(57)【要約】  本発明は、健康評価用マーカー及びその応用に関し、医学検査の分野に属する。哺乳動物の健康度を検出する試薬の製造における、マーカーを同定する試薬の用途は、（１）被験試料から、８−ｏｘｏＧｓｎのレベルであるマーカーを検出することと、（２）前記マーカーを参照と比較することで、参照との前記マーカーの差異を用いて被験者の健康状態を評価することと、を含む。本発明は、簡単な臨床身体検査法を採用して、被験者に対して全面的な健康状態評価を行い、人々の健康状態及び生活規律をタイムリーかつ迅速に把握することができ、ヘルスサービス管理の分野では、半健康の検出や早期警告、疾患の治療効果の観察、精神情動状態の検出などにおいて、一般的な医学的検出方法に比べて顕著な優位性を有する。
2020535428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の健康度を検出する試薬の製造における、マーカーを同定する試薬の応用であって、
（１）被験試料から、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）濃度の比のレベルであるマーカーを検出することと、
（２）前記マーカーを参照と比較することで、参照との前記マーカーの差異を用いて被験者の健康状態を評価することと、を含む応用。
【請求項２】
前記試料は体液であることを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項３】
前記体液は、末梢血、血清、血漿、滑液、房水、乳汁、精液、前立腺液、汗、涙、胸水、腹水、心膜液、乳糜、胆汁、間質液、経血、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、膵液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、臍帯血、尿、脳脊髄液、唾液、リンパ液又は排泄物を含むことを特徴とする、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記体液は、尿、末梢血、血清、血漿であることを特徴とする、請求項３に記載の応用。
【請求項５】
前記参照は、
（１）健康な哺乳動物の８−ｏｘｏＧｓｎのレベルの範囲値、
（２）健康な哺乳動物の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度との比の範囲値のいずれか１つ又は２つであることを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項６】
前記範囲値は、９５パーセンタイルであることを特徴とする、請求項５に記載の応用。
【請求項７】
前記哺乳動物は、ヒトであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の応用。
【請求項８】
哺乳動物の健康度を評価する製品の製造における、８−ｏｘｏＧｓｎを検出する試薬の応用。
【請求項９】
前記８−ｏｘｏＧｓｎを検出する試薬は、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度を測定する試薬であることを特徴とする、請求項８に記載の応用。
【請求項１０】
哺乳動物の健康度を評価する製品の製造における、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度及びクレアチニン濃度を検出する試薬の応用。
【請求項１１】
前記哺乳動物は、ヒトであり、前記製品は、キットであることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の応用。
【請求項１２】
８−ｏｘｏＧｓｎ濃度を検出する試薬と、クレアチニン濃度を検出する試薬とを含むことを特徴とする、哺乳動物の健康状態を検出するキット。
【請求項１３】
前記哺乳動物は、ヒトであることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
８−ｏｘｏＧｓｎ標準品、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、メタノール、１〜２０００ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎ、及び１〜２０００ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎで構成され、好ましくは、同位体内部標準物質の濃度が１００〜８００ｐｇ／μＬであることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記１０ｍＭ酢酸アンモニウムとメタノールは、７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液であり、混合後の溶液のｐＨ値が３．５〜４．０であることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康評価用マーカー及びその応用に関し、より具体的には、尿中の遊離８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅの比を検出して臨床上の新たな健康評価指標とする（両者の比を評価指標とする）ことに関し、医学検査の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
生活様式、環境要因及び疾患は、刻々と人々の健康に影響を及ぼす。運動不足のため、心脳血管、胃腸系、免疫系及び頸椎などの疾患を引き起こし、長時間パソコンを使っていると、人々の視力低下、関節損傷、放射線損傷、頭痛及び肩痛、自律神経失調症、鬱病、動脈硬化性精神障害などを引き起こし、水汚染、空気汚染、自動車排ガス汚染などによる人体への害は言うまでもなく、食品添加物、抗生物質などの長期使用も身体の健康に悪影響を与える。
【０００３】
現在、個人健康状態の評価は、ほぼ医学検査範囲に限られ、被験者は、一般的に、全体的な健康状態評価結果を得るために複数の医学的検査を行うことが必要であり、時間がかかり、検出費用が高いなどの欠点があり、大量の試料の迅速診断と全体的な健康状態の評価にはあまり適していない。また、有機体が病理学的に変化していない「半健康」状態、例えば疲労、脱力感、免疫力や抵抗力低下、風邪に罹りやすい、運動中の息切れ、発汗、腰や足の痛み、食欲不振など、及び心理的な倦怠感、低気分、反応の鈍化、不眠、多夢、不注意、記憶力減退、不快感、不安、恐怖を感じやすいなどの状況について、それが不健康状態にあるかどうかを示す臨床的検出指標がない。
【０００４】
最近の研究では、ＲＮＡの酸化的損傷が老化、糖尿病などの病変において重要な役割を果たす新しい病原性メカニズムであり、ますます注目されていることが示される。８−オキソグアノシン（８−ｏｘｏ−Ｇｓｎ）は、ＲＮＡ中のグアノシンの酸化物であり、バイオマーカーとして体内のＲＮＡの酸化的損傷のレベルを示すことができ、他の組織及び体液検体に比べて、尿中の８−ｏｘｏ−Ｇｓｎは酸化的損傷後により急激に変化し、より検出されやすい。中国特許ＺＬ２０１１１０３０９５３１号明細書は、哺乳動物の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ（８−ｏｘｏ−Ｇｓｎ）の検出方法を開示し、この発明のキット、検出システム及び検出方法は、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度を迅速かつ容易に測定することができ、特異性が高く、感度が高く、結果が正確で信頼できる。この発明の８−ｏｘｏＧｓｎ検出技術は、現在、世界最先端の生体情報検出技術であり、人体の老化度の評価及び老化関連疾患の早期警告に成功裏に応用されている。
【０００５】
８−ｏｘｏＧｓｎは感度が高くそのレベルの上昇は様々な疾患に関連している。したがって、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎのレベルと疾患との間の関係を検討することは非常に必要である。現在、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度の比の範囲値と健康状態との関連性の報告がなく、既存の研究では８−ｏｘｏＧｓｎが健康マーカーとして使用できることが示されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、新規な哺乳動物（ヒトを含むがこれに限定されない）の健康状態マーカーとこのマーカーを検出する試薬を提供することである。
【０００７】
本出願人は、哺乳動物（ヒトを含むがこれに限定されない）の体液における８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度の比（８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）とこの哺乳動物の健康状態との間に検出かつ評価可能な対応関係を有し、この比が哺乳動物の健康状態の新規なマーカーとすることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の技術手段を採用する。
【０００９】
本発明の第１の態様では、
（１）被験試料から、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）濃度の比のレベルであるマーカーを検出することと、
（２）前記マーカーを参照と比較することで、参照との前記マーカーの差異を用いて被験者の健康状態を評価することと、を含む、哺乳動物の健康度を検出する試薬の製造における、マーカーを同定する試薬の用途を提供する。
【００１０】
前記試料は体液である。
【００１１】
前記体液は、末梢血、血清、血漿、滑液、房水、乳汁、精液、前立腺液、汗、涙、胸水、腹水、心膜液、乳糜、胆汁、間質液、経血、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、膵液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、臍帯血、尿、脳脊髄液、唾液、リンパ液又は排泄物を含む。
【００１２】
前記体液は、好ましくは、尿、末梢血、血清、血漿である。最も好ましくは、哺乳動物の尿である。
【００１３】
血漿試料について、まずアセトニトリルでタンパク質を沈殿させ、窒素ガスで上澄み液を吹付けて乾燥させ、移動相で再溶解し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで８−ｏｘｏＧｓｎの量を検出する。８−ｏｘｏＧｓｎ濃度は、直接的に８−ｏｘｏＧｓｎ標準曲線により得られる。
【００１４】
血液試料について、より良好な分離効果を得るために、一般的にＨＰＬＣの溶出液を用いて勾配溶出を行う。しかし、これは必然的に検出の複雑さを増す。また、試料の処理もより複雑になり、検出時間の延長と費用の増加を招く。したがって、検出の利便性、経済性の観点から、尿試料が最も好ましい。
【００１５】
前記８−ｏｘｏＧｓｎのレベルは、試料の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度との比である。尿試料に対して同時にクレアチニン濃度を検出することにより、飲水量による尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度への影響を補正する。
【００１６】
前記参照は、
（１）健康な哺乳動物の８−ｏｘｏＧｓｎのレベルの範囲値、
（２）健康な哺乳動物の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度との比の範囲値のいずれか１つ又は２つである。
【００１７】
前記範囲値は、９５パーセンタイルである。健康な被験者の０〜９５パーセンタイルを健康者参照区間とする。
【００１８】
本発明に係る哺乳動物は、好ましくは、ヒトであり、他の哺乳動物、例えば猫、犬、馬などであってもよい。
【００１９】
哺乳動物の体内８−ｏｘｏＧｓｎを測定する方法は、従来技術に属する。好ましい実施形態では、まず８−ｏｘｏＧｓｎ標準品を用いて標準曲線を作成し、こうすれば試料中の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度をより迅速かつ正確に測定することができる。標準曲線の濃度範囲は、被験試料によって調整することができる。
【００２０】
より好ましい実施形態では、被験試料に内部標準物質を添加して、測定器の誤差を補正する。内部標準物質は、いずれか１つ又は複数の元素が同位体で置換された８−ｏｘｏＧｓｎであってよく、好ましくは、Ｎ及びＣのうちの少なくとも一つがそれに対応する同位体で置換される。例えば、１４Ｎが１５Ｎで置換されてもよく、１２Ｃが１３Ｃで置換されてもよい。１つの元素のみが置換されてもよく、２つ以上の元素が置換されてもよい。１回の検出では、内部標準の濃度は、各試料で同じである。
【００２１】
本発明の第２の態様では、哺乳動物の健康度を評価する製品（キットを含むがそれに限定されない）の製造における、８−ｏｘｏＧｓｎを検出する試薬の応用を提供する。
【００２２】
前記８−ｏｘｏＧｓｎを検出する試薬は、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度を測定する試薬である。
【００２３】
前記哺乳動物は、ヒトである。
【００２４】
本発明の第３の態様では、哺乳動物の健康度を評価する製品（キットを含むがそれに限定されない）の製造における、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度及びクレアチニン濃度を検出する試薬の応用を提供する。
【００２５】
このキットは、被験者試料中の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度を測定し、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度との比を算出し、この比を参照と比較することで、被験試料由来者の健康状態を評価する。
【００２６】
前記参照は、健康な哺乳動物の８−ｏｘｏＧｓｎのレベルの範囲値（９５パーセンタイル）である。
【００２７】
前記参照は、健康な哺乳動物の８−ｏｘｏＧｓｎ濃度とクレアチニン濃度との比の範囲値（９５パーセンタイル）である。
【００２８】
本発明の第４の様態では、８−ｏｘｏＧｓｎ濃度を検出する試薬と、クレアチニン濃度を検出する試薬とを含む、哺乳動物の健康状態を検出するキットを提供する。
【００２９】
前記哺乳動物は、ヒトである。
【００３０】
キットは、８−ｏｘｏＧｓｎ標準品、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、メタノール、１〜２０００ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎ、及び１〜２０００ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎで構成され、好ましくは、同位体内部標準物質の濃度が１００〜８００ｐｇ／μＬである。
【００３１】
前記１０ｍＭ酢酸アンモニウムとメタノールは、７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液であり、混合後の溶液のｐＨ値が３．５〜４．０である。つまり、本キット内の作動溶液は、メタノールと１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を体積比７：３の割合で調製して得られる。
【００３２】
本発明者は、同位体希釈高速液体クロマトグラフィー技術（方法は、中国特許ＺＬ２０１１１０３０９５３１．５号明細書「哺乳動物の老化度を評価するキット、検出システム及び８−ｏｘｏＧｓｎの応用」と同じである）を用いて中国北京健康者集団の尿標本中の８−ｏｘｏＧｓｎの参照区間を作成し、詳細は図１及び表１に示すとおりであり、大量の試料の研究により、２０〜７４歳の健康者は、男女を問わず、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量と年齢との間に正の相関があり、これを加齢指標とすることができることが分かる。
【００３３】
本発明者は、同様の方法を用いて、７つの疾患（エイズ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒、肝癌、冠状動脈性心臓病、急性冠動脈症候群）の患者の尿標本中の８−ｏｘｏＧｓｎを測定し、７つの疾患の測定結果と上記健康者の８−ｏｘｏＧｓｎの参照区間とを比較検討したことにより、各疾患患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量が健康者に比べて明らかに増加し、詳細は表２及び図２に示すとおりであり、各疾患の少なくとも６０％以上の患者の値が健康者の区間よりも高いことが分かった。特に細菌やウイルス感染性疾患、例えば梅毒、エイズ、Ｂ型肝炎などの場合、健康者の区間よりも高い人数の割合が９０％程度であり、その次は慢性疾患であり、８−ｏｘｏＧｓｎの増加と疾患との関連性が証明された。
【００３４】
さらに、本発明者は、２０〜３０歳の健康なボランティアを８人募集し、各人から２ヶ月以内に尿を２５回収集し、尿カップで収集した直後に、５ｍｌの尿チューブに移し、−８０℃の冷蔵庫に保管し、表３に示す詳細のように、対応する記録マニュアルにその日の体調、例えば激しい運動、身体的不快感、不眠、重労働などの要因があるかどうかを記録し、それにより健康者の８−ｏｘｏＧｓｎレベルの上昇を引き起こす特定の影響要因を選別した。各人の尿試料の最終検出結果を対応する健康者参照区間の９５パーセンタイル上限と比較することにより、健康者の区間上限よりも高かった時点の多くには、その日の特別な状態、例えば病気、過度の疲労、夜更かし、激しい運動などが対応して記録されたことが分かる。以上の結果は、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎレベルの高感度を十分に反映しており、健康者が不快な症状、特に病気状態さえ感じれば、そのレベルが対応して増加し、人の健康状態をある程度反映することができる。また、今回の実験により、常に運動する人の体内のＲＮＡ酸化レベルが運動していない人のＲＮＡ酸化レベルよりも明らかに低かったことが分かり、例えば、図３の番号２０１と２０２の健康者は、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎレベルが基本的に健康者参照区間の９５パーセンタイル上限以下に維持された。
【００３５】
また、本発明者は、さらに慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者の血漿と尿中の核酸酸化レベルを検出し、表４から、ＲＮＡ酸化レベルと疾患の重症度との間に顕著な正の相関があり、血漿及び尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ比の増加が末期の腎臓病の新しい評価指標になり得ることが分かる。
【００３６】
本発明は、大量の実験研究により、被験者における８−ｏｘｏＧｓｎの異なる年齢層での健康状態の値区間、心理的ストレス状態、身体の半健康状態、慢性疾患状態、急性疾患状態、癌性疾患状態、ウイルス性疾患状態などの異なる健康状態でのデータが取得された。本発明では、これらのデータを科学的かつ詳細に分析研究することにより、８−ｏｘｏＧｓｎと人の全体的な健康状態との関連性が初めて発見され、８−ｏｘｏＧｓｎの値と健康状態との間に正の相関があり、人の８−ｏｘｏＧｓｎの値を測定するだけで、被験者の健康状態に対して価値のある評価を与えることができる。以上の研究結果は、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎが、有機体の酸化ストレス及び老化を評価する有用な指標だけでなく、新しい臨床健康評価指標でもあることを示した。
【００３７】
本発明は、利用可能性が広く、疾患の検出と早期警告、学生、部隊、特殊作業人間集団の心理的評価、腫瘍患者の罹患状況の検出の支援などに応用でき、疫学調査、特定の地域又は特定の年齢層の人々の健康診断、人間集団の健康状態に対する外的要因の影響の評価、健康状態を改善するために生活様式を変え、医療サービスを受けるためのガイダンスに特に適する。本発明は、簡単な臨床身体検査法を採用して、被験者に対して全面的な健康状態評価を行い、人々の健康状態及び生活規律をタイムリーかつ迅速に把握することができ、ヘルスサービス管理の分野では、半健康の検出や早期警告、疾患の治療効果の観察、精神情動状態の検出などにおいて、一般的な医学的検出方法に比べて顕著な優位性を有する。
【００３８】
以下、実施例及び図面を参照しながら本発明を詳細に説明するが、それらが本発明を限定するものではなく、本発明の開示内容に従って行った本分野の均等置換は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】クレアチニンで補正された、２０〜７４歳の健康な男女の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅの値である。
【図２Ａ】男性エイズ患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｂ】男性Ｂ型肝炎患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｃ】女性Ｂ型肝炎患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｄ】男性Ｃ型肝炎患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｅ】女性Ｃ型肝炎患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｆ】男性梅毒患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｇ】女性梅毒患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｈ】男性ＡＣＳ患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｉ】女性ＡＣＳ患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｊ】男性冠状動脈性心臓病患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｋ】女性冠状動脈性心臓病患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｌ】男性肝癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｍ】女性肝癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｎ】男性腎臓癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｏ】女性腎臓癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｐ】男性膀胱癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｑ】女性膀胱癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図２Ｒ】男性前立腺癌患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【図３Ａ−３Ｈ】８人の健康者から２ヶ月間に２５回収集した尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ／ｃｒｅレベルと健康者参照区間の９５パーセンタイル上限との比較である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
実施例１：２０〜７４歳の健康者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量の測定
一、試薬及び方法：
（一）試料：健康者の尿検体５１７９点、そのうち男性２５９１例、女性２５８８例。
【００４１】
（二）試薬及び機器：
試薬：８−オキソグアノシン（純度＞９８％）は米国のＡＬＥＸＩＳ社から購入され、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のシグマアルドリッチ社から購入され、［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−オキソグアノシン（純度＞９８％）はカナダのＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入され、［１５Ｎ５］８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、クレアチニン検出キットは中国の北京九強生物技術公司から購入され、メタノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、イソプロパノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、ギ酸（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、酢酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）は米国のサーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入される。
【００４２】
カラム：アジレントＳＢ−Ａｑ、３．０×１００ｍｍ、１．８μｍ
機器：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いられる機器はアジレント液相（１２９０）タンデム質量分析計（６４９０）である。
【００４３】
（三）測定方法：
随時尿の中間尿を３ｍｌ収集し、３つの１．５ｍｌのＥＰチューブに均等に分け、測定するまで−８０℃で、冷蔵庫で保存した。尿検体の処理：
１．尿検体を解凍し、４℃で、７５００ｇで５ｍｉｎ遠心した。
【００４４】
２．２００μＬの上澄み液を１．５ｍｌの高圧滅菌遠心管に吸引した。２００μＬの作動液Ａ［７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＰＨ＝３．７）］を添加し、使用した作動液は尿中に存在するタンパク質を沈殿させるためである。
【００４５】
３．さらに濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎと４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎをそれぞれ１０μＬ添加し、ｖｏｔｅｘで２ｍｉｎ均一に混合し、使用した内部標準物質は測定器の誤差を補正するためである。
【００４６】
４．３７℃の生化学インキュベーター内に１０ｍｉｎ置いた後、４℃で、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、このステップにより沈殿と結合した８−ｏｘｏＧを放出させた。
【００４７】
５．１００μＬの生成物を使い捨て内挿管に入れ、バイアル瓶に装入し、質量スペクトルによるシーケンシングを行った。
【００４８】
６．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより標準品８−ｏｘｏＧを検出し、８−ｏｘｏＧの濃度−強度標準曲線を作成した。また、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより試料中の８−ｏｘｏＧの強度を検出し、標準曲線を参照して試料中の８−ｏｘｏＧの濃度を算出した。
【００４９】
７．試料中のクレアチニン濃度を日立生化学検出機器で測定し、これは、尿の異なる希釈程度による結果への影響を補正するために用いられる。
【００５０】
二、結果
図１及び表１（参照群におけるクレアチニン補正後の８−ｏｘｏＧｓｎの平均値とパーセンタイル）に示すように、大量の試料の研究により、２０〜７４歳の健康者は、男女を問わず、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量と年齢との間に正の相関があり、これを加齢指標とすることができることが分かる。健康者を疾患患者に比べると、疾患患者の８−ｏｘｏＧｓｎレベルは健康者の８−ｏｘｏＧｓｎレベルよりも高く、この高い値がより有意である。したがって、各年齢層の０〜９５パーセンタイルを健康者参照区間とする（各年齢層の０〜９５％参照区間は表１を参照）。
【００５１】
実施例２：７つの疾患患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量の測定
一、試薬及び方法：
（一）試料：合計として、エイズ患者の尿検体１１１点、Ｂ型肝炎患者の尿検体１１５点、Ｃ型肝炎患者の尿検体１０４点、梅毒患者の尿検体７９点、肝癌患者の尿検体９０点、冠状動脈性心臓病患者の尿検体１１９点、ＡＣＳ患者の尿検体９８例を収集した。
【００５２】
（二）試薬及び機器：
試薬：８−オキソグアノシン（純度＞９８％）は米国のＡＬＥＸＩＳ社から購入され、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のシグマアルドリッチ社から購入され、［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−オキソグアノシン（純度＞９８％）はカナダのＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入され、［１５Ｎ５］８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、クレアチニン検出キットは中国の北京九強生物技術公司から購入され、メタノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、イソプロパノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、ギ酸（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、酢酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）は米国のサーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入される。
【００５３】
カラム：アジレントＳＢ−Ａｑ、３．０×１００ｍｍ、１．８μｍ
機器：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いられる機器はアジレント液相（１２９０）タンデム質量分析計（６４９０）である。
【００５４】
（三）測定方法：
随時尿の中間尿を３ｍｌ収集し、３つの１．５ｍｌのＥＰチューブに均等に分け、測定するまで−８０℃で、冷蔵庫で保存した。尿検体の処理：
１．尿検体を解凍し、４℃で、７５００ｇで５ｍｉｎ遠心した。
【００５５】
２．２００μＬの上澄み液を１．５ｍｌの高圧滅菌遠心管に吸引した。２００μＬの作動液Ａ［７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＰＨ＝３．７）］を添加し、使用した作動液は尿中に存在するタンパク質を沈殿させるためである。
【００５６】
３．さらに濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎと濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎをそれぞれ１０μＬ添加し、ｖｏｔｅｘで２ｍｉｎ均一に混合し、使用した内部標準物質は測定器の誤差を補正するためである。
【００５７】
４．３７℃の生化学インキュベーター内に１０ｍｉｎ置いた後、４℃で、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、このステップにより沈殿と結合した８−ｏｘｏＧを放出させた。
【００５８】
５．１００μＬの生成物を使い捨て内挿管に入れ、バイアル瓶に装入し、質量スペクトルによるシーケンシングを行った。
【００５９】
６．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより標準品８−ｏｘｏＧを検出し、８−ｏｘｏＧの濃度−強度標準曲線を作成した。また、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより試料中の８−ｏｘｏＧの強度を検出し、標準曲線を参照して試料中の８−ｏｘｏＧの濃度を算出した。
【００６０】
７．試料中のクレアチニン濃度を日立生化学検出機器で測定し、これは、尿の異なる希釈程度による結果への影響を補正するために用いられる。
【００６１】
二、結果
結果は図２及び表２（健康者参照区間の９５パーセンタイルよりも高い様々な疾患の人数及び百分率）に示すとおりであり、７つの疾患（エイズ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒、肝癌、冠状動脈性心臓病、急性冠動脈症候群）の患者の尿標本中の８−ｏｘｏＧｓｎを測定し、７つの疾患の測定結果と上記健康者の８−ｏｘｏＧｓｎの参照区間とを比較検討したことにより、各疾患患者の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量が健康者に比べて明らかに増加し、詳細について、表２及び図２に示すとおりであり、各疾患の少なくとも６０％以上の患者の値が健康者の区間よりも高かったことが分かる。特に細菌やウイルス感染性疾患、例えば梅毒、エイズ、Ｂ型肝炎などの、健康者の区間よりも高かった人数割合が９０％程度であり、慢性疾患がこれに次ぎ、８−ｏｘｏＧｓｎの増加と疾患との関連性が証明された。
【００６２】
実施例３：健康なボランティアの尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ含有量の測定
一、試薬及び方法：
（一）試料：合計８人の健康なボランティアの尿を収集し、一人当たり２５回の尿を収集した。
【００６３】
（二）試薬及び機器：
試薬：８−オキソグアノシン（純度＞９８％）は米国のＡＬＥＸＩＳ社から購入され、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のシグマアルドリッチ社から購入され、［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−オキソグアノシン（純度＞９８％）はカナダのＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入され、［１５Ｎ５］８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、クレアチニン検出キットは中国の北京九強生物技術公司から購入され、メタノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、イソプロパノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、ギ酸（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、酢酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）は米国のサーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入される。
【００６４】
カラム：アジレントＳＢ−Ａｑ、３．０×１００ｍｍ、１．８μｍ
機器：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いられる機器はアジレント液相（１２９０）タンデム質量分析計（６４９０）である。
【００６５】
（三）測定方法：
随時尿の中間尿を３ｍｌ収集し、３つの１．５ｍｌのＥＰチューブに均等に分け、測定するまで−８０℃で、冷蔵庫で保存した。尿検体の処理：
１．尿検体を解凍し、４℃で、７５００ｇで５ｍｉｎ遠心した。
【００６６】
２．２００μＬの上澄み液を１．５ｍｌの高圧滅菌遠心管に吸引した。２００μＬの作動液Ａ［７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＰＨ＝３．７）］を添加し、使用した作動液は尿中に存在するタンパク質を沈殿させるためである。
【００６７】
３．さらに濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎと濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎをそれぞれ１０μＬ添加し、ｖｏｔｅｘで２ｍｉｎ均一に混合し、使用した内部標準物質は測定器の誤差を補正するためである。
【００６８】
４．３７℃の生化学インキュベーター内に１０ｍｉｎ置いた後、４℃で、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、このステップにより沈殿と結合した８−ｏｘｏＧを放出させた。
【００６９】
５．１００μＬの生成物を使い捨て内挿管に入れ、バイアル瓶に装入し、質量スペクトルによるシーケンシングを行った。
【００７０】
６．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより標準品８−ｏｘｏＧを検出し、８−ｏｘｏＧの濃度−強度標準曲線を作成した。また、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより試料中の８−ｏｘｏＧの強度を検出し、標準曲線を参照して試料中の８−ｏｘｏＧの濃度を算出した。
【００７１】
７．試料中のクレアチニン濃度を日立生化学検出機器で測定し、これは、尿の異なる希釈程度による結果への影響を補正するために用いられる。
【００７２】
二、結果
結果は図３及び表３（８人の健康なボランティアの１人当たり２５回の尿の健康評価日の身体的不快感の記録）に示すとおりであり、各人の尿試料の最終検出結果を対応する健康者参照区間の９５パーセンタイル上限と比較することにより、健康者の区間上限よりも高かった時点の多くには、その日の特別な状態、例えば病気、過度の疲労、夜更かし、激しい運動などが対応して記録されたことが分かる。以上の結果は、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎレベルの高感度を十分に反映しており、健康者が不快な症状、特に病気状態さえ感じれば、そのレベルが対応して増加し、人の健康状態をある程度反映することができる。また、今回の実験により、常に運動する人の体内のＲＮＡ酸化レベルが運動していない人のＲＮＡ酸化レベルよりも明らかに低かったことが分かり、例えば、図３Ａ及び図３Ｂの番号２０１と２０２の健康者は、尿中の８−ｏｘｏＧｓｎレベルが基本的に健康者参照区間の９５パーセンタイル上限以下に維持された。
【００７３】
実施例４：
一、試薬及び方法：
（一）被験者集団及び試料量：３０例の慢性腎臓病ステージ１患者、３０例の慢性腎臓病ステージ２患者、３１例の慢性腎臓病ステージ３患者、３０例の慢性腎臓病ステージ４患者、２５例の慢性腎臓病ステージ５患者、合計１４６例の慢性腎臓病患者の血漿及び尿を収集した。
【００７４】
（二）試薬及び機器は以下を含む：
試薬：８−オキソグアノシン（純度＞９８％）は米国のＡＬＥＸＩＳ社から購入され、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のシグマアルドリッチ社から購入され、［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−オキソグアノシン（純度＞９８％）はカナダのＴｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入され、［１５Ｎ５］８−ヒドロキシデオキシグアノシン（純度＞９８％）は米国のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、クレアチニン検出キットは中国の北京九強生物技術公司から購入され、メタノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、イソプロパノール（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、ギ酸（ＨＰＬＣグレード）はドイツのメルク社から購入され、酢酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）は米国のサーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入される。
【００７５】
カラム：アジレントＳＢ−Ａｑ、３．０×１００ｍｍ、１．８μｍ
機器：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いられる機器はアジレント液相（１２９０）タンデム質量分析計（６４９０）である。
【００７６】
（三）検出方法：尿及び／又は血漿試料を選択して検出することができる。
【００７７】
尿検体の検出：随時尿の中間尿を３ｍｌ収集し、３つの１．５ｍｌのＥＰチューブに均等に分け、測定するまで−８０℃で、冷蔵庫で保存した。尿検体の処理：
１．尿検体を解凍し、４℃で、７５００ｇで５ｍｉｎ遠心した。
【００７８】
２．２００μＬの上澄み液を１．５ｍｌの高圧滅菌遠心管に吸引した。２００μＬの作動液Ａ［７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＰＨ＝３．７）］を添加し、使用した作動液は尿中に存在するタンパク質を沈殿させるためである。
【００７９】
３．さらに濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎと濃度４８０ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎをそれぞれ１０μＬ添加し、ｖｏｔｅｘで２ｍｉｎ均一に混合し、使用した内部標準物質は測定器の誤差を補正するためである。
【００８０】
４．３７℃の生化学インキュベーター内に１０ｍｉｎ置いた後、４℃で、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、このステップにより沈殿と結合した８−ｏｘｏＧを放出させた。
【００８１】
５．１００μＬの生成物を使い捨て内挿管に入れ、バイアル瓶に装入し、質量スペクトル検出によるシーケンシングを行った。
【００８２】
６．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより標準品８−ｏｘｏＧを検出し、８−ｏｘｏＧの濃度−強度標準曲線を作成した。また、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより試料中の８−ｏｘｏＧの強度を検出し、標準曲線を参照して試料中の８−ｏｘｏＧの濃度を算出した。
【００８３】
７．試料中のクレアチニン濃度を日立生化学検出機器で測定し、これは、尿の異なる希釈程度による結果への影響を補正するために用いられる。
【００８４】
血漿試料の測定：患者の血漿を３ｍｌ収集して１．５ｍｌのＥＰチューブに均等に分け、測定するまで−８０℃で、冷蔵庫で保存した。血漿検体の処理：
１．血漿を−８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上で解凍した。均一に混合し、４℃で、１４０００ｇで１０ｍｉｎ遠心した。
【００８５】
２．３００μＬの血漿に２種類の３００ｐｇ／μＬの内部標準物質をそれぞれ１０μＬ添加した。使用した内部標準物質は測定器の誤差を補正するためである。
【００８６】
３．９００μＬの３倍体積のアセトニトリルを用いて均一に混合し、１ｍｉｎボルテックスにかけた。アセトニトリルを用いて血漿中に存在するタンパク質を沈殿させる。
【００８７】
４．４℃で、１４０００ｇで２０ｍｉｎ遠心し、定量体積１ｍｌの上澄み液を収集し、窒素ガスで吹付けて乾燥させた。
【００８８】
５．１００μＬの流動相で再溶解し、４℃で、１２０００ｇで２０ｍｉｎ遠心した。
【００８９】
６．８５μＬの生成物を使い捨て内挿管に入れ、バイアル瓶に装入し、質量スペクトル検出によるシーケンシングを行った。
【００９０】
二、結果
結果は表４（慢性腎臓病患者の血漿、尿中のクレアチニン及び核酸酸化レベル）に示すとおりであり、表４から、ＲＮＡ酸化レベルと疾患の重症度との間に正の相関があり、血漿及び尿中の８−ｏｘｏＧｓｎ比の増加が末期の腎臓病の新しい評価指標である可能性があることが分かる。
【００９１】
実施例５：マーカー８−ｏｘｏＧｓｎを同定する試薬及びその応用
一、キットの構成
１．８−ｏｘｏＧｓｎの濃度−強度標準曲線を作成するための８−ｏｘｏＧｓｎ標準品。
【００９２】
２．作動液［７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＰＨ＝３．７）］を調製するための１０ｍＭ酢酸アンモニウム及び純メタノール、又は調製された７０％のメタノール＋３０％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ３．５〜４．０）。つまり、本キット内の作動溶液は、メタノールと１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を体積比７：３の割合で調製して得られる。
【００９３】
３．５００ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１３Ｃ，１５Ｎ２］８−ｏｘｏ−ｄＧｓｎ及び５００ｐｇ／μＬの同位体内部標準物質［１５Ｎ５］８−ｏｘｏＧｓｎ。
【００９４】
二、健康状態を測定する応用
１．被検試料から、８−ｏｘｏＧｓｎのレベルであるマーカーを検出する。
【００９５】
２．前記マーカーを参照（実施例１で得られた健康者の９５パーセンタイル信頼区間値）と比較することで、参照との前記マーカーの差異を用いて被験者の健康状態を評価する。
【００９６】
３．以下、どのように前記マーカーを参照（実施例１で得られた健康者の９５パーセンタイル参照区間値）と比較することで被験者の健康状態を評価するかについて説明する。健康なボランティアから収集された２５回の尿の検出では、２５回の尿の検出により取得されたマーカーの濃度と所属する年齢層の健康者の９５パーセンタイル参照区間値の上限とを比較する。９５パーセンタイル参照区間よりも高ければ、被験者が高酸化ストレス状態にあることを表す。２５回の尿のマーカー濃度のほとんど又は全てが９５パーセンタイル参照区間よりも高ければ、被験者が持続的に高い酸化ストレスを伴った不健康状態にあり、介入が必要であることを表す。被験者の体調不良記録（表３を参照）により、外因性病原性要因と内因性病原性要因による人体の尿中の８−ｏｘｏＧｓｎレベルへの影響を明らかにし、８−ｏｘｏＧｓｎレベルの増加を引き起こす主な要因をスクリーニングし、人体の健康状態をリアルタイムで評価して、人体の半健康状態及び疾患への適時な早期警告の目的を達成する。
【００９７】
具体的な実施形態に基づいて本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、前述の内容を理解した後、これらの実施形態の変形、変更又は均等物を容易に想到し得ることを理解されたい。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲として評価されるべきである。
【００９８】
【表１】
2020535428.tif 000003
【００９９】
【表２】
2020535428.tif 000004
【０１００】
【表３】
2020535428.tif 000005
【０１０１】
【表４】
2020535428.tif 000006
【図１】
2020535428.tif 000007
【図２Ａ】
2020535428.tif 000008
【図２Ｂ】
2020535428.tif 000009
【図２Ｃ】
2020535428.tif 000010
【図２Ｄ】
2020535428.tif 000011
【図２Ｅ】
2020535428.tif 000012
【図２Ｆ】
2020535428.tif 000013
【図２Ｇ】
2020535428.tif 000014
【図２Ｈ】
2020535428.tif 000015
【図２Ｉ】
2020535428.tif 000016
【図２Ｊ】
2020535428.tif 000017
【図２Ｋ】
2020535428.tif 000018
【図２Ｌ】
2020535428.tif 000019
【図２Ｍ】
2020535428.tif 000020
【図２Ｎ】
2020535428.tif 000021
【図２Ｏ】
2020535428.tif 000022
【図２Ｐ】
2020535428.tif 000023
【図２Ｑ】
2020535428.tif 000024
【図２Ｒ】
2020535428.tif 000025
【図３Ａ】
2020535428.tif 000026
【図３Ｂ】
2020535428.tif 000027
【図３Ｃ】
2020535428.tif 000028
【図３Ｄ】
2020535428.tif 000029
【図３Ｅ】
2020535428.tif 000030
【図３Ｆ】
2020535428.tif 000031
【図３Ｇ】
2020535428.tif 000032
【図３Ｈ】
2020535428.tif 000033
【国際調査報告】
2020535428.tif 000034
2020535428.tif 000035
2020535428.tif 000036
2020535428.tif 000037
2020535428.tif 000038