(57)【要約】  本発明は、スペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）でストレプトマイセス・メラノスポロファシエンスＣＥＣＴ９４２０として同定されたストレプトマイセス・メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株、及び植物における駆除剤としての前記株の使用に関する。本発明の更なる態様は、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の懸濁液及び抽出物、並びにそれを作製する方法に関する。追加の態様は、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５を含む駆除組成物に関する。最後に、本発明は、植物Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株に、上記株又はＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５由来の無細胞抽出物を含む組成物を投与することを含む、植物有害生物の生物防除方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・メラノスポロファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＣＥＣＴ９４２０として、スペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）において同定されたストレプトマイセス・メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株。
【請求項２】
請求項１に記載のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の生細胞を得る方法であって、
（ｉ）ＡＧＬ２２５株を適切な培養培地に接種する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の接種培養培地を前記株の増殖に適した条件に供して細胞懸濁液を得る工程であって、前記条件が、温度２５℃〜３０℃、ｐＨ６〜ｐＨ８、及び酸素濃度１０％〜５０％を含む、工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞懸濁液を分離に供して、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の生細胞及び代謝産物含有上清を得る工程、
（ｉｖ）Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の細胞を収集する工程、並びに
（ｖ）任意に、得られた細胞を脱水プロセスに供する工程、を含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の工程（ｉ）〜工程（ｉｉｉ）及び前記上清を収集する更なる工程を含む方法により得ることができる、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５代謝産物含有上清。
【請求項４】
請求項２に記載される方法によりＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の生細胞を取得すること、並びに緩衝液及び請求項３に記載される代謝産物含有上清から選択される適切な溶液中に所望の密度に再懸濁することを含む方法によって得ることができる、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５細胞懸濁液。
【請求項５】
請求項２に記載の方法によりＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の生細胞を得る工程、及び、
（ｉ）Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の細胞を破壊する工程、
（ｉｉ）無細胞抽出物を細胞片から分離する工程、
（ｉｉｉ）無細胞抽出物を収集する工程、及び
（ｉｖ）任意に、無細胞抽出物を濃縮プロセスに供する工程、を行うことを含む方法により得ることができる、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の無細胞抽出物。
【請求項６】
請求項１に記載のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株及び１以上の農業上許容可能な化合物を含む組成物。
【請求項７】
前記１以上の農業的に許容可能な化合物が、植物強化剤、栄養素、湿潤剤、接着を改善する化合物、緩衝化合物、安定化剤、抗酸化剤、浸透圧保護剤、及び日焼け止めからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの浸透圧保護剤を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
追加の駆除剤を更に含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記追加の駆除剤が、殺真菌活、殺菌及び／又は殺線虫活性を有する別の細菌株である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記他の細菌株が、Ｓ．ヤテンシスＣＥＣＴ９４２１としてスペイン・タイプ・カルチャー・コレクションで同定されたＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
植物における駆除剤としての、請求項１で定義されたＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株又は請求項６〜１１のいずれかで定義される組成物の使用。
【請求項１３】
真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するためのものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１に記載のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５又は請求項６〜１１のいずれかに記載の組成物を植物に投与することを含む、植物有害生物の生物防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１０月６日に出願された欧州特許出願第１７３８２６６９．４号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、バイオ駆除剤（ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ）の分野、より詳しくはストレプトマイセス・メラノスポラファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒａｆａｃｉｅｎｓ）の株、特に野菜作物及び果樹における細菌、真菌及び線虫によって引き起こされる植物病害の生物防除におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
環境及び消費者の健康に対する合成駆除剤（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ）の大量使用の悪影響がよく知られている。これらの問題のために、植物病害の防除は、殺真菌剤及び殺菌剤の合理的な使用の傾向、並びに毒性の少ない製品を適用する傾向がある。さらに、植物保護は、種々の方法（物理的、機械的、化学的、生物学的、遺伝的、法的及び文化的）を組み合わせた総合有害生物管理（ＩＰＭ：ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｅｓｔ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）を目的としている。有害生物及び病害の防除におけるこの方向転換は、欧州連合の加盟国と他の国々の両方における植物保護製品の商業化及び使用のための新たな立法上の枠組みに結び付いた。この規制は、従来の植物保護製品の使用を削減し、統合された有害生物及び病害の管理を通じてそれらの持続可能性を実施することを目的とし、植物検疫制御手段が生物学的及び物理的であることが望ましいと述べている。
【０００４】
この文脈において、植物に有益な微生物の株、主にそれらに関連する細菌及び真菌に基づくバイオ駆除剤は、従来の合成駆除剤の代替又は補完物を提供する。微生物駆除剤の主な利点の１つは、その使用により残留物のない作物の生産が可能になることであり、これは、特に有機農業生産での認可に有利である。しかしながら、化学駆除剤と比較して、少数の微生物駆除剤が現在利用可能であり、そのほとんどは真菌によって引き起こされる病害に対しては有効であるが、細菌性病害に対しては有効ではない。この分野での熱心な研究にも関わらず、市販の生物学的製品の有効成分であるほとんどの微生物株は、有毒な二次代謝産物を生成し、植物の定着に十分な環境適合性（ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ）に欠け、合成製品よりも有効性が低く、経時的に不安定になるため、それらを長期間持続する組成物に配合することは難しい。さらに、微生物駆除剤は生きている生物であるため、環境（温度、相対湿度、雨等）と宿主の条件（植物種、栽培品種、生物季節学的段階等）は、それらの生物活性に強い影響を及ぼし、結果として従来の化学駆除剤よりも低い又は変動する病害防除効率をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０１１５８０２号
【特許文献２】韓国特許第１００８６９６６８号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４００５７３３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多くの微生物バイオ駆除剤の問題は、それらが従来の合成駆除剤と適合しないことであり、農業における統合された有害生物及び病害の管理におけるそれらの使用を制限する。例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はグリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）の拮抗菌等の真菌の株に基づくほとんどの有効成分は、殺真菌剤に感受性である。この意味で、微生物には、殺真菌剤に非感受性であるため、同時に使用できるという利点がある。
【０００７】
さらに、管轄当局によるバイオ駆除剤としての微生物の承認の主な要件の１つは、環境保護庁（ＥＰＡ）又は欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ、欧州）等の機関によって評価されるそれらの微生物のバイオセーフティである。このように、臨床事例で言及されているシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）の特定種の場合のように、バイオ駆除薬剤として使用するには障害である、ヒト又は動物に対する日和見病原性の可能性があるため、有害生物及び病害の防除に有効性を示した特定の微生物は安全であるとして廃棄された。
【０００８】
また、微生物バイオ駆除剤の開発では、微生物株の生産を工業化する能力と並んで、製品の耐用年数を長くするための処方も考慮する必要がある。これは主に脱水によって得られる粉末製剤により達成されるが、乾燥プロセスは微生物、特にグラム陽性菌よりも感受性の高いグラム陰性菌（例えば、シュードモナス）の生存率に大きく影響する。胞子を生産するストレプトマイセス属及びバチルス属の場合、３つのコンポーネント（栄養細胞、胞子、及び発酵代謝物）に適した製剤を、畑の作物環境で高い性能及び適合性で調製され得る。
【０００９】
上記の全ての利点を収集する取り組みにより、ストレプトマイセス・ライディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｙｄｉｃｕｓ）ＷＹＥＣ１０８及びストレプトマイセスＫ６１等のストレプトマイセス又は関連種の様々な株が生物防除剤として商業的に開発された（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｂｏｎａｔｅｒｒａ，２００９）。しかしながら、これらの株は、主に真菌病原体の制御に焦点を合わせた活性プロファイルを示す。ジャガイモ塊茎病及び幾つかの土壌植物病原体に対して活性なＳ．メラノスポロファシエンスＥＦ−７６（特許文献１）、様々な真菌病に対するＳ．ヤテンシス（Ｓ．ｙａｔｅｎｓｉｓ）ＣＪＳ−２４（特許文献２）、並びに抗真菌及び殺線虫の活性を有するストレプトマイセス・サラセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓａｒａｃｅｔｉｕｓ）ＳＳ３１（特許文献３）のような幾つかのストレプトマイセス株が開示されている。
その結果、植物病原性真菌、細菌及び線虫に対する広範囲の活性を有する、有害生物の生物防除に使用される改良された細菌株の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、植物の根圏からの天然サンプルからストレプトマイセスの新たな株を単離し、これは生物学的有害生物防除（ｐｅｓｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ）での使用に非常に適した特性を有する。この株は、驚くほど広い農薬スペクトルを特徴とし、様々な植物病原性真菌及び細菌と並んで、線虫を防除するのに非常に効率的である。この株はまた、植物の防御を誘導し、バイオ駆除剤としての使用への関心を更に高める。この株はまた、好都合なことに工業処理に抵抗性であり、貯蔵寿命が長く、環境ストレスに抵抗性がある。全体として、この株は、以下に示すように、技術水準で説明されている他の株によって示される幾つかの制限を克服する。
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様は、スペイン・タイプ・カルチャー・コレクションにおいてストレプトマイセス・メラノスポロファシエンスＣＥＣＴ９４２０として同定されたストレプトマイセス・メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株に関する。
【００１２】
本発明のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株は、ジローナのポプラの木（ポプラス・ニグラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ））の根から単離され、ブダペスト条約に従い、２０１７年７月１８日にパルクシエンティフィックバレンシア大学、カテドラーティコアグスティンエスカルディーノ、９、４６９８０パテルナ（バレンシア）バレンシア大学にあるスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ：ＣｏｌｅｃｃｉｏｎＥｓｐａｎｏｌａｄｅ  Ｃｕｌｔｉｖｏｓ  Ｔｉｐｏ）に寄託された。Ｓ．メラノスポロファシエンス株は、識別参照ＡＧＬ２２５で寄託され、アクセッション番号ＣＥＣＴ９４２０を受領した。特に、この株は以下を示すことを特徴とする。
【００１３】
（ｉ）ＩＳＰ２（国際ストレプトマイセスプロジェクト寒天（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ａｇａｒ））、ＡＩＡ（放線菌分離寒天（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｇａｒ））、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ及びＳＮＭ（硝酸塩及び澱粉寒天（ｎｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｓｔａｒｃｈ  ａｇａｒ））等の様々な培養培地における植物病原性真菌及び細菌に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拮抗作用（表１）。
（ｉｉ）エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、シュードモナス・シリンガエ病原型トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）、Ｐ．シリンガエ病原型アクチニジア（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ａｃｔｉｎｉｄｉａｅ）、キサントモナス・アルボリコラ病原型プルニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ  ｐｖ．ｐｒｕｎｉ）の細菌、並びにボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）及びステンフィリウム・べシカリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｖｅｓｉｃａｒｉｕｍ）の真菌に対する拮抗作用（表１及び表２）；
（ｉｉｉ）モデル線虫カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）に対するキチン分解活性及び殺線虫活性（表１、表４、図５）。
（ｉｖ）抗菌性ＩＩ型ポリケチドの産生遺伝子（ａｃｔ０４）があるが、アミノグリコシド系抗生物質の遺伝子がない（図３）。
（ｖ）一旦細胞がなくなると（増殖した細胞懸濁液の上清）、上記株が増殖した培養培地は、発酵によって該株により産生される活性代謝産物の特有のＨＰＬＣプロファイルを有する。この代謝産物プロファイルは、ＡＧＬ２２５株に特徴的であり、ストレプトマイセスの他の株と区別される（図４）。これらの代謝物はまた、殺菌活性、殺真菌活性、及び殺線虫活性を持つ。
（ｖｉ）過敏反応を起こすことにより、また植物に防御遺伝子を誘導することにより、天然の植物防御を誘導する（表３）。
（ｖｉｉ）ナシにおける植物病原菌Ｅ．アミロボーラ、トマト植物に対してＰ．シリンガエ病原型トマト、プルヌスにおいてＸ．アルボリコラ病原型プルニ；並びにレタスにおいて植物病原性菌スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、トマトにおいてＦ．オキシスポラム分化型ラディシス・リコペルシチ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｒａｄｉｃｉｓ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、及びトマトにおいてＢ．シネラによって引き起こされる感染を阻害する能力を有する（図６）。
【００１４】
ＡＧＬ２２５株には、抗真菌活性、抗菌活性、及び殺線虫活性を同時に発揮するという大きな利点がある。さらに、この株は、植物に天然防御機構を誘導する。ストレプトマイセス株にこれら４つの機構が同時に存在することには、植物保護製品の単一の有効成分に対する幅広い病害防除機構を組み合わせるという利点がある。
【００１５】
植物病原性薬剤に対する本発明の株の高い拮抗活性は、一部には、植物病原性細菌及び真菌、並びに線虫の増殖を阻害する抗菌化合物の産生の結果である。これらの化合物には、ポリケチド、キチナーゼ及びおそらくまだ知られていない抗菌活性を有する他の化合物が含まれる。
【００１６】
ストレプトマイセスの多くの株は（アミノグリコシド又はポリケチドとして抗菌性生合成遺伝子を保有しているにもかかわらず）、植物病原性真菌及び細菌に対する顕著な拮抗活性を持たない。対照的に、表１では、本発明のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株が、異なる植物病原性細菌に対して、及び異なる植物病原性真菌に対して、広範囲の顕著な拮抗作用を示し、これが驚くべきことに４種類の培養培地で維持されていることがわかる。これは、ナシ植物ナシにおけるＥ．アミロボーラ、トマト植物におけるシリンガエ病原型トマト、及びプルヌスにおけるＸ．アルボリコラ病原型プルニ（ＧＦ６７７）、並びに他の植物病原菌等の細菌によって引き起こされる感染を阻害することにおける本発明の株の有効性を示す（図６）。さらに、驚くべきことに、ＡＧＬ２２５株は、ポリケチド生合成遺伝子（図３）を提示することを除いて、真菌と線虫の両方に対して活性であるキチナーゼを産生する。殺線虫活性は、実施例６（図５、表４）に記載されているように、培養物に由来する無細胞上清を用いた線虫Ｃ．エレガンスの死亡率のアッセイで実証されている。
【００１７】
この抗菌プロファイル（抗菌剤と抗真菌剤の両方）は、ストレプトマイセスの他の株と比較すると驚くべきことである（分離された他のストレプトマイセス株が収載されている表１を参照されたい）。加えて、強力な抗菌活性は、本発明の株にいくらか特有の殺線虫及び植物防御活性により補完される。
【００１８】
抗菌性ポリケチドの合成に関連する遺伝子の存在は、実施例５に記載されるように判断され得る。植物病原性真菌及び細菌に対する拮抗活性は、実施例２及び実施例３に記載のように判断され得る。植物の真菌及び細菌性疾患を防除する能力は、実施例７に記載のように判断され得る。
【００１９】
この株のもう１つの顕著な特性は、タバコ植物で過敏反応（ＨＲ反応）を起こし、トマト植物の防御機構に関連する遺伝子の発現を誘導することである（実施例４、表３）。植物に関連する特定の微生物は、根圏又は地上部での処理として適用されると、いわゆる誘導全身抵抗性（ＩＳＲ：Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、病原体に対する防御反応を誘導することができることが知られている。ＩＳＲは、実施例４に開示されるように、タバコ植物におけるＨＲ反応により判断され得る。他の場合では、これらの微生物の成分又はそれらの増殖中に生成される代謝産物（発酵代謝産物）は、全身獲得抵抗性（ＳＡＲ：Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）と呼ばれるタイプの反応を誘導する場合がある。ＳＡＲは、実施例４に開示されているように、トマト植物においてＨａｒｐ遺伝子のような又はその他の防御遺伝子を誘導することで判断され得る。植物で誘導されるこれらの防御機構は、様々な病原体による感染に対する抵抗性、更には干ばつ等のストレスの状況に対する抵抗性を付与する。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等の様々な植物種でこれらの防御を誘発する植物関連細菌の例があるが、この特性はストレプトマイセス株では以前に実証されていない。
【００２０】
また、ＡＧＬ２２５株には、アミノグリコシド系抗生物質を産生しないという利点もある。ストレプトマイセス株はアミノグリコシド系抗生物質のよく知られた生産菌であり、総合有害生物防除、特に生物学的有害生物防除での安全性への懸念から、その使用が制限されている。ＡＧＬ２２５はこれらの物質を発現するための遺伝子を欠いているため、アミノグリコシドを生成しない。これは図３に示されている。代わりに、ＡＧＬ２２５はＩＩ型ポリケチドの合成のための生合成経路遺伝子（ａｃｔ０４）を含み（実施例５）、これは生物学的有害生物防除に適した抗菌性ポリケチドを産生する能力を必要とする。
【００２１】
Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株には、総合有害生物防除での使用に特に適した幾つかの利点がある。本発明では、「総合有害生物管理」は、農学の分野で通常の意味を有し、様々な補完的方法：物理的、機械的、化学的、生物学的、遺伝的、法的及び文化的側面の有害生物防除を使用する戦略として理解される。「総合有害生物管理」は、化学合成駆除剤の使用を削減又は排除し、環境への影響を最小限に抑えることを目的とした生態学的手法である。生態学的又は生物学的有害生物防除除の話もある。したがって、「有害生物防除」及び「生物学的有害生物防除」という用語は、同じ意味で使用され、総合有害生物防除を指す。
【００２２】
以下の実施例によって効果的に示されるように、本発明の株は、園芸植物及び果樹における種々の細菌性及び真菌性の病原体によって引き起こされる感染を予防するのに非常に効果的である。以下に示すデータから、この有効性は主に植物の空中器官（ａｅｒｉａｌ  ｏｒｇａｎ）（葉、果実、及び／又は花）と並んで根におけるこれらの病原体に対するその高い拮抗作用によるものであると結論付けることもできる。この素晴らしい能力は、生物学的有害生物防除に非常に重要である。
【００２３】
したがって、本発明の別の態様は、植物における駆除剤としてのＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の使用に関する。
【００２４】
本発明では、「駆除剤」という用語は、害有害生物とみなされる生体を殺傷する、撃退する、調節する、又は増殖を妨害することを意図した製品として、作物栽培学の分野におけるその通常の意味で理解される。明らかに、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の性質に起因して、「駆除剤」はバイオ駆除剤とも称される生物学的又は生態学的な駆除剤であることが理解される。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、植物中の細菌、真菌又は線虫によって引き起こされる病害を防除するためのＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の使用を提供する。「病害防除」とは、細菌、真菌又は線虫によって引き起こされる植物の病害の予防、治癒又は改善と理解される。この株は、病害を引き起こす有害生物を予防、減少若しくは根絶するため、及び／又は植物の自然防御を強化するため、この効果を達成する。特定の実施形態では、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の使用は、細菌、真菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するためのものである。この実施形態を、殺菌活性、殺真菌活性及び殺線虫活性を有する駆除剤としての上記株の使用として表現することもできる。本発明はまた、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株を植物に投与することを含む、植物有害生物の生物防除方法を提供する。
【００２６】
一実施形態では、処理される植物は、園芸植物又は果樹植物である。
【００２７】
植物における駆除剤としてのその使用を考慮して、上記株、また発酵代謝産物から十分な量の生存細胞を得ることができることが重要である。実施例２に示されるように、上記組成物は９０％超の細胞生存率を示し、それは保存の間、更には濃縮及び凍結乾燥の後も維持される。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、したがって、請求項１に記載のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の生細胞を得る方法であって：
（ｉ）ＡＧＬ２２５株を適切な培養培地に接種する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の接種培養培地を前記株の増殖に適した条件に供して細胞懸濁液を得る工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の細胞懸濁液を分離に供して、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の生細胞及び代謝産物含有上清（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を得る工程、
（ｉｖ）Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の細胞を収集する工程、並びに
（ｖ）任意に、得られた細胞を脱水プロセスに供する工程、を含む方法に関する。
【００２９】
本発明の株は、１％〜５％の最終濃度で液体培地に接種することができる。好ましくは、接種される培養物は、指数増殖期にある。細胞増殖を、好ましくは最終指数期又は定常期の開始に到達させ、７×１０＊８ＣＦＵ／ｍｌ〜２×１０＊９ＣＦＵ／ｍｌの細胞濃度を達成する。ストレプトマイセス株が胞子を生成することはよく知られている。この能力は、市販のバイオ駆除剤を製剤化するのに便利である。胞子はストレス条件に対して非常に抵抗性があり、ストレプトマイセスを含む製品を植物に適用した場合、産業処理が容易になり、有効期間が長く、生存率が高くなる。本発明の幾つか実施形態では、胞子を得るために、ＡＧＬ２２５培養物を定常期まで増殖させるか、又はストレス条件に供する。次いで、培養物を以下に記載するように更に処理するか、又は胞子を分離するためにＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターで濾過することができる。次に、Ｔｗｅｅｎ２０等の適切な溶液を加えて、胞子の均質な懸濁液を維持する。本発明はまた、別の態様において、ＡＧＬ２２５の胞子を提供する。これらの胞子は、上に記載するように入手可能であり得る。
【００３０】
胞子が幾つかの植物や微生物のライフサイクルの一部を形成することはよく知られているため、それらは胞子細胞とも呼ばれる。したがって、以下の実施形態では、「細胞」という用語は、それらの形成に条件が適切であった場合、胞子細胞を含む場合がある。
本発明の株の増殖に適した培養培地は、ＩＳＰ２、ＡＩＡ、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ及びＳＮＭ等の合成培養培地である。上記株の増殖に適した条件は、温度２５℃〜３０℃、ｐＨ６〜ｐＨ８、酸素濃度１０％〜５０％である。本発明の株の増殖は、固体培地で、又は液体培地で攪拌しながら行われる。好ましくは、液体培地が使用される。液体培地で本発明の株の細胞を得るための詳細な手順の例は、実施例２に記載されている。固体培地での生産では、ＡＧＬ２２５株をＩＳＰ２寒天の入ったペトリ皿に播種し、２８℃で１週間〜２週間インキュベートすることができる。接種したペトリ皿を上記株の増殖に適した条件、例えば上記の条件に供した後、３枚〜４枚の培養皿から滅菌蒸留水を含む４０ｍｌ〜６０ｍｌの懸濁液を調製する。
【００３１】
好適な分離技術としては、培養物の遠心分離又は濾過が挙げられる。培養液の遠心分離を、例えば最低８０００ｒｐｍで行うことにより、細胞を培養液（上清）から分離することができる。次いで、細胞を直接使用し、所望の密度に再懸濁し、脱水に供するか、又は破壊して、無細胞抽出物を得ることができる。
【００３２】
上記の方法から得られた細胞を、緩衝液等の適切な溶液中に、所望の密度、例えば１０＊１０ＣＦＵ／ｍｌに再懸濁してもよい。このようにして、細胞懸濁液が得られる。細胞懸濁液を得るため、適切な溶液は、細胞が増殖した培養培地、すなわち上記の工程（ｉｉｉ）の分離から生じる代謝産物含有上清でもあり得る。上清には、分離によって部分的に失われる活性代謝物が含まれるため、これは有利かもしれない。細胞を再懸濁するための別の適切な溶液は、新鮮な培地の使用であってもよい。細胞懸濁液は、上記で定義された方法の工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）を含む方法、すなわち、工程（ｉｉ）から得られた細胞懸濁液を分離に供しない方法によって直接得ることもできる。このようにして、懸濁液は細菌細胞によって分泌される活性代謝物を含む。直接得られた懸濁液は、当業者に知られている任意の適切な手段によって濃縮され得る。
【００３３】
本発明の別の態様では、上に開示されるようにして得られるＡＧＬ２２５細胞の細胞懸濁液、及び特に真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するための植物における駆除剤としてのこの細胞懸濁液の使用が提供される。本発明の特定の実施形態では、細胞懸濁液は、生存可能なＡＧＬ２２５細胞、培養培地、及び養培地を発酵させることによって上記株により産生された活性代謝産物を含む。この細胞懸濁液は、適切なバイオ駆除剤を製剤化するのに特に有利である。別の実施形態では、細胞懸濁液は、好ましくは新鮮な培養培地に再懸濁され、例えば１０９を超える高濃度で、生存可能なＡＧＬ２２５細胞を含む。高濃度のこの後者の細胞懸濁液は「接種物」とも呼ばれ、適切な培養培地に接種された場合にその株の新たな生存細胞を得るために使用される。
【００３４】
すでに言及されているように、培養培地からの細胞の分離によって得られた上清は、拮抗活性を持つ活性代謝物を含む。したがって、本発明の別の態様は、上で定義したＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の生細胞を得る方法の工程（ｉ）〜工程（ｉｉｉ）、及び上清を収集する更なる工程を含む、ＡＧＬ２２５代謝産物含有上清を得る方法を提供する。任意に、得られた上清を、蒸発又は限外濾過等の任意の適切な手段により濃縮してもよい。別の態様は、上記で定義されるＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の生細胞を得る方法の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）、及び工程（ｉｉｉ）から生じる上清を収集する工程、並びに任意に、該上清を濃縮する工程からなるＡＧＬ２２５代謝産物含有上清を得る方法を指す。別の態様は、これらの方法によって得られるＡＧＬ２２５代謝産物含有上清と並んで、特に真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するための植物における駆除剤としてのこのＡＧＬ２２５代謝産物含有上清の使用を提供する。
【００３５】
任意に、上記で定義された方法で得られたＡＧＬ２２５細胞を脱水プロセスに供してもよい。脱水は凍結乾燥プロセスによって実行され得るが、スラリーは流動床乾燥又は噴霧によっても乾燥され得る。これに関して、本発明の株の別の有利な特徴は、該株が胞子を産生するため、それが工業規模での微生物の産生において一般的である脱水プロセスに対して高い抵抗性を示すことである。したがって、本発明は、本明細書で定義されるように入手可能なＡＧＬ２２５株の脱水細胞も提供する。脱水細胞は、もちろん、特に真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物の有害生物を防除するために、植物において駆除剤として使用することもできる。
【００３６】
Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の細胞を更に処理して、無細胞抽出物を得ることができる。したがって、本発明の別の態様は、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の細胞を：
（ｉ）Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の細胞を破壊する工程、
（ｉｉ）無細胞抽出物を細胞片から分離する工程、
（ｉｉｉ）無細胞抽出物を収集する工程、及び
（ｉｖ）任意に、無細胞抽出物を濃縮プロセスに供する工程、に供することを含む、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５の無細胞抽出物を得る方法を提供する。
【００３７】
適切な破壊手段は、当業者に知られており、物理的破壊、例えば凍結融解若しくはフレンチプレス、又は化学的破壊、例えばリゾチームの添加を含み得る。適切な分離手段は上記に記載されている。濃縮のための適切なプロセスの非限定的な例は、脱水（凍結乾燥噴霧乾燥）、濾過、限外濾過、沈殿、遠心分離、及びクロマトグラフィーである。無細胞抽出物はまた、好ましくは代謝産物含有上清を含む、上で定義された細胞懸濁液から得られてもよい。
【００３８】
別の態様は、上記に定義されるプロセスによって得られるＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５代謝産物含有上清と並んで、特に真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するための植物における駆除剤としてのこの無細胞抽出物の使用を提供する。
【００３９】
本発明はまた、いずれも上記に定義されるＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５細胞、脱水ＡＧＬ２２５細胞、ＡＧＬ２２５の細胞懸濁液、代謝産物含有ＡＧＬ２２５上清又はＡＧＬ２２５無細胞抽出物を植物に投与することを含む、植物有害生物の生物防除方法に関する。
【００４０】
有害生物防除におけるそれらの使用を考慮して、駆除薬剤は通常、それらが設計される農業用途に適した添加剤も含む組成物に製剤化される。本発明の組成物は、固体（例えば、脱水した細菌濃縮物を含む）又は液体（細菌濃縮懸濁液を含む）であってもよい。したがって、本発明の別の態様は、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株、及び１つ又は複数の農業上許容可能な化合物を含む組成物を提供する。「農業上許容可能な化合物」とは、農業での使用に適し、一般に受け入れられている化合物及び／又は材料を指す。一般に、かかる化合物は人間に対して無毒でなければならず、環境に優しいことが望ましい。
【００４１】
本発明はまた、上記で定義される脱水細胞、細胞懸濁液、代謝産物含有上清、無細胞抽出物、又はそれらの組み合わせを、１つ又は複数の農業上許容される化合物と共に含む組成物も提供する。以下本明細書において、「本発明の組成物」とは、上に言及される組成物のいずれかを指し、その全てがＡＧＬ２２５株又はＡＧＬ２２５株に由来する生成物を含む。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、本発明の組成物は、処理される植物において上記株の接着を改善する化合物、植物強化化合物、栄養素、湿潤剤、安定化剤、浸透圧保護剤、抗酸化剤、日焼け止め、緩衝化合物、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。幾つかの接着促進化合物は、ゼラチン、デンプン、ペクチン、アルギン酸塩、及びキサンタン等の様々なタイプのガムである。これらの化合物の多くは保湿剤でもある。日焼け止めにはコンゴレッド等の染料が含まれる。植物強化剤は、作物の活力、又は病原菌若しくは有害な環境条件への抵抗性を促進する可能性のある化合物である。植物強化剤の非限定的な例は、ジャスモン酸類縁体、及びハルピン、キトサン、及びラミナリン等の植物における特定の防御刺激物質である。特に、本発明の組成物は、少なくとも１つの浸透圧保護剤を含む。浸透圧保護化合物の非限定的な例は、ベタイン、アミノ酸及びトレハロースである。幾つか微生物駆除剤では、生理学的適応（浸透圧保護剤）及び栄養強化によって、幾つかの植物病原菌による感染に対する生物防除剤の有効性の改善が実証されている。例えば、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＥＰＳ１２５では、浸透圧調節物質（例えば、トレハロース等）を含む製剤を補正することにより、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）によって引き起こされる収穫後の果実の腐敗に対して、水ストレス下で生存及び病害防除の有効性が証明されている（Ｂｏｎａｔｅｒｒａら２００５）。さらに、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＥＰＳ６２ａでは、栄養強化（例えば、グリシン、Ｔｗｅｅｎ８０の添加等）及び浸透圧調節物質（グリシン−ベタイン等）によって、リンゴ及びナシの木の火傷病の防除の適応性及び有効性が改善された（Ｃａｂｒｅｆｉｇａら２０１１，Ｃａｂｒｅｆｉｇａら２０１４）。興味深いことに、オスモライト及び／又は特定の栄養素と生物防除細菌の組み合わせの効果は、防除のより良い有効性を伴って相乗効果を提供したが、試験間でもより一貫していた。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、ＡＧＬ２２５株及び少なくとも１つの追加の駆除剤を含む組成物を提供し、該追加の駆除剤はＡＧＬ２２５株の活性に悪影響を及ぼさない。一実施形態では、追加の駆除剤は、殺菌剤、殺真菌剤、殺線虫剤又は殺虫剤である。別の実施形態では、追加の駆除剤はバイオ駆除剤である。別の実施形態では、バイオ駆除剤は、殺真菌、殺菌及び／又は殺線虫活性を有する別の細菌株である。好ましくは、追加の駆除剤はストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８である。
【００４４】
本発明の更なる態様は、上記で定義された組成物のいずれかの、植物において、特に真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するための駆除剤としての使用と並んで、上記で定義された組成物のいずれかを植物に投与することを含む植物有害生物の生物防除方法を提供する。
【００４５】
Ｓ．メラノスポラファシエンス（ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒａｆａｃｉｅｎｓ）ＡＧＬ２２５株と同様に、本発明者らは、Ｓ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株が抗真菌活性、抗菌活性及び殺線虫活性を同時に発揮するという大きな利点を示すことを見出した。Ｓ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株は、ジローナのクルミの木の畑の土壌から単離され、ブダペスト条約に従い、２０１７年７月１８日にパルクシエンティフィックバレンシア大学、カテドラーティコアグスティンエスカルディーノ、９、４６９８０パテルナ（バレンシア）バレンシア大学にあるスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）に寄託された。Ｓ．ヤテンシス株は、識別参照ＡＧＬ１４８で寄託され、アクセッション番号ＣＥＣＴ９４２１を受領した。
【００４６】
この株はまた、植物の自然な防御機構を誘導する。Ｓ．ヤテンシスＡＧＬ１４８は、特定の拮抗パターンにおいてＡＧＬ２２５とは異なるが、植物保護製品の単一の有効成分に対して幅広い病害防除を合わせるという同じ利点を提供する。Ｓ．ヤテンシスＡＧＬ１４８は、生物学的有害生物防除での使用にも安全であり、胞子形成能力等の特性を備えているため、産業用バイオ駆除剤の生産及び使用に特に適している。
【００４７】
したがって、本開示はまた、スペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）でストレプトマイセス・ヤテンシスＣＥＣＴ９４２１として同定されたＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株にも言及している。以下の実施例に示すように、ＡＧＬ１４８株は次の特性を持つことを特徴とする。
（ｉ）細菌Ｅ．アミロボーラ、Ｐ．シリンガエ病原型トマト、Ｐ．シリンガエ病原型アクチニジア、アルボリコラ病原型プルニＸ．、並びに真菌Ｂ．シネレア、Ｆ．オキシスポラム及びＳ．べシカリウムに対する拮抗活性（表１）；
（ｉｉ）ＩＳＰ２、ＡＩＡ、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、及びＳＮＭ等の様々な培養培地でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拮抗作用（表１）。
（ｉｉｉ）線虫Ｃ．エレガンスに対するキチン分解及び殺線虫活性（図５、表４）。
（ｉｖ）抗菌性ＩＩ型（ａｃｔ０４／ＡＣＴ８）ポリケチド産生のための遺伝子を有するが、アミノグリコシド系抗生物質の遺伝子はない（図３）。
（ｖ）一旦細胞がなくなると（増殖した細胞懸濁液の上清）、上記株が増殖した培養培地は、発酵によって該株により産生される活性代謝産物の特有のＨＰＬＣプロファイルを有する。この代謝産物プロファイルは、ＡＧＬ２２５株に特徴的であり、ストレプトマイセスの他の株と区別される（図４）。これらの代謝物はまた、殺菌活性、殺真菌活性、及び殺線虫活性を持つ。
（ｖｉ）タバコの葉に細胞を浸潤させることにより過敏性反応を起こし（ＨＲ反応）、またトマト植物に防御遺伝子Ｈａｒｐを誘導することによって、天然の植物防御を誘導する（表３）。
（ｖｉｉ）ナシにおけるＥ．アミロボーラ、トマト植物に対してＰ．シリンガエ病原型トマト、プルヌスにおいてＸ．アルボリコラ病原型プルニの植物病原菌；並びにレタスに対してＳ・スクレロチオラム、トマトにおいてＦ．オキシスポラム分化型ラディシス・リコペルシチ、及びトマトにおいてＢ．シネラの植物病原性真菌によって引き起こされる感染を阻害する能力を有する（図６）。
【００４８】
Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株について上述した全ての態様及び実施形態は、ストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８株にも適用される。したがって、本発明はまた、上記に定義されるものと同じ特徴を含む、ストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８細胞（上記で説明されるように条件が胞子形成に適切である場合、胞子の形態の細胞を含む又はそれからなる）、脱水ＡＧＬ１４８細胞、ＡＧＬ１４８の細胞懸濁液、代謝産物含有ＡＧＬ１４８上清、及びＡＧＬ１４８無細胞抽出物を得る方法を提供する。本発明はまた、上記方法により得られるストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８細胞、脱水ＡＧＬ１４８細胞、ＡＧＬ１４８の細胞懸濁液、代謝産物含有ＡＧＬ１４８上清、及びＡＧＬ１４８無細胞抽出物を提供する。ストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８細胞、脱水ＡＧＬ１４８細胞、ＡＧＬ１４８の細胞懸濁液、代謝産物含有ＡＧＬ１４８上清、ＡＧＬ１４８無細胞抽出物、又はそれらの混合物を含む組成物も、上記で定義される類似の用語で提供される。ＡＧＬ１４８株、その誘導体（脱水細胞、細胞懸濁液、代謝産物含有上清又は無細胞抽出物）、又はそれらを含む組成物の使用は、特に真菌、細菌又は線虫によって引き起こされる植物有害生物を防除するため、植物における駆除剤として提供される。最後に、ＡＧＬ１４８株、その誘導体（脱水細胞、細胞懸濁液、代謝産物含有上清又は無細胞抽出物）、又はそれらを含む組成物を植物に投与することを含む、植物有害生物の生物防除方法が提供される。Ｓ．メラノスポラファシエンスＡＧＬ２２５について上述したこれらの態様のそれぞれの特定の実施形態は、ストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８株に関連する態様にも適用される。また、上で示したように、「細胞」という用語は、胞子細胞が形成に適切な条件である場合、胞子細胞を含むか、又は胞子細胞からなる場合ある。
【００４９】
本発明はまた、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５及びストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８株の変異体に関する。「変異体」という用語は、本発明のＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５又はストレプトマイセス・ヤテンシスＡＧＬ１４８を出発株として使用して得られ、上記の特性を維持することを特徴とする株を指す。本発明によれば、株の「変異体」も「バリアント」として理解される。当業者は、本発明の株を出発材料として使用すると、例えば、自発的突然変異又は定方向突然変異誘発により、本明細書に記載の特徴及び関連する利点を保持する突然変異体を日常的に得ることができることを理解するであろう。所与の細菌株の変異体を取得する方法は、当技術分野で知られている。例は（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ´´Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ´´，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，´´Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ´´，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１）に見られる。
【００５０】
発明の詳細な説明及び特許請求の範囲を通して、「含む」という単語及びその変形は、他の技術的特徴、付加物、構成要素又は工程を除外することを意図していない。さらに、「含む」という単語は「からなる」という場合を含む。本発明の他の目的、利点及び特徴は、一部は発明の詳細な説明から、一部は本発明の実施から当業者には明らかとなる。以下の実施例は、実例として提供され、本発明の限定を意図するものではない。さらに、本発明は、本明細書に述べられる特定及び好ましい実施形態の全ての可能性のある組み合わせを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ストレプトマイセス株のｒｐｏＢ及び１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を使用して得られた系統樹。ＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株は、樹状図の上部にＳ．ヤテンシス／Ｓ．メラノスポロファシエンスとして表わされる。樹上図を、Ｄｉｃｅ及び近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して構築した。
【図２】ストレプトマイセス分離株に対するＲＡＰＤパターンで得られた樹状図。距離行列を、Ｄｉｃｅ係数及びＵＰＧＭＡ分類を使用して計算した。ＬＴＩ、ｄ８６３５、及び１．８０．７プライマーで得られたＲＡＰＤパターンを使用して、各株についてデータを合わせる。示される株には、この研究で得られたストレプトマイセスの２５の分離株及び参照コレクションからの９菌（Ｓ．サラセチカス（Ｓ．ｓａｒａｃｅｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ハイグロスコピカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、Ｓ．グリセオビリジス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｓ．ビオラセンス（Ｓ．ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ）、Ｓ．リプマニイ（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｉ）、Ｓ．アンチビオチクス（Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、Ｓ．フラディア（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、Ｓ．ロケイ（Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ）、及びＳ．バイオラセウス（Ｓ．ｖｉｏｌａｓｃｅｕｓ））が含まれる。ＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株が示される。
【図３】ストレプトマイセス種の株における種々のタイプの代謝産物（アミノグリコシド、ポリケチド及びベータ−ラクタム）の生合成経路遺伝子の存在。検出はＰＣＲ増幅により行われた。円外の株は、３つの経路遺伝子のプライマーのいずれを用いても増幅産物が検出されなかった株である。
【図４】Ｃ１８カラムＫｉｎｅｔｅｘ２５０（左パネル）又はＣ１８−ＸＢカラム（右パネル）でのストレプトマイセス株のクロマトグラフィープロファイル（ＨＰＬＣ）。左パネル：ＩＳＰ２新鮮培地（Ａ）、Ｓ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株の抽出物（Ｂ）及びＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の抽出物（Ｃ）。右パネル：ストレプトマイセス種ＡＧＬ２６０株（Ｄ）と比較した、ＩＳＰ２新鮮培養培地（Ａ）、Ｓ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株の抽出物（Ｂ）及びＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株の抽出物（Ｃ）におけるもの。Ｙ軸は、収集された各画分の吸光度を示し（ｍＡＵ＝ミリ−吸光度単位）、Ｘ軸は溶出時間（分）である。
【図５】ＩＳＰ２培地でのストレプトマイセス株の培養物に由来する上清で処理した後の、線虫に対する殺線虫活性。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯＰ５０（Ａ）、アジ化ナトリウム（Ｂ、死亡率の対照）、ＡＧＬ１４８の上清（Ｃ）及びＡＧＬ２２５（Ｄ）を含むＭ９バッファー対照。まっすぐな線虫は死滅したものに対応し、湾曲したものは生きている個体に対応することに注意されたい。
【図６】プルヌス・ハイブリッド・ピーチ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｅａｃｈ）×アーモンドＧＦ６７７（Ｘａｐ）においてＸ．アルボリコラ病原型プルニ（Ｘ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ  ｐｖ．ｐｒｕｎｉ）、ナシでＥ．アミロボーラ（Ｅ．ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（Ｅａ）、トマトにおいてＰ．シリンガエ病原型トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）、トマトにおいてＦ．オキシスポラム分化型リコペルシチ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）（Ｆｏｘ）、トマトにおいてボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（Ｂｃ）、及びレタスでＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（Ｓｓ）によって引き起こされる感染症の防除におけるストレプトマイセスＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株を用いる処理の効果。結果を未処理（ＮＴＣ）対照と比較する。Ｙ軸は疾患の重症度を表す。Ｘ軸は株のコードを表す。ＱＳＴ７１３（枯草菌）及びＳｓ３１（ストレプトマイセス・サラセチカス）株を参照生物防除（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。値は３回の反復の平均であり、エラーバーは平均の９５％信頼区間を表す。Ｎｄ：特定していない。
【実施例】
【００５２】
実施例１．Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株及びＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株の単離及び特性評価
【００５３】
ａ）ストレプトマイセス株の分離のための野外サンプルの調製
ストレプトマイセスの分離株を取得するためのサンプリングは、２０１４年７月から９月に実施された。５４の全てのサンプルで、農地、森林地域、及び極端な条件（海岸砂丘）のある地域を選択した。サンプルを、ホモジナイザーを使用して、リン酸緩衝水溶液で植物又は土壌の材料を抽出することにより処理した。得られた懸濁液を希釈し、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ寒天を含むペトリ皿に播種し、３０℃で３日間インキュベートした。典型的なストレプトマイセスの形態を持つコロニーを使用して、更に純粋な培養物を得た。５４のサンプルから推定ストレプトマイセスの合計３９７分離株を得た。分離株を保存するために、コロニーを掻き取り、リン酸バッファーに再懸濁することにより、固体培地で約５日間の純粋培養から細胞及び胞子の懸濁液を得た。次いで、同じ容量の懸濁液を４０％グリセロールと混合した。該容量を２つのクライオチューブに分割し、−２０℃で２４時間後に、−７０℃のディープフリーザーに保管した。
【００５４】
ｂ）ストレプトマイセス属レベルでの分離株の同定
分離株がストレプトマイセス属に属することを確認するために、その属に特異的なプライマー（Ｓｔｒｅｐ／ＳｔｒｅｐＦ及びＳｔｒｅｐＢ／ＳｔｒｅｐＥ）を用いたＰＣＲに基づく方法を使用した（Ｒｉｎｔａｌａら２００１）。各懸濁培養物を、１００℃で１５分間の熱ショックを使用するＤＮＡ抽出に供した。最初のＰＣＲを、プライマーＳｔｒｅｐＢ／ＳｔｒｅｐＦ（フォワード５´−３´ＡＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＴ；配列番号１、リバース５´−３´ＡＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡ；配列番号２）を行い、負の増幅を与えたそれらの株を用いて、新しいＰＣＲのセットをＳｔｒｅｐＢ／ＳｔｒｅｐＥプライマー（フォワード５´−３´ＡＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＴ；配列番号１、リバース５´−３´ＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴ；配列番号３）を使用して行った。ＤＮＡがいずれかのプライマーで増幅された場合、分離株はストレプトマイセス属に属すると見なされた。３９７株の分離株のうち、３１１株がストレプトマイセス属に属することが最終的に確認された。並行して、コロニーの形態を、ストレプトマイセスについて記載されている様々な培地（ＩＳＰ２、ＹＥＭＥＳ及びオートミール）において、及び真菌に適したジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）においても調べた（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，１９９６，Ｓｃｈｅｐｅｒら２０１０）。
【００５５】
ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拮抗作用とキチン溶解作用
ストレプトマイセス属に属する純粋培養で得られた分離株を、真菌及び細菌の増殖を阻害する能力について最初に研究した。
ＩＳＰ２培地で５日間〜７日間増殖させたストレプトマイセスの培養物のディスクを使用して、拮抗アッセイを実施した。これらのディスクを、コンフルエント増殖で病原体と共に先に播種しておいたＩＳＰ２寒天ペトリ皿（又はストレプトマイセスの増殖に適した他の増殖培地）に入れた。幾つかの植物病原体に対する拮抗作用を調査した。病原体を植物病原菌のなかから選択した：バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）で火傷病を引き起こす変異非病原性株ＣＦＢＰ１４３０（フランス国アンジェの植物病原性細菌のフレンチ・バクテリア・コレクション）であるエルウィニア・アミロボーラ６０７６、トマトに細菌斑を引き起こすシュードモナス・シリンガエ病原型トマトＤＣ３０００、キウイフルーツに細菌性潰瘍を引き起こすＰ．シリンガエ病原型アクチニジアＮＣＰＰＢ３７９３（イギリス国、植物病原性細菌のナショナル・コレクション）、核果樹に細菌斑を引き起こすキサントモナス・アルボリコラ病原型プルニＣＦＢＰ５５６３；及び褐色の腐敗又は青枯病を引き起こすラルストニア・ソラナセウムＣＥＣＴ１２５（スペイン国バレンシアのスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション）。植物病原性真菌として選択された指標は次の通りである：トマトで維管束閉塞萎凋（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｗｉｌｔｉｎｇ）を引き起こすＦ・オキシスポラム分化型リコペルシチＡＴＣＣ  ２０１８２９（米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）；ボトリティス・シネレア３３７５９Ｂ、多くの植物で灰色腐敗病（ｇｒａｙ  ｒｏｔ）を引き起こす、並びに洋ナシ及びタマネギに茶色の斑点を引き起こすステンフィリウム・べシカリウムＥＰＳ  ２６（ＩＮＴＥＡ、ジローナの農業食品技術研究所（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。
【００５６】
ペトリ皿を３０℃で数日間インキュベートした後、ストレプトマイセス株の周囲及び標的微生物の発育阻止帯の直径を決定した。阻止帯の直径を考慮した活動指数を使用した。細菌場合、次の指標を使用した：０、阻害なし；１、０ｃｍ＜ＩＺ≦１ｃｍ；２、１ｃｍ＜ＩＺ≦２ｃｍ；３、２ｃｍ＜ＩＺ≦３ｃｍ。真菌の場合、次のスケール：０、抑制なし；１、０ｃｍ＜ＩＺ≦０．６ｃｍ；２、０．６ｃｍ＜ＩＺ≦１．２ｃｍ；３、１．２ｃｍ＜ＩＺ≦２ｃｍ。
【００５７】
細菌株のキチン分解活性を、キチン培地を使用して評価した。唯一の栄養素としてキチンを補充したミネラル塩からなる最小培養培地を調製した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｋａｂａｎａら１９８３；Ｆｒａｅｎｄｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｕｅｒｅｒ，１９９８）。培地には、蒸留水１Ｌに１．５ｇ／Ｌのコロイドキチン、２．７ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．７ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮａＣｌ、０．１３ｇの酵母抽出物、及び２０ｇの寒天が含まれていた。ストレプトマイセスの分離株をキチン寒天表面上で３回採取し、プレートを２８℃で７日間インキュベートした。キチナーゼを分泌できるコロニーは、それらの周りに透明なハローを示した。キチナーゼの陽性対照として、参照株シュードモナス・フルオレッセンスＢＬ９１５を使用した。試験した２８１の分離株のうち、大半（２４７）がキチナーゼ活性を示した。意義深いことに、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５及びＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８は、活性なキチナーゼ生産菌であり、これらの株に潜在的な殺線虫活性、更には殺虫活性も与えた。
【００５８】
得られたストレプトマイセスの３１１の分離株のうち、６６は異なるレベルで抗菌活性及びキチン分解活性を有しており、抗菌活性のより詳細な研究のために選択された。選択された６６株の最初のスクリーニングは、８つの植物病原性微生物に対して異なるスペクトル及び作用強度を示した。
【００５９】
培養培地の種類については、他の培地（ＡＩＡ、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、ＳＮＭ）と比較して、真菌と細菌の両方に対するＩＳＰ２培地で抗菌活性の増加が観察された。１つの群では、株は抗菌活性（例えば、ＡＧＬ７、ＡＧＬ１１３、ＡＧＬ１５）を示したが、他の群では、主に抗真菌活性（例えば、ＡＧＬ１４８、ＡＧＬ１６４、ＡＧＬ２２７、ＡＧＬ２１９）を示した。驚くべきことに、ＡＧＬ２２５株は強力な抗真菌活性と同時に抗菌活性を示した。選択された株の例を表１に示す。
【００６０】
表１．植物病原性細菌（Ｘ．アルボリコラ病原型プルニ、Ｅ．アミロボーラ、Ｐ．シリンガエ病原型トマト、Ｐ．シリンガエ病原型アクチニジア、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ））；及び植物病原性真菌（Ｓ．べシカリウム、Ｆ．オキシスポラム及びＢ．シネレア）に対するストレプトマイセス種の分離株の抗菌及びキチン分解活性。示される結果は、ＩＳＰ２、ＡＩＡ、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、及びＳＮＭの増殖培地で得られた平均ハルス（ｈａｌｕｓ）である。キチナーゼ活性も示される。値は、細菌コロニー又はキチンハルスの周囲のハルスの直径を考慮した活動係数（各病原体について０〜３）に対応する。
【表１】
2020535841.tif 000002
【００６１】
ｄ）種レベルでのストレプトマイセス株の同定
もともとストレプトマイセスとして分類された３１１の分離株のうち、重要な抗菌活性を持つ６６を選択した。分離株を１６ＳｒＤＮＡ及びｒｐｏＢ遺伝子の部分的な配列決定に供した（Ｋｉら´´Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｐｏｒｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ´，２００９，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．２８０６−２８１１）。ＰＣＲは、培養液に由来するＤＮＡに対して、ＳｔｒｅｐＢ／ＳｔｒｅｐＦプライマーを使用して、１６ＳｒＤＮＡ（Ｒｉｎｔａｌａら２００１）の５１９ｂｐの断片を増幅し、ＳＲＰＯＦ１プライマー（５´−ＴＣＧＡＣＣＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＣＧＣ−３´；配列番号４）、及び３５２ｂｐのアンプリコンを生成するＳＲＰＯＲ１（５´−ＴＣＧＡＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＧＣＧＧＣＣ−３´；配列番号５）（Ｋｉｍら２００１）を用いて行った。
【００６２】
２遺伝子の増幅を、１×バッファー、３ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、２ＵのＴａｑポリメラーゼ（スペイン国、Ｂｉｏｏｔｏｌｓ）及び２μｌのサンプルを含む２５μｌの最終容量で行った。サーモサイクラープログラムは、９５℃で５分間を１サイクル、９５℃で４５秒間を３０サイクル、６０℃で４０秒間、及び７２℃で２分間で構成され；最終的に７２℃で１０分間増幅し、最後に４℃で維持した。Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）のプロフェッショナルＴＲＩＯサーモサイクラーを使用した。増幅が完了すると、結果を１％アガロースゲルで観察し、７５Ｖの電場を４０分間印加し、臭化エチジウムで２０分間染色した。画像を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でキャプチャした。
ＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｋｉｔ  Ｑｕｉｑｕｉｃｋ精製ＰＣＲ）、ＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／マイクロリットルに調整し、シーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（米国カリフォルニア州のＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＤＮＡ５μｌ及び５μＭのプライマー５μｌを用いてシーケンシングを行った。シーケンシングをＤＮＡ鎖の両方向で行った。編集された配列を、Ｃｈｒｏｍａｓ  ２．４（プログラムｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｉｎｆｏｒｍｅｒ．ｃｏｍ／ｃｈｒｏｍａｓ／２．４／）で取得し、プログラムＢｉｏＥｄｉｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｅｄｉｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）、及びＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のＢＬＡＳＴプログラムによって相動性を決定した。
【００６３】
ＢＬＡＳＴプログラム（ＧｅｎＢａｎｋ）を使用した１６ＳｒＤＮＡの配列分析では、種レベルで全ての分離株を明確に区別することはできなかった。このため、ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニット（ｒｐｏＢ）の遺伝子のシーケンシングを更に進め（Ｋｉｍら２００４）、これはストレプトマイセスの株に適用することができ、系統解析にも適している（Ｄａｈｌｌｏｅｆら２０００；Ｋｉｍら２００４）。
【００６４】
６６株のうち、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで２５の一致が得られた。２５株のうち９株で、２つの同定システム（１６ＳｒＤＮＡ及びｒｐｏＢ）が一致した。ストレプトマイセスに属する分離株の中で、Ｓ．ヤテンシス（ＡＧＬ１４８、ＡＧＬ１６４及びＡＧＬ２１９）又はＳ．メラノスポロファシエンス（ＡＧＬ１７１及びＡＧＬ２２５）に属する最も活発な抗菌株であることが確認された。Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５株及びＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８株の配列をＧｅｎＢａｎｋに寄託した（ＡＧＬ２２５株：遺伝子１６ＳｒＤＮＡアクセッション番号ＭＧ００８６２５、遺伝子ｒｐｏＢアクセッション番号ＭＧ００７９０２；株ＡＧＬ１４８：遺伝子１６ＳｒＤＮＡアクセッション番号ＭＧ００８６２６、遺伝子ｒｐｏＢアクセッション番号ＭＧ００７９０３）。
【００６５】
さらに、１６ＳｒＤＮＡ及びｒｐｏＢ遺伝子の配列を使用して系統樹を行った。最初に、分析に適切なフラグメント長を選択するため、それらをＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）と整列した。デンドログラムを、ＭＥＧＡ６を使用して１０００回のブートストラップ複製を行う近隣結合法で実行した（Ｔａｍｕｒａ  Ｋら．２０１３）。
【００６６】
系統発生分析は、ほとんどの株が樹状図全体に分布していることを示したが、ＡＧＬ２１９、ＡＧＬ２２５、ＡＧＬ１６４、ＡＧＬ１６１及びＡＧＬ１４８からなる明確で非常に均質な明らかなグループが存在した（図１）。ＧｅｎＢａｎｋデータベースとの相同性によると、ＡＧＬ１４８株はＳ．ヤテンシス種に、ＡＧＬ２２５株はＳ．メラノスポロファシエンス種に対応している。
【００６７】
ｅ）株レベルでのストレプトマイセス分離株の区別
ストレプトマイセスＡＧＬ２２５及びＡＧＬ１４８の株を他のストレプトマイセスの株と区別するため、それらのＤＮＡフィンガープリンティングプロファイルを決定した。本発明者らは、株の類型化を可能にする（Ｗｉｌｌｉａｍｓら１９９０）、ＰＣＲ増幅によって生成された単一の短い任意のプライマー（８〜１２ヌクレオチド）を用いるＲＡＰＤ手法（無作為増幅多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ））を使用した。Ｓ．サラセチカスＳｓ３１を含む、野外サンプルに由来する２５系統及び９系統の参照系統のセットを使用した。
菌株をＩＳＰ２液体培地で５日間増殖させ、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ抽出ミニキットを使用して製造元の指示に従ってＤＮＡを抽出した。
【００６８】
ＲＡＰＤを実行するため、最初の試験では、株のＤＮＡ（２５ｎｇ／μｌ）を１２のプライマー：ＬＩＴ（５´−３´（ＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧ；配列番号６、ＯＰＡ９（５´−３´ＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣ；配列番号７）、ＯＰＡ１０（５ＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴ；配列番号８）、ＯＰＡ２  ５´−３）（Ｋｏｎｇら２００１）´´−３´ＧＴＧＡＴＣＧＣＡＧ；配列番号９）（Ｇｈａｒａｉｂｅｈら２００３）、ＯＰＡ  Ｂ９（５´−３´ＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣ；配列番号１０）（Ｂｏｒｏｕｊｅｎｉら２０１２）、ｄ８６３５（５´−３´ＧＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣ；配列番号１１）（Ｋｕｔｃｈｍａら１９９８）、Ｇｅｎｅ１．８０．５（５´−３´ＡＣＣＣＣＡＧＣＣＧ；配列番号１２）、遺伝子１．８０．７（５´−３´ＧＣＡＣＧＣＣＧＧＡ；配列番号１３）、Ｇｅｎｅ２．８０．１１（５´−３´ＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧ；配列番号１４）、遺伝子４．８０．３５（５´−３´ＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣ；配列番号１５）、遺伝子４．８０．３６（５´−３´ＧＧＣＣＴＣＣＡＣＧ；配列番号１６）、遺伝子４．８０．３７（５´−３´ＣＧＣＣＡＧＧＡＧＣ；配列番号１７）（Ｍａｒｔｉｎら２０００）で増幅した。最良の結果が得られたのは、プライマーＬＩＴ、ｄ８６３５、及び１．８０．７で、より多くのバンドが得られた。
【００６９】
ＰＣＲカクテルは２５μｌで、そのうち２μｌは株のＤＮＡであった。バッファーの最終濃度は１×、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．４μＭプライマー、及びＴａｑポリメラーゼ１単位であった。２つの異なる増幅サイクルのシーケンス（３７℃で５サイクル、５５℃で３０サイクル）のプログラムを使用した。Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）のプロフェッショナルＴＲＩＯサーモサイクラーを使用した。増幅が完了したら、結果を１．５％アガロースゲルで観察し、６０分間７５Ｖの電場に供し、ＥｔＢｒで２０分間染色した。結果をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でキャプチャした。ゲルの画像をＩｍａｇｅ  Ｌａｂ  ｖ．４（Ｂｉ−Ｒａｄ）プログラムで処理して、フラグメントサイズ（ｂｐ）を計算した。３つのプライマーのデータを使用して、バイナリマトリクスを構築し、株内の特定の分子量のフラグメントの有無を判断した。類似性の計算をＤｉｃｅ係数を使用して行い、最後にデンドログラムをプログラムＮＴＳＹＳｐｃ  ｖ２．０によるＵＰＧＭＡ法（算術平均を使用した非加重ペアグループ法）を使用するクラスター分析により行った。
【００７０】
図２は、２５の分離株と１０の参照株Ｓ．サラセチカス、Ｓ．ハイグロスコピカス、Ｓ．グリセオビリジス、Ｓ．ビオラセンス、Ｓ．リプマニイ、Ｓ．アンチビオチクス、Ｓ．フラディア、Ｓ．ロケイ及びＳ．バイオラセウスについて、ＲＡＰＤパターンとＬＩＴ、ｄ８６３５及び１．８０．７のプライマーとの組み合わせから派生したＵＰＧＭＡ法により得られた樹状図を示している。各株は、ＲＡＰＤ  ＤＮＡフィンガープリント法、特にＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株で区別できることがわかる。したがって、本発明の株は、コレクション又は市販製品からのものを含む他の分離株とは異なる独特で特徴的なＲＡＰＤパターンを有する。
【００７１】
実施例２．培養培地に由来する細胞懸濁液及び抽出物の濃縮物を得るための、本発明の株の培養物及び無細胞抽出物の調製。
【００７２】
ＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株の細胞又は代謝産物の生産のため、培養物をＩＳＰ２プレートで増殖させた。本発明のストレプトマイセスの発酵代謝産物を含む培養物の濃縮細胞懸濁液又は無細胞上清を得るため、株を液体ＩＳＰ２培地で１週間培養し、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃でインキュベートした。固定相で得られた物質を、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離に供した。細胞を含むペレットを少量のリン酸バッファーに再懸濁して、１０＊９ＣＦＵ／ｍｌの濃縮細胞懸濁液を得ることができる。濃縮された細胞懸濁液は、植物病原体に人工的に感染した植物の病害防除のように更なるアッセイに使用できる。
【００７３】
上記株を培養することにより生成された代謝産物を含む遠心分離の上清を、抗菌活性アッセイに使用した。上清を０．４５マイクロメートルのポアフィルターで濾過し、濾液を後で使用するために−８０℃で凍結した。これらの抽出物を凍結乾燥により更に濃縮して、固体抽出物を得て、使用するまで保存してもよい。この場合、固体材料を蒸留水若しくはメタノールに懸濁するか、又は酢酸エチル若しくはヘキサン／クロロホルムによる相抽出により、その成分の抽出／部分精製にかけることができる。かかる画分を蒸発させ、ペレットをメタノールに再懸濁してもよい。これらの材料は全て、抗菌活性又は殺線虫活性のアッセイ、及び活性成分のＨＰＬＣクロマトグラフィー分析に使用することができる。
【００７４】
実施例３．無細胞培養上清の抗菌活性
１００マイクロウェルプレートを使用して、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎシステム（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で培養上清をアッセイした。プレートの各ウェルには、１００μｌの上清（直接又は所望の希釈）、８０のＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロス（２×）、及び２０μｌのＸ．アルボリコラ病原型プルニ又はＦ．オキシスポラムの胞子の懸濁液が含まれていた。阻害の結果をＡＵｍｌ−１として任意単位に変換した。ＡＵを病原菌の増殖を阻害する最高希釈（Ｄ）の逆数として計算し、４０倍した（Ｐａｒｅｎｔｅら１９９５）。表２は、６つの最良の株の結果を示している。ＡＧＬ１３、ＡＧＬ２５、ＡＧＬ３１株の上清はＦ．オキシスポラムに対して抗真菌活性を示し、ＡＧＬ２８６株は抗細菌活性を示したが、ＡＧＬ１４８株及びＡＧＬ２２５株の上清は同時に抗菌性及び抗真菌性を示した。
【００７５】
表２．ストレプトマイセス株の培養上清の２つの病原体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性（ＡＵｍｌ−１）
【表２】
2020535841.tif 000003
【００７６】
実施例４．植物防御の誘導
ａ）タバコ植物の過敏反応（ＨＲ）
植物の防御を誘導する能力を実証するため、タバコ植物の葉の浸潤からなる技術を使用した。この方法は、細胞又は抽出物に対する植物指標の過敏反応（ＨＲ）を測定する（Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｔｔｉｅ，２００８）。３９の選択されたストレプトマイセス株の懸濁液を、タバコの葉（ニコチアナ・バタカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））の葉肉に浸透させた。浸潤のために、皮下針を用いて葉の裏に穿刺を行った。ストレプトマイセス株の材料を充填した無針注射器を使用して、４つの異なる植物で浸潤を行った。１０８ｃｆｕ／ｍｌの植物病原菌シュードモナス・シリンガエＥＰＳ９４を陽性対照として使用し、水を陰性対照として使用した。植物を２４時間〜７２時間インキュベーションした後、症状が観察された。ＨＲ応答は、２つの葉脈と薄茶色の乾燥組織の間に限定されたブロッキング壊死（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）で構成されていた。試験した３９株のうち、コレクションに由来する１０株（ＡＧＬ３１、ＡＧＬ２１４、ＡＧＬ２２５、ＡＧＬ２２７、ＡＧＬ２６０、ＡＧＬ２７２、ＡＧＬ３０５、ＡＧＬ１４８、ＡＧＬ１６１、ＡＧＬ１６４、ＡＧＬ１７１、ＡＧＬ１７４、ＡＧＬ１８６）、特にＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８及びＳ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５が陽性であった。この結果は、タバコの葉のＨＲ反応に従って植物の防御を誘導する能力を示している。
【００７７】
ｂ）植物の防御又はストレスに関連する遺伝子の発現の誘導
ＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株による処理でタバコ植物の葉で観察されたＨＲ反応は、植物の防御応答に関連する遺伝子の誘導によるものであることを確認するため、この場合、トマト植物でトランスクリプトーム研究を行った。遺伝子発現に関して利用可能な多くの研究があることからトマトをモデル植物として使用した。
【００７８】
トマト植物を、水耕栽培、不活性基質の岩綿（Ｇｒｏｄａｎ（著作権）Ｐｌｕｇｓ）で栽培した。２週間〜３週間後（２つの子葉の生物季節学的段階）、苗を岩綿ブロック（Ｇｒｏｄａｎ（著作権）Ｄｅｌｔａ）に移植した。これらを、試験を実施する約８週間前に温室で順化させた。ストレプトマイセス株による１回の処理を行い、植物材料（葉）のサンプルを２４時間後に採取し、ｍＲＮＡの抽出に進んだ。植物の防御を刺激するベンゾチアジアゾール（Ｂｉｏｎ、Ｓｙｎｇｅｎｔａ）による参照処理を、陽性対照として使用した。実験計画は、処理ごとに９つの植物で構成された（３つの植物それぞれに３つの複製物）。サンプルからＲＮＡを抽出するために、３つの単一の植物（約３０ｍｇ）の３つの若い葉を混合し、２つのボール（直径４ｍｍのホウケイ酸）と共に液体窒素で凍結し、−７０℃で保存した。３０Ｈｚの周波数を１０秒間使用して、サンプルをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）で均質化した。ｍＲＮＡ抽出をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。得られたＲＮＡの定量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐシステムで行った（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ（著作権）ＮＤ−１０００，ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。微量のＤＮＡを除去するため、サンプルをＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）．Ｌｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。その後、サンプルの核酸抽出物の逆転写（ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換）を製造業者の指示に従ってｃＤＮＡ逆転写ＫＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。最後に、内因性参照遺伝子アクチン（Ｆ５´−３´：ＣＡＣＴＧＴＡＴＧＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴ、配列番号１８；Ｒ５´−３´：ＧＡＣＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡ、配列番号：１９）と並んで、病因関連タンパク質の各遺伝子：ＰＲ１ａ（Ｆ５´−３´：ＴＣＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣ、配列番号２０；Ｒ５´−３´：ＡＴＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＣＡ、配列番号２１）（Ａｉｍｅら２００８）、グルカナーゼ：ＧｌｕＡ（Ｆ５´−３´：ＴＣＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣ、配列番号２２；Ｒ５´−３´：ＡＴＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＣＡ、配列番号：２３）（Ａｉｍｅら２００８）、ＧＬＵＢ（Ｆ５´−３´：ＴＴＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡ、配列番号：２４；Ｒ５´−３´：ＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣ、配列番号２５）、キチナーゼ：ｃｈｉａ（Ｆ５´−３´：ＴＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧ、配列番号２６；Ｒ５´−３´：ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＧＣＧＧ、配列番号２７）、ＰＥＲＡＪ（Ｆ５´−３´：ＡＧＧＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧＧＴＧＧ、配列番号２８、Ｒ５´−３´：ＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＴＣＴＡＧＣＡＡ、配列番号２９）、ＰＥＲ１（Ｆ５´３´：ＴＣＴＴＡＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴ、配列番号３０；Ｒ５´−３´：ＣＴＡＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣ、配列番号３１）、ＨＡＲＰ（Ｆ５´−３´：ＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＣＡＴＴＣＣＧ、配列番号３２；Ｒ５´−３´：ＡＴＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧ、配列番号：３３）の���遺伝子の両方に対してｑＰＣＲを行った。
【００７９】
表３には、植物の防御応答に関連する４つの遺伝子に対応する遺伝子発現レベル（ｍＲＮＡ）に対する処理の効果が示されている。陽性対照（Ｓｙｎｇｅｎｔａ製のＢｉｏｎ）及び陰性対照（水）との関連で、ＡＧＬ１４８株及びＡＧＬ２２５株の効果を比較した。陰性対照と比較して、ＡＧＬ１４８株はＰｅｒ  ＡＪ、Ｐｒ  １ａ、Ｃｈｉａ  Ａ及びＨａｒｐの遺伝子の発現を誘導し、ＡＧＬ２２５株はＨａｒｐ遺伝子を誘導した。Ｂｉｏｎ陽性対照は、ＰＲ１ａ、Ｃｈｉａ、及びＨａｒｐを誘導する。したがって、両方の株が植物の防御を誘導すると結論付けることができるが、ＡＧＬ２２５よりもＡＧＬ１４８の方が効果は広範囲で強力である。
【００８０】
表３．防御応答に関連する遺伝子、Ｐｒ１ａ、ＣｈｉＡ、ＰｅｒＡＪ、及びＨａｒｐの発現レベル（ｍＲＮＡ）におけるＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株によるトマト植物の処理の効果陽性対照（Ｂｉｏｎ）及び陰性（水）対照。
【表３】
2020535841.tif 000004
【００８１】
実施例５．株の活性に関与する遺伝子及び代謝産物
幾つかの微生物バイオ駆除剤の生物防除活性に関連していることから、ストレプトマイセスの培養による発酵代謝物の産生が研究された（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｂｏｎａｔｅｒｒａ２００９）。ストレプトマイセス属では、アミノグリコシド及びポリケチドのグループに由来する多数の抗菌化合物の産生が記載されている。ストレプトマイセス属は、それらのメンバーに植物検疫分野での幅広い用途を与える二次代謝産物の産生について注目に値する。
【００８２】
ａ）抗菌性代謝産物の合成に関与する遺伝子の特性評価
上記株による植物に有益な抗菌代謝産物の産生を確認するため、特定の代謝産物プロファイルの化学分析の前に分子的アプローチを行った。本発明者らは、放線菌によって産生される生物活性のある二次代謝産物の３つのグループの合成に関連する遺伝子の検出を進めた。アミノグリコシドを検出するため、代謝産物の生合成に対する３組のプライマーを使用した（ｓｔｒＤ０１ｆ５´−３´：ＣＴＴＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＣＴＣＧＧＣＧＡＣＡＡ、配列番号３４；ｓｔｒＤ０１ｒ５´−３´：ＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＧ、配列番号３５）、ＩＩ型ポリケチド（ａｃｔ０４ｆ５´−３´：ＧＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣ、配列番号３６；ａｃｔ０６ｒ５´−３´：ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＣＧＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣ、配列番号３７）及びベータ−ラクタム（ｐｃｂ０３ｆ５´−３´：ＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣ、配列番号３８；ｐｃｂ０３ｒ５´−３´：ＴＣＡＴＣＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣ、配列番号３９）（Ｂｅｒｖａｎａｋｉｓ，２００８）。培養物に由来するＤＮＡを、分離株の同定と同じの、実施例１の段落ｂ）に記載されているプロトコルに従って抽出した。増幅は、２５μｌの容量のカクテルで行い、最終濃度は１×バッファー、３ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ、各最初の０．２μＭ、２Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（スペイン国、Ｂｉｏｏｔｏｌｓ）及びサンプル２．５μｌであった。サーモサイクラープログラムは、９５℃で５分間を１サイクル、９５℃で４５秒間を３０サイクル、６５℃で４５秒間、及び７２℃で１分間で構成され；最後に７２℃で１０分間増幅し、最終段階で４℃にて維持した。Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）のプロフェッショナルＴＲＩＯサーモサイクラーを使用した。アンプリコンを、４０分間９０Ｖの電場において１．５％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次いで、ゲルをＥｔＢｒで２０分間染色した。結果をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でキャプチャした。ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＤＳＭ４０２３６を、アミノグリコシド生合成遺伝子の存在の陽性チェックとして使用した；ベータ−ラクタムに対してＳ．カトレア（Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ）ＤＭＳ４６４８８（ＮＲＲＬ８０５７））、ポリケチドに対してＳ．ノガラテル（Ｓ．ｎｏｇａｌａｔｅｒ）ＤＳＭ４０５４６。
【００８３】
図３は、分析したコレクションの５９株のうち、１４株がアミノグリコシド生合成遺伝子、２６株がポリケチド合成遺伝子、８株が両方のグループの遺伝子を示したことを示している。いずれの株もベータ−ラクタムの合成遺伝子を示さず、１７株はどの遺伝子も示さなかった。ＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株は、ＩＩ型ポリケチドの遺伝子に対してのみ陽性であった。
【００８４】
ｂ）発酵代謝物プロファイル
３種類の抗菌代謝産物関連遺伝子の分析後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって株によって生成された代謝産物のプロファイルを決定することを進めた。液体培養で産生された代謝物を、各株の特徴的なプロファイルとして決定した。これは、ＡＧＬ２２５株及びＡＧＬ１４８株に対して特異的に行われた。ＩＳＰ２培養培地を該株で接種し、１５０ｒｐｍで攪拌しながら２８℃で１週間培養した。培養物を濾過し、上清を−８０℃で凍結した。対照として使用されるＩＳＰ２非接種培地を使用して、同じ手順を行った。
【００８５】
培養上清の代謝産物の抽出を行った。抽出プロセスは、ヘキサン（１：１）と酢酸エチル（１：１）で構成され、蒸発及びアセトニトリル再懸濁が続いた。各抽出液５０μｌを次の条件下で分析した：流速：１．２５ｍｌ／分；溶媒：Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ  Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ。クロマトグラムを２２０ｎｍ（ペプチド化合物）、２５４ｎｍ（芳香族化合物）、２８０ｎｍ（フェノール化合物）で分析した。Ｃ１８−ＸＦ及びＰＦＰカラムを使用すると、様々な波長（２２０ｎｍ、２４５ｎｍ、及び２８０ｎｍ）のクロマトグラムで、生成された幾つかの代謝産物に適合するＡＧＬ１４８株とＡＧＬ２２５株との差及び識別ピークを検出することができる。
【００８６】
図４には、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５及びＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８によって産生される中程度の成分に関する微分ピークを示す幾つかのプロファイルを見ることができる。これらのプロファイルは、かかる株の特徴であり、他のストレプトマイセス株とは異なる特徴的な分子フィンガープリントである。化合物の性質は不明であるが、ＰＣＲによって検出されたこれらの経路の遺伝子と一致して、おそらくポリケチド遺伝子産物であった。
【００８７】
実施例６．殺線虫活性
株の殺線虫活性を判断するため、線虫カエノラブディティス・エレガンスＷＴ  Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｎ２をモデル線虫として使用し、これは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ）の野生株である。線虫は、Ｅ．コリＯＰ５０を日常的に食べさせて成長させた。結果として生じた線虫の不均一な集団を次亜塩素酸ナトリウム（１．５％）で処理し、卵のみを保存し、個体を排除した。Ｍ９バッファーで数回洗浄した後、卵の孵化を進めて卵を孵化させ、これを食品としてＥ．コリＯＰ５０を含む培地ＮＭＧに移し、Ｌ２ステージまでインキュベートした。この段階で、固体培地及び液体培地での生存アッセイを行った。固形培地での試験では、ストレプトマイセスの対応する株を、Ｅ．コリＯＰ５０の代わりにＮＭＧに播種した。１２日間増殖させた後、Ｌ２ステージの線虫を堆積させた。陽性対照（病原体対照）として、Ｓ．エンテリカ亜種エンテリカＡＴＣＣ１４０２８（ＣＥＣＴ４５９４）株及びＬＴ２（ＣＥＣＴ４０８５）株を使用した。液体培地中で、上記の遠心分離により得られたストレプトマイセス株の培養上清をマイクロプレートで試験した。試験は、各マイクロプレートウェルに培養上清１ｍｌと線虫の懸濁液（７５個〜１００個体）を含む３０マイクロリットルのＮＭＧを堆積させることで構成されていた。新鮮なＮＭＧ、ＩＳＰ２培地、及びＭ９バッファーを陰性対照として使用し、殺生物剤アジ化ナトリウムを殺線虫剤対照として使用した。プレートを２３℃でインキュベートし、２４時間及び４８時間生存した個体を測定した。線虫の観察には実体顕微鏡（ＳＭＺ  ＮＩＫＯＮ１０００）を使用した。線虫の長さ及び形状を測定し、正弦曲線及び可動性の個体を生きていると見なしたが、死んだ線虫はまっすぐな形態を呈した。
【００８８】
ストレプトマイセス株の細胞単独では、固形培地で行われた試験で線虫の生存に著しい影響を及ぼさなかったが、病原性サルモネラの２つの株は死亡を引き起こした。しかしながら、Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５及びＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８の無細胞培養物に由来する上清は強い殺線虫効果を有していた（図５、表４）。また、高用量でも線虫個体の一部が溶解し、実際には認識されないことが注目された。この効果は、キチナーゼの可能な作用、及びストレプトマイセス株によって産生された多数の線虫毒性代謝物に起因していた。かかる特性は、植物保護における用途を有する生物殺線虫剤としての上記株の使用にとって重要であると考えることができる。
【００８９】
表４．Ｓ．メラノスポロファシエンスＡＧＬ２２５及びＳ．ヤテンシスＡＧＬ１４８の殺線虫活性
【表４】
2020535841.tif 000005
【００９０】
実施例７．植物における細菌及び真菌の感染防除における本発明の株の有効性
【００９１】
本発明の株の有効性を実証するため、植物病原性細菌及び植物病原性真菌の両方を含む幾つかの代表的な病原体（作物植物及び病原体）の制御された環境条件（温室）で幾つかの試験を行った。細菌の病原体系は、アーモンド×桃のハイブリッド台木ＧＦ６７７においてキサントモナス・アルボリコラ病原型プルニ（Ｘａｐ）、トマトにおいてＰ．シリンガエ病原型トマト（Ｐｔｏ）、及びナシに対してＥ．アミロボーラであった。真菌の病原体系の場合、レタスにおいてＳ．スクレロチオラム、トマトにおいてＢ．シネレア、及びトマトにおいてＦ．オキシスポラム分化型ラディシス・リコペルシチ（Ｆｏｒｌ）を使用した。結果を図６に示す。
【００９２】
処理の準備のため、ストレプトマイセスの株をＩＳＰ２に播種し、２８℃で５日間インキュベートして、栄養細胞、胞子及び発酵代謝物を得た。滅菌蒸留水中の上記株の懸濁液は、実施例２で上述した通りに調製した。生菌数は、アッセイに応じて、３×１０＊８ｃｆｕ／ｍｌ〜４×１０＊８ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００９３】
ａ）プルヌスにおけるキサントモナス・アルボリコラ病原型プルニの防除
アーモンド及びピーチのハイブリッド（プルヌス・アミグダラス（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）×プルヌス・ペルシカ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ）のＧＦ６６７プルヌス台木植物を、６葉〜７葉の時に使用した。実験計画は、各処理の繰り返し毎に３つの植物の３回の繰り返しで構成される。ストレプトマイセスの株を用いた処理を、病原体の接種の７日前及び１日前のドロップポイント（ｄｒｏｐ  ｐｏｉｎｔ）までエアブラシを用いて適用した。Ｓ．サラセチカスＳＳ３１を参照対照として使用した。病原体であるＸ．アルボリコラ病原型プルニＣＦＢＰ５５６３の株をＬＢ寒天プレートの表面に接種し、２８℃でインキュベートし、接種物を２４時間インキュベートしたプレートから調製した。病原体の懸濁液を、約６．８×１０＊７ｃｆｕ／ｍｌの濃度に調整した。植物内の全ての葉に、流出点（ｒｕｎ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔ）までエアブラシで噴霧することにより接種した。接種後、植物を４８時間ビニール袋に入れて感染プロセスを加速し、その後、相対湿度６０％で２６±２℃、及び日中１６時間の光及び１５±２℃、８０％ＲＨ及び８時間暗所で一晩インキュベートした。病原体の接種後１５日目（ｄｐｉ）に評価を行い、影響を受けた葉の面積に基づいて病害の指標を割り当てた。０：症状なし；１、葉面積の０％〜２５％；２、葉面積の２５％〜５０％、３、葉面積の５０％〜７５％、及び４、７５％超。
【００９４】
図６（Ｘａｐ）は、参照対照としてのＳ．サラセチカスＳＳ３１と並んで、本発明のストレプトマイセスの株による治療の効果を示す。ＡＧＬ１４８株及びＡＧＬ２２５株は有効であり、未処理の対照と比較して感染の重症度を有意に低下させた。
【００９５】
ｂ）ナシのエルウィニア・アミロボーラの防除
この試験を、自根で鉢植えされた樹齢２年のナシ植物の栽培品種コンファレンス（Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）（ＣＡＶクローン）を用いて行った。実験計画は、各処理の繰り返し毎に３つの植物の３回の繰り返しで構成される。この試験では、病原体接種の７日前及び１日前に処理を適用した。菌株による処理は、ドロップポイントまでエアブラシを使用して、若葉の上部（３葉〜４葉／植物）で行われた。処理の１日前に、葉の主葉脈に切開を作って植物を傷つけた。処理は、ストレプトマイセスの株からなった。使用した病原菌株は、解凍され、２８℃でインキュベートした新鮮なＬＢ寒天プレートで継代培養することにより維持された、Ｅ．アミロボーラＥＰＳ１０１であった。感染のため、３．５×１０７ｃｆｕ／ｍｌの用量で新たな接種物を調製した。Ｅ．アミロボーラの接種は、各傷口に１０μｌを滴下して行った。接種後、植物をビニール袋に入れて感染のプロセスを加速し、病原体を隔離した。病害の評価を、植物の壊死の進展に基づく０〜４の指標：０：感染なし１：創傷からの壊死の発症；２：葉脈による壊死の開始；３：壊死は葉柄に達し、４：葉から新芽への壊死、を使用して、５ｄｐｉ、７ｄｐｉ、１２ｄｐｉ行った。図６（Ｅａ）は、ＡＧＬ２２５株が未処理のコントロールと比較して感染レベルを著しく低下させたことを示している。
【００９６】
ｃ）トマト植物におけるシュードモナス・シリンガエ病原型トマトの防除
トマト植物を得るため、リオグランデ品種の種子をアルベオール（ａｌｖｅｏｌｉ）に播き、１５日〜２１日後に鉢に移植した。温室の条件は、２５±２℃で１６時間の明期、及び１５±２℃で８時間の暗期であった。実験計画は、処理ごとに、１反復当たり３つの植物の３回の反復で構成された。病原菌としてＰ．シリンガエ病原型トマト（Ｐｓｔ）ＤＣ３０００株を使用した。接種物の調製のため、コロニーを解凍し、２８で２４時間インキュベートした新鮮なＬＢプレートで維持した。水懸濁液を調製し、約１０＊８ｃｆｕ／ｍｌに調整した。葉の微小傷、したがって感染を促進するため、接種材料を珪藻土（１ｇ／Ｌ）で補完した。各植物にエアブラシをドロップポイントまで接種し、日中は相対湿度６０％及び１６時間の光で２５±２℃、及び夜間は１５±２℃、８０％ＲＨ及び８時間の暗期でインキュベートした。
【００９７】
処理は、病原菌接種の７日前及び１日前に３枚目と４枚目の本葉が現れて作られたときに開始した。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＱＳＴ７１３を対照として使用した。評価を７ｄｐｉで行い、症状が検出されなかった場合は０；１、影響を受けた領域が２５％未満、２、影響を受けた領域が２５％〜５０％；３、影響を受けた葉の面積が５０％〜７５％、及び４、影響を受けた領域が７５％以上の指標に従って、影響を受けた葉の領域に応じて評価した。Ｓｅｒｅｎａｄｅを除く全ての処理は、Ｐｓｔによる感染の重症度の減少を示した（図６Ｐｓｔ）。ＡＧＬ２２５及びＡＧＬ１４８株は、未処理の対照と比較して、疾患の重症度の軽減に効果的であった。
【００９８】
ｄ）トマトにおけるフザリウム・オキシスポラム分化型ラディシス・リコペルシチの防除
トマト植物を実施例７の段落ｂの通り調製した。病原菌接種製剤Ｆ．オキシスポラム分化型ラディシス・リコペルシチには、ＦＯＲＬ株を使用した。ＰＤＡ寒天プレートを病原体の接種の１０日前に播種し、２３℃〜２５℃で１６時間の明期及び８時間の暗期の光周期でインキュベートした。病原体の懸濁液を調製し、２．９×１０＊６分生子／ｍＬに調整した。真菌を接種する前に、メスを使用して植物の根に４つの病変を作った。各植物に、１０ｍｌのＦＯＲＬ懸濁液を洗浄法により接種した。実施した最初の処理を、植物の３番目及び４番目の本葉が現れたときに開始した。病原体接種の前に７及び１で処理を行い、２０ｍｌの各株調製物を散水により適用した。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＱＳＴ７１３を対照として使用した。病気の植物の評価を２１ｄｐｉで行った。茎の壊死の進化に基づいて指標を使用した：０：感染なし；１病変表面が茎に到達していない；２：感染が植物の茎から上昇する、３：植物が枯れた。図６（Ｆｏｘ）に示すように、ＡＧＬ１４８及びＡＧＬ２２５株は感染の防除に効果的であった。
【００９９】
ｅ）トマトに対するボトリティス・シネレアの防除
トマト植物は、実施例７の段落ｃの通り調製した。病原体接種のため、Ｂ．シネレア株を使用した。ＰＤＡ寒天プレートを病原体の接種の１０日前に播種し、２３℃〜２５℃で１６時間の明期及び８時間の暗期の光周期でインキュベートした。病原体の懸濁液を調製し、２．９×１０６分生子／ｍＬに調整した。参照処理として、市販品であるＳｅｒｅｎａｄｅ  ＭＡＸ（バチルス・サブチリスＱＳＴ７１３）を対照として使用した。植物には、流出点まで真菌懸濁液を噴霧した。評価を病原体接種（ｄｐｉ）の７日後に行った。葉の重症度の指標を、０、非感染；１、表面の２５％未満；２、２５％〜５０％未満；３、５０％〜７５％未満；４、７５％超として確立した。
【０１００】
図６（Ｂｃ）は、ＡＧＬ１４８株及びＡＧＬ２２５株がＢ．サブチリスＱＳＴ７１３と同様に非常に効果的であることを示している。
【０１０１】
ｆ）レタスに対するスクレロチニア・スクレロチオラの防除。
レタスの種子をアルベオールに播き、１５日〜２１日後に鉢に移植した。病原体の接種の７日前と１日前に処理を行った。参照処理として、Ｓｅｒｅｎａｄｅ  ＭＡＸ（枯草菌ＱＳＴ７１３）及びＳ．サラセチカスＳｓ３１を対照として使用した。植物病原性真菌Ｓ．スクレロチオラムを、オートクレーブ処理したライ麦種子２５ｇ及び蒸留水２５ｍｌを入れた２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコで培養した。植物への病原体の接種は播種の２１日後に行い、各植物に１粒の感染した（ｉｎｆｅｓｔｅｄ）ライ麦を用いて感染させた。評価を病原体接種（ｄｐｉ）の３日後及び７日後に行った。重症度指数は、０：健康な植物；１：根からクラウンまでの腐敗；２：クラウンに影響する腐敗；３：クラウンを超える腐敗；４：枯れたレタスとして確立された。図６（Ｓｓ）は、未処理の対照の病害の重症度が非常に高かったことを示している。ＡＧＬ１４８株及びＡＧＬ２２５株には抑制効果があった。
引用文献一覧
【０１０２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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