(57)【要約】  アンカータンパク質を含む少なくとも１つの包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含む二重層又はミセルであるリン脂質組成物が提供され、アンカータンパク質は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、ａ）酵素である、又は、ｂ）アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンカータンパク質を含む少なくとも１つの包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含む二重層又はミセルであるリン脂質組成物であって、前記アンカータンパク質は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、
ａ）  酵素である、又は、
ｂ）  アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質である、組成物。
【請求項２】
前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、ポリエチレングリコールを含有する界面活性剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、少なくとも約５００Ｄａの分子量を有する界面活性剤を含み、任意的に前記界面活性剤はＳ１７８３である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リン脂質二重層は、細胞、任意的に間葉系幹細胞又は心筋細胞の表面膜を形成する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記アンカータンパク質は、アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質であり、前記アンカータンパク質は、ＣｓｈＡである又は配列番号１９を含むＣｓｈＡの機能的変異体若しくは部分である２次分子に結合する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のリン脂質組成物を含み、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルをさらに含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のリン脂質組成物と、少なくとも１つの外科的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルとを含む、外科用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物を作製する方法であって、
ａ）  タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを提供するステップ、及び、
ｂ）  前記コンジュゲートにリン脂質二重層又はミセルを接触させるステップを含み、
前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、（ｉ）酵素である、及び／又は、（ｉｉ）アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質であるアンカータンパク質を含む、方法。
【請求項９】
前記リン脂質二重層は細胞であり、ステップ（ｂ）は、前記細胞を前記コンジュゲートに接触させることと、低くとも約１０℃の温度で少なくとも約２分の時間インキュベートすることと、任意的に、その後前記細胞を洗浄することとを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質と界面活性剤との静電的コンジュゲーションを可能にする条件下で、前記アンカータンパク質を前記界面活性剤に接触させることを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤はポリエチレングリコールを含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤は少なくとも約５００Ｄａの分子量を有し、任意的に前記界面活性剤はＳ１７８３を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンカータンパク質は、
ｉ）  アンカー前駆体タンパク質の溶液をＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）又はその類似体のｐＨ中和溶液と混合するステップ、及び任意的に、混合物をｐＨ５〜７に調節するステップ、
ｉｉ）  その後又は同時に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを添加するステップ、及び前記混合物をｐＨ４〜７に調節するステップ、
ｉｉｉ）  （ｉｉ）の前記混合物をｐＨ４〜７において０〜２５℃の温度で１〜３０時間かく拌するステップ、
ｉｖ）  水又はバッファーに対して（ｉｉｉ）の前記混合物内の前記タンパク質をｐＨ６．５〜８．５において少なくとも４時間透析するステップ、
ｖ）  必要であれば、（ｉｖ）の前記混合物のｐＨをｐＨ６．５〜８．５に調節するステップ、を含む方法によって得られ、
前記アンカー前駆体タンパク質は酵素であり、さらに、
−  ステップ（ｉｉｉ）は約１２０分以下継続され、及び／又は、
−  前記方法は、ステップ（ｉｖ）、若しくは存在する場合はステップ（ｖ）の前記混合物にサイズ排除クロマトグラフィーを行うステップ（ｖｉ）をさらに含む、請求項１０、１１、又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンカータンパク質は、スーパーチャージタンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列の発現を含む方法によって得られる、請求項１０、１１、又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えＤＮＡ配列は、前記スーパーチャージタンパク質と２次分子とを含む融合タンパク質をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記２次分子は、ＣｓｈＡ、配列番号１９を含むＣｓｈＡの機能的変異体若しくは部分、ＯｐｄＡ（配列番号１０若しくは配列番号３９）、トロンビン、プロトロンビン、ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）、若しくは配列番号２１を含むＰＩＧＦ−２の機能的変異体若しくは部分、スパイキャッチャーポリペプチド（配列番号２３）、若しくはスパイタグポリペプチド（配列番号２４）の１つ以上を含む、又は非変異体配列に対して少なくとも約６０％の配列同一性を有するこれらのいずれかの機能的変異体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えＤＮＡ配列は配列番号４〜７の配列を有する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質標識で細胞を標識する方法であって、請求項８〜１７のいずれかに記載の方法を含み、前記リン脂質二重層が前記細胞の外膜を形成し、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが前記タンパク質標識を含む、方法。
【請求項１９】
請求項８の方法におけるステップ（ａ）は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質と界面活性剤との静電的コンジュゲーションを可能にする条件下で、前記アンカータンパク質を前記界面活性剤に接触させることを含み、さらに、前記アンカータンパク質は、スーパーチャージタンパク質と２次分子とを含む融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列の発現を含む方法によって得られ、前記タンパク質標識は前記２次分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれかに記載のリン脂質組成物を含む組織工学用足場。
【請求項２１】
前記リン脂質組成物は、そのアンカー前駆体タンパク質形態において組織の成長及び／若しくは治癒を促進することが知られているアンカータンパク質を含む、並びに／又は、前記リン脂質組成物は、組織の成長及び／若しくは治癒を促進することが知られている２次分子を含む、請求項２０に記載の組織工学用足場。
【請求項２２】
前記アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン、若しくはトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体、若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体である、並びに／又は、前記２次分子は、トロンビン、プロトロンビン、ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）、若しくは配列番号２１を含むＰＩＧＦ−２の機能的変異体若しくは部分である、請求項２１に記載の組織工学用足場。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載の組織工学用足場を形成する方法であって、前記タンパク質がカチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン若しくはプロトロンビン、若しくは、トロンビン若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体である、又は、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートがトロンビン若しくはプロトロンビン、若しくはトロンビン若しくはプロトロンビンの機能的変異体である２次分子を含む請求項４に記載の細胞を、フィブリノゲン含有ゲル又は構造などのフィブリノゲン組成物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項２４】
組織の成長及び／又は治癒を促進する方法であって、前記アンカータンパク質が前記組織の成長及び／若しくは治癒を促進することで知られている、又は、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが前記組織の成長及び／若しくは治癒を促進することで知られている２次分子を含む請求項４に記載のリン脂質組成物である細胞を、前記組織の成長及び／又は治癒が求められる部位に導入することによって、該細胞を使用するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記細胞は間葉系幹細胞であり、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）又は配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分である２次分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項６に記載の医薬組成物、又は請求項７に記載の外科用組成物、又は請求項２０に記載の組織工学用足場を使用するステップを含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を組織にターゲティングする方法であって、請求項４に記載のリン脂質組成物である細胞を使用するステップを含み、前記リン脂質二重層が前記細胞の外膜を形成し、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが前記組織に特異的なタンパク質を含む、方法。
【請求項２８】
前記組織に特異的な前記タンパク質は、前記アンカータンパク質又は２次分子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記２次分子は、カチオン化若しくはスーパーチャージの抗体、レクチン、インテグリン、又は接着分子、任意的にＣｓｈＡ（配列番号２０）又は配列番号１９を含むその部分若しくは機能的変異体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項６に記載の医薬組成物、又は請求項７に記載の外科用組成物、又は請求項２０に記載の組織工学用足場を使用するステップを含む、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎に罹患するヒト又は動物個体を処置する方法である請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質を細胞内部に送達する方法であって、請求項４に記載のリン脂質組成物である細胞を得るため請求項８〜１７のいずれかに記載の方法を使用するステップを含み、前記リン脂質二重層が前記細胞の外膜を形成し、さらに前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートがエンドサイトーシスのスピード／速度を促進又は抑制する分子を含む、方法。
【請求項３３】
治療における使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載のリン脂質組成物、又は請求項６に記載の医薬組成物、又は請求項７に記載の外科用組成物、又は請求項２０に記載の組織工学用足場。
【請求項３４】
前記組成物は組織の成長及び／又は治癒を促進することが知られているタンパク質を含む、前記組織の成長及び／又は治癒の促進における使用のための、請求項３３に記載のリン脂質組成物。
【請求項３５】
心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎の処置の方法における使用のための、請求項３３又は３４に記載のリン脂質組成物。
【請求項３６】
前記リン脂質組成物は、（ａ）毒物を中和可能な酵素であるアンカータンパク質を含む、又は（ｂ）毒物に結合若しくは毒物を中和可能な２次分子に結合するアンカータンパク質を含む、前記毒物に接触した被毒ヒト又は動物の処置における使用のための、請求項３３に記載の使用のためのリン脂質組成物。
【請求項３７】
酵素である前記アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのＯｐｄＡ、若しくは、有機リン化合物を分解することができるそのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体若しくは部分である、又は、前記アンカータンパク質に結合する前記２次分子は、ＯｐｄＡ（配列番号１０若しくは配列番号３９）、若しくは有機リン化合物を分解することができるその機能的変異体若しくは部分である、請求項３６に記載の使用のためのリン脂質組成物。
【請求項３８】
毒物を含むサンプルを除染する方法であって、（ａ）前記アンカータンパク質が前記毒物を中和可能な酵素である、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物に前記サンプルを接触させるステップ、又は（ｂ）前記アンカータンパク質が前記毒物に結合若しくは前記毒物を中和可能な２次分子に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物に前記サンプルを接触させるステップを含む、方法。
【請求項３９】
前記サンプルは液体サンプル又は固体サンプルである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固体サンプルは、表面、地面、土壌サンプル、又は布帛であり、任意的に前記布帛は衣服若しくは寝具類である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
酵素である前記アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのＯｐｄＡ、若しくは、有機リン化合物を分解することができるそのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体若しくは部分である、又は、前記アンカータンパク質に結合する前記２次分子は、ＯｐｄＡ（配列番号１０若しくは配列番号３９）、若しくは有機リン化合物を分解することができるその機能的変異体若しくは部分である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
配列番号１１、１３〜１６、若しくは４０のいずれか、若しくは非変異体配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するそれらのいずれかの機能的変異体を含む、又は、
配列番号１０、１９〜２２、若しくは２５〜３９のいずれかのスーパーチャージのものを含む、又は、
スーパーチャージアンカータンパク質及び配列番号１０、若しくは１９〜３９のいずれか、若しくはスーパーチャージアンカータンパク質及び少なくとも６０％の配列同一性を有する配列番号１０、若しくは１９〜３９のいずれかの機能的変異体の融合タンパク質を含む、ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリペプチドをコードし、任意的に配列番号２、又は４〜７のいずれかを含むポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項４２に記載のポリペプチド、及び／又は請求項４３に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項４５】
治療における使用のための、請求項４２に記載のポリペプチド、及び／若しくは請求項４３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
請求項４２若しくは４５に記載のポリペプチド、及び／若しくは請求項４３若しくは４５に記載の核酸、又は請求項４４若しくは４５に記載の医薬組成物を、治療処置を必要とする対象に投与するステップを含む治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酵素などのタンパク質を細胞膜などのリン脂質構造に配置する新規の方法に関する。本発明はまた、該方法から生じる構造及びそうした構造の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞生物学の多くの分野において、細胞表面のタンパク質又は他の部分で細胞を「標識する」ことが望まれることがある。ビオチン若しくはストレプトアビジン、又は金粒子、又は緑色蛍光タンパク質（GFP）による標識など、これを行うために利用可能な多くのシステムが存在する。また、内在性膜タンパク質は標識プロセスにおいて有用なターゲットであり得る。
【０００３】
例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇらは(Nat. Commun.(2015) Jun 17;6:7405)、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）膜への機能化タンパク質の送達を可能にするタンパク質のポリマー−界面活性剤コンジュゲートによってヒト間葉系幹細胞（hMSC）を機能化する方法を記載した。これは、界面活性剤分子が、直接的に(Matsuura et al.(1993) J. Am. Chem. Soc. vol. 155, 1261-1264)、又は、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン(DMPA)基の溶媒露出酸性アミノ酸側鎖へのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド(EDC)媒介結合によるタンパク質表面のカチオン化によって(Perriman et al.(2010) Nature Chem. vol. 2, 622-626; Brogan et al. (2013) J. Phys. Chem. B vol.117, 8400-8407; Sharma et al. (2013) Adv. Mater. vol. 25, 2005-2010)、静電的相互作用によりタンパク質表面にコンジュゲートする、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート（PPSC）を提供する以前の研究に基づいて得られた。これにより、研究者らは、水及び有機溶媒におけるタンパク質の溶解性を変えること(Matsuura et al.(1993) J. Am. Chem. Soc. vol. 155, 1261-1264)、又は液体形態のタンパク質(溶液内のものとは対照的である。例えばPerriman et al.(2010) Nature Chem. vol. 2, 622-626を参照）、若しくは自立膜を形成するタンパク質(Sharma et al. (2013) Adv.Mater. vol. 25, 2005-2010)を提供することができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書に記載の本発明は、細胞膜又はリポソーム膜などのリン脂質二重層に、機能的酵素を初めて含む特定のタンパク質を局在化させる他の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様において、少なくとも１つの包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含むリン脂質二重層又はミセルであるリン脂質組成物を提供し、該コンジュゲートはアンカータンパク質を含み、該アンカータンパク質は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、（ａ）活性酵素である、及び／又は、（ｂ）アミノ酸側鎖、例えば酸性アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質である。
【０００６】
本明細書に開示される組成物及び方法は、幹細胞、リンパ球、及び小胞（エクソソームを含む）を含む広範囲の細胞タイプ、並びに非常に広い範囲のタンパク質に適用可能である。細胞の特定の位置へのターゲット送達を必要とする広範囲の臨床及び非臨床用途の可能性のあるプラットホームが得られる。本発明の使用によって、例えば心臓治療における幹細胞の提供、細胞由来創傷接着剤、及び有機リン中毒の処置など、要求が対処されていない、いくつかの臨床領域に対応することができる。
【０００７】
アミノ酸側鎖に共有結合する、タンパク質における上述のものなどのリンカー（すなわち−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカー）の有り無しは、例えば、タンパク質のアミノ酸組成を判定して、上述のようなリンカーなどの任意の非天然基（例えば、本明細書の他の個所に記載されるようなＤＭＰＡによって修飾されるアミノ酸残基）を見つけるプロテオミクスの方法（トリプシン消化後の質量分析など）によって、当業者によって容易に判定される。
【０００８】
「カチオン化タンパク質」又は「アニオン化タンパク質」という用語は、アンカータンパク質が静電的改変タンパク質であることを示す。これは、天然（又は「改変されていない」若しくは「野生型」）のタンパク質と比較して異なる表面電荷分布を有するという点で、その天然の状態とは（すなわちタンパク質の野生型の状態とは）異なるタンパク質である。典型的には、この表面電荷分布は、生理学的なｐＨにおいて、例えば約ｐＨ６〜９において、例えば約ｐＨ６、６．５、７、７．５、８、８．５、又は約９において、評価される。天然のタンパク質は、本明細書において「アンカー前駆体タンパク質」と呼ばれ得る。本明細書に記載されるように、アンカータンパク質とアンカー前駆体タンパク質との静電的改変の違い（一部の実施形態においてジアミン基の付加など）は、タンパク質環境（例えばタンパク質溶液）のｐＨとは関係なく存在する。例えば、静電的改変は、例えば上述のように生理学的なｐＨにおいて、アンカー前駆体タンパク質のカチオン化によって、又はアンカー前駆体タンパク質のアニオン化によって、又はアンカー前駆体タンパク質と比較してより正若しくはより負の全体電荷を有するタンパク質の組換え発現によって、得られる。得られたタンパク質は、全体で正の表面電荷が増加する改変の場合にカチオン化タンパク質、又は全体で負の表面電荷が増加する改変の場合にアニオン化タンパク質と呼ばれ得る。ゆえに、アンカータンパク質は、例えば生理学的なｐＨにおいて判定されるような自然起源又は野生型のタンパク質ではない。カチオン化タンパク質では、正の表面電荷における全体的変化は、＋１〜＋１００、例えば、＋１〜＋８０、＋１０〜＋７０、＋２０〜＋６０、又は＋３０〜＋５０であり得、約＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、＋２５、＋２６、＋２７、＋２８、＋２９、＋３０、＋３１、＋３２、＋３３、＋３４、＋３５、＋３６、＋３７、＋３８、＋３９、＋４０、＋４１、＋４２、＋４３、＋４４、＋４５、＋４６、＋４７、＋４８、＋４９、＋５０、＋５１、＋５２、＋５３、＋５４、又は＋５５などであり得る。アニオン化タンパク質では、負の表面電荷における全体的変化は、−１〜−１００、例えば、−１〜−８０、−１０〜−７０、−２０〜−６０、又は−３０〜−５０であり得、約−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０、−３１、−３２、−３３、−３４、−３５、−３６、−３７、−３８、−３９、−４０、−４１、−４２、−４３、−４４、−４５、−４６、−４７、−４８、−４９、−５０、−５１、−５２、−５３、−５４、又は−５５などであり得る。
【０００９】
特定のタンパク質の名前は、互換的にアンカータンパク質又はアンカータンパク質前駆体を示すように本明細書において使用することができる。例えば、組成物は静電的改変トロンビンを含むことができ、その場合、「トロンビン」という用語は、アンカータンパク質又はアンカー前駆体タンパク質のいずれかを示すように使用することができる。あるいは、カチオン化アンカータンパク質は、本明細書において、例えばカチオン化トロンビンでは「ｃトロンビン」など、「ｃ」の接頭辞とともに示され得る。組み換えて調製したスーパーチャージタンパク質（以下にさらに記載される）は、本明細書において、例えばスーパーチャージＯｐｄＡでは「ｓｃＯｐｄＡ」など、「ｓｃ」の接頭辞とともに示され得る。
【００１０】
ゆえに、この明細書にわたって使用されるようなアンカー前駆体タンパク質は、アンカータンパク質を提供するように改変可能な又は改変されたタンパク質である。例えば、アンカー前駆体タンパク質は、本明細書の他の個所に記載されるような静電的改変の化学的方法を施すことができ、又は、前駆体タンパク質と比較して改変された全体電荷を有するとともに、組換えＤＮＡ技術を使用して発現及び取得される、改変タンパク質の合理的設計のためのベース又は開始点として使用され得るタンパク質である。ゆえに、アンカー前駆体タンパク質は、生理学的なｐＨにおける自然起源又は野生型のタンパク質であり得る。
【００１１】
アンカータンパク質は、酵素であるとき、活性酵素、すなわちアンカー前駆体タンパク質によって触媒される反応を触媒する能力を保持する酵素である。例えば、（カチオン化又はアニオン化アンカー前駆体タンパク質である）アンカータンパク質の酵素活性は、アンカー前駆体タンパク質酵素の活性の少なくとも約７５％であり、例えば、アンカー前駆体タンパク質酵素の活性の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％であり得る。酵素活性は、当業者の通常の能力に従って、対象の酵素に関連する任意の従来の方法によって測定することができる。一部の場合において、（カチオン化又はアニオン化アンカー前駆体タンパク質である）アンカータンパク質の酵素活性は、アンカー前駆体タンパク質の活性と比較して増加する、すなわち、アンカー前駆体タンパク質の活性の１００％を超える活性を有することができる。
【００１２】
本発明におけるリン脂質組成物は、小胞、リポソーム、細胞、人工細胞、又は細胞小器官の一部を形成することができる二重層構造の形態をとることができる、又はミセルの形態をとることができる。ゆえに、リン脂質組成物は、それ自体、小胞、リポソーム、人工細胞、若しくは細胞小器官であり得る、又はミセルであり得る。「組成物」という用語は、リン脂質二重層又はミセル、及び包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート以外の任意の成分の存在を必要としないが、リン脂質組成物は、本明細書の他の個所において言及される細胞、医薬組成物、又は外科用組成物などの広範な組成物内に存在することができる。
【００１３】
本明細書にわたって使用される「タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート」という用語は、タンパク質の表面において荷電アミノ酸残基と静電的に会合される１つ以上の界面活性剤分子を有するタンパク質（「アンカータンパク質」と呼ばれる）を含む個別の構築物を示す。上述のように、例えばＰｅｒｒｉｍａｎ等(2010; NatureChem. vol. 2, 622-626)、Ｂｒｏｇａｎ等(2013; J. Phys. Chem. B vol. 117, 8400-8407)、及びＳｈａｒｍａ等（2013; Adv. Mater.vol. 25, 2005-2010）によって類似の構築物の調製が記載された。コンジュゲートは、全体構造の少なくとも一部の周りに、本明細書に記載されるような、両親媒性界面活性剤コロナを有するタンパク質である。そうしたコロナの存在は、コンジュゲートを対応する野生型アンカー前駆体タンパク質と比較して、電荷及び／又はサイズの変化を検出することによって確認することができる。そうした変化を検出するため、質量分析法、ゼータ電位差測定法、Ｘ線小角散乱法、及び／又は動的光散乱法、特にこれらの２つ以上の組合せなどの技術を使用することができる。
【００１４】
「包埋」という用語は、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが少なくとも部分的にリン脂質二重層又はリン脂質層（ミセルの場合）内に位置するということを示す。すなわち、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、リン脂質二重層又はリン脂質層の表面とのみ相互作用するのではなく、少なくとも部分的にリン脂質二重層又はリン脂質層と交わる。例えばＦｕｔａｍｉ等(J. Biosci.Bioeng. (2005) vol. 99, 95-103)によって非包埋／非交差表面相互作用が記載され、タンパク質とリン脂質二重層又はリン脂質層とのそうした静電的相互作用は本発明に包含されない。
【００１５】
包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含む二重層である本発明におけるリン脂質組成物の概略図を図２に示す。本発明における組成物は、広範囲のタンパク質を、細胞膜などの広範囲のリン脂質二重層及び／又はミセルタイプに導入させるため有用であり得る。有利には、そして驚くべきことに、本明細書に記載の組成物及び方法は、活性酵素を、細胞表面に、それゆえ組織又は他の細胞個体群に局在化させる。
【００１６】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートにおけるアンカータンパク質は、例えばまたタンパク質、若しくはポリペプチド、若しくはペプチドであり得る、又はスパイキャッチャー／スパイタグシステム(Reddington & Howarth (2015) Curr. Op. Chem. Biol. vol. 29 p94-99、国際公開第２０１４／１７６３１１号)、若しくはストレプトアビジン／ビオチンなどのバイオコンジュゲートシステムの一半であり得る２次分子に結合することができる。２次分子は、カチオン化又はアニオン化タンパク質ではないタンパク質であり得、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート全体の一部を形成するが、両親媒性界面活性剤コロナを有しない。これは、２次分子において、界面活性剤分子が静電的に会合し得る荷電アミノ酸側鎖の十分な表面分布がないためである。
【００１７】
つまり、リン脂質組成物において、２次分子は、リン脂質二重層又はリン脂質層において残余のタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートとともに包埋されないように位置することができる。すなわち、２次分子は、組成物において、リン脂質二重層又はリン脂質層が少なくとも一部を形成する小胞、リポソーム、細胞、人工細胞、細胞小器官、又はミセルの内部又は外部に配置されるように、アンカータンパク質に結合することができる。この配置の概略図は図３に示される。そのように、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート全体の一部であるため、２次分子は、リン脂質二重層又はリン脂質層内に包埋されたアンカータンパク質との結合によって、リン脂質二重層又はリン脂質層が少なくとも一部を形成する小胞、リポソーム、細胞、人工細胞、細胞小器官、又はミセルの内部又は外部に付加される。各タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートにおけるアンカータンパク質は、１を超える記載の２次分子と結合することができる。ゆえに、「タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート」という用語は、アンカータンパク質が１つ以上の２次分子に結合する任意の実施形態を含むことができる。
【００１８】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、非限定的例として、ＧＦＰ、ＰｓｍＯｒａｎｇｅ、若しくはマグネトフェリチンなどの標識タンパク質、標識分子若しくはナノ粒子とコンジュゲートしたタンパク質、ペルオキシダーゼ若しくはホスホトリエステラーゼ（アグロバクテリウム・ラジオバクターのＯｐｄＡ（配列番号１０、配列番号３９にも記載）若しくはその機能的変異体若しくは部分）若しくはプロテアーゼ（トロンビンなど）などの酵素タンパク質、若しくはプロトロンビン（例えば配列番号２５若しくは２６）などの酵素前駆体タンパク質、抗体、レクチン、インテグリン、若しくは接着分子（例えばストレプトコッカス・ゴルドニのタンパク質ＣｓｈＡ（配列番号２０）、若しくはＣｓｈＡのフィブロネクチン結合ドメイン（配列番号１９）を含むその機能的変異体若しくは部分、若しくは表４に記載の任意のタンパク質）などの接着若しくは「帰巣」タンパク質、成長因子（ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）若しくはＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）（配列番号２１）を含むその機能的変異体若しくは部分など）、又はグロビン、例えばミオグロビンなどの担体タンパク質を含む。タンパク質に対応して、タンパク質は、アンカータンパク質を形成するためにカチオン化又はアニオン化することができる、又は上述のような２次分子であることができる。上述の選択肢に加えて、２次分子は、ペプチド、ポリペプチド、又はスパイキャッチャー若しくはスパイタグモチーフ、ビオチン若しくはストレプトアビジンなどの他の分子から選択することができる。
【００１９】
「トロンビン」という用語は、任意の種のトロンビン、例えばウシトロンビン又はヒトトロンビンを示し得る。当業者は、適切なトロンビン分子を容易に特定することができる。
【００２０】
「界面活性剤分子」という用語は当業者によって十分に理解されており、界面活性剤は典型的に両親媒性である有機化合物であり、界面活性剤は疎水基（そのテール）及び親水基（そのヘッド）の両方を含有するということを意味する。カチオン界面活性剤は正荷電ヘッド基を有する一方、アニオン界面活性剤は負荷電ヘッド基を有する。双性イオン界面活性剤は、ナトリウムラウロアンフォアセテートなど、ヘッド基内に正電荷及び負電荷の両方を含むものである。界面活性剤は、イメージング標識などの機能的特性（例えば磁性界面活性剤(Brown (2013)Adv.Mater. vol. 24, 6244-6247)若しくは蛍光性界面活性剤）、又は酸素結合能力などの特徴をさらに含むことができる。
【００２１】
リン脂質組成物は、リン脂質以外の脂質、例えばコレステロールを含むことができる。また、リン脂質組成物は内在性膜タンパク質などの他の成分も含むことができる。これは、特に、リン脂質組成物が細胞膜を形成する二重層である場合であり得る。
【００２２】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、ポリエチレングリコール(PEG)含有界面活性剤を含むことができる。例えば、界面活性剤は、以下の化学式Ｉの一般構造を有することができる。
【化１】
2020534261.tif 000002
【００２３】
化学式Ｉにおいて、ｎは、５〜１５０を含む又は５〜１５０の任意の整数、例えば８〜１１０を含む又は８〜１１０の任意の整数であり得る。例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、又は１１０であり得る。
【００２４】
Ｒ１は
【化２】
2020534261.tif 000003
であり得る。
【００２５】
Ｒ２は、ＣｘＨ（２ｘ＋１）であり得、式中、ｘは８〜１８を含む又は８〜１８の任意の整数であり、例えばｘ＝１１、１２、又は１３であり得る。また、Ｒ２は、８〜１８個の炭素原子、例えば１１、１２、又は１３個の炭素原子を有する不飽和炭化水素であり得る。さらなる他の態様において、Ｒ２は
【化３】
2020534261.tif 000004
であり得る。
【００２６】
界面活性剤は、Ｓ６２１（Sigma-Aldrichのカタログ463221番）、Ｓ９０７（Sigma-Aldrichのカタログ463256番）、Ｓ１１９８（Sigma-Aldrichのカタログ473197番）、又はＳ１７８３（グリコール酸エトキシレート４−ノニルフェニルエーテルの酸化形態、Sigma-Aldrichのカタログ238678番）など本明細書に記載されるものの１つであり得る。
【００２７】
これらのアニオン界面活性剤は、図４にも示されるように以下の構造を有する。
【化４】
2020534261.tif 000005
Ｓ６２１及びＳ９０７では、ｘ＝１１〜１３である。
Ｓ６２１では、ｙ＝７〜９である。
Ｓ９０７では、ｙ＝１４〜１５である。
【００２８】
分子量及び多分散性は質量分析によって測定され、表１のとおりであった。
表１は界面活性剤の分子量及び多分散性を示す。
【表１】
2020534261.tif 000006
【００２９】
「多分散性」は、化学反応から生成される合成ポリマーが重合の内在性エントロピープロセスから生じる分子量分布を有するということを反映している。ばらつきの程度は、反応メカニズムと反応条件との両方に対応する。このばらつきの程度は、近年まで「多分散性」として既知であった分散性（u）によって定められる。これは式によって定められ、
【数１】
2020534261.tif 000007
式中、Ｍｗは重量平均モル質量であり、Ｍｎは数平均モル質量である。
【００３０】
ポリマーの分散性は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF)を使用して推定することができる。
【００３１】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、少なくとも約５００Ｄａ、例えば少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００又は少なくとも約４０００Ｄａの分子量を有する界面活性剤を含むことができる。
【００３２】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、Ｓ１７８３（すなわち酸化グリコール酸エトキシレート４−ノニルフェニルエーテル）である界面活性剤を含むことができる。あるいは又はさらに、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、カチオン界面活性剤、例えばＰＥＧ−１５水素化牛脂モニウム（tallowmodium）クロリド（Ethoquad（登録商標）HT25として販売）を含むことができる。
【００３３】
本発明における組成物は、少なくとも２つのタイプの界面活性剤を含むタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含むことができる。少なくとも１つの界面活性剤は、イメージング標識などの機能的特性（例えば磁性界面活性剤(Brown (2013)Adv.Mater. vol. 24, 6244-6247)若しくは蛍光性界面活性剤）、又は酸素結合能力などの特徴を含むことができる。
【００３４】
アンカータンパク質が活性酵素であるとき、カチオン化タンパク質は、カチオン又はポリカチオンリンカーのタンパク質における酸性アミノ酸側鎖への共有結合によって得ることができる。例えば、これは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（EDC）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の存在下で、タンパク質を、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（DMPA）又はその類似体と混合することによって得ることができる。反応は図１に示され、酸残基（図の符号（１））が、長さゼロのクロスリンカーＥＤＣ（２）の付加によって求核攻撃に向けて活性化されて、活性化ｏ−アシルイソ尿素基（３）を形成することを示す。そして、求核剤ＤＭＰＡ（４）は活性化カルボニルを攻撃し、イソ尿酸を脱離して、カチオン化残基（５）を形成する。ゆえに、カチオン化タンパク質は、リンカー−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋を含み得る。ＤＭＰＡ又はその類似体は、ＥＤＣとの混合前にタンパク質に付加されて、過剰なＤＭＰＡ又はその類似体の存在を確保することでタンパク質が互いに架橋結合することを回避する。
【００３５】
カチオンリンカーのタンパク質における酸性アミノ酸側鎖への共有結合のステップは、静電的カップリングの安定性を向上させるため、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）又はその水溶性類似体のスルホ−ＮＨＳの存在下にて行うことができる。
【００３６】
本発明において、カルボジイミドの存在下におけるタンパク質のＤＭＰＡ又はその類似体との混合は、タンパク質変性及び／又は凝集を回避するため、所定の時間継続することができる。そうした所定の時間は、例えば、最大若しくは約２時間、又は最大若しくは約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、若しくは約９０分であり得る。あるいは又はさらに、カルボジイミドの存在下におけるＤＭＰＡとの混合の生成物は、その後にサイズ排除クロマトグラフィーを行い、クロマトグラフィーの生成物をカチオン化タンパク質として使用することができる。当業者は、所望のアンカータンパク質の理論上のサイズを測定して、例えばキャリブレーションしたクロマトグラフィーカラムの使用によって捕集するため適切なクロマトグラフィー溶離液を決定することができる。これらの方法の特徴のいずれか又は両方を方法に包含することで、酵素が活性状態に保持されることを確実にする。これは、酵素とともに使用する場合にその活性を壊し得る、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等(Nat. Commun.(2015) Jun 17;6:7405)の記載するものなどの先行技術の方法から予測されなかった。アンカータンパク質を調製する適切な方法は、さらに詳細に以下に示される。
【００３７】
ＤＭＰＡの類似体は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルヘキサン−１，６−ジアミン（DMHA）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（DMEA）、３−ジメチルアミノプロピルアミン（DMAPA）、エチレンジアミン（EN）、１，３−ジアミノプロパン（DAP）、１，４−ジアミノブタン（DAB）、１，５−ジアミノプロパン（DAP）、１，６−ジアミノヘキサン（DAH）、ヘキサメチレンジアミン（HMA）、１，７−ジアミンヘプタン（diaminheptane）（DAH）、１，８−ジアミノオクタン（DAO）、及び２−（２−アミノエチル）グアニジン（AEG）であり得る。他の適切な求核剤は、例えば荷電求核剤など、当業者が考慮することができる。例えば、求核剤はまた、他の第１級、第２級、及び第３級アルキルジアミン、及び、対向末端が第１級、第２級、又は第３級アミンのいずれかを含む場合第４級アミンで終端するアルキルジアミンを含むことができる。また、直鎖又は分岐構造としてのポリエチレンイミンなどのポリアルキルアミンも考慮される。
【００３８】
あるいは、静電的改変タンパク質は、タンパク質のアニオン化によって得ることができる。これは、例えばジカルボン酸（HOOC-R-COOH）を天然タンパク質のリジン側鎖に求核付加することによって得ることができる。
【００３９】
さらなる他の態様において、静電的改変カチオン化又はアニオン化タンパク質（アミノ酸側鎖に共有結合しない−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まない）は、変化させた電荷、すなわち、アンカー前駆体タンパク質と比較してより正又はより負の全体電荷を有するアンカータンパク質の組換え発現によって得ることができる。組換え改変は、非突然変異アンカー前駆体タンパク質の配列と比較してアミノ酸配列全体内に１つ以上のアミノ酸置換を含む突然変異体であるアンカータンパク質を組み換えで発現させることを含むことができ、アミノ酸置換は、置換位置又は各置換位置において天然アミノ酸に異なるアミノ酸電荷を与えることで、アンカー前駆体タンパク質と比較してアンカータンパク質に異なる表面電荷分布を導入する。そうしたタンパク質は当該技術分野において既知であり、「スーパーチャージ」タンパク質と呼ばれる。
【００４０】
タンパク質の３次構造及び／又は生物学的活性を有意に変化させない限り、例えば、無荷電側鎖を有するアミノ酸は、（それぞれ＋１又は−１の全体の電荷変化を与えるため）正荷電又は負荷電側鎖を有するアミノ酸によって置換されることができる、又は、負荷電側鎖を有するアミノ酸は、（＋２の全体の電荷変化を与えるため）正荷電側鎖を有するアミノ酸によって置換されることができる、又は、正荷電側鎖を有するアミノ酸は、（−２の全体の電荷変化を与えるため）負荷電側鎖を有するアミノ酸によって置換されることができる。この合理的設計手法は、ユーザーがタンパク質表面電荷の変更を重要でないアミノ酸位置に行うことができるので、タンパク質の機能／活性が特定のアミノ酸、例えば荷電側鎖を有するものの関与によって決まる場合に特に有利であり得る。これは、本明細書の他の個所に記載の化学修飾方法では常に可能であるわけではない。天然（アンカー前駆体タンパク質）又はスーパーチャージ（アンカータンパク質）の形態におけるタンパク質の生物学的活性は、当業者によって容易に選択されるような、タンパク質に適切なアッセイを使用して測定することができる。例えば、トロンビン活性は、フィブリノゲンと接触させて、フィブリン形成率を検出することで、評価することができる。具体的なそうしたアッセイは、以下の詳細な方法に記載される。
【００４１】
典型的には、天然タンパク質（すなわちアンカー前駆体タンパク質）と組み換え改変タンパク質（すなわちアンカータンパク質）との間で、グローバルレベルで判定されるアミノ酸配列同一性（又は「グローバル配列同一性」として既知である）は、少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％である。グローバルレベルにおける配列同一性の判定は、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔインターネットサイト(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を介してインターネット上で利用可能なニードルマン・ウンシュグローバルシーケンスアライメントツールを使用して行うことができる。このツールにより、ユーザーが２つの配列をその全長にわたって比較することが可能になる。
【００４２】
例えば、タンパク質がＣｓｈＡ（配列番号２０）又はその機能的変異体若しくは一部であるとき、（ＣｓｈＡのフィブロネクチン結合部分である）配列番号１９のアミノ酸配列、又は配列番号１９とグローバルレベルで少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質であり得る。タンパク質がＣｓｈＡの変異体である場合、変異体のＣｓｈＡ（配列番号２０）とのグローバル配列同一性は、変異体が配列番号１９とグローバルレベルで少なくとも９０％同一である、任意的に少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％同一である、又は配列番号１９であるアミノ酸配列を含む限り、６０％未満であり得る。
【００４３】
他の態様において、タンパク質がＰＩＧＦ−２（配列番号２２）又はその機能的変異体若しくは一部であるとき、タンパク質は、（ＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）である）配列番号２１、又は配列番号２１とグローバルレベルで少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。タンパク質がＰＩＧＦ−２の変異体である場合、変異体のＰＩＧＦ−２（配列番号２２）とのグローバル配列同一性は、変異体が配列番号２１とグローバルレベルで少なくとも９０％同一である、任意的に少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは少なくとも約９５％同一である、又は配列番号２１であるアミノ酸配列を含む限り、６０％未満であり得る。
【００４４】
タンパク質がＯｐｄＡ（配列番号１０若しくは配列番号３９）又はその機能的変異体若しくは一部であるとき、タンパク質は、配列番号１０若しくは配列番号３９に見受けられるように３１位、３３位、１４５位、１７７位、２０６位、及び２７７位において天然アミノ酸、すなわち３１位、３３位、１７７位、及び２０６位においてヒスチジン、１４５位においてカルボキシル化リジン、並びに及び２７７位においてアスパラギン酸を含む。（配列番号１０は、当業者がカルボキシル化リジンとして理解する１４５位における「リジン」を示す配列である。配列番号３９は、１４５位におけるカルボキシル化リジンを明らかに特定していること以外、配列番号１０と同一である。ゆえに、これは、これらの位置のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されず、任意の変異体配列がこれらの位置を含むということを意味する。例えば、配列番号１０の機能的変異体は、配列番号１０のアミノ酸３１〜２７７（例えばアミノ酸３０〜２８０、２５〜２８５、２０〜２９０、１５〜２９５、１０〜３００、５〜３０５）を有する（すなわち含む）配列と少なくとも約９０％同一である配列番号１０の一部を含み得、該一部は３１位、３３位、１７７位、及び２０６位におけるヒスチジン、１４５位におけるカルボキシル化リジン、並びに２７７位におけるアスパラギン酸を含む。配列番号３９の機能的変異体は、配列番号３９のアミノ酸３１〜２７７（例えばアミノ酸３０〜２８０、２５〜２８５、２０〜２９０、１５〜２９５、１０〜３００、５〜３０５）を有する（すなわち含む）配列と少なくとも約９０％同一である配列番号３９の一部を含み得、該一部は３１位、３３位、１７７位、及び２０６位におけるヒスチジン、１４５位におけるカルボキシル化リジン、並びに２７７位におけるアスパラギン酸を含む。ＯｐｄＡにおけるこれらのアミノ酸位置は、酵素が正確に機能することに重要であることが知られている。
【００４５】
疑義を回避するため、配列番号３９は配列番号１０と同じタンパク質配列を記載しており、いずれにしても配列番号１０に存在するとして当業者に理解される１４５位におけるカルボキシル化リジンを明らかに示すのみである。
【００４６】
本明細書における「機能的変異体」への言及は、非変異体配列と同一でないが、非変異体配列の活性と比較して有意に低下していない（例えば実質的に類似の）活性を示すアミノ酸配列を示す。例えば、非変異体配列は、当業者が評価することができる活性のレベルを有する酵素であり得る一方、機能的変異体は、非変異体配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は少なくとも約９５％の活性のレベルを保持する。一部の場合に、機能的変異体の活性は、非変異体の活性よりも大きいものであり得る。あるいは、非変異体配列は他の成分（分子、タンパク質、ペプチド、抗原、又は細胞など）に結合することができ得、結合親和性は当業者によって評価されることができる。機能的変異体は、非変異体配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は少なくとも約９５％の結合親和性のレベルを保持する、又は結合親和性が増加し得る。当業者は、変異体アミノ酸配列が機能的変異体であるかどうかを容易に判定することができる。
【００４７】
そうした組換え方法は、静電的に改変されるとともに、アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないアンカータンパク質を調製するために使用可能である。典型的には、そうしたアンカータンパク質は、自然起源の、例えばタンパク質を構成するアミノ酸（標準的アミノ酸を含む）又はタンパク質を構成しないアミノ酸から選択される、アミノ酸からなる。タンパク質を構成するアミノ酸は、自然の翻訳プロセスでタンパク質に組み込まれるものである。タンパク質を構成しないアミノ酸は、自然のタンパク質翻訳に使用されないが、自然又は人工の翻訳後メカニズムを含むメカニズムによってアミノ酸配列に組み込まれ得るものである。アンカータンパク質内に含まれ得るアミノ酸の非限定的例は、以下の表２及び表３に示される。
【表２】
2020534261.tif 000008
表２は、タンパク質を構成するアミノ酸の例である。太字は正荷電アミノ酸を示し、斜体は負荷電アミノ酸を示す。
【００４８】
また、アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まない限り、タンパク質を構成するアミノ酸及びタンパク質を構成しないアミノ酸の改変も考慮される。
【００４９】
また、任意の自然起源ではないアミノ酸がアミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まない限り、自然起源ではないアミノ酸も含むことができる（特有のコドン及び対応するアミノアシル−ｔＲＮＡシステムを使用してタンパク質に導入され得るものなど）。
【表３】
2020534261.tif 000009
表３は、タンパク質を構成しないアミノ酸の例である。
【００５０】
典型的に、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート内のアンカータンパク質は、タンパク質におけるアミノ酸残基の総数の百分率として決定される正荷電アミノ酸残基（上記表２の太字強調したものなど）の百分率を含むことができ、これは対応するアンカー前駆体タンパク質におけるそうした残基の百分率より大きい。例えば、アンカー前駆体タンパク質は、その全アミノ酸残基の５．０〜１７．５％を正荷電残基として有することができ、アンカータンパク質は対応するアンカー前駆体タンパク質におけるものより大きい百分率を有することができる。アンカータンパク質は、その全アミノ酸残基の少なくとも約１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は少なくとも約３０％を正荷電残基として有することができる。例えば、本明細書に記載されるスーパーチャージＧＦＰはその全アミノ酸残基の約２８％を正荷電残基として有する一方、本明細書に記載されるスーパーチャージＯｐｄＡはその全アミノ酸残基の約１８％を正荷電残基として有する。非スーパーチャージで自然起源のＯｐｄＡはその全アミノ酸残基の約１３％を正荷電残基として有する一方、非スーパーチャージＧＦＰはその全アミノ酸残基の約１５％を正荷電残基として有する。典型的に、タンパク質の電荷全体は、上述のように生理学的なｐＨにおいて評価することができる。
【００５１】
アンカータンパク質は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セレノシステイン、及びピロリジンからなる群より選ばれるアミノ酸のみを含むことができる。あるいは又はさらに、アンカータンパク質は、対応するアンカー前駆体タンパク質に存在するアルギニン及び／又はヒスチジン及び／又はリジン残基の数よりも少ないアルギニン及び／又はヒスチジン及び／又はリジン残基を含むことができる。例えば、アンカータンパク質は、アルギニン及び／又はヒスチジン及び／又はリジン残基を含まなくともよい。あるいは又はさらに、アンカータンパク質は、対応するアンカー前駆体タンパク質よりも少ない正荷電残基を含むことができる、又は対応するアンカー前駆体タンパク質よりも少ない負荷電残基を含むことができる。アンカー前駆体タンパク質における１つ以上の無荷電及び／又は正荷電残基はそれぞれ、負荷電残基によって置換されてアニオン化アンカータンパク質を形成することができる。あるいは、アンカー前駆体タンパク質における１つ以上の無荷電及び／又は負荷電残基はそれぞれ、正荷電残基によって置換されてカチオン化アンカータンパク質を形成することができる。
【００５２】
緑色蛍光タンパク質（GFP）の文脈におけるそうした改変（「スーパーチャージ」）タンパク質の生成例は、Ｌａｗｒｅｎｃｅ等(J. Am. Chem. Soc.(2007) vol. 129 p.10110-10112)によって記載されている。そうした所謂「スーパーチャージ」タンパク質は、リン脂質二重層細胞膜を介して細胞内部に分子送達を可能にするため以前に使用されている(Zang et al.(2017) PLoS One 12(6):e0180138; 国際公開第2009/134808号; 国際公開第2010/129023号; 国際公開第2016/069910号; Thompson et al. (2012) Methods Enzymol.vol. 503 p. 293-319; McNaughton et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.vol. 106 p. 6111-6116)。ゆえに、本明細書に記載のようなタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに組み込まれると、包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含む細胞などのリン脂質組成物を得ることができるということは実に驚くべきことである。
【００５３】
本明細書における上述のような組成物では、リン脂質二重層は細胞の表面膜を形成し得る。細胞は、リン脂質二重層を含むいずれのもの、特にまた細胞外壁を含まない細胞であり得る。しかしながら、本明細書において、「細胞」という用語は、プロトプラスト又はスフェロプラスト、すなわち通常細胞壁を通常含むが、例えば機械的又は酵素的プロセスによって少なくとも一部の該壁が除去されている又は崩壊している細胞を包含する。
【００５４】
細胞は、動物若しくは植物細胞、又は微生物細胞、例えば、細胞若しくは組織培養物におけるものなどのインビボ若しくはインビトロ若しくはエクスビボでの哺乳動物細胞など、ユーザーが、細胞膜にタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを包埋させるためタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートと接触させることを望む任意のものであり得る。哺乳動物細胞は、ヒト、イヌ、ネコ、若しくはウマの細胞、又はウシ、ブタ、若しくはヒツジの細胞であり得る。
【００５５】
例えば、哺乳動物細胞は、間葉系幹細胞を含むヒト細胞、又はヒト細胞であり得る胚性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞由来の細胞であり得る。細胞は、ヒト細胞若しくはヒト胚細胞若しくはヒト胚性幹細胞ではないもの、及び／又はヒト細胞若しくはヒト胚細胞若しくはヒト胚性幹細胞由来ではないものであり得る。また、細胞は、心臓をターゲットとするための心筋細胞、軟骨をターゲットとするための軟骨細胞、骨をターゲットとするための骨芽細胞、肝臓をターゲットとするための肝細胞、膵臓をターゲットとするための膵島β細胞、脳をターゲットとするための神経細胞若しくは神経前駆細胞、血管内腔をターゲットとするための内皮細胞、筋肉をターゲットとするための筋細胞、又は靱帯をターゲットとするための靱帯細胞（ligamentocyte）などの特化型細胞であり得る。これらの例は限定するものではなく、任意の特化型細胞を身体の任意の部分に使用することができる。さらに、適切な標識を使用して細胞分布を示すため、ＣＨＯ又はＨＥＬＡなどの細胞株を動物研究又はインビボの研究に使用することできる。
【００５６】
本発明における組成物は、リン脂質組成物が間葉系幹細胞膜の少なくとも一部を形成するものであり得る（すなわちＭＳＣの細胞膜はリン脂質組成物である）。幹細胞は、ヒト胚細胞又は幹細胞から得られないものであり得る。リン脂質組成物は、
ＣｓｈＡのスーパーチャージフィブロネクチン結合ドメイン、
ＣｓｈＡのフィブロネクチン結合ドメインを含む、スーパーチャージＣｓｈＡ、又はそのスーパーチャージ機能的変異体若しくは一部、
スーパーチャージＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）、又は、ＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）を含む、スーパーチャージＰＩＧＦ−２、若しくはそのスーパーチャージ機能的変異体若しくは一部、
カチオン化若しくはスーパーチャージプロトロンビン若しくはトロンビン、又はプロトロンビン若しくはトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージ機能的変異体、の１つ以上を含むことができる。
【００５７】
本発明のリン脂質組成物は、間葉系幹細胞又は心筋細胞の膜の少なくとも一部を形成するものであり得る。この文脈において、リン脂質組成物は、ＣｓｈＡのスーパーチャージフィブロネクチン結合ドメイン、又はフィブロネクチン結合ドメインを含むスーパーチャージＣｓｈＡ、若しくはＣｓｈＡのスーパーチャージ機能的変異体若しくは一部を含むことができる。
【００５８】
リン脂質二重層が細胞の表面膜を形成するとき、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、細胞をタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに接触させることで、本発明におけるリン脂質組成物が形成された後、１〜３０日間、又は１〜１５日、又は１〜１０日、又は１〜５日間、リン脂質二重層に包埋されることができる。例えば、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は約１０日間包埋されることができる。
【００５９】
本発明におけるリン脂質組成物は、少なくとも１つのさらなる成分、例えば水、バッファー溶液、以下に記載されるような医薬組成物の形成に必要な１つ以上の成分、又は、液体又は膜若しくは布帛などの足場材料などの外科用組成物の形成に必要な１つ以上の成分、をさらに含む複合体組成物内に存在することができる。
【００６０】
本発明の第２の態様において、本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物を調製する方法が提供され、該方法は、
ａ）  タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを提供すること、及び、
ｂ）  コンジュゲートにリン脂質二重層又はミセルを接触させることを含み、
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、（ｉ）活性酵素である、及び／又は、（ｉｉ）アミノ酸側鎖、例えば酸性アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質である、アンカータンパク質を含む。
【００６１】
リン脂質二重層は、細胞、人工細胞、リポソーム、若しくは他の小胞の形態であり得る、又は細胞、人工細胞、リポソーム、若しくは他の小胞の一部を形成することができる。本発明の第２の態様における方法では、リン脂質二重層は、上述のようにステップ（ｂ）においてタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに接触させて、低くとも約１０℃の温度で少なくとも約２分の時間インキュベートされる細胞であり得る。温度は、典型的には、約３０〜４０℃、例えば約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は約４０℃、例えば約３７℃±約１℃であり得る。時間は、典型的には、約２〜６０分、例えば約２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又は約６０分、例えば約１５、約２０、又は約３０分であり得る。ステップは約０〜１０％ＣＯ２、例えば５％ＣＯ２の雰囲気中にて行うことができる。リン脂質二重層が人工細胞、リポソーム、又は他の非細胞小胞の形態であるとき、ステップ（ｂ）は、１％未満ＣＯ２、例えば空気中において室温（例えば約１５℃〜約２５℃）で行うことができる。
【００６２】
本発明の第２の態様における方法のステップ（ｂ）は任意的に、その後に、例えば２つ以上の洗浄ステップで、例えばリン酸緩衝食塩液（PBS）などのバッファーを使用して、リン脂質二重層又はミセル（例えば細胞）を洗浄するステップ（ｃ）を行うことができる。当業者は、必要に応じたそうしたステップの適応、洗浄ステップが求められるときの判定を容易に行うことができる。
【００６３】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを提供する、本発明の第２の態様における方法のステップ（ａ）は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質と界面活性剤との静電的コンジュゲーションを可能にする条件下で、アンカータンパク質を界面活性剤に接触させることを含む。界面活性剤は、固体又は液体形態においてタンパク質の溶液に添加することができる。界面活性剤は、タンパク質のカチオン部位につき０．５〜５モルの界面活性剤、例えば、タンパク質のカチオン部位につき約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は約３．０モルの界面活性剤に相当する量で添加することができる。タンパク質は、ＣｏＣｌ２有り若しくは無しで、ＨＥＰＥＳバッファーなどの適切なバッファーとともに溶液内において、又はトリス−ＨＣｌバッファー内において、存在することができる。適切なバッファーの選択は、当業者の通常の能力内のことである。条件は、５〜８のｐＨ、例えば約５、６、７、又は約８のｐＨ（５．１〜５．９、６．１〜６．９、及び７．１〜７．９の任意の個々のｐＨ中間値含む）を含むことができ、０〜２５℃の温度、例えば約４℃の温度又はおよそ室温において、０〜３０時間、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は約１２時間混合物をかく拌することを含むことができる。例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等(Nat. Commun.(2015) Jun 17;6:7405)によって記載されるようなコンジュゲーション条件が適し得る。
【００６４】
「カチオン部位」は、正荷電側鎖を伴う又はカチオン（すなわち正荷電）リンカーを含むアミノ酸を有するタンパク質のアミノ酸配列内の位置である。アンカータンパク質内のカチオン部位の数は、当業者によって創作能力を用いることなく測定することができる。
【００６５】
界面活性剤は、例えば、少なくとも約５００Ｄａ、例えば少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、又は少なくとも約４０００Ｄａの分子量を有し得るポリエチレングリコールを含むことができる。界面活性剤は、５〜５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約１０、１５、２０、２５、又は約３０ｍｇ／ｍＬの濃度のバッファー溶液内に存在することができる。
【００６６】
界面活性剤はＳ１７８３（すなわち酸化グリコール酸エトキシレート４−ノニルフェニルエーテル）であり得る。あるいは、界面活性剤コンジュゲートは、カチオン界面活性剤、例えばＰＥＧ−１５水素化牛脂モニウム（tallowmodium）クロリド（Ethoquad（登録商標）HT25として販売）を含むことができる。
【００６７】
アンカータンパク質は、界面活性剤との接触前に、上述のように、２次分子に結合することができる。
【００６８】
また、ステップ（ａ）は、リン脂質二重層又はミセルをタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに接触させる前に、バッファー交換ステップを含むことができる。バッファー交換ステップは、カチオン化又はアニオン化タンパク質を界面活性剤に接触させるステップの生成物のスピン濃縮を含むことができる。あるいは、バッファー交換ステップは透析ステップを含むことができる。そうした方法は、本明細書において実施例の項に記載されており、当業者の通常の能力内のことである。
【００６９】
アンカータンパク質は、活性酵素であるとき、（ポリカチオンであり得る）カチオンリンカーのタンパク質における酸性アミノ酸側鎖への共有結合によって得たカチオン化タンパク質であり得る。例えば、少なくとも１つの酸性アミノ酸側鎖は、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含み得る。これは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（EDC）の存在下で、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（DMPA）又はその類似体の溶液を、（上述のような）アンカー前駆体タンパク質と混合する方法によって得ることができる。上述のように、反応を図１に示す。ＤＭＰＡの類似体は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルヘキサン−１，６−ジアミン（DMHA）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（DMEA）、３−ジメチルアミノプロピルアミン（DMAPA）、エチレンジアミン（EN）、１，３−ジアミノプロパン（DAP）、１，４−ジアミノブタン（DAB）、１，５−ジアミノプロパン（DAP）、１，６−ジアミノヘキサン（DAH）、ヘキサメチレンジアミン（HMA）、１，７−ジアミンヘプタン（diaminheptane）（DAH）、１，８−ジアミノオクタン（DAO）、及び２−（２−アミノエチル）グアニジン（AEG）であり得る。他の適切な求核剤は、例えば荷電求核剤など、当業者が考慮することができる。例えば、求核剤はまた、他の第１級、第２級、及び第３級アルキルジアミン、及び、対向末端が第１級、第２級、又は第３級アミンのいずれかを含む場合第４級アミンで終端するアルキルジアミンを含むことができる。また、直鎖又は分岐構造としてのポリエチレンイミンなどのポリアルキルアミンも考慮される。
【００７０】
ゆえに、アンカータンパク質は、活性酵素であるとき、
ｉ）  アンカー前駆体タンパク質の溶液をＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（DMPA）又はその類似体のｐＨ中和溶液と混合すること、及び任意的に（例えばステップ（ｉｉ）がステップ（ｉ）と同時ではなく行われる場合）、混合物をｐＨ５〜７、例えば約ｐＨ６に調節すること、
ｉｉ）  その後又は同時に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（EDC）などのカルボジイミドを添加すること、及び混合物をｐＨ４〜７に調節すること、
ｉｉｉ）  （ｉｉ）の混合物をｐＨ４〜７において０〜２５℃の温度で１〜３０時間かく拌すること、
ｉｖ）  水又はバッファーに対して（ｉｉｉ）の混合物内のタンパク質をｐＨ６．５〜８．５において少なくとも４時間透析すること、
ｖ）  必要であれば、（ｉｖ）の混合物のｐＨをｐＨ６．５〜８．５に調節すること、を含む方法によって得ることができる。
【００７１】
方法において、ステップ（ｉｉｉ）は約１２０分以下、例えば約９０分以下継続される、及び／又は、方法は、ステップ（ｉｖ）、若しくは存在する場合はステップ（ｖ）の混合物にサイズ排除クロマトグラフィーを行って、要求される分子量のアンカータンパク質を含む溶離液を得るステップ（ｖｉ）をさらに含む。これらの限定のいずれか又は両方は、方法におけるアンカータンパク質酵素の生成物が酵素活性を保持するように、プロセスが、タンパク質変性及び／又は凝集を少なくする又は防ぐように制御される、ということを確実にする。これは、公開される先行技術から予測されなかった。
【００７２】
ステップ（ｉ）において使用されるアンカー前駆体タンパク質の溶液は、任意の従来のバッファー、例えばＨＥＰＥＳにおいて調製することができる。アンカー前駆体タンパク質溶液は、１００：１〜４００：１、例えば約１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、又は約３００：１のＤＭＰＡモル：タンパク質のアニオン部位数の比でＤＭＰＡと混合される。ＥＤＣは、３０：１〜６０：１、例えば約３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、４０：１、４５：１、又は約５０：１のＥＤＣモル：タンパク質のアニオン部位数の比で添加される。
【００７３】
「アニオン部位」は、負荷電側鎖を伴うアミノ酸を有するタンパク質のアミノ酸配列内の位置である。アンカー前駆体タンパク質内のアニオン部位数は、当業者の通常の能力を用いて測定することができる。
【００７４】
ステップ（ｉｉ）はステップ（ｉ）とともに完了させることができる、すなわち、タンパク質溶液、ＤＭＰＡ、及びＥＤＣは同時に混合することができる。ステップ（ｉｉ）をステップ（ｉ）の後に完了させるとき、ステップ（ｉｉ）は、上述のような単一のステップであって、その後直ちにステップ（ｉｉｉ）が続き得、又は、ＥＤＣの一部をステップ（ｉ）の混合物に添加し、混合物を約２、３、４、５、６、７、又は約８時間０〜２５℃の温度でかく拌するステップ（ｉｉａ）、その後、さらなるＥＤＣをステップ（ｉｉａ）の混合物に添加して、かく拌を継続するステップ（ｉｉｂ）が続くという、２つのステップに分けることができ、ステップ（ｉｉｂ）の後にステップ（ｉｉｉ）が続く。
【００７５】
ステップ（ｉｉｉ）において要求されるかく拌は、例えばかきまぜることなどの任意の従来の手法によって行うことができ、ｐＨは約４、約５、約６、又は約７（４．１〜４．９、５．１〜５．９、及び６．１〜６．９の任意のｐＨ中間値を包含する）であり得る。ステップ（ｉｉｉ）における時間は１２０分を超え、約２０〜３０時間、例えば約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は約３０時間、例えば約２４時間継続され得る。すべてのステップは、例えば、およそ室温で、例えば１８〜２３℃で行うことができる、又は約４℃で行うことができる。
【００７６】
当業者は、その後のサイズ排除クロマトグラフィーステップが存在するか否かに関わらず、ステップ（ｉｉｉ）の最適な時間を決定するため、種々の時間ステップ（ｉｉｉ）を行うとともに、酵素に対応して任意の従来の適切なアッセイを使用して酵素活性の保持性をテストすることによって、ステップ（ｉｉｉ）の適切な時間を決定することができる。
【００７７】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに含ませるためカチオン化ＯｐｄＡアンカータンパク質を提供する具体的な方法の例は、以下のとおりである。
１）  ３００：１のＯｐｄＡにおけるアニオン部位に対するＤＭＰＡの比でＤＭＰＡのｐＨ中和溶液に（１００μＭのＣｏＣｌ２を含む３０ｍＭのＨＥＰＥＳ内の）ＯｐｄＡの溶液を添加すること、及びｐＨを約５．１に調節すること。
２）  ４時間空けて２回の半分ずつの添加をすることで５０：１のＯｐｄＡにおけるアニオン部位に対するＥＤＣモルの比で（１）の混合物にＥＤＣを添加すること。
３）  全部で約２０時間（ＥＤＣの最初の半分の添加のみを含む時間を含む）約４℃の温度で（２）の混合物をかく拌すること。
４）  １０，０００のＭＷＣＯのスピン濃縮器を使用して（３）の混合物を脱塩すること。
５）  （４）の混合物にサイズ排除クロマトグラフィーを行うこと、及びカチオン化ＯｐｄＡアンカータンパク質を含む溶離液を保持すること。
ステップ（４）は、約１、２、３、４、５、又は約６回繰り返すことができる。
【００７８】
タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに含ませるためのカチオン化トロンビンアンカータンパク質を提供する具体的な方法の例は、以下のとおりである。
０１）  １５０：１のトロンビンにおけるアニオン部位に対するＤＭＰＡの比でＤＭＰＡのｐＨ中和溶液に（６０ｍＭのＨＥＰＥＳ内の）トロンビンの溶液を添加すること、及びｐＨを約６．５に調節すること。
０２）  ３４：１のトロンビンにおけるアニオン部位に対するＥＤＣモルの比で（０１）の混合物にＥＤＣを添加すること。
０３）  約６０分間室温で（０２）の混合物をかく拌すること。
４）  ４℃で、例えば約４倍、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）で（０３）の混合物を希釈すること、及び１０ＫのＭＷＣＯのスピン濃縮器にかけること。
ステップ（０４）は、約１、２、３、４、５、又は約６回繰り返すことができる。
【００７９】
他の一般の方法において、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、上述のようなアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質をカチオン界面活性剤である界面活性剤に接触させることで調製することができる。例えば、タンパク質は、ジカルボン酸（HOOC-R-COOH）を天然タンパク質のリジン側鎖に求核付加することによってアニオン化することができる。
【００８０】
上述の改変に対してあるいは又はさらに、上述のように、すなわち、本発明の第２の態様における方法に使用するために提供されるタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに含ませるため、界面活性剤と接触させられるアンカータンパク質は、アミノ酸側鎖、例えば酸性アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないアニオン化アンカータンパク質又はカチオン化アンカータンパク質を提供するように、組換え方法で得ることができる。例えば、アンカータンパク質は、スーパーチャージタンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列の発現を含む方法によって得ることができる。アンカータンパク質である得られたタンパク質は、その後に単離することができる。
【００８１】
例えば、スーパーチャージタンパク質の調製は、タンパク質の３次構造及び／又は生物学的活性を有意に変化させない限り、無荷電側鎖を有するアミノ酸を荷電側鎖を有するアミノ酸と置換すること、又は荷電側鎖を有するアミノ酸を反対の電荷を有する側鎖と置換すること、に関与し得る。これは、ユーザーがタンパク質表面電荷の変更を重要でないアミノ酸位置に行うことができるので、タンパク質の機能／活性が荷電側鎖を有するアミノ酸の関与によって決まる場合に特に有利であり得る。タンパク質が酵素又は他の生物学的活性を有するタンパク質であるとき、スーパーチャージタンパク質は、野生型形態のタンパク質における機能的に重要な部分又はドメインを含むことができる、すなわち、ドメイン又は部分は任意のアミノ酸置換を含まない。あるいは又はさらに、当業者は、文献又は従来の方法を使用して、タンパク質活性（例えば酵素活性）に重要な１つ以上の位置における野生型アミノ酸残基を決めることができる。スーパーチャージタンパク質は、その位置又は各位置で野生型アミノ酸を含み、他の位置のアミノ酸は任意的に置換されることができる。
【００８２】
典型的には、組み換え改変スーパーチャージタンパク質（すなわちアンカータンパク質）と天然タンパク質（すなわちアンカー前駆体タンパク質）との間で、グローバルレベルで判定されるアミノ酸配列同一性（又は「グローバル配列同一性」として既知である）は、少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％である。グローバルレベルにおける配列同一性の判定は、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔインターネットサイト(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を介してインターネット上で利用可能なニードルマン・ウンシュグローバルシーケンスアライメントツールを使用して行うことができる。上述のように、機能的に重要なドメインの配列同一性は、アンカータンパク質とアンカー前駆体タンパク質との間において、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％同一であり得る。
【００８３】
そうした組換え方法は、アンカー前駆体タンパク質に対して静電的に改変されるとともに、アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないアンカータンパク質を調製するために使用可能である。典型的には、そうしたアンカータンパク質は、自然起源の、例えば、上記においてより詳細に記載されるようなタンパク質を構成するアミノ酸（標準的アミノ酸を含む）又はタンパク質を構成しないアミノ酸から選択される、アミノ酸からなる。また、アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まない限り、タンパク質を構成するアミノ酸及びタンパク質を構成しないアミノ酸の改変も考慮される。また、自然起源でないアミノ酸も上述のように含むことができる。
【００８４】
典型的に、本発明の第２の態様における方法に使用されるタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートに含ませるためのアンカータンパク質は、タンパク質におけるアミノ酸残基の総数の百分率として決定される正荷電アミノ酸残基（上記表２の太字強調したものなど）の百分率を含むことができ、これは対応するアンカー前駆体タンパク質におけるそうした残基の百分率より大きい。例えば、アンカー前駆体タンパク質は、その全アミノ酸残基の５．０〜１７．５％を正荷電残基として有することができ、アンカータンパク質は対応するアンカー前駆体タンパク質におけるものより大きい百分率を有することができる。アンカータンパク質は、その全アミノ酸残基の少なくとも約１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は少なくとも約３０％を正荷電残基として有することができる。例えば、本明細書に記載されるスーパーチャージＧＦＰはその全アミノ酸残基の約２８％を正荷電残基として有する一方、本明細書に記載されるスーパーチャージＯｐｄＡはその全アミノ酸残基の約１８％を正荷電残基として有する。非スーパーチャージで自然起源のＯｐｄＡはその全アミノ酸残基の約１３％を正荷電残基として有する一方、非スーパーチャージＧＦＰはその全アミノ酸残基の約１５％を正荷電残基として有する。典型的に、タンパク質の電荷全体は、上述のように生理学的なｐＨにおいて評価することができる。
【００８５】
アンカータンパク質は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セレノシステイン、及びピロリジンからなる群より選ばれるアミノ酸のみを含むことができる。あるいは又はさらに、アンカータンパク質は、対応するアンカー前駆体タンパク質に存在するアルギニン及び／又はヒスチジン及び／又はリジン残基の数よりも少ないアルギニン及び／又はヒスチジン及び／又はリジン残基を含むことができる。例えば、アンカータンパク質は、アルギニン及び／又はヒスチジン及び／又はリジン残基を含まなくともよい。あるいは又はさらに、アンカータンパク質は、対応するアンカー前駆体タンパク質よりも少ない正荷電残基を含むことができる、又は対応するアンカー前駆体タンパク質よりも少ない負荷電残基を含むことができる。アンカー前駆体タンパク質における１つ以上の無荷電及び／又は正荷電残基はそれぞれ、負荷電残基によって置換されてアンカータンパク質を形成することができる。あるいは、アンカー前駆体タンパク質における１つ以上の無荷電及び／又は負荷電残基はそれぞれ、正荷電残基によって置換されてアンカータンパク質を形成することができる。
【００８６】
緑色蛍光タンパク質（GFP）に関するそうした改変（「スーパーチャージ」）タンパク質の生成例は、Ｌａｗｒｅｎｃｅ等(J. Am. Chem.Soc. (2007) vol. 129 p.10110-10112)によって記載されている。該文献に公開される方法は、例えば本明細書に記載されるような他のスーパーチャージタンパク質の提供を可能にするように、当業者によって容易に適応されることができる。
【００８７】
組換えＤＮＡは、配列番号２、又は、スーパーチャージＯｐｄＡをコードする、例えば、配列番号１０の１４５位に相当する位置にカルボキシル化リジンを有するスーパーチャージＯｐｄＡである配列番号１１をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含むことができ、この位置は配列番号１１の１５１位である。配列番号４０は配列番号１１と同じ配列であり、配列番号１１おいてもそうであるとして当業者に理解されるように、カルボキシル化リジンが１５１位に存在することを明らかに示す。ゆえに、配列番号２はまた、配列番号４０をコードすると言える。
【００８８】
組換えＤＮＡ配列は、（本明細書に記載されるようなアンカータンパク質であり得る）スーパーチャージタンパク質と２次分子を含む融合タンパク質をコードし得る。２次分子は、非限定的例として、ＧＦＰ、ＰｓｍＯｒａｎｇｅ、若しくはマグネトフェリチンなどの標識タンパク質、標識分子若しくはナノ粒子とコンジュゲートしたタンパク質、ペルオキシダーゼ若しくはホスホトリエステラーゼ（アグロバクテリウム・ラジオバクターのＯｐｄＡなど）若しくはプロテアーゼ（トロンビンなど）などの酵素タンパク質、若しくはプロトロンビンなどの酵素前駆体タンパク質、抗体、レクチン、インテグリン、若しくは接着分子（例えばストレプトコッカス・ゴルドニのタンパク質ＣｓｈＡ、若しくはＣｓｈＡのフィブロネクチン結合ドメインを含むＣｓｈＡの機能的変異体若しくは部分）などの接着若しくは「帰巣」タンパク質、ＰＩＧＦ−２若しくはＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）を含むその一部若しくはその機能的変異体などの成長因子、又はグロビン、例えばミオグロビンなどの担体タンパク質、又はスパイキャッチャー若しくはスパイタグモチーフなどのペプチド若しくはポリペプチドであり得る又はそれらを含み得る。
【００８９】
アンカータンパク質は、スーパーチャージＧＦＰ（例えば配列番号１２）又はスーパーチャージＯｐｄＡ（配列番号１１、配列番号４０にも記載）であり得る。あるいは又はさらに、融合タンパク質内に含まれる２次分子は、トロンビン又はプロトロンビン（例えば配列番号２５又は２６）、ＣｓｈＡ（例えばストレプトコッカス・ゴルドニの配列番号２０）又はフィブロネクチン結合ドメイン（配列番号１９）を含むその機能的変異体若しくは部分、ＯｐｄＡ（リゾビウム・ラジオバクターの配列番号１０、又はその機能的変異体若しくは部分、この配列はまた配列番号３９としても記載される）、胎盤成長因子−２（配列番号２２）、又はＰＩＧＦ−２（１２３ー１４４）（配列番号２１）を含むその機能的変異体若しくは部分、スパイキャッチャーポリペプチド（配列番号２３）、又はスパイタグポリペプチド（配列番号２４）であり得る。ゆえに、２次分子は、配列番号１９、又は配列番号１９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含むことができる。あるいは、２次分子は、配列番号１９、又は配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するその機能的変異体を含むことができる。
【００９０】
「トロンビン」という用語は、任意の種のトロンビン、例えばウシトロンビン又はヒトトロンビンを示し得る。当業者は、他の適切なトロンビン分子を容易に特定することができる。
【００９１】
融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列は、配列番号４〜７、又はコドンが変更されているが配列は同じアミノ酸配列をコードするそれらのいずれかに相当する配列から選択することができる。融合タンパク質は、配列番号１３〜１６、又は非変異体配列と少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそれらのいずれか機能的変異体から選択されるアミノ酸配列を有することができる。機能的変異体は配列番号１９又は２１を含むことができる。ゆえに、組換えＤＮＡ配列は、配列番号１３〜１６のいずれか又は記載されるような機能的変異体をコードする任意のものであり得る。グローバルレベルにおける配列同一性の判定は、上述のように行うことができる。本発明において使用するために静電的改変され得る他のタンパク質は表４に記載される。
【表４】
2020534261.tif 000010
表４は適切な接着タンパク質の一覧を示す。
【００９２】
本明細書にわたって使用されるような「ＣｓｈＡ」への言及は、配列番号２０又は２７、例えば配列番号２０に関する。
【００９３】
組換えＤＮＡ配列は、当業者の通常の能力によって、任意の従来の方法に従って、例えば大腸菌での発現など任意の発現系を使用して発現することができる。また、発現したアンカータンパク質の発現系からの単離は当業者の通常の能力内のものである。
【００９４】
本発明の第３の態様は、タンパク質標識で細胞を標識する方法を提供し、該方法は本発明の第２の態様における方法を含み、ステップ（ｂ）のリン脂質二重層が細胞の外膜を形成し、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートはタンパク質標識を含む。タンパク質標識は、アンカータンパク質、又は存在する場合に２次分子であり得る。タンパク質標識は、ＧＦＰ、ＰｓｍＯｒａｎｇｅ、若しくはマグネトフェリチン、標識分子若しくはナノ粒子とコンジュゲートしたタンパク質、ペルオキシダーゼ若しくはホスホトリエステラーゼ（アグロバクテリウム・ラジオバクターのＯｐｄＡ若しくはその機能的変異体若しくは部分など）若しくはプロテアーゼ（トロンビンなど）などの酵素タンパク質、酵素前駆体（プロトロンビンなど）、抗体、レクチン、インテグリン、若しくは接着分子（例えばストレプトコッカス・ゴルドニのタンパク質ＣｓｈＡ、若しくは配列番号１９などのＣｓｈＡのフィブロネクチン結合ドメインを含むその機能的変異体若しくは部分、若しくは表４に記載の任意のタンパク質）などの接着若しくは「帰巣」タンパク質、成長因子（ＰＩＧＦ−２若しくはＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）（配列番号２１）を含むその機能的変異体若しくは部分など）、又はグロビン、例えばミオグロビンなどの担体タンパク質であり得る。上述の選択肢に加えて、２次分子は、ペプチド、ポリペプチド、又はスパイキャッチャー若しくはスパイタグモチーフ、ビオチン若しくはストレプトアビジンなどの他の分子からさらに選択することができる。
【００９５】
タンパク質標識は、蛍光性タンパク質などの検出可能なタンパク質標識、又は金属粒子、ナノ粒子、蛍光性色素、若しくは蛍光性プローブなどの標識分子にコンジュゲートしたタンパク質であり得る。標識は、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含まない同等の細胞からの標識細胞の分離を可能にするものであり得る。標識は、標識結合部分と相互作用できる又は標識結合部分に結合できるものであり得る。例えば、タンパク質標識が抗体であるとき、標識結合部分は抗体に結合可能な抗原であり得る。タンパク質標識がスパイキャッチャーポリペプチドであるとき、標識結合部分はスパイタグポリペプチドであり得る。タンパク質標識がスパイタグポリペプチドであるとき、標識結合部分はスパイキャッチャーポリペプチドであり得る。タンパク質標識がストレプトアビジンであるとき、標識結合部分はビオチンであり得る。標識結合部分自体は、本明細書に記載の方法によって又は当該技術分野で既知の他の方法によって、細胞にさらに付加される、又はより大きな構築物、分子、若しくは構造の一部を形成することができる。
【００９６】
ゆえに、本発明の関連する態様は、本発明の第３の態様における方法によって得られた細胞を提供する。そうした細胞は、典型的に、本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物である。
【００９７】
本明細書に記載される発明の任意の態様又は実施形態に関して、本明細書にわたって使用されるような「細胞」という用語は、原核生物細胞又は真核生物細胞、例えば、細菌類、真菌類、原生生物、植物、昆虫類、爬虫類、鳥類、魚類、又は哺乳動物の細胞、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、若しくはウマの細胞、又はウシ、ブタ、若しくはヒツジの細胞であり得る。細胞は、ヒト細胞ではない、及び／又は、ヒト胚細胞若しくはその由来細胞ではない、及び／又は、ヒト胚性幹細胞若しくはその由来細胞ではないものであり得る。
【００９８】
本発明の第４の態様は、組織工学用足場を形成する方法を提供し、該方法は、（例えば本明細書の第２又は第３の態様における方法によって得られた）本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物（細胞など）を使用することを含み、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが、タンパク質の自然起源の形態において組織の成長及び／又は治癒を促進することが知られている（アンカータンパク質であり得る又は２次分子であり得る）タンパク質を含む。例えば、アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン若しくはプロトロンビンであり得る、若しくは、トロンビン若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体若しくは部分であり得る、又は、２次分子は、トロンビン若しくはプロトロンビン（例えば配列番号２５又は２６）、若しくはトロンビン若しくはプロトロンビンの機能的変異体若しくは部分、若しくはＰＩＧＦ−２（配列番号２２）若しくは配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分であり得る。例えば、方法には、アンカータンパク質がカチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビンであるか又は２次分子がトロンビンである本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物である細胞を、フィブリノゲン含有ゲルなどのフィブリノゲン組成物、又は、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等により(Adv. Healthcare Mat. (2016) vol. 5 p 1724-1730)及び同時係属中出願の国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５３３５８号に(国際公開第2017/187114号として公開)記載される方法によって形成されたフィブリノゲン含有構造に接触させることを含むことができる。あるいは又はさらに、方法には、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートがＰＩＧＦ−２（配列番号２２）又は配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分である２次分子を含む本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物である細胞を、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチン、及び／又はフィブリノゲンの１つ以上を含む材料に接触させることを含むことができる。材料は、細胞外マトリックス及び／又はゲル及び／又はＡｒｍｓｔｒｏｎｇ等により(Adv. Healthcare Mat. (2016) vol. 5 p 1724-1730)及び同時係属中出願の国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５３３５８号に(国際公開第2017/187114号として公開)記載される方法によって形成された構造であり得る。
【００９９】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物（細胞など）を含む組織工学用足場、例えば本発明の第４の態様における方法によって調製される足場を提供する。タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、タンパク質の自然起源のアンカー前駆体タンパク質形態において組織の成長及び／又は治癒を促進することが知られている（アンカータンパク質であり得る又は２次分子であり得る）タンパク質を含むことができる。例えば、アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン若しくはプロトロンビン、若しくは、トロンビン若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体若しくは部分であり得る、又は、２次分子は、トロンビン若しくはプロトロンビン（例えば配列番号２５又は２６）、若しくはトロンビン若しくはプロトロンビンの機能的変異体若しくは部分であり得、若しくはＰＩＧＦ−２（配列番号２２）若しくは配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分であり得る。組織工学用足場は、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等により(Adv.Healthcare Mat. (2016) vol. 5 p 1724-1730)及び同時係属中出願の国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５３３５８号に(国際公開第2017/187114号として公開)記載される方法を含む方法によって形成され得る。あるいは又はさらに、組織工学用足場は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチン、及び／又はフィブリノゲンの１つ以上を含むことができる。
【０１００】
本発明の第６の態様は、組織の成長及び／又は治癒を促進する方法を提供し、該方法は、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが、タンパク質の自然起源のアンカー前駆体タンパク質形態において組織の成長及び／又は治癒を促進することで知られている（アンカータンパク質であり得る又は２次分子であり得る）タンパク質を含む、（例えば本明細書の第２の態様における方法によって得られた）本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物である（又はそれを含む）細胞を、組織の成長及び／又は治癒が求められる部位に導入することによって、該細胞を使用することを含む。例えば、細胞は間葉系幹細胞であり得、アンカータンパク質はカチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン若しくはプロトロンビン（例えば配列番号２５又は２６）、若しくは、トロンビン若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体であり得、又は、２次分子はトロンビン若しくはプロトロンビン（例えば配列番号２５又は２６）、若しくはトロンビン若しくはプロトロンビンの機能的変異体若しくは部分、若しくはＰＩＧＦ−２（配列番号２２）若しくは配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分であり得る。組織は、インビトロ若しくはエクスビボであり得、又は動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、若しくはウマなどの哺乳動物内におけるインビボであり得る。方法は、本発明の第５の態様における足場、及び／又は本発明の第１１の態様における医薬組成物、及び／又は本発明の第１２の態様における外科用組成物を使用することを含むことができる。
【０１０１】
本発明の第７の態様は、細胞を組織にターゲティングする方法を提供し、該方法は、（例えば本明細書の第２の態様における方法によって得られた）本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物である（又はそれを含む）細胞を使用することを含み、リン脂質二重層が細胞の外膜の少なくとも一部を形成し、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが、抗体、レクチン、インテグリン、又はアドヘシンなどの組織に特異的な（アンカータンパク質又は２次分子であり得る）タンパク質を含む。組織は、インビトロ若しくはエクスビボであり得、又は動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、若しくはウマなどの哺乳動物内におけるインビボであり得る。組織は心臓組織であり得、細胞は間葉系幹細胞又は心筋細胞であり得、その場合タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートがＣｓｈＡ又は配列番号１９を含むその機能的変異体若しくは部分である２次分子を含み得る。方法には、組織培養容器、エクスビボの組織（例えば心筋梗塞、心筋症、及び／若しくは心筋炎に罹患する個体から得たもの）、又は組織を含む身体、例えば心筋梗塞、心筋症、及び／若しくは心筋炎に罹患する身体などの、組織が存在する（ヒト又は動物の身体ではないシステムであり得る）システムに、細胞を導入することを含むことができる。ゆえに、組織は、インビトロ若しくはエクスビボであり得、又は動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、若しくはウマなどの哺乳動物内におけるインビボであり得る。方法は、本発明の第５の態様における足場、及び／又は本発明の第１１の態様における医薬組成物、及び／又は本発明の第１２の態様における外科用組成物を使用することを含むことができる。
【０１０２】
本発明の第８の態様は、細胞内部にタンパク質を送達する方法を提供し、該方法は本発明の第２の態様における方法を含み、リン脂質二重層が細胞の外膜を形成する。これは、細胞膜の部分及び／又は膜に関与する分子が細胞に内部移行する、当業者に既知であるエンドサイトーシスのプロセスを可能とする又は促進することでなされる。タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートの組成物は、該プロセスを促進又は抑制することができる、すなわち、包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートのエンドサイトーシスのスピード／速度を促進又は抑制する。細胞は、ヒト胚細胞又はヒト胚性幹細胞ではない細胞であり得る。細胞は、インビトロ又はエクスビボである細胞、すなわち、ヒト又は動物の体内におけるインビトロではない細胞であり得る。
【０１０３】
本発明の第９の態様は、治療において使用される本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物を提供する。リン脂質組成物は、間葉系幹細胞などの細胞であり得る。第９の態様において、リン脂質組成物は、組織の成長及び／又は治癒を促進する方法に使用されるためのものであり得、包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが、組織の成長及び／又は治癒を促進することが知られている（アンカータンパク質又は２次分子であり得る）タンパク質を含む。例えば、タンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン若しくはプロトロンビン、若しくは、トロンビン若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体であり得る、又は、タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、トロンビン若しくはプロトロンビン（例えば配列番号２５又は２６）、若しくはトロンビン若しくはプロトロンビンの機能的変異体若しくは部分である、若しくはＰＩＧＦ−２（配列番号２２）若しくは配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分である２次分子を含むことができる。あるいは、組織の成長及び／又は治癒を促進することが知られているタンパク質はミオグロビンであり得、その場合組織は軟骨であり得る。あるいは、２次分子は、ＣｓｈＡ又は配列番号１９を含むその機能的変異体若しく部分であり得、その場合、組織は心臓組織であり得、組成物は心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎の処置のための方法に使用されるものであり得る。この場合、細胞は心筋細胞であり得る。組織は、インビトロ若しくはエクスビボであり得、又は動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、若しくはウマなどの哺乳動物内におけるインビボであり得る。方法は、本発明の第５の態様における足場、及び／又は本発明の第１１の態様における医薬組成物、及び／又は本発明の第１２の態様における外科用組成物を使用することを含むことができる。
【０１０４】
あるいは、本発明の第９の態様において、本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物は、被毒したヒト又は動物、例えば毒物に接触したヒト又は動物の処置において使用されるものであり得る。本発明の第１０の態様は、被毒したヒト又は動物、例えば毒物に接触したヒト又は動物の処置のための方法を提供し、該方法は、ヒト又は動物を本発明の第１の態様における組成物に接触させること、又はヒト又は動物に治療有効量のそうした組成物を投与することを含む。「毒物に接触する」ことは、ヒト又は動物が、食物若しくは飲料物とともに若しくは食物若しくは飲料物として毒物を摂取した、又は毒物を吸引した、又は皮膚若しくは他の外部体表面との接触後毒物を吸収した、又は任意の他の手段で毒物を取り込んだことを示し得る。「被毒」という用語は、毒物との接触後、ヒト又は動物の正常な健康が失われる又は負の影響を受けること示し得る、従来より使用される用語であり、「処置」という用語は、ヒト又は動物の健康が被毒前状態に対して改善又は回復されることを示し得る。「処置」は、本発明の第９の態様における処置が存在せず、ヒト又は動物が毒物に接触した後、死が予想される結果であるとき、ヒト又は動物の死を回避する又は防ぐことを含むことができる。健康が失われること及び／又は改善することは、任意の従来の方法、例えば、非限定的例として、発疹、出血、嘔吐、下痢、体温上昇、脱水、体重減少、視力低下、聴力低下、筋けいれん、及び／又まひの発生又は減少によって判定することができる。「毒物」という用語は、細胞、又はヒト若しくは動物の身体若しくは植物を含む生体の正常な機能に悪影響を及ぼすとともに、非限定的例として、毒素及び毒液、並びに殺虫剤又は神経剤を含む、任意の物質を包含する。
【０１０５】
本発明の第９又は第１０の態様において、本発明の第１の態様における組成物は、（ａ）毒物を中和可能な酵素であるアンカータンパク質を含む、又は（ｂ）毒物に結合若しくは毒物を中和可能な２次分子に結合するアンカータンパク質を含むことができる。「中和」という用語は、毒物物質が分解される、あるいは変化する（又はヒト又は動物の身体におけるその影響が変化する）ことで、毒性（すなわちヒト又は動物に害がある）でなくなる、又は毒性が低下するということを示す。アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのＯｐｄＡ、若しくは、有機リン化合物を分解することができるそのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体若しくは部分であり得る、又は、２次分子は、ＯｐｄＡ、若しくは有機リン化合物を分解することができるその機能的変異体若しくは部分を含み得る。
【０１０６】
本発明の第６、第７、第８、第９、又は第１０の態様において、リン脂質組成物は、本発明の第１１の態様を構成する医薬組成物の形態であり得、該医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルをさらに含む。例えば、医薬組成物は、水性若しくは油性懸濁剤、又は非経口に許容される非毒性の希釈剤又は溶媒内の懸濁剤であり得る無菌注射剤の形態であり得る。水性懸濁剤は、例えば、マンニトール、水、リンゲル液、又は生理食塩水内において調製することができる。あるいは、水性懸濁剤はリン酸緩衝食塩水内において調製することができる。油性懸濁剤は、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、脂肪酸、又は薬学的に許容可能な天然油内において調製することができる。脂肪酸は、オレイン酸又はオレイン酸グリセリド誘導体であり得る。薬学的に許容される天然油は、オリーブ油、ヒマシ油、又はポリオキシエチル化オリーブ油若しくはヒマシ油であり得る。油性懸濁剤は、例えば欧州薬局方及び／又はスイス薬局方に準拠する、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含むことができる。医薬組成物は、本発明のリン脂質組成物に加えて１つ以上の薬学的あるいは生物学的活性剤を含むことができる。例えば、組成物は、従来の薬剤、抗体、又は他のタンパク質成分などの治療剤を含むことができる。
【０１０７】
本発明の第１２の態様は、本発明の第１の態様におけるリン脂質組成物、フィブリノゲン、及び／又は外科的に許容される担体、希釈剤、若しくはビヒクル、例えば本発明の第１１の態様について上述されたもの、を含む外科用組成物を提供する。外科的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルはヒドロゲルを含むことができる。外科的に許容される担体は、膜又は布帛などの足場材料であり得る。足場材料は、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等により(Adv.Healthcare Mat. (2016) vol. 5 p 1724-1730)及び同時係属中出願の国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５３３５８号に(国際公開第2017/187114号として公開)記載される方法を含む方法によって形成され得る。一部の実施形態において、外科用組成物は本明細書において「外科用接着剤」と呼ばれ得る。
【０１０８】
本発明の第１３の態様は、毒物を含むサンプルを除染する方法を提供し、該方法は、（ａ）アンカータンパク質が毒物を中和可能な酵素である、本発明の第１の態様における組成物にサンプルを接触させること、又は（ｂ）アンカータンパク質が毒物に結合若しくは毒物を中和可能な２次分子に結合する、本発明の第１の態様における組成物にサンプルを接触させることを含む。「中和」という用語は、毒物物質が分解される、あるいは変化することで、毒性でなくなる、又は毒性が低下するということを示す。サンプルは、任意の液体サンプル（水サンプルなど）又は固体サンプル（任意の固体表面、若しくは地面、若しくは土壌サンプル、又は布帛、例えば衣服若しくはベッド用リネンとして使用される材料）であり得る。毒物は、ヒト、動物、昆虫類、魚類、及び／又は植物に毒性のある任意の化学物質、例えば殺虫剤又は神経剤であり得る。本発明の第９の態様において、アンカータンパク質、又は存在する場合に２次分子は、リゾビウム・ラジオバクターから得られるＯｐｄＡなどの有機リンヒドロラーゼ酵素、又は他の生物体から得られる若しくはそうした酵素から改変された相同酵素であり得る。
【０１０９】
本発明の第１４の態様は、スーパーチャージアンカータンパク質及び配列番号１９〜３８のいずれか、又はスーパーチャージアンカータンパク質及び少なくとも６０％配列同一性を有する配列番号１９〜３８のいずれかの機能的変異体の融合タンパク質を含むポリペプチドを提供する。例えば、スーパーチャージアンカータンパク質はｓｃＧＦＰであり得、ポリペプチドは、配列番号１３〜１６の少なくとも１つ、又は非変異体配列と少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそれらのいずれかの機能的変異体を含むことができる。本発明の他の第１４の態様において、配列番号３９によっても記載される配列番号１０のスーパーチャージのものを含む（例えば配列番号４０によっても記載される配列番号１１を含む）、又は配列番号１０、１９〜２２、若しくは２５〜３９のいずれかのスーパーチャージのものを含むポリペプチドが提供される。本発明の第１５の態様は、例えば、配列番号２、若しくは４〜７の少なくとも１つ、又はコドンが変更されているが配列は同じアミノ酸配列をコードするそれらのいずれかに相当する配列を含む、本発明の第１４の態様におけるポリペプチドをコードする、ＤＮＡ配列などの組換え核酸配列（すなわちポリヌクレオチド）を提供する。本発明の第１４の態様におけるポリペプチド又は本発明の第１５の態様における核酸は、治療に使用されるためのものであり得、例えばポリペプチドが配列番号１４、１９、２０、又は２７〜３８のいずれかを含むとき、本発明の第１４の態様におけるポリペプチド又は本発明の第１５の態様における核酸は、心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎の処置の方法に使用されるためのものであり得る。
【０１１０】
ゆえに、本発明の第１６の態様は、本発明の第１４の態様におけるポリペプチド又は本発明の第１５の態様における核酸、又はそうしたポリペプチド若しくは核酸配列を含む医薬組成物を、治療処置を必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。そうした医薬組成物は、本発明の第１１の態様に関して上述するような形態であり得る。例えば、医薬組成物は、上述のような薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルをさらに含むことができる。方法は、治療量の、配列番号１４、１９、２０、若しくは２７〜３８のいずれかを含むポリペプチド、又はこれらの１つ以上をコードする核酸配列、又は１つ以上のそうしたポリペプチド若しくは核酸配列を含む医薬組成物を、処置を必要とする対象（すなわち心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎の１つ以上に罹患する対象）に投与することを含む、心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎の処置の方法であり得る。
【０１１１】
この明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲において、「含む」及び「含有」という用語、並びに例えば「含むこと」及び「含む」などのその用語の変形は、「含むが限定されない」ということを意味し、他の成分、構成物、又はステップを除外するものではない。この明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲において、文脈においてあるいは要求されない限り、単数は複数を含む。特に、不定冠詞が使用されるとき、文脈においてあるいは要求されない限り、明細書は単数形とともに複数形も考慮するとして理解される必要がある。
【０１１２】
本発明の他の特徴は以下の実施例から明らかになる。一般に、本発明は、この明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示される特徴の任意の新規のもの又は任意の新規の組合せに拡大される。このように、本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例と併せて記載される特徴、構成物，特性、化合物、又は化学的部分は、これらと矛盾しない限り本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態、又は実施例に適用可能であることが理解される。
【０１１３】
さらに、あるいは記載されない限り、本明細書に開示される任意の特徴は、同じ又は類似の目的を果たす他の特徴によって置き換えられ得る。
【０１１４】
ここで、本発明は添付の図面に関して例のみとして記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、求核付加―脱離メカニズムによるグルタミン酸及びアスパラギン酸残基の共有変化の反応経路を示す。
【図２】図２は、リン脂質二重層に挿入されたタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲート（又は「タンパク質−界面活性剤バイオコンジュゲート」）を示す模式図である。
【図３】図３は、２次分子が膜の外側に位置する、アンカータンパク質及び２次分子を含むタンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを示す模式図である。
【図４】図４は、本発明に記載の作業で使用される種々の界面活性剤の化学構造を示す（S621及びS907では、x = 11-13、S621では、y = 7-9、S907ではy = 14-15）。
【図５】図５は、ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡの質量スペクトルを示す。
【図６】図６は、（ａ）［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］のＵＶ−ｖｉｓ吸光度と、（ｂ）［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］の蛍光励起及び発光を示す。
【図７】図７は、ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡのＵＶ−ｖｉｓ吸光度を示す。
【図８】図８は、ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡの励起及び発光特性を示す。
【図９】図９は、電荷数３におけるトロンビン及びカチオン化トロンビンの質量スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、ＯｐｄＡ、ｃＯｐｄＡ、及び［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］のゼータ電位差測定を示す。
【図１１】図１１は、トロンビンカチオン化時の経時におけるゼータ電位の変化を示す。
【図１２】図１２は、（ａ）ＯｐｄＡ、ｃＯｐｄＡ、及び［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］の２次構造組成物、並びに（ｂ）ＯｐｄＡ、ｃＯｐｄＡ、及び［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］の熱変性を示す。
【図１３】図１３は、ＯｐｄＡ、ｃＯｐｄＡ、及び［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］の径率分布を示す。
【図１４】図１４は、３０℃、６０℃、及び９０℃における（ａ）ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ及び（ｂ）［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］の円２色性を示す。
【図１５】図１５は、ｈＭＳＣにつき結合したｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］分子の数を示す。
【図１６】図１６は、刺激したｈＭＳＣの蛍光性を示す。
【図１７】図１７は、ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］の細胞毒性を示す。
【図１８】図１８は、［ｓｃＧＦＰ_ＣｓｈＡ］及び［ｓｃＧＦＰ_ＣｓｈＡ］［Ｓ］で刺激したｈＭＳＣの増殖を示す。
【図１９】図１９は、ＯｐｄＡ、ｃＯｐｄＡ、及び［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］のミカエリス―メンテンパラメータを示す。
【図２０】図２０は、トロンビンカチオン化時の経時における酵素活性の変化を示す。
【図２１】図２１は、［トロンビン］［Ｓ］触媒フィブリンゲルの共焦点顕微鏡図を示す。
【図２２】図２２は、ＢＳＡ被膜及びＦｎ被膜プレートにおける未標識ｈＭＳＣ、ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ刺激ｈＭＳＣ、及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］刺激ｈＭＳＣの細胞接着性を示す。
【図２３】図２３は、ｈＭＳＣ及びｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）刺激ｈＭＳＣとともに外植したウシ関節軟骨の走査型電子顕微鏡イメージを示す。
【実施例】
【０１１６】
［方法概要］
＜プラスミド調製＞
ＯｐｄＡ遺伝子をｐＥＴＭＳＣＩベクターにて取得し、さらなるプロセスを必要としなかった。Ｇｉｂｓｏｎ等によって以前に記載されたように(Nat Methods.(2009) April 12;6(5):343-5.)ギブソンアセンブリーによってｓｃＯｐｄＡ遺伝子をｐＥＴＭＳＣＩベクターに挿入した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングシステムによって、製造者の指示に従って、ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ、ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー、ｍＣｈｅｒｒｙ−スパイタグ、ＣｓｈＡ−スパイタグ、ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡ、及びｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ遺伝子をｐＯＰＩＮＦベクターに挿入した。それぞれ製造者の指示に従って、Ｓｔｅｌｌａｒ細胞（Clontech、米国）又はＴｏｐ１０細胞（Thermo Fisher Scientific、米国）への形質転換によってベクターを増幅し、その後ミニプレップ精製（Qiagen、独国）を行った。ＤＮＡ及びアミノ酸配列を表５に記載する。
【表５】
2020534261.tif 000011
表５は、本明細書で使用されるタンパク質遺伝子及びアミノ酸配列を示す。
【０１１７】
＜タンパク質発現＞
従来の方法を用いて、ＯｐｄＡ、ｓｃＯｐｄＡ、ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ、ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡ、及びｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）をＢＬ２１（DE3）細胞（New England Biolabs、米国）における発現によって得て、そのそれぞれの遺伝子を含むベクターで形質転換させた。タンパク質特異的パラメータを表６に記載する。市販のウシトロンビン及びヒトフィブリノゲンを得た（それぞれSigma、カタログ番号T7326及びF3879）。
【表６】
2020534261.tif 000012
表６は、タンパク質発現パラメータを示す。
【０１１８】
＜タンパク質精製＞
従来の方法を用いて、細胞ペレットに溶解バッファーを添加して、パルス音波処理を使用して溶解した。そして、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）を使用してタンパク質を精製した。従来の方法を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質をさらに精製した。タンパク質特異的精製ステップを表７に記載する。市販で購入したトロンビン又はフィブリノゲンは精製を必要としなかった。
【表７】
2020534261.tif 000013
表７はタンパク質精製条件を示す。
【０１１９】
＜グリコール酸エトキシレート４−ノニルフェニルエーテル（酸化IGEPAL-CO890）界面活性剤の合成＞ 
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等によって記載されるように(Nat. Commun.(2015) Jun 17;6:7405)界面活性剤を調製した。簡単に説明すると、５０ｍＬの脱イオン水に溶解した２ｇのＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−８９０を３０ｍｇの２，２，６，６，−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（TEMPO）、５０ｍｇのＮａＢｒ、及び１０〜１５％有効塩素を含む５ｍＬのＮａＣｌＯ溶液と混合した。溶液を定期的にｐＨ１１に調節し、２４時間かく拌した。反応をエタノールでクエンチして、ｐＨ１に調節した。溶媒抽出を、８０ｍＬアリコートのクロロホルムの洗浄、そしてｐＨ１に調節した８０ｍＬアリコートの脱イオン水による３回の洗浄で行った。得られた溶液を４０℃の減圧下で乾燥させた。残留する固体を４０ｍＬのエタノールに再溶解し、−２０℃で再結晶化させ、エタノールを移し、結晶を６５℃の減圧下で乾燥させた。
【０１２０】
＜タンパク質−界面活性剤コンジュゲーション＞
コンジュゲート構築物を形成するため、カチオン化タンパク質又はスーパーチャージＧＦＰ若しくはＯｐｄＡを含むタンパク質の溶液にグリコール酸エトキシレート４−ノニルフェニルエーテルを添加した（以下参照）。任意の余剰の界面活性剤を１４，０００ＭＷＣＯのチューブを使用して透析によって除去してもよい。具体的なパラメータを表８に示す。
【表８】
2020534261.tif 000014
表８はコンジュゲーションパラメータを示す。
【０１２１】
＜質量分析＞
Ｂｒｕｋｅｒの質量分析計ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＴＯＦをリニアポジティブモードで使用して質量分析を行った。マトリックスは、最終濃度０．１％トリフルオロ酢酸と、等量のアセトニトリル及び水の混合物におけるシナピン酸又はα−ヒドロキシケイ皮酸の飽和溶液であった。分析するため、０．５μＬの１：１のサンプル及びマトリックス混合物を下地鋼プレートに配置した。
【０１２２】
＜動的光散乱法及びゼータ電位差測定法＞
動的光散乱法（DLS）及びゼータ電位差測定法の分析をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＳＰ（Malvern Instruments、英国）において行い、データをＺｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェア（Malvern Instruments）を使用して分析した。
【０１２３】
＜Ｘ線小角散乱法＞
Ｘ線小角散乱法を、オックスフォードのダイヤモンドライトソースにて、Ｂ２１ビームラインで行った。サンプルを、１０，０００のＭＷＣＯのスピン濃縮器で濃縮し、フロースルーをバックグラウンドとして使用するため保持した。そして、サンプルを１，０００，０００ＭＷＣＯのスピン濃縮器でスピンして、大きい混入物を除去した。サンプルをそれぞれ１０秒の１８フレームで暴露させた。データ分析を、ＡＴＳＡＳプラグインを使用してＳｃAｔｔｅｒソフトウェアパッケージにて行った。
【０１２４】
＜細胞培養＞
ブリストルのサウスミード病院研究倫理委員会のガイドライン（参照番号078/01）に完全に準拠し、すべての患者の告知に基づく同意を得て、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を、股関節全置換術を受ける変形性関節症患者の近位大腿骨骨髄から採取した。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタマックス（Gibco, 米国）、１００μｇ／ｍｇペニシリン−ストレプトマイシン、及び５ｎｇ／ｍＬの新しく添加したヒト塩基性線維芽細胞成長因子（FGF）（Peprotech, 米国）を添加した低グルコースＤＭＥＭを使用して、５％ＣＯ２にて、細胞を培養した。
【０１２５】
＜細胞刺激＞
細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Sigma, 英国）で懸濁した。タンパク質溶液を、フェノール非含有ＤＭＥＭ内の懸濁細胞に添加し、振とうさせ、３７℃で１５分間インキュベートした。そして、細胞を５００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。そして、すぐに使用するため又はプレーティングするため、細胞を再懸濁した。
【０１２６】
あるいは、タンパク質溶液をプレーティングした細胞に直接付加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、タンパク質溶液を３７℃で振とうさせて最大３０分間適切なバッファーに添加した。そして、細胞を再びＰＢＳで洗浄して、使用できるようにした。
【０１２７】
＜細胞毒性アッセイ＞
製造者の指示に従って、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（MTS）又はアラマーブルーを使用して、構築物の細胞毒性をアッセイした。簡単に説明すると、標準曲線を得るため、ｈＭＳＣを９６ウェルプレートに種々の濃度でプレーティングした。既知の量の細胞を構築物の溶液で１５分間刺激し、ＰＢＳで洗浄した後、ＭＴＳ又はアラマーブルー溶液で１〜２時間インキュベートした。そして、プレートリーダーを使用して吸光度又は蛍光度の値を収集し、値を標準曲線に対して比較して刺激細胞の生存率を測定した。
【０１２８】
＜ＵＶ−可視及び蛍光分光光度法＞
従来の方法を使用して、ＵＶ−可視及び蛍光分光光度法を行った。
【０１２９】
＜ビシンコニン酸アッセイ＞
製造者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイを行った。簡単に説明すると、２０μＬのサンプルを、９６ウェルプレートにおいて５０：１比で混合した２００μＬの試薬Ａ及びＢ（Thermo Scientific, 英国）に添加した。そして、プレートを３７℃で３０分インキュベートした後、プレートリーダーを使用して吸光度を５３０ｎｍで測定した。分析物に関して収集した吸光度値を、既知の濃度のタンパク質の標準曲線に対して比較して、分析物の濃度を計算した。
【０１３０】
＜ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）＞
従来の方法を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。簡単に説明すると、分析物を、グリセロール、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、トリス、メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルーを含むサンプルアプリケーションバッファーとー１：１で混合して、５分間９５℃に加熱した。そして、サンプルをＮｏｖｅｘ（登録商標）の４〜２０％のトリス−グリシンプリキャストゲル（Thermo Fisher Scientific）にロードした。２００Ｖの電圧を５０分間印加して、得られたゲルをクーマシーブルーで染色した。
【０１３１】
＜円２色性測定＞
シンクロトロン放射円２色性測定を、オックスフォードのダイヤモンドライトソースにて、Ｂ２３ビームラインで行った。サンプルを塩化物非含有バッファーにするように脱塩した。スペクトルを、２００μｍの光路長を有するキュベットを使用して、１８０〜２６０ｎｍまで収集した。熱調査では、１分のインキュベート時間の５℃間隔で、２０℃〜９０℃〜２０℃まで、データを収集した。あるいは、ランプ照射円２色性測定を、１００μｍの光路長のキュベットを使用して、Ｊ−１５００ＣＤ分光光度計（JASCO, 独国）において行った。ＢｅＳｔＳｅｌウェブサービスを使用してデータのデコンボリューションを行った(Micsonai et al.(2015) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, E3095-3103)。
【０１３２】
＜蛍光顕微鏡法＞
従来の方法を用いて、ライカＴＣＳ  ＳＰ８共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡（Leica Microsystems, 独国）を使用して、共焦点顕微鏡法を行った。従来の方法を用いて、ライカＤＭＩ６０００倒立型落射蛍光顕微鏡（Leica Microsystems, 独国）を使用して、広視野顕微鏡法を行った。ＯｐｄＡ及びトロンビンを、製造者の指示に従って、５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Sigma）又はローダミンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Thermo Scientific, 独国）で蛍光性タグ付けしたが、ｓｃＧＦＰ含有構築物はもともと蛍光性である。複合体の局在化を観察するため、タンパク質を、１０〜３０分間ガラスボトムディッシュにプレーティングした細胞に添加し、ＰＢＳで洗浄して、イメージングした。
【０１３３】
＜走査型電子顕微鏡法＞
ウシ関節表面サンプルを、２．５％のグルタルアルデヒドで１時間固定し、１００ｍＭのｐＨ７．４リン酸ナトリウムバッファーで１０分間３回リンスし、１％の四酸化オスミウム内に１時間存在させ、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーで１０分間３回洗浄し、水で１０分間洗浄した。脱水ステップを、２５、５０、７０、８０、９０、９６、及び１００％のエタノールで、１０分ごとに濃度を変えて行い、臨界点乾燥器で処理した。サンプルをパラジウム又はクロムでスパッタリングを用いてコーティングして、ＦＥＩ電界放射型走査電子顕微鏡（Quanta 200）においてイメージングした。
【０１３４】
＜増殖＞
［ｃトロンビン］［Ｓ］触媒フィブリン構築物内の組織再生ｈＭＳＣの増殖を、経時で行ったＭＴＳアッセイ（「細胞毒性アッセイ」にて上述されている）の結果を比較することで分析した。増殖における［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］でのｈＭＳＣの刺激の効果を、細胞をカウントするため血球計算器を使用し、それらをその播種数と比較して、分析した。
【０１３５】
＜フローサイトメトリー＞
タンパク質複合体で刺激したｈＭＳＣを採取し、初期洗浄ステップにおいて洗浄し、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。死染色を含むＰＢＳ内に沈降物を再懸濁した。１ｍＬにつき約１，０００，０００細胞を含む懸濁剤を個々のフローサイトメトリーチューブに移し、フローサイトメーター及び関連ソフトウェアを使用して分析した。細胞懸濁剤を１秒につき１００〜３００イベントの速度で検出点を通過させ、全部で２０，０００の全細胞イベントを測定した。側方散乱面積（SSC-A）、前方散乱面積（FSC-A）、前方散乱高さ（FSC-H）、及び実験特異的蛍光度を測定し、ゲート面積を規定するコントロール群としての未標識細胞をすべてのサンプルに使用した。細胞個体群全体をＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａゲートによってまず規定し、この領域外のデータは細胞片として除いた。この後、細胞個体群全体を、単一細胞個体群を規定するＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈによってゲートした。単一細胞個体群を、ＦＳＣ−Ａ対死染色フィルタードットプロットにおける上限を規定することでさらにゲートし、この限界より上のデータは死細胞として除いた。生細胞をＦＳＣ−Ａ対ＦＩＴＣ−Ａプロットにおいてゲートし、領域内のデータはｓｃＧＦＰポジティブ標識細胞に相当し、及び領域外のデータは非蛍光細胞（ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ構築物での刺激ｈＭＳＣ）に相当した、又は、ＰＥ−ＣＦ５９４−Ａ対ＦＩＴＣ−Ａプロットにおいてゲートし、領域内のデータはｓｃＧＦＰポジティブ（Ｑ１及びＱ２）及びｍＣｈｅｒｒｙポジティブ（Ｑ２及びＱ４）標識細胞に相当し、及び領域外のデータは非蛍光細胞（Ｑ３）（ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー及びｍＣｈｅｒｒｙスパイタグ細胞表面反応）に相当する。実験特異的パラメータを表９に示す。
【表９】
2020534261.tif 000015
表９はフローサイトメトリーのパラメータを示す。
【０１３６】
＜細胞膜取り込み定量化＞
ｈＭＳＣを、フェノール非含有ＤＭＥＭにおいて種々の濃度でタンパク質（例えば［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］）及びコンジュゲート（例えば［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］）を使用して１５分間刺激した。細胞膜に結合するタンパク質量は、細胞に添加したタンパク質量から、上清内のタンパク質量を減算して計算し、４８７ｎｍでＵＶ−可視分光光度法を使用して測定することができた。
【０１３７】
＜沈降速度分析用超遠心分離法（SV-AUC）＞
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ｉ（Beckman Coulter, 米国）において、２チャンネル１２ｍｍＥｐｏｎセンタピースを使用して４０，０００ｒｐｍ及び２０℃で、２８０ｎｍ及び４８７ｎｍにおいてＵＶ／可視吸光システムを使用して、ＳＶ−ＡＵＣ実験を行った。バッファー濃度及び粘度を落球式粘度計Ｌｏｖｉｓ２０００（Anton Paar, 墺国）の使用によって測定した。沈降係数（S）を連続分布ラム方程式モデル（c(S)）の使用によって決定し、標準条件（Sw (20, w)）に変換した。分子量を積分ｃ（ｓ）ピークから直接計算した。
【０１３８】
［化学カチオン化方法］
＜タンパク質カチオン化＞
タンパク質（OpdA又はトロンビン）をＡｒｍｓｔｒｏｎｇ等(Nat. Commun.(2015) Jun 17;6:7405)により記載されたものに由来する方法を使用してカチオン化した。簡単に説明すると、ＨＥＰＥＳバッファー内のタンパク質溶液（OpdA又はトロンビン）を所定の比でｐＨ中和Ｎ−Ｎ´−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（DMPA）に添加して、溶液を６ＭのＨＣｌでｐＨ調節した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（EDC）を１回の添加又は２回の半分ずつの添加で添加し、溶液をかく拌して、１０ＫのＭＷＣＯスピン濃縮器でのバッファー交換を使用して脱塩し、反応を停止させる。各タンパク質の具体的な実験パラメータを表１０に示す。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等による報告のように方法を行うことで、酵素活性を大きく失うことになり、これは、カチオン化反応が経時で不活性化をもたらすためである。発明者らは、反応時間を限定すること又はカチオン化粗溶液にサイズ排除クロマトグラフィーを行うことで活性酵素が生成されると判断した。
【表１０】
2020534261.tif 000016
表１０は、カチオン化パラメータを示す。
【０１３９】
［スーパーチャージタンパク質の組換え調製］
＜スーパーチャージ融合タンパク質の調製＞
スーパーチャージＧＦＰをＬａｗｒｅｎｃｅ等(J. Am. Chem. Soc.(2007) vol. 129 p.10110-10112)によって記載されるようなものである。ＣｓｈＡのフィブロネクチン結合部分（配列番号１９）、ＯｐｄＡ（配列番号２０）、ＰＩＧＦ−２（１２３−１４４）（配列番号２１）、及びスパイキャッチャー（配列番号２３）とのｓｃＧＦＰ融合タンパク質の調製のため、リンカー領域を以下に記載するように設計した。その後のステップを「プラスミド調製」というタイトルの項に上述するように行った。
【０１４０】
＜リンカー設計＞
融合タンパク質を形成するために使用される結合領域を、Ｃｈｅｎ等(Adv. Drug.Deliv. Rev. (2013) September 29;65,1357-69)によって記載される方法を使用して設計した。
【０１４１】
＜ＯｐｄＡのスーパーチャージ＞
ＯｐｄＡは、以下の表１１に記載される１１個のアスパラギン酸／グルタミン酸残基をリジン残基に突然変異させてｓｃＯｐｄＡを形成するようにスーパーチャージした（配列番号１０に関する位置番号）。突然変異残基を有する遺伝子をＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（独国）に依頼した。
【表１１】
2020534261.tif 000017
表１１はｓｃＯｐｄＡを生成するようにＯｐｄＡになされた突然変異を示す。
【０１４２】
［タンパク質特異的アッセイ］
＜パラオキソン加水分解＞
タンパク質（OpdA含有構築物）をバッファー内で作業濃度に希釈した。１００×パラオキソンの貯蔵物をイソプロパノール内で調製した。４−ニトロフェノラートの形成を、経験的に決定したε４０５＝１２０１３Ｍ−１・ｃｍ−１の吸収係数を使用して、４０５ｎｍで測定した。初期レートのデータに非線形回帰を行って、ミカエリス−メンテンパラメータを決定した。
【０１４３】
＜［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］膜活性アッセイ＞
３’，６’−ビス（ジフェニルホスフィニル）フルオレセイン（DPPF）を、Ｌｉｇｕｏ  Ａｎ等(Chem. Eur. J.(2007), February 2;13:1411)によって記載されるように蛍光イメージングのための基質として合成した。ＤＰＰＦをＤＭＳＯ内で１００ｍＭの貯蔵濃度に溶解し、１ｍＭの最終濃度で３０分間細胞に添加した。ガラスボトムマイクロウェルディッシュにプレーティングした細胞を、ＤＰＰＦへの暴露後１２μＭの［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］で標識した。共焦点顕微鏡法を使用してイメージを得た。また、アセチルチオコリンを使用して膜結合［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］の活性を５日にわたってアッセイした。４５０μＭのアセチルチオコリンと３００μＭの５，５´−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）をｈＭＳＣに添加して、１０μＭの［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］で刺激したｈＭＳＣを０、１、及び５日目に９６ウェルプレートにプレーティングした。得られた吸光度を経時で４１２ｎｍにおいて読み取り、１４１５０Ｍ−１・ｃｍ−１の吸収係数を使用して初期レートからのアセチルチオコリンターンオーバーを計算した。
【０１４４】
＜中性子反射率法＞
中性子反射率法を、オックスフォードのＩｓｉｓ施設にてＩＮＴＥＲビームラインで行い、グルノーブルのラウエ・ランジュバン研究所にてＤ１７ビームラインで行った。４：１の２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（POPC）及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（POPG）のフローティング二重層を、ラングミュア−ブロジェットトラフ堆積法を使用してシリコン基質に共有結合した１−パルミトイル−２−［１６−（アクリロイルオキシ）ヘキサデカノイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（al-PC）単層でシリコンブロック上において会合させた。ＯｐｄＡ構築物を０．２及び５μＭの濃度でロードし、弱結合材料をバッファーで洗浄した。ＭＡＴＬＡＢのＲａｓＣａｌソフトウェアパッケージでデータのデコンボリューションを行った。
【０１４５】
＜ｃトロンビンのフィブリン形成＞
カチオン化プロセス時にトロンビン触媒フィブリン形成を６００ｎｍの吸光度によって測定した。簡単に説明すると、７５μＬの０．０６ｍｇ／ｍＬトロンビンを１２５μＬの５ｍｇ／ｍＬフィブリノゲンに添加して、２０秒間振とうし、６００ｎｍの吸光度を経時で測定した。
【０１４６】
＜膜結合［ｃトロンビン］［Ｓ］によって触媒されるフィブリン構築物＞
［ｃトロンビン］［Ｓ］刺激ｈＭＳＣをアガロースでプレコーティングしたウェル内の７．５ｍｇ／ｍＬヒトフィブリノゲンの溶液に添加した。正常なフィブリン形成をＡｌｅｘａ−５９４タグ付きフィブリノゲンで共焦点顕微鏡法を使用して分析できた。
【０１４７】
＜スパイキャッチャー及びスパイタグ構築物の溶液カップリング＞
［ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー］又は［ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー］［Ｓ］の［ｍＣｈｅｒｒｙ−スパイタグ］又は［ＣｓｈＡ−スパイタグ］とのカップリングをＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して調査した。等量の［ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー］又は［ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー］［Ｓ］及び［ｍＣｈｅｒｒｙ−スパイタグ］又は［ＣｓｈＡ−スパイタグ］をガラスバイアル内で混合し、マグネチックスターラーを使用してかく拌した。反応における所定の時点で、１０μＬの得られた溶液を取り除いて、等量のＳＤＳサンプルアプリケーションバッファーと５分間混合した。この方法で得られた種々のサンプルを以前に記載されたようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付加した後、染色及び脱染色を行った。
【０１４８】
＜ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ及びｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）の静的接着アッセイ＞
細胞−基質接着性をＣｙＱＵＡＮＴ  ＮＦ細胞増殖アッセイキット（Invitrogen, 英国）を使用して調査した。ヒトフィブロネクチン（Sigma Aldrich）をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈し、コラーゲンＩ（ラット尾部、Sigma Aldrich）及びコラーゲンＩＩ（ウシ気管、Sigma Aldrich）を０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。１００μＬのこれらの溶液を使用して非組織培養物処理９６ウェルプレートの各ウェルをコーティングした。そして、プレートを１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（BSA; Sigma Aldrich）を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄して、非特異性相互作用を阻害した。ＢＳＡで処理したウェルをコントロールとして使用した。細胞をタンパク質複合体で刺激し、採取して、血球計算器を使用してカウントした。標準曲線サンプルを拡大培地において株化した。４時間のインキュベーション後、培地をゆっくりと吸引して細胞から取り除き、１００μＬの色素結合溶液を各ウェルに注いだ。プレートを覆って、３７℃で１時間インキュベートした。プレートリーダーを使用して各サンプルの蛍光強度を４８５ｎｍの励起及び５３０ｎｍの発光検出で測定した。接着細胞数を、フェノール非含有ＤＭＥＭでインキュベートした未処理細胞のコントロールサンプルと比較した。
【０１４９】
＜フロー接着性アッセイ＞
動的細胞接着性実験をＶｅｎａ８  Ｆｌｕｏｒｏ＋バイオチップを流れるＥｘｉＧｏマイクロ流体力学ポンプ（Cellix Ltd）で行った。チップを０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＩ（Sigma Aldrich）で一晩コーティングし、非特異的部位を１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（Sigma Aldrich）で阻害した。添加剤を含まないフェノール非含有ＤＭＥＭで、チャンネルを３０秒間４０μＬ／ｍｉｎで洗浄した。ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）刺激及び［ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）］［Ｓ］刺激ｈＭＳＣを、１ｍＬにつき百万細胞の密度で、添加剤を含まないフェノール非含有ＤＭＥＭ内に再懸濁した。５０μＬのアリコートを各回でチャンネルリザーバーに添加して、細胞を６、４、又は３ｍＬ／ｍｉｎｕｔｅの流量で取り出した。
【０１５０】
＜ウシ関節軟骨移植片への付着性＞
軟骨移植片を、死後６〜８時間で得た生後６〜８週の子牛の側方膝蓋溝から採取した。ディスクを８ｍｍの生検パンチで切り離し、外科用メス（サイズ22; Swann Morton）で慎重に剥離した。剥離後、小片を１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ内に保存した。軟骨ディスクを生検パンチで６ｍｍ直径に切り出し、添加物を含まない２００μＬのフェノール非含有ＤＭＥＭを含む非組織培養物処理９６ウェルプレート（Fisher, 英国）に配置した。細胞をｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）又は対応するコンジュゲートで刺激して、フェノール非含有ＤＭＥＭ内に再懸濁した。細胞を軟骨に添加し、インキュベーターに３７℃で５％ＣＯ２とともに４時間配置した。そして、サンプルをＳＥＭイメージング又は組織学的分析のために固定した。
【０１５１】
＜マウスにおけるｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ刺激ｈＭＳＣのインビボ移植＞
オスの生後２０週ＦＶＢ／Ｎ及びＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを動物リソースセンター（パース、西オーストラリア州）から購入した。すべての動物処置は、クイーンズランド大学の動物倫理委員会によって承認され、科学目的の動物の管理・利用に対する豪州の規定８版に従って行われた。マウスをイソフルランで麻酔した。３７℃に設定した温熱パッドにマウスを配置することで、体温を管理した。［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］、２×１０６未処理ｈＭＳＣ、又は［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］改変ｈＭＳＣの１５０μＬの懸濁剤を、それぞれ尾静脈（静脈内注射）を介して、又は胸壁を介して左心室（心臓内注射）に、２７ゲージ針で注射した。注射の前に、ｈＭＳＣを４℃で保持し、細胞をピペットでゆっくりと再懸濁して注射前に凝集がないようにした。注射後２時間及び２４時間でマウスを屠殺した。心臓及び肺のゲノムＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＤＮＡミニキット（Qiagen, 米国）及びヒトＡｌｕ配列を標的とするプライマーを使用して単離した。そして、液滴デジタルＰＣＲ（ddPCR）を使用して各組織におけるヒト細胞の数を定量化した。簡単に説明すると、２０μＬのｄｄＰＣＲ反応混合物を、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（BioRad, 米国）で液滴に分離した。液滴を９６ウェルのＰＣＲプレートに移し、封止して、９５℃５分間の１サイクル、９５℃３０秒間、５５℃１分間の４５サイクル、４℃５分間、９０℃５分間の１サイクル、１２℃の無限保持のサイクル条件でインキュベートした。熱サイクル後、ＰＣＲプレートをＱＸ２００ドロップレットリーダー（read）に写し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔバージョン１．７を使用してＦＡＭチャンネルにおいて読み取った。
【０１５２】
［結果］
＜タンパク質発現及び精製＞
すべてのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（MADLI-TOF）、及び活性アッセイを使用して発現及び精製されることが確認された。ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡの質量スペクトルを図５に示す。ＵＶ−可視分光光度法及び蛍光分光光度法により、ｓｃＧＦＰ−融合構築物の正しいフォールディングを確認した。
【０１５３】
＜カチオン化＞
ＯｐｄＡ及びトロンビンの正常なカチオン化を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF）を使用して確認した。ＯｐｄＡは、２０ＤＭＰＡ分子の付加に対応する、約１７００Ｄａの質量の増加を示した。トロンビンカチオン化は、３９ＤＭＰＡ分子に相当する、約３３００Ｄａの質量の増加をもたらした。トロンビンに対して電荷数３において採取した質量スペクトルを図９に示す。
【０１５４】
ゼータ電位差測定法を使用して、カチオン化に関連する電荷の増加を示した。カチオン化は、ＯｐｄＡのゼータ電位を−７ｍＶから＋２１ｍＶに増加させた（図１０参照）。トロンビンカチオン化時のゼータ電位の変化を図１１に示す。
【０１５５】
カチオン化に関連する構造的変化を、動的光散乱法（DLS）、円２色性測定（CD）、及びＸ線小角散乱法（SAXS）を使用してアッセイした。ＤＬＳは、ＯｐｄＡのカチオン化が、ＤＭＰＡ分子の表面残基への付加に対応する０．８ｎｍのサイズの増加をもたらすことを示す一方、ＣＤは、２次構造における微少変化を示すが、熱安定性において増加を示す（図１２）。ＳＡＸＳは、ＯｐｄＡがカチオン化後に２量体に保たれることを示した（図１３）。
【０１５６】
＜コンジュゲーション＞
界面活性剤のアニオンヘッド基の正荷電残基への静電グラフトにより、タンパク質表面電荷の減少がもたらされ、ゆえにゼータ電位が低下すると予想される。ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）は＋２２ｍＶのゼータ電位を有することが示される一方、［ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）］［Ｓ］は−０．５ｍＶであった。ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡは、ＣｓｈＡの高アニオン領域にもかかわらず＋１ｍＶのゼータ電位を有し、［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］は−１５ｍＶであった。ｃＯｐｄＡから［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］へは１３ｍＶの減少を示した（図１０）。
【０１５７】
界面活性剤コロナの付加に対応するサイズの増加も予想される。ＤＬＳは、それぞれｃＯｐｄＡ、ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ、及びｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）のコンジュゲートにおいて１．９ｎｍ、２ｎｍ、及び２．９ｎｍの流体力学的径の増加を示した。ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡは、クラスター形成のため、３８８ｎｍのサイズ増加を示した。ＳＶ−ＡＵＣは、４．１から４．８への［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］の沈降係数の増加を示し、界面活性剤結合を示唆する。
【０１５８】
重要な点は、界面活性剤コンジュゲーションが変性をもたらさなかったということである。ＣＤは、ＯｐｄＡ及びｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡ構築物の２次構造を評価するために使用した。［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］は、ＯｐｄＡ及びｃＯｐｄＡのそれぞれに対して２次構造の微少な変化を示し、ｃＯｐｄＡの向上した熱安定性を保持した（図１２）。ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡのコンジュゲーションは、熱安定性の増加をもたらす（図１４）。ＵＶ−可視分光光度法及び蛍光分光光度法により、フルオロフォアの構造が保持されることが確認された（図６）。
【０１５９】
＜細胞のロード＞
コンジュゲートシステムの膜への正常なロードは、顕微鏡法、分光光度法、フローサイトメトリー、反射率法、及び活性アッセイによって確認した。
【０１６０】
ｓｃＧＦＰ含有構築物はもともと蛍光性であるので、単純に蛍光顕微鏡観法を使用して可視化した。ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ、［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］、ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）、［ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）］［Ｓ］、ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡ、及び［ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡ］［Ｓ］刺激細胞はすべて蛍光性膜を示すが、コンジュゲート種は、非コンジュゲートタンパク質では約１５分に対してコンジュゲートタンパク質では２４時間を超えるという、より長い時間膜蛍光性を保持し、非コンジュゲートタンパク質が迅速にエンドサイトーシスを受けるが、コンジュゲートタンパク質は膜に留まるということを示唆する。
【０１６１】
トロンビン及びＯｐｄＡはそれぞれ、「顕微鏡法」の方法の項に記載されるようにイメージング前に蛍光性タグ付けをする必要がある。ｃＯｐｄＡは迅速に内部移行される一方、［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］は細胞膜に留まった。［ｃトロンビン］［Ｓ］は細胞膜において最大７日間観察された。天然ＯｐｄＡ及びトロンビンは細胞と相互作用しなかった。
【０１６２】
ＵＶ−可視分光光度法は、細胞膜に結合するタンパク質の量を測定するために使用することができる。１５分後に、約７億個のｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ複合体が１細胞につき結合する一方、１０億個の［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］複合体が１細胞につき結合した（図１５）。同様に、フローサイトメトリーは、ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡロード細胞に対して［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］ロード細胞において有意により大きい蛍光度を示した（図１６）。１細胞につき観察可能なｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡの量は、非コンジュゲートタンパク質の迅速なエンドサイトーシスにより、［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］の量と比較してより長い時間の後有意に減少する。
【０１６３】
中性子反射率法は、モデル膜への［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］の挿入を評価するために使用された。［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］は脂質二重層に挿入されることが示され、膜がコンジュゲートで飽和すると、膜の上方に層を形成する。ｃＯｐｄＡは、二重層を貫通して支持単層を崩壊させ、膜内に包埋されないことを示唆する。
【０１６４】
重要な点は、有意な細胞毒性が存在することなく細胞が各タンパク質構築物で処理可能であったということである。また、界面活性剤のグリコール酸エトキシレート４−ノニルフェニルエーテルをアッセイした。有意な細胞毒性より低いアッセイした最大ロード濃度を以下の表１２に示す。アスタリスクは、有意な細胞毒性が観察されなかったデータを示す。ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］のデータを図１７に示す。
【０１６５】
また、刺激細胞は迅速に増殖することが示された。［ｃトロンビン］［Ｓ］刺激細胞はＭＴＳアッセイによって２２日にわたって増殖することを示した（図１１）。ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］刺激細胞は、直接的な細胞カウントによって確認されるように、非刺激細胞と同じ速度で増殖し（図１８）、刺激成分（ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ又は［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］）で細胞を刺激するプロセスが細胞の増殖能力に影響を与えないということを示唆する。
【０１６６】
また、細胞の分化能は刺激による影響を受けなかった。脂肪生成又は骨形成培地で処理した［ｃトロンビン］［Ｓ］刺激細胞は、広視野顕微鏡法で観察されるように、２１日後、それぞれ特徴的な脂肪滴及び細胞外カルシウム沈着を示した。
【表１２】
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表１２は、コンジュゲートタンパク質の最大ロード濃度を示し、＊は有意な細胞毒性が観察されなかったことを示す。
【０１６７】
＜構築物の溶液活性＞
改変後、各タンパク質は活性を保持した。リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）及びサーモマイセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）のリパーゼによるＢｒｏｇａｎ等(Nat. Commun.(2014) October 10;5:5058)による以前の研究は、それぞれ、カチオン化後の基質ターンオーバー速度における９８％及び８５％の低下、さらにコンジュゲーション後の５５％及び４０％低下を報告しており、発明者等が活性を保持できたことは驚きである。活性を測定するために必要とされるアッセイは各タンパク質に特異的である。
【０１６８】
ＯｐｄＡ含有構築物は、パラオキソンの加水分解速度を測定することで活性をアッセイした。ｃＯｐｄＡのミカエリス−メンテンパラメータはＯｐｄＡのものと有意に相違しなかったが、［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］では、ＫＭは有意に減少し（25.0 ± 4.49 vs.45.6 ± 8.80 μM）、ｋｃａｔは有意に増加し（92.4 ± 3.63 vs.75.4 ± 3.68 s-1）、特異性係数において２．２倍の増加をもたらした（図１９）。ｓｃＧＦＰ−ＯｐｄＡは、３１μＭのＫＭ、１．９８ｓ−１のｋｃａｔを有することが示された。
【０１６９】
トロンビンの活性は、フィブリノゲン切断からのフィブリン形成に対応する６００ｎｍでの吸光度の測定によってアッセイされた。カチオン化時に、トロンビンの活性は最大１２０分のカチオン化まで保持されたが、図２０に示すように、活性はカチオン化時間の増大によって緩やかに低下する。
【０１７０】
ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー及び［ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー］［Ｓ］のｍＣｈｅｒｒｙ−スパイタグ又はＣｓｈＡ−スパイタグとのカップリングはＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してアッセイした。高分子量におけるバンドの出現は、スパイタグ構築物のそれぞれのコンジュゲート及び非コンジュゲートサンプルのそれぞれにおける、スパイタグ部分とスパイキャッチャー部分との間のイソペプチド結合の形成を示した。
【０１７１】
＜構築物の膜活性＞
細胞膜における［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］の活性は、顕微鏡法によって求められた。ＤＰＰＦに３０分間暴露した後、［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］で処理した細胞は、細胞膜において蛍光度の増大を示した。さらに、［ｃＯｐｄＡ］［Ｓ］で刺激したｈＭＳＣは、少なくとも５日にわたって非刺激細胞よりアセチルチオコリンをターンオーバーできた。
【０１７２】
細胞膜に結合する［ｃトロンビン］［Ｓ］は、Ａｌｅｘａ−５９４−タグ付きフィブリノゲンを使用して、共焦点顕微鏡法によって確認されるように、フィブリノゲンを切断してフィブリンゲルを形成することができた（図２１）。
【０１７３】
ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ、ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）、それらのそれぞれのコンジュゲートは、そのフィブロネクチン（scGFP-CshA及びscGFP-PlGF(123-144)）並びにコラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩ（scGFP-PlGF(123-144)）に結合するその能力についてアッセイした。ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ刺激細胞及び［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］刺激細胞は、非標識細胞より有意に大きい数でフィブロネクチン処理プレートに接着した（図２２）。４ｍＬ／ｍｉｎフローのもと、［ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）］［Ｓ］で刺激したｈＭＳＣは、広視野顕微鏡法によって観察されるように、非刺激ｈＭＳＣより有意に大きい数でコラーゲンＩＩに接着した。
【０１７４】
フローサイトメトリーは、ｓｃＧＦＰ−スパイキャッチャー又はその対応するコンジュゲートで刺激したｈＭＳＣが最大７２時間ｍＣｈｅｒｒｙ−スパイタグと共有結合を形成することができることを示した。
【０１７５】
［ｓｃＧＦＰ−ＰＩＧＦ（１２３−１４４）］［Ｓ］刺激ｈＭＳＣは、図２３に見受けられるように、非刺激ｈＭＳＣより大きい数で、外植したウシ関節軟骨に接着すると見られた。
【０１７６】
＜構築物のインビボ活性＞
［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］刺激ｈＭＳＣは、静脈内及び心臓内注射によりマウスに移植された。２時間、２４時間、及び４週後にマウスから心臓及び肺組織を採取した後、液滴デジタルＰＣＲを使用して各組織におけるｈＭＳＣの数を測定した。心臓における［ｓｃＧＦＰ−ＣｓｈＡ］［Ｓ］刺激ｈＭＳＣの組織：血漿分布係数は、２時間及び２４時間で非刺激ｈＭＳＣに対して２倍増加することを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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