(57)【要約】  本発明の目的は、他の器官、例えば腎臓における同時に非常に低い蓄積によりＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍における蓄積をさらに改善するミニガストリン誘導体を提供することである。この目的は、式Ｘ−Ｚ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｙ）［式中、連結しているアミド又は末端アミドの少なくとも１つは、配列Ｚのアミノ酸の間、前又は後ろで、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ及びＮＨ2を結合し、又はＹ（Ｃ末端）は、１，４−二置換又は１，５−二置換の１，２，３−トリアゾールにより置き換えられる一方で、Ｘは、ＣＣＫ−２受容体関連疾患で診断的介入及び／又は治療的介入の目的のためのペプチドに付着した化学基を意味し、Ｙは、ペプチドのＣ末端修飾、例えばアミド、第一級及び第二級アミド、遊離カルボン酸、並びに制限されることなく直鎖又は分枝鎖のアルキルアルコール、アルケニルアルコール、アルキニルアルコール、芳香族アルコール及び複素環アルコールに由来するアミド及びエステルを含むカルボン酸エステル誘導体を意味し、かつＺは、リンカー又はＤＧｌｕ*を意味し、ここでＤＧｌｕ*は、１〜６個の繰り返しを有するＤＧｌｕ鎖（−ＤＧｌｕ−から−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−）を意味する］を有するミニガストリン誘導体により本発明に従って達せられる。これらのミニガストリン誘導体は、高い特異的な内部移行、優れたＩＣ50値、及び十分な血漿安定性を有する。
2020534327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ｘ−Ｚ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｙ）
［式中、連結しているアミド又は末端アミドの少なくとも１つは、配列Ｚのアミノ酸の間、前又は後ろで、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ及びＮＨ2を結合し、又はＹ（Ｃ末端）は、１，４−二置換又は１，５−二置換の１，２，３−トリアゾールにより置き換えられる一方で、Ｘは、ＣＣＫ−２受容体関連疾患での診断的介入及び／又は治療的介入の目的のためのペプチドに付着した化学基を表し、Ｙは、ペプチドのＣ末端修飾、例えばアミド、第一級及び第二級アミド、遊離カルボン酸、並びに制限されることなく直鎖又は分枝鎖のアルキルアルコール、アルケニルアルコール、アルキニルアルコール、芳香族アルコール及び複素環アルコールに由来するアミド及びエステルを含むカルボン酸エステル誘導体を表し、かつＺは、リンカー又はＤＧｌｕ*を表し、ここでＤＧｌｕ*は、１〜６個の繰り返しを有するＤＧｌｕ鎖（−ＤＧｌｕ−から−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−）を表す］
を有するミニガストリン誘導体。
【請求項２】
メチオニンをノルロイシンに置き換えて、好ましくは１つのＤＧｌｕのみを有するミニガストリン誘導体［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１及び／又はミニガストリン誘導体ＰＰ−Ｆ１１Ｎを提供する、請求項１に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項３】
Ｘが、放射性金属のためのキレーターを含む放射性核種を表す、請求項１又は２に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項４】
放射性金属のためのキレーターが、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ、ＮＯＴＡＧＡ、ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ及びＴＣＭＣからなる群から選択される、請求項３に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項５】
放射性核種が、177Ｌｕ、90Ｙ、111Ｉｎ、Ｇａ−６８／６７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｃｕ−６４／６７、Ａｃ−２２５、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２及びＴｈ−２２７からなる群から選択される、請求項３に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項６】
ＰＰ−Ｆ１１Ｎ及び［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１が、それぞれ
ＤＯＴＡ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2及び
ＤＯＴＡ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2
と定義される、請求項２に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項７】
ＤＯＴＡ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、177Ｌｕで標識されているか、又はＤＯＴＡ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、177Ｌｕで標識されている、請求項６に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項８】
Ｘが、任意に活性化学化合物を表す、請求項１又は２に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項９】
Ｘが、化学療法活性化合物、又はチロシンキナーゼ阻害剤もしくは免疫原性活性化合物のような任意の他の治療活性化合物を表す、請求項１又は２に記載のミニガストリン誘導体。
【請求項１０】
Ｘが、診断機能（例えば光学活性又はＭＲＩ造影剤）を有するか、又はそれら自体による治療機能を有しもしくは活性化合物を有する、ナノ粒子又はリポソームを表す、請求項１又は２に記載のミニガストリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミニガストリン誘導体、及びＣＣＫ２受容体陽性腫瘍の診断及び／又は治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、９０年代の始めから放射標識したペプチドのための標的タンパク質として使用されている。ソマトスタチン受容体は、オクトレオチド（Ｌｉｔ）のＹ−９０及びＬｕ−１７７で標識した誘導体での神経内分泌癌のための臨床の第一線の治療においてもたらされるペプチド（Ｌｉｔ）での放射性核種イメージング及び治療のための原型であった。いくつかの放射標識したペプチドは、ガストリン放出ペプチド類似体（ＧＲＰ）、グルカゴン様ペプチド１類似体（ＧＬＰ−１）、ニューロテンシン類似体（ＮＴ）又はニューロペプチドＹ類似体（ＮＰＹ）を含む腫瘍で過剰発現したＧＰＣＲを標的とすることを可能にするために試験されていた（Ｍａｅｃｋｅ， Ｒｅｕｂｉ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００８；４９：１７３５−１７３８）。さらに非常に興味深い標的は、コレシストキニン−２受容体（ＣＣＫ−２Ｒ）である。この受容体は、主に、髄様甲状腺癌（ＭＴＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び間質性卵巣腫瘍で発現される（Ｒｅｕｂｉ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． １９９６及びＲｅｕｂｉ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７）。放射標識したガストリン類似体は、標的画像化及び治療のための良好な候補である。Ｉｎ−１１１で標識したガストリン類似体が、ＯｃｔｒｅｏＳｃａｎ−１１１と比較してＭＴＣを検出するために優れており、かつ特にそれらがソマスタチン受容体シンチグラフィにおいて陰性である場合に神経内分泌腫瘍に対して追加の情報を与えることが示された（Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ． ２００６ Ｄｅｃ；１３ （４） ： １２０３−１１．；Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ． ２００６ Ｎｏｖ； ３３ （１１）：１２７３−９）。
【０００３】
しかし、高い腎臓取り込みによって、放射標識したペプチドを治療に使用できなかった。高い腎臓取り込みは、６個の負に帯電したグルタミン酸に関係する。１２個のガストリン関連化合物が設計され、合成され、かつ111Ｉｎで標識付けした化合物と比較された。腎臓に対する腫瘍の高い割合に関する最良の化合物は、６個のＤ−グルタミン酸又は６個のグルタミンを有するミニガストリンである。これらの化合物は、容易に酸化しうるメチオニンをさらに有する。これは、臨床適用についての欠点である。それというのも、受容体親和性がメチオニンの酸化後に劇的に減少し、かつＧＭＰ下での製造を劇的に妨害しうるからである。
【０００４】
転移性髄様甲状腺癌（ＭＴＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及びさらなるＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍を有する患者での治療及び画像生成の著しい改善のための高い可能性は、放射標識したガストリン類似体での腫瘍細胞の特異的な標識を有する。この発見についての根拠は、調査したＭＴＣの９２％でのそれぞれのＣＣＫ−２標的受容体の過剰発現の証拠であり、その証拠はｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験により得られた［Ｒｅｕｂｉ １９９７］。さらに、同じ作業グループは、小細胞肺癌の５７％、星状細胞腫の６５％及び間質性卵巣腫瘍の１００％で、ＣＣＫ−２標的受容体の同一の過剰発現を同定した。
【０００５】
最初の治療研究（０相研究）は、進行性転移性髄様甲状腺癌を有する８人の患者で実施された。90Ｙで標識したミニガストリン類似体での治療後に、以前は強く進行していた癌疾患であるＭＴＣの経過について、２人の患者については部分的な寛解に達し、４人の患者は安定化を示した。腎臓における前記アッセイで使用した物質の強い蓄積という点での治療の腎毒性により、この研究を中止しなければならなかった。
【０００６】
欧州のＣＯＳＴ発案（European Cooperation in Science and Technology（欧州科学技術協力機構））の支持により、その間に、複数の著しく改善された放射標識したガストリン類似体が種々のワーキンググループによって合成され、かつその特性について調査されている。以前のガストリン類似体と比較して、これらのより新しい物質は、ヒトの組織における吸収に関して、著しく高い腫瘍 対 腎臓の割合を示す［Ｌａｖｅｒｍａｎ ２０１１， Ｐｏｌｅｎｃ−Ｐｅｉｔｌ ２０１１， Ｏｃａｋ ２０１１， Ｆａｎｉ ２０１２］。現在、これらのより新しいガストリン類似体のうち、177Ｌｕ−ＰＰ−Ｆ１１（６個のＤ−Ｇｌｕ残基を有する直鎖状ミニガストリン類似体、以下ＰＰ−Ｆ１１という）は、腎臓での低い蓄積に伴う腫瘍におけるその好ましい高い蓄積によって、今後の放射性核種治療に最適な特性を示した。
【０００７】
このＰＰ−１１ミニガストリン類似体は、国際公開番号第２０１５／０６７４７３号（WO 2015/067473 Al）に従ってさらに改善されており、その際、ミニガストリン類似体ＰＰ−Ｆ１１は式：Ｘ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を有しており、ここで、Ｙは、メチオニンを置き換えるアミノ酸を示し、Ｘは、ＣＣＫ−２受容体関連疾患での診断的介入及び／又は治療的介入の目的のためのペプチドに付着した化学基を表す。特に、腎臓に対する腫瘍の高い割合に関して非常に適した化合物は、６個のＤ−グルタミン酸又は６個のグルタミンを有するミニガストリン誘導体である。これらの化合物は、生じる可能性のある形態によりＧＭＰでの臨床適用には不利であり、容易に酸化されうるメチオニンを未だ有している。したがって、メチオニンを非酸化性等配電子であるが生物学的活性を保持しているアミノ酸で置き換えることは、酸化電位を有さない化合物を導く。これは、低い腫瘍 対 腎臓の割合をもたらす低い親和性の化合物を導きうる貯蔵及び生成中の酸化を妨げる。国際公開番号第２０１５／０６７４７３号に従った好ましい実施形態において、メチオニンは、ノルロイシンに置き換えられる。このいわゆるＰＰ−Ｆ１１Ｎミニガストリンは、優れた腫瘍腎臓比を示し、したがって臨床適用のための非常に期待が持てる候補の１つである。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、他の器官、例えば腎臓における同時に非常に低い蓄積によりＣＣＫ−２受容体陽性腫瘍における、ペプチドの代謝安定化による蓄積をさらに改善するか又はその受容体親和性及び特異性を改善するミニガストリン誘導体を提供することである。
【０００９】
この目的は、式
Ｘ−Ｚ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｙ）
［式中、連結しているアミド又は末端アミドの少なくとも１つは、配列Ｚのアミノ酸の間、前又は後ろで、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ及びＮＨ2を結合し、又はＹ（Ｃ末端）は、１，４−二置換又は１，５−二置換の１，２，３−トリアゾールにより置き換えられる一方で、Ｘは、ＣＣＫ−２受容体関連疾患で診断的介入及び／又は治療的介入の目的のためのペプチドに付着した化学基を表し、Ｙは、ペプチドのＣ末端修飾、例えばアミド、第一級及び第二級アミド、遊離カルボン酸、並びに制限されることなく直鎖又は分枝鎖のアルキルアルコール、アルケニルアルコール、アルキニルアルコール、芳香族アルコール及び複素環アルコールに由来するアミド及びエステルを含むカルボン酸エステル誘導体を表し、かつＺは、リンカー又はＤＧｌｕ*を表し、ここでＤＧｌｕ*は、１〜６個の繰り返しを有するＤＧｌｕ鎖（−ＤＧｌｕ−から−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−）を表す］
を有するミニガストリン誘導体により本発明に従って達せられる。
【００１０】
これらのミニガストリン誘導体は、高い受容体特異的な細胞内部移行、ＣＣＫ２に対する優れたＩＣ50値、及び十分な血漿安定性を有する。
【００１１】
好ましくは、メチオニンが、ノルロイシン、又は受容体への親和性を保持している他のアミノ酸に置き換えられて、好ましくは１つのＤＧｌｕのみを有するミニガストリン誘導体［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１が得られる。
【００１２】
放射線癌治療に関して、Ｘは、放射性金属、例えば177Ｌｕ又は90Ｙ又は111Ｉｎのためのキレーター、又は非金属、例えば18Ｆ、１１Ｃ、又は放射性ヨウ素のための補欠分子族のような付着基を含む放射性核種、又はプレターゲティングアプローチに適した官能基を表してよい。医療画像を改善するために、Ｘは、光学活性化学化合物、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ、ＤＹ−７００又は任意の他の光活動性物質、及び光学治療適用（光増感剤、例えばＰｈｏｔｏｆｒｉｎ、Ｆｏｒｓｃａｍ又はＰｈｏｔｏｃｈｌｏｒであってよい）を表してよい。双方の適用について、活性化学化合物は、光学活性ナノ粒子であってよい。化学療法的介入治療を支持するために、Ｘは、化学療法的に活性のある化合物、例えばゲムシタビン、ドキソルビシン又はシクロホスファミドを表してよい。Ｘは、造影剤（色素、放射性核種）と治療実体（細胞毒性化合物、放射性核種）との組み合わせも表してよい。記載した薬剤の送達は、Ｘとしてナノ粒子又はリポソームにより行われてよいが、それらは化学療法剤を含んでいる。
【００１３】
Ｚは、ペプチドの生物学的特性との潜在的な干渉を回避するために、距離を保ちながらペプチドとイメージングプローブ又は治療法とを共有結合するリンカー又はスペーサーユニットを提示してもよい。
【００１４】
リンカー部分は、これらに制限されないがヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐを含む）１〜１０個を含む炭素長１〜２０個の直鎖又は分枝鎖のアルキル鎖、全ての炭素又は複素環芳香族部分、例えばフェニル、ナフタレン、トリアゾール、チオフェン、フラン等、並びにリンカー主鎖又は１つもしくは複数の側鎖での不飽和Ｃ−Ｃ又はＣ−ヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ）結合を含んでよいが、これらに制限されない。
【００１５】
好ましくは、Ｘは、キレーターを表し、ここで放射性金属についての１つのキレーターは、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）であってよく、及び／又は放射性核種は、177Ｌｕ、Ｇａ−６８／６７、90Ｙ及び111Ｉｎからなる群から選択される。他の放射性核種（Ｔｃ−９９ｍ、Ｃｕ−６４／６７、Ａｃ−２２５、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２、Ｔｈ−２２７）及び他の適したキレーターは、当該技術分野において公知のもの、例えばＭＡＧ３、ＨＹＮＩＣ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＤＯＴＡＧＡ、ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ、ＤＦＯ、ＴＣＭＣ、ＨＥＨＡ、サルコファジン、サイクラムの架橋した変型及びサイクレンキレーターである。
【００１６】
適したミニガストリン誘導体は、ＰＰ−Ｆ１１Ｎ及び［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１であり、これらは、
ＤＯＴＡ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＰＰ−Ｆ１１Ｎ）及び
ＤＯＴＡ−ＤＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１）
と定義される。
【００１７】
好ましくは、Ｘは、診断機能（例えば光学活性又はＭＲＩ造影剤）を有するか、又はそれら自体による治療機能を有しもしくは活性化合物を有する、ナノ粒子又はリポソームを表す。
【００１８】
本発明のミニガストリン誘導体の使用に関して、ＣＣＫ−２受容体関連疾患での診断的介入及び／又はＣＣＫ−２受容体関連疾患での治療的介入が予測されている。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態を、以下に示す添付の図面に関してより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】いわゆるトリアゾールスキャンによる誘導型における［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１の特異的な内部移行
【図２】いわゆるトリアゾールスキャンによる誘導型における［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１の最大半量阻害濃度ＩＣ50
【図３】いわゆるトリアゾールスキャンによる誘導型における［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１の血漿安定性
【図４】図１〜図３において示した結果の概要
【図５】ＰＰ−Ｆ１１Ｎと［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１誘導体ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ15、Ｔｙｒ12−（Ｔｚ）−Ｇｌｙ13］−ＭＧ１１との比較
【図６】主にＤＯＴＡ［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１でのトリアゾールスキャン
【図７】表２からのビス−ＴＺＭＧの合計の内部移行
【図８】表２からのビス−ＴＺＭＧの最大半量阻害濃度ＩＣ50
【図９】表２からのビス−ＴＺＭＧの血漿安定性
【図１０】２つの一置換トリアゾールミニガストリン 対 追加の改善を示す双方の変異を有する類似体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴
【図１１】表３によるＰＰＦ１１Ｎ及びその誘導型の合計な内部移行
【図１２】表３によるその誘導型におけるＰＰＦ１１Ｎの最大半量阻害濃度ＩＣ50
【図１３】表３によるその誘導型におけるＰＰＦ１１Ｎの血漿安定性
【００２１】
［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１は、種々のタイプの癌において過剰発現させたコレシストキニン２受容体（ＣＣＫ２Ｒ）に対して高い親和性及び特異性を有する調節ペプチドであるミニガストリンの切断型類似体である。１，４，７，１０−テラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）のＮ末端接合は、金属性放射性核種（例えば117Ｌｕ）でのペプチドの放射標識を可能にし、続いてｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍イメージング及びペプチド受容体の放射性核種治療のために使用する。
【００２２】
腫瘍ターゲティングベクターとしてＭＧ１１を使用する欠点は、数分のみの生物学的半減期をもたらす速い酵素分解により腫瘍への取り込みが低いことである。安定な１，４−二置換した又は１，５−二置換した１，２，３−トリアゾールによるペプチド配列における単一アミド結合の体系的置換、いわゆるトリアゾールスキャンは、改善されたタンパク質分解安定性及び腫瘍ターゲティング特性をもたらす。この新たな方法論の一般的な有用性を証明するために、トリアゾールスキャンを、図６に体系的に示したようにＳＰＰＳと銅（Ｉ）−触媒化アジド−アルキン環付加（１，４−二置換した１，２，３−トリアゾールについてのＣｕＡＡＣ）との組合せを使用する固相アプローチによりＤＯＴＡ［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１で実施した。１，５−二置換した１，２，３−トリアゾールの導入は、類似しているが、ルテニウム−触媒化アジド−アルキン環付加（ＲｕＡＡＣ）を使用する。
【００２３】
次の例は、放射標識したトリアゾールペプチド模倣物の合成及びそれらの生理化学的特徴の評価を論ずる。ペプチド接合体の受容体親和性（ＩＣ50）、腫瘍細胞内部移行率及び血漿安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した。異種移植したマウスでのｉｎ ｖｉｖｏ研究の最初の結果に達した。この計画の最終的な目標は、ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１又はＰＰＦ１１Ｎの類似体を同定することであり、維持もしくは改善された生物学的活性又は酵素分解に対する優れた耐性を導き、腫瘍への取り込みを改善した。
【００２４】
ＣｕＡＡＣ及びトリアゾールペプチドの構成要素は、Ｖａｌｄｅｒｅら及びＭａｓｃａｒｉｎらによる文献において報告される適合した手順により製造される。
【００２５】
一般的な手順Ａ：ワインレブ（Ｗｅｉｎｒｅｂ）アミドの合成
【化１】
2020534327.tif 000003
Ｒ1＝アミノ酸特異的側鎖
Ｒ2＝Ｂｏｃ／Ｆｍｏｃ
対応するＦｍｏｃ保護又はＢｏｃ保護したアミノ酸（１当量）をＣＨ2Ｃｌ2（０．１Ｍ）中で溶解し、そしてＤＩＰＥＡ（２．５当量）及びＢＯＰ（１当量）を添加した。その溶液を１５分間撹拌し、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン（１．２当量）を添加し、そして１２〜１４時間室温で撹拌して反応させた。その溶液を、ＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、０．１ＭのＨＣｌ（３×）、飽和ＮａＨＣＣ3（３×）水溶液及び水（３×）で洗浄した。その有機相を、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたワインレブアミドを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００２６】
一般的な手順Ｂ：α−アミノアルコールの合成
【化２】
2020534327.tif 000004
Ｒ＝アミノ酸特異的側鎖
側鎖に保護されたカルボン酸を有するアミノ酸について、対応するＦｍｏｃ保護したアミノ酸（１当量）を、アルゴン下で無水ＴＨＦ（０．２Ｍ）中で溶解し、０℃に冷却した（氷浴）。Ｎ−メチルモルホリン（１．１当量）及びイソブチルクロロホルメート（１．０５当量）を添加し、そして１５分間０℃で撹拌して反応させた。反応の完了をＴＬＣによりモニタリングした。白色の懸濁液を、−７８℃（ドライアイス、アセトン）でＴＨＦ／ＭｅＯＨ（３：１、又は純粋なＴＨＦ）中でのＮａＢＨ4（２当量）の予め冷却した懸濁液に滴加し、そして２０分間撹拌した。還元の完了時に、残留水素化物を水性１０％酢酸により急冷し、そしてその溶液を減圧下で濃縮させた。その在留物を酢酸エチルで抽出し（３×）、そしてその有機相を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（２×）及び水（１×）で洗浄した。その有機層を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたα−アミノアルコールを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００２７】
一般的な手順Ｃ：α−アミノアルキン５の合成
Ｃ．１  Ｂｏｃ保護したワインレブアミドからのα−アミノアルキンの合成
【化３】
2020534327.tif 000005
Ｒ＝アミノ酸特異的側鎖
対応するワインレブアミド（１当量）をアルゴン下で引火乾燥させたフラスコに入れ、そして無水ＣＨ2Ｃｌ2（０．１Ｍ）中で溶解させた。その溶液を−７８℃（ドライアイス／アセトン浴）まで冷却し、そしてトルエン中１Ｍ ＤＩＢＡＬ−Ｈを滴加した（３当量）。１時間撹拌した後に、その反応を、ＴＬＣにより完了を確認した。反応が終わっていなかった場合に、トルエン中１Ｍ ＤＩＢＡＬ−Ｈ（１当量）を滴加し、−７８℃で１時間再度撹拌して反応させた。出発材料の消費後に、過剰な水素化物を無水ＭｅＯＨをゆっくりと添加することにより急冷し、そして０℃まで温めて反応させた（氷／水浴）。Ｋ2ＣＯ3（３当量）、ジメチル−（１−ジアゾ−２−オキソプロピル）ホスホネート（２当量）及び無水ＭｅＯＨを添加し、そしてその反応混合物を１２〜１４時間室温で撹拌した。ロッシェル塩の飽和溶液を添加し、その混合物を３０分間撹拌した。その溶液を水及びＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、その水性相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した（３×）。合した有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたアルキンを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００２８】
Ｃ．２  Ｆｍｏｃ保護したワインレブアミドからのα−アミノアルキンの合成
【化４】
2020534327.tif 000006
Ｒ＝アミノ酸特異的側鎖
対応するワインレブアミド（１当量）をアルゴン下で引火乾燥させたフラスコに入れ、そして無水ＣＨ2Ｃｌ2（０．１Ｍ）中で溶解させた。その溶液を−７８℃（ドライアイス／アセトン浴）まで冷却し、そしてトルエン中１Ｍ ＤＩＢＡＬ−Ｈを滴加した（３当量）。１時間撹拌した後に、その反応を、ＴＬＣにより完了を確認した。反応が終わっていなかった場合に、トルエン中１Ｍ ＤＩＢＡＬ−Ｈ（１当量）を添加し、−７８℃で１時間再度撹拌して反応させた。出発材料の消費後に、過剰な水素化物を無水ＭｅＯＨをゆっくりと添加することにより急冷し、そして０℃まで温めて反応させた（氷／水浴）。Ｋ2ＣＯ3（３当量）、ジメチル−（１−ジアゾ−２−オキソプロピル）ホスホネート（２当量）及び無水ＭｅＯＨを添加し、そしてその反応混合物を１２〜１４時間室温で撹拌した。ロッシェル塩の飽和溶液を添加し、その混合物を３０分間撹拌した。その溶液を水及びＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、その水性相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した（３×）。合した有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。Ｆｍｏｃ保護基の切断がＴＬＣにより検出された場合に、粗混合物をＣＨ2Ｃｌ2（初期スケール０．１Ｍ）中で溶解した。ＤＩＰＥＡ（２．５当量）及びＦｍｏｃ−ＯＳｕ（２当量）を添加し、そして１２〜１４時間室温で撹拌して反応させた。そしてその反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2及び水で希釈した。水性相をＣＨ2Ｃｌ2で３回抽出した。合した有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたアルキンを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００２９】
Ｃ．３  Ｆｍｏｃ保護したα−アミノアルコールからのα−アミノアルキンの合成
【化５】
2020534327.tif 000007
Ｒ＝アミノ酸特異的側鎖
ＤＭＳＯ（２．２当量）を無水ＣＨ2Ｃｌ2（１Ｍ）中で溶解し、そしてアルゴン下で−４５℃（ドライアイス／ＭｅＣＮ浴）まで冷却した。二塩化オキサリル（１．２当量）を気体の発生下で−４５℃で滴加した。その溶液を５分間撹拌して、対応するＦｍｏｃ保護したα−アミノアルコール（１当量、ＣＨ2Ｃｌ2中０．１３Ｍ）を−４５℃で滴加し、そして３０分間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（３当量）を添加し、−２０℃まで温めて反応させ（ＮａＣｌ／氷浴）、そして完了するまでＴＬＣによりモニタリングした。そして、その溶液をＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、その有機相を、水、１Ｍ ＮａＨＳＯ4、及び水で抽出した。合した有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。続いて、その粗反応物を無水ＭｅＯＨ（初期収量に従って０．１Ｍ）中で溶解し、そしてＫ2ＣＯ3（３当量）及びジメチル−（１−ジアゾ−２−オキソプロピル）ホスホネート（２当量）を添加し、反応混合物を１２〜１４時間室温で撹拌した。その反応混合物を水で希釈し、その水性相をＣＨ2Ｃｌ2で３回抽出した。合した有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。Ｆｍｏｃ保護基の切断がＴＬＣにより検出された場合に、粗混合物をＣＨ2Ｃｌ2（初期スケール０．１Ｍ）中で溶解した。ＤＩＰＥＡ（２．５当量）及びＦｍｏｃ−ＯＳｕ（２当量）を添加し、そして１２〜１４時間室温で撹拌して反応させた。そしてその反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2及び水で希釈した。水性相をＣＨ2Ｃｌ2で３回抽出した。合した有機相を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたアルキンを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００３０】
α−アミノアルキン構成要素の光学純度の決定のための一般的な手順Ｄ：α−アミノアルキンからのジペプチドの合成
Ｄ．１  Ｂｏｃ保護したα−アミノアルキンからのジペプチドの合成
【化６】
2020534327.tif 000008
Ｒ＝アミノ酸特異的側鎖
対応するα−アミノアルキン（１当量）を、ＣＨ2Ｃｌ2／ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ（７５：２０：５）（０．０５Ｍ）の溶液中で溶解し、１５〜３０分間撹拌して反応させ、反応の完了後に、溶媒を減圧下で取り除いた。水及びＴＦＡの残留量をトルエンでの同時蒸発により取り除いた。その残留物をＣＨ2Ｃｌ2（０．１Ｍ）中で溶解し、そしてＰＧ−Ａｌａ−ＯＨ（２当量、ＰＧ＝Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、２当量）及びＤＩＰＥＡ（５当量）を添加した。室温で撹拌して反応させ、そして完了するまでＴＬＣによりモニタリングした。溶媒を減圧下で粗混合物から取り除き、そして所望のジペプチドをシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００３１】
Ｄ．２  Ｆｍｏｃ保護したα−アミノアルキンからのジペプチドの合成
【化７】
2020534327.tif 000009
Ｒ＝アミノ酸特異的側鎖
対応するα−アミノアルキン（１当量）を、ＤＭＦ中２５％ピペリジン（０．０５Ｍ）中で溶解し、そして室温で１５〜３０分間撹拌して反応させた。氷冷したＨ2Ｏを反応混合物に添加し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×）。合した有機画分を、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。その残留物をＣＨ2Ｃｌ2（０．１Ｍ）中で溶解し、そしてＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（２当量）、ＢＯＰ（２当量）及びＤＩＰＥＡ（５当量）を添加した。室温で撹拌して反応させ、そして完了するまでＴＬＣによりモニタリングした。溶媒を減圧下で粗混合物から取り除き、そして所望のジペプチドをシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
【００３２】
一般的な手順Ｅ：手動の固相ペプチド合成
ｒｉｎｋアミドＭＢＨＡ  ＬＬ樹脂（約１００ｍｇ、０．０３〜０．０４ｍｍｏｌ）を、プロピレンフリット及びテフロンタップを有するプロピレンシリンジ中に置き、そしてＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ中で繰り返し膨張させた。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ保護基を切断した（３×３分、室温）。配列の伸長のために、Ｆｍｏｃ保護したアミノ酸又はＤＯＴＡ−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）（２当量、０．０６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．９当量、０．０５７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５当量、０．１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で（合計３ｍＬ）、樹脂に添加した。１時間室温で振盪して懸濁させた。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2で繰り返し洗浄した。反応の完了をカイザー試験によりモニタリングし、そして適宜カップリングを繰り返した。
【００３３】
一般的な手順Ｆ：固体支持体上でのペプチドのＮ末端上のアジド官能性の導入
Ｆｍｏｃ保護基の切断後に、遊離Ｎ末端アミンを、イミダゾール−１−スルホニルアジドヒドロクロリド（３当量、０．０９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（９当量、０．２７ｍｍｏｌ）及びＣｕＳＯ4（０．０１当量、０．０３μｍｏｌ）の触媒量７でＤＭＦ中で（合計２ｍＬ）試験した。１時間室温で振盪して懸濁させた。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をＤＭＦ中ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの０．５％溶液、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2で繰り返し洗浄した。反応の完了をカイザー試験によりモニタリングし、そして適宜繰り返した。
【００３４】
一般的な手順Ｇ：固相銅（Ｉ）−触媒化環化付加（ＣｕＡＡＣ）
Ｆｍｏｃ保護したα−アミノアルキン（２当量、０．０６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１当量、０．０３ｍｍｏｌ）、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロホスフェート（０．５当量、０．０１５ｍｍｏｌ）及びトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ、０．５当量、０．０１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中で、Ｎ末端アジド官能性に添加し、そして１２〜１４時間室温で振盪して懸濁した。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をＤＭＦ中ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの０．５％溶液、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2で繰り返し洗浄した。反応の完了を、脂肪族アジドについての比色分析試験によりモニタリングした。
【００３５】
一般的な手順Ｈ：固相ルテニウム触媒化環化付加（ＲｕＡＡＣ）
Ｆｍｏｃ保護したα−アミノアルキン（２当量、０．０６ｍｍｏｌ）及び（クロロ（ペンタメチルシクロペンタジエニル）（シクロオクタジエン）ルテニウム（ＣｐＲｕ（ＣＯＤ）Ｃｌ、０．５当量）をＤＭＦ中（２ｍＬ）でＮ末端アジド官能性にアルゴン雰囲気下で添加し、そして１２〜１４時間室温で振盪して懸濁した。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をＤＭＦ中ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの０．５％溶液、ＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2で繰り返し洗浄した。反応の完了を、脂肪族アジドについての比色分析試験によりモニタリングした。
【００３６】
一般的な手順Ｉ：ペプチド接合体の切断及び精製
Ｎ末端キレーターＤＯＴＡ−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）の最終的なカップリング後に、その接合体を、５時間室温で撹拌しながらＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ／フェノール（９２．５／２．５／２．５／２．５、６ｍＬ）を使用して樹脂から脱保護及び切断した。切断混合物を、樹脂から濾過により分離して、そして窒素流を揮発性成分の蒸発のために適用した。そして、粗ペプチドを氷冷ジエチルエーテル（１５ｍＬ）の添加により沈澱させた。遠心分離（１８００ｒｐｍ、５分）及び氷冷したジエチルエーテルでの２回の洗浄工程の後に、粗ペプチド接合体を、水中２０％ＣＨ3ＣＮ（１ｍｇ／ｍＬ）中で溶解し、そして逆相半調製用ＨＰＬＣにより精製した。続いて凍結乾燥して、白色の粉末として最終生成物を得た。
【００３７】
合成結果を表１において示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００３８】
（放射性）金属標識
ストック溶液を、基準物質（ＤＯＴＡ−［Ｎｌｅ１５］−ＭＧ１１及びＤＯＴＡ−ＰＰ−Ｆ１１−Ｎ）又はトリアゾロミニガストリン（１ｍｇ、７５０ｎｍｏｌ）を酢酸アンモニウム緩衝液（５０μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ５．５）中で溶解し、そして最終ペプチド濃度２５０μΜ（約０．３ｍｇ／ｍＬ）まで水を添加することにより調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験のために、ＤＯＴＡ官能化化合物（１ｎｍｏｌ、４μＬの２５０μΜストック溶液）を水性ＨＣｌ（２２．５μＬ、０．０５Ｍ、ｐＨ１．３），酢酸アンモニウム緩衝液（１０μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ５．５）及び水性アスコルビン酸ナトリウム（５μＬ、０．５Ｍ）の混合物に添加した。２０〜２５ＭＢｑの177ＬｕＣｌ３（約２．５μＬ、０．０４Ｍ ＨＣｌ中、２０〜２５ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）を添加し、そしてその混合物を加熱ブロック中で２０分間９５℃まで加熱した。標識後に、標識混合物の１μＬアリコートを、γ−ＨＰＬＣによる品質制御のために水性ＤＴＰＡ（２００μＬ、２５μＭ）に添加した。
【００３９】
放射活性のない175Ｌｕでの標識のために、試験化合物（２５ｎｍｏｌ、１００μＬ、２５０μＭ）を、５モルの過剰な水性175ＬｕＣｌ3（１２５ｎｍｏｌ、１２．５μＬ、１０ｍＭ）、酢酸アンモニウム（５μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ５．５）と混合し、そして加熱ブロック中で９５℃まで２０分間加熱した。
【００４０】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、ＤＯＴＡ官能化化合物を、多量の177ＬｕＣｌ3で標識付けして、４５〜５５ＭＢｑ／ｎｍｏｌの特異的活性をもたらし、そして、品質制御後に、ＰＢＳで希釈して、１００ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度に達した。
【００４１】
細胞培養
ＣＣＫ２Ｒを発現するヒト髄様甲状腺癌細胞（ＭＺ−ＣＲＣ１）を、ＮｕｎｃｌｏｎTM Ｄｅｌｔａで処理した細胞培養フラスコ中で単層で５％ＣＯ2及び３７℃での加湿空気中で成長させた。細胞を、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕ）及び１０％  ＦＣＳで補った培養培地ＤＭＥＭ（高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））中で維持した。０．２５％トリプシン０．３８‰ＥＤＴＡ溶液を使用して、８０〜９０％の培養密度で培養物を定期的に継代した。アッセイを、０．１％ＢＳＡを含むアッセイ培地ＤＭＥＭ（高グルコース）中で実施した。
【００４２】
細胞内部移行実験
実験の前日に、ＭＺ−ＣＲＣ１細胞を細胞培養培地中で６ウェルプレート（０．８５・１０６細胞／ウェル）に入れ、付着のために一晩インキュベートした。実験当日に、培地を取り除き、細胞を１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。プレートを調製のために氷上に置いた。０．９ｍＬのアッセイ培地を非特異的結合のものを除く全てのウェルに分注した。０．２ｐｍｏｌの177Ｌｕ標識した接合体（１００μＬ、アッセイ培地中２ｎＭ、約４．２ｋＢｑ）を全てのウェルに分注した。非特異的結合を測定するために、５０００倍過剰のミニガストリン（１ｎｍｏｌ、１００μＬ、アッセイ培地中１０μＬ）を、177Ｌｕ標識した接合体を含む０．８ｍＬのアッセイ培地に添加した。プレートを５％ＣＯ2中で３７℃でインキュベートして、結合及び内部移行させた。このプロセスを、３０分、６０分、１２０分及び２４０分後に上清を回収することによって停止した。細胞をＰＢＳで２回（それぞれ０．６ｍＬ）洗浄した。合した上清は、放射活性の遊離した非結合部分を表す。細胞を冷却した生理食塩水グリシン緩衝液（０．６ｍＬ、０．０５Ｍ、ｐＨ２．８）で２回室温で５分間インキュベートすることにより、膜結合活性を測定した。内部移行した画分を、ＮａＯＨでの細胞溶解を２サイクル（それぞれ０．６ｍＬ、１Ｍ、１０分、室温）実施することによって単離した。画分の放射活性を、ＣＯＢＲＡ−ＩＩガンマカウンターにより測定し、適用した合計の放射活性量のパーセンテージとして表す（ｎ＝３〜５で３回）。
【００４３】
受容体親和性−ＩＣ５０アッセイ
実験の前日に、ＭＺ−ＣＲＣ１細胞を細胞培養培地中で６ウェルプレート（０．８５・１０６細胞／ウェル）に入れ、付着のために一晩インキュベートした。実験当日に、培地を取り除き、細胞を１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄した。氷上で、０．８ｍＬのアッセイ培地及び放射標識した基準化合物177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＰＰ−Ｆ１１Ｎ（０．２ｐｍｏｌ、アッセイ培地中２ｎＭ、１００μＬ、約４．２ｋＢｑ）をそれぞれのウェルに分注した（ウェル中の最終濃度＝０．２ｎＭ）。175Ｌｕで標識した試験化合物を添加して、１０-11〜５・１０-6Ｍの最終ウェル濃度（アッセイ培地中１０-10〜５・１０-5Ｍの１００μＬの希釈系列）に達した。177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＰＰ−Ｆ１１Ｎの総結合を、試験化合物を添加せずに細胞をインキュベートすることによって確認した。プレートを４℃で１時間インキュベートした後に、上清を取り除き、細胞を１ｍＬの冷したＰＢＳで２回洗浄した。細胞溶解のために、ＮａＯＨを全てのウェルに２回添加した（０．６ｍＬ、１Ｍ、１０分、室温）。溶解させた細胞に関連する放射活性を、ＣＯＢＲＡ−ＩＩガンマカウンターで測定した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｎ＝３で３回）での正規化非線形回帰によって算出した。
【００４４】
血漿安定性
177Ｌｕで標識した化合物を０．９％ＮａＣｌで３．７５μΜの濃度に希釈し、そして窒素でフラッシュした新鮮なヒト血漿（１．５ｍＬ）中で３７℃でインキュベートした（３７５ｐｍｏｌ、１００μＬ、７．５〜１２ＭＢｑ）。異なる時点（０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間及び２４時間）でアリコート（７５μＬ）を取り、そしてタンパク質をＣＨ3ＣＮ（１００μＬ）中で沈殿させ、遠心分離した（２分、１４６８０ｒｐｍ、室温）。上清（７５μＬ）を水（７５μＬ）で希釈し、γ−ＨＰＬＣで分析した。単相減衰非線形回帰（Ａ＝Ａ０*ｅ-kT）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｎ＝２〜３）でのペプチド接合体の半減期（ｔ1/2）を算出した。
【００４５】
ＬｏｇＤ測定
放射標識したトリアゾロペプチドの親油性（ｌｏｇＤ）を、「振盪フラスコ法」によって測定した。放射標識した接合体（１０ｐｍｏｌ、１０μＬ、ＰＢＳ中１μｌ、約０．２５ＭＢｑ）をｎ−オクタノール／ＰＢＳ（１ｍＬ、ｐＨ７．４）の飽和１：１混合物に添加し、ボルテックスにより１分間激しく振盪した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）後に、双方の相の１００μＬアリコートを取り出し、放射活性をガンマカウンターで測定した（ｎ＝２で４通り）。
【００４６】
異種移植したマウスにおける体内分布研究
全ての手順は、地域の動物委員会によって承認され、動物の倫理的使用に関する国際的なガイドラインに従った。６週齢のメスのＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ドイツ）に、５ Ｍｉｏ ＭＺＣＲＣ細胞を接種した。マウスを５０〜２００ｍｍ２のサイズに達するまで２週間成長させた。実験当日に、マウスに、尾静脈を介して１００μｌのＰＢＳ（約０．５ＭＢｑ）中でそれぞれ177Ｌｕで標識した化合物１０ｐｍｏｌを注射した。マウスを、注射後４時間でＣＯ2窒息により屠殺し、臓器（血液、心臓、肺、脾臓、腎臓、膵臓、胃、腸、肝臓、筋肉、骨、腫瘍）を解剖により採取し、重量を測定し、ガンマカウンターで測定した（ｎ＝４）。ブロッキング実験のために、放射標識した化合物の注射前に、マウスに１００μｌのＰＢＳ中１００ｍｇのミニガストリン（約６００００ｐｍｏｌ、６０００倍過剰）を注射した（ｎ＝４）。組織分布データを、組織１グラムあたりの注射された活性のパーセント（％ＩＤ／ｇ）として算出し、そして統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで実施した。
【００４７】
図１は、基準としてミニガストリン誘導体ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５］−ＭＧ１１の特異的な内部移行、及び最後の６個のアミノ酸の鎖における異なる位置で組み込まれたＴｚ（１，４−二置換１，２，３−トリアゾール）を有する誘導ミニガストリンを示す。ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５、Ｔｙｒ12−（Ｔｚ）−Ｇｌｙ13］−ＭＧ１１は、１２０分後に５０％超の特異的な内部移行の値を示す。
【００４８】
図２は、基準のミニガストリン誘導体ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５］−ＭＧ１１と比較した、いわゆるトリアゾールスキャンによるその誘導型における［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１の最大半量阻害濃度ＩＣ50を示す。したがって、ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５、Ｔｙｒ12−（Ｔｚ）−Ｇｌｙ13］−ＭＧ１１は、放射標識した基準化合物ＰＰ−Ｆ１１−Ｎを置換することにおいて最高の効果を有するミニガストリン誘導体である。
【００４９】
図３は、基準のミニガストリン誘導体ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５］−ＭＧ１１と比較した、いわゆるトリアゾールスキャンによるその誘導型における［Ｎｌｅ15］−ＭＧ１１の血漿安定性を示す。ほとんどの誘導体は、基準誘導体と同様に機能する。ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５、Ｔｙｒ12−（Ｔｚ）−Ｇｌｙ13］−ＭＧ１１は、この点で安定性は低いが、それにもかかわらず、ペプチドの６０％超が少なくとも２時間超安定したままであり、広範囲の診断及び治療の適用が可能である。したがって、図１から３に表示された結果の要約の図４にも示されているように、ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５、Ｔｙｒ12−（Ｔｚ）−Ｇｌｙ13］−ＭＧ１１は、最も高い測定された特異的な内部移行及び最も低いＩＣ50値がわずかに低い血漿の半減期を補償することから、将来の診断及び治療の適用のための最良の候補であるように考えられる。
【００５０】
国際公開番号第２０１５／０６７４７３号からのミニガストリン誘導体ＰＰＦ１１Ｎと比較して、ミニガストリン誘導体ＤＯＴＡ［Ｎｌｅ１５、Ｔｙｒ12−（Ｔｚ）−Ｇｌｙ13］−ＭＧ１１は、１２０分までの範囲の時間間隔でより高い特異的な内部移行を有し、したがって、対処される受容体（例えばＧＰＣＲ）を「ブロック」する効果が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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