(57)【要約】  本発明は、表面に播種されたヒト肝細胞を含む製造物を提供し、播種された肝細胞の少なくともいくつかは、フィーダー細胞における１つ以上の肝細胞クラスターにあり、表面に付着される。播種されたヒト肝細胞を調製する方法も提供される。調製方法は、ヒト肝細胞をフィーダー細胞の存在下の表面に適用し、適用される肝細胞をフィーダー細胞と共培養し、及び表面に付着されるフィーダー細胞において共培養された肝細胞によって、１つ以上の肝細胞クラスターを形成することを含む。播種された肝細胞は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染肝細胞培養モデルの調製及び薬剤試験を含む、様々な目的に使用することができる。
2020534018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に播種されたヒト肝細胞を含む製造物であって、前記播種された肝細胞の少なくとも７０％がフィーダー細胞上の１つ以上の肝細胞クラスターであり、前記フィーダー細胞が内皮細胞及び線維芽細胞であり、前記表面に付着される、表面に播種されたヒト肝細胞を含む製造物。
【請求項２】
前記１つ以上の肝細胞クラスターにおける前記播種された肝細胞の少なくとも９０％が、直接肝細胞間接触にある、請求項１に記載の製造物。
【請求項３】
前記１つ以上の肝細胞クラスターが表面の少なくとも５０％を覆う、請求項１に記載の製造物。
【請求項４】
前記表面が少なくとも３ｍｍの最短の直径を有する、請求項１に記載の製造物。
【請求項５】
さらに培地を含み、前記播種された肝細胞の少なくとも９０％が少なくとも７日間、前記表面に残る、請求項１に記載の製造物。
【請求項６】
さらに培地を含み、前記播種された肝細胞の少なくとも９０％が少なくとも４２日間、前記表面に残る、請求項１に記載の製造物。
【請求項７】
前記播種された肝細胞がアルブミンを産生する、請求項１に記載の製造物。
【請求項８】
前記播種された肝細胞がチトクロムＰ４５０を発現する、請求項１に記載の製造物。
【請求項９】
前記内皮細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の製造物。
【請求項１０】
前記内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１に記載の製造物。
【請求項１１】
前記内皮細胞が肝細胞ではない、請求項１に記載の製造物。
【請求項１２】
前記内皮細胞が増殖しない、請求項１に記載の製造物。
【請求項１３】
前記内皮細胞が初代細胞である、又は最大７継代培養される、請求項１に記載の製造物。
【請求項１４】
前記内皮細胞が不死ではない、請求項１に記載の製造物。
【請求項１５】
前記線維芽細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の製造物。
【請求項１６】
前記線維芽細胞がヒト皮膚線維芽細胞である、請求項１に記載の製造物。
【請求項１７】
前記線維芽細胞が肝細胞ではない、請求項１に記載の製造物。
【請求項１８】
前記線維芽細胞が増殖しない、請求項１に記載の製造物。
【請求項１９】
前記線維芽細胞が初代細胞である、又は最大７継代培養される、請求項１に記載の製造物。
【請求項２０】
前記線維芽細胞が不死ではない、請求項１に記載の製造物。
【請求項２１】
前記播種された肝細胞、前記内皮細胞及び前記線維芽細胞が３：１：１〜２４：１：１の細胞比を有する、請求項１に記載の製造物。
【請求項２２】
前記播種された肝細胞が１つのドナーから得られる、請求項１に記載の製造物。
【請求項２３】
前記ドナーが微小脂肪変性をり患している、請求項２２に記載の製造物。
【請求項２４】
前記ドナーが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をり患している、請求項２２に記載の製造物。
【請求項２５】
前記播種された肝細胞が２つ以上のドナーから得られる請求項１に記載の製造物。
【請求項２６】
（ａ）ヒト肝細胞をフィーダー細胞の存在下で表面に適用し、前記フィーダー細胞が内皮細胞及び線維芽細胞であり、
（ｂ）工程（ａ）の後に、前記適用した肝細胞を前記フィーダー細胞と共培養し、並びに（ｃ）前記フィーダー細胞上に、前記共培養された肝細胞によって、１つ以上の肝細胞クラスターを形成し、前記フィーダー細胞が前記表面に付着され、前記共培養された肝細胞の少なくとも８５％が、１つ以上の肝細胞クラスターにあり、それによって播種されたヒト肝細胞が調製されることを含む、播種されたヒト肝細胞を調製する方法。
【請求項２７】
工程（ａ）において、前記適用した肝細胞が、フィーダー細胞の非存在下で、前記表面において、６０％未満の接着能を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）において、前記適用した肝細胞が、フィーダー細胞の非存在下で、前記表面において、少なくとも８５％の接着能を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上の播種された肝細胞クラスターが前記表面の少なくとも５０％を覆う、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記表面が少なくとも３ｍｍの最短の直径を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記播種された肝細胞の少なくとも９０％が少なくとも７日間、前記表面に残る、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記播種された肝細胞の少なくとも９０％が少なくとも４２日間、前記表面に残る、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記フィーダー細胞が工程（ａ）の前に前記表面に付着される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記フィーダー細胞が工程（ｂ）において前記表面に付着される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が細胞外マトリックスタンパク質の添加を除外する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝細胞が工程（ａ）の前に凍結される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２６〜３６の何れか一項に記載の方法に従って調製される播種された肝細胞。
【請求項３８】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の製造物の播種された肝細胞又は請求項３７に記載の播種された肝細胞に、前記播種された肝細胞の特性を変えるのに有効な量の医薬物質を投与することを含む、医薬物質を試験する方法。
【請求項３９】
前記医薬物質が小分子、抗体、生ウイルス、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド及び細胞から成る群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の製造物の前記播種された肝細胞又は請求項３７に記載の播種された肝細胞に有効量の薬剤を投与し、前記播種された肝細胞における前記薬剤の量を決定することを含む、薬剤代謝を試験する方法。
【請求項４１】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の製造物の前記播種された肝細胞又は請求項３７に記載の播種された肝細胞に有効量の薬剤を投与し、前記播種された肝細胞における前記薬剤の位置を決定することを含む、薬剤輸送を試験する方法。
【請求項４２】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の製造物の前記播種された肝細胞又は請求項３７の播種された肝細胞に有効量の薬剤を投与し、生存する播種された肝細胞を検出することを含む、薬剤の毒性を試験する方法。
【請求項４３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染肝細胞培養モデルを調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜２５の何れか一項に記載の製造物の前記播種された肝細胞又は請求項３７に記載の播種された肝細胞にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を接種し、
（ｂ）前記感染した播種された肝細胞を少なくとも１４日間インキュベートし、それにより前記ＨＢＶ感染肝細胞培養モデルが調製されることを含む、方法。
【請求項４４】
（ａ）初代肝細胞を含む第１凍結保存バイアル、
（ｂ）内皮細胞を含む第２凍結保存バイアル、
（ｃ）線維芽細胞を含む第３凍結保存バイアル、並びに
（ｄ）請求項２６〜３６の何れか一項に記載の方法に従って、前記初代肝細胞、前記内皮細胞及び前記線維芽細胞を用いて、播種されたヒト肝細胞を調製する説明書を含む,
肝細胞を播種するキット。
【請求項４５】
前記第２凍結保存バイアル及び前記第３凍結保存バイアルが同じである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記第１凍結保存バイアル、前記第２凍結保存バイアル及び前記第３凍結保存バイアルが同じである、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／５６２，１２７号明細書の利益を主張し、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して播種されたヒト肝細胞並びにその調製及び用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ドナーから単離された初代ヒト肝細胞は、薬剤代謝又は薬剤誘発性肝損傷を研究するために２次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養システムに使用されてきた。２次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養システムにおいて、初代ヒト肝細胞は培地に保持され、表面（例えばプレート）に付着して、薬剤代謝、毒性又はウイルス感染の試験を行うのに適した肝細胞の単層を生成する。２次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養システムについて、長期間、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２又は４９日間、少なくとも８５％以上の接着能（ｐｌａｔｅａｂｉｌｉｔｙ）を有する単離された初代ヒト肝細胞が望ましく、６０％未満の接着能を有する単離された初代肝細胞を有する単離された初代ヒト肝細胞は、概して、あまり望ましくないと考えられ、長期間の実験に適さない。凍結保存された初代ヒト肝細胞バッチの高確率が薬剤代謝、毒性又はウイルス感染を試験する等の適用について、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の所望のドナー規格を有する多くのバッチの利用可能性を限定する接着性のない又は接着性に乏しい肝細胞の後者のカテゴリーに分類される。初代ヒト肝細胞の接着能、機能安定性及び培養寿命を改善する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、播種されたヒト肝細胞並びにその調製及び用途に関する。
【０００５】
表面に播種されたヒト肝細胞を含む製造物が提供される。播種された肝細胞の少なくとも７０％がフィーダー細胞上の１つ以上の肝細胞クラスターにある。フィーダー細胞は、内皮細胞及び線維芽細胞であり、表面に付着される。製造物において、１つ以上の肝細胞クラスターの播種された肝細胞の少なくとも９０％が、直接肝細胞間接触し得る。１つ以上の肝細胞クラスターは、表面の少なくとも５０％を覆い得る。表面は、少なくとも３ｍｍの最短の直径を有し得る。
【０００６】
製造物は、さらに、培地を含み得、播種された肝細胞の少なくとも９０％が少なくとも７又は４２日間表面に残る。
【０００７】
播種された肝細胞は、アルブミンを産生し得、及び／又はチトクロムＰ４５０を発現し得る。
【０００８】
内皮細胞はヒト細胞であってもよい。例えば、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であってもよい。内皮細胞は肝細胞でなくてもよい。内皮細胞は増殖性でなくてもよい。内皮細胞は、初代細胞であり得又は７継代まで培養されてもよい。内皮細胞は不死でなくてもよい。
【０００９】
線維芽細胞はヒト細胞であってもよい。線維芽細胞はヒト皮膚線維芽細胞であってもよい。線維芽細胞は肝細胞でなくてもよい。線維芽細胞は増殖性でなくてもよい。線維芽細
胞は、初代細胞である又は７継代まで培養されてもよい。線維芽細胞は不死でなくてもよい。
【００１０】
製造物において、播種された肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞は、３：１：１〜２４：１：１の細胞比を有し得る。
【００１１】
播種された肝細胞は、１つのドナーから得ることができる。播種された肝細胞は、２つ以上のドナーから得ることができる。それぞれのドナーは微小脂肪変性（ｍｉｃｒｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をり患し得る。
【００１２】
播種されたヒト肝細胞を調製する方法も提供される。調製方法は、ヒト肝細胞を、フィーダー細胞の存在下、表面に適用し、フィーダー細胞は、内皮細胞及び線維芽細胞であり、適用工程の後に、適用した肝細胞をフィーダー細胞と共培養し、及び表面に付着されるフィーダー細胞上の共培養された肝細胞によって、１つ以上の肝細胞クラスターを形成することを含む。共培養された肝細胞の少なくとも８５％は、１つ以上の肝細胞クラスターにある。適用される肝細胞は、フィーダー細胞の非存在下で、表面に６０％未満の接着能を有し得る。適用される肝細胞は、フィーダー細胞の非存在下で、表面に少なくとも８５％の接着能を有し得る。１つ以上の播種された肝細胞クラスターは、表面の少なくとも５０％を覆い得る。表面は、少なくとも３ｍｍの最短の直径を有し得る。
【００１３】
調製方法に従って、播種された肝細胞の少なくとも９０％が少なくとも７又は４２日間表面に残り得る。フィーダー細胞は、適用工程の前又は共培養工程において表面に付着し得る。肝細胞は、適用工程の前に凍結されてもよい。
【００１４】
調製方法は、細胞外マトリックスタンパク質の添加を除外し得る。
【００１５】
それぞれの調製方法について、方法に従って調製される播種された肝細胞が提供される。
【００１６】
医薬物質の試験を行う方法が提供される。方法は、播種された肝細胞の特性を変えるのに有効な量の医薬物質を播種された肝細胞に投与することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。医薬物質は、小分子、抗体、生ウイルス、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド及び細胞から成る群から選択され得る。
【００１７】
薬剤代謝を試験する方法が提供される。方法は、有効量の薬剤を播種された肝細胞に投与することを含み、播種された肝細胞における薬剤の量を決定することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。
【００１８】
薬剤輸送を試験する方法が提供される。方法は、有効量の薬剤を、播種された肝細胞に投与することを含み、播種された肝細胞における薬剤の位置を決定することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。
【００１９】
薬剤の毒性を試験する方法が提供される。方法は、有効量の薬剤を、播種された肝細胞に投与することを含み、生存している播種された肝細胞を検出することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。
【００２０】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染肝細胞培養モデルを調製する方法が提供される。方法は、播種された肝細胞にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を接種し、感染した播種された肝細胞を少なくとも１４日間インキュベートすることを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。
【００２１】
肝細胞の播種のためのキットが提供される。キットは、初代肝細胞を含む第１の凍結保存バイアル、内皮細胞を含む第２凍結保存バイアル、線維芽細胞を含む第３凍結保存バイアル、並びに本発明の方法に従って、初代肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞で、播種されたヒト肝細胞を調製する説明書を含む。第２凍結保存バイアル及び第３凍結保存バイアルは同じであってもよい。第１凍結保存バイアル、第２凍結保存バイアル及び第３凍結保存バイアルは同じであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態に記載のヒト肝細胞共培養物の模式図＃１を示す。この模式図は、細胞培養物の調製及びタイムフレームによる分析を提供する。模式図＃１に従って、肝細胞共培養物は、ヒト肝細胞を、０日目に事前に播種された内皮細胞及び線維芽細胞であるフィーダー細胞上に播種することによって調製される。ＥＣ、内皮細胞；Ｆｂ、線維芽細胞；ＭＧ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ。
【図２】本発明の別の実施形態に記載のヒト肝細胞共培養物についての模式図＃２である。この模式図は、細胞培養物の調製及びタイムフレームによる分析を提供する。模式図＃２に従って、肝細胞共培養物は、ヒト肝細胞を、０日目に、内皮細胞及び線維芽細胞であるフィーダー細胞と一緒に播種することによって調製される。ＥＣ、内皮細胞；Ｆｂ、線維芽細胞；ＭＧ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ。
【図３】肝細胞共培養物：皮膚線維芽細胞単独（左上）、不死化肝類洞内皮細胞単独（中央上）、初代肝細胞単独（右上）、線維芽細胞及び内皮細胞の混合物（左下）、並びに初代肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の混合物（右下）に使用されるヒト細胞の形態を示す。
【図４】肝細胞単一培養（単一培養）、フィーダー細胞を有する肝細胞共培養物（共培養）、又はフィーダー細胞培養物（フィーダー）におけるアルブミン、ＣｙＰ４５０  １Ａ２、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された播種後１週間の発現レベルを示す。これらの４つの遺伝子のそれぞれの発現レベルは、単一培養よりも共培養に有意に高かった。*，ｐ＜０．０５；**，ｐ＜０．０１。
【図５】誘導前後の、播種後７日間の単一培養又は共培養で播種された肝細胞数に基づいて正規化されたＣｙＰ４５０  １Ａ２、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６又はＣｙＰ４５０  ３Ａ４の活性を示す。*，ｐ＜０．０５；**，ｐ＜０．０１。
【図６】２週間の肝細胞の培養にわたってＥＬＩＳＡによって測定されたアルブミン（ＡＬＢ）及び尿素の分泌を示す。分泌されたアルブミン及び尿素のレベルは、単一培養よりも共培養の肝細胞において有意に高かった。Ｍｏｎｏ、単一培養；Ｃｏ、共培養；*，ｐ＜０．０５；**，ｐ＜０．０１。
【図７】単一培養（左）又は内皮細胞及び線維芽細胞による共培養（右）における懸濁グレードのヒト初代肝細胞の顕微鏡による観察を示す。単一培養の肝細胞は、播種後から離れ始め、共培養に播種された肝細胞の大部分は、良好な品質で付着したままであった。
【図８】単一培養の接着性グレードの肝細胞に比べて、同様又はより高い発現レベルのＣｙＰ４５０  １Ａ２（上）及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４（下）を示す共培養の懸濁グレードの肝細胞を示す。両方の接着性及び懸濁グレードの肝細胞は、単一培養に比べて共培養のほうが高い代謝活性を示した。Ｍｏｎｏ−Ｕ、単一培養非誘導；Ｍｏｎｏ−Ｉ、単一培養誘導；Ｃｏ−Ｕ、共培養非誘導；Ｃｏ−Ｉ、共培養誘導。
【図９】単一培養における接着性グレードの肝細胞に比べて、同様又はより高い分泌レベルのアルブミン（左）及び尿素（右）を示す共培養の懸濁グレードの肝細胞を示す。両方の接着性及び懸濁グレードの肝細胞は、単一培養に比べて共培養のほうが高い機能的アルブミン及び尿素分泌を示した。Ｍｏｎｏ−Ｕ、単一培養非誘導；Ｍｏｎｏ−Ｉ、単一培養誘導；Ｃｏ−Ｕ、共培養非誘導；Ｃｏ−Ｉ、共培養誘導。
【図１０】通常のサンドイッチ培養条件（単一培養）下の約７日間の培養で保持されたヒト初代肝細胞を示す。接着性グレードの肝細胞の３つのバッチ及び懸濁グレードの肝細胞の３つのバッチを含む肝細胞の６つのバッチは、４週間の培養にわたって観察された。大部分の肝細胞は、培養約７日目に離れた。
【図１１】最大６週間保持された共培養の内皮細胞及び線維芽細胞の混合物上に播種された肝細胞を示す。１０倍の拡大。
【図１２】共培養における播種後４３日間の肝細胞の免疫細胞化学的染色を示す。アルブミン（右下）及びＣＤ３１（左下）の染色は、肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の地図的分布を示した。１０倍の拡大。
【図１３】６週間の培養にわたる単一培養のＣｙＰ４５０  ３Ａ４に比べて、共培養のＣｙＰ４５０  ３Ａ４のより高い活性レベルを示す肝細胞を示す。ＣｙＰ４５０  ３Ａ４の活性レベルは３週目にピークとなり、共培養では６週間代謝活性を維持し、単一培養では代謝活性が中断した。**，ｐ＜０．０１。
【図１４】毛細胆管へのＦＩＴＣ結合ＣＤＦＤＡの流出を画像化することによって、観察される共培養におけるヒト肝細胞からの機能的胆汁分泌を示す。１０倍の拡大。
【図１５】最大６週間保持された共培養条件下で、３つの別々のバッチ及びプールされた３つのバッチからの肝細胞を示す。肝細胞は、内皮細胞及び線維芽細胞の混合物に播種された翌日にＭＡＴＲＩＧＥＬで覆われた。１０倍の拡大。
【図１６】３つの異なるバッチからプールされた肝細胞を共培養において最大６週間保持することができたことを示す。肝細胞は内皮細胞及び線維芽細胞の混合物においてＭＡＴＲＩＧＥＬで覆われずに培養された。１０倍の拡大。
【図１７】ＭＡＴＲＩＧＥＬをタッピングしない共培養の肝細胞からのアルブミン（左）及び尿素（右）の分泌レベルは、ＭＡＴＲＩＧＥＬタッピングで共培養された肝細胞と同様であったことを示す。ＭＧ、ＭＡＴＲＩＧＥＬタッピング；ＭＧなし、ＭＡＴＲＩＧＥＬタッピングなし；Ｄ４、４日目；Ｄ７、７日目。
【図１８】ＭＡＴＲＩＧＥＬをタッピングしない共培養の肝細胞からのＣｙＰ４５０  ３Ａ４の発現レベルは、最大６週間ＭＡＴＲＩＧＥＬタッピングで共培養された肝細胞と同様であったことを示す。ＭＧ、ＭＡＴＲＩＧＥＬタッピング；ＭＧなし、ＭＡＴＲＩＧＥＬタッピングなし。
【図１９】ヒト初代肝細胞の３つの異なるバッチからのＣｙＰ４５０  ３Ａ４によって測定された代謝活性は、最大６週間の共培養における３つの異なるバッチからのプールされた肝細胞の代謝活性と同様であったことを示す。
【図２０】異なる源の内皮細胞が肝細胞培養を支持することを示す。不死化肝類洞内皮細胞（ＳＥＣ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の両方は肝細胞培養を支持することができた。
【図２１】不死化肝類洞内皮細胞（ＳＥＣ）又はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に共培養された肝細胞によるＣｙＰ４５０  １Ａ２及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４の類似の発現レベルを示す。Ｄ４、４日目；Ｄ７、７日目。
【図２２】不死化肝類洞内皮細胞（ＳＥＣ）又はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に共培養された肝細胞によるアルブミン及び尿素の類似のレベルを示す。Ｄ４、４日目；Ｄ７、７日目。
【図２３】異なる細胞比の共培養における肝細胞の形態を示す。ＨＨ、ヒト肝細胞；Ｆｂ、線維芽細胞；ＥＣ、内皮細胞。
【図２４】異なる比の内皮細胞及び線維芽細胞で共培養された肝細胞によるＣｙＰ４５０  １Ａ２及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４の発現レベルを示す。１２：１：１の肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の細胞混合物は、その他の比の細胞混合物に比べて、ＣｙＰ４５０  １Ａ２及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４の最も高い発現レベルを示す。ＣＴＲＬ、非誘導コントロール；Ｉｎｄ、誘導。
【図２５】複数のタイムポイントにおいて、共培養された肝細胞におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）についての細胞受容体としてのナトリウム・タウロコール酸共輸送体（ＮＴＣＰ）の発現レベルを示す。
【図２６】共培養における肝細胞及びフィーダー細胞の地図的分布を示す。細胞核の大きさは、画像の全体領域（左）及び肝細胞クラスター（右）から、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定された。
【図２７】本発明の一実施形態に記載の共培養システムの模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、播種された肝細胞並びにその調製及び用途を提供する。本発明は、内皮細胞及び線維芽細胞と共にヒト肝細胞を共培養することによって、ヒト肝細胞の接着能、機能的安定性及び培養寿命を改善するという発見に基づいている。
【００２４】
本明細書で使用される「播種された肝細胞」という用語は、表面又はフィーダー細胞層に直接的又は間接的に付着したヒト肝細胞を指す。本明細書で使用される「接着能（ｐｌａｔｅａｂｉｌｉｔｙ）」又は「接着性（ｐｌａｔｅａｂｌｅ）」という用語は、肝細胞がプラスチック又は処理された表面（例えば、培養容器又はマルチウェルプレート）等の表面に、肝細胞を表面に暴露して、例えば、所定の時間（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６又は１２時間）内に付着する能力を指す。肝細胞の接着能は、所定の時間内に、例えば、フィーダー細胞又は非細胞物質（すなわち、細胞ではない物質）を介して、直接的又は間接的に表面に付着することができる細胞の割合によって特徴付けることができる。
【００２５】
本明細書で使用される「フィーダー細胞」という用語は、肝細胞の生存及び機能の維持を補助する肝細胞以外の細胞を指す。フィーダー細胞の例として、線維芽細胞及び内皮細胞が挙げられる。非細胞物質は、化学化合物及び／又は生物分子であってもよい。非細胞物質の例として、細胞外マトリックスタンパク質、血液動態流条件、パラクリン及びオートクリン因子、接着性タンパク質、及び多糖類が挙げられる。
【００２６】
肝細胞は、細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％が例えば所定の時間内に表面に付着することができる場合、接着性と考えることができる。
【００２７】
肝細胞は、細胞のわずか７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％又は４０％の細胞しか例えば所定の時間内に表面に付着することができない場合、接着性がない、又は接着性に乏しいと考えることができる。
【００２８】
本明細書で使用される「肝細胞クラスター」という用語は、３次元構造の２つ以上の肝細胞の群を指す。肝細胞における肝細胞の少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％は、直接肝細胞間接触にあり得、ギャップ結合タンパク質（例えばコネキシン３２）又はタイトギャップ結合関連タンパク質（ｔｉｇｈｔ−ｇａｐ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えばオクルディン、ＺＯ−１、クローディン−１及びクローディン−４）の存在によって証明することができる。
【００２９】
細胞間相互作用及び細胞結合の他に、共培養システムにおける肝細胞の全体形状及び３次元構造は、細胞シグナル伝達経路及び正常遺伝子発現プログラムを含む正常な構造及び機能を維持する。共培養システムは、経時的に肝細胞の３次元構造及び形状を維持し、したがって、細胞間相互作用を高め、正常な肝表現型の喪失及び細胞伸展を防ぐ。対照的に
、特にサブコンフルエント条件で単一培養物として保持される肝細胞は、経時的に細胞形状及び構造を喪失し、周囲の間質細胞及びそれらの支持ＥＣＭ因子の非存在下で、伸展し始め、「より薄く」なる（高さを失う）。肝細胞の広範な細胞伸展による細胞形状の変質は、重要な機能の対応する減少及び喪失を示し始め、遺伝子発現プログラムが変化し、薬剤化合物に対する応答が変化する。
【００３０】
本明細書で使用される「機能的安定性」又は「機能的に安定な」という用語は、所定の時間における１つ以上の肝細胞の基本的な肝細胞の機能の安定性を指す。基本的な肝細胞の機能として、アルブミン及び尿素合成率、チトクロムＰ４５０酵素活性率、及び誘導性チトクロムＰ４５０レベルが挙げられる。肝細胞の機能的安定性は、ドナーから単離された後の最初の期間、例えば、最初の４〜６日間以内の、細胞の基本機能の割合によって最初に特徴付けることができ、所定の期間後も、例えば、続く１、２、３、４、５又は６日間又は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週間（例えば、最大２８又は４２日）、培地に維持される。肝細胞は、細胞の基本的な肝細胞の機能の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％が、５、１０、１５、２０又は２５％超の偏差なく、所定の期間後も保持される場合、機能的に安定と考えられる。
【００３１】
本明細書で使用される「培養寿命」という用語は、生存及び機能を維持する肝細胞の寿命を指す。表面に付着される細胞は、また、播種細胞としても呼ばれる。播種細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％は、所定の期間、例えば、１、２、３、４、５若しくは６日間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間、表面に付着して生存し続けることができる。生存肝細胞は、例えば、アルブミン及び尿素の産生及びチトクロムＰ４５０酵素活性によって証明されるように機能的である。
【００３２】
本明細書で使用される「肝細胞」という用語は、１つ以上のドナーから単離され、又は得られ、及び所定の継代数（例えば、０、１、２、３、４又は５つの継代）について培養されたことのない初代肝細胞を指す。本明細書で使用される「プールされた肝細胞」という用語は、２つ以上のドナーから単離され、その後混合される初代肝細胞を指す。肝細胞は、特定のジェノタイピング情報に基づいてドナーから選択することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「ドナー」という用語は、肝臓を有する生きている哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、ラット若しくはマウス等のげっ歯類、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はシカであってもよい。ドナーは、肝疾患若しくは病態、例えば、微小脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又は肝炎（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）をり患したヒトであってもよい。ＮＡＳＨ疾患の肝臓からの肝細胞は、サイトケラチン１８等のマーカーを発現し得る。
【００３４】
本明細書で使用される「内皮細胞」という用語は、任意の内皮細胞を指す。内皮細胞は、初代ヒト細胞、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であってもよい。内皮細胞は肝細胞でなくてもよい。内皮細胞は、臍帯、肝臓、肺、腎臓、脳、膵臓、リンパ節、心臓、腸又はその他の動脈、血管又は毛細血管から単離することができる。内皮細胞は増殖性でなくてもよい。内皮細胞は、初代細胞であり得又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の継代まで培養されてもよい。内皮細胞は不死でなくてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される「線維芽細胞」という用語は、任意の線維芽細胞を指す。線維芽細胞は初代ヒト細胞、例えば、ヒト皮膚線維芽細胞であってもよい。線維芽細胞は皮膚、肺、膀胱、角膜又はその他の組織種から単離することができる。線維芽細胞は肝細胞でな
くてもよい。線維芽細胞は増殖性でなくてもよい。線維芽細胞は、初代細胞である又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の継代まで培養されてもよい。線維芽細胞は不死でなくてもよい。
【００３６】
フィーダー細胞は、培養の７継代において、又は７継代の前に培養された皮膚線維芽細胞及びＨＵＶＥＣの不活性化及び凍結によって調製することができる。フィーダー細胞の不活性化は、マイトマイシンＣ又はガンマ照射で完了し、その後、ＰＣＮＡ又はＢｒｄＵ又は細胞計数の何れかによって検証することができる。不活性なフィーダー細胞は、バイアルにつき共培養の１つのプレートを調製するために凍結することができる。フィーダー細胞のそれぞれのロットに試験を行って、限定されないが、細胞数、生存率、細胞倍加時間、殺菌性及び純度等の品質基準を保証することができる。本明細書で使用される線維芽細胞及び内皮細胞は、本明細書で使用される肝細胞に全く干渉しない、又は少ない干渉を有し得る。本明細書で使用される「干渉」という用語は、肝細胞の通常の特徴、例えば、生物活性を指す。例えば、線維芽細胞及び内皮細胞は、約０％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、７％、１０％、２０％、３０％又は４０％しか共培養で使用される肝細胞のアルブミン分泌、代謝クリアランス、誘導、トランスポータ活性、又はその他の生物活性を有することができない。線維芽細胞及び内皮細胞は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の細胞生存率を有し得る。ＨＵＶＥＣ等の内皮細胞に対する線維芽細胞の比は、例えば、線維芽細胞マーカー（例えば、ＴＥ−７）及び内皮細胞マーカー（例えば、ＣＤ３１）によって証明されるように、約１：１０〜約１０：１の範囲、例えば、１：１、１：２、２：１又は任意のその他の所望の比にあってもよい。フィーダー細胞は、マイコプラズマ及びエンドトキシンを有しない場合がある。
【００３７】
本明細書で使用される「共培養」という用語は、培地に２つ以上の細胞種を含む培養物を指す。本明細書で使用される「肝細胞共培養物」という用語は培地における肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞であるフィーダー細胞を含む培養物を指す。肝細胞及びフィーダー細胞の細胞比は、約１：４０〜約４０：１の範囲にあり得、フィーダー細胞における線維芽細胞及び内皮細胞の細胞比は、約１：１０〜約１０：１の範囲にあり得る。肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の細胞比は、３：１：１、６：１：１、１２：１：１〜２４：１：１にあり得る。肝細胞及びフィーダー細胞の細胞比並びにフィーダー細胞における線維芽細胞及び内皮細胞の細胞比は、共培養において肝細胞の接着能又は寿命を改善するように調節することができる。
【００３８】
培地の細胞を含む組成物が提供される。細胞は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）及びフィーダー細胞からなり得、内皮細胞及び線維芽細胞を含み得る。肝細胞は接着性であってもよい。肝細胞は機能的に安定していてもよい。肝細胞は細胞寿命を有してもよい。
【００３９】
細胞は、一般的に、細胞の所望の特性（例えば、増殖）を促進するように開発された培地に培養される。肝細胞は、通常、所望の細胞濃度範囲内に肝細胞播種培地に培養される。線維芽細胞は、通常、所望の細胞濃度範囲内に線維芽細胞培地に培養される。内皮細胞は、通常、所望の細胞濃度範囲内に内皮細胞培地に培養される。肝細胞が内皮細胞及び線維芽細胞と共培養される場合、肝細胞播種培地、線維芽細胞培地及び内皮細胞培地は、細胞の播種及び／又は共培養に使用される共培養播種培地に寄与する。
【００４０】
内皮細胞及び線維芽細胞に対する肝細胞の所望の細胞比を達成するために、共培養播種培地の組成物は調節することができる。共培養播種培地は、肝細胞播種培地、線維芽細胞培地及び内皮細胞培地を約（５−３０）：（１−５）：（１−５）、例えば、約１０：１：１〜約２０：１：１の容量比で含み得る。一実施形態において、共培養播種培地は、１２：１：１の肝細胞培地、内皮細胞培地及び線維芽細胞の比を有し得、これは、１２部の
肝細胞播種培地、１部の内皮細胞培地及び１部の線維芽細胞培地を意味する。
【００４１】
肝細胞播種培地は、１０％の熱不活性ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ１００８２−１４７）、１倍のＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４５）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ１１３６０−０７０）、５μｇ／ｍＬのインスリン及び５μＭのデキサメタゾンを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ２１０６３−０２９）であってもよい。肝細胞播種培地は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  ＢＰ２９９１００）、１倍のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ３５０５００６１）、１倍のＩＴＳ−Ａ（Ｇｉｂｃｏ５１３００−０４４）及び１０μＭのデキサメタゾンを補充したＷＥＭ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉａ、Ｇｉｂｃｏ  Ａ１２１７６０１）であってもよい。
【００４２】
内皮細胞培地は、ＬｉｆｅＬｉｎｅから購入することができる。内皮細胞培地は、ＶａｓｕｌＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、５ｎｇ／ｍＬのｒｈ−ＦＧＦ−ｂ、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、２％のＦＢＳ、１０ｍＭのＬ−グルタミン、１５ｎｇ／ｍＬのｒｈ  ＩＧＦ−１、５ｎｇ／ｍＬのｒｈ  ＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬのｒｈ  ＶＥＧＦ及び０．７５Ｕ／ｍＬのヘパリン硫酸塩であってもよい。
【００４３】
線維芽細胞培地は、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ１１９９５−０６５）であってもよい。
【００４４】
一実施形態において、肝細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば、少なくとも８５％は、内皮細胞及び線維芽細胞の存在下で接着性である。別の実施形態において、肝細胞の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％未満、例えば、６０％未満は、内皮細胞及び線維芽細胞の非存在下で接着性であり得る。
【００４５】
組成物における肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）は播種することができる。播種された肝細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％、例えば、９０％は、所定の期間、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２又は４９日間、例えば、少なくとも７又は４２日間、表面に接着しながら生存し続けることができ、機能的であり続ける。
【００４６】
表面に播種されたヒト肝細胞を含む製造物が提供される。播種された肝細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば、少なくとも７０％がフィーダー細胞上の１つ以上の肝細胞クラスターにある。フィーダー細胞は、内皮細胞であり、線維芽細胞であり、表面に付着される。１つ以上の肝細胞クラスターの播種された肝細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば少なくとも９０％が、直接肝細胞間接触し得る。１つ以上の肝細胞クラスターは、表面の少なくとも４０％、５０％、６０％，７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば少なくとも５０％を覆い得る。表面は少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１００ｍｍの最短の直径を有し得る。
【００４７】
製造物は、さらに培地を含み得る。培地は、肝細胞播種培地、内皮細胞培地及び線維芽細胞培地の混合物であってもよい。播種された肝細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば、少なくとも９０％は、少なくとも３、４、５、６、７、１４、２１、２８又は４２日間、表面に残る。
【００４８】
播種された肝細胞は、肝細胞の１つ以上の基本的な肝細胞機能を示すことができる。例
えば、播種された肝細胞は、アルブミンを産生し、及び／又はチトクロムＰ４５０を発現することができる。
【００４９】
内皮細胞はヒト細胞であってもよい。例えば、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。内皮細胞は肝細胞でなくてもよい。内皮細胞は増殖性でなくてもよい。内皮細胞は、初代細胞であり得又は３、４、５、６、７、８、９、１０、例えば７継代まで培養されてもよい。内皮細胞は不死でなくてもよい。
【００５０】
線維芽細胞はヒト細胞であってもよい。線維芽細胞はヒト皮膚線維芽細胞であってもよい。線維芽細胞は肝細胞でなくてもよい。線維芽細胞は増殖性でなくてもよい。線維芽細胞は、初代細胞であり得又は３、４、５、６、７、８、９、１０、例えば７の継代まで培養されてもよい。線維芽細胞は不死でなくてもよい。
【００５１】
製造物において、播種された肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞は、肝細胞の接着能を改善する任意の細胞比、例えば、３：１：１、６：１：１、１２：１：１〜２４：１：１を有し得る。
【００５２】
播種された肝細胞は、１つ、２つ以上のドナーから得ることができる。それぞれのドナーは、肝疾患又は障害、例えば、微小脂肪変性及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をり患し得る。
【００５３】
播種されたヒト肝細胞を調製する方法が提供される。調製方法は、ヒト肝細胞をフィーダー細胞の存在下、表面に適用し、フィーダー細胞は、内皮細胞及び線維芽細胞であり、適用工程の後に、適用された肝細胞をフィーダー細胞と共培養し、及び表面に付着されるフィーダー細胞上の共培養された肝細胞によって、１つ以上の肝細胞クラスターを形成することを含む。共培養された肝細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば少なくとも７０％は、１つ以上の肝細胞クラスターにある。
【００５４】
適用される肝細胞は、フィーダー細胞の非存在下で、表面に７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％又は４０％未満、例えば６０％未満の接着能を有し得る。適用される肝細胞は、フィーダー細胞の非存在下で、表面に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％、例えば少なくとも８５％の接着能を有し得る。
【００５５】
１つ以上の肝細胞クラスターは、表面の少なくとも４０％、５０％、６０％，７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば少なくとも５０％を覆い得る。表面は少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１００ｍｍの最短の直径を有し得る。１つ以上の肝細胞クラスターの播種された肝細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００、例えば少なくとも９０％が、直接肝細胞間接触し得る。
【００５６】
播種された肝細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％、例えば、少なくとも９０％は、内皮細胞及び線維芽細胞の存在下で、所定の期間、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２又は４９日間、例えば、少なくとも７又は４２日間、接着したままであり、すなわち、表面に接着したままである。肝細胞は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１日程度、例えば、３日程度しか内皮細胞及び線維芽細胞と共培養しなくてもよい。
【００５７】
本発明の調製方法に従って、内皮細胞及び／又は線維芽細胞は、肝細胞が表面に付着す
る前、付着するとき、又は付着後に表面に付着することができる。内皮細胞及び／又は線維芽細胞は、共培養工程の前、間に表面に付着することができる。
【００５８】
調製方法は、追加の細胞外マトリックスタンパク質を除外してもよい。追加の細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲンマトリックス、例えば、ＢｉｏＣｏａｔ、又はラット尾コラーゲン、ＨｕＧｅｎｔｒａ  Ｍａｔｒｉｘ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ及びＨｕＢｉｏｇｅｌから成る群から選択することができる。
【００５９】
調製方法は、さらに、播種された肝細胞を凍結することを含む。
【００６０】
それぞれの調製方法について、調製される播種された肝細胞が提供される。
【００６１】
医薬物質の試験を行う方法が提供される。方法は、播種された肝細胞の特性を変化させるのに有効な量の医薬物質を播種された肝細胞に投与することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。医薬物質は、小分子、抗体、生ウイルス（Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎）、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド及び細胞から成る群から選択され得る。
【００６２】
薬剤代謝を試験する方法が提供される。方法は、有効量の薬剤を、播種された肝細胞に投与することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。本明細書で使用される「薬剤代謝」という用語は、薬剤の転換又はクリアランスを指す。方法は、さらに、播種された肝細胞における薬剤の量を決定することを含む。
【００６３】
薬剤輸送を試験する方法が提供される。方法は、有効量の薬剤を、播種された肝細胞に投与することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。方法は、さらに、播種された肝細胞における薬剤の細胞取込及び分布を決定することを含む。
【００６４】
薬剤の毒性を試験する方法が提供される。方法は、有効量の薬剤を、播種された肝細胞に投与することを含む。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。方法は、さらに、毒性イベントを検出することを含む。毒性イベントの検出は、残っている生存播種肝細胞の減少した割合によって証明することができる。
【００６５】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染肝細胞培養モデルを調製する方法が提供される。方法は、播種された肝細胞にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を接種し、感染した播種された肝細胞を少なくとも７、１４又は２１日間、例えば、１４日間インキュベートすることを含む。ＨＢＶ感染肝細胞培養モデルが調製される。播種された肝細胞は、本発明の製造物にあってもよく、又は本発明の方法に従って調製されてもよい。方法は、さらに、肝特異的胆汁酸輸送体、例えば、肝細胞のナトリウム・タウロコール酸共輸送体（ＮＴＣＰ）の転写又は発現レベルを決定し、所望の転写又は発現レベルのＮＴＣＰを有する肝細胞のバッチを選択し、本発明の方法に従って、肝細胞の選択されたバッチを播種し、その後、播種された肝細胞をＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に接種させる。タンパク質マトリックスで覆うことは、ウイルス接種効率を増加させるために、本発明では必要とされない場合がある。所望のＮＴＣＰレベルを有する懸濁グレード肝細胞バッチは、ＨＢＶ接種に使用され得、長期の培養研究に適する場合がある。
【００６６】
本発明に従って肝細胞を播種するキットが提供される。キットは、初代肝細胞を含む第１の凍結保存バイアル、内皮細胞を含む第２凍結保存バイアル、線維芽細胞を含む第３凍
結保存バイアル、並びに本発明の方法に従って、初代肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞で播種されたヒト肝細胞を調製する説明書を含む。第２凍結保存バイアル及び第３凍結保存バイアルは同じであってもよい。第１凍結保存バイアル、第２凍結保存バイアル及び第３凍結保存バイアルは同じであってもよい。キットは、１つのドナーからの肝細胞凍結保存バイアル又は複数のドナーからの肝細胞凍結保存バイアルを含み得る。キットは、肝細胞共培養システムについて、試験結果又は分析証明書（ＣＯＡ）を含む。キットは、調製方法のための使用説明書プロトコルを含む。キットは、肝細胞、線維芽細胞及び内皮細胞を解凍、播種及び培養するための培地を含む。
【００６７】
肝細胞共培養システムを調製する方法が提供される。方法は、ドナーの肝臓から肝細胞を単離し、単離された肝細胞に線維芽細胞及び内皮細胞を加え、線維芽細胞及び内皮細胞と混合された肝細胞を凍結することを含む。方法は、さらに、培地において細胞を増殖することを含み、細胞は、肝細胞、線維芽細胞及び内皮細胞からなる。ドナーは、動物、好ましくはヒトであってもよい。
【００６８】
使用準備済の肝細胞共培養システムが提供される。共培養肝細胞システムは、ＥＣＭ基質コーティング、培養ウェルの表面に付着される線維芽細胞及び内皮細胞層、並びに線維芽細胞及び内皮細胞又は細胞層に付着される肝細胞層を有する、又は有しない培養ウェルを有する組織培養プレートを含み、肝細胞クラスター又は肝細胞の島を形成する。肝細胞の島としても知られる肝細胞クラスターは、線維芽細胞及び内皮細胞に播種又は共に播種された後に自己組織化される。肝細胞クラスター又は肝細胞島の内部の肝細胞は、直接肝細胞間接触を維持する。及び肝細胞は、カドヘリン及びコネキシン等の肝細胞間接着分子を産生する。共培養システムの７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％超の肝細胞は、肝細胞クラスターに分布し、直接肝細胞間接触を維持する。培養ウェルの表面の２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％超は、肝細胞クラスターによって覆われる。本明細書で使用される肝細胞は、１つのドナー、又は複数のドナーに由来することができる。及び共培養システムの内皮細胞は、培養の間、容器様構造を形成し得る（図２７）。
【実施例】
【００６９】
実施例１ 共培養ヒト肝細胞
ヒト初代肝細胞はヒト皮膚線維芽細胞及び内皮細胞と共培養され、特徴付けられた。この例において、懸濁グレードの肝細胞は、７０％未満の接着能を有し、接着性グレードの肝細胞は少なくとも７０％の接着能を有した。
【００７０】
１．方法
１．１ ヒト初代肝細胞の単離及び冷凍保存
ヒト初代肝細胞は、ヒトドナーから単離され、その後、液体窒素に保存された。
【００７１】
１．２ ヒト皮膚線維芽細胞及び内皮細胞の源
ヒト皮膚線維芽細胞は成人の皮膚から単離され、ＴＥ−７発現によって特徴付けられる。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、臍帯から単離され、ＣＤ３１及び内皮（ＶＥ）−カドヘリン発現によって特徴付けられる。不死化ヒト肝類洞内皮細胞（ＳＥＣ）はａｂｍ  Ｉｎｃ．から購入された。皮膚線維芽細胞及び内皮細胞の両方は、１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含む継代＃０又は＃１の凍結培地で凍結された。
【００７２】
１．３ 共培養の不活性フィーダー細胞層の調製
成人の皮膚線維芽細胞は増殖され、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）高グルコースにおいて集密度まで増殖された。ＨＵＶＥＣ及びＳＥＣの両方は、Ｌｏｎｚａから購入された内皮細胞増殖培地において、集密
度になるまで増殖された。集密度になると、細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）又はトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）による酵素消化によって継代された。何れかの酵素は細胞を組織培養表面から離すために使用され、細胞の懸濁液を形成し、計数することができた。懸濁液の細胞は、その後、細胞懸濁液の容量を増やし、細胞懸濁液を以前播種されたときよりも大きい表面積の組織培養プラスチックに移動することによって、より低い密度で播種された。細胞は、１０，０００〜１５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種され、約５〜７日毎に、集密度に達成すると継代された。細胞は、最大５回継代され、その後、有糸分裂的に不活性にされ、凍結された。
【００７３】
マイトマイシンＣ又はガンマ照射は、二重鎖の破壊を引き起こすことによって細胞を不活性にするので、マイトマイシンＣが、集密度な線維芽細胞及び／又は内皮細胞を不活性にするために使用された。不活性細胞は、有糸分裂的に不活性になり、増殖しなかった。端的には、細胞は、ダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で３回リンスされ、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃で３時間インキュベートされ、その後、ＤＰＢＳで３回リンスされた。不活性の後、線維芽細胞及び内皮細胞は、細胞数についてＴｒｙｐＬＥで直ぐに分離され、その後、冷凍保存培地で１〜２百万細胞／ｍｌの濃度で再懸濁された。細胞は、その後凍結保存バイアルに分注され、−８０℃で一晩保存された。翌日、細胞は、長期保存のために、液体窒素条件に移された。
【００７４】
１．４ 懸濁グレード及び接着性グレードのヒト肝細胞を不活性フィーダー細胞、内皮
細胞及び線維芽細胞の混合物に播種
ヒト皮膚線維芽細胞及び内皮細胞から成るフィーダー細胞は解凍され、コラーゲンコーティング（ＢｉｏＣｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）又はマトリックスコーティングされていない通常の組織培養プラスチック２４若しくは９６ウェルプレートのいずれかに２５，０００細胞／ｃｍ２播種された。試験対象のフィーダー細胞の密度は、１２，５００細胞／ｃｍ２〜１００，０００細胞／ｃｍ２であった。
【００７５】
フィーダー細胞を播種してから３０分後、初代ヒト肝細胞が１５０，０００細胞／ｃｍ２播種された（模式図＃１）。伝統的に、肝細胞はコラーゲンコーティングされた組織培養プレートに２５０，０００細胞／ｃｍ２播種された。肝細胞の細胞密度は、共培養システムに調節されて、多少の肝細胞の相互作用を可能にし、肝細胞の付着率を説明することができる。あるいは、フィーダー細胞及び肝細胞は、肝細胞及びフィーダー細胞を均一な懸濁液に混合し、その後フィーダー細胞及び肝細胞をコラーゲンコーティングされたプレートに一緒に播種することによって、一緒に播種することができる（模式図＃２）。肝細胞を播種してから４〜６時間後、培地は交換されて、付着していない細胞及び細胞デブリを除去した。培地を交換する前のインキュベーション時間又は振盪条件は、培養プレートの種類（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、又は３８４ウェルプレート）によって変えることができる。
【００７６】
肝細胞を播種してから１６〜２０時間後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ等の余剰な細胞マトリックスは、培地上で肝細胞の成熟誘導のためにタッピングされた。培養プラットフォームは、余剰な細胞マトリックスを添加することなく成功した。
【００７７】
１．５ 共培養条件下の肝細胞の長期培養
伝統的な接着性肝細胞単一培養モデルは、最大７日間の培養を可能にし、高グレート肝細胞の分析を可能にし、それらの膜の崩壊によって伸展を開始し始め、それらの機能性を喪失するに至る。接着性グレートの肝細胞及び懸濁グレードの肝細胞は共培養モデルのフィーダー細胞に播種されて、最大６週間、それらの形態及び機能が研究された。培地は培養期間にわたり毎日交換された。肝細胞培地は、ＨＥＰＥＳ（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｇｌｕｔ
ａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、ＩＴＳ＋（インスリン、トランスフェリン、セレン複合体、ＢＳＡ及びリノール酸、Ｇｉｂｃｏ）、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、及びＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含んだ。
【００７８】
６週間の培養にわたり、共培養の肝細胞は、培地１２：１：１のＨＨＣＭと共に毎日与えられ、この培地は、それらの典型的な立方体形態、毛細胆管形成、ＣｙＰ４５０酵素活性並びにアルブミン及び尿素分泌の試験において、１２：１：１の容量比の肝細胞培地、内皮細胞培地及び線維芽細胞培地の混合物である。
【００７９】
１．６ 複数のドナーから肝細胞をプールすることによりドナー間の変動を除去
肝細胞は、多くはドナーに起因して、それらの付着率、形態、タンパク質発現及び酵素機能性が変化している。懸濁グレード又は接着性グレードに関わらず、複数のドナーからの肝細胞は、プールがこれらの変動のいくつかを減少又は除去するかどうかを決定するためにプールされた。３〜１０以上の異なるドナーからの肝細胞は個別に解凍され、数えられ、及び等量に一緒に混合された。プールされた肝細胞及び各ドナーからの肝細胞は、１５０，０００細胞／ｃｍ２で線維芽細胞及び内皮細胞のフィーダー層に個別に播種された。肝細胞は肝細胞が解凍される前後に一緒にプールされた。
【００８０】
１．７ 共培養条件における肝細胞の特徴付け
懸濁又は接着性グレードの肝細胞は、２５，０００細胞／ｃｍ２で不活性フィーダー細胞に播種され、６週間共培養された。それらの典型的な立方体及び多核肝細胞形態は、６週間の培養にわたり、毛細胆管における５−（及び−６）−カルボキシ−２’、７’−ジクロロ−フルオレセインジアセタート（ＣＤＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の流出によって可視化された。
【００８１】
１．８ 共培養肝細胞のＣｙＰ４５０活性
共培養された肝細胞のＣｙＰ４５０  １Ａ２、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６、及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性は、製造者の説明書に従うことによってＰｒｏｍｅｇａのＰ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイで分析された。試料は、ＣｙＰ４５０  １Ａ２については１００μＭのオメプレゾール、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６については１００ｎＭのＣＩＴＣＯ、及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４については２５μＭのリファンピシンによって、４８時間誘導された。
【００８２】
複数週間の試験を行う場合、試料は５日間で回収することができ、その後、培地は、分析前の別の４８時間、誘導培地に切り替えられた。誘導及び非誘導試料の活性レベルは６週間分析された。
【００８３】
１．９ タンパク質及び遺伝子発現
使い古された培地試料は回収され、６週間の培養にわたり、共培養された肝細胞からアルブミン及び尿素レベルについて評価された。アルブミン、尿素、ＣｙＰ４５０  １Ａ２、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４についての遺伝子発現レベルは、６週間の培養にわたり、毎週評価された。共培養肝細胞は、培養から１週間、２週間及び６週間後に固定され、アルブミン、ＣＤ３１、ＣＤ９０、ＣｙＰ４５０  １Ａ２、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４が染色された。
【００８４】
１．１０ 毛細胆管形成
５−（及び−６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロ−フルオレセインジアセタート（ＣＤＦＤＡ）の流出は、共培養された肝細胞の内部の蛍光顕微鏡下で可視化された。共培養された肝細胞はＤＰＢＳ（−Ｃａ／−Ｍｇ）で２回リンスされ、その後、３：１：１のＨＨＣＭで３７℃でインキュベートされ、５％のＣＯ２で１０分間インキュベートされ、その後、３７℃の５μＭのＣＤＦＤＡ、５％のＣＯ２を含む３：１：１のＨＨＣＭで２
０分間インキュベートされた。細胞は、その後、ＤＰＢＳ（−Ｃａ／−Ｍｇ）で２回リンスされ、フェノールレッドのない完全培地で画像化された。
【００８５】
２．内皮細胞及び線維芽細胞の混合物におけるヒト肝細胞共培養の模式図：細胞培養物及びタイムフレームによる分析
２．１ 模式図＃１
模式図＃１において、ヒト初代肝細胞は、フィーダー細胞として内皮細胞及び線維芽細胞の混合物で事前に播種された表面に播種された（図１）。
【００８６】
フィーダー細胞を播種してから３０〜６０分後、肝細胞がフィーダー細胞に添加されて、３：１：１の容量比の肝細胞播種培地、内皮細胞培地及び線維芽細胞培地の播種培地混合物、３：１：１のＨＨＰＭとも呼ばれる、において、３：１：１の細胞比の肝細胞、内皮細胞及び線維芽細胞を有する肝細胞共培養物を確立した。共培養された細胞は３７℃で５％のＣＯ２に置かれ、肝細胞共培養物の最初に時間に、１５分毎に４回、Ｎ−Ｓ及びＥ−Ｗの様式で振盪された。
【００８７】
肝細胞の播種から４〜６時間後、播種培地混合物は、３：１：１の容量比の内皮細胞培地、線維芽細胞培地及び肝細胞培地の培地混合物に変えた。
【００８８】
肝細胞を播種してから２０〜２４時間後、培地混合物は、使い古された培地になり、３：１：１の容量比の肝細胞播種培地、内皮細胞培地、及び線維芽細胞培地の新鮮な混合物、３：１：１のＨＨＣＭとも呼ばれる、に交換された。ＭＡＴＲＩＧＥＬ等の細胞外マトリックスが、培地混合物に希釈され、細胞に加えられた場合、培地混合物は、続いて、新鮮な３：１：１のＨＨＣＭに毎日交換した。
【００８９】
チトクロムＰ４５０（ＣｙＰ４５０）レベルは、４日目又は７日目のいずれかにＰｒｏｍｅｇａのＰ４５０Ｇｌｏ（商標）アッセイで決定された。
【００９０】
毛細胆管は、ＣＤＦＤＡの流出によって、１週間のアッセイの５日目に可視化された。このアッセイは、延長された培養にわたり、複数回繰り返すことができた。
【００９１】
タンパク質発現は、免疫細胞化学的（ＩＣＣ）染色及びＥＬＩＳＡによって検出された。ＥＬＩＳＡを使用して、アルブミン及び尿素を検出し、定量化した。ＥＬＩＳＡは２４時間の培養後に回収された３００μｌの使い古された培地において実施された。誘導されていない及び誘導された試料は、長期培養にわたり、７日目及び様々なタイムポイントに、ＩＣＣについて固定された。細胞試料は、また、後のＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析についてＴｒｉｚｏｌで急速凍結された。
【００９２】
２．２ 模式図＃２
模式図＃２において、ヒト初代肝細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞が一緒に播種された（図２）。模式図＃２は、模式図＃１と同一であるが、ただし、凍結前に非増殖フィーダー細胞がヒト肝細胞と混合され、その後、同時に復活し、遠心分離にかけられ、再懸濁され、肝細胞の意図される適用及びグレードに依存して、１００，０００細胞／ｃｍ２〜７７５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、コラーゲンコーティングされた組織培養プラスチックプレートに播種された。
【００９３】
３．共培養された肝細胞対単一培養された肝細胞
ヒト初代肝細胞は、フィーダー細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の混合物に播種されて、模式図＃１又は２の下、共培養物を確立し、又はフィーダー細胞の非存在下、表面に播種されて、単一培養を確立した。模式図＃１又は２の下、調製された共培養された肝細胞の
肝細胞特性（例えば、形態又は遺伝子発現）の有意差はなかった。模式図＃１又は２の下、共培養された肝細胞は、単一培養された肝細胞よりも良好な肝細胞特性（例えば、形態又は遺伝子発現）を示した。
【００９４】
共培養された肝細胞は、単一培養された肝細胞よりも良好な培養寿命及びより肝細胞の形態を示した（図３）。
【００９５】
共培養された肝細胞は、７日目に、単一培養された肝細胞よりも、ＣｙＰ４５０  １Ａ２、ＣｙＰ４５０  ２Ｂ６及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４の非常に高い遺伝子発現を示した（図４）。
【００９６】
共培養された肝細胞は、７日目に、単一培養された肝細胞よりも、４８時間の誘導後に高いＣｙＰ４５０  １Ａ２活性及びＣｙＰ４５０  ２Ｂ６活性を示した。さらに、７日目に、共培養された肝細胞は、単一培養された肝細胞と同様の誘導されたＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性を示した（図５）。
【００９７】
共培養された肝細胞は、単一培養された肝細胞に比べて、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、２週間の培養の間、非常に高いレベルのアルブミン及び尿素を分泌した（図６）。
【００９８】
４．共培養された懸濁グレードヒト初代肝細胞対単一培養された接着性グレード肝細胞の改善された性能
懸濁グレードとして特徴付けられた肝細胞は、複数日間、集密度の単層を維持することができない。より多くの細胞を添加することでドナーの付着率を調節することは、肝細胞の付着及びコンフルエンスを改善しない。より多くの肝細胞が播種されて、特定のドナーの付着率を調節しても、追加のデブリが細胞は付着するのを妨げると考えられる。懸濁グレードの肝細胞の付着する能力がないことは、典型的な肝細胞の形態又は機能を示すことを妨げる。肝細胞共培養物の線維芽細胞及び内皮細胞から成るフィーダー細胞層の追加は、懸濁グレードの肝細胞の付着、形態及び機能性を改善した（図７〜９）。
【００９９】
共培養された懸濁グレードのヒト初代肝細胞の大部分は、接着したままであり、単一培養された懸濁グレードのヒト初代肝細胞の大部分は、付着せず、又は４日目まで表面から離れた（図７）。
【０１００】
共培養された肝細胞は、また、単一培養された肝細胞を上回る細胞機能の改善を示した。共培養された懸濁グレードの肝細胞は、４日目及び７日目に、単一培養された懸濁グレードの肝細胞よりもＣｙＰ４５０  １Ａ２活性及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性の改善を示し、７日目を通じて高いレベルを維持した。共培養された懸濁グレードの肝細胞のＣｙＰ４５０  １Ａ２活性は、４日目及び７日目に、単一培養された接着性グレードの肝細胞と同様であった。共培養された懸濁グレードの肝細胞のＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性は、４日目及び７日目に、接着性グレードの肝細胞よりも高かった（図８）。共培養された懸濁グレードの肝細胞及び接着性グレードの肝細胞は、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、単一培養された懸濁グレードの肝細胞及び接着性グレードの肝細胞よりも高いアルブミン及び尿素発現を示し、維持した。共培養された懸濁グレード肝細胞は、４日目及び７日目に、単一培養された接着性グレードの肝細胞よりも高いアルブミン及び尿素発現を示した（図９）。
【０１０１】
５．共培養された肝細胞の寿命、形態、マーカー発現、代謝活性及び機能的胆汁分泌
単一培養された懸濁グレードのヒト初代肝細胞の大部分は表面に付着せず、表面に付着しなかった肝細胞は、培地において最大１週間後に表面から離れ始めた。接着性グレード
の肝細胞は、最初、高効率で表面に付着したが、表面から離れ、培養７日目までにそれらの立方体形態を喪失し始めた。接着性肝細胞は、培養１１日目超の間、付着し続けなかった（図１０）。
【０１０２】
共培養された懸濁グレードの肝細胞は、６週間以上維持された。線維芽細胞及び内皮細胞の非増殖フィーダー層状の小型の島に６週間付着し続けた肝細胞については立方体の肝細胞の形態が明白に維持された（図１１）。より長いタイムポイントは試験されなかった。肝細胞とフィーダー細胞との相互作用は、アルブミン及びＣＤ３１染色によって可視化された。肝細胞は、細胞の複雑なネットワークとして、支持フィーダー層に統合された。肝細胞の機能は、アルブミン及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４染色によって可視化されるように、このネットワークに保持された（図１２）。共培養された懸濁グレードの肝細胞のＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性は６週間保持された。共培養された懸濁グレードの肝細胞の高い活性は、サンドイッチ単一培養物として培養された同肝細胞の低いＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性とは対照的であった（図１３）。共培養された懸濁グレード肝細胞は発現し、６週間の培養の間、毛細胆管の機能的ネットワークを維持した（図１４）。
【０１０３】
６．共培養された肝細胞の寿命：ＭＡＴＲＩＧＥＬの存在下又は非存在下の共培養における肝細胞の成熟誘導
共培養された肝細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ又は任意のその他の細胞外マトリックスを必要とせず、それらの形態、機能又は寿命を維持した。ＭＡＴＲＩＧＥＬのある場合及びない場合の共培養された懸濁グレードの肝細胞の形態は、１〜６週間にわたって、酷似した（図１５及び１６）。ＭＡＴＲＩＧＥＬのある場合及びない場合の肝細胞は、小型の細胞の島及びそれらのフィーダー層を有するネットワークを形成した。フィーダー細胞と肝細胞との相互作用は、培養から６週間後にＩＣＣによって可視化され、毛細胆管が６週間観察された（データ示さず）。ＭＡＴＲＩＧＥＬのある場合及びない場合で培養された肝細胞において、形態の差は観察されなかった。ＭＡＴＲＩＧＥＬの存在は、共培養された肝細胞の機能性に影響しなかった。アルブミン及び尿素の濃度並びにＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性は、ＭＡＴＲＩＧＥＬのある場合及びない場合の共培養された肝細胞の６週間の培養において一定を維持した（図１７及び１８）。
【０１０４】
異なるドナーからの単一培養及び共培養された肝細胞は、形態、タンパク質発現及び酵素活性において著しい変化を示した。複数のドナーからの肝細胞は、一緒にプールされて、これらの変化を正規化することができた。共培養システムにおける３つのドナーからのプールされた肝細胞の付着率、集密度及び脂質蓄積は、正規化されたように見えた（図１５及び１６）。プールされた肝細胞のＣｙＰ４５０  ３Ａ４酵素活性は、個別のドナーからの肝細胞と比較する場合、平均又は僅かに平均よりも高く見えた（図１９）。３つ以上のドナーからの肝細胞をプールする正規化効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の適用に有用である。
【０１０５】
フィーダー層は、内皮細胞及び線維芽細胞の複数の種類からなってもよい。類洞内皮細胞又はＨＵＶＥＣを含むフィーダー細胞層における共培養されたヒト肝細胞の形態及び機能が比較された。形態（図２０）、ＣｙＰ４５０活性（図２１）又はアルブミン及び尿素（図２２）の分泌において有意差は観察されなかった。
【０１０６】
７．共培養された肝細胞の細胞混合物の最適比
１２，５００細胞／ｃｍ２〜１００，０００細胞／ｃｍ２のフィーダー層の密度が共培養システムにおいて試験された。異なるフィーダー細胞の密度における個別の肝細胞の形態は同様に見えたが、より低い密度のフィーダー細胞は、より多くの肝細胞間相互作用を可能にした（図２３）。１２，５００細胞／ｃｍ２（２４：１：１）又は２５，０００細胞／ｃｍ２（１２：１：１）のフィーダー細胞の密度で共培養された肝細胞は、５０，０
００細胞／ｃｍ２（６：１：１）又は１００，０００細胞／ｃｍ２（３：１：１）のより高い密度の肝細胞よりも、高いＣｙＰ４５０  １Ａ２活性及びＣｙＰ４５０  ３Ａ４活性を示した（図２４）。
【０１０７】
８．肝細胞の共培養についての複数の種類の培養プレート
２４又は９６ウェルプレートの何れかの内皮細胞及び線維芽細胞において共培養された肝細胞は、形態（図２５、左及び中央パネル）、アルブミン分泌のレベル（図２６）及びバイオマーカー発現（図２７）等の同様の特徴を示した。コラーゲンコーティングされていない一般的な組織培養プラスチックにおいて共培養された肝細胞は、コラーゲンコーティングされたＢｉｏＣｏａｔプレートにおいて共培養された肝細胞に比べて、同様の形態（図２５、右パネル）及びバイオマーカー発現パターン（図２７）を示した。
【０１０８】
懸濁グレードの肝細胞のみを共培養したが、接着性グレードの肝細胞が６週間以上同様の高グレードの形態及び機能を維持することが予想される。より高いグレード細胞は、互いに及びフィーダー細胞とより迅速に、より複雑なネットワークを発現さえし得ることが予想される。
【０１０９】
実施例２ ＨＢＶ感染モデル（ＮＴＣＰ発現）
ＮＴＣＰ（ナトリウム／タウロコール酸共輸送体）発現は、肝細胞によるＨＢＶの取込に必要である。共培養された肝細胞は、免疫細胞化学で検出されるＮＴＣＰを７、１１、１４、１９及び２１日目に発現することが判明した。細胞は固定され、透過性にされ、及び１：１００の濃度で、４℃で一晩、一次抗体ＳＬＣ１０Ａ１（ａｂｃａｍ  １３１０８４）でインキュベートされた。二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１００８）は、１：１０００の濃度で、４℃で１時間インキュベートされて、一次抗体を検出した。細胞はＨｏｅｃｈｓｔで対比染色された。ＮＴＣＰ発現は、ＢＭＧ  ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒで、４８３ｎｍ及び５３０ｎｍで、全ウェル蛍光スキャニングで定量化された（図２５）。したがって、ＮＴＣＰ発現は、２週間、共培養された肝細胞によって維持された。
【０１１０】
実施例３ 細胞及び培地についての最適な比
１平方センチメートルあたり１２，５００、２５，０００、５０，０００及び１００，０００細胞のフィーダー細胞播種密度の肝細胞付着及びクラスター形成について試験が行われた。１平方センチメートルあたり１５０，０００、２５０，０００、３７５，０００細胞の肝細胞播種密度が試験された。肝細胞培地、内皮細胞培地及び線維芽細胞培地の培地の比の理想的な細胞比についても試験が行われた。１平方センチメートルあたり１２，５００〜２５，０００細胞のフィーダー細胞比及び１平方センチメートルあたり１５０，０００細胞の肝細胞播種密度が最も高い付着率、クラスター形成及び肝細胞機能を示した。細胞比に合う培地の比は、また肝細胞の形態及び機能を最大に支持することが見つけられた。
【０１１１】
実施例４ 肝細胞クラスター
線維芽細胞及び内皮細胞から成るフィーダー細胞の層は、フィーダー細胞が播種された後の数分以内に、組織培養プラスチック表面に付着した。フィーダー細胞は、フィーダー細胞が伸展し、遊走し、組織培養プラスチック表面を覆うのに充分な低密度で播種された。肝細胞は、その後、フィーダー細胞の上部に付着し、互いに遊走し、クラスター肝細胞を形成した。この肝細胞の遊走は、肝細胞の特徴に依存して、最初の時間又は最大４８時間以内に発生した。肝細胞クラスターが形成されると、隣接する肝細胞は毛細胆管及びタイトな結合を形成した。毛細胆管は、４日目に開始するＣＤＦＤＡの流出によって可視化された。連結タンパク質帯状オクルディン１、コネキシン−３２は、免疫細胞化学を使用して７日目に可視化された。クラスターにおける肝細胞の少なくとも９０％は、タイトな
ギャップ結合を示し、直接肝細胞間接触を示す。
【０１１２】
実施例５ クラスターの測定値
接着性品質の肝細胞は、全ての細胞領域に比べて、全体領域及び肝細胞クラスターによって占有されない領域の核の特徴の分析によって評価された。懸濁品質の肝細胞は、全ての細胞培養領域に比べて、クラスターによって占有される領域を分析することによって評価された。フィーダー細胞及び肝細胞は、それらのそれぞれの核の大きさによって分化された。線維芽細胞及び内皮細胞は、肝細胞よりも大きい平均核サイズを有する。フィーダー細胞の平均核サイズは、共培養のフィーダー細胞単独の核サイズを測定することによって確立された。平均フィーダー細胞＋１つの標準偏差の閾値を使用して、肝細胞とフィーダー細胞とを区別した。使用される閾値は、３４５ピクセル＾２未満の肝細胞核領域であった。全ての測定値は、ＩｍａｇｅＪで取られた（図２６）。
【０１１３】
本明細書に記載される全ての書類、本、マニュアル、論文、特許、出願された特許出願、ガイド、要約及び／又はその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本発明のその他の実施形態は、本明細書に開示される本発明の明細書及び実施の考慮から、当業者に明らかである。本明細書及び実施例は、本発明の真の範囲及び趣旨が以下の請求項によって示されながら、例示に過ぎないと考えられることが意図される。
【図１】
2020534018.tif 000003
【図２】
2020534018.tif 000004
【図３】
2020534018.tif 000005
【図４】
2020534018.tif 000006
【図５】
2020534018.tif 000007
【図６】
2020534018.tif 000008
【図７】
2020534018.tif 000009
【図８】
2020534018.tif 000010
【図９】
2020534018.tif 000011
【図１０】
2020534018.tif 000012
【図１１】
2020534018.tif 000013
【図１２】
2020534018.tif 000014
【図１３】
2020534018.tif 000015
【図１４】
2020534018.tif 000016
【図１５】
2020534018.tif 000017
【図１６】
2020534018.tif 000018
【図１７】
2020534018.tif 000019
【図１８】
2020534018.tif 000020
【図１９】
2020534018.tif 000021
【図２０】
2020534018.tif 000022
【図２１】
2020534018.tif 000023
【図２２】
2020534018.tif 000024
【図２３】
2020534018.tif 000025
【図２４】
2020534018.tif 000026
【図２５】
2020534018.tif 000027
【図２６】
2020534018.tif 000028
【図２７】
2020534018.tif 000029
【国際調査報告】
2020534018.tif 000030
2020534018.tif 000031