(57)【要約】  原核生物宿主において使用するためのタンパク質発現系であって、ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターに動作可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットと、ｂ）宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターおよび単一の完全なパリンドロームオペレーター配列に動作可能に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットとを含み、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための発現カセットは、宿主細胞の染色体に位置する、発現系が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物宿主において使用するためのタンパク質発現系であって、
ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターに動作可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットと、
ｂ）宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターおよび単一の完全なパリンドロームオペレーター配列に動作可能に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットと
を含み、
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための前記発現カセットは、宿主細胞の染色体に位置する、タンパク質発現系。
【請求項２】
前記プロモーターが、λｐＬプロモーターである、請求項１に記載のタンパク質発現系。
【請求項３】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１または２のいずれかに記載のタンパク質発現系。
【請求項４】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターが、２つの完全なパリンドロームオペレーター配列の制御下にある、請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質発現系。
【請求項５】
完全なパリンドロームオペレーターが、前記プロモーターの上流に位置し、１つの完全なパリンドロームオペレーターが、前記プロモーターの下流に位置する、請求項４に記載のタンパク質発現系。
【請求項６】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターを制御する前記オペレーターと、前記宿主細胞ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターに動作可能に連結された前記オペレーターとが、同じインデューサーによって誘導される、請求項４または５のいずれかに記載のタンパク質発現系。
【請求項７】
前記宿主細胞ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターに動作可能に連結された前記オペレーターが、ｌａｃオペレーターである、請求項１から６のいずれか１項に記載のタンパク質発現系。
【請求項８】
前記宿主細胞ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターに動作可能に連結された前記オペレーターが、転写開始点とオーバーラップする、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質発現系。
【請求項９】
前記完全なパリンドロームオペレーター配列が、ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣまたはＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴのいずれかである、請求項１から８のいずれか１項に記載のタンパク質発現系。
【請求項１０】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターに動作可能に連結されたタンパク質の発現カセットをさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のタンパク質発現系。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質発現系を発現させるステップを含む、タンパク質の調製のためのプロセス。
【請求項１２】
タンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
タンパク質の産生のための方法であって、原核生物宿主において、
ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターに動作可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットと、
ｂ）宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターおよび単一の完全なパリンドロームオペレーター配列に動作可能に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットと
を含む発現系を発現させるステップを含み、
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための前記発現カセットが、宿主細胞の染色体に位置する、方法。
【請求項１４】
前記原核生物宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉであり、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターが、２つの完全なパリンドロームオペレーター配列の制御下にあり、１つの完全なパリンドロームオペレーターが、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターの上流に位置し、１つの完全なパリンドロームオペレーターが、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターの下流に位置し、前記宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターが、λｐＬプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記完全なパリンドロームオペレーター配列が、ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣおよびＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を発現させるための方法および系、特に、Ｔ７プロモーターを利用する方法および系に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現において使用するためのＴ７プロモーター系がよく知られている。しかしながら、Ｔ７プロモーターはタンパク質を発現する能力において有効であると認識されているが、Ｔ７ベースの系にはある欠点がある。Ｔ７系の操作にはファージポリメラーゼが必要とされ、これは、一般的に、必要とされるファージポリメラーゼを発現させるλＤＥ３プロファージをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ宿主菌株に挿入して、溶原宿主菌株を作り出すことによってもたらされる。ファージポリメラーゼはまた、ファージポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の遺伝子を運ぶ特殊λ形質導入ファージの感染によって細胞に送達することもできる。λＤＥ３プロファージは、溶菌ファージ粒子を形成するためのプロファージの切除に必要とされる遺伝要素が欠如している。しかしながら、λＤＥ３溶原宿主菌株は、ファージ粒子を放出し、それにより、発酵プラントにおいて望ましくない感染を引き起こす可能性があることが示された。実際に、λＤＥ３菌株の使用は、特定の発酵プラント操作者によっては許されていない。
【０００３】
ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （１９８５年）  ８２：１０７４〜１０７８ページ）は、動作可能な発現系が１つのプラスミドのλＰＬプロモーターからＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させ、目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）を別のプラスミドのＴ７プロモーターに連結することによって構築できることを示した。しかしながら、この系は、ＧＯＩの高い非誘導レベルを示した。Ｍｅｒｔｅｎｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９５年）１３：１７５〜１７９ページ）は、構成されたＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（上記）の系が高いバックグラウンド発現のために本質的に不安定であることを実証した。彼らが提案した解決手段は、プロモーターとＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの間に転写ターミネーターを加えることであった。これを温度誘導性λＰＬプロモーターと組み合わせると、きっちりと抑制がもたらされることが示された。しかしながら、それらが認めた高温を使用するこの必要とされる誘導は、生成物溶解性を高めることもある低温における発現の適応性を認めなかった。代替的なＩＰＴＧ誘導性プロモーターが使用された場合、これは、発現の漏れを示し、それが長期の不安定性につながることがわかった。ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎによってならびにＭｅｒｔｅｎｓらによって提言されたものなどの系によるその他の１つの課題は、系が誘導されると、その結果、高レベルのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現があることになり、それが、その後、タンパク質に翻訳され得る大量のＲＮＡを合成するその能力のために、細胞に大きな代謝的負担をもたらすことである。細胞が誘導直後に増殖を止めると言う理由で、誘導期間があまり長く継続できないため、これは発酵プロセスにおけるそのような系の使用に制限を課す。
【０００４】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現のためにＤＥ３に使用されるＬａｃＵＶ５プロモーターに対する代替案の多くの報告があった。これらとしては、以下のものが挙げられる。
ａ）アラビノースプロモーターの使用、ただし、これは、依然として検出可能な基礎レベルの発現しか示さない（例えば、Ｗｙｃｕｆ  （２０００年）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７７：６７〜７３ページ、Ｃｈａｏら（２００２年）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １８：３９４〜４００ページを参照）；
ｂ）塩誘導性発現系（ＵＳ５８３０６９０）、これに関しては不安定性のエビデンスがある（Ｂｈａｎｄａｒｉ  ＰおよびＧｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ  Ｊ．  Ｊ  Ｂａｃｔ  １９９７年  １７９：４４０３〜６ページ）；
ｃ）ラムノース誘導性系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  （２００６年）  ９４：２７〜３０ページ）、ただし、これは、極めて菌株特異的であり、高濃度の高価なインデューサーを必要とする；および
ｄ）ｇａｌプロモーター、これは、発現の比較的高い非誘導レベルを示した（ＭｅｎｚｅｌｌおよびＧｒａｍａｊｏ  （２００４年）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２０：１２６３〜６ページ）。
【０００５】
ＷＯ２００８１３９１５３は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための発現カセットがλｐＬプロモーターおよび少なくとも２つの完全なパリンドロームオペレーター配列に動作可能に連結されたタンパク質発現系を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらなるＴ７ベースの発現系を特定することが依然として望ましい。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の第１の態様によると、原核生物宿主において使用するためのタンパク質発現系であって、
ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターに動作可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットと、
ｂ）宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターおよび単一の完全なパリンドロームオペレーター配列に動作可能に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットと
を含み、
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための発現カセットは、宿主細胞の染色体に位置する、タンパク質発現系が提供される。
【０００８】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための発現カセットは、相同組み換え、部位特異的な組み換えまたはトランスポゾンが関係する遺伝子転位などの当該技術分野において既知の方法を使用して宿主細胞の染色体に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットは、さまざまな宿主のさまざまな場所に組み込まれ、特に、発現が活発な宿主が選択される。
【０００９】
発現系に利用されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系は、好ましくは、単一のＴ７プロモーターである。そのようなプロモーターの例は、当該技術分野において周知であり、参照によって本明細書に組み込まれるＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８９：１１３〜１３０ページ（１９８６年）によって開示されているものが挙げられる。最も好ましくは、利用されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系は、Ｔ７遺伝子１０プロモーターである。
【００１０】
本発明による発現系に完全なパリンドロームオペレーター配列として利用されてもよいオペレーター配列としては、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏおよびｇｌｎが挙げられる。多くの実施形態において、オペレーター配列は、宿主細胞ポリメラーゼ依存性プロモーターの下流に位置する。好ましいオペレーター配列は、ｌａｃオペレーターであり、最も好ましくは、核酸配列ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号１）またはＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ（配列番号２）を有するオペレーターである。好適な実施形態において、オペレーター配列は、転写開始点とオーバーラップする。
【００１１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターは、一般的に少なくとも１つのオペレーター配列の制御下において利用され、このオペレーター配列は、パリンドロームまたは非パリンドロームであってもよい。利用することができるオペレーター配列の例は、当該技術分野において周知であり、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏ、ｇｌｎ、ｒａｆ、ｒｈａ、ａｒａＣ、ｆｒｕおよびｍｅｌが挙げられる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターを制御するために２つのオペレーターが利用される場合、オペレーター配列は、プロモーターの制御を最大にするために好ましくは間隔があけられる。多くの実施形態において、間隔は、９０から１２６塩基対離れている、例えば、９１または９２塩基対離れているなど８５から１５０塩基対離れている。好適な実施形態において、１つのオペレーター、好ましくは、完全なパリンドロームオペレーターは、プロモーターの上流に位置し、１つのオペレーター、好ましくは、完全なパリンドロームオペレーターは、プロモーターの下流に位置する。特定の実施形態において、オペレーター配列、とりわけ、完全なパリンドロームオペレーター配列は、転写開始点とオーバーラップする。
【００１２】
特定の実施形態において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系を制御するオペレーターは、宿主細胞ポリメラーゼ依存性プロモーターを制御する完全なパリンドロームオペレーター配列と同じインデューサーによって誘導されることが好ましい。例えば、宿主細胞ポリメラーゼ依存性プロモーターが完全なパリンドロームｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎによって制御される場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系は、対応する完全なパリンドローム、または非パリンドロームｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎオペレーターによって有利に制御される。
【００１３】
オペレーターが、一般的に適したリプレッサー配列とともに利用されることは認識されるであろう。ｌａｃオペレーターを使用する場合、リプレッサー配列、例えば、ｌａｃｌ遺伝子配列は、リプレッサータンパク質を産生する。その他のｌａｃリプレッサー配列が使用されてもよく、例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質のレベルを増加させるために、ｌａｃｌＱ配列が使用されてもよい。リプレッサー配列はまた、宿主細胞ゲノムによって、または付加的な適合したプラスミドを使用することによってもたらされてもよい。多くの実施形態において、宿主細胞ポリメラーゼ依存性プロモーターを制御するオペレーターのために選択されるリプレッサー配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターを制御するオペレーター配列に対するリプレッサー配列として働く。
【００１４】
発現系のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよいが、好ましくは、プラスミドなどの染色体外要素に含まれる。
本発明の発現系を含むプラスミドまたは発現ベクターは、当該技術分野において既知の方法によって構築することができる。プラスミドはまた、一般に以下：選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性を付与する配列、ｃｅｒ安定配列（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および発現カセットのうちの１つまたは複数を含む。所望のタンパク質の分泌が必要とされる場合、発現系は、シグナル配列を取り込んでいてもよい。
【００１５】
発現は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＩＰＴＧの類似体、例えば、イソブチル−Ｃ−ガラクトシド（ＩＢＣＧ）、ラクトースまたはメリビオースなどのインデューサーの添加によって誘導されてもよい。その他のインデューサーが使用されてもよく、他でより詳細に説明されている（例えば、Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｅｎｚｎｉｋｏｆｆ編（１９７８年）を参照）。インデューサーは、個別にまたは組み合わせて使用されてもよい。適したプラスミドまたは発現ベクターの構築は、当業者には明白であろう。
【００１６】
本発明の発現系は、原核生物宿主細胞において、とりわけ微生物において、タンパク質を発現させるために利用されてもよい。本明細書中で使用される場合、「タンパク質」とは、一般にポリペプチド、典型的には約１０個を超えるアミノ酸を有するポリペプチドを指す。
【００１７】
原核生物の細胞の例としては、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むグラム陰性菌細胞、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを含むグラム陽性菌細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞は、腸内細菌科、好ましくは、Ｅ  ｃｏｌｉ、とりわけ、そのＢまたはＫ１２菌株である。特定の実施形態において、宿主細胞は、少なくとも１つの固有のプロテアーゼが欠乏するよう操作される。多くの好適な実施形態において、宿主細胞は、ｏｍｐＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ株、とりわけ、Ｗ３１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株である。
【００１８】
宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターの例としては、λｐＬ、λｐＲおよびλｃｌ、好ましくは、λｐＬが挙げられる。
多くの極めて好適な実施形態において、発現系は、少なくとも１つの固有のプロテアーゼが欠乏するよう操作されたＥ  ｃｏｌｉ、とりわけ、そのＢまたはＫ１２菌株、とりわけ、ｏｍｐＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ株、最も著しくは、Ｗ３１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株を含み、プロモーターは、λｐＬプロモーターである。
【００１９】
本発明の発現系は、組み換え細胞を培養することによるタンパク質、とりわけ、組み換えまたは異種タンパク質の製造に有利に利用される。タンパク質の発現に関して、プロモーター配列およびオペレーター配列が、発現させるタンパク質をコードする核酸、最も一般的にはＤＮＡに動作可能に連結されることは認識されるであろう。
【００２０】
したがって、本発明はまた、タンパク質の産生のための方法であって、
ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターに動作可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットと、
ｂ）宿主ポリメラーゼ依存性λファージプロモーターおよび単一の完全なパリンドロームオペレーター配列に動作可能に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットと
を含む発現系を発現させるステップを含み、
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための発現カセットは、宿主細胞の染色体に位置する、方法を提供する。
【００２１】
産生の方法に関する好ましい特徴は、本発明の第１の態様による発現系に関して説明されているとおりである。
発現系は、利用される細胞に対して当該技術分野において周知の方法によって発現される。好ましい発現方法は、増殖培地において組み換え細胞を、とりわけ発酵によって培養するステップ、およびその後、発現タンパク質を回収するステップを含む。「増殖培地」という用語は、組み換え細胞を増殖させるために使用される栄養培地を指す。多くの実施形態において、栄養液が利用される。所与の組み換え細胞に適した増殖培地は、当該技術分野において周知である。
【００２２】
多くの実施形態において、タンパク質回収は、ろ過、遠心分離、ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルろ過およびＨＰＬＣのうちの１つまたは複数を含む。
【００２３】
本発明は、以下の実施例によって限定されることなく示される。
【実施例】
【００２４】
発現菌株ＣＬＤ１３６２の構築
発現菌株ＣＬＤ１３６２の構築のための開始菌株は、ＣＬＤ１０４０と指定するｏｍｐＴオープンリーディングフレームの完全なインフレーム欠失を有するＷ３１１０（ＣＧＳＣ４４７４）菌株とした。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットを染色体に導入するために、合成のＤＮＡ分子を合成した。
【００２５】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＧＵ０７１０９１．１から入手したＤＮＡ配列）を合成した。１つはプロモーターの上流に、１つはその下流に位置する一対の完全なパリンドロームｌａｃオペレーターを含むλｐＬプロモーターカセット、およびＴ７遺伝子１０翻訳開始領域をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’末端に配置し、Ｎｃｏｌ部位が上流のパリンドロームオペレーターに隣接した。プロモーターカセットおよびポリメラーゼ構築物の両側に染色体の挿入位置に隣接する７００ｂｐのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ配列を配置した。下の配列番号３に配列を示し、Ｅ  ｃｏｌｉゲノムＤＮＡには一重の下線を引き、λｐＬプロモーターには二重下線を引き、オペレーターは太字にし、転写開始点は、太字で下線を引いた
【００２６】
【化１】
2020511151.tif 000002
【００２７】
である。
配列番号３
【００２８】
【化２−１】
2020511151.tif 000003
【００２９】
【化２−２】
2020511151.tif 000004
【００３０】
組み込みカセットをＮｏｔｌ／ＳａｌｌとしてｐＡＶＥ１０５０、温度感受性レプリコンを有するｐＳＣ１０１ベースのプラスミドにクローン化して、ｐＡＶＥ１０７９を作製した。得られたプラスミドを、Ｎｃｏｌを用いて消化して、プロモーターの上流のオペレーター配列を除去し、再連結して、ｐＡＶＥ１１６０にした。
【００３１】
ｐＡＶＥ１１６０をＣＬＤ１０４０に別々に形質転換した。プラスミドを確立したら、菌株をＬＢ＋クロラムフェニコール上に広げ、許容されていない温度でインキュベーションした。生じたコロニーを許容温度に戻し、３回継代培養した後、ＬＢスクロース対抗選択プレートに播いた。生じたコロニーを取ってＬＢおよびＬＢ＋クロラムフェニコールプレートに置いた。クロラムフェニコール感受性コロニーをＰＣＲによってスクリーニングして、組み込まれた導入遺伝子の存在を確認した。単一の陽性コロニーを精製し、ＣＬＤ１３６２と名づけてグリセロールストックとして−７０℃で維持した。
【００３２】
試験プラスミドの構築
Ｓｕｐｅｒ  Ｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ遺伝子配列をＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００６年１月；２４（１）：７９〜８８ページ、Ｅｐｕｂ  ２００５年、１２月２０日、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｐｅｄｅｃｌａｃｑ  ＪＤ、Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  Ｓ、Ｔｒａｎ  Ｔ、Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ＴＣ、Ｗａｌｄｏ  ＧＳから得た。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に対する最適条件を有する、このタンパク質をコードする遺伝子を合成した。この遺伝子をＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌフラグメントとして、特許出願第ＷＯ９９／０５２９７号に記載されているとおりのｐＺＴ７＃３．３発現ベクターにクローン化した。組み換えプラスミドを制限消化によってスクリーニングし、シークエンシングによって確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ１０３０と名づけた。
【００３３】
ｐＡＶＥ１２３１（比較）の構築
Ｔ７Ａ３プロモーターカセット（配列番号４）を合成し、Ｎｃｏｌ／ＮｄｅｌによってｐＡＶＥ１０７９にクローン化して、ｐＡＶＥ１２３１を作製した。
【００３４】
配列番号４
【００３５】
【化３】
2020511151.tif 000005
【００３６】
ＣＬＤ１３９２（対照）の構築
プラスミドｐＡＶＥ１０３０をＣＬＤ１０４０に形質転換した。生じた組み換え菌株（ＣＬＤ１３９２と名づけた）を精製し、グリセロールストックとして−７０℃で維持した。
【００３７】
ＣＬＤ１３９４の構築
プラスミドｐＡＶＥ１０３０をＣＬＤ１３６２に形質転換した。生じた組み換え菌株（ＣＬＤ１３９４と名づけた）を精製し、グリセロールストックとして−７０℃で維持した。
【００３８】
ＣＬＤ１３９５（比較）の構築
プラスミドｐＡＶＥ１０３０をＢＬ２１（λＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）  カタログ番号６９４５０−３）に形質転換した。生じた組み換え菌株（ＣＬＤ１３９５）を、精製し、グリセロールストックとして−７０℃で維持した。
【００３９】
ｐＡＶＥ１２３１のＣＬＤ１０４０（比較）への組み込み
ｐＡＶＥ１２３１プラスミドをＣＬＤ１０４０の染色体に組み込むために２つの試みを行った。どちらの試みでも染色体に組み込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットを有するいかなるクローンも得られなかった。
【００４０】
ｓｆＧＦＰのマイクロウェルプレート発現
ＣＬＤ１３９２、ＣＬＤ１３９４およびＣＬＤ１３９５のそれぞれのバイアルを−７０℃の冷凍庫から取り出し、解凍した。１０μＬの解凍したグリセロールストックを、テトラサイクリン（１０  μｇ／ｍＬ）を加えた５ｍＬのｖｅｇｇｉｅ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ｖＬＢ  ５ｇ／Ｌ  酵母エキス（ＢＤ）、１０ｇ／Ｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（ＢＤ）、および５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム）に接種した。培養物をオービタルシェーカー中、３７℃で１６時間インキュベーションした。２０μＬのこの培養物を、２ｍＬのｖＬＢ（上記のとおりの組成）を入れた２４ディープウェルプレート上の４ウェルに接種した。このプレートを、オービタルシェーカー中、３７℃、２００ｒｐｍでインキュベーションした。接種の３時間後、このプレートをシェーカーから取り除いた。２０μＬのサンプルを各ウェルからフローサイトメトリー分析のために取り出した。その後、３つのウェルをＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、それぞれ０．００５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．５ｍＭの最終濃度にした。４つ目のウェルは、基礎発現を観察するために誘導しないまま残した。上記の条件下においてインキュベーションを継続した。誘導の３時間および２２時間後にフローサイトメトリー分析のためにさらにサンプルを採取し、ｓｆＧＦＰの蓄積を測定した。
【００４１】
フローサイトメトリー分析をＦＬ１−Ａ検出器を使用したＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターにおいて実施した。収集設定は、最大１００００事象、中程度の流速で２分とした。採取した細菌の全細胞ライセートのＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を使用してｓｆＧＦＰの蓄積レベルを求めた。その結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2020511151.tif 000006
【００４３】
このデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体（ＣＬＤ１３９４）に組み込まれたλｐＬプロモーターおよび単一のパリンドロームｌａｃオペレーターからのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの送達が、誘導の２２時間後にＢＬ２１  λＤＥ３菌株（ＣＬＤ１３９５）の使用と同様のレベルの蛍光強度およびｓｆＧＦＰ蓄積を示すことを示している。驚くべきことに、誘導の直前の時点のＢＬ２１  λＤＥ３菌株ＣＬＤ１３９５のＦＬ１−Ａレベルは、ＣＬＤ１３９４に関するレベルよりも１００倍超高かった。誘導時のＣＬＤ１３９４のＦＬ１−Ａレベルは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含まない対照菌株ＣＬＤ１３９２の２倍に過ぎなかった。
【００４４】
さらに、ＣＬＤ１３９５は、３から２２時間の間の０．５ｍＭ  ＩＰＴＧのＦＬ１−Ａレベルの低下によって立証されるとおり一晩で乏しい安定性を呈した。これは、（本発明による）ＣＬＤ１３９４宿主菌株が、組み換えタンパク質産生に関してλＤＥ３を利用したものよりも漏れが少ないと同時に同じレベルの標的タンパク質発現をもたらす誘導が可能であることを示す。ＣＬＤ１３９４菌株が、組み込まれたプロモーターに動作可能に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する一方で、ＣＬＤ１３９５は、λＤＥ３構築物のプロモーターとＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の間にあるＬａｃＺαフラグメントオープンリーディングフレームのためにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の翻訳が妨げられたと予想されることを考慮すると、これは、特に驚くべきことである。
【００４５】
発酵評価
菌株ＣＬＤ１３９４およびＣＬＤ１３９５に対する発酵接種材料は、以下に示される各菌株の５０μｌのグリセロールストックを、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた２００ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ、５ｇ／Ｌ  酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ）、１０ｇ／Ｌ  トリプトン（Ｏｘｏｉｄ）、および５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム）を含有する５００ｍＬのバッフル付振盪フラスコに添加することによって戻した。接種材料を、２００ｒｐｍの撹拌を行いながらシェーカーインキュベーター中、３７℃で１２時間増殖させた。１５０ｍＬの定義されたグリセロールバッチ増殖培地を含有する２５０ｍＬの有効体積（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）の発酵槽に接種するために０．７５ｍｌの振盪フラスコ接種材料を使用した。以下に示す操作条件下において発酵を行った。温度を３７℃に制御し、３５％（ｗ／ｖ）水酸化アンモニウムの自動添加によってｐＨを６．７に制御した。溶存酸素圧力（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｅｎｓｉｏｎ）（ｄＯＴ）設定点は、３０％の空気飽和度とし、５００ｒｐｍの最低から４５００ｒｐｍの最大までの発酵槽撹拌機速度の自動調節、および入り口ガス流への酸素の自動補充によって制御した。発酵容器への空気流は、全体をとおして１．０ｖ／ｖ／ｍとした。発酵槽中の圧力を５０から２００ｍｂａｒの間に維持した。
【００４６】
発酵は、接種のおよそ１０時間後に生じ、ｄＯＴの急な上昇を特徴とする炭素源（すなわち、グリセロール）の欠乏までバッチ方式で行われた。流加発酵は、炭素源枯渇の時点で、制限を設けた供給速度でのグリセロール／硫酸アンモニウム供給材料の添加によって開始した。欠乏の１．５時間後にＩＰＴＧを０．０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭまたは０．５ｍＭの最終濃度で添加することによって誘導を行った。流加段階は、誘導後１２時間継続した。フローサイトメトリーによる蛍光レベル（誘導時）および回収時、誘導の１２時間後に緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蓄積（％ＴＣＰ）（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）を測定するためにサンプルを採取した。
【００４７】
フローサイトメトリーの結果の概要を下記表２に示す。
【００４８】
【表２】
2020511151.tif 000007
【００４９】
表２のデータは、誘導時に４つのＣＬＤ１３９４バイオリアクターが、４つのＣＬＤ１３９５バイオリアクターと比較してわずか５５％の蛍光事象の数しかないことを示している。蛍光レベルの中央値は、ＣＬＤ１３９５で見られた中央値の８６％しかない。これは、ＣＬＤ１３９４菌株が、定義された発酵培地においてはるかに低い基礎発現レベルを有することを示し、これは、マイクロウェルプレートに使用した複合培地において見られる影響を再現している。
【００５０】
表３は、総細胞タンパク質パーセンテージとして、菌株についての発酵の終わりにおけるＧＦＰの蓄積を示す。
【００５１】
【表３】
2020511151.tif 000008
【００５２】
表２は、誘導時にＣＬＤ１３９４がＣＬＤ１３９５よりも低い基礎発現を有するにもかかわらず、光学密度に関する正規化後の試験タンパク質の最終的な蓄積がＣＬＤ１３９５菌株と同じか、またはそれより高いことを示している。
【００５３】
このデータは、異種タンパク質の製造に対する系の有用性を明らかに示す。本発明の発現系に関してより低い基礎発現およびより高い誘導産生性が得られた。
【国際調査報告】
2020511151.tif 000009
2020511151.tif 000010
2020511151.tif 000011
2020511151.tif 000012
2020511151.tif 000013