(57)【要約】  本発明は、被験体において、老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断する方法であって、前記被験体由来の試料において、１つまたはそれより多い選択したｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１９に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くのレベルを定量化する、請求項１の方法。
【請求項３】
老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断するための請求項１または２の方法であって、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、前記方法。
【請求項４】
老化細胞除去治療を監視するための請求項１または２の方法であって、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、前記方法。
【請求項５】
被験体において、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法。
【請求項６】
（ｉ）ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、（ｉｉ）ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、および（ｉｉｉ）表１に列挙する１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、請求項５の方法。
【請求項７】
表２に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
表３〜１５の任意の１つに列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
表２〜１５および１９〜２２の任意の１つに列挙する少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０および最大１５の異なる群由来の２つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
参照レベルが、健康な被験体の、あるいは薬理学的、食餌的またはライフスタイル干渉またはその群に供された被験体の試料における、対応する１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
レベル比較の１標準偏差より大きい相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の、被験体において、老化細胞除去治療反応を監視するための方法であって
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１、１９または２１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）ｂ）のレベルを、前記被験体由来のより早期の試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の１．５倍より大きい相違が、老化細胞除去治療に対する反応の指標である
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡレベルが、定量的またはデジタルＰＣＲ、シーケンシング、マイクロアレイ、Ｌｕｍｉｎｅｘ核酸アッセイ、または他のハイブリダイゼーションに基づく技術によって決定される、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
被験体が、年齢少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０歳であり、特に、加齢関連疾患のリスクがあるおよび／またはＳＡＳＰのリスクがある被験体である、請求項１〜１４のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
試料が血液試料、特に細胞不含血液試料である、請求項１〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
老化細胞の低下または細胞性老化の減少を検出するための、請求項１〜１６のいずれか一項の方法であって、前記ｍｉＲＮＡのレベルを、老化細胞除去剤、抗加齢剤または任意の抗加齢介入での治療の前の対応するｍｉＲＮＡのレベルと比較する、前記方法。
【請求項１８】
老化細胞によって分泌される１つまたはそれより多いタンパク質のさらなるレベルを測定し、そしてタンパク質参照レベルに比較する、請求項１〜１７のいずれか一項の方法であって、タンパク質参照レベルに比較した際の前記タンパク質レベルの相違の度合いが、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である、前記方法。
【請求項１９】
ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐを含み、そして随意に、表１９、２０および／または２１に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くをさらに含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイス。
【請求項２０】
表１９、２０および／または２１に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くを含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体において、老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、１つまたはそれより多い選択されたｍｉＲＮＡのレベルを、前記被験体由来の試料において定量化する、前記方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞性老化は細胞周期停止の安定な型であり、細胞の増殖可能性を制限する機構である。老化反応は、多様な細胞性ストレス因子に反応して、多くの細胞タイプで誘発されうる。これは、腫瘍形成に対する強力なバリアであり、そして特定の抗癌剤の細胞傷害性に寄与する。老化は、細胞自律方式で、腫瘍形成および組織損傷を制限する一方、老化細胞は、細胞非自律方式で、炎症、組織加齢および破壊を誘導可能であり、そして腫瘍形成および転移を促進しうる。
【０００３】
老化細胞は、身体機能低下に寄与し、そして老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）と称される炎症促進性分泌活性によって、複製可能性の喪失およびしたがって再生能の喪失によって、そして脱分化または分化転換を含む組織および細胞タイプ特異的機能性の喪失によって、加齢関連疾患の開始を促進する。ｐ１６プロモーターに駆動される自殺遺伝子による、または老化細胞を特異的に殺すであろう化合物による、老化細胞の除去は、マウスモデルの健康寿命に有益な効果を有し、腎不全、骨粗鬆症および他の加齢関連疾患の開始を遅延させる。
【０００４】
近年の研究は、細胞性老化を、加齢の検出可能な細胞培養モデルと見なすことから、加齢関連疾患への寄与因子および潜在的薬剤ターゲットとして受け止めるように移行してきている。今日までに、老化細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、皮膚、心臓血管系、腎臓、肝臓、免疫系、骨、白色脂肪組織および肺を含む、多様なヒト組織において、ならびにアルツハイマー病または神経膠芽腫に関連する脳において、そしてまたマウスにおいて、特に、肺、脾臓、真皮、肝臓および腸上皮において、生じることが明らかになっている。
【０００５】
こうした老化細胞が、ｐ１６プロモーターによって制御される組換え自殺遺伝子の活性化によって除去されうる、遺伝子改変されたマウスモデルにおいて、老化細胞のマーカーおよびその後の加齢関連疾患の開始が観察された（Ｂａｋｅｒら  ２００１、２０１６）。このモデル系において特に試験された加齢関連疾患の中に、腎疾患がある（Ｂａｋｅｒら  ２０１６）が、老化細胞はまた、骨粗鬆症、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症および心筋線維化にも関与する。
【０００６】
組織に集積した老化細胞のこの負の影響は、主に、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）によって引き起こされると考えられている。ＳＡＳＰは、炎症促進性因子の増加によって特徴づけられるが、正常および腫瘍細胞増殖を促進する細胞外マトリックスリモデリング因子によっても特徴づけられる。しかし、細胞はまた、負の影響も有する可能性もあり、老化細胞自体の生理変化または分化状態変化自体が、加齢プロセスに寄与する可能性もある。
【０００７】
それでもなお、老化細胞の一過性の存在は、創傷治癒、肝線維症の制限および胚発生の微調整に有益であることが見出されてきている。
老化細胞を特異的に殺す化学的化合物の検索が始まっており、そしてすでに、ケルセチン、ダサチニブ（Ｚｈｕら  ２０１５）、ナビトクラックス（Ｚｈｕら  ２０１６）、ＡＢＴ２６３（Ｃｈａｎｇら  ２０１６）およびＦＯＸＯ４阻害ペプチド（Ｂａａｒら  ２０１７）を含むいくつかのこうした化合物が同定されてきている。これらの薬理学的化合物は、加齢関連疾患の治療に、ならびにストレス誘導性細胞性老化を生じる療法、例えば化学療法の副作用を軽減するために意図される。
【０００８】
老化細胞除去（ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ）療法を開発するため、新規バイオマーカーが必要である。バイオマーカーは、特定の生物学的状態の測定可能な指標と定義され、特に疾患の存在のリスクまたは疾患の病期に関連するものである。老化細胞除去療法の背景において、バイオマーカーは、療法前に存在し、そして療法後には失われ、老化細胞の存在そして次いで非存在を反映するであろう。いくつかの意見論文は、この目的のため、循環内に分泌されうるいくつかのＳＡＳＰタンパク質の使用を主張する（Ｍａｔｊｕｓａｉｔｉｓら  ２０１６）。
【０００９】
バイオマーカーは、しばしば、コンパニオン（ＣＤｘ）または相補診断試験の形で臨床的有用性を見出す。ＣＤｘは、対応する薬剤または生物学的産物の安全でそして有効な使用のために必要とされる情報を提供する診断試験である。老化細胞除去療法の背景において、こうしたバイオマーカー（またはＣＤｘ試験）は、多様な組織における老化細胞の存在または非存在に感受性であり、そして特異的でなければならない。
【００１０】
今日まで、細胞不含（循環）ｍｉＲＮＡは、細胞性老化の潜在的なバイオマーカーとして論じられてこなかった。細胞不含血液において、ｍｉＲＮＡは、タンパク質複合体に結合するか、または細胞外小胞内にパッケージングされるかのいずれかとして同定されてきている（Ｔｕｒｃｈｉｎｏｖｉｃｈら  ２０１３）。これらはまた、癌（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら  ２００８ａ）、骨粗鬆症、変形性関節症（Ｂｅｙｅｒら  ２０１５）および心臓血管疾患（Ｚａｍｐｅｔａｋｉら  ２０１０、２０１２）を含む、いくつかの疾患の潜在的な診断または予後指標として示唆されてきている（ＳｃｈｒａｍｌおよびＧｒｉｌｌａｒｉ  ２０１２；Ｈａｃｋｌら  ２０１５）。しかし、細胞不含循環マイクロＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｖｏの老化細胞の存在または除去を検出するために使用可能であるかは不明である。
【００１１】
現在、野生型動物およびヒトにおける老化細胞除去の監視は、老化細胞の同定が組織生検などの侵襲性技術を必要とするため、困難である。これは、分析が特定の組織に局所的に限定され、他の組織で進行中である影響を潜在的に見逃すために、大きな欠点である。さらに、ヒト組織において、非老化細胞から老化細胞を特異的に区別するためのバイオマーカーの使用は、なお、議論の余地がある。したがって、老化細胞の存在を検出する、最小限に侵襲性の新規バイオマーカーおよび診断法に関する、満たされていない要求がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、被験体において、細胞性老化を診断し、そして老化関連疾患のリスクを診断する背景において、老化細胞の存在を決定し、そして老化細胞除去薬剤の有効性を監視するため、老化細胞の存在ならびに集積を検出し、そして監視するための、老化細胞除去（ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ）バイオマーカーを提供することである。
【００１３】
この目的は、本発明の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の態様において、細胞不含循環マイクロＲＮＡを用いて、被験体において、老化細胞の存在または除去を検出可能であることが示されてきている。
細胞不含生体液、例えば血清、血漿、尿および唾液中で検出可能な細胞不含（循環）ｍｉＲＮＡを用いて、老化細胞の存在、集積および除去を同定可能であり、該ｍｉＲＮＡは、老化細胞除去療法のためのコンパニオンまたは相補的診断法として、高レベルの老化細胞を持つ個体を同定し、老化細胞除去薬剤を投薬設定し、ならびに治療反応を監視するために必要であると主張する。
【００１５】
本発明は、被験体において、老化細胞を検出し、または細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視する方法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法を提供する。
【００１６】
本発明の１つの態様において、前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを測定し、そして参照レベルに比較する、ここで、レベル比較の相違の度合いが、老化細胞の存在の指標であるかまたは細胞性老化の指標である。
【００１７】
本発明はまた、被験体において、老化細胞を検出し、または細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）表１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを測定し、そして
ｃ）前記ｍｉＲＮＡのレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルと比較する、
ここで、それぞれのｍｉＲＮＡレベルを比較した際、相違の度合いは、老化細胞の存在の指標または細胞性老化の指標である
工程を含む、前記方法も含む。参照試料中のｍｉＲＮＡのレベルは参照レベルである。
【００１８】
さらなる態様において、（ｉ）ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、（ｉｉ）ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、および（ｉｉｉ）表１に列挙する１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。さらなる態様にしたがって、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐまたはその任意の組み合わせのさらなるレベルを定量化する。
【００１９】
さらなる態様において、本明細書において、被験体において、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１９に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
特定の態様において、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くのレベルを定量化する。
【００２１】
さらなる態様において、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２２】
さらにさらなる態様において、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２３】
さらなる態様にしたがって、表２に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表３に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２４】
さらなる態様にしたがって、表４に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表５に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２５】
さらなる態様にしたがって、表６に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表７に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２６】
さらなる態様にしたがって、表８に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表９に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２７】
さらなる態様にしたがって、表１０に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表１１に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２８】
さらなる態様にしたがって、表１２に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表１３に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００２９】
さらなる態様にしたがって、表１４に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
さらなる態様にしたがって、表１５に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００３０】
さらなる態様にしたがって、任意の組み合わせの、表２〜１５のいずれか１つに列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００３１】
さらなる態様にしたがって、表２〜１５および表１９〜２２の任意の１つに列挙するような少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９の異なる群由来の２つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００３２】
さらなる態様にしたがって、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、特に最大３０のｍｉＲＮＡまたはそれより多くのレベルを定量化する。
別の態様において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【００３３】
さらなる態様にしたがって、参照レベルは、健康な被験体の試料における対応するｍｉＲＮＡのレベル、または健康な被験体由来の試料のプールのｍｉＲＮＡレベル、ならびに／あるいは薬理学的、例えば老化細胞除去性、食餌的またはライフスタイル干渉の前の被験体におけるそれぞれのｍｉＲＮＡのレベル、あるいは薬理学的、食餌的またはライフスタイル干渉の前の被験体由来の試料のプールのｍｉＲＮＡレベル、あるいは試料のプールにおける前記ｍｉＲＮＡの平均レベルである。
【００３４】
さらなる態様にしたがって、レベル比較の１標準偏差より大きい相違は、老化細胞の存在の指標または細胞性老化の指標である。
さらなる態様にしたがって、本明細書において、被験体において、老化細胞除去治療反応を監視するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）ｂ）のレベルを、前記被験体由来のより早期の試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の１．５倍より大きい相違が、老化細胞除去治療に対する反応の指標である
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様にしたがって、本明細書において、被験体において、老化細胞除去治療反応を監視するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１９、２１または２２に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）ｂ）のレベルを、前記被験体由来のより早期の試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する
工程を含む、前記方法を提供する。特に、前記レベル間の１．５倍より大きい相違が、老化細胞除去治療に対する反応の指標である。
【００３６】
さらなる態様にしたがって、ｍｉＲＮＡレベルの相違は、定量的またはデジタルＰＣＲ、シーケンシング、マイクロアレイ、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく核酸アッセイ、または他のハイブリダイゼーションに基づく技術によって決定される。
【００３７】
さらなる態様にしたがって、さらに、老化細胞によって分泌される１つまたはそれより多いタンパク質のレベルを測定し、そしてタンパク質参照レベルに比較する、ここで、タンパク質参照レベルに比較した際の前記タンパク質レベルの相違の度合いが、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である。特定の態様にしたがって、それぞれのｍｉＲＮＡバイオマーカー測定値と組み合わせたタンパク質レベル比較の１標準偏差より大きい相違は、老化細胞の存在の指標であるか、または細胞性老化の指標である。
【００３８】
さらなる態様にしたがって、被験体は、年齢少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０歳であり、特に、加齢関連疾患のリスクがあるおよび／またはＳＡＳＰのリスクがある被験体である。
【００３９】
さらなる態様にしたがって、細胞不含試料は、細胞不含血液試料、特に血清または血漿試料である。
さらなる態様にしたがって、細胞不含試料は、尿または唾液試料である。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、老化細胞の低下または細胞性老化の減少を検出するための本明細書記載の方法の使用であって、前記ｍｉＲＮＡのレベルを、老化細胞除去剤、抗加齢剤または任意の抗加齢介入での治療の前の対応するｍｉＲＮＡのレベルと比較する、前記方法に関する。
【００４１】
さらなる態様にしたがって、本明細書において、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｍｉＲ−３０５８−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−６３９５、ｍｉＲ−６５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡを含み、そして随意に、表２〜１５および１９〜２２に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くをさらに含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイスを提供する。
【００４２】
さらなる態様にしたがって、本明細書において、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡを含み、そして随意に、表１９、２０および／または２１に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くをさらに含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイスを提供する。
【００４３】
さらなる態様にしたがって、本明細書において、表１９、２０および／または２１に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くを含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイスを提供する。
【００４４】
別の態様にしたがって、本明細書において、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡを含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイスを提供する。
【００４５】
別の態様にしたがって、本明細書において、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡを含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイスを提供する。
【００４６】
さらなる態様にしたがって、本明細書に記載するような方法はまた、細胞培養由来のまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した単離細胞由来の試料において、老化細胞を検出するために用いてもよい。特に、本明細書において、細胞培養由来の試料において、老化細胞を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記細胞培養から試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１または表１９に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法を提供する。
【００４７】
さらなる態様において、参照試料または参照レベルを伴う上述のようなｍｉＲＮＡのパネル、ならびにデータ規準化および解釈、特に、古典的モデルを用いた、前記被験体における老化の負荷を定量的に反映する、単一指標スコアの計算のためのソフトウェアを含む、部分のキットもまた提供する。
【００４８】
随意にソフトウェアプロトコルを用いて、本明細書に記載するような本発明の方法を実施すために設計された装置。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する方法およびバイオマーカーを用いて、老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断するための、そしてソフトウェアプロトコルを用いて設定された、装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】Ａ）実験概観。
【図１−２】Ｂ）シーケンシング結果：総読み取りおよび注釈。
【図２】主成分分析。１３すべての試料に渡って最高の変動を持つ５０のマイクロＲＮＡを分析に用いた。最初の２つの主成分が、変動の６６．７％を説明する。
【図３】老化の誘導（ｄｏｘ対ｐｂｓ）およびガンシクロビルを用いた老化のレスキュー（ｄｏｘ／ｇｃｖ対ｄｏｘ）後の示差的に制御されたｍｉＲＮＡのベン・オーバーラップ。ベン図に含有されるマイクロＲＮＡのリスト：  ｄｏｘ対ｐｂｓ：  ｍｍｕ−ｌｅｔｆ−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ１４３−３ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−９８−５ｐ、ｍｍｕ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２１５−３ｐ  ｄｏｘ／ｇｃｖ対ｄｏｘ：  ｍｍｕ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０６−３ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−３４５−３ｐ  オーバーラップゾーン：  ｍｍｕ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ
【図４−１】対照（ｐｂｓ）、ガンシクロビル（ｇｃｖ）、ドキソルビシン（ｄｏｘ）およびｄоｘ＋ｇｃｖ処置動物における、ｐ１６−３ＭＲマウス血清中の示差的に制御されたマイクロＲＮＡの規準化読み取りカウント（ＴＰＭ）のスキャッタープロット。有意差を強調する（＊）。＊ｐ＜０．０５、両側ｔ検定。
【図４−２】対照（ｐｂｓ）、ガンシクロビル（ｇｃｖ）、ドキソルビシン（ｄｏｘ）およびｄоｘ＋ｇｃｖ処置動物における、ｐ１６−３ＭＲマウス血清中の示差的に制御されたマイクロＲＮＡの規準化読み取りカウント（ＴＰＭ）のスキャッタープロット。有意差を強調する（＊）。＊ｐ＜０．０５、両側ｔ検定。
【図５−１】オスおよびメスマウス両方を含む、マウス血清試料（群あたりｎ＝８）の独立のセットにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲに基づくＮＧＳ結果の検証から得られた、規準化デルタＣｑ値（ｄＣｑ）のボックスプロット。明確にするため、２４のマイクロＲＮＡに関するデータを２つのグラフＡ）およびＢ）に分けた。事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを行って、群間の統計的に有意な変化を同定した（＊＜０．０５）。
【図５−２】オスおよびメスマウス両方を含む、マウス血清試料（群あたりｎ＝８）の独立のセットにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲに基づくＮＧＳ結果の検証から得られた、規準化デルタＣｑ値（ｄＣｑ）のボックスプロット。明確にするため、２４のマイクロＲＮＡに関するデータを２つのグラフＡ）およびＢ）に分けた。事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを行って、群間の統計的に有意な変化を同定した（＊＜０．０５）。
【図６】Ａ）細胞性老化を診断し、そしてＢ）老化細胞除去治療を監視するための、非関連マイクロＲＮＡの組み合わせ（ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５８２−５ｐ）に対する、含まれるマイクロＲＮＡの組み合わせ（ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ）の診断性能の直接比較。ＲＯＣ曲線から計算したＡＵＣ値をプロットレジェンドに示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書全体で用いるような特定の用語は、以下の意味を有する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、本明細書において、同義的に使用可能であり、そしてさらなるメンバーまたは部分または要素を許容する、開いた定義として理解されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、構成する定義の特徴のさらなる要素を伴わない、最も閉じた定義と見なされる。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はより広く、そして「からなる」定義を含有する。
【００５１】
本明細書および付随する請求項で用いる際、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、背景が明らかに別に指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。
用語「約」は、本明細書において、同じ値、または所定の値の＋／−１０％まで異なる値を指す。
【００５２】
細胞性老化は、細胞外または細胞内ストレスに対する反応として、培養中でおよびｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。老化反応は、細胞を細胞周期停止に固定し、これは損傷を受けた細胞の増殖を防止し、そして潜在的な悪性形質転換を排除する。
【００５３】
老化は、長期に起こる一連の変化を指す。参照細胞または試料または被験体（例えば、非老化であることが知られる同じタイプまたは年齢の細胞または試料）に比較して、老化細胞、試料または被験体は、以下の特徴：細胞増殖能の減少；リポフスチンの集積（例えばリポフスチン集積の増加）；ベータ−ガラクトシダーゼ活性の増加；ミトコンドリア由来活性酸素種の増加；核ＤＮＡ損傷巣の増加；テロメアの短縮；ｐ１６またはｐ２１の発現の増加あるいはその任意の組み合わせのいずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれより多くまたはすべてを示す細胞または被験体と定義されるか；あるいは細胞または被験体は、上記のものを引き起こすプロセスを示す。
【００５４】
老化細胞または被験体は、オートファジー活性の減少またはミトコンドリア膜電位の減少をさらに示す可能性もあり、あるいは上記のものを引き起こすプロセスを示す。既知の老化細胞または被験体などの細胞または被験体と比較して、非老化細胞または被験体は、細胞増殖能の増加、リポフスチン集積の減少、β−ガラクトシダーゼ活性の減少、またはその組み合わせを示しうる。ヒトの場合、約３０歳またはそれより高齢、約４０歳またはそれより高齢、約５０歳またはそれより高齢、約６０歳またはそれより高齢、約７０歳またはそれより高齢、約８０歳またはそれより高齢、約９０歳またはそれより高齢のヒトから採取した細胞または試料を、老化細胞または試料と定義してもよい。
【００５５】
用語「細胞性老化」および「老化細胞」は、したがって、分裂可能な細胞が、決定的に短いテロメア、発癌ストレスまたはＤＮＡ損傷に出会うか、あるいは強い分裂促進シグナル、例えば限定されるわけではないが、癌遺伝子または高発現される増殖促進遺伝子を経験した際に起こる、本質的に不可逆的な増殖停止、ならびに代謝的に活性であり、そしてタンパク質発現および分泌の広範囲の変化を経験し、最終的にＳＡＳＰを発展させる、潜在的に持続性の細胞である老化細胞を指す。この表現型はまた、老化伝達性（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｅｓｓａｇｉｎｇ）セクレトームとも称されてきており、これは、多くの異なるタンパク質が、静止細胞によるよりも、より豊富に分泌されていると同定されていることを意味する。これまでに、ＩＬ６、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＧＦＢＰ、またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１、２、３、１０、１２、１３）を含む＞８９のタンパク質が、ＳＡＳＰ因子として記載されてきている。
【００５６】
特に、前記タンパク質は、限定されるわけではないが、アディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、受容体チロシンキナーゼＡＸＬ、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１（ＣＣＬ１）、エオタキシン（Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１１）（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２７（ＣＣＬ２７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン８（ＣＣＬ８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ２）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、増殖制御性アルファタンパク質（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１）（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１１（ＣＸＣＬ１１）、間質細胞由来因子１（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２）（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン５（ＣＸＣＬ５）、インターロイキン８（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン８）（ＣＸＣＬ８）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー６（ＦＡＳ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、１型インターロイキン１受容体（ＩＬ１Ｒ１）、インターロイキン２受容体サブユニットアルファ（ＩＬ２ＲＡ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６受容体サブユニットベータ（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インヒビンベータＡ鎖（ＩＮＨＢＡ）、Ｋｉｔリガンド（ＫＩＴＬＧ）、レプチン（ＬＥＰ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、間質性コラゲナーゼ（ＭＭＰ１）、ストロメリシン２（ＭＭＰ１０）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、コラゲナーゼ３（ＭＭＰ１３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１４（ＭＭＰ１４）、７２ｋＤａ  ＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ２）、ストロメリシン１（ＭＭＰ３���、ヌクレオソーム集合タンパク質１様４（ＮＡＰ１Ｌ４）、ベータ−神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトール・グリカン生合成クラスＦタンパク質（ＰＩＧＦ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＴ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＵ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子表面受容体（ＰＬＡＵＲ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＳＥＲＰＩＮＢ２）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ４（ＳＴＫ４）、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ２）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ガンマ・チューブリン複合体構成要素２（ＴＵＢＧＣＰ２）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）であってもよい。
【００５７】
上に列挙するタンパク質の１つまたはそれより多くの発現速度または分泌の測定は、本明細書に記載するような方法のさらなる要素であってもよく、したがって、タンパク質発現および分泌の増加または減少は、老化細胞、細胞性老化または老化細胞除去治療に対する反応の存在に関する指標となりうる。
【００５８】
用語「老化細胞」は、特に、老化に特徴的であるマーカーまたはマーカーの組み合わせを発現する細胞を指す。こうしたマーカーには、限定されるわけではないが、ｐ１６ＩＮＫ４ａ腫瘍抑制因子タンパク質、ならびにＤＮＡ損傷反応（ＤＤＲ）マーカーのレベル、５３ＢＰ１またはガンマＨ２ＡＸのようなＤＮＡ損傷タンパク質とテロメアの共局在、ならびに細胞周期阻害剤ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ２１ＣＩＰ１、およびｐ５３の、参照、例えば非老化細胞に比較した発現増加が含まれる。ＤＥＣ１、ＤＣＲ２、およびＰＡＩ１もまた、老化バイオマーカーとして用いてもよい。１つの態様において、老化細胞は、Ｘ−Ｇａｌでの染色が、「陽性染色」とも称される青色を生じる度合いまで、ＳＡ−ベータ−Ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ）を発現する。
【００５９】
「培養ストレス」は、その天然およびｉｎ  ｖｉｖｏの同等物が不明であり、有意なテロメア浸食を伴わずに、老化停止を引き起こす。これらのストレスには、不適切な支持体、例えば組織培養プラスチック、血清（大部分の細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血漿を経験するが、血清は経験しない）、および酸化ストレス、例えば超生理的（ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｏｃａｌ）である大気Ｏ２中での培養が含まれうる。細胞はまた、増殖促進性／生存促進性キナーゼと対抗するホスファターゼである、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の喪失に際して老化する。さらに、通常は、老化増殖停止を強制するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫｉｓ）、特にｐ２１ＷＡＦ１および／またはｐ１６ＩＮＫ４ａの異所性発現は、老化を引き起こしうる。
【００６０】
本発明記載の「加齢」は、生物の発生期間に続く悪化のプロセスの組み合わせである。加齢は、一般的に、ストレスに対する適応可能性の低下、ホメオスタシス不均衡の増加、老化細胞の増加、および疾患リスクの増加によって特徴づけられる。このため、加齢の最終的な結論は死である。
【００６１】
加齢速度の加速は、限定されるわけではないが、化学的、物理的、および生物学的ストレスを含むストレス条件によって誘導されうる。例えば、加齢の加速は、ＵＶおよびＩＲ照射、薬剤および他の化学薬品、化学療法、中毒性物質、例えば、限定されるわけではないが、ＤＮＡ挿入および／または損傷剤、酸化ストレス因子等；分裂促進刺激、発癌刺激、毒性化合物、低酸素、オキシダント、カロリー制限、環境汚染物質、例えばシリカに対する曝露、職業性汚染物質、例えば塵、煙、アスベスト、または煙霧に対する曝露によって引き起こされるストレスによって誘導されうる。いくつかの態様において、被験体は喫煙経験がある。すべてのこれらのストレス要因もまた、単独でまたは組み合わされて、細胞性老化を引き起こしうる。
【００６２】
細胞性老化はまた、細胞分裂反復から生じるテロメア機能不全（テロメア・アンキャッピング）（複製性老化と称される）、ミトコンドリア変質、酸化ストレス、重度または回復不能ＤＮＡ損傷およびクロマチン破壊（遺伝毒性ストレス）、および特定の癌遺伝子の発現（癌遺伝子誘導性老化）によっても引き起こされうる。細胞性老化を引き起こすストレスは、寿命の経過中、療法的介入（例えばＸ線照射または化学療法）中、または内因性プロセス、例えば酸化呼吸および分裂促進シグナルの結果として遭遇する、外部または内部化学的および物理的傷害によって誘導されうる。外部分裂刺激シグナル、例えば、正常細胞にごく近接した腫瘍細胞による増殖関連癌遺伝子アルファ（ＧＲＯα）分泌、または循環アンギオテンシンＩＩもまた、細胞性老化を誘導することが示されてきている。分裂能を有するすべての体細胞は、老化を経験しうる。老化誘導ストレスの別個の機構に関わらず、ひとたび細胞が決定的なレベルの損傷または機能不全を感知したら、老化プログラムが活性化される。これまでに、老化増殖停止は、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐＲＢ（網膜芽細胞腫タンパク質）によって、ならびにｐ５３によって制御される、主要腫瘍抑制因子経路の活性に依存することが示されてきている。老化関連表現型の上流および下流の経路に関与する分子のいくつかが、培養中、およびｉｎ  ｖｉｖｏで、老化細胞を検出するマーカーとして用いられてきている。
【００６３】
化学療法剤の限定されない例には、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、パクリタキセル、ゲムシタビン、ポマリドミド、およびレナリドミドが含まれる。
【００６４】
本発明のいくつかの側面において、老化は、ストレスの組み合わせ、例えば２つまたはそれより多い化学的および物理的ストレス；２つまたはそれより多い化学的および生物学的ストレス；２つまたはそれより多い物理的および生物学的ストレス；化学的、物理的、および生物学的ストレスの組み合わせ等によって誘導される。
【００６５】
細胞不含血液、例えば血清または血漿中の循環マイクロＲＮＡは、最小限の侵襲性検出、およびしたがって、診療所および研究レポジトリーにおける広い適用可能性を可能にする、最小限の侵襲性または非侵襲性のバイオマーカー供給源である。
【００６６】
用語「老化細胞除去治療」は、細胞または被験体の老化細胞除去薬剤または剤への曝露を指し、これは、老化細胞の溶解を誘導し、そしてそれによって、加齢関連またはストレス誘導性疾患を遅延させるか、防止するか、軽減するか、または逆転させることも可能である。
【００６７】
老化細胞除去剤または薬剤は、老化細胞を殺すことによって、老化細胞のアポトーシスを選択的に誘導する剤である。言い換えると、老化細胞除去剤は、非老化細胞を破壊するかまたは殺す能力と比較して、生物学的、臨床的、および／または統計的に有意な方式で、老化細胞を破壊するかまたは殺す。特定の態様において、老化細胞除去剤は、老化細胞の死を誘導し（開始し、刺激し、誘発し、活性化し、促進し）、そして死を生じる（すなわち引き起こす、導く）方式で、少なくとも１つのシグナル伝達経路を改変する。老化細胞除去剤は、例えば老化細胞における細胞生存および／または炎症経路内のタンパク質と拮抗することによって、例えば、細胞生存シグナル伝達経路（例えばＡｋｔ経路）または炎症経路のいずれかまたは両方を改変しうる。老化細胞除去剤は、細胞の老化プロセス中に活性化される１つまたはそれより多い細胞経路を改変する（すなわちこれに干渉する、これに影響を及ぼす）。老化細胞除去剤は、老化細胞において、細胞生存シグナル伝達経路（例えばＡｋｔ経路）または炎症経路のいずれかを改変するか、あるいは、細胞生存シグナル伝達経路および炎症経路の両方を改変することも可能である。老化中の特定の細胞経路の活性化は、細胞がアポトーシスを誘導し、そして最終的にアポトーシスを経る能力を減少させるかまたは阻害する。
【００６８】
こうした剤は、限定されるわけではないが、小分子、ＨＳＰ９０阻害剤、抗アポトーシス因子のＢｃｌ−２ファミリーをターゲティングする剤、例えばナビトクラックスおよびＴＷ−３７、ネズミ二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤、例えばシス−イミダゾリン化合物、スピロ−オキシインドール化合物、ベンゾジアゼピン化合物、ピペリジノン化合物、トリプタミン化合物、およびＣＧＭ０９７、ならびに関連類似体であってもよい。特定の態様において、ＭＤＭ２阻害剤はまた、ＭＤＭＸ（ネズミ二重微小染色体Ｘ、ヒトにおいてはＨＤＭＸとしても知られる）に結合し、そしてその活性を阻害することも可能である。ＭＤＭ２のヒト相同体は、当該技術分野において、ＨＤＭ２（ヒト二重微小染色体２）と称される。他のプロテインキナーゼに比較して、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ、ＰｋＢ）キナーゼ阻害剤、例えばその３つのアイソフォームＡｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３を選択的に阻害する化合物。Ａｋｔ阻害剤は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）競合剤から、触媒ドメインにおけるＡｋｔアイソフォーム間の高い度合いの構造的類似性、およびＡＧＣキナーゼファミリーに対するかなりの構造的相似性を克服するために、アロステリック部位を使用した代替アプローチに発展し、特異性がより高く、副作用が減少し、そして毒性がより低い阻害剤、例えばユプロセルチブ、アフュレセルチブ、ＭＫ−２２０６、およびイパタセルチブを生じてきた。他の剤、例えばガンシクロビル（ＧＣＶ）またはＡＰ２０１８７もまた、老化細胞除去剤として作用する可能性もあり、そして本明細書に含まれる。他の態様において、老化細胞除去剤は、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片（すなわち少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドおよびポリペプチド）、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸であってもよい。特定の態様において、老化細胞除去剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはペプチドである。例えば、老化細胞除去剤、例えばポリペプチド、抗体、核酸等には、例えば、ＭＤＭ２阻害剤、ＢＣＬ−２ファミリー阻害剤、またはＡｋｔキナーゼ阻害剤が含まれる。他の態様において、本明細書に記載する小分子老化細胞除去剤のリガンドまたはターゲットタンパク質に特異的に結合するポリペプチド、ペプチド、抗体（その抗原結合断片を含む）を、小分子老化細胞除去剤の使用を特徴づけるかまたは監視するためのアッセイおよび方法において、用いてもよい。
【００６９】
用語「試料」は、一般的に、組織または臓器試料、血液、細胞不含血液、例えば血清および血漿、尿、唾液、ならびに脳脊髄液試料を指す。
用語「細胞不含」は、本明細書において、９０％またはそれより多い度合いまで、いかなる細胞も欠く試料を指す。
【００７０】
元来の試料が細胞含有試料である場合、前記試料を、当該技術分野に知られるように実行可能な細胞枯渇法に供してもよく、したがってこうした枯渇法は限定されるわけではないが、フェレーシス、遠心分離、沈降、濾過、ＦＡＣＳまたは磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）による細胞除去、クロマトグラフィ等であってもよい。
【００７１】
本明細書において、用語「血液試料」は、血清、血漿、細胞不含血液、全血およびその構成要素、血液由来産物または調製物を指す。血漿および血清は、実施例に示すように非常に有用である。特に、血液試料は、細胞不含血液試料である。
【００７２】
本明細書において、用語「被験体」または「個体」または「患者」は、温血哺乳動物、特にヒトを指すものとする。あるいは、これはまた、動物、例えばマウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、または非ヒト霊長類であってもよい。
【００７３】
用語「患者」には、予防的または療法的治療のいずれかを受けているか、あるいは細胞性老化または老化関連疾患と診断されたヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。
本明細書において、用語「被験体のプール」は、健康な個体群を指すものとし、そして前記個体から得られる試料を特に指してもよい。プールの個体の数は、多様であってもよく、すなわち、２、３、４、５、６、７またそれより多い個体を含んでもよいが、また、被験体のより大きな群、例えば限定されるわけではないが、１０、５０、１００またはそれより多い個体であってもよい。本発明の態様にしたがって、プールはまた、５００またはそれより多い個体の大きなコホートを含んでもよい。
【００７４】
本明細書において、用語「コンパニオン診断」は、対応する薬剤または医学的製品の安全でそして有効な使用に必要である、本明細書に記載するような１つまたはそれより多いバイオマーカーの分析から得られる結果を生じる診断法を指すものとする。
【００７５】
本明細書において、用語「相補的診断」は、薬剤または医学的製品の安全でそして有効な使用に関する重大な情報を提供する、本明細書に記載するような１つまたはそれより多いバイオマーカーの分析から得られる結果を生じる診断法を指すものとする。
【００７６】
したがって、本明細書記載の方法は、コンパニオン診断および相補的診断ツールとして有用である。
本明細書において、本発明は、被験体において、老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記被験体由来の試料において、表１および／または表１９に列挙するｍｉＲＮＡあるいはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを、随意に、表２〜１５に列挙するｍｉＲＮＡのいずれかと組み合わせて、定量化する工程を含む、前記方法を提供する。
【００７７】
本明細書において、用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」は、コーディングメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズし、そしてその発現を制御する、約１７〜２５ヌクレオチドの長さを有する、特に１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さを有する、非コーディングＲＮＡ分子を指す。
【００７８】
用語「ｍｉＲＮＡ分子」は、天然ｍｉＲＮＡ分子、すなわち成熟ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡを含む、ｍｉＲＮＡに相当する任意の核酸分子を指す。
「ｍｉＲ前駆体」、「プレｍｉＲＮＡ」または「プレｍｉＲ」は、ｍｉＲＮＡを含有する、ヘアピン構造を有する非コーディングＲＮＡを指す。プレｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ転写物または「プリｍｉＲ」の、Ｄｒｏｓｈａとして知られる二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＩＩＩ）による切断産物である。前駆体は、それぞれのポリヌクレオチドの成熟中に生じるため、それぞれのポリヌクレオチドの型でありうる。
【００７９】
成熟ｍｉＲＮＡおよびそのそれぞれの前駆体のヌクレオチド配列は、当該技術分野に知られ、そしてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌでデータベースｍｉＲＢａｓｅから、またはｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｆｔｐ．ｓｈｔｍｌでＳａｎｇｅｒデータベースから入手可能である。
【００８０】
本明細書に記載するような方法によって検出しようとするポリヌクレオチドの背景において、本明細書において、同一ポリヌクレオチドは、配列番号１〜９２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むかまたは該配列からなるポリヌクレオチドに比較して、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を持つか、あるいは３または２未満の単一ヌクレオチド修飾を含む、核酸配列を有してもよい。
【００８１】
さらに、本明細書に記載するような方法によって検出しようとするポリヌクレオチドの背景において、同一ポリヌクレオチドは、本明細書において、それぞれのシード配列の５’端および／または３’端の対応するプレｍｉＲＮＡ配列の１つ、２つ、３つまたはそれより多いヌクレオチドを含めて、配列番号１〜９２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むかまたは該配列からなるポリヌクレオチドに、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を持つ核酸配列を有してもよい。
【００８２】
本発明にしたがって用いられる、明記するｍｉＲＮＡのすべてはまた、そのアイソフォームおよび変異体も含む。
表１〜１５および１９〜２２に列挙する、明記するｍｉＲＮＡは、ヒト起源であるが、記載する本発明の方法に関する任意の他の供給源由来の対応するｍｉＲＮＡの使用が本明細書に含まれるものとする。したがって、典型的には、任意の起源由来のｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが含まれ、ここでｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが、明確に表１に言及される。同じことが、任意の起源であってもよい、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｍｉＲ−３０５８−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−６３９５、ｍｉＲ−６５２−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−６６３ａ、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ＭＩＲ１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐに関して読み取れる。
【００８３】
本発明の目的のため、用語、参照ｍｉＲＮＡの「アイソフォームおよび変異体」（アイソｍｉｒ（ｉｓｏｍｉｒ）ともまた称される）には、トリミング変異体（５’ダイシング部位が参照ｍｉＲＮＡ配列の上流または下流である５’トリミング変異体；３’トリミング変異体：３’ダイシング部位が参照ｍｉＲＮＡ配列の上流または下流である）、あるいは１つまたはそれより多いヌクレオチド修飾を有する変異体（参照ｍｉＲＮＡの３’端に対する３’ヌクレオチド付加；ｍｉＲＮＡ前駆体からヌクレオチドを変化させることによるヌクレオチド置換）、あるいはそのアイソフォームおよび変異体を含む相補的成熟マイクロＲＮＡ（例えば所定の５’成熟マイクロＲＮＡに関して、相補的３’成熟マイクロＲＮＡおよびその逆）が含まれる。ヌクレオチド修飾に関しては、ＲＮＡ／ＲＮＡ結合に適したヌクレオチド、すなわち５’シード領域および切断／アンカー側のヌクレオチドは、修飾から排除される。
【００８４】
以下において、別に言及しない限り、用語「ｍｉＲＮＡ」は、３ｐおよび５ｐ鎖を含み、そしてまたそのアイソフォームおよび変異体を含む。
特に、用語「ｍｉＲ−各番号−３ｐ」は、本明細書において、また、その相補的５ｐ  ｍｉＲＮＡも含み、そして逆も当てはまる。
【００８５】
特定の態様において、関心対象のｍｉＲＮＡと、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸配列を用いて、そしてハイブリダイゼーションシグナルを測定して、関心対象の前記ｍｉＲＮＡを検出する。
【００８６】
細胞不含血液、例えば血清または血漿中の循環マイクロＲＮＡは、最小限の侵襲性の検出、およびしたがって、診療所および研究レポジトリーにおける広い適用可能性を可能にする、最小限の侵襲性または非侵襲性の供給源である。これは、生検のために容易にアクセス可能ではない組織が罹患する疾患に関して、特に好適である。Ｍｉｔｃｈｅｌｌらは、同じ採血により、同じ健康な個体から収集した血清および血漿におけるｍｉＲＮＡ測定が、非常に相関することを立証した（Ｃｈｅｎら  ２００８；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら  ２００８ｂ）。しかし、ヘパリンは、ＰＣＲに基づくアッセイにおいて、酵素活性に干渉する（Ｇａｒｃｉａら  ２００２；Ｂｏｅｃｋｅｌら  ２０１３）ため、抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウムまたはフッ化ナトリウム／シュウ酸カリウム（ＮａＦ／ＫＯｘ））の選択が重要である。ヘパリン同様、クエン酸塩もまた、ｑＰＣＲに対して阻害性の影響を示し、そしてしたがって、どちらも、ｑＰＣＲによるｍｉＲＮＡ定量化には推奨されない。ヘパリンとは異なり、ＥＤＴＡはＰＣＲマスターミックスから除去可能であり、そしてしたがって、ＰＣＲに基づくｍｉＲＮＡプロファイリングに関して選択される抗凝固剤と見なされる（Ｚａｍｐｅｔａｋｉ  ＆  Ｍａｙｒ、２０１２）。抗凝固剤としてのＮａＦ／ＫＯｘの使用は、ｍｉＲＮＡ検出率の増加を生じ、そして血清またはＥＤＴＡ血液が使用不能である場合には、適切な代替物になりうる（Ｋｉｍら  ２０１２）。遠心分離の時間ならびに遠心分離速度は、血小板由来ｍｉＲＮＡの混入に影響を及ぼすため、ＥＤＴＡ血漿試料におけるｍｉＲＮＡの検出に決定的な影響を及ぼすことが示されてきている（Ｃｈｅｎｇら、２０１３）。対照的に、血清におけるｍｉＲＮＡ検出は、プレプロセシング変動に対してより感受性でないことが示された。技術水準を考慮すると、ｍｉＲＮＡ診断に関する適切な状態の選択は、過度の負荷を伴わずに、当業者によって実行されうる。
【００８７】
用語「定量化する」または「定量化」は、本明細書において、絶対定量化、すなわちそれぞれのｍｉＲＮＡ量の決定を指すが、また、それぞれのｍｉＲＮＡのレベルを測定し、そして前記レベルを参照または対照ｍｉＲＮＡと比較する工程も含む。本明細書の表に列挙するようなそれぞれのｍｉＲＮＡの定量化は、老化細胞の発現プロファイリングを可能にし、そしてしたがって、老化と関連するシグネチャーの同定、ならびに治療に対する予後および反応と関連するシグネチャーの同定も可能にする。ｍｉＲＮＡの量またはｍｉＲＮＡレベルの相違を、本明細書記載の方法のいずれによって決定してもよい。
【００８８】
特定の態様において、関心対象のｍｉＲＮＡのレベルを、次世代シーケンシングによって決定する。用語「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」は、合成によるいわゆる平行化シーケンシングまたは連結プラットホームによるシーケンシングを指し、現在、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、およびＲｏｃｈｅ等によって使用されている。次世代シーケンシング法にはまた、ナノポアシーケンシング法または電子検出に基づく方法、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されているイオントレント技術も含まれうる。
【００８９】
特に、ＮＧＳは、平行して数千から数百万のシーケンシング反応を実行する、ハイスループットシーケンシング技術を指す。異なるＮＧＳプラットホームは、多様なアッセイ化学反応を使用するが、これらはすべて、多数のテンプレート上で同時に行われる、多数のシーケンシング反応からの配列データを生成する。典型的には、配列データは、スキャナを用いて収集され、そして次いでバイオインフォマティクス的に組み立てられ、そして分析される。したがって、シーケンシング反応は、平行して実行され、読み取られ、組み立てられ、そして分析される；例えば、Ｂｅｈｊａｔｉ  ＳおよびＴａｒｐｅｙ，  Ｐ．，  ２０１３  （Ａｒｃｈ．Ｄｉ．Ｃｈｉｌｄ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒａｃｔ  Ｅｄ  ２０１３，  ９８，  ２３６−２３８）；  Ｈｅａｄ  Ｓ．ら，  ２０１５  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ５６（２），  ６１−各所）を参照されたい。
【００９０】
テンプレート増幅を必要とするＮＧＳ法もあり、そして必要としないＮＧＳ法もある。増幅を必要とする方法には、ピロシーケンシング（例えば米国特許第６，２５８，５６８号；Ｒｏｃｈｅによって市販）；  Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（例えば米国特許第号６，８３３，２４６号、第７，１１５，４００号、および第６，９６９，４８８号）；ならびに支持オリゴヌクレオチド連結および検出（ＳＯＬｉＤ）プラットホーム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；例えば米国特許第５，９１２，１４８号および第６，１３０，０７３号）が含まれる。増幅を必要としない方法、例えば一分子シーケンシング法には、ナノポアシーケンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（米国特許第号７，１６９，５６０号；第７，２８２，３３７号；第７，４８２，１２０号；第７，５０１，２４５号；第６，８１８，３９５号；第６，９１１，３４５号；および第７，５０１，２４５号）；合成によるリアルタイムシーケンシング（例えば、米国特許第７，３２９，４９２号）；ゼロモード導波（ＺＭＷ）を用いる一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシング法；ならびに、米国特許第号７，１７０，０５０号；第７，３０２，１４６号；第７，３１３，３０８号；および第７，４７６，５０３号、ＵＳ  ２０１３０２７４１４７；  ＵＳ２０１４００３８８３１；ならびにＭｅｔｚｋｅｒ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（１）：  ３１−４６  （２０１０）に記載されるものを含む他の方法が含まれる。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づく配列法または他のハイスループット法、例えばマイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、または他のシーケンシングプラットホームもまた、用いてもよい。
【００９１】
さらなる特定の態様において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、関心対象のｍｉＲＮＡのレベルを決定する。多様な態様において、核酸を増幅する。当該技術分野に知られる、任意の増幅法を用いてもよい。用いてもよい増幅技術の例には、限定されるわけではないが、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＧＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、一細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ホットスタートＰＣＲ、入れ子ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕポロニーＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、架橋ＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲが含まれる。他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自己持続性配列複製、ターゲットポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列にプライミングされるポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、恣意的にプライミングされるポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドにプライミングされるＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が含まれる。
【００９２】
本発明で有用なＰＣＲ法において、プライマーは通常、成熟ｍｉＲＮＡ分子に基づくが、ハイブリダイゼーションの振る舞いを最適化するため、化学修飾が含まれてもよい。
ｑＲＴ−ＰＣＲ法は、ｍｉＲＮＡの発現の絶対レベルを決定してもよい。あるいは、ｑＲＴ−ＰＣＲ法は、ｍｉＲＮＡの相対量を決定してもよい。ｍｉＲＮＡの相対量は、ｍｉＲＮＡのレベルを、１つまたはそれより多い内部標準核酸配列のレベル（参照ｍｉＲＮＡ値）に対して規準化することによって決定してもよい。一般的に、こうした内部標準核酸配列は、分析される血液または血清試料において、一定のレベルを有するべきである。例えば、内部標準核酸配列は、恒常的に転写されるＲＮＡ核酸配列、例えばグリセロアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）のようなｍＲＮＡ、または非コーディングＲＮＡ、例えば５Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡ、ＲＮＵ４８、ＲＮＵ４４、およびＲＮＵ６であってもよい。さらに、ＲＮＡ単離またはｃＤＮＡ合成中に等モル量で添加される合成ＲＮＡ配列を、特定のｍｉＲＮＡの相対量に関する参照として用いてもよい。
【００９３】
本発明で有用なリアルタイムＰＣＲ定量化法の概観は、Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎら，  ２００８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｊａｎｕａｒｙ；  ４４（１）：  ３１−３８によって提供される。
【００９４】
ｍｉＲＮＡ検出のためのプライマーは、例えばＥｘｉｑｏｎからマイクロＲＮＡ  ＬＮＡＴＭ  ＰＣＲプライマーセットとして、商業的に入手可能である。
ｍｉＲＮＡは比較的短い分子であるため、例えばＷＯ２０１１１４４７６Ａに示唆されるように、逆転写および増幅前に、鎖にアデノシン単量体を付加すること（ポリアデニル化として知られる技術）によって、これらを長くすることが有用でありうる。簡潔には、適切な試薬（例えばＴｒｉｚｏｌ試薬）によって、試料からＲＮＡを抽出し、ＡＴＰおよびポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でポリアデニル化し、ポリ（Ｔ）アダプターおよび５’ＲＡＣＥ配列を用いて、ｃＤＮＡに逆転写し、そしてｍｉＲＮＡの３’端由来の順方向プライマーおよび逆方向ＲＡＣＥプライマーを用いて増幅してもよい。この技術の改善には、３’端でヌクレオチド（ポリＡ配列上のいずれかへのプライミングを排除し、そしてｍｉＲＮＡ配列上でのプライミングを強制するため、Ａ、Ｃ、またはＧからなるが、Ｔからならない）を含むＲＡＣＥプライマー、あるいは化学的修飾を伴いまたは伴わずに、２つ、３つ、４つまたはそれより多いヌクレオチドを用いた、特定のマイクロＲＮＡの３’ｃＤＮＡ端に係留されるＲＡＣＥプライマーの設計が含まれる。
【００９５】
ｍｉＲＮＡの検出はまた、ディープシーケンシング法、ビーズに基づく定量化、例えばＩｌｌｕｍｉｎａビーズアレイ、ヒドロゲル粒子に基づく定量化、例えばマイクロアレイ技術によるＦｉｒｅｆｌｙＴＭ、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能なＮｃｏｄｅＴＭヒトｍｉＲＮＡアレイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔより入手可能なチップアレイ、あるいは例えばＥｘｉｑｏｎのＬＮＡ主鎖捕捉プローブを使用するマイクロアレイ（ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡＴＭアレイ）によるような、ＷＯ２０１１１４７６Ａに記載されるものなどの、当該技術分野に知られる他の方法によって達成されてもよい。
【００９６】
ｍｉＲＮＡレベルの相違はまた、多重化学発光に基づく核酸アッセイ、例えばＰａｎｏｍｉｃｓ、またはマイクロＲＮＡ相補的制御部位を含むレポータータンパク質を含有するレポータープラスミドアッセイ（「バイオセンサー」）、または当該技術分野に知られる他のハイブリダイゼーションに基づく技術を用いて、決定されてもよい。
【００９７】
バイオマーカーは、一般的に、体液、例えば血液、または組織中に見られる、正常なまたは異常なプロセスの、あるいは状態または疾患の徴候である、生物学的分子と定義される。バイオマーカーの臨床的有用性は、特に、しばしば、健康、疾患および治療被験体の群を含む、２つまたはそれより多い群を区別する能力に依存する。いくつかの方法、もっとも一般的には、分散分析（ＡＮＯＶＡ）または受信者動作特性分析（ＲＯＣ）を用いて、バイオマーカーが２つまたはそれより多い群を区別する能力を評価してもよい。ＡＮＯＶＡは、各群が少なくとも３つの独立の複製物からなる場合、３つまたはそれより多い群間のバイオマーカーレベルにおける相違の統計的な有意味性を評価する。＜０．２０のｐ値は、群間のバイオマーカーレベルにおける推定上の相違を示す傾向と見なされうる。＜０．０５のｐ値は、群間のバイオマーカーレベルにおける有意な変化を示すと一般的に見なされる。ＲＯＣ分析は、２つの特定の群、例えば健康および疾患、または疾患および治療の相違に関して、バイオマーカーレベルの感度および特異度を調べるために実行され、ここで、感度は、疾患を有する被験体において、陽性試験結果を得る確率を意味し、そして特異度は、疾患を持たない被験体において、陰性試験結果を得る確率を意味する。ＲＯＣ曲線は、陽性試験結果に関する連続して増加する閾値に関連する、バイオマーカー試験の感度および特異度の間の関連を示す。バイオマーカーの識別力は、このＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）によって定義され、ここで、ＡＵＣ＜０．６は低い、０．６〜０．７の範囲は中程度の、０．７〜０．８の範囲は優れた、そして＞０．８は非常に優れた識別力を示す。さらに、０．５のＡＵＣ値は、ランダムな分類力を示し、一方、１．０の面積は、いかなる誤りも伴わない、完全な分類を示す。
【００９８】
「対照」、「対照試料」または「参照値」または「参照レベル」は、本明細書において交換可能に使用可能な用語であり、そして実験試料との比較のために用いる試料または標準と理解されるものとする。対照には、健康な被験体、あるいは老化のリスクにないかもしくは老化に苦しんでいないか、または老化を誘導するストレス条件に曝露されていないか、または老化細胞除去剤での治療に曝露されている被験体から得た試料が含まれてもよい。参照レベルは、特に、健康な被験体由来の、老化のリスクにないかもしくは老化に苦しんでいないか、または老化を誘導するストレス条件に曝露されていない被験体由来の試料において定量化されたｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ発現レベルを指すか、あるいは老化細胞除去治療監視の場合、前記レベルはまた、老化細胞除去治療開始前の、または老化細胞除去治療の経過中の被験体の試料から得られていてもよい。
【００９９】
特に、より早い時点の被験体の試料と比較した、老化細胞除去治療中のまたは治療後の同じ被験体の試料から得た、本明細書に定義するような１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベル間の１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０倍より大きい相違（個体内比較または個体内相違）は、老化細胞除去治療に対する反応の指標である。
【０１００】
さらに、対照はまた、標準参照値または値の範囲、すなわち、例えば、試料中で安定に発現されるｍｉＲＮＡ、例えば内因性対照Ｕ６  ｓｎＲＮＡであってもよい。
参照レベルはまた、健康な被験体および／または薬理学的、食餌的またはライフスタイル介入前の被験体の試料における、対応するｍｉＲＮＡの平均レベルとして決定されてもよい。あるいは、やはり、１またはそれより多い被験体由来の試料プール、あるいは文献中に開示される参照を用いてもよい。
【０１０１】
該態様にしたがって、レベル比較の１より大きい標準偏差の相違は、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である。
特定の態様において、本明細書に記載するｍｉＲＮＡレベルの測定値に加えて、老化細胞によって分泌される１つまたはそれより多いタンパク質のレベルを測定し、そしてタンパク質参照レベルに比較し、ここで、タンパク質参照レベルおよびＲＮＡ参照レベルに比較した際のタンパク質およびｍｉＲＮＡレベルの相違の度合いは、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である。
【０１０２】
本明細書記載の方法によって定量化すべきｍｉＲＮＡを以下の表１に列挙する：
表１：
【０１０３】
【表１】
2020525050.tif 000002
【０１０４】
本明細書記載の方法によって定量化すべきｍｉＲＮＡを、以下の表１９に列挙する。特に、表１９のｍｉＲＮＡの発現レベルは、老化に相関し、そして試料において、老化細胞を検出するか、または老化もしくはストレス誘導性老化を決定するために有意であり、そして／または老化細胞除去治療に相関し、そして試料における老化細胞除去治療の成功を監視するために有意である。
【０１０５】
表１９：
【０１０６】
【表２】
2020525050.tif 000003
【０１０７】
本明細書記載の方法によって定量化すべきｍｉＲＮＡを、以下の表２０に列挙する。特に、表２０のｍｉＲＮＡの発現レベルは、老化に有意に相関し、そして試料において、老化細胞を検出するか、あるいは老化またはストレス誘導性老化を決定するために有用である。
【０１０８】
表２０：
【０１０９】
【表３】
2020525050.tif 000004
【０１１０】
本明細書記載の方法によって定量化すべきｍｉＲＮＡを、以下の表２１に列挙する。特に、表２１のｍｉＲＮＡの発現レベルは、老化細胞除去治療に有意に相関し、そして試料において、老化細胞除去療法の成功を監視するために有用である。
【０１１１】
表２１
【０１１２】
【表４】
2020525050.tif 000005
【０１１３】
本明細書記載の方法によって定量化すべき老化ｍｉＲＮＡの選択した識別子のパネルを、以下の表２２に列挙する。識別子は、その発現が、老化と、そして老化細胞除去治療の成功と相関するｍｉＲＮＡを含む。
【０１１４】
表２２
【０１１５】
【表５】
2020525050.tif 000006
【０１１６】
特定の態様にしたがって、（ｉ）ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、（ｉｉ）ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、および（ｉｉｉ）表１に列挙する１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【０１１７】
さらなる態様にしたがって、以下の表２に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表２
【０１１８】
【表６】
2020525050.tif 000007
【０１１９】
さらなる態様にしたがって、以下の表３に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表３
【０１２０】
【表７】
2020525050.tif 000008
【０１２１】
さらなる態様にしたがって、以下の表４に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表４
【０１２２】
【表８】
2020525050.tif 000009
【０１２３】
さらなる態様にしたがって、以下の表５に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表５
【０１２４】
【表９】
2020525050.tif 000010
【０１２５】
さらなる態様にしたがって、以下の表６に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表６
【０１２６】
【表１０】
2020525050.tif 000011
【０１２７】
さらなる態様にしたがって、以下の表７に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表７
【０１２８】
【表１１】
2020525050.tif 000012
【０１２９】
さらなる態様にしたがって、以下の表８に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表８
【０１３０】
【表１２】
2020525050.tif 000013
【０１３１】
さらなる態様にしたがって、以下の表９に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表９
【０１３２】
【表１３】
2020525050.tif 000014
【０１３３】
さらなる態様にしたがって、以下の表１０に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表１０
【０１３４】
【表１４】
2020525050.tif 000015
【０１３５】
さらなる態様にしたがって、以下の表１１に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表１１
【０１３６】
【表１５】
2020525050.tif 000016
【０１３７】
さらなる態様にしたがって、以下の表１２に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表１２
【０１３８】
【表１６】
2020525050.tif 000017
【０１３９】
さらなる態様にしたがって、以下の表１３に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表１３
【０１４０】
【表１７】
2020525050.tif 000018
【０１４１】
さらなる態様にしたがって、以下の表１４に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表１４
【０１４２】
【表１８】
2020525050.tif 000019
【０１４３】
さらなる態様にしたがって、以下の表１５に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
表１５
【０１４４】
【表１９】
2020525050.tif 000020
【０１４５】
特定の態様にしたがって、表1由来の１つまたはそれより多くのｍｉＲＮＡのレベルを、表２〜１５のいずれか由来の１つまたはそれより多い異なるｍｉＲＮＡと組み合わせて定量化する。
【０１４６】
特に、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐおよび／またはｍｉＲ−２７ａ−３ｐのレベルを、表２〜１５由来の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、またはｍｉＲ−３７６ａと組み合わせて定量化する。
【０１４７】
特に、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−７６６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−４２４−５ｐのレベルを、表２〜１５のいずれか由来の１つまたはそれより多い異なるｍｉＲＮＡと組み合わせて定量化する。
【０１４８】
さらなる特定の態様にしたがって、表１または表１９由来の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを、表２〜１５および表１９〜２２のいずれか１つに列挙する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８の異なる群由来の２つまたはそれより多いｍｉＲＮＡと組み合わせて定量化する。
【０１４９】
特に、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐおよび／またはｍｉＲ−２７ａ−３ｐのレベルを、表２〜１５のいずれか１つに列挙する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３または１４の異なるｍｉＲＮＡ由来の２つまたはそれより多いｍｉＲＮＡと組み合わせて定量化する。
【０１５０】
特に、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐを、本明細書記載の方法にしたがって定量化する。特に、ｌｅｔ−７ａ−５ｐを、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐを、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−３４５−５ｐを、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−４２３−３ｐを、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐを、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、およびｍｉＲ−４２３−３ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。前記ｍｉＲＮＡはまた、表２０または２１のｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くと組み合わせて定量化されてもよい。
【０１５１】
特に、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐを、本明細書記載の方法にしたがって定量化する。特に、ｌｅｔ−７ａ−５ｐを、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐを、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１５１−５ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１５５−５ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−３４５−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−３４５−５ｐを、ｌｅｔ  ７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５��−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてと組み合わせて定量化する。前記ｍｉＲＮＡはまた、表２１または２２のｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くと組み合わせて定量化されてもよい。
【０１５２】
特に、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐを、本明細書記載の方法にしたがって定量化する。特に、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐを、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−２４−３ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−４２３−３ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１８３−３ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−２１５−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−３１−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−３７５−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−４０９−３ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−４８３−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。特に、ｍｉＲ−１５０−５ｐを、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−４８３−５ｐの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、またはすべてと組み合わせて定量化する。前記ｍｉＲＮＡはまた、表２０または２２のｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くと組み合わせて定量化されてもよい。
【０１５３】
特に、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する。
【０１５４】
本発明は、診断シグネチャーまたは発現パターンを示すｍｉＲＮＡセットを提供し、診断シグネチャーまたは発現パターンの両方は、特に、限定されるわけではないが、線維芽細胞、内皮細胞、腎臓上皮細胞、肝細胞、神経細胞、皮膚細胞、肺上皮細胞、または結腸上皮細胞を含む、多様な細胞タイプの広い範囲に亘るの老化に適用可能である。特に、若い被験体または老化を誘導するストレス条件に曝露されていない被験体、および高齢被験体または老化を誘導するストレス条件に曝露されている被験体の血液または血清において、示差的に制御されているｍｉＲＮＡの検出は、初期診断、長期予後、および細胞性老化を伴う患者のスクリーニングに、より高い有意性を有する、診断および予測ツールを提供する。本明細書に記載するような方法はまた、老化細胞除去剤での治療を監視するための診断ツールも提供する。
【０１５５】
被験体において、老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断する方法を、特に、被験体において、老化関連疾患を診断するかまたは老化関連疾患のリスクを診断する背景において、老化細胞の存在を決定するために用いてもよい。
【０１５６】
老化細胞関連状態は、限定されるわけではないが、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、鬱血性心不全、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、頸動脈疾患、心内膜炎、冠動脈血栓症、頸動脈血栓症、心筋梗塞（ＭＩ）、血圧上昇／高血圧、大動脈瘤、脳動脈瘤、心筋線維化、心臓拡張期機能不全、高コレステロール血症／高脂血症、僧帽弁逸脱、末梢血管疾患、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、心臓ストレス耐性、および脳卒中を含む、心臓血管状態であってもよい。
【０１５７】
老化細胞関連状態は、神経学的状態であってもよい。神経学的状態には、限定されるわけではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、球麻痺、仮性球麻痺、原発性側索硬化症、運動ニューロン機能不全（ＭＮＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ハンチントン病、眼疾患、黄斑変性症（湿性および乾性）、緑内障、視力喪失、老視、白内障、進行性筋萎縮症、下位運動ニューロン疾患、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、ウェルドニッヒ・ホフマン病（ＳＭＡ１）、ＳＭＡ２、クーベルベルク・ヴェランダー病（ＳＭ３）、ケネディ病、ポリオ後症候群、遺伝性痙性対麻痺、加齢性記憶減退、ならびに抑鬱および気分障害が含まれる。
【０１５８】
老化細胞関連状態は、炎症性状態であってもよい。炎症性状態には、限定されるわけではないが、筋骨格疾患、変形性関節症、骨粗鬆症、筋肉減少症、ループス、間質性膀胱炎、強皮症、脱毛症、口腔粘膜炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、円背、椎間板ヘルニア、潰瘍性結腸炎、クローン病、潰瘍性喘息、移植後腎線維症を含む腎線維症、肝線維症、膵線維症、心筋線維化、糖尿病関連創傷治癒を含む皮膚創傷治癒、および口腔粘膜下線維症が含まれる。
【０１５９】
老化細胞関連状態は、黄斑変性症、乾性（非血管新生）または湿性（血管新生）黄斑変性症であってもよい。
老化細胞関連状態は、肺状態であってもよい。肺状態には、限定されるわけではないが、特発性肺線維症（ＴＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺気腫、肺機能の加齢性喪失、および加齢性睡眠時無呼吸が含まれる。
【０１６０】
老化細胞関連状態は、皮膚科学的状態であってもよい。皮膚科学的状態には、限定されるわけではないが、乾癬、湿疹、皺（ｒｈｙｔｉｄｅｓ）、掻痒症、異常感覚、丘疹鱗屑性障害、紅皮症、扁平苔癬、苔癬様皮膚病、アトピー性皮膚炎、湿疹性発疹、好酸球性皮膚病、発疹、光線感受性および光老化関連疾患および障害、反応性好中球性皮膚病、天疱瘡、類天疱瘡、免疫水疱性皮膚病、皮膚の線維組織球性（ｆｉｂｒｏｈｉｓｔｏｃｙｔｉｃ）増殖、皮膚母斑、蕁麻疹、色素増加症、皮膚リンパ腫、乾癬、および皮膚エリテマトーデスが含まれる。
【０１６１】
本発明の態様はまた、移植臓器機能を予測するかまたは臓器移植の失敗を予測するための、本明細書に記載する方法の使用も含む。
本発明の方法を単一の測定として実行してもよいが、また、反復決定によって実行してもよい。
【０１６２】
また、本明細書記載の方法を、老化細胞減退または細胞性老化減少を検出するために用いてもよく、ここで、前記ｍｉＲＮＡのレベルを、老化細胞除去剤での治療、抗加齢剤または任意の抗加齢介入の前の対応するｍｉＲＮＡのレベルと比較する。具体的には、シグネチャーは、例えば老化細胞除去剤、抗加齢剤（例えばラパマイシン、スペルミジン、メトフォルミン）、または食餌、運動等の任意の他の抗加齢介入の使用中の、老化細胞除去の指標となりうる。このシグネチャーはまた、任意の老化細胞除去介入から利益を受けるであろう被験体を同定するためにも使用可能である。
【０１６３】
特に、方法は、特に老化細胞除去治療に対する被験体の反応を測定するために、被験体を監視するために有用である。したがって、発現シグネチャーをまた、効率的な薬剤用量の指標として用いてもよい（例えば、任意のタイプの介入の発展中に、あるいは個別化治療オプションまたは投薬の同定に関する、用量決定）。
【０１６４】
本明細書記載の方法を、療法および治療の成功を監視するか、または老化誘導剤（酸化ストレス要因、ＤＮＡ損傷剤等を含む、中毒性物質）に対する曝露を監視するために用いてもよい。
【０１６５】
本明細書に含む表記載のｍｉＲＮＡのシグネチャーは、例えば、加齢、加齢関連疾患、早老性症候群、化学療法中、中毒、または老化細胞の量を増加させる任意の他の治療／事故において、任意の哺乳動物種において、老化細胞の存在を示しうる。
【０１６６】
さらなる項目が本明細書に含まれる：
１．  被験体において、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法。
【０１６７】
２．  （ｉ）ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、（ｉｉ）ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、および（ｉｉｉ）表１に列挙する１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、項目１の方法。
【０１６８】
３．  被験体において、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１９に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）随意に、ｂ）のレベルを、参照試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である
工程を含む、前記方法。
【０１６９】
４．  ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、およびｍｉＲ−１２５ａ−５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くのレベルを定量化する、項目３の方法。
【０１７０】
５．  老化細胞を検出するかまたは細胞性老化を診断するための項目３または４の方法であって、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、前記方法。
【０１７１】
６．  老化細胞除去治療を監視するための項目３または４の方法であって、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、前記方法。
【０１７２】
７．  表２に列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、項目１〜６のいずれか一項の方法。
８．  表３〜１５の任意の１つに列挙するｍｉＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれより多いさらなるｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、項目１〜７のいずれか一項の方法。
【０１７３】
９．  表２〜１５および１９〜２２の任意の１つに列挙する少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０および最大１５の異なる群由来の２つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、項目１〜８のいずれか一項の方法。
【０１７４】
１０．  ２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化する、項目１〜９のいずれか一項の方法。
【０１７５】
１１．  参照レベルが、健康な被験体の、あるいは薬理学的、食餌的またはライフスタイル干渉またはその群に供された被験体の試料における対応する１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルである、項目１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【０１７６】
１２．  レベル比較の１標準偏差より大きい相違が、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である、項目１〜１１のいずれか一項記載の方法。
１３．  項目１〜１１のいずれか一項記載の、被験体において、老化細胞除去治療反応を監視するための方法であって
ａ）前記被験体から細胞不含試料を提供し、
ｂ）前記試料における、表１、１９または２１に列挙するｍｉＲＮＡまたはそのアイソフォームからなる群より選択される１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡのレベルを定量化し、そして
ｃ）ｂ）のレベルを、前記被験体由来のより早期の試料中の前記の１つまたはそれより多いｍｉＲＮＡの参照レベルと比較する、ここで前記レベル間の１．５倍より大きい相違が、老化細胞除去治療に対する反応の指標である
工程を含む、前記方法。
【０１７７】
１４．  ｍｉＲＮＡレベルが、定量的またはデジタルＰＣＲ、シーケンシング、マイクロアレイ、Ｌｕｍｉｎｅｘ核酸アッセイ、または他のハイブリダイゼーションに基づく技術によって決定される、項目１〜１３のいずれか一項の方法。
【０１７８】
１５．  被験体が、年齢少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０歳であり、特に、加齢関連疾患のリスクがあるおよび／またはＳＡＳＰのリスクがある被験体である、項目１〜１４のいずれか一項の方法。
【０１７９】
１６．  試料が血液試料、特に細胞不含血液試料である、項目１〜１５のいずれか一項の方法。
１７．  老化細胞の低下または細胞性老化の減少を検出するための、項目１〜１６のいずれか一項の方法であって、前記ｍｉＲＮＡのレベルを、老化細胞除去剤、抗加齢剤または任意の抗加齢介入での治療の前の対応するｍｉＲＮＡのレベルと比較する、前記方法。
【０１８０】
１８．  老化細胞によって分泌される１つまたはそれより多いタンパク質のさらなるレベルをさらに測定し、そしてタンパク質参照レベルに比較する、項目１〜１７のいずれか一項の方法であって、タンパク質参照レベルに比較した際の前記タンパク質レベルの相違の度合いが、老化細胞または細胞性老化の存在の指標である、前記方法。
【０１８１】
１９．  ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐを含み、そして随意に、表１９、２０および／または２１に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くをさらに含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイス。
【０１８２】
２０．  表１９、２０および／または２１に列挙するｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くを含む、老化細胞を検出し、細胞性老化を診断し、そして／または老化細胞除去治療の成功を監視するための、ｍｉＲＮＡのパネルを含む、診断デバイス。
【０１８３】
以下の実施例は、本発明の理解を補助するために示されるが、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するとは意図されず、そしてそのように見なしてはならない。実施例には、慣用法の詳細な説明は含まれない。こうした方法は、一般の当業者には周知である。
【実施例】
【０１８４】
本発明者らは、ＳＡＳＰの一部として分泌ｍｉＲＮＡを同定し、そしてしたがって、細胞不含血液由来の循環ｍｉＲＮＡが、老化細胞除去の非侵襲性の特異的バイオマーカーの基礎となりうると仮定した。こうしたバイオマーカーを同定するため、本発明者らは、ｐ１６−３ＭＲマウス（Ｄｅｍａｒｉａら，  ２０１４，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ３１：７２２−７３３）を用い、老化ならびに老化細胞除去を誘導し、そして次世代シーケンシング（実施例１を参照されたい）ならびに逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ、実施例２を参照されたい）分析のため、血清から小分子ＲＮＡを単離した。
【０１８５】
実際、本発明者らは、老化細胞の誘導およびそれに続く除去後に、示差的に循環するものとして、マウスおよびヒト細胞性老化において上方制御されることが周知である、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐを含めて、いくつかのｍｉＲＮＡを同定した。
【０１８６】
本発明者らのデータは、循環ｍｉＲＮＡが、老化細胞の存在レベルを概算し、老化細胞殺傷を監視するための価値あるツールであり、そしてしたがって、診療所に対して、老化細胞除去物質の解釈のための不可欠のツールになりうることを示唆する。さらに、これらのｍｉＲＮＡは、ＳＡＳＰ因子が不活性化される必要がある場合は常に、療法ターゲットとして使用されうる。
【０１８７】
実施例１
１．  材料および方法
１．１．  マウス研究および血清試料採取
ｐ１６−３ＭＲ（Ｄｅｍａｒｉａら，  ２０１４，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ３１：７２２−７３３）マウスを社内で育種し、そしてＡＡＬＡＣ公認のＢｕｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ（カリフォルニア州ノバート）動物施設で維持した。１０〜１２週齢のｐ１６−３ＭＲオスマウスを実験に用いた。マウスを４群に分け、そして各群は３匹の動物からなった。群Ａでは、対照マウスにＰＢＳを注射した。群Ｂでは、マウスを、ＰＢＳ中に溶解したガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で連続５日間処置した。群Ｃでは、マウスを、ＰＢＳ中に溶解した１用量のドキソルビシン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置した。群Ｄでは、マウスをまず、ドキソルビシンで処置し、そして次いで、１０日後、ＧＣＶで処置した。マウスに、１用量の１０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン塩酸塩を腹腔内注射し、そしてＧＣＶを、ＰＢＳ中、２５ｍｇ／ｋｇの濃度で、連続５日間、腹腔内注射によって毎日投与した。最後のＧＣＶ投与の４日後、動物をＣＯ２で安楽死させ、そして直ちに血液を抜き取った。次いで、血液を室温で３０分間インキュベーションし、そして３４００ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さずに、血清を注意深く無菌チューブに収集し、そしてさらなる実験のため、−８０℃で保存した。
【０１８８】
１．２．  次世代シーケンシング
Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、２００μｌの血清から、総ＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡ収集物（ｙｉｅｌｄ）を、スパイクインのｑＰＣＲ増幅ならびに溶血反応性ＲＮＡ（Ｂｌｏｎｄａｌら）に基づいて、均一抽出効率および溶血に関して品質チェックした。総量２μｌにおいて、アダプター自己連結を防止するため、化学的に修飾されたアダプターを用いる、ＣｌｅａｎＴａｇライブラリー調製プロトコル（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、ライブラリー調製のため、総ＲＮＡを用いた。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ−１０００チップを用いて、ライブラリー品質および収量を調節した。高純度であったため、５０ｂｐ単一端読み取りでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００上でのシーケンシングの前に、ライブラリーを精製しなかった。
【０１８９】
１．３．  バイオインフォマティクス
Ｅｘｉｑｏｎ（デンマーク）で、次世代シーケンシングを行った。生の読み取りを、３０またはそれより高いＱ−スコアに関して品質フィルタリングした。アダプター配列をトリミングし、そして残りの読み取りをマウスゲノム、ｍｉＲＢａｓｅ、非コーディングＲＮＡデータベースに対してマッピングし、そしてマイクロＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、ゲノムマッピングＲＮＡまたはアウトマッピングＲＮＡ配列のいずれかとして分類した。読み取りカウントをすべてのマイクロＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）に関して付加し、そしてマイクロＲＮＡ読み取りカウントを、マッピングされた読み取りの総数で割り、そして１００万を乗じることによって規準化した（１００万あたりのタグ）。ウェブツール、ｃｌｕｓｔｖｉｓ（ＭｅｔｓａｌｕおよびＶｉｌｏ  ２０１５）を用いて、１００万あたりのタグをデータマイニング（ＰＣＡおよび階層的クラスタリング）に用いた。
【０１９０】
示差発現分析のため、ＥｄｇｅＲ統計ソフトウェアパッケージを用いた。規準化のため、試料間の発現レベルにおいて、対数倍率および絶対遺伝子関連変化に基づいて、Ｍ値法のトリミング平均を用いた（ＴＭＭ規準化）。この規準化は、主に、試料特異的影響（一般的に、試料間のシーケンシング深度の変動によって引き起こされる）を補償する。さらに、規準化工程は、マイクロＲＮＡの大部分に渡って、試料間の対数倍率変化を最小限にするスケーリング要因を同定することによって、低試料採取効果（読み取りセットを支配する高発現マイクロＲＮＡによる）を相殺する。＜０．０５のｐ値を持つマイクロＲＮＡを、有意に制御されていると見なした。
【０１９１】
２．  結果
２．１．  特徴づけ
老化細胞の誘導または除去後の、示差的な循環ＲＮＡを同定するため、実験概観に概略するように、動物を処置し、そして最後の処置の４日後に血清を試料採取した（図１Ａ）。
【０１９２】
発現分析のため、全マイクロＲＮＡ読み取りカウント（すべてのｉｓｏｍｉＲの総計）を、ライブラリーあたりの総マッピング読み取りに対して規準化した（「１００万あたりのタグ、ＴＰＭ」）。本発明者らは、１３の試料の各々において、１またはそれより多いＴＰＭで、１７９のｍｉＲＮＡを同定し、このうち９４は、１３の試料各々において、少なくとも１０  ＴＰＭで存在した。これらの９４のｍｉＲＮＡをさらなる分析に含めた。
【０１９３】
２．２．  循環ｍｉＲＮＡが群間を区別する
説明的データ分析のため、本発明者らは、変動係数にしたがって、５０の最も可変性であるマイクロＲＮＡのデータセットに対して、主成分分析（ＰＣＡ）を適用した。ＰＣＡプロットは、ＰＢＳ処置対照動物に比較して、ｐ１６−３ＭＲマウスにおいて、循環マイクロＲＮＡレベルに対するドキシサイクリン（ｄｏｘ）処置の影響を明らかに示す（図２）。これは、循環ｍｉＲＮＡレベルが、ドキシサイクリン処置を用いた老化の誘導に際して、有意に変化することを示す。示差的な循環ｍｉＲＮＡの分析は、老化の誘導によって調節されるｍｉＲＮＡを同定するために、ｄｏｘ処置対対照（ＰＢＳ）の間の変化に、ならびに老化細胞の除去後に変化するｍｉＲＮＡを同定するために、ｄｏｘ−ＧＣＶ対ｄｏｘの間の変化に焦点を当てた。多重試験のため、補正なしに、＜０．０５のｐ値閾値を用いた。それによって、本発明者らは、ｄｏｘ対対照に関して、１０の有意に制御されたｍｉＲＮＡを（表１７）、そしてｄｏｘ−ＧＣＶ対Ｄｏｘに関して、３つのｍｉＲＮＡを（表１８）同定し、１つのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが、ベン図によって視覚化されるように、重複と示された（図３ＡおよびＢ）。単一の示差的に発現されるｍｉＲＮＡ各々の血清レベルを、１００万あたりのタグとして、図４に示す。興味深いことに、ガンシクロビル処置（ＧＣＶ）は、ＰＢＳ処置動物に比較して、血清ｍｉＲＮＡの一貫した減少を生じた。ＧＣＶ処置動物は、強制されたアポトーシスのため、ＰＢＳに比較して、老化細胞の数が減少していると仮定される。ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐおよびｍｉＲ−３４５−３ｐの場合、ｄоｘ処置動物におけるレベルは、ＰＢＳ対照に比較してより高いが、ｄоｘ＋ＧＣＶでのレスキュー後には減少している。結果を図２、主成分分析に示す。１３すべての試料に渡って、最も高い変動を有する５０のマイクロＲＮＡを分析に用いた。最初の２つの主成分が、変動の６６．７％を説明する。
【０１９４】
表１６：老化活性化剤での処置後、示差的に分泌されるマイクロＲＮＡ（ｄоｘ対ｐｂｓ）
【０１９５】
【表２０】
2020525050.tif 000021
【０１９６】
表１７：老化活性化剤のレスキュー後、示差的に分泌されるマイクロＲＮＡ（ｄоｘ＋ｇｃｖ対ｇｃｖ）
【０１９７】
【表２１】
2020525050.tif 000022
【０１９８】
これらのデータは、これらの１２のｍｉＲＮＡの循環レベルが、老化細胞殺傷のシグネチャーと見なされうることを示唆する。
これらの知見を、潜在的なさらなるｍｉＲＮＡに拡張するため、本発明者らは、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐおよびｍｉＲ−２７ａ−３ｐに対するピアソン相関を行い、さらなる潜在的なバイオマーカーを生じた（表１８）。
【０１９９】
表１８−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐおよびｍｉＲ−２７ａに対する高いピアソン相関（＞０．７）を有するマイクロＲＮＡ
【０２００】
【表２２】
2020525050.tif 000023
【０２０１】
考察
ここで、本発明者らは、ＮＧＳによって同定された、マウスモデルにおける、老化細胞の増加に対して、そして老化細胞の減少に対して反応する循環ｍｉＲＮＡを記載する。循環ｍｉＲＮＡは、ＥＶにパッケージングされることによって、あるいはタンパク質またはリポタンパク質粒子により保護されることによってのいずれかで、血清および血漿中に存在するＲＮアーゼから保護され、そしてしたがって血液試料採取および−８０℃での貯蔵の数十年後であっても、生体液中で安定して検出可能であることから、近年、バイオマーカーとして注目を集めてきている（Ｈａｃｋｌら  ２０１５）。マウス血清試料が少量であるため、本発明者らはここで、細胞不含血液から総ＲＮＡを単離し、そしてしたがって小胞パッケージングされたまたはタンパク質が結合したｍｉＲＮＡの間を区別することは不可能である。しかし、いくつかのｍｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの老化細胞の誘導または除去後に、示差的なレベルを明らかに示す。本発明者らは、増加することが見出されたｍｉＲ−２７ａ−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐを除き、老化誘導剤への曝露後にマイクロＲＮＡの大部分は減少することを観察した。したがって、老化細胞の除去後、マウス血清におけるｍｉＲ−３４ａのレベルの有意な低下が観察され、これは、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐの血清レベルおよび全身細胞性老化の間に関連があることを示唆する。
【０２０２】
このｍｉＲＮＡは、ヒト線維芽細胞（Ｔａｚａｗａら  ２００７）、（Ｈｅら  ２００７）、（Ｍａｅｓら  ２００９）、内皮細胞（Ｉｔｏら  ２０１０）および近位尿細管上皮細胞（Ｈａｃｋｌら  ２０１０）において、ｐ５３誘導による細胞性老化において上方制御され、そしてまた、老化様増殖停止を誘導するために十分であることが同定された最初のものであった。該ｍｉＲＮＡはまた、マウス腎臓加齢（Ｂａｉら  ２０１１）中、ならびに若いドナーに対して高齢のドナー由来の骨髄由来間葉系幹細胞および皮膚（Ｈａｃｋｌら、２０１０）においても上方制御される。該ｍｉＲＮＡは、アポトーシスの振る舞いを調節し（Ｔａｒａｓｏｖら  ２００７）、（Ｙａｍａｋｕｃｈｉら  ２００８）、また、ｐ５３からは独立である（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎら  ２００９）。ｐ５３制御ネットワーク内の機能と一致して、該ｍｉＲＮＡは、多くの癌細胞タイプで示差的に発現され、そして癌細胞増殖、化学耐性またはアポトーシスの制御に機能的に関与する。最後に、いくつかのタイプの癌は、ｍｉＲ−３４を欠くことが同定されてきているため、該ｍｉＲＮＡは、マウスモデル中の腫瘍において、アポトーシスの誘導に用いられてきており（Ｘｕｅら  ２０１４）、そして今日までに、固形腫瘍に対する第Ｉ相臨床試験に到達してきている（Ａｄａｍｓら  ２０１６）。
【０２０３】
加齢の背景において、ｍｉＲ−３４ファミリーメンバーは、２型糖尿病（Ｋｏｎｇら  ２０１１）、聴覚喪失（Ｐａｎｇら  ２０１６）、非アルコール性脂肪肝疾患（Ｓａｌｖｏｚａら  ２０１６）、（Ｙａｍａｄａら  ２０１３）、（Ｃｅｒｍｅｌｌｉら  ２０１１）、アルツハイマー病（Ｂｈａｔｎａｇａｒら  ２０１４）を含む、加齢関連疾患における循環において、そして冠動脈心臓疾患の患者（Ｈａｎら  ２０１５）において、または心筋梗塞後の左心室リモデリング中（Ｌｖら  ２０１４）に、増加することが見出された。この背景において、該ｍｉＲＮＡは、心筋細胞アポトーシスの促進に、機能的に関与しているようである（Ｆａｎら  ２０１３）。該ｍｉＲＮＡはまた、肥満においても上昇しており、この場合、該ｍｉＲＮＡは、ＦＧＦ２１およびｋｌｏｔｈｏ軸に作用することが見出されており（ＦｕおよびＫｅｍｐｅｒ  ２０１６）、そしてまたｉｎｆｌａｍｍａｍｉＲとして分類されている（Ｒｉｐｐｏら  ２０１４）、（ｄｅ  Ｇｏｎｚａｌｏ−Ｃａｌｖｏら  ２０１５）。興味深いことに、ワイン抽出物およびレスベラトロールを伴うＴ２Ｄの栄養補助は、血清におけるｍｉＲ−３４ａレベルを減少させる（Ｔｏｍｅ−Ｃａｒｎｅｉｒｏら  ２０１３）。変形性関節症におけるｍｉＲ−３４−５ｐの高い組織レベルは、少なくともラットモデルにおける軟骨細胞の喪失に寄与している可能性があり（ＧｒｉｌｌａｒｉおよびＧｒｉｌｌａｒｉ−Ｖｏｇｌａｎｄｅｒ  ２０１０）、（Ａｂｏｕｈｅｉｆら  ２０１０）、一方、ｍｉＲ−３４過剰発現トランスジェニックマウスにおいて、骨粗鬆症は減少する（Ｋｒｚｅｓｚｉｎｓｋｉら  ２０１４）。さらに、腎線維症モデルにおいて、腎線維芽細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍｉＲ−３４ａ−５ｐを分泌し（Ｚｈｏｕら  ２０１４）、そして本発明者らはまた、老化ヒト皮膚線維芽細胞によって、ｍｉＲ−３４ファミリーのメンバーが分泌されることも見出している（本発明者らの未公表結果）。
【０２０４】
慢性ＨＩＶ感染および高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）は、最近、未成熟加齢とある程度の類似性を持つことが推測されてきており（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら  ２０１６）、そして実際、ｍｉＲ−３４−５ｐは、Ｔ細胞数が減少した患者において、増加していることが観察されてきている（Ｒｅｙｎｏｓｏら  ２０１４）。
【０２０５】
これらの状態すべてにおいて、最近概説されるように、それぞれの組織において、老化細胞の増加が観察されてきている（Ｍｕｎｏｚ−ＥｓｐｉｎおよびＳｅｒｒａｎｏ  ２０１４）。したがって、組織微小環境および循環に、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが分泌された結果である、ｍｉＲ−３４ファミリーメンバー、特にｍｉＲ−３４ａ−５ｐの増加は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの老化細胞の増加によって引き起こされる可能性が高い。それによって、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐは、いくつかの研究において、ＥＶ中に見られるように、細胞外小胞内にパッケージングされる可能性が高い（Ｃｏｒｃｏｒａｎら  ２０１４）。
【０２０６】
ｍｉＲ−２７ａ−３ｐもまた、老化内皮細胞において（Ｄｅｌｌａｇｏら  ２０１３）ならびにＴ細胞の複製老化において（Ｈａｃｋｌら  ２０１０）、細胞内上方制御されているため、これもまた循環中の有望なマーカーである。
【０２０７】
本発明者らは、健康な高齢個体対若年個体由来のＴ細胞において、ｍｉＲ−３４−５ｐまたは本明細書で検出する他のｍｉＲＮＡを観察せず、さらにこれらは血清（Ｎｏｒｅｎ  Ｈｏｏｔｅｎら  ２０１３）中でも、またＢ細胞（Ｇｏｍｂａｒら  ２０１２）または単核細胞（Ｓｅｒｎａら  ２０１２）中でも、加齢のシグネチャー中に見られていないため、ここで同定するｍｉＲＮＡは、経時的なＴ細胞老化から得られていないようではない。
【０２０８】
最後に、本発明者らのマウスモデルにおいて、老化の誘導は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、老化を誘導することが示されているいくつかの化学療法剤の１つであるドキソルビシンに基づき、そして実際、特にｍｉＲ−３４ファミリーメンバーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでシスプラチン、ペメトレキセド（Ｆｒａｎｃｈｉｎａら  ２０１４）を含む多様な化学療法剤に際して、またはネオアジュバント療法で、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでドキソルビシンによって、誘導される。
【０２０９】
総合すると、本発明者らは、ここで同定した血清に基づくｍｉＲＮＡが、老化細胞の存在に関するとともに、その除去に関するバイオマーカーとして作用すると提唱する。これは、老化細胞除去剤開発において、コンパニオン診断として特に価値があるであろう。
【０２１０】
実施例２
１．  材料および方法
１．１．  マウス研究および血清試料採取
ｐ１６−３ＭＲ（Ｄｅｍａｒｉａら，  ２０１４，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ３１：７２２−７３３）マウスを社内で育種し、そしてＡＡＬＡＣ公認のＢｕｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ（カリフォルニア州ノバート）動物施設で維持した。１０〜１２週齢のｐ１６−３ＭＲオスマウスを実験に用いた。マウスを４群に分け、そして各群は、それぞれ５匹のメスおよび３匹のオスの８匹の動物からなった。群Ａでは、対照マウスにＰＢＳを注射した。群Ｂでは、マウスを、ＰＢＳ中に溶解したガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で連続５日間処置した。群Ｃでは、マウスを、ＰＢＳ中に溶解した１用量のドキソルビシン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置した。群Ｄでは、マウスをまず、ドキソルビシンで処置し、そして次いで、１０日後、ＧＣＶで処置した。マウスに、１用量の１０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン塩酸塩を腹腔内注射し、そしてＧＣＶを、ＰＢＳ中、２５ｍｇ／ｋｇの濃度で、連続５日間、腹腔内注射によって毎日投与した。最後のＧＣＶ投与の４日後、動物をＣＯ２で安楽死させ、そして直ちに血液を抜き取った。次いで、血液を室温で３０分間インキュベーションし、そして３４００ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さずに、血清を注意深く無菌チューブに収集し、そしてさらなる実験のため、−８０℃で保存した。
【０２１１】
１．２．  ＲＴ−ｑＰＣＲ分析
Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、２００μｌの血清から、総ＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡ収集物（ｙｉｅｌｄ）を、スパイクインのｑＰＣＲ増幅ならびに溶血反応性ＲＮＡ（Ｂｌｏｎｄａｌら）に基づいて、均一抽出効率および溶血に関して品質チェックした。総量２μｌにおいて、Ｅｘｉｑｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＴキットＩＩ（Ｅｘｉｑｏｎ、デンマーク）を用いた逆転写のため、総ＲＮＡを用いた。得たｃＤＮＡ試料を、あらかじめ１：４０に希釈し、そして続いてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）混合物（Ｅｘｉｑｏｎ、デンマーク）と混合して、１：１００希釈を達成した。９６の選択したマイクロＲＮＡまたは品質管理アッセイ用の乾燥プライマー対を含有する、プライマーコーティングされた３８４ウェルプレートに、混合物を分配した。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩ上で、アニーリング、伸長および変性に関する製造者の推奨を用いて、ＱＰＣＲ増幅を行った。
【０２１２】
１．３．  バイオインフォマティクス
二次導関数法を用いて、生Ｃｑ値を計算した。ピークに関して融解曲線をチェックして、増幅反応の特異性を確実にした。続いて、参照としてスパイクイン対照を用いて、Ｃｑ値を規準化して、データ中の技術的ノイズを減少させた。
【０２１３】
Ｍｅｄｃａｌｃ（バージョン１８．２．１）を用いて統計分析を行った。ダゴスティーノ・ピアソン検定を用いて正規分布を評価し、この場合、ｐ＞０．０５で正規性が認められた。すべての対比較（事後検定）に、一方向ＡＮＯＶＡをスチューデント・ニューマン・クールズ検定とともに用いて、群間の有意変化を同定した（ｐ＜０．０５）。個々のマイクロＲＮＡの識別力を評価するため、受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を適用した。感度（ｙ軸）および１−特異度（ｘ軸）を用いてＲＯＣ曲線をプロットし、そしてＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。＞０．７のＡＵＣ値を持つマイクロＲＮＡを優れた識別子／バイオマーカーと見なした。ＡＵＣ値＞０．８を持つマイクロＲＮＡを、非常に優れた識別子／バイオマーカーと見なした。
【０２１４】
２．  結果
２．１．  老化誘導および老化細胞除去治療後の血清循環マイクロＲＮＡ変化のＲＴ−ｑＰＣＲ検証
上述の統計分析を用いて、本発明者らは、以下のマイクロＲＮＡが、実際に、性別からは独立に、陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、老化誘導剤（ＤＯＸ）に曝露された動物血清において、有意に制御されていることを立証する：ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐは、ＤＯＸへの曝露後、動物血清において、有意である（有意に上方または下方制御される）ことが見出された（表２３）。
【０２１５】
逆に、ＧＣＶ治療を通じて老化を不活性化（ＤＯＸ／ＧＣＶ）し、そしてストレスを掛けた対照動物（ＤＯＸ）と比較した後、メスおよびオスマウス由来の血清試料の分析によって、以下のマイクロＲＮＡバイオマーカーの上方または下方制御が確認された（ｐ＜０．０５）：ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐは、老化細胞除去治療後、有意に変化する（上方または下方制御される）ことが見出された。
【０２１６】
図５Ａは、４つすべての群に渡る、確証されたマイクロＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ）の血清レベルを示す。図５Ｂは、４つすべての群に渡る、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐの血清レベルを示す。
【０２１７】
２．２．  老化診断および老化細胞除去治療に関する、循環マイクロＲＮＡの識別力を評価するＲＯＣ分析
老化誘導物質（ＤＯＸ）への曝露ならびに老化細胞除去治療の有効性に関して、循環マイクロＲＮＡの診断力を評価するため、ＲＯＣ分析を行い、そして曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。一般的に、＞０．８のＡＵＣ値を持つバイオマーカーは、非常に優れた診断性能を示すと見なされる一方、ＡＵＣ＞０．７を持つバイオマーカーは、優れた診断性能を有すると見なされる。以下の表２３は、２４の選択された循環マイクロＲＮＡに関する、ＡＵＣ値ならびに９５％信頼区間を要約する。
【０２１８】
表２３
【０２１９】
【表２３】
2020525050.tif 000024
【０２２０】
２．３．  特定のマイクロＲＮＡの組み合わせは、個々のマイクロＲＮＡまたは非関連マイクロＲＮＡに比較して、増加した診断性能を示す
本発明者らは、多重ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ分析を行って、個々の含まれるマイクロＲＮＡのもの（表２３）ならびに老化関連マイクロＲＮＡと関連しないマイクロＲＮＡの組み合わせ（「非関連マイクロＲＮＡ」）に対して、含まれるマイクロＲＮＡの組み合わせの性能を比較した。
【０２２１】
図６Ａは、老化の診断に関して、非関連マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５８２−５ｐ）のものに対する、表２３に含まれるマイクロＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ）の診断性能の相違を明らかに示す：０．７１９のＡＵＣに比較して、０．９５３のＡＵＣ（ｐ＝０．１）。
【０２２２】
図６Ｂは、老化細胞除去治療の有効性に関して、非関連マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５８２−５ｐ）のものに対する、含まれる同じマイクロＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ）の診断性能の相違を明らかに示す：０．５７８のＡＵＣに比較して、０．９３８のＡＵＣ（ｐ＝０．０１５）。
【０２２３】
個々のマイクロＲＮＡはいずれも、細胞老化および老化細胞除去治療監視の診断両方に関して、ＡＵＣ＞０．９に到達しなかったため、細胞老化の診断ならびに老化細胞除去治療の監視のための特定のマイクロＲＮＡの組み合わせのＡＵＣ値（どちらもＡＵＣ＞０．９）は、明らかに、マイクロＲＮＡの個々の性能より優れている（表２３）。
【０２２４】
３．  考察
循環マイクロＲＮＡの検出および定量化のための分析技術は、生得的なバイアスを有し、これは最終的に、偽陽性または偽陰性バイオマーカー候補の選択を生じうる。この落とし穴を回避するため、本発明者らは、元来のＮＧＳに基づく発見研究におけるものと同じ４つの群に由来する、オスおよびメス動物の拡大されたセットに対して、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を適用して、結果の比較可能性、そしてしたがって、本発明者らの知見における信頼の増加を評価した。
【０２２５】
本発明者らの分析は、２４のマイクロＲＮＡが、老化細胞および老化細胞除去治療後の細胞において、有意に制御されていることを示す。特に、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５−５ｐは、老化誘導化合物への曝露後、動物血清において、有意に上方または下方制御されていることが見出された。
【０２２６】
逆に、老化の不活性化、すなわち老化細胞除去治療の結果としてのものは、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、およびｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、およびｍｉＲ−１５０−５ｐの有意な上方または下方制御を生じた。
【０２２７】
本発明者らはまた、それぞれ、老化および老化細胞除去治療両方の状態において、有意な制御（ｐ＜０．０５）、または少なくとも制御に関する傾向（ｐ＜０．２０）を示すいくつかのマイクロＲＮＡも見出した。したがって、これらのマイクロＲＮＡは、老化の非常に優れた識別子と見なされる（ＡＵＣ＞０．８）：ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ。
【０２２８】
最後に、本発明者らは、多重回帰モデルの形で、これらのマイクロＲＮＡの組み合わせが、老化細胞の存在（図６Ａ）、ならびに老化細胞除去療法の有効性（図６Ｂ）に関して、非常に高感度でそして特異的であるスコアを生じ、そして個々の含まれるマイクロＲＮＡならびに非関連マイクロＲＮＡの組み合わせよりも性能が優れていると立証する。
【０２２９】
引用参考文献
【０２３０】
【表２４−１】
2020525050.tif 000025
【０２３１】
【表２４−２】
2020525050.tif 000026
【０２３２】
【表２４−３】
2020525050.tif 000027
【０２３３】
【表２４−４】
2020525050.tif 000028
【０２３４】
【表２４−５】
2020525050.tif 000029
【０２３５】
【表２４−６】
2020525050.tif 000030
【０２３６】
【表２４−７】
2020525050.tif 000031
【０２３７】
【表２４−８】
2020525050.tif 000032
【図１−１】
2020525050.tif 000033
【図１−２】
2020525050.tif 000034
【図２】
2020525050.tif 000035
【図３】
2020525050.tif 000036
【図４−１】
2020525050.tif 000037
【図４−２】
2020525050.tif 000038
【図５−１】
2020525050.tif 000039
【図５−２】
2020525050.tif 000040
【図６】
2020525050.tif 000041
【配列表】
2020525050000001.app
【国際調査報告】
2020525050.tif 000042
2020525050.tif 000043
2020525050.tif 000044
2020525050.tif 000045
2020525050.tif 000046
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