(57)【要約】ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）水溶液と、（ｂ）（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャーを含む基質プローブとを含むピコ液滴を含む検出組成物を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ピコ液滴」は、０．０１４〜２．６ピコリットルの体積を有する液体の液滴を含む。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する少なくとも１つの個々のヌクレアーゼ分子を検出する方法であって、
（ａ）水性反応混合物を形成するために、少なくとも１つのヌクレアーゼ分子を含有することが疑われる水性試料に、少なくとも１つの検出組成物を接触させるステップであって、前記検出組成物が、水溶液と、磁気マイクロビーズに作動可能に連結した基質プローブとを含むピコ液滴を含み、前記基質プローブが、
（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および
（ｉｉｉ）前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャー
を含む、ステップと、
（ｂ）エマルジョン中でピコリットルスケールの液滴を形成するために、前記水性混合物を油中で乳化させるステップと、
（ｃ）前記ヌクレアーゼが存在すれば前記マイクロビーズに連結した前記基質プローブを消化するように、前記エマルジョン中で前記ピコリットルスケールの液滴をインキュベートするステップと、
（ｄ）前記マイクロビーズを回収するステップと、
（ｅ）前記マイクロビーズから発する蛍光を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
（ｆ）前記マイクロビーズの蛍光をフローサイトメトリーによって定量するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）前記マイクロビーズの蛍光を顕微鏡によって定量するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、血液、血清、血漿、便、皮膚抽出物、汗、尿、滑液、腹水、脳脊髄液、硝子体液、肺洗浄液、鼻抽出物、またはこれらのいずれかに由来する材料（例えば、それらから精製された１つもしくは複数のヌクレアーゼ分子）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料を十分に希釈して、ヌクレアーゼを有する一部のピコ液滴と、ヌクレアーゼを有しない一部の液滴とを生じる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記油が、鉱物油、ＡＢＩＬ  ＷＥ０９、およびＴｅｇａｓｏｆｔ  ＤＥＣの混合物である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベートするステップが、３０秒〜１０時間である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベートするステップが、４〜５時間である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）において、前記水性試料に、２つの検出組成物を接触させ、各々の検出組成物が異なる蛍光標識を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応混合物の体積がナノリットルより小さい、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、４〜１５ヌクレオチド長である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、４〜１１ヌクレオチド長である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ピリミジンを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチドの１つまたは複数が、化学修飾されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ピリミジンの１つまたは複数が、化学修飾されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピリミジンの１つまたは複数が、２’−Ｏ−メチル修飾されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ピリミジンの１つまたは複数が、２’−フルオロ修飾されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
プリンの１つまたは複数が、存在する場合、化学修飾されている、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記プリンの１つまたは複数が、２’−Ｏ−メチル修飾されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プリンの１つまたは複数が、２’−フルオロ修飾されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記フルオロフォアが、表１に記載のフルオロフォアからなる群から選択される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記フルオロフォアが、近赤外線範囲で発出を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記クエンチャーが、表２に記載のクエンチャーからなる群から選択される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、請求項１から１３または１５から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロビーズが、直径約０．５〜２０μｍである、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロビーズが、直径約２〜１０μｍである、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記マイクロビーズが連結部分を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記連結部分が、ストレプトアビジン分子、クリックケミストリーリンカー、アミノリンカー、またはチオールリンカーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記基質プローブが、ビオチン部分を含み、前記基質プローブが、ビオチン−ストレプトアビジン結合を通して前記磁気マイクロビーズに連結される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶液が、０．１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１〜２０ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝剤、０．１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２、もしくはＣａＣｌ２、または他の二価カチオンを含む緩衝剤、あるいは二価カチオンを有しないおよび／または二価カチオンのキレート剤（ＥＤＴＡ）を有する緩衝剤である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ピコ液滴が、０．０１４〜２．６ピコリットルである、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロビーズが、ピコ液滴あたり平均で１個未満のマイクロビーズを生じる濃度で存在する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）マグネシウムを欠如する、および／または二価カチオンキレート剤を含む水溶液と、
（ｂ）（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および
（ｉｉｉ）前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャー
を含む基質プローブと
を含むピコ液滴を含む検出組成物。
【請求項３７】
前記水溶液が、亜鉛、マンガン、および／またはカルシウムを含む、請求項３６に記載の検出組成物。
【請求項３８】
前記亜鉛、マンガン、および／またはカルシウムが、独立して１００μＭ〜２０ｍＭの濃度で存在する、請求項３７に記載の検出組成物。
【請求項３９】
前記二価カチオンキレート剤がＥＤＴＡである、請求項３６に記載の検出組成物。
【請求項４０】
前記ＥＤＴＡが、２０〜５０ｍＭの濃度で存在する、請求項３９に記載の検出組成物。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが、４〜１５ヌクレオチド長である、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドが、４〜１１ヌクレオチド長である、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ピリミジンを含む、請求項３６から４２のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドが、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１）である、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項４５】
前記ヌクレオチドの１つまたは複数が、化学修飾されている、請求項３６から４４のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項４６】
前記ピリミジンの１つまたは複数が、化学修飾されている、請求項３６から４５のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項４７】
前記ピリミジンの１つまたは複数が、２’−Ｏ−メチル修飾されている、請求項４６に記載の検出組成物。
【請求項４８】
前記ピリミジンの１つまたは複数が、２’−フルオロ修飾されている、請求項４６に記載の検出組成物。
【請求項４９】
プリンの１つまたは複数が、存在する場合、化学修飾されている、請求項３６から４８のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項５０】
前記プリンの１つまたは複数が、２’−Ｏ−メチル修飾されている、請求項４９に記載の検出組成物。
【請求項５１】
前記プリンの１つまたは複数が、２’−フルオロ修飾されている、請求項５０に記載の検出組成物。
【請求項５２】
前記フルオロフォアが、表１に記載のフルオロフォアからなる群から選択される、請求項３６から５１のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項５３】
前記フルオロフォアが、近赤外線範囲で発出を有する、請求項５２に記載の検出組成物。
【請求項５４】
前記クエンチャーが、表２に記載のクエンチャーからなる群から選択される、請求項３６から５３のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項３６から５４のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、請求項３６から４３または４５から５５のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項５７】
前記基質プローブが、磁気マイクロビーズに作動可能に連結している、請求項３６から５６のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項５８】
前記マイクロビーズが、直径約０．５〜２０μｍである、請求項５７に記載の検出組成物。
【請求項５９】
前記マイクロビーズが、直径約２〜１０μｍである、請求項５７に記載の検出組成物。
【請求項６０】
前記マイクロビーズが、連結部分を含む、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項６１】
前記連結部分が、ストレプトアビジン分子、クリックケミストリーリンカー、アミノリンカー、またはチオールリンカーである、請求項６０に記載の検出組成物。
【請求項６２】
前記基質プローブが、ビオチン部分を含み、前記基質プローブが、ビオチン−ストレプトアビジン結合を通して前記磁気マイクロビーズに連結される、請求項６１に記載の検出組成物。
【請求項６３】
前記溶液が、０．１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１〜２０ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝剤、０．１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２、もしくはＣａＣｌ２、または他の二価カチオンを含む緩衝剤である、請求項３６から６２のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項６４】
前記ピコ液滴が、０．０１４〜２．６ピコリットルである、請求項３６から６３のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項６５】
前記マイクロビーズが、ピコ液滴あたり平均で１個未満のマイクロビーズを生じる濃度で存在する、請求項５７から６４のいずれか一項に記載の検出組成物。
【請求項６６】
ｐＨが、８．５〜１０．５を含むその間である、請求項３６から６５のいずれか一項に記載の検出組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願
本出願は、２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６５，６７４号に基づく優先権を主張する。上記で引用した出願の全内容は、本明細書によって参考として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府助成研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた連邦政府助成金番号Ｒ０１  ＡＩ１０６７３８の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明にある一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
蛍光を消光させる化学部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プロセスおよび基底状態消光を含む多様な機構を通して作動する。ＦＲＥＴは、蛍光消光の最も一般的な機構の１つであり、蛍光ドナーの発出スペクトルがクエンチャーの吸収スペクトルとオーバーラップする場合、ならびにドナーおよびクエンチャーがフェルスター距離として公知の十分な距離内にある場合に起こり得る。クエンチャーによって吸収されたエネルギーは、次にクエンチャーの化学的性質に応じて多様な機構を通して放出され得る。捕獲されたエネルギーは、蛍光を通して、もしくは電荷移動および衝突機構を含む非蛍光機構を通して、またはそのような機構の組合せを通して放出され得る。クエンチャーが、非蛍光機構を通して、捕獲されたエネルギーを放出する場合、ＦＲＥＴは、蛍光ドナーの蛍光発出の低減として単純に観察される。
【０００４】
ＦＲＥＴは、最も一般的な消光機構であるが、消光をもたらす分子の方向性およびスペクトル一致のいずれかの組合せが、本発明の化合物による消光にとって有用な機構である。例えば、基底状態消光は、フルオロフォアおよびクエンチャーが、共に十分に近くに存在して基底状態複合体を形成する場合には、スペクトルオーバーラップの非存在下で起こり得る。
【０００５】
２つの色素のその空間的関係の変化としての相互作用に依存する消光プロセスは、ヌクレオチド配列および他の生物現象を検出および／または同定するために簡便に使用することができる。既に指摘したように、エネルギー移動プロセスは、蛍光ドナーの発出スペクトルとクエンチャーの吸収スペクトルとの間のオーバーラップを必要とする。必ずしも全ての潜在的クエンチャー／ドナー対を使用できるわけではないことから、このためにプローブの設計は複雑になる。例えば、約５００〜５５０ｎｍの波長範囲で光を極大吸収するクエンチャーＢＨＱ−１は、約５２０ｎｍの波長を有するフルオロフォアであるフルオレセインから発出した蛍光を消光することができる。これに対し、約６５０〜７００ｎｍの波長範囲で光を極大吸収するクエンチャーＢＨＱ−３は、フルオレセインの蛍光の消光に関してあまり有効ではないが、約６７０ｎｍで蛍光を発するフルオロフォアＣｙ５の蛍光の消光には非常に有効であろう。所定のプローブの精製が、取り付けられたクエンチャーの性質に応じて大きく異なり得ることから、多様なクエンチャーを使用することは、アッセイの開発を難しくする。
【０００６】
多くのクエンチャーが、蛍光を通してエネルギーを放射し、それらを含有するプローブのシグナル対ノイズ比およびそれらを利用するアッセイの感度を低減させる。そのようなクエンチャーの場合、類似の波長範囲で蛍光を発するフルオロフォアを使用することができない。これによって、そのようなクエンチャーと共に使用することができるフルオロフォアの数が制限され、それによって全て単一のクエンチャーを含有する別個のプローブにおける別個のフルオロフォアの使用に依存する多重アッセイのその有用性が制限される。
【０００７】
フェムトリットルまたはピコリットルスケールの区画（例えば、油中水エマルジョン）を使用する、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む酵素の単一分子検出は、以前に証明されている（Basu,  A.S.  (2017b).  Digital  Assays  Part  II:  Digital  Protein  and  Cell  Assays.  SLAS  Technol  22,  387-405を参照されたい）。これらの研究に使用した蛍光発生基質は、フルオレセインジ−β−ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）などの低分子である。
【０００８】
エンドヌクレアーゼ（例えば、ある特定のリボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼ）は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、これに対しエキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する。典型的には、制限部位、すなわち、制限酵素として公知のあるクラスのエンドヌクレアーゼの認識部位は、４〜６ヌクレオチド長の回文配列（例えば、ＴＧＧＡＴＣＣＡ、配列番号３）である。
【０００９】
細菌および古細菌において見出される制限酵素は、侵入するウイルスに対する防御機構を提供するために進化したと考えられている。細菌宿主内で、制限酵素は、制限と呼ばれるプロセスにおいて外来ＤＮＡを選択的に刻み、宿主ＤＮＡは、自身を制限酵素の活性から保護するために修飾酵素（メチラーゼ）によってメチル化される。集合的に、これらの２つのプロセスは、制限修飾系を形成する。ＤＮＡをカットするために、制限酵素は、ＤＮＡ二重らせんの各々の糖−リン酸骨格（すなわち、各々の鎖）を通して２つの切開部を作製する。
【００１０】
一部の細胞は、ＡおよびＴ１などの非特異的ＲＮアーゼの豊富な量を分泌する。ＲＮアーゼは、極めて一般的であることから、保護された環境に存在しないいかなるＲＮＡもその寿命は非常に短い。二本鎖ＤＮＡの非常に特異的な配列を切断する制限酵素と同様に、一本鎖ＲＮＡの特異的配列を認識して切断する多様なエンドリボヌクレアーゼが、最近分類されている。
【００１１】
ヌクレアーゼ反応速度論は非線形であることから、ヌクレアーゼ濃度を定量することは難しい。ヌクレアーゼ活性は経時的に低下し、非消化プローブからのバックグラウンドシグナルによってシグナルがマスクされる。加えて、曲線の誤差が定量を難しくする。したがって、標的分子の正確な定量を可能にする超高感度の分子検出技術が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Basu,  A.S.  (2017b).  Digital  Assays  Part  II:  Digital  Protein  and  Cell  Assays.  SLAS  Technol  22,  387-405
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
ある特定の実施形態では、本発明は、検量線を使用することなく、ヌクレアーゼ濃度を定量する手段を提供する。この方法の利点としては、単一のヌクレアーゼ分子の感度；連続的ではないバイナリ出力；より高濃度の消化された基質；シグナルの拡散を防止するビーズ；および検量線を生成する必要がないことが挙げられる。
【００１４】
（ａ）マグネシウムを欠如する、および／または二価カチオンキレート剤を含む水溶液と、（ｂ）（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャーを含む基質プローブとを含むピコ滴剤を含む検出組成物。
【００１５】
ある特定の実施形態では、本発明は、試料中に存在する少なくとも１つの個々のヌクレアーゼ分子を検出する方法であって、（ａ）水性反応混合物を形成するために、少なくとも１つのヌクレアーゼ分子を含有することが疑われる水性試料に、少なくとも１つの検出組成物を接触させるステップであって、検出組成物が、水溶液と、磁気マイクロビーズに作動可能に連結した基質プローブとを含むピコ滴剤を含み、基質プローブが（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドの酵素的切断時にマイクロビーズへのフルオロフォアの持続的連結をもたらす構成で、オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドの酵素的切断時にマイクロビーズからのその放出をもたらす構成で、オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャーを含む、ステップと、（ｂ）エマルジョン中でピコリットルスケールの液滴を形成するために、水性混合物を油中で乳化させてるステップと、（ｃ）ヌクレアーゼが存在すればマイクロビーズに連結した基質プローブを消化するように、エマルジョン中でピコリットルスケールの液滴をインキュベートするステップと、（ｄ）マイクロビーズを回収するステップと、（ｅ）マイクロビーズから発する蛍光を検出するステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、希薄なヌクレアーゼによるプローブ消化の図である。
【００１７】
【図２】図２は、デジタルヌクレアーゼ検出のためのオリゴヌクレオチドプローブの図である。ビオチンは、ストレプトアビジンビーズへのプローブのカップリングを可能にする。オリゴヌクレオチド部分が消化されると、クエンチャーが拡散し、蛍光ビーズをもたらす。
【００１８】
【図３】図３は、ストレプトアビジンカップリング磁気ビーズの図である。ある特定のビーズの容量は、ビーズ（ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））あたり約３５０，０００個のプローブ分子である。
【００１９】
【図４】図４は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介してプローブをビーズにカップリングする図である。
【００２０】
【図５】図５は、オリゴヌクレオチドの消化によって、ビーズからクエンチャーが放出され、それによって蛍光が大きく増加する図である（フルオロフォアはビーズに結合したままである）。
【００２１】
【図６−１】図６は、油中水エマルジョンを介した反応のコンパートメント化の図である。低濃度のビーズおよびヌクレアーゼは、液滴あたり１個またはそれより少ないビーズ、および液滴あたり１個またはそれより少ないヌクレアーゼ分子をもたらす。
【図６−２】図６は、油中水エマルジョンを介した反応のコンパートメント化の図である。低濃度のビーズおよびヌクレアーゼは、液滴あたり１個またはそれより少ないビーズ、および液滴あたり１個またはそれより少ないヌクレアーゼ分子をもたらす。
【００２２】
【図７−１】図７は、プローブが溶液中に存在する（すなわち、ビーズが存在しない）プローブ−ビーズアプローチの派生型の図である。
【図７−２】図７は、プローブが溶液中に存在する（すなわち、ビーズが存在しない）プローブ−ビーズアプローチの派生型の図である。
【００２３】
【図８】図８は、油中水エマルジョン中の水滴中で孤立させたプローブカップリングストレプトアビジンビーズ（直径１μｍ、矢印を参照されたい）の図である。
【００２４】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｃは、油中の水性緩衝剤の小さい体積の液滴中の、緩衝剤のみ（図９Ａ）、マイクロコッカスヌクレアーゼの高濃度のマイクロコッカスヌクレアーゼ（直径６μｍの液滴あたりヌクレアーゼ約１６３分子）（図９Ｂ）、または低濃度のマイクロコッカスヌクレアーゼ（直径６μｍの液滴あたりヌクレアーゼ約０．２分子）（図９Ｃ）と共にインキュベートした後の、デジタルヌクレアーゼプローブにビオチン／ストレプトアビジンを介してカップリングしたビーズの蛍光顕微鏡写真である。低濃度のヌクレアーゼと共にインキュベートしたビーズにおける活性化（中実矢印）および非活性化（中抜き矢印）ビーズの存在に注意されたい。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｃは、油中の水性緩衝剤の小さい体積の液滴中の、緩衝剤のみ（図９Ａ）、マイクロコッカスヌクレアーゼの高濃度のマイクロコッカスヌクレアーゼ（直径６μｍの液滴あたりヌクレアーゼ約１６３分子）（図９Ｂ）、または低濃度のマイクロコッカスヌクレアーゼ（直径６μｍの液滴あたりヌクレアーゼ約０．２分子）（図９Ｃ）と共にインキュベートした後の、デジタルヌクレアーゼプローブにビオチン／ストレプトアビジンを介してカップリングしたビーズの蛍光顕微鏡写真である。低濃度のヌクレアーゼと共にインキュベートしたビーズにおける活性化（中実矢印）および非活性化（中抜き矢印）ビーズの存在に注意されたい。
【００２５】
【図１０】図１０は、油中の水性緩衝剤の小さい体積の液滴中の、緩衝剤のみ（左）、高濃度（中央）、または低濃度（右）のマイクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベートした後のデジタルヌクレアーゼプローブにカップリングしたビーズのフローサイトメトリー蛍光測定を示す図である。低濃度ヌクレアーゼ試料（右）に活性化および非活性化ビーズが存在することに注意されたい。単一のビーズを単離するために、前方散乱および側方散乱に基づいて事象のゲートを設定した。
【００２６】
【図１１】図１１は、液滴におけるＭＮ分子のポアソン分布モデリングの図である。
【００２７】
【図１２】図１２は、ビーズの１３．５％が非活性化されたエマルジョンの液滴に対するＭＮのポアソン分布の図である。ヌクレアーゼの濃度を直接計算することができる（すなわち、滴定したヌクレアーゼの検量線を必要としない）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
現在、標的分子の正確な定量を可能にする超高感度の分子検出技術が必要である。例として、生物学的液体中の微生物病原体の分子標的の検出および定量を使用して、患者が特定の微生物による感染症を有するか否かを決定することができる。定量は、存在する病原体レベルを決定するために必要であり、これはバックグラウンドを臨床的に有意なレベルと識別することができる重要なデータピースである。食品中の病原体の検出（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＥ．ｃｏｌｉの検出）およびバイオテロリズムに関して類似の応用が存在する。超高感度検出法は、本質的に非線形である酵素的増幅ステップに主に依存し、したがって的確な解釈のためには連続希釈した標準物質の同時並行評価（検量線）を必要とする。この追加の負担は、検量線がなくとも標的ＤＮＡ配列を正確に定量することができるデジタル液滴またはエマルジョンＰＣＲに基づく方法によって回避される。本発明は、デジタルＰＣＲの正確な検量線非依存性を利用するが、標的分子の代替のカテゴリーであるヌクレアーゼを検出することが可能である。ヌクレアーゼは、ＤＮＡ配列より実質的に豊富に存在することから、本発明は、現在最も感度のよいプラットフォーム技術であるＰＣＲより標的微生物病原体に関してより大きい感度を生じる。さらに、本発明は、複雑な反応混合物および繊細な温度サイクリング機器を必要とするデジタルＰＣＲほど実質的に複雑ではなく、これらはいずれもヌクレアーゼ検出にとって必要ではない。全体的に見て、デジタルヌクレアーゼ検出アプローチは、多様な貴重な応用の優れた代替となる潜在能力を有する。
【００２９】
磁気ビーズに取り付けられた消光した蛍光プローブを含むフォーマットでの方法の実現可能性を証明するデータを提供する実験が実施されている。ビーズを、反応緩衝剤中でヌクレアーゼを含む水相に懸濁させる。この溶液を油中で乳化させ、何千もの非常に小さい反応を作り出す。反応の進行後、ビーズを回収し、その蛍光をフローサイトメトリーによって測定する。２つの別個のビーズ集団、すなわち蛍光が上昇したビーズおよび基底レベルの蛍光を有するビーズを認めることができる。
【００３０】
予想される応用分野としては、感染性疾患の診断、食品における病原体の検出、およびバイオテロリズムの検出が挙げられる。本発明は、２つの重要な問題を克服する。本発明は、単一の標的ヌクレアーゼ分子を検出する手段を提供するが、以前の方法では、数百個より少ない数を検出することができない。本発明はまた、試料中に存在する標的ヌクレアーゼ分子の数を定量する単純な手段も提供し、このアプローチは、検量線を必要としない。
【００３１】
本発明のアプローチを使用して、細胞あたりに発現されるヌクレアーゼ分子の数を正確に定量することもできる。例として、ヌクレアーゼを、プラスミドまたは細胞における他のベクターから発現させて、細胞数あたり発現されるヌクレアーゼの数を正確に定量することができる。本発明の感度は、これを単細胞レベルで可能にする（すなわち、マイクロ流体単離などの確立された方法によって単離された単細胞上でのタンパク質発現の単細胞分析）。言い換えれば、ヌクレアーゼは発現レポーターとして使用される。タンパク質発現を測定するために一般的に使用される半定量的方法（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）とは対照的に、本発明のアプローチは定量的であり、別個のプローブを別個の酵素に適合させることによって容易に多重化することができる。例えば、制限酵素認識部位をプローブ（別個のフルオロフォアを有する）に組み入れて、対応する酵素からなるレポーターを使用して、別個のプロモーターによって駆動される発現を報告する。
【００３２】
ある特定の実施形態では、本発明は、新規オリゴヌクレオチドプローブおよび組成物をも含むプロセスである。ある特定の実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼ反応が、油中水エマルジョンに存在することにより互いに単離しているおよそ１０ピコリットルまたはそれ未満の何千もの同時並行の水相反応に分割されるプロセスを含む。基質は、消化時に活性化されて蛍光の増加を生じる消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブである。反応ステップの完了後、個々の反応の蛍光を測定する。ヌクレアーゼが非常に希薄な濃度で存在する場合、各々の反応は、０、１、またはまれな場合では１個より多くのヌクレアーゼ分子を含有するであろう。感度が十分に高ければ、単一のヌクレアーゼ分子は、上昇した蛍光を産生する。これによって、得られた反応を１つまたは複数のヌクレアーゼ分子を有する反応と、有しない反応とに分割することができる（すなわち、デジタルエンドポイント）。ヌクレアーゼ分子のランダム分布を仮定すると、ヌクレアーゼは、反応においてポアソン分布を示すであろう。ポアソンモデルをデジタル反応結果に適合させることを使用すると、このように検量線を必要とすることなく、投入量として使用された試料中のヌクレアーゼ分子数を決定することができる。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本発明は、その多くのコピーがストレプトアビジンカップリング磁気ビーズ上に固定されている、消光した蛍光オリゴヌクレオチド基質を利用する。オリゴ配列および組成物は以下の通りである。ビオチン−Ｃｙ５−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＺＥＮ−ＲＱ、式中、ビオチンは、ストレプトアビジン結合部分であり、Ｃｙ５はフルオロフォアであり、Ｔはデオキシチミジン（ＤＮＡ）ヌクレオチドであり、ＺＥＮは、ＩＤＴ  Ｚｅｎクエンチャーであり、およびＲＱは、ＩＤＴ  Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱクエンチャーである。ある特定の実施形態では、オリゴ配列および組成物は、以下の通りである：Ｃｙ５−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＺＥＮ−ＲＱ−ビオチン。オリゴカップリングビーズを、ポリＴオリゴを効率よく消化することができるＳ．ａｕｒｅｕｓの分泌型ヌクレアーゼであるマイクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮ）と共にインキュベートすると、ビーズは、蛍光プレートリーダーおよび蛍光顕微鏡によって測定することができる蛍光の強い増加を示す。オリゴカップリングビーズを、反応緩衝剤中の様々な濃度のマイクロコッカスヌクレアーゼと組み合わせて、油中で反応を直ちに乳化させると、顕微鏡で見ることができる何千もの水性反応液滴を産生した。
【００３４】
ほとんどのエマルジョンの水性液滴は、顕微鏡によって確認することができるように、平均でビーズを含有しないかまたは１つのみのビーズを含有する。これらのエマルジョンは安定であり、これらを室温および３７℃で異なる期間インキュベートした。３７℃で数時間後、反応あたりおよそ１６３個のＭＮ分子が存在する（ランダム分布を仮定する）反応から回収したビーズは、均一に上昇した蛍光を示した。漸減濃度は均一に上昇した蛍光を産生したが、より低い蛍光レベルであった（すなわち、ビーズは、非消化ビーズより明るいが、完全に消化されたビーズほど明るくはなかった）。最後に、平均で１つのみのＭＮ分子を有するまたはＭＮ分子を有しない反応を生じる希薄なＭＮ濃度と共にオリゴカップリングビーズをインキュベートすると、一部が上昇した蛍光を示し、一部が基底レベルを示す２つの別個の蛍光ビーズ集団を産生した。これは、蛍光顕微鏡画像によって、およびフローサイトメトリー（２つの別個のピークが明白である）によって認めることができる。この最後の試料についての結果は、ＭＮの１つの分子が、このフォーマットで検出可能な蛍光を産生することができること、およびフォーマットが反応集団の所望のデジタル読み出しをもたらすことを示している。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本発明は、一方の末端で少なくとも１つのフルオロフォアが隣接し、他方の末端で少なくとも１つの蛍光クエンチャーが隣接する化学修飾ＤＮＡまたはＲＮＡで構成される短いオリゴヌクレオチドプローブ（基質）を提供する。プローブがヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）によって切断されると、フルオロフォアはクエンチャーから拡散し、蛍光を示す。このように、プローブを使用して、生体試料、例えば血液、血清、血漿、便、汗、皮膚抽出物、細胞培養物、および食品中の、およびｉｎ  ｖｉｖｏで、ならびに環境試料、例えば水中のヌクレアーゼの存在を検出することができる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、蛍光レポーター基およびクエンチャー基を、レポーター基からの蛍光シグナルがクエンチャー基によって抑制されるように物理的に近位に含む。プローブをヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）酵素によって切断すると、クエンチャー基からのレポーター基（フルオロフォア）の鎖切断および物理的分離が起こる。レポーターとクエンチャーとが分離すると、消光を除去し、それによってレポーター基からの蛍光発出が増加する。クエンチャーが、いわゆる「ダーククエンチャー」である場合、得られた蛍光シグナルは、直接の目視検査（顕微鏡、および発出された光が可視光波長を含む場合には、適した波長の照射源を使用して）によって検出することができる。本発明に記載の基質組成物の切断もまた、蛍光光度法によって検出することができる。
【００３７】
一実施形態では、合成基質は、リボヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドである。合成基質はまた、ＲＮアーゼ切断可能な、例えばＲＮＡ残基、またはＲＮアーゼ抵抗性修飾ＲＮＡ残基を含むキメラオリゴヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態では、基質組成物は、切断が、リボヌクレアーゼ特異的事象であり、厳密にデオキシリボヌクレアーゼである酵素による切断が起こらない組成物である。
【００３８】
一実施形態では、合成基質は、リボヌクレオチド残基と、修飾リボヌクレオチド残基とを含むキメラオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、合成基質は、リボヌクレオチド残基と、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基とを含むキメラオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、合成基質は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基と、４つのリボヌクレオチド残基、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウリジンの各々の１つまたは複数とを含むキメラオリゴヌクレオチドである。単一の基質に４つの別個のリボヌクレオチド塩基を含めることによって、単一の基質オリゴヌクレオチドによるエンドヌクレアーゼ酵素活性のスペクトルの増加を検出することが可能となる。
【００３９】
一実施形態では、合成基質は、デオキシリボヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドである。合成基質はまた、ＤＮアーゼ切断可能な、例えばＤＮＡ残基、またはＲＮアーゼ抵抗性修飾ＲＮＡ残基を含むキメラオリゴヌクレオチドであり得る。基質組成物は、切断がデオキシリボヌクレアーゼ特異的事象であり、厳密にリボヌクレアーゼである酵素による切断が起こらない組成物である。
【００４０】
一実施形態では、合成基質は、デオキシリボヌクレオチド残基と、修飾リボヌクレオチド残基とを含むキメラオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、合成基質は、デオキシリボヌクレオチド残基と、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基とを含むキメラオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、合成基質は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基と、４つのデオキシリボヌクレオチド残基、デオキシアデニン、デオキシシトシン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンの各々の１つまたは複数とを含むキメラオリゴヌクレオチドである。単一の基質に４つの別個のデオキシリボヌクレオチド塩基を含めることによって、単一の基質オリゴヌクレオチドによるデオキシリボヌクレアーゼ酵素活性のスペクトルの増加を検出することが可能となる。
【００４１】
目視による検出法を可能にするために、消光基はそれ自身、蛍光発出を行うことが可能ではない「ダーククエンチャー」である。「ダーククエンチャー」の使用により、そうでなければレポーターフルオロフォアからのエネルギー移動の結果として起こるインタクト基質のバックグラウンド蛍光が除去される。一実施形態では、蛍光クエンチャーは、ダブシル（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）である。一実施形態では、蛍光クエンチャーは、ＱＳＹ（商標）−７カルボン酸、スクシンイミジルエステル（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−４−（（５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノペンチル）アミノカルボニル）ピペリジニルスルホンローダミン；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．のジアリールローダミン誘導体）からなる。そのスペクトル特性が、選択したクエンチャーと共に使用するために都合がよい限り、任意の適したフルオロフォアを、レポーターとして使用することができる。フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ−色素、テキサスレッド、Ｂｏｄｉｐｙ色素、およびＡｌｅｘａ色素を含むがこれらに限定されない多様なフルオロフォアを、レポーターとして使用することができる。
【００４２】
蛍光消光基に関して、ダーククエンチャーである任意の化合物を、本発明の方法および組成物において使用することができる。複数の化合物が蛍光の消光を行うことが可能であるが、その多くはそれ自身蛍光性ではない（すなわち、ダーククエンチャーである）。一実施形態では、蛍光消光基は、窒素置換キサンテン化合物、置換４−（フェニルジアゼニル）フェニルアミン化合物、または置換４−（フェニルジアゼニル）ナフチルアミン化合物である。本実施形態のある特定の具体的な様式では、蛍光消光基は、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−４−（（５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノペンチル）アミノカルボニル）ピペリジニルスルホンローダミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．によってＱＳＹ−７（商標）として販売）、４’，５’−ジニトロフルオレセイン、ピペコリン酸アミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．によってＱＳＹ−３３（商標）として販売）、４−［４−ニトロフェニルジアジニル］フェニルアミン、または４−［４−ニトロフェニルジアジニル］ナフチルアミン（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．から販売）である。本実施形態の他の具体的な様式では、蛍光消光基は、Ｂｌａｃｋ−Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）１、２、または３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である。
【００４３】
ある特定の実施形態では、蛍光レポーター基は、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ色素、テキサスレッド、Ｂｏｄｉｐｙ色素、またはＡｌｅｘａ色素である。
【００４４】
前述の方法および組成物に関して、蛍光レポーター基または蛍光消光基は、基質の５’−末端ヌクレオチドに取り付けることができるが、必ずしもその必要はない。
【００４５】
本発明の方法における基質として使用するための核酸を含む本発明の核酸は、ある特定の実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子である。他の実施形態では、本発明の核酸は、ヌクレアーゼ抵抗性修飾リボヌクレオチド残基を含むキメラオリゴヌクレオチドである。例示的なＲＮアーゼ抵抗性修飾リボヌクレオチド残基には、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−メトキシエトキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ペンチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ブチルリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、アンロックド核酸（ＵＮＡ）ヌクレオチド、分岐核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチド、および２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）が挙げられる。本実施形態の一様式では、修飾リボヌクレオチド残基は、切断ドメインの５’−末端または３’−末端に存在する。さらに他の実施形態では、本発明の核酸は、デオキシリボヌクレアーゼ抵抗性修飾デオキシリボヌクレオチド残基を含むキメラオリゴヌクレオチドである。本実施形態の具体的な様式では、デオキシリボヌクレアーゼ抵抗性修飾ヌクレオチド残基は、ホスホトリエステルデオキシリボヌクレオチド、メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド、ホスホロアミデートデオキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド、ホスホロジチオエートデオキシリボヌクレオチド、またはボラノホスフェートデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−メトキシエトキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ペンチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ブチルリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、アンロックド核酸（ＵＮＡ）ヌクレオチド、分岐核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチド、または２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）である。本発明のさらに他の実施形態では、本発明の核酸は、リボヌクレアーゼ切断可能な修飾リボヌクレオチド残基を含む。
【００４６】
本発明の方法において基質として使用するための核酸を含む本発明の核酸は、少なくとも２ヌクレオチド長、例えば２〜７５ヌクレオチド長である。ある特定の具体的な実施形態では、本発明の核酸は、５〜２０、５〜１５、５〜１０、７〜２０、７〜１５、または７〜１０ヌクレオチド長である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸の蛍光消光基は、切断ドメインに対して５’であり、蛍光レポーター基は、切断ドメインに対して３’である。ある具体的な実施形態では、蛍光消光基は、基質の５’末端に存在する。別の具体的な実施形態では、蛍光レポーター基は、基質の３’末端に存在する。
【００４８】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸の蛍光レポーター基は、切断ドメインに対して５’であり、蛍光消光基は、切断ドメインに対して３’である。具体的な実施形態では、蛍光レポーター基は、基質の５’末端に存在する。別の具体的な実施形態では、蛍光消光基は、基質の３’末端に存在する。
【００４９】
本発明の一実施形態では、式：５’−Ｎ１−ｎ−Ｎ２−３’を含む本発明の核酸、式中、（ａ）「Ｎ１」は０〜５個の２’修飾リボヌクレオチド残基を表し；（ｂ）「Ｎ２」は、０〜５個の２’修飾リボヌクレオチド残基を表し；および（ｃ）「ｎ」は、１〜１０個の、例えば４〜１０個の非修飾リボヌクレオチド残基を表す。ある特定の具体的な実施形態では、「Ｎ１」は、１〜５個の２’修飾リボヌクレオチド残基を表す。本実施形態のある特定の様式では、蛍光消光基または蛍光レポーター基は、Ｎ１の５’末端の２’修飾リボヌクレオチド残基に取り付けられる。
【００５０】
式：５’−Ｎ１−ｎ−Ｎ２−３’を有する核酸を含む本発明の核酸において、蛍光消光基は、切断ドメインに対して５’であり得て、蛍光レポーター基は、切断ドメインに対して３’である；あるいは蛍光レポーター基は、切断ドメインに対して５’であり、蛍光消光基は、切断ドメインに対して３’である。
「プローブ」または「基質」オリゴヌクレオチド
【００５１】
本発明の組成物は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）酵素の基質である合成オリゴヌクレオチド基質を含む。本発明の基質オリゴヌクレオチドは、１）その一部または全てが切れやすい連結として機能する１つまたは複数のヌクレアーゼ切断可能塩基、例えばＲＮＡ塩基、２）蛍光レポーター基および蛍光クエンチャー基（光学的ＦＲＥＴに基づく蛍光消光（および非消光）検出法を可能にする組合せおよび近位で）を含み、および３）必要に応じて、ＲＮアーゼ抵抗性修飾ＲＮＡ塩基、ヌクレアーゼ抵抗性ＤＮＡ塩基、または非修飾ＤＮＡ塩基を含有していてもよい。内部ＲＮＡ結合が切れやすい連結として機能する合成オリゴヌクレオチドＲＮＡ−ＤＮＡキメラは、米国特許第６，７７３，８８５号および第７，８０３，５３６号に記載されている。蛍光レポーター基および蛍光クエンチャー基は、少なくとも１つのＲＮアーゼ切断可能残基、例えばＲＮＡ塩基によって分離されている。そのような残基は、エンドヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）の切断ドメインとしての役目を果たす。
【００５２】
ある特定の実施形態では、基質オリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖または二本鎖オリゴリボヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、修飾オリゴリボヌクレオチドで構成される。用語「修飾された」は、共有結合により修飾された塩基および／または糖を有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドは、３’位でのヒドロキシル基以外のおよび５’位でのリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合により取り付けられている糖を有するヌクレオチドを含む。このように、修飾ヌクレオチドはまた、２’−Ｏ−メチル−、２−Ｏ−アルキル、２−Ｏ−アリル、２’−Ｓ−アルキル、２’−Ｓ−アリル、２’−フルオロ−、２’−ハロ、または２−アジド−リボースなどの２’置換糖、炭素環糖アナログａ−アノマー糖；エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプツロースを含み得る。ある特定の実施形態では、基質は、これらに限定されないが、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−メトキシエトキシＲＮＡ、２’−Ｏ−アリルＲＮＡ、２’−Ｏ−ペンチルＲＮＡ、および２’−Ｏ−ブチルＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、基質は、一般構造５’ｒ−ＮｎＮ−ｑ３’を有するＲＮＡ−２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、式中、「Ｎ」は、約１〜５個の２’−修飾リボヌクレオチド残基を表し、「ｎ」は、１〜１０個の非修飾リボヌクレオチド残基を表し、「ｒ」は、蛍光レポーター基を表し、および「ｑ」は、蛍光クエンチャー基を表す。レポーターおよびクエンチャーの５’位および３’位は、互換可能である。一実施形態では、蛍光レポーター基および蛍光クエンチャー基は、分子の反対側またはその近傍に位置する。いずれの基が５’末端および３’末端またはその近傍にあるかは重要ではない。レポーターおよびクエンチャー基が、末端修飾である必要はないが、これらの基が末端に位置すると、基質の製造が単純となる。蛍光レポーター基および蛍光クエンチャー基はまた、ＲＮＡの切れやすい連結がレポーターとクエンチャーとの間に存在する限り、内部に位置してもよい。
【００５３】
修飾ヌクレオチドは、当技術分野で公知であり、例えばおよび限定ではないが、アルキル化プリンおよび／もしくはピリミジン、アシル化プリンおよび／もしくはピリミジン、または他の複素環を含む。これらのクラスのピリミジンおよびプリンは当技術分野で公知であり、シュードイソシトシン；Ｎ４、Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチル−アデニン；１−メチルアデニン；１−メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルケオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；シュード（psueo）ウラシル；２−チオシトシン；５−メチル−２チオウラシル、２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル５−オキシ酢酸；ケオシン；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；および２，６，−ジアミノプリン；メチルシュード（psuedo）ウラシル；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンを含む。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合ヌクレオチドを使用して合成され、当技術分野で公知の標準的な固相または液相合成技術を使用して合成される。ヌクレオチド間の連結は、代替の連結分子を使用してもよい。例えば、式Ｐ（Ｏ）Ｓ、（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ、（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；またはＣＯＮＲ’２の連結基、式中、Ｒは、Ｈ（または塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒ６は、−Ｏ−または−Ｓ−を通して隣接するヌクレオチドに連接するアルキル（１〜９Ｃ）である。
【００５５】
本発明のある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ピリミジンの追加の修飾、例えば２’Ｏ−メチル修飾を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの全てが、２’Ｏ−メチル修飾されている。あるいは、ピリミジンまたは全てのヌクレオチドが、２’フルオロ（ピリミジンおよびプリンの両方）によって修飾されてもよい。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは短く、例えば２〜３０ヌクレオチド長（またはその間の任意の値）の間である。ある特定の実施形態では、そのオリゴヌクレオチドは、８〜１５ヌクレオチド長の間である。ある特定の実施形態では、そのオリゴヌクレオチドは、１１〜１３ヌクレオチド長の間である。一般的に、より短い配列は、より長いプローブより良好なシグナル対ノイズ比を与え、したがってより感度が高い。しかし、ある特定の実施形態では、より短いプローブは、ヌクレアーゼにとって最適な基質ではなく、長さに関してある程度の経験的な最適化が必要である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０〜１００％プリン（またはその間の任意の値）を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１００％ピリミジンを含む。
【００５７】
オリゴヌクレオチドの具体的な配列は重要ではないことに注意すべきである。プリンおよびピリミジンのある特定の組合せは、細菌エンドヌクレアーゼに対して感受性であるが、哺乳動物ヌクレアーゼに対して抵抗性である。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、これに対しエキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する。多くの細菌ヌクレアーゼは、典型的に認識部位および切断パターンを必要とする制限酵素のように配列特異的ではない。いくつかのエンドヌクレアーゼは、一本鎖核酸分子を切断するが、他のエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸分子を切断する。ステムループを形成するオリゴは、それによって二本鎖特異的ヌクレアーゼの基質としての役目を果たすことができる二本鎖領域を提供する。例として、フルオロフォアが５’末端に存在し、クエンチャーが３’末端に存在する以下のプローブは、ＳｎａＢＩ制限酵素認識部位を有する二本鎖領域を形成する。二本鎖領域はまた、Ｅ．ｃｏｌｉのエンドヌクレアーゼＩなどの配列非選択的ヌクレアーゼの基質としての役目も果たすことができる。
／５ビオチンＴＥＧ／／ｉＣｙ３／ＡＣＴＡＣＧＴＡＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＴＡＧＴ／ＺＥＮ／／３ＩＡｂＲＱＳｐ／
【００５８】
このプローブ上のＣｙ３フルオロフォアを、実施例のポリＴプローブにおいて使用されるＣｙ５フルオロフォアと区別することができることに留意されたい。このように、これらの２つのプローブを組み合わせて使用して、多重フォーマットにおいて別個のヌクレアーゼを検出することができる。
【００５９】
自己ハイブリダイズするプローブの構成もまた使用して、二本鎖核酸基質を消化するヌクレアーゼを検出することができる。例として、以下のプローブは、自身の他のコピーとハイブリダイズして二重鎖を形成し、これは消光した蛍光二本鎖ＤＮＡプローブを生じる。
５’−／５６−ＦＡＭ／／ＣＴＡＣＧＴＡＧ／／ＺＥＮ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／−３’
【００６０】
このプローブは、ＳｎａＢＩ制限酵素の基質を形成し、Ｅ．ｃｏｌｉの配列非選択的エンドヌクレアーゼＩによって効率的に活性化される（Flenker,  K.S.,  Burghardt,  E.L.,  Dutta,  N.,  Burns,  W.J.,  Grover,  J.M.,  Kenkel,  E.J.,  Weaver,  T.M.,  Mills,  J.,  Kim,  H.,  Huang,  L.,  et  al.  (2017).  Rapid  Detection  of  Urinary  Tract  Infections  via  Bacterial  Nuclease  Activity.  Mol  Ther  25,  1353-1362）。
フルオロフォア
【００６１】
ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、「蛍光タグ」とも呼ばれ得る１つまたは複数のフルオロフォアに作動可能に連結する。フルオロフォアは、特徴的な波長で光を吸収し（すなわち、励起し）、よりエネルギーが低い第２の波長で光を放射する（すなわち、蛍光を発する）分子である。基質組成物に組み入れることができる蛍光レポーター基としては、これらに限定されないが、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラメチルローダミン、ローダミン、シアニン誘導体色素、テキサスレッド、Ｂｏｄｉｐｙ、およびＡｌｅｘａ色素が挙げられる。これらの各々の特徴的な吸収および発出波長は、当業者に周知である。
【００６２】
蛍光クエンチャーは、励起したフルオロフォア（すなわち、レポーター）からエネルギーを吸収または放出し、そのフルオロフォアの特徴的な波長で蛍光を発することなく、フルオロフォアをより低いエネルギー状態に戻す分子である。消光が起こるためには、レポーターとクエンチャーは、物理的近位に存在しなければならない。レポーターとクエンチャーが分離されている場合、レポーターによって吸収されたエネルギーは、クエンチャーに移動せず、その代わりに、レポーターに特徴的な波長で光として放射される。消光の除去後でのレポーター基からの蛍光シグナルの出現は、検出可能な事象であり、本発明のアッセイにおいて「陽性シグナル」を構成し、試料中のヌクレアーゼの存在を示している。
【００６３】
蛍光クエンチャー基は、いかなる蛍光シグナルも放射しない分子（「ダーククエンチャー」）およびそれ自身がフルオロフォアである分子（「蛍光クエンチャー」）である分子を含む。「蛍光クエンチャー」を採用する基質組成物は、インタクトの状態および切断された状態の両方で光を放射する。インタクトの状態では、レポーターによって捕獲されたエネルギーは、ＦＲＥＴを介してクエンチャーに移動し、蛍光クエンチャーに特徴的な波長で光として放射される。切断された状態では、レポーターによって捕獲されたエネルギーは、レポーターに特徴的な波長で光として放射される。蛍光クエンチャーを採用する組成物をＦＲＥＴアッセイに使用する場合、蛍光分光計を使用して検出を行わなければならない。ある特定の実施形態では、「ダーククエンチャー」を採用する基質組成物は、切断された状態に限って光を放射し、シグナル検出を目視によって実施することが可能である（検出は、この場合も蛍光分光計を使用して行わなければならない）。目視による検出は、迅速、簡便であり、いかなる専門の機器の利用も必要としない。ＲＮアーゼ検出アッセイは、利用可能な選択肢として目視による検出法を有することが望ましい。「ダーククエンチャー」を採用する基質組成物は、目視による検出のエンドヌクレアーゼアッセイを可能にするが、「蛍光クエンチャー」を採用する基質組成物は、目視による検出アッセイとは相容れない。
【００６４】
本発明の一実施形態では、基質は、それ自身蛍光シグナルを放射しない、すなわち「ダーククエンチャー」である蛍光クエンチャー基からなる。本発明の組成物において有用な「ダーククエンチャー」としては、これらに限定されないが、ダブシル、ＱＳＹ（商標）−７、ＱＳＹ−３３（４’，５−ジニトロフルオレセイン、ピペコリン酸アミド）、ならびにＢｌａｃｋ−Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）１、２、および３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。このように、アッセイ結果（すなわち、切断した基質からのシグナル）を、光学的に検出することができる。必要に応じて、蛍光シグナルを、蛍光分光計、または定量的もしくは定性的に蛍光の発出を検出することが可能な他の任意のデバイスを使用して検出することができ、例として蛍光は、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡、またはスキャナによって検出することができる。
【００６５】
ある特定の実施形態では、フルオロフォアは、表１に記載のフルオロフォアの１つまたは複数である。
【表１−１】
2020535807.tif 000003
【表１−２】
2020535807.tif 000004
【００６６】
ある特定のｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態では、フルオロフォアは、近赤外線範囲、例えば６５０〜９００ｎｍ範囲で発する（Weissleder  et  al.,  "Shedding  light  onto  live  molecular  targets,"  Nature  Medicine,  9:123-128  (2003)）。
蛍光クエンチャー基
【００６７】
ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の蛍光クエンチャー基または「クエンチャー」に作動可能に連結する。
【００６８】
ある特定の実施形態では、クエンチャーは、表２に記載のクエンチャーの１つまたは複数である。
【表２−１】
2020535807.tif 000005
【表２−２】
2020535807.tif 000006
【００６９】
さらなるクエンチャーは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４３９，３４１号に記載されている。
リンカー
【００７０】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リンカーによってフルオロフォアおよび／またはクエンチャーに連結される。
【００７１】
ある特定の実施形態では、脂肪族またはエチレングリコールリンカー（当業者に周知のリンカー）を使用する。ある特定の実施形態では、リンカーは、ホスホジエステル結合である。ある特定の実施形態では、リンカーは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合である。ある特定の実施形態では、これらの結合をより安定にして、それによってヌクレアーゼに対する分解を制限するために、色素などの修飾基とクエンチャーおよび塩基との間に他の修飾結合を使用する。
【００７２】
ある特定の実施形態では、リンカーは結合対である。ある特定の実施形態では、「結合対」は、例えば、対が互いに特異的に結合する特性を有する、イオン結合、共有結合、疎水性結合、ファンデルワールス結合、および水素結合を含む多様な分子力のいずれかを通して互いに相互作用する２つの分子を指す。特異的に結合するとは、結合対のメンバーが、それらが別の分子には結合しない条件で、互いに対する結合を示すことを意味する。結合対の例としては、ビオチン−アビジン、ホルモン−受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡ、抗原−抗体等がある。ある特定の実施形態では、結合対の第１のメンバーは、アビジンまたはストレプトアビジンを含み、結合対の第２のメンバーは、ビオチンを含む。
【００７３】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、共有結合によってフルオロフォアおよび／またはクエンチャーに連結される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ、すなわちフルオロフォアおよびクエンチャーに作動可能に連結したオリゴヌクレオチドはまた、固体基質に作動可能に連結する。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを磁気ビーズに連結してもよい。
【００７５】
フルオロフォアおよびクエンチャーを、オリゴヌクレオチドに連結するために使用することができる化学は、当技術分野で公知であり、例えばジスルフィド結合、アミノ結合、共有結合等である。ある特定の実施形態では、当業者に周知である脂肪族またはエチレングリコールリンカーを使用することができる。ある特定の実施形態では、色素などの修飾基とクエンチャーとの間で、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、および／または修飾された他の結合を使用する。これらの結合は、プローブに安定性をもたらし、それによって核酸塩基に対する分解を制限する。さらなる結合および修飾は、ワールドワイドウェブ上でｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｏｌｉｇｏ／ｏｌｉｇｏ＿ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐにおいて見出され得る。
基質合成
【００７６】
本発明の核酸基質の合成は、固相ホスホロアミダイト化学（米国特許第６，７７３，８８５号）を使用して、自動シンセサイザーによって実施することができるが、他の核酸合成法（例えば、Ｈ−ホスホネート法）を使用してもよい。核酸の化学合成は、修飾された連結を有する核酸、キメラ組成物、および核酸の全長を通して選択された場所で取り付けられている非標準塩基または修飾基の様々な形態の産生を可能にする。
【００７７】
ある特定の（ertain）実施形態では、支持体構造をクエンチャーに独立に結合させて、同様に、ヌクレオチド配列−フルオロフォアに個別に結合させる。ヌクレオチド配列が切断されると、フルオロフォアが放出され、クエンチャーに対するその近位性が長くなり、消光の喪失を引き起こす。同様に、ある特定の実施形態では、フルオロフォアが基質に個別に結合し、ヌクレオチド配列−クエンチャーが結合する反対の構成が開発される。
検出方法
【００７８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試料中のヌクレアーゼを検出する方法を提供する。本発明の方法は、以下のステップで進行する：（ａ）少なくとも１つのヌクレアーゼを含有することが疑われる水性試験試料に、水溶液と、基質プローブ（フルオロフォアおよびクエンチャーに連結したオリゴヌクレオチド）とを含む少なくとも１つの検出組成物を接触させて、水性反応混合物を形成するステップ、（ｂ）水性混合物を油中で乳化して、エマルジョン中でフェムトリットルスケールまたはピコリットルスケールの液滴を形成するステップ、（ｃ）ヌクレアーゼが存在すればマイクロビーズに連結した基質プローブを消化するように、エマルジョン中のフェムトリットルスケールまたはピコリットルスケールの液滴をインキュベートするステップ、（ｄ）マイクロビーズを回収するステップ、ならびに（ｅ）マイクロビーズから発する蛍光を検出するステップ。
【００７９】
「試験試料」は、エンドヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）活性に関してアッセイされる任意の材料を指し、ある特定の実施形態では液体である。固体は、溶媒、例えば水中で洗浄または含浸した後に溶媒のアッセイを行うことによってヌクレアーゼに関して間接的に試験することができる。
【００８０】
例えば、試料に、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブを接触させて、蛍光分光計を使用して細菌エンドヌクレアーゼの存在を検出することができる。
【００８１】
ある特定の実施形態では、本発明のプローブはまた、研究所などの状況で細菌の混入を検出するためにも有用である。
【００８２】
インキュベーション。アッセイミクス（例えば、試験試料プラス基質）をインキュベートする。インキュベーション時間および条件は、反応の効率および必要な感度に応じて、数分から２４時間またはそれより長い時間で変化し得る。１時間またはそれ未満のインキュベーション時間が望ましい。ヌクレアーゼは触媒性である。したがって、インキュベーション時間の増加は、基質のバックグラウンド切断（加水分解）が低いままである限り、アッセイの感度を増加させるはずである。明白であるように、アッセイバックグラウンドは経時的に安定であり、アッセイ感度は、インキュベーション時間と共に増加する。インキュベーション温度は一般的に室温から３７℃までで変化し得るが、夾雑物として存在することが疑われる具体的なヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）の至適温度に調節してもよい。
【００８３】
シグナル検出。蛍光の発出は、いくつかの技術を使用して検出することができる（米国特許第６，７７３，８８５号）。１つの検出方法では、目視検査を利用する。目視による検出は迅速、単純であり、いかなる専門の機器も必要とすることなく行うことができる。あるいは、検出は、蛍光分光計、または蛍光発出の定性的もしくは定量的評価を可能にする他の任意の方法を使用して行うことができる。
【００８４】
目視による検出方法。インキュベーション後、ピコリットル液滴を、ＵＶ光に暴露して、蛍光レポーター基の励起をもたらす。基質がインタクトのままである反応混合物は、蛍光シグナルを放射せず、目視によりはっきりまたは暗く見える。蛍光シグナルの非存在は、陰性アッセイ結果を構成する。プローブが切断されている反応混合物は、蛍光シグナルを放射し、目視により明るく見える。蛍光シグナルの存在は、陽性アッセイ結果を構成し、試料中のヌクレアーゼ活性の存在を示している。
【００８５】
反応混合物は、理想的には、比較的小さい体積、例えば乳化前に水相約１００マイクロリットルを構成するが、これより大きいまたは小さい体積を採用することができる。
【００８６】
様々なステップ（混合、インキュベート、検出）を１つの管で実施することができる。一実施形態では、管は小さく、ＵＶ透過性のシンウォールマイクロ管であるが、他の構成の管を使用してもよい。蛍光励起の一実施形態では、２５４ｎｍまたはその付近で発する「短波」ＵＶ光源を使用する。３００ｎｍまたはその付近で発する「長波」ＵＶ光源もまた採用することができる。高い強度の短波ＵＶ光源は、最善の感度を提供する。この種のＵＶ光源は、ほとんどの分子生物学研究室において一般的に見出されている。目視による検出は、研究室のベンチまたはフィールドで実施することができるが、暗所で行う場合、感度が改善する。
【００８７】
蛍光分光検出法。インキュベーション後、蛍光の発出を、蛍光分光計を使用して検出することができる。蛍光分光検出機器としては、これらに限定されないが、単一試料キュベットデバイスおよびマルチウェルプレートリーダーが挙げられる。先に述べたように、混合、インキュベーション、および検出は、同じ容器で実施することができる。マルチウェルプレートフォーマットの使用は、小さい試料体積、例えば２００μｌまたはそれ未満を可能にし、一度に多くの試料のハイスループットロボット処理を可能にする。このフォーマットは、ある特定の産業用ＱＣの状況で使用される。方法はまた、ＲＮアーゼフリーキュベットで実施されるアッセイも提供する。先に述べたように、混合、インキュベーション、および検出は、同じ容器で実施することができる。蛍光分光検出の使用は、非常に感度が高く定量的な検出を可能にする。
キット
【００８８】
本発明は、ピコ液滴（水溶液および基質プローブ）ならびに使用説明書を含む、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）活性を検出するためのキットをさらに特徴とする。そのようなキットは、必要に応じて陽性対照ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼフリー水、および緩衝剤の１つまたは複数を含有し得る。キットは、ヌクレアーゼフリーの実験用プラスチックウェア、例えば目視による検出法によって使用するためのＵＶ透過性のシンウォールマイクロ管および／またはハイスループットフォーマットでのプレート−蛍光分光計検出法によって使用するためのマルチウェルプレートを含み得ることが提供される。
【００８９】
本発明の１つのキットは、広いスペクトルのエンドヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）活性に対して感受性である万能基質を含む。キットは、多様な起源からのエンドヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）活性を検出することが意図される。アッセイは、目視による検出と適合性である。ある特定の実施形態では、基質は、個々のＵＶ透過性のシンウォールマイクロ管またはハイスループット手順に適したマルチウェル（例えば、９６ウェル）フォーマットにおいて乾燥型で提供される。凍結乾燥基質は、水または緩衝剤中での液体溶液と比較して長期間の安定性を改善した。液体溶液中で提供される場合、安定性は、少なくとも−２０℃より低い、例えば−８０℃での保存によって改善する。個々のアリコートで保存することにより、環境エンドヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）による混入の可能性が制限される。あるいは、基質は、凍結乾燥または液体溶液のいずれかでバルクで提供することができる。あるいは、基質はバルクで提供され、ユーザーの裁量で分配することができる。
【００９０】
本発明のさらなるキットは、共にほとんどのＲＮアーゼ活性を検出し、個々に使用して異なるエンドヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）酵素を識別することができる酵素特異的または酵素選択的基質のセットを含む。そのようなキットを使用して、ＲＮアーゼ混入の性質および起源を評価することができ、または目的の具体的な酵素の活性を測定することができる。
ヌクレアーゼ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
【００９１】
ある特定の実施形態では、本発明は、様々な核酸基質上での微生物ヌクレアーゼの活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを提供する。ある特定の実施形態では、アッセイは、マイコプラズマヌクレアーゼの活性を評価する。ある特定の実施形態では、アッセイは、細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）またはウイルスのヌクレアーゼの活性を評価する。例えば、生体試料（例えば、組織、細胞、もしくは生物学的液体）またはそのような試料に由来する材料を、オリゴヌクレオチドに基づくプローブと組み合わせて、一定期間インキュベートする。次に、この反応の蛍光レベルを測定し（例えば、蛍光分光計によって）、陽性および陰性対照としての役目を果たす類似の反応の蛍光レベルと比較する。
【００９２】
ある特定の実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼの存在および量を検出するための組成物および方法を提供する。
【００９３】
非常に低濃度のヌクレアーゼの検出は、極めて難題である。個々のヌクレアーゼ分子は、基質を消化する能力が限定されており、非常に希薄なシグナルは、検出することが難しい（図１）。加えて、ヌクレアーゼ反応速度論は、非線形であり、ヌクレアーゼ濃度を定量する努力を難しくする。本発明は、多くの同時並行の縮小版反応を生成することによってこれらの問題に対処し、それによって消化された基質のかなり高濃度を可能にし、出力は、連続的ではなくてデジタル（活性に関してありまたはなし）である。
【００９４】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブを、デジタルヌクレアーゼ検出のために使用する（図２）。ビオチンは、ストレプトアビジンビーズに対するプローブのカップリングを可能にする。オリゴヌクレオチド部分が消化されると、クエンチャーが拡散し、蛍光ビーズをもたらす。ある特定の実施形態では、プローブは、例えばストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって磁気ビーズにカップリングされる（図３および４）。オリゴヌクレオチドが消化されると、ビーズからクエンチャーを放出し、蛍光の大きい増加をもたらす（フルオロフォアはビーズに結合したままである）（図５）。ある特定の実施形態では、プローブコーティングビーズは、水性反応緩衝剤中に存在し、緩衝剤を油中で乳化して、「コンパートメント化された」ピコ液滴を産生する。低濃度のビーズおよびヌクレアーゼによって、液滴あたり１つまたはそれより少ないビーズ、および液滴あたり１つまたはそれより少ないヌクレアーゼ分子をもたらす（図６）。
【００９５】
ある特定の実施形態では、プローブは、マイクロビーズの存在がなくともピコ液滴内に含有される。図７。
【００９６】
本発明は、何千もの同時並行の独立したナノリットルまたはナノリットルより小さい反応において単一の標的ヌクレアーゼ分子を検出する方法である。各反応の蛍光は、１つ（または複数）のヌクレアーゼ分子の存在または非存在を示す。ランダム分布を仮定すると、ヌクレアーゼは、反応においてポアソン分布を示す。次に、初回溶液中に存在するヌクレアーゼの総数を計算する。この方法を使用して、検量線がなくとも試料中のヌクレアーゼ分子の数を正確に決定する。方法は、個々の反応レベルで単一分子の感度を有する。
検出組成物
【００９７】
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）水溶液と、（ｂ）（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャーを含む基質プローブとを含むピコ液滴を含む検出組成物を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ピコ液滴」は、０．０１４〜２．６ピコリットルの体積を有する液体の液滴を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態では、水溶液は、マグネシウムを欠如する。
【００９９】
ある特定の実施形態では、水溶液は、二価カチオンキレート剤を含む。
【０１００】
ある特定の実施形態では、水溶液は、亜鉛またはマンガンを含む。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、亜鉛またはマンガンは、１００μＭ〜２０ｍＭの濃度で存在する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、二価カチオンキレート剤は、ＥＤＴＡである。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、ＥＤＴＡは、２０〜５０ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、ＥＤＴＡは、３０ｍＭの濃度で存在する。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４〜１５ヌクレオチド長である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４〜１１ヌクレオチド長である。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ピリミジンを含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１）である。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチドの１つまたは複数は、化学修飾されている。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、ピリミジンの１つまたは複数は、化学修飾されている。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、ピリミジンの１つまたは複数は、２’−Ｏ−メチル修飾されている。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、ピリミジンの１つまたは複数は、２’−フルオロ修飾されている。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、プリンの１つまたは複数は、存在する場合、化学修飾されている。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、プリンの１つまたは複数は、２’−Ｏ−メチル修飾されている。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、プリンの１つまたは複数は、２’−フルオロ修飾されている。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、フルオロフォアは、表１に記載のフルオロフォアからなる群から選択される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、フルオロフォアは、近赤外線範囲で発出を有する。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、クエンチャーは、表２に記載のクエンチャーからなる群から選択される。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、基質プローブは、磁気マイクロビーズに作動可能に連結している。磁気マイクロビーズは、当技術分野で周知であり、購入により容易に入手できる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、マイクロビーズは、直径約０．５〜２０μｍである。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、マイクロビーズは、直径約２〜１０μｍである。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、マイクロビーズは、連結部分を含む。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、連結部分は、ストレプトアビジン分子である。他の連結部分としては、クリックケミストリーリンカー、アミノリンカー、およびチオールリンカーが挙げられる。例示的なリンカーは、当技術分野で周知である（例えば、米国特許出願公開第２０１０−０２３４４５０号を参照されたい）。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、基質プローブは、ビオチン部分を含み、基質プローブは、ビオチン−ストレプトアビジン結合を通して磁気マイクロビーズに連結される。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、溶液は、０．１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１〜２０ｍＭのＣａＣｌ２を有する緩衝剤である。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、溶液は、０．１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２、もしくはＣａＣｌ２、または他の二価カチオンを有する緩衝剤である。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、溶液は、二価カチオンを有しないおよび／または二価カチオンのキレート剤（ＥＤＴＡ）を有する緩衝剤である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ピコ液滴は、０．０１４〜２．６ピコリットルである。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、マイクロビーズは、ピコ液滴あたり平均で１個未満のマイクロビーズを生じる濃度で存在する。
区画化、および反応構成
【０１３１】
一実施形態では、ヌクレアーゼは、親和性捕獲に基づく方法、例えばビーズ、例えば磁気ビーズ上の免疫沈降によって捕獲され（例えば、Burghardt,  E.L.,  Flenker,  K.S.,  Clark,  K.C.,  Miguel,  J.,  Ince,  D.,  Winokur,  P.,  Ford,  B.,  and  McNamara,  J.O.,  2nd  (2016).  Rapid,  Culture-Free  Detection  of  Staphylococcus  aureus  Bacteremia.  PLoS  One  11,  e0157234の例のように）、次にヌクレアーゼによって消化（活性化）することができる遊離の（水相）オリゴヌクレオチドプローブとの何千または何百万もの小さい体積（フェムトリットルまたはピコリットルスケール）の水相反応に分配される。この場合、ビーズの濃度は、小さい体積の反応あたりビーズ０または１個が存在する濃度である。ヌクレアーゼの濃度は平均で各ビーズあたり０または１個のヌクレアーゼ分子が存在する濃度である。このフォーマットを使用して、マイクロスケールビーズに固定したβ−ガラクトシダーゼを測定し、次にこれを疎水性中親水性表面上で区画化されるフェムトリットルスケールの反応に単離させた（Kim,  S.H.,  Iwai,  S.,  Araki,  S.,  Sakakihara,  S.,  Iino,  R.,  and  Noji,  H.  (2012).  Large-scale  femtoliter  droplet  array  for  digital  counting  of  single  biomolecules.  Lab  Chip  12,  4986-4991）。
【０１３２】
一実施形態では、プローブは、固体表面、例えば疎水性表面上にエッチングされた親水性表面のマイクロメートルスケール寸法の何千または何百万ものスポットまたはウェルに固定される。言い換えれば、プローブは、親水性スポットまたはウェルを互いから単離させる役目を果たす疎水性表面に取り囲まれた親水性表面の別個のマイクロメートルスケールのスポットまたはウェルに位置する。次に、反応緩衝剤に溶解したヌクレアーゼからなる試料を表面に適用し、この試料のフェムトリットルまたはピコリットル体積の区画を、各々のスポットまたはウェルにおいて単離させ、多くの別個のヌクレアーゼ反応が生じる。ヌクレアーゼの濃度は、区画化されたフェムトリットルまたはピコリットル反応あたり、平均で０、１または小さい数のヌクレアーゼ分子が存在するような濃度である。
【０１３３】
一実施形態では、ヌクレアーゼは、水相試料内で遊離であり、次にこれを消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを含む水相溶液と組み合わせて、反応混合物を作り出す。次に、この混合物を油中で乳化して、区画化された反応としての役目を果たす何千または何百万もの小さい体積（フェムトリットルもしくはピコリットルスケール）の水相液滴を生成する。インキュベーション期間の後、液滴の蛍光レベルを適した機器、例えば蛍光顕微鏡によって測定する。
より小さい反応体積は、より早期の時点でのヌクレアーゼ検出を生じると予想される
【０１３４】
デジタル酵素アッセイにおけるプローブ消化速度は、反応体積と反比例することが見出されている（Basu,  A.S.  (2017b).  Digital  Assays  Part  II:  Digital  Protein  and  Cell  Assays.  SLAS  Technol  22,  387-405）。一実施形態では、区画化された反応の体積は、１４フェムトリットル未満、例えば１フェムトリットルまたは０．５フェムトリットルである。
【０１３５】
小さい体積中でのプローブ消化速度がより速いことは、より早期の時点、例えば反応のアセンブリの数分後でのヌクレアーゼ活性の検出を可能にすると予想される。一実施形態では、区画化反応のインキュベーション時間は、３０秒〜１時間である。
別個のヌクレアーゼを識別するための反応速度論の使用可能性
【０１３６】
デジタル酵素アッセイにおけるプローブ消化速度は、酵素の代謝回転率（すなわち、酵素がプローブを消化する速度）に比例することが見出されている（Basu,  A.S.  (2017b).  Digital  Assays  Part  II:  Digital  Protein  and  Cell  Assays.  SLAS  Technol  22,  387-405）。いくつかの時点での反応の蛍光の測定は、反応の速度論の測定を可能にする。別個のヌクレアーゼ（例えば、マイクロコッカスヌクレアーゼと、ヘビ毒ホスホジエステラーゼとの比較）は、特定の基質に関して異なる代謝回転率を示すことから、反応速度論の測定は、反応におけるヌクレアーゼの同一性の指標を提供することができる。一実施形態では、何千または何百万ものピコリットルまたはフェムトリットルスケールの区画化ヌクレアーゼ反応の反応速度論は、複数の時点で反応の進行を示す蛍光レベルを測定することによって決定される（すなわち、蛍光の増加が消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブの消化に起因する）。次に、蛍光生成速度を使用して試料中に存在し得る別個のヌクレアーゼを識別する。最初の試料中のこれらのヌクレアーゼの量、したがってその濃度もまた、その速度論シグネチャーが測定される特定のヌクレアーゼを有するおよび／または有しない反応の分画から決定することができる。
【０１３７】
特定の酵素の反応速度論シグネチャーはまた、より単純なエンドポイント蛍光測定、すなわち単一のインキュベーション期間の終了時の蛍光の測定によって識別され得る。この場合、ヌクレアーゼを含有する一部の反応の蛍光レベルは、基底レベルより高く、別個のヌクレアーゼを含有する他の反応の蛍光レベルは、基底レベルより高いことに加えて、第１のヌクレアーゼを含有する反応より高い。一実施形態では、何千または何百万ものピコリットルまたはフェムトリットルスケールの区画化されたヌクレアーゼ反応の反応速度論は、単一の時点での反応の進行を示す蛍光レベルを測定すること（エンドポイント測定）によって推定される（すなわち、蛍光の増加は消光したオリゴヌクレオチドプローブの消化に起因する）。次に、推定される速度論シグネチャーを使用して、試料中に存在し得る別個のヌクレアーゼを識別する。最初の試料中のこれらのヌクレアーゼの量、したがってその濃度もまた、速度論シグネチャーが測定される特定のヌクレアーゼを有するおよび／または有しない反応の分画から決定することができる。
反応区画化アプローチ
【０１３８】
水相酵素反応のシリコン油中でのエマルジョンが個々の酵素分子の測定を可能にすることは、何十年も前に証明されている（Rotman,  B.  (1961).  Measurement  of  activity  of  single  molecules  of  beta-D-galactosidase.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  47,  1981-1991）。エマルジョンは、超音波処理、振動、およびマイクロ流体デバイスを含む多様なアプローチによって産生することができる（例えば、総説：  Basu,  A.S.  (2017a).  Digital  Assays  Part  I:  Partitioning  Statistics  and  Digital  PCR.  SLAS  Technol  22,  369-386;  Basu,  A.S.  (2017b).  Digital  Assays  Part  II:  Digital  Protein  and  Cell  Assays.  SLAS  Technol  22,  387-405を参照されたい）。フローフォーカシングマイクロチャネルマイクロ流体デバイス（フローフォーカシングジャンクション）を使用すると、均一なサイズの液滴を有するエマルジョンを産生することができ（Anna,  S.L.,  Bontoux,  N.,  and  Stone,  H.A.  (2003).  Formation  of  dispersions  using  "flow  focusing"  in  microchannels.  Appl  Phys  Lett  82,  364-366）、そのようなエマルジョンは、デジタル酵素検出に関してより大きい精度を可能にする（Arayanarakool,  R.,  Shui,  L.,  Kengen,  S.W.,  van  den  Berg,  A.,  and  Eijkel,  J.C.  (2013).  Single-enzyme  analysis  in  a  droplet-based  micro-  and  nanofluidic  system.  Lab  Chip  13,  1955-1962を参照されたい）。段階的エマルジョン液滴生成をまた使用して、より迅速にエマルジョンを生成することができる。
【０１３９】
フェムトリットルまたはピコリットルスケールの反応としての役目を果たす表面固定液滴は、エマルジョンの液滴に対する代替の区画化アプローチである。例として、その上にマイクロメートルスケールのウェルがエッチングされているきれいなエラストマー表面は、表面としての役目を果たすことができる（Rondelez,  Y.,  Tresset,  G.,  Tabata,  K.V.,  Arata,  H.,  Fujita,  H.,  Takeuchi,  S.,  and  Noji,  H.  (2005).  Microfabricated  arrays  of  femtoliter  chambers  allow  single  molecule  enzymology.  Nat  Biotechnol  23,  361-365）。水相反応溶液を表面に適用後、カバーガラスをその上に載せ、このようにフェムトリットルからピコリットルスケールの反応を互いに単離させる。不活性のブロッキングタンパク質、例えばウシ血清アルブミンを含めることは、そうでなければ固体表面に対する酵素の吸着により起こり得る酵素活性の低減を遮断することによって検出を改善することができる。
【０１４０】
反応の表面固定の別の例は、その上に親水性表面（例えば、ＳｉＯ２）のマイクロメートルスケールのスポットがエッチングされる疎水性表面（例えば、炭素−フッ素の疎水性ポリマー（ＣＹＴＯＰ））を使用することである（Sakakihara,  S.,  Araki,  S.,  Iino,  R.,  and  Noji,  H.  (2010).  A  single-molecule  enzymatic  assay  in  a  directly  accessible  femtoliter  droplet  array.  Lab  Chip  10,  3355-3362）。水溶液を表面に適用し、その後溶液を疎水性溶液（例えば、フルオロカーボン油、例えばＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  ＦＣ４０）と交換すると、水相のフェムトリットルからピコリットルスケールの液滴は、表面の親水性部分に結合したままであり（次に、これはフルオロカーボン油によって取り囲まれる）、このように区画化された反応としての役目を果たすことができる。
【０１４１】
反応を、フェムトリットルまたはピコリットルスケールの体積に区画化するために使用される方法および試薬は、上記で言及した方法および試薬、ならびにデジタルＰＣＲおよびデジタルＥＬＩＳＡ法のために使用される方法および試薬を含む、当技術分野で公知である他のそのような方法および試薬を含む（総説：  Basu,  A.S.  (2017a).  Digital  Assays  Part  I:  Partitioning  Statistics  and  Digital  PCR.  SLAS  Technol  22,  369-386;  Basu,  A.S.  (2017b).  Digital  Assays  Part  II:  Digital  Protein  and  Cell  Assays.  SLAS  Technol  22,  387-405を参照されたい）。これらの方法は、チャンバーに基づく区画化アプローチおよび油中水エマルジョンを含む。使用することができるエマルジョン油には、上記の油が挙げられる（シリコン油、フルオロカーボン油、例えばＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  ＦＣ４０）。油に界面活性剤を含めることは、そうでなければ反応物質の液滴表面への接着および／または油相への拡散に起因し得る反応試薬の喪失を低減することが公知である（Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０、および鉱物油の混合物は、Roach,  L.S.,  Song,  H.,  and  Ismagilov,  R.F.  (2005).  Controlling  nonspecific  protein  adsorption  in  a  plug-based  microfluidic  system  by  controlling  interfacial  chemistry  using  fluorous-phase  surfactants.  Anal  Chem  77,  785-796）が、安定な油中水エマルジョンを生成するために有効であることを示している界面活性剤／油混合物の一例である（Miller,  O.J.,  Bernath,  K.,  Agresti,  J.J.,  Amitai,  G.,  Kelly,  B.T.,  Mastrobattista,  E.,  Taly,  V.,  Magdassi,  S.,  Tawfik,  D.S.,  and  Griffiths,  A.D.  (2006).  Directed  evolution  by  in  vitro  compartmentalization.  Nat  Methods  3,  561-570）。
ピコリットルおよびフェムトリットルスケールの酵素反応の検出方法
【０１４２】
検出方法は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラ、電子増倍型電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）カメラ、相補的金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラ、または光増倍管（ＰＭＴ）を備えた蛍光顕微鏡による反応の蛍光レベルの撮像を含む。油中の水性液滴（エマルジョン）中の蛍光を撮像する場合、液滴を、マイクロ流体デバイス内で撮像することができる。フローサイトメーターは、デジタルＰＣＲのためにマイクロスケールビーズ上に固定された蛍光シグナルを検出するために使用されている（Dressman,  D.,  Yan,  H.,  Traverso,  G.,  Kinzler,  K.W.,  and  Vogelstein,  B.  (2003).  Transforming  single  DNA  molecules  into  fluorescent  magnetic  particles  for  detection  and  enumeration  of  genetic  variations.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  100,  8817-8822）。レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）サイトメトリーもまた、Ｂｉｏ−ＲａｄおよびＲａｉｎｄａｎｃｅデジタル液滴ＰＣＲシステムにおいて蛍光を検出するために使用されている。同様に、（Miller,  O.J.,  Bernath,  K.,  Agresti,  J.J.,  Amitai,  G.,  Kelly,  B.T.,  Mastrobattista,  E.,  Taly,  V.,  Magdassi,  S.,  Tawfik,  D.S.,  and  Griffiths,  A.D.  (2006).  Directed  evolution  by  in  vitro  compartmentalization.  Nat  Methods  3,  561-570）に記載されるように、エマルジョンが水中油中水エマルジョンとして生成される場合、フローサイトメーターを使用して、小さい体積の液滴を使用する区画化反応構成のいずれかの蛍光を測定することができる。
追加のフルオロフォア、クエンチャー、およびリンカー
【０１４３】
本発明のプローブのために使用され得る本文書に記載のものに加えて、他のフルオロフォア、クエンチャー、およびリンカーが、11th  Edition  of  the  Molecular  Probes  Handbook-  A  Guide  to  Fluorescent  Probes  and  Labeling  Technologiesに記載されており、これらはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｐｒｏｂｅｓ−ｔｈｅ−ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｈｔｍｌにてオンラインで見出すことができる。Ａｔｔｏ色素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって販売）もまた、適したフルオロフォアである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｙ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ａｔｔｏ．ｈｔｍｌを参照されたい）。Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ蛍光クエンチャーなどの蛍光クエンチャーは、適したクエンチャーである。他の適したフルオロフォア、クエンチャー、および連結化学は、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ．ｃｏｍ／）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｔｏ−ｔｅｃ．ｃｏｍ／）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ）、およびＡｍｂｉｏｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｂｒａｎｄｓ／ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ａｍｂｉｏｎ．ｈｔｍｌ）の製品提供に見出され得る。
検出方法
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、患者が具体的な微生物による感染症を有するか否かを決定する。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、存在する病原体のレベルを定量し、これはバックグラウンドを臨床的に有意なレベルと識別するために重要である。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本発明のヌクレアーゼ検出方法は、食品の安全性のためにおよびバイオテロリズムを検出するために使用される。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、本発明は、試料中に存在する少なくとも１つの個々のヌクレアーゼを検出する方法であって、（ａ）少なくとも１つのヌクレアーゼを含有することが疑われる水性試料に、少なくとも１つの検出組成物を接触させて、水性反応混合物を形成するステップであって、検出組成物が、水溶液と、磁気マイクロビーズに作動可能に連結した基質プローブとを含むピコ液滴を含み、基質プローブが、（ｉ）２〜７５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャーを含む、ステップと、（ｂ）水性混合物を油中で乳化し、エマルジョン中でピコリットルスケールの液滴を形成するステップと、（ｃ）ヌクレアーゼが存在すればマイクロビーズに連結した基質プローブを消化するように、エマルジョン中のピコリットルスケールの液滴をインキュベートするステップと、（ｄ）マイクロビーズを回収するステップと、（ｅ）マイクロビーズから発する蛍光を検出するステップとを含む方法を提供する。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、方法は、（ｆ）マイクロビーズの蛍光をフローサイトメトリーによって定量するステップをさらに含む。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、方法は、（ｆ）マイクロビーズの蛍光を顕微鏡によって定量するステップをさらに含む。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、試料は血液、血清、血漿、または血液抽出物（例えば、血液から精製した１つもしくは複数のヌクレアーゼ）、便、汗、皮膚抽出物、尿、滑液、腹水、脳脊髄液、硝子体液、肺洗浄液、または鼻抽出物、あるいはこれらの試料のいずれかに由来する材料である。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、試料を十分に希釈して、ヌクレアーゼを有する一部のピコ液滴と、ヌクレアーゼを有しない一部のピコ液滴とを生じる。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、油は、鉱物油、ＡＢＩＬ  ＷＥ０９、およびＴｅｇａｓｏｆｔ  ＤＥＣの混合物；またはシリコン油；またはＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  ＦＣ４０などのフルオロカーボン油；またはＳｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０、および鉱物油の混合物である。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、インキュベートするステップは、２〜１０時間である。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、インキュベートするステップは、４〜５時間である。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）において水性試料に、２つの検出組成物を接触させ、各々の検出組成物が異なる蛍光標識を有する。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、反応混合物の体積は、ナノリットルより小さい。
【０１５７】
本発明を、以下の非制限的な実施例によって例証する。
【実施例】
【０１５８】
（実施例１）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのマイクロコッカスヌクレアーゼを検出するために消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用したこれまで公表されていない実験から、このヌクレアーゼの約３３０個もの少ない分子を、約５０マイクロリットルの反応において検出できることが示された。これらは、Burghardt,  E.  L.  et  al.  Rapid,  Culture-Free  Detection  of  Staphylococcus  aureus  Bacteremia.  PLoS  One  11,  e0157234,  doi:10.1371/journal.pone.0157234  (2016）に記載される方法に基づいた。この超高感度によって、本研究者らは、そのようなプローブが、単一のヌクレアーゼ分子の検出を可能にするか否かを検討した。反応体積を（例えば、ピコリットルスケールに）縮小する方法が、マイクロリットルスケールの反応で観察された感度を超える検出感度の実質的な増加を可能にし得ることは理にかなっていた。消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブフォーマットによるプローブのヌクレアーゼ消化は、非消光フルオロフォアが結果として反応に放出されることにより検出される。これらのフルオロフォアは、拡散のためにより大きい体積の反応では希釈され、そのためにそれらを検出する能力が低減する。より小さい反応体積では、その拡散が小さい反応体積によって制限されることから、活性化プローブは濃縮されたままである。さらに、プローブをビーズに固定することは、消化されたフルオロフォアを濃縮状態に維持する簡便な方法を提供し、このように、プローブ活性化の検出を容易にする。
【０１５９】
小さい体積の反応において個々のヌクレアーゼ分子を検出することが可能であれば、各々の反応は、ヌクレアーゼに関して陽性または陰性であるとスコアをつけることができることから、検量線の必要なく、試料中に存在するヌクレアーゼの数を定量することが可能であろう。酵素反応の進行は一般的に非線形であることから、これは酵素の定量を複雑にするが、各々の反応におけるヌクレアーゼの存在を全か無かで説明することによって、開始試料中に存在するヌクレアーゼの総数の単純な計算が可能となる。陽性反応中に存在するヌクレアーゼの総数を、陽性および陰性反応の総体積で除算すると、試料中のヌクレアーゼ濃度を生じる。複数のヌクレアーゼがいくつかの反応に存在する条件では（これらは、単一のヌクレアーゼのみを有する反応と区別ができない場合がある）、ヌクレアーゼの総数は、陰性である反応の分画から計算することができる（例に関しては以下を参照されたい）。反応におけるヌクレアーゼのランダム分布は、ポアソン分布によって説明され、１、２、３個等のヌクレアーゼ分子を有する反応の分画の各々は、陰性反応の分画の測定後に計算することができ、ヌクレアーゼの総数の計算を生じる。これは、総体積と共に、ヌクレアーゼ濃度の測定を提供する。ヌクレアーゼ定量のこのアプローチは、小さい体積のＰＣＲ反応を使用して、全か無かのＰＣＲ増幅を介して試料中に存在する鋳型ＤＮＡ分子の数を定量する、デジタルＰＣＲに関して開発されている概念に基づいて構築される（Vogelstein,  B.  &  Kinzler,  K.  W.  Digital  PCR.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  96,  9236-9241  (1999)）。
【０１６０】
小さい反応体積が、消光した蛍光プローブによるヌクレアーゼ検出の感度を増強する可能性を探索するために、デジタルＰＣＲ（ＢＥＡＭｉｎｇとして公知）に関して開発されたプロトコールを、磁気ビーズに固定されたポリ−デオキシチミジン消光蛍光プローブによってマイクロコッカスヌクレアーゼを検出するように適合させた（Diehl,  F.  et  al.  BEAMing:  single-molecule  PCR  on  microparticles  in  water-in-oil  emulsions.  Nat  Methods  3,  551-559,  doi:10.1038/nmeth898  (2006);    Dressman,  D.,  Yan,  H.,  Traverso,  G.,  Kinzler,  K.  W.  &  Vogelstein,  B.  Transforming  single  DNA  molecules  into  fluorescent  magnetic  particles  for  detection  and  enumeration  of  genetic  variations.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  100,  8817-8822,  doi:10.1073/pnas.1133470100  (2003)）。ビーズ上のプローブ分子の消化によって、ビーズ表面上に非消光フルオロフォアが残され、これによって蛍光ビーズが得られる（本プロトコールのプローブカップリングビーズを、ＢＥＡＭｉｎｇデジタルＰＣＲプロトコールのＰＣＲプライマーカップリングビーズと置き換えた）。このアプローチの考え方は、これらのプローブカップリングビーズの水性懸濁液を、ヌクレアーゼの希薄濃度を含有する水性試料と混合し、次にこの混合物を油中で乳化し（この条件は、ＢＥＡＭｉｎｇデジタルＰＣＲプロトコールにおいて開発および記載された）、何百万もの小さい体積（ピコリットルスケール）の液滴を産生するというものである。これらの液滴のサブセットは、ビーズを含有するが、希薄なヌクレアーゼ試料と共に調製したビーズ含有液滴では、一部の液滴は、ヌクレアーゼ分子を含有せず、他は１、２、３個等のヌクレアーゼ分子を含有する。エマルジョンを一定期間インキュベートして、液滴中に存在するヌクレアーゼ分子に、ビーズ上のプローブ分子を消化させた後、ビーズをエマルジョンから回収し、その蛍光を測定する。単一分子の検出感度が達成されれば、１つまたは複数のヌクレアーゼ分子を有する液滴中の全てのビーズは、上昇した蛍光を有し、ヌクレアーゼ分子を有しない液滴中に存在するビーズと識別することができる。
【０１６１】
以下のデータは、デジタルヌクレアーゼ検出の概念の裏付けとなる。ビオチンによって５’末端が標識されたデジタルヌクレアーゼプローブ（図２）は、ストレプトアビジンコーティングビーズ（直径１μｍのビーズあたり約３５０，０００個のプローブのコピー）に対するプローブの取り付けを可能にする。プローブがヌクレアーゼによって消化されると、クエンチャーを放出し、蛍光ビーズをもたらす。ビーズの水性懸濁液を油中で乳化することによって、ビーズを小さい液滴として単離させる（図８）。水性懸濁液に非常に低濃度のヌクレアーゼを含めると、ビーズと、１）ヌクレアーゼ分子を有しない、または２）１つもしくは複数のヌクレアーゼ分子のいずれかとを含有する液滴を生じる。蛍光測定によるこの２つの反応集団を識別する能力によって、デジタル分子検出が可能となる。図９Ａ〜９Ｃおよび１０に示す実験では、反応は緩衝剤のみ（左のパネル）、高濃度のＭＮ（２．５６ｎＭ、中央のパネル）または低濃度のＭＮ（２．５６ｐＭ、右のパネル）を含んだ。図９Ａ〜９Ｃおよび１０（右のパネルを参照されたい）に示すように、そのプローブが消化されていない集団と比較してそのプローブが消化されているビーズ集団はそれぞれ、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって明白に識別することができる。デジタルＰＣＲに関して、試料中の標的分子の濃度は、標的分子が液滴全体にポアソン分布を示す限り、非活性化ビーズの分画から直接計算することができる（以下の計算を参照されたい）（Vogelstein,  B.  &  Kinzler,  K.  W.  Digital  PCR.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  96,  9236-9241  (1999);  Beer,  N.  R.  et  al.  On-chip,  real-time,  single-copy  polymerase  chain  reaction  in  picoliter  droplets.  Anal  Chem  79,  8471-8475,  doi:10.1021/ac701809w  (2007)）。
【０１６２】
使用した低濃度（２．５６ｐＭ）のヌクレアーゼによって、０、１、または小さい数のヌクレアーゼ分子を各々有する液滴の実質的な数が得られることから、この濃度を評価のために選択した。例として、この濃度によって調製した直径１０μｍの液滴は、液滴あたり０．８０８個の平均ヌクレアーゼ分子数を有する（評価したより高濃度のヌクレアーゼに関する平均値は、液滴あたり８０８個の分子である）。これらの条件に関して、ヌクレアーゼ分子のポアソン分布に基づくと、液滴の４５％は、０個のヌクレアーゼ分子を有し、３６％は１個のヌクレアーゼ分子を有する。この低濃度のヌクレアーゼを有する試料中で活性化されていない観察されたビーズの分画は、１３．５％であり、わずかにより大きい液滴のサイズと一貫した（直径約１３．５μｍ）。この試料における液滴のサイズの範囲（主に直径３〜１７μｍ以内）および液滴内のＭＮのポアソン分布モデリングに基づくと、これらのデータは、わずか１つのヌクレアーゼ活性が、液滴中に封入された場合に活性化ビーズを生じることと一貫する。
【０１６３】
液滴における分子の無作為分布を、以下のようにポアソン分布によってモデルとすることができる：ＭＮ分子ｘ個を有する液滴の確率は、ｆ（ｘ）＝（μｘｅ−μ）／ｘ！であり、式中、μは、液滴あたりのＭＮ分子の平均数である。１３．５％の陰性ビーズの場合（図１１および１２を参照されたい）、ｆ（０）＝０．１３５＝（μ０ｅ−μ）／０！＝（１ｅ−μ）／１＝ｅ−μである。等式の両側の自然対数をとると、ｌｎ（０．１３５）＝−２およびｌｎ（ｅ−μ）＝−μであり、式中、μは、液滴あたりＭＮ分子の平均数であり、２に等しい。
【０１６４】
各々１個のＭＮ分子を有する液滴の分画を、図１２に示されるように計算する。これらの分画（各々０〜８個のヌクレアーゼ分子を有する分画）は、液滴の９９．９７６％を占める。８個より多くのヌクレアーゼ分子を有する液滴が無視できる部分を構成することを考慮すると、試料中のマイクロコッカスヌクレアーゼの濃度を以下のように計算することが可能である。
全体で１９，９９５個（０．９９９７６×２０，０００）の液滴の場合、反応中のＭＮ分子の数は：
【数１】
2020535807.tif 000007
【０１６５】
液滴の直径に関して１３．５μｍ（これは、試料において観察された液滴の直径範囲内である）を使用すると、液滴の体積＝（４／３）＊π＊（１３．５μｍ／２）３＝１．２９×１０−１５ｍ３である。これに１，０００Ｌ／ｍ３を乗算してリットルに変換すると、１．２９×１０−１２Ｌ／液滴を生じる。上記に関して計算される液滴中の総体積は、０．９９９７６×２０，０００個の液滴×１．２９×１０−１２Ｌ＝２５．８×１０−９Ｌである。これにより、濃度は、（３９，９５６個のＭＮ分子）／（（２５．８×１０−９Ｌ）×（６．０２×１０２３分子／ｍｏｌｅ））＝２．５７ｐＭである。
【０１６６】
ＢＥＡＭｉｎｇプロトコールは、何百万ものピコリットルスケールの液滴を生じるが、液滴は均一なサイズではない。均一なサイズの液滴を産生するためにマイクロ流体法が開発されている（Anna,  S.  L.,  Bontoux,  N.  &  Stone,  H.  A.  Formation  of  dispersions  using  "flow  focusing"  in  microchannels.  Appl  Phys  Lett  82,  364-366,  doi:10.1063/1.1537519  (2003);  Kiss,  M.  M.  et  al.  High-Throughput  Quantitative  Polymerase  Chain  Reaction  in  Picoliter  Droplets.  Analytical  Chemistry  80,  8975-8981,  doi:10.1021/ac801276c  (2008)）。ヌクレアーゼ検出のための液滴を生成するためのこれらの方法の使用は、上記のデジタルヌクレアーゼ検出データからヌクレアーゼ濃度を計算するために必要な反応体積の決定を単純化する。
材料および方法
オリゴヌクレオチドプローブ
【０１６７】
ＰｏｌｙＴ  Ｃｙ５  Ｂｔｎオリゴヌクレオチドプローブは、以下からなった（ＩＤＴの命名法で記載）：５’−／５ビオチンＴＥＧ／／ｉＣｙ５／ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ＺＥＮ／／３ＩＡｂＲＱＳｐ／−３’、式中、５ビオチンＴＥＧは、その後にリンカーが続く５’末端でのビオチン部分を示し、ｉＣｙ５はＣｙ５フルオロフォアを示し、Ｔはデオキシチミジンヌクレオチドを示し、ＺＥＮは、ＩＤＴのＺＥＮクエンチャーを示し、３ＩＡｂＲＱＳｐは、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱクエンチャーを示す。使用したプローブのバッチの参照番号は、１５４３０７３０４である。凍結乾燥したプローブを、１００μＭの最終濃度となるようにＴＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９８４９）に溶解した。
プローブカップリング磁気ビーズの調製
【０１６８】
オリゴヌクレオチドプローブを、磁気ストレプトアビジンカップリングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号６５００１）にカップリングした。プローブをビーズにカップリングさせるために、ビーズ１００μｌを、洗浄緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１００μｌによって、毎回磁石を使用して水相からビーズを分離して２回洗浄した。次にビーズを、結合緩衝剤（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ）１００μｌと組み合わせた１００μＭ  ＰｏｌｙＴ  Ｃｙ５  Ｂｔｎプローブ１０μｌからなる溶液に再懸濁した。このビーズ懸濁液を、室温で３０分間インキュベートし、懸濁液を、１０分毎に軽くピペッティングして上下することによって混合した。次に液体を捨て、ビーズを洗浄緩衝剤によって３回洗浄し、洗浄緩衝剤１００μｌに再懸濁し、必要となるまで４℃で保存した。
マイクロコッカスヌクレアーゼ保存液の調製
【０１６９】
精製マイクロコッカスヌクレアーゼは、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（カタログ番号Ｌ５００４７９７、ロット番号Ｒ３Ｐ１４５８８）から得た。凍結乾燥ヌクレアーゼ１８，９４５単位（２２，３３０単位／ｍｇタンパク質）を、５０％ＤＰＢＳ（２価カチオンを含まない）、５０％グリセロールの１．８９５ｍｌに溶解し、−２０℃で保存した。保存液中のタンパク質の総質量＝１８，９４５単位／２２，３３０単位／ｍｇ＝０．８４８ｍｇ。保存液中のタンパク質濃度＝０．８４８ｍｇ／１．８９５ｍｌ＝０．４４８ｍｇ／ｍｌ＝０．４４８ｇ／Ｌ。モル濃度＝０．４４８ｇ／Ｌ／１６，９００ｇ／ｍｏｌ＝２６．５μＭ＝２６．５ｐｍｏｌ／μｌ。（２６．５×１０−１２モル／μｌ）×６．０２×１０２３分子／モル＝１．６０×１０１３分子／μｌである。
エマルジョン油の調製
【０１７０】
エマルジョン油は、７％（体積）ＡＢＩＬ  ＷＥ−０９（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｅｓｅｒｖ−Ａ−Ｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．、商品番号＃１００２６７−Ｌ１５１）、２０％（体積）鉱物油（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ３５１６）、７３％（体積）Ｔｅｇａｓｏｆｔ  ＤＥＣ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｅｓｅｒｖ−Ａ−Ｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．、商品番号２７０１７３−１５１）を組み合わせ、軽く混合し、および室温で少なくとも３０分間インキュベートして調製した。
反応の調製および実行
【０１７１】
マイクロコッカスヌクレアーゼを、保存溶液から反応緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で希釈し、１：１０，０００希釈液（２．６５ｎＭ）および１：１０，０００，０００希釈液（２．６５ｐＭ）を生じた。各希釈液または反応緩衝剤のみ（陰性対照）の１４５μｌを、プローブカップリング磁気ビーズ５μｌと組み合わせた。これによって、反応の水相中のマイクロコッカスヌクレアーゼの最終濃度は０、２．５６ｎＭ、および２．５６ｐＭとなった。反応中のビーズの濃度は、約２．８３×１０５ビーズ／μｌであった。次に、これらの混合物の各々を、５ｍｍスチールビーズおよびエマルジョン油６００μｌを含有する２ｍｌ  ＬｏＢｉｎｄ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に直ちに添加した。管を、Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩのカセットに直ちに入れて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒにおいて１５Ｈｚで１０秒間振とうさせた後、１７Ｈｚで７秒間振とうさせた。これによって、エマルジョン油に懸濁した水相液滴（その一部は、プローブカップリングビーズを含んだ）からなる何百万個もの反応を生成した。次に、各エマルジョン１６０μｌを、２−ｍｌ  ＬｏＢｉｎｄ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管４本の各々に移し、３７℃で５時間インキュベートした。最初の管に残った各エマルジョンの一部をプラスチック組織培養プレートにおいて画線培養し、液滴サイズのおおよその測定を提供するために、浜松ホトニクス株式会社の冷却ＣＣＤカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立顕微鏡において、明視野を使用して４０倍の対物レンズで撮像した。
エマルジョンからのビーズの回収
【０１７２】
反応時間の終了時、溶解緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）３００μｌを各管に添加し、Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩのカセットに直ちに入れて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒにおいて２０Ｈｚで３０秒間振とうさせた。次に、管を３，２００×Ｇで２分間遠心分離させた。各々の油層を真空ラインに接続したピペットの先端によって除去した。さらなる溶解緩衝剤３００μｌを各々に添加し、管を３，２００×Ｇで再度２分間遠心分離させた。次に管を磁石の上に置き、液体を除去して捨てた。管４本（特定の反応に属する管）の各々の対応するセットからのビーズを、それらを洗浄緩衝剤１００μｌ中に懸濁することによって組み合わせた。次に、各試料を再度磁石の上に置いて、液体を捨て、ビーズを新しい洗浄緩衝剤１００μｌに再懸濁した。次に、ビーズを倒立顕微鏡によって撮像し、フローサイトメトリーによって評価して、後に分析するまで４℃で保存した。
反応したビーズの撮像
【０１７３】
各回収したビーズ試料１０μｌを、ピペットでＭａｔｔｅｋ撮像皿（カタログ番号Ｐ３５Ｇ−１．５−２０−Ｃ）のガラス表面上に載せ、Ｃｙ５の蛍光フィルター、冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス株式会社）および４０倍油浸対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立蛍光顕微鏡によって撮像した。ビーズがカバーガラス上に沈降した後、各試料に関していくつかの明視野およびＣｙ５蛍光画像を獲得した。
反応したビーズのフローサイトメトリー
【０１７４】
各ビーズ試料の蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを使用して、その前方散乱および側方散乱プロファイルが、それらが単一ビーズとして存在する（複数または凝集ビーズではない）ことを示すビーズ１０，０００〜２０，０００個の蛍光を測定した。Ｃｙ５チャネルの蛍光をこれらのビーズに関して記録した。
（実施例２）
【０１７５】
本実施例では、エマルジョンを生成するために、プローブカップリングビーズ、エマルジョン混合物、および機器（Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ）を使用した。ビーズは、ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓであった。これらを上記のプローブにカップリングさせた。エマルジョン油は３つのエマルジョン油の混合物であった。これらを以下のように組み合わせた：７％ＡＢＩＬ  ＷＥ０９、２０％鉱物油、７３％Ｔｅｇａｓｏｆｔ  ＤＥＣ。酵素（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのマイクロコッカスヌクレアーゼ）は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎから購入し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２中で希釈した。各反応に関して、各酵素希釈液１４５マイクロリットルをプローブカップリングビーズ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に懸濁した）５マイクロリットルと組み合わせた後、エマルジョン油混合物６００マイクロリットルおよび５ｍｍスチールビーズと組み合わせた。これらの混合物を、Diehl,  F.  et  al.  BEAMing:  single-molecule  PCR  on  microparticles  in  water-in-oil  emulsions.  Nat  Methods  3,  551-559,  doi:10.1038/nmeth898  (2006)に記載されるようにＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩによって振とうさせた。各反応の一部を、この時点で組織培養皿において画線培養し、明視野顕微鏡によって撮像し、エマルジョンが形成されていることを確認した。次に、反応を３７℃で５時間インキュベートした後、論文に記載されているようにエマルジョンを破裂させてビーズを回収した。次に、ビーズを、Ｃｙ５にとって適切なフィルターを使用して蛍光顕微鏡によって撮像した。ビーズの蛍光を、フローサイトメーター（ＬＳＲバイオレット）によって定量した。
【０１７６】
前述の明細書および実施例は、本発明を完全に開示および可能にするが、それらは本明細書に添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限しないと意図される。
【０１７７】
全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明は、そのある特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細が例示目的のために記載されているが、本発明は、追加の実施形態が可能であり、本明細書に記載のある特定の詳細は、本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変化し得ることは、当業者には明らかであろう。
【０１７８】
用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」、ならびに本発明を記載する文脈における類似の言及は、本明細書において特に別段示していない限り、または本文と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に指摘していない限り、制限のない用語であると解釈される（すなわち、「これらに限定されないが含む」ことを意味する）。本明細書における値の範囲の引用は、本明細書において特に別段示していない限り、その範囲内に入る各々の個別の値に個々に言及する簡略法としての役目を果たすと単に意図され、各々の個別の値は、それが本明細書において個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、特に別段示していない限り、または本文と明らかに矛盾しない限り、任意の適した順序で実施することができる。本明細書に提供される、いずれかのおよびすべての実施例の使用、または例を示す言語（例えば、「例えば」）は、本発明をよりよく例証することを単に意図しており、特許請求される場合を除き、本発明の範囲に対して制限を与えない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実践にとって必須であると示していると解釈してはならない
【０１７９】
本発明を実施するために本発明者らに公知である最善の様式を含む本発明の実施形態を本明細書に記載する。それらの実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことによって当業者に明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を必要に応じて採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載している内容とは異なるように実践されることを意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲において引用される主題の全ての改変および均等物を含む。その上、その全ての起こり得る変形形態における上記の要素のいずれかの組合せは、本明細書において特に別段示していない限り、または本文と矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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