(57)【要約】  本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断する手段としての、対象由来のサンプルに対するライブラリーの選択の前後の、既知の予後の少なくとも１個体の参照対象由来の少なくとも１つのサンプルに対して選択したライブラリーにおけるアプタマーの相対的な頻度の変化の使用に関する。また本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断するための方法であって、病状、疾患、または病態に対してアプタマー間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、決定した相関に基づき上記対象を診断するステップとを含む、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の病状、疾患、または病態を診断する手段としての、前記対象由来のサンプルに対するライブラリーの選択の前後における、少なくとも１個体の既知の予後の参照対象由来の少なくとも１つのサンプルに対して選択したライブラリーにおけるアプタマーの相対的な頻度の変化の使用。
【請求項２】
対象の病状、疾患、または病態を診断するための方法であって、
少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対して選択および任意選択でカウンターセレクションしたアプタマー配列の集合を含む、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも１個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと、前記対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも１個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、前記選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと前記対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、前記病状、疾患、または病態について前記対象を診断するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
対象の病状、疾患、または病態を診断するための方法であって、
少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対して選択および任意選択でカウンターセレクションしたアプタマー配列の集合を含む、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも２個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマー間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも２個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、前記病状、疾患、または病態について前記対象を診断するステップと
を含む、方法。
【請求項４】
前記少なくとも１個体の参照対象が、前記病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する対象である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記病状、疾患、または病態が、神経変性疾患である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記病状、疾患、または病態が、アルツハイマー病である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記選択したアプタマーのライブラリーを生体サンプルと接触させるステップが、２回以上の選択ラウンドを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記選択したアプタマーのライブラリーが、既知であり特徴づけられたアプタマー配列のサブセットを既知の比率で含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記相対的な頻度の変化を、様々な時点で決定することにより、前記対象の病状、疾患、または病態の進行の速度を評価する、請求項１に記載の使用または請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記使用または方法が、前記対象において病状、疾患、または病態が発症する可能性を割り当てるためのものである、請求項１に記載の使用または請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記使用または方法が、前記対象の病状、疾患、または病態の重症度のレベルを診断するためのものである、請求項１に記載の使用または請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記使用または方法が、前記対象の病状、疾患、または病態の進行の速度を決定するためのものである、請求項１に記載の使用または請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記使用または方法が、前記病状、疾患、または病態を罹患した対象を階層化するためのものである、請求項１に記載の使用または請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記使用または方法が、前記病状、疾患、または病態を罹患した対象における治療の有効性を評価するためのものである、請求項１に記載の使用または請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の中で、病態を診断するため、または病態のサブタイプを診断するため、または病態の進行速度を決定するため、バイオマーカーとして使用され得るアプタマーの同定に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、対象の中で、病態を診断するため、病態のサブタイプを診断するため、または病態の進行速度を決定するための方法であって、体液または体組織におけるエピトープに結合する配列において存在量が多く、さらにはある表現型に関して異なる複数の対象由来の同体液または体組織のサンプルに対して存在量が多いアプタマーのセットの使用と、このような対象間における存在量の多いアプタマーの頻度の相対的な頻度のバリエーションおよび表現型のバリエーションの相関とを含む、方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＳｔｒｉｍｂｕおよびＴａｖｅｌ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＨＩＶ  ＡＩＤＳ．  ２０１０  Ｎｏｖ；  ５（６）：４６３−４６６）は、バイオマーカーを、「正確かつ再現可能に測定することができる、患者の外側から観察される病状の客観的な指標」として定義している。この定義は、バイオマーカーと病状との間の機能的な関係を理解することを必要としておらず、単にこの定義は、バイオマーカーの測定と病状との間の関係が、正確かつ再現可能に測定されることを必要としている。
【０００４】
当該分野で知られているバイオマーカーには主に２つの種類がある：１つは、「ゲノム解析」と称されており、患者間におけるゲノム配列のバリアントおよび病状の相関に基づいている。第２の種類のバイオマーカーは、存在量がある病状に関連している、タンパク質または代謝物の存在量の測定値である。ゲノム解析の場合、この相関は、タンパク質配列の予測に基づく。相関に関する物理的な根拠は、タンパク質の機能に及ぼすタンパク質レベルでの配列の作用であると想定されている。タンパク質または代謝物のバイオマーカーでは、相関に関する物理的な根拠は、発現レベルの変化、または発現の特異性、または翻訳後修飾の結果であると想定されている。
【０００５】
各場合において、一般的に、医学的な診断に関するバイオマーカーの有用性の根拠は、測定したバイオマーカーと病状との間の相関であり、物理的な因果関係ではない。またバイオマーカーは、診断自体よりもむしろ表現型の可能性を割り当てるために使用される場合がある。例として、血液中の高いコレステロール値は、心不全の診断としてではなく、心不全の可能性を予測するために使用される。
【０００６】
本発明において、本発明者らは、医学的な診断および／または病状の可能性の予測に関して、同じであり全般的な有用性の根拠を満たす、新規の種類のバイオマーカーを開示する。
【０００７】
本発明は、体液または体組織においてエピトープに結合する能力に関して多く存在しているアプタマーのライブラリーの使用により、可能となる。アプタマーは、特定のエピトープに結合する能力を呈する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらの混合物）から通常形成される短いオリゴマーである。リガンドおよびバイオマーカーの同時発見（ｃｏ−ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に関して抗体を超える、鍵となるアプタマーの利点は、アプタマーの同定が、見込みのあるリガンドの非常に大きなランダムプールの反復する選択に基づくものであることである。よって、病態を呈する組織にランダムなアプタマーのライブラリーを曝露すること、およびこの組織の中でエピトープに結合するアプタマーを選択することが可能である。さらに、これを、病態を呈さない組織（実質的に健常な組織）に曝露し、当該組織に結合する配列に対して選択することにより、このようなライブラリーにカウンターセレクション（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を課すことが可能である。実質的に健常な組織への結合に対する選択と病態の影響を受ける組織への結合に関する選択とを交互に行うことにより、病態の影響を受ける組織において特に存在量が高まるエピトープに結合する配列の存在量の増大をもたらされる。よって病態の影響を受ける組織における幅広い範囲のエピトープに結合する、選択したアプタマーのライブラリーを開発することが可能である。この、病態のエピトープに関するアプタマー配列の存在量を高める同じプロセスはまた、所定の病態を罹患していない個体由来の体液に対するカウンターセレクションを用いて、所定の病態を罹患した患者由来の同じ体液における当該エピトープに関するアプタマーの選択に適用する。体液においてアプタマーの選択を可能にするための方法は、国際特許公開公報第２０１７０３５６６６号に提供されている。
【０００８】
用語「エピトープ」は、免疫学から生じたものであり、一般に、抗体により認識および結合される標的分子上の部位を意味すると見なされる。この概念は、準用（ｍｕｔａｔｉｓ  ｍｕｔａｎｄｉｓ）することによりアプタマーに当てはまる。
【０００９】
病態のエピトープに対する選択に応答する個々のアプタマー配列の存在量の多さは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などのプロセスを介して、ライブラリー由来のサンプルにおける個々の配列の相対的な頻度を測定することにより、特徴づけられる。選択したアプタマーのライブラリーの中の各アプタマーの相対的な頻度は、所定のアプタマー配列が観察される回数（コピー数）を、ライブラリーの中で観察されるアプタマー配列の総数で除算することにより決定される。病態のエピトープに関する、連続した選択ラウンドにおけるライブラリーの中のアプタマーの存在量の多さは、正の標的に対する各アプタマーの結合能、および選択に使用されるサンプルにおける標的の相対的な頻度または濃度の関数である。
【００１０】
本発明の基盤である知見は、異なる患者のサンプルに対する、アプタマーのライブラリーの同時選択から生じる特定のアプタマーの相対的な頻度の差が、複数の患者間のエピトープの頻度の差によるものでなければならないことである。結合親和性の差異は、患者間においてエピトープの頻度が等しい場合に、相対的な頻度において同じ変化をもたらすであろう。すなわち、選択プロセスは、患者間におけるアプタマーの結合親和性の差異およびエピトープの濃度の差異の結果として、選択ライブラリーの中にアプタマーの相対的な頻度の変化をもたらす。同じ選択ラウンドにおける同時選択では、患者間におけるアプタマーの相対的な頻度の差異は、単に、結合するエピトープの相対的な頻度の差異によるものであり得る。
【００１１】
よって、実質的に健常な個体と特定の病態を罹患した個体との間の、選択したライブラリーと特定の患者のライブラリーとの間の相対的な頻度の変化の差異を有するアプタマーの特徴を考慮すると、当該アプタマーの相対的な頻度の変化は、病状の診断を提供するため、または当該病状の発症の可能性を割り当てるために、使用することができる。
【００１２】
本発明者らは、所定の病態の診断に有用であることを特徴とするアプタマーを、“ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ”と名付けた。
【００１３】
当該ＡｐｔａＭａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化は、選択したライブラリーに存在するアプタマーに関する、特定の患者の選択プロセスの関数である。病態のエピトープに関して、複数のアプタマーの中で競合が存在する。あるサンプルが他のサンプルよりも高いレベルの病態のエピトープを有する場合、その結果として、この病態のエピトープに結合するアプタマーは、他のサンプルよりも当該サンプルにおいて高いレベルで存在量が高まるであろう。逆に、あるサンプルが他のサンプルよりも低いレベルの病態のエピトープを有する場合、その結果として、この病態のエピトープに結合するアプタマーは、他のサンプルよりも当該サンプルにおいて低いレベルの存在量であろう。さらに、本発明が、シーケンシングプロセスにより特徴づけられた配列のセットにおける当該アプタマーの相対的な頻度に基づくものである場合、結合するエピトープが所定のサンプルにおいて他より高い濃度で存在するため上記サンプルにおいてより高いレベルの存在量となる場合に、濃度が複数のサンプル間で同じであるエピトープに結合する他のアプタマーは、存在量が少なくなる結果となる。すなわち、いずれかの所定のアプタマーが相対的な頻度で存在量が多い場合、他のアプタマーの相対的な頻度は、この代償として減少しているはずである。
【００１４】
よって、ライブラリーにおける各アプタマーの相対的な頻度は、ライブラリーにおける他の全てのアプタマーの相対的な頻度の影響を受ける。よって本発明は、ライブラリーの文脈の中で、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒの、それ自身の相対的な変化ではない、相対的な頻度の変化に基づくものである。
【００１５】
また、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化が、病態の重症度のレベルの診断を提供するために使用され得ることが、本発明者らの知見である。ＡｐｔａＭａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化のレベルは、結合する病原性のエピトープの頻度の関数である。よって、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化のレベルは、病原性のエピトープの濃度と相関し得る。臨床データと比較して、これによってＡｐｔａｍａｒｋｅｒのセットの相対的な頻度の変化のレベルを使用して病態の重症度のレベルを表すスコアを作製するアルゴリズムを、開発することができる。
【００１６】
また、経時的な、個々の患者間におけるＡｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化を、病態の進行速度の予測を開発するために使用できるとのことが、本発明者らの知見である。特定の患者は、所定の病態の、異なる進行速度を呈し得る。このような患者らの反復解析を経時的に行うことにより、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒの変化の比率を決定することができる。高い比率のＡｐｔａｍａｒｋｅｒの変化を呈する患者は、病態の進行の速度が速いことを表すと予測することができる。よって、病態の変化の速度にＡｐｔａｍａｒｋｅｒの変化の比率を相関させるアルゴリズムを、開発することができる。
【００１７】
また、個々の患者間におけるＡｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化が、患者を階層化するために使用できるとのことが、本発明者らの知見である。異なる患者は、同じ病態に関して異なる病原性のエピトープを呈し得る。よって、類似した複数の患者のクラスターを特徴づけるため、およびある病態の中の患者の異なるクラスターを結果として同定するために、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化を使用することが可能である。この情報は、病態に関して見込みのある治療の試験、および臨床研究への参加に関する対象のより標的化した選択に有効であろう。このＡｐｔａｍａｒｋｅｒの適用は、治療に対する患者の応答レベルと相関し得る、患者の階層化に有用であり得る。
【００１８】
また、ある治療を受けた個々の患者間におけるＡｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化を、当該治療の有効性を評価するために使用できるとのことが、本発明者らの知見である。このような治療を受ける前の個々の患者の相対的な頻度の変化の測定は、患者が上記治療を受けてから経時的に反復して、どのＡｐｔａｍａｒｋｅｒが当該治療の影響を受けるか、どの程度Ａｐｔａｍａｒｋｅｒが影響を受けるか、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒに及ぼす作用と当該治療の用量との間に相関が存在するか、または当該治療および当該治療の有効性のレベルの適用の方法を決定するために、使用することができる。Ａｐｔａｍａｒｋｅｒは病原性のエピトープに結合しているため、このＡｐｔａｍａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化に関する情報は重要である。
【００１９】
よって、特定の治療に応答する病態を罹患した患者を同定することと、同じ治療の適用のための患者の選択に関する予測指標として、当該患者のＡｐｔａｍａｒｋｅｒの応答を使用することとが、可能である。これは、治療の開発に有効であろう。
【００２０】
また、自身がバイオマーカーとしてのアプタマーの使用のためではない、バイオマーカーを同定するためのアプタマーの使用のための方法を開発することが、試みられてきた。
【００２１】
特に、米国特許出願公開公報第２０１５００８７５３６号は、アプタマーの使用を介した、体液中のタンパク質の同定および定量化のための方法を記載している。しかしながらこの方法は、既知のタンパク質に対する結合がすでに確立しているアプタマーの使用に限定されている。このようなアプタマーのプールは、体液由来のタンパク質と混合され、結合が可能となる。結合していないアプタマーは、洗浄により除去される、残りの結合したアプタマーはシーケンシングされ、体液に存在するタンパク質の仕様および量が、シーケンシングにより明らかとなったアプタマーの存在および量により決定される。
【００２２】
本発明は、まず第１に、組織または体液における特徴づけられていない病原性のエピトープに関するアプタマーの選択を含む点で、米国特許出願公開公報第２０１５００８７５３６号に開示される発明より優れた改善を提示する。本発明者らは、病態エピトープに結合するアプタマーの頻度の変化を測定することにより、当該病態エピトープの存在量の変化の特徴づけを可能にした。しかしながら、米国特許出願公開公報第２０１５００８７５３６号は、この出願において、既知のタンパク質の標的が同定されたアプタマーのみに限定されている。本発明は、所定のタンパク質に結合することが知られている既知のアプタマーの開発により、限定されるものではない。
【００２３】
さらに、米国特許出願公開公報第２０１５００８７５３６号は、精製したタンパク質に結合するアプタマーに限定されている。本発明は、このように限定されるものではない。本発明者らは、実際に、他のタンパク質または代謝物または細胞膜などの他の生物学的な実体を含む複合体においてタンパク質の存在量を検出することができた。また本発明者らは、代謝物の中の複合体、代謝物単独、または細胞膜に結合する代謝物を含む、病原性のエピトープの一部を検出することができたため、本発明は、タンパク質に限定されるものではない。
【００２４】
さらに本発明は、存在量が病態により高まるタンパク質のペプチドフラグメントの存在量を検出することができる。例として、神経障害の場合では、タンパク質が、多くの場合、血液脳関門を介する除去のため、ペプチドへと切断される。これらペプチドは、血液中に存在し、病態のエピトープとして本発明の標的となり得る。上記ペプチドにより提示されるエピトープは、精製したタンパク質により提示されるエピトープと異なり得るため、精製したタンパク質に対して選択したアプタマーは、多くの場合、当該タンパク質由来のペプチドに結合しない。
【００２５】
Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋｉらによる刊行物（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００８  Ｊｕｌ  １６；１３０（２８）：９１３７−４３）は、アプタマーの存在量が多いプールの選択のための方法、およびバイオマーカーを同定するためのこれら存在量が多いプールの使用を記載している。アプタマーのライブラリーは、病態を有する患者由来の血清中のタンパク質に対して選択されている。このライブラリーは、その後の、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズへの固定化のために、ビオチン基と共に合成されている。このライブラリーは、最初に、体液由来のタンパク質と共にインキュベートされ、次に、タンパク質／アプタマー複合体が、磁気ビーズの導入によりこのインキュベーションから除去される。結合したタンパク質は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析により同定される。
【００２６】
Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋｉらの開示は、見込みのあるタンパク質のバイオマーカーを同定するためにアプタマーを使用するが、これらバイオマーカーの診断または定量化のための方法を直接開発してはいない点で、本発明と異なる。
【００２７】
またＢｅｒｅｚｏｖｓｋｉらの方法は、ペプチド、代謝物、タンパク質と代謝物との間の複合体、または他のタンパク質を伴うタンパク質ではなく、特定のタンパク質の同定に限定されている。
【００２８】
またＢｅｒｚｏｖｓｋｉらの方法は、タンパク質を発見するためのツールとしてのアプタマーの使用に限定されており、この範囲は、当該タンパク質のバイオマーカーとしてのその後の使用に限定されている。
【００２９】
バイオマーカーとして、これらタンパク質に結合するアプタマーを使用する概念は、これら著者によって企図されていなかった。
【００３０】
本発明は、タンパク質の異なるフォールディングを検出することができ、よって、単なる所定のタンパク質の同定に限定はされない。たとえばアルツハイマー病の事例におけるアミロイドβペプチド（Ａβ）およびｐＴａｕといった、特定のタンパク質のミスフォールディングまたは当該タンパク質に由来するペプチドがある病態を表し得ることは、当該分野でよく知られている。Ａβプラークおよびタウの線維変化（ｔａｕ  ｔａｎｇｌｅ）は両方とも、タンパク質自身ではなく、タンパク質のフォールディングされた状態に関連する病態のエピトープの供給源の例を提供する。本発明は、Ｂｅｒｚｏｖｓｋｉらの方法が有さなかった、これら病態のエピトープの存在量を直接測定する能力を有する。
【００３１】
従来技術に記載されている限定に直面しているため、より正確に症状を診断すること、このような病状の発症の可能性を割り当てること、病態の重症度のレベルを診断すること、病態の進行速度の予測を開発すること、患者を階層化すること、治療の有効性を評価すること、および／または特定の治療に応答する病態を罹患した患者を同定することに対する新規の方法の開発に関する需要は、依然として満たされていない。
【００３２】
ここで、本発明者らは、自身がバイオマーカーとして、体液または体組織の中の標的に結合するアプタマーを使用する方法を開発した。バイオマーカーとしてのアプタマーの使用は、体液または体組織に対する単一のラウンドの選択の後の、アプタマーのライブラリーの中のアプタマーまたはアプタマーのセットの相対的な頻度と、表現型または病状との間の相関に基づく。
【００３３】
よって、本発明は、アプタマーが体液または体組織において何に結合しているかを知る必要性を回避した。実際に、以前に開示されている方法は、その後バイオマーカーとしてタンパク質を使用するタンパク質を同定するためにアプタマーを使用する手段を必然的に伴っている。しかしながら、本発明は、エピトープを提示できる任意のものにまで、可能性のある標的の範囲を広げ、標的が何であるかを同定する必要性を回避している。
【００３４】
さらに、体液および体組織における可能性のある標的の同定は、標的の低い濃度を受けて困難である可能性があり、この困難は、標的の複合的な混合物において当該標的を特徴づけることに関連し得る。
【００３５】
本発明は、標的の同定を必要とすることなく、病状のバリエーションに相関する、標的のバリエーションの特徴づけを可能にすることにより、この困難を克服している。
【発明の概要】
【００３６】
本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断する手段としての、対象由来のサンプルに対するライブラリーの選択の前後における、少なくとも１個体の既知の予後の参照対象由来の少なくとも１つのサンプルに対して選択したライブラリーにおけるアプタマーの相対的な頻度の変化の使用に関する。
【００３７】
また本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断するための方法であって、
少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対して選択および任意選択でカウンターセレクションしたアプタマー配列の集合を含む、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも１個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと、前記対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも１個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、前記選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと前記対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、前記病状、疾患、または病態について前記対象を診断するステップと
を含む、方法に関する。
【００３８】
また本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断するための方法であって、
少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対して選択および任意選択でカウンターセレクションしたアプタマー配列の集合を含む、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも２個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも２個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と、前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、前記病状、疾患、または病態について前記対象を診断するステップと
を含む、方法に関する。
【００３９】
一実施形態では、少なくとも１個体の参照対象は、上記病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する対象である。
【００４０】
一実施形態では、上記病状、疾患、または病態は、神経変性疾患である。
【００４１】
一実施形態では、上記病状、疾患、または病態は、アルツハイマー病である。
【００４２】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーを生体サンプルと接触させるステップは、２回以上の選択ラウンドを含む。
【００４３】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、既知であり特徴づけられたアプタマー配列のサブセットを既知の比率で含む
【００４４】
一実施形態では、相対的な頻度の変化を、様々な時点で決定することにより、前記対象の病状、疾患、または病態の進行の速度を評価する。
【００４５】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、対象において病状、疾患、または病態が発症する可能性を割り当てるためのものである。
【００４６】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、対象の病状、疾患、または病態の重症度のレベルを診断するためのものである。
【００４７】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、対象の病状、疾患、または病態の進行の速度を決定するためのものである。
【００４８】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、病状、疾患、または病態を罹患した対象を階層化するためのものである。
【００４９】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、病状、疾患、または病態を罹患した対象における治療の有効性を評価するためのものである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００５１】
用語「アプタマー」は、本明細書中使用される場合、リガンドとして作用し、解析物に結合する特性において、抗体を模倣するオリゴヌクレオチドを表す。一実施形態では、アプタマーは、天然のＤＮＡヌクレオチド、天然のＲＮＡヌクレオチド、改変されたＤＮＡヌクレオチド、改変されたＲＮＡヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５２】
用語「選択したライブラリー」または「選択したアプタマーのライブラリー」は、本明細書中使用される場合、標的に曝露されたアプタマー配列の集合を表し、ここでこのような標的は、アプタマーの選択として当該分野で知られているプロセスを介した、体組織または体液であり得、このような選択したライブラリーは、１００万の配列のサンプルで観察される配列の少なくとも０．０１％が、その後の同じ標的に対する選択ラウンドで再度観察される特徴を呈する。
【００５３】
用語「対象に特異的なアプタマーのライブラリー」、「患者に特異的なアプタマーのライブラリー」、または「診断ライブラリー」は、本明細書中使用される場合、標的に対するアプタマーの選択のプロセスで少なくとも１度適用された選択したライブラリーからのアリコートを表す、アプタマー配列の集合を表し、ここでこのような標的は、個体由来の体組織または体液であり得る。
【００５４】
用語「相対的な頻度」は、あるアプタマーに関して本明細書中使用される場合、観察される配列の総数で除算した、選択したアプタマーのライブラリーまたは対象に特異的なアプタマーのライブラリーのいずれかに由来する配列のサンプルにおける当該アプタマーのコピー数を表す。
【００５５】
用語「相対的な頻度の変化」は、あるアプタマーに関して本明細書中使用される場合、対象に特異的なアプタマーのライブラリーにおける当該アプタマーの、選択したアプタマーのライブラリーまたは別の対象に特異的なアプタマーのライブラリーのいずれかにおける同アプタマーの相対的な頻度と比較した、相対的な頻度を表す。
【００５６】
用語「アプタマーのクラスター」は、本明細書中使用される場合、異なる配列を有するアプタマーの集合またはプールを表し、ここで「アプタマーのクラスター」の中のアプタマーの全ての相対的な頻度は、対象に特異的なアプタマーのライブラリー間において統計的に有意なレベルの共分散を呈する。
【００５７】
用語「対象」は、温血動物、好ましくはヒト、ペットまたは家畜を表す。本明細書中使用される場合、用語「ペット」および「家畜」は、限定するものではないが、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、および家禽を含む。一部の実施形態では、対象は、雄性または雌性の対象である。一部の実施形態では、対象は、成体（たとえば１８歳超の対象（ヒトの年数）または生殖機能を獲得した後の対象）である。別の実施形態では、対象は、小児（たとえば１８歳未満の対象（ヒトの年数）または生殖機能を獲得する前の対象）である。一実施形態では、対象は、２０歳超、好ましくは、３０歳超、４０歳超、５０歳超、６０歳超、７０歳超、８０歳超、９０歳超、またはそれ以上の年齢である。一実施形態では、対象は、３０〜９０歳、好ましくは４０〜９０歳、より好ましくは５０〜９０歳、さらにより好ましくは６０〜９０歳、さらにより好ましくは７０〜９０歳である。一部の実施形態では、対象は、「患者」、すなわち医療の受診を待機している対象、または医療を受診している対象、または過去／現在／将来に本発明に係る医学的または診断上の手法の対象となった／なる／なるであろう対象、または疾患の発達に関してモニタリングされている対象であり得る。
【００５８】
詳細な説明
本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断する手段としての、上記対象由来のサンプルに対するライブラリーの選択の前後における、少なくとも１個体の既知の予後の参照対象由来の少なくとも１つのサンプルに対して選択したライブラリーにおけるアプタマーの相対的な頻度の変化の使用に関する。
【００５９】
また本発明は、対象の病状、疾患、または病態を診断するための方法に関する。
【００６０】
また本発明は、対象において病状、疾患、または病態が発症する可能性を割り当てるための方法に関する。
【００６１】
また本発明は、対象の病状、疾患、または病態を重症度のレベルを診断するための方法に関する。
【００６２】
また本発明は、対象の病状、疾患、または病態の進行の速度を決定するための方法に関する。
【００６３】
また本発明は、病状、疾患、または病態を罹患した対象を階層化するための方法に関する。
【００６４】
また本発明は、病状、疾患、または病態を罹患した対象における治療の有効性を評価するための方法に関する。
【００６５】
一実施形態では、本発明の使用または方法は、
選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
選択したアプタマーのライブラリーを、病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも１個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと、対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも１個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定した、ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と、前記病状、疾患、または病態との間で決定された相関に基づき、診断を提供するステップと
を含む。
【００６６】
一実施形態では、本発明の使用または方法は、
参照対象由来の体組織または体液に対して選択および任意選択でカウンターセレクションしたアプタマー配列の集合を含む、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
選択したアプタマーのライブラリーを、病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも１個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと前記対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも１個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、前記選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと前記対象に特異的なアプタマーライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、診断を提供するステップと
を含む。
【００６７】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、
選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも２個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも２個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された、前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、診断を提供するステップと
を含む。
【００６８】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、
参照対象由来の体組織または体液に対して選択および任意選択でカウンターセレクションしたアプタマー配列の集合を含む、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する少なくとも２個体の対象由来の生体サンプルと接触させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーから、前記生体サンプルに結合するアプタマーを選択することにより、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップと、
前記少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーの間の相対的な頻度の変化を決定するステップと、
前記少なくとも２個体の対象の病状、疾患、または病態に対して、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー間の相対的な頻度の変化を相関させるステップと、
前記選択したアプタマーのライブラリーを、前記病状、疾患、または病態が知られていない対象に適用することにより、前のステップで決定された、前記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と前記病状、疾患、または病態との間の相関に基づき、診断を提供するステップと
を含む。
【００６９】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、病態のレベルが知られていない個体（本明細書中以下で「診断対象（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」と呼ばれている）由来のサンプルで、以下を特徴づけるために行われる：
ａ）患者が病態を罹患しているか？
ｂ）ａ）に対する回答がはいの場合、患者が呈している病態の作用のレベルは何か？
ｃ）ａ）に対する回答がはいの場合、この患者由来のサンプルを、通常の時間間隔で処理して、関連するアプタマーの頻度の変化の割合を決定する。この情報は、個体の病態の罹患の度合いの増大の速度（ｒａｔｅ）を予測するために、使用できる。
【００７０】
これらのステップは、バイオマーカーとしてのアプタマーセットの使用のためのフレームワークを作製するための基盤を提供する。
【００７１】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを準備するステップを含む。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、市販の選択したアプタマーのライブラリーである。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、最初から（ａｂ  ｉｎｉｔｉｏで）調製される。
【００７２】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、アプタマー選択のプロセスを介して、入手または調製された。
【００７３】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、アプタマー選択後に、配列のライブラリーに含まれる配列の少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％を、含む。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、アプタマー選択後に少なくとも１０００００の配列、少なくとも２５００００の配列、少なくとも５０００００の配列、少なくとも７５００００の配列、少なくとも１００００００の配列、少なくとも１２５００００の配列、少なくとも１５０００００の配列、少なくとも１７５００００の配列、少なくとも２００００００の配列のライブラリーに含まれる配列の少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％を、含む。好ましい実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、アプタマー選択後に、１００万の配列のライブラリーに含まれる配列の少なくとも０．０１％を含む。
【００７４】
本明細書中使用される場合、「選択したアプタマーのライブラリー」は、少なくとも１つのエピトープに特異的なアプタマー配列のライブラリーを表す。
【００７５】
一実施形態では、少なくとも１つのエピトープは、病態のエピトープである。用語「病態のエピトープ」は、調査下の病状、疾患、または病態の特徴であるエピトープを表す。
【００７６】
本発明において、様々な病状、疾患、または病態を、本明細書中記載の使用および方法のいずれか１つを使用して調査できることが企図されている。よって、用語「調査下の病状、疾患、または病態」は、診断が所定の対象で決定される、所定の病状、疾患、または病態を表すように本明細書中で使用される。
【００７７】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、またはそれ以上のエピトープ、好ましくは病態のエピトープに特異的なアプタマー配列を含む。
【００７８】
一実施形態では、病状、疾患、または病態は、限定するものではないが、神経変性疾患、神経性疾患、癌、自己免疫疾患、心血管疾患、感染症、炎症性疾患、および代謝性疾患を含む。
【００７９】
神経変性疾患の例として、限定するものではないが、アルツハイマー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、記憶機能不全、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（家族性ＡＬＳおよび孤発性ＡＬＳを含む）、ピック病、認知症、抑うつ状態、睡眠障害、精神障害、てんかん、統合失調症、妄想性障害、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、健忘症候群、進行性核上性麻痺、脳腫瘍、頭部外傷、およびライム病が挙げられる。
【００８０】
好ましい実施形態では、病状、疾患、または病態は、アルツハイマー病である。
【００８１】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、ａｂ  ｉｎｉｔｉｏで調製される。
【００８２】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対するオリゴヌクレオチド配列のランダムなセットの反復する選択により、調製される。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対するオリゴヌクレオチド配列のランダムなセットの反復するカウンターセレクションにより、調製される。
【００８３】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対するオリゴヌクレオチド配列のランダムなセットの反復する選択および反復するカウンターセレクションを交互に行うことにより、調製される。
【００８４】
一実施形態では、反復する選択は、少なくとも１回のラウンド、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回、またはそれ以上のラウンドの、少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対する選択を含む。一実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回、またはそれ以上のラウンドの選択は、異なる参照対象由来の体組織または体液に対して、行われる。一実施形態では、各ラウンドの選択は、別の参照対象由来の体組織または体液に対して、行われる。
【００８５】
一実施形態では、反復するカウンターセレクションは、少なくとも１回のラウンド、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回、またはそれ以上のラウンドの、少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対するカウンターセレクションを含む。一実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回、またはそれ以上のラウンドのカウンターセレクションは、異なる参照対象由来の体組織または体液に対して行われる。一実施形態では、各ラウンドのカウンターセレクションは、別の参照対象由来の体組織または体液に対して行われる。
【００８６】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーの調製は、少なくとも１個体の参照対象由来の体組織または体液に対する反復する選択および反復するカウンターセレクションを交互に行う、少なくとも１回のラウンド、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回、またはそれ以上のラウンドを含む。一実施形態では、反復する選択および反復するカウンターセレクションを交互に行う、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回、またはそれ以上のラウンドは、異なる参照対象由来の体組織または体液に対して行われる。一実施形態では、反復する選択および反復するカウンターセレクションを交互に行う各ラウンドは、別の参照対象由来の体組織または体液に対して行われる。
【００８７】
体組織の例として、限定するものではないが、脳、心臓、肺、筋肉、腸、胃、腎臓、皮膚、生殖腺、神経細胞、角膜、網膜、および他の眼の構造、腱、骨、骨髄、爪をベースとする細胞、軟骨、非胎児性の妊婦関連の組織、たとえば、胎盤、臍帯血、包皮、内腔の表面、血管組織、膵臓、脾臓、副腎、甲状腺、ならびに下垂体が挙げられる。一実施形態では、体組織は、生検のサンプルである。
【００８８】
体液の例として、限定するものではないが、血液、血漿、血清、粘液、唾液、尿、汗、乳、リンパ液、脳脊髄液、腹水、心膜液、胸膜液（ｐｌｅｕｒａ  ｆｌｕｉｄ）、滑液、経血、精液、および膣の体液が挙げられる。
【００８９】
好ましい実施形態では、体組織または体液は血液である。好ましい実施形態では、体組織または体液は脳である。好ましい実施形態では、体組織または体液は脳の生検サンプルである。
【００９０】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、１〜１０１１個のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、６５〜１００ヌクレオチド長、好ましくは６６〜９９ヌクレオチド長、６７〜９８ヌクレオチド長、６８〜９７ヌクレオチド長、６９〜９６ヌクレオチド長、７０〜９５ヌクレオチド長、７１〜９４ヌクレオチド長、７２〜９３ヌクレオチド長、７３〜９２ヌクレオチド長、７４〜９１ヌクレオチド長、７５〜９０ヌクレオチド長、７６〜８９ヌクレオチド長、７７〜８８ヌクレオチド長、７８〜８７ヌクレオチド長、７９〜８６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、５’から３’への方向に、
５’末端に既知のプライマー認識配列領域と、
ランダムな領域と、
３’末端に既知のプライマー認識配列領域と
を含む、オリゴヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
一実施形態では、ランダムな領域は、２０〜６０ヌクレオチド長、好ましくは２２〜５８、２４〜５６、２６〜５４、２８〜５２、３０〜５０、３２〜４８、３４〜４６、３６〜４４、３８〜４２ヌクレオチド長の配列を含む。一実施形態では、ランダムな領域は、４０ヌクレオチド長の配列を含む。
【００９４】
一実施形態では、既知のプライマー認識配列領域は、１０〜３５ヌクレオチド長、好ましくは１２〜３３、１４〜３１、１６〜２９、１８〜２７、２０〜２５ヌクレオチド長の配列を含む。一実施形態では、ランダムな領域は、２３ヌクレオチド長の配列を含む。
【００９５】
一実施形態では、既知のプライマー認識配列領域は、配列番号４７および４８を含む配列から選択される。
配列番号４７：ＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴ
配列番号４８：ＧＡＣＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ
【００９６】
オリゴヌクレオチド配列の例を、配列番号１として提供する：
５’ＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴ（Ｎ４０）ＧＡＣＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号１）
（式中、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはいずれかの修飾されたヌクレオチドであり得、好ましくは、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧであり得る）。
【００９７】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーの各オリゴヌクレオチドの頻度は、約１〜約１，０００，０００の範囲にある。
【００９８】
一実施形態では、体組織または体液は、以前に参照対象から採取されたものであり、すなわち、本発明の使用および方法は、参照対象から上記体組織または体液を回収するステップを含まない。結果として、この実施形態では、本発明の使用および方法は、非侵襲的な使用および方法、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用および方法である。
【００９９】
本明細書中使用される場合、用語「参照対象」は、調査下の病状、疾患、または病態に関して既知の予後を有する対象、すなわち、限定するものではないが、鑑別診断、パターン認識、診断基準、臨床意思決定支援システム（ＣＤＳＳ）、医学的アルゴリズム、診断の精密検査、検知ピル（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｉｌｌ）、ＯＣＴ（光干渉断層撮影）、ならびに本発明のいずれかの使用および方法を含む医学的な診断による調査の下、過去／現在に、病状、疾患、または病態と診断された／される対象を表す。
【０１００】
一実施形態では、参照対象は、哺乳類、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。一実施形態では、参照対象は男性である。一実施形態では、参照対象は女性である。一実施形態では、参照対象は、２０歳超、好ましくは３０歳超、４０歳超、５０歳超、６０歳超、７０歳超、８０歳超、９０歳超、またはそれ以上の年齢である。一実施形態では、参照対象は、３０〜９０歳、好ましくは４０〜９０歳、より好ましくは５０〜９０歳、さらにより好ましくは６０〜９０歳、さらにより好ましくは７０〜９０歳である。
【０１０１】
一実施形態では、体組織または体液は、実質的に健常な参照対象から提供される。本明細書中使用される場合、「実質的に健常な」は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断されなかった／されていない対象を表す。一実施形態では、体組織または体液は、過去／現在、調査下の病状、疾患、または病態と診断された／される参照対象から、提供される。
【０１０２】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、いくつかの参照対象由来の体組織または体液のプールに対するオリゴヌクレオチド配列のランダムなセットの反復する選択により、調製される。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、いくつかの参照対象由来の体組織または体液のプールに対するオリゴヌクレオチド配列のランダムなセットの反復するカウンターセレクションにより、調製される。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、いくつかの参照対象由来の体組織または体液のプールに対するオリゴヌクレオチド配列のランダムなセットの反復する選択および反復するカウンターセレクションを交互に行うことにより、調製される。
【０１０３】
本明細書中使用される場合、用語「体組織または体液のプール」は、少なくとも２、好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、またはそれ以上の参照対象から提供される体組織または体液の混合物を含むサンプルを表す。一実施形態では、体組織または体液のプールは、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、またはそれ以上の参照対象から提供される、事実上類似または同一の組織または体液を含む。一実施形態では、体組織または体液のプールは、実質的に健常な参照対象から提供される。一実施形態では、体組織または体液のプールは、過去／現在、調査下の病状、疾患、または病態と診断された／される対象から提供される。
【０１０４】
好ましい実施形態では、体組織または体液のプールは、全てが同じ病状、疾患、または病態を罹患したいくつかの個体由来の、同じ種類の生体サンプルを含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、調査下の病状、疾患、または病態を罹患したいくつかの個体由来の、同じ種類の体組織または体液のプールに対する反復する選択により、調製される。
【０１０６】
好ましい実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、調査下の病状、疾患、または病態を罹患していないいくつかの個体由来の、同じ種類の体組織または体液のプールに対する反復する選択により、調製される。
【０１０７】
選択は、生体サンプル（すなわちそのプールの体組織または体液）に結合するオリゴヌクレオチド配列の保持を表し、カウンターセレクションは、生体サンプル（すなわちそのプールの体組織または体液）に結合しないオリゴヌクレオチド配列の保持を表すことは、当該分野でよく知られている。
【０１０８】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、少なくとも１ケ月、少なくとも３ケ月、少なくとも６ケ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年、好ましくは無期限に、維持される。
【０１０９】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、ＰＣＲ増幅を介して維持される。
【０１１０】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、診断的選択（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を用いずに維持される。
【０１１１】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、当該分野で知られている技術を使用した化学合成により、維持される。
【０１１２】
一実施形態では、アプタマー配列のサブセットは、選択したアプタマーのライブラリーの中で同定することができ、合成することができる。本明細書中使用される場合、このようなアプタマー配列は、「ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ」と称される。一実施形態では、ＡｐｔａＭａｒｋｅｒを組み合わせて、「シミュレートされた選択アプタマーのライブラリー（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｐｔａｍｅｒ  ｌｉｂｒａｒｙ）」を形成することができ、ここでのシミュレートされた選択アプタマーのライブラリーは、既知のＡｐｔａＭａｒｋｅｒを既知の相対的な頻度で含む。
【０１１３】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを解析するさらなるステップを含む。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーを解析するステップは、各アプタマー配列の性質、量、および／または相対的な頻度を決定するステップを含む。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーを解析するステップは、上記ライブラリーを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ｑＰＣＲ、アンチセンス配列のハイブリダイゼーションまたは定量的リガーゼ連鎖反応（ｑＬＣＲ）に供するステップを含む。
【０１１４】
好ましい実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、ＮＧＳ解析に供される。選択したアプタマーのライブラリーから、ＮＧＳ解析により捕捉された各配列のコピー数が、決定される。
【０１１５】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列のコピー数が、決定される。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列の相対的なコピー数が、決定される。一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列の相対的なコピー数は、上記ライブラリーで観察されるアプタマー配列の総数で上記コピー数を除算することにより、決定される。
【０１１６】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列の相対的な頻度は、上記アプタマーのライブラリーで観察される配列の総数で観察される各アプタマー配列の数を除算することにより、決定される。
【０１１７】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを、少なくとも１個体の対象由来の生体サンプルと接触させるさらなるステップを含む。一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを、少なくとも２個体の対象由来の生体サンプルと接触させるさらなるステップを含む。一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の対象に由来する生体サンプルと接触させるさらなるステップを含む。
【０１１８】
一実施形態では、対象は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断された／されている。一実施形態では、対象は、調査下の病状、疾患、または病態を発症するリスクがある。一実施形態では、対象は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断されていなかった／いない。一実施形態では、少なくとも２個体以上の対象が、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断された／されている。一実施形態では、少なくとも２個体以上の対象は、調査下の病状、疾患、または病態を発症するリスクがある。一実施形態では、少なくとも２個体以上の対象は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断されていなかった／されていない。一実施形態では、少なくとも２個体以上の対象は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断された／されている少なくとも１個体の対象と、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断されていなかった／いない少なくとも１個体の対象とを含む。一実施形態では、少なくとも２個体以上の対象が、過去／現在に調査下の病状、疾患、または病態と診断されており、異なるステージまたはフェーズの、調査下の病状、疾患、または病態を呈する。
【０１１９】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを、「診断対象（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」由来の生体サンプルと接触させるさらなるステップを含む。用語「診断対象」は、本明細書中使用される場合、病状、疾患、または病態に関して調査されている対象を表す。
【０１２０】
一実施形態では、対象は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断された／されている。一実施形態では、対象は、調査下の病状、疾患、または病態を発症するリスクがある。一実施形態では、対象は、過去／現在に、調査下の病状、疾患、または病態と診断されなかった／されない。好ましくは、本明細書中使用される場合、「診断対象」は、調査下の病状、疾患、または病態を発症するリスクがあり、かつ／または、調査下の病状、疾患、または病態と診断されなかった／されていない。
【０１２１】
一実施形態では、対象または診断対象は、哺乳類、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。一実施形態では、対象または診断対象は男性である。一実施形態では、対象または診断対象は女性である。一実施形態では、対象または診断対象は、２０歳超、好ましくは、３０歳超、４０歳超、５０歳超、６０歳超、７０歳超、８０歳超、９０歳超、またはそれ以上の年齢である。一実施形態では、対象または診断対象は、３０〜９０歳、好ましくは４０〜９０歳、より好ましくは５０〜９０歳、さらにより好ましくは６０〜９０歳、さらにより好ましくは７０〜９０歳である。
【０１２２】
一実施形態では、病状、疾患、または病態は、限定するものではないが、神経変性疾患、神経性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、感染症、炎症性疾患、および代謝性疾患を含む。
【０１２３】
神経変性疾患の例として、限定するものではないが、限定するものではないが、アルツハイマー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、記憶機能不全、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（家族性ＡＬＳおよび孤発性ＡＬＳを含む）、ピック病、認知症、抑うつ状態、睡眠障害、精神障害、てんかん、統合失調症、妄想性障害、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、健忘症候群、進行性核上性麻痺、脳腫瘍、頭部外傷、およびライム病が挙げられる。
【０１２４】
好ましい実施形態では、病状、疾患、または病態は、アルツハイマー病である。
【０１２５】
一実施形態では、対象または診断対象は、病状、疾患、または病態に関する投薬を受けていない。一実施形態では、対象または診断対象は、アルツハイマー病に関する投薬を受けていない。
【０１２６】
一実施形態では、対象または診断対象は、病状、疾患、または病態に関する投薬を受けている。一実施形態では、対象または診断対象は、アルツハイマー病に関する投薬を受けている。
【０１２７】
アルツハイマー病の投薬の例として、限定するものではないが、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＮＭＤＡ型受容体の拮抗薬および抗体が、挙げられる。
【０１２８】
アセチルコリンエステラーゼ阻害薬の例として、限定するものではないが、ドネペジル（アリセプト（登録商標）、Ｎａｍｚａｒｉｃ（登録商標））、リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標））、ガランタミン（ラザダイン（登録商標））、フペルジンＡ、およびタクリン（Ｃｏｇｎｅｘ（登録商標））が挙げられる。
【０１２９】
ＮＭＤＡ型受容体の拮抗薬の例として、限定するものではないが、メマンチン（Ａｘｕｒａ（登録商標）、Ｅｂｉｘａ（登録商標）、Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標）、Ｎａｍｚａｒｉｃ（登録商標））が挙げられる。
【０１３０】
抗体の例として、限定するものではないが、Ａβに対するモノクローナル抗体（たとえばアデュカヌマブ、バピネオズマブ、クレネズマブ、ガンテネルマブ、ポネズマブ、ソラネズマブなど）、および免疫グロブリン療法（たとえばガンマガード（登録商標）、Ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ（登録商標）など）が、挙げられる。
【０１３１】
一実施形態では、アルツハイマー病の投薬は、国家または地方の医薬機関が承認した投薬、すなわち、食品医薬品局（ＦＤＡ−米国）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ−ＥＵ）、医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ−日本）、中華人民共和国国家食品薬品監督管理局（ＣＦＤＡ−中国）、および食品医薬品安全処（ＭＦＤＳ−韓国）からなる群から選択される国立または地域の医薬機関により承認された投薬である。
【０１３２】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーは、サブサンプルに分けられる。一実施形態では、それぞれの選択したアプタマーのライブラリーのサブサンプルは、選択したアプタマーのライブラリーを調製する際の最初の選択に使用される参照対象由来のものよりは、同じ種類の生体サンプル（すなわち診断対象由来の体組織または体液）と、接触させる。言い換えると、それぞれの選択したアプタマーのライブラリーのサブサンプルは、個体の対象由来の生体サンプルと、接触させる。すなわち、選択したアプタマーのライブラリーは、選択プロセスにおいて、いくつかの異なる個体の生体サンプル（すなわち体組織または体液）に適用される。この方法でサンプリングされる個体の数は、限定されていない。
【０１３３】
一実施形態では、生体サンプル（すなわち診断対象由来の体組織または体液）は、患者のサンプルが受領されると、継続的、経時的に処理される。
【０１３４】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、少なくとも１つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップをさらに含む。一実施形態では、本発明の使用および方法は、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップをさらに含む。一実施形態では、本発明の使用および方法は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップをさらに含む。
【０１３５】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを入手するステップは、選択したアプタマーのライブラリーから、対象または診断対象の生体サンプルに結合するアプタマーを選択するステップを含む。
【０１３６】
本明細書中使用される場合、このような選択に由来するアプタマーのライブラリーは、「対象に特異的なアプタマーのライブラリー」、または「患者に特異的なアプタマーのライブラリー」と称され、この選択は、「診断的選択」と称される。
【０１３７】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、またはそれ以上のエピトープ、好ましくは病態のエピトープに特異的なアプタマー配列を含む。
【０１３８】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、対象または診断対象由来の体組織または体液に対する、本明細書中上述されるように選択したアプタマーのライブラリーのオリゴヌクレオチド配列の選択により、入手される。一実施形態では、診断的選択は、単一のラウンドの、対象または診断対象由来の体組織または体液に対する選択を含む。
【０１３９】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、対象または診断対象由来の体組織または体液に対する、本明細書中上述されるように選択したアプタマーのライブラリーのオリゴヌクレオチド配列の反復する選択により、入手される。一実施形態では、反復する診断的選択は、少なくとも１回のラウンド、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０回のラウンド、またはそれ以上の、対象または診断対象由来の体組織または体液に対する選択を含む。
【０１４０】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、１〜１０１１個のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１４１】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、６５〜１００ヌクレオチド長、好ましくは６６〜９９ヌクレオチド長、６７〜９８ヌクレオチド長、６８〜９７ヌクレオチド長、６９〜９６ヌクレオチド長、７０〜９５ヌクレオチド長、７１〜９４ヌクレオチド長、７２〜９３ヌクレオチド長、７３〜９２ヌクレオチド長、７４〜９１ヌクレオチド長、７５〜９０ヌクレオチド長、７６〜８９ヌクレオチド長、７７〜８８ヌクレオチド長、７８〜８７ヌクレオチド長、７９〜８６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１４２】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、５’から３’へ、
５’末端の既知のプライマー認識配列領域と、
ランダムな領域と、
３’末端の既知のプライマー認識配列領域と
を含む。
【０１４３】
一実施形態では、ランダムな領域は、２０〜６０ヌクレオチド長、好ましくは２２〜５８、２４〜５６、２６〜５４、２８〜５２、３０〜５０、３２〜４８、３４〜４６、３６〜４４、３８〜４２ヌクレオチド長の配列を含む。一実施形態では、ランダムな領域は、４０ヌクレオチド長の配列を含む。
【０１４４】
一実施形態では、既知のプライマー認識配列領域は、１０〜３５ヌクレオチド長、好ましくは１２〜３３、１４〜３１、１６〜２９、１８〜２７、２０〜２５ヌクレオチド長の配列を含む。一実施形態では、ランダムな領域は、２３ヌクレオチド長の配列を含む。
【０１４５】
一実施形態では、既知のプライマー認識配列領域は、配列番号４７および４８を有する配列から選択される。
配列番号４７：ＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴ
配列番号４８：ＧＡＣＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ
【０１４６】
オリゴヌクレオチド配列の例を、配列番号１として提供する：
５’ＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴ（Ｎ４０）ＧＡＣＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ−３’
（配列番号１）
（式中、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、または修飾されたヌクレオチドであり得、好ましくは、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧであり得る）。
【０１４７】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーにおける各オリゴヌクレオチド配列の頻度は、約１〜約１，０００，０００の範囲にある。
【０１４８】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを解析するさらなるステップを含む。一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを解析するステップは、各アプタマー配列の性質、量、および／または相対的な頻度を決定するステップを含む。一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーを解析するステップは、上記ライブラリーを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ｑＰＣＲ、アンチセンス配列ハイブリダイゼーション、または定量的リガーゼ連鎖反応（ｑＬＣＲ）に供するステップを含む。
【０１４９】
好ましい実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーは、ＮＧＳ解析に供される。対象に特異的なアプタマーのライブラリーから、ＮＧＳ解析により捕捉された各配列のコピー数が、決定される。
【０１５０】
実際に、選択したアプタマーのライブラリーは、対象または診断対象由来の個体の生体サンプル（すなわち体組織または体液）における診断的選択に、適用される。次に、対象に特異的なアプタマーのライブラリーはＮＧＳ解析に供され、ライブラリーの中のアプタマー配列の相対的な頻度が決定される。一実施形態では、診断上のアプタマーの相対的な頻度が、定量的ＰＣＲ解析、アンチセンス配列に対するハイブリダイゼーション、または定量的ＬＣＲ解析などの、ＮＧＳ解析以外の方法を介して、決定され得る。
【０１５１】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列のコピー数が、決定される。一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマーの相対的なコピー数が、決定される。一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマーの相対的なコピー数は、上記コピー数を、上記ライブラリーで観察されるアプタマー配列の総数で除算することにより決定される。一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列の相対的な頻度は、観察される所定のアプタマーのコピー数を、当該ライブラリーで観察されるアプタマーの総数で除算することにより決定される。
【０１５２】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を決定するステップをさらに含む。
【０１５３】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマー間の相対的な頻度の変化を決定するステップをさらに含む。
【０１５４】
ライブラリーにおけるアプタマーの相対的な頻度は、アプタマーの全体の系に関する選択プロセスの関数である。よって、アプタマーの相対的な頻度の変化は、アプタマー自身よりはむしろ、ライブラリー全体に関する選択の関数である。
【０１５５】
選択したアプタマーのライブラリーは、シーケンシング解析で観察されなかった配列を含み得ること、およびライブラリーにおけるこれら配列の存在は、いずれかの所定の対象に特異的なアプタマーのライブラリーにおけるいずれかのアプタマーの頻度の変化に関連することが、理解される。また本発明は、既知であり特徴づけられたアプタマーのみが既知の比率で組み合わさった、選択したアプタマーのライブラリーのサブセットにより有効となり得ることが、企図される。
【０１５６】
一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー配列の相対的な頻度を、選択したアプタマーのライブラリーにおけるアプタマー配列の相対的な頻度と比較することにより、アプタマーの相対的な頻度の変化を決定する。一実施形態では、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー配列の相対的な頻度を、少なくとも１個体の他の、少なくとも２個体の他の、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上の他の対象に特異的なアプタマーのライブラリーにおけるアプタマー配列の相対的な頻度と比較することにより、アプタマーの相対的な頻度の変化を決定する。一実施形態では、アプタマーの頻度の変化は、バイオマーカーの測定である。
【０１５７】
一実施形態では、選択したアプタマーのライブラリーおよび対象に特異的なアプタマーのライブラリーの両方において観察されるそれぞれのアプタマー配列に関するアプタマーの相対的な頻度の変化は、それぞれの対象に特異的なアプタマーのライブラリーのアプタマーの相対的な頻度を、選択したアプタマーのライブラリーにおける同じアプタマーの相対的な頻度で除算することにより決定される。一実施形態では、少なくとも２つの対象に特異的なアプタマーのライブラリーで観察される各アプタマー配列に関するアプタマーの相対的な頻度の変化は、対象に特異的なアプタマーのライブラリーのアプタマーの相対的な頻度を、別の対象に特異的なアプタマーのライブラリーにおける同アプタマーの相対的な頻度で除算することにより決定される。
【０１５８】
一実施形態では、相対的な頻度の比較は、共分散の特徴付けを含む。
【０１５９】
共分散を特徴付けるための多くの方法が、当該分野で知られている。このような方法の例、たとえば相関分析が、本出願の実施例に提供されている。
【０１６０】
よって、一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリー由来のアプタマーと対象に特異的なアプタマーのライブラリー由来のアプタマーとの間の相対的な頻度の変化を、少なくとも１個体の対象の病状、疾患、または病態に対して相関させるステップを含む。一実施形態では、本発明の使用および方法は、対象に特異的なアプタマーのライブラリーの中のアプタマー間の相対的な頻度の変化を、少なくとも２個体の対象の病状、疾患、または病状に対して相関させるステップを含む。
【０１６１】
一実施形態では、アプタマーの相対的な頻度の共分散の分析は、参照対象および診断対象を通してどのアプタマーが共変するか、および参照対象および診断対象を通してどのアプタマーが共変しないかを決定するために、使用される。別の実施形態では、アプタマーの相対的な頻度の共分散の分析は、既知の予後の対象および診断対象を通してどのアプタマーが共変するか、および既知の予後の対象および診断対象を通してどのアプタマーが共変しないかを決定するために、使用される。共変するアプタマーが同じ疾患単位（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）に結合していること、および共変しないアプタマーが同じ疾患単位に結合していないことは、合理的な想定である。
【０１６２】
一実施形態では、アプタマー間の相対的な頻度の変化の共分散は、複数の対象に特異的なアプタマーのライブラリー間の標準的な共分散分析を介して、評価される。
【０１６３】
一実施形態では、アプタマーは、共分散分析に基づき、それぞれと比較してクラスタリングされる。
【０１６４】
一実施形態では、各アプタマーのクラスター由来の代表的なアプタマーは、既知の予後の対象間の差異を特徴づけるために、使用される。
【０１６５】
一実施形態では、相対的な頻度の比較は、疾患、好ましくは進行したステージの疾患を罹患していることが知られている患者由来のサンプルと、この病態を罹患していない個体由来のサンプルとの間で、行われる。この情報は、どのアプタマーが診断上の関連性を有するかを定義するために使用される。これらアプタマーは、「ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ」と称される。
【０１６６】
一実施形態では、共変したアプタマーのクラスターの視覚化を可能にするための距離行列を、当該相関値から導出する。
【０１６７】
病態に罹患していない個体由来の生体サンプル（すなわち実質的に健常な参照対象由来の体組織または体液の生体サンプル）を含める場合、病態を罹患した個体と病態を罹患していない個体との間に一貫性のある区分け（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を提供する、病態のアプタマーのクラスターを同定することが可能である。アプタマーの頻度の変化の解析は、病状が知られていない診断対象由来の生体サンプルの、同一の解析を介した当該病態の診断に関する基盤を提供する。
【０１６８】
さらに、特定の疾患単位は、病態を罹患した全ての個体によって共有されない場合があることが例証されている。このような疾患単位の相対的な存在量は、複数の個体について、個体間の疾患単位を定義するアプタマーのクラスターの共分散を分析することにより、特徴づけることができる。
【０１６９】
疾患単位の相対的な存在量のバリエーションの特徴づけは、そのような疾患単位の正体を決定する際に有用であり得る。
【０１７０】
一実施形態では、本発明の使用および方法は、選択したアプタマーのライブラリーを、病状、疾患、または病態が知られていない対象（本明細書中「診断対象」と呼ばれる）に適用することにより、上記ライブラリーの中のアプタマーの相対的な変化と、上記病状、疾患、または病態との間で決定される相関に基づく診断を提供するステップをさらに含む。
【０１７１】
これらのバイオマーカーのさらなる使用は、診断のための、他の対象由来の生体サンプルに対する選択したアプタマーのライブラリーのその後の適用を含む。本発明の一実施形態は、選択したアプタマーのライブラリーにおいて最も高頻度な配列を合成すること、および上記選択したアプタマーのライブラリーで観察されたものと同等のモル比でそれらを混合することである。これは、選択したライブラリーを単純化し、それを無期限に維持する手段として作用する。
【０１７２】
本発明の別の実施形態は、診断のための、他の対象由来の生体サンプルに対する選択したアプタマーのライブラリーのその後の適用を含む。本発明の一実施形態は、それらの相対的な頻度のバリエーションが、病状が特徴づけられた複数の対象間（ａｍｏｕｎｔ）の病状のバリエーションと相関しているかまたは当該バリエーションに特徴的であることが示されているアプタマーを合成することである。このようなアプタマーのサブセットは、上記の選択したアプタマーのライブラリーで観察されたものと同等のモル比で混合することができる。これは、選択したライブラリーを単純化し、それを無期限に維持する手段として、および分析を単純化する手段として作用する。
【０１７３】
選択したライブラリー由来のアプタマーのサブセットの使用を含む本発明の実施形態は、当該サブセットの中のアプタマーの等モル混合物に限定されず、他のサブセットを調節する手段が実現可能であるが、いずれの調製の手段も、診断ツールとして使用する前に、バリデーションを必要とする。
【０１７４】
本発明の別の実施形態は、捕捉した配列の総数、または解析のためライブラリーを増幅するために必要なＰＣＲ反応の回数、もしくはアプタマーのサブセットの相対的な頻度に関連したライブラリーにおける配列の相対的な頻度の正規化、またはこれら正規化方法のいくつかの組み合わせを含む。この実施形態の意図は、アプタマーの相対的な頻度の推定値に対するＮＧＳ解析の影響に関して補正することにより、解析の誤差を低減することである。
【０１７５】
限定するものではないが、主成分分析法、ｋ平均法（ｋ−ｃｌｕｓｔｒｉｎｇ）、ピアソン相関、またはＷａｒｄ．Ｄ２クラスタリングを含む多くの種類の統計解析を使用して、クラスタリングの度合いまたはアプタマーの関連性のレベルを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、健常な脳組織に対するカウンターセレクションを用いた、アルツハイマー病を罹患した患者の脳組織に対する選択ラウンド＃１６（「選択したライブラリー」）におけるアプタマーのコピー数の分布を示すグラフである。ｙ軸は、選択ラウンド＃１６の中の各配列の観察されたコピー数を表す。ｘ軸は、各観察されたコピー数を観察した頻度を表す。
【図２】図２は、アルツハイマー病を有する５名の個体由来の７つの脳組織のサンプルおよび２つの健常な脳組織のサンプルに対する、４０８のアプタマーの共分散分析を示す放射状の近接結合法による樹形図である。この画像の表現において個々の標識を識別することは困難であるが、これは、配列のクラスターの一般的な性質程重要ではない。
【図３】図３は、脳組織のサンプル間における、正規化されたアプタマーの頻度の変化を示すヒストグラムである。この解析に選択したアプタマーは、キャプションに列挙されている。「Ｈ  ａｖｇ」は、健常なサンプルの平均である。
【図４】図４は、アルツハイマー病を罹患した患者の間の、全体的な関係を示す系統樹である。
【図５】図５は、アルツハイマー病の脳組織の解析のためクラスターＡと指定されたアプタマーのセットに関する、選択ラウンドと「患者に特異的なライブラリー」との間の頻度の正規化した変化を示すヒストグラムである。この解析で使用したアプタマーは、キャプションに列挙されている。「Ｈ  ａｖｇ」は、健常なサンプルの平均値を表す。
【図６】図６は、クラスターＡにより記載された病原性のエピトープの相対的な存在量に関して、アルツハイマー病を罹患した複数の個体由来の脳組織サンプル間の距離を表す系統樹である。
【図７】図７は、クラスターＢと指定されたアプタマーのセットに関する、選択ラウンドと「患者に特異的なライブラリー」との間の頻度の正規化した変化を示すヒストグラムである。この解析で使用したアプタマーは、キャプションに列挙されている。「Ｈ  ａｖｇ」は、健常なサンプルの平均値を表す。
【図８】図８は、クラスターＢにより記載された病原性のエピトープの相対的な存在量に関して、アルツハイマー病を罹患した複数の個体由来の脳組織サンプル間の距離を表す系統樹である。
【図９】図９は、アルツハイマー病を罹患した患者のサンプル間の血清由来のアプタマーのクラスタリングを表す系統樹である。
【図１０】図１０は、アルツハイマー病を罹患した患者に関する、血清の「患者に特異的なライブラリー」から選択したコアとなる１６のＡｐｔａＭａｒｋｅｒの間の関係を表す系統樹である。
【図１１】図１１は、アルツハイマー病に関する１６の血清のＡｐｔａＭａｒｋｅｒに関して、「患者に特異的なアプタマーのライブラリー」と健常なサンプルとの間の相対的な頻度の変化の比較を示すヒストグラムである。
【図１２】図１２は、アルツハイマー病に関する５つの血清のＡｐｔａＭａｒｋｅｒに関する、各患者と健常なサンプルとの間の相対的な頻度の変化の差に基づき展開させたアルツハイマー病のスコアと、各患者の臨床評価との間の比較を示すヒストグラムである。
【図１３】図１３は、同じ対象（Ａｃｈ  １）に関する２度の反復した解析の間の１０，０００個のアプタマーの相対的な頻度を示す散布図である。ｘ軸は、第１のレプリケートの解析における１０，０００個のアプタマーの相対的な頻度を表し、ｙ軸は、第２のレプリケートの解析における１０，０００個のアプタマーの相対的な頻度を表す。
【図１４】図１４は、上位１００個のアプタマーの相対的な頻度の再現性を示す散布図である。この図は、１００の最も存在量が多いアプタマーの相対的な頻度の観点からの、各サンプルで捕捉した配列の最も少ない数（ｙ軸）対複数のレプリケートを通してサンプルで得られた回帰係数（ｘ軸）の比較を提供する。
【図１５】図１５は、アプタマーの頻度の相対的な変化対エピトープの濃度の変化を示すヒストグラムである。
【図１６】図１６は、血清におけるＡｐｔａｍａｒｋｅｒベースの後期アルツハイマー病（ＡＤ）の診断の反復した解析（Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２）を示すヒストグラムである。
【図１７】図１７は、アルツハイマー病を診断するために一般に使用される認知試験ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）と比較した、ＡｐｔａＭａｒｋｅｒスコアの関連性を示す散布図である。
【図１８】図１８は、ＡｐｔａＭａｒｋｅｒスコアに基づく、実質的に健常な対象とアルツハイマー病患者との間の全般的な差異を示す箱ひげ図である。
【図１９】図１９は、無作為化したＡＩＢＬサンプルの、血清におけるＡｐｔａｍａｒｋｅｒベースの後期アルツハイマー病（ＡＤ）の診断の反復した解析（Ｒｅｐ  １およびＲｅｐ２）を示すヒストグラムである。
【図２０】図２０は、（Ａ）図１６および（Ｂ）図１９の２つのレプリケートの平均値（ｍｅａｎｓ  ｖａｌｕｅｓ）を示す２つのヒストグラムである。
【実施例】
【０１７７】
実施例
本発明を、さらに以下の実施例により説明する。
【０１７８】
実施例１：アルツハイマー病に関する脳組織解析
脳組織のサンプルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ教授の下、パリのピティエ＝サルペトリエール病院（Ｈｏｐｉｔａｌ  Ｐｉｔｉｅ  Ｓａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ）のアルツハイマー病の脳バンクから、好意により調製および提供されたものであった。
【０１７９】
選択ライブラリーが、任意の所定の選択ラウンド後にどれほど多くの配列を含むかは知られていない。本出願人らは、選択ラウンド＃１６後のライブラリーのアリコートのＮＧＳ解析により合計２，３３７，５７５個のランダムなアプタマー配列を観察することができた。
【０１８０】
図１は、選択ラウンド＃１６後に観察された２，３３７，５７５個の配列のコピー数の分布を提供する。本出願人らは、この実施例で「選択したライブラリー」におけるこの最後の選択ラウンド後に、アプタマーの包有に関する最小カットオフとして、５×１０−６の頻度を選択した。このコピー数の分布は、ライブラリーの複雑さの尺度を、我々に提供する。
【０１８１】
次に、「選択したライブラリー」を、診断的選択の間の個々のサンプルの解析に使用した。この実施例では、個々の脳組織のサンプルを対象として選択したアプタマーのライブラリーの第１の選択ラウンドを、「診断的選択」とみなし、これは、「診断ライブラリー」を提供する。
【０１８２】
解析に使用した脳組織のサンプルは、アルツハイマー病で死亡した（ブラークステージ分類によりステージＶＩ；Ｔｈａｌ  ｐｈａｓｅ５；死亡時平均年齢：７７．２（６９〜８７））５名の男性患者からＰＭＤｃ（運動前野の背側部、尾側部）の大脳皮質の脳組織からなるものであった。Ａβプラークの存在およびタウの線維変化が、各サンプルで確認された。１つのサンプルを複製させた。また本出願人らは、２つの別々の健常な脳組織のサンプルを含めた。これらサンプルは、２つの健常なサンプルが異なる２個体に由来するものであったため、病態のサンプルの複製と同様の複製を表すものではない。解析のため、これら２つの健常なサンプルの平均を使用した。
【０１８３】
本出願人らは、診断的選択の中の解析のため、選択したライブラリー由来のアプタマーを含めることに関する最小カットオフとして、５×１０−６の頻度を選択した。これは、１０５０個の配列を表すものであった。
【０１８４】
これら１０５０個の配列のうち４０８個が、診断ライブラリーの少なくとも６つで観察された。その後、さらなる解析のために、これら４０８個の配列を選択した。
【０１８５】
本出願人らは、全体のセットに関する頻度の平均で個々の頻度を除算することにより、各ライブラリーにおけるこれら４０８個のアプタマーの相対的な頻度を正規化した。次に、本出願人らは、「選択したアプタマーのライブラリー」における正規化した頻度で、それぞれの「対象に特異的なアプタマーのライブラリー」における正規化した頻度を除算した。これにより、７つの脳組織のサンプルのそれぞれに対する４０８のアプタマーのそれぞれに関して正規化した変化の値のデータセットを、我々に提供する。
【０１８６】
本出願人らは、以下の式に従い、アプタマーに関して共分散分析を行う。
【数１】
2020508055.tif 000002
【０１８７】
この結果は、４０８×４０８値の相関行列をもたらす。本出願人らは、１から各値を減算することにより、これを、距離行列に変換する。この距離行列は、Ｔｒｅｘ  ｏｎｌｉｎｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒｅｘ．ｕｑａｍ．ｃａ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｃｔｉｏｎ＝ｍａｔｒｉｘＴｏＮｅｗｉｃｋ＆ｐｒｏｊｅｃｔ＝ｔｒｅｘ）を用いてこの関係を視覚化するために使用する、Ｎｅｗｉｃｋ書式に変換される。
【０１８８】
４０８個全てのアプタマーの間の全般的な関係を、図２に提供する。アプタマーの明確なクラスタリングが観察された。
【０１８９】
患者間におけるこの手法の診断能力の例証のため、これらのアプタマーのうち特定のものを選択した。これらアプタマーのそれぞれで観察された変化のデータの比率を、図３に提供し、患者の共分散分析による空間的関係を、図４に提供する。患者の共分散分析を、平均値および標準偏差の値を各生体サンプルで決定したことを除き、アプタマーの共分散分析と同じ方法で行った。
【０１９０】
図４から、「Ｄｅｎ」サンプルの２つのレプリケートは、選択したライブラリーから同じ正規化した変化を呈したことが明らかである。また、健常なサンプル由来のサンプルの距離が異なっていたことも明らかである。このことは、必ずしも、疾患の重症度の差異として受け取るべきではない。より合理的な解釈は、これら患者が、単純に、疾患に関して異なる病態のエピトープを呈すること、およびこれらのうち特定の患者が、他の患者よりも当該エピトープをより多く呈することである。実際に、全ての患者が、後期のアルツハイマー病を罹患していた。
【０１９１】
各クラスターは、異なる病態のエピトープに基づいている。このことは、本出願人らが異なるアプタマーのクラスターについて行った解析により示されている。アプタマーのクラスターＡに関する変化の比率は、図５に提示されており、この病原性のエピトープに関して患者間の関係を示す系統樹が、図６に提示されている。アプタマーのクラスターＢに関する同じ情報が、図７および図８にそれぞれ提示されている。
【０１９２】
クラスターＡでは、患者「Ｂｏｙ」が、この病原性エピトープを、健常なサンプルよりも有意に多く呈さなかった。クラスターＢでは、患者「Ｓｔｉ」が、病原性エピトープを、健常なサンプルよりも有意に多く呈さなかった。このことは、これらアプタマーのクラスターが、異なる標的の実体に結合することを明らかに示している。またこのことは、複数の患者が、自身の病原性のエピトープの相対的な存在量において異なっていることを明らかに示している。特定の場合では、このバリエーションは、特定の病原性のエピトープに関して、罹患した患者と健常な個体との間に差異がないことを表している。
【０１９３】
実施例２：アルツハイマー病に関する血清の解析
患者のサンプルを、パリのピティエ＝サルペトリエール病院にて、ＩＦＲＡＤのコホートから好意により提供された。これらは、Ｂｒｕｎｏ  Ｄｕｂｏｉｓ教授が主導する上記病院の臨床医のチームによりアルツハイマー病と評価された患者に由来するものであった。Ｐ１〜Ｐ３およびＰ９と標識された患者は、後期のアルツハイマー病を呈した。Ｐ４〜Ｐ８と標識された患者は、中期〜早期のアルツハイマー病の症状を呈した。健常な血清のサンプルは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【０１９４】
実施例１で使用したライブラリーと、記載において同一であるＤＮＡアプタマーライブラリーの反復する選択を、この実施例で使用した。ＦＲＥＬＥＸと呼ばれる所有権のあるアプタマーの選択プロセスを、カナダのＮｅｏＶｅｎｔｕｒｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのライセンスの下、この解析全体に使用した（国際特許出願公開公報第２０１７０３５６６６号）。このプロセスは、標的分子の固定化の必要性を完全に回避する。このライブラリーを、２３回のラウンドの、４名全ての後期ＡＤ患者由来の血清のプールに対する反復する選択に供した。カウンターセレクションを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した健常な血清サンプルに対して行った。
【０１９５】
選択ラウンド＃１６〜２３を、次世代シーケンス（ＮＧＳ）解析により解析した。４００のアプタマー配列の複合物のセットを、大きなコピー数および１つの選択から次の選択までの保存に基づき、選択した。
【０１９６】
選択ラウンド＃２３由来の「選択したライブラリー」を分け、９名の患者のそれぞれに由来する個々の血清、および健常な血清の２つのレプリケートに対する選択に適用した。第１の選択ラウンド後に第２の選択を可能にするためには不十分な量のライブラリーが回収された患者のサンプル６および７を除き、各選択を反復した。これら選択したライブラリーを、「患者に特異的なライブラリー」と指定し、全てを、ＮＧＳ解析に供した。
【０１９７】
４名の後期ＡＤ患者および２名の健常な患者間における上位４００の配列の共分散分析を、図９に提示する。この相関分析は、これらの「患者に特異的なライブラリー」と「選択したライブラリー」（すなわち選択ラウンド＃２３由来のライブラリー）との間の相対的な頻度の変化に関して行った。本出願人らのアプタマーのライブラリーが、血清においていくつかの異なる病態のエピトープに結合したことを表す、多数の配列のクラスターが観察されたことが、明らかである。これら配列のうち１６のサブセットを、４００のアプタマーのセットを特徴づけるエピトープの範囲の提示に基づき、選択した。４名の後期ＡＤ患者および２名の健常なライブラリーのサンプルに対する、この１６のアプタマーのサブセットの共分散分析を、図１０に提供する。本出願人らは、これら１６のアプタマーを「ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ」と呼ぶ。
【０１９８】
血清を用いた診断の鍵は、アルツハイマー病を有する患者と健常な個体との間の相対的な頻度の変化の間の比較である。図１１で、本出願人らは、健常なサンプルの相対的な頻度で除算した、９名のアルツハイマー病患者のそれぞれにおける１６のＡｐｔａＭａｒｋｅｒのそれぞれの相対的な頻度の図式的な特徴（ｇｒａｐｈｉｃ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）を提供する。これら患者のそれぞれに帰属する臨床スコアを、表１に提供する。臨床スコアの値が低いほど、疾患の重症度は大きくなり、このスコアの最大値は、当該疾患を罹患していない個体を表す３０である。
【表１】
2020508055.tif 000003
【０１９９】
これは、相対的な頻度の変化の尺度を除外し、これを、後期アルツハイマー病患者のサンプルと健常者のサンプルとの間の差異の尺度と置き換えるため、当該差異を表す有用な手段である。
【０２００】
これらの後期アルツハイマー病患者において著しい増加を呈するＡｐｔａＭａｒｋｅｒは、恐らくは、健常な患者と比較して後期アルツハイマー病患者において多く存在する。
【０２０１】
これら差異が、複数の患者にわたり全く一致しないことに留意することは興味深い。すなわち、特定のＡｐｔａＭａｒｋｅｒは、特定の患者と健常なサンプルとの間に著しい差異を示し、対して同じ差異は、他の患者の場合では同ＡｐｔａＭａｒｋｅｒに関して明らかではない。たとえば、ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ  Ｌ３は、患者１では、健常なサンプルと有意に異なるものではないが、患者２および３では有意に異なっている。ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ  Ｌ１４は、患者２では、健常なサンプルと有意差を呈してはいないが、患者１および３では有意差を呈している。ＡｐｔａＭａｒｋｅｒ  Ｌ１６は、患者３と健常なサンプルとの間でのみ有意差を呈し、他の２人の患者では有意差を呈していない。このことは恐らくは、患者の病態の結果として呈する、複数のエピトープに関する患者間の差異によるものである。この知見は、アルツハイマー疾患の適切な診断を可能にするために、いくつかのＡｐｔａＭａｒｋｅｒを使用することが必要であるとの結論を、我々にもたらすものである。
【０２０２】
本発明の鍵となる適用は、患者においてアルツハイマー病を診断するための、この方法の使用である。これは、少なくとも２つのＡｐｔａＭａｒｋｅｒに関する、「診断ライブラリー」と「選択したライブラリー」との間の存在量の比率（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｒａｔｅ）が、健常なサンプルに関する上記と同じ２つのこれらＡｐｔａＭａｒｋｅｒの存在量の比率よりも有意に大きいことを示すことにより、達成されるであろう。
【０２０３】
また図１１において、臨床スコア（ＭＭＩ）に基づき病態の進行の低さを呈する患者が、同様に、健常なサンプルと比較してＡｐｔａＭａｒｋｅｒの相対的な頻度の変化の差が少ないことを示すことが、明らかである。
【０２０４】
本出願人らは、図１１に表されたＡｐｔａＭａｒｋｅｒのうちの５つの相対的な割合に基づき、表示した値のｌｏｇ（１０）として、各ＡｐｔａＭａｒｋｅｒについて９名の患者を通して観察された最大値のアルゴリズムを開発した。これらの相対的な割合の平均を、各患者に関するＡＤスコアとして決定した。各患者の臨床アセスメントの値を、図１２において、ＡＤスコアと共に提供する。全患者にわたり、本出願人らは、ＡＤスコアと臨床スコアとの間に０．７８の相関を観察した。この相関の統計的有意性は、自由度８の場合、Ｐ＞０．９８である。
【０２０５】
実施例３：拡張したヒトの対象のセットからの血清解析
材料および方法
選択に関するｓｓＤＮＡライブラリーは、配列番号１：
５’ＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴ（Ｎ４０）ＧＡＣＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ−３’
（配列番号１）（式中Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧであり得る）
に記載されるように、プライマーのハイブリゼーションのため２つの定常領域が隣接した４０ｍｅｒのランダム領域から構成されていた（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）。
【０２０６】
増幅に使用したプライマーは、ＩＤＴ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【０２０７】
神経心理学的なアセスメント、ライフスタイルのアセスメント、および気分のアセスメントを含むコホート募集のプロセスは、以前に詳細に記載されている（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｐｓｙｃｈｏｇｅｒｉａｔｒ．  ２００９  Ａｕｇ；２１（４）：６７２−８７）。簡潔に述べると、ＡＩＢＬ試験は、ベースラインとして６０歳超の合計１１６６名の参加者を動員し、そのうち５４名を、合併症の障害またはコンセントの撤回のため除外した。ＡＤの診断に関するＮＩＮＣＤＳ−ＡＲＤＡ国際基準（Ｔｉｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．  １９８８  Ｍａｒ；３８（３）：３５９−６４）およびＭＣＩ診断に関する前兆となる認知症の前段階（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐｒｅｄｅｍｅｎｔｉａ  ｐｈａｓｅ）の基準（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．  ２０１１  Ｍａｙ；７（３）：２７０−９）を使用して、臨床レビュー委員会（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｐａｎｅｌ）は、参加者の間での正確かつ一定の診断を確保するため、各アセスメントの時点での疾患の分類を決定した。これら診断の基準により、参加者を、３つのグループ：ＡＤ（アルツハイマー病）、ＭＣＩ（軽度認知障害）、またはＨＣ（健常な対照）のうちの１つに分類した。ベースラインとして、総計７６８名のＨＣ、１３３名のＭＣＩ、および２１１名のＡＤが存在した。
【０２０８】
ＡＩＢＬ試験は、１８か月の間隔での参加者による、前向きな縦断研究である。この固有の試験は、完全な試験のアセスメント、ならびにベースライン、１８ケ月、および３６ケ月の経過観察期間の時点での対応する血液サンプルの回収を完了した７１１名の個体について記録している。
【０２０９】
Ａｕｓｔｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｓｔ．  Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、およびＥｄｉｔｈ  Ｃｏｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの機関倫理委員会が、ＡＩＢＬ試験を承認した。志願者全員が、この試験に参加する前に、記入済みのインフォームドコンセントを提供した。
【０２１０】
この試験で解析したサンプルを、表２に表す。
【表２】
2020508055.tif 000004
2020508055.tif 000005
【０２１１】
ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）は、認知症を診断するために開発された認知試験である（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｒｅｓ．  １９７５  Ｎｏｖ；１２（３）：１８９−９８）。スコア３０は、完全な認知能力を表し、この値からのスコアの減少が、認知能力の減少および進行した段階のアルツハイマー病と相関している。
【０２１２】
サンプルは、１８ケ月の間隔で対象から入手し、ＭＭＳＥ試験は、各サンプリング日において各対象で行った。表２の「サンプル１」および「サンプル２」は、１８ケ月離れた、続いて行われた２回のサンプリング日を表している。この試験における対象の登録からの月数は、見出しの「サンプリング日」の下、各サンプリング日で列挙されている。列の頭に付された「年齢」は、コホートプロジェクトの開始時の対象の年齢を提供する。よって、サンプリング時の対象の年齢は、上記年齢に、列のサンプリング日の月数を加算することにより提供される。
【０２１３】
本出願人らは、正の選択に関する列「ライブラリートレーニング（Ｌｉｂｒａｒｙ  ｔｒａｉｎｉｎｇ）」にまとめられた６名の対象（後期ＡＤ）、および負の選択に関する５名の対象（健常）に由来する血清のプールを使用した。個々の解析に関するサンプルが、最後の列に記載されている。Ｓ１およびＳ２は、「サンプル１」および「サンプル２」、すなわち、トレーニングまたは解析に使用されたサンプルのサンプリング日を表す。
【０２１４】
ＮｅｏＮｅｕｒｏ  ＳＡＳは、アプタマーのライブラリーの選択について、ＮｅｏＶｅｎｔｕｒｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによりこの試験に関して、ＦＲＥＬＥＸ選択プラットフォーム（全体が本明細書中参照として援用されている国際特許出願公開公報第２０１７０３５６６６号に記載）を使用することを、快く承認された。
【０２１５】
ＦＲＥＬＥＸは、チオール化したランダムな８塩基対のＤＮＡオリゴヌクレオチド（以後、「８ｍｅｒ」と呼ぶ）でコーティングした金のチップを含む固定フィールド（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｉｅｌｄ）の調製を必要とする。この８ｍｅｒを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（８．０ｍＭのＮａ２ＰＯ４、１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）５０μｌに、１０μＭの濃度で溶解した。この溶液を、金の表面のチップ（寸法：７×１０×０．３ｍｍ（Ｘａｎｔｅｃ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））上で、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次にこのチップを空気乾燥させ、チオールで終結したポリエチレングリコール（ＳＨ−ＰＥＧ）分子を含む溶液５０μＬに加え、軽く振とうさせながら室温で３０分間インキュベートした。このステップは、残存する、８ｍｅｒで覆われていない金の表面をブロッキングする。その後、ＳＨ−ＰＥＧを、第２の時間の１６時間の間、添加した。この後、ＳＨ−ＰＥＧ溶液をチップから除去し、官能基付与した金のチップの表面を、脱イオン水で洗浄し、空気乾燥させた。
【０２１６】
この試験で使用される第１のフェーズのＦＲＥＬＥＸ（以降本明細書中で、「フェーズＩ」または「負の選択フェーズ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）」と呼ばれる）では、以前に記載したランダムなアプタマーのライブラリー由来の１０１６個の配列（配列番号１に記載の核酸配列を有する）を、ライブラリーを９５℃で１０分間加熱しその直後に氷冷槽に浸すことにより、即座に冷却（ｓｎａｐ−ｃｏｏｌｅｄ）した。これらの一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ配列を、選択バッファー（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ）において官能基を付与した固定フィールド（８ｍｅｒでコーティングされた金のチップ）と共に、ＲＴで３０分間インキュベートした。残存する溶液は、除去し、廃棄された。これにより、二次構造が多すぎて８ｍｅｒへの表面での結合を行うことができない配列を除去している。固定フィールドを、１０×のＴＥバッファー５０μＬで２回洗浄し、残存する結合したオリゴヌクレオチドを溶出させ、１ｍＬの選択バッファーにおいて、９５℃でそれぞれが１５分間の２回のインキュベーションを用いて回収した。これら溶出物（ｅｌｕｔａｔｅ）を、ＧｅｎｅＪＥＴ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者が説明する通り使用して、プールし、精製を行い、脱イオン水２５μＬで溶出した。
【０２１７】
第２のフェーズのＦＲＥＥＬＥＸ（フェーズＩＩ」または「正の選択フェーズ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）」）では、８ｍｅｒに結合する能力に関して選択されたこのアプタマーのライブラリーを、総体積５０μｌの１×選択バッファーにおいて、後期ＡＤ由来の血清のプールを用いて正の選択に関して使用した。この溶液を、１５分間インキュベートし、次に、室温で１５分間、固定フィールドと共にインキュベートした。残存する溶液を、注意深く回収し、未使用のチューブ（ｆｒｅｓｈ  ｔｕｂｅ）に保存した。固定フィールドを、１×選択バッファー５０μＬで２回洗浄し、ここで各洗浄物を回収し、第１のステップで除去した溶液と共にプールした。この溶液は、恐らくは代わりに血清の中のいくつかの部分に結合しているため固定フィールドに結合しなかった配列を含む。このプールした溶液を、ＦＲＥＥＬＥＸの「フェーズＩ」で記載したように精製し、４００μＬで溶出し、適切な回数のサイクルのＰＣＲ増幅に供して、約５ｎｇの増幅したＤＮＡの明確なバンドを作製した。
【０２１８】
第１のラウンドの選択（すなわちフェーズＩおよびＩＩ）の後、ＰＣＲを使用して、選択したｓｓＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に、適切な回数のサイクルで増幅させて、約５ｎｇの増幅したＤＮＡの明確なバンドを作製した。全てのＰＣＲの手法は、標準的な分子生物学のプロトコルにしたがい、以下の条件：
９５℃で５分間
９５℃で１０秒間をｘサイクル
５５℃で１５秒間
７２℃で３０秒間
その後、７２℃で５分間の最終的な伸長
の下で、行った。
【０２１９】
このプロセスでは、本出願人らは、増幅した産物の３’末端にＴ７プロモーターを作製するようにＰＣＲプライマーを使用した。次に、ｄｓＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のためのテンプレートとして使用して、５５℃での一晩の反応においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用しアンチセンスＲＮＡコピーを入手した。転写したアンチセンスＲＮＡを、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅ  ｃｌｅａｎｕｐ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製して残存するｄｓＤＮＡのテンプレートを除去した。次に、このアンチセンスＲＮＡライブラリーを、逆転写反応のテンプレートとして使用して、センス鎖のｃＤＮＡオリゴヌクレオチドを入手した。ｃＤＮＡ−ＲＮＡ混合物を、製造者の説明に従いＲＮａｓｅ  Ｈで処理し、残存するアンチセンスＲＮＡ分子を除去した。ｃＤＮＡは、ＰＣＲ  ｃｌｅａｎｕｐカラムで精製し、次のラウンドの選択のためのテンプレートとして使用した。
【０２２０】
次に、本明細書中上述した選択プロセスを、数ラウンドの間反復した。その後の選択ラウンドを、健常な患者由来の血清のプールを負の選択フェーズ（「ＦＲＥＬＥＸのフェーズＩ」）に添加した（ここで本出願人らは、固定フィールドに結合する能力を呈するアプタマーに関して選択した）ことを除き、同じ方法で行った。健常な血清を含めることによって、この物質の中に存在する標的に結合するアプタマーに対する選択を可能にする。これは、本出願人らが、後期ヒトのＡＤの血液のプールにおいて存在量が多いエピトープに結合するアプタマーを効率的に選択している対比をもたらしている。この選択プロセスを、合計１０回の選択ラウンドで、反復させた。選択ラウンド＃５〜＃１０のアリコートを、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｃａｎａｄａ）によるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ器具を使用したＮＧＳ解析により、解析した。配列の解析を、ＮｅｏＶｅｎｔｕｒｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．のプロプライエタリ・ソフトウェアを使用して行った。
【０２２１】
１０回目の選択ラウンド由来の残存するアプタマーのライブラリー（「選択したアプタマーのライブラリー」）を、増幅させ、以前に記述したようにｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ２００ｎｇを、ＦＲＥＥＬＥＸ「フェーズＩＩ」（すなわち後期のＡＤステージのプールに対するライブラリーの正の選択ステップ）と同一の方法で、単一の「診断的選択」ラウンドのため、各個体の対象由来の血清に適用した。
【０２２２】
選択の後、それぞれの選択したライブラリーを、カナダのトロントのＨｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎにて、ｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ器具を用いた次世代シーケンシングにより解析した。
【０２２３】
結果
全般的に、１つの反復した解析由来のアプタマーのその他に対する相対的な頻度の再現性は、著しく有意な回帰の値を呈した。例として、図１３に、同じ対象（Ａｃｈ  １）に関する２つの複製した解析の間の１０，０００個のアプタマーの相対的な頻度を提供する。
【０２２４】
各ＮＧＳプロセスにより捕捉された配列の数は、これらサンプル由来のアプタマーの相対的な頻度の再現性に効果があった。図１４は、選択ラウンド＃１０において１００個の最も著しく存在量が多いアプタマーの相対的な頻度（すなわち、上位１００個のアプタマーの相対的な頻度の再現性）の観点からの、各サンプルに関していずれかの複製で捕捉した配列の最小数対レプリケートを通して複数のサンプルで得られた回帰係数の比較を提供する。
【０２２５】
本発明者らは、捕捉した配列の数と、アプタマーの相対的な頻度の再現性との間に曲線の関係があると推定した。一貫したレベルの再現性を確保するため、解析に１００万超の配列を必要とした。この知見に基づき、本発明者らは、さらなる解析から６つのサンプルを除外した：２つの健常なサンプル（Ａｃｈ−２０および２４）、ならびに３つのＡＤサンプル（Ａｃｈ−４、１６、および４４）。
【０２２６】
各アプタマーの相対的な頻度は、視覚的な比較のため３次元のグラフにプロットすることができる（不図示）。しかしながら、本出願人らは、これら３次元のグラフ上に見られるパターンをスコアに定量化する手段を開発する必要があった。これを行うために、本出願人らは、最も多くの情報を提供する存在量の多いライブラリーにおいてアプタマーを同定することに焦点を当てた。
【０２２７】
ライブラリーにおけるアプタマーは、２つのグループに分類することができる：結合するエピトープが健常な血液サンプルとＡＤの血液サンプルとの間で濃度において変化する点で動的であるグループ、および結合するエピトープが健常な血液サンプルとＡＤの血液サンプルとの間で濃度において変化しない点で一定であるグループ。図１５は、この点を模式的に示している。
【０２２８】
一定なアプタマーは、動的なアプタマーの作用の影響を受ける。動的なアプタマーに関するエピトープが、所定の血液サンプルにおいて高い濃度である場合、一定なアプタマーは減少を呈する。逆の場合でも、同じことが言える。
【０２２９】
本出願人らのアプタマー配列のデータベースは、両方の種類のアプタマーを含み、両方の種類は、相対的な頻度の変化を呈しているであろう。よって、本出願人らは、動的なアプタマーの対であって、所定の血液サンプルにおいて、この対の１つのメンバーが相対的な頻度で増加しており、もう一方が減少している、動的なアプタマーの対を同定することを望んでいた。
【０２３０】
個々のアプタマーの相対的な頻度が再現可能であるため、１つの複製から別の複製までのわずかな変化は、異なるクラスターに割り当てられたアプタマーに有意に影響を与えることができた。結果として、本出願人らは、動的なアプタマーの対を同定することにより、本発明の改善を進展させた。本出願人らは、１つの相対的な頻度を別の相対的な頻度で除算する場合に個体間で有意差を呈するアプタマーの対として、動的なアプタマーの対を定義する。この有意性は、相対的な頻度において１つのアプタマーが増加し、もう１つのアプタマーが減少する関数、またはその逆の関数である。
【０２３１】
このような動的な対の事象の根底に生物学的な意味が存在する可能性がある。一例として、あるタンパク質が、病態の状態で特定の方法でフォールディングし、アプタマーが結合するエピトープを作製し、健常な状態では異なる方法でフォールディングを行うことにより、同じアプタマーは上記エピトープと結合しないが、異なるアプタマーは結合することが、あり得る。この例では、病態のエピトープに結合したアプタマーは、相対的な頻度が増加し、健常なエピトープに結合したアプタマーは、協調した方法において相対的な頻度が減少するであろう。すなわち、一方が増加する場合は、常にもう一方が減少する。
【０２３２】
このような動的な対の根底にある潜在的な生物学的な意味の他の例は、病態の状態でのタンパク質に接着した代謝物の存在、および健常な状態での当該代謝物の非存在を含み得る。これら例は、単に、動的な対の根底にある潜在的な生物学的意味の概念を示すように作用しており、完全なものと解釈すべきではない。
【０２３３】
この動的な対の概念は、当該動的な対が、測定した差を暗に増大させ、かつ協調して増大させる点で、個体間のアプタマーの相対的な頻度の変化のより強力な解釈に関する基盤を提供する。
【０２３４】
このような動的な対は、本発明の有効な使用可能性として有用であるために、実際に対となる生物学的な基盤を有することが必要ではない。
【０２３５】
アプタマーの動的な対を同定するために、本出願人らは、最初に、各サンプルにおける上位１００のアプタマーのそれぞれの、互いに対する比例的な相対的な頻度を決定した。これは、この１００個のアプタマーのセットにおいて、各アプタマーの相対的な頻度を、互いのアプタマーの相対的な頻度で除算することを含むものであった。
【０２３６】
各レプリケートの中の、これら割合のそれぞれの平均値を、ＡＤ対象および健常な対象で計算した。各セット（ＡＤおよび健常者）の中の各値の標準偏差の平均で除算したこれら平均値間の差異を、決定した。これは、Ｚ統計量とみなすことができる
【０２３７】
各個体の割合に関する複製のそれぞれに由来するＺ統計量を、乗算した。よって、同じ方向（負または正）にあったＺ統計量は、正の値をもたらし、反対の方向のＺ統計量は、負の値をもたらす。
【０２３８】
次に、本出願人らは、健常者とＡＤを区別するために最も強力なアプタマー対に対応する、各複製由来のＺ統計量の積を同定するために、１．２のカットオフ値を使用した。これは、表３に記載される７２のアプタマー対の同定をもたらした。
【表３】
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【０２３９】
【表４】
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【０２４０】
これらアプタマー対の７２個全ては、健常な平均と比較してＡＤの平均に関して低い値を呈した。これは、正のＺ値の積が、ＡＤの平均が両方のレプリケートにおいて健常な平均よりも高かった割合、およびＡＤの平均が両方のレプリケートにおいて健常な平均よりも低かった割合に由来し得るため、この解析のプロセスの必要な結果として予測されない。よって、データの無作為化のセットは、１つの平均が他よりも高い割合の半分の平均、および１つの平均が他よりも低い割合の半分の平均をもたらすと予測される。
【０２４１】
このランダムな確率分布由来の著しい有意差は、単に、相対的な頻度の生物学的な意味の指標と見なすことができる。この意味は、ＡＤの対象および健常な対象の血液中のエピトープの相対的な頻度の差異の、選択プロセスおよび性質の両方の結果である。
【０２４２】
全ての値が同じ方向にあった場合、本出願人らは、各個体のサンプルの中で、同じ７２のアプタマー対に関する相対的な頻度の割合を足し合わせた。これら値を、図１６に提供する。ＡＤの値と健常者の値との間のゼロの縦座標を作製するために、２．７の一定な作用素の値（ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｖａｌｕｅ）を、全ての合計から除算した。この最終的な値を、「Ａｐｔａｍａｒｋｅｒスコア」と称した。
【０２４３】
各対象の、ＭＭＳＥスコアに対する「Ａｐｔａｍａｒｋｅｒスコア」の平均の比較を、図１７に提供する。Ａｐｔａｍａｒｋｅｒプラットフォームを用いたヒトの対象の血液解析は、ＭＭＳＥスコアにおける減少に基づき、対象を区別するために効率的かつ高い信頼性で使用することができることが明らかである。
【０２４４】
図１８は、この解析に基づく、ＡＤの対象と健常な対象との間の区別の全般的な概略を提供する。
【０２４５】
結論
これらデータから、アルツハイマー病を罹患した患者と健常な患者との間を彼らの血液サンプルに基づき区別するために、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒプラットフォームを我々が使用できることは明らかである。
【０２４６】
Ａｐｔａｍａｒｋｅｒのフィンガープリントと、疾患の重症度の度合いとの間の相関は、中期のアルツハイマー病のサンプルに関してアプタマーのライブラリーをトレーニングすることにより、解析されるであろう。
【０２４７】
実施例４：後期ＡＩＢＬデータの無作為化解析
実施例３に記載した本出願人らの試験において、本出願人らは、１３名のＡＤ対象および６名の健常な対象を有していた。無作為化したグループ分けを、同じ分布を用いて設定したが、健常な対象のうちの４名を、無作為にＡＤのグループに割り当て、４名のＡＤ対象を、無作為に健常なグループに割り当てた。
【０２４８】
動的なアプタマー対を、実施例３の元の解析に関して同じ方法で選択した。このような４６個の対を、同定した。
【０２４９】
健常な対象と比較したＡＤ対象における平均値間の差異が、全て同じ方向ではなかったことが、最初の差異として観察された。実施例３で提供された解析では、７２個全ての動的なアプタマー対が、ＡＤのプールよりも健常なプールにおいてより高い値を呈した。このランダムな解析では、第１の複製において、動的な対のうちの３０が、ＡＤのプールでより高い値を呈した。第２の複製では、同じ動的な対のうちの１７が、ＡＤのプールでより高い値を呈した。
【０２５０】
よって、最良の行動の指針は、健常なプールよりもＡＤのプールにおいてより低い値を有した値を加算すること、および健常なプールよりもＡＤのプールにおいてより高い値を有した値を除算することであった。このアルゴリズムは、第１の複製に関して確立された。図１９は、両方の複製を通した結果をまとめている。
【０２５１】
このアルゴリズムを、第１の複製に適合させ、この結果は、実施例３の解析と同じように良好ではなかった（図１６）。このアルゴリズムを、第２の複製由来のデータに適合することにより得られた結果は、特定の傾向を全く示さない。しかし、実施例３の解析では、同じアルゴリズムを、複製したデータのセットの両方に使用した。
【０２５２】
図２０は、実施例３の解析におけるヒトの対象あたりの全体の平均の間の比較（図２０Ａ）および本実施例のシュミレーションした無作為化解析（図２０Ｂ）を提供する。
【０２５３】
これら結果は、明らかに、Ａｐｔａｍａｒｋｅｒを用いた、ＡＤ対象と健常な対象との間で得られた差異が、動的なアプタマーの対を同定するために使用される統計的なプロセスの関数ではないが、生物学的な現実（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅａｌｉｔｙ）を反映していることを示している。
【０２５４】
結論
アルツハイマー病の進行の速度は、患者の間で非常に異なっている場合がある。医療の計画の支援として、この速度を個別に予測する必要がある。また、候補の治療の特性を特徴づける手段として、病態の発達の速度を特徴づけることができることも有用であろう。
【０２５５】
本出願人らは、アルツハイマー病を罹患した患者由来の血清の反復した解析を用いて、各患者の中で疾患が進行している速度を特徴づけることを企図した。Ａｐｔａｍａｒｋｅｒの存在量の多さの割合の差異は、疾患の進行速度に関連しており、診断の基盤として減少速度を予測するために使用されるであろう。
【０２５６】
また、このＡｐｔａｍａｒｋｅｒプラットフォームは、エピトープの差異、またはエピトープの集積の比率の差に基づき、患者のサブグループまたは病態のサブタイプを同定する特性を有することに、本出願人らは注目している。よって、このプラットフォームの適用は、候補の治療薬の臨床試験で患者を階層化するためのガイドとして非常に有用である。さらに、疾患を表すエピトープの向上を特徴づけるこの手法の特性は、この手法の使用を、治療を成功させるためのコンパニオン診断として魅力的なものにするであろう。
【０２５７】
また、このプロセスに対する改善は、アプタマー、たとえば限定するものではないが、実施例３で同定された７２の動的な対に関与するアプタマーのサブセットの使用を含み得ることに、本出願人らは注目している。このようなセットは、アプタマー分布が、適用した各試験で同じであることを確保するために合成することが可能であった。また、このようなサブセットの使用は、解析した対象間のエピトープ頻度の変化に対する個体のアプタマーの応答の大きさの増大をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月21日(2019.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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