(57)【要約】  患者の血清または血漿サンプルにおいてヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）をアッセイするための方法であって、低濃度のヘパリンまたは高濃度のヘパリンのいずれかの存在下で患者の血清または血漿サンプルと共に血小板の混合物をインキュベートすること、血小板活性化剤の存在または不在下で血小板の混合物をインキュベートすること、混合物中の血小板および活性化血小板を定量化すること、混合物それぞれに関する血小板中の活性化血小板のパーセンテージを算出すること、算出したパーセンテージを用いてヘパリン血小板活性化（ＨＥＰＬＡ）指数を算出すること、ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数からカットオフ値を算出すること、および患者のＨＥＰＬＡ指数をカットオフ値と比較することによって患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定すること、を含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の血清または血漿サンプルにおいてヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）をアッセイするための方法であって、
低濃度のヘパリン（患者低ヘパリン混合物）または高濃度のヘパリン（患者高ヘパリン混合物）のいずれかの存在下で前記患者の血清または血漿サンプルと共に血小板をインキュベートすること、
血小板活性化剤の存在（陽性対照混合物）または不在（陰性対照混合物）下で血小板をインキュベートすること、
前記患者低ヘパリン混合物、前記患者高ヘパリン混合物、前記陽性対照混合物および前記陰性対照混合物中の血小板および活性化血小板を定量化すること、
前記混合物のそれぞれに関する前記血小板中の活性化血小板のパーセンテージを算出することおよび以下の値：
前記患者低ヘパリン混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（低）］；
前記患者高ヘパリン混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（高）］；
前記陽性対照混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（Ｃｔ＋）］；および
前記陰性対照混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（Ｃｔ−）］
を得ること、
％Ｒ（低）と％Ｒ（高）の間の差を％Ｒ（Ｃｔ＋）と％Ｒ（Ｃｔ−）の間の差で割ることおよび得られた商に１００を掛けることによってヘパリン血小板活性化（ＨＥＰＬＡ）指数を算出すること、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、
前記ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数からカットオフ値を算出すること、
患者の前記ＨＥＰＬＡ指数を前記カットオフ値と比較することによって前記患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記血小板のインキュベーションおよび前記血小板および活性化血小板の定量化が、一工程インキュベーションにおいてであり、
前記患者低ヘパリン混合物が、
患者から得られた血清または血漿のサンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
低用量のヘパリンと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含み、
前記患者高ヘパリン混合物が、
患者から得られた血清または血漿のサンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
高用量のヘパリンと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含み、
前記陽性対照混合物が、
血小板を含有するサンプルと、
血小板活性化剤と、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含み、
前記陰性対照混合物が、
血小板を含有するサンプルと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血小板の定量化が、前記標識された血小板の検出要素から得られた信号のレベルに従い、かつ前記活性化血小板の定量化が、前記標識された活性化血小板の検出要素から得られた信号のレベルに従う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血小板のインキュベーションおよび前記血小板および活性化血小板の定量化が、二工程インキュベーションにおいてであり、
前記二工程インキュベーションが、第一インキュベーションおよび第二インキュベーションを含み、
前記第一インキュベーションが、
患者から得られた血清または血漿のサンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
低用量のヘパリン
を含む患者低ヘパリン第一混合物、
患者から得られた血清または血漿のサンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
高用量のヘパリン
を含む患者高ヘパリン第一混合物、
血小板を含有するサンプルと、
血小板活性化剤と、
希釈剤
を含む陽性対照第一混合物、および
血小板を含有するサンプルと、
希釈剤
を含む陰性対照第一混合物
のものであり、
前記第二インキュベーションが、
インキュベーション後の前記患者低ヘパリン第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む患者低ヘパリン第二混合物、
インキュベーション後の前記患者高ヘパリン第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と
標識された活性化血小板の検出要素
を含む患者高ヘパリン第二混合物、
前記陽性対照第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む陽性対照第二混合物
のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血小板の定量化が、前記標識された血小板の検出要素から得られた信号のレベルに従い、かつ前記活性化血小板の定量化が、前記標識された活性化血小板の検出要素から得た信号のレベルに従う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血小板を含有するサンプルを前記患者低ヘパリン第一混合物および前記患者高ヘパリン第一混合物に添加する代わりに、前記血小板を含有するサンプルが前記患者低ヘパリン第二混合物および患者高ヘパリン第二混合物に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記カットオフ値の算出が、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、
前記ＨＩＴに罹患していないドナーから得られたサンプルのＨＥＰＬＡ指数値の平均値および標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、
前記ＳＤ値を３倍（３ＳＤ）および２倍（２ＳＤ）に増大することおよび得られた積を前記平均値に加えることによって前記カットオフ値を算出すること
を含み、一方で平均値＋３ＳＤ（３ＳＤカットオフ）がＨＩＴに罹患していないドナーの９９％を包含しかつ平均値＋２ＳＤ（２ＳＤカットオフ）がＨＩＴに罹患していないドナーの９５％を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
患者の前記ＨＥＰＬＡ指数を前記カットオフ値と比較することによって前記患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定することが、以下の決定を含む、請求項７に記載の方法：
前記患者のＨＥＰＬＡ指数が前記３ＳＤカットオフよりも高い場合、前記患者はＨＩＴに罹患している；
前記患者のＨＥＰＬＡ指数が前記２ＳＤカットオフと前記３ＳＤカットオフの間である場合、前記患者はＨＩＴに罹患しているまたは罹患していない可能性がありかつ血小板を含有する新鮮なサンプルで前記アッセイを繰り返すことが場合により推奨される；
前記患者のＨＥＰＬＡ指数が前記２ＳＤカットオフよりも低い場合、前記患者はＨＩＴに罹患していない。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／４７８，１０５号に対する優先権を主張するものであり、その全内容を参照により本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本主題は、診断アッセイに関する。より詳細には、本主題は、ヘパリン起因性血小板減少症アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＴとしても知られているヘパリン起因性血小板減少症は、血栓形成促進性のかつ潜在的に致命的な医原性疾患であり、ヘパリン曝露患者の実質的に５〜１０％において発症する（Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ５２  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １５５−１６０；  Ｋｉｎｇ  ＤＪ，  Ｋ．  Ｊ．，  １９８４，  Ｈｅｐａｒｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ５３５；Ｄｒｙｊｓｋｉ  Ｍ，  Ｄ．  Ｈ．，  １９９６，  Ｈｅｐａｒｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ，  ２６０−２６９）。ＨＩＴは、抗凝固性ヘパリンの投与による血小板減少症、つまり、低血小板数の発症を伴う。血小板がトロンビンを活性化する微粒子を放出することにより血栓症に至るため、ＨＩＴは血栓症、つまり、血管内部での血餅の異常形成の素因である。血栓症が確認されると、この症状は、ＨＩＴＴとしても知られている「ヘパリン起因性血小板減少症および血栓症症候群」と呼ばれる。ＨＩＴは、血小板を活性化する抗体、例えば、血小板第４因子（ＰＦ４）とヘパリンの複合体に対する抗体の形成により引き起こされる。よって、ヘパリンを投与されるＨＩＴ罹患患者は新たな血栓症を発症するか、この患者において既に存在する血栓症が悪化するか、または患者の血小板数が減少する場合がある。患者が血栓事象を患う可能性があり、患者のおよそ３０〜５０％がＨＩＴ診断時に静脈および／または動脈血栓症を発症しているため（Ｋｅｌｔｏｎ  ＪＧ，  １９８６，  Ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，  １７３−１８６）、診断確定までヘパリン投与を停止し、患者は推論的に代替抗凝固療法に切り替えられる。
【０００４】
最も重篤なＨＩＴ形態である２型ＨＩＴは、薬理学的濃度でＰＦ４とヘパリン（Ｈ）の複合体を標的とする免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を循環させることにより媒介される。ＩｇＧ：ＰＦ４：Ｈ複合体は、ＦｃγＲＩＩ受容体を介して血小板を結合し活性化し、トロンビン生成および血小板凝集に至る（Ｖｉｓｅｎｔｉｎ  ＧＰ，  Ｆ．  Ｓ．，  １９９４，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ／Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ａｒｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ４  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｒ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ８１−８８）。血栓事象はＨＩＴ患者において頻繁であるため、代替抗凝固薬への速やかな切替えを可能にする迅速かつ信頼性のある診断が必須である。
【０００５】
ヘパリン投与５〜１４日目に５０％（＜５０，０００／ｍｍ３）を超えて血小板数が減少する患者に対して現在推奨されるＨＩＴ診断アルゴリズムは、ＨＩＴ陽性患者の初期管理をガイドするために、ＨＩＴ患者の初期スクリーニングのための高感度免疫アッセイによりサポートされる４Ｔスコアを使用して臨床的確率を概算することを含む。
【０００６】
ＨＩＴ患者の初期検出のためのスクリーニング免疫アッセイ例は、ヘパリン−ＰＦ４−ＥＬＩＳＡ、すなわち、へパリン−ＰＦ４−酵素結合免疫吸着剤アッセイである。このスクリーニング免疫アッセイは、ヘパリン−ＰＦ４複合体に対する抗体を検出することを目的とする。しかしながら、ヘパリン−ＰＦ４−ＥＬＩＳＡは、ヘパリン−ＰＦ４複合体を結合する全ての循環抗体を検出し、ＨＩＴを引き起こさない抗体を誤って検出する可能性もある。よって、この免疫アッセイは非常に高感度であっても、特異性に欠ける。故に、スクリーニング免疫アッセイで陽性と判明した患者は更に、確定のためのより特異的な機能アッセイで試験される。
【０００７】
他の機能ＨＩＴアッセイは、患者の血清または血漿サンプルがヘパリンの存在下で血小板凝集を引き起こす能力を試験するものである。このようなアッセイの例は、透過光血小板凝集検査法（ＬＴＡ）、ヘパリン起因性多電極凝集検査法（ＨＩＭＥＡ）およびヘパリン起因性血小板活性化検査（ＨＩＰＡ）である。ＨＩＰＡでは、例えば、被検患者からの血清を、ヘパリンの存在下で、ドナーからの血小板と混合する。ドナーの血小板の凝集反応は、被験患者の血清中のＰＦ４−ヘパリンに対する抗体の存在を示す。
【０００８】
幾つかの機能的ＨＩＴアッセイ、例えば、ゴールドスタンダードである１４Ｃ−セロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）が利用可能である。この試験は、数名のドナーからの血小板と被験患者からの血清とを使用する。血小板に１４Ｃ−セロトニンを負荷し、それらを洗浄し、血清およびヘパリンと混合する。次いで、血小板活性化のマーカーであるセロトニンの放出について、サンプルを試験する。ＳＲＡが高いセロトニン放出を示す場合、ＨＩＴ診断が確定される。
【０００９】
上述のＨＩＴ診断試験は、それらの複雑性により、遠くの基準研究所で行われる。それらがバッチングを必要とするため、これらの試験は時間がかかる。換言すると、これらの試験を個々の患者についてオンデマンドで行うことは不可能である。結果として、これら従来技術の試験は定期的に、例えば毎月行われる。この状況の結果は、試験結果を利用できるようになるまで数週間かかるということである。故に、従来技術のＨＩＴ診断試験は、例えば、心臓外科手術中または体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）処置中の、臨床ケアの意思決定のために迅速な回答が必要とされる緊急事態には不適切である。この状況の１つの結果は、試験結果が得られるまで、患者が有害であり得るかまたは致命的でさえあり得る不適切な処置を受けてきている可能性があるということである。更に、医師による検査時に試験結果がないため、ＨＩＴが疑われる患者は、ヘパリンよりも１００〜２００倍高価であるか、ヘパリンよりも取り扱いが困難であるか、または出血事象と関連する代替抗凝固薬を投与される可能性がある。
【００１０】
従来技術のＨＩＴアッセイの別の欠点は、それらが、被験患者の血漿または血清サンプルと共にインキュベートされるドナーの血小板の使用を必要とすることである。この理由は、患者の出血確認と試験それ自体の間の期間が長いため、患者自身の血小板を使用できないからである。
【００１１】
更に、従来技術のＨＩＴアッセイは、ＨＩＴの生理病理学とは完全には一致しない。ＨＩＴにおいて、血小板活性化は、好中球、単球およびマクロファージ上でも見られる血小板膜Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩａ）（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃに対する低親和性受容体）への抗ヘパリン−ＰＦ４複合体抗体の定常フラグメント（Ｆｃ）の結合によって生じる。しかしながら、Ｆｃ受容体には多型があり、受容体構造はヘパリン起因性血小板活性化にとって抗体濃度よりも更に重要であり得る。故に、ドナーの血小板が患者の血小板とは異なる多型を有する場合に、これは潜在的に診断バイアスを生じ、結果として精度の低下や誤診を招く。
【００１２】
従来技術のＨＩＴアッセイの別の欠点は、アッセイで使用される血小板に関する。従来技術のＨＩＴアッセイの幾つかは、血小板が抗ヘパリン−ＰＦ４抗体によってよく活性化されるという知識に基づきドナーから採取した血小板を用いて行われる。通常、血小板ドナーは研究所のスタッフである。これは倫理的問題と方法論的問題の両方を生じる。倫理的問題に関して、ベルギーなどのいくつかの国では、研究所で行われる診断アッセイにおいて用いられる血液を研究所職員から抜き取ることが禁じられている。方法論的問題は、研究所スタッフが繰り返しまたは習慣的に血小板を提供できないという事実に関する。更に、研究所職員の勤務時間後に緊急アッセイが必要とされる場合などの時には研究所スタッフは対応できない。別の方法論的問題は、ＳＲＡなどのいくつかのアッセイでは、ドナーの血小板を洗浄する必要がある。これは、アッセイプロセスに工程を追加し、追加は、被験患者の血清または血漿サンプルへ血小板を曝す前にそれらを間違って活性化させてしまう可能性がある。
【００１３】
更に、ＳＲＡやＨＩＰＡなどの従来技術アッセイの結果が得られるまでに長い時間が経過するため、これらのアッセイを繰り返すことはほぼ不可能である。当業者であれば、必要な時にアッセイを繰り返すことができないことの臨床的意義を認めることができる。
【００１４】
上述のように、ＳＲＡやＨＩＰＡなどの従来技術のＨＩＴアッセイは、それらの複雑性および遠くの基準研究所でこれらのアッセイを行うことの必要性により、抗ヘパリン−ＰＦ４抗体スクリーニング免疫アッセイ、例えばヘパリン−ＰＦ４−ＥＬＩＳＡが陽性結果を示した時にのみ行われる。
【００１５】
従来技術のＨＩＴアッセイの別の欠点は、ＨＩＰＡなど一部のＨＩＴアッセイでは、結果がマイクロタイタープレートの目視検査に基づいているということである。これは、経験を積んだ研究所の従業者によるアッセイの操作を必要とする。更に、目視検査は主観的であり、従来技術アッセイの精度および再現性は疑わしい。
【００１６】
更に、従来技術のＨＩＴアッセイは標準化されていない。例えば、ＳＲＡは、各研究所において異なるプロトコルに従って行われる。インピーダンス凝集検査法（例えば、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ登録商標  Ａｎａｌｙｓｉｓ）などの他の従来技術の方法は、このアッセイを行う各研究所が、ＨＩＴ＋患者とＨＩＴ−患者を区別する独自の臨床的カットオフを規定することを必要とする。この制限は、例えば臨床検査または臨床診療の局面などにおいて、例えば異なる研究所から得た同じ患者に関するアッセイ結果を比較する必要がある場合、研究所間でのアッセイ性能の格差を増大させ、異なる研究所で得られた結果を比較する能力を制限することになる。故に、異なる研究所からの結果は、複雑な統計学的メタ分析なくしては容易に集計できない。
【００１７】
要約すると、ＨＩＴ試験における２つの主要な問題は、特異性に関する免疫アッセイ性能の制限および所用時間、ならびに機能アッセイの他の上述の欠点である。これらの問題は、ＨＩＴの過剰診断および過剰治療という懸念事項を生じ、これらは高価な代替抗凝固薬およびそれらに付随する１０〜２０％の大出血のリスクに多数の血小板減少症患者を曝し、臨床的および経済的な影響は相当なものだと思われる。現状では、ＨＩＴ診断は依然として、止血研究所に直接アクセスできると共に高特異的である迅速かつ標準化された試験を必要としている。
【発明の概要】
【００１８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本主題が属する技術分野の当業者が普通に理解するのと同じ意味を持つ。本主題の実施または試験では、本明細書に記載されるものと類似したまたは等価の方法および材料を使用できるが、以下では好適な方法および材料について説明する。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本特許明細書が優先する。更に、材料、方法および例は説明のためのものにすぎず、限定を意図するものではない。
【００１９】
本主題の一態様によれば、患者の血清または血漿サンプルにおいてヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）をアッセイするための方法であって、
低濃度のヘパリン（患者低ヘパリン混合物）または高濃度のヘパリン（患者高ヘパリン混合物）のいずれかの存在下で上記患者の血清または血漿サンプルと共に血小板をインキュベートすること、
血小板活性化剤の存在（陽性対照混合物）または不在（陰性対照混合物）下で血小板をインキュベートすること、
上記患者低ヘパリン混合物、上記患者高ヘパリン混合物、上記陽性対照混合物および上記陰性対照混合物中の血小板および活性化血小板を定量化すること、
上述の混合物それぞれに関する上記血小板中の活性化血小板のパーセンテージを算出することおよび以下の値：
上記患者低ヘパリン混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（低）］；
上記患者高ヘパリン混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（高）］；
上記陽性対照混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（Ｃｔ＋）］；および
上記陰性対照混合物中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（Ｃｔ−）］
を得ること、
％Ｒ（低）と％Ｒ（高）の間の差を％Ｒ（Ｃｔ＋）と％Ｒ（Ｃｔ−）の間の差で割ることおよび得られた商に１００を掛けることによってヘパリン血小板活性化（ＨＥＰＬＡ）指数を算出すること、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、
上記ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数からカットオフ値を算出すること、
患者の上記ＨＥＰＬＡ指数を上記カットオフ値と比較することによって上記患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定すること
を含む、方法が提供される。
【００２０】
一実施形態によれば、上記血小板のインキュベーションおよび上記血小板および活性化血小板の定量化は一工程インキュベーションにおいてであり、
上記患者低ヘパリン混合物は、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
低用量のヘパリンと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含み、
上記患者高ヘパリン混合物は、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
高用量のヘパリンと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含み、
上記陽性対照混合物は、
血小板を含有するサンプルと、
血小板活性化剤と、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含み、
上記陰性対照混合物は、
血小板を含有するサンプルと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含む。
【００２１】
別の実施形態によれば、上記血小板の定量化は、上記標識された血小板検出要素から得た信号のレベルに従い、上記活性化血小板の定量化は、上記標識された活性化血小板検出要素から得た信号のレベルに従う。
【００２２】
更に別の実施形態によれば、上記血小板のインキュベーションおよび上記血小板および活性化血小板の定量化は二工程インキュベーションにおいてであり、上記二工程インキュベーションは第一インキュベーションと第二インキュベーションとを含み、
上記第一インキュベーションは、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
低用量のヘパリン
を含む患者低ヘパリン第一混合物、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
高用量のヘパリン
を含む患者高ヘパリン第一混合物、
血小板を含有するサンプルと、
血小板活性化剤と、
希釈剤
を含む陽性対照第一混合物、および
血小板を含有するサンプルと、
希釈剤
を含む陰性対照第一混合物
のものであり、
上記第二インキュベーションは、
インキュベーション後の上記患者低ヘパリン第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む患者低ヘパリン第二混合物、
インキュベーション後の上記患者高ヘパリン第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む患者高ヘパリン混合物、
上記陽性対照第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む陽性対照第二混合物
のものである。
【００２３】
更に別の実施形態によれば、上記血小板を含有するサンプルを上記患者低ヘパリン第一混合物および上記患者高ヘパリン第一混合物に添加する代わりに、上記血小板を含有するサンプルを、上記患者低ヘパリン第二混合物および患者高ヘパリン第二混合物に添加する。
【００２４】
更なる実施形態によれば、上記カットオフ値の算出は、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、
上記ＨＩＴに罹患していないドナーから得たサンプルのＨＥＰＬＡ指数値の平均値および標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、
上記ＳＤ値を３倍（３ＳＤ）および２倍（２ＳＤ）に増大することおよび得られた積を上記平均値に加えることによって上記カットオフ値を算出すること
を含み、平均値＋３ＳＤ（３ＳＤカットオフ）はＨＩＴに罹患していないドナーの９９％を包含し、平均値＋２ＳＤ（２ＳＤカットオフ）はＨＩＴに罹患していないドナーの９５％を包含する。
【００２５】
更なる実施形態によれば、患者の上記ＨＥＰＬＡ指数を上記カットオフ値と比較することによって、上記患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定することは、以下の決定を含む：
上記患者のＨＥＰＬＡ指数が上記３ＳＤカットオフよりも高い場合、上記患者はＨＩＴに罹患している；
上記患者のＨＥＰＬＡ指数が上記２ＳＤカットオフと上記３ＳＤカットオフの間である場合、上記患者はＨＩＴに罹患しているまたは罹患していない可能性があり、場合により、血小板を含有する新鮮なサンプルで上記アッセイを繰り返すことが推奨される；
上記患者のＨＥＰＬＡ指数が上記２ＳＤカットオフよりも低い場合、上記患者はＨＩＴに罹患していない。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する上に、本主題がその適用において、下記の説明に示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されないことを理解すべきである。本主題は、他の実施形態が可能である、または様々な様式で実現もしくは実施することが可能である。また、本明細書で採用される表現及び用語は説明のためのものであって、限定と見なされるべきではないことも理解すべきである。
【００２７】
明瞭にするために、必須ではない要素は一部の図面から省略した。
【００２８】
従来技術のＨＩＴアッセイとは対照的に、本主題のＨＩＴアッセイは１つのサンプルに対してでさえオンデマンドで行うことができるが、ＳＲＡおよびＨＩＰＡのような従来技術の機能的ＨＩＴアッセイはまとまった量で行われる。更に、本主題のＨＩＴアッセイは、短時間で結果を提供し、緊急設定で行うことができる。従来技術の機能的ＨＩＴアッセイとは対照的に、本主題のＨＩＴアッセイは、被験患者の血小板をさらに包含する、血液バンクなどにおいて利用可能な任意タイプの供給源からの健康な血小板を用いて行われてよい。これらの血小板をＰＲＰ懸濁液中で単離するか、またはその代わりに、全血から直接用いることもできる。更に、本主題のＨＩＴアッセイは、一つまたは２つの工程のみを含んでよく、先に確立された測定装置の設定を再利用してもよい。この特徴により、本主題のＨＩＴアッセイは、特殊な血球計算従業者の関与を必要としないため、使用者にとって使い易いものとなる。上述の特徴、具体的には、方法が単純であること、結果を得るのにかかる時間が短いこと、および血小板が高可用性であることにより、本主題のＨＩＴアッセイは繰り返し行い易い、つまり、必要な時に即座に再度行うことができる。これは、血小板を活性化する可能性がある抗ヘパリン−ＰＦ４抗体を患者が有するか否かを即座に知る必要がある場合に重要である。従来技術のＨＩＴアッセイとは対照的に、本主題のＨＩＴアッセイはこのような回答を容易かつ迅速に提供できる。換言すると、従来技術のＨＩＴアッセイとは対照的に、本主題のＨＩＴアッセイは、ヘパリン投与に対する反応に関して患者の臨床状態を確認するための即時かつ迅速な試験を提供する。従来技術の機能ＨＩＴアッセイと比較した、本主題のＨＩＴアッセイの別の利点は、本主題のＨＩＴアッセイはスクリーニング免疫アッセイの前に、その代わりに、またはそれと並行して行うことができるが、従来技術の機能ＨＩＴアッセイは、スクリーニング免疫アッセイの後にのみ、かつ、スクリーニング免疫アッセイにおいて陽性結果を得た患者に関してのみ行われるということである。よって、特にいくつかのＨＩＴ事象がスクリーニング免疫アッセイによって検出されるものとは異なる抗体によって生じ得るため、本主題のＨＩＴアッセイにより、高い信頼性をもって患者におけるＨＩＴ反応状態を決定できる。換言すると、本主題のＨＩＴアッセイは、従来技術のＨＩＴアッセイよりも確実なＨＩＴ診断を可能にする。本主題のＨＩＴアッセイの別の利点は、従来技術のＨＩＴアッセイと比較して単純であるということ、特定の研究所のインフラストラクチャーを必要とすることなく、かつ、当該アッセイを行うために経験を積んだ研究所従業者を必要として、小型の自動ベンチトップ血球計算器上で当該アッセイを行うことができるということである。この利点は、従来のＨＩＴアッセイと比較して、患者に対するＨＩＴアッセイの利用可能性を大幅に広げる。本主題のＨＩＴアッセイの更に別の利点は、従来技術のＨＩＴアッセイとは対照的に、標準化されているということである。これは異なる設定で得られた結果の比較を可能にするが、従来技術のＨＩＴにおいて、このような比較は不可能である。これは、例えば異なる研究所で得られた結果の一元管理データベースへのデジタル集計を可能にし、それによって、大規模な多施設観察研究を可能にする、または研究所での実施のための評価基準をもたらす。この能力の医療的かつ経済的利点は言うまでもない。
【００２９】
本主題はＨＩＴアッセイを提供する。また、本主題はＨＩＴ診断方法を提供する。本アッセイおよび／方法は、
低濃度のヘパリンまたは高濃度のヘパリンのいずれかの存在下で患者の血清または血漿サンプルと共に血小板をインキュベートすること、
血小板活性化剤の存在（陽性対照混合物）または不在（陰性対照混合物）下で血小板をインキュベートすること、
上述の４つのインキュベーションにおける血小板および活性化血小板を定量化すること、
上述の４つのインキュベーションのそれぞれに関する血小板中の活性化血小板のパーセンテージを算出することおよび以下の値：
低濃度のヘパリンと共にインキュベートした血清または血漿中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（低）］；
高濃度のヘパリンと共にインキュベートした血清または血漿中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（高）］；
陽性対照中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（Ｃｔ＋）］；および
陰性対照中の活性化血小板のパーセンテージ［％Ｒ（Ｃｔ−）］
を得ること、
％Ｒ（低）と％Ｒ（高）の間の差を％Ｒ（Ｃｔ＋）と％Ｒ（Ｃｔ−）の間の差で割ることおよび得られた商に１００を掛けることによってヘパリン血小板活性化（ＨＥＰＬＡ）指数を算出すること、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数からカットオフ値を算出すること、
患者のＨＥＰＬＡ指数をカットオフ値と比較することによって患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定すること
を含み得る。
【００３０】
本アッセイおよび／または方法は、患者から得た血清または血漿サンプルを提供する工程を含み得る。一実施形態によれば、患者から得た血清または血漿サンプルは血清サンプルである。別の実施形態によれば、患者から得た血清または血漿サンプルは血漿サンプルである。血清または血漿サンプルを、患者から抜き取った全血サンプルから調製してもよい。血漿サンプルを得るために全血を、ヘパリンではない抗凝固薬、例えばクエン酸塩が入った試験管に採取する。血漿サンプルを得るために全血を、抗凝固薬が入っていない試験管に採取する。血漿または血清を、例えば、実質的に２，０００ｇにて、実質的に１０分間、実質的に２５℃での、全血の遠心分離によって血液細胞から分離してもよい。遠心分離の後に得られた血漿または血清を、ＨＩＴアッセイにおいて、調製後にそのまま使用、つまり新鮮なサンプルを使用してもよい。あるいは、血漿または血清サンプルを、実質的に−８０℃で保存し、後の段階で使用してもよい。使用する前に、凍結した血漿または血清サンプルを、例えば周囲温度、または実質的に３７℃などにすることにより解凍してもよい。一実施形態によれば、血漿または血清サンプルを、例えばその中に存在し得る汚染物質による血小板の人為的活性化を回避するために、０．２μｍフィルターで、ＨＩＴ試験の前に濾過してもよい。要約すると、ＨＩＴアッセイは、患者からの血清または血漿サンプルを提供する工程を含む。
【００３１】
本アッセイおよび／または方法はまた、血小板を含有するサンプルを調製する工程を含み得る。一実施形態によれば、血小板を含有するサンプルは、ＰＲＰとしても知られている血小板リッチ血漿である。別の実施形態によれば、血小板を含有するサンプルは全血である。
【００３２】
ＰＲＰの調製は、健康なドナー、すなわち、ＨＩＴに罹患していないドナー、または被験患者からの全血サンプルを供給することを含む。この全血サンプルを、ヘパリンではない抗凝固薬、例えばクエン酸塩が入った試験管に採取する。一実施形態によれば、容積比は、抗凝固薬１容積に対して健康なドナーからの全血サンプル９容積である。別の実施形態によれば、健康なドナーからの全血サンプルを採取する前に、全血サンプル、例えば、実質的に３〜４ｍｌの全血を健康なドナーから別の試験管に採取し、廃棄する。全血を、圧迫帯などを用いて、例えば、２１Ｇサイズの針を使用することによって、剪断応力を最小にしつつ患者から採取する。全血サンプルを採取した後、それを周囲温度、例えば、実質的に２０〜２５℃の温度範囲で、少なくとも実質的に３０分間静置させる。その後、全血サンプルを、例えば、実質的に２００ｇで、実質的に５分間、周囲温度にて、例えば、実質的に２０〜２５℃の範囲で遠心分離する。一実施形態によれば、遠心分離は制動なしで行う。遠心分離後、健康なドナーからのＰＲＰである上澄みを、ポリプロピレン試験管などの新たな試験管に静かに移し、周囲温度で、例えば、実質的に２０〜２５℃の温度範囲で、例えば１０ｒｐｍで緩速撹拌を続けて維持する。一実施形態によれば、遠心分離の開始と血球計算によるアッセイ結果の読み取りの間の好ましい期間は、実質的に３時間である。別の実施形態によれば、全血中に血小板を保存する推奨期間は、振とうなしで実質的に６時間である。更なる実施形態によれば、ＰＲＰ中の血小板の人為的活性化を阻止するために、無理な力を加えずにＰＲＰを処理する。例えば、ＰＲＰの操作量は最小であり、ＰＲＰは渦流によって混合されず、各使用の前に指の間に挟んで静かに振とうして血小板をＰＲＰにゆっくりと再懸濁させる。
【００３３】
本アッセイおよび／または方法は更に、一工程インキュベーションまたは二工程インキュベーションのいずれかを含み得る。
一工程インキュベーション
【００３４】
一工程インキュベーションは、患者低ヘパリン混合物と、患者高ヘパリン混合物とを調製する工程を含む。
当該患者低ヘパリン混合物は、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
低用量のヘパリンと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含む。
当該患者高ヘパリン混合物は、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
高用量のヘパリンと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含む。
【００３５】
一実施形態によれば、低用量のヘパリンは、最終濃度が実質的に０．３〜１ＩＵ／ｍｌの範囲である、好ましくは実質的に０．３ＩＵ／ｍｌであるヘパリンである。別の実施形態によれば、高用量のヘパリンは、最終濃度が実質的に３０〜５００ＩＵ／ｍｌの範囲である、好ましくは１００ＩＵ／ｍｌであるヘパリンである。当該技術分野で知られているタイプのヘパリンはすべて、本主題の範囲内であり、例えば、標準的なブタヘパリンナトリウム、より特定的には５，０００ＩＵ／ｍｌの標準的なブタヘパリンナトリウム（フランス、サノフィ社（Ｓａｎｏｆｉ））である。
【００３６】
一実施形態によれば、患者低ヘパリン混合物および患者高ヘパリン混合物の総容積は５０μｌであり、そのうち、患者から得た血清または血漿サンプルの容積は１０μｌであり、血小板を含有するサンプルの容積は１０μｌであり、ヘパリン原液の容積は、低用量ヘパリンまたは高用量ヘパリンのいずれの場合であっても、５μｌである。
【００３７】
好ましい実施形態によれば、血小板を含有するサンプルは、混合物に添加される時に、新鮮である。別の実施形態によれば、血小板を含有するサンプルは、血小板を含有するサンプルの調製後実質的に３時間以内に混合物に添加される。
【００３８】
一工程インキュベーションは更に、患者からの血清または血漿サンプルに存在する特定の抗体により血小板を活性化するために患者低ヘパリン混合物および患者高ヘパリン混合物をインキュベートすることを含む、インキュベーションの工程を含み得る。
一実施形態によれば、当該インキュベーションは、暗所で静かに振とうしつつ、実質的に３０分間行われる。別の実施形態によれば、当該インキュベーションは周囲温度で行われる。更に別の実施形態によれば、当該温度は実質的に２０〜２５℃の範囲である。
【００３９】
一工程インキュベーションは更に、陽性対照混合物と、陰性対照混合物とを調製する工程を含み得る。
当該陽性対照混合物は、
血小板を含有するサンプルと、
血小板活性化剤と、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含む。
当該陰性対照混合物は、
血小板を含有するサンプルと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素と、
希釈剤
を含む。
当該技術分野において知られている血小板活性化剤はすべて本主題の範囲内であり、例えばトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、カルシウムイオノフォア、アラキドン酸、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、トロンビンなどであるが、これらに限定されない。
陽性対照混合物は血小板活性化剤により活性化された血小板を得ることを目的とし、陰性対照混合物は、その中に血小板活性化剤を含まないため、活性化されていない血小板を得ることを目的とする。一実施形態によれば、陽性対照混合物中の血小板を活性化するために、陽性対照混合物を、血小板活性化剤で血小板を活性化するのに適した期間インキュベートする。別の実施形態によれば、陽性対照を、静かに振とうしつつ実質的に３０分間インキュベートする。更に別の実施形態によれば、陽性対照混合物を暗所でインキュベートする。更なる実施形態によれば、陰性対照混合物を陽性対照混合物と同様にインキュベートする。
【００４０】
一実施形態によれば、陽性対照混合物および陰性対照混合物の総容積は実質的に５０μｌであり、そのうち、血小板を含有するサンプルの容積は実質的に１０μｌである。別の実施形態によれば、陽性対照混合物中の血小板活性化剤は飽和濃度である。例えば、血小板活性化剤がＴＲＡＰである場合、ＴＲＡＰ濃度は実質的に５０μｍＭである。
【００４１】
標識された血小板の検出要素は、当該技術分野で知られている任意の要素であり、この要素は、血小板を検出するように構成され、かつ、フローサイトメトリーで使用されるように構成されたマーカーで標識される。標識は、当該技術分野で知られている任意の発光分子であっても、当該技術分野で知られている任意の蛍光色素であってもよい。標識された血小板の検出要素は、血小板に特異的に結合する任意のマーカーまたは分子、好ましくは血小板に特異的な抗体に対する標識抗体、例えば、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する標識抗体、例えば、標識抗ＣＤ４１抗体、標識抗ＣＤ４１ａ抗体などであってよい。更なる実施形態によれば、抗体は当該技術分野において知られている任意のタイプの抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、または好ましくはモノクローナル抗体であってよい。
【００４２】
標識された活性化血小板の検出要素は、当該技術分野で知られている任意の要素であり、この要素は、活性化させた血小板を検出するように構成され、かつ、フローサイトメトリーで使用されるように構成されたマーカーで標識される。標識は、当該技術分野で知られている任意の発光分子であっても、当該技術分野で知られている任意の蛍光色素であってもよい。標識された活性化血小板の検出要素は、活性化血小板に特異的に結合する任意のマーカーまたは分子、好ましくは活性化血小板に特異的である抗体に対する標識抗体、例えば、活性化血小板ｐ−セレクチンに対する標識抗体、例えば、標識抗ＣＤ６２ｐ抗体などであってよい。更なる実施形態によれば、抗体は当該技術分野において知られている任意のタイプの抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、または好ましくはモノクローナル抗体であってよい。
【００４３】
一実施形態によれば、血小板の検出要素および活性化血小板の検出要素はそれぞれ、蛍光標識または任意の発光分子で標識される。別の実施形態によれば、血小板の検出要素の蛍光標識の励起および発光スペクトルは、活性化血小板の検出要素の蛍光標識の励起および発光スペクトルとは異なる。励起および発光スペクトルの差異により、混合物に一緒に存在する場合、これらの標識の蛍光発光の別個の励起および検出を同時に行うことができる。これらの標識の同時の励起および発光検出を可能にする任意の組み合わせは、本主題の範囲内である。組み合わせ例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびフィコエリスリン（ＰＥ）である。よって、一方の検出要素がＦＩＴＣで標識され、他方の検出要素がＰＥで標識されてよい。更に、上述のように、当該技術分野で知られている任意のタイプの抗体は本主題の範囲内である。よって、例えば、混合物は、ＰＥ共役抗ＣＤ４１ａモノクローナル抗体と、ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ６２ｐモノクローナル抗体を含み得る。
【００４４】
一実施形態によれば、患者低ヘパリン活性化検出混合物、患者高ヘパリン活性化検出混合物、陽性対照検出混合物および陰性対照検出混合物の総容積は実質的に５０μｌであり、そのうち、相当するインキュベーション後の患者低ヘパリン混合物、インキュベーション後の患者高ヘパリン混合物、陽性対照混合物および陰性対照混合物の容積は実質的に５μｌである。
【００４５】
一工程インキュベーションは更に、インキュベートした患者低ヘパリン活性化検出混合物、インキュベートした患者高ヘパリン活性化検出混合物、インキュベートした陽性対照検出混合物およびインキュベートした陰性対照検出混合物を、生物学的適合性のある緩衝剤と共に含み得る。別の実施形態によれば、当該生物学的適合性のある緩衝剤は、当該技術分野で知られているように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。本実施形態は、本明細書中で言及される任意の希釈剤に関する。例えば、インキュベートした患者低ヘパリン活性化検出混合物、インキュベートした患者高ヘパリン活性化検出混合物、インキュベートした陽性対照検出混合物およびインキュベートした陰性対照検出混合物の容積が実質的に５０μｌの容積である場合、生物学的適合性のある緩衝剤の容積は実質的に４５０μｌであり、総容積は５００μｌとなる。
二工程インキュベーション
【００４６】
二工程インキュベーションは、患者低ヘパリン第一混合物と、患者高ヘパリン第一混合物とを調製する工程を含み得る。
当該患者低ヘパリン第一混合物は、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
低用量のヘパリン
を含む。
当該患者高ヘパリン第一混合物は、
患者から得た血清または血漿サンプルと、
血小板を含有するサンプルと、
高用量のヘパリン
を含む。
【００４７】
低用量のヘパリンおよび高用量のヘパリンに関する実施形態は、一工程インキュベーションで説明した相当する実施形態と同様である。
【００４８】
一実施形態によれば、上述のように、血小板を含有するサンプルを患者低ヘパリン第一混合物および患者高ヘパリン第一混合物に添加してもよい。別の実施形態によれば、血小板を含有するサンプルを患者低ヘパリン第二混合物および患者高ヘパリン第二混合物に添加してもよい。
【００４９】
一実施形態によれば、患者低ヘパリン第一混合物および患者高ヘパリン第一混合物の総容積は５０μｌであり、そのうち、患者から得た血清または血漿サンプルの容積は１０μｌであり、血小板を含有するサンプルの容積は１０μｌであり、ヘパリン原液の容積は、低用量ヘパリンまたは高用量ヘパリンのいずれの場合であっても、５μｌである。
【００５０】
二工程インキュベーションは更に、患者からの血清または血漿サンプルに存在する特定の抗体により血小板を活性化するために患者低ヘパリン第一混合物および患者高ヘパリン第一混合物をインキュベートすることを含む、第一インキュベーションの工程を含み得る。
一実施形態によれば、当該第一インキュベーションは実質的に１時間行われる。別の実施形態によれば、当該インキュベーションは周囲温度で行われる。更に別の実施形態によれば、当該温度は実質的に２０〜２５℃の範囲である。
【００５１】
二工程インキュベーションは更に、陽性対照第一混合物と、陰性対照第一混合物とを調製する工程を含み得る。
陽性対照第一混合物は、
血小板を含有するサンプルと、
血小板活性化剤と、
希釈剤
を含む。
陰性対照第一混合物は、
血小板を含有するサンプルと、
希釈剤
を含む。
血小板活性化剤に関する実施形態は、一工程インキュベーションで説明した相当する実施形態と同様である。
また、二工程インキュベーションにおいて、陽性対照第一混合物は血小板活性化剤により活性化された血小板を得ることを目的とし、陰性対照第一混合物は、その中に血小板活性化剤を含まないため、活性化されていない血小板を得ることを目的とする。一実施形態によれば、陽性対照第一混合物中の血小板を活性化するために、血小板活性化剤で血小板を活性化するのに適した期間、陽性対照第一混合物をインキュベートする。別の実施形態によれば、陽性対照第一混合物を実質的に１５分間インキュベートする。別の実施形態によれば、陽性対照第一混合物を暗所でインキュベートする。更なる実施形態によれば、陰性対照第一混合物を陽性対照混合物と同様にインキュベートする。
【００５２】
一実施形態によれば、陽性対照第一混合物および陰性対照第一混合物の総容積は実質的に５０μｌであり、そのうち、血小板を含有するサンプルの容積は実質的に１０μｌである。別の実施形態によれば、陽性対照第一混合物中の血小板活性化剤は飽和濃度である。例えば、血小板活性化剤がＴＲＡＰである場合、ＴＲＡＰ濃度は実質的に５０μｍＭである。
【００５３】
二工程インキュベーションは更に、患者低ヘパリン第二混合物および患者高ヘパリン第二混合物と、陽性対照第二混合物と、陰性対照第二混合物とを調製する工程を含み得る。
当該患者低ヘパリン第二混合物は、
インキュベーション後の患者低ヘパリン第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む。
当該患者高ヘパリン第二混合物は、
インキュベーション後の患者高ヘパリン第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む。
当該陽性対照第二混合物は、
陽性対照第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む。
当該陰性対照第二混合物は、
陰性対照第一混合物のアリコートと、
標識された血小板の検出要素と、
標識された活性化血小板の検出要素
を含む。
【００５４】
標識された血小板の検出要素および標識された活性化血小板の検出要素に関する実施形態は、一工程インキュベーションで説明した相当する実施形態と同様である。
【００５５】
一実施形態によれば、患者低ヘパリン第二混合物、患者高ヘパリン第二混合物、陽性対照第二混合物および陰性対照第二混合物の総容積は実質的に５０μｌであり、そのうち、相当するインキュベーション後の患者低ヘパリン第一混合物、インキュベーション後の患者高ヘパリン第一混合物、陽性対照第一混合物および陰性対照第一混合物の容積は実質的に５μｌである。
【００５６】
二工程インキュベーションは更に、標識された検出要素の各々をその標的に結合させるために、患者低ヘパリン第二混合物、患者高ヘパリン第二混合物、陽性対照第二混合物および陰性対照第二混合物をインキュベートすることを含む第二インキュベーションの工程を含み得、例えば標識された検出要素が抗体である場合に、当該第二インキュベーションは、その特定の抗原に抗体を結合させることを目的とする。一実施形態によれば、当該第二インキュベーションは実質的に１５分間行われる。別の実施形態によれば、当該第二インキュベーションは周囲温度で行われる。更に別の実施形態によれば、当該第二インキュベーションは、実質的に２０〜２５℃の温度範囲で行われる。更に別の実施形態によれば、当該第二インキュベーションは、蛍光標識に害を及ぼさない当該技術分野で知られている任意の条件下で、例えば暗所で行われる。
【００５７】
本アッセイおよび／または方法は更に、インキュベートした患者低ヘパリン第二混合物と、インキュベートした患者高ヘパリン第二混合物と、インキュベートした陽性対照第二混合物と、インキュベートした陰性対照第二混合物とを希釈剤で希釈することを含み得る。希釈剤および希釈剤の第二混合物の希釈に関する実施形態は、一工程インキュベーションで説明した相当する実施形態と同様である。
算出および解釈
【００５８】
本アッセイおよび／または方法は更に、一工程インキュベーションまたは二工程インキュベーションのいずれかの後に、希釈したインキュベート患者低ヘパリン活性化検出混合物（以下、「％Ｒ（低）」と呼ぶ）と、希釈したインキュベート患者高ヘパリン活性化検出混合物「％Ｒ（高）」と、希釈したインキュベート陽性対照検出混合物（以下、「％Ｒ（Ｃｔ＋）」と呼ぶ）と、希釈したインキュベート陰性対照検出混合物（以下、「％Ｒ（Ｃｔ−）」と呼ぶ）の各々における全血小板から活性化された血小板のパーセンテージを算出する工程を含み得る。この算出は、サンプルを読み取る装置によって行ってもよい。
【００５９】
一実施形態によれば、全血小板から活性化された血小板のパーセンテージを算出することは、
標識された血小板検出要素から得た信号のレベルに従って全血小板量を測定すること、
標識された活性化血小板検出要素から得た信号のレベルに従って、全血小板量における活性化血小板量を測定することを含む。
【００６０】
本アッセイおよび／または方法は更に、潜在的に活性化可能な血小板に対するヘパリン活性化血小板の比（以下、「ＨＥＰＬＡ指数」と呼ぶ）を算出する工程を含み得る。ＨＥＰＬＡ指数は、％Ｒ（低）と％Ｒ（高）の間の差を％Ｒ（Ｃｔ＋）と％Ｒ（Ｃｔー）の間の差で割ることおよび得られた商に１００を掛けることによって算出される。以下の式は、ＨＥＰＬＡ指数の算出をまとめたものである。
％ＨＥＰＬＡ指数＝１００＊［％Ｒ（低）−％Ｒ（高）］／［％Ｒ（Ｃｔ＋）−％Ｒ（Ｃｔ−）］
【００６１】
本アッセイおよび／または方法は更に、カットオフ値を算出するための方法によって得られた算出カットオフ値との比較に基づきＨＥＰＬＡ指数を解釈する工程を含み得、当該カットオフ値算出方法は、
ＨＩＴに罹患していないドナーからの血清または血漿サンプルのＨＥＰＬＡ指数を測定し算出すること、
ＨＩＴに罹患していないドナーから得たサンプルのＨＥＰＬＡ指数値の平均値および標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、
ＳＤ値を３倍（３ＳＤ）および２倍（２ＳＤ）に増大することおよび得られた積を平均値に加えることによってカットオフ値を算出すること
を含み、平均値＋３ＳＤ（３ＳＤカットオフ）はＨＩＴに罹患していないドナーの９９％を包含し、平均値＋２ＳＤ（２ＳＤカットオフ）はＨＩＴに罹患していないドナーの９５％を包含する。
一実施形態によれば、ＨＥＰＬＡ指数の２ＳＤカットオフ値は実質的に９．６％であってよく、３ＳＤカットオフ値は実質的に１３％であってよい。上述のカットオフ値は例にすぎず、使用される一工程または二工程法の異なる関数であり得ることに留意されたい。しかしながら、ＨＩＴに罹患していないドナーから得たサンプルについて得られるＨＥＰＬＡ指数の任意のカットオフ値が本主題の範囲内であることにも留意されたい。
【００６２】
本アッセイおよび／または方法は更に、患者がＨＩＴに罹患しているか否かを決定する工程を含み得、当該工程は、
患者のＨＥＰＬＡ指数をカットオフと比較すること
を含み、
患者のＨＥＰＬＡ指数が３ＳＤカットオフよりも高い場合、患者はＨＩＴに罹患しており；
患者のＨＥＰＬＡ指数が２ＳＤカットオフと３ＳＤカットオフの間である場合、患者はＨＩＴに罹患しているまたは罹患していない可能性があり、場合により、血小板を含有する新鮮なサンプルでアッセイを繰り返すことが推奨され；
患者のＨＥＰＬＡ指数が２ＳＤカットオフよりも低い場合、患者はＨＩＴに罹患していない。
【００６３】
一実施形態によれば、本アッセイおよび／または方法で使用される試薬は、使用前に周囲温度で平衡化される。別の実施形態によれば、当該周囲温度は実質的に２０〜２５℃の範囲である。
【００６４】
明瞭性のために別々の実施形態の文脈で記載された本主題の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されることも可能であることが理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で記載された本主題の多様な特徴が、別々に、または任意の適切な部分的組み合わせで提供されることも可能である。
【００６５】
本主題は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、当然のことながら、当業者には、多数の代案、変更および変形が明らかとなるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲の意図および広範な範囲内に入る代案、変更、および変形すべてが含まれるものとする。
【国際調査報告】
2020515848.tif 000002
2020515848.tif 000003