(57)【要約】病理検査及び臨床検査室検査は、現代の診断及び予後診療の重要な態様である。対照試料は、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、及び他の分子分析方法により、検査結果の再現性についての品質管理（ＱＣ）を維持するためによく使用される。腫瘍組織及び他の疾患組織のＩＨＣ染色及びＩＳＨ染色に利用可能な対照のいくつかは、がん組織由来の対照である。しかしながら、そのようなタイプの対照はごく限られた数量でしか利用できず、また、そのような対照を使い果たすと、同じ特徴を有する代替の対照を利用できない場合がある。他のタイプの利用可能な対照は、がん細胞株由来の対照である。しかしながら、そのようなタイプの対照は、所定のマーカーの細胞発現の一貫したパターン及びレベル、または腫瘍組織に遍在する前記発現の不均一性を示さない。そのため、これらの対照は、実際の腫瘍組織と形態学的にほとんどまたはまったく類似していない。さらに、対照を形成する従来の技術は、収率が低いプロセスを伴うため、そのような対照を形成するためにかなりの量の培養細胞を必要とし、それによって生産コストが増加し、生産効率が低下する。【選択図】図１
2020515287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成組織対照の共培養細胞の収率の増加方法であって、前記方法が：
流動性ゲルを固化させて固形細胞保持体を形成し；
前記細胞保持体に空洞を形成して共培養細胞を保持することを含み、前記空洞が、複数の共培養細胞の細胞培養バッグを保持するように動作可能であり、前記共培養細胞が、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養した正常細胞及びあるがんタイプのがん細胞を含み、前記少なくとも１つの共培養因子が、共培養する前記がん細胞のタイプ、共培養する前記正常細胞に対する前記がん細胞の比、共培養する前記正常細胞と前記がん細胞の播種濃度、前記正常細胞と前記がん細胞の共培養を促進するために使用する細胞増殖サプリメント、及び前記正常細胞と前記がん細胞の共培養を促進するために使用する前記細胞増殖サプリメントのタイプの濃度を含み；前記方法がまた、
前記複数の共培養細胞の細胞培養バッグのうちの少なくとも２つに由来する共培養細胞を、前記細胞保持体の前記空洞内に堆積させ；ならびに
前記共培養細胞を処理して、前記合成組織対照を形成することを含む、前記増加方法。
【請求項２】
前記共培養細胞の前記処理中に一定量の色素を前記空洞に加え、前記空洞内に堆積した前記共培養細胞を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記空洞に堆積した前記共培養細胞の数に基づいて、前記空洞に加える前記色素の量を決定することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞保持体に前記空洞を形成することが：
前記流動性ゲルが固化している間に物体を前記流動性ゲルに挿入することを含み、前記物体の一部が前記空洞を画定する形状を有し；及び
前記流動性ゲルが固化して前記空洞を形成した後、前記物体を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記合成組織対照をパラフィンブロックに包埋し、合成組織マイクロアレイを形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記空洞上に濾材を加え；及び
前記細胞保持体を病理カセットに移し、前記病理カセットを処理して前記合成組織対照を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
がんの存在の判定に使用するための合成組織対照の形成方法であって、前記方法が：
正常細胞及びあるがんタイプのがん細胞を含む複数の細胞の細胞培養バッグを少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養することを含み、前記少なくとも１つの細胞培養因子が、培養する前記がん細胞のタイプ、培養する前記正常細胞に対する前記がん細胞の比率、及び培養する前記正常細胞及び前記がん細胞の播種濃度を含み；前記方法がまた、
前記複数の共培養細胞の細胞培養バッグのうちの少なくとも２つの共培養細胞の細胞培養バッグを細胞保持体の空洞に堆積させ；
前記空洞に堆積した前記少なくとも２つの共培養細胞の細胞培養バッグ由来の共培養細胞を処理し；一定量の色素を前記空洞に加え、前記共培養細胞の前記処理中に前記空洞に堆積した前記共培養細胞を特定し；及び
前記空洞に堆積した前記共培養細胞から前記合成組織対照を形成することを含む、前記形成方法。
【請求項８】
前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、細胞培養チャンバー内のＣＯ２濃度及び温度を前記少なくとも１つの細胞培養因子に基づいたレベルに維持するように構成された前記細胞培養チャンバー内で、前記正常細胞及び前記がん細胞を共培養することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記細胞培養チャンバーを：
前記合成組織対照を保持し；及び
前記少なくとも１つの細胞培養因子に基づいた速度で前記細胞培養チャンバーを回転させるように動作可能な電動回転装置内に維持することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、治療応答の診断マーカーとして、及び予測マーカーとして、ＩＨＣにおいて使用するマーカーの発現を提供することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、治療応答の診断マーカーとして、または予測マーカーとして、ＩＨＣにおいて使用するマーカーの発現を提供することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、ＦＩＳＨ技術で観察する場合にＲＮＡマーカー及びＤＮＡマーカーの一貫した発現レベルを提供することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、ＣＩＳＨ技術で観察する場合にＲＮＡマーカー及びＤＮＡマーカーの一貫した発現レベルを提供することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮａｓｅを加えて、前記正常細胞及び前記がん細胞の非凝集を促進することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
非凝集の正常細胞を有する均質なコアを形成し；及び
前記均質なコアに前記がん細胞の非凝集細胞を侵入させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
フィブロネクチンを加えて、前記正常細胞及び前記がん細胞の非凝集を促進することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
複数の合成組織対照を含む合成組織マイクロアレイであって、前記複数の合成組織対照の各合成組織対照が：
正常細胞；及び
あるがんタイプのがん細胞を含み、
前記正常細胞及び前記がん細胞を、複数の共培養する正常細胞及びがん細胞の細胞培養バッグのうちの少なくとも２つの細胞培養バッグにおいて共培養し、
前記複数の共培養した正常細胞及び前記がん細胞の細胞培養バッグを、培養する前記がん細胞のタイプ、培養する前記正常細胞に対する前記がん細胞の比率、培養する前記正常細胞及び前記がん細胞の播種濃度、ならびに前記正常細胞及びがん細胞の培養を促進するために使用する細胞増殖サプリメントのタイプを含む、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養する、前記合成組織マイクロアレイ。
【請求項１８】
前記正常細胞及びがん細胞を共培養して、ＩＨＣまたはＩＳＨ染色で使用するマーカーの高発現を提供する、請求項１７に記載の合成組織マイクロアレイ。
【請求項１９】
前記正常細胞及びがん細胞を共培養して、ＩＨＣまたはＩＳＨ染色で使用するマーカーの中程度の発現を提供する、請求項１７に記載の合成組織マイクロアレイ。
【請求項２０】
前記正常細胞及びがん細胞を共培養して、ＩＨＣまたはＩＳＨ染色で使用するマーカーの低発現を提供する、請求項１７に記載の合成組織マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
病理検査及び臨床検査室検査は、現代の診断及び予後診療の重要な態様である。対照試料は、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、及び他の分子分析方法により、検査結果の再現性についての品質管理（ＱＣ）を維持するためによく使用される。
【０００２】
腫瘍組織及び他の疾患組織のＩＨＣ染色及びＩＳＨ染色に利用可能な対照のいくつかは、がん組織由来の対照である。しかしながら、そのようなタイプの対照はごく限られた数量でしか利用できず、また、そのような対照を使い果たすと、同じ特徴を有する取り替えの対照を利用できない場合がある。他のタイプの利用可能な対照は、がん細胞株由来の対照である。しかしながら、そのようなタイプの対照は、所定のマーカーの細胞発現の一貫したパターン及びレベル、または腫瘍組織に遍在する前記発現の不均一性を示さない。そのため、これらの対照は、実際の腫瘍組織と形態学的にほとんどまたはまったく類似していない。さらに、対照を形成する従来の技術は、収率が低いプロセスを伴うため、そのような対照を形成するためにかなりの量の培養細胞を必要とし、それによって生産コストが増加し、生産効率が低下する。
【発明の概要】
【０００３】
開示する実施形態は、がんの診断及び予後診断のためのＩＨＣ及びＩＳＨ検査のための合成組織対照及び合成組織マイクロアレイ対照を形成する方法、ならびに１つ以上のタイプのがんの存在の判定方法を提供する。
【０００４】
例示的な実施形態により、少なくとも１つのタイプのがんの存在の判定方法を提供する。この方法は、合成組織対照（ＳＴＣ）の一部を染色することを含む。ＳＴＣには、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養した正常細胞及びあるがんタイプのがん細胞が含まれる。少なくとも１つの共培養因子には、以下の因子が含まれる：培養するがん細胞のタイプ、正常細胞と共培養するがん細胞の比、培養する細胞の播種濃度、細胞の共培養を促進するために使用する細胞増殖サプリメントのタイプ、及び細胞の共培養を促進するために使用する細胞増殖サプリメントの濃度。この方法は、ＳＴＣの染色部分を観察して、１つ以上のバイオマーカータイプの存在を判定することをさらに含み、１つ以上のバイオマーカータイプはがん細胞の存在を示す。
【０００５】
例示的な実施形態により、がんの存在の判定に使用するための合成組織対照の形成方法を提供する。この方法は、正常細胞、及びあるがんタイプのがん細胞を含む細胞を、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて培養することを含む。少なくとも１つの細胞培養因子には、培養するがん細胞のタイプ、培養する正常細胞に対するがん細胞の比率、及び培養する細胞の播種濃度が含まれる。
【０００６】
別の例示的な実施形態により、合成組織マイクロアレイを提供する。合成組織マイクロアレイは、複数のＳＴＣを含み、複数のＳＴＣの各ＳＴＣは、正常細胞及びあるがんタイプのがん細胞を含む。正常細胞及びがん細胞を、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて培養する。少なくとも１つの細胞培養因子には、培養するがん細胞のタイプ、培養する正常細胞に対するがん細胞の比率、培養する正常細胞及びがん細胞の播種濃度、ならびに正常細胞とがん細胞の培養及び増殖を促進するための、使用する細胞増殖サプリメントのタイプが含まれる。
【０００７】
開示する実施形態のさらなる詳細を、以下の詳細な説明及び対応する図面において提供する。
【０００８】
本発明の例示的な実施形態を、参照として本明細書に援用する添付の図面を参照して、以下で詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】一実施形態による、４つの対照を含む合成組織マイクロアレイの図である。
【図２Ａ】一実施形態による、固化されて細胞保持体を形成する流動性ゲルの側面図を示す。
【図２Ｂ】一実施形態による、細胞保持体内に空洞を有する図２Ａの細胞保持体の側面図を示す。
【図２Ｃ】一実施形態による、図２Ａの細胞保持体の上面図を示す。
【図２Ｄ】一実施形態による、空洞内に堆積した共培養細胞に加えた色素を有する図２Ａの細胞保持体の別の上面図を示す。
【図３Ａ】一実施形態による、ＨＥＲ−２／ｎｕｅ発現の存在を示すために、ＨＥＲ−２／ｎｕｅに対する特異的抗体で染色した乳癌細胞を含む合成組織の画像を示す。
【図３Ｂ】一実施形態による、ＨＥＲ−２／ｎｕｅ発現の存在を示すために、ＨＥＲ−２／ｎｕｅに対する特異的抗体で染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。
【図３Ｃ】一実施形態による、染色の特異性の検査として、事前に吸収させた抗体ＨＥＲ−２／ｎｕｅで染色した図３Ａの合成組織の画像を示す。
【図３Ｄ】一実施形態による、染色の特異性の検査として、事前に吸収させた抗体ＨＥＲ−２／ｎｕｅで染色した図３Ｂの乳房腫瘍組織の画像を示す。
【図４Ａ】一実施形態による、Ｅカドヘリンマーカーの存在を示すために染色した合成組織の画像を示す。
【図４Ｂ】一実施形態による、Ｅカドヘリンマーカーの存在を示すために染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。
【図４Ｃ】一実施形態による、エストロゲン受容体マーカーの存在を示すために染色した合成組織の画像を示す。
【図４Ｄ】一実施形態による、エストロゲン受容体マーカーの存在を示すために染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。
【図４Ｅ】一実施形態による、細胞増殖（Ｋｉ−６７）マーカーの存在を示すために染色した合成組織の画像を示す。
【図４Ｆ】一実施形態による、細胞増殖（Ｋｉ−６７）マーカーの存在を示すために染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。
【図５】一実施形態による、本明細書に記載の合成組織対照及び合成組織マイクロアレイによってカバーされる、異なるタイプのがんを検出するための抗体の例を示す。
【００１０】
示した図は単に例示に過ぎず、異なる実施形態が実装され得る環境、アーキテクチャ、設計、またはプロセスに関して、限定することを主張または暗示することを意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
３−Ｄ合成組織対照（ＳＴＣ）は、規定され制御された条件下で正常細胞とある種のがん細胞を懸濁液中で共培養することにより生成される。本明細書において定義するように、「正常」細胞には、非腫瘍細胞が含まれる。正常細胞は、間質細胞及び他の適切な細胞型から形成され得る。
【００１２】
ＳＴＣは、腫瘍組織に非常に類似した、細胞及び細胞外（ＥＣＭ）マーカー及びアーキテクチャに関連する腫瘍組織の予想されるパターン及びレベルを再現可能に示す。ＳＴＣと腫瘍組織との間の密接な類似の例を、図３Ａ〜３Ｄ及び図４Ａ〜４Ｅに示す。３−Ｄ合成組織マイクロアレイ対照（ＳＴＭＣ）は、複数のＳＴＣから構成される。好ましい実施形態では、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを、ホルマリン固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックとして調製するか、病理学検査室で使用する様々なマーカーの切片に事前にカットする。互換性のあるマーカーの例には、以下の記載で詳細に説明し、図に示す様々なマーカーが含まれる。ＳＴＣ及びＳＴＭＣブロック及び切片は、腫瘍組織及び他の病変組織のＩＨＣ染色及びＩＳＨ染色の陽性対照及び陰性対照の両方として使用することができる。ＳＴＣ及びＳＴＭＣを形成し、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを使用してがんの存在を検出するプロセスを、以下の段落で詳細に示す。
【００１３】
ＳＴＣ及びＳＴＭＣの細胞培養
【００１４】
ＳＴＣは、通常、ホルマリン固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ブロックの形態で、ほぼ無重力培養で培養され、各ＳＴＣは、ある種のがん細胞及び間質細胞を含む。いくつかの実施形態では、がん細胞及び正常間質細胞を、細胞培養フラスコで別々に培養する。そのような実施形態の１つでは、細胞培養培地１ミリリットルあたりおよそ５マイクログラムのＤＮａｓｅを、がん細胞または正常間質細胞のいずれかを含む各細胞培養フラスコに加える。ＤＮａｓｅの添加により、細胞培養フラスコから採取したがん細胞または正常間質細胞の凝集が防止される。結果として、がん細胞及び／または正常間質細胞の細胞数を正確に測定し得、非凝集のがん細胞及び正常間質細胞を採取し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞型（すなわち、がん細胞及び正常間質細胞）を、厳密に定義された条件下、及び制御された環境内で共培養する。いくつかの実施形態では、がん細胞と間質細胞を、細胞の複数の細胞培養バッグにおいて共培養する。本明細書中で定義するように、細胞培養バッグは、細胞を追加及び除去するための組み込みポートを有する容器である。いくつかの実施形態では、細胞培養バッグは無菌である。さらなる実施形態では、細胞培養バッグの組み込みポートは気密キャップを含む。バッグは、共培養の産生段階において、がん細胞及び間質細胞を保持する。いくつかの実施形態では、およそ１０日間の共培養後に、各細胞培養バッグからおよそ８０００万の間質細胞及び／またはがん細胞を採取し得る。他の実施形態では、およそ２週間の共培養後に、各細胞培養バッグからおよそ３０００万〜１億２０００万の間質細胞及び／またはがん細胞を採取してもよい。細胞培養バッグの寸法は、共培養する細胞のタイプ、及びそのような細胞を共培養するのに最適な栄養素のタイプに基づいて異なり得る。そのような実施形態の１つでは、細胞培養培地１ミリリットルあたりおよそ５マイクログラムのＤＮａｓｅをがん細胞及び正常間質細胞を含む各細胞培養バッグに加え、共培養プロセス中、細胞培養バッグをＣＯ２インキュベーター内のバイオリアクターに取り付ける。ＤＮａｓｅの添加により、共培養中に細胞が懸濁状態で非凝集の状態を維持しやすくなる。より具体的には、ＤＮａｓｅの添加により、正常間質細胞の非凝集の維持が促進され、したがって正常間質細胞が均質なコアを形成することが可能になる。さらに、ＤＮａｓｅの添加により、がん細胞の非凝集の維持が促進され、非凝集のがん細胞が均質なコアへ侵入しやすくなる。そのような別の一実施形態では、細胞培養培地１ミリリットルあたりおよそ１マイクログラムのフィブロネクチンを初日に加え、がん細胞及び正常間質細胞を含む各細胞培養バッグで共培養する。そのような実施形態では、フィブロネクチンの添加は、共培養細胞の増殖の初期段階において基底膜様構造の形成を促進する。さらに、フィブロネクチンの添加は、共培養するがん細胞と正常間質細胞との間の接触の向上を促進する。基底膜様構造の形成により、共培養細胞が実際の腫瘍組織に類似することが促進される。
【００１６】
好ましい実施形態では、がん細胞と間質細胞を、８〜１２日間、ほぼ無重力環境で共培養する。さらに、チャンバーの内外のＣＯ２濃度と温度を少なくとも１つの細胞培養因子に基づくレベルに維持するように構成された細胞培養チャンバー内でがん細胞と間質細胞を共培養して、実際の腫瘍組織と類似または同一の特徴を細胞に生じさせる。電動回転装置は、少なくとも１つの細胞培養因子に基づく速度で細胞培養チャンバーを保持してゆっくり回転させ、実際の腫瘍組織の特徴と類似または同一の特徴を細胞に生じさせる。
【００１７】
細胞培養因子には、培養するがん細胞のタイプ、間質細胞に対するがん細胞の比率、培養する細胞の播種濃度、及び使用する細胞増殖サプリメントの濃度及びタイプが含まれるが、これらに限定されない。細胞の培養を促進して、実際の腫瘍組織と類似または同一の特徴を生じさせる。例示的な一実施形態では、ＳＴＣを生成するための、正常間質細胞（線維芽細胞）に対する乳癌細胞株（ＭＣＦ．７）のがん細胞の比率はそれぞれ９９．８に対して１である。さらに、１０マイクログラムのインスリンをＭＣＦ７の増殖を促進する成長因子サプリメントとして使用する。さらに、ＭＣＦ．７がん細胞の播種濃度は１ミリリットルあたり１８，７５０個であり、一方、線維芽細胞の播種濃度は１ミリリットルあたり１８７，８７６個である。同様に、ＳＴＭＣも上記のプロセスに基づいて培養する。一実施形態では、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを、上記で特定した因子の１つに基づいて培養する。別の実施形態では、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを、上記で特定した因子のうちの２つに基づいて培養する。さらなる実施形態では、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを、上記で特定した因子のうちの３つに基づいて培養する。さらなる実施形態では、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを、上記で特定した因子のすべてに基づいて培養する。
【００１８】
前述の細胞培養因子の少なくとも１つに基づいてＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養し、特定の特異的／標的療法のための診断、予後、及び患者の選択のための、目的のタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び他の成分を含む、既知の発現パターン及び発現レベルの様々なマーカーを有する対照「偽」組織を提供する。上皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２／ｎｕｅ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、Ｋｉ−６７、及び他のタイプの治療応答のための適切な診断及び予測マーカーの検査により例示される、治療応答の診断及び予測マーカーとしてＩＨＣにおいて使用するマーカーの標準的な発現のために、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養してもよい。さらに、ＨＥＲ−２／ｎｕｅ、Ｍｅｔ４、及び他のタイプの治療応答のための適切な予測マーカーの検査により例示される、治療応答に対する予測マーカーとしてＩＨＣにおいて使用するマーカーの標準的な発現のために、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養してもよい。さらに、免疫蛍光法で使用するマーカーの標準的な発現のためにＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養してもよい。
【００１９】
また、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡマーカーのための蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ベースの技術を介して観察する場合、一貫した発現レベルを提供するためにＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養してもよい。特定の実施形態では、発現には、ＲＮＡトランスロケーションの発現レベルが含まれ得る。他の実施形態では、発現には、ＤＮＡ変異の発現レベルが含まれ得る。また、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡマーカーのための発色性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）ベースの技術を介して観察する場合、一貫した発現レベルを提供するためにＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養してもよい。特定の実施形態では、発現には、ＲＮＡトランスロケーション及び／またはＤＮＡ変異の発現レベルが含まれ得る。そのため、ＳＴＣまたはＳＴＭＣの作成に用いる細胞株の選択により、ほぼ無限の範囲のバイオマーカーを提供し得る。
【００２０】
前述の細胞培養因子の少なくとも１つに基づいてＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養することにより、ＩＨＣ及びＩＳＨ染色で使用するバイオマーカーの様々な発現レベルを一貫して提供し得る。いくつかの実施形態では、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養して、ＩＨＣ及びＩＳＨ染色で用いる高発現（ＨＥまたは３＋）のバイオマーカーを提供する。他の実施形態では、ＩＨＣ及びＩＳＨ染色で用いる中程度の発現（ＭＥまたは２＋）のバイオマーカーを有するように、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養する。さらなる実施形態では、ＩＨＣ及びＩＳＨ染色で用いる低発現（ＬＥまたは１＋）のバイオマーカーを有するように、ＳＴＣ及びＳＴＭＣを培養する。いくつかの実施形態では、複数の細胞培養バッグ由来の共培養細胞を遠心管に沈殿させ、共培養細胞を混合し、処理及び包埋のために共培養細胞を組み合わせる。本明細書に記載するように、共培養した細胞産物に、生検濾紙をしっかりと巻き付け、本明細書に記載の組織処理装置、例えば、遠心分離機または別の処理装置に配置する。
【００２１】
ＳＴＣ及びＳＴＭＣの処理及び包埋
【００２２】
培養したＳＴＣを処理し、次いで包埋する。少なくとも２つの細胞培養バッグ由来の共培養細胞を保持するために利用する空洞を備えた細胞保持体を利用して、共培養細胞の処理及び包埋時に共培養細胞を保持する。いくつかの実施形態では、細胞保持体を、室温で固化する流動性ゲルから形成する。いくつかの実施形態では、一度流動性ゲルを固化させてから、流動性ゲルの所望の形状と同様の形状を有するリザーバーに流動性ゲルを配置する。流動性ゲルの固化中に物体を流動性ゲルに挿入し、次いで、流動性ゲルが固化して空洞を形成した後、流動性ゲルから物体を取り除く。空洞のサイズと形状は、物体の外部形状及び外形サイズによって画定される。いくつかの実施形態では、処理する共培養細胞の所望の量、処理するがん細胞のタイプ、所望のＳＴＣの量、及び本明細書に記載する他の因子に基づいて、異なる外形サイズ及び外部形状を有する異なる物体を利用して、異なるサイズ及び形状を有する空洞を形成させる。空洞は、共培養細胞をしっかりと保持して、本明細書に記載の処理及び包埋プロセス中に共培養細胞が周囲の培地に散逸するのを防止する。
【００２３】
本明細書に記載するように、空洞は、２つの細胞培養バッグから回収した共培養細胞を保持するように動作可能である。いくつかの実施形態では、空洞は、追加の細胞培養バッグ由来の共培養細胞を貯蔵するように動作可能であり、それにより、所望の細胞コアの収率がさらに増加する。いくつかの実施形態では、回収した共培養細胞産物を細胞保持体の空洞に移す際に、回収した共培養細胞産物に着色色素を加える。より具体的には、回収した共培養細胞産物に、所定の色を有する色素を、そのような産物に触れることなく添加し、それにより、色素を空洞内に閉じ込めたままにすることができる。回収した共培養細胞産物をパラフィンに包埋する前に、回収した共培養細胞産物に着色色素を加えることにより、回収した共培養細胞産物を特定する正確な手段が促進される。いくつかの実施形態では、次いで、その空洞内に回収した共培養細胞産物及び色素を含む細胞保持体の周りに生検濾紙などの濾材を巻き付ける。次いで、細胞保持体を組織学的カセットに入れ、組織処理トレイに移す。次いで、真空浸透プロセス及びパラフィン包埋プロセスなどの追加のプロセスを、回収した共培養細胞産物に対してブロックとして実行してもよい。いくつかの実施形態では、回収した共培養細胞産物を、後続の処理及び包埋のためにホルマリンで固定する。他の実施形態では、回収した共培養細胞産物を、後続の処理及び包埋のために、ブアン（ｂｏｕｓｉｎ）液または別の固定液で固定する。本明細書に記載するように、空洞は、少なくとも２つの細胞培養バッグから回収した共培養細胞を保持するように動作可能である。細胞保持体、細胞保持体の形成、及び細胞保持体の空洞への共培養細胞の堆積の追加の説明を、以下の段落に提供するとともに、少なくとも図２Ａ〜２Ｄに示す。
【００２４】
一実施形態では、培養ＳＴＣの直径は、およそ０．０４Ｃｍである。別の実施形態では、培養ＳＴＣの直径は、０．０１〜０．０４Ｃｍの範囲内であってもよい。ＳＴＣとは異なり、組織標本の直径は２〜４Ｃｍであり得る。培養ＳＴＣのサイズを考慮して、孔径がおよそ０．００１ｃｍのメッシュを有する処理及び包埋装置を使用して、包埋プロセス中に組織標本を保持する。別の実施形態では、包埋装置の孔径は、０．００１〜０．００４Ｃｍの範囲内である。所望のバイオマーカーの所望の発現レベルを提供する複数の培養ＳＴＣを包埋し、ＳＴＭＣを形成する。
【００２５】
ＳＴＣ及びＳＴＭＣの染色
【００２６】
包埋したＳＴＣの各ブロック由来の切片をＩＨＣ染色技術により評価して、個々の構築物を特定する。いくつかの実施形態では、包埋したＳＴＣ内の個々の構築物は、合計およそ５００の個々の構築物の５０〜６０％を占め、がん細胞と正常間質細胞の所望の組み合わせ、及びがん細胞による正常間質細胞コアの浸潤を伴う。他の実施形態では、包埋したＳＴＣ内の個々の構築物は、合計５００〜６００の個々の構築物の８０％を占め、がん細胞と正常間質細胞の所望の組み合わせ、及びがん細胞による正常間質細胞コアの浸潤を伴う。いくつかの実施形態では、実際の腫瘍組織と類似または同一の特徴を有する構築物のみをＳＴＣとして選択する。
【００２７】
実際の腫瘍組織と類似または同一の特徴を有する共培養細胞のタイプの特定の組み合わせを含む各ブロック由来の個々の構築物を、元のブロックから機械的に除去し、ＳＴＭＣを構築するために使用する。目的のマーカーの様々な発現レベル及び発現パターンを有する複数のタイプのがん細胞を含むように、ＳＴＭＣを構築する。実験室のオペレーターは、様々な装置、例えば、顕微鏡、ｗｈｏｌｅ  ｓｌｉｄｅ  ｉｍａｇｉｎｇ（ＷＳＩ）装置、及びバイオマーカーの発現を観察するための他の適切な装置を介してＳＴＣ及びＳＴＭＣを見てもよい。
【００２８】
図１は、一実施形態による、４つのＳＴＣ１０１、１０２、１０３、及び１０４を含む合成組織マイクロアレイ１００の図である。図１に示す実施形態では、対照１０１、１０２、１０３、及び１０４を、同じ組織学的スライド上の検査組織１０５に近接して配置する。対照１０１、１０２、１０３、及び１０４ならびに検査組織１０５を、異なるタイプのバイオマーカーに対する１つ以上の染色剤で染色する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、合成組織マイクロアレイ１００を染色して、治療応答の診断マーカー及び予測マーカーとしてＩＨＣにおいて使用するマーカーの発現を観察する。他の実施形態では、合成組織マイクロアレイ１００を染色して、治療応答の予測マーカーとしてＩＨＣにおいて使用するマーカーの発現を観察する。さらなる実施形態では、合成組織マイクロアレイ１００を染色し、ＲＮＡ及びＤＮＡマーカーの発現レベルについて、ＦＩＳＨ技術により観察する。さらなる実施形態では、合成組織マイクロアレイ１００を染色し、ＲＮＡ及びＤＮＡマーカーの発現レベルについて、ＣＩＳＨ技術により観察する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、合成組織マイクロアレイ１００は、少なくとも１つのタイプのがんの陽性対照を提供する。他の実施形態では、合成組織マイクロアレイ１００のいくつかの対照は陽性対照を提供し、合成組織マイクロアレイ１００の他の対照は陰性対照を提供する。合成組織マイクロアレイ１００を培養して、マーカーの高発現、中発現、または低発現を提供してもよい。図１に示す実施形態は、４つの対照１０１、１０２、１０３、及び１０４を含むが、異なる数の対照から合成組織マイクロアレイ１００を形成してもよい。実験室のオペレーターは、顕微鏡及びＷＳＩ装置などの様々な装置の下で合成組織マイクロアレイ１００を調べ、染色対照を染色検査組織と比較して、検査腫瘍組織のマーカーの発現の有無を判定してもよい。
【００３１】
図２Ａは、一実施形態による、固化されて細胞保持体２００を形成する流動性ゲル２０１の側面図を示す。流動性ゲル２０１を冷却物体２２０に近接して堆積させ、流動性ゲル２０１の温度を冷却し、それにより流動性ゲル２０１を固化して細胞保持体２００を形成する。いくつかの実施形態では、流動性ゲル２０１は室温で固体であり、流動性ゲル２０１が流体状態になるように最初に加熱する。いくつかの実施形態では、流動性ゲル２０１を、凝固プロセス中にリザーバー内に配置し、リザーバーの内部表面によってほぼ画定される形状をとらせる。いくつかの実施形態では、冷却物体２２０は、流動性ゲル２０１の冷却を促進する氷である。流動性ゲル２０１が固化する間に物体２１０を流動性ゲル２０１に挿入し、流動性ゲル２０１が固化して細胞保持体２００の空洞（図２Ｂ〜２Ｄに示す）を形成した後に流動性ゲル２０１から除去する。いくつかの実施形態では、物体２０１は、空洞の所望の形状及び寸法に近い形状及び寸法を有する管である。本明細書に記載するように、空洞は、本明細書に記載する少なくとも２つの細胞培養バッグ由来の共培養細胞を保持するように動作可能である。
【００３２】
図２Ｂは、一実施形態による、細胞保持体２００に空洞２０２を有する図２Ａの細胞保持体２００の側面図を示す。図２Ｃは、一実施形態による、空洞２０２を有する図２Ａの細胞保持体２００の別の画像を示す。図２Ｂ及び２Ｃは、細胞保持体２００に形成された１つの空洞２０２を示しているが、少なくとも２つの細胞培養バッグ由来の共培養細胞を各々が動作可能に保持する複数の空洞を細胞保持体２００に形成してもよい。さらに、図２Ｃの空洞は、細胞保持体２００の反対の表面を貫通するが、他の空洞は、細胞保持体２００を貫通しない場合がある。本明細書に記載するように、空洞２０２は、図２Ｂ及び２Ｃに示す形状を含む様々な形状及び寸法を取り得る。
【００３３】
図２Ｄは、一実施形態による、空洞に堆積させた共培養細胞２０４に色素を加えた、図２Ａの細胞保持体２００の別の上面図を示す。図２Ｄの実施形態では、空洞２０２に堆積させた共培養細胞２０４に青色の色素を加える。加える色素の量は、空洞２０２に堆積させた共培養細胞の数、空洞２０２に堆積させたがん細胞のタイプ、空洞２０２のサイズ及び寸法、及び本明細書に記載する他の因子を含む、様々な因子に基づき得る。いくつかの実施形態では、事前に選択した着色色素を空洞２０２内の共培養細胞産物に注意深く加えて、着色色素が空洞２０２内に確実に閉じ込められたままにする。図２Ｄは、空洞２０２に加えた青色の色素を示しているが、異なる色の色素を加えて、共培養細胞を特定しやすくしてもよい。いくつかの実施形態では、濾紙などの濾材を空洞の上に加える。いくつかの実施形態では、次いで、細胞保持体２００を病理カセット（図示せず）に移し、病理カセットを処理してＳＴＣを形成する。いくつかの実施形態では、次いでＳＴＣをパラフィンブロックに包埋し、ＳＴＭＡを形成する。
【００３４】
図３Ａは、一実施形態による乳癌細胞を含む合成組織の画像を示す。図３Ｂは、一実施形態による乳房腫瘍組織の画像を示す。図３Ａに示す合成組織を、本明細書に記載の条件下で培養した。図３Ａ及び３Ｂに示すように、乳癌細胞を含む合成組織及び実際の乳房腫瘍組織は、極めて類似した特徴を示す。
【００３５】
図３Ｃは、一実施形態による、ＨＥＲ−２／ｎｕｅに対して予め吸収させた抗体で合成組織を染色した後の図３Ａの合成組織の画像を示し、ＨＥＲ−２／ｎｕｅマーカーに対する染色の特異性を示す。図３Ｄは、一実施形態による、ＨＥＲ−２／ｎｕｅに対して予め吸収させた抗体で腫瘍組織を染色した後の図３Ｂの乳房腫瘍組織の画像を示し、ＨＥＲ−２／ｎｕｅマーカーに対する染色の特異性を示す。図３Ｃ及び３Ｄに示すように、染色した合成組織と染色した腫瘍組織は極めて類似した特徴を示すため、ＨＥＲ−２／ｎｕｅなどの治療応答の診断マーカーとして、または予測マーカーとしてＩＨＣにおいて使用するマーカーの標準的な発現の対照として、合成組織を使用することができる。ＩＨＣにおいて治療応答の予測マーカーとして使用するマーカーの発現の他の例には、Ｍｅｔ４、及び治療応答の他の適切な診断マーカーまたは予測マーカーが含まれる。さらなる実施形態では、図３Ａ及び３Ｃに示す合成組織は、ＦＩＳＨ技術を介して観察する場合、ＲＮＡ及びＤＮＡマーカーの発現レベルも提供し得る。さらなる実施形態では、図３Ａ及び３Ｃに示す合成組織はまた、ＣＩＳＨ技術を介して観察する場合、ＲＮＡ及びＤＮＡマーカーの発現レベルを提供し得る。
【００３６】
図４Ａは、一実施形態による、Ｅカドヘリンマーカーの存在を示すために染色した合成組織の画像を示す。図４Ｂは、一実施形態による、Ｅカドヘリンマーカーの存在を示すために染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。図４Ｃは、一実施形態による、エストロゲン受容体マーカーの存在を示すために染色した合成組織の画像を示す。図４Ｄは、一実施形態による、エストロゲン受容体マーカーの存在を示すために染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。図４Ｅは、一実施形態による、増殖（Ｋｉ−６７）マーカーの存在を示すために染色した合成組織の画像を示す。図４Ｆは、一実施形態による、増殖（Ｋｉ−６７）マーカーの存在を示すために染色した乳房腫瘍組織の画像を示す。
【００３７】
図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅに示す合成組織を、本明細書に記載の条件下で培養した。図４Ａ〜４Ｆに示すように、合成組織と染色した腫瘍組織は極めて類似した特徴を示し、これにより、Ｅカドヘリン、ＥＲ、プロゲステロン受容体、及びＫｉ−６７の検査、ならびに他の適切なタイプの治療応答の診断マーカー及び予測マーカーの検査を例とする、治療応答の診断マーカー及び予測マーカーとして、合成組織をＩＨＣにおいて使用することができる。他の実施形態では、図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅに示す合成組織を使用して、治療応答の予測マーカーとしてＩＨＣにおいて使用するバイオマーカーの発現を提供してもよい。さらなる実施形態では、図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅに示す合成組織は、ＦＩＳＨ技術を介して観察する場合、ＲＮＡ及びＤＮＡマーカーの発現レベルも提供し得る。さらなる実施形態では、図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅに示す合成組織は、ＣＩＳＨ技術を介して観察する場合、ＲＮＡ及びＤＮＡマーカーの発現レベルも提供し得る。
【００３８】
図５は、一実施形態による、本明細書に記載の合成組織対照及び合成組織マイクロアレイ対照によってカバーされる異なるタイプのがんを検出するための抗体の例を示す。図５に示すように、ＳＴＣ及びＳＴＭＣは、乳癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、卵巣癌、黒色腫癌、脳癌、白血病、リンパ腫、及び他のタイプのがんを含むがこれらに限定されない、様々なタイプのがんを検査するために使用することができる。
【００３９】
上記の開示した実施形態は、例示を目的として、また、開示した実施形態を当業者が実施できるように提示するものであるが、それが網羅的であること、または開示した形態に限定することを意図するものではない。本開示の範囲及び精神から逸脱することのない、多くの実質的でない改変及び変形が当業者には明らかであろう。例えば、フローチャートはシリアルなプロセスを示してはいるが、いくつかの工程／ブロックを、並列またはシーケンス外で実行するか、単一の工程／ブロックに結合してもよい。特許請求の範囲は、開示した実施形態及び任意のそのような改変を広くカバーすることを意図している。さらに、以下の条項は、本開示の追加の実施形態を表し、本開示の範囲内で考慮されるべきである：
【００４０】
条項１、合成組織対照の共培養細胞の収率の増加方法であって、前記方法が、流動性ゲルを固化させて固形細胞保持体を形成し；前記細胞保持体に空洞を形成して共培養細胞を保持することを含み、前記空洞が、複数の共培養細胞の細胞培養バッグを保持するように動作可能であり、前記共培養細胞が、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養した正常細胞及びあるがんタイプのがん細胞を含み、前記少なくとも１つの共培養因子が、共培養する前記がん細胞のタイプ、共培養する前記正常細胞に対する前記がん細胞の比、共培養する前記正常細胞と前記がん細胞の播種濃度、前記正常細胞と前記がん細胞の共培養を促進するために使用する細胞増殖サプリメント、及び前記正常細胞と前記がん細胞の共培養を促進するために使用する前記細胞増殖サプリメントの濃度を含み；前記方法がまた、前記複数の前記共培養細胞の細胞培養バッグのうちの少なくとも２つに由来する共培養細胞を、前記細胞保持体の前記空洞内に堆積させ；ならびに前記共培養細胞を処理して、前記合成組織対照を形成することを含む、前記増加方法。
【００４１】
条項２、前記共培養細胞の前記処理中に一定量の色素を前記空洞に加え、前記空洞内に堆積した前記共培養細胞を特定することをさらに含む、条項１に記載の方法。
【００４２】
条項３、前記空洞に堆積した前記共培養細胞の数に基づいて、前記空洞に加える前記色素の量を決定することをさらに含む、条項１または２に記載の方法。
【００４３】
条項４、前記細胞保持体に前記空洞を形成することが：前記流動性ゲルが固化している間に物体を前記流動性ゲルに挿入することを含み、前記物体の一部が前記空洞を画定する形状を有し；及び前記流動性ゲルが固化して前記空洞を形成した後、前記物体を除去することを含む、条項１〜３の少なくとも一項に記載の方法。
【００４４】
条項５、さらに、前記合成組織対照をパラフィンブロックに包埋し、合成組織マイクロアレイを形成することを含む、条項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【００４５】
条項６、前記空洞上に濾材を加え；及び前記細胞保持体を病理カセットに移し、前記病理カセットを処理して前記合成組織対照を形成することをさらに含む、条項１〜５のうちの少なくとも一項に記載の方法。
【００４６】
条項７、がんの存在の判定に使用するための合成組織対照の形成方法であって、前記方法が：正常細胞及びあるがんタイプのがん細胞を含む複数の細胞の細胞培養バッグを少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養することを含み、前記少なくとも１つの細胞培養因子が、培養する前記がん細胞のタイプ、培養する前記正常細胞に対する前記がん細胞の比率、及び培養する前記正常細胞及び前記がん細胞の播種濃度を含み；前記方法がまた、前記複数の共培養細胞の細胞培養バッグのうちの少なくとも２つの共培養細胞の細胞培養バッグを細胞保持体の空洞に堆積させ；前記空洞に堆積した前記少なくとも２つの共培養細胞の細胞培養バッグ由来の共培養細胞を処理し；一定量の色素を前記空洞に加え、前記共培養細胞の前記処理中に前記空洞に堆積した前記共培養細胞を特定し；及び前記空洞に堆積した前記共培養細胞から前記合成組織対照を形成することを含む、前記形成方法。
【００４７】
条項８、前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、細胞培養チャンバー内のＣＯ２濃度及び温度を前記少なくとも１つの細胞培養因子に基づいたレベルに維持するように構成された前記細胞培養チャンバー内で、前記正常細胞及び前記がん細胞を共培養することを含む、条項７に記載の方法。
【００４８】
条項９、前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記細胞培養チャンバーを：前記合成組織対照を保持し；及び前記少なくとも１つの細胞培養因子に基づいた速度で前記細胞培養チャンバーを回転させるように動作可能な電動回転装置内に維持することをさらに含む、条項７または８に記載の方法。
【００４９】
条項１０、前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、治療応答の診断マーカーとして、及び予測マーカーとして、ＩＨＣにおいて使用するマーカーの発現を提供することをさらに含む、条項７〜９の少なくとも一項に記載の方法。
【００５０】
条項１１、前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、治療応答の診断マーカーとして、または予測マーカーとして、ＩＨＣにおいて使用するマーカーの発現を提供することをさらに含む、条項７〜９の少なくとも一項に記載の方法。
【００５１】
条項１２、前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、ＦＩＳＨ技術で観察する場合にＲＮＡマーカー及びＤＮＡマーカーの一貫した発現レベルを提供することをさらに含む、条項７〜９の少なくとも一項に記載の方法。
【００５２】
条項１３、前記複数の細胞の細胞培養バッグを共培養することが、前記共培養細胞を培養して、ＣＩＳＨ技術で観察する場合にＲＮＡマーカー及びＤＮＡマーカーの一貫した発現レベルを提供することをさらに含む、条項７〜９の少なくとも一項に記載の方法。
【００５３】
条項１４、ＤＮａｓｅを加えて、前記正常細胞及び前記がん細胞の非凝集を促進することをさらに含む、条項７〜１３の少なくとも一項に記載の方法。
【００５４】
条項１５、非凝集の正常細胞を有する均質なコアを形成し；及び前記均質なコアに前記がん細胞の非凝集細胞を侵入させることをさらに含む、条項７〜１４のうちの少なくとも一項に記載の方法。
【００５５】
条項１６、フィブロネクチンを加えて、前記正常細胞及び前記がん細胞の非凝集を促進することをさらに含む、条項７〜１５の少なくとも一項に記載の方法。
【００５６】
条項１７、複数の合成組織対照を含む合成組織マイクロアレイであって、前記複数の合成組織対照の各合成組織対照が：正常細胞；及びあるがんタイプのがん細胞を含み、前記正常細胞及び前記がん細胞を、複数の共培養する正常細胞及びがん細胞の細胞培養バッグのうちの少なくとも２つの細胞培養バッグにおいて共培養し、前記複数の共培養した正常細胞及び前記がん細胞の細胞培養バッグを、培養する前記がん細胞のタイプ、培養する前記正常細胞に対する前記がん細胞の比率、培養する前記正常細胞及び前記がん細胞の播種濃度、ならびに前記正常細胞及びがん細胞の培養を促進するために使用する細胞増殖サプリメントのタイプを含む、少なくとも１つの細胞培養因子に基づいて共培養することを含む、前記合成組織マイクロアレイ。
【００５７】
条項１８、前記正常細胞及びがん細胞を共培養して、ＩＨＣまたはＩＳＨ染色で使用するマーカーの高発現を提供する、条項１７に記載の合成組織マイクロアレイ。
【００５８】
条項１９、前記正常細胞及びがん細胞を共培養して、ＩＨＣまたはＩＳＨ染色で使用するマーカーの中程度の発現を提供する、条項１７または１８に記載の合成組織マイクロアレイ。
【００５９】
条項２０、前記正常細胞及びがん細胞を共培養して、ＩＨＣまたはＩＳＨ染色で使用するマーカーの低発現を提供する、条項１７〜１９のうちの少なくとも一項に記載の合成組織マイクロアレイ。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「ほぼゼロ重力環境」とは、ゼロ重力環境を含むものとして定義される。
【００６１】
本明細書中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数形も含むことを意図している。さらに、本明細書及び／または特許請求の範囲において使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた特性、工程、操作、要素、及び／または成分の存在を指定するが、１つ以上の他の特性、工程、操作、要素、成分、及び／またはそれらの群の存在または追加を除外するものではないことは理解されたい。さらに、上記の実施形態及び図に記載する工程及び成分は、単に例示的なものに過ぎず、特定の工程または成分が請求する実施形態の要件であることを意味するものではない。
【図１】
2020515287.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020515287.tif 000005
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020515287.tif 000009
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020515287.tif 000013
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2020515287.tif 000015
【図４Ｅ】
2020515287.tif 000016
【図４Ｆ】
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【図５−１】
2020515287.tif 000018
【図５−２】
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【国際調査報告】
2020515287.tif 000020