(57)【要約】本開示は、標的キメラ抗原受容体を含むＴ細胞など、遺伝子操作した細胞に関する。特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原の内因性発現が、当該Ｔ細胞においてノックダウンまたは抑制を受けると、Ｔ細胞標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、さらに高レベルで発現する。特定の実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、Ｔ細胞抗原発現を妨げる、または、抑制するように遺伝子改変した免疫調節細胞であり、または、当該Ｔ細胞抗原の発現を抑制すると、当該Ｔ細胞抗原の発現を改変または抑制しない同様の状態にある免疫調節細胞と比較してキメラ抗原受容体の発現を増大させる条件下で、当該免疫調節細胞は、Ｔ細胞ｍＲＮＡ発現を抑制またはノックダウンする核酸を含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原として、ＣＤ５、ＣＤ７、及び、ＣＤ３があるが、これらに限定されない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを処置する方法であって：
対象からＴ細胞を単離し；
Ｔ細胞抗原の発現を抑制するように、前記単離したＴ細胞を改変し；
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入し、前記ベクターは、Ｔ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、形質導入したＴ細胞を提供する前記抗原認識ドメインを前記Ｔ細胞が発現する条件下で、コードし、及び、発現し、前記Ｔ細胞抗原の発現の抑制は、Ｔ細胞と比較して、前記Ｔ細胞での前記Ｔ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、前記Ｔ胞抗原の発現は、変化しておらず、または、抑制されておらず；及び
有効量の形質導入したＴ細胞を前記対象に対して、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて、前記対象に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ５、ＣＤ７、または、ＣＤ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
がんを処置する方法であって：
対象からＴ細胞を単離し；
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記単離したＴ細胞を改変し；
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入し、前記ベクターは、ＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、形質導入したＴ細胞を提供する前記ＣＤ５抗原認識ドメインを前記Ｔ細胞が発現する条件下で、コードし、及び、発現する；及び
有効量の形質導入したＴ細胞を前記対象に対して、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて、前記対象に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
ＣＤ５の発現の抑制が、Ｔ細胞と比較して、前記Ｔ細胞でのＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、ＣＤ５の発現は、変化しておらず、または、抑制されていない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターは、前記ＣＤ５遺伝子、または、ＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、または、発現のブロックのための配列を標的とするＣａｓヌクレアーゼ、及び、ガイドＲＮＡをコードし、及び、発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、前記ＣＤ５遺伝子、または、ＣＤ５  ｍＲＮＡにおける切れ目を開裂するための配列を標的とするガイドＲＮＡとを、前記Ｔ細胞に挿入することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、ベクターまたはｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターまたはｍＲＮＡは、ＣＤ５  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる短いヘアピンＲＮＡをコードし、及び、発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＣＤ５  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞を、前記対象の自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から得る請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象への有効量の形質導入したＴ細胞の投与は、前記対象へのリンパ球除去レジメンの投与の後である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンパ球除去レジメンが、非骨髄破壊的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンパ除去レジメンが、シクロホスファミド、フルダラビン、または、それらの組み合わせの投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ５抗原認識ドメインは、
【化７】
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（配列番号８）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
【化８】
2020525537.tif 000010
（配列番号８）を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１８】
プロモーターと作動可能に組み合わせた請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１６に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２０】
膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメインを含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年６月１２日に出願した、米国仮出願第６２／５１８，５８８号の利益を主張する。すべての目的のために、本明細書の一部を構成するものとして、同出願の全内容を援用する。
【０００２】
連邦政府から資金提供を受けた研究または開発に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより、補助金交付番号第１Ｒ４３ＣＡ１９２７１０−０１号の下で、合衆国政府の支援を受けて完成した。合衆国政府は、本発明について、一定の権利を有する。
【０００３】
庁電子ファイリングシステム（ＥＦＳ−ＷＥＢ）を介して、テキストファイルとして提出した情報の援用
本出願に関連する配列表を、紙媒体に代えてテキスト形式で提供し、かつ、本明細書の一部を構成するものとして援用する。配列表を含むテキストファイルの名称は、１７１７２ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。当該テキストファイルは、１１ＫＢであり、２０１８年６月１２日に作成をしたものであり、そして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送信している。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子操作して改変したＴ細胞の養子移入は、抗腫瘍免疫応答を生成するための有望な手法である。前処置化学療法レジメンと、それに続く、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作した自己Ｔ細胞の投与は、リンパ腫を退縮させるとの報告がある。Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１０，１１６（２０）：４０９９−１０２。しかしながら、Ｔ細胞悪性腫瘍の処置は、Ｔリンパ芽球特異的表面抗原が欠如しており、複雑である。その結果、悪性Ｔ細胞を標的として生成したＣＡＲ  Ｔ細胞は、死滅するリスク、すなわち、ＣＡＲ  Ｔ細胞の自己破壊のリスクに曝されている。したがって、標的としたがんＴ細胞に対するそれらの活性化は損なわれる。したがって、改善した方法を特定する必要がある。
【０００５】
ＣＤ５は、大抵のＴ細胞悪性腫瘍で一般的に過剰発現している汎Ｔ細胞マーカーである。正常細胞によるＣＤ５の発現は、胸腺細胞、末梢Ｔ細胞、及び、Ｂ−１細胞と称されているＢリンパ球の小部分集団に限定する、と考えられている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、抗ＣＤ５キメラ抗原受容体を使用した攻撃的なＴ細胞悪性腫瘍の前臨床標的を報告している。Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１７，３１（１０）：２１５１−２１６０。この報告は、固有のＣＤ５発現に起因する、遺伝子操作したＣＡＲ  Ｔ細胞間の死滅を示す。Ｍａｍｏｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５，１２６（８）：９８３−９２，ＷＯ２０１６／１７２６０６、ＷＯ２０１６／１３８４９１、ＷＯ２０１７／１４６７６７、Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＣＡＲ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ５  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＡＧＥＮＴＡ）と称するＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖでのＮＣＴ０３０８１９１０の識別番号の表題箇所も参照されたい。
【０００６】
本明細書で引用した参考文献を、先行技術として認めるものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、標的キメラ抗原受容体を含む、Ｔ細胞などの遺伝子操作した細胞に関する。特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原の内因性発現を、当該Ｔ細胞でノックダウンまたは抑制すると、Ｔ細胞標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、より高レベルで発現する。特定の実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、Ｔ細胞抗原の発現を妨げる、または、抑制するように遺伝子改変した免疫調節細胞であり、または、当該Ｔ細胞抗原の抑制した発現が、同様の状態にある免疫調節細胞と比較して、キメラ抗原受容体の発現を増大させる条件下で、当該免疫調節細胞は、Ｔ細胞ｍＲＮＡ発現を抑制、または、ノックダウンする核酸を含み、前記Ｔ細胞抗原の発現は、変化せず、または、抑制を受けない。特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原として、ＣＤ５、ＣＤ７、及び、ＣＤ３があるが、これらに限定されない。
【０００８】
特定の実施形態では、開示は、Ｔ細胞抗原標的キメラ抗原受容体を含む遺伝子操作した細胞に関する。特定の実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、Ｔ細胞抗原発現を妨げる、または、抑制するように遺伝子改変した免疫調節細胞であり、または、当該免疫調節細胞は、Ｔ細胞抗原ｍＲＮＡ発現を抑制またはノックダウンする核酸を含む。特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞悪性腫瘍を処置するなど、異常なＴ細胞状態に関連する病態を管理する方法に関し、Ｔ細胞悪性腫瘍との診断を受けた対象に対して、Ｔ細胞抗原標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）で遺伝子操作した細胞を投与して、天然Ｔ細胞抗原表面発現を抑制させることを含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原の発現の抑制は、同様の状態にある免疫調節細胞と比較して、Ｔ細胞などの免疫調節細胞でのＴ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、Ｔ細胞抗原の発現は、変化せず、または、抑制を受けない。
【０００９】
特定の実施形態では、開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的キメラ抗原受容体を含む遺伝子操作した細胞に関する。特定の実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現を妨げる、または、抑制するように遺伝子改変した免疫調節細胞であり、または、当該免疫調節細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３  ｍＲＮＡの発現を抑制またはノックダウンする核酸を含む。特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞悪性腫瘍を処置するなど、異常なＴ細胞状態に関連する病態を管理する方法に関し、Ｔ細胞悪性腫瘍との診断を受けた対象に対して、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）で遺伝子操作した細胞を投与して、天然ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３表面発現を抑制させることを含む。特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現の抑制は、同様の状態にある免疫調節細胞と比較して、Ｔ細胞などの免疫調節細胞でのＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現は、変化せず、または、抑制を受けない。
【００１０】
特定の実施形態では、本開示は、血液悪性腫瘍のためのＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）、その組成物、及び、その使用方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、遺伝子操作したキメラ抗原受容体ポリペプチドを提供し、当該ポリペプチドは：シグナルペプチド、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメインを含む。
【００１１】
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ５標的ｓｃＦｖなどのＣＤ５に選択的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする遺伝子操作したキメラ抗原受容体ポリペプチド、または、ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、当該ＣＤ５標的ｓｃＦｖは、配列番号８、または、その変異体を有する。特定の実施形態では、変異体は、配列番号８に対して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％または、それ以上を超える同一性を有する。特定の実施形態では、変異は、軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、または、ＣＤＲ３の外側での１つまたは２つの突然変異、欠失、または、挿入である。特定の実施形態では、変異は、軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、または、ＣＤＲ３の外側での３つまたは４つの突然変異、欠失、または、挿入である。特定の実施形態では、変異は、軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、または、ＣＤＲ３内部での１つまたは２つの突然変異、欠失、または、挿入である。
【００１２】
別の実施形態では、本開示は、上記したキメラ抗原受容体ポリヌクレオチド、または、ポリペプチドのいずれかを発現する遺伝子操作した細胞を提供する。特定の実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫調節細胞である。特定の実施形態では、当該Ｔ細胞は、精製したガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、または、それらの組み合わせの組成物である。
【００１３】
特定の実施形態では、本開示は、がんを処置することに関し：対象からＴ細胞などの免疫調節細胞を単離し；Ｔ細胞抗原の発現を抑制するように、Ｔ細胞などの単離した免疫調節細胞を改変し；Ｔ細胞などの当該免疫調節細胞にベクターまたはＤＮＡを挿入し、形質導入または遺伝子操作したＴ細胞などの形質導入または遺伝子操作した細胞を提供するＴ細胞抗原認識ドメインを、Ｔ細胞などの当該免疫調節細胞が発現する条件下で、ＤＮＡの当該ベクターが、Ｔ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体をコード及び発現し；及び、当該対象に対して、有効量の形質導入または遺伝子操作した細胞を、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて投与する、ことを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、本開示は、がんを処置することに関し：対象からＴ細胞などの免疫調節細胞を単離し；ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現が抑制するように、Ｔ細胞などの単離した免疫調節細胞を改変し；Ｔ細胞などの当該免疫調節細胞にベクターまたはＤＮＡを挿入し、形質導入または遺伝子操作したＴ細胞などの形質導入または遺伝子操作した細胞を提供するＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを、Ｔ細胞などの当該免疫調節細胞が発現する条件下で、ＤＮＡの当該ベクターが、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体をコード及び発現し；及び、当該対象に対して、有効量の形質導入または遺伝子操作した細胞を、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて投与する、ことを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、Ｔ細胞抗原の発現の抑制は、同様の状態にある免疫調節細胞と比較して、Ｔ細胞などの免疫調節細胞でのＴ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、Ｔ細胞抗原の発現は、変化せず、または、抑制を受けない。
【００１６】
特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現の抑制は、同様の状態にある免疫調節細胞と比較して、Ｔ細胞などの免疫調節細胞でのＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、Ｔ細胞抗原の発現は、変化せず、または、抑制を受けない。
【００１７】
特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現を抑制するようにＴ細胞などの単離した免疫調節細胞を改変することは、Ｔ細胞などの免疫調節細胞にベクターまたはＤＮＡを挿入することを含み、当該ベクターまたはＤＮＡは、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子、または、ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、または、発現のブロックのための配列を標的とするＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、及び、ガイドＲＮＡをコード及び発現する。特定の実施形態では、当該ガイドＲＮＡは、ＣＤ５を標的とするためのＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現を抑制するようにＴ細胞などの単離した免疫調節細胞を改変することは、Ｔ細胞などの免疫調節細胞に、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子、または、ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、または、発現のブロックのための配列を標的とするＣａｓヌクレアーゼ、及び、ガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡを挿入することを含む。特定の実施形態では、当該ガイドＲＮＡは、ＣＤ５を標的とするためのＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現を抑制するようにＴ細胞などの免疫調節細胞を改変することは、ベクターまたはｍＲＮＡを、Ｔ細胞などの免疫調節細胞に挿入することを含み、当該ベクターまたはｍＲＮＡは、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３  ｍＲＮＡの発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ、または、短いヘアピンＲＮＡをコード及び発現する。特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の発現を抑制するようにＴ細胞などの単離した免疫調節細胞を改変することは、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｔ細胞、例えば、細胞質に挿入することを含み、当該ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの遺伝子操作した免疫調節細胞は、上記した発現を抑制したＣＤ５改変細胞とみなす。
【００２０】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を、例えば、白血球除去で単離した、当該対象の自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から得る。
【００２１】
特定の実施形態では、対象に対するＴ細胞などの形質導入した免疫調節細胞の有効量の投与は、当該対象に対して、リンパ球除去レジメンを投与した後にする。特定の実施形態では、当該リンパ球除去レジメンは、非骨髄破壊的または骨髄破壊的である。特定の実施形態では、当該リンパ球除去レジメンは、シクロホスファミド、フルダラビン、または、それらの組み合わせを投与することを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的キメラ抗原受容体を含むＴ細胞などの免疫調節細胞、及び、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３  Ｔ細胞株などのＣＲＩＳＰＲ編集免疫調節細胞株を使用することで、Ｔ細胞悪性腫瘍を標的とする使用に関する。特定の実施形態では、本開示は、１）ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメイン：を含むポリペプチドである遺伝子操作したキメラ抗原受容体ポリペプチド、及び、２）ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３表面発現を抑制または解消するように欠失または変異させたＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子を含む、Ｔ細胞などの免疫調節細胞に関する。特定の実施形態では、当該ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインは、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的ｓｃＦｖ−ＣＡＲなどのＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３に特異的に結合するモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集を使用した、ＣＡＲ  Ｔ細胞での当該標的抗原のノックアウト表面発現に関する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３−ＣＡＲを発現すると、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３ポジティブＴ細胞のものと比較して自己活性化の抑制を受けているＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３−ＣＲＩＳＰＲ編集Ｔ細胞を意図している。
【００２４】
特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞などの免疫調節細胞におけるＣＤ５の発現の抑制に関し、Ｔ細胞などの免疫調節細胞と比較して、免疫調節細胞でのＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／またはＣＤ３の発現は変化せず、または、抑制を受けない。
【００２５】
特定の実施形態では、当該ＣＤ５抗原認識ドメインは、例えば、配列番号１に対して選択的であるポリペプチドを含む、ホモサピエンスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５アイソフォーム１である。
【化１】
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【００２６】
特定の実施形態では、本開示は、遺伝子操作した細胞でＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を発現せず、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を提供するような突然変異、付加、または、欠失を含む、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３、及び、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子に対して特異的に結合する抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ポリペプチド、または、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子操作した細胞の製造方法を提供する。特定の実施形態では、当該方法は、（ｉ）末梢血細胞または臍帯血細胞を提供し；（ｉｉ）上記したポリヌクレオチドを、上記した細胞に導入し；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の細胞を増殖し；及び、ステップ（ｉｉｉ）の細胞を単離して、当該遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を提供する、ことを含む。特定の実施形態では、当該方法は、（ｉ）末梢血細胞または臍帯血細胞を提供し；（ｉｉ）ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的キメラ抗原受容体、及び、任意に、当該ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子、または、ｍＲＮＡを標的とするＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、及び、ｇＲＮＡをコードする上記したポリペプチド、または、ポリヌクレオチドを、上記した細胞に導入し；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の細胞を増殖し；及び、ステップ（ｉｉｉ）の細胞を単離して、当該遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を提供する、ことを含む。
【００２７】
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３に選択的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原ポリペプチド、または、ポリヌクレオチドを発現する、遺伝子操作した細胞、または、発現の抑制を受けたＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を製造する方法を提供する。特定の実施形態では、当該方法は、（ｉ）胎盤細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または、造血幹細胞を提供し；（ｉｉ）例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を標的とするｓｃＦｖ−ＣＡＲをコードする上記したポリヌクレオチドをステップ（ｉ）の細胞に導入し；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の細胞を増殖し；及び、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の細胞を単離して、当該遺伝子操作した細胞を提供する、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を提供する、ことを含む。
【００２８】
特定の実施形態では、本開示は、細胞の表面で発現するＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を有する免疫調節細胞の個数を減らす方法を提供する。この方法は、（ｉ）当該免疫調節細胞を、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲポリペプチドを発現する、有効量の遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞と接触させ；及び、（ｉｉ）任意に、免疫調節細胞の個数の減少についてアッセイする、ことを含む。
【００２９】
ある実施形態では、本開示は、細胞増殖性疾患を処置する方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に対して、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３  ｓｃＦｖ−ＣＡＲをコードし、かつ、任意に、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子、または、ｍＲＮＡ発現を標的とするＣａｓヌクレアーゼ、及び、ｇＲＮＡを含むＴ細胞標的抗原認識ドメインを有するＣＡＲポリペプチドを発現する、治療有効量の遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を投与することを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）それを必要とする患者に対して、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的抗原認識ドメインを有するＣＡＲポリペプチドを発現する、治療有効量の遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を投与することを含む。
【００３１】
特定の実施形態では、本開示は、細胞増殖性疾患の処置において使用するＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲポリペプチドを発現する、遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞を提供する。この使用は、それを必要とする患者に対して、当該遺伝子操作した細胞、または、発現を抑制したＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３改変細胞、または、それらの組み合わせを投与することを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、一般的には、細胞内シグナル伝達、ヒンジ、及び／または、膜貫通ドメインの少なくとも１つを含む。第１世代のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータを含むが、第２世代のＣＡＲは、例えば、ＣＤ２８または４−ＩＢＢに由来する単一の共刺激ドメインを含むが、これらに限定されない。第３世代ＣＡＲは、例えば、ＣＤ２８、４−ｌＢＢ（別名、ＣＤ１３７）、ＯＸ−４０、及び、その他の共刺激分子などの２つの共刺激ドメインを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
一部の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセット内の遺伝子の一部である。好ましい実施形態では、当該発現遺伝子または当該カセットは、アクセサリー遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、または、タグまたはその一部を含み得る。当該アクセサリー遺伝子は、カスパーゼ９遺伝子など、誘導性自殺遺伝子、または、その一部とし得るが、これらに限定されない。当該「自殺遺伝子」アブレーション手法は、遺伝子治療の安全性を向上させ、そして、特定の化合物または分子によって活性化した場合のみに、細胞を死滅させる。一部の実施形態では、当該エピトープタグは、ｃ−ｍｙｃタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）、欠失ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｔ）、または、それらの一部、または、それらの組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａは、ＣＤ５を対象とする可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）、または、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲ構造を示す。当該抗原認識ドメインとして、ｓｃＦｖ（左側）またはＶＬＲ（右側）を含むＣＤ２８のＣＡＲ構造を示す。  図１Ｂは、Ｐ２Ａ自己開裂配列を使用して、強化した緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、及び、ＣＤ５−ＣＡＲを発現するために使用するバイシストロン性導入遺伝子配列を示す。それは、５’長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ｈＵＢＣ）、ｅＧＦＰ配列、Ｐ２Ａ配列、インターロイキン２シグナルペプチド（ＩＬ−２  ＳＰ）、ＣＤ５−ＶＬＲ（上側）またはＣＤ５−ｓｃＦｖ（下側）、ｍｙｃエピトープタグ、ＣＤ２８領域、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、及び、３’ＬＴＲを含む。
【図２−１】図２Ａは、ＮＫ−９２細胞の全細胞溶解物での抗ＣＤ３ゼータ抗体を使用したウェスタンブロットが、選別及び増殖した細胞におけるＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ及びＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲタンパク質の存在を示す、ことを示している。ｅＧＦＰ−Ｐ２  Ａ−ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲレンチウイルスベクターで、ＮＫ−９２細胞への導入を行い、そして、ＧＦＰ発現細胞について選別をした。２度の選別を行った後に、９９％ｅＧＦＰ発現で、濃縮したＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞の集団を生成した。
【図２−２】図２Ｂは、双方のＣＤ５−ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞を、ＣＤ５ポジティブ標的細胞ジャーカットと、エフェクター：標的の様々な比率で混合したデータを示しており、そして、パーセント細胞傷害性を、フローサイトメトリーで測定した。  図２Ｃは、ＭＯＬＴ−４についてのデータを示す。ＣＤ５−ＣＡＲ改変ＮＫ−９２細胞は、４時間のアッセイでの未改変ＮＫ−９２細胞と比較して、ＣＤ５ポジティブジャーカット、及び、ＭＯＬＴ−４細胞に対して、有意に大きな細胞傷害性（ｐ＜０．０１）を示した。このデータは、ＣＤ５−ＣＡＲを使用して、ＣＤ５ポジティブＴ−ＡＬＬ細胞株に対するＮＫ−９２細胞媒介細胞傷害性を示す。
【図２−３】図２Ｄは、ＣＤ５−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞を、ＣＤ５−ネガティブ６９７細胞と共に培養すると、細胞傷害性の増大が認められないことを示すデータを示す。
【図３−１】図３Ａは、ｅＧＦＰの共発現を伴う、ｓｃＦｖをベースとした、または、ＶＬＲをベースとしたＣＤ５−ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスベクターでジャーカットＴ細胞を形質導入した方法を示す。当該ジャーカットＴ細胞活性化アッセイは、Ｔ細胞活性化の測定、及び、ウェスタンブロット分析の時点を示す。  図３Ｂは、ウイルスベクターの量の増大に伴って形質導入が増加して４日後の表面ＣＤ６９発現で測定した活性化に関するデータを示す。ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ  ジャーカットグループで、大きな活性化を認めた。
【図３−２】図３Ｃは、活性化した細胞のパーセンテージに関するデータを、細胞の形質導入集団の各々について得たベクターコピー数（ＶＣＮ）と比較した、ことを示す。これらの図への差し込み図は、各グループを定義している。  図３Ｄは、ＣＤ６９発現に関するデータを、形質導入の４日後と１２日後に測定したことを示しており、双方のＣＤ５−ＣＡＲ発現ジャーカットＴ細胞グループにおいて、経時的な活性の抑制を示した。
【図４−１】図４Ａは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集を使用したジャーカットＴ細胞のＣＤ５ノックアウトに関するデータを示す。ジャーカットＴ細胞で５日間、フローサイトメトリーでＣＤ５発現を測定した後に、モックトランスフェクション、または、Ｃａｓ９と、３つの異なるｇＲＮＡ標的配列の１つとをコードするプラスミドでトランスフェクションする。モックトランスフェクトしたＴ細胞、及び、トランスフェクトしたジャーカットＴ細胞でのＣＤ５発現のヒストグラムプロットを、単一の軸に沿って表示する。  図４Ｂは、ＣＤ５−ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ＃２でトランスフェクトしたナイーブジャーカットＴ細胞、及び、流動選別したＣＤ５ネガティブジャーカットＴ細胞におけるＣＤ５発現のヒストグラムプロットの重ね合わせ画像を示す。
【図４−２】図４Ｃは、ＣＤ５に関してＰＣＲ増幅をした、ナイーブ（左上）ＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴ（配列番号２）、及び、選別したＣＤ５編集（右上）ＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡ（配列番号３）ジャーカットＴ細胞ゲノムＤＮＡ由来の代表的な配列トレース図を示しており、ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子の配列を決定する。  図４Ｄは、Ｃａｓ９が生成した予測切断部位の後にあるＣＤ５遺伝子内でのインデルの頻度のＴＩＤＥ分析を示す。結果は、７７％のＣＤ５ネガティブ細胞が編集されており、２７％が、−１の欠失を有していたことを示す。
【図５−１】図５Ａは、ｅＧＦＰポジティブ細胞のパーセンテージを示す。ＣＤ５編集ＣＤ５−ＣＡＲ改変ジャーカットＴ細胞は、自己活性化の抑制を受け、そして、ＣＤ５−ＣＡＲ発現を増大させた。ナイーブ（白色）、及び、ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞（黒色）に対して、１、１０、及び、２０のＭＯＩで、ｅＧＦＰ−Ｐ２  Ａ−ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ、ｅＧＦＰ−Ｐ２  Ａ−ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ、または、コントロールのｅＧＦＰ−Ｐ２  Ａ−ＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入の間、ポリブレンを使用しなかったので、１〜１０のＭＯＩでの形質導入効率で、分離の改善をみた。ジャーカットＴ細胞の双方の集団において、ｅＧＦＰポジティブ細胞で測定した、１、１０、及び、２０のＭＯＩでの各ＣＡＲベクターの形質導入効率。  図５Ｂは、各ＭＯＩで、各ＣＡＲベクターで形質導入したジャーカットＴ細胞の双方の集団におけるＣＤ５発現に関するデータを示す。
【図５−２】図５Ｃは、ｅＧＦＰ発現で測定した、ＣＤ６９発現、及び、形質導入効率をモニタリングして活性化に関するデータを測定したことを示す。ＣＤ５−ＣＡＲを形質導入したジャーカットＴ細胞では、活性化とｅＧＦＰ発現との間に相関関係が存在する。未編集ＣＤ５−ＣＡＲ改変細胞は、ＣＤ５−編集ＣＤ５−ＣＡＲ改変細胞と比較して、Ｔ細胞活性化が増大している。  図５Ｄは、ＶＬＲ−ＣＡＲベクターで形質導入した、未編集ジャーカットＴ細胞（左側）、及び、ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞（右側）でのＣＤ３ゼータ発現を示す全細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。内因性ＣＤ３ゼータを、１８ｋＤａのバンドで表し、そして、ＣＡＲ構築物でのＣＤ３ゼータを、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ構築物の４８ｋＤａバンドで表す。ｅＧＦＰ、ＣＤ５、及び、ＣＤ６９表面発現を、フローサイトメトリーで測定した。
【図６】図６Ａは、ナイーブ標的Ｔ細胞を含む培養物でのＣＤ５編集ＣＤ５−ＣＡＲ改変エフェクター細胞が、エフェクター細胞活性化と、ＣＤ５の標的細胞ダウンレギュレーションを刺激することを示すデータを示す。ナイーブ、及び、ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞を、ＭＯＩ  ５で、ｅＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ、または、ｅＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入の間、ポリブレンは使用しなかった。標的ナイーブジャーカットＴ細胞を、ＶＰＤ４５０で標識した。形質導入をして５日後に、エフェクター細胞を、標識した標的細胞と、Ｅ：Ｔ比を、２：１、１：１、及び、１：５にして培養した。２４時間後に、フローサイトメトリーで細胞を分析した。白色棒は、未編集のエフェクター細胞を示す。黒色棒は、ＣＤ５編集エフェクター細胞を示す。実験は、３回繰り返して行っており、そして、エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲを発現する、未編集エフェクタージャーカットＴ細胞、及び、ＣＤ５編集エフェクタージャーカットＴ細胞と共に培養した標的ジャーカットＴ細胞におけるベースラインＣＤ５発現のパーセント。単独で培養した標的細胞（灰色棒）でのＣＤ５発現を、ベースラインとして使用し、かつ、１００％に設定した。  図６Ｂは、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲのデータを示す。  図６Ｃは、単独で培養して、及び、標的ジャーカットＴ細胞と培養して、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲを発現する未編集エフェクタージャーカットＴ細胞、及び、ＣＤ５編集エフェクタージャーカットＴ細胞のＴ細胞活性化に関するデータを示す。  図６Ｄは、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲのデータを示す。
【図７−１】図７Ａは、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  ＭＯＩ  ５を含む未編集ジャーカットＴ細胞に関するデータを示す。  図７Ｂは、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  ＭＯＩ  ５を含むＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞のデータを示す。
【図７−２】図７Ｃは、ＣＡＲ発現の増大における抗原編集結果を示すデータを示す。
【図８】図８Ａは、未編集ジャーカットＴ細胞全細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。  図８Ｂは、ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞全細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。  図８Ｃは、ＣＤ５編集Ｔ細胞においてＣＡＲ発現の増大を示すウェスタンブロット定量に関するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示のさらに詳細な説明に先だって、本開示は、説明した特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら、変化し得ることを理解されたい。また、本開示の範囲は、添付した特許請求の範囲による制限だけを受けるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態の説明だけを目的としており、かつ、限定を意図するものではない、ことも理解されたい。
【００３６】
特に断りが無い限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野での当業者が、一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似の、または、同等のあらゆる方法及び材料も本開示の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法、及び、材料について説明をする。
【００３７】
本明細書で引用するすべての刊行物及び特許は、本明細書の一部を構成するものとして援用しており、個々の刊行物または特許を、具体的かつ個別に援用するものであることを示し、かつ、本明細書の一部を構成するものとして、引用する文献に関連する方法、及び／または、材料を開示及び説明する。あらゆる刊行物の引用は、出願日前でのそれらの開示が故であり、また、本開示が、先行する開示に照らして、そのような刊行物に対して先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、示された発行日が、実際の発行日と異なる可能性があり、個別に確認する必要もあり得る。
【００３８】
本開示に接した当業者には明らかな通り、本明細書で説明及び例示した個々の実施形態は、本開示の範囲または趣旨から逸脱せずとも、その他の幾つかの実施形態いずれかの特徴から容易に分離する、または、それらを組み合わせ得る別個の構成要素及び特徴を有する。例示したあらゆる方法は、例示した実施順序で、または、論理的に可能なその他の順序で実行することができる。
【００３９】
本開示の実施形態は、特に断りが無い限り、医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学などの技術を使用しており、これらは、当該技術分野での技術の範囲内である。そのような技術は、文献で詳細に説明されている。
【００４０】
様々な実施形態の説明に先だって、以下の定義を提供しており、また、特に断りの無い限りは、使用すべきである。さらに、本明細書で提供する見出しは、便宜上のものに他ならず、特許請求の範囲または意味を解釈するものではない。
【００４１】
明細書、及び、添付した特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で特に断りの無い限りは、複数の意味を含む、ことに留意しなくてはならない。本明細書、及び、添付した特許請求の範囲では、反対の意図が明確でない限りは、以下の意味を持ち合わせるものと定義されている数多くの用語を援用する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」及び「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象（例えば、患者）を治癒させ、かつ、病気を根絶する、ことに限定されない。むしろ、本開示の実施形態は、単に症状を軽減する、及び／または、疾患の進行を遅延させる処置をも意図している。
【００４３】
文脈がそうでないことを必要としない限り、明細書、及び、特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び、その変形、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または、「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」などは、オープンな包括的意味、すなわち、「があるが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈され、また、その他の記載されていない要素、または、方法のステップを除外しない。対照的に、移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲に記載されていない要素、ステップ、または、成分を除外する。移行句「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲を、特定の材料またはステップ、「及び、特許請求した発明の基礎的かつ新規な特徴事項（複数可）に実質的な影響を及ぼさないもの」に限定する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を移行句として使用する実施形態または請求項では、そのような実施形態は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に置換することも想定できる。
【００４４】
アミノ酸配列を有するペプチドに関する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、さらなるＮ末端（アミン末端）またはＣ末端（カルボン酸末端）アミノ酸を含有し得るペプチドのことを指し、すなわち、この用語は、より大きなペプチドでのアミノ酸配列を含むことを意図している。アミノ酸配列を有するペプチドに関する用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、配列に正確な個数、及び、それを超えない個数のアミノ酸を有するペプチド、そして、特許請求の範囲で明示的に示したアミノ酸の範囲を超えないアミノ酸を有するペプチドのことを指す。特定の実施形態では、本開示は、「ペプチドのＮ末端が、アミノ酸配列からなり得る」ことを意図しており、このことは、配列に正確な個数、及び、それを超えない個数のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端、そして、特許請求の範囲で示したアミノ酸の範囲を超えないアミノ酸を有するペプチドのＮ末端のことを指すが、Ｃ末端は、例えば、大きなペプチドの一部として、さらなるアミノ酸に接続し得る。同様に、本開示は、「ペプチドのＣ末端が、アミノ酸配列からなり得る」ことを意図しており、このことは、配列に正確な個数、及び、それを超えない個数のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端、そして、特許請求の範囲で示したアミノ酸の範囲を超えないアミノ酸を有するペプチドのＣ末端のことを指すが、Ｎ末端は、例えば、大きなペプチドの一部として、さらなるアミノ酸に接続し得る。
【００４５】
特定の実施形態では、配列「同一性」とは、アライメントの２つの配列の間における同一の位置の数を、最短配列の大きい方、または、突出部を除いた等価位置の数で割ったものを使用して計算した配列アライメントにおいて、正確に一致するアミノ酸の数（パーセンテージとして表す）のことを指し、内部ギャップは、等価位置として計数する。例えば、ポリペプチドＧＧＧＧＧＧ及びＧＧＧＧＴは、５個の内の４個、または、８０％の配列同一性を有する。例えば、ポリペプチドＧＧＧＰＰＰ及びＧＧＧＡＰＰＰは、７個の内の６個、または、８５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、本明細書で示す配列同一性のあらゆる記載が、配列類似性の代わりになり得る。パーセント「類似性」を、アライメントの２つの配列の間における類似性を定量するために使用する。この方法は、特定のアミノ酸を一致させるために同一とする必要がないことを除けば、同一性の決定と同じである。アミノ酸は、以下のアミノ酸グループにしたがって、類似の特性を有するグループに属する場合は、一致として分類される：芳香族−Ｆ  Ｙ  Ｗ；疎水性−Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｌ；正に帯電：Ｒ  Ｋ  Ｈ；負に帯電−Ｄ  Ｅ；極性−Ｓ  Ｔ  Ｎ  Ｑ。アミノ酸グループも、保存置換とみなす。
【００４６】
キメラ抗原受容体ポリペプチド
特定の実施形態では、本開示は、シグナルペプチド、Ｔ細胞抗原認識ドメイン、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。
【００４７】
本明細書で使用する用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び、「タンパク質」は、互換的に使用しており、そして、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基を有する化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有する必要があり、アミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドとして、ペプチド結合で互いに結合した２つ以上のアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質がある。本明細書で使用する当該用語は、例えば、当該技術分野で、一般的に、ペプチド、オリゴペプチド、及び、オリゴマーとも称されている短鎖と、当該技術分野で、一般的に、タンパク質と称されており、数多くの種類がある長鎖の両方のことを指す。
【００４８】
「ポリペプチド」として、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質がある。当該ポリペプチドとして、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または、それらの組み合わせがある。
【００４９】
「シグナルペプチド」として、細胞内のペプチド、及び、あらゆる付着ポリペプチドを、例えば、特定の細胞小器官（小胞体など）、及び／または、細胞表面への輸送及び局在化を対象とするペプチド配列がある。当該シグナルペプチドとは、本開示のポリペプチドを、細胞膜及び細胞表面への輸送を指示し、そして、本開示のポリペプチドの正確な局在化を提供する、あらゆる分泌タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチドである。特に、本開示のシグナルペプチドは、本開示のポリペプチドを細胞膜に誘導し、当該ポリペプチドの細胞外部分を細胞表面に提示し、当該膜貫通部分を原形質膜に広げ、そして、当該活性ドメインは、細胞質部分、または、細胞の内部にある。ある実施形態では、当該シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）を通過した後に切断するペプチド、すなわち、開裂可能なシグナルペプチドである。ある実施形態では、当該シグナルペプチドは、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、または、ＩＶのヒトタンパク質である。ある実施形態では、当該シグナルペプチドとして、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドがある。
【００５０】
「抗原認識ドメイン」として、当該標的の抗原、受容体、ペプチドリガンド、または、タンパク質リガンド；または、当該標的のポリペプチドに選択的なポリペプチドがある。ある実施形態では、当該抗原認識ドメインとして、当該標的に対する（選択的な）モノクローナル抗体、または、ポリクローナル抗体の結合部分、または、可変領域がある。ある実施形態では、当該抗原認識ドメインとして、断片抗原結合断片（Ｆａｂ）がある。別の実施形態では、当該抗原認識ドメインとして、一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）がある。ｓｃＦＶとは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、短いリンカーペプチドで結合している。別の実施形態では、当該抗原認識ドメインとして、それらの同族受容体に関与するリガンドがある。別の実施形態では、当該抗原認識ドメインを、ヒト化する。抗原認識ドメインは、その配列内にある程度の変動性を有し得るものであり、本明細書に開示した標的に対して依然として選択的である、ことを理解されたい。したがって、当該抗原認識ドメインのポリペプチドは、本明細書で開示した当該抗原認識ドメインポリペプチドと、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、または、少なくとも７０％が同一であり、また、本明細書に記載した標的に対して、なおも選択的であり、そして、本開示の範囲内にある。
【００５１】
当該ヒンジ領域とは、例えば、キメラ抗原受容体、及び、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメインの間に位置する配列であるが、これらに限定されない。当該ヒンジ配列は、例えば、ヒトなどのあらゆる属、または、その一部に由来する、あらゆる適切な配列から取得し得る。そのようなヒンジ領域は、当該技術分野で公知である。ある実施形態では、当該ヒンジ領域として、ＣＤ−８アルファ、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３−ゼータ、Ｔ細胞受容体ａまたはβ鎖、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｓ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、それらの機能性誘導体、及び、それらの組み合わせなどのヒトタンパク質のヒンジ領域がある。ある実施形態では、当該ヒンジ領域として、ＣＤ８ａヒンジ領域がある。一部の実施形態では、当該ヒンジ領域として、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び、ＩｇＤ）から選択したものがあるが、これらに限定されない。
【００５２】
当該膜貫通ドメインとして、細胞膜に広がる疎水性ポリペプチドがある。特に、当該膜貫通ドメインは、細胞膜の一方の側（細胞外）から細胞膜の他方の側（細胞内、または、細胞質）まで広がる。当該膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、または、ベータバレル、または、それらの組み合わせの形態とし得る。当該膜貫通ドメインは、数多くの膜貫通セグメント、各アルファヘリカル、ベータシート、または、それらの組み合わせを有する多型タンパク質を含み得る。ある実施形態では、当該ＣＡＲにあるドメインの１つに対して自然と関連する膜貫通ドメインを使用する。別の実施形態では、当該膜貫通ドメインを、アミノ酸置換で選択または改変して、それらのドメインが、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへ結合することを回避して、受容体複合体のその他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。例えば、膜貫通ドメインとして、Ｔ細胞受容体ａまたはβ鎖、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｓ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、それらの機能性誘導体、及び、それらの組み合わせの膜貫通ドメインがある。人工的にデザインした膜貫通ドメインは、ロイシンやバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。ある実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及び、バリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に認められる。ある実施形態では、当該膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。別の実施形態では、当該膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。そのような膜貫通ドメインは、当該技術分野で公知である。
【００５３】
当該シグナル伝達ドメイン、及び、共刺激ドメインとして、免疫細胞の活性化を提供して、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様を刺激または活性化するポリペプチドがある。ある実施形態では、当該シグナル伝達ドメインとして、ＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメインのポリペプチド、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ、ＦｃＲベータ（Ｆｃ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｒｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）、その活性断片、その機能性誘導体、及び、それらの組み合わせがある。そのようなシグナル伝達ドメインは、当該技術分野で公知である。ある実施形態では、当該ＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激ドメインをさらに含む。ある実施形態では、当該共刺激ドメインとは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８、ナチュラルキラーグループ２メンバーＣ（ＮＫＧ２Ｃ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１ｌａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ、及び、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に結合するリガンド、それらの活性断片、それらの機能性誘導体、及び、それらの組み合わせを含むタンパク質由来の機能性シグナル伝達ドメインである
【００５４】
キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド
本開示は、本明細書に記載したキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。当該ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、あらゆる従来の方法で特定したＣＡＲのアミノ酸配列から調製する。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、上記したＮＣＢＩ参照配列番号、または、各ドメインのアミノ酸配列のＧｅｎＢｅｎｋの受託番号から取得することができ、そして、本開示の核酸は、標準的な分子生物学的、及び／または、化学的手順を使用して調製することができる。例えば、塩基配列に基づいて、ポリヌクレオチドを合成することができ、また、本開示のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーから取得するＤＮＡ断片を組み合わせて調製することができる。ある実施形態では、本明細書に開示したポリヌクレオチドは、遺伝子、または、発現またはクローニングカセットの一部である。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義する。ポリヌクレオチドとして、ＤＮＡ及びＲＮＡがある。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用する核酸、及び、ポリヌクレオチドは、互換可能である。当業者であれば、核酸がポリヌクレオチドであり、単量体の「ヌクレオチド」に加水分解できる、という一般的な知識を持ち合わせている。当該単量体ヌクレオチドは、加水分解されてヌクレオシドになる。本明細書で使用するポリヌクレオチドとして、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術、及び、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを使用して、組換えライブラリー、または、細胞ゲノム由来の核酸配列をクローニングするなど、これらに限定されない当該技術分野で利用可能なあらゆる手段、及び、合成手段によって得られるすべての核酸配列があるが、これらに限定されない。
【００５６】
ポリヌクレオチドベクター
上記したポリヌクレオチドを、ベクターにクローニングすることができる。「ベクター」は、単離したポリヌクレオチドを含み、当該単離したポリヌクレオチドを細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。数多くのベクターが当該技術分野で公知であり、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、ファージミド、コスミド、及び、ウイルスなどがあるが、これらに限定されない。ウイルスとして、ファージ、ファージ誘導体がある。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸の移動を促す非プラスミド、及び、非ウイルス化合物も含む、と解釈すべきである。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されない。
【００５７】
ある実施形態では、ベクターとして、クローニングベクター、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、組み込み型ベクター、及び、配列決定ベクターがある。ある実施形態では、当該ベクターは、ウイルスベクターである。ある実施形態では、当該ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、または、レンチウイルスベクターである。ある実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、当該ポリヌクレオチド配列を発現するようにウイルス形質導入する。
【００５８】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、ウイルスをベースとした数多くのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当該技術分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入して、レトロウイルス粒子に格納することができる。次いで、当該組換えウイルスを単離して、インビボまたはエクスビボのいずれかで、当該対象の細胞に送達することができる。数多くのレトロウイルスシステムが、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。数多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で公知である。ある実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び、米国特許第６，３２６，１９３号）。
【００５９】
キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドの発現は、発現ベクターを使用して達成し得るものであり、同発現ベクターとして、例えば、ＳＦＦＶ、または、ヒト伸長因子１１ａ（ＥＦ）プロモーター、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサーを含むニワトリベータ−アクチンプロモーター）プロモーターヒト伸長因子ｌａ（ＥＦ）プロモーターの少なくとも１つがあるが、これらに限定されない。利用する低強度／低発現プロモーターの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、及び、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、または、それらの一部があるが、これらに限定されない。キメラ抗原受容体の誘導性発現は、テトラサイクリン応答性プロモーターを使用して達成し得るものであり、同応答性プロモーターとして、例えば、ＴＲＥ３ＧＶ（全世代、好ましくは、第３世代を含むＴｅｔ応答要素）、誘導性プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）または、それらの一部、または、組み合わせがあるが、それらに限定されない。
【００６０】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに機能的に結合したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる、強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１ａ（ＥＦ−１ａ）である。しかしながら、その他の構成的プロモーター配列も使用でき、同プロモーター配列として、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバールウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターがあるが、これらに限定されず、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及び、クレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターなどがあるが、これらに限定されない。さらに、本開示を、構成的プロモーターの使用に限定すべきではなく、誘導性プロモーターも、本開示の一部として意図している。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現を所望する時に作動可能に結合するポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、または、発現を所望しない特に発現をオフにすることができる、分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例として、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及び、テトラサイクリンプロモーターがあるが、これらに限定されない。
【００６１】
「発現ベクター」とは、発現するヌクレオチド配列に作動可能に結合した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み；発現のためのその他の要素は、宿主細胞、または、インビトロ発現系で供給することができる。発現ベクターとして、当該組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、または、リポソームに含有したもの）、及び、ウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルス）など、当該技術分野で公知のすべてものがある。
【００６２】
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。一般的に、これらは、開始部位の３０〜１００ｂｐ上流の領域に位置するが、最近では、数多くのプロモーターが、当該開始部位の下流にも機能的要素を含む、ことが報告されている。プロモーター要素間の間隔が可変である場合が多く、要素が互いに反転または移動しても、プロモーター機能は維持されるので、チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が落ち始める前に、プロモーター要素間の間隔を５０ｂｐだけ開けることができる。当該プロモーターに応じて、個々の要素は、協調的に、または、独立して機能して転写を活性化できる。
【００６３】
ＣＡＲポリペプチド、または、その一部分の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子、または、レポーター遺伝子のいずれか、または、その双方を含んで、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとした細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にすることができ、その他の態様では、当該選択可能なマーカーを、別のＤＮＡ片に担持させ、そして、共トランスフェクション手順で使用し得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の双方を、当該宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列に隣接させ得る。有用な選択可能なマーカーとして、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子がある。
【００６４】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトした細胞を同定し、また、調節配列の機能を評価するために使用する。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せず、または、そこでは発現しない遺伝子であり、そして、それらの発現が、幾つかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性で明らかになるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後の適切な時間にアッセイする。適切なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または、緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適切な発現系は周知であり、また、公知の技術を使用して調製し、または、市販品を購入して入手し得る。一般的に、最高レベルの発現を示すレポーター遺伝子の最小の５’隣接領域を有する構築物を、当該プロモーターとして同定する。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に結合され、そして、プロモーター駆動転写を調節する能力に関する作用物質を評価するために使用し得る。
【００６５】
遺伝子を細胞に導入し、そして、発現させる方法は、当該技術分野で公知である。発現ベクターに関連して、当該ベクターは、当該技術分野でのあらゆる方法で、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または、昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、当該発現ベクターは、物理的、化学的、または、生物学的手段で、宿主細胞に移入することができる。
【００６６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、微量注入法、電気穿孔法などがある。ベクター、及び／または、外因性核酸を含む細胞を製造する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【００６７】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法として、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用がある。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も普及が進んだ方法である。その他のウイルスベクターを、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどに由来したものとすることができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【００６８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段として、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、及び、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及び、リポソームなどの脂質をベースとした系がある。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。非ウイルス性送達システムを利用する事例では、例示的な送達媒体は、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、または、インビボ）を意図している。別の態様では、核酸は脂質と結合し得る。脂質に関連する核酸を、リポソームの含水部でカプセル化し、リポソームの脂質二重層内に散在させ、リポソームとオリゴヌクレオチドの双方に関連する結合分子を介してリポソームに付着させ、リポソームに取り込み、リポソームと複合体を形成させ、脂質を含む溶液に分散させ、脂質と混合し、脂質と組み合わせて、脂質懸濁液として含有させ、ミセルを含有または複合し、または、さもなければ、脂質と関連させる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または、脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液での特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして、または、「崩壊した」構造を備えた二重層構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液に点在し得るものであり、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成する可能性がある。脂質は、天然または合成の脂質となり得る脂肪物質である。例えば、脂質として、細胞質に自然に発生する脂肪滴、ならびに、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及び、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素と、それらの誘導体を含む化合物のクラスがある。
【００６９】
使用に適した脂質は、市販品から入手できる。例えば、ジミリスチホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ；ジミリスチホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）から入手することができ；及び、その他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手し得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノールでの脂質の原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用する。
【００７０】
「リポソーム」とは、封入した脂質二重層または凝集体の生成によって形成した様々な単一、及び、多重膜脂質媒体を包むものの総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と、含水部媒体とを備えた小胞構造を有することを特徴とする。多重膜リポソームは、水性媒体で分離した複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰な水性溶液に懸濁すると、それらは自然に形成される。当該脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再配置を受け、そして、脂質二重層の間に水と溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５，５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる溶液構造を有する組成物も意図している。例えば、当該脂質は、ミセル構造となり、あるいは、脂質分子の不均一な凝集体として存在し得るだけである。リポフェクタミン−核酸複合体も意図している。
【００７１】
宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを導入するために使用する方法、さもなければ、細胞を本開示のポリヌクレオチドに曝露する方法に関係なく、当該宿主細胞での組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施し得る。そのようなアッセイとして、例えば、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ、及び、ウエスタンブロット）、または、本明細書に記載のアッセイで、特定のペプチドの有無を検出して、本開示の範囲内にある作用物質を同定する「生化学的」アッセイがある。
【００７２】
遺伝子操作した細胞
別の実施形態では、本開示は、上記したキメラ抗原受容体ポリペプチド、または、それをコードし、かつ、上記したポリヌクレオチドを発現する遺伝子操作した細胞を提供する。「遺伝子操作した細胞」とは、遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、または、タンパク質またはポリペプチドの付加または修飾によって改変、形質転換、または、操作したあらゆる生物のあらゆる細胞のことを意味する。本開示の単離した細胞、宿主細胞、及び、遺伝子組換細胞として、キメラ抗原受容体またはキメラ抗原受容体複合体をコードし、かつ、当該細胞表面で当該キメラ受容体を発現する当該ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの単離した免疫細胞がある。単離した宿主細胞及び遺伝子操作した細胞は、例えば、ＮＫ細胞活性またはＴリンパ球活性の増強、がんの処置、及び、感染症の処置に使用し得る。
【００７３】
本明細書で開示したキメラ抗原受容体ポリペプチドを、その膜で、発現、及び／または、組み込むことができるあらゆる細胞を使用し得る。ある実施形態では、当該遺伝子操作した細胞として、免疫調節細胞がある。免疫調節細胞として、ＣＤ４  Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８  Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＴＬ）などのＴ細胞、及び、記憶Ｔ細胞、または、記憶幹細胞Ｔ細胞がある。別の実施形態では、Ｔ細胞として、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ  Ｔ細胞）がある。Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８細胞から構成されている。ＣＤ４は、Ｔヘルパー細胞などの免疫細胞の表面に存在する糖タンパク質であり、Ｔ細胞の活性化とＨＩＶの受容体に重要である。一部の単球またはマクロファージも、ＣＤ４を発現する。ＣＤ４は、ＯＫＴ４とも称する。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８糖タンパク質を、それらの表面で発現する、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞としても知られている。これらのＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩが提示するペプチド抗原に曝すと活性化する。ある実施形態では、当該遺伝子操作した細胞として、ナチュラルキラー細胞がある。ナチュラルキラー細胞は、当該技術分野で周知である。ある実施形態では、ナチュラルキラー細胞として、ＮＫ−９２細胞などの細胞株がある。ＮＫ細胞株のさらなる例として、ＮＫＧ、ＹＴ、ＮＫ−ＹＳ、ＨＡＮＫ−１、ＹＴＳ細胞、及び、ＮＫＬ細胞がある。ＮＫ細胞は、ＧｖＨＤのリスク無しで抗腫瘍効果を媒介し、かつ、Ｔ細胞に比べて短命である。したがって、ＮＫ細胞は、がん細胞を破壊した後すぐに消尽され、当該改変細胞を除去するＣＡＲ構築物での誘導性自殺遺伝子の必要性を抑制する。
【００７４】
ある実施形態では、遺伝子操作した細胞、特に、ドナーから得た同種Ｔ細胞を改変して、ＭＨＣ認識に関与するＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）の成分を不活性化することができる。その結果、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさなくなる。
【００７５】
Ｔ抗原欠損Ｔ細胞
Ｔ細胞リンパ腫、または、Ｔ細胞白血病は、特定の抗原を発現し、これらの疾患の有用な標的となり得る。例えば、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、ＣＤ５を発現する。しかしながら、ＣＤ５は、ＣＡＲ  Ｔでも発現するが、ＮＫ細胞では発現せず、これらの抗原を標的とする能力を相殺する。このような自殺は、これらの抗原のいずれかを標的とするＣＡＲを具備したＴ細胞で起こり得る。これにより、これらの抗原を標的とするＣＡＲの生成が困難になる。したがって、ＣＡＲを具備させるための標的として使用する場合、Ｔ細胞内の内因性抗原を不活性化する必要となり得る。
【００７６】
別の実施形態では、遺伝子操作した細胞をさらに改変して、細胞表面ポリペプチドを不活性化し、遺伝子操作した細胞が、その他の遺伝子操作した細胞へ作用することを防げる。例えば、内因性ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子、または、遺伝子操作した細胞の遺伝子発現は、ノックアウト、または、不活性化され得る。別の好ましい実施形態では、当該遺伝子操作した細胞は、ノックアウトまたは不活性化した内因性ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子を有するＴ細胞である。ある実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲを発現する遺伝子操作した細胞は、その抗原を発現する遺伝子を不活性化またはノックアウトする。例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３  ＣＡＲを有するＴ細胞は、不活性化またはノックアウトしたＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原遺伝子を有する。遺伝子を、ノックアウト、または、不活性化する方法は公知である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び、メガヌクレアーゼを使用して、当該遺伝子操作した細胞のＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３遺伝子または遺伝子発現を、ノックアウトまたは不活性化し得る。
【００７７】
細胞の供給源
当該遺伝子操作した細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄、腫瘍浸潤リンパ球、リンパ節組織、または、胸腺組織から取得し得る。当該宿主細胞として、胎盤細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または、造血幹細胞がある。当該細胞は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及び、それらのトランスジェニック種から取得し得る。これらの細胞は、確立した細胞株から取得し得る。上記した細胞は、あらゆる公知の手段で取得し得る。これらの細胞は、当該遺伝子操作した細胞のレシピエントに対して自己、同系、同種、または、異種とし得る。
【００７８】
用語「自己」は、その個体に対して後に再導入するのと同じ個体に由来するあらゆる材料のことを指す。
【００７９】
用語「同種異系」とは、材料を導入した個体と同じ種の異なる動物に由来するあらゆる材料のことを指す。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２名以上の個人を、互いに同種異系であると言う。一部の態様において、同じ種の個体に由来する同種異系材料は、抗原類縁物と相互作用するのに遺伝子学的に十分に異なり得る。
【００８０】
用語「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。
【００８１】
用語「同系」とは、特に、抗原または免疫学的反応に関して、極めて近い遺伝的類似性または同一性のことを指す。同系として、例えば、臓器と細胞と（例えば、がん細胞と、その非がん性の対応物）が、同じ個体に由来するモデル、及び／または、臓器と細胞とが、同じ近交系の異なる個体に由来するモデルがある。
【００８２】
自殺システム
本開示の遺伝子操作した細胞は、自殺システムをも含み得る。自殺システムは、メカニズムを提供し、それにより、当該遺伝子操作した細胞は、不活性化または破壊され得る。そのような特徴は、当該遺伝子操作した細胞を使用するあらゆる処置での正確な治療制御を可能にする。本明細書で使用する自殺システムでは、自殺システムが、メカニズムを提供し、それにより、当該自殺システムを有する細胞を、不活性化または破壊することができる。自殺システムは、当該技術分野で周知である。
【００８３】
ある実施形態では、自殺システムは、必要に応じて含有細胞を除去するために、薬理学的に活性化することができる遺伝子を含む。特定の態様では、当該自殺遺伝子は、ポリヌクレオチド、または、細胞を保有する宿主に対して免疫原性ではない。一例では、当該自殺システムは、当該遺伝子操作した細胞の細胞表面でＣＤ２０を発現させる遺伝子を含む。したがって、リツキシマブの投与を、当該遺伝子を含む遺伝子操作した細胞を破壊するために使用し得る。
【００８４】
一部の実施形態では、当該自殺システムは、エピトープタグを含む。エピトープタグの例として、ｃ−ｍｙｃタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）、及び、欠失ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｔ）がある。この実施形態では、当該エピトープタグを、遺伝子操作した細胞で発現する。したがって、当該エピトープタグに対する抗体の投与を、当該遺伝子を含む遺伝子操作した細胞を破壊するために使用し得る。
【００８５】
別の実施形態では、当該自殺システムは、当該遺伝子操作した細胞の表面で発現する、欠失した上皮成長因子受容体を招く遺伝子を含む。したがって、セツキシマブの投与は、当該遺伝子を含む遺伝子操作した細胞を破壊するために使用し得る。別の実施形態では、当該自殺遺伝子として、カスパーゼ８遺伝子、カスパーゼ９遺伝子、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、または、シトクロムＰ４５０がある。さらなる自殺システムの例として、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｎｅｓ  ＢＳ，Ｌａｍｂ  ＬＳ，Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｆ  ａｎｄ  Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  Ａ（２０１４）Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：２５４）に記載されたものがある。
【００８６】
遺伝子操作したＣＲＩＳＰＲシステム
遺伝子操作したＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、高度に特異的な遺伝子ノックアウトなどの遺伝子改変を誘発することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌に固有のものであり、また、ウイルスやプラスミドに対する適応免疫を提供する。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムには、適切なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との複合体において、単一のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ（具体的には、Ｃａｓ９）を利用する上で望ましい特性がある。細菌では、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、２つの異なるＲＮＡ種：ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを含む。標的固有のＣＲＩＳＰＲ活性化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、特定のＤＮＡ配列に結合して標的するように案内する。当該ｃｒＲＮＡは、２つの機能性ドメイン、すなわち、標的特異的な５’−ドメインと、当該トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）への当該ｃｒＲＮＡの結合を指示する３’−ドメインとを有する。当該ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに結合し、かつ、Ｃａｓ９に対するｇＲＮＡ複合体との結合を媒介する、長く、普遍的なＲＮＡである。当該ｇＲＮＡ機能を、人工単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として提供することもでき、当該ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとが単一種に融合する（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−２１，２０１２を参照されたい）。このｓｇＲＮＡフォーマットは、転写プロモーターと当該ｓｇＲＮＡ配列とを含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）カセットで提供することができる、単一の転写ユニット由来の機能性ｇＲＮＡの転写を可能にする。哺乳類系では、これらのＲＮＡは、ＲＮＡ転写、ウイルスベクター、及び、インビトロ転写後の一本鎖ＲＮＡを駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（Ｕ６、または、Ｈ１など）を含むＤＮＡカセットのトランスフェクションで導入している（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４．８０（５）：１５４４−５２を参照されたい）。
【００８７】
自然系では、次いで、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、ヌクレアーゼとして機能して、標的ＤＮＡ配列を開裂する。当該標的配列は、ガイド配列と同一であり、また、当該系を機能させる標的領域に隣接し、かつ、下流に位置する「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）オリゴヌクレオチド（３’）」も含む。Ｃａｓ９などの公知のＣａｓヌクレアーゼの中でも、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９がよく報告されている。
【００８８】
Ｃａｓヌクレアーゼは、一般的に、２つの異なるヌクレアーゼドメインを含む大きなマルチドメインタンパク質である。Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼに点突然変異を導入してヌクレアーゼ活性を無効にすると、ｇＲＮＡでプログラムした方法で、ＤＮＡと結合する能力を保持している、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼ不活性Ｃａｓヌクレアーゼが得られる。Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ、例えば、転写因子や調節因子などのｍＲＮＡへの遺伝子翻訳の速度を変えるタンパク質ドメインを持つ融合タンパク質を作成することで、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムは、ＲＮＡガイド遺伝子発現コントローラーとして機能する。
【００８９】
野生型Ｃａｓ９タンパク質には、ＲｕｖＣとＨＮＨという２つの機能性エンドヌクレアーゼドメインがある。当該ＲｕｖＣドメインは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を開裂し、そして、ＨＮＨドメインは、別の鎖を開裂する。双方のドメインが活性である場合、当該Ｃａｓ９タンパク質は、ゲノムＤＮＡにてＤＳＢを生成することができる。当該酵素活性の一方だけを有するＣａｓ９タンパク質を開発した。そのようなＣａｓ９タンパク質は、当該標的ＤＮＡの一方の鎖だけを開裂する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の当該Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、それぞれ、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異で不活性化する。自然発生メカニズムは、二本鎖または一本鎖での切れ目を修復することができる；しかしながら、当該修復は、当初の配列に追加または削除をもたらし得る。当該Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの双方が不活性化されてしまうと、当該Ｃａｓ９は、当該遺伝子の転写を停止及びブロックするだけで終わりかねない。
【００９０】
本明細書で使用する用語「Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ」とは、ｇＲＮＡの存在下でＤＮＡ分子に結合する能力を有するタンパク質のことを意味し、同タンパク質として、ＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼ活性の双方を有するＣａｓ９タンパク質、及び、ヌクレアーゼ活性の一方または双方を欠いたＣａｓ９タンパク質がある。Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合活性及びヌクレアーゼ活性は、例えば、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、５０７，６２−６７（２０１４）に記載の方法で測定することができる。
【００９１】
ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡまたはＣａｓ９  ｍＲＮＡは、所望のＣａｓヌクレアーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、インビトロ転写に適したベクターにクローニングし、そして、インビトロ転写を行うことで取得し得る。インビトロ転写に適したベクターは、当業者に公知である。Ｃａｓ９タンパク質をコードするクローン化ＤＮＡを含むインビトロ転写ベクターも公知であり、例えば、ｐＴ７−Ｃａｓ９がある。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
【００９２】
本明細書で使用する用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とは、当該センス配列、及び、「ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリダイジングセグメント」、例えば、ｃｒＲＮＡに由来するセグメントで、そこに隣接するＰＡＭを有する二本鎖標的配列のテンプレート鎖にハイブリダイズするガイド配列の融合を有する合成ＲＮＡのことを指す。
【００９３】
当該ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリダイジングセグメント、及び、ｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカー、例えば、オリゴヌクレオチドリンカー、または、その他のものを介して一緒に結合し得る。一般的に言えば、ガイドＲＮＡには、様々な形状のものがある。ある形状では、標的をガイドするために一緒にハイブリダイズする別個の標的ガイドＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを使用しており、そして、別の形式では、ヘアピンを形成する一本鎖のＲＮＡ内での２つの別々のＲＮＡに結合するキメラ標的ガイドＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを使用しており、ｓｇＲＮＡとも称する。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１も参照されたい。
【００９４】
自然状態では、ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡの配列特異性を担っている。本明細書で開示した実施形態では、当該標的配列は、選択した二本鎖核酸のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のすぐ上流に当該配列が存在するように選択する。当該標的配列は、当該ゲノムＤＮＡのいずれか一方の鎖に存在し得る。しかし、本開示の好ましい実施形態では、当該ｇＲＮＡは、ＰＡＭの上流にあるセンス鎖と同一の配列を含む。標的配列の選択、及び／または、ｇＲＮＡのデザインのためのツールが利用可能であり、また、様々な種の様々な遺伝子を予測する標的配列のリストを取得し得る。例えば、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｌａｂ’ｓ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｏｕｔｒｏｓ  ｌａｂ’ｓ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮツール：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム内の特定のＣａｓ９標的を識別するための柔軟なアルゴリズム、及び、ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒがあり、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。
【００９５】
Ｃａｓヌクレアーゼ、または、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列を有するあらゆるＤＮＡに結合することができる。当該ＰＡＭの正確な配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ、または、Ｃａｓ９が由来する細菌種に依存している。あるＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来しており、そして、対応するＰＡＭ配列は、当該標的配列の３’末端のすぐ下流に存在するＮＧＧ（配列番号４）であり、Ｎは、Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｇ、及びＣのいずれか１つである。様々な細菌種のＰＡＭ配列は、公知である。
【００９６】
細菌では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡの一部にハイブリダイズして、ヘアピンループ構造を形成する。その構造は、Ｃａｓ９タンパク質が認識し、そして、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び、Ｃａｓ９タンパク質の複合体を形成する。したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡが、Ｃａｓ９タンパク質に結合する能力を担っている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性の細菌ＲＮＡに由来しており、そして、細菌種に固有の配列を有している。上記したＣＲＩＳＰＲシステムを有することが公知である細菌種に由来するｔｒａｃｒＲＮＡを、本明細書で使用し得る。好ましくは、同じ種に由来するｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を使用する。
【００９７】
ｇＲＮＡは、所望のｇＲＮＡ配列を有するＤＮＡを、インビトロ転写に適したベクターにクローニングし、そして、インビトロ転写を実施することで取得し得る。インビトロ転写に適したベクターは、当業者に公知である。標的配列を持たないｇＲＮＡに対応する配列を含むインビトロ転写ベクターも、当該技術分野で公知である。ｇＲＮＡは、標的配列の合成オリゴヌクレオチドを、そのようなベクターに挿入し、そして、インビトロ転写を実施することで取得し得る。そのようなベクターとして、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能なｐＵＣ５７−ｓｇＲＮＡ発現ベクター、ｐＣＦＤ１−ｄＵ６：１ｇＲＮＡ、ｐＣＦＤ２−ｄＵ６：２ｇＲＮＡ  ｐＣＦＤ３−ｄＵ６：３ｇＲＮＡ、ｐＣＦＤ４−Ｕ６：１＿Ｕ６：３タンデムｇＲＮＡｓ、ｐＲＢ１７、ｐＭＢ６０、ＤＲ２７４、ＳＰ６−ｓｇＲＮＡ−スキャフォールド、ｐＴ７−ｇＲＮＡ、ＤＲ２７４、及び、ｐＵＣ５７−シンプル−ｇＲＮＡバックボーン、ならびに、Ｏｒｉｇｅｎｅから入手可能なｐＴ７−ガイド−ＩＶＴがある。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
【００９８】
遺伝子操作した細胞の製造方法
ある実施形態では、本開示は、上記した遺伝子操作した細胞を製造する方法も提供する。この実施形態では、上記した細胞を、取得または単離する。これらの細胞は、あらゆる公知の手段で単離し得る。これらの細胞として、末梢血細胞または臍帯血細胞がある。別の実施形態では、これらの細胞は、胎盤細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または、造血幹細胞である。
【００９９】
上記したキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、あらゆる公知の手段で、末梢血細胞または臍帯血細胞に導入する。ある例では、上記したキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスベクターで、当該細胞に導入する。
【０１００】
上記したキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、あらゆる公知の手段で、胎盤細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または、造血幹細胞に導入する。ある例では、上記したキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスベクターで、当該細胞に導入する。
【０１０１】
その他の実施形態では、当該キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドを、一過性ＲＮＡ改変「生分解性誘導体」として構築し得る。当該ＲＮＡ改変誘導体を、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に電気穿孔法し得る。さらなる実施形態では、本明細書に記載したキメラ抗原受容体は、当該キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドを、ウイルスベクター無しで、宿主ゲノムに組み込む、「眠れる森の美女」とも称されているトランスポゾン系で構築し得る。
【０１０２】
上記したポリヌクレオチドが、細胞に導入されると、遺伝子操作した細胞が提供され、遺伝子操作した細胞は増殖する。上記したポリヌクレオチドを含む遺伝子操作した細胞は、あらゆる公知の手段で増殖する。これらの増殖した細胞は、あらゆる公知の手段で単離して、本開示の単離した遺伝子操作した細胞を提供する。
【０１０３】
使用の方法
本開示は、免疫調節細胞を死滅させる、個数を抑制する、または、枯渇させる方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を有する細胞を死滅させる、個数を抑制する、または、枯渇させる方法を提供する。本明細書で使用する「個数の抑制として、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または、１００％の抑制がある。本明細書で使用する「枯渇」として、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または、１００％の抑制がある。
【０１０４】
ある実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／またはＣＤ３抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ペプチドを発現する上記した遺伝子操作した細胞の有効量を、当該免疫調節細胞と接触させることにより、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を有する免疫調節細胞の個数を減らす方法を含む。任意に、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を有する免疫調節細胞の個数の抑制は、当該技術分野で公知のあらゆる細胞アッセイで決定し得る。
【０１０５】
本明細書で使用する当該免疫調節細胞は、患者、細胞培養物、または、単離物にあり得る。本明細書で使用する「患者」として、哺乳動物がある。本明細書で使用する用語「哺乳動物」は、マウス及びハムスターなどの齧歯目の哺乳類、及び、ウサギなどのウサギ目の哺乳類など、これらに限定されないあらゆる哺乳動物のことを指す。当該哺乳動物を、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目由来のものとし得る。当該哺乳動物を、ウシ亜科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）などの偶蹄目、または、ウマ科（ウマ）などの奇蹄目由来のものとし得る。当該哺乳動物を、霊長目、広鼻猿類、もしくは、狭鼻猿類（サル）、または、類人猿（ヒトと類人猿）とし得る。好ましくは、当該哺乳動物は、ヒトである。
【０１０６】
特定の実施形態では、当該患者は、０〜６ヶ月齢、６〜１２ヶ月齢、１〜５歳、５〜１０歳、５〜１２歳、１０〜１５歳、１５〜２０歳、１３歳〜１９歳、２０歳〜２５歳、２５歳〜３０歳、２０歳〜６５歳、３０歳〜３５歳、３５歳〜４０歳、４０歳〜４５歳、４５歳〜５０歳、５０歳〜５５歳、５５歳〜６０歳、６０歳〜６５歳、６５歳〜７０歳、７０歳〜７５歳、７５歳〜８０歳、８０歳〜８５歳、８５歳〜９０歳、９０歳〜９５歳、または、９５歳〜１００歳のヒトである。
【０１０７】
本明細書で使用する遺伝子操作した細胞の「有効量」及び「治療有効量」という用語は、所望の治療的、または、生理学的、または、効果、または、結果を提供するのに十分な遺伝子操作した細胞の量のことを意味する。そのような、効果または結果として、細胞性疾患の症状の軽減または改善がある。望ましくない効果、例えば、副作用は、望ましい治療効果と共に出現することがあり；したがって、医師であれば、何が適切な「有効量」であるかを決定する際に、潜在的な利益と潜在的なリスクのバランスを図る。必要とする正確な量は、当該対象の生物種、年齢、及び、全身状態、投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。したがって、正確な「有効量」を特定しえない場合もある。しかしながら、あらゆる個別の事例における適切な「有効量」は、当業者であれば、日頃の実験だけを使用して決定し得る。一般的に、当該遺伝子操作した細胞（複数可）を、標的細胞の増殖を抑制させるのに十分な量で、及び、条件下で投与する。
【０１０８】
ある実施形態では、本開示は、Ｔ細胞抗原抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ペプチドを発現する上記した遺伝子操作した細胞の有効量を、当該免疫調節細胞と接触させることによって、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３などのＴ細胞抗原を有する免疫調節細胞の個数を減らす方法を含む。任意に、Ｔ細胞抗原を有する免疫調節細胞の個数の抑制は、当該技術分野で公知のあらゆる細胞アッセイで決定し得る。
【０１０９】
処置の方法
別の実施形態では、本開示は、細胞増殖性疾患の処置のための方法を提供する。この方法は、治療有効量の上記した遺伝子操作した細胞を、それを必要とする患者に対して投与することを含む。細胞増殖性疾患とは、がん、腫瘍性疾患、または、制御されていない細胞増殖（例えば、細胞塊の形成）を伴うあらゆる疾患のいずれか１つであり、これらの細胞は、特殊かつ異なる細胞に分化することはない。細胞増殖性疾患として、悪性腫瘍、または、骨髄異形成症候群または前白血病、または、前リンパ腫などの前がん病態がある。開示した方法に関して、がんは、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱癌（例えば、膀胱癌腫）、骨癌、脳癌（例えば、髄芽腫）、乳癌、肛門、肛門管、または、肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管癌、関節のがん、頚部、胆嚢、または、胸膜のがん、鼻、鼻腔、または、中耳のがん、口腔のがん、外陰のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌腫）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌腫）、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、Ｂ慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、及び、バーキットリンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、Ｋ細胞白血病／リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網、及び、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、及び、尿管癌のいずれか１つなど、あらゆるがんとすることができる。好ましくは、当該がんは、血液悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、Ｂ慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び、バーキットリンパ腫など、これらに限定されない白血病またはリンパ腫）、胸腺癌腫、びまん性大細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及び、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、及び、末梢Ｔ細胞リンパ腫である。
【０１１０】
本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に関連するＴ細胞の枯渇による、急性臓器拒絶の処置のための方法を提供する。
【０１１１】
ある実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、または、ＣＤ３などのＴ細胞抗原の少なくとも１つと関連するＴ細胞の枯渇による、急性または慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のための方法を含む。
【０１１２】
ある実施形態では、本開示は、幹細胞移植のために、インビボでＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して、ドナー、及び、宿主Ｔ細胞を枯渇または抑制するための方法を含む。このことは、骨髄幹細胞移植片を注入する直前に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を患者に対して投与することで達成できる。
【０１１３】
本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に関連する細胞増殖性疾患の処置のための免疫療法を、移植前処置、または、移植の橋渡し手順、または、孤立型の方法として提供する。
【０１１４】
本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に関連する細胞増殖性疾患の処置の方法を提供する。
【０１１５】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３などのＴ細胞抗原の発現に関連する非がん関連疾患の処置の方法を提供する。
【０１１６】
一部の実施形態では、細胞増殖性疾患の処置に使用するためのＴ細胞抗原認識ドメインを有するＣＡＲを、別の抗癌剤と組み合わせる。特定の実施形態では、当該抗癌剤を、アベマシクリブ、酢酸アビラテロン、メトトレキサート、パクリタキセル、アドリアマイシン、アカラブルチニブ、ブレンツキシマブベドチン、アド−トラスツズマブエムタンシン、アフリベルセプト、アファチニブ、ネツピタント、パロノセトロン、イミキモド、アルデスロイキン、アレクチニブ、アレムツズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、コパンリシブ、メルファラン、ブリガチニブ、クロラムブシル、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アパルタミド、アプレピタント、パミドロネート二ナトリウム、エキセメスタン、ネララビン、三酸化ヒ素、オファツムマブ、アテゾリツマブ、ベバシツマブ、アベルマブ、アキシカブタジンシロロイセル、アキシチニブ、アザシチジン、カルムスチン、ベリノスタット、ベンダムスチン、イノツズマブ、オゾガマイシン、ベバシツマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリガチニブ、ブスルファン、イリノテカン、カペシタビン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、セリチニブ、ダウノルビシン、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、クロファラビン、コビメチニブ、カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩、ダクチノマイシン、クリゾチニブ、イホスファミド、ラムシルマブ、シタラビン、ダブラフェニブ、ダカルバジン、デシタビン、ダラツムマブ、ダサチニブ、デフィブロチド、デガレリックス、デニロイキン、ジフチトックス、デノスマブ、デキサメタゾン、デキソラゾキサン、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドゥルバルマブ、ラスブリカセ、エピルビシン、エロツズマブ、オキサリプラチン、エルトロンボパグオラミン、エナシデニブ、エンザルタミド、エリブリン、ビスモデギブ、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ラロキシフェン、トレミフェン、パノビノスタット、フルベストラント、レトロゾール、フィルグラスチム、フルダラビン、フルタミド、プララトレキサート、オビヌツズマブ、ゲフィチニブシ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガミシン、グルカルピダーゼ、ゴセレリン、プロプラノロール、トラスツズマブ、トポテカン、パルボシクリブ、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ポナチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イマチニブ、タリモジーンラヘルパレプベク、イピリムマブ、ロミデプシン、イクサベピロン、イキサゾミブ、ルキソリチニブ、カバジタキセル、パリフェルミン、ペンブロリツマブ、リボシクリブ、チサゲンレクロイセル、ランレオチド、ラパチニブ、オララツマブ、レナリドミド、レンバチニブ、ロイコボリン、ロイプロリド、ロムスチン、トリフルリジン、オラパリブ、ビンクリスチン、プロカルバジン、メクロレタミン、メゲストロール、トラメチニブ、テモゾロミド、メチルナルトレキソンブロマイド、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プレリキサフォー、ビノレルビン、ネクチツムマブ、ネラチニブ、ソラフェニブ、ニルタミド、ニロチニブ、ニラパリブ、ニボルマブ、タモキシフェン、ロミプロスチム、ソニデギブ、オマセタキシン、ペガスパルガーゼ、オンダンセトロン、オシメルチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、インターフェロンアルファ−２ｂ、ペルツズマブ、ポマリドマイド、メルカプトプリン、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ロラピタント、ルカパリブ、シルツキシマブ、スニチニブ、チオグアニン、テムシロリムス、サリドマイド、チオテパ、トラベクテジン、バルルビシン、バンデタニブ、ビンブラスチン、ベムラフェニブ、ボリノスタット、ゾレドロン酸、または、それらの組み合わせから選択する。
【０１１７】
一部の実施形態では、細胞増殖性疾患の処置に使用するためのＴ細胞抗原、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲを、ＣＴＬＡ−４、及び、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１などのチェックポイント遮断剤と組み合わせる。特定の実施形態では、当該化学療法剤は、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４抗体、または、それらの組み合わせ、例えば、抗ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）、及び、抗ＰＤ１（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）などである。特定の実施形態では、投与の方法は、リンパ球枯渇環境を有する対象にある。特定の実施形態では、リンパ除去剤は、例えば、シクロホスファミド、及び、フルダラビンである。
【０１１８】
一部の実施形態では、Ｔ細胞抗原、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲを、初期化学療法に対する応答を、深化する、除去する、抑制する、妨げる、及び／または、延長する手立てとして使用し、または、その他の補助療法と組み合わせた場合に使用する。当該疾患病態を処置または予防するために利用可能なすべての補助療法は、本開示の一部とみなし、かつ、本開示の範囲内にある。
【０１１９】
別の実施形態では、Ｔ細胞抗原、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３抗原認識ドメインを有するＣＡＲポリペプチドの投与を、関節リウマチを処置するために使用する。別の実施形態では、Ｔ細胞抗原、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３−ＣＡＲは、骨髄移植療法（ＢＭＴ）療法後の移植片対宿主疾患の予防薬として使用し得る。別の実施形態では、Ｔ細胞抗原、例えば、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３−ＣＡＲを使用して、自己免疫障害、及び、悪性腫瘍の処置における発現を改変し得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＣＤ５に選択的なキメラ抗原受容体を有する遺伝子操作した細胞の開示は、化学療法にもはや応答しておらず、または、残存病変が最小限であり、そして、骨髄移植に不適格である患者の骨髄移植への橋渡しとして機能し得る。
【０１２１】
特定の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３−ＣＡＲａＴ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３を発現する細胞を標的とする。標的細胞として、Ｔ細胞リンパ腫またはＴ細胞白血病、前駆急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３ポジティブびまん性大型Ｂ細胞リンパ腫、及び、胸腺癌腫などのがん細胞があるが、これらに限定されない。
【０１２２】
ある実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３−ＣＡＲは、関節リウマチ、移植片対宿主病、及び、自己免疫疾患など、これらに限定されない非血液学的障害を処置するために使用し得る。
【０１２３】
遺伝子操作した、または、改変したＴ細胞を、ＩＬ−２、または／及び、ＩＬ−７とＩＬ−１５との双方の存在下で、または、その他の分子を使用して、増殖させ得る。
【０１２４】
ＣＡＲの導入は、患者への投与前に、インビトロで遺伝子操作したＴ細胞を増殖することで、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３の不活性化の前または後に実行することができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、ＣＤ５、ＣＤ７、及び／または、ＣＤ３標的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＴＬＡ−４、及び、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断剤など、これらに限定されない免疫調節薬、または、ＩＬ−２及びＩＬ１２などのサイトカイン、または、ＦＰＡ００８などのコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の阻害剤、と同時投与する。
【０１２６】
別の実施形態では、本開示は、抗白血病、または、抗リンパ腫免疫を付与、補助、増大、または、増強する方法を提供する。
【０１２７】
有効成分としてＣＡＲを発現する遺伝子操作した細胞を含む治療薬の投与経路は限定しないが、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、腫瘍内投与、または、輸入リンパ管への非経口投与、例えば、注射または点滴で投与することができる。
【０１２８】
本開示のあらゆる方法は、手術、放射線、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、または、それらの組み合わせなど、さらなるがん療法を個体に送達するステップをさらに含み得る。化学療法として、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチィ、プレドニゾン）、ＥＰＯＣＨ（エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、プレドニゾン）、または、その他の多剤レジメンがあるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＣＤ５４標的ＣＡＲ細胞を、幹細胞移植、及び／または、化学療法後の残存疾患を処置または予防するために利用する。
【０１２９】
別の実施形態では、本開示のあらゆる方法は、抗ウイルス療法、シドフォビル、及び、インターロイキン−２、シタラビン（別名、ＡＲＡ−Ｃ）、または、ＭＳ患者のナタリズマブ処置、または、乾癬患者のエファリズマブ処置、または、ＰＭＬ患者のその他の処置をさらに含み得る。さらなる態様では、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及び、ＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、または、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、または、その他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び、放射線照射などのその他の免疫除去剤と組み合わせて、処置計画で使用し得る。カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン、及び、ＦＫ５０６）のいずれかを阻害する薬剤、または、成長因子誘導シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を阻害する薬剤。（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５、１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎ．５：７６３−７７３，１９９３）も使用することができる。さらなる態様では、本開示の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビン、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または、ＯＫＴ３やＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法と併せて（例えば、先に、同時に、または、後に）患者に対して投与する。ある態様では、本開示の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法の後に投与する。例えば、ある実施形態では、対象は、高用量化学療法と、それに続く末梢血幹細胞移植による標準処置を受け得る。特定の実施形態では、移植した後に、対象は、本開示の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増殖した細胞を、手術の前または後に投与する。
【０１３０】
本明細書で使用する用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答に起因する障害として定義する。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切で過剰な反応に起因する。自己免疫疾患の例として、アディション病、脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（１型）、異栄養性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス症候群、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊髄炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、及び、潰瘍性大腸炎などがあるが、これらに限定されない。
【０１３１】
本開示は、以下に記載した実施例を参照することで、理解を深め得る。以下の実施例は、本明細書で特許請求した化合物、組成物、物品、機器、及び／または、方法を、再現及び評価する方法の完全な開示、及び、説明を、当業者に提供するために提示したものであって、単なる例示を意図しており、開示の限定は意図していない。がんを処置、阻害、または、予防するための送達システムの投与に続いて、遺伝子操作した治療用細胞の有効性は、専門医に周知の様々な方法で評価することができる。例えば、化学アジュバントと組み合わせて送達する遺伝子操作した治療用細胞は、遺伝子操作した治療用細胞が、がん細胞の担持量を抑制し、または、がん細胞の担持量のさらなる増大を妨げることを観察することで、対象でのがんを処置または阻害する上で有効である。がん細胞の担持量は、例えば、対象または患者由来の試料（例えば、血液、これに限定されない）でのマーカーの存在を検出する抗体アッセイを用いて、例えば、血中の特定のがん細胞核酸の存在を検出し、または、特定のがん細胞マーカーを同定するポリメラーゼ連鎖反応アッセイを使用する当該技術分野で公知の方法で測定することができ、または、当該患者で循環している癌細胞抗体のレベルをもってして測定することができる。
【０１３２】
ＮＫ及びＣＲＩＳＰＲ編集Ｔ細胞株の２つの構造的に異なる抗ＣＤ５抗原結合ドメインを使用した、Ｔ細胞悪性腫瘍を標的とするキメラ抗原受容体の開発
再発Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、または、リンパ芽球性リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ／Ｔ−ＬＬｙ）の患者は、化学療法だけで処置すると、死亡率が８０％を超えるという惨憺たる結果を招く。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、そのような患者の処置において、絶好の機会を提供する。Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが行った最近の研究では、移植前に完全な二次寛解（ＣＲ２）を達成できる患者では、ＨＳＣＴでの３年全生存率（ＯＳ）は４８％であったことが示されている。Ｔ−ＡＬＬ／ＬＬｙの最初の再発患者では、移植時の疾患状態が、全生存率に関連する最も重要な要素であるので、ＣＲ２を達成することが、ＨＳＣＴを行う前での最も重要なステップである。しかしながら、再発後の臨床的寛解の達成は、Ｔ細胞疾患を処置する上での最大の課題であり、また、再発性疾患の優勢な側面を考慮すると、ほとんどの患者は、移植を受けることができなくなる。したがって、同種ＨＳＣＴの利益を最大化し、かつ、改善するために、このような再発患者に寛解をもたらす新たな手法の開発が待望されている。
【０１３３】
ＣＡＲをベースとした免疫療法は、再発後の持続的寛解を提供することで重要な役割を果たすことができ、それにより、幹細胞移植への橋渡しとして機能する。無関係な傷害性に起因する持続的なＢ細胞形成不全を、定期的な免疫グロブリンの静脈内注入で管理できるＢ細胞悪性腫瘍のＣＡＲ療法とは異なり、Ｔ細胞が指示するＣＡＲ療法が引き起こす持続的なＴ細胞形成不全は、生命を脅かす重篤な免疫抑制を招くこととなる。したがって、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の後に実施し、免疫再構築を許容する造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、合理的な手法である。
【０１３４】
細胞傷害性とＴ細胞の活性化を、抗ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲを使用して実証した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集でのＣＤ５−ＣＡＲ  Ｔ細胞の使用は、仲間の死滅を防ぐための手法である。ＣＤ５ポジティブＣＤ５−ＣＡＲ改変エフェクター細胞の自己活性化は、自己及び隣接ＣＤ５抗原との相互作用に起因する。ｓｃＦｖ−とＶＬＲをベースとした双方のＣＤ５−ＣＡＲを使用した試験は、細胞あたりの導入遺伝子コピーの平均数が減少するにつれて、この効果が、時間の経過と共に小さくなることを示す。悪性細胞の非存在下でのエフェクター細胞の活性化を防ぐ１つの手法は、抗ＣＤ５  ＣＡＲを発現するように改変したＣＤ５ネガティブＮＫ細胞を使用する。インビトロ及びインビボのデータは、ＣＤ５−ＣＡＲを発現するように改変したＮＫ−９２細胞が、ＣＤ５ポジティブＴ細胞白血病細胞株を標的とする上で有効であることを示す。エフェクター細胞であるＮＫ−９２細胞の持続性は、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて、反復投与し得ることを意図しており、または、初代ＮＫ  ＣＤ５−ＣＡＲ細胞に移行させて、Ｔ細胞白血病マウスモデルにおける抗腫瘍効果を高めることを意図している。
【０１３５】
別の手法は、ゲノム編集を使用して、エフェクター細胞から標的抗原をノックアウトすることである。ＣＤ５−編集ＣＤ５−ＣＡＲ改変ジャーカットＴ細胞は、標的細胞と共に培養すると、自己活性化は抑制を受けるが、活性化は増大する。ＣＤ５で編集したエフェクター細胞は、培養単独での活性化の初期レベルと比較して、標的Ｔ細胞との培養で有意に活性化した。Ｔ細胞でのＣＤ５−ＣＡＲ発現は、ＣＤ５のダウンレギュレーションを招く。興味深いことに、本明細書で報告したデータは、未編集ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＣＤ５編集ＣＡＲ改変Ｔ細胞と比較して、ＣＤ５−ＣＡＲタンパク質発現を抑制した、ことを示す。このデータは、ジャーカットＴ細胞と、初代Ｔ細胞の双方について示している。さらに、ＣＤ５編集エフェクター細胞と標的細胞とを含む培養物では、エフェクター細胞は、標的細胞でのＣＤ５に対して、より強固に相互作用し；一方で、ＣＤ５ポジティブの未編集エフェクターＴ細胞は、エフェクター細胞と標的細胞の双方で、ＣＤ５抗原と相互作用して、その効力を低下させる。全体として、このデータは、ＣＤ５ネガティブエフェクター細胞が、それらの自己活性化の低下とＣＡＲ発現の増大が故に、ＣＤ５ポジティブエフェクター細胞と比較して、有利であることを示す。
【０１３６】
ＣＤ５編集エフェクター細胞は、標的細胞のＣＤ５発現に大きな影響を及ぼす。ＣＡＲ構築物で使用する当該ＣＤ５−ＶＬＲは、親和性をベースとした抗体であり、ＶＬＲ抗体の多量体型は、単量体型と比較して、高い効率でヒトＣＤ５に結合する。当該ｓｃＦｖは、マウスＨ６５抗ヒトＣＤ５  ＩｇＧ抗体に由来した。いずれにあっても、実質的な標的細胞の会合と、エフェクター細胞の活性化とを示すので、いずれのＣＤ５−ＣＡＲが最も有利であるのかについて、インビトロ研究で結論付けすることはできない。しかしながら、当該インビボ研究は、当該ＶＬＲ−ＣＡＲが、当該ｓｃＦｖ−ＣＡＲほどの性能を持ち合わせていないことを示した。
【０１３７】
ＣＤ５−ＣＡＲで改変した、エフェクター細胞としてのＮＫ細胞、及び、エフェクターＴ細胞におけるＣＤ５ノックアウトは、ＣＡＲ療法の使用をＴ細胞悪性腫瘍の処置へ適用することを妨げる自己活性化と仲間の死滅という障壁を克服する可能性がある。本開示の１つの目的は、再発患者に対する同種移植への橋渡しを提供することにある。ＣＡＲ改変免疫応答性細胞を使用する手法も、これらの患者で長期寛解を達成するための治療薬として意図している。
【実施例】
【０１３８】
ＣＤ５が指示したＣＡＲの構築
ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲを、ＣＤ５抗原に特異的であることが示されたＶＬＲタンパク質配列を使用して生成した。当該ＣＤ５−ｓｃＦｖの配列を、公開されたヒト化マウス免疫グロブリンタンパク質配列を使用して生成した。Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｔａｉｎ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＣＤＲ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９４，  ７（６）：８０５−１４。当該ｓｃＦｖを発現するようにデザインしたｃＤＮＡ配列を、ヒト細胞発現用にコドン最適化した。ＶＨのＣ末端を、グリシン、及び、セリンペンタペプチド反復（Ｇ４Ｓ）３をコードする１５ｂｐリンカーを使用して、ＶＬのＮ末端と結合した。
【０１３９】
短い５７０ｂｐのＣＤ５−ＶＬＲ配列と比較して、ＣＤ５−ｓｃＦｖ配列全体は、合計で７２０ｂｐであった。それら２つのＣＤ５配列を、Ｎ末端ＩＬ−２シグナルペプチドと、それに続く、ＣＤ５−ＶＬＲ、または、−ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、ＣＤ２８の膜貫通及び細胞内ドメイン、及び、ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインからなる、第２世代のＣＡＲであるＣＡＲカセットにクローニングした（図１Ａ）。自己開裂２Ａペプチド配列（Ｐ２Ａ）を介して、ｅＧＦＰとＣＤ５−ＣＡＲとを共発現するバイシストロン性ベクターを使用して、流動選別によるポジティブ形質導入細胞の選別を可能にした（図１Ｂ）。
【０１４０】
ＣＤ５  ＶＬＲ  ＣＡＲプラスミド配列：Ｎ末端ＩＬ−２シグナル配列と、それに続く、ＣＤ５  ＶＬＲ（太字）、ＣＤ２８（太字）、及び、ＣＤ３ゼータ
【化２】
2020525537.tif 000004
（配列番号６）
【０１４１】
ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲプラスミド配列：ＩＬ−２シグナル配列と、それに続く、ＣＤ５  ｓｃＦｖ（太字）、ＣＤ２８（太字）、及び、ＣＤ３ゼータ
【化３】
2020525537.tif 000005
（配列番号７）
【０１４２】
ＣＤ５  ｓｃＦｖ（ＣＤＲは、太字である）
【化４】
2020525537.tif 000006
（配列番号８）
【０１４３】
ＣＤ５−ＣＡＲ  ＮＫ細胞が媒介した細胞傷害性
ＣＡＲが関係した細胞傷害性を実証するために、細胞傷害能力を維持しているインターロイキン−２（ＩＬ−２）依存性の不死化細胞株であり、十分な特徴決定をした細胞傷害性ヒトＮＫ細胞株ＮＫ−９２を使用した。ＮＫ−９２細胞は、それらの表面にＣＤ５を表示しないので、自己活性化もないままに、また、形質導入した細胞の仲間を死滅させずに、ＣＤ５−ＣＡＲの発現を許容する。ＮＫ−９２細胞を発現するＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲを生成するために、ｅＧＦＰ、及び、当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲを発現するバイシストロン性構築物で、それらを形質導入した。最初のレンチウイルスベクターの形質導入の後に、形質導入効率の低下（＜５％）が認められた。当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞と同様に、流動選別を使用して、ポジティブ形質導入細胞の選択マーカーとしてｅＧＦＰを使用して、ＮＫ−９２細胞株を発現するＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲを生成した。ｅＧＦＰの流動選別を２ラウンド行った後に、ＮＫ−９２集団を発現するＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲが、９９％  ｅＧＦＰ発現で生成した。ｑＰＣＲ分析は、選別と増殖をした細胞において、平均で１．０の形質導入遺伝子コピー／細胞を実証した。流動選別したＮＫ−９２細胞株におけるＣＤ５−ＣＡＲ発現を確認するために、ＣＤ３ゼータ抗体を使用して、ウェスタンブロット分析を実施した。当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ、及び、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲタンパク質のそれぞれに対応する４８及び５５ｋＤａのバンドが目視できた（図２Ａ）。
【０１４４】
それらの細胞傷害性を評価するために、ＣＤ５−ＣＡＲ発現ＮＫ−９２エフェクター（Ｅ）細胞を、様々なＥ：Ｔ比で、ＣＤ５ポジティブジャーカット、及び、ＭＯＬＴ−４  Ｔ細胞白血病標的（Ｔ）細胞と共に培養した。ＣＤ５ネガティブＢ細胞白血病細胞株６９７を、ネガティブコントロールとして使用した。標的細胞を膜色素ＰＫＨ２６で事前に標識していたので、フローサイトメトリーを使用して、未標識のエフェクター細胞と容易に区別することができた。細胞死のマーカーである７−ＡＡＤの標的細胞への取り込みを介して、細胞傷害性を測定した。最低のＥ：Ｔ比であっても、ナイーブＮＫ−９２細胞と比較して、ＣＤ５−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞では、細胞傷害性の有意な増加が認められた（図２Ｂ及び図２Ｃ）。Ｅ：Ｔ比が大きくなると、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲグループにおいて、より大きな細胞傷害性が認められたが、１：１という小さなＥ：Ｔ比では、ＶＬＲ−ＣＡＲとｓｃＦｖ−ＣＡＲとの間の細胞傷害性の差異は有意ではなかった。当該ＣＤ５−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞を、ＣＤ５ネガティブ６９７細胞株に対して試験しても、細胞傷害性の増加は認められなかった（図２Ｄ）。
【０１４５】
ＣＤ５  ＣＡＲが指示したＴ細胞の活性化
Ｔ細胞に関するＣＤ５−ＣＡＲの効果を分析するために、ｅＧＦＰ及びＣＤ５−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、ＣＤ５ポジティブのジャーカットＴ細胞白血病株に、１〜２０の範囲のＭＯＩで形質導入した。ＣＤ５−ＣＡＲと隣接細胞のＣＤ５との結合によって誘導するＴ細胞活性化を測定するために、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の表面発現を、形質導入後４日目と１２日目にフローサイトメトリーで測定した（図３Ａ）。活性化の程度は、形質導入ベクターの量と相関しており、用量依存的に活性化が増大した。ジャーカットＴ細胞を発現する当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲでは、当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲを発現するものと比較して、大きな活性化が認められており、ｅＧＦＰネガティブ細胞では、活性化は認められなかった。
【０１４６】
ジャーカットＴ細胞ゲノムに対する当該ＣＤ５−ＣＡＲ導入遺伝子の格納を確認するために、定量的ＰＣＲを使用して、プロウイルスベクターコピー数（ＶＣＮ）を測定した。ＶＣＮの増大は、ベクター量の増加と、活性化の増大と相関していた（図３Ｃ）。当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲジャーカットＴ細胞は、対応するＭＯＩで、当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ細胞と比較してＶＣＮが大きく、このことは、当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ細胞でわずかに高い活性化が認められた理由であると思われる（図３Ｂ）。２つのＣＤ５−ＣＡＲ改変細胞集団間での活性化をＶＣＮの関数として比較すると、双方のグループで線形相関（ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲでＲ２＝０．９１、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲでＲ２＝０．８２）が認められ、また、当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ細胞は、当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ細胞と比較して高い活性化を示した（図３Ｃ）。形質導入したＴ細胞におけるＣＤ５−ＣＡＲタンパク質発現を測定する手段として、形質導入の９日後に、全細胞溶解物についてウェスタンブロット分析を行った。ＣＤ５−ＣＡＲタンパク質を、抗ＣＤ３ゼータ抗体を使用して検出した。約４８及び５５ｋＤａのタンパク質が認められ、これらは、当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ、及び、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲのそれぞれの予測サイズに対応しており、ならびに、１８ｋＤａのバンドは、ジャーカットＴ細胞で発現することが公知である内因性ＣＤ３ゼータタンパク質の分子量に対応していた。ＣＡＲ発現は、ベクターＭＯＩ依存的に増大した。形質導入の１２日後に、ＣＤ５−ＣＡＲを発現する双方のジャーカットＴ細胞集団で活性化とＶＣＮを、改めて測定した。４〜１２日目でのＶＣＮの抑制が認められ、このことは、ＣＤ６９発現での対応する抑制と同様であった（図３Ｄ）。ジャーカットＴ細胞の活性化とＶＣＮでのこの減少は、部分的には、偽形質導入によるものかもしれないが、ＣＤ５−ＣＡＲ発現細胞と比較して、非改変細胞のさらに迅速な増殖速度、ならびに、自己及び隣接細胞でのＣＤ５抗原との相互作用を介した、形質導入した細胞集団の継続的な活性化に起因する活性化が誘導した細胞死の結果がもたらしたのかもしれない。
【０１４７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集を使用したジャーカットＴ細胞のＣＤ５ノックアウト
抗ＣＤ５が指示したＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を高めるために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ジャーカットＴ細胞において、ＣＤ５発現をノックアウトした。Ｔ細胞では、全長ＣＤ５タンパク質だけが発現する。しかしながら、ＣＤ５ポジティブＢ細胞では、エクソン１の選択的スプライシングにより、欠失したサイトゾルＣＤ５タンパク質をコードする代替エクソン、別名、エクソン１Ｂが生じる。遺伝子の初期、スプライス部位の上流の配列を標的とすることで、非機能性タンパク質産物を生成し、そして、選択的スプライシング現象を回避し得る。Ｔ細胞は、エクソン１Ｂを自然に発現しないが、１Ａに対するエクソン下流を編集しておれば出現し得る、エクソン１Ａとエクソン１Ｂとの間の発現のバランスはＴ細胞に関係している。エクソン１Ａの最初の１００ｂｐ以内での異なる標的配列で生成した、ＣＤ５発現をノックアウトするための３つのｇＲＮＡ。各ｇＲＮＡを、単一のプラスミドで、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９と共に発現した。
【０１４８】
ＣＲＩＳＰＲ技術を使用した遺伝子ノックアウトは、Ｃａｓ９が媒介したｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡの切断によって達成し得る。切断した後、または、刻み目を入れた後に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの自然修復メカニズムが、頻繁に削除と挿入を引き起こし、結果として、フレームシフトが、改変した配列の転写を撹乱する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９を使用する場合、潜在的な標的部位は、［５’−２０ｎｔ−ＮＧＧ−３’］と［５’−ＣＣＮ−２０ｎｔ−３’］の双方であり、式中、Ｎは、あらゆるヌクレオチドである。したがって、ＤＮＡのコード鎖またはテンプレート鎖を標的とすることができる。
ＣＤ５シグナルペプチド（ＣＤ５翻訳の開始）
ＰＡＭ及びＣＤ５標的配列（太字）
【化５】
2020525537.tif 000007
（配列番号１０）。
【０１４９】
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、及び、ＴｒａｃｒＲＮＡ配列＃２：配列は、Ｕ６プロモーターに続いて、ＣＤ５標的ｇＲＮＡ（太字）、及び、ＴｒａｃｒＲＮＡを含み−当該コード鎖に対するハイブリダイゼーションを標的とする。
【化６】
2020525537.tif 000008
（配列番号９）
【０１５０】
ヌクレオポレーションを使用して、ナイーブジャーカットＴ細胞に、各ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物をトランスフェクトし、そして、トランスフェクションから５日後のＣＤ５ネガティブ細胞のパーセンテージを測定した。ＣＤ５−ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ＃２は、ＣＤ５ネガティブのジャーカットＴ細胞を最も多く増やし、本来は１５％のＣＤ５ネガティブであるクローンであるモックトランスフェクト細胞と比較して、４８％のＣＤ５ネガティブ細胞をもたらした。ｇＲＮＡ  ＃１及びｇＲＮＡ  ＃３は、それぞれ、３８％及び２４％のＣＤ５ネガティブ細胞をもたらした（図４Ａ）。公開ウェブツールであるＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、及び、削除を示すＣＲＩＳＰＲオフ標的部位）を使用して、ＣＲＩＳＰＲシステムの標的となり得るヒトゲノム内の部位を特定できる。同じ検索パラメーターを使用して、ｇＲＮＡ  ＃１及び＃２を使用して認められる標的以外の潜在的な部位を特定した；ｇＲＮＡ  ＃１は、ＣＤ５遺伝子内にある１つの部位（目的の標的部位から離間した位置）で、３つの遺伝子に標的以外の部位を有する可能性があると予測し、そして、ｇＲＮＡ  ＃２は、ＣＤ５遺伝子内だけに標的以外の部位を有する可能性があると予測した。より効率的なＣＤ５ノックアウトと、標的以外に結合する可能性の低さとを考え併せて、ｇＲＮＡ  ＃２を、その後の実験で使用した。
【０１５１】
流動選別によって、ＣＤ５−ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ  ＃２で編集した混合細胞集団からＣＤ５ネガティブジャーカットＴ細胞の集団を分離、及び、増殖することができた。選別した細胞の内の２．１％だけが、ＣＤ５を発現した（図４Ｂ）。
【０１５２】
ＣＤ５編集ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は自己活性化を低下させ、ＣＤ５−ＣＡＲ発現を増加させました
ナイーブ及び選別済のＣＤ５−ＣＲＩＳＰＲ編集ジャーカットＴ細胞に対して、ｅＧＦＰ及び当該ＣＤ５−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。加えて、ｅＧＦＰ及びＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲをコードする第３のレンチウイルスベクターを、ネガティブコントロールとして使用した。ジャーカットＴ細胞で発現したＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲは、ＢＣＬ細胞の非存在下では、Ｔ細胞の活性化を刺激しない。双方のＣＤ５−ＣＡＲが、ナイーブジャーカットＴ細胞を、ＣＤ５で編集したジャーカットＴ細胞よりも大幅に活性化するのに対して、当該ＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲは、すべてのジャーカットＴ細胞において、低レベル及び同等レベルのＴ細胞活性化を刺激する。ｅＧＦＰ発現を、ＣＡＲを発現する集団を同定するために、形質導入したジャーカットＴ細胞のマーカーとして使用し、そして、細胞を、１、１０、または、２０のＭＯＩで形質導入した。３つのベクターすべてについて、当該ベクター力価の増加に伴い、ｅＧＦＰポジティブ細胞が増加しており、この増加は、双方の細胞集団で類似しており、かつ、一貫している（図５Ａ）。ＣＤ５−ＣＡＲのベクター量が増加すると、未編集のジャーカットＴ細胞でのＣＤ５発現は抑制を受ける（図５Ｂ）。この減少は、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ改変ジャーカットＴ細胞で最も顕著である。この効果は、ＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲ改変Ｔ細胞では認められず、これらの結果が、ＣＤ５−ＣＡＲ発現の結果であることを示している。さらに、ＣＤ６９発現を、すべての細胞群において、ｅＧＦＰ発現と比較した。ｓｃＦｖをベースとしたＣＡＲとＶＬＲをベースとしたＣＡＲの双方、及び、編集した細胞と未編集の細胞の双方で、ｅＧＦＰ発現と活性化との間に正の相関が認められた（図５Ｃ）。活性化の増大を、当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ、または、当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲのいずれかを発現するＣＤ５編集細胞で劇的に抑制した。当該ＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲは、非常に低レベルのＴ細胞活性化だけを刺激した。形質導入して９日後に回収した全細胞溶解物を使用したウェスタンブロット分析は、ナイーブジャーカットＴ細胞、及び、ＢＣＬ−ＣＡＲ改変ジャーカットＴ細胞と比較して、ＣＤ５−ＣＡＲ改変ジャーカットＴ細胞でのＣＤ５発現を抑制することを確認した。ウェスタンブロット分析は、ＣＤ５で編集したジャーカットＴ細胞が、形質導入細胞と非形質導入細胞の双方で、未編集細胞と比較して、ＣＤ５発現が低いことを示した。ＣＤ５レベルの抑制が、当該ＣＤ５−ＣＡＲと当該ＣＤ５細胞表面タンパク質との間の相互作用に起因するものであるのならば、ＣＤ５−ＣＡＲレベルも、ＣＤ５発現の影響を受け得る。したがって、ＣＤ５発現レベルが低い細胞では、ＣＤ５抗原との相互作用が抑制されるため、ＣＤ５−ＣＡＲタンパク質の発現が増大する。このことを試験するために、ＩｇＧのＦｃ部分に融合したＣＤ５抗原からなるＣＤ５−Ｆｃ融合タンパク質を使用して、フローサイトメトリーを行った。ジャーカットＴ細胞を、ＣＤ５−Ｆｃタンパク質で染色した後に、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体を使用して、２回目の染色を行った。当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ改変ＣＤ５編集ジャーカット���細胞は、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ改変未編集ジャーカットＴ細胞よりも、ＣＤ５−Ｆｃに強く結合する。このデータは、４日目に潜在的な偽形質導入も示したが、ＣＤ５−Ｆｃ結合は８日目まで減少し、その後、頭打ちになった。形質導入の初期に有意な差異が認められるが、未編集細胞でＣＤ５−ＣＡＲの発現が抑制を受けて正常化すると、それらはさほど重要ではなくなる。形質導入して８日後に、ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞の３５．７％と比較して、未編集ジャーカットＴ細胞の１８．６％が、ＣＤ５−Ｆｃタンパク質、及び、ｅＧＦＰに結合した。ジャーカットＴ細胞での実験は、初代Ｔ細胞を使用するための基礎として機能する。初代Ｔ細胞を、ＩＬ−２及びＩＬ−７を含む培地で増殖し、そして、ジャーカットＴ細胞で使用したのと同じＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用して、ＣＤ５発現を、初代Ｔ細胞の３８．６％でノックアウトした。未編集、及び、ＣＤ５編集初代Ｔ細胞に対して、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲレンチウイルスベクターを形質導入し、そして、形質導入の９日後に、フローサイトメトリーで、ｅＧＦＰ及びＣＤ５−Ｆｃ結合を測定した。ジャーカットＴ細胞のデータは、未編集細胞と比較して、ＣＤ５−Ｆｃタンパク質に結合したＣＤ５編集細胞のパーセンテージが増加していること、すなわち、６．１％  ＣＤ５−Ｆｃ結合未編集細胞に対して、６４．４％  ＣＤ５−Ｆｃ結合ＣＤ５編集細胞を示した。
【０１５３】
未編集細胞と比較した編集細胞に対するＣＤ５−Ｆｃ結合の違いは、未編集細胞でＣＡＲに結合するＣＤ５の立体障害の結果であり、これらの細胞での抑制したＣＡＲ発現とは対照的に、ＣＡＲに対するＣＤ５−Ｆｃの結合をブロックする。このことを試験するために、ＣＤ３ゼータ抗体を使用して、ジャーカット全細胞溶解物に関してウェスタンブロット分析を行って、ＣＡＲ構築物（それぞれ、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ、及び、ＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲ構築物での４８、５５、及び、４７ｋＤａ）での内因性ＣＤ３ゼータ（１８ｋＤａ）と、ＣＤ３ゼータとを検出した。内因性ＣＤ３ゼータをコントロールとして使用すると、未編集ジャーカットＴ細胞と比較して、当該ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞は、双方のＣＤ５−ＣＡＲを高いレベルで発現する（図５Ｄ）。さらに、ＣＤ５編集を利用する、または、ＣＤ５編集を利用しない形質導入細胞と比較して、未編集ジャーカットＴ細胞が、ＣＤ５−ＣＡＲ発現をダウンレギュレートしているようであれば、ＢＣＬ−ＣＡＲ発現に影響は及ばない。
【０１５４】
ＣＤ５編集エフェクター細胞は、ＣＤ５をダウンレギュレートする標的Ｔ細胞で効率的に刺激を受ける
ＣＤ５−ＣＡＲ改変エフェクター細胞を、ナイーブジャーカットＴ細胞で培養すると、ｉ）ＣＡＲ改変細胞で発現したＣＤ５と、標的細胞で発現したＣＤ５との間での競合に起因する未編集エフェクターＣＤ５発現の増大、ｉｉ）ＣＤ５発現の標的細胞ダウンレギュレーション、及び、ｉｉｉ）未編集細胞と比較して、ＣＤ５編集エフェクター細胞の活性化の増大を招く。未編集ジャーカットＴ細胞、及び、ＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞に、ＭＯＩが５で、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ、または、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入して５日後に、フローサイトメトリーで、ｅＧＦＰ発現、ならびに、未編集のジャーカットＴ細胞でのＣＤ５発現の抑制を確認した。ナイーブジャーカットＴ細胞を、Ｖｉｏｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｙｅ  ４５０（ＶＰＤ４５０）で標識して、標的細胞とエフェクター細胞とを識別し、続いて、２：１、１：１、１：５のＥ：Ｔ比で、ＣＡＲ改変エフェクター細胞と共に培養した。２４時間後に、細胞を回収し、そして、フローサイトメトリーを使用して、エフェクター細胞と標的細胞でのＣＤ５発現、ならびに、エフェクター細胞でのＣＤ６９発現を測定した。標的細胞と共培養すると、編集形質導入細胞、及び、未編集形質導入細胞のエフェクター細胞でのＣＤ５発現は低く、共培養をしている間の当該エフェクター細胞でのＣＤ５発現への影響はほとんど認められない。当該標的細胞におけるＣＤ５発現を比較するために、単独で培養したＶＰＤ４５０標識ナイーブジャーカットＴ細胞におけるＣＤ５発現のレベルを、当該標的細胞におけるベースラインＣＤ５発現として設定した。ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ−（図６Ａ）、及び、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ改変エフェクター細胞（図６Ｂ）と培養すると、ＣＤ５発現は標的細胞で抑制を受け、当該ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ改変細胞で培養した標的細胞では、さらに大きな抑制が認められた。Ｅ：Ｔ比が、２：１及び１：１の場合、ＣＤ５編集ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲエフェクター細胞（図６Ａ）と、ＣＤ５編集ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ−エフェクター細胞（図６Ｂ）で培養したグループの間で、標的細胞のＣＤ５発現に有意差がある。加えて、当該未編集エフェクター細胞群と、当該ＣＤ５編集エフェクター細胞群とを、すべてのＥ：Ｔ比で比較すると、標的細胞のＣＤ５発現に有意差が認められた。しかしながら、Ｅ：Ｔ比が小さい（エフェクター細胞に対する標的細胞のパーセンテージが大きい）と、ＣＤ５発現の抑制はそれほど顕著ではない（図６Ａ及び図６Ｂ、Ｅ：Ｔ比は１：５であり、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ−エフェクター細胞培養物と、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲエフェクター細胞培養物において、それぞれ、ｐ＝０．０２８及びｐ＝０．０４５）。これらの結果は、未編集ＣＡＲ改変エフェクターＴ細胞と比較して、ＣＤ５改変ＣＡＲ改変エフェクターＴ細胞が、当該標的細胞との関連性を高め、当該標的細胞でのＣＤ５発現の劇的な抑制を招くことを示す。エフェクター細胞の活性化での差異の有無を判断するために、ＣＤ６９の発現を測定した。すべてのＥ：Ｔ比で、ＣＤ５編集ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ−（図６Ｃ）、及び、ＣＤ５−編集ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ改変（図６Ｄ）エフェクターＴ細胞を、ナイーブ標的細胞を用いて培養する以前のそれらの活性化と比較して、活性化が有意に増大した（図６Ｃ及び６Ｄ）。非ＣＡＲ改変ＣＤ５編集エフェクター細胞を使用して、同じパラメーターを測定したコントロール実験は、細胞だけでは効果がないことを示した。このデータは、ＣＤ５編集エフェクターＴ細胞が、未編集エフェクターＴ細胞と比較して、標的細胞との相互作用を高めて、エフェクター細胞活性化を増大させることを例示している。
【０１５５】
ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞は、異種移植Ｔ細胞白血病マウスモデルにおける疾患進行の遅延において、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞よりも優れている
２つのＣＤ５−ＣＡＲ構造の細胞傷害性の可能性をさらに比較するために、ＮＫ−９２細胞を発現するＣＤ５−ＣＡＲの有効性を、Ｔ細胞白血病異種移植マウスモデルで試験した。ルシフェラーゼ発現ジャーカットＴ細胞を使用することで、生物発光イメージングを使用して腫瘍量のモニタリングを可能にする白血病モデルを確立した。腫瘍注射の７日後に処置を開始した。ＮＫ−９２細胞は、ＩＬ−２を補充せずに、週２回で、合計４回注射した。週２回の投与計画は、ＩＬ−２の非存在下で、非照射ＮＫ−９２細胞が３日間を超えて末梢血に残存せず、かつ、骨髄への生着の証拠を示さない、という我々の実験に基づいている。腫瘍担持の有意な抑制は、２１日目のＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２処置群において明らかであった。ホルム−サイダック法による多重比較試験の重要性は、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ対生理食塩水、及び、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ対ナイーブＮＫ−９２グループでは認められたが、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ対ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲグループでは認められなかった。同様の全体的な傾向は、１４日目と２８日目での疾患の負担に関して認められた。しかしながら、一元配置分散分析試験では、すべてのグループを比較することはできなかった。ＮＫ−９２細胞の細胞用量と持続性が故に、些細な効果しか認められなかったが、当該ｓｃＦｖ−ＣＡＲで処置したグループは、平均で４９日生存しており、その他の３つのグループ、生理食塩水、ナイーブＮＫ−９２、及び、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲＮＫ−９２の各グループでの４０、４１、及び、４２日と比較して、生存については有意に良好であった。対照的に、当該ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ−ＮＫ−９２マウスは、生理食塩水、及び、ナイーブＮＫ−９２処理群よりも有意に良好な生存を示さなかった。
【０１５６】
レンチウイルスベクターをコードするＣＡＲの生成
高力価の組換え自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶレンチウイルスベクターを、４つのプラスミドシステムを使用して生産した。当該ＣＤ５−ＣＡＲ構築物、及び、ＢＣＬ−ＶＬＲ−ＣＡＲ構築物をコードする発現プラスミド、ならびに、ｇａｇ、ｐｏｌ、及び、エンベロープ（ＶＳＶ−ｇ）遺伝子を含むパッケージングプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクションによって、ＨＥＫ−２９３  Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトした。１０％ＦＢＳ、及び、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで細胞を培養した。トランスフェクションをして２４時間後に、細胞培養培地を、新鮮な培地と交換した。４８及び７２時間で、ベクター上清を回収し、０．２２ｍｍフィルターでろ過し、そして、−８０℃で保存した。最終回収の後に、当該ベクター上清をプールし、そして、４℃で、１０，０００ｘｇで遠心分離して、一晩、濃縮した。次に、ペレット化したベクターを、無血清ＳｔｅｍＰｒｏ培地に再懸濁した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、ＨＥＫ−２９３  Ｔ細胞ゲノムＤＮＡで、力価測定を行った。濃縮組換えウイルスベクターの力価は、約１ｘ１０７ＴＵ／ｍＬであった。
【０１５７】
細胞株のレンチウイルスベクター形質導入
特に断りが無い限り、組換えＨＩＶ−１をベースとしたレンチウイルスベクター粒子の形質導入は、６ｍｇ／ｍＬポリブレンを補充した適切な培養培地で、細胞をベクターとインキュベートして行った。形質導入をして２４時間後に、培地を新鮮な培地と交換した。次いで、形質導入した細胞を、少なくとも３日間培養した後に、下流での利用に供した。ジャーカットＴ細胞を、１〜２０の範囲の多重指数（ＭＯＩ）で形質導入した。
【０１５８】
初代Ｔ細胞のレンチウイルスベクター遠心
組換えＨＩＶ−１をベースとしたレンチウイルスベクターの形質導入は、５ｍｇ／ｍＬポリブレンを補充した適切な培養培地で、ベクターと細胞をインキュベートして行い、その後、３０００ＲＰＭで、２．５時間、遠心分離した。遠心して２４時間後に、培地を新鮮な培地と交換した。次いで、形質導入した細胞を、少なくとも３日間培養した後に、下流での利用に供した。
【０１５９】
ジャーカットＴ細胞及び初代Ｔ細胞のトランスフェクション
ジャーカットＴ細胞及び初代Ｔ細胞を、Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂ  Ｄｅｖｉｃｅ、及び、ｔｈｅ  Ａｍａｘａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｖ、または、ｔｈｅ  Ａｍａｘａ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、それぞれの製造元のプロトコルに従って、トランスフェクトした。細胞に対して、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９の双方をコードする単一プラスミドＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムの６ｍｇをトランスフェクトした。トランスフェクションして５日後までに、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して、ＣＤ５ノックアウトを確認した。
【０１６０】
ＣＡＲ改変エフェクターＴ細胞、及び、ナイーブ標的Ｔ細胞を使用した共培養アッセイ
ナイーブ及びＣＤ５編集ジャーカットＴ細胞を、５のＭＯＩで、ｅＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ、または、ｅＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲをコードする高力価の組換え自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターとインキュベートして、形質導入した。２４時間後に、培養培地を新鮮な培地と交換した。形質導入の５日後に、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーで、ｅＧＦＰ発現を確認した。同日に、形質導入細胞を、２：１、１：１、及び、１：５のエフェクター（Ｅ）対標的（Ｔ）の比率で、Ｖｉｏｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｙｅ４５０（ＶＰＤ４５０）で標識したナイーブジャーカットＴ細胞と共に培養した。各培養での最終濃度は、５ｘ１０５細胞／ｍＬであった。ナイーブジャーカットＴ細胞を、製造業者のプロトコルに従って標識した。フローサイトメトリーを使用して、エフェクター細胞及び標的細胞でのＣＤ５の変化、ならびに、共培養を開始して２４時間後でのエフェクター細胞でのＣＤ６９発現を分析した。
【０１６１】
Ｔ細胞白血病マウス異種移植モデルの生成、及び、ＮＫ−９２細胞を発現するＣＤ５−ＣＡＲを用いた処置
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、そして、特定の病原体のいない環境で維持した。Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の定めた原則に従ってマウスを飼育し、そして、すべての動物プロトコルは、ＩＡＣＵＣから承認を受けた。ルシフェラーゼを発現するジャーカットＴ細胞白血病細胞株を、Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｇｒａｈａｍ博士（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）のご厚意で提供いただいた。ＮＫ−９２細胞による処置投薬計画を決定するために、ＮＳＧマウスに対して、ＩＬ−２を補充していない非照射ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞を注射し、そして、ＮＫ−９２細胞の経時的な持続性を追跡した。末梢血、骨髄、及び、脾臓での注射をして１日、３日、及び、１８日後に、フローサイトメトリーで、ＮＫ−９２細胞の証拠についてマウスを評価した。この実験の結果に基づいて、ＩＬ−２を補充していない非照射ＮＫ−９２細胞の週２回投与レジメンを確立した。次いで、７〜９週齢のＮＳＧマウスに、０日目に、２ｘ１０６個のルシフェラーゼ発現ジャーカットＴ細胞を静脈内注射して、疾患を確立した。注射前に、細胞を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。腫瘍注射して７日後に処置を開始した。マウスに対して、ＰＢＳ（コントロール）、未改変のナイーブＮＫ−９２細胞、ＣＤ５−ＶＬＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞、または、ＣＤ５−ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞を投与して、４つの処置グループを設けた。細胞の投与を受けるマウスの場合、各処置は、１００ｕＬ  ＰＢＳに再懸濁した１０７  ＮＫ−９２細胞を、眼窩後部に注射して静脈内投与する、ことから構成されていた。７日目、１１日目、１４日目、及び、１８日目に、各マウスに対して４回の処置をした。７日ごとに、マウスに対して、インビボ生物発光イメージングを行って、腫瘍担持をモニタリングした。動物に対して頻繁にモニタリングを行って、白血病の進行の兆候（２０％を超える体重減少、活動低下、及び／または、後肢麻痺）が認められれば、安楽死させた。
【０１６２】
未編集ジャーカットＴ細胞と比較して、すべてのＭＯＩでのＣＤ５編集Ｔ細胞におけるＶＬＲ−ＣＡＲ、及び、ｓｃＦｖ−ＣＡＲタンパク質発現の増大
未編集Ｔ細胞株、及び、ＣＤ５編集Ｔ細胞株に、５のＭＯＩで、抗ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲを形質導入した。フローサイトメトリーを使用して、形質導入の５日後に、ＣＡＲ発現の尺度であるＧＦＰ、及び、ＣＤ５−Ｆｃ細胞表面発現を測定した。ＧＦＰ発現で測定した同様のレベルの形質導入（図７Ａは、未編集細胞を示し、及び、図７Ｂは、編集したＴ細胞を示す）で、ＣＤ５編集Ｔ細胞は、非発現細胞でのＣＡＲ発現と比較して、少なくとも２倍のＣＡＲ発現の増加を実証する（図７Ｃ）。加えて、１、１０、及び、２０のＭＯＩで、ＣＤ５  ＶＬＲ  ＣＡＲ、及び、ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲレンチウイルスベクターを形質導入した未編集、及び、ＣＤ５編集Ｔ細胞から全細胞溶解物を単離した。ＣＡＲタンパク質の発現を、抗ＣＤ３ゼータ抗体を使用したウェスタンブロットで測定し、未編集Ｔ細胞でのＣＡＲタンパク質発現と比較して、ＣＤ５編集Ｔ細胞でのＣＡＲタンパク質発現が大きかったことを確認した。内因性ＣＤ３ゼータを１８ｋＤａで検出し、そして、当該ＣＡＲ構築物でのＣＤ３ゼータは、ＣＤ５  ＶＬＲ  ＣＡＲ、及び、ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲにおいて、それぞれ、４８及び５５ｋＤａである（図８Ａ及び８Ｂ）。内因性ＣＤ３ゼータに対するバンドの強度の定量は、未編集ジャーカットＴ細胞でのタンパク質発現と比較して、すべてのＭＯＩで、ＣＤ５編集Ｔ細胞におけるＶＬＲ−ＣＡＲ、及び、ｓｃＦｖ−ＣＡＲタンパク質発現の増大を示す（図８Ｃ）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020525537.tif 000026