(57)【要約】  抗生物質又は抗菌剤に対する細菌の識別及び感受性又は耐性を判定するための方法が提供される。一実施形態では、細菌は、複数の一次培養物を作製するため、抗生剤の存在下又は不在下で培養され、次に、抗生剤で処置されている形質転換細菌を含む第１の二次培養物、及び抗生剤で処置されていない形質転換細菌を含む第２の二次培養物を作製するため、形質転換ファージの存在下又は不在下で培養される。組換えファージは、細菌に特異的であり、異種マーカーを含む。抗生物質又は抗菌剤に対する細菌の感受性又は耐性は、第１及び第２の二次培養物中でのマーカーのレベル又は活性を比較することにより判定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同時に、細菌種を同定し、且つ前記細菌種の試験抗菌剤に対する感受性を判定するための方法であって、
（ａ）前記細菌種に特異的な形質転換ファージ(transforming phage)であって、マーカーをコードする、ヒトと前記細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである形質転換ファージを準備することと；
（ｂ）一次試験抗菌剤を含まない培養物を作製するため、前記細菌種を前記試験抗菌剤の不在下で培養することにより、且つ前記一次試験抗菌剤を含まない培養物を前記形質転換ファージの存在下で培養することにより、第１の培養物を調製することと；
（ｃ）一次試験抗菌剤を含有する培養物を作製するため、前記細菌種を前記試験抗菌剤の存在下で培養することにより；前記一次試験抗菌剤を含有する培養物を前記形質転換ファージの存在下で培養することにより、第２の培養物を調製することと；
（ｄ）前記第１及び第２の培養物の各々の中の前記マーカーのレベル又は活性を判定するため、前記第１及び第２の培養物を分析することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の培養物中の前記マーカーの検出により、前記細菌種の前記形質転換ファージが特異的である対象の前記細菌種としての陽性同定が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の培養物中の前記マーカーのレベル又は活性と比べての前記第２の培養物中の前記マーカーのレベル又は活性における低下が、前記細菌種が前記試験抗菌剤に感受性があることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の培養物中の前記マーカーのレベル又は活性と比べての前記第２の培養物中の前記マーカーのレベル又は活性における均一性又は増加が、前記細菌種が前記試験抗菌剤に対して感受性がない又は耐性があることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
それを必要とする対象における細菌性疾患を診断するための方法であって、
（ａ）細菌種を含む対象サンプルを準備することと；
（ｂ）複数の一次細菌培養物を作製するため、前記対象サンプルを培養することと；
（ｃ）複数の形質転換ファージであって、それらの各々が異なる細菌種に特異的であり、ここで各形質転換ファージが、固有のマーカーをコードする、ヒトと前記細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである、複数の形質転換ファージを準備することと；
（ｄ）複数の二次細菌培養物を提供するため、（ａ）の前記一次細菌培養物を、前記二次細菌培養物の中で変動する（ｃ）の形質転換ファージの存在下で培養することと；
（ｅ）前記二次細菌培養物中での前記固有のマーカーの存在又は不在を判定するため、前記二次細菌培養物を分析することと；
（ｆ）前記固有のマーカーの検出を細菌種の存在と相関させることと；
（ｇ）前記細菌種の存在を前記細菌性疾患と相関させることと、
を含む、方法。
【請求項６】
前記細菌種が、グラム陽性及びグラム陰性細菌からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、エンテロバクター(Enterobacter sp.)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、大腸菌(Escherichia coli)、腸内毒素原性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)(ETEC)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic Escherichia coli)、大腸菌(E. coli)O157:H7、野兎病菌(Francisella tularensis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、在郷軍人病菌(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ライ菌(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、プロテウス(Proteus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ロッキー山紅斑熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、腸チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)、腐性ブドウ球菌(Staphylococcus saprophyticus)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (MRSA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) (VSA)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae) 、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae) 、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes) 、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、及びペスト菌(Yersinia pestis)又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌が、炭疽菌(Bacillus anthracis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、大腸菌(Escherichia coli)、デルブリュッキ菌(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シリンゲ菌(Pseudomonas syringae)、クレブシエラ(Klebsiella)、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ファージが、溶解ファージ；温帯若しくは溶原性ファージ；又は糸状ファージである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ファージが、T4、T7、T3、及びMS2からなる群から選択される溶解又は増殖ファージである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記温帯又は溶原性ファージが、λファージである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ファージが、f1、fd、及びM13からなる群から選択される糸状ファージである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子が、真菌、植物又は昆虫起源である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーが、加水分解酵素である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記加水分解酵素が、セルラーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホエステラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及びプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
加水分解酵素が、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ディスパーゼ、プラスミン、ブロメリン、クロストリパイン、サーモリシン、ノイラミニダーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スブチリシン、パパイン、キモパパイン、プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、フィブリノリシン、セラチオペプチダーゼ、パンクレアチン、アミラーゼ、リゾチーム、カテプシン−Ｇ、アルカリ性ａｎｄ酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ，Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドゥロナーゼ、及びＰＭＮ白血球セリンプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記加水分解酵素のレベル又は活性を判定するため、培養物を分析することが、前記加水分解酵素に特異的な基質の加水分解を検出することを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記基質が、分子内で消光されるフルオロフォア又は分子内で消光される色素原である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分子内で消光されるフルオロフォア又は前記分子内で消光される色素原が、式：
Ｑ−Ｓ−Ｆ
（式中、
Ｓは、前記加水分解酵素に特異的な基質を含み；
Ｆは、フルオロフォア、化学発光分子、又は色素原であり；且つ
Ｑは、クエンチャーであり；
ここで、ＳはＱとＦとの間に結合を形成し、且つＳの加水分解は前記結合を切断し、それによりＦに対するＱの消光効果を低減する）
を有する化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆが色素原であり、且つ前記基質の加水分解の検出が、視覚的な色変化を検出すること又は比色若しくは分光読み取り値を取得することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｆがフルオロフォアであり、且つ前記基質の加水分解の検出が、蛍光を検出すること又は蛍光定量読み取り値を取得することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｆが、Alexa 405、FAM、Cy3、及びCy5からなる群から選択され、且つＱが、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、及びBHQ-3からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｆが化学発光分子であり、且つ前記基質の加水分解の検出が、化学発光アッセイを実施することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記基質が核酸配列を含み、且つ前記加水分解酵素が、前記核酸配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼである、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質がポリペプチドを含み、前記加水分解酵素がプロテアーゼであり、且つ前記ポリペプチドが前記プロテアーゼに特異的である、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マーカーが、ヒトと前記標的種の双方に対して異種の非コードリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非コードＲＮＡが、自己スプライシングする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非コードＲＮＡが、２以上のスプライスイントロンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記非コードＲＮＡのレベル又は活性を判定するため、培養物を分析することは、前記非コードＲＮＡを増幅することを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記非コードＲＮＡが、逆転写ヘリカーゼ依存性増幅（ＲＴ−ＨＤＡ）によって増幅され、それにより前記非コードＲＮＡに対応する相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）増幅産物が生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非コードＲＮＡが、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約１×１０６倍、少なくとも約１×１０７倍、少なくとも約１×１０８倍、少なくとも約１×１０９倍、又は少なくとも約１×１０１０倍増幅される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｃＤＮＡ増幅産物に特異的に結合する分子内で消光されるプローブを介して、前記ｃＤＮＡ増幅産物を検出することをさらに含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記分子内で消光されるプローブが、前記非コードＲＮＡのスプライス接合部に対応する部位に重複する領域で、前記ｃＤＮＡ増幅産物に結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記分子内で消光されるプローブが、約１５〜約３０塩基長の核酸リンカーを介してクエンチャーに連結されたフルオロフォアを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
リボヌクレアーゼを前記分子内で消光されるプローブに接触させることにより、前記フルオロフォアを前記クエンチャーから連絡切断することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記リボヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨＩＩである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光を検出すること又は蛍光定量読み取り値を取得することをさらに含む、請求項３５又は請求項３６に記載の方法。?
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，８６４号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
技術分野
[0002]  本明細書に記載の主題は、細菌病原体を同定し、試験剤に対する細菌の感受性を規定するための方法、及び標的細菌種が１以上の抗菌剤に耐性があるか否かを判定するための方法に関する。さらなる実施形態は、新しい試験化合物をそれらの抗菌又はプロバイオティック活性についてスクリーニングする、例えば臨床サンプル、並びに食物及び環境サンプルを含む生体サンプル中でのかかる薬剤の存在を検出するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
背景
[0003]  抗生物質ペニシリンが最初に実用されて以来、多数の他の抗菌剤が開発されており、また抗菌薬治療が現代医学の進歩や平均寿命の延長に大いに寄与している。しかし、病原菌は、抗菌剤の大部分に対する耐性を獲得し、それにより抗菌治療の全体的有効性を損なっている一方で、新たな公衆衛生問題をさらに提示している。特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (MRSA)は、β−ラクタム系抗菌剤に対する耐性があることから、高度耐性病原体である。それは、米国単独でのほぼ９４，０００名の新規入院／年と、それから生じるおよそ１９，０００名の死亡／年に直接的に関連する(Voss et al., International Journal of Antimicrobial Agents, 5:101-106, 1995; McGeer et al., LPTP Newsletter, 190:1-4, 1996; CDC MRSA tracking)。部分的には畜産及び動物病院における抗生物質の使用増加のおかげで、多剤耐性細菌の新規株もまた、驚異的な速さで出現している。例えば、ＭＲＳＡ感染に対してバンコマイシンで治療中の患者において、バンコマイシン中間体黄色ブドウ球菌(S. aureus) (VISA)感染についての報告がなされている(Hiramatsu et al., J Antimicrob Chemother, 40(1), 135-6, 1997; Perichon et al., Antimicrob Agents Chemother., 53(11):4580-7, 2009)。確かに、一部の株が一般に利用可能な薬剤の事実上すべてに耐性があるようになっている。悪名高い症例がＭＲＳＡのＭｕ５０株であり、それもまたアミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、及びリンコサミドに耐性がある(Hiramatsu et al.,上記)。イソニアジド及びリファンピシンに耐性がある多剤耐性結核菌(Mycobacterium tuberculosis)もまた、同定されている(Dalton et al., Lancet, 380:1406-17, 2012)。
【０００４】
[0004]  食物由来の細菌性疾患、特に薬剤耐性菌によって引き起こされるものもまた、ヒトの健康に相当な脅威をもたらす。野菜サラダ、生卵表面、生チキン、低温殺菌処理されていない牛乳、及び生肉を含む１５０の食物サンプルを大腸菌(E. coli)に対して分析する微生物学的試験によると、薬剤耐性大腸菌(E. coli)単離物の最高百分率が、生チキン（２３．３％）、続いて野菜サラダ（２０％）、生肉（１３．３％）、生卵表面（１０％）及び低温殺菌処理されていない牛乳（６．７％）において検出された。薬剤耐性大腸菌(E. coli)の全発生率は１４．７％であった(Rasheed et al., Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 56(4):341-346, 2014)。試験によると、薬剤耐性大腸菌(E. coli)が薬剤耐性遺伝子を他種、例えばクレブシエラ(Klebsiella sp.)に導入させる能力によってもたらされる脅威がさらに強調されている。
【０００５】
[0005]  科学的証拠の増加により、細菌が現在用いられている抗菌剤の５つの主要なクラスに対して保護するためにいかに防御系を進化させているかが指摘される。これらの薬剤は、広義には、β−ラクタム、β−ラクタマーゼ阻害剤、セファロスポリン、キノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン／グリシルサイクリン及びポリミキシンとして分類される。各薬剤の制限は特に、単独で用いられるとき、以下に概説される。
【０００６】
[0006]  β−ラクタムは、グラム陰性感染に対する主要な治療である広域スペクトル薬剤の大クラスである。β−ラクタム薬のサブクラスは、狭域スペクトル（ペニシリン）から広域スペクトル（カルバペネム）にかけての範囲である。グラム陰性細菌は、β−ラクタム耐性に対するいくつかの経路を発生させている。おそらく最も関連する機構は、β−ラクタム抗生物質を破壊する酵素であるβ−ラクタマーゼの進化を含む。一部のβ−ラクタマーゼは、狭域スペクトル薬剤（例えばペニシリンに対する活性のみ）を破壊する一方で、より新しいβ−ラクタマーゼ（例えば、カルバペネム耐性腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、即ちＣＲＥ中に見出されるカルバペネマーゼ）は、すべてのβ−ラクタム抗生物質を中和する能力がある。
【０００７】
[0007]  β−ラクタマーゼ阻害剤は、β−ラクタマーゼを有するグラム陰性細菌に対してさらに活性があり、β−ラクタム抗生物質を破壊するための活性が制限される。広域スペクトルのセファロスポリン及びカルバペネムに耐性がある細菌は通常、これらの薬剤に対して同様に耐性がある。開発中の新たなβ−ラクタマーゼ阻害剤の組み合わせ薬剤は、最も強力なβ−ラクタマーゼ、例えばＣＲＥ中に見出されるものからの耐性の全部ではないが一部を克服するという可能性を有する。
【０００８】
[0008]  広域スペクトルのセファロスポリンは、過去２０年間、重篤なグラム陰性感染を治療するための礎石となっている。（薬剤）耐性グラム陰性感染は、コミュニティーに拡散中である。耐性から、カルバペネムを唯一の有効な抗菌剤とすることが多い。
【０００９】
[0009]  フルオロキノロンは、入院患者と外来患者の双方における使用を便利にするように経口的に投与されることが多い広域スペクトル抗生物質である。しかし、患者集団における使用増加に伴い、薬剤耐性株は、急速に進化し、薬剤を無効化する。使用増加はまた、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)の耐性のある高毒性株によって引き起こされる感染における増加に関連する。
【００１０】
[0010]  アミノグリコシドは、グラム陰性細菌によって引き起こされる感染を治療するため、β−ラクタム剤と併用されることが多い。耐性増加に関係するにもかかわらず、これらの薬剤は、重症感染に対する最後のリゾートとして重要な治療選択肢であり続ける。しかし、それらは、耐性及びそれらの副作用延長への懸念から、臨床医により単独で用いられることは（たとえあるにしても）まれである。
【００１１】
[0011]  テトラサイクリンは、重篤なグラム陰性感染に対する第一選択治療選択肢ではないが、他の薬剤クラスの有効性が限られており、それらは重症感染を治療するための選択肢として考慮される。グリシルサイクリン（即ちチゲサイクリン）は、多剤耐性グラム陰性感染の治療用として考慮されることが多い。チゲサイクリンは、体内に一様に分布しない薬剤であることから、それらは感染部位に応じて他の薬剤と併用されることが多い。比較的一般的でないが、チゲサイクリンに耐性がある株の発生頻度についての報告がなされている。
【００１２】
[0012]  ポリミキシンは、毒性が懸念されることから好ましいものでなくなった旧型のクラスである。それは現在、多剤耐性グラム陰性感染を治療するための「最後のリゾート」薬剤として用いられることが多い。これらは、ジェネリック医薬品であることから、薬量測定及び有効性に関する現データは限られている。加えて、高度耐性菌の検出に関するデータは、いくらか存在するが限られている。
【００１３】
[0013]  細菌の薬剤耐性株の数が迅速に増加すると仮定すれば、細菌、特にＥＳＫＡＰＥグループ（エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)及びエンテロバクター(Enterobacter)種）に属するものの臨床及び非臨床単離物の双方に対して同定及び核型分析を行うための新しい効率的方法が直に求められている(Boucher et al., Clinical Infectious Diseases, 48:1-12, 2009)。医師が、例えば潜在的には生命を脅かしているような感染に対して適切に反応・応答できるようにするための迅速且つ正確な病原体同定についても求められている。現在、病原体の同定は、固形培地（寒天ベースプレート）上での培養と、それに続く、通常は培養下でのさらなる回数の複製又は特定の細菌産物の精製を必要とするような診断分析を必要とする。最善には、微生物同定は、バイオセイフティー上の封じ込めのさらなるレベルが病原体の全分類に応じて要求される場合にかかる数日を要する。この生物学的な増殖に基づくアッセイの第２世代バージョンは、細菌集団が肉眼によって見えるための十分な密度に達するのを待つのではなく、増殖する細菌によって生成される代謝産物を測定するための放射測定（例えば、Becton DickinsonのＢＡＣＴＥＣ（商標））装置又は比色分析／蛍光定量（例えば、Becton DickinsonのＭＧＩＴ（商標）及びBiomerieuxのＢＡＣＴ  ＡＬＥＲＴ（登録商標））装置を用いることにより、微生物同定及び耐性試験の双方の検出までの時間を加速する。しかし、これらのアッセイ系は、汚染問題に直面することが多いため、再処理とその結果としての不必要な遅延に対しての要求が増大する(Tortoli et al., J. Clin. Microbiol., 40:607-610, 2002)。
【００１４】
[0014]  薬剤耐性菌の生物学的検出を加速するためのより最近の手法では、抗微生物が単離物に対して有する効果をプローブするためにバクテリオファージを用いることが注目されている(Schofield et al., Bacteriophage, 2(2):105-283, 2012及び国際公開第０８／１２４１１９号)。ファージは、用いることで、細菌に感染し、宿主の細胞生合成機構をハイジャックして複製し、それにより臨床検体中の細菌の特定株の存在を同定するためのツールとして役立つ。ファージの検出において、種々の方法が利用されてもよい。一方法は、核酸増幅の使用に依存する（米国特許出願公開第２０１４−０２５６６６４号及び国際公開第１２／１５８５０２号）。この方法では、結核菌(M. tuberculosis)の薬剤感受性は、マイコバクテリオファージＤ２９  ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ産物を分析することにより、スクリーニングされる。
【００１５】
[0015]  関連方法は、ファージを宿す細菌で二次培養物に感染し、二次培養物の増殖特性を分析することに依存する。この方法は、典型的には、薬剤耐性結核菌(M. tuberculosis)を同定することに用いられる。この間接的検出方法に基づく代表的な市販キットは、Biotec, Inc. (Suffolk, UK)により、FASTPLAQUE-RESPONSE（商標）という表記で販売されている(Mole et al., J Med Microbiol., 56(Pt 10):1334-9, 2007; Albert et al., J Appl Microbiol., 103(4):892-9, 2007)。キットには、マイコバクテリオファージＤ２９も提供されるが、Ｄ２９  ＤＮＡの直接的ＰＣＲ分析と対照的に、この方法は、細菌に感染しなかったファージを除去するための抗ウイルス薬を用いることにより、偽陽性を最小化することを試みる。感染されたマイコバクテリアについてのスクリーニング後、ファージに感染された結核菌(M. tuberculosis)は、迅速に複製するスメグマ菌(M. smegmatis)と組み合わされ、次に混合物は寒天皿上に蒔かれる。アッセイ系は、スメグマ菌(M. smegmatis)がＤ２９によって効率的に交叉感染され、スメグマ菌(M. smegmatis)菌叢上に透明な可視プラークを形成することで、各プラークが最初にＤ２９によって感染された結核菌(M. tuberculosis)細胞を表すという原理に基づく。したがって、アッセイでは、結核菌(M. tuberculosis)の小プール中のＤ２９の複製を定量測定する。正確且つ迅速な試験にもかかわらず、このアッセイは、寒天プレート上でのプラーク形成によるウイルス増殖の分析が熟練した技術者により研究室内で実施される必要があるため、資源不足の状況下で用いるには複雑すぎて、扱いにくい。さらに、このアッセイにおいて利用可能な二次高速増殖細菌の数は制限され、アッセイは、多数の標的細菌種についてスクリーニングするためにカスタマイズ又は改良することができない。
【００１６】
[0016]  同様に、例えば改変されたマイコバクテリオファージＴＭ４を用いた、元のルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＬＲＡ）に対する変動もまた、検出の感度に関連して制限される。Piuri et al., PLoS One, 2009; 4(3):e4870を参照されたい。フルオロファージ(fluorophages)（フルオロマイコバクテリオファージ(fluoromycobacteriophages)）は、感染の１６時間後、結核菌(M. tuberculosis)細胞の５０％だけを検出することができた。さらに、このアッセイが小サンプル中で発現される蛍光又は発光マーカーの検出を含むことから、アッセイは、分析されてもよいサンプルのタイプに関連して制限される。
【００１７】
[0017]  要するに、薬剤耐性菌を同定するための現在の手法は、多種多様な細菌、例えばそれらの混合物の、例えばそれらが保有する耐性のタイプに基づく表現型分析のための効率的且つ実践的手段について、今日の需要を満たすことができない。したがって、細菌の特定株の抗菌剤に対する感受性をスクリーニングするのに有用であるアッセイ系について、切迫した需要がある。かかるアッセイ技術であれば、多くのヒト及び動物疾患、例えば、尿路感染、呼吸器感染、血流感染などの診断、治療及び管理と有効に組み合わせることができる。かかる系及びアッセイであれば、工業的に有用な微生物、例えば、大腸菌(E. coli)、Ｒ．ユートロファ(R. eutropha)、Ｓ．カルノサス(S. carnosus)などの増殖を補助するために使用可能なプロバイオティクスのスクリーニングにおいても用いることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
概要
[0018]  したがって、選択微生物（例えば細菌）の検出のための、現在利用可能な技術によって提供される場合よりも、低コスト、効率的、特異的、高速、アクセス容易であり、且つより優れた適応可能なプロセス及び装置を提供することが目的である。したがって、細菌の抗生物質に対する耐性を判定するための方法及び微生物種を同定するための方法が提供される。該方法では、バクテリオファージのそれらに対応する宿主細菌に対する内因的特異性が利用される。
【００１９】
[0019]  前述によると、実施形態は、組換えバクテリオファージ、かかる組換えバクテリオファージを構築及び生成するための方法、並びに標的細菌を検出し且つ／又は標的細菌が耐性がある薬剤若しくは抗生物質を判定するため、かかる組換えバクテリオファージを用いるための方法を提供する。組成物及び方法はまた、実験室レベル又は工業規模での酵素、ホルモン、抗体、核酸、糖、及び他の生体分子の生合成にとって有用である新しいプロバイオティック剤についてスクリーニングするように適応されてもよい。
【００２０】
[0020]  実施形態によると、例えば、標的化された生存可能な細菌において、特異的分子、例えばタンパク質などのマーカーの存在をプローブすることにより、細菌の特異型を検出する能力がある製品、キット、及び方法。一旦薬剤耐性株が同定されると、該方法は、例えば、薬剤耐性機構、例えば、遺伝子突然変異、遺伝子重複、形質転換、抗生物質分解などにおける分子基盤を同定するための他の技術と共役されてもよい。蛍光アッセイによって検出可能である、異種加水分解酵素又は非コードＲＮＡの遺伝子を含む組換えファージのここでの利用は、上記の目的を達成する。
【００２１】
[0021]  いくつかの実施形態では、同時に、細菌種を同定し、且つ細菌種の試験抗菌剤に対する感受性を判定するための方法であって、（ａ）細菌種に特異的な形質転換ファージ(transforming phage)であって、マーカーをコードする、ヒトと細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである形質転換ファージを準備することと；（ｂ）一次試験抗菌剤を含まない培養物を作製するため、細菌種を試験抗菌剤の不在下で培養することにより、また一次試験抗菌剤を含まない培養物を形質転換ファージの存在下で培養することにより、第１の培養物を調製することと；（ｃ）一次試験抗菌剤を含有する培養物を作製するため、細菌種を試験抗菌剤の存在下で培養することにより；一次試験抗菌剤を含有する培養物を形質転換ファージの存在下で培養することにより、第２の培養物を調製することと；（ｄ）第１及び第２の培養物の各々の中のマーカーのレベル又は活性を判定するため、第１及び第２の培養物を分析することと、を含む、方法が提供される。
【００２２】
[0022]  いくつかの実施形態では、第１の培養物中のマーカーの検出は、形質転換ファージが特異的である対象の細菌種としての細菌種の陽性同定を提供する。
【００２３】
[0023]  いくつかの実施形態では、第１の培養物中のマーカーのレベル又は活性と比べての第２の培養物中のマーカーのレベル又は活性における低下は、細菌種が試験抗菌剤に感受性があることを示す。
【００２４】
[0024]  いくつかの実施形態では、第１の培養物中のマーカーのレベル又は活性と比べての第２の培養物中のマーカーのレベル又は活性における均一性又は増加は、細菌種が試験抗菌剤に対して感受性がない又は耐性があることを示す。
【００２５】
[0025]  いくつかの実施形態では、細菌種に対する試験剤のプロバイオティック効果を判定するための方法であって、（ａ）細菌種に特異的な形質転換ファージであって、マーカーをコードする、ヒトと細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである形質転換ファージを準備することと；（ｂ）一次試験剤を含まない培養物を作製するため、細菌種を試験剤の不在下で培養することにより、また一次試験剤を含まない培養物を形質転換ファージの存在下で培養することにより、第１の培養物を調製することと；（ｃ）一次試験剤を含有する培養物を作製するため、細菌種を試験剤の存在下で培養することにより；一次試験剤を含有する培養物を形質転換ファージの存在下で培養することにより、第２の培養物を調製することと；（ｄ）第１及び第２の培養物の各々の中のマーカーのレベル又は活性を判定するため、第１及び第２の培養物を分析することと、を含み、ここで第１の培養物中のマーカーのレベル又は活性と比べての第２の培養物中のマーカーのレベル又は活性における増加が、試験剤がプロバイオティック効果を有することを示す、方法が提供される。
【００２６】
[0026]  いくつかの実施形態では、標的細菌検体に対する抗菌活性について試験剤をスクリーニングするための方法であって、（ａ）標的細菌検体に特異的な形質転換ファージであって、マーカーをコードする、ヒトと細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである形質転換ファージを準備することと；（ｂ）一次試験剤を含まない培養物を作製するため、標的細菌検体を試験剤の不在下で培養することにより、また一次試験剤を含まない培養物を形質転換ファージの存在下で培養することにより、第１の培養物を調製することと；（ｃ）一次試験剤を含有する培養物を作製するため、標的細菌検体を試験剤の存在下で培養することにより；一次試験剤を含有する培養物を形質転換ファージの存在下で培養することにより、第２の培養物を調製することと；（ｄ）第１及び第２の培養物の各々の中のマーカーのレベル又は活性を判定するため、第１及び第２の培養物を分析することと、を含み、ここで第１の培養物中のマーカーのレベル又は活性と比べての第２の培養物中のマーカーのレベル又は活性における低下が、試験剤が抗菌活性を有することを示す、方法が提供される。
【００２７】
[0027]  いくつかの実施形態では、食物サンプル中での抗生剤の存在又は不在を判定するための方法であって、（ａ）食物サンプルを複数の細菌培養物中で培養し、それにより複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）細菌種に特異的な形質転換ファージであって、マーカーをコードする、ヒトと細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである形質転換ファージを準備することと；（ｃ）（ａ）の一次培養物を、細菌種に特異的であり且つマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は不在下で培養し、それにより複数の二次培養物を生成することと；（ｃ）第１及び第２の形質転換された二次培養物の各々の中のマーカーのレベル又は活性を判定するため、第１及び第２の形質転換された二次培養物を分析することと、を含み、ここで第１の培養物が、抗生物質に感受性がある細菌種を含み、且つ第２の培養物が、抗生物質に耐性がある点以外では同じ細菌種を含み、ここで第１の形質転換された二次培養物が、抗生剤に感受性がある細菌を含む培養物に由来し、且つ第２の形質転換された二次培養物が、抗生剤に耐性がある形質転換細菌を含み、ここで第２の形質転換された二次培養物中のマーカーのレベル又は活性と比べての第１の形質転換された二次培養物中のマーカーのレベル又は活性における低下が、食物サンプルが抗生剤を含むことを示す、方法が提供される。
【００２８】
[0028]  いくつかの実施形態では、標的細菌検体に対する抗菌剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するための方法であって、（ａ）細菌検体に特異的な形質転換ファージであって、マーカーをコードする、ヒトと細菌検体の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである形質転換ファージを準備することと；（ｂ）標的細菌検体を抗菌剤の不在下で培養することにより対照培養物を調製し、一次培養物を生成し、且つその後、一次培養物を形質転換ファージの存在下で培養することと；（ｃ）標的細菌検体及び抗菌剤を含む複数の実験培養物を培養することにより実験群を調製し、且つその後、実験培養物を形質転換ファージの存在下で培養することと；（ｄ）実験群の培養物及び対照培養物中のマーカーのレベル又は活性を判定するため、実験群からの培養物及び対照培養物を分析することと、を含み、ここで抗菌剤は実験培養物中で変動する濃度を有し、ここで抗菌剤が、マーカーのレベル又は活性を、対照培養物中のマーカーの閾値レベル又は活性と比べて低減することが可能な最小濃度が、標的細菌検体に対する薬剤の最小発育阻止濃度を示す、方法が提供される。
【００２９】
[0029]  いくつかの実施形態では、それを必要とする対象における細菌性疾患を診断及び治療するための方法であって、（ａ）細菌種を含む対象サンプルを準備することと；（ｂ）対象サンプルを培養し、複数の一次細菌培養物を生成することと；（ｃ）各々が異なる細菌種に特異的である複数の形質転換ファージであって、各形質転換ファージが固有のマーカーをコードする、ヒトと細菌種の双方に対して異種である遺伝子を有する改変又は組換えファージである、複数の形質転換ファージを準備することと；（ｄ）（ａ）の一次細菌培養物を（ｃ）の形質転換ファージの存在下で培養し、複数の二次細菌培養物を提供することと；（ｅ）二次細菌培養物中での固有のマーカーの存在又は不在を判定するため、二次細菌培養物を分析することと；（ｆ）固有のマーカーの検出を細菌種の存在と相関させることと；（ｇ）細菌種の存在を細菌性疾患と相関させることと；（ｈ）任意選択的には、検出された細菌種に特異的な抗生剤を対象に投与し、それにより細菌性疾患を治療することと、を含み、ここで形質転換ファージが二次細菌培養物中で変動する、方法が提供される。
【００３０】
[0030]  上記方法のいくつかの実施形態では、細菌種又は標的細菌検体は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌からなる群から選択される。
【００３１】
[0031]  上記方法のいくつかの実施形態では、細菌は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、エンテロバクター(Enterobacter sp.)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、大腸菌(Escherichia coli)、腸内毒素原性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)(ETEC)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic Escherichia coli)、大腸菌(E. coli)O157:H7、野兎病菌(Francisella tularensis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、在郷軍人病菌(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ライ菌(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、プロテウス(Proteus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ロッキー山紅斑熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、腸チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)、腐性ブドウ球菌(Staphylococcus saprophyticus)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (MRSA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) (VSA)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、及びペスト菌(Yersinia pestis)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３２】
[0032]  上記方法のいくつかの実施形態では、細菌は、表１〜３に列挙されるものから選択される。上記方法のいくつかの実施形態では、細菌は、炭疽菌(Bacillus anthracis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、大腸菌(Escherichia coli)、デルブリュッキ菌(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シリンゲ菌(Pseudomonas syringae)、クレブシエラ(Klebsiella)、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からなる群から選択される。
【００３３】
[0033]  上記方法のいくつかの実施形態では、ファージは、溶解若しくは増殖ファージ；温帯若しくは溶原性ファージ；又は糸状ファージである。
【００３４】
[0034]  上記方法のいくつかの実施形態では、ファージは、T4、T7、T3、及びMS2からなる群から選択される溶解又は増殖ファージである。
【００３５】
[0035]  上記方法のいくつかの実施形態では、温帯若しくは溶原性ファージは、λファージである。
【００３６】
[0036]  上記方法のいくつかの実施形態では、ファージは、f1、fd、及びM13からなる群から選択される糸状ファージである。
【００３７】
[0037]  上記方法のいくつかの実施形態では、該方法は、様々なファージの組み合わせを用いて実施されてもよい。
【００３８】
[0038]  上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、真菌又は植物に基づく遺伝子である。
【００３９】
[0039]  上記方法のいくつかの実施形態では、マーカーは、加水分解酵素である。いくつかの実施形態では、加水分解酵素は、セルラーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホエステラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及びプロテアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、加水分解酵素は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ディスパーゼ、プラスミン、ブロメリン、クロストリパイン、サーモリシン、ノイラミニダーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スブチリシン、パパイン、キモパパイン、プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、フィブリノリシン、セラチオペプチダーゼ、パンクレアチン、アミラーゼ、リゾチーム、カテプシン−Ｇ、アルカリ性及び酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ，Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドゥロナーゼ、及びＰＭＮ白血球セリンプロテアーゼからなる群から選択される。
【００４０】
[0040]  いくつかの実施形態では、加水分解酵素のレベル又は活性を判定するために培養物を分析することは、加水分解酵素に特異的な基質の加水分解を検出することを含む。いくつかの実施形態では、基質は、分子内で消光されるフルオロフォア又は分子内で消光される色素原である。いくつかの実施形態では、分子内で消光されるフルオロフォア又は分子内で消光される色素原は、式：
Ｑ−Ｓ−Ｆ
（式中、
Ｓは、加水分解酵素に特異的な基質を含み；
Ｆは、フルオロフォア、化学発光分子、又は色素原であり；且つ
Ｑは、クエンチャーであり；
ここで、ＳはＱとＦとの間に結合を形成し、且つＳの加水分解は結合を切断し、それによりＦに対するＱの消光効果を低減する）
を有する化合物である。
【００４１】
[0041]  いくつかの実施形態では、Ｆは色素原であり、且つ基質の加水分解の検出は、視覚的な色変化を検出すること又は比色若しくは分光読み取り値を取得することを含む。いくつかの実施形態では、Ｆはフルオロフォアであり、且つ基質の加水分解の検出は、蛍光を検出すること又は蛍光定量読み取り値を取得することを含む。いくつかの実施形態では、Ｆは、Alexa 405、FAM、Cy3、及びCy5からなる群から選択され、且つＱは、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、及びBHQ-3からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆは化学発光分子であり、且つ基質の加水分解の検出は、化学発光アッセイを実施することを含む。
【００４２】
[0042]  いくつかの実施形態では、基質は核酸配列を含み、加水分解酵素は、核酸配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、基質はポリペプチドを含み、加水分解酵素はプロテアーゼであり、且つポリペプチドはプロテアーゼに特異的である。
【００４３】
[0043]  いくつかの実施形態では、マーカーは、ヒトと細菌種の双方に対して異種の非コードリボ核酸（ＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、自己スプライシングしている。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、２以上のスプライスされたイントロンを含む。
【００４４】
[0044]  いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡのレベル又は活性を判定するために培養物を分析することは、非コードＲＮＡを増幅することを含む。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、逆転写ヘリカーゼ依存性増幅(Reverse Transcriptase Helicase Dependent Amplification)（ＲＴ−ＨＤＡ）によって増幅され、それにより非コードＲＮＡに対応する相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）増幅産物が生成される。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約１×１０６倍、少なくとも約１×１０７倍、少なくとも約１×１０８倍、少なくとも約１×１０９倍、又は少なくとも約１×１０１０倍増幅される。
【００４５】
[0045]  いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡのレベル又は活性を判定するために培養物を分析することは、ｃＤＮＡ増幅産物をｃＤＮＡ増幅産物に特異的に結合する分子内で消光されるプローブを介して検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、分子内で消光されるプローブは、非コードＲＮＡのスプライス接合部に対応する部位に重複する領域で、ｃＤＮＡ増幅産物に結合する。いくつかの実施形態では、分子内で消光されるプローブは、約１５〜約３０塩基長の核酸リンカーを介してクエンチャーに連結されたフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ増幅産物の検出は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を分子内で消光されるプローブに接触させることにより、フルオロフォアをクエンチャーから連絡切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＨＩＩである。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡ又はｃＤＮＡ増幅産物のレベル又は活性を判定するために培養物を分析することは、フルオロフォアの蛍光を検出すること又は蛍光定量読み取り値を取得することをさらに含む。
【００４６】
[0046]  上記方法のいくつかの実施形態では、該方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸である二次マーカーを検出することにより検出結果を検証することをさらに含んでもよい。初期検出が検証されるような実施形態では、二次核酸マーカーは、ゲル電気泳動、核酸増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はそれらの組み合わせを用いて検出されてもよい。
【００４７】
[0047]  本発明の１以上の実施形態の詳細は、貼付の図面／表及び以下の説明において示される。本発明の他の特徴、対象、及び利点は、図面／表及び詳細な説明から、且つ特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
図面の簡単な説明
【図１】[0048]本明細書に記載のような分子内で消光される基質の代表的図面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
[0049]  本明細書に記載の実施形態は、組換えバクテリオファージを用いて細菌感染病原体及び疾患を診断又は検出するための方法及びアッセイを提供する。該方法は、細菌感染病原体の検出、さらにはかかる感染病原体の薬剤耐性を判定することに適する。さらに、該方法は、抗菌剤に対する感染病原体の感受性に関する情報を提供するために用いられる。
【００５０】
Ａ．感染性細菌
[0050]  本質的に任意の細菌が検出可能であり、該方法及び組成物は、細菌の抗生物質感受性を判定するため、又は標的細菌に対して望ましい（例えば、抗菌性又は細胞傷害性）効果を果たす候補抗生剤をスクリーニングするため、用いることができる。
【００５１】
[0051]  一実施形態では、細菌はグラム陰性細菌である。典型的なグラム陰性細菌は、プロテオバクテリア、例えば、大腸菌(E. coli)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、及びヘリコバクター(Helicobacter)、並びにシアノバクテリアを含む。薬剤に関連して分類されるとき、それらは、呼吸器系の障害を引き起こす緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)及びインフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、泌尿器系の障害をもたらす大腸菌(Escherichia coli)及びプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、並びに消化器系の障害をもたらすヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)及びゲルトネル菌(Bacillus Gaertner)、並びに小球菌(micrococci)、例えば、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、カタル球菌(Moraxella catarrhalis)（例えば中枢神経系の障害をもたらす）、並びに淋菌(Neisseria gonorrhea)（生殖器系の障害をもたらす）を含む。
【００５２】
[0052]  別の実施形態では、細菌は、グラム陽性細菌である。「グラム陽性細菌」は、テイコ酸（例えば、リポテイコ酸及び／又は壁テイコ酸）、又はその細胞壁内の機能的等価物グリコポリマー（例えば、ラムノ多糖、テイクロン酸、アラビノガラクタン、リポマンナン、及びリポアラビノマンナン）を含む１又は複数の細菌を意味する。機能的等価物グリコポリマーの非限定例が、Weidenmaier et al., Nature, 6:276-287, 2008中に記載されている。機能的等価物グリコポリマーのさらなる例は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、グラム陽性細菌は、グラム染色法（例えば、一般に、クリスタルバイオレットで染色するステップ、ヨウ素溶液で処理するステップ、アルコールで脱色するステップ、及びサフラニンで対比染色するステップを含み、ここでグラム陽性細菌はバイオレット染色を保持する）を用いて同定される。グラム陽性細菌の非限定例が、本明細書に記載される。グラム陽性細菌のさらなる例は、当該技術分野で公知である。グラム陽性細菌を検出又は同定するための代表的方法が、本明細書に記載される。グラム陽性細菌を検出又は同定するためのさらなる方法は、当該技術分野で公知である。
【００５３】
[0053]  標的細菌は、哺乳動物宿主（例えば、ウシ、マウス、ウマ、霊長類、ネコ、イヌ、及びヒト宿主）に感染する病原菌を含む。一実施形態では、細菌は、ヒト宿主に感染し、且つ／又は疾患を引き起こす。かかる病原菌の例として、例えば、バクテロイデス(Bacteroides)、クロストリジウム(Clostridium)、連鎖球菌(Streptococcus)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ヘモフィルス(Haemophilus)、レジオネラ(Legionella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、ビブリオ(Vibrio)、又はリステリア(Listeria)などの細菌種のメンバーが挙げられる。ヒト宿主において疾患を引き起こす病原菌のいくつかの臨床的に関連する例として、限定はされないが、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロバクター菌種(Enterobacter spp.)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・アムニゲナス(Enterobacter amnigenus)、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)、エンテロバクター・アラキディス(Enterobacter arachidis)、エンテロバクター・アスブリアエ(Enterobacter asburiae)、エンテロバクター・カンセロゲナス(Enterobacter cancerogenous)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター・コワニイ(Enterobacter cowanii)、エンテロバクター・ディソルベンス(Enterobacter dissolvens)、エンテロバクター・ジェルゴビアエ(Enterobacter gergoviae)、エンテロバクター・ヘルヴェティクス(Enterobacter helveticus)、エンテロバクター・ホルメシェイ(Enterobacter hormaechei)、エンテロバクター・インターメディウス(Enterobacter intermedius)、エンテロバクター・コベイ(Enterobacter kobei)、エンテロバクター・ルドウィギイ(Enterobacter ludwigii)、エンテロバクター・モリ(Enterobacter mori)、エンテロバクター・ニミプレッスラリス(Enterobacter nimipressuralis)、エンテロバクター・オリゼ(Enterobacter oryzae)、エンテロバクター・パルベリス(Enterobacter pulveris)、エンテロバクター・ピリヌス(Enterobacter pyrinus)、エンテロバクター・ラディシンシタンス(Enterobacter radicincitans)、エンテロバクター・テイロラエ(Enterobacter taylorae)、エンテロバクター・チュリセンシス(Enterobacter turicensis)、エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazakii)、エンテロバクター・ソリ(Enterobacter soli)、大腸菌(Escherichia coli)、腸内毒素原性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)(ETEC)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic Escherichia coli)、大腸菌(E. coli)O157:H7、野兎病菌(Francisella tularensis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ菌種(Klebsiella spp.)、クレブシエラ・グラニュロマティス(Klebsiella granulomatis)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena)、クレブシエラ・バリイコーラ(Klebsiella variicola)、在郷軍人病菌(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ライ菌(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、プロテウス(Proteus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ロッキー山紅斑熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、腸チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア菌種(Serratia spp.)、セラチア・アクアティリス(Serratia aquatilis)、セラチア・エントモフィラ(Serratia entomophila)、セラチア・フィカリア(Serratia ficaria)、セラチア・フォンティコーラ(Serratia fonticola)、セラチア・グロッシナエ(Serratia glossinae)、セラチア・グリメシイ(Serratia grimesii)、セラチア・リケファシエンス(Serratia liquefaciens)、霊菌(Serratia marcescens)、セラチア・ミオティス(Serratia myotis)、セラチア・ネマトディフィラ(Serratia nematodiphila)、セラチア・オドリフェラ(Serratia odorifera)、セラチア・プリムシカ(Serratia plymuthica)、セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)、セラチア・キニボランス(Serratia quinivorans)、セラチア・ルビダエア(Serratia rubidaea)、セラチア・シンバイオティカ(Serratia symbiotica)、セラチア・ウレイリティカ(Serratia ureilytica)、セラチア・ヴェスペルティリオニス(Serratia vespertilionis)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、ボイド赤痢菌(Shigella boydii)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)、腐性ブドウ球菌(Staphylococcus saprophyticus)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (MRSA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) (VSA)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae) 、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae) 、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes) 、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、及びペスト菌(Yersinia pestis)が挙げられる。
【００５４】
[0054]  別の実施形態では、感染性細菌は、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、カルバペネム耐性腸内細菌科(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae)（ＣＲ−クレブシエラ菌種(CR-Klebsiella spp)；ＣＲ−大腸菌(CR-E. coli)）、及び淋菌(Neisseria gonorrhoeae)からなる群から選択される。別の実施形態では、感染性細菌は、多剤耐性アシネトバクター(multidrug-resistant Acinetobacter)、薬剤耐性カンピロバクター(drug-resistant Campylobacter)、拡張スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生腸内細菌科(β-Lactamase (ESBL)-producing enterobacteriaceae)、バンコマイシン耐性腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus)、多剤耐性緑膿菌(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa)、薬剤耐性非チフス性サルモネラ(drug-resistant non-typhoidal Salmonella)、薬剤耐性チフス菌(drug-resistant Salmonella enterica serovar Typhi)、薬剤耐性シゲラ(drug-resistant Shigella)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (MRSA)、薬剤耐性肺炎球菌(drug-resistant Streptococcus pneumoniae)、及び薬剤耐性結核菌(drug-resistant M.tuberculosis)からなる群から選択される。別の実施形態では、感染性細菌は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus)、エリスロマイシン耐性Ａ群連鎖球菌(erythromycin-resistant Group A Streptococcus)、クリンダマイシン耐性Ｂ群連鎖球菌(clindamycin-Resistant Group B Streptococcus)からなる群から選択される。
【００５５】
[0055]  特定の実施形態では、感染病原体は、宿主対象において天然に見出される。別の実施形態では、感染病原体は、宿主対象に対して外来性である侵入種である。好ましくは、宿主は、哺乳類、例えば、齧歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオン動物、又は非家畜化又は野生動物である。一実施形態では、対象は、齧歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどであってもよい。別の実施形態では、対象は、家畜動物であってもよい。好適な家畜動物の非限定例として、ブタ、雌ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ及びアルパカを挙げてもよい。さらに別の実施形態では、対象は、コンパニオン動物であってもよい。コンパニオン動物の非限定例として、ペット、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、及びトリを挙げてもよい。さらに別の実施形態では、対象は、動物学的動物であってもよい。本明細書で用いられるとき、「動物学的動物」は、動物園内で見出されてもよい動物を指す。かかる動物は、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミ、及びクマを含んでもよい。例示的な実施形態では、対象はヒトである。
【００５６】
[0056]  該方法は、種々のサンプル、例えば、生体サンプル、研究試験サンプル、環境サンプル（水の自然体、池、公共貯水槽、レクリエーション水、水泳プール、ホワールプール、温水浴槽、温泉、親水公園、天然に存在する新鮮水、及び海洋表層水から選択される水サンプルを含む水サンプルなど）及び工業サンプル（発酵接種材料など（ラクトバクテリア(Lactobacteria)など）、化学試薬、培地、清浄液）などの中に含有される感染病原体を分析するため、用いられてもよい。
【００５７】
[0057]  好ましくは、サンプルは、体液、例えば、痰、涙、唾液、汗、粘液、血清、精液、尿、便、嘔吐物、及び血液を含む生体サンプルである。サンプルは、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、血清、リンパ、肺洗浄液、胸水などを含んでもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、任意の公知の装置又は方法、例えば、スワブ、尿道カテーテル、吸引器、皮下針、細針生検、中空針生検、パンチ生検、代謝ケージ、及び注射器を用いて、対象から得られてもよい。
【００５８】
[0058]  いくつかの実施形態では、生体サンプルは、本明細書に記載の方法において用いるため、処理される。非限定例として、痰又は気道表面液（ＡＳＦ）が適切な容器、例えば滅菌検体バイアルに収集される。サンプルは、例えば、約６０％の最終濃度までアセトニトリルを用いて、約０．１％の最終濃度までトリフルオロ酢酸を用いて、又はＮ−アセチルシステインを用いて可溶化される。
【００５９】
[0059]  特定の実施形態では、生体サンプルは、その中に含有される細菌を培養するように操作されてもよい。用語「培養物」は、培養細胞、培養上清、それらの混合物、又は液体培地が用いられる場合には培養濾液、のいずれかを意味し；固形培地が用いられる場合、用語「培養物」は、細胞とそれらが増殖している培地の混合物を意味する。例えば、液体培地が用いられる場合、マーカーは、以下の手順により培養混合物から回収されてもよい。細菌の完全増殖が達成されるとき、培養混合物は抗生物質及び／又はファージによる処置を受ける。かかる下流プロセスは、汚染物質から遊離された粗細菌調製物を得るため、遠心分離又は濾過を含む１回以上の洗浄及び／又は分離ステップにより介入されてもよい。マーカーは、細胞レベル（例えば原位置）で、又は培養物に対してさらなる処理を実施後、検出又は分析されてもよい。例えば、マーカーがサイトゾル内のタンパク質又はＤＮＡである場合、それらは粉砕又は超音波処理などの好適な方法を用いて細胞を破壊することにより抽出されてもよい。細胞を破壊するため、細胞は培地中で超音波処理が直接的に施されてもよく、また処理溶液から任意の不溶性物質を除去することにより、粗酵素溶液を得てもよい。
【００６０】
[0060]  固形培地上で培養が実施される場合、マーカーは、培養細胞を含有する固形培地に水が添加され、且つ任意の不溶性物質が、超音波処理などの好適な手段により、細胞を破壊して直ぐ又は破壊した後のいずれかに混合物から除去されるといった手順を用いて、まず培養物を操作することにより分析されてもよい。粗製マーカー調製物は、通常の精製技術、例えば、有機溶媒分画、硫安分画、透析、等電沈殿及びカラムクロマトグラフィー（独立又は組み合わせのいずれかで用いられてもよい）により、粗可溶化液から単離されてもよい。マーカーのレベル又は活性は、通常の方法、例えば、酵素様マーカー(enzyme-like markers)における酵素アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅などを用いて判定されてもよい。
【００６１】
[0061]  対象に応じて、細胞培養物は、通常の技術を用いて分析されてもよい。例えば、細菌は、対数期（ＭＳＳＡ  ＵＳＡ３００及びＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）まで培養されてもよく、ピーク対数期は、通常の技術、例えば分光光度法を用いて検出されてもよい。対数期細菌の使用は、それらがアドヘシンのより高い発現に起因して接着性である可能性が高まり、それらのペプチドグリカン層が定常期の細胞と比べて架橋性が低下し、濃い可能性が高く、また細胞における代謝活性が高まり、損傷に対してより迅速に応答可能になることから好ましいことがある。しかし、最適条件は、株間で変動してもよい。異なる株が臨床状況下で遭遇機会が多いことから、この情報は、診断方法の有用性を評価するために重要である。本明細書で株間の変動性が生じることが考察されるが、すべての株を試験するための単一プロトコルの使用を可能にするように細菌が十分類似的に振舞うことが予想される。この予想は、細菌ファミリー（例えば、ブドウ球菌(staphylococci)）が遺伝的に互いにかなり類似しており、それ故、特定のファージに対するそれらの応答性における主要成分となるような類似的な細胞構造を有するという事実に基づく。
【００６２】
[0062]  いくつかの実施形態では、該方法及び組成物は、微生物、例えば細菌の感受性の判定にとって有用である。本明細書で用いられるとき、用語「感受性」は、細菌細胞が抗生物質によって影響される程度を指す。即ち、細胞は、全く影響されなくてもよい、殺滅されることなく、その成長及び増殖が緩徐化若しくは停止されてもよい、又は殺滅されてもよい。感受性はまた、細菌種又は株の集団が抗生物質による影響を受ける程度を指す。この場合、集団の特定の高度感受性細胞は、非常に感受性が高くてもよく、且つ非常に低い濃度の抗生物質により殺滅されてもよく、他の感受性がより低い細胞は、それらの成長及び増殖が緩徐化されていてもよく、他方で全く影響されなくてもよい。
【００６３】
[0063]  関連実施形態では、該方法及び組成物は、抗菌剤又は抗生物質に対する微生物、例えば細菌の耐性を同定するために有用である。本明細書における用語「抗生物質に耐性がある」は、特定の細菌株、多くは突然変異体株が殺滅されない、又は株の由来元である対応する野生型株と比べて有意により緩徐に殺滅されることを意味する。耐性はまた、突然変異株及び野生型株の改変された成長特性によって反映されうる。例えば、培地中の低濃度の抗生物質は、野生型株の成長を阻止する又は有意に低減することになる一方で、突然変異株の成長は影響されない。耐性株の表現型、例えば、改変された成長、細胞分裂、代謝、バイオフィルム生成、病原性などは、例えば、測定中のパラメータにおける変化を評価するため、同一条件下で、成長する野生型及び突然変異体株に対して、通常の技術を用いて判定されてもよい。感受性株は、耐性の評価における参照標準（陽性対照）として用いてもよい。
【００６４】
[0064]  一実施形態では、該方法は、細菌サンプルを抗生物質の存在下及び不在下で培養することにより実施される。培地又は発酵培地は、各株の要件を満たすように修飾又は調整されてもよい。様々な微生物に対する培地の説明は、米国細菌学協会（American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)の“Manual of Methods for General Bacteriology”に提示されている。培地及び発酵培地又は媒体という用語は、互換可能である。
【００６５】
[0065]  培地は、その最も簡単な意味で、少なくとも１つの炭素源（例えばグルコース）及び少なくとも１つの窒素源（例えば硝酸塩）を、任意選択的にはリン供給源、例えば、リン酸、リン酸カリウム又は他のリン酸塩と一緒に含有する。好ましくは、培養培地は、細菌増殖のために緩衝される。培地は、増殖及び／又は代謝活性を促進する、塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄などの金属の塩化物又は硫酸塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などをさらに含んでもよい。最後に、必須の増殖因子、例えばアミノ酸、例えばホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチン又はパントテン酸が、必要性に応じて培地に添加されてもよい。米国特許第９，０７４，２２９号を参照されたし。
【００６６】
[0066]  細菌を含有するスターターサンプルが、単一バッチの形態で培養物に添加されてもよく、又は培養中、好適な様式で、例えば、２〜４時間ごと若しくは１〜３時間ごと、又は１、２、３、若しくは４時間ごとに供されてもよい。
【００６７】
[0067]  培養物のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくは水性アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸若しくは硫酸などの酸性化合物を好適な様式で利用することにより制御されうる。一般に、ｐＨは、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。泡沫化を制御するため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を利用することは可能である。細菌の安定性を維持するため、培地に好適な選択的物質、例えばイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの誘導因子などを添加することは可能である。発酵は、好ましくは好気性条件下で実施される。これらの条件を維持するため、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気などが培養物に導入される。バッチ又はフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、微生物の所望される密度の量に達するまで継続される。検出は、分光光度的に実施される（吸収、蛍光）。この目標は、通常は２時間から１６０時間以内に達成される。連続プロセスでは、培養時間の長期化が可能である。微生物の活性は、発酵培地中及び／又は微生物の細胞内での様々なマーカーの濃縮（蓄積）をもたらす。
【００６８】
[0068]  好適な発酵培地の例が、特に米国特許第５，７７０，４０９号；米国特許第５，２７５，９４０号；米国特許第５，８２７，６９８号；米国特許第５，７５６，３４５号；及び国際公開第２００７／０１２０７８号及び国際公開第２００９／０４３８０３号において見出されうる。
【００６９】
Ｂ．抗生物質
[0069]  上記の培地は、抗生物質が添加されても又は添加されなくてもよい。本明細書で用いられるとき、用語「抗生物質」又は「抗菌剤」は、微生物の増殖を阻害する又は微生物を破壊する物質を指す。好ましくは、抗生物質は、感染病原体の病原性を抑制し、且つ／又は感染性疾患を治療するのに有用である。抗生物質はまた、微生物、例えば酵母又は真菌によって生成された天然形態が後に構造的に修飾される場合の半合成物質を指す。
【００７０】
[0070]  別の実施形態では、培地には、プロバイオティック物質が添加されてもよい又は添加されなくてもよい。本明細書で用いられるとき、用語「プロバイオティック」は、微生物の増殖又は代謝活性を促進する物質、例えば微量栄養素、増殖誘導物質、又は毒素を除去する物質を指す。
【００７１】
[0071]  好ましくは、抗生物質は、β−ラクタム（β−ラクタマーゼ阻害剤及びセファロスポリンを含む）、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン及び／又はグリシルサイクリン及び／又はポリミキシンからなる群から選択される。抗菌剤、例えば、少なくとも１つのβ−ラクタム及び少なくとも１つのフルオロキノロン；少なくとも１つのアミノグリコシド及び１つのセファロスポリン；少なくとも１つのβ−ラクタム及び１つのβ−ラクタマーゼ阻害剤の、任意選択的にはアミノグリコシドなどを伴う任意の組み合わせもまた、試験されてもよい。
【００７２】
[0072]  本明細書で用いられるとき、用語「β−ラクタム」は、その分子構造中にβ−ラクタム環を有する任意の抗生剤を指す。代表例として、天然及び半合成のペニシリン及びペニシリン誘導体、クラブラン酸、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン並びにモノバクタムが挙げられる。これらの薬剤は、広義には「β−ラクタマーゼ」と称される酵素により代謝される。β−ラクタマーゼは、４つの分子クラス（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）に組織化される。クラスＡ酵素は、優先的にペニシリンを加水分解し；クラスＢ酵素は、それ以外よりも広範な基質特性を有する金属酵素を含み；クラスＣ酵素は、グラム陰性細菌の種々の抗生物質に対する耐性に関与し；且つクラスＤ酵素は、固有の基質特性を呈するセリンヒドロラーゼである。
【００７３】
[0073]  一般に、β−ラクタムは、そのコア環構造に基づいて分類及びグループ化され、ここで各グループは、異なるカテゴリーに分割されてもよい。用語「ペナム」は、ペニシリン抗生物質のメンバーのコア骨格を記述するために用いられ、例えばチアゾリジン環を有するβ−ラクタムが挙げられる。ペニシリンは、狭域ペニシリン、例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン及びオキサシリンを含んでもよい。狭域ペニシリナーゼ耐性ペニシリンとして、例えば、メチシリン、ジクロキサシリン及びフルクロキサシリンが挙げられる。狭域βラクタマーゼ耐性ペニシリンは、テモシリンを含んでもよい。中域ペニシリンとして、例えばアモキシシリン及びアンピシリンが挙げられる。広域ペニシリンは、コ−アモキシクラブ（アモキシシリン＋クラブラン酸）を含む。最後に、ペニシリングループはまた、拡張スペクトルペニシリン、例えば、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン及びピペラシリンを含む。合成ペニシリン誘導体として、例えばファロペネムが挙げられる。
【００７４】
[0074]  ピロリジン環を有するβ−ラクタムは、カルバペナム(carbapenams)と称される。カルバペネムグループは、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム及びＰＺ−６０１を含む。
【００７５】
[0075]  セファロスポリン及びセファマイシンは、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロール、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフォタキシム、及びセフポドキシムを含む。グラム陽性細菌に対して活性がある第４世代セファロスポリンは、セフェピム及びセフピロムを含む。セファロスポリンクラスは、セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピム及びセフピロムをさらに含んでもよい。セファマイシンとして、例えば、セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾール及びフロモキセフが挙げられる。
【００７６】
[0076]  カルバセフェムの例として、ロラカルベフが挙げられる。グラム陰性細菌に対して活性があるモノバクタムとして、例えば、チゲモナム、ノカルディシンＡ及びタブトキシンが挙げられる。合成セフェムとして、例えばクラブラン酸及びオキサセフェム、例えばモキサラクタム及びフロモキセフが挙げられる。
【００７７】
[0077]  フルオロキノロンは、細菌ＤＮＡの複製にとって必須である酵素を阻害することにより作用する。代表例として、シプロフロキサシン、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、及びモキシフロキサシンが挙げられる。
【００７８】
[0078]  アミノグリコシドは、大部分のグラム陰性好気性及び通性嫌気性桿菌(aerobic and facultative anaerobic bacilli)に対する殺菌活性を有する。代表例として、例えば、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）及びストレプトマイシン、例えば、合成誘導体クラリスロマイシン及びアジスロマイシンが挙げられる。
【００７９】
[0079]  テトラサイクリンは、オクタヒドロテトラセン−２−カルボキサミド骨格を有するポリケタイドのサブクラスである。それらは、天然（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン）又は半合成（例えば、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン）であってもよい。グリシルサイクリン（例えば、ミノサイクリン／チゲサイクリン）は、テトラサイクリンに由来する。
【００８０】
[0080]  ポリミキシンは、大腸菌(E. coli)及び緑膿菌(P. aeruginosa)などのグラム陰性細菌に対して活性があるポリペプチド抗生物質である。ポリミキシンＢ及びポリミキシンＥ（コリスチン）のみが臨床的に用いられる。
【００８１】
[0081]  該方法の実施において、培地は、上記の抗生物質の１以上が添加されてもよい。抗生物質の濃度は、抗生物質及び試験株のタイプに応じて変動してもよい。好ましくは、抗生物質の用量は、特定株に対する特定の抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）以上である。ＭＩＣを決定するための方法は、当該技術分野で公知である（Andrews et al., J Antimicrob Chemother., 48 Suppl 1:5-16, 2001を参照）。４つの細菌種（大腸菌(E. coli)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、緑膿菌(P. aeruginosa)、及びフェカリス菌(E. faecalis)）に対する約４０の抗菌剤におけるＭＩＣの代表的チャートが、“Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by broth dilution”という表題でEuropean Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)によって公表された報告書の表３に示されている(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases CMI, 9, 1-7, 2003)。
【００８２】
[0082]  一般に、抗生物質の濃度は、例えば、ベースラインＭＩＣを少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも３００倍又はさらに１０００倍上回るような耐性菌を同定又は検出するため、増加させてもよい。これは、標的細菌及び該細菌に対する抗生物質のＭＩＣが既知である場合の事例では特に有効である。例えば、大腸菌(E. coli)においては、大部分の抗生物質におけるＭＩＣは、約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの範囲であってもよいが；耐性菌は、濃度がベースラインレベルよりも例えば１０倍（即ち、１ｌｏｇ倍）〜１０００倍（即ち、３−ｌｏｇ倍）高く増加するまで、感受性を示さなくてもよい。したがって、最終抗生物質濃度は、これに関連して調節されてもよい。
【００８３】
[0083]  真に例示を目的として、以下の用量が用いられてもよい、即ち、アモキシシリンなどのβ−ラクタムに対する細菌の耐性を試験するため、濃度は約２ｍｇ／Ｌ〜約４０ｍｇ／Ｌ、特に約５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌの範囲であってもよい。米国特許第９，３４７，８８８号を参照されたし。他方、クロキサシリンに対する細菌の耐性を試験するため、濃度は約２５ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌの間の範囲であってもよい。カルバペネムにおいては、濃度は０．０５〜３２ｍｇ／Ｌの間の範囲であってもよい。これは、ファロペネムに対して約２ｍｇ／Ｌ〜約３２ｍｇ／Ｌの間の範囲、またドリペネムに対して約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌの範囲を含む（Woodman et al., J Med Microbiol., 19(1):15-23, 1983を参照）。セファロスポリンにおいては、濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌの間、好ましくは約４ｍｇ／Ｌ〜約１６ｍｇ／Ｌの範囲であってもよい（Waterworth, J Clin Pathol, 35:1177-1180, 1982を参照）。
【００８４】
[0084]  より詳細には、抗生物質は、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、１７μｇ／ｍＬ、１８μｇ／ｍＬ、１９μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２１μｇ／ｍＬ、２２μｇ／ｍＬ、２３μｇ／ｍＬ、２４μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、２６μｇ／ｍＬ、２７μｇ／ｍＬ、２８μｇ／ｍＬ、２９μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３１μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、３３μｇ／ｍＬ、３４μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、３６μｇ／ｍＬ、３７μｇ／ｍＬ、３８μｇ／ｍＬ、３９μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４１μｇ／ｍＬ、４２μｇ／ｍＬ、４３μｇ／ｍＬ４４μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍ、９０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、又はそれ以上のいずれか１つの濃度で用いられてもよい。例えば、イミペネム及びエルタペネムは、５０、３０、２０、１５、１０、５及び１μｇ／ｍＬの濃度で用いられてもよい。用量は、例えば野生型株に対するＭＩＣをまず決定し（組み合わせ薬剤）、耐性株を同定するために用量を漸増させることにより、抗生物質の組み合わせに対して同様に調節されてもよい。
【００８５】
[0085]  細菌は、特定期間、例えば、０〜２時間の間、２時間〜１６０時間、特に８時間〜２４時間の間、特に１０時間〜１６時間の間、抗生物質の存在下又は不在下で培養される。細菌は、バクテリオファージとの接触に先立ち、それらの増殖期又は定常期であってもよい。増殖期は、培養下の細胞の数が指数関数的に増加するような細胞倍加によって特徴づけられる期間である。定常期は、新しい細菌の増殖と老化細胞の死滅の双方から生じるが、必須栄養素の枯渇又は老廃物の蓄積などの増殖制限因子に起因することが多い。好ましくは、細菌は、バクテリオファージの接種前の増殖期に存在する。細菌の増殖期を決定するための方法は、当該技術分野で公知である。Hall et al., Mol Biol Evol., 31(1):232-8, 2014を参照されたし。
【００８６】
[0086]  一実施形態では、細菌は、バクテリオファージの接種前に抗生物質で処置される。一次培養物は、任意選択的には、接種前に、例えば洗浄緩衝液で洗浄されてもよい。生存培養物の密度に応じて、一次培養物又は（一次培養物の遠心分離後に得られた）その洗浄ペレットは、バクテリオファージが接種されている新しい天然培地（又は抗生物質を含有する培地）中で再成長されてもよい。
【００８７】
[0087]  別の実施形態では、細菌は、抗生剤での処置と同時に、バクテリオファージが接種される。この実施形態は、特に非溶解ファージに適していてもよい。
【００８８】
Ｃ．ファージ
[0088]  本方法の実施形態では、宿主特異的バクテリオファージが利用される。本明細書で用いられるとき、用語「バクテリオファージ」は、当該技術分野で理解されているようなその通常の意味を有し、例えば１以上の細菌に選択的に感染するウイルスが挙げられる。多数のバクテリオファージが、細菌の特定の属又は種又は株に特異的である。用語「バクテリオファージ」は、用語「ファージ」と同義である。バクテリオファージは、限定はされないが、以下のウイルスファミリー：コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、マイオウイルス科(Myoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、シホウイルス科(Siphoviridae)、又はテクティウイルス科(Tectiviridae)のいずれかに属するバクテリオファージを含んでもよい。バクテリオファージは、溶解バクテリオファージ又は温帯バクテリオファージ又は糸状バクテリオファージであってもよい。溶解バクテリオファージは、溶原経路に侵入するのではなく、溶菌サイクルの完了に至るまでの溶解経路に従うものである。溶解バクテリオファージは、ウイルス複製を経て、細胞膜の溶解、細胞の破壊、及び他の細胞に感染する能力がある子孫バクテリオファージ粒子の放出をもたらす。温帯バクテリオファージは、バクテリオファージが溶菌サイクルの完了前に至る細胞のゲノムの休止状態の受動的部分になるような溶原経路に侵入する能力があるものである。糸状バクテリオファージは、長いフィラメントにパッケージングされた環状一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。これらのファージは、細菌を溶解することにより再生しないばかりか、宿主を殺滅することなく環境に分泌される。
【００８９】
[0089]  一実施形態では、ファージは、溶解又は増殖ファージ（例えば、T4、T7、T3、及びMS2）である。別の実施形態では、ファージは、温帯又は溶原性ファージ（例えば、λファージ）である。さらに別の実施形態では、ファージは、糸状ファージ（例えば、f1、fd、及びM13）である。また、様々なファージの組み合わせが用いられてもよい。ファージディスプレイ技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，６８５，８９３号；米国特許第７，８１１，９７３号；及び米国特許出願公開第２００２−００４４９２２号が挙げられる。好ましくは、ファージは、宿主細菌を形質転換する能力がある。本明細書で用いられるとき、用語「形質転換」は、ＤＮＡの宿主細胞への導入により、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体組込みにより複製されうることを意味する。即ち、形質転換は、外来ＤＮＡを細胞に導入することによる遺伝子の合成改変を指す。当該技術分野で認識されている通り、大部分の細菌のＤＮＡは、細菌染色体と称される単一環状分子及び１以上のプラスミドの中に含有される。
【００９０】
[0090]  ファージは、天然ファージに対して外来の遺伝子に対するベクターとして役立つ改変又は組換えバクテリオファージである。本明細書で用いられるとき、用語「組換えファージ」又は「改変ファージ」は、天然に存在していない核酸配列を有するもの又は２つの通常は分離された配列のセグメントの人工的組み合わせによって作成される配列を有するものである。この人工的組み合わせは、核酸の単離されたセグメントの化学合成又は人工的操作により、例えば遺伝子工学技術又はＤＮＡ転位の使用により達成されてもよい。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によってコードされるものである。組換えバクテリオファージという用語は、専ら核酸の挿入により、例えばレポーター又は指標分子として役立つ異種タンパク質をコードする核酸を挿入することにより、改変されているバクテリオファージを含む。
【００９１】
[0091]  特定の実施形態では、ファージは、精製ファージである。精製されたという用語は、絶対純度を必要としないばかりか、相対的な用語が意図されている。精製分子は、分子がその天然環境下にある場合よりも濃縮される場合のもの、例えば分子がサンプル中の類似分子の総含量の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％又はそれ以上の含量を表す場合の調製物である。例えば、組換えファージの精製サンプルは、組換えファージがサンプル中の全バクテリオファージの少なくとも５０％を表す場合のものである。
【００９２】
[0092]  病原菌属及びそれらの公知の宿主特異的バクテリオファージのリストが、以下の段落中に提示され、細菌−ファージ対の好ましいタイプが表１〜３に提示される。異名や綴りの異なるものが括弧内に示される。異物同名は、それらが生じるたびごとに反復される（例えば、D,D,d）。名称のないファージは、それらの属に「NN」を添えることにより示される。
【００９３】
[0093]  アクチノマイセス(Actinomyces)属の細菌は、ファージ：Av-1、Av-2、Av-3、BF307、CT1、CT2、CT3、CT4、CT6、CT7、CT8及び1281によって感染される。
【００９４】
[0094]  アエロモナス(Aeromonas)属の細菌は、ファージ：AA-1、Aeh2、N、PM1、TP446、3、4、11、13、29、31、32、37、43、43-10T、51、54、55R 1、56、56RR2、57、58、59.1、60、63、Aeh1、F、PM2、1、25、31、40RR2.8t、(syn=44R)、(syn=44RR2.8t)、65、PM3、PM4、PM5及びPM6によって感染される。
【００９５】
[0095]  バチルス(Bacillus)属の細菌は、ファージ：A、aiz1、Al-K-I、B、BCJA1、BC1、BC2、BLL1、BL1、BP142、BSL1、BSL2、BS1、BS3、BS8、BS15、BS18、BS22、BS26、BS28、BS31、BS104、BS105、BS106、BTB、B1715V1、C、CK-1、Col1、Cor1、CP-53、CS-1、CS1、D, D, D, D5、ent1、FP8、FP9、PS1、FS2、FS3、FS5、FS8、FS9、G、GH8、GT8、GV-1、GV-2、GT-4、g3、g12、g13、g14、g16、g17、g21、g23、g24、g29、H2、ken1、KK-88、Kum1、Kyu1、J7W-1、LP52、(syn=LP-52)、L7、Mex1、MJ-1、mor2、MP-7、MP10、MP12、MP14、MP15、Neo1、No 2、N5、N6P、PBC1、PBLA、PBP1、P2、S-a、SF2、SF6、Sha1、Sil1、SPO2、(syn=ΦSPP1)、SPβ、STI、ST1、SU-11、t、Tb1、Tb2、Tb5、Tb10、Tb26、Tb51、Tb53、Tb55、Tb77、Tb97、Tb99、Tb560、Tb595、Td8、Td6、Td15、Tg1、Tg4、Tg6、Tg7、Tg9、Tg10、Tg11、Tg13、Tg15、Tg21、Tin1、Tin7、Tin8、Tin13、Tm3、Toc1、Tog1、tol1、TP-1、TP-10vir、TP-15c、TP-16c、TP-17c、TP-19、TP35、TP51、TP-84、Tt4、Tt6、type A、type B、type C、type D、type E、Tφ3、VA-9、W、wx23、wx26、Yun1、α、γ、ρ11、φmed-2、φT、φμ-4、φ3T、φ75、φ105、(syn=φ105)、1A、1B、1-97A、1-97B、2, 2, 3, 3, 3, 5、12、14、20、30、35、36、37、38、41C、51、63、64、138D、I、II、IV、NN-Bacillus (13)、ale1、AR1、AR2、AR3、AR7、AR9、Bace-11、(syn=11)、Bastille、BL1、BL2、BL3、BL4、BL5、BL6、BL8、BL9、BP124、BS28、BS80、Ch、CP-51、CP-54、D-5、dar1、den1、DP-7、ent2、FoS1、FoS2、FS4、FS6、FS7、G、gal1、gamma、GE1、GF-2、GS1、GT-1、GT-2、GT-3、GT-4、GT-5、GT-6、GT-7、GV-6、g15、I9、I10、IS1、K、MP9、MP13、MP21、MP23、MP24、MP28、MP29、MP30、MP32、MP34、MP36、MP37、MP39、MP40、MP41、MP43、MP44、MP45、MP47、MP50、NLP-1、No. 1、N17、N19、PBS1、PK1、PMB1、PMB12、PMJ1、S、SPO1、SP3、SP5、SP6、SP7、SP8、SP9、SP10、SP-15、SP50、(syn=SP-50)、SP82、SST、sub1、SW、Tg8、Tg12、Tg13、Tg14、thu1、thu4、thu5、Tin4、Tin23、TP-13、TP33、TP50、TSP-1、type V、type VI、V、Vx、β22、φe、φNR2、φ25、φ63、1, 1, 2, 2C、3NT、4、5、6、7、8、9、10、12、12、17、18、19、21、138、III、4 (B.メガテリウム（B. megaterium）)、4 (B. スファエリカス（B. sphaericus）、AR13、BPP-10、BS32、BS107、B1、B2、GA-I、GP-10、GV-3、GV-5、g8、MP20、MP27、MP49、Nf、PP5、PP6、SF5、Tg18、TP-1、Versailles、φ15、φ29、1-97、837/IV、NN-Bacillus (1)、Bat10、BSL10、BSL11、BS6、BS11、BS16、BS23、BS101、BS102、g18、mor1、PBL1、SN45、thu2、thu3、Tm1、Tm2、TP-20、TP21、TP52、type F、type G、type IV、NN-Bacillus (3)、BLE、(syn=θc)、BS2、BS4、BS5、BS7、B10、B12、BS20、BS21、F、MJ-4、PBA12、AP50、AP50-04、AP50-11、AP50-23、AP50-26、AP50-27及びBam35によって感染される。以下のバチルス(Bacillus)に特異的なファージ：DLP10716、DLP-11946、DPB5、DPB12、DPB21、DPB22、DPB23、GA-2、M、No. 1M、PBLB、PBSH、PBSV、PBSW、PBSX、PBSY、PBSZ、phi、SPα、type 1及びμは欠損する。
【００９６】
[0096]  バクテリオデス(Bacteriodes)属の細菌は、ファージ：ad12、Baf-44、Baf-48B、Baf-64、Bf-1、Bf-52、B40-8、F1、β1、φA1、φBr01、φBr02、11、67.1、67.3、68.1、NN-Bacteroides (3)、Bf42、Bf71、及びBF-41によって感染される。
【００９７】
[0097]  ボルデテラ(Bordetella)属の細菌は、ファージ：134及びNN-Bordetella (3)によって感染される。
【００９８】
[0098]  ボレリア(Borrelia)属の細菌は、ファージ：NN-Borrelia (1) 及びNN-Borreliaによって感染される。
【００９９】
[0099]  ブルセラ(Brucella)属の細菌は、ファージ：A422、Bk、(syn=Berkeley)、BM29、FO1、(syn=FO1)、(syn=FQ1)、D、FP2、(syn=FP2)、(syn=FD2)、Fz、(syn=Fz75/13)、(syn=Firenze 75/13)、(syn=Fi)、F1、(syn=F1)、F1m、(syn=F1m)、(syn=Fim)、F1U、(syn=F1U)、(syn=FiU)、F2、(syn=F2)、F3、(syn=F3)、F4、(syn=F4)、F5、(syn=F5)、F6、F7、(syn=F7)、F25、(syn=F25)、(syn=f25)、F25U、(syn=F25u)、(syn=F25U)、(syn=F25V)、F44、(syn=F44)、F45、(syn=F45)、F48、(syn=F48)、I、Im、M、MC/75、M51、(syn=M85)、P、(syn=D)、S708、R、Tb、(syn=TB)、(syn=Tbilisi)、W、(syn=Wb)、(syn=Weybridge)、X、3、6、7、10/1、(syn=10)、(syn=F8)、(syn=F8)、12m、24/II、(syn=24)、(syn=F9)、(syn=F9)、45/III、(syn=45)、75、84、212/XV、(syn=212)、(syn=F10)、(syn=F10)、371/XXIX、(syn=371)、(syn=F11)、(syn=P11)及び513によって感染される。
【０１００】
[0100]  バークホルデリア(Burkholderia)属の細菌は、ファージ：CP75によって感染される。
【０１０１】
[0101]  カンピロバクター(Campylobacter)属の細菌は、ファージ：C type、NTCC12669、NTCC12670、NTCC12671、NTCC12672、NTCC12673、NTCC12674、NTCC12675、NTCC12676、NTCC12677、NTCC12678、NTCC12679、NTCC12680、NTCC12681、NTCC12682、NTCC12683、NTCC12684、32f、111c、191、Vfi-6、(syn=V19)、Vfv-3、V2、V3、V8、V16、(syn=Vfi-1)、V19、V20(V45)、V45、(syn=V-45)及びNN-Campylobacter (1)によって感染される。
【０１０２】
[0102]  クラミジア(Chlamydia)属の細菌は、ファージ：Chp1によって感染される。
【０１０３】
[0103]  クロストリジウム(Clostridium)属の細菌は、ファージ：CAK1、CA5、Ca7、CEβ、(syn=1C)、CEγ、Cld1、c-n71、c-203 Tox-、DEβ、(syn=1D)、(syn=1Dtox+)、HM3、KM1、KT、Ms、NA1、(syn=Na1tox+)、PA1350e、
【数１】
2020535808.tif 000002
、PL73、PL78、PL81、P1、P50、P5771、P19402、1Ctox+、2Ctox-、2D、(syn=2Dtox+)、3C、(syn=3Ctox+)、4C、(syn=4tox+)、56、III-1、NN-Clostridium (61)、NB1tox-α1、CA1、HMT、HM2、PF1、P-23、P-46、Q-05、Q-06、Q-16、Q-21、Q-26、Q-40、Q-46、S111、SA02、WA01、WA03、W111、W523、80、C、CA2、CA3、CPT1、CPT4、c1、c4、c5、HM7、H11/A1、H18/A1、H22/S23、H158/A1、K2/A1、K21/S23、ML、NA2tox-、Pf2、Pf3、Pf4、S9/S3、S41/A1、S44/S23、α2、41、112/S23、214/S23、233/A1、234/S23、235/S23、II-1、II-2、II-3、NN-Clostridium (12)、CA1、F1、K、S2、1、5及びNN-Clostridium (8)によって感染される。
【０１０４】
[0104]  コリネバクテリウム(Corynebacterium)属の細菌は、ファージ：CGI1 (欠損)、A、A2、A3、A110、A128、A133、A137、A139、A155、A182、B、BF、B17、B18、B51、B271、B275、B276、B277、B279、B282、C、cap1、CC1、CG1、CG2、CG33、CL31、Cog、(syn=CG5)、D、E、F、H、H-1、hq1、hq2、I1/H33、I1/H33、J、K, K、(syn=Ktox-)、L, L、(syn=Ltox+)、M、MC-1、MC-2、MC-3、MC-4、MLMa、N、O、ov1、ov2、ov3、P, P, P、RP6、RS29、S、T、U、UB1、ub2、UH1、UH3、uh3、uh5、uh6、β、(syn=βtox+)、βlav64、βvir、γ、(syn=γtox-)、γ19、δ、(syn=δtox+)、ρ、(syn=ρtox-)、φ9、φ984、ω、1A、1/1180、2、2/1180、5/1180、5ad/9717、7/4465、8/4465、8ad/10269、10/9253、13/9253、15/3148、21/9253、28、29、55、2747、2893、4498及び5848によって感染される。
【０１０５】
[0105]  腸球菌(Enterococcus)属の細菌は、ファージ：DF78、F1、F2、1、2、4、14、41、867、D1、SB24、2BV、182、225、C2、C2F、E3、E62、DS96、H24、M35、P3、P9、SB101、S2、2BII、5、182a、705、873、881、940、1051、1057、21096C、NN-Enterococcus (1)、PE1、P1、F3、F4、VD13、1、200、235及び341によって感染される。
【０１０６】
[0106]  エリシペロスリクス(Erysipelothrix)属の細菌は、ファージ：NN-Erysipelothrix (1)によって感染される。
【０１０７】
[0107]  エシェリキア(Escherichia)属の細菌は、ファージ：BW73、B278、D6、D108、E、E1、E24、E41、FI-2、FI-4、FI-5、HI8A、HI8B、i、MM、Mu、(syn=mu)、(syn=Mu1)、(syn=Mu-1)、(syn=MU-1)、(syn=MuI)、(syn=mu)、O25、PhI-5、Pk、PSP3、P1、P1D、P2、P4 (欠損)、S1、Wφ、φK13、φR73 (欠損)、φ1、φ2、φ7、φ92、ψ (欠損)、7A、8φ、9φ、15 (欠損)、18、28-1、186、299、NN-Escherichia (2)、AB48、CM、C4、C16、DD-VI、(syn=Dd-Vi)、(syn=DDVI)、(syn=DDVi)、E4、E7、E28、F11、F13、H、H1、H3、H8、K3、M、N、ND-2、ND-3、ND4、ND-5、ND6、ND-7、Ox-1、(syn=OX1)、(syn=11F)、Ox-2、(syn=Ox2)、(syn=OX2)、Ox-3、Ox-4、Ox-S、(syn=OX5)、Ox-6、(syn=66F)、(syn=φ66t)、(syn=φ66t-)、O111、PhI-1、RB42、RB43、RB49、RB69、S、Sal-1、Sal-2、Sal-3、Sal-4、Sal-5、Sal-6、TC23、TC45、TuII*-6、(syn=TuII*)、TuII*-24、TuII*46、TuII*-60、T2、(syn=gamma)、(syn=γ)、(syn=PC)、(syn=P.C.)、(syn=T-2)、(syn=T2)、(syn=P4)、T4、(syn=T-4)、(syn=T4)、T6、T35、α1、1、1A、3、(syn=Ac3)、3A、3T+、(syn=3)、(syn=M1)、5φ、(syn=φ5)、9266Q、CFO103、HK620、J、K、K1F、m59、no. A、no. E、no. 3、no. 9、N4、sd、(syn=Sd)、(syn=SD)、(syn=Sd)、(syn=sd)、(syn=SD)、(syn=CD)、T3、(syn=T-3)、(syn=T3)、T7、(syn=T-7)、(syn=T7)、WPK、W31、ΔH、φC3888、φK3、φK7、φK12、φV-1、Φ04-CF、Φ05、Φ06、Φ07、φ1、φ1.2、φ20、φ95、φ263、φ1092、φI、φII、(syn=φW)、Ω8、1、3、7、8、26、27、28-2、29、30、31、32、38、39、42、933W、NN-Escherichia (1)、Esc-7-11、AC30、CVX-5、C1、DDUP、EC1、EC2、E21、E29、F1、F26S、F27S、Hi、HK022、HK97、(syn=ΦHK97)、HK139、HK253、HK256、K7、ND-1、no. D、PA-2、q、S2、T1、(syn=α)、(syn=P28)、(syn=T-1)、(syn=T1)、T3C、T5、(syn=T-5)、(syn=T5)、UC-1、w、β4、γ2、λ、(syn=lambda)、(syn=Φλ)、ΦD326、φγ、Φ06、Φ7、Φ10、φ80、χ、(syn=χ1)、(syn=φχ)、(syn=φχ1)、2、4、4A、6、8A、102、150、168、174、3000、AC6、AC7、AC28、AC43、AC50、AC57、AC81、AC95、HK243、K10、ZG/3A、5、5A、21EL、H19-f及び933Hによって感染される。
【０１０８】
[0108]  フソバクテリウム(Fusobacterium)属の細菌は、ファージ：NN-Fusobacterium (2)、fv83-554/3、fv88-531/2、227、fv2377、fv2527及びfv8501によって感染される。
【０１０９】
[0109]  ヘモフィルス(Haemophilus)属の細菌は、ファージ：HP1 (ヘモフィルス・ファージHP1)、S2及びN3によって感染される。
【０１１０】
[0110]  ヘリコバクター(Helicobacter)属の細菌は、ファージ：HP1 (ヘリコバクター・ピロリファージHP1)及びNN-Helicobacter (1)によって感染される。
【０１１１】
[0111]  クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌は、ファージ：AIO-2、Kl4B、Kl6B、Kl9、(syn=Kl9)、Kl14、Kl15、Kl21、Kl28、Kl29、Kl32、Kl33、Kl35、Kl106B、Kl171B、Kl181B、Kl832B、AIO-1、AO-1、AO-2、AO-3、FC3-10、K、Kl1、(syn=Kl1)、Kl2、(syn=K12)、Kl3、(syn=Kl3)、(syn=K170/11)、Kl4、(syn=Kl4)、Kl5、(syn=Kl5)、Kl6、(syn=Kl6)、Kl7、(syn=Kl7)、Kl8、(syn=K18)、Kl19、(syn=Kl9)、Kl27、(syn=K127)、Kl31、(syn=Kl31)、Kl35、Kl171B、II、VI、IX、CI-1、Kl4B、Kl8、Kl11、Kl12、Kl13、Kl16、Kl17、Kl18、Kl20、Kl22、Kl23、Kl24、Kl26、Kl30、Kl34、Kl106B、Kl165B、Kl328B、KLXI、K328、P5046、11、380、III、IV、VII、VIII、FC3-11、Kl2B、(syn=Kl2B)、Kl25、(syn=Kl25)、Kl42B、(syn=Kl42)、(syn=Kl42B)、Kl181B、(syn=Kl181)、(syn=Kl181B)、Kl765/1、(syn=Kl765/1)、Kl842B、(syn=Kl832B)、Kl937B、(syn=Kl937B)、L1、φ28、7、231、483、490、632及び864/100によって感染される。
【０１１２】
[0112]  レプトスピラ(Leptospira)属の細菌は、ファージ：LE1、LE3、LE4及びNN-Leptospira (1)によって感染される。
【０１１３】
[0113]  リステリア(Listeria)属の細菌は、ファージ：A511、O1761、4211、4286、(syn=BO54)、A005、A006、A020、A500、A502、A511、A118、A620、A640、B012、B021、B024、B025、B035、B051、B053、B054、B055、B056、B101、B110、B545、B604、B653、C707、D441、HSO47、H1OG、H8/73、H19、H21、H43、H46、H107、H108、H10、H163/84、H1312、H340、H387、H391/73、H684/74、H924A、PSA、U153、φMLUP5、(syn=P35)、00241、00611、02971A、02971C、5/476、5/911、5/939、5/11302、5/11605、5/11704、184、575、633、699/694、744、900、1090、1317、1444、1652、1806、1807、1921/959、1921/11367、1921/11500、1921/11566、1921/12460、1921/12582、1967、2389、2425、2671、2685、3274、3550、3551、3552、4276、4277、4292、4477、5337、5348/11363、5348/11646、5348/12430、5348/12434、10072、11355C、11711A、12029、12981、13441、90666、90816、93253、907515、910716及びNN-Listeria (15)によって感染される。
【０１１４】
[0114]  モルガネラ(Morganella)属の細菌は、ファージ：47によって感染される。
【０１１５】
[0115]  マイコバクテリウム(Mycobacterium)属の細菌は、ファージ：I3、AG1、AL1、ATCC 11759、A2、B.C3、BG2、BK1、BK5、butyricum、B-1、B5、B7、B30、B35、Clark、C1、C2、DNAIII、DSP1、D4、D29、GS4E、(syn=GS4E)、GS7、(syn=GS-7)、(syn=GS7)、IPα、lacticola、Legendre、Leo、L5、(syn=ΦL-5)、MC-1、MC-3、MC-4、minetti、MTPH11、Mx4、MyF3P/59a、phlei、(syn=phlei 1)、phlei 4、Polonus II、rabinovitschi、smegmatis、TM4、TM9、TM10、TM120、Y7、Y10、φ630、1B、1F、1H、1/1、67、106、1430、B1、(syn=Bol)、B24、D、D29、F-K、F-S、HP、Polonus I、Roy、R1、(syn=R1-Myb)、(syn=R1)、11、31、40、50、103a、103b、128、3111-D、3215-D及びNN-Mycobacterium (1)によって感染される。
【０１１６】
[0116]  ナイセリア(Neisseria)属の細菌は、ファージ：Group I、group II及びNP1によって感染される。
【０１１７】
[0117]  ノカルジア(Nocardia)属の細菌は、ファージ：P8、NJ-L、NS-8、N5及びNN-Nocardia (1)によって感染される。
【０１１８】
[0118]  プロテウス(Proteus)属の細菌は、ファージ：Pm5、13vir、2/44、4/545、6/1004、13/807、20/826、57、67b、78、107/69、121、9/0、22/608、30/680、Pm1、Pm3、Pm4、Pm6、Pm7、Pm9、Pm10、Pm11、Pv2、π1、φm、7/549、9B/2、10A/31、12/55、14、15、16/789、17/971、19A/653、23/532、25/909、26/219、27/953、32A/909、33/971、34/13、65、5006M、7480b、VI、13/3a、Clichy 12、π2600、φχ7、1/1004、5/742、9、12、14、22、24/860、2600/D52、Pm8及び24/2514によって感染される。
【０１１９】
[0119]  プロビデンシア(Providencia)属の細菌は、ファージ：PL25、PL26、PL37、9211/9295、9213/9211b、9248、7/R49、74761322、7478/325、7479、7480、9000/9402及び9213/9211aによって感染される。
【０１２０】
[0120]  シュードモナス(Pseudomonas)属の細菌は、ファージ：Pf1、(syn=Pf-1)、Pf2、Pf3、PP7、PRR1、7s、NN-Pseudomonas (1)、AI-1、M-2、B17、B89、CB3、Col 2、Col 11、Col 18、Col 21、C154、C163、C167、C2121、E79、F8、ga、gb、H22、K1、M4、N2、Nu、PB-1、(syn=PB1)、pf16、PMN17、PP1、PP8、Psa1、PsP1、PsP2、PsP3、PsP4、PsP5、PS3、PS17、PTB80、PX4、PX7、PYO1、PYO2、PYO5、PYO6、PYO9、PYO10、PYO13、PYO14、PYO16、PYO18、PYO19、PYO20、PYO29、PYO32、PYO33、PYO35、PYO36、PYO37、PYO38、PYO39、PYO41、PYO42、PYO45、PYO47、PYO48、PYO64、PYO69、PYO103、P1K、SLP1、SL2、S2、UNL-1、wy、Ya1、Ya4、Ya11、φBE、φCTX、φC17、φKZ、(syn=ΦKZ)、φ-LT、Φmu78、φNZ、φPLS-1、φST-1、φW-14、φ-2、1/72、2/79、3、3/DO、4/237、5/406、6C、6/6660、7、7v、7/184、8/280、9/95、10/502、11/DE、12/100、12S、16、21、24、25F、27、31、44、68、71、95、109、188、337、352、1214、NN-Pseudomonas (23)、A856、B26、CI-1、CI-2、C5、D、gh-1、F116、HF、H90、K5、K6、K104、K109、K166、K267、N4、N5、O6N-25P、PE69、Pf、PPN25、PPN35、PPN89、PPN91、PP2、PP3、PP4、PP6、PP7、PP8、PP56、PP87、PP114、PP206、PP207、PP306、PP651、Psp231a、Pssy401、Pssy9220、ps1、PTB2、PTB20、PTB42、PX1、PX3、PX10、PX12、PX14、PYO70、PYO71、R、SH6、SH133、tf、Ya5、Ya7、φBS、ΦKf77、φ-MC、ΦmnF82、φPLS27、φPLS743、φS-1, 1、2, 2、3、4、5、6、7, 7、8、9、10、11、12、12B、13、14、15、14、15、16、17、18、19、20、20、21、21、22、23、23、24、25、31、53、73、119x、145、147、170、267、284、308、525、NN-Pseudomonas (5)、af、A7、B3、B33、B39、BI-1、C22、D3、D37、D40、D62、D3112、F7、F10、g、gd、ge、gf、Hw12、Jb19、KF1、L°、OXN-32P、O6N-52P、PCH-1、PC13-1、PC35-1、PH2、PH51、PH93、PH132、PMW、PM13、PM57、PM61、PM62、PM63、PM69、PM105、PM113、PM681、PM682、PO4、PP1、PP4、PP5、PP64、PP65、PP66、PP71、PP86、PP88、PP92、PP401、PP711、PP891、Pssy41、Pssy42、Pssy403、Pssy404、Pssy420、Pssy923、PS4、PS-10、Pz、SD1、SL1、SL3、SL5、SM、φC5、φC11、φC11-1、φC13、φC15、φMO、φX、φ04、φ11、φ240、2、2F、5、7m、11、13、13/441、14、20、24、40、45、49、61、73、148、160、198、218、222、236、242、246、249、258、269、295、297、309、318、342、350、351、357-1、400-1、NN-Pseudomonas (6)、G10、M6、M6a、L1、PB2、Pssy15、Pssy4210、Pssy4220、PYO12、PYO34、PYO49、PYO50、PYO51、PYO52、PYO53、PYO57、PYO59、PYO200、PX2、PX5、SL4、φ03、φ06及び1214によって感染される。
【０１２１】
[0121]  リケッチア(Rickettsia)属の細菌は、ファージ：NN-Rickettsia (1)によって感染される。
【０１２２】
[0122]  サルモネラ(Salmonella)属の細菌は、ファージ：b、Beccles、CT、d、Dundee、f、Fels 2、GI、GIII、GVI、GVIII、k、K、i、j、L、O1、(syn=O-1)、(syn=O1)、(syn=O-I)、(syn=7)、O2、O3、P3、P9a、P10、Sab3、Sab5、San15、San17、SI、Taunton、ViI、(syn=Vil)、9、NN-Salmonella (1)、N-1、N-5、N-10、N-17、N-22、11、12、16-19、20.2、36、449C/C178、966A/C259、a、B.A.O.R.、e、G4、GIII、L、LP7、M、MG40、N-18、PSA68、P4、P9c、P22、(syn=P22)、(syn=PLT22)、(syn=PLT22)、P22a1、P22-4、P22-7、P22-11、SNT-1、SNT-2、SP6、ViIII、ViIV、ViV、ViVI、ViVII、Worksop、ε15、ε34、1、37、1(40)、(syn=φ1[40])、1、422、2、2.5、3b、4、5、6、14(18)、8、14(6,7)、10、27、28B、30、31、32、33、34、36、37、39、1412、SNT-3,7-11、40.3、c、C236、C557、C625、C966N、g、GV、G5、G173、h、IRA、Jersey、M78、P22-1、P22-3、P22-12、Sab1、Sab2、Sab2、Sab4、San1、San2、San3、San4、San6、San7、San8、San9、San13、San14、San16、San18、San19、San20、San21、San22、San23、San24、San25、San26、SasL1、SasL2、SasL3、SasL4、SasL5、S1BL、SII、ViII、φ1、1、2、3a、3aI、1010、NN-Salmonella (1)、N-4、SasL6及び27によって感染される。
【０１２３】
[0123]  セラチア(Serratia)属の細菌は、ファージ：A2P、PS20、SMB3、SMP、SMP5、SM2、V40、V56、κ、DCP-3、(DCP-6、3M、10/1a、20A、34CC、34H、38T、345G、345P、501B、SMB2、SMP2、BC、BT、CW2、CW3、CW4、CW5、L1232、L2232、L34、L.228、SLP、SMPA、V.43、σ、φCW1、ΦCP6-1、ΦCP6-2、ΦCP6-5、3T、5、8、9F、10/1、20E、32/6、34B、34CT、34P、37、41、56、56D、56P、60P、61/6、74/6、76/4、101/8900、226、227、228、229F、286、289、290F、512、764a、2847/10、2847/10a、L.359及びSMB1によって感染される。
【０１２４】
[0124]  シゲラ(Shigella)属の細菌は、ファージ：Fsa、(syn=a)、FSD2d、(syn=D2d)、(syn=W2d)、FSD2E、(syn=W2e)、fv、F6、f7.8、H-Sh、PE5、P90、SfII、Sh、SHIII、SHIV、(syn=HIV)、SHVI、(syn=HVI)、SHVIII、(syn=HVIII)、SKγ66、(syn=gamma 66)、(syn=γ66)、(syn=γ66b)、SKIII、(syn=SIIIb)、(syn=III)、SKIV、(syn=SIVa)、(syn=IV)、SKIVa、(syn=SIVAn)、(syn=IVA)、SKVI、(syn=KVI)、(syn=SVI)、(syn=VI)、SKVIII、(syn=SVIII)、(syn=VIII)、SKVIIIA、(syn=SVIIIA)、(syn=VIIIA)、STVI、STIX、STXI、STXII、S66、W2、(syn=D2c)、(syn=D20)、φI、φIV1、3-SO-R、8368-SO-R、F7、(syn=FS7)、(syn=K29)、F10、(syn=FS10)、(syn=K31)、I1、(syn=alfa)、(syn=FSα)、(syn=K18)、(syn=α)、I2、(syn=a)、(syn=K19)、SG35、(syn=G35)、(syn=SO-35/G)、SG55、(syn=SO-55/G)、SG3201、(syn=SO-3201/G)、SHII、(syn=HII)、SHV、(syn=SHV)、SHX、SHX、SKII、(syn=K2)、(syn=KII)、(syn=SII)、(syn=SsII)、(syn=II)、SKIV、(syn=SIVb)、(syn=SsIV)、(syn=IV)、SKIVa、(syn=SIVab)、(syn=SsIVa)、(syn=IVa)、SKV、(syn=K4)、(syn=KV)、(syn=SV)、(syn=SsV)、(syn=V)、SKX、(syn=K9)、(syn=KX)、(syn=SX)、(syn=SsX)、(syn=X)、STV、(syn=T35)、(syn=35-50-R)、STVIII、(syn=T8345)、(syn=8345-SO-S-R)、W1、(syn=D8)、(syn=FSD8)、W2a、(syn=D2A)、(syn=FS2a)、DD-2、Sf6、FS1、(syn=F1)、SF6、(syn=F6)、SG42、(syn=SO-42/G)、SG3203、(syn=SO-3203/G)、SKF12、(syn=SsF12)、(syn=F12)、(syn=F12)、STII、(syn=1881-SO-R)、γ66、(syn=gamma 66a)、(syn=Ssγ66)、φ2、B11、DDVII、(syn=DD7)、FSD2b、(syn=W2B)、FS2、(syn=F2)、(syn=F2)、FS4、(syn=F4)、(syn=F4)、FS5、(syn=F5)、(syn=F5)、FS9、(syn=F9)、(syn=F9)、F11、P2-SO-S、SG36、(syn=SO-36/G)、(syn=G36)、SG3204、(syn=SO-3204/G)、SG3244、(syn=SO-3244/G)、SHI、(syn=HI)、SHVII、(syn=HVII)、SHIX、(syn=HIX)、SHXI、SHXII、(syn=HXII)、SKI、KI、(syn=SI)、(syn=SsI)、SKVII、(syn=KVII)、(syn=SVII)、(syn=SsVII)、SKIX、(syn=KIX)、(syn=SIX)、(syn=SsIX)、SKXII、(syn=KXII)、(syn=SVII)、(syn=SsXII)、STI、SIII、STIII、STIV、STVII、S70、S206、U2-SO-S、3210-SO-S、3859-SO-S、4020-SO-S、φ3、φ5、φ7、φ8、φ9、φ10、φ11、φ13、φ14、φ18、SHIII、(syn=HIII)、SHXI、(syn=HXI) and SXI、(syn=KXI)、(syn=SXI)、(syn=SsXI)、(syn=XI)によって感染される。
【０１２５】
[0125]  ブドウ球菌(Staphylococcus)属の細菌は、ファージ：A、EW、K、Ph5、Ph9、Ph10、Ph13、P1、P2、P3、P4、P8、P9、P10、RG、SB-1、(syn=Sb-1)、S3K、Twort、φSK311、φ812、06、40、58、119、130、131、200、1623、STC1、(syn=stc1)、STC2、(syn=stc2)、44AHJD、68、AC1、AC2、A6″C″、A9″C″、b581、CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、D11、L39×35、L54a、M42、N1、N2、N3、N4、N5、N7、N8、N10、N11、N12、N13、N14、N16、Ph6、Ph12、Ph14、UC-18、U4、U15、S1、S2、S3、S4、S5、X2、Z1、φB5-2、φD、ω、11、(syn=φ11)、(syn=P11-M15)、15、28、28A、29、31、31B、37、42D、(syn=P42D)、44A、48、51、52、52A、(syn=P52A)、52B、53、55、69、71、(syn=P71)、71A、72、75、76、77、79、80、80a、82、82A、83A、84、85、86、88、88A、89、90、92、95、96、102、107、108、111、129-26、130、130A、155、157、157A、165、187、275、275A、275B、356、456、459、471、471A、489、581、676、898、1139、1154A、1259、1314、1380、1405、1563、2148、2638A、2638B、2638C、2731、2792A、2792B、2818、2835、2848A、3619、5841、12100、AC3、A8、A10、A13、b594n、D、M12、N9、N15、P52、P87、S1、S6、Z4、φRE、3A、3B、3C、6、7、16、21、42B、42C、42E、44、47、47A、47C、51、54、54×1、70、73、75、78、81、82、88、93、94、101、105、110、115、129/16、174、594n、1363/14、2460及びNN-Staphylococcus (1)によって感染される。
【０１２６】
[0126]  連鎖球菌(Streptococcus)属の細菌は、ファージ：EJ-1、NN-Streptococcus (1)、a、Cl、FLOThs、H39、Cp-1、Cp-5、Cp-7、Cp-9、Cp-10、AT298、A5、a10/J1、a10/J2、a10/J5、a10/J9、A25、BT11、b6、CA1、c20-1、c20-2、DP-1、Dp-4、DT1、ET42、e10、FA101、FEThs、FK、FKK101、FKL10、FKP74、FK11、FLOThs、FY101、f1、F10、F20140/76、g、GT-234、HB3、(syn=HB-3)、HB-623、HB-746、M102、O1205、φO1205、PST、P0、P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P9、P12、P13、P14、P49、P50、P51、P52、P53、P54、P55、P56、P57、P58、P59、P64、P67、P69、P71、P73、P75、P76、P77、P82、P83、P88、sc、sch、sf、Sfi11、(syn=SFi11)、(syn=φSFi11)、(syn=ΦSfi11)、(syn=φSfi11)、sfi19、(syn=SFi19)、(syn=φSFi19)、(syn=φSfi19)、Sfi21、(syn=SFi21)、(syn=φSFi21)、(syn=φSfi21)、STG、STX、st2、ST2、ST4、S3、(syn=φS3)、s265、Φ17、φ42、Φ57、φ80、φ81、φ82、φ83、φ84、φ85、φ86、φ87、φ88、φ89、φ90、φ91、φ92、φ93、φ94、φ95、φ96、φ97、φ98、φ99、φ100、φ101、φ102、φ227、Φ7201、ω1、ω2、ω3、ω4、ω5、ω6、ω8、ω10、1、6、9、10F、12/12、14、17SR、19S、24、50/33、50/34、55/14、55/15、70/35、70/36、71/ST15、71/45、71/46、74F、79137、79/38、80/J4、80/J9、80/ST16、80/15、80/47、80/48、101、103/39、103/40、121/41、121/42、123/43、123/44、124/44、337/ST17及びNN-Streptococcus (34)によって感染される。
【０１２７】
[0127]  トレポネーマ(Treponema)属の細菌は、ファージ：NN-Treponema (1)によって感染される。
【０１２８】
[0128]  ビブリオ(Vibrio)属の細菌は、ファージ：CTXΦ、fs、(syn=s1)、fs2、1vpfs、Vf12、Vf33、VPIΦ、VSK、v6、493、CP-T1、ET25、kappa、K139、LaboI,) XN-69P、OXN-86、O6N-21P、PB-1、P147、rp-1、SE3、VA-1、(syn=VcA-1)、VcA-2、VcA-1、VP1、VP2、VP4、VP7、VP8、VP9、VP10、VP17、VP18、VP19、X29、(syn=29 d’Herelle)、1、ΦHAWI-1、ΦHAWI-2、ΦHAWI-3、ΦHAWI-4、ΦHAWI-5、ΦHAWI-6、ΦHAWI-7、ΦHAWI-8、ΦHAWI-9、ΦHAWI-10、ΦHC1-1、ΦHCl-2、ΦHCl-3、ΦHC1-4、ΦHC2-1、ΦHC2-2、ΦHC2-3、ΦHC2-4、ΦHC3-1、ΦHC3-2、ΦHC3-3、ΦHD1S-1、ΦHD1S-2、ΦHD2S-1、ΦHD2S-2、ΦHD2S-3、ΦHD2S-4、ΦHD2S-5、ΦHDO-1、ΦHDO-2、ΦHDO-3、ΦHDO-4、ΦHDO-5、ΦHDO-6、ΦKL-33、ΦKL-34、ΦKL-35、ΦKL-36、ΦKW1H-2、ΦKWH-3、ΦKWH-4、ΦMARQ-1、ΦMARQ-2、ΦMARQ-3、ΦMOAT-1、ΦO139、ΦPEL1A-1、ΦPEL1A-2、ΦPEL8A-1、ΦPEL8A-2、ΦPEL8A-3、ΦPEL8C-1、ΦPEL8C-2、ΦPEL13A-1、ΦPEL-13B-1、ΦPEL13B3-2、ΦPEL13B-3、ΦPEL13B-4、ΦPEL13B-5、ΦPEL13B-6、ΦPEL13B-7、ΦPEL13B-8、ΦPEL13B-9、ΦPEL13B-10、φVP143、φVP253、Φ16、φ138、1-11、5、13、14、16、24、32、493、6214、7050、7227、II、(syn=group 11)、(syn=φ2)、V、VIII、NN-Vibrio (13)、KVP20、KVP40、nt-1、O6N-22P、P68、e1、e2、e3、e4、e5、FK、G、J、K、nt-6、N1、N2、N3、N4、N5、O6N-34P、OXN-72P、OXN-85P、OXN-100P、P、Ph-1、PL163/10、Q、S、T、φ92、1-9、37、51、57、70A-8、72A-4、72A-10、110A-4、333、4996、I、(syn=group I)、III、(syn=group III)、VI、(syn=A-Saratov)、VII、IX、X、NN-Vibrio (6)、pA1、7、7-8、70A-2、71A-6、72A-5、72A-8、108A-10、109A-6、109A-8、110A-1、110A-5、110A-7、hv-1、OXN-52P、P13、P38、P53、P65、P108、P111、TP1、VP3、VP6、VPI2、VP13、70A-3、70A-4、70A-10、72A-1、108A-3、109-B1、110A-2、149、(syn=φ149)、IV、(syn=group IV)、NN-Vibrio (22)、VP5、VP11、VP15、VP16、α1、α2、α3a、3b、353B及びNN-Vibrio (7)によって感染される。
【０１２９】
[0129]  エルシニア(Yersinia)属の細菌は、ファージ：H、H-1、H-2、H-3、H-4、Lucas 110、Lucas 303、Lucas 404、YerA3、YerA7、YerA20、YerA41、3/M64-76、5/G394-76、6/C753-76、8/C239-76、9/F18167、1701、1710、PST、1/F2852-76、D’Herelle、EV、H、Kotljarova、PTB、R、Y、YerA41、φYerO3-12、3、φA1122、4/C1324-76、7/F783-76、903、1/M6176及びYer2ATによって感染される。
【０１３０】
[0130]  別の実施形態では、該方法は、上記ファージの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又はより大きい数の組み合わせを用いて実施される。当業者は、形質転換の効率が、利用されるファージの特定の組み合わせに応じて操作され、例えば増強又は抑制されてもよいことを理解している。
【０１３１】
[0131]  特に、細菌種（及び対応する宿主特異的バクテリオファージ）は、アエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)(PM2)、炭疽菌(Bacillus anthracis)（Ｇａｍｍａ）、バチルス・サブチラス(Bacillus subtilus)(SPP1)、百日咳菌(Bordetella pertussis)（Pereversev et al. Zh Mikrobiol 5:54-57, 1981を参照）、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)（φBB-1，Eggers et al., J Bacteriol 183:4771-4778, 2001を参照）、ウシ流産菌(Brucella abortus) (TB; 212; 371)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)（φ４，φＣ）、クロストリジウム・パーフリンジェス(Clostridium perfringes) (φ3626)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis) (φFC1)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium) (ENB6)、大腸菌(Escherichia coli) (P1; T1; T3, T4, T5; T7, KH1、φV10;lambda;φ20;mu）、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) (60; 92)、リステリア菌(Listeria monocytogenes) (A511, A118; 243; H387; 2389; 2671; 2685; 4211)、ライ菌(Mycobacterium leprae)（マイコバクテリオファージ，L5）、結核菌(Mycobacterium tuberculosis) (LG; DSGA)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa) (E79, G101; B3; pp. 7)、サルモネラ・アナツム(Salmonella anatum) (E5)、サルモネラ・ボビスモルビフィカンス(Salmonella bovismorbificans) (98)、サルモネラ・コレレスイス(Salmonella choleraesuis) (102)、腸炎菌(Salmonella enteritidis) (L; P22; 102; FO; IRA; φ8)、サルモネラ・ニューイントン(Salmonella Newington)（(E34)、ショトミュラー菌(Salmonella schottmulleri) (31; 102; F0; 14)、腸チフス菌(Salmonella typhi) (163; 175; ViI; ViVI; 8; 23; 25; 46; 175; F0)、霊菌(Serratia marcescens) (S24VA)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae) (φ80; P2; 2; 37)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri) (Sf6)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) (K; P1; P14; UC18; 15; 17; 29; 42D; 47; 52; 53; 79; 80; 81; 83A; 92; Twort、φ11)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae) (Dp-1; Cp-1; HB-3; EJ-1; MM1; VO1)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes) (φX240; 1A; 1B; T12; 12/12; 113; 120; 124; P58; H4489a)、コレラ菌(Vibrio cholerae) (138; 145; 149; 163)、及びペスト菌(Yersinia pestis) (A1122; R; Y; P1)を含む。追加的情報が、米国特許出願公開第２００９−０１５５７６８号に提示されている。
【０１３２】
[0132]  特に、表１〜３は、特定の宿主特異的ファージ、及びそれらが例えば自らの作用を媒介する受容体に特異的である場合の宿主の代表例を提示する。Bertozzi et al., FEMS Microbiology Letters, 363, 1-11, 2016も参照されたし。
【０１３３】
【表１】
2020535808.tif 000003
【０１３４】
【表２】
2020535808.tif 000004
【０１３５】
【表３】
2020535808.tif 000005
【０１３６】
【表４】
2020535808.tif 000006
【０１３７】
Ｄ．バクテリオファージパッケージング部位
[0133]  バクテリオファージパッケージング部位は、ビリオンへのゲノムパッケージングにおけるファージゲノム上の特異的ＤＮＡ配列である。プラスミドがファージパッケージング部位を含むように改変されることで、プラスミドは形質導入粒子にパッケージングされる。宿主特異的バクテリオファージ（及びそれらのパッケージング部位）は、限定はされないが、SPP1 (SPP1 pac部位)、P1 (P1 pac部位)、T1 (T1 pac部位)、T7 (T7コンカテマー接合部)、lambda(cos部位)、mu(mu pac部位)、P22 (P22 pac部位)、φ8 (φ8 pac部位)、Sf6 (Sf6 pac部位)、149 (149 pac部位)、及びA1122 (A1122コンカテマー接合部)を含む。大部分のバクテリオファージにおいては、パッケージング部位は、pac部位と称される。場合によっては、パッケージング部位は、コンカテマー接合部（例えば、Ｔ７コンカテマー接合部）と称される。あらゆる場合において、パッケージング部位は、バクテリオファージゲノム中の天然に存在する隣接配列と異なる。
【０１３８】
[0134]  いくつかのバクテリオファージにおいては、パッケージング部位は、未知であってもよい。これらの場合、pac部位は、機能的バクテリオファージpac部位を有するプラスミドがパッケージングされるという特性を利用することにより決定されうる。例えば、バクテリオファージλのパッケージングに必要なＤＮＡ配列は、λファージゲノムＤＮＡの小さい制限断片をプラスミドに組み込むことにより決定された(Hohn et al., PNAS USA 80:7456-7460, 1983)。インビボパッケージング株への導入後、パッケージング／形質導入の効率が定量的に評価された。類似の方法を用いて、いくつかのバクテリオファージ：λ(Miwa et al., Gene 20:267-279, 1982；Mu (Croenen et al., Virology 144:520-522, 1985)；f1、fd、M13、及びIkeを含む糸状バクテリオファージ(Russel et al., J Virol., 63:3284-3295, 1989)；P22 (Petri et al., Gene 88:47-55, 1990; Wu et al., Mol. Microbiol 45:1631-1646, 2002)；T7 (Chung et al., J Mol Biol 216:927-938, 1990)、並びにT3 (Hashimoto et al., Virology 187:788-795, 1992)におけるpac部位は決定されている。
【０１３９】
[0135]  該方法の実施形態は、バクテリオファージパッケージング配列及びそれらの機能断片を含む。これらの核酸の実施形態は、ヌクレオチド断片がプラスミドＤＮＡのバクテリオファージカプシドへのパッケージングを媒介しうる限り（パッケージングを媒介し、それにより機能的形質導入粒子を生成するその能力によって判断されるとき）、例えば、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、及び９００ヌクレオチド長でありうる。バクテリオファージパッケージング部位又はそれらの断片を含む核酸は、プラスミド中に組み込まれる。
【０１４０】
Ｅ．マーカー遺伝子構築物
[0136]  遺伝子技術は、細胞遺伝子発現を監視するため、広範に用いられている(Naylor et al., Biochem Pharm 58:749-757, 1990)。好ましくは、マーカー分子は、検出可能な産物、例えばタンパク質又は酵素をコードする遺伝子である。特に好ましくは、マーカーは、ファージ、ヒト、又は細菌によって天然には発現されない分子である。例えば、マーカーは、異種真核生物タンパク質、異なる細菌種のタンパク質、又はウイルスタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、マーカーは、植物ベースの酵素又は非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、マーカーは、遺伝子又は遺伝子によってコードされる産物であり、ここで該遺伝子は非ヒト動物に由来する。
【０１４１】
[0137]  一実施形態では、マーカーは、加水分解酵素である。
【０１４２】
[0138]  本方法は、部分的には、サンプル中の少なくとも１つのマーカー又は指標の存在（又は不在）又はレベル（例えば濃度）又は活性（例えば酵素活性）を判定することを含む。用語「マーカー」又は「指標」は、本明細書で用いられるとき、ベクターが正確にトランスフェクト又は形質導入されていること、及びその配列が正確に発現されることの判定又は確認を可能にする核酸（例えばｍＲＮＡ）、ペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。マーカーはまた、組換え又は改変ファージ中での異種遺伝子の発現によって生成される核酸、ペプチド、タンパク質、又は酵素を指してもよい。マーカーは、ベクターを保有する細胞を選択するために用いられる、タンパク質をコードするヌクレオチド配列又は抗生物質耐性をコードする遺伝子であってもよい。本明細書で用いられるとき、用語「少なくとも１つのマーカーの存在を検出すること」は、目的の各マーカーの存在を、当業者に公知の任意の定量的又は定性的アッセイを用いることにより判定することを含む。特定の場合、特定の形質、変数、遺伝子型、及び／又は生化学的若しくは血清学的物質（例えばタンパク質又は抗体）の存在又は不在を判定する定性的アッセイは、目的の各マーカーを検出することに適する。特定の他の場合、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、又は活性の存在又は不在を判定する定量的アッセイは、目的の各マーカーを検出することに適する。本明細書で用いられるとき、用語「少なくとも１つのマーカーのレベルを検出すること」は、当業者に公知の任意の直接的又は間接的な定量的アッセイを用いることにより、目的の各マーカーのレベルを決定することを含む。特定の場合、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、又は活性の相対量又は絶対量を決定する定量的アッセイは、目的の各マーカーのレベルを検出することに適する。当業者は、マーカーのレベルを検出するのに有用な任意のアッセイが、マーカーの存在又は不在を検出するためにも有用であることを理解するであろう。
【０１４３】
[0139]  いくつかの実施形態では、マーカーは、その存在を、例えばその発光特性又は酵素反応を実行するその能力を介して示すことができるレポーター分子である。別の実施形態では、マーカーは、マーカーのレベル又は活性を示すため、レポーター分子に結合する。
【０１４４】
（ｉ）レポーター
[0140]  一実施形態では、レポーター分子は、検出可能なタンパク質の発現をコードする、レポーター遺伝子と称される遺伝子である。一般に用いられるレポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、１３−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。一般に、レポーター遺伝子は、遺伝子発現後の低いバックグラウンド活性及び感受性シグナルの検出といった利点を有する。例えば、高感度な電荷カップリングデバイス（ＣＣＤ）イメージングカメラ及び蛍光顕微鏡を用いての検出の容易性と組み合わせた、遺伝子発現の非侵襲性マーカーとしてのルシフェラーゼ及びＧＦＰの開発は、たとえ単細胞レベルであっても遺伝子発現についての経時的及び空間的情報を可能にしている。
【０１４５】
[0141]  ルシフェラーゼ遺伝子及びレポーター遺伝子としてのその使用に関するレビューは、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)（受入番号Ｍ１０９６１及びＡＡＡ８８６８５）、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)（受入番号Ｍ１０９６１及びＡＡＡ８８６８６）、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)（受入番号Ｍ２８８１５及びＡＡＡ２７５３１）、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)（受入番号Ｘ０６７５８及びＣＡＡ２９９３１）ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)（受入番号Ｘ０６７９７及びＣＡＡ２９９３２）、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)（受入番号ＡＦ１７０１０４（その変異体を含む））、フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)（受入番号Ｍ６２９１７）、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)（Ｍ１５０７７及びＡＡＡ２９７９５）、ゲンジボタル(Luciola cruciate)（受入番号Ｍ２６１９４及びＡＡＡ２９１３５）、ウミホタル(Vargula hilgendorfii)（受入番号Ｅ０２７４９、Ｍ２５６６６、及びＡＡＡ３０３３２）、オワンクラゲ(Aequorea victoria)（受入番号Ｍ１６１０３、ＡＡＡ２７７１９、Ｍ１１３９４、ＡＡＡ２７７１６、Ｍ１６１０４、ＡＡＡ２７７１７、Ｍ１６１０５、ＡＡＡ２７７１８、Ｌ２９５７１、ＡＡＡ２７７２０、及びＥ０２３１９）；ヒオドシエビ(Oplophorus gracilorostris)（受入番号ＡＢ０３０２４６、ＢＡＢ１３７７６、ＡＢ０３０２４５及びＢＡＢ１３７７５）；ウミシイタケ(Renilla muelleri)（受入番号ＡＹ０１５９８８及びＡＡＧ５４０９４）；及びウミシイタケ(Renilla reniformis)（受入番号Ｍ６３５０１及びＡＡＡ２９８０４）における公知のルシフェラーゼ遺伝子、ｃＤＮＡ、タンパク質、及び対応するジェンバンク受入番号のリストを提供する。Greer et al., Luminescence 17:43-74, 2002）を参照されたし。Greerはまた、イメージングにとって有用である多数の構築物及びベクターを提供している（Table 2, pp 48-52を参照）。これらのベクターは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、大腸菌(E. coli)及び他の細菌における発現に適する。公知のルシフェラーゼの中に、原核生物ルシフェラーゼ（Ｌｕｘ）、及び真核生物ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、Ｒｕｃ及びそれらの調節タンパク質）が存在し、それら双方は生細胞におけるルシフェラーゼ発現のイメージングにおいて一般に用いられる。
【０１４６】
[0142]  別の実施形態では、レポーター分子は、細菌中で発現されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含む(Miller et al., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。細菌コロニーによって発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性は、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有する培地上で青色呈色により検出される。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もまた、細菌中でのレポーター遺伝子としての使用に適する。ＣＡＴは、細菌の薬剤耐性遺伝子によってコードされる(Kondo et al., J Bacteriol 88:1266-1276)。それは、その２つのヒドロキシル基の一方又は両方で薬剤をアセチル化することにより、クロラムフェニコールを不活性化する。典型的なＣＡＴアッセイでは、細胞抽出物は、１４Ｃ又は３Ｈ標識クロラムフェニコール及びｎ−ブチリル補酵素Ａを含有する反応混合物中でインキュベートされる。ＣＡＴは、補助因子のｎ−ブチリル部分をクロラムフェニコールに移す。反応生成物はキシレンで抽出され、ｎ−ブチリルクロラムフェニコールが、主にキシレン相に分配する一方で、非修飾クロラムフェニコールは、主に水相に残存する。キシレン相に分配する放射標識クロラムフェニコールは、シンチレーション計数管を用いて測定される。
【０１４７】
[0143]  大腸菌(E. coli)のｐｈｏＡによってコードされる細菌アルカリホスファターゼは、細胞膜を横切ってペリプラズム空間に輸送されているときに限り、酵素的に活性がある(Gibson et al., Appl and Env Microbiol 68:928-932, 2002)。この特性は、ＰｈｏＡタンパク質を細胞内位置の分子センサとして改変するため、利用されている。グラム陽性細菌エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)に由来する別の細菌アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＺ）(Lee et al., J Bacteriol 181:5790-5799, 1999)は、グラム陽性細菌における活性の高いレポーターとして開発されている(Granok et al., J Bacteriol 182:1529-1540, 2000; Lee et al., J Bacteriol 181:5790-5799, 1999)。ＰｈｏＺのアルカリホスファターゼ活性は、ＰｈｏＡの場合と同様、細胞質からのその輸送に依存する。アルカリホスファターゼアッセイでは、アルカリホスファターゼは、４−ニトロフェニルリン酸（４ＮＰＰ）などの基質を加水分解し、色素原（例えば、４−ニトロフェノール、４ＮＰ）を生成する。
【０１４８】
[0144]  レポーター遺伝子は、より簡単な操作手順（例えば、還元精製又は細胞溶解）を可能にし、大規模なハイスループットスクリーニング測定に適応可能であり、且つ細菌系に適合する。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子、又は遺伝子操作、例えば組換えＤＮＡ技術若しくは突然変異誘発によって生成されるもののいずれかでありうる。レポーター遺伝子は、コード領域及び任意の関連発現配列、例えば、プロモーター、翻訳開始配列、及び制御配列を有する核酸セグメントである。
【０１４９】
（ｉｉ）プロモーター
[0145]  いくつかの実施形態では、ファージ由来のプロモーターは、マーカー又はレポーター遺伝子に連結される。いくつかの実施形態では、細菌特異的プロモーターが用いられる。
【０１５０】
[0146]  レポーター遺伝子は、典型的には、ＲＮＡの合成を制御し、且つ誘導するプロモーター配列に連結される。プロモーター配列が様々な細菌種によって発現される多数の細菌遺伝子から選択されてもよいことは当業者によって理解されるであろう。プロモーターの選択は、検出されるべき標的細菌に基づいてなされる。大腸菌(E. coli)における遺伝子の高レベル発現を達成するための方法に関するレビューとして、Makrides et al., Microbiol Rev 60:512-538, 1996を参照されたし。大腸菌(E. coli)において有効である代表的なプロモーター配列がＴ７プロモーターであるが、原核細胞内で機能的である任意のプロモーター又はエンハンサーが用いられてもよい。有用なプロモーターとして、限定はされないが、ｌａｃプロモーター（大腸菌(E. coli)）、ｔｒｐプロモーター（大腸菌(E. coli)）、ａｒａＢＡＤプロモーター（大腸菌(E. coli)）、ｌａｃハイブリッドプロモーター、（大腸菌(E. coli)）、ｔｒｃハイブリッドプロモーター（大腸菌(E. coli)）、ＰＬ（Ｘ）、ＳＰ６、及びＴ７が挙げられる。
【０１５１】
[0147]  プロモーター配列は、標的病原菌における発現の検出可能なレベルを達成するようなその能力に基づいて選択される。好ましい実施形態では、レポーター遺伝子は、検出されるべき病原菌宿主から得られるプロモーターに好ましくは共役される。構成的プロモーターは、生理学的要求又は基質の濃度と無関係に、一定速度でレポーターを発現することになる。或いは、レポーター遺伝子発現のタイミングを制御するため、誘導性プロモーターを用いることが有利であってもよい。ｌａｃ及びｔｒｐオペロンなどの誘導性プロモーターにおいては、発現が通常は阻止され、所望される時点で誘導されうる。ラクトースの不在下で、ｌａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサータンパク質によって阻止される。誘発はラクトース又はＩＰＴＧの添加により達成可能であり、リプレッサーのｌａｃオペレーターへの結合が阻止されうる。同様に、ｌｉｐプロモーターは、ｔｒｐオペレーターに結合するトリプトファン−リプレッサー複合体によって負に調節される。ｔｒｐオペロンにおいては、遺伝子発現は、トリプトファンを除去することにより、又はβ−インドールアクリル酸を添加することにより、誘導されうる。
【０１５２】
（ｉｉｉ）細菌に特異的な複製起点
[0148]  プラスミドにおいて用いられる複製起点は、ｐＢＲ３２２（１５〜２０コピー／細胞）又はＲ６Ｋプラスミド（１５〜２０コピー／細胞）由来のｃｏｌＥ１  ｏｒｉなど、中等度のコピー数であってもよく、又は複製起点は、ｐＵＣ  ｏｒｉｓ（５００〜７００コピー／細胞）、ｐＧＥＭ  ｏｒｉｓ（３００〜４００コピー／細胞）、ｐＴＺ  ｏｒｉｓ（＞１０００コピー／細胞）又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｏｒｉｓ（３００〜５００コピー／細胞）など、高コピー数であってもよい。複製起点は、大腸菌(E. coli)又は任意の他の原核生物種、例えば炭疽菌(Bacillus anthracis)若しくはペスト菌(Yersinia pestis)において機能的であってもよい。
【０１５３】
[0149]  プラスミド複製は、宿主酵素並びにプラスミドコード及びプラスミド制御のシス及びトランス決定基に依存する。例えば、一部のプラスミドは、ほぼすべてのグラム陰性細菌において認識され、且つ各宿主における複製開始及び調節の間、正確に作用する決定基を有する。他のプラスミドは、いくつかの細菌に限り、この能力を有する(Kues et al., Microbiol Rev 53:491-516, 1989)。プラスミドは、３つの一般的機構、即ち、θ型、鎖置換、及びローリングサークルによって複製される（Del Solar et al. Microbio and Molec Biol Rev 62:434-464, 1998によってレビューされている）。
【０１５４】
[0150]  θ型機構による複製においては、複製起点は、（ｉ）プラスミドの自律的複製を支持しうる最小シス作用領域、（ｉｉ）複製プロセスを開始するようにＤＮＡ鎖が融解される領域、又は（ｉｉｉ）リーディング鎖合成が開始する塩基と定義されうる。複製起点は、プラスミド及び／又は宿主コード化タンパク質の相互作用において必要とされる部位を有する。θ型複製を経ているプラスミドはまた、ｐＰＳ１０、ＲＫ２（ｏｒｉＶを有する）、ＲＰ４、Ｒ６Ｋ（ｏｒｉｙを有する）、ＣｏｌＥ１及びＣｏＩＥ２を含む。ＣｏｌＥ１は、θ型機構によって複製する小型マルチコピープラスミドのクラスのプロトタイプである。Ｃ６１Ｅ１複製起点は、約１ｋｂの領域に及ぶ(Del Solar et al. 1998)。
【０１５５】
[0151]  鎖置換機構によるプラスミド複製の例は、プロトタイプがＲＳＦ１０１０であるＩｎｃＱファミリーの乱雑なプラスミドである。このファミリーのメンバーは、ＤＮＡ複製の開始用に３つのプラスミドコード化タンパク質を必要とする。これらのタンパク質は複雑な起点領域で開始を促進し、鎖置換機構により複製がいずれかの方向に進行する。複製起点は、ＲＳＦ１１０複製タンパク質（ＲｅｐＡ、ＲｅｐＢ、及びＲｅｐＣ）が第２のプラスミドによりトランスに供されるとき、双方向複製を支持することが可能な最小領域と定義されている。最小ｏｒｉ領域は、３つの同一の２０ｂｐのイテロン＋ＧＣリッチストレッチ（２８ｂｐ）及びＡＴリッチセグメント（３１ｂｐ）を有する１７４ｂｐの領域を含む(Del Solar et al. 1998)。
【０１５６】
[0152]  ローリングサークル（ＲＣ）機構による複製は、一方向性であり、リーディング鎖の合成及びラギング鎖の合成が共役的でないため、不斉プロセスであると考えられる。ＲＣ複製の基礎となる分子機構に対する試験が、主にブドウ球菌プラスミドｐＴ１８１、ｐＣ２２１、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４を用いて、また連鎖球菌プラスミドｐＭＶ１５８及びそのＡｍｏｂ誘導体ｐＬＳ１を用いて実施されている。ＲＣ複製を経る他のプラスミド又はファージとして、限定はされないが、ｐＳ１９４、fd、φＸ１７４、ｐＥ１９４及びｐＦＸ２が挙げられる(Del Solar et al. 1998)。
【０１５７】
[0153]  原核生物は、典型的には単一の複製起点を有する染色体ＤＮＡの環状分子を有する。例えば、大腸菌(E. coli)及び他の細菌の染色体複製起点は、ｏｎｉＣと称される。本方法では、種特異的プラスミドＤＮＡから同定されている当該技術分野で公知の複製起点（例えば、本明細書中の上で考察されたＣｏｌＥ１、Ｒ１、ｐＴ１８１など）、バクテリオファージから同定されている当該技術分野で公知の複製起点（例えば、φX174及びM13）、及び細菌染色体の複製起点（例えば、ｏｒｉＣ）の使用が想定される。
【０１５８】
（ｉｖ）抗生物質耐性遺伝子
[0154]  形質導入粒子のプラスミドＤＮＡは、任意選択的には、プラスミドの分子生物学的クローニングを容易にするため、またプラスミドによって形質転換された細菌の選択を可能にするため、抗生物質耐性遺伝子を有することになる。抗生物質耐性遺伝子は、当該技術分野で周知であり、限定はされないがアンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔｒ）、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）、ハイグロマイシン耐性（ｈｙｇ又はｈｐｈ遺伝子）、及びゼオマイシン耐性（Ｚｅｏｒ）を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子は、耐性又は感受性が試験中である薬剤以外の（又はそれと異なる）薬剤の抗菌性又は細胞傷害性効果から細菌を保護する。別の実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、耐性又は感受性が試験中である薬剤と同じである薬剤の抗菌性又は細胞傷害性効果から細菌を保護する。
【０１５９】
Ｆ．形質導入粒子を作製する方法
[0155]  本方法で用いられる形質導入粒子又は組換えファージは、以降はレポーター遺伝子と称される、容易に認識可能な表現型に標的細菌を形質転換する能力がある遺伝子を保有するように、天然に存在するバクテリオファージを修飾することにより得られる。形質導入粒子は、レポーター遺伝子を標的細菌宿主に、細菌宿主が遺伝子機能を検出可能な様式で発現しうるような方法で特異的に導入する能力がなければならない。多数のバクテリオファージが存在し、所望される宿主域に基づく修飾及びバクテリオファージが目的の遺伝子を保有し、形質導入する能力について選択されてもよい。特に、バクテリオファージは、レポーター遺伝子、関連プロモーター領域、ファージパッケージング部位、及び含まれてもよい任意の他のＤＮＡ領域を収容するほどに十分に大きい必要がある。修飾バクテリオファージは、通常は非修飾バクテリオファージの正常な宿主域特異性を保持することになるが、特異性における一部の改変であれば、選択された標的細菌を同定する能力に影響しない限り、許容できることになる。
【０１６０】
[0156]  修飾されるべきバクテリオファージは、温帯性又は病原性、好ましくは温帯性であってもよい。バクテリオファージの修飾は、レポーター遺伝子を標的細菌宿主に導入する能力を維持する形質導入粒子をもたらす。レポーター遺伝子は、感染宿主内で維持及び発現されることになるプラスミド又は他の自己複製エピソーム単位の一部である。
【０１６１】
[0157]  レポーター遺伝子の形質導入は、レポーター遺伝子の一過性発現（即ち、細胞によって安定的に遺伝されないレポーター遺伝子からの発現）を介してなされてもよい。かかる場合、バクテリオファージによって形質導入されるＤＮＡは、全試験期間を通じてインタクトに生存しなくてもよい。しかし、ファージによって形質導入されるレポーター遺伝子の転写は、ＤＮＡが分解される前、十分に効率的となり、試験期間の終了までに細菌が機能的レポーター遺伝子を構築していることが保証される。したがって、細菌は、たとえ細菌がファージＤＮＡを分解しても、アッセイにより検出されうる。
【０１６２】
[0158]  本方法において有用なバクテリオファージは、微生物リポジトリ、例えばアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, Va., 20108, USA)から入手されてもよい。病原性バクテリオファージは、無菌の可溶化液中で利用可能である一方、溶原性バクテリオファージは、一般に感染宿主細胞として利用可能である。任意の供給源から得られる野生型バクテリオファージは、目的の検出可能な表現型を生成する能力がある所望されるレポーター遺伝子を導入するため、通常の組換えＤＮＡ技術により修飾されてもよい。導入前、目的のレポーター遺伝子は、好適な遺伝子カセット上でプロモーター領域と組み合わせられることになる。遺伝子カセットは、好適な宿主、例えば大腸菌(E. coli)において通常の組換えＤＮＡ技術により構築されてもよい。レポーター遺伝子とプロモーター領域の双方が、標的宿主内で機能するように選択される必要があり、カセットは、任意選択的には、インビトロ操作を容易にするため、第２のレポーター遺伝子、例えば、抗生物質耐性、重金属耐性などを含んでもよい。
【０１６３】
[0159]  レポーター遺伝子（又は遺伝子、単一の遺伝子系でない場合）は、標的細菌宿主内でスクリーニング可能な表現型を発現する能力がある。スクリーニング可能な表現型という用語は、後に用いられるとき、たとえすべての細胞が混合培養物中で通常的に増殖し、再生しているときであっても、表現型を発現する細胞が表現型を発現しない他の細胞と区別されることを可能にする特徴又は形質を意味することが意図される。即ち、特徴又は形質の検出が実施されてもよい一方で、感染された標的細胞は、表現型を発現しない、生存可能な通常は増殖する非標的細菌の混合集団内に存在する。好ましくは、スクリーニング可能な表現型は、仮想的に検出可能な形質、即ち、標的及び非標的細胞の混合集団内で直接的又は間接的に観察可能なものを含むことになる。表現型は、通常は選択可能とならず、即ち、生存若しくは優先的増殖を特定条件（ポジティブ選択）下でもたらすもの、又は増殖阻害若しくは殺滅を特定条件下でもたらすものが挙げられる。標的細菌が存在する生存細菌の一部のみを含むときに形質が観察可能となることから、サンプル中に存在する標的細菌がサンプル中に存在してもよい非標的細菌から単離される又はそれらと比べて濃縮されることを該方法は必要としない。
【０１６４】
[0160]  レポーター遺伝子は、他の遺伝子が検出されるべき宿主内に存在する又は該宿主に別々に導入される場合、それ自身によりスクリーニング可能な表現型をコードしうる、又は表現型をコードする複数の遺伝子系の一部であってもよい。例えば、形質導入粒子は、発現用宿主における相補的ｌａｃＺβ遺伝子又はｌａｃＺΔＭ１５欠失を必要とする、ｌａｃＺα遺伝子を保有してもよい。
【０１６５】
[0161]  好適なスクリーニング可能な表現型は、生物発光、蛍光、酵素触媒的色生成（例えば、酵素アルカリホスファターゼを用いる）などを含む。これら表現型の各々は、シグナル生成反応を完了するのに必要な化学試薬をもたらす通常の可視化技術により観察されてもよい。いくつかの実施形態では、スクリーニング可能な表現型は、フルオロフォア又は色素原などの検出可能な産物への基質の加水分解を触媒する異種の加水分解酵素である。いくつかの実施形態では、スクリーニング可能な表現型は、結果としての増幅産物に特異的に結合するプローブによって増幅及び検出されうる、異種の非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、異種の非コードＲＮＡは、ＲＴ−ＨＤＡにより検出されうる。
【０１６６】
[0162]  バクテリオファージにおいては、プラスミド又はレポーター遺伝子カセットを、ＤＮＡ構築物内のバクテリオファージパッケージング部位とプラスミド又はカセットとの結合によりパッケージングすることが可能である。パッケージング部位は、バクテリオファージゲノムから得て、レポーター遺伝子、プロモーター領域、及び任意選択的な第２のレポーターを保有するプラスミドにクローン化されてもよい。次に、プラスミドは、好適な細菌宿主に導入されてもよい。次に、細菌宿主は、プラスミドＤＮＡをその宿主域の細菌に挿入する能力があるバクテリオファージコート中にパッケージングされたプラスミド及び／又はマーカー遺伝子カセットを有する形質導入粒子を生成することになる。プラスミドは、プラスミドとバクテリオファージの双方による好適な宿主の同時感染により、所望されるバクテリオファージ中に転位される。宿主細胞はインキュベートされ、形質導入粒子は収集される。ファージの画分は、プラスミドを保有することになる。形質導入粒子は、通常の技術により、ファージから分離されうる。
【０１６７】
[0163]  宿主特異的バクテリオファージパッケージング部位は、バクテリオファージゲノムにおけるそれらに隣接する天然に存在する配列から実質的に単離される。本明細書で用いられるとき、用語「実質的に単離される」は、バクテリオファージパッケージング部位に関連して、それらがそれらの天然環境下に存在しないことを意味する。即ち、パッケージング部位は、天然に見出される完全長のバクテリオファージゲノム核酸配列内に存在しない。パッケージング部位は、実験技術、例えば、制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用及びポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング又は増幅を介して、完全長バクテリオファージゲノム配列から単離されてもよい。パッケージング部位はまた、合成的に作製されてもよい。
【０１６８】
[0164]  バクテリオファージパッケージング部位は、通常は天然にそれに関連する配列を全体的又は部分的に欠いている核酸断片；又は天然に存在するが、それに関連した異種配列を有するような配列である。それはファージゲノムと関連性のない断片である。
【０１６９】
[0165]  本明細書で用いられるとき、用語「機能的等価物」は、バクテリオファージパッケージング部位に関連して、定性的には野生型バクテリオファージパッケージング部位と同じく機能するパッケージング部位を意味する。したがって、単離されたバクテリオファージパッケージング部位がＤＮＡのパッケージングを誘導する場合、ＤＮＡ断片は、それもまた同様にしてＤＮＡのパッケージングを誘導する場合、機能的等価物となる。該方法に従う機能的等価物であるべき断片において、定量的等価性は要求されない。したがって、ヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加を有するバクテリオファージパッケージング部位は、単離されたバクテリオファージパッケージング部位の機能的等価物でありうる。
【０１７０】
Ｇ．バクテリオファージを用いる方法
[0166]  上記の実施形態は、最小構造要素を含む完全にインタクトなファージ又はその変異体からなる形質導入ファージ粒子を用いて実施され、該粒子の宿主細胞への形質導入を可能にしてもよい。いくつかの例では、生体サンプルに感染させ、改変及び表現型を直接的に観察するが可能となるが、他の例では、サンプル中に存在する細菌の培養塊を最初に調製することが好ましいことがある。サンプルを入手して、（必要な場合に）培養塊を調製するための方法は、生体サンプルの性質に応じて変化することになり、且つ様々なサンプルタイプを調製するのに好適な技術は、Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (8th ed.), Buchanan and Gibbons (eds.) Williams & Wilkens Co., Baltimore (1974); Manual of Methods for General Bacteriology, Gerhardt et al. (eds.), Am. Soc. Microbiology, Wash. (1981);及びManual of Clinical Microbiology (8th ed.), Patrick, R et al. (eds.), Am. Soc. Microbiology, Washington (2003) などの標準的な微生物学及び細菌学テキストに詳述されている。
【０１７１】
[0167]  ファージ自体は、種々の形態でサンプルに添加されてもよい。それは乾燥状態で添加されてもよい。ファージは、液体試薬混合物に混合又は懸濁されてもよい。それは、サンプルが添加されるバイアルに懸濁されてもよい。それはまた、任意の他の好適な形態をとってもよい。サンプルに添加されるファージは、時として本明細書中で「親ファージ」と称される。サンプルは、一旦バクテリオファージと接触されると、ファージ曝露サンプルと称される。
【０１７２】
[0168]  ファージ曝露サンプルは、所定の時間インキュベートされてもよい。インキュベーションは、該曝露サンプル中に存在する場合、感染された標的細菌中でのファージマーカーの生成を可能にするため、十分な時間行ってもよい。ファージ曝露サンプルは、標的細菌のファージ感染を助ける条件下にある。これは種々の方法で達成されうる。例えば、親ファージは、サンプルに添加されるときに感染を助ける試験サンプルをもたらすような試薬に混合されてもよい。サンプルは、ファージ感染を助ける条件を確立するための多くの異なる方法で調製されてもよい。
【０１７３】
[0169]  サンプル中に標的細菌が存在したことを仮定すると、試験サンプルは、ファージマーカーを含有することになる。親ファージは、自身を標的細菌の細胞壁に付着し、ウイルス核酸を注入し、感染細菌を創出することにより、標的細菌に感染する。次に、組換えバクテリオファージマーカー遺伝子が感染細菌中で大量に発現される。細菌が例えば増殖又は分裂するといった代謝活性を示す場合、各子孫は、マーカー遺伝子のさらなるコピーを有する（又はファージによって感染される）ことになり、それ故、より大きいシグナルを生成する。それに対し、細菌が静止又は死滅状態である場合、より小さいシグナルが生成される。
【０１７４】
[0170]  マーカーは、複数の処理ステップの実行を介して分析されてもよい。一実施形態では、該方法は、細菌を溶解することを含む。一実施形態では、微生物リゾチームがバクテリオファージ曝露サンプルに添加される。一実施形態では、溶解は、クロロホルムをバクテリオファージ曝露サンプルに添加する、バクテリオファージ曝露サンプルを酸で処理する、又はそれ以外としてバクテリオファージ曝露サンプルを物理的に処理することを含む。
【０１７５】
[0171]  他の方法と対照的に、子孫ファージの生成、宿主の破壊、子孫ファージの試験サンプルへの放出と、その後の細菌感染の繰り返しは要求されない。さらに、多くの先行分野の方法がインタクトな子孫ファージの検出に依存する一方で、本開示の実施形態は、細菌又はファージ又はヒトなどの細菌感染宿主により天然には発現されない、過剰発現されたマーカータンパク質の検出を含む。他の実施形態では、マーカー遺伝子の産物は、機能的にスクリーニングされてもよい、特定の表現型、例えば抗生物質耐性又は増強された増殖特性をもたらしてもよい。
【０１７６】
[0172]  一実施形態では、バクテリオファージマーカーは、サンプル中での標的細菌の存在の間接的指標である。バクテリオファージマーカーが親ファージの成分である場合、該曝露サンプル中の親ファージの初期濃度は、生成されたバックグラウンドシグナルがアッセイにおいて検出不能であるように制御されてもよい。したがって、標的細菌がサンプル中に存在しない場合、感染が生じず、組換えバクテリオファージマーカー遺伝子が発現されず、そして新たなバクテリオファージマーカーが合成されない。一実施形態では、使用のバクテリオファージがアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを生成しないことを確認するため、標的細菌型を欠いていることが知られる対照サンプルを用いて負の制御が実行される。本開示の他の態様は、標的細菌を含む曝露サンプルから生じる任意のシグナルと識別できるバックグラウンドシグナルを同定するため、陰性対照の使用を提供してもよい。
【０１７７】
[0173]  特定の実施形態では、一旦生体サンプルが（培養塊の増殖の存在下又は不在下で）調製されていると、典型的には、それは形質導入粒子に、該粒子と細菌との結合及び遺伝子材料の注入を促進する条件下で、典型的には細菌の迅速な増殖を支持する温度（例えば３５℃〜４０℃）で、感染を可能にするのに十分な時間（例えば１５分〜１２０分）撹拌せずに曝露されることになる。感染後、レポーター遺伝子の発現を可能にするため、細胞はインキュベートされ、レポーター遺伝子発現が下記のように検出される。
【０１７８】
[0174]  該方法は、均質な単離物とともに、例えば複数の細菌種を含む異質な細菌サンプルに適用可能である。用語「複数」は、２以上の単位、例えば細菌種を意味するが、各単位は、構造的に且つ／又は機能的に異なる必要はない。特定の実施形態では、該サンプルは、例えば特定集団に適応される特定の栄養培地を用いてスクリーニングされ、均質な細菌集団を提供してもよい。
【０１７９】
[0175]  形質導入された細菌細胞の均質なコロニーを生成することを意図した通常のファージ形質導入技術と対照的に、該方法は、形質導入細菌が何らかの方法で単離されることを必要としない。その代わり、生存可能であり、通常は増殖する非標的細菌が存在する場合、レポーター遺伝子又はその産物によって与えられる、スクリーニング可能な表現型、例えば肉眼的に観察可能な形質は、生体サンプルの非選択的部分において検出されうる。スクリーニングは、形質導入細菌を単離する必要がないことから、選択なしに行うことができる。
【０１８０】
[0176]  いくつかの実施形態では、該方法は、マーカー核酸又はその産物の存在又は不在についてサンプルを分析することを含む。マーカー核酸又はその産物の検出に適した方法は、当該技術分野で公知であり、サンプルの性質に応じて変化しうるものであり、変化することになる。
【０１８１】
[0177]  いくつかの実施形態では、細菌の抗生物質に対する感受性又は耐性を判定するための方法は、上記の抗生物質処置、ファージ形質転換及び検出ステップを実施することにより提供される。抗生物質処置及びファージ形質転換のこれらのステップは、任意の順序で又は同時に実施されてもよい。一実施形態では、抗生物質処置及びファージ形質転換のステップは、経時的に実施される。用語「経時的に」は、本明細書で用いられるとき、該ステップが順に、例えば、分、時間、日又は週の１又は複数の間隔で実施されることを意味する。適切な場合、該ステップは、規則的な反復サイクルで実施されてもよい。別の実施形態では、抗生物質処置及びファージ形質転換ステップは、一緒に実施され、次いで測定ステップが実施される。
【０１８２】
Ｈ．検出方法
[0178]  レポーター遺伝子又はその産物を検出する方法は、間接的又は直接的であってもよい。間接的検出は、レポーター遺伝子若しくはその産物をサンプル中の他の成分から分離すること、又はサンプル中のレポーター遺伝子若しくはその産物を濃縮すること、その後の精製若しくは濃縮サンプル中でのレポーター遺伝子若しくはその産物の検出を含んでもよい。レポーター遺伝子又はその産物は、遊離状態（例えば、ファージを含有する培地中）で又は（例えば、サイトゾル内の又はゲノム中に組み込まれた細菌内部に含有される）結合形態で検出されてもよい。いくつかの実施形態では、レポーターは、先に記載の通り、酵素活性、例えばＣＡＴ活性又はＡＰ活性を有するタンパク質であってもよい。かかる場合、レポーター活性は、酵素技術を用いて判定される。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、基質の検出可能な分子への加水分解を触媒する加水分解分子である。
【０１８３】
[0179]  一実施形態では、レポータータンパク質又はその断片は、質量分析を用いて検出される。特に、クロマトグラフィーステップを質量分析ステップと連結させる技術が用いられてもよい。概して、レポータータンパク質又はその断片の存在は、液体クロマトグラフィーと後続する質量分析を用いて判定されてもよい。
【０１８４】
[0180]  いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣの非限定例として、分配クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、置換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、バイオアフィニティークロマトグラフィー、水性順相クロマトグラフィー、又は超高速液体クロマトグラフィーを挙げてもよい。一実施形態では、液体クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィーであってもよい。
【０１８５】
[0181]  いくつかの実施形態では、質量分析は、コンスタントニュートラルロス質量分析であってもよい。他の実施形態では、質量分析は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）であってもよい。異なる実施形態では、質量分析は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）であってもよい。具体的な実施形態では、質量分析は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）であってもよい。
【０１８６】
[0182]  例示的な実施形態では、該方法は、液体クロマトグラフィーとその後のタンデム質量分析を含む。特に例示的な実施形態では、該方法は、実施例に記載の通り、液体クロマトグラフィーとその後のタンデム質量分析を含む。別の例示的な実施形態では、該方法は、液体クロマトグラフィーとその後のコンスタントニュートラルロス質量分析を含む。特に例示的な実施形態では、該方法は、実施例に記載の通り、液体クロマトグラフィーとその後のコンスタントニュートラルロス質量分析を含む。さらに別の例示的な実施形態では、該方法は、液体クロマトグラフィーとその後のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を含む。
【０１８７】
[0183]  上記実施形態の各々において、サンプル中でのレポータータンパク質又はその断片の存在を判定するため、液体クロマトグラフィーとその後の質量分析が用いられてもよい、又はサンプル中でのレポータータンパク質又はその断片の存在及び量を判定するため、液体クロマトグラフィーとその後の質量分析が用いられてもよい。好ましい実施形態では、サンプル中でのレポータータンパク質又はその断片の存在を判定するため、液体クロマトグラフィーとその後の質量分析が用いられてもよい。
【０１８８】
[0184]  別の実施形態では、レポータータンパク質又はその断片は、細胞数測定技術を用いて検出されてもよい。培養された細菌の細胞数測定を実施するための方法は、他で報告されている(Martinez et al., Cytometry (1982) 3(2):129-33; Suller et al., J Antimicrob Chemother (1997) 40(1):77-83;及びRoth et al., Appl Environ Microbiol (1997) 63(6):2421-31)が、それらはファージレポータータンパク質の検出を含まない。細胞数検出方法は、グラム陽性及びグラム陰性細菌の双方、例えば、大腸菌(Escherichia coli)（Martinez、上記）、セレウス菌(Bacillus cereus)（Roth、上記）、黄色ブドウ球菌(S. aureus) (Suller et al., J Antimicrob Chemother (1997) 40(1):77-83)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis) (Cohen et al., J Clin Microbiol (1989) 27(6):1250-6)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes) （Cohen、上記）、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)（Cohen、上記）、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)（Cohen、上記）、Ｐ．スタッツェリ(P. stutzeri)（Cohen、上記）、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)（Cohen、上記）、及びエンテロバクター菌種(Enterobacter spp.)（Cohen、上記）に適応されうる。
【０１８９】
[0185]  上記の実施形態では、該方法では、宿主特異的な組換え又は改変ファージが利用される。例えば、ペスト菌(Yersinia pestis)の特異的検出においては、ペスト菌(Yersinia pestis)に感染する能力がある遺伝子組換えφA1122を用いることができる。複数の標的細菌型を検出するため、各標的細菌型に特異的なバクテリオファージの１種が単一の試験サンプル、又は個別にその区画に添加されてもよい。
【０１９０】
Ｉ．加水分解酵素
[0186]  本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、組換え又は改変バクテリオファージは、標的細菌種、バクテリオファージ、非ヒト動物、ヒト、又はそれらの組み合わせに対して異種でありうる、加水分解酵素をコードする遺伝子を含有してもよい。本開示を意図して、加水分解酵素は、特異的基質の１以上の化学結合の加水分解を触媒する任意の酵素でありうる。好適な基質の例として、限定はされないが、タンパク質、ポリペプチド、デンプン、脂肪、リン酸エステル、及び核酸などの化合物が挙げられる。
【０１９１】
[0187]  いくつかの実施形態では、加水分解酵素は、セルラーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホエステラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及びプロテアーゼから選択されうる。いくつかの実施形態では、加水分解酵素は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ディスパーゼ、プラスミン、ブロメリン、クロストリパイン、サーモリシン、ノイラミニダーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スブチリシン、パパイン、キモパパイン、プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、フィブリノリシン、セラチオペプチダーゼ、パンクレアチン、アミラーゼ、リゾチーム、カテプシン−Ｇ、アルカリ性及び酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ，Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドゥロナーゼ、並びにＰＭＮ白血球セリンプロテアーゼからなる群から選択されうる。他の好適な加水分解酵素は、当業者にとって明らかであろう。
【０１９２】
[0188]  改変又は組換えファージにおいてコードされる加水分解酵素は、好ましくは異種であり、通常はヒト、細菌、又は改変若しくは組換えファージにおいて見出されない。かかる異種の遺伝子及び酵素の使用により、本開示方法の試験系と標的細菌種に対して天然の成分との交差反応性の可能性が最小化される。
【０１９３】
[0189]  本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、改変又は組換えファージによってコードされる加水分解酵素は、特定の細菌−ファージ相互作用時に限って生成される。したがって、酵素が生成されるとき、それは標的細菌種の存在の陽性指標である。改変又は組換えファージが増幅され、細胞溶解が生じるとき、酵素は溶液中に放出され、その場合、それは基質と相互作用しうる。或いは、酵素は、細胞から酵素を分泌するため、シグナル配列に融合されてもよい。
【０１９４】
Ｊ．基質
[0190]  基質は、標的細菌種と改変又は組換えファージとの相互作用時に限って生成される、選択された異種酵素と特異的に相互作用するように設計されうる。設計された基質は、細菌を培養するための試薬配合物中に含めることができる。基質の触媒作用又は加水分解時、検出可能なシグナルが生成される。いくつかの実施形態では、基質は、分子内で消光される酵素特異的基質である。分子内で消光される酵素特異的基質は、消光されたシグナル伝達分子、例えばフルオロフォア又は色素原、消光分子（即ちクエンチャー）、及び基質リンカーを含みうる。基質リンカーは、シグナル伝達分子をクエンチャーに架橋し、その２者を近接状態で維持する。
【０１９５】
[0191]  図１は、分子内で消光される酵素特異的基質の一実施形態を図示する。この図示では、１以上のクエンチャー（黒丸）は、基質リンカー（白色リボン形状）によりシグナル伝達分子（外向きに広がる放射線を有する白丸）に連結される。いくつかの実施形態では、１以上の基質リンカーが、１以上のクエンチャーを１以上のシグナル伝達分子に連結しうる。いくつかの実施形態では、単一のシグナル伝達分子が、単一の基質リンカーを介して単一のクエンチャーに連結される。いくつかの実施形態では、複数のシグナル伝達分子が、単一の基質リンカーを介して複数のクエンチャーに連結される。
【０１９６】
[0192]  いくつかの実施形態では、クエンチャーは、互いに近接状態にある、例えば約３ｎｍ〜約５ｎｍであるときに限り、蛍光又は比色分析シグナルを消光する。架橋基質の加水分解時、クエンチャー及びシグナル伝達分子は、もはや近接状態で結合されず、消光効果は低減又は除去される。シグナル伝達分子がフルオロフォア又は色素原であるとき、消光されないシグナル伝達分子は、蛍光又は比色分析シグナルを測定することにより検出されうる。シグナルが所定閾値を超えるとき、標的細菌種の存在が示される。それに対し、標的細菌種が存在しないとき、ファージは増幅しないことになり、且つシグナルは所定閾値を超えないことになる。
【０１９７】
[0193]  いくつかの実施形態では、標的細菌種の感受性は、本開示の酵素特異的基質の使用により検出されうる。いくつかの実施形態では、細菌種が感受性を示す有効量の抗生物質又は抗菌剤の存在下でインキュベートされた標的細菌種は、検出可能なシグナル又は所定閾値を超える検出可能なシグナルを生成するのに十分な量で組換え又は改変ファージを増幅しないことになる。シグナルが検出されない又は所定閾値未満であるとき、抗菌剤に対する感受性が示される。標的細菌種が抗生物質又は抗菌剤に耐性がある又は感受性がない場合、所定閾値を超える検出可能なシグナルが生成されることになる。したがって、陰性又は陽性結果は、抗生物質又は抗菌剤に対する細菌種の感受性を示しうる。
【０１９８】
[0194]  好適なシグナル伝達分子は、当業者にとって明らかになるであろう。例えば、フルオロフォア及びクエンチャーの組み合わせは、下の表４中に列挙されるペアの１つから選択されうる
【０１９９】
【表５】
2020535808.tif 000007
【０２００】
Ｋ．ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）
[0195]  マーカーが異種非コードＲＮＡをコードする遺伝子であるとき、マーカーのレベル又は活性は、逆転写ヘリカーゼ依存性増幅（ＲＴ−ＨＤＡ）を用いて検出又は測定されうる。本方法にＲＴ−ＨＤＡを適用するための手順は、当業者の技能の範囲内にある。かかる方法は、米国特許第７，２８２，３２８号、米国特許第７，６６２，５９４号、米国特許第７，８２９，２８４号、米国特許第８，６８５，６４８号、米国特許第９，３０３，２８８号、米国特許第９，１２１，０５４号（内容はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。ＨＤＡを用いる商業的な方法及び計測手段、例えばQuidel (San Diego, CA)により市販されているSolanaシステムが利用可能である。
【０２０１】
[0196]  ＲＴ−ＨＤＡは、マーカーの低レベルでの検出のための使用にＲＴ−ＨＤＡを適合させる、せいぜい約１０９に相当する倍数分、改変バクテリオファージで生成されるシグナルを増幅しうる。特有の安定な自己スプライシングＲＮＡが、標的細胞の感染時に生成され、細胞溶解後、ＲＴ−ＨＤＡにより検出されうる。ＲＴ−ＨＤＡでは、ＲＮＡ鋳型の検出用に最適化されている、試薬（逆転写酵素、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨＩＩ、緩衝液、ｄＮＴＰ及び補助因子）の所定の混合物を用いることができる。いくつかの実施形態では、各非コードＲＮＡに特異的なプライマーは、標準のソフトウェアを用いて、イントロン接合部を網羅するように設計されることになる。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、自己スプライシングする。さらに、ＲＴ−ＨＤＡでは、プローブを用いてもよい。いくつかの実施形態では、プローブは約１８〜２０塩基長でありえ、それは非コードＲＮＡ及び／又は非コードＲＮＡに対応するｃＤＮＡのスプライス接合部位（それ故、ＲＮＡに固有であり、且つファージＤＮＡに不在である）に重複し、且つ異なる波長で蛍光を発することになる各細菌種に特異的なフルオロフォア／クエンチャー対を宿すように設計されている。次に、培養単離物の検出及び薬剤感受性分析が評価されうる。
【０２０２】
[0197]  いくつかの実施形態では、等温ＨＤＡが用いられる。この技術では、ＤＮＡヘリカーゼを用いて、６５℃の一定温度で指数関数的増幅中にＤＮＡ鎖が分離される。結果として、計測手段のコストは、温度循環を要するＰＣＲよりも有意に低い。ＰＣＲと同様、ＨＤＡは、２つのプライマーに依存し、プローブに基づく検出に広範な形式で適応しうる。選択された酵素は、一般に臨床標本中に見出される阻害剤の存在下で標的配列を増幅することができる。ＤＮＡヘリカーゼがＲＮＡ：ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をほどくとともに、逆転写及び増幅反応の双方が同時に生じることから、ＨＤＡはＲＮＡをＤＮＡよりも高速に増幅しうる。
【０２０３】
[0198]  例示的な実施形態では、非コードＲＮＡをコードする異種遺伝子を有する改変ファージによって形質転換されている培養物は、以下の様式でＲＴ−ＨＤＡによって分析される。感染後、非コードＲＮＡマーカーは、細胞から発現され、放出される。非コードＲＮＡは、２以上のスプライスイントロンを含む自己スプライシングＲＮＡでありうる。次に、非コードＲＮＡは、逆転写酵素を用いて転写され、ｃＤＮＡ増幅産物が生成される。次に、ヘリカーゼ及び他の転写を助けるタンパク質は、ＲＮＡ：ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をほどき、転写及び増幅を補助しうる。このサイクルは、十分な量の増幅産物が生成されるまで反復される。増幅産物を検出するため、分子内で消光されるプローブが用いられる。プローブは、クエンチャー、シグナル伝達分子（例えば、フルオロフォア又は色素原）、及び核酸リンカーを含みうる。核酸リンカーは、シグナル伝達分子及びクエンチャーに結合し、クエンチャー及びシグナル伝達分子を近接状態（例えば約３〜約５ｎｍ）で保持する架橋として作用する。リンカーは、非コードＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡ増幅産物のスプライスイントロン接合部の配列位置を網羅する部位で増幅産物に結合するように設計された核酸である。リンカー核酸は、リンカーの迅速な切断を補助するため、イントロン接合部位に単一のＲＮＡ塩基を有しうる。切断時、シグナル伝達分子及びクエンチャーは、もはや近接状態で保持されず、消光が減少する。１以上のＲＮＡ塩基を含む核酸リンカーを切断するため、リボヌクレアーゼが使用可能である。次に、シグナル伝達分子のシグナル効果が検出されうる。いくつかの実施形態では、シグナルは、蛍光又は比色分析測定により検出される。
【０２０４】
[0199]  本明細書に記載の方法の一実施形態に従う第１の例示的ワークフローでは、細菌を含むサンプルが得られる。上記の通り、サンプルは、対象由来、食品由来、環境由来などでありうる。サンプルは、要求又は所望される場合、処理又は処置されうる。サンプルの一定分量が抗生物質の存在下でインキュベート又は培養される、また任意選択的には、サンプルの一定分量が抗生物質の不在下でインキュベート又は培養される。同時に又は経時的に、サンプルの一定分量は、サンプル中の細菌に特異的な組換え又は改変ファージとともにインキュベート又は培養される。上記の通り、改変ファージは、異種マーカーを含む。次に、抗生物質及び改変ファージとのインキュベーションにより生成された培養物は、マーカーの存在又は不在を判定するため、分析され（定量的又は定性的）、結果又はデータが報告される。
【０２０５】
[0200]  本明細書に記載の方法の別の実施形態に従う第２の例示的ワークフローでは、細菌を含むサンプルが得られる。サンプルは、要求又は所望される場合、処理又は処置されうる。抗生物質を伴う流体培地及び抗生物質を伴わない流体培地を含有する容器が調製される。サンプルの一定分量が各容器中に入れられ、混合される。次に、各容器は、所望される温度で所望される期間インキュベートされ、この実施形態では、各容器は３５℃で２時間インキュベートされる。容器は、インキュベーション後、再び混合可能であり、次に改変ファージが容器に導入され、混合され、次にインキュベートされることで、二次培養物が生成される。次に、二次培養物の一定分量が、異種マーカーの存在又は不在について分析される（定量的又は定性的）。
【０２０６】
[0201]  上記の第１及び第２のワークフローは、候補抗生物質を細菌サンプル、細菌株又は細菌株の混合物に対する有効性についてスクリーニングするため、本明細書に記載の方法及びアッセイを実施するのに典型的である。一般に、該方法は、細菌サンプルを試験抗生物質と接触させ、一次培養物を得て、且つ試験抗生物質が欠如した媒体と接触させ、対照一次培養物を得ることと；異種レポーター遺伝子の発現をコードする核酸配列を含む特異的バクテリオファージを、一次培養物及び対照一次培養物と接触させ、試験抗生物質で処置された細菌を含む第１の二次培養物、及び試験抗生物質で処置されていない細菌を含む第２の二次培養物を得ることと；第１及び第２の二次培養物中でのレポーター遺伝子又はその産物のレベル又は活性を検出することと、を含み、ここで第２の二次培養物と比べての第１の二次培養物中のレポーター遺伝子又はその産物のレベル又は活性における低下（又は不在）は、試験化合物が抗生剤であることを示す。該方法はまた、複数の細菌株に対する単一の試験抗生物質をスクリーニングするために用いられる。該方法はまた、抗生物質又は候補抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を意図して、且つ／又は臨床用抗生物質化合物の有効性を判定するためのスクリーニング用に用いられる。
【０２０７】
[0202]  本明細書で用いられるとき、用語「最小発育阻止濃度」は、微生物の可視的増殖を阻害することになる抗生物質の最低濃度を指す。該用語はまた、本明細書に記載の方法及びアッセイを用いて細菌細胞死を引き起こす又は細胞壁修復を阻害する抗生物質の最低濃度を包含する。一実施形態では、本明細書に記載の方法及びアッセイは、細菌株に対する抗生物質又は候補抗生物質における最小発育阻止濃度の決定を可能にする。一実施形態では、抗生物質の最小発育阻止濃度は、抗生物質に曝露されたサンプル中での細菌細胞の、抗生物質に曝露されていないサンプル中、又は異なる濃度の同じ抗生物質に曝露されたサンプル中での同じ細菌細胞と比べての応答（例えば、レポーター染色の取り込み又は放出、形態における変化、代謝における変化など）における調節を評価することにより決定されうる。
【０２０８】
[0203]  最小発育阻止濃度は、細菌細胞死を誘導し且つ／又は細菌媒介性疾患の少なくとも１つの症状を低減するため、対象に投与されるべき抗生物質の最小有効用量を示す臨床的に重要な値である。臨床的には、最小発育阻止濃度は、対象が受けることになる抗生物質の量を決定するだけでなく、使用されるべき好ましい抗生物質を決定するために用いられる。最小発育阻止濃度はまた、候補抗生物質について、例えば臨床試験のための有効性判定及び投与情報が得られるように、決定されうる。
【０２０９】
[0204]  本方法は、細菌の抗生物質及び他の殺菌剤に対する感受性の判定を可能にすることから、インビトロ診断において有用である。形質導入粒子への曝露前、細菌とスクリーニング対象の抗生物質又は殺菌剤との短いインキュベーションを実施することにより、細胞の代謝活性は停止され、表現型の改変が阻止されることになる。かかる試験は、細菌の存在が上記のような形質導入粒子を用いて最初に確認されると、有用となる。次に、細菌感染に対して致死性と判定されている抗生物質及び殺菌剤が、対象の治療用に用いられてもよい。有用な抗生物質及び殺菌剤のかかる迅速且つ早期な検出は、重篤な細菌感染を治療するのに貴重でありうる。
【０２１０】
[0205]  一実施形態では、診断方法は、細菌性疾患を患っている又はそのリスクがあると疑われる対象のサンプルを本明細書に記載のような１以上の組換えファージと接触させること；ファージによって発現されるマーカーの存在又は不在を検出し、且つ任意選択的には定量化すること；マーカーの存在を細菌性疾患の病原体（例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)）に相関させ、それにより対象における細菌性疾患を診断すること、を含んでもよい。「対象」は、限定はされないが、ヒト及び他の霊長類、例えば非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；家畜哺乳類、例えばイヌ及びネコ；実験動物、例えば齧歯類、例えば、マウス、ラット及びモルモット；鳥類、例えば家禽、野鳥及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなどを含む脊索動物門の任意のメンバーを意味する。該用語は、成体及び新生個体の双方を網羅する。
【０２１１】
[0206]  特定の実施形態では、細菌性疾患の陽性診断がなされた後、対象は、任意選択的には、標準の臨床的手順と合致するように、治療、管理、及びフォローアップされてもよい。例えば、対象は、有効量の医薬品、例えば抗生物質で治療されてもよい。本方法を意図して、薬剤の「有効量」は、対象における、病原体、例えば黄色ブドウ球菌(S. aureus)に対する応答をもたらす量となる。これに関連して、咽頭炎を患う対象は、ペニシリンＧベンザチン及び／又はアモキシシリンで治療されてもよい。対象が治療に応答しないことが見出される場合、病原体は、上記の方法を用いて、抗生物質耐性について分析されてもよい。耐性菌としての陽性同定がなされる場合、対象は、第２の抗生剤又はより高用量の抗生剤、又は２以上の抗生剤の組み合わせで治療されてもよい。
【０２１２】
[0207]  同様に、本方法は、抗生物質、例えば動物産物中の抗生物質残基の存在を検出するのに有用である。この手法では、分析対象の材料の抽出物が、問題の抗生物質に感受性がある細菌株の培養物に添加され、且つ所定量の抗生物質が存在する場合、混合物が株を殺滅するのに十分である所定の期間インキュベートされる。この時点で、株に特異的な形質導入粒子が添加され、且つ本明細書に記載のようなアッセイが実施される。所定量の抗生物質が存在する場合、細菌株の細胞は死滅することになり、読み取りは陰性（即ち、ルシフェラーゼアッセイにおける発光の欠如）となる。所定量の抗生物質が存在しない又はＭＩＣより低い場合、細菌は生存することになり、読み取りは陽性（即ち、発光）となる。
【０２１３】
[0208]  具体的な実施形態では、ファージ特異性に基づき、形質導入粒子に感受性が予め与えられている細菌をアッセイするための手段が提供される。即ち、第１のステップでは、標的細菌は、例えば形質転換により修飾されることで、目的のバクテリオファージに対する細胞特異的受容体を含有及び発現する。第２のステップでは、修飾（又はタグ付け）された細菌は、それらが従うべきサンプル環境に導入される、又は混合される。サンプル環境は、外界（例えば、土壌、空気又は水）を含む；生体宿主（例えば、植物、動物、昆虫）に対する；機器（例えば、製造、処理又はパッケージング機器）に対する；且つ臨床サンプル中の、細菌が存在する任意の状況でありうる。次に、本明細書に記載のようなバクテリオファージアッセイは、導入される受容体に特異的であり、且つタグ付き細菌の存在が監視又は定量化されうるバクテリオファージを用いて実施される。
【０２１４】
[0209]  上記の実施形態は、以下の非限定例を考慮してさらに説明される。
【実施例】
【０２１５】
実施例
[0210]  本明細書に記載の構造、材料、組成物、及び方法は、本発明の代表例であることが意図され、且つ本発明の範囲が実施例の範囲によって限定されないことは理解されるであろう。当業者は、本発明が本開示の構造、材料、組成物及び方法に対する変更を伴って実施されてもよく、かかる変更が本発明の境界内とみなされることを理解するであろう。
【０２１６】
実施例１
異種マーカーの発現のための組換えバクテリオファージの構築
[0211]  この試験では、標的細胞又はファージベクター又は細菌−感染宿主により天然には生成されない分子（マーカー）を調製し、その後、異種分子（マーカー）の特異的検出を行う。
【０２１７】
[0212]  組換えバクテリオファージの構築：組換えバクテリオファージを、異種マーカーをコードするＤＮＡ配列を、組換えプラスミドによって媒介される相同組換えを介して、カプシドタンパク質（ｃｐｓ）をコードする核酸配列の下流にあるファージゲノムの強力に発現される領域に挿入することにより構築する。ｃｐｓの上流に位置する強力なプロモーターは、感染後のバクテリオファージゲノムの発現の過程で選択的に活性化され、対応するｍＲＮＡ転写物の多数のコピーを生成する。組換えバクテリオファージの構築は、好適な翻訳シグナル（リボソーム結合部位、中間領域、開始コドン）を有する、レポーターをコードする核酸の融合産物を用いて達成される。代表的な方法は、Loessner et al., Appl. Environ. Microbiol., 62(4):1133-40, 1996及び米国特許第５，８２４，４６８号に記載されている。
【０２１８】
[0213]  プラスミドベクターのエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)K1株（ＡＴＣＣ株２３５０３）へのエレクトロトランスフォーメーション：該株は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中、３７℃で０．８の光学密度（ＯＤ）まで増殖し、その後、１５％グリセロールで数回洗浄することにより、エレクトロコンピテント作製する。エレクトロトランスフォーメーションは、Bio-Rad Labs (Hercules, CA)から入手可能なGENE PULSERを用いて行われる
【０２１９】
[0214]  天然型バクテリオファージによる形質転換大腸菌(E. coli)K1株の感染：宿主細菌の感染後、少なくとも少数の天然バクテリオファージは、プラスミド内でカプシド配列に隣接するluxABの一部との相同組換えを経ることで、luxABの導入により、組換えファージを形成することになる。形質転換細菌は、ＬＢ−アンピシリン培地中、３７℃で０．４の光学密度（ＯＤ）まで増殖させる。バクテリオファージK1-5を約１のバクテリオファージ／１０の細菌の感染多重度（ＭＯＩ）で添加し、溶解が生じるまでＯＤを監視する。可溶化液を、０．４５ミクロンのニトロセルロース膜（Millipore Corp., Bedford, MAから入手可能）を通じて濾過することにより収集する。
【０２２０】
[0215]  可溶化液を、段階希釈を用いて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを有するＬＢ固形寒天上で増殖する野生型大腸菌(E. coli)K1（ＡＴＣＣ２３５０３）上に蒔き、プラークし、プラークのレポーター活性についてアッセイすることにより組換えK1-5バクテリオファージについてスクリーニングする。組換えバクテリオファージが適切に組み込まれたレポーター遺伝子配列を含有するように生成されているという確認は、ファージゲノムを配列決定することにより実施可能である。配列決定は、市販のシークエンサー(Commonwealth Biotechnologies, Richmond, VA)を用いて達成される。
【０２２１】
[0216]  最後に、発現されたマーカーは、蛍光又は比色分析測定により検出する。
【０２２２】
実施例２
ＤＮＡ転位を用いての組換えバクテリオファージの作出
[0217]  異種レポーター核酸を有するバクテリオファージは、Goryshin et al., J. Biol. Chem., 273(13):7367-7374, 1998に記載のように市販のEZ::TN（商標）トランスポザーゼシステム(Epicenter Technologies, Madison, Wis.)を用いて構築する。次に、末端にＭＥに結合されたEZ::TN（商標）トランスポソームをエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)K1株（ＡＴＣＣ株２３５０３）にエレクトロトランスフォームする。該株は、ＬＢ培地中、３７℃で０．８の光学密度（ＯＤ）まで増殖し、その後、１５％グリセロールで数回洗浄することにより、エレクトロコンピテント作製する。エレクトロトランスフォーメーションは、Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)から入手可能なBIORAD GENE PULSERを用いて達成される。
【０２２３】
[0218]  形質転換大腸菌(E. coli)K1株を天然型K1-5バクテリオファージで感染させる。形質転換細菌は、ＬＢ−アンピシリン培地中、３７℃で０．４のＯＤまで増殖する。バクテリオファージK1-5を約１のバクテリオファージ／１０の細菌の感染多重度で添加し、溶解が生じるまでＯＤを監視する。トランスポソームでエレクトロトランスフォームされた宿主細菌の感染後、少なくとも少数の天然K1-5バクテリオファージは、ファージのプラーク形成能に影響しない非侵害性の位置でのランダム転位により、異種レポーター遺伝子を受けることになる。可溶化液を、０．４５ミクロンのニトロセルロース膜（Millipore Corp., Bedford, MAから入手可能）を通じて濾過することにより収集する。
【０２２４】
[0219]  可溶化液を、レポーター遺伝子の産物の活性について、標準的方法、例えば、蛍光定量、比色分析などを用いてスクリーニングする。
【０２２５】
実施例３
組換えバクテリオファージを用いて対象から得られるスクリーニングサンプル
[0220]  細菌感染症の症状（例えば、発熱、頭痛、腹痛、及び悪心）を呈している対象（例えばヒト患者）を同定し、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル０．０１ｍＬ、痰サンプル１．０ｍＬ、及び血液サンプル１．０ｍＬといったサンプルの少なくとも１つを対象から収集する。サンプルの３つ全部を収集するとき、各サンプルを、ＬＢ培地４．０ｍＬで希釈することで各サンプル中に存在する全細菌の増殖を促進し、３７℃で４時間インキュベートする。インキュベーション後、各サンプルを、一定分量１００μＬにより、９６ウェルプレートの３０ウェルに分布させる。血液サンプルの一定分量をウェル１〜３０に添加し、ＣＳＦサンプルの一定分量をウェル３１〜６０に添加し、且つ痰サンプルの一定分量をウェル６１〜９０に添加する。ウェル９１〜９３は陽性対照として役立ち、ウェル９４〜９６は陰性対照として役立つ。１以上の抗菌剤に対する感受性について同時にスクリーニングするとき、ウェルの一部は抗生物質又は抗生物質の組み合わせを有することになり、ウェルの一部は存在する抗生物質を有しないことになる。
【０２２６】
[0221]  ５つの組換えバクテリオファージ、即ち、大腸菌(E. coli)K1細菌に感染するK1-5::luxABバクテリオファージ；腸球菌(enterococcus)に感染するEBN6::luxABバクテリオファージ；ブドウ球菌(staphylococcus)に感染するTwort::luxABバクテリオファージ；サルモネラ(Salmonella)菌に感染するSp6::luxABバクテリオファージ；及び連鎖球菌(streptococcus)に感染するRZh::luxABバクテリオファージを入手する。該ファージは、別の供給源から得る、又は実施例１に記載のプロトコルを用いて原位置で改変する。
【０２２７】
[0222]  約３×１０８のファージ／ｍＬに相当する組換えバクテリオファージ懸濁液を、患者から収集した３つのサンプルの各々に対応する、３０ウェルの群の６つの各ウェルに添加する。上に示す３つのサンプルの同時的な同定及び抗菌薬の感受性に対する９６ウェルプレートの例示的な立体配置を、下の表５に提示する。各改変バクテリオファージは、固有のマーカーを発現し、それらの各々が比活性を有する。マイナーな調節により、この系は多重検出に適応し、例えば、ここで複数のサンプルは一緒に又は同時に処理する。後者の系は、特定疾患の病態形成に関与する細菌病原体のコホートの同定に特に有用である。例えば、尿路感染（ＵＴＩ）に関連する病原体、例えば、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ(Klebsiella)、エンテロバクター(Enterobacter)、シュードモナス(Pseudomonas)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、プロテウス(Proteus)はすべて、多重アレイフォ−マットを用いて同定及び特徴づけが可能である。
【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
【表７】
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【０２３０】
実施例４
マーカーの存在についてのウェルの分析
[0223]  実施例３におけるウェル内のサンプルの各々を、それらに適用した組換えファージによってコードされる異種マーカーの存在についてさらに分析する。マーカーの存在は、ウェル１〜９６の溶液の各々中でのプローブの使用により検出される。培養物の所定の時間にわたるインキュベーション後、プローブを添加する。或いは、培養物はプローブの存在下でインキュベートしてもよい。
【０２３１】
加水分解酵素マーカーについての分析
[0224]  加水分解酵素に対するプローブは、特定のフルオロフォアを特定のクエンチャーと連結することにより設計する。例えば、１本のプローブは、FAMをBHQ-1と組み合わせ、４９４ｎｍの蛍光励起波長及び５１９ｎｍの蛍光発光波長を有する。クエンチャー及びフルオロフォアは、連結ペプチドにより、近接状態（例えば３〜５ｎｍ）で一緒に連結される。ペプチドによって一緒に連結されるとき、クエンチャーとフルオロフォアとが近接状態であることにより、フルオロフォアの蛍光特性が低下する。特定のフルオロフォア又は色素原を対応するクエンチャーとともに用いて、追加的プローブが作られ、各プローブは、ペプチド、炭水化物、及び核酸から選択される固有のリンカーを有する。固有の各リンカーは、そのリンカーに特異的な対応する加水分解酵素マーカーが所与の培養物中に存在する場合に限り、加水分解されることになる。
【０２３２】
[0225]  プローブを９６ウェルプレートのウェル１〜９３に添加し、所定の時間にわたりインキュベーションの継続を可能にする。所定の時間後、９６ウェルプレートを蛍光分光計に導入し、プローブ中で用いられる特定のフルオロフォアに応じて、蛍光及び放射スペクトルが得られる。FAMプローブにおいては、４９４ｎｍで励起スペクトルが得られ、５１９ｎｍで放射スペクトルが得られる。
【０２３３】
[0226]  加水分解酵素マーカーが存在するとき、対応する特異的なリンカーが加水分解され、蛍光が検出される。蛍光の閾値量の検出は、マーカーの存在を示す。マーカーを有しないウェル９１〜９３内、及びマーカー又はプローブを有しないウェル９４〜９６内では蛍光が検出されない。抗生物質が不在である内在する標的細菌種を有するウェルが、対応するバクテリオファージにより形質転換され、加水分解酵素マーカーが生成される。加水分解酵素は基質リンカーを切断し、フルオロフォアの消光が低減又は除去される。蛍光が検出されることにより、標的細菌種の存在が示され、同定される。標的細菌種が存在しないようなウェルは、ファージ感染を経ることができないことから、蛍光シグナルに翻訳可能であるようなマーカーが生成されない。蛍光シグナルを生成する抗生物質に加えて標的細菌種が存在するようなウェルは、標的細菌種が抗生物質に感受性がない又は耐性があることの指標である。蛍光シグナルを生成しない又は減弱した蛍光シグナルを生成する抗生物質に加えて標的細菌種が存在するようなウェルは、標的細菌種が抗生物質に感受性があることを示す。下の表６は、ウェル１〜６に対するアッセイ例を提示する。
【０２３４】
【表８】
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【０２３５】
非コードＲＮＡマーカーについての分析
[0227]  或いは、マーカーが固有の非コードＲＮＡをコードするとき、非コードＲＮＡ部位の各イントロン−スプライスにまたがる５つの固有プローブを、異なる波長で蛍光を発することになるフルオロフォア／クエンチャー対を内包するように設計する。非コードＲＮＡのイントロン−スプライス接合部にまたがる配列に対応する核酸プローブによって一緒に連結されるＲＯＸフルオロフォア及びBHQ-2クエンチャーにより、１本のプローブが作られる。核酸リンカーは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を有する。ＲＯＸは、６２５ｎｍの蛍光発光波長を有する。
【０２３６】
[0228]  バックグラウンド蛍光を最小化するため、プローブ内部でのフルオロフォアとクエンチャーとの間のスペーシングを最適化することで（＜３．４ｎｍの距離）、≧９５％のシグナル抑制をもたらす。単一のＲＮＡ塩基を各プローブ内部に位置づけ、リボヌクレアーゼＨＩＩによるその切断の効率を最大化する。必要な場合、２以上のＲＮＡ塩基を考慮することができる。
【０２３７】
[0229]  Quidel,Corpによって市販されているSOLANAシステム上でＲＴ−ＨＤＡを用いて、実施例３のウェルにおける非コードＲＮＡの存在について試験する。酵素（逆転写酵素、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、及びリボヌクレアーゼＨＩＩ）のマスターミックスを培養物に添加し、その中に存在する任意の非コードＲＮＡを単離する。非コードＲＮＡを酵素混合物を用いて増幅し、マーカー又はその増幅産物を、対応するプローブを添加し、且つＲＯＸに基づくプローブに対する正確な波長、例えば６２５ｎｍで蛍光発光を測定することにより検出する。結果の解釈は、上の表６に提示される例と同様に行う。
【０２３８】
[0230]  他の実施形態：先行例は、一般に若しくは具体的に述べられる反応物及び／又は本明細書中の他の箇所で述べられる操作条件を、先行例の中で用いられるものと置き換えることにより反復し、同様の成功を収めることができる。
【０２３９】
[0231]  前述から、当業者は、本方法の本質的特徴を容易に確認することができ、またその精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修飾を行うことで、それを様々な使用及び条件に適応させることができる。
【０２４０】
[0232]  特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される場合に類似又は相当する方法及び材料を本発明の実施又は試験において用いることができるが、好適な方法及び材料が前述のパラグラフにおいて説明される。さらに、材料、方法、及び例は、あくまで例示的なものであり、限定することが意図されていない。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が制御することになる。
【０２４１】
[0233]  本明細書に引用されるすべての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により援用される。本明細書に引用されるすべての公開された外国特許及び特許出願は、本明細書により、参照により援用される。本明細書に引用されるすべての公開された参照文献、文書、論文、科学文献は、本明細書により、参照により援用される。科学データベース（例えば、ＮＣＢＩ、ジェンバンク、ＥＢＩ）に関係するすべての識別子及び受入番号は、本明細書により、参照により援用される。
【図１】
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【国際調査報告】
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