(57)【要約】チェックポイント受容体およびそれらの同族リガンドは自己免疫障害においてＢおよびＴ細胞により頻繁に標的とされ、これらの適応免疫応答は根底にある免疫病理に大きく寄与する可能性がある。チェックポイント受容体およびそれらのリガンドを標的とする自己反応性Ｂ細胞のクローン排除のための新規技術が本明細書で記載される。この技術の一実施形態は、Ｂ細胞アポトーシス、壊死、および／または寛容化／反応不顕性化（ａｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎ）を誘導することができるエフェクタードメインとのチェックポイント受容体またはリガンド細胞外ドメイン分子キメラであり、本明細書で、この技術はＰａｎｔＩｄ（ポリクローナル抗イディオタイプ）と呼ばれる。他の実施形態では、この技術は免疫調節性サイトカインとのエフェクター分子キメラも含む。新規アポトーシスエフェクターも記載される。チェックポイント受容体／リガンド自己反応性Ｂ細胞応答の同定、ＰａｎｔＩｄの構築、ならびにそれらのインビトロおよびインビボ適用の方法も記載される。【選択図】図５
2020515289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己反応性Ｂ細胞が、免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、および／または免疫調節性サイトカインに応答する自己免疫疾患または障害の治療のためのＰａｎｔＩｄ分子であって、前記分子が２、３、４、または５つのタンパク質、ドメイン、またはペプチドの分子キメラを含み、
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの第１が、免疫学的チェックポイント受容体、チェックポイントリガンド、または免疫調節性サイトカインのうちの１つであり、
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの第２がエフェクターである、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２】
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの前記第１が、免疫学的チェックポイント受容体である、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３】
前記免疫学的チェックポイント受容体が、リガンドに結合し、白血球またはリンパ系組織関連細胞内でシグナル伝達を誘発する、細胞内、膜貫通、または膜結合タンパク質である、請求項２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項４】
前記白血球またはリンパ系組織関連細胞内のシグナル伝達が、ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、ＰＩ−３Ｋ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ、ｃＧＭＰ−ＰＫＧ、ＭＡＰＫ、カスパーゼ、ＳＭＡＤ、Ｒｈｏ−ファミリーＧＴＰａｓｅ、チロシンキナーゼもしくはホスファターゼ、脂質キナーゼもしくはホスファターゼ経路により、またはＴおよびＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球、およびマスト細胞）、単球、マクロファージ、またはリンパ系組織関連細胞の他のシグナル伝達経路により免疫調節作用を媒介する、請求項３に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項５】
前記免疫学的チェックポイント受容体が、ＰＤ−１（配列０３８）、ＣＤ２８（配列０３９）、ＣＴＬＡ−４（配列０４０）、ＩＣＯＳ（配列０４１）、ＢＴＬＡ（配列０４２）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）（ＫＩＲ２ＤＬ１（配列０４３）、ＫＩＲ２ＤＬ２（配列０４４）、ＫＩＲ２ＤＬ３（配列０４５）、ＫＩＲ２ＤＬ４（配列０４６）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ（配列０４７）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ（配列０４８）、ＫＩＲ２ＤＳ１（配列０４９）、ＫＩＲ２ＤＳ２（配列０５０）、ＫＩＲ２ＤＳ３（配列０５１）、ＫＩＲ２ＤＳ４（配列０５２）、ＫＩＲ２ＤＳ５（配列０５３）、ＫＩＲ３ＤＬ２（配列０５４）、ＫＩＲ３ＤＬ３（配列０５５）、およびＫＩＲ３ＤＳ１（配列０５６）を含む）、ＬＡＧ−３（配列０５７）、ＣＤ１３７（配列０５８）、ＯＸ４０（配列０５９）、ＣＤ２７（配列０６０）、ＣＤ４０（配列０６１）、ＴＩＭ−３（配列０６２）、ならびに他のＴ細胞免疫グロブリンおよび１−ドメイン含有（ＴＩＭ）受容体（ＴＩＭ−１（配列０６３）、ＴＩＭ−２（配列０６４）、およびＴＩＭ−４（配列０６５）を含む）、Ａ２ａＲ（配列０６６）、またはＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ、配列０６７）、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン依存性阻害モチーフ、配列０６８）、もしくはＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ、配列０６９）モチーフ、ドメイン、またはペプチドを含有する任意の貫通膜、表在性膜、膜結合、もしくは細胞質タンパク質、例えば、ＣＤ２４４（２Ｂ４、配列０７０）およびＴＩＧＩＴ受容体（配列０７１）のうちの１つである、請求項２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６】
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの前記第１が、免疫学的チェックポイントリガンドを含む、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項７】
前記免疫学的チェックポイントリガンドが、免疫学的チェックポイント受容体においてシグナル伝達を誘発することができるタンパク質、ドメイン、またはペプチドである、請求項６に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項８】
前記シグナル伝達が、チェックポイントリガンドに結合するチェックポイント受容体がリガンド発現細胞シグナル伝達に関連する逆シグナル伝達である、請求項７に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項９】
前記免疫学的チェックポイントリガンドが、ＰＤ−Ｌ１（配列０７２）およびＰＤ−Ｌ２（配列０７３）、ＣＤ８０（配列０７４）およびＣＤ８６（配列０７５）、Ｂ７ＲＰ１（配列０７６）、Ｂ７−Ｈ３（配列Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４（配列Ｂ７−Ｈ４）、ＨＶＥＭ（配列０７９）、任意の対立遺伝子のＭＨＣ−Ｉ（配列０８０）およびＭＨＣ−ＩＩ（配列０８１）、ＣＤ１３７Ｌ（配列０８２）、ＯＸ４０（配列０８３）、ＣＤ７０（配列０８４）、ＧＡＬ９（配列０８５）、またはＩＴＡＭ、ＩＴＩＭ、もしくはＩＴＳＭモチーフを含有する膜貫通、表在性膜、膜結合、もしくは細胞質受容体／タンパク質に結合するタンパク質、ペプチド、脂質、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、リボ核タンパク質、もしくはデオキシリボ核タンパク質のいずれかに由来する全て、一部、またはペプチドである、請求項６に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１０】
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの前記第１が、免疫調節性サイトカインである、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１１】
前記免疫調節性サイトカインが、白血球においてシグナル伝達を誘導することができるタンパク質、ドメイン、またはペプチドである、請求項１０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１２】
前記免疫調節性サイトカインがインターロイキンである、請求項１１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１３】
前記インターロイキン（ＩＬ）が、ＩＬ−１α（配列０８６）、ＩＬ−１β（配列０８７）、ＩＬ−１Ｒａ（配列０８８）、ＩＬ−３３（配列０８９）、ＩＬ−１８（配列０９０）、ＩＬ−３６Ｒａ（配列０９１）、ＩＬ−３６α（配列０９２）、ＩＬ−３６β（配列０９３）、ＩＬ−３６γ（配列０９４）、ＩＬ−３７（配列０９５）、およびＩＬ−３８（配列０９６）を含むＩＬ−１ファミリーのメンバー、ＩＬ−２（配列０９７）、ＩＬ−３（配列０９８）、ＩＬ−４（配列０９９）、ＩＬ−５（配列１００）、ＩＬ−６（配列１０１）、ＩＬ−７（配列１０２）、ＩＬ−８（配列１０３）、ＩＬ−９（配列１０４）、ＩＬ−１０（配列１０５）、ＩＬ−１１（配列１０６）、ＩＬ−１２（配列１０７）、ＩＬ−１３（配列１０８）、ＩＬ−１４（配列１０９）、ＩＬ−１５（配列１１０）、ＩＬ−１６（配列１１１）、ＩＬ−１７（配列１１２）、ＩＬ−１９（配列１１３）、ＩＬ−２０（配列１１４）、ＩＬ−２１（配列１１５）、ＩＬ−２２（配列１１６）、ＩＬ−２３（配列１１７）、ＩＬ−２４（配列１１８）、ＩＬ−２５（配列１１９）、ＩＬ−２６（配列１２０）、ＩＬ−２７（配列１２１）、ＩＬ−２８（配列１２２）、ＩＬ−２９（配列１２３）、ＩＬ−３０（配列１２４）、ＩＬ−３１（配列１２５）、ＩＬ−３２（配列１２６）、またはＩＬ−３５（配列１２７）である、請求項１２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１４】
前記免疫調節性サイトカインがインターフェロンである、請求項１０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１５】
前記インターフェロンが、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型インターフェロンである、請求項１４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１６】
前記免疫調節性サイトカインがケモカインである、請求項１０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１７】
前記ケモカインが、Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、またはＣＸ３Ｃケモカインである、請求項１６に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１８】
前記免疫調節性サイトカインがＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンドである、請求項１０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項１９】
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンドが、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、およびＣＤ７０または４−１ＢＢＬのうちの１つである、請求項１８に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２０】
前記免疫調節性サイトカインが、非標準の化学運動性または走化性の物質である、請求項１０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２１】
前記非標準の化学運動性または走化性の物質が、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、およびＳｌｉｔ３のうちの１つである、請求項２０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２２】
前記エフェクターが、白血球、任意選択でＴおよびＢ細胞においてアポトーシス、壊死、細胞分裂停止、寛容化、または反応不顕性を誘導することができる、タンパク質、ドメイン、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、糖タンパク質、リポタンパク質、リボ核タンパク質、デオキシリボ核タンパク質、共有結合修飾されたペプチド、もしくは１０，０００ダルトン未満の小分子、またはそれらの組み合わせもしくはそれらの分子キメラを含む、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２３】
前記エフェクターが、ＣＤ９５Ｌ（別名ＦａｓＬ、配列００１）、ＴＲＡＩＬ（別名Ａｐｏ２Ｌ、配列００２）、またはＴＷＥＡＫ（別名腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２、配列００３）を含む細胞死受容体リガンドを含む、請求項２２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２４】
前記エフェクターが修飾された細菌毒素である、請求項２２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２５】
前記修飾された細菌毒素が、細胞内の細胞傷害性エフェクターの送達に関してＡ−Ｂ毒素、またはオートトランスポーターであり、前記細胞傷害性エフェクターが、カスパーゼ、細菌毒素、または他の酵素であり得る、請求項２４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２６】
前記エフェクターがＮＫ活性化受容体リガンドである、請求項２２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２７】
前記ＮＫ活性化受容体リガンドが、ＮＫＧ２Ｄに結合するＭＩＣＡ（配列０２３）もしくはＭＩＣＢ（配列０２４）、ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ１−６（配列０２５〜０３０）、Ｒａｅ−１（配列０３１）、ＭＵＬＴ１（配列０３２）、もしくはＨ６０（配列０３３）、ＤＮＡＭ−１リガンド、ＣＤ１５５（配列０３４）もしくはＣＤ１１２（配列０３５）、ＮＫｐ３０に結合するＢ７−Ｈ６（配列０３６）もしくはＢＡＴ３（配列０３７）、またはＣＤ７０に結合するＣＤ２７を含む、請求項２６に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２８】
前記エフェクターが、１０，０００ダルトン未満の細胞傷害性または細胞分裂停止物質小分子である、請求項２２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項２９】
前記細胞傷害性または細胞分裂停止物質小分子が、微小管もしくはアクチン細胞骨格調節物質、ＤＮＡ複製阻害剤、リボソーム阻害剤、ＲＮＡ合成阻害剤、放射性核種、またはそれらの配位複合体である、請求項２８に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３０】
前記エフェクターが免疫調節性サイトカインである、請求項２２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３１】
前記免疫調節性サイトカインが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、標準のケモカイン（例えば、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、およびＣＸ３Ｃのクラス）、または非標準の走化性もしくは化学運動性の物質（例えば、Ｓｌｉｔ１、２、および３）である、請求項３０に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３２】
前記エフェクターが、ヒト、マウス、ブタ、またはイヌの免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項２２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３３】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ免疫グロブリン、またはそれらのサブクラスのものである、請求項３２に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３４】
前記分子キメラの前記２、３、４、または５つのタンパク質、ドメイン、またはペプチドが、共有結合または非共有結合による結合複合体である、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３５】
（１）免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、もしくは免疫調節性サイトカイン、および（２）ヘテロ二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、もしくはオリゴマー化ドメイン、またはそれらの組み合わせの分子キメラからなるＰａｎｔＩｄ分子であって、前記分子キメラが、エフェクターと、ヘテロ二量体化ドメイン、ホモ二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、もしくはオリゴマー化ドメイン、またはそれらの組み合わせとの分子キメラと混合されるか、または混合可能である、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３６】
自己反応性Ｂ細胞が免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、および／または免疫調節性サイトカインに応答する自己免疫障害の治療のためのＰａｎｔＩｄ分子であって、前記分子が、免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、および／または免疫調節性サイトカインと、ヘテロ二量体化ドメイン、ホモ二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、もしくはオリゴマー化ドメイン、またはそれらの組み合わせとの分子キメラを含み、前記キメラがＢ細胞活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を誘導する、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３７】
エフェクターに対するＢまたはＴ細胞自己抗原の分子キメラからなるＰａｎｔＩｄ分子であって、前記キメラが、非共有結合または共有結合キメラ化により形成される、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３８】
（ａ）エフェクター分子に対応する核酸、合成タンパク質、またはペプチドのうちの１つ、および（ｂ）免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、または免疫調節性サイトカインからなる、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項３９】
前記エフェクター分子に対応する前記核酸、合成タンパク質、またはペプチドが、発現プラスミド、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ｍＲＮＡ、合成タンパク質、合成ペプチド、または核酸、タンパク質、もしくはペプチドを含む形質導入もしくはトランスフェクトされた細胞を含む、請求項３８に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項４０】
前記分子が、リボソーム翻訳、細菌培養、古細菌培養、真菌培養、植物培養、動物培養、またはヒト細胞培養によりインビトロで発現された、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項４１】
前記分子が、生物全体により発現された、請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項４２】
自己免疫疾患または障害の治療のための組成物であって、前記組成物が、請求項１に記載の１つ以上の精製されたＰａｎｔＩｄ分子を含む、組成物。
【請求項４３】
請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子を細胞培養上清に添加することと、
前記ＰａｎｔＩｄ分子を特徴づけることと、を含む、方法。
【請求項４４】
請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子を細胞内に微量注入することと、
前記ＰａｎｔＩｄ分子を特徴づけることと、を含む、方法。
【請求項４５】
自己免疫疾患または障害を治療する方法であって、
請求項１に記載のＰａｎｔＩｄ分子または請求項４１に記載の組成物を、それを必要とする動物に導入することと、
前記疾患または障害を治療することと、を含む、方法。
【請求項４６】
前記動物がヒトまたはマウスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記導入が投与による、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与が、注射、鼻腔内送達、経皮、または経上皮送達による、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｐａｎｔｉｄ分子が、ピルとして製剤化されるか、またはパッチ内に存在するか、または粒子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｐａｎｔｉｄをクローニングすることを含む、Ｐａｎｔｉｄを産生する、方法。
【請求項５１】
Ｐａｎｔｉｄの２つ以上の構成要素を化学的に結合することによりＰａｎｔｉｄを産生する、方法。
【請求項５２】
前記チェックポイント受容体、チェックポイントリガンド、または免疫調節性サイトカインが、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、およびそれらの一部から選択される場合、前記エフェクターが、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、およびそれらの一部から選択されないことを条件とする、請求項１もしくは５のいずれか１項に記載のＰａｎｔＩｄ、または請求項１〜５１に記載の組成物および方法のいずれかで使用するための、ＰａｎｔＩｄ。
【請求項５３】
前記チェックポイント受容体がＣＴＬＡ−４ではないことを条件とする、請求項１〜５２に記載の組成物または方法のいずれかで使用するための、ＰａｎｔＩｄ。
【請求項５４】
自己反応性Ｂ細胞が、免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、および／または免疫調節性サイトカインに応答する自己免疫疾患または障害の治療のためのＰａｎｔＩｄ分子であって、前記分子が２、３、４、または５つ、５つまでのタンパク質、ドメイン、またはペプチドの分子キメラを含み、
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの第１が、免疫学的チェックポイント受容体、チェックポイントリガンド、または免疫調節性サイトカインのうちの１つであり、
前記タンパク質、ドメイン、またはペプチドの第２がエフェクターである、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項５５】
自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失による自己免疫疾患または障害の治療のためのＰａｎｔＩｄ分子であって、前記ＰａｎｔＩｄ分子が、免疫学的チェックポイント受容体、チェックポイントリガンド、免疫調節性サイトカイン、または本明細書に記載の任意の他の同族抗原から選択される第１のタンパク質、ドメイン、またはペプチドを含み、第２のタンパク質、ドメイン、またはペプチドエフェクターが、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域である、ＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項５６】
前記ＰａｎｔＩｄの前記第１または第２のドメイン、タンパク質、またはペプチドが、ＴおよびＢ細胞上に発現されるＩＴＩＭ受容体、またはそれらの一部に対するリガンドを含む、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項５７】
ＩＴＩＭレセポートに対する前記リガンドが、ＣＴＬ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＬＡＩＲ−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３３、ＣＤ２２、Ｓｉｇｌｅｃ−４、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＦｃγＲＩＩ、ＣＤ５、ＣＤ６６ａ、ＰＩＲ−Ｂ、ＩＬＴ−２、またはＣＤ７２である、請求項５６に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項５８】
前記第２のタンパク質、ドメイン、またはペプチドが、細胞死受容体またはその一部に対するリガンドである、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項５９】
前記細胞死受容体が、ＴＲＡＩＬ１、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、またはＦａｓＬである、請求項５８に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６０】
前記ＰａｎｔＩｄが、アフィニティ精製エピトープＶ５またはＨＡペプチドを含む、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６１】
前記ＰａｎｔＩｄがヘテロ二量体化配列を含む、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６２】
前記ＰａｎｔＩｄが、Ｂ細胞表面マーカーに特異的なペプチドまたはリガンドに結合する、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６３】
前記ＰａｎｔＩｄが、細菌、真菌、またはウイルス毒素にコンジュゲートする、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６４】
前記ＰａｎｔＩｄが、代謝拮抗薬、放射性核種、細胞傷害性薬物、シグナル伝達経路調節物質、リポソーム剤、またはエンドソーム破壊剤にコンジュゲートされる、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６５】
前記ＰａｎｔＩｄが自己抗原−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＰａｎｔＩｄが、自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失のためにホモ二量体もしくはヘテロ二量体、または高次ヘテロ−オリゴマーを形成する、請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６６】
ヘテロ二量体化または高次ヘテロ−オリゴマー化が、ヘテロ二量体化ドメインにより指向される、請求項６５に記載のＰａｎｔＩｄ分子。
【請求項６７】
請求項５４に記載のＰａｎｔＩｄ分子をコードする、レンチベクターまたは他の発現ベクター。
【請求項６８】
自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失のためのＰａｎｔＩｄを創出する目的の、自己抗原のハイスループット同定のための方法。
【請求項６９】
前記ＰａｎｔＩｄの発現および精製のための方法。
【請求項７０】
自己反応性Ｂ細胞の欠失のための、または自己抗原−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態もしくは薬力学特性のための、ヒト、ペット、および／または家畜における自己抗原−Ｆｃ  ＰａｎｔＩｄの使用。
【請求項７１】
内在性循環抗体の排除のためにプラスマフェレーシスを用いた、または用いない、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む動物における自己抗原−Ｆｃ  ＰａｎｔＩｄの使用。
【請求項７２】
前記ＰａｎｔＩｄが自己抗原−Ｆｃである、請求項６８または６９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
通常の寛容原性機構
自己免疫障害は、内在性宿主タンパク質に対する適応免疫応答を通常防止する寛容原性および寛容原性機構の段階的で、しばしば漸進的な低下を特徴とする。正常なＢおよびＴ細胞の発達中、自己反応性細胞は、それぞれ骨髄および胸腺で排除され、宿主組織およびタンパク質に対して「中枢性寛容」を創出する。Ｂ細胞に関して、Ｂ細胞の発達場所である骨髄に存在する細胞表面タンパク質に対して高親和性のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の発現は、アポトーシスをもたらす。加えて、偏在性の可溶性リガンドに応答するＢ細胞は、反応不顕性により不活性化される。Ｔ細胞に関して、同様のプロセスはＴ細胞発達場所である胸腺で生じる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ複合体に存在する自己抗原ペプチドに対して高親和性で応答するＴ細胞もアポトーシスにより削除される。該ペプチド−ＭＨＣ複合体に対して中間または低親和性のＴ細胞に関して、これらの細胞は、末梢性寛容の維持を助ける調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に発達し得、代替的に、これらの細胞は、反応不顕性になるか、またはアポトーシスを受ける場合がある。
【背景技術】
【０００２】
末梢性寛容は、中枢免疫系外の宿主タンパク質に対する適応免疫応答を防止する一連の機構を指す。前述のように、これらは、自己抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体に応答して免疫抑制性エフェクターを発現することにより末梢性寛容の維持を助ける中枢的に発生するＴｒｅｇ細胞を含む。Ｔｒｅｇ抑制機構は、今もなお定義されているが、可溶性の免疫抑制性エフェクターおよび細胞接触特異的免疫抑制因子の分泌を含む。前の機構では、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、アデノシン（ＣＤ３９およびＣＤ７３により産生される）、およびＩＬ−３５は、Ｔｒｅｇ細胞から分泌されて、ＴおよびＢ細胞の活性化を防止することができる免疫抑制環境を創出し、寛容原性ＡＰＣを創出する１。細胞接触機構において、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、膜結合ＴＧＦ−β、およびパーフォリン、ならびにグランザイムは免疫抑制に寄与する１。また抹消において、自己反応性Ｔ細胞は、アポトーシスされる（ａｐｏｐｔｏｓｅｄ）か、またはＢＴＬＡ＋樹状細胞などの寛容原性ＡＰＣにより抹消性Ｔｒｅｇに変換され得る２。これらの抹消性Ｔｒｅｇ（ｐＴｒｅｇ）は、中枢または胸腺Ｔｒｅｇ（ｃＴｒｅｇｓまたはｔＴｒｅｇ）に関して記載される機構の多くにより末梢性寛容に寄与した。
【０００３】
末梢性寛容の追加機構は、Ｔ細胞活性化の共刺激のための一般的な要件である。Ｔ細胞がペプチド−ＭＨＣ複合体としてそれらの同族抗原に関与する場合、共刺激の存在により２つの推定結果が存在する：Ｔ細胞発現ＣＤ２８に結合するＣＤ８０またはＣＤ８６などの共刺激アゴニストの存在下では、Ｔ細胞は活性化された状態になり、増殖およびエフェクター機能の関与をもたらし、代替えの場合では、共刺激が不在であるか、またはＴ細胞が共刺激シグナルの代わりに、もしくはそれと組み合わせて阻害シグナルを受容する場合、Ｔ細胞は、アポトーシス、反応不顕性化（ａｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎ）、またはｐＴｒｅｇへの変換を受ける場合がある。Ｂ細胞に関して、同様の共刺激要件はＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化のために存在し、Ｔ細胞発現ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞活性化のためにＢ細胞発現ＣＤ４０に結合しなければならない。共刺激（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ４０）のこれらの標準モダリティは最もよく説明されているが、さらなる共刺激因子および共阻害因子が最近解明された。抗原関与の結果を累積的に決定するそのような受容体およびそれらのリガンドは、免疫チェックポイント受容体またはリガンドと呼ばれ、現在、これらの免疫学的チェックポイントは１５のシグナル伝達軸を含む（図１）。
チェックポイント受容体へのベースライン調節性自己反応性の一例では、Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２０１３）が免疫チェックポイントリガンドＰＤ−Ｌ１を自然に認識するＣＤ８  Ｔ細胞の存在を示した７。これらの抗ＰＤ−Ｌ１細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、健康な患者、および多くは腎細胞がん腫または悪性黒色腫を有する患者において観察され、天然に存在する抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＴＬが腫瘍微小環境において炎症中高レベルのＰＤ−Ｌ１発現に応答し、がん患者において抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＴＬ応答の増加をもたらすと推測された７。著者は、これらの天然に存在する抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＤ８  Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１発現細胞の頻度を調節することによって健康な患者において免疫調節の役割を果たし得、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＴＬがＰＤ−Ｌ１発現ＡＰＣを排除することにより自己免疫を低減し得ることも述べた。この同じグループは、ＣＤ４  Ｔ細胞の炎症性サブセットである抗ＰＤ−Ｌ１  Ｔｈ１７細胞の存在を認め、これらの細胞も、抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＴＬの場合と同じように、ベースライン免疫および抗がん免疫の両方を調節すると仮定された８。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｏｊｋａ，Ｄ．Ｋ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．−Ｈ．＆  Ｆｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  −  ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｒｓｅｎａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｍｏｖｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２４，１３−２２  （２００８）．
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＢＴＬＡ  ａｎｄ  ＨＶＥＭ  Ｇｏｖｅｒｎ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｔｈｙｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４５，１０６６−１０７７  （２０１６）．
【非特許文献３】Ｍｕｎｉｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＨＬＡ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬ  Ｔｈａｔ  Ａｒｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｌｉｇａｎｄ  ＰＤ−Ｌ１  Ｏｃｃｕｒ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３，１７６４−１７７６  （２０１３）．
【非特許文献４】Ｍｕｎｉｒ，Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｇ．Ｈ．，Ｓｖａｎｅ，Ｉ．Ｍ．＆  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｈ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＰＤ−Ｌ１  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２，（２０１３）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載され請求される発明は、この概要に説明または記載または参照されるものを含むがこれらに限定されない多くの特性および態様を有する。包括的であることは意図されず、本明細書に記載され請求される発明は、この概要において同定される特徴または実施形態に、またはそれによって限定されず、この概要は単に図示の目的のために含まれ、制限するものではない。
【０００６】
一態様では、本明細書に記載される技術は、同族抗原がチェックポイント受容体またはそれらのリガンドに対応する自己反応性Ｂ細胞の特異的標的のためのＰａｎｔＩｄ、ＰａｎｔＩｄの産生、およびＰａｎｔＩｄの使用に関し、これらの自己反応性Ｂ細胞は、自己免疫疾患の発症および進行に寄与しており、おそらく病因である。一態様では、ＰａｎｔＩｄは、２〜５つの構成要素、例えば、２、３、４、または５つの構成要素、例えば、（１）チェックポイントリガンド、受容体、または免疫調節性サイトカインから選択される第１の構成要素と、（２）エフェクターを含む第２の構成要素とを含む分子キメラであってよく、このエフェクターは、白血球のアポトーシス、壊死、寛容化、または反応不顕性化を誘発する。ＰａｎｔＩｄは、分子キメラに柔軟性を提供するために、２〜５つ、例えば、２、３、４、または５つの構成要素の各々の間にリンカーも含み得る。ＰａｎｔＩｄは、追加のエフェクターおよび／またはホモ二量体化、ヘテロ二量体化、三量体化、四量体化、またはオリゴマー化ドメインも含み得る。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、既知の抗原および抗体またはその断片を含むＰａｎｔＩｄで患者の自己反応性Ｂ細胞を標的とするための方法およびベクターを特徴とする。例えば、ＰａｎｔＩｄは、ＡｂのＦｃ（断片結晶性）部分を含み得、Ｆｃは、抗体のクラスにより、各々２つまたは３つの定常ドメインを含有する２つの重鎖を含む。ヒトは、抗体の各クラスに１つの、５つの異なるクラスのＦｃ受容体（ＦｃＲ）を有する。ＦｃＲハプロタイプまたは遺伝子変異型も報告されている。ＦｃＲを有するＦｃドメインと抗体の他のサブクラスとの相互作用は、他の免疫学的細胞の動員および動員された細胞型を媒介する。したがって、選択されたＦｃＲならびに／または免疫グロブリンの他のクラスおよびサブクラスに結合するＦｃドメインを操作し、所望の免疫細胞型のみを動員する能力が療法に重要である。一態様では、ＩｇＧのＦｃ領域は、自己反応性Ｂ細胞上のＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１〜４などの膜貫通アイソフォームに結合するように操作され得る。Ｂ細胞受容体が自己抗原−Ｆｃ融合タンパク質に結合する場合、Ｂ細胞は細胞溶解を標的とする。他の態様では、本開示のＰａｎｔＩｄはＦｃドメインを含まない場合がある。
【０００８】
本開示のいくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄ構成要素は同じ細胞を標的とする。本開示のいくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄ構成要素は同じ自己反応性Ｂ細胞を標的とする。いくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄは、チェックポイント受容体またはその同族リガンドの細胞外ドメインと、エフェクターまたはエフェクタードメインとを含む分子キメラを含み、このエフェクターまたはエフェクタードメインは、Ｂ細胞のアポトーシス、壊死、または寛容化／反応不顕性化を促進する。いくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄでの治療は自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失をもたらす。例えば、一実施形態では、分子キメラは、ポリクローナル抗ＰＤ−Ｌ１自己反応性Ｂ細胞のアポトーシスを媒介するＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインおよびＦａｓＬ細胞外ドメインを含む。この実施形態では、ＰａｎｔＩｄの投与は抗ＰＤ−Ｌ１自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のＰａｎｔＩｄは粒子を含まない。
【０００９】
一態様では、ＰａｎｔＩｄを含む医薬組成物は、免疫学的チェックポイント受容体もしくはそれらのリガンド、または免疫調節性サイトカインに応答性を示す自己反応性Ｂ細胞を特徴とする自己免疫疾患の治療または寛解に有用である。一態様では、これらのＰａｎｔＩｄは、それらのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を通して自己反応性Ｂ細胞を標的とし、クローン欠失をもたらす。一態様では、抗チェックポイントタンパク質の自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失は、自己免疫に関連する炎症、病的状態、および死亡の顕著な軽減をもたらす。いくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄの投与は、根底にある免疫病理において自己反応性Ｂ細胞の中枢的な役割に関連する自己免疫疾患の症状の臨床寛解をもたらす。より具体的には、これらの抗チェックポイント自己反応性Ｂ細胞が自己免疫疾患において極めて重要な役割を果たす自己免疫疾患および障害に関して、ＰａｎｔＩｄによる自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失は、下流事象を標的とする他の治療薬よりも明らかな臨床利益をもたらす。
【００１０】
本開示の別の態様では、ＰａｎｔＩｄは、自己抗体が結合する治療薬物抗体上にエピトープを含む免疫原性治療薬物抗体の一部を含んでも含まなくてもよい。この態様では、ＰａｎｔＩｄは、治療抗体に対する免疫原性反応の治療に有用である治療抗体からの同族抗原を含む。
【００１１】
抗チェックポイントタンパク質のＴ細胞がベースライン免疫調節において役割を果たす場合、それらの調節不全は自己免疫に寄与し得る。例えば、本明細書に記載されるチェックポイント受容体およびリガンドの１つの役割は、自己抗原自体としてのチェックポイントタンパク質の役割である。この能力において、免疫学的チェックポイントタンパク質への自己抗体およびＴ細胞応答は、チェックポイント共阻害因子を遮断するか、チェックポイント共刺激因子を刺激するか、または微妙に均衡が保たれたサイトカインネットワークを調節不全にすることができる。これらの免疫応答は、未調節のＴおよびＢ細胞活性化を促進することにより自己免疫病理を悪化、増強、および場合によってはさらに扇動する。
【００１２】
一態様では、本開示は、臨床的に自己免疫に寄与している免疫学的チェックポイントタンパク質への自己反応性適応免疫応答を無効にすることにより、自己免疫疾患および障害を治療または寛解するための組成物および方法に関する。１つの非限定的な例として、抗チェックポイントタンパク質の急な増加は、チェックポイント陽性Ｔｒｅｇを排除し得、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＴＬおよびＴｈ１７応答は、ＰＤ−Ｌ１陽性Ｔｒｅｇを排除することができ、末梢性寛容の極めて重要な構成要素を弱体化させる。本開示のＰＤ−Ｌ１  ＰａｎｔＩｄは、一態様では、寛容の回復に有用である。
【００１３】
本開示は、以下の目的のための、チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカインに対する自己免疫応答の検出および同定のための方法にも関する：（１）十分に特徴づけされた自己免疫障害（すなわち、全身性エリテマトーデス）における該応答の有病率を決定すること、（２）チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカインに重点を置いて、候補ＰａｎｔＩｄ分子キメラパートナーのリストをさらに定義し拡大すること、（３）ならびに患者のためにＰａｎｔＩｄ療法を調整すること（ＰａｎｔＩｄのサブセットが患者の血清の免疫反応性プロファイルに基づいて投与され得る）。
【００１４】
これに従って、患者の血清のスクリーニング、ＰａｎｔＩｄのクローニング、およびインビトロ、インビボモデル、および患者におけるＰａｎｔＩｄ投与のための方法が記載される。一態様では、本開示は、患者試料を２つ以上のチェックポイントタンパク質、チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカイン、またはそれらの一部のパネルと接触させて、患者試料中の自己抗体と複合体を形成することと、任意の複合体を検出することとを含む、患者の血清のスクリーニング方法に関する。いくつかの実施形態では、パネルは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のチェックポイントタンパク質、チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカイン、またはそれらの一部もしくはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、パネルは、チェックポイントタンパク質、チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカイン、ならびに他のタンパク質を含む、最大９，０００またはそれを超えるヒトタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、プロファイルは逆相タンパク質マイクロアレイ（ＲＰＭＡ）を使用して得られる。いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄ療法は、患者の免疫反応性プロファイルに基づいて調整され、患者に投与される。いくつかの実施形態では、チェックポイントタンパク質、チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカイン、またはそれらの一部のパネルは、標識されたポリペプチドもしくはその一部、または標識された抗ヒト抗体を含み得、標識された複合体は、本明細書でさらに記載される患者の免疫反応性プロファイルを得るために検出される。いくつかの実施形態では、標識は、例えば、酵素、化学発光、蛍光、またはナノ粒子の標識であり得る。
【００１５】
チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカインに対する自己免疫応答の検出により、広範囲の抗チェックポイントタンパク質ＴおよびＢ細胞自己反応性が全身性自己免疫に寄与し、かつ／またはそれに完全に関与するかを決定する。この決定は、本開示のＰａｎｔＩｄを使用して、自己免疫障害の発生および治療に関する現在のパラダイムを根本的に変える可能性がある。
【００１６】
例として、抗免疫学的チェックポイント応答は、自己免疫障害を有する患者において観察されている。本明細書で例示されるように、逆相タンパク質マイクロアレイ（ＲＰＭＡ）研究は、自己免疫患者の血清において抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＩＬ−１０応答を検出し、対照的に、これらの応答は健康な対照血清において不在であった。この現象の別の例では、意外にも、それは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者の８．２％、関節リウマチを有する患者の１８．８％、全身性硬化症を有する患者の３．１％、ベーチェット病を有する患者の３１．８％、シェーグレン症候群を有する患者の１３．３％で検出されたが、免疫抑制性チェックポイント受容体ＣＴＬＡ−４に対する検出可能な自己抗体応答を有した健康なドナーは０％であった９。さらに、これらのＣＴＬＡ−４自己抗体は、ベーチェット病におけるぶどう膜炎と負に相関し９、インビトロでＴ細胞増殖を促進したため１０、免疫病理に寄与している。
【００１７】
別の態様では、本開示は、ＰａｎｔＩｄの産生のための方法に関する。そのような方法には、（１）自己反応性Ｂ細胞に結合するチェックポイント受容体、リガンド、または免疫調節性サイトカイン、またはそれらの任意の一部（チェックポイント受容体、リガンド、もしくは免疫調節性サイトカインの任意の細胞外ドメインまたはエピトープを含む）から選択される第１のドメインと、（２）エフェクターもしくはその任意の一部、またはホモ二量体化、ヘテロ二量体化、三量体化、四量体化、またはオリゴマー化ドメインを含む第２のドメインとを含むタンパク質／ペプチド分子キメラのクローニングが含まれ得る。分子キメラＰａｎｔＩｄのクローニングは、ＩＲＥＳ要素もしくはＰ２Ａ／／Ｔ２Ａピコルナウイルススリップ部位、または代替えのポリタンパク質／ポリシストロン発現モチーフおよびモダリティを用いて、または用いずに、任意の核酸発現系または発現系の組み合わせを使用し得る。代替的に、分子キメラは、２つ以上の構成要素を化学結合することにより産生され得る。例えば、一態様では、エフェクターまたはエフェクター分子キメラは、化学カップリング試薬により、免疫学的チェックポイント受容体、リガンド、または免疫調節性サイトカインに共有結合される。
【００１８】
一態様では、本開示は、ウイルスおよび非ウイルスタンパク質の形質導入によるものを含む、組換えタンパク質として細胞培養、動物モデル、およびヒトにおいてＰａｎｔＩｄを導入するための方法に関する。本開示は、細胞生存アッセイ、細胞死アッセイ、細胞代謝アッセイ、細胞分裂停止アッセイ、細胞増殖アッセイ、標的化細胞死滅アッセイ、免疫細胞死滅アッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、サイトカインＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットアッセイ、全血検査アッセイ、白血球計数、ＨＰＬＣおよび質量分光アッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、蛍光および化学発光結合免疫吸着アッセイ、インビボ撮像などを含むがこれらに限定されない、治療有効性または生物活性評価および定量化のための方法も含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】免疫学的チェックポイント受容体およびそれらのリガンドの描写。Ｔ細胞は、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ：ペプチド複合体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合すると、「シグナル１」と描写される一次シグナルを受信する。このシグナルは、活性化、反応不顕性、またはアポトーシスのためにＴ細胞を予備刺激する。しかしながら、Ｔ細胞の運命は、これら３つの結果のうちの１つへのＴ細胞応答を偏らせる可能性がある刺激および阻害免疫学的チェックポイント受容体シグナル伝達の特異的な組み合わせによって最終的に決定される。
【図２Ａ】２つのＰａｎｔＩｄ技術の具体化図２Ａは、ＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ共有結合分子キメラのＤＮＡ断片図を提供する。図２Ｂは、同族ヘテロ二量体化ドメインを有する分子キメラとしてＰＤ−Ｌ１およびＦａｓＬを別個にコードする２つのＤＮＡ断片の図を提供する。いくつかの実施形態では、図２ＢからのＰａｎｔＩｄは、ＰＤ−Ｌ１−ＣＣ−ＢＮ４：ＦａｓＬ−ＣＣ−ＡＮ４ヘテロ二量体の産生のために発現構築物内にクローニングされた後、哺乳類細胞内に同時導入される。これは、（Ａ）と同じ治療機能性であるが、より簡単な遺伝子合成、クローニング、およびインビトロ特徴づけで治療機能性を達成する。
【図２Ｂ】同上
【図３Ａ】ＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ分子キメラ断片のプラスミド図であり、レンチベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ内にクローニングされた。図３Ａは、ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ内へのクローニングを可能にする末端制限部位を有するＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ分子キメラ断片を描写する。図３Ｂは、発現ベクターおよび産生細胞のレンチウイルス形質導入のためのレンチベクターの両方として使用されるであろう最終ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターのプラスミド図を提供する。
【図３Ｂ】同上
【図４−１】アミノ酸配列。
【図４−２】同上
【図４−３】同上
【図４−４】同上
【図４−５】同上
【図４−６】同上
【図４−７】同上
【図４−８】同上
【図４−９】同上
【図４−１０】同上
【図４−１１】同上
【図４−１２】同上
【図４−１３】同上
【図４−１４】同上
【図４−１５】同上
【図４−１６】同上
【図４−１７】同上
【図４−１８】同上
【図４−１９】同上
【図４−２０】同上
【図４−２１】同上
【図４−２２】同上
【図４−２３】同上
【図４−２４】同上
【図４−２５】同上
【図４−２６】同上
【図４−２７】同上
【図４−２８】同上
【図４−２９】同上
【図４−３０】同上
【図４−３１】同上
【図４−３２】同上
【図４−３３】同上
【図４−３４】同上
【図４−３５】同上
【図４−３６】同上
【図４−３７】同上
【図５】自己抗原−Ｆｃを含むＰａｎｔＩｄの作用機構の描写。自己抗原ＩｇＧ−融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒβに対する循環自己抗体を中和するＩＬ−２Ｒβ  ＥＣＤ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合により表される。ＡＤＣＣ、補体活性化、および自己反応性Ｂ細胞アポトーシスをもたらす、自己抗原Ｆｃ融合タンパク質の自己抗体分泌Ｂ細胞のＢＣＲ（Ｂ細胞抗原受容体）への結合も示される。
【図６】ＰａｎｔＩｄがクローニングされるｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏのプラスミド図。ＳＩＮ  ３´ＬＴＲ、５´ＬＴＲ、Ｒｅｖ−応答エレメント（ＲＲＥ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）  転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が示される。この配列は配列ＩＤ００１３２に対応する。
【図７】ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ内にクローニングされたＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  Ｆｃのプラスミド図。ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域に融合したヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃの細胞外ドメイン．ｎ（ＥＣＤ）を示す。この配列は、ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ多クローニング部位（ＭＣＳ）の５´ＥｃｏＲＩおよび３´ＢａｍＨＩ部位内にクローニングされる。この配列は配列ＩＤ００１３３に対応する。
【図８Ａ】ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ内にクローニングされたＰＤ−Ｌ１（８Ａ）およびＦａｓＬ（８Ｂ）ＰａｎｔＩｄヘテロ二量体のプラスミド図。これらの配列はそれぞれ配列ＩＤ００１３４および００１３５に対応する。
【図８Ｂ】同上
【図９】図９は、ＰａｎｔＩｄ構築物および対照構築物と接触させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清におけるＣＴＬＡ−４  ＰａｎｔＩｄの力価の棒グラフを示す。クローン１〜４と標識される棒（Ｙ軸上の標識を参照されたい）は、４つのｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＣＴＬＡ４−ｈＩｇＧ１Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏクローンの各々でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清からのＣＴＬＡ−４  ＰａｎｔＩｄ力価を示し、２つの陰性対照は、ＣＴＬＡ４−ｈＩｇＧ１挿入物を含まないベクターと接触させた細胞、および培養培地のみと接触させた細胞からの力価を含んだ。ｖＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清の力価も示される。
【図１０】図１０は、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ  ＰａｎｔＩｄがホモ二量体構造をとることを実証するウエスタンブロットを示す。ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃについての結果が示される。ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  ＦＣ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏクローン１〜４はＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、上清は還元剤の存在下または不在下で分析された。左から最初の４つのレーンは、還元剤に曝された４つのクローンの各々からの試料を同定する。次の４つのレーンは、４つのクローンの各々からの試料であり、還元剤の不在下のＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ  ＰａｎｔＩｄのオリゴマー、ホモ二量体、および単量体の構造を同定する。空の親ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターは「Ｅ」で表される。加えて、還元試料において、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ単量体は予想された分子質量４３ｋＤａを示す。より高い分子量バンドはオリゴマーおよびその糖変異型に対応する。
【図１１】抗ヒトＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＰＤ−Ｌ１の抗体に結合するＰａｎｔＩｄの第１の構成要素を示す免疫ブロットである。ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素である精製されたＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４、およびＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４は、ＳＤＳゲル電気泳動により分析され、ニトロセルロース膜に移された。左側のパネルは、マウス抗ヒトＣＴＬＡ−４でプローブされたニトロセルロース膜を示す。左側中央のパネルは、ヤギ抗マウス二次抗体でのみプローブされた同様のニトロセルロース膜を示す。右側中央のパネルは、抗ヒトＰＤ−１抗体でプローブされた同様のニトロセルロース膜を示す。右側のパネルは、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体でプローブされた同様のニトロセルロース膜を示す。
【図１２】ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４がマウス抗ヒトＰＤ−１の組換えヒトＰＤ−１タンパク質への結合を特異的に中和したことを示す実験の結果を描写する。
【図１３】ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４がマウス抗ヒトＰＤ−１の組換えヒトＰＤ−１タンパク質への結合を特異的に中和したことを示す実験の結果を描写する。ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４は、１３６ｎｇまたは３１．８ｎＭのＩＣ５０で１μｇ／ｍｌの抗ヒトＰＤ−１を中和し、ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された分子量４３ｋＤａを示した。
【図１４】抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体による還元および非還元ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ  ＰａｎｔＩｄの特異的結合を示す。
【図１５】Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂によるＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰポリペプチドの精製を示す。
【図１６】Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂によるＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰポリペプチドの精製、ならびにＣＨＯ細胞におけるＰａｎｔＩｄの第２の構成要素ＦａｓＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰおよびＴＲＡＩＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一実施形態では、本開示は、免疫学的チェックポイント受容体もしくはそれらのリガンド、または免疫調節性サイトカインに応答性を示す自己反応性Ｂ細胞を特徴とする自己免疫疾患の治療のための治療薬としてのＰａｎｔＩｄａの使用に関する。
【００２１】
大半の自己免疫疾患に関する自己寛容および自己免疫の機構は十分に理解されていないが、初期寛容の機構が十分に特徴づけられている稀な例がある。例えば、コクサッキーウイルスＢ関連心筋炎３において、初期ウイルス感染の後に心筋および心膜を伴う炎症性続発症が続き、これは、心筋炎の臨床提示を促進する、単核細胞浸潤、心アクチンおよびミオシンに対する抗体、関連ＣＤ４  Ｔ細胞応答に関連する３。この例では、コクサッキーウイルスＢ関連抗原は、心ミオシンおよびアクチンを分子的に模倣し、得られるＴおよびＢ細胞応答は、これらの自己反応性ＴおよびＢ細胞を活性化するための心ミオシンおよびアクチンの能力によりウイルス感染の不在下で継続する。同様に、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ誘導リウマチ性心疾患において、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｍタンパク質に対する適応免疫応答は、心ミオシンおよびアクチンと交差反応し、同様の免疫病理をもたらす４，５。注目すべきは、これらの病原体関連自己免疫状態は典型的には急性であり、したがって、本明細書で認識されるように、自己免疫への他の根底にある素因は、慢性臨床自己免疫疾患を誘導するそのような扇動刺激と一致する可能性がある。
【００２２】
そのため、自己寛容における初期崩壊中、病原体のタンパク質と宿主タンパク質との間の分子模倣は、宿主タンパク質に対するＴおよびＢ細胞反応性を促進することができる。より一般的には、内在性宿主組織における代替えの炎症性刺激の存在は、これらの組織に対して異常なＴおよびＢ細胞応答をもたらし得る。これらの炎症性刺激は、共刺激の要件である末梢性寛容の極めて重要な機構のうちの１つを迂回する免疫学的チェックポイント共刺激因子の発現をもたらし得る。より広範には、チェックポイント共刺激因子の発現をもたらす初期炎症状態は、必ずしも病原体駆動ではなく、病原体関連分子パターン受容体（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン受容体（ＤＡＭＰ）を通して炎症を促進し得る共生細菌、組織損傷、放射線、または化学曝露により引き起こされ得る。代替的に、宿主タンパク質に共有結合し、それらに免疫原性を付与するハプテンへの曝露は、共刺激の存在下で自己免疫応答をもたらし得る。
【００２３】
自己免疫への一遺伝子および多遺伝子素因は寛容破壊のこれらの機構に重ねられ、これらは以下を含むがこれらに限定されない：（１）特定の宿主ペプチドの有効なＭＨＣ提示に関連し、したがって、宿主をこれらのペプチドに対してＴ細胞応答させる、特異的なＨＬＡハプロタイプ、（２）免疫学的チェックポイント受容体もしくはリガンド発現または機能の遺伝的または後成的調節不全、これは、適応免疫系を全身的活性化へ偏らせる不均衡を創出し得る、ならびに（３）慢性炎症を促す非チェックポイントタンパク質の遺伝子変異（例えば、タイトジャンクションタンパク質変異、これは共生細菌に対する慢性曝露および慢性炎症を促進し得る）。自己免疫に対するこれらの根底にある遺伝的素因が前述の扇動刺激のうちの１つと組み合わされると、急性自己免疫は、慢性自己免疫、病的状態、および死亡をもたらし得る。
【００２４】
他の状況では、抗腫瘍もしくは抗ウイルス療法のためのチェックポイント共刺激アゴニストまたはチェックポイント共阻害因子アンタゴニストの投与は、中枢および末梢性寛容原性機構を弱体化させることにより日和見自己免疫障害を促進する可能性があり、これらの場合において、治療薬の投与後、患者は、全身性免疫学的脱抑制により免疫関連有害事象（ＩＲＡＥ）を示す６。これらのＩＲＡＥは頻繁であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体を受ける患者の９０％、およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断抗体を受ける患者の７０％において生じる６。大半のＩＲＡＥは、主に皮膚および消化管に影響を及ぼすＩ〜ＩＩ〜軽度の症状としてグレード分けされるが、より重度のＩＩＩ〜Ｖグレードの症状は珍しいわけではなく、１〜１０％の患者に影響を及ぼす６。チェックポイント遮断療法の新規性により、治療後の管理、慢性作用、およびＩＲＡＥ持続は今もなお特徴づけされており、そのため、これらのＩＲＡＥが新しいカテゴリーの全身性慢性自己免疫疾患を含むかは不明である。
【００２５】
前に述べたように、チェックポイント受容体は、遺伝的に素因のある集団において、宿主抗原に応答することをＴおよびＢ細胞に許可することにより、自己免疫に中心的に寄与する。これらの場合では、炎症に関連するＤＡＭＰおよびＰＡＭＰ受容体シグナル伝達は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの発現を駆動し、組み合わせて、これらは、ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＣＤ４０Ｌを含むチェックポイント受容体発現を促進し、したがって、末梢性寛容に必要な共刺激の要件を排除する。その後、ＢおよびＴ細胞は、活性化し、増殖し、以下などの自己免疫の臨床所見に寄与する免疫病理学的エフェクター機能を示す：（１）Ｂ細胞による自己抗体産生、（２）自己抗体媒介細胞死滅および免疫複合体形成、（３）活性化された自然免疫細胞により媒介されるサイトカイン関連炎症および炎症関連組織損傷、損傷した宿主組織、およびＣＤ４  Ｔ細胞、ならびに（４）ＣＤ８Ｔ細胞による標的化された宿主Ｔ細胞死滅。並行して、これらの現象は、それぞれエピトープおよび抗原拡散と呼ばれる、１つの抗原上の１つのエピトープから１つの抗原上の複数のエピトープ、複数の抗原への適応免疫応答の段階的な広幅化である。これは寛容および機能寛容原性機構の段階的な低下と広く一致する。
【００２６】
一実施形態では、本開示は、免疫学的チェックポイント受容体もしくはそれらのリガンド、または免疫調節性サイトカインに応答性を示す自己反応性Ｂ細胞を特徴とする自己免疫疾患の治療のための治療薬としてのＰａｎｔＩｄおよびそれらの使用に関する。いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄは、２〜５つのタンパク質、ドメイン、またはペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄは、いくつかの実施形態では、少なくとも（１）チェックポイントリガンド、受容体、または免疫調節性サイトカインから選択される第１の構成要素と、（２）エフェクターから選択される第２の構成要素とを含み得る２つ以上の構成要素を含む分子キメラであり、このエフェクターは、白血球のアポトーシス、壊死、寛容化、または反応不顕性化を誘発する。分子キメラは、追加のエフェクターおよび／またはホモ二量体化、ヘテロ二量体化、三量体化、四量体化、またはオリゴマー化ドメインも含み得る。Ｐａｎｔｉｄの第１の構成要素は、リガンドに結合し、白血球またはリンパ系組織関連細胞、例えば、自己反応性Ｂ細胞内でシグナル伝達を誘発する。Ｐａｎｔｉｄは、２つ以上の構成要素またはドメイン間にリンカーも含み得る。本開示のいくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄ構成要素は同じ細胞を標的とする。本開示のいくつかの態様では、ＰａｎｔＩｄ構成要素は同じ自己反応性Ｂ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のＰａｎｔＩｄは粒子を含まず、例えば、ＰａｎｔＩｄは、微小粒子、ナノ粒子、または他の粒子担体もしくはビーズを含まない。
【００２７】
リンカーは、ａ）ＰａｎｔＩｄが生理学的条件下で安定している、ｂ）リンカーとＰａｎｔＩｄとの間の接続がＰａｎｔＩｄのその標的に結合する能力を変更しないように、第１の構成要素と第２の構成要素とを接続する試薬、分子、または巨大分子であり得る。
【００２８】
一実施形態では、リンカーはペプチド結合であり得る。ＰａｎｔＩｄは、第１の構成要素からの１つ以上のアミノ酸セグメント、および第２の構成要素からの１つ以上のアミノ酸セグメントを含む融合ポリペプチドであり得る。第１の構成要素のアミノ酸セグメントは第２の構成要素のアミノ酸セグメントと近接し得るか、またはそれらは構造スペーサーとして挿入されたアミノ酸により分離され得る。スペーサーセグメントは１つ以上のアミノ酸であり得る。１つ以上のアミノ酸は、同じまたは異なるアミノ酸を含み得る。ＰａｎｔＩｄをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も包含する。
【００２９】
別の実施形態では、第１の構成要素および第２の構成要素は、化学合成またはインビボでの合成のいずれかを通して別個に得られ、精製され、その後、非共有結合または共有結合され得る。非共有結合は、例えばイオン結合であり得る。共有結合は、化学架橋剤、例えば、ホモ二官能性架橋試薬またはヘテロ二官能性架橋試薬を通してであり得る。別の実施形態では、第１の構成要素および第２の構成要素は、例えば、線状もしくは分岐ポリマーまたはコポリマー（例えば、ポリアルキレン、ポリ（エチレン−リジン）、ポリメタクリレート、ポリアミノ酸、多糖もしくはオリゴ糖、またはデントリマー）を含む、結合ポリマーを通して接続され得る。
【００３０】
第１の構成要素および第２の構成要素は、それらのそれぞれの標的に特異的に結合する。一般に、標的に特異的に結合する構成要素は、閾値レベルの結合活性を示し、かつ／または関連する標的分子と顕著に交差反応しない。構成要素の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析により決定され得る。例えば、第１の構成要素または第２の構成要素は、密接に関連するか、または関連しない標的よりも、標的に対して、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍以上の親和性でそのそれぞれの標的に結合することができる。第１の構成要素または第２の構成要素は、高親和性（１０−４Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−９Ｍ以下で、またはサブナノモル親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭ、またはさらにそれ以下）でその標的に結合することができる。第１の構成要素または第２の構成要素はまた、標的へのそれらの結合親和性に関して記載されるか、または特定されてもよく、例えば、結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、もしくは１０−１５Ｍ未満、またはそれ以下のＫｄのものを含む。
【００３１】
一実施形態では、キメラは、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよびアポトーシス誘導ＦａｓＬ細胞外ドメインを含む。１つの具体化では、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、アポトーシス誘導ＦａｓＬ細胞外ドメインとの分子キメラとしてクローニングされ、それらのＢＣＲを通して抗ＰＤ−Ｌ１自己反応性Ｂ細胞に結合するとき、Ｂ細胞発現ＦａｓのＦａｓＬ関与は、Ｂ細胞アポトーシスおよびこの自己反応性クローンのクローン欠失を促進する（図２Ａ）。この実施形態では、１つ以上のエフェクタークラスとの複数のチェックポイント受容体、リガンド、または免疫調節性エフェクター分子キメラを含む１つ以上のＰａｎｔＩｄは、治療作用を誘発するために、動物モデルまたはヒト患者に静脈内投与される。
【００３２】
インビトロで、ＰａｎｔＩｄは、インビトロ作用を決定するために、培養物の上清に添加される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、分子キメラは、チェックポイントリガンド、受容体、または免疫調節性サイトカイン、およびＴｈｏｍａｓら、２０１３１１に記載されるようなヘテロ二量体化ドメイン、またはＭｉｔｔｌら、２０００１２に記載されるようなホモ二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメインを含む（配列１３１）。いくつかの実施形態では、同族ヘテロ二量体化ドメインは、本明細書で開示される任意のエフェクター、例えばＦａｓＬとの分子キメラとしても発現される。クローニングされ、同時発現される場合、例えば、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインおよびヘテロ二量体化ドメインＣＣ−ＡＮ４の分子キメラ（配列１２９）は、同族ヘテロ二量体化ドメイン、例えばＣＣ−ＢＮ４１１（配列１３０）との指向されたアセンブリを可能にし、これは、いくつかの実施形態では、エフェクター（例えばＦａｓＬ）との分子キメラとして発現される。そのため、機能性治療薬ＰＤ−Ｌ１、この例ではＦａｓＬのアセンブリは、翻訳後に達成される（図２Ｂ）。このＰａｎｔＩｄ構築の方法は、ＰａｎｔＩｄの遺伝子合成およびクローニングコストを低減し、エフェクターまたはエフェクターの組み合わせのインビトロ有効性スクリーニングを容易にする。この方法論は、エフェクターおよびチェックポイントタンパク質の相乗作用が容易に同定され得るため、ＰａｎｔＩｄ最適化中に適用される。
【００３４】
第１および第２の実施形態、または本明細書で開示される任意の他の実施形態で使用されるエフェクターは、以下の非限定的な例に説明される、複数のクラスのタンパク質、ドメイン、ペプチド、脂質、グリカン、および化学物質、ならびにそれらの複合体および分子キメラを含み得る。
【００３５】
例えば、いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄのエフェクター構成要素は、ＰａｎｔＩｄのエフェクタークラスのＣＤ９５Ｌ（別名ＦａｓＬ、配列００１）、ＴＲＡＩＬ（別名Ａｐｏ２Ｌ、配列００２）、およびＴＷＥＡＫ（別名腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２、配列００３）を含む細胞死受容体リガンドから選択され得るか、またはそれを含まない場合がある。いくつかの実施形態では、エフェクターは、ＯＸ４０Ｌ（配列００４）、ＴＮＦ−α（配列００５）、リンホトキシン−β（別名ＴＮＦ−Ｃ、配列００６）、およびその結合パートナーリンホトキシン−α（別名ＴＮＦ−β、配列００７）、ＣＤ１５４（別名ＣＤ４０Ｌ、配列００８）、ＬＩＧＨＴ（別名ＣＤ２５８  配列００９）、ＣＤ７０（配列０１０）、ＣＤ１５３（配列０１１）、４−１ＢＢＬ（別名ＣＤ１３７Ｌ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー９（配列０１２）、ＲＡＮＫＬ（別名ＣＤ２５４、配列０１３）、ＡＰＲＩＬ（配列０１４）、神経成長因子リガンド（例えば、ＮＧＦ配列０１５、ＢＤＮＦ（配列０１６）、ＮＴ−３（配列０１７）、およびＮＴ−４（配列０１８）、ＢＡＦＦ（配列０１９）、ＧＩＴＲリガンド（配列０２０）、ＴＬ１Ａ（配列０２１）、ならびにＥＤＡ−Ａ２（配列０２２）を含むが、これらに限定されないＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンドの任意の他のメンバーを含むか、またはそれを含まない場合がある。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄのエフェクター構成要素は、以下のいずれか、もしくはそのリガンドから選択されるか、または以下のいずれか、もしくはそのリガンドを含まない場合がある：（ａ）ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む抹消単核細胞上にみられる阻害受容体である白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ−１）、（ｂ）シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１（ＣＤ１６９）、Ｓｉｇｌｅｃ−２（ＣＤ２２）、Ｓｉｇｌｅｃ−３（ＣＤ３３）、Ｓｉｇｌｅｃ−４（ミエリン関連糖タンパク質）、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ（Ｓｉｇｌｅｃ５〜１２）、（ｃ）Ｆｃ−ガンマ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、（ｄ）白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３（ＬＩＬＲＢ３）、ＰＩＲ−Ｂ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−５、（ｅ）ＣＤ５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ７２。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄのエフェクター構成要素は、（a）修飾された細菌毒素、細胞傷害性エフェクターを細胞内に送達するためのＡ−Ｂ毒素およびオートトランスポーターを含み、該細胞傷害性エフェクターは、カスパーゼ、細菌毒素、もしくは他の酵素であり得る、（ｂ）１０，０００ダルトン未満の細胞傷害性もしくは細胞分裂停止物質小分子、例えば、微小管もしくはアクチン細胞骨格調節物質、ＤＮＡ複製の阻害剤、リボソーム阻害剤、ＲＮＡ合成の阻害剤、放射性核種、およびそれらの配位複合体など、（ｃ）ＮＫ活性化受容体リガンド、ＮＫＧ２Ｄに結合するＭＩＣＡ（配列０２３）およびＭＩＣＢ（配列０２４）；ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ１−６（配列０２５−０３０）、Ｒａｅ−１（配列０３１）、ＭＵＬＴ１（配列０３２）、Ｈ６０（配列０３３）；ＤＮＡＭ−１リガンド、ＣＤ１５５（配列０３４）、およびＣＤ１１２（配列０３５）；ＮＫｐ３０に結合するＢ７−Ｈ６（配列０３６）およびＢＡＴ３（配列０３７）；ならびにＣＤ７０に結合するＣＤ２７を含む、（ｄ）免疫調節性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、標準のケモカイン（例えば、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、およびＣＸ３Ｃクラス）、および非標準の走化性もしくは化学運動性物質（例えば、Ｓｌｉｔ１、２、および３）、または（ｅ）ヒト、マウス、ブタ、またはイヌの免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびそれらのサブクラスを含む）のＦｃドメイン、から選択され得るか、またはそれらを含まない場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＰａｎｔＩｄの生物学的利用能および／または半減期を増加し得る。    いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄエフェクター構成要素は、上に列記されたＦｃドメインのずれかを含まない場合がある。
【００３８】
本開示の一実施形態では、ＰａｎｔＩｄのチェックポイント受容体、リガンド、または免疫調節性サイトカインは、エフェクターの不在下でオリゴマー化される。この１つの具体化では、ＰＤ−Ｌ１オリゴマーは、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）による抗ＰＤ−Ｌ１自己反応性Ｂ細胞の排除のために治療的に適用される。この実施形態では、チェックポイント受容体、リガンド、および免疫調節性サイトカインから選択されるＰａｎｔＩｄの分子キメラの第１の構成要素は、オリゴマー化を達成するために、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、三量体化、四量体化、またはオリゴマー化ドメインとともにクローニングされる。
【００３９】
一実施形態では、免疫学的チェックポイント受容体は、リガンドに結合し、かつ／または自己反応性Ｂ細胞などの白血球もしくはリンパ系組織関連細胞に結合し、それら内でシグナル伝達を誘発する細胞内、膜貫通、または膜結合性タンパク質である。いくつかの実施形態では、白血球またはリンパ系組織関連細胞内でのシグナル伝達は、ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、ＰＩ−３Ｋ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ、ｃＧＭＰ−ＰＫＧ、ＭＡＰＫ、カスパーゼ、ＳＭＡＤ、Ｒｈｏ−ファミリーＧＴＰａｓｅ、チロシンキナーゼもしくはホスファターゼ、脂質キナーゼもしくはホスファターゼ経路により、またはＴおよびＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球、およびマスト細胞）、単球、マクロファージ、または多様な起源および表現型のリンパ系組織関連細胞（例えば、濾胞性樹状細胞）の他のシグナル伝達経路により免疫調節作用を媒介する。
【００４０】
本明細書の実施形態のいずれかでは、チェックポイント受容体は、白血球またはリンパ系組織関連細胞、例えば、自己反応性Ｂおよび／もしくはＴ細胞自己反応性Ｂ細胞もしくはＴ細胞に結合し、かつ／またはそれら内でシグナル伝達を誘発する、以下のタンパク質のいずれか、ならびにその任意の活性部分、ペプチド、もしくはエピトープから選択され得るか、あるいはそれらを含まない場合がある：ＰＤ−１（配列０３８）、ＣＤ２８（配列０３９）、ＣＴＬＡ−４（配列０４０）、ＩＣＯＳ（配列０４１）、ＢＴＬＡ（配列０４２）、ＫＩＲ（キラー免疫グロブリン受容体）（ＫＩＲ２ＤＬ１（配列０４３）、ＫＩＲ２ＤＬ２（配列０４４）、ＫＩＲ２ＤＬ３（配列０４５）、ＫＩＲ２ＤＬ４（配列０４６）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ（配列０４７）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ（配列０４８）、ＫＩＲ２ＤＳ１（配列０４９）、ＫＩＲ２ＤＳ２（配列０５０）、ＫＩＲ２ＤＳ３（配列０５１）、ＫＩＲ２ＤＳ４（配列０５２）、ＫＩＲ２ＤＳ５（配列０５３）、ＫＩＲ３ＤＬ２（配列０５４）、ＫＩＲ３ＤＬ３（配列０５５）、およびＫＩＲ３ＤＳ１（配列０５６）を含む）、ＬＡＧ−３（配列０５７）、ＣＤ１３７（配列０５８）、ＯＸ４０（配列０５９）、ＣＤ２７（配列０６０）、ＣＤ４０（配列０６１）、ＴＩＭ−３（配列０６２）、ならびに他のＴ細胞免疫グロブリンおよび１−ドメイン含有（ＴＩＭ）受容体（ＴＩＭ−１（配列０６３）、ＴＩＭ−２（配列０６４）、およびＴＩＭ−４（配列０６５）を含む）、Ａ２Ａｒ（配列０６６）、およびおよびＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ、配列０６７）、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン依存性阻害モチーフ、配列０６８）、もしくはＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ、配列０６９）モチーフ、ドメイン、またはペプチドを含有する任意の貫通膜、表在性膜、膜結合、もしくは細胞質タンパク質、例えば、ＣＤ２４４（２Ｂ４、配列０７０）およびＴＩＧＩＴ受容体（配列０７１）。いくつかの実施形態では、チェックポイント受容体が、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、またはそれらの一部である場合、エフェクターは、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、またはそれらの一部ではない。いくつかの実施形態では、チェックポイント受容体はＣＴＬＡ−４ではない。
【００４１】
一実施形態では、ＰａｎｔＩｄ分子は、免疫学的チェックポイント受容体においてシグナル伝達を誘発することができるタンパク質、ドメイン、またはペプチドであり得、かつ／または自己反応性Ｂ細胞などの白血球もしくはリンパ系組織関連細胞に結合し、それら内でシグナル伝達を誘発する免疫学的チェックポイントリガンドを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達は、チェックポイントリガンドに結合するチェックポイント受容体がリガンド発現細胞シグナル伝達に関連するか、またはリガンドが受容体もしくはリガンドの両方の特性を示す逆シグナル伝達であり、リガンドに関して一般的に使用される科学共通認識用語が使用される。
【００４２】
この開示の実施形態のいずれかでは、チェックポイントリガンドは、免疫学的チェックポイントにおいてシグナル伝達を誘発し、かつ／または自己反応性Ｂ細胞および／もしくは自己反応性Ｔ細胞などの白血球もしくはリンパ系組織関連細胞に結合し、それら内でシグナル伝達を誘発する、以下のタンパク質のいずれか、ならびにその任意の活性部分、ペプチド、もしくはエピトープから選択され得るか、あるいはそれらを含まない場合がある：ＰＤ−Ｌ１（配列０７２）およびＰＤ−Ｌ２（配列０７３）、ＣＤ８０（配列０７４）およびＣＤ８６（配列０７５）、Ｂ７ＲＰ１（配列０７６）、Ｂ７−Ｈ３（配列Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４（配列Ｂ７−Ｈ４）、ＨＶＥＭ（配列０７９）、任意の対立遺伝子のＭＨＣ−Ｉ（配列０８０）およびＭＨＣ−ＩＩ（配列０８１）、ＣＤ１３７Ｌ（配列０８２）、ＯＸ４０（配列０８３）、ＣＤ７０（配列０８４）、ＧＡＬ９（配列０８５）、またはＩＴＡＭ、ＩＴＩＭ、もしくはＩＴＳＭモチーフを含有する膜貫通、表在性膜、膜結合、もしくは細胞質受容体／タンパク質に結合する任意のタンパク質、ペプチド、脂質、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、リボ核タンパク質、もしくはデオキシリボ核タンパク質。
【００４３】
この開示の実施形態のいずれかでは、免疫調節性サイトカインは、白血球またはリンパ系組織関連細胞、例えば、自己反応性Ｂおよび／もしくはＴ細胞に結合し、かつ／またはそれら内でシグナル伝達を誘発する、以下のタンパク質のいずれか、ならびにその任意の活性部分、ペプチド、もしくはエピトープであり得る：ＩＬ−１ファミリーのメンバー（ＩＬ−１α（配列０８６）、ＩＬ−１β（配列０８７）、ＩＬ−１Ｒａ（配列０８８）、ＩＬ−３３（配列０８９）、ＩＬ−１８（配列０９０）、ＩＬ−３６Ｒａ（配列０９１）、ＩＬ−３６α（配列０９２）、ＩＬ−３６β（配列０９３）、ＩＬ−３６γ（配列０９４）、ＩＬ−３７（配列０９５）、およびＩＬ−３８（配列０９６）を含む）、ＩＬ−２（配列０９７）、ＩＬ−３（配列０９８）、ＩＬ−４（配列０９９）、ＩＬ−５（配列１００）、ＩＬ−６（配列１０１）、ＩＬ−７（配列１０２）、ＩＬ−８（配列１０３）、ＩＬ−９（配列１０４）、ＩＬ−１０（配列１０５）、ＩＬ−１１（配列１０６）、ＩＬ−１２（配列１０７）、ＩＬ−１３（配列１０８）、ＩＬ−１４（配列１０９）、ＩＬ−１５（配列１１０）、ＩＬ−１６（配列１１１）、ＩＬ−１７（配列１１２）、ＩＬ−１９（配列１１３）、ＩＬ−２０（配列１１４）、ＩＬ−２１（配列１１５）、ＩＬ−２２（配列１１６）、ＩＬ−２３（配列１１７）、ＩＬ−２４（配列１１８）、ＩＬ−２５（配列１１９）、ＩＬ−２６（配列１２０）、ＩＬ−２７（配列１２１）、ＩＬ−２８（配列１２２）、ＩＬ−２９（配列１２３）、ＩＬ−３０（配列１２４）、ＩＬ−３１（配列１２５）、ＩＬ−３２（配列１２６）、ＩＬ−３５（配列１２７）、インターフェロン（Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型インターフェロンなど）、Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、およびＣＸ３Ｃクラスのケモカイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、およびＣＤ７０、ならびに４−１ＢＢＬなど）、または非標準の化学運動性および走化性物質（Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、およびＳｌｉｔ３など）、またはＴＧＦ−β（配列１２８）。
【００４４】
例示的なＰａｎｔＩｄは、チェックポイント受容体ＰＤ−Ｌ１およびエフェクターＦａｓＬを含み得る。例示的なＰａｎｔＩｄは、サイトカイン受容体ＩＬ２ＲβおよびエフェクターＩｇＧ１Ｈ定常領域１〜３を含み得る。例示的なＰａｎｔＩｄは、チェックポイント受容体ＣＴＬＡ−４およびエフェクターＩｇＧ１Ｈ定常領域１〜３、ＩｇＧ１Ｈ定常領域２〜３、またはＩｇＧ１Ｈ  Ｆｃ領域を含み得る。
【００４５】
本明細書および本文書全体を通して使用されるように、分子キメラは、タンパク質、ドメイン、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、糖タンパク質、リポタンパク質、リボ核タンパク質、デオキシリボ核タンパク質、および共有結合により修飾されたペプチドから構成される１つ以上のパートナーの任意の共有結合された、または非共有結合された複合体である。
【００４６】
一実施形態では、本開示は、ＰａｎｔＩｄの産生のための方法を特徴とする。そのような方法は、（１）チェックポイント受容体、リガンド、もしくは免疫調節性サイトカイン、またはそれらの任意の活性部分ペプチドもしくはエピトープの、（２）白血球、例えば、Ｂ細胞のアポトーシス、壊死、寛容化を誘発するエフェクター、もしくはその任意の活性部分、および／またはホモ二量体化、ヘテロ二量体化、三量体化、四量体化、もしくはオリゴマー化ドメインとのタンパク質／ペプチド分子キメラとしてのクローニングを含み得る。クローニングおよび発現は、ＩＲＥＳ要素もしくはＰ２Ａ／／Ｔ２Ａピコルナウイルススリップ部位、または代替えのポリタンパク質／ポリシストロン発現モチーフおよびモダリティを用いて、または用いずに、任意の核酸発現系または発現系の組み合わせを利用し得る。そのような核酸発現系は、線状または環状の二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。そのような発現系は、細菌または真核生物起源の複製、抗生物質もしくは親和性選択マーカー、および／または原核生物もしくは真核生物プロモーターを含有するプラスミドを含むか、または含まない場合がある。潜在的な一実施形態では、そのようなプラスミドは、ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）および転写後ウイルス調節配列（ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む）、ならびにそれらから産生されるウイルスまたはサブウイルス粒子を含むがこれらに限定されない、ＨＩＶ、レトロウイルス、または泡沫状スプーマウイルス由来ウイルス配列を含み得る。代替的に、発現は、合成ペプチドおよびその分子キメラを構成し得る。
【００４７】
ＰａｎｔＩｄをコードする核酸は、発現プラスミド、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはｍＲＮＡを含み得る。Ｐａｎｔｉｄは、合成タンパク質、合成ペプチドであるか、または核酸、タンパク質、もしくはペプチドを含む形質導入もしくはトランスフェクトされた細胞において発現され得る。
【００４８】
ＰａｎｔＩｄの発現系には、リボソーム翻訳などのインビトロ系、または細菌培養、古細菌培養、真菌培養、植物培養、もしくは動物細胞培養（ＣＨＯ細胞培養を含む）などの細胞に基づく系が含まれる。加えて、いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄは、ヒト細胞発現系において発現される。いくつかの実施形態では、異種成分不含発現系のヒト細胞におけるＰａｎｔＩｄの発現は、ＰａｎｔＩｄ組成物の抗原性を低減する。
【００４９】
一実施形態では、本開示は、任意のカラムクロマトグラフィー、溶媒排除、沈殿、または磁性もしくは非磁性ナノ／微小粒子方法論（親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および任意の大きさの免疫親和性磁性もしくは非磁性粒子およびビーズを含むがこれらに限定されない）によるＰａｎｔＩｄタンパク質の精製の方法を特徴とする。
【００５０】
別の実施形態では、本開示は、ウイルスおよび非ウイルスタンパク質の形質導入によるものを含む、組換えタンパク質として、細胞培養、動物モデル、およびヒトにおいてＰａｎｔＩｄを導入するための方法を特徴とする。加えて、この実施形態では、本発明は、細胞生存アッセイ、細胞死アッセイ、細胞代謝アッセイ、細胞分裂停止アッセイ、細胞増殖アッセイ、標的化細胞死滅アッセイ、免疫細胞死滅アッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、サイトカインＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットアッセイ、全血検査アッセイ、白血球計数、ＨＰＬＣおよび質量分光アッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、蛍光および化学発光結合免疫吸着アッセイ、インビボ撮像などを含むがこれらに限定されない、治療有効性または生物活性評価および定量化のための方法も含む。
【００５１】
本開示の別の実施形態は、逆相タンパク質マイクロアレイ（ＲＰＭＡ）、順相タンパク質マイクロアレイ、免疫吸着アッセイ（酵素結合、蛍光定量、および発光定量を含む）、粒子凝集アッセイ、電気泳動移動度シフトおよびキャピラリー電気泳動アッセイ、電気化学もしくはエレクトロルミネセンスアッセイ、または単一もしくは多重組織または細胞アレイ、あるいはフローサイトメトリーによる、チェックポイント受容体、それらのリガンド、および免疫調節性サイトカインに対する自己免疫Ｂ細胞応答の発見、定量化、および特徴づけのための方法に関する。
【００５２】
本開示のある実施形態では、自己免疫疾患およびがんの動物モデルにおいて、ＰａｎｔＩｄおよびＰａｎｔＩｄと他の治療薬との組み合わせを送達するための方法も特徴づけされる。
【００５３】
一実施形態では、本開示は、静脈内、舌下、鼻腔内、皮内、筋肉内、眼窩内もしくは眼窩周囲、経皮、または皮下送達方法によるかにかかわらず、自己免疫疾患もしくは障害、またはがんの治療のための、ヒトまたは動物を含む対象における、ＰａｎｔＩｄおよびＰａｎｔＩｄと他の治療薬との組み合わせの送達を特徴とする。
【００５４】
組成物は、錠剤、ピル、カプセル、半固体、粉末、徐放性製剤、溶液、懸濁液を含む、任意の標準的な既知の剤形の形態を取り得る。さらなる例として、組成物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤も含み得る。
【００５５】
本開示による治療薬または医薬組成物は、Ｐａｎｔｉｄおよび薬学的担体を含み得る。Ｐａｎｔｉｄは、本質的に純粋であることが好ましく、本質的に同種（すなわち、汚染タンパク質などを含まない）であることが望ましい。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％のタンパク質、好ましくは少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に同種の」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は抗体である。代替えの組成物は、タンパク質または核酸の形質導入を媒介するレンチウイルス、レトロウイルス、他のウイルス、および非ウイルス粒子を含む。潜在的な一実施形態では、「組成物」は、投与後にＰａｎｔＩｄを産生する哺乳類または宿主起源の形質導入された、またはトランスフェクトされた細胞も含み得る。
【００５６】
製剤中のＰａｎｔｉｄの量は、所望の投与体積、投与モード（複数可）などを考慮して決定される。ＰａｎｔＩｄ製剤は、薬学的に許容される担体または希釈剤を含み得る。いくつかの態様では、好適な担体および希釈剤には、緩衝水溶液、等張生理食塩溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、等張水、減菌水、溶液、溶媒、分散媒、遅延剤、ポリマーおよび脂質剤、エマルジョンなどが含まれる。Ｐａｎｔｉｄは、約４〜８、好ましくは約５〜７のｐＨのｐＨ緩衝溶液中に存在し得る。例示的な緩衝液には、ヒスチジン、リン酸、Ｔｒｉｓ、クエン酸、コハク酸、および他の有機酸が含まれる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の等張性により、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約３ｍＭ〜約１５ｍＭであり得る。さらなる例として、特に注射可能溶液に関して、好適な液体担体は、水、水性生理食塩溶液、水性デキストロース溶液などを含み、静脈内、脊髄内、および大槽内投与に関しては、等張溶液が好ましく、リポソームなどのビヒクルも薬剤の投与に特に適している。
【００５７】
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されるものなどの他の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、前凍結乾燥した製剤（および／または凍結乾燥した製剤および／または再構築された製剤）に含まれてもよいが、但し、それらは製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさないことを条件とする。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ポリエステルなどの生分解性ポリマー、および／またはナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。
【００５８】
一実施形態では、本開示の医薬組成物は、用いられる投薬量および濃度でそれに曝される細胞または哺乳動物に非毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む、本明細書で使用される担体「Ｃａｒｒｉｅｒ」を含む。しばしば、生理学的に許容される担体は水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００５９】
「治療すること（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「寛解」は、治療上の処置および予防もしくは防止措置の両方を指し、目的は、標的の自己免疫疾患もしくは障害、またはがんを防止または遅らせる（減らす）ことである。治療を必要とするものには、すでに障害を有するもの、ならびに障害を有しやすいもの、または障害が防止されるもの、例えば、チェックポイント受容体、リガンド、もしくは免疫調節性サイトカインに応答する自己反応性Ｂ細胞などの白血球を有する対象が含まれる。
【００６０】
対象または哺乳動物は、本発明の方法により治療量の本開示のＰａｎｔｉｄを受けた後、対象が自己反応性Ｂ細胞の数もしくは１つ以上の自己免疫症状の低減、またはがんの低減のうちの１つ以上の観察可能および／もしくは測定可能な低減またはその不在を示す場合、感染に関して良好に「治療される」。
【００６１】
「治療有効量」という用語は、対象もしくは哺乳動物において疾患または障害を「治療する」のに有効なＰａｎｔｉｄの量を指す。
【実施例】
【００６２】
当業者は、以下の実施例がＰａｎｔＩｄのクローニングおよび発現の非限定的な例であり、他の方法、ベクター、および発現系が本開示のＰａｎｔＩｄのクローニングにも使用され得ることを理解する。当業者は、本方法、ベクター、および発現系が本開示に記載される他の構成要素を含むＰａｎｔＩｄのクローニングにも使用され得ることも理解する。
実施例１−ＰａｎｔＩｄクローニング
【００６３】
チェックポイント受容体、リガンド、もしくは免疫調節性サイトカイン、または細胞外ドメイン、またはそれらの活性部分ペプチドもしくはエピトープ（シグナルペプチドを有する、または有しない）は、ｍＲＮＡ配列から逆翻訳される。例えば、アミノ酸１〜２３９に対応するＰＤ−Ｌ１は、ホモサピエンスコドン使用オプションを使用して、ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅで入手可能なコドン適合ツールを使用して逆翻訳される。得られる配列は、コピーされ、最終ＰａｎｔＩｄ配列のコンピュータを用いた生成のために新しいＳｎａｐＧｅｎｅ．ｄｎａファイルにペーストされる。
【００６４】
アミノ酸１〜１８に対応するＰＤ−Ｌ１のシグナルペプチドは、除去され、逆翻訳後、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド（アミノ酸配列ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ）に置き換えられる。これは、ＰＤ−Ｌ１配列の最５´端上にコピーされる。
【００６５】
エフェクターの細胞外ドメインは、逆翻訳され、チェックポイント受容体、リガンド、もしくは免疫調節性サイトカインの３´端、またはそれらの任意の活性部分ペプチドもしくはエピトープ上にコピーされる。例えば、アミノ酸１０３〜２８１に対応するＦａｓＬは、逆翻訳され、ＰＤ−Ｌ１配列の３´端上にコピーされる。
【００６６】
リンカーも２つの構成要素間に挿入され得る。例えば、ＧＧＧＧＳリンカーまたは他の好適に柔軟なリンカーが使用され得る。例えば、ＧＧＧＧＳリンカーは、後に２つの特徴間にペーストされ、最終タンパク質において分子キメラの柔軟性を可能にする。代替的に、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、または２つ以上のアミノ酸の任意の長さの５０％以上の総グリシン、セリン、およびスレオニン含有量を含有する任意のペプチドを含む、このリンカーの倍数。
【００６７】
いくつかの実施形態では、親和性ペプチドは、精製を容易にするために、分子キメラにも含まれ得る。例えば、ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ、アミノ酸配列ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）を使用することができる。例えば、（ＳＢＰ、アミノ酸配列ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）は、免疫親和性精製のためにＦａｓＬの末端に付加される。
【００６８】
停止コドン（ＤＮＡ配列５´ＴＧＡ３´）は、タンパク質を終結させるために、分子キメラ配列の末端、例えばＳＢＰの末端に挿入される。
【００６９】
適切な制限酵素部位は、発現ベクター内にクローニングするために、それぞれのＤＮＡ終端に付加され得る。例えば、５´終端ＥｃｏＲＩ部位（５´ＧＡＡＴＴＣ３´）および３´ＢａｍＨＩ部位（５´ＧＧＡＴＣＣ３´）は、ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏなどの好適なベクター内にクローニングするために、それぞれのＤＮＡ終端上にコピーされる。最終的なコンピュータを用いて生成されたマップを図３Ａに示す。
【００７０】
この配列は、ｐＵＣ５７−Ａｍｐ内にクローニングされた精製されたプラスミドとして、ＧＥＮＥＷＩＺによる遺伝子合成のためのテキストとしてエクスポートされる。
【００７１】
ｐＵＣ５７−Ａｍｐは、化学的にコンピテントな細菌細胞のＤＨ５αに形質転換され、これはスクリーニングの後、単一のクローンをもたらす。
【００７２】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス中でこのクローンを培養し、ＱＩＡＧＥＮプラスミド抽出ミニプレップキットを使用してプラスミドを抽出する。
【００７３】
このＤＮＡを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＢａｍＨＩで消化して、ＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ断片を遊離させ、これをアガロースゲル電気泳動および抽出により単離した。
【００７４】
この断片を、ＳＡＰ−脱リン酸化、ＢａｍＨＩ−ＨＦ／ＥｃｏＲＩ−ＨＦ二重消化、およびＰＣＲカラム精製されたｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ直線化ＤＮＡと３：１のモル比で混合する。
【００７５】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの１〜１００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、断片をライゲートした。
【００７６】
得られるＤＮＡをＤＨ５αに形質転換し、挿入物の存在に関して、ＢａｍＨＩ−ＨＦ／ＥｃｏＲＩ−ＨＦ二重消化によりクローンをスクリーニングする。単一の挿入物陽性クローンを、後続の組換えＰａｎｔＩｄのトランスフェクション、特徴づけ、および精製のために選択する。陽性クローンプラスミドマップの例を図３Ｂに示す。
実施例２−ＰａｎｔＩｄ発現ベクターのトランスフェクション
【００７７】
ＦＢＳ中７％ＤＭＳＯからなる凍結培地中で、３７℃で３分間、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を解凍する。
【００７８】
細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含む追加の５ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、チューブを反転させることにより混合し、次いで、室温で５分間、３００ｘｇで遠心分離した。
【００７９】
上清をデカントし、細胞を、１０％ＦＢＳを含む１５ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁する。
【００８０】
細胞を、７０％を超える集密度を達成するまでＴ−７５フラスコ中で１〜３日間培養する。
【００８１】
この時点で、細胞培養培地を除去し、細胞を、３ｍｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで、３７℃で５分間、トリプシン処理する。
【００８２】
ピペットマンで細胞を３０秒間勢いよく粉砕した後、１０％ＦＢＳを含む７ｍｌのＤＭＥＭに希釈する。
【００８３】
細胞を計数し、３・１０６細胞を、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む、１０％ＦＢＳを含む総体積１０ｍｌのＤＭＥＭで１０ｃｍペトリ皿にピペットで取る。トランスフェクションの前に、細胞をさらに１２〜１８時間培養する。
【００８４】
翌日、細胞培養上清を７ｍｌの無血清ＤＭＥＭと交換する。
【００８５】
レンチウイルス粒子産生に関して、１０μｇのｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏを、７．５μｇのｐＣＭＶΔ８．２および２．５μｇのｐＨＣＭＶ−Ｇならびに１．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭと混合する。タンパク質発現に関して、２０μｇのｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏを１．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭと混合する。
【００８６】
これと並行して、６０μｌのリポフェクタミン−２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭと混合する。
【００８７】
両混合物を室温で５分間インキュベートする。
【００８８】
この後、ＤＮＡおよびリポフェクタミン溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートする。
【００８９】
リポソーム−ＤＮＡ混合物を１０ｃｍペトリ皿の細胞に滴下して適用する。
【００９０】
細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で４〜６時間トランスフェクトした後、トランスフェクション上清を除去し、１０％ＦＢＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む１０ｍｌのＤＭＥＭと交換した。
【００９１】
細胞を、さらに４８時間培養した後、タンパク質またはレンチウイルス粒子を採取した。
【００９２】
レンチウイルス粒子に関して、上清を０．５または１ｍｌのアリコートとして等分し、−８０℃で保管する。
【００９３】
タンパク質産生に関して、上清を採取し、プロテアーゼ阻害剤カクテルと混合した後、−８０℃で保管する。
実施例３−ＰａｎｔＩｄ免疫親和性精製
【００９４】
磁性粒子濃縮器（ＭＰＣ）を使用して、０．１ｍｇのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、０．１％ＢＳＡを含む２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄する。
【００９５】
ＰａｎｔＩｄ含有上清を１ｍｇの洗浄ストレプトアビジンビーズで混合する。
【００９６】
ビーズを含む試料を、室温で３０分間転倒揺動することにより混合する。
【００９７】
磁性粒子濃縮器（ＭＰＣ）で１分間、ビーズを濃縮した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄する。
【００９８】
試料を、穏やかに振盪させながら１０分間インキュベートした後、１〜１０ｍＭビオチンを含む０．５ｍｌのＰＢＳにおいて溶出する。
【００９９】
ストレプトアビジン−磁気ビーズをＭＰＣにより除去し、溶出したタンパク質を収集する。
【０１００】
Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ  ＰａｎｔＩｄを脱塩して、残りのビオチンを除去する。
【０１０１】
タンパク質濃度は保管前にＢＣＡタンパク質アッセイにより推定される。
【０１０２】
長期保管に関して、ＰａｎｔＩｄをグリセロール中に５０％希釈した後、−８０℃で保管する。代替的に、ＰａｎｔＩｄを５０μｌのアリコートに等分した後、−２０℃で保管する。
実施例４−ＰａｎｔＩｄ媒介細胞死滅のインビトロ特徴づけ
【０１０３】
５０ｍｌの患者の末梢血を１×ＤＰＢＳに２倍希釈した後、等体積のフィコールリンパ球分離培地上に重ねる。
【０１０４】
４００ｘｇで３０〜４５分間遠心分離し、次いで上層を吸引する。
【０１０５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層を吸引し、新しい５０ｍｌの円錐チューブに移す。
【０１０６】
３００ｘｇで５分間遠心分離することにより、５０ｍｌの１×ＤＰＢＳで３回洗浄する。
【０１０７】
細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に１ｍｌ当たり１・１０５細胞に再懸濁し、次いで、ウェル当たり１００〜２００μｌを使用して、９６ウェルプレートにそれらを蒔く。
【０１０８】
３７℃および５％ＣＯ２で一晩、細胞を培養する。
【０１０９】
翌日、異なる処理群にカラムを割り当てる：カラム１は未処理の対照であり、カラム２〜４は３つ組で系列２倍希釈物として１．５〜１００μｇ／ｍｌのＰａｎｔＩｄで処理され、カラム５は細胞傷害性の陽性対照であり、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する。カラム６〜１０はＢおよびＴ細胞同時染色のために、同様に処理される。カラム１１および１２は、アイソタイプ対照および単一染色対照のために確保される。
【０１１０】
３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベートする。
【０１１１】
上清を除去し、３７℃で５分間、５０〜１００μｌのトリプシンと交換する。
【０１１２】
１０％ＦＢＳを含む１５０μｌのＲＰＭＩを添加し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で２回洗浄する。
【０１１３】
細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、次いで、ウェル当たり５μｌの７−ＡＡＤ、Ｂ細胞を染色するための５μｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートされた抗ヒトＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、またはＴ細胞を染色するための５μｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、または５μｌの適切なアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加する。
【０１１４】
細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄して、残りの抗体および７−ＡＡＤを除去する。
【０１１５】
細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー分析を行う。死滅細胞は、７−ＡＡＤ陽性事象として現れ、ＣＤ１９陽性、ＣＤ３陽性、およびＣＤ１９またはＣＤ３陰性集団の間でのこれらの事象の相対的分布は、特異性を予め評価するために使用することができる。
実施例５−患者の血清のスクリーニング
【０１１６】
いくつかの実施形態では、タンパク質アレイを使用して、患者の血清をスクリーニングする。いくつかの実施形態では、アレイは、例えば、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ヒトタンパク質マイクロアレイであり得る。アレイは、複数の選択されたチェックポイント受容体、リガンド、もしくは免疫調節性サイトカイン、または任意の細胞外ドメイン、またはそれらの活性部分ペプチドもしくはエピトープも含み得る。
【０１１７】
例として、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ヒトタンパク質マイクロアレイを使用する場合、使用前に、−２０℃での保管から取り出してから、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ヒトタンパク質マイクロアレイを含有するメイラー（ｍａｉｌｅｒ）を即時に４℃にさらし、メイラーを４℃で１５分間平衡化する。
【０１１８】
マイクロアレイのバーコードの端が凹凸のある数表示を含むトレイの端の近くにあるように、バーコード面を上にして、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ヒトタンパク質マイクロアレイを４−チャンバインキュベーショントレイの底に設置する。トレイの底の凹凸は緩衝液を除去するための場所として使用される。
【０１１９】
減菌ピペットを使用して、５ｍＬのブロッキング緩衝液を各チャンパに添加する。緩衝液をアレイ表面上に直接ピペットで取ることを避ける。
【０１２０】
５０ｒｐｍの振盪機（円振盪）上で、４℃で１時間トレイをインキュベートする。回転中、アレイを一平面に保つ振盪機を使用する。転倒振盪機は、交差ウェル汚染のリスクが増加するため、使用されない。
【０１２１】
インキュベーション後、バキュームにより、またはピペットで、ブロッキング緩衝液を吸引する。吸引器またはピペットの先端を凹凸のある数表示内に配置し、各ウェルから緩衝液を吸引する。凹凸のある数表示があるトレイの端に残りの緩衝液がたまるように、トレイを傾ける。たまった緩衝液を吸引する。重要：傷をつける可能性があるため、マイクロアレイ表面に先端を配置しない、またはそこから吸引しない。アレイ表面のあらゆる部分の、高または不均等な背景をもたらす可能性がある乾燥を防ぐため、直ちに次の溶液の添加に進む。
アレイのプローブ：
【０１２２】
ピンセットを使用して、４−ウェルトレイからスライドを取り除く。ピンセットの先端を凹凸のある数表示内に挿入し、スライドの縁部をそっと上に開ける。アレイをその縁部しか触らないように注意して、手袋をはめた手でアレイを持ち上げる。ペーバータオルでアレイの後ろおよび側面をそっと乾燥させ、過剰の緩衝液を除去する。留意：アレイの表面が濡れた状態のままであることを確実にするために、場合によっては、標識された抗ヒト抗体、例えば、蛍光もしくは化学発光標識された抗ヒト抗体を含み得る希釈されたプローブを添加する前に、一度に２つ以上のアレイ、およびＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ（商標）カバースリップを乾燥させない。
【０１２３】
血清Ｉ：１０００を洗浄緩衝液中に希釈し、次いで、洗浄緩衝液中の希釈した血清５ｍｌを容器の適切なチャンバに入れる。
【０１２４】
アレイを上に向けて４−ウェルアレイを平らに保ちながら、４℃で９０分間インキュベートする（振盪なし）。
【０１２５】
５ｍＬの冷洗浄緩衝液を添加する。
【０１２６】
４℃で穏やかに攪拌しながら５分間洗浄する。
【０１２７】
吸引により洗浄緩衝液を除去する。
【０１２８】
洗浄ステップをさらに４回繰り返す。
【０１２９】
洗浄緩衝液に希釈した二次抗体５ｍＬを、インキュベーショントレイの番付けされた端の凹凸部に添加し、液体をスライド表面にわたって流す。蛍光強度および背景における局所変動を避けるために、アレイとの直接的な接触を避ける。抗体溶液をスライドに直接注がない。
【０１３０】
一次染色と違い、穏やかに円振盪（約５０ｒｐｍ）しながら、４℃で９０分間インキュベートする。
【０１３１】
吸引により二次抗体を除去する。
【０１３２】
４℃で穏やかに攪拌しながら、５ｍＬの新しい洗浄緩衝液で５分間洗浄する。吸引により洗浄緩衝液を除去する。
【０１３３】
洗浄ステップをさらに４回繰り返す。
アレイの乾燥：
【０１３４】
ピンセットを使用して、４−ウェルトレイからアレイを取り除く。ピンセットの先端を凹凸のある数表示内に挿入し、スライドの縁部をそっと上に開ける（下の図を参照されたい）。スライドをその縁部しか触らないように注意して、手袋をはめた手でスライドを持ち上げる。その側のスライドを軽くたたいて、過剰の流体を除去するが、アレイの乾燥を避ける。平な表面またはベンチトップに置く。
【０１３５】
アレイをスライドホルダ（または減菌の５０−ｍＬ円錐チューブ）に設置する。遠心分離中のアレイへの損傷を防ぐために、スライドが適切に設置され、ホルダに固定されていることを確実にする。アレイを含むスライドホルダを室温の蒸留水に手短に１回浸漬して、塩を除去する。スライドホルダを使用しない場合、室温の蒸留水の入った５０−ｍＬの円錐チューブにアレイを浸漬する。
【０１３６】
遠心分離機（スライドホルダを使用する場合、プレートローターが装備されている）において、スライドホルダまたは５０−ｍＬの円錐チューブ内のアレイを、２００×ｇで１分間、室温で遠心分離する。アレイが完全に乾燥したことを確認する。スライドがプローブされた後、それらを垂直または水平のいずれかで保管することができる。４．乾燥させたのち、光から保護されたスライドボックス中で垂直または水平にアレイを保管する。シグナル強度を弱めるため、光への長期曝露は避ける。最良の結果を得るために、プローブの２４時間以内にアレイをスキャンする。
【０１３７】
アレイを蛍光マイクロアレイスキャナ内に挿入する。
アレイのスキャン：
【０１３８】
スキャナの設定を調整する。
【０１３９】
マイクロアレイをプレビューし、必要ならば設定を調整する。
【０１４０】
マイクロアレイをスキャンする。
【０１４１】
画像データを保存する。
【０１４２】
結果をエクスポートし分析する
アレイの分析：
【０１４３】
対照血清と自己免疫患者の血清との間のアレイ複製でスチューデントｔ検定を行い、０．０５以下のＰ値を有する試料を同定する。
【０１４４】
このサブセットから、自己免疫患者の血清の蛍光強度対対照患者の血清の蛍光強度の比のカットオフ閾値未満の上であるこれらの抗原を除外する：これは、アレイにおける高い有意性、低倍率変化のヒットを除外するためである。
【０１４５】
局所アレイ背景よりも３倍、５倍、または１０倍未満上である試料を除外して、背景よりもごくわずかに上である自己抗原を除外する。
【０１４６】
ＰｕｂＭｅｄデータベースを使用して、それらの関連するＲｅｆＳｅｑ  ＩＤを調べることにより、自己抗原に注釈を付ける。
実施例６−有効性のマウスモデル実証
【０１４７】
いくつかの実施形態では、マウスモデルなどの動物モデルを使用して、本開示のＰａｎｔＩｄの有効性を実証することができる。有効性モデルの非限定的な例として、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター、例えば、ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏは、ドキシサイクリン誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ、およびＣＤ２２プロモーター−５´ＵＴＲ−ＬｏｘＰ１−ＰｏｌｙＡシグナル１−ＬｏｘＰ２−ＰＤ−１−ＩｇＧ  Ｆｃ−３´ＵＴＲ−ＰｏｌｙＡシグナル２などの本発明のＰａｎｔＩｄ分子キメラをコードする核酸を含有する第２の転写単位を含むように修飾される。ドキシサイクリンをマウスの水もしくは食餌に、または注射により導入することにより、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現をもたらす。Ｃｒｅの不在下で、ＣＤ２２プロモーターは、分子キメラ、例えば、この非限定的な例では、ＰＤ−ＩｇＧ  Ｆｃの前で転写を終結する初期ＰｏｌｙＡシグナルにより、空のｍＲＮＡの発現を駆動する。Ｃｒｅの存在下で、ＬｏｘＰ部位間の組換えは、第１のｐｏｌｙＡシグナルの除去をもたらし、ＰＤ−１−ＩｇＧ  Ｆｃ分子キメラを可能にする。その後、ＰＤ−１−ＩｇＧ  Ｆｃは、細胞上のＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合し、これらのリガンドの寛容原性作用を拮抗する：加えて、ＰＤ−１−ＩｇＧ  Ｆｃは、ＰＤ−１発現Ｔｒｅｇｓ細胞に結合し、細胞死滅のためにそれらを標的とし、したがって、別の寛容原性機構を排除する。さらに、ＣＤ２２プロモーターはＢ細胞特異的発現を駆動する。結果として、自己反応性Ｂ細胞媒介チェックポイント受容体脱抑制の完全な模倣である自己免疫疾患がもたらされる。このモデルは、誘導された自己免疫疾患の寛解が明確なエンドポイントである生理学的に関与する系におけるＰａｎｔＩｄの試験を可能にする。以下に記載される方法は、それらのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を通して自己反応性Ｂ細胞を標的とし、クローン欠失をもたらす任意のＰａｎｔＩｄの有効性を実証するのに有用である。抗チェックポイントタンパク質の自己反応性Ｂ細胞のクローン欠失は、自己免疫に関連する炎症、病的状態、および死亡の顕著な軽減をもたらす。
【０１４８】
レンチウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのヘルパープラスミドとの同時導入により、上述のように産生される。
【０１４９】
マウスＢＡＬＢ／Ｃ胚盤胞は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入され、幹細胞培養培地を使用して、支持細胞で培養される。
【０１５０】
胚盤胞は、１のＭＯＩで６−ウェルプレートに形質導入される。
【０１５１】
２４時間後、培地を交換する。
【０１５２】
４８時間後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを使用して、胚盤胞を選択する。
【０１５３】
さらに４８時間後、胚盤胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再懸濁する。
【０１５４】
次いで、ホールピペットにより胚盤胞を偽妊娠ＢＡＬＢ／ｃ子宮内に移す１３。
【０１５５】
出産後、子の遺伝子型を同定し、近親交配して、研究のためのホモ接合Ｆ２世代を生成する。
【０１５６】
これらのマウスを、５匹のマウスの５つの群に分ける。群１は処置なしでドキシサイクリンを受け、群２はドキシサイクリンを受けず、群３はドキシサイクリンおよび１００μｇ／ｋｇのＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ  ＰａｎｔＩｄを週２回受け、群４はドキシサイクリンおよび５００μｇ／ｋｇのＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ  ＰａｎｔＩｄを週２回受け、群５はドキシサイクリンおよび１ｍｇ／ｋｇのＰＤ−Ｌ１−ＦａｓＬ  ＰａｎｔＩｄを週２回受ける。ドキシサイクリンでの自己免疫誘導の２週間後、静脈内注射によりＰａｎｔＩｄを投与する。静脈内尾静脈注射による処置の３週間後、マウスの尾静脈血液を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＴＧＦ−β、およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡのために採取した。加えて、免疫に関連する症状は、１〜５のスケールでスコア化され、ＰａｎｔＩｄ処置の１週間後、毎週監視される。研究が終わった後、エンドポイントを分析して、非自己免疫対照と比べたＰａｎｔＩｄ治療有効性を決定する。
【０１５７】
この実施例に記載される方法は、本明細書に開示されるＰａｎｔＩｄのいずれかを使用して実行することができる。
実施例７−自己抗原−Ｆｃを含む例示的なＰａｎｔＩｄのクローニング
【０１５８】
レンチウイルス発現ベクターにおいて例示的なＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ構築物を発現させることにより、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ  ＰａｎｔＩｄをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生した。ＣＴＬＡ−４を含むＰａｎｔＩｄをｈＩｇＧ１  Ｆｃ断片に融合した。ＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ断片をｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）内にＮｈｅＩ−ＨＦ／ＢａｍＨＩ−ＨＦ指向クローニングすることにより４つのｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  ＦＣ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏクローンをもたらす、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃレンチウイルス発現プラスミドを産生した（示されるクローン１〜４）。次いで、この発現ベクターをリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）トランスフェクションによりヒトＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、上清を収集した後、Ｆｃ−融合ＰａｎｔＩｄ産生の専有ＥＬＩＳＡ試験を使用して系列希釈および定量化を行った。図９は、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞内への４つのレンチウイルスクローンの各々から得られた上清ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ  ＰａｎｔＩｄの力価を示す。対照試料からの追加の力価も図９に示され、以下を含む：２つの陰性対照（すなわち、希釈された培養培地およびｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター）、これら両方はＰａｎｔＩｄの発現に関して予想された陰性結果をもたらした。ｖＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏをレンチウイルスにより形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清における力価も示され、これは、トランスフェクトされた細胞と比較して適度の発現をもたらした。
【０１５９】
他の実施形態では、本明細書全体を通して記載されるＰａｎｔ−Ｉｄのいずれかが、このアプローチを使用して、クローニングされ、発現され、特徴づけされ得る。例えば、本明細書のいくつかの実施形態および任意選択の特徴では、クローニングされ、発現されたＰａｎｔＩｄは、例えば、限定されないが、ＰＤ−１（配列０３８）、ＣＤ２８（配列０３９）ＣＴＬＡ−４（配列０４０）、ＩＣＯＳ（配列０４１）、ＢＴＬＡ（配列０４２）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）（ＫＩＲ２ＤＬ１（配列０４３）、ＫＩＲ２ＤＬ２（配列０４４）、ＫＩＲ２ＤＬ３（配列０４５）、ＫＩＲ２ＤＬ４（配列０４６）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ（配列０４７）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ（配列０４８）、ＫＩＲ２ＤＳ１（配列０４９）、ＫＩＲ２ＤＳ２（配列０５０）、ＫＩＲ２ＤＳ３（配列０５１）、ＫＩＲ２ＤＳ４（配列０５２）、ＫＩＲ２ＤＳ５（配列０５３）、ＫＩＲ３ＤＬ２（配列０５４）、ＫＩＲ３ＤＬ３（配列０５５）、およびＫＩＲ３ＤＳ１（配列０５６）を含む）、ＬＡＧ−３（配列０５７）、ＣＤ１３７（配列０５８）、ＯＸ４０（配列０５９）、ＣＤ２７（配列０６０）、ＣＤ４０（配列０６１）、ＴＩＭ−３（配列０６２）、ならびに他のＴ細胞免疫グロブリンおよび１−ドメイン含有（ＴＩＭ）受容体（ＴＩＭ−１（配列０６３）、ＴＩＭ−２（配列０６４）、およびＴＩＭ−４（配列０６５）を含む）、Ａ２ａＲ（配列０６６）、またはＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ、配列０６７）、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン依存性阻害モチーフ、配列０６８）、もしくはＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ、配列０６９）モチーフ、ドメイン、またはペプチドを含有する任意の貫通膜、表在性膜、膜結合、もしくは細胞質タンパク質、例えば、ＣＤ２４４（２Ｂ４、配列０７０）およびＴＩＧＩＴ受容体（配列０７１）、から選択される免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、および／または免疫調節性サイトカインを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態および任意選択の特徴では、ＰａｎｔＩｄは、限定されないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＬＡＩＲ、ＴＩＧＩＴ、Ｓｉｇｌｅｃ−２、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−４、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＦｃγＲＩＩ、ＣＤ５、ＣＤ６６ａ、ＰＩＲ−Ｂ、ＩＬＴ−２、およびＣＤ７２から選択される免疫学的チェックポイント受容体、免疫学的チェックポイントリガンド、および／または免疫調節性サイトカインを含み得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、クローニングされ、発現されるＰａｎｔＩｄのエフェクター構成要素は、本明細書全体を通して記載される任意のエフェクターであり得、例えば、以下のうちのいずれか、またはそのリガンドから選択され得るか、あるいは以下のうちのいずれかを含まない場合がある：白血球、任意選択でＴおよびＢ細胞においてアポトーシス、壊死、細胞分裂停止、寛容化、反応不顕性を誘導することができる任意のタンパク質、ドメイン、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、糖タンパク質、リポタンパク質、リボ核タンパク質、デオキシリボ核タンパク質、共有結合修飾されたペプチド、もしくは１０，０００ダルトン未満の小分子、またはそれらの組み合わせもしくは分子キメラ。いくつかの実施形態では、本明細書でクローニングされ、発現され、かつ／または特徴づけされたＰａｎｔＩｄのエフェクター構成要素は、以下のうちのいずれかまたはその結合パートナーから選択され得るか、またはそれらを含まない場合がある：ＰａｎｔＩｄのエフェクタークラスのＣＤ９５Ｌ（別名ＦａｓＬ、配列００１）、ＴＲＡＩＬ（別名Ａｐｏ２Ｌ、配列００２）、およびＴＷＥＡＫ（別名腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２、配列００３）を含む細胞死受容体リガンド。いくつかの実施形態では、エフェクターは、ＯＸ４０Ｌ（配列００４）、ＴＮＦ−α（配列００５）、リンホトキシン−β（別名ＴＮＦ−Ｃ、配列００６）、およびその結合パートナーリンホトキシン−α（別名ＴＮＦ−β、配列００７）、ＣＤ１５４（別名ＣＤ４０Ｌ、配列００８）、ＬＩＧＨＴ（別名ＣＤ２５８  配列００９）、ＣＤ７０（配列０１０）、ＣＤ１５３（配列０１１）、４−１ＢＢＬ（別名ＣＤ１３７Ｌ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー９（配列０１２）、ＲＡＮＫＬ（別名ＣＤ２５４、配列０１３）、ＡＰＲＩＬ（配列０１４）、神経成長因子リガンド（例えば、ＮＧＦ配列０１５、ＢＤＮＦ（配列０１６）、ＮＴ−３（配列０１７）、およびＮＴ−４（配列０１８）、ＢＡＦＦ（配列０１９）、ＧＩＴＲリガンド（配列０２０）、ＴＬ１Ａ（配列０２１）、ならびにＥＤＡ−Ａ２（配列０２２）、細胞傷害性エフェクターを細胞内に送達するためのＡ−Ｂ毒素およびオートトランスポーターを含む修飾された細菌毒素（該細胞傷害性エフェクターはカスパーゼ、細菌毒素、または他の酵素であり得る）、１０，０００ダルトン未満の細胞傷害性もしくは細胞分裂停止物質小分子、例えば、微小管もしくはアクチン細胞骨格調節物質、ＤＮＡ複製の阻害剤、リボソーム阻害剤、ＲＮＡ合成の阻害剤、放射性核種、およびそれらの配位複合体など、ＮＫ活性化受容体リガンド（ＮＫＧ２Ｄに結合するＭＩＣＡ（配列０２３）およびＭＩＣＢ（配列０２４）、ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ１−６（配列０２５−０３０）、Ｒａｅ−１（配列０３１）、ＭＵＬＴ１（配列０３２）、Ｈ６０（配列０３３）、ＤＮＡＭ−１リガンド、ＣＤ１５５（配列０３４）、およびＣＤ１１２（配列０３５）、ＮＫｐ３０に結合するＢ７−Ｈ６（配列０３６）およびＢＡＴ３（配列０３７）、ならびにＣＤ７０に結合するＣＤ２７を含む）、免疫調節性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、標準のケモカイン（例えば、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、およびＣＸ３Ｃクラス）、および非標準の走化性もしくは化学運動性物質（例えば、Ｓｌｉｔ１、２、および３）、またはヒト、マウス、ブタ、またはイヌの免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびそれらのサブクラスを含む）のＦｃドメインを含むが、これらに限定されないＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンドの任意の他のメンバーを含むか、または含まない場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＰａｎｔＩｄの生物学的利用能および／または半減期を増加し得る。いくつかの実施形態では、ＰａｎｔＩｄエフェクター構成要素は、上に列記されたＦｃドメインのずれかを含まない場合がある。
実施例８−ＰａｎｔＩｄのオリゴマー／ホモ二量体構造の実証
【０１６２】
ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ  ＰａｎｔＩｄのオリゴマー／ホモ二量体構造は、予想通りホモ二量体であることが実証された。ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ  ＰａｎｔＩｄの構造および大きさは、ウエスタンブロット分析により確認された。ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ＣＴＬＡ−４−ｈＩｇＧ１  ＦＣ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏクローン１〜４とともに、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、上清は還元剤の存在下または不在下で分析された。これにより、単量体、ホモ二量体、および高次オリゴマーが同定された。クローン番号は数字により示され、空の親ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ／ＤＤＫ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターが対照として使用された。適したホモ二量体形態が非還元試料において主なバンドであり、適切な構造を示す。加えて、還元試料において、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ単量体は、予測された分子質量４３ｋＤａを示す。より高い分子量バンドはオリゴマーおよびその糖変異型に対応する。結果を図１０に示す。
実施例９−抗ヒトＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＰＤ−Ｌ１の抗体に結合するＰａｎｔＩｄの第１の構成要素
【０１６３】
ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素の精製されたＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４、およびＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４は、ＬＤＳ試料緩衝液において調製され、マーカーラダーとともにＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填される前に８０℃に加熱された。電気泳動後、ポリペプチドを電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および５％脱脂乳５％脱脂乳を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）において遮断した後、１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣＴＬＡ−４（Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ１７７５２３）、マウス抗ヒトＰＤ−１（Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ５２５８７）、またはウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１（ＰｒｏＳｃｉカタログ番号：４０５９）で、４℃で一晩、５％脱脂乳を含むＴＢＳ−Ｔにおいて染色した。二次染色のみを受けた対照膜はブロッキング試薬に一晩放置された。翌日、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、膜を、１：４，０００希釈のヤギ抗マウス、ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：Ａ１６０７８）、またはヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号：１１１−０３５−００３）で、１時間、５％脱脂乳を含むＴＢＳ−Ｔにおいて染色した。膜を３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：３４０９６）でＥＣＬ発色させ、Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ撮像ステーションで撮像した。結果を図１１に示す。図１１に示されるように、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＣＴＬＡ−４−Ｆｃに特異的に結合した（左側のパネル）。抗マウスＩｇＧ二次抗体にのみ曝された対照膜は、隣接する左側の中央パネルに示される。３０秒の曝露では、非特異的結合はほとんどまたは全く観察されなかった。図１１にも示されるように、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、それぞれ、ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４およびＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４に特異定に結合した（右側の中央パネルおよび最右側のパネルを参照されたい）。
実施例１０−インビトロでのＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４による抗ＰＤ−１抗体の中和
【０１６４】
組換えヒトＰＤ−１タンパク質（Ａｂｃａｍカタログ番号：１７４０３５）を０．５ｍｇ／ｍｌにＰＢＳにおいて再構築した。このストックを、ＢｕｐＨ炭酸／重炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液において５００倍希釈して、１μｇ／ｍｌの組換えＰＤ−１作用試薬を生成し、そのうち１００μｌ（１００ｎｇの組換えＰＤ−１）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。４℃で一晩コーティングした後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、次いで、室温で２時間、５％脱脂乳を含むＰＢＳで遮断した。この間に、１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＰＤ−１の溶液（Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ５２５８７）をＰＢＳにおいて調製した。１μｇのＰＤ−１−ＣＣＡＮ４（ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素）、１μｇのヒトＩｇＧ陰性対照、およびそれらの系列２倍希釈物を、室温で１時間にわたって、中和のために抗ＰＤ−１抗体と混合した。その後、プレートを洗浄し、中和した抗体ミックスを、室温で１時間、結合のためにそれらの適切なウェルに添加した。続いて、プレートを洗浄し、次いで、ヤギ抗マウス、ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：Ａ１６０７８）で、室温で１時間染色した後、さらに洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：３４０２８）を、色素体発色が明らかになるまで各ウェルに添加し、その後、反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ多重モード検出器でプレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１６５】
図１２に示されるように、ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４は、マウス抗ヒトＰＤ−１の組換えヒトＰＤ−１タンパク質への結合を特異的に中和した。中和活性は、用量依存であり、ヒトＩｇＧ対照抗体では観察されなかった。
実施例１１−インビトロでのＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４による抗ＰＤ−１抗体の中和
【０１６６】
組換えヒトＰＤ−１タンパク質（Ａｂｃａｍカタログ番号：１７４０３５）を０．５ｍｇ／ｍｌにＰＢＳにおいて再構築した。このストックを、ＢｕｐＨ炭酸／重炭酸ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液において５００倍希釈して、１μｇ／ｍｌの組換えＰＤ−１作用試薬を生成し、そのうち１００μｌ（１００ｎｇの組換えＰＤ−１）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。４℃で一晩コーティングした後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、次いで、室温で２時間、５％脱脂乳を含むＰＢＳで遮断した。この間に、１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＰＤ−１の溶液（Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ５２５８７）をＰＢＳにおいて調製した。２μｇのＰＤ−１−ＣＣＡＮ４（ＰａｎｔＩｄの第２の構成要素）、２μｇのヒトＩｇＧ陰性対照、および２μｇのＢＳＡ陰性対照、ならびにそれらの系列２倍希釈物を、室温で１時間にわたって、中和のために抗ＰＤ−１抗体と混合した。その後、プレートを洗浄し、中和した抗体ミックスを、室温で１時間、結合のためにそれらの適切なウェルに添加した。続いて、プレートを洗浄し、次いで、ヤギ抗マウス、ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：Ａ１６０７８）で、室温で１時間染色した後、さらに洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：３４０２８）を、色素体発色が明らかになるまで各ウェルに添加し、その後、反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ多重モード検出器でプレートを４５０ｎｍで読み取った。さらなる分析のために、質量（μｇ）を対数変換した。
【０１６７】
図１３に示されるように、ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４は、マウス抗ヒトＰＤ−１の組換えヒトＰＤ−１タンパク質への結合を特異的に中和した。中和活性は、用量依存であり、ヒトＩｇＧ対照抗体またはＢＳＡを含んだ試料では観察されなかった。ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４は、１３６ｎｇまたは３１．８ｎＭのＩＣ５０で１μｇ／ｍｌの抗ヒトＰＤ−１を中和し、ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された分子量４３ｋＤａを示した。
実施例１２−ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素ＣＴＬＡ−４−Ｆｃの抗ヒトＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体への結合
【０１６８】
８４０ｎｇの還元もしくは非還元いずれかのＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（ＰａｎｔＩｄの第１の構成要素）を含む試料を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルで分析した。還元に関して、試料はベータ−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ試料緩衝液で処理した。ゲルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および５％脱脂乳を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）において１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＴＬＡ−４（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ１７７５２３）で一晩染色した。洗浄後、ゲルを、５％脱脂乳を含むＴＢＳ−Ｔにおいて１：４，０００希釈物としてヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  ＨＲＰ−コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  カタログ番号：Ａ１６０６６）で染色した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して化学発光を発生させた。
【０１６９】
図１４に示されるように、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ  ＰａｎｔＩｄは抗ヒトＣＴＬＡ−４により特異的に結合した。結合は、非還元および還元ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ  ＰａｎｔＩｄの両方で観察された。
実施例１３−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂によるＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰポリペプチドの精製
【０１７０】
ＣＣＡＮ４ヘテロ二量体化ドメインおよびＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）に融合したＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインをコードするレンチウイルス発現ベクター、ｐＬｅｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清（２ｍｌ）を採取し、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号：３０００２）を使用して、精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで画分を分析した。ポリペプチドをクマシーブルー染色により可視化した。
【０１７１】
図１５に示されるように、ＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰポリペプチド（「ＰＤ−Ｌ１ヘテロ二量体ＰａｎｔＩｄ」）を、第１および第２の溶出画分においてＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂から回収した。
実施例１４−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂によるＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰポリペプチドの精製ならびにＣＨＯ細胞におけるＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬヘテロ二量体のＰａｎｔＩｄの第２の構成要素の発現
【０１７２】
ＣＣＡＮ４ヘテロ二量体化ドメインおよびＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）に融合したＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインをコードするレンチウイルス発現ベクター、ｐＬｅｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清（２ｍｌ）を採取し、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号：３０００２）を使用して、精製した。ＣＣＡＮ４ヘテロ二量体化ドメインおよびＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）に融合したＰＤ−１細胞外ドメインをコードするレンチウイルス発現ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＰＤ−１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２ｍｌの上清を採取し、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号：３０００２）を使用して、精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた後、抗Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅカタログ番号：７１５９１−３）を使用して免疫ブロットを行った。同様に、ＣＨＯ細胞をｐＬｅｎｔ−ＦａｓＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰおよびｐＬｅｎｔｉ−ＴＲＡＩＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰでトランスフェクトした。ｐＬｅｎｔ−ＦａｓＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰは、同族ＣＣＢＮ４ヘテロ二量体化ドメインおよびＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩ  ＳＢＰに融合したＦａｓＬを発現した。ｐＬｅｎｔｉ−ＴＲＡＩＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰは、同族ＣＣＢＮ４ヘテロ二量体化ドメインおよびＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩ  ＳＢＰに融合したＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを発現した。ペレットおよび上清を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩとの免疫ブロットにより分析した。
【０１７３】
図１６に示されるように、ＰＤ−Ｌ１−ＣＣＡＮ４−ＳＢＰポリペプチド（「ＰＤ−Ｌ１ヘテロ二量体ＰａｎｔＩｄ」）を、第１および第２の溶出画分においてＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ樹脂から回収した。図１６にも示されるように、ＦａｓＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰまたはＴＲＡＩＬ−ＣＣＢＮ４−ＳＢＰを発現するＣＨＯ細胞は、予想される質量のポリペプチドを産生する。
【０１７４】
本明細書に記載され請求される発明は、本開示に説明または記載または参照されるものを含むがこれらに限定されない多くの特性および実施形態を有する。包括的であることは意図されず、本明細書に記載され請求される発明は、本開示において同定される特徴または実施形態に、またはそれによって限定されず、本発明は単に図示の目的のために含まれ、制限するものではない。当業者は、構成要素およびパラメータの多くが、本発明の範囲から逸脱することなく、ある程度変動もしくは修正されるか、または既知の等価物に代替され得ることを容易に認識するだろう。そのような修正および等価物は、個々に説明されるかのように本明細書に組み込まれることを理解するべきである。本発明は、個々にまたは集合的に、本明細書で参照または示されるステップ、特徴、組成物、および化合物の全て、ならびに該ステップまたは特徴の任意の２つ以上のあらゆるおよび全ての組み合わせも含む。
【０１７５】
本明細書で参照または記述される全ての特許、刊行物、科学文献、ウェブサイト、ならびに他の文書および材料は、本発明が属する当業者の技術レベルを示し、そのような各参照される文書および材料は、その全体が個々に参照により組み込まれるか、またはその全体が本明細書において説明されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。出願者らは、任意のそのような特許、刊行物、科学文献、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、および他の参照される材料または文書からのあらゆるおよび全ての材料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を有する。本明細書における任意の出願、特許、および刊行物への参照は、それらが世界のあらゆる国において有効な先行技術を構成するか、または共通の一般的知識の一部を形成するという同意または何らかの提案ではなく、またそのように見なされるべきではない。
【０１７６】
本明細書に記載される具体的な方法および組成物は、好ましい実施形態を代表し、例示であり、本発明の範囲を制限することを意図しない。他の目的、態様、および実施形態は本明細書を考慮することにより当業者に生じ、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨内に包含される。様々な置換および修正が本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例示として記載される本発明は、必須として本明細書に具体的に開示されない任意の要素（複数可）または制限（複数可）の不在下で実践することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、本発明の実施形態または実施例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語のいずれも、本明細書において、他の２つの用語のうちのいずれかと交換可能である。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語などは、広くかつ制限することなく解釈されるべきである。本明細書に例示として記載される方法およびプロセスは好適に、異なる順序のステップで実践されてもよく、また本明細書または特許請求の範囲に示されるステップの順序に必ずしも限定されない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明白に示さない限り、複数指示対象も含む。いかなる状況でも、本特許は本明細書に具体的に開示される具体的な実施例もしくは実施形態または方法に制限されるものと解釈されない。いかなる状況でも、いずれの審査員、または特許商標庁のいずれの他の職員もしくは従事者による供述が、出願者により具体的かつ無制限もしくは無条件で明確に応答書面により承認されない限り、本特許は、そのような供述により制限されるものと解釈されない。さらに、題名、表題などは、読者の本文書の理解を深めるために提供され、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。本明細書で参照される本発明の態様、実施形態、または構成要素のあらゆる例は、非限定的であると見なされるべきである。
【０１７７】
用いられる用語および表現は、説明の用語として使用され、制限の用語としては使用されず、またそのような用語および表現を、示され記載される特徴のいずれの等価物またはその一部を除外するように使用することを意図しないが、様々な修正が特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示されるが、本明細書に開示される概念の修正および変形が当業者によって用いられてもよく、そのような修正および変形は添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明の範囲内であるとみなされることを理解する。
【０１７８】
本発明は本明細書において広く一般的に記載される。一般的な開示内にあるより狭い種および亜属の分類も本発明の一部を形成する。これは、削除される材料が具体的に本明細書に列挙されるか否かにかかわらず、条件付きでまたは否定的な制限で、属から任意の対象物を除外する本発明の一般的な説明を含む。
【０１７９】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本発明が本明細書においてマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載されることも認識するだろう。
【０１８０】
本明細書に記述される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで本明細書に参照により組み込まれる。
開示に引用されている参考文献
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１３．Ｃｈｏ，Ａ．，Ｈａｒｕｙａｍａ，Ｎ．＆  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ａ．Ｂ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｅｄｉｔｏｒ．Ｂｏａｒｄ  Ｊｕａｎ  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  Ａｌ  ＣＨＡＰＴＥＲ，Ｕｎｉｔ−１９．１１  （２００９）．
【図１】
2020515289.tif 000003
【図２Ａ】
2020515289.tif 000004
【図２Ｂ】
2020515289.tif 000005
【図３Ａ】
2020515289.tif 000006
【図３Ｂ】
2020515289.tif 000007
【図４−１】
2020515289.tif 000008
【図４−２】
2020515289.tif 000009
【図４−３】
2020515289.tif 000010
【図４−４】
2020515289.tif 000011
【図４−５】
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【図４−６】
2020515289.tif 000013
【図４−７】
2020515289.tif 000014
【図４−８】
2020515289.tif 000015
【図４−９】
2020515289.tif 000016
【図４−１０】
2020515289.tif 000017
【図４−１１】
2020515289.tif 000018
【図４−１２】
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【図４−１３】
2020515289.tif 000020
【図４−１４】
2020515289.tif 000021
【図４−１５】
2020515289.tif 000022
【図４−１６】
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【図４−１７】
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【図４−１８】
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【図４−１９】
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【図４−２０】
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【図４−２１】
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【図４−２２】
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【図４−２３】
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【図４−２４】
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【図４−２５】
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【図４−２６】
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【図４−２７】
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【図４−２８】
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【図４−２９】
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【図４−３０】
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【図４−３１】
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【図４−３２】
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【図４−３３】
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【図４−３４】
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【図４−３５】
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【図４−３６】
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【図４−３７】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020515289.tif 000047
【図８Ａ】
2020515289.tif 000048
【図８Ｂ】
2020515289.tif 000049
【図９】
2020515289.tif 000050
【図１０】
2020515289.tif 000051
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2020515289000001.app
【国際調査報告】
2020515289.tif 000058
2020515289.tif 000059
2020515289.tif 000060