(57)【要約】  本発明において特に提供されるのは、慢性腎臓病の治療のため自然腎に再生効果を与えるために、遺伝子改変された生物活性腎細胞集団を使用するための、組成物および方法である。特定の実施形態において、その目的は、「ユニバーサルドナー」免疫特権のある腎細胞集団を効果的に提供することにあり、免疫抑制なしに患者に投与することができる改変された同種腎細胞集団を作製するために、遺伝子編集が使用される。【選択図】図１０
2020525003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム改変された生物活性腎細胞（BRC）を作製する方法であって、BRCのゲノム免疫原性遺伝子を遺伝子改変することを含み、該遺伝子は主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子もしくはMHCクラスII分子内のタンパク質をコードする、前記方法。
【請求項２】
遺伝子が、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、またはHLA-DQB1遺伝子である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子を遺伝子改変することが、遺伝子を変異させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子を変異させることが、遺伝子またはその一部を欠失させることを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、および/またはHLA-DQB1遺伝子のうち任意の2つ以上の組み合わせを変異させることを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
BRCが、選択された腎細胞（SRC）である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
SRCが、SRC集団の中にある、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
SRCが尿細管細胞である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
尿細管細胞が、近位尿細管細胞である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
SRCが、内分泌細胞、血管細胞、または糸球体細胞である、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
SRC集団が、低酸素抵抗性およびイオジキサノール抵抗性細胞を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
SRC集団が、ヒアルロン酸合成酵素2を発現する細胞を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
SRC集団が、受容体を介したアルブミン輸送能力を有する細胞を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子を遺伝子改変することが、(i) BRCにおいて遺伝子編集タンパク質を発現させること；または(ii) BRCの細胞膜を横切って遺伝子編集タンパク質を送達することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子編集タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガTAL、またはRNAガイド型エンドヌクレアーゼである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
RNAガイド型エンドヌクレアーゼがCasタンパク質である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子を遺伝子改変することがさらに、(i) BRCにおいてガイドRNA（gRNA）を発現させること；または(ii) BRCの細胞膜を横切ってガイドRNA（gRNA）を送達することを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
Cas9タンパク質およびgRNAがリボ核タンパク質複合体の一部である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
BRCを培養して、遺伝子内に遺伝子改変を有する子孫を生じることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
子孫が、遺伝子内に遺伝子改変を含有しない対応する細胞と比較して、免疫拒絶の可能性の低下を示す、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子編集タンパク質が、トランスフェクトされたmRNAから発現される、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子編集タンパク質が、組換えタンパク質であって、ex vivoでgRNAと複合体を形成する、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子編集タンパク質が、組換えタンパク質であって、ex vivoでgRNAと複合体を形成し、そのタンパク質/gRNA複合体は、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによって細胞に送達される、請求項15に記載の方法。
【請求項２５】
選択可能なマーカーをコードする追加の核酸エレメント、および/または標的遺伝子に対する特異的変異が、Cas9タンパク質/gRNA複合体とともに、細胞に導入される、請求項17に記載の方法。
【請求項２６】
Casタンパク質が、トランスフェクトされたmRNAから発現され、gRNAはプラスミドDNAから発現される、請求項18に記載の方法。
【請求項２７】
トランスフェクトされたmRNAが、修飾された核酸塩基またはポリアデニル化配列を含めることによって安定化される、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
トランスフェクトされたmRNAが、少なくとも1つの細胞透過性ペプチドと結合している、請求項22に記載の方法。
【請求項２９】
Casタンパク質がDNAベクターから発現される、請求項16に記載の方法。
【請求項３０】
Casタンパク質の発現が、細胞においてgRNAが発現されている期間の少なくとも一時期の間に誘導される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
DNAベクターがゲノムに組み込まれない、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
DNAベクターがエピソームベクターまたは人工染色体である、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
DNAベクターがトランスポゾンである、請求項29に記載の方法。
【請求項３４】
gRNAがDNAベクターからの転写物である、請求項18に記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子を遺伝子改変することが、細胞表面におけるMHCクラスIの量を減少させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３６】
遺伝子を遺伝子改変することが、細胞表面におけるMHCクラスIIの量を減少させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３７】
2つ以上の遺伝子において遺伝子改変することを含み、遺伝子の少なくとも1つは、MHCクラスI分子内のタンパク質をコードし、遺伝子の少なくとも1つは、MHCクラスII分子内のタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子の少なくとも1つがHLA遺伝子である、請求項1に記載の方法。
【請求項３９】
薬剤として使用されるBRCを調製するための、請求項1に記載の方法。
【請求項４０】
患者において慢性腎臓病を治療するためのBRCを調製するための、請求項1に記載の方法。
【請求項４１】
子孫を増殖させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項４２】
子孫の増殖が、子孫を少なくとも1回、2回、3回、4回、または5回継代することを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
細胞増殖速度が、細胞継代ごとにモニターされる、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
子孫の細胞数および生存率が、トリパンブルー色素排除およびPrestoBlueの代謝によってモニターされる、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
SRCがCK18を発現する、請求項7に記載の方法。
【請求項４６】
SRCがGGT1を発現する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
PrestoBlueの代謝ならびにVEGFおよびKIM-1の産生が、生存可能で機能的な子孫の存在のマーカーとして使用される、請求項41に記載の方法。
【請求項４８】
BRCまたはSRC機能性が、遺伝子発現プロファイリングまたは酵素活性測定によってさらに確立される、請求項44に記載の方法。
【請求項４９】
測定される酵素活性がLAPおよび/またはGGTに関する活性である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
BRCが腎生検から得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項５１】
請求項1に記載の方法によって得られる、操作されたBRC集団。
【請求項５２】
主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子またはMHCクラスII分子の中に含まれるタンパク質をコードする遺伝子内に変異を含んでいる、操作されたBRC。
【請求項５３】
遺伝子の少なくとも一部分が欠失しており、その遺伝子が、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、またはHLA-DQB1遺伝子である、請求項52に記載の操作されたBRC。
【請求項５４】
患者において腎臓病を治療するための方法であって、その方法は、BRC集団を患者に投与することを含むが、このBRC集団は操作されたBRCを含んでおり、この操作されたBRCは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子またはMHCクラスII分子の中に含まれるタンパク質をコードする遺伝子内に変異を含んでいる、前記方法。
【請求項５５】
腎臓病が慢性腎臓病である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
BRC集団がSRC集団である、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
SRC集団が患者に由来する、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
SRC集団が1人または複数人のドナーを起源とする、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
SRC集団が、低酸素培養条件に暴露された後に得られる、請求項56に記載の方法。
【請求項６０】
SRC集団が、増殖させた腎細胞の密度勾配分離後に得られる、請求項56に記載の方法。
【請求項６１】
SRC集団が、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す、請求項56に記載の方法。
【請求項６２】
SRC集団が、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞型をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞型を欠いているかまたはそれらが不足している、請求項56に記載の方法。
【請求項６３】
a) 温度感受性の細胞安定化バイオマテリアル、およびb) BRC集団を含む、注射可能製剤であって：
このBRC集団は操作されたBRCを含有し、操作されたBRCは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子またはMHCクラスII分子の中に含まれるタンパク質をコードする遺伝子内に変異を含んでおり、
この温度感受性の細胞安定化バイオマテリアルはハイドロゲルであって、このハイドロゲルは、
(i) 約8℃以下において実質的に固体の状態を維持し、この実質的に固体の状態とはゲル状態である、
(ii) ほぼ外気温以上では、実質的に液体の状態を維持する、ならびに
(iii) 約8℃からほぼ外気温までの間、またはそれより高い温度では、固体から液体への遷移状態をとる、
前記注射可能製剤。
【請求項６４】
ハイドロゲルが、組換え起源の細胞外マトリックスタンパク質を含有するか、腎臓または別の組織もしくは臓器から得られる細胞外マトリックスに由来するか、あるいはゼラチンを含んでなる、請求項63に記載の注射可能製剤。
【請求項６５】
ゼラチンが、I型αIコラーゲンに由来する、請求項64に記載の注射可能製剤。
【請求項６６】
ゼラチンが、ブタI型αIコラーゲンまたは組換えヒトI型αIコラーゲンに由来する、請求項65に記載の注射可能製剤。
【請求項６７】
BRC集団が選択された腎細胞（SRC）集団であり、操作されたBRCは操作されたSRCである、請求項63に記載の注射可能製剤。
【請求項６８】
患者において腎臓病を治療する方法であって、その方法が、請求項61に記載の製剤を患者に注入することを含み、その製剤が18〜30ゲージ針を通して注入される、前記方法。
【請求項６９】
針が、約27 ゲージ、約26ゲージ、約25ゲージ、約24ゲージ、約23ゲージ、約22ゲージ、約21ゲージ、または約20ゲージの直径を有する、請求項68に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年6月21日出願の米国仮出願第62/523,241号の優先権の利益を主張し、その内容はすべてそのまま参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による引用
ファイル名“050400-516001WO_SEQUENCE_LISTING.txt”の配列表テキストファイルは2018年6月21日に作製されたものであって、サイズは88,654バイトであるが、その内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腎臓病を治療するための細胞、組成物、および方法に関する。一部の態様は、腎臓病を有する被験体を治療するために、好ましくはアロ反応性のない、遺伝子操作された生物活性腎細胞集団を開発するための組成物および方法に関するものであり、ならびに選択された腎細胞集団を用いて自然腎に再生効果を与える方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
組織および臓器の再生は今や、科学技術的に現代医学の手の届く範囲となっているので、腎細胞による治療は最近の関心を集めている（Ludlow et al. The Future of Regenerative Medicine: Urinary System. Tissue Engineering. 2012; 18:218-24）。組織工学および細胞ベースの応用に関わる新たな治療パラダイムが報告されているが、それは、この患者集団において、腎機能の実質的かつ永続的な増強をもたらし、病気の進行を遅らせ、さらにクオリティ・オブ・ライフを改善するものである。こうした次世代の再生医療技術は、慢性腎臓病（CKD）の治療オプションとして単離された腎細胞を提供する。Presnell et al. WO/2010/056328およびIlagan et al. PCT/US2011/036347は、単離された生物活性腎細胞、および同細胞を単離して培養する方法、ならびにその細胞集団による治療の方法を記載する。この生物活性腎細胞をレシピエントの腎臓に注入することによって、非臨床試験において、たとえば尿濃縮および濾過機能からも明らかなように、動物の生存および腎機能の有意な改善がもたらされた。
【０００５】
選択された腎細胞を使用する、患者（患畜）の治療のための現行のプロトコルは、自己細胞移植に基づく。このアプローチにおいて、生物活性腎細胞は、患者から回収され、ex vivoで選択されて、必要ならば細胞数を増大させるためにin vitroで培養され、最終的にその患者に注入される。それぞれの患者は、患者自身の腎細胞を用いて、個別に作り上げられた治療を受ける（すなわち自家移植治療）。自家移植治療は、実際に適用するには、大きな技術的および物流上の困難に直面しており、それを作り出すには高価な専用施設および専門職員が必要であって、患者の診断後短時間のうちに作製されなければならないが、場合によっては、病気の進行の程度次第で、患者の細胞がほとんど機能しない、および/またはごく少数しか存在しない可能性がある。これらの障害のため、自己細胞標品は、有効性および安全性に相当なばらつきを有する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO/2010/056328
【特許文献２】PCT/US2011/036347
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ludlow et al. The Future of Regenerative Medicine: Urinary System. Tissue Engineering. 2012; 18:218-24
【発明の概要】
【０００８】
本明細書で提供されるのは、特に、腎臓病を有する被験体の治療に使用するための、免疫原性の減少した細胞である。ある実施形態において、（たとえば炎症および免疫系の拒絶反応が起こりうるために）通常は患者に投与されることのないドナー由来の細胞が、遺伝子改変され、（たとえば、その細胞が存続して、腎機能の改善を促すように）患者に有用となる。そのような細胞を作製する方法も本明細書に含まれる。
【０００９】
ある態様において、遺伝子改変された生物活性腎細胞（BRC）を作製する方法が本明細書に示される。ある実施形態において、遺伝子改変BRCはゲノム改変されたBRC（すなわち、ゲノム内に遺伝子改変を有するBRC）である。ある実施形態において、遺伝子改変BRCは、BRCにおいてゲノムの免疫原性遺伝子の発現を減少させるRNA干渉（RNAi）分子を発現する、外来ポリヌクレオチド（たとえば、プラスミドもしくはウイルスベクター）を含有する。ある実施形態において、RNAi分子は低分子干渉RNA分子もしくは低分子ヘアピン型RNA分子である。ある実施形態において、方法は、BRCにおいてゲノムの免疫原性遺伝子を遺伝子改変することを含む。
【００１０】
ある実施形態において、遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子もしくはMHCクラスII分子内のタンパク質をコードする。ある実施形態において、遺伝子は、β2ミクログロブリン（β2Mとしても知られるB2M）、ヒト白血球抗原(HLA)-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、またはHLA-DQB1遺伝子である。
【００１１】
ある実施形態において、遺伝子は、マイナー組織適合抗原（MiHAもしくはmHA）をコードする。ある実施形態において、遺伝子は、HA-1、HA-2、HA-8、HB-1、HY-A1、HY-A2、HY-B7、HY-B8、HY-B60、またはHY-DQ5遺伝子である。
【００１２】
ある実施形態において、本明細書で言及される遺伝子（たとえばHLA遺伝子、B2M、もしくはmHA遺伝子）のアレルバリアントはいずれも、改変する（たとえば、欠失させる）、またはRNA干渉の標的とすることができる。
【００１３】
ある実施形態において、遺伝子を遺伝子改変することは、遺伝子を変異させることを含む。ある実施形態において、遺伝子を変異させることは、遺伝子またはその一部を欠失させることを含む。
【００１４】
ある実施形態において、細胞を遺伝子改変することは、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、および/またはHLA-DQB1遺伝子のうち任意の2つ以上の組み合わせを変異させることを含む。
【００１５】
ある実施形態において、遺伝子改変BRCは、遺伝子改変された初代腎細胞である。ある実施形態において、遺伝子改変された初代腎細胞は、遺伝子改変の前または後に少なくともほぼ1回、2回、3回、4回、5回、または6回以上、継代された。ある実施形態において、方法はさらに、遺伝子改変BRCからSRCを得ることを含む。ある実施形態において、SRCが得られ、それから遺伝子改変される。
【００１６】
ある実施形態において、BRCは、BRC集団の中にある。ある実施形態において、BRCは、選択された腎細胞（SRC）である。ある実施形態において、SRCは、SRC集団の中にある。SRCのさまざまな非限定的な例が本明細書において開示される。ある実施形態において、SRCは尿細管細胞である。ある実施形態において、尿細管細胞は、近位尿細管細胞である。ある実施形態において、SRCは、内分泌細胞、血管細胞、または糸球体細胞である。ある実施形態において、SRC集団は、低酸素抵抗性およびイオジキサノール抵抗性細胞を含む。ある実施形態において、SRC集団は、ヒアルロン酸合成酵素2を発現する細胞を含む。ある実施形態において、SRC集団は、受容体を介したアルブミン輸送能力を有する細胞を含む。ある実施形態において、SRCは、CK18およびGGT1を発現するという特徴を有する。ある実施形態において、PrestoBlue（プレストブルー）の代謝ならびにVEGFおよびKIM-1の産生は、生存可能で機能的な子孫の存在のマーカーとして使用される。ある実施形態において、BRCは腎生検によって得られる。
【００１７】
ある実施形態において、BRCは、BRC集団の中にあって遺伝子改変され、そのBRC集団内の全細胞より少ない細胞が遺伝子改変されることになる。ある実施形態において、方法はさらに、遺伝子改変されたBRCをBRC集団から単離または富化することを含む。ある実施形態において、方法はさらに、遺伝子改変されたSRCをSRC集団から単離または富化することを含む。ある実施形態において、BRC（たとえばSRC）の集団は、遺伝子操作を受けて、遺伝子改変された細胞もあるが、改変されていない細胞もある、BRC集団を生じる。ある実施形態において、遺伝子改変細胞の一部は、その改変についてホモ接合型である。ある実施形態において、遺伝子改変細胞の一部は、その改変についてヘテロ接合型である。ある実施形態において、改変がホモ接合型である細胞が富化または選択される。ある実施形態において、改変がヘテロ接合型である細胞が富化または選択される。ある実施形態において、改変がホモ接合型またはヘテロ接合型である細胞が富化または選択される。ある実施形態において、改変は、その遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を減少させる変異である。ある実施形態において、変異は、改変された細胞の表面の当該タンパク質レベルを低下させる。ある実施形態において、そのタンパク質を発現する細胞は激減（枯渇）し、または除外される。ある実施形態において、変異は、細胞の表面のMHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子のレベルを低下させる。ある実施形態において、変異を有する細胞は、その表面に、MHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子がない。ある実施形態において、その表面にMHCクラスI分子を発現する細胞は激減し、または除外される。ある実施形態において、その表面にMHCクラスII分子を発現する細胞は、激減し、または除外される。ある実施形態において、セルソーティング法を用いて、タンパク質であるMHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子を発現する細胞が、集団から除去される。ある実施形態において、セルソーティング法は、タンパク質であるMHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子と結合する（抗体のような）作用物質を含む。ある実施形態において、細胞の激減または選択は、その細胞表面上に特定のタンパク質を有する細胞を取り出すことができる、ビーズ/抗体結合を含む。ある実施形態において、セルソーティング法は、磁気標識セルソーティング（MACS）または蛍光標識セルソーティング（FACS）である。ある実施形態において、遺伝子改変のために選ばれる遺伝子は、そのタンパク質が細胞表面に発現される遺伝子であって、FACSおよび/またはMACS技術は、（たとえば、表面上に結合する抗体に基づいて）生細胞を区別することができる。実施形態において、MACSは、MHC分子（たとえばMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子）を発現する細胞を、発現しない細胞から取り出すために使用される。ある実施形態において、組込み型または非組込み型ベクターを使用して、別のHLA成分ポリペプチドを発現させ、ナチュラルキラー（NK）細胞による標的指向化および溶解を妨げるなど、適応免疫系または自然免疫系をさらに変更または調節することができる。
【００１８】
ある実施形態において、遺伝子を遺伝子改変する（たとえば、変異させる）ことは、(i) BRCにおいて遺伝子編集タンパク質を発現させること；または(ii) BRCの細胞膜を横切って遺伝子編集タンパク質を送達することを含む。ある実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガTAL、またはRNAガイド型エンドヌクレアーゼである。ある実施形態において、RNAガイド型エンドヌクレアーゼはCasタンパク質である。ある実施形態において、Casタンパク質はCas9タンパク質である。ある実施形態において、遺伝子を遺伝子改変することはさらに、(i) BRCにおいてガイドとなるシングルガイドRNA（gRNA）を発現させること；または(ii) BRCの細胞膜を横切ってガイドのシングルガイドRNA（gRNA）を送達することを含む。ある実施形態において、Cas9タンパク質およびgRNAはリボ核タンパク質複合体の一部である。
【００１９】
ある実施形態において、遺伝子改変BRCを作製する方法は、BRCにおいてゲノム免疫原性遺伝子を遺伝子改変して遺伝子改変BRCを作製すること、そしてその後、改変BRCを培養して遺伝子内に遺伝子改変を有する子孫を生じることを含む。ある実施形態において、その子孫は、遺伝子内に遺伝子改変を含有しない対応する細胞と比較して、免疫拒絶の可能性が低下している。ある実施形態において、方法は子孫を増殖させることを含む。ある実施形態において、子孫の増殖は、子孫を少なくとも1回、2回、3回、4回、または5回継代することを含む。ある実施形態において、細胞増殖速度および/または生存率は細胞継代ごとにモニターされる。ある実施形態において、増殖させた子孫の生存率をアッセイする。ある実施形態において、増殖させた細胞数を測定する。ある実施形態において、子孫の細胞数および生存率は、トリパンブルー色素排除およびPrestoBlueの代謝によってモニターされる。ある実施形態において、BRCまたはSRC機能性は、遺伝子発現プロファイリングまたは酵素活性測定によって評価される。ある実施形態において、酵素活性はLAPおよび/またはGGTについて測定される。
【００２０】
ある実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、トランスフェクトされたmRNAから発現される。ある実施形態において、Casタンパク質は、トランスフェクトされたmRNAから発現され、gRNAはプラスミドDNAから発現される。ある実施形態において、トランスフェクトされたmRNAは、修飾された核酸塩基またはポリアデニル化配列を含めることによって安定化される。ある実施形態において、トランスフェクトされたmRNAは、少なくとも1つの細胞透過性ペプチドと結合している。ある実施形態において、Casタンパク質はDNAベクターから発現される。ある実施形態において、Casタンパク質の発現は、細胞においてgRNAが発現されている期間の少なくとも一時期の間に誘導される。ある実施形態において、DNAベクターはゲノムに組み込まれない。ある実施形態において、DNAベクターはエピソームベクターである。ある実施形態において、DNAベクターはトランスポゾンである。ある実施形態において、gRNAはDNAベクターからの転写物である。ある実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、組換えタンパク質であって、ex vivoでgRNAと複合体を形成する。ある実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、組換えタンパク質であって、ex vivoでgRNAと複合体を形成し、そのタンパク質/gRNA複合体は、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または当業者に公知の他の方法によって細胞に送達される。ある実施形態において、選択可能なマーカーをコードする追加の核酸エレメント、および/または標的遺伝子に対する特異的変異が、Cas9タンパク質/gRNA複合体とともに、細胞に導入される。
【００２１】
ある実施形態において、遺伝子を遺伝子改変することは、細胞表面におけるMHCクラスIの量を減少させる。ある実施形態において、遺伝子を遺伝子改変することは、細胞表面におけるMHCクラスIIの量を減少させる。ある実施形態において、方法は2つ以上の遺伝子において遺伝子改変することを含み、それらの遺伝子の少なくとも1つは、MHCクラスI分子内のタンパク質をコードしており、それらの遺伝子の少なくとも1つは、MHCクラスII分子内のタンパク質をコードする。ある実施形態において、それらの遺伝子の少なくとも1つはHLA遺伝子である。
【００２２】
ある態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法によって得られる、操作された（たとえば、遺伝子改変された）BRC集団である。ある実施形態において、遺伝子改変されたBRC集団は、ゲノム改変されたBRC集団である。ある実施形態において、集団は、遺伝子改変されていない細胞および遺伝子改変された細胞の両者を含む。ある実施形態において、集団は操作されたBRCについて富化されている。ある実施形態において、操作されたBRCは遺伝子改変についてホモ接合型である。
【００２３】
ある態様において、本明細書で提供されるのは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子またはMHCクラスII分子の中に含まれるタンパク質をコードする遺伝子に変異を含んでいる、操作された（たとえば、遺伝子改変された）BRCである。ある実施形態において、遺伝子の少なくとも一部分が欠失しているが、その遺伝子は、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、またはHLA-DQB1遺伝子である。ある実施形態において、操作されたBRCは、BRCの集団の中に含まれる。ある実施形態において、遺伝子改変されたBRC集団は、ゲノム改変されたBRC集団である。ある実施形態において、集団は、遺伝子改変されていない細胞および遺伝子改変された細胞の両者を含む。ある実施形態において、集団は操作されたBRCについて富化される。ある実施形態において、操作されたBRCは遺伝子改変についてホモ接合型である。
【００２４】
ある態様において、本明細書で提供されるのは、患者において腎臓病を治療するための方法であって、その方法は、BRC集団を患者に投与することを含むが、このBRC集団は操作されたBRCを含んでおり、この操作されたBRCは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子またはMHCクラスII分子の中に含まれるタンパク質をコードする遺伝子内に変異を含む。
【００２５】
ある実施形態において、腎臓病は慢性腎臓病である。
【００２６】
ある実施形態において、BRC集団はSRC集団である。ある実施形態において、SRC集団は患者に由来する。ある実施形態において、SRC集団は、1人または複数人のドナーが起源である。ある実施形態において、SRC集団は、低酸素培養条件に暴露された後に得られる。ある実施形態において、SRC集団は、増殖させた腎細胞の密度勾配分離後に得られる。ある実施形態において、SRC集団は、約1.04、1.0419、または1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す。ある実施形態において、SRC集団は、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞型をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞型を欠いているかまたはそれらが不足している。
【００２７】
ある態様において、本明細書で提供されるのは注射可能製剤である。ある実施形態において、製剤は、a) 温度感受性の細胞安定化バイオマテリアル、およびb) BRC集団を含んでいるが、このBRC集団は操作されたBRCを含有し、操作されたBRCは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子またはMHCクラスII分子の中に含まれるタンパク質をコードする遺伝子内に変異を含む。ある実施形態において、温度感受性細胞安定化バイオマテリアルはハイドロゲルであって、このハイドロゲルは、(i) 約8℃以下において実質的に固体の状態を維持し、この実質的に固体の状態とはゲル状態である、(ii) ほぼ外気温以上では、実質的に液体の状態を維持する、ならびに(iii) 約8℃からほぼ外気温の間またはそれより高い温度では、固体から液体への遷移状態をとる。
【００２８】
ある実施形態において、ハイドロゲルは、組換え起源の細胞外マトリックスタンパク質を含むか、腎臓または別の組織もしくは臓器から得られる細胞外マトリックスに由来するか、あるいはゼラチンを含んでなる。ある実施形態において、ハイドロゲルはゼラチンを含んでなる。ある実施形態において、ゼラチンはI型αIコラーゲンに由来する。ある実施形態において、ゼラチンは、ブタI型αIコラーゲンまたは組換えヒトI型αIコラーゲンに由来する。ある実施形態において、BRC集団は選択された腎細胞（SRC）集団であり、操作されたBRCは操作されたSRCである。
【００２９】
ある態様において、本明細書で提供されるのは、患者において腎臓病を治療する方法であって、その方法は、本明細書に記載の操作されたBRCを含有する製剤を患者に注入することを含み、製剤は18〜30ゲージ針を通して注入される。ある実施形態において、針は、約27 ゲージ、約26ゲージ、約25ゲージ、約24ゲージ、約23ゲージ、約22ゲージ、約21ゲージ、または約20ゲージの直径を有する。
【００３０】
本発明は、BRCを遺伝子操作して、その存在が免疫源として認識されない、ドナーから得られる同種BRCとするための方法を開示するが、それは、Cas9/CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)などのRNAガイド型エンドヌクレアーゼの使用によって、このBRCを治療目的に適合させる。本明細書で提供される方法は、より詳細には、免疫クリアランスBRCの免疫学的認識なしに同種移植としてこれらの細胞の取り込みを可能にするように、（たとえば、MHC認識および/または免疫チェックポイントタンパク質）に関わる遺伝子を不活化および/または置き換えることによって、腎組織再生に適したBRCのゲノムの正確な改変を可能にする。
【００３１】
ある態様において、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変された免疫特権のある生物活性腎細胞集団を調製する方法であって、その方法は、(a) RNAガイド型エンドヌクレアーゼおよび特異的ガイドRNAの細胞内への導入および/または発現を含む、BRCまたはSRCを遺伝子改変するステップであって、このガイドRNAが、エンドヌクレアーゼを、BRCまたはSRCゲノム内の少なくとも1つの標的免疫原性遺伝子に方向付けるものである、前記ステップ；ならびに(b) その結果得られた、免疫拒絶の可能性が低い、または低下している、免疫特権を有する細胞を増殖させるステップを含む。ある実施形態において、RNAガイド型エンドヌクレアーゼはCas9である。RNAガイド型エンドヌクレアーゼは、トランスフェクトされたmRNAから発現させることができるが、すなわちRNAガイド型エンドヌクレアーゼはトランスフェクトされたmRNAから発現されており、そのgRNAはプラスミドDNAから発現される。ある実施形態において、トランスフェクトされたmRNAは、修飾された核酸塩基またはポリアデニル化配列を含めることによって安定化される。ある実施形態において、トランスフェクトされたmRNAは、少なくとも1つの細胞透過性ペプチドと結合している。方法の特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼはDNAベクターから発現される。エンドヌクレアーゼの発現は、ガイドRNAが細胞内に産生された時点で誘導されうる。ある実施形態において、DNAベクターはゲノムに組み込まれない。DNAベクターはエピソームベクター、人工染色体、またはトランスポゾンとすることができる。ある実施形態において、ガイドRNAは、DNAベクターからの転写物である。ある実施形態において、Casタンパク質は、指定の変異を含有する、ガイドRNAおよび/またはDNA標的化構築物とex vivoで複合体を形成している、精製組換えタンパク質である。ある実施形態において、Cas/gRNA複合体またはプラスミドはエレクトロポレーションによって細胞内に導入される。
【００３２】
ある実施形態において、少なくとも1つの標的免疫原性遺伝子は、MHCクラスIを制御する1つもしくは複数の遺伝子をコードする。ある実施形態において、少なくとも1つの標的免疫原性遺伝子は、MHCクラスIIを制御する1つもしくは複数の遺伝子をコードする。ある実施形態において、少なくとも1つの標的免疫原性遺伝子は、MHCクラスIおよびMHCクラスIIを制御する1つもしくは複数の遺伝子をコードする。ある実施形態において、少なくとも1つの標的遺伝子座は、HLA遺伝子をコードしていてもよい。ある実施形態において、HLA遺伝子は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5、HLA-DQファミリー遺伝子（たとえば、HLA-DQA1、および/またはHLA-DQB1）、およびHLA-DPファミリー遺伝子（たとえば、HLA-DPA1および/またはHLA-DPA2）からなる一群から選択される。
【００３３】
ある実施形態において、BRC（たとえばSRC）におけるMHCの抑制は、慢性腎臓病（RD）のための既製の同種組織工学/再生医療製品の開発を可能にする。ある実施形態において、改変BRC（たとえば、ユニバーサルドナーSRCなどの改変SRC）は、SRCの表面におけるMHCクラスIのノックダウンによって作製される。ある実施形態において、MHCクラスI複合体のB2MもしくはHLA-A（αサブユニット）成分を標的にする（たとえば、その全体または一部分を欠失させることによって、または塩基対を編集することによって、または選択可能なマーカーおよび/または改変されたゲノム断片などの外来DNAエレメントの導入によって、変異させる）ために、遺伝子編集（たとえばCRISPR/Cas-9遺伝子編集）が用いられる。
【００３４】
方法の特定の実施形態において、遺伝子改変BRCはin vitroで増殖させる。ある実施形態において、方法は、薬剤として使用するためのBRCまたはSRCを調製するために使用される。ある実施形態において、方法は、必要のある患者において慢性腎臓病を治療するためのBRCまたはSRCを調製するために使用される。
【００３５】
ある態様において、本明細書に記載の方法で得られる、操作されたBRCまたはSRC集団が提供される。
【００３６】
ある態様において、本明細書に含まれるのは、患者を治療するための方法であって、その方法は、(a) 上記の方法にしたがって、遺伝子改変されたBRCまたはSRC集団を調製すること；ならびに(b) 遺伝子改変BRCまたはSRCを患者に投与することを含む。ある実施形態において、患者は慢性腎臓病と診断されている。ある実施形態において、BRCまたはSRCは、治療を受ける患者が起源である。ある実施形態において、BRCまたはSRCは、1人または複数人のドナーが起源である。
【００３７】
ある態様において、生物活性腎細胞集団は、腎臓再生能力のある細胞を富化する培養条件下で、腎組織から腎細胞を単離して増殖させることにより得られる。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、低酸素培養条件に暴露された後に得られる。ある実施形態において、BRC集団は、増殖させた腎細胞の密度勾配分離後に得られるSRC集団である。ある実施形態において、SRCは、約1.04、1.0419、または1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞集団をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞集団を欠いているかまたはそれらが不足している。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団の細胞増殖速度は、細胞継代ごとにモニターすることができる。たとえば、BRCまたはSRC細胞数および生存率は、トリパンブルー色素排除、およびPrestoBlueの代謝によってモニターすることができる。ある実施形態において、BRCまたはSRCは、特定のバイアビリティマーカーおよび機能性マーカー、たとえばCK18およびGGT1の表現型発現によって特徴づけることができる。ある実施形態において、VEGFおよびKIM-1の生成を、生きた機能的なBRCまたはSRCが存在するマーカーとして使用することができる。ある実施形態において、生存率および機能性は、遺伝子発現プロファイルまたは酵素活性の測定によって確証（確立）することができる。ある実施形態において、BRCまたはSRCは、LAPおよび/またはGGTの酵素活性の測定によって特徴づけられる。
【００３８】
本発明は、本明細書（たとえば、概要、詳細な説明、実施例、および図面）に記載の遺伝子改変を含有する、単離された細胞または細胞集団、ならびに、腎細胞を免疫原性の低い（たとえば、免疫特権のある）状態にするように腎細胞のゲノム改変を行うのに有用な、たんぱく質、ポリペプチド、またはベクターのいかなるものも包含するが、それに限定されない。本明細書で提供される改変された腎細胞は、慢性腎臓病を治療または予防するための方法において、治療用製品として、理想的には「既成の」製品として使用することができる（患者の大半またはすべてではないにしても多くの患者の使用に役立つ）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】慢性腎臓病の治療に使用される、改変ヒト同種腎細胞を作製するための製造計画のフローチャート表示。
【図２】NKA製造工程全体の非限定的な例のフローチャート。
【図３Ａ】図２に示す工程の非限定的な例をさらに詳細に示すフローチャート。
【図３Ｂ】図２に示す工程の非限定的な例をさらに詳細に示すフローチャート。
【図３Ｃ】図２に示す工程の非限定的な例をさらに詳細に示すフローチャート。
【図３Ｄ】図２に示す工程の非限定的な例をさらに詳細に示すフローチャート。
【図４】MHCクラスI複合体の模式図。
【図５−１】ガイドRNAの結合部位を示すB2M遺伝子におけるゲノムスキャフォールド
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】ヒト初代腎細胞におけるCRISPR/Cas9を介したB2M（MHC-Iの不変のサブユニット）のノックダウンを示すFACS。
【図７】ヒト初代腎細胞におけるCRISPR/Cas9を介したB2M（MHC-Iの不変のサブユニット）のノックダウンを示すFACS。
【図８】B2M座位における遺伝子編集の成功を示すゲノム切断アッセイからの画像。下図は、明確化するために白黒反転させた、エチジウムブロマイド染色されたDNAゲルである。非限定的な例において、標的座位のゲノム切断アッセイまたは直接配列決定を用いて、標的ゲノム改変を確認することができる。
【図９】SRCにおけるCRISPRを介したB2M座位の編集を示すFACSアウトプット。ドナーABOハプロタイプの相違に注目すべきであり、MHC-Iの遺伝子編集を実行する能力がABOハプロタイプと無関係であることを示す。ドナー  血液型  TCHK006  O(+)  TCHK011  AB(-)  TCHK004  O(-)
【図１０】B2M CRISPR改変SRCは未改変対照SRCと比べてリンパ球増殖が低下していることを示す、リンパ球増殖アッセイからのグラフであって、これはB2MのCRISPR標的化がCRISPR改変SRCの免疫原性を低下させる証拠を提供する。
【図１１】B2M CRISPR改変SRCの効力検定試験からのグラフであって、これは、改変SRCと未改変SRCの間でVEGFおよびKIM1の分泌に有意な相違がないことを示す。CRISPR改変はSRCの機能性に影響を与えない。
【図１２】ヒト第6染色体上のHLA MHC複合体を示す模式図。
【図１３】培養中の典型的なヒト腎細胞の形態を示す画像。
【図１４】密度境界を超える遠心分離による典型的なSRCバンド形成を示す画像。
【図１５】ゲル化に関する典型的なゼラチン溶液の温度特性を示すグラフ。
【図１６】NKAゲル化時の回転時間の関数としての典型的な細胞分布を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本明細書で与えられるのは、特に、多数の患者に使用することができる、腎細胞集団を得るための、製剤および方法である。ある実施形態において、その集団は、その集団の起源である元の集団より免疫原性が低い。ある実施形態において、遺伝子編集を用いて、免疫抑制することなく患者に投与することができる同種腎細胞集団が作製される。免疫原性遺伝子ハプロタイプの相違にかかわらず、レシピエント被験体への移植に成功しうる、異なる組織型もしくはドナーからの好適なドナー細胞が本明細書に含まれる。
【００４１】
理想的には、標準化された治療法を使用したいが、その治療法において同種治療用細胞はあらかじめ製造され、詳細に特徴づけられており、患者への速やかな投与に使用することができる。残念ながら、1つもしくは複数の免疫原性遺伝子座においてマッチするアレルを有する好適なドナー細胞の利用可能性は、ヒト集団におけるハプロタイプの多様性のために限られている。たとえば、HLAは、初期の骨髄造血幹細胞/前駆細胞移植（HSCT）臨床治療の際に最初に同定された免疫原性遺伝子である。ドナーとレシピエント被験体との間のHLA不一致は免疫反応を引き起こしうるが、この場合レシピエントのT細胞は、同種ドナー細胞表面上に発現または提示されるHLAタンパク質もしくはドナー特異的抗原を認識することによって、体内に入ってくるドナーの同種組織を外来異物として認識し、最終的に移植片拒絶に至る（Bhatia S. Expert Rev Hematol. 2011; 4(4):437-452; Garnett C, et al. TherAdv Hematol. 4(6): 366-78 (2013)）。同種移植されたドナー細胞に対する免疫反応を抑制する、医療分野の進歩にもかかわらず、依然として、ドナー細胞の拒絶を低下させ、ならびに/または、ドナー細胞の免疫適合性を高めることができる、追加の方法および組成物が必要である。中でも注目すべきことに、免疫原性遺伝子ハプロタイプの相違にかかわらず、レシピエント被験体への移植に成功しうる好適なドナー細胞の利用可能性を向上させることは、依然として必要である。
【００４２】
細胞移植の免疫学的障壁を乗り越えるための1つのアプローチは、HLA分子の遺伝子操作である。ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用することによって、Torikaiらは、胚性幹細胞（ESC）においてヒト白血球抗原（HLA）クラスIを除去し、HLA-A細胞がHLA制限型細胞傷害性Tリンパ球による溶解を免れることができることを実証した（Oberg L etc., Eur J Immunol., 2004, 34(6): 1646-1653）。別の研究において、Riolobosらは、MHCクラスI分子のアクセサリー鎖をコードし、その表面発現のために必要とされるB2Mを破壊した（Laura Riolobos etc., 2013, 21(6): 1232-1241）。B2M遺伝子のホモ接合性欠失は、クラスIヒト白血球抗原（HLA）分子の表面移行を妨げて、免疫原性を低下させた。さらに最近では、哺乳動物細胞におけるCRISPR/Cas9システムの発見および応用が、たとえば、非相同末端結合経路（NHEJ）、相同組換え修復（HDR）、または他のDNA修復経路によって、効果的で正確な標的遺伝子の編集をもたらすことが示されている（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012）。Cas9分子および標的特異的ガイドRNA（gRNA）分子の同時デリバリーは、ゲノム内の標的配列の遺伝子編集を容易にする。したがって、細胞内の遺伝子を改変するためにCRISPR/Cas9システムを使用することは、レシピエント被験体への移植用ドナー細胞の免疫適合性を高めるための、有望な戦略でもある（WO2016201047 A1）。
【００４３】
ある細胞型（たとえば胚性幹細胞）の免疫原性に関する実験を、別の細胞型（たとえば腎細胞）に予想どおりに当てはめたり、置き換えたりすることはできない。驚くべきことに、一部のB2M発現をノックアウトすることはまた、腎細胞集団の免疫原性をノックダウンした。その上、改変された細胞集団においてある程度のB2M発現が残されているにもかかわらず、免疫原性の低下が観察された。本発明には、腎臓病治療用のユニバーサルドナー細胞を作製するためにBRC（たとえばSRC）の適応免疫系を改変するという、遺伝子編集技術が含まれる。ある実施形態において、免疫原性は、適応（T細胞性）免疫反応を引き起こす能力である。
【００４４】
本発明の態様は、少なくともある程度は、あるハプロタイプを有するドナー由来のSRCを遺伝子改変して、異なるハプロタイプを有する被験体においてその免疫原性を低くすることができるという発見に関わる。本明細書に含まれるのは、免疫原性遺伝子ハプロタイプの相違にかかわらずレシピエント被験体への移植に成功しうる、遺伝子改変されたSRC、ならびにそのような改変SRCにより腎臓病を治療するための方法および製剤である。
【００４５】
ここでは発明の特定の実施形態について詳細に記載することとする。発明を実施例例証的実施形態と関連して説明するが、当然のことながらそれらは本発明をそれらの実施形態に限定するものではない。それどころか、発明は、請求の範囲に記載される本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替物、変更、および同等物を含めるものとする。当業者は、本明細書に記載の方法および材料と類似した、または同等の多くの方法および材料を認識することが可能であり、それらを本発明の実践に使用することができるであろう。本発明は、けっして記載された方法および材料に限定されない。
【００４６】
本明細書を通じて引用されるすべての参考文献は、そのまま参照により、明確に本明細書に組み入れられる。万一、組み入れられた文献、特許、および同種材料の1つもしくはいくつかが、それに限らないが定義された用語、用語法、記載の技法などを含む本出願と異なるか、または矛盾する場合には、本出願が優先される。
【００４７】
定義
他に記載のない限り、本明細書に使用される科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007 は、当業者に、本出願に使用される用語の多くに対する一般的な指針を与える。当業者は、本明細書に記載の方法および材料と類似した、または同等の多くの方法および材料を認識すること可能であって、それらを本発明の実践に使用することができる。実際、本発明は記載された方法および材料にいかなる態様においても限定されない。
【００４８】
本明細書において用いる、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数系も含むことが意図される。本明細書において用いる、「及び／又は」は、列挙された事項の任意のそしてあらゆる組み合わせを含む。
【００４９】
「含む」（"comprise," "comprising," "include," "including," および "includes"）という用語は、本明細書および請求の範囲に使用される場合、言明された特徴、整数、構成成分、またはステップの存在を明記するものであるが、1つもしくは複数の他の特徴、整数、構成成分、ステップ、またはそれらの一群が存在すること、または追加されることを排除しない。
【００５０】
本明細書において用いる、数値または範囲の文脈での「約」との用語は、文脈がより限定された範囲を要求しない限り、記載された又は請求された数値又は範囲±10%を意味するものとする。
【００５１】
本明細書で使用される「細胞集団」という用語は、適当な組織起源、通常は哺乳動物から、直接単離することによって得られる多数の細胞を指す。たとえば、細胞集団は腎細胞の集団、およびその混合物を含み得る。単離された細胞集団は、その後in vitroで培養することができる。本明細書で使用するための細胞集団を単離および培養するためのさまざまな方法、ならびに本明細書で使用するのに適した細胞集団中のさまざまな細胞数が、当業者に理解されるであろう。細胞集団は、たとえば腎臓などの臓器もしくは組織に由来する、未分画の不均一な細胞集団、または富化された均一な細胞集団とすることができる。たとえば、不均一な細胞集団は、組織生検または全臓器組織から単離することができる。あるいはまた、不均一な細胞集団は、組織生検または全臓器組織から確立された哺乳動物細胞のin vitro培養物から得ることができる。未分画不均一細胞集団は、非富化細胞集団と呼ぶこともできる。ある実施形態において、細胞集団は生物活性細胞を含有する。均一細胞集団は、共通の表現型を共有するか、または類似した物理的特性を有する同一細胞型の細胞を、未分画不均一細胞集団より多くの割合で含んでいる。たとえば、均一細胞集団は、不均一腎細胞集団から単離し、取り出し、または富化することができる。ある実施形態において、均一細胞集団は、不均一な細胞懸濁物の密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離による分離によって、細胞画分として得られる。ある実施形態において、均一細胞集団は、不均一細胞懸濁物の連続または不連続（単一段階または多段階）密度勾配分離によって、細胞画分として得られる。ある実施形態において、腎臓起源の均一もしくは不均一細胞集団は、腎臓以外の組織もしくは臓器を起源とする均一もしくは不均一細胞集団と混合されるが、それに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される、「生物活性のある」という用語は、薬理学的もしくは治療的活性のような「生物学的活性を有する」ことを意味する。ある実施形態において、生物活性は、腎機能の強化および/または腎臓の恒常性への効果である。ある実施形態において、生物学的活性は、鎮痛性；抗ウイルス性；抗炎症性；抗腫瘍性；免疫刺激性；免疫調節性；細胞生存能力の強化、抗酸化性、酸素運搬体、細胞動員、細胞接着、免疫抑制、血管新生、創傷治癒活性、宿主幹細胞もしくは前駆細胞の動員、細胞増殖、損傷部位への細胞遊走の刺激、細胞および組織線維症の改善、上皮間葉シグナル伝達カスケードの妨害、サイトカイン、増殖因子、タンパク質、核酸、エキソソーム、マイクロベシクルの分泌、またはそれらの任意の組み合わせであるが、それに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される「生物活性腎細胞」または「BRC」という用語は、被験者の腎臓に投与されたときに以下の性質：慢性腎臓病もしくはその症状の悪化もしくは進行を軽減する（たとえば遅らせる、または止める）能力、腎機能を強化する能力、腎臓の恒常性に影響を及ぼす（改善する）能力、ならびに腎組織もしくは腎臓の治癒、修復および/または再生を促す能力、のうち1つもしくはいくつかを有する腎細胞を指す。特定の実施形態において、BRCは、遺伝子改変なしである場合よりも、患者において免疫原性が低いよう、遺伝子改変されている（例えば、ゲノム改変されているおよび／またはRNAiを介して改変されている）。特定の実施形態において、BRCは、患者のハプロタイプにかかわりなく患者に投与され得る。特定の実施形態において、BRCは、免疫学的拒絶反応なしに、腎機能を増強し、腎ホメオスタシスに影響を与え（改善し）、および／または腎組織又は腎臓の治癒、修復および／若しくは再生を促進することができる遺伝子改変された（例えば、ゲノム改変されたおよび／またはRNAiを介して改変された）免疫特権細胞である。特定の実施形態において、こうした細胞は、機能的な尿細管細胞（たとえばクレアチニン排出およびタンパク質保持の改善に基づく）、糸球体細胞（たとえば、タンパク質保持の改善に基づく）、血管細胞、ならびに皮髄境界部の他の細胞を含み得る。特定の実施形態において、BRCは、腎組織からの腎細胞の単離および増殖から得られる。特定の実施形態において、BRCは、生物活性細胞（例えば再生的能力を有する細胞）を選択する方法を用いて、腎組織からの腎細胞の単離および増殖から得られる。特定の実施形態において、BRCは腎臓への再生効果を有する。特定の実施形態において、BRCは、選択された腎細胞（SRC）を含み、主としてSRCからなり、またはSRCからなる。特定の実施形態において、BRCはSRCである。生物活性な腎細胞（BRC）を取得する方法は、例えばare disclosed, for example, in Presnellら、WO/2010/056328, Ilaganら、PCT/US2011/036347、及びJainら、PCT/US2016/044866に開示されている。
【００５４】
特定の実施形態において、SRCは、適当な腎組織起源に由来する腎細胞の単離および増殖から得られる細胞であって、このSRCは、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞型をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞型を欠いているか、またはより少ない割合で含有する。特定の実施形態において、SRCは、出発の腎細胞集団より高い割合のBRCを含有する。特定の実施形態において、SRC集団は、腎臓病の治療に使用するための単離された腎細胞の集団であって、その腎細胞集団は、特定の生物活性成分および/もしくは細胞型を豊富に含む腎細胞集団、ならびに/または、特定の不活性な、および/もしくは望ましくない成分または細胞型を減少させた腎細胞集団であり、すなわち、腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす腎細胞集団である。特定の実施形態において、SRCは、遺伝子改変なしである場合よりも、患者において免疫原性が低いよう、遺伝子改変されている（例えば、ゲノム改変されているおよび／またはRNAiを介して改変されている）。特定の実施形態において、SRCは、患者のハプロタイプにかかわりなく患者に投与され得る。特定の実施形態において、SRCは、遺伝子改変（例えば、ゲノム改変および／またはRNAiを介して改変）されたものであり、それにより免疫特権化されているか拒絶反応が不可能であり、腎機能の安定化、及び／又は改善及び／又は再生をもたら能力を有する。SRCは、出発集団と比べて、すぐれた治療および再生の成果を提供する。特定の実施形態において、SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られる。特定の実施形態において、SRCは、1つもしくは複数のマーカーの発現に基づいて、（たとえば、MACS又はFACSによって）選択される。特定の実施形態において、SRCは、細胞型における1つもしくは複数のマーカーの発現に基づいて、1つもしくは複数の細胞型が（たとえば、MACS又はFACSによって）激減（枯渇）している。特定の実施形態において、細胞の枯渇又は選択は、細胞表面に特定のタンパク質を有する細胞を引き出すための、ビーズ／抗体カップリングを含む。特定の実施形態において、SRCは生物活性腎細胞の集団から選択される。特定の実施形態において、SRCは、増殖させた腎細胞の密度勾配分離によって選択される。特定の実施形態において、SRCは、密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心分離によって、または単一段階不連続ステップ勾配分離によって、増殖させた腎細胞を分離することによって選択される。特定の実施形態において、SRCは、低酸素条件下で培養された、増殖腎細胞の連続もしくは不連続密度勾配分離によって選択される。特定の実施形態において、SRCは、低酸素条件下で少なくとも約8、12、16、20、または24時間培養された、増殖腎細胞の密度勾配分離によって選択される。特定の実施形態において、SRCは、低酸素条件下で培養された増殖腎細胞の、密度境界、バリアー、もしくは界面を超える遠心による分離によって選択される。特定の実施形態において、SRCは、低酸素条件下で少なくとも約8、12、16、20、または24時間培養された増殖腎細胞の、密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心による分離（たとえば、単一段階不連続密度勾配分離）によって選択される。特定の実施形態において、SRCは主として尿��管腎細胞から構成される。特定の実施形態において、他の実質（たとえば血管）および間質（たとえば集合管）細胞がSRC中に含まれる可能性がある。特定の実施形態において、SRC集団において約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の細胞は、血管細胞である。実施形態において、SRC集団において約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の細胞は、集合管細胞である。特定の実施形態において、SRC集団において約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の細胞は、血管細胞または集合管細胞である。SRCを取得する方法は、例えば本明細書の実施例１において、Presnellら、WO/2010/056328、Ilaganら、PCT/US2011/036347、及びJainら、PCT/US2016/044866に開示されている。
【００５５】
「自然臓器（ネイティブ臓器）」という用語は、生きた被験者の臓器を意味するものである。被験者は健康であっても、健康でなくてもよい。健康でない被験者は、その特定臓器に関わる疾患を有することもある。
【００５６】
「自然腎（ネイティブ腎）」という用語は、生きた被験者の腎臓を意味するものである。被験者は健康であっても、健康でなくてもよい。健康でない被験者は、腎疾患を有することもある。
【００５７】
「再生効果（再生作用）」という用語は、腎臓などの自然臓器にたいして利益をもたらす効果を意味するものである。その効果には、自然臓器損傷程度の低減、または自然臓器の機能若しくは構造の改善、回復もしくは安定化を含めることができるがそれらに限定されない。腎損傷は、線維症、炎症、糸球体肥大、萎縮などの形をとることがあり、被験者の自然臓器に関連する疾患に関わる可能性がある。
【００５８】
細胞集団の文脈において、本明細書で使用される「混合物」という用語は、未分画不均一細胞集団に由来する2つ以上の単離され、富化された細胞集団表現型を組み合わせたものを指す。特定の実施形態によれば、
本発明の細胞集団は腎細胞集団である。
【００５９】
「富化された」細胞集団もしくは標品は、出発臓器細胞集団（たとえば、未分画不均一細胞集団）から得られる細胞集団であって、特定の細胞型を、出発集団におけるその細胞型の割合より高い割合で含有する、前記細胞集団を指す。たとえば、出発腎細胞集団を、目的とする第1、第2、第3、第4、第5の細胞集団などについて富化することができる。本明細書で使用される場合、「細胞集団」、「細胞標品」、および「細胞表現型」は区別なく使用される。
【００６０】
本明細書で使用される「低酸素」培養条件という用語は、細胞が、大気中酸素レベル（約21%）で培養される標準培養条件と比べて、培養系における有効酸素レベルの低下にさらされる培養条件を指す。低酸素でない条件は、本明細書では、正常条件または正常酸素条件と呼ぶ。
【００６１】
本明細書において提供されるのは、「遺伝子改変された」または「遺伝子操作された」または「遺伝子改変」を受けた、BRC(たとえばSRC)である。ある実施形態において、このような細胞は、遺伝子編集技術を用いて1つもしくは複数の特定の細胞表面抗原、たとえば主要組織適合抗原をSRC/BRCドナー集団から除去することによって得ることができる。さまざまな技術を用いてこのような細胞を工学的に作製することができる。たとえば、a) CRISPR/Casシステム；b) 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）；c) ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）；およびd) 人工メガヌクレアーゼホーミングヌクレアーゼなどの、人工ヌクレアーゼによるゲノム編集法によって、クローン化DNAまたは合成人工DNAが挿入、置換、または除去され、遺伝子操作されたSRC/BRCを生成することができる。当技術分野で公知のさまざまな他のポリヌクレオチドデリバリー法、たとえばトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、リポフェクション、有機修飾シリカもしくは有機修飾ケイ酸塩などのナノ加工物質（たとえばOrmosil）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスデリバリー法、または別の適当な方法が、SRC/BRCの遺伝子操作に適している可能性がある。
【００６２】
「RNAガイド型エンドヌクレアーゼ」は、そのエンドヌクレオチド活性および特異性がRNA分子との関連によって決まってくるポリペプチドを意味する。このRNA分子の全配列、またはより一般的には、このRNA分子の断片は、好ましくは8核酸塩基より長い配列であって、より好ましくは10核酸塩基より長く、さらにより好ましくは12核酸塩基より長い配列であるが、ゲノム中の標的配列を特定する能力を有する。概して、このRNA分子は、標的配列とハイブリダイズして、上記のようなエンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性を仲介する能力を有する。RNAガイド型エンドヌクレアーゼの例は、Cas9/CRISPRシステムの一部としてのCas9（CRISPR関連タンパク質9）である。より詳細には、たとえば、Sanders and Joung, Nature Biotechnology  32, 347-355 (2014)を参照されたい。
【００６３】
本明細書で使用される「免疫原性」は、ある物質が被験体（たとえばヒト被験者）に導入されたときに、検出可能な免疫反応（液性もしくは細胞性）を誘導することができる性質を意味する。
【００６４】
「免疫原性遺伝子」という用語は、主要組織適合抗原複合体タンパク質またはマイナー組織適合抗原をコードする遺伝子を含む。ある実施形態において、免疫原性遺伝子は、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、および/またはHLA-DQB1遺伝子のいずれか1つ、またはそれらの任意の組み合わせである。ある実施形態において、免疫原性遺伝子は、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRファミリー遺伝子（たとえばHLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、および/またはHLA-DRB5）、HLA-DPファミリー遺伝子（たとえばHLA-DPA1および/またはHLA-DPA2）、ならびにHLA-DQファミリー遺伝子（たとえばHLA-DQA1、および/またはHLA-DQB1）からなる一群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００６５】
「免疫適合性腎細胞」または「免疫適合性腎細胞集団」という用語は、細胞を免疫学的に認識されるようにする主要組織適合抗原複合体タンパク質および/またはマイナー組織適合抗原をコードする遺伝子の1つもしくは複数のアレルを欠いた、腎細胞または集団を含む。ある実施形態において、免疫適合性腎細胞または免疫適合性腎細胞集団は、B2Mをコードする遺伝子の1つもしくは複数のアレルを欠いた、腎細胞または集団である。ある実施形態において、免疫適合性腎細胞または免疫適合性腎細胞集団は、B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1, and/or HLA-DQB1遺伝子のいずれか1つ、もしくは任意の組み合わせの、1つもしくは複数のアレルを欠いた、腎細胞または集団である。ある実施形態において、免疫適合性腎細胞のレシピエント被験体への投与は、免疫学的特権を有し、レシピエント被験体において免疫反応誘導しない。
【００６６】
本明細書で使用される「バイオマテリアル」という用語は、選択された生物活性細胞を生存可能な状態で維持する、生体組織への導入に適した、天然または合成の生体適合性材料を指す。天然バイオマテリアルは、生体系によって作られる、または生体系を起源とする材料である。合成バイオマテリアルは、生体系によって作られない、または生体系を直接の起源としない材料であるが、その代わりに、当業者によく知られた特定の化学的方法およびプロトコルによって合成または構成される。本明細書に記載のバイオマテリアルは、天然および合成の生体適合性材料の組み合わせであってもよい。本明細書で使用されるバイオマテリアルには、たとえばポリマーマトリックスおよび足場が含まれる。当業者に理解されるように、バイオマテリアルはさまざまな形、たとえば多孔質発泡体、ゲル、液体、ビーズ、固体などとして構成される可能性があり、1つもしくは複数の天然または合成の生体適合性材料を含有することができる。ある実施形態において、バイオマテリアルは、ハイドロゲルとなることができる溶液の液体状態である。
【００６７】
本明細書において「ハイドロゲル（ヒドロゲル）」という用語は、（天然または合成の）有機ポリマーが、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋し、水分子を捕捉してゲルを形成する3次元の開放格子構造を生成するときに形成される物質を指す。ヒドロゲルの形成に使用することができる材料の例としては、アルギネートなどの多糖類、ポリホスファジン類、およびポリアクリレート類（これらはイオン的に架橋される）、或いは、温度によってまたはpHによってそれぞれ架橋される、Pluronics(商標)またはTetronics(商標)などのブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーが挙げられる。本明細書で使用されるヒドロゲルは、好ましくは、生分解性ゼラチンベースのヒドロゲルである。
【００６８】
本明細書で使用されるバイオマテリアルは、たとえば、ヒトまたは動物起源の既存の腎臓から得られる細胞外マトリックスを含むが、その天然細胞集団は、当業者に知られている界面活性剤および/または他の化学薬品を適用することによって除去されている。ある実施形態において、バイオマテリアルは、ハイドロゲルとなりうる溶液の液体状態であり、当業者に知られている3次元バイオプリンティング法を適用することにより、特定の細胞集団とともに、または特定の細胞集団なしで、積層される。ある実施形態において、バイオマテリアルは、脱細胞化された腎臓の3次元フラクタル組織構造を模して構成される。
【００６９】
「放出調節」という用語、または「放出制御」、「遅延放出」もしくは「持続放出」という同等の用語は、生物活性細胞などの活性作用物質を、長時間にわたって、または個体への投与後いっときより長い時間、放出する製剤を意味する。活性作用物質の放出調節は、製剤に応じて、望ましい時間範囲、たとえば数分間、数時間、数日間、数週間、またはそれより長期間にわたって起こりうるものであって、投与単位のほぼ全体が投与直後に利用できる標準製剤とは対照的である。組織工学および再生医療の応用に向けて、好ましい放出調節製剤は、局所投与（たとえば、活性作用物質の固形臓器への直接投与）後多くの時点で活性作用物質の放出をもたらす。たとえば、生物活性細胞の放出調節製剤は、投与した時すぐに細胞の初回放出を与え、その後の時点で後の2回目の放出をもたらす。活性作用物質の2回目の放出の遅延時間は、初回投与後数分、数時間、または数日とすることができる。概して、放出の遅延時間は、活性作用物質のバイオマテリアル担体がその構造的完全性を失うのにかかる時間に相当する。活性作用物質の遅延放出は、そうした完全性が劣化し始めるとすぐに始まり、完全性が完全になくなる時点までに終了する。当業者は、他の適当な放出メカニズムを想定することができる。
【００７０】
「外気温」という用語は、本明細書の製剤が被験体に投与される温度を指す。概して、外気温は温度制御環境の温度である。外気温は約18℃から約30℃までの範囲である。ある実施形態において、外気温は約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、または約30℃である。
【００７１】
本明細書で使用される「腎臓病」という用語は、血液を濾過し、血液から余分な水分、電解質、および老廃物を除去する機能を果たす、腎臓の能力の喪失をもたらす、あらゆる病期もしくは程度の急性もしくは慢性腎不全を伴う疾患を表す。腎臓病は、貧血などの内分泌機能不全（エリスロポエチン欠乏）、および無機質不均衡（ビタミンD欠乏）も含むことがある。腎臓病は腎臓で起こることもあるが、さまざまな疾患に続発することもあり、これには心不全、高血圧、糖尿病、自己免疫疾患、または肝疾患が含まれる（が、それに限定されない）。腎臓病は、急性腎損傷後に発症する慢性腎不全の状態であることもある。たとえば、虚血および/または中毒物質への暴露による腎損傷は急性腎不全を引き起こす可能性がある；急性腎損傷後の不完全な回復は慢性腎不全の発症につながることがある。
【００７２】
「治療（処置）」という用語は、腎臓病、貧血、尿細管輸送不全、または糸球体濾過不全に対する治療的処置および予防対策の両方を表すが、その目的は、標的とされる疾患を回復に向かわせ、予防し、または進行を遅くする（抑える）ことである。治療を必要とする人は、すでに腎臓病、貧血、尿細管輸送不全、もしくは糸球体濾過不全を有する人、ならびに腎臓病、貧血、尿細管輸送不全、もしくは糸球体濾過不全にかかりやすい人、または腎臓病、貧血、尿細管輸送不全、もしくは糸球体濾過不全を予防すべき人を含む。本明細書で使用される「治療」という用語は、腎機能の安定化および/または改善を含む。
【００７３】
本明細書で使用される「in vivo接触」という用語は、富化された細胞集団による分泌産物と自然臓器との直接接触を意味する。たとえば、富化された腎細胞集団（または腎細胞/腎細胞分画を含有する混合物もしくはコンストラクト）による分泌産物は、自然腎とin vivoで接触しうる。in vivo直接接触は、本来、パラ分泌、内分泌、または接触分泌とすることができる。分泌される産物は、本明細書に記載のさまざまな産物の不均一集団とすることができる。
【００７４】
「コンストラクト（構築物）」または「製剤」という用語は、1つもしくは複数の合成もしくは天然由来の生体適合性材料で構成される、足場またはマトリックスの表面上または内部に配置された1つもしくは複数の細胞集団のことをいう。1つもしくは複数の細胞集団は、1つもしくは複数の合成もしくは天然由来の生体適合性バイオマテリアル、ポリマー、タンパク質またはペプチドで構成されるバイオマテリアルで被覆され、その上に配置され、その中に包埋され、それに付着し、またはその中にシードされ（埋め込まれ）、または捕捉されている可能性がある。ある実施形態において、天然由来バイオマテリアルは、ヒトもしくは動物起源の脱細胞化された腎臓である。ある実施形態において、バイオマテリアルは、3次元バイオプリンティングによって構造的に作製された。1つもしくは複数の細胞集団は、in vitroまたはin vivoで、バイオマテリアルまたは足場またはマトリックスと組み合わせることができる。コンストラクトまたは製剤を作製するために使用される1つもしくは複数のバイオマテリアルは、コンストラクトの細胞成分の分散および/または内在組織との一体化を方向付け、促進し、または許容するように選択することができるが、コンストラクトまたは製剤の細胞成分の生存、生着、寛容、または機能的パフォーマンスを方向付け、促進し、または許容するように選択してもよい。ある実施形態において、足場/バイオマテリアルを形成するために使用される1つもしくは複数の生体適合性材料は、その上に配置される細胞集団のうち少なくとも1つの、多細胞性3次元組織の形成を方向付け、促進し、または許容するように選択される。ある実施形態において、バイオマテリアルは、組織化の方向性を含むがそれに限定されない、自然腎組織の様相を再現する特定の三次元細胞集合体もしくはオルガノイドの構築を方向付ける。ある実施形態において、バイオマテリアルは、管腔を含めた自然腎組織の様相を再現する、特定の尿細管構造の構築を方向付ける。ある実施形態において、バイオマテリアルは、そこに配置された細胞集団からのタンパク質、核酸および膜結合小胞の分泌を増進または促進する。概して、コンストラクトの作製に使用される1つもしくは複数のバイオマテリアルは、これらの細胞集団の起源である本来の生物環境に対応する、自然腎もしくは腎実質内部の特定の3次元組織または環境ニッチの様相を模倣または再現するように選択することもできる。こうした細胞集団の起源であった本来の生物学的ニッチを再創造することは、細胞の生存能力および効力をさらに増進または促進すると考えられる。
【００７５】
「細胞集合体（細胞凝集体）」または「スフェロイド」という用語は、単層での増殖とは対照的に3D増殖を可能にするように培養された細胞の凝集体または集合体を指す。「スフェロイド」という用語が、その集合体が幾何学的に球体であることを意味しないことは、特筆される。集合体は、明確に定義された形態および方向性をもって高度に組織化されることがあるが、組織化されない塊となることもある；それは単一の細胞型を含むことがあるが、2つ以上の細胞型を含むこともある。細胞は一次単離物とすることができるが、永久細胞株であっても、その2つの組み合わせであってもよい。この定義に含まれるのは、オルガノイドおよび器官型培養である。ある実施形態において、スフェロイド（たとえば細胞集合体またはオルガノイド）は、スピナーフラスコ内で形成される、ある実施形態において、スフェロイド（たとえば細胞集合体またはオルガノイド）は、3次元マトリックス中で形成される。
【００７６】
「Neo-Kidney Augment（ネオ腎臓増強剤、NKA）」という用語は、ゼラチンベースのヒドロゲルからなる生体材料中に製剤化された選択された腎細胞（SRC）により構成される注射可能製品である生物活性細胞製剤をいう。「先進的細胞療法（Advance Cell Therapy, ACT）」という用語もまた、NKAによる治療に使用される。特定の実施形態において、NKAは、ゼラチンベースのヒドロゲルからなる生体材料中で製剤化された免疫適合性腎細胞集団（例えば、免疫適合性SRC）を含む注射可能製品である。特定の実施形態において、NKAは、ゼラチンベースのヒドロゲルからなる生体材料に配合された免疫拒絶が不可能な、ゲノム的に改変された免疫特権を有する、相同的なSRCから構成される注射可能製品である。
【００７７】
「被験者（被験体）」という用語は、治療を受けるのにふさわしい、患者を含めた、任意の一人のヒト被験者を意味するものとするが、この被験者は腎疾患の、1つもしくは複数の徴候、症状または他の指標を経験しているかまたは、経験したことがある。このような被験者には、新規に診断されたか、または以前に診断されて再発もしくは再燃を現在経験している被験者、または理由に関わらず腎疾患のリスクがある被験者が含まれるが、それらに限定されない。被験者は、すでに腎疾患の治療を受けたものであり得るが、そうでないこともあり得る。
【００７８】
「患者（患畜）」という用語は、治療が望まれる任意の一個体の動物、より好ましくは哺乳動物（たとえば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類などの非ヒト動物を含む）を指す。もっとも好ましくは、本明細書において患者はヒトである。
【００７９】
「サンプル」または「患者サンプル」または「生体サンプル（生物学的サンプル）」という用語は、総じて、被験者もしくは患者、体液、体組織、細胞株、組織培養または他の起源から得られる任意の生物学的サンプルを意味するものとする。この用語は、たとえば、腎生検などの組織生検を含む。この用語は、たとえば、培養された哺乳動物腎細胞などの培養細胞を含む。組織生検および培養細胞を哺乳動物から得るための方法は当技術分野でよく知られている。「サンプル」という用語が単独で使用される場合、これはやはり、「サンプル」が「生体サンプル」または「患者サンプル」であること、すなわちこれらの用語が区別せずに使用されることを意味するものとする。
【００８０】
「テストサンプル（試験サンプル）」という用語は、本明細書の方法によって治療された被験者に由来するサンプルを指す。テストサンプルは、哺乳動物被験体のさまざまな起源に由来する可能性があり、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織などが含まれるが、それに限定されない。
【００８１】
「対照」または「対照サンプル」という用語は、陰性もしくは陽性対照を表し、この陰性もしくは陽性の結果がテストサンプルでの結果を相互に関連付けるのに役立つことが期待される。本明細書に適した対照としては、正常な腎機能に特徴的な指標を示すことが判明しているサンプル、腎疾患のないことが判明している被験者から得られたサンプル、ならびに腎疾患を有することが判明している被験者から得られたサンプルがあるが、それに限定されない。それに加えて、対照は、本明細書の方法で治療される前に被験者から得られたサンプルとすることができる。さらに適当な対照は、任意のタイプまたは病期の腎疾患を有することが判明している被験者から得られるテストサンプル、および、いかなるタイプまたは病期の腎疾患も有していないことが判明している被験者から得られたサンプルとすることができる。対照は、正常で健康な対応対照とすることができる。当業者は、本明細書において使用するのに適した他の対照を正しく認識することができる。
【００８２】
「再生予後（regeneration prognosis）」、「再生的予後（regenerative prognosis）」または「再生の予後」は総じて、本明細書に記載の細胞集団、混合物またはコンストラクトの投与または移植に関する、可能性の高い再生経過または結果の予想もしくは予測を意味する。再生予後について、予想もしくは予測は、移植もしくは投与後の機能的臓器（たとえば腎臓）の改善、移植もしくは投与後の機能的腎臓の発生、移植もしくは投与後の改善された腎機能もしくは能力の出現、ならびに移植もしくは投与後の自然腎による特定マーカーの発現の1以上により情報を与えられ得る。
【００８３】
「再生臓器」は、本明細書に記載の細胞集団、混合物またはコンストラクトの移植もしくは投与後の自然臓器を表す。再生臓器は、さまざまな指標によって特徴づけられ、それには、自然臓器における機能もしくは能力の出現、自然臓器における機能もしくは能力の改善、疾患に関連する特定のマーカーおよび生理学的指標の改善、ならびに／或いは自然臓器における特定のマーカーの発現が含まれるがそれらに限定されない。当業者は、他の指標が再生臓器を特徴づけるのに適している可能性があることを理解することができる。
【００８４】
「再生腎臓」は、本明細書に記載の細胞集団、混合物、またはコンストラクトの移植もしくは投与後の自然腎を指す。再生腎臓は、さまざまな指標によって特徴づけられ、それには、自然腎における機能もしくは能力の出現、自然腎における機能もしくは能力の改善、腎疾患に関連する特定のマーカーおよび生理学的指標の改善、ならびに自然腎における特定のマーカーの発現があるがそれに限定されない。当業者は、他の指標が再生腎臓を特徴づけるのに適している可能性があることを理解することができる。
【００８５】
生物活性細胞集団
特定の実施形態において、本項で与えられる治療用組成物または製剤は、特定の生物活性成分もしくは細胞型について富化された、および/または、特定の不活性な、もしくは不要な、成分または細胞型を欠いた、単離された不均一な腎細胞集団を含有する。特定の実施形態において、このような組成物および製剤は、腎疾患の治療に使用され、たとえば腎臓の機能および/または構造の、安定化および/または改善および/または再生をもたらす。特定の実施形態において、組成物は、健康な個体と比べて細胞成分を欠いているが、治療的性質は保持している、単離された腎細胞画分を含有し、たとえば腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす。特定の実施形態において、本項に記載の細胞集団は、健康な個体、腎疾患を有する個体、または本項に記載の被験者から得ることができる。
【００８６】
被験体の標的臓器もしくは組織に投与されることになる、選択された腎細胞集団の治療用組成物は、本明細書に含まれる。特定の実施形態において、生物活性のある選択された腎細胞集団は、概して、被験者への投与で治療的特性を有する可能性のある細胞集団を指す。特定の実施形態において、生物活性腎細胞集団は、必要のある被験者への投与で、被験体の腎機能の安定化および/または改善および/または修復および/または再生をもたらすことができる。特定の実施形態において、治療的特性は修復または再生効果を含み得る。
【００８７】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、腎臓に由来する未分画不均一細胞集団または富化均一細胞集団である。特定の実施形態において、不均一細胞集団は、組織生検から、または全臓器組織から単離される。特定の実施形態において、腎細胞集団は、組織生検または全臓器組織から確立された哺乳動物細胞のin vitro培養から得られる。特定の実施形態において、腎細胞集団は、生物活性成分（たとえば生物活性腎細胞）を富化し、不活性な、または不必要な、成分もしくは細胞をなくした、腎細胞不均一集団の亜分画もしくは亜集団を含む。
【００８８】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、GGTおよびサイトケラチンを発現する。特定の実施形態において、GGTは、約10%、約15%、約18%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、または約60%より高い発現レベルを有する。特定の実施形態において、GGTはGGT-1である。特定の実施形態において、腎細胞集団の細胞は、GGT-1、サイトケラチン、VEGF、およびKIM-1を発現する。特定の実施形態において、腎細胞集団の18%より多くの細胞が、GGT-1を発現する。特定の実施形態において、腎細胞集団の80%より多くの細胞が、サイトケラチンを発現する。特定の実施形態において、サイトケラチンは、CK8、CK18、CK19およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、サイトケラチンは、CK8、CK18、CK19、CK8/CK18、CK8/CK19、CK18/CK19またはCK8/CK18/CK19であって、この“/”はそれに隣り合うサイトケラチンの組み合わせを意味する。特定の実施形態において、サイトケラチンは、約80%、約85%、約90%、または約95%より高い発現レベルを有する。腎細胞集団の80%より多くの細胞が、サイトケラチンを発現する。特定の実施形態において、腎細胞集団はAQP2を発現する。特定の実施形態において、40%未満の細胞がAQP2を発現する。特定の実施形態において、腎細胞集団の少なくとも3%の細胞がAQP2を発現する。
【００８９】
特定の実施形態において、細胞集団内の18%より多くの細胞がGGT-1を発現し、細胞集団内の80%より多くの細胞がサイトケラチンを発現する。特定の実施形態において、サイトケラチンはCK18である。特定の実施形態において、細胞集団内の4.5%〜81.2％の細胞がGGT-1を発現し、細胞集団内の3.0%〜53.7%の細胞がAQP2を発現し、細胞集団内の81.1%〜99.7%の細胞がCK18を発現する。
【００９０】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、AQP1、AQP2、AQP4、カルビンディン、カルポニン、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31 (PECAM-1)、CD54 (ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8、CK18、CK19、CK8およびCK18およびCK19の組み合わせ、コネキシン43、キュビリン、CXCR4 (フーシン)、DBA、E-カドヘリン (CD324)、EPO (エリスロポエチン)、GGT1、GLEPP1 (糸球体上皮タンパク質1)、ハプトグロビン、Itgbl (インテグリンβ1)、KIM-1 (腎障害分子-1)、T1M-1 (T細胞免疫グロブリンおよびムチン含有分子)、MAP-2(微小管結合タンパク質2)、メガリン、N-カドヘリン、ネフリン、NKCC (Na-K-Cl-コトランスポーター)、OAT-1 (有機アニオントランスポーター1)、オステオポンチン、Pan-カドヘリン、PCLP1 (ポドカリキシン様1分子)、ポドシン、SMA (平滑筋αアクチン)、シナプトポジン、THP (タム・ホースフォールタンパク質)、ビメンチン、およびαGST-1 (αグルタチオンS-トランスフェラーゼ)から選択されるバイオマーカーの任意の組み合わせのうち1つもしくはいくつかを発現する細胞を含有する。
【００９１】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、腎組織生検における細胞の集団またはその初代培養物などの、出発集団と比べて上皮細胞が富化されている（たとえば、腎細胞集団は、出発集団より少なくとも約5%、10%、15%、20%、または25%多い上皮細胞を含む）。特定の実施形態において、腎細胞集団は、腎組織生検における細胞の集団またはその初代培養物などの、出発集団と比べて尿細管細胞が富化されている（たとえば、腎細胞集団は、出発集団より少なくとも約5%、10%、15%、20%、または25%多い尿細管細胞を含む）。特定の実施形態において、尿細管細胞は近位尿細管細胞を含む。特定の実施形態において、腎細胞集団は、出発集団と比べて少ない割合の遠位尿細管細胞、集合尿細管細胞、内分泌細胞、血管細胞、または前駆細胞様細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の遠位尿細管細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の集合尿細管細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の内分泌細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の血管細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の前駆細胞様細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、非富化集団（たとえば、出発腎細胞集団）と比較して、より高い割合の尿細管細胞、ならびに低い割合のEPO産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、非富化集団と比較して、より高い割合の尿細管細胞、ならびに低い割合のEPO産生細胞および血管細胞を含有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、非富化集団と比較して、より高い割合の尿細管細胞、ならびに低い割合の糸球体細胞および血管細胞を含有する。
【００９２】
特定の実施形態において、腎細胞集団の細胞は、ヒアルロン酸（HA）を発現する。特定の実施形態において、HAの分子量範囲は約5 kDaから約20000 kDaまでである。特定の実施形態において、HAは、5 kDa、60 kDa、800 kDa、および/または3000 kDaの分子量を有する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、特に腎臓内移植後に、ヒアルロン酸合成酵素2（HAS-2）の発現によって高分子量HAを合成し、および/または高分子量HAの合成を刺激する。特定の実施形態において、腎細胞集団の細胞は、HAS-2の作用によって、in vitroおよび/またはin vivoで比較的高分子量のHAを発現する。特定の実施形態において、腎細胞集団の細胞は、HAS-2の作用によって、in vitroでもin vivoでも比較的高分子量のHAを発現する。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも100 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約800 kDaから約3500 kDaまでの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約800 kDaから約3000 kDaまでの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも800 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも3000 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約800 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約3000 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、HAS-2は2x105から2x106 Daまでの分子量を有するHAを合成する。特定の実施形態において、比較的小さいHA分子種が、分解性ヒアルロニダーゼの作用によって生成される。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約200 kDaから約2000 kDaまでの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約200 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約20
00 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも200 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも2000 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも5000 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも10000 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも15000 kDaの分子量を有するHAである。特定の実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約20000 kDaの分子量を有するHAである。
【００９３】
特定の実施形態において、集団は、受容体を介したアルブミン輸送の能力を有する細胞を含有する。
【００９４】
特定の実施形態において、腎細胞集団の細胞は低酸素抵抗性である。
【００９５】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、メガリン、キュビリン、N-カドヘリン、E-カドヘリン、アクアポリン-1、およびアクアポリン-2の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９６】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素2 (HAS2)、ビタミンD3 25-ヒドロキシラーゼ (CYP2D25)、N-カドヘリン (Ncad)、E-カドヘリン (Ecad)、アクアポリン-1 (Aqp1)、アクアポリン-2 (Aqp2)、RAB17、RASがん遺伝子ファミリーメンバー(Rab17)、GATA結合タンパク質3 (Gata3)、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4 (Fxyd4)、溶質輸送体ファミリー9 (ナトリウム水素交換輸送体)・メンバー4 (Slc9a4)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ3ファミリー・メンバーB1 (Aldh3b1)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー・メンバーA3 (Aldh1a3)、およびカルパイン8 (Capn8)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９７】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素2 (HAS2)、ビタミンD3 25-ヒドロキシラーゼ (CYP2D25)、N-カドヘリン (Ncad)、E-カドヘリン (Ecad)、アクアポリン-1 (Aqp1)、アクアポリン-2 (Aqp2)、RAB17、RASがん遺伝子ファミリーメンバー(Rab17)、GATA結合タンパク質3 (Gata3)、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4 (Fxyd4)、溶質輸送体ファミリー9 (ナトリウム水素交換輸送体)・メンバー4 (Slc9a4)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ3ファミリー・メンバーB1 (Aldh3b1)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー・メンバーA3 (Aldh1a3)、およびカルパイン8 (Capn8)、およびアクアポリン-4 (Aqp4)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９８】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、アクアポリン7 (Aqp7)、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子2 (Fxyd2)、溶質輸送体ファミリー17 (リン酸ナトリウム)・メンバー3 (Slc17a3)、溶質輸送体ファミリー3・メンバー1 (Slc3a1)、クローディン2 (Cldn2)、Napsin Aアスパラギン酸ペプチダーゼ(Napsa)、溶質輸送体ファミリー2 (グルコース促進輸送体（facilitated glucose transporter）)・メンバー2 (Slc2a2)、アラニン(膜)アミノペプチダーゼ(Anpep)、膜貫通タンパク質27 (Tmem27)、アシル-CoA合成酵素中鎖ファミリーメンバー2 (Acsm2)、グルタチオンペルオキシダーゼ3 (Gpx3)、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ1 (Fbp1)、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ2 (Agxt2)、血小板内皮細胞接着分子(Pecam)、およびポドシン(Podn)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９９】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146、ポドシン(Podn)、およびネフリン(Neph)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4 (Cxcr4)、エンドセリン受容体B型(Ednrb)、V型コラーゲンα2 (Col5a2)、カドヘリン5 (Cdh5)、組織プラスミノゲン活性化因子(Plat)、アンジオポエチン2 (Angpt2)、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体(Kdr)、分泌型システインリッチ酸性タンパク質(オステオネクチン) (Sparc)、セルグリシン(Srgn)、TIMPメタロペプチダーゼインヒビター3 (Timp3)、ウィルムス腫瘍1 (Wt1)、ウイングレス型MMTV統合部位ファミリー（wingless-type MMTV integration site family）・メンバー4 (Wnt4)、Gタンパク質シグナル伝達制御因子4 (Rgs4)、エリスロポエチン(EPO)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【０１００】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、ポドシン、ネフリン、EPO、CK7、CK8/18/19の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【０１０１】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【０１０２】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、ポドシン(Podn)およびネフリン(Neph)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【０１０３】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、およびEPOの任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【０１０４】
特定の実施形態において、サンプルまたは細胞集団中のさまざまなバイオマーカーの存在（たとえば発現）および/またはレベル/量は、数多くの方法によって分析することができるが、その方法の多くは当技術分野で周知であって、当業者に理解されており、そうした方法には、免疫組織化学 (“IHC”)、ウェスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFA、蛍光活性化セルソーティング(“FACS”)、MassARRAY、プロテオミクス、生化学的酵素活性アッセイ、in situハイブリダイゼーション、サザン解析、ノーザン解析、全ゲノム配列解析、定量的リアルタイムPCR (“qRT-PCR”)および他の増幅型検出法 (たとえば、分岐DNA法、SISBA、TMAなど)を含むポリメラーゼ連鎖反応(“PCR”)、RNA-Seq、FISH、マイクロアレイ解析、遺伝子発現プロファイリング、および/または遺伝子発現プロファイリング技術 (“SAGE”)、ならびにタンパク質、遺伝子、および/または組織アレイ解析によって実施されるさまざまなアッセイのいずれか1つ、などがあるがそれらに限定されない。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するためのプロトコルに関する限定的でない例としては、ノーザンブロット法、サザンブロット法、免疫ブロット法、およびPCR分析が挙げられる。特定の実施形態において、Rules Based MedicineまたはMeso Scale Discoveryから入手できるマルチプレックスイムノアッセイも使用することができる。特定の実施形態において、サンプルもしくは細胞集団中のさまざまなバイオマーカーの存在（たとえば発現）および/またはレベル/量は、数多くの方法によって分析することが可能であって、その方法の多くは当技術分野で周知であり、当業者に理解されているが、そうした方法には、ゲノムワイドなトランスクリプトミクス、プロテオミクス、セクレトミクス（secretomics）、リピドミクス、ホスファトミックス(phospatomics)、エキソソミクス（exosomics）などといった「-オミクス」（“-omics”）プラットフォームがあり、これに限らないが、このハイスループットな方法は、計算生物学およびバイオインフォマティクス技術と連動して、検討中の細胞集団によって発現される、ならびに発現されない、遺伝子、miRNA、タンパク質、分泌型タンパク質、脂質などの完全な生物学的シグネチャーを明らかにする。
【０１０５】
特定の実施形態において、腎細胞集団中の2つ以上のバイオマーカーの存在を検出する方法は、抗体とその関連リガンド（すなわちバイオマーカー）との結合を可能にする条件下で、バイオマーカーに対する抗体とサンプルを接触させること、ならびに、たとえば、抗体とバイオマーカーとの間で複合体が形成されているかを見分けることによって、結合した抗体の存在を検出することを含む。特定の実施形態において、1つもしくは複数のバイオマーカーの存在は、免疫組織化学的方法によって検出される。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的検出および/または定性的検出を含む。
【０１０６】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、本明細書に記載のバイオマーカーの検出を可能にする1つもしくは複数の試薬、たとえば、AQP1、AQP2、AQP4、カルビンディン、カルポニン、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31 (PECAM-1)、CD54 (ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8/18、CK8/18/19、コネキシン43、キュビリン、CXCR4 (フーシン)、DBA、E-カドヘリン(CD324)、EPO (エリスロポエチン)、GGT1、GLEPP1 (糸球体上皮タンパク質1)、ハプトグロビン、Itgbl (インテグリンp)、KIM-1 (腎障害分子-1)、T1M-1 (T細胞免疫グロブリンおよびムチン含有分子)、MAP-2 (微小管結合タンパク質2)、メガリン、N-カドヘリン、ネフリン、NKCC (Na-K-Cl-コトランスポーター)、OAT-1 (有機アニオントランスポーター1)、オステオポンチン、Pan-カドヘリン、PCLP1 (ポドカリキシン様1分子)、ポドシン、SMA (平滑筋αアクチン)、シナプトポジン、THP (タム・ホースフォールタンパク質)、ビメンチン、およびαGST-1 (αグルタチオンS-トランスフェラーゼ)などを用いて同定される。特定の実施形態において、バイオマーカーはモノクローナルまたはポリクローナル抗体によって検出される。
【０１０７】
特定の実施形態において、細胞の起源は、対象とする標的臓器もしくは組織と同一である。特定の実施形態において、BRCおよびSRCは、腎臓に投与される製剤に使用するために、腎臓から得ることができる。特定の実施形態において、細胞集団は、腎生検から得られる。特定の実施形態において、細胞集団は、全腎臓組織から得られる。特定の実施形態において、細胞集団は、腎生検もしくは全腎臓組織から確立された、哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。
【０１０８】
特定の実施形態において、BRCおよびSRCは、生物活性腎細胞の不均一な混合物もしくは画分を含む。特定の実施形態において、BRCおよびSRCは、健康な個体から得ることができるが、あるいは、健康な個体からの本人の腎細胞画分である。特定の実施形態において、（たとえば腎臓もしくは腎生検において）健康な個体の腎細胞集団と比べて特定の細胞型を欠いている可能性がある、健康でない個体から得られた腎細胞集団もしくは画分が、本明細書に含まれる。特定の実施形態において、健康な個体と比べて細胞型を欠いた、治療的活性のある細胞集団が与えられる。特定の実施形態において、細胞集団は自己細胞集団から単離して増殖させる。
【０１０９】
特定の実施形態において、SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られる腎細胞を単離して増殖させることによって得られる。特定の実施形態において、腎細胞は酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、その増殖腎細胞から密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心分離によって選択される。特定の実施形態において、腎細胞は酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、その増殖腎細胞から、連続もしくは不連続の単一段階または多段階密度勾配遠心分離によって選択される。特定の実施形態において、SRCは主として腎上皮細胞からなり、それは再生能のあることで知られている。特定の実施形態において、他の実質（血管）細胞および間質細胞が、自己SRC集団に含まれていることもある。
【０１１０】
上記に記載のとおり、BRCは、腎修復及び再生に生来的に関与する、再生的腎細胞の単離集団である。特定の実施形態において、BRCは、腎組織から酵素消化によって単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させた腎細胞から得られる。細胞培養培地は、再生能力のある生物活性腎細胞を増殖させるように作製され得る。特定の実施形態において、BRCは、酵素消化により腎組織から単離された腎細胞から取得されたものであり、これらは免疫特権化されるよう又は移植拒絶が不可能となるよう遺伝的に改変されたものであり（例えばゲノム的に改変された及び／又はRNAiにより改変された）、標準的な培養技術を用いて拡大（増幅）されたものである。細胞培養培地は、再生的能力を有し、免疫特権を有する生物活性腎細胞を拡大（増幅）するよう設計され得る。特定の実施形態において、細胞培養培地は、分化因子を含有しない。特定の実施形態において、増殖させた腎細胞の不均一混合物は、再生能力のある細胞の組成をさらに増やすために、低酸素条件下で培養される。理論に縛られるつもりはないが、これは、以下の現象のうち1つもしくはいくつかに起因する可能性がある：1) 低酸素培養期間中の特定の細胞成分の選択的な生存、死、または増殖；2) 低酸素培養に反応して細胞の粒度および／または大きさが変化し、それによって浮遊密度、ならびにその後の、密度勾配分離の際の局在性に変化をもたらすこと；ならびに3) 低酸素培養に反応して細胞遺伝子/タンパク質発現が変化し、その結果として単離増殖集団において細胞の性質の差異をもたらすこと。
【０１１１】
特定の実施形態において、生物活性腎細胞集団は、腎臓再生能を有する細胞を富化する培養条件下での腎組織（生検で得られる組織など）由来の腎細胞の単離および増殖から得られる。
【０１１２】
特定の実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞（腎臓再生能力を有する細胞を富化した細胞集団など）を生じるために、1、2、3、4、5、または6回以上継代される。特定の実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、1回継代される。特定の実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、2回継代される。特定の実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、3回継代される。特定の実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、4回継代される。特定の実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、5回継代される。特定の実施形態において、細胞の継代は生物活性のない腎細胞の細胞集団を激減（枯渇）させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、少なくとも1つの細胞型の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、1.095 g/mlより密度の高い細胞の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、粒度の低い小さな細胞の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、赤血球より小さい細胞の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、直径が6μm未満の細胞の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、直径が2μm未満の細胞の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞の継代は、赤血球より粒度の低い細胞の細胞集団を激減させる。特定の実施形態において、細胞集団の生存率は、1回または2回以上の継代後に増加する。特定の実施形態において、小さい細胞および低い粒度という記述は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって、たとえば細胞の出現箇所の散布図のX-Y軸を用いて細胞を分析したときに使用される。
【０１１３】
特定の実施形態において、増殖させた生物活性腎細胞は、低酸素条件下で、少なくとも約6、9、10、12、もしくは24時間で48時間未満の間、または6から9時間までの間、または6から48時間までの間、または12から15時間までの間、または約8時間、または約12時間、または約24時間、または約36時間、または約48時間の間、培養される。特定の実施形態において、低酸素条件で培養された細胞は、密度に基づいて選択される。特定の実施形態において、生物活性腎細胞集団は、（たとえば、継代および/または低酸素条件下で培養後の）増殖させた腎細胞の、連続もしくは不連続の（単一段階もしくは多段階）密度勾配分離後に得られた、選択された腎細胞（SRC）集団である。特定の実施形態において、生物活性腎細胞集団は、（たとえば、継代および/または低酸素条件下での培養後の）増殖させた腎細胞の、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離による分離後に得られた、選択された腎細胞（SRC）集団である。特定の実施形態において、低酸素培養条件は、細胞が、細胞が大気中の酸素レベル（約21%）で培養される標準培養条件と比べて、培養系において利用できる酸素レベルの低下にさらされる培養条件である。特定の実施形態において、低酸素培養条件下で培養される細胞は、約5%から約15%、または約5%から約10%、または約2%から約5%、または約2%から約7%、または約2%、または約3%、または約4%、または約5%の酸素レベルで培養される。特定の実施形態において、SRCは、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す。特定の実施形態において、SRCは、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す。特定の実施形態において、SRCは、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す。特定の実施形態において、BRCまたはSRCは、出発腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞集団をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞集団を欠いているか、またはそれらが不足している。
【０１１４】
特定の実施形態において、増殖させた腎細胞は、SRCを得るために密度勾配分離に供することができる。特定の実施形態において、SRCは次に遺伝的に改変される。特定の実施形態において、遺伝的に改変された（例えばゲノム的に改変及び／又はRNAiにより改変）されたBRCは、密度勾配分離に供されて、遺伝的に改変されたSRCが取得される。特定の実施形態において、遺伝的に改変された（例えばゲノム的に改変及び／又はRNAiにより改変）されたBRCは、低酸素培養条件及び密度勾配分離の両方に供されて、遺伝的に改変されたSRCが取得される。特定の実施形態において、連続もしくは不連続の、単一段階もしくは多段階密度勾配遠心分離は、細胞浮遊密度に基づいて、収集された腎細胞集団を分離するために使用される。特定の実施形態において、増殖させた生物活性腎細胞は、SRCを得るために、密度境界、バリアーまたは界面を超える遠心分離によって分離することができる。特定の実施形態において、密度境界または界面を超える遠心分離は、細胞浮遊密度に基づいて、収集された腎細胞集団を分離するために使用される。特定の実施形態において、SRCは、一つにはOPTIPREP (Axis-Shield)培地を使用することによって作製されるが、この培地は非イオン性ヨウ素化合物イオジキサノールの60% (w/v)水溶液を含有する。しかしながら、生物活性腎細胞を得るために、他の培地、密度勾配（連続もしくは不連続）、密度境界、バリアー、界面、または他の手段、たとえば、本明細書に記載の細胞集団の単離に必要な特徴を有する、当技術分野で公知の細胞表面マーカーを用いた免疫学的分離、を使用することができることは、当業者に理解されるであろう。特定の実施形態において、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。特定の実施形態において、1.04 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。特定の実施形態において、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。特定の実施形態において、1.0419 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。特定の実施形態において、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。特定の実施形態において、1.045 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。
【０１１５】
特定の実施形態において、細胞浮遊密度は、SRC集団を得るために、および/または、腎細胞集団が生物活性腎細胞であるかを判断するために使用される。特定の実施形態において、細胞浮遊密度は、生物活性腎細胞を単離するために用いられる。特定の実施形態において、細胞浮遊密度は、単一段階OptiPrep (7%イオジキサノール；60% (w/v)、OptiMEM中)密度界面を超える（単一段階不連続密度勾配）遠心分離によって測定される。OptiPrepは、60% w/vイオジキサノール水溶液である。典型的な密度界面または単一段階不連続密度勾配に使用される場合、OptiPrepは、OptiMEM (細胞培養基本培地)により7%イオジキサノール（水およびOptiMEM中）の終濃度となるように希釈される。OptiMEMの調製は、HEPESおよび炭酸水素ナトリウムで緩衝化し、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミンまたはGLUTAMAX、微量元素、および増殖因子を添加する、イーグル最小必須培地の改変である。タンパク質レベルは最小（15 μg/mL）であり、インスリンおよびトランスフェリンが、わずかにタンパク質添加物である。フェノールレッドがpH指示薬として低濃度で含まれる。特定の実施形態において、OptiMEMは使用前に2-メルカプトエタノールを添加することができる。
【０１１６】
特定の実施形態において、OptiPrep溶液が調製され、望ましい密度を示す屈折率が使用前に測定される（R.I. 1.3456 +/- 0.0004）。特定の実施形態において、腎細胞は、溶液の上部に層をなす。特定の実施形態において、密度界面または単一段階不連続密度勾配は、遠心管（50mlコニカルチューブ）または細胞処理装置（たとえばCOBE 2991）の中で、室温にて20分間800gで（ブレーキなしで）遠心される。特定の実施形態において、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。特定の実施形態において、1.04 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。特定の実施形態において、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。特定の実施形態において、1.0419 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。特定の実施形態において、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。特定の実施形態において、1.045 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。特定の実施形態において、細胞密度の評価または密度に基づく選択の前に、細胞は、それが少なくとも50%コンフルエントとなるまで培養され、一晩（たとえば少なくとも約8時間から12時間）、37℃にて5% CO2雰囲気下で2%酸素に設定された低酸素インキュベーターの中でインキュベートされる。
【０１１７】
特定の実施形態において、腎臓サンプルから得られる細胞を増殖させた後、処理し（たとえば、低酸素および遠心分離）、SRC集団を作製する。特定の実施形態において、SRC集団は、本明細書に記載の試薬および方法を用いて作製される。特定の実施形態において、SRC集団の細胞を被験者に投与する前に、その集団由来の細胞サンプルの生存能力を調べる。特定の実施形態において、SRC集団の細胞を被験者に投与する前に、その集団由来の細胞サンプルの、本明細書に記載のマーカーのうち1つもしくはいくつかの発現を調べる。
【０１１８】
SRCを調製するための組成物および方法の限定的でない例が、U.S. Patent Application Publication No. 2017/0281684 A1に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
特定の実施形態において、BRCまたはSRCは、天然の自己もしくは同種の腎臓サンプルから得られる。特定の実施形態において、BRCまたはSRCは、非自己腎臓サンプルから得られる。特定の実施形態において、サンプルは腎生検で得ることができる。
【０１２０】
特定の実施形態において、腎細胞の単離および増殖は、腎上皮細胞および間質細胞を含む、腎細胞型の混合物をもたらす。特定の実施形態において、SRCは、増殖させた腎細胞の、連続もしくは不連続密度勾配分離によって得られる。特定の実施形態において、密度勾配分離されたSRC集団中の主要な細胞型は尿細管上皮表現型の細胞型である。特定の実施形態において、SRCは、密度境界、バリアーまたは界面を超える遠心分離により、増殖させた腎細胞を分離することによって得られる。特定の実施形態において、密度境界/バリアー/界面を超えて分離されるSRC集団中の主要な細胞型は、尿細管上皮表現型の細胞型である。特定の実施形態において、増殖させた腎細胞から得られるSRCの特性は、多方面からのアプローチで評価される。特定の実施形態において、腎細胞増殖過程の間、細胞の形態、増殖速度、および細胞生存率がモニターされる。特定の実施形態において、SRC浮遊密度および生存率は、密度勾配媒体上または密度勾配媒体を通した遠心分離およびトリパンブルー色素排除によって特徴づけられる。特定の実施形態において、SRC表現型はフローサイトメトリーによって特徴づけられ、SRC機能はVEGFおよびKIM-1の発現によって実証される。特定の実施形態において、プレフォーミュレーションであるSRCの細胞機能は、近位尿細管に存在する2つの特異的酵素；GGT (γ-グルタミルトランスペプチダーゼ) およびLAP (ロイシンアミノペプチダーゼ)の活性を測定することによっても評価することができる。
【０１２１】
特定の実施形態において、密度媒体を介した細胞亜集団の分離に寄与する細胞の特徴（サイズおよび粒度）を利用して、細胞亜集団をフローサイトメトリーで分離することができる（前方散乱 = フローサイトメトリーによるサイズの反映、ならびに側方散乱 = 粒度の反映）。特定の実施形態において、密度勾配または分離媒体は、対象とする特定の細胞に対して毒性が低くなければならない。特定の実施形態において、密度媒体は、対象とする特定の細胞に対して低い毒性を有するべきであるが、本明細書は、対象とする細胞の選択プロセスに役割を果たす媒体の使用を考慮する。特定の実施形態において、理論に拘束されることを望むものではないが、ローディングステップと回収ステップの間に細胞の相当な損失があるので、イオジキサノール含有媒体によって回収される本明細書に記載の細胞集団は、イオジキサノール抵抗性であるようであり、密度勾配、または密度境界、密度バリアーもしくは密度界面の条件下でのイオジキサノールへの暴露が、特定の細胞の排除をもたらすことを示唆する。特定の実施形態において、イオジキサノール密度勾配または密度界面分離後に現れる細胞は、イオジキサノールおよび/または密度勾配または界面暴露のあらゆる悪影響に対して抵抗性である。特定の実施形態において、軽度から中程度までの腎毒素を含有する造影剤が、たとえばSRC集団などの細胞集団の単離および/または選択に使用される。特定の実施形態において、SRCはイオジキサノール抵抗性である。特定の実施形態において、密度媒体は、ヒト血漿中のタンパク質と結合してはならず、対象とする細胞の重要な機能に悪影響を及ぼしてはならない。
【０１２２】
特定の実施形態において、細胞集団は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて1つもしくは複数の腎細胞型を富化および/または減少させた。特定の実施形態において、BD FACSAria（商標名）または同等の製品を用いて腎細胞型を富化および/または減少させることができる。特定の実施形態において、FACSAria III（商標名）または同等の製品を用いて腎細胞型を富化および/または減少させることができる。
【０１２３】
特定の実施形態において、細胞集団は、磁気細胞分離を用いて、1つもしくは複数の腎細胞型を富化および/または減少させた。特定の実施形態において、Miltenyi autoMACS（登録商標）システムまたは同等の製品を用いて1つもしくは複数の腎細胞型を富化および/または減少させることができる。
【０１２４】
特定の実施形態において、腎細胞集団は3次元培養に供された。特定の実施形態において、細胞集団を培養する方法は、連続灌流による。特定の実施形態において、3次元培養および連続灌流によって培養された細胞集団は、静置培養された細胞集団と比べて、高い細胞充実性および相互結合性を示す。特定の実施形態において、3次元培養および連続灌流によって培養された細胞集団は、そうした細胞集団の静置培養物と比べて、EPOの高い発現、ならびにE-カドヘリンなどの尿細管関連遺伝子の発現強化を示す。特定の実施形態において、連続灌流によって培養された細胞集団は、静置培養された細胞集団より高レベルのグルコースおよびグルタミン消費を示す。
【０１２５】
特定の実施形態において、本明細書に提供される細胞集団を調製する方法で低酸素条件を使用することができる。特定の実施形態において、細胞集団を調製する方法は、低酸素を条件付けるステップなしで使用することができる。特定の実施形態において、正常酸素圧条件を使用することができる。
【０１２６】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、腎組織から単離および/または培養した。腎細胞成分、たとえば治療用の製剤に使用される富化細胞集団、を分離および単離するための方法の限定的でない例を本明細書に記載するが、これには腎疾患、貧血、EPO欠損、尿細管輸送欠損、および糸球体濾過欠損の治療を含む。特定の実施形態において、細胞集団は、新たに消化された、すなわち機械的もしくは酵素的に消化された腎臓組織から、または哺乳動物腎細胞の不均一なin vitro培養物から単離される。
【０１２７】
特定の実施形態において、腎細胞集団は、EPO産生腎細胞を含有する。特定の実施形態において、被験者は貧血および/またはEPO欠損を有する。特定の実施形態において、EPO産生腎細胞集団は、EPOの発現、および酸素に対する生物学的応答を特徴としており、培養系の酸素圧の低下は、結果としてEPO発現の誘導をもたらす。特定の実施形態において、EPO産生細胞集団は、EPO産生細胞が富化されている。特定の実施形態において、EPO発現は、細胞集団が、標準大気中レベル（約21%）の有効酸素で培養される細胞集団と比べて、細胞が培養系の有効酸素レベルの低下にさらされる条件下で培養されたときに、誘導される。特定の実施形態において、低酸素条件で培養されたEPO産生細胞は、標準酸素条件で培養されたEPO産生細胞より高レベルのEPOを発現する。概して、低下したレベルの有効酸素（低酸素培養条件ともいわれる）における細胞の培養とは、低下した酸素のレベルが、標準大気中レベルの有効酸素（正常培養条件もしくは正常酸素圧培養条件ともいわれる）における細胞培養と比較して、低下していることを意味する。特定の実施形態において、低酸素細胞培養条件は、約1%未満の酸素、約2%未満の酸素、約3%未満の酸素、約4%未満の酸素、または約5%未満の酸素で細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、正常培養条件もしくは正常酸素圧培養条件は、約10%酸素、約12%酸素、約13%酸素、約14%酸素、約15%酸素、約16%酸素、約17%酸素、約18%酸素、約19%酸素、約20%酸素、または約21%酸素で細胞を培養することを含む。
【０１２８】
特定の実施形態において、約5%未満の有効酸素で細胞を培養し、EPO発現レベルを大気中（約21%）酸素で培養された細胞と比較することによって、EPOの誘導もしくは発現の増加が得られ、これを観察することができる。特定の実施形態において、EPOを発現する能力を有する細胞の培養物において、細胞培養物がある程度の期間、大気中酸素（約21%）で培養される第1培養期、および、有効酸素レベルを低下させ、同じ細胞が約5%未満の有効酸素で培養される第2培養期を含む方法によって、EPOの誘導が得られる。特定の実施形態において、低酸素条件に反応するEPO発現は、HIF1αによって制御される。特定の実施形態において、当技術分野で知られている他の酸素操作培養条件を、本明細書に記載の細胞のために使用することができる。
【０１２９】
特定の実施形態において、製剤は、灌流条件に対する生物学的反応性（たとえばEPO発現）を特徴とするEPO産生哺乳動物細胞の富化集団を含有する。特定の実施形態において、灌流条件には、一過性、間欠性、または連続性の流体流動（灌流）が含まれる。特定の実施形態において、細胞を培養する培地を間欠的または連続的に循環させて、流れを介して動的な力が細胞に伝えられるように攪拌した場合、EPO発現は機械的に誘導される。特定の実施形態において、一過性、間欠性、または連続性流体流動にさらされる細胞は、それらの細胞が、フレームワーク、および/またはそうした3次元構造が形を成すスペースを提供する材料の中で、またはその表面上に、3次元構造として存在するように培養される。特定の実施形態において、細胞は多孔質ビーズ上で培養され、揺動プラットフォーム、軌道周回プラットフォーム、またはスピナーフラスコを用いて、間欠的または連続的な流体流動にさらされる。特定の実施形態において、細胞は3次元足場材料上で培養され、デバイスの中にセットされるが、その足場は、そのデバイスによって固定されており、流体がその足場を通過して、または横切って流れる。当業者には当然のことながら、当技術分野で知られている他の灌流培養条件を、本明細書に記載の細胞のために使用することができる。
【０１３０】
特定の実施形態において、細胞集団は腎生検から得られる。特定の実施形態において、細胞集団は全腎臓組織から得られる。特定の実施形態において、細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から樹立された哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。特定の実施形態において、腎細胞集団は、SRC集団である。特定の実施形態において、細胞集団は未分画細胞集団であって、本明細書では非富化細胞集団とも称される。
【０１３１】
さまざまな活性作用物質（たとえば腎細胞以外）を含有する組成物は本明細書に含まれる。適当な活性作用物質の非限定的な例としては、細胞凝集体、無細胞バイオマテリアル、生物活性細胞からの分泌産物、高分子および低分子治療薬、ならびにそれらの組み合わせがあるがそれに限定されない。たとえば、ある生物活性細胞型は、治療用分子または別の生物活性細胞型とともに、またはそれらなしで、バイオマテリアルベースのマイクロキャリアと組み合わせることができる。特定の実施形態において、非付着性細胞を無細胞粒子と組み合わせることができる。
【０１３２】
特定の実施形態において、腎細胞集団の細胞はスフェロイドの中に存在する。特定の実施形態において、腎細胞集団は、スフェロイドの形をとる。特定の実施形態において、生物活性腎細胞を含有するスフェロイドは被験者に投与される。特定の実施形態において、スフェロイドは、少なくとも1つの非腎細胞型または細胞集団を含有する。特定の実施形態において、スフェロイドは、(i)生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団を組み合わせること、ならびに(ii)その生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団を、スフェロイドが形成されるまで、スピナーフラスコを含む3次元培養系で培養すること、を含む方法で作製される。
【０１３３】
特定の実施形態において、非腎細胞集団は、内皮細胞集団および内皮前駆細胞集団を含む。特定の実施形態において、生物活性細胞集団は内皮細胞集団である。特定の実施形態において、内皮細胞集団は細胞株である。特定の実施形態において、内皮細胞集団はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を含む。特定の実施形態において、非腎細胞集団は、間葉系幹細胞集団である。特定の実施形態において、非腎細胞集団は、造血系、乳房、腸、胎盤、肺、骨髄、血液、臍帯、内皮、歯髄、脂肪、神経、嗅神経、神経堤、または精巣起源の幹細胞集団である。特定の実施形態において、非腎細胞集団は、脂肪由来前駆細胞集団である。特定の実施形態において、細胞集団は、異種、同系、同種、自己の集団、またはその組み合わせである。特定の実施形態において、生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団は、0.1:9.9から9.9:0.1までの割合で培養される。特定の実施形態において、生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団は、約1:1の割合で培養される。特定の実施形態において、腎細胞集団および生物活性細胞集団は増殖培地中に懸濁される。
【０１３４】
増殖させた生物活性腎細胞はさらに、連続もしくは不連続密度媒体分離に供し、SRCを得ることができる。具体的には、連続もしくは不連続の、単一段階もしくは多段階の密度勾配遠心分離を用いて、収集された腎細胞集団を細胞浮遊密度に基づいて分離する。特定の実施形態において、増殖させた生物活性腎細胞はさらに、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心による分離に供し、SRCを得ることができる。具体的には、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離を用いて、収集された腎細胞集団を細胞浮遊密度に基づいて分離する。ある実施形態において、SRCは、一つには、非イオン性ヨウ素化合物イオジキサノールの60%水溶液を含有するOPTIPREP (Axis-Shield)媒体を用いて作製される。しかしながら、当業者には、たとえば、本明細書の細胞集団の分離に必要な特徴を有する当技術分野で公知の細胞表面マーカーを用いた免疫学的分離など、特定の媒体もしくは他の手段に限らず、任意の密度勾配媒体を、本明細書にしたがって使用することができることが認識されるであろう。たとえば、パーコール（Percoll）またはショ糖を用いて、密度勾配もしくは密度境界を形成することができる。ある実施形態において、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。ある実施形態において、1.04 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は排除され廃棄される。ある実施形態において、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。ある実施形態において、1.0419 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は排除され廃棄される。ある実施形態において、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。ある実施形態において、1.045 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は排除され廃棄される。
【０１３５】
本明細書の治療用組成物およびその製剤は、腎疾患の治療に使用するために、特定の生物活性成分もしくは細胞型を富化し、および/または、特定の不活性もしくは不要な成分もしくは細胞型を減少させた、ものであって、受容者における免疫拒絶に与る細胞表面抗原をコードする遺伝的構成要素を除くことにより遺伝的に改変されたものであり、すなわち、腎臓の機能および/または構造の安定化および/または改善および/または再生をもたらす、単離された腎細胞の不均一集団および/またはその混合物を含有することができる。かかる安定化及び改善をもたらす細胞の非限定的な例は、たとえば、Presnell et al. U.S. 8,318,484およびIlagan et al. PCT/US2011/036347及びJain et al. PCT/US2016/044866に既に記載されており、その全体を参照により本明細書に含めるものとする。組成物は、健康な個体と比べて細胞成分を欠いているが治療的特性は保持している、すなわち腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす、単離された腎細胞画分を含有することができる。本明細書に記載の細胞集団、細胞画分、および/または細胞混合物は、健康な個体、腎臓病の個体、または本明細書に記載の被験者から得ることができる。
【０１３６】
本明細書は、必要のある被験者の標的臓器もしくは組織に投与されることになる、遺伝的に改変された（例えばゲノム的に改変及び／又はRNAiにより改変）された免疫特権を有する、選択された腎細胞集団の治療用組成物を考慮する。生物活性のある選択された腎細胞集団は総じて、被験者への投与において治療的特性を有する可能性のある細胞集団を指す。たとえば、必要のある被験者への投与によって、生物活性腎細胞集団は、被験者の腎機能の安定化および/または改善および/または修復および/または再生をもたらすことができる。治療的特性には修復又は再生効果を含めることができる。
【０１３７】
ある実施形態において、細胞の起源は対象とする標的臓器もしくは組織と同じである。たとえば、BRCおよび/またはSRCは腎臓から得られ、腎臓に投与される製剤に使用することができる。ある実施形態において、細胞集団は腎生検から得られる。ある実施形態において、細胞集団は全腎臓組織から得られる。特定の実施形態において、細胞集団は、腎生検もしくは全腎臓組織から樹立された、哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。ある実施形態において、BRCおよび/またはSRCは、生物活性腎細胞の不均一混合物もしくは画分を含有する。BRCおよび/またはSRCは、健康な個体から得ることが可能であって、すなわち健康な個体から得られるそれ自身の腎細胞画分である。それに加えて、本明細書は、健康でない個体から得られる腎細胞画分であって、健康な個体の対応する腎細胞画分と比べて、特定の細胞成分を欠く可能性があるが、それでも治療的特性は依然として保持している前記腎細胞画分を提供する。本明細書はまた、健康な個体と比べて細胞成分を欠いた、治療活性のある細胞集団を提供するが、その細胞集団は、ある実施形態において、さまざまな病期の自己の起源から単離して増殖させることができる。
【０１３８】
ある実施形態において、SRCは、患者の腎生検による腎皮質組織から腎細胞を単離して増殖させることから得られる。腎細胞は、酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、密度境界、バリアー、または界面を超える増殖腎細胞の遠心分離によって選択される。この実施形態において、SRCは、主として尿細管上皮細胞からなり、これはその再生能力で知られている（Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl. 1):S55-61; Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. PNAS. 2011;108:9226-31; Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A, et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2008;2:284-91）他の実質（血管）細胞および間質細胞が自己SRC集団に存在していてもよい。ある実施形態において、腎細胞は、連続もしくは不連続の単一段階もしくは多段階勾配による遠心分離によって選択される。
【０１３９】
必要のある被験体の標的臓器もしくは組織に投与されることになる、遺伝子改変された（たとえば、ゲノム改変された、および/またはRNAiを介して改変された）免疫特権のある選択された腎細胞集団の治療用組成物は、本明細書に含まれる。生物活性のある選択された腎細胞集団は、概して、被験者への投与にあたって治療的特性を有する可能性のある細胞集団を指す。たとえば、生物活性腎細胞集団は、必要のある被験体に投与すると、被験体の腎機能の安定化および/または改善および/または修復および/または再生をもたらすことができる。治療的特性は修復または再生効果を含みうる。
【０１４０】
ある実施形態において、細胞の起源は、同一起源もしくは異なる起源からの、対象とする標的臓器もしくは組織と同一である。たとえば、BRCおよび/またはSRCは、腎臓に投与される製剤に使用するために、腎臓から得ることができる。ある実施形態において、細胞集団は腎生検から得られる。ある実施形態において、細胞集団は全腎臓組織から得られる。ある実施形態において、細胞集団は、腎生検もしくは全腎臓組織から確立された、哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。ある実施形態において、BRCおよび/またはSRCは、遺伝子改変された（たとえば、ゲノム改変された、および/またはRNAiを介して改変された）免疫特権のある生物活性腎細胞の不均一な混合物もしくは分画を含む。BRCおよび/またはSRCは、健康な個体から得ることができるが、あるいは、健康な個体からの本人の腎細胞分画である。さらに、本発明は、健康な個体の対応する腎細胞分画と比較して、特定の細胞成分を欠いている可能性があるが、依然として治療的性質は保持している、健康でない個体から得られる腎細胞分画を提供する。本発明はまた、健康な個体と比べて細胞成分を欠いた、治療的活性のある細胞集団を提供するが、その細胞集団は、ある実施形態において、さまざまな哺乳動物から得られる腎臓から単離して増殖させることができる。
【０１４１】
ある実施形態において、SRCは、異なる患者の腎皮質組織から腎生検によって得られる腎細胞を単離して増殖させることによって得られる。ある実施形態において、腎細胞は酵素消化によって腎組織から単離され、その腎細胞が免疫特権を有するように、または拒絶することができないように、遺伝子改変され（たとえば、ゲノム改変、および/またはRNAiを介して改変され）、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、増殖させた腎細胞から密度勾配遠心分離によって選択される。ある実施形態において、SRCは主として腎上皮細胞からなるが、それは免疫特権および再生能力のあることで知られている。他の実質（血管）細胞および間質細胞が、そのSRC集団にわずかに存在することもある。
【０１４２】
本項に記載のように、本発明は、一つには、生物活性成分を富化し、不活性もしくは不要な成分を減少させた、腎細胞の不均一集団の特定の亜分画が、出発集団より優れた治療および再生の成果をもたらすという驚くべき知見に基づいている。
【０１４３】
腎細胞の単離および増殖は、腎上皮細胞および間質細胞を含めた腎細胞型の混合物を与える。上記のように、SRCは、増殖させた腎細胞の密度勾配分離により得られる。密度勾配分離されたSRC集団の主要な細胞型は、尿細管上皮表現型の細胞型である。増殖させた腎細胞から得られるSRCの特徴は、多方面からのアプローチによって評価される。腎細胞増殖過程の間、細胞の形態、増殖速度、および細胞生存率をモニターする。SRC浮遊密度および生存率は、密度勾配およびトリパンブルー色素排除によって、特徴づけられる。SRC表現型はフローサイトメトリーによって特徴づけられ、SRC機能はVEGFおよびKIM-1の発現によって実証される。
【０１４４】
当業者には当然のことながら、当技術分野で知られている分離および培養の他の方法を本明細書に記載の細胞に使用することができる。やはり当業者には当然のことながら、具体的に上記に挙げられる以外の起源、たとえば、限定はしないが、腎臓、体液および脂肪以外の組織および臓器から生物活性細胞集団を得ることができる。
【０１４５】
SRC表現型
ある実施形態において、細胞表現型はフローサイトメトリーを用いた腎細胞マーカーの発現解析によってモニターされる。細胞の表現型分析は、分析しようとする細胞型に特異的な抗原マーカーの利用に基づく。フローサイトメトリー分析は、分析しようとする抗原マーカーを発現するサンプル集団中の細胞について定量的指標を与える。
【０１４６】
尿細管上皮細胞の表現型を特徴づけるために有用な、さまざまなマーカーが文献に報告されている：(i) サイトケラチン；(ii) 輸送に関する膜タンパク質（アクアポリンおよびキュビリン）；(iii) 細胞結合分子（adherin（アドヘリン及び分化のクラスターおよびレクチン）；ならびに(iv) 代謝酵素（グルタチオンおよびγグルタミルトランスペプチダーゼ（GGT））。（表１）全腎臓消化物から得られる培養物中の細胞の大部分は、上皮および内皮細胞であるので、調べられるマーカーは、これら2群に特異的なタンパク質の発現に重点を置く。
【表１】
2020525003.tif 000003
【０１４７】
表2は、選択されたマーカー、SRC集団における表現型の範囲およびパーセント平均値、ならびにそれらの選択の論理的根拠を提供する。
【表２】
2020525003.tif 000004
【０１４８】
細胞機能
SRCは馴化培地の分析によって検出することができるタンパク質を活発に分泌する。細胞機能は、細胞がPrestoBlueを代謝する能力、ならびにVEGF（血管内皮増殖因子）およびKIM-1（腎障害分子1）を分泌する能力によって評価される。
【０１４９】
表3は、腎細胞およびSRC培養物から得られた馴化培地中に存在するVEGFおよびKIM-1の量を示す。腎細胞はほぼコンフルエンスとなるまで培養された。その腎細胞培養物への一晩の暴露から得られた馴化培地のVEGFおよびKIM-1を調べた。
【表３】
2020525003.tif 000005
【０１５０】
SRC酵素活性
プレフォーミュレーションであるSRCの細胞機能は、腎臓近位尿細管に存在する2つの特異的酵素；GGT（γグルタミルトランスペプチダーゼ）およびLAP（ロイシンアミノペプチダーゼ）の活性を測定することによっても評価することができる。
【０１５１】
選択された腎細胞組成物が本明細書に記載されているが、本発明は、さまざまな他の活性作用物質を含有する組成物を考慮する。他の適当な活性作用物質としては、細胞凝集体、無細胞バイオマテリアル、生物活性細胞からの分泌産物、高分子および低分子治療薬、ならびにそれらの組み合わせがあるがそれらに限定されない。たとえば、ある生物活性細胞型を、治療用分子または別の生物活性細胞型を有する、または有さないバイオマテリアルベースのマイクロキャリアと組み合わせることができ、非付着性細胞を無細胞粒子と組み合わせることができる。
【０１５２】
代表的な遺伝子改変法
ある実施形態において、BRC（たとえばSRC）などの細胞を遺伝子改変することは、（たとえば、発現を介して、または細胞膜を横切るデリバリーによって）遺伝子編集タンパク質および/または核酸をBRCの中に導入することを含む。
【０１５３】
ある実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガTAL、またはCasタンパク質である。ある実施形態において、遺伝子編集タンパク質は、一本鎖レア切断型ヌクレアーゼ構造物（「メガTAL」）である。ある実施形態において、ZFN、メガTAL、またはCasタンパク質（たとえばCas9）などの遺伝子編集タンパク質は、タンパク質として送達されてもよいが、あるいはまた、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド（たとえばmRNAまたはベクター）が細胞に送達される。
【０１５４】
ある実施形態において、Cas9タンパク質はタンパク質として送達される。ある実施形態において、Cas9タンパク質をコードするポリヌクレオチド（たとえばmRNAまたはベクター）が細胞に送達される。ある実施形態において、gRNAなどの遺伝子編集ポリヌクレオチドが細胞内に送達される。CRISPR/Cas9システムに関連して、シングルガイドRNA（「gRNA」または「ガイドRNA」）は、標的指向性配列（crRNA配列）およびCas9ヌクレアーゼリクルーティング配列（tracrRNA）をともに含有する。ある実施形態において、crRNAおよび/またはtracrRNAは細胞内に送達される。ある実施形態において、遺伝子編集ポリヌクレオチドは、細胞内で、たとえばmRNAまたはベクターから発現される。ある実施形態において、Cas9タンパク質ならびにgRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAを含有する遺伝子編集複合体、すなわちCRISPRリボ核タンパク質複合体（RNP）が細胞内に送達され、または発現される。
【０１５５】
ある実施形態において、細胞を遺伝子改変するために、（たとえば、RNPの一部として発現され、または送達される）Casタンパク質が使用される。ある実施形態において、Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその変異体である。（Cas9、およびCas9変異体の非限定的な例を含めた）Casタンパク質の非限定的な例は、本明細書に記載される。
【０１５６】
ある実施形態において、第1および第2のgRNA、または第1および第2のcrRNA分子は全体として、遺伝子もしくはその一部に隣接する標的配列（たとえばプロモーターおよび/または1つもしくは複数のエキソンおよび/またはそのイントロン）に相補的な核酸配列を含んでおり、この遺伝子もしくはその一部は、約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100キロベースの長さであり、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100キロベースの長さである。ある実施形態において、第1および第2のgRNA、または第1および第2のcrRNA分子を含有するRNPのペアは、細胞内で発現され、または送達される。ある実施形態において、RNPの一方の成分（たとえばCasタンパク質またはgRNA）は細胞内で発現され、もう一方の成分（たとえばgRNAまたはCasタンパク質）はその細胞の細胞膜を横切って送達される。
【０１５７】
ある実施形態において、gRNAまたはcrRNAの標的配列は、約12〜約25、すなわち、約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17-23、または18-22ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的配列は20ヌクレオチド長であり、またはほぼ20ヌクレオチド長である。
【０１５８】
ある実施形態において、標的とされるゲノム遺伝子座におけるエピゲノム改変は、標的とされるDNA部位のCasタンパク質に対するアクセシビリティを改変することができる。ある実施形態において、gRNAは、その転写開始部位に近い、および/またはヌクレオソームのH3K4（もしくは他の）残基の広範なメチル化を特徴とするオープンクロマチン領域内の、遺伝子を標的する。ある実施形態において、標的配列は、標的とされる遺伝子の転写開始部位の（たとえば、5’末端または3’末端のいずれかにおける）、約5000、2500、2000、1500、1250、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、または25塩基の範囲内である。ある実施形態において、標的配列は、遺伝子の転写開始部位の少なくとも一部とオーバーラップしているか、またはそれに相補的である。ある実施形態において、公開されているソフトウェア（CHOPCHOP, WU-CRISPR）を用いてCRISPR標的指向性構築物（指定のDNA配列と結合するgRNA）をデザインすることができる。B2MおよびHLA-A遺伝子について可能性のあるgRNA標的部位の非限定的な例を表4および表5に示す。
【０１５９】
【表４】
2020525003.tif 000006
2020525003.tif 000007
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【０１６０】
【表５】
2020525003.tif 000009
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【０１６１】
ある実施形態において、（BRC、たとえばSRC、などの）細胞が、その細胞の細胞膜を横切って、Casタンパク質、gRNA分子、RNP、ならびに/またはCasタンパク質および/もしくはgRNA分子を発現する1つもしくは複数のベクターを（たとえば、エレクトロポレーションまたは他の方法によって）送達するための手順に供された後、細胞の集団の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、1-99%、またはそれ以上が生存能力を有する。
【０１６２】
CRISPR-Casシステムのさまざまな態様が当技術分野で知られている。このシステムの非限定的な態様が、たとえば、米国特許第9,023,649号、2015年5月5日発行；米国特許第9,074,199号、2015年、7月7日発行；米国特許第8,697,359号、2014年4月15日発行；米国特許第8,932,814号、2015年1月13日発行；米国出願公開第2016/0298096号、2016年10月13日公開；Cho et al., (2013) Nature Biotechnology Vol 31 No 3 pp 230-232 (including supplementary information)；およびJinek et al., (2012) Science Vol 337  No 6096  pp 816-821に記載されており、これらはいずれもその内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６３】
CRISPR/Casヌクレアーゼシステムにおいて、CRISPR遺伝子座はシステムのRNA成分をコードし、Cas（CRISPR-関連)遺伝子座はタンパク質をコードする。微生物宿主のCRISPR遺伝子座は、CRISPR関連（Cas）遺伝子、ならびにCRISPRによるポリヌクレオチド切断の特異性をプログラムする能力を有する非コードRNAエレメントの組み合わせを含有する。
【０１６４】
II型CRISPRはもっともよく特徴づけられたシステムであって、一連の4ステップで標的とされる二本鎖切断を行う。第1に、2つの非コードRNA、プレcrRNAアレイおよびtracrRNAをCRISPR遺伝子座から転写する。第2に、tracrRNAはプレcrRNAの反復領域とハイブリダイズし、それぞれのスペーサー配列を含有する成熟crRNAへのプレcrRNAのプロセシングを媒介する。第3に、成熟crRNA:tracrRNA複合体は、crRNA上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）に隣接する標的DNA上のプロトスペーサーとの間の、ワトソン・クリック塩基対合によって、Cas9を標的DNAに向かわせる。操作されたCRISPR/Cas9システムにおいて、シングルガイドRNA（「gRNA」）とも称されるgRNAは、crRNAおよびtracrRNAを、プロトスペーサーエレメントおよびリンカーループ配列を含む一つのRNA構築物で置き換えることができる。gRNAの使用は、ゲノム編集のためのCRISPR/Cas9の使用に必要な成分を単純化することができる。異なる生物のCas9種は異なるPAM配列を有する。たとえば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）（Sp）は、5′-NGG-3′というPAM配列を有し、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（Sa）は、5′-NGRRT-3′または5′-NGRRN-3′のPAM配列を有し、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（NM）は、5′-NNNNGATT-3′のPAM配列を有し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（St）は、5′-NNAGAAW-3′のPAM配列を有し、トレポネーマ・デンチコラ（Treponema denticola）（Td）は、5′-NAAAAC-3′のPAM配列を有する。Cas9は標的DNAの切断を仲介し、プロトスペーサー内でDSBをもたらす。CRISPR/Casシステムの活性は本来、3つのステップを含む：(i) 「適応」と呼ばれるプロセスにおいて将来の攻撃を防ぐために外来DNA配列をCRISPRアレイに挿入すること、(ii) 関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて(iii) RNAを介して外来ポリヌクレオチドを妨害すること。外来ポリヌクレオチドは、細菌細胞を攻撃するウイルスに由来する。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Cas」タンパク質のいくつかがCRISPR/Casシステムの本来の機能に関与しており、外来DNAの挿入などの機能に役割を担っている。CRISPRはCas9以外のヌクレアーゼとともに機能することもある。Cpf2ファミリーの2つの遺伝子は、RuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、Cas9の第2のHNHエンドヌクレアーゼドメインを欠いている。Cpf1は、段違いの（staggered）パターンでDNAを切断し、Cas9によって切断に必要とされる2つのRNA（tracrRNAおよびcrRNA）ではなく、ただ1つのRNAを必要とする。Cpf1の好ましいPAMは5′-TTNであって、ゲノム位置およびGC含量のいずれにおいてもCas9のPAM（3′-NGG）とは異なる。Cpf1による切断のための成熟crRNAは、42-44ヌクレオチド長であって、Cas9のそれとほぼ同サイズであるが、スペーサーの後ろではなくその前にダイレクトリピートを有する。Cpf1 crRNAはまた、Cas9より構造がはるかに単純である；ダイレクトリピート中の短いステムループ構造のみが、標的の切断に必要である。Cpf1はまた、追加のtrancrRNAを必要としない。Cas9がPAM部位の3 nt上流に平滑末端を生じるのに対して、Cpf1は、段違いの様式で切断し、PAMから18-23 nt離れて5ヌクレオチドの5′オーバーハングを生成する。Cas9以外のCRISPR関連タンパク質をCas9の代わりに使用することができる。たとえば、CRISPR関連タンパク質1（Cas1）は、CRISPR原���生物免疫防御システムに見いだされる2つの普遍的に保存されたタンパク質の1つである。Cas1は、二本鎖DNA断片を生成する、金属依存性DNA特異的エンドヌクレアーゼである。Cas1は、もう1つの普遍的に保存されたCRISPR関連タンパク質、Cas2とともに安定な複合体を形成するが、これはCRISPRシステムのためのスペーサー獲得の一環である。
【０１６５】
NgAgoのような、PAM配列を使用しないCRISPR/Cas9バリアントも存在する。NgAgoは、24ヌクレオチドのssDNAガイドとともに機能し、この配列の開始から8-11ヌクレオチドを切断すると考えられる。ssDNAは、タンパク質がたたみこむようにロードされ、温度が非生理的な55℃にまで上昇しない限り、異なるガイドに交換されない。標的DNA内の少数のヌクレオチドが、切断部位の近くで除去される。NgAgoを用いた技法は、Gao, F. et al., DNA-guided Genome Editing Using the Natronobacterium Gregoryi Argonaute, 34 Nature Biotechnology 768 (2016)に記載されており、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。DSBは、2つの一本鎖切断を異なる位置で行って、粘着末端を有する切断されたDNA分子を作製することによって形成されうる。一本鎖切断もしくは「ニック」は、ただ1つの活性触媒ドメイン（「Cas9ニッカーゼ」と称される）を含有する、改変型のCas9酵素によって形成されうる。Cas9ニッカーゼは依然としてgRNAの特異性に基づいてDNAに結合するが、ニッカーゼはDNA鎖の一方を切断する能力を有するのみである。標的DNAにDSBを生じるには、向かい合ったストランドを標的とする2つのニッカーゼが必要である（しばしば、「ダブルニック」または「デュアルニッカーゼ」CRISPRシステムと称される）。この要件は標的特異性を劇的に高めるが、それは、DSBを引き起こせるほど近接した近傍内で2つのオフターゲットニックが生じる可能性は低いからである。DSBを生じさせるためにデュアルニッカーゼCRISPRシステムを用いるための技術は、Ran, et al., Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity, 154 Cell 6:1380 (2013)に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６６】
Casタンパク質の非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても知られる）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、ならびにその相同型および改変型がある。これらの酵素は既知である；たとえば、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースではアクセッション番号Q99ZW2（配列番号1）として、NCBIデータベースではアクセッション番号Q99ZW2.1として、見出すことができる。UniProtデータベースアクセッション番号A0A0G4DEU5およびCDJ55032は、Cas9タンパク質アミノ酸配列のもう1つの例を提供する（配列番号2）。もう1つの非限定的な例は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9タンパク質であって、そのアミノ酸配列は、UniProtデータベースにおいてアクセッション番号Q03JI6.1のもとに見出すことができる（配列番号3）。ある実施形態において、未改変CRISPR酵素は、Cas9のようなDNA切断活性を有する。ある実施形態において、CRISPR酵素はCas9であって、S. pyogenes由来のCas9であっても、肺炎球菌（S. pneumoniae）由来のCas9であってもよい。ある実施形態において、CRISPR酵素は、標的配列の位置において、たとえば、標的配列の内部および/または標的配列の相補鎖の内部において、一本鎖もしくは二本鎖の切断を指示する。ある実施形態において、CRISPR酵素は、標的配列の最初のヌクレオチドもしくは最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500塩基対、またはそれ以上の塩基対の範囲内で一本鎖もしくは二本鎖の切断を指示する。ある実施形態において、ベクターは、変異したCRISPR酵素が標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一本鎖もしくは二本鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素について変異させたCRISPR酵素をコードする。たとえば、S. pyogenes由来Cas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（D10A、このアミノ酸ナンバリングは配列番号1に示すとおりである）は、Cas9を、二本鎖を切断するヌクレアーゼから、ニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Cas9をニッカーゼにする変異の他の例には、H840A、N854A、およびN863Aがあるがそれに限定されない（このアミノ酸ナンバリングは配列番号1に示すとおりである）。ある実施形態において、相同組換えによるゲノム編集のためにニッカーゼを使用することができる。
【０１６７】
ある実施形態において、Cas9ニッカーゼは、1つもしくは複数のガイド配列、たとえば、DNA標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする2つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組み合わせは、二本鎖にニックを入れ、それを用いてNHEJを誘導することを可能にする。
【０１６８】
ある実施形態において、遺伝子操作は塩基編集タンパク質を用いて達成される。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、二本鎖DNA切断を（最初に、またはそれ以外にも）誘導することなく、ある塩基の別の塩基へのトランジションおよびトランスバージョン（たとえばAからTへ、CからGへ、など）を触媒する改変されたタンパク質（Casタンパク質または別のタンパク質など）である。塩基エディターCasタンパク質を含んでなるCRISPR/Casシステムは、次世代CRISPRシステムを代表する。このようなシステムの非限定的な例は、Gaudelli et al. (2017) Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature volume 551, pages 464-471；およびGehrke et al. (2018) High-precision CRISPR-Cas9 base editors with minimized bystander and off-target mutations, bioRxiv 273938; doi: https://doi.org/10.1101/273938に示されており、その内容はいずれも全体として参照により本明細書に組み入れられる。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、ゲノムDNAにおいてA・TからG・Cへの変換を仲介するアデニン塩基エディター（ABE）である。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、触媒性の損なわれたCRISPR-Cas変異体（たとえばCRISPR-Cas9変異体）と融合されたアデノシンデアミナーゼ（たとえば、DNAに作用するように改変されたRNAアデノシンデアミナーゼ）を含む。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、ゲノムDNAにおいてC・GからT・Aへの変換を仲介するシチジン塩基エディター（ABE）である。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、アポリポタンパク質B編集複合体（Apolipoprotein B Editing Complex）（APOBEC）（たとえば、ラットAPOBEC1もしくはヒトAPOBEC3A（A3A）シチジンデアミナーゼ）およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）と融合された、Cas9ヌクレアーゼをニッカーゼに変換する変異を有するCas9ヌクレアーゼを含む。ある実施形態において、RNAまたはDNA塩基エディターは、Cas9バリアント以外のCasバリアント、たとえばCas13バリアントなどを含む。さまざまな遺伝子編集タンパク質およびCasバリアントを塩基編集のために使用することができる。
【０１６９】
ある実施形態において、送達される遺伝子編集タンパク質（ZFN、メガTAL、またはCasタンパク質など）は、細胞内局在化シグナルを含んでいても、細胞内局在化シグナルと融合されていてもよく、遺伝子編集融合タンパク質を構成する。文脈に応じて、たとえばCas9および核局在化シグナルを含有する融合タンパク質は、本明細書では、核局在化シグナルを含んでいることを明記せずに「Cas9」と呼ぶことがある。ある実施形態において、融合タンパク質は、核局在化シグナルを含有することがある。ある実施形態において、Casタンパク質は、2つ以上の局在化シグナル、たとえば2、3、4、5、または6つ以上の核局在化シグナルを含有してもよい。ある実施形態において、局在化シグナルはCasタンパク質のN末端にあり、他の実施形態において、局在化シグナルはCasタンパク質のC末端にある。
【０１７０】
核局在化シグナルの非限定的な例には、GGSGPPKKKRKV (配列番号4)、PKKKRKV (配列番号5)、KR[PAATKKAGQA]KKKK (配列番号6)、KR[XXXXXXXXXX]KKKK (配列番号7)、KKXK (配列番号8)、KRXK (配列番号9)、KKXR (配列番号10)、KRXR (配列番号11)、AVKRPAATKKAGQAKKKKLD (配列番号12)、MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN (配列番号13)、PAAKRVKLD (配列番号14)、PPKKKRKV (配列番号15)、およびKLKIKRPVK (配列番号16)がある。
【０１７１】
ある実施形態において、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、たとえば哺乳動物細胞、たとえばヒト細胞における発現のために最適化される。
【０１７２】
概して、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、CRISPR複合体の配列特異的結合を標的配列に向けるのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。ある実施形態において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性の程度は、適当なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインされたとき、約90%、95%、97.5%、98%、99%、もしくはそれ以上であるか、またはそれを上回る。ある実施形態において、相補性の程度は100%である。最適なアラインメントは、配列をアラインするのに適した任意のアルゴリズムを用いて決定することができるが、その非限定的な例には、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム（たとえば、Burrows Wheeler Aligner）、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP (soap.genomics.org.cnで利用可能)、およびMaq (maq.sourceforge.netで利用可能)がある。ある実施形態において、ガイド配列は、約15、16、17、18、19、20ヌクレオチド長、もしくはそれ以上のヌクレオチド長であるか、またはそれを上回る。ある実施形態において、ガイド配列は約30、25、20、15ヌクレオチド長未満であるか、またはより少数のヌクレオチド長である。ガイド配列がCRISPR複合体の配列特異的結合を標的配列に向ける能力は、任意の適当なアッセイで評価することができる。たとえば、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPRシステムの成分は、テストされるべきガイド配列を含めて、たとえばCRISPR配列の成分をコードするベクターを用いたトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に与えられ、続いて標的配列内の選択的切断を評価することができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、CRISPR複合体の成分を、被験ガイド配列および被験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めて提供し、被験ガイド配列の反応と対照ガイド配列の反応との間で、標的配列における結合または切断率を比較することによって、試験管内で評価することができる。
【０１７３】
ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。ある実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内にある配列である。ある実施形態において、標的配列は標的ゲノムにおいてただ1つである。
【０１７４】
ある実施形態において、ZFNは、細胞を遺伝子改変するために使用される。ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合することによって作製された人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の望ましいDNA配列を標的とするように操作することができるので、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内でユニークな配列を標的とすることができるようになる。内在するDNA修復機構を利用することによって、これらの試薬を用いて、高等動物のゲノムを正確に変化させることができる。Cas9およびTALENタンパク質と並んで、ZFNは、ゲノム編集分野において卓越したツールとなりつつある。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、特定の位置でDNAに結合しそれを切断するようにデザインされた、部位特異的エンドヌクレアーゼである。2つのタンパク質ドメインが存在する。第1のドメインはDNA結合ドメインであって、これは真核生物転写因子およびジンクフィンガーを含有する。第2のドメインはヌクレアーゼドメインであって、これは制限酵素（FokI制限酵素など）を含み、触媒作用によるDNA切断の原因となる。個々のZFNのDNA結合ドメインは典型的には、3個から6個の個別のジンクフィンガーリピートを含有し、それぞれ9から18塩基対を認識することができる。ある実施形態において、ジンクフィンガードメインが、目的とする標的部位に完全に特異的であるならば、18塩基対の全体を認識する1対の3フィンガーZFNで、哺乳動物（たとえばヒト）ゲノムにおいて1つの遺伝子座を標的とすることができる。ある実施形態において、既知の特異性を有する小型のジンクフィンガー「モジュール」が組み合わせられる。ある実施形態において、モジュール組立工程は、それぞれ3塩基対DNA配列を認識することができる3つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、9塩基対の標的部位を認識することができる3フィンガーアレイを作製することを含む。ある実施形態において、II型制限エンドヌクレアーゼFokIに由来する非特異的切断ドメインは、ZFNにおいて切断ドメインとして使用される。この切断ドメインは、DNAを切断するために二量体化しなければならない。ある実施形態において、1対のZFNを用いて、非パリンドロームDNA部位を標的とする。ある実施形態において、切断ドメインはそれぞれのジンクフィンガードメインのC末端に融合される。ある実施形態において、2つの個別のZFNは、一定の距離をおいてC末端を有するDNAの向かい合ったストランドに結合する。
【０１７５】
TALENは、DNAの特定の配列を切断するように操作することができる制限酵素である。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメイン（すなわち、DNA鎖を切断するヌクレアーゼ）と融合することによって作製することができる。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、任意の望ましいDNA配列と実際に結合するように操作することができるが、そうしてヌクレアーゼと組み合わせると、特定の位置でDNAを切断することができる。制限酵素は、遺伝子編集用に、またはin situゲノム編集のために、細胞内に導入することができる。DNA結合ドメインは、12位および13位に多様なアミノ酸を有する、高度に保存された33-34アミノ酸配列の繰り返しを含んでいる。これら2つの位置は、反復可変二残基（RVD）と呼ばれ、可変性が高く、特異的ヌクレオチド認識との強い相関を示す。アミノ酸配列とDNA認識との間の直接的な関係は、適当なRVDを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、特異的DNA結合ドメインの操作を可能にした。とりわけ、RVDのわずかな変化、および「非従来型」RVD配列の組込みは、ターゲティング特異性を向上させることができる。当業者は、望ましい標的部位においてdsDNA内でDSBを生じるように、TALENをデザインして使用する方法がわかるであろう。Hermann, M. et al., Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases, 86 J. Vis. Exp. 50930 (2014) および Sakuma, T. et al., Efficient TALEN Construction and Evaluation Methods for Human Cell and Animal Applications, 18(4) Genes Cells 315 (2013)において、適当なプロトコルが入手できる。
【０１７６】
メガTALは、DNAを標的とする異なる2種類の酵素の組み合わせから得られる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる）は、同一ドメイン内にDNA認識およびヌクレアーゼ機能という両方の利点を有する単一ペプチド鎖である。しかしながら、メガヌクレアーゼの標的認識は改変しにくく、多くの場合、特異性は低く、他のゲノムターゲティングエンドヌクレアーゼよりオンターゲット切断効率は低い。転写活性化因子様（TAL）エフェクターは、標的DNA二本鎖切断を達成するために、別々のDNAエンドヌクレアーゼドメインと連結された、DNA認識タンパク質である。メガヌクレアーゼとは対照的に、TALは特定のDNA配列を標的とするように、容易に操作される。メガTALは、TALエフェクターとメガヌクレアーゼとを一体化したものであって、このTALエフェクターのDNA結合領域は、単一の望ましいゲノム標的部位の隣に、部位特異的メガヌクレアーゼを「アドレス指定する」ために使用される。メガTALに関する非限定的な説明がBoissel et al. (2014) Nucleic Acids Research 42(4):2591-2601に記載されており、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
本明細書の態様は、たとえば、変異（たとえば挿入、欠失、もしくは点変異）による、ゲノム免疫原性遺伝子の改変に関する。ある実施形態において、遺伝子はMHC-Iの成分をコードする。ある実施形態において、遺伝子はMHC-IIの成分をコードする。ゲノム免疫原性遺伝子の非限定的な例には、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、および/またはHLA-DQB1がある。このような遺伝子の多くのバリアントは、当然、たとえばヒトに存在する。
【０１７８】
ある実施形態において、遺伝子改変はゲノム改変ではない。ある実施形態において、低分子干渉、および低分子ヘアピンRNAは、遺伝子サイレンシングを仲介するために使用される。ある実施形態において、自然のゲノムは改変されず、むしろ、RNAiがRNAレベルで作用して、B2MもしくはHLA-Aなどの標的遺伝子の発現を低下または停止させ、それによって遺伝子編集と類似した最終結果を達成できる可能性がある。
【０１７９】
遺伝子操作された腎細胞集団
本発明の1つの主要な目的は、慢性腎臓病の治療に用いるために、アロ反応性のない腎細胞、詳細にはBRC（たとえばSRC集団）を操作するための方法において、既述の遺伝子編集技術（たとえばCRISPR/Cas9）を使用することである。本明細書に記載の方法および組成物は、レシピエント被験体への移植のためのドナー細胞（たとえば、SRCなどのBRC）の免疫適合性（immunocompatibility）（免疫特権）を高めるので、「ユニバーサルドナー」腎細胞集団を使用できることが確実となり、「同種」腎細胞を免疫抑制なしに患者に投与することが可能となる。これは、細胞の1つもしくは複数の免疫原性遺伝子（たとえばHLA遺伝子）の、標的特異的な不活化もしくは改変によって達成されうるものであって、その結果としてレシピエント被験体への移植に適したドナー細胞を生じることができる。
【０１８０】
哺乳動物細胞におけるCRISPR/Cas9システムの発見および応用は、たとえば、非相同末端結合経路（NHEJ）、相同組換え修復（HDR）、または他のDNA修復経路によって、標的遺伝子を編集するための有効で正確な手段であることが判明した。Cas9分子および標的特異的ガイドRNA（gRNA）分子を、必要ならばドナーDNA修復鋳型分子もともに、同時に送達することは、ゲノム内の標的配列の遺伝子編集を容易にする。したがって、細胞において遺伝子を改変するためのCRISPR/Cas9システムの使用は、複数の遺伝性疾患を治療するための有望な戦略である。さらに詳細には、たとえば、Sanders and Joung, Nature Biotechnology  32, 347-355 (2014)を参照されたい。
【０１８１】
ある実施形態において、特定のHLAアレルは、Cas9分子、および少なくとも1つの、内在性免疫原性遺伝子を標的とする標的特異的ガイドRNA（gRNA）と、本明細書に記載の細胞を接触させることによって変更され、免疫適合性細胞集団（たとえば、免疫適合性腎細胞集団）を生じる。本明細書に記載の方法および組成物を用いて作製された細胞は、レシピエント被験体において移植時に免疫反応を誘導する可能性が低く、ならびに/または、レシピエント被験体の免疫系に拒絶される可能性が低い。ドナーの免疫原性遺伝子のハプロタイプにかかわらず、任意のドナー被験体に移植されるようにカスタマイズされうる、ドナー細胞の免疫適合性を改善することができることは、数多くの臨床応用のために細胞治療分野で使用することができるドナー細胞プールの劇的な増加をもたらすので、特に有利である。
【０１８２】
遺伝子を不活化することは、当該遺伝子が機能タンパク質の形で発現されないことを意味する。ある実施形態において、本方法の遺伝子改変は、操作するために提供された細胞における、RNAガイド型エンドヌクレアーゼの発現に依存しており、同エンドヌクレアーゼは1つの標的遺伝子において切断を触媒し、それによって標的遺伝子を不活化するものである。エンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は、通常、相同組換え、または非相同末端結合（NHEJ）という異なる機序で修復される。しかしながら、NHEJは、切断部位においてDNA配列の変化を生じることの多い不完全な修復プロセスである。そのメカニズムは、直接再連結（Critchlow and Jackson 1998）または、いわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003）による、2つのDNA末端の残存部分の再結合を含む。非相同末端結合（NHEJ）による修復は、小さな挿入もしくは欠失をもたらすことが多く、特定の遺伝子のノックアウトを生じるために用いることができる。前記の改変は、少なくとも1つのヌクレオチドの、置換、欠失、または付加とすることができる。切断によって引き起こされる変異誘発イベント、すなわちNHEJイベントに続く変異誘発イベントが生じた細胞は、当業者によく知られた方法によって同定および/または選択することができる。ある実施形態において、DNA切断（たとえば二本鎖DNA切断）を導入しない塩基編集CRISPRタンパク質が使用される。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、二本鎖DNA切断を（最初に、またはそれ以外にも）導入することなく、ある塩基の別の塩基へのトランジションおよびトランスバージョン（たとえばAからT、CからG、など）を触媒する、改変されたCasタンパク質である。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、触媒性の損なわれたCRISPR-Cas変異体（たとえばCRISPR-Cas9変異体）と融合されたアデノシンデアミナーゼを含む。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、アポリポタンパク質B編集複合体（Apolipoprotein B Editing Complex）（APOBEC）（たとえば、ラットAPOBEC1もしくはヒトAPOBEC3A（A3A）シチジンデアミナーゼ）およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）と融合された、Cas9ヌクレアーゼをニッカーゼ（nCas9）に変換する変異を有するCas9ヌクレアーゼを含む。ある実施形態において、RNAまたはDNA塩基エディターは、Cas9バリアント以外のCasバリアント、たとえばCas13バリアントなどを含む。ある実施形態において、塩基編集タンパク質は、特異的にRNAに作用するCas13変異体である。
【０１８３】
ある実施形態において、腎細胞の1つもしくは複数の内在性免疫原性遺伝子の、細胞表面発現を減少させるための方法が提供されるが、その方法は、腎細胞を、第1のアレルに特異的なgRNA分子およびCas9分子と接触させることを含み、このアレル特異的gRNA分子およびCas9分子は、内在性免疫原性遺伝子の第1のアレルに結合し、それによって内在性免疫原性遺伝子の第1のアレルの細胞表面発現を減少させる。ある実施形態において、腎細胞集団を、第1のアレルに特異的な改変gRNA分子およびCas9分子と接触させることによって、改変された免疫適合性腎細胞集団を提供するための方法が与えられるが、この第1のアレルに特異的な改変gRNA分子およびCas9分子は、内在性免疫原性遺伝子の第1のアレルに結合し、それによって内在性免疫原性遺伝子の第1のアレルが改変されて、免疫適合性腎細胞集団が提供される。ある実施形態において、遺伝子改変腎細胞は、混合リンパ球もしくは白血球反応アッセイで測定されるように、ドナーとレシピエント細胞間のマッチングの増加および免疫原性の低下に基づいて、レシピエント被験体による拒絶の可能性が低下している。ある実施形態において、本明細書に記載の方法は、1つもしくは複数のアレルに特異的な1つもしくは複数のgRNA分子およびCas9分子を用いて、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10のアレル、または複数のアレルを変化させるために、使用することができる。ある実施形態において、本明細書に記載の方法を用いて変化させたアレルは、その変化したアレルの不活化をもたらす可能性がある。ある実施形態において、その方法は、細胞もしくは細胞集団を第2のCas9と接触させることをさらに含んでいてもよい。
【０１８４】
ある実施形態において、細胞集団を少なくとも1つの標的特異的gRNA分子およびCas9分子と接触させることであって、その標的特異的gRNA分子およびCas9分子が同定可能な遺伝子産物をコードする遺伝子と結合するものである、前記接触；ならびに同定可能な遺伝子産物の発現を欠く細胞の富化によって、特定の遺伝子改変について富化された細胞集団を含有する組成物を作製するための、ex vivo法が提供される。ある実施形態では、本明細書に記載の方法において遺伝子産物を発現する細胞を富化するステップは、たとえばFACSもしくはMACSなどを用いた細胞選別を含んでいてもよい。ある実施形態において、ex vivo法には、アレル特異的遺伝子改変を有する細胞集団を富化することであって、そのアレル特異的gRNA分子およびCas9分子が同定可能な遺伝子産物をコードする遺伝子の単一のアレルと結合するものである、前記富化；ならびに同定可能な遺伝子産物を発現するが第1のアレルを発現しない細胞の富化が含まれる。ある実施形態において、その遺伝子を発現するが第1のアレルを発現しない細胞を富化するステップは、多数の細胞をそれぞれ、その遺伝子の第1のアレルによってコードされる同定可能な遺伝子産物の第1バリアントと特異的に結合する第1の抗体、ならびに同定可能な遺伝子産物の第2バリアントと結合する第2の抗体と、接触させることを含むことがある。ある実施形態において、その遺伝子を発現するが第1のアレルを発現しない細胞を富化するステップは、多数の細胞のそれぞれの細胞において、同定可能な遺伝子産物の機能的バリアントと関連する物質もしくはシグナルを検出することを含んでいてもよい。細胞集団は生物活性腎細胞の集団とすることができる。
【０１８５】
本明細書に記載の方法は、必要に応じて、アレル特異的抗体を用いた細胞集団の選別によって遺伝子の特定のアレルを発現する細胞を選択することを、さらに含んでいてもよい。ある実施形態において、細胞集団は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）もしくは免疫磁気マイクロビーズによるセルソーティングによって選別することができる。ある実施形態において、その方法は、改変を確認するために一連の細胞を得ることをさらに含む。
【０１８６】
ある実施形態において、遺伝子は免疫原性遺伝子とすることができる。ある実施形態において、同定可能な遺伝子産物は細胞表面マーカーとすることができる。ある実施形態において、同定可能な遺伝子産物は、ヒト白血球抗原（HLA）とすることができる。ある実施形態において、同定可能な遺伝子産物は、主要組織適合抗原複合体タンパク質または主要組織適合抗原（MiHAまたはmHA）（たとえば、ケモカイン受容体）とすることができる。mHAの非限定的な例には、下記のものがある。
2020525003.tif 000029
【０１８７】
遺伝子多型がマイナー組織不適合性を生じさせる可能性はあるが、マイナー抗原をコードする遺伝子の数は限られている。常染色体上にあるおよそ10個のマイナー抗原が、存在する100個ほどの中から同定された。Y染色体もmHAをコードする遺伝子を保有する。同定された最初のマイナー組織適合性ペプチドは、移植片対宿主病関連mHAであるHA-2であった。すべてのmHAの中でもっとも研究されたのはHY抗原である。ある実施形態において、gRNA分子は、mHA遺伝子の標的ドメインに相補的な、標的指向性ドメインを含有することができる。ある実施形態において、gRNA分子は、HA-1、HA-2、HA-8、HB-1、HY-A1、HY-A2、HY-B7、HY-B8、HY-B60、またはHY-DQ5遺伝子の標的ドメインに相補的な、標的指向性ドメインを含有することができる。
【０１８８】
ある実施形態において、gRNA分子は、HLA遺伝子の標的ドメインに相補的な、標的指向性ドメインを含有することができる。HLA遺伝子は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5、HLA-DQファミリー遺伝子（たとえば、HLA-DQA1および/またはHLA-DQB1）、ならびにHLA-DPファミリー遺伝子（たとえば、HLA-DPA1および/またはHLA-DPA2）からなる一群から選択することができる。
【０１８９】
ある実施形態において、細胞または細胞集団は、初代腎細胞または選択された腎細胞集団とすることができる。ある実施形態において、細胞集団は、不均一な細胞集団であっても、均一な細胞集団であってもよい。
【０１９０】
ある実施形態において、1つもしくは複数の標的とされるHLA遺伝子がCRISPR/Cas9活性によって不活化されたことを検証するために、標的化の前後でドナー細胞の、1つもしくは複数のアレル配列の変化、または1つもしくは複数のアレルの発現を、従来法（たとえば、1つもしくは複数のアレルに特異的なPCR、qRT- PCR、またはフローサイトメトリー）を用いてアッセイすることができる。ある実施形態において、ゲノム編集あり、またはゲノム編集なしのドナー細胞を、NK細胞とともに同時培養することができるが、このドナー細胞に向けられる細胞溶解活性は、HLA発現のダウンレギュレーションを判定するために定量される。検証後、1つもしくは複数のミスマッチのドナーHLAアレルが不活化された細胞、および/または1つもしくは複数のマッチしたレシピエントHLAアレルが導入された細胞を、従来の選別法によって、未改変細胞から、富化、単離、または精製することができる。
【０１９１】
細胞凝集体
ある態様において、本明細書の製剤は、細胞凝集体またはスフェロイドを含有する。ある実施形態において、細胞凝集体は、本明細書に記載の生物活性細胞集団を含む。ある実施形態において、細胞凝集体は、たとえば、腎細胞混合物、富化された腎細胞集団などの生物活性腎細胞、ならびに、腎細胞画分および腎細胞混合物と、間葉系幹細胞、内皮前駆細胞、脂肪の間質血管細胞群に由来する細胞、または無制限にその他の任意の非腎細胞集団との組み合わせを含む。
【０１９２】
ある実施形態において、本明細書の生物活性腎細胞は、本項でさらに説明される3Dフォーマットで培養することができる。特定の実施形態において、「オルガノイド」という用語は、自然腎の様相を再現する表現型および/または機能を有する細胞の集積を意味する。一部の実施形態において、オルガノイドは、さまざまな系譜の細胞の混合集団を含んでおり、それらは典型的には所与の組織内にin vivoで見られるものである。特定の実施形態において、本明細書のオルガノイドは、in vitroで任意の方法によって形成されるが、本明細書の細胞はその方法によって集合体を形成し、それが次にスフェロイド、オルガノイド、またはそれらの組み合わせを形成することができる。このような集合体、スフェロイド、またはオルガノイドは、特定の実施形態において、特定の臓器と合致する構造を呈する。一部の実施形態において、このような集合体、スフェロイド、またはオルガノイドは、典型的には特定の臓器の細胞によって発現される表面マーカーを発現する。特定の実施形態において、このような集合体、スフェロイド、またはオルガノイドは、典型的には特定の臓器の細胞によって発現される、化合物もしくは材料を産生する。ある実施形態において、本明細書の細胞は、たとえばゼラチンなどの天然基質上で培養することができる。ある実施形態において、本明細書の細胞は、たとえばPLGAなどの合成基質上で培養することができる。
【０１９３】
バイオマテリアル
さまざまなバイオマテリアルを活性作用物質と組み合わせて、本明細書の治療用製剤を提供することができる。特定の実施形態において、バイオマテリアルは、適当な任意の形態（たとえばビーズ）もしくは形状（たとえば液体、ゲルなど）をとることができる。ポリマーマトリックスの形態の適当なバイオマテリアルはBertram et al. U.S. Published Application 20070276507 (参照によりそのまま本明細書に含められる)に記載される。特定の実施形態において、ポリマーマトリックスもしくは足場はいくつもの望ましい形態に形作ることができ、総合的なシステム、形状もしくはスペースの制限をいくらでも満足させることができる。一部の実施形態において、バイオマテリアルは、液体懸濁物の形をとる。ある実施形態において、本明細書のマトリックスもしくは足場は3次元であって、臓器もしくは組織構造の寸法および形状に適合するように形作ることができる。たとえば、腎疾患、尿細管輸送欠損もしくは糸球体濾過欠損を治療するための高分子足場の使用において、自然腎組織構造および組織化の様相もしくはその全体、ならびに腎実質のそれを再現する3次元（3-D）マトリックスを使用することができる。
【０１９４】
さまざまに形の異なる3-D足場を使用することができる。当然、ポリマーマトリックスは、大きさの異なる患者に合わせて、さまざまなサイズと形状に形作ることができる。ポリマーマトリックスは、患者の特別なニーズに応えるために他の方法で形作られることもある。特定の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、生体適合性の材料（例えば多孔質高分子足場）とすることができる。足場は、さまざまな合成もしくは天然由来の材料から形成され、そうした材料には、オープンセルポリ乳酸（OPLA(登録商標)）、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ素化ポリエチレン、フェノール類、ポリ-4-メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリル酸塩、ポリベンゾオキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンスルファイド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルファイド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、フッ化ポリビニリデン、再生セルロース、シリコーン、尿素ホルムアルデヒド、コラーゲン類、ゼラチン、アルギン酸塩、ラミニン、フィブロネクチン、絹、エラスチン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらのコポリマーもしくは物理的ブレンドがあるがそれらに限定されない。足場材料の形態は、柔らかい多孔質の足場から、形を保持できる硬い多孔質の足場まで多岐にわたる可能性がある。ある実施形態において、足場は、たとえば融点を上回っているハイドロゲルなどの、ハイドロゲルとなりうる液体溶液として構成される。
【０１９５】
ある実施形態において、足場はヒトもしくは動物起源の実在する腎臓もしくは他の臓器から得られるが、その場合、天然の細胞集団は、当業者に公知の界面活性剤および/または他の化学薬品および/または他の酵素的および/または物理的方法の適用によって除去されている。この実施形態において、供給源となる臓器の天然の3次元構造は、関連するすべての細胞外マトリックス成分とともに、それらの天然の生物活性のある状況で保持される。ある実施形態において、足場は、ヒトもしくは動物の腎臓または他の臓器から得られる細胞外マトリックスである。ある実施形態において、配置構成は、3次元バイオプリンティング法を適用することによって、組織様構造となるように構築される。ある実施形態において、配置構成はハイドロゲルとなりうる溶液の液体形態をとる。
【０１９６】
特定の実施形態において、バイオマテリアル（生物材料）はハイドロゲルである。ハイドロゲルはさまざまなポリマー材料から形成され、さまざまな生物医学的応用に有用である。ハイドロゲルは、親水性ポリマーの3次元ネットワークとして物理的に説明することができる。ハイドロゲルの種類に応じて、さまざまな割合の水を含有するが、水にまったく溶解しない。含水量が高いにもかかわらず、ハイドロゲルは、親水性残基が存在するため、大量の液体とさらに結合することができる。ハイドロゲルはそのゼラチン状の構造を変化させることなく、大幅に膨潤する。ハイドロゲルの基本的な物理的特性は、使用されるポリマーの性質およびハイドロゲルを投与するために使用されるデバイスに応じて、個別に変更することができる。
【０１９７】
ハイドロゲル材料は炎症反応を引き起こさないことが好ましい。ハイドロゲルを形成するために使用することができる他の材料の例には、(a) 修飾アルギン酸、(b) 1価カチオンへの暴露によりゲル化する多糖類（たとえばジェランガムおよびカラギーナン）、(c) 非常に粘性のある液体であるか、または揺変性であって、構造のゆっくりとした進化によって徐々にゲルを形成する多糖類（たとえばヒアルロン酸）、(d) ゼラチンもしくはコラーゲン、ならびに(e) ハイドロゲルポリマー前駆物質（たとえば、ポリエチレンオキサイド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーおよびタンパク質）が挙げられる。U.S. Pat. No. 6,224,893 B1は、本明細書にしたがってハイドロゲルを作製するのに適した、さまざまなポリマー、およびそうしたポリマーの化学的性質について詳細な説明を提供する。
【０１９８】
特定の実施形態において、本明細書のバイオマテリアルを調製するために使用されるハイドロゲルは、ゼラチンベースである。ゼラチンは、コラーゲンから得られる、毒性のない生分解性の水溶性タンパク質であって、間葉組織細胞外マトリックス（ECM）の主要な構成成分である。コラーゲンは、動物体のさまざまな結合組織内の細胞外空間における主要な構造タンパク質である。結合組織の主成分として、哺乳類ではもっとも大量に存在するタンパク質であって、全身タンパク質含量の25%から35%を構成している。石灰化の程度に応じて、コラーゲン組織は、硬く（骨）、伸展性があり（腱）、または硬いものから伸展性のあるものまで変化の度合いがある（軟骨）。細長い小線維の形をとるコラーゲンは、腱、靭帯、および皮膚などの線維組織におもに存在する。コラーゲンは、角膜、軟骨、骨、血管、消化管、椎間板、および歯の象牙質にも多く存在する。筋肉組織において、コラーゲンは筋内膜の主成分として機能を果たす。コラーゲンは筋肉組織の1〜2%を構成し、強い腱質の筋肉の重量の6%を占める。コラーゲンは体中の多くの場所に存在する。しかしながら、人体のコラーゲンの90%より多くを占めるのはI型である。
【０１９９】
これまでに、28種類のコラーゲンが同定され、報告されている。そうしたコラーゲンは、それらが形成する構造にしたがっていくつかのグループに分けることができる：線維性（I、II、III、V、XI型）、非線維性FACIT（断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン）（IX、XII、XIV、XVI、XIX型）、短鎖（VIII、X型）、基底膜（IV型）、マルチプレキシン（複数の中断を有する多数の三重らせんドメイン）（XV、XVIII型）、MACIT（断続性三重らせんを有する膜結合型コラーゲン）（XIII、XVII型）、その他（VI、VII型）。もっとも一般的な5つの型は：I型：皮膚、腱、血管、靭帯、臓器、骨（骨の有機部分の主成分）；II型：軟骨（軟骨の主要コラーゲン成分）；III型：網状（細網線維の主成分）で、通常I型と併存する；IV型：基底層、上皮により分泌される基底膜の層を形成する；V型：細胞表面、毛髪および胎盤である。
【０２００】
ゼラチンはアルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）配列を含む情報シグナルを保持しており、それは細胞接着、増殖および幹細胞分化を促進する。ゼラチンの特徴的な性質は、それが上部臨界共溶温度挙動（UCST）を示すことである。40℃の特定温度閾値を超えると、フレキシブルなランダム一重コイルを形成することによって水に溶解することができる。冷却すると、水素結合およびファンデルワールス相互作用が生じ、その結果、三重らせんの形成をもたらす。こうしたコラーゲン様三重らせんはジャンクションゾーンとして機能するので、ゾル-ゲル転移を引き起こす。ゼラチンは薬学および医学的応用に広く使用されている。
【０２０１】
ある実施形態において、本明細書において注射用細胞組成物を製剤するために使用されるハイドロゲルは、ブタのゼラチンに基づくものであり、これはブタの皮膚から供給可能であって、たとえばNitta Gelatin NA Inc (NC, USA)またはGelita USA Inc. (IA, USA)から市販されている。ゼラチンは、たとえば、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）に溶解して、熱反応性ハイドロゲルを形成することができるが、それはさまざまな温度でゲル化および液化する可能性がある。ある実施形態において、本明細書の注射用細胞組成物を製剤するために使用されるハイドロゲルは、当業者に公知の方法によって発現され、精製された、組換えヒトもしくは動物ゼラチンに基づくものである。ある実施形態において、ヒトI型、αIコラーゲンのcDNAのすべて、または一部を含有する発現ベクターが、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現される。他の発現ベクター系および生物が当業者に知られている。特定の実施形態において、本明細書のゼラチンベースのハイドロゲルは室温（22-28℃）以上で液体であり、冷蔵温度（2-8℃）に冷却するとゲル化する。
【０２０２】
当業者には当然のことながら、本明細書に記載の足場を形成するために、当技術分野で知られている他の種類の合成材料または天然由来材料を使用することができる。
【０２０３】
ある実施形態において、本明細書にしたがって使用されるバイオマテリアルは、ハイドロゲルの形をとるヒアルロン酸（HA）からなり、これは分子量5.1 kDAから>2 x 105 kDaに及ぶHA分子を含む。HAは、関連する生物活性細胞集団の、分岐形態形成および3次元自己組織化を促進することができる。ある実施形態において、本明細書にしたがって使用されるバイオマテリアルは、多孔質発泡体の形をとるヒアルロン酸からなり、やはり分子量5.1 kDAから>2 x 105 kDaに及ぶHA分子を含む。ある実施形態において、ハイドロゲルは、それに限らないが腎臓またはその他の任意の組織もしくは臓器から供給される細胞外マトリックスから得られるか、またはその細胞外マトリックスを含有する。さらに別の実施形態において、本明細書にしたがって使用されるバイオマテリアルは、ポリ乳酸（PLA）ベースの発泡体からなるが、これはオープンセル構造を有し、孔径は約50ミクロンから約300ミクロンである。
【０２０４】
温度感受性バイオマテリアル
本明細書に記載のバイオマテリアルは、たとえば、in vitroもしくはin vivoで一定の外部状況に対応するように、設計または構成することもできる。ある実施形態において、バイオマテリアルは温度感受性である（たとえば、in vitroでもin vivoでも）。ある実施形態において、バイオマテリアルは、（たとえば、in vitroでもin vivoでも）酵素分解への暴露に反応するように構成される。バイオマテリアルの外部状況への反応は、本明細書に記載のように微調整することができる。記載の製剤の温度感受性は、製剤中のバイオマテリアルの割合を調整することによって変化させることができる。たとえば、溶液中のゼラチンの割合を調整して、最終製剤中のゼラチンの温度感受性を調節することができる（たとえば液体、ゲル、ビーズなど）。あるいはまた、バイオマテリアルを化学的に架橋して、酵素分解に対する抵抗性を高めることができる。たとえば、カルボジイミドクロスリンカーを使用して、ゼラチンビーズを化学的に架橋することによって、内在性酵素に対する感受性を低下させることができる。
【０２０５】
ある態様において、本明細書に記載の製剤は、生物活性腎細胞などの活性作用物質を被験者に投与するために好ましい環境を作り出す特性を有するバイオマテリアルを組み込んでいる。ある実施形態において、製剤は、活性作用物質をバイオマテリアルとともに製剤した時から被験者に投与する時点まで、好ましい環境をもたらす第1のバイオマテリアルを含有する。特定の実施形態において、好ましい環境は、被験者に投与する前の（本明細書に記載の）液体中の細胞に対して、生物活性細胞をほぼ固体状態で懸濁させることの優位性に関する。ある実施形態において、第1のバイオマテリアルは、温度感受性バイオマテリアルである。温度感受性バイオマテリアルは、(i) 8℃以下で実質的に固体状態、ならびに(ii) 外気温以上では実質的に液体状態を有する可能性がある。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。
【０２０６】
特定の実施形態において、バイオマテリアルは、少なくとも2つの異なる相または状態を温度に応じて維持することができる、温度感受性バイオマテリアルである。バイオマテリアルは、第1の温度において第1の状態を維持し、第2の温度において第2の状態を、ならびに/または第3の温度において第3の状態を維持することができる。第1、第2または第3の状態は、実質的に固体、実質的に液体、または実質的に半固体もしくは半液体状態とすることができる。ある実施形態において、バイオマテリアルは、第1の温度において第1の状態をとり、第2の温度において第2の状態をとるが、この第1の温度は第2の温度より低い。
【０２０７】
特定の実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、8℃以下の温度において実質的に固体状態である。ある実施形態において、実質的に固体の状態は、約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、または約8℃において維持される。ある実施形態において、実質的に固体の状態はゲルの形をとる。ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、外気温以上では実質的に液体状態である。ある実施形態において、実質的に液体の状態は、約25℃、約25.5℃、約26℃、約26.5℃、約27℃、約27.5℃、約28℃、約28.5℃、約29℃、約29.5℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、または約37℃において維持される。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。
【０２０８】
ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、ほぼ外気温以下の温度において実質的に固体状態である。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。ある実施形態において、実質的に固体の状態は、約17℃、約16℃、約15℃、約14℃、約13℃、約12℃、約11℃、約10℃、約9℃、約8℃、約7℃、約6℃、約5℃、約4℃、約3℃、約2℃、または約1℃において維持される。ある実施形態において、実質的に固体の状態はビーズの形をとる。ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、約37℃以上の温度において実質的に液体の状態である。特定の実施形態において、実質的に固体の状態は、約37℃、約38℃、約39℃、または約40℃において維持される。
【０２０９】
温度感受性バイオマテリアルは、溶液の形で、固体の形で、ビーズの形で、または本明細書に記載の、および/もしくは当業者に公知の、他の適当な形で、与えられる可能性がある。本明細書に記載の細胞集団および標品は、温度感受性バイオマテリアルで被覆され、その上に堆積され、それに包埋され、それに付着し、その中にシードされ（埋め込まれ）、その中に懸濁され、またはその中に捕捉される可能性がある。ある実施形態において、本明細書に記載の細胞集団は、温度感受性バイオマテリアルとともに複合体を形成する前に、3次元細胞集合体もしくはオルガノイド、または3次元管状構造として構築されていてもよいが、温度感受性バイオマテリアルとともに複合体を形成する際に上記のように構築されてもよい。あるいはまた、温度感受性バイオマテリアルは、細胞なしで、たとえばスペーサービーズの形で提供されることもある。この実施形態において、温度感受性バイオマテリアルは、再生生物活性、たとえば、血管新生、または宿主細胞集団の浸潤および遊走のために標的臓器の内部にスペースを作り出すために、純粋に受動的な役割として機能する。
【０２１０】
ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルは、第1の状態と第2の状態の間の遷移状態をとる。ある実施形態において、遷移状態は、温度が約8℃からほぼ外気温までの間の固体から液体への遷移状態である。特定の実施形態において、外気温はほぼ室温である。特定の実施形態において、固体から液体への遷移状態は、約8℃、約9℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、約15℃、約16℃、約17℃、および約18℃のうち1つもしくは複数の温度において生じる。
【０２１１】
温度感受性バイオマテリアルは、所定の温度で、センチポアズ（cP）単位で測定される一定の粘度を有する。ある実施形態において、バイオマテリアルは、25℃において、約1 cPから約5 cP、約1.1 cPから約4.5 cP、約1.2 cPから約4 cP、約1.3 cPから約3.5 cP、約1.4 cPから約3.5 cP、約1.5 cPから約3 cP、約1.55 cPから約2.5 cP、または約1.6 cPから約2 cPの粘度を有する。ある実施形態において、バイオマテリアルは、37℃において、約1.0 cPから約1.15 cPの粘度を有する。37℃における粘度は、約1.0 cP、約1.01 cP、約1.02 cP、約1.03 cP、約1.04 cP、約1.05 cP、約1.06 cP、約1.07 cP、約1.08 cP、約1.09 cP、約1.10 cP、約1.11 cP、約1.12 cP、約1.13 cP、約1.14 cP、または約1.15 cPとすることができる。特定の実施形態において、バイオマテリアルはゼラチン溶液である。ゼラチンは、溶液中に約0.5%、約0.55%、約0.6%、約0.65%、約0.7%、約0.75%、約0.8%、約0.85%、約0.9%、約0.95%、または約1% (w/v)存在する。一例を挙げると、バイオマテリアルは、PBS中0.75% (w/v)ゼラチン溶液である。ある実施形態において、この0.75% (w/v)溶液は、25℃において約1.6 cPから約2 cPの粘度を有する。ある実施形態において、その0.75% (w/v)溶液は、37℃において約1.07 cPから約1.08 cPの粘度を有する。ゼラチン溶液は、PBS、DMEM、または他の適当な溶媒中で与えられる。
【０２１２】
ある態様において、製剤は生物活性細胞を第2のバイオマテリアルと組み合わせて含有するが、このバイオマテリアルは、製剤時点から被験者への投与後の時点まで、組み合わされた細胞にとって好ましい環境を提供するものである。ある実施形態において、第2のバイオマテリアルによって提供される好ましい環境は、被験者への投与時点まで、ならびに投与後しばらくの間、構造的完全性を保持するバイオマテリアル中の細胞を投与することの優位性に関する。ある実施形態において、移植後の第2のバイオマテリアルの構造的完全性は、数分、数時間、数日、または数週間である。ある実施形態において、構造的完全性は1月未満、1週間未満、1日未満、または1時間未満である。比較的短期間の構造的完全性は、取り込まれたエレメントと、それが留置された組織もしくは臓器との相互作用に対する妨害もしくは障害となることなしに、制御された処理、配置、または分散によって、活性作用物質およびバイオマテリアルを、組織もしくは臓器内の標的部位に送達することができる製剤をもたらす。
【０２１３】
ある実施形態において、第2のバイオマテリアルは、第1のバイオマテリアルとは異なる感受性を有する温度感受性バイオマテリアルである。第2のバイオマテリアルは、(i) ほぼ外気温以下で実質的に固体の状態、ならびに(ii) 約37℃以上で実質的に液体の状態をとる可能性がある。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。
【０２１４】
ある実施形態において、第2のバイオマテリアルは、架橋されたビーズである。架橋ビーズは、本明細書に記載のように、架橋の程度に応じて、細かく調整可能なin vivo滞留時間を有することができる。ある実施形態において、架橋ビーズは、生物活性細胞を含有し、本明細書に記載の酵素分解に抵抗性である。本明細書の製剤は、活性作用物質、たとえば生物活性細胞と組み合わせた第2のバイオマテリアルとともに、またはそうしたバイオマテリアルなしに、第1のバイオマテリアルを活性作用物質、たとえば生物活性細胞と組み合わせて含有することができる。製剤が第2のバイオマテリアルを含有する場合、それは温度感受性ビーズおよび/または架橋ビーズとすることができる。
【０２１５】
ある態様において、本明細書は、およそ数分、数時間、または数日という一定期間で分解するバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、数日、数週間、または数か月にわたってゆっくりと分解する固形物の移植に焦点を当てた多数の一連の研究とは対照的である。ある実施形態において、バイオマテリアルは以下の特徴のうち1つもしくはいくつかを有する：生体適合性、生分解性/生体吸収性、被験者への移植の前およびその間に実質的に固体の状態であること、移植後の構造的完全性（実質的に固体の状態）の喪失、ならびに細胞生存能力および増殖を支える細胞適合性のある環境。移植中に移植された粒子の間に一定の間隔をあけておくことができるバイオマテリアルの能力は、天然の組織の内部成長を増進する。バイオマテリアルはまた、固体製剤の移植を促進する。固体ユニットの挿入は、送達された材料が移植中に組織内部で分散しないようにするのに役立つので、バイオマテリアルは本明細書に記載の製剤の局在化をもたらす。細胞製剤について、固体バイオマテリアルはまた、液体中に懸濁された細胞と比較して、足場依存性細胞の安定性および生存能力を改善する。しかしながら、構造的完全性の短い持続時間は、バイオマテリアルが、移植直後に、組織の内部成長または送達された細胞/材料の宿主組織との統合に対して有意な障害をもたらさないことを意味する。
【０２１６】
ある態様において、本明細書は、実質的に固体の形で移植され、その後液化/融解され、またはそうでなくても、体内への移植後に構造的完全性を失うようなバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、液体として注入され、その後体内で固化する材料の使用に焦点を当てた、重要な一連の研究とは対照的である。
【０２１７】
生体適合性ビーズ
他の態様において、製剤は、本明細書に記載の温度感受性バイオマテリアル、ならびにバイオマテリアルを含有する生体適合性ビーズ群を含有する。ある実施形態において、ビーズは架橋されている。架橋は、当業者に公知の任意の適当な架橋剤を用いてなされるが、その架橋剤はたとえば、カルボジイミド；アルデヒド（たとえば、フルフラール、アクロレイン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリセリルアルデヒド）、スクシンイミド架橋剤｛スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル) (BS3)、グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)、スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)、ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)、エチレン グリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)、エチレン グリコールビス(スクシンイミジルスクシナート) (EGS)、グルタル酸ビス(スルホスクシンイミジル) (BS2G)、酒石酸ジスクシンイミジル (DST)；エポキシド（エチレングリコール ジグリシジル エーテル、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル）；糖類（グルコースおよびアルドース糖）；スルホン酸およびp-トルエンスルホン酸；カルボニルジイミダゾール；ゲニピン；イミン；ケトン；ジフェニルホスホリルアジド (DDPA)；塩化テレフタロイル；硝酸セリウム(III)六水和物；微生物トランスグルタミナーゼ；および過酸化水素などである。当業者は、本開示にしたがって使用される、他の適当な架橋剤および架橋法を正しく認識することができる。
【０２１８】
ある実施形態において、ビーズはカルボジイミド架橋ビーズである。カルボジイミド架橋ビーズは、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド 塩酸塩 (EDC)、DCC - N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)、およびN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド (DIPC)からなる一群から選択されるカルボジイミドで架橋されている。低濃度のEDCで処理されたビーズは、多数の遊離一級アミンを有することが予想されたが、高濃度の架橋剤で処理された試料は、一級アミンの大半がアミド結合に関与していると考えられる。一級アミンとピクリルスルホン酸との共有結合によって発色するオレンジ色の強度は、分光光度法で335 nmにおいて検出可能であって、試料中に存在する一級アミンの数と比例する。サンプル中に存在するタンパク質ミリグラムに対して基準化すると、含まれる遊離アミン数と架橋に使用されるEDCの初濃度との間に逆相関を観察することができる。この結果はビーズ架橋の差異を示しており、これは反応に使用されるカルボジイミドの量によって決定される。概して、架橋ビーズは、非架橋ビーズと比べて遊離の一級アミン数の減少を示す。
【０２１９】
架橋ビーズは、架橋されていない生体適合性ビーズと比べて、酵素分解を受けにくくなっており、それによって、in vivoでの滞留時間を微調整できるビーズをもたらす。たとえば、架橋ビーズは、コラゲナーゼなどの内在性酵素に抵抗性である。架橋ビーズの提供は、下記のうち1つもしくはいくつかを促進するデリバリーシステムの一部である：(a) 付着した細胞を望ましい部位に送達し、天然組織の再生および内部成長ならびに血管供給のための空間を作り出すこと；(b) 細胞がその微小環境を確立し、機能し、再構築し、その細胞自身の細胞外マトリックス（ECM）を分泌することを可能にするほど十分に長く、その部位において存続できる能力；(c) 移植された細胞と周囲の組織との統合の促進；(d) 細胞を実質的に固体の形で移植することができる能力；(e) 組織の内部成長、新生血管形成、または送達された細胞/材料と宿主組織との統合に対して有意な障害をもたらさない短期構造的完全性；(f) 実質的に固体の形で局所的にin vivo送達することによって、移植中の組織内での細胞の分散を防止すること；(g) 液体中に懸濁された細胞と比較して、足場依存性細胞の安定性および生存能力の改善；ならびに(h) 細胞が1) 実質的に固体の形で（たとえばビーズに付着して）、ならびに2) 実質的に液体の状態で（たとえば液体中に懸濁されて）、送達される場合の二相性放出；(i) これらの生物活性細胞集団の起源である、3次元生物学的ニッチもしくは腎実質の発生反復および模倣。
【０２２０】
ある実施形態において、本明細書はゼラチンを含有する架橋ビーズを提供する。架橋されていないゼラチンビーズが生物活性細胞製剤に適していないのは、それらが速やかに完全性を失い、細胞が注入部位から消失するからである。それに対して、高度に架橋されたゼラチンビーズは、あまりにも長く注入部位に存続することが可能であって、新規のECM分泌、細胞集積、血管新生および組織再生を妨げる可能性がある。本明細書は、架橋ビーズのin vivo滞留時間を微調整することを可能にする。バイオマテリアルの生分解性を調整するために、全サンプルについてあらゆる反応条件を一定に保った一方で、さまざまな架橋剤濃度のカルボジイミドを使用する。たとえば、カルボジイミド架橋ビーズの酵素感受性は、架橋剤の濃度を約0から約1Mまで変化させることによって微調整することができる。特定の実施形態において、濃度は、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM、約25 mM、約26 mM、約27 mM、約28 mM、約29 mM、約30 mM、約31 mM、約32 mM、約33 mM、約34 mM、約35 mM、約36 mM、約37 mM、約38 mM、約39 mM、約40 mM、約41 mM、約42 mM、約43 mM、約44 mM、約45 mM、約46 mM、約47 mM、約48 mM、約49 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM、または約100 mMである。架橋剤濃度は、約0.15 M、約0.2 M、約0.25 M、約0.3 M、約0.35 M、約0.4 M、約0.45 M、約0.5 M、約0.55 M、約0.6 M、約0.65 M、約0.7 M、約0.75 M、約0.8 M、約0.85 M、約0.9 M、約0.95 M、または約1 Mとすることもできる。ある実施形態において、架橋剤は、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド 塩酸塩（EDC）である。ある実施形態において、EDC架橋ビーズはゼラチンビーズである。ビーズの分解％は、架橋剤の濃度に応じて微調整することができる。ある実施形態において、ゼラチンビーズは、ゼラチン以外（たとえば、それに限らないが、アルギン酸もしくはHA）のビーズもしくは微小粒子と混合されて、生物活性細胞集団を送達する効力を促すことができる。
【０２２１】
架橋ビーズは、生物活性細胞集団の播種、付着またはカプセル化に有利な一定の性質を有する可能性がある。たとえば、ビーズは多孔質表面を有し、ならびに/または、実質的に中空である可能性がある。孔の存在は、孔のないすなわち平滑な表面より多数の細胞の付着を可能にする、細胞付着表面の増加をもたらす。それに加えて、細孔構造は、新たな組織の形成を支える多孔質ビーズと宿主組織の統合をサポートすることができる。ビーズは、一般的な粒子分布パターンに対応するワイブル（Weibull）プロットに当てはめることができる粒度分布を有する。ある実施形態において、架橋ビーズは、約120μm、約115μm、約110μm、約109μm、約108μm、約107μm、約106μm、約105μm、約104μm、約103μm、約102μm、約101μm、約100μm、約99μm、約98μm、約97μm、約96μm、約95μm、約94μm、約93μm、約92μm、約91μm、または約90μm未満の平均直径を有する。架橋ビーズの特性は、キャスティング法次第でさまざまである。たとえば、気流を用いて液体ゼラチン溶液をエアロゾル化し、それを薄層クロマトグラフィー試薬噴霧器（ACE Glassware）により液体窒素中に噴霧する方法を用いて、前記の性質を有するビーズが与えられる。当業者には当然のことながら、キャスティング法のパラメーターを調整することは、ビーズのさまざまな特性、たとえばさまざまな粒度分布を目的に合わせる機会をもたらす。ある実施形態において、ビーズの微小起伏、表面および内部の特性をさらに改変して細胞付着を容易にすることができる。
【０２２２】
架橋ビーズの細胞適合性は、最終的な生物活性細胞製剤に対応する細胞とともにビーズを培養するという細胞培養技術を用いて、製剤前にin vitroで評価される。たとえば、生物活性腎細胞製剤の調製前に、ビーズを初代腎細胞とともに培養し、生細胞/死細胞アッセイを用いて細胞適合性を確認する。細胞の生存能力に加えて、細胞の代謝能力、特定の重要なサイトカインおよび増殖因子およびエキソソームの分泌、ならびに、機能的生物活性腎細胞集団と関連するmiRNAなどの、特定の重要なタンパク質および核酸マーカーの発現を測定する、特異的な機能テストが当業者によく知られており、それらをさらに使用して、架橋ビーズを有する製剤における細胞の効力を確認する。
【０２２３】
ある実施形態において、生体適合性架橋ビーズは、溶液中の温度感受性バイオマテリアルと、溶液量の約5% (w/w)から約15% (w/w)で組み合わせられる。架橋ビーズは、溶液量の約5% (w/w)、約5.5% (w/w)、約6% (w/w)、約6.5% (w/w)、約7% (w/w)、約7.5% (w/w)、約8% (w/w)、約8.5% (w/w)、約9% (w/w)、約9.5% (w/w)、約10% (w/w)、約10.5% (w/w)、約11% (w/w)、約11.5% (w/w)、約12% (w/w)、約12.5% (w/w)、約13% (w/w)、約13.5% (w/w)、約14% (w/w)、約14.5% (w/w)、または約15% (w/w)で存在しうる。
【０２２４】
ある態様において、本明細書は、およそ数分、数時間、または数日という一定期間で分解するバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、数日、数週間、または数か月にわたってゆっくりと分解する固形物の移植に焦点を当てた多数の一連の研究とは対照的である。
【０２２５】
ある態様において、本明細書は、生体適合性架橋ビーズにデリバリーマトリックスとともに生物活性細胞を入れた製剤を提供する。ある実施形態において、デリバリーマトリックスは、以下の特性のうち1つもしくはいくつかを有する：生体適合性、生分解性/生体吸収性、被験者への移植の前およびその間に実質的に固体の状態であること、移植後の構造的完全性（実質的に固体の状態）の喪失、ならびに細胞生存能力を支える細胞適合性のある環境。移植中に移植された粒子の間に一定の間隔をあけておくことができるデリバリーマトリックスの能力は、天然の組織の内部成長を増進する。デリバリーマトリックスがない場合、移植中の細胞化ビーズの圧縮は、十分な組織の内部成長のためには不十分な空間をもたらす可能性がある。デリバリーマトリックスは、固体製剤の移植を促進する。それに加えて、短期間の構造的完全性は、マトリックスが、移植直後に、組織の内部成長、新生血管形成、または送達された細胞/材料の宿主組織との統合に対して有意な障害をもたらさないことを意味する。固体ユニットの挿入は、移植中に送達された材料が組織内部で分散しないようにするのに役立つので、デリバリーマトリックスは、本明細書に記載の製剤の局在化をもたらす。ある実施形態において、本明細書に記載のデリバリーマトリックスの適用は、腎実質への送達後に排尿によって移植細胞が急速に失われることを防止するのに役立つ。細胞製剤のために、固体デリバリーマトリックスは、液体中に懸濁された細胞と比較して、足場依存性細胞の安定性および生存能力を改善する。
【０２２６】
ある実施形態において、デリバリーマトリックスは、細胞を入れられていない生体適合性ビーズの集団である。ある実施形態において、細胞の入っていないビーズは、個々の細胞入りビーズの間に、その全体にわたって分散する。細胞の入っていないビーズは、移植の前と直後に、細胞入りビーズの間で「スペーサービーズ」として機能する。スペーサービーズは、第1の温度では実質的に固体の状態をとり、第2の温度では実質的に液体の状態をとる温度感受性バイオマテリアルを含有するが、この第1の温度は第2の温度より低い。たとえば、スペーサービーズは、本明細書に記載のように、ほぼ外気温以下では実質的に固体の状態をとり、約37℃では実質的に液体の状態をとるバイオマテリアルを含有する。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。ある実施形態において、バイオマテリアルはゼラチン溶液である。ゼラチン溶液は、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約10.5%、または約11% (w/v)で存在する。ゼラチン溶液は、PBS、細胞培養培地（DMEM）、または別の適当な溶媒中で与えられる。ある実施形態において、バイオマテリアルはヒアルロン酸である。ある実施形態において、バイオマテリアルは、ハイドロゲルとしてさらに再構成される可能性のある、ヒトもしくは動物の腎臓から供給される脱細胞化された細胞外マトリックスである。
【０２２７】
ある態様において、本明細書は、実質的に固体の形で移植され（たとえばスペーサービーズ）、その後液化/融解され、そうでなくても、体内への移植後に構造的完全性を失うようなバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、液体として注入され、その後体内で固化する材料の使用に焦点を当てた、重要な一連の研究とは対照的である。
【０２２８】
スペーサービーズの温度感受性は、製剤前にin vitroで評価することができる。スペーサービーズは標識し、標識されていない温度非感受性ビーズと混合することができる。次にその混合物を37℃でインキュベートし、物理的遷移における変化を観察する。標識された温度感受性ビーズの高温での形の崩壊を経時的に観察する。たとえば、温度感受性ゼラチンビーズは、物理的遷移のマーカーとして機能するように、アルシアンブルー色素とともに作製することができる。青いゼラチンビーズは、架橋ビーズ（白色）と混合され、カテーテル内に入れてから、押し出して、1X PBS, pH 7.4中で37℃においてインキュベートする。青いゼラチンビーズの形がなくなるのを、さまざまな時点で顕微鏡により追跡する。青いゼラチンビーズの物理的状態の変化は、30分後に目に見えるようになり、インキュベーション時間の延長によりもっと顕著になる。ビーズは、材料の粘性のため、完全には消散しない。
【０２２９】
放出調節製剤
ある態様において、本明細書の製剤は、放出調節製剤として提供される。概して、放出調節は、投与直後に第1の活性作用物質の最初の放出があり、その後少なくとも1つの追加の、第2の活性作用物質の放出が続くことを特徴とする。第1および第2の活性作用物質は、同一であっても異なっていてもよい。ある実施形態において、製剤は、同一製剤において複数の成分によって放出調節をもたらす。ある実施形態において、放出調節製剤は、第1の成分の一部として活性作用物質を含有するが、この第1の成分は、活性作用物質が製剤の体積の全体にわたって自由に移動することを可能にするものであって、それによって投与後すぐに標的部位における即時放出を可能にする。第1の成分は、実質的に液相および実質的に固相をとる温度感受性バイオマテリアルとすることができるが、この第1の成分は、投与時点では実質的に液相である。ある実施形態において、活性作用物質は、製剤の体積の全体にわたって実質的に自由に移動できるように実質的に液相となっており、したがって、投与直後に標的部位でただちに放出される。
【０２３０】
ある実施形態において、放出調節製剤は、第2の成分の一部として活性作用物質を有するが、この活性作用物質は、投与前後に標的部位に存在し続ける第2の成分に付着し、配置され（堆積され）、覆われ、包埋され、シードされ（埋め込まれ）、または捕捉されている。第2の成分は、活性作用物質を結び付けることができる構造的要素を含んでおり、それによって投与の時点で第2の成分から活性作用物質が即時放出されるのを防止する。たとえば、第2の成分は、実質的に固体の形で、たとえば、生体適合性ビーズとして与えられるが、それは架橋されてin vivo酵素分解を防止し、もしくは遅らせることができる。ある実施形態において、実質的に固相状態の活性作用物質は、投与の前後で製剤内部においてその構造的完全性を保持しており、したがって、投与直後すぐには活性作用物質を標的部位に放出しない。放出調節製剤に適したキャリアは本明細書に記載したが、当業者は本明細書での使用に適した他のキャリアを正しく識別することができる。
【０２３１】
ある実施形態において、製剤は、細胞、ナノ粒子、治療用分子などを含めた、送達される要素の、最初の迅速な送達/放出をもたらし、続いてその後の遅延放出をもたらす。ある実施形態において、製剤は、エキソソーム、miRNAおよび他の生物活性核酸もしくはタンパク質分子の最初の迅速な送達/放出をもたらすが、これらは可溶性であって、腎細胞もしくは他の細胞集団から供給された分泌型生物活性産物である。再生の生物活性を伴う他の分子もしくは治療用作用物質を、当業者は正しく認識することができる。本明細書の製剤は、送達されるべき作用物質が非付着型（たとえば溶液中の細胞）および付着型（たとえばビーズもしくは別の適当な担体と一緒になった細胞）として与えられるような、二相性放出特性を得るためにデザインすることができる。最初の投与後すぐに、妨害のない作用物質は送達部位にただちに供給される一方で、動きをふさがれた作用物質の放出は、キャリア（たとえばビーズ）の構造的完全性が破綻するまで遅れ、その時点であらかじめ付着していた作用物質が放出される。以下に検討されるように、他の適当な放出メカニズムが当業者に理解されるであろう。
【０２３２】
放出の遅延時間は、活性作用物質の性質に基づいて調整することができる。たとえば、生物活性細胞製剤における放出の遅延時間は、おおよそ数秒、数分、数時間、または数日とすることができる。状況によって、おおよそ数週間の遅延が適当である。低分子もしくは高分子などの他の活性作用物質については、製剤における放出の遅延時間は、おおよそ数秒、数分、数時間、数日、数週間、または数か月とすることができる。製剤が、異なる時間遅延放出プロファイルを与える、異なるバイオマテリアルを含有することも可能である。たとえば、第1の活性作用物質を有する第1のバイオマテリアルは、第1の放出時間を示し、第2の活性作用物質を有する第2のバイオマテリアルは、第2の放出時間を示すことがある。第1と第2の活性作用物質は同一であっても、異なっていてもよい。
【０２３３】
本明細書に記載のように、遅延放出時間は、概して、バイオマテリアルが構造的完全性を失う時間に対応することになる。しかしながら、当業者は、他の遅延放出メカニズムを理解するであろう。たとえば、活性作用物質は、たとえばポリマーマトリックスからの薬物の拡散のように、特定のバイオマテリアルの分解時間と無関係に経時的に、連続して放出されてもよい。さらに、生物活性細胞は、バイオマテリアルを含有する製剤から離れて遊走し、その生物活性細胞は天然組織に遊走することができる。ある実施形態において、生物活性細胞はバイオマテリアル、たとえばビーズから天然組織へと遊走する。ある実施形態において、生物活性細胞はバイオマテリアルから天然組織へと遊走し、増殖因子、サイトカイン、エキソソーム、miRNA、ならびに再生させる生物活性に関わる他の核酸およびタンパク質の分泌を引き起こす。ある実施形態において、エキソソームおよび他の細胞外小胞、ならびにmiRNA、他の生物活性のある核酸およびタンパク質は、バイオマテリアルから移動する。さらに別の実施形態において、生物活性細胞はバイオマテリアルから天然組織へと遊走し、その後損傷部位もしくは病変部位に向かって遊走または回遊する宿主の幹細胞および前駆細胞の動員に関与する。
【０２３４】
エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。製剤中に、吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチン、を含めることによって、注射用製剤（注射可能製剤）の持続的吸収がもたらされる。そのような製剤を調製するための多くの方法が特許を受け、または当業者に広く知られている。たとえば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。ポリペプチド薬の制御放出または持続放出に適用できる他の方法が、たとえば、U.S. Pat. Nos. 6,306,406および6,346,274、ならびに、たとえばU.S. Patent Application Nos. US20020182254およびUS20020051808に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３５】
生物活性細胞製剤
本明細書に記載の生物活性細胞製剤は、必要のある被験者の腎疾患を治療するための、本明細書に記載の遺伝的に改変された生物活性腎細胞を有する上記バイオマテリアルから作製される移植可能なコンストラクト（構築物）を含有する。ある実施形態において、コンストラクトは、生体適合性材料もしくはバイオマテリアル、1つもしくは複数の合成もしくは天然由来の生体適合性材料からなる足場またはマトリックス、ならびに、付着および/または捕捉によって足場の表面上に配置され（堆積され）、もしくは包埋された、本明細書に記載の1つもしくは複数の細胞集団もしくは細胞混合物で構成される。ある実施形態において、コンストラクトは、バイオマテリアル、ならびに、バイオマテリアル成分（1つもしくは複数）の表面または内部に配置され、それに付着し、捕捉され、包埋され、シードされ（埋め込まれ）、または組み合わせられた、本明細書に記載の1つもしくは複数の細胞集団または細胞混合物で構成される。富化された細胞集団またはその混合物を含めて、本明細書に記載の細胞集団はいずれも、コンストラクトを形成するためにマトリックスと組み合わせて使用することができる。ある実施形態において、生物活性細胞製剤は、本明細書に記載の生体適合性材料もしくはバイオマテリアル、および遺伝的に改変されたSRC集団で構成される。
【０２３６】
ある実施形態において、生物活性細胞製剤は、免疫原性を低下させるように遺伝子改変されたSRCからなる注射可能製剤であって、バイオマテリアル（たとえばゼラチンベースのハイドロゲル）中で製剤される。ある態様において、同種SRCは、腎生検を経たドナー患者の腎皮質組織からの腎細胞の単離および増殖、遺伝子編集技術を用いたSRCの遺伝子改変、ならびに増殖させた腎細胞からの密度勾配遠心分離による選択により得られる。SRCは、主として、その再生能でよく知られている腎上皮細胞で構成されている（Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91）。他の実質（血管）細胞および間質（集合管）細胞は、SRC集団中にわずかに存在する可能性がある。レシピエント腎臓へのSRCの注入は、非臨床試験において、動物の生存、尿濃縮、および濾過機能の有意な改善をもたらした。しかしながら、SRCは、保存可能期間および安定性が限られている。ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアル中のSRC製剤は、細胞の安定性を高め、したがって製品の保存可能期間を延長をもたらし、臨床的有用性のために輸送中および腎皮質への送達中の安定性の改善をもたらす。
【０２３７】
ある態様において、生物活性細胞製剤は、まず臨床的標準治療の腎生検法を用いてドナーから腎皮質組織を得ることによって製造される。腎細胞は、酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させる。細胞培養培地は、初代腎細胞を増殖させるようにデザインされ、分化因子はまったく含有しない。収集された腎細胞は、密度勾配分離に供されて、SRCが得られる。SRCの免疫原性を改変するために遺伝子編集技術を使用することは、密度勾配分離の前に行っても後に行ってもよい。
【０２３８】
ある実施形態において、製剤された細胞集団は、ほぼ外気温かそれ以上の温度において、バイオマテリアルの全体にわたって実質的に自由に移動できる。それより低い温度で実質的に固相の中に細胞集団を懸濁させることは、液体中の細胞と比べて、足場依存性細胞などの細胞に、安定性の利点をもたらす。その上、実質的に固体状態に細胞を懸濁させることは、次の利点のうち1つもしくはいくつかを提供する：i) 細胞の沈降を防ぐ；ii) 細胞を、懸濁された状態でバイオマテリアルに固定されたままにすることができる；iii) バイオマテリアルの全体にわたって、細胞をより均一に分散されたままにすることができる；iv) 細胞集合体の形成を防止する；ならびにv) 製剤の貯蔵および輸送中に細胞をよりよく保護する。被験体への投与に至るまでこのような特徴を保持できる製剤は、少なくとも、製剤中の細胞の全般的な健全性がより良好であり、一貫した投与量の細胞を投与することができるので、有利である。
【０２３９】
好ましい実施形態において、SRCを製剤するために使用されるゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルは、熱反応性ハイドロゲルを形成するようにバッファー中に溶解したブタゼラチンである。このハイドロゲルは、室温では液体であるが、冷蔵温度（2-8℃）に冷却するとゲル化する。SRCはハイドロゲルとともに製剤され、冷却によりゲル化して冷蔵温度（2-8℃）下でクリニックに出荷される。臨床現場において、製品は患者の腎臓への注入前に室温に温められる。生物活性細胞製剤は、経皮的方法もしくは腹腔鏡法による投与に適した注射針およびシリンジを用いて腎皮質内に移植される。
【０２４０】
Neo-Kidney Augment組成物の説明および組成
特定の実施形態において、生物活性細胞製剤はNeo-Kidney Augment（NKA）であり、これはバイオマテリアル（ゼラチンに基づくハイドロゲル）中で製剤化された自己の、選択された腎細胞（SRC）の注射可能製剤である。ある態様において、自己SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られた腎細胞の単離および増殖、ならびに、増殖させた腎細胞を、密度境界、バリアー、または界面を超えて遠心分離することによる選択によって得られる。ある実施形態において、自己SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られた腎細胞の単離および増殖、ならびに連続もしくは不連続の単一段階もしくは多段階密度勾配を超える、増殖させた腎細胞の選択によって得られる。SRCは、主として尿細管上皮細胞からなるが、これはその再生能力でよく知られている（Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91）。他の実質（血管）および間質（集合管）細胞は、自己SRC集団にわずかに存在する可能性がある。SRCのレシピエント腎臓内への注入は、前臨床試験において、動物の生存、尿濃縮および濾過機能に顕著な改善をもたらした。しかしながら、SRCは保存可能期間および安定性が限られている。ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアル中のSRC製剤は、細胞の安定性を高めるので、製品の保存可能期間の延長し、臨床的有用性のために、腎皮質へのNKAの輸送および送達中のNKAの安定性の改善をもたらす。
【０２４１】
ある態様において、NKAは、最初に標準治療の腎生検法を用いてドナー/レシピエントから腎皮質組織を得ることによって製造される。特定の実施形態において、腎細胞を酵素消化によって腎組織から単離し、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させる。特定の実施形態において、細胞培養培地は、初代腎細胞を増殖させるようにデザインされ、分化因子は含有しない。特定の実施形態において、収集された腎細胞は、SRCを得るために、密度境界もしくは界面もしくは密度勾配を超える分離に供される。特定の実施形態において、SRCは、本開示にしたがって遺伝的に改変される。
【０２４２】
本明細書ではさらに、本明細書に記載の外部状況に対応するようにデザインされ、または適合させたバイオマテリアルで構成される製剤が含まれる(提供される)。その結果、コンストラクト中での生物活性細胞集団とバイオマテリアルとの会合の性質は、外部状況に応じて変化させることができる。たとえば、細胞集団の、温度感受性バイオマテリアルとの会合は温度によって変化する。ある実施形態において、コンストラクトは、生物活性腎細胞集団、および約8℃以下では実質的に固体の状態をとり、ほぼ外気温以上では実質的に液体の状態をとるバイオマテリアルを含有し、その細胞集団は約8℃以下でバイオマテリアル中に懸濁されている。しかしながら、細胞集団は、およそ外気温以上の温度において、バイオマテリアルの体積の全体にわたって実質的に自由に移動する。細胞集団をより低い温度で実質的に固相中に懸濁することは、液体中の細胞と比較して、足場依存性細胞のような細胞にとって安定性の利点をもたらす。その上、細胞を実質的に固体状態に懸濁することは、以下の利点のうち1つもしくはいくつかを提供する：i) 細胞の定着を防ぐ；ii) 細胞が懸濁状態でバイオマテリアルに固定されたままにしておく；iii) 細胞がバイオマテリアルの体積の全体にわたってより均一に分散したままにしておく；iv) 細胞集合体の形成を防ぐ；ならびにv) 製剤の保管および輸送中に細胞をよりよく保護する。被験者への投与までこのような特徴を保持しうる製剤は、少なくとも、製剤中の細胞の全般的な健全性がすぐれており、より均一で一貫した投与量の細胞が投与されるので、有利である。
【０２４３】
特定の実施形態において、SRCを調剤してNKAとするために使用されるゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルは、熱反応性ハイドロゲルを形成する、バッファーに溶解したブタゼラチンである。このハイドロゲルは、室温では液体であるが、冷蔵温度（2-8℃）に冷却されるとゲルとなる。SRCは、ハイドロゲルとともに調剤されてNKAが得られる。NKAは冷却によってゲル化し、冷蔵温度条件下（2-8℃）でクリニックに輸送される。NKAの保存可能期間は3日間である。臨床現場において、製品は患者の腎臓に注入される前に室温に温められる。NKAは、経皮的または腹腔鏡下の方法でNKAを送達するのに適した針とシリンジを用いて腎皮質内に移植される。ある実施形態において、ハイドロゲルは、ゼラチンまたは他の組換え起源の細胞外マトリックスタンパク質から得られる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、腎臓または別の組織もしくは臓器を起源とする細胞外マトリックスから得られる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、組換え細胞外マトリックスタンパク質から得られる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、組換えコラーゲンに由来するゼラチン（すなわち組換えゼラチン）を含んでいる。
【０２４４】
細胞生存作用物質
ある態様において、生物活性細胞製剤には、細胞生存作用物質も含まれる。ある実施形態において、細胞生存作用物質は、抗酸化物質、酸素運搬体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症薬、血管新生因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、創傷治癒因子、および生物活性細胞からの分泌産物からなる一群から選択される。
【０２４５】
抗酸化物質は、他の分子の酸化を阻害することができるといつ特徴を有する。抗酸化物質には、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸（Trolox（登録商標））、カロテノイド、フラボノイド、イソフラボン、ユビキノン、グルタチオン、リポ酸、スーパーオキシドジスムターゼ、アスコルビン酸、ビタミンE、ビタミンA、混合カロテノイド（たとえば、βカロテン、αカロテン、γカロテン、ルテイン、リコピン、フィトエン、フィトフルエン、およびアスタキサンチン）、セレン、コエンザイムQ10、インドール-3-カルビノール、プロアントシアニジン、レスベラトロール、ケルセチン、カテキン、サリチル酸、クルクミン、ビリルビン、シュウ酸、フィチン酸、リポ酸、バニリン酸、ポリフェノール、フェルラ酸、テアフラビン、およびそれらの誘導体のうち1つもしくはいくつかが挙げられるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な抗酸化物質を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２４６】
酸素運搬体は、酸素を運び放出する能力を特徴とする作用物質である。それには、パーフルオロカーボン、およびパーフルオロカーボン含有医薬品などがあるがこれらに限定されない。適当なパーフルオロカーボンに基づく酸素運搬体には、パーフルオロオクチルブロミド（C8F17Br）；パーフルオロジクロロタン（perfluorodichorotane）（C8F16C12）；パーフルオロデシルブロミド；パーフルブロン（perflubron）；パーフルオロデカリン； パーフルオロトリプロピルアミン；パーフルオロメチルシクロピペリジン；Fluosol（登録商標）（パーフルオロデカリンおよびパーフルオロトリプロピルアミン）；Perftoran（登録商標）（パーフルオロデカリンおよびパーフルオロメチルシクロピペリジン）；Oxygent（登録商標）（パーフルオロデシルブロミドおよびパーフルブロン）；Ocycyte（商標名）（パーフルオロ(tert-ブチルシクロヘキサン)）などがあるがそれらに限定されない。当業者には当然のことであるが、他の適当なパーフルオロカーボンに基づく酸素運搬体を、本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２４７】
免疫調節因子は、オステオポンチン、FASリガンド因子、インターロイキン、トランスフォーミング増殖因子β、血小板由来増殖因子、クラスタリン、トランスフェリン、RANTES（regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1（Pai-1）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン6（IL-6）、α1ミクログロブリン、およびβ2ミクログロブリンなどがあるが、それに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な免疫調節因子を、本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２４８】
抗炎症薬もしくは免疫抑制薬（下記）も製剤の一部とすることができる。当業者には当然のことながら、他の適当な抗酸化物質を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２４９】
細胞動員因子には、単球走化性タンパク質1（MCP-1）およびCXCL-1があるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な細胞動員因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２５０】
細胞接着因子には、フィブロネクチン、プロコラーゲン、コラーゲン、ICAM-1、結合組織増殖因子、ラミニン、プロテオグリカン、RGDおよびYSIGRなどの特異的細胞接着ペプチドがあるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な細胞接着因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２５１】
血管新生因子には、血管内皮増殖因子F（VEGF）およびアンジオポエチン-2（ANG-2）があるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な血管新生因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２５２】
マトリックスメタロプロテアーゼには、マトリックスメタロプロテアーゼ1 (MMP1)、マトリックスメタロプロテアーゼ2 (MMP2)、マトリックスメタロプロテアーゼ9 (MMP-9)、および組織メタロプロテアーゼ阻害物質1 (TIMP-1)があるがそれに限定されない。
【０２５３】
創傷治癒因子には、ケラチノサイト増殖因子（KGF-1）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、カルビンジン、クラスタリン、シスタチンC、トレフォイル因子3があるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な創傷治癒因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２５４】
本明細書に記載の生物活性細胞からの分泌産物も、細胞生存作用物質として生物活性細胞製剤に添加することができる。
【０２５５】
ヒトまたは動物起源の体液、組織または臓器、たとえば、限定はしないが、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿またはウシ下垂体抽出物などから得られる組成物を、細胞生存作用物質として生物活性細胞製剤に添加してもよい。
【０２５６】
当業者には当然のことながら、コンストラクトを形成するために、バイオマテリアルで細胞集団を配置し、または他の方法で細胞集団とバイオマテリアルとを組み合わせる、いくつかの適当な方法がある。
【０２５７】
使用方法
ある態様において、本明細書の細胞および製剤は、本明細書に記載の使用法における使用に適している。特定の実施形態において、本発明の製剤は、疾患の治療のために投与することができる。たとえば、遺伝的に改変された生物活性細胞は、本明細書に記載の製剤の一部として自然臓器に投与することができる。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性細胞は、投与の対象である自然臓器から供給されることがあるが、標的の自然臓器ではない供給源から得られることもある。
【０２５８】
ある実施形態において、本明細書は、本明細書に記載の生物活性腎細胞集団を含有する製剤を用いて、必要のある被験者において腎疾患を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、治療用製剤は、免疫原性を低減するために遺伝子編集により改変された選択された腎細胞集団、またはその混合物を含有する。実施形態において、製剤は腎機能の改善を必要とする被験者への投与に適している。
【０２５９】
ある態様において、本明細書の方法による被験者の腎疾患の有効な治療を、腎機能に関するさまざまな指標によって観察することができる。ある実施形態において、腎機能の指標としては、血清アルブミン、アルブミン/グロブリン比（A/G比）、血清リン、血清ナトリウム、腎サイズ（超音波により測定）、血清カルシウム、リン：カルシウム比、血清カリウム、タンパク尿、尿クレアチニン、血清クレアチニン、血中尿素窒素（BUN）、コレステロール値、トリグリセリド値、および糸球体濾過率（GFR）があるが、それに限定されない。さらに、全般的な健康および幸福に関する重要な指標には、体重の増減、生存率、血圧、（平均全身血圧、拡張期血圧、または収縮期血圧）および身体持久運動能力があるがそれに限定されない。
【０２６０】
ある態様において、生物活性腎細胞集団による有効な治療は、腎機能に関する1つもしくは複数の指標の安定化によって証明される。腎機能の安定化は、本明細書の方法によって治療されていない被験者の指標と比較して、本明細書の方法によって治療された被験者における同じ指標の変化を観察することによって実証される。あるいはまた、腎機能の安定化は、治療前の被験者の指標と比較して、本明細書の方法で治療されたが同被験者における同じ指標の変化を観察することによって実証することができる。第1の指標の変化は、値の増加であることも減少であることもある。ある実施形態において、本明細書で与えられる治療は、被験者における血清クレアチン及び／又は血中尿素窒素（BUN）値の安定化を含むことがあり、この被験者で観察されるBUN値は、本明細書の方法で治療されていない同様の病態を有する被験者と比べて低い。特定の実施形態において、治療は、被験者における血清クレアチニン値の安定化を含むことがあり、この被験者で観察される血清クレアチニン値は、本明細書の方法で治療されていない同様の病態を有する被験者と比べて低い。ある実施形態において、腎機能に関する上記指標の1つもしくはいくつかの安定化は、免疫原性を低減するよう遺伝子編集されることにより改変された選択された腎細胞製剤による治療の結果である。
【０２６１】
当業者には当然のことながら、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の1つもしくは複数の追加の指標を測定して、被験者における腎疾患の有効な治療を判定することができる。
【０２６２】
特定の実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞製剤による有効な治療は、腎構造及び／又は機能に関する1つもしくは複数の指標の改善によって実証される。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、血清クレアチン及び／又は血中尿素窒素（BUN）値の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、血清中のタンパク質保持の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、血清アルブミン濃度の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、A:G比の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、血清コレステロール値および/またはトリグリセリド値の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、ビタミンD値の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、リン：カルシウム比の改善をもたらす。ある実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、ヘモグロビン値の改善をもたらす。特定の実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、血清クレアチニン値の改善をもたらす。また特定の実施形態において、遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、ヘマトクリット値の改善をもたらす。ある実施形態において、腎機能に関する上記指標のうちの1つもしくはいくつかの改善は、選択された腎細胞製剤による治療の結果である。ある実施形態において、腎機能に関する上記指標のうちの1つもしくはいくつかの改善は、免疫原性を低減するために遺伝子編集により改変された腎細胞製剤による治療の結果である。
【０２６３】
別の態様において、本明細書は、それを必要とする被験者の自然腎を再生するための方法に用いる製剤を提供する。ある実施形態において、その方法は、本明細書に記載の遺伝的に改変された生物活性細胞集団、混合物、またはコンストラクトを投与または移植するステップを含む。再生された自然腎は、多くの指標によって特徴づけることが可能であって、その指標には、自然腎の機能もしくは能力の発達、自然腎の機能もしくは能力の改善、ならびに自然腎の特定のマーカーの発現があるがそれに限定されない。ある実施形態において、機能もしくは能力の発達または改善は、上記の、腎機能に関するさまざまな指標に基づいて観察することができる。ある実施形態において、再生された腎臓は、1つもしくはいくつかの幹細胞マーカーの発現の差異によって特徴づけられる。幹細胞マーカーは、以下のうち1つもしくはいくつかとすることができる：SRY（性決定領域Y）-ボックス2 (Sox2)；未分化胚性細胞転写因子 (UTF1)；マウス由来Nodalホモログ（NODAL）；プロミニン1 (PROM1)もしくはCD133 (CD133)；CD24；およびそれらの任意の組み合わせ（参照により本明細書にそのまま編入されるIlagan et al. PCT/US2011/036347を参照されたい、また、やはり参照によりそのまま本明細書に編入されるGenheimer et al., 2012. Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renal cells in a rodent model of chronic kidney disease. Cells Tissue Organs 196: 374-384も参照されたい）。ある実施形態において、1つもしくは複数の幹細胞マーカーの発現は、対照と比べてアップレギュレートされている。
【０２６４】
ある態様において、本明細書に与えられるのは、被験者の腎疾患を治療する方法であって、その方法は、本明細書に記載の製剤、組成物、または細胞集団を被験者に注入することを含む。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、18〜30ゲージの針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、20ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、21ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、22ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、23ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、24ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、25ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、26ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、27ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、28ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、29ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約20ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約21ゲージである針で注入される。
【０２６５】
ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約22ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約23ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約24ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約25ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約26ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約27ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約28ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約29ゲージである針で注入される。
【０２６６】
ある実施形態において、針の内径は0.84 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.61 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.51 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.41 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.33 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.25 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.20 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.15 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は1.27 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.91 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.81 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.71 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.64 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.51 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.41 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.30 mm未満である。ある実施形態において、針は以下の表中のサイズの1つを有する：
2020525003.tif 000030
【０２６７】
分泌産物
ある実施形態において、効果は細胞自体によって、および/または細胞からの分泌産物によってもたらされる。再生効果は、以下のうち1つもしくはいくつかによって特徴づけることができる：上皮間葉転換の減少（TGFβシグナル伝達の減弱によると考えられる）；腎線維症の減少；腎臓の炎症の減少；自然腎における幹細胞マーカーの発現の差異；移植された細胞および/または体内に生じた細胞の腎損傷部位、たとえば尿細管損傷部位への遊走、移植された細胞の腎損傷部位、たとえば尿細管損傷部位における生着；（本明細書に記載の）腎機能に関する1つもしくは複数の指標の安定化；腎発生と関連したS-shaped body/comma-shaped bodyのde novo形成、尿細管またはネフロンのde novo形成、（本明細書に記載の）赤血球ホメオスタシスの修復；ならびにこれらの任意の組み合わせ（Basu et al., 2011. Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering. Cell Transplantation 20: 1771-90; Bruce et al., 2015. Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB and TGF-β1 pathways. Regenerative Medicine 10: 815-839を参照されたいが、これらのそれぞれの全体は参照により本明細書に組み入れる）。
【０２６８】
組織生検の代わりに、治療を受けた被験者における再生の結果を、たとえば尿などの体液の検査から評価することができる。被験者の尿から得られる微小胞は、下記に限らないが、特定のタンパク質およびmiRNAなどの一定の成分を含有することが判明しており、これらの成分は、本明細書の細胞集団による治療の影響を受けた腎細胞集団から最終的に由来するものである。これらの成分には、幹細胞の複製および分化、アポトーシス、炎症および免疫修飾、線維症、上皮間葉転換、TGF-βシグナリングおよびPAI-1シグナリングに関与する因子を含めることができるがそれらに限定されない。微小胞関連miRNA/タンパク質発現パターンの経時的分析によって、本明細書の細胞集団、混合物、もしくはコンストラクトの投与を受けた被験者の腎臓内での再生の結果を連続的にモニターすることができる。
【０２６９】
ある実施形態において、本発明は、腎疾患（KD）患者が治療用製剤による治療に反応するかどうかを評価する方法を提供する。その方法には、上記治療薬で治療されたKD患者由来のテストサンプル中の小胞もしくはその管腔内容物の量を、対照サンプル中（例えばその治療薬による治療前の同じ患者由来のサンプル）の小胞の量と比較もしくは対比して、測定もしくは検出するステップを含めることができるが、このテストサンプル中の小胞もしくはその管腔内容物の量が対象サンプル中の小胞もしくはその管腔内容物の量と比較して増減していることは、その治療薬による治療に対して、治療を受けた患者が反応性を有することを示している。
【０２７０】
これらの腎臓由来小胞および/または腎臓由来小胞の管腔内容物はまた、被験者の尿中に流れ出て、再生の結果または治療有効性を示すバイオマーカーとして分析することができる。非侵襲的予後判定法には、本明細書に記載の遺伝的に改変された生物活性腎細胞集団、混合物もしくはコンストラクトの投与もしくは移植の前、および/または後に、被験者から尿サンプルを得るステップを含めることができる。小胞およびその他の分泌産物は、標準的方法を用いて尿サンプルから単離することが可能であって、この標準的方法には、不要なデブリを除去するための遠心分離（Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al. U.S.特許出願公開第 20110053157号、これらのそれぞれの全体は参照により本明細書に組み入れる）、尿からエキソソームを分離するための沈澱、特定の核酸を同定するためのポリメラーゼ連鎖反応および核酸配列決定、ならびに再生成果と結びつく特定のタンパク質を同定するための質量分析および/または2Dゲル電気泳動があるがそれに限定されない。
【０２７１】
投与方法および投与経路
本発明の生物活性細胞製剤は、単独で投与することができるが、他の生物活性成分と組み合わせて投与することもできる。製剤は、組織を再生するための、固形臓器の内部への組込み型組織工学エレメントの注入もしくは移植に適している。それに加えて、製剤は、組織を再生するための、管腔臓器壁への組織工学エレメントの注入もしくは移植に使用される。
【０２７２】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載の生物活性細胞製剤を、必要とする被験体に提供する方法を与える。ある実施形態において、生物活性細胞の起源は、同種であっても同系であってもよく、それらの任意の組み合わせであってもよい。ある実施形態において、方法は、免疫抑制薬の投与を含むこともある（たとえば、U.S. Patent No. 7,563,822を参照されたい）。
【０２７３】
対象発明の治療法は、本明細書に記載の生物活性細胞製剤の送達に関する。ある実施形態において、意図した利点のある部位への細胞の直接投与は好ましい。必要のある被験体は、1つもしくは複数の富化された腎細胞集団、および/または同集団を含有する混合物もしくは構築物から選択される製品とともに、自然腎と本明細書に記載の生物活性細胞製剤とをin vivo接触させることによっても治療することができる。in vivo接触のステップは、自然腎に再生効果をもたらす。
【０２７４】
選択された腎細胞の組成物を被験体に投与するためのさまざまな手段が、本明細書を考慮すると、当業者に明白となるであろう。そうした方法は、被験体の標的部位への細胞の注入を含む。
【０２７５】
デリバリー担体
細胞および/または分泌産物は、デリバリーデバイスまたは担体の中に入れることができるが、これは被験体への注入もしくは移植による導入を促進する。ある実施形態において、デリバリー担体は天然材料を含むことができる。他のある実施形態において、デリバリー担体は、合成材料を含むことができる。ある実施形態において、デリバリー担体は、臓器の構造を模した、または臓器の構造に適切に合った構造体をもたらす。ある実施形態において、デリバリー担体は、本来、流体様である。このようなデリバリーデバイスには、レシピエント被験体の体内に細胞および流体を注入するためのチューブ、たとえばカテーテルを含めることができる。好ましい実施形態において、チューブはさらに、それを通して本発明の細胞が望ましい位置において被験体に導入されうる、針、たとえばシリンジを有する。ある実施形態において、哺乳動物腎臓由来細胞集団は、カテーテルを通して血管内に投与されるように製剤される（この「カテーテル」という用語は、物質の血管へのデリバリーのためのさまざまなチューブ様システムのいずれかを含むものとする）。あるいはまた、細胞は、バイオマテリアルまたはスキャフォールドの中または上に入れ込むことが可能であって、これにはテキスタイル、たとえば織物、編物、組みひも、メッシュ、および不織布など、有孔フィルム、スポンジおよびフォーム、ならびにビーズ、たとえば中空でないビーズもしくは多孔質ビーズ、微粒子、ナノ粒子など（たとえば、Cultispher-S ゼラチンビーズ - Sigma）があるがそれらに限定されない。細胞は、デリバリーのためにさまざまな形で調製することができる。たとえば、細胞は、溶液もしくはゲル中に懸濁することができる。細胞は、製薬上許容される基剤または賦形剤と混合することができるが、この基剤または賦形剤は、その中で本発明の細胞が依然として生存可能であるものである。製薬上許容される基剤および賦形剤には、生理食塩水、バッファー水溶液、溶媒、および/または分散媒がある。このような基剤および賦形剤の使用は、当技術分野でよく知られている。溶液は好ましくは無菌で流動性であって、多くの場合等張性である。好ましくは、溶液は製造および貯蔵の条件下で安定しており、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。当業者には当然のことながら、本発明の細胞集団およびその混合物のデリバリーに使用されるデリバリー担体には、上記の特性の組み合わせを含めることができる。
【０２７６】
投与方法
製剤の投与方法には、全身性、腎内（たとえば実質内）、静脈内、または動脈内注入、および目的とする作用部位における組織への直接注入があるが、それらに限定されない。本発明にしたがって使用されるさらに他の投与方法には、直接開腹による、直接腹腔鏡法による、経腹壁的な、または経皮的な、単回もしくは複数回の注入がある。またさらに他の、本発明にしたがって使用される投与法には、たとえば、逆行注入および尿管腎盂注入がある。外科的投与手段には、腎部分切除術およびコンストラクト移植、腎部分切除術、部分的腎盂切開術、網±腹膜による血管新生、多局所生検穿刺経路、円錐もしくは錐体から円柱へ、および腎極様置換術などの一段階法、ならびに、たとえば、改植のためのオルガノイド内部バイオリアクターなどの二段階法があるが、それに限定されない。ある実施形態において、細胞混合物を含有する製剤は、同時に同一経路で送達される。ある実施形態において、制御された混合物を含む細胞組成物はそれぞれ、本明細書に記載の1つもしくは複数の方法によって、特定の位置に別々に、または、特定の方法により、同時に、もしくは時間的に制御された方式で送達される。ある実施形態において、選択された腎細胞は、腎臓の腎皮質の中に経皮的に注入される。ある実施形態において、ガイド用カニューレを経皮的に挿入し、これを用いて、腎臓内への組成物の注入前に腎臓被膜を穿刺する。
【０２７７】
腹腔鏡技術もしくは経皮法を用いて、製剤されたBRCもしくはSRC集団を注入するために腎臓にアクセスすることができる。腹腔鏡手術法を用いることで、腎臓を直接目で見ることが可能となるので、いかなる出血およびその他の有害事象も注入中に発見して、ただちに対処することができる。腎臓への経皮的アプローチの使用は、主として腎臓内の腫瘤の除去のために、10年超にわたって使用されている。こうした手技は、電極もしくは極低温の針を、腎臓内の指定された腫瘤に挿入し、病変が除去される（典型的には）10〜20分の間、接触したままにしておく。治療用製剤の注入用の経皮的器具類は、それより大規模でも複雑でもなく、このアプローチは、手術なし（腹膜穿刺創およびガスによる膨張の回避）および最小限の固定時間という、安全上の利点を提供する。さらに、アクセス経路は、有意な出血の可能性をさらに低下させるために、止血作用のある生分解性材料を留置しておくことができる。
【０２７８】
注入による送達に関するある実施形態によれば、治療用生物活性細胞製剤は、腎皮質内に注入される。治療用製剤を腎皮質内で可能な限り広範に分布させることが重要であるが、これは、たとえば、実行できる範囲でできる限り広範に分布する、腎皮質内の治療用製剤の配置を可能にする角度で、腎皮質内に入ることによって達成することができる。これは、個別の患者の特性に応じて、超音波ガイドによる、またはコンピューター体軸断層撮影（CT）イメージングによる、縦断もしくは横断アプローチで腎臓を画像化する必要があると考えられる。理想的には、注射針/カニューレが徐々に引き抜かれるにつれて、注入は多数の移植を引き起こすことになる。治療用製剤の全量を、1つまたは複数の注入点に移植することができる。ある実施形態において、2か所までの注入点を用いて治療用製剤の全量を腎臓内に移植することができる。ある実施形態において、注入は1つもしくは複数の注入点、たとえば1か所または2か所の注入点を用いて、1つの腎臓に施すことができる。ある実施形態において、注入は両方の腎臓に、それぞれの腎臓において1つもしくは複数の注入点、たとえば1か所または2か所の注入点を用いて、行われる。
【０２７９】
前記の説明は、当業者が本発明を実施するのを可能にするために十分であるとみなされる。当然のことながら、本発明は好ましい実施形態およびオプションの特徴によって具体的に開示されてはいるが、当業者は、本明細書に記載のコンセプトの修正および変更に依拠してもよく、そのような修正および変更は、添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるものとみなされる。以下の実施例は、説明目的でのみ提供されるものであって、けっして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際、前記の説明から、本明細書で提示され説明されたことのほかに、本発明のさまざまな修正が当業者に明白となるであろうが、それは添付の請求の範囲に含まれる。
【０２８０】
本明細書に引用された特許、特許出願、および文献はすべて、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
（実施例）
【実施例１】
【０２８１】
実施例１−SRCを作製するための方法および組成物の非限定的な例
実施例１．１−溶液の調製
本項の実施例は、不均一腎細胞集団の単離および性質検討、ならびに再生治療製品の製造のために使用される、さまざまな培地製品および溶液の組成を、この実施例において提供する。
【０２８２】
【表６】
2020525003.tif 000031
すべての細胞洗浄にはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を使用した。
【０２８３】
実施例１．２−不均一未分画腎細胞集団の単離
本項の実施例は、ヒトからの未分画の（UNFX）不均一腎細胞集団の単離を示す。最初に組織の解離を行って、ヒト腎組織から不均一細胞懸濁物を作製した。
【０２８４】
腎生検による腎組織は、不均一腎細胞集団のための原料をもたらした。皮質、皮髄境界部または髄質組織のうち1つもしくはいくつかを含む腎組織を使用することができる。皮髄境界部組織を使用することが好ましい。瘢痕組織を避けて、CKD腎臓からの複数の生検コア（最低2個）が必要であった。腎組織は、最終NKAの計画された移植の約4週間前に、臨床現場において患者から、臨床研究者によって得られた。その組織は、実施例1.1の組織輸送培地中で輸送された。
【０２８５】
その組織は次に、細胞を取り出すために組織を処理する前に、侵入するバイオバーデンを減少させるために、実施例1.1の組織洗浄溶液で洗浄した。
【０２８６】
腎組織を細分して計量し、実施例1.1の消化溶液中で解離させた。得られた細胞懸濁物をダルベッコの改変イーグル培地（D-MEM）+ 10%ウシ胎仔血清（FBS）（Invitrogen, Carlsbad Calif.）中で中和し、洗浄し、無血清、無添加の、ケラチノサイト培地（KSFM）（Invitrogen）中に再懸濁した。次に細胞懸濁物を、15% (w/v)イオジキサノール (OptiPrep（商標名）、Sigma)密度境界を越えて遠心分離し、組織培養処理されたポリスチレンフラスコもしくはディッシュ上で、実施例1.1の腎細胞増殖培地中25,000細胞/cm2の細胞密度で培養を開始する前に、赤血球およびデブリを取り除いた。たとえば、細胞は、150 mlの50:50培地中、25x106 細胞/フラスコで、T500 Nuncフラスコの表面上で培養することができる。
【０２８７】
実施例１．３−単離された腎細胞集団の細胞増殖
腎細胞の増殖は、受け取った組織の量、および受け入れた組織からの腎細胞の単離の成功に左右される。単離された細胞は必要に応じて凍結保存することができる（上記を参照されたい）。腎細胞の増殖速度は、個々の患者から単離された細胞に固有の多様性に起因して、サンプルごとに変動する可能性がある。
【０２８８】
表7に記載の、受け入れた組織の多様性に起因する細胞回収率の範囲に適合した、細胞増殖プロセスを開発した。腎細胞の増殖は、指定の細胞培養法を用いて、表6の腎細胞増殖培地の中で、閉鎖培養容器（たとえば、Tフラスコ、Cell Factories、 HyperStacks（登録商標））内での連続継代を必要とする。
【０２８９】
ヒト臨床試験のため、BPEの使用に伴う固有のリスクを排除するために、BPEフリー培地を開発した。細胞の増殖、表現型（K18）、および細胞機能（GGTおよびLAP酵素活性）をBPEフリー培地中で評価し、動物実験で使用されたBPE含有培地と比較した。腎細胞増殖、表現型および機能は2つの培地において同等であった（データは示さず）。
【表７】
2020525003.tif 000032
【０２９０】
最初のTフラスコ内で細胞増殖が観察され（継代0）、目に見えるコンタミネーションの徴候がなければ、培地を置き換えて、その後2-4日ごとに交換した（図3B）。顕微鏡下で培養物を目視観察することによって、細胞を評価して腎細胞の形態を検証した。培養物は、細胞同士の集合に起因して、きっちりした敷石状の外観を特徴的に示した。これらの形態学的特徴は増殖中に変化し、すべての継代において存在しているわけではない可能性がある。細胞培養コンフルエンスは、細胞増殖の期間中ずっと使用される培養容器内でさまざまなコンフルエンスレベルにおいて、推定された。
【０２９１】
腎細胞は、培養容器が少なくとも50%コンフルエントとなった時に、トリプシン処理によって継代された（図3B）。脱離された細胞を、腎細胞増殖培地を入れた容器内に集め、計数し、細胞生存率を計算した。細胞継代ごとに、NKAを製剤するために必要な数まで細胞数を増やすために、十分な数の培養容器内に500-4000 細胞/cm2の細胞をシード（播種）した（図3B）。培養容器は37℃のインキュベーター内で5% CO2の環境に置いた。上記のように、細胞形態およびコンフルエンスをモニターし、組織培養培地を2-4日ごとに交換した。表8は、ヒトドナー由来の6つの腎生検検体の細胞を単離して増殖させる間に観察された、ヒト腎細胞の生存率を記載する。
【表８】
2020525003.tif 000033
【０２９２】
異なる患者から得られる組織の固有の（内在の）多様性は、培養中の細胞収率の差異をもたらした。したがって、細胞継代のタイミング、または目標細胞数を達成するために継代ごとに必要とされる培養容器の数およびタイプを厳密に定めることは現実的でない。典型的には、腎細胞は2もしくは3回の継代を受ける；しかしながら、培養期間および細胞収率は、細胞増殖速度によって変動しうる。
【０２９３】
細胞は収集または継代のために、EDTAを有する0.25%トリプシン(Invitrogen)によって脱離される。生存率はトリパンブルー色素排除によって評価され、血球計を用いて手作業で、または自動化Cellometer（登録商標）計数システム（Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.）を用いて計数が行われた。
【０２９４】
実施例１．４−培養細胞の凍結保存
増殖させた腎細胞は、個別の患者からの細胞増殖の固有のばらつきを調整するために、そして事前に決められた臨床投与スケジュールで製品を投与するために、慣用的に凍結保存した。凍結保存された細胞は、万一もう1つのNKAが必要となった場合には（たとえば、患者の病気による遅れ、予期せぬ経過事象など）、予備の細胞供給源を提供する。細胞を凍結保存し、融解すると生きた機能的な細胞を回復することができるように用いられる条件を確立した。
【０２９５】
凍結保存のために、細胞は、凍結保存溶液（実施例1.1を参照されたい）中で約50x106 細胞/mLの終濃度となるように懸濁され、バイアル中に分注された。約50x106 細胞/mLの入った1 mlバイアルをコントロールレートフリーザーの冷凍室に入れ、あらかじめプログラムされた速度で凍結した。凍結した後、細胞を中間貯蔵のために液体窒素フリーザーに移した。
【０２９６】
実施例１．５−SRC細胞集団の調製
選択された腎細胞（SRC）は、スケジューリングに応じて、凍結保存細胞から増殖させた最終培養容器から、または増殖培養物から直接、調製することができる（図3B）。
【０２９７】
凍結保存された細胞を使用する場合には、細胞を融解し、最後の1段階の増殖ステップのために組織培養容器の表面上で培養した。最終培養容器が約50-100%コンフルエントとなったら、細胞はSRC分離のために処理を行う準備が整った。NKAの培地交換および最終洗浄は、最終製品中に残存する凍結保存溶液を薄める。
【０２９８】
最後の細胞培養容器が、少なくとも50%コンフルエンスに達したら、その培養容器を、37℃にて5% CO2の環境で2%酸素に設定された低酸素インキュベーターに移し（図3C）、一晩培養した。細胞は48時間もの間、2%酸素にセットされた酸素コントロールインキュベーター内に保持することができる。より生理学的に適している低酸素（2%）環境に暴露することは、細胞分離効率を向上させ、VEGFなどの低酸素誘導マーカーのよりよい検出を可能にした。
【０２９９】
細胞を十分な時間（たとえば一晩から48時間）低酸素条件に暴露した後、EDTA含有0.25%トリプシン（Invitrogen）を用いて細胞を脱離した。生存率はトリパンブルー色素排除によって評価され、血球計を用いて手作業で、または自動化Cellometer（登録商標）計数システム（Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.）を用いて計数が行われた。細胞はDPBSで1回洗浄し、DPBS中に約850x106 細胞/mLとなるように再懸濁した。
【０３００】
密度境界/界面を超える遠心分離を用いて、細胞浮遊密度に基づいて、収集した細胞集団を分離した。腎細胞懸濁物は、7%イオジキサノール溶液を超える遠心分離によって分離された（OptiMEM中OptiPrep; 60% (w/v)；実施例1.1を参照されたい）。
【０３０１】
7% OptiPrep密度界面溶液を調製し、望ましい密度を示す屈折率を使用前に測定した（R.I. 1.3456+/-0.0004）。収集した腎細胞の層を溶液の上に重ねた。この密度界面を遠心管または細胞処理装置（たとえばCOBE 2991）の中で室温にて800gで20分間遠心分離した。約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後、個別のペレットとして集められた。1.045 g/mL未満の浮遊密度を維持する細胞は、除外して廃棄された。
【０３０２】
SRCペレットをDPBS中に再懸濁した（図3C）。残存するOptiPrep、FBS、培地、および補助材料のキャリーオーバーは、4回のDPBS洗浄および1回のゼラチン溶液ステップによって最小限に抑えられた。
【実施例２】
【０３０３】
選択された腎細胞の調製
手短に述べると、腎生検材料は、4.0ユニット/mLディスパーゼ（Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada）および300ユニット/mLコラゲナーゼIV（Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA）を含有するバッファー中で酵素により解離される。赤血球およびデブリを、15%イオジキサノール（Optiprep（登録商標）、Axis Shield, Norton, MA, USA)を用いた遠心分離によって除去する。初代腎細胞を、組織培養処理（Tissue culture treated）ポリスチレンプレート（NUNC, Rochester, NY, USA）上にシードし、50:50培地、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）：5%ウシ胎仔血清（FBS）、1X ITS（インスリン/トランスフェリン/亜セレン酸ナトリウム培地添加物）および抗生物質/抗真菌薬を含有するケラチノサイト無血清培地（KSFM）の1:1混合物中で培養する（すべてInvitrogen製、Carlsbad, CA, USA）。培養後に細胞分離する前に、初代腎細胞培養物は、細胞分離効率を向上させるために、大気中の酸素条件（21%）から、より生理学的に適切な低酸素（2%）環境に24時間移される。添加物なしのKSFM（uKSFM）2 mL中75 x 106 細胞として調製された、初代腎細胞培養物の分離は、15 mL ポリプロピレン製コニカルチューブ中で、4段階のイオジキサノール（OptiPrep；60% w/v、uKSFM中）密度勾配（16%、13%、11%、および7%）を用いた遠心分離によって行われ、室温にて20分間800gで遠心分離される。遠心分離後、使用前に、すべてのバンドを滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で3回洗浄する。
【０３０４】
ある実施形態において、細胞は、レシピエントによる拒絶を低下させるようにSRCをゲノム改変して免疫特権を有する状態にするために、免疫学的に活性のある細胞表面抗原をコードする遺伝子を除去するようにゲノム改変される。ある実施形態において、細胞は、レシピエントによる拒絶を低下させるようにSRCを遺伝子改変して免疫特権を有する状態にするために、免疫学的に活性のある細胞表面抗原をコードする遺伝子の発現を低下させる（たとえばRNAiを用いて）ように遺伝子改変される。
【０３０５】
密度勾配遠心分離ステップから、約1.0419 g/mLを上回る浮遊密度を示す、混合した生物活性腎細胞を、治療的に生物活性のあるSRCを作製するために使用する。選択された腎細胞の調製は、たとえば、Kelley et al. (Am J Physiol Renal Physiol 2010; 299: F1026-39)、Kelley et al. (Cell Transplant 2013; 22:1023-39)、Bruce et al. (Methods Mol Biol. 2013; 1001:53-64)およびBasu et al. (Cell Transplant. 2011; 20:1171-90l)にも記載されている。細胞懸濁物（100μL）をゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルと混合して10ccシリンジにロードし、治療用製品を調剤する。
【０３０６】
それぞれの培養継代ごとに、ならびに製剤中に、細胞生存率を測定する（トリパンブルー色素排除）。細胞表現型および細胞能力のアッセイは、既述のように最終製品について実施される（Basu and Ludlow. Regen Med 2014; 9:497-512）。すべての手順は、FDAおよびMPA QPの指針のもとで、現行の医薬品適正製造基準（cGMP）を順守して実行される。
【実施例３】
【０３０７】
慢性腎臓病治療用のヒト同種腎細胞を操作するための一般的方法
本発明の選択された腎細胞を用いた患者の治療は、細胞を拒絶能力のある状態にする表面抗原を欠いた、ゲノム改変された免疫特権のある細胞を使用することを基礎とする。ある実施形態において、生物活性腎細胞は、患者またはドナーから回収され、ex vivoで選択され、必要ならば細胞数を増幅するためにin vitroで培養されて、最終的に患者に注入される。それぞれの患者は、腎細胞の拒絶をもたらす表面抗原を欠いた、ゲノム改変された、免疫特権のある生物活性腎細胞を用いて準備された治療を受ける（すなわち、免疫特権のある生物活性腎細胞治療）。本発明をよりよく理解するために、免疫特権のあるNKA製品のための製造プロセスステップの模式図を図1に示す。
【０３０８】
HLAマッチングのレベルが不適切なドナー候補とレシピエントとの間のマッチングレベルを上げるために、標的化されたアレルに特異的な遺伝子編集が、Cas9および明確に同定されたgRNA分子を用いて行われる。結果として、ミスマッチのドナーに由来する細胞間のHLAマッチングのレベルは、遺伝子破壊を通じて、レシピエントとなりうる患者への移植に、より適したものとなる（HLAミスマッチを減少させることによって）。同種ドナー候補およびレシピエントのペアから得られた、初代ヒト腎細胞もしくは富化されたSRCの、多重HLA（MHCクラスIおよびクラスII）遺伝子編集を用いて、ドナーSRCのレシピエントとのマッチングを高めることができる。
【０３０９】
移植されたHLAミスマッチ同種細胞（たとえば生物活性腎細胞）の拒絶が起こる可能性を減少させるために、6つのHLAアレル（HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRB1におけるそれぞれ2つのアレル）において、移植を必要とするレシピエント被験体のHLAをタイプ分けする（たとえば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRB1多型を判定する）。レシピエントの遺伝子型は、6/6 HLAアレルのマッチが、移植後の免疫拒絶のリスク低下と結びついているので、同一の6/6 HLAアレルを有するドナーとマッチすることが理想的である。6/6 HLAアレルのマッチを有するドナーは（たとえば、骨髄もしくは臍帯血HSCバンクから、または親族メンバーから）得られないが、5/6、4/6、3/6または2/6 HLAアレルマッチを有する部分的にマッチするドナーは利用できる場合には、本明細書に記載の方法を用いて、部分マッチドナーとレシピエントとのミスマッチを減らすことができる。必要に応じて、1つもしくは複数のアレル（2、3、4、5、もしくは6つのアレル）を、本明細書明細に記載の遺伝子編集法を用いて破壊して、移植レシピエントにおいて免疫抑制を生じさせるリスク、および疾患の重症度を低下させることができる。
【０３１０】
免疫特権を有する腎細胞を作製するために、本明細書に記載の方法を用いてドナー腎細胞（たとえば、BRCおよび/またはSRC）を改変することができる。たとえば、特定の集団においてもっとも高頻度に存在するHLA遺伝子型とマッチする細胞と作製するために、本方法を用いて、ドナーSRCの1、2または3つのHLAアレルを破壊（たとえばノックアウト）することができる。たとえば、北米における4つの民族について、もっとも一般的な10個のハプロタイプは、たとえば、https://bioinformatics.bethematchclinical.org/hla-resources/haplotype-frequencies/; Burdett et al. , Hum. Immunol. 64 (10 Suppl): S6 (2003)で提供されるNational Marrow Donor Program HLAハプロタイプ頻度データに見出すことができる。
【０３１１】
それぞれのgRNAについて、1つのオリゴヌクレオチドがデザインされ、得られる。U6プロモーターおよびgRNAスキャフォールド（たとえば、標的指向性ドメイン以外のすべてを含み、たとえば、crRNAおよびtracrRNAに由来する配列を含み、たとえば、第1の相補性ドメイン；リンカードメイン；第2の相補性ドメイン；近位ドメイン；および尾部ドメインを含む）は、別々にPCR増幅され、dsDNA分子として精製される。PCR反応でgRNA特異的オリゴヌクレオチドを用いて、U6およびgRNAスキャフォールドをつなぎ合わせ、オリゴヌクレオチド内に特定される標的指向性ドメインで連結される。得られたdsRNA分子をトランスフェクションのために精製する。in vivo転写で作動させるために、またはin vitro転写のために、代わりのプロモーターを使用することができる。任意のgRNAスキャフォールドを用いて、任意の細菌種に由来するCas9と適合するgRNAを作製することができる。
【０３１２】
調べたいgRNAをそれぞれ、Cas9を発現するプラスミドおよび少量のGFP発現プラスミドとともにヒト細胞内にトランスフェクトする。予備的な実験において、これらの細胞は293T、K562もしくはU20Sなどの不死化ヒト細胞株とすることができる。あるいはまた、初代ヒト細胞を使用してもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的に関係していてもよい（たとえば赤血球系細胞）。想定される治療標的細胞集団に類似した初代細胞の使用は、内在するクロマチンおよび遺伝子発現との関連において、遺伝子ターゲティングの割合について重要な情報を提供する可能性がある。
【０３１３】
トランスフェクションは、脂質性トランスフェクション（LipofectamineまたはFugeneなど）を用いて、またはエレクトロポレーション（Lonza Nucleofection（商標名）など）によって、行うことができる。トランスフェクション後、GFP発現を、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーによって判定し、一定の高レベルのトランスフェクションを確認することができる。これらの予備的なトランスフェクションは、どのgRNA/gRNAの組み合わせが最大の活性を与えるかを判定するために、さまざまなgRNAおよびさまざまなターゲティングアプローチ（17-mer、20-mer、ヌクレアーゼ、デュアルニッカーゼなど）を含めることができる。
【０３１４】
それぞれのgRNAによる切断の効率は、標的遺伝子座においてNHEJによって引き起こされるインデル（挿入欠失）形成を、T7EIアッセイによって、または配列決定によって、アッセイすることができる。あるいはまた、他のミスマッチ感受性酵素、たとえばCel1/Surveyorヌクレアーゼなども使用することができる。
【０３１５】
T7EIアッセイのために、PCRアンプリコンは約500-700bpであって、目的の切断部位はアンプリコンの中に非対称に位置する。PCR産物の増幅、精製およびサイズ確認後、DNAを変性させ、95℃まで加熱することによってふたたびハイブリッド形成させた後、ゆっくりと冷却する。ハイブリッド形成させたPCR産物を、次に、完全にはマッチしていないDNAを認識して切断するT7エンドヌクレアーゼI（または他のミスマッチ感受性酵素）により消化する。元の鋳型DNAにインデルが存在するならば、アンプリコンを変性させて、再アニールしたときに、結果として、異なるインデルを有するDNA鎖のハイブリダイゼーションをもたらすので、したがって、完全にはマッチしていない二本鎖DNAをもたらす。消化産物は、ゲル電気泳動によって、またはキャピラリー電気泳動によって、可視化することができる。切断されたDNAの割合（切断および未切断の（光学）密度で割った切断産物の密度）を用いて、以下の等式によってNHEJパーセントを推定することができる：%NHEJ = (1-(1 -切断された割合)'72)。T7EIアッセイは約2-5% NHEJに至るまで感受性がある。
【０３１６】
T7EIアッセイの代わりに、またはそれに加えて、配列決定を用いてもよい。サンガー（Sanger）の配列決定法のために、精製されたPCRアンプリコンはプラスミド骨格にクローニングされ、形質転換され、ミニプレップで調製されて、1つのプライマーで配列決定される。T7EIによるNHEJ率の決定後にインデルの正確な性質を究明するために、サンガーの配列決定法を用いることができる。次世代シーケンシング技術を用いて配列決定を行うこともできる。次世代シーケンシング技術を用いる場合、アンプリコンは目的とする切断部位が非対称に配置された300-500bpとすることができる。PCR後に、次世代シーケンシングアダプターおよびバーコード（たとえばIllumina multiplexアダプターおよびインデックス）を、たとえば、ハイスループットシーケンシング（たとえばIllumina MiSeq）で用いるために、アンプリコンの末端に付加することができる。この方法は、非常に低いNHEJ率の検出を可能にする。
【０３１７】
本明細書に記載の方法は、CRISPR/Cas9分子とともに使用するためのgRNAを同定するために例示されるが、本明細書に記載のgRNA同定法を用いて、他のヌクレアーゼ（たとえばTALEN、Cpfl、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ）とともに使用できる配列を同定し、選択することができることは、当業者にはただちに明らかとなろう。実施例の実施形態についてさまざまな改変が当業者にただちに明白となるであろうが、本明細書に記載の一般的な原理は、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに他の実施形態および応用に適用することができる。さらに、以下の記述において、説明のために多数の詳細情報が記載される。しかしながら、これらの具体的な詳細項目を用いることなく本発明を行うことができることを当業者は認識するであろう。
【実施例４】
【０３１８】
ゲノム改変された免疫特権を有するSRCを用いた免疫原性および有効性研究
第1の動物実験において、野生型ラットから得られたゲノム改変された免疫特権を有するSRCを、多発性嚢胞腎（PCK）を有する変異型Sprague Dawley (SD)ラットの腎臓に注入する。評価されるべき主要エンドポイントは、変異型腎臓ネフロンに残存する野生型のゲノム改変された免疫特権を有するSRCの数である。慢性腎臓病（CKD）を有し、野生型同系SDラットSRCを注入された、PCK SDラットは、局在性の定性的検討のために、ならびに分子レベルで、罹患したネフロンへの野生型の組込みおよび保持の程度を定量するために、組織のin situハイブリダイゼーションおよびPCR、組織学的方法を用いて評価されることになる。
【０３１９】
第2の実験において、MHCクラスI、クラスII、またはクラスIおよびIIを制御する遺伝子が除去されたら、SRC機能を評価するために、4効力検定を用いたin vitro分析によって、ヒトSRC遺伝子編集が評価される。CRISPR/Cas9は、エレクトロポレーションによって導入され、SRCは、走化性affective、尿細管形成、サイトカイン放出、および走化性effectiveについて検討される。
【実施例５】
【０３２０】
SRCにおけるMHCの抑制
CRISPR/Cas9は、高い特異性および低い細胞毒性をもたらすフレキシブルでシンプルなシステムにおいて、特定のゲノムの破壊および置換を可能にする。CRISPR/Cas9ゲノム編集システムは、Cas9タンパク質と、ヒトU6ポリメラーゼIIIプロモーターから発現されるガイドRNAベクターとの同時発現を必要とする。3’末端にプロトスペーサー近接モチーフ（PAM - 配列NGG）が存在すると、Cas9は、ガイドRNAによって標的配列を認識して、DNA二本鎖を巻き戻し、両鎖を切断する。次に、レスキュードナーベクターで合成された機能的カセットを、巻き戻されたDNAに挿入することができる。修復されたゲノムはこれで、タグあり、またはタグなしの望ましい配列を発現することになる。CRISPRは、当初は、さまざまな細胞型および生物において標的遺伝子を「ノックアウト」するために使用されたが、Cas9酵素の改変は、標的遺伝子を選択的に活性化もしくは抑制し、DNAの特定領域を精製し、蛍光顕微鏡を用いて生細胞においてDNAを画像化することさえできるように、CRISPRの適用を拡大した。
【０３２１】
本発明者らは、MHC-IのB2MまたはHLA-A（サブユニット）成分を標的とするために、CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いることを選択した。標的とされるゲノム遺伝子座におけるエピゲノム改変は、casタンパク質と標的DNA部位のアクセシビリティを改変することができる。本発明者らは、B2M遺伝子発現のノックダウンに成功するガイドRNAが、ヌクレオソームのH3K4残基の広範なメチル化を特徴とするオープンクロマチン領域内の、遺伝子の転写開始部位の近くを標的とすることを見出した。公開されているソフトウェア（CHOPCHOP, WU-CRISPR）が、CRISPRターゲティング構築物（特定のDNA配列と結合するガイドRNA）をデザインするために利用され、腎細胞にトランスフェクトするために、エレクトロポレーションが使用された。FACSデータを作成するために標的化に成功したB2M遺伝子のための標的DNA配列は次のとおりである：
標的DNA配列
GAGTAGCGCGAGCACAGCTA (配列番号346)
PAM配列
AGG
標的遺伝子座
Chr.15: 44711563 - 44711585、GRCh38（UCSC(the University of California Santa Cruz)ゲノムブラウザ・ゲノムアセンブリGRCh37/hg19、chr15:45003685-45010357のNM_004048.2を参照されたい)
ストランド
リバース
【０３２２】
CRISPR/Cas9構築物を初代ヒト腎細胞に導入するためにエレクトロポレーションを使用した。CRISPR/Cas9構築物を送達するために、当業者に知られているリポフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクションなどを含めた他の方法を適用してもよい。以下に示される結果はB2Mサブユニットに注目しているが、ポリペプチド（HLA-A）を標的とするために同様のアプローチを適用することができる。
【０３２３】
ヒト初代腎細胞（1x106）に、MHC-I複合体のB2M成分を特異的標的とするCRISPR/Cas9構築物を、エレクトロポレーションにより導入した。図6-8に関するすべての作業は、腎組織の酵素消化後に培養されたヒト初代腎細胞を用いて行われた。この細胞は、SRCを得るように処理されなかった。細胞はエレクトロポレーションの48時間後に回収することができた。B2Mの発現はFACSにより評価した。エレクトロポレーションは、Gene Pulser Xcell（商標名）エレクトロポレーションシステム（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA）、プリセットプログラム#1：矩形波パルス型を用いて、全容積100μL、0.2 cmキュベット内で、160ボルトにて5ミリ秒間、行った。
【０３２４】
これとは別に、ヒト初代腎細胞（1x106）に、MHC-I複合体のB2M成分を特異的標的とするCRISPR/Cas9構築物を、エレクトロポレーションにより導入した。細胞はエレクトロポレーションの5日後に回収することができた。B2Mの発現はFACSにより評価した。
【０３２５】
図6に示すように、本発明者らは、エレクトロポレーション後48時間でのFACSによる測定で、B2M発現を47%減少させることができた。同様の減少は、エレクトロポレーションの5日後にも観察されたので、トランスフェクションが安定していることが示された。図7を参照されたい。
【０３２６】
位置ごとの分子解析は、間違いなくB2M遺伝子座においてB2Mノックアウトが起こっていることを示した。図8を参照されたい。これは細胞製品の安定性のために重要である。
【０３２７】
SRCドナー細胞ABOハプロタイプにかかわらず、このアプローチは、SRCの効力検定となる、VEGFおよびKIM1の分泌によって測定される、SRC機能に影響を与えることなく、B2Mのノックアウトに成功する。図9および11を参照されたい。
【０３２８】
混合リンパ球反応（MLR）は、薬物もしくは移植可能な材料の安全性を示すために、医薬品およびバイオテクノロジー関連団体により使用される試験である。それは米国食品医薬品局（FDA）の認可プロセスの一環として一般に用いられる。技術的には、それは、2つの同種リンパ球集団（同一種であるが遺伝学的に異なる）の間で生じるex vivo細胞性免疫アッセイである。一方向MLRでは、ただ1つのリンパ球集団が反応または増殖しうる。二方向MLRでは、2つの集団がいずれも増殖しうる。MLRを行って、T細胞が外部刺激に対してどのように反応するかを評価する。T細胞は、細胞異常および感染をスキャンする白血球型である。T細胞はヒト免疫に必須である。
【０３２９】
本発明者らは、対照、および刺激物質集団としてCRISPR遺伝子編集細胞を用いて、一方向MLRを行った。B2M発現がうまくノックアウトもしくはノックダウンされれば、リンパ球の細胞増殖の減少があるはずだと予測される。図10に示すように、FACSに基づいてそれぞれ異なるレベルのB2Mダウンレギュレーションを有する、3つの異なるSRC標品を調べ、付随するリンパ球増殖の減少が観察された。
【０３３０】
本発明者らは、レベル調整された遺伝子ノックアウト、およびin vitro免疫反応との相関を立証することができるシステムを有する。人体にそれ自体の有害な影響を及ぼす免疫抑制薬の使用をなくすほどに最小限にすることは、この治療のレシピエントのために必要とされるであろう。
【実施例６】
【０３３１】
典型的なNKA製剤成分
1. 細胞成分および材料
SRCは、NKAの生物学的活性成分を構成する。SRCは主として、その再生能力で知られる尿細管上皮細胞からなる。他の実質（血管）細胞、間葉細胞、内皮細胞、および間質（集合管）細胞は、自己SRC集団中に存在する可能性がある。
【０３３２】
SRCは、腎組織のコアを採取するするための標準治療腎生検法を用いて得られた、腎皮質組織から調製される。腎細胞は、酵素消化により腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させる。細胞は、顕微鏡下で培養物を目視観察することによって、細胞を評価して腎細胞の形態を検証する。培養物は、細胞同士の集合に起因する、きっちりした敷石状の外観を特徴的に示す（図13）。SRCは、単離し増殖させた細胞を、密度境界もしくは密度界面もしくは単一段階不連続密度勾配を超えて分離することによって得られる。
【０３３３】
密度境界もしくは界面を超える遠心分離を用いて、細胞浮遊密度に基づいて収集された腎細胞集団を分離する。腎細胞懸濁物は、オプティプレップ（OptiPrep）（OptiMEM中7%イオジキサノール；60% (w/v)）媒体の溶液を通じて分離される。約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分を、個別のペレットとして遠心後に収集する（図14）。1.0419 g/mL未満の浮遊密度を維持する細胞は除外して廃棄される。
【０３３４】
SRCペレットをDPBS中に再懸濁する。最終産物中の、残存するオプティプレップ、FBS、培地および補助材料のキャリーオーバーは、洗浄ステップによって最小限にする。
【０３３５】
2. バイオマテリアル成分および補助材料
以下のバイオマテリアル成分および補助材料が、SRCのNKAへの製剤のために使用される：
1. ブタゼラチン - 熱反応性ハイドロゲルを作製するために使用される。
2. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS） - ブタゼラチンを溶解するために使用される。このバッファーはヒト血漿またはヒト血小板溶解物に置き換える、またはそれらと混合することができる。
【０３３６】
バイオマテリアル標品
バイオマテリアルは、ブタゼラチンからなる、DPBS中のゼラチン溶液である。ゼラチンはDPBS中、またはヒト血漿/ヒト血小板溶解物中、または両者の混合物中に指定の濃度となるように溶解して、熱反応性ハイドロゲルのゼラチン溶液を形成する。ゼラチン溶液を、0.1μmフィルターに通して濾過滅菌し、そのまま調剤できる1回使用分に分けて冷蔵もしくは凍結保存する。
【０３３７】
バイオマテリアルの重要な性質は、それが熱に反応するハイドロゲルであって、異なる温度でゲル化し、液化することができることである。NKA製剤中に用いられるゼラチン溶液は、室温以上（22-28℃）で液体であり、冷蔵温度（2-8℃）に冷却するとゲル化する。
【０３３８】
ゼラチン溶液濃度
ゲル化の特性 - 冷蔵温度においてゲルを形成する能力（逆さにしたときに流れない）、および室温において液体となる能力（逆さにしたときに自由に流動する）について、0.5-1.0%の範囲のゼラチン濃度を評価した。表9は、さまざまな濃度のゼラチン溶液のゲル化の特性を示す。
【０３３９】
【表９】
2020525003.tif 000034
【０３４０】
0.63%以上のゼラチン溶液を用いて製剤されたNKAは判定基準を矛盾なく満たすことができたので、NKA製剤のためのゼラチン濃度に、0.88 ± 0.12%の範囲を選択した。しかしながら、約0.63%から約1%までの濃度範囲でゼラチンを含有する製剤も好適であることに言及しておく。
【０３４１】
3. NKA製剤
SRCは、ゼラチンベースの熱反応性ハイドロゲルであるゼラチン溶液を用いてNKAへと製剤される。ゼラチンベースの熱反応性ハイドロゲルは、細胞の安定性の改善をもたらし、したがって、製品の保存可能期間の延長、臨床的有用性のための腎皮質内へのSRCの輸送および送達中の安定性をもたらす。製剤の開発はゼラチン溶液の組成、濃度および安定性を評価した。
【０３４２】
トリパンブルー色素排除法によって、洗浄したSRCを計数する。ゼラチン溶液を冷蔵保存から取り出し、26-30℃に加温して液化する。必要数の細胞を含有するある容積のSRC懸濁物を遠心分離し、最終洗浄ステップのために液化したゼラチン溶液中に再懸濁する。この懸濁物を遠心分離し、そのSRCペレットを、製剤されたNKA中に100x106 細胞/mLというSRC濃度を結果として達成するのに十分なゼラチン溶液中に再懸濁する。
【０３４３】
NKA充填およびゲル化
NKA製品はシリンジ内に無菌充填される。充填工程の持続期間中、生菌サンプリングおよび非生菌サンプリングを含めた、ダイナミックエアーサンプリングを実施する。最終的なゲル化NKAを形成するために、2-8℃に冷却している間、NKAパッケージを最低2時間回転させて細胞を懸濁状態に保つ。細胞がゼラチン溶液中で定着しないようにゲル化が行われるために、迅速な冷却が必要である。冷蔵条件に置いたらすぐに、シリンジ内のゼラチン溶液の温度をモニターした。図15に示すように、急速な温度低下が観察される。1時間後、温度は典型的には最終温度4.4℃から0.3℃の範囲内に低下する。
【０３４４】
ゼラチン溶液の冷却はゲル化のプロセスを開始させるが、SRCが保存中にゲル中で懸濁状態を維持するように、形成されたゲルが安定化するために、一定の時間を必要とする。製剤されたNKAを含有するシリンジは、一晩または1.25時間回転させた後、一晩立たせておいた。その後、内容物を取り出し、製品の異なる4区分において細胞濃度を測定した。分析によれば、4区分の間に差異はないので、NKAは最低限1.25時間低温で回転させたら、測定可能な細胞の定着は起こらない（図16）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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