(57)【要約】本開示は、新規のペプチドベースのワクチン、新規のペプチドベースのワクチンを製造する方法、および免疫応答、特にＴ細胞応答を誘導するためにペプチド抗原を被験体に送達するためのそれらの使用に関する。本発明者らは、現行のペプチドベースのワクチンアプローチの制約の少なくとも１つを克服するペプチドベースのワクチンを製造する新規組成物および方法を開発した。本明細書で開示される新規のペプチドベースのワクチン組成物および製造方法は、ペプチド抗原の物理的および化学的性質の可変性を考慮し、したがって、任意のペプチド抗原に対して一般化可能である。さらに、本明細書で開示される新規のペプチドベースのワクチン組成物は、被験体において免疫応答を誘導するために様々な異なるペプチド抗原の最適な送達を確保する。
2020515629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ペプチド抗原（Ａ）、
および
ｂ．疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）のどちらか
を含むペプチド抗原コンジュゲートであって、
前記ペプチド抗原（Ａ）が、前記疎水性分子（Ｈ）または前記粒子（Ｐ）のどちらかに、直接連結されているか、または前記ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結されている必要に応じたＮ末端伸長部（Ｂ１）または前記ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されている必要に応じたＣ末端伸長部（Ｂ２）を介して間接的に連結されており、必要に応じて、前記疎水性分子（Ｈ）または前記粒子（Ｐ）が、前記伸長部（Ｂ１またはＢ２）にリンカー（Ｌ）を介して間接的に連結されている、ペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２】
荷電分子（Ｃ）をさらに含む、請求項１に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３】
約７．４のｐＨの水性緩衝液中で約＋３より大きいかもしくは約＋３に等しい、または約−３未満であるかもしくは約−３に等しい正味静電荷を有する、請求項２に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項４】
前記荷電分子（Ｃ）、および前記疎水性分子（Ｈ）または前記粒子（Ｐ）のどちらかが、両方とも、前記ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端のどちらかに、直接、または必要に応じた前記Ｎ末端伸長部（Ｂ１）もしくは必要に応じた前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）を介して、それぞれ結合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項５】
前記荷電分子（Ｃ）、および前記疎水性分子（Ｈ）または前記粒子（Ｐ）のどちらかが、前記ペプチド抗原（Ａ）の両端に結合されている、請求項２および３のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項６】
（ｉ）前記荷電分子（Ｃ）が、前記ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に前記Ｎ末端伸長部（Ｂ１）によって結合されており、（ｉｉ）前記疎水性分子（Ｈ）または前記粒子（Ｐ）のどちらかが、前記ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）を介して結合されている、請求項５に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項７】
前記Ｎ末端伸長部（Ｂ１）が、アミノ酸ＰＮ１を含む酵素分解性ペプチド配列を含み、ＰＮ１が、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシン、またはメチオニンから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項８】
前記アミノ酸ＰＮ１を含む前記酵素分解性ペプチド配列が、以下：
ａ．グリシン、バリン、ロイシンもしくはイソロイシンから選択されるアミノ酸ＰＮ２、
ｂ．グリシン、セリン、プロリンもしくはロイシンから選択されるアミノ酸ＰＮ３、
ｃ．アルギニン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンもしくはセリンから選択されるアミノ酸ＰＮ４、または
ｄ．ａ〜ｃの組み合わせのいずれか
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項７に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項９】
前記酵素分解性ペプチド配列が、以下：
ａ．  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｂ．  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号４）；
ｃ．  Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｄ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｅ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；
ｆ．  Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号５）；
ｇ．  Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６）；
ｈ．  Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号２１）；
ｉ．  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）；
ｊ．  Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）；
ｋ．  Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｌ．  Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１０）；
ｍ．  Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；または
ｎ．  Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ
から選択されるテトラペプチドであって、ＧｌｕがＡｓｐで置き換えられていてもよい、および／またはＡｒｇがＬｙｓで置き換えられていてもよい、テトラペプチドを含む、請求項７または請求項８のどちらかに記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１０】
前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）が、以下：
ｉ．グリシン、セリン、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニンから選択される単一アミノ酸ＰＣ１’；
ｉｉ．ＰＣ１’が、グリシンもしくはセリンから選択され、ＰＣ２’が、グリシン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニンから選択される、ジペプチド；
ｉｉｉ．ＰＣ１’が、グリシンもしくはセリンから選択され、ＰＣ２’が、グリシン、セリンもしくはプロリンから選択され、ＰＣ３’が、グリシン、セリン、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニンから選択される、トリペプチド；
ｉｖ．ＰＣ１’が、グリシンもしくはセリンから選択され、ＰＣ２’が、グリシン、セリン、プロリンもしくはロイシンから選択され、ＰＣ３’が、グリシン、バリン、ロイシンもしくはイソロイシンから選択され、ＰＣ４’が、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニンから選択される、テトラペプチド；
ｖ．ＰＣ１’が、グリシンもしくはセリンから選択され、ＰＣ２’が、グリシン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸から選択され、ＰＣ３’が、グリシン、セリン、プロリンもしくはロイシンから選択され、ＰＣ４’が、グリシン、バリン、ロイシンもしくはイソロイシンから選択され、ＰＣ５’が、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニンから選択される、ペンタペプチド；または
ｖｉ．ＰＣ１’が、グリシンもしくはセリンから選択され、ＰＣ２’が、グリシン、セリンもしくはプロリンから選択され、ＰＣ３’が、グリシン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸から選択され、ＰＣ４’が、プロリンもしくはロイシンから選択され、ＰＣ５’が、グリシン、バリン、ロイシンもしくはイソロイシンから選択され、ＰＣ６’が、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニンから選択される、ヘキサペプチド
を含む酵素分解性ペプチド配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１１】
前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）が、
ａ．
ｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１１）；
ｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１３）；
ｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６１）；
ｉｖ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｖ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｖｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；
ｖｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１４）；
ｖｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１５）；
ｉｘ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１６）；
ｘ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ
から選択されるヘキサペプチドであって、ＧｌｕがＡｓｐで置き換えられていてもよい、および／もしくはＡｒｇがＬｙｓで置き換えられていてもよい、ヘキサペプチド；または
ｂ．
ｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１７）；
ｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；
ｉｖ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｖ．  Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｖｉ．  Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１８）；
ｖｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１９）；
ｖｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号２０）
から選択されるペンタペプチドであって、ＧｌｕがＡｓｐで置き換えられていてもよい、および／もしくはＡｒｇがＬｙｓで置き換えられていてもよい、ペンタペプチド；または
ｃ．
ｉ．  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｉｉ．  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号４）；
ｉｉｉ．  Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｉｖ．  Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；
ｖ．  Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号５）；
ｖｉ．  Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６）；
ｖｉｉ．  Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）；
ｖｉｉｉ．  Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）；
ｉｘ．  Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；
ｘ．  Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１０）；
ｘｉ．  Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ；または
ｘｉｉ．  Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ
から選択されるテトラペプチドであって、ＧｌｕがＡｓｐで置き換えられていてもよい、および／もしくはＡｒｇがＬｙｓで置き換えられていてもよい、テトラペプチド；または
ｄ．
ｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ；
ｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ；
ｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ；
ｉｖ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｉｔ；
ｖ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；
ｖｉ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ；
ｖｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ；
ｖｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ
から選択されるトリペプチド；または
ｅ．
ｉ．  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ；
ｉｉ．  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；
ｉｉｉ．  Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
ｉｖ．  Ｇｌｙ−Ｃｉｔ
から選択されるジペプチド；または
ｆ．Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ＧｌｎもしくはＮｌｅからなる群から選択される単一アミノ酸
を含む酵素分解性ペプチド配列を含む、請求項１０に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１２】
前記粒子（Ｐ）が、ポリスチレン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、リポソーム、アルミニウムの無機塩、またはエマルジョンを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１３】
前記疎水性分子（Ｈ）が、約７．４のｐＨの水性緩衝液に、下は約０．１ｍｇ／ｍＬに至るまで不溶性である、分岐した長鎖もしくは環式脂肪族分子、または脂肪酸、脂質もしくはステロール誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１４】
前記疎水性分子が、アクリレート、アクリルアミド、メタ（アクリレート）、メタ（アクリルアミド）、スチリルモノマー、ビニルモノマー、ジオキソホスホラン、環式エステル、天然もしくは非天然アミノ酸から選択されるモノマー単位に基づくポリマー、およびジオールもしくはジアミンとジイソシアネートもしくはポリイソシアネートとの反応から生じるポリマーを含み、必要に応じて、アジュバントが、前記ポリマーを構成する１つまたは複数のモノマーに連結されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１５】
前記疎水性分子（Ｈ）が、式Ｉ：
【化１１２】
2020515629.tif 000117
のポリ（アミノ酸）であり、式中、Ｒ２は、水素、ヒドロキシルまたはアミンのうちの１つから選択され、ｘは、３〜３００の間であり、ｙ３は、１〜８であり、リガンドは、任意の適する手段によってリンカーＸを介して結合されている、
請求項１４に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１６】
前記疎水性分子（Ｈ）が、式ＩＩ：
【化１１３】
2020515629.tif 000118
に基づくポリ（アミノ酸）であり、式中、ｌは、３〜３００の間であり、ｏは、０〜３００の間であり、Ｒ３は、水素、ヒドロキシルまたはアミンのうちの１つから選択され、Ｒ４は、水素、低級アルキル、
【化１１４】
2020515629.tif 000119
のうちの１つから選択され、ｙ１１は、通常は１〜８から選択され、ＦＧは、アジュバント特性を有するリガンドに連結されている、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、アミン、チオール、アジドまたはアルキンから選択される官能基であり、Ｎ末端は、アミド結合によって直接、またはリンカーによって間接的に、のどちらかで、前記ペプチド抗原に、直接、または前記伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）および／またはリンカー（Ｌ）または荷電分子（Ｃ）によってのどちらかで連結されている、
請求項１４に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１７】
前記疎水性分子（Ｈ）が、ポリ（ロイシン）、ポリ（トリプトファン）、ポリ（γ−グルタミルジエチレングリコールモノメチルエーテル）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）、ポリ［２（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］（ＤＥＧＭＡ）またはポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＨＰＭＡ）からなるホモポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１４に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１８】
式Ｉのポリ（アミノ酸）を含む前記疎水性分子（Ｈ）が、ポリ（ロイシン）、ポリ（トリプトファン）、ポリ（γ−グルタミルジエチレングリコールモノメチルエーテル）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）、ポリ［２（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］（ＤＥＧＭＡ）またはポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＨＰＭＡ）に基づく第２のポリマーに、グラフトされているか、または末端において連結されている、請求項１５に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項１９】
式ＩＩのポリ（アミノ酸）を含む前記疎水性分子（Ｈ）が、ポリ（ロイシン）、ポリ（トリプトファン）、ポリ（γ−グルタミルジエチレングリコールモノメチルエーテル）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）、ポリ［２（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］（ＤＥＧＭＡ）またはポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＨＰＭＡ）に基づく第２のポリマーに、グラフトされているか、または末端において連結されている、請求項１６に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２０】
前記第２のポリマーが、約３０〜５００モノマー単位の複数のモノマー単位を含む、請求項１８または請求項１９のどちらかに記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２１】
１つまたは複数のアジュバントが、前記疎水性分子（Ｈ）を構成する前記ポリマーに、ペンダント側鎖として連結されている、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２２】
１つまたは複数のアジュバントが、前記ポリマー（セミテレケリック）の一端に連結されている、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２３】
前記アジュバントが、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストのどちらかである、請求項２１または請求項２２のどちらかに記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２４】
前記Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストが、Ｔｏｌｌ様受容体−７および／または−８のアゴニストのどちらかである、請求項２３に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２５】
前記アジュバントが、式ＩＩＩ：
【化１１５】
2020515629.tif 000120
のイミダゾキノリンであり、式中、Ｒ７は、水素、必要に応じて置換されている低級アルキル、または必要に応じて置換されている低級エーテルのうちの１つから選択され、Ｒ８は、必要に応じて置換されているアリールアミン、または必要に応じて置換されている低級アルキルアミンのうちの１つから選択される、
請求項２４に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２６】
式ＩＩＩの３つまたはそれより多くのイミダゾキノリン分子が、前記疎水性分子（Ｈ）を構成する前記ポリマーに連結されており、Ｒ８が、必要に応じて置換されている低級アルキルアミンの１つから選択される、請求項２５に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２７】
式ＩＩＩの３つまたはそれ未満のイミダゾキノリン分子が、前記疎水性分子（Ｈ）を構成する前記ポリマーに連結されており、Ｒ８が、必要に応じて置換されているアリールアミンの１つから選択される、請求項２６に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２８】
前記粒子（Ｐ）または前記疎水性分子（Ｈ）が、約７．４のｐＨで約２０℃〜４０℃の間の温度の水性緩衝液に、下は０．１ｍｇ／ｍＬに至るまで不溶性である、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項２９】
約７．４のｐＨの水性緩衝液中で集合して、２つまたはそれより多くのペプチド抗原コンジュゲートを含むミセルまたは他のタイプのナノもしくはマイクロサイズの超分子会合体から構成される、５ｎｍより大きい直径の粒子を構築する、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３０】
約７．４のｐＨの水性緩衝液中で集合して約５〜２００ｎｍの間の直径のミセルを構築する、請求項２９に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３１】
約７．４のｐＨの水性緩衝液中で凝集体である、請求項２９に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３２】
リンカー前駆体Ｘ１が、前記ペプチド抗原（Ａ）に、直接、またはＣ末端伸長部（Ｂ２）によってのどちらかで、連結されており、前記疎水性分子（Ｈ）上または前記粒子（Ｐ）上どちらかのリンカー前駆体Ｘ２とリンクを形成する、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３３】
前記リンカー前駆体Ｘ１が、式：
【化１１６】
2020515629.tif 000121
を有し、式中、タグのＮ末端アミンは、ペプチド抗原（Ａ）に、直接、または前記Ｃ末端伸長部Ｂ２によってのどちらかで、連結されており；Ｒ１は、水素、ヒドロキシルまたはアミンのうちの１つから選択され；ｙ１は、１〜８の整数であり；ＦＧは、チオール、アミン、アジドまたはアルキン（もしくはＤＢＣＯ）のうちの１つから選択される、
請求項３２に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３４】
前記ＦＧが、アジドであり、ｙ１が、４であり、さらに、前記アジドが、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）と連結されているＤＢＣＯ分子に連結している、請求項３３に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３５】
リンカー前駆体Ｘ１が、前記Ｎ末端伸長部（Ｂ１）に連結されており、かつ式：
【化１１７】
2020515629.tif 000122
を有し、式中、タグのカルボニルは、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に、直接、またはＢ１伸長部を介してのどちらかで連結されており；ｙ２は、１〜８の整数であり；ＦＧは、チオール、アミン、アジドまたはアルキン（もしくはＤＢＣＯ）のうちの１つから選択される、
請求項１〜３２のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３６】
前記ペプチド抗原（Ｐ）、必要に応じた前記Ｎ末端伸長部（Ｂ１）、必要に応じた前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）および必要に応じた前記荷電分子（Ｃ）および必要に応じた前記リンカー前駆体Ｘ１が、固相ペプチド合成により単一ペプチドとして合成され、前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）が、プロリン（または固相ペプチド合成中、配列が、ペプチドを合成するために使用される樹脂に結合されている間は、プソイドプロリン）を含有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３７】
前記荷電分子（Ｃ）が、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミン、グアニジニウム、イミダゾリウム、アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ホスホルアミデートまたはホスホネートから選択される１つまたは複数の官能基を含む、請求項２〜３６のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３８】
前記荷電分子（Ｃ）が、負荷電官能基と正荷電官能基の両方を含む、請求項３７に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項３９】
前記荷電分子（Ｃ）を構成する荷電官能基の数が、以下：
ａ．前記ペプチド抗原（Ａ）が、約０．７５より大きいかもしくは約０．７５に等しい総平均ハイドロパシー値を有する場合、前記ペプチド抗原コンジュゲートの前記正味静電荷が、約＋６より大きいかもしくは約＋６に等しい正の値を含むように；
ｂ．前記ペプチド抗原（Ａ）が、約０．２５より大きいかもしくは約０．２５に等しく、かつ約０．７５未満である総平均ハイドロパシー値を有する場合、前記ペプチド抗原コンジュゲートの前記正味静電荷が、約＋５より大きいかもしくは約＋５に等しい正の値を含むように；
ｃ．前記ペプチド抗原（Ａ）が、約０．２５未満である総平均ハイドロパシー値を有する場合、前記ペプチド抗原コンジュゲートの前記正味静電荷が、約＋４より大きいかもしくは約＋４に等しい正の値を含むように；
ｄ．前記ペプチド抗原（Ａ）が、約０．７５より大きいかもしくは約０．７５に等しい総平均ハイドロパシー値を有する場合、前記ペプチド抗原コンジュゲートの前記正味静電荷が、約−６未満であるかもしくは約−６に等しい負の値を含むように；
ｅ．前記ペプチド抗原（Ａ）が、約０．２５より大きいかもしくは約０．２５に等しく、かつ約０．７５未満である総平均ハイドロパシー値を有する場合、前記ペプチド抗原コンジュゲートの前記正味静電荷が、約−５未満であるかもしくは約−５に等しい負の値を含むように；または
ｆ．前記ペプチド抗原（Ａ）が、約０．２５未満である総平均ハイドロパシー値を有する場合、前記ペプチド抗原コンジュゲートの前記正味静電荷が、約−４より大きいかもしくは約−４に等しい正の値を含むように、
調整される、請求項２〜３８のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項４０】
前記ペプチド抗原（Ａ）、前記Ｎ末端伸長部（Ｂ１）、前記Ｃ末端伸長部（Ｂ２）、前記荷電分子（Ｃ）および前記リンカー前駆体Ｘ１が、約７．４のｐＨの水性緩衝液に最大約１．０ｍｇ／ｍＬに至るまで可溶性である単一ペプチドとして生成される、請求項３９に記載のペプチド抗原コンジュゲート。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲートを含む、粒子。
【請求項４２】
複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む、請求項４１に記載の粒子。
【請求項４３】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲートまたは請求項４１〜４２に記載の粒子を含む、免疫原性組成物。
【請求項４４】
ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む、請求項４３または請求項４４のどちらかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記ペプチド抗原（Ａ）が、腫瘍関連抗原を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート、請求項４１および４２のいずれか一項に記載の粒子、または請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記腫瘍関連抗原が、ネオ抗原である、請求項４６に記載のペプチド抗原コンジュゲート、請求項４６に記載の粒子、または請求項４６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
前記ペプチド抗原（Ａ）が、最小ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞エピトープである、請求項１〜４０および４６〜４７のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート、請求項４１〜４２および４６〜４７のいずれか一項に記載の粒子、または請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
最小ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ、または最小ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ両方から選択されるペプチド抗原（Ａ）から構成される１０〜５０の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
最小ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープ、最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ、または最小ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ両方と、ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープおよび／またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含む１５〜３５アミノ酸合成長鎖ペプチドとの両方から選択されるペプチド抗原（Ａ）から構成される１０〜５０の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
前記最小ＣＤ８  Ｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープが、被験体に適合するＭＨＣ分子についてＩＥＤＢコンセンサスアルゴリズムにより０．５パーセンタイル未満であるかまたは０．５パーセンタイルに等しい予測結合親和性を有する、請求項４８に記載のペプチド抗原コンジュゲート、請求項４８に記載の粒子、または請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
前記ペプチド抗原（Ａ）が普遍的ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープである、ペプチド抗原コンジュゲートをさらに含む、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
疾患に罹患している患者を処置する方法であって、前記疾患に罹患している前記患者に、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲートまたは免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５４】
免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体；腫瘍浸潤リンパ球およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞ベースの治療；二重特異性抗体；抗腫瘍抗体；または免疫抑制を克服するために設計された薬物を含む、追加の免疫治療モダリティを投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物またはペプチド抗原コンジュゲートが、異種ワクチンとともにプライムまたはブーストのどちらかとして使用される、異種免疫化スキームを含む、請求項５３または請求項５４のどちらかに記載の方法。
【請求項５６】
処置が、放射線療法、化学療法または外科手術と組み合わせて使用される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
疾患の処置のための医薬品の製造における、請求項１〜５２のいずれか一項に記載のペプチド抗原コンジュゲート、粒子または免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権書類
本出願は、２０１７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８１，４３２号および２０１８年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／６１７，５１９号（ともに表題は、「ＰＥＰＴＩＤＥ−ＢＡＳＥＤ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＡＮ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ」であり、両方の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、米国保健福祉省、国立衛生研究所との共同研究開発契約を履行することで生じたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、新規のペプチドベースのワクチン、新規のペプチドベースのワクチンを製造する方法、および免疫応答、特に、被験体におけるＴ細胞応答を誘導するためのそれらの使用に関する。本開示のペプチドベースのワクチンの実施形態は、感染性疾患およびがんの予防または処置に使用することができ、ならびに自己免疫およびアレルギーを予防または処置するための寛容の誘導または免疫の調節に使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
抗原の免疫原性組成物を含むワクチンは、がんもしくは感染性疾患の処置もしくは予防のための免疫応答の誘導を含む、被験体における免疫応答の誘導に使用することができ、またはさらには自己免疫もしくはアレルギーの処置もしくは予防のための寛容および／もしくは免疫抑制の誘導に使用することができる。がんおよび感染性疾患の処置または予防のために免疫応答を誘導するためのワクチンの組成物は、ウイルス感染細胞またはがん性細胞の病原体排除または死滅を媒介する抗原と、その抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答および／または抗体を誘導する特定のタイプのアジュバントとを含有する。対照的に、免疫寛容原性または抑制性応答を誘導するワクチンの組成物は、抗原、およびビヒクル（例えば、粒子担体などの送達系）、および／または免疫抑制化合物、例えばｍＴＯＲ阻害剤を含有しうるが、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する特異的アジュバントを欠くことになり、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するのではなく、応答の質的特性をダウンレギュレートするまたは調節する、Ｔ細胞寛容または調節性Ｔ細胞などの調節性細胞の活性化を誘導しうる。
【０００５】
患者の遺伝的バックグラウンド、特に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子の組成、および環境が、がん、感染性疾患、自己免疫およびアレルギーに対する彼らの感受性に影響を与えうることはもちろん、そのような状態を処置するために使用されるワクチンに対する彼らの応答にも影響を及ぼしうるという認識が増している。疾患の分子的基礎の理解をもたらす新たな診断およびインフォマティクス法の継続的開発により、患者特異的情報がますます入手しやすくなってきた。それ故、がん、感染性疾患、自己免疫およびアレルギーを処置または予防するためのワクチンを含む特定の免疫療法の選択を含む、個体が受ける医療を方向付けるために、個体の遺伝子、タンパク質および環境についての情報を使用することへの関心が高まってきている。
【０００６】
がん療法では、個体の腫瘍についての特定の情報を使用して、診断を助けること、処置を計画すること、治療の効果を調べること、または予後予測を行うことができる。例えば、個体の遺伝子、タンパク質および環境についての特定の情報を使用して、その情報に基づいてワクチンを開発することにより、がんの処置に合せて予防的アプローチを調整することができる。ある特定のがんの免疫学的処置または予防に使用されるワクチンは、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導しなくてはならない。１つの好ましい免疫応答は、腫瘍関連抗原を認識するＣＤ８  Ｔ細胞応答および／またはＣＤ４  Ｔ細胞応答である。
【０００７】
同様に、自己免疫またはアレルギーを処置するための個別化アプローチは、免疫が媒介する病態の原因である特異的な自己抗原または外来抗原の同定によって、それぞれ、可能である。公知であり、患者共通である自己抗原およびアレルゲンもあるが、患者特異的でありうる自己抗原およびアレルゲンもあり、したがって、これらの患者の処置は、これらの患者に合せて調整しなければならない。病態の原因として同定された抗原を、自己抗原（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）（すなわち、自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ））に対する寛容を誘導することができるワクチンとして、ペプチドの形態で投与することができる。あるいは、アレルギーに対して生じる外来抗原に対する免疫応答は、病態をもたらす特定の免疫応答型のものであることもある。したがって、そのような外来抗原に対するワクチンを、ペプチドベースのワクチンとして提供して、免疫応答を、病態をもたらさない質的に明確に異なる免疫応答型にシフトさせることができる。
【０００８】
がんの処置または予防におけるＴ細胞の役割
養子Ｔ細胞療法および免疫チェックポイント阻害剤に基づく免疫療法を使用して示されているように、Ｔ細胞が腫瘍退縮を媒介し、患者の生存を改善することは公知である。ヒトにおけるいくつかの研究により、単一の腫瘍関連抗原を認識する大量の増殖ＣＤ８および／またはＣＤ４  Ｔ細胞の静脈内注入は、腫瘍退縮を媒介し、生存を改善することができることが示されている（参照：Ｅ．  Ｔｒａｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７５巻：２２５５〜２２６２頁、２０１６年；およびＥ．  Ｔｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４巻：６４１〜６４５頁、２０１４年）。加えて、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を遮断するモノクローナル抗体（いわゆる「チェックポイント阻害剤」）などの、Ｔ細胞抑制を遮断するまたは逆転させる薬物での、ある特定のがんの処置は、腫瘍を退縮させ、全生存を改善する結果となる（参照：Ｄ．  Ｍ．  Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、１２巻：２５２〜２６４頁、２０１２年；Ｆ．  Ｓ．  Ｈｏｄｉら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６３巻：７１１〜７２３頁、２０１０年；およびＭ．  Ｒｅｃｋら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３７５巻：１８２３〜１８３３頁、２０１６年；Ｊ．  Ｅ．  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３８７巻：１９０９〜１９２０頁、２０１６年）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１がＴ細胞上に発現され、ＰＤ−Ｌ１が腫瘍における細胞上に発現される、受容体−リガンドペアである。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用は、それがなければ、Ｔ細胞により認識された腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の成長の緩徐化または消失をもたらすことになるそれらのエフェクター機能をＴ細胞が実行するのを阻止する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をモノクローナル抗体で遮断すると、抑制シグナルが停止し、それによって、Ｔ細胞が解き放たれてエフェクター機能を実行し、その結果、腫瘍細胞成長が緩徐化されるかまたは腫瘍細胞が死滅することになる（Ｄ．  Ｍ．  Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、１２巻：２５２〜２６４頁、２０１２年）。
【０００９】
患者において腫瘍排除を促進することにおけるＴ細胞の役割は、処置開始時に腫瘍生検試料中に存在するＴ細胞浸潤レベルが高い患者ほどチェックポイント阻害剤の有効性が高い（死亡率が低い）ことを示す、ヒトにおける研究によって裏付けられる（参照：Ｊ．  Ｅ．  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３８７巻：１９０９〜１９２０頁、２０１６年）。さらに、腫瘍の変異レベルが高い患者ほど、チェックポイント阻害剤の有効性が高いことも示されており（参照：Ａ．  Ｓｎｙｄｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７１巻、２１８９〜２１９９頁２０１４年；およびＮ．  Ａ．  Ｒｉｚｖｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：１２４〜１２８頁、２０１５年）、恐らくこれは、変異数が増加すると、変異体タンパク質がより多くなり、その結果、Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識してそれらを消失の標的とすることができる、より多数の潜在的標的が供給されるためである。
【００１０】
しかし、大きな課題は、蔓延している多くの腫瘍（例えば、前立腺がん、乳がんおよび膵がん）の変異荷重が低いこと（参照：Ｔ．  Ｎ．  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、Ｒ．  Ｄ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：６９〜７４頁、２０１５年）、およびこれらのがんを有する患者が、チェックポイント阻害剤からの恩恵をほとんどまたは全く得られないことである。さらに、変異荷重が高い腫瘍の間ですら、被験体の大多数に、免疫療法が効果を媒介するために必要とされる必須の既存腫瘍特異的Ｔ細胞応答が欠如しているため、患者の小集団しかチェックポイント阻害剤治療からの恩恵を受けない。
【００１１】
がんの処置または予防のための腫瘍関連抗原を標的とするワクチン
がんの処置または予防のために免疫応答、特にＴ細胞応答を生成するには、適する腫瘍関連抗原の同定が必要である。腫瘍関連抗原には、ある特定の健常細胞上に存在するが腫瘍細胞によって優先的に発現される、自己抗原；発癌性微生物病原体からの、病原体由来抗原；および／または腫瘍細胞に特異的であり、常にではないが多くの場合、個々の患者に特有である異常タンパク質であるネオ抗原が含まれる。
【００１２】
適する自己抗原は、出産後の被験体にはもはや発現されないタンパク質に由来する抗原でありうる。例えば、適する自己抗原としては、腫瘍細胞により優先的に発現される抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３を挙げることができる（参照：Ｎ．  Ｎ．  Ｈｕｎｄｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５８巻：２６９８〜２７０３頁、２００８年）。あるいは、自己抗原としては、健常組織に発現される抗原であって、その健常組織に対するＴ細胞応答が、患者にとって過度に有害でない抗原、例えば、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を挙げることができる（参照：Ｐ．  Ｗ．  Ｋａｎｔｏｆｆら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３巻：４１１〜４２２頁、２０１０年）。
【００１３】
腫瘍関連抗原は、新生物性過程の基礎をなす駆動因子であるウイルスまたは他の病原体などの病原体由来抗原、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からのタンパク質でありうる（参照：Ｇ．  Ｇ．  Ｋｅｎｔｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６１巻：１８３８〜１８４７頁、２００９年）。
【００１４】
ネオ抗原は、腫瘍細胞にのみ存在し、正常細胞には存在しない変異の結果である抗原である（参照：Ｔ．  Ｎ．  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、Ｒ．  Ｄ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：６９〜７４頁、２０１５年）。ネオ抗原は、非保存的アミノ酸変化をもたらすヌクレオチド多型によって作出されることがある。ネオ抗原は、挿入または欠失またはフレームシフト変異を含有するペプチド抗原を生じさせる原因となりうる挿入および／または欠失によって作出されることもある。ネオ抗原は、終止コドンの導入によって作出されることもあり、この終止コドンは、その新たな状況では終止コドン機構により認識されず、その結果、リボソームはそのコドンをスキップし、単一アミノ酸欠失を含有するペプチドを生成することになる。ネオ抗原は、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写物を生じさせる結果となる、スプライシング部位での変異によって作出されることもある。ネオ抗原は、融合タンパク質を生じさせる結果となる、逆位および／または染色体転座によって作出されることもある。
【００１５】
最後に、腫瘍関連抗原は、変異していないペプチドまたは変異体ペプチドの新規翻訳後修飾であって、正常組織には存在しない翻訳後修飾を含有することもある。
【００１６】
まとめると、腫瘍関連抗原は、新生物性細胞により産生される任意の抗原であって、Ｔ細胞応答による標的化時に、理想的には、腫瘍成長の有意義な退縮をもたらすかまたは腫瘍形成を防止し、健常な非がん性細胞に対して制限された効果を有する抗原である。
【００１７】
ワクチン分野が直面している課題
ある特定のがんの処置に好ましい免疫応答は、腫瘍関連抗原を認識するＣＤ８  Ｔ細胞応答（参照：Ｅ．  Ｔｒａｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７５巻：２２５５〜２２６２頁、２０１６年）および／またはＣＤ４  Ｔ細胞応答（ならびに参照：  Ｅ．  Ｔｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４巻：６４１〜６４５頁、２０１４年；およびＮ．  Ｎ．  Ｈｕｎｄｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５８巻：２６９８〜２７０３頁、２００８年）であって、優先的に維持されうる、大規模でありうる、かつ高度に機能しうる（高品質）ＣＤ８  Ｔ細胞応答および／またはＣＤ４  Ｔ細胞応答である（Ｌ．  Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７巻：１２９０〜１２９７頁、２０１１年）。
【００１８】
被験体において抗原、例えば腫瘍関連抗原、に対するＴ細胞応答を誘導する１つの手段は、ワクチン接種による手段である。ＤＮＡ／ＲＮＡベースの、ウイルスベクターベースの、およびペプチドベースのアプローチを含む、腫瘍関連抗原に対するＣＤ８および／またはＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導するための非常に多くのアプローチが、現在研究されている（例えば、参照：Ｌ．  Ｍ．  Ｋｒａｎｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ５３４巻、３９６〜４０１頁、２０１６年；およびＣ．  Ｊ．  Ｍｅｌｉｅｆ、Ｓ．  Ｈ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８巻：３５１〜３６０頁、２００８年）。しかし、がんに対する有効なＴ細胞免疫を生じさせるための大きな課題は、ほとんどの現行のワクチンアプローチが、ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を惹起するには弱い免疫原性、およびほとんどの予測ネオ抗原に対する応答の限定された抗原性の幅によって制約されることである（参照：Ｓ．  Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ５２０巻、６９２〜６９６頁、２０１５年）。
【００１９】
抗腫瘍Ｔ細胞免疫を誘導するための多くの努力が、異なる免疫刺激剤および／またはビヒクル（アジュバント）と単に混合された合成ペプチド抗原の使用（参照：Ｃ．  Ｊ．  Ｍｅｌｉｅｆ、Ｓ．  Ｈ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８巻：３５１〜３６０頁、２００８年；およびＭ．  Ｓ．  Ｂｉｊｋｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８巻、１０３３〜１０４２頁、２００８年）またはＲＮＡ（参照：Ｋｒａｎｚ  ＬＭら、Ｎａｔｕｒｅ  ５３４巻（７６０７号）：３９６〜４０１頁、２０１６年およびＫｒｅｉｔｅｒ  Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ５２０巻（７５４９号）：６９２〜６９６頁、２０１５年）のどちらかに集中している。
【００２０】
しかし、がんに対する有効なＴ細胞免疫を生じさせるための大きな課題は、ペプチド抗原またはＲＮＡに基づくほとんどの現行のワクチンアプローチが、ネオ抗原を含む腫瘍関連抗原に対する応答の小さな規模および限定された抗原性の幅によって阻まれてきたことである。例えば、抗原性の幅に関しては、ペプチド抗原に基づく（例えば、２５アミノ酸合成長鎖ペプチドをアジュバントポリＩＣ：ＬＣと混合する）またはＲＮＡに基づく現行の標準ペプチドベースのワクチンアプローチは、予測ネオ抗原の１０％未満に対してＴ細胞応答を誘導する（参照：Ｓ．  Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ５２０巻、６９２〜６９６頁、２０１５年）。それ故、向上したワクチンアプローチ、特に、ペプチドベースのワクチンアプローチが、必要である。
【００２１】
現代のワクチン技術によるＴ細胞応答の小さな規模および乏しい抗原性の幅についての十分な説明は、依然として不確定であり、それ故、継続している課題は、がんの処置および予防のために、ならびに感染性疾患の処置および予防を含む他の適用のために、Ｔ細胞免疫の確実なプライミングを確保するためのペプチド抗原の送達についての最適なパラメーターをめぐって目下一致した見解がないことである。同様に、抑制および寛容を誘導するためのペプチドベースのワクチンについての最適なパラメーターも、依然として不明である。
【００２２】
ペプチドベースのＴ細胞ワクチンをめぐる現行の課題
感染性疾患およびがんの処置または予防のためのワクチンの開発にとっての大きな課題は、ほとんどの抗原に対して大規模Ｔ細胞免疫を確実に惹起するためのペプチドベースのワクチンを構築するのに最良の方法に関して目下一致した見解がないことである。同様に、免疫寛容を誘導するための、または免疫応答を、アレルギーを誘導するものから無害な型の応答にシフトさせるための、ペプチドベースのワクチンを構築するのに最良な方法に関して、一致した見解がない。例えば、がんおよび感染性疾患の処置または予防のためにならびに自己免疫およびアレルギーの処置または予防のために最適なＴ細胞免疫を誘導するのに必要な、最適なペプチド抗原長、ペプチド抗原送達の物理的形式（例えば、可溶性対微粒子）および自然免疫刺激のタイプ（例えば、アジュバント選択）については、いまだに相当な議論が交わされている。実際、免疫応答に対する、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞エピトープに隣接するアミノ酸、使用されるリンカー化学、電荷などの影響を含む、ペプチドベースのワクチンの多くのパラメーターの影響は、依然としてほとんど明らかになっていない。この問題は、個別化ワクチンアプローチを各患者に合せて独特に調整しなければならないことを考えると、特に顕著であり、それ故、免疫、特に、患者特異的抗原に対するＴ細胞免疫を確実に惹起するための普遍的なペプチドベースのワクチンアプローチが必要である。
【００２３】
現行のペプチドベースのワクチンアプローチが直面しているもう１つの大きな課題は、それらのアプローチが、ペプチド抗原の可能性のある幅広い物理的および化学的特性を考慮しないことである。例えば、個人別がんワクチンアプローチには、各患者から、可能性のある幅広い物理的および化学的特性を有しうる特有のセットのペプチド抗原を生成することが必要となる。自己免疫に関しては、複数の異なる抗原が、病態の原因として同定されうる。したがって、寛容誘導ワクチンは、各患者に特有である１セットのペプチド抗原を含有しなければならない。問題は、ペプチド抗原組成の可変性が、２５アミノ酸長のまたはそれより長いペプチドベースの抗原の約１０〜３０％であると推定される、ネイティブペプチド抗原として製造することが困難または不可能である一部のペプチドベースの抗原をもたらしうることである。それ故、ネイティブペプチド抗原を効率的に生成することも、合成後に単離することもできないため、多くの抗原は、現行のワクチンアプローチによって標的化することができない。加えて、現行のペプチドベースのワクチンアプローチでは制御されない、電荷および溶解度に影響を及ぼすペプチド抗原組成の可変性は、ペプチドの物質負荷を含む、ワクチン製剤の様々な特質に影響を及ぼすことがあり、および／またはペプチド抗原と他のペプチド抗原もしくはワクチンの他の成分のどちらかとの有害な相互作用をもたらすこともある。
したがって、現行のペプチドベースのワクチンアプローチの制約を克服するために、（ｉ）ワクチン製剤中ばかりでなく製造中のペプチド抗原の物理的および化学的性質の可変性も考慮する、ペプチドベースのワクチンを製造する新規組成物および方法であって、（ｉｉ）ほとんどの抗原に対する免疫応答、特に、被験体におけるＴ細胞応答を確実に誘導するためのペプチド抗原の最適な送達を確保するための新規組成物および方法が、必要とされている。ペプチド抗原可変性を考慮する、したがって、任意のペプチド抗原に対して一般化可能である、そのようなワクチンおよび方法は、個別化がんワクチンに使用されるペプチド抗原の特性が患者によって変わりうる個別化がん処置の分野において、特に有用であろう。しかし、任意のペプチド抗原に対するペプチドベースのワクチン組成物の適用可能性は、これらの組成物を、他の個別化された免疫学ベースの処置において、例えば、自己免疫およびアレルギーの処置のための寛容の誘導にまたはアレルゲンに対する免疫応答の調節に、それぞれ、使用することもできるということである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｃ．Ｊ．Ｍｅｌｉｅｆ、Ｓ．Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００８年）８巻：３５１〜３６０頁
【非特許文献２】Ｍ．Ｓ．Ｂｉｊｋｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８年）３８巻、１０３３〜１０４２頁
【非特許文献３】Ｋｒａｎｚ  ＬＭら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１６年）５３４巻（７６０７号）：３９６〜４０１頁
【非特許文献４】Ｋｒｅｉｔｅｒ  Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１５年）５２０巻（７５４９号）：６９２〜６９６頁
【非特許文献５】Ｓ．Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１５年）５２０巻、６９２〜６９６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、現行のペプチドベースのワクチンアプローチの制約の少なくとも１つを克服するペプチドベースのワクチンを製造する新規組成物および方法を開発した。本明細書で開示される新規のペプチドベースのワクチン組成物および製造方法は、ペプチド抗原の物理的および化学的性質の可変性を考慮し、したがって、任意のペプチド抗原に対して一般化可能である。さらに、本明細書で開示される新規のペプチドベースのワクチン組成物は、被験体において免疫応答を誘導するために様々な異なるペプチド抗原の最適な送達を確保する。
【００２６】
本明細書で開示される新規組成物は、ペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。ペプチド抗原コンジュゲートは、粒子を形成する疎水性分子（Ｈ）または予め形成された粒子（Ｐ）のどちらかに、直接、あるいは必要に応じたリンカー（Ｌ）および／またはペプチド抗原のＮもしくはＣ末端のどちらかにそれぞれ連結されている必要に応じたＮもしくはＣ末端伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結されているペプチド抗原（Ａ）を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子は、必要に応じた荷電分子（Ｃ）をさらに含む。一部の実施形態では、荷電分子は、水性条件で粒子を安定させるためにペプチド抗原コンジュゲートに連結される。他の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、別の分子上に備えられており、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子に組み込まれる。
【００２８】
ある特定のＮ末端および／もしくはＣ末端伸長部（Ｂ１および／もしくはＢ２）ならびに／または荷電分子（Ｃ）の付加は、固相合成によるペプチドベースのワクチンの製造の予想外の向上をもたらし、ならびに有機溶媒溶解度向上によって精製の容易さの向上をもたらし、ならびにペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性に対する制御の予想外の向上をもたらす。これらの組成物は、Ｔ細胞免疫および腫瘍排除の予想外の向上、特に、腫瘍関連抗原に対して生成されるＴ細胞の規模および幅についての予想外の向上を示す。
【００２９】
本開示の実施形態は、ペプチド抗原（Ａ）、および疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）のどちらかを含むペプチド抗原コンジュゲートであって、ペプチド抗原（Ａ）が、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）のどちらかに、直接連結されているか、またはペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結されているＮ末端伸長部（Ｂ１）もしくはペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されているＣ末端伸長部（Ｂ２）を介して間接的に連結されている、ペプチド抗原コンジュゲートを含む。本開示のさらなる実施形態は、ペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む。本開示のなおさらなる実施形態は、疾患に罹患している患者を処置する方法であって、疾患に罹患している患者に、そのペプチド抗原コンジュゲート、または免疫原性組成物を投与することを含む方法を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、がん処置に使用されるワクチンは、単独で使用することができ、または化学療法、チェックポイント阻害剤、放射線照射、およびがんと闘うために使用される任意の他の技術をこれらに限定されないが含む、他の免疫療法およびかん処置モダリティと組み合わせて使用することができる。
【００３１】
したがって、疾患に罹患している患者を処置する方法であって、疾患に罹患している患者に、本開示のペプチド抗原コンジュゲートまたは免疫原性組成物を投与することを含む方法も、本明細書で開示する。
【００３２】
さらに、疾患の処置のための医薬品の製造における本開示のペプチド抗原コンジュゲートまたは免疫原性組成物の使用を、本明細書で開示する。
【００３３】
本明細書で開示する予想外の発見は、以下に関係する：
（ｉ）Ｔ細胞免疫の確実なプライミングを確保するためにがんワクチンにおいて使用されるペプチド抗原（Ａ）の最適な長さ；
（ｉｉ）ペプチドベースのワクチンの製造を助長する、ペプチド抗原伸長配列、すなわちＮ末端もしくはＣ末端伸長部（Ｂ１および／もしくはＢ２）、ならびに／または必要に応じた荷電分子（Ｃ）の使用；
（ｉｉｉ）ペプチド抗原コンジュゲートを構成する疎水性分子（Ｈ）の特性が、製造性ならびに粒子のサイズおよび安定性に対してどのような影響を及ぼすのか、およびこれらのパラメーターが生物活性に対してどのような影響を及ぼすのか；
（ｉｖ）Ｔ細胞免疫の促進に最適なサイズの粒子を誘導するおよび安定させるために必要な、荷電分子（Ｃ）の組成およびペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷；
（ｖ）ペプチド抗原コンジュゲートの状況内において送達される最小エピトープの効率的プロセシングを促進する酵素分解性ペプチド配列の組成；および／または
（ｖｉ）ペプチド抗原コンジュゲートで送達される、アジュバント特性を有するリガンド（例えば、ＰＲＲアゴニスト）の作用強度および質的特性が、Ｔ細胞応答の幅、規模および質にどのような影響を及ぼすのか。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ペプチド抗原コンジュゲートのある特定の実施形態の略画概要図である。
【００３５】
【図２】図２は、アジドを有するリンカー前駆体Ｘ１を含むペプチド抗原断片と、ＤＢＣＯを有するリンカー前駆体Ｘ２とを反応させて、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）に連結させるトリアゾールリンカー（Ｌ）を形成することによる、ペプチド抗原コンジュゲートの合成についての一般スキームの図である。
【００３６】
【図３】図３は、化合物１の合成についての概要図である。
【００３７】
【図４】図４は、ＭＣ３８腫瘍細胞株に由来する合成長鎖ペプチド（ＳＬＰもしくは「ＬＰ」）または最小（「Ｍｉｎ」）ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープのどちらかから構成される、ペプチド抗原（Ａ）についての、およびペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートについての、分子量および流体力学的挙動の図である。ＬＰから構成されるペプチド抗原（Ａ）をリンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に連結させ、このリンカー前駆体Ｘ１を未連結のままにしたか、またはＤＢＣＯ−Ｗ３もしくはＤＢＣＯ−２ＢＸｙ３のどちらかから構成される疎水性分子（Ｈ）に連結させた。ＬＰから構成されるペプチド抗原（Ａ）を伸長部（Ｂ１）に連結させ、この伸長部（Ｂ１）をリンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に連結させ、このリンカー前駆体Ｘ１を未連結のままにしたか、またはＤＢＣＯ−Ｗ３もしくはＤＢＣＯ−２ＢＸｙ３のどちらかから構成される疎水性分子（Ｈ）に連結させた。
【００３８】
【図５】図５は、ペプチドベースのネオ抗原（Ｉｒｇｑ）の免疫原性に対する、ペプチド抗原（Ａ）の長さ、流体力学的挙動、およびＴＬＲ−７／８アゴニスト（ＴＬＲ−７／８ａ）の共送達の影響の図である。ＭＣ３８腫瘍細胞株に由来する抗原Ｉｒｇｑの合成長鎖ペプチド（ＬＰ、「ＳＬＰ」と呼ばれることもある）または最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ｍｉｎ、ＭＥと呼ばれることもある）のどちらかに基づくペプチド抗原（Ａ）を、ＴＬＲ−７／８ａアジュバントと混合された単独のペプチド抗原（Ａ）として、疎水性分子（Ｈ）であるＷ３に連結され、ＴＬＲ−７／８ａアジュバントと混合された、ペプチド抗原（Ａ）として、またはＴＬＲ−７／８ａアジュバントである２ＢＸｙ３を共送達する疎水性分子（Ｈ）に連結されたペプチド抗原（Ａ）としてのいずれかで含む、異なる免疫原性組成物を用いて、マウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化した。０および１４日目にマウスに免疫化し、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対する％ＩＦＮｇ＋）を０および２５日目に全血から評価した。白抜きの丸は、ペプチド抗原（Ａ）が可溶性（すなわち、非微粒子状）であったことを示し、これに対して黒塗りの丸は、マウスにペプチド抗原（Ａ）の微粒子免疫原性組成物を施したことを示す。
【００３９】
【図６】図６は、ペプチドベースのネオ抗原（Ｃｐｎｅ１）の免疫原性に対する、ペプチド抗原（Ａ）の長さ、流体力学的挙動、およびＴＬＲ−７／８ａアジュバントの共送達の影響の図である。合成長鎖ペプチド（ＬＰ）またはＭＣ３８腫瘍細胞株に由来する抗原Ｃｐｎｅ１の最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ｍｉｎ）のどちらかに基づくペプチド抗原（Ａ）を、ＴＬＲ−７／８ａアジュバントと混合された単独のペプチド抗原（Ａ）として、疎水性分子（Ｈ）であるＷ３に連結され、ＴＬＲ−７／８ａアジュバントと混合された、ペプチド抗原（Ａ）として、またはＴＬＲ−７／８ａアジュバントである２ＢＸｙ３を共送達する、疎水性分子（Ｈ）に連結されたペプチド抗原（Ａ）としてのいずれかで含む、異なる免疫原性組成物を用いて、マウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化した。０および１４日目にマウスに免疫化し、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対する％ＩＦＮｇ＋）を０および２５日目に全血から評価した。白抜きの丸は、ペプチド抗原（Ａ）が可溶性（すなわち、非微粒子状）であったことを示し、これに対して黒塗りの丸は、マウスにペプチド抗原（Ａ）の微粒子免疫原性組成物を施したことを示す。
【００４０】
【図７】図７は、Ｂ１６腫瘍細胞株に由来する合成長鎖ペプチド（ＳＬＰもしくは「ＬＰ」）または最小（「Ｍｉｎ」）ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープのどちらかから構成される、ペプチド抗原（Ａ）についての、およびペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートについての、分子量および流体力学的挙動の図である。ＬＰから構成されるペプチド抗原（Ａ）をリンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に連結させ、このリンカー前駆体Ｘ１を未連結のままにしたか、またはＤＢＣＯ−Ｗ３もしくはＤＢＣＯ−ＢＸｙ３のどちらかから構成される疎水性分子（Ｈ）に連結させた。ＬＰから構成されるペプチド抗原（Ａ）を伸長部（Ｂ１）に連結させ、この伸長部（Ｂ１）をリンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に連結させ、このリンカー前駆体Ｘ１を未連結のままにしたか、またはＤＢＣＯ−Ｗ３もしくはＤＢＣＯ−２ＢＸｙ３のどちらかから構成される疎水性分子（Ｈ）に連結させた。
【００４１】
【図８】図８は、ペプチド抗原コンジュゲートの免疫原性に対する、ペプチド抗原（Ａ）の長さ、および疎水性分子（Ｈ）に連結されたＴＬＲ−７／８ａの作用強度の影響の図である。疎水性分子（Ｈ）であるＤＢＣＯ−２ＢＸｙ５もしくはＤＢＣＯ−２Ｂ５のどちらかに連結されたＢ１６腫瘍由来ペプチド抗原（Ａ）の合成長鎖ペプチド（ＬＰ）、最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ｍｉｎ）、またはＳＬＰとＭｉｎの両方のいずれかを送達するペプチド抗原コンジュゲートを含む、異なる免疫原性組成物を用いて、マウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化した。０および１４日目にマウスに免疫化し、抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答（全体に対する％ＩＦＮｇ＋）を２４日目に全血から評価した。棒グラフは、各ペプチド抗原（Ｍ４７、Ｍ４４、Ｍ３０、Ｍ２５、Ｍ３３、Ｍ２７およびＭ０８）に対する平均応答の合計を示す。
【００４２】
【図９】図９は、ペプチドネオ抗原の免疫原性およびペプチドネオ抗原のライブラリーに対して生成されるＴ細胞応答の幅に対する、疎水性分子（Ｈ）に連結されたＴＬＲ−７／８ａの作用強度の影響の図である。２ＢＸｙ５または２Ｂ５どちらかの疎水性分子（Ｈ）に連結された明確に異なるＭＣ３８腫瘍由来最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（合計４０のエピトープ）を送達する４つの特有のペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を用いて、マウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化した。０および１４日目にマウスに免疫化し、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対する％ＩＦＮｇ＋）を２４日目に全血から評価した。４０のエピトープの各々に対するＣＤ８  Ｔ細胞応答が示されている。ＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらした最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）の割合が、円グラフで示されている。
【００４３】
【図１０】図１０は、ペプチドベースのネオ抗原の免疫原性に対する、ペプチド抗原（Ａ）の数および用量、ならびにワクチン接種部位数の影響の図である。単一の最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ａｄｐｇｋ）を含むペプチド抗原コンジュゲート、または４つの異なる最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ｄｐａｇｔ、Ｃｐｎｅ１、ＡｄｐｇｋおよびＡａｔｆ）を含むペプチド抗原コンジュゲートのどちらかを用いて、マウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化した。ペプチド抗原（Ａ）の用量およびワクチン接種部位数を、種々の群について変えた。０および１４日目にマウスに免疫化し、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対する％ＩＦＮｇ＋）を２４日目に全血から評価した。
【００４４】
【図１１】図１１は、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの概要図である。
【００４５】
【図１２】図１２は、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用強度に対するＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）の影響の図である。ＡＰＣおよびネオ抗原（Ｃｐｎｅ１）特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を伴う脾細胞培養物を、異なる伸長部（Ｂ１およびＢ２）に連結された最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ｃｐｎｅ１）ペプチド抗原（Ａ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、Ｃｐｎｅ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のＩＦＮｇ産生を刺激するそれらの能力について評価した。
【００４６】
【図１３】図１３は、図１２で評価したペプチド抗原コンジュゲートの図である。最小エピトープであるＣｐｎｅ１（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ  配列番号１）から構成されるペプチド抗原（Ａ）を、カテプシン切断部位および／または免疫プロテアソーム切断部位を含むＢ１および／またはＢ２伸長部のどちらかまたは両方に連結させ、加えて、この場合は、ペプチド抗原（Ａ）を、直接、またはＢ２伸長部によってのどちらかで、リンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に連結させ、このリンカー前駆体Ｘ１を疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ３に連結されたＤＢＣＯ分子に連結させた。
【００４７】
【図１４】図１４は、最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープから構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性に対する、荷電分子（Ｃ）および伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の影響の図である。０および１４日目に異なる荷電分子（Ｃ）および伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）を含むペプチド抗原コンジュゲートを用いてマウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化し、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対する％ＩＦＮｇ＋）を１０日目（上のパネル）および２４日目（下のパネル）に全血から評価した。
【００４８】
【図１５】図１５は、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用強度に対するＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）の影響の図である。最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ａｄｐｇｋ）ペプチド抗原（Ａ）を異なる伸長部（Ｂ１およびＢ２）に連結させ、Ａｄｐｇｋ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞からのＩＦＮｇ産生を刺激する能力について評価した。
【００４９】
【図１６】図１６は、半最大活性での有効濃度（ＥＣ５０）が、図１５で評価された異なるペプチド抗原コンジュゲートについて示されている。ＥＣ５０が低いほど、高い作用強度を示す図である。
【００５０】
【図１７】図１７は、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用強度、およびデノボＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起するｉｎ  ｖｉｖｏ作用強度に対する、Ｎ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）の影響の図である。（Ａ）最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ａｄｐｇｋ）ペプチド抗原（Ａ）を異なる伸長部（Ｂ１およびＢ２）に連結させ、Ａｄｐｇｋ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞からのＩＦＮｇ産生を刺激する能力について評価した（Ｂ）。疎水性分子（Ｈ）である２Ｂ３Ｗ２に連結された異なるＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）を有するペプチド抗原コンジュゲートの能力を１３日目、単回免疫化後に評価した。
【００５１】
【図１８−１】図１８は、流体力学的挙動に対する、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷および疎水性分子の組成の影響の図である。７．４のｐＨでＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬの式Ｖの様々な異なるペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動を、動的光散乱により評価した。ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷および数または質量平均粒子径が報告されている。濁度は、４９０ｎｍで溶液の吸光度を測定することにより決定した。濁度＞０．０４は、凝集を示す。
【図１８−２】同上
【図１８−３】同上
【図１８−４】同上
【図１８−５】同上
【図１８−６】同上
【図１８−７】同上
【図１８−８】同上
【図１８−９】同上
【図１８−１０】同上
【００５２】
【図１９−１】図１９は、流体力学的挙動に対する、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷の影響の図である。（Ａ）７．４のｐＨのＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させた式Ｖの様々な異なるペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動に対する正味電荷の影響を、動的光散乱により評価した。（Ｂ）図パネルＢは、図パネル（Ａ）に示されているデータの精選されたリストを示す。ペプチド抗原コンジュゲートとして送達された抗原の（Ｃ）ＧＲＡＶＹ度数分布および（Ｄ）電荷度数分布。（Ｅ）自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を共送達するナノ粒子を構築する、＋６または≧＋８の正味電荷を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして調製された、適合するＬＰネオ抗原（ｎ＝３９）の粒径。（Ｆ）流体力学的挙動に対するペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷および総平均ハイドロパシー（ｇｒａｎｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）（ＧＲＡＶＹ）の影響。７．４のｐＨのＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍＬで懸濁させた様々な異なるペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動を、動的光散乱により評価した。数平均粒子径が正味電荷およびＧＲＡＶＹ値の関数として報告されている。
【図１９−２】同上
【図１９−３】同上
【図１９−４】同上
【００５３】
【図２０】図２０は、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動に対する、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷ならびに疎水性分子（Ｈ）の長さおよび組成の影響の図である。モデルネオ抗原ベースの最小エピトープ（Ｍｉｎ）、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２）（「Ａｄｐｇｋ」）を送達する、様々な正味電荷および疎水性分子組成を有する、７．４のｐＨのＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍＬで懸濁させた異なるペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動を、動的光散乱により評価した。（Ａ）数平均粒子径が、４つの異なる疎水性分子（２Ｂ２Ｗ８、２ＢＸｙ５、２Ｂ５、Ｗ５）について、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷の関数として報告されている。（Ｂ）自己集合してナノ粒子（「Ｍｉｎ−ＳＮＰ−７／８ａ」）を構築する、＋６の正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートについての、および同じペプチド抗原（Ａ）を送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ）が０の正味電荷を有する、集合して微小粒子／凝集体（「Ｍｉｎ−ＭＰ−７／８ａ」）を構築するペプチド抗原コンジュゲートについてのサイズ分布データが示されている。
【００５４】
【図２１】図２１は、疎水性ペプチド抗原を送達する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動に対する正味電荷の影響の図である。（Ａ）４つのマウス腫瘍モデル（Ｂ１６．Ｆ１０、ＭＣ３８、３１２３およびＰａｎｃ０２）からの１，３７７のＬＰネオ抗原の総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）分布プロット。（Ｂ）図パネル（Ａ）（赤塗りの丸）で識別される最も疎水性の高いＬＰネオ抗原を、自己集合してＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を共送達するナノ粒子を構築する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるＬＰおよびＭｉｎとして調製し、粒径に対する正味電荷（絶対値）の影響について評価した。粒径は、７．４のｐＨのＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させたペプチド抗原コンジュゲートを用いて動的光散乱により評価した。質量平均粒子径が、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷の関数として報告されている。
【００５５】
【図２２】図２２は、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたネオ抗原最小エピトープであるＡｄｐｇｋに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答を生成する免疫原性に対する、荷電分子（Ｃまたは「Ｃブロック」）および疎水性分子（Ｈまたは「Ｈブロック」）組成の影響の図である。（Ａ〜Ｅ）最小エピトープであるＡｄｐｇｋを送達する、様々な荷電分子組成（ポリ（Ｋ）、ポリ（Ｒ）、ポリ（Ｄ）、またはなしのいずれか）および疎水性分子組成（Ｗ５、２ＢＸｙ３Ｗ２または２Ｂ３Ｗ２のいずれか）を有するペプチド抗原コンジュゲートを、０、１４および２８日目に異なる用量でマウス（用量ごとに１群当たりＮ＝３）に投与し、その後、ネオ抗原（Ａｄｐｇｋ）特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を一連の時点で全血から評価した。
【００５６】
【図２３】図２３は、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたネオ抗原最小エピトープであるＡｄｐｇｋに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答を生成する免疫原性に対する、荷電分子（Ｃまたは「Ｃブロック」）組成の影響の図である。（Ａ）最小エピトープであるＡｄｐｇｋを送達する、ポリ（Ｋ）ベースのＣブロック、ポリ（Ｄ）ベースのＣブロックまたはＰＥＧベースのＣブロックのいずれかを有するペプチド抗原コンジュゲートを、０、１４および２８日目に異なる用量でマウス（用量ごとに１群当たりＮ＝３）に投与し、ネオ抗原（Ａｄｐｇｋ）特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を３６日目に全血から評価した（Ｂ）。
【００５７】
【図２４】図２４は、ペプチド抗原コンジュゲート（「ＳＮＰ−７／８ａ」）により生成されたＣＤ８  Ｔ細胞応答に対する投与経路の影響の図である。ネオ抗原最小エピトープ（Ａｄｐｇｋ＝Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号７７））を送達する、ポリ（Ｋ）荷電分子（Ｃ）および２Ｂ３Ｗ２疎水性分子（Ｈ）を有するペプチド抗原コンジュゲートを、０、１４および２８日目にマウスに投与し、ネオ抗原（Ａｄｐｇｋ）特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を３６日目に全血から評価した。
【００５８】
【図２５】図２５は、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答に対する、疎水性分子（Ｈ）の組成およびペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動の影響の図である。最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ４  Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥエピトープ）を含む免疫学的組成物を、様々な量および作用強度のＴＬＲ−７／８アゴニストを有する微小粒子（ＭＰ）（直径＞５００ｎｍ）またはナノ粒子（ＮＰ）ミセル（直径＜２００ｎｍ）のどちらかとして用いて、マウス（１群当たりＮ＝５）に免疫化した。０および１４日目にマウスに免疫化し、抗原（Ａｄｐｇｋ）特異的（Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対する％ＩＦＮｇ＋）および（Ｂ）ＰＡＤＲＥ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を２４日目に全血から評価した。
【００５９】
【図２６】図２６は、ペプチド抗原のＬＰまたはＭｉｎエピトープ形態のどちらかを送達する、ポリ（Ｋ）荷電分子（Ｃ）および２Ｂ３Ｗ２ベースの疎水性分子（Ｈ）を有するペプチド抗原コンジュゲートの略画および化学的概要図である。
【００６０】
【図２７−１】図２７は、ペプチドネオ抗原の微粒子送達がペプチド抗原（Ａ）ベースのネオ抗原に対するＣＤ８  Ｔ細胞応答を増強する図である。（Ａ）ネイティブＬＰ、集合して微小粒子（「ＭＰ−７／８ａ」）を構築する疎水性分子（２Ｂ３Ｗ２）に連結されたＬＰ、または自己集合してナノ粒子（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を構築する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして合成されたＬＰとしての、異なるネオ抗原の濁度。濁度＞０．０５ＯＤは、凝集を示す。（Ｂ〜Ｅ）ポリＩＣＬＣと混合されたネイティブＬＰ、またはＭＰ−７／８ａもしくはＳＮＰ−７／８ａとして送達されるＬＰを用いて０および１４日目にマウスに免疫化し、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を２８日目に全血から評価した。対数スケールでのデータが、９５％ＣＩでの幾何平均として報告されている。統計的有意性のための複数の群の比較は、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。ｎｓ＝有意でない；＊、ｐ＝０．０５；＊＊、ｐ＝０．０１。
【図２７−２】同上
【図２７−３】同上
【００６１】
【図２８】図２８は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、ペプチド抗原コンジュゲートの免疫原性向上を明らかにするメカニズムの図である。（Ａ〜Ｃ）最小エピトープであるＡｄｐｇｋに蛍光標識し、次いで、それを、小分子ＴＬＲ−７／８ａ（７／８ａ）と混合した可溶性ペプチド、ＭＰ−７／８ａと混合した可溶性ペプチド、またはＭＰ−７／８ａもしくはＳＮＰ−７／８ａに共有結合で連結させた可溶性ペプチドのいずれかとして、０日目にマウスの後足蹠に皮下投与した。その後、免疫化部位を排液するリンパ節（群ごとに１時点当たりＮ＝５）を一連の時点で回収し、ペプチド量（Ｅ）、細胞ごとのリンパ節ＡＰＣによるペプチド取り込み（Ｆ）、およびＩＬ−１２ｐ４０サイトカイン産生（Ｇ）について評価した。データは、平均±ＳＥＭで報告されている。統計的有意性のための複数の群の比較は、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。ｎｓ＝有意でない；＊、ｐ＝０．０５；＊＊、ｐ＝０．０１。
【００６２】
【図２９−１】図２９は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして、ＬＰまたはＭｉｎのどちらかとして送達されるペプチドベースのネオ抗原の免疫原性の図である。荷電分子（Ｃ）がポリ（リシン）であり、疎水性分子（Ｈ）が２Ｂ３Ｗ２であり、これらが自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」と呼ばれる）を共送達するナノ粒子を構築する、ペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるＬＰまたはＭｉｎのどちらかとして、異なるペプチドベースのネオ抗原を、調製した。ＳＮＰ−７／８ａに連結されたペプチドベースのネオ抗原のＬＰまたはＭｉｎ形態どちらかを用いて、０および１４日目に、マウス（Ｎ＝７／群）に免疫化した。（Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答および（Ｂ）ＣＤ４  Ｔ細胞応答を、２８日目に全血から評価した。対数スケールでのデータが、９５％ＣＩでの幾何平均として報告されている。統計的有意性のための複数の群の比較は、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。ｎｓ＝有意でない；＊、ｐ＝０．０５；＊＊、ｐ＝０．０１。
【図２９−２】図２９は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして、ＬＰまたはＭｉｎのどちらかとして送達されるペプチドベースのネオ抗原の免疫原性の図である。荷電分子（Ｃ）がポリ（リシン）であり、疎水性分子（Ｈ）が２Ｂ３Ｗ２であり、これらが自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」と呼ばれる）を共送達するナノ粒子を構築する、ペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるＬＰまたはＭｉｎのどちらかとして、異なるペプチドベースのネオ抗原を、調製した。ＳＮＰ−７／８ａに連結されたペプチドベースのネオ抗原のＬＰまたはＭｉｎ形態どちらかを用いて、０および１４日目に、マウス（Ｎ＝７／群）に免疫化した。（Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答および（Ｂ）ＣＤ４  Ｔ細胞応答を、２８日目に全血から評価した。対数スケールでのデータが、９５％ＣＩでの幾何平均として報告されている。統計的有意性のための複数の群の比較は、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。ｎｓ＝有意でない；＊、ｐ＝０．０５；＊＊、ｐ＝０．０１。
【００６３】
【図３０】図３０は、ポリＩＣＬＣと混合されたネイティブＬＰと比較した、荷電分子（Ｃ）がポリ（リシン）であり、疎水性分子（Ｈ）が２Ｂ３Ｗ２であり、これらが自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」と呼ばれる）を共送達するナノ粒子を構築する、式ＶのＬＰベースのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチドベースのネオ抗原の免疫原性の図である。０および１４日目にマウスに免疫化し、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を２８日目に全血から評価した。
【００６４】
【図３１】図３１は、免疫原性と予測結合親和性との関係の図である。（Ａ）免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）コンセンサスアルゴリズムを使用して予測された結合親和性に対してプロットされた、疎水性分子（Ｈ）がポリマー−ＴＬＲ−７／８ａであるペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたときにＣＤ８  Ｔ細胞応答を生成する最小エピトープ（Ｎ＝１７９）の免疫原性。（Ｂ）コンセンサススコア０．５のカットオフまたはバインダーとしての５００ｎＭに基づく異なるＭＨＣ−Ｉ結合予測アルゴリズムの感度および特異性についての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線。
【００６５】
【図３２】図３２は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート上でペプチド抗原（Ａ）として送達された、自己抗原およびネオ抗原が、確立したメラノーマのＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞媒介排除を惹起する図である。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍が確立したマウスを、ＰＤ１と、ＳＮＰ−７／８ａ送達Ａｄｐｇｋ  ＬＰ（Ｂ１６．Ｆ１０に存在しないＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ）、自己抗原（Ｔｒｐ１）、最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ、またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを有するネオ抗原であるＭ３０  ＬＰのいずれかとを用いて、２、９および１６日目に処置した。
【００６６】
【図３３】図３３は、皮下および静脈内経路により投与された、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたネオ抗原が、確立腫瘍の堅固なＣＤ８  Ｔ細胞媒介排除を惹起する図である。ＭＣ３８腫瘍が確立したマウスに、Ａｄｐｇｋ  ＬＰ−ＳＮＰ−７／８ａを用いて９および１６日目に皮下または静脈内経路のどちらかによってワクチン接種し、その後、一連の時点で腫瘍体積を評価した。
【００６７】
【図３４】図３４は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたネオ抗原が、確立したメラノーマのＣＤ８  Ｔ細胞媒介排除を惹起する図である。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍が確立したマウスを、ＰＤＬ１と、ＳＮＰ−７／８ａ送達Ｍｅｄ１２（ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを有するＭＣ３８ネオ抗原）、Ｔｒｐ１（ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを有する、Ｂ１６自己抗原）またはＭ３９（ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを有するＢ１６ネオ抗原）、いずれかとを用いて、１、８および１５日目に処置した。（Ａ）腫瘍成長をモニターし、（Ｂ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、１７日目に評価した。
【００６８】
【図３５】図３５は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたウイルス（ＨＰＶ）抗原が、ＨＰＶ＋腫瘍のＣＤ８  Ｔ細胞媒介拒絶を惹起する図である。（ＡおよびＢ）自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」と呼ばれる）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート（式中、荷電分子（Ｃ）は、ポリ（リシン）であり、疎水性分子（Ｈ）は、２Ｂ３Ｗ２である）として送達される、ＨＰＶに由来する異なるＥ６およびＥ７ペプチド最小エピトープ（ｍｉｎ）を用いて、０および１４日目に、マウスに免疫化した。（Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答を２８日目に評価し、マウスにＨＰＶ＋がん細胞株（ＴＣ１）をチャレンジし、（Ｂ）チャレンジ後１４日目に腫瘍体積を評価した。
【００６９】
【図３６−１】図３６は、多抗原粒子の粒径および安定性の図である。（Ａ）様々な電荷（−６〜＋６）およびハイドロパシー（−２〜＋２のＧＲＡＶＹ）を有するペプチド抗原（Ａ）（Ａ１〜Ａ９）としてのネオ抗原ＬＰを、（Ｂ）自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート（式中、荷電分子（Ｃ）はポリ（Ｋ）であり、Ｂ１は、ＶＲであり、Ｂ２は、ＳＰＶＺであり、Ｘ１リンカー前駆体は、アジド−リシン（「Ｘ」は、Ｋ’とも呼ばれる）であり、疎水性分子（Ｈ）は、２Ｂ３Ｗ２である）として合成した。ペプチド抗原コンジュゲートをＰＢＳ  ＰＨ７．４に０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、濁度（ＯＤ４９０ｎｍ）および粒径（直径、ｎｍ）について評価した。（Ｃ）複数の異なるペプチド抗原コンジュゲート（Ａ１〜Ａ９）を含む多抗原粒子を、ＤＭＳＯ溶液中で、異なる比率で混合し（シナリオ１〜７）、次いで、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、濁度（ＯＤ４９０ｎｍ）および粒径（直径、ｎｍ）について評価した。各シナリオの多抗原粒子を含む各ペプチド抗原コンジュゲートのパーセントが、表に提供されている。
【図３６−２】図３６は、多抗原粒子の粒径および安定性の図である。（Ａ）様々な電荷（−６〜＋６）およびハイドロパシー（−２〜＋２のＧＲＡＶＹ）を有するペプチド抗原（Ａ）（Ａ１〜Ａ９）としてのネオ抗原ＬＰを、（Ｂ）自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート（式中、荷電分子（Ｃ）はポリ（Ｋ）であり、Ｂ１は、ＶＲであり、Ｂ２は、ＳＰＶＺであり、Ｘ１リンカー前駆体は、アジド−リシン（「Ｘ」は、Ｋ’とも呼ばれる）であり、疎水性分子（Ｈ）は、２Ｂ３Ｗ２である）として合成した。ペプチド抗原コンジュゲートをＰＢＳ  ＰＨ７．４に０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、濁度（ＯＤ４９０ｎｍ）および粒径（直径、ｎｍ）について評価した。（Ｃ）複数の異なるペプチド抗原コンジュゲート（Ａ１〜Ａ９）を含む多抗原粒子を、ＤＭＳＯ溶液中で、異なる比率で混合し（シナリオ１〜７）、次いで、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、濁度（ＯＤ４９０ｎｍ）および粒径（直径、ｎｍ）について評価した。各シナリオの多抗原粒子を含む各ペプチド抗原コンジュゲートのパーセントが、表に提供されている。
【００７０】
【図３７】図３７は、腫瘍に関連する自己抗原、感染性疾患（ＨＩＶ）抗原、および外来抗原を送達する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートにより誘導されたＴ細胞応答を示す図である。
【００７１】
【図３８−１】図３８は、式ＩＩＩのアジュバントに連結された、異なる荷電分子（Ｃ）、または式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【図３８−２】図３８は、式ＩＩＩのアジュバントに連結された、異なる荷電分子（Ｃ）、または式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【図３８−３】図３８は、式ＩＩＩのアジュバントに連結された、異なる荷電分子（Ｃ）、または式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【００７２】
【図３９−１】図３９は、異なるＰＲＲアゴニストに連結された式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【図３９−２】図３９は、異なるＰＲＲアゴニストに連結された式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【００７３】
【図４０】図４０は、異なるリンカー化学（アミドおよびチオ−エーテル）を使用してペプチド抗原（Ａ）が疎水性分子（Ｈ）に連結されている式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【００７４】
【図４１−１】図４１は、脂肪酸、脂質およびコレステロールに基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【図４１−２】図４１は、脂肪酸、脂質およびコレステロールに基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【００７５】
【図４２】図４２は、Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーに基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式ＩＶおよびＶのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【００７６】
【図４３】図４３は、予め形成された粒子（Ｐ）に連結されたペプチド抗原（Ａ）に基づく式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および安定性を示す図である。
【００７７】
【図４４】図４４は、寛容の誘導に使用された自己抗原を送達するペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性を示す図である。
【００７８】
【図４５】図４５は、Ａ−Ｈ＋Ｃ−ＨまたはＡ−Ｈ（Ｃ）（式ＶＩ）から構成される粒子の粒径および生物活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本開示の実施に当業者を導くことを目的として、化合物、組成物、方法、および被験体において免疫応答を誘導するためのそれらの使用に関してより明確にするために、用語および方法の詳細が、下に与えられる。本開示における専門用語は、特定の実施形態のよりよい説明を提供する目的で有用であると解され、本開示における専門用語を限定と見なすべきではない。
【００８０】
約：本開示に関して、「約」は、設定量からプラスまたはマイナス５％を意味する。例えば、「約１０」は、９．５〜１０．５を指す。「約５：１」の比は、４．７５：１〜５．２５：１の比を指す。
【００８１】
アジュバント：抗原の免疫原性を増強または改変するためにワクチンに添加される任意の材料。アジュバントは、抗原が、単に混合もしくは吸着されている、内部に組み込まれている、または共有結合性相互作用によって間接的にもしくは直接連結されている送達系、例えば、無機塩（例えば、水酸化アルミニウム、またはミョウバンと呼ばれるリン酸塩）に基づく粒子、油中水型もしくは水中油型エマルジョンまたはポリマー粒子（例えば、ＰＬＧＡ）でありうる。あるいは、アジュバントは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニスト、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の合成もしくは天然に存在するアゴニスト、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体（ＮＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ様受容体（ＲＬＲ）またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）を含む、特定の受容体と結合して下流シグナル伝達経路を誘導する化学的に規定された分子、ならびに生体分子（「生物学的アジュバント」）、例えば、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、４−１ＢＢＬでありうる。Ｔｏｌｌ様受容体−７（ＴＬＲ−７）およびＴＬＲ−７／８ａとそれぞれ結合するヒドロキシアデニンおよびイミダゾキノリンなどの、ヌクレオチド塩基の小分子類似体、ならびにＴＬＲ−２／６、ＴＬＲ−４、ＳＴＩＮＧおよびＮＯＤのアゴニストは、本開示において例示的ＰＲＲアゴニストとして使用される。当業者は、アジュバントを熟知している（参照：Ｐｅｒｒｉｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３６４巻：２７２〜２８０頁、２００８年およびＢｒｉｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、１９０Ｃ巻：５６３〜５７９頁、２０１４年）。一般に、本明細書に収載される任意のＰＲＲアゴニストまたは生物学的アジュバントを、任意の適する手段によって、本開示のペプチド抗原コンジュゲートに結合させることができる。
【００８２】
投与：被験体に任意の有効な経路により薬剤、例えば、本明細書に記載のペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供するまたは与えること。
【００８３】
例示的投与経路としては、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
化合物「の投与」および「を投与すること」は、本明細書に記載の化合物、化合物のプロドラッグ、または医薬組成物を提供することを意味すると解されたい。化合物または組成物は、別人により被験体に投与されることもあり、または被験体により自己投与されることもある。
【００８５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびランゲルハンス細胞を含むがこれらに限定されない、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合した抗原をＴ細胞に提示する任意の細胞。
【００８６】
抗原：Ｔ細胞またはＢ細胞受容体と結合するエピトープを含有し、被験体における免疫応答、特に、Ｂ細胞応答および／またはＴ細胞応答を刺激することができる、任意の分子。エピトープは、特定のＢ細胞またはＴ細胞タンパク質の成分と相互作用することができるエピトープを含有する、ペプチド、糖ペプチド、脂質または任意の適する分子から構成されうる。そのような相互作用は、免疫細胞による応答を生成することができる。「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞タンパク質、すなわちＢ細胞受容体およびＴ細胞受容体、が相互作用する、ペプチド抗原の領域を指す。
【００８７】
本開示の実施形態で使用される抗原は、病原体、がん性細胞、自己抗原またはアレルゲンから選択することができる。一部の実施形態では、抗原は、病原体（例えば、ウイルス、細菌もしくは真菌）または目的の組織（例えば、がん性細胞）からのポリペプチドまたはタンパク質の領域を含みうる、ペプチドベースの抗原でありうる。他の実施形態では、抗原は、病原体に由来する全タンパク質もしくは糖タンパク質であることもあり、または前記タンパク質もしくは糖タンパク質のペプチドもしくは糖ペプチド断片であることもある。他の実施形態では、抗原は、腫瘍組織により主として発現される（しかし健常組織には発現されない）かつ腫瘍関連抗原である、タンパク質、またはタンパク質のペプチド断片でありうる。他の実施形態では、抗原は、自己免疫に関連する、タンパク質またはペプチドである。さらに他の実施形態では、抗原は、アレルギーに関連する、タンパク質または糖タンパク質である。
【００８８】
多くのそのような抗原を本発明の実施形態に従って使用することができ、多くのそのような抗原が、本明細書中でより詳細に論じられる。
【００８９】
芳香族：芳香族化合物は、環を形成する炭素または窒素原子間に非局在化している奇数のパイ軌道電子対を有する不飽和環式環である。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの、芳香族基を含む側鎖を有するものを含む。３つの二重結合を含有する６炭素環であるベンゼンは、プロトタイプの芳香族化合物である。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）は、プロトタイプの芳香族アミノ酸である。アリールは、芳香族置換基を指すこともあり、アリール−アミンは、アミンを含む芳香族基を指すこともある。例示的芳香族アミンは、アニリンである。芳香族ヘテロ環は、炭素と、別の原子、例えば窒素、酸素または硫黄とを含む環式環構造を含む芳香族環を指す。ヌクレオチド塩基、例えば、アデニンおよびシトシンは、例示的芳香族ヘテロ環である。
【００９０】
生体適合性：材料は、体液、体細胞または体組織と接触しているときに破壊的効果も宿主応答効果もほとんど発揮しない場合、生体適合性と見なされる。
【００９１】
生体適合性基は、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式、アリールまたはヘテロアリールクラスからのものを含む、化学部分を含有しうる。しかし、分子組成次第で、そのような部分は、必ずしも生体適合性とは限らない。
【００９２】
あるいは、用語「生体適合性」は、認識タンパク質と、および／もしくは生物系の他の成分（例えば、天然に存在する抗体、糖タンパク質を含む細胞タンパク質、もしくは細胞）とほとんど相互作用しないことを意味する、または相互作用の結果が実質的にネガティブでも破壊的でもないような、生物系の成分（例えば、薬物およびプロドラッグ）との相互作用を引き起こすことを特に目的とする物質および官能基を意味すると、考えられる。
【００９３】
ＣＤ４：他の細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用する表面糖タンパク質である、表面抗原分類４。Ｔ細胞のサブセットは、ＣＤ４を発現し、これらの細胞は、一般に、ヘルパーＴ細胞と呼ばれる。
【００９４】
ＣＤ８：他の細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と相互作用する表面糖タンパク質である、表面抗原分類８。Ｔ細胞のサブセットは、ＣＤ８を発現し、これらの細胞は、一般に、細胞傷害性Ｔ細胞またはキラーＴ細胞と呼ばれる。
【００９５】
電荷：他の原子および分子（溶質および溶媒を含む）とのその相互作用に影響を与える物質の物理的性質。荷電物質は、他のタイプの荷電物質からの、および極性分子などの完全電荷整数値を保持しない分子からの、静電力を受ける。同じ電荷の２つの荷電分子は、互いに反発し合うが、異なる電荷の２つの荷電分子は、互いに引き合う。電荷は、正または負の整数単位で記載されることが多い。
【００９６】
荷電分子（Ｃ）：荷電分子（Ｃ）は、正にまたは負に荷電している１つまたは複数の官能基を有する任意の分子を指す。荷電分子を構成する官能基は、部分または完全電荷整数値であることがある。荷電分子は、単一の荷電官能基または複数の荷電官能基を有する分子であることがある。官能基は、永久荷電型であることもあり、または荷電分子を構成する官能基は、ｐＨに依存して電荷を有することもある。荷電分子は、正荷電官能基から、負荷電官能基から、または正荷電官能基と負荷電官能基の両方から、構成されることがある。荷電分子の正味電荷は、正、負、または中性でありうる。分子の電荷は、当業者に公知である分子のルイス構造および容認されている方法に基づいて、容易に推定することができる。電荷は、誘起効果の結果として生じることもあり、例えば、電子親和性に差がある互いに結合している原子は、部分的に負に荷電した原子と部分的に正に荷電した原子とを生じさせる結果となる、極性共有結合をもたらすこともある。例えば、水素と結合している窒素は、結果的に、窒素上に負の部分電荷をもたらし、水素原子上に正の部分電荷をもたらす。あるいは、原子は、その原子に割り当てられた電子の数が、その原子の原子番号未満であるか、その原子番号に等しい場合、完全電荷整数値を有すると考えることができる。官能基の電荷は、その官能基を構成する各原子の電荷を合算することにより決定される。荷電分子（Ｃ）の正味電荷は、その分子を構成する各原子の電荷を合算することにより決定される。当業者は、分子または官能基中の各原子の形式電荷をそれぞれ合算することにより、分子または個々の官能基の電荷を推定する方法を熟知している。
【００９７】
荷電分子（Ｃ）は、負荷電官能基、例えば、生理的ｐＨで酸の共役塩基として存在するもの（例えば、約６．５未満のｐＫａを有する官能基）、例えば、約７．４のｐＨで酸の共役塩基として存在するものを含みうる。これらは、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ホスホルアミデートおよびホスホネートを有する分子を含むが、これらに限定されない。荷電分子は、正荷電官能基、例えば、生理的ｐＨで塩基の共役酸として存在するもの（例えば、塩基の共役酸のｐＫａが約８．５より高い官能基）を含みうる。これらは、第一級、第二級および第三級アミンを有する分子、ならびにアンモニウムを有する分子、グアニジニウムを有する分子を含むが、これらに限定されない。荷電分子は、第四級アンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウム官能基を含む、ｐＨ非依存性である電荷を有する官能基を含むこともある。一部の実施形態では、荷電分子は、負荷電アミノ酸、または正荷電アミノ酸、または負荷電アミノ酸と正荷電アミノ酸の両方から構成される、ポリ（アミノ酸）である。一部の実施形態では、負荷電アミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。他の実施形態では、正荷電アミノ酸は、リシンまたはアルギニンである。当業者は、多くのそのような実施形態が可能であることを認知している。
【００９８】
クリックケミストリー反応：２つの化合物を、穏やかな条件下で、最小限の生体適合性および／または無害な副生成物を生成する高収率反応で、互いに結合させる、生体直交型反応を指しうる。本開示で使用される例示的クリックケミストリー反応は、歪みにより促進される［３＋２］アジド−アルキン付加環化によってトリアゾールリンカー（Ｌ）を形成する、リンカー前駆体Ｘ１上に備えられているアジド基と、リンカー前駆体Ｘ２上に備えられているアルキンとの反応である。
【００９９】
有効量：所望の応答を誘導するために必要な量。例えば、免疫応答、例えばペプチド抗原コンジュゲートに対する免疫応答、を誘導するために必要な、単独か、または１つもしくは複数の追加の薬剤を伴うかのどちらかでの薬剤の量。
【０１００】
伸長部：伸長部という用語は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端に連結される分子であって、アミノ酸、非天然アミノ酸、親水性エチレンオキシドモノマー（すなわちＰＥＧ）、疎水性アルカン鎖、またはこれらの組み合わせから構成され、ペプチド抗原（Ａ）の分解速度を調節するように機能する分子を記述するために、本明細書では使用される。ペプチド抗原のＮ末端に連結される伸長部はＢ１と呼ばれ、ペプチド抗原のＣ末端に連結される伸長部はＢ２と呼ばれる。伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、主として、ペプチド抗原の分解速度を制御するように機能するが、任意の１つまたは複数のさらなる機能を果たすこともある。一部の実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、別の分子、例えば、荷電分子（Ｃ）または疎水性分子（Ｈ）と連結されることもあり、リンカーとして機能することもあり、ならびに他の分子からのペプチド抗原（Ａ）の放出速度を制御することもある。さらなる実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、任意の２つの異種分子間に距離、すなわち間隔、を設けるように機能する。他の実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、ペプチド抗原コンジュゲートに疎水性または親水性を付与するように機能する。さらに他の実施形態では、リンカーとして使用される伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の組成は、ペプチド抗原（Ａ）と異種分子間に剛性または可撓性を付与するように選択されうる。好ましい実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、プロテアーゼなどの酵素による認識および加水分解のために選択されるペプチド配列である。Ｂ１およびＢ２伸長部が、それぞれ、Ｂ１およびＢ２リンカー、またはＢ１およびＢ２と呼ばれることもあることに留意されたい。本開示の実施に適しているであろう伸長部の具体的な組成は、至る所で説明される。
【０１０１】
グラフトポリマー：ある組成のポリマーの異なる組成の第２のポリマーの側鎖への連結の結果として生じるポリマーと記述されうる。コモノマーによって第２のポリマーに連結されている第１のポリマーは、グラフトコポリマーである。末端基によって第２のポリマーに連結されている第１のポリマーは、ブロックポリマー（例えば、Ａ−Ｂ型ジブロック）または末端グラフト型ポリマーと記述されることもある。
【０１０２】
ハイドロパシー指数／ＧＲＡＶＹ値：アミノ酸の疎水または親水特性を表す数である。ペプチドを構成するアミノ酸の相対的な疎水および親水特性を表すために使用することができる様々なスケールがある。本開示では、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシースケール（Ｋｙｔｅ  Ｊ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １５７巻：１０５〜３２頁、１９８３年）が、ペプチド抗原（Ａ）とペプチドベースのＮ末端およびＣ末端の必要に応じた伸長部（Ｂ１およびＢ２）と必要に応じた荷電分子（Ｃ）とを含むペプチド抗原コンジュゲートを構成するアミノ酸の配列の、ＧＲＡＶＹスコアとも呼ばれることがある、総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値を計算するために使用される。ペプチドのＧＲＡＶＹ値は、ペプチドの長さ（すなわち、アミノ酸の数）で割った、ペプチドを構成する全アミノ酸のハイドロパシー値の合計である。ＧＲＡＶＹ値は、相対値である。ペプチド配列は、ＧＲＡＶＹ値が大きいほど疎水性が高いと見なされ、その一方で、ペプチド配列は、ＧＲＡＶＹ値が低いほど親水性が高いと見なされる。
【０１０３】
親水性：水性媒体に自由に分散する材料の傾向を指す。材料は、他の親水性材料と相互作用することを好み、疎水性材料と相互作用することを避ける場合、親水性と見なされる。一部の場合には、親水性は、相対的な用語として使用されることがあり、例えば、同じ分子が、比較されるもの次第で、親水性と記載されることもあり、記載されないこともある。親水性分子は、多くの場合、極性であり、および／または荷電しており、良好な水溶解度を有する、例えば、上は０．１ｍｇ／ｍＬまたはそれより高い値に至るまで可溶性である。
【０１０４】
疎水性：水との接触を避ける材料の傾向を指す。材料は、他の疎水性材料と相互作用することを好み、親水性材料と相互作用することを避ける場合、疎水性と見なされる。疎水性は、相対的な用語であり、同じ分子が、比較されるもの次第で、疎水性と記載されることもあり、記載されないこともある。疎水性分子は、多くの場合、非極性かつ非荷電であり、乏しい水溶解度を有する、例えば、下は０．１ｍｇ／ｍＬまたはそれ未満に至るまで不溶性である。
【０１０５】
疎水性リガンド：生物学的受容体と結合し、疎水特性を有する分子である。一部の実施形態では、疎水性リガンドは、ポリマーの主鎖に沿って配列され、それによって、そのリガンドが連結されるポリマーに疎水性を付与する。一部の実施形態では、疎水性リガンドは、制限された水溶解度しかなく、それ故、疎水性と記述されうる、パターン認識受容体アゴニストである。さらなる実施形態では、疎水性リガンドは、ＴＬＲ−７またはＴＬＲ−７／８アゴニスト、例えば、イミダゾキノリンである。
【０１０６】
疎水性分子（Ｈ）：本開示では、用語「疎水性分子」（Ｈ）は、ペプチド抗原に連結されて、水性条件で粒子を形成するペプチド抗原コンジュゲートをもたらすことができる、制限された水溶解度しかないまたは両親媒特性を有する分子を記述するための、一般用語として使用される。この文脈での疎水性分子（Ｈ）は、水性条件で、ある特定の温度およびｐＨ範囲にわたって、その乏しい溶解度に起因して粒子集合または集合して粒子を構築する傾向を促進する。
【０１０７】
本明細書に記載の疎水性分子（Ｈ）は、超分子構造、例えば、ミセルまたは二重層形成ラメラもしくは多重ラメラ構造（例えば、リポソームもしくはポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ））を形成しうる両親媒性分子、ならびに完全不溶性であり、単独で凝集体を形成する化合物を含む。分子の疎水特性は、温度および／またはｐＨ応答性であることもある。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、低温では水溶性であるが、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０℃などの、２０℃より高い温度では、不溶性またはミセル形成性である、ポリマーである。他の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、低ｐＨでは、例えば６．５未満のｐＨでは、水溶性であるが、例えば６．５より高いｐＨでは、不溶性である、ポリマーである。疎水性分子（Ｈ）の例としては、脂肪酸、コレステロールおよびその誘導体、長鎖脂肪族、脂質、ならびに様々なポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ならびに主として疎水性アミノ酸から構成されるポリ（アミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、複数の疎水性リガンドが結合している親水性ポリマーである。本開示の実施に有用な様々な疎水性分子が、本明細書で開示される。
【０１０８】
免疫応答：直接的、または間接的（例えば、細胞もしくはサイトカインの仲介による）のどちらかでの刺激の結果としての、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球などの、免疫系の細胞の活性の変化。一実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的（「抗原特異的応答」）である。一実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞応答またはＣＤ８  Ｔ細胞応答である。一実施形態では、免疫応答は、追加のＴ細胞子孫の産生をもたらす。一実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞が移動する結果となる。別の実施形態では、応答は、Ｂ細胞応答であり、特異的抗体の産生または追加のＢ細胞子孫の産生をもたらす。他の実施形態では、応答は、抗原提示細胞応答である。「免疫応答を増強すること」は、ペプチド抗原コンジュゲートの一部としての、アジュバントと、ペプチド抗原などの免疫原性薬剤との併用投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）であって、アジュバントが、アジュバントの非存在下での被験体への免疫原性薬剤の投与と比較して免疫原性薬剤に対する所望の免疫応答を増大させる、併用投与を指す。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス感染細胞またはがん性細胞を死滅させる細胞傷害性Ｔ細胞の活性化をもたらすように免疫応答を刺激するために使用される。一部の実施形態では、抗原は、寛容または免疫抑制を誘導するために使用される。免疫寛容原性応答は、抗原に対するＴ細胞またはＢ細胞の無応答性の結果として生じることがある。抑制性免疫応答は、免疫応答をダウンレギュレートする、すなわち、ひいては免疫、応答を減弱させる、調節性Ｔ細胞などの調節性細胞の活性化の結果として生じることもある。アジュバントの非存在下で患者に投与された抗原は、一般に、免疫寛容原性または抑制性であり、アジュバントとともに投与される抗原は、一般に刺激性であり、免疫細胞の動員、増殖および活性化をもたらす。
【０１０９】
免疫原性組成物：抗原と、必要に応じて、抗原に対する測定可能な免疫応答を誘導するアジュバントとを含む材料の製剤。
【０１１０】
リガンド：生物学的受容体と結合する任意の分子を記述するための一般用語である。パターン認識受容体アゴニストは、パターン認識受容体と結合する特定のタイプのリガンドであり、アジュバント、またはアジュバント特性を有するリガンドと呼ばれることもある。例えば、ＰＲＲアゴニストは、ＴＬＲなどのＰＲＲと結合するリガンドである。ＰＲＲと結合するリガンド（またはＰＲＲａ）は、アジュバント、分子アジュバント、アジュバント分子、またはアジュバント特性を有するリガンドと呼ばれることもある。水中での制限された溶解度しか有さないリガンドは、疎水性リガンドと呼ばれることもあり、その一方で、水溶性であるリガンドは、親水性リガンドと呼ばれることもある。アジュバント特性を有する疎水性リガンドまたは親水性リガンドは、疎水性アジュバントまたは親水性アジュバントと、それぞれ呼ばれることもある。
【０１１１】
連結された（される、されている）またはカップリングされた（される、されている）：用語「連結された（される、されている）」または「カップリングされた（される、されている）」は、直接、または間接的に、のどちらかで、互いに結合された（される、されている）を意味する。第１の部分は、第２の部分に、共有結合で連結されることもあり、または非共有結合で連結されることもある。一部の実施形態では、第１の分子は、共有結合により、別の分子に連結される。一部の実施形態では、第１の分子は、静電引力により、別の分子に連結される。一部の実施形態では、第１の分子は、双極子間力（例えば、水素結合）により、別の分子に連結される。一部の実施形態では、第１の分子は、ファンデルワールス力（ロンドン力としても公知）により、別の分子に連結される。第１の分子は、そのようなカップリングの任意のおよびすべての組み合わせにより、別の分子に連結されることもある。
【０１１２】
分子は、間接的に、例えば、リンカーを使用することにより、連結されることもある。分子は、両方の分子と独立して非共有結合する成分の介在により、間接的に、連結されることもある。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「連結された（される、されている）」およびそのバリエーションは、分子を化学的または物理会合状態で維持することを指し、これは、免疫化後に少なくともそれらが細胞、特に免疫細胞、と接触するまで維持することを含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、連結されている成分は、それらの成分が免疫細胞などの細胞と少なくとも接触するまでは互いから自由に分散することができないように会合している。例えば、２つの成分は、別々に分散することも拡散することもできないように互いに共有結合で連結されていることもある。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に、直接、または間接的に伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）を介してのどちらかで、共有結合で連結されているペプチド抗原（Ａ）から構成される。疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、水性条件で集合して粒子を構築し、この水性条件では、個々のペプチド抗原コンジュゲート、およびペプチド抗原コンジュゲートを構成する成分が、免疫細胞などの細胞と遭遇する前に分散することも拡散することもできない、安定したものを形成するように、２つまたはそれより多くのペプチド抗原コンジュゲートが会合する。
【０１１５】
連結は、例えば、従来のワクチン、例えば、アジュバントと混合された水溶性ペプチド抗原を含有するワクチンに見受けられうるような、抗原とアジュバントとの単純混合物と、特に区別される。単純混合物の場合、成分は、ワクチン接種を受けた組織内で、およびそれを超えて、自由に、別個に分散することができる。
【０１１６】
リンカー、リンカー前駆体およびリンカー（Ｌ）：リンカーは、２つまたはそれより多くの部分を互いに連結またはカップリングまたは結合させる、分子または原子団である。本明細書で開示されるペプチド抗原コンジュゲートは、いずれの適する手段によって互いに連結または結合されていてもよい複数の異なる機能性成分（ペプチド抗原（Ａ）、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／もしくはＢ２）、必要に応じた荷電分子（Ｃ）、必要に応じたリンカー（Ｌ）、または必要に応じたアジュバントなど）を含む、複合分子である。例えば、疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）は、ペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）の間にリンカーを使用することがある。ペプチド抗原（Ａ）は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に、直接、または任意の適するリンカーを含む任意の適する手段によってリンカー（Ｌ）、伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくは荷電分子（Ｃ）によって間接的に、のどちらかで、連結されていることがある。一部の実施形態では、リンカーは、カップリングされる部分両方に共有結合されている。一部の実施形態では、リンカーは、二官能性であり、これは、２つの部位に官能基を有することを意味し、これらの官能基が、リンカーを２つの部分とカップリングさせるために使用される。２つの官能基は、同じであってもよく（ホモ二官能性リンカーと見なされることになる）、または異なっていてもよい（ヘテロ二官能性リンカーと見なされることになる）。例えば、一部の実施形態では、アルキンおよび酸をさらに含むヘテロ二官能性リンカーを構成するリンカー前駆体Ｘ２は、アミンを有する疎水性分子（Ｈ）と、アジドを有するリンカー前駆体Ｘ１に連結されているペプチド抗原（Ａ）とを連結させるために使用され、リンカー前駆体Ｘ２の酸およびアルキンが、アミンおよびアジドとそれぞれ反応して、アミドおよびトリアゾール結合を形成し、かくして、２つの異種分子を連結させる。一部の実施形態では、ヘテロ二官能性リンカーを構成するリンカー前駆体Ｘ２は、酸に連結されているジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）分子である。他の実施形態では、リンカー前駆体は、アミンとチオールを結合させるマレイミドにまたは２つのアミンを結合させるビス（カルボン酸）に連結されている酸である。さらに他の実施形態では、連結が同じであるまたは異なる、三官能性または多官能性リンカーが、使用されることもある。他の実施形態では、切断可能なＮ末端またはＣ末端ペプチド伸長部（Ｂ１またはＢ２）が、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）に連結させるために使用される。一部の実施形態では、切断可能なペプチド伸長部（Ｂ１またはＢ２）は、ヘテロ二官能性であり、例えば、Ｂ２伸長部のＮ末端アミンは、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結され、Ｂ２伸長部のＣ末端カルボキシル基は、疎水性分子（Ｈ）に直接連結される。伸長部（Ｂ１またはＢ２）は、リンカーとして機能しうるが、すべてのリンカーが伸長部であるとは限らない。
【０１１７】
リンカー（Ｌ）は、リンカー前駆体Ｘ１とリンカー前駆体Ｘ２の反応の結果として生じる、リンカーの特異的サブセットであって、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に、直接、または間接的に、伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくは荷電分子（Ｃ）によってのどちらかで、結合させるように特異的に機能する、特異的サブセットである。リンカーは、ペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）を部位選択的にカップリング、すなわち、互いに結合または連結させる、特異的機能を果たす。リンカー前駆体Ｘ１を、ペプチド抗原に、直接、または間接的に、伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって、通常は固相ペプチド合成中に、連結させることができる。ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端に直接連結されるリンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原の分解速度を調節するように特異的に機能しないので、伸長部と見なされないことに、留意されたい。リンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）の分解速度に対して何らかの影響を及ぼすこともあるが、リンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）の分解速度を調節するためにも、他の分子からのその放出を調節するためにも選択されず、その代わり、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に結合させるように特異的に機能する。
【０１１８】
一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１を固相ペプチド合成中にペプチド抗原（Ａ）に連結させることができ、連結は、直接的であることもあり、または分解性ペプチドリンカーを含む伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）を介して間接的であることもある。典型的に、ペプチド抗原（Ａ）に直接または間接的に連結されるリンカー前駆体Ｘ１は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）上に備えられているリンカー前駆体Ｘ２との生体直交型反応を促進するように選択される。生体直交型反応は、ペプチド抗原（Ａ）を構成するいずれのアミノ酸の修飾ももたらすことなく、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）へのペプチド抗原（Ａ）の部位選択的連結を可能にする。生体直交型反応を可能にする好ましいリンカー前駆体Ｘ１としては、アジドまたはアルキンを有するものが挙げられる。抗原の組成に依存して、部位選択的反応性を可能にする追加のリンカー前駆体Ｘ１は、チオール、ヒドラジン、ケトンおよびアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、リンカー前駆体は、アジド官能基を有する。一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、アジドを有する非天然アミノ酸、例えば、アジド−リシンＬｙｓ（Ｎ３）である。そのような実施形態では、アジド官能性を有するリンカー前駆体Ｘ１に連結されているペプチド抗原（Ａ）は、疎水性分子（Ｈ）上に備えられているアルキン含有リンカー前駆体Ｘ２と反応することができ、その結果、ペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）を結合させるトリアゾールリンカーが形成されることになる。様々なリンカー前駆体（Ｘ１およびＸ２）およびリンカーは、至る所で説明される。
【０１１９】
本明細書では、リンカーおよびリンカー前駆体Ｘ１は、両方とも、Ｔａｇ（Ｔ）と呼ばれることがあるが、Ｔａｇ（Ｔ）の文脈は、Ｔａｇ（Ｔ）が、リンカーであるのか、リンカー前駆体（Ｘ１）であるのかを識別するために使用される。ペプチド抗原（Ａ）に、直接、または間接的に、必要に応じた伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくは必要に応じた荷電分子（Ｃ）によってのどちらかで、連結されるが、疎水性分子（Ｈ）にも粒子（Ｐ）にも連結されないＴａｇ（Ｔ）は、リンカー前駆体Ｘ１と呼ばれることもある。ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に連結させるＴａｇ（Ｔ）は、リンカー（Ｌ）と呼ばれることもある。リンカー前駆体Ｘ２は、リンカー前駆体Ｘ１と反応してリンカーを形成する。リンカー前駆体Ｘ１は、Ｔａｇと呼ばれることもありえ、リンカー前駆体Ｘ２は、Ｔａｇに対して特異的または反応性である官能基を含む、タグ反応性部分またはタグ反応性分子と呼ばれることがある。
【０１２０】
正味電荷：分子または、明記されている場合には、分子のセクション、が帯びている静電荷の合計。
【０１２１】
粒子：分子の集合体から構成されるナノサイズまたはマイクロサイズの超分子構造。本開示のペプチド抗原コンジュゲートは、集合してミセルまたは他の超分子構造を構築する、予め形成された粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）のどちらかを含む。ペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子は、細胞（例えば、抗原提示細胞などの免疫細胞）に取り込まれうる。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、水溶液中で粒子を形成する。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートによる粒子の形成は、ｐＨまたは温度依存性である。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートから構成されるナノ粒子は、５ナノメートル（ｎｍ）〜５００ｎｍの間の直径平均を有する。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートから構成されるナノ粒子は、１００ｎｍより大きいこともある。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートから構成されるナノ粒子は、大き過ぎて免疫細胞により取り込まれることができない、より大きい粒子構造（例えば、約５０００ｎｍより大きい粒子）に含まれ、これらのより大きい粒子構造が、ペプチド抗原コンジュゲートを含むより小さいナノ粒子をゆっくり放出する。
【０１２２】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、ナノ粒子を形成する。ナノ粒子は、疎水性相互作用によるペプチド抗原コンジュゲートの会合により形成され、したがって、超分子集合体と見なすことができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ミセルである。好ましい実施形態では、ナノ粒子ミセルは、直径約５〜５０ｎｍの間である。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、ミセルを形成し、ミセル形成は、温度依存性であるか、ｐＨ依存性であるか、または温度依存性かつｐＨ依存性である。一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、アジュバント特性を有するリガンド、例えばＰＲＲアゴニスト、に連結されているポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートを含み、ナノ粒子中でのＰＲＲアゴニストとペプチド抗原の連結は、被験体への投与後にＰＲＲアゴニストが自由に分散するのを防止し、それによって全身毒性が防止される。
【０１２３】
粒子は、ペプチド抗原コンジュゲートを構成する個々の分子の集合により形成されることもあり、または予め形成された粒子（Ｐ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートの場合には、粒子は、共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって架橋されていることもある。
【０１２４】
式に記載の予め形成された粒子（Ｐ）／粒子（Ｐ）：予め形成された粒子（Ｐ）または単に「粒子（Ｐａｒｔｉｃｌｅ）」（Ｐ）は、ペプチド抗原（Ａ）への連結前に既に形成されている粒子を表す。したがって、粒子（Ｐ）は、式に記載の粒子を記述するために使用され、疎水性分子（Ｈ）を含む２つまたはそれより多くのペプチド抗原コンジュゲートの集合により形成される粒子とは明確に異なる。明確にするために、ペプチド抗原コンジュゲートの集合により形成される粒子は、式に記載の予め形成された粒子（Ｐ）または粒子（Ｐ）とは明確に異なる。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）を粒子（Ｐ）に直接または間接的に連結させてペプチド抗原コンジュゲートを形成することができ、このペプチド抗原コンジュゲートは、水性条件で粒子になることができる。
【０１２５】
ペプチド抗原コンジュゲートにより形成された粒子と予め形成された粒子（Ｐ）との違いを正確に記述するために、式に記載の予め形成された粒子または粒子（Ｐ）を指す場合、文字ｐは、「粒子（Ｐａｒｔｉｃｌｅ）」では常に大文字であり、これにカッコでくくられた大文字（Ｐ）が続く、すなわち、「粒子（Ｐ）」である。一部の実施形態では、粒子（Ｐ）は、水性条件で形成され、そしてその後、ペプチド抗原（Ａ）に連結されて、水性条件で粒子のままであるペプチド抗原コンジュゲートを形成する、ＰＬＧＡ粒子（Ｐ）であることもある。一部の実施形態では、粒子（Ｐ）は、水性条件で形成され、そしてその後、ペプチド抗原（Ａ）に連結されて、水性条件で粒子のままであるペプチド抗原コンジュゲートを形成する、リポソーム粒子（Ｐ）などの、脂質から構成されることもある。
【０１２６】
パターン認識受容体（ＰＲＲ）：病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と呼ばれる、合成分子および天然に存在する分子の多様な群と結合する様々な細胞集団、特に自然免疫細胞、により発現される受容体。ＰＡＭＰは、ある特定の微生物およびウイルス上に存在する保存分子モチーフである。ＤＡＭＰは、細胞死または損傷中に放出または発現される細胞成分である。
【０１２７】
パターン認識受容体のＰＡＭＰまたはＤＡＭＰ活性化は、宿主細胞の生理の変更をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する。そのような生理的変化は、様々な炎症促進性および生存促進性遺伝子の発現を誘導するような細胞の転写プロファイルの変化を含みうる。これらの遺伝子の協調発現は、適応免疫を増強しうる。
【０１２８】
ＰＲＲにはいくつかのクラスがある。ＰＲＲの非限定的な例としては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体、およびＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）が挙げられる。そのようなＰＲＲのアゴニストを使用して、標的抗原に対する免疫応答を増強することができる。
【０１２９】
ＰＲＲのアゴニストは、アジュバントであり、リガンド、またはアジュバント特性を有するリガンドと呼ばれることもある。本開示の一部の実施形態では、ＰＲＲアゴニストは、ペプチド抗原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される。
【０１３０】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）１〜１３は、多様なＰＡＭＰを認識する膜貫通型ＰＲＲである。ＴＬＲには次の２つの広いカテゴリーがある：細胞表面に局在するＴＬＲ、およびエンドソーム内腔に局在するＴＬＲ。細胞表面に存在するＴＬＲは、典型的に細菌の認識に重要である。エンドソームの内腔に局在するＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ３、７、８および９は、核酸を認識するのに役立ち、それ故、典型的にウイルスの認識に重要であり、したがって、抗ウイルス免疫応答の促進に重要である。ポリイノシン・ポリシチジン酸は、ＴＬＲ−３のリガンドである。ＴＬＲ−７およびＴＬＲ−８は、１本鎖ＲＮＡならびにヌクレオチド塩基類似体およびイミダゾキノリンを認識する。ＴＬＲ−９は、主として細菌に見られる、非メチル化デオキシシチジレート・ホスフェート・デオキシグアニレート（ＣｐＧ）ＤＮＡを認識する。
【０１３１】
ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）およびＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）は、細胞質に局在している。ＲＬＲの非限定的な例としては、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＬＧＰ２が挙げられる。２２のヒトＮＬＲがあり、これらを５つの構造的に関連しているＮＬＲファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、ＰおよびＸに細分することができる。すべてのＮＬＲは、シグナル伝達に関与するＮ末端ドメイン、ヌクレオチド結合ＮＯＤドメイン、およびリガンド認識に重要なＣ末端ロイシンリッチ領域（ＬＲＲ）という、３つのドメインを有する。ＮＬＲの非限定的な例としては、ＮＡＬＰ３およびＮＯＤ２が挙げられる。
【０１３２】
パターン認識受容体に関するより多くの情報については、Ｗａｌｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．、３５巻：１５０１〜１５０３頁、２００７年を参照されたい。
【０１３３】
ペプチドまたはポリペプチド：アミド結合によって互いに結合されている２つまたはそれより多くの天然または非天然アミノ酸残基。アミノ酸残基は、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）を有することもある。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏで自然に起こる翻訳後修飾を模倣することもあり、非天然であることもある。ペプチド抗原コンジュゲートの成分のいずれか１つまたは複数がペプチドから構成されうる。
【０１３４】
ペプチドの長さの概念的上限はない。ペプチドの長さは、通常は、適用に依存して選択される。いくつかの実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、長さ３〜１，０００アミノ酸の間、通常は長さ３００アミノ酸以下でありうる、ペプチドから構成される。一部の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、長さ約１〜８アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、正荷電アミノ酸、負荷電アミノ酸、または正荷電アミノ酸と負荷電アミノ酸の両方から構成されるペプチドであり、通常は、長さ１６アミノ酸以下である。
【０１３５】
好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、５〜約５０アミノ酸の間、通常は、約７〜３５アミノ酸、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸のペプチドである。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、長さ約５０アミノ酸であるか、またはそれより長い。したがって、一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、タンパク質と見なすことができる。
【０１３６】
ペプチド抗原（Ａ）は、最小エピトープ（ｍｉｎもしくはＭＥと呼ばれることもある）であることもあり、または最小エピトープを含む長鎖ペプチド（ＬＰもしくはＳＬＰと呼ばれることもある）であることもあることに、留意されたい。したがって、最小エピトープまたは長鎖ペプチドが、ペプチド抗原コンジュゲートとして送達されると言われる場合には、最小エピトープまたは長鎖ペプチドが、別段の記述がない限り、ペプチド抗原（Ａ）であることは、理解される。
【０１３７】
一部の実施形態では、必要に応じた荷電分子（Ｃ）、抗原（Ａ）、必要に応じた伸長部（Ｂ１およびＢ２）、およびリンカー前駆体Ｘ１は、アミノ酸であり、固相ペプチド合成により、「ペプチド抗原断片」と呼ばれることもある連続ペプチド配列として調製されうる。ペプチド抗原断片の正味電荷またはＧＲＡＶＹの計算がリンカー前駆体Ｘ１を含まないことに留意されたい。
【０１３８】
ペプチド抗原を指すペプチド配列は、「ＰＡ」と表記され、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）を指すペプチド配列は、「ＰＮ」と表記され、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）を指すペプチド配列は、「ＰＣ」と表記される。ペプチド抗原（Ａ）を構成するアミノ酸の配列は、式ＰＡ１．．．ＰＡｎ（式中、ＰＡは、ペプチド抗原（Ａ）を構成する任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、整数値である）によって表される。例えば、８アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、ＰＡ１−ＰＡ２−ＰＡ３−ＰＡ４−ＰＡ５−ＰＡ６−ＰＡ７−ＰＡ８と表すことができる。Ｎ末端伸長部（Ｂ１）を構成するアミノ酸の配列は、式ＰＮ．．．ＰＮｎ（式中、ＰＮは、Ｎ末端伸長部を構成する任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、整数値である）によって表される。Ｃ末端伸長部（Ｂ２）を構成するアミノ酸の配列は、式ＰＣ１．．．ＰＣｎ（式中、ＰＣは、Ｃ末端伸長部を構成する任意のアミノ酸残基を表し、ｎは、整数値である）によって表される。
【０１３９】
ペプチド修飾：ペプチドは、下に示すようないくつかの修飾のうちの１つまたは複数を用いて、変更または別様に合成されることがある。加えて、これらのペプチドの類似体（非ペプチド有機分子）、誘導体（ペプチドから出発して得られる化学的に官能化されたペプチド分子）および改変体（ホモログ）を、本明細書に記載される方法において利用することができる。本明細書に記載されるペプチドは、Ｌバージョンおよび／またはＤバージョンのどちらかでありうる、アミノ酸、類似体、誘導体および改変体の配列から構成される。そのようなペプチドは、天然に存在するおよびそうでないペプチド、類似体、誘導体および改変体を含有しうる。
【０１４０】
様々な化学的手法によって、未修飾のペプチドと本質的に同じ活性を有し、必要に応じて他の望ましい性質を有する、誘導体を生成するように、ペプチドを修飾することができる。例えば、カルボキシル末端にあるのか側鎖にあるのかを問わず、ペプチドのカルボン酸基を、薬学的に許容されるカチオンの塩の形態で提供することができ、またはエステル化してＣＣ１〜ＣＣ１６エステル（式中、ＣＣは、炭素鎖を指す（したがって、ＣＣ１は、単一炭素を指し、ＣＣ１６は、１６個の炭素を指す））にすることができ、またはアミドに変換することができる。アミノ末端にあるのか側鎖にあるのかを問わず、ペプチドのアミノ基は、薬学的に許容される酸付加塩、例えば、ＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および他の有機塩の形態であることができ、または修飾され得るかまたはアミドに変換され得る。
【０１４１】
アミノ酸が共有結合性連結によってＰＲＲアゴニスト、例えばＴＬＲアゴニスト、例えば、イミダゾキノリンベースのＴＬＲ−７またはＴＬＲ−７／８アゴニストを含有するように、アミノ酸を修飾することができる。
【０１４２】
正電荷または負電荷または両方を含有する置換基を含有するように、ペプチドを修飾してもよい。正および／または負電荷は、ペプチドが存在するｐＨによる影響を受けうる。
【０１４３】
ペプチド側鎖のヒドロキシル基を、十分に認知されている手法を使用してＣＣ１〜ＣＣ１６アルコキシに、もしくはＣＣ１〜ＣＣ１６エステルに変換してもよく、または負電荷を導入するようにヒドロキシル基を変換（例えば、硫酸化もしくはリン酸化）してもよい。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環を、１つもしくは複数のハロゲン原子、例えば、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素で置換してもよく、またはＣＣ１〜ＣＣ１６アルキル、ＣＣ１〜ＣＣ１６アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはそのようなカルボン酸のアミドで置換してもよい。ペプチド側鎖のメチレン基を延長して、同族ＣＣ２〜ＣＣ４アルキレンにすることができる。チオールを使用してジスルフィド結合またはチオエーテルを、例えばマレイミドとの反応によって、形成することができる。チオールを、多数の十分に認知されている保護基のいずれか１つ、例えばアセトアミド基、で保護してもよい。当業者は、本発明のペプチドに環式構造を導入して、安定性増強をもたらすコンフォメーション上の制約を選択し、それを構造に備えさせるための方法も認知しているであろう。官能基に加えることができるさらなる修飾の詳細については、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ、２００６年を参照することができる。
【０１４４】
ペプチド抗原（Ａ）のペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）およびオルガノミメティック（ｏｒｇａｎｏｍｉｍｅｔｉｃ）実施形態であって、そのようなペプチドミメティックおよびオルガノミメティックの化学成分の三次元配置が、ペプチド主鎖および成分アミノ酸側鎖の三次元配置を模倣し、その結果、寛容もしくは免疫抑制を誘導する測定可能な能力、または刺激性免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくは抗体応答を生成する能力増強を有する、免疫原性ペプチドのそのようなペプチドミメティックおよびオルガノミメティックが得られる、実施形態が、想定される。
【０１４５】
薬学的に許容されるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Ｅ．  Ｗ．  ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）には、１つまたは複数の治療用がんワクチンおよびさらなる医薬剤などの、１つまたは複数の治療用組成物の薬学的送達に適している組成物および製剤が記載されている。
【０１４６】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール、またはこれらに類するものをビヒクルとして含む、注射可能な流体を通常は含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）のための従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤、ならびにこれらに類するもの、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有しうる。
【０１４７】
極性：物質の性質の記述。極性は、相対的な用語であり、窒素と水素間の結合などの、分子中の互いに結合している原子間の電気陰性度の差から生じる部分電荷を有する、分子または、分子の一部分を記載することができる。極性分子は、他の極性分子と相互作用することを好み、通常は、非極性分子と会合しない。特定の、非限定的な場合、極性基は、ヒドロキシル基、またはアミノ基、またはカルボキシル基、または荷電基を含有することがある。特定の、非限定的な場合、極性基は、水などの極性溶媒と相互作用することを好むこともある。特定の、非限定的な場合、さらなる極性基の導入は、分子の一部分についての溶解度を上昇させることもある。
【０１４８】
ポリマー：反復構造単位（モノマー）を含有する分子。本開示の至る所でより詳細で説明される通り、ポリマーは、ペプチド抗原コンジュゲートについての任意の数の成分に使用することができ、天然であってもよく、または合成であってもよい。好ましい実施形態では、疎水性または両親媒性ポリマーが、疎水性分子（Ｈ）として使用され、ペプチド抗原コンジュゲートの粒子集合を駆動する。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、アミノ酸を含むポリマーである。一部の実施形態では、伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、例えば、ＰＥＧ、ポリ（アミノ酸）またはこれらの組み合わせなどの、ポリマーを含む。開示される実施形態に含まれるポリマーは、有害な副作用を引き起こすことなく被験体に投与することができるポリマーナノ粒子を形成することができる。開示される実施形態に含まれるポリマーは、免疫応答を生じさせるために、または疾患を処置および／もしくは改善するために、被験体に投与することができる、ポリマーナノ粒子を形成することができる。開示される実施形態に含まれるポリマーは、例えば、免疫抑制または寛容を誘導するために使用されるアジュバントまたは分子、例えば、マクロライド、例えばラパマイシン、への連結を助長するために利用することができる、官能基を有する側鎖を含みうる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、両親媒性ジブロックコポリマーなどのブロックコポリマーを作出するようにリンカーによって連結されている、２つまたはそれより多くのポリマーブロックを含有することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーブロックは、性質的には主として疎水性でありうる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ペプチド、それらの類似体、誘導体および改変体からなる。本発明の実施に有用なポリマーの様々な組成は、他の箇所でより詳細に論じられる。
【０１４９】
重合：触媒、熱または光を用いて通常は行われる化学反応であって、モノマーが結合して鎖状の、または架橋した、高分子（ポリマー）を形成する化学反応。適切な置換基および化学反応を使用するさらなる化学合成により、鎖をさらに結合させることができる。モノマーは、反応性物質を含有しうる。重合は、一般に、付加または縮合により起こる。付加重合は、開始剤、通常はフリーラジカル、がモノマーの二重結合と反応すると、起こる。フリーラジカルは、二重結合の一方の側に付加して、他方の側に自由電子を生じさせる。次いで、この自由電子が別のモノマーと反応し、鎖は、自己成長する、したがって、成長鎖の末端に一度に１モノマー単位ずつ付加させることになる。縮合重合は、水分子から開裂される結果となる、２つのモノマーの反応を含む。重合の他の形態では、モノマーは、活性化モノマーの段階的導入、例えば、固相ペプチド合成中の段階的導入によって、成長鎖に１度に１つずつ付加される。
【０１５０】
精製された（される、されている）：物質の質を落とすまたは物質に夾雑する不純物または物質が比較的含まない組成物を有すること。精製された（される、されている）という用語は、相対的な用語であり、絶対純度を必要としない。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、その天然環境、例えば、細胞内にあるペプチドまたはタンパク質より濃縮されているものである。一実施形態では、調製物は、ペプチド抗原コンジュゲートが、調製物の全内容物の少なくとも５０％に相当するように精製される。実質的精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋である。したがって、１つの特定の、非限定的な例では、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞成分または夾雑ペプチドが９０％含まない。
【０１５１】
可溶性：溶媒に分子的にまたはイオン的に分散されて均一な溶液になることができる。ペプチドに言及するとき、可溶性ペプチドは、疎水性または他の非共有結合性相互作用によって集合して多量体または他の超分子構造を構築しない、溶液中の単一分子であると解される。可溶性分子は、単一分子として溶液に自由に分散されると解される。いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４に室温で最大少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌまで溶解する可溶性ペプチド抗原でありうる。他の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、室温でジメチルスルホキシドおよび／または他の有機溶媒に可溶性であることができるが、室温で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水などの水性溶媒に可溶性であることができない。本明細書に記載される疎水性分子は、下は約０．１ｍｇ／ｍＬに至るまで不溶性である。溶解度は、目視検査により、濁度測定により、または動的光散乱により、決定することができる。
【０１５２】
被験体：ヒトと非ヒト動物の両方を指し、非ヒト動物には、鳥類および非ヒト哺乳動物、例えば、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル）、伴侶動物（例えば、飼い慣らされたイヌおよびネコ）、家畜（例えば、ブタ、ヒツジ、ウシ、ラマおよびラクダ）、および飼い慣らされていない動物（例えば、大型のネコ科動物）が含まれる。
【０１５３】
超分子の：非共有結合性相互作用によって会合している２つまたはそれより多くの分子を指す。一部の実施形態では、分子は、疎水性相互作用に起因して会合する。一部の実施形態では、分子は、静電相互作用に起因して会合する。会合は、超分子複合体に、成分分子のどちらによっても共有されなかった新たな性質、例えば、免疫系との材料の相互作用に影響を与えるサイズ増大、および異なる免疫応答、を付与する。例えば、ペプチド抗原コンジュゲートは、凝集して超分子複合体を形成することができる。
【０１５４】
Ｔ細胞：免疫系の一部であり、免疫応答に関与しうる白血球の種類。Ｔ細胞は、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞を含むが、これらに限定されない。ＣＤ４  Ｔ細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を提示し、これらの細胞は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれることが多い。これらの細胞は、抗体応答および細胞傷害性Ｔ細胞応答を含む、免疫応答を調整することが多いが、ＣＤ４  Ｔ細胞は、免疫応答を抑制することもでき、ＣＤ４  Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞として作用することもある。ＣＤ８  Ｔ細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を提示し、細胞傷害性またはキラーＴ細胞と呼ばれることが多いが、ＣＤ８  Ｔ細胞は、免疫応答を抑制することもできる。
【０１５５】
テレケリック（ｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃ）：１つの反応性末端、または同じであってもよく異なっていてもよい２つの反応性末端を有する、ポリマーを記述するために使用される。この語は、末端および鉤爪をそれぞれ表すギリシャ語であるｔｅｌｏｓおよびｃｈｅｌｅに由来する。セミテレケリックポリマーは、重合などのさらなる反応を起こすことができる反応性官能基などの末端基を１つだけ有するポリマーを記載する。ヘテロテレケリックポリマーは、異なる反応特性を有する反応性官能基などの末端基を２つ有するポリマーを記載する。
【０１５６】
本明細書では、疎水性分子（Ｈ）は、一方または両方の末端に反応性基を有するポリマーから構成されうる。一部の実施形態では、アジュバントをポリマーの一方の末端に配置し、ポリマーの他方の末端を、ペプチド抗原に直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくはリンカー（Ｌ）によって間接的に連結されているリンカーと、反応させることができる。この例では、ポリマーは、アジュバントに対してセミテレケリックであり、これは、アジュバントが、疎水性分子（Ｈ）を含むポリマー鎖の一方の末端のみに結合されることを意味する。
【０１５７】
疾患を処置すること、予防すること、または改善すること：「処置すること」は、疾患または病的状態の徴候または症状またはマーカーを、それが発生し始めた後に、低減させる介入を指す。例えば、疾患を処置することは、腫瘍負荷の低減をもたらすことがあり、腫瘍負荷の低減は、腫瘍および／もしくは転移の数もしくはサイズの減少を意味し、または疾患を処置することは、自己免疫に関連する系を低下させる免疫寛容をもたらすこともある。疾患を「予防すること」は、疾患の完全発生を阻害することを意味する。疾患は、全く発生しないように予防されることもある。疾患は、重症度または程度または種類が進展しないように予防されることもある。「改善すること」は、がんなどの疾患の徴候または症状またはマーカーの数または重症度の低減を指す。
【０１５８】
疾患、または疾患に関連する病的状態の、徴候または症状またはマーカーを低減させることは、処置の任意の観察可能な有益効果、および／または症候性であるか否かを問わず、近位の代替エンドポイント、例えば腫瘍体積、に対する任意の観察可能な効果を指す。腫瘍またはウイルス感染に関連する徴候または症状を低減させることは、例えば、感受性被験体（例えば、まだ転移していない腫瘍を有する被験体、もしくはウイルス感染に曝露されうる被験体）における疾患の臨床症状の発症遅延によって、疾患の一部もしくはすべての臨床症状の重症度の低下によって、疾患のより緩徐な進行によって（例えば、腫瘍を有するもしくはウイルスに感染している被験体の寿命を延長することによって）、疾患の再燃数の低減によって、被験体の健康全般もしくは満足できる生活状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）の向上によって、または当技術分野において周知の他のパラメーター（例えば、特定の腫瘍もしくはウイルス感染に特異的なパラメーター）によって、証明することができる。「予防的」処置は、病態発生のリスクまたは重症度を低下させる目的で、疾患の徴候を示さないまたは初期徴候のみを示す被験体に投与される処置である。
【０１５９】
一例では、所望される応答は、被験体における腫瘍のサイズ、体積、成長速度、または数（例えば転移）の低減につながる免疫応答を誘導することである。例えば、薬剤（単数または複数）は、腫瘍のサイズ、体積または数を、所望の量、例えば、薬剤の非存在下での応答と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、減少させる免疫応答を誘導することができる。
【０１６０】
腫瘍またはがんまたは新生物性：良性であることもあり、または悪性であることもあるが、多くの場合、必ずしも臨床症状を生じさせるとは限らない、細胞の異常成長。「新生物性」細胞成長は、成長および阻害因子などの生理的合図に応答性でない細胞成長を指す。
【０１６１】
「腫瘍」は、新生物性細胞の収集物である。ほとんどの場合、腫瘍は、固形塊を形成する新生物性細胞の収集物を指す。そのような腫瘍は、固形腫瘍と呼ばれることがある。一部の白血病に関する場合などの、一部の場合、新生物性細胞は、固形塊を形成しないこともある。そのような場合、新生物性細胞の収集物は、液性がんと呼ばれることがある。
【０１６２】
がんは、固形または液性のどちらかである、新生物性細胞の悪性成長を指す。悪性と定義されるがんの特徴としては、転移、隣接細胞の正常機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、および炎症性応答または免疫学的応答の抑制または悪化、周囲または遠隔組織または器官、例えばリンパ節への浸潤などが挙げられる。
【０１６３】
実質的有害臨床症状を提示しない、および／または緩徐に成長している腫瘍は、「良性」と呼ばれる。
【０１６４】
「悪性」は、有意な臨床症状を引き起こすこと、または将来引き起こす可能性が高いことを意味する。周囲組織に浸潤する、ならびに／または転移する、ならびに／または近隣もしくは遠隔身体系に対して影響を与える化学媒介因子の産生および分泌により実質的な臨床症状を生じさせる、腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。
【０１６５】
「転移性疾患」は、元の腫瘍部位から離れて身体の他の部分に、例えば、血流経由で、リンパ系経由で、または腹腔もしくは胸腔などの体腔経由で移動した、がん細胞を指す。
【０１６６】
個体における腫瘍の量が、「腫瘍負荷」である。腫瘍負荷は、腫瘍の数、体積または質量として測定することができ、理学的検査、放射線イメージング、または病理学検査により評価されることが多い。
【０１６７】
「確立」または「既存」腫瘍は、治療が開始される時点で存在する腫瘍である。多くの場合、確立腫瘍は、診断検査により識別することができる。一部の実施形態では、確立腫瘍を触診することができる。一部の実施形態では、確立腫瘍は、少なくとも約５００ｍｍ３、例えば、少なくとも６００ｍｍ３、少なくとも７００ｍｍ３、または少なくとも８００ｍｍ３のサイズである。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１ｃｍ長である。固形腫瘍に関しては、確立腫瘍は、一般に、新たに確立したものであり、堅固な血液供給があり、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を誘導した可能性がある。
【０１６８】
上記で提供された定義が、許されない置換パターン（例えば、５つの異なる基で置換されたメチル、およびこれに類するもの）を含むことを意図しないことは、当業者には認識されるであろう。そのような許されない置換パターンは、当業者には容易に認識される。本明細書で開示されるおよび／または上記で定義されたいずれの官能基も、本明細書中で別段の指示がない限り、置換されていてもよく、または非置換であってもよい。別段の解説がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の指示被験体を含む。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ」または「Ｂ」を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、Ａを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、Ｂを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、またはＡとＢの両方を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を指す。核酸またはポリペプチドについて与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値が、近似値であり、説明のために提供されることを、さらに理解されたい。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験の際に使用することができるが、適する方法および材料が本明細書に記載される。矛盾がある場合、用語の説明を含めて、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法および例は、説明に役立つものに過ぎず、限定することを意図したものではない。
【０１６９】
免疫原性組成物
粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）をさらに含むペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子を含む新規免疫原性組成物が、本明細書に記載される。ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）の粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）への連結、例えば共有結合またはその他、の結果として得られる化合物を指す。疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）は、集合して粒子を構築するようにペプチド抗原コンジュゲートを誘導し、これは、ペプチド抗原（Ａ）に対する免疫応答の予想外の向上をもたらす。ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結されている必要に応じたＮ末端伸長部（Ｂ１）および／またはＣ末端伸長部（Ｂ２）であって、製造および生物活性の予想外の向上をもたらす、必要に応じたＮ末端伸長部（Ｂ１）および／またはＣ末端伸長部（Ｂ２）と；ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性の予想外の向上をもたらし、それによって、製造向上および生物活性向上をもたらす、必要に応じた荷電分子（Ｃ）と；ペプチド抗原（Ａ）に連結されているリンカー前駆体Ｘ１と、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）上に備えられているリンカー前駆体Ｘ２との反応、それによる、効率的過程でのペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）と粒子（Ｐ）との結合の結果として生じる必要に応じたリンカー（Ｌ）であって、ペプチド抗原コンジュゲートの製造効率の予想外の向上をもたらす、必要に応じたリンカー（Ｌ）とを、さらに含むことができる。ペプチド抗原コンジュゲートを構成する成分は、任意の適する手段によって連結させることができ、至る所でより詳細に説明される。
【０１７０】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に直接連結されて、式Ａ−ＨまたはＡ−Ｐのペプチド抗原コンジュゲートを形成する。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に、リンカー（Ｌ）によって連結されて、式Ａ−Ｌ−ＨまたはＡ−Ｌ−Ｐのペプチド抗原コンジュゲートを形成する。さらに他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に、直接、またはリンカー（Ｌ）によってのどちらかで、連結されている伸長部（Ｂ１またはＢ２）に連結されて、式Ａ−Ｂ２−Ｈ、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ、Ｈ−Ｂ１−Ａ、Ｈ−Ｌ−Ｂ１−Ａ、Ａ−Ｂ２−Ｐ、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ、Ｐ−Ｂ１−ＡまたはＰ−Ｌ−Ｂ１−Ｐのいずれか１つのペプチド抗原コンジュゲートを形成する。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、リンカー前駆体Ｘ１に直接または伸長部（Ｂ１およびＢ２）によって連結されて、式Ａ−Ｘ１、Ａ−Ｂ２−Ｘ１、Ｘ１−ＡまたはＸ１−Ｂ１−Ａのペプチド抗原断片を形成し、この断片が、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）上のリンカー前駆体Ｘ２、すなわち、Ｘ２−ＨまたはＸ２−Ｐ、と反応して、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に結合させるリンカー（Ｌ）を形成し、その結果、式、すなわち、Ａ−Ｌ−Ｈ、Ａ−Ｌ−Ｐ、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ、Ｈ−Ｌ−Ａ、Ｐ−Ｌ−Ａ、Ｈ−Ｂ１−Ａ、またはＰ−Ｂ１−Ａ、のいずれか１つのペプチド抗原コンジュゲートが得られる。本開示において、そのような実施形態は、被験体において免疫応答を誘導するのに有用であることが示される、粒子を水性条件で形成することが示される。
【０１７１】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、両方の伸長部（Ｂ１およびＢ２）に連結される。そのような実施形態は、式Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｈ、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｐ、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ、Ｈ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、Ｈ−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、Ｐ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、またはＰ−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２のペプチド抗原コンジュゲートを含む。本開示において、そのような実施形態は、被験体における免疫応答を誘導するのに有用であることが実証される、粒子を水性条件で形成することが示される。
【０１７２】
一部の実施形態では、静電荷を付与する官能基を含有する分子、すなわち、荷電分子（Ｃ）は、ペプチド抗原（Ａ）に、直接、または間接的に、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／もしくはＢ２）、必要に応じたリンカー（Ｌ）、または疎水性分子（Ｈ）もしくは粒子（Ｐ）によって、連結される。荷電分子によりペプチド抗原コンジュゲートに付与される電荷は、水性条件で形成される超分子構造を安定させる。荷電分子（Ｃ）を含むペプチド抗原コンジュゲートの非限定的な例としては、Ｃ−Ａ−Ｈ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｈ、Ｃ−Ａ−Ｂ２−Ｈ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｈ、Ａ−Ｈ（Ｃ）、Ａ−Ｂ２−Ｈ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｈ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｈ（Ｃ）、Ｃ１−Ａ−Ｈ（Ｃ２）、Ｃ１−Ａ−Ｂ２−Ｈ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｈ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｈ（Ｃ２）、Ｈ−Ａ−Ｃ、Ｈ−Ｂ１−Ａ−Ｃ、Ｈ−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｈ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｈ（Ｃ）−Ａ、Ｈ（Ｃ）−Ｂ１−Ａ、Ｈ（Ｃ）−Ａ−Ｂ２、Ｈ（Ｃ）−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、Ｈ（Ｃ１）−Ａ−Ｃ２、Ｈ（Ｃ１）−Ｂ１−Ａ−Ｃ２、Ｈ（Ｃ１）−Ａ−Ｂ２−Ｃ２、Ｈ（Ｃ１）−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ２、Ｃ−Ａ−Ｌ−Ｈ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｌ−Ｈ、Ｃ−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ、Ａ−Ｌ−Ｈ（Ｃ）、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｌ−Ｈ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（Ｃ）、Ｃ１−Ａ−Ｌ−Ｈ（Ｃ２）、Ｃ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｌ−Ｈ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（Ｃ２）、Ｈ−Ｌ−Ａ−Ｃ、Ｈ−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｃ、Ｈ−Ｌ−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｈ−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｈ（Ｃ）−Ｌ−Ａ、Ｈ（Ｃ）−Ｌ−Ｂ１−Ａ、Ｈ（Ｃ）−Ｌ−Ａ−Ｂ２、Ｈ（Ｃ）−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、Ｈ（Ｃ１）−Ｌ−Ａ−Ｃ２、Ｈ（Ｃ１）−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｃ２、Ｈ（Ｃ１）−Ｌ−Ａ−Ｂ２−Ｃ２、Ｈ（Ｃ１）−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ２、Ｃ−Ａ−Ｐ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｐ、Ｃ−Ａ−Ｂ２−Ｐ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｐ、Ａ−Ｐ（Ｃ）、Ａ−Ｂ２−Ｐ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｐ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｐ（Ｃ）、Ｃ１−Ａ−Ｐ（Ｃ２）、Ｃ１−Ａ−Ｂ２−Ｐ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｐ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｐ（Ｃ２）、Ｐ−Ａ−Ｃ、Ｐ−Ｂ１−Ａ−Ｃ、Ｐ−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｐ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｐ（Ｃ）−Ａ、Ｐ（Ｃ）−Ｂ１−Ａ、Ｐ（Ｃ）−Ａ−Ｂ２、Ｐ（Ｃ）−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、Ｐ（Ｃ１）−Ａ−Ｃ２、Ｐ（Ｃ１）−Ｂ１−Ａ−Ｃ２、Ｐ（Ｃ１）−Ａ−Ｂ２−Ｃ２、Ｐ（Ｃ１）−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ２、Ｃ−Ａ−Ｌ−Ｐ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｌ−Ｐ、Ｃ−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ、Ａ−Ｌ−Ｐ（Ｃ）、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｌ−Ｐ（Ｃ）、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ（Ｃ）、Ｃ１−Ａ−Ｌ−Ｐ（Ｃ２）、Ｃ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｌ−Ｐ（Ｃ２）、Ｃ１−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｐ（Ｃ２）、Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｃ、Ｐ−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｃ、Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｐ−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ、Ｐ（Ｃ）−Ｌ−Ａ、Ｐ（Ｃ）−Ｌ−Ｂ１−Ａ、Ｐ（Ｃ）−Ｌ−Ａ−Ｂ２、Ｐ（Ｃ）−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２、Ｐ（Ｃ１）−Ｌ−Ａ−Ｃ２、Ｐ（Ｃ１）−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｃ２、Ｐ（Ｃ１）−Ｌ−Ａ−Ｂ２−Ｃ２またはＰ（Ｃ１）−Ｌ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｃ２が挙げられる。
【０１７３】
荷電分子（Ｃ）は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させる。荷電分子（Ｃ）をペプチド抗原コンジュゲートに直接連結させてもよい。あるいは、荷電分子（Ｃ）を、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子と会合する別の分子上に備えさせてもよい。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、疎水性分子（Ｈ）と連結されて、式Ｃ−Ｈ、またはＣ−Ａ’−Ｈ（式中、Ａ’は、保存抗原である）の荷電分子コンジュゲートを形成し、このコンジュゲートが、水性条件で、式［Ｃ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）のペプチド抗原コンジュゲートと混合され、結果として生じる粒子は、Ｃ−Ｈ、またはＣ−Ａ’−Ｈとペプチド抗原コンジュゲートとを含む。
【０１７４】
疎水性分子（Ｈ）は、ペプチド抗原コンジュゲートを水性条件で集合して粒子を構築するように誘導する任意の適する分子を含みうる。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートを構成する疎水性分子（Ｈ）は、制限された水溶解度しか有さないポリマーである。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、特定の温度またはｐＨ値で制限された水溶解度しか有さない、温度またはｐＨ応答性ポリマーである。他の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、脂質、脂肪酸またはコレステロールである。多くの疎水性分子（Ｈ）が、本開示に有用であり、至る所でより詳細に説明される。
【０１７５】
本明細書で開示されるペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子は、被験体において免疫応答を誘導するのに有用である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原を含むペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子は、がんの処置または予防のために、Ｔ細胞応答、例えば、細胞傷害性ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導するために被験体に提供される。一部の実施形態では、感染性疾患抗原を含むペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子は、感染性疾患の処置または予防のために、Ｔ細胞応答、例えば、細胞傷害性ＣＤ４もしくはＣＤ８  Ｔ細胞応答または抗体応答を誘導するために被験体に提供される。一部の実施形態では、自己抗原を含むペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子は、自己免疫疾患の処置のために、免疫寛容原性または抑制性Ｔ細胞応答を誘導するために被験体に提供される。
【０１７６】
ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）、必要に応じたＮ末端および／またはＣ末端伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）、必要に応じたリンカー（Ｌ）、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）および必要に応じた荷電分子（Ｃ）を含む。これらの成分の各々は、下で、および至る所でより詳細に、説明される。
【０１７７】
ペプチド抗原（Ａ）
ペプチド抗原（Ａ）は、被験体において免疫応答を誘導するのに有用であるいずれの抗原であってもよい。ペプチド抗原（Ａ）は、その適用に求められる免疫応答の性質に依存して炎症促進性免疫応答または免疫寛容原性免疫応答のどちらかを誘導するために使用することができる。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、腫瘍関連抗原、例えば、自己抗原、ネオ抗原、または腫瘍関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７）である。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、感染性疾患抗原、例えば、ウイルス、細菌、真菌または原生動物微生物病原体から単離されたタンパク質に由来するペプチドである。さらに他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、アレルギーまたは自己免疫を引き起こすことが公知であるかまたは引き起こすことが疑われる、アレルゲンまたは自己抗原に由来するペプチドである。
【０１７８】
ペプチド抗原（Ａ）は、被験体において免疫応答、例えばＴ細胞またはＢ細胞応答、を誘導することができる、アミノ酸またはペプチドミメティックの配列から構成される。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、アミノ酸、または翻訳後修飾を有するアミノ酸、非天然アミノ酸、またはペプチドミメティックを含む。ペプチド抗原は、抗原または予測される抗原、すなわち、Ｔ細胞もしくはＢ細胞エピトープを有する抗原を有する、天然、非天然もしくは翻訳後修飾アミノ酸、ペプチドミメティックまたはこれらの任意の組み合わせについてのいずれの配列であってもよい。
【０１７９】
免疫原性組成物は、異なるペプチド抗原（Ａ）組成を各々が有する、１つまたは複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含みうる。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、特有のペプチド抗原（Ａ）組成を各々が有する最大５０種の異なるペプチド抗原コンジュゲートを有する粒子を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、２０の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含むモザイク粒子を含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は、５つの異なるペプチド抗原コンジュゲートを含むモザイク粒子を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、特有のペプチド抗原コンジュゲートから各々集合した２０の異なる粒子組成物を含む（すなわち、各々の粒子が単一のペプチド抗原コンジュゲート組成物を含有する）。他の実施形態では、免疫原性組成物は、特有のペプチド抗原コンジュゲートから各々集合した５つの異なる粒子組成物を含む（すなわち、各々の粒子が単一のペプチド抗原コンジュゲート組成物を含有する）。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、単一のペプチド抗原コンジュゲート組成物から構成される単一の粒子組成物を含む。
【０１８０】
ペプチド抗原（Ａ）の長さは、特定の適用に依存し、通常は約５〜約５０アミノ酸の間である。好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、約７〜３５アミノ酸の間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５アミノ酸である。他の実施形態では、ペプチド抗原は、ポリペプチドの断片である。さらに他の場合には、ペプチド抗原は、完全長ポリペプチド、例えば、組換え発現されうるタンパク質抗原である。腫瘍関連抗原、感染性疾患抗原、アレルゲンまたは自己抗原に基づくペプチド抗原（Ａ）を、好ましくは長さ５０アミノ酸以下だが、完全長配列として送達することができる。好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、７〜３５アミノ酸、通常は約２５である。したがって、長さ２５アミノ酸より長い腫瘍関連抗原、感染性疾患抗原、アレルゲンまたは自己抗原、例えば１００アミノ酸抗原については、抗原は、各々のペプチド抗原（Ａ）が特有のアミノ酸組成を有する、７〜３５アミノ酸、例えば２５アミノ酸、ペプチド抗原（Ａ）に分割することができ；またはペプチド抗原（Ａ）は、重複ペプチドプールである場合もあり、この場合、抗原は、重複配列を有する、設定数の７〜３５アミノ酸、例えば２５アミノ酸、ペプチド抗原（Ａ）に分割される。例えば、１００アミノ酸抗原を含む重複ペプチドプールは、１２個のアミノ酸によって各々が相殺される８つの２５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）に分割することができる（すなわち、１００アミノ酸ペプチド配列を構成する、結果として得られる２５アミノ酸ペプチド各々は、前のペプチドからの１３番目のアミノ酸位置で開始する）。抗原からペプチドプールを生成するための多くの順列が存在することは、当業者には理解される。
【０１８１】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ分子に結合することがｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される（または実験により測定される）、腫瘍関連抗原、感染性疾患抗原、アレルゲンまたは自己抗原の一部分を含む、最小ＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープである。腫瘍関連抗原については、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ分子に結合することがｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される（または実験により測定される）最小ＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープであるペプチド抗原（Ａ）は、腫瘍細胞に特有であるアミノ酸の配列であるべきでもある。ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩへの結合を予測するためのアルゴリズムは、広く入手可能である（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３６巻：Ｗ５０９〜Ｗ５１２頁、２００８年およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／を参照されたい）。特定の被験体（例えば、患者）のための個別化治療の一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートを構成するペプチド抗原（Ａ）は、その被験体により発現される特定のＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子に対して＜１，０００ｎＭの結合親和性を有すると予測される、通常は７〜１３アミノ酸ペプチドである、腫瘍関連抗原、感染性疾患抗原、アレルゲンまたは自己抗原からの最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを含みうる。特定の被験体（例えば、患者）のための個別化治療の一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、その被験体により発現される特定のＭＨＣ−ＩＩ対立遺伝子に対して＜１，０００ｎＭの結合親和性を有すると予測される、１０〜１６アミノ酸ペプチドである、腫瘍関連抗原、感染性疾患抗原、アレルゲンまたは自己抗原からの最小ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含みうる。好ましい実施形態では、最小ＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープが、腫瘍関連抗原についても、感染性疾患抗原についても、アレルゲンについても、自己抗原についても同定することができない場合、または腫瘍関連抗原、感染性疾患抗原、アレルゲンもしくは自己抗原が、複数のＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含有する場合、ペプチド抗原（Ａ）は、１６〜３５アミノ酸の間であってもよく、可能性のあるすべてのＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含有しうるように、最大５０アミノ酸、例えば、最大３５アミノ酸、最大２５アミノ酸、または最大２０アミノ酸、または最大１６アミノ酸であってもよい。
【０１８２】
本開示の一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、腫瘍関連抗原に由来する。腫瘍関連抗原は、健常細胞上に存在するが腫瘍細胞により優先的に発現される自己抗原、または腫瘍細胞に特異的であって個々の患者に特有のものである異常タンパク質であるネオ抗原、のどちらかでありうる。適する自己抗原としては、腫瘍細胞により優先的に発現される抗原、例えば、ＣＬＰＰ、サイクリン−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＳＳＸ２、ＸＡｇＥ１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、チロシナーゼ、ＣＤ４５、グリピカン−３、ＩＧＦ２Ｂ３、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ５ＡＣ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３が挙げられる。ネオ抗原は、ＤＮＡ、ＲＮＡスプライス改変体の変異および翻訳後修飾の変化（これらのすべてが、ネオ抗原と総称されるまたは予測ネオ抗原と呼ばれることもあるデノボタンパク質産物をもたらす可能性がある）につながりうる、がんの固有の遺伝的不安定性から生じる。ＤＮＡ変異は、非同義ミスセンス変異、ナンセンス変異、挿入、欠失、染色体逆位および染色体転座（これらのすべてが、新規遺伝子産物、したがって、ネオ抗原をもたらす可能性がある）を含む、ＤＮＡに対する変化を含む。ＲＮＡスプライス部位の変化は、新規タンパク質産物をもたらすことがあり、ミスセンス変異は、抗原性でありうる翻訳後修飾（例えば、リン酸化）を許容するアミノ酸を導入することもある。さらに、腫瘍細胞の不安定性は、ある特定の転写因子の後成的変化および活性化をもたらすことがあり、その結果、健常な非がん性細胞により発現されないある特定の抗原が、腫瘍細胞により選択的に発現されることになることもある。
【０１８３】
個別化がんワクチンに使用されるペプチド抗原コンジュゲートは、腫瘍細胞に特有である腫瘍関連抗原の一部分を含むペプチド抗原（Ａ）を含むべきである。ミスセンス変異から生じるネオ抗原を含むペプチド抗原（Ａ）は、１つまたは複数のヌクレオチド多型によりコードされるアミノ酸変化を包含するべきである。フレームシフト変異、スプライス部位改変体、挿入、逆位および欠失から生じるネオ抗原を含むペプチド抗原（Ａ）は、新規ペプチド配列、および新規ペプチド配列の接合部を包含するべきである。新規翻訳後修飾を有するネオ抗原を含むペプチド抗原（Ａ）は、翻訳後修飾を有するアミノ酸、例えば、リン酸塩またはグリカンを包含するべきである。好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、変異に起因して生じるアミノ酸変化または新規接合部が両側に隣接している、０〜２５個のアミノ酸を含む。一実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、単一ヌクレオチド多型から生じるアミノ酸変化が両側に隣接している１２個のアミノ酸を含む、ネオ抗原配列、例えば、１３番目のアミノ酸が単一ヌクレオチド多型の結果として生じるアミノ酸残基である、２５アミノ酸ペプチドである。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、新規翻訳後修飾を有するアミノ酸が両側に隣接している１２個のアミノ酸を含む、ネオ抗原配列、例えば、１３番目のアミノ酸が新規翻訳後修飾部位の結果として生じるアミノ酸残基である、２５アミノ酸ペプチドである。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、挿入、欠失または逆位によって生じた新規接合部が両側に隣接している０〜１２個のアミノ酸を含む、ネオ抗原配列である。一部の場合には、新規配列の結果として生じるネオ抗原を含むペプチド抗原（Ａ）は、同じく生じることがある新規接合部の両側に０〜２５個のアミノ酸を含む、新規配列全体を包含しうる。
【０１８４】
本開示の免疫原性組成物のためのペプチド抗原（Ａ）として適する腫瘍関連抗原は、当業者に周知の様々な手法によって同定することができる。腫瘍関連抗原は、健常細胞、すなわち、被験体からの非がん性細胞と比較して、腫瘍細胞のタンパク質発現を評価することにより、同定することができる。タンパク質発現の適する評価方法としては、免疫組織化学、免疫蛍光検査、ウェスタンブロット、クロマトグラフィー（すなわち、サイズ排除クロマトグラフィー）、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。優先的に腫瘍細胞により発現されるが、健常細胞により発現されない、または制限された数の健常細胞によってしか発現されない（例えば、ＣＤ２０）タンパク質は、適する腫瘍関連抗原である。ＲＮＡとして発現され、患者抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ対立遺伝子と結合すると予測されるペプチドを産生する、タンパク質コードＤＮＡの変異を同定するための、患者腫瘍生検試料のＤＮＡおよびＲＮＡシークエンシング、続いてのバイオインフォマティクスもまた、本開示の免疫原性組成物のためのペプチド抗原（Ａ）として適する腫瘍関連抗原を同定するために使用することができる。
【０１８５】
好ましい実施形態では、免疫原性組成物のためのペプチド抗原（Ａ）として適する腫瘍関連抗原は、質量分析を使用して同定される。適するペプチド抗原（Ａ）は、患者腫瘍生検試料からのＭＨＣ分子、しかし同じ被験体からの健常組織からのものでないＭＨＣ分子からの溶出後に質量分析によって同定されたペプチドである（すなわち、ペプチド抗原は、同じ被験体の健常細胞ではなく腫瘍細胞上にのみ存在する）。質量分析を単独で使用してもよく、または腫瘍関連抗原を同定するための他の手法と組み合わせて使用してもよい。当業者は、本開示の発明の実施のためのペプチド抗原（Ａ）として適しているネオ抗原などの腫瘍関連抗原を同定するための多くの方法（Ｙａｄａｖら、Ｎａｔｕｒｅ、５１５巻：５７２〜５７６頁、２０１４年を参照されたい）があることを認知している。
【０１８６】
好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）として使用される腫瘍関連抗原は、新生物性細胞の集団内でクローナルまたはほぼクローナルであり、これらは、他の点では不均質と見なされうる。
【０１８７】
個別化がんワクチン接種スキームにおけるペプチド抗原（Ａ）としての使用に選択される腫瘍関連抗原は、ペプチド−ＭＨＣ結合および／またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測ＭＨＣ結合親和性ならびに腫瘍内のＲＮＡ発現レベルの質量分析による確認に基づいて、選択することができる。これらのデータは、腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞により発現され、提示されるか否か、したがって、Ｔ細胞の適する標的であるか否かについての情報を提供する。そのような基準を使用して、個別化がんワクチンに使用するペプチド抗原（Ａ）を選択することができる。
【０１８８】
免疫原性組成物に基づく個別化がんワクチンは、特有のペプチド抗原（Ａ）組成を各々が有する、１つまたは複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含みうる。一部の実施形態では、個別化がんワクチンは、特有のペプチド抗原（Ａ）を各々が有する１０〜５０の異なるペプチド抗原コンジュゲート組成物を含有しうる。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、長さ７〜３５アミノ酸の間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５アミノ酸、通常は５０アミノ酸以下のペプチド抗原（Ａ）を各々が含む、２０の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む。非限定的な例では、長さ８アミノ酸のペプチド抗原（Ａ）から構成される２０の異なるペプチド抗原コンジュゲートから形成される粒子から構成される免疫原性組成物が、個別化がんワクチンとして使用される。別の非限定的な例では、長さ２５アミノ酸のペプチド抗原（Ａ）から構成される２０の異なるペプチド抗原コンジュゲートから形成される粒子から構成される免疫原性組成物が、個別化がんワクチンとして使用される。
【０１８９】
５０より多くの腫瘍関連ネオ抗原を有する高度に変異した腫瘍を有する患者については、ダウンセレクションプロセスを使用して、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンにおける使用のためのペプチド抗原（Ａ）を選択してもよい。一部の実施形態では、ダウンセレクションプロセスは、最も高いＭＨＣ結合親和性および腫瘍細胞内でのＲＮＡ発現レベルを有すると予測されるエピトープを含むペプチド抗原（Ａ）を選択するために使用される。さらなる基準を、腫瘍に関連する自己抗原またはネオ抗原の選択に適用してもよい。例えば、自己免疫につながりうる、他の自己抗原と反応するＴ細胞をもたらすペプチド抗原（Ａ）の予測される免疫原性または予測される能力は、考えられるさらなる基準である。例えば、腫瘍関連抗原を含むペプチド抗原（Ａ）であって、免疫原性が高いと予測されるが、自己免疫につながる可能性は低いとも予測されるペプチド抗原（Ａ）は、個別化がんワクチンにおける使用のための可能性のあるペプチド抗原（Ａ）を選択するために使用される基準である。一部の実施形態では、健常細胞上に見られる自己抗原と反応するＴ細胞または抗体応答をもたらすと予想されるネオ抗原は、ペプチド抗原（Ａ）としての使用に選択されない。予測されるネオ抗原がより少ない、例えば２０〜５０である、患者については、ダウンセレクションプロセスは、重要な意味を持たないことがあり、そのため、２０〜５０の予測ネオ抗原すべてが、個別化がんワクチンにおいてペプチド抗原（Ａ）として使用されうる。
【０１９０】
がんワクチンは、患者特異的である腫瘍関連抗原および／または患者間で共有される腫瘍関連抗原を含むペプチド抗原（Ａ）を含みうる。例えば、腫瘍関連抗原は、保存された自己抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１（精巣がん）もしくはｇｐ１００（メラノーマ）であることもあり、または抗原は、通常は健常細胞により発現されず、患者間で保存された、隠れたエピトープ、例えば、Ｎａ１７（メラノーマ）であってもよい。本開示の免疫原性組成物は、偶然に予測されるより高い頻度で存在するある特定の遺伝子または遺伝子領域の高頻度変異である、いわゆるホットスポット変異から生じる、ペプチド抗原（Ａ）を含みうる。ホットスポット変異の非限定的な例としては、メラノーマ、乳頭状甲状腺癌および結腸直腸癌に共通して見られる、ＢＲＡＦタンパク質のＶ６００Ｅ変異、または最もよく見られる変異の１種であるＫＲＡＳ  Ｇ１２変異、例えばＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃが挙げられる。多数の適する自己抗原、ならびにホットスポット変異から生じるネオ抗原が公知であり、参照により本明細書に組み込まれる：Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３４巻：１５５〜１６３頁、２０１６年；Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，  Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３巻：１５〜２０頁、２０１３年を参照されたい。
【０１９１】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、血液腫瘍からのものであることもある。血液腫瘍の非限定的な例としては、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病）を含む白血病、真正赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常が挙げられる。
【０１９２】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、固形腫瘍からのものであることもある。肉腫および癌腫などの、固形腫瘍の非限定的な例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性疾患、膵がん、乳がん（基底乳癌、腺管癌および乳房小葉癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられる。いくつかの例では、腫瘍は、メラノーマ、肺がん、リンパ腫、乳がんまたは結腸がんである。
【０１９３】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、腺管癌または小葉癌などの、乳がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、前立腺がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫またはメラノーマなどの、皮膚がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、腺癌、気管支肺胞上皮癌（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｖｅｏｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、または小細胞癌などの、肺がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、膠芽腫または髄膜腫などの、脳がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、結腸がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、肝細胞癌などの、肝がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、膵がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、腎細胞癌などの、腎がんからの腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、精巣がんからの腫瘍関連抗原である。
【０１９４】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、上皮内癌、または外陰上皮内新生物、子宮頸部上皮内新生物、または膣上皮内新生物の改変体などの、前悪性状態に由来する腫瘍関連抗原である。
【０１９５】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、ウイルス、細菌または真菌などの、感染性因子からの抗原である。さらなる実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、感染性因子に由来するペプチドまたは糖ペプチド、例えば、ＨＩＶエンベロープ融合ペプチド、またはＨＩＶからのＶ３もしくはＶ１／Ｖ２糖ペプチドである。
【０１９６】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、自己抗原を表す。自己抗原は、患者自身のＭＨＣ−Ｉ分子に関連して提示される自己抗原に対する自己反応性について被験体自身のＴ細胞のスクリーニングに基づいて、同定および選択することができる。あるいは、ペプチド抗原は、（ｉ）被験体自身のＭＨＣ−Ｉ分子に対する高い結合親和性が予測される、ならびに（ｉｉ）発現される、および／または被験体の自己免疫症候群の原因である病態に関連することが公知である、可能性のある自己抗原を予測するためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して、選択することができる。他の実施形態では、ペプチド抗原は、アレルゲンに由来するＣＤ４エピトープを表し、患者自身のＭＨＣ−ＩＩ分子に対して高い結合親和性を有するペプチド抗原に基づいて選択される。
【０１９７】
免疫応答をもたらし、疾患の予防または処置に有用である、任意のペプチド、タンパク質または翻訳後修飾タンパク質（例えば、糖タンパク質）を、本発明の免疫原性組成物において使用するためのペプチド抗原（Ａ）としての使用に選択することができることは、当業者には認識される。
【０１９８】
伸長部（Ｂ１およびＢ２）：
必要に応じたＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結される分子を意味する。Ｎ末端およびＣ末端伸長部Ｂ１およびＢ２は、次のうちのいずれか１つまたは複数から構成されうる：非天然アミノ酸を含む、アミノ酸；親水性エチレンオキシドモノマー（例えば、ＰＥＧ）；疎水性アルカン鎖；もしくはこれらに類するもの；またはこれらの組み合わせ。Ｎ末端およびＣ末端伸長部Ｂ１およびＢ２は、任意の適する手段によって、例えば、安定したアミド結合によって、ペプチド抗原（Ａ）に連結される。
【０１９９】
一部の実施形態では、伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、ペプチド抗原（Ａ）の分解速度を制御するように機能するが、いずれか１つまたは複数のさらなる機能を果たすこともできる。一部の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端伸長部（Ｂ１またはＢ２）は、遊離しており（この場合、Ｎ末端またはＣ末端伸長部の一方の末端は、ペプチド抗原（Ａ）に連結されており、他方の末端は、別の分子に連結されていない）、ペプチド抗原の分解を緩徐化するように機能することができる。例えば、Ｂ１ペプチドベースの伸長部をアミド結合によってペプチド抗原のＮ末端に連結させて分解を緩徐化することができる。他の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）を異種分子に連結させることができ、これらの伸長部は、リンカーとして機能し、ペプチド抗原（Ａ）分解を調節することもできる。リンカー機能を提供するＮ末端および／またはＣ末端伸長部は、ペプチド抗原を、直接、またはリンカー（Ｌ）によって間接的に、のどちらかで、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）、および／または荷電分子（Ｃ）に連結させることができる。
【０２００】
一部の実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、任意の２つの異種分子間に距離、すなわち間隔、を設けるように機能する。他の実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、ペプチド抗原コンジュゲートに疎水性または親水性を付与するように機能する。さらに他の実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の組成は、剛性または可撓性を付与するように選択されうる。他の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定化するのに役立ちうる。
【０２０１】
一部の実施形態では、伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）は、生理的ｐＨで静電荷を付与する荷電官能基、例えば、荷電アミノ酸残基（例えば、アルギニン、リシン）から構成される。伸長部に存在する荷電残基の数は、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷を調節するために使用することができる。プロテアーゼにより認識され、特定の静電荷を付与する、ペプチドベースの伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）であって、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させるように機能する伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の選択についての系統的プロセスを説明するアルゴリズムが、本明細書で開示される。
【０２０２】
加えて、一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）に付加されるＣ末端伸長部（Ｂ２）は、βシート形成を妨げて固相ペプチド合成中の配列短縮を防止するアミノ酸配列をＢ２に組み込むことにより、［Ｃ］−［Ｂ１］−Ａ−Ｂ２−［Ｘ１］（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）を含むペプチドの製造を助長するように、選択される。非限定的な例では、Ｃ末端ジペプチドリンカー（Ｂ２）であるＧｌｙ−Ｓｅｒが、固相ペプチド合成中に、プソイドプロリンジペプチド（例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ））として組み込まれる。さらなる実施形態では、プロリンは、カテプシン切断性Ｃ末端伸長部（Ｂ２）配列、例えば、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号２１）に組み入れられ、それによって、プロリンが組み入れられて、製造の助長も、エンドソームプロテアーゼによる伸長部のプロセシングの促進もする。
【０２０３】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、そのＣ末端がＢ２伸長部に連結され、このＢ２伸長部が、直接、またはリンカー（Ｌ）によって間接的に、のどちらかで、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に連結される。一部の実施形態では、Ｂ１伸長部は、ペプチド抗原のＮ末端に連結され、Ｂ２伸長部は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結され、この場合、Ｂ１またはＢ２のどちらかが、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に、直接、またはリンカー（Ｌ）を介してのどちらかで、連結される。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、そのＮ末端がＢ２伸長部に連結され、このＢ２伸長部は、直接、またはリンカー（Ｌ）を介してのどちらかで、粒子または疎水性分子（Ｈ）に連結される。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端にそれぞれ連結されるＢ１またはＢ２である伸長部に連結され、この場合、荷電分子（Ｃ）に連結されない伸長部は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に、直接、またはリンカー（Ｌ）を介してのどちらかで連結される。さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、伸長部Ｂ１とＢ２の両方に連結され、これらの伸長部が、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端の両方にそれぞれ連結される。さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結されるＢ１伸長部に連結されるが、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に結合されているＢ２伸長部であって、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に直接、またはリンカー（Ｌ）によってのどちらかで、連結されうる、Ｂ２伸長部には連結されない。リンカー前駆体Ｘ１またはリンカー（Ｌ）を、伸長部のどちらか（Ｂ１またはＢ２）に、アミド結合などの任意の適する手段によって連結させることができる。好ましい実施形態では、伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、プロテアーゼなどの酵素による認識および加水分解のために選択されるペプチド配列である。伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、好ましくは、エンドソームプロテアーゼまたは免疫プロテアソームのどちらかまたは両方により認識されるアミノ酸を含む切断可能なペプチドである。
【０２０４】
より詳細にここで説明する通り、分解可能なペプチドから構成される伸長部（Ｂ１およびＢ２）の組成は、その伸長部が、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結される（Ｂ１）か、またはＣ末端に連結される（Ｂ２）かに依存する。
【０２０５】
一部の実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、長さ約１〜８アミノ酸の間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸、通常は、長さ１０アミノ酸以下のペプチド配列であって、ペプチド抗原（Ａ）に、例えば、伸長部（Ｂ１）のカルボキシル基とペプチド抗原（Ａ）のＮ末端残基のアルファアミンとで形成されるアミド結合によって連結されるペプチド配列である。Ｂ１とペプチド抗原（Ａ）間のアミド結合は、酵素により切断されうる。ダッシュ記号により示される切断部位（例えば、Ｐｎ’）に対してＣ末端側のアミノ酸位置に関して、切断部位の近位から遠位の順にアミノ酸位置に番号を付与するのが慣例となっていることは、理解される。例えば、オクタペプチド（ＰＡ１’−ＰＡ２’−ＰＡ３’−ＰＡ４’−ＰＡ５’−ＰＡ６’−ＰＡ７’−ＰＡ８’）であるペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結されているテトラペプチド伸長部（ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）、例えば、ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１−ＰＡ１’−ＰＡ２’−ＰＡ３’−ＰＡ４’−ＰＡ５’−ＰＡ６’−ＰＡ７’−ＰＡ８’について、ＰＮ１−ＰＡ１’間のアミド結合は、酵素により認識され、加水分解される。
【０２０６】
一部の実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、エンドソームプロテアーゼにより認識される酵素分解性テトラペプチドであって、テトラペプチド伸長部（例えば、ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）のＰＮ１位が、好ましくは、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択され、例えば、ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−Ａｒｇであり、ＰＮ２が、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択され、ＰＮ３が、グリシン、セリン、アラニン、プロリンまたはロイシンから選択され、ＰＮ４が、グリシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択される、酵素分解性テトラペプチドである。一部の実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、エンドソームプロテアーゼにより認識される酵素分解性トリペプチドであって、トリペプチド伸長部（例えば、ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）のＰＮ１位が、好ましくは、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択され、ＰＮ２が、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択され、ＰＮ３が、グリシン、セリン、アラニン、プロリンまたはロイシンから選択される、酵素分解性トリペプチドである。一部の実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、エンドソームプロテアーゼにより認識される酵素分解性ジペプチドであって、ジペプチド伸長部（例えば、ＰＮ２−ＰＮ１）のＰＮ１位が、好ましくは、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択され、ＰＮ２が、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択される、酵素分解性ジペプチドである。なおさらなる実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、エンドソームプロテアーゼにより認識されるアミノ酸であって、ＰＮ１位が、好ましくは、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択される、アミノ酸である。
【０２０７】
他の実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、免疫プロテアソームにより認識される酵素分解性ペプチドであって、テトラペプチド伸長部（ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）のＰ１位が、好ましくは、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシンまたはバリンから選択され、例えばＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−Ｌｅｕである、酵素分解性ペプチドである。
【０２０８】
さらなる実施形態では、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）は、エンドソームプロテアーゼと免疫プロテアソームの両方により認識される酵素分解性ペプチドであって、オクタペプチド伸長部（ＰＮ８−ＰＮ７−ＰＮ６−ＰＮ５−ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）についてのＰＮ５およびＰＮ１位が、カテプシンにより認識されるＰＮ５位についてはアルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択され、免疫プロテアソームにより認識されるＰＮ１位についてはイソロイシン、ロイシン、ノルロイシンまたはバリンから選択され、例えば、ＰＮ８−ＰＮ７−ＰＮ６−Ａｒｇ−ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−Ｌｅｕである、酵素分解性ペプチドである。カテプシンおよび免疫プロテアソームにより認識されるＮ末端伸長部（Ｂ１）の非限定的な例は、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号３）である。
【０２０９】
免疫プロテアソームにより認識されるテトラペプチドＮ末端伸長部（Ｂ１）の非限定的な例としては、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号４）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号５）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号９）、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＣｉｔおよびＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔが挙げられる。トリペプチドＮ末端伸長部（Ｂ１）の非限定的な例としては、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒが挙げられる。ジペプチドＮ末端伸長部（Ｂ１）の非限定的な例としては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇが挙げられる。単一アミノ酸Ｎ末端伸長部（Ｂ１）の非限定的な例としては、Ｃｉｔ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＬｙｓが挙げられる。上記の例では、ＡｒｇをＬｙｓで置き換えることができ、ＬｙｓをＡｒｇで置き換えることができ、ＧｌｕをＡｓｐで置き換えることができ、ＡｓｐをＧｌｕで置き換えることができる。Ｃｉｔ＝シトルリンであることに留意されたい。
【０２１０】
一部の実施形態では、伸長部（Ｂ２）は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端残基に連結され、ある特定のプロテアーゼにより認識され加水分解されるアミノ酸配列から構成される分解性ペプチドである。一部の実施形態では、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）は、長さ約１〜８アミノ酸の間、例えば、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸、通常は１０アミノ酸以下の、ペプチド配列である。好ましい実施形態では、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）は、ペプチド抗原（Ａ）に、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端カルボキシル基と伸長部（Ｂ２）のＮ末端残基のアルファアミンとで形成されるアミド結合によって連結される。Ｂ２とペプチド抗原（Ａ）間のアミド結合は、酵素により切断されうる。ダッシュ記号により示される切断部位（例えば、Ｐｎ’）に対してＣ末端側のアミノ酸位置に関して、切断部位の近位から遠位の順にアミノ酸位置に番号を付与するのが慣例となっていることに留意されたい。例えば、オクタペプチド抗原（ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１）のＣ末端に連結されているテトラペプチド伸長部（ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’）、例えば、ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１−ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’について、ＰＡ１−ＰＣ１’間のアミド結合は、酵素により認識され、加水分解される。
【０２１１】
好ましい実施形態では、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）は、免疫プロテアソーム認識および切断ならびに必要に応じてエンドソームプロテアーゼ認識を促進するように選択される、アミノ酸配列である。ペプチド抗原（Ａ）は、例えばペプチド抗原（Ａ）のＣ末端残基に近位のアミド結合に対する、免疫プロテアソームによる加水分解を促進するＣ末端残基、例えばロイシン、を通常は含有するので、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結される伸長部を、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端の近位のアミド結合に対する免疫プロテアソームによる認識および切断を促進するように選択するべきである。免疫プロテアソームは、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端アミノ酸であるＰＡ１に隣接するＰＣ１’位、例えば、ＰＡ１−ＰＣ１’間のアミド結合における、小さい非荷電アミノ酸を好む。しかし、エンドソームプロテアーゼは、嵩高い疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、ノルロイシン、メチオニンまたはグルタミン）および塩基性アミノ酸（すなわち、アルギニンおよびリシン）を好む。したがって、Ｃ末端伸長部を、どちらかまたは両方のクラスのプロテアーゼによる認識を促進するように選択することができる。
【０２１２】
一部の実施形態では、配列ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１を有するペプチド抗原（Ａ）は、配列ＰＣ１’．．．ＰＣｎ’（この配列中のｎは、１〜８の整数値である）を有するＣ末端ペプチド伸長部（Ｂ２）に連結され、例えば、ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１−ＰＣ１’．．．ＰＣｎ’となる。Ｃ末端伸長部（Ｂ２）の組成は、使用される伸長配列の長さに依存する。一部の実施形態では、Ｃ末端伸長部であるＢ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＭｅｔから選択される、単一アミノ酸ＰＣ１’である。さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長部であるＢ２は、ジペプチドであるＰＣ１’−ＰＣ２’（ここで、ＰＣ１’は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒから選択され、ＰＣ２’は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＭｅｔから選択される）である。さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長部であるＢ２は、トリペプチドであるＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’（ここで、Ｐ１’は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒから選択され、ＰＣ２’は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＰｒｏから選択され、ＰＣ３’は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＭｅｔから選択される）である。
【０２１３】
さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長部であるＢ２は、テトラペプチド伸長部であるＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’（ここで、ＰＣ１’は、グリシン、アラニンまたはセリンから選択され、ＰＣ２’は、グリシン、アラニン、セリン、プロリンまたはロイシンから選択され、ＰＣ３’は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択され、ＰＣ４’は、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択される）である。さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長部であるＢ２は、ペンタペプチドであるＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’（ここで、ＰＣ１’は、グリシン、アラニンまたはセリンから選択され、ＰＣ２’は、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸から選択され、ＰＣ３’は、グリシン、アラニン、セリン、プロリンまたはロイシンから選択され、ＰＣ４’は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択され、ＰＣ５’は、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択される）である。さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長部であるＢ２は、ヘキサペプチドであるＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’−ＰＣ６’（ここで、ＰＣ１’は、グリシン、アラニンまたはセリンから選択され、ＰＣ２’は、グリシン、アラニン、セリンまたはプロリンから選択され、ＰＣ３’は、グリシン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸から選択され、ＰＣ４’は、プロリンまたはロイシンから選択され、ＰＣ５’は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンから選択され、ＰＣ６’は、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択される）である。
【０２１４】
ヘキサペプチドＣ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号１２）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１６）が挙げられる。ペンタペプチドＣ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例としては、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１８）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１９）、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号２０）が挙げられる。テトラペプチドＣ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例としては、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号４）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号５）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔが挙げられる。トリペプチドＣ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例としては、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔが挙げられる。ジペプチドＣ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例としては、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｃｉｔが挙げられる。単一アミノ酸Ｃ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＮｌｅが挙げられる。上記の例では、ＡｒｇをＬｙｓで置き換えることができ、ＬｙｓをＡｒｇで置き換えることができ、ＧｌｕをＡｓｐで置き換えることができ、ＡｓｐをＧｌｕで置き換えることができる。
【０２１５】
ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されるＣ末端リンカー（Ｂ２）は、免疫プロテアソームとエンドソームプロテアーゼ両方による認識（すなわち、加水分解）のために選択することができる。非限定的な例では、配列ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１を有するペプチド抗原（Ａ）は、配列ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’（ここで、ＰＣ１’は、グリシン、アラニンまたはセリンから選択され、ＰＣ４’は、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択される）を有するＣ末端テトラペプチド伸長部（Ｂ２）、例えばＳｅｒ−Ｐ３−Ｐ２−Ａｒｇ、のＣ末端に連結される。一部の実施形態では、配列ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１を有する抗原は、配列ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’−ＰＣ６’（ここで、ＰＣ１’およびＰＣ２’は、グリシン、アラニン、プロリンまたはセリンから選択され、ＰＣ６’は、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択される）を有するＣ末端ヘキサペプチド伸長部（Ｂ２）、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’−Ａｒｇ、のＣ末端側に連結される。ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結される、免疫プロテアソームとカテプシンの両方によるプロセシングを促進する、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）の非限定的な例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号１２）である。免疫プロテアソームおよびカテプシンによるプロセシングに有利に働く、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されるＣ末端伸長部（Ｂ２）のさらなる非限定的な例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔである。
【０２１６】
リンカー（Ｌ）およびリンカー前駆体（Ｘ１およびＸ２）
ペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）を部位選択的にカップリング、すなわち、互いに結合または連結させる、特異的機能を果たすリンカーのサブセットは、「リンカー（Ｌ）」と呼ばれる。リンカー（Ｌ）は、リンカー前駆体Ｘ１とリンカー前駆体Ｘ２との反応の結果として形成する。例えば、ペプチド抗原（Ａ）に直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくは荷電分子（Ｃ）を介して間接的に連結されるリンカー前駆体Ｘ１は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に結合されているリンカー前駆体Ｘ２と反応して、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に連結させるリンカー（Ｌ）を形成することができる。リンカー前駆体Ｘ１は、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）へのペプチド抗原（Ａ）の部位選択的連結を可能にする。一部の実施形態では、直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によってのどちらかで、リンカー前駆体Ｘ１に連結されているペプチド抗原（Ａ）を生成し、単離し、次いで、ペプチド抗原（Ａ）を粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に結合させるリンカー（Ｌ）を形成するように選択的に反応するリンカー前駆体Ｘ２を含有する粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に、別々に付加させることができる。
【０２１７】
リンカー（Ｌ）またはリンカー前駆体Ｘ１を、ペプチド抗原（Ａ）に、このペプチド抗原のＮ末端またはＣ末端のどちらかにおいて、直接、またはＮ末端伸長部（Ｂ１）もしくはＣ末端伸長部（Ｂ２）によって間接的に、のどちらかで、それぞれ連結させることができる。好ましい実施形態では、リンカー（Ｌ）またはリンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）にアミド結合によって連結される。ペプチド抗原のＮ末端またはＣ末端に直接連結されたリンカー（Ｌ）またはリンカー前駆体Ｘ１が伸長部と見なされないことに留意されたい。
【０２１８】
適するリンカー前駆体Ｘ１は、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）上のリンカー前駆体Ｘ２と選択的に反応し、ペプチド抗原（Ａ）または必要に応じた伸長部（Ｂ１および／もしくはＢ２）または必要に応じた荷電分子（Ｃ）のいずれの他の部位においても連結が生じないものである。この選択性は、ペプチド抗原（Ａ）を修飾することなくペプチド抗原（Ａ）と粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）との連結を確実に形成できるようにするのに重要である。リンカー（Ｌ）は、ペプチド抗原（Ａ）を粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に共有結合性および／または高親和性相互作用によって直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に連結させることができる。好ましい実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、粒子または疎水性分子（Ｈ）上のリンカー前駆体Ｘ２と共有結合を形成する。
【０２１９】
好ましい実施形態では、リンカー（Ｌ）は、リンカー前駆体Ｘ１とＸ２間の生体直交型「クリックケミストリー」反応の結果として形成される。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、無触媒クリックケミストリー反応、例えば、銅の使用もいかなる触媒の使用も必要としない歪み促進型アジド−アルキン付加環化反応である。生体直交型反応を可能にするリンカー前駆体Ｘ１の非限定的な例としては、アジド、アルキン、テトラジンおよびトランスシクロオクテンから選択される官能基を含む分子が挙げられる。一部の実施形態では、アジドを含むリンカー前駆体Ｘ１は、リンカー前駆体Ｘ２と反応してトリアゾールリンカーを形成する。他の実施形態では、テトラジンを含むリンカー前駆体Ｘ１は、トランスシクロオクテン（ｔｒａｎｓｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ）（ＴＣＯ）を含むリンカー前駆体Ｘ２と反応して、逆要求型ディールス・アルダーライゲーション（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｄｅｍａｎｄ  Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）産物を含むリンカーを形成する。好ましい実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、１，３−双極性付加環化を受けて安定したトリアゾール環を形成する、存在するアルキンを含むリンカー前駆体Ｘ２と反応するアジド官能基を有する非天然アミノ酸である。好ましい実施形態では、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に連結されるＸ２リンカー前駆体は、歪み促進型付加環化を受けるアルキン、例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む。さらなる実施形態では、Ｘ１リンカー前駆体は、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）上に存在する、アジドを含むリンカー前駆体Ｘ２と反応するアルキンである。
【０２２０】
他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）の組成に依存して部位選択的反応性を可能にするリンカー前駆体Ｘ１は、チオール、ヒドラジン、ケトンおよびアルデヒドを含む官能基を含みうる。一部の実施形態では、チオールを含むリンカー前駆体Ｘ１は、ピリジル−ジスルフィドまたはマレイミドを含むリンカー前駆体Ｘ２と反応して、それぞれ、ジスルフィドまたはチオエーテルリンカーを形成する。他の実施形態では、ヒドラジンを含むリンカー前駆体Ｘ１は、ケトンまたはアルデヒドを含むリンカー前駆体Ｘ２と反応して、ヒドラゾンリンカーを形成する。一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、マレイミドまたはピリジルジスルフィドなどのチオール反応性官能基を含むリンカー前駆体Ｘ２と反応する、システインなどのチオール官能基を有する天然または非天然アミノ酸残基である。
【０２２１】
一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）上に備えられているリンカー前駆体Ｘ２を構成する別のペプチド配列にライゲーションされる、ペプチド配列である。他の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）上のリンカー前駆体Ｘ２を構成する相補的分子と、高親和性、非共有結合性、相互作用によって、例えば、コイルドコイル相互作用または静電相互作用によって、結合する。他の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、タンパク質、例えばストレプトアビジン、と高親和性相互作用を形成するタンパク質、例えばビオチン、と結合する。
【０２２２】
リンカー前駆体Ｘ１およびＸ２に選択される官能基の適切なペア、または相補的分子が、Ｘ１とＸ２間で置き換え可能でありうることは、当業者には認識される。例えば、トリアゾールから構成されるリンカーを、アジドおよびアルキンをそれぞれ含むリンカー前駆体Ｘ１およびＸ２から形成してもよく、またはアルキンおよびアジドをそれぞれ含むリンカー前駆体Ｘ１およびＸ２から形成してもよい。したがって、リンカーを生じさせる結果となる任意の適する官能基ペアを、Ｘ１またはＸ２のどちらに配置してもよい。
【０２２３】
本開示で提供される特定のリンカー前駆体（Ｘ１およびＸ２）およびリンカー（Ｌ）は、製造性の予想外の向上および生物活性の向上をもたらす。多くのそのようなリンカー前駆体（Ｘ１およびＸ２）およびリンカー（Ｌ）は、本発明の実施に適切でありえ、至る所でより詳細に説明される。
【０２２４】
リンカー前駆体（Ｘ１）を、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端のどちらかに、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくは荷電分子（Ｃ）によって間接的に、のどちらかで、結合させることができる。
【０２２５】
一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に、直接、またはＢ２伸長部もしくは荷電分子（Ｃ）によって間接的に、のどちらかで、連結されるアミノ酸であり、式：
【化１】
2020515629.tif 000003
（式中、官能基（ＦＧ）は、リンカー前駆体Ｘ２上のＦＧと特異的に反応するように選択され、通常は、アミン、アジド、ヒドラジンまたはチオールから選択され；Ｒ１は、通常は、ＯＨまたはＮＨ２から選択され；ｙ１は、任意の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７または８であり；このアミノ酸のアルファアミンは、通常は、伸長部Ｂ２のＣ末端アミノ酸に、またはＢ２伸長部がない場合はペプチド抗原（Ａ）のＣ末端アミノ酸に、連結される）を有する。
【０２２６】
他の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）もしくは荷電分子（Ｃ）によって間接的に、のどちらかで、連結され、式：
【化２】
2020515629.tif 000004
（式中、官能基（ＦＧ）は、リンカー前駆体Ｘ２と反応するように選択され、通常は、アミン、アジド、ヒドラジンまたはチオールから選択され；ｙ２は、任意の整数、通常は、１、２、３、４、５、６、７または８であり；カルボニルは、通常は、伸長部Ｂ１の、またはＢ１が存在しない場合はペプチド抗原（Ａ）の、Ｎ末端アミノ酸のアルファアミンに、連結される）を有する。
【０２２７】
疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）上に備えられているリンカー前駆体Ｘ２は、リンカー（Ｌ）を形成するためのリンカー前駆体Ｘ１との選択的反応を可能にするように選択される官能基を含む。一部の実施形態では、Ｘ２を構成する官能基は、リンカー前駆体Ｘ１上に備えられているアミンまたはヒドラジンと反応して、アミドまたはヒドラゾンを含むリンカー（Ｌ）を形成する、カルボニル、例えば、活性化エステル／カルボン酸またはケトンを含む。他の実施形態では、Ｘ２を構成する官能基は、リンカー前駆体Ｘ１上に備えられているアルキンと反応してトリアゾールを形成する、アジドを含む。さらに他の実施形態では、Ｘ２を構成する官能基は、リンカー前駆体Ｘ１上に備えられているチオールと反応して、チオエーテルまたはジスルフィドを含むリンカー（Ｌ）を形成する、マレイミドまたはジスルフィドから選択される。リンカー前駆体Ｘ２を任意の適する手段によって疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に結合させることができる。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）はペプチドを含み、Ｘ２は、ペプチドベースの疎水性分子（Ｈ）のＮ末端に連結される。
【０２２８】
リンカー（Ｌ）は、アジドおよびアルキンをそれぞれ含むリンカー前駆体Ｘ１およびＸ２間で形成されたトリアゾールを含みうる。一部の実施形態では、トリアゾールを含むリンカーは、アジド含有リンカー前駆体Ｘ１と、アルキン（例えば、シクロオクチン）含有リンカー前駆体Ｘ２の反応の結果として生じる。一部の実施形態では、アジド含有リンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）もしくは伸長部（Ｂ１）のＮ末端にまたはペプチド抗原（Ａ）もしくは伸長部（Ｂ２）のＣ末端に連結される、アジド官能基を有する非天然アミノ酸である。アジド官能基は、ペプチド抗原（Ａ）に直接、またはＮ末端伸長部（Ｂ１）もしくはＣ末端伸長部（Ｂ２）を介して間接的に、のどちらかで、連結されている反応性ハンドル（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈａｎｄｌｅ）であって、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に連結されているアルキン（例えば、シクロオクチン）含有リンカー前駆体Ｘ２と選択的に反応することによって、ペプチド抗原（Ａ）を疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に結合させるトリアゾールリンカー（Ｌ）を形成する、反応性ハンドルを提供する。
【０２２９】
一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に、直接、またはＢ２伸長部もしくは荷電分子（Ｃ）によって間接的に、のどちらかで、連結されるアジドアミノ酸であり、式：
【化３】
2020515629.tif 000005
（式中、アミノ酸のアルファアミンは、Ｂ２の、またはＢ２伸長部がない場合にはペプチド抗原（Ａ）の、Ｃ末端アミノ酸に連結され；Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２から選択され；ｎは、任意の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８である）
を有する。アジド含有リンカー前駆体Ｘ１の非限定的な例は、５−アジド−２−アミノペンタン酸、４−アジド−２−アミノブタン酸および３−アジド−２−アミノプロパン酸である。
【０２３０】
他の実施形態では、アジド含有リンカー前駆体Ｘ１が、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）に連結されるか、またはＢ１が存在しない場合にはペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に直接連結される場合、リンカー前駆体Ｘ１は、式：
【化４】
2020515629.tif 000006
（式中、カルボニルは、通常は、伸長部Ｂ１の、またはＢ１が存在しない場合にはペプチド抗原（Ａ）の、Ｎ末端アミノ酸のアルファアミンに連結され；ｙ２は、任意の整数、通常は、１、２、３、４、５、６、７または８である）
を有する。アジド含有リンカー前駆体の非限定的な例としては、６−アジド−ヘキサン酸、５−アジド−ペンタン酸、４−アジド−ブタン酸および３−アジド−プロパン酸が挙げられる。
【０２３１】
リンカー前駆体Ｘ１がアジドを含む、一部の実施形態では、リンカー前駆体Ｘ２は、アルキン部分を含む。アルキンの非限定的な例としては、脂肪族アルキン、シクロオクチン、例えばジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯまたはＤＩＢＯ）、ジフルオロオクチン（ＤＩＦＯ）、およびビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）が挙げられる。一部の特定の実施形態では、アルキン含有リンカー前駆体Ｘ２は、ＤＢＣＯ分子を含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）は、ペプチド抗原（Ａ）に、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端においてアミド結合によって連結され、そしてまたそれがリンカー（Ｌ）を介して疎水性ブロック（Ｈ）に連結される。そのようなＣ末端連結ペプチド抗原コンジュゲートの例は、（Ａ）７〜３５−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（式中、（Ａ）７〜３５は、７〜３５個のアミノ酸を含むペプチド抗原を表す）である。非限定的な例では、オクタペプチド配列ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１を有するペプチド抗原（Ａ）は、そのＣ末端で、アジド含有リンカー前駆体（Ｘ１）アジド−リシン（６−アジド２−アミノヘキサン酸、Ｌｙｓ（Ｎ３））に連結されているテトラペプチド伸長部（Ｂ２）、例えば、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）に連結され、そしてまたそれが、疎水性分子（Ｈ）と連結されているシクロオクチン含有リンカー前駆体（Ｘ２）のジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分と反応して、ＰＡ８−ＰＡ７−ＰＡ６−ＰＡ５−ＰＡ４−ＰＡ３−ＰＡ２−ＰＡ１−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｎ３−ＤＢＣＯ−Ｈ）を生成する。
【０２３３】
一部の代替実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端においてＮ末端伸長部（Ｂ１）に連結され、そしてまたそれがリンカー（Ｌ）を介して疎水性ブロック（Ｈ）に連結される。非限定的な例では、配列ＰＡ１’−ＰＡ２’−ＰＡ３’−ＰＡ４’−ＰＡ５’−ＰＡ６’−ＰＡ７’−ＰＡ８’を有するペプチド抗原は、そのＮ末端で、アジド−ペンタン酸（Ａｚｐ）に連結されているテトラペプチド伸長部（ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）、例えばＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）に連結され、そしてまたそれが、疎水性分子（Ｈ）に連結されているシクロオクチン含有リンカー前駆体（Ｘ２）のジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分と反応する：Ｈ−ＤＢＣＯ−Ａｚｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＰＡ１’−ＰＡ２’−ＰＡ３’−ＰＡ４’−ＰＡ５’−ＰＡ６’−ＰＡ７’−ＰＡ８’。
【０２３４】
他のリンカーおよび連結
リンカーは、一般に、ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２つまたはそれより多くの異種分子を互いに結合させる任意の分子を指し、Ｉ）水溶解度を増大もしくは減少させる機能；ＩＩ）ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２成分、すなわち異種分子、間の距離を増加させる機能、ＩＩＩ）剛性もしくは可撓性を付与する機能；またはＩＶ）任意の２つもしくはそれより多くの異種分子間の連結の分解／加水分解の速度を制御／調節する機能、のうちのいずれか１つまたは複数をさらに果たすことができる。本明細書で使用される特定のタイプのリンカーが、指名される。リンカー（Ｌ）は、ペプチド抗原（Ａ）を粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、部位特異的に連結させるために使用される特定のタイプのリンカー分子である。ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ配置されるＮ末端およびＣ末端伸長部であるＢ１およびＢ２を、異種分子、例えば、荷電分子（Ｃ）、Ｌｉｎｋｒ（Ｌ）、粒子（Ｐ）もしくは疎水性分子（Ｈ）、または任意の異種分子に連結させることができ、したがって、Ｂ１およびＢ２は、リンカーとして機能することができることに、留意されたい。明確にするために、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端に配置されたいずれの分子も、Ｎ末端またはＣ末端伸長部（Ｂ１またはＢ２）であるが、伸長部は、それが別の分子、例えば荷電分子（Ｃ）、に連結される場合、リンカーとしての機能を果たすこともできる。したがって、本明細書中で定義される通り、抗原のＮ末端またはＣ末端にあるリンカーは、常に伸長部（Ｂ１またはＢ２）であるが、伸長部は、必ずしもリンカーであるとは限らない。
【０２３５】
ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２成分、例えば、伸長部（Ｂ１またはＢ２）によって間接的に疎水性分子（Ｈ）に連結されるペプチド抗原（Ａ）、を結合させるために使用されるリンカーは、いずれの適する手段によるものであってもよい。リンカーは、任意の２つまたはそれより多くの成分、すなわち、異種分子、例えば、ペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）を結合させるために、共有結合性手段を使用することもあり、または非共有結合性手段を使用することもある。
【０２３６】
好ましい実施形態では、リンカーは、ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２成分を共有結合によって結合させる、すなわち連結させる、ことができる。共有結合は、ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２成分、すなわち異種分子、を結合させるために使用される好ましい連結であり、被験体への投与の直後に、成分が、他方の成分、例えば、ペプチド抗原および疎水性分子（Ｈ）、から分散できないことを確実にする。さらに、共有結合性連結は、通常は、非共有結合性連結より高い安定性を提供し、ペプチド抗原コンジュゲートの各成分が、投与された各成分の割合またはほぼその割合で、抗原提示細胞に共送達されることを確保するのに役立つ。
【０２３７】
共有結合性連結の非限定的な例では、クリックケミストリー反応によって、ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２成分を連結させる、すなわち、互いに結合させる、トリアゾールを得ることができる。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応は、歪み促進型［３＋２］アジド−アルキン付加環化反応である。アルキン基およびアジド基を、ペプチド抗原コンジュゲートを構成するそれぞれの分子上に備えさせて、「クリックケミストリー」により連結させることができる。一部の実施形態では、アジド官能基を有するリガンド、例えばＴＬＲアゴニストは、アルキン、例えばジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、などの適切な反応性基を有する疎水性分子（Ｈ）とカップリングされる。さらなる実施形態では、チオール官能基を有するＸ１リンカー前駆体は、ペプチド抗原（Ａ）に直接、またはＮ末端もしくはＣ末端伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によってのどちらかで、連結される。アルキン、アルケン、マレイミドなどの、適切な反応性基を有する疎水性分子（Ｈ）にチオールを連結させ、その結果、チオエーテル結合を生じさせることができ、またはチオールをピリジルジスルフィドと反応させて、例えば、その結果、ジスルフィド連結を生じさせてもよい。一部の実施形態では、アミンを１つの分子上に備えさせ、そのアミンを、カルボン酸、酸塩化物もしくは活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）などの任意の適する求電子基と反応させ、その結果、アミド結合を形成することにより、別の分子に連結させてもよく、またはアミンを、アルケンと（マイケル付加によって）、アルデヒドと、およびケトンと（シッフ塩基によって）反応させてもよい。好ましい実施形態では、リンカー前駆体Ｘ１、必要に応じたＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）、必要に応じた荷電分子（Ｃ）、およびペプチド抗原（Ａ）は、固相ペプチド合成により生成される単一ペプチド配列のように、アミド結合によって互いに連結される。共有結合、すなわち連結、を生じさせる結果となる多数の適する反応を利用することができ、そのような反応は、当業者には周知であろう。
【０２３８】
任意の２つまたはそれより多くの異種分子、すなわち、ペプチド抗原コンジュゲートの明確に異なる成分、を結合させるために使用されるリンカーのタイプは、特定の機能を果たすように、およびその適用の具体的な要件を満たすように、選択することができる。通常は、リンカーは、成分がペプチド抗原（Ａ）、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）、必要に応じたＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）、必要に応じたリンカー（Ｌ）、必要に応じた荷電分子（Ｃ）、必要に応じた第２のポリマー（疎水性分子（Ｈ）に連結されている）、ならびに必要に応じたリガンド、例えばＰＲＲアゴニストである、ペプチド抗原コンジュゲートの２つまたはそれより多くの異種分子間に共有結合を形成することができる。
【０２３９】
当業者に周知である、多くの適するリンカーがあり、そのようなリンカーとしては、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、ヘテロ環式炭素リンカー、剛性芳香族リンカー、可撓性エチレンオキシドリンカー、ペプチドリンカー、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、炭素リンカーは、Ｃ１〜Ｃ１８アルカンリンカー、例えば、低級アルキルＣ４含むことができ、アルカンリンカーは、２つまたはそれより多くの異種分子間の間隔を増加させる働きをすることができる一方、より長鎖のアルカンリンカーを使用して、疎水特性を付与することができる。あるいは、エチレンオキシドリンカーなどの親水性リンカーを、任意の２つまたはそれより多くの異種分子間の間隔を増加させるために、および水溶解度を増加させるために、アルカンリンカーの代わりに使用してもよい。他の実施形態では、リンカーは、剛性を付与する芳香族化合物またはポリ（芳香族）化合物でありうる。リンカー分子は、親水性リンカーを含むこともあり、疎水性リンカーを含むこともある。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内酵素（例えば、カテプシンまたは免疫プロテアソーム）により切断可能である分解性ペプチド配列を含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、リンカーは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）から構成されうる。リンカーの長さは、リンカーの目的に依存する。例えば、ＰＥＧリンカーなどのリンカーの長さを、免疫原性組成物の成分を隔てるために、例えば、立体障害を低減させるために、増加させることができ、または親水性ＰＥＧリンカーの場合には、水溶解度を向上させるために使用することができる。ＰＥＧなどのリンカーは、長さ少なくとも２モノマーでありうる、短いリンカーであってもよい。ＰＥＧなどのリンカーは、長さ約４〜約２４モノマーの間、例えば、長さ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４モノマーであってもよく、またはそれより長くてもよい。一部の実施形態では、リガンドは、ＰＥＧリンカーによって疎水性分子（Ｈ）に連結される。
【０２４１】
リンカーが炭素鎖を含む一部の実施形態では、リンカーは、長さ約１または２〜約１８炭素の間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８炭素の、またはそれより炭素数が多い、鎖を含みうる。リンカーが炭素鎖を含む一部の実施形態では、リンカーは、約１２〜約２０炭素の間の鎖を含みうる。リンカーが炭素鎖を含む一部の実施形態では、リンカーは、１８炭素以下の鎖を含みうる。一部の実施形態では、ＰＲＲアゴニストなどのリガンドは、低級アルキルによって疎水性分子（Ｈ）に連結される。
【０２４２】
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、したがって、リンカーの切断により、リンカーに連結されている任意の成分、例えばペプチド抗原が放出される結果となる。
【０２４３】
例えば、リンカーは、細胞内小胞中（例えば、リソソームもしくはエンドソームもしくはカベオラ内）に局在する酵素により、またはサイトゾル中の酵素、例えば、プロテアソームもしくは免疫プロテアソームにより、切断可能でありうる。リンカーは、例えば、細胞内小胞中に局在するプロテアーゼ、例えば、リソソームまたはエンドソーム区画内のカテプシンを含むがこれらに限定されない、プロテアーゼ酵素により切断される、ペプチドリンカーでありうる。ペプチドリンカーは、通常は、１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０アミノ酸長であるか、またそれより長く（例えば、最大２０）、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長であるか、またはそれより長い。ある特定のジペプチドが、カテプシン、例えばカテプシンＢおよびＤ、ならびにプラスミンを含む、プロテアーゼにより加水分解されることは、公知である（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁を参照されたい）。例えば、チオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断可能であるペプチドリンカー（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号２３）リンカー）を使用することができる。そのようなリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを用いるドキソルビシンの合成が記載されている、米国特許第６，２１４，３４５号を参照されたい）。
【０２４４】
リンカー内の切断可能なペプチドの特定の配列を使用して、細胞内取込み後の免疫細胞によるプロセシングを促進することができる。例えば、本明細書で開示される免疫原性組成物のいくつかの実施形態は、水性条件で粒子を形成し、これらの粒子は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）などの免疫細胞に内在化される。切断可能なペプチドリンカーを、免疫細胞による細胞内取込み後のペプチドリンカーのプロセシング（すなわち、加水分解）を促進するように、選択することができる。切断可能なペプチドリンカーの配列を、細胞内小胞中のカテプシンまたはサイトゾル空間内のプロテアソームもしくは免疫プロテアソームなどの、細胞内プロテアーゼによるプロセシングを促進するように、選択することができる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、式Ｐｎ．．．Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１（式中、Ｐ１は、アルギニン、リシン、シトルリン、グルタミン、トレオニン、ロイシン、ノルロイシンまたはメチオニンから選択され、Ｐ２は、グリシン、ロイシン、バリンまたはイソロイシンから選択され、Ｐ３は、グリシン、セリン、アラニン、プロリンまたはロイシンから選択され、Ｐ４は、グリシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択される）のペプチド配列から構成されるリンカーが、カテプシンによる認識を促進するために使用される。非限定的な例では、アミド結合によって異種分子に連結されている式Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１のテトラペプチドリンカーは、配列Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）を有する。明確にするために、アミノ酸残基（Ｐｎ）は、Ｐ１残基のＣ末端側にある切断部位の近位から遠位へと番号が付与され、例えば、Ｐ１−Ｐ１’間のアミド結合が加水分解される。カテプシンなどの、エンドソームおよびリソソームプロテアーゼによる切断を促進する、適するペプチド配列は、文献に十分に記載されている（参照：Ｃｈｏｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１巻：１２８２４〜１２８３２頁、２００６年）。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、ペプチド配列から構成されるリンカーは、プロテアソームまたは免疫プロテアソームによる認識を促進するように選択される。式Ｐｎ．．．Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１のペプチド配列は、プロテアソームまたは免疫プロテアソームによる認識を促進するように選択され、式中、Ｐ１は、塩基性残基および疎水性分岐残基、例えば、アルギニン、リシン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択され、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４は、必要に応じて、ロイシン、イソロイシン、バリン、リシンおよびチロシンから選択される。非限定的な例では、プロテアソームにより認識される式Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１の切断可能なリンカーは、Ｐ１においてアミド結合によって異種分子に連結され、配列Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号２４）を有する。プロテアソームまたは免疫プロテアソームによる分解を促進する配列を、単独で使用してもよく、またはカテプシン切断性リンカーと組み合わせて使用してもよい。一部の実施形態では、免疫プロテアソームプロセシングを促進するアミノ酸は、エンドソームプロテアーゼによるプロセシングを促進するリンカーに連結される。免疫プロテアソームによる切断を促進するための多数の適する配列が、文献に十分に記載されている（参照：Ｋｌｏｅｔｚｅｌら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２巻：１７９〜１８７頁、２００１年、Ｈｕｂｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４８巻：７２７〜７３８頁、２０１２年、およびＨａｒｒｉｓら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、８巻：１１３１〜１１４１頁、２００１年）。
【０２４７】
好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結されるＮ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２）は、さらなる分子、例えば、荷電分子（Ｃ）および疎水性分子（Ｈ）にそれぞれ連結され、切断可能なペプチドから構成される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチド伸長部は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端および／またはＣ末端のどちらかまたは両方に配置される。ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に配置される切断可能なペプチド伸長部は、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）であるが、伸長部が、ペプチド抗原に加えて、別の分子、例えば荷電分子（Ｃ）、に連結されるとき、リンカーとしてさらに機能することができる。ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に配置される伸長部は、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）であるが、伸長部が、別の分子、例えば疎水性分子（Ｈ）、に連結されるとき、リンカーとしてさらに機能することができる。Ｎ末端またはＣ末端のどちらかにおけるリンカー（Ｂ１およびＢ２）を構成する切断可能なペプチドの好ましい配列は明確に異なり、至る所でより詳細に説明される。
【０２４８】
他の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２つまたはそれより多くの成分を、酸性条件下で加水分解に感受性であるｐＨ感受性リンカーによって互いに結合させることができる。多数のｐＨ感受性連結が、当業者に周知であり、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール、またはこれらに類するものを含む（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、同第５，８２４，８０５号、同第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１４６５３〜１４６６１頁を参照されたい）。好ましい実施形態では、連結は、生理的ｐＨで、例えば約７．４のｐＨで、安定しているが、リソソームのｐＨである約ｐＨ５〜６．５では加水分解される。一部の実施形態では、ＴＬＲ−７／８アゴニストなどのリガンドは、疎水性分子（Ｈ）にｐＨ感受性結合を形成するＦＧによって、例えば、ｐＨ不安定性ヒドラゾン結合を形成するようにケトンとヒドラジンとが反応することによって、連結される。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、ケトン基を有するリンカー前駆体Ｘ１に、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結され、このリンカー前駆体Ｘ１が、疎水性分子（Ｈ）上にヒドラジンを含むリンカー前駆体Ｘ２に連結される。ヒドラゾンなどのｐＨ感受性連結は、結合が、生理的ｐＨで、約ｐＨ７．４で、安定しているが細胞内小胞のｐＨなどのより低いｐＨ値では加水分解されるという、利点をもたらす。
【０２４９】
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である連結、例えば、還元性ジスルフィド結合を含む。ジスルフィド連結を導入するために使用される多くの異なるリンカーが、当技術分野において公知である（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７巻：５９２４〜５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  （Ｃ．  Ｗ．  Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：９２８０９２９０頁、２００８年を参照されたい）。米国特許第４，８８０，９３５号も参照されたい。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、チオール官能基を有するリンカー前駆体Ｘ１に、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結され、このリンカー前駆体Ｘ１が、疎水性分子（Ｈ）に連結されているピリジルジスルフィドを含むＸ２リンカー前駆体と、ジスルフィド結合を形成する。
【０２５０】
なおさらなる実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートの任意の２成分間の連結を、酵素的反応、例えば、発現されたタンパク質のライゲーションにより、またはソルターゼ（参照：Ｆｉｅｒｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１１１巻：Ｗ１１７６〜１１８１頁、２０１４年およびＴｈｅｉｌｅら、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．、８巻：１８００〜１８０７頁、２０１３年）、化学酵素的反応（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２５巻：７８８〜７９５頁、２０１４年）または非共有結合性高親和性相互作用、例えば、ビオチン−アビジンおよびコイルドコイル相互作用など（Ｐｅｃｈａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、３１巻：９０〜９６頁、２０１３年）または当業者に公知である任意の適する手段（参照：Ｃｈａｌｋｅｒら、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、４４巻：７３０〜７４１頁、２０１１年、Ｄｕｍａｓら、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５２巻：３９１６〜３９２１頁、２０１３年）により、形成することができる。
【０２５１】
粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）
本開示の免疫原性組成物は、予め形成された粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）をさらに含むペプチド抗原コンジュゲートを含む。粒子（Ｐ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、水性条件で粒子として存在する。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で単一可溶性分子として存在しうるが、水性条件では集合して粒子を構築しうる。他の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中および水性条件で、ある特定の温度およびｐＨ範囲にわたって単一可溶性分子として存在しうるが、水性条件で、ある特定の温度およびｐＨ範囲にわたって、例えば、生理的温度およびｐＨでは、集合して粒子を構築しうる。
【０２５２】
粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）の目的は、薬物動態を調節するためのおよび抗原提示細胞による取込みを促進するための手段として、ペプチド抗原コンジュゲートを微粒子形式にさせることである。ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子は、直径約１０ｎｍ〜１０，０００ｎｍの間のサイズであるべきである。好ましい実施形態では、粒子は、細胞（例えば、免疫細胞）のエンドソーム系に取り込まれることができるサイズである、ナノ粒子である。ナノ粒子は、直径約１０ｎｍ〜約５００ｎｍの平均サイズ範囲のものでありうる。したがって、一部の実施形態では、ナノ粒子は、平均すると直径約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍまたは５００ｎｍになりうる。他の実施形態では、ナノ粒子は、平均すると、直径約１０〜５０ｎｍ、または約１０〜１００ｎｍ、または約１０〜２００ｎｍまたは約１０〜５００ｎｍになりうる。好ましい実施形態では、粒径は、直径約２０〜２００ｎｍの範囲である。組成物中の粒子は、様々なサイズでありうるが、一般には、本明細書に示すサイズ範囲内に入ることになる。例えば、組成物中の粒子の５０％より多く、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９１％より多く、９２％より多く、９３％より多く、９４％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多くが、本明細書に示すサイズ範囲内に入ることになる。一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）を、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に直接、またはリンカー（Ｌ）を介して連結されている伸長部（Ｂ１またはＢ２）に連結させることができ、これにより、集合して、大き過ぎて免疫細胞により取り込まれることができない粒子（例えば、約５，０００ｎｍより大きい粒子）が構築され、注射部位に貯留部を形成する。
【０２５３】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、予め形成された粒子（Ｐ）に連結される。粒子（Ｐ）は、水性条件で構造を保持する疎水性材料、例えば、ポリマーまたは脂質、架橋親水性ポリマー、例えばヒドロゲル、または架橋疎水性ポリマー、例えば架橋ポリスチレンから構成されうる。粒子（Ｐ）の非限定的な例としては、ポリマー粒子、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリマーソームまたはポロキサマー（ｐｏｌａｘｍｅｒ）；脂質ベースのミセル、リポソーム、または多重ラメラ小胞；水中油型エマルジョン、例えば、水中鉱油型および鉱油中水型エマルジョン；ならびに無機塩粒子、例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム塩粒子（すなわち、ミョウバン）が挙げられる。一部の実施形態では、粒子（Ｐ）は、リポソームナノ粒子である。他の実施形態では、粒子（Ｐ）は、鉄粒子である。さらに他の実施形態では、粒子（Ｐ）は、ポリマー粒子である。
【０２５４】
予め形成された粒子（Ｐ）へのペプチド抗原（Ａ）の連結効率は、ペプチド抗原の性質および使用される連結のタイプに依存する。例えば、ペプチド抗原（Ａ）を粒子（Ｐ）の内部に吸着するまたは組み込むことができ、ペプチド抗原（Ａ）の性質が吸着および組込みに影響を与えうるので、この工程の効率を、各ペプチド抗原（Ａ）について実験により決定することができる。ペプチド抗原（Ａ）を粒子（Ｐ）に高親和性相互作用（例えば、静電的）または共有結合によって連結させることができ、この場合、粒子（Ｐ）は、設定された数の反応部位を有し、この数が、粒子（Ｐ）に連結させることができるペプチド抗原（Ａ）の数を決定づけることになる。複数の異なるペプチド抗原（Ａ）、例えば２０の異なるペプチド抗原（Ａ）、を含む免疫原性組成物については、各タイプのペプチド抗原（Ａ）の複数のコピーを別々の粒子（Ｐ）上に送達してもよく、または２０タイプすべてのペプチド抗原（Ａ）の複数のコピーを同じ粒子（Ｐ）上に送達してもよい。
【０２５５】
予め形成された粒子（Ｐ）の制約は、抗原の粒子（Ｐ）に対する比を容易に制御することができないことである。あるいは、好ましい実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、水性条件で粒子集合を促進する疎水性分子（Ｈ）に、直接またはリンカー（Ｌ）を介してのどちらかで、連結される。疎水性分子（Ｈ）に、直接またはリンカー（Ｌ）を介してのどちらかで、連結されている伸長部（Ｂ１またはＢ２）によって必要に応じて連結されるペプチド抗原（Ａ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートは、分子的に規定された実体であり、ペプチド抗原（Ａ）の疎水性分子（Ｈ）に対する比を正確に制御することができる。好ましい実施形態では、比は、ペプチド抗原（Ａ）対疎水性分子（Ｈ）  １：１である。さらなる非限定的な例では、比は、ペプチド抗原（Ａ）対疎水性分子（Ｈ）  １：３〜３：１でありうる。
【０２５６】
予め形成された粒子とは対称的に、ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）を、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）および／もしくはリンカー（Ｌ）によって間接的に疎水性ブロック（Ｈ）に連結させて化学的に規定された単一分子を生成することにより、形成することができる。疎水性分子（Ｈ）は、実質的に制限された水溶解度しか有さない分子であるかまたは性質の点で両親媒性であり、水性条件で集合して超分子構造、例えば、ミセル粒子、ナノ粒子または微小粒子を構築することができる。好ましい実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、水性条件で下は約０．１ｍｇ／ｍＬまたは約０．０１ｍｇ／ｍＬに至るまで不溶性であり、またはミセルを形成する。
【０２５７】
疎水性分子（Ｈ）は、水性条件で分子が集合して粒子を構築する結果となる、制限された水溶解度しか有さないおよび／または両親媒特性を有する、高級アルカン、環式芳香族、脂肪酸、テルペン／イソプレンに由来する化合物、またはポリマーを含む任意の分子から選択することができる。例示的高級アルカンとしては、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカンおよびオクタデカンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的環式芳香族としては、ベンゼンおよび縮合ベンゼン環構造またはヘテロ環式芳香族分子が挙げられるが、これらに限定されない。例示的飽和および不飽和脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはオレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、脂肪酸、例えば、ミリスチン酸である。他の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、ジアシル脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたはリポペプチド、例えばＰａｍ２Ｃｙｓ、を含む。一部の実施形態では、脂肪酸または脂質ベースの疎水性分子（Ｈ）は、ＰＥＧをさらに含みうる。テルペン／イソプレンに由来する例示的化合物としては、ステロール誘導体、例えばコレステロール、およびスクアレンが挙げられる。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、コレステロールを含む。
【０２５８】
好ましい実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、制限された水溶解度しか有さないポリマーであるか、または両親媒性であり、水性条件で集合して粒子、例えばミセル、を構築することができる。例示的ポリマーとしては、ＰＬＧＡ、疎水性ポリ（アミノ酸）、ポリ（ベンジルグルタメート）、ポリスチレン、エチレンオキシドプロピレンオキシドモノマーに基づくポロキサマー、および温度応答性ポリマー、例えば、ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙ（Ｎ−ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｃｒｌｙａｍｉｄｅ））、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ［ジ（エチレングリコール）メタクリル酸メチルエーテル］、およびある特定のＰＥＧ化ポリ（アミノ酸）、例えばポリ（γ−（２−メトキシエトキシ）エステリル−Ｌ−グルタメート）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、疎水性アミノ酸から構成されるポリ（アミノ酸）である。好ましい実施形態では、ポリ（アミノ酸）を含む疎水性分子（Ｈ）は、芳香族環を含むアミノ酸から構成される。他の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、ＰＲＲアゴニストなどのリガンドに連結されているポリ（アミノ酸）である。他の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーである。一部の実施形態では、ジブロックコポリマーは、温度応答性であり、温度シフトに応答して集合して粒子を構築することができる。一部の実施形態では、Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーを含む疎水性分子（Ｈ）は、ジブロックコポリマーの一方のブロックに連結されたリガンド、例えばＰＲＲアゴニスト、をさらに含む。ペプチド抗原コンジュゲートのための疎水性分子（Ｈ）として有用なポリマーは、下でより詳細に説明される。
【０２５９】
ポリマー
疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）は、直鎖または分岐ポリマーを含みうる。ポリマーは、ホモポリマー、コポリマーまたはターポリマーでありうる。ポリマーは、１タイプまたは多くの異なるタイプのモノマー単位から構成されうる。ポリマーは、統計的コポリマー（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）または交互コポリマーであることもある。ポリマーは、Ａ−Ｂ型などのブロックコポリマーであることもあり、またはポリマーは、２つのポリマーがポリマー類似反応によって連結される、グラフト型コポリマーから構成されることもある。
【０２６０】
疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）は、天然に存在するおよび／または非天然モノマーならびにこれらの組み合わせを含む、ポリマーを含みうる。天然バイオポリマーは、アミノ酸から構成されるペプチド（ポリ（アミノ酸）と呼ばれることもある）を含むことがあり、具体的な例は、ポリ（トリプトファン）である。天然バイオポリマーが化学的に修飾されることもある。例えば、グルタミン酸またはリシン残基から構成されるバイオポリマーは、それぞれ、ガンマカルボキシルまたはイプシロンアミノ基が、リガンドの結合のために、修飾されることがある。バイオポリマーは、多糖であることもあり、多糖としては、グリコーゲン、セルロースおよびデキストランを挙げることができるが、これらに限定されない。さらなる例としては、アルギン酸塩およびキトサンを含む、自然界に存在する多糖が挙げられる。ポリマーはまた、天然に存在する小分子、例えば乳酸もしくはグリコール酸から構成されていてもよく、またはこれら２つのコポリマー（すなわち、ＰＬＧＡ）であってもよい。
【０２６１】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）は、アニオン性（例えばポリ（酸性））ポリマー、またはカチオン性（例えばポリ（塩基性））ポリマー、またはアニオン性ポリマーとカチオン性ポリマーの組み合わせから構成される。カチオン性ポリマーは、静電相互作用により負荷電ペプチドと結合することができ、またはＤＮＡおよびＲＮＡなどの負荷電核酸との複合体化に有用でありうる。一部の実施形態では、ポリマーは、ｐＨ７．４では水不溶性双性イオンであるが、約６未満のｐＨでは正味正電荷を帯び、水溶性である。一部の実施形態では、第１のポリマーを含む疎水性分子（Ｈ）は、第２のポリマー上の負または正電荷とそれぞれ相補的である正電荷または負電荷を帯びており、第１のポリマーと第２のポリマーは、電荷中和によって静電複合体を形成し、電荷中和がこの複合体を不溶性にする。一部の実施形態では、カチオン性ポリマーは、天然に存在するまたは合成のポリ（アミン）、例えば、ポリ（リシン）またはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）でありうる。さらなる実施形態では、カチオン性ポリマーは、アミンとビス（アクリルアミド）またはビス（アクリルエステル）とのマイケル付加反応から生成されるポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）またはポリ（ベータアミノエステル）（ＰＢＡＥ）でありうる。開示される実施形態において使用することができるカチオン性ポリマーの非限定的な例としては、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アリルアニオン塩酸塩；ＰＡＨ）、プトレシン、カダベリン、ポリ（リシン）（ＰＬ）、ポリ（アルギニン）、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（ヒスチジン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。カチオン性ポリマーは、メチル化キトサン上に存在するものなどの、第四級アンモニウム基を含有しうる。あるいは、ポリマーは、アニオン性ポリマーであってもよい。一部の非限定的な例では、ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（グルタミン酸）である。代替実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）である。ポリマーは、ポリホスホエステル系ポリマーであることもある。ポリマーは、（１−４）連結されたβ−Ｄ−マンヌロネートおよびグルロン酸から構成される、例えばアルギン酸を含む、天然アニオン性多糖を含むこともある。ポリマーは、ヌクレオチドを含むこともある。他のポリアニオン性ポリマーも同様に適しうる。
【０２６２】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、ある特定のｐＨ範囲にわたって水溶性カチオン性ポリマーであるが、生理的ｐＨ７．４付近のｐＨ範囲では、非荷電であり、水不溶性である。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、芳香族アミンを含むポリマーであって、芳香族アミンの共役酸のｐＫａが７．５未満である、ポリマーである。芳香族アミンのｐＫａ未満のｐＨで、芳香族アミンは、プロトン化され、したがって、ポリマーに正電荷を付与する。芳香族アミンを含むポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的な例は、ポリ（フェニルアラニンアミン）である。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、窒素ヘテロ環を含むポリマーであって、ヘテロ環を構成する窒素原子のｐＫａが７．５未満である、ポリマーである。ヘテロ環を構成する窒素原子のｐＫａ未満のｐＨで、窒素は、プロトン化し、ポリマーに正電荷を付与する。プロトン化可能な（すなわち塩基性の）窒素原子を有するヘテロ環を含むポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的な例は、ポリ（ヒスチジン）である。本明細書において、本発明者らは、プロトン化可能な窒素（例えば、芳香族アミン）を含むポリマーから構成される疎水性分子が、製造、粒子安定性および生物活性の予想外の向上をもたらすという予想外の発見を報告する。
【０２６３】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、ポリ（ジエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート）−（ＤＥＧＭＡ）系ポリマーでありうる。さらなる実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、スチリルおよびビニル部分のモノマーを含みうるポリマーである。（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ならびにスチリル系およびビニル系モノマーの具体的な例としては、Ｎ−２−ヒドロキシプロピル（メタクリルアミド）（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシエチル（メタクリレート）（ＨＥＭＡ）、スチレンおよびビニルピロリドン（ＰＶＰ）がそれぞれ挙げられる。ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＮＩＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡｍ）、Ｎ−（Ｌ）−（１−ヒドロキシメチル）プロピルメタクリルアミド（ＨＭＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）、２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）のモノマーから構成される熱応答性ポリマーでありうる。一部の実施形態では、疎水性ポリマーは、ＨＰＭＡモノマー、またはＨＰＭＡ・ＤＥＧＭＡモノマーを含む、ポリマーである。一部の実施形態では、ＨＰＭＡおよびＤＥＧＭＡモノマーを含むポリマーは、Ａ−Ｂ型ジブロックポリマーである。本明細書で報告される予想外の発見は、ＨＰＭＡ親水性ブロックを含むＡ−Ｂ型ジブロックコポリマーに連結されたペプチド抗原（Ａ）が、集合して、ペプチド抗原（Ａ）組成とは無関係に均一なサイズのナノ粒子ミセルを構築するということである。
【０２６４】
疎水性分子（Ｈ）は、環式ウレタン、環式エーテル、環式アミド、環式エステル、環式無水物、環式スルフィドおよび環式アミンを含む環式モノマーに基づくポリマーも含みうる。
【０２６５】
環式モノマーを含むポリマーに基づく疎水性分子（Ｈ）は、開環重合により生成することができ、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリウレタンおよびポリホスフェートを含み、具体的な例としては、ポリカプロラクトンおよびポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を挙げることができるが、これらに限定されない。適するポリマーは、縮合反応によって生成することもでき、ポリアミド、ポリアセタールおよびポリエステルを含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、３〜１０，０００モノマー単位を含むことができるポリマーである。好ましい実施形態では、ポリマーは、３〜３００モノマー単位、例えば、３〜１０モノマー単位、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０モノマー単位、または約１０〜１００モノマー単位、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または約１００〜２００モノマー単位、または約２００〜３００モノマー単位、通常は１，０００以下のモノマー単位を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、最大１，０００〜１０，０００モノマー単位を含みうる。通常は、ペプチド抗原コンジュゲートの粒子形成を促進するのに十分なサイズの疎水性分子（Ｈ）を形成するために少なくとも５モノマーが必要であるが、意外なことに、芳香族環を含むわずか３つのモノマーを有するポリマーから構成された疎水性分子（Ｈ）が、ペプチド抗原コンジュゲートの粒子集合を駆動するのに十分であった。３モノマーから５モノマーへ、そして５モノマーから１０モノマーへポリマーの長さを増加させると、粒子形成を促進する力の強度が増し、より安定性の高い、よりサイズの大きい粒子がペプチド抗原コンジュゲートにより形成されることになる。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートを構成する疎水性分子（Ｈ）は、５〜１００の間のモノマーから構成されるポリマーであり、その結果、水性条件で直径おおよそ１０〜３００ｎｍの粒子が形成されることになる。さらなる実施形態では、疎水性分子（Ｈ）を構成するポリマーは、約３００モノマーから構成され、集合して約２０〜５００ｎｍの間、または約１００〜５００ｎｍの粒子を構築するペプチド抗原コンジュゲートをもたらす。
【０２６７】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）を構成するポリマーの平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌの間でありうる。好ましい実施形態では、ポリマーの平均分子量は、約１，０００〜６０，０００ｇ／ｍｏｌの間である。一部の実施形態では、ポリマー分子量は、約１，０００〜５，０００の間、または約５，０００〜１０，０００の間、または約１０，０００〜２０，０００の間、または約２０，０００〜３０，０００の間、または約２５，０００〜６０，０００の間である。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜約６０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、２０，０００ｇ／ｍｏｌ、３０，０００ｇ／ｍｏｌ、４０，０００ｇ／ｍｏｌ、５０，０００ｇ／ｍｏｌまたは６０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、Ａ−Ｂ型ジブロックポリマーである。一部の実施形態では、ポリマーは、ＡブロックとＢブロックの分子量の比が約１：５〜約５：１である、Ａ−Ｂ型ジブロックポリマーである。非限定的な例では、約６０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＡ−Ｂ型ジブロックポリマーは、約１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＡブロックおよび約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＢブロック；約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＡブロックおよび約４０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＢブロック；約３０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＡブロックおよび約３０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＢブロック；約４０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＡブロックおよび約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＢブロック；約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＡブロックおよび約１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＢブロックから構成される。
【０２６８】
ポリマーの多分散性、Ｍｗ／Ｍｎは、約１．０〜約５．０の範囲でありうる。ポリマーは、様々な重合技術によって形成することができる。ペプチドおよびヌクレオチド系ポリマーは、固相合成により調製することができ、ポリマーを分子的に規定すると１．０の多分散性を有することになる。連鎖成長重合により形成されるポリマーは、多分散性＞１．０を有することになる。ポリマーは、リビング重合技術または溶液フリーラジカル重合によって合成することができる。好ましい実施形態では、ペプチド系バイオポリマーは、固相ペプチド合成により合成される。芳香族環を有するアミノ酸、例えばトリプトファン、を含むペプチド（または「ポリ（アミノ酸）」）系ポリマーは、水性条件で疎水性にもかかわらず、芳香族環のないペプチド（または「ポリ（アミノ酸）」）と比較して、固相合成による製造の予想外の向上をもたらした。したがって、好ましい実施形態では、固相合成により生成されるペプチドに基づく疎水性分子（Ｈ）は、芳香族環を含むアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、アクリルアミド系およびアクリレート系ポリマーが可逆的付加−開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合により合成される。さらなる実施形態では、ポリ（アミノ酸）およびポリ（ホスホエステル）が開環重合により合成される。
【０２６９】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、リガンド（単数または複数）、例えばＰＲＲアゴニスト、をさらに含むポリマーを含みうる。一部の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）は、リガンドとカップリングさせることができる少なくとも１つの官能基、またはリガンドとカップリングさせることができるリンカーとカップリングさせることができる少なくとも１つの官能基を含むモノマーを含みうる。他の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）は、ポリマーの末端および／または側鎖に連結されているリガンドを含みうる。
【０２７０】
がんおよび感染性疾患の処置または予防のための免疫原性組成物の好ましい実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、リガンドに連結されるポリマーである。一部の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）に連結されるリガンドは、芳香族環構造を含む。一部の実施形態では、ポリマーに連結されるリガンドは疎水性であり、水性条件でペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性の増大を促進する。他の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）に連結されるリガンドは、ヘテロ環式芳香族環を含む。一部の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）に連結されるリガンドは、アリールアミンをさらに含む芳香族環を含む。一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）に結合されるリガンドは、ヘテロ環式芳香族環を含む疎水性リガンドであり、必要に応じて、この疎水性リガンドは、芳香族アミン（すなわち、Ａｒ−ＮＨ２）をさらに含む。疎水性分子（Ｈ）が、芳香族基を含むリガンドであって、必要に応じてヘテロ環および／またはアリールアミンを含むリガンドを含む、実施形態では、本発明者らは、そのような疎水性分子（Ｈ）が、ＤＭＳＯおよびエタノールなど、薬学的に許容される有機溶媒に高度に可溶性であるが、水性緩衝液に不溶性であるという、予想外の発見を報告する。
【０２７１】
一部の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）に連結されるリガンドは、パターン認識受容体アゴニスト（ＰＲＲａ）、例えば、アジュバント特性を有するＳＴＩＮＧ、ＮＯＤ受容体、またはＴＬＲのアゴニストである。ポリマーに連結される、アジュバント特性を有するリガンドは、ＰＲＲアゴニストなどのいずれの適するアジュバント化合物であってもよく、またはいずれの適するアジュバント化合物に由来してもよい。アジュバント特性を有する、適するリガンドは、小有機分子、すなわち、約３，０００ダルトン未満の分子量を有する分子、を含む化合物を含むが、一部の実施形態では、アジュバントは、約７００ダルトン未満の分子量を有することもあり、一部の場合には、アジュバントは、約２００ダルトン〜約７００ダルトンの分子量を有することもある。
【０２７２】
がんまたは感染性疾患の処置または予防に使用される免疫原性組成物の好ましい実施形態における疎水性分子（Ｈ）は、アジュバント特性を有するリガンドに連結されているポリマーである。ＰＲＲアゴニストなどの、アジュバント特性を有するリガンドを、ポリマーの側鎖または末端基に、任意の適するリンカーによって連結させることができる。一部の実施形態では、ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）を構成するモノマーは、アジュバント特性を有するリガンドとカップリングさせることができる少なくとも１つの官能基、またはアジュバント特性を有するリガンドとカップリングさせることができるリンカーとカップリングさせることができる少なくとも１つの官能基を含む側鎖を含む。ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）が、アジュバント特性を有するリガンドを含む、一部の実施形態では、ポリマーのモノマーのすべてが、アジュバント特性を有するリガンドに連結されている。疎水性分子（Ｈ）が、アジュバント特性を有するリガンドを含む、他の実施形態では、ポリマーのモノマーのすべてが、アジュバントに連結されているとは限らない。
【０２７３】
疎水性分子（Ｈ）が、ポリマーの主鎖に沿って分布しているモノマー単位によって、アジュバント特性を有するリガンドに連結されているポリマーを含む、一部の実施形態では、ポリマー上のリガンドの密度を増加させると、ペプチド抗原（Ｈ）に対する免疫応答の予想外の向上に至る。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、ＰＲＲアゴニストなどの、アジュバント特性を有するリガンドの、ポリマーのモノマーに対するモル比は、約１：１００〜１：１  ｍｏｌ／ｍｏｌ（または約１ｍｏｌ％〜約１００ｍｏｌ％）、例えば、１：２．５〜１：１  ｍｏｌ／ｍｏｌから選択することができる。
【０２７５】
ポリマーに連結されている、ＰＲＲアゴニストなどの、アジュバント特性を有するリガンドの密度は、特定の適用の必要に応じて変えることができる。ＰＲＲアゴニストなどの、アジュバント特性を有するリガンドを、ポリマーに、１〜１００ｍｏｌ％、例えば、１〜１０ｍｏｌ％または５０〜１００ｍｏｌ％に連結させることができる。ｍｏｌ％は、ＰＲＲアゴニストなどの、アジュバント特性を有するリガンドに連結されているポリマーを構成するモノマーのパーセンテージを指す。例えば、１０ｍｏｌ％リガンド（例えば、ＰＲＲアゴニスト）は、合計１００モノマー単位からの、リガンドに連結されている１０モノマー単位に等しい。残りの９０はリガンドに連結されていない、高分子形成モノマー単位でありうる。
【０２７６】
ポリマーベースの疎水性分子（Ｈ）に連結されている、アジュバント特性を有するリガンドなどの、リガンドの密度は、ペプチド抗原コンジュゲートが、（ｉ）ＤＭＳＯなどの薬学的に許容される有機溶媒に可溶性であること、（ｉｉ）水性条件で、生理的温度およびｐＨで、安定したナノ粒子を形成することができること、ならびに／または（ｉｉｉ）被験体において免疫応答、特にＴ細胞応答、を誘導することができることを確保するように、選択するべきである。
【０２７７】
ポリマーに連結されている、ＰＲＲアゴニストなどの、リガンドの最適な密度は、リガンドの組成ばかりでなく、ポリマー組成、ポリマー長にも依存する。リガンドが、水溶解度が低い、疎水性／両親媒性分子、例えば、イミダゾキノリンベースのＴｏｌｌ様受容体−７および−８アゴニスト（ＴＬＲ−７／８ａ）であり、単独でのポリマーが、水溶性である（すなわち、リガンドに連結されていないポリマーが水溶性である）場合、リガンドは、通常は、ポリマーに、ポリマーが約５〜３０の間のモノマー単位から構成されるときには約２０〜１００ｍｏｌ％の密度で、ポリマーが３０〜１００の間のモノマー単位から構成されるときには１０〜５０ｍｏｌ％の密度、またはポリマーが１００〜３００の間のモノマー単位から構成されるときには５〜２０ｍｏｌ％の間の密度で、連結されている。一般に、アジュバント特性を有するリガンドのｍｏｌ％は、ポリマーが短いほど高く、ポリマーが長いほど低い。
【０２７８】
１０，０００ｇ／ｍｏｌより多い親水性または温度応答性ポリマーであって、Ｎ−２−ヒドロキシプロピル（メタクリルアミド）（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシエチル（メタクリレート）（ＨＥＭＡ）、スチレン、ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＮＩＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡｍ）、Ｎ−（Ｌ）−（１−ヒドロキシメチル）プロピルメタクリルアミド（ＨＭＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）、２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）または置換ポリ（ホスホエステル）から選択されるコモノマーに基づくポリマーに結合されている、アジュバント特性を有するリガンド、例えばＰＲＲａ、の最適な密度は、１〜２５％であり、例えば、ポリマーに結合されているアジュバントの密度は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％または約２５％でありうる。
【０２７９】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、一方のブロックが疎水性であり、他方のブロックが親水性である、両親媒性Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーである。疎水性分子（Ｈ）が、両親媒性Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーであり、リガンドが、疎水性、例えば、イミダゾキノリンＴＬＲ−７／８アゴニストである、一部の実施形態では、リガンドは、好ましくは、疎水性ブロックに約１〜５０ｍｏｌ％の間、通常は約１〜２０ｍｏｌ％の密度で、連結されている。疎水性分子（Ｈ）が、両親媒性Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーであり、リガンドが親水性である、一部の実施形態では、リガンドは、好ましくは、親水性ブロックに約１〜２０ｍｏｌ％の間の密度で、または親水性ブロックの親水性末端に連結されており、したがって、Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーは、リガンドに対してセミテレケリックである。非限定的な例では、疎水性分子（Ｈ）は、ＨＰＭＡブロックとＤＥＧＭＡブロックとを含む温度応答性Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーを含み、イミダゾキノリンＴＬＲ−７／８アゴニストがＤＥＧＭＡブロックに約１〜５ｍｏｌ％の間の密度で連結されている。さらなる非限定的な例では、疎水性分子（Ｈ）は、ＨＰＭＡコポリマー疎水性ブロックとＨＰＭＡホモポリマー親水性ブロックとを含むＡ−Ｂ型ジブロックポリマーを含み、イミダゾキノリンＴＬＲ−７／８アゴニストがＨＰＭＡコポリマー疎水性ブロックに約２０ｍｏｌ％の密度で連結されている。一部の実施形態では、疎水性分子は、トリブロックコポリマー、例えばＡ−Ｂ−Ａ、または他のマルチブロックコポリマー組成である。
【０２８０】
本明細書で報告される予想外の発見は、アジュバント特性を有するリガンドに連結されているＨＰＭＡ親水性ブロックを含むＡ−Ｂ型ジブロックコポリマーに連結されているペプチド抗原（Ａ）が、集合して、ペプチド抗原（Ａ）組成とは無関係に均一なサイズのナノ粒子ミセルを構築するということであり、ナノ粒子ミセル形成のこの確実性向上は、Ｔ細胞免疫の規模増加と関連付けられた。非限定的な例では、ペプチド抗原（Ａ）は、ＨＰＭＡコポリマー疎水性ブロック（すなわち、ｐ［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］）およびＨＰＭＡホモポリマー親水性ブロック（すなわち、ｐ（ＨＰＭＡ））から構成されるジブロックコポリマーに、トリアゾールリンカー（Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＤＢＣＯ）によって連結されて、ペプチド抗原コンジュゲートｐ｛［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（Ｌｙｓ（Ｎ３））−Ａ（ここで、２Ｂは、化合物１とも呼ばれるＴＬＲ−７／８ａである）が形成される。さらなる実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、ＤＥＧＭＡコポリマー疎水性ブロック（すなわち、ｐ［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］）およびＨＰＭＡホモポリマー親水性ブロック（すなわち、ｐ（ＨＰＭＡ））から構成されるジブロックコポリマーに、トリアゾールリンカー（Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＤＢＣＯ）によって連結されて、ペプチド抗原コンジュゲートｐ｛［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（Ｌｙｓ（Ｎ３））−Ａ（ここで、２Ｂは、化合物１とも呼ばれるＴＬＲ−７／８ａである）が形成される。他の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、アジュバント特性を有するリガンドに連結されているＤＥＧＭＡホモポリマー（すなわち、２ＢＸｙ−ｐ［（ＤＥＧＭＡ））およびＨＰＭＡホモポリマー親水性ブロック（すなわち、ｐ（ＨＰＭＡ））から構成されるジブロックコポリマーに、トリアゾールリンカー（Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＤＢＣＯ）によって連結されて、ペプチド抗原コンジュゲート２ＢＸｙ−ｐ｛［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（Ｌｙｓ（Ｎ３））−Ａが形成され、この場合、ペプチド抗原（Ａ）および２ＢＸｙ（化合物２とも呼ばれるＴＬＲ−７／８ａ）が、ポリマーの両端の単一部位に連結されており、これがポリマーをヘテロテレケリックにする。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、グルタミン酸またはアスパラギン酸ならびに芳香族および／または疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、アミノフェニルアラニンアミン（または「フェニルアラニンアミン」）、トリプトファン、チロシン、ベンジルグルタメート、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシンおよびバリンのコモノマーから構成される、ポリ（アミノ酸）系ポリマーであり、アジュバント特性を有する１つまたは複数のリガンド、例えばＰＲＲａ、が、グルタミン酸のガンマカルボン酸またはアスパラギン酸のベータカルボン酸によってこのポリマーに結合されている。好ましい実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、グルタミン酸およびトリプトファンのコモノマーから構成されるポリ（アミノ酸）系ポリマーであって、アジュバント特性を有する１つまたは複数のリガンド、例えばＰＲＲａ、が、ガンマカルボン酸によってグルタミン酸残基に連結されている、ポリ（アミノ酸）系ポリマーである。さらなる実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、リシンならびに芳香族および／または疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、アミノフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、ベンジルグルタメート、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシンおよびバリンのコモノマーから構成される、ポリ（アミノ酸）系ポリマーであって、アジュバント特性を有する１つまたは複数のリガンド、例えばＰＲＲａ、が、リシンのイプシロンアミンによってポリマーに結合されている、ポリ（アミノ酸）系ポリマーである。好ましい実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、リシンおよびトリプトファンのコモノマーから構成されるポリ（アミノ酸）系ポリマーであって、アジュバント特性を有する１つまたは複数のリガンド、例えばＰＲＲａ、が、イプシロンアミンによってリシンに連結されている、ポリ（アミノ酸）系ポリマーである。疎水性分子（Ｈ）が、アジュバント特性を有する１つまたは複数のリガンド、例えばＰＲＲａ、に連結されている、ポリ（アミノ酸）コポリマーである、好ましい実施形態では、ポリマーは、長さ５〜３０アミノ酸の間であり、アジュバントは、２０〜１００ｍｏｌ％、例えば、３０％、５０％、６０％、８０％および１００ｍｏｌ％の密度で結合されている。さらなる実施形態では、リガンドは、ポリ（アミノ酸）ポリマー、すなわちセミテレケリックポリマー、の一端のみに結合されている。本明細書において、本発明者らは、ポリ（アミノ酸）系コポリマーから構成され、このポリマーに連結されている芳香族基、例えば、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、アミノフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、ベンジルグルタメート）または芳香族リガンド（例えば、イミダゾキノリン）をさらに含む、疎水性分子（Ｈ）が、脂肪族アミノ酸または脂肪族リガンドから主として構成されるポリ（アミノ酸）と比較して、有機溶媒溶解度の向上ならびにペプチド抗原コンジュゲートの粒子安定性および生物活性の向上によって、製造性の予想外の向上をもたらすという、予想外の発見を報告する。したがって、好ましい実施形態では、ポリ（アミノ酸）または他のクラスのポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）は、１つまたは複数の芳香族アミノ酸、および／または芳香族基を含むリガンドを含む。
【０２８２】
さらなる実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、カルボン酸を有する、グルタミン酸、アスパラギン酸または非天然アミノ酸残基から全面的に構成されるポリ（アミノ酸）系ポリマーであって、アジュバント特性を有するリガンドが、グルタミン酸、アスパラギン酸または非天然アミノ酸残基のすべてに連結されており、すなわち、アジュバント特性を有するリガンドが、１００ｍｏｌ％の密度で結合されている、ポリ（アミノ酸）系ポリマーである。さらなる実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、遊離アミンを有するリシンまたは非天然アミノ酸から全面的に構成されるポリ（アミノ酸）系ポリマーであり、アジュバント特性を有するリガンドは、リシンまたは非天然アミノ酸残基のすべてに連結されており、すなわち、アジュバントは、１００ｍｏｌ％の密度で結合されている。さらなる実施形態では、γ−（２−メトキシエトキシ）エステリル−Ｌ−グルタメート）などのＰＥＧ化コモノマーが、コポリマーに温度応答特性を付与するために組み入れられる。他の実施形態では、温度応答性ポリマーをポリ（アミノ酸）のペンダント側鎖にグラフトさせて、グラフトコポリマーを形成することができる。さらなる実施形態では、温度応答性ポリマーをポリ（アミノ酸）ポリマーの末端に連結させて、温度応答性ジブロックポリマーを形成することができる。なおさらなる実施形態では、疎水性である第２のポリマーを、アジュバント特性を有するリガンドに連結されているポリ（アミノ酸）ポリマーにペンダント側鎖（ｐｅｎｄａｎｔ  ｓｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）によって連結させてグラフトコポリマーを形成することができ、またはそのようなポリ（アミノ酸）の末端に連結させてジブロックコポリマーを形成することができる。
【０２８３】
一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、アジュバント特性を有する疎水性リガンドなどの、リガンドに連結されているポリ（アミノ酸）系ポリマーであり、式：
【化５】
2020515629.tif 000007
を有する。
【０２８４】
式Ｉ中、Ｒ２は、通常は、水素、ヒドロキシルまたはアミンのうちの１つから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２は、リガンドまたは別のポリマーに、任意の適するリンカー分子によって連結される。メチレン単位であるｙ３の数は、通常は１〜６、例えば、１、２、３、４、５または６である。式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端アミンは、通常はリンカー前駆体Ｘ２に連結され、またはペプチド抗原（Ａ）に、直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）を介してのどちらかで、連結されうる。モノマーの繰り返し数は、ｋにより示され、通常は３〜３００の間である。任意の適するリンカーであるＸが、アジュバント特性を有する疎水性リガンドなどのリガンドをポリ（アミノ酸）主鎖に連結させるために使用される。一部の実施形態では、リンカーＸを、リガンドに連結されている第２のポリマーに連結させることができる。一部の実施形態では、モノマーｋを２つまたはそれより多くの異なるリガンドに連結させることができる。
【０２８５】
一部の実施形態では、式Ｉのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、
【化６】
2020515629.tif 000008
（式中、ｙ４は、任意の整数、例えば、０〜６、例えば０、１、２、３、４、５または６である）
である。リガンドを官能基（ＦＧ）に任意の適する手段によって連結させることができ、ＦＧは、直接またはリンカーを介してのどちらかでの、リガンドの結合、すなわち連結、のための、アミン、カルボン酸、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルキン、ヒドラジン、アルデヒドまたはケトンを含む、任意の適する官能基である。
【０２８６】
ｙ３が１に等しい場合、式Ｉのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、
【化７】
2020515629.tif 000009
である。
【０２８７】
式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端を任意の適する手段によってリンカー（Ｌ）によってペプチド抗原（Ａ）に連結させることができる。一部の実施形態では、式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端にまたはＢ２伸長部のＣ末端にアミド結合によって直接連結される。他の実施形態では、式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）に直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって連結されているリンカー前駆体（Ｘ１）と反応する、リンカー前駆体（Ｘ２）に連結される。一部の実施形態では、シクロオクチン（例えば、ＤＢＣＯ）含有リンカー前駆体（Ｘ２）が、式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端に結合され、アジド含有リンカー前駆体（Ｘ１）と反応してトリアゾール結合を形成する。
【０２８８】
一部の実施形態では、ポリ（アミノ酸）ベースの疎水性分子（Ｈ）は、疎水性アミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸）、またはリガンドに連結されている疎水性アミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸）およびアミノ酸、好ましくは有機溶媒中での製造中に可溶性であるが水性条件で粒子を形成することができる材料を生成するために、疎水性分子（Ｈ）の物理的および化学的特性を補うのにまたは調節するのに有用である、さらなるアミノ酸、例えば荷電または親水性アミノ酸、を含みうる。したがって、一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、式：
【化８】
2020515629.tif 000010
を有するポリ（アミノ酸）系ポリマーである。
【０２８９】
式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、通常はモノマーであるｌと、必要に応じたモノマーであるｍ、ｎおよびｏとを含む。Ｒ３は、通常は、水素、ヒドロキシルまたはアミンのうちの１つから選択される。一部の実施形態では、Ｒ３は、任意の適するリンカー分子によって疎水性分子（Ｈ）に連結される、リガンド、例えば、アジュバント特性を有するリガンド、または別のポリマーである。メチレン単位の数は、ｙ５、ｙ６、ｙ７およびｙ８により示され、通常は１〜６、例えば、１、２、３、４、５または６である。式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端アミンは、通常はリンカー前駆体Ｘ２に連結され、またはペプチド抗原（Ａ）に、直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）を介してのどちらかで、連結されうる。典型的な実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、任意の天然または非天然アミノ酸から選択されるモノマーであるｌを含み、式中、Ｒ４は、低級アルキルまたは芳香族基から選択され、ポリマー主鎖に疎水性を付与する。一部の実施形態では、式ＩＩに含まれるＲ４は、
【化９−１】
2020515629.tif 000011
【化９−２】
2020515629.tif 000012
【化９−３】
2020515629.tif 000013
から選択することができ、ここで、Ｒ４のＸは、任意の適するリンカーである。
【０２９０】
一部の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、必要に応じたコモノマーであるｍを含み、コモノマーｍは、任意の天然もしくは非天然アミノ酸、例えば、ＰＥＧアミノ酸スペーサー（例えば、式ＩＩのｍは、−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｙ９−（ＣＨ２）ｙ１０−（ＣＯ）−であり、ここで、ｙ９は、通常は１〜２４の間の、整数であり、ｙ１０は、通常は１〜３の間の、整数である）、または小さい置換基を有するアミノ酸から選択され、式中、例えばＲ５は、水素、低級アルキル、またはヒドロキシルを含む低級アルキルから選択され、ポリマー主鎖の間隔または可撓性を増すために備えられている。一部の実施形態では、式ＩＩに含まれるＲ５は、
【化１０】
2020515629.tif 000014
から選択することができる。
【０２９１】
一部の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、任意の天然または非天然アミノ酸から選択される必要に応じたコモノマーであるｎを含み、式中、Ｒ６は、恒久的にまたは特定のｐＨで、のどちらかで、電荷を帯びる官能基を含む任意の基から選択される。一部の実施形態では、式ＩＩに含まれるＲ６は、
【化１１】
2020515629.tif 000015
から選択することができる。
【０２９２】
一部の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、任意の天然または非天然アミノ酸から選択される必要に応じたコモノマーであるｏを含み、式中、リガンドは、任意の適するリンカーＸによってこのモノマー、ｏ、に連結されている。リガンドは、アジュバント特性を有するリガンドであってもよい。式ＩＩのポリ（アミノ酸）に連結されているリガンドは、性質の点で、疎水性であってもよく、親水性であってもよく、両親媒性であってもよく、荷電していてもよく、または中性であってもよい。モノマーｏを含む式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、モノマーｏに結合されているリガンドの性質を補うモノマー単位であるｌ、ｍおよびｎをさらに含むことができる。
【０２９３】
式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーにおいて、モノマーの繰り返し数は、ｌ、ｍ、ｎおよびｏにより示され、ｌ、ｍ、ｎおよびｏの合計は、通常は、３〜３００の間の任意の整数である。異なるタイプのモノマーであるｌ、ｍ、ｎまたはｏの各々は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。「ｌ」により示されるモノマーは、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーに疎水性を付与する、すなわち、ポリマーを水不溶性疎水性分子（Ｈ）にする。疎水性モノマーであるｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよく、通常は、芳香族環を含む。好ましい実施形態では、疎水性モノマーであるｌは、ヘテロ環式および／またはアミン置換芳香族環を含む。「ｍ」により示される必要に応じたコモノマーは、ポリマー主鎖を構成する異なるモノマーの可撓性または間隔を増加させるために使用することができる。「ｎ」により示される必要に応じたコモノマーは、荷電官能基を含む。「ｏ」により示される必要に応じたコモノマーは、ＰＲＲアゴニストなどのリガンドの結合に使用される。一部の実施形態では、モノマーであるｏに任意の適するリンカーによって連結されているリガンドは、ＰＲＲアゴニストである。一部の実施形態では、モノマーであるｏは、正または負電荷を帯びているリガンドに連結され、反対の電荷のモノマーであるｎに隣接している。一部の実施形態では、荷電コモノマーであるｎは、このコモノマーｎを含む官能基の反対の電荷の官能基を含むコモノマーであるｏに隣接して配置され、これらの反対の電荷の結果として正味電荷がゼロとなり、したがって、モノマーｎは、モノマーｏに結合されているリガンドが帯びている電荷を中和するように機能する。
【０２９４】
式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーを構成するモノマーであるｌ、ｍ、ｎおよびｏのパーセンテージは、具体的な適用に依存する。一部の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、全面的にモノマーｌから構成される。他の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、コモノマーであるｌおよびｏ、例えば、５〜９５ｍｏｌ％の間のモノマーｌおよび約９５〜５ｍｏｌ％のモノマーｏから構成される。一部の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、コモノマーであるｌおよびｍを含み、この場合、ｍは、疎水性モノマーであるｌの間に間隔、すなわち距離を設け、ポリマーの剛性を低下させることができる。他の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、モノマーであるｌ、ｍおよびｏを含み、この場合、モノマーｍは、モノマーｌおよびｏを構成する嵩高い置換基間に間隔を設ける。他の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、モノマーであるｌおよびｏ、ならびに必要に応じてモノマーｍおよびｎを含み、この場合、モノマーｎは、ポリマー主鎖の電荷を調節するために使用される。ある特定の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、モノマーｍおよびｏから全面的に構成される。他の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、モノマーｍ、ｎおよびｏから、またはｎおよびｏだけから、全面的に構成される。さらに他の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、モノマーｌ、ｍ、ｎおよびｏを含む。
【０２９５】
式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーがアジュバントを含む場合、任意の適するリンカーを介してアジュバントに連結されているモノマーであるｏによって表される、ポリマーを構成するモノマーのパーセンテージは、通常は１０〜６０％であり、例えば、長さ２０アミノ酸であるポリマーの２〜１２の間のアミノ酸がモノマーｏである。式ＩＩのポリ（アミノ酸）ポリマーの一部の実施形態では、ｌが、主モノマー単位である。さらなる実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーは、ｌモノマーから全面的に構成され、すなわち、すべてのモノマーが、ｌモノマーであり、この場合、必要に応じて、アジュバントが、ポリ（アミノ酸）の末端に、直接、または第２のポリマーを介してもしくは任意の適するリンカー分子によって間接的に、のどちらかで、結合する。
【０２９６】
式ＩＩのポリマーが、ｏモノマーを含むコポリマーである場合、リガンドは、ここで示されるようなポリマー主鎖に沿って分布しているペンダント官能基（ＦＧ）に連結されていることもある：
【化１２】
2020515629.tif 000016
（式中、ｙ１１は、メチレン単位の数を示し、任意の整数、例えば、０〜６、例えば０、１、２、３、４、５または６である）。官能基（ＦＧ）は、直接またはリンカーを介してのどちらかでの、リガンドの結合、すなわち連結を可能にする、アミン、カルボン酸、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルキン、ヒドラジン、アルデヒドまたはケトンを含む、任意の適する官能基である。
【０２９７】
一部の実施形態では、ｙ５、ｙ６、ｙ７およびｙ８は、１に等しく、式ＩＩのポリマーは、
【化１３】
2020515629.tif 000017
である。
【０２９８】
アジュバント特性を有するリガンドを、本開示の疎水性分子（Ｈ）のいずれに連結させてもよい。ある特定の実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドは、式ＩＩのポリマーに連結される。アジュバント特性を有するリガンドを、式ＩＩのポリ（アミノ酸）系ポリマーにｏモノマー上のペンダント官能基（ＦＧ）によって連結させてもよく、ポリマーの末端に連結させてもよく、またはペンダント官能基（ＦＧ）にグラフトされているもしくはポリマーの末端にある別の分子もしくはポリマーによって間接的に連結させてもよい。好ましい実施形態では、モノマーｏの官能基（ＦＧ）は、アジュバント特性を有するリガンド、または他のリガンド分子を、ポリ（アミノ酸）主鎖に、共有結合によって連結させる。一部の実施形態では、式ＩＩのモノマーｏを構成するＦＧを第２のポリマーに連結させることができる。式ＩＩに含まれているＦＧは、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、アミン、ヒドラジン、チオール、アジドもしくはアルキン、またはポリマー主鎖にリガンドもしくは別のポリマーを連結させるために使用することができる任意の適する官能基から選択することができる。
【０２９９】
好ましい実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、リンカー前駆体Ｘ１およびＸ２の反応によって、リンカー（Ｌ）によってペプチド抗原（Ａ）に、直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によってのどちらかで、連結される。一部の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端にまたはＢ２伸長部のＣ末端にアミド結合によって直接連結される（すなわち、リンカー（Ｌ）は存在しない）。他の実施形態では、式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）に直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって連結されているアジド含有リンカー前駆体（Ｘ１）と反応するシクロオクチン（ＤＢＣＯ）含有リンカー前駆体（Ｘ２）に連結される。
【０３００】
式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）は、Ｎ末端アミン、Ｃ末端カルボン酸によって、または必要に応じた側鎖によって、例えば、コモノマーの官能基によって、いずれかで、直接、またはリンカー（Ｌ）もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、ペプチド抗原（Ａ）に連結させることができる、疎水性分子（Ｈ）である。一部の実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）は、ペプチド抗原（Ａ）に連結され、その結果、式［Ｃ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ、または［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ（Ｃ）（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）のペプチド抗原コンジュゲートとなる、疎水性分子（Ｈ）である。
【０３０１】
好ましい実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）は、疎水性分子（Ｈ）であり、そのＮ末端がリンカー（Ｌ）に連結されており、このリンカー（Ｌ）は、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）に連結されており、このＣ末端伸長部（Ｂ２）は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されており、このペプチド抗原（Ａ）は、Ｎ末端が、Ｎ末端伸長部（Ｂ１）に連結されており、このＮ末端伸長部（Ｂ１）は、荷電分子（Ｃ）に連結されている。
【０３０２】
例えば、Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｔ−Ｈ
【０３０３】
さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）を、式ＩもしくはＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）に直接連結させることができ、または伸長部を介してペプチド抗原（Ａ）に連結されているリンカー（Ｌ）を介して連結させることができる。ここで、Ａ−Ｂ２−Ｌ（Ｃ）−Ｈについて、カッコの表記は、ＬがＣとＨの両方に連結されていることを示すことが意図される。
【０３０４】
例えば、Ａ−Ｂ２−Ｌ（Ｃ）−ＨまたはＡ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（Ｃ）
【０３０５】
さらなる実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）は、疎水性分子（Ｈ）であり、そのＮ末端がリンカー（Ｌ）に連結されており、このリンカー（Ｌ）は、必要に応じた荷電（Ｃ）分子にも、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されているＣ末端伸長部（Ｂ２）にも、連結されている。
【０３０６】
例えば、Ａ−Ｂ２−（Ｃ−Ｌ）−Ｈ
【０３０７】
好ましい実施形態では、疎水性ブロックは、ポリ（アミノ酸）を含み、アジュバント特性を有するリガンドが、このポリ（アミノ酸）の主鎖に沿って分布している側鎖に結合している。アジュバント特性を有するリガンドは、性質の点で、疎水性であってもよく、または親水性であってもよく、荷電していてもよく、または非荷電であってもよい。好ましい実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドは、ＰＲＲアゴニストである。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストでありうる。パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストの非限定的な例としては、ＴＬＲ−１／２／６アゴニスト（例えば、リポペプチドおよび糖脂質、例えば、Ｐａｍ２ｃｙｓまたはＰａｍ３ｃｙｓリポペプチド）、ＴＬＲ−３アゴニスト（例えば、ｄｓＲＮＡ、例えばポリＩ：Ｃ、およびヌクレオチド塩基類似体）、ＴＬＲ−４アゴニスト（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導体、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、および小分子は、ピリミドインドールの誘導体または類似体である）、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ−７および−８アゴニスト（例えば、ｓｓＲＮＡおよびヌクレオチド塩基類似体（イミダゾキノリン、ヒドロキシ−アデニン、ベンゾナフチリジンおよびロキソリビンの誘導体を含む））ならびにＴＬＲ−９アゴニスト（例えば、非メチル化ＣｐＧ）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト（例えば、環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジアデニル酸一リン酸（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ））、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）アゴニスト（例えば、直鎖状であってもよく、または分岐していてもよい、様々な単、二、三およびポリマー糖、例えば、マンノース、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ三糖など）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）アゴニスト、ならびにＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）アゴニスト（例えば、細菌からのペプチドグリカンおよび構造モチーフ、例えば、メソ−ジアミノピメリン酸およびムラミルジペプチド）、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、パターン認識受容体アゴニストは、ＴＬＲアゴニスト、例えば、イミダゾキノリンベースのＴＬＲ−７／８アゴニストでありうる。例えば、アジュバント特性を有するリガンドは、ヒトへの使用がＦＤＡにより承認されている、イミキモド（Ｒ８３７）またはレシキモド（Ｒ８４８）でありうる。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドは、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−８アゴニスト、および／またはＴＬＲ−７／８アゴニストでありうる。多くの異なるイミダゾキノリン化合物を含む、非常に多くのそのようなアゴニストが、公知である。
【０３１０】
イミダゾキノリンは、本明細書で開示される方法において使用される。イミダゾキノリンは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）上のＴｏｌｌ様受容体７および８（ＴＬＲ−７／ＴＬＲ−８）に結合することにより作用する合成免疫調節薬であって、構造的には、これらの受容体の天然リガンドであるウイルス１本鎖ＲＮＡを模倣する、合成免疫調節薬である。イミダゾキノリンは、縮合キノリン−イミダゾール骨格を含むヘテロ環式化合物である。その誘導体、塩（水和物、溶媒和物およびＮ−オキシドを含む）およびプロドラッグも、本開示により企図される。特定のイミダゾキノリン化合物は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，５１８，２６５号および米国特許第４，６８９，３３８号を参照されたい。一部の非限定的な実施形態では、イミダゾキノリン化合物は、イミキモドでなく、および／またはレシキモドでない。
【０３１１】
一部の実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドは、５員窒素含有ヘテロ環式環に縮合している２−アミノピリジンを有する小分子でありえ、そのような小分子は、これらに限定されないが、イミダゾキノリンアミンおよび置換イミダゾキノリンアミン、例えば、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−または９−アリール、ヘテロアリール、アリールオキシまたはアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、およびイミダゾキノリンジアミンなど；アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、オキシム置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、およびテトラヒドロイミダゾキノリンジアミンを、これらに限定されないが、含むテトラヒドロイミダゾキノリンアミン；アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテル、およびチオエーテル置換イミダゾピリジンアミンを、これらに限定されないが、含むイミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；ピラゾロピリジンアミン；ピラゾロキノリンアミン；テトラヒドロピラゾロキノリンアミン；ピラゾロナフチリジンアミン；テトラヒドロピラゾロナフチリジンアミン；ならびにピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合している１Ｈ−イミダゾ二量体を含む。
【０３１２】
一部の実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドは、式：
【化１４】
2020515629.tif 000018
を有するイミダゾキノリンである。
【０３１３】
式ＩＩＩ中、Ｒ７は、水素、必要に応じて置換されている低級アルキル、または必要に応じて置換されている低級エーテルのうちの１つから選択され、Ｒ８は、必要に応じて置換されているアリールアミン、または必要に応じて置換されている低級アルキルアミンのうちの１つから選択される。Ｒ８を、ポリマーに連結するリンカーになるように、必要に応じて置換してもよい。予想外の発見は、Ｒ８が低級アルキルアミンから選択された一部の化合物では、化合物は、アリールアミンから選択されたＲ８より作用強度が弱かったが、応答の質は向上されたことであった。したがって、式ＩＩＩの中等度の作用強度のアジュバントが、より質の良い応答をもたらした。式ＩＩＩのアジュバントが、リガンドの１つのタイプであり、式ＩＩＩのアジュバント、またはアジュバント特性を有するリガンドと呼ばれることもあることに、留意されたい。
【０３１４】
一部の実施形態では、式ＩＩＩに含まれるＲ７を、水素、
【化１５】
2020515629.tif 000019
から選択することができる。
【０３１５】
一部の実施形態では、Ｒ８を、
【化１６】
2020515629.tif 000020
（式中、ｅは、メチレン単位の数を示し、１〜４の整数である）
から選択することができる。
【０３１６】
一部の実施形態では、Ｒ８は、
【化１７】
2020515629.tif 000021
でありうる。
【０３１７】
一部の実施形態では、Ｒ８は、
【化１８】
2020515629.tif 000022
でありうる。
【０３１８】
一部の実施形態では、Ｒ７は、
【化１９】
2020515629.tif 000023
でありえ、Ｒ８は、
【化２０】
2020515629.tif 000024
でありうる。
【０３１９】
式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的な例としては、
【化２１】
2020515629.tif 000025
（式中、ｋは、３〜３００の間である）が挙げられる。例えば、ｋ＝５の場合、ペプチドは、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている５個のアミノ酸から構成される。一部の実施形態では、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）を、荷電分子（Ｃ）に任意の適する手段によって必要に応じて連結されているペプチド抗原（Ａ）に、直接、またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）を介して間接的に、のどちらかで、連結させてペプチド抗原コンジュゲートを形成することができる。一部の実施形態では、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端にまたはＢ２伸長部のＣ末端にアミド結合によって直接連結される。他の実施形態では、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）に直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって連結されているリンカー前駆体（Ｘ２）と反応する、クリック可能なリンカー前駆体Ｘ２、例えばアルキンもしくはＤＢＣＯ、またはチオール反応性リンカー前駆体Ｘ２、例えばマレイミド、に連結される。好ましい実施形態では、ＤＢＣＯリンカー前駆体Ｘ１は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）のＮ末端に結合し、ペプチド抗原（Ａ）に直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によってのどちらかで、連結されているアジド含有リンカー前駆体Ｘ２と反応するために使用される。
【０３２０】
式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的な例としては、
【化２２】
2020515629.tif 000026
が挙げられる。
【０３２１】
例えば、
【化２３】
2020515629.tif 000027
（式中、コモノマーｌは、通常は、３〜３００の間の整数であり、必要に応じたコモノマーｏは、通常は、アミノ酸残基３〜３００の間の整数であり、ｌとｏの合計は、通常は、約３〜３００の間である）。あるいは、ｏは、０であり、ポリマーは、全面的にｌから構成され、すなわち、ポリマーは、アジュバントに連結されていないポリ（トリプトファン）ポリマーである。一部の実施形態では、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）に、直接、またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、任意の適する手段によって、連結される。一部の実施形態では、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端にまたはＢ２伸長部のＣ末端にアミド結合によって直接連結される。他の実施形態では、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端は、ペプチド抗原（Ａ）に直接または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって連結されているリンカー前駆体Ｘ１と反応する、クリック可能なリンカー前駆体Ｘ２、例えばＤＢＣＯ、またはチオール反応性リンカー前駆体Ｘ２、例えばマレイミド、に連結される。好ましい実施形態では、ＤＢＣＯリンカー前駆体Ｘ２は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩＩのポリ（アミノ酸）のＮ末端に結合され、アジド官能基を有するリンカー前駆体Ｘ１と反応するために使用される。
【０３２２】
本明細書で開示される予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲートの疎水性分子（Ｈ）を構成する式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩのどちらかのポリ（アミノ酸）の長さ、すなわち、そのようなポリ（アミノ酸）のモノマー単位の数が、ペプチド抗原（Ａ）に対して生成されるＴ細胞応答の規模に影響を及ぼす主要決定因子であるということである。したがって、５つまたはそれより多くのモノマー単位を有する式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートは、長さ５アミノ酸未満である同じ式のポリ（アミノ酸）と比較して高いＴ細胞応答の質および規模を促進することが判明した。さらなる発見は、式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）に連結されている式ＩＩＩのアジュバントの数が、生成される免疫応答の規模にも影響を及ぼし、式ＩＩＩのアジュバントを３つまたはそれより多く含む式ＩまたはＩＩの疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートが、式ＩＩＩのアジュバントを３つ未満含む式ＩまたはＩＩの疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートと比較して大規模なＴ細胞応答をもたらしたことであった。これらの発見の非限定的な説明は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩの疎水性分子（Ｈ）の長さの増加により、たとえ親水性ペプチド抗原に連結された場合でも、ミセルまたは他の超分子構造が確実に形成されるということ、およびそのような粒子の形成が、ことによると、可溶性材料ではなく粒子に起因する薬物動態および細胞取込みの向上によって、免疫応答の向上をもたらすということである。さらなる非限定的な説明は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）の長さを増加させると、水性緩衝液中でペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性、例えば、動力学的安定性が向上されることになり、粒子の安定性の向上が、粒子がインタクトなままであることを確実にし、それによって、粒子を構成するペプチド抗原コンジュゲートのクリアランス（腎クリアランスまたは肝クリアランスどちらかの）が遅延され、抗原提示細胞による取込みが促進されるということである。
【０３２３】
本明細書で開示されるさらなる予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲートの疎水性分子（Ｈ）を構成する式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）に連結されている式ＩＩＩのアジュバントの作用強度が、複数回の免疫化後にペプチド抗原に対して生成されるＴ細胞応答の規模および幅に逆に関係することが判明したことである。したがって、開示される本明細書において、本発明者らは、化合物１とも呼ばれる式ＩＩＩのアジュバント（式中、
Ｒ７＝
【化２４】
2020515629.tif 000028
およびＲ８＝
【化２５】
2020515629.tif 000029
）に連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）が、化合物２とも呼ばれる式ＩＩＩのアジュバント（式中、Ｒ７＝
【化２６】
2020515629.tif 000030
およびＲ８＝
【化２７】
2020515629.tif 000031
）に連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）と比較してＴ細胞応答のより大きな規模および広いＴ細胞応答の幅をもたらすことを示す。
【０３２４】
非限定的な説明は、式ＩＩＩのアジュバント（式中、Ｒ７＝
【化２８】
2020515629.tif 000032
）のより低い作用強度が、式ＩＩＩのアジュバント（式中、Ｒ７＝
【化２９】
2020515629.tif 000033
）より少ない炎症をもたらすということ、およびより低い作用強度のアゴニストにより誘導される中等度の炎症が、より少ないＴ細胞応答疲弊につながり、それによって、全体としてＴ細胞応答のより大きな規模および広い幅が得られるということである。
【０３２５】
これらの発見に基づいて、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）の好ましい実施形態は：
【化３０】
2020515629.tif 000034
である。
【０３２６】
開示される本明細書において、本発明者らは、化合物１である式ＩＩＩのアジュバント（式中、Ｒ７＝
【化３１】
2020515629.tif 000035
およびＲ８＝
【化３２】
2020515629.tif 000036
）に連結されている式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく疎水性分子（Ｈ）が、ポリ（アミノ酸）ポリマーが５〜１０の間のアミノ酸から構成され、コポリマーの６０〜１００％の間が、式ＩＩＩのアジュバントに連結されているコモノマーｏから構成される場合、Ｔ細胞応答の規模および質の有意な増加をもたらすという、予想外の発見を報告する。好ましい実施形態では、コモノマーｏは、式ＩＩのポリ（アミノ酸）のモノマー単位の２０〜６０％の間、例えば６０％、を構成する。
【０３２７】
例えば、
【化３３】
2020515629.tif 000037
【０３２８】
本明細書で開示される予想外のデータは、疎水性分子（Ｈ）を含むポリマーの長さ、ならびに結合されている、アジュバント特性を有するリガンド（すなわち、式ＩＩＩのＴＬＲ−７／８アゴニスト）の数および作用強度が、ペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチド抗原（Ａ）に対して生成される免疫応答の規模および質の主要決定因子であることを明示する。これらのデータは、疎水性アミノ酸および／またはリガンドに連結されているアミノ酸から構成される、ポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）が、粒子集合を駆動するポリ（アミノ酸）ベースの疎水性分子（Ｈ）の傾向を無効にする高親水性ペプチド抗原（Ａ）を含む、いかなるペプチド抗原（Ａ）に連結されたときにも、粒子形成を可能にするのに十分な長さであるべきであることを示唆する。不十分な長さ、例えば、長さ３アミノ酸未満のポリ（アミノ酸）は、ある特定のペプチド抗原、特に、高い電荷密度を有する親水性ペプチド抗原、に連結された場合、水性条件で粒子形成を促進するのに十分な疎水性表面積を提供することができない。したがって、本明細書で開示する通り、式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）は、３アミノ酸より長い長さ、好ましくは、長さ５〜３０アミノ酸の間、例えば、長さ５、６、７、８、９、１０、２０または３０アミノ酸であるべきである。より長いポリ（アミノ酸）、例えば、３０アミノ酸より長い、例えば、長さ約３０、４０または５０アミノ酸のポリ（アミノ酸）は、例えば固相ペプチド合成により、生成されうる。固相ペプチド合成の代案として、溶液重合反応を使用して、疎水性モノマーから構成される長鎖ポリ（アミノ酸）を生成してもよい。
【０３２９】
本明細書において、本発明者らは、１０８ナノモル濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定されたＴＬＲ−７活性（すなわち、ＥＣ５０）についての作用強度を有する化合物１が、１８．７ナノモル濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定されたＴＬＲ−７活性（すなわち、ＥＣ５０）についての作用強度を有する、より作用強度の強いアゴニストである化合物２と比較して、反復免疫化後のＴ細胞応答の向上をもたらすという、さらなる予想外の発見を開示する。これらのデータは、免疫原性組成物に含まれるアジュバントの作用強度を、免疫応答を最適化するように調節することができること、およびアジュバントによる自然免疫活性化を、Ｔ細胞免疫を最適化するために必要とされる適切なレベルの刺激をもたらすように加減することができることを示唆する。ペプチド抗原コンジュゲートを用いて中等度の作用強度のアゴニスト（すなわち、ＥＣ５０＞１００ナノモル濃度であるアゴニスト）を複数回、例えば３回もしくはそれより多く送達することにより、またはより作用強度の高いアゴニスト（すなわち、ＥＣ５０＜１００ナノモル濃度であるアゴニスト）を３回未満送達することにより、自然免疫刺激レベルを加減することができる。
【０３３０】
様々なＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−８アゴニスト、および組み合わせＴＬＲ−７・ＴＬＲ−８アゴニストの作用強度を、文献から容易に突き止めることができる。イミダゾキノリンベースのおよびアデニンベースのＴＬＲ−７およびＴＬＲ−７／８アゴニストは、記載されており（参照：Ｓｈｕｋｌａら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、５３巻：４４５０〜４４６５頁、２０１０年およびＧｅｒｓｔｅｒら、Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、米国特許第６，０６９，１４９号、およびＨｉｒｏｔａら、Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５巻：５４１９〜５４２２頁、２００２年、これらは参照により本明細書に組み込まれる）、式ＩＩＩのアジュバントのＲ２に選択される芳香族リンカー、例えばベンジルおよびキシリルリンカーが、式ＩＩＩのアジュバントのＲ２が低級アルキルから選択された化合物と比較して、ＴＬＲ−７に対する作用強度が増した化合物をもたらすことを明らかにする。
【０３３１】
本明細書に記載される予想外の発見に基づくと、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）の好ましい実施形態は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されているコモノマーの密度が２０〜１００ｍｏｌ％の間である場合、通常は、長さ５〜３０アミノ酸の間である。必要に応じて、式ＩＩＩのアジュバントが、低級アルキルから選択されるＲ８を含む場合、例えば、化合物１の場合、化合物１に連結されているアミノ酸の密度は、４０〜１００％の間、例えば６０％であるべきである。必要に応じて、式ＩＩＩのアジュバントが、芳香族から選択されるＲ８を含む場合、例えば、化合物２の場合、化合物２に連結されているアミノ酸の密度は、２０％未満、または各ポリマー上の送達される化合物２の１〜２分子の間であるべきである。
【０３３２】
好ましい実施形態では、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するポリマーであって、Ｎ−２−ヒドロキシプロピル（メタクリルアミド）（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシエチル（メタクリレート）（ＨＥＭＡ）、スチレン、ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＮＩＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡｍ）、Ｎ−（Ｌ）−（１−ヒドロキシメチル）プロピルメタクリルアミド（ＨＭＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）、２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）または置換ポリ（ホスホエステル）から選択されるコモノマーに基づくポリマーに連結されている、式ＩＩＩのアジュバントの密度は、約５〜１００ｍｏｌ％であり、例えば、ポリマーに結合されているアジュバントの密度は、約５〜６％、約６〜７％、約８〜９％、約９〜１０％、約１０〜１１％、約１１〜１２％、約１２〜１３％、約１３〜１４％、約１５〜１６％、約１７〜１８％、約１８〜２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％でありうる。
【０３３３】
好ましい実施形態では、１０，０００ｇ／ｍｏｌより高い分子量を有するポリマーであって、Ｎ−２−ヒドロキシプロピル（メタクリルアミド）（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシエチル（メタクリレート）（ＨＥＭＡ）、スチレン、ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＮＩＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡｍ）、Ｎ−（Ｌ）−（１−ヒドロキシメチル）プロピルメタクリルアミド（ＨＭＰＭＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）、２−（２−メトキシエトキシ）エチルメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）または置換ポリ（ホスホエステル）から選択されるコモノマーに基づくポリマーに連結されている、式ＩＩＩのアジュバントの密度は、約１〜２５ｍｏｌ％であり、例えば、ポリマーに結合されているアジュバントの密度は、約１〜２％、約２〜３％、約３〜４％、約５〜６％、約６〜７％、約７〜８％、約８〜９％、約９〜１０％、約１０〜１１％、約１１〜１２％、約１３〜１４％、約１４〜１５％、約１６〜１７％、約１７〜１８％、約１９〜２０％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、または約２５％でありうる。
【０３３４】
さらなる実施形態では、疎水性および／または温度応答性モノマーから構成される第２のポリマーが、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）の末端または側鎖のどちらかに連結される。
【０３３５】
式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）にグラフトされた温度応答性ＤＥＧＭＡ系ポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的例が、明確にするために、ここに提供される：
【化３４】
2020515629.tif 000038
（式中、コモノマーｋは、通常は、３〜３００の間の整数であり、コモノマーｋ’は、通常は、アミノ酸残基３〜３００の間の整数であり、ｋとｋ’の合計は、通常は、約３〜３００の間である）。好ましい実施形態では、ｋは、約３〜１０の間であり、ｋは、約１〜１０の間である。リンカーであるＸは、任意の適するリンカー分子でありえ、ｍは、通常は、約１０〜３００モノマー単位である。ポリ（アミノ酸）のＮ末端が、任意の適する手段によって、ペプチド抗原（Ａ）に、直接またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結されて、さらなる荷電分子（Ｃ）を含むこともあるペプチド抗原コンジュゲートが形成される。
【０３３６】
式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）の末端に連結されている温度応答性ＤＥＧＭＡ系ポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的例が、明確にするために、ここに提供される：
【化３５】
2020515629.tif 000039
（式中、コモノマーｋは、通常は、３〜１００モノマー単位の間の整数である）。リンカーであるＸは、任意の適するリンカー分子でありうる。好ましい実施形態では、ｋ’は、約３〜１０モノマー単位の間である。ポリ（アミノ酸）のＮ末端が、任意の適する手段によって、ペプチド抗原（Ａ）に、直接またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結されて、さらなる荷電分子（Ｃ）を含むこともあるペプチド抗原コンジュゲートが形成される。
【０３３７】
式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）の末端に連結されているポリホスホエステル系ポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的例が、明確にするために、ここに提供される：
【化３６】
2020515629.tif 000040
（式中、コモノマーｋは、通常は、３〜１００モノマー単位の間の整数である）。リンカーであるＸは、任意の適するリンカー分子でありうる。好ましい実施形態では、ｋは、約５〜１０モノマー単位の間であり、ｍは、約１０〜３００モノマー単位の間である。ポリ（アミノ酸）のＮ末端が、任意の適する手段によって、ペプチド抗原（Ａ）に、直接またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結されて、さらなる荷電分子（Ｃ）を含むこともあるペプチド抗原コンジュゲートが形成される。
【０３３８】
式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）の末端に連結されているポリ（ベンジルグルタメート）系ポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）の非限定的例が、明確にするために、ここに提供される：
【化３７】
2020515629.tif 000041
（式中、コモノマーｋは、通常は、３〜１００モノマー単位の間の整数であり、ｍは、通常は、アミノ酸残基５０〜３００の間の整数である）。リンカーは、任意の適するリンカー分子でありうる。好ましい実施形態では、ｘは、約５〜１０モノマー単位の間であり、ｍは、約１０〜３００モノマー単位の間である。ポリ（アミノ酸）のＮ末端が、任意の適する手段によって、ペプチド抗原（Ａ）に、直接またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に、のどちらかで、連結されて、さらなる荷電分子（Ｃ）を含むこともあるペプチド抗原コンジュゲートが形成される。
【０３３９】
非限定的な例では、ペプチド抗原（Ａ）は、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に連結されており、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲート（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）を得るための、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）および必要に応じたリンカー（Ｌ）をさらに含みうる。
［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｐ、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ、Ｐ−［Ｌ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］またはＨ−［Ｌ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］
式ＩＶ
【０３４０】
式ＩＶのペプチド抗原（Ａ）は、整数のアミノ酸数、ｎから構成され、ｎは、通常は、７〜３５の間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５アミノ酸であり、疎水性分子（Ｈ）は、通常は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩまたはＩＩのポリ（アミノ酸）である。
【０３４１】
カテプシン切断性テトラペプチド伸長部（Ｂ１＝Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ  配列番号８）にＮ末端が、および式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）に連結されているトリアゾールリンカー（Ｌ）に連結されている組み合わせた免疫プロテアソーム・カテプシン切断性ヘキサペプチド伸長部（Ｂ２＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号１３）にＣ末端が、必要に応じて連結されている、ペプチド抗原（Ａ）から構成される式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートの非限定的な例が、一例としてここに示される：
【化３８】
2020515629.tif 000042
【０３４２】
必要に応じた荷電分子（Ｃ）
本明細書で開示されるペプチド抗原コンジュゲートは、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）から構成され、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）、必要に応じたリンカー（Ｌ）、および必要に応じた荷電分子（Ｃ）をさらに含むことがあり、ここで、Ｃ＝は、静電荷を付与する官能基を有する荷電分子を示す。粒子（Ｐ）にまたは水性条件で集合して粒子を構築する疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原を含む、本明細書で開示される免疫原性組成物は、粒子を安定させるのに十分な表面電荷がないと凝結しうる。したがって、荷電分子（Ｃ）を、必要に応じて、粒子を安定させて凝結を防止する手段としてペプチド抗原コンジュゲートに連結させてもよく、または、代替的に、荷電分子（Ｃ）を、粒子を安定させる手段として、ペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子に組み込んでもよい。したがって、荷電分子（Ｃ）の目的は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性を促進する手段として、これらの粒子の正味電荷を制御することである。
【０３４３】
荷電分子（Ｃ）は、約７．４のｐＨの水性緩衝液中で正または負に荷電している１つまたは複数の官能基を有する任意の分子を指す。荷電分子（Ｃ）を構成する官能基は、部分または完全電荷整数値でありうる。荷電分子（Ｃ）は、単一の荷電官能基または複数の荷電官能基を有する分子であることがある。荷電分子（Ｃ）の正味電荷は、正、負または中性でありうる。荷電分子（Ｃ）を構成する官能基の電荷は、荷電分子（Ｃ）が分散される溶液のｐＨに依存することもあり、または依存しないこともあり、例えば、それぞれ、ｐＨ依存性およびｐＨ非依存性である、第三級アミンおよび第四級アンモニウム化合物の場合がそうである。分子の電荷は、当業者に公知である分子のルイス構造および容認されている方法に基づいて、容易に推定することができる。電荷は、誘起効果の結果として生じることもあり、例えば、電子親和性に差がある互いに結合している原子は、部分的に負に荷電した原子と部分的に正に荷電した原子とを生じさせる結果となる、極性共有結合をもたらすこともある。例えば、水素と結合している窒素は、結果的に、窒素上に負の部分電荷をもたらし、水素原子上に正の部分電荷をもたらす。あるいは、分子中の原子は、その原子に割り当てられた電子の数が、その原子の原子番号未満であるか、またはその原子番号に等しい場合、完全電荷整数値を有すると考えることができる。分子の電荷は、その分子を構成する各原子の電荷を合算することにより決定される。当業者は、分子中の各原子の形式電荷を合算することにより、分子の電荷を推定する方法を熟知している。
【０３４４】
荷電分子（Ｃ）は、正味負電荷、正味正または中性電荷のいずれかを帯びることができ、本明細書で開示される本発明の特定の適用に必要とされるペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷に依存する。例えば、ほとんどの細胞表面が正味負電荷を帯びていることは公知である。したがって、正の正味電荷を有する粒子は、高い程度の特異性を持たずにすべての細胞表面と相互作用しうる。対照的に、負の正味電荷を有する粒子は、ほとんど細胞表面からの静電反発を受けることになるが、ある特定の抗原提示細胞集団による選択的取込みを促進することが証明されている。例えば、循環に静脈内送達された正荷電粒子は、肝臓および肺にはもちろん脾臓の抗原提示細胞内にも蓄積することが判明しており、その一方で、負荷電粒子は、静脈内投与後に脾臓の抗原提示細胞内に優先的に蓄積することが判明している。したがって、荷電分子（Ｃ）の正味電荷を、適用の特定の要求を満たすように調整することができる。
【０３４５】
一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、正味負電荷を有し、生理的ｐＨで、約７．４のｐＨで、負電荷を帯びる官能基から構成される。正味負電荷を帯びている、適する荷電分子（Ｃ）としては、生理的ｐＨで、約７．４のｐＨで、酸の共役塩基として存在する官能基（例えば、約６．５未満のｐＫａを有する官能基）を有する分子が挙げられる。これらは、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ホスホルアミデートおよびホスホネートを有する分子を含むが、これらに限定されない。カルボキシレートを有する荷電分子（Ｃ）は、これらに限定されないが、グルタミン酸、アスパラギン酸、ピルビン酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、シトレート、イソシトレート、アルファ−ケト−グルタレート、スクシネート、フマレート、マレートおよびオキサロアセテートならびにこれらの誘導体でありうる。好ましい実施形態では、負荷電分子（Ｃ）は、１〜２０の間の負荷電官能基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の負荷電官能基であるが、通常は１６以下の負荷電官能基を有する分子から構成される。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、２〜６アミノ酸の間の長さのポリ（グルタミン酸）ペプチドである。１、２、３、４、５または６アミノ酸から構成されるポリ（グルタミン酸）配列は、ｐＨ７．４でそれぞれ−１、−２、−３、−４、−５および−６の負電荷を帯びていると予想される。さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、ホスホセリンまたはスルホセリンである。
【０３４６】
ある特定の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、正味負電荷を有し、１つまたは複数の負荷電アミノ酸から構成される。好ましい実施形態では、正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）は、１〜２０の間の負荷電アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の負荷電アミノ酸から構成される。非限定的な例では、荷電分子（Ｃ）は、１６のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号２５）から構成され、−１６の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１５のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号２６）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１５の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１４のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号２７）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１４の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１３のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号２８）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１３の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１２のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号２９）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１２の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１１のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３０）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１１の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１０のアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３１）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１０の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；９つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３２）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−９の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；８つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３３）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−８の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；７つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３４）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−７の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；６つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３５）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−６の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；５つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３６）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−５の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；４つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３７）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−４の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；３つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−３の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；２つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−２の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１つのアスパラギン酸モノマー、例えば、Ａｓｐ、から構成される荷電分子（Ｃ）は、−１の正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用される。上記の例におけるアスパラギン酸（Ａｓｐ）を、グルタミン酸、スルホ−セリン、またはホスホル−セリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｓｅｒｉｎｅ）を含むがこれらに限定されない任意の適する負荷電アミノ酸で置き換えることができ、その場合、負荷電アミノ酸は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【０３４７】
一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、正味正電荷を有し、正荷電官能基から構成される。適する正荷電分子（Ｃ）としては、塩基の共役酸のｐＫａが約８．５より大きい、弱塩基の共役酸などの、生理的ｐＨで、約７．４のｐＨで、正電荷を帯びる官能基を有するものが挙げられる。適する正荷電分子（Ｃ）としては、第一級、第二級および第三級アミンならびに第四級アンモニウム、グアニジニウム、ホスホニウムおよびスルホニウム官能基を有する分子が挙げられるが、これらに限定されない。アンモニウム官能基を有する、適する分子としては、例えば、イミダゾリウム、およびテトラアルキルアンモニウム化合物が挙げられる。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、ｐＨに関係なく正の永久電荷を帯びている第四級アンモニウム化合物から構成される。
【０３４８】
ｐＨに関係なく電荷を有する正荷電官能基の非限定的な例としては：
【化３９】
2020515629.tif 000043
（式中、Ｘ−は、任意の適する対アニオンである）。
が挙げられる。
【０３４９】
さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、生理的ｐＨで塩基の共役酸として存在する官能基、例えば、第一級、第二級および第三級アミンから構成される。好ましい実施形態では、正荷電分子（Ｃ）は、１〜２０の間の正荷電官能基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の正荷電官能基であるが、通常は１６以下の荷電官能基から構成される。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、長さ１〜６アミノ酸の間のポリ（リシン）ペプチドである。１、２、３、４、５または６アミノ酸から構成されるポリ（リシン）配列は、ｐＨ７．４でそれぞれ＋１、＋２、＋３、＋４、＋５または＋６の正電荷を帯びていると予想される。さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、長さ２〜６アミノ酸の間のポリ（アルギニン）ペプチドである。
【０３５０】
ある特定の実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、正味正電荷を有し、１つまたは複数の正荷電アミノ酸から構成される。好ましい実施形態では、正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）は、１〜２０の間の正荷電アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の正荷電アミノ酸から構成される。非限定的な例では、１６のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３８）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１６の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１５のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３９）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１５の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１４のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４０）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１４の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１３のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４１）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１３の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１２のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４２）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１２の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１１のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４３）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１１の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１０のリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４４）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１０の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；９つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４５）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋９の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；８つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４６）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋８の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；７つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４７）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋７の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；６つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４８）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋６の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；５つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４９）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋５の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；４つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号５０）、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋４の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；３つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋３の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；２つのリシンモノマー、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋２の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用され；１つのリシン、例えば、Ｌｙｓ、から構成される荷電分子（Ｃ）は、＋１の正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を調製するために使用される。上記の例におけるリシン（Ｌｙｓ）を、トリメチル−リシンまたはアルギニンを含むがこれらに限定されない任意の適する正荷電アミノ酸で、置き換えることができ、その場合、正荷電アミノ酸は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【０３５１】
荷電分子（Ｃ）は、ｉ）水溶解度を向上させるようにおよびｉｉ）不完全イオン化を防止するために荷電官能基間の距離を増すように機能する、小さい非荷電の、親水性アミノ酸、または親水性リンカー、例えばエチレンオキシドを、さらに含むことがある。例えば、ポリマー上の１つの官能基のイオン化が、局所効果によって隣接官能基のｐＫａに影響を及ぼすことがある。例えば、第２のアミンのすぐそばにあるアミンのプロトン化が、第２のアミンの共役酸のｐＫａを低下させることがある。隣接官能基のイオン化ポテンシャルに対する局所効果の影響を低減させるために、リンカー分子を使用して、荷電分子を構成する荷電官能基間の距離を増すことができる。リンカー分子は、１〜５個の間の小さい非荷電親水性アミノ酸、例えば、１、２、３、４および５個のアミノ酸を含みうる。あるいは、リンカーは、１〜４モノマー単位の間、例えば１、２、３または４のエチレンオキシドモノマーの長さのエチレンオキシド（すなわちＰＥＧ）リンカーを含みうる。好ましい実施形態では、１〜２個の小さい非荷電親水性アミノ酸は、荷電分子（Ｃ）を構成する、隣接する荷電アミノ酸であって、アミド結合によって連結されているアミノ酸の間に配置される。ある特定の実施形態では、正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）を構成する各荷電アミノ酸間にセリンが配置される。好ましい実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、リシンとセリンの反復ジペプチド、すなわち（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、通常は、１〜２０の間の任意の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）から構成される。他の例として、セリンは、＋２の正味電荷を有するトリペプチド荷電分子（Ｃ）の各荷電アミノ酸間に配置され（例えば、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ）；セリンは、＋３の正味電荷を有する５アミノ酸荷電分子（Ｃ）の各荷電アミノ酸間に配置され（例えばＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号５１））；セリンは、＋４の正味電荷を有する７アミノ酸荷電分子（Ｃ）の各荷電アミノ酸間に配置される（例えばＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号５２））。上記の例におけるリシン（Ｌｙｓ）を、トリメチル−リシンまたはアルギニンを含むがこれらに限定されない任意の適する正荷電アミノ酸で、置き換えることができ、その場合、正荷電アミノ酸は、同じであってもよく、もしくは異なっていてもよい。
【０３５２】
ある特定の実施形態では、正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）を構成する各荷電アミノ酸間にセリンが配置される。好ましい実施形態では、荷電分子は、アスパラギン酸とセリンの反復ジペプチド、すなわち（Ａｓｐ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、通常は、１〜２０の間の任意の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）から構成される。例えば、セリンは、−２の正味電荷を有するトリペプチド荷電分子（Ｃ）の各荷電アミノ酸間に配置され（例えば、Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）；セリンは、−３の正味電荷を有する５アミノ酸荷電分子（Ｃ）の各荷電アミノ酸間に配置され（例えばＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号５３））；セリンは、−４の正味電荷を有する７アミノ酸荷電分子（Ｃ）の各荷電アミノ酸間に配置される（例えばＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号５４））。上記の例におけるアスパラギン酸（Ａｓｐ）を、グルタミン酸、スルホ−セリン、またはホスホ−セリンを含むがこれらに限定されない任意の適する負荷電アミノ酸で置き換えることができ、その場合、負荷電アミノ酸は、同じであってもよく、もしくは異なっていてもよい。
【０３５３】
さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、負荷電アミノ酸と正荷電アミノ酸の両方から構成される。反対の電荷のアミノ酸から構成されるジペプチド、例えばＬｙｓ−Ａｓｐは、ｐＨ７．４で正味中性、０、電荷を有すると予測されるため、双性イオンジペプチドと呼ばれる。１つまたは複数の双性イオンジペプチドを、荷電分子（Ｃ）に、ｉ）水溶解度を向上させるための手段およびｉｉ）ある特定のｐＨ範囲にわたって優勢な電荷（例えば、正味負または正味正電荷）を提供する手段として、組み入れることができる。例えば、双性イオンジペプチドを使用して、ｐＨ７．４でのペプチド配列の電荷を増加または減少させることなく、ペプチド配列の親水性を増大させることができる。しかし、双性イオンを使用して、特定のｐＨで正味電荷を付与することができる。例えば、この例ではＮ末端アミンおよびＣ末端カルボン酸の寄与を除外して、双性イオンジペプチドであるＬｙｓ−Ａｓｐは、ｐＨ７．４で０の正味電荷を有するが、ｐＨ＜４では＋１の正味電荷、ｐＨ＞１０では−１の正味電荷を有する。１つまたは複数の双性イオンジペプチド、例えば、１つのジペプチド、Ｌｙｓ−Ａｓｐ；２つのジペプチド、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号５５）；３つのジペプチド、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号５６）などを、荷電分子（Ｃ）の配列に付加させることができる。上記の例において、リシン（Ｌｙｓ）を、トリメチル−リシンまたはアルギニンを含むがこれらに限定されない任意の適する正荷電アミノ酸で置き換えることができ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）を、グルタミン酸、スルホ−セリンまたはホスホ−セリンを含むがこれらに限定されない任意の適する負荷電アミノ酸で置き換えることができ、その場合の正荷電または負荷電アミノ鎖は、同じであってもよく、もしくは異なっていてもよい。
【０３５４】
荷電分子（Ｃ）の組成は、ペプチド抗原コンジュゲートの特定の適用に必要とされる正味電荷が得られるように選択される。本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、リシンもしくはアルギニンから構成される、またはリシンもしくはアルギニンおよび非荷電アミノ酸から構成される、正荷電ポリ（アミノ酸）である。一部の実施形態では、荷電部分は、ｐＨ非依存性である正電荷を帯びるスルホニウムまたは第四級アンモニウム官能基を含んだ。本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸から構成される、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸および非荷電アミノ酸から構成される、負荷電ポリ（アミノ酸）である。一部の実施形態では、荷電部分は、スルホセリンまたはホスホセリンなどの、リン酸基または硫酸基を含む。さらなる実施形態では、荷電分子は、リシンもしくはアルギニンおよびグルタミン酸もしくはアスパラギン酸から構成されるか、またはリシンもしくはアルギニンおよびグルタミン酸もしくはアスパラギン酸ならびに非荷電アミノ酸から構成される。正荷電官能基と負荷電官能基の両方が、同じ荷電分子（Ｃ）上に組み入れられていることもある。荷電分子（Ｃ）は、正であってもよく、負であってもよく、または中性であってもよいが、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷は、ゼロであってはならず、例えば、＋３より大きいまたは−３より小さい正味電荷が好ましく、特定の適用に依存する。
【０３５５】
荷電分子（Ｃ）に関するさらなる考慮事項は、選択される対イオンである。正電荷を有する官能基を有する荷電分子（Ｃ）の非限定的な例としては、塩化物、臭化物およびヨウ化物アニオンを含む、ハロゲン化物；ならびにリン酸イオン、硫酸イオン、亜硫酸イオンを含む、酸の共役塩基；ならびにギ酸、コハク酸、酢酸およびトリフルオロ酢酸を含む、カルボン酸アニオンが挙げられるが、これらに限定されない。負電荷を有する官能基を有する荷電分子（Ｃ）の適する対イオンは、水素ならびにアルカリおよびアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムを含む）、またはアンモニウム化合物などの弱塩基の共役酸を、これらに限定されないが、含む。
【０３５６】
荷電分子（Ｃ）を、ペプチド抗原（Ａ）に、直接、あるいは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって、リンカー（Ｌ）によって、リンカーおよび伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって、またはペプチド抗原に直接またはリンカー（Ｌ）および／もしくは伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）によって間接的に連結されている粒子（Ｐ）もしくは疎水性分子（Ｈ）によって、間接的に、のどちらかで、連結させることができる。
【０３５７】
一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）が、必要に応じたＮ末端またはＣ末端伸長部（Ｂ１またはＢ２）に連結され、この必要に応じたＮ末端またはＣ末端伸長部が、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端のどちらかにそれぞれ連結され、このペプチド抗原（Ａ）が、Ｃ末端またはＮ末端のどちらかにおいて、それぞれ、必要に応じた伸長部（Ｂ２）に連結され、この必要に応じた伸長部（Ｂ２）が、粒子（Ｐ）または疎水性分子（Ｈ）のどちらかに、直接、またはリンカー（Ｌ）を介してのどちらかで、連結されて、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）が得られる。
Ｃ−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｐ、Ｃ−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ、Ｐ−［Ｌ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｃ、またはＨ−［Ｌ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｃ
式Ｖ
【０３５８】
いくつかの実施形態では、荷電分子（Ｃ）は、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートのＮ末端に配置され、この場合、荷電分子（Ｃ）は、カテプシン切断性テトラペプチド伸長部から構成されるＮ末端伸長部（Ｂ１）（Ｂ１＝ＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）に連結されており、このＮ末端伸長部（Ｂ１）は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結されており、このペプチド抗原（Ａ）は、Ｃ末端が、組み合わせた免疫プロテアソーム・カテプシン切断性ヘキサペプチド伸長部から構成されるＣ末端伸長部（Ｂ２）（Ｂ２＝ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’−ＰＣ６’）に連結されており、このＣ末端伸長部（Ｂ２）は、リンカー（Ｌ）に連結されており、このリンカー（Ｌ）は、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）に連結されている。式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートのペプチド抗原（Ａ）は、整数のアミノ酸数、ｎから構成され、ｎは、通常は、７〜３５アミノ酸の間であり、疎水性分子（Ｈ）は、通常は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩまたはＩＩのポリ（アミノ酸）である。
【０３５９】
荷電分子（Ｃ＝Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）を含み、この荷電分子が、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端におけるカテプシン切断性テトラペプチド伸長部（Ｂ１＝Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ  配列番号８）に連結されており、このペプチド抗原（Ａ）が、Ｃ末端においてカテプシン切断性ヘキサペプチド伸長部（Ｂ２＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号１３）に連結されており、このカテプシン切断性ヘキサペプチド伸長部が、トリアゾールリンカー（Ｌ）に連結されており、このトリアゾールリンカー（Ｌ）が、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）に連結されている、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの非限定的な例が、ここに提供される：
【化４０】
2020515629.tif 000044
【０３６０】
さらなる実施形態では、荷電分子（Ｃ；もしくは２つの荷電分子が存在する場合にはＣ１およびＣ２）を、疎水性分子（Ｈ）に直接連結させて、もしくは追加の必要に応じた荷電部分（Ｃ１）に必要に応じて連結されているＮ末端伸長部（Ｂ１）にＮ末端が必要に応じて連結されているペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されているＣ末端伸長部（Ｂ２）に連結されているリンカー（Ｌ）に、直接連結させて、または荷電分子（Ｃ；もしくは２つの荷電分子が存在する場合にはＣ１およびＣ２）を、疎水性分子（Ｈ）に直接連結させて、もしくは追加の必要に応じた荷電部分（Ｃ２）に必要に応じて連結されているＣ末端伸長部（Ｂ２）にＣ末端が必要に応じて連結されているペプチド抗原（Ａ）のＮ末端に連結されているＮ末端伸長部（Ｂ１）に連結されているリンカー（Ｌ）に、直接連結させて、式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲート（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）を得ることができる。
［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｌ（Ｃ）−Ｈ、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｌ−Ｈ（Ｃ）、［Ｃ１］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｌ（Ｃ２）−Ｈ、［Ｃ１］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｌ−Ｈ（Ｃ２）、Ｈ−Ｌ（Ｃ）−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］、Ｈ（Ｃ）−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］、Ｈ−Ｌ（Ｃ１）−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｃ２またはＨ（Ｃ１）−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｃ２
式ＶＩ
【０３６１】
いくつかの実施形態では、荷電分子（Ｃ）が式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートのＣ末端に配置され、この場合、荷電分子（Ｃ）は、リンカー（Ｌ）に連結され、このリンカー（Ｌ）は、通常は１〜６アミノ酸の間の長さの、免疫プロテアソーム切断性、カテプシン切断性、または組み合わせた免疫プロテアソーム・カテプシン切断性伸長部から構成される、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）（Ｂ２＝ＰＣ１’、ＰＣ１’−ＰＣ２’、ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’、ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’、ＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’、またはＰＣ１’−ＰＣ２’−ＰＣ３’−ＰＣ４’−ＰＣ５’−ＰＣ６’）に必要に応じて連結されており、このＣ末端伸長部（Ｂ２）は、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端に連結されており、このペプチド抗原（Ａ）は、Ｎ末端が、通常は１〜４アミノ酸の間の長さのカテプシン切断性伸長部（Ｂ１＝ＰＮ１、ＰＮ２−ＰＮ１、ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１またはＰＮ４−ＰＮ３−ＰＮ２−ＰＮ１）に必要に応じて連結されており、このリンカー（Ｌ）は疎水性分子（Ｈ）にさらに連結されており、ここに示される：
【化４１】
2020515629.tif 000045
【０３６２】
式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートのペプチド抗原（Ａ）は、整数のアミノ酸数、ｎから構成され、ｎは、通常は、７〜３５アミノ酸の間、または最大５０アミノ酸であり、疎水性分子は、通常は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式ＩまたはＩＩのポリ（アミノ酸）である。
【０３６３】
荷電分子（例えば、Ｃ＝Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、この荷電分子がアミド結合を介してＣ末端に連結しているリンカー（Ｌ）、このリンカー（Ｌ）が連結している組み合わせた免疫プロテアソーム・カテプシン切断性ヘキサペプチドＣ末端伸長部（例えば、Ｂ２＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号１３）、このＣ末端伸長部がＣ末端に連結しているペプチド抗原（Ａ）、このペプチド抗原（Ａ）のＮ末端が連結しているカテプシン切断性テトラペプチドＮ末端伸長部（例えば、Ｂ１＝Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ  配列番号８）から構成され、リンカー（Ｌ）が、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）にさらに連結されている、式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートの非限定的な例が、提供される：
【化４２】
2020515629.tif 000046
【０３６４】
式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートのさらなる非限定的な例であるＢ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ（Ｃ）は、荷電部分（Ｃ＝Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ  配列番号４９）、この荷電部分がリンカーを介して連結している、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）、この疎水性分子（Ｈ）が連結しているリンカー（Ｌ）、このリンカー（Ｌ）が連結している組み合わせた免疫プロテアソーム・カテプシン切断性ヘキサペプチドＣ末端伸長部（Ｂ２＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号１３）、このＣ末端伸長部がＣ末端に連結しているペプチド抗原（Ａ）であり、このペプチド抗原（Ａ）のＮ末端は、カテプシン切断性テトラペプチドＮ末端伸長部（Ｂ１＝Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ  配列番号８）に連結されている：
【化４３】
2020515629.tif 000047
【０３６５】
式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートの非限定的な例であるＢ１−（Ａ）７〜３５−Ｂ２−Ｌ（−Ｃ）−Ｈでは、配列Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号２２）を有するペプチド抗原（Ａ）が、配列Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）を有するＮ末端伸長部（Ｂ１）と、配列Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）を有するＣ末端伸長部（Ｂ２）とに連結され、このＣ末端伸長部（Ｂ２）が、リンカー前駆体Ｘ１、例えばＬｙｓ（Ｎ３）に連結され、このリンカー前駆体Ｘ１が、配列Ｇｌｕ−Ｌｙｓを有するジペプチドから構成される荷電部分（Ｃ）と、ＤＢＣＯ分子を含むリンカー前駆体Ｘ２の両方に連結され、このリンカー前駆体Ｘ２が疎水性分子（Ｈ）に連結され、例えば、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｎ３−ＤＢＣＯ−Ｈ）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（式中、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ配列は、リンカー（Ｌ）（Ｌｙｓ（Ｎ３−ＤＢＣＯ））のＣ末端に連結されている）、その結果、ｐＨ７．４で＋４の予測正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートが得られる。ここでは、疎水性分子（Ｈ）は、ペプチド抗原コンジュゲートの電荷に無視できるほどしか寄与しないと仮定される。より詳細に下で説明されるように、ペプチド抗原コンジュゲートを構成するペプチド配列の所望の正味電荷およびハイドロパシーを提供する荷電残基の特定の数が得られるように荷電部分（Ｃ）および伸長配列（Ｂ１およびＢ２）の組成を選択することができることに、留意されたい。好ましい実施形態では、荷電部分（Ｃ）を構成する荷電官能基の数は、荷電部分（Ｃ）と、ペプチド抗原（Ａ）と、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）と、リンカー（Ｌ）と、疎水性分子（Ｈ）とを含むペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷が、約−３〜−１０の間、または＋３〜＋１０の間になるように、調節される。
【０３６６】
荷電部分（Ｃ）が疎水性分子（Ｈ）に連結されている、式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートは、個別化がんワクチンなどの個別化治療薬の迅速な生産に有利でありうる。荷電分子（Ｃ）とリンカー前駆体Ｘ２（例えば、シクロオクチンを含むＸ２）とに連結されている疎水性分子（Ｈ）をバルクで調製し、次いで、リンカー前駆体Ｘ１（例えば、アジドを含むＸ１）を有する任意のペプチド抗原（Ａ）と容易に組み合わせて、式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートである［Ｃ１］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｌ−Ｈ（Ｃ２）またはＨ（Ｃ）−Ｌ−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｃ２］（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）を形成することができる。
【０３６７】
荷電部分（Ｃ）の機能は、水性条件でペプチド抗原コンジュゲートにより形成されるナノ粒子を安定させることである。疎水性分子（Ｈ）がペプチド抗原コンジュゲートの粒子形成を誘導する一方で、必要に応じた荷電分子（Ｃ）は、凝結を防止する、および一部の実施形態では荷電部分（Ｃ）により提供される表面電荷でペプチド抗原コンジュゲートが集合してナノ粒子ミセルを構築するように駆動する、相殺する力を提供する。
【０３６８】
一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲート、例えば、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）は、荷電分子を含まない。非限定的な例としては、Ａ−Ｈ、Ａ−Ｌ−Ｈ、Ａ−Ｂ２−Ｈ、Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈ、Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｌ−Ｈが挙げられる。荷電分子（Ｃ）を含まないペプチド抗原コンジュゲートは、水性条件で凝集しうる。荷電部分（Ｃ）を含まないペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性を向上させるために、荷電または両親媒性分子を加えることができる。一部の実施形態では、荷電部分（Ｃ）を含まない第１のペプチド抗原コンジュゲート（すなわち、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ）が、ＤＭＳＯ溶液中で、荷電部分を含む第２のペプチド抗原コンジュゲート（例えば、Ｃ−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ）と混合され、次いで、水性条件で再懸濁されて、安定したナノ粒子が形成される。他の実施形態では、荷電分子（Ｃ）を含まないペプチド抗原コンジュゲート（すなわち、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ）が、ＤＭＳＯ溶液中で、荷電分子（Ｃ）に連結されている疎水性分子（Ｈ）、例えばＣ−Ｈ、と混合され、次いで、水性条件で再懸濁されて、安定したナノ粒子が形成される。
【０３６９】
一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）を含まないペプチド抗原コンジュゲート、例えば、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）は、両親媒性担体と組み合わされる、Ｃ−［Ｂ１］−［Ａ’］−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示し、必要に応じたＡ’は、保存抗原である（すなわち、患者特異的でない））。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、両親媒性担体と組み合わされる。両親媒性担体は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成されるナノ粒子ミセルなどの、ナノ粒子を安定させるのに役立つ。
【０３７０】
荷電分子および伸長部（Ｂ１およびＢ２）の選択
必要に応じた荷電分子（Ｃ）を伴う、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結される必要に応じた伸長部Ｂ１およびＢ２の組成は、Ｉ）生理的温度および約７．４のｐＨの水性緩衝液中でペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させるために必要とされる、適切な正味電荷および親水特性と疎水特性のバランスを達成するように、ならびにＩＩ）ペプチド抗原コンジュゲートの状況内において送達されるペプチド抗原（Ａ）が、ペプチド抗原（Ａ）上に備えられている最小ＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを放出し、その結果、エピトープがＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に関連して提示されうるように、確実にプロセシングされるように、選択されるべきである。以下の説明は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性に対する制御の予想外の向上をもたらす、ならびに／またはＴ細胞応答の有意な増強につながる、それらの粒子上にペプチド抗原（Ａ）として提供されるＣＤ４および／もしくはＣＤ８  Ｔ細胞エピトープのプロセシングおよび提示の向上をもたらす、荷電分子（Ｃ）を伴うＢ１およびＢ２伸長部の特定の組成を開示するものである。
【０３７１】
本明細書で開示される予想外の発見は、Ｃ末端酵素分解性伸長部（Ｂ２）が、Ｃ末端でペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）の間に使用されたとき、および／またはＮ末端酵素分解性伸長部（Ｂ１）が、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端と荷電分子（Ｃ）の間に使用されたとき、ペプチド抗原コンジュゲート、例えば式ＩＶ、ＶおよびＶＩのペプチド抗原コンジュゲート、として送達される最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを含有するペプチド抗原（Ａ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最も効率よくプロセシングされ、ｉｎ  ｖｉｖｏでより高いＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらすことである。一部の実施形態では、荷電分子（Ｃ）とペプチド抗原（Ａ）の間にカテプシン切断性部位を含むＢ１伸長部を組み入れること（例えば、Ｃ−Ｂ１−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す））は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより大規模なＴ細胞応答に関連する、ペプチド抗原コンジュゲートからの最小Ｔ細胞エピトープのより効率的なプロセシングをもたらした。したがって、式ＶおよびＶＩの好ましい実施形態は、ペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子として提供されるペプチド抗原（Ａ）の効率的プロセシングおよび提示を可能にするために、カテプシン切断性配列をＮ末端（Ｂ１）およびＣ末端（Ｂ２）伸長部として使用するべきである。
【０３７２】
さらなる予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲートの一部の実施形態により形成される粒子を安定させるために必要とされる正味電荷の特定に関する。ペプチド抗原コンジュゲートとして送達される高度に疎水性のペプチド抗原（Ａ）は、水性条件で凝集する傾向がある。この傾向を無効にするために、荷電分子（Ｃ）およびある特定の伸長部（Ｂ１またはＢ２）をペプチド抗原コンジュゲート、例えば式ＶおよびＶＩ参照、への結合に選択することができ、または荷電分子を含むコンジュゲート（例えば、Ｃ−［Ａ’］−［Ｌ］−Ｈ（式中、Ａ’は、保存抗原であり、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示す）を、ペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子に加えることができる。本明細書で開示される予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲートの一部の実施形態、例えば、ポリ（アミノ酸）ベースの疎水性分子（Ｈ）を含む式ＶおよびＶＩのペプチド抗原コンジュゲート、により形成される粒子を安定させるために必要とされる電荷（すなわち、正味電荷）の量が、ペプチド抗原（Ａ）と必要に応じた荷電分子（Ｃ）と必要に応じた伸長部（Ｂ１およびＢ２）とを含むペプチド抗原断片のハイドロパシー（すなわち、疎水性）に依存することである。本発明者らは、ペプチド抗原コンジュゲートのある特定の実施形態により形成される粒子を安定させるのに有用な正味電荷を、ペプチド抗原（Ａ）またはペプチド抗原断片のハイドロパシーに基づいて決定することができるという、予想外の発見を報告する。したがって、好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷は、ペプチド抗原（Ａ）の算出ハイドロパシーに基づいて選択され、荷電分子（Ｃ）および必要に応じて伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）により調節される。他の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷は、ペプチド抗原断片の算出ハイドロパシーに基づいて選択され、荷電分子（Ｃ）により調節される。明確にするために、リンカー前駆体（Ｘ１およびＸ２）、リンカー（Ｌ）および疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）は、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷を選択するために使用される、ペプチド抗原（Ａ）のハイドロパシー値の決定にも、ペプチド抗原断片のハイドロパシー値の決定にも、考慮されない。したがって、ペプチド抗原コンジュゲートのハイドロパシーは、ペプチド抗原断片のハイドロパシーと等価である。
ペプチド抗原（Ａ）、またはペプチド抗原（Ａ）と必要に応じた荷電分子（Ｃ）と必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）とを含む、ペプチド抗原断片のハイドロパシーは、ペプチドの疎水／親水特性の決定に利用可能な様々な方法のいずれか１つを使用して計算することができる。非限定的な例として、ペプチド抗原（Ａ）またはペプチド抗原断片のハイドロパシーを決定する方法は、下で説明するようにＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによる方法を使用する総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値の計算である。非天然アミノ酸（すなわち、シトルリン、スルホセリン、ホスホセリンおよびトリメチルリシン）について提供される推定値を伴う以下のハイドロパシー値は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法に基づいたものであり、本明細書でのＧＲＡＶＹ値の計算に使用される：
【表１】
2020515629.tif 000048
【０３７３】
ペプチドのＧＲＡＶＹ値を決定する方法は、ペプチドを構成する個々のアミノ酸各々についてのハイドロパシー値を合計し、次いで、ペプチドの全長で割ることである。例えば、配列Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（配列番号５７）を有する９アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、３．８６（例えば、（４．２＋４．２＋４．５＋１．８＋４．５＋２．８＋４．５＋４．５＋３．８）／９アミノ酸）のＧＲＡＶＹ値を有する。非限定的な例として、荷電分子（Ｃ＝Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ  配列番号５８）が、ペプチド抗原のＮ末端におけるＮ末端伸長部（Ｂ１＝Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ  配列番号８）に、およびＣ末端におけるＣ末端伸長部（Ｂ２＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号１１）に連結され、このＣ末端伸長部がリンカー前駆体Ｘ１（ここで、Ｘ１は、Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２である）に連結される、固相ペプチド合成によりペプチド抗原断片として調製された、同じペプチド抗原（Ａ）、すなわち、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（配列番号５７）は、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２となり、０．７５のＧＲＡＶＹ値および＋６の正味電荷を有する。
【０３７４】
ペプチド抗原断片またはペプチド（Ａ）のＧＲＡＶＹ値の決定により、ペプチド配列の疎水／親水特性が説明される。一般に、ゼロ未満のＧＲＡＶＹ値は、ペプチドが主として親水性アミノ酸から構成されることを示し、これに対してゼロより大きいＧＲＡＶＹ値は、ペプチドが主として疎水性アミノ酸残基から構成されることを示す。本明細書で報告される予想外の発見は、ペプチド抗原（Ａ）またはペプチド抗原断片のＧＲＡＶＹ値が増加するにつれて、ペプチド抗原（Ａ）（またはペプチド抗原断片）を含むペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させるために必要とされる正味電荷（正または負のどちらか）の大きさも増加することである。したがって、高いＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原（Ａ）またはペプチド抗原断片ほど、通常は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性を確保するために必要とする正味電荷が大きい。
【０３７５】
ペプチド抗原（Ａ）、必要に応じた荷電分子（Ｃ）および／または必要に応じた伸長部（Ｂ１および／もしくはＢ２）のアミノ酸組成に基づいて（ならびにリンカー前駆体（Ｘ１およびＸ２）、リンカー（Ｌ）および疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）を構成しうる一切のアミノ酸の寄与を除外して）計算される、ペプチド抗原（Ａ）またはペプチド抗原断片のＧＲＡＶＹ値を計算して、ペプチド抗原コンジュゲートの一部の実施形態による安定した粒子形成を確保するために必要とされる正味電荷を決定することができる。注記：ペプチド抗原コンジュゲートのＧＲＡＶＹは、ペプチド抗原断片のＧＲＡＶＹと等価であると見なされ、したがって、ペプチド抗原断片のＧＲＡＶＹ値は、ペプチド抗原コンジュゲートのＧＲＡＶＹ値も指すことができる。
【０３７６】
一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）のＧＲＡＶＹ値は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させるために必要とされる正味電荷を決定するために使用される。非限定的な例として、ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）のＧＲＡＶＹ値が０．７５より大きい場合、≧＋６（＋６より大きいか、もしくは＋６に等しい）または≦−６（−６未満であるか、もしくは−６に等しい）の正味電荷を有するべきであり、正味電荷は、ＧＲＡＶＹ値が０．２５〜０．７５の間である場合、≧＋５（＋５より大きいか、もしくは＋５に等しい）または≦−５（−５未満であるか、もしくは−５に等しい）であるべきであり、正味電荷は、ＧＲＡＶＹ値が０．２５未満である場合、≧＋４（＋４より大きいか、もしくは＋４に等しい）または≦−４（−４未満であるか、もしくは−４に等しい）であるべきである。好ましい実施形態では、正味電荷は、正味正電荷が必要とされるのか、または正味負電荷が必要とされるのかに依存して、それぞれ、＋４より大きいか、もしくは＋４に等しく、または−４未満であるか、もしくは−４に等しい。一部の実施形態では、０．２５未満のＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原（Ａ）は、約＋４〜＋１５、例えば、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４もしくは＋１５であるが、通常は約＋４〜＋１２の間の正味正電荷を有する、または約−４〜−１５、例えば、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４もしくは−１５であるが、通常は約−４〜−１２の間の正味負電荷を有する、ペプチド抗原コンジュゲートとして合成される。一部の実施形態では、０．２５〜０．７５の間のＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原（Ａ）は、約＋５〜＋１５、例えば、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５であるが、通常は約＋５〜＋１２の間の正味正電荷を有する、または約−５〜−１５、例えば、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４もしくは−１５であるが、通常は約−５〜−１５の間の正味負電荷を有する、ペプチド抗原コンジュゲートとして合成される。一部の実施形態では、０．７５より大きいＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原（Ａ）は、約＋６〜＋１５、例えば、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５であるが、通常は約＋６〜＋１２の間の正味正電荷を有する、または約−６〜−１５、例えば、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４もしくは−１５であるが、通常は約−６〜−１２の間の正味負電荷を有する、ペプチド抗原コンジュゲートとして合成される。
【０３７７】
所望の正味電荷のペプチド抗原コンジュゲートを生成するために荷電分子（Ｃ）および必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）を選択する方法の一実施形態では、方法は、（ｉ）ペプチド抗原（Ａ）のＧＲＡＶＹおよび電荷を決定するステップと、（ｉｉ）所望の正味電荷に達するために十分な数の荷電官能基を達成するために荷電分子（Ｃ）および必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）を選択するステップとを含みうる。非限定的な例では、ペプチド抗原コンジュゲートに必要とされる正味電荷は、次の基準に従ってペプチド抗原（Ａ）のハイドロパシーによって変わりうる：０．７５より大きいＧＲＡＶＹ値を有する２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）には＋６より大きいか、または＋６に等しい電荷が必要とされる；０．２５〜０．７５の間のＧＲＡＶＹ値を有する２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）には＋５より大きいか、または＋５に等しい電荷が必要とされる；および０．２５未満のＧＲＡＶＹを有する２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）には＋４より大きいか、または＋４に等しい電荷が必要とされる。したがって、この非限定的な例では、＋６のペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷を達成するために、２．０のＧＲＡＶＹ値および＋２の電荷を有する２５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）を、少なくとも＋４の正味電荷を含む荷電分子（Ｃ）および必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）と組み合わせるべきである。さらなる非限定的な例では、ペプチド抗原コンジュゲートに必要とされる正味電荷は、次の基準に従ってペプチド抗原（Ａ）のハイドロパシーによって変わりうる：０．７５より大きいＧＲＡＶＹ値を有する２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）には−６未満のまたは−６に等しい電荷が必要とされる；０．２５〜０．７５の間のＧＲＡＶＹ値を有する２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）には−５未満のまたは−５に等しい電荷が必要とされる；および０．２５未満のＧＲＡＶＹを有する２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）には−４未満のまたは−４に等しい電荷が必要とされる。したがって、この非限定的な例では、−６のペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷を達成するために、２．０のＧＲＡＶＹ値および＋２の電荷を有するペプチド抗原（Ａ）を、−８の正味電荷を含む荷電分子（Ｃ）および必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）と組み合わせるべきである。
【０３７８】
一部の実施形態では、必要に応じた荷電分子（Ｃ）、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）およびペプチド抗原（Ａ）を含む、ペプチド抗原断片についてのＧＲＡＶＹ値の決定は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させるために必要とされる正味電荷を決定するために使用される。非限定的な例として、ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原断片のＧＲＡＶＹ値が０．７５より大きい場合、≧＋６（＋６より大きいか、もしくは＋６に等しい）または≦−６（−６未満であるか、もしくは−６に等しい）の正味電荷を有するべきであり、正味電荷は、ＧＲＡＶＹ値が０．２５〜０．７５の間である場合、≧＋５（＋５より大きいか、もしくは＋５に等しい）または≦−５（−５未満であるか、もしくは−５に等しい）であるべきであり、正味電荷は、ＧＲＡＶＹ値が０．２５未満である場合、≧＋４（＋４より大きいか、もしくは＋４に等しい）または≦−４（−４未満であるか、もしくは−４に等しい）であるべきである。好ましい実施形態では、正味電荷は、正味正電荷が必要とされるのか、または正味負電荷が必要とされるのかに依存して、それぞれ、＋４より大きいか、もしくは＋４に等しく、または−４未満であるか、もしくは−４に等しい。一部の実施形態では、０．２５未満のＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原断片は、約＋４〜＋１５、例えば、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４もしくは＋１５であるが、通常は約＋４〜＋１２の間の正味正電荷、または約−４〜−１５、例えば、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４もしくは−１５であるが、通常は約−４〜−１２の間の正味負電荷を有する。一部の実施形態では、０．２５〜０．７５の間のＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原断片は、約＋５〜＋１５、例えば、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５であるが、通常は約＋５〜＋１２の間の正味正電荷、または約−５〜−１５、例えば、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４もしくは−１５であるが、通常は約−５〜−１２の間の正味負電荷を有する。一部の実施形態では、０．７５より大きいＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原断片は、約＋６〜＋１５、例えば、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５であるが、通常は約＋６〜＋１２の間の正味正電荷、または約−６〜−１５、例えば、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４もしくは−１５であるが、通常は約−６〜−１２の間の正味負電荷を有する。
【０３７９】
さらなる予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲート、例えば式Ｖおよび式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲート、のある特定の実施形態により形成される粒子を安定させるために必要とされる正味電荷の大きさが、一般に、ペプチド抗原（Ａ）の長さに伴って増大することである。一部の実施形態では、７〜１４アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、＋６より大きいかもしくは＋６に等しいまたは−６未満のもしくは−６に等しい正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートとして合成され、１５〜２４アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、＋７より大きいかもしくは＋７に等しいまたは−７未満のもしくは−７に等しい正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートとして合成され、２５〜３５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、＋８より大きいかもしくは＋８に等しいまたは−８未満のもしくは−８に等しい正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートとして合成される。
【０３８０】
一部の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、式［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈのペプチド抗原コンジュゲートおよび式Ｃ−［Ａ’］−［Ｌ］−Ｈの荷電分子（Ｃ）コンジュゲート（式中、［  ］は、その基が必要に応じたものであることを示し、Ａ’は、必要に応じた保存抗原（すなわち、患者特異的でないもの）である）から構成される粒子を含み、加えて、この場合、［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−ＨのＣ−［Ａ’］−［Ｌ］−Ｈに対するモル比は、１：２０〜２０：１の範囲、例えば、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１、２：１、５：１、１０：１および２０：１から選択され、Ｃ−［Ａ’］−［Ｌ］−Ｈの正味電荷は、負であり、−２〜−２０、例えば、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９もしくは−２０、通常は約−４〜約−１２から選択され、または正であり、＋２〜＋２０、例えば、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９もしくは＋２０、通常は約＋４〜＋１２から選択される。非限定的な例では、免疫原性組成物は、０の正味電荷を帯びている１モル当量のペプチド抗原コンジュゲート、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（Ｎ３−ＤＢＣＯ−Ｈ）−ＮＨ２（このペプチド断片がＣ末端アミドを有することに留意されたい）と、＋６の正味電荷を帯びている、（Ｌｙｓ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３−ＤＢＣＯ−ＮＨ）−ＮＨ２から構成される、１モル当量の荷電分子（Ｃ）コンジュゲートとを含む粒子を含み、ペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子コンジュゲートに対する比は、１：１であり、これら２分子の各セットの正味電荷は、＋６である。したがって、粒子の正味電荷は、ペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子（Ｃ）コンジュゲートに対する比を調節することにより、または荷電分子コンジュゲートの正味電荷を調節することにより、調整することができる。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子に対する比は、約１：４〜４：１であり、荷電分子の正味電荷は、粒子を構成する分子の平均正味電荷が、約＋４〜約＋１２、または約−４〜約−１２になるように、選択される。例えば、ペプチド抗原コンジュゲートが、０の正味電荷を有し、分子の平均正味電荷が、荷電分子（Ｃ）コンジュゲートの正味電荷が＋８であるとき＋４である、ペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子コンジュゲート（Ｃ）に対するモル比１：１を含む粒子。
【０３８１】
ある特定の適用には、正荷電ペプチド抗原コンジュゲートが有用でありうる。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）と、正荷電官能基を含む荷電分子（Ｃ）と、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）と、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）と、必要に応じたリンカー（Ｌ）とを含みうる。荷電分子（Ｃ）および必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の組成は、ペプチド抗原コンジュゲートの粒子安定性および生物活性を最大にするように選択される。一部の実施形態では、正味正電荷を有する荷電分子（Ｃ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、Ｎ末端ペプチド伸長部（Ｂ１）に連結され、この伸長部（Ｂ１）がペプチド抗原（Ａ）に連結され、このペプチド抗原（Ａ）が、Ｃ末端ペプチド伸長部（Ｂ２）に連結され、このＣ末端ペプチド伸長部（Ｂ２）が、疎水性分子（Ｈ）に直接またはリンカー（Ｌ）によってのどちらかで、連結され、結果として得られるペプチド抗原コンジュゲートは、正味正電荷を有する。この例では、ペプチド抗原（Ａ）のＣ末端を介して連結された疎水性分子（Ｈ）は、粒子形成を誘導するように機能し、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端を介して連結された荷電分子（Ｃ）は、それらの粒子の表面における高い正電荷密度によって粒子を安定させるように機能する。したがって、荷電分子（Ｃ）がペプチド抗原（Ａ）のＮ末端を介して連結されている、式Ｖの正の正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートの疎水性分子（Ｈ）の近位に配置される必要に応じたＢ２伸長部は、粒子形成を促進するのに役立つ非荷電の疎水性アミノ酸であって、通常は、単一アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、シトルリン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニン；ジペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−ＳｅｒもしくはＧｌｙ−Ｌｅｕ；トリペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ、もしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；テトラペプチド、例えば、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＣｉｔもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｉｔ；ペンタペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；またはヘキサペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、もしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔから選択されるアミノ酸から好ましくは構成される。一部の実施形態では、単一荷電アミノ酸を含むＣ末端伸長部（Ｂ２）が使用され、通常は、単一アミノ酸、例えば、アルギニンもしくはリシン；ジペプチド、例えば、Ｇｌｙ−ＡｒｇもしくはＧｌｙ−Ｌｙｓ；トリペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇもしくはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ；テトラペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号５９）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６０）もしくはＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）；ペンタペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１７）（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）；およびヘキサペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１３）もしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６１）（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択される。荷電分子（Ｃ）がペプチド抗原（Ａ）のＮ末端を介して連結されている、式Ｖの正荷電プチド抗原コンジュゲートの荷電分子（Ｃ）の近位に配置されるＢ１伸長部は、好ましくは、荷電アミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓを含有し、通常は、ＡｒｇもしくはＬｙｓから選択される単一アミノ酸；Ｖａｌ−ＡｒｇもしくはＬｅｕ−Ａｒｇ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択されるジペプチド；Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡｒｇもしくはＧｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択されるトリペプチド；またはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６２）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号９）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６）（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択されるテトラペプチドから選択される。異なる伸長部であるＢ１およびＢ２を、任意の荷電分子（Ｃ）、ペプチド抗原（Ａ）、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）およびリンカー（Ｌ）と組み合わせて、所期の適用に必要とされるペプチド抗原コンジュゲートの総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値および正味電荷を達成することができる。
【０３８２】
一部の実施形態では、正味正電荷を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、４〜１２の間の正荷電官能基、例えば（Ｌｙｓ）４〜１２、を通常は含む荷電分子（Ｃ）を含み、この荷電分子（Ｃ）は、ジペプチドＮ末端伸長部（Ｂ１）、例えばＶａｌ−Ａｒｇ、に連結されており、このＮ末端伸長部（Ｂ１）は、７〜３５の間のアミノ酸を通常は含むペプチド抗原（Ａ）に連結されており、このペプチド抗原（Ａ）は、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）、例えばＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、に連結されており、このＣ末端伸長部（Ｂ２）は、リンカー（Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＤＢＣＯ）に連結されており、このリンカーは、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）に連結されている。
【０３８３】
ある特定の適用には、負荷電ペプチド抗原コンジュゲートが必要とされる。一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）と、負荷電官能基を含む荷電分子（Ｃ）と、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）と、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）と、必要に応じたリンカー（Ｌ）とを含みうる。荷電分子（Ｃ）および必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の組成は、ペプチド抗原コンジュゲートの粒子安定性および生物活性を最大にするように選択される。一部の実施形態では、正味負電荷を有する荷電分子（Ｃ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、Ｎ末端ペプチド伸長部（Ｂ１）に連結され、この伸長部（Ｂ１）がペプチド抗原（Ａ）に連結され、このペプチド抗原（Ａ）が、Ｃ末端ペプチド伸長部（Ｂ２）に連結され、この伸長部（Ｂ２）が、疎水性分子（Ｈ）に、直接またはリンカー（Ｌ）によってのどちらかで、連結され、結果として得られるペプチド抗原コンジュゲートは、正味負電荷を有する。したがって、荷電分子（Ｃ）がペプチド抗原（Ａ）のＮ末端におけるＢ１伸長部によって連結されている、式Ｖの負の正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートの疎水性分子（Ｈ）の近位に配置されるＢ２伸長部は、粒子形成を促進するのに役立つ非荷電の疎水性アミノ酸であって、通常は、単一アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、シトルリン、ロイシン、ノルロイシンもしくはメチオニン；ジペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−ＣｉｔもしくはＧｌｙ−Ｌｅｕ；トリペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ、もしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；テトラペプチド、例えば、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＣｉｔもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｉｔ；ペンタペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；またはヘキサペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、もしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、もしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔから選択される、アミノ酸から好ましくは構成される。一部の実施形態では、単一荷電アミノ酸を含むＣ末端伸長部（Ｂ２）が使用され、通常は、単一アミノ酸、例えば、アルギニンまたはリシン；ジペプチド、Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）；トリペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）；テトラペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号５９）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６０）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号６３）（ここで、Ａｓｐは、Ｇｌｕで置き換えることができ、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）；ペンタペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１７）またはＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号６４）またはＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６５）；およびヘキサペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１３）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６１）（ここで、Ａｓｐは、Ｇｌｕで置き換えることができ、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）またはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６６）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６７）（ここで、Ａｓｐは、Ｇｌｕで置き換えることができ、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択される。荷電分子（Ｃ）が、Ｂ１伸長部を介してペプチド抗原のＮ末端を介して連結されている、式Ｖの負の正味電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子（Ｃ）の近位に配置されるＢ１伸長部は、好ましくは、荷電アミノ酸、例えばＡｓｐまたはＧｌｕ、を含有し、典型的には、単一アミノ酸、例えば、Ｃｉｔ、Ｌｅｕ、ＡｒｇもしくはＬｙｓ；Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−ＡｒｇもしくはＬｅｕ−Ａｒｇ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択されるジペプチド；Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＡｒｇもしくはＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができる）から選択されるトリペプチド；またはＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６８）、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号６９）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号６３）、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＣｉｔもしくはＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ（ここで、Ａｒｇは、Ｌｙｓで置き換えることができ、Ａｓｐは、Ｇｌｕで置き換えることができる）から選択されるテトラペプチドから、選択される。異なる伸長部であるＢ１およびＢ２を、任意の荷電分子（Ｃ）、ペプチド抗原（Ａ）、および疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）と組み合わせて、必要とされるペプチド抗原コンジュゲートの総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値および正味電荷を達成することができる。
【０３８４】
一部の実施形態では、正味負電荷を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、６〜１４の間の負荷電官能基、例えば（Ｇｌｕ）６〜１４、を通常は含む荷電分子（Ｃ）を含み、この荷電分子（Ｃ）は、ジペプチドＮ末端伸長部（Ｂ１）、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、に連結されており、このＮ末端伸長部（Ｂ１）は、７〜３５の間のアミノ酸を通常は含むペプチド抗原（Ａ）に連結されており、このペプチド抗原（Ａ）は、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）、例えばＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、に連結されており、このＣ末端伸長部（Ｂ２）は、リンカー（Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＤＢＣＯ）に連結されており、このリンカーは、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている式Ｉまたは式ＩＩのポリ（アミノ酸）から構成される疎水性分子（Ｈ）に連結されている。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、荷電分子（Ｃ）および／または伸長部（Ｂ１およびＢ２）の付加は、ペプチド抗原（Ａ）を含むペプチド抗原断片のＧＲＡＶＹ値を低下させ、配列の正味電荷を増大させ、これは、ペプチド抗原断片の製造の予想外の向上を伴った。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸残基を含む荷電分子（Ｃ）の付加は、別の方法ではネイティブペプチド抗原（すなわち、他の修飾がないネイティブペプチド抗原）として製造することができなかったペプチド抗原（Ａ）を含むペプチド抗原断片の合成およびＨＰＬＣ精製の成功につながった。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプロリン、プソイドプロリン（ｐｓｅｕｄｏ  ｐｒｏｌｉｎｅ）（Ｐｒｏ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸から構成されるＣ末端伸長部（Ｂ２）に連結されたペプチド抗原（Ａ）は、別の方法ではネイティブペプチド抗原（すなわち、他の修飾がないネイティブペプチド抗原）として製造することができなかったペプチド抗原（Ａ）を含むペプチド抗原断片の合成の成功をもたらした。いくつかの実施形態では、全面的に固相ペプチド合成により生成されたペプチド抗原断片またはペプチド抗原コンジュゲートへの、１つまたは複数の芳香族アミン、例えばフェニルアラニンアミン、の付加は、別の方法ではネイティブペプチド抗原（すなわち、他の修飾がないネイティブペプチド抗原）として製造することができなかったペプチド抗原（Ａ）を含むペプチド抗原断片またはペプチド抗原コンジュゲートの合成の成功につながった。
【０３８６】
個別化がんワクチンにおける使用のためのペプチド抗原（Ａ）の選択
一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートを構成するペプチド抗原（Ａ）は、個々の患者に特異的である。個々の患者に特異的であるペプチド抗原（Ａ）を含むペプチド抗原コンジュゲートは、個別化がんワクチン、または自己免疫もしくはアレルギーを処置するために寛容もしくは抑制を誘導するための個別化ワクチンとしての使用などの、個別化治療のために使用することができる。
【０３８７】
個別化がんワクチンに組み入れるためのペプチド抗原（Ａ）の選択は、一部のステップが必要でないこともあるマルチステッププロセスである。
【０３８８】
第１のステップは、腫瘍に特異的である、または正常組織と比較して腫瘍により過剰発現される腫瘍関連抗原の同定を含む。したがって、腫瘍組織および正常組織を採取する。腫瘍組織および正常組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋してもよく、または腫瘍組織および正常組織は、単離された新鮮組織であってもよい。正常組織は、白血球を含有する血液であってもよい。腫瘍組織および正常組織を処理してＤＮＡを単離する。ＤＮＡをさらに処理し、シークエンシングして、腫瘍ＤＮＡと正常組織ＤＮＡ間の差異を同定する。これらのＤＮＡの差異は、非同義変異をもたらす、単一ヌクレオチドもしくはジヌクレオチドもしくはより高次のヌクレオチド変化であってもよく、フレームシフト変異をもたらす挿入および欠失であってもよく、選択的スプライス改変体をもたらすスプライス部位変異であってもよく、または単一アミノ酸欠失をもたらすリードスルーでありうる終止コドンであってもよい。さらなる変異が、染色体転座または逆位または重複によって起こりうることもある。ＤＮＡレベルでの変化が、異常な翻訳後修飾を有する異常ペプチド配列および／またはペプチド（これらは、腫瘍特異的であり、ネオ抗原もしくは予測ネオ抗原と呼ばれることもある）を生じさせうる、非常に多くの方法がある。
【０３８９】
第２のステップは、ステップ１で同定された腫瘍関連抗原が、実際に腫瘍によって発現されるか否かの決定を含む。腫瘍ＲＮＡを単離し、処理し、シークエンシングして、ステップ１により同定された変異が、腫瘍細胞によってＲＮＡとして発現されるかどうかを決定する。腫瘍および正常組織のＤＮＡシークエンシングから同定された変異を含むペプチド抗原（Ａ）を、ＲＮＡ発現レベルに基づいて個別化がんワクチンへの組入れに選択することができる。加えて、腫瘍において非がん性組織と比較して高レベルのＲＮＡを産生する、腫瘍に関連する自己抗原を、組入れのためのペプチド抗原（Ａ）として選択することができる。ＲＮＡ転写物が同定されない変異は、一般に、ワクチンへの組入れのためのペプチド抗原（Ａ）として選択されない。変異もしくは腫瘍に関連する自己抗原を含むペプチド抗原（Ａ）に、変異体ペプチド（すなわち、ネオ抗原）または腫瘍に関連する自己抗原のＲＮＡ発現レベルに基づいて、優先順位を付けることができ、例えば、より高度に発現される変異または腫瘍に関連する自己抗原に優先順位を付けることができる。複数の基準を、個別化がんワクチンへの組入れのためのペプチド抗原（Ａ）の選択に、同時に使用することができる。例えば、変異体ペプチド（すなわち、ネオ抗原）または腫瘍に関連する自己抗原が含有するエピトープのＲＮＡ発現レベルおよび予測ＭＨＣ結合親和性を共に使用して、個別化がんワクチンへの組入れのためのペプチド抗原（Ａ）の最適なセットを選択することができる。そのようなシナリオでは、非常に高度に発現される中等度の結合親和性を有するＴ細胞エピトープを含有するペプチド抗原（Ａ）に、より高い結合親和性を有するが腫瘍によって非常に低レベルで発現されるＴ細胞エピトープを含有する異なるペプチド抗原（Ａ）より高い優先順位を付けることができる。
【０３９０】
もう１つの考慮事項は、どの程度、変異または腫瘍に関連する自己抗原が、腫瘍を含む異なる腫瘍細胞にわたってクローン性であるか保存されているかである。変異のクローン性は、腫瘍から単離されたＤＮＡにおける変異の頻度と野生型改変体の頻度を比較することにより評価する。腫瘍関連ネオ抗原または自己抗原を、それらが含む変異のクローン性またはクローン性に近いことに基づいて、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンへの組入れのためのペプチド抗原（Ａ）としての使用に選択することができる。例えば、ペプチド抗原（Ａ）が、腫瘍細胞の＞５０％、腫瘍細胞の＞７５％、腫瘍細胞の＞８５％、腫瘍細胞の＞９５％、または腫瘍細胞の＞９９％に存在すると予測された場合、それらを組み入れのために優先順位をつけることができる。
【０３９１】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ結合アルゴリズムにより決定されるような所与のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子に対する抗原内に含有されるエピトープの予測結合に基づいて、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンへの組入れのためのペプチド抗原（Ａ）に、さらに優先順位を付けることができる。非限定的な例では、各被験体のＭＨＣ型を、先ず、シークエンシングによって同定する。次いで、任意の適する手段（例えば、ＤＮＡシークエンシング、ＲＮＡ発現または質量分析）により同定された各変異体ペプチド（すなわち、ネオ抗原）または腫瘍に関連する自己抗原を、被験体に存在する各ＭＨＣ分子への予測結合について試験し、ＭＨＣ分子は、ヒト患者の場合、例えば、最大６の特有のクラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子でありうる。ｎｅｔＭＨＣ人工ニューラルネットワーク、安定化行列法およびＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓアルゴリズムを含む、ＭＨＣ結合を予測するために使用することができるアルゴリズムが、いくつか公開されている。公開されていないアルゴリズムを使用してもよい。予測結合親和性が高いエピトープを含有するペプチド抗原（Ａ）は、予測結合親和性が低いエピトープを含有するペプチド抗原（Ａ）より免疫応答を誘導する可能性が高い。本明細書で開示される予想外の発見は、ＩＥＤＢコンセンサスアルゴリズムによる予測結合親和性が０．５パーセンタイル未満であるエピトープを有する、予測ネオ抗原を含む、ペプチド抗原（Ａ）の５０％より多くが、本明細書で記載されるペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を使用して投与されたとき、Ｔ細胞応答（すなわち、ＣＤ８  Ｔ細胞応答）を生成することができることである。この予想外の発見に基づくと、ＩＥＤＢコンセンサスアルゴリズムで結合親和性が０．５パーセンタイル未満であるエピトープを有する、予測ネオ抗原を含む、ペプチド抗原（Ａ）を含む、ペプチド抗原（Ａ）を、ペプチド抗原コンジュゲートを含む個別化がんワクチンにおける使用に選択することができる。
【０３９２】
加えて、ＭＨＣへの抗原結合の質量分析による確認、またはＭＨＣへの抗原の結合を質量分析で学習したアルゴリズムを使用して、個別化がんワクチンへの組入れのためのペプチド抗原（Ａ）を選択することができる。このシナリオでは、ＭＨＣ分子と結合しているペプチドを同定するために腫瘍組織を処理する。変異体ペプチド（すなわち、ネオ抗原）、プロテアソームスプライス改変体または腫瘍に関連する自己抗原でありうる、正常細胞ではなく腫瘍細胞の表面で同定されるペプチドを、個別化がんワクチンにおける組み入れのために優先順位をつけることができる。本明細書で開示される予想外の発見は、腫瘍細胞上のＭＨＣ−Ｉに対する、質量分析により確認された結合に基づいて個別化がんワクチンにおける使用に選択された予測ネオ抗原の高い割合（すなわち、７つのうちの７つ）が、ペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物中のペプチド抗原（Ａ）として送達されたときに大規模なＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらしたことであり、これは、質量分析、または質量分析に基づく予測アルゴリズムが、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンにおけるペプチド抗原（Ａ）として使用するためのネオ抗原を選択するための信頼できるフィルターでありうることを示唆する。
【０３９３】
ペプチド抗原（Ａ）をＴ細胞認識アッセイに基づいて組入れのために選択することもできる。例えば、予測ネオ抗原または腫瘍に関連する自己抗原を含む合成ペプチド（またはｉｎ  ｓｉｔｕでペプチドを産生する発現系）を被験体からの血液、腫瘍組織または他の組織に由来するＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物に加える、アッセイを使用することができる。所与のペプチドのＴ細胞認識は、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより、またはフローサイトメトリーにより、評価することができた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞アッセイにおいて認識される抗原を、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化ワクチンへのペプチド抗原（Ａ）として組み入れのために優先順位をつけることができる。
【０３９４】
最後に、ペプチド抗原（Ａ）を任意の数の予測アルゴリズムに基づいて選択することができる。大きいデータセットで学習した予測アルゴリズムに基づいて免疫原性または効果的であると予測されるペプチド抗原（Ａ）を使用することができる。加えて、予測アルゴリズムを使用して、野生型エピトープではなく変異体エピトープに特異的であるＴ細胞応答、すなわち、自己抗原に対して交差反応性でないＴ細胞、をもたらすと予測されるペプチドネオ抗原を選択することができる。
【０３９５】
上記方法の任意の組み合わせを、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンにおける使用のための、ネオ抗原または腫瘍に関連する自己抗原またはこれらに類するものを含むペプチド抗原（Ａ）の同定および選択に、使用することができる。
【０３９６】
個別化がんワクチンについてのペプチド抗原（Ａ）の長さならびにＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答の誘導に対する効果
非同義的アミノ酸置換をもたらす単一ヌクレオチド多型は、通常は長さ８〜１３アミノ酸であるクラスＩ  ＭＨＣと結合するペプチドエピトープ内のあらゆる位置に出現しうる。したがって、所与のクラスＩ  ＭＨＣに結合することができる可能性のあるエピトープすべてを網羅するために、個別化がんワクチンにおける使用のためのネオ抗原を含むペプチド抗原（Ａ）は、非同義変異の両側に１２個のアミノ酸を含むことができ、そのため、中央（１３番目）の残基として変異体アミノ酸を有する、長さ２５アミノ酸のペプチドになる。あるいは、ペプチド抗原（Ａ）は、クラスＩ  ＭＨＣと結合すると予測される最小エピトープ（長さ８〜１３アミノ酸）のみを含むことができる。あるいは、個別化がんワクチンは、２５アミノ酸ネオ抗原を含むペプチド抗原（Ａ）と、ネオ抗原の予測最小エピトープのみを含むペプチド抗原（Ａ）の両方を含有することができるであろう。
【０３９７】
ＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合ポケットは、通常は１２〜１６アミノ酸のペプチドに結合し、一部は２０またはそれを超えるほどの数のアミノ酸のペプチドに結合する。したがって、最小エピトープ（通常は、長さ８〜１３アミノ酸である）に結合する予測クラスＩのみを含有するペプチド抗原（Ａ）から構成される個別化がんワクチンは、ＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導する可能性が低い。しかし、２５アミノ酸（または「２５ｍｅｒ」）ペプチド抗原（Ａ）を含有するがんワクチンは、所与の変異を標的とするＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導しうるが、必ずしもそうではない。
【０３９８】
がんワクチン中の２５アミノ酸（または「２５ｍｅｒ」）ペプチド抗原（Ａ）は、的確な約７〜１２アミノ酸最小エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）と比較して低いレベルのＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することができ、これは、恐らく、異なる長さのペプチド抗原のプロセシングおよび提示効率の差に起因する。それ故、がんワクチンに組み入れられる２５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、最小エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）により誘導される規模と比較して小さな規模のＣＤ８  Ｔ細胞応答を生じさせる結果となりうる。したがって、一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートから構成されるがんワクチンに組み入れられる２５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、検出可能なＣＤ８  Ｔ細胞応答を生じさせない結果となり、その一方で、的確な最小エピトープを含む７〜１２アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、検出可能なＣＤ８  Ｔ細胞応答を生じさせる結果となる。さらなる実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートから構成されるがんワクチンに組み入れられる２５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、検出可能なＣＤ４  Ｔ細胞応答を生じさせる結果となり、的確な最小エピトープを含む７〜１２アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）は、検出可能なＣＤ４  Ｔ細胞応答を生じさせない結果となる。これらの予想外の発見に基づくと、一部の実施形態では、最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（「Ｍｉｎ」または最小エピトープ（ＭＥ）と呼ばれる）と２５アミノ酸ペプチド（合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）または長鎖ペプチドと呼ばれる）の両方である、同じエピトープを含む２つの長さのペプチド抗原（Ａ）を、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンにペプチド抗原（Ａ）として組み入れることができる。一部の実施形態では、最小ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞エピトープからなるペプチド抗原（Ａ）は、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンに組み入れられる。さらなる実施形態では、最小ＣＤ８  Ｔ細胞からなるペプチド抗原（Ａ）、および普遍的ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）、および必要に応じて、最小ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープからなるペプチド抗原（Ａ）は、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化がんワクチンに組み入れられる。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される個別化ワクチンに組み入れられるペプチド抗原（Ａ）は、７〜３５アミノ酸、通常は１５〜３５アミノ酸、例えば２５アミノ酸である。
【０３９９】
併用免疫療法
本明細書で開示されるペプチド抗原コンジュゲートは、腫瘍または感染性疾患を処置するための免疫原性組成物に使用することができる。ペプチド抗原コンジュゲートを単独で使用してもよく、または他の治療と組み合わせて使用してもよい。がんの処置のために、ペプチド抗原コンジュゲートから構成される免疫原性組成物を、外科手術、放射線療法または化学療法などの、任意の形態の処置の前、処置中または処置後に使用することができる。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物は、免疫調節物質、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、抗腫瘍抗体、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１）抗体、または免疫抑制を逆転させる、腫瘍細胞を直接死滅させる、もしくは腫瘍に対する免疫応答を増強する、他の小分子もしくは生物製剤と、組み合わせて使用される。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートに基づくがんワクチンは、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４）と組み合わせて担腫瘍被験体に提供される。好ましい実施形態では、がんワクチン、例えば、個別化がんワクチンは、チェックポイント阻害剤の投与の前に被験体に提供される。本明細書で開示されるペプチド抗原コンジュゲートは、異種プライム・ブースト免疫化、例えば、ペプチド抗原コンジュゲートでのプライムまたはブースト、およびウイルスベクターなどの異種ワクチンでのプライムまたはブースト、にも使用することができる。
【０４００】
組成物の製剤化
本明細書で開示されるペプチド抗原コンジュゲートから構成される免疫原性組成物は、被験体への投与のために調製される医薬組成物であって、本明細書に記載の免疫原の１つまたは複数についての治療有効量を含む医薬組成物として、製剤化することができる。開示される化合物の治療有効量は、投与経路、被験体の種、および処置されることになる被験体の身体的特徴に依存することになる。考慮されうる具体的な因子としては、疾患重症度およびステージ、体重、食事、ならびに併用薬物が挙げられる。開示される化合物の治療有効量の決定に対するこれらの因子の関係は、当業者に理解されている。
【０４０１】
被験体への投与のための免疫原性組成物は、医薬組成物であることができ、選ばれた分子に加えて、少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される添加剤、例えば、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤およびこれらに類するものを含むことができる。免疫原性組成物は、１つまたは複数の追加の活性成分、例えば、抗微生物剤、麻酔剤およびこれらに類するものも含むことができる。これらの製剤に有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ著、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９版（１９９５年）には、本明細書で開示される化合物の薬学的送達に適している組成物および製剤が記載されている。
【０４０２】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール、またはこれらに類するものをビヒクルとして含む、注射可能な流体を通常は含有する。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤、ならびにこれらに類するもの、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【０４０３】
免疫原性組成物を製剤化するために、開示されるナノ粒子成分、または開示されるナノ粒子成分を含有する溶液を、様々な薬学的に許容される添加剤、ならびにナノ粒子の分散のための基剤またはビヒクルと併せることができる。所望される添加剤としては、ｐＨ制御剤、例えば、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸およびこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。加えて、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＭｉｇｌｙｏｌ  ８１２）、溶解増強剤（例えば、シクロデキストリンおよびそれらの誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、および還元剤（例えば、グルタチオン）を挙げることができる。当技術分野において周知である多くの他の適するアジュバントの中でも特に、水酸化アルミニウム（例えば、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＩＮ）およびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）などのアジュバントを、組成物に組み入れることができる。組成物が液体である場合、単一のものと考えられる０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩溶液の張度を基準にして測定される製剤の張度は、通常は、投与部位で実質的な不可逆的組織損傷を誘導しないであろう値に調整される。一般に、溶液の張度は、約０．３〜約３．０、例えば、約０．５〜約２．０、または約０．８〜約１．７の値に調整される。
【０４０４】
本開示の免疫原性組成物は、通常は、無菌であり、製造、保管および使用条件下で安定している。無菌溶液は、必要量の化合物を、必要に応じて、本明細書に列挙される成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒に組み入れ、その後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、化合物および／または他の生物活性薬剤を、基礎分散媒と本明細書に列挙されるものからの他の必要成分とを含有する無菌ビヒクルに、組み入れることにより調製される。無菌粉末の場合、調製方法は、化合物と任意の追加の所望成分の粉末を、前もって滅菌濾過されたそれらの溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥を含む。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールおよびこれらに類するものによって果たすことができる。
【０４０５】
本開示は、哺乳動物被験体における疾患および他の状態の予防および処置に使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物、活性成分、および／またはそれらを投与する手段を収容している、キット、パッケージおよび多容器ユニットも含む。一実施形態では、これらのキットは、本明細書に記載の免疫原性組成物の１つもしくは複数を収容している容器、または本明細書に記載の免疫原性組成物の１つもしくは複数を含有する製剤を含む。一例では、免疫原性組成物は、被験体への送達のための薬学的調製物に製剤化される。免疫原性組成物は、必要に応じて、バルク調剤容器に、または単位剤形もしくは複数単位剤形で、収容される。必要に応じた調剤手段、例えば、肺または鼻腔内スプレーアプリケーターを備えさせることができる。包装材料は、必要に応じて、処置の目的および／またはその包装材料で包装されている医薬剤を使用することができる方法を示す、ラベルまたは指示を含む。
【０４０６】
免疫応答を誘導する方法
本明細書に記載のペプチド抗原（Ａ）を含む免疫原性組成物は、被験体におけるペプチド抗原（Ａ）に対する免疫応答を惹起するために使用することができる。開示される方法による恩恵を受けることができる被験体は、ヒトおよび獣医学的被験体を含む。
【０４０７】
一部の実施形態では、例えば感染性因子への曝露または曝露の可能性のため、ペプチド抗原を含む感染性因子に感染している、またはそのような感染性因子による感染症を発症するリスクがある被験体が、処置に選択される。開示される免疫原性組成物の治療有効量の投与後、被験体を感染、感染に関連する症状、または両方についてモニターすることができる。
【０４０８】
一部の実施形態では、悪性腫瘍などのがんを有するまたはがんを発症するリスクがある被験体が、処置に選択される。開示される免疫原の治療有効量の投与後、被験体を、がんの存在、腫瘍負荷の低減、がんの任意の適切な症状、またはこれらの組み合わせについてモニターすることができる。
【０４０９】
本開示の治療薬および方法での処置が意図される典型的な被験体は、ヒトはもちろん、非ヒト霊長類および他の動物も含む。本開示の方法による予防または処置のための被験体を同定するために、許容されるスクリーニング方法が、標的とされるもしくは疑われる疾患もしくは状態に関連するリスク因子の決定に、または被験体における既存の疾患もしくは状態のステータスの決定に、利用される。これらのスクリーニング方法は、例えば、標的とされるまたは疑われる疾患または状態に関連する可能性がある、環境リスク因子、家族性リスク因子、職業リスク因子および他のそのようなリスク因子を決定するための従来の精密検査、ならびに疾患または状態を検出および／または特徴付けるための当技術分野において利用可能であり、周知である診断方法、例えば、様々なＥＬＩＳＡおよび他の免疫アッセイ法を含む。これらのおよび他の慣例的方法により、臨床医は、本開示の方法および医薬組成物を使用して、治療を必要とする患者を選択することができる。これらの方法および原理に従って、本明細書における教示、または当業者に公知の他の従来の方法に従って、独立した予防もしくは処置プログラムとして、または他の処置に対する経過観察、補助的、もしくは協調的処置レジメンとして、組成物を投与することができる。
【０４１０】
本明細書で開示のペプチド抗原を含む免疫原性組成物の治療有効量の投与は、予防目的である場合もあり、または治療目的であることもある。予防的に提供される場合、免疫原性組成物は、いずれかの症状より前に、例えば、感染症または腫瘍発症より前に、提供される。免疫原性組成物の予防的投与は、疾患または状態のその後の発症を予防または改善するのに役立つ。それ故、一部の実施形態では、方法は、感染症に罹患するまたは腫瘍を発症するリスクがある被験体を選択すること、および開示される免疫原性組成物の開示される治療有効量の治療有効量を投与することを含む。したがって、免疫原性組成物を、感染性因子への予想される曝露の前にまたは腫瘍発症前に提供して、感染症または腫瘍および／または任意の関連疾患症状の予想される重症度、継続期間または程度を減弱することができる。
【０４１１】
治療的に提供される場合、開示される免疫原性組成物を、疾患もしくは状態の症状の発生時または発生後、例えば、感染症の症状の発症、または感染症の診断、または腫瘍の症状の発症、または腫瘍の診断の後に、提供することができる。感染症または腫瘍の処置は、被験体における感染症または腫瘍の徴候または症状を遅延および／または低減させることを含むことができる。一部の例では、本明細書で開示される方法を使用する処置は、被験体の生存期間を延長する。
【０４１２】
免疫原性組成物を協調的免疫化プロトコールまたは組み合わせ製剤で使用することができる。
【０４１３】
一部の実施形態では、開示される免疫原性組成物の治療有効量を被験体に投与して、被験体における感染性因子を処置または阻害することができる。感染性因子は、ウイルス、細菌および真菌を含むがこれらに限定されない、被験体を感染させることができる作用因子である。感染性因子に感染している、感染していることが疑われる、または感染性因子による感染症を発症するリスクがある被験体を、処置に選択することができる。一部の実施形態では、感染性因子は、上記の通りウイルス、細菌または真菌であり、ペプチド抗原は、特定のウイルス、細菌または真菌からの抗原を含む。
【０４１４】
一部の実施形態では、開示される免疫原性組成物の治療有効量を被験体に投与して、被験体における腫瘍および／またはがんを処置または阻害することができる。腫瘍および／またはがんを有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体を、処置に選択することができる。一部の実施形態では、被験体における腫瘍および／またはがんの処置は、腫瘍の成長および／または増殖を減少させる。腫瘍は、目的の任意の腫瘍であってよく、良性であってもよく、または悪性であってもよい。
【０４１５】
腫瘍の処置は、一般に、腫瘍の診断後にまたは前駆状態（例えば、異形成、もしくは良性腫瘍発症）の開始後に、開始される。処置をがんの早期に開始することができ、例えば、被験体が状態の症状を明示する前に、例えば、ステージＩ診断中に、または異形成が診断されたときに、開始することができる。しかし、処置を、疾患の任意のステージ、例えば、これらに限定されないが、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶがん中に開始することができる。一部の例では、処置は、悪性腫瘍またはさらには転移性腫瘍に転換しうる良性腫瘍を有する被験体に投与される。
【０４１６】
悪性がんなどの状態の発症後に開始された処置は、状態のうちの１つの症状の重症度を低下させる結果となることもあり、または症状を完全に除去する結果となることもあり、または転移、腫瘍体積もしくは腫瘍数を低減させる結果となることもある。一部の例では、腫瘍は、処置後に検出不能になる。本開示の一態様では、転移などの、腫瘍の形成が、遅延、予防または減少される。別の態様では、原発性腫瘍のサイズが、減少される。さらなる態様では、腫瘍の症状が、軽減される。さらに別の態様では、腫瘍体積が、減少される。
【０４１７】
開示される治療を開始する前に、例えば、被験体が腫瘍を有するかどうかを決定するために、被験体をスクリーニングすることができる。腫瘍の存在は、当技術分野において公知の方法によって決定することができ、そのような方法には、通常は、細胞学的および形態学的評価が含まれる。腫瘍は、確立腫瘍である場合もある。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞であってもよく、または生検から得られる細胞を含むｅｘ  ｖｉｖｏの細胞であってもよい。腫瘍の存在は、本明細書で提供される方法を使用して腫瘍を処置することができることを示す。
【０４１８】
治療有効量は、疾患の重症度、および患者の全身の健康状態に依存することになる。治療有効量は、症状の主観的軽減、または臨床医もしくは他の有資格観察者により認められるような客観的に同定可能な向上のどちらかをもたらす量である。一実施形態では、治療有効量は、腫瘍成長を阻害するのに必要な量、または腫瘍の徴候もしくは症状を低減させるのに有効な量である。別の実施形態では、治療有効量は、感染性因子による感染を阻害するのに必要な量、または感染の徴候もしくは症状を低減させるのに有効な量である。投与される薬剤の治療有効量は、所望の効果および処置される被験体に依存して変わりうる。一部の例では、治療量は、患者の腫瘍負荷を消失もしくは低減させる量、または転移性細胞の増殖を予防するまたは低減させる量、または被験体における感染性因子の負荷を低減させる量である。
【０４１９】
免疫原性組成物の実際の投薬量は、被験体の疾患適応症および特定のステータス（例えば、被験体の年齢、サイズ、適応度、症状の程度、感受性因子およびこれらに類するもの）、投与の回数および経路、同時に投与される他の薬物または処置、ならびに被験体において所望の活性または生物学的応答を惹起するための化合物の具体的な薬理などの因子に従って変わることになる。投薬レジメンを、最適な予防または治療応答が得られるように調整することができる。治療有効量は、化合物および／または他の生物活性薬剤の任意の毒性または有害副作用より、治療有益効果のほうが臨床的観点で上回る量でもある。
【０４２０】
担当臨床医は、標的部位（例えば、肺または体循環）において所望の濃度を維持するように、投薬量を変化させることができる。送達方式に基づいて、例えば、静脈内または皮下または筋肉内送達に対して、経皮、直腸、経口、肺、骨内または鼻腔内送達に基づいて、より高いまたはより低い濃度を選択することができる。投与される製剤の放出速度、例えば、粉末に対する肺内噴霧の放出速度、注射微粒子または経皮送達製剤に対する徐放性経口送達製剤の放出速度、などに基づいて、投薬量を調整することもできる。
【０４２１】
局所および全身投与を含む任意の投与方式を、開示される治療剤に使用することができる。例えば、局所、経口、血管内、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔内および皮下投与を使用することができる。特定の投与方式および投薬レジメンは、症例の詳細（例えば、被験体、疾患、罹患している病状、および処置が予防的であるかどうか）を考慮に入れて、担当臨床医により選択されることになる。１つより多くの薬剤または組成物が投与されることになる場合、１つまたは複数の投与経路が使用されることもある。
【０４２２】
開示される治療剤を、正確な投薬量の個別投与に適している単位剤形で製剤化することができる。加えて、開示される治療剤を単回用量または複数回用量スケジュールで投与することができる。複数回用量スケジュールは、主要処置過程が、１つより多くの別個の用量、例えば、１〜１０用量、続いて、組成物の作用を維持または強化する必要に応じたその後の時間間隔で与えられる他の用量を用いるものである。処置は、数日から数ヶ月、またはさらには数年にわたっての、化合物の毎日用量または複数回毎日用量を含みうる。したがって、投薬レジメンはまた、少なくとも一部では、処置される被験体の特定の要求に基づいて決定されることになり、投与実施者の判断に依存することになる。
【実施例】
【０４２３】
化合物１
【化４４】
2020515629.tif 000049
【０４２４】
２Ｂと呼ばれる化合物１である１−（４−アミノブチル）−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンは、図３に示すスキームに従って合成した。
【０４２５】
１−ｃ．  ２，４−キノリンジオールから出発して、中間体である１−ｂを、以前に記載されたように調製した（Ｌｙｎｎ  ＧＭら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻（１１号）：１２０１〜１２１０頁、２０１５年）。２１０ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１０％  ｗ／ｗ）中の２１ｇの１−ｂ（８７．８ｍｍｏｌ、１当量）に１６．３４ｇ（８７．８ｍｍｏｌ、１当量）のＮ−ｂｏｃ−１，４−ブタンジアミンを激しく撹拌しながら添加した。反応混合物を７０℃に加熱し、ＨＰＬＣによりモニターし、２時間後に反応が完了したことを確認した。トリエチルアミンを真空下で除去し、得られた油を２００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いで３×１００ｍＬのＤＩ  Ｈ２Ｏで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空下で除去し、得られた油を１：１（ｖ：ｖ）ヘキサンおよびジエチルエーテルと研和して、３０．７ｇの中間体１−ｃの黄色結晶を得た。ＭＳ（ＡＰＣＩ）Ｃ１８Ｈ２３ＣｌＮ４Ｏ４、ｍ／ｚの計算値  ３９４．１、実測値  ３９４．９。
【０４２６】
１−ｄ．  ３０．７ｇ（７６．４ｍｍｏｌ）の中間体１−ｃを、Ｐａｒｒ反応器容器内で３００ｍＬの酢酸エチルに溶解し、これをアルゴンでバブリングし、その後、３ｇの炭素担持１０％白金を添加した。反応容器をアルゴン下に保ち、次いで排気し、Ｈ２（気体）で数回加圧した後、激しく振盪させながら加圧して５５ＰＳＩ  Ｈ２（気体）にした。圧力が５５ＰＳＩで安定化するまでＨ２（気体）を継続的に加え、５５ＰＳＩになった時点で反応が完了したと決定した。次いで、Ｐａｒｒ反応器から反応混合物をセライトに通して濾過し、蒸発乾固させて黄色油を得、これを１：１ヘキサン／エーテルと研和して白色結晶を得、これを濾過によって回収して、２７．４ｇの１−ｄの分光学的に純粋な白色結晶を得た。ＭＳ（ＡＰＣＩ）Ｃ１８Ｈ２５ＣｌＮ４Ｏ２、ｍ／ｚの計算値  ３６４．２、実測値３６５．２。
【０４２７】
１−ｅ．  ５０ｍＬのＴＨＦ中の１０ｇ（２７．４ｍｍｏｌ、１当量）の１−ｄに、７．７ｍＬのトリエチルアミン（５４．８ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、続いて、３０ｍＬのＴＨＦ中の３．６ｇの塩化バレロイル（３０．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を激しく撹拌しながら滴下添加し、この間、反応混合物は氷上にあった。９０分後、氷浴を取り外し、ＴＨＦを真空下で除去して黄色油を得、これを１００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、これを３×５０ｍＬのｐＨ５．５  １００ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄した。ＤＣＭを油中、真空下で除去し、これを酢酸エチルと研和して１０．４ｇの白色固体を得、これを、１ｇのＣａＯ（固体）を含有するメタノールに溶解し、これを１００℃で５時間、激しく撹拌しながら加熱した。反応混合物を濾過し、乾燥させて、１０．２ｇのオフホワイトの固体である中間体１−ｅを得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２３Ｈ３１ＣｌＮ４Ｏ２、ｍ／ｚの計算値  ４３０．２１、実測値  ４３１．２。
【０４２８】
１−ｆ．  １０．２ｇ（２３．７ｍｍｏｌ、１当量）の１−ｅに、３０．４ｇ（２８４ｍｍｏｌ、１２当量）の液体ベンジルアミンを添加し、これを、激しく撹拌しながら１１０℃に加熱した。反応は１０時間後に完了し、反応混合物を２００ｍＬの酢酸エチルに添加し、４×１００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空下で除去し、得られた油を酢酸エチルから再結晶させて、１０．８ｇの中間体１−ｆの分光学的に純粋な白色結晶を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３０Ｈ３９Ｎ５Ｏ２、ｍ／ｚの計算値  ５０１．３１、実測値  ５０２．３。
【０４２９】
化合物１．  １０．８ｇ（２１．５ｍｍｏｌ）の１−ｆを５４ｍＬの濃（＞９８％）Ｈ２ＳＯ４に溶解し、反応混合物を、３時間、激しく撹拌した。３時間後、粘稠赤色反応混合物を、激しく撹拌しながら５００ｍＬの  ＤＩ  Ｈ２Ｏにゆっくりと添加した。反応混合物を３０分間撹拌し、次いでセライトに通して濾過し、その後、溶液のｐＨが約ｐＨ１０になるまで１０Ｍ  ＮａＯＨを添加した。次いで、水性層を６×２００ｍＬのＤＣＭで抽出し、得られた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で減量させて、分光学的に純粋な白色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨＺ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．０３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  ＨＺ，  １Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４１Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．９１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６４  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．８０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４６  （ｓｅｐ，  Ｊ＝  ７．７５  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ０．９６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１８Ｈ２５Ｎ５、ｍ／ｚの計算値  ３１１．２１、実測値  ３１２．３。
【０４３０】
化合物２
【化４５】
2020515629.tif 000050
【０４３１】
２ＢＸｙと呼ばれる化合物２である１−（４−（アミノメチル）ベンジル）−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンは、以前に記載された（参照：Ｌｙｎｎ  ＧＭら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｌｉｎｋｅｄ  ＴＬＲ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻（１１号）：１２０１〜１２１０頁、２０１５年、およびＳｈｕｋｌａ  ＮＭら、Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２０巻（２２号）：６３８４〜６３８６頁、２０１０年）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．７７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  １．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３５  −  ７．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０６  −  ６．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．８１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．６４  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９２−２．８４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１５  （ｓ，  ２Ｈ），  １．７１  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．５Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．３６  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．４Ｈｚ，  ２Ｈ），  ０．８５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ３Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ）Ｃ２２Ｈ２５Ｎ５、ｍ／ｚの計算値  ３５９．２、実測値  ３６０．３。
【０４３２】
化合物３
【化４６】
2020515629.tif 000051
【０４３３】
ＤＢＣＯ−２ＢＸｙ３、２ＢＸｙ３またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２ＢＸｙ）３）と呼ばれる、化合物３は、固相ペプチド合成により調製したＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ）３−ＮＨ２前駆体から出発して合成した。５０ｍｇのＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ）３−ＮＨ２（０．０８ｍｍｏｌ、１当量）、１４３ｍｇの化合物２（０．４０ｍｍｏｌ、５当量）、８４ｍｇの２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）（０．４８ｍｍｏｌ、６当量）および４８．５ｍｇの４−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（０．４８ｍｍｏｌ、６当量）を、３．２５ｍＬのＤＭＳＯに、激しく撹拌しながら、室温で、周囲空気下で添加した。反応の進行をＨＰＬＣ（ＡＵＣ  ２５４ｎｍ）によりモニターした。追加の１当量の化合物２および追加の２当量のＣＤＭＴとＮＭＭの両方を、３０分後に添加した。２時間後、反応は完了し、反応混合物を５０ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ溶液に添加してＦｍｏｃ保護中間体を沈殿させ、これを、４℃で１０分間、３０００ｇでその溶液を遠心分離することにより回収した。ＨＣｌ溶液を廃棄し、Ｆｍｏｃ保護中間体を固体白色ペレットとして回収した。白色固体を５０ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ溶液に再懸濁させ、３０００ｇで、４℃で５分間、回転させ、１Ｍ  ＨＣｌ溶液を廃棄し、生成物を固体ペレットとして回収した。この工程を反復し、その後、固体を回収し、真空下で乾燥させて、１５６．１ｍｇのＦｍｏｃ保護中間体を定量的収率で得た。次いで、Ｆｍｏｃ保護生成物を、ＤＭＦ溶液中の２０％ピペリジン  １．５ｍＬに、３０分にわたって室温で添加して脱保護生成物を得、次いで、これを５０ｍＬのエーテルから沈殿させ、４℃で３０分間、３０００ｇで遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、エーテルでさらに２回洗浄し、その後、真空下で乾燥させて１２６．４ｍｇの中間体を得た。得られた中間体、ＮＨ２−（Ｇｌｕ−２ＢＸｙ）３−ＮＨ２、のうちの６０ｍｇ（０．０４２ｍｍｏｌ、１当量）を、１ｍＬのＤＭＳＯ中の１８．６ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ、１．１当量）のＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、Ａｒｉｚｏｎａ、ＵＳＡ）および８．５μＬのトリエチルアミン（０．０８４ｍｍｏｌ、２当量）と、６時間、室温で反応させた。得られた生成物、化合物３を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜７０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物が７．０分で溶出し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで、凍結乾燥させて、４０．１２ｍｇ（収率５５．７％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１００Ｈ１０６Ｎ２０Ｏ８  ｍ／ｚの計算値  １７１４．８５、実測値  ８５８．９（Ｍ／２）＋
【０４３４】
化合物４
【化４７】
2020515629.tif 000052
【０４３５】
ＤＢＣＯ−２ＢＸｙ５、２ＢＸｙ５またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２ＢＸｙ）５）と呼ばれる、化合物４は、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）５−ＮＨ２を化合物２のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物４を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３８〜４８％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は８．０分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、４５．９ｍｇ（収率６３．４％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１５４Ｈ１６６Ｎ３２Ｏ１２  ｍ／ｚの計算値  ２６５５．３４、実測値  ８８６．６（Ｍ／３）＋。
【０４３６】
化合物５
【化４８】
2020515629.tif 000053
【０４３７】
ＤＢＣＯ−２Ｂ５、２Ｂ５またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）５）と呼ばれる、化合物５は、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）５−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物５を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３３〜４５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は約１０．０分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、２５．２ｍｇ（収率６２．６％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３４Ｈ１６６Ｎ３２Ｏ１２  ｍ／ｚの計算値  ２４１５．３４、実測値  １２０９．３（Ｍ／２）＋。
【０４３８】
化合物６
【化４９】
2020515629.tif 000054
【０４３９】
ＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２、２Ｂ３Ｗ２またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）３（Ｔｒｐ）２）と呼ばれる、化合物６は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物６を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３３〜４７％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は約８分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、１９７ｍｇ（収率５０．６％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１１０Ｈ１２６Ｎ２４Ｏ１０  ｍ／ｚの計算値  １９４３．０１、実測値  ９７３．０（Ｍ／２）＋。
【０４４０】
化合物７
【化５０】
2020515629.tif 000055
【０４４１】
ＤＢＣＯ−２Ｂ２Ｗ３、２Ｂ２Ｗ３またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）２（Ｔｒｐ）３）と呼ばれる、化合物７は、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物７を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００  ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３５〜６５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は約９分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、１１．６ｍｇ（収率６２．５％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ９８Ｈ１０６Ｎ２０Ｏ９  ｍ／ｚの計算値  １７０６．８５、実測値  ８５４．９（Ｍ／２）＋。
【０４４２】
化合物８
【化５１】
2020515629.tif 000056
【０４４３】
ＤＢＣＯ−２Ｂ２Ｗ８、２Ｂ２Ｗ８またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）２（Ｔｒｐ）８）と呼ばれる、化合物８は、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物８を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３５〜８５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は約８．０分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、３．３ｍｇ（収率１６．３％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１５３Ｈ１５６Ｎ３０Ｏ１４  ｍ／ｚの計算値  ２６３７．２４、実測値  １３２０．２（Ｍ／２）＋。
【０４４４】
化合物９
【化５２】
2020515629.tif 000057
【０４４５】
ＤＢＣＯ−２Ｂ１Ｗ４、２Ｂ１Ｗ４またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）１（Ｔｒｐ）４）と呼ばれる、化合物９は、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物９を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって５０〜５５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は８．９分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、９．７ｍｇ（収率５５．４％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ８６Ｈ８６Ｎ１６Ｏ８  ｍ／ｚの計算値  １４７０．６８、実測値  ７３６．６（Ｍ／２）＋。
【０４４６】
化合物１０
【化５３】
2020515629.tif 000058
【０４４７】
ＤＢＣＯ−Ｗ３、Ｗ３またはＤＢＣＯ−（Ｔｒｐ）３と呼ばれる、化合物１０は、固相ペプチド合成により調製した５０．２ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ、１当量）のトリペプチド前駆体ＮＨ２−（Ｔｒｐ）３−ＮＨ２を、１．５ｍＬのＤＭＳＯ中で、３５ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．０９６ｍｍｏｌ、１．１当量）および４４ｍｇのトリエチルアミン（０．４４ｍｍｏｌ、５当量）と反応させることにより合成した。化合物１０を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜９５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は約９分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、３１．２ｍｇ（収率４１．５％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）ものを得た。
【０４４８】
化合物１１
【化５４】
2020515629.tif 000059
【０４４９】
ＤＢＣＯ−Ｗ５、Ｗ５またはＤＢＣＯ−（Ｔｒｐ）５と呼ばれる、化合物１１は、ＮＨ２−（Ｔｒｐ）５−ＮＨ２（配列番号７０）をペプチド前駆体としてＤＢＣＯ−ＮＨＳとのコンジュゲーションに使用したことを除き、化合物１０と同じ手順を使用して合成した。化合物１１を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜９５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は約１０分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、２８．７ｍｇ（収率４４．１％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ７４Ｈ６６Ｎ１２Ｏ７  ｍ／ｚの計算値  １２３４．５２、実測値  １２３５．６（Ｍ＋Ｈ）＋
【０４５０】
化合物１２
【化５５】
2020515629.tif 000060
【０４５１】
ＤＢＣＯ−２ＢＸｙ３Ｗ２、２ＢＸｙ３Ｗ２またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２ＢＸｙ）３（Ｔｒｐ）２）と呼ばれる、化合物１２は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＮＨ２および化合物２を出発物質として使用して調製した。５００ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（０．５ｍｍｏｌ、１当量）、５９５．６ｍｇのチアゾリン−２−チオール（ＴＴ）（５ｍｍｏｌ、１０当量）、および５７５．７ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（３ｍｍｏｌ、６当量）を、２６ｍＬのＤＣＭに懸濁させた。１８．３ｍｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（０．２ｍｍｏｌ、０．３当量）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。４時間後、追加の４当量のＴＴおよび２当量のＥＤＣを添加した。終夜撹拌した後、２当量のＴＴおよび半当量のＥＤＣを添加した。６時間後、反応が完了した。ＤＣＭを真空下で除去し、固体を６ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶かした。５３９．３ｍｇの化合物２（１．５ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、反応混合物を２時間、室温で撹拌した。次いで、コンジュゲートした中間体を３００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌから沈殿させ、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。ペレットを回収し、１Ｍ  ＨＣｌでさらに１回、そしてＤＩ水で１回洗浄した。最終回収ペレットを凍結させ、真空下で乾燥させた。８０９．０６ｍｇのＦｍｏｃ−２ＢＸｙ３Ｗ２−ＮＨ２（０．４ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  ４ｍＬに溶解した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、脱保護された中間体を１００ｍＬのエーテルから沈殿させ、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、エーテルでさらに２回洗浄し、その後、真空下で乾燥させて中間体を得た。７２９ｍｇのＮＨ２−２ＢＸｙ３Ｗ２−ＮＨ２（０．４ｍｍｏｌ、１当量）を６ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。４８８．８ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（１．２ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。得られた生成物を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、５０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３６〜４６％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させて、２３９ｍｇ（収率３８．１％）の分光学的に純粋な白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１２２Ｈ１２６Ｎ２４Ｏ１０  ｍ／ｚの計算値  ２０８７．６５  実測値  ６９７（ｍ／３）＋。
【０４５２】
化合物１３
【化５６】
2020515629.tif 000061
【０４５３】
ＤＢＣＯ−２Ｂ６Ｗ４、２Ｂ６Ｗ４またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）６（Ｔｒｐ）４）と呼ばれる、化合物１３は、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ）２−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物１３を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２４〜４５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２０１Ｈ２３６Ｎ４６Ｏ１８  ｍ／ｚの計算値  ３５８２．４、実測値  ７１７．７（Ｍ／５）＋。
【０４５４】
化合物１４
【化５７】
2020515629.tif 000062
【０４５５】
ＤＢＣＯ−２Ｂ４Ｗ６、２Ｂ４Ｗ６またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）４（Ｔｒｐ）６）と呼ばれる、化合物１４は、Ｆｍｏｃ−（Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ）２−ＮＨ２を化合物１のコンジュゲーションのための出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物１４を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２４〜４５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１７７Ｈ１９６Ｎ３８Ｏ１６  ｍ／ｚの計算値  ３１１１．７、実測値  ７７７．５（Ｍ／４）＋。
【０４５６】
化合物１５
【化５８】
2020515629.tif 000063
【０４５７】
ＤＢＣＯ−２ＢＸｙ１Ｗ４、２ＢＸｙ１Ｗ４またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２ＢＸｙ）１（Ｔｒｐ）４）と呼ばれる、化合物１５は、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して調製した。化合物１５を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１６分にわたって４０〜７０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、３．４ｍｇ（収率７３．３％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ９０Ｈ８５Ｎ１５Ｏ９  ｍ／ｚの計算値  １５１９．６７、実測値  ７６０．５（Ｍ／２）＋。
【０４５８】
化合物１６
【化５９】
2020515629.tif 000064
【０４５９】
ＤＢＣＯ−（ＧＧ２Ｂ）５、２Ｂ５Ｇ１０またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）５（Ｇｌｙ）１０）と呼ばれる、化合物１６は、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）５−ＮＨ２および化合物１を出発物質として使用したことを除き、化合物３について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物１６を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって２２〜４２％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は７分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、２２．８ｍｇ（収率３６．２％）の分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１５４Ｈ１９６Ｎ４２Ｏ２２  ｍ／ｚの計算値  ２９８５．５１、実測値  ５９８．５（Ｍ／５）＋。
【０４６０】
化合物１７
【化６０】
2020515629.tif 000065
【０４６１】
ＤＢＣＯ−（ＧＧ２ＢＧＧＷ）２ＧＧ２Ｂ、２Ｂ３Ｗ２Ｇ１０またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）３（Ｔｒｐ）２（Ｇｌｙ）１０）と呼ばれる、化合物１７は、固相ペプチド合成により調製したＦｍｏｃ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ）２−Ｇｌｙ２−Ｇｌｕ−ＮＨ２前駆体、および化合物１から合成した。２３５．４ｍｇのＦｍｏｃ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ）２−Ｇｌｙ２−Ｇｌｕ−ＮＨ２（０．１５ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  ２ｍＬに溶解した。３０分後、反応が完了し、生成物を１００ｍＬのエーテルから沈殿させ、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、エーテルでさらに２回洗浄し、その後、真空下で乾燥させて、約２００ｍｇの脱保護中間体を得た。２００ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、１当量）のＮＨ２−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ）２−Ｇｌｙ２−Ｇｌｕ−ＮＨ２を、２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、８９．７３ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．２２ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、その後、ＴＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。得られたＤＢＣＯ中間体を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、５０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜５０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させて、中間体を得た。２５ｍｇのＤＢＣＯ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ）２−Ｇｌｙ２−Ｇｌｕ−ＮＨ２（０．０１５ｍｍｏｌ、１当量）および１７．１１ｍｇの化合物１（０．０５５ｍｍｏｌ、３．６当量）を、１．２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。ＴＥＡ（０．１８３ｍｍｏｌ、１２当量）を添加し、反応混合物を室温で５時間撹拌した。１９．１７ｍｇのＨＡＴＵ（０．０５ｍｍｏｌ、３．３当量）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。反応の進行をＬＣ−ＭＳによりモニターした。追加の１．２当量の化合物１、および１．１当量のＨＡＴＵを１時間後に添加した。２時間後、反応が完了した。得られた生成物を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜６０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を合わせて、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３０Ｈ１５６Ｎ３４Ｏ２０  ｍ／ｚの計算値  ２５１５．９６  実測値  ８３９（ｍ／３）＋。
【０４６２】
化合物１８
【化６１】
2020515629.tif 000066
【０４６３】
Ｂｉｓ（ＴＴ）と呼ばれる化合物１８は、スベリン酸および２−チアゾリン−２−チオール（ＴＴ）を出発物質として使用して合成した。簡単に述べると、５００ｍｇのスベリン酸（２．８７ｍｍｏｌ、１当量）、７５２．７ｍｇのＴＴ（６．３１ｍｍｏｌ、２．２当量）および１．４３１ｇのＥＤＣ（７．４６ｍｍｏｌ、２．６当量）を、１７．５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。７０．１５ｍｇのＤＭＡＰ（０．５７ｍｍｏｌ、０．２当量）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌで２回、そしてＤＩ水で１回洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて、黄色固体を定量的収率で得た。
【０４６４】
化合物１９
【化６２】
2020515629.tif 000067
【０４６５】
２Ｂ−ＴＴと呼ばれる化合物１９は、化合物１８および化合物１を出発物質として使用して合成した。簡単に述べると、５０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、１当量）の化合物１を、０．６ｍＬのメタノールに溶解し、１．９３ｍＬのＤＣＭ中の３０１．１ｍｇの化合物１８（０．８ｍｍｏｌ、５当量）の激しく撹拌している溶液に滴下添加した。３０分後、反応混合物をカラムに直接注入し、フラッシュクロマトグラフィーにより、２段階グラジエント：５カラム体積（ＣＶ）にわたってＤＣＭ中の５％メタノール、続いて、２０ＣＶにわたってＤＣＭ中５〜５０％メタノールのグラジエント、を使用して精製した。画分を併せ、溶媒を真空下で除去した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２９Ｈ４０Ｎ６Ｏ２Ｓ２  ｍ／ｚの計算値  ５６８．２７  実測値  ５６９．３  （ｍ＋Ｈ）＋。
【０４６６】
化合物２０
【化６３】
2020515629.tif 000068
【０４６７】
ＤＢＣＯ−（２ＢＧＷＧＷＧ）５、２Ｂ５Ｗ１０Ｇ１５またはＤＢＣＯ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）５（Ｔｒｐ）１０（Ｇｌｙ）１５）と呼ばれる、化合物２０は、固相ペプチド合成により調製したＦｍｏｃ−（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ）５−ＮＨ２ペプチド前駆体、および化合物１９から合成した。４９．８ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ、１当量）のＦｍｏｃ−（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ）５−ＮＨ２を、０．５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。この溶液に、０．４９２ｍＬの化合物１９（０．０３ｍｍｏｌ、２．５当量）を、乾燥ＤＭＳＯ中の４０ｍｇ／ｍＬのストック溶液として添加した。ＴＥＡ（０．０１ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。１０分にわたって４５〜６５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用する分析ＨＰＬＣは、五置換中間体への完全転化を示した。アミノ−２−プロパノール（０．０３ｍｍｏｌ、２．５当量）の添加により反応をクエンチし、次いで、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  ０．５ｍＬを添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を５０ｍＬのエーテルに添加し、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、エーテルでさらに２回洗浄し、その後、真空下で乾燥させて、脱保護中間体を得た。７３．４ｍｇの脱保護中間体（０．０１３１ｍｍｏｌ、１当量）を、０．５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、その後、０．０６６ｍＬ（０．０１９６ｍｍｏｌ、１．５当量）のＤＢＣＯ−ＮＨＳ（４０ｍｇ／ｍＬ）およびＴＥＡ（０．０１３１ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応物を１時間、室温で撹拌し、次いで、アミノ−２−プロパノール（０．０１９６ｍｍｏｌ、１．５当量）の添加によりクエンチした。次いで、生成物を５０ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌから沈殿させ、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、１Ｍ  ＨＣｌでさらに１回、そしてＤＩ水でさらに１回洗浄した。最終回収ペレットを真空下で乾燥させて、１５．１ｍｇ（収率２６％）の最終生成物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３１９Ｈ３９６Ｎ７２Ｏ４２  ｍ／ｚの計算値  ５９０９．１  実測値  １１８３（ｍ／５）＋。
【０４６８】
化合物２１
【化６４】
2020515629.tif 000069
【０４６９】
Ｍａｌ−２Ｂ３Ｗ２またはＭａｌ−（Ｇｌｕ（２Ｂ）３（Ｔｒｐ）２）と呼ばれる、化合物２１は、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ）３（Ｔｒｐ）２−ＮＨ２および化合物１から出発して合成した。１００ｍｇのＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ）３（Ｔｒｐ）２−ＮＨ２（０．１ｍｍｏｌ  １当量）および１１２．１ｍｇの化合物１（０．３６ｍｍｏｌ、３．６当量）を、８ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。ＴＥＡ（１．２ｍｍｏｌ、１２当量）を添加し、溶液を氷浴で撹拌しながら５分間冷却した。ＨＡＴＵ（０．３３ｍｍｏｌ、３．３当量）を添加し、反応混合物を４℃で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を５０ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌに添加し、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、１Ｍ  ＨＣｌでさらに１回、そしてＤＩ水でさらに１回洗浄して、コンジュゲートした中間体を得た。次いで、１８８ｍｇのＦｍｏｃ−２Ｂ３Ｗ２−ＮＨ２（０．１ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ溶液中の２０％ピペリジン  ２ｍＬに溶解し、３０分間、室温で撹拌した。脱保護された中間体を１００ｍＬのエーテルから沈殿させ、３０００ｇで、４℃で３０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、エーテルでさらに２回洗浄し、その後、真空下で乾燥させて、脱保護中間体を得た。３０ｍｇのＮＨ２−２Ｂ３Ｗ２−ＮＨ２（０．０１８ｍｍｏｌ、１当量）を０．３ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、その後、２２ｍｇのスクシンイミジル６−（（ベータ−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ６−（（ｂｅｔａ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ）（０．０５８ｍｍｏｌ、３．２当量）を添加した。反応混合物を１時間、室温で撹拌し、得られた生成物を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、５０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜５０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物が４．７５分で溶出し、得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させて、２３ｍｇ（収率６６．７％）の分光学的に純粋な白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１０４Ｈ１２９Ｎ２５Ｏ１２の計算値  １９２１．３３、実測値  ９６１（ｍ／２）＋。
【０４７０】
化合物２２
【化６５】
2020515629.tif 000070
【０４７１】
ＮＨＳ−２Ｂ３Ｗ２と呼ばれる化合物２２は、乾燥ＤＭＳＯ中で１２５μｇ（０．０００４ｍｍｏｌ、１当量）の３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（Ａｚ−ＮＨＳ、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）を０．８ｍｇの（０．０００４ｍｍｏｌ、１．０当量）化合物６と反応させることにより合成した。ＨＰＬＣは、ＮＨＳ活性化化合物への完全転化を示し、この化合物を、反応性アミンを有するコンジュゲーションペプチドのために直ちに使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１１７Ｈ１３３Ｎ２８Ｏ１７Ｓ  ｍ／ｚの計算値  ２２３４  実測値  １１１９（ｍ／２）＋。
【０４７２】
化合物２３
【化６６】
2020515629.tif 000071
【０４７３】
ＤＢＣＯ−２ＢＸｙと呼ばれる化合物２３は、乾燥ＤＭＳＯ中で５．０ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ、１当量）のＤＢＣＯ−ＮＨＳを４．９１ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ、１．１当量）の化合物２と反応させることにより合成した。ＤＭＳＯ溶液を酢酸エチルに溶解し、次いで、１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。有機層を真空下で除去して、約３ｍｇの分光学的に純粋な白色固体を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ４１Ｈ４０Ｎ６Ｏ２の計算値  ６４６．３１、実測値  ６４７．３（ｍ／２）＋。
【０４７４】
化合物２４
【化６７】
2020515629.tif 000072
【０４７５】
ＤＢＣＯ−ＷＷＴＴＷＷまたはＷ４ＴＴと呼ばれる、化合物２４は、固相ペプチド合成により調製したＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２を使用して調製した。３２．８ｍｇのＮＨ２−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）を０．５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、１５．５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）のＤＢＣＯ−ＮＨＳを添加し、その後、ＴＥＡ（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。得られたＤＢＣＯ中間体を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１６分にわたって４０〜７０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させた。ＴＴがＤＢＣＯ−ペプチドを活性化するように、６．１ｍｇのＤＢＣＯ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（０．００５ｍｍｏｌ、１当量）、０．６８ｍｇのＴＴ（０．００６ｍｍｏｌ、１．１当量）および１．２６ｍｇのＥＤＣ（０．００７ｍｍｏｌ、１．３当量）を、ＤＭＳＯとＤＣＭの１：１溶液  ０．２ｍＬに溶解した。反応混合物に、０．０６ｍｇのＤＭＡＰ（０．００１ｍｍｏｌ、０．１当量）を激しく撹拌しながら室温で添加した。２時間後、追加の３．３当量のＴＴ、４．０当量のＥＤＣおよび０．１当量のＤＭＡＰを添加し、反応は、合計３時間後に完了した。ＤＢＣＯ−ＷＷＴＴＷＷを後続のステップで中間体として使用した。
【０４７６】
化合物２５
【化６８】
2020515629.tif 000073
【０４７７】
ＤＢＣＯ−ＷＷＰＩＷＷ、ＷＷ（ＰＩ）ＷＷまたはＰＩＷ４と呼ばれる、化合物２５。ピリミド−インドール−Ｐｅｇ４−ＮＨ２（ＰＩ−ＮＨ２、ＴＬＲ−４アゴニスト）を、以前に記載されたように調製した（Ｌｙｎｎ  ＧＭら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｌｉｎｋｅｄ  ＴＬＲ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻（１１号）：１２０１〜１２１０頁、２０１５年）。３．６ｍｇのＰＩＮＨ２（０．００５ｍｍｏｌ、２当量）に、ＤＭＳＯ中の３．３１ｍｇの化合物３３（０．００２６ｍｍｏｌ、１当量）およびＴＥＡ（０．００３ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、それを室温で終夜撹拌した。得られた生成物を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１６分にわたって４５〜７５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１０３Ｈ１０７Ｎ１７Ｏ１５Ｓ  ｍ／ｚの計算値  １８５４．７７  実測値  ９２８．６（ｍ／２）＋。
【０４７８】
化合物２６
【化６９】
2020515629.tif 000074
【０４７９】
ＴＬＲ−２／６アゴニストである、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＴＴまたはＰ２Ｃ−ＴＴと呼ばれる、化合物２６は、Ｆｍｏｃ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ａｃｉｄを出発物質として使用したこと、および反応をＴＬＣ（ＤＣＭ中１％メタノール）でモニターしたことを除き、化合物２４と同じ手順を使用して合成した。この手順は、黄色固体を定量的収率で生成し、この黄色固体を後続の反応ステップで中間体として使用した。
【０４８０】
化合物２７
【化７０】
2020515629.tif 000075
【０４８１】
ＤＢＣＯ−ＷＷＰａｍ２ＣｙｓＷＷ、ＷＷ（Ｐ２Ｃ）ＷＷまたはＰ２Ｃ（Ｗ）４と呼ばれる、化合物２７は、化合物２４、ＰＥＧ２−ジアミン、および化合物２６を出発物質として使用して調製した。先ず、１．１５ｍｇのＰｅｇ２−ジアミン（０．００８ｍｍｏｌ、３当量）を、３．３１ｍｇの化合物２４（０．００２６ｍｍｏｌ、１当量）を含有する反応混合物に添加し、反応混合物を１時間、室温で撹拌した。反応混合物を１５ｍＬのＤＩ水に添加し、遠心分離した。ペレットを回収し、さらにＤＩ水で３回洗浄し、凍結乾燥させた。中間体（ＤＢＣＯ−ＷＷＰｅｇ２ＮＨ２ＷＷ）を０．１ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶かし、２．５８ｍｇの化合物２６（０．００２６ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＣＭ中の１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液として添加した。反応混合物を１時間、室温で撹拌し、次いで、ＤＣＭを真空下で除去し、その後、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  ０．２ｍＬを添加した。反応混合物を３０分間、室温で撹拌し、次いで、ＤＣＭで希釈し、ＤＩ水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。得られた油をＤＭＳＯに溶解し、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、９．４×１００ｍｍ、５μｍで、１６分にわたって７０〜１００％イソプロパノール／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を併せ、蒸発させて、生成物、ＤＢＣＯ−ＷＷＰａｍ２ＣｙｓＷＷを得た。化合物２７のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０４８２】
化合物２８
【化７１】
2020515629.tif 000076
【０４８３】
ＮＨ２−ＧＫ（ＤＢＣＯ）ＧＷ５と呼ばれる化合物２８は、固相ペプチド合成により調製したＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−（Ｔｒｐ）５−ＮＨ２、およびＤＢＣＯ−ＮＨＳを出発物質として使用して合成した。５０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−（Ｔｒｐ）５−ＮＨ２（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）を、０．２５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。ＴＥＡ（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、溶液を室温で５分間撹拌した。１４．２４ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を１時間、室温で撹拌した。反応をアミノ−２−プロパノール（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）でクエンチし、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  ０．５ｍＬを添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで、生成物を５０ｍＬのエーテルから沈殿させ、３０００ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。生成物を固体ペレットとして回収し、次いで、エーテルでさらに２回洗浄し、その後、真空下で乾燥させた。生成物を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２５〜４５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は９．４分で溶離し、得られた画分を合わせて、凍結させ、凍結乾燥させて、分光学的に純粋なオフホワイトの固体末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ８４Ｈ８４Ｎ１６Ｏ１０  ｍ／ｚの計算値  １４７７．６４  、実測値  ７３９．６（ｍ／２）＋。
【０４８４】
化合物２９
【化７２】
2020515629.tif 000077
【０４８５】
ＴＬＲ−７アゴニストである、ＣＬ２６４−アジド、ヒドロキシアデニン−アジドまたはＴＬＲ−７−アジドと呼ばれる、化合物２９は、ＣＬ２６４（Ｉｎｖｉｇｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびアジド−プロピル−アミンを出発物質として使用して合成した。５ｍｇのＣＬ２６４（０．０１２ｍｍｏｌ、１当量）および６．１ｍｇのアジド−プロピル−アミン（０．０６１ｍｍｏｌ、５当量）を、乾燥ＤＭＦに溶解した。ＴＥＡ（０．０７３ｍｍｏｌ、６当量）を添加し、溶液を氷浴を用いて０℃に冷却した。２７．６ｍｇのＨＡＴＵ（０．０７３ｍｍｏｌ、６当量）を添加し、０℃で１時間、反応物を撹拌した。化合物２９を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２０〜４０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物が５分で溶出し、得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２２Ｈ２９Ｎ１１Ｏ３  ｍ／ｚの計算値  ４９５．２５、実測値  ４９６．３（ｍ＋Ｈ）＋。
【０４８６】
化合物３０
【化７３】
2020515629.tif 000078
【０４８７】
ＤＢＣＯ−ＧＫ（ＣＬ２６４）Ｇ−Ｗ５、Ｃｌ２６４−（Ｗ）５またはＤＢＣＯ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ−ＣＬ２６４）−Ｇｌｙ−（Ｔｒｐ）５−ＮＨ２と呼ばれる、化合物３０は、化合物２８および２９を出発物質として使用して合成した。５ｍｇの化合物２８（０．００３４ｍｍｏｌ、１当量）を、０．２５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、１．６８ｍｇの化合物２９（０．００３４ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を２時間撹拌し、その後、１．５ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．００３７ｍｍｏｌ、１．１当量）および０．５当量のＴＥＡを添加した。反応混合物を終夜、室温で撹拌し、次いで、生成物を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２５〜５５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物が９．４分で溶出し、得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させて、分光学的に純粋な白色固形を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１２５Ｈ１２８Ｎ２８Ｏ１５  ｍ／ｚの計算値  ２２６１．０１、実測値  １１３２．２（ｍ／２）＋。
【０４８８】
化合物３１
【化７４】
2020515629.tif 000079
【０４８９】
ＳＴＩＮＧアゴニストであるＤＭＸＡＡ−アジドと呼ばれる、化合物３１は、ＤＭＸＡＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を出発物質として使用したことを除き、化合物２９と同じ手順を使用して合成した。化合物３１を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって３５〜６５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は６分で溶離し、得られた画分を合わせて、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２０Ｈ２２Ｎ４Ｏ３  ｍ／ｚの計算値  ３６６．４２、実測値  ３６５．２
【０４９０】
化合物３２
【化７５】
2020515629.tif 000080
【０４９１】
ＤＢＣＯ−ＧＫ（ＤＭＸＡＡ）−Ｇ−Ｗ５、ＤＭＸＡＡ−（Ｗ）５、ＤＭＸＡＡ−Ｗ５またはＤＢＣＯ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ−ＤＭＸＡＡ）−Ｇｌｙ−（Ｔｒｐ）５−ＮＨ２と呼ばれる、化合物３２は、化合物３１をアゴニストカーゴとして使用したことを除き、化合物３０と同じ手順を使用して合成した。化合物３２を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって４５〜８５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１２３Ｈ１２１Ｎ２１Ｏ１５  ｍ／ｚの計算値  ２１３１．９４、実測値  １０６７．６（ｍ／２）＋。
【０４９２】
化合物３３
【化７６】
2020515629.tif 000081
【０４９３】
ＮＨ２−ＧＲＫ（ＤＢＣＯ）ＧＷ５、ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ＤＢＣＯ）−Ｇｌｙ−（Ｔｒｐ）５−ＮＨ２と呼ばれる、化合物３３は、固相ペプチド合成により生成したＦｍｏｃ−ＧＲＫＧＷ５−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物２８と同じ手順を使用して合成した。化合物３３を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２５〜５５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物が７．５分で溶出し、得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ９０Ｈ９６Ｎ２０Ｏ１１  ｍ／ｚの計算値  １６３３．７４、実測値  ８１７．５（ｍ／２）＋。
【０４９４】
化合物３４
【化７７】
2020515629.tif 000082
【０４９５】
ＮＯＤ  ２アゴニストである、ムラミルアジドと呼ばれる、化合物３４は、ムラミルトリ−リシン（Ｍ−ＴｒｉＬｙｓ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびアジドプロピオン酸スルホＮＨＳを出発物質として使用して合成した。５ｍｇのムラミルトリ−リシン（０．００８ｍｍｏｌ、１当量）を、ＴＥＡ（０．０２ｍｍｏｌ、２．５当量）を含有する乾燥ＤＭＳＯ  ０．５ｍＬに溶解し、２．２ｍｇのアジドプロピオン酸スルホＮＨＳ（０．００８ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をアミノ−２−プロパノール（０．００８ｍｍｏｌ、１当量）でクエンチし、この中間体を直ちに反応に使用した。
【０４９６】
化合物３５
【化７８】
2020515629.tif 000083
【０４９７】
ＤＢＣＯ−ＧＲＫ（ムラミル）ＧＷ５、ムラミル−Ｗ５またはＤＢＣＯ（ムラミル）Ｗ５と呼ばれる、化合物３５は、化合物３３および３４を出発物質として使用したことを除き、化合物３０と同じ手順を使用して合成した。化合物３５を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって３５〜６５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物が４．６分で溶出し、得られた画分を併せ、凍結させ、凍結乾燥させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３７Ｈ１５８Ｎ３０Ｏ２６  ｍ／ｚの計算値  ２６３９．２、実測値  １３１９．５（ｍ／２）＋。
【０４９８】
化合物３６
【化７９】
2020515629.tif 000084
【０４９９】
ＮＨ２−ＧＧＲＫ（ＤＢＣＯ）ＲＧＧＷ５と呼ばれる、化合物３６は、固相ペプチド合成により調製したＦｍｏｃ−ＧＧＲＫＲＧＧＷ５−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物２８と同じ手順を使用して合成した。化合物３６を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２５〜４５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は７．８分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１００Ｈ１１４Ｎ２６Ｏ１４  ｍ／ｚの計算値  １９０２．９、実測値  ９５１．４  （ｍ／２）＋。
【０５００】
化合物３７
【化８０】
2020515629.tif 000085
【０５０１】
ＤＢＣＯ−ＧＧＲＫ（ＡＭＰ）ＲＧＷ５またはＤＢＣＯ（ＡＭＰ）Ｗ５と呼ばれる、化合物３７は、化合物３６と、アジド−プロピオン酸で置換されたアデノシン一リン酸８−（６−アミノヘキシル）アミノアデノシン５’一リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを出発物質として使用したことを除き、化合物３０と同じ手順を使用して合成した。化合物３７を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって３０〜６０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は５．２分で溶離し、得られた画分を合わせて、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３８Ｈ１５８Ｎ３７Ｏ２４Ｐの計算値  ２７４８．２  実測値  ９１７．５（ｍ／３）＋。
【０５０２】
化合物３８
【化８１】
2020515629.tif 000086
【０５０３】
ＮＨ２−ＧＲＲＫ（ＤＢＣＯ）−ＲＧＷ５と呼ばれる、化合物３８は、Ｆｍｏｃ−ＧＲＲＫＲＧＷ５−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物２８と同じ手順を使用して合成した。化合物３８を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２５〜５５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。生成物は５．１分で溶離し、得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１０２Ｈ１２０Ｎ２８Ｏ１３  ｍ／ｚの計算値  １９４４．９６、実測値  ９７３．４（ｍ／２）＋。
【０５０４】
化合物３９
【化８２】
2020515629.tif 000087
【０５０５】
ＮＨ２−ＧＫ（ＤＢＣＯ）［ＧＧＫ（ＤＢＣＯ）］２ＧＷ５と呼ばれる化合物３９は、Ｆｍｏｃ−ＧＫ（ＧＧＫ）２ＧＷ５−ＮＨ２を出発物質として使用したこと、ならびに追加の３当量のＴＥＡおよびＤＢＣＯ−ＮＨＳを使用したことを除き、化合物２８と同じ手順を使用して合成した。化合物３９を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって４５〜８５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、表題の化合物として分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１４２Ｈ１４６Ｎ２６Ｏ２０  ｍ／ｚの計算値  ２５３５．１２、実測値  １２６９（ｍ／２）＋。
【０５０６】
化合物４０
【化８３】
2020515629.tif 000088
【０５０７】
ＮＨ２−［ＧＲＫ（ＤＢＣＯ）ＲＧ］３−Ｗ５と呼ばれる、化合物４０は、ＮＨ２−［ＧＲＫ（ＤＢＣＯ）ＲＧ］３−Ｗ５を出発物質として使用したことを除き、化合物３９について説明したのと同じ手順を使用して合成した。化合物４０を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって３５〜６５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１７８Ｈ２１８Ｎ５０Ｏ２６  ｍ／ｚの計算値  ３４７１．３１、実測値  ６９５．６（ｍ／５）＋。
【０５０８】
化合物４１
【化８４】
2020515629.tif 000089
【０５０９】
Ｅ１０−２Ｂ３Ｗ２と呼ばれる化合物４１は、アジド−（Ｇｌｕ）１０−ＮＨ２および化合物６を出発物質として使用して合成した。５ｍｇのアジド−（Ｇｌｕ）１０−ＮＨ２（０．００３５ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、６．７７ｍｇの化合物６（０．００３５ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＳＯ中の４０ｍｇ／ｍＬ溶液として添加した。反応混合物を終夜、室温で撹拌した。化合物４１を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２５〜４５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、定量的収量において１１．８ｍｇの分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３３７７．３１、実測値  １１２７（Ｍ／３）＋。
【０５１０】
化合物４２
【化８５】
2020515629.tif 000090
【０５１１】
Ｋ１０−２Ｂ３Ｗ２と呼ばれる、化合物４２は、アジド−（Ｌｙｓ）１０−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物４１と同じ手順を使用して合成した。化合物４２を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２０〜４０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、定量的収量において分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３３６７．５８、実測値  ４８２（Ｍ／７）＋。
【０５１２】
化合物４３
【化８６】
2020515629.tif 000091
【０５１３】
ＤＢＣＯ−Ｇ５−２Ｂ３Ｗ２−Ｇ５−Ｄ９またはＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２（Ｄ）９と呼ばれる、化合物４３は、ＮＨ２−（Ｇｌｙ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ｇｌｙ）５−（Ａｓｐ）９−ＮＨ２、化合物６およびＤＢＣＯ−ＮＨＳを出発物質として使用して合成した。５ｍｇのＮＨ２−（Ｇｌｙ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ｇｌｙ）５−（Ａｓｐ）９−ＮＨ２（０．００２８ｍｍｏｌ、１当量）を、０．１ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、６．５６ｍｇの化合物６（０．００３４ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。反応混合物を終夜、室温で撹拌した。３．５５ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．００８４ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、その後、ＴＥＡ（０．００２８ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を２時間、室温で撹拌した。化合物４３を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜４０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末として３．８ｍｇ（収率３３．７％）の表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ４００８．３１、実測値  １００３．３（ｍ／４）＋。
【０５１４】
ＤＢＣＯ−Ｇ５−２Ｂ３Ｗ２−Ｇ５−Ｄ８またはＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２（Ｄ）８と呼ばれる、化合物４４は、ＮＨ２−（Ｇｌｙ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ｇｌｙ）５−（Ａｓｐ）８−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物４３と同じ手順を使用して合成した。化合物４４を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって３０〜４０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末として表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３８９４．５２、実測値  ９７４．６（ｍ／４）＋。
【０５１５】
ＤＢＣＯ−Ｇ５−２Ｂ３Ｗ２−Ｇ５−Ｄ７またはＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２（Ｄ）７と呼ばれる、化合物４５は、ＮＨ２−（Ｇｌｙ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ｇｌｙ）５−（Ａｓｐ）７−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物４３と同じ手順を使用して合成した。化合物４５を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって２９〜３９％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末として表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３７７９．４３、実測値  ９４５．８（ｍ／４）＋。
【０５１６】
ＤＢＣＯ−Ｇ５−２Ｂ３Ｗ２−Ｇ５−Ｄ６またはＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２（Ｄ）６と呼ばれる、化合物４６は、ＮＨ２−（Ｇｌｙ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ｇｌｙ）５−（Ａｓｐ）６−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物４３と同じ手順を使用して合成した。化合物４６を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって２９〜３９％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末として表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３６６４．３５、実測値  ９１７．１（ｍ／４）＋。
【０５１７】
ＤＢＣＯ−Ｇ５−２Ｂ３Ｗ２−Ｇ５−Ｄ５またはＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２（Ｄ）５と呼ばれる、化合物４７は、ＮＨ２−（Ｇｌｙ）５−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ｇｌｙ）５−（Ａｓｐ）５−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物４３と同じ手順を使用して合成した。化合物４７を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって２９〜４１％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末として表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３５４９．２６、実測値  １１８４．１（ｍ／３）＋。
【０５１８】
化合物４８
【０５１９】
【化８７】
2020515629.tif 000092
【０５２０】
ＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２−Ｒ６またはＤＢＣＯ−２Ｂ３Ｗ２（Ｒ）６と呼ばれる、化合物４８は、ＮＨ２−Ｌｙｓ（Ｎ３）−（Ａｒｇ）６−ＮＨ２を出発物質として使用したことを除き、化合物４３と同じ手順を使用して合成した。化合物４８を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって２６〜３６％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、分光学的に純粋な（２５４ｎｍで＞９５％ＡＵＣ）白色粉末として１７．８ｍｇ（収率５１．８％）の表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの計算値  ３３３８．１９、実測値  ４７８．１（ｍ／７）＋。
【０５２１】
化合物４９
【化８８】
2020515629.tif 000093
【０５２２】
Ｍｙｒ−ＤＢＣＯまたはＣ１４−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物４９は、塩化ミリストイルおよびＤＢＣＯ−アミンから調製した。５０ｍｇのＤＢＣＯ−アミン（０．１８ｍｍｏｌ、１当量）を０．５ｍＬのＤＣＭに溶解した。ＴＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、溶液を室温で５分間撹拌した。塩化ミリストイル（０．１６ｍｍｏｌ、０．９当量）を添加し、反応混合物を１時間、室温で撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ中２．５％メタノール）は、Ｍｙｒ−ＤＢＣＯの、０．５のｒｆを有する新たなスポットを示した。反応混合物をフラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、１２ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜３％メタノールのグラジエントを使用して精製した。画分を回収し、乾燥させて、８６ｍｇのＭｙｒ−ＤＢＣＯを定量的収率で得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３２Ｈ４２Ｎ２Ｏ２  ｍ／ｚの計算値  ４８６．３２、実測値  ４８７．３（ｍ＋Ｈ）＋。
【０５２３】
化合物５０
【化８９】
2020515629.tif 000094
【０５２４】
Ｖａｌ−ＤＢＣＯまたはＣ５−ＤＢＣＯと呼ばれる、化合物５０は、塩化バレロイルを出発物質として使用したことを除き、化合物４９について説明した同じ手順を使用して調製した。Ｖａｌ−ＤＢＣＯを、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって４０〜６０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。得られた画分を回収し、凍結させ、次いで凍結乾燥させて、定量的収量において８０ｍｇのＶａｌ−ＤＢＣＯを得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２３Ｈ２４Ｎ２Ｏ２  ｍ／ｚの計算値  ３６０．１８、実測値  ３６１．２（ｍ＋Ｈ）＋。
【０５２５】
化合物５１
【化９０】
2020515629.tif 000095
【０５２６】
Ｐｌｍ−ＤＢＣＯまたはＣ１６−ＤＢＣＯと呼ばれる、化合物５１は、塩化パルミトイルを出発物質として使用したことを除き、化合物４９について説明したのと同じ手順を使用して調製した。化合物５１を、フラッシュクロマトグラフィーにより、１２ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜３％メタノールのグラジエントを使用して、精製した。画分を回収し、乾燥させて、８０ｍｇのＰｌｍ−ＤＢＣＯを定量的収率で得た。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３４Ｈ４６Ｎ２Ｏ２  ｍ／ｚの計算値  ５１４．３６、実測値  ５１５．３（ｍ＋Ｈ）＋。
【０５２７】
化合物５２
【化９１】
2020515629.tif 000096
【０５２８】
Ｍｙｒ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯまたはＣ１４−ＰＥＧ１１−ＤＢＣＯと呼ばれる、化合物５２は、塩化ミリストイル、Ｂｏｃ−Ｐｅｇ１１−アミンおよびＤＢＣＯ−ＮＨＳを出発物質として使用して合成した。１１６．０６ｍｇのＢｏｃ−Ｐｅｇ１１−アミン（０．１８ｍｍｏｌ、１当量）を０．５ｍＬのＤＣＭに溶解した。ＴＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。塩化ミリストイルを添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌで２回、そしてＤＩ水で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。この中間体を０．３５ｍＬのＤＣＭに溶解し、０．１５ｍＬのＴＦＡを添加した。反応混合物を３０分間、室温で撹拌し、次いで、空気を吹付けることにより乾燥させ、高真空下でさらに乾燥させた。１２２．５ｍｇのその油（０．１６２ｍｍｏｌ、１当量）を０．５ｍＬのＤＣＭに溶解した。ＴＥＡ（０．４９ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、溶液を５分間、室温で撹拌した。６５．１９ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．１６２ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を１時間、室温で撹拌した。反応混合物をフラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、１５ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜１５％メタノールのグラジエントを使用して精製した。画分を回収し、乾燥させて、Ｍｙｒ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯを得た。化合物５２のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０５２９】
化合物５３
【化９２】
2020515629.tif 000097
【０５３０】
Ｐｌｍ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯまたはＣ１６−ＰＥＧ１１−ＤＢＣＯと呼ばれる、化合物５３は、塩化パルミトイルを出発物質として使用したことを除き、化合物５２と同じ手順を使用して合成した。Ｐｌｍ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯを、
【０５３１】
フラッシュクロマトグラフィーにより、１５ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜１５％メタノールのグラジエントを使用して、精製した。画分を回収し、乾燥させて、Ｐｌｍ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯを得た。化合物５３のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０５３２】
化合物５４
【化９３】
2020515629.tif 000098
【０５３３】
ＮＨ２−Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物５４は、化合物２６およびＤＢＣＯ−アミンを出発物質として使用して合成した。３０ｍｇの化合物２６（０．０３ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＣＭ中の１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液として調製した。このストック溶液に、８．３４ｍｇのＤＢＣＯ−アミン（０．０３ｍｍｏｌ、１当量）も、ＤＣＭ中の１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液として添加した。反応混合物を１時間、室温で撹拌し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、精製した。使用したグラジエントは、ＤＣＭ中０〜５％メタノールの段階的グラジエント（５ＣＶは保持、１ＣＶは、メタノール濃度を１％ずつ上昇させる）であった。画分を回収し、乾燥させて、ＤＢＣＯ中間体を得た。２６ｍｇのＦｍｏｃ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＤＢＣＯ（０．０２３ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  １ｍＬに溶解し、３０分間、室温で撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＤＩ水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。固体を０．５ｍＬのＤＣＭに溶かし、フラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、精製した。使用したグラジエントは、ＤＣＭ中０〜５％メタノールの段階的グラジエントであった。画分を回収し、乾燥させて、ＮＨ２−Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＤＢＣＯを得た。化合物５４のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０５３４】
化合物５５
【化９４】
2020515629.tif 000099
【０５３５】
ＮＨ２−Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物５５は、化合物２６、Ｂｏｃ−Ｐｅｇ１１−アミン、およびＤＢＣＯ  ＮＨＳを出発物質として使用して合成した。６０ｍｇの化合物２６（０．０６ｍｍｏｌ、１当量）を０．６ｍＬのＤＣＭに溶解した。３８．９ｍｇのＢｏｃ−Ｐｅｇ１１−アミン（０．０６  ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ＤＣＭを真空下で除去し、この油をＤＭＳＯに溶かし、ＤＩ水に添加した。この水を３０００ｇで５分間、遠心分離し、ペレットを回収し、真空下で乾燥させた。このＰＥＧ化中間体を０．３５ｍＬのＤＣＭに溶解し、０．１５ｍＬのＴＦＡを添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、空気でブロー乾燥させ、高真空下でさらに乾燥させた。７１．７６ｍｇのこのＢｏｃ脱保護油（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、ＴＥＡ（０．１ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、その後、２０．３ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を１時間、室温で撹拌した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン  ０．５ｍＬを添加し、反応混合物を３０分間、室温で撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、ｐＨ９．５の炭酸水素ナトリウムで３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。固体を０．５ｍＬのＤＣＭに溶かし、フラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、精製した。使用したグラジエントは、３０ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜１０％メタノールであった。これにより、全収率６．７％で生成物を得た。化合物５５のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０５３６】
化合物５６
【化９５】
2020515629.tif 000100
【０５３７】
Ｃｈｏｌ−ＴＴと呼ばれる化合物５６は、ヘミコハク酸コレステリルおよびＴＴを出発物質として使用して調製した。１００ｍｇのヘミコハク酸コレステリル（０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、２６．９４ｍｇのＴＴ（０．２３ｍｍｏｌ、１．１当量）および５１．２０ｍｇのＥＤＣ（０．２７ｍｍｏｌ、１．３当量）を、１ｍＬのＤＣＭに溶解した。２．５１ｍｇのＤＭＡＰ（０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。１時間後、明黄色反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌで２回、そしてＤＩ水で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、１２０ｍｇの黄色固体を定量的収率で得た。化合物５６のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０５３８】
化合物５７
【化９６】
2020515629.tif 000101
【０５３９】
Ｃｈｏｌ−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物５７は、化合物５６およびＤＢＣＯ−アミンから調製した。１０６．２８ｍｇの化合物５６（０．１８ｍｍｏｌ、１当量）および５０ｍｇのＤＢＣＯ−アミン（０．１８ｍｍｏｌ、１当量）を、０．５ｍＬのＤＣＭに溶解し、室温で撹拌した。１時間の過程にわたり、溶液の明黄色が退色し、ＤＣＭ中でのＴＬＣは、化合物５６の完全非存在を示した。反応混合物をフラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、１２ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜３％メタノールのグラジエントを使用して精製した。画分を回収し、乾燥させて、１３９ｍｇのＣｈｏｌ−ＤＢＣＯを定量的収率で得た。化合物５７のペプチド抗原コンジュゲートについてＭＳ（ＥＳＩ＋）に基づいて生成物の分子量を検証した。
【０５４０】
化合物５８
【化９７】
2020515629.tif 000102
【０５４１】
Ｃｈｏｌ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物５８は、化合物５６、Ｂｏｃ−Ｐｅｇ１１−アミン、およびＤＢＣＯ−ＮＨＳから調製した。５０ｍｇの化合物５６（０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）を０．５ｍＬのＤＣＭに溶解した。６０．３８ｍｇのＢｏｃ−Ｐｅｇ１１−アミン（０．０９ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。１時間の過程にわたり、溶液の明黄色が退色し、ＤＣＭ中でのＴＬＣは、化合物５６の完全非存在を示した。反応混合物に１５０μＬのＴＦＡを添加して、ＤＣＭ中の３０％溶液を製造した。反応混合物を３０分間、室温で撹拌し、次いで、空気を吹付けることにより乾燥させ、高真空下でさらに乾燥させた。８６．２５ｍｇのその油（０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）を０．５ｍＬのＤＣＭに溶解した。ＴＥＡ（０．２６ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、溶液を５分間、室温で撹拌した。３４．２６ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を１時間、室温で撹拌した。反応混合物をフラッシュクロマトグラフィーカラムに注入し、１５ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜１５％メタノールのグラジエントを使用して精製した。画分を回収し、乾燥させて、Ｃｈｏｌ−Ｐｅｇ１１−ＤＢＣＯを得た。
【０５４２】
化合物５９
【化９８】
2020515629.tif 000103
【０５４３】
ＬＡ−ＴＴと呼ばれる化合物５９は、レブリン酸およびＴＴを出発物質として使用して合成した。５００ｍｇのレブリン酸（４．３ｍｍｏｌ、１当量）、５６４．７ｍｇのＴＴ（４．７ｍｍｏｌ、１．１当量）および１．０３２ｇのＥＤＣ（５．４ｍｍｏｌ、１．３当量）を、１０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。５２．６ｍｇのＤＭＡＰ（０．４ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。酢酸エチルでの希釈、１Ｍ  ＨＣｌで２回およびＤＩ水で１回の洗浄により、化合物５９を処理した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で除去した。固体を酢酸エチルから再結晶させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ８Ｈ１１ＮＯ２Ｓ２、ｍ／ｚの計算値  ２１７．０２、実測値  ２１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５４４】
化合物６０
【化９９】
2020515629.tif 000104
【０５４５】
ＬＡ−２ＢＸｙと呼ばれる化合物６０は、化合物５９および化合物２を出発物質として使用して合成した。５０ｍｇの化合物５９（０．２３ｍｍｏｌ、１当量）および８２．６２ｍｇの化合物２（０．２３ｍｍｏｌ、１当量）を、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン中の３５％酢酸エチル）は、両方の出発物質の消失を示した。化合物６０を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって１５〜３０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２７Ｈ３１Ｎ５Ｏ２、ｍ／ｚの計算値  ４５７．２５、実測値  ４５８．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５４６】
化合物６１
【化１００】
2020515629.tif 000105
【０５４７】
ＣＴＡ−ＴＴと呼ばれる化合物６１は、４−シアノ−４−（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸（ＣＴＡ）を出発物質として使用したこと、およびＤＣＭを溶媒として使用したことを除き、化合物５９と同じ手順を使用して合成した。ＤＣＭでの希釈、１Ｍ  ＨＣｌで２回およびＤＩ水で１回の洗浄により、化合物６１を処理した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で除去した。固体を酢酸エチルから再結晶させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１６Ｈ１６Ｎ２ＯＳ４、ｍ／ｚの計算値  ３８０．０１、実測値  ３８１．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５４８】
化合物６２
【化１０１】
2020515629.tif 000106
【０５４９】
ＣＴＡ−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物６２は、「ＣＴＡ−ＮＨＳ」（４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＤＢＣＯ−アミン（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）から合成した。２１０ｍｇのＣＴＡ−ＮＨＳ（０．５６ｍｍｏｌ、１当量）および１６７．８ｍｇのＤＢＣＯ−アミン（０．６１ｍｍｏｌ、１．１当量）を、２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、室温で２時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌで２回、そしてＤＩ水で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。化合物６２を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、３０×１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって５０〜７０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３１Ｈ２７Ｎ３Ｏ２Ｓ２  ｍ／ｚの計算値  ５３７．７  実測値  ５３８．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５５０】
化合物６３
【化１０２】
2020515629.tif 000107
【０５５１】
ＣＴＡ−２ＢＸＹと呼ばれる化合物６３は、化合物６１および化合物２を出発物質として使用したことを除き、化合物６０と同じ手順を使用して合成した。
化合物６３を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１２分にわたって４０〜５０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３５Ｈ３６Ｎ６ＯＳ２  ｍ／ｚの計算値  ６２０．８３、実測値  ６２１．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５５２】
化合物６４
【化１０３】
2020515629.tif 000108
【０５５３】
ＡＣＶＡ−ＴＴと呼ばれる化合物６６は、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）を出発物質として使用したこと、および活性部位の倍増を反映するようにＴＴ、ＥＤＣおよびＤＭＡＰの当量を倍増させたことを除き、化合物５９と同じ手順を使用して合成した。酢酸エチルでの希釈、１Ｍ  ＨＣｌで２回およびＤＩ水で１回の洗浄により、化合物６６を処理した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で除去した。固体をＤＣＭ：エーテルから再結晶させた。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１８Ｈ２２Ｎ６Ｏ２Ｓ４、ｍ／ｚの計算値  ４８２．６５、実測値  ４８３．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５５４】
化合物６５
【化１０４】
2020515629.tif 000109
【０５５５】
ＡＣＶＡ−２ＢＸｙと呼ばれる化合物６５は、化合物６４を出発物質として使用したこと、および活性部位の倍増を反映するように化合物２の当量を倍増させたことを除き、化合物６０と同じ手順を使用して合成した。化合物６５を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、５０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２８〜４８％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ５６Ｈ６２Ｎ１４Ｏ２  ｍ／ｚの計算値  ９６３．２１、実測値  ４８２．４（Ｍ／２）＋。
【０５５６】
化合物６６
【化１０５】
2020515629.tif 000110
【０５５７】
ＡＣＶＡ−ＤＢＣＯと呼ばれる化合物６６は、化合物６４およびＤＢＣＯ−アミン（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）を出発物質として使用したことを除き、化合物６０と同じ手順を使用して合成した。化合物６６を、フラッシュクロマトグラフィーにより、１５ＣＶにわたってＤＣＭ中０〜３％メタノールのグラジエントを使用して、精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ４８Ｈ４４Ｎ８Ｏ４  ｍ／ｚの計算値  ７９６．９３、実測値  ７９７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５５８】
化合物６７
【化１０６】
2020515629.tif 000111
【０５５９】
Ａｚｐ−２ＢＸＹと呼ばれる化合物６７は、５−アジド−ペンタン酸（Ａｚｐ）および化合物２から合成した。１６．２ｍｇのＡｚｐ（０．１１４ｍｍｏｌ、１．１当量）、１２．３ｍｇのＴＴ（０．１０３ｍｍｏｌ、１当量）および２７．２ｍｇのＥＤＣ（０．１４２ｍｍｏｌ、１．３当量）を、０．５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。１．４ｍｇのＤＭＡＰを添加し、反応混合物を２時間、室温で撹拌した。３７．０９ｍｇの化合物２（０．１０３ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を１時間、室温で撹拌した。化合物６７を、分取ＨＰＬＣシステムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８カラム、３０ｘ１００ｍｍ、５μｍで、１０分にわたって２２〜４２％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２７Ｈ３２Ｎ８Ｏ  ｍ／ｚの計算値  ４８４．２７、実測値  ４８５．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５６０】
化合物６８
【化１０７】
2020515629.tif 000112
【０５６１】
（ＨＰＭＡ−２Ｂ）−ｂ−（ＨＰＭＡ）−ＤＢＣＯまたはｐ｛［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯとも呼ばれる、化合物６８。以前に記載されたように調製した前駆体ＨＰＭＡおよびＭＡ−ｂ−Ａｌａ−ＴＴ（参照：Ｌｙｎｎ  ＧＭら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻（１１号）：１２０１〜１２１０頁、２０１５年）、ならびに２−シアノ−２−プロピルベンゾジチオエート（「ＣＴＡ−ＡＢＩＮ」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、アゾビスイソブチロニトリル（「ＡＩＢＮ」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、化合物１および化合物６６を使用して、２合成ステップでのＲＡＦＴ重合によって、ミセル形成性ジブロックコポリマー（Ａ−Ｂ型）を生成した。ＣＴＡ−ＡＩＢＮを連鎖移動剤としておよびＡＩＢＮを開始剤として使用して、７０℃で１６時間、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール／ＤＭＳＯ混合物中で、ＨＰＭＡをＭＡ−ｂ−Ａｌａ−ＴＴと共重合させることにより、疎水性ブロックＡを調製した。その後、疎水性ブロックＢを、ＡＩＢＮの存在下、７０℃でさらに１６時間、ＲＡＦＴメカニズムによりＨＰＭＡを付加させることによる連鎖延長重合に付した。Ａ−Ｂジブロックコポリマー、ｐ｛［ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−ＴＴ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＴＢを、沈殿により単離して、緑色の固体を得た。８０℃で２時間、ＤＭＳＯ中での化合物６６との反応、続いて化合物１の付加により、コポリマーの一端のＤＴＢ基を置き換えた。生成物を沈殿させ、次いで、ＬＨ−２０により精製して化合物６８を得、次いで、この化合物６８をペプチド抗原との反応に使用して、異なるタイプのペプチド抗原コンジュゲート、例えば、下で十分に説明するｐ｛［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（ペプチド抗原）を得た。
【０５６２】
化合物６９
【化１０８】
2020515629.tif 000113
【０５６３】
（ＨＰＭＡ−ＮＨＮＨ−２ＢＸｙ）−ｂ−（ＨＰＭＡ）−ＤＢＣＯまたはｐ｛［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−Ａｃａｐ−ＮＨＮ＝ＣＨ−２ＢＸｙ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯとも呼ばれる、化合物６９。以前に記載されたように調製した前駆体ＨＰＭＡおよびＭＡ−Ａｃａｐ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ（参照：Ｌｙｎｎ  ＧＭら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻（１１号）：１２０１〜１２１０頁、２０１５年）、ならびに２−シアノ−２−プロピルベンゾジチオエート（「ＣＴＡ−ＡＢＩＮ」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、アゾビスイソブチロニトリル（「ＡＩＢＮ」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、化合物６０および化合物６６を使用して、２合成ステップでのＲＡＦＴ重合によって、ミセル形成性ジブロックコポリマー（Ａ−Ｂ型）を生成した。ＣＴＡ−ＡＩＢＮを連鎖移動剤としておよびＡＩＢＮを開始剤として使用して、７０℃で１６時間、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール／ＤＭＳＯ混合物中で、ＨＰＭＡをＭＡ−Ａｃａｐ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃと共重合させることにより、疎水性ブロックＡを調製した。その後、疎水性ブロックＢを、ＡＩＢＮの存在下、７０℃でさらに１６時間、ＲＡＦＴメカニズムによりＨＰＭＡを付加させることによる連鎖延長重合に付した。Ａ−Ｂジブロックコポリマー、ｐ  ｐ｛［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−Ａｃａｐ−ＮＨＮ＝ＣＨ−２ＢＸｙ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＴＢを、沈殿により単離し、次いで、３０％トリフルオロ酢酸ＴＦＡ／ＤＣＭ中でＢｏｃ脱保護を行った。ＴＦＡ／ＤＣＭを真空下で除去し、次いで、８０℃で２時間、ＤＭＳＯ中での化合物６６との反応、続いて化合物６０の付加により、コポリマーの一端のＤＴＢ基を置き換えた。生成物を沈殿させ、次いで、ＬＨ−２０により精製して化合物６９を得、次いで、この化合物６９をペプチド抗原との反応に使用して、異なるタイプのペプチド抗原コンジュゲート、例えば、下で十分に説明するｐ｛［（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（ペプチド抗原）を得た。
【０５６４】
化合物７０
【化１０９】
2020515629.tif 000114
【０５６５】
（ＤＥＧＭＡ−２Ｂ）−ｂ−（ＨＰＭＡ）−ＤＢＣＯまたはｐ｛［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯとも呼ばれる、化合物７０。以前に記載されたように調製した前駆体ＤＥＧＭＡ、ＨＰＭＡおよびＭＡ−ｂ−Ａｌａ−ＴＴ（参照：Ｌｙｎｎ  ＧＭら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻（１１号）：１２０１〜１２１０頁、２０１５年）、ならびに２−シアノ−２−プロピルベンゾジチオエート（「ＣＴＡ−ＡＢＩＮ」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、アゾビスイソブチロニトリル（「ＡＩＢＮ」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、化合物１および化合物６６を使用して、２合成ステップでのＲＡＦＴ重合によって、温度応答性ミセル形成性ジブロックコポリマー（Ａ−Ｂ型）を生成した。ＣＴＡ−ＡＩＢＮを連鎖移動剤としておよびＡＩＢＮを開始剤として使用して、７０℃で１６時間、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール／ＤＭＳＯ混合物中で、ＤＥＧＭＡをＭＡ−ｂ−Ａｌａ−ＴＴと共重合させることにより、温度応答性疎水性ブロックＡを調製した。その後、疎水性ブロックＢを、ＡＩＢＮの存在下、７０℃でさらに１６時間、ＲＡＦＴメカニズムによりＨＰＭＡを付加させることによる連鎖延長重合に付した。Ａ−Ｂジブロックコポリマー、ｐ｛［ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＴＢを、沈殿により単離して緑色の固体を得た。８０℃で２時間、ＤＭＳＯ中での化合物６６との反応、続いて化合物１の付加により、コポリマーの一端のＤＴＢ基を置き換えた。生成物を沈殿させ、次いで、ＬＨ−２０により精製して化合物７０を得、次いで、この化合物７０をペプチド抗原との反応に使用して、異なるタイプのペプチド抗原コンジュゲート、例えば、下で十分に説明するｐ｛［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２Ｂ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（ペプチド抗原）を得た。
【０５６６】
化合物７１
【化１１０】
2020515629.tif 000115
【０５６７】
（ＤＥＧＭＡ−２ＢＸｙ）−ｂ−（ＨＰＭＡ）−ＤＢＣＯまたはｐ｛［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２ＢＸｙ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯとも呼ばれる、化合物７１は、化合物２をリガンドとして使用したことを除き、化合物７０と同じ手順を使用して調製した。生成物を沈殿させ、次いで、ＬＨ−２０により精製して化合物６９を得、次いで、この化合物６８をペプチド抗原との反応に使用して、異なるタイプのペプチド抗原コンジュゲート、例えば、下で十分に説明するｐ｛［（ＤＥＧＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−ｂ−Ａｌａ−２ＢＸｙ）］−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）｝−ＤＢＣＯ−（ペプチド抗原）を得た。
【０５６８】
化合物７２
【化１１１】
2020515629.tif 000116
【０５６９】
２ＢＸｙ−ＤＥＧＭＡ−ｂ−ＨＰＭＡ−ＤＢＣＯとも呼ばれる化合物７２。前駆体ＤＥＧＭＡ、ＨＰＭＡ、化合物６３、化合物６５および化合物６６を使用して２合成ステップでＲＡＦＴ重合によりミセル形成性ジブロックコポリマー（Ａ−Ｂ型）を生成した。化合物６３を連鎖移動剤としておよび化合物６５を開始剤として使用して、７０℃で１６時間、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール／ＤＭＳＯ混合物中で、ＤＥＧＭＡを共重合させることにより、疎水性ブロックＡを調製した。その後、疎水性ブロックＢを、ＡＩＢＮの存在下、７０℃でさらに１６時間、ＲＡＦＴメカニズムによりＨＰＭＡを付加させることによる連鎖延長重合に付した。Ａ−Ｂジブロックコポリマー、２ＢＸｙ−［ｐ（ＤＥＧＭＡ）−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）］−ＤＴＢを、沈殿により単離し、８０℃で２時間、ＤＭＳＯ中での化合物６６との反応により、コポリマーの一端のＤＴＢ基を置き換えた。生成物を沈殿させ、次いで、ＬＨ−２０により精製して化合物７２を得、次いで、この化合物７２をペプチド抗原との反応に使用して、異なるタイプのペプチド抗原コンジュゲート、例えば、下で十分に説明する２ＢＸｙ−ｐ［（ＤＥＧＭＡ）−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡ）］−ＤＢＣＯ−（ペプチド抗原）を得た。
【０５７０】
（実施例２：ペプチド抗原コンジュゲートを生成するためのペプチド抗原断片と疎水性分子（Ｈ）の反応）
ペプチド抗原（Ａ）、必要に応じた荷電分子（Ｃ）、必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）およびリンカー前駆体Ｘ１から構成されるペプチド抗原断片、例えば、［Ｃ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｘ１（式中、［  ］は、この例では、その基が必要に応じたものであることを示す）を、疎水性分子（Ｈ）と連結されているＸ２、例えばＸ２−Ｈ、と反応させて、ペプチド抗原コンジュゲート、例えば、［Ｃ］−［Ｂ１］−Ａ−［Ｂ２］−Ｌ−Ｈを得ることができる。ペプチド抗原断片が、アジド、例えば、Ｋ’と呼ばれることもあるアジド−リシン（Ｌｙｓ（Ｎ３））、を含むリンカー前駆体Ｘ１を含む場合、ペプチド抗原断片を、疎水性分子（Ｈ）に連結されている、ＤＢＣＯなどのアルキンを含むリンカー前駆体Ｘ２と反応させて、トリアゾールリンカー（Ｌ）を形成することができる。非限定的な例として、化合物３〜５は、式ＩＩＩのアジュバント（すなわち、ＴＬＲ−７／８ａ）にさらに連結される、ＤＢＣＯリンカー前駆体Ｘ２を有する式Ｉの疎水性分子（Ｈ）の例であり、化合物６〜１１は、式ＩＩＩのアジュバント（すなわち、ＴＬＲ−７／８ａ）にさらに連結される、ＤＢＣＯリンカー前駆体Ｘ２を有する式Ｉの疎水性分子（Ｈ）の例であり、化合物１０〜１１は、ＤＢＣＯリンカー前駆体Ｘ２を有する式ＩＩの疎水性分子（Ｈ）の例であるが、アジュバント特性を有するリガンドを含有しない。
【０５７１】
図２に示す非限定的な例は、アジド含有リンカー前駆体Ｘ１を含むペプチド抗原断片と１．１対１のモル比で反応させる、ＤＢＣＯを含むリンカー前駆体Ｘ２に連結されている疎水性分子（Ｈ）の反応である。ＨＰＬＣクロマトグラムに示されているように、疎水性分子（Ｈ）上のＤＢＣＯは、アジドを含むリンカー前駆体Ｘ１と反応し、その結果、荷電分子（Ｃ）に連結されているＢ１伸長部に連結されているペプチド抗原（Ａ）に連結しているＢ２伸長部に連結されるトリアゾールリンカー（Ｌ）が得られ、それによって、ペプチド抗原（Ａ）と疎水性分子（Ｈ）を結合させて、ペプチド抗原コンジュゲートを得る。アジド含有ペプチド抗原断片とＤＢＣＯ含有疎水性分子（Ｈ）の反応により形成される異なるペプチド抗原コンジュゲートの何百もの例を、至る所に記載する。アジドとＤＢＣＯの反応は、確実であり、生成されるペプチド抗原コンジュゲートの全てにわたって一貫しているので、コンジュゲートを形成するために使用する反応およびそれらの特徴付けについての完全な説明を提供しない。注記：付加環化から生じるペプチド抗原コンジュゲートの分子量は、出発物質の質量の合計である。
【０５７２】
ペプチド抗原断片が、チオール、例えば、Ｃと呼ばれることもあるシステイン（Ｃｙｓ）、を含むリンカー前駆体Ｘ１を含む場合、ペプチド抗原断片を、マレイミドを含むリンカー前駆体Ｘ２を有する疎水性分子（Ｈ）、例えば化合物２１、と反応させることができ、その結果、チオール−エーテルベースのリンカー（Ｌ）が得られる。ペプチド抗原断片が、アミン、例えば、Ｋと呼ばれることもあるリシン（Ｌｙｓ）、を含むリンカー前駆体Ｘ１を含む場合、ペプチド抗原断片を、ＮＨＳなどの活性化エステルを含むリンカー前駆体Ｘ２を有する疎水性分子（Ｈ）、例えば化合物２２、と反応させ、その結果、アミド結合を形成することができる。
【０５７３】
（実施例３：式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートの合成および生物学的特徴付け）
以前の研究により、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導する手段としての、様々なワクチンアジュバントと組み合わせた約２０〜４０アミノ酸合成「長鎖」ペプチド（ＳＬＰまたはＬＰ）としてのＴ細胞エピトープの送達が報告されている。しかし、ペプチドの長さおよび流体力学的挙動の、ならびにペプチドと免疫刺激剤、例えばＴＬＲａ、の共送達の、免疫原性に対する影響は、適切に研究されていない。ペプチドベースの抗原の種々のパラメーターがＴ細胞免疫にどのような影響を及ぼすのかについてのより大きな洞察を与えるために、本発明者らは、本明細書に記載の式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートの種々の性質がｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答にどのような影響を及ぼすのかを系統的に評価した。
【０５７４】
ＣＤ８  Ｔ細胞応答に対するペプチド抗原の流体力学的挙動、ペプチド抗原（Ａ）長およびＴＬＲ−７／８ａの共送達の影響
本開示のペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチド抗原（Ａ）の長さが、免疫原性、特に、生成されるＣＤ８および／またはＣＤ４  Ｔ細胞応答の規模および質にどのような影響を及ぼすのかは、事前には不明であった。
【０５７５】
ペプチド抗原（Ａ）長が式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートの免疫原性にどのような影響を及ぼすのかを系統的に調査するために、マウス腫瘍モデルであるＭＣ３８に由来する２つのモデルネオ抗原ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ、ＩｒｇｑおよびＣｐｎｅ１、を、ペプチド抗原（Ａ）が２６アミノ酸合成長鎖ペプチド（ＳＬＰもしくは「ＬＰ」）または１０アミノ酸最小エピトープ（ＭＥもしくは「Ｍｉｎ」）のどちらかである、ペプチド抗原コンジュゲートとして生成した（図４）。図４で概要を述べる式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートを生成するために、ＳＬＰベースのペプチド抗原（Ａ）は、そのＣ末端をリンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に連結させ、これをリンカー前駆体Ｘ２であるＤＢＣＯに連結させ、これを疎水性分子（Ｈ）のＮ末端に連結させた一方で、最小エピトープペプチド抗原（Ａ）は、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）に連結させ、これをリンカー前駆体Ｘ２であるＤＢＣＯに連結させ、これを疎水性分子（Ｈ）のＮ末端に連結させた。
【０５７６】
ペプチド抗原コンジュゲートの合成についての一般スキームは、反応性アジドを有する１．０当量のペプチド抗原断片と、１．２当量のＤＢＣＯ含有疎水性分子（Ｈ）とを、ＤＭＳＯ中、室温で反応させることであった。反応は、２４時間後に完了し、さらなる精製を必要としなかった。
【０５７７】
本発明者らは、先ず、ペプチド抗原（Ａ）およびペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動を評価した（図４）。注目すべきこととして、ＩｒｇｑとＣｐｎｅ１の両方の、最小エピトープ（Ｍｉｎ）およびＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）は、最大０．１ｍｇ／ｍＬに至るまで水溶性であることが判明したが、２つの疎水性分子（Ｈ）、Ｗ３または２ＢＸｙ３、のどちらかへのペプチド抗原（Ａ）の結合によって、結果として生じたペプチド抗原コンジュゲートは、Ｗ３に結合されているＣｐｎｅ１のＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを除き、粒子を形成することになった。これらの結果は、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートが、水溶性ペプチドの粒子形成を誘導すること、および疎水性分子（Ｈ）の長さの増加、またはより疎水性の高いモノマー（例えば、トリプトファンに対してＧｌｕ（２ＢＸｙ））の使用が、粒子形成の確実性を向上させることを示す。
【０５７８】
したがって、式Ｉの疎水性分子（Ｈ）は、式ＩＩＩのアジュバントに連結されている５つまたはそれより多くのモノマー単位から構成された場合には、試験したペプチド抗原コンジュゲートの大部分が粒子を形成したが、５つ未満のモノマー単位、例えば、１つまたは３つのモノマー単位を有する式ＩまたはＩＩの疎水性分子（Ｈ）は、粒子形成を誘導する確実性が低いことが、予想外に判明した。これらのデータに基づいて、ペプチド抗原コンジュゲートに使用する疎水性分子（Ｈ）の好ましい実施形態は、高親水性および／または荷電ペプチド抗原（Ａ）の粒子を確実に形成するために、５つまたはそれより多くのモノマー単位から構成される。しかし、一部の実施形態では、疎水性分子（Ｈ）は、３つまたはそれより多くのモノマー単位、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０またはそれより多くのモノマー単位、通常は、最大約３００モノマー単位の長さでありうる。
【０５７９】
本発明者らは、次に、ペプチド抗原コンジュゲートの流体力学的挙動、ならびにペプチド抗原（Ａ）長、およびペプチド抗原コンジュゲートを構成するＴＬＲ−７／８ａアジュバントの共送達が、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性にどのような影響を及ぼすのかを評価した。２６アミノ酸長鎖ペプチド（ＬＰ）または１０アミノ酸最小エピトープ（Ｍｉｎ）から構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを、２ＢＸｙと呼ばれる化合物２である小分子ＴＬＲ−７／８ａと混合したか；疎水性分子（Ｈ）であるＷ３に連結させ、２ＢＸｙと混合したか；またはペプチド抗原（Ａ）を、粒子を形成してＴＬＲ−７／８ａアジュバントとともにペプチド抗原（Ａ）を確実に共送達する疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ３に、連結させた（図４〜６を参照されたい）。疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ３に連結された最小エピトープから構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを用いて免疫化したマウスは、単回免疫化後に最大規模のＣＤ８  Ｔ細胞応答（全体に対して＞１％ＩＦＮｇ＋ＣＤ８  Ｔ細胞）を提供した。これは、粒子形式での最小エピトープとＴＬＲ−７／８ａの共送達が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起するための効率的アプローチであることを示す。注目すべきこととして、ＴＬＲ−７／８ａと混合した可溶性最小エピトープおよび可溶性ＬＰは、未処置群と比較して統計的に有意でない最低のＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した。これは、可溶性形態のペプチド抗原（Ａ）が、免疫原性が最低であることを示す（図５および６）。最後に、疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ３に連結されたＩｒｇｑの最小エピトープまたはＩｒｇｑのＬＰどちらかから構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートは、同等の規模のＣＤ８  Ｔ細胞応答を提供したが、最小エピトープＣｐｎｅ１から構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートは、ＬＰとしてＣｐｎｅ１を送達するペプチド抗原コンジュゲートと比較してほぼ１０倍高いＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した。
【０５８０】
式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートに対するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞免疫を促進するための免疫原性に対するペプチド抗原（Ａ）長の役割をさらに調査するために、マウス腫瘍モデルであるＢ１６に由来する７つの予測最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（すなわち、予測ネオ抗原）を、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートを構成するペプチド抗原（Ａ）（図７を参照されたい）としての、２７アミノ酸合成長鎖ペプチド（ＬＰ）または１０アミノ酸最小エピトープ（ＭＥもしくはＭｉｎと呼ばれる）のどちらかとして送達した。図７で概要を述べる式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートを生成するために、ＬＰベースのペプチド抗原（Ａ）は、そのＣ末端を、リンカー前駆体Ｘ１であるアジド−リシン（Ｋ’）に直接連結させ、これをリンカー前駆体Ｘ２であるＤＢＣＯに連結させ、これを疎水性分子（Ｈ）のＮ末端に連結させた一方で、最小エピトープペプチド抗原（Ａ）は、Ｃ末端伸長部（Ｂ２）に連結させ、これをリンカー前駆体Ｘ２であるＤＢＣＯに連結させ、これを疎水性分子（Ｈ）のＮ末端に連結させた。ペプチド抗原（Ａ）を、２ＢＸｙ５または２Ｂ５どちらかの疎水性分子（Ｈ）に連結させて、ペプチド抗原コンジュゲートを形成した。構造的に類似しているが、ＴＬＲ−７に対する作用強度の点で異なる、２ＢＸｙ５と２Ｂ５を比較することにより、炎症が免疫原性にどのような影響を及ぼすのかを評価することができた。最小エピトープ（Ｍｉｎ）、ＬＰのどちらか、または最小エピトープとＬＰの両方としてペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートから構成される免疫原性組成物を用いて、マウスに免疫化した。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の規模を、２回の免疫化の２週間後に評価した（図８）。
【０５８１】
顕著な予想外の発見は、最小エピトープ（「Ｍｉｎ」）を含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを施したマウスが、最大規模のＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導したのに対して、ＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートは、より低レベルのＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導したことである。この傾向は、疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ５と２Ｂ５の両方について明らかであった。それ故、疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ５に連結されたＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートについて、ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、約０．３５％であり、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は、約０．２５％であった（図８）。対照的に、疎水性分子である２ＢＸｙ５に連結された最小エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを施したマウス群については、ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、約１．９％であり、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は、約０．１％であり、ＬＰを送達するペプチド抗原コンジュゲートに対してＣＤ８  Ｔ細胞応答の約６倍増加を提供したが、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は検出不能であった。最小エピトープとＬＰの両方（「ＬＰ＋ｍｉｎ」）を含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを施したマウス群では、ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、約０．６％であり、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は、約０．５％であり、ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞両方の均衡をもたらした（図８）。
【０５８２】
同様の傾向が、２ＢＸｙを含む疎水性分子（Ｈ）である２ＢＸｙ５と比較して作用強度の低いＴＬＲ−７／８アゴニストである２Ｂを含む２Ｂ５疎水性分子（Ｈ）を使用するペプチド抗原コンジュゲートについて、観察された。それ故、２Ｂ５疎水性分子（Ｈ）とＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）とを含むペプチド抗原コンジュゲートを施した群では、約１．０％にＣＤ８  Ｔ細胞応答が検出され、約０．７５％にＣＤ４  Ｔ細胞応答が検出されたのに対して、Ｍｉｎを単独で含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを施した群では、約４．５％にＣＤ８  Ｔ細胞応答および約０．１％にＣＤ４  Ｔ細胞応答があり、ＣＤ８  Ｔ細胞応答においてほぼ４倍の増加があったが、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は検出不能であった。疎水性分子（Ｈ）２Ｂ５に連結された最小エピトープおよびＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを含むワクチンを施した群では、ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、約２．２％であり、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は、約０．９５％であった（図８）。
【０５８３】
まとめると、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートのペプチド抗原（Ａ）としてのＭＥ（または「Ｍｉｎ」）の使用は、ＬＰを含むペプチド抗原（Ａ）と比較してＣＤ８  Ｔ細胞応答の予想外の著しい増加をもたらした。しかし、これは、ＣＤ４  Ｔ細胞応答の低減ももたらした。重要なこととして、マウスに投与した免疫原性組成物への、ペプチド抗原（Ａ）としてＬＰおよびＭｉｎを送達するペプチド抗原コンジュゲートの組入れは、単独でのＬＰから構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートと比較して、ＣＤ４  Ｔ細胞応答の回復および予想以上に高いＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらした。もう１つの肝要な発見は、炎症の量が、免疫原性に著しい影響を及すことであった。２Ｂ５である疎水性分子（Ｈ）は、２ＢＸｙ５である疎水性分子（Ｈ）を用いて送達される２ＢＸｙである化合物２の作用強度のほぼ１０分の１である、化合物１であるＴＬＲ−７／８ａを含有する。したがって、２Ｂ５である疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートに対するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の、２ＢＸｙ５を使用するものと比較して、ほぼ３倍〜４倍の増加は、アジュバント作用強度の調節によって炎症の量を加減することが、本開示のペプチド抗原コンジュゲートの最適な免疫原性レベルを達成するために好ましい可能性があることを示唆する。実際、ＭＣ３８マウス腫瘍細胞株に由来する４０の異なるペプチドベースのネオ抗原の免疫原性のスクリーニングにおいて、２Ｂ５である疎水性分子（Ｈ）に連結された最小エピトープから構成されるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートに基づく個別化がんワクチンは、２ＢＸｙ５である疎水性分子（Ｈ）に連結された最小エピトープから構成されるペプチド抗原コンジュゲートと比較して、達成されるＣＤ８  Ｔ細胞応答の幅において６倍の向上をもたらした（図９）。
【０５８４】
さらなる予想外の発見は、複数の異なるＴ細胞エピトープをペプチド抗原コンジュゲートとして投与する最適な手段の同定を模索する研究に関連した。以前の研究は、同じＭＨＣ分子に結合する複数のＴ細胞エピトープの同じ部位への投与が、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子との結合について競合しうること、およびこのことが、結果として、Ｔ細胞への提示についての競合を生じさせることになる場合があり、それによって、一緒に送達されるエピトープに対するＴ細胞応答の規模が、免疫化部位ごとに単一のエピトープとして単独で送達されるエピトープと比較して低下することになることを示唆した。本発明者らは、単一エピトープを含むペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物のマウスへの投与が、１部位または４部位どちらかへの、すべてが同じＭＨＣ分子に結合する異なるエピトープを含む３つの異なるペプチド抗原コンジュゲートでの同じエピトープの併用投与と比較して、そのエピトープに対してより大規模なＴ細胞応答を生じさせる結果となったことを観察した（図１０）が、予想外の発見は、同じ動物における４箇所の別個の部位へのこれら４つの同じエピトープ（すなわち、１部位あたりに１つの特有エピトープ）の送達が、４つのエピトープすべてを一緒に４部位へ送達することより低い応答をもたらしたことであった（図１０）。これは、予想外であり、複数部位に複数のエピトープを一緒に送達するよりも、エピトープ間の競合を回避するために、複数のエピトープを異なる部位に投与することがよいことを示唆する現行のパラダイムと矛盾した。これらのデータは、各エピトープを投与する部位数の最大化に基づいて複数の異なるエピトープを送達するための新たなパラダイムを示唆する。それ故、免疫応答を誘導する好ましい方法では、免疫応答を最大にするために、複数の異なるペプチド抗原（Ａ）を含む免疫原性組成物を複数の部位に投与する。
【０５８５】
（実施例３：式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート）
前のデータは、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートのパラメーターが免疫原性にどのような影響を及ぼすのかを実証する。これらのデータは、粒子でのペプチド抗原（Ａ）とＴＬＲ−７／８ａを確実に共送達するペプチド抗原コンジュゲートが、ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を誘導するための好ましい実施形態であることを示す。式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートの制約は、このアプローチにより形成される粒子が、疎水性分子（Ｈ）に連結されたペプチド抗原（Ａ）の組成の可変性のためにサイズおよび安定性が変わりやすいことである。ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させる１つの可能な手段は、水性媒体中で粒子凝集を防止してペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子を安定させる表面電荷を導入することによる手段である。
【０５８６】
疎水性分子（Ｈ）に連結されているペプチド抗原（Ａ）に荷電分子（Ｃ）を付加させることにより、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートによる規定のサイズの安定した粒子の形成が可能になる（図１１）。しかし、ペプチド抗原（Ａ）に直接隣接させて荷電分子（Ｃ）および／または疎水性分子（Ｈ）を直接コンジュゲーションさせることは、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩに関連して最小エピトープの提示を可能にするＡＰＣのプロセシングおよび提示機序への干渉を引き起こしうる。したがって、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを使用して送達される最小エピトープ（Ｍｉｎ）またはＬＰに基づくペプチド抗原（Ａ）の効率的プロセシングを確実にするために、本発明者らは、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端に荷電分子（Ｃ）および疎水性分子（Ｈ）をそれぞれ連結させる酵素分解性伸長部（Ｂ１およびＢ２）の使用を評価した（図１１）。
【０５８７】
式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートからの最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープのプロセシングに対する伸長部（Ｂ１およびＢ２）の影響を評価するために、本発明者らは、一連のペプチドを合成し、リンカー前駆体Ｘ１（Ｌｙｓ（Ｎ３））にＣ末端における必要に応じた伸長部（Ｂ２）に連結された最小エピトープ、Ｃｐｎｅ１、のＮ末端における必要に応じた伸長部（Ｂ１）に荷電分子（Ｃ）を連結させ、荷電分子（Ｃ）および伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）が、Ｃｐｎｅ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化するためのペプチド抗原（Ａ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用強度にどのような影響を及ぼすのかを評価した。図１２に示すように、最小エピトープのＮ末端およびＣ末端のどちらかまたは両方（Ｂ１および／またはＢ）において、カテプシン切断性伸長部、または組み合わせたカテプシン切断性・免疫プロテアソーム伸長部を使用して、ペプチド配列を調製した。伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）に連結されたこれらのペプチド抗原（Ａ）配列を異なる濃度で脾細胞培養物に添加して、これらの異なる構築物が、最小エピトープであるＣｐｎｅ１のＡＰＣによる取込みおよび提示を促進する効率を評価した。
【０５８８】
予想通り、プロセシングを必要とせず、ＭＨＣ−Ｉに関連して直接負荷され、ＡＰＣに提示されうる、最小エピトープ（黒塗りの四角、図１２）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、最も効率が高く、最高の作用強度（最低ＥＣ５０）を提供した。しかし、分解性伸長部（Ｂ１）を使用しない最小エピトープ（黒塗りの菱形）のＮ末端に荷電分子（Ｃ）（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ  配列番号７１）を直接付加させると、単独で使用した最小エピトープと比較して、作用強度がほぼ１０，０００分の１に低下した。注目すべきこととして、最小エピトープの活性は、荷電分子（Ｃ）と最小エピトープの間に酵素分解性テトラペプチド伸長部（Ｂ１）（すなわち、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号７）を単に配置することにより回復した（六角形、図１２）。Ｃ末端への追加のカテプシン切断性伸長部（Ｂ２）（すなわち、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号７）の配置、またはＮ末端（Ｂ１）（Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  配列番号７２）もしくはＣ末端（Ｂ２）（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  配列番号１３）における免疫プロテアソーム分解性配列とカテプシン切断性伸長部の併用が、作用強度に及ぼす追加の影響は、荷電分子（Ｃ）と最小エピトープペプチド抗原（Ａ）間での単一テトラペプチド伸長部（Ｂ１）の使用と比較して最小限のものであった。
【０５８９】
次の研究は、疎水性分子（Ｈ）が２ＢＸｙ３である、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原交差提示の効率に対する酵素分解性伸長部（Ｂ１およびＢ２）の影響の評価を模索した。
【０５９０】
式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの合成についての一般スキームは、反応性アジドを有する１．０当量のペプチド抗原と、１．２当量のＤＢＣＯ含有疎水性分子（Ｈ）とを、ＤＭＳＯ中、室温で反応させることであった。反応は、２４時間後に完了し、さらなる精製を必要としなかった。
【０５９１】
図１３に示すように、Ｃｐｎｅ１である最小エピトープのＮ末端およびＣ末端（Ｂ１およびＢ２）において酵素切断性伸長部の異なる組み合わせを使用して、異なる荷電分子（Ｃ）（例えば、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ  配列番号７３、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ  配列番号７４およびＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ  配列番号７１）を有するペプチド抗原コンジュゲートを合成した。図１３で報告する異なる免疫原性組成物を０および１４日目に用いてマウスにワクチン接種し、Ｔ細胞応答を１０日目（図１４Ａ）および２８日目（図１４Ｂ）に全血から評価した。図１２からのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータと一致して、Ｂ１伸長部を使用しない最小エピトープのＮ末端への３つの荷電分子（Ｃ）のいずれかの配置は、単回免疫化でプライミングした動物の全血における応答の評価後、ＣＤ８  Ｔ細胞応答の完全消失（全ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対して約０．１％ＩＦＮ−γ＋）をもたらした（図１４）。しかし、荷電分子（Ｃ）と最小エピトープから構成されるペプチド抗原（Ａ）のＮ末端との間へのカテプシン切断性伸長部（Ｂ１）の配置は、正荷電分子（Ｃ）（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ  配列番号７３）を使用してペプチド抗原コンジュゲートのＣＤ８  Ｔ細胞応答においてほぼ１０倍の増加、およびＥＳおよびＥＫ荷電分子（Ｃ）を用いてペプチド抗原コンジュゲートに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答の小規模な向上をもたらした（図１４）。正荷電分子（Ｃ）（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ  配列番号７３）を含むペプチド抗原コンジュゲートを用いてワクチン接種した群の中で、Ｎ末端およびＣ末端カテプシン切断性伸長部（Ｂ１およびＢ２）両方の付加は、単回免疫化後に約３．５％のＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらしたが、カテプシン切断性配列に加えてのＢ１および／またはＢ２への免疫プロテアソーム配列の付加は、ＣＤ８  Ｔ細胞応答の規模においてさらなる増加をほんのわずかしかもたらさなかった（図１４）。３セットの荷電分子（Ｃ）すべてを使用するペプチド抗原コンジュゲートについての２回の免疫化後のデータの傾向は一致しており、荷電分子（Ｃ）と疎水性分子（Ｈ）の間へのＮ末端およびＣ末端カテプシン切断性伸長部（Ｂ１およびＢ２）それぞれの組入れは、一般に、最大規模の応答をもたらしたが、免疫プロテアソームリンカーの追加による応答の向上は、ほとんどまたは全くなかった。
【０５９２】
これらのデータは、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートのペプチド抗原のＮ末端に配置されるカテプシン切断性ペプチド伸長部（Ｂ１）、例えば、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号７）などが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原提示およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８  Ｔ細胞のクロスプライミングを促進するための好ましい実施形態であるという予想外の発見を例証する。カテプシン切断性ペプチド伸長部をＮ末端とＣ末端の両方に配置したとき、およびＣ末端におけるカテプシン切断性伸長部（Ｂ２）と、免疫プロテアソームプロセシングにさらに有利に働く配列（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（配列番号１３）のジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ）とを組み合わせたとき、ＣＤ８  Ｔ細胞応答の小規模な追加の向上が見られた。まとめると、ペプチド抗原コンジュゲートの好ましい実施形態は、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端と任意の追加の成分、例えば荷電分子（Ｃ）、との間にカテプシン切断性伸長部（Ｂ１）を含み、必要に応じて、カテプシン分解性または組み合わせたカテプシン・免疫プロテアソーム分解性伸長部（Ｂ２）をＣ末端に含む。
【０５９３】
これらの発見を拡大するために、本発明者らは、最小エピトープであるＡｄｐｇｋのＮ末端およびＣ末端（Ｂ１およびＢ２）に異なる組み合わせおよび組成のカテプシン分解性伸長部を有するペプチド抗原コンジュゲートを合成した（図１５）。図１５に示す異なる組成のペプチドを異なる濃度で脾細胞培養物に添加して、これらの異なる構築物が、最小エピトープであるＡｄｐｇｋのＡＰＣによる取込みおよび提示を促進する効率を評価した。Ｎ末端およびＣ末端（Ｂ１およびＢ２）に異なる組み合わせおよび組成のカテプシン分解性伸長部を有するペプチド抗原、Ａｄｐｇｋ、についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定した作用強度（ＥＣ５０）を図１６に示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発見を確認するために、図１５に示す、式Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−Ｘ１に基づく、配列のサブセットを、疎水性分子（Ｈ）である２Ｂ３Ｗ２に連結させ、次いで、マウスに投与した。ＣＤ８  Ｔ細胞応答を１３日目に評価した（図１７）。このＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニングからの結果と一致し、このことにより、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端およびＣ末端を荷電分子（Ｃ）および疎水性分子（Ｈ）にそれぞれ連結させるカテプシン分解性伸長部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原提示の向上はもちろん、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原交差提示の効率の向上ももたらすことができることが確認される。
【０５９４】
粒径に対する正味電荷および伸長配列（Ｂ１およびＢ２）の影響
粒子の表面電荷が溶液中でのそれらの安定性に影響することは理解されているが、ペプチド抗原コンジュゲートの電荷密度および正味電荷の、これらのペプチド抗原コンジュゲートの水溶液中での超分子集合体のサイズおよび安定性に対する影響は、あまり研究されてこなかった。
【０５９５】
両親媒性高分子の電荷密度および正味電荷が、自己集合粒子の流体力学的挙動にどのように影響を及ぼすのかについてのより深い理解を与えるために、本発明者らは、ペプチド抗原（Ａ）、荷電分子（Ｃ）、伸長部（Ｂ１およびＢ２）および疎水性分子（Ｈ）の組成を変えて式Ｖの一連のペプチド抗原コンジュゲート（図１８）を合成し、これらのパラメーターが、約７．４のｐＨの水溶液に懸濁させたペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性にどのような影響を及ぼすのかを評価した（図１８）。
【０５９６】
本発明者らの最初の研究は、正味電荷を増加させることが、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および安定性にどのような影響を及ぼすのかを調査した（図１８および１９）。本発明者らの結果は、広範な異なるペプチド抗原（Ａ）（Ｎ＝７５４）を送達する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを用いて形成される粒子の電荷の大きさとサイズとの間の逆の関係性を示し、正味電荷（絶対値）＞６である式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたペプチド抗原（Ａ）の約９０％は、集合して約２０〜４０ｎｍナノ粒子ミセルを構築した。注目すべきこととして、ナノ粒子ミセル化を確実にするために必要な正味電荷の大きさは、ペプチド抗原（Ａ）の長さおよびハイドロパシーに大いに依存し、ＬＰベースのペプチド抗原（Ａ）を送達するほとんどのペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原コンジュゲートが＋８もしくはそれより高いまたは−８もしくはそれ未満の正味電荷を有したとき、ミセルを形成したが、最も疎水性が高い抗原は、安定したナノ粒子ミセルを確実に形成するために、最大＋１０もしくはそれより高い、または−１０もしくはそれ未満の正味電荷を必要とした。
【０５９７】
ペプチドベースのＰＣＶの大きな課題は、それらが、ヒトゲノムから得ることができる任意の可能性のあるペプチド抗原を使用して製剤一貫性を確保しなければならないことである。ＰＣＶとしてのＳＰ−７／８ａの一般化可能性を評価するために、本発明者らは、先ず、起こりうるすべてのミスセンス変異を含む基準転写物（７２．６Ｍ  ２４ｍｅｒ）から得られる、可能性のあるすべての２５アミノ酸ペプチド（１１．３Ｍ  ２５ｍｅｒ）の電荷およびハイドロパシーの度数分布をコンピュータで計算した。意外なことに、本発明者らの結果は、２５アミノ酸ペプチドベースのネオ抗原の９８％より多くが、−６〜＋６の間の電荷（ｐＨ７．４で）および＋２〜−２の間の総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）を有するであろうことを示唆する。これらの結果は、ここで使用したマウスネオ抗原の電荷およびハイドロパシー分布が、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測されたヒトネオ抗原の特性を代表することを示す（図１９ＣおよびＤ）。注目すべきこととして、正味電荷の約２〜４整数単位の小規模な増加でさえ、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の安定性を著しく向上させる結果となる。それ故、＋６の正味電荷を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたＬＰネオ抗原の約２５％またはそれより多くが凝集したが、＋８より大きいかまたは＋８に等しい正味電荷を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達された同じＬＰネオ抗原は、集合して安定したナノ粒子ミセルを構築した（図１９Ｅ）。これらの結果は、＋６および＋８より大きいかまたは＋６および＋８に等しい（あるは−６および−８未満であるかまたは−６および−８に等しい）正味電荷をそれぞれ有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるＭｉｎおよびＬＰペプチド抗原が、確実に集合してナノ粒子ミセルを構築することを示す。重要なこととして、これらの予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲートが、可能性のある２５アミノ酸ネオ抗原の９８％に十分な正味電荷を与えられることを確実にするように、約−６〜約＋６の範囲の電荷を有する２５アミノ酸ペプチド抗原（Ａ）に対応しなければならず、したがって、少なくとも１３の特有の、荷電分子（Ｃ）と必要に応じた伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の組み合わせが、ペプチド抗原コンジュゲートの必要正味電荷を達成するのに十分な量の電荷をペプチド抗原（Ａ）に加えること（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４荷電官能基を持たせること）を確実にするために、必要であることを示唆する。
【０５９８】
ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷と水性緩衝液中でペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性との間の傾向をさらに入念に調べるために、本発明者らは、ペプチド抗原コンジュゲート（例えば、ペプチドベースの荷電分子（Ｃ）、ペプチド伸長部（Ｂ１およびＢ２）およびペプチド抗原（Ａ）を含む、ペプチド抗原断片）を構成するペプチド配列の総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値と、形成される粒子のサイズおよび安定性との間の相互作用を調査した（図１９Ｆ）。ＧＲＡＶＹ値と正味電荷と粒径の間には、強い相互依存性があった。したがって、＋４の正味電荷および０未満の総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値を有するペプチド抗原コンジュゲートの多くが、安定した粒子を形成した（図１９Ｆ）。対照的に、＋４の正味電荷および０より大きいＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原コンジュゲートの約２５％は、凝集体を形成したが、凝集体を形成した、＋６の正味電荷および０より大きいＧＲＡＶＹ値を有するペプチド抗原コンジュゲートは、ほとんどなかった。これらのデータは、好ましい実施形態では、送達されるペプチド抗原（Ａ）のＧＲＡＶＹ値を相殺するように正味電荷の大きさを選択するべきであることを示す。好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される安定した粒子の形成を促進するために、＋４より大きいかもしくは＋４に等しい正味電荷または−４未満であるかもしくは−４に等しい電荷を有するペプチド抗原コンジュゲートが得られるように、荷電分子（Ｃ）および伸長部（Ｂ１およびＢ２）の組成を選択し、最も疎水性が高いペプチド抗原（Ａ）であっても安定したナノ粒子が確実に形成されるように、＋６より大きいかまたは−６未満の正味電荷を使用する（図１９Ｆ）。実際、高度に疎水性のＬＰベースの抗原は、正味電荷のさらに大きい絶対値を必要としうる。しかるが故に、ペプチド抗原コンジュゲートは、０．２５未満のＧＲＡＶＹ値を有するＬＰペプチド抗原（Ａ）については、＋８より大きいかもしくは＋８に等しい、または−８未満であるかもしくは−８に等しい正味電荷、約０．２５〜０．７５の間のＧＲＡＶＹ値を有するＬＰペプチド抗原（Ａ）については、＋９より大きいかもしくは＋９に等しい、または−９未満であるかもしくは−９に等しい正味電荷、および０．７５より大きいＧＲＡＶＹ値を有するＬＰペプチド抗原（Ａ）については、＋１０より大きいかもしくは＋１０に等しい、または−１０未満であるかもしくは−１０に等しい正味電荷を有するべきであり、ここでのＬＰは、最小エピトープより長いペプチド抗原（Ａ）、例えば、１５アミノ酸より多い、通常は、２０またはそれより多い、例えば２５アミノ酸のペプチド抗原を指すために使用している。
【０５９９】
本発明者らの分析が、電荷およびハイドロパシーに関して、極端な組成を有するペプチド抗原を含むことに、留意されたい。したがって、４つのマウス腫瘍細胞株から採取した合計１，３７７の予測ネオ抗原のうちの大部分の−すなわち、９０パーセンタイルのまたはそれより高い−疎水性（Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（配列番号５７））、正荷電（Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｑｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ  配列番号７５）、および負荷電（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ  配列番号７６）−配列を代表する３つの特有のペプチド抗原、ならびに検証されたＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２））を、評価に選択した。検証されたＣＤ４  Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ＝Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ  配列番号２２）を含むペプチド抗原（Ａ）も、公知の普遍的ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープとして分析に含めた（図１８）。
【０６００】
粒径に対する疎水性分子（Ｈ）の長さおよび組成の影響
ペプチド抗原コンジュゲートが持つ正味電荷は、形成される粒子の安定性を促進するのに非常に重要であることが判明したが、本発明者らは、次に、粒径に影響を及ぼすさらなる因子を調査した。前の研究は、ミセル、リポソームおよびポリマーソームを構成する高分子の長さを調節して、形成される粒子のサイズを変えることができることを示している。それ故、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチド抗原（Ａ）としてモデルＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを使用して、本発明者らは、疎水性分子（Ｈ）の長さおよび組成が粒径にどのような影響を及ぼすのかを評価した（図２０）。前のデータと一致して、本発明者らは、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性が、使用した様々な異なる疎水性分子（Ｈ）にわたってペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷に大いに依存することを発見した（図２０）。＋４またはそれより高い正味電荷を使用すると、５トリプトファン単位から構成される最小の疎水性分子（Ｈ）であるＷ５は、約１０ｎｍの平均直径を有する最小粒子をもたらし、その一方で、この例で使用した最大の疎水性分子（Ｈ）である２Ｂ２Ｗ８は、直径３０〜１００ｎｍの間の粒子をもたらした（図２０）。注目すべきこととして、中間サイズの疎水性分子（Ｈ）である２Ｂ５および２ＢＸｙ５は、正味電荷が＋４より大きいかまたは＋４に等しい場合、直径約１０〜３０ｎｍサイズの粒子である中間サイズの粒子をもたらした。
【０６０１】
まとめると、これらの結果は、荷電分子（Ｃ）および疎水性分子（Ｈ）の正確に規定された化学的パラメーターを使用して、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性を調整する方法についての予想外の発見を提供する。
【０６０２】
高度に疎水性のペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートの粒径および安定性に対する正味電荷の影響
高度に疎水性であるペプチド抗原（Ａ）を送達するための式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの忍容性を実証するために、本発明者らは、４つのマウス腫瘍系統からの１，３７７のペプチドネオ抗原のライブラリーの中で最も疎水性の高いＬＰネオ抗原を選択し、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチド抗原をＬＰまたはＭｉｎのどちらかとして合成した（図２１）。ＳＮＰ−７／８ａとして送達される疎水性Ｍｉｎ（ＧＲＡＶＹ＝３．９６）を安定させるために、８に等しいかまたは８より大きい正味電荷が必要であったが、ＳＮＰ−７／８ａとして送達される疎水性ＬＰ（ＧＲＡＶＹ＝２．０）を安定させるためには、１０に等しいかまたは１０より大きい正味電荷が必要であった（図２１）。さらなる予想外の発見は、ネイティブＬＰおよびｍｉｎを固相ペプチド合成により製造可能ではなかったが、固相ペプチド合成中の樹脂上のペプチド抗原（Ａ）への荷電分子（Ｃ）および伸長部（Ｂ１およびＢ２）の付加が、配列短縮を防止することならびに水性および有機溶媒中での溶解度向上に起因してＨＰＬＣ精製を可能にすることにより製造を向上させたことであった。
【０６０３】
ペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子（Ｃ）および疎水性分子（Ｈ）組成の免疫原性に対する影響
本発明者らの上記結果は、正味電荷が、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成されるナノ粒子ミセルを安定させるのに非常に重要であることを示す。本発明者らは、次に、最小エピトープであるＡｄｐｇｋを送達するペプチド抗原コンジュゲートの免疫原性に対する荷電分子（Ｃ）および疎水性分子（Ｈ）の組成の影響を調査した（図２２〜２４）。アジュバントを伴わない式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導しなかった（図２２）が、ＴＬＲ−７／８ａに連結された他の組成のペプチド抗原コンジュゲートのすべてが、堅固なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した（図２２）。注目すべきこととして、荷電分子（Ｃ）を伴わない式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲート、およびリシン（すなわち、ポリ（Ｋ））またはアルギニン（すなわち、ポリ（Ｒ））ベースの荷電分子（Ｃ）を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、下は０．２５ｎｍｏｌに至るまでの用量を投与したときでさえ、堅固なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した一方で、アスパラギン酸（すなわち、ポリ（Ｄ））ベースの荷電分子（Ｃ）を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして投与された同じネオ抗原は、０．２５ｎｍｏｌで投与したときも１ｎｍｏｌで投与したときも、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導しなかったが、４および１６ｎｍｏｌで投与したときには大規模なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した。注目すべきこととして、負荷電ペプチド抗原コンジュゲート（図２２）は、複数回免疫化後、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートまたは式Ｖの正荷電ペプチド抗原コンジュゲートのどちらかにより誘導されたＣＤ８  Ｔ細胞応答より約１．５〜２倍高い最大規模のＣＤ８  Ｔ細胞応答（全ＣＤ８  Ｔ細胞に対して約３０％ＩＦＮｇ＋）を誘導した。これらの結果は、自己集合して微小粒子（図２２）または正荷電ナノ粒子（図２２）を構築するペプチド抗原コンジュゲートが、負荷電ペプチド抗原コンジュゲートと比較してＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導するのにより強力であるが、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、負荷電ペプチド抗原コンジュゲートは、ブースト可能性の高いＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することができ、複数回免疫化後、より大規模な応答をもたらすことを示唆する。
【０６０４】
本発明者らの発見を拡大するために、本発明者らは、ペプチド抗原コンジュゲートの荷電分子（Ｃ）組成が、皮下経路の投与後にＣＤ８  Ｔ細胞応答に対してどのような影響を及ぼすのかを評価した（図２３）。注目すべきこととして、それぞれポリ（Ｋ）またはポリ（Ｄ）のどちらかである負荷電または正荷電ポリ（アミノ酸）ベースの荷電分子（Ｃ）のどちらかを有する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、中性のＰＥＧベースのＢ１伸長部を有する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートより大規模なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した（図２３）。
【０６０５】
重要なこととして、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、一般的な経路（筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ））のワクチン接種、ならびに静脈内経路の後に、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起するのに高度に免疫原性であることが判明した（図２４）。
【０６０６】
免疫原性に対するペプチド抗原コンジュゲートの粒径およびアジュバント作用強度および組成の影響
粒径ならびにＴＬＲアゴニストの量および作用強度が、単回免疫化後または複数回（「ブースター」）免疫化後のＴ細胞応答にどのような影響を及ぼすのかは、以前は不明であった。従来技術は、免疫刺激剤の量および作用強度を増加させると、より高い、または少なくとも劣ってはいない、ＣＤ８  Ｔ細胞応答が得られることを示唆したであろうが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８  Ｔ細胞応答のプライミングおよびブースティングに対する免疫刺激剤、例えばＴＬＲアゴニスト、量および作用強度の影響は、あまり研究されてこなかった。それ故、本発明者らの次の研究は、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートに関する粒径ならびにそれらを用いて送達されるアゴニストの量および作用強度が免疫原性にどのような影響を及ぼすのかの評価を模索した。
【０６０７】
粒径およびアゴニスト組成が免疫原性にどのような影響を及ぼすのかを決定するために、一方が、最小ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）を送達し、他方が、最小ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含むペプチド抗原（Ａ）を送達する、２つのペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を用いて、マウスにワクチン接種した（図２５）。式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを、それらが、異なる量および作用強度のＴＬＲ−７／８アゴニストを送達する、小粒子（約２０〜１００ｎｍ径ナノ粒子（ＮＰ））を形成するのか、または大粒子（約１，０００ｎｍ径微小粒子（ＭＰ））を形成するのかに基づいて、区別した。小または大粒子の各セットの中のペプチド抗原コンジュゲートは、１、２、３もしくは５分子の化合物１である２Ｂ、または５分子のより作用強度の高いアゴニストである化合物２である２ＢＸｙのどちらかを含有する疎水性分子（Ｈ）を含んだ。所与の免疫原性組成物を用いてマウスに２回、ワクチン接種し、各ワクチン接種の１週間後に血液中のＴ細胞応答を測定した。
【０６０８】
顕著な予想外の発見は、小粒子（２０〜１００ｎｍ）についても、大粒子（約１０００ｎｍ）についても、疎水性分子（Ｈ）に連結されたアゴニスト２Ｂの量を増加させると、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答が増加されることになり、単一２Ｂ分子のみを含む疎水性分子（Ｈ）に連結されたペプチド抗原コンジュゲートが、最低のＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答をもたらしたことであった。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答は、両方とも、２個の２Ｂ分子を追加することにより増加され、小規模な追加の増加が、疎水性分子（Ｈ）への３または５個の２Ｂ分子の追加後にあった。３分子またはそれより多い、作用強度がより高いアゴニストＴＬＲ−７／８ａである２ＢＸｙを送達する疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートが、３分子またはそれより多い、作用強度がより低いアゴニストである２Ｂを送達する疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートと比較して、複数回免疫化後により低いＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらしたことを示す、本発明者らの前の予想外のデータ（図６および７）と一致して、図２５からの結果は、２ＢＸｙ５が、中等度の作用強度のアゴニストである２Ｂ５を送達する疎水性分子（Ｈ）の使用と比較して、より低いＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答をもたらすことを示す。この予想外の発見、つまり、作用強度がより高いアゴニストが、より低い免疫応答をもたらすことは、文献の中の以前の発見に基づいて予測されなかったであろう。
【０６０９】
まとめると、ペプチド抗原コンジュゲートに対してアゴニストである化合物１である２Ｂの数を増加させると、一般に、より高いＣＤ８  Ｔ細胞応答が得られたが、これらの応答は、生来の刺激剤が作用強度のより高いアゴニストに変わると、規模が減少した。したがって、好ましい実施形態は、ペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を使用して最適なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導するために、高密度の中等度の作用強度のＴＬＲ−７／８ａアゴニスト、または低密度の高い作用強度のＴＬＲ−７／８ａのどちらかを使用する。
【０６１０】
粒径
もう１つの顕著な予想外の発見は、約１０〜２００ｎｍ径粒子である小粒子を形成するペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物が、より大きい粒子（直径＞１，０００ｎｍ）を形成するペプチド抗原コンジュゲートと比較して、より大規模なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらしたことであった。例えば、疎水性分子（Ｈ）２Ｂ５に連結されたペプチド抗原コンジュゲートであって、小粒子を形成するペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を施した群では、ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、大粒子を形成する、疎水性分子（Ｈ）２Ｂ５に連結されたペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物を施した群についての、約０．５％と比較して、約２．５％であった（図２５）。同様に、疎水性分子（Ｈ）２Ｂ３Ｗ２に連結されたペプチド抗原コンジュゲートを小粒子として含む免疫原性組成物を施した群におけるＣＤ８  Ｔ細胞応答は、疎水性分子（Ｈ）２Ｂ３Ｗ２に連結されたペプチド抗原コンジュゲートを大粒子として含む免疫原性組成物を施した群と比べておおよそ１０倍高かった。
【０６１１】
まとめると、これらのデータは、免疫原性組成物に使用したペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズが、ＣＤ８  Ｔ細胞応答に対して大きくかつ予想外の影響を及ぼしたことを示す。したがって、２０〜１００ｎｍの粒子を形成するペプチド抗原コンジュゲートは、最適なＴ細胞免疫を惹起するための免疫原性組成物における使用に好ましい実施形態である。
【０６１２】
つまるところ、これらの研究は、本開示のペプチド抗原コンジュゲートを使用してＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を最大化するために最適である、正確な物理的および化学的パラメーターを解明するものである。
【０６１３】
追加の予想外の発見は、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の流体力学的挙動および安定性が、ペプチド抗原コンジュゲートを構成するペプチド配列の、正味電荷と、Ｋｙｔｅと、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（参照：Ｋｙｔｅ  Ｊ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ、Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １５７巻：１０５〜３２頁、１９８３年）を使用して決定されるような総平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）値の両方に依存したことであった。注記：ＧＲＡＶＹ値および電荷決定は、リンカー（Ｌ）および疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）の寄与を除外した。
【０６１４】
したがって、ＧＲＡＶＹ値＞０．７５である高度に疎水性のペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷が、≧＋６である（＋６より大きいか、もしくは＋６に等しい）または≦−６である（−６未満であるか、もしくは−６に等しい）場合、約ｐＨ７．４のｐＨの水性緩衝液中で安定した粒子を確実に形成し、ＧＲＡＶＹ値が０．２５〜０．７５の間である中等度に疎水性のペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷が、≧＋５である（＋５より大きいか、もしくは＋５に等しい）または≦−５である（−５未満であるか、もしくは−５に等しい）場合、約ｐＨ７．４のｐＨの水性緩衝液中で安定した粒子を確実に形成し、ＧＲＡＶＹ値が０．２５未満であるペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートは、正味電荷が、≧＋４である（＋４より大きいか、もしくは＋４に等しい）または≦−４である（−４未満であるか、もしくは−４に等しい）場合、約ｐＨ７．４のｐＨの水性緩衝液中で安定した粒子を確実に形成した。したがって、本発明者らの予想外の発見に基づくと、任意の組成のペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートの安定した粒子形成を促進する手段として、荷電分子（Ｃ）および伸長配列（Ｂ１およびＢ２）の適切な組成を選択して、電荷を調節することができる。
【０６１５】
免疫原性に対するペプチドネオ抗原の流体力学的挙動の影響
本発明者らは、次に、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート（図２６）を使用する、より一貫した製剤が、電荷安定化を伴わず、結果として微小分子／凝集体（ＭＰ−７／８ａ）が生じることになる、疎水性ポリマー−ＴＬＲ−７／８ａへのＬＰネオ抗原の連結と比較して、またはＬＰネオ抗原と微粒子アジュバント（ＬＰ＋ポリＩＣＬＣ）を混合する、より従来的なアプローチと比較して、ＣＴＬ応答の免疫原性向上につながるかどうかを評価した（図２７）。本発明者らは、Ａｄｐｇｋ、Ｃｐｎｅ１およびＩｒｇｑという３つのＬＰネオ抗原を評価に選択した。Ａｄｐｇｋは、集合して、ネイティブＬＰとして粒子を構築したが、Ｃｐｎｅ１  ＬＰおよびＩｒｇｑ  ＬＰは、両方とも、水溶性であった（図２７Ａ）。
【０６１６】
本発明者らの前の発見と一致して、粒子として送達されたネオ抗原ＬＰのみが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した（図２７ＢおよびＣ）。したがって、ｐＩＣＬＣと混合した可溶性ＬＰ  Ｃｐｎｅ１およびＩｒｇｑは、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導しなかったが、ＭＰ−７／８ａ（微小粒子／凝集体）またはＳＮＰ−７／８ａ（ナノ粒子）として送達された同じネオ抗原は、大規模ＣＤ８  Ｔ細胞免疫の発生をもたらした（図２７Ｂ〜Ｅ）。ｐＩＣＬＣと混合した可溶性ＬＰは、前に説明した通り、不活性であったが、粒子ＬＰであるＡｄｐｇｋは、バックグラウンドと比較してＣＤ８  Ｔ細胞応答の有意な増加を誘導した。これは、アジュバント、すなわちｐＩＣＬＣ、ではなく、ペプチドネオ抗原の物理的形態が、ｐＩＣＬＣと混合したＣｐｎｅ１  ＬＰおよびＩｒｇｑ  ＬＰによる弱いＴ細胞応答の原因である可能性が高かったことを示す。
【０６１７】
粒子形式でのネオ抗原を送達する製剤の中で、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートに基づくナノ粒子ミセル（ＳＮＰ−７／８ａ）が、最大規模の応答をもたらし、次が、微小粒子（ＭＰ−７／８ａ）製剤であり、そして最後が、アジュバントと混合した単独のＬＰであった（図２７Ｂ〜Ｅ）。注目すべきこととして、単回免疫化後のナノ粒子ミセル（ＳＮＰ−７／８ａ）による応答は、微小粒子製剤による応答より有意に（約５〜１０倍）高かったが、２回または３回の免疫化後の応答は、同等であった。これは、微小粒子と比較してより小さいナノ粒子ミセルが、より速いＴ細胞誘導動態を有することを示す。
【０６１８】
観察された免疫原性の差を明らかにするための機構の研究により、安定したナノ粒子ミセルを形成するペプチド抗原コンジュゲートは、濃度が早期にピークに達し、１日目にリンパ節ＡＰＣにより取り込まれて、最高量のネオ抗原が流入領域リンパ節に取り込まれる結果となった一方で、微小粒子は、濃度が７日目にピークに達して、より緩徐にリンパ節に取り込まれる（これは、微小粒子に起因するＣＤ８  Ｔ細胞応答のより緩徐な動態が原因でありうる）ことを示すことが、明らかになった（図２８）。対照的に、可溶性アジュバントまたは粒子アジュバントのどちらかと混合した可溶性ネオ抗原は、流入領域リンパ節へのネオ抗原の制限された取込みしか示さなかった。アジュバントの粒子製剤のすべてが、リンパ節において同等の自然免疫活性化の規模および動態を誘導するにもかかわらず、粒子形態の抗原のみが、ＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらした。リンパ節における可溶性ネオ抗原の制限された蓄積は、この可溶性ネオ抗原がＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することができないことの原因である可能性が高い。
【０６１９】
免疫原性に対するペプチド長の影響
ペプチド長は、ペプチド抗原（Ａ）免疫原性に影響を及ぼす大きな要因であると考えられる。それ故、本発明者らは、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチドネオ抗原の長さが、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成されるＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の規模にどのような影響を及ぼすのかを調査した（図２９）。ＭＣ３８腫瘍細胞株に由来する７つのペプチドネオ抗原を、本明細書でＳＮＰ−７／８ａと呼ばれる、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達される最小エピトープ（ｍｉｎ）またはＬＰベースのペプチド抗原（Ａ）のどちらかとして調製し、次いで、マウスに投与した。本発明者らの結果は、ＳＮＰ−７／８ａとして送達された、ｍｉｎ形態とＬＰ形態両方のネオ抗原が、バックグラウンドに比べて（非免疫原性であると以前に報告された４つのネオ抗原に対して、を含む）約１０〜１００倍大きい、同等の規模のＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起することを示す（図２９Ａ）。しかし、予想通り、ＬＰは、ｍｉｎと比較して有意に高いＣＤ４  Ｔ細胞応答を惹起した。これは、ｍｉｎが小さ過ぎてＣＤ４エピトープをコードすることができないためである可能性が高い（図２９Ｂ）。重要なこととして、これらの結果は、ペプチド長が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答に対してほとんど影響を及ぼさないことを示し、粒子で適切に製剤化された場合の、製造効率がより高い、最小ＣＤ４またはＣＤ８エピトープを含有する短鎖ペプチド（７〜１４アミノ酸）が、ＬＰ（＞２０アミノ酸）よりもワクチンにおける使用に好ましい場合があることを示唆する。実際、ＭＨＣ−ＩＩ予測アルゴリズムの向上によって、ＣＤ４  Ｔ細胞応答とＣＤ８  Ｔ細胞応答の両方を惹起するための最小エピトープの使用が可能になり、その結果、ＬＰを使用する必要がなくなるはずである。
従来のアプローチと比較したペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるペプチドネオ抗原の免疫原性のベンチマーク評価（ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ）
本発明者らは、次に、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖの本発明者らのペプチド抗原コンジュゲートの活性を、ネイティブＬＰを微粒子アジュバントポリＩＣＬＣと混合する従来のペプチドベースのワクチンアプローチとともに、ベンチマーク評価を行った（図３０）。Ｙａｄａｖらの発見（Ｙａｄａｖ  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ５１５巻（７５２８号）：５７２〜５７６頁（２０１４年））と一致して、質量分析により検証した７つの予測ネオ抗原のうちの２つのみ（Ｒｅｐｓ１およびＡｄｐｇｋ、これらは両方とも微粒子である）が、ｐＩＣＬＣと併せた場合、免疫原性であったが、ＳＮＰ−７／８ａとしての、すなわち、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたペプチド抗原（Ａ）としての、７つのＬＰネオ抗原すべてが、大規模ＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起した（図３０）。注目すべきこととして、図３０に示す７つのネオ抗原すべてが、質量分析により腫瘍ＭＨＣ−Ｉに結合することが確認された。これは、質量分析が、ペプチド抗原（Ａ）、例えばネオ抗原、の免疫原性を予測するための信頼できるフィルターであるという予想外の発見を提供する。
【０６２０】
最小エピトープ予測結合親和性と免疫原性との関係
本発明者らの結果は、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたペプチドベースのネオ抗原が、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起するための高度に効率的なアプローチであることを示す。ワクチンプラットフォームの効率の向上によって、免疫原性の予測アルゴリズムを洗練させることが可能でありうる。実際、本発明者らは、ＳＮＰ−７／８ａを伴う１９２の特有のＣＤ８  Ｔ細胞エピトープをｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングした後に予測ＭＨＣ−Ｉ結合と免疫原性との強い相関関係を観察し、高親和性エピトープ（ＩＥＤＢコンセンサススコア＜０．５パーセンタイル）のほぼ５０％が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらした。これは、公表されている応答と比較して、ＣＤ８  Ｔ細胞応答のプライミング効率のほぼ５倍の上昇である（図３１）。これらの結果は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測結合親和性、特に、ＩＥＤＢコンセンサススコアが、ペプチド抗原（Ａ）免疫原性を高度に予測することを示す。
【０６２１】
ペプチド抗原コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍排除を媒介する堅固な腫瘍関連（自己抗原、ネオ抗原およびウイルス抗原）特異的ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答を惹起する
本発明者らは、以前に報告された非免疫原性エピトープに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答が、確立腫瘍の排除の向上をもたらすことができるかどうかを調査した（図３２〜３３）。本発明者らの結果は、非免疫原性であると以前に報告された２つの腫瘍モデルであるＭＣ３８およびＢ１６．Ｆ１０からのいくつかのネオ抗原が、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（「ＳＮＰ−７／８ａ」）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートとして送達されたとき、確立腫瘍の排除をもたらすことを示す。注目すべきこととして、Ｋｒｅｉｔｅｒらは、ネオ抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答が確立Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍の排除を主として媒介することを以前に報告したが、本発明者らは、ワクチンの効率向上によって、ネオ抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答とＣＤ８  Ｔ細胞応答の両方がＢ１６．Ｆ１０の排除の媒介に動員されうることを観察した（図３２および３４）。重要なこととして、これらの発見は、ネオ抗原の使用に留まらなかった。なぜならＳＮＰ−７／８ａとして送達されたウイルス抗原（ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７、図３５）と自己抗原（Ｔｒｐ１、図３２）の両方が、腫瘍排除向上に関連する大規模ＣＤ８  Ｔ細胞応答を惹起したからである。
【０６２２】
複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子は安定しており、均一な粒径を示す
ＰＣＶアプローチは、Ｔ細胞応答の幅を増加させるために患者への複数の異なるエピトープの投与を必要とする可能性が高い。それ故、本発明者らは、複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む多抗原粒子ワクチンにおける使用に対する、自己集合して、ＴＬＲ−７／８ａ（ＳＮＰ−７／８ａ）を共送達するナノ粒子を構築する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの、寛容を評価した（図３６）。複数の異なるペプチド抗原コンジュゲートを含む粒子は、ネオ抗原ＬＰ組成に関係なく、２０〜４０ｎｍの間の一貫した粒径になった（図３６）。
【０６２３】
腫瘍に関連する自己抗原または感染性疾患抗原を送達する式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート
上記の本発明者らの発見を拡大するために、本発明者らは、Ｔ細胞免疫を誘導するための普遍的ワクチンプラットフォームとしてのペプチド抗原コンジュゲートの使用の一般化可能性を評価した。図３７に示すように、癌遺伝子（Ｋｒａｓ）と、ウイルス（ＨＩＶ）に由来するペプチドと、外来抗原（すなわち、オボアルブミン）とを含むペプチド抗原（Ａ）を送達する、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、すべてが安定したナノ粒子を形成し、ｉｎ  ｖｉｖｏで大規模Ｔ細胞応答を誘導した。
【０６２４】
式ＩＩＩのアジュバントに連結された式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく、異なる荷電分子（Ｃ）または異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性
上で実証したように、ペプチド抗原コンジュゲートワクチンは、成分、例えば、荷電分子（Ｃ）、伸長部（Ｂ１およびＢ２）、ペプチド抗原（Ａ）、リンカー（Ｌ）および疎水性分子（Ｈ）、の各々についての広範な異なる組成を可能にしうるモジュラープラットフォームである。一部の実施形態では、これは、ほとんどの生理的に適切なｐＨ範囲、例えばｐＨ４．５〜約ｐＨ８．５、にわたってｐＨ非依存性である官能基を含む荷電分子（Ｃ）を組み入れるために重要でありうる。それ故、本発明者らは、ホスホセリンまたはトリメチル−リシン（ｐＨ非依存性第四級アンモニウム）アミノ酸をそれぞれ含む荷電分子（Ｃ）を使用して、正味負電荷または正味正電荷のどちらかを有するペプチド抗原コンジュゲートを合成した（図３８）。本発明者らの結果は、ホスホセリンまたはトリメチル−リシンベースの荷電分子（Ｃ）を含むペプチド抗原コンジュゲートが、安定したナノ粒子を形成し、大規模Ｔ細胞応答を誘導するのに対して、荷電分子（Ｃ）を有さないペプチド抗原コンジュゲートが凝集体を形成することを示す。
【０６２５】
これらの発見を拡大するために、本発明者らは、式ＩＩＩのアジュバントに連結された式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく、異なる長さ（３０アミノ酸（２Ｂ５Ｗ１０Ｇ１０と呼ばれる化合物２０）および１５アミノ酸（２Ｂ５Ｇ１０と呼ばれる化合物１６））のＤＢＣＯ含有疎水性分子（Ｈ）を有する、ペプチド抗原コンジュゲートを生成した。予想外の発見は、疎水性ブロック上のアミンおよび芳香族基の含有量を増加させると、芳香族基またはアミンがより少ない疎水性ブロックと比較して、有機溶媒溶解度が向上されることになり、したがって、製造が向上されることになったことであった。それ故、より長鎖にもかかわらず、２Ｂ５Ｗ１０Ｇ１０およびそのペプチド前駆体は、２Ｂ５Ｇ１０およびその前駆体より製造効率が高かった。
【０６２６】
２つの異なる疎水性分子（Ｈ）である２Ｂ５Ｗ１０Ｇ１０および２Ｂ５Ｇ１０を、長鎖ペプチドベースのネオ抗原をペプチド抗原（Ａ）として含むペプチド抗原断片に、トリアゾールリンカー（Ｌ）によって連結させて、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを形成した。本発明者らの前の発見と一致して、安定したナノ粒子形成は、異なる疎水性分子（Ｈ）を含むペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷に依存した（図３８）。意外なことに、疎水性分子（Ｈ）上の高密度の疎水性基にもかかわらず、両方のペプチド抗原コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、安定したナノ粒子ミセルを形成し、大規模Ｔ細胞応答を誘導した（図３８）。一部の実施形態では、より長鎖の疎水性分子（Ｈ）を使用して、ペプチド抗原コンジュゲートの動力学的安定性、例えば、静脈内経路により送達されるワクチンに必要とされうる動力学的安定性を向上させる。
【０６２７】
異なるＰＲＲアゴニストに連結された式ＩＩのポリ（アミノ酸）に基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性
免疫原性組成物の上記の例では、ＴＬＲ−７／８ａ（例えば、式ＩＩＩのアジュバント）に連結された、またはリガンドに連結されていない、疎水性分子（Ｈ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートを主として使用したが、疎水性分子（Ｈ）を任意のリガンドに連結させることができる。一部の実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドを疎水性分子（Ｈ）上に組み入れるが、他の実施形態では、アジュバント特性を有さないリガンドを疎水性分子に組み入れる。アジュバント特性を有する異なるリガンドを送達するペプチド抗原コンジュゲートの一般化可能性を実証するために、本発明者らは、ＴＬＲ−４アゴニスト（すなわち、ＷＷ（ＰＩ）ＷＷ）、ＴＬＲ−２／６アゴニスト（すなわち、ＷＷ（ＰＩ）ＷＷ）、ＴＬＲ−７アゴニスト（すなわち、ＣＬ２６４−Ｗ５）、ＮＯＤアゴニスト（ムラミル−Ｗ５）、およびＳＴＩＮＧのアゴニスト（すなわち、ＤＭＸＡＡ−Ｗ５）を含む、異なるリガンドに連結された式ＩＩの疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを合成した。本発明者らの前の発見と一致して、安定したナノ粒子形成は、異なる疎水性分子を含むペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷に依存し（図３９）、アジュバント特性を有する異なるリガンドを含む疎水性分子（Ｈ）に基づく異なる免疫原性組成物のすべてが、測定可能なＴ細胞免疫を誘導した。注目すべきこととして、ＴＬＲ−７アゴニストは、最大規模の応答を誘導した。それ故、ＴＬＲ−７またはＴＬＲ−７／８アゴニストを、感染性疾患またはがんの予防または処置のどちらかのためにＴ細胞応答を誘導するためのペプチド抗原コンジュゲートの好ましい実施形態に使用する。
【０６２８】
異なるリンカー化学（アミドおよびチオ−エーテル）を使用する疎水性分子（Ｈ）へのペプチド抗原（Ａ）の結合
ペプチド抗原コンジュゲートの好ましい実施形態は、クリックケミストリーを使用して、リンカー前駆体Ｘ１およびリンカー前駆体Ｘ２からリンカー（Ｌ）を形成するが、他のタイプのリンカー化学が適している。それ故、ペプチド抗原（Ａ）のＮ末端またはＣ末端のどちらかによって連結された、アミドベースのリンカー（Ｌ）またはチオ−エーテルベースのリンカー（Ｌ）のどちらかを使用して、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを疎水性分子（Ｈ）に連結させた。本発明者らの結果は、アミドまたはチオ−エーテルのいずれかを含むリンカー（Ｌ）に、ペプチド抗原のＮ末端またはＣ末端を介して（Ｂ１またはＢ２伸長部を介して）のどちらかで、連結されたペプチド抗原（Ａ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定したナノ粒子を形成して大規模Ｔ細胞応答を誘導するペプチド抗原コンジュゲートをもたらした（図４０）が、疎水性分子（Ｂ）にアミドリンカー（Ｌ）を介して連結されたペプチド抗原（Ａ）が、チオエーテルリンカー（Ｌ）を使用して連結されたものと比較してより大規模な応答を誘導したことを示す。それ故、好ましい実施形態では、安定したアミドまたはトリアゾールリンカー（Ｌ）を使用して、ペプチド抗原（Ａ）を、疎水性分子（Ｈ）に、直接、または伸長部（Ｂ１もしくはＢ２）を介してのどちらかで、連結させる。
【０６２９】
脂肪酸、脂質およびコレステロールに基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性
ペプチド抗原コンジュゲートの好ましい実施形態は、ポリマー、例えば、ポリ（アミノ酸）またはＡ−Ｂ型ジブロックコポリマー、から構成される疎水性分子（Ｈ）を使用するが、疎水性分子（Ｈ）は、脂肪酸、脂質およびコレステロールなどの、様々な他の疎水性分子に基づくこともある。したがって、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートを、ミリスチン酸（ＭｙｒまたはＣ１４、化合物４９および５２）、パルミチン酸（ＰａｌｍまたはＣ１６、化合物５１および５３）、コレステロール（Ｃｈｏｌ、化合物５７および５８）およびジアシル脂質（Ｐａｍ２Ｃｙｓ、化合物５４および５５）に基づく疎水性分子（Ｈ）に連結させた。本発明者らの前の発見と一致して、安定したナノ粒子形成は、異なる疎水性分子を含むペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷に依存し（図４１）、＋６より大きいかまたは＋６に等しい正味電荷は、安定したナノ粒子形成をもたらした。重要なこととして、脂肪酸、コレステロールおよび脂質ベースの疎水性分子（Ｈ）に基づくペプチド抗原コンジュゲートの免疫原性組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで大規模Ｔ細胞応答を誘導した（図４１）。脂肪酸、コレステロールおよび脂質ベースの粒子は、ペプチド抗原コンジュゲートとして粒子形成およびの生物活性に関して適切な性能を実証したが、１つの制約は、脂肪酸、コレステロールおよび脂質に基づく疎水性分子（Ｈ）が、例えば、ほとんどの有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、アセトニトリルなど）に可溶性である、芳香族基を含むポリマーから構成される疎水性分子（Ｈ）と比較して、多くの溶媒へのこれらの材料の制限された溶解度（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦおよび多くのアルコールへの乏しい溶解度）に起因して製造がより困難であり、したがって、生物学的により過酷な塩素化溶媒（例えば、ジクロロメタンおよびクロロホルム）を必要とし、このことが、特に、個別化ワクチン戦略のための、特徴付けおよび精製をより困難にし、安全性リスクを高めることである。
【０６３０】
Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーに基づく異なる疎水性分子（Ｈ）から構成される式ＩＶおよびＶのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性
式ＩＶおよび式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）をＨＰＭＡ系ジブロックコポリマーに結合させることによって調製した（参照：化合物６８〜７２）。予想外なことに、ミセル形成性ジブロックコポリマーは、ペプチド抗原断片の正味電荷に関係なく、非常に安定したナノ粒子ミセルを形成した（図４２）。それ故、疎水性分子（Ｈ）がＨＰＭＡモノマーから構成されるジブロックコポリマーである一部の実施形態では、式ＩＶのペプチド抗原コンジュゲートが好ましいこともある。ジブロックは、温度に関係なく、水性条件で粒子を形成することもあり、または粒子形成が、温度依存性であることもある。さらに、リガンドを、２つのブロックのどちらかに、ジブロックコポリマーの末端または側鎖のどちらかに、組み入れることができる。本発明者らの結果は、ＨＰＭＡモノマーから構成されるＡ−Ｂ型ジブロックポリマーが、ペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物の疎水性分子（Ｈ）として組み入れられたとき、安定したナノ粒子を確実に形成し、大規模Ｔ細胞応答をもたらすことを示す（図４２）。
【０６３１】
粒子に連結されたペプチド抗原（Ａ）に基づく式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートの粒径および安定性
好ましい実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、疎水性分子（Ｈ）を含むが、一部の実施形態では、ペプチド抗原コンジュゲートは、予め形成された粒子（Ｐ）を含む。リポソーム、ポリスチレン、シリカ（ｓｉｌｉｃ）および酸化鉄粒子に基づく予め形成された粒子（Ｐ）に異なる正味電荷を有するペプチド抗原断片（Ｃ−Ｂ１−Ａ−Ｂ２−）を結合させることによって、粒子（Ｐ）を含む式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートに基づく粒子の安定性へのペプチド抗原断片の電荷の依存性を、評価した。本発明者らの前の発見と一致して、安定したナノ粒子形成は、異なる疎水性分子を含むペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷に依存した（図４３）。
【０６３２】
寛容の誘導に使用される自己抗原を送達するペプチド抗原コンジュゲートの粒径および生物活性
ペプチド抗原コンジュゲートは、寛容または抑制性調節性Ｔ細胞を誘導するために使用することもできる。寛容および免疫抑制を誘導するための好ましい実施形態では、アジュバント特性を有するリガンドを通常は組み入れない。その代わりに、ペプチド抗原コンジュゲートは、ペプチド抗原（Ａ）、疎水性分子（Ｈ）または粒子（Ｐ）ならびに必要に応じたリンカー（Ｌ）、荷電分子（Ｃ）および伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）を含む粒子であって、アジュバント特性を有するリガンドを含まない粒子を含むべきである。寛容または抑制の誘導に使用するための、本明細書に記載のペプチド抗原コンジュゲートの一般化可能性を評価するために、関節炎を誘導するためのモデル自己抗原（すなわち、コラーゲンＩＩ）、およびＭＳに似ているＣＮＳ症候群を誘導するためのモデル自己抗原（すなわち、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、「ＭＯＧ」）を、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲート上のペプチド抗原（Ａ）として生成した。本発明者らの前の結果と一致して、式Ｖのペプチド抗原コンジュゲートで送達された自己抗原は、集合して安定したナノ粒子を構築し、低レベルの調節性Ｔ細胞応答を誘導した（図４４）。
【０６３３】
Ａ−Ｈ＋Ｃ−ＨまたはＡ−Ｈ（Ｃ）（式ＶＩ）から構成される粒子の粒径および生物活性
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、荷電分子コンジュゲート（例えば、Ｃ−［Ａ’］−［Ｌ］−Ｈ）と混合した、荷電分子を有さないペプチド抗原コンジュゲート（例えば、Ａ−［Ｂ２］−［Ｌ］−Ｈ）から構成される粒子を含む。例えば、ＬＰネオ抗原（Ａｄｐｇｋ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートを、トリアゾールリンカー（Ｌ）によって、疎水性分子２Ｂ３Ｗ２に連結させて、ペプチド抗原コンジュゲート（Ａ−Ｌ−Ｈ）を形成し、これを、化合物４２（Ｋ１０−２Ｂ３Ｗ２）である荷電分子コンジュゲート（Ｃ−Ｈ）と混合して、大規模Ｔ細胞免疫を誘導する安定したナノ粒子を形成した（図４５）。別の実施形態では、ＬＰネオ抗原（Ａｄｐｇｋ）から構成されるペプチド抗原コンジュゲートを、トリアゾールリンカー（Ｌ）によって、疎水性分子２Ｂ３Ｗ２に連結させて、ペプチド抗原コンジュゲート（Ａ−Ｌ−Ｈ）を形成し、これを、保存抗原Ａ’をさらに含む荷電分子コンジュゲート（すなわち、Ｃ−Ａ’−Ｈ）と混合して、大規模Ｔ細胞免疫を誘導する安定したナノ粒子を形成した（図４５）。
【０６３４】
あるいは、荷電分子（Ｃ）を、ペプチド抗原（Ａ）に連結されている疎水性分子（Ｈ）に連結させて、式ＶＩのペプチド抗原コンジュゲートを形成することができる。非限定的な例では、ペプチドネオ抗原（Ａｄｐｇｋ）を、式Ａ−［Ｌ］−Ｈ（Ｃ）のペプチド抗原コンジュゲート上のペプチド抗原（Ａ）として送達する。結果として得られたコンジュゲートは、安定したナノ粒子および大規模Ｔ細胞免疫を形成することが判明した。したがって、粒子を含む免疫原性組成物の好ましい実施形態では、荷電分子（Ｃ）を、直接または間接的連結のどちらかによって、ペプチド抗原（Ａ）に、またはペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子と会合する別の分子上に、備えさせることができる。
【０６３５】
重要なこととして、本開示は、腫瘍関連抗原（自己抗原、ネオ抗原およびウイルス抗原）、感染性疾患抗原および外来抗原を含む、ペプチド抗原（Ａ）に対して生成されるＴ細胞の規模および幅の予想外の向上をもたらす、ペプチド抗原コンジュゲートと呼ばれる、新規ペプチドベースのワクチンアプローチを記載するものである。アジュバントを含まないペプチド抗原コンジュゲートを含む免疫原性組成物は、自己抗原に対して誘導する免疫寛容原性／抑制性応答レベルが低いことも判明し、これは、自己免疫および／またはアレルギーの処置に有用でありうる。
【０６３６】
本開示において、本発明者らは、最小エピトープ（ＭＥ）を含むペプチド抗原（Ａ）と合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）として送達される同じＭＥの両方をペプチド抗原コンジュゲートから構成されるナノ粒子として送達することによって、両方を薬物動態について正規化したとき、最小エピトープ（ＭＥ）を含むペプチド抗原（Ａ）が、合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）として送達される同じＭＥより、大規模なＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらすことができるという予想外の発見を実証する。加えて、本発明者らは、ペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるＳＬＰ中のＭＥが、単回免疫化後にＣＤ８  Ｔ応答をもたらさないが、ペプチド抗原コンジュゲートとして送達されるＭＥが、恐らく、ＭＨＣ  Ｉ分子との関連でのＭＥのＡＰＣによる細胞表面提示が増加されることになる、より効率的なプロセシングによって、ＣＤ８  Ｔ細胞応答をもたらす例を、提供する。そのようなＭＥベースのワクチンは、Ｔ細胞応答の幅を拡大することが判明し、加えて、確立腫瘍の成長を低減させることに関連して機能的であることを示した。それ故、本発明者らの予想外の発見に基づき、免疫原性組成物の好ましい実施形態は、最小エピトープに基づくまたはＭＥとＳＬＰの組み合わせに基づくペプチド抗原（Ａ）を送達するペプチド抗原コンジュゲートを使用する。しかし、一部の実施形態では、ペプチド抗原（Ａ）は、ＳＬＰ（または「ＬＰ」）である。
【０６３７】
さらに、様々な性質を有するペプチド抗原（Ａ）を送達する粒子の物質負荷およびサイズおよび安定性に対する制御の向上をもたらすために、本発明者らは、水性緩衝液中で集合してミセルおよびナノサイズの超分子会合体を構築するペプチド抗原コンジュゲートとしてペプチド抗原（Ａ）を送達するための新規アプローチを本明細書で開示する。重要なこととして、本発明者らは、必要に応じた粒子安定化荷電分子（Ｃ）と疎水性分子（Ｈ）と必要に応じた（リンカー）と必要に応じた伸長配列（Ｂ１およびＢ２）とを含むペプチド抗原コンジュゲートの組成を、可能性のあるいずれのペプチド抗原（Ａ）についても規定のサイズの安定した粒子を確実に達成することができるように、最適化することができる方法を示す。本発明者らは、確実な粒子形成および安定性向上を、疎水性分子（Ｈ）の長さおよび疎水特性を調整することによって、ならびにペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子の電荷を調節することによって、達成することができることを示す。
【０６３８】
ペプチド抗原コンジュゲートを構成するＴ細胞エピトープのプロセシングを向上させるための手段として、本発明者らは、水性条件で安定しているが抗原提示細胞のエンドソーム内の酵素により優先的に加水分解され、それによって、抗原のプロセシングおよび提示をそのような細胞に限定し、ＡＰＣ内での最小ＣＤ８および／またはＣＤ４  Ｔ細胞エピトープの効率的放出を促進する、Ｎ末端およびＣ末端伸長部（Ｂ１およびＢ２または「伸長部」）の使用の有用性を実証する。
【０６３９】
最後に、本開示において、本発明者らは、Ｔ細胞免疫を促進するために必要なＰＲＲアゴニストベースの免疫刺激剤の最適な組成、数および作用強度を系統的に評価した。本発明者らは、ＩＬ−１２およびＩ型ＩＦＮの産生を誘導するＴＬＲアゴニストの数および作用強度を漸増させると、最初はＴ細胞応答の規模が向上される結果となり、しかし、新規の予想外の発見では、さらに増加させると、結果として、抗原性の幅がより狭くなり、Ｔ細胞応答の規模がより小さくなるデータを提供する。したがって、本発明者らは、Ｔ細胞免疫の最適な規模、質および幅の提供に好ましい、疎水性分子（Ｈ）に結合させる免疫刺激剤（すなわち、ＰＲＲアゴニスト）の組成、数および作用強度を報告する。
【０６４０】
まとめると、本明細書で開示する予想外の発見は、以下に関係する：
ｉ．Ｔ細胞免疫の確実なプライミングを確保するためにがんワクチンにおいて使用されるペプチド抗原（Ａ）の最適な長さ。
ｉｉ．ペプチドベースのワクチンの製造を助長し、粒子安定性を促進し、ＡＰＣによる効率的提示を可能にするためのプロセシングを助長する、ペプチド抗原伸長配列、すなわち、Ｎ末端および／もしくはＣ末端伸長部（Ｂ１および／またはＢ２）の使用。
ｉｉｉ．Ｔ細胞免疫の促進に最適なサイズの粒子を誘導するおよび安定させるために必要な、荷電分子（Ｃ）の組成およびペプチド抗原コンジュゲートの正味電荷。
ｉｖ．疎水性分子（Ｈ）の長さおよび組成が、ペプチド抗原コンジュゲートにより形成される粒子のサイズおよび安定性、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの免疫原性に、どのように影響を及ぼすのか。
ｖ．疎水性分子（Ｈ）上に組み入れるリガンド（例えばＰＲＲアゴニスト）の作用強度および質的特性が、Ｔ細胞応答の幅、規模および質にどのように影響を及ぼすのか。
【０６４１】
本明細書および後続の特許請求の範囲を通して、文脈による別段の要求がない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などのバリエーションは、述べられている整数または整数群の包含を含意するが、いずれの他の整数および整数群の除外も含意しないと、または述べられている組成（物）（単数もしくは複数）の包含を含意するが、いずれの他の組成（物）（単数もしくは複数）の除外も含意しないと、解されるものとする。
【０６４２】
本明細書におけるいずれの先行技術への言及も、そのような先行技術が、誰もが知っている一般知識の一部を形成するという何らかの形の提言の是認ではなく、かつ是認と解釈すべきでない。
【０６４３】
本発明が、記載した特定の適用にその使用が限定されないことは、当業者には理解されるであろう。本発明は、本明細書において説明または図示する特定の要素および／または特徴に関するその好ましい実施形態にも限定されない。本発明が、開示する実施形態（単数または複数）に限定されず、後続の特許請求の範囲によって示され定義される本発明の範囲を逸脱することなく非常に多くの再構成、修飾および置換が可能であることは、理解されるであろう。
【図１】
2020515629.tif 000123
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１８−９】
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【図１８−１０】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020515629.tif 000189
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