(57)【要約】  本発明は、とりわけ、癌及び／又は炎症性疾患などの疾患の治療に使用される、キメラタンパク質並びに併用療法を含む、組成物及び方法に関する。【選択図】図１５Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、その必要がある対象に、
（ｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造の第１のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、かつ前記第１のキメラタンパク質は自然免疫系を調節する）；及び
（ｉｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造の第２のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、かつ前記第２のキメラタンパク質は適応免疫系を調節する）
を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記第１のキメラタンパク質が、前記第２のキメラタンパク質の前に投与される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記第１のキメラタンパク質が、前記第２のキメラタンパク質の後に投与される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記第１キメラタンパク質が、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰ１α、ＶＳＩＧ８、ＴＩＭ３、４１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、及びＬＩＧＨＴの少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のキメラタンパク質が、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰ１α、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＩＬ−２の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のキメラタンパク質及び前記第２のキメラタンパク質が、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌから独立して選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、その必要がある対象に、
Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造の第２のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、かつ前記第２のキメラタンパク質は適応免疫系を調節する）
を投与することを含み、
前記対象が、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造の第１のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、かつ前記第１のキメラタンパク質は自然免疫系を調節する）での治療を受けているか又は治療を受けたことがある、
方法。
【請求項１２】
前記第１キメラタンパク質が、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、ＶＳＩＧ８、ＴＩＭ３、４１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、及びＬＩＧＨＴの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のキメラタンパク質が、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＩＬ−２の少なくとも１つを含む、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のキメラタンパク質及び前記第２のキメラタンパク質が、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌから独立して選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のキメラタンパク質及び／又は前記第２のキメラタンパク質が、抗原提示細胞の活性化を引き起こす、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のキメラタンパク質及び／又は前記第２のキメラタンパク質が、抗原を提示する抗原提示細胞の能力を増強する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のキメラタンパク質及び／又は前記第２のキメラタンパク質が、持続的な免疫調節効果を提供する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のキメラタンパク質及び／又は前記第２のキメラタンパク質が、腫瘍細胞が免疫阻害シグナルを伝達するのを防ぐ、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のキメラタンパク質が、Ｔ細胞による腫瘍死滅活性を増強する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記リンカーが、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されるポリペプチドである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカーが、ＩｇＧ４由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載。
【請求項２６】
前記ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４に由来する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リンカーが、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記リンカーが、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記リンカーが、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記リンカーが、配列番号４８〜９４から選択される少なくとも１つの結合リンカーをさらに含む、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記リンカーが、各結合リンカーが配列番号４８〜９４から独立して選択される少なくとも２つの結合リンカーを含み、１つの結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ＦｃドメインのＮ末端に位置しかつ別の結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ＦｃドメインのＣ末端に位置する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
医薬品として使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質。
【請求項３３】
癌の治療で使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質。
【請求項３４】
炎症性疾患の治療で使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質。
【請求項３５】
医薬品の製造における、本明細書に記載のキメラタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１７年２月２７日出願の米国仮出願第６２／４６４，００２号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に送信されたテキストファイルの説明
本出願は配列リストを含有する。配列リストは、「ＳＨＫ−００１ＰＣ２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」というタイトルのＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送信された。配列リストは１４９，０８４バイトのサイズであり、２０１８年２月２７日頃に作成された。配列リストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、とりわけ、癌及び自己免疫のための免疫療法などの疾患の治療で使用されるキメラタンパク質を含む組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
癌に対する例外的な治療は、長年の努力にもかかわらず避けられてきた。これは、部分的に、多くの癌が免疫系を避けるメカニズムを発達させているからである。そのため、免疫系の複数のアームを適切に関与させて抗癌免疫応答を生じさせる治療及び治療レジメンを開発する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
したがって、様々な態様において、本発明は、癌免疫療法に有用である組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は、部分的には、免疫活性化又は共刺激シグナルを提供しながら免疫阻害シグナルを逆転又は抑制する特定のキメラタンパク質に関する。とりわけ、重要なことに、本発明は、理論に縛られることなく、１以上のジスルフィド結合を含むリンカー領域における安定化に基づいて、安定で生成可能な多量体状態を維持できる改善されたキメラタンパク質を提供する。したがって、本組成物及び方法は、二重特異性薬剤の生成における様々な欠陥を克服する。
【０００６】
いくつかの態様において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端：の一般構造のものであり、式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含む。
【０００７】
また、様々な態様において、本発明は、本発明のキメラタンパク質の組み合わせを用いることによって癌を治療する方法に関する。例えば、本方法は、必要に応じて順番に、自然免疫応答及び適応免疫応答などの、免疫系の特定のアームを調節するレジメンを可能にする。
【０００８】
いくつかの態様において、癌を治療する方法であって、その必要がある対象に、（ｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第１のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第１のキメラタンパク質は自然免疫系を調節する）；かつ（ｉｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第２のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第２のキメラタンパク質は適応免疫系を調節する）を投与することを含む、方法が提供される。
【０００９】
いくつかの態様において、癌を治療する方法であって、その必要がある対象に、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第２のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第２のキメラタンパク質は適応免疫系を調節する）を投与することを含み、対象はＮ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第１のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第１のキメラタンパク質は自然免疫系を調節する）で治療を受けているか、又は治療を受けたことがある、方法が提供される。
【００１０】
実施形態において、第１のキメラタンパク質は、第２のキメラタンパク質の前に投与される。
【００１１】
実施形態において、第１のキメラタンパク質は、第２のキメラタンパク質の後に投与される。
【００１２】
実施形態において、第１のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、ＶＳＩＧ８、ＴＩＭ３、４１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、及びＬＩＧＨＴの少なくとも１つを含む。
【００１３】
実施形態において、第２のキメラタンパク質は、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＩＬ−２の少なくとも１つを含む。
【００１４】
実施形態において、第１のキメラタンパク質及び第２のキメラタンパク質は、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌから独立して選択される。
【００１５】
実施形態において、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される。実施形態において、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される。実施形態において、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される。実施形態において、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される。
【００１６】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−１Ｄ】Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質（図１Ａ及び図１Ｃ）が工学処理され得る方法の模式図を示し、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを取り除きリンカー配列を用いて隣接させて（図１Ｂ）Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインの各々が単一キメラタンパク質中で外側に向かう単一キメラタンパク質を作製する。図１Ｂは、各タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの除去によるＩ型とＩＩ型膜タンパク質の連結を示し、各タンパク質由来の遊離細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はリンカー配列により接合されている。この図のＥＣＤは、典型的には細胞膜の外側に局在する候補Ｉ型又はＩＩ型タンパク質の全アミノ酸配列、又は意図された受容体若しくはリガンドへの結合を保持するその任意の部分を含み得る。図１Ｄは、Ｉ型膜タンパク質の細胞外ドメインが構築物の「左」側に面しＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインが構築物の「右」側に面する、線形構造での隣接細胞外ドメインを示す。
【図２】理論に縛られることなく、単量体ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−１７２１５４）のコンピューターシミュレーション予測構造を示す。
【図３Ａ】理論に縛られることなく、活性腫瘍の破壊を刺激するためのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の作用機序を示す概略図を示す。キメラタンパク質は次いで、腫瘍細胞の表面から「ぶら下がる」ことができ、キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌ部分は次いで、Ｔ細胞の表面上で発現するＣＤ４０に結合できる。これは、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強する共刺激ＣＤ４０Ｌシグナルとの阻害性ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）シグナルの置換をもたらす。
【図３Ｂ】腫瘍細胞とＴ細胞の間のキメラタンパク質によって形成されたシナプスを示す。
【図４】ウェスタンブロットによるヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−１７２１５４）の特徴づけを示す。具体的には、キメラタンパク質の個々のドメインを、抗ＣＤ１７２ａ、抗Ｆｃ、又は抗ＣＤ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン２にロードした（β−メルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼなし）。レーン３の試料を還元剤β−メルカプトエタノールで処理し、レーン４の試料をＰＮＧアーゼで処理した。
【図５Ａ−５Ｃ】約６，０００個のヒト膜タンパク質を含有するマイクロアレイから特定されたヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（図５Ａ）、ヒトＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（図５Ｂ）、又はヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（図５Ｃ）の結合パートナーを示す結果の表である。いずれの場合も、各候補分子に対して予想される結合パートナーをスクリーニングによって特定した。他のヒトタンパク質への非特異的結合の証拠はなく、ガレクチン−１への結合は、全てのＦｃ含有融合タンパク質についてのスクリーニングで見られる。
【図６】それぞれの結合パートナーに対する、ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す。第１（左端）パネルは、ヒトＩｇＧに対するｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出を示し、ＦＣ．ヒトＩｇ（ｈＩｇ）の結合パートナーを標準物質として使用した。左から２番目のパネルは、ＣＤ１７２ａの結合パートナーであるＣＤ４７に対するｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出を示す。左から３番目のパネルは、ＣＤ４０Ｌの結合パートナーである受容体ＣＤ４０に対するｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出を示す。最後の（右端）パネルは、組換えヒトＣＤ４０を使用してＣＤ４０Ｌドメインを捕捉し組換えヒトＣＤ４７を使用してＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）ドメインを検出した、二重結合機能ＥＬＩＳＡアッセイを実証し、その結合パートナーの両方へのＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの同時結合を実証する。
【図７Ａ−７Ｂ】哺乳動物細胞膜の表面上のそれぞれの結合パートナー（例えば、受容体又はリガンド）に結合するＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの能力を実証するエクソビボ細胞結合アッセイを示す。図７Ａは、ｈＣＤ４７へのヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合を示す（上の曲線はＨｅＬａ／ｈＣＤ４７であり、下はＨｅＬａ親である）。図７Ｂは、ｍＣＤ４０へのマウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合を示す（上の曲線はＣＨＯＫ１／ｍＣＤ４０であり、下の曲線はＣＨＯＫ１親である）。
【図８Ａ−８Ｅ】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性を示す。図８Ａは、ｈＣＤ４７へのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合を示す（上の曲線はＣＤ１７２Ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（２５０ｎＭ）であり、下の曲線はＣＤ１７２Ａ−Ｆｃ−Ｃｎｔｌ（２５０ｎＭ）である）。図８Ｂは、ｈＦｃγＲ１ＡへのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合を示す（下の曲線はＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（２５０ｎＭ）であり、上の曲線はＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−Ｃｎｔｌ（２５０ｎＭ）である）。図８Ｃは、ｈＦｃＲｎへのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合を示す（下の曲線はＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（２５０ｎＭ）であり、上の曲線はＣＤ１７２Ａ−Ｆｃ−Ｃｎｔｌ（２５０ｎＭ）である）。図８Ｄに、図８Ａ〜図８Ｃの親和性の結果をまとめる。図８Ｅは、ｍＣＤ４０へのマウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性を示す。
【図９Ａ−９Ｃ】ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のエクソビボ機能アッセイを示す。図９Ａは、ｈＣＤ４７を過剰発現する細胞へのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの結合を実証するＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイを示す。図９Ｂは、マクロファージ貪食アッセイの作用様式の模式図を示す。図９Ｃは、濃度依存的にＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質に応答する二重陽性細胞（食作用）のレベルの増加を示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】ウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡアッセイによるマウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。図１０Ａは、抗ＣＤ１７２ａ、抗Ｆｃ、又は抗ＣＤ４０Ｌ抗体を用いたｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ融合構築物の各個々のドメインの検出を示す。ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン２にロードした（β−メルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼなし）。レーン３の試料を還元剤β−メルカプトエタノールで処理し、レーン４の試料をＰＮＧアーゼで処理した。図１０Ｂは、それぞれの結合パートナーに対するｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＣＤ４７（図１０Ｂ、左側）への結合において、ＣＤ１７２ａの結合パートナーであるＣＤ４７へのｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出（四角の記号）が実証された。組換えｍＣＤ１７２ａ−ｍＦｃを使用して、標準曲線を作成した（円の記号）。ＣＤ４０（図１０Ｂ、右側）への結合において、ＣＤ４０Ｌの結合パートナーである受容体ＣＤ４０へのｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出（四角の記号）が実証された。組換えｍＣＤ４０Ｌを使用して、標準曲線を作成した（円の記号）。
【図１１Ａ−１１Ｃ】ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の抗腫瘍有効性を実証するインビボ腫瘍研究の結果を示す。ＣＴ２６腫瘍を、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４０、２つの抗体の組み合わせでの、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌでの、又は対照抗体での治療の前にＢａｌｂ／ｃマウスに移植した。図１１Ａは、各グループの腫瘍接種後４５日にわたる腫瘍サイズの発達を示す。図１１Ｂは、腫瘍接種後５０日までのマウスの全生存率を示す（５０日目で、上から下へと曲線は、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（１５０μｇ×２）、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（３００μｇ×２）、αＣＤ４７／ＣＤ４０、αＣＤ４０、αＣＤ４７（３０〜３５日目まで０％生存）及び未処置（２０〜２５日目まで０％生存）である。図１１Ｃに、グループサイズ及び各グループの治療結果をまとめる。
【図１２Ａ−１２Ｆ】ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ機能アッセイを示す。免疫プロファイリングを、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置した腫瘍担持マウスにて行った。図１２Ａは、キメラタンパク質で処置したマウスの脾臓におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団における変化を示す。図１２Ｂは、キメラタンパク質で処置したマウスの脾臓におけるＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞集団における変化を示す。図１２Ｃ及び図１２Ｄは、キメラタンパク質で処置したマウスのそれぞれ抹消リンパ節及び腫瘍におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団における変化を示す。図１２Ｅは、ＣＴ２６腫瘍により天然に発現されるＡＨ１腫瘍抗原を認識した脾臓又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）内のＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を決定するための四量体染色を示す。図１２Ｆは、ＣＤ４０活性化の指標であるＩＬ−１５受容体α（ＩＬ１５Ｒα）を上方制御する細胞の割合の変化を示す。図１２Ａ〜図１２Ｆの各々において、左から右へと条件は、未処理、αＣＤ４０／ＣＤ４７、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（１５０μｇ×２）、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ（３００μｇ×２）である。
【図１３】ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌで処置したカニクイザルのデータを示す。１匹のオス及び１匹のメスのカニクイザルを、１ｍｇ／ｋｇのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの単回投与で処置した。血清を、薬物動態及び安全性を評価するために、事前処置から治療後１４日目まで複数の時点で収集した。ＣＢＣ／ＣＭＰを、安全性並びに溶血及び血小板減少症の特定の評価のために５つの時点で行った。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌでの治療後、赤血球溶解又は血小板枯渇の証拠は観察されなかった。総安全評価を、毎日複数回行い、さらなる安全シグナルは観測されなかった。
【図１４】チェックポイントタンパク質に対する抗体での処置（単剤療法として又は組み合わせで）又はキメラタンパク質での処置による腫瘍体積の低下におけるインビボ相乗効果を示す。条件は、左から右に、ビヒクル、抗ＯＸ４０（ＯＸ８６）、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）、抗ＰＤ−１（２９Ｆ．１Ａ１２）、抗ＴＩＭ３（ＲＭＴ３−２３）、抗ＴＩＭ３＋ＯＸ４０、抗ＴＩＭ３＋ＯＸ４０＋ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）、抗ＴＩＭ３＋ＯＸ４０＋ＰＤ−１（２９Ｆ．１Ａ１２）、ＡＲＣ  ３００μｇ×２（「ＡＲＣ」はＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質である）。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａは同じキメラタンパク質での２つの逐次処置又は２つの異なるキメラタンパク質での処置のいずれかの、キメラタンパク質の逐次処置による腫瘍体積のインビボ低下を示す。図１５Ｂは図１５Ａに示すマウスの経時的な生存率を示す。分かりやすくするために、図１５Ａでは、ｘ軸上の２０日の時点の条件は、（上から下に）、ビヒクル、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ−  −ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１５０μｇ×２）、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ−  −ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ−  −ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、及びＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ−  −ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌである。分かりやすくするために、図１５Ｂでは、条件は、ビヒクル：「１」；ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１５０μｇ×２）：「２」；ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ−  −ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ：「３」；ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ−  −ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ：「４」；ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ−  −ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ：「５」；及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ−  −ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ：「６」として識別される。
【図１６】理論に縛られることなく、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の４つの可能性のある構成を示す。
【図１７】非還元条件下、還元条件下、並びに還元条件かつその後のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）による処理下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１８】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のクロマトグラフを示す。
【図１９】非還元条件下（「−」）又は還元条件下（「＋」）で泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２０】ＦＣドメインを欠くＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】理論に縛られることなく、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成する方法についてのモデルを示す。
【図２２Ａ−２２Ｑ】ウェスタンブロット分析による、異なる結合リンカー配列を有するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。異なる結合リンカーの配列を、以下の「実施例」の節に提供する。具体的には、融合構築物の各個々のドメインを、α−ＰＤ−１、α−ＦＣ、又はα−ＯＸ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。各図において、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン１にロードした（β−メルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼなし）。レーン２の試料を還元剤β−メルカプトエタノールで処理し、レーン３の試料をＰＮＧアーゼで処理した。
【図２３】タンパク質の中央Ｆｃ領域に対するＥＬＩＳＡベースの捕捉及び検出アッセイによる、異なる結合リンカー配列を有するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。異なる結合リンカー配列を有する各ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（＃１〜＃１７）のタンパク質濃度を決定した。
【図２４Ａ−２４Ｐ】ＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０に対するＦＡＣＳ分析による、異なる結合リンカー配列を有するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のフローサイトメトリープロファイルを示す。ＥＣ５０値を、異なる結合リンカー配列を有する各ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（＃２〜＃１７）について計算した。
【図２５Ａ】図２５Ａは非限定的な例としてＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を用いて、腫瘍細胞が細胞表面上でＰＤ−Ｌ１を発現し、ＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞により発現されるＰＤ−１に結合できることを示す（図２５Ｂ）。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化を抑制する。ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインに結合したＰＤ−１の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、腫瘍細胞の表面上でＰＤ−Ｌ１に結合し、Ｔ細胞の表面上でＰＤ−１への結合を防止し得る（図２５Ｃ）。キメラタンパク質は次いで、腫瘍細胞の表面から「ぶら下がる」ことができ、キメラタンパク質のＯＸ４０Ｌ部分は、Ｔ細胞の表面上で発現されるＯＸ４０に結合し得る。これは、共刺激ＯＸ４０Ｌシグナルとの阻害性ＰＤ−Ｌ１シグナルの置換をもたらしてＴ細胞の抗腫瘍活性を増強する。
【図２６Ａ】マウスＰＤ−Ｌ１（ＣＨＯＫ１／ｍＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−Ｌ２（ＣＨＯＫ１／ｍＰＤ−Ｌ２）、又はＯＸ４０（ＣＨＯＫ１／ｍＯＸ４０）を過剰発現するように作製した細胞株を示す。
【図２６Ｂ】マウスＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が工学処理した細胞株に結合する能力を実証するためのインビトロ細胞結合を示す。
【図２６Ｃ−２６Ｄ】黄色ブドウ球菌、エンテロトキシンＢ型（ＳＥＢ）スーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示し、ＩＬ−２（図２６Ｃ）及びＴＮＦα（図２６Ｄ）分泌に対するｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の効果を実証する。図２６Ｃ及び図２６Ｄにおいて、ｘ軸の２．５の点における曲線は、上から下に、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、ＰＤ１−Ｆｃ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、ＰＤ１−Ｆｃ、及びＩｇＧ対照である。
【図２７Ａ】図に記載のマウスの各グループについての、ＣＴ２６腫瘍接種後のインビボ腫瘍サイズの発達を示す。
【図２７Ｂ−２７Ｃ】腫瘍接種後４０日までの、マウスの全体的な生存率及び統計並びに腫瘍拒絶反応を示す。図２７Ｂにおいて、異なる処置条件は、未処置：「ａ」、「ｅ」、及び「ｈ」；αＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）：「ｂ」；αＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）：「ｃ」；αＯＸ４０（ＯＸ８６）：「ｄ」；ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０：「ｆ」；αＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）／ＯＸ４０：「ｇ」；ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１００μｇ×２）：「ｉ」；ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１５０μｇ×２）：「ｊ」；及びＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（３００μｇ×２）：「ｋ」として特定される。
【図２７Ｄ−２７Ｅ】マウスＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質又は抗体で（αＰＤ−１、αＰＤ−Ｌ１、又はαＯＸ４０の単剤療法として、又はαＰＤ−Ｌ１とαＯＸ４０又はαＰＤ−１とαＯＸ４０の併用療法として）処置したＣＴ２６腫瘍担持マウスにて行った免疫プロファイリングを示す。図２７Ｄ及び図２７Ｅの両方において、左から右へと試験品の順序は、未処置、αＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）、αＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）、αＯＸ４０（ＯＸ８６）、αＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）／ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１５０μｇ×２）、及びＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（３００μｇ×２）である。
【図２７Ｆ】各実験グループの処置の結果をまとめる。
【図２７Ｇ−２７Ｈ】ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を示す。図２７Ｇにおいて、左の２つのパネル：未処置は上の曲線である。図２７Ｇにおいて、左から３番目のパネル：曲線の上から下に、未処置、αＰＤ１（２×１００μｇ）、αＰＤ−Ｌ１（１×１００μｇ）、及びαＰＤ−Ｌ１（２×１００μｇ）である。図２７Ｇにおいて、右端のパネル：曲線の上から下に、未処置、αＯＸ４０／αＰＤ−Ｌ１（１×１００μｇ）、αＯＸ４０／αＰＤ−Ｌ１（２×１００μｇ）、αＯＸ４０／αＰＤ−１（２×１００μｇ）である。図２７Ｈにおいて、「ＡＲＣ融合タンパク質」とラベル付けされたパネルの曲線は、上から下に：未処置、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（３００μｇ×２）、及びＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１５０μｇ×２）である。図２７Ｈにおいて、「ＯＸ４０アゴニスト」とラベル付けされたパネルの曲線は、上から下に：未処置及びａＯＸ８６である。図２７Ｈにおいて、「ＰＤ−１／Ｌ１遮断」とラベル付けされたパネルの曲線は、上から下に：未処置、ａＰＤ−１、ａＰＤ−Ｌ１である。図２７Ｈにおいて、「抗体組み合わせ」とラベル付けパネルの曲線は、上から下に：未処置、ａＰＤ１／ａＯＸ８６、ａＰＤ−Ｌ１／ａＯＸ８６である。
【図２８Ａ−２８Ｃ】それぞれの結合ヒストグラムパートナーに対するヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−２７９２５２とも呼ばれる）の異なるドメインの結合親和性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す。図２８Ｃにおいて、各濃度について、左がＯＸ４０−Ｈｉｓであり、右がＨＶＥＭ−Ｈｉｓである。
【図２９Ａ】ヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌへのインビトロ結合に用いられるヒト細胞株の特徴付けを示す。
【図２９Ｂ−２９Ｄ】それぞれ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、又はＯＸ４０を発現する細胞へのｈＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を示す。それぞれにおいて、右側のパネルは、漸増濃度のキメラタンパク質の滴定曲線を示す。
【図３０】ウェスタンブロット分析によるヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＳＬ−２７９２５２）の特徴付けを示す。キメラタンパク質の３つのドメインの各々を、それぞれ、抗ＰＤ−１、抗ＦＣ、又は抗ＯＸ４０Ｌ抗体でプローブした。ｈＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン１にロードした（β−メルカプトエタノール又はペプチドなし：Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ））。
【図３１Ａ−３１Ｂ】ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＳＬ−２７９２５２）のグリコシル化がその機能に影響を与えるかどうかを決定する機能性ＥＬＩＳＡ（図３１Ａ）及び細胞結合アッセイ（図３１Ｂ）を示す。
【図３２Ａ−３２Ｇ】ヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質のインビトロ機能アッセイを示す。図３２ＣはｈＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＨＣＣ８２７細胞（図３２Ｃ、右の一団）よりもＰＣ３細胞においてより高いレベルの分泌ＩＬ２を誘導した（図３２Ｃ、右の一団）。図３２Ｄは図３２Ｃで概説したＴ細胞／腫瘍細胞共培養アッセイから採取した細胞のフローサイトメトリー分析である。左端のバーは、腫瘍細胞が存在しない場合のＫｉ６７（増殖の指標として）を発現するＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の割合を示す。左のバーから２番目は、ＡＲＣはないが腫瘍細胞の存在下でＫｉ６７を発現するＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の割合を示し、左から３番目と右端のバーは、それぞれ５００ｎｇ又は５ｕｇのＡＲＣの存在下でＫｉ６７を発現するＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の割合を示す。図３２Ｆ及び図３２Ｇは差し込み図のヒストグラムにおける試験品の順序、左から右へ：培地対照、ＩｇＧ対照、ＰＤ１−Ｆｃ、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、ＰＤ−１−Ｆｃ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、及びＰＤ−１−Ｆｃ−Ｏｘ４０Ｌ。
【図３３Ａ−３３Ｃ】カニクイザルのＰＤ−Ｌ１に対する（図３３Ａ）及びＰＤ−Ｌ２（図３３Ａ）又はアカゲザルのＯＸ４０（図３３Ｃ）に対するヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の結合親和性並びに交差反応性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図３４】理論に縛られることなく、単量体ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−３６６２５２）のコンピューターシミュレーション予測構造を示す。
【図３５】ウェスタンブロット分析によるマウスＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−３６６２５２）の特徴付けを示す。具体的には、融合構築物の各個々のドメインを、抗ＴＩＭ３、抗ＦＣ、又は抗ＯＸ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン２にロードした（β−メルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼなし）。レーン３の試料を還元剤β−メルカプトエタノールで処理し、レーン４の試料をＰＮＧアーゼで処理した。
【図３６】ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が哺乳動物細胞膜の表面上でその結合パートナー（例えば、受容体又はリガンド）に結合する能力を実証するエクソビボ細胞結合アッセイを示す。具体的には、このグラフは、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のｍＯＸ４０への結合を示す（ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０は上の曲線であり、ＣＨＯＫ１親は下である）。
【図３７Ａ−３７Ｃ】マウスＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ機能アッセイを示す。免疫プロファイリングを、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置した腫瘍担持マウスにて行った。図３７Ａは、キメラタンパク質で処置したマウスにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の変化を示す。図３７Ｂは、キメラタンパク質で処置したマウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の変化を示す。図３７Ｃは、ＣＴ２６腫瘍により天然で発現されるＡＨ１腫瘍抗原を認識した脾細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）内のＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を分析するための四量体染色を示す。全てのパネルにおいて、左の条件は未処理であり、右の条件はｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（１５０μｇ×２）である。
【図３８Ａ−３８Ｃ】ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がＣＴ２６マウスモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を有することを実証するインビボ腫瘍研究の結果を示す。マウスにＣＴ２６腫瘍を接種した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した時に、マウスを、１５０μｇのｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質又は対照抗体で２回処置した。図３８Ａは、各グループの腫瘍接種後４５日にわたる腫瘍サイズの発達を示す。図３８Ｂは、腫瘍接種後５０日までのマウスの全体的な生存率を示す（ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは上の曲線である）。図３８Ｃに、各グループのグループサイズ及び処置の結果をまとめる。
【図３９】例示的なモジュラーリンカーに組み合わせることができる結合リンカー及びＦｃリンカーを示す表である。示される例示的なモジュラーリンカーは、本明細書に記載の任意のＩ型及びＩＩ型タンパク質並びに／又は本明細書に記載のＩ型及びＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインと組み合わされて、本発明のキメラタンパク質を形成できる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、部分的には、これらのタンパク質の配向（例えば、Ｉ型対ＩＩ型）を利用し、したがって、例えば、癌の治療において免疫阻害シグナルをマスキングし免疫刺激シグナルに置き換えることを含む、免疫刺激及び／又は免疫阻害シグナルの送達を可能にする様式で、キメラタンパク質が、免疫調節膜貫通タンパク質の細胞外領域又はエフェクター領域から工学処理され得るという発見に基づいている。
【００１９】
キメラタンパク質
いくつかの態様において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造のものであり、式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を有するリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含み、第１及び第２の細胞外ドメインの１つが免疫阻害シグナルであり、第１及び第２の細胞外ドメインの１つが免疫刺激シグナルである。
【００２０】
実施形態において、キメラタンパク質は、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に記載の細胞外ドメインを有する単一のポリペプチドを指す。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、細胞中で単一単位として翻訳される。実施形態において、キメラタンパク質は、複数のポリペプチド、例えばインビトロで（例えば、本明細書に記載の１以上の合成リンカーを用いて）、連結されて単一単位をもたらす、例えば、本明細書に記載の複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質、を指す。実施形態において、キメラタンパク質は１つのポリペプチドとして化学合成されるか、又は各ドメインが別々に化学合成され、次いで組み合わされ得る。実施形態において、キメラタンパク質の一部は翻訳され、一部は化学合成される。
【００２１】
実施形態において、細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用できる膜貫通タンパク質の一部を指す。実施形態において、細胞外ドメインは、リガンド又は受容体に結合し細胞にシグナルを効果的に伝達するのに十分な膜貫通タンパク質の一部を指す。実施形態において、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にある膜貫通タンパク質の全アミノ酸配列である。実施形態において、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にある膜貫通タンパク質のアミノ酸配列のその一部であり、当技術分野で知られる方法（例えば、インビトロリガンド結合及び／又は細胞活性化アッセイ）を用いてアッセイされ得るように、シグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要とされる。
【００２２】
実施形態において、免疫阻害シグナルは、免疫応答を減少又は排除するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減少又は排除し得る。通常の生理的条件下で、阻害シグナルは、自己耐性の維持（例えば、自己免疫の予防）において、及び免疫系が病原性感染に反応しているときに組織を損傷から保護するために有用である。例えば、限定されないが、免疫阻害シグナルは、そのような阻害シグナルが遮断される場合に、細胞増殖、サイトカイン産生、細胞死滅活性又は食作用活性の増加を検出することによって特定され得る。
【００２３】
実施形態において、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは抗腫瘍免疫を増強し得る。例えば、限定されないが、免疫刺激シグナルは、増殖、サイトカイン産生、白血球の死滅活性又は食作用活性を直接刺激することによって特定され得る。具体的な例は、受容体アゴニスト抗体を用いるか、又はそのような受容体のリガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＴＬ１Ａ、それぞれ）をコードするキメラタンパク質を用いる、ＯＸ４０、ＬＴｂＲ、４−１ＢＢ又はＴＮＦＲＳＦ２５などのＴＮＦスーパーファミリー受容体の直接刺激を含む。これらの受容体のいずれか１つからの刺激は、個々のＴ細胞サブセットの増殖及びサイトカイン産生を直接刺激し得る。別の例は、そのような免疫抑制細胞の活性を阻害する受容体を介する免疫抑制細胞の直接刺激を含む。これは、例えば、従来のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制する制御性Ｔ細胞の能力を低下させるＧＩＴＲアゴニスト抗体又はＧＩＴＲＬ含有キメラタンパク質でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の刺激を含む。別の例において、これは、ＣＤ４０アゴニスト抗体又はＣＤ４０Ｌ含有キメラタンパク質を用いる抗原提示細胞の表面上のＣＤ４０の刺激を含み、Ｂ７又はＴＮＦスーパーファミリー中のものを含む、適切な天然の共刺激分子の状況で抗原を提示するそれらの細胞の増強した能力を含む抗原提示細胞の活性化をもたらす。別の例では、これは、ＬＩＧＨＴ含有キメラタンパク質を用いるリンパ球又は間質細胞の表面上でのＬＴＢＲの刺激を含み、必要に応じて腫瘍内で、免疫応答をさらに刺激するリンパ球細胞の活性化及び／又は炎症促進性サイトカイン若しくはケモカインの産生をもたらす。
【００２４】
膜タンパク質は典型的には、細胞外ドメイン、１つ又は一連の膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなる。理論に縛られることなく、膜タンパク質の細胞外ドメインは、可溶性若しくは膜結合の受容体又はリガンドと相互作用するのに関与する。理論に縛られることなく、膜貫通ドメイン（複数可）は、タンパク質を原形質膜に局在化するのに関与する。理論に縛られることなく、膜タンパク質の細胞内ドメインは、細胞外の環境と細胞内応答を調整するために細胞シグナル伝達分子との相互作用を調整するのに関与する（逆もまた然り）。２種類の１回膜貫通タンパク質、細胞外アミノ末端と細胞内カルボキシ末端（Ｉ型）を有するもの並びに細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端（ＩＩ型）を有するもの、が存在する。Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の両方は、受容体又はリガンドのいずれかであり得る。Ｉ型膜タンパク質については、タンパク質のアミノ末端は細胞外に面し、したがって、細胞外環境で他の結合パートナー（リガンド又は受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含有する。ＩＩ型膜タンパク質については、タンパク質のカルボキシ末端は細胞外に面し、したがって、細胞外環境で他の結合パートナー（リガンド又は受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含有する。そのため、これら２種類のタンパク質は、互いに反対の向きを有する。
【００２５】
Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の外向きのドメインは反対であるため、分子の「外側向き」ドメインも互いに反対方向にあるように、Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを連結することが可能である（図１Ｄ）。生じる構築物はしたがって、リンカー配列を用いて分子の「右」側のＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインに連結される、分子の「左」側にあるＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインからなる。この構築物は、これらの３つの断片（Ｉ型タンパク質の細胞外ドメイン、続いてリンカー配列、続いてＩＩ型タンパク質の細胞外ドメイン）をベクター（プラスミド、ウイルス又はその他）にクローニングすることによって生成でき、完全配列のアミノ末端は、Ｉ型タンパク質を含有する分子の「左」側に相当し、完全配列のカルボキシ末端は、ＩＩ型タンパク質を含有する分子の「右」側に相当した。したがって、実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、そのように工学処理される。
【００２６】
実施形態において、細胞外ドメインは、その受容体のリガンドによるシグナル伝達を競合的に阻害する可溶性タンパク質を生成するために使用され得る。実施形態において、細胞外ドメインは、人工シグナル伝達を提供するために使用され得る。
【００２７】
実施形態において、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、免疫阻害シグナルである。実施形態において、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、免疫刺激シグナルである。
【００２８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。
【００２９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、ＳＬＡＭＦ４、ＩＬ−２  Ｒ  α、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＬ−２  Ｒ  β、ＡＬＣＡＭ、ＢＴＬＡ、Ｂ７−１、ＩＬ−４  Ｒ、Ｂ７−Ｈ３、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＬ−６  Ｒ、ＩＬ−７  Ｒα、ＩＬ−１０Ｒ  α、ＩＬ−ｌ０  Ｒ  β、ＩＬ−１２  Ｒ  β  １、ＩＬ−１２  Ｒ  β  ２、ＣＤ２、ＩＬ−１３  Ｒ  α  １、ＩＬ−１３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＩＬＴ２／ＣＤＳ５ｊ、ＩＬＴ３／ＣＤＳ５Ｋ、ＩＬＴ４／ＣＤＳ５ｄ、ＩＬＴ５／ＣＤＳ５ａ、ルテグリン（ｌｕｔｅｇｒｉｎ）  α  ４／ＣＤ４９ｄ、ＣＤＳ、インテグリン  α  Ｅ／ＣＤ１０３、ＣＤ６、インテグリン  α  Ｍ／ＣＤ  １１  ｂ、ＣＤＳ、インテグリン  α  Ｘ／ＣＤ１１ｃ、インテグリン  β  ２／ＣＤＩＳ、ＫＩＲ／ＣＤ１５Ｓ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＣＤ２Ｓ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦＳ、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５Ｓｄ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＬＡＧ−３、ＣＤ４３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ４５、ＬＡＩＲ２、ＣＤＳ３、ロイコトリエン  Ｂ４−Ｒ１、ＣＤＳ４／ＳＬＡＭＦ５、ＮＣＡＭ−Ｌ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＮＴ−４、ＣＤ６９、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、共通（Ｃｏｍｍｏｎ）γ鎖／ＩＬ−２Ｒ  γ、オステオポンチン、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ−１、ＣＲＴＡＭ、ＰＳＧＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、Ｌ−セレクチン、ＳＩＲＰ  β  １、ＳＬＡＭ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＤＮＡＭ−１、チモポエチン、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＴＩＭ−１、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−２、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＩＭ−３、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＩＭ−４、Ｆｃγ  ＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＴＩＭ−６、ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、グラニュリシン、ＴＮＦ  ＲＩＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＩＬ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＯＡ、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＴＲＡＩＬＲ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＩＦＮ−γＲ１、ＴＲＡＩＬＲ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＩＦＮ−γ  Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＩＬ−１  Ｒ１、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）及びＴＳＬＰ  Ｒの細胞外ドメイン（該当する場合）を含むヒト白血球に存在する１以上の分子を標的にするように工学処理され得る。
【００３０】
制御性Ｔ細胞の活性化は、共刺激シグナル及び共阻害シグナルによって決定的に影響される。共刺激分子の２つの主要なファミリーは、Ｂ７及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーを含む。これらの分子は、それぞれＣＤ２８又はＴＮＦ受容体ファミリーに属するＴ細胞上の受容体に結合する。多くの明確に定義された共阻害剤及びその受容体は、Ｂ７及びＣＤ２８ファミリーに属する。
【００３１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えば、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＨＫ１及びＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、並びに様々なＢ−７ファミリーリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６及びＢ７−Ｈ７を含むが、これらに限定されない）を含む、免疫阻害に関与する１以上の分子を標的とするように工学処理され得る。
【００３２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、２Ｂ４、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ８、ＣＤ２００及びＴＭＩＧＤ２を含む、免疫阻害剤の細胞外ドメインを含む。
【００３３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害特性を有するＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害シグナルの伝達を妨害、阻止、低減、及び／又は阻害するように工学処理される。
【００３４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＯＸ−４０リガンド（ＯＸ−４０Ｌ）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１３７リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＬ１Ａの１以上である免疫刺激シグナルの細胞外ドメインを含む。
【００３５】
実施形態において、キメラタンパク質は、その同族受容体への阻害シグナルリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１；例えば、ＣＤ４７へのＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）；例えば、ＣＳＦ１へのＣＤ１１５；例えば、ガレクチン−９又はホスファチジルセリンへのＴＩＭ−３）の結合をシミュレート（ｓｉｍｕｌａｔｅ）するが、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ又は他の白血球）への阻害シグナル伝達を阻害する。
【００３６】
実施形態において、キメラタンパク質は、限定されないが、腫瘍細胞の免疫阻害シグナルをマスキングしながらＴ細胞に免疫刺激を送達できる、免疫阻害受容体細胞外ドメイン及び免疫刺激リガンド細胞外ドメインを含む。実施形態において、キメラタンパク質は、Ｔ細胞活性化の最終結果を有するシグナルを送達する。
【００３７】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害シグナルの受容体のＥＣＤである免疫阻害シグナルを含み、これは免疫阻害シグナルの同族リガンドを保有する腫瘍細胞に作用する。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫刺激シグナルのリガンドのＥＣＤである免疫刺激シグナルを含み、これは免疫刺激シグナルの同族受容体を保有するＴ細胞に作用する。実施形態において、キメラタンパク質は、（Ｉ）免疫阻害シグナルの受容体であり、免疫阻害シグナルの同族リガンドを保有する腫瘍細胞に作用する免疫阻害シグナル、並びに（ＩＩ）免疫刺激シグナルのリガンドであり、免疫刺激シグナルの同族受容体を保有するＴ細胞に作用する免疫刺激シグナルの両方を含む。
【００３８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｈｏｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１５：１４；５６１−５８５に記載の免疫調節剤の１以上の細胞外ドメインを含む。
【００３９】
実施形態において、キメラタンパク質は、マウスリガンド（複数可）／受容体（複数可）に結合できる。
【００４０】
実施形態において、キメラタンパク質は、ヒトリガンド（複数可）／受容体（複数可）に結合できる。
【００４１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激特性を有するＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激するように工学処理される。
【００４２】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＰＤ−１の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＰＤ−１／４−１ＢＢＬ；ＰＤ−１／ＯＸ−４０Ｌ；ＰＤ−１／ＬＩＧＨＴ；ＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ；ＰＤ−１／ＣＤ７０；ＰＤ−１／ＣＤ３０Ｌ；ＰＤ−１／ＣＤ４０Ｌ；及びＰＤ−１／ＴＬ１Ａとペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、ＰＤ１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ又はＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌであり、その中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す。
【００４３】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＰＤ−１の細胞外ドメインを含み、免疫刺激剤ＯＸ４０Ｌとペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約５ｎＭ、例えば、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、又は約５ｎＭのＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約５ｎＭ〜約１５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１０．５ｎＭ、約１１ｎＭ、約１１．５ｎＭ、約１２ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１３．５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１４．５ｎＭ、又は約１５ｎＭのＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００４４】
実施形態において、キメラタンパク質は、増強した安定性及びタンパク質半減期を示す。実施形態において、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎに結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、又は約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）に実質的に結合しない。
【００４５】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激受容体：ＰＤ−Ｌ１／４−１ＢＢ；ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０；ＰＤ−Ｌ１／ＨＶＥＭ；ＰＤ−Ｌ１／ＧＩＴＲ；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２７；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２８；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ３０；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１３７とペアになる。
【００４６】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激受容体：ＰＤ−Ｌ２／４−１ＢＢ；ＰＤ−Ｌ２／ＯＸ４０；ＰＤ−Ｌ２／ＨＶＥＭ；ＰＤ−Ｌ２／ＧＩＴＲ；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ２７；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ２８；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ３０；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ２／ＣＤ１３７とペアになる。
【００４７】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＴＩＭ３の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＴＩＭ３／ＯＸ４０Ｌ；ＴＩＭ３／ＬＩＧＨＴ；ＴＩＭ３／ＧＩＴＲＬ；ＴＩＭ３／ＣＤ７０；ＴＩＭ３／ＣＤ３０Ｌ；ＴＩＭ３／ＣＤ４０Ｌ；ＴＩＭ３／ＣＤ１３７Ｌ；ＴＩＭ３／ＴＬ１Ａ；及びＴＩＭ３／ＯＸ４０Ｌとペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌであり、その中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す。
【００４８】
実施形態において、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を対象に投与することにより癌又は炎症性疾患（例えば、本明細書の別の場所に記載のものの任意の１つ）を治療する方法であって、キメラタンパク質中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す、方法が提供される。実施形態において、本方法は、例えば、再発を防止し得る記憶応答を生じさせる。
【００４９】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＢＴＬＡの細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＢＴＬＡ／ＯＸ４０Ｌ；ＢＴＬＡ／ＬＩＧＨＴ；ＢＴＬＡ／ＧＩＴＲＬ；ＢＴＬＡ／ＣＤ７０；ＢＴＬＡ／ＣＤ３０Ｌ；ＢＴＬＡ／ＣＤ４０Ｌ；ＢＴＬＡ／ＣＤ１３７Ｌ；ＢＴＬＡ／ＴＬ１Ａ；及びＢＴＬＡ／ＯＸ４０Ｌとペアになる。
【００５０】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＬＩＧＨＴ；ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＣＤ７０；ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＣＤ１３７Ｌ；ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＴＬ１Ａ；及びＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）／ＯＸ４０Ｌとペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴであり、その中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す。
【００５１】
実施形態において、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を対象に投与することにより癌又は炎症性疾患（例えば、本明細書の別の場所に記載のものの任意の１つ）を治療する方法であって、キメラタンパク質中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す、方法が提供される。実施形態において、本方法は、例えば、再発を防止できる記憶応答を生じさせる。実施形態において、本方法は、必要に応じて持続的な負のシグナルマスキング効果及び／又はより長い正のシグナル効果を提供するために、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にするために、例えば、遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）での細胞外ドメイン成分のそれらのそれぞれの結合パートナーへの結合による、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの持続的な治療効果を含む。
【００５２】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＣＤ１１５の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＣＤ１１５／ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１１５／ＬＩＧＨＴ；ＣＤ１１５／ＣＤ７０；ＣＤ１１５／ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ１１５／ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１１５／ＣＤ１３７Ｌ；ＣＤ１１５／ＴＬ１Ａ；及びＣＤ１１５／ＯＸ４０Ｌとペアになる。
【００５３】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＴＭＩＧＤ２の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＴＭＩＧＤ２／ＯＸ４０Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＬＩＧＨＴ；ＴＭＩＧＤ２／ＧＩＴＲＬ；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ７０；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ３０Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ４０Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ１３７Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＴＬ１Ａ；及びＴＭＩＧＤ２／ＯＸ４０Ｌとペアになる。
【００５４】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＣＤ２００の細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＣＤ２００／ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ２００／ＬＩＧＨＴ；ＣＤ２００／ＧＩＴＲＬ；ＣＤ２００／ＣＤ７０；ＣＤ２００／ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ２００／ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ２００／ＣＤ１３７Ｌ；ＣＤ２００／ＴＬ１Ａ；及びＣＤ２００／ＯＸ４０Ｌとペアになる。
【００５５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の細胞外ドメインの変異体を含み、例えば、細胞外ドメイン、例えば、ヒト細胞外ドメイン、例えば、配列番号２、４、７、１０、１２、１５、１８、２１、２４、２９、３２、３４、３６、４２、及び４４の１以上の既知のアミノ酸又は核酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００５６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００５７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。
【００５８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）の細胞外ドメイン（配列番号１０）を含む。
【００５９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００６０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号１２）を含む。
【００６１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン（配列番号２）及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００６２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン（配列番号７）及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００６３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）の細胞外ドメイン（配列番号１０）及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号１２）を含む。
【００６４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号４５、４６、又は４７）を含む。
【００６５】
実施形態において、キメラタンパク質は、図３９に示すモジュラーリンカーを含む。
【００６６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラは配列番号５である）。
【００６７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＰＤ−１の細胞外ドメイン（配列番号７）及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラは配列番号８である）。
【００６８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）の細胞外ドメイン（配列番号１０）及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラは配列番号１３である）。
【００６９】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン及びＴＬ１Ａの細胞外ドメイン（配列番号１５）を含む。
【００７０】
さらなる例は、Ｆｃを介してＯＸ４０Ｌに連結されるＢＴＬＡの細胞外ドメイン（配列番号１９）をコードするキメラタンパク質を含む。
【００７１】
別の例は、Ｆｃリンカー配列を用いてヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインに結合されるＴＭＩＧＤ２の細胞外ドメイン（配列番号２２）を組み込むキメラタンパク質である。
【００７２】
別の例は、Ｆｃリンカー配列を用いてヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインに結合されるＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメイン（配列番号２６）を組み込むキメラタンパク質である。
【００７３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号２９）を含む。
【００７４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号２９）及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号１２）を含む。
【００７５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号２９）及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号１２）を含む（このＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラは配列番号３０である）。
【００７６】
実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書で特定される別の配列からの細胞外ドメインと組み合わせた、本明細書で特定される配列からの細胞外ドメインを含んでよい。
【００７７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の変異体であり得、例えば、本発明のキメラタンパク質は、本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号５、５、８、１３、１６、１９、２２、２５、２６、２７、又は３０の１以上と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有し得る。
【００７８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表１に列挙したヒトＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表２に列挙したヒトＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表１に列挙したＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表２に列挙したＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に記載のタンパク質配列のいずれかと比較して１以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み得る。実施形態において、１以上のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠損、及び切り詰めから独立して選択され得る。
【００８０】
実施形態において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、かつ保存的及び／又は非保存的置換を含み得る。
【００８１】
「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、大きさ、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関与するアミノ酸残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。２０個の天然アミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸のグループ：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶＡＬ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅにグループ化できる。
【００８２】
本明細書で使用する「保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループの同じグループ内にリストされた別のアミノ酸とのアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド中に１つの負電荷を保持する。加えて、グリシン及びプロリンは、α−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。
【００８３】
本明細書で使用する「非保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループ（１）〜（６）の異なるグループにリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【００８４】
実施形態において、置換はまた、非古典的アミノ酸（例えば、一般的に、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノベンゾイン酸（ＰＡＢＡ））、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、及びアミノ酸類似体）を含み得る。
【００８５】
変異はまた、コドン縮重を考慮することを含む、遺伝コードを参照することによってキメラタンパク質のヌクレオチド配列に行われ得る。
【００８６】
実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含む。本明細書の他の場所で説明するように、ジスルフィド結合を形成できるそのような少なくとも１つのシステイン残基は、理論に縛られることなく、キメラタンパク質の適切な多量体状態を維持し効率的な生成を可能にすることに関与する。
【００８７】
実施形態において、得られるキメラタンパク質が適切に折り畳まれかつ／又は安定な多量体状態に形成されるように、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーでＩ型及びＩＩ型膜貫通タンパク質細胞外ドメインを結合することを含む、安定なキメラタンパク質を作製する方法が提供される。
【００８８】
実施形態において、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来し得るか、又は例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｃｈｉｌｉら、（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２）：１５３−１６７，Ｃｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載の実験的リンカーである。実施形態において、リンカーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９及びＣｒａｓｔｏら，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３０９−３１２に記載のものなどのデータベース及びコンピュータプログラムを設計するリンカーを用いて設計され得る。
【００８９】
実施形態において、リンカーはＰＥＧなどの合成リンカーである。
【００９０】
実施形態において、リンカーはポリペプチドである。実施形態において、リンカーは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、又は約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、又は約２アミノ酸長未満であり得る。実施形態において、リンカーは柔軟である。別の実施形態において、リンカーは硬い。
【００９１】
実施形態において、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）を含む。
【００９２】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内で自由に移動することを可能にする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列と長さの両方が変化する。例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で変化する。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６〜２３１を包含し、それが自由に柔軟であるため、Ｆａｂ断片は、それらの対称の軸を中心に回転し２つの重鎖間のジスルフィド架橋の第１を中心とする球内を移動できる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２のアミノ酸残基及び４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠き、比較的短く、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された硬いポリプロリン二重らせんを含有する。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、その特有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスと異なり、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的離れており、分子により高い柔軟性を与える。ＩｇＧ３中の伸長したヒンジはまた、他のサブクラスと比較してより高いその分子量に関与する。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１及びＩｇＧ２の柔軟性の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順序で減少すると報告されている。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体化（Ｓ２２８Ｐを含む）又はＦｃＲｎ結合を増強するための１以上の変異を含有し得る。
【００９３】
結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、さらに３つの領域：上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域に機能的に細分化できる。Ｓｈｉｎら，１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域は、ＣＨ１のカルボキシル末端〜動きを制限するヒンジ中の第１の残基のアミノ酸、一般に２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基、を含む。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド架橋を含有し、下部ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインのアミノ末端に結合し、ＣＨ２中の残基を含む。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、ジスルフィド結合形成によって二量体化すると、ピボットとして作用すると考えられる環状オクタペプチドを生じ、そのため柔軟性を与える、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含有する。実施形態において、本リンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の１つ、又は２つ、又は３つを含む。ヒンジ領域はまた、炭水化物結合のための部位のいくつかの構造的に別個の種類を含む、１以上のグリコシル化部位を含有し得る。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸のセグメント内に５つのグリコシル化部位を含有し、分泌性免疫グロブリンに有利な性質と考えられる、腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの耐性を付与する。実施形態において、本発明のリンカーは、１以上のグリコシル化部位を含む。
【００９４】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増加及び結合の増強を示す。実施形態において、Ｆｃドメインは、親和性を増加させＦｃＲｎへの結合を増強する１以上の変異を含む。理論に縛られることなく、ＦｃＲｎに対する親和性の増加及び結合の増強は、本発明のキメラタンパク質のインビボ半減期を増加させると考えられる。
【００９５】
実施形態において、Ｆｃドメインリンカーは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３又は４３４（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での１以上のアミノ酸置換、又はそれらの等価物を含有する。実施形態において、アミノ酸残基２５０におけるアミノ酸置換はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５４におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５６におけるアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０９におけるアミノ酸置換は、プロリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３１１におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８５におけるアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン又はグリシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８６におけるアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、又はメチオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８７におけるアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、又はアラニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８９におけるアミノ酸置換は、プロリン、セリン又はアスパラギンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４１６におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換は、ロイシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３３におけるアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、又はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、又はチロシンとの置換である。
【００９６】
実施形態において、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、又は４３６（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での置換などの１以上の変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異又はＹＴＥ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異又はＫＦＨ変異を含む。さらなる実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＹＴＥ変異とＫＦＨ変異を含む。
【００９７】
実施形態において、本発明の改変されたヒト化抗体は、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４１６、４２８、４３３、４３４、及び４３５における１以上の変異を含有するＩｇＧ定常領域を含む。例示的変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｒ４１６Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａを含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異又はＬＳ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異又はＱＬ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異又はＡＡＡ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異又はＩＨＨ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異とＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。
【００９８】
ＩｇＧ定常領域における追加の例示的変異は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｂｉｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７−６１５３，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４−２４，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１−８０，Ｋｏら，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）  ５１４：６４２−６４５，Ｇｒｅｖｙｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７−５０８，及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載される。
【００９９】
実施形態において、リンカーは、配列番号４５、又は配列番号４５と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、安定性及び／又は半減期を増加させるために、変異が配列番号４５に行われる。例えば、実施形態において、リンカーは、配列番号４６、又は配列番号４６と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。実施形態において、リンカーは、配列番号４７、又は配列番号４７と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
理論に縛られることなく、キメラタンパク質中のＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーを含めることは、不溶性で及び、おそらく非機能的なタンパク質コンカテマー及び／又は凝集体の形成を回避するのに役立つ。これは、キメラタンパク質間でジスルフィド結合を形成できるＦｃドメイン中のシステインの存在に部分的に起因する。
【０１０１】
例示的なＦｃ安定化変異体はＳ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本リンカーは、これらの変異体の１、又は２、又は３、又は４、又は５個を含み得る。
【０１０２】
さらに、１以上の結合リンカーは、リンカー中のＦｃドメイン（例えば、配列番号４５、配列番号４６、又は配列番号４７、又はそれらと少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するものの１つ）と細胞外ドメインを連結するために使用され得る。例えば、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーを連結し得る。必要に応じて、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーの間に置かれる。必要に応じて、配列番号４５〜９４、又はそれらの変異体の任意の１つは、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のＦｃドメインの間に位置する。実施形態において、キメラタンパク質は、Ｆｃドメインの前に１つの結合リンカー及びＦｃドメインの後ろに第２の結合リンカーを含み、そのため、キメラタンパク質は、以下の構造：ＥＣＤ１−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ２、を含み得る。
【０１０３】
実施形態において、第１及び第２の結合リンカーは異なっていてよく、又はそれらは同じであってよい。
【０１０４】
例示的なリンカーのアミノ酸配列は、以下の表１に提供される。
【０１０５】
【表１】
2020508329.tif 000003
2020508329.tif 000004
【０１０６】
さらなる例示的な結合リンカーは、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号６９）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号６９〜７２）、（Ｇｌｙ）８（配列番号７８）、（Ｇｌｙ）６（配列番号７９）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号８０〜８２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号８３〜配列番号８６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号８７）、ＰＡＰＡＰ（配列番号８８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号８９）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号５６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９０）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕである）を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
実施形態において、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、約９８％、又は約９９％、又は約１００％の）グリシン及びセリン））で構成される。例えば、実施形態において、結合リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎは、約１〜約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８（それぞれ配列番号６９〜配列番号７６）である。実施形態において、結合リンカー配列はＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７７）である。追加の例示的な結合リンカーは、配列ＬＥ、（Ｇｌｙ）８（配列番号７８）、（Ｇｌｙ）６（配列番号７９）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号８０〜８２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号８３〜配列番号８６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号４３）、ＰＡＰＡＰ（配列番号４４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４５）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号８７）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕである）を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。実施形態において、結合リンカーはＧＧＳである。
【０１０８】
実施形態において、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号９１）、ＧＳＥＳＧ（配列番号９２）、ＧＳＥＧＳ（配列番号９３）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号９４）、及び４アミノ酸ごとの間隔でＧ、Ｓ、及びＥがランダムに配置される結合リンカーの１以上である。
【０１０９】
実施形態において、キメラタンパク質は、図３９に示すモジュラーリンカーを含む。
【０１１０】
実施形態において、リンカーは、限定されないが高度に柔軟を含む、柔軟であり得る。実施形態において、リンカーは、硬くてよく、限定されないが硬いアルファらせんを含む。
【０１１１】
実施形態において、リンカーは機能的であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明のキメラタンパク質の折りたたみ及び／又は安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、かつ／又は生理活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、特定の細胞型又は位置にキメラタンパク質を標的化するように機能し得る。
【０１１２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫活性化（例えば、腫瘍に対して）を促進でき、かつ促進することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害を抑制でき（例えば、腫瘍が生き残ることを可能にする）、かつそれを抑制することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、構築物のキメラ性質によって提供されるシグナル伝達の近接性に起因する免疫活性化の改善及び／又は免疫阻害の抑制の改善を提供する。
【０１１３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫応答の増幅を調節すること、例えば、エフェクター出力のレベルを調節できるか、又はそれを調節することを含む方法で使用できる。実施形態において、例えば、癌の治療に使用される場合、本発明のキメラタンパク質は、サイトカインの生成、増殖又は標的殺傷能力のレベルの増加を刺激することを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞応答の増幅を増加させる免疫阻害と比較して、免疫刺激の程度を変える。
【０１１４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、実施形態において、腫瘍細胞の表面上の阻害リガンドをマスクしその免疫阻害リガンドを免疫刺激リガンドに置き換えることができるか、又はそれをマスクし置き換えることを含む方法で使用される。したがって、本発明のキメラタンパク質は、実施形態において、阻害性免疫シグナルを低下させること若しくは除去すること、かつ／又は免疫刺激シグナルを増加すること若しくは活性化することができるか、又は阻害性免疫シグナルを低下させ若しくは除去するかつ／又は免疫刺激シグナルを増加することを含む方法で使用される。例えば、阻害シグナルを保有する（ひいては、免疫応答を回避する）腫瘍細胞は、次いで腫瘍細胞を攻撃できるＴ細胞上で結合する正のシグナルと置換され得る。したがって、実施形態において、阻害性免疫シグナルは、本発明の構築物によってマスクされ、刺激性免疫シグナルが活性化される。そのような有益な特性は、本発明のキメラタンパク質の単一構築アプローチによって増強される。例えば、シグナル置換をほぼ同時に行うことができ、シグナル置換は臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍微小環境）で局所的であるように調整される。さらなる実施形態は、例えば、とりわけ（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン；（ｉ）ＢＴＬＡの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＭ３の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＣＤ１１５の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＴＩＭ３の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインなどの、他のキメラタンパク質構築物に同じ原理を適用する。
【０１１５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激受容体／リガンド対の結合を刺激若しくは増強できるか、又はそれを刺激若しくは増強することを含む方法で使用される。例示的なＴ細胞共刺激受容体及びそのリガンドは、ＯＸ−４０：ＯＸ４０−Ｌ、ＣＤ２７：ＣＤ７０、ＣＤ３０：ＣＤ３０−Ｌ、ＣＤ４０：ＣＤ４０−Ｌ；ＣＤ１３７：ＣＤ１３７−Ｌ、ＨＶＥＭ：ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ：ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２５：ＴＬ１Ａ、ＤＲ５：ＴＲＡＩＬ、及びＢＴＬＡ：ＨＶＥＭを含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害受容体／リガンド対の結合を阻害するか若しくは低下させることができるか、又はそれを阻害するか低下させることを含む方法で使用される。例示的なＴ細胞共阻害受容体及びそれらのリガンドは、例えば、とりわけ、ＣＴＬＡ−４：ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ：ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３：ガレクチン−９／ホスファチジルセリン、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５又はＣＤ１１２、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）／ＣＤ４７、Ｂ７Ｈ３Ｒ／Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４Ｒ／Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２４４／ＣＤ４８、ＴＭＩＧＤ２／ＨＨＬＡ２を含む。
【０１１６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２並びに／又はＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２とのＰＤ−１の結合を阻止し、低下し並びに／又は阻害する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＴＬＡ−４の活性並びに／若しくはＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１以上とのＣＴＬＡ−４の結合を阻止し、低下し並びに／又は阻害する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲリガンドの１以上とのＧＩＴＲの結合を増加させ、かつ／又は刺激する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０及び／又はＯＸ４０リガンドの１以上とのＯＸ４０の結合を増加させ、かつ／又は刺激する。
【０１１７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫調節を増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激できるか、又はそれを増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激することを含む方法で使用される。実施形態において、本明細書に記載の本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含むが、これらに限定されない腫瘍細胞に対する１以上の免疫細胞の活性又は活性化を回復し、促進し及び／又は刺激する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、非限定的な例として、生存促進シグナル；オートクリン又はパラクリン成長シグナル；ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ、ＪＡＫ、ＡＫＴ若しくはＰＩ３Ｋ媒介性シグナル；抗アポトーシスシグナル；並びに／又は炎症性サイトカイン生成若しくはＴ細胞移動若しくはＴ細胞腫瘍浸潤の１以上を促進しかつ／又はそれに必要なシグナルを含む、１以上のＴ細胞固有シグナルを活性化し及び／又は刺激することを含み、Ｔ細胞の活性及び／若しくは活性化を増強し、回復し、促進し並びに／又は刺激する。
【０１１８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍若しくは腫瘍微小環境中へのＴ細胞（限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１以上）の１以上の増加を引き起こすことができるか、又はそれを引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍及び／若しくは腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の動員を阻害でき、かつ／又は動員の減少を引き起こすことができ、又はそれらの動員を阻害するかつ／又は動員の減少を引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、本療法は、Ｍ１マクロファージを優先するように腫瘍部位及び／又はＴＭＥでＭ１対Ｍ２マクロファージの比率を変更し得る。
【０１１９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の有効量のキメラタンパク質を対象に投与することを含む、Ｔ細胞の不活性化及び／若しくは腫瘍に対する免疫耐性を阻害する並びに／又は低下させることができ、かつそれを阻害する並びに／又は低下させることを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２の１以上を含むが、これらに限定されない様々なサイトカインの血清レベルを増加させることができる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、治療対象の血清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦα又はＩＦＮγを増強できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質の投与は、ＴＮＦα分泌を増強できる。特定の実施形態において、本発明のキメラタンパク質の投与は、白血球によるスーパー抗原媒介性ＴＮＦα分泌を増強できる。そのようなサイトカイン応答の検出は、示されたキメラタンパク質について最適な投与レジメンを決定するための方法を提供し得る。
【０１２０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を阻害し、阻止し及び／若しくは低下させるか；又は腫瘍促進性Ｔ細胞の細胞死を刺激し、誘導し、及び／若しくは増加させる。Ｔ細胞枯渇は、増殖機能及びエフェクター機能の進行性喪失を特徴とするＴ細胞機能障害の状態であり、クローン欠失に至る。したがって、腫瘍促進性Ｔ細胞は、多くの慢性感染症及び癌の間に生じるＴ細胞機能障害の状態を指す。この機能不全は、不十分な増殖機能及び／又はエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現及び機能性エフェクター又は記憶Ｔ細胞の転写状態とは異なる転写状態によって定義される。枯渇は、感染症及び腫瘍の最適な制御を妨げる。加えて、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を開始できるＴ細胞を指す。例示的な腫瘍促進性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ、１以上のチェックポイント阻害受容体を発現するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞を含むが、これらに限定されない。チェックポイント阻害受容体は、制御されない免疫応答を防止又は阻害する免疫細胞上で発現する受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３）を指す。
【０１２１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させることができ、それを含む方法で使用できる。例示的なエフェクターＴ細胞は、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）；ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；エフェクター記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋、ＣＣＲ７低）；中央記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋；又はＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋）；ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ６２Ｌ−）及び後期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７−ＣＤ６２Ｌ−）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）を含むＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）；ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（低／−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（−）ＣＤ２５（−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞記憶エフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋及びＣＣＲ５＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−１２Ｒ＋、ＩＦＮγＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋及びＣＣＲ８＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−４Ｒ＋、ＩＬ−３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ−１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）；ＴＨ９  エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ−１Ｒ＋）；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（−）エフェクターＴ細胞；並びにＩＬ−２、ＩＬ−４及び／又はＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞を含む。例示的な制御性Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５高制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ３＋ＰＤ−１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌセレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢ低制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、ＢＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパータイプ３（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型の調節細胞（ＮＫＴｒｅｇ）、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８−制御性Ｔ細胞及び／又はＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ガレクチン−１、ＩＦＮ−γ及び／又はＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞を含む。
【０１２２】
実施形態において、キメラタンパク質は、例えば、再発を防止するか、又は再発から動物を保護し、かつ／又は転移を防止するか、若しくは転移の可能性を低下させることができる可能性がある記憶応答をもたらす。そのため、キメラタンパク質で処置された動物は後に、キメラタンパク質での初期の治療後に関連する抗原にさらされた場合に、腫瘍細胞を攻撃し、かつ／又は腫瘍の発症を防ぐことができる。したがって、本発明のキメラタンパク質は、活性腫瘍破壊と、再発を防止できる記憶応答をプログラミングするのに不可欠である腫瘍抗原の免疫認識の両方を刺激する。
【０１２３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的にエフェクターＴ細胞を刺激でき、かつそれを刺激することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的に制御性Ｔ細胞を枯渇させること又は阻害することができ、かつそれを枯渇させること又は阻害することを含む方法で使用できる。実施形態において、エフェクターＴ細胞の一過性刺激及び／又は制御性Ｔ細胞の一過性枯渇若しくは阻害は実質的に、患者の血流において、又は、例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、非リンパ組織などのリンパ組織を含む特定の組織／位置において、又は腫瘍微小環境において生じる。
【０１２４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、使用の容易さ及び生成の容易さを含む利点を提供する。これは、２つの異なる免疫療法剤が、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスを可能にする１つの生成物に組み合わされるためである。加えて、２つの別々の薬剤の代わりの単一薬剤の投与は、より容易な投与及びより多くの患者のコンプライアンスを可能にする。また、例えば、多数のジスルフィド結合及びグリコシル化などの翻訳後修飾を含有する大きな多量体タンパク質であるモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のキメラタンパク質は、製造するのにより容易であり費用効率がより良い。
【０１２５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、分泌可能で完全に機能する単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞中で生成可能である。
【０１２６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は予期せず、遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）でそれらのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメイン成分の結合を提供する。実施形態において、これは、受容体のリガンドへの予想外に長い相互作用を提供し、その逆も同様である。そのような効果は、持続的な負のシグナルマスキング効果を可能にする。また、実施形態において、これは、より長い正のシグナル効果を提供し、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、Ｔ細胞増殖を提供し、抗腫瘍攻撃を可能にするのに十分なシグナル伝達を可能にする。さらなる例として、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、例えば、サイトカインなどの刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする。
【０１２７】
本発明の薬剤によって促進される細胞（例えば、負のシグナルを有する腫瘍細胞及び腫瘍を攻撃する可能性のあるＴ細胞）の安定なシナプスは、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を位置付けることかつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされたものを超える負のシグナルを含む、腫瘍細胞が負のシグナルを送達するのを立体的に防ぐことなどの、腫瘍の縮小を優先する空間的配向を提供する。
【０１２８】
実施形態において、これは、キメラタンパク質の血清Ｔ１／２と比較して、より長いオンターゲット（例えば、腫瘍内）半減期（ｔ１／２）を提供する。そのような性質は、キメラタンパク質の全身分布に関連し得る、オフターゲット毒性を低下させる利点の組み合わせを有し得る。
【０１２９】
また、実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用の改善を可能にする相乗的な治療効果を提供する。
【０１３０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、オフサイト及び／又は全身の毒性を低下させる可能性を提供する。
【０１３１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、現在の免疫療法、例えば、本明細書に記載のチェックポイント分子に対する抗体に対し、低減された副作用、例えば、ＧＩ合併症を提供する。例示的なＧＩ合併症は、腹痛、食欲不振、自己免疫効果、便秘、けいれん、脱水、下痢、摂食問題、疲労、鼓腸、腹水（ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｄｏｍｅｎ）又は腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、消化管（ＧＩ）腸内毒素症、ＧＩ粘膜炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｄ及びＩＢＳ−Ｃ）、吐き気、痛み、便又は尿の変化、潰瘍性大腸炎、嘔吐、保持液からの体重増加、及び／又は衰弱を含む。
【０１３２】
疾患；治療方法、及び患者選択
実施形態において、本発明は、癌及び／又は腫瘍、例えば、癌及び／若しくは腫瘍の治療又は予防に関する。本明細書の他の場所で説明するように、癌の治療は、実施形態において、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するように本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを伴い得る。
【０１３３】
癌又は腫瘍は、身体の器官及びシステムの正常な機能を妨げる細胞の制御不能な増殖並びに／又は異常に増加した細胞生存率並びに／又はアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに休眠腫瘍又は微小転移が含まれる。免疫系によって妨げられない異常増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。癌は、原発性癌又は転移性癌であり得る。原発性癌は、臨床的に検出可能になる原発部位の癌細胞の領域であり、原発性腫瘍であり得る。対照的に、転移性癌は、ある器官又は部分から別の非隣接器官又は部分への疾患の広がりであり得る。転移性癌は、局所的な領域で周囲の正常組織に浸透及び浸潤する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされ得、新しい腫瘍を形成し、それは局所的な転移であり得る。癌はまた、リンパ及び／又は血管の壁を貫通する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされる可能性があり、その後、癌細胞は、体内の他の部位及び組織に血流を介して循環できる（それによって循環腫瘍細胞である）。癌は、リンパ性の又は血行性の広がりなどのプロセスに起因し得る。癌はまた、別の部位で停止し、血管又は壁を通って再浸透し、増殖し続け、最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。癌は、この新しい腫瘍であり得、それは転移性（又は続発性）腫瘍であり得る。
【０１３４】
癌は、転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得、それは続発性又は転移性腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍中のものと同様であり得る。一例として、乳癌又は結腸癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は、肝臓に存在する間、異常な肝細胞からではなく、異常な乳房又は結腸細胞から構成される。肝臓中の腫瘍はそのため、肝臓癌ではなく、転移性乳癌又は転移性結腸癌であり得る。
【０１３５】
癌は、任意の組織からの起源を有し得る。癌は、黒色腫、結腸、乳房、又は前立腺に由来し、そのため、それぞれ、元は皮膚、結腸、乳房、又は前立腺であった細胞から構成され得る。癌はまた、血液学的悪性腫瘍であり得、それは白血病又はリンパ腫であり得る。癌は、肝臓、肺、膀胱、又は腸などの組織に侵入し得る。
【０１３６】
本発明の代表的な癌及び／又は腫瘍は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腸骨の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化管癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；肝腫；上皮内新生物；腎臓癌又は腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺の扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞種；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮又は子宮内膜癌；尿系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低グレード／濾胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレードの拡散性ＮＨＬ；高グレードの免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードのリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレードの小さい非正円形細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びウォルデンストロームのマクログロブリン血症；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他の癌腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１３７】
実施形態において、キメラタンパク質は、治療−難治性癌を有する対象を治療するために使用される。実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の免疫調節剤に難治性である対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、治療の１２週間程度後に、治療に対する応答、或いはさらに進行を示さない対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、対象は、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２剤に難治性であり、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及び／又はＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）難治性患者を含む。例えば、実施形態において、対象は、抗ＣＴＬＡ−４剤に対して難治性であり、例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）難治性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、実施形態において、本発明は、１以上の免疫調節剤の単剤療法を含む、様々な治療に応答しない患者を救済する癌治療の方法を提供する。
【０１３８】
実施形態において、本発明は、腫瘍微小環境内の細胞又は組織を標的とするキメラタンパク質を提供する。実施形態において、腫瘍微小環境内の細胞又は組織は、キメラタンパク質の１以上の標的又は結合パートナーを発現する。腫瘍微小環境は、そこに腫瘍が存在する細胞、分泌タンパク質、生理的低分子、及び血管を含む細胞環境を指す。実施形態において、腫瘍微小環境内の細胞又は組織は、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；並びに腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞の１以上である。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は癌細胞を標的とする。実施形態において、癌細胞は、キメラタンパク質の標的又は結合パートナーの１以上を発現する。
【０１３９】
例示的な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＧＩＴＲを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、４−１ＢＢを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ４０を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＳＦ１を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＩＬ−３４を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ４７を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例示的な実施形態において、キメラタンパク質は、ガレクチン−９及び／又はホスファチジセリンを発現する細胞（例えば、癌細胞、間質細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。
【０１４０】
実施形態において、本方法は、追加の薬剤に難治性である患者にキメラタンパク質での治療を提供し、そのような「追加の薬剤」は本明細書の他の場所に記載されており、本明細書に記載の様々な化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の炎症性の疾患又は状態を治療する、調節する又は予防するために使用される。炎症性疾患の非限定的な例は、にきび、急性炎症、アレルギー性鼻炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、常染色体劣性痙性失調症、気管支拡張症、セリアック病、慢性胆嚢炎、慢性炎症、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、家族性好酸球増加症（ｆｅ）、糸球体腎炎、グリセロールキナーゼ欠乏症、化膿性汗腺炎、過敏症、炎症、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、間質性膀胱炎、喉頭炎症性疾患、リー症候群、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、眼炎症性疾患、耳炎、疼痛、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、呼吸器疾患、再狭窄、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、珪肺症及び他の肺炎、移植拒絶反応、結核、及び血管炎を含む。
【０１４２】
実施形態において、炎症性疾患は、多発性硬化症、糖尿病、ループス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、強皮症、グッドパスチャー症候群、ウェーゲナー肉芽腫症、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛、メニエール症候群；移植拒絶反応（例えば、同種移植片拒絶の予防）悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、及び他の自己免疫疾患などの、自己免疫の疾患又は状態である。
【０１４３】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、細胞内病原体を排除するために使用される。いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、１以上の感染症を治療するために使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ及びＨＣＶを含む）、寄生虫感染症（例えば、マラリアを含む）、及び細菌感染症を治療する方法に使用される。実施形態において、感染症は、免疫抑制を誘発する。例えば、ＨＩＶ感染症は、感染した対象において免疫抑制をもたらす場合が多い。したがって、本明細書の他の場所に記載されるように、そのような感染症の治療は、実施形態において、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するように、本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを含み得る。或いは、本発明は、免疫活性化を誘導する感染症を治療するための方法を提供する。例えば、腸内蠕虫感染症は、慢性免疫活性化と関連している。これらの実施形態において、そのような感染症の治療は、免疫刺激よりも免疫阻害を優先するように、本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを含み得る。
【０１４４】
実施形態において、本発明は、限定されないが、例えば、気道の、パピローマウイルス感染の、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染の、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の、及び肝炎ウイルスによる感染などの内臓のウイルス感染の急性又は慢性のウイルス感染を含むウイルス感染を治療する方法を提供する。実施形態において、ウイルス感染は、フラビウイルス科のウイルスによって引き起こされる。実施形態において、フラビウイルス科のウイルスは、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルスから選択される。実施形態において、ウイルス感染は、ピコルナビリダ科のウイルス、例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、オルトミクソウイルス科のメンバー、例えば、インフルエンザウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、レトロウイルス科のメンバー、例えば、レンチウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、パラミクソウイルス科のメンバー、例えば、呼吸器多核体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス、及びヒトメタニューモウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、ブニヤウイルス科のメンバー、例えば、ハンタウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、レオウイルス科のメンバー、例えば、ロタウイルスによって引き起こされる。
【０１４５】
実施形態において、本発明は、原虫又は蠕虫感染症などの寄生虫感染症を治療する方法を提供する。実施形態において、寄生虫感染は原虫寄生虫によるものである。実施形態において、オリチツィアブ（ｏｒｉｔｉｚｉａｂ）寄生虫は、腸原生動物、組織原生動物、又は血液原虫から選択される。例示的な原虫寄生虫は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリジウム・ムリス（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍｕｒｉｓ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｃｒｕｓｉ）、メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、ドノヴァン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・オーバル（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、及びヒストモナス・メレアグリジス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を含むが、これらに限定されない。実施形態において、寄生虫感染は、線虫などの蠕虫性寄生虫（例えば、双器綱）によるものである。実施形態において、寄生虫は、双線綱（例えば、鞭虫、回虫、蟯虫、ズビニ鉤虫、アメリカ鉤虫、糞線虫、バンクロフト糸状虫、メジナ虫）から選択される。実施形態において、寄生虫は、吸虫（例えば、住血吸虫、肝吸虫、腸吸虫、及び肺吸虫）から選択される。実施形態において、寄生虫は、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、異形吸虫（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ）、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）から選択される。実施形態において、寄生虫は、条虫類（例えば、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、小形条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）から選択される。
【０１４６】
実施形態において、本発明は、細菌感染症を治療する方法を提供する。実施形態において、細菌感染は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性及び／又は嫌気性細菌によるものである。実施形態において、細菌は、ブドウ球菌、乳酸菌、連鎖球菌、八連球菌、大腸菌、エンテロバクター、クレブシエラ、シュードモナス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、プロテウス、カンピロバクター、シトロバクター、ニセリア（Ｎｉｓｓｅｒｉａ）、バチルス、バクテロイド、ペプトコッカス、クロストリジウム、サルモネラ菌、シゲラ、セラティア、ヘモフィルス、ブルセラ及び他の生物から選択されるが、これらに限定されない。実施形態において、細菌は、緑膿菌、蛍光菌、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、大腸菌、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  Ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スチュアーティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ヘモリティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリティカ（��ｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア・インターメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・ヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ブランハメラ・カタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、キンゲラ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス３４５２Ａ相同性グループ、バクテロイデス・ブルガータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・オバルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｌｕｓ）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・エガーシー（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、バクテロイデス・スプランクニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、��核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ群β溶血連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・ヒカス亜種ヒカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｙｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、又はスタフィロコッカス・サッカロリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）から選択されるが、これらに限定されない。
【０１４７】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、１以上の自己免疫疾患又は障害を治療するために使用される。実施形態において、自己免疫疾患又は障害の治療は、免疫刺激よりも免疫阻害を優先するように、本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを含み得る。本発明のキメラタンパク質で治療可能な例示的自己免疫疾患又は障害は、体自体の抗原が免疫応答の標的となるもの、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、サルコイドーシス、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、乾癬、過敏反応（例えば、アレルギー、花粉症、喘息、及び急性水腫は、Ｉ型過敏反応を引き起こす）、並びに血管炎を含む。
【０１４８】
さらに別の態様において、本発明は、限定されないが、本明細書の他の場所に記載の疾患又は障害及び炎症性疾患又は障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植拒絶反応、及びＴ細胞増殖障害などのＴ細胞媒介性疾患及び障害を治療並びに予防する方法に関する。この使用方法で有用なＩ型  ＥＣＤドメインの具体例は、とりわけ、ＴＮＦＲＳＦ１ｂ、ＢＴＮＬ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、Ｔ細胞を活性化する方法において、例えば、免疫刺激シグナルを有する細胞外ドメインを介して使用される。
【０１５０】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、免疫抑制シグナルの細胞伝達を防止する方法において使用される。
【０１５１】
併用療法及びコンジュゲーション
実施形態において、本発明は、対象に追加の薬剤を投与することをさらに含むキメラタンパク質及び方法を提供する。実施形態において、本発明は、共投与及び／又は共製剤化に関する。本明細書に記載の組成物はいずれも、共製剤化及び／又は共投与され得る。
【０１５２】
実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、別の薬剤と共投与された場合に相乗的に作用し、そのような薬剤が単剤療法として使用される場合に一般的に使用される用量よりも低い用量で投与される。実施形態において、本明細書で参照される任意の薬剤は、本明細書に記載のキメラタンパク質のいずれかと組み合わせて使用され得る。
【０１５３】
実施形態において、本明細書に開示されるキメラタンパク質のいずれも、本明細書に開示される別のキメラタンパク質と共投与され得る。理論に縛られることなく、自然免疫応答を誘導する１以上のキメラタンパク質と、適応免疫応答を誘導する１以上のキメラタンパク質の投与を伴う組み合わせレジメンは、相乗効果（例えば、相乗的な抗腫瘍効果）を提供し得ると考えられている。
【０１５４】
いくつかの態様において、癌を治療する方法であって、その必要がある対象に、（ｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第１のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第１のキメラタンパク質は自然免疫系を調節する）；かつ（ｉｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第２のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第２のキメラタンパク質は適応免疫系を調節する）を投与することを含む、方法が提供される。
【０１５５】
いくつかの態様において、癌を治療する方法であって、その必要がある対象に、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第２のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第２のキメラタンパク質は適応免疫系を調節する）を投与することを含み、対象は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む第１のキメラタンパク質（式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、第１のキメラタンパク質は自然免疫系を調節する）で治療を受けている、又は治療を受けたことがある、方法が提供される。
【０１５６】
実施形態において、第１のキメラタンパク質は、第２のキメラタンパク質の前に投与される。
【０１５７】
実施形態において、第１のキメラタンパク質は、第２のキメラタンパク質の後に投与される。
【０１５８】
実施形態において、第１のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、ＶＳＩＧ８、ＴＩＭ３、４１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＬＩＧＨＴの少なくとも１つを含む。
【０１５９】
実施形態において、第２のキメラタンパク質は、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、ＩＬ−２の少なくとも１つを含む。
【０１６０】
実施形態において、第１のキメラタンパク質及び第２のキメラタンパク質は、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、及びＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌから独立して選択される。
【０１６１】
実施形態において、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される。実施形態において、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前に投与される。実施形態において、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰ１α）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される。実施形態において、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの前に投与される。
【０１６２】
実施形態において、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質は、抗原提示細胞の活性化を引き起こす。
【０１６３】
実施形態において、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質は、抗原提示細胞の抗原を提示する能力を増強する。
【０１６４】
実施形態において、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質は、持続的な免疫調節効果を提供する。
【０１６５】
実施形態において、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質は、腫瘍細胞が免疫阻害シグナルを伝達するのを防ぐ。
【０１６６】
実施形態において、第２のキメラタンパク質は、Ｔ細胞による腫瘍死滅活性を増強する。
【０１６７】
実施形態において、自然免疫応答を誘導する任意のキメラタンパク質が、本発明において利用され得る。実施形態において、適応免疫応答を誘導する任意のキメラタンパク質が、本発明において利用され得る。例示的な実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＣ末端にＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。別の実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＳＩＲＰαの細胞外ドメイン及びＣ末端にＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。例示的な実施形態において、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＰＤ−１の細胞外ドメイン及びＣ末端にＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。別の実施形態において、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン及びＣ末端にＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。
【０１６８】
実施形態において、本発明は、例えば、自然免疫応答を誘導する第１のキメラタンパク質、及び例えば、適応免疫応答を誘導する第２のキメラタンパク質の共投与に関する。そのような実施形態において、第１のキメラタンパク質は、第２のキメラタンパク質の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。例えば、キメラタンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態において、第１のキメラタンパク質及び第２のキメラタンパク質は、１週間間隔で投与されるか、又は隔週で投与される（すなわち、第１のキメラ、すなわち、タンパク質の投与に続き、１週間後に第２のキメラタンパク質の投与など）。
【０１６９】
本明細書に開示される任意のキメラタンパク質は、本明細書に記載の第１のキメラタンパク質であり得、本明細書に開示される任意のキメラタンパク質は、本明細書に記載の第２のキメラタンパク質であり得る。
【０１７０】
実施形態において、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質と共投与される。実施形態において、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質の前に投与される。実施形態において、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質の後に投与される。
【０１７１】
実施形態において、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質と共投与される。実施形態において、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質の前に投与される。実施形態において、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質の後に投与される。実施形態において、共投与は、同じキメラタンパク質を、時間を隔てて第１の投与及び第２の投与により２回投与することを含む。例えば、第１の投与及び第２の投与は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔であり得る。
【０１７２】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例は、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコーン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ  １−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン系抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））を参照されたい；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロン酸塩などのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質（ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎ）エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシンドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリ���類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（例えば、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール  パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、アブラクサン  クレモフォールを含まない、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びタキソテール  ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ジェムザール  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン  ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサル、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵ及びロイコボリンとのイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤  ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｆ、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、細胞増殖を低下させるエルロチ���ブ（Ｔａｒｃｅｖａ）及びＶＥＧＦ−Ａ）並びに上記のいずれかの医薬として許容される塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されない。加えて、本治療方法は、放射線の使用をさらに含んでよい。加えて、本治療方法は、光力学療法の使用をさらに含んでよい。
【０１７３】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明の追加の薬剤は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（テセントリク、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ））、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及び／又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と４−１ＢＢリガンドの１以上の結合を増加及び／又は刺激する薬剤（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体）、並びにＣＴＬＡ−４の活性及び／又はＣＴＬＡ−４と、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１以上の結合及び／又はＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）から選択される１以上の免疫調節剤である。
【０１７４】
実施形態において、限定されないが、感染性疾患適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての抗感染剤に関する。実施形態において、抗感染剤は、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、及びホスカルネットを含むがこれらに限定されない抗ウイルス剤である。実施形態において、抗感染剤は、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テキン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、及びメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；及びカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、及びメロペネム）を含むがこれらに限定されない抗菌剤である。実施形態において、抗感染剤は、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、キニン、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメーター（ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）／ルメファントリン、アトバコン（ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）／プログアニル及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、ピランテルパモ酸塩、及びアルベンダゾールを含む。
【０１７５】
実施形態において、限定されないが、自己免疫適用を含み、追加の薬剤は、免疫抑制剤である。実施形態において、免疫抑制剤は、ステロイド系抗炎症剤又は非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に、副腎コルチコステロイド及びその合成類似体は、当技術分野で周知である。本発明に有用なコルチコステロイドの例は、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、ベータ−メチルベタメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンベンゾエート、ベタメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンバレレート、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾンジアセテート、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステル類のバランス、クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸塩を含むが、これらに限定されない。本発明で使用され得る（ＮＳＡＩＤ）は、サリチル酸、アセチルサリチル酸、メチルサリチル酸、グリコールサリチル酸、サリチルアミド（ｓａｌｉｃｙｌｍｉｄｅ）、ベンジル−２，５−ジアセトキシベンゾイン酸、イブプロフェン、スリンダク（ｆｕｌｉｎｄａｃ）、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、及びインドメタシンを含むが、これらに限定されない。実施形態において、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン（ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ）、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレート、及び小さな生物学的薬剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞分裂阻害剤であり得る。
【０１７６】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、修飾される誘導体、すなわち、共有結合が組成物の活性を防止しないような、組成物への任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定されないが、誘導体は、特に、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質溶解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾された組成物を含む。多数の化学修飾のいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。さらに他の実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、例示的な実施形態において、毒素、化学療法剤、放射性同位体、及びアポトーシス若しくは細胞死を引き起こす薬剤を含む、細胞傷害性薬剤をさらに含む。そのような薬剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートされ得る。
【０１７７】
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はしたがって、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質などの検出可能な部分、及び化学発光部分、又は、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、サイトトキシン、細胞傷害性薬剤、及び放射性物質などの機能的部分を付加するために翻訳後に修飾され得る。
【０１７８】
製剤
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される塩を形成するために、無機酸若しくは有機酸と反応できる十分に基本的な官能基、又は無機塩基若しくは有機塩基と反応できるカルボキシシル基を保有できる。医薬として許容される酸添加塩は、当技術分野で周知の医薬として許容される酸から形成される。そのような塩は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）並びに医薬塩のハンドブック；性質、選択、及び使用（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編集），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される医薬として許容される塩を含む。
【０１７９】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、医薬として許容される塩の形態である。
【０１８０】
また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される担体又はビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与できる。そのような組成物は、必要に応じて、適切な投与のための形態を提供するように、適量の医薬として許容される賦形剤を含んでよい。医薬用賦形剤は、水並びにピーナッツ油、大豆油、鉱物油、及びゴマ油などの、石油、動物、野菜、又は合成起源のものを含む油類などの、液体であり得る。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、及び尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用できる。一実施形態において、医薬として許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。水は、本明細書に記載の任意の薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液がまた、特に注射可能な溶液のために、液体賦形剤として使用できる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールなども含む。本明細書に記載の任意の薬剤は、必要に応じて、微量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含んでよい。
【０１８１】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、及びＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない）に再懸濁される。
【０１８２】
実施形態において、キメラタンパク質は、半減期を延長するか、又はそうでなければ、薬物力学的及び薬物動態学的性質を改善するために別の薬剤とコンジュゲート並びに／又は融合され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、及びトランスフェリンなどのうちの１以上と融合又はコンジュゲートされ得る。実施形態において、個々のキメラタンパク質のそれぞれは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５〜２３９に記載の薬剤のうちの１以上に融合される。
【０１８３】
投与、投薬、及び治療レジメン
本発明は、記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を様々な製剤中に含む。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、溶液、懸濁液、エマルション、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適する任意の他の形態をとり得る。タンパク質配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ構築物も使用され得る。一実施形態において、組成物は、カプセルの形態にある（例えば、米国特許第５、６９８、１５５号を参照されたい）。適切な医薬賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集，第１９版、１９９５）に記載されている。
【０１８４】
適宜、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、可溶化剤も含んでよい。また、薬剤は、当技術分野で公知の適切なビヒクル又は送達装置により送達できる。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクル又は送達装置で共送できる。投与のための組成物は、必要に応じて、注射部位での痛みを軽減するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含んでよい。
【０１８５】
本発明のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、単位剤形で都合よく提示され、薬学の当技術分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。そのような方法は、一般に、１以上の付属成分を構成する担体と治療薬を結合させる工程を含む。典型的には、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、又はその両方と治療薬を均一かつ密接に結合させ、必要に応じて、所望の製剤の剤形に生成物を形成する（例えば、湿式又は乾燥造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で公知の従来の方法を用いて打錠する）ことによって調製される。
【０１８６】
一実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。
【０１８７】
投与経路は、例えば、皮内、筋肉内、経皮内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入による投与、又は局所的に、特に、耳、鼻、目、若しくは皮膚への投与を含む。実施形態において、投与は、経口又は非経口注射によってなされる。ほとんどの場合、投与は、血流への本明細書に記載の任意の薬剤の放出をもたらす。
【０１８８】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、経口投与できる。そのようなキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はまた、任意の他の便利な経路によって、例えば、静脈内注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与でき、かつ別の生物学的活性剤と共に投与できる。投与は、全身的又は局所的であり得る。様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、投与のために使用できる。
【０１８９】
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。一実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍に近位に位置する他の免疫細胞を含む腫瘍細胞を取り囲み、かつ／若しくは腫瘍細胞に栄養を与える、例えば、細胞、分子、細胞外マトリックス並びに／又は血管）又はリンパ節に投与され、かつ／又は腫瘍微小環境若しくはリンパ節を標的とする。実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍内に投与される。
【０１９０】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ（ＯＰＤＩＶＯ）、キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ヤーボイ（ＹＥＲＶＯＹ）及びテセントリク（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）の１以上での治療）に見られる副作用よりも少ない副作用をもたらす二重効果を可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、低血圧、大腸炎、肝炎、肺炎、発疹、及びリウマチ性疾患などの、皮膚、消化管、腎臓、末梢神経系及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、目、膵臓、及び内分泌系を含む様々な組織並びに器官に影響を与える一般的に観察される免疫関連有害事象を低減又は予防する。また、本発明の局所投与、例えば腫瘍内投与は、標準的な全身投与、例えば、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ、キイトルーダ、ヤーボイ、及びテセントリクの１以上での治療）で使用されるようなＩＶ注入で見られる有害事象を未然に防ぐ。
【０１９１】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内への注射並びに注入）に適する剤形は、例えば、溶液、懸濁液、分散剤、及びエマルションなどを含む。それらはまた、使用直前に無菌注射培地に溶解又は懸濁できる無菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造され得る。それらは、例えば、当技術分野で公知の懸濁剤又は分散剤を含有し得る。
【０１９２】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量並びに投薬スケジュールは、治療される疾患、対象の全体的な健康、及び投与する医師の裁量を含むが、これらに限定されない様々なパラメータに依存し得る。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、それを必要とする対象への追加の薬剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）か、追加の薬剤の投与と同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与できる。実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質及び追加の薬剤は、１分間間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与される。
【０１９３】
実施形態において、本発明は、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質及び適応免疫応答を誘導する別のキメラタンパク質の共投与に関する。そのような実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。例えば、キメラタンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質及び適応応答を誘発するキメラタンパク質は、１週間間隔で投与されるか、又は隔週で投与される（すなわち、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与は、その１週間後に、適応免疫応答などを誘発するキメラタンパク質などの投与を伴う）。
【０１９４】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量は、病態の重症度、病態が治療又は予防されるか否か、並びに治療される対象の年齢、体重、及び健康を含むいくつかの要因に依存し得る。さらに、特定の対象についての薬物ゲノムの（薬物動態、薬理力学的又は治療の有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響の）情報が、使用される投薬量に影響を与える可能性がある。また、正確な個々の投薬量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む様々な要因に依存して、幾分か調節できる。投薬量のいくつかのバリエーションが予想される。
【０１９５】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の非経口注射による投与について、投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、１日あたり約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日あたり約３ｍｇ〜約５ｍｇであり得る。一般に、経口又は非経口投与の場合、本明細書に記載の任意の薬剤の投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は１日あたり約２００〜約１、２００ｍｇ（例えば、１日あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）であり得る。
【０１９６】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、治療あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は治療あたり約２００〜約１、２００ｍｇ（例えば、治療あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）の投薬量での非経口注射によるものである。
【０１９７】
実施形態において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の適切な投薬量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、その間の全ての値と範囲を含む約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．２ｍｇ／ｋｇ体重、約１．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．４ｍｇ／ｋｇ体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６ｍｇ／ｋｇ体重、約１．７ｍｇ／ｋｇ体重、約１．８ｍｇ／ｋｇ体重、約１．９ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約４ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約６ｍｇ／ｋｇ体重、約７ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重、約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１９８】
別の実施形態において、送達は、小胞中で、特にリポソーム中であり得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら，感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ），Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ及びＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照されたい）。
【０１９９】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、制御放出手段若しくは持続放出手段によるか、又は当業者に周知の送達装置によって投与できる。例は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第３、８４５、７７０号、同第３、９１６、８９９号、同第３、５３６、８０９号、同第３、５９８、１２３号、同第４、００８、７１９号、同第５、６７４、５３３号、同第５、０５９、５９５号、同第５、５９１、７６７号、同第５、１２０、５４８号、同第５、０７３、５４３号、同第５、６３９、４７６号、同第５、３５４、５５６号、及び同第５、７３３、５５６号に記載のものを含むが、これらに限定されない。そのような剤形は、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、微小球、又はそれらの組み合わせを用いる１以上の活性成分の制御放出又は持続放出を提供するのに有用であり得る。活性成分の制御放出又は持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、光の適切な波長による刺激、酵素の濃度又は利用可能性、水の濃度又は利用可能性、又は他の生理学的条件若しくは化合物を含むがこれらに限定されない、様々な条件によって刺激できる。
【０２００】
別の実施形態において、ポリマー材料を使用できる（制御放出の医学的用途（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ），Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；制御される薬物バイオアベイラビリティ、医薬品の設計と性能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ），Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。
【０２０１】
別の実施形態において、制御放出システムは、治療される標的領域の近くに配置でき、したがって、全身用量のほんの一部を必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、上記のＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２巻，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説で説明されている他の制御放出システムが使用され得る。
【０２０２】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、独立して、１日に１〜４回、又は月に１〜４回、又は年に１〜６回、又は２年、３年、４年若しくは５年に１回であり得る。投与は、１日又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であり得、さらには対象の寿命の間であり得る。
【０２０３】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を利用する投薬量レジメンは、対象の種類、種、年齢、体重、性別及び病状；治療される病態の重症度；投与経路；対象の腎機能又は肝機能；個人の薬理ゲノミクス構造；及び使用される本発明の特定の化合物を含む様々な要因に従って選択できる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、毎日の単回用量で投与でき、又は総１日投薬量は、１日２回、３回又は４回の分割用量で投与できる。また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、投薬量レジメン全体を通して断続的ではなく、連続的に投与できる。
【０２０４】
細胞及び核酸
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。実施形態において、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。実施形態において、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
【０２０５】
原核生物ベクターと真核生物ベクターの両方が、キメラタンパク質の発現に使用できる。原核生物ベクターは、大腸菌配列に基づく構築物を含む（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，６０：５１２−５３８を参照されたい）。大腸菌での発現に使用できる調節領域の非限定的な例は、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７及びλＰＬを含む。原核生物発現ベクターの非限定的な例は、λｇｔ１１などのλｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈら，「ＤＮＡクローニング技術（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｉ巻：実用的なアプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編），ｐｐ．４９−７８，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０，１８５：６０−８９）を含み得る。しかしながら、原核生物宿主ベクター系は、哺乳動物細胞の翻訳後処理の多くを行うことができない。そのため、真核生物宿主ベクター系が、特に有用であり得る。様々な調節領域を、哺乳動物宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現に使用できる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞に有用であり得る誘導性プロモーターは、限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子に関連するプロモーター、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，４９：２７３５−４２；及びＴａｙｌｏｒら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，１０：１６５−７５を参照されたい）。ヒートショックプロモーター又はストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現を促進するのに有利であり得る。
【０２０６】
実施形態において、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である、発現制御領域、若しくはその補体に作動可能に連結されたキメラタンパク質（及び／若しくは追加の薬剤）又はその補体をコードする核酸を含む。発現制御領域は、発現ベクターで形質転換されたヒト細胞でブロッキング剤及び／又は刺激剤が生成されるように、作動可能に連結されたブロッキング剤及び／又は刺激剤をコードする核酸の発現を促進できる。
【０２０７】
発現制御領域は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を与える、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（本明細書でエレメントと呼ばれることもある）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞中で作動可能に連結されたコード核酸を発現できる。実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態において、細胞は非腫瘍細胞である。実施形態において、発現制御領域は、作動可能に連結された核酸に調節可能な発現を与える。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結された核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、多くの場合、誘導性と呼ばれる。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、多くの場合、抑制可能と呼ばれる。典型的には、そのようなエレメントによって与えられる増減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増減が大きくなる。
【０２０８】
実施形態において、本発明は、合図に応答して一過的に高レベルの発現をもたらすことができる誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近くにある場合、そのような発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）用の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換細胞を適切な合図に暴露することによって高レベルの薬剤を一過的に生成するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域は、低分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。特定の例は、例えば、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５、９８９、９１０号、同第５、９３５、９３４号、同第６、０１５、７０９号、及び同第６、００４、９４１号の中で見つけることができる。
【０２０９】
発現制御領域及び遺伝子座制御領域は、天然のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの全長プロモーター配列、並びに全長若しくは非バリアンド機能の全て又は一部を保持するサブ配列又はポリヌクレオチドバリアントを含む。本明細書で使用する用語「機能的」及びその文法的異形は、核酸配列、サブ配列又は断片を参照して使用される場合に、配列が天然核酸配列（例えば、非バリアント又は非改変配列）の１以上の機能を有することを意味する。
【０２１０】
本明細書で使用する「作動可能な連結」は、それらが意図される様式で機能することを可能にすると説明される構成成分の物理的な並置を指す。核酸との作動可能な連結における発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。典型的には、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端（すなわち「上流」）付近に並置される。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン）に配置できる。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離（例えば、核酸から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、又はそれより多くのヌクレオチド）に配置できる。発現制御エレメントの具体的な例はプロモーターであり、それは転写される配列の５’側に通常は位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、それは転写される配列の５’側若しくは３’側又は転写される配列内に配置できる。
【０２１１】
ヒト細胞で機能する発現系は、当技術分野で周知であり、かつウイルス系を含む。一般的に、ヒト細胞中で機能的なプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合しｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）転写を開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端に通常位置する、転写開始領域及び典型的には、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流に典型的に位置する、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用できる。ウイルス遺伝子は高度に発現される場合が多く広い宿主範囲を有するので、プロモーターとして特に使用されるのは、哺乳動物ウイルスゲノム由来のプロモーターである。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターを含む。
【０２１２】
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そのため、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネータ及びポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。イントロンも、発現構築物中に含まれ得る。
【０２１３】
生存細胞に核酸を導入するために利用可能な様々な技術がある。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適する技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーベースのシステム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。インビボ遺伝子導入に関しては、リポソーム；キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクルを含むいくつかの技術及び試薬を用いてもよい。ウイルスベクターも、インビボ形質導入に適する。場合によっては、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又はリガンドなどの、標的剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型を指向するカプシドタンパク質又はその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし細胞内半減期を増強するタンパク質を標的化し、かつ／又はその取り込みを促進するために使用され得る。受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。
【０２１４】
適宜、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達作用因子を用いることもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１−３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２−３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋら，ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３を参照されたい）。これらは、リコンビナーゼ及びトランスポサーゼを含む。例は、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６，１９８１）、ｌａｍｂｄａ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３−５４５，１９７４），Ｆｌｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ら，Ｃｅｌｌ，２９：２２７−２３４，１９８２），Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０−６１８，１９９０），ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）、マリナーファミリーのトランスポサーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋら、上記）、及びＡＡＶ、レトロウイルスなどのウイルスを組み込むための構成成分、並びにレトロウイルス又はレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する構成成分を有するアンチウイルス（Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３）を含む。加えて、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を挿入するために使用され得る。
【０２１５】
一態様において、本発明は、ウイルスベクターであるキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の発現用の発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが公知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１  １７，１２２，２００３を参照されたい）。例示的なウイルスベクターは、アンチウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものを含むが、他のウイルスベクターも使用され得る。インビボ使用の場合、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターが、αウイルス及びアデノウイルスなどの使用に適する。αウイルスの例示的な種類は、シンドビスウイルス、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）を含む。インビトロ使用の場合、レトロウイルス、ＡＡＶ、及びアンチウイルスなどの、宿主ゲノムに組み込むウイルスベクターが適する。実施形態において、本発明は、インビボでヒト細胞を形質導入する方法であって、インビボで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む、方法を提供する。
【０２１６】
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【０２１７】
発現ベクターは、本発明のキメラタンパク質を生成するための宿主細胞に導入できる。細胞は、例えば、インビトロで培養されるか、又は遺伝子操作され得る。有用な哺乳動物宿主細胞は、限定されないが、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞を含む（例えば、「遺伝子導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」１９９０、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．を参照されたい）。これらは、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３、２９３−ＥＢＮＡ、又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，７７：４２１６）；ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８０，２３：２４３−２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）を含む。本明細書に記載のキメラタンパク質を発現させるための例示的癌細胞型は、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びそのオブアルブミン形質移入体、Ｅ．Ｇ７、マウス黒色腫細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、及びヒト小細胞肺癌細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７を含む。
【０２１８】
宿主細胞は、健康なヒト、癌患者、及び感染症患者を含む健常又は罹患している患者、民間研究室預託、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの公共の培養物コレクション、又は商業サプライヤーから入手できる。
【０２１９】
インビトロ、エクソビボ、及び／又はインビボで本発明のキメラタンパク質の生成に使用できる細胞は、限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に、造血幹細胞又は前駆細胞（例えば、骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などを含む。細胞型の選択は、治療若しくは予防される腫瘍の種類又は感染症に依存し、当業者が決定できる。
【０２２０】
Ｆｃ含有高分子（モノクローナル抗体など）の生成及び精製は、生成物間のわずかな改変を伴う標準化されたプロセスとなっている。例えば、多くのＦｃ含有高分子は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（若しくはその変異体）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（若しくはその変異体）又は場合によっては、細菌による方法又は合成方法によって生成される。生成後、ＨＥＫ細胞又はＣＨＯ細胞によって分泌されるＦｃ含有高分子は、プロテインＡカラムへの結合を通じて精製され、その後、様々な方法を用いて「完璧に」される。一般的に言えば、精製されたＦｃ含有高分子は、ある期間液体形態で保存され、長期間凍結されるか、又は場合によっては、凍結乾燥される。実施形態において、本明細書で企図されるキメラタンパク質の生成は、従来のＦｃ含有高分子と比較して特有の特徴を有し得る。ある例において、キメラタンパク質は、特定のクロマトグラフィー樹脂を用いるか、又はプロテインＡ捕捉に依存しないクロマトグラフィー法を用いて精製され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、オリゴマー状態で、又は複数のオリゴマー状態で精製され、特定の方法を用いて特定のオリゴマー状態について濃縮され得る。理論に縛られることなく、これらの方法は、特定の塩濃度、ｐＨ及び添加剤組成物を含む特定の緩衝液による処理を含み得る。他の例では、そのような方法は、１つのオリゴマー状態を別のオリゴマー状態よりも優先する処理を含み得る。本明細書で得られるキメラタンパク質は、当技術分野で特定される方法を用いて、さらに「完璧に」され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、非常に安定であり、広範囲のｐＨの曝露（ｐＨ３〜１２）に耐えることができ、多数の凍結／解凍ストレス（３回超の凍結／解凍サイクル）に耐えることができ、高温（４０℃で２週間超）での延長したインキュベーションに耐えることができる。実施形態において、キメラタンパク質は、そのようなストレス条件下での分解、脱アミド化などの証拠なしに、無傷のままでいると示される。
【０２２１】
対象及び／又は動物
実施形態において、対象及び／又は動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又はサル、チンパンジー、若しくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。実施形態において、対象及び／又は動物は、例えば、ゼブラフィッシュなどの非哺乳動物である。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光タグ付き細胞（例えば、ＧＦＰを有する）を含み得る。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
【０２２２】
実施形態において、対象及び／又は動物は、ヒトである。実施形態において、ヒトは小児のヒトである。実施形態において、ヒトは、成人のヒトである。実施形態において、ヒトは、老人のヒトである。実施形態において、ヒトは、患者と呼ばれ得る。
【０２２３】
ある実施形態において、ヒトは、生後約０ヶ月〜約６ヶ月、生後約６ヶ月〜約１２ヶ月、生後約６ヶ月〜約１８ヶ月、生後約１８ヶ月〜約３６ヶ月、約１歳〜約５歳、約５歳〜約１０歳、約１０歳〜約１５歳、約１５歳〜約２０歳、約２０歳〜約２５歳、約２５歳〜約３０歳、約３０歳〜約３５歳、約３５歳〜約４０歳、約４０歳〜約４５歳、約４５歳〜約５０歳、約５０歳〜約５５歳、約５５歳〜約６０歳、約６０歳〜約６５歳、約６５歳〜約７０歳、約７０歳〜約７５歳、約７５歳〜約８０歳、約８０歳〜約８５歳、約８５歳〜約９０歳、約９０歳〜約９５歳、又は約９５歳〜約１００歳の範囲の年齢を有する。
【０２２４】
実施形態において、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学での使用に関する。特定の実施形態において、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態において、非ヒト動物は家畜動物である。
【０２２５】
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化できるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形で含む。一実施形態において、単位剤形は、殺菌できる予め充填された注射器などの容器であり、本明細書に記載の任意の薬剤及び医薬として許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する。キットは、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を説明するラベル又は印刷された説明書をさらに含んでよい。キットはまた、蓋スペキュラム、局所麻酔薬、及び投与場所のための洗浄剤を含み得る。キットはまた、本明細書に記載の１以上の追加の薬剤をさらに含んでよい。一実施形態において、キットは、本明細書に記載のものなどの、有効量の本発明の組成物及び有効量の別の組成物を含有する容器を含む。
【０２２６】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０２２７】
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明される。
【０２２８】
実施例
実施例１：単量体ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のコンピューターシミュレーション予測構造
７９２個のアミノ酸残基を有する単量体ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−１７２１５４）のコンピューターシミュレーション構造予測を行い、ｐ値は１．１４×１０−２１であった。単量体タンパク質の分子量は８８．１ｋＤａであると予測された。キメラタンパク質の構造を図２に提供する。
【０２２９】
具体的には、構造予測により、４８個の位置（６％）が無秩序であり得ることが明らかになった。キメラタンパク質の配列全体の二次構造予測は、タンパク質が２％のα−ヘリックス（Ｈ）、５０％のβシート（Ｅ）、及び４７％のコイル（Ｃ）の組成を有することを示した。絶対グローバル品質のＧＤＴ（グローバル距離検定）及びｕＧＤＴ（非正規化ＧＤＴ）も、キメラタンパク質について計算され、４２９（５４）の全体的なｕＧＤＴ（ＧＤＴ）を得た。タンパク質残基の溶媒アクセシビリティに関する３つの状態予測は、３３％の露出（Ｅ）、４８％の中間（Ｍ）、及び１７％の埋没（Ｂ）であった。
【０２３０】
活発な腫瘍破壊を刺激するためのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の作用機序を示す概略図を図３に示す。キメラタンパク質は次いで、腫瘍細胞の表面から「ぶら下がる」ことがあり得、キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌ部分は次いで、Ｔ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０に結合し得る。これは、共刺激ＣＤ４０Ｌシグナルとの阻害性ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）シグナルの置換をもたらしてＴ細胞の抗腫瘍活性を増強し得る。
【０２３１】
多くの腫瘍型は、マクロファージの表面上でＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）に結合できる高レベルの膜結合ＣＤ４７を発現し、それによって、マクロファージの貪食又は腫瘍細胞の食作用を阻害する「私を食べるな」シグナルを誘発する。理論に縛られることなく、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−１７２１５４）は、ＣＤ４７を発現する腫瘍を結合し、マクロファージとのその相互作用を阻止し、マクロファージの成熟及び腫瘍細胞の食作用媒介性破壊を可能にすると考えられている。これは次に、増強された腫瘍抗原放出及び他のマクロファージへの交差提示をもたらす。興味深いことに、抗原の交差提示は、マクロファージ／ＡＰＣ結合ＣＤ４０とキメラタンパク質からのＣＤ４０Ｌの間の共刺激と同時に、かつ同じ腫瘍微小環境状況で起こる。ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質はしたがって、活発な腫瘍破壊と腫瘍抗原の免疫認識の両方を刺激し、これらは、再発を防ぐことのできる記憶応答をプログラミングする上で不可欠である（図３）。
【０２３２】
実施例２：ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を構築した。キメラタンパク質を、キメラタンパク質の各個々のドメインに対する、すなわち、抗ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、抗ＦＣ、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体による、ウェスタンブロット分析を行うことにより特徴付けた。
【０２３３】
ウェスタンブロットは、非還元レーン（図４、各ブロットのレーン２）で優勢な二量体バンドの存在を示し、これは、還元剤β−メルカプトエタノールの存在下で、グリコシル化単量体バンドに還元された、（図４、各ブロットのレーン３）。図４で、各ブロットのレーン４に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）とエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で、８８．１ｋＤａの予測分子量で単量体として移動した。
【０２３４】
実施例３：ＥＬＩＳＡを用いるＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性の特徴付け
機能性ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイを、ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの、それぞれの結合パートナーに対する結合親和性を実証するために開発した。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）ドメインを、プレート結合組換えヒトＣＤ４７タンパク質へ捕捉し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体により検出した。組換えｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃタンパク質を用いて、標準曲線を作成した。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＦｃ部分を、プレート結合ヒトＩｇＧへ捕捉し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ｈＩｇ）により検出した。組換えｈＩｇタンパク質を使用して、標準曲線を作成した。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＣＤ４０Ｌドメインを、プレート結合組換えヒトＣＤ４０タンパク質へ捕捉し、ＣＤ４０Ｌ特異的抗体により検出した。組換えｈＣＤ４０Ｌタンパク質を用いて、標準曲線を作成した。
【０２３５】
図６に示すように、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインは、濃度依存的にかつ高い親和性でそれぞれの結合パートナーと効果的に相互作用した。さらに、図６の右パネルに示すように、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、ＣＤ４０とＣＤ４７の両方に同時に結合できる。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、中央Ｆｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出することは、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、低レベルのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質が、このアッセイにおいて標準物質と比較して検出された。このデータに基づいて、ＣＤ４７に対し１．３９ｎＭの、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）に対し１．１２ｎＭの、及び同時のＣＤ４７及びＣＤ４０に対し１８．１ｎｍのＥＣ５０値が、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質について計算された。
【０２３６】
エクソビボ細胞結合アッセイも利用して、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの、それぞれの結合パートナーに結合する能力を評価した。ここで、細胞株を、ヒトＣＤ４７（すなわち、ＨｅＬａ／ｈＣＤ４７）を過剰発現するように工学処理し、細胞株を、マウスＣＤ４０（すなわち、ＣＨＯＫ１／ｍＣＤ４０）を過剰発現するように工学処理した。
【０２３７】
ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質又はマウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を、親細胞株及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、かつ予想されるように、キメラタンパク質は、親細胞株に顕著に結合しなかった。しかしながら、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、濃度依存的にＨｅＬａ／ｈＣＤ４７工学処理細胞株に結合し、このデータに基づいて、２１．５１ｎＭのＥＣ５０値が計算された（図７Ａ）。同様に、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、濃度依存的にＣＨＯＫ１／ｍＣＤ４０工学処理細胞株に結合し、このデータに基づいて、２０．２ｎＭのＥＣ５０値が計算された。
【０２３８】
実施例４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性の特徴付け
ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６０システムを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。具体的には、ＣＤ４７、ＦｃγＲ１Ａ、及びＦｃＲｎに対するキメラタンパク質の親和性を決定し、組換え対照タンパク質と比較し、その結果を、それぞれ図８Ａ〜図８Ｃに示す。収集した動態データを、図８Ｄに示す表にまとめる。
【０２３９】
図８Ａに示すように、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、ＣＤ４７に結合し、高い親和性を有する。ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬのヒトＣＤ４７への「オン速度」は、急速であったが、「オフ速度」ははるかにより遅く、実際に、組換えＣＤ４７−Ｆｃの「オフ速度」よりも約４０倍遅く、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、長い的確な滞在時間で、迅速にかつ安定に結合することを示す。ヒトＣＤ４７に結合するＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬのＫＤは、３．５９ｎＭであると計算された。親和性測定は、エフェクター機能を有するＦｃ受容体に対して以外、キメラタンパク質への高い親和性結合を実証した（図８Ｂ及び図８Ｃ）。重要なことに、キメラタンパク質のオフ速度は、ベンチマーク対照タンパク質のそれよりもはるかに遅く、ＣＤ４７からのキメラタンパク質解離は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃよりも２．７８倍長かった。
【０２４０】
さらに、ｍＣＤ４０へのマウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの結合親和性を、ＳＰＲにより評価した。図８Ｅに示すように、キメラタンパク質は、０．７５６ｎＭのｋｄでｍＣＤ４０に密接に結合すると決定された。
【０２４１】
実施例５：ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の機能性アッセイ
機能性アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイ及びマクロファージ貪食アッセイを行って、ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を実証した。ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイを行って、ヒトＣＤ４７（ＨｅＬａ／ｈＣＤ４７及びＪｕｒｋａｔ／内因性ＣＤ４７）を過剰発現する細胞へのｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合が、ヒトＣＤ４７ブロッキング抗体と細胞を事前にインキュベートすることによって破壊できることを実証した。ヒトＣＤ４７発現プラスミドで安定にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、単独で、漸増濃度のヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質とインキュベートするか、又はＨｅＬａ／ｈＣＤ４７細胞をヒトＣＤ４７ブロッキング抗体と事前にインキュベートした後にインキュベートした（図９Ａ、中央パネル）。ＨｅＬａ／ｈＣＤ４７は、濃度依存的にｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質に結合した（図９Ａ、中間パネル、上の曲線）。結合は、ＨｅＬａ／ｈＣＤ４７細胞をＣＤ４７ブロッキング抗体で事前処理した場合に阻止された（図９Ａ、中間パネル、下の曲線）。
【０２４２】
高レベルのヒトＣＤ４７を内因的に発現したＪｕｒｋａｔ細胞は、濃度依存的にｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質に結合した（図９Ａ、右パネル、上の曲線）。同様に、この結合は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を同じＣＤ４７ブロッキング抗体と事前処理した場合に、阻止された（図９Ａ、右パネル、下の曲線）。
【０２４３】
全体として、これらのデータは、ＣＤ４７のアクセスが阻止された場合にｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の結合が妨げられたので、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）成分の結合が、過剰発現されたＣＤ４７と内因性ＣＤ４７の両方に非常に特異的であることを示した。
【０２４４】
マクロファージ貪食アッセイにおいて、マクロファージ結合ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）がＣＤ４７と自由に相互作用できる場合に生成される「私を食べるな」シグナルの抑制を評価するために、初代由来のヒトマクロファージを、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の存在下又は非存在下で、ＣＤ４７発現細胞とインキュベートした。マクロファージ貪食アッセイの基本原理を示す概略図を図９Ｂに示す。初代ヒト単球を単離し、マクロファージへとインビトロで分化させた。ＣＤ４７のドナーとして、懸濁細胞株Ｊｕｒｋａｔは、高レベルの膜結合ＣＤ４７を発現すると特定された。マクロファージ及びＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の存在下又は非存在下で、異なる細胞トレース色素とインキュベートし、共培養した（図９Ｂ）。キメラタンパク質の非存在下では、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ４７は、マクロファージ−ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）と相互作用し、食作用を阻止し、両方の細胞トレース色素に対して二重陽性であるベースラインレベルの細胞をもたらした（図９Ｃ、左のバー）。キメラタンパク質をＪｕｒｋａｔ／マクロファージ共培養物に添加すると、増加したレベルの二重陽性細胞が検出され、これは濃度依存的に増加した（図９Ｃ、右の３本のバー）。マクロファージ貪食アッセイの結果は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質がＣＤ４７＋細胞のマクロファージ食作用を促進できることを示した。
【０２４５】
実施例６：マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を、キメラタンパク質の各個々のドメインに対してウェスタンブロット分析を行うことによって、すなわち、抗ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、抗ＦＣ、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体を介して特徴付けた。図１０Ａに示すように、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の全３つのドメインは、非還元（レーン２）、還元（レーン３）及び還元＋ＰＮＧアーゼ処理（レーン４）下で検出された。キメラタンパク質の還元型グリコシル化形態は、約１１０ｋＤａの予想分子量で移動した。還元型脱グリコシル化形態はいずれの抗体でも検出されず、これはグリコシル化されるタンパク質へのその依存性に起因する可能性があった。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡアッセイを行って、それらの予測結合パートナー（すなわち、ＣＤ４７又はＣＤ４０）と相互作用するｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証した。具体的には、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）ドメインを、プレートに結合した組換えＣＤ４７タンパク質に捕捉し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｆｃ抗体を介して検出することによって検出した（図１０Ｂ、左パネル、四角の記号）。組換えｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−ｍＦｃを用いて、標準曲線を作成した（図１０Ｂ、左パネル、円の記号）。キメラタンパク質のＣＤ４０Ｌドメインを、プレートに結合した組換えマウスＣＤ４０タンパク質に捕捉し、ＣＤ４０Ｌ特異的抗体を介して検出することによって検出した（図１０Ｂ、右パネル、四角の記号）。組換えｍＣＤ４０Ｌを用いて、標準曲線を作成した（図１０Ｂ、右パネル、円の記号）。図１０Ｂに示すように、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインは、それらのそれぞれの結合パートナーと高い親和性で効果的に相互作用した。
【０２４７】
ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を、ＣＴ２６マウス大腸腫瘍モデルを用いて分析した。１組の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、かつ／又は３０日目にＣＴ２６腫瘍細胞の２回目の接種により再負荷を行った。腫瘍成長の４日後に、腫瘍が直径４〜５ｍｍに達すると、マウスを抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４０、２つの抗体の組み合わせ、又はｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置した。
【０２４８】
各処置群の腫瘍成長を、図１１Ａに示すように評価した。具体的には、未処置マウスは腫瘍を迅速に発症した。抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４０、又はこれら２つの抗体の組み合わせによる処置は、腫瘍の発症をわずかに遅らせるように思われた。これに対して、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質でのマウスの処置は、腫瘍の発症を著しく妨げ、かつ／又は遅らせた。重要なことに、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、再負荷される（癌再発を示す）と腫瘍細胞を効果的に死滅させることができかつ／又は腫瘍成長を効果的に低減できる。そのため、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、再発を防止できる可能性のある記憶応答を生じさせるように見える。
【０２４９】
腫瘍接種後４５日目までのマウスの全生存率も評価した。未処置マウスの全ては、腫瘍接種後２１日以内に死亡した。単一抗体で処置したマウスのほとんどは、３０日前後に死亡した。抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＤ４７抗体の組み合わせを投与されたマウスは、５０日目にわずか約３０％の生存率を示した。重要なことに、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置した全てのマウスは、図１１Ｂに示すように、腫瘍接種後５０日を過ぎても生存した。
【０２５０】
図１１Ｃに示すように、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ４７のいずれかによる単剤療法は、ほとんどのマウスの腫瘍成長率に中程度の延長をもたらし、１匹の動物が腫瘍を完全に拒絶した（抗ＣＤ４０群、処置した全１２匹のマウスのうち）。２つの抗体を組み合わせて投与した場合、相乗効果があり、長期の経過観察群の６匹のうちの２匹のマウスが完全な腫瘍拒絶を有した。ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌで処置したマウスについては、抗体併用と比較して１５０と３００μｇの両方の用量レベルで著しく優れた活性があり、１５０対３００μｇの群において拒絶率がわずかに改善された。抗体併用処置と比較して、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を用いた処置では８０％の完全拒絶率が観察された。
【０２５１】
免疫表現型決定もまた、腫瘍接種後１３日目に脾細胞、リンパ節細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球を分析することによって行った。図１２Ａ、図１２Ｃ、及び図１２Ｄに示すように、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−ＦＣ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、対照群又は併用抗体処置群（抗ＣＤ４０と抗ＣＤ４７）と比較して、脾臓、末梢リンパ節及び腫瘍で全ＣＤ４＋Ｔ細胞のより高い割合を示した。脾臓内では、この増加は、主にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増加を含み、これは非制御性Ｔ細胞の活性化が関与するという考えと一致した（図１２Ｂ）。ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌで処置したマウスでは、末梢リンパ節においてＣＤ８＋Ｔ細胞の増加もあったが、この増加は脾臓又は腫瘍では観察されなかった（図１２Ａ、図１２Ｃ、及び図１２Ｄ）。
【０２５２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍抗原の認識を刺激するｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の能力も分析した。具体的には、図１２Ｅは、ＣＴ２６腫瘍によって天然に発現されるＡＨ１腫瘍抗原を認識したＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を決定するための四量体染色分析を示す。脾臓及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）内では、より高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞が、未処置マウスと比較して、キメラタンパク質で処置したマウスにおいてＡＨ１腫瘍抗原を認識することが判明した。
【０２５３】
ＣＤ４０活性化の指標の１つは、ＩＬ−１５受容体αを上方制御した細胞の割合であった。処置群の中で、１５０μｇ用量のｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスにおいて著しい増加があったが、抗ＣＤ４０／ＣＤ４７処置群では増加はなかった（図１２Ｆ）。
【０２５４】
全体として、これらのデータは、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが、確立された腫瘍を排除すること、及び再負荷時に腫瘍成長を防ぐことができる記憶免疫応答を生じさせることにおいて有効であったことを実証する。さらに、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、最適用量で投与した場合、ベンチマーク抗体併用（抗ＣＤ４７＋抗ＣＤ４０）を上回った。特に、１５０μｇ用量のｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌは、３００μｇ用量よりも有効でありかつより明確に定義された免疫の特徴を有するように思われた。
【０２５５】
上記のデータは、とりわけ、少なくとも、癌の治療において、インビボでのｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの機能活性を明確に実証する。
【０２５６】
実施例７：インビボでのヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質が赤血球に結合できず、それによって溶血をもたらすことを試験した。ここで、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを、カニクイザル赤血球と接触させた（ＲＢＣ；図１３左上パネル）。ＲＢＣ数における著しい変化は２匹のサルにおいて検出されなかったため、キメラタンパク質は、インビボでカニクイザルＲＢＣの著しい溶血を引き起こさなかった。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質も同様に、溶血指標に著しい影響を及ぼすようには見えなかった（図１３、残りのパネル参照）。ＲＢＣ溶血又は血小板枯渇の証拠は、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌによる処置後に観察されなかった。総合安全評価を毎日複数回行い、追加の安全シグナルは観測されなかった。これらのデータは、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌが望ましくない副作用としてＲＢＣの溶血を引き起こさないことを示す。
【０２５７】
実施例８：複数のキメラタンパク質による併用治療の特徴付け
この実施例において、抗腫瘍効力及び／又は相乗効果を、キメラタンパク質の組み合わせを含む処置について決定した。具体的には、大腸癌（ＭＣ３８若しくはＣＴ２６）又は黒色腫（Ｂ１６．Ｆ１０）のマウスモデルを用いて、腫瘍の成長及び全体的な生存に対するこれらの処置の効果を評価した。
【０２５８】
図１４に記載のＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６、８、又は９）に、２．５×１０５個のＭＣ３８−ｏｖａ腫瘍細胞を後ろの脇腹に接種した。５日目及び８日目に、マウスをＯＸ８６（抗ＯＸ４０）抗体；ＲＭＰ１−１４又は２９Ｆ．１．Ａ１２（抗ＰＤ−１）抗体；ＲＭＴ３−３２（抗ＴＩＭ３）抗体；抗ＴＩＭ３及び抗ＯＸ４０抗体；抗ＴＩＭ３、抗ＯＸ４０、及び抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）抗体；抗ＯＸ４０、抗ＴＩＭ３、及び２９Ｆ．１．Ａ１２／抗ＰＤ−１抗体；又はＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置した。与える場合、各抗体の１００μｇを経皮注射を介して投与した。与える場合、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の３００μｇを５日目及び７日目に経皮注射を介して投与した。腫瘍面積を、接種後１９日目に、電子キャリパーを用いて垂直腫瘍の直径の測定を行うことによって計算した。単一抗体で処置したマウスも、抗ＴＩＭ３抗体と抗ＯＸ４０抗体の両方で処置したマウスも、対照の処置と比較して統計的に有意な腫瘍サイズの減少はなかった。しかしながら、対照処置と比較して、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）腫瘍サイズの減少が、３つの抗体の組み合わせのいずれかで処置したマウス及びＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の２つの逐次用量で処置したマウスにおいて観察された。
【０２５９】
図１５Ａ及び図１５Ｂに記載のＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８又は９）に、ＣＴ２６腫瘍細胞を後の脇腹に接種した。第１の処置群のマウスを、５日目及び７日目に、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置した。第２の処置群のマウスを、５日目及び７日目に、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置し、その後、７日目と９日目に、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置した。第３の処置群のマウスを、５日目及び７日目に、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置し、その後、７日目と９日目に、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置した。第４の処置群のマウスを、５日目及び７日目に、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置し、その後、７日目と９日目に、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置した。第５の処置群のマウスを、５日目及び７日目に、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置し、その後、７日目と９日目に、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質１５０μｇで処置した。腫瘍領域を定期的に計算した。第１、第２、第３、及び第５の処置群中のマウスのうち、各処置群で１匹のマウスのみが腫瘍接種を拒絶し、第４群で２匹のマウスが腫瘍接種を拒絶した。
【０２６０】
図１５Ａに示すように、各処置群中のマウスは、試験期間中にわたり腫瘍サイズの減少を示し（対照処置と比較して）、最初にＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置し次いでＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置した、第４の処置群のマウスについて最大減少が観察された。２番目に大きい腫瘍減少は、ＴＩ逆の順序であったがＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌと組み合わせた同じＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌについてであった。そのため、この組み合わせについて、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で第２の処置を行うと、大きな腫瘍サイズの減少がもたらされた。驚くべきことに、反対のパターンがキメラタンパク質の他の組み合わせについて観察された。実際に、ＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの前にＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置すると、最初にＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質で処置した場合と比較して、腫瘍サイズのより大きな減少が生じた。そのため、この組み合わせについて、最初にＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置すると、腫瘍サイズのより大きな減少がもたらされる。最後に、最初にＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置した処置群については、第１と第２の両方の処置としてＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを投与したマウスと比較して、異なるキメラタンパク質を２番目に提供した場合に、腫瘍サイズのより大きな減少が観察された。そのため、特定のキメラタンパク質について、異なる第１及び第２のキメラタンパク質を投与することからの利点があり得る。
【０２６１】
同様に、図１５Ｂに示すように、各処置群におけるマウスは、対照処置マウスと比較して、生存率が改善され、約３０日で約５０％〜７５％が生存した。再び、最初にＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置した処置群については、第１と第２の両方の処置としてＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを投与したマウスと比較して、異なるキメラタンパク質を２番目に提供した場合に、生存率の向上が観察された。再び、特定のキメラタンパク質について、異なる第１及び第２のキメラタンパク質を投与することからの利点があり得る。
【０２６２】
これらのデータは、２つのキメラタンパク質（同一の又は異なるキメラタンパク質のいずれか）での逐次処置を含む処置が、抗腫瘍有効性の増強及び生存率の向上をもたらすことを実証する。さらに、特定のキメラタンパク質について、有効性及び生存率は、２つの異なるキメラタンパク質が投与される順序によって影響を受ける可能性がある。さらに、特定のキメラタンパク質について、投与される第２のキメラタンパク質が最初に投与されるキメラタンパク質と異なる場合に、有効性及び生存率が影響を受ける可能性がある。これらのデータは、適応免疫応答を誘導する１以上のキメラタンパク質の投与の前に、投与と同時に、又は投与の後に自然免疫応答を誘導する１以上のキメラタンパク質の投与を伴う組み合わせレジメンが、相乗効果（例えば、相乗的な抗腫瘍効果）を提供し得るという理解を裏付ける。
【０２６３】
実施例９：キメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与の特徴付け
この実施例において、本発明のキメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与をアッセイした。ここで、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをＦｃ含有キメラタンパク質のモデルとして用いた。そのため、以下に示すデータは、本発明のキメラタンパク質に関連する。
【０２６４】
天然状態では、ＰＤ１は単量体として存在し、一方でＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用により二量体化する傾向がある。Ｆｃドメインは、ジスルフィド結合を介して、例えば、それらのシステイン残基（複数可）を介して互いに結合する。まとめると、いくつかの分子間相互作用は、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの四次構造に寄与し得る。少なくとも、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの４つの潜在的な構造があり、キメラタンパク質は単量体、二量体、三量体、又は六量体として存在する。図１６を参照されたい。
【０２６５】
キメラタンパク質の単量体及び二量体の構造の存在を、キメラタンパク質を還元条件及び非還元条件に暴露し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動することによって試験した。非還元条件下（還元：「−」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２００ｋＤａの位置に移動した。ここで、ウェスタンブロットを、ＰＤ−１、Ｆｃ、又はＯＸ４０Ｌに対する抗体でプローブし、それぞれ、図１７の左、真ん中、及び右のブロットに示した。キメラタンパク質の予測単量体分子量は５７．６ｋＤａであるので、２００ｋＤａ種は、少なくとも二量体であると予想された。しかしながら、ジスルフィド結合（例えば、Ｆｃドメイン間の）を還元する還元条件下（還元：「＋」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１００ｋＤａの位置に移動した。１００ｋＤａ種は予想よりも大きかったので、余分な質量はグリコシル化によるものと予測された。最後に、キメラタンパク質をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ「＋」）で処理し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。これらの条件下で、キメラタンパク質は約５７．６ｋＤａの位置に移動した。これらのデータは、キメラタンパク質がグリコシル化され、少なくとも二量体として天然に存在することを示唆しており、二量体化は、例えば、それらのシステイン残基（複数可）を介するＦｃドメイン間のジスルフィド結合に起因する可能性が高い。
【０２６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル法は、高電荷及び／又は大きな分子量のタンパク質について分子量を正確に予測しない。そのため、キメラタンパク質を次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて特徴付けた。負電荷ＳＤＳがペプチド間の電荷ベースの相互作用を低下させるＳＤＳ−ＰＡＧＥとは異なり、ＳＥＣは界面活性剤又は還元剤を使用しない。ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をＳＥＣにかけると、約２００ｋＤａ付近にピークはなかった。これは、天然では、キメラタンパク質は二量体として存在しないことを示唆する。代わりに、６７０ｋＤａを超えるサイズを有するピークが検出された。図１８を参照されたい。このデータ及び以前のデータは、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がその天然状態で六量体として存在することを示唆する。
【０２６７】
上に示したように、非還元条件下又は還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動すると、試料及び／又は泳動緩衝液中のＳＤＳは、還元剤の有無にかかわらず、六量体のＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をそれぞれ優勢な二量体又は単量体に変換する。図１９（左ゲル）を参照されたい。ＳＤＳを欠くネイティブＰＡＧＥで泳動すると、還元剤の非存在下で、キメラタンパク質は六量体として存在する。しかしながら、還元剤（ジスルフィド結合を低下させる）の存在下で、ネイティブＰＡＧＥで泳動すると、キメラタンパク質は予想よりも重く移動した。図１９に示すように（右ゲル、レーン２）、キメラタンパク質は、実質的に、ローディングウェルから移動できなかった。このデータは、キメラタンパク質が、より高次のタンパク質にオリゴマー化されることを示唆する。そのため、キメラタンパク質において、ジスルフィド結合は、より高次のオリゴマー化を制御するのに重要であると思われる。
【０２６８】
これをさらに確認するために、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質、例えば「ＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ」を構築した。そのようなキメラタンパク質は、前述のキメラタンパク質中のＦｃドメイン間で生じるジスルフィド結合を有しない。図２０に示すように、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質をネイティブＰＡＧＥで泳動すると、どのタンパク質もそのローディングウェルから実質的に移動しなかったことから、再び、「Ｆｃを含まない」キメラタンパク質は、多数のタンパク質を含むコンカテマー様複合体を形成したことを示唆する。そのため、キメラタンパク質中のＦｃドメインの除去は、タンパク質凝集体の形成をもたらす。これらのデータは、例えば、異なるキメラタンパク質上のＦｃドメイン間の、ジスルフィド結合が、キメラタンパク質を安定化しかつ、それらが高次タンパク質／コンカテマーとしてではなく、六量体としてそれぞれ存在することを保証することを示す。言い換えれば、Ｆｃドメインは驚くべきことに、キメラタンパク質複合体に秩序をもたらす。レーン１〜４はそれぞれ、ＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを２．５μｇ、ＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを５μｇ、ＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを２．５μｇ、及びＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを５μｇ含む。
【０２６９】
図２１に示すのは、上記のデータをまとめ、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成される方法を示すモデルである。例示的なキメラタンパク質（ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）は、自然に六量体を形成する（ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用とＦｃドメインによる二量体化による）。しかしながら、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質について還元条件下で、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合の制御効果が存在せず、かつＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ中にＦｃドメインが存在しないために、これらの後者のキメラタンパク質はコンカテマーを形成する。
【０２７０】
さらに、Ｆｃドメイン（本明細書に記載の）がフィコリン（キメラタンパク質間のジスルフィド結合に必要なシステイン残基を欠く）と置換されたキメラタンパク質を構築した。Ｆｃを含まないキメラタンパク質及びＦｃを含みネイティブＰＡＧＥで還元剤の存在下で泳動したキメラタンパク質（両方ともゲル中に移動しない凝集体を形成した）と同様に、フィコリンを含むキメラタンパク質もまた、高次格子を形成するように見え、ゲル中に移動しなかった。これらのデータは、ジスルフィド結合が本発明のキメラタンパク質の適切な折りたたみ及び機能にとって重要であるという結論を強化する。
【０２７１】
最後に、キメラタンパク質を、コイル状Ｆｃドメイン（ＣＣＤＦｃ）を用いて調製した。機能評価において、ほとんどの精製タンパク質は送達されなかった。
【０２７２】
したがって、キメラタンパク質のリンカー中にＦｃドメインを含めること（これはキメラタンパク質間のジスルフィド結合を形成できる）は、不溶性で、おそらく非機能的なタンパク質コンカテマー及び／又は凝集体の形成を回避するのに役立つ。
【０２７３】
実施例１０：キメラタンパク質用の異なる結合リンカー配列の特徴付け
様々な特徴（長さ、溶解度、電荷及び柔軟性）を有する異なる特有の結合リンカー配列（１７種のリンカー）を特定した。構築物を次いで、それらの１７種の結合リンカー配列の各々を「リンカー２」の位置に組み込んで合成した。キメラタンパク質の構成は、ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃ−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２である。
【０２７４】
それらの１７種の構築物の生成レベルをＣＨＯ細胞で試験した。以下の表に、異なる結合リンカー配列、それらの結合リンカーの特徴、生成レベル（Ａ２８０による）、及びＦＡＣＳ分析に基づくＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０への結合値（ＥＣ５０）のまとめを提供する。特定の結合リンカー配列間の生成レベル及び活性のいくつかのバリエーションを決定した。
【０２７５】
【表２】
2020508329.tif 000005
2020508329.tif 000006
【０２７６】
ウェスタンブロット分析による異なる結合リンカー配列（１７種のリンカー）を有するＰＤ−１−ＩｇＧ４−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを、図２２Ａ〜図２２Ｑに示す。具体的には、融合構築物の各個々のドメインを、抗ＰＤ−１、抗ＦＣ、又は抗ＯＸ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。結果は、各キメラタンパク質間で同様の性能を示し、候補結合リンカー配列の全てが機能的であることを示唆した。
【０２７７】
さらに、異なるリンカー配列を有する各精製タンパク質を、ＥＬＩＳＡアッセイ（図２３）、及び細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ（図２４Ａ〜図２４Ｐ）におけるＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０への結合によっても特徴付けた。
【０２７８】
実施例１１：マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
腫瘍細胞は、その細胞表面上でＰＤ−Ｌ１を発現し得、それはＴ細胞により発現されるＰＤ−１に結合できる（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化を抑制する。ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインに結合したＰＤ−１の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質（すなわち、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）は、腫瘍細胞の表面上でＰＤ−Ｌ１に結合し、Ｔ細胞の表面上でＰＤ−１への結合を防止し得る（図２５Ｃ）。キメラタンパク質は次いで、腫瘍細胞の表面から「ぶら下がる」ことができ、キメラタンパク質のＯＸ４０Ｌ部分は次いで、Ｔ細胞の表面上で発現されるＯＸ４０に結合し得る。これは、阻害性ＰＤ−Ｌ１シグナルの共刺激ＯＸ４０Ｌシグナルによる置換をもたらして、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強し得る。
【０２７９】
マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６０システムを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。具体的には、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＯＸ４０、及びＦｃＲｎに対するキメラタンパク質の親和性を決定し、組換え対照タンパク質と比較し、その結果を以下の表に示す。
【０２８０】
【表３】
2020508329.tif 000007
【０２８１】
ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＳＰＲを用いてチップに結合したｍＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（９．８ｎＭ）、ＰＤ−Ｌ２−Ｈｉｓ（１０．６ｎＭ）、ＯＸ４０−Ｈｉｓ（９．６２ｎＭ）、及びＦｃＲｎ−Ｈｉｓ（５５．６ｎＭ）に結合した。対照タンパク質（ＰＤ−１−Ｆｃ、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、及びＩｇＧ２Ａ）の結合も示された。ＦｃγＲ１へのｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合は検出されなかった。
【０２８２】
追加の分析を行って、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が生細胞の表面上でその標的を結合できるかどうかを決定した。マウスＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＯＸ４０へのｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ結合を評価するために、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯＫ１でトランスフェクトして、マウスＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＯＸ４０を安定発現させた（図２６Ａ）。ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、各親及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。全ての工学処理細胞株（ＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ１、ＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ２、及びＣＨＯＫ１／ｈＯＸ４０）は、図２６Ｂに示すように、低いｎＭで濃度依存的にｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに結合した。ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、それらが検出可能なレベルのヒトＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０、又はＰＤ−Ｌ２を発現しなかったので、親のＣＨＯＫ１細胞に結合しなかった。しかしながら、ＣＨＯＫ１−ＰＤ−Ｌ１、ＣＨＯＫ１−ＰＤ−Ｌ２、及びＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０細胞のほぼ全集団が著しくシフトし、キメラタンパク質の異なる成分が生細胞上のそれぞれの受容体／リガンドに結合できることを示した（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。
【０２８３】
ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を、スーパー抗原サイトカイン放出アッセイを用いて評価した。このアッセイでは、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）の濃度の上昇を用いて、様々な試験剤の存在下でヒト末梢血白血球を活性化した。培養上清中に分泌されるＴＮＦα又はＩＬ−２の量を、抑制シグナル伝達事象を遮断するか、又は免疫活性化シグナルを共刺激するかのいずれかの試験剤の能力の機能的読み出しとして監視した。図２６Ｃに示すように、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、他の試験剤、すなわち、ＰＤ−１−Ｆｃ、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、及びＰＤ−１−Ｆｃ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃと比較して、より高いレベルでＩＬ−２の分泌を誘導した（上の曲線）。しかしながら、図２６Ｄに示すように、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質及びＰＤ−１−Ｆｃ／ＯＸ４０Ｌ−ＦＣは、他の試験剤：ＰＤ−１−ＦＣ及びＯＸ４０Ｌ−Ｆｃと比較して、最高レベルの分泌ＴＮＦαを誘導した（上の２つの曲線）。培地及びＩｇＧ対照を使用した。全体として、これらの結果は、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がインビトロで初代白血球を機能的に活性化して、ＴＮＦα及びＩＬ−２を放出することを示唆する。
【０２８４】
図２７Ａ〜図２７Ｆは、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がＣＴ２６腫瘍再負荷モデルにおいて著しい抗腫瘍活性を有することを実証するインビボ腫瘍研究からの結果を示す。ＣＴ２６腫瘍を接種したマウスを交代で、対照抗体と共に、又はｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の３つの用量の１つ（すなわち、１００μｇ、１５０μｇ及び３００μｇ）で２回、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−Ｌ１とＯＸ４０抗体の組み合わせ、抗ＰＤ−１抗体とＯＸ４０抗体の組み合わせで処置した（下のパネル参照）。具体的には、腫瘍接種を０日目、第１の処置を５日目に、２回目の処置を７日目に行った。腫瘍再負荷（薬物での再処置を行うことなく反対側の腹上に第２の腫瘍を移植）を、原発腫瘍を拒絶した全てのマウスで３０日目に行った。マウスをＣＴ２６腫瘍細胞で再負荷した。図２７Ａは、各グループの腫瘍接種後６５日にわたる腫瘍サイズの発達を示す。重要なことに、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、効果的に腫瘍細胞を死滅させることができ、かつ／又は再負荷時（癌の再発を示す）に腫瘍成長を低下させることができる。そのため、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、再発を防止できる記憶応答を生じさせるように見える。
【０２８５】
図２７Ｂ及び図２７Ｃは、腫瘍接種後４０日間のマウスの全体的な生存率及び統計並びに腫瘍拒絶反応を示す。図２７Ｄは、キメラタンパク質及び他のベンチマーク抗体で処置したマウスの腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の変化を示す。図２７Ｅは、キメラタンパク質及び他のベンチマーク抗体で処置したマウスの脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の変化を示す。図２７Ｆに、各グループの治療結果をまとめる。図２７Ｄ及び図２７Ｅについては、処置したマウスのコホートを、最初の腫瘍接種後１３日後に安楽死させた。腫瘍及び脾臓を分離し、解離し、フローサイトメトリーによりエフェクター及び非エフェクター／Ｔｒｅｇ集団の割合について分析した。
【０２８６】
全体的に、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの投与は、ＣＴ２６大腸癌モデルにおいて腫瘍サイズを著しく低下させた。特に、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの使用は、ＯＸ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体よりも大きな腫瘍退縮をもたらした（図２７Ｇ）。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、低用量（１００μｇ、図２７Ｇ）及びより高い用量（３００μｇ、図２７Ｈ）で、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗体の組み合わせを上回った。サイトカインシグニチャーは、１００μｇが準最適用量であることを示唆する。より高い用量（３００μｇのキメラタンパク質対２７００μｇのｍＡｂ）では、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、抗ＰＤ−１／Ｌ１＋抗ＯＸ４０  ｍＡｂの組み合わせを著しく上回った。図２７Ｇ及び図２７Ｈにおいて、「ＡＲＣ融合タンパク質」と特定されたデータは、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を指す。
【０２８７】
上記のデータは、とりわけ、少なくとも癌の治療における、インビボのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの機能活性を明確に実証する。
【０２８８】
実施例１２：ヒトＰＤ−１−ＦＣ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイが、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−２７９２５２とも呼ばれる）の異なるドメインのそれぞれの結合パートナーへの結合親和性を実証するために開発された。図２８Ａは、Ｆｃの結合パートナーであるヒトＩｇＧへの、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出を示す（四角の記号）。ヒトＩｇ（ｈＩｇ）を標準物質として用いた（円の記号）。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて一般に、中央のＦｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出すると、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、このアッセイでは標準物質と比較して低レベルのｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が検出された。図２８Ｂは、受容体ＯＸ４０、すなわち、ＯＸ４０Ｌの結合パートナーへの、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出を示す（四角の記号）。組換えＯＸ４０Ｌ−Ｆｃを使用して、標準曲線を作成した（円の記号）。図２８Ｃは、同時に両方の標的（ＰＤ−Ｌ１及びＯＸ４０−Ｈｉｓ）を結合し及びそれらと関与するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの能力を実証するデュアル結合ＥＬＩＳＡアッセイを示す。漸増濃度のｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、固定量のプレート結合組換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質とインキュベートした。その後、組換えＯＸ４０−Ｈｉｓタンパク質又は対照Ｈｉｓタグ付きタンパク質（ＨＶＥＭ−Ｈｉｓ）を複合体とインキュベートし、ＨＲＰコンジュゲート抗ＨＩＳ抗体を介して結合を検出した。結果は、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬがＰＤ−Ｌ１及びＯＸ４０に、同時にかつ高い特異性で結合することを明らかに示す。
【０２８９】
ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質が、インビトロで生細胞の表面上のその標的を結合できるかどうかを決定するために追加の分析を行った。ヒトＯＸ４０受容体へのｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を評価するために、ヒトＡＭＬ  Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔを、ＯＸ４０を過剰発現するように工学処理し、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０細胞を作製した（フローサイトメトリーによって検証した；図２９、右パネル）。ＰＤ−Ｌ１への結合を評価するために、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯＫ１を、ヒトＰＤ−Ｌ１を安定に発現させるためにトランスフェクトした（図２９Ａ、左パネル）。ヒトＰＤ−Ｌ２への結合を評価するために、ＣＨＯＫ１細胞を、ヒトＰＤ−Ｌ２を安定に発現させるためにトランスフェクトした（図２９Ａ、中央パネル）。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、各親細胞株及び過剰発現細胞株の各々と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出用の抗体で染色した。左側及び中央のヒストグラムについては、親のＣＨＯＫ１（右側の細胞集団）及びＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ１（左側の細胞集団）細胞を、それぞれｈＰＤ−Ｌ１抗体又はｈＰＤ−Ｌ２抗体を用いるフローサイトメトリーにより評価した。右のヒストグラムにおいて、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（右側の細胞集団）及びＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０（左側の細胞集団）を、ｈＯＸ４０抗体を用いるフローサイトメトリーにより評価した。全ての工学処理細胞株（ＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ１、ＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ２、及びＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０）は、低いｎＭで濃度依存的にｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに結合した。
【０２９０】
図２９Ｂ〜図２９Ｄに示すように、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、それらが検出可能なレベルのヒトＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２を発現しなかったので、親のＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合しなかった。同様に、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、それらが検出可能なレベルのＯＸ４０を発現しなかったので、親のＪｕｒｋａｔ細胞に結合しなかった。しかしながら、ＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−Ｌ１、ＣＨＯＫ１−ＰＤ−Ｌ２、及びＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０細胞のほぼ全集団が著しくシフトし、キメラタンパク質の異なる成分が生細胞上でそれぞれの受容体／リガンドに結合できることを示した。インビトロ細胞結合親和性は、ＳＬ−２７９２５２−ＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ１では２６．１１ｎＭであり、ＳＬ−２７９２５２−ＣＨＯＫ１／ｈＰＤ−Ｌ２では７．６０ｎＭであり、かつＳＬ−２７９２５２−Ｊｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０では６．２８ｎＭであった。
【０２９１】
次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を行って、ＳＬ−２７９２５２がｈＰＤ−Ｌ１、ｈＰＤ−Ｌ２、及びｈＯＸ４０に結合する親和性を決定した。具体的には、組換えヒトＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、又はＯＸ４０のポリヒスチジンタグ付きバージョンが、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＨＴＧ  トリス−ＮＴＡチップ（ＢＩＯＲＡＤ）に結合した。その後、ＳＬ−２７９２５２は、時間とともに結合リガンドを越えて流れ、「オン速度」（Ｋａ）と「オフ速度」（Ｋｄ）の相対指数を得て各パートナーに対するＳＬ−２７９２５２の結合親和性（ＫＤ）を計算した。組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃ及びＯＸ４０Ｌ−Ｆｃを、結合のための正の対照として使用した。これらの対照は、比較的速い「オン速度」及び等しく速い「オフ速度」を有し、低いナノモルの結合親和性をもたらす。ＳＰＲ結合親和性の結果は、融合タンパク質の各部分に対する高い親和性結合を実証した（エフェクター機能を有するＦｃ受容体に対するものを除く）。重要なことに、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのオフ速度は、ベンチマーク対照タンパク質のオフ速度よりもはるかに遅かった：ＰＤ−Ｌ１からのｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ解離は、ＰＤ−１−Ｆｃよりも１８倍長く、ＰＤ−Ｌ２からはＰＤ−１−Ｆｃより１３．４倍長く、ＯＸ４０からはＯＸ４０Ｌ−Ｆｃよりも３６．３２倍長かった。まとめると、これらの結果は、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に結合した場合に、長い滞留時間を有したことを示した。
【０２９２】
上記のデータは、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＳＬ−２７９２５２）の異なるドメインが、哺乳動物細胞膜の表面上でそれらのネイティブ結合パートナー（例えば、受容体又はリガンド；ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＯＸ４０）を結合することを明確に実証する。
【０２９３】
ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ−２７９２５２）の全３つのドメインが無傷であり、かつタンパク質検出アッセイによって認識できることを確認するために、ヒト抗ＰＤ−１、抗ＦＣ、及び抗ＯＸ４０Ｌでプローブした精製融合タンパク質にてウェスタンブロット分析を行った（図３０）。ＳＬ−２７９２５２を全３つの抗体によって検出し、タンパク質を還元条件下で泳動すると、タンパク質は約７５ｋＤａの位置に移動した。非還元タンパク質の約５０％が二量体として泳動し、ＯＸ４０Ｌのシグナル伝達及び機能に関連するインビボオリゴマー化を考慮すると、それは潜在的に都合がよかった。ＳＬ−２７９２５２の予測分子量は６０．３ｋＤａであった。ＳＬ−２７９２５２の還元画分は、より高い分子量で検出され、これは、理論に縛られることなく、グリコシル化に起因し得る。これを、ＳＬ−２７９２５２をタンパク質の脱グリコシラーゼ、ＰＮＧアーゼＦで処理することによって検証した。脱グリコシル化後に、ＳＬ−２７９２５２の還元画分は６０．３ｋＤａの予測分子量の位置に正確に移動した。これは、ＳＬ−２７９２５２が、タンパク質の適切な折りたたみ及び安定性、並びに細胞間接着に不可欠な役割を果たす、グリコシル化を通じて、翻訳と同時に／翻訳後に修飾されたという証拠を提供した（Ｄａｌｚｉｅｌ  Ｍ，Ｄｗｅｋ  ＲＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；Ｍａｖｅｒａｋｉｓ  Ｅ，Ｌｅｂｒｉｌｌａ  ＣＢ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２０１５）。
【０２９４】
ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質はグリコセラーゼ修飾を保持したので、さらなる分析を行って、そのグリコシル化状態がその機能に影響を与えたかどうかを決定した。ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを、脱グリコシアラーゼＰＮＧアーゼＦで処理し、次いでｈＯＸ４０へのその結合を、日常的な機能ＥＬＩＳＡ（図３１Ａ）及びｈＯＸ４０を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を用いる細胞結合アッセイ（図３１Ｂ）で評価した。ｈＯＸ４０を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞株を対照として用いた。結果は、グリコシル化が相互作用するパートナーへのｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ結合において重要な役割を果たさなかったことを示した。
【０２９５】
次に、ＥＬＩＳＡベースのブロッキング／競合アッセイを行って、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌがプレート結合組換えヒトＰＤ−Ｌ１への結合についてヒトＰＤ−１−ビオチンを上回ることができることを実証した。このアッセイでは、組換えヒトＰＤ−Ｌ１で高結合ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のシグナルは、組換えヒトＰＤ−１−ビオチン、続いて、アビジン−ＨＲＰアビジンでの検出を用いて生成された。図３２Ａに示すように、負の対照（ＰＤ−Ｌ１結合ドメインを含有するキメラタンパク質）の場合、ＰＤ−１−ビオチンに対するシグナルは破壊されなかった（図３２Ａ、上の曲線／四角の記号）。特に、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、濃度依存的に、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１−ビオチン結合を阻止した（それによってＨＲＰシグナルを減少させる）（図３２Ａ、下の曲線／円の記号）。このアッセイの結果は、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、６．６８ｎＭの計算されたＩＣ５０で、組換えヒトＰＤ−Ｌ１への結合についてＰＤ−１−ビオチンと強く競合することを実証した。
【０２９６】
サイトカイン放出腫瘍共培養アッセイを行って、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がＴ細胞中でＩＬ−２の発現を誘導できることを実証した。図３２Ｂに示すように、初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの存在下又は非存在下で、ＰＤ−Ｌ１低又はＰＤ−Ｌ１高ヒト腫瘍細胞とインキュベートし、したがって、ＩＬ−２分泌及びフローサイトメトリーベースの免疫評価を用いてＴ細胞のエフェクター機能及び増殖の評価を可能にした。具体的には、ヒト末梢血白血球を、密度勾配遠心分離により単離し、続いて、ＣＤ３＋細胞について負の濃縮、及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによるその後の活性化を行った。活性化細胞を次いで、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（５００ｎｇ及び５μｇの濃度）の存在下又は非存在下で、ＰＤ−Ｌ１低前立腺癌細胞（ヒトＰＣ３）又はＰＤ−Ｌ１高肺腺癌細胞（ヒトＨＣＣ８２７）のいずれかと共培養した。生成され細胞培養上清中に分泌されたＩＬ−２の量を次いで、ＥＬＩＳＡによって測定した（図３２Ｃ）。ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＨＣＣ８２７細胞（図３２Ｃ、右の一団）でよりもＰＣ３細胞（図３２Ｃ、左の一団）で、より高いレベルのＩＬ−２の分泌を誘導した。ヒトＴ細胞がＨＣＣ８２７細胞株と共培養した場合よりもＰＣ３細胞株と共培養した場合に顕著により多くのＩＬ−２を生成したので、これはＰＤ−Ｌ１の量がＩＬ−２生成を阻害することを示唆した（図３２Ｃ）。しかしながら、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを共培養物に添加すると、ＩＬ−２生成の増加が両方の共培養システムで観察された。ＩＬ−２分泌量を測定することに加えて、共培養アッセイから活性化Ｔ細胞を採取し、細胞内フローサイトメトリーにより分析した。これらのデータは、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方でＫｉ６７、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα染色を増加させたことを示した（図３２Ｄ）。
【０２９７】
ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を特徴付ける別の機能アッセイは、スーパー抗原サイトカイン放出アッセイである。このアッセイでは、漸増濃度のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いて、様々な試験剤の存在下でヒト末梢血白血球を活性化した。工程のフローチャートを図３２Ｅに示す。培養上清中に分泌されたＴＮＦα（図３２Ｆ）又はＩＬ−２（図３２Ｇ）の量を、抑制性シグナル伝達事象を阻止するか、又は免疫活性化シグナルを共刺激する試験剤の能力の機能的読み出しとして監視した。図３２Ｆ及び図３２Ｇに示すように、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、他の試験剤ＰＤ−１−Ｆｃ、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ、及びＰＤ−１−Ｆｃ／ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃと比較して、より高いレベルでＴＮＦαの分泌及びＩＬ−２の分泌（上の曲線）を誘導した。培地及びＩｇＧ対照を使用した。まとめると、これらの結果は、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がインビトロで初代ヒト白血球細胞を機能的に活性化したことを示唆する。
【０２９８】
最後に、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、アカゲザル由来のＯＸ４０及びカニクイザル由来のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２への、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性及び交差反応性を実証した。図３３Ａに示すように、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、プレート結合組換えｃｍＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、結合を、ＨＲＰコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体によって検出した。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、２つの異なる供給源（四角及び三角の記号）から使用した。ヒトＣＤ１２０ｂ−Ｆｃ−ＴＧＦｂキメラタンパク質（反転三角記号）を対照として使用し、組換えｃｍＰＤ−１−ｈＦｃを用いて、標準曲線を作成した（円の記号）。これらの結果は、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がｃｍＰＤ−Ｌ１と交差反応したことを示す。
【０２９９】
ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、プレート結合組換えｃｍＰＤ−Ｌ２に特異的に結合し、結合を、ヤギ抗ｈＯＸ４０Ｌ抗体へのＨＲＰコンジュゲート抗ヤギＩｇＧ結合を介して検出した。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、２つの異なる供給源（図３３Ｂ、四角及び円の記号）から使用した。ヒトＣＤ１２０ｂ−Ｆｃ−ＴＧＦｂキメラタンパク質（図３３Ｂ、三角の記号）を対照として用いた。図３３Ｃに示すように、２つの異なる供給源（四角及び円の記号）由来のヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質及びｈＣＤ１２０ｂ−Ｆｃ−ＴＧＦｂキメラタンパク質（三角の記号）の、プレート結合ｒｍＯＸ４０への結合が実証された。結合を、ヤギ抗ｈＯＸ４０Ｌ抗体に結合するＨＲＰコンジュゲート抗ヤギＩｇＧにより検出した。したがって、上記のデータは、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がｃｍＰＤ−Ｌ１、ｃｍＰＤ−Ｌ２、及びｒｍＯＸ４０と交差反応したことを実証する。
【０３００】
実施例１２：マウスＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
５４８個のアミノ酸残基を有する単量体ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（ＳＬ−３６６２５２）のコンピューターシミュレーション構造予測を行い、ｐ値は５．１×１０−１７であった。単量体タンパク質の分子量は６１．６ｋＤａであると予測された。キメラタンパク質の構造を図３４に提供する。
【０３０１】
具体的には、構造予測は、６つの位置（１％）が無秩序であり得ることを明らかにした。キメラタンパク質の配列全体の２次構造予測は、タンパク質が３％のα−ヘリックス（Ｈ）、４３％のβ−シート（Ｅ）、及び５１％のコイル（Ｃ）の組成を有することを示した。絶対グローバル品質のＧＤＴ（グローバル距離検定）及びｕＧＤＴ（非正規化ＧＤＴ）も、キメラタンパク質について計算し、４８１（８７）の全体的なｕＧＤＴ（ＧＤＴ）を得た。タンパク質残基の溶媒アクセシビリティに関する３つの状態予測は、３５％の露出（Ｅ）、４９％の中間（Ｍ）、及び１４％埋没（Ｂ）であった。
【０３０２】
マウスＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を構築した。キメラタンパク質を、キメラタンパク質の各個々のドメインに対して、すなわち、抗ＴＩＭ３、抗Ｆｃ、及び抗ＯＸ４０Ｌ抗体によってウェスタンブロット分析を行うことによって特徴付けた。ウェスタンブロットは、非還元レーン（図３５、各ブロットのレーン２）における優勢の三量体バンドの存在を示し、これは還元剤β−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図３５、各ブロットのレーン３）。図３５、各ブロットのレーン４に示すように、キメラタンパク質は還元剤（β−メルカプトエタノール）とエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で、６１．６ｋＤａの予測分子量で単量体として移動した。
【０３０３】
細胞結合アッセイを行って、哺乳動物細胞膜の表面上でのそれぞれの結合パートナーに対するｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証した。細胞結合アッセイのために、不死化細胞株を、マウス受容体ＯＸ４０（ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０）を安定に発現するように工学処理した。漸増濃度のｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを、各親細胞株（対照）及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。図３６に示すように、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、低いｎＭ親和性で濃度依存的に、工学処理細胞株（ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０）に結合した。具体的には、ＣＨＯＫ１親細胞株（下の曲線）は、ｍＯＸ４０を過剰発現しなかったため、増加濃度のｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質に応答しなかった。これに対し、ｍＯＸ４０を過剰発現したＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０細胞株は、濃度依存的にｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに結合した。細胞結合アッセイも、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが１５．２ｎＭの親和性でｍＯＸ４０に結合することを示した。
【０３０４】
インビボ機能アッセイを行って、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を実証した。マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を接種した。腫瘍が触知可能で、直径が少なくとも４〜６ｍｍになった時に、マウスを、１５０μｇのｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の２回の用量で処置した。免疫フェノタイピングを、移植後１３日目にマウスから採取した様々な組織にて行った。
【０３０５】
免疫プロファイリングを、マウスＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置した腫瘍担持マウスにて行った。図３７Ａに示すように、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、対照処置群（図３７Ａの左の一団）と比較して、脾臓、末梢リンパ節及び腫瘍においてより高い割合の全ＣＤ４＋Ｔ細胞を示した（図３７Ａの右の一団）。脾臓及び腫瘍内では、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団のこの増加は、主にＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の増加によるものであり、非制御性Ｔ細胞の活性化が関与したという考えと一致した（図３７Ｂ）。処置したマウスはまた、より低い割合のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞も示し、キメラタンパク質によって制御性Ｔ細胞が抑制され得ることを示唆した（図３７Ｂ）。
【０３０６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍抗原の認識を刺激するキメラタンパク質の能力も解析した。具体的には、図３７Ｃは、ＣＴ２６腫瘍により天然に発現されるＡＨ１腫瘍抗原を認識したＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を決定するための四量体染色分析を示す。脾臓内では、未処置マウス（図３７Ｃの左の一団）と比較して、より高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞が、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウス（図３７Ｃの右の一団）において、ＡＨ１腫瘍抗原を認識することが判明した。特に、はるかにより高い割合のＡＨ１四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、未処置対照マウス（図３７Ｃの右の一団）と比較してキメラタンパク質で処置したマウス（図３７Ｃの右の一団）について、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）内で観察された。
【０３０７】
ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を、ＭＣ３８及びＣＴ２６マウス大腸腫瘍モデルを用いて分析した。一組の実験で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、かつ／又は３０日目にＣＴ２６腫瘍細胞の２回目の接種を行った。腫瘍成長の４日後に、腫瘍が直径４〜５ｍｍに達すると、マウスを、対照抗体又は１５０μｇのｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかで処置した。処置を７日目に繰り返した。腫瘍接種後４５日間にわたって腫瘍サイズの発達の分析を行った。
【０３０８】
図３８Ａに示すように、未処置マウスは顕著な腫瘍を発症したが、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスはいずれも、検出可能なサイズの腫瘍を発症しなかった。重要なことに、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、再負荷時（癌の再発を示す）に、腫瘍細胞を効果的に死滅させることができ、かつ／又は腫瘍の増殖を低下させることができる。したがって、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、再発を防止できる記憶応答を生じさせるように見える。腫瘍接種後５０日までのマウスの全生存率（図３８Ｂ）は、未処置マウスの全てが腫瘍接種後２１日以内に死亡したのに対して、ｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは腫瘍接種後５０日目に１００％の生存率を示したことを示す。図３８Ｃに、各グループの処置の結果をまとめる。
【０３０９】
上記のデータは、とりわけ、少なくとも、癌の治療における、インビボのｍＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの機能活性を明確に実証する。
【０３１０】
等価物
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解され、本出願は、一般的に、本発明の原理に従い、かつ本開示からのそのような逸脱を含めて、本発明が関連する技術の中で公知又は慣習的な慣行に入り、かつ本明細書で前述し、かつ以下の添付の特許請求の範囲の中の本質的な特徴に適用され得るので、本発明の任意のバリエーション、用途、又は適応を包含することが意図される。
【０３１１】
当業者は、日常的な実験を超えることをせずに、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態に対して多数の等価物を認識するか、又は確定できる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０３１２】
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１３】
本明細書に記載の出版物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本明細書において、本発明が前の発明によってそのような出版物に先行する権利がないことを認めるものは何もない。
【０３１４】
本明細書で使用する全ての見出しは、単なる構成のためのものであり、いかなる方法においても開示を制限することを意図しない。任意の個々の節の内容は、全ての節に等しく適用され得る。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ−１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−２２Ｄ】
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【図２２Ｅ−２２Ｈ】
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【図２２Ｉ−２２Ｌ】
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【図２２Ｍ−２２Ｐ】
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【図２２Ｑ】
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【図２３】
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【図２４Ａ−２４Ｂ】
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【図２４Ｃ−２４Ｄ】
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【図２４Ｅ−２４Ｆ】
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【図２４Ｇ−２４Ｈ】
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【図２４Ｉ−２４Ｊ】
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【図２４Ｋ−２４Ｌ】
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【図２４Ｍ−２４Ｎ】
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【図２４Ｏ−２４Ｐ】
2020508329.tif 000051
【図２５Ａ−２５Ｃ】
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【図２６Ａ−２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ−２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ−３２Ｃ】
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【図３２Ｄ−３２Ｇ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ−３７Ｃ】
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【図３８Ａ−３８Ｃ】
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【図３９】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月23日(2019.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020508329000001.app
【国際調査報告】
2020508329.tif 000079
2020508329.tif 000080