(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、バイオフィルムを、抗菌剤または抗菌エッセンシャルオイルと組み合わせて有効量の１つまたは複数のバイオフィルム分解酵素を含む組成物と接触させることを含む、バイオフィルムに対抗する方法を提供する。バイオフィルムは、生物または非生物の表面上にあってもよく、医学的および非医学的使用および方法の両方が提供される。好ましい態様において、本発明は、対象、特に口腔におけるバイオフィルム感染の治療または予防に使用するための組成物および方法を提供する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、前記組成物の送達のための生物学的に許容される担体に、相乗的に作用してバイオフィルム構造を分解し、バイオフィルムの沈着を阻害する、１つ以上のエッセンシャルオイルおよび少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素を有する組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、前記エッセンシャルオイルがメントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの１つ以上を含み、前記少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素がムタナーゼ、デキストラナーゼ、およびグルコアミラーゼから選択される組成物。
【請求項３】
請求項２記載の組成物において、前記エッセンシャルオイルがメントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルであり、前記バイオフィルム分解酵素がムタナーゼおよびデキストラナーゼである組成物。
【請求項４】
請求項２記載の組成物において、前記バイオフィルム分解酵素が植物色素体で産生される組成物。
【請求項５】
請求項３記載の組成物において、さらに、
グルコアミラーゼを有するものである組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物において、前記バイオフィルム分解酵素が、デキストラナーゼとムタナーゼとの比が５：１である組成物。
【請求項７】
組成物であって、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、およびグルコアミラーゼから選択される１つ以上のバイオフィルム分解酵素の有効量と、メントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のエッセンシャルオイルとを、経口送達に適した担体において有し、前記担体が、マウスウォッシュ、マウスリンス、マウススプレー、練り歯磨き、チューインガム、歯用のゲル、歯肉下ゲル、ムース、フォーム、咀嚼錠、歯磨剤、ロゼンジ、および溶解性ストリップから成る群から選択される組成物。
【請求項８】
請求項７記載の組成物において、前記担体がマウスウォッシュ、マウスリンス、またはマウススプレーである組成物。
【請求項９】
請求項７記載の組成物において、前記担体がチューインガム、咀嚼錠、ロゼンジ、または溶解性ストリップである組成物。
【請求項１０】
請求項７記載の組成物において、前記担体がチューインガムである組成物。
【請求項１１】
請求項７記載の組成物において、前記エッセンシャルオイルが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの組み合わせを含む組成物。
【請求項１２】
口腔から望ましくないバイオフィルムを分解および／または除去する方法であって、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つまたは複数のバイオフィルム分解酵素の有効量、およびメントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のエッセンシャルオイルを、前記バイオフィルムを有する口腔の表面に投与する工程を有し、前記フィルムを分解する前記酵素および前記エッセンシャルオイルが殺菌効果を発揮し、それにより、前記望ましくないバイオフィルムを相乗的に低減または排除する方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、前記１つ以上のエッセンシャルオイルが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびメチルサリチル酸から選択される少なくとも２つのエッセンシャルオイルを含む方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記エッセンシャルオイルが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの組み合わせを含む方法。
【請求項１５】
請求項１２、請求項１３、または請求項１４のいずれか一項に記載の方法において、共生細菌Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉおよびＳ．ｏｒａｌｉｓに悪影響を与えることなく、病原性Ｓ．ｍｕｔａｎｓを選択的に死滅させるのに有効である方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法において、前記投与工程が、最初に前記バイオフィルム分解酵素を投与し、続いて前記エッセンシャルオイルを投与することを含む方法。
【請求項１７】
口腔の表面へのバイオフィルムの沈着を抑制する方法であって、バイオフィルムの沈着の影響を受けやすい口腔の表面と、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つまたは複数のバイオフィルム分解酵素の有効量と接触させ、メントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のエッセンシャルオイルを、前記バイオフィルムを有する前記口腔の表面に接触させる工程を有し、前記バイオフィルムを分解する前記酵素および前記エッセンシャルオイルが殺菌効果を発揮し、それにより、前記望ましくないバイオフィルムの沈着を相乗的に抑制する方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、抗菌性の経口リンスが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルから選択される少なくとも２つのエッセンシャルオイルを含む方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記エッセンシャルオイルが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの組み合わせを含む方法。
【請求項２０】
請求項１７、請求項１８、または請求項１９のいずれか一項に記載の方法において、共生細菌Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉおよびＳ．ｏｒａｌｉｓに悪影響を与えることなく、病原性Ｓ．ｍｕｔａｎｓを選択的に死滅させるのに有効である方法。
【請求項２１】
請求項１７記載の方法において、前記投与工程が、最初に前記バイオフィルム分解酵素を投与し、続いて前記エッセンシャルオイルを投与することを含む方法。
【請求項２２】
請求項４記載の組成物において、さらに、
植物の残骸を有するものである組成物。
【請求項２３】
請求項２０記載の組成物において、前記植物がタバコまたはレタス植物である組成物。
【請求項２４】
請求項１記載の組成物において、前記酵素が組換え体であり、細菌中で融合タンパク質として発現され、そこから精製される組成物。
【請求項２５】
請求項１記載の組成物において、前記酵素が、非組換え酵素発現細菌から精製される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年５月１２日に提出されたＰＣＴ／米国特許第出願公開第２０１７／０３２４３７号に対する優先権を主張し、その開示全体がこの参照により本明細書に組み込まれるかのように本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号：Ｒ０１  ＨＬ１０７９０４およびＲ０１  ＨＬ１０９４４２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、バイオフィルム沈着および疾患の治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、齲蝕および他の口腔疾患の治療に有用な組成物および方法を提供する。本発明はまた、望ましくないバイオフィルムの沈着を防止するための生物医学機器をコーティングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
本発明が関係する最新技術を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
現在のシステムで生産されるバイオ医薬品は法外に高価であり、世界人口の大多数にとって妥当な価格ではない。タンパク質医薬品のコスト（２０１３年に１，４００億ドル）は、世界各国のＧＤＰの７５％を超える［Ｗａｌｓｈ  ２０１４］ため、妥当でない価格になっている。世界人口の３分の１が１日２ドル未満の稼ぎであり、タンパク質医薬品（米国の恵まれない高齢者や低年齢の社会経済グループを含む）を購入する余裕はない。このような高コストは、法外に高価な発酵槽でのタンパク質の生産、精製、冷蔵輸送／貯蔵、保存期間の短縮、および無菌送達方法に関連している［Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５，２０１６］。
【０００６】
バイオフィルムは、医療機器の表面に存在するエキソポリサッカライドマトリックスに付着する微生物細胞の複雑な群によって形成される。医療機器の移植に関連するバイオフィルム関連の感染は、深刻な問題を引き起こし、機器の機能に悪影響を及ぼす。口腔および整形外科手術で使用される医療用インプラントは、ステンレス鋼やチタンなどの合金を使用して製造されている。細菌の付着は周囲の組織の損傷に関連し、頻繁にインプラントの機能不全を引き起こすため、表面特性を改善し、生体統合を促進し、細菌の付着を抑制するために、様々な物理的および化学的手法による医療用インプラントの表面処理が試みられてきた。
【０００７】
ヒトの多くの感染症は、バイオフィルムによって引き起こされており、口の中で生じるものを含んでいる［Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｒｓｈ、ｅｔ  ａｌ  ２０１１］。例えば、齲蝕（または歯の衰退）は、単独のバイオフィルム関連の最も一般的な口腔疾患であり、米国および世界中の大半の恵まれない子供や大人を苛ませ、年間８１０億ドル以上の支出をもたらしている［Ｂｅｉｋｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｅｍｍｉｇ，２０１１；Ｄｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｋａｓｓｅｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１５］。齲蝕惹起の（齲蝕原性）バイオフィルムは、細菌が歯の表面に蓄積すると発達し、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）などの高分子物質で構成される細胞外マトリックスにしっかりと付着し、絡み合った細菌細胞の組織クラスタを形成する［Ｂｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏ，２０１１］。齲蝕原性バイオフィルムを制御するための現在の局所的な抗菌法は限られている。クロルヘキシジン（ＣＨＸ）は、経口抗菌薬療法の「ゴールドスタンダード」と考えられているが、歯の染みや結石の形成などの副作用があり、毎日治療で使うのには推奨しない［Ｊｏｎｅｓ，１９９７；Ａｕｔｉｏ−Ｇｏｌｄ，２００８］。別の方法として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓなどの齲蝕惹起の口腔病原体に対して潜在的な抗バイオフィルム効果を持ついくつかの抗菌ペプチド（ＡＭＰｓ）が登場した［ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５］。
【０００８】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は自然免疫応答の進化的に保存されたコンポーネントであり、人間を含む様々な生物で自然に発見される。従来の抗生物質と比較した場合、ＡＭＰは、耐性の発現が起こりにくい。それらは細菌、真菌、ウイルスに対して強力に活性であり、表面抗原との融合により特定の病原体を標的とするように調整することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１；ＤｅＧｒａｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。線形ＡＭＰｓは、複雑な二次構造を持つＡＭＰと比較した場合、安定性または抗菌活性が劣っている。例えば、レトロサイクリンまたはプロテグリンは、環化すると（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）、またはジスルフィド結合形成によりヘアピン構造を形成すると（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）、高い抗菌活性または安定性を示す。ＲＣ  １０１は、ｐＨ３、４、７、温度２５°Ｃから３７°Ｃで、またヒトの膣液で４８時間（Ｓａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１ａ）にわたり極めて安定しているが、抗菌活性が維持されたのは最大６か月間であった（Ｓａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１ｂ）。同様に、プロテグリンは塩またはヒトの体液で非常に安定している（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００２；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）が、線形化すると効力が失われる。複雑な二次構造を持つ抗菌ペプチドのこれらの興味深い特徴は、新規治療薬の開発を促進する可能性がある。しかし、十分な量の抗菌ペプチドを生産するための高いコストは、それらの臨床的開発と商業化にとっての大きな障壁である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、バイオフィルム構造を分解し、バイオフィルム沈着を阻害するために相乗的に作用する少なくとも１つの抗菌ペプチド（ＡＭＰ）および少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素を含む多成分組成物が提供される。特定の実施形態では、ＡＭＰは、プロテグリン１、ＲＣ−１０１、および表１に列挙されたＡＭＰから選択される。バイオフィルム分解酵素には、例えば、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＤＮＡアーゼ、ディスパーシンＢ、グリコシドヒドロラーゼ、および表２で提供される酵素が含まれる。特定の実施形態では、これらの酵素のコード配列は、植物の葉緑体での発現のためにコドン最適化されている。特に好ましい実施形態では、少なくとも１つのＡＭＰおよび少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素は組換えにより産生される。特に好ましい実施形態では、ＡＭＰおよびバイオフィルム分解酵素は融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、酵素は化学的に合成されるか、微生物から得られるか、商業的供給業者から得られる。組成物が口腔疾患の治療用である場合、組成物は、抗生物質、フッ化物、ＣＨＸ、エッセンシャルオイル、または上記のすべてを任意選択でさらに含んでもよい。組成物は、チューインガム、ハードキャンディー、または口腔リンス内に含まれていてもよい。本発明の好ましい融合タンパク質には、バイオフィルムの分解に単独でまたは組み合わせて使用する、ＰＧ−１−Ｍｕｔ、ＰＧ−１−Ｄｅｘ、ＰＧ−１−Ｍｕｔ−Ｄｅｘ、ＲＣ−１０１−Ｍｕｔ、ＲＣ−１０１−Ｄｅｘ、ＲＣ−１０１−Ｍｕｔ−Ｄｅｘが含まれるが、これらに限定されない。特に、表１に列挙されたＡＭＰのいずれかが、前述の融合タンパク質のＰＧ−１またはＲＣ−１０１のいずれかを置き換えて、融合タンパク質の殺菌作用を変更または改善できる。融合タンパク質の分解活性を変更するために、上記および下記に列挙される酵素は、本発明の融合タンパク質のＭｕｔ、Ｄｅｘまたは両方を置き換えてもよい。別の実施形態では、２つの異なるＥＰＳ酵素が組成物に使用される場合、そのような酵素は、異なる比、例えば、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８などで送達されてもよい。ＭｕｔとＤｅｘがガムまたは口腔リンスなどで一緒に送達される場合、好ましい比率は５：１のＤｅｘ：Ｍｕｔである。
【００１０】
別の態様では、本発明は、バイオフィルムを有する表面を上記組成物と接触させ、組成物は殺菌効果を有し、１つまたは複数の望ましくない微生物を含む前記バイオフィルムを低減または排除することを含むバイオフィルムの分解および／または除去方法を提供し、前記バイオフィルムが、前記減少または除去を必要とする動物の対象の中または上に存在する場合である。特定の実施形態では、バイオフィルムは口の中に存在する。他の実施形態では、バイオフィルムは移植された医療機器上に存在する。この方法は、尿路の表面、中耳、前立腺、血管内膜、心臓弁、皮膚、頭皮、爪、歯、および傷の内側から成る群から選択された内側または外側の身体表面に存在するバイオフィルムを除去するためにも使用できる。
【００１１】
さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのＡＭＰおよび前記少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素を含む本発明の組成物は、植物色素体で産生される。植物はタバコ植物であってもよく、前記ＡＭＰおよび酵素をコードする配列は植物色素体での発現のためにコドン最適化されている。好ましい実施形態では、ＡＭＰおよびバイオフィルム分解酵素は、レタス色素体内に存在する内因性調節要素の制御下で融合タンパク質としてレタス植物で発現される。
【００１２】
本発明の別の態様では、送達用の生物学的に許容される担体における、相乗的に作用してバイオフィルム構造を分解しバイオフィルム沈着を阻害する１つ以上のエッセンシャルオイルと少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素を含む組成物が、開示されている。いくつかの実施形態において、エッセンシャルオイルは、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの１つ以上を含み、少なくとも１つのバイオフィルム分解酵素はムタナーゼ、デキストラナーゼ、およびグルコアミラーゼから選択される。他の実施形態では、エッセンシャルオイルは、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルであり、バイオフィルム分解酵素がムタナーゼおよびデキストラナーゼである。他の実施形態では、ムタナーゼとデキストラナーゼは５：１の比率で存在する。特定の実施形態では、酵素は商業的に入手されるか、生物学的供給源から精製されるか、植物色素体で産生される。特定の実施形態において、エッセンシャルオイルは、マウスウォッシュ、マウスリンス、マウススプレー、練り歯磨き、チューインガム、歯磨きジェル、歯肉下用ジェル、ムース、フォーム、咀嚼錠、歯磨剤、ロゼンジ、および溶解性ストリップなどから成る群から選択される担体に存在する。特定の実施形態では、担体はマウスウォッシュである。メントール、チモール、ユーカリプトール、および／またはサリチル酸メチルなどのエッセンシャルオイルを含む市販のマウスウォッシュの例には、アルコールを含まないうがい薬、例えばＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）Ｚｅｒｏ（商標）ブランドで販売されているものや、消毒用の口内洗浄剤、例えばＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）ブランドで販売されているものが含まれる。
【００１３】
本発明はまた、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、およびグルコアミラーゼから成る群から選択される１つ以上のバイオフィルム分解酵素の有効量と、メントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のエッセンシャルオイルとを、経口送達に適した担体において含む組成物であって、担体が、マウスウォッシュ、マウスリンス、マウススプレー、練り歯磨き、チューインガム、歯用のゲル、歯肉下ゲル、ムース、フォーム、咀嚼錠、歯磨剤、ロゼンジ、および溶解性ストリップから成る群から選択される組成物を提供する。特定の実施形態では、担体は、マウスウォッシュ、マウスリンス、マウススプレーなどの液体担体である。特定の実施形態では、担体は、チューインガム、咀嚼錠、ロゼンジ、または溶解性ストリップなどの固体または半固体の担体である。特定の実施形態において、担体は練り歯磨きである。
【００１４】
さらに別の態様では、口腔から望ましくないバイオフィルムを分解および／または除去する方法が開示される。例示的な一方法は、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つまたは複数のバイオフィルム分解酵素の有効量、およびメントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のエッセンシャルオイルを、前記バイオフィルムを有する口腔の表面に投与することを含む。特定の実施形態において、前記エッセンシャルオイルは、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの組み合わせを含む。別の例示的な方法は、前記バイオフィルムを有する口腔の表面を、適切な担体中にバイオフィルム分解酵素を含む有効量の前処理組成物と接触させ、続いて抗菌口腔リンスで処理することを含み、前記接触および処理することは、殺菌効果を発揮し、それにより、前記望ましくないバイオフィルムを相乗的に低減または排除する。特定の態様において、抗菌性口腔リンスは、抗菌性の経口リンスが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルから選択される少なくとも２つのエッセンシャルオイルを含む。他の態様では、エッセンシャルオイルはＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）マウスウォッシュに存在している。特に、前述の方法は、共生細菌Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉおよびＳ．ｏｒａｌｉｓに悪影響を与えることなく、病原性Ｓ．ｍｕｔａｎｓを選択的に死滅させるのに有効である。
【００１５】
本発明はまた、バイオフィルムの沈着の影響を受けやすい口腔の表面と、ムタナーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つまたは複数のバイオフィルム分解酵素の有効量と接触させ、メントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のエッセンシャルオイルを、前記バイオフィルムを有する前記口腔の表面に接触させることを含む、口腔の表面へのバイオフィルムの沈着を阻害する予防方法を提供する。特定の実施形態において、エッセンシャルオイルは、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの組み合わせを含む。別の例示的な方法は、バイオフィルム沈着の影響を受けやすい口腔の表面を、適切な担体中にバイオフィルム分解酵素を含む有効量の前処理組成物と接触させ、続いて抗菌口腔リンスで処理することを含み、前記接触および処理することは、殺菌効果を発揮し、それにより、望ましくないバイオフィルムの沈着を相乗的に阻害する。特定の態様において、抗菌性口腔リンスは、抗菌性の経口リンスが、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルから選択される少なくとも２つのエッセンシャルオイルを含む。他の態様では、エッセンシャルオイルはＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）に存在している。特に、前述の方法は、共生細菌Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉおよびＳ．ｏｒａｌｉｓに悪影響を与えることなく、病原性Ｓ．ｍｕｔａｎｓを選択的に死滅させるのに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−１Ｄ】タバコ葉緑体で発現したＧＦＰ融合レトロサイクリン（ＲＣ１０１）およびプロテグリン（ＰＧ１）の精製−図１Ａ。抗ＧＦＰ抗体を使用した精製ＧＦＰ−ＲＣ１０１融合のウェスタンブロット分析。図１Ｂ。精製ＧＦＰ−ＲＣ１０１融合物の天然蛍光ゲル。図１Ｃ。抗ＧＦＰ抗体を使用した精製ＧＦＰ−ＰＧ１融合のウェスタンブロット。図１Ｄ。精製ＧＦＰ−ＰＧ１の天然蛍光ゲル。注−図１Ａ〜１Ｄのすべてのサンプルは、ブラッドフォード法から得られた総タンパク質値に基づいて装填された。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用したデンシトメトリが、ＧＦＰ濃度の発現レベル、純度、および収量を判決するために行われた。総タンパク質値に対するＧＦＰ濃度から発現レベルと収量を計算した。収量は、ＧＦＰ濃度に精製後の回収量を掛けて判定した。個々のペプチド収量は、ＧＦＰ収量をモル係数１４（ペプチドＭＷに対するＧＦＰ  ＭＷの比率）で割ることによって判定された。倍濃縮は、植物粗抽出物の純度の割合（％）を発現した割合（％）で割ることにより計算された。
【図２Ａ−２Ｅ】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓおよびその他の口腔微生物に対するＡＭＰｓ（ＧＦＰ−ＰＧ１およびＧＦＰ−ＲＣ１０１）の抗菌活性。細胞の生存率は、吸光度（Ａ６００ｎｍ）および経時的なコロニー形成単位（ＣＦＵ）のカウントによって判定された。（図２Ａ）異なる濃度のＧＦＰ−ＰＧ１および合成ＰＧ１で処理したＳ．ｍｕｔａｎｓの時間殺傷曲線（Ａ６００ｎｍ）。（図２Ｂ）各時点でＧＦＰ−ＰＧ１および合成ＰＧ１で処理したＳ．ｍｕｔａｎｓの生細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。（図２Ｃ）異なる濃度（Ａ６００ｎｍ）のＧＦＰ−ＲＣ１０１で処理したＳ．ｍｕｔａｎｓの時間殺傷曲線。（図２Ｄ）各時点でＧＦＰ−ＲＣ１０１で処理したＳ．ｍｕｔａｎｓの生細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。（図２Ｅ）１０μｇ／ｍｌのＧＦＰ−ＰＧ１で１時間および２時間処理したＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの生細胞（ＣＦＵ／ｍｌ）。
【図３Ａ−３Ｃ】共焦点蛍光およびＳＥＭイメージングを介して判定されたＧＦＰ−ＰＧ１による細菌殺傷（図３Ａ）１０μｇ／ｍｌのＧＦＰ−ＰＧ１で処理されたＳ．ｍｕｔａｎｓのタイムラプス的殺傷。コントロール群（図３Ｂ）は、緩衝液のみで処理したＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞で構成されていた。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（赤色）を、共焦点顕微鏡を使用して、単一細胞レベルでの経時的な細菌の生存率を判定した。ＰＩは細胞不透過性であり、膜が損傷した細胞にのみ侵入する。死にかけている細胞や死んだ細胞では、ＰＩがＤＮＡに結合すると真っ赤な蛍光が発生する。ＧＦＰ−ＰＧ１は緑色で示される。（図３Ｃ）走査型電子顕微鏡を使用した、１０μｇ／ｍｌの濃度のＧＦＰ−ＰＧ１に１時間さらされたＳ．ｍｕｔａｎｓの形態学的観察。赤い矢印は、ディンプル膜と細胞内成分の押し出しを示している。
【図４Ａ−４Ｃ】ＧＦＰ−ＰＧ１の単一局所治療によるバイオフィルム形成の阻害。この図は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの３次元（３Ｄ）レンダリングの代表的な画像を示している。細菌細胞はＳＹＴＯ  ９（緑色）で染色され、ＥＰＳはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（赤色）で標識された。唾液コーティングヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）のディスク表面を、ＧＦＰ−ＰＧ１の単回局所処置で短期間の３０分間の曝露で処置した（図４Ｂ）。コントロール群（図４Ａ）は緩衝液のみで処理された。次に、処理されたｓＨＡディスクを１％（ｗ／ｖ）スクロースと活発に増殖するＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞（１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を含む培地に移し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で１９時間インキュベートした。バイオフィルムの成長後、バイオフィルムを２光子共焦点顕微鏡で分析した。（図４Ｃ）プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）処理のある場合またはない場合での、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるＳ．ｍｕｔａｎｓの生細胞と死細胞の割合の定量分析（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＰＭＡとｑＰＣＲの組み合わせ（ＰＭＡ−ｑＰＣＲ）は、無傷の膜を備えた生細胞を定量化する。ゲノムＤＮＡの分離とｑＰＣＲの定量化の前に、ＰＭＡを追加して死細胞のＤＮＡを選択的に架橋し、それによりＰＣＲ増幅を防ぐ（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。アスタリスクは、ＧＦＰ−ＰＧ１処理の値がコントロールと有意に異なることを示す（Ｐ<０．０５）。
【図５】バイオフィルムマトリックスを消化するＥＰＳ分解酵素。デキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせで処理したＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムのＥＰＳ分解の代表的なタイムラプス画像。細菌細胞はＳＹＴＯ  ９（緑色）で染色され、ＥＰＳはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（赤色）で標識された。白い矢印は、細菌細胞クラスタ間の空間の「開き」と、ＥＰＳの酵素分解後の「覆いなし」の細胞を示す。
【図６Ａ−６Ｃ】合成ＰＧ１単独またはＥＰＳ分解酵素との組み合わせによるバイオフィルムの破壊。（図６Ａ）ＣＯＭＳＴＡＴを使用した無傷のバイオフィルム内のＥＰＳ分解のタイムラプス定量化。（図６Ｂ）合成ＰＧ１およびＥＰＳ分解酵素（Ｄｅｘ／Ｍｕｔ）単独または組み合わせでＩｍａｇｅＪにより処理されたＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの生存率。（図６Ｃ）合成ＰＧ１の抗バイオフィルム活性は、ＥＰＳ分解酵素（Ｄｅｘ／Ｍｕｔ）によって増強された。アスタリスクは、異なる実験群の値が互いに有意に異なることを示している（Ｐ<０．０５）。
【図７】共焦点顕微鏡による、異なるヒト歯周細胞株：ヒト歯周靭帯幹細胞（ＨＰＤＬＳ）、上顎間葉系幹細胞（ＭＭＳ）、ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞（ＳＣＣ）、歯肉由来間葉系間質細胞（ＧＭＳＣ）、成人の歯肉角化細胞（ＡＧＫ）および骨芽細胞（ＯＢＣ）における精製融合タンパク質ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰ、プロテグリン−１−ＧＦＰ（ＰＧ１−ＧＦＰ）およびレトロサイクリン１０１−ＧＦＰ（ＲＣ１０１−ＧＦＰ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ取り込み。ヒト細胞株ＨＰＤＬＳ、ＭＭＳ、ＳＣＣ、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣの２ｘ１０４細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）で３７°Ｃで一晩培養し、その後、１００μｌのＰＢＳにおいて精製ＧＦＰ融合タンパク質：ＣＴＢ−ＧＦＰ（８．８μｇ）、ＰＴＤ−ＧＦＰ（１３μｇ）、ＰＧ１−ＧＦＰ（１．２μｇ）、ＲＣ１０１−ＧＦＰ（１７．３μｇ）を、それぞれ１％ＦＢＳを添加して、３７℃で１時間インキュベートした。ＲＴで１０分間２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＤＡＰＩを含む退色防止マウンティング培地で染色した。陰性コントロールのために、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中の市販のＧＦＰ（２μｇ）で細胞をインキュベートし、同じ条件で処理した。すべての固定細胞は、共焦点顕微鏡を使用して画像化された。緑色の蛍光はＧＦＰ発現を示している。青い蛍光はＤＡＰＩ標識細胞核を示している。画像は１００倍の対物レンズの下で観察され、少なくとも１０〜１５個のＧＦＰ陽性細胞または画像が各細胞株で観察された。スケールバーは１０μｍを表す。すべての画像研究は３回分析されている。
【図８】トランスプラストミックタバコからのＧＦＰ融合の下流処理：温室で栽培されたトランスプラストミックタバコ植物からの精製ＧＦＰ融合の生成に関与する様々な工程を示すフロー図。
【図９Ａ−９Ｂ】ムタナーゼ（図９Ａ）およびデキストラナーゼ（図９Ｂ）のベクターおよびコドン最適化配列。コドン最適化ムタナーゼ：配列ＩＤ番号：１。コドン最適化デキストラナーゼ：配列ＩＤ番号：２。
【図１０】図９のＥＰＳタンパク質を含む融合タンパク質の単独使用または発現のために、ＧＶＧＶＰと融合したＡＭＰのタンデムリピートを発現する葉緑体ベクターの模式図。
【図１１】新規精製戦略：逆温度サイクリング精製プロセスは高収率を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】大腸菌における機能的コドン最適化ムタナーゼの発現。図１２は、大腸菌におけるムタナーゼ発現を示すウェスタンブロットを示す。図１２Ｂは、０．５％ブルーデキストランプレートに広がった大腸菌を示す。形質転換されたクローンは、通常Ｓ．ｍｕｔａｎｓで作られた組換えデキストラナーゼを産生し、コロニー周辺の青いハローを明瞭にすることができる。
【図１２Ｃ】ペニシリン由来の商業的に精製された酵素と比較した、ブルーデキストランに対する形質転換された大腸菌からの粗溶解物に存在する組換えデキストラナーゼの分解活性（総タンパク質装填）を比較するゲル拡散アッセイを表す。
【図１３】ＡＭＰ／バイオフィルム分解酵素産生のためにレタス植物を操作するための工程のフロー図。
【図１４】チューインガムタブレットの調製を示す。本明細書ではＧＦＰが例示されているが、ＡＭＰ−酵素融合タンパク質（例えば、図９および図１０で提供されるもの）を含むチューインガムも本発明の範囲内である。
【図１５】ＧＦＰの濃度を確認するために、蛍光を介して、およびウェスタンブロットによってガムテーブルを評価した。（ｉ）ウェスタンブロッティング（ｉｉ）蛍光計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ−Ｔｈｅｒｍｏ；λｅｘ４８５ｎｍ；λｅｍ５３８ｎｍ）に基づくチューインガムからのＧＦＰ放出の定量化。市販のＧＦＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＭＢ−０７５２）が標準として使用された。チューインガムをタンパク質抽出バッファで粉砕した。
【図１６】本発明のガムタブレットからのバイオフィルム分解剤の放出動態を評価するために人工唾液を使用する咀嚼シミュレータが示されている。
【図１７】チューインガムから放出されるＧＦＰの定量化を示すグラフ。レタスの葉に発現される濃度を増加させたＧＦＰを含むガムタブレットを、ＧＦＰ放出動態を判定するために、人工唾液の存在下で咀嚼シミュレータで評価した。
【図１８】葉緑体ベクターから発現した酵素を含む粗抽出物は、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）マウスウォッシュと混合した場合、市販の酵素と同様にＣＦＵ形成を阻害するのに有効であることを示すグラフ。リステリンで補った大腸菌由来のムタナーゼとデキストラナーゼ（比率１：５）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの酵素分解。市販のムタナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ａｍａｎｏ由来）およびデキストラナーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｓｉｇｍａ由来）を陽性コントロールとして使用し、一方で粗大腸菌抽出物を陰性コントロールとして使用した。ＣＦＵ／ｍｌは、平均±標準偏差（ｎ＝２）で表される。＊＊＊、大腸菌抽出物に対してＰ<０．００１。
【図１９Ａ−１９Ｅ】グルカノヒドロラーゼは、最適な活性比でＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの抗菌殺菌効果を高める。（図１９Ａ）この研究で使用した唾液コーティングヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）バイオフィルムモデル。（図１９Ｂ）治療レジメンの概略図および事前に形成されたＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムに対するＥＰＳ分解／抗菌（ＥＤＡ）アプローチの仮説。（図１９Ｃ）抗菌殺傷効力に対するデキストラナーゼ／ムタナーゼ処理の効果。ｓＨＡ上の１９時間前もって形成されたＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムは、グルカノヒドロラーゼの異なる組み合わせで１２０分間局所的に処理され、その後すぐに抗菌剤（ＥＯｓ）に１分間さらされた。抗菌殺菌効果は、ＣＦＵの回収率に基づいて判定された。最も強力な殺傷は、抗菌薬曝露前に８．７５Ｕ／ｍＬのデキストラナーゼと１．７５Ｕ／ｍＬのムタナーゼを使用して一貫して達成された（５：１の酵素活性比、抗菌薬単独に対して約３ログより効果的）。データは平均±標準偏差として示されている（ｎ＝４）。ＮＳ、有意差なし；＊、ｐ<０．０５；＊＊、ｐ<０．０１＊＊＊、ｐ<０．００１（スチューデントのｔ検定）。（図１９Ｄ）ＥＰＳ分解に対するデキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせ効果のスクリーニング。チェッカーボード微量希釈アッセイの代表的な画像。（図１９Ｅ）チェッカーボード微量希釈アッセイによって判定されたデキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせ効果（バイオマスの減少）。この研究のさらなる実験のために選択された、赤い矢印、最適な組み合わせ（８．７５Ｕ／ｍＬのＤｅｘと１．７５Ｕ／ｍＬのＭｕｔ、５：１の活性比）。
【図２０Ａ−２０Ｆ】ＥＰＳ分解酵素は、ｉｎ  ｓｉｔｕでバイオフィルムマトリックスを分解し、バイオフィルム内での抗菌ターゲティングを促進する。（図２０Ａ）グルカノヒドロラーゼによる１２０分間のマトリックス分解後の１９時間Ｓ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの形態を示す共焦点顕微鏡。緑、ＳＹＴＯ９で染色された細菌細胞。赤、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）。白い矢印、二重酵素処理により誘発された細菌の分散。（図２０Ｂ）リアルタイムの細菌の生／死染色およびイメージングを使用して実行されたタイムラプス殺傷アッセイ。事前に形成された（１９時間）Ｓ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムは、８．７５Ｕ／ｍＬデキストラナーゼ＋１．７５Ｕ／ｍＬムタナーゼまたはビヒクルコントロールで１２０分間処理され、両方とも殺菌（ＥＯｓ）で負荷された。単一のマイクロコロニーの画像は、抗菌薬負荷から０分、１分、および５分後に取得された。緑、生細胞（ＳＹＴＯ  ９）；マゼンタ、死細胞（ヨウ化プロピジウム）；赤、ＥＰＳ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）。ビヒクルで処理した群の白い矢印は、内部に存在する細胞が大半生きたままである間、抗菌剤がマイクロコロニーの表面近くの細菌を容易に死滅させた。（図２０Ｃ）１２０分間のグルカノヒドロラーゼによるマトリックス分解後のバイオフィルムあたりの総バイオマス（乾燥重量）。（図２０Ｄ）１２０分間のグルカノヒドロラーゼによるマトリックス分解後のＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムのエキソポリサッカライドの生化学的特性。（図２０Ｅ）グルカノヒドロラーゼと抗菌剤の相乗的抗バイオフィルム効果。Ｄ、デキストラナーゼ；Ｍ、ムタナーゼ；Ｄ＋Ｍ、デキストラナーゼ＋ムタナーゼ。データは平均±標準偏差として示されている（ｎ＝４）。ＮＳ、有意差なし；＊＊＊、ｐ<０．００１（スチューデントのｔ検定）。（図２０Ｆ）デキストラナーゼ、ムタナーゼ、およびグルコアミラーゼとの３つの酵素の組み合わせは、抗菌殺傷効力をさらに高める。Ｇ：２０Ｕ／ｍＬのグルコアミラーゼ；Ｄ＋Ｍ：８．７５Ｕ／ｍＬのデキストラナーゼ＋１．７５Ｕ／ｍＬのムタナーゼ；Ｄ＋Ｍ＋Ｇ：デキストラナーゼ＋ムタナーゼ＋グルコアミラーゼ。＊、ｐ<０．０５；＊＊＊、ｐ<０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図２１Ａ−２１Ｅ】酵素によるＥＰＳマトリックスの分解の動力学とそれに関連する難治性の保護メカニズム。事前に形成された（１９時間）Ｓ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＥＰＳ）は、５μＭのＳＹＴＯ９および３０μＭのヨウ化プロピジウムを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ溶液で画像化され、継続的なラベリングと生きているおよび死んだ細菌細胞のリアルタイムの可視化が経時的に行われた。緩衝液にグルカノヒドロラーゼを加えて、最終濃度８．７５Ｕ／ｍＬのデキストラナーゼと１．７５Ｕ／ｍＬのムタナーゼを得、一方で同じ体積の緩衝液をビヒクルコントロールとして使用した。（図２１Ａおよび図２１Ｂ）マトリックス分解の４次元タイムラプス共焦点イメージング。（図２１Ｃ）および（図２１Ｄ）１分間の抗菌殺傷（ＥＯｓ）後に取得したマイクロコロニーの最終画像。緑、生細胞（ＳＹＴＯ  ９）；マゼンタ、死細胞（ヨウ化プロピジウム）；赤、ＥＰＳ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）。黒い点線の円は、抗菌薬による攻撃後、主に生きている細菌で構成されたビヒクル処理マイクロコロニーの中核である。白い矢印、マイクロコロニー内にあるＥＰＳは、グルカノヒドロラーゼによって効率的に分解された。挿入された破線のボックス、抗菌剤曝露後の外層の生きた細菌。（図２１Ｅ）ＥＰＳ分解は、マイクロコロニー内部の細菌細胞の抗菌性殺傷を促進する（死んだ細菌のタイムラプス画像のみ）。マゼンタ、死んだ細胞（ヨウ化プロピジウム）。
【図２２Ａ−２２Ｃ】バイオフィルム足場の機械的安定性と完全性はＥＰＳ分解により損傷を受ける。（図２２Ａ）１２０分以内にマトリックス分解（８．７５Ｕ／ｍＬのデキストラナーゼおよび１．７５Ｕ／ｍＬのムタナーゼ）により引き起こされる広範な細胞分散を伴うＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの物理構造の「内破様」崩壊を示すタイムラプスイメージング。緑、ＳＹＴＯ９で染色された細菌細胞。赤、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベル付けされたＥＰＳ。（図２２Ｂ）時間分解ＥＰＳ分解（赤の四角）およびマイクロコロニー空間変位（緑の円）曲線。バイオフィルム中のＥＰＳの生体体積は、ＣＯＭＳＴＡＴ２を使用してアルゴリズムで分析された。各マイクロコロニーの動きは、ＴｒａｃｋＭａｔｅを使用して累積変位として計算により定量化された。累積変位のデータは、中央値±四分位範囲として示されている。（図２２Ｃ）グルカノヒドロラーゼ前処理あり／なしのｓＨＡビーズのグルカン形成の共焦点画像。灰色：ヒドロキシアパタイト表面；赤：ＥＰＳグルカン。
【図２３Ａ−２３Ｆ】ＥＤＡは、混合種バイオフィルムにおけるＥＰＳ産生病原体の標的化を強化するためにＥＰＳを局所的に分解する。（図２３Ａ）事前に形成された混合種バイオフィルムに対するＥＤＡアプローチの治療計画と仮説の概略図。（図２３Ｂ）この研究で使用した混合種バイオフィルムモデルの生態学的変化。破線のボックス、ＥＤＡアプローチは４３時間（初期段階）および６７時間（後期段階）の時点で試験された。（図２３Ｃ）初期の混合種バイオフィルムの微生物生態学に対するＥＤＡの影響（４３時間）。上、ＥＤＡ処理後の混合種バイオフィルムから回収された様々な細菌の種のＣＦＵ。下、異なる種の割合。（図２３Ｄ）後期の混合種バイオフィルムの微生物生態学に対するＥＤＡの影響（６７時間）。上、ＥＤＡ処理後の混合種バイオフィルムから回収された様々な細菌の種のＣＦＵ。下、異なる種の割合。（図２３Ｅ）後期混合種バイオフィルムにおけるＥＰＳ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、および共生生物の空間分布を示す蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（６７時間）。ａ．ｓＨＡの混合種バイオフィルムの概要；ｂ．断面拡大画像（融合）；ｃ．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのみ（緑）；ｄ．ＥＰＳのみ（赤）；ｅ．Ｓ．オラリスのみ（黄色）；ｆ．Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉのみ（シアン）。（図２３Ｆ）混合種バイオフィルム内部のＥＰＳの局所分解のダイナミクスは、埋め込まれた細菌を露出する（黄色の矢印）。灰色、ＳＹＴＯ９で染色されたすべての細菌；赤、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）。Ｄ、デキストラナーゼ；Ｍ、ムタナーゼ；Ｄ＋Ｍ、デキストラナーゼ＋ムタナーゼ。データは平均±標準偏差として示されている（ｎ＝４）。ＮＳ、有意差なし；＊、ｐ<０．０５＊＊、ｐ<０．０１＊＊＊、ｐ<０．００１（スチューデントのｔ検定）
【図２４Ａ−２４Ｆ】実験的唾液ペリクルのＥＰＳ分解酵素は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの形成を阻害する。（図２４Ａ）ＥＰＳ分解酵素前処理によるＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム予防の治療計画および仮説の概略図。（図２４Ｂ）実験的唾液ペリクルにおけるグルカノヒドロラーゼによるバイオフィルム形成の相乗的阻害を示す代表的な共焦点画像。ｓＨＡディスクは、接種前６０分間ＥＰＳ分解酵素（８．７５Ｕ／ｍＬデキストラナーゼおよび／または１．７５Ｕ／ｍＬムタナーゼ）またはビヒクルコントロールで局所処理され、イメージング前に１９時間Ｓ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの形成を可能にするようにインキュベートされた。緑、ＳＹＴＯ９で染色された細菌細胞；赤、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＥＰＳ；白い矢印、単一酵素で前処理されたｓＨＡ上に形成されたバイオフィルムは、構造は変化しているものの、マイクロコロニー様の形成を示した。（図２４Ｃ）唾液ペリクルのグルカノヒドロラーゼは、バイオマス（乾燥重量）の蓄積を減少させる。（図２４Ｄ）グルカノヒドロラーゼで前処理した唾液ペリクルに形成されたバイオフィルムのＣＦＵ。（図２４Ｅ）グルカノヒドロラーゼで前処理した唾液ペリクルのバイオフィルムから回収されたＣＦＵ、その後の１９時間での抗菌殺害。ＥＰＳ分解酵素またはビヒクルで前処理したｓＨＡで形成されたＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムは、１９時間時点にて１分間抗菌剤（ＥＯｓ）で負荷し、バイオフィルムから回収されたＣＦＵを測定することにより、抗バイオフィルムの有効性を分析した。（図２４Ｆ）精製ＧｔｆＢによる可溶性および不溶性グルカン合成に対するデキストラナーゼおよび／またはムタナーゼの用量依存的阻害効果。精製ＧｔｆＢ（１０Ｕ）をデキストラナーゼまたは／およびムタナーゼと混合し、（［１４Ｃ］グルコシル）−スクロース基質と３７℃で４時間インキュベートしてグルカンを合成した。不溶性グルカンを遠心分離（１３，４００ｇ、４℃、１０分）により収集した。エタノール（最終濃度：７０％）で−２０℃で１８時間沈殿させた後、上清から可溶性グルカンを収集した。放射標識された不溶性および可溶性グルカンの量は、シンチレーション計数により定量化された。Ｄ、デキストラナーゼ；Ｍ、ムタナーゼ；Ｄ＋Ｍ、デキストラナーゼ＋ムタナーゼ。データは平均±標準偏差として示されている（ｎ＝４）。ＮＳ、有意差なし；＊、ｐ<０．０５＊＊、ｐ<０．０１＊＊＊、ｐ<０．００１（スチューデントのｔ検定）
【図２５Ａ−２５Ｅ】ＥＤＡは、混合種バイオフィルムにおけるＳ．ｍｕｔａｎｓの初期コロニー形成を選択的に防止する。（図２５Ａ）ＥＰＳ分解酵素前処理によるＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム予防の治療計画および仮説の概略図。ＥＰＳ分解酵素前処理によるＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム予防の治療計画と仮説の概略図。（図２５Ｂ）ｓＨＡでの初期コロニー形成後の混合種バイオフィルムの微生物集団。ｓＨＡディスクは、接種前６０分間ＥＰＳ分解酵素（８．７５Ｕ／ｍＬデキストラナーゼおよび１．７５Ｕ／ｍＬムタナーゼ）またはビヒクルコントロールで局所的に処理され、混合種バイオフィルムの形成を可能にするようにインキュベートされた。（図２５Ｃ）コロニー形成初期の混合種コミュニティのＦＩＳＨ画像。緑、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ；黄色、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ；シアン、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ；赤、ＥＰＳ。（図２５Ｄ）酵素の前処理は、全体的な殺菌効果を増強し、混合種バイオフィルムのＳ．ｍｕｔａｎｓの除去を助ける。ＥＰＳ分解酵素またはビヒクルで前処理したｓＨＡで形成された４３時間の混合種バイオフィルムは、１分間抗菌剤（ＥＯｓ）で負荷し、バイオフィルムから回収された異なる細菌種のＣＦＵを測定することにより、抗バイオフィルムの有効性を分析した。（図２５Ｅ）３Ｈ−チミジン放射性同位体追跡分光法によりアッセイされた細菌接着。ｓＨＡビーズは、ＧｔｆＢ固定化前にビヒクルまたはＥＰＳ分解酵素で前処理され、グルカンはスクロース基質の存在下でｉｎ  ｓｉｔｕで合成された。ビーズを１．０×１０９ｃｅｌｌ／ｍＬの放射標識Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｏｒａｌｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉでそれぞれインキュベートし、洗浄して未結合の細菌を除去した。付着した細菌の数をシンチレーションカウンティングにより定量化した。Ｄ、デキストラナーゼ；Ｍ、ムタナーゼ；Ｄ＋Ｍ、デキストラナーゼ＋ムタナーゼ。ＮＳ、有意差なし；＊、ｐ<０．０５；＊＊、ｐ<０．０１＊＊＊、ｐ<０．００１（スチューデントのｔ検定）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ヒトの多くの感染症は、口腔内で発生するものを含む、病原性のあるバイオフィルムによって引き起こされる（齲蝕や歯周病など）。齲蝕（または歯の衰退）は、米国および世界で単一で最も費用がかかり一般的なバイオフィルム関連の口腔疾患であり続けている。それは子供も大人も同様に苛み、仕事や学校からの欠勤につながる、緊急に治療室を訪れる主な理由である。残念ながら依然として、齲蝕の有病率は依然として高く（米国の成人人口の９０％超）、特に貧困な社会経済的背景の小児および青年を苛む最も一般的な慢性疾患である。さらに、口腔の健康状態が悪いと、多くの場合、全身へ影響を与える結果となり、全体的な健康に影響を与える。重要なのは、この疾患の破壊（齲蝕の病変や歯髄感染など）を治療するための費用が米国だけで年間４００億ドルを超えていることである。フッ化物は齲蝕の予防の主力である。しかし、その広範な使用は、疾患に対する不完全な保護を提供する。フッ化物は、初期の齲蝕の病変の脱灰を減らし、脱灰を強化するのに効果的であるが、バイオフィルムに対する効果は限られている。逆に、齲歯の原因となるバイオフィルムを制御するための現在の抗菌薬のモダリティは、ほとんど効果がない。
【００１８】
毒性の口腔内のバイオフィルムを制御するための効果的な治療法を開発する緊急の必要性がある。本発明によれば、現在の抗バイオフィルム／齲歯モダリティよりも優れた治療上有効な植物発現のバイオ医薬品の低コストの生産および送達方法が提供される。特定の実施形態において、抗菌剤および酵素は、商業的供給源から入手される。
【００１９】
定義：
本明細書で使用される場合、抗菌ペプチドは、任意の細菌活性を有する小さなペプチドである。「ＲＣ−１０１」は、環状オクタデカペプチドであるレトロサイクリンの類似体であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＣＤ４＋細胞をＨＩＶ−１のＴおよびＭ向性株による感染から保護し、ヒト子宮頸部組織でのＨＩＶ−１の感染を防ぐ。ＲＣ−１０１は、ＨＩＶ−１の感染を防ぎ、膣液の存在下で完全な活性を保持する能力を備えているため、特に経口バイオフィルムにおける他の局所殺菌剤用途に良好に適している。ＲＣ−１０１のシーケンスは、この参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２０１１  Ｊａｎ；９（１）：１００−１１５で提供されている。
【００２０】
「Ｃ１６Ｇ２」は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに特異性を持つ新規の合成抗菌ペプチドである。
【００２１】
「プロテグリン−１（ＰＧ）」は、システインに富む１８残基のβシートペプチドである。細菌、真菌、ウイルス、および特に臨床的に重要な抗生物質耐性菌を含む広範な微生物に対して強力な抗菌活性を持っている。例えば、病原性微生物の大腸菌および真菌日和見菌Ｃ．アルビカンスは、実験室の試験でＰＧによって効果的に死滅される。ＰＧ−１のシーケンスは、この参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２０１１  Ｊａｎ；９（１）：１００−１１５で提供されている。
【００２２】
追加の抗菌ペプチドには、以下の表１に示されるものが含まれる。
【００２３】
【表１】
2020519560.tif 000002
【００２４】
本明細書で使用される場合、「抗菌剤」には、ＣＨＸ、トリクロサン／共重合体歯磨剤、クリンダマイシン、ドキシサイクリンゲル、ミノサイクリン粉末、マクロライド、スルホンアミド、ペニシリンおよびその誘導体、テトラサイクリン、キノロン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、およびフルコナゾールが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
「エッセンシャルオイル」には、メントール、チモール、ユーカリプトール、サリチル酸メチル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから成る群から選択される１つ以上のものが含まれ得る。特定の実施形態では、エッセンシャルオイルはメントールを含む。特定の実施形態では、エッセンシャルオイルはチモールを含む。特定の好ましい実施形態では、エッセンシャルオイルは、メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの組み合わせを含む。
【００２６】
「バイオフィルム」は、定期的に水と接触する表面に付着する複雑な構造であり、バクテリアのコロニーと、通常それらが包まれている粘液性保護コーティングを分泌する酵母、真菌、原虫などのその他の微生物で構成される。バイオフィルムは、生体の軟組織だけでなく固体または液体の表面にも形成でき、通常の従来の消毒方法に耐性がある。歯垢、パイプやタンクを汚す粘液性のコーティング、水域の藻類マットはバイオフィルムの例である。バイオフィルムは一般に体内で病原性であり、齲蝕、嚢胞性線維症、中耳炎などの疾患を引き起こす。
【００２７】
「バイオフィルム分解酵素」には、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、ＤＮＡｓｅ、エンドヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ディスパーシンＢ、およびグリコシド加水分解酵素、例えば１→３）−α−Ｄ−グルカン加水分解酵素などのエキソ多糖類分解酵素が非限定的に含まれ、デキストラナーゼおよびムタナーゼをコードする葉緑体コドン最適化配列の使用が好ましいが、当業者は、当技術分野の多くの異なるバイオフィルム分解酵素をよく知っている。本発明の融合タンパク質で使用するための追加の酵素配列を以下に提供する。上記のように、適切な酵素は、それらを産生する細菌から精製することも、商業的供給源から入手することもできる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、対象への薬剤、薬物、またはペプチドの「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、その意図された機能を果たす化合物を対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）または投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、経口、局所、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、または直腸を含む、任意の適切な経路で実施することができる。投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）または投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）には、自己投与と他者による投与が含まれる。一実施形態では、単回投与は、酵素および抗菌剤を含む単一製剤の経口送達を伴う。他の実施形態では、投与は連続的であり得る。好ましい実施形態では、バイオフィルム分解酵素が最初に投与され、続いて抗菌剤が送達される。酵素処理は、口腔内で歯肉と歯が少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分の間酵素にさらされる細胞外マトリックスを分解するのに適した時間行われる。好ましくは、歯および歯肉は、３０〜１２０分間酵素で処理される。最も好ましくは、酵素処理は少なくとも３０分間行われる。この期間の後、２０、３０、４０、５０、６０、９０、または１２０秒間、抗菌性の経口のリンスが投与される。好ましい実施形態では、メトール、ユーカリプトール、チモールおよびメチルサリチル酸の少なくとも２つ以上がリンスに存在する。特に好ましい実施形態では、リンスはＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）である。酵素含有組成物は、マウスウォッシュ、マウスリンス、マウススプレー、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯肉下用ジェル、ムース、フォーム、義歯ケア製品、咀嚼錠、歯磨剤、ロゼンジ、溶解性ストリップなどから成る群から選択される形態であってもよい。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、または「合併症」という用語は、対象の正常な状態からの任意の逸脱を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」「有効量（ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」などの用語は、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量を意味する。特定の実施形態では、この量は、バイオフィルムの形成を阻害するよう予防的に作用するのに有効である。他の実施形態では、その量は、既存のバイオフィルムを分散させるのに有効である。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「阻害する」または「予防する」という用語は、疾患の状態にさらされているまたは罹患しやすい対象において、疾患の状態の臨床的症状を悪化または発症させないこと、例えば疾患の発症を抑制するが、疾患の状態の症状をまだ経ていない、または呈していないことを意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、遺伝子またはポリヌクレオチドの文脈における「発現」という用語は、遺伝子またはポリヌクレオチドのＲＮＡへの転写を伴う。この用語は、必ずしもそうではないが、ＲＮＡのその後のポリペプチド鎖への翻訳およびタンパク質へのそれらの集合も含み得る。
【００３３】
植物の残骸には、目的のタンパク質が発現した植物に由来する１つ以上の分子（タンパク質およびその断片、ミネラル、ヌクレオチドおよびその断片、植物構造成分などが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。したがって、植物材料全体（植物の葉、茎、果実などの全体または一部など）、または粗植物抽出物に関連する組成物には、高濃度の植物の残骸、および検出可能な植物の残骸が１つ以上ある目的の精製タンパク質を含む組成物が、確実に含まれる。特定の実施形態では、植物の残骸はルビスコである。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕ（例えば、口内）およびステント、人工関節などの外科的移植に有用な生物医学的機器上でのバイオフィルム形成を治療または予防するための投与可能な組成物に関する。この実施形態では、機器は、機器の望ましくないバイオフィルムの沈着を抑制するために組成物でコーティングされる。組成物は、治療有効量の１つ以上の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）、および組み合わせてバイオフィルム分解活性を有する１つ以上の酵素を含み、前記ＡＭＰおよびその酵素のそれぞれは、植物および植物の残骸によって発現され、相乗的に作用して前記バイオフィルムを分解する。特定の実施形態では、ＡＭＰおよび酵素は、別々の色素体形質転換ベクターから発現される。他の実施形態では、ＡＭＰおよび酵素の両方が単一のベクターから発現されるポリシストロン性コード配列を含む色素体形質転換ベクター。
【００３５】
他の実施形態では、抗菌ペプチドは任意選択であり、１つ以上の酵素は、１つ以上の抗菌剤および／またはエッセンシャルオイルと組み合わせて使用される。
【００３６】
本明細書で教示される特定の実施形態に従って発現されるタンパク質は、様々な方法で対象、ヒトまたは動物に投与することによりインビボで使用され得る。医薬組成物は、経口、局所、皮下、筋肉内、または静脈内投与することができるが、経口局所投与が好ましい。
【００３７】
本発明の実施形態により生成される経口組成物は、色素体由来の治療用タンパク質を生成するトランスジェニック植物で製造された食料の消費により投与させることができる。植物の食用部分またはその一部は、食物成分として使用される。治療組成物は、所望の投与様式に適した固体または液体のビヒクル、希釈剤および添加剤を使用して、古典的な様式で製剤化することができる。経口で、組成物は、少なくとも１つのビヒクル、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどとともに、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、ゴムなどの形態で、投与することができる。対象の治療用タンパク質は、植物ホモジネートから任意選択で精製してもよい。調製物は乳化されてもよい。活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの少量の補助物質を含んでもよい。好ましい実施形態において、医薬生産トランスジェニック植物の食用植物、果汁、穀物、葉、塊茎、茎、種子、根、または他の植物の部分は、ヒトまたは動物によって摂取され、そのため疾患の治療の非常に安価な手段を提供する。
【００３８】
特定の実施形態において、ＡＭＰｓを発現する葉緑体、およびバイオフィルム分解酵素、およびそれらの組み合わせを含む植物材料（例えば、レタス材料）は、均質化およびカプセル化される。特定の一実施形態では、レタス材料の抽出物がカプセル化される。別の実施形態では、レタス材料はカプセル化の前に粉末化される。前述のように、バイオフィルム分解タンパク質は、発現後に植物から精製することもできる。
【００３９】
別の実施形態では、投与の便宜のために、組成物にトランスジェニック植物の果汁を提供してもよい。前述の目的のために、形質転換される植物は、とりわけトマト、ニンジン、およびリンゴから成る食用植物から選択されることが好ましく、これらは通常ジュースの形で消費される。
【００４０】
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示されるペプチドの組み合わせを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換葉緑体ゲノムに関する。
【００４１】
特に興味深いのは、１つ以上のＡＭＰおよびバイオフィルム分解酵素またはそれらの組み合わせ、ポリペプチドを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換された、形質転換葉緑体ゲノムである。関連する実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるペプチドを発現するように形質転換された少なくとも１つの細胞を含む植物に関する。
【００４２】
本明細書における遺伝子配列への言及は、一本鎖または二本鎖核酸配列を指し、目的のポリペプチドのコード配列またはコード配列の相補体を含む。ポリペプチドをコードする縮重核酸配列％、ならびにｃＤＮＡと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６０％、好ましくは約７５％、９０％、９６％、または９８％同一である相同ヌクレオチド配列を、本明細書で教示のポリヌクレオチドに関して使用することができる。２つのポリヌクレオチドの配列間の配列同一性の割合は、−１２のギャップオープンペナルティおよび−２のギャップ拡張ペナルティを伴うアフィンギャップサーチを使用して、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するＡＬＩＧＮなどのコンピュータプログラムを使用して判定される。生物学的に活性なポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体、および核酸配列の変異体も、有用なポリヌクレオチドである。
【００４３】
上記の核酸配列の変異体および相同体も有用な核酸配列である。典型的には、相同ポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知のように、ストリンジェントな条件下で、候補ポリヌクレオチドを既知のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることにより同定され得る。例えば、次の洗浄条件を使用する：２  Ｘ  ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温２回、各３０分；その後、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分；その後、２Ｘ  ＳＳＣ、室温２回、各１０分間最大約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む各相同配列を特定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、さらにより好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００４４】
本明細書で言及されるポリヌクレオチドの種相同体は、適切なプローブまたはプライマーを作製し、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定することもできる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは、相同性が１％低下するごとに１〜１．５°Ｃ低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１，１２３（１９７３）。目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に続くそれらの相補体も、有用なポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は、当技術分野において周知であり、理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９，ａｔ  ｐａｇｅｓ  ９．５０−９．５１に開示されている。
【００４５】
実施例ＩおよびＩＩの実施を促進するために、以下の材料および方法が提供されている。
【００４６】
微生物と成長条件
本研究では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９血清型ｃ（ＡＴＣＣ  ７００６１０）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＡＴＣＣ  １２１０４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ  ＤＬ−１およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４を使用した。これらの株が選択されたのはＳ．ｍｕｔａｎｓが良く確立された毒性の齲蝕原性細菌であるからである［Ａｊｄｉｃ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，２００２］．Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは歯科用バイオフィルムの先駆的な生着菌であり、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉも歯科用バイオフィルム形成の初期段階で検出され、根の齲蝕の発生に関連することがある［Ｄｉｇｅ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ、２００９］。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、人間の粘膜表面に定着する真菌生物であり、児童期初期の齲蝕のある幼児の歯垢からも検出される［Ｈａｊｅｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１５］。すべての株は、２０％グリセロールを含むトリプシンソイブロスで−８０°Ｃで保存した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの培養には、血液寒天プレートを使用した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにはサブロー寒天プレートを使用した。これらの株はすべて、使用前に中間指数期まで（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）１％グルコースを用いて、限外ろ過（１０ｋＤａ分子量カットオフ膜；Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州）で緩衝化されたトリプトン酵母エキスブロス（ＵＦＴＹＥ；２．５％トリプトンおよび１．５％酵母エキス、ｐＨ７．０）で成育させた。
【００４７】
異なるタグ付きＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラストミック線の作成
ＣＴＢ、ＰＴＤ、レトロサイクリンおよびプロテグリンと融合したＧＦＰを発現するトランスプラストミック植物は、以前の研究に記載されているように作成された［Ｌｉｍａｙｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００６；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１］。ＧＦＰ融合タンパク質を発現するトランスプラストミック系統は、以前に記載されているようにサザンブロットアッセイを使用して確認された［Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ  ２００８］。また、ＧＦＰ標識タンパク質の発現は、ＵＶ照明下で各構築物の葉からの緑色蛍光を視覚化することによって確認された。
【００４８】
タグ融合ＧＦＰタンパク質の精製
トランスプラストミックタバコからのＧＦＰ融合プロテグリン−１（ＰＧ１）およびレトロサイクリン（ＲＣ１０１）の精製は、有機抽出に続いて以前に行われた疎水性クロマトグラフィによって達成された（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。凍結乾燥した葉の物質約０．２〜１ｇを取り、１０〜２０ｍｌの植物抽出バッファ（０．２ＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．４Ｍスクロース、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、２％のフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび１つのプロテアーゼ阻害剤カクテルにて補充）で再構成した。再懸濁物を氷中で１時間インキュベートし、１５分ごとにボルテックス均質化した。次いで、ホモジネートを４℃、７５０００ｇで１時間遠心沈殿させ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＥ−８０Ｋ  ｏｐｔｉｍａ超遠心機）、清澄化した溶解物を得た。溶解物を７０％飽和硫酸アンモニウムおよび１／４容量の１００％エタノールで前処理した後、２分間激しく振とうした（Ｙａｋｈｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。処理した溶液を２１００ｇで３分間遠心沈殿させた。上部エタノール相を収集し、１／１６容量の１００％エタノールを使用してプロセスを繰り返した。プールしたエタノール相を、１／３容量の５ＭのＮａＣｌおよび１／４容量の１−ブタノールでさらに処理し、２分間激しく均質化し、２１００ｇで３分間遠心分離した。最下相を収集し、７ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に装填し、メーカーの推奨に従って脱塩した。
【００４９】
次いで脱塩された抽出物は、さらに精製するために、捕捉相の間に疎水性相互作用クロマトグラフィにかけられた。脱塩した抽出物を、ＦＰＬＣユニット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ−ＦＰＬＣシステム）で実行したＴｏｙｏｐｅａｒｌブチル−６５０Ｓ疎水性相互作用カラム（Ｔｏｓｏｈ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入した。カラムを２．３カラム容量の塩緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび５０％飽和硫酸アンモニウム）で平衡化して、最終的に２０％塩を飽和にし、樹脂へのＧＦＰの結合を促進した。これに続いて、５．８カラム容量の塩および無塩の緩衝液混合物でカラム洗浄し、その後、無塩緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）で溶出した。ＧＦＰ画分は、クロマトグラムで観察されたピークに基づいて特定され、収集された。収集された画分は、一晩の透析による最終研磨工程にかけられた。透析後、最終生成物を濃縮するために精製タンパク質を凍結乾燥し（ｌａｂｃｏｎｃｏ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ）、−２０℃で保存した。
【００５０】
精製ＧＦＰ融合の定量化
ＧＦＰ−ＲＣ１０１およびＧＦＰ−ＰＧ１の定量化は、ウェスタンブロット法と蛍光法の両方で行われた。凍結乾燥した精製タンパク質を滅菌１Ｘ  ＰＢＳに再懸濁し、総タンパク質をブラッドフォード法により判定した。次に、変性タンパク質のサンプルを市販のＧＦＰ標準（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）とともに１２％ＳＤＳゲルに装填することにより、精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で定量し、１：３０００希釈のマウスＡｎｔｉ−ＧＦＰ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、その後１：４０００希釈の二次ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ）でプローブした。
【００５１】
精製タンパク質はまた、ＧＦＰ蛍光を使用して定量化された。タンパク質のサンプルは、素の条件下で１２％ＳＤＳゲルで泳動した。実行後、ゲルをＵＶランプの下に置き、次いで写真を撮った。標準の曲線を取得するために、市販のＧＦＰ標準を使用したＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用したデンシトメトリ分析により、ウェスタン法と素の蛍光法の両方におけるＧＦＰ濃度を判定した。純度は、ブラッドフォード法で判定された総タンパク質値に関するＧＦＰ定量に基づいて判定された。
【００５２】
ヒト歯周細胞株による精製タグ融合ＧＦＰタンパク質の取り込み
前述のように（Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ  ２０１６）、ヒト歯周靭帯幹細胞（ＨＰＤＬＳ）、上顎間葉系幹細胞（ＭＭＳ）、ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞（ＳＣＣ−１）、歯肉由来間葉系間質細胞（ＧＭＳＣ）、成人歯肉ケラチノサイト（ＡＧＫ）および骨芽細胞（ＯＢＣ）を含む、異なるヒト歯周細胞株における４つのタグＣＴＢ、ＰＴＤ、ＰＧ１およびＲＣ１０１の取り込みを判定するために、簡単に言うと、各ヒト細胞株細胞（２ｘ１０４）を、３７°Ｃで８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）で一晩培養した後、精製ＧＦＰ融合タグとのインキュベーションを行った；１％ＦＢＳを３７℃で１時間補充した１００μｌＰＢＳ中のＣＴＢ−ＧＦＰ（８．８μｇ）、ＰＴＤ−ＧＦＰ（１３μｇ）、ＧＦＰ−ＰＧ１（１．２μｇ）およびＧＦＰ−ＲＣ１０１（１７．３μｇ）で行った。ＲＴにて２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、すべての細胞をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の退色防止マウンティング培地で染色した。ネガティブ制御のために、細胞を１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中の市販のＧＦＰ（２μｇ）で３７℃で１時間インキュベートした。すべての固定細胞は、共焦点顕微鏡を使用して画像化された。画像は１００倍の対物レンズの下で観察され、３つの独立した分析で各細胞株について少なくとも１０〜１５個のＧＦＰ陽性細胞が記録された。
【００５３】
抗菌活性の評価
Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対するＡＭＰ（Ｇｆｐ−ＰＧ１およびＧｆｐ−ＲＣ１０１）の殺傷動態を、タイムラプス殺傷アッセイによって分析した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓを対数期まで成長させ、成長培地で１０５ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。ＧＦＰ−ＰＧ１とＧＦＰ−ＲＣ１０１をそれぞれ０〜１０μｇ／ｍｌと０〜８０μｇ／ｍｌの濃度でＳ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液に加えた。０、１、２、４、８、および２４時間でサンプルを採取し、０．８９％ＮａＣｌで連続希釈し、その後寒天プレートに広げ、４８時間後にコロニーをカウントした。各時点で６００ｎｍの吸光度もチェックした。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ懸濁液を１０μｇ／ｍｌの濃度でＧｆｐ−ＰＧ１と混合し、０、１、および２時間でＣＦＵを数えあげるためにアリコートを取り出した。
【００５４】
また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ細胞の生存率に対するＡＭＰの影響は、タイムラプス測定によって評価された。Ｓ．ｍｕｔａｎｓを対数期まで成長させ、遠心分離で収穫し（５５００ｇ、１０分間）、ペレットをリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で１回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、１×１０５ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度に調整した。ＧＦＰ−ＰＧ１をＳ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液に１０μｇ／ｍｌの濃度で加え、２．５μＭのヨウ化プロピジウム−ＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州、米国）を死細胞の標識に加えた。共焦点イメージングのために、５μｌの混合物をアガロースパッドに装填した。共焦点画像は、１００倍（開口数１．４）の油浸の対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ５−ＦＬＩＭ倒立単一光子レーザー走査顕微鏡を使用して取得した。励起波長は、ＧＦＰおよびＰＩでそれぞれ４８８ｎｍおよび５４３ｎｍであった。ＧＦＰの放射フィルタは４９５／５４０  ＯｌｙＭＰＦＣ１フィルタで、ＰＩは５９８／６２８  ＯｌｙＭＰＦＣ２フィルタであった。タイムラプスシリーズでは、同じ視野の画像が０、１０、３０、および６０分に撮影され、ＩｍａｇｅＪ  １．４４（Ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｈｔｍｌ）によって作成された。
【００５５】
ＡＭＰで処理されたＳ．ｍｕｔａｎｓの形態学的観察も、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって調べられた。Ｓ．ｍｕｔａｎｓを対数増殖期まで成長させ、ＰＢＳで１０５ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。細菌懸濁液をＧＦＰ−ＰＧ１（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）と、３７℃で１時間混合した。処理後、０．４μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタを使用したろ過により細菌を回収した。沈着物を室温で１時間、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒドおよび２．０％パラホルムアルデヒドで固定し、ＳＥＭ（Ｑｕａｎｔａ  ＦＥＧ  ２５０、ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、オレゴン州）の観察のために処理した。未処理または緩衝液で処理された細菌のみがコントロールとして機能した。
【００５６】
抗バイオフィルム活性の評価
口腔病原体であるＳ．ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９を産生する十分に特徴付けられたＥＰＳマトリックスを使用して、唾液コーティングヒドロキシアパタイトディスク表面にバイオフィルムを形成した。簡単に説明すると、ヒドロキシアパタイトディスク（直径１．２５ｃｍ、表面積２．７±０．２ｃｍ２、クラークソン、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｐｏｒｔ、ペンシルバニア州）をフィルタ滅菌した透明な全ヒト唾液（ｓＨＡ）でコーティングした［Ｘｉａｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌｏ．，２０１２］。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＵＦＴＹＥ培地で中間指数期（３７℃、５％ＣＯ２）まで増殖させた。各ｓＨＡディスクに、１％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＵＦＴＹＥ培地で１ｍｌあたり１０５ＣＦＵの活発に増殖するＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２で１９時間接種した。接種前に、ｓＨＡディスクをＧＦＰ−ＰＧ１溶液（１０ｕｇ）で３０分間局所処理した。３Ｄバイオフィルムアーキテクチャに対するＧＦＰ−ＰＧ１処理の阻害効果は、共焦点イメージングを介して観察された。簡単に説明すると、２．５μＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識デキストランコンジュゲート（１０  ｋＤａ；６４７／６６８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用してＥＰＳを標識し、一方で細菌細胞を２．５μＭのＳＹＴＯ９（４８５／４９８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）で染色した。イメージングは、２０倍（開口数、１．００）の水浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ５顕微鏡を使用して実行された。励起波長は７８０ｎｍ、ＳＹＴＯ  ９の発光波長フィルタは４９５／５４０  ＯｌｙＭＰＦＥＣ１フィルタであり、一方Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７のフィルタはＨＱ６５５／４０Ｍ−２Ｐフィルタであった。共焦点画像シリーズは、選択した各位置での光学セクショニングによって生成され、ｚシリーズスキャンのステップサイズは２μｍであった。Ａｍｉｒａ  ５．４．１ソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、バイオフィルムアーキテクチャの３Ｄレンダリングを作成した［Ｘｉａｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｋｏｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１０］。
【００５７】
ｓＨＡディスク上で１９時間Ｓ．ｍｕｔａｎｓで形成されたバイオフィルムに対するＰＧ１の影響を調べるために、１）コントロールと、２）ＥＰＳ分解酵素のみ、３）ＰＧ１のみ、または４）ＰＧ１およびＥＰＳ分解酵素を最大６０分間、バイオフィルムインキュベーションした後、タイムラプス共焦点顕微鏡を使用して、ＥＰＳマトリックスの３Ｄアーキテクチャ、およびｉｎ  ｓｉｔｕ細胞生存率を調べた。ここで使用したＥＰＳ分解酵素は、デキストラナーゼとムタナーゼであり、α−１，６グルコシド結合とα−１，３グルコシド結合を加水分解することにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ由来のＥＰＳを消化することができた［Ｈａｙａｃｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００４］。ペニシリウム属から生産されたデキストラナーゼＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から商業的に購入し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍから産生されたムタナーゼはＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈ．Ｂｏｗｅｎ（ロチェスター大学医療センター、口腔生物学センター）から親切にも提供された。デキストラナーゼとムタナーゼは、バイオフィルムに適用する前に５：１の比率で混合した［Ｍｉｔｓｕｅ  Ｆ．Ｈａｙａｃｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００４］。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識デキストランコンジュゲートを使用してＥＰＳマトリックスを標識し、一方でＳＹＴＯ  ９およびＰＩを使用して生細胞と死細胞を標識した。バイオフィルムは、０、１０、３０、および６０分で共焦点蛍光イメージングを使用して検査され、ＡＭＩＲＡ／ＣＯＭＳＴＡＴ／ＩｍａｇｅＪ分析にかけられた。共焦点画像の各シリーズにおけるＥＰＳマトリックス、生細胞および死細胞の総バイオマスを、ＣＯＭＳＴＡＴおよびＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。各時点での全細菌に対する生菌の比率を計算し、生細胞の生存率（０分での生細胞に対する）をプロットした。０分時点での生細胞の初期数が１００％とみなされた。生存率は、０分時点と比較して判定された。
【００５８】
微生物学的アッセイ
選択した時点（１９時間）で、バイオフィルムを取り出し、超音波処理によりホモジナイズし、以前に詳述したように微生物学的分析を行った［Ｘｉａｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｋｏｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１０］。本発明者らの超音波処理手順は、細菌細胞を殺すことなく、最適な分散と最大の回復可能なカウントを提供する。バイオフィルム懸濁液のアリコートを連続希釈し、噴霧式渦Ｊｅｔ  Ｓｐｉｒａｌ  Ｐｌａｔｅｒ（ＩＵＬ、ＳＡ、バルセロナ、スペイン）を使用して血液寒天プレートに播種した。一方、定量的ＰＣＲ（ＰＭＡ−ｑＰＣＲ）と組み合わせたプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）は、記載されているようにＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞の生存率の分析に使用された。［Ｋｌｅｉｎ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ．２０１２］。死細胞のＤＮＡに架橋したＰＭＡと細胞外ＤＮＡは、ＤＮＡを改変し、抽出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を阻害するため、ＰＭＡとｑＰＣＲの組み合わせは、無傷の膜を持つ細胞（すなわち、生細胞）のみを定量化する。手短に言えば、バイオフィルムペレットを５００μｌのＴＥ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で再懸濁した。ピペットを使用して、バイオフィルム懸濁液を１．５  ｍｌの微量遠心管に移した。次にＰＭＡと混合した。１．５μｌのＰＭＡ（２０％ジメチルスルホキシド中２０ｍＭ；Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、カリフォルニア州）をバイオフィルム懸濁液に添加した。時々混合しながら、室温で５分間、暗所でチューブをインキュベートした。次に、サンプルを３分間光にさらした（６００Ｗハロゲン光源）。光誘起架橋後、バイオフィルム懸濁液を遠心分離し（１３，０００ｇ／１０分／４℃）、上清を廃棄した。ペレットを１００μｌのＴＥで再懸濁した後、１０．９μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌストック）と５μｌのムタニリジン（５Ｕ／μｌストック）でインキュベートした（３７°Ｃ／３０分）。次に、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マディソン、ウィスコンシン州）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。サンプルおよびネガティブ制御（ＤＮＡなし）あたりのゲノムＤＮＡの１０ピクトグラムを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州）およびＳ．ｍｕｔａｎｓ特異的プライマー（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）を使用したＭｙｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システムにより増幅した［Ｋｌｅｉｎ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０］。
【００５９】
統計分析
データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。すべてのアッセイは、少なくとも２つの異なる実験で２回実施された。スチューデントのｔ検定を使用して、試験とコントロールのペアワイズの比較を行った。本研究におけるすべての統計的検定で選択された有意水準は、Ｐ<０．０５であった。
【００６０】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を図示するために提供される。それらは、決して本発明を限定することを意図していない。
【００６１】
実施例Ｉ  
トランスプラストミック系統の作成と特性評価
すべての融合タグ（ＣＴＢ、ＰＴＤ、プロテグリン、レトロサイクリン）は、効率と特異性を評価するために、Ｎ末端で緑色蛍光タンパク質（ｓｍＧＦＰ）に融合された。これらの融合タンパク質をコードする融合構築物は、葉緑体形質転換ベクターにクローン化され、それはその後、この参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／１０１，３８９号に記載されているように目的の植物を形質転換するために使用された。ＧＦＰ融合タンパク質を発現する植物を作成するために、タバコ葉緑体は微粒子銃粒子送達システムを使用して形質転換された。図１Ｂに見られるように、各タグ融合ＧＦＰは同一の調節配列−ｐｓｂＡプロモータと、光によって調節される５’ＵＴＲによって駆動され、転写されたｍＲＮＡは３’ｐｓｂＡ  ＵＴＲによって安定化される。ｐｓｂＡ遺伝子は最も高度に発現する葉緑体遺伝子であるため、ｐｓｂＡ調節配列は、本発明者らの研究室で導入遺伝子の発現に使用される［７、３４］。葉緑体ゲノムへの発現カセットの統合を促進するために、２つの隣接配列、イソロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｎＩ）およびアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｎＡ）遺伝子は、天然葉緑体ゲノム配列と同一の発現カセットに隣接している。選択培地からの新芽は、ｔｒｎＩおよびｔｒｎＡスペーサ領域での導入遺伝子カセットの特異的統合について調査され、その後各植物細胞におけるすべての葉緑体ゲノムの形質転換（非形質転換野生型葉緑体ゲノムの不在）がサザンブロット分析によって確認された。したがって、融合タンパク質を抽出する前に、すべてのＧＦＰ発現カセットと葉緑体ゲノムのホモプラスミーと導入遺伝子の安定した統合が確認された。さらに、ＵＶ光の下で緑色蛍光を視覚化することにより、ＧＦＰの発現が表現型で確認された。その後、確認された同質細胞質のラインを移し、自動温室で培養してバイオマスを増やした。
【００６２】
各ＧＦＰタグ付き植物の葉材料のバイオマスをスケールアップするために、各同質細胞質のラインを温度と湿度が制御された温室で成長させた。完全に成長した成熟した葉を夕方遅くに収穫して、光調節された調節配列により駆動されるＧＦＰ融合タンパク質の蓄積を最大化した。重量ベースで融合タンパク質の含有量をさらに増加させるために、凍結葉を真空下で−４０℃で凍結乾燥させた。タンパク質の濃縮効果に加えて、凍結乾燥により、室温で１年以上、植物で発現した治療用タンパク質の有効期間が延長された［Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５；２０１６］。したがって、この研究では、ＧＦＰ融合タグタンパク質を発現する凍結乾燥および粉末化植物細胞をマウスへの経口送達に使用した。
【００６３】
トランスプラストミックタバコからのＧＦＰ融合抗菌ペプチドの発現と精製
ＧＦＰ融合抗菌ペプチドＲＣ１０１およびＰＧ１を発現するタバコの葉を温室から収穫し、その後タンパク質の抽出と精製のために凍結乾燥した。ＧＦＰ−ＲＣ１０１の平均発現レベルは、粗抽出物中の総タンパク質の８．８％であることがわかり、一方でＧＦＰ−ＰＧ１の発現は、デンシトメトリに基づく総タンパク質の３．８％であった。発現レベルの違いは、以前に報告されたものと同様であった（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１，Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。
【００６４】
異なる抗菌ペプチド（ＲＣ１０１およびＰＧ１）に融合したＧＦＰの精製は、プランクトンおよびバイオフィルム形成Ｓ．ｍｕｔａｎｓの両方に対する殺菌活性を検証するために行われた。異なるＧＦＰ融合を発現する凍結乾燥タバコ材料を抽出および後続のダウンストリーム処理に使用して（図８を参照）完成した精製された生成物を取得し、ＧＦＰ融合ペプチドの濃度を判定するために後続的に定量化した。精製されたＧＦＰ−ＲＣ１０１およびＧＦＰ−ＰＧ１の定量は、ウェスタンブロットとネイティブＧＦＰ蛍光法の両方で行われた。精製されたＧＦＰ−ＲＣ１０１は、９４％の平均純度を示し、凍結乾燥した葉材料１ｇあたり１６２４μｇのＧＦＰ（１１６μｇのＲＣ１０１ペプチド）という平均収量であった（図１Ａおよび図１Ｂ）。ＧＦＰ−ＰＧ１では、両方の方法（図１Ｃおよび図１Ｄ）が１７％の平均純度を示し、凍結乾燥葉材料１ｇｍあたり５８．８μｇのＧＦＰ（４．２μｇ、ＰＧ１ペプチド）の平均収量であった。純度の違いは、以前の研究で見られたように、ＧＦＰに融合したタグのタイプの違いに起因する可能性がある（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５，Ｓｋｏｓｙｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）。植物抽出物からの精製ＧＦＰ−ＲＣ１０１およびＧＦＰ−ＰＧ１の倍濃縮は、それぞれ１０．６および４．５であった。また、ウェスタンブロットは、２７ｋＤａのＧＦＰ標準も示す。これは、６〜８ｎｇのＧＦＰの範囲の負荷で、５４ｋＤａのＧＦＰダイマーとともに単量体の断片に対応する。ＧＦＰ−ＲＣ１０１ウェスタンブロットでは、２９ｋＤａおよび５８ｋＤａの断片がはっきりと見え、これは融合の単量体および二量体型に対応する（図１Ａ）。これは、ＧＦＰが二量体を形成する能力に起因する可能性がある（Ｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＧＦＰ−ＰＧ１のウェスタンブロット（図１Ｄ）は、２９ｋＤａの単量体が４０ｋＤａの断片とともに、以前に記載したように同時精製された可能性のある他の非特異的植物タンパク質に結合したＧＦＰ−ＰＧ１による移動度のシフトによる可能性があることを明確に示している（Ｍｏｒａｓｓｕｔｔｉａ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。ＧＦＰ−ＲＣ１０１およびＧＦＰ−ＰＧ１のネイティブ蛍光（図１Ｂおよび図１Ｄ）は、ＧＦＰがカチオン性ペプチドに融合されているためにＧＦＰが、以前の研究で説明されている各ＧＦＰ断片で電気泳動移動度シフトを引き起こしている可能性がある、２７ｋＤａ  ＧＦＰ標準サイズ以下で見えるマルチマーバンドを示している（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。
【００６５】
ＡＭＰの抗菌活性
図２（Ａ〜Ｅ）に示されるように、本発明者らは最初に用量反応時間−殺傷研究を使用してＧＦＰ−ＰＧ１の抗菌活性を調べた。ＧＦＰ−ＰＧ１は、証明済みのバイオフィルム形成および齲歯惹起の病原であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓに対して強力な抗菌活性を示し、低濃度で１時間以内に細菌細胞を急速に殺傷する（図２Ａ）。ＧＦＰ−ＰＧ１はまた、初期の口腔生着菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉも殺傷したが、試験した濃度でＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対して限られた抗真菌活性を示した（図２Ｅ）。タイムラプス共焦点イメージングは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの生存率が、未処理のコントロール（図３Ｂ）と比較して、図３Ａに示すように、１０分で影響を受けることを示している。ＳＥＭイメージングにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ膜表面の破壊が明らかになり、細胞内含有量の押し出しと不規則な細胞形態が引き起こされた一方で、未処理の細菌が、いかなる可視の細胞溶解またはデブリもなく、素のままで滑らかな表面を示していた（図３Ｃ）。Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対するＧＦＰ−ＰＧ１の抗菌効果を示したので、この抗菌ペプチドのバイオフィルム形成の防止または事前に形成されたバイオフィルムの破壊の可能性を調べた。
【００６６】
ＡＭＰによるバイオフィルムの開始の阻害
薬物は局所適用後に治療効果を発揮する必要があるため、病原性口腔バイオフィルムの形成を防ぐことは困難である。ＧＦＰ−ＰＧ１がバイオフィルムの開始を妨害できるかどうかを判断するために、唾液コーティングアパタイト（ｓＨＡ）表面（歯の代理）をＧＦＰ−ＰＧ１の単一局所治療で３０分間処理し、その後、活発に成長するＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞と蝕原性（スクロースに富む）条件でインキュベートした。ＧＦＰ−ＰＧ１処理ｓＨＡ表面上でＥＰＳマトリックスの蓄積が最小限のＳ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成の実質的な障害が観察された（図４Ｂおよび４Ｃ）。少数の付着細胞クラスタは、コントロールと比較してほとんど生存不能であり（図４Ａ）、局所的な短期曝露にもかかわらず、バイオフィルムの開始に対するＧＦＰ−ＰＧ１の強力な効果を示した。
【００６７】
ＥＰＳ分解酵素を含むまたは含まないＡＭＰによる事前形成バイオフィルムの破壊
表面に形成されたバイオフィルムの破壊は困難である。齲蝕原性バイオフィルムの破壊は、周囲のエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）を豊富に含んだマトリックスを取り込んで保護するため、薬物が病原菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓなど）のクラスタに到達できないことが多いため、特に困難である［Ｂｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏ，２０１１］。デキストラナーゼやムタナーゼなどのＥＰＳ分解酵素は、抗菌効果はないが、齲蝕原性バイオフィルムのマトリックスの消化に役立つ。まず、細胞生存率に影響を与えることなく、ＥＰＳマトリックスの破壊に必要なデキストラナーゼおよび／またはムタナーゼを最適化した（データは示さず）。図５に示すように、デキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせは、ＥＰＳ（赤色）と細菌細胞クラスタ（緑色）と「覆いのない」細胞（矢印参照）間の「オープンスペース」（矢印参照）を消化できる。したがって、ＧＦＰ−ＰＧ１とＥＰＳ分解酵素の組み合わせは、全体的な抗バイオフィルム効果を相乗的に強化する。
【００６８】
この概念を探求するため、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓバイオフィルムをｓＨＡ表面に事前に形成し、ＧＦＰ−ＰＧ１およびＥＰＳ分解酵素（Ｄｅｘ／Ｍｕｔ）を単独または組み合わせて局所的に処理した。タイムラプス共焦点イメージングと定量的計算分析を実施して、バイオフィルム内のＥＰＳマトリックス分解と生／死菌細胞を分析した（図６Ａ）。酵素とペプチドの組み合わせにより、ＥＰＳマトリックスが６０％以上分解されたが、ＧＦＰ−ＰＧまたはＤｅｘ／Ｍｕｔ単独と比較した場合、細菌の死滅が増加した。これらの発見は、コロニー形成単位を判定することにより、標準的な培養アッセイを介してさらに検証された。Ｄｅｘ／Ｍｕｔと組み合わせたＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムに対するＰＧの抗菌活性は、単独のいずれよりも大幅に強化された。Ｄｅｘ／Ｍｕｔ単独の局所曝露はバイオフィルム細胞の生存率に影響を示さなかったが、ＧＦＰ−ＰＧ−１単独は限られた殺傷活性を示した（図６Ｂ）。合わせて、データは、確立されたバイオフィルムに対するＧＦＰ−ＰＧ−１の抗菌効果を相乗的に強化するこの組み合わせアプローチの可能性を実証している（図６Ｃ）。
【００６９】
ヒト歯周細胞による異なるタグと融合したＧＦＰの取り込み。
【００７０】
ＨＰＤＬＳ、ＭＭＳ、ＳＣＣ−１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよび骨芽細胞（ＯＢＣ）を含むヒト培養細胞とインキュベートした場合の精製ＧＦＰ融合タンパク質は、興味深い結果を明らかにした。各細胞株の代表的な画像が１つだけ提示されているが、取り込み研究は３回繰り返して行われ、共焦点顕微鏡下で少なくとも１０〜１５枚の画像が記録された。融合タグがなければ、ＧＦＰは試験されたヒト細胞株には入らなかった。ＣＴＢ−ＧＦＰとＰＴＤ−ＧＦＰは、試験対象のすべての細胞タイプに効果的に浸透したが、局在パターンは異なった。ＣＴＢ−ＧＦＰとインキュベーションすると、ＧＦＰシグナルは主にＨＰＤＬＳＣおよびＭＭＳＣの周辺、ＳＳＣ−１の均一な小さな細胞質斑点、ＡＧＫ、ＯＢＣおよびＧＭＳＣの大きな細胞質病巣に局在した。ＰＴＤ−ＧＦＰは、ＭＭＳＣの小さな細胞質病巣、ＨＰＤＬＳＣ、ＧＭＳＣ、ＡＧＫ、ＯＢＣ、および細胞質とＳＣＣ−１細胞の周辺の様々なサイズの細胞質斑点として観察された。ＰＧ１−ＧＦＰは、ＧＦＰが他のいずれの融合タンパク質よりも１０倍低い濃度で局在化できるため、試験されたすべてのヒト細胞への進入に最も効率的なタグである。ＰＧ１−ＧＦＰは、ＨＰＤＬＳＣ、ＳＣＣ−１、ＧＭＳＣおよびＡＧＫ細胞でのみ細胞質局在を示し、ＭＭＳＣでは末梢およびサイトゾルの両方に局在していたが、ＯＢＣの末梢にのみ局在している。ＲＣ１０１−ＧＦＰはＳＣＣ−１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣに局在していたが、ＨＰＤＬＳＣでの局在は無視でき、ＭＭＳＣ細胞では検出できなかった。
【００７１】
考察と結論
齲蝕原性口腔バイオフィルムの集合は、細胞外ＥＰＳマトリックスが発達するにつれて、病原性細菌がどのように表面（歯）に蓄積するかを示す代表的な例である。齲蝕原性バイオフィルム形成の予防には、局所治療による歯の表面での細菌の蓄積の破壊が必要である。クロルヘキシジン（ＣＨＸ）は、局所抗菌療法の「ゴールドスタンダード」とみなされている（Ｆｌｅｍｍｉｇ  ａｎｄ  Ｂｅｉｋｌｅｒ  ２０１１；Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１；Ｃａｕｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。ＣＨＸは唾液中のミュータンス連鎖球菌レベルを効果的に抑制するが、歯の染色や結石形成などの有害な副作用があり、毎日の予防的または治療的使用には推奨しない（Ａｕｔｉｏ−Ｇｏｌｄ  ２００８）。別の方法として、いくつかの抗菌ペプチド（ＡＭＰ）が開発され、口腔細菌に対して試験され、バイオフィルムに対する潜在的な影響が示されている（影響はプランクトン細胞に対して減少している）（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２によるレビュー）。残念ながら、これらの研究では、臨床的に使用される局所治療レジメンではなく、ＡＭＰｓへの継続的で長時間のバイオフィルム曝露（数時間）を使用して、抗バイオフィルムの有効性を試験した。さらに、合成ＡＭＰｓは製造コストが高く、歯科用途には妥当でない。ここでは、植物で作られたＡＭＰを示す。これは、歯の代理表面の単一の短期局所治療でバイオフィルム形成を制御する強力な効果を示している。
【００７２】
開発された齲蝕原性バイオフィルムは、ＥＰＳマトリックスに埋め込まれた細菌によって特徴付けられ、バイオフィルムの処理と除去を非常に困難にする（Ｐａｅｓ  Ｌｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００６；Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。ＥＰＳが豊富なマトリックスは、微生物の付着、凝集、保護を促進し、拡散を妨げる（Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３；Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  ２０１０）。ＥＰＳマトリックスは、バイオフィルムに空間的および微小環境的な不均一性を作り出し、局所的に抗菌剤に対する病原体の成長と保護を調整し、歯の表面にバイオフィルムをしっかりと付着させる接着性の高い足場を作る（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  ２０１０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ＣＨＸは、形成された齲蝕原性バイオフィルムに対してはるかに効果が低い（Ｈｏｐｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ、２００４；Ｖａｎ  Ｓｔｒｙｄｏｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＥＰＳは、主に不溶性（α１，３結合グルコースの含有量が高い）と可溶性（主にα１，６結合グルコース）グルカンの混合物で構成されている（Ｂｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏ  ２０１１）。このように、ＥＰＳマトリックス分解デキストラナーゼまたはムタナーゼ（真菌由来）を使用してバイオフィルムを破壊し、齲蝕を予防する可能性が調査され、商業的に入手可能な市販のマウスウォッシュ（例えば、Ｂｉｏｔｅｎｅ  ＰＢＦ）に含まれている。しかし、おそらく抗菌作用の欠如と口内での酵素活性の低下のために、酵素のみの局所適用は臨床的に中程度の抗バイオフィルム／抗齲蝕効果を生み出した（Ｈｕｌｌ  １９８０）（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）。興味深いことに、最近のｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、デキストラナーゼとムタナーゼが融合して構成されたキメラグルカナーゼが、いずれかの酵素単独よりもプラークバイオフィルムの破壊に効果的であることが示されている（Ｊｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。しかし、抗菌薬と両方のＥＰＳマトリックス分解酵素を単一の治療システムに組み合わせるアプローチは、おそらくコストと製剤に関連する困難のために、まだ開発されていない。この研究では、ＰＧ１とマトリックス分解酵素が相乗的かつ効果的に作用して齲蝕原性バイオフィルムを破壊することを実証する。この実現可能で効果的な局所抗バイオフィルムアプローチは、同時に、バイオフィルムマトリックスの足場を分解し、ＥＰＳ消化酵素と組み合わせた抗菌ペプチドを使用して、埋め込まれた細菌を殺すことができる。
【００７３】
プロテグリンとＧＦＰ融合による高レベルの抗菌活性の保持は、バイオフィルムの破壊を超えて、口腔の健康を向上させる多くの臨床応用への扉を開く。バイオフィルムの破壊に加えて、歯肉組織の創傷治癒を強化することは重要な臨床的ニーズである。本発明者らは最近、プロテグリンとレトロサイクリンの両方がヒトのマスト細胞に入り、創傷治癒プロセスの重要な工程である脱顆粒を誘導できることを報告した（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。したがって、抗菌ペプチドのプロテグリンとレトロサイクリンは、バイオフィルムの細菌を殺すのに重要な役割を果たし、マスト細胞の脱顆粒を通じて創傷治癒を開始する。さらに、成長ホルモンまたは他のタンパク質を効果的に送達して、細胞接着を強化し、骨形成、血管新生、骨再生、骨芽細胞または内皮細胞の分化を刺激することが重要である。以前に同定された細胞透過性ペプチドにはいくつかの制限がある。ＣＴＢは、ユビキタスＧＭ１受容体を介してすべての細胞タイプに入り、これにはＣＴＢの五量体型が必要である。一方、ＰＴＤは免疫細胞に侵入しない（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６）。
【００７４】
この研究では、ＰＧ１−ＧＦＰまたはＲＣ１０１−ＧＦＰが歯周および歯肉細胞に入る能力を試験した。ＰＧ１−ＧＦＰは、他の融合タンパク質よりも１０倍低い濃度でもＧＦＰシグナルを検出できるため、歯周または歯肉のヒト細胞への進入に最も効率的なタグである。細胞内局在には多少のばらつきがあったが、ＰＧ１−ＧＦＰはＨＰＤＬＳＣ、ＳＣＣ−１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫ、ＭＭＳＣ、ＯＢＣに効果的に入った。対照的に、ＲＣ１０１−ＧＦＰはＳＣＣ−１、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣに入ったが、ＨＰＤＬＳＣおよびＭＭＳＣ細胞での局在は不十分であるか検出できなかった。したがって、この研究では、骨芽細胞、歯根膜細胞、歯肉上皮細胞、または線維芽細胞に薬物を送達して口腔の健康を増進させるプロテグリンの新しい役割を特定した。機械的粉砕によって植物細胞で合成されたタンパク質薬物を放出することが可能であり、チューインガムに埋め込まれた凍結乾燥植物細胞にバイオカプセル化されたタンパク質薬物は、長時間のゆっくりとした持続放出のための理想的な薬物送達モードを提供する。これにより、現在の口腔洗浄剤の主な制限である、歯茎／歯面への抗菌剤の短時間の接触が克服される。
【００７５】
局所適用を超えて、植物細胞で発現したプロテグリンと融合したタンパク質薬は、非侵襲的な方法で歯肉組織のより深い層に経口送達され、患者のコンプライアンスを向上させることができる。植物にバイオカプセル化されたタンパク質薬は、効力を失うことなく室温で長年保存できる（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５；Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６）。現在のタンパク質医薬品の高コストは、法外に高価な発酵槽での生産、精製、冷蔵輸送／貯蔵、貯蔵寿命の短さ、および無菌送達方法によるものである。これらの課題はすべて、この新しいドラッグデリバリーの概念を使用して、口腔の健康を向上させることができる。タンパク質医薬品の製造のための植物細胞の最近のＦＤＡの承認（Ｗａｌｓｈ  ２０１４）は、この新しい概念の臨床的進歩に向けて順調に進んでいる。
【００７６】
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【００７７】
実施例ＩＩ
ＡＭＰを発現する葉緑体ベクター、バイオフィルム分解酵素およびその融合タンパク質の作成
バイオフィルムに関連する感染症の効果的な治療は、抗菌薬が周囲の細胞外マトリックス内に存在する微生物のクラスタに到達できず、それらを取り込んで保護するため、頻繁に問題となる。さらに、バイオフィルム関連の口腔疾患に対する新しい治療法の開発と口腔衛生の維持には、費用対効果が高く、容易にアクセスできる必要がある。
【００７８】
試薬の継続的な供給を確保するために、デキストラナーゼ／ムタナーゼとプロテグリン／レトロサイクリンは、タバコおよびレタスなどの他の植物の葉緑体の融合タンパク質として独立して発現される。タンパク質は、低コストの精製戦略で生産および使用される。タバコ植物は１００万個の種子を生産するため、生産を容易に拡大することが可能である。タバコの各エーカーは、最大４０メートルトンのバイオマスを生産し、ＡＭＰ、酵素、およびそれをコードする融合コンストラクトの低コストの大規模生産を促進する。別のアプローチでは、タンパク質はレタスなどの食用植物で生産される。
【００７９】
いくつかのデキストラナーゼ（Ｄｅｘ）およびムタナーゼ（Ｍｕｔ）は、真菌および細菌から単離され、それらの酵素活性について特徴付けられている。最適なデキストラナーゼおよびムタナーゼ酵素は、ヒトの口腔環境に適した酵素特性を備えている必要がある。短時間の経口治療に基づいて、プラークバイオフィルムへの強力な結合／保持特性と両方のタイプのＥＰＳ（デキストランとミュータンス）への触媒活性が非常に望ましい。市販のデキストラナーゼ含有うがい薬（ビオテンなど）に添加される酵素は、主に菌類（ペニシリウム属およびチェトミウムエラティカム）に由来する。ただし、真菌のデキストラナーゼは、細菌のデキストラナーゼ（３５〜４０°Ｃ）よりも高い温度（５０〜６０°Ｃ）の最適値を示す。さらに、細菌のデキストラナーゼは口内温度（約３７℃）でより安定し、効果的であり、齲蝕予防に適している。最近、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ株Ａｒｔｈ４１０のデキストラナーゼは、真菌のデキストラナーゼと比較して、口内および齲蝕原性バイオフィルムに見られる最適温度（３５〜４５°Ｃ）およびｐＨの値（ｐＨ５〜７）で優れたデキストラン分解特性を示した。さらに、細菌のデキストラン酵素の局所適用は、真菌のデキストランよりもｉｎ  ｖｉｖｏで齲蝕を減らすのにより効果的である。同様に、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．株ＲＭ１の細菌ムタナーゼは、バイオフィルムと３分間の最初のインキュベーションが先行するムタナーゼの除去後でも、バイオフィルムが６時間のインキュベーションによって効果的に分解されたことを示している。また、他の微生物種と比較すると、ＲＭ１のムタナーゼはバイオフィルム分解特性の向上を示している。特に、真菌酵素はグリコシル化を必要とするため、葉緑体での発現が妨げられる。さらに、ヒトのシステムにおける糖タンパク質の免疫原性により、規制上の懸念がさらに生じる可能性がある。したがって、本発明は、葉緑体での発現のための細菌のデキストラナーゼおよびムタナーゼの使用を含む。
【００８０】
葉緑体におけるＡｒｔｈ４１０デキストラナーゼおよびＲＭ１ムタナーゼタンパク質の産生を増加させるために、両方の配列は葉緑体発現用にコドン最適化されている。図９Ａおよび９Ｂを参照されたい。
【００８１】
レトロサイクリンとプロテグリン
合成を最大限にし、ＡＭＰｓの毒性を低減するために、図１０に示すように、プロテアーゼ切断部位で分離されたＰＧ１またはＲＣ１０１の１０個のタンデムリピートが使用される。発現遺伝子の各コピーについて、ＰＧ１またはＲＣ  １０１の１０個の機能的コピーが作成される。この目的のために、高い特異性と７つのアミノ酸の短い切断部位を持つＴｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）プロテアーゼを選択した。あるいは、フューリン切断部位も使用できる。このベクターは、バイオフィルム分解酵素をコードする核酸を含むように設計することもできる。コード領域は、ＡＭＰを発現するために利用されるプロモータの下で発現できるか、第２のプロモータ領域に作動可能に連結されたベクターに連結できる。バイオフィルム分解酵素コード配列は、酵素の放出を促進するためにＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含んでもよい。このアプローチは、化学的開裂法よりも安全でクリーンなオプションを提供する。最も重要なことは、融合タンパク質中の個々のＰＧ１ペプチドは切断前に二次構造を形成せず、それにより宿主生産システムに致命的なこともある機能性ペプチドの蓄積が回避されることである。切断されたＰＧ１／ＲＣ１０１の抗菌活性、バイオフィルム分解酵素またはそれらの融合タンパク質を使用して、実施例Ｉに開示された方法を使用してバイオフィルムを分解することができる。
【００８２】
上記のように、ＡＭＰ／バイオフィルム分解酵素をコードする配列は、ｐＬＤなどの葉緑体形質転換ベクターへの挿入の前に、任意選択でコドン最適化されている。葉緑体の形質転換は、二重相同組換えイベントに依存している。したがって、葉緑体ベクターは、目的の異種タンパク質をコードする発現カセットに隣接する葉緑体ゲノムとの相同領域を含み、それが機能遺伝子を破壊することなく、葉緑体ゲノムの遺伝子間スペーサ領域への導入遺伝子カセットの挿入を促進する。いずれかの遺伝子間スペーサ領域は導入遺伝子の挿入に使用できるが、最も一般的に使用される導入遺伝子統合部位は、葉緑体ゲノムのＩＲ領域内に位置するｔｒｎＩ−ｔｒｎＡ遺伝子（ｒｒｎオペロン内）間の転写活性遺伝子間領域である（図１０）。大腸菌と葉緑体のタンパク質合成機構は類似しているため、コドン最適化の効率も大腸菌で評価でき、そのため植物を作成できる。両方のシステムは、ＡＭＰｓ、バイオフィルム分解酵素、またはそれらの融合タンパク質の発現、およびＡＭＰｓまたは酵素活性の精製と評価に使用できる。
【００８３】
精製戦略
疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ；ＴＯＳＯＨ  Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０ｍ）を使用して、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）と融合したＰＧ１を精製できる。ＧＦＰはＨＩＣに選択的に結合し、Ｒｃ１０１／ＰＧ１の純度を>９０％にする。高額なＨＩＣクロマトグラフィメソッドを使用しているにもかかわらず、回収率は非常に低い（<２０％）。この問題に対処し、収率を高めるために、エラスチン様生体高分子（ＧＶＧＶＰ（配列ＩＤ番号：１１）、図１０）とＰＧ１の１０個のタンデムリピートがベクターに組み込まれている。この生体高分子は、逆転移温度（Ｔｔ）を超える温度に上昇すると溶液から沈殿するという独特の熱特性を持っている。ＧＶＧＶＰはＴｔ未満で可溶性モノマー状態のままで、Ｔｔを超えると不溶性凝集体を形成する。溶解状態から不溶性状態へのこの相転移は、溶液の温度を変えることで可逆的であり、これによりタンパク質の精製が容易になる。続いて、図１１に示すように、Ｔｔ未満に冷却し、共沈したいかなる不溶性汚染物質をも除去することにより、融合タンパク質を再可溶化する。加熱（３７°Ｃ）および冷却（４°Ｃ）のプロセスは逆遷移サイクリング（ＩＴＣ）として知られており、３−５ラウンドのＩＴＣを実行すると高純度のタンパク質が得られる（純度>９８％、図１１）。
【００８４】
別のアプローチでは、大腸菌での発現のためにシグナルペプチドをデキストラナーゼまたはムタナーゼと融合させ、そこでシグナルペプチドは細胞外培地への酵素の分泌をもたらす。さらに、分泌タンパク質は、大腸菌の２つの膜システムを通過する必要があり、その間にジスルフィドイソメラーゼ、フォルダーゼ、シャペロンが存在するペリプラズム環境を通過する。したがって、分泌タンパク質の正しいフォールディングとジスルフィド結合の形成は酵素によって促進され、タンパク質の生物学的活性が向上する（ＡＭＰｓに最適）。この生産戦略の別のメリットは、組換えタンパク質の安定性を高める働きをする培地中のタンパク質分解活性が低いレベルであることである。分泌されたタンパク質のシグナル配列は、エクスポートプロセス中に切断され、自然のタンパク質に対する本物のＮ末端を作成する。ＴＡＴ、ＳＲＰ、またはＳｅｃＢ依存経路など、タンパク質を細胞外培地に移動させるのに役立つ分子がいくつかある。ただし、独立して機能するのではなく、異なる経路は互いに密接に相互作用する。ＳＲＰとＳｅｃＢの両方に依存する経路は、単一のタンパク質のターゲティングで一緒に機能できる。また、Ｓｅｃ欠乏条件下では、Ｓｅｃ経路基質の転座はＴＡＴシステムによって救助される。
【００８５】
多数のシグナル配列の中で、外膜プロテインＡ（ＯｍｐＡ）およびＳｅｑ  Ｘ（ｌａｃ  Ｚ由来）シグナルペプチドは優れたエクスポート機能を示し、それぞれ最大４ｇ／Ｌおよび１ｇ／Ｌで融合タンパク質を細胞外培地にエクスポートできる。したがって、これらのシグナル配列は、Ａｒｔｈ  ４１０  ＤｅｘおよびＲＭ１  Ｍｕｔを細胞外環境に効率的にエクスポートするために使用される。培地にエクスポートされたデキストラナーゼとムタナーゼの蓄積は、タンパク質の定量と酵素アッセイによって判定される。
【００８６】
大腸菌におけるこれらのタンパク質の成功した発現が達成された。図１２に示すウェスタンブロットの結果を参照されたい。これらの配列を保持する葉緑体ベクターは、タバコまたはレタスの葉に衝突して、エクストラナーゼ／ムタナーゼ／ＡＭＰタンパク質の大規模産生が可能な植物を作成する。大規模なバイオマスを収穫した後、葉は凍結乾燥され、室温で保存される。別のアプローチでは、（フッ化物２５０ｐｐｍ）などの臨床的に証明された齲歯予防化合物および広域殺菌剤であるクロルヘキシジン０．１２％を含めて、これらの薬剤が有効性を高めるかどうかを評価できる。
【００８７】
ＡＭＰ−酵素の組み合わせは、齲蝕原性バイオフィルムの形成とｉｎ  ｖｉｖｏでのキャビテーションの開始を効果的に破壊する。さらに、ＡＭＰ−酵素融合タンパク質は、抗菌薬療法と齲歯の予防のための現在の化学療法よりも優れているように見える。
【００８８】
前述のように、大規模なＧＬＰ生産と安定性評価のために、内在性レタス調節エレメントの制御下で、レタス葉緑体に有効なＡＭＰ酵素を（独立してまたは組み合わせて）発現させることができる。主な利点は、法外に高額な精製プロセスの排除による生産コストの削減である。ＡＭＰ／酵素を発現する凍結乾燥葉材料は、その完全性と機能性を維持しながら、周囲温度で数ヶ月または数年保存できる。図１３を参照されたい。長期保存に加えて、タンパク質薬物濃度の増加と微生物汚染の減少は他の利点である。レタスの葉は、凍結乾燥後、新鮮な葉と比較してタンパク質薬物濃度が２０〜２５倍増加したことを示したため、経口または局所送達に使用される材料の量が減少した。凍結乾燥後、植物材料をチューインガムに組み込んで、そこに含まれるバイオフィルム分解組成物を送達することができる。
【００８９】
ＡＭＰ／酵素またはその融合物を生成するための工程を図１２に示す。本発明のタンパク質の発現に有用なレタス葉緑体ベクターは、この参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０５９，３７６号に以前に記載されている。レタス葉緑体のプロインスリンなどの治療用タンパク質の場合、総タンパク質の最大７０％の発現レベルは、このシステムを使用すると、達成できる。
【００９０】
食用植物で発現されるＡＭＰ酵素は、口腔の疾患の治療および齲歯形成の予防および抑制に使用される場合、好ましくは経口的に（局所的に）送達される。口腔内の植物細胞の溶解を強化するために、ＡＭＰ／酵素発現植物細胞は、この参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３９６，３８２号に記載されている細胞壁分解酵素を発現する植物細胞と任意選択で混合される。
【００９１】
チューインガムタブレットの調製を図１４に示す。対象のタンパク質の例としてＧＦＰを使用すると、このデータはチューインガムタブレットに組み込むことができるＧＦＰの量を示す。ＧＦＰレベルは、蛍光とウェスタンブロットの両方で評価された。結果を図１５に示す。本発明者らは、図１６に示される咀嚼シミュレータおよび人工唾液を使用して、ＧＦＰを含むガムタブレットからのＧＦＰ放出動態を評価した。図１７は、組換えレタスに存在する異なる量のＧＦＰを含むガムタブレットからの経時的な放出動態を示すグラフを示している。
【００９２】
これらのデータから、本発明のＡＭＰ酵素融合タンパク質を含むガムタブレットは、適切な期間活性物質を送達して、細菌の死滅およびプラークまたはバイオフィルムの分解を達成することが明らかである。しかしながら、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）などの経口すすぎ液も、ＡＭＰ−酵素融合タンパク質または本発明の組み合わせを送達するために使用することができる。図１８は、ＬＩＳＴＥＲＩＮＥマウスウォッシュと混合された本発明の酵素を含む粗抽出物が、調製するのに非常に費用がかかる商業的に生産され精製された酵素と同じくらい効果的であることを実証する。データは、様々な組み合わせ（異なる比率と量の両方）の二重酵素がＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムのバイオマスを用量依存的に著しく減少させたことを明らかにしている。様々な組み合わせの中で、２５Ｕ  Ｄｅｘと５Ｕ  Ｍｕｔ（５：１、Ｄｅｘ：Ｍｕｔ比）が最も効果的であり、１２０分以内に総バイオマス分解の８０％以上をもたらした。さらなる実験により、５：１のＤｅｘ／Ｍｕｔ活性比は、ＥＰＳの分解とＬＩＳＴＥＲＩＮＥマウスウォッシュによる細菌死滅の両方に対して最高の効果を示したことが確認された。エキサイティングなことに、二重酵素の前処理により、ＬＩＳＴＥＲＩＮＥマウスウォッシュ媒介の細菌殺傷の効果が劇的に向上した（ビヒクル前処理およびＬＩＳＴＥＲＩＮＥマウスウォッシュに対して３  ｌｏｇ減少）。３番目の酵素を含めると、全体的な抗バイオフィルム活性がさらに向上した。さらに、混合種モデルの結果は、二重酵素の組み合わせが全体的な抗菌活性を高めるだけでなく、酵素前処理後にリステリン洗口液を使用したときに（共生／プロバイオティクスＳ．ｏｒａｌｉｓの割合を増加させながら）Ｓ．ｍｕｔａｎｓの優位性のターゲットを絞った減少を誘導できることを示した。したがって、酵素＋ＬＩＳＴＥＲＩＮＥマウスウォッシュ戦略は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの病原体を選択的に標的とする一方で、共生Ｓ．ｏｒａｌｉｓの割合を増加させ、それによって混合種バイオフィルム内の微生態学的不均衡を防止する必要がある。
【００９３】
ＡＭＰＳには、抗菌活性に加えて、自然免疫と創傷治癒を刺激する能力がある。抗菌特性に加えて、ＡＭＰｓのこの新しいマスト細胞宿主防御機能を活用すると、臨床での応用が拡大する。バイオフィルム関連の齲蝕は、局所治療薬の開発のための最も挑戦的なモデルである。マトリックス形成が他の多くのバイオフィルム関連疾患での薬効を妨げるので、開発されると、そのような局所薬物送達は他のバイオフィルムに容易に適合できる。マトリックスはすべてのバイオフィルムに固有であるため、応用は口の中のバイオフィルムを超えている。本明細書に記載のバイオフィルム阻害組成物は、疾患の治療のために人体に挿入されるステント、人工関節、インプラント、弁、および他の医療機器のコーティングにも使用できる。
【００９４】
上述のように、ＡＭＰ／酵素、またはそれを発現する葉は、口腔疾患の治療のためのチューインガムに効果的に局所適用するためにチューインガムに組み込むことができる。組成物は、ＬＩＳＴＥＲＩＮＥマウスウォッシュなどの口内リンスに組み込むこともできる。前述のように、フッ化物やＣＨＸなどの他の抗齲歯の薬剤は、そのような歯茎または口腔リンスに含まれる場合がある。
【００９５】
以下の表２の参照は、様々な生物学的ソースからの多くの異なるムタナーゼについて説明している。これらの参考文献のそれぞれは、この参照により本明細書に組み込まれる。
【表２】
2020519560.tif 000003
【００９６】
本発明の実施において有用な配列をコードする追加のバイオフィルム分解酵素には、非限定的に、以下を含む。
【００９７】
Ｉ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｕｍｉｃｕｓ  ＮＡ１１２３
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB489092も参照されたい
Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ４８９０９２
長さ：１，１４６
質量（Ｄａ）：１１９，００７
参照：Otsuka R,et al.Microbiol Immunol.2015 Jan;59(1):28-36.
２．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｕｍｉｃｕｓ  ＮＡ１１２３のムタナーゼのタンパク質配列
>ｇｉ｜２５７１５３２６５｜ｄｂｊ｜ＢＡＩ２３１８７．１｜推定ムタナーゼ［Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｕｍｉｃｕｓ］
MRIRTKYMNWMLVLVLIAAGFFQAAGPIAPATAAGGANLTLGKTVTASGQSQTYSPDNVKDSNQGTYWESTNNAFPQWIQVDLGASTSIDQIVLKLPSGWETRTQTLSIQGSANGSTFTNIVGSAGYTFNPSVAGNSVTINFSAASARYVRLNFTANTGWPAGQLSELEIYGATAPTPTPTPTPTPTPTPTPTPTPTVTPAPSATPTPTPPAGSNIAVGKSITASSSTQTYVAANANDNNTSTYWEGGSNPSTLTLDFGSNQSITSVVLKLNPASEWGTRTQTIQVLGADQNAGSFSNLVSAQSYTFNPATGNTVTIPVSATVKRLQLNITANSGAPAGQIAEFQVFGTPAPNPDLTITGMSWTPSSPVESGDITLNAVVKNIGTAAAGATTVNFYLNNELAGTAPVGALAAGASANVSINAGAKAAATYAVSAKVDESNAVIEQNEGNNSYSNPTNLVVAPVSSSDLVAVTSWSPGTPSQGAAVAFTVALKNQGTLASAGGAHPVTVVLKNAAGATLQTFTGTYTGSLAAGASANISVGSWTAASGTYTVSTTVAADGNEIPAKQSNNTSSASLTVYSARGASMPYSRYDTEDAVLGGGAVLRTAPTFDQSLIASEASGQKYAALPSNGSSLQWTVRQGQGGAGVTMRFTMPDTSDGMGQNGSLDVYVNGTKAKTVSLTSYYSWQYFSGDMPADAPGGGRPLFRFDEVHFKLDTALKPGDTIRVQKGGDSLEYGVDFIEIEPIPAAVARPANSVSVTEYGAVANDGKDDLAAFKAAVTAAVAAGKSLYIPEGTFHLSSMWEIGSATSMIDNFTVTGAGIWYTNIQFTNPNASGGGISLRIKGKLDFSNIYMNSNLRSRYGQNAVYKGFMDNFGTNSIIHDVWVEHFECGMWVGDYAHTPAIYASGLVVENSRIRNNLADGINFSQGTSNSTVRNSSIRNNGDDGLAVWTSNTNGAPAGVNNTFSYNTIENNWRAAAIAFFGGSGHKADHNYIIDCVGGSGIRMNTVFPGYHFQNNTGITFSDTTIINSGTSQDLYNGERGAIDLEASNDAIKNVTFTNIDIINAQRDGVQIGYGGGFENIVFNNITIDGTGRDGISTSRFSGPHLGAAIYTYTGNGSATFNNLVTRNIAYAGGNYIQSGFNLTIK  （配列ＩＤ番号：１２）
３．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属ＮＡ１１２３からのｍＲＮＡの配列
>ｇｉ｜２５７１５３２６４｜ｄｂｊ｜ＡＢ４８９０９２．１｜推定ムタナーゼのＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｕｍｉｃｕｓ  ｍｕｔ遺伝子、完全なｃｄ
1 aaaggaggat cgccaaccaa tcatcccagc aaagaaggtg atggcagccc aagaattgaa
61 agcgctttga atttggaata tacggatttg gccgacctgc tgattcagtc gtattcaagc
121 gattatgccg cgaaccaatc gaacccgagg aggactataa tgcgtatccg cactaaatat
181 atgaactgga tgttggtgct cgtcctgatc gccgccggct tcttccaggc tgccggcccc
241 atcgctcccg ccaccgctgc aggaggcgcg aatctgacgc tcggcaaaac cgtcaccgcc
301 agcggccagt cgcagacgta cagccccgac aatgtcaagg acagcaatca gggaacttac
361 tgggaaagca cgaacaacgc cttcccgcag tggatccaag tcgaccttgg cgccagcacg
421 agcatcgacc agatcgtgct caagcttccg tccggatggg agactcgtac gcaaacgctc
481 tcgatacagg gcagcgcgaa cggctcgacg ttcacgaaca tcgtcggatc ggccgggtat
541 acattcaatc catccgtcgc cggcaacagc gtcacgatca acttcagcgc tgccagcgcc
601 cgctacgtcc gcctgaattt cacggccaat acgggctggc cagcaggcca gctgtcggag
661 cttgagatct acggagcgac ggcgccaacg cctactccca cgcctactcc aacaccaacg
721 ccaacgccaa caccaacgcc aacccctaca gtaacccctg cgccttcggc cacgccgact
781 ccgactcctc cggcaggcag caacatcgcc gtagggaaat cgattacagc ctcttccagc
841 acgcagacct acgtagctgc aaatgcaaat gacaacaata catccaccta ttgggaggga
901 ggaagcaacc cgagcacgct gactctcgat ttcggttcca accagagcat cacttccgtc
961 gtcctcaagc tgaatccggc ttcggaatgg gggactcgca cgcaaacgat ccaagttctt
1021 ggagcggatc agaacgccgg ctccttcagc aatctcgtct ctgcccagtc ctatacgttc
1081 aatcccgcaa ccggcaatac ggtgacgatt ccggtctccg cgacggtcaa gcgcctccag
1141 ctgaacatta cggcgaactc cggcgcccct gccggccaga ttgccgagtt ccaagtgttc
1201 ggcacgccag cgcctaatcc ggacttgacc attaccggca tgtcctggac tccgtcttct
1261 ccggtcgaga gcggcgacat tacgctgaac gccgtcgtca agaacatcgg aactgcagct
1321 gcaggcgcca cgacggtcaa tttctacctg aacaacgaac tcgccggcac cgctccggta
1381 ggcgcgcttg cggcaggagc ttctgcaaat gtatcgatca atgcaggcgc caaagcagcc
1441 gcaacgtatg cggtaagcgc caaagtcgac gagagcaacg ccgtcatcga gcagaatgaa
1501 ggcaacaaca gctactcgaa cccgactaac ctcgtcgtag cgccggtgtc cagctccgac
1561 ctcgtcgccg tgacgtcatg gtcgccgggc acgccgtcgc agggagcggc ggtcgcattt
1621 accgtcgcgc ttaaaaatca gggtacgctg gcttccgccg gcggagccca tcccgtaacc
1681 gtcgttctga aaaacgctgc cggagcgacg ctgcaaacct tcacgggcac ctacacaggt
1741 tccctggcag caggcgcatc cgcgaatatc agcgtgggca gctggacggc agcgagcggc
1801 acctataccg tctcgacgac ggtagccgct gacggcaatg aaattccggc caagcaaagc
1861 aacaatacga gcagcgcgag cctcacggtc tactcggcgc gcggcgccag catgccgtac
1921 agccgttacg acacggagga tgcggtgctc ggcggcggag ctgtcctgag aacggcgccg
1981 acgttcgatc agtcgctcat cgcttccgaa gcatcgggac agaaatacgc cgcacttccg
2041 tccaacggct ccagcctgca gtggaccgtc cgtcaaggcc agggcggtgc aggcgtcacg
2101 atgcgcttca cgatgcccga cacgagcgac ggcatgggcc agaacggctc gctcgacgtc
2161 tatgtcaacg gaaccaaagc caaaacggtg tcgctgacct cttattacag ctggcagtat
2221 ttctccggcg acatgccggc tgacgctccg ggcggcggca ggccgctctt ccgcttcgac
2281 gaagtccact tcaagctgga tacggcgttg aagccgggag acacgatccg cgtccagaag
2341 ggcggtgaca gcctggagta cggcgtcgac ttcatcgaga tcgagccgat tccggcagcg
2401 gttgcccgtc cggccaactc ggtgtccgtc accgaatacg gcgctgtcgc caatgacggc
2461 aaggatgatc tcgccgcctt caaggctgcc gtgaccgcag cggtagcggc cggaaaatcc
2521 ctctacatcc cggaaggcac cttccacctg agcagcatgt gggagatcgg ctcggccacc
2581 agcatgatcg acaacttcac ggtcacgggt gccggcatct ggtatacgaa catccagttc
2641 acgaatccca atgcatcggg cggcggcatc tccctgagaa tcaaaggaaa gcttgatttc
2701 agcaacatct acatgaactc caacctgcgt tcccgttacg ggcagaacgc cgtctacaaa
2761 ggctttatgg acaatttcgg cactaattcg atcatccatg acgtctgggt cgagcatttc
2821 gaatgcggca tgtgggtcgg cgactacgcc catactcctg cgatctatgc gagcgggctc
2881 gtcgtggaaa acagccgcat ccgcaacaat cttgccgacg gcatcaactt ctcgcaggga
2941 acgagcaact cgaccgtccg caacagcagc atccgcaaca acggcgatga cggcctcgcc
3001 gtctggacga gcaacacgaa cggcgctccg gccggcgtga acaacacctt ctcctacaac
3061 acgatcgaga acaactggcg cgcggcggcc atcgccttct tcggcggcag cggccacaag
3121 gctgaccaca actacatcat cgactgtgtc ggcggctccg gcatccggat gaatacggtg
3181 ttcccaggct accacttcca gaacaacacc ggcatcacct tctcggatac gacgatcatc
3241 aacagcggca ccagccagga tctgtacaac ggcgagcgcg gagcgattga tctggaagct
3301 tccaacgacg cgatcaaaaa cgtcaccttc accaacatcg acatcatcaa tgcccagcgc
3361 gacggcgttc agatcggcta tggcggcggc ttcgagaaca tcgtgttcaa caacatcacg
3421 atcgacggca ccggccgcga cgggatatcg acatcccgct tctcgggacc tcatcttggc
3481 gcagccatct atacgtacac gggcaacggc tcggcgacgt tcaacaacct ggtgacccgg
3541 aacatcgcct atgcaggcgg caactacatc cagagcgggt tcaacctgac gatcaaatag
3601 gctgcaaaaa aaaggaagct cctcggagct tccttttttt  （配列ＩＤ番号：１３）
【００９８】
ＩＩ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＭＰ−１
１．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＭＰ−１のムタナーゼの一般情報
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HQ640944
Ｇｅｎｂａｎｋ  ＨＱ６４０９４４；長さ：１，２６１；質量（Ｄａ）：１３１，６３１
参照：Pleszczynska M,et al.Protein Expr Purif.2012 Nov;86(1):68-74.
２．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＭＰ−１のムタナーゼのタンパク質配列
>ｇｉ｜３１５２０１２６１｜ｇｂ｜ＡＤＴ９１０６３．１｜アルファ−１，３−グルカナーゼ［Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ］
MRNKYVTWTLALTMLFSSFFLAVGPNKVVHAAGGTNLALGKNVTASGQSQTYSPNNVKDSNQSTYWESTNNAFPQWIQVDLGATTSIDQIVLKLPAGWGTRTQTLAVQGSTDGSSFTNIVGSAGYVFNPAVANNAVTINFSAASTRYVRLNVTANTAWPAAQLSEFEIYGAGGTTTPPTTPAGTYEAESAALSGGAKVNTDHTGYTGTGFVDGYWTQGATTTFTANVSAAGNYDVTLKYANASGSAKTLSVYVNGTKIRQTTLASLANWDTWGTKVETLSLNAGNNTIAYKYEASDSGNVNIDSIAVAPSTSTPVDPEPPITPPTGSNIAIGKAISASSNTQAFVAANANDNDTNTYWEGGAASSTLTLDLGANQNVTSIVLKLNPSSAWSTRTQTIQVLGHNQSTTTFSNLVSSQSYTFNPATGNSVTIPVTATVKRLQLSITANSGSGAGQIAEFQVYGTPAPNPDLTITGMSWTPASPIETDAVTLNATVKNSGNADAPATTVNFYLNNELVGSSPVGALAAGASSTVSLNVGTKTAATYAVSAKVDESNSIIEQNDANNSYTNASSLVVAPVASSDLVGATTWTPSTPVAGNAIGFMVNLKNQGTIASASGAHGITVVVKNAAGAALQSFSGTYSGAIAAGASVNVTLPGTWTAVNGSYTVTTTVAVDANELTNKQGNNVSTSNLVVYAQRGASMPYSRYDTEDATRGGGATLQTAPTFNQAQIASEASGQSYIALPSNGSSAQWTVRQGQGGAGVTMRFTMPDSTDGMGLNGSLDVYVNGVKVKTVSLTSYYSWQYFSGDMPGDAPSAGRPLFRFDEVHWKLDTPLQPGDTIKIQKGNGDSLEYGIDFLEIEPVPTAIAKPANSLSVTEYGAVANDGQDDLAAFKATVTAAVAAGKSVYIPAGTFNLSSMWEIGSANNMINNITITGAGYWHTNIQFTNPNAAGGGISLRISGQLDFSNVYMNSNLRSRYGQNAIYKGFMDNFGTNSKIHDVWVEHFECGMWVGDYAHTPAIYATGLVVENSRIRNNLADGINYSQGTSNSIVRNSSIRNNGDDGLAVWTSNTNGAPAGVNNTFSYNTIENNWRAGGIAFFGGGGHKADHNLIVDTVGGSGIRMNTVFPGYHFQNNTGITFSDNTLINTGTSQDLYNGERGAIDLEASNDAIKNVTFTNIDIINTQRDAIQFGYGGGFENIVFNNININGTGLDGVTTSRFAGPHKGAAIYTYTGNGSATFNNLTTSNVAYPGLNFIQQGFNLVIQ  （配列ＩＤ番号：１４）
３．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＭＰ−１からのｍＲＮＡの配列
1 atgcgcaaca agtatgtcac atggacgctc gccctgacga tgctattttc gagcttcttc
61 cttgcagtag gtcccaacaa ggtcgttcac gcagcaggcg gaacgaattt agcgctcggc
121 aaaaacgtta cggcaagcgg ccaatcgcaa acgtatagtc ccaacaatgt aaaagacagc
181 aatcaatcga cgtactggga aagcacgaac aatgcattcc cgcaatggat tcaagtagac
241 ttaggcgcaa cgacgagcat tgaccaaatc gtactgaagc tgcccgctgg atggggtacg
301 cgtacgcaaa cgttagctgt tcaaggaagc acggacggtt cctcgttcac gaatatcgtg
361 ggctccgcag gctatgtatt taatcctgct gttgccaata acgccgttac gattaacttc
421 tctgctgcaa gcacgcgtta tgttcgtctg aacgtaacag cgaacacggc ttggccagca
481 gcgcagctgt ccgaattcga gatttatggc gctggcggca cgacgacgcc tccaacaacg
541 ccagcaggca catatgaagc tgaatccgca gcattgtccg gcggtgcgaa agtgaacacg
601 gatcataccg gctacacggg tacgggcttt gttgacggct actggacaca aggcgcgaca
661 acgacgttca cggctaacgt gtccgcagct ggcaactatg acgttacatt gaaatatgcc
721 aacgcaagcg gcagtgccaa gacgctaagc gtttacgtca acggcacgaa gattcgccag
781 acgacgctgg caagcctggc aaactgggac acttggggca cgaaggttga gacgctgagc
841 ttgaatgccg gcaataatac gattgcatac aagtatgagg ctagcgactc gggcaacgtg
901 aatatcgact ccattgccgt ggcgccatcg acttcgacac cggtagatcc agaaccgccg
961 atcacgccgc caacgggcag caatatcgca atcggcaaag cgatcagcgc atcttcgaat
1021 acgcaagcat tcgtagctgc caacgcgaac gataacgata cgaacacgta ctgggaaggc
1081 ggagctgcat cgagcacgct gacgctggat cttggcgcga accaaaatgt aacctcgatc
1141 gtgctgaagc tgaatccttc ttcggcatgg agcacgcgta cgcaaacgat ccaagtgctt
1201 ggccacaacc aaagcacgac gacgttcagc aatctggtat cttcgcaatc gtatacgttc
1261 aatcctgcaa cgggcaactc cgtgacgatt ccggttacgg caacagttaa gcgcttgcag
1321 ctgagcatta cggcgaactc gggttccggc gctggtcaaa ttgcggaatt ccaagtgtat
1381 ggaacgccgg caccaaaccc agacctgacg atcacaggca tgtcctggac gcctgcttcg
1441 ccaattgaaa cggatgcagt tacgctgaat gcaacggtta aaaacagcgg aaatgcagac
1501 gctcctgcaa cgacggtaaa cttctacctg aacaatgagc tcgtaggctc ctcgccagtt
1561 ggcgcacttg ctgcaggcgc ttcctcgacg gtttcgctga atgttggtac gaaaacggct
1621 gcaacttatg cagttagcgc gaaagtcgat gagagcaatt cgattatcga gcaaaatgat
1681 gcgaacaaca gttatacgaa cgcatcctcg ctcgtcgtcg ctcctgtcgc aagctctgac
1741 ttggttggcg cgacgacgtg gacgcctagc acgccggttg ccggcaatgc aattggcttc
1801 atggtaaatc ttaaaaacca aggaacgatt gcatctgcaa gcggcgcgca tggcattaca
1861 gttgtcgtga aaaatgccgc aggcgctgcg ctccaatcgt tcagcggcac ctacagcgga
1921 gcaatcgcag ctggcgcatc cgttaacgta accctgccag gtacgtggac ggctgtgaat
1981 ggcagctaca cggtaacgac aacggttgct gtcgatgcta acgagctgac gaacaaacaa
2041 gggaacaacg taagcacttc gaacctcgtt gtttatgcac aacgtggcgc aagcatgcct
2101 tacagccgtt atgacacgga agacgctaca cgtggcggcg gtgcaacgct gcaaaccgca
2161 ccaaccttca accaagcgca aatcgcttcg gaagcatccg gacaaagcta tatcgcgctg
2221 ccttcgaacg gctcctccgc acaatggacg gtccgtcaag gacaaggcgg agctggcgtt
2281 acgatgcgct tcacgatgcc ggattcgact gacggtatgg gtttgaacgg ttcgctcgac
2341 gtttatgtca acggcgttaa agtaaaaacg gtatcgctca cgtcctacta cagctggcag
2401 tatttctcgg gcgatatgcc tggcgatgcg ccgtccgctg gccgtccgtt gttccgcttt
2461 gacgaagtac actggaagct tgacacgcct cttcaaccag gcgacacgat caaaatccaa
2521 aaaggcaacg gagatagcct ggaatacggc attgacttcc tcgaaatcga gccggttcca
2581 acagcaatcg ctaaacctgc caactcgctt tccgttacgg agtatggcgc tgtagcaaac
2641 gatggccaag acgaccttgc cgcattcaaa gcaacggtta cggctgcagt tgctgctggc
2701 aaatccgttt acattcctgc tggcacgttc aatctgagca gcatgtggga aatcggatcg
2761 gctaacaaca tgatcaacaa cattacgatt acaggcgcag gctactggca tacgaacatt
2821 caattcacga atccgaatgc agcaggcggc ggcatttcgc tccggatttc cggacagctt
2881 gatttcagca atgtttacat gaactccaac ctgcgttcgc gttatggtca aaatgcgatt
2941 tacaaaggct tcatggacaa cttcggcaca aactccaaaa tccatgacgt atgggttgag
3001 cacttcgagt gcggcatgtg ggtaggcgat tacgcgcata cgccagcgat ctatgcaacg
3061 ggtcttgtcg ttgaaaacag ccggattcgc aacaaccttg cagacggcat caactactcg
3121 caaggcacga gcaattcgat cgtacgcaac agcagtatcc gcaataacgg tgatgacggt
3181 ctggcggttt ggacgagtaa cacgaatggc gcgccagcag gcgtgaacaa cacgttctcg
3241 tacaacacga tcgaaaacaa ctggcgtgca ggcggtatcg cattcttcgg cggcggcggc
3301 cacaaggctg accacaacct gatcgttgat acggttggcg gctccggcat ccggatgaac
3361 acggtattcc caggctacca cttccaaaac aacacgggta ttacgttctc cgacaacacg
3421 ctgatcaaca caggcacaag ccaagatttg tacaacggcg agcgcggtgc gatcgatctc
3481 gaagcatcga acgatgcaat caagaacgtc acgttcacga acatcgacat catcaacacc
3541 cagcgcgatg cgatacaatt cggctacggc ggcggattcg agaacatcgt atttaacaac
3601 attaacatta acggtacggg gcttgacggc gttacaacct cacggtttgc tggaccgcat
3661 aaaggtgctg caatctacac gtacacgggc aatggctctg caacgttcaa taacctgacg
3721 acgagcaacg tggcatatcc aggcttgaat ttcattcagc aaggctttaa tctggtgatc
3781 cagtag  （配列ＩＤ番号：１５）
【００９９】
ＩＩＩ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＲＭ１株。
【０１００】
１．ムタナーゼの一般情報
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｅ１６５９０；長さ：１，２９１；質量（Ｄａ）：１３５ｋＤ
参照：Shimotsuura I,et al.Appl Environ Microbiol.2008 May;74(9):2759-65.
２．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．株ＲＭ１のムタナーゼのタンパク質配列。
2020519560.tif 000004
【０１０１】
ムタナーゼＲＭ１の推定アミノ酸配列。シグナルペプチド領域には下線が引かれ、リンカー領域は四角で囲まれている。矢印は、タンパク質のＮ末端ドメインの切断部位を示している。ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｅ１６５９０として登録された。（配列ＩＤ番号：１６）
３．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＲＭ１株からのｍＲＮＡの配列
1 cccgggtacc agacctatcg ggaaaaacgc gagcggccct tcgcgcctta tgcgctacgg
61 acggtgctgg cgggcggttt gtttttcatc atcattcccc tgatgatcta cacggcatcg
121 tatatcccgt ttttgctcgt gccgggtccc ggacacgggt tgaaagacgt cgtctccgcc
181 cagaagttca tgttcaatta tcatagccgg cttaacgcca cccacccatt ctcgtcgctg
241 tggtgggagt ggcctctcat ccgcaagccg atctggtatt acggagccgc ggaattggcg
301 ccgggaaaaa tggcgagcat cgtgggcatg ggcaatccgg cggtgtggtg gacgggaacg
361 attgcggtaa tcgcggccct tcgctcggcc tggaagaagc gggaccggag catgaccgtc
421 gtcttcgttg gaatcgcctc gtcttatctt ccgtgggttt tcgtatccag actcaccttt
481 atttatcact ttttcgcttg cgttccgttt ctcgttcttt gcatcgttta ttggattcga
541 aaaatggaat agcgtaagcc gggatatcgg attgcgacgc tcctttacgc aggcgcggtt
601 ctggtgctgt tcattttgtt ttacccgatt ttgtcgggga ccgaaataga cgtttcttac
661 gcggaccgcg ttctgaagtg gttcggcggg tggatttttc acgggtaagc gagcgttgga
721 agcaaggaag ggaaggaaga cgagcgtctc cttcccgaaa tccatccaat atcttgaaat
781 tgcatacatt tttcgtaaga ttgcttctta tctgtctccc tcccctgttc ttataatggg
841 ggtatcccaa cgaaaggagg gtttgtaagc gctgtcagcs tgtttgccga aagttctcgc
901 atttgctgac ctacactttg aggaggagga atttaatgcg ctgcaaattt gtcgcatggt
961 cgcttgttac agccatgctg atggccagtt tgctgacggc tgtaggaccg ttcggccccg
1021 cttccgccgc gggaggaccg aatctgacgc cgggcaaacc cattacggcg agcggccaat
1081 cccaaaccta cagccctcag aacgtaaaag acggcaatca aaatacgtat tgggaaagca
1141 cgaacaacgc gttcccgcaa tggattcaag tggatttggg cgcaagcacg ggcatcgacc
1201 aaattgtgct gaagctgccc gcaagctggg aagcgcgcac gcaaacgctg gccgttcaag
1261 gcagcttgaa cggttcgacg ttcacggaca ttgtcggctc cgccaattat gtattcagtc
1321 cgtctgtcgg gaacaacacg gttacgatca actttaccgc gaccagcacg cgctacgtgc
1381 gcttgtatgt aacggccaac acgggctggc cggcggcgca gctgtccgaa ttcgaaattt
1441 acggctccgg cgaccagacg ccggcgcctg atacgtatca agccgaatcc gcggctctgt
1501 ccggcggcgc gaaagtcaac acggaccatg ccggatatat cggcacgggc tttgttgacg
1561 gttactggac gcaaggcgcg acgacgacct tttcggtcaa cgcgccgacg gcgggcaact
1621 acgatgtaac gctgaggtac ggcaacgcaa ccggcagcaa caaaacggta agcctctacg
1681 tcaatggagc gaagattcgc cagaccacgc tgcccagcct gcctaactgg gattcatgga
1741 gcagcaagac ggagacgctt aacctgaatg caggcagcaa caccattgcg tacaaatacg
1801 acccgggcga ttccggcaac gtcaatcttg accaaatcac ggtcgaagcg tcgacttcaa
1861 cgcctactcc tactccatcc cctactccta cacctacgcc aacgccgacg cctacgccta
1921 cgcctacacc cacacctact ccgaccccga cgcctacgcc tacacctaca cctacaccta
1981 cgccgacgcc tcctccgggc ggcaacatcg ccatcggcaa atcgatttcc gcatcctccc
2041 acacgcagac gtacgttgcg gagaacgcga acgataacga tgtcaacacg tactgggaag
2101 gcggcggcaa tccgagcacg ctgacgctcg atctcggagc gaactacaat attacgtcca
2161 tcgtgctgaa gctgaacccg tcctcgatat gggctgcgcg tacgcaaacg attcaagtgc
2221 tcggacacga tcagaacacg acgaccttca gcaatctggt ctcggcgaaa tcgtactcgt
2281 tcgatccggc ctccggcaat actgtgacca ttccggttac ggcgacggtg aaacgtttgc
2341 agttgaacat tacgtcgaac tccggcgccc cggccggaca agtcgccgag ttccaggtgt
2401 tcggcacgcc tgcgccgaat ccggacctga cgattaccgg catgtcctgg tcgccttctt
2461 ctccggttga gaccgacgcc attacgctaa acgcaacggt gaagaacaac gggaatgcca
2521 gcgccgcggc gaccaccgtc aatttctacc tgaacaacga gctggcgggt tccgcgccgg
2581 tagccgcgct ggcggcaggc gcttcggcaa cggtgccgct gaatgtcggc gcgaaaaccg
2641 ccgcgacata cgcggtcggc gccaaagtag acgagagcaa cgcggtcatc gagctgaacg
2701 agtcgaacaa cagctacacg aatccggctt cactcgttgt ggcccccgtt tccagctcgg
2761 atctggtggg cacggtttcg tggacgccga gcactccgat tgccaacaat gccgtttctt
2821 ttaacgtaaa tcttaaaaat caaggaacga ttgcttccgc cggcgggtct cacggcgtga
2881 cggtcgtgct taaaaatgct tccggttcga ccgttcaaac gttcagcggt tcctataccg
2941 gcagcctggc tccgggagcg tccgtcaaca tcacccttcc ggggacctgg acggcggcag
3001 ccggcagcta cacggtaacg gccaccgttg cggcagacgc caacgaactt ccgatcaagc
3061 aagccaacaa cgcgaacacc gcaagcctga ccgtatattc cgcccgcggc gcgagcatgc
3121 cgtacagccg gtatgacacc gaggacgcca ccctcggcgg cggcgccacg ctgaagtccg
3181 cgccgacatt cgatcaggcg cttacggcat cggaagccac cggccaactc tatgcggcgc
3241 tgccctcgaa cggctcctat cttcaatgga ccgtcagaca gggtcagggc ggcgcaggcg
3301 tgacgatgag atttacgatg cccgactcgg cggacggcat gggattaaac ggttcgctag
3361 acgtttacgt caacggcacc aaagtcaaaa ccgtatcgct gacctcctac tacagctggc
3421 agtatttctc gggcgatatg cccggagacg ctcccagcgc gggccgtccg ctcttccgct
3481 ttgacgaagt gcactggaag ctggatactc cgctcaaacc cggagacacg attcgcatcc
3541 agaagaacaa cggcgacagc ctggaatacg gtgtcgactt tattgaaatc gaaccggttc
3601 cggctgcgat ctcccgtccg gccaactcgg tttccgtaac ggattacggc gctgtgccga
3661 acgacggaca ggacgatctc accgccttta aagccgccgt aaacgcggcg gtcgcatccg
3721 acaagatctt gtacattccg gaaggaacgt tccacctcgg caacatgtgg gagatcggtt
3781 ccgtcagcaa catgatcgat cacattacga ttacgggagc cggtatctgg tatacgaaca
3841 tccagtttac caacgccaat ccggcgtccg gcggcatctc gctccggatt acgggcaagc
3901 ttgatttcag caacgtgtac ctcaactcca atttgcggtc gcggtatggt caaaatgcgg
3961 tttacaaagg ctttatggac aacttcggga ccaattccgt catccgcgac gtctgggtcg
4021 agcacttcga atgcggcttc tgggtcgggg actacgggca tacgccggcg atccgcgcga
4081 gcgggctgct gattgaaaac agccgaatcc gcaacaacct ggccgatggc gtcaacttcg
4141 cccaagggac cagcaattcg accgtacgca acagcagcct gcgcaacaac ggcgacgacg
4201 cccttgccgt atggacgagt aatacgaacg gcgcgcccga aggcgtaaac aataccttct
4261 cgtacaacac catcgaaaac aactggcgcg cgggaggcat cgccttcttc ggaggaagcg
4321 gacacaaggc cgaccacaac tacatcgtcg actgcgtcgg cggttccggc atccggatga
4381 acaccgtgtt ccccggatac cacttccaga acaataccgg cattgtgttc tcggacacga
4441 ccatcgtcaa ctgcggcacg agcaaagacc tatacaacgg cgaacgcggc gccatcgatc
4501 tggaagcttc gaacgacgcc atccggaacg tgacgtttac caacatcgat attatcaact
4561 ctcagcgcga tgcgatccag ttcggttacg gcggcggctt caccaacatc gtgttcaaca
4621 acatcaacat taacggaacc ggtcttgacg gcgtaaccac ctcgcggttc tcgggaccgc
4681 atctgggcgc ggcgatcttc acctataccg gcaacggctc cgccacgttc aacaatctga
4741 ggaccagcaa tatcgcttac cccaatctgt attacatcca gagcgggttc aatctgatca
4801 tcaataatta gatatctggg cccgtctgcg ggggaggaac tcttcggagc tcgaattcgt
4861 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca
4921 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat
4981 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa ctgtcgtgcc agctgcatta
5041 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcsg tttkcgtatt gggcgccctt  （配列ＩＤ番号：１７）
【０１０２】
ＩＶ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ（ＣＣＭ  Ｆ−４７０）
１．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼの一般情報
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7Length:635も参照されたい
質量（Ｄａ）：６７，７２６
最終改変日：２００２年３月１日−ｖ１
Ｃｈｅｃｋｓｕｍ：ｉＢＢ０Ｄ８６４Ｅ２Ｆ４３２Ｃ５８
２．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼのタンパク質配列
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7.fasta)
>ｔｒ｜Ｑ８ＷＺＭ７｜Ｑ８ＷＺＭ７＿ＴＲＩＨＡ  Ａｌｐｈａ−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ＯＳ＝Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ＧＮ＝ｐ３  ＰＥ＝２  ＳＶ＝１
MLGVFRRLRLGALAAAALSSLGSAAPANVAIRSLEERASSADRLVFCHFMIGIVGDRGSSADYDDDMQRAKAAGIDAFALNIGVDGYTDQQLGYAYDSADRNGMKVFISFDFNWWSPGNAVGVGQKIAQYANRPAQLYVDNRPFASSFAGDGLDVNALRSAAGSNVYFVPNFHPGQSSPSNIDGALNWMAWDNDGNNKAPKPGQTVTVADGDNAYKNWLGGKPYLAPVSTWVFNHFGPEVSYSKNWVFPSGPLIYNRWQQVLQQGFPRVEIVTWNDYGESHYVGPLKSKQFHDGNSKWVNDMPHDGFLDLSKPFIAAYKNRDTDISKYVQNEQLVYWYRRNLKALDCDATDTTSNRPANNGSGNYFEGRPDGWQTMDDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGTTQTFQANAGANLFQIPASIGQQKFALTRNGQTVFSGTSLMDITNVCSCGIYNFNPYVGTIPAGFDDPLQADGLFSLTIGLHVTTCQAKPSLGTNPPVTSGPVSSLPASSTTRASSPPPVSSTRVSSPPVSSPPVSRTSSAPPPPGNSTPPSGQVCVAGTVADGESGNYIGLCQFSCNYGYCPPGPCKCTAFGAPISPPASNGRNGCPLPGEGDGYLGLCSFSCNHNYCPPTACQYC  （配列ＩＤ番号：１８）
３．ｍＲＮＡの配列（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ
http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/AJ243799&display=fasta)
>ＥＮＡ｜ＡＪ２４３７９９｜ＡＪ２４３７９９．１  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ｐ３  ｇｅｎｅ）
ATGTTGGGCGTTTTCCGCCGCCTCAGGCTCGGCGCCCTTGCCGCCGCAGCTCTGTCTTCTCTCGGCAGTGCCGCTCCCGCCAATGTTGCTATTCGGTCTCTCGAGGAACGTGCTTCTTCTGCTGACCGTCTCGTATTCTGTCATTTCATGATTGGGATCGTGGGTGACCGTGGCAGCTCGGCAGATTATGATGACGATATGCAACGTGCCAAAGCCGCTGGCATTGACGCCTTCGCCCTGAACATCGGCGTTGACGGCTATACCGACCAGCAGCTCGGCTATGCCTATGACTCTGCCGATCGTAATGGCATGAAAGTCTTCATTTCATTTGATTTCAACTGGTGGAGCCCCGGCAATGCAGTTGGTGTTGGCCAGAAGATTGCGCAGTATGCCAACCGCCCTGCCCAGCTGTATGTCGACAACCGGCCATTCGCCTCTTCCTTCGCCGGTGACGGTCTGGATGTAAATGCGTTGCGCTCTGCTGCAGGCTCCAACGTTTACTTTGTGCCCAACTTCCACCCTGGTCAATCTTCCCCCTCCAACATTGATGGCGCCCTTAACTGGATGGCCTGGGATAATGATGGAAACAACAAGGCACCCAAGCCGGGCCAGACTGTCACAGTGGCAGACGGTGACAACGCTTATAAGAATTGGTTGGGTGGCAAGCCTTACCTGGCGCCTGTCTCAACTTGGGTTTTCAACCATTTCGGGCCCGAAGTTTCATATTCCAAGAACTGGGTTTTCCCAAGTGGGCCTCTGATCTATAACCGGTGGCAACAAGTCTTGCAGCAAGGGTTCCCAAGGGTTGAGATCGTTACCTGGAATGACTACGGGGAATCTCACTACGTCGGTCCCCTGAAGTCTAAGCAATTTCATGATGGGAACTCCAAATGGGTCAATGATATGCCCCACGATGGATTCCTGGATCTTTCGAAGCCGTTCATAGCCGCATATAAAAACAGGGATACCGACATCTCCAAGTATGTTCAAAATGAGCAGCTTGTTTACTGGTACCGCCGCAACTTAAAGGCACTGGACTGTGACGCCACCGACACAACCTCTAACCGCCCGGCTAACAATGGAAGCGGCAATTACTTTGAGGGACGCCCCGATGGTTGGCAAACTATGGATGATACGGTTTACGTGGCGGCACTTCTCAAGACTGCCGGTAGCGTCACGGTCACGTCTGGTGGCACCACTCAAACGTTCCAGGCCAACGCCGGAGCCAATCTCTTCCAAATCCCGGCCAGCATCGGCCAGCAAAAGTTTGCTCTGACTCGTAACGGTCAGACCGTCTTTAGCGGAACCTCATTGATGGATATCACCAACGTTTGCTCTTGCGGTATCTACAACTTCAACCCATATGTTGGCACCATTCCTGCCGGCTTTGACGACCCTCTTCAGGCTGACGGTCTTTTCTCTTTGACCATCGGATTGCACGTCACAACTTGTCAGGCCAAGCCATCTCTTGGAACTAACCCTCCTGTCACTTCCGGCCCTGTGTCCTCGCTTCCAGCTTCCTCCACCACCCGCGCATCCTCGCCGCCTCCTGTTTCTTCAACTCGTGTCTCTTCTCCCCCTGTCTCTTCCCCTCCAGTTTCTCGCACCTCTTCTGCCCCTCCCCCTCCGGGCAACAGCACGCCGCCATCGGGTCAGGTTTGCGTTGCCGGCACCGTTGCCGACGGCGAGTCTGGCAACTACATCGGCCTGTGCCAATTCAGCTGCAACTACGGTTACTGCCCACCAGGACCGTGTAAGTGCACCGCCTTTGGTGCTCCCATCTCGCCACCGGCATCCAACGGCCGCAACGGCTGCCCTCTGCCGGGAGAAGGCGATGGTTATCTGGGCCTGTGCAGTTTCAGTTGTAACCATAATTACTGCCCGCCAACGGCATGTCAATACTGCTAGGAGGGATCAATCTCAGTATGAGTATATGGAGGCTGCTGAAGGACCAATTAGCTGTTCTTATCGGCAGACGAAACCCATAGAGTAAGAAGTTAAATAAAATGCAATTAATGTGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAAA  （配列ＩＤ番号：１９）
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍは菌類であるため、ポリＡテールがある）
【０１０３】
Ｖ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ
１．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼの一般情報
http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7も参照されたい。
【０１０４】
２．Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼのタンパク質配列
参照：http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WZM7.fasta）
>ｔｒ｜Ｑ８ＷＺＭ７｜Ｑ８ＷＺＭ７＿ＴＲＩＨＡ  Ａｌｐｈａ−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ＯＳ＝Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ＧＮ＝ｐ３  ＰＥ＝２  ＳＶ＝１
MLGVFRRLRLGALAAAALSSLGSAAPANVAIRSLEERASSADRLVFCHFMIGIVGDRGSSADYDDDMQRAKAAGIDAFALNIGVDGYTDQQLGYAYDSADRNGMKVFISFDFNWWSPGNAVGVGQKIAQYANRPAQLYVDNRPFASSFAGDGLDVNALRSAAGSNVYFVPNFHPGQSSPSNIDGALNWMAWDNDGNNKAPKPGQTVTVADGDNAYKNWLGGKPYLAPVSTWVFNHFGPEVSYSKNWVFPSGPLIYNRWQQVLQQGFPRVEIVTWNDYGESHYVGPLKSKQFHDGNSKWVNDMPHDGFLDLSKPFIAAYKNRDTDISKYVQNEQLVYWYRRNLKALDCDATDTTSNRPANNGSGNYFEGRPDGWQTMDDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGTTQTFQANAGANLFQIPASIGQQKFALTRNGQTVFSGTSLMDITNVCSCGIYNFNPYVGTIPAGFDDPLQADGLFSLTIGLHVTTCQAKPSLGTNPPVTSGPVSSLPASSTTRASSPPPVSSTRVSSPPVSSPPVSRTSSAPPPPGNSTPPSGQVCVAGTVADGESGNYIGLCQFSCNYGYCPPGPCKCTAFGAPISPPASNGRNGCPLPGEGDGYLGLCSFSCNHNYCPPTACQYC  （配列ＩＤ番号：２０）
３．ｍＲＮＡの配列（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ、さらなる情報は、以下で見出せる。
【０１０５】
http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/AJ243799&display=fasta）
>ＥＮＡ｜ＡＪ２４３７９９｜ＡＪ２４３７９９．１  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ｐ３  ｇｅｎｅ）
ATGTTGGGCGTTTTCCGCCGCCTCAGGCTCGGCGCCCTTGCCGCCGCAGCTCTGTCTTCTCTCGGCAGTGCCGCTCCCGCCAATGTTGCTATTCGGTCTCTCGAGGAACGTGCTTCTTCTGCTGACCGTCTCGTATTCTGTCATTTCATGATTGGGATCGTGGGTGACCGTGGCAGCTCGGCAGATTATGATGACGATATGCAACGTGCCAAAGCCGCTGGCATTGACGCCTTCGCCCTGAACATCGGCGTTGACGGCTATACCGACCAGCAGCTCGGCTATGCCTATGACTCTGCCGATCGTAATGGCATGAAAGTCTTCATTTCATTTGATTTCAACTGGTGGAGCCCCGGCAATGCAGTTGGTGTTGGCCAGAAGATTGCGCAGTATGCCAACCGCCCTGCCCAGCTGTATGTCGACAACCGGCCATTCGCCTCTTCCTTCGCCGGTGACGGTCTGGATGTAAATGCGTTGCGCTCTGCTGCAGGCTCCAACGTTTACTTTGTGCCCAACTTCCACCCTGGTCAATCTTCCCCCTCCAACATTGATGGCGCCCTTAACTGGATGGCCTGGGATAATGATGGAAACAACAAGGCACCCAAGCCGGGCCAGACTGTCACAGTGGCAGACGGTGACAACGCTTATAAGAATTGGTTGGGTGGCAAGCCTTACCTGGCGCCTGTCTCAACTTGGGTTTTCAACCATTTCGGGCCCGAAGTTTCATATTCCAAGAACTGGGTTTTCCCAAGTGGGCCTCTGATCTATAACCGGTGGCAACAAGTCTTGCAGCAAGGGTTCCCAAGGGTTGAGATCGTTACCTGGAATGACTACGGGGAATCTCACTACGTCGGTCCCCTGAAGTCTAAGCAATTTCATGATGGGAACTCCAAATGGGTCAATGATATGCCCCACGATGGATTCCTGGATCTTTCGAAGCCGTTCATAGCCGCATATAAAAACAGGGATACCGACATCTCCAAGTATGTTCAAAATGAGCAGCTTGTTTACTGGTACCGCCGCAACTTAAAGGCACTGGACTGTGACGCCACCGACACAACCTCTAACCGCCCGGCTAACAATGGAAGCGGCAATTACTTTGAGGGACGCCCCGATGGTTGGCAAACTATGGATGATACGGTTTACGTGGCGGCACTTCTCAAGACTGCCGGTAGCGTCACGGTCACGTCTGGTGGCACCACTCAAACGTTCCAGGCCAACGCCGGAGCCAATCTCTTCCAAATCCCGGCCAGCATCGGCCAGCAAAAGTTTGCTCTGACTCGTAACGGTCAGACCGTCTTTAGCGGAACCTCATTGATGGATATCACCAACGTTTGCTCTTGCGGTATCTACAACTTCAACCCATATGTTGGCACCATTCCTGCCGGCTTTGACGACCCTCTTCAGGCTGACGGTCTTTTCTCTTTGACCATCGGATTGCACGTCACAACTTGTCAGGCCAAGCCATCTCTTGGAACTAACCCTCCTGTCACTTCCGGCCCTGTGTCCTCGCTTCCAGCTTCCTCCACCACCCGCGCATCCTCGCCGCCTCCTGTTTCTTCAACTCGTGTCTCTTCTCCCCCTGTCTCTTCCCCTCCAGTTTCTCGCACCTCTTCTGCCCCTCCCCCTCCGGGCAACAGCACGCCGCCATCGGGTCAGGTTTGCGTTGCCGGCACCGTTGCCGACGGCGAGTCTGGCAACTACATCGGCCTGTGCCAATTCAGCTGCAACTACGGTTACTGCCCACCAGGACCGTGTAAGTGCACCGCCTTTGGTGCTCCCATCTCGCCACCGGCATCCAACGGCCGCAACGGCTGCCCTCTGCCGGGAGAAGGCGATGGTTATCTGGGCCTGTGCAGTTTCAGTTGTAACCATAATTACTGCCCGCCAACGGCATGTCAATACTGCTAGGAGGGATCAATCTCAGTATGAGTATATGGAGGCTGCTGAAGGACCAATTAGCTGTTCTTATCGGCAGACGAAACCCATAGAGTAAGAAGTTAAATAAAATGCAATTAATGTGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAAA  （配列ＩＤ番号：２１）
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍは菌類であるため、ポリＡテールがある）
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍのデキストラナーゼ（Ｄｅｘ）遺伝子
ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ４１５６２．１
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L41562.1）
成熟したタンパク質は５７４アミノ酸で、分子量は６７ＫＤである。最適な反応条件はｐＨ５．５および４０℃である。ｐＨ範囲は３〜６である。
【０１０６】
アミノ酸配列
MATMLKLLALTLAISESAIGAVMHPPGNSHPGTHMGTTNNTHCGADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGTNNFHDSFVYESIPRNGNGRIYAPTDPPNSNTLDSSVDDGISIEPSIGLNMAWSQFEYSHDVDVKILATDGSSLGSPSDVVIRPVSISYAISQSDDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKTDLYTFLSDGNEYVTSGGSVVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMTPDNTQTMTPGPINNGDWGAKSILYFPPGVYWMNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYLAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGILSGENYVYQANAGDNYIAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGISSQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCHNDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSRKSISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGLTMGLNISNWTVGGQKVTMENFQANSLGQFNIDGSYWGEWQIS  （配列ＩＤ番号：２２）
ＤＮＡ配列
1 ggcatagtaa tcccgacagc cgagtatgat ggagcttctt cggataatga tagcgccacc
61 agaccttgct tgagctggag agctaaaaca ttaaacgcca cacgaccaac actctcatta
121 gttgcgatag atgatgctcg gagctgttga aactcagaaa ttccttctat gcggggtctc
181 caagatcgat cctgggggat gtgaatacta cggtggacct aattgacgcc ttgacaggtg
241 atgttaagcg aaccaaggaa gaataatctg gggctagatg aagatgttga gctgtaaggt
301 acggtacgtt cctattggct ttatcggagc ttctccgggt tactcagtct ttccgggagc
361 atgatcattt ttgtattgtc caatagtaag cagaaactga gagccaccac aaactcaaaa
421 cctcggtagc gaagtttccc ggaaccagtc aggattctca gaaactgtgc tcgtgttgcg
481 gggaatccgc attctacgtc gtctggagca aggaaatgtt cgtgctggat tgaggaggat
541 aggtaggttg gagaatctct tcagctaacc aatctataag catgctccgg taacctttag
601 agtttcacat tcaacgtaat ttccaagata gccagagcgt ccttgaatta ctatgtagaa
661 atcctaaaat ttcccctgta aaatgcaagt caacgagatg cgtgccctca atgtctctcg
721 gcgctacccc ggaaatgatg cataaggcca agaatgtcac ccggtaactt tttcttcaga
781 atatcctaag atttccatca aacacagtcg aataggtcaa tgctcgcgag agactttctg
841 ccttcactct acgtcctact catagaagtt caacggctca attccggggt aatctagagt
901 ttggacctca agggagatgt tgcaacaaat tgtactagaa cgatgcgctt gctttccaat
961 acagtagttg acttcatata gcttccaaca aaagggatgg ggatgaaggc tctatagcga
1021 gaagtctata agaaagtgtc ctcatacctg tatctctcag tcgttcgaga acaatcccgg
1081 aaactatctt atcttgcgag aaagaagaca atatctcaaa cttatggcca caatgctaaa
1141 gctacttgcg ttgacccttg caattagcga gtccgccatt ggagcagtca tgcacccacc
1201 tggcaattct catcccggta cccatatggg cactacgaat aatacccatt gcggcgccga
1261 tttctgtacc tggtggcatg attcagggga gatcaatacg cagacacctg tccaaccagg
1321 gaacgtgcgc caatctcaca agtattccgt gcaagtgagc ctagctggta caaacaattt
1381 tcatgactcc tttgtatatg aatcgatccc ccggaacgga aatggtcgca tctatgctcc
1441 caccgatcca cccaacagca acacactaga ttcaagtgtg gatgatggaa tctcgattga
1501 gcctagtatc ggccttaata tggcatggtc ccaattcgag tacagccacg atgtagatgt
1561 aaagatcctg gccactgatg gctcatcgtt gggctcgcca agtgatgttg ttattcgccc
1621 cgtctcaatc tcctatgcga tttctcagtc tgacgatggt gggattgtca tccgggtccc
1681 agccgatgcg aacggccgca aattttcagt tgagttcaaa actgacctgt acacattcct
1741 ctctgatggc aacgagtacg tcacatcggg aggcagcgtc gtcggcgttg agcctaccaa
1801 cgcacttgtg atcttcgcaa gtccgtttct tccttctggc atgattcctc atatgacacc
1861 cgacaacacg cagaccatga cgccaggtcc tatcaataac ggcgactggg gcgccaagtc
1921 aattctttac ttcccaccag gtgtatactg gatgaaccaa gatcaatcgg gcaactcggg
1981 gaagttagga tctaatcata tacgtctaaa ctcgaacact tactgggtct accttgcccc
2041 cggtgcgtac gtgaagggtg ctatagagta ttttaccaag cagaacttct atgcaactgg
2101 tcatggtatc ctatcgggtg aaaactatgt ttaccaagcc aatgccggcg acaactacat
2161 tgcagtcaag agcgattcaa ccagcctccg gatgtggtgg cacaataacc ttgggggtgg
2221 tcaaacatgg tactgcgttg gcccgacgat caatgcgcca ccattcaata ctatggattt
2281 caatggaaat tctggcatct caagtcaaat tagcgactat aagcaggtgg gagccttctt
2341 cttccagacg gatggaccag aaatatatcc caatagtgtc gtgcacgacg tcttctggca
2401 cgtcaatgat gatgcaatca aaatctacta ttcgggagca tctgtatcgc gggcaacgat
2461 ctggaaatgt cacaatgacc caatcatcca gatgggatgg acgtctcggg atatcagtgg
2521 agtgacaatc gacacattaa atgttattca cacccgctac atcaaatcgg agacggtggt
2581 gccttcggct atcattgggg cctctccatt ctatgcaagt gggatgagtc ctgattcaag
2641 aaagtccata tccatgacgg tttcaaacgt tgtttgcgag ggtctttgcc cgtccctatt
2701 ccgcatcaca ccccttcaga actacaaaaa ttttgttgtc aaaaatgtgg ctttcccaga
2761 cgggctacag acgaatagta ttggcacagg agaaagcatt attccagccg catctggtct
2821 aacgatggga ctgaatatct ccaactggac tgttggtgga caaaaagtga ctatggagaa
2881 ctttcaagcc aatagcctgg ggcagttcaa tattgacggc agctattggg gggagtggca
2941 gattagctga attccagctc tcggagcgcg tgagtgcttc tacccgctcc tttacccttg
3001 tcgagagata aaggcataag ttagctcatg tgaaggcgat ttcagttcat tctctctttt
3061 tggagcttat ttcctgttcg accaattgtg acaccaactt gcctttcaaa agacgtggac
3121 gatatgtgta cggtaatcag tcaaatgaac gtcaacattc atttaataag gacatttcca
3181 ggtttcctta ctctgtcgat tatgcctaac tcgggttgat gtcttgtcag gatggaaaat
3241 ctcgttgtgt acttccagtg aaatgggcag ggctaagccc taaaccctaa cgcatacaat
3301 ttgtaggcac ctacccatgt aagttcacac ccagtcgact tataagtcta gatatttatg
3361 ctatgcaggc tctggaatga tttacattcc atgctataca tagttatttg caagaatttg
3421 cagacgagat aaaaatcaat ggacgaataa tcacgcatta ctccacaggc tcatgccacg
3481 gagcaagggt tcccccgaat ctaggccaga ccgggatgat attcaaccga ttctttttgc
3541 agtaactatc tccgtacgag ctgcacgagc taaacggatt atataaaggt gctaactgag
3601 cattggatcc gtcagttata tgaaatgca  （配列ＩＤ番号：２３）
２．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｃｕｌｅａｔｕｍ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ株ｚ０１）のデキストラナーゼ（Ｄｅｘ）遺伝子
ＧｅｎＢａｎｋ：ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF999646.1のＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のＫＦ９９９６４６．１
最適なｐＨは約５である。ｐＨ範囲は３〜６である。
【０１０７】
アミノ酸配列
MATMLKLLTLALAISESAIGAVLHPPGSSHPSTRTDTTNNTHCGADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGANNFQDSFVYESIPRNGNGRIYAPTDPPNSNTLDSSVDDGISIEHSIGLNMAWSQFEYSQDVDIKILAADGSSLGSPSDVVIRPVSISYAISQSDDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKNDPYTFLSDGNEYVTSGGSVVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMTPDNTQTMTPGPINNGDWGSKSILYFPPGVYWMNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYFAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGVLSGENYVYQANAGENYVAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGISSQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCHNDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSSKSISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGLTMGLDISNWSVGGQKVTMQNFQANSLGQFDIDGSYWGEWQIN  （配列ＩＤ番号：２４）
ＤＮＡ配列
1 atggccacaa tgctaaagct acttacgttg gcccttgcaa ttagcgagtc tgccattgga
61 gcagtcctgc acccacctgg cagttctcat cccagtaccc gtacggacac tacgaataat
121 acccattgcg gtgccgactt ctgtacctgg tggcatgatt caggcgagat caacacacag
181 acacctgtcc aaccggggaa cgtgcgccaa tctcacaagt attccgtaca agtgagccta
241 gctggtgcga acaactttca ggactccttt gtatatgaat cgatccctcg gaacggaaat
301 ggtcgcatct atgctcccac cgatccaccc aacagcaaca cactagattc aagtgttgat
361 gatggaatct cgattgaaca tagtattggc ctcaatatgg catggtccca attcgagtac
421 agccaggatg tcgatataaa gatcctggcc gctgatggct catcgttggg ctcaccaagt
481 gatgttgtta ttcgccccgt ctcaatctcc tatgcaattt ctcaatccga cgatggcgga
541 attgtcattc gggtcccagc cgatgcgaac ggccgcaaat tttcagtcga gttcaaaaat
601 gacccgtaca cgttcctctc tgacggcaac gagtacgtca catcgggagg cagcgttgtc
661 ggcgttgagc ctaccaacgc acttgtgatc ttcgcaagcc cgtttcttcc gtcaggcatg
721 attcctcata tgacacccga caacacgcag accatgacac caggacctat caataacggc
781 gactggggct ccaagtcaat tctttatttc ccaccgggcg tatactggat gaaccaagat
841 caatcaggca actcggggaa attaggatct aatcatatac gcctgaactc gaacacctac
901 tgggtctact ttgccccagg tgcgtacgtg aagggtgcta tagagtattt caccaagcag
961 aacttctatg caactggtca tggtgtccta tcgggtgaaa actatgttta ccaagccaat
1021 gctggcgaaa actacgttgc ggtcaagagc gattcgacta gcctccggat gtggtggcac
1081 aataacctgg gaggtggaca aacatggtac tgcgttgggc ctacgatcaa tgcgccgcca
1141 tttaacacaa tggatttcaa tggaaattcc ggtatctcaa gtcaaattag cgactataag
1201 caggtgggag ctttcttctt tcagacggat ggaccagaaa tttatcccaa tagtgtcgtg
1261 cacgacgtct tctggcatgt caatgatgat gcaatcaaaa tctactattc cggagcatct
1321 gtctcgcggg caacgatctg gaaatgtcac aacgatccaa tcatccagat gggatggacg
1381 tctcgggata tcagtggagt gacaatcgac acattgaatg tcatccacac ccgctacatc
1441 aagtcggaga cggtggtgcc ttcggctatc attggggctt ctccattcta tgcaagtggg
1501 atgagtcctg attcaagcaa gtctatatcc atgacggttt caaacgttgt ctgcgaggga
1561 ctttgcccgt ctctgttccg aatcacacct ttacagaact acaagaattt tgttgtcaaa
1621 aatgtggctt tcccagatgg gctacagacg aatagtattg gcacgggaga aagcattatt
1681 ccagccgcat ctggtctaac gatgggactg gatatctcca actggtctgt tggtggtcag
1741 aaggtgacta tgcagaactt tcaagccaat agtctggggc aattcgacat tgacggcagc
1801 tattgggggg agtggcagat taactagctg aataatattg cagctttcag ggcgcatgag
1861 tgcttgtacc cgctccttta cccttgtc  （配列ＩＤ番号：２５）
３．デキストラナーゼのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ  ｄｅｘ遺伝子
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ２７２０６６．１（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/7801166）
最適なｐＨは約５．５である。最適な温度は６０℃である。ｐＨ範囲は５〜７．５である（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032959298001277）
アミノ酸配列
MATMLKLLALTLAISESAIGAVMHPPGVSHPGTHTGTTNNTHCGADFCTWWHDSGEINTQTPVQPGNVRQSHKYSVQVSLAGTNNFHDSFVYESIPRNGNGRIYAPTDPSNSNTLDSSVDDGISIEPSIGLNMAWSQFEYSQDVDIKILATDGSSLGSPSDVVIRPVSISYAISQSNDGGIVIRVPADANGRKFSVEFKNDLYTFLSDGNEYVTSGGSVVGVEPTNALVIFASPFLPSGMIPHMKPHNTQTMTPGPINNGDWGAKSILYFPPGVYWMNQDQSGNSGKLGSNHIRLNSNTYWVYLAPGAYVKGAIEYFTKQNFYATGHGVLSGENYVYQANAGDNYVAVKSDSTSLRMWWHNNLGGGQTWYCVGPTINAPPFNTMDFNGNSGISQISDYKQVGAFFFQTDGPEIYPNSVVHDVFWHVNDDAIKIYYSGASVSRATIWKCHNDPIIQMGWTSRDISGVTIDTLNVIHTRYIKSETVVPSAIIGASPFYASGMSPDSSKSISMTVSNVVCEGLCPSLFRITPLQNYKNFVVKNVAFPDGLQTNSIGTGESIIPAASGLTMGLNISSWTVGGQKVTMENFQANSLGQFNIDGSYWGEWQISRISSSQSA  （配列ＩＤ番号：２６）
ＤＮＡ配列
1 atggccacaa tgctaaagct acttgcgttg acccttgcaa ttagcgagtc cgccattgga
61 gcagtcatgc acccacctgg cgtttctcat cccggtaccc atacgggcac tacgaataat
121 acccattgcg gcgccgactt ctgtacctgg tggcatgatt caggggagat caacacgcag
181 acacctgtcc aaccagggaa cgtgcgccaa tctcacaagt attccgtgca agtgagtcta
241 gctggtacaa acaactttca tgactccttt gtatatgaat cgatcccccg gaacggaaat
301 ggtcgcatct atgctcccac cgatccatcc aacagcaaca cattagattc aagcgtggat
361 gatggaatct cgattgagcc tagtatcggc ctcaatatgg catggtccca attcgagtac
421 agccaggatg tcgatataaa gatcctggca actgatggct catcgttggg ctcaccaagt
481 gatgttgtta ttcgccccgt ctcaatctcc tatgcgattt ctcagtccaa cgatggcggg
541 attgtcatcc gggtcccagc cgatgcgaac ggccgcaaat tttcagtcga attcaaaaat
601 gacctgtaca ctttcctctc tgatggcaac gagtacgtca catcgggagg tagcgtcgtc
661 ggcgttgagc ctaccaacgc acttgtgatc ttcgcaagtc cgtttcttcc ttctggcatg
721 attcctcata tgaaacccca caacacgcag accatgacgc caggtcctat caataacggc
781 gactggggcg ccaagtcaat tctttacttc ccaccaggtg tatactggat gaaccaagat
841 caatcgggca actcgggtaa attaggatct aatcatatac gtctaaactc gaacacttac
901 tgggtctacc ttgcccccgg tgcgtacgtg aagggtgcta tagagtattt caccaagcaa
961 aacttctatg caactggtca tggtgtccta tcaggtgaaa actatgttta ccaagccaat
1021 gctggcgaca actatgttgc agtcaagagc gattcgacca gcctccggat gtggtggcac
1081 aataaccttg ggggtggtca aacatggtac tgcgttggcc cgacgatcaa tgcgccacca
1141 ttcaacacta tggatttcaa tggaaattct ggcatctcaa gtcaaattag cgactataag
1201 caggtgggag ccttcttctt ccagacggat ggaccagaaa tctatcccaa tagtgtcgtg
1261 cacgacgtct tctggcacgt caatgatgat gcaatcaaaa tctactattc gggagcatct
1321 gtatcgcggg caacgatctg gaaatgtcac aatgacccaa tcatccagat gggatggaca
1381 tctcgggata tcagtggagt gacaatcgac acattaaatg ttattcacac ccgctacatc
1441 aaatcggaga cggtggtgcc ttcggctatc attggggcct ctccattcta tgcaagtggg
1501 atgagtcccg attcaagcaa gtccatatcc atgacggttt caaacgttgt ttgcgagggt
1561 ctttgcccgt ccctgttccg catcacaccc ctacagaact acaaaaattt tgttgtcaaa
1621 aatgtggctt tcccagatgg gctacagaca aatagtattg gcacaggaga aagcattatt
1681 ccagccgcat ctggtctaac gatgggacta aatatctcca gctggactgt tggtggacaa
1741 aaagtgacaa tggagaactt tcaagccaat agcctggggc agttcaatat tgacggcagc
1801 tattgggggg agtggcagat tagtcgaatt tccagctctc agagcgcgtg agtgcttcta
1861 cccgctcctt tacccttgtc gaaggatcaa ggcataagtt agctcatgtg aaggcgattt
1921 cagttcattc tctctttttt ggagctcatt tccttttcga ccaattgtga caccaaattg
1981 ccatgtgtac tgtaattggt caaatgaacg ttaaccttcg atttaatatg gacatttcca
2041 ggtttcctta ctctgtcgat tatgcctaac tcgggttgat gtcttgtcag gatgaaaatc
2101 tcgttgtcat gtacttcgag tgaaatgggc agggctaacc cctaagccct aacgcccaat
2161 cgacttataa gtctagatgt ttatgctatg caggctctgg aatgatttac attccatgct
2221 ataca  （配列ＩＤ番号：２７）
【０１０８】
実施例ＩＩＩ
ＥＰＳマトリックス分解の二重ターゲティングアンチバイオフィルムアプローチ
および強化された細菌殺傷
上記のように、バイオフィルムは、細菌の接着−凝集および薬物耐性に関連する細胞外マトリックスに埋め込まれた構造化された微生物群集を含むため、従来の抗菌剤単独療法を使用して治療することは困難である。現在の例では、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）マトリックス分解グルカノヒドロラーゼと臨床的に使用されるエッセンシャルオイルベースの抗菌薬を組み合わせて、抗バイオフィルム効果を高めるマルチターゲットアプローチをさらに調査した。本発明者らのデータは、デキストラナーゼがムタナーゼと相乗作用して、事前に形成された口腔バイオフィルム中のＥＰＳグルカンマトリックスを分解する一方で、抗菌剤による細菌殺傷を著しく強化することを示した（３ログ増加対抗菌剤単独）。さらなる分析により、ＥＰＳ分解／抗菌二重アプローチ（ＥＤＡ）がマトリックスの足場を破壊し、細菌クラスタの「物理的崩壊」を引き起こし、細胞の分散を誘発し、細菌細胞を急速な抗菌殺害にさらすことが明らかになった。興味深いことに、記載したＥＤＡアプローチを使用したアパタイト表面の単一の前処理は、ＥＰＳ合成とｉｎ  ｓｉｔｕでの細菌結合を阻害することにより、バイオフィルムの蓄積を防止した。また、予期せぬことに、ＥＤＡアプローチはＥＰＳ産生口腔病原体Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓを選択的にターゲティングし、混合種の生態学的バイオフィルムモデルでのコロニー形成と異常増殖を破壊できることを発見した。局所化されたＥＰＳの分解と埋め込まれた病原体の曝露により殺害が強化され（他の種と比較）、共生細菌の優位性を促進する、興味深いメカニズムが観察された。併せて、これらの結果は、ＥＰＳマトリックスとその保護微小環境を解体することにより、抗バイオフィルムの有効性と精度を高め、それによって内部の細菌細胞の殺傷を強化することのできるアプローチを示している。
【０１０９】
以下の材料と方法は、例ＩＩＩの実施を容易にするために提供されている。
【０１１０】
細菌株と生育条件
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９血清型ｃ（ＡＴＣＣ  ７００６１０）、証明済みの齲蝕原性歯科病原体であり、また水不溶性ＥＰＳマトリックスの主要生産者（２６）が単一種バイオフィルムモデルに使用された。Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）１２１０４（商標））およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）３５０３７（商標））は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓとの混合種生物学的バイオフィルムを生成するために選択された共生生物である。これら３種はすべて、ヒトの歯肉縁上のプラークに豊富に存在するからである（３７）。Ｓ．ｏｒａｌｉｓは、唾液で覆われた歯の表面にある最も初期の先駆的な生着菌の１つである（３７）。それらは、ショ糖から可溶性グルカンを生成し、耐酸性であることが知られていた（３８）。Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉはまた、プラーク形成の初期段階で唾液のペリクルに定着する。株は、２５％グリセロールを含むトリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ）で−８０℃で保存した。すべての株は、使用前に中間指数期まで、３７℃、また５％ＣＯ２で１％（ｗ／ｖ）グルコースで補充して、限外ろ過（１０ｋＤａ分子量カットオフ膜；Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州）緩衝トリプトン酵母エキスブロス（ＵＦＴＹＥ培地、２．５％トリプトンおよび１．５％酵母エキス、ｐＨ７．０）で生育させた（２５）。
【０１１１】
ＥＰＳ分解酵素および抗菌剤
ＥＰＳ分解酵素は、多糖類のグルコシド結合を切断できるグルカノヒドロラーゼである。異なる起源の（１→６）−α−Ｄ−グルカンのグルコシド結合の加水分解を触媒できるデキストラナーゼ［α−（１→６）グルカナーゼ；ＥＣ  ３．２．１．１１］は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。（１→３）−α−Ｄ−グルカンのグルコシド結合を加水分解するムタナーゼ［α−（１→３）グルカナーゼ；ＥＣ  ３．２．１．５９］は、Ｊｏｈｎｓｏｎ&Ｊｏｈｎｓｏｎ（ニューブランズウィック、ニュージャージー州）からの親切な贈り物であった。グルカノヒドロラーゼ活性は、Ｋｏｐｅｃ  ｅｔ  ａｌ．（３９）がいくつかの修正を加えて記述したように判定された。簡単に説明すると、精製したＳ．ｍｕｔａｎｓ  ＧｔｆＤグルカン［α−（１→６）−リンクグルカン］またはＧｔｆＢグルカン［α−（１→３）−リンクグルカン］を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）のデキストラナーゼまたはムタナーゼとともに１時間３７℃でインキュベートした。各グルカノヒドロラーゼによってグルカンから放出された還元糖の量は、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎメソッドを使用して比色定量された（４０）。デキストラナーゼの活性の１単位（Ｕ）は、３７℃でｐＨ５．５のα−（１→６）結合グルカンから１分間に１．０μｍｏｌの還元糖（マルトースとして測定）と読む酵素の量として定義された。ムタナーゼ１単位（Ｕ）は、３７℃でｐＨ５．５のα−（１→３）結合グルカンから毎分１．０μｍｏｌの還元糖（グルコースとして測定）を遊離する酵素の量として定義された。メントール、チモール、ユーカリプトール、およびサリチル酸メチルの抗菌剤の組み合わせを含むアルコールを含まないエッセンシャルオイル（ＥＯ）ベースの溶液を実施例ＩＩＩに使用した。これらのＥＯを含むＬＩＳＴＥＲＩＮＥ  ＺＥＲＯ（登録商標）は、Ｊｏｈｎｓｏｎ&Ｊｏｈｎｓｏｎから親切に提供され、モデル抗菌剤として使用された。
【０１１２】
単一種および混合種のバイオフィルムモデル
単一および混合種のバイオフィルムは、前述のように、垂直に懸濁した唾液コーティングヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）、生物学的な歯の表面を模倣するモデルに形成された（２５）。簡単に説明すると、ヒドロキシアパタイトディスク（直径１．２５ｃｍ、表面積２．７±０．２ｃｍ２、クラークソン、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｐｏｒｔ、ペンシルバニア州）をフィルタ滅菌した全ヒト唾液でコーティングした。単一種バイオフィルムの場合、各ｓＨＡディスクに１％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＵＦＴＹＥ培地で１０５ＣＦＵ／ｍＬの活発に増殖するＳ．ｍｕｔａｎｓを接種し、１９時間（３７℃および５％ＣＯ２）増殖させた（２５）。混合種バイオフィルムモデルは、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２４）によって説明されているように、「生態学的プラーク−バイオフィルム」の概念（４１）に基づいてバイオフィルム形成を模倣するように設計された。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ、およびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの細菌培養物を希釈して、０．１％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＵＦＴＹＥ培地中のＳ．ｍｕｔａｎｓ（１０２ＣＦＵ／ｍＬ）、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ（１０７ＣＦＵ／ｍＬ）、およびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（１０６ＣＦＵ／ｍＬ）の定義された微生物集団を接種に提供する。生物は最初のバイオフィルムコミュニティを形成するために最初の２９時間成長し、１９時間で培地が変化した。２９で、バイオフィルムを１％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＵＦＴＹＥ培地に移して、齲蝕原性の課題をシミュレートする環境変化を誘発した。バイオフィルムは、４３時間（初期の齲蝕原性バイオフィルム）または６７時間（成熟齲蝕原性バイオフィルム）で分析した。培養培地は、４３時間より長い実験期間の間、１％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＵＦＴＹＥ培地で１日２回（午前８時と午後６時）交換された。
【０１１３】
ＥＰＳ分解に対するデキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせ効果のスクリーニング
異なる活性比でのデキストラナーゼとムタナーゼによるＥＰＳの分解に対する組み合わせ効果のスクリーニングのために、９６ウェルプレートに、フィルタ滅菌したヒト全唾液をコーティングし、１％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＵＦＴＹＥ培地で、１０５ＣＦＵ／ｍＬの活発に増殖するＳ．ｍｕｔａｎｓを接種した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムを破壊するためのデキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせ効果の前に、バイオフィルムを１９時間（３７℃、５％ＣＯ２）成長させた後、若干の修正を加えて前述のようにチェッカーボード微量希釈アッセイにより測定した（４２）。簡単に説明すると、各ウェルのバイオフィルムを、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）と連続希釈した試験グルカノヒドロラーゼを組み合わせて、３７℃で１２０分間インキュベートした。デキストラナーゼとムタナーゼの最終濃度は、０〜１７．５０Ｕ／ｍＬの範囲であった。インキュベーション後、各ウェルを０．８９％塩化ナトリウムで簡単に洗浄して、可溶化／分離したバイオマスを除去し、視覚化と定量化のために残留バイオフィルムを０．２％クリスタルバイオレットで染色した。相対減少率は、対照としてのビヒクル対照群のものを使用して計算された（０％減少）。薬物相互作用係数（ＣＤＩ）を使用して、２つのグルカノヒドロラーゼ間の相乗作用／拮抗作用を以下の式（ＲＤｅｘおよびＲＭｕｔ、デキストラナーゼまたはムタナーゼ単独での相対的減少；ＲＤｅｘ＋Ｍｕｔ、Ｄｅｘ／Ｍｕｔの組み合わせの相対的減少）で評価した。  
【数１】
2020519560.tif 000005
【０１１４】
ＣＤＩ<０．７は、有意な相乗効果を示す。ＣＤＩ＝１は付加的な効果を示す。ＣＤＩ>１は拮抗作用を示す（４３）。
【０１１５】
ＥＰＳ分解／抗菌（ＥＤＡ）アプローチの治療レジメン
ＥＤＡアプローチの抗バイオフィルム効果は、事前に形成されたバイオフィルム（バイオフィルム破壊の有効性）とバイオフィルム形成のプロセス（バイオフィルム防止の有効性）の両方を使用して試験された。バイオフィルムの破壊については、ｓＨＡの事前に形成されたバイオフィルム（単一種の場合は１９時間、混合種のバイオフィルムの場合は４３時間／６７時間）を以下で処理した：１）ビヒクルコントロール（０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ＝５．５）；２）１２０分間最適濃度のＥＰＳ分解酵素、その後、バイオフィルムを１分間完全強度の抗菌剤（ＥＯｓ）で処理し、さらに分析するために収穫した。バイオフィルムの予防のために、接種前の６０分間、ｓＨＡディスクをＥＰＳ分解酵素（最適濃度）またはビヒクルコントロール（０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ＝５．５）で局所処理し、単一種または混合種の細菌の定着とバイオフィルムの形成を可能にするためにインキュベートした。実験期間の終了時に（単一種バイオフィルムの場合は１９時間、混合種バイオフィルムの場合は４３時間）、バイオフィルムをＥＯに最大強度で１分間曝露し、収穫時に分析した。
【０１１６】
定量的バイオフィルム分析
バイオフィルムは、他の場所で詳細に説明されているように、生化学的分析および微生物学的分析の対象となった（２２、２５）。簡単に説明すると、ＨＡ表面のバイオフィルムを採取し、超音波処理でホモジナイズし、自動Ｅｄｄｙ  Ｊｅｔ  Ｓｐｉｒａｌ  Ｐｌａｔｅｒ（ＩＵＬ、ＳＡ、バルセロナ、スペイン）を使用して連続希釈した後、血液寒天にプレーティングして、各ヒドロキシアパタイトディスクのＣＦＵ（バイオフィルムあたりのＣＦＵ）を判定した。混合種バイオフィルムでは、血液寒天上のコロニー形態の観察により３種を区別し、多様な種の割合を計算した（バイオフィルムあたりの総ＣＦＵは１００％とみなされた）。バイオフィルム懸濁液のアリコートを遠心分離し（５，５００ｇ、１０分、４℃）、ペレットを水で洗浄し、オーブンで乾燥し、水不溶性乾燥重量を測定した（１０５℃、２４時間）。バイオフィルムマトリックス中の水溶性および非水溶性多糖類を抽出し、以前に詳述したようにフェノール硫酸法を使用して比色定量した（４４、４５）。各アッセイについて、少なくとも３回の独立したバイオフィルム実験を実施した。
【０１１７】
バイオフィルム３Ｄアーキテクチャに対するＥＤＡアプローチの効果は、定評のあるプロトコルを使用して、様々な時点での超解像蛍光共焦点顕微鏡法によって分析された（２４）。簡単に説明すると、ＥＰＳは、細菌細胞が２．５μＭＳＹＴＯ  ９緑色蛍光核酸染色（４８５／４９８ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色されている間、バイオフィルム形成中グルカンの合成のプライマーとして機能するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７デキストランコンジュゲート（最終濃度、１μＭ、分子量、１０ｋＤａ、６４７／６６８ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州の吸光度／蛍光発光の最大値）の取り込みによって動的に標識された。イメージングは、２０倍（１．０開口数）の水浸対物レンズを備えた単一光子レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ８００、ドイツ、ツァイス）を使用して実行された。各バイオフィルムをランダムに選択した５つの領域でスキャンし、これらの位置のそれぞれで光学セクショニングによって共焦点画像シリーズを生成した。Ｃｏｍｓｔａｔ２（ｗｗｗ．ｃｏｍｓｔａｔ．ｄｋ）を使用した共焦点画像の計算分析を実施して、生化学的および微生物学的分析を補完するために、細菌およびＥＰＳの生体体積を判定した（４６）。Ａｍｉｒａ  ５．４．１ソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、バイオフィルムアーキテクチャの３Ｄレンダリングを作成した。
【０１１８】
４次元タイムラプス共焦点ライブイメージングおよび分析
バイオフィルムＥＰＳ構造、機械的安定性、および殺傷効果に対するＥＤＡの動的な影響は、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２４）によって修正された４次元（ｘ、ｙ、ｚ、ｔ）タイムラプス共焦点ライブイメージングを使用して評価されたＥＰＳは、培地に補充された１ｍＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７デキストランコンジュゲートを使用して標識された。バイオフィルム形成の終わりに（単一種バイオフィルムでは１９時間、混合種バイオフィルムでは６７時間）、ｓＨＡディスクを５μＭのＳＹＴＯ９（生細胞染色用；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）および４ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中の３０μＭのヨウ化プロピジウム（死細胞または膜損傷細胞の染色用、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含むペトリ皿（直径３５ｍｍ）に移した。これにより、実験期間全体にわたって生細胞および死細胞の連続標識およびリアルタイム可視化が可能になった。３７℃で３０分間の初期染色の後、２０倍の水浸対物レンズを備えたＬＳＭ８００単一光子高解像度共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、マルチチャンネル画像を取得した。最初のスキャンの完了直後に、ＥＰＳ分解酵素またはビヒクルのバッファを溶液に慎重に添加し、よく混合した。４Ｄタイムラプスシリーズでは、ＥＰＳ分解酵素を加えた後、１０分ごとに同じ視野の画像が取得された。１２０分で、同じ緩衝液に抗菌剤（ＥＯｓ）を加えて混合し、最終濃度が最大強度の２５％になるようにした。この濃度は、イメージングへの影響を最小限に抑えながら最高の殺害効果を得るために予備実験で最適化された。同じ視野のイメージングは、抗微生物剤の挑戦の１分後に開始された。各シリーズの共焦点画像におけるＥＰＳの総バイオマスは、ＣＯＭＳＴＡＴ２を使用してアルゴリズム的に分析された（４６）。バイオフィルムの構造安定性（単一粒子追跡）のダイナミクスの計算分析は、オープンソースプラットフォームＴｒａｃｋＭａｔｅを使用して実行された（４７、４８）。各マイクロコロニーの動きは累積変位として定量化され、観察期間中にどれだけ移動したかの尺度である。フィジー（ＩｍａｇｅＪの配布）（４９）およびアミラ（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）は、バイオフィルムアーキテクチャの画像処理およびタイムラプスレンダリングの作成に使用された。
【０１１９】
精製ＧｔｆＢによるグルカン合成に対するＥＰＳ分解酵素の効果
ＧｔｆＢはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ  ＫＳＢ８から入手し、Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．およびＫｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（５０、５１）により詳細に記載されているヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィによりほぼ均一に精製された。Ｇｔｆ活性は、放射標識スクロース（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州、米国）から１４Ｃ−グルコースをグルカンに取り込むことで測定した（５０）。ＧｔｆＢ活性の１単位（Ｕ）は、４時間の反応で１μｍｏｌのグルコースを取り込む酵素の量として定義される。ＥＰＳ分解酵素の存在下でのグルカン合成は、Ｈａｙａｃｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２１）によって詳細に説明されているように、いくつかの修正を加えて実施された。簡単に説明すると、ＧｔｆＢ（１０Ｕ）をデキストラナーゼまたはムタナーゼ（０〜５０Ｕの範囲）と混合し、（［１４Ｃ］グルコシル）−スクロース基質（０．２μＣｉ／ｍＬ；２００．０ｍＭスクロース、４０μＭデキストランＴ−１０、０．０２％アジ化ナトリウムを吸着バッファ：５０ｍＭのＫＣｌ、０．３５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、０．６５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．５中に）で４時間、３７℃でインキュベートし、グルカンを合成する。デキストラナーゼとムタナーゼの効果を組み合わせるために、様々な量のデキストラナーゼ（０〜１０Ｕ）を含む１Ｕのムタナーゼをアッセイで使用した。遠心分離（１３，４００ｇ、４℃、１０分）後に不溶性グルカンを回収し、水で３回洗浄した。可溶性グルカンをエタノール（最終濃度：７０％）で−２０℃で１８時間沈殿させた。放射標識された不溶性および可溶性グルカンの量は、シンチレーションカウンティングによって定量化された（５０）。
【０１２０】
混合種バイオフィルムの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
修正を加え他の箇所で説明されているように、ＥＤＡによって誘発される精度と抗バイオフィルムの有効性の向上のメカニズムを理解するために、ＦＩＳＨを使用して、混合種バイオフィルムの形態形成と、生態学的なバイオフィルムモデルの多微生物集団の空間分布を評価した（５２〜５４）。簡単に説明すると、ｓＨＡで形成された混合種バイオフィルムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回穏やかに洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ、ｐＨ７．４で）で４°Ｃで４時間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを５０％エタノール（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中）に移し、−２０℃で保存した。ハイブリダイゼーションでは、まずリゾチーム（Ｓｉｇｍａ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ中４００，０００Ｕ／ｍＬ）で３７℃にて１４分間処理することにより、細菌細胞を透過処理した。ＦＩＳＨオリゴヌクレオチドプローブ（ＳＭＵ５８７、５’−ＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＣ−３’（配列ＩＤ番号：２８）を含むハイブリダイゼーション溶液（２５％ホルムアミド、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０１％ＳＤＳ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ；ＭＩＴ５８８、５’−ＡＣＡＧＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＴＡＴＣＴＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：２９）の場合はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ；５’−ＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：３０）の場合はＣｙ３、ＡＣＴ４７６、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉの場合はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４で、各プローブは最終濃度１μＭ）で、バイオフィルムを４６℃で４時間インキュベートし、洗浄液（０．２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％ＳＤＳ）に対して３７°Ｃで１５分間洗浄した。２０倍の水浸対物レンズを備えたＬＳＭ８００単一光子共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、高解像度の画像を取得した。各視野は、６４０ｎｍ、５６１ｎｍ、および４８８ｎｍレーザー線による連続励起を使用してイメージングされ、放出された蛍光スペクトル全体がラムダスタックとして検出された（５５）。Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアで、標本のすべての蛍光色素分子の参照スペクトルを使用して、ラムダスタックに線形混合アルゴリズムを適用した。混合されていない画像は、フィジーを使用して組み合わせ、偽色を付けた（４９）。
【０１２１】
細菌の初期付着の評価
齲蝕原性病原体Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、Ｇｔｆ合成グルカンの存在下で歯表面への定着を大いに促進するグルカン結合タンパク質を産生する（５６）一方で、他の共生生物は、唾液ペリクルへの優先的な付着を媒介するアドヘシン−受容体相互作用に依存している（５７）。表面に吸着したＥＰＳ分解酵素が多微生物の結合親和性に及ぼす影響を調査し、初期の微生物コロニー形成への影響を機械的に理解するために、放射性同位体追跡分光法を使用して細菌の付着を分析した（２１、５８）。簡単に説明すると、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ、およびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは、放射性標識細菌へと指数関数中間期まで３７℃、５％ＣＯ２で、１０μＣｉ  ３Ｈ−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）および１％（ｗ／ｖ）グルコースを補充したＵＦＴＹＥ培地で増殖させ、細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）は、Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｓｅｒカウントチャンバーを使用して測定した。唾液でコーティングされたヒドロキシアパタイトビーズ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、カリフォルニア州、米国、８０μｍ粒子サイズ）は、ＧｔｆＢ固定化の前に最適な組み合わせでビヒクルまたはグルカノヒドロラーゼで前処理され、グルカンはスクロース基質（２００．０ｍＭのスクロース、４０μＭのデキストランＴ−１０、０．０２％のアジ化ナトリウムを吸着バッファｐＨ６．５中に）の存在下で４時間ｉｎ  ｓｉｔｕで合成した。次に、グルカンでコーティングした表面を、吸着バッファ中の１．０×１０９ｃｅｌｌ／ｍＬのアイソトープ標識細菌と３７℃で１時間インキュベートした。唾液ペリクルのみのヒドロキシアパタイトビーズをコントロールとして使用した。吸着バッファでビーズを３回洗浄することにより、未結合の細菌を除去した。細菌付着の親和性は、シンチレーション計測により定量化された。ｓＨＡビーズの接着細胞の実際の数は、測定された放射能（１分あたりのカウント、ＣＰＭ）と放射標識された細菌の数の検量線を使用して計算された。
【０１２２】
結果
ＥＰＳ分解酵素は、最適な活性比で相乗的に抗菌殺傷効果を高める。
【０１２３】
連鎖球菌Ｇｔｆｓによって生成されるＥＰＳは、齲蝕原性バイオフィルムマトリックスの重要なコンポーネントであり、主にα−（１→３）−、α−（１→６）−、および高い構造多型を含むα−（１→４）−リンクのグルカンで構成されるグリコシド結合の混合物を含む（２１）。したがって、ＥＰＳの豊富なマトリックスをターゲットにすることは難しく、複数の特定の化学結合の分解が必要になる場合がある。デキストラナーゼ［α−（１→６）グルカノヒドロラーゼ］およびムタナーゼ［α−（１→３）グルカノヒドロラーゼ］などのグルカノヒドロラーゼは、Ｇｔｆｓによるグルカン合成を破壊し、事前に形成されたＥＰＳマトリックスを消化することが示された（１６、２１、２２）。最適な効果を得るために、まず、ハイスループットバイオフィルムモデルを使用して、デキストラナーゼとムタナーゼの様々な組み合わせのＥＰＳ分解活性をスクリーニングした（図１９Ｄ）。試験した最高濃度（１７．５Ｕ／ｍＬ、還元率の<２５％）であっても、デキストラナーゼもムタナーゼ単独でもバイオフィルムを効率的に分解することはできなかった。ただし、デキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせは、ＥＰＳ分解に対して相乗効果を示し、８．７５Ｕ／ｍＬのデキストラナーゼおよび１．７５Ｕ／ｍＬムタナーゼ（活性比５：１）で最高の減少率（>６０％）と最高の相乗効果（薬物相互作用係数、ＣＤＩ＝０．６３５、顕著な相乗効果を示す）を達成した。
【０１２４】
本発明者らのマルチターゲティングのコンセプトを試験するために、モデル抗菌剤として、グルカノヒドロラーゼと臨床的に使用されるエッセンシャルオイル（ＥＯｓ）ベースの製剤を組み合わせた併用療法を開発した。確立された唾液コーティングヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）経口バイオフィルムモデルを使用して、抗バイオフィルム効果を評価した（図１９Ａ）。バイオフィルムは、ＥＰＳ分解酵素で局所的に処理され、その後すぐに抗菌剤にさらされた（図１９Ｂ）。グルカノヒドロラーゼの最適化と一致して、８．７５Ｕ／ｍＬデキストラナーゼと１．７５Ｕ／ｍＬムタナーゼを使用した場合に最も強力な殺害活性が観察された（抗菌剤単独に対して１０００倍効果的）（図１９Ｃ）。グルカンマトリックスもα−（１→４）グリコシド結合のかなりの割合を保有しているため、グルコアミラーゼ［α−（１→４）グルカナーゼ］を含めることで有効性をさらに改善できるかどうかも調査した。最適化された二重酵素の組み合わせと比較した場合、殺害効果の緩やかな増加（約０．５ログのＣＦＵ）のみが観察された（図２０Ｆ）。二重酵素アプローチが本研究で提案された概念の検証をするための十分な高ＥＰＳ分解活性を提供することを示している。全体として、データは、デキストラナーゼとムタナーゼが相乗的に保護ＥＰＳマトリックスを分解し、バイオフィルム細胞の殺傷を大幅に強化できることを示唆している。
【０１２５】
ＥＰＳ分解酵素は、ｉｎ  ｓｉｔｕでバイオフィルムマトリックスを分解し、バイオフィルム内の抗菌ターゲティングを促進する。
【０１２６】
ＥＰＳマトリックスは、バイオフィルムの薬物抵抗の重要な要因として認識されている（４）。ただし、マトリックスとバイオフィルム３Ｄアーキテクチャの構造組織が抗菌効果を妨げる方法はよくわかっていないままである。高解像度タイムラプス共焦点顕微鏡を使用して、バイオフィルムがＥＰＳ分解に続く時空間の形態変化を観察した。図２０Ａに示すように、ビヒクル処理バイオフィルムは、通常齲蝕原性バイオフィルムに見られる豊富な量のＥＰＳマトリックス（赤色）で埋め込まれた、マイクロコロニー（１〜３）と呼ばれる密集した細菌（緑色）細胞のクラスタを示す。極めて対照的に、デキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせにより処理されたバイオフィルムは、本質的にＥＰＳを欠いていたが、細菌細胞の分散を示していた（白い矢印；図２０Ａ〜ｄ）。デキストラナーゼもムタナーゼだけでも、事前に形成されたバイオフィルムのマトリックスを完全に分解することはできなかった。共焦点画像データと一致して、二重酵素処理は、グルカノヒドロラーゼ単独と比較して、最小限のエキソポリサッカライド含有量（図２０Ｄ）でバイオマスを著しく少なくし（図２０Ｃ）、単一のグリコシド結合を標的にすることはバイオフィルムマトリックスを完全に分解するには不十分であることを示した。
【０１２７】
次に、ＥＰＳ分解が単一のマイクロコロニーレベルで抗菌殺傷プロファイルを調整する方法を調査した。タイムラプス殺傷アッセイは、リアルタイムの細菌の生／死染色とＥＰＳイメージングを使用して実行された（図２０Ｂおよび図２１Ｅ）。二重酵素処理（ビヒクル処理）なしのバイオフィルムには、局所抗菌剤（ＥＯｓ）への短時間（１分）および長時間（５分）の曝露後、多くの生細胞（緑色）が含まれていた（図２０Ｂ、上）。表面近くの細菌細胞（白い矢印）が、抗菌薬への曝露によりほとんど死滅（マゼンタ）しているのに対し、マイクロコロニー内に存在する細胞はほとんど生存（緑）していることが見出した。しかし、グルカノヒドロラーゼによるＥＰＳ分解に続いて、抗菌剤は破壊されたマイクロコロニーの内側と外側の両方で細菌を効率的に死滅させた（図２０Ｂ、下）。これらの発見は微生物分析によってさらに検証され、グルカノヒドロラーゼは組み合わせで相乗的に抗菌剤の抗菌殺傷を増強したことが示された（約３ログより効果的な殺傷対ＥＯｓ単独、ｐ<０．００１）一方で、酵素単独には抗菌活性がなかった（ビヒクル処理コントロールに対して、ｐ>０．０５）（図２０Ｅ）。したがって、グルカノヒドロラーゼは、ＥＰＳマトリックスによって提供される「物理的障壁を無効にするもの」のように見え、そのため抗菌活性を高めるために細菌細胞を露出させる。
【０１２８】
酵素によるＥＰＳマトリックス解体のダイナミクスとそれに関連する反抗的な保護メカニズムをさらに理解するために、時間分解超解像共焦点イメージングを使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＥＰＳの時空間分解を調べた（図２１Ａおよび２１Ｂ）。単一のマイクロコロニー内のマトリックスの超微細構造の特徴を視覚化すると、架橋したＥＰＳの複雑なネットワークが明らかになる（図２１Ａ、赤）。興味深いことに、二重酵素の組み合わせは、マイクロコロニーの外側と内側の両方にあるＥＰＳを効率的に分解し（図２１Ｂ、白い矢印）、ＥＯＳに１分間さらした後、より効果的で均一な細菌を死滅させた（図２１Ｄ、生菌と死菌がそれぞれ緑とマゼンタ）。対照的に、ビヒクル処理されたマイクロコロニーは、主に生細胞（緑色）で構成される細菌の中心核（図２１Ｃ、破線の円）を示したが、外側の層は抗菌剤曝露後の生細胞と死細胞の混在を保持した（挿入された破線のボックスにて生細菌が示されている）。データは、デキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせは、周囲のＥＰＳを分解することに加えて、細菌のマイクロコロニーの内部に到達し、抗菌効果を高めるＥＰＳ足場を消化することができることを示している。
【０１２９】
バイオフィルムの足場の機械的安定性と完全性は、ＥＰＳ分解により損傷を受ける。
【０１３０】
エキソポリサッカライドマトリックスの存在は、機械的安定性に不可欠な足場を提供し、基層からの機械的クリアランスに対するバイオフィルムの耐性を調節し（２３）、バイオフィルム破壊戦略の開発に対する別の課題を提起する。ここでは、マトリックス足場を分解すると、バイオフィルムアーキテクチャの物理的完全性と安定性に影響を与えられるかどうかを調べた。タイムラプスイメージングを使用して、ＥＰＳ分解中のバイオフィルム構造の動的な変化を追跡した。ＥＰＳの除去の結果として、物理的構造の「内破のような」崩壊が観察された。そこでは、マイクロコロニー全体が本質的に細胞の分散を伴い、ｓＨＡ表面の底に砕け落ちた（図２２Ａ）。この動的プロセスをさらに測定するために、時間解析されたＥＰＳ分解化（赤の四角）およびマイクロコロニー空間変位（緑の円）曲線を生成するための計算解析が実行された。図２２Ｂに示すように、最初の３０分間でより高い故障率でＥＰＳが時間とともに除去され（約７０％の減少）、その時点でＥＰＳの分解は時間の経過とともに遅くなった。特に、「物理的崩壊」はＥＰＳ分解の後期（７０分後）で検出され、マイクロコロニーの検出可能な変位として現れた。これは、バイオフィルムの機械的安定性を完全に損なうのＥＰＳ足場の完全な解体と３Ｄ整合性が必要な場合があることを示している。全体として、データは、ＥＰＳ分解／抗菌二重アプローチ（ＥＤＡ）がＥＰＳ産生および齲蝕原性Ｓ．ｍｕｔａｎｓによって媒介されるバイオフィルムを強力に破壊できることを示している。
【０１３１】
ＥＤＡは、混合種バイオフィルムにおけるＥＰＳ産生病原体の標的化を強化するためにＥＰＳを局所的に分解する。
【０１３２】
スクロースの存在下でのＥＰＳの生産は、共生生物が豊富なコミュニティから病理学的バイオフィルムへの移行を調節するＳ．ｍｕｔａｎｓの確立を促進する（２２）。ここで、本発明者らは、齲蝕原性バイオフィルムの生態学的発達を模倣する混合種モデルにおいて、ＥＤＡアプローチがＥＰＳ産生病原体を標的にできると仮定した（２２、２４）。生態学的バイオフィルムモデルでは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは初期の生着菌であるＳ．ｏｒａｌｉｓおよびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉと共培養され、ｓＨＡに初期の微生物群集コミュニティを形成する（図２３Ａおよび２３Ｂ）。次に、スクロースを導入して、共生生物が豊富なコミュニティ（Ｓ．ｏｒａｌｉｓが多く、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ細胞が少なく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓが最も少ない種である）から、ＥＰＳが豊富なマトリックスと酸性を特徴とする微小環境（２２、２５）Ｓ．ｍｕｔａｎｓの成長を促進するバイオフィルムへの生態学的な変化を誘発する（図２３Ａおよび２３Ｂ）。したがって、本発明者らは、ＥＤＡアプローチが蝕原性条件下での病原体優性バイオフィルムの確立を乱すことができるかどうかを調べた（図２３Ａに示す治療計画）。この概念を示すために、混合種バイオフィルムの異なる生態学的段階を表す２つの異なる時点でＥＤＡアプローチを試験した（図２３Ｂ）。Ｓ．ｍｕｔａｎｓが低ＥＰＳ産生で優勢ではなかった４３時間（初期段階）で、ＥＰＳ分解の有無にかかわらず抗菌剤（ＥＯｓ）による同様の死滅が観察された（図２３Ｃ）。蓄積されたＥＰＳが特に豊富でＳ．ｍｕｔａｎｓが優勢になった６７時間（後期）で、ＥＤＡは抗菌薬（ＥＯｓ）単独と比較して全体的な殺害効果が高かった（図２３Ｄ、上）。興味深いことに、ＥＰＳ分解酵素を含めると、より選択的な細菌の死滅が起こり（図２３Ｄ、上）、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ（約０．５ログ削減）よりもＳ．ｍｕｔａｎｓに対して非常に高い効力（約２．０ログ削減対抗菌）、バイオフィルムにおける共生の優位性をもたらす（図２３Ｄ、下）。
【０１３３】
病原性の優位性を混乱させる効率を考え、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による成熟混合種バイオフィルムのＥＰＳマトリックス、病原体および共生生物の空間組織をさらに特徴付けた。代表的な共焦点画像は、細菌成分が高度に構造化された特徴的な空間組織に組織化されていることを示した（図２３Ｅ）。バイオフィルム構造は、周辺層を形成するＳ．ｏｒａｌｉｓ細胞に囲まれたＥＰＳ埋め込みＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞クラスタの存在によって特徴付けられた（図２３Ｅ  ｂ、断面の重ね合わせ図）。「コア−コロナ型」というフレーズを使用して、ＥＰＳ（赤で表示）にからませる密集したＳ．ｍｕｔａｎｓのマイクロコロニー（緑色で表示）を囲むハローのような構造を形成する、放射状に方向付けられたＳ．ｏｒａｌｉｓコミュニティ（黄色で表示）から生成されたコンソーシアム構造を記述する（図２３Ｅ  ｂ〜ｆ）。そのような空間的かつ保護された組織は、抗菌剤のみを使用して、確立された混合バイオフィルム内のＳ．ｍｕｔａｎｓを標的とすることを困難にするように思われる。逆に、タイムラプス共焦点顕微鏡では、二重酵素の組み合わせを含めるとＥＰＳが局所的に分解でき、埋め込まれた細菌が露出して抗菌剤による殺菌力が強化されることが明らかになった（図２３Ｆ）。総合すると、ＥＤＡアプローチは、構造と毒性の特性を排除することにより、混合種のＥＰＳ産生病原体を標的とし、それにより、抗バイオフィルムの精度と有効性を高めることができる。
【０１３４】
ＥＰＳ分解酵素はｉｎ  ｓｉｔｕでのグルカン合成を阻害することによりバイオフィルム形成を防ぐ
以前の研究では、ハイドロキシアパタイトと微生物の表面に形成されたＥＰＳが細菌の付着と凝集を促進することが示されている。具体的には、連鎖球菌Ｇｔｆｓによる食餌性スクロースから合成されたＥＰＳグルカンは、バイオフィルムの開始に足場材料を提供する接着相互作用において中心的な重要性を持つ（２６）。本発明者らのデータは、ＥＰＳ分解酵素が、事前に形成されたバイオフィルムに対する強力な効果を考えると、バイオフィルムの形成を防ぐことができることを示している。この問題に対処するために、バイオフィルム形成前に、ＥＰＳ分解酵素を実験的な唾液ペリクル表面（ｓＨＡ）に局所的に適用した（図２４Ａ）。デキストラナーゼ／ムタナーゼで前処理したｓＨＡ表面のグルカノヒドロラーゼ活性を確認し（表３）、表面形成ＥＰＳを分解することができた（図２２Ｃ）。ｓＨＡ上に形成されたＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルムの代表的な３Ｄレンダリングを図２４Ｂに示した。二重酵素前処理ｓＨＡのバイオフィルム形成は非常に欠陥があり、ＥＰＳマトリックスまたはマイクロコロニーを形成できなかったが、単一酵素前処理ｓＨＡで形成されたバイオフィルムは、検出可能なＥＰＳを伴う変化したマイクロコロニー構造（白い矢印、図２４Ｂ）の形成を示した（減少しているにもかかわらず）。微生物学的データは、二重酵素の組み合わせが、デキストラナーゼまたはムタナーゼ単独よりもバイオマス蓄積の抑制（図２４Ｃ）およびバイオフィルムの総ＣＦＵの減少（図２４Ｄ）に高い効果をもたらすことを示した。また、前処理のｓＨＡ表面に形成されたバイオフィルムを抗菌剤に曝露して、殺傷に対する感受性が高まるかどうかを調べる。酵素で前処理されたｓＨＡ表面のバイオフィルムで（ビヒクルで前処理された表面に対して）、１００倍の効果的な死滅（合計で>４ログＣＦＵ以上の減少）が観察された（図２３Ｅ）。
【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
ｉｎ  ｓｉｔｕでのＥＰＳ分解をさらに理解するために、デキストラナーゼおよび／またはムタナーゼの存在下でグルカン合成アッセイを実行し、Ｇｔｆ由来グルカンの生合成および組成が影響を受けるかどうかを判断した。一般に、両方のグルカノヒドロラーゼは、合成された可溶性／不溶性グルカンの量と割合を妨害した（図２４Ｆ）。デキストラナーゼの存在は、ＧｔｆＢの不溶性グルカン合成能力に影響を与えたが、抑制活性のプラトーに達し（ビヒクルコントロールに対して不溶性グルカンの減少が最大６０％減少）（図２４Ｆ、左）、以前の観察結果と一致している（２１）。ムタナーゼは、低濃度で不溶性グルカン合成を完全に阻害したが、可溶性グルカンの産生は増強された（図２４Ｆ、中央）。しかし、二重酵素の組み合わせにより、不溶性および可溶性グルカンの合成が完全に破壊され、デキストラナーゼとムタナーゼの相乗作用が確認された（図２４Ｆ、右）。まとめると、これらのデータは、ＥＰＳ分解酵素が細菌由来のＧｔｆによるグルカン生合成を阻害し、そのためグルカン依存性メカニズムを介してｉｎ  ｓｉｔｕでのバイオフィルム形成を防止できることを示している。
【０１３７】
ＥＤＡアプローチは、混合種バイオフィルムにおけるＳ．ｍｕｔａｎｓの初期コロニー形成を選択的に防止する。
【０１３８】
表面に形成されたＥＰＳは、ショ糖の存在下でグルカン結合齲蝕原性病原体（Ｓ．ｍｕｔａｎｓなど）の結合部位を提供し、それらのコロニー形成を促進し、共生の豊富なコミュニティを破壊することが示された（２２）。混合種の生態モデル（前述）を使用して、図２５Ａに示すように、治療レジメンを使用して、微生物の個体数変化のダイナミクスに対するＥＤＡアプローチの影響を最初に調査した。４３時間（初期の齲蝕原性バイオフィルム、スクロース導入後１４時間）で、微生物集団の劇的な変化が認められた。ＥＰＳ分解酵素で前処理したｓＨＡで形成された初期の混合バイオフィルムは、ビヒクルコントロールと比較してＳ．ｍｕｔａｎｓ集団（ＣＦＵ）の２ログの減少を示したが、Ｓ．ｏｒａｌｉｓもＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ集団も影響を受けず（図２５Ｂ）、細菌のコロニー形成に対する選択的阻害効果を示唆している。３つの種特異的プローブを使用したＦＩＳＨ（図２５Ｃに示す代表的な画像）は、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（シアンで表示）細胞およびＳ．ｍｕｔａｎｓ（緑色で表示）細胞に関連する多数のＳ．ｏｒａｌｉｓ（黄色で表示）を示した（図２４Ｃ左）。対照的に、共生動物、特にＳ．ｏｒａｌｉｓは、酵素処理ｓＨＡで形成されたバイオフィルムを占めた（図２５Ｂ右のグラフと２５Ｃ右のグラフ）。注目すべきことに、抗菌剤による局所治療は、酵素前処理群のＳ．ｍｕｔａｎｓを完全に除去したが、ビヒクル前処理群では多数のＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞が検出された（図２５Ｄ）。
【０１３９】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは表面に形成されたＥＰＳ（２７）への熱接着を促進するグルカン結合タンパク質を発現できるため、グルカノヒドロラーゼはＥＰＳ産生病原体のコロニー形成を選択的に妨害できると考えた。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの選択的破壊をさらに理解するため、グルカンでコーティングされたｓＨＡ表面への細菌の付着を３Ｈ−チミジン放射性同位体追跡分光法で評価した。共生菌（Ｓ．ｏｒａｌｉｓとＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）は、病原体（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）よりも唾液ペリクルに効果的に結合し、一方でペリクルで生成されたグルカンは、共生菌の結合を有意に抑制し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの結合を強化することがわかった（図２５Ｅ）。興味深いことに、グルカン形成前のペリクルのグルカノヒドロラーゼ前処理は、細菌の結合親和性に様々な影響を示し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの有害性を伴う共生付着に有利であった。この発見は、細菌のコロニー形成に対する選択的阻害が、グルカン依存性メカニズムによる病原体の接着破壊に関連していることを示していた。
【０１４０】
考察
バイオフィルムの薬物抵抗は、既存の抗菌剤単独療法に大きな課題を課し、マルチターゲットまたは組み合わせアプローチの緊急の必要性を示している（２）。ここでは、臨床的に使用される抗菌剤と組み合わせた容易に入手可能なＥＰＳ分解酵素が、保護マトリックスを標的とし、局所治療レジメンでの局所殺害を増幅することにより、抗バイオフィルム効果を相乗および増強できることを実証する。重要なことに、この戦略は、コロニー形成を中断し、抗菌除去を強化するためにｉｎ  ｓｉｔｕで曝露することにより、混合種バイオフィルム内のＥＰＳ産生病原体を空間的に標的にすることができる。本発明者らの研究は、抗菌作用を伴うマトリックス破壊が最適なバイオフィルムの制御を生み出し、同時に混合種コミュニティのコンテキストでＥＰＳ産生病原体を標的とし、それにより強力でありながら選択的な抗バイオフィルムアプローチを提供することを示している。
【０１４１】
バイオフィルムの抗菌抵抗における細胞外マトリックスの重要性はますます認識されている（２８）。ただし、マトリックスが抗菌剤に対する細菌の耐性を強化するメカニズムはよくわかっていない。ＥＰＳマトリックスの時空間的分解と細菌の殺害の強化とバイオフィルムの分解の発生への影響を詳細に説明すると、存在する細菌の「保護的な物理的足場」の作成におけるＥＰＳマトリックスの役割に関するさらなる洞察が得られる。高度に特異的なＥＰＳ分解酵素を使用した時間分解バイオフィルムイメージングを使用して、マトリックスの解体がバイオフィルムの予防と破壊を最適化し、抗菌薬耐性を克服する方法を発見した。第１に、グルカノヒドロラーゼによる抗菌効果の増強は、ＥＰＳ分解の有効性と密接に関連していた。本発明者らのデータは、グルカンマトリックスのα−（１→３）およびα−（１→６）グリコシル結合の同時分解が、マトリックスを効果的に消化し、マイクロコロニー構造を破壊するために必要であることを明らかにした。構造の解体と同時に、ＥＰＳ分解されたマイクロコロニーの内部の細菌細胞へのアクセスと死滅を促進することにより、抗菌効果の大幅な増強が観察された。さらに、グルカノヒドロラーゼで前処理されたｓＨＡ表面は、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＥＰＳ産生を低下させ、ＥＰＳに埋め込まれた細菌クラスタの確立を防ぎ、生じた欠陥バイオフィルムの殺傷を促進できる。したがって、固有の抗菌活性の欠如にもかかわらず、グルカノヒドロラーゼは、様々なタイプの抗菌薬の強力なアジュバントとなれる。デキストラナーゼとムタナーゼの組み合わせはＥＰＳマトリックス分解に効果的であったが、α−（１→４）などの追加のグルコシル結合や他の生体高分子も齲蝕原性バイオフィルムのマトリックスで見つかった（２９〜３１）。例えば、歯科用バイオフィルムマトリックス内の細胞外ＤＮＡおよびリポテイコ酸の存在もバイオフィルム構造にとって重要であり、ＤＮａｓｅによる局所治療は、初期のバイオフィルムの分散に役立つことが示されている。また、α−（１→４）結合を標的とするグルコアミラーゼを含めると、ＥＰＳマトリックスの全体的な消化が向上でき、抗菌効果がさらに高まることも見出した。したがって、様々な細胞外高分子物質を標的とすることにより、マトリックス分解性能を最大化できると予測する。これにより、マトリックスが誘導する抗菌薬の抵抗をなくす効果がさらに高まる可能性がある。
【０１４２】
機械的クリアランスに対する耐性は、バイオフィルムが非生物的および生物的表面に持続的に付着し、物理的除去を困難にすることによる別の重要なメカニズムを表す（１３、３２）。本発明者らのデータは、ＥＰＳ分解酵素が機械的安定性を弱め、バイオフィルムアーキテクチャの構造的崩壊を引き起こす能力を強調している。観察された「物理的崩壊」は、グルカノヒドロラーゼがバイオフィルムのコア構造足場構造を分解できることを強く示している。特に、酵素は、細菌細胞を包み、安定化する接着性多糖を分解することにより、細菌細胞の分散を誘発することもできる。臨床環境では、バイオフィルムからの分散細胞は浮遊状態に戻り、抗菌剤や宿主防御による殺傷に対してより敏感になる（２）。しかし、バイオフィルムの分散も伝染性の伝達に寄与し、病原体の宿主内拡散／持続を仲介し（３３）、再コロニー形成または菌血症のリスクをもたらすことは注目に値する。したがって、ＥＰＳ分解アプローチは抗菌剤と共投与して、細菌を相乗的に殺し、ｉｎ  ｓｉｔｕでの細菌の再定着を防ぐという概念を強化する必要がある。これらの発見は、分散効果と予防効果の両方を備えた抗バイオフィルム治療アプローチとしてのＥＤＡの潜在的な使用を示唆している。
【０１４３】
混合種バイオフィルム内の細菌種は、多因子微小環境の影響を受ける広範囲かつ複雑な競争を示す（３４）。マトリックスターゲティング戦略に関する以前の研究は、主に単一種のバイオフィルムモデルを使用して行われた。ここでは、混合種バイオフィルムモデルを使用して初めてこのアプローチの有効性を評価する。予期せぬことに、ＥＤＡアプローチはＥＰＳを生成する口腔病原体Ｓ．ｍｕｔａｎｓを選択的に標的とし、混合種生態学的バイオフィルムモデルでのコロニー形成と過成長を防ぎ、そのため共生生物に競争上の優位性を提供できることを発見した。グルカノヒドロラーゼは、グルカン依存性の結合メカニズムを破壊することにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのコロニー形成を標的にできることが見出した。これは、病原菌の付着と蓄積に有利である。唾液由来のアドヘシンと表面に固定された受容体の相互作用に大きく依存している共生動物（Ｓ．ｏｒａｌｉｓやＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉなど）の付着とは異なり（３５）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは表面吸着Ｇｔｆおよびグルカン結合タンパク質（Ｇｂｐｓ）などのグルカン依存メカニズムにより接着を大幅に促進する（３６）。単一細胞ベースの分析を使用して、グルカノヒドロラーゼが、グルカン産生をｉｎ  ｓｉｔｕで破壊することにより、ＥＰＳ産生病原体の定着を選択的に妨害することを発見した。グルカンでコーティングされたｓＨＡ表面がＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞の接着とさらなる蓄積を促進することを見出した。逆に、グルカンでコーティングされた表面のＥＰＳの分解は、共生細菌によるアドヘシン媒介結合のためにペリクル受容体を露出させることによる可能性がある、共生によるコロニー形成を再確立した。
【０１４４】
不均一なアーキテクチャと多様な種の分布のために、特定の種は殺害に対する保護的な微小環境を発達させることができる（２）。本発明者らのモデルでは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、共生生物よりも抗菌薬の負荷に対してより高い耐性を付与するＥＰＳ−マイクロコロニー複合体を作成できる。本発明者らのデータは、ＥＤＡアプローチが保護マトリックスを局所的に分解し、ｉｎ  ｓｉｔｕでの細菌殺傷を促進することにより、ＥＰＳ産生病原体を空間的に標的にできることを示している。そのような相乗効果は、薬剤が事前に形成されたバイオフィルムのマトリックスを根絶することができず、マトリックス内にからませた病原体を残したままにする従来の抗菌単剤療法と比較して明らかな利点を提供する。集合的に、本発明者らの組み合わせたアプローチは、混合種バイオフィルムにコミュニティレベルの影響を与え、生態学的観点から、病原菌の定着と過成長を防ぐ。
【０１４５】
本発明の特定の好ましい実施形態が上記で説明され、具体的に例示されたが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。添付の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な修正をそれに加えることができる。
【図１Ａ−１Ｄ】
2020519560.tif 000007
【図２Ａ−２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ−１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−１９Ｃ】
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【図１９Ｄ−１９Ｅ】
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【図２０Ａ−２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ−２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ−２３Ｆ】
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【図２４Ａ−２４Ｆ】
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【図２５Ａ−２５Ｅ】
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【国際調査報告】
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