦＢＳ(HyClone)添加ＰＢＳで洗浄した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズベースの分離キット(Miltenyi Biotecｈ)およびａｕｔｏＭＡＣｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ(Miltenyi Biotecｈ)を使用する陰性選択により、ＰＢＭＣから単離した。精製ＮＫ細胞を５００ＩＵ／mL  ＩＬ−２添加ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ培地に１×１０６細胞／mLで再懸濁し、一夜、３７℃でインキュベートした。
【０４４６】
翌日、活性化ＮＫエフェクター細胞をアッセイ培地で２回洗浄し、濃度をアッセイ培地で４.３３〜５×１０５細胞／mLに調節した。標識標的細胞(５０μL／ウェル)を、５０μL／ウェルの試験または対照抗体を含むＵ底９６ウェルプレートに加えた。次いで、活性化ＮＫエフェクター細胞(１００μL／ウェル)を加えて、１０：１の最終エフェクター細胞対標的細胞比(Ｅ：Ｔ)および０.０００２μg／mL〜１μg／mL範囲の最終抗体濃度とした。次いで、プレートを加湿３７℃インキュベーターに２時間入れた。上清(５０μL／ウェル)を、光学９６ウェル黒色プレートに移し、蛍光強度を４８５励起および５３５発光フィルターに設定したＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読んだ。
【０４４７】
抗体非存在下、エフェクター細胞とインキュベートした標的細胞は、抗体非依存的溶解(自発的溶解)の背景の対照を提供し、一方２０μLまたは１００μL／ウェルDelfia溶解緩衝液で溶解した標的細胞は、アッセイにおける最大放出を表した。
【０４４８】
抗体依存性細胞溶解のパーセンテージを、平均蛍光強度(ＭＦＩ)に基づき、次の式で計算した。
【数１】
2020515239.tif 000015
標的細胞溶解のパーセンテージを、GraphPad Inc.のPrism v5.01ソフトウェアを使用して、各抗体についてプロットした。
【０４４９】
結果
標的として活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる初代ＮＫ  ＡＤＣＣ
抗ＩＣＯＳ抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、標的としてのＩＣＯＳ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＤＣＣを誘発する能力について試験し、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１により誘発されたＡＤＣＣと比較した。２つの実験を、標的細胞およびＮＫ細胞ドナー対で行った。何れの場合も、修飾ＩｇＧ１アイソタイプを有するＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞でＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１より低いＡＤＣＣを誘発した。これらの実験からのデータを表１１および図９Ａおよび９Ｂに要約する。
【表１３】
2020515239.tif 000016
【０４５０】
Ｃ１ｑ結合アッセイ
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのヒトＣ１ｑへの結合をＥＬＩＳＡにより調査した。全ての抗体を、ウェルあたり５０μLでＰＢＳ中１０μg／mLで高結合イムノアッセイプレートに被覆した。ＰＢＳのみで被覆したウェルの非特異的結合対照を含んだ。プレートを、一夜、４℃でインキュベートした。翌日、プレートおよび全試薬を室温に平衡化し、全てのその後の工程を環境室温で実施した。非占有タンパク質結合部位を、ウェルあたり２００μLのSmartBlock(登録商標)で、３０分遮断した。プレートを、２００μL／ウェルの洗浄溶液(ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０)で３回洗浄した。ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液中、段階的用量のヒトＣ１ｑ(４８.００〜０.７６μM)を５０μL／ウェルで加えた。プレートを２時間インキュベートし、洗浄溶液で３回洗浄した。固定化抗体へのヒトＣ１ｑの結合を、ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で１：１０００希釈したビオチニル化マウス抗Ｃ１ｑ  ｍＡｂにより検出し、１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄後、コンジュゲート緩衝液で１：５０００希釈したストレプトアビジン−ポリ−ＨＲＰを５０μL／ウェルで添加し、３０分間インキュベートした。最終洗浄工程を完了し、プレートを５０μL／ウェルのＴＭＢ基質で５分間展開した。光学密度を、SpectraMax 340PC384 Microplate Reader(Molecular Device)で６５０nmで読んだ。データをPrism, Version 5.01を使用してグラフ化した。
【０４５１】
結果
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅはヒト補体のＣ１ｑ成分に結合する
抗ＩＣＯＳ抗体ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１と比較して、ヒト補体のＣ１ｑ成分に結合する能力について試験した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１より高い親和性でヒトＣ１ｑに結合することが判明した。データを図１０および表１２に要約する。
【表１４】
2020515239.tif 000017
【０４５２】
結論
修飾ＩｇＧ１を有するＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、野生型ＩｇＧ１を有する抗ＩＣＯＳ抗体より低いＩＣＯＳ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＤＣＣ介在死滅を誘発し、なお高い親和性でヒトＣ１ｑに結合した。
【０４５３】
実施例６
インビボ抗腫瘍活性
単剤療法または他の薬剤との組み合わせとしての抗マウスＩＣＯＳの抗腫瘍活性
Ｔ細胞表面受容体(共刺激性および共阻害性両者)に特異的な抗体のアイソタイプの多様性は、抗腫瘍活性を変え得る。１７Ｇ９およびＩＣＯＳ.４両者のマウスＦｃアイソタイプバリアントを産生し、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプとして発現させた。両者とも、下記のとおり、マウスＩｇＧ１バリアントと比較して優れた抗腫瘍活性を示した。いかなる理論にも拘束されないが、これは、腫瘍部位でのＴ制御性細胞(Ｔｒｅｇ)枯渇ならびにＩＣＯＳの抗体介在アゴニズムからのエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)増大による可能性が高かった。１７Ｇ９  Ａｂで試験したマウスは、脾臓および腫瘍両者のＴ細胞集団上のＩＣＯＳ受容体の下方制御も示した。ＩＣＯＳ発現は、ＦｃＲ(ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ)を結合するＡｂアイソタイプで処置したマウスで低いことが観察され、一方、受容体レベルは、非ＦｃγＲ結合Ａｂ(ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ、「ＩＣＯＳ.１  Ｄ２６５Ａ」とも称する)処置マウスで変わらなかった。ＦｃγＲ相互作用への依存は、架橋がこの下方制御に必要であることを示唆した。重要なことに、受容体が下方制御されても、抗腫瘍活性は示された。
【０４５４】
１７Ｇ９(ＩＣＯＳ.１)および親ハムスター抗体(ＩＣＯＳ.４)両者のマウスＩｇＧ１バリアントは、ＦｃＲII(阻害性受容体)に結合する能力のため、アゴニスト活性を有することが予測された。表１３に要約するとおり、両マウスＩｇＧ１バリアントは、検出可能であるが、ＩｇＧ２ａアイソタイプと比較して低レベルの抗腫瘍活性および腫瘍Ｔｒｅｇの少ない減少を示した。対照的に、ＦｃＲ(１７Ｇ９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ)に結合しない抗ＩＣＯＳ抗体は、抗腫瘍活性を示さなかった。マウスＩｇＧ２ａなどの枯渇性アイソタイプはアゴニストｍＩｇＧ１より高い抗腫瘍活性を示したが、ＴｅｆｆでのＩＣＯＳの高発現が、この作用機序を、Ｔｒｅｇをより選択的に枯渇することが予測される、抗ＣＴＬＡ−４抗体処置などの他の処置と組み合わせて考慮するとき、あまり都合がよいものとしない。Ｓ２６７Ｅ変異を有するアイソタイプでの良好なアゴニスト活性のインビトロ知見に一致して、これらのアイソタイプは、ヒトＦｃＲトランスジェニックマウスでヒトＩｇＧ１より僅かに高いまたは等価な抗腫瘍活性も示し得る。
【表１５】
2020515239.tif 000018
【０４５５】
ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントの抗腫瘍活性
ヒトＩｇＧ１  Ｓ２６７ＥがマウスＩｇＧ１抗体に類似するが、ＣＤ３２およびアゴニスト受容体結合へのＦｃＲ結合に関してより効力をもって挙動するかどうかを決定するために、さらなる腫瘍モデル実験を実施した。具体的に、ヒトＦｃ受容体(ＦｃＲ)−トランスジェニックマウスで抗ヒトＩＣＯＳアイソタイプバリアントを評価するために、次の抗体を構築した：
(ａ)マウスＩＣＯＳへの抗ＩＣＯＳ  ｈＩｇＧ１−モノクローナル抗体、キメラハムスター／マウス抗マウスＩＣＯＳ、アイソタイプＩｇＧ１(ＩＣＯＳ.４  ｈｇ１)；
(ｂ)マウスＩＣＯＳへの抗ＩＣＯＳ  ｈＩｇＧ１  ＳＥ−モノクローナル抗体、キメラハムスター／マウス抗マウスＩＣＯＳ、ＣＤ３２ＲおよびＣＤ３２Ｂに非修飾バージョンより良好に結合することを可能とする変異を有する、アイソタイプＩｇＧ１  ＳＥ(ＩＣＯＳ.４  ｈｇ１  ＳＥ)；および
(ｃ)ＩｇＧ１アイソタイプ対照−完全ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照(ＤＴ−１Ｄ１２  ｈｇ１)。
【０４５６】
ＭＣ３８マウス結腸癌細胞をマウスの右脇腹皮下にインプラントした。マウスを３処置群に分け、６０μgの(１)抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１または(２)抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ＳＥまたは(３)ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体(すなわち、ＩＣＯＳ抗体と同じアイソタイプの抗体であるが、任意の天然に存在するマウスタンパク質に結合しない抗体、例えば、とりわけＫＬＨ、ジフテリア毒素に対する抗体)を、移植７日、１０日および１４日後投与した。体重および腫瘍サイズを、５２日目の試験終了まで週２回測定した。腫瘍が≧２０００mm３となるか潰瘍化が出現したら、動物を屠殺した。抗腫瘍活性の増強が、マウスあたり６０μgの抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ＳＥ  ｍＡｂ処置で観察され；表１４および図１１Ａ〜Ｃに示すとおり、平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)は７６％であり、これに対して、ＳＥ修飾がない抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１は６３％であった。処置に関連する体重変化も、臨床毒性の何らかの明らかな徴候も観察されなかった。
【０４５７】
結果
ヒトＦｃＲ−トランスジェニックマウスモデルにおいて、ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ＳＥおよびＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ｍＡｂの投与は、それぞれ７６％および６３％の平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)をもたらした(表１４に示す)。試験した用量レベル(６０μg／マウス)で各群で５匹の完全退行が観察された(表１４および図１１Ａ〜Ｃ)。毒性の身体上の徴候または体重減少は観察されなかった。
【表１６】
2020515239.tif 000019
ａ  完全退行＝試験最終日に少なくとも３測定で腫瘍＜２０mm３のマウス。
ｂ  ヒトＩｇＧ１を有するＩＣＯＳ.４
ｃ  ヒトＩｇＧ１およびＳ２６７Ｅ変異を有するＩＣＯＳ.４
【０４５８】
結論
Ｒａｖｅｔｃｈ同系腫瘍モデル試験(表１５に要約)において、両抗ＩＣＯＳ単剤療法は、中程度の抗腫瘍活性を促進し、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ＳＥが僅かに大きな有効性を３０日目に示した(７６％対６３％平均ＴＧＩ)(表１４)。処置に関連する体重変化も、臨床毒性の何らかの明らかな徴候も観察されなかった。全体として、抗ＩＣＯＳ単剤療法は抗腫瘍活性を促進し、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  ＳＥは、僅かに大きな有効性を３０日目に示した(７６％対６３％平均ＴＧＩ)。両処置は、５匹のマウスの腫瘍拒絶をもたらした。処置に関連する体重変化も、臨床毒性の何らかの明らかな徴候も観察されなかった。
【表１７】
2020515239.tif 000020
【０４５９】
実施例７
Ｓａ１Ｎ腫瘍モデル
Ｓａ１Ｎ線維肉腫マウスモデルを、キメラ抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体の抗腫瘍活性評価のために使用した。ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１は、このＩＣＯＳ.４バリアントがマウス阻害性Ｆｃ受容体に優先的に結合するため、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｓ  Ｓ２６７Ｅのための良好なサロゲートである。腫瘍モデルがマウスＦｃ受容体を発現するマウスで実施されるため、ＩＣＯＳ.４バリアントがヒト抗体のための良好なサロゲートとなる。ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａバリアントは、このＩＣＯＳ.４バリアントが、マウス活性化Ｆｃ受容体に結合するため、ヒトＩｇＧ１により類似するため、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１抗体のための良好なサロゲートである。さらに、これらのバリアントは、マウスおよびヒトＩＣＯＳタンパク質両者に既に交差反応するその可変領域に修飾が必要でなかったため、サロゲートとして特に適切であった。対照的に、抗ＩＣＯＳ.１マウスＩｇＧ１(ｍＩｇＧ１)Ｄ２６５ＡはＦｃＲに結合しない。ＩＣＯＳタンパク質に結合しないＩｇＧ１抗体をアイソタイプ対照として使用した。
【０４６０】
キメラ抗ＩＣＯＳサロゲートモノクローナル抗体で処置後にＳａ１Ｎ線維肉腫モデルにおける抗腫瘍活性を評価するために、Ｓａ１Ｎ細胞をマウスの右脇腹皮下にインプラントした。マウスに、移植７日、１０日および１４日後に
(１)キメラ抗ＩＣＯＳ.１マウスＩｇＧ１(ｍＩｇＧ１)Ｄ２６５Ａ、
(２)抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１
(３)抗ＩＣＯＳ.４  ｈＩｇＧ１、
(４)抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａまたは
(５)ＩｇＧ１アイソタイプ対照、
各１０mg／kgの５処置群でｍＡｂを投与した。
【０４６１】
１５日目、腫瘍および脾臓を、群あたり４匹のマウスから免疫モニタリング分析のために採取した。残りのマウスで、体重および腫瘍サイズを、５６日の試験終了まで週２回測定した。腫瘍が≧２０００mm３となるか潰瘍化が出現したら、動物を屠殺した。
【０４６２】
生存している処置群動物の６０％に基づき中央腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)が計算できた最終日である、移植２３日後、Ｓａ１Ｎ腫瘍に対する抗ＩＣＯＳアイソタイプの処置有効性は、アイソタイプ対照処置と比較したとき、明らかであった。中央ＴＧＩ値は、２１％(ＩＣＯＳ.１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ)、５５％(ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１)、６９％(ＩＣＯＳ.４  ｈＩｇＧ１)および８４％(ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａ)であった。２０％未満の平均および中央体重減少により示される毒性はいずれの処置群でも見られなかった。
【０４６３】
免疫モニタリングデータは、全抗ＩＣＯＳアイソタイプで種々のレベルの腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇を示した。さらに、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞レベル増加が、全抗ｍＩＣＯＳ.４処置で観察された。
【０４６４】
腫瘍応答は、１５日目にＴｒｅｇ減少と一部相関し、これは、これらのｍＡｂのＦｃ受容体への相対的結合と一致する。これらのデータは、Ｔｒｅｇを減少させた抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂが、減少させないものより強力であることを示唆した。
【０４６５】
抗腫瘍処置
移植７日後(０２−Ｆｅｂ−２０１５)、７０匹のマウスを、腫瘍体積(Ｌ×Ｗ×Ｈ／２)により１４匹のマウスの５群に無作為化した。平均腫瘍体積は、各群約１３４mm３であった。７日、１０日および１４日目、アイソタイプ対照または指定ｍＡｂを投与した。マウスは腹腔内(ＩＰ)投与された。
【０４６６】
Ｔ細胞集団の免疫モニタリング
細胞レベルで抗腫瘍活性をさらに試験するために、免疫モニタリングを実施して、腫瘍部位の免疫細胞のサブセットを調査し、抗体処置とリンパ系細胞集団の変化に関連があるか否かを決定した。１５日目、各処置群からの４匹のマウスについて、腫瘍および脾臓が動物施設作業者により採取された。組織をまず穏やかなMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi, San Diego, CA)で処理し、次いで種々のＴ細胞マーカーについて染色した。サンプルを、Ｆｏｒｔｅｓｓａ血球計算器(BD Biosciences, San Jose, CA)でのフローサイトメトリーにより分析した。
【０４６７】
処置後モニタリング
マウスの腫瘍および体重を、試験終了まで週２回測定した。腫瘍を、電子デジタルノギスで三次元で測定し、データＳｔｕｄｙｌｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ(South San Francisco, CA)からのStudyDirectorソフトウェアを使用して電子的に記録した。マウスを、体位、毛づくろいおよび呼吸器変化ならびに嗜眠について毎日確認した。マウスを、腫瘍が２０００mm３エンドポイントに達するかまたは潰瘍化が出現したとき屠殺した。
【０４６８】
結果
腫瘍応答
試験中の全マウスが生存していた最終日は移植１４日後であり、ＩＰ投与の最終日であった。結果として、平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)は計算できなかった。中央ＴＧＩが計算できた最終日である移植２３日後、Ｓａ１Ｎ腫瘍に対する抗ＩＣＯＳアイソタイプの処置有効性は、アイソタイプ対照処置と比較したとき明らかであった。中央ＴＧＩ値は２１％(ＩＣＯＳ.１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ)、５５％(ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１)、６９％(ＩＣＯＳ.４  ｈＩｇＧ１)および８４％(ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａ)であった。
【０４６９】
処置群毎の腫瘍増殖曲線を図１２Ａ〜Ｅに示す。ＴＧＩを、表１６に処置群毎にようやくする。処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を図１３Ａおよび１３Ｂに示す。
【表１８】
2020515239.tif 000021
【０４７０】
抗ＩＣＯＳアイソタイプ間の有効性差は、ｍＩｇＧ２ａ＞ｈＩｇＧ１＞ｍＩｇＧ１＞ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａの階層を示した。ＦｃＲに結合できない不活性ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａバリアントは、２３日目の２１％中央ＴＧＩで幾分抗腫瘍活性を示した。阻害性Ｆｃ受容体、ＦｃγＲIIＢと結合できる非修飾ｍＩｇＧ１アイソタイプはアゴニズムを増強でき、この試験で２３日目で５５％中央ＴＧＩを示した。高いＴＧＩ値に一致して、ｍＩｇＧ２ａおよびｈＩｇＧ１アイソタイプはマウス活性化受容体に結合し、Ｔｒｅｇ発現ＩＣＯＳのＡＤＣＣまたは抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)に介在できる。さらに、腫瘍内Ｔｒｅｇレベル減少は、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍縮小の増加と相関した。平均および中央体重変化が２０％未満であって、明らかな毒性は見られなかった。
【０４７１】
Ｔ細胞集団変化
抗ＩＣＯＳ.４  ｍＡｂのｍＩｇＧ２ａおよびｈＩｇＧ１バリアント処置群で、図１４Ａ〜Ｄに示されるとおりＦｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージがこれらの群でアイソタイプ対照群より有意に低いため、Ｔｒｅｇ枯渇が１５日目に観察された。同じ傾向が非枯渇性抗ＩＣＯＳ抗体(ｍＩｇＧ１)処置群でも観察された。さらに、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)増加が、全処置群で次の順番で明らかであった：ｍＩｇＧ１＞ｈＩｇＧ１＞ｍＩｇＧ２ａ。この観察は、ＩＣＯＳ＋である可能性が高い一部ＣＤ４＋Ｔｅｆｆが、最高枯渇能を有するｍＩｇＧ２ａアイソタイプにより枯渇されている可能性を示唆した。腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞レベル増加も全抗ｍＩＣＯＳ.４処置で観察された。
【０４７２】
結論
表１７に要約するとおり、ステージ分類Ｓａ１Ｎ同系腫瘍モデルにおいて、キメラ抗ＩＣＯＳアイソタイプは、２３日目で２１％〜８４％中央ＴＧＩ範囲である、種々のレベルの抗腫瘍活性を促進する。この試験でのアイソタイプバリアントの抗腫瘍能は次の順番であった：ｍＩｇＧ２ａ＞ｈＩｇＧ１＞ｍＩｇＧ１＞ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ。腫瘍応答は１５日目のＴｒｅｇ枯渇と一部相関し、これは、これらのｍＡｂのＦｃ受容体への相対的結合と一致する。
【０４７３】
この試験からの結果は、アイソタイプの選択が、抗ＩＣＯＳ抗体処置の重要な決定因子であることを示した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプと同等に活性化Ｆｃγ受容体に結合する抗ＩＣＯＳ  ｍＩｇＧ２ａアイソタイプは腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇でき、腫瘍増殖阻害で最大有効性を示した。キメラ抗ＩＣＯＳアイソタイプバリアントは種々のレベルの抗腫瘍活性を促進した。腫瘍応答は１５日目のＴｒｅｇ枯渇と一部相関し、これらのｍＡｂのＦｃ受容体への相対的結合と一致した。結果は、ｍｇ２ａが、最良の抗腫瘍活性を促進したことを示唆した。
【表１９】
2020515239.tif 000022
【０４７４】
実施例８
抗ＩＣＯＳ抗体と抗ＰＤ−１抗体の組み合わせ
試験１
抗ＩＣＯＳサロゲートモノクローナル抗体で処置後のＣＴ２６結腸直腸癌モデルの抗腫瘍活性を評価するために、ＩＣＯＳ.４(親ハムスター抗体のマウスＩｇＧ１バリアント)を、種々の用量でおよび／または抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、ＣＴ２６細胞をマウスの右脇腹皮下にインプラントした。腫瘍が３１mm３に達したとき、マウスを各１０〜１４匹のマウスの９処置群に無作為化した。各マウスに、移植７日、１０日および１４日後ｍＡｂまたはアイソタイプ対照(すなわち、同じアイソタイプの抗体であるが、任意の天然に存在するマウスタンパク質に結合しない抗体、例えば、とりわけＫＬＨ、ジフテリア毒素に対する抗体)を投与した。
【０４７５】
マウスを、３５日の試験終了まで週２回秤量し、腫瘍を測定した。腫瘍が≧２０００mm３となるか潰瘍化が出現したら、動物を屠殺した。移植１５日後、４処置群の４匹のマウスを屠殺し、脾臓および腫瘍を採取した。組織を単一細胞懸濁液に処理し、細胞をＴ細胞集団を分析するためにフローサイトメトリー抗体を使用して染色した。
【０４７６】
アイソタイプ対照抗体に対する平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)が計算できた最終日である移植２１日後、抗ＩＣＯＳ単剤療法のＴＧＩ値は、３mg／kgおよび１０mg／kgでそれぞれ３７％および３３％であった；抗ＰＤ−１単剤療法のＴＧＩ値は２２％であった。１０mg／kg、３mg／kgまたは１mg／kgの抗ＩＣＯＳを抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせたとき、中央ＴＧＩ値＞５４％が観察された。０.３mg／kg、０.１mg／kgまたは０.０３mg／kgの抗ＩＣＯＳを抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせとき、＜４０％であるが、＞２０％である中央ＴＧＩ値が観察された。すべての処置群で明らかな毒性は見られなかった。
【０４７７】
抗体処置
ＣＴ２６細胞移植７日後、１２０匹のマウスを、腫瘍体積により各１０〜１４匹のマウスの１０群に無作為化した。群は約３１mm３の平均腫瘍体積を有した。マウスに抗体を７日、１０日および１４日目に投与した。
【０４７８】
処置後モニタリング
マウスを、体位、毛づくろいおよび呼吸器変化ならびに嗜眠について毎日確認した。動物を少なくとも週２回秤量し、体重減少が≧２０％であるならば屠殺した。各動物の脇腹を、死亡、屠殺または試験期間終了まで少なくとも週２回腫瘍の存在およびサイズについて確認した。腫瘍を、電子デジタルノギスで三次元(長さ[Ｌ]、幅[Ｗ]および高さ[Ｈ])で測定し、記録した。腫瘍体積を次の式を使用して計算した：体積＝(Ｌ×Ｗ×Ｈ０.５)。処置への応答を腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)の関数として測定し、(対照mm３−試験品mm３)／対照mm３１００として計算した。腫瘍体積が約２０００mm３より大きくなるかまたは潰瘍化が出現したとき、動物を屠殺した。
【０４７９】
Ｔ細胞集団の免疫モニタリング
Ｔ細胞集団に対するＩＣＯＳ抗体の効果を調査するために、組織を、移植１５日後に４処置群の各４匹のマウスから採取した。脾臓および腫瘍を穏やかなMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi, San Diego, CA)でホモゲナイズした。単一細胞懸濁液を蛍光色素コンジュゲート抗体を使用してＴ細胞マーカーについて染色した。抗体蛍光をＦｏｒｔｅｓｓａ血球計算器(BD Biosciences, San Jose, CA)でのフローサイトメトリーで検出し、結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア(FlowJo, LLC, Ashland, OR)を使用して分析した。
【０４８０】
統計解析
腫瘍サイズの平均、標準偏差(ＳＤ)および中央値ならびに平均体重値を計算した。平均値は、試験動物が１００％生存したままであるときに計算した；そして、中央値は、試験動物が少なくとも６０％生存したままであるときに計算した。一元配置分散分析(ＡＮＯＶＡ)を使用して、処置群間の平均が統計的に有意に異なるか否かを決定した；ｐ値≦０.０５を有意差と見なした。GraphPad Prism(登録商標)Version 5.01ソフトウェア(GraphPad Software, La Jolla, CA)をデータプロットに使用し、群間の統計的差異を決定した。処置群毎の個々のマウスの腫瘍増殖曲線は、図１５Ａ〜Ｊにみることができる。処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線は図１６Ａおよび１６Ｂに示す。
【０４８１】
結果
腫瘍増殖阻害
中央ＴＧＩが計算できた最終日である腫瘍移植２１日後、１０mg／kgの抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１で単剤療法として処置したマウスは、対照ｍＩｇＧ１抗体処置マウスと比較して３３％中央ＴＧＩを示した。３mg／kgの抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１単剤療法で処置したマウスは３７％ＴＧＩを示し、単剤抗ＰＤ−１  ４Ｈ２  ｍＡｂは２２％ＴＧＩを示した。試験期間最後に(３５日目)、無腫瘍マウスの割合は対照抗体群で０／１０、抗ＰＤ−１群で０／１０、１０mg／kg抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１群で１／１０および３mg／kg抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１群で０／１０であった。抗マウスＰＤ−１と種々の用量(１０mg／kg、３mg／kgまたは１mg／kg)の抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１の組み合わせは、単剤療法何れよりも優れた抗腫瘍活性を示した(それぞれＴＧＩ値５４％、６０％および６６％)。試験終了時の無腫瘍マウス数は、４／１０無腫瘍マウスであった３mg／kg用量以外、これらの群で同じであった(１／１０無腫瘍マウス)。さらに、中央ＴＧＩを、対照と処置群間の効果曲線下面積の相対差を使用して、２１日間計算した(表１８)。
【表２０】
2020515239.tif 000023
【０４８２】
免疫モニタリング分析
免疫モニタリングを、移植１５日後、ある処置群で実施した(図１７Ａ〜Ｄ)。腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの枯渇は、単剤抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１処置群(１０mg／kgおよび３mg／kg)で観察された(図１７Ａ)。抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１処置マウスは、ＴＩＬ  Ｔｒｅｇの減少を示さなかった。抗ＰＤ１ｍＩｇＧ１または３mg／kgの抗ＩＣＯＳ.４で処置された群は、ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増加も示した(図１７Ｂ)。１０mg／kgで、単剤抗ＩＣＯＳ.４処置は、対照群と比較して、このサブセットのレベルは類似するように見えた。
【０４８３】
細胞増殖のマーカーであるＫｉ−６７のレベルは、３mg／kgでの抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１の単剤処置後、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞サブセットで増加した(図１７Ｃ)。ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性のマーカーであるグランザイムＢ陽性の細胞パーセントも、３mg／kgの抗ＩＣＯＳ  ｍＩｇＧ１または抗ＰＤ−１単独で処置された群で高いことも判明した(図１７Ｄ)。
【０４８４】
結論
ステージ分類ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて、単剤療法としての抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１は、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１を３mg／kgで投与したとき、より強力なＴＧＩを示した(２１日目に３７％ＴＧＩ、０／１０無腫瘍マウス)対１０mg／kg(２１日目に３３％ＴＧＩ、０／１０無腫瘍マウス))。免疫モニタリングデータは、１０mg／kg処置群より高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクターの高いＫｉ−６７レベルおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の高いグランザイムＢレベルを、抗ＩＣＯＳ  ｍＩｇＧ１  ３mg／kg処置群で示した。これらのデータは、抗ＩＣＯＳ単剤療法について、３mg／kg用量が１０mg／kg用量より抗腫瘍活性を有することを示唆する。
【０４８５】
抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１  ｍＡｂ  １０mg／kg、３mg／kgおよび１mg／kgと抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１の組み合わせ処置は、４／１０無腫瘍マウスであった３mg／kgの抗ＩＣＯＳ.４以外、これらの処置群で中央ＴＧＩ値＞５４％と１／１０無腫瘍マウスを示した。これらの結果は、３つの最高用量で抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１処置と組み合わせた抗ＩＣＯＳ  ｍＩｇＧ１の同等なレベルの抗腫瘍活性を示唆する。
【０４８６】
試験２
この試験は、種々の用量での抗ＩＣＯＳサロゲートモノクローナル抗体、ＩＣＯＳ.４(親ハムスター抗体のマウスＩｇＧ１バリアント)および／または抗ＰＤ−１  ｍＡｂで処置後のＣＴ２６結腸直腸癌モデルにおける抗腫瘍活性を評価するために設計した。ＣＴ２６細胞をマウスの右脇腹に皮下的にインプラントした。腫瘍が４５mm３に達したとき、マウスを、各群１５〜２０匹のマウスで９処置群に無作為化した。各マウスに、移植９日、１２日および１５日後にｍＡｂまたは無関係のアイソタイプ対照を投与した。マウスを、５１日目の試験終了まで週２回秤量し、腫瘍を測定した。腫瘍が≧２０００mm３であるか潰瘍化が出現したら、動物を屠殺した。全血サンプルを、分析用に種々の時点(腫瘍移植９日、１５日および１６日後)で採った。腫瘍移植１６日後、８処置群の５匹のマウスを屠殺し、脾臓および腫瘍を採取した。組織を単一細胞懸濁液に処理し、細胞をＴ細胞集団を分析するためにフローサイトメトリー抗体を使用して染色した。
【０４８７】
アイソタイプ対照抗体に対する平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)が計算できた最終日である腫瘍移植２９日後、抗ＩＣＯＳ単剤療法のＴＧＩ値は３０mg／kgで５３０mg／kg、１０mg／kg、３mg／kgまたは１mg／kgの抗ＩＣＯＳを抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせたとき、平均ＴＧＩ値＞７４％が観察された。すべての処置群で明らかな毒性は見られなかった。
【０４８８】
抗体処置
腫瘍移植９日後、２００匹のマウスを、腫瘍体積により各１５〜２０匹のマウスの９群に無作為化した。群は約４５mm３の平均腫瘍体積を有した。マウスに９日、１２日および１５日目に抗体を投与した。
【０４８９】
処置後モニタリング
動物を、体位、毛づくろいおよび呼吸器変化ならびに嗜眠について毎日確認した。動物を少なくとも週２回秤量し、体重減少が≧２０％であるならば屠殺した。各動物の脇腹を、死亡、屠殺または試験期間終了まで少なくとも週２回腫瘍の存在およびサイズについて確認した。腫瘍を、電子デジタルノギスで三次元(長さ[Ｌ]、幅[Ｗ]および高さ[Ｈ])で測定し、記録した。腫瘍体積を次の式を使用して計算した：体積＝(Ｌ×Ｗ×Ｈ０.５)。処置への応答を腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)の関数として測定し、(対照mm３−試験品mm３)／対照mm３×１００として計算した。腫瘍体積が約２０００mm３より大きくなるかまたは潰瘍化が出現したとき、動物を屠殺した。
【０４９０】
Ｔ細胞集団の免疫モニタリング
種々の方法を使用して、Ｔ細胞およびＢ細胞集団に対するＩＣＯＳ抗体の効果を調査した。全血サンプルを種々の時点(９日目、１５日目および１６日目)でマウスから採り、次いで分析用に処理した。さらに、移植１６日後に８処置群の各５匹のマウスから採取した。脾臓および腫瘍を穏やかなMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi, San Diego, CA)でホモゲナイズした。単一細胞懸濁液を蛍光色素コンジュゲート抗体を使用してＴ細胞マーカーについて染色した。抗体蛍光をＦｏｒｔｅｓｓａ血球計算器(BD Biosciences, San Jose, CA)でのフローサイトメトリーで検出し、結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア(FlowJo, LLC, Ashland, OR)を使用して分析した。
【０４９１】
統計解析
腫瘍サイズの平均、標準偏差(ＳＤ)および中央値ならびに平均体重値を計算した。平均値は、試験動物が１００％生存しているときに計算した；中央値は、試験動物が少なくとも６０％生存しているときに計算した。一元配置分散分析(ＡＮＯＶＡ)を使用して、処置群間の平均が統計的に有意に異なるか否かを決定した；ｐ値≦０.０５を有意差と見なした。GraphPad Prism(登録商標)Version 7.02ソフトウェア(GraphPad Software, La Jolla, CA)をデータプロットに使用し、群間の統計的差異を決定した。処置群毎の個々のマウスの腫瘍増殖曲線は図１８Ａ〜Ｉに見られ得る。処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線は図１９Ａおよび１９Ｂに示す。
【０４９２】
結果
腫瘍増殖阻害
平均ＴＧＩが計算できた最終日である腫瘍移植２９日後、ＣＴ２６腫瘍に対する抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ治療の処置有効性を単剤療法および抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの組み合わせで観察した(表１９)。３mg／kgの抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１単剤療法で処置したマウスは３３％ＴＧＩを示し、単剤抗ＰＤ−１  ４Ｈ２  ｍＡｂは７４％ＴＧＩを示した。試験期間最後に(５１日目)、無腫瘍マウス数は対照抗体群で０／１０、抗ＰＤ−１群で８／１５および全抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１用量(３０mg／kg、１０mg／kgまたは３mg／kg)で１／１５であった。抗ＰＤ−１と種々の用量(３０mg／kg、１０mg／kg、３mg／kgおよび１mg／kg)の抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１の組み合わせは、単剤療法より優れたまたは等しい抗腫瘍活性を示した(それぞれＴＧＩ値７４％、８０％、８７％および７８％)。試験終了時の無腫瘍マウス数は、４組み合わせ群で８〜１１／１５の範囲であった。
【表２１】
2020515239.tif 000024
【０４９３】
免疫モニタリング分析
免疫モニタリングを、ある処置群で移植後種々の時点で実施した(図２０Ａ〜Ｄ)。腫瘍移植１６日後、腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの枯渇は、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１  ｍＡｂで処置した全群で観察された(図２０Ａおよび２０Ｂ)。ＣＴ２６腫瘍担持抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１処置マウス単独は、ＴＩＬ  Ｔｒｅｇの減少を示さなかった。かなり変動するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照に対して全処置群でＴＩＬで増加した(図２０Ｄ)。
【０４９４】
細胞増殖のマーカーであるＫｉ−６７のレベルは、抗ＰＤ−１(中程度増加)または抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１(高増加)の単剤処置後、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞サブセットで増加した(図２１Ａ〜Ｃ)。Ｋｉ−６７レベルのさらなる増加が抗ＰＤ−１および抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１組み合わせ処置群で観察された。
【０４９５】
ＩＣＯＳのリガンドであるＩＣＯＳ−Ｌは、抗ＩＣＯＳ.４抗体で処置後、Ｂ細胞で高い平均蛍光強度(ＭＦＩ)レベルを示した。ＩＣＯＳ−ＬのＭＦＩレベルも、腫瘍移植９日、１５日および１６日後採取した全血および腫瘍移植１６日後の脾臓で増加した。最高用量の抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１がＩＣＯＳ−Ｌに対して最高ＭＦＩを有するとき現れるとの傾向が見られた(図２２Ａ−Ｄ)。
【０４９６】
ＩＣＯＳレベルの調査で、ＣＤ４＋Ｔ細胞上受容体発現の喪失が抗体処置後に観察された。これは、腫瘍ＴＩＬＳで最も明らかであった(表２０)。抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１用量の高さが、ＩＣＯＳレベルの低さと相関した。抗体(３０mg／kgのアイソタイプ対照および５mg／kgの抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ；１mg／kg、３mg／kg、１０mg／kgおよび３０mg／kg用量レベルの抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１  ｍＡｂ)投与は、ＣＴ２６細胞移植９日、１２日および１５日後の腹腔内注射であった。全血を種々の時点(移植９日、１５日および１６日後)採取し、腫瘍を、ある処置群の５匹のマウスから移植１６日後に採取した。フローサイトメトリーによる免疫モニタリング分析を処理サンプルで実施した。
【表２２】
2020515239.tif 000025
【０４９７】
結論
表２１に要約するとおり、ステージ分類ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１  ｍＡｂでの処置は、単剤としても、抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせたときも何れも抗腫瘍活性を示した。単剤療法として、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１を３０mg／kg、１０mg／kgまたは３mg／kgで投与したときに類似レベルの抗腫瘍活性が観察されたが、３mg／kg用量は、２９日目に最高平均ＴＧＩ(３３％)を有した。免疫モニタリングデータは、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ(腫瘍)枯渇増加、高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞(腫瘍)、ＣＤ４＋エフェクターの高いＫｉ−６７タンパク質レベル(腫瘍)、Ｂ細胞における高いＩＣＯＳ−Ｌレベル(全血および脾臓)およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＣＯＳ発現喪失(全血および脾臓)を、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１で処置した全用量群にわたり示した。これらのデータは、この腫瘍モデルにおいて抗ＩＣＯＳ単剤療法が良好な有効性を有することを示した。
【０４９８】
抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１処置は、この実験において極めて強い活性を有した。３０mg／kg、１０mg／kg、３mg／kgおよび１mg／kgの抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１  ｍＡｂと抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１の組み合わせ処置は、これらの処置群で平均ＴＧＩ値≧７４％と、８〜１１／１５無腫瘍マウスをもたらした。これらの結果は、全投与量にわたり、抗ＰＤ−１  ｍＩｇＧ１処置と組み合わせた抗ＩＣＯＳの同等レベルの抗腫瘍活性を示した。ＣＴ２６モデルにおける抗腫瘍有効性の改善は、抗ＩＣＯＳと抗ＰＤ−１  ｍＡｂを組み合わせたときにみられた。腫瘍増殖阻害は、抗ＰＤ−１と組み合わせた４用量の各々(１mg／kg、３mg／kg、１０mg／kg、３０mg／kg)の抗ＩＣＯＳ処置群で≧７４％であり、これらの群の各々で少なくとも８／１５無腫瘍マウスであった。単剤としての抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの腫瘍増殖阻害は、３mg／kgで投与したとき、３３％であり、１／１５無腫瘍マウスであった。免疫モニタリングはまた、抗ＩＣＯＳ単剤療法での低いＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ、高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクターにおける高いＫｉ−６７レベル、Ｂ細胞における高いＩＣＯＳ−Ｌレベルおよび低いＩＣＯＳ受容体発現レベルも示した。
【表２３】
2020515239.tif 000026
【０４９９】
実施例９
ＣＴ２６腫瘍モデルにおける抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせた抗ＩＣＯＳ抗体の抗腫瘍活性
概要
種々のＦｃ抗ＩＣＯＳサロゲートモノクローナル抗体、ＩＣＯＳ.４(親ハムスター抗体のマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２バリアント)および／または抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂでの処置後のＣＴ２６結腸直腸癌モデルにおける抗腫瘍活性を評価するために、ＣＴ２６細胞をマウスの右脇腹に皮下的にインプラントした。腫瘍が９６mm３に達したとき、マウスを、各１０〜１５匹のマウスの６処置群に無作為化した。各マウスに、移植１３日、１６日および２０日後、ｍＡｂまたはアイソタイプ対照(すなわち、同じアイソタイプの抗体であるが、任意の天然に存在するマウスタンパク質に結合しない抗体、例えば、とりわけＫＬＨ、ジフテリア毒素に対する抗体)を投与した。マウスを、６６日目の試験終了まで、週２回、秤量し、腫瘍を測定した。腫瘍が≧２０００mm３であるか潰瘍化が出現したら、動物を屠殺した。
【０５００】
アイソタイプ対照抗体に対する中央腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)が計算できた最終日である移植３０日後、抗ＩＣＯＳ単剤療法のＴＧＩ値は、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａバリアント(例えば、配列配列番号３および４のＶＨ／ＶＬ配列＋ＩｇＧ１またはＩｇＧ２を有するキメラマウス抗体)でそれぞれ、１５％および６９％であり；抗ＣＴＬＡ−４単剤療法は−７％のＴＧＩ値を示した。抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂを抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂと組み合わせたとき、４０％(ｍＩｇＧ１)および７９％(ｍＩｇＧ２ａ)の平均ＴＧＩ値が観察された。すべての処置群で明らかな毒性は見られなかった。
【０５０１】
実験手順
試験抗体および対照
次の抗体を構築した。
(ａ)抗マウスＩＣＯＳマウスＩｇＧ１抗体−抗ＩＣＯＳ.４  ｍＡｂ、アイソタイプマウスＩｇＧ１をチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株から発現させた；
(ｂ)抗マウスＩＣＯＳマウスＩｇＧ２ａ抗体−抗ＩＣＯＳ.４  ｍＡｂ、アイソタイプマウスＩｇＧ２ａをＣＨＯ細胞株から発現させた；
(ｃ)抗マウスＣＴＬＡ−４  ９Ｄ９マウスＩｇＧ２ｂ抗体−モノクローナル抗体ｔｏマウスＣＴＬＡ−４クローン９Ｄ９、アイソタイプマウスＩｇＧ２ｂをトランスフェクトＣＨＯ細胞株から発現させ、ＰＢＳで製剤した；および
(ｄ)マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照−完全マウスＩｇＧ１抗体、ＩＣＯＳに非結合；ＰＢＳ中１０mg／kgでで調製した。
【０５０２】
腫瘍細胞の製造
ＣＴ２６マウス結腸癌細胞をAmerican Type Culture Collection(ATCC, Catalog CRL-2638)から購入し、ダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)＋１０％熱不活性化胎児ウシ血清(ＦＢＳ)の無菌培養で、１０未満の継代で、インビトロで維持した。細胞は、マウス抗体産生試験により無ウイルスであることが確認された。
【０５０３】
腫瘍移植
ＣＴ２６細胞を。１０％胎児ウシ血清(ＦＢＳ)(Gibco, Life Technologies, Catalog 26140-079, Lot 1704315)添加ＲＰＭＩ−１６４０培地(HyClone/GE Healthcare, Logan UT, Catalog 10-040-CM, Lot 16915003)で培養した。細胞を３〜４日毎に１：１０に分けた。各マウスの右脇腹に、０.２mL  ＰＢＳ中の１１０６  ＣＴ２６細胞を、１cmシリンジおよび２６ゲージ半インチ針を使用して、皮下的に移植した。
【０５０４】
抗体処置
ＣＴ２６細胞移植１３日後、１２０匹のマウスを、腫瘍体積に従い各１０〜１５匹のマウスの６群に無作為化した。群は約９６mm３の平均腫瘍体積を有した。マウスに、１３日、１６日および２０日目に抗体を投与した。
【０５０５】
処置後モニタリング
動物を、体位、毛づくろいおよび呼吸器変化ならびに嗜眠について毎日確認した。動物を少なくとも週２回秤量し、体重減少が２０％以上であるならば、屠殺した。各動物の脇腹を、死亡、屠殺または試験期間終了まで少なくとも週２回腫瘍の存在およびサイズについて確認した。腫瘍を、電子デジタルノギスで三次元(長さ[Ｌ]、幅[Ｗ]および高さ[Ｈ])で測定し、記録した。腫瘍体積を次の式を使用して計算した：体積＝(Ｌ×Ｗ×Ｈ０.５)。処置への応答を腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)の関数として測定し、(参照mm３−試験品mm３)／参照mm３１００として計算した。腫瘍体積が約２０００mm３より大きくなるかまたは潰瘍化が出現したとき、動物を屠殺した。
【０５０６】
結果
表２２に示すとおり、中央ＴＧＩが計算できた最終日である腫瘍移植３０日後、ＣＴ２６腫瘍に対する抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ治療の処置有効性は、単剤療法としておよび抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂとの組み合わせの何れでも観察された。単剤療法として抗ＩＣＯＳ.４バリアントで処置されたマウスは、１５％中央ＴＧＩ(ｍＩｇＧ１)および６９％ＴＧＩ(ｍＩｇＧ２ａ)を示した。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ(−７％ＴＧＩ)の組み合わせは、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１バリアントが４０％ＴＧＩを有し、抗ＩＣＯＳ.４mｇ２ａバリアントが７９％ＴＧＩを有したため、高い中央ＴＧＩをもたらした。試験期間最後に(６６日目)、無腫瘍マウス数は、全群で０であった。処置群毎の個々のマウスの腫瘍増殖曲線は図２３Ａ〜Ｆに示す。抗体(２０mg／kgでのアイソタイプ対照；１０mg／kgでの抗ＣＴＬＡ−４ｍＩｇＧ２ｂ、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１および抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａ)の投与は、ＣＴ２６細胞移植１３日、１６日および２０日後に腹腔内注射であった。
【０５０７】
処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を図２４Ａおよび２４Ｂに示す。平均および中央体重変化が２０％未満であって、すべての処置群で明らかな毒性は見られなかった。
【表２４】
2020515239.tif 000027
【０５０８】
結論
表２３に要約するとおり、ステージ分類ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて、両抗ＩＣＯＳ  Ｆｃバリアント単剤療法(すなわち、ＩＣＯＳ.４親ハムスター抗体のマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２バリアント)は中程度の抗腫瘍活性を促進し、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａは、３０日目に抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１より大きな有効性を示した(６９％対１５％中央ＴＧＩ)。抗ＩＣＯＳ.４処置と抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの組み合わせは、有効性を増加させ、中央ＴＧＩの７９％(ｍＩｇＧ２ａ)および４０％(ｍＩｇＧ１)に増加した。処置に関連する体重変化も、臨床毒性の何らかの明らかな徴候も観察されなかった。抗ＩＣＯＳ単剤療法は抗腫瘍活性を促進し、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａは、３０日目に大きな抗腫瘍有効性を示した(６９％対１５％中央ＴＧＩ)。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ処置と組み合わせたとき、抗腫瘍有効性は増加し、抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ２ａ組み合わせ群で７９％ＴＧＩおよび抗ＩＣＯＳ.４  ｍＩｇＧ１は４０％ＴＧＩであった。
【表２５】
2020515239.tif 000028
【０５０９】
実施例１０
親和性、結合、生物物理学的性質、強制安定性および免疫原性
結合性質の特徴づけ
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、カニクイザルＰＢＭＣおよびマウスおよびラット脾細胞を、プレート結合種特異的抗ＣＤ３(６ウェルプレートで２mL／ウェルのＰＢＳ中４μg／mL溶液で３時間、３７℃で被覆し、１mL培地で２５回洗浄)＋１μg／mL可溶性種特異的抗ＣＤ２８と、新鮮培地中、１〜２×１０６細胞／mLで３〜４日間インキュベーションすることにより活性化した。カニクイザルＰＢＭＣおよびマウスおよびラット脾細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化３〜４日後に主にＴ細胞となることは注意すべきである。細胞をを採取し、計数し、遠沈させ、染色緩衝液＋１００μg／mLマウスＩｇＧに再懸濁して、１５分間、室温で遮断した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、２μg／mLから４倍連続希釈で染色緩衝液中０.００２μg／mLまで薄め、活性化ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウス細胞と３０分間、４〜８℃でＵ底プレートでインキュベートすることにより力価測定した。次いで、細胞を１５０〜２００μLの染色洗浄緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液で１：２００希釈した５０μLのＡＰＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃガンマ)で再懸濁し、穏やかにボルテックス処理し、暗所で３０分間、４〜８℃でインキュベートした。次いで、細胞を２００μL染色洗浄緩衝液で１回洗浄し、それに再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏフローサイトメーターで分析した。
【０５１０】
図２５Ａおよび２５Ｂに記載するとおり、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅはヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスＴ細胞に、３種間で有意に異ならないＥＣ５０値で強い結合を示す。
【０５１１】
さらに、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２５７Ｅの結合アビディティーを、２つの異なる抗ＩＣＯＳ競合抗体と比較した。簡潔には、抗体を活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞と、氷上、３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、結合抗体を抗ヒト−ＩｇＧ−ＰＥ二次試薬で検出した。シグナルをフローサイトメトリーにより測定し、平均蛍光強度を計算した。図２６Ａ〜Ｂに示すとおり、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、２つの競合抗体と比較して、ＥＣ５０で計算して、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に大きな結合アビディティーを示した。ここに記載するとおり、抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロアッセイの文脈での用語「ＥＣ５０」は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間の応答を誘発する抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度をいう。図２６Ａにおいて、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＥＣ５０は約０.０７μg／mLであり、一方競合抗体１のＥＣ５０は約１.４μg／mLであり、競合抗体２のＥＣ５０は約０.４μg／mLであった。換言すると、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＥＣ５０は競合抗体１のＥＣ５０より約２０倍低く、競合抗体２のＥＣ５０より約６倍低い。図２６Ｂにおいて、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＥＣ５０は約０.０８μg／mLであり、一方抗体１のＥＣ５０は約２.４μg／mLであり、競合抗体２のＥＣ５０は約１.０μg／mLであった。換言すると、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＥＣ５０は競合抗体１のＥＣ５０より約３０倍低く、競合抗体２のＥＣ５０より約１２倍低かった。
【０５１２】
親和性試験
単量体ヒトＩＣＯＳが利用可能ではないため、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの真の親和性を決定するための実験が、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ  Ｆａｂフラグメント(Lot PC-1804-04)およびヒトＩＣＯＳ  Ｆｃ(R&D Systems, 169-CS-050)抗原とＢｉａｃｏｒｅTM  Ｔ２００装置を使用して、実施された。結合実験は、インビボ条件下の抗体の抗原への親和性を得るため(またはモデルとなるため)、３７℃で実施した。ＣＭ４チップを、Biacoreの抗ｈＦｃ捕捉試薬で共有結合性に被覆した。表面をエチレンジアミンで遮断した。次に、Ｆｃタグを有するヒトＩＣＯＳをＣＭ４チップに捕捉し、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＦａｂフラグメントを０.９１nM、２.７nM、２５nM、７４nM、６６７nMおよび２０００nM濃度で流した。
【０５１３】
会合速度定数(ｋｏｎ)および解離速度定数(ｋｏｆｆ)を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、Version 3.2を使用して、時間および応答単位(ＲＵ)でプロットした。データを１：１ラングミュアモデルに適合させた。ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比は、抗体−抗原複合体の解離定数(ＫＤ)により表された。Ｂｉａｃｏｒｅチップを、１００μL／分の流速の５０mM水酸化ナトリウム溶液で再生した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＦａｂフラグメントにより測定した抗体のヒトＩＣＯＳ抗原に対する親和性は、５２nM〜６５nMであった。
【０５１４】
生物物理学的分析
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの同一性を、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー(ＬＣ−ＭＳ)により確認した。重鎖および軽鎖質量測定のために、サンプルを標準試験方法により脱グリコシル化し、還元し、アルキル化し、Waters LCT Premier ESI-TOF装置を使用して分析した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ軽鎖および重鎖の質量は、ＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列に基づく、それぞれ２３,７９５Daおよび５０,１６１Daの予測される質量割り当てに等しかった。
【０５１５】
抗体の同一性をエドマン配列分析により決定した。抗体重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列決定を、ABI Procise Automated Protein Sequence Analyzerで実施した。観察されたＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＮ末端アミノ酸配列は、軽鎖および重鎖の予測アミノ酸配列と一致した。
【０５１６】
Agilent 2100 BioAnalyzer系を使用して、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅが、非還元(ＮＲ)条件下約１６０kDa移動したことを示した。還元条件(Ｒ)下、重鎖は約６０kDa移動し、軽鎖は約２５kDa移動した。
【０５１７】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの純度を、キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(ＣＥ−ＳＤＳ)により決定した。サンプルを、Beckman Coulter Proteome Lab PA 800でおよび非還元および還元条件下で分析した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、非還元条件下、ＣＥ−ＳＤＳで９３.４５％インタクトＩｇＧからなった。抗体フラグメントが次のとおり検出された：１軽鎖(１.８５％)、１重−軽鎖(０.４５％)、２重鎖(０.８８％)および２重鎖および１軽鎖(３.３７％)。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの純度は、還元条件下、ＣＥ−ＳＤＳで９６.５１％(６２.２２％重鎖＋３４.２９％軽鎖)であった。
【０５１８】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、産物不均一性レベルを決定するために疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)により特徴づけした。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、９８.１％主ピーク、主ピーク前の０.４％ピークおよび１.５％テーリングショルダーで低不均一性を示し、低化学または立体構造不均一性を示した。
【０５１９】
毛管等電点電気泳動(ｃＩＥＦ)を利用して、荷電アイソフォームについてＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを特徴づけした。サンプルを、iCE Analyzer Model iCE3を使用して分析した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、７.３０〜７.７２の等電点(ｐＩ)範囲を示し、主ピークは７.７２(４５.１９％)であった。観察された他のピークは、７.３０(７.５１％)、７.４０(１６.２１％)および７.５６(３１.１０％)であった。観察されたｐＩ範囲は、ＩｇＧ１抗体サンプルについて予測される通常の範囲内であった。
【０５２０】
多角度光散乱(ＭＡＬＳ)と連結したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ；ゲル濾過)を、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの単量体含量および主不純物のＭＷ分布を決定した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、９９.８％を超える単量体を含むことが判明した。ＭＡＬＳによるＭＷ割り当ては、単量体成分が１４４,３００DaのＭＷを有したことを示した。ごく少量の凝集体は、６２６,８００Daの見かけのＭＷを有した。
【０５２１】
ペプチドフィンガープリンティングおよび配列決定を、消化ペプチドを、LTQ-Orbitrap XL質量分析計と連結したAcquity UPLC BEH C18  １.７μm(２.１×１５０mm；Waters Corporation)を用いるWaters Acquity UPLC上のＬＣ−ＭＳによる分析により実施した。重鎖および軽鎖配列同定は、トリプシン、キモトリプシンおよびペプシンを含む種々の消化からのＭＳ／ＭＳデータを使用して１００％であった。ペプチド配列決定は、アロタイプがヒトＩｇＧ１であり、ＤＮＡ配列により予測される予測アミノ酸配列に一致することを確認した。単一Ｎ−グリコシル化部位は、重鎖のＮ２９７であることが確認された。ジスルフィド結合は、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体について予測されるとおりであることが判明した。ＣＤ３２ｂ受容体結合増強のために行ったＳ２６７Ｅ変異も配列で同定された。
【０５２２】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅに存在するＮ結合糖のオリゴ糖プロファイルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＭＤＱ装置を使用するキャピラリーレーザー誘起蛍光(ｃＬＩＦ)により決定した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅに存在するＮ結合グリカンは、ガラクトース取り込みレベルに関して変動する、フコースを含まないアシアロ−二分岐糖の混合物であった。主要グリカン構造はＧ０Ｆ(３０.６４％)およびＧ１Ｆ(４３.６５％)および程度は低いがＧ２Ｆ(１９.０７％)であった。
【０５２３】
ＶＰキャピラリー示差走査熱量計を使用して、抗体の熱的安定性および可逆性を決定した。データをＯｒｉｇｉｎ  ７ソフトウェアプログラムを使用して分析した。熱的安定性は、典型的ヒトモノクローナル抗体について許容される範囲内であった。熱的スキャニング実験において、多数の抗体は、３つの分解できる融解温度を示した；最初のものはＣＨ２ドメインのアンフォールディング、二番目のものはＦａｂドメインのアンフォールディングおよび三番目のものはＣＨ３ドメインのアンフォールディングによるものであった。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、これら３つのアンフォールディング温度を有するサーモグラムを示した：６５.２℃(Ｔｍ１)、８３.２℃(Ｔｍ２)、８６.３℃(Ｔｍ３)。熱的可逆性は、撹乱、この場合加熱後にタンパク質がその天然立体構造に再折りたたみして戻る能力のマーカーである。８３.２℃(二番目の融解温度)での熱的可逆性実験は５５.２％可逆性を示し、これは抗体が頑強な再折りたたみ性質を有することを示唆する。
【０５２４】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの安定性を表２４に要約する。
【表２６】
2020515239.tif 000029
【０５２５】
実施例１１
表面プラズモン共鳴によるヒトＦｃγＲに対するＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ結合親和性
ヒトＦｃγＲのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅへの結合を表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により試験し、対照抗体抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１ｆと比較した。抗体をプロテインＡセンサー表面に捕捉し、ＦｃγＲの力価測定シリーズを検体として注入した。
【０５２６】
これらの試験のために、プロテインＡを、１０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤ｐ２０のランニング緩衝液中、エタノールアミン遮断と共にＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４に標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用して約３０００ＲＵの密度で固定化した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ(３μg／mL)またはｈＩｇＧ１ｆ対照抗体(３μg／mL)を、約４００〜５００ＲＵの密度でプロテインＡ表面に捕捉し、ＦｃγＲ検体の結合を、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０緩衝液(ＰＢＳ−Ｔ)ｐＨ７.１からなるランニング緩衝液中、２５℃で、３０μL／分流速で１２０秒会合時間および１８０秒解離時間を使用して試験した。結合の速度論および親和性を決定するために、１μMから０.１５nMまで減少(ＣＤ６４タンパク質)または１０μMから１.５nMまで減少(他の全ＦｃγＲ)のＦｃγＲ濃度シリーズ(３：１希釈)を試験した。速度論的データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１ラングミュアモデルまたは定常状態モデルに適合させた。
【０５２７】
定常状態結合で極めて迅速な会合および解離速度を示したセンサーグラムデータを、１：１定常状態親和性モデルに適合させ、一方遅い速度論を示したものを１：１ラングミュアモデルに適合させた。単一検体濃度(ｈＣＤ６４を０.１１μMおよびｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ａ−Ｆ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ１およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２１を１.１μM)でのデータを抗ＩＣＯＳ対照抗体およびＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅと比較し、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、数個のＦｃγＲについて高い結合応答および遅い解離速度を示し、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびｈＣＤ３２ｂは最も著しい結合および遅い解離速度増加を示した。
【０５２８】
最良適合速度論的および親和性値を表２５に示す。これらのデータは、Ｓ２６７Ｅ変異が、数ＦｃＲに対して結合親和性をｈＩｇＧ１ｆ対照抗体と比較して変化させることを定量的に示した。例えば、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１への結合は、１５００nM(ｈＩｇＧ１ｆ対照)のＫＤから３４nM(ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ)に改善され、これは、４０倍を超える改善であり、ｈＣＤ３２ｂへの結合は、５０００nM(ｈＩｇＧ１ｆ対照)のＫＤから１７０nM(ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ)に改善され、これは少なくとも２９倍の改善であった。カニクイザルＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂへの結合は、ヒトＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂでみられるより低かった。
【表２７】
2020515239.tif 000030
【０５２９】
実施例１２
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの薬物動態(ＰＫ)
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの単回投与ＰＫ／ＰＤおよび耐容性試験から得たＰＫパラメータを表２６に要約する。暴露は、１mg／kg〜１０mg／kgで用量比例的であり、１３〜１４日の半減期であった。抗薬物抗体(ＡＤＡ)は、１mg／kg用量群の４匹中３匹のカニクイザルで投与７日後にみられ、投与４２日後まで増加し続けた。ＡＤＡシグナルの増加は、これららサルにおける抗体の迅速なクリアランスに対応し、ＡＤＡに左右されるこの部分のデータは、ＰＫデータ分析に包含しなかった。
【表２８】
2020515239.tif 000031
【０５３０】
マウスにおけるマウスサロゲート抗体の薬物動態
１mg／kgでの単回静脈内投与および単回腹腔内投与(０.１mg／kg、１mg／kgおよび１０mg／kg)後の抗マウスＩＣＯＳサロゲートｍＡｂ(ＩＣＯＳ.４、親ハムスター抗体のマウスＩｇＧ１バリアント)の薬物動態を、イエハツカネズミのアルビノ、研究室飼育系統である非腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。抗体は、表２７に示すとおり、１mg／kg〜１０mg／kg用量範囲にわたり、暴露の用量比例的より大きな増加を示した。半減期は、最低１mg／kg用量の０.５３日から最高１０mg／ｇ用量の１.５日の範囲であった。マウスにおける非直線的ＰＫは、少なくとも一部標的介在薬物処分によるものであると考えられた。
【表２９】
2020515239.tif 000032
【０５３１】
実施例１３
交差反応性および組織染色
結合アッセイは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ親和性(ＥＣ５０)が、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒトで類似することを示している。
【０５３２】
組織交差反応性分析において、ＦＩＴＣコンジュゲートＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、各１〜４ドナーの２０正常ヒト組織からの凍結切片(アセトンまたはアセトン／ホルマリン固定)に適用した。特異的染色が、リンパ系(胸腺、扁桃および脾臓)およびリンパ系富組織(胃および小腸)、ならびに数組織(甲状腺、皮膚、肺、子宮および精巣)の散乱した極稀な単核細胞(ＭＮＣ)のリンパ球サブセットで観察され、これは根底の炎症に大きく関係した。大脳、小脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、末梢神経、結腸、下垂体および前立腺で陽性標識は見られなかった。リンパ系組織で、陽性リンパ球は主に胸腺の髄質ならびに胚中心の明調域および扁桃の濾胞間領域に分布した。これらの結果は、親抗体ＩＣＯＳ.４での先の免疫組織化学(ＩＨＣ)に一致する。
【０５３３】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ−ＦＩＴＣ染色をまた大脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、胸腺、扁桃、皮膚および精巣を含む１０の正常カニクイザル組織からの凍結切片において免疫組織化学(ＩＨＣ)でも評価した。全体として、染色パターンはヒト組織のものに類似した。特異的染色は、リンパ系組織(扁桃、脾臓および胸腺)のリンパ球サブセットで観察された。予想外の染色は試験した組織で観察されなかった。
【０５３４】
実施例１４
サイトカイン放出、補体活性化および耐容性
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅで処理したヒト全血からのサイトカイン放出
この試験は、新鮮全血サンプルでＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅで処理後のヒト末梢血細胞におけるサイトカイン応答の評価のために設計した。
【０５３５】
新鮮正常ナトリウム−ヘパリン添加全血(１００μL)を９６ウェル丸底プレートに加えた。ＡＩＭ  Ｖ無血清培地で希釈した１００μLのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥまたはＩＣＯＳ.３３、アイソタイプ対照抗ＫＬＨ−ｈＩｇＧ１−２Ｆ５  ｍＡｂまたはＴＧＮ(５.１１Ａ１)抗ＣＤ２８  ｍＡｂをウェルに加えて、１０μg／mL／ウェルの最終抗体濃度および２００μL／ウェルの最終体積とした。ＡＩＭ  Ｖ培地で希釈したＳＥＢ(１００μL)を、最終濃度１００ng／mL  ＳＥＢでウェルに加えて、２００μL／ウェルの最終体積とした。ＡＩＭ  Ｖ培地で希釈したＣＤ３−ＣＤ２８(１００μL)を１μg／mL  ＣＤ３−ＣＤ２８の最終濃度および２００μL／ウェルの最終体積でウェルに加えた。ＡＩＭ  Ｖ培地で希釈したＬＰＳ(１００μL)を、１０μg／mL  ＬＰＳの最終濃度および２００μL／ウェルの最終体積でウェルに加えた。プレートを、５％〜７％ＣＯ２雰囲気のインキュベーターで、２０時間、３７℃インキュベートした。各ウェルからの形質細胞培養上清を２０時間後採取し、−２０℃で保存した。サンプルを、アッセイ実行のためにドライアイスコンテナでBMS Lawrenceville, NJ(LVL)に輸送した。
【０５３６】
サイトカイン分泌評価のために、１２μLの予め混合された標準、対照およびサンプルをアッセイプレートに移した。磁気ビーズ(６μL)を各３８４ウェルプレートに加え、次いで密閉し、プレートシェーカーで２時間、室温でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、磁気ビーズを２回洗浄し、６μLの検出抗体を各ウェルに加えた。プレートを再び密閉し、プレートシェーカーで室温でインキュベートした。ストレプトアビジン−フィコエリスリン(６μL)を、検出抗体を含む各ウェルに加え、次いで３０分間、室温でインキュベートし、プレート洗浄機を使用して２回洗浄した。シース液(８０μL)を各ウェルに加え、ビーズを５分間、プレートシェーカー上で再懸濁させた。プレートサンプルを、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ３Ｄ装置配列システムを使用して読んだ。生データを平均蛍光強度(ＭＦＩ)として測定した。濃度(pg／mL)をＸｐｏｎｅｎｔソフトウェアにより計算した。
【０５３７】
一団の７５サイトカインを、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅが介在するサイトカイン放出について８名のヒト正常ドナーからの全血で評価した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅのドナー全血への添加は、アイソタイプ対照と比較してサイトカイン分泌を介在しなかった。これらのデータは、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ処置が、全血でサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)をもたらさないことを示した。
【０５３８】
サルにおける周期的静脈内投与毒性試験
この試験を、何らかの観察される変化の可逆性の評価、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅへの全身暴露の決定、免疫応答評価およびヒトにおけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを支持するデータの提供のために、１か月間、週１回または３週に１回、サルに静脈内投与したときの、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの潜在的毒性および生物学的活性を決定するために実施した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、０(媒体、１日、８日、１５日、２２日および２９日目に週１回)、１.５mg／kg(１日および２２日目に３週に１回)、１５mg／kg(週１回)または７５mg／kg(週１回)の用量の遅いボーラス注射として、５匹の雌サルおよび５匹の雄サルの群に静脈内投与した。全用量を、２０mMヒスチジン、２６０mMスクロース、５０μM  ジエチレントリアミン四酢酸および０.０５％(ｗ／ｖ)ポリソルベート８０(ｐＨ６.０)からなる媒体／担体中、２mL／kgで投与した。少なくとも一部、潜在的薬力学指標として、全サルを１日目にキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ、一次応答を刺激するための免疫原)、ウイルスベクターアデノウイルス−５(Ａｄ５)−ＧａｇおよびＡｄ５−Ｎｅｆ(抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激するための免疫原)およびテタヌストキソイド(二次応答を刺激するための免疫原)で免疫化した。例えば、テタヌストキソイドでの免疫化は、テタヌストキソイドに特異的なＴ細胞を増大させ、抗原特異的集団のＰＫ／ＰＤ評価を可能とする。
【０５３９】
評価基準は、生存、毒物動態学、臨床的観察(摂食行動を含む)、体重、身体的(呼吸器、心血管および神経学を含む)および眼科的試験、臨床病理学的評価、免疫原性評価(抗ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体の；ＡＤＡ)、免疫毒性学的および薬理学的評価(ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の受容体占有率および受容体発現、ＫＬＨまたはテタヌストキソイドへのＴ細胞依存性抗体応答(ＴＤＡＲ)、末梢血リンパ球表現型解析、Ｔ細胞活性化、抗原特異的Ｔ細胞表現型解析ならびにＫＬＨ、ＧａｇまたはＮｅｆペプチドへのエクスビボ二次応答を含む)、臓器重量ならびに肉眼的および顕微鏡的病理分析を含んだ。予定された剖検を、１か月(３／群／性別)および８週間回復期間(２／群／性別)後に実施した。
【０５４０】
反復投与後、平均ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ全身性暴露(ＡＵＣ[０−Ｔ])は、全用量で実質的性差は観察されず、ほぼ用量比例的に１５mg／kgから７５mg／kg(週１回)に増加した。１.５mg／kgで反復投与後(３週に１回)、平均ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ全身性暴露(ＡＵＣ[０−５０４ｈ])は、１日目の投与後より低く(０.４倍)、一方１５mg／kgおよび７５mg／kg(ＱＷ)で反復投与後のＡＵＣ(０−１６８ｈ)値は、１日目の投与後より僅かに高く(２.１倍〜２.６倍)、蓄積が示唆された。
【０５４１】
処置誘発ＡＤＡ応答は、１.５mg／kg(３週に１回)および１５mg／kg(週１回)でそれぞれ１０匹のサル／群中８匹および２匹で、８日目またはその後観察された。回復期の間、ＡＤＡは、１.５mg／kgのサルでのみ観察された。反復投与後、ＡＤＡを有するサルの血清ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ濃度は一般に測定不可能(すなわち、＜定量下限；ＬＬＯＱ)であるか、または１.５mg／kgおよび１５mg／kgでＡＤＡがないサルより低く、ＡＤＡの存在は、１.５mg／kgの低平均ＡＵＣ値に寄与した。
【０５４２】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの毒物動態学的概要を表２８に示す。
【表３０】
2020515239.tif 000033
【０５４３】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは全投与量で耐容性が良好であり、体重、身体的(呼吸器、心血管および神経学を含む)および眼科的評価、血液学、凝固、血清化学、検尿、臓器重量および肉眼的または顕微鏡的病理にＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ関連臨床的観察または効果はなかった。さらに、何れの試験用量でも、テタヌストキソイドに対するＴＤＡＲ、細胞毒性Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の絶対数、Ｔ細胞サブタイプ(ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞、エフェクター記憶ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ２５＋活性化ＣＤ４  Ｔ細胞、ＨＬＡ−ＤＲ＋活性化ＣＤ４  Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞、エフェクター記憶ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ２５＋活性化ＣＤ８  Ｔ細胞およびＨＬＡ−ＤＲ＋活性化ＣＤ８  Ｔ細胞を含む)、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびエクスビボ二次応答にＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ関連効果はなかった。
【０５４４】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ介在効果の証拠は、全用量で示された。ＣＤ４ヘルパーＴ細胞のＩＣＯＳ受容体発現は、全用量で１日目の投与４時間後ほぼ０％であり、これは、ＩＣＯＳ受容体の下方制御および／または内部移行を示唆し、一般に投与期間および回復期間をとおして≧１５mg／kgで低いままであった。低ＩＣＯＳ受容体発現は、ＩＣＯＳ受容体占有率の意味ある評価を妨げた。３週に１回、１.５mg／kg投与で、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞のＩＣＯＳ受容体発現は８日目以降に回復し始め、投与２２日目の前に４１％に増加し、２２日目の投与後４％に減少し、そして２９日目に４２％に増加した。受容体発現の完全な回復が４３日目までに観察された(９１％)。受容体占有率は、一般に受容体発現と相関した(例えば、２２日目[投与前]および２９日目の７１％および８５％ＲＯ)。一般に、ＩＣＯＳ受容体発現レベルは、血清ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ濃度と逆相関した。これは、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体が受容体の喪失を引き起こしているとの結論に一致した。
【０５４５】
媒体対照と比較して、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)特異的ＩｇＭ(最大８日目の５２％)およびＩｇＧ応答(最大２９日目の７８％)の用量非依存的抑制があった。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥによるＫＬＨへのＴ細胞依存性抗体応答の抑制は、別の作用機序を表し得て、カニクイザルにおける先の試験で観察されていた。何らかの機構に拘束されないが、ＩＣＯＳ共刺激経路のアゴニストによるＴＤＡＲ抑制は、ＩＣＯＳ発現の早期かつ持続した下方制御の結果として、Ｔヘルパー細胞のアゴニズムの障害と関連し得る。
【０５４６】
投与期間および／または回復期間中の全てまたは一部の用量レベルでの他のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ関連効果は、総Ｔ細胞の平均絶対数およびＣＤ４ヘルパーＴ細胞、パーセントＣＤ４  Ｔ制御性細胞、パーセント中央記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞、パーセント中央記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞、パーセントＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびパーセントＧａｇ＋およびＮｅｆ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の減少であった。
【０５４７】
結論として、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、サルで１か月、週１回≦７５mg／kg用量静脈内投与で、臨床的に耐容性であった。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ関連効果は、ＩＣＯＳ受容体発現および受容体占有率変化、ＫＬＨに対するＴ細胞依存性抗体応答抑制、あるＴ細胞サブセットのレベル減少、ＣＤ４−Ｔ細胞活性化減少および抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージ減少により示されるとおり、全用量で示された。これらの変化の多くは、≧１５mg／kg  ＱＷで、これらの用量での回復期間をとおした継続したＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ暴露および続く持続するＩＣＯＳ受容体発現の下方制御と一致して回復期間の最後になお明らかであった。３週に１回、１.５mg／kgの低用量投与は、最初の投与後低血清ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ濃度をもたらし、二回目の投与前に細胞表面の受容体回復をさせた。有害ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ関連治験はなかった。それ故に、無毒性量(ＮＯＡＥＬ)は、７５mg／kg(４５２,０００μg・時間／mLの平均ＡＵＣ[０−１６８ｈ])と見なした。さらに、最大推奨ヒト開始用量の決定を可能とするために、７５mg／kgをまた重篤な毒性を発現しない最大投与量(ＨＮＳＴＤ)として見なした。
【０５４８】
サルにおける単回投与静脈内薬物動態および受容体占有率試験
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの薬物動態を、タンパク質ナイーブサルで評価した。全サルを、２.５mgのキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)で筋肉内に免疫化した。免疫化後、サルに０、１mg／kgまたは１０mg／kg(媒体および１mg／kgおよび１０mg／kg群についてＮ＝２／性別)用量で２０mMヒスチジン(ｐＨ６.０)、２５０mMスクロース緩衝液、５０μM  ペンテト酸(ＤＰＴＡ)および０.０５％ポリソルベート８０中のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを、大腿静脈に静脈内投与した。連続的血液サンプル(約０.５mL)を投与前および投与６時間、２４時間、７２時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、４０８時間、５０４時間、６７２時間、８４０時間および１００８時間後に採取した。血液サンプルを凝結させ、次いで４℃(１５００〜２０００×ｇ)で遠心分離して、血清を得た。血清サンプルを−２０℃で保存し、分析用にドライアイス上で輸送した。受容日に分析しないサンプルは、分析まで≦７０℃の温度に維持するよう設定した冷凍庫で凍結して保存した。
【０５４９】
カニクイザル血清サンプルを、認定Ｇｙｒｏｓ(登録商標)イムノアッセイを使用して、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの検出について分析した。ビオチニル化ヒトＩＣＯＳ  ｍＧ１(Lot No 22Oct2015−ビオチン)を、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの捕捉分子として使用した。サンプル、標準およびＱＣを、１０％カニクイザル血清の最終マトリクス濃度とし、Ｇｙｒｏｌａｂに充填した。Gyrolab Bioaffy 200 CDを用いるWash 2 V2 Wizard方法を使用した。最終洗浄工程後、捕捉ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥをAlexa 647標識マウス抗Ｈｕ  ＩｇＧ  Ｆｃ特異的モノクローナル抗体、クローン１０Ｃ７(Lot No 15C3483473-10C7A)を検出分子として使用して検出した。カニクイザル血清サンプルにおけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ濃度を、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅキャリブレータから作成した４パラメータロジスティック(４−ＰＬ)較正曲線を使用してGyrolabから測定した蛍光強度から計算した。
【０５５０】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ較正曲線の範囲はカニクイザル血清３ng／mL〜３０,０００ng／mLであった。定量上限および下限はそれぞれ３０,０００ng／mLおよび３ng／mLであった(すなわち、ＵＬＯＱ  ３００００ng／mL、ＬＬＯＱ  ３ng／mL)。品質対照サンプルを、カニクイザル血清２０ng／mL、２００ng／mL、２,０００ng／mLおよび２０,０００ng／mLで調製し、各ＣＤで分析して、許容されるアッセイ性能を確認した。キャリブレータ、ＱＣおよびサンプルを、ＰＴＢで１０倍希釈した。アッセイ性能は許容される範囲内であった：標準の％ＣＶは２５％未満であり、ＱＣ回収率は名目値の±３０％以内であった。
【０５５１】
サル血清サンプルを、抗ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ  ＡＤＡの存在について、Meso Scale Discovery(ＭＳＤ)プラットフォーム上で認定電気化学発光法イムノアッセイを使用して、ABO/BAS, Lawrenceville, New Jerseyにより測定した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅマウス抗イディオタイプ抗体細胞上清を、陽性対照(ＰＣ)調製に使用した。ビオチニル化ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを捕捉分子として使用し、スルホタグ標識ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを検出試薬として使用した。ビオチニル化ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅおよびスルホタグ標識ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥをＰＴＢで希釈し、組み合わせて、１,０００ng／mLのビオチニル化ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅおよび１,０００ng／mLのスルホタグ標識ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの最終濃度のマスターミックスを産生した。サンプルをマスターミックスで１０％最小希釈倍率(ＭＲＤ)で希釈し、２２℃で２時間インキュベートした。次いでマスターミックスをストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートに５０μL／ウェルで移した。さらに１時間の２２℃でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＭＳＤ読み取り緩衝液を添加した。次いでプレートをMSD Sector Imager 6000ですぐに読んだ。サル血清サンプルにおける検出可能抗ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ抗体の存在を、サンプルシグナル対陰性サンプルシグナル比を使用して決定した。
【０５５２】
サル血清サンプルは、BAR, Lawrenceville, New Jerseyにより分析された。カニクイザル血清サンプルを、直接トリプシン消化逆相液体クロマトグラフィー直列マススペクトロメトリー(ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ)を使用して、「総」ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅについて分析した。サル血清サンプルを、免疫親和性富化標的捕捉ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、Ｎ３２９位での脱アミド化および非修飾ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅについても分析した。アッセイ範囲を規定する標準曲線を、市販カニクイザル血清から作成し、完全分析用セットとして試験サンプルと共に分析した。「総」ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの濃度は、毒物動態学的および薬物動態解釈のためにExcelスプレッドシートでμg／mlで報告した。
【０５５３】
ＰＫパラメータ値を、非コンパートメント分析方法(Phoenix WinNonlin 6.4, Certara, Princeton, New Jersey)を使用して計算した。定量下限(ＬＬＯＱ：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅについて＜１０ng／mL(０.０７nM))未満の暴露値は分析に使用しなかった。時間０〜最終サンプリング時間の曲線下面積(ＡＵＣ(０−Ｔ))を、線形および対数台形加算の組み合わせを使用して計算した。
【０５５４】
カニクイザルへの１mg／kgおよび１０mg／kgの単回静脈内後のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＰＫパラメータを表２９に要約する。静脈内投与後、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの血漿濃度は双指数関数的減少を示した。加速クリアランスが、７日後、１mg／kg群の４匹中３匹のサルで観察された。結果として、１４日目までの濃度時間データを、分析のために１mg／kg用量群の全動物で使用し、ＡＵＣ(０−１４ｄ)をＡＤＡの影響を排除するために報告した。血漿サンプルの免疫原性試験は、１mg／kg用量で試験に参加した８匹中５匹のサルがＡＤＡを発生させ、高いＡＤＡレベルのサルは、速いクリアランスを示したことを示唆した。ＡＵＣ(０−４２ｄ)を１０mg／kg群について報告した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、ＣｍａｘおよびＡＵＣ(０−Ｔ)およびＡＵＣ(０−ＩＮＦ)のほぼ用量比例的増加を示した。１：１０比での用量増分で、雄および雌サルのＣｍａｘは、それぞれ１：８および１：８の比で増加し；そしてＡＵＣ(０−Ｔ)はそれぞれ１：１６および１：１１比で増加し、ＡＵＣ(０−ＩＮＦ)はそれぞれ１：１１および１：１１比で増加した。
【０５５５】
１０mg／kg静脈内投与後のインタクトＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅおよび脱アミド化産物の濃度をＬＣＭＳ／ＭＳを使用して定量した。脱アミド化産物の濃度は全測定時点で総ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの０.５％〜８％の範囲であった。脱アミド化産物のＡＵＣ(０−４２ｄ)は、総ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ暴露の２.９％であった。
【表３１】
2020515239.tif 000034
【０５５６】
Ｃ１ｑ結合増加がインビトロで観察されたが、サルにおける単回投与試験での明らかな臨床徴候の非存在および心血管装着サルモデルにおける血行動態効果の非存在が、補体活性化のリスクが低いことを示した。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは、カニクイザルへの単回１mg／kgまたは１０mg／kgでの静脈内投与による暴露の用量比例的増加に対する耐容性は良好であった。また、有害臨床病理学的兆候は観察されなかった。
【０５５７】
実施例１５
抗ＩＣＯＳ抗体結合競合
エピトープビニング実験を実施して、どの抗ＩＣＯＳ抗体がｈｕＩＣＯＳへの結合について他の抗体と競合するかを決定した。エピトープビニングは、対でのコンビナトリアル様式で抗体を試験するために競合的イムノアッセイを使用する方法であり、同じ結合領域、すなわち、抗原の同一または密接に関連するエピトープについて競合する抗体は、一緒にビンに群分けされる。抗ｈｕＩＣＯＳ抗体間の対での競合を次のとおり決定した。対照抗体(すなわち、ＩＣＯＳ.３３、２０Ｈ４、２７Ｂ９、２３Ｂ６、１２Ｄ１０、２３Ａ１０、１５Ｂ７、１２Ｆ３、１３Ｂ４、１７Ｈ９、２６Ｅ１１、２３Ｈ５、６Ｄ１、１２Ａ９、５Ｃ４、１０Ｂ１０、１７Ｃ４、１Ｄ７、２１Ｅ１、９Ｆ１１、１５Ｈ１１、２５Ｂ１０、８Ａ１０、４Ｄ１１、６Ｄ５、７Ｃ６、２６Ｅ９、３Ｅ８、１６Ｈ４、２５Ｅ４または２６４４)をセンサーチップ表面に結合させ、試験抗体を混合物でｈｕＩＣＯＳポリペプチド構築物とプレインキュベートし、プレインキュベート混合物をセンサーチップ上を流して、試験抗体がチップ表面上の対照抗体へのｈｕＩＣＯＳポリペプチド構築物の結合を妨害する程度を決定した。競合実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)装置を使用して実施した。具体的に、対照抗ｈｕＩＣＯＳ抗体をセンサーチップＣＭ５チップ(シリーズＳ、GE Healthcare CAT# BR-1005-30)表面、フローセル２、フローセル３およびフローセル４(５０００共鳴単位、ＲＵ)に固定化し、フローセル１を陰性対照として使用した。試験抗体(すなわち、ＩＣＯＳ.３３、２０Ｈ４、２７Ｂ９、２３Ｂ６、１２Ｄ１０、２３Ａ１０、１５Ｂ７、１２Ｆ３、１３Ｂ４、１７Ｈ９、２６Ｅ１１、２３Ｈ５、６Ｄ１、１２Ａ９、５Ｃ４、１０Ｂ１０、１７Ｃ４、１Ｄ７、２１Ｅ１、９Ｆ１１、１５Ｈ１１、２５Ｂ１０、８Ａ１０、４Ｄ１１、６Ｄ５、７Ｃ６、２６Ｅ９、３Ｅ８、１６Ｈ４、２５Ｅ４または２６４４)を出発濃度で１２０μg／mL(２倍)に希釈した。試験抗体の一連の希釈物を、力価測定曲線を得るために、対照サンプル(０μg／ml)と共に７つの異なる濃度について抗体を緩衝液で１：３濃度に希釈して調製した。各抗体濃度シリーズを半分に分けた。濃度シリーズの最初の半分に、４０nM(２倍)ヒトＩＣＯＳ抗原(例えばｈｕＩＣＯＳ／Ｆｃ)を加えて、最終濃度シリーズ(６０μg／ml〜０.０μg／ml)および各ウェルで２０nMの最終抗原濃度とした。濃度シリーズの二番目の半分で、抗原の代わりに、緩衝液を加えて、抗体を同じ濃度に希釈させ、この半分をブランクとして処理した。試験抗ＩＣＯＳ抗体とｈｕＩＣＯＳ／Ｆｃの複合体を２時間インキュベートした。４０μL複合体を、対照抗体被覆表面に３０μL／分で注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)Ｔ２００  ＳＰＲ装置を使用し、濾過し、脱気した、HBE-EP, GE Healthcare CAT# BR-1001-88のランニング緩衝液、０.０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１５  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.００５％界面活性剤Ｐ２０中であった。表面を２５mM  ＮａＯＨ(注文コード：BR-1003-58, GE Healthcare)で、１００μL／分で５秒間再生した。データをMicrosoft Excelを使用して分析し、そこで、試験抗体濃度を対応する応答単位に対してプロットし、力価測定曲線を得た。
【０５５８】
結合競合実験は、抗体ＩＣＯＳ.３３、２０Ｈ４、２７Ｂ９、２３Ｂ６、１２Ｄ１０、２３Ａ１０、１５Ｂ７、１２Ｆ３、１３Ｂ４、１７Ｈ９、２６Ｅ１１、２３Ｈ５、６Ｄ１、１２Ａ９、５Ｃ４、１０Ｂ１０、１７Ｃ４、１Ｄ７、２１Ｅ１、９Ｆ１１、１５Ｈ１１、２５Ｂ１０、８Ａ１０、４Ｄ１１、６Ｄ５、７Ｃ６および２６Ｅ９が互いに交差競合し、ｈｕＩＣＯＳへのリガンド(Ｂ７−Ｈ２；ＩＣＯＳ−Ｌ)結合を遮断することを決定した。抗体３Ｅ８、１６Ｈ４および２５Ｅ４は互いに交差競合するが、ｈｕＩＣＯＳへのリガンド結合を遮断しなかった。対照的に、抗体２６４４は抗体３Ｅ８と交差競合することが判明したが、ＩＣＯＳへのリガンド結合も遮断できた。
【０５５９】
実施例１６
抗ＩＣＯＳ抗体エピトープマッピング
酵母ディスプレイによる抗ＩＣＯＳ抗体エピトープマッピング
抗ｈｕＩＣＯＳ抗体３Ｅ８およびＩＣＯＳ.４についてのエピトープを、酵母細胞(Saccharomyces cerevisiae)によりヒトＩＣＯＳの細胞外ドメイン(NP_036224.1の残基２１〜１３４、配列番号１７３として提供)の無作為変異バリアントをディスプレイさせ、特定の抗体への結合または非結合に基づき酵母細胞を選別することにより決定した。選択酵母細胞を増幅させ、試験抗ＩＣＯＳ抗体への結合能に基づき、さらなるラウンドの選択に付した。例えば、Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:539参照。ｈｕＩＣＯＳバリアントの配列を得られた酵母について決定し、抗体結合に対する各残基の効果を分析した。本発明の抗体についての結合エピトープは、一アミノ酸変異が本発明の抗ｈｕＩＣＯＳ抗体への結合を破壊するところであるｈｕＩＣＯＳ配列内の座位として決定した。
【０５６０】
簡潔には、エラープローンＰＣＲを使用して、ヒトＩＣＯＳコード化ＤＮＡ(配列番号１の残基２１〜１３４をコード)を構築物にクローン化して、さらにｃ−ｍｙｃタグ配列および酵母細胞壁プロテインＡｇａ１ｐを含む融合タンパク質のアミノ末端部分としてｈｕＩＣＯＳバリアントを発現させた。このような構築物は、酵母(Saccharomyces cerevisiae)で発現させたとき、Ａｇａ１ｐポリペプチドにより細胞表面に固定された、バリアントｈｕＩＣＯＳポリペプチドを酵母細胞表面にディスプレイする。ｃ−ｍｙｃタグを、ｈｕＩＣＯＳ融合タンパク質をディスプレイする酵母細胞を選別するための陽性対照として使用した。次いでこれらの酵母細胞を適切に折りたたまれたｈｕＩＣＯＳ−融合タンパク質(アロフィコシアニン(ＡＰＣ)標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次により検出される対照マウス抗ｈｕＩＣＯＳ抗体の結合により決定して)を発現するが、本発明の抗体に結合しない(二次としてフィコエリスリン(ＰＥ)標識ヤギ抗ヒトＩｇＧでの検出により決定して)ものをさらに選別した。これらの選択酵母細胞をプールし、増幅させ、選択の続くラウンドに使用した。ｈｕＩＣＯＳ配列を、選択後残った酵母の構築物について決定した。
【０５６１】
ＩＣＯＳ.４および３Ｅ８に結合する抗母集団は、異なる変異パターンを示し、異なるエピトープがこれら２抗体により認識されたことを示した。類似する実験を、ＩＣＯＳへのＩＣＯＳ−リガンド結合を遮断し、ＩＣＯＳ.４と競合する抗体９Ｄ５で実施した。９Ｄ５実験について、単なる構造的破壊変異とは逆に、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−２複合体の結晶構造(例えばStamper et al. (2001) Nature 410:608)に基づくＩＣＯＳの三次元構造の分子モデルを使用して、どのアミノ酸残基が埋没し、どれが表面に露出しているかを区別し、選択変異のどれか最も可能性の高い抗体特異的接触残基(すなわち、エピトープ残基)を決定した。ＩＣＯＳ.４、３Ｅ８および９Ｄ５についての酵母ディスプレイ推定エピトープを表３０に示す。表３０のエピトープは、２０アミノ酸シグナル配列を含む配列番号１のｈｕＩＣＯＳの一覧の残基として示す。従って、成熟ｈｕＩＣＯＳ(すなわち、シグナル配列がないＩＣＯＳタンパク質)の残基数は、表３０に示す残基から２０を減じたものである(例えば、シグナル配列を伴ってはＶ４８またはシグナル配列を伴わなくてはＶ２８)。
【表３２】
2020515239.tif 000035
【０５６２】
類似する酵母ディスプレイ実験を、抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの代わりにＩＣＯＳ−Ｌ(Ｂ７−Ｈ２)で実施し、ＩＣＯＳのどの残基がＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用に重要か、すなわちＩＣＯＳ上のＩＣＯＳ−Ｌへの結合部位ｋを決定した。ＩＣＯＳ−Ｌ結合部位は、配列番号１に提供するＩＣＯＳの残基Ｑ５０、Ｋ５２、Ｆ１１４、Ｐ１１７、Ｐ１１８およびＦ１１９に帰することが決定された。表３０における抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂのエピトープの精査は、実験的に観察されたものに一致して(上の実施例１５に記載)、ＩＣＯＳ.４および９Ｄ５がＩＣＯＳ−Ｌ結合を遮断するはずであるが、３Ｅ８はしないであろうことを示唆する。
【０５６３】
ＨＤＸ−ＭＳによる抗ＩＣＯＳ抗体エピトープマッピング
抗体ＩＣＯＳ.４および９Ｄ５での重水素交換実験は、Ｓ１１２〜Ｌ１２３の領域が、ＩＣＯＳがＩＣＯＳ−Ｌに結合したとき接触することを確認し、これは、ＩＣＯＳの残基１１２〜１２３(配列番号１)またはSIFDPPPFKVTL(配列番号２０３)の機能的エピトープ領域を示唆した。この領域は、酵母ディスプレイにより決定されたエピトープのＣ末端部分と重複し、一次配列に沿った残基の最大クラスターを表す。
【０５６４】
抗ｈｕＩＣＯＳ抗体ＩＣＯＳ.４および９Ｄ５のエピトープを、ここに記載する水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)により決定した(例えばEpitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。ＩＣＯＳ−Ｆｃを１：１比でｍＡｂと混合し、ＨＤＸ−ＭＳを１分、１０分、４時間、デュプリケートで流した。
【０５６５】
結果は、ＩＣＯＳ.４および９Ｄ５が、下に(エピトープは下線)および図１に示す同じ非連続的エピトープに結合することを示す。
【化２】
2020515239.tif 000036
【０５６６】
実施例１７
肺、腎臓および結腸癌患者からの末梢血および腫瘍浸潤リンパ球におけるＩＣＯＳの発現
種々の腫瘍タイプおよび患者集団における腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)におけるＩＣＯＳ発現の理解は、特にニボルマブなどの抗ＰＤ−１剤と組み合わせた、有効なＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ治療のための適切な疾患適応症および患者集団の同定に役立つ。末梢血細胞およびＴＩＬ(ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞)におけるＩＣＯＳおよびＰＤ−１発現の頻度および強度を、非小細胞肺、腎臓細胞および結腸直腸癌(ＣＲＣ)検体でプロファイルした。
【０５６７】
新鮮な腫瘍組織および適合する末梢血サンプルを、肺癌、腎臓癌またはＣＲＣ患者から得て(ConversantBio, MT Group, Benaroya)、それぞれ、一夜、４℃でhypothermosol FRS(Biolife Solutions)およびACD Solution A(BD Biosciences)で輸送した。全サンプルを、手術２４時間以内に処理し、染色した。腫瘍組織を秤量し、Miltenyi dissociation kit(Miltenyi, Catalog 130-095-929)を使用して分離し、一方末梢血細胞を、RBC Lysis Buffer(BioLegend, Catalog 420301)への赤血球(ＲＢＣ)の溶解後単離した。細胞懸濁液(腫瘍組織または末梢血から)をＨＢＳＳ(無Ｃａ、無Ｍｇ)で２回洗浄し、NIR Viability Dye(Molecular Probes by Life Technologies, Catalog L34976)で染色し、ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(ｄＰＢＳ)中のヒトＡＢ血清で遮断し、抗体のカクテル(表３１)を含むウェルに加え、氷上で暗所で４５分インキュベーションした。次いで、細胞をｄＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｎａアジドで２回洗浄し、固定し、FOXP3 buffer kit(BioLegend, Catalog 421403)を使用して透過処理した。Fluorescence minus one(ＦＭＯ)対照を全抗体について作製し、陽性細胞集団の決定に使用した。サンプルを、Fortessaフローサイトメーター(BD Biosciences)上で取得し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア(TreeStar)を使用して分析した。
【０５６８】
表３１に示すとおり、複数のマーカーの発現を試験するための一団を考案し、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＣＯＳ発現を分析した。
【表３３】
2020515239.tif 000037
【０５６９】
Ｔｒｅｇ、Ｔｅｆｆ、Ｂ細胞およびＮＫ細胞染色のために、頭頸部、肺、ＣＲＣおよび子宮内膜癌からの新鮮な腫瘍を、１〜２mLの分離培地に浸漬した、氷上で休止させた６ウェルプレートに入れた。腫瘍を小片に切断し、腫瘍溶液を分離のためにダウンス型ホモジナイザーに入れた。腫瘍溶液を、さらなる分離培地と共に７０μmフィルターで濾過し、遠心分離した。得られた細胞を染色緩衝液に再懸濁した。新鮮網転移腫瘍組織サンプルをＭｉｌｔｅｎｙｉ分離キット(Miltenyi, Catalog 130-095-929)を使用して分離した。凍結腫瘍サンプルを融解し、ＤＮＡａｓｅを滴下した(２mL  ＤＮＡａｓｅ溶液)。融解培地(３７℃浴で温めた８mL)を腫瘍およびＤＮＡａｓｅ溶液に加え、７０μmフィルターで濾過した。細胞を遠心分離し、染色緩衝液に再懸濁した。
【０５７０】
ＴＩＬのＩＣＯＳ発現をＦＡＣＳ分析により評価した。腫瘍由来細胞懸濁液を、Near-IR Dead Cell染色を含む染色緩衝液で遮断した。表面細胞集団マーカーを抗体(表３２に示すとおり)で染色し、陽性細胞集団を決定し、続いて固定化および透過処理後ＦＯＸＰ３の細胞内染色をした。フローサイトメトリーデータを、Fortessa X-20フローサイトメーターを使用して取得した。細胞断片および死細胞を除去するためのパラメータであるFSC-SSC-Live/Deadマーカーでゲーティング後、ＩＣＯＳ＋細胞の頻度をＣＤ４＋Ｔｅｆｆ、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞サブセットについて決定した。Ｃｄ４＋フローサイトメトリー分析をＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアで実施した。
【表３４】
2020515239.tif 000038
【０５７１】
ＩＣＯＳ発現を、１６名の健常ドナーおよび１４名の肺癌、２２名のＲＣＣおよび１４名のＣＲＣ患者からの全血サンプルにおける抗ＩＣＯＳ  Ｃ３９８.４ａクローンを使用して評価した。健常ドナーと比較して、癌患者から得たＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は高かった(表３３、健常ドナーと比較して全癌患者群でＰ＜０.００１、マン・ホイットニー検定)。ＲＣＣ患者からのＩＣＯＳ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、健常ドナーと比較して有意に高かった(表３３、Ｐ＜０.０１、マン・ホイットニー)。肺癌およびＣＲＣ患者血液サンプルにおいて、ＩＣＯＳ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージも、統計的有意差には達しないが、健常ドナーサンプルより高かった(表３３)。
【０５７２】
文献の報告より高い頻度が観察され、Ｃ３９８.４ａクローンが他の一般に使用されるクローンＩＳＡ−３,６,７,８,９,１０より多くのＴ細胞を陽性に染色するため、高レベルのＩＣＯＳ(ＩＣＯＳｈｉ)を発現する細胞の頻度も分析した。文献に一致して、ＣＤ８＋Ｔ細胞は最小量のＩＣＯＳｈｉを発現し、背景と同等であった(表３３)。ＣＤ４＋Ｔ細胞において、しかしながら、ＩＣＯＳｈｉ細胞の頻度は、平均で健常ドナーの３.０％からＲＣＣを有する患者の４.９％の範囲であった(表３３、ＲＣＣ対健常：Ｐ＜０.０５、マン・ホイットニー)。
【０５７３】
次に、ＩＣＯＳ発現を、１１名の肺癌、２１名のＲＣＣおよび８名のＣＲＣ患者のＴＩＬで評価した。ＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋およびＩＣＯＳ＋ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度は、腫瘍タイプ間で類似した(表３４)。末梢血におけると同様、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬ  Ｔ細胞によるＩＣＯＳの高発現が測定された。平均で、高レベルのＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋Ｔ細胞より大きかった(表３４)。ＴＩＬにおけるＩＣＯＳとＰＤ−１の共発現も測定した。高レベルのＰＤ−１(ＰＤ−１ｈｉ)が、大きな患者間変動で、ＩＣＯＳｈｉ  ＣＤ４＋ＴＩＬで発現された(表３４)。ＩＣＯＳｈｉ  ＣＤ４＋ＴＩＬと比較して、高い割合のＩＣＯＳｈｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞が、高レベルのＰＤ−１を共発現した(表３４)。
【表３５】
2020515239.tif 000039
【０５７４】
【表３６】
2020515239.tif 000040
【０５７５】
２名の肺腺癌、１名の子宮内膜腺癌、１名の漿液性乳頭癌の網転移、１名の結腸直腸腺癌の肝転移および１名の頭頸部扁平上皮細胞癌を有する患者からのヒト腫瘍サンプルを分離し、種々のリンパ球集団のＩＣＯＳ発現のフローサイトメトリー分析のために染色した。ここに記載する５つのリンパ球集団(ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞)のうち、ＣＤ４＋ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇは、最高頻度のＩＣＯＳを発現した。ＩＣＯＳを発現する細胞集団(ＣＤ４  Ｔｅｆｆ、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞)で、Ｔｒｅｇは、他の細胞型と比較して細胞当たり、より多くのＩＣＯＳを発現した。
【０５７６】
要約すると、ＩＣＯＳは、末梢血およびＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞でＣＤ８＋Ｔ細胞より高いレベルで発現された。ＩＣＯＳ発現は患者間で可変であり、試験した３腫瘍タイプで類似した。平均で、３３％〜４８％のＩＣＯＳｈｉ  ＣＤ４＋ＴＩＬおよび６２％〜７１％のＩＣＯＳｈｉ  ＣＤ８＋ＴＩＬが高レベルのＰＤ−１を共発現した。さらに、Ｔｒｅｇは、ヒト腫瘍微小環境でＣＤ４＋Ｔｅｆｆ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞より高いレベルのＩＣＯＳを発現した。
【０５７７】
実施例１８
進行型固形腫瘍を有する患者におけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単独または１以上の抗ＰＤ−１抗体、１以上の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または１以上の抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせの安全性および耐容性、薬物動態および有効性を評価するための用量漸増および組み合わせコホート試験
単剤療法としてまたは抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体(例えばニボルマブおよび／またはイピリムマブ)と組み合わせたＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅのフェーズ１／２、非盲検式試験を、進行型固形腫瘍を有する参加者で実施する。試験は次の部分を含む：
１)用量漸増単剤療法(予備的安全性コホートおよびパートＡ)；
２)ニボルマブ(パートＢ)またはイピリムマブ(パートＣ)との用量漸増併用療法；および
３)ニボルマブ(パートＤ)またはイピリムマブ(パートＥ)との用量拡大フェーズ。
【０５７８】
目標
この試験の主目標は、単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで進行型固形腫瘍を有する参加者に投与したＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの安全性および耐容性の特徴づけである。
副次目標は、進行型固形腫瘍を有する参加者に単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで投与されたＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの予備的有効性の探索；進行型固形腫瘍を有する参加者に単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで投与したときのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥのＰＫの特徴づけ；進行型固形腫瘍を有する参加者に単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで投与したときのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの免疫原性の特徴づけ；および進行型固形腫瘍を有する参加者に単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで投与されたＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの標的結合のモニタリングを含む。
【０５７９】
さらに、探索的目標は、処置前およびＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせ投与後の腫瘍組織および末梢血における抗腫瘍活性と特異的バイオマーカー測定値の相関；ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ  ＰＫ単独およびニボルマブＰＫまたはイピリムマブＰＫとの組み合わせおよび安全性、有効性および／または臨床的バイオマーカーの相関の特徴づけ；ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで処置された参加者の全生存率(ＯＳＲ)の評価；ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅと組み合わせて投与したときのニボルマブおよびイピリムマブのＫおよび免疫原性の特徴づけ；ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅと組み合わせて投与したときのニボルマブおよびイピリムマブの免疫原性の特徴づけ；補正したＱＴ間隔(ＱＴｃ)におけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの影響の可能性の評価；および選択末梢血バイオマーカーと有害事象(ＡＥ)および重篤有害事象(ＳＡＥ)発生率の相関の探索を含む。
【０５８０】
全体的設計
試験設計の模式図を図２７に示す。
単剤療法は、次の２つの異なるコホートからなる：
・予備的安全性コホート：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを単剤療法として２mgおよび８mgを４週に１回、２４週間投与。
・パートＡ：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを２５mg、８０mg、２００mg、４００mgおよび８００mgで４週に１回、２４週間投与。
【０５８１】
パートＢおよびＣは、次のものを含む異なる組み合わせコホートからなる：
・Ｂ１：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを１２週に１回＋ニボルマブ４８０mgを４週に１回を、ベイズ流ロジスティック縮小モデル(ＢＬＲＭ)−コピュラモデルおよびパートＡから利用可能なＰＫ／ＰＤデータにより推奨される出発用量レベルのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅで投与。
・Ｂ２：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを４週に１回＋ニボルマブ４８０mgを４週に１回を、  ベイズ流ロジスティック縮小モデル(ＢＬＲＭ)−コピュラモデル(ＢＬＲＭ−ＲＤ)およびパートＡから利用可能なＰＫ／ＰＤデータから推奨される用量レベルのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅで投与。
・Ｃ１：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを１２週に１回＋イピリムマブ３mg／kgを４週に１回を、ベイズ流ロジスティック縮小モデル(ＢＬＲＭ)−コピュラモデルおよびパートＡから利用可能なＰＫ／ＰＤデータにより推奨される出発用量レベルのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅで投与。
・Ｃ２：ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを４週に１回＋イピリムマブ３mg／kgを４週に１回を、ベイズ流ロジスティック縮小モデル(ＢＬＲＭ)−コピュラモデルおよびパートＡから利用可能なＰＫ／ＰＤデータにより推奨される用量レベルのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅで投与。
パートＢ１およびＣ１は同時に登録される。パートＢ２およびＣ２は、用量および／またはスケジュール選択最適化のために必要である場合のみ、登録される。
【０５８２】
パートＢおよびＣのためのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの用量(ニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせ)は、全ての利用可能な安全性(臨床および検査)、ＰＫおよび標的結合／薬力学的バイオマーカーデータ、ならびに階層ベイズモデリングフレームワーク内でのモデリング推奨、すなわち、ＢＬＲＭ−コピュラモデルを使用して、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ(予備的安全性コホートおよびパートＡ)およびニボルマブまたはイピリムマブ両者の単剤毒性プロファイルおよびパートＢおよびＣからのすべての利用可能な組み合わせ毒性プロファイル(パートＢおよびＣにおけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅのその後の投与のため)、ＰＫ／ＰＤモデリングを組み込み決定し、予備的安全性コホートおよびパートＡにおけるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単剤療法の最大投与用量(ＭＡＤ)を超えない。ＢＬＲＭ−コピュラモデル、すなわち、ＢＬＲＭ−ＲＤにより推奨されるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの用量レベルは、任意のコホートのＢＬＲＭ−ＲＤが常に全ての利用可能なおよび最新のデータ更新された情報に基づくように一般的概念により定義される。
【０５８３】
全時点で、ニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで投与されるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの用量は(パートＢおよびＣ)、単剤療法用量漸増アーム(パートＡ)で安全であることが示されたＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの用量を超えてはならず、パートＢおよびＣにおける併用療法中の全時点で、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ用量は、単剤療法用量漸増アーム(パートＡ)で耐容性を示すと決定された最高用量を超えてはならない。さらに、ニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせで使用するＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの出発用量レベル(パートＢおよびＣ)は、ＤＬＴ期間を通過している単剤療法(パートＡ)用量より１用量低い。
【０５８４】
パートＢ１およびＣ１は、４週に１回のニボルマブ(パートＢ１)または４週に１回のイピリムマブ(パートＣ１)の複数投与存在下の、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ投与後のＩＣＯＳ受容体下方制御および再発現の速度論(および／または選択標的結合／薬力学的バイオマーカー変化)の探索を目的としたＰＫ／薬力学的サブスタディからなる。
異なる用量のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７ＥがパートＢ１およびＣ１で投与される：
・少なくとも４週間の期間ほぼ完全な受容体下方制御(および／または選択標的結合／薬力学的バイオマーカー変化)を誘発する少なくとも一つ用量を含む、種々のレベルのＩＣＯＳ受容体下方制御を誘発するまたは誘発することが予測される用量。これらの用量レベルは、パートＡの投与間隔と等しい、短期間および／または長期間について、ほぼ完全な下方制御後のＩＣＯＳ受容体再発現速度の特徴づけを可能にする。ＩＣＯＳ受容体速度論の理解により、将来の試験でのＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ投与間隔試験に役立ち得る。
・ＢＬＲＭ−ＲＤ：用量レベルは、先のおよび現在のコホートの完了部分および／または、該当する場合はいつでも、ＢＬＲＭ／ＢＬＲＭ−コピュラモデルからの全ての利用可能な安全性(臨床および検査)およびＰＫデータならびに末梢標的結合マーカーの変化(例えば、Ｔ細胞およびＩＣＯＳ＋Ｂ細胞のＩＣＯＳ下方制御)により決定される。
【０５８５】
２４週間の単剤療法処置または２年間の併用療法後、参加者は、再処置に適格であり得る。パートＡについて、走査を中心的に集め、後日または試験中いつでも盲検独立中央判定(ＢＩＣＲ)によりレビューされ得る。パートＢおよびＣについて、走査を中心的に集め、リアルタイムでＢＩＣＲによりレビューされ得る。
身体検査、バイタルサイン測定、１２誘導心電図(ＥＣＧ)および臨床検査評価を、投与間隔の間の選択した時点で実施する。
【０５８６】
参加者は、試験中ＡＥについて密接にモニターされる。血液を、ＰＫ分析のための試験処置投与後３０日、６０日および１００日フォローアップ来院時に採取する。
参加者は、下記のとおり、スクリーニング、処置、安全性フォローアップおよび応答／生存フォローアップの試験の４相までを完了する。試験への参加の全期間は約２年間である。
【０５８７】
テタヌスワクチン
パートＡ、ＢおよびＣの全患者は、承認されたテタヌスワクチンを受ける。テタヌストキソイドなどの強力なリコール抗原の投与は免疫系の引き金をひき、免疫応答を誘発し、より免疫原性の状態を促進する。
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅが二次応答を増強する能力を、テタヌスワクチン接種後のテタヌスに対する抗体ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞による増殖性およびサイトカイン応答のモニタリングにより決定する。約７０％の一般的集団は、テタヌスに対する保護抗体を有する。しかしながら、細胞性免疫応答は、通常テタヌスワクチン１か月後、末梢血で検出可能である。テタヌスは、ワクチンでの免疫療法を受けている癌患者におけるレポーター抗原として使用されており、容易にモニターされ得る。結果的に、テタヌスワクチン接種は、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組み合わせと共に強力な二次応答を提供し得る。
【０５８８】
スクリーニング
スクリーニングフェーズは最大２８日間続き、試験処置の最初の投与前に実施する。スクリーニングフェーズ注、参加者の初期適格性を確立し、書面でのインフォームドコンセントを得る。腫瘍生検を全参加者で採取し、免疫組織化学によりＩＣＯＳ発現を中心的に評価し、結果を試験処置の最初の用量の投与前に評価する。参加者は、自動応答技術(ＩＲＴ)を使用して参加する。
【０５８９】
処置フェーズ
予備的安全性コホートおよびパートＡにおける処置フェーズは、６回までの４週間処置サイクル(１サイクル＝２８日)からなる。予備的安全性コホートおよびパートＡにおいて、各処置サイクルは、計２４週間のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単剤療法からなる。
パートＢおよびＣの用量レベルは、先のおよび現在のコホートの完了部分からの全ての利用可能な安全性(臨床および検査)およびＰＫデータならびに末梢標的結合マーカーの変化(例えば、Ｔ細胞およびＩＣＯＳ＋Ｂ細胞のＩＣＯＳ下方制御)に基づき、該当する場合はいつでもＢＬＲＭ／ＢＬＲＭ−コピュラモデルにより導かれる。
【０５９０】
パートＢ１およびＣ１において、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ＋ニボルマブまたはイピリムマブ投与がサイクル１の１日に開始されるように、４週間サイクルを使用する。ニボルマブおよびイピリムマブは、各サイクルの１日目に投与される。ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅは１２週毎に１回または各３回目のサイクルの１日目(サイクル１、１日目、サイクル４、１日目、サイクル７、１日目など)。パートＢ１およびＣ１の参加者は、最大で計２年間の処置を継続する。
パートＢ２およびＣ２における処置フェーズは、計２年間の各サイクルの１日目に投与されるＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ＋ニボルマブまたはイピリムマブからなり、さらなる安全性、ＰＫまたはＰＤデータが用量および／またはスケジュール選択の最適化に必要である場合のみ登録する。
【０５９１】
各処置サイクル後、さらなるサイクルの試験処置で参加者を処置する決定は、１２週毎(１２週間±１週間に１回)に実施され、次サイクルの最初の投与前に完了する腫瘍査定評価に基づく。腫瘍進行または応答エンドポイントを、固形癌効果判定基準(ＲＥＣＩＳＴ)  ｖ１.１または前立腺のみのための前立腺癌ワーキング・グループ３(ＰＣＧＷ３)ガイドラインを使用して評価する(Scher et al., 2016. Trial Design and Objectives for Castration-Resistant Prostate Cancer: Updated Recommendations From the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group 3. Clin Oncol. 34(12):1402-1418)。
【０５９２】
試験処置のさらなるサイクルでの進行後処置は、治験担当医およびＢＭＳメディカルモニター／試験ディレクター間での検討と、ベネフィット・リスク評価が試験処置の継続投与を支持するとの同意後に、パートＡについて最大２４週間までおよびパートＢ、Ｃ、ＤおよびＥについて２年間まで、初期ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１またはＰＣＧＷ３(前立腺のみ)て定義されたＰＤの選択参加者について許可される(例えば、参加者が治験医により評価して、臨床的有効性を継続して経験する、処置に耐容性であるおよび他の特定の基準を満たす)。
【０５９３】
あるサイクルの最後に未確定の疾患進行(ＰＤ)、疾患安定(ＳＤ)、部分寛解(ＰＲ)または完全寛解(ＣＲ)の応答である参加者は次処置サイクルを続ける。参加者は、一般に１)最大数のサイクル完了、２)確認されたＰＤ、３)処置によりさらに利益を得る可能性がないことを示唆する臨床的悪化、４)治療への不耐容性または５)試験処置の中止の基準を満たす患者が最初に起こるまで試験処置を継続できる。確認されたＣＲを有する個々の参加者は、個々の場合に応じて、治験医とＢＭＳメディカルモニター／試験ディレクターの間の特定の協議およびベネフィット／リスクが試験処置の中止を正当化する状況の同意の後、試験処置中止の選択肢が与えられる。
【０５９４】
安全性フォローアップ
パートＡについて２４週間(または該当する場合最大４８週間)またはパートＢ、Ｃ、ＤおよびＥについて２年間(または該当する場合最大４年間)の試験処置後、参加者が試験処置を中止するとの決定がなされ(例えば、処置終了時[ＥＯＴ])、全参加者は安全性フォローアップ期間に入る。
治療の全予定サイクルを完了した参加者について、ＥＯＴ来院は予定され、かつ完了した最終オントリートメント来院および１週目安全性フォローアップ来院の開始と同じである。試験処置の全予定サイクルを完了しなかった参加者について、ＥＯＴ来院は、直近のオントリートメント来院(安全性および応答データが全て利用可能である)であり、安全性フォローアップ来院の開始と見なされる。
ＥＯＴ来院後、全参加者は、最後の試験処置投与後、少なくとも１００日間、何らかの新規ＡＥについて評価される。ＡＥをモニターするためのフォローアップ来院は、最後の投与３０日、６０日および１００日後または中止の日(±７日)に行う。試験参加の同意を撤回した参加者以外、全参加者は、新規抗癌処置を開始しているかしていないかにかかわらず、３回の臨床的安全性フォローアップ来院を完了する必要がある。
【０５９５】
生存フォローアップ
安全性フォローアップ来院完了後、単剤療法および併用療法で処置された全参加者は、生存フォローアップ期間に入る。参加者は、死亡、追跡不能、同意撤回または試験の結論がでるまでの、何れか最初のときまで約３カ月毎(１２週間)追跡する。このフェーズの期間間は、試験処置の最初の投与から２年間までであるが、有効性シグナルが明らかなであるならば、選択症例でより長いフォローアップ期間が考慮される。
【０５９６】
応答フォローアップ
安全性フォローアップ期間完了後、ＥＯＴ来院時にＳＤ、ＰＲまたはＣＲが進行中の参加者は、応答フォローアップ期間に入る。この期間は、上記参加者について、生存フォローアップ期間と同時に発生する。参加者は、死亡、追跡不能、同意撤回または試験の結論がでるまでの、何れか最初のときまで放射線学的および臨床的腫瘍評価を約３カ月毎(１２週間)に受け続ける。臨床的有効性が進行中の参加者についての放射線学的腫瘍評価は、参加者が試験の生存フェーズを完了後も集め続ける。試験処置の最初のコース後に疾患進行をした参加者は、ＥＯＴ来院以降に応答を評価せず、必要に応じて他の腫瘍指向治療を受けさせる。参加者がＰＤ以外の何らかの理由で処置を中止したならば、放射線学的フォローアップを、参加者がさらなる処置を受けるまで続ける。
【０５９７】
２４週間以降のさらなるサイクルでの処置
全参加者は、早期に試験処置中止の基準を満たさない限り、２４週間の単剤療法または併用療法で処置される。疾患制御(ＣＲ、ＰＲまたはＳＤ)または未確定のＰＤが進行中で処置を完了した全参加者は、パートＡについてさらなる２４週間の試験処置または併用療法について計２年間、個々の場合に応じて、リスク／ベネフィット比が試験処置のさらなる投与を支持するか否かのＢＭＳメディカルモニター／試験ディレクターによる注意深い評価および検討の後、適格となる。さらなる試験処置期間完了後、全参加者は安全性フォローアップ期間に入る。
【０５９８】
進行後処置
進行後処置は、ＢＭＳメディカルモニター／試験ディレクターの検討およびベネフィット・リスク評価が試験処置の継続処置を支持するとの同意の後、初期ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１またはＰＣＧＷ３(前立腺のみ)規定ＰＤを有する選択参加者で可能である(例えば、参加者が治験医により評価して、臨床的有効性を継続して経験する、処置に耐容性であるおよび他の特定の基準を満たす)。
【０５９９】
参加者は、進行後処置を継続するために、インフォームドコンセント書式(ＩＣＦ)補遺に再同意しなければならない。進行後処置は、継続腫瘍評価を必要とする。
【０６００】
応答フォローアップ中の再処置
応答フォローアップ期間中に疾患進行したら、この試験で再処置は可能である。パートＡについて２４週間(または該当する場合最大４８週間)またはパートＢ、Ｃ、ＤおよびＥについて２年間(または該当する場合最大４年間)のまたは疾患制御(ＣＲ、ＰＲまたはＳＤ)が進行である応答フォローアップ期間に入ったＣＲにより中止したそれより短い試験処置を完了し、何ら著しい毒性がない参加者は、個々の場合に応じて、リスク／ベネフィット比がさらなる試験処置投与を支持し、参加者が試験処置での処置の適格性基準を満たし続けているか否かのＢＭＳメディカルモニター／試験ディレクターによる注意深い評価および検討後、最後の試験処置投与の１２カ月以内のその後の確認された疾患進行により、再処置に適格である。
再処置の基準を満たす参加者は、もともと割り当てられた単剤療法または併用療法レジメン(例えば、最初の２４週間同じ用量および投与スケジュールで投与)で、該用量およびスケジュールがその後に最新ＢＬＲＭ−ＲＤを超えることが判明しない限り処置され、判明した場合、参加者はＢＬＲＭ−ＲＤで処置される。このフェーズに入る参加者は、手続き上のスケジュールに従う。ＰＫおよび薬力学用サンプルは、低頻度で採取する(各処置サイクルの前用量で)。再処置中、血液から得る薬力学的バイオマーカーサンプルを採取する。
【０６０１】
参加者のタイプおよび標的疾患特徴
ａ)参加者は少なくとも１８歳であり、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１またはＰＣＧＷ３(前立腺のみ)に従い測定可能な疾患の転移および／または切除不能結腸直腸癌(ＣＲＣ)、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺の腺癌(ＰＲＣ)および尿路上皮癌(ＵＣＣ)の組織学的または細胞学的確認を有し、標的病変に加えて、生検に利用できる少なくとも１つの病変を有しなければならない。
ｂ)応答評価のために固形腫瘍についてＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１またはＰＣＧＷ３(前立腺のみ)により定義される測定可能な疾患の少なくとも１つの病変の存在。測定可能な疾患の唯一の部位として先に照射された場所における病変を有する参加者は、病変が明らかな進行を示し、測定され得る限り、参加が許される。
ｃ)参加者は、進行型または転移設定における少なくとも１標準処置レジメンを、もしそのような治療が存在するならば、受け、次いで進行するかまたは非耐容性となっており、参加前に全ての他の有効である可能性のある治療が考慮されていなければならない。
ｄ)チェックポイント経路阻害(例えば抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４)を特異的にターゲティングする何れかの薬剤での治療に先に暴露されていた参加者は、最後の処置から４週間を超える何れかの期間のウォッシュアウト期間後に許される。
【０６０２】
腫瘍タイプ
ａ)結腸直腸癌(ＣＲＣ)
ｉ)確認された疾患進行を伴う転移または再発である組織学的に確認されたＣＲＣ。
ii)判明しているならば、確認マイクロサテライト不安定性、ミスマッチ修復、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ状態。
iii)先の治療必要性：参加者は、転移および／または切除不能疾患について少なくとも１つの、しかし３つを超えない、先の全身治療を受けていなければならない(または６カ月以内のアジュバント治療で進行している)。
iv)参加者は、不治の転移疾患を有しなければならない(すなわち、外科的切除で治癒可能である可能性のある疾患を有する患者は処置に適格ではない)。
【０６０３】
ｂ)頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)(口腔、咽頭、喉頭)
ｉ)組織学的に確認された不治の局所的に進行した、再発性または転移ＨＮＳＣＣ(口腔、咽頭、喉頭)、ステージIIIまたはIVであり、治癒目的の局所治療(化学療法を併用するまたは併用しない手術または放射線療法)が適用不可能である。
ii)確認されたＨＰＶ状態およびサブタイプ、特にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を有しなければならない。
iii)参加者は、転移または局所的に進行した非切除可能疾患の処置のための少なくとも１つの、しかし２を超えない先の全身治療(例えば、白金ベースの化学療法)レジメンを受け、次いで進行するかまたは非耐容性となっており、またはそれに難治性でなければならない。
iv)先の治癒的放射線療法は、試験処置投与の少なくとも４週間前に完了していなければならない。先の限局性対症的放射線療法は、試験処置投与の少なくとも２週間前に完了していなければならない。
【０６０４】
ｃ)非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)
ｉ)参加者は、進行型(転移および／または切除不能)である扁平上皮または非扁平上皮組織診断とＮＳＣＬＣ(第７回国際肺癌学会[ＩＡＳＬＣ]による)の組織学的または細胞学的確認を受けていなければならない。
(１).参加者は、ＮＳＣＬＣのための少なくとも１つ、しかし２を超えない、先の全身治療を受けていなければならない。維持、アジュバントまたはネオアジュバント(化学療法または化学放射線同時併用療法)治療はさらなる選択処置として数えられない。
(２).参加者は、ＮＳＣＬＣのための白金ベースの化学療法を勧められていなければならない。白金ベースの化学療法は、アジュバント、ネオアジュバントまたは化学放射線同時併用療法状況においてなされ得る。このような処置完了６カ月以内で再発している再発性／転移疾患を有する参加者は、試験処置に適格であると考えられる。先のアジュバントまたはネオアジュバント化学療法は、先のレジメンの最後の投与が参加の少なくとも４週間前であるならば、許可される。
(３).局所的に進行した疾患のための先の根治的化学放射線同時併用療法も、化学療法または放射線療法の最後の適用(どちらを最後に適用しても)が参加の少なくとも４週間前であるならば、許可される。
(４).既知ＥＧＦＲ変異またはＡＬＫ再配列を有する参加者は、それぞれＥＧＦＲまたはＡＬＫ阻害剤を受けていなければならない。判明しておれば、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＫＲＡＳおよびＲＯＳ１変異状況が確認されなければならない。
【０６０５】
ｄ)前立腺の腺癌(ＰＲＣ)
ｉ)前立腺の腺癌の組織学的または細胞学的確認。
ii)参加者は、精巣摘出術により処置されているかまたは黄体化ホルモン放出ホルモンアナログを受けており、テストステロンレベル≦５０ng／dLでなければならない。
iii)次のモダリティの何れか１つによる転移疾患：コンピュータ断層撮影(ＣＴ)、磁気共鳴造影(ＭＲＩ)および骨スキャン。
【０６０６】
ｅ)尿路上皮癌(ＵＣＣ)
ｉ)膀胱、尿道、尿管または腎盂を含む尿路上皮の転移の組織学的または細胞学的証拠または外科的に切除不能な移行細胞癌。
【０６０７】
ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ用量規制毒性(ＤＬＴ)
用量漸増を方向付ける目的で、ＤＬＴを、明らかな別の原因が特定されないＡＥの発生率、強度および期間に基づき、定義する。ＤＬＴ期間は３５日間(５週間)である。
予備的安全性コホートにおいて、１用量のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを受け、完了したまたは４週間ＤＬＴ期間中にＤＬＴにより中止した参加者を、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単剤療法についてのＤＬＴ評価可能参加者と見なす。
【０６０８】
パートＡにおいて、２用量のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅを受け、完了したまたは５週間ＤＬＴ期間中にＤＬＴにより中止した参加者を、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅ単剤療法についてのＤＬＴ評価可能参加者と見なす。
パートＢ、Ｃ、ＤおよびＥにおいて、１用量のＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅまたは２用量のニボルマブまたはイピリムマブを受け、完了した参加者または５週間組み合わせ処置ＤＬＴ期間中にＤＬＴにより中止した参加者を、組み合わせ処置についてのＤＬＴ評価可能参加者と見なす。ＤＬＴ評価期間中に試験を中止したまたはＤＬＴ以外の理由で単剤療法(パートＡ)２用量または併用療法(パートＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ)１用量未満しか受けていない参加者はＤＬＴ評価可能参加者と見なさず、同じ用量レベルの新規参加者と置き換えない。ＤＬＴ以外の理由でＤＬＴ評価期間中に投与が遅れたパートＡの参加者は、少なくとも２用量の治療を受けているならば、ＤＬＴ評価可能参加者と見なす。
【０６０９】
参加者管理の目的で、ＤＬＴ基準を満たす何らかのＡＥは、どのサイクルで生じたかにかかわらず、試験処置を中止させる。ＤＬＴ以外の理由で５週間ＤＬＴ評価期間中に試験を中止した参加者は、同じ用量レベルの新規参加者と置き換えてよい。５週間ＤＬＴ評価期間中のＤＬＴの発生率を用量漸増決定およびＢＬＲＭ−ＲＤの決定に使用する。ＤＬＴ期間後に生じたＡＥは、スポンサー、メディカルモニター／試験ディレクターおよび治験担当医間の同意によりＢＬＲＭ−ＲＤ決定の目的のために考慮される。
【０６１０】
ＤＬＴを経験した参加者は、試験の安全性フォローアップ期間に入る。予備的安全性コホートについて４週間ＤＬＴ観察期間またはパートＡ、ＢおよびＣについて５週間ＤＬＴ観察期間後に生じたＤＬＴは、組み合わせパートの最大投与用量(ＭＡＤ)決定において考慮される。
この試験は、投与された抗ＩＣＯＳ抗体が癌処置に安全であり、かつ有効であることを示す。
【０６１１】
実施例１９
腫瘍増殖に対する抗ＩＣＯＳ抗体増加用量の組み合わせ効果
マウスモデルで腫瘍増殖阻害に対する抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたアゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、ＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅの用量増加の効果を評価した。図２８に示すとおり、組み合わせは、高用量で低い有効性、すなわち、「フック効果」を示し、ほぼ飽和または飽和濃度の抗体は、低濃度、すなわち、飽和をもたらさない濃度での抗体の有効性と比較して、有効性が低減した。
すなわち、確立されたＣＴ２６腫瘍を有するマウス(約２０mgの８週齢に平均化)を、抗ＰＤ−１単剤療法またはＩＣＯＳ.３３  ＩｇＧ１ｆ  Ｓ２６７Ｅとの組み合わせで処置した。抗ＩＣＯＳ用量漸増を０.１mg／kgから開始し、３倍増加で１０mg／kg(または約２００μg／マウス一定用量の最大用量)まで増加させた。抗ＰＤ−１抗体を１０mg／kgで(または約２００μg／マウス一定用量の最大用量)で投与した。抗ＩＣＯＳおよび抗ＰＤ１抗体を、腫瘍移植後同じスケジュール(すなわち、７日目に開始して４日毎)で投与した。
図２８に示すとおり、抗ＩＣＯＳおよび抗ＰＤ１併用療法での最大腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)は、試験した最大用量(１０mg／kg)ではなく低用量の抗ＩＣＯＳ抗体(３mg／kg)で観察され、３mg／kgを超える用量でのＴＧＩの減少を示し、すなわち、最大有効性は飽和未満の用量で達成される。
【０６１２】
【表３７】
2020515239.tif 000041
【表３８】
2020515239.tif 000042
【０６１３】
【表３９】
2020515239.tif 000043
【表４０】
2020515239.tif 000044
【０６１４】
【表４１】
2020515239.tif 000045
【表４２】
2020515239.tif 000046
【０６１５】
【表４３】
2020515239.tif 000047
【表４４】
2020515239.tif 000048
【０６１６】
【表４５】
2020515239.tif 000049
【表４６】
2020515239.tif 000050
【０６１７】
【表４７】
2020515239.tif 000051
【表４８】
2020515239.tif 000052
【０６１８】
【表４９】
2020515239.tif 000053
【表５０】
2020515239.tif 000054
【０６１９】
【表５１】
2020515239.tif 000055
【表５２】
2020515239.tif 000056
【０６２０】
【表５３】
2020515239.tif 000057
【表５４】
2020515239.tif 000058
【０６２１】
【表５５】
2020515239.tif 000059
【表５６】
2020515239.tif 000060
【０６２２】
【表５７】
2020515239.tif 000061
【表５８】
2020515239.tif 000062
【０６２３】
【表５９】
2020515239.tif 000063
【図１】
2020515239.tif 000064
【図２】
2020515239.tif 000065
【図３】
2020515239.tif 000066
【図４】
2020515239.tif 000067
【図５】
2020515239.tif 000068
【図６】
2020515239.tif 000069
【図７】
2020515239.tif 000070
【図８】
2020515239.tif 000071
【図９】
2020515239.tif 000072
【図１０】
2020515239.tif 000073
【図１１】
2020515239.tif 000074
【図１２−１】
2020515239.tif 000075
【図１２−２】
2020515239.tif 000076
【図１３】
2020515239.tif 000077
【図１４】
2020515239.tif 000078
【図１５−１】
2020515239.tif 000079
【図１５−２】
2020515239.tif 000080
【図１６】
2020515239.tif 000081
【図１７−１】
2020515239.tif 000082
【図１７−２】
2020515239.tif 000083
【図１８−１】
2020515239.tif 000084
【図１８−２】
2020515239.tif 000085
【図１９】
2020515239.tif 000086
【図２０−１】
2020515239.tif 000087
【図２０−２】
2020515239.tif 000088
【図２１−１】
2020515239.tif 000089
【図２１−２】
2020515239.tif 000090
【図２２−１】
2020515239.tif 000091
【図２２−２】
2020515239.tif 000092
【図２３】
2020515239.tif 000093
【図２４】
2020515239.tif 000094
【図２５】
2020515239.tif 000095
【図２６】
2020515239.tif 000096
【図２７】
2020515239.tif 000097
【図２８】
2020515239.tif 000098
【配列表】
2020515239000001.app
【国際調査報告】
2020515239.tif 000099
2020515239.tif 000100
2020515239.tif 000101
2020515239.tif 000102
2020515239.tif 000103
2020515239.tif 000104
2020515239.tif 000105
2020515239.tif 000106
2020515239.tif 000107