(57)【要約】  本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は藻類から抗酸化物質を生産するための方法に関する。好ましくは、本発明は、２０１７年１０月２日付のスパニッシュ・バンク・オブ・アルジー（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）の受託番号ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂの微細藻類ムリエロプシスｓｐ（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ属の種）からの、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスの生産と、および動物飼料またはヒトの飲食のための調製におけるその使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高いルテイン含量と低い金属含量をもつバイオマスを生産するための、微細藻類ムリエロプシスｓｐ（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ属の種）の野外すなわち「屋外」における培養方法であって、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）の受託番号ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂのムリエロプシスｓｐ株を、海水および、培地ＵＭＡ５またはＦ／２において培養すること、そして次に収穫物をデカンテーションしてペレットを収集し、これを任意で遠心分離し、洗浄し、凍結および凍結乾燥することを含む、該方法。
【請求項２】
前記培養が、ＵＭＡ５培地を用いて実施される、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培養が、Ｆ／２培地を用いて実施される、請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記培養が、開放水路型の系において実施される、請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記培養が、開放プールにおいて実施される、請求項１に記載の培養方法。
【請求項６】
前記洗浄および遠心工程が、飲用水を用いて少なくとも２回実施される、請求項１に記載の培養方法。
【請求項７】
前記微細藻類の培養が、０．２ｇ／Ｌ以上の初回接種濃度を用いて実施される、請求項１に記載の培養方法。
【請求項８】
前記微細藻類の培養が、０．３ｇ／Ｌ以上の初回接種濃度を用いて実施される、請求項４に記載の培養方法。
【請求項９】
前記微細藻類の培養が、０．４ｇ／Ｌ以上の初回接種濃度を用いて実施される、請求項４に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は微細藻類からの抗酸化物質の生産のための方法に関する。好ましくは、本発明は、２０１７年１０月２日付のスパニッシュ・バンク・オブ・シーウィード（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｓｅａｗｅｅｄ）の受託番号ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂの微細藻類ムリエロプシスｓｐ（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ属の種）からの、高いルテイン含量と低い金属含量をもつバイオマスの生産と、および動物飼料またはヒトの飲食のための調製におけるその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的な傾向は、生産プロセスにおける化学物質、染料、抗体などの有機的生産および置換に関連する。この意味において微細藻類は、それらが生み出す広範囲な天然産物を考慮すれば、高度に多様な適用によって、多種多様な生物工学的応用のための良好な可能性を示している。
【０００３】
微細藻類は、食品から化学物質およびバイオ燃料まで、ヒトにとり有用な種々の化合物の潜在的な供給源として、長年にわたり想定されてきた。しかしながら、現在それらを入手することはそれほど経済的ではなく、それ故その実行の可能性は、生産されるべき目標製品のその生産コストに対する最低価格によって示される。こうした状況において、抗酸化物質の生産は、ともに微細藻類をベースとする操作を支持することも可能な、その市場の成長と魅力的な価格とを考慮すれば、良好な機会を示している。
【０００４】
この傾向において、微細藻類ムリエロプシスｓｐから入手可能なルテインは、変性疾患、特に、黄斑変性、白内障、および動脈硬化症の防止および治療におけるその有益な治療効果に関し、北米ＦＤＡによって推奨された１０の「健康な」物質の１つとして登録されている。ムリエロプシスｓｐは、多量のルテイン（乾燥重量の０．５と１％の間）を生産する能力をもつ単細胞緑藻である。
【０００５】
一方、近年の加速的な人口増加においては、その加齢および関連する疾患は、今日、世界においてますます増加する懸念である。その結果として、育てやすく、収益性が高く、かつ持続可能である食品の代用源の探索を通して、栄養上の需要に備えることが必要である。この点については、微細藻類の培養の応用に関する研究は、養殖産業のためまたは商業的価値の高い化合物の生産のためにかなり増加しており、該化合物の中でも多価不飽和脂肪酸およびカロテノイド色素を見出すことができる。これらの色素は、魚の餌に混入するため、およびヒトの食事における栄養補助食品として使用されてきた。
【０００６】
特許文献１は、緑藻ルテインを、特にクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）（受託番号ＣＣＡＰ２１  １−３２、英国カルチャーコレクション・オブ・アルジー・アンド・プロトゾア（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｚｏａ）において寄託）から得るためのプロセスを開示しており、これは、２０ｍＭから６０ｍＭまでの酢酸塩中で育てられかつおよそ２００から１．５００μｌ（Ｅｍ２ｓ１）の光を放射された場合、全カロテノイドの少なくとも約９０重量％を産生し、その後、それは収穫物からルテインを得るべく収穫される。抗酸化剤、例えばアルファ−トコフェロールが、収穫の前または後に付加的に添加され得る。また、ルテインが富化された製品を調製するための方法が開示され、これは、微細藻類クロレラ・ソロキニアナを２０から６０ｍＭの酢酸塩中で培養すること、および約２００から１，５００μ／（Ｅｍ２ｓ１）の光を放射すること、および収穫して濃縮された懸濁液を生成すること、ならびに任意でかつ付加的に、濃縮懸濁液の細胞を破壊すること、およびそれらを乾燥させてルテインまたはルテインが富化された製品を得ることを含む。この藻類は約２０から約４０℃の間の温度で増殖し、かつ光照射、化学的ストレス、塩、温度、または酸化ストレスというストレス条件の下に行われ得る。製品は、５を超えるルテイン／ゼアキサンチン比、および１０未満のクロロフィルＡ／ルテイン比を有する。かくて緑藻からのルテインの高生産が得られる。ルテイン、およびルテインが富化された製品は、栄養補助食品および／または食品添加物、または化粧品もしくは医薬品の原料としての使用に適する。
【０００７】
特許文献２は、微細藻類バイオマスからのルテイン富化組成物の調製であって、前記バイオマスの細胞溶解物を調製すること、およびそれを、１５重量％を超える乾物含量まで濃縮すること、該溶解物を極性溶媒で処理すること、およびルテインおよび脂質を含有する油性樹脂を得ること、該油性樹脂を２５ＭＰａおよび４０ＭＰａの圧力および３５℃から９０℃の温度においてＣＯ２の超臨界液の形態にある非極性溶媒で抽出して、トリグリセリドを含有する非極性脂質画分とルテインに富む不溶性画分とを得、そして前記不溶性画分を回収することによる、該調製を開示している。極性溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、ブタノールおよびイソブタノール、エステルおよびケトンから、単独でまたは組合せて選択される。該微細藻類は、クロレラ科に属する。ルテインに富む画分は、医薬組成物、栄養補助食品、および食品において有用である。
【０００８】
特許文献３は、微細藻類においてルテインを蓄積するための方法であって、培養物の希釈後に光により誘導可能な従属栄養培養物を調製すること、および任意で、藻類を収穫して、細胞密度０．１−１０ｇ／リットルの従属栄養藻類から希釈されたアルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）の溶液を用いてルテインを分離および抽出する、該方法を教示する。培養は有機炭素を含まず、かつｐＨ４．０−９．０において実施される。微細藻類は、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、およびクロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）から選択され得る。培養は光によって誘導され、かつ微細藻類の希釈溶液を含む。培養温度は５−５０℃の間であり、強度０．１−１５０ｋｌｘの連続光または間欠光を用いて、１から１５０時間にわたり培養される。この方法はさらに、藻類の乾燥粉末または生物活性物質の混合後に、ルテインを含む藻類色素を、分離および抽出によって取り出すことを含む。このように、それは、光により誘導される微細藻類の従属栄養培養においてルテインの迅速な蓄積を可能にする方法を教示し、またそれにより、産業化され得る方法を提供する。
【０００９】
特許文献４は、収集された細胞を破壊すること、およびそれらを乾燥させてルテインまたはルテインが富化された組成物を得ることにより、より生物学的利用能の高いルテインをいかに入手するかを記載することに加えて、ビーズを使用し、これにおいてマス懸濁液が適当な抗酸化剤の存在下に水を分解してルテインの酸化を防止する。乾燥後、小径粒子の粉末化された生成物が得られ、これを直接ヒトの飲食のための食品用途において、または他の成分と混合してアクアフィード用に使用し得る。ルテインは、栄養補助食品または医薬品を調合する目的で、非極性溶媒または超臨界溶媒を用いた抽出により濃縮され得る。それ故、本発明の技術的問題は、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスを、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）の受託番号ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂの微細藻類ムリエロプシス（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）種から生産するための代替え法、および動物飼料またはヒトの飲食のための調製におけるその使用を提供することである。
【００１０】
非特許文献１は、屋外の管状光バイオリアクタにおける単細胞緑藻ムリエロプシスｓｐの希釈率、混合、ならびに、ルテインおよびバイオマス産生の毎日の太陽サイクルについての研究である。ルテインの生産性の最高値は、１日当たり約１８０ｍｇ／ｍ２であり、バイオマスは、１日当たり約４０ｇ（ドライベース）／ｍ２であった。最適な希釈率は、最低値０．０６／ｈから最大値０．０９／ｈまでの範囲であった。約４％の光合成効率に類似した値が記録され、培養条件の最適化が確認された。毎日の太陽サイクルは、１日の最初の数時間の間は、照射に応答してムリエロプシスｓｐのルテイン含量に迅速な増加を示し、最大ルテイン含量は、正午に乾燥重量で約６ｍｇ／ｇであった。細胞増殖における増加は、最大のクロロフィル・ルテイン比の達成後に確認され、そのことは、ルテインが細胞の光障害からの防御に関与していることを示唆するものであろう。
【００１１】
非特許文献２は、１５株の微細藻類のカロテノイドプロフィールを調べている。ルテイン、ベータ−カロテン、およびビオラキサンチンが全ての株に存在し、全般的にはルテインが最も豊富であった。カンタキサンチンおよびアスタキサンチンは、いくつかの株にのみ見出された。クロレラ・フスカ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）ＳＡＧ  ２１１−８ｂ、クロロコックム・シトリフォルメ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｅ）ＳＡＧ  ６２．８０、ムリエロプシスｓｐ、ネオスポンギオコックム・ゲラチノスム（Ｎｅｏｓｐｏｎｇｉｏｃｏｃｃｕｍ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｍ）ＳＡＧ  Ｂ  ６４．８０、およびクロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＣＣＡＰ  ２１  １／１４は、高レベルのルテインを示した。クロレラ・ゾフィンギエンシスＣＣＡＰ  ２１  １／１４はまた、高レベルのアスタキサンチンも示した。ムリエロプシスｓｐは、３５ｍｇ／リットル培養物までの高いルテイン含量、０．１７−０．２３／ｈまでの高い増殖速度、および８ｘ１０１０細胞／リットル培養物までの細胞密度を示した。ルテインレベルは、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）におけるアスタキサンチン、およびカロテノイドを生産するために興味が認められた微細藻類、ドナリエラ（Ｄｏｎａｌｉｅｌｌａ）におけるベータ−カロテンについて報告されたものの範囲内にある。ムリエロプシスｓｐのルテイン含量は、対数増殖期の間増加し、定常期初期には高い値が記録された。収穫物ムリエロプシスｓｐにおけるルテインの最大レベル。それらは、２０−４０ｍＭ  ＮａＮＯ３、２−１００ｍＭ  ＮａＣｌ、４６０マイクロモルの光子／ｍ２ｓ１、ｐＨ６．５、および２８℃において記録され、一般に細胞増殖にも最適な条件であった。増殖制限条件は、６または９のｐＨ値、および３３℃の温度であり、またムリエロプシスｓｐにおけるカロテノイド生成も刺激した。この研究は、該株が、養殖および家禽における応用のため、ならびに癌および網膜の変性に関連する疾患の予防のための、商業的興味のカロテノイドであるルテインの、潜在的な供給源を意味することを示している。非特許文献３は、攪拌された開放池における微細藻類の増殖、およびそのカロテノイドを蓄積する能力を研究し、開放系における細胞増殖が主たるカロテノイドとして遊離ルテインを有していたこと、またそこにはビオラキサンチン、β−カロテン、およびネオキサンチンも存在したことを結論付けた。乾燥バイオマスのルテイン含量は、増殖条件および環境に依存して、０．４から０．６％の範囲内である。加えて、ムリエロプシスｓｐのバイオマスは、高いタンパク質および脂質含量を有しており、約半分が多価不飽和脂肪酸で、ほぼ３０％がα−リノレン酸であった。半連続的な系の下で生産的作物を維持するための開放池における培養の性能と、バイオマスおよびルテインの収量とを決定するパラメータの影響は、閉鎖された管状光バイオリアクタにおいて得られたものよりも高くはなく、かつ夏季には約１００ｍｇルテイン／ｍ２日１を含有する、２０ｇの乾燥バイオマスという生産性の値に達していた。それ故この研究は、ルテインを生産するための、開放プールにおけ���ムリエロプシスｓｐの屋外培養の可能性を確証している。したがって、本発明は、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）の受託番号ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂの微細藻類ムリエロプシスｓｐの、海水中での安定な培養系であって、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスを微細藻類ムリエロプシスｓｐから生産することを可能にする該系と、その動物飼料またはヒトの飲食のための調製における使用とを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０１９６８９３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／０２２５３２２号明細書
【特許文献３】中国特許第１０２０９４０６１号明細書
【特許文献４】欧州特許第１８０８４８３号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌｕｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｉｎ  ａｎ  ｏｕｔｄｏｏｒ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（屋外管状光バイオリアクタにおけるムリエロプシスｓｐによるルテイン生産）「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００１年２月２３日、第８５巻、第３号、Ｐ．２８９−２９５
【非特許文献２】Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｎ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ：Ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｌｕｔｅｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類に属する微細藻類のカロテノイド含量：ムリエロプシスｓｐ（緑藻植物門）におけるルテイン蓄積を決定する因子）「Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、２０００年１月７日、第７６巻、第１号、Ｐ．５１−９
【非特許文献３】Ｏｕｔｄｏｏｒ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｉｎ  ｏｐｅｎ  ｐｏｎｄｓ（開放池でのムリエロプシスｓｐのルテイン富化細胞の屋外培養）「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００７年１月、第７３巻、第６号、Ｐ．１２５９−１２６６
【発明の概要】
【発明を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、アタカマ砂漠に固有の淡水株を使用する。この株は、２０１７年１０月２日付のスパニッシュ・バンク・オブ・アルジー（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）の受託番号ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂのムリエロプシスｓｐ（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ属の種）であり、カロテノイド色素、特にルテインの天然供給源として可能性をもち、これにおいて得られる濃度は０．３乾燥重量％から０．６乾燥重量％の範囲内である。これらの値は、０．０３％というそのルテイン産生が報告されているこの色素の現在の供給源、花卉タゲテス・エレクタ（Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ）、一般名カレンデュラ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）の花弁から得られたものよりも１０倍から２０倍の間を示す。
【００１５】
ＵＭＡ５培地を加えた海水における、ムリエロプシスｓｐ（ＭＣＨ−３５、ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）株。研究室分析は、様々なバッチで得られたいくつかのバイオマスの近似の含量（灰分、タンパク質、脂質、ルテイン）のために実施された。灰分含量についての結果は、７．１５％および１１．８８％の範囲内であり、全てのサンプル間の平均値は１０．０６％であった。タンパク質含量は、８．７０から１２．０９の範囲内であり、平均は１０．３１であった。炭水化物含量は、６５．００％から７４．２５％の範囲内であり、平均値は６８．３７％であった。脂質含量は、８．９５％から１３．４８％の範囲内であり、平均値は１１．２６であった。水分は、１７．５８％から３１．５２％の範囲内であり、平均値は２５．９３％であった。ルテインのパーセントは、０．３７％から０．６６％の範囲内であり、平均値は０．５４％であった。クロロフィルａ、ｂ、および総カロテノイドの測定は、７日間にわたる、４バッチまたは複数のバッチの平均として実施され、それぞれ０．０６％；０．１０％；および０．０９％の範囲内の値であった。平均の７日の、４バッチのルテインのパーセント含量は、０．５３％であった。得られた結果によれば、１４ｍ３の水路において７日間にわたり戸外で培養された、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジーの受託番号ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂの微細藻類ムリエロプシスｓｐは、高い、抗酸化能、ポリオレフィンおよびルテイン含量をもち、良好な栄養素量と抗酸化特性とをもつ農産食品における使用への可能性を示す、バイオマスの生産を可能にする。
【００１６】
このカロテノイドの最高のパーセントが得られている、セネスデムス・アルメリエンシス（Ｓｃｅｎｅｓｄｅｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ）株から得られた参考値は、０．５５％ルテインである。現在、抽出によってルテインを入手するための一般的な供給源は、タゲテス・エレクタ（チャイニーズカーネーションまたはマリーゴールド）の花であり、その０．０３％が得られている（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００８年）。それ故、本発明は、ムリエロプシスｓｐのための、良好な抗酸化特性をもちかつ動物飼料またはヒトの飲食のための調製に有用である、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスを生産する目的のために有望な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ムリエロプシスｓｐの株ＭＥ３５、および培地Ｆ／２およびＵＭＡ５中で培養されたＭＥ３５の、培養物中のバイオマス濃度（ｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチ式で、またはバッチ別に、１、３、６、８、１０、１３、１５、１７、および２１日に得られ、培養は２０リットルボトルにおいて行われた。
【図２】ムリエロプシスｓｐの株ＭＥＯ、および培地Ｆ／２およびＵＭＡ５中で培養されたＭＥＯの、培養物中のバイオマス濃度（ｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチ式で、またはバッチ別に、１、３、６、８、１０、１３、１５、１７、および２１日に得られ、培養は２０リットルボトルにおいて行われた。
【図３】２つの培地Ｆ／２およびＵＭＡ５を用いた、ムリエロプシスｓｐ、ＭＣＨ３５、ＭＥ３５、ＭＣＨ０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、およびＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）の株培養物における、灰分、タンパク質、脂質、およびルテインのパーセントを示す図であり、データは、２０リットルボトル中で培養された、バッチまたはバッチ式における培養の２３日後に得られた。
【図４】２つの培地Ｆ／２およびＵＭＡ５を用いた、ムリエロプシスｓｐの株、ＭＥ３５、ＭＥ３５、ＭＣＨ０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、およびＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）の培養物における、ルテインのパーセントを示す図であり、データは、２０リットルボトル中で増殖された、バッチまたはバッチ式における培養の２３日後に得られた。
【図５】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５の、培養物中のバイオマス濃度（ｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチまたはバッチ式で、０、３、６、および１３日に得られた。括弧内の数字は、ボールが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図６】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５の、１３日のバッチまたはバッチ培養物中のバイオマス生産性（ｇ／Ｌ）を示す図である。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示し、空色のバーはＭＥ３５を、緑色のバーはＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）を示す。
【図７】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５の、培養物中の窒素濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチまたはバッチ式で、０、３、６、および１３日に得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図８】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５の、培養物中のリンの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチまたはバッチ式で、０、３、６、および１３日に得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図９】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５の株培養物中の、灰分、タンパク質、脂質、およびルテインのパーセントを示す図であり、データは、バッチ式またはバッチ式での培養の１３日において得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図１０】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥＯの、培養物中のバイオマスの濃度（ｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチまたはバッチ式で、０、３、６、および１３日に得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図１１】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥＯの、１３日のバッチ培養物中のまたはバッチ別のバイオマス生産性（ｇ／Ｌ）を示す図である。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示し、空色のバーはＭＥＯを、緑色のバーはＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）を示す。
【図１２】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨＯ（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）およびＭＥＯの、培養物中の窒素濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチまたはバッチ式で、０、３、６、および１３日に得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図１３】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨＯ（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）およびＭＥＯの、培養物中のリン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す図であり、データは、バッチまたはバッチ式で、０、３、６、および１３日に得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図１４】３つの濃度の初回接種材料を用いた、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥＯ培養物中の、灰分、タンパク質、脂質、およびルテインのパーセントを示す図であり、データは、バッチ式またはロット別の培養の１３日に得られた。括弧内の数字は、バルーンが接種されたｇ／Ｌを示す。
【図１５】バッチ式またはバッチ別で２５日にわたる、ＵＭＡ５培地を用いた４００リットル系における、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥＯの培養物におけるバイオマスの濃度（ｇ／Ｌ）を示す図である。
【図１６】バッチ式またはバッチ別で２４日にわたる、ＵＭＡ５培地を用いた４００リットル系における、ムリエロプシスｓｐの株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５の培養物におけるバイオマスの濃度（ｇ／Ｌ）を示す図である。
【図１７】バッチ式またはバッチ別で１７日にわたる、ＵＭＡ５培地を用いた４００リットル系における、ムリエロプシスｓｐＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５株の培養物におけるバイオマスの濃度（ｇ／Ｌ）を示す図である。
【図１８】ＵＭＡ５培地を用いた、海水中のチリおよびスペインのムリエロプシスｓｐ、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５、ならびに淡水中のＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥＯ株の培養物中の、灰分、タンパク質、脂質、およびルテインのパーセントを示す図であり、データは、４００リットルのバッグでの、バッチまたはバッチ式における培養の１３および１４日おいて得られた。
【図１９】４００リットルのボトル、ボール、およびバッグで実施された３つの実験における、ムリエロプシスｓｐ（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）の培養物におけるルテインのパーセントについて得られた値の要約を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
スパニッシュ・バンク・オブ・アルジーの受託番号ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂの、ＵＭＡ５培地を用いた海水中の、チリ産のムリエロプシスｓｐ株（ＭＣＨ−３５）。様々なバッチで得られた微細藻類のいくつかの培養物の、近似の含量（灰分、タンパク質、脂質、ルテイン）の研究室分析が実施された。灰分含量についての結果は、７．１５％および１１．８８％の範囲内であり、全てのサンプル間の平均値は１０．０６％であった。タンパク質含量は、８．７０から１２．０９の範囲内であり、平均は１０．３１％であった。炭水化物含量は、６５．００％から７４．２５％の範囲内であり、平均値は６８．３７％であった。脂質含量は、８．９５％から１３．４８％の範囲内であり、平均値は１１．２６％であった。水分は、１７．５８％から３１．５２％の範囲内であり、平均値は２５．９３％であった。ルテインの含量は、０．３７％から０．６６％の範囲内であり、平均値は０．５４％であった。クロロフィルａ、ｂ、および総カロテノイドの測定は、７日間の、４バッチまたは複数のバッチの平均として実施され、それぞれ以下の値：０．０６％；０．１０％、および０．０９％を得た。７日の、４バッチまたは複数のバッチのルテインパーセントの平均含量は、０．５３％であった。表３から７を参照。
【００１９】
得られた結果によれば、１４ｍ３の水路において７日間にわたり、屋外において海水中で培養された、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジーの受託番号ＢＥＡ＿Ｄ０１＿１１の微細藻類ムリエロプシスｓｐは、高い抗酸化能と、ポリフェノールおよびルテインの高い含量とを示しており、それは結果として、良好な栄養素量と抗酸化特性とをもつ潜在的な農産食製品を生じる。
【００２０】
この培養方法は１４ｍ３の水路プールにおいて実施され、凍結乾燥されたサンプルは、繊維分析に加えて、重金属分析（ヒ素、カドミウム、水銀、および鉛）に供された。分析の結果を、動物飼料向けの供給品における不純物の最大限度を規定するもの、例えば、重金属では、特にヒ素：４０ｐｐｍ；鉛：１５ｐｐｍ；水銀：０．３−０．５ｐｐｍ、およびカドミウム：１ｐｐｍに比較した場合、サンプルは結果として、最も使用されている基準による許容値を下回る値、すなわち、以下の値：ヒ素：１．８２３ｐｐｍ；鉛：０．２ｐｐｍ；水銀：０．１１１ｐｐｍ、およびカドミウム：０．２０ｐｐｍを生じた。さらに、微細藻類バイオマス中に含有された生繊維の量は４．４３ｇ／１００ｇであった。
【００２１】
７日の微細藻類培養物の総ポリフェノール（フェノール化合物）含量は、３２２ｍｇ  ＥＡＧ／１００ｇ試料の値を示す。一方１４日では、その値は２５４ｍｇ  ＥＡＧ／１００ｇ試料である。抗ラジカル活性は、７日および１４日についてＯＲＡＣ法を用いて評価され、以下の値：８．９７４および６．３１６μｍｏｌ  ＥＴ／１００ｇを得た。このことは、７日の培養物が、１４日に比較して３０％多い抗酸化活性をもつことを示す。ＯＲＡＣアッセイが、抗酸化活性に対する、所与の食品中に含有されるポリフェノールおよび非ポリフェノール化合物のいずれかによる貢献力発揮の測定を含むことに言及することは重要である。ウェブサイトｗｗｗ．ｐｏｒｔａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｓ．ｃｏｍにより提供された、果実における抗酸化活性および総ポリフェノール含量のデータベースのＯＲＡＣ値によって述べられたように、７日について得られた結果は、調べられたいくつかの果実と同様か、またはより優れている。報告された全１４７の果実から、ＭＣＨ−３５は９９位に位置されることとなる。
【００２２】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【実施例】
【００２３】
実施例１：海水および淡水中での種々の株の増殖
スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）の受託番号ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂのチリ産ムリエロプシスｓｐの株の増殖挙動を、任意に命名された（ＭＣＨ３５）を海水中で、および任意に命名された（ＭＣＨＯ）を淡水中で評価した。スペイン産ムリエロプシスｓｐの株、（ＭＥ３５）および（ＭＥＯ）もまた評価した。培養は、バイオマス濃度の増加に関する挙動を測定する目的で、２つの培地中で実施し、それにより屋外作物において使用されるべき培地を確認することが可能となった。
【００２４】
かくて、２０リトルボトルに、淡水および海水と、かつまた以下の２つの培地、Ｆ／２およびＵＭＡ５とを用いて、チリ産およびスペイン産の株を接種した。培養物を、以下のようにコードした：
培地Ｆ／２
ＭＣＨ３５  Ｆ／２（海水および培地Ｆ／２における、ムリエロプシスｓｐのチリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ））；
ＭＣＨＯ  Ｆ／２（淡水および培地Ｆ／２における、ムリエロプシスｓｐのチリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）の培養）；
ＭＥ３５  Ｆ／２（海水および培地Ｆ／２における、ムリエロプシスｓｐのスペイン産株の培養）
ＭＥＯ  Ｆ／２（淡水および培地Ｆ／２における、ムリエロプシスｓｐのスペイン産株の培養）；および
培地ＵＭＡ５
ＭＣＨ３５  ＵＭＡ５（海水およびＵＭＡ５培地における、ムリエロプシスｓｐのチリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）の培養）；
ＭＣＨＯ  ＵＭＡ５（淡水および培地ＵＭＡ５における、ムリエロプシスｓｐのチリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）の培養）
ＭＥ３５  ＵＭＡ５（海水およびＵＭＡ５培地における、ムリエロプシスｓｐのスペイン産株の培養）
ＭＥＯ  ＵＭＡ５（淡水および培地ＵＭＡ５における、ムリエロプシスｓｐのスペイン産株の培養）。
【００２５】
サンプルは、培養の１、３、６、８、１０、１３、１５、１７、および２１日に、水路から採取した。最後に、培養物はデカンテーションし、ペレットを各ボトルから収集して、後に遠心分離し、飲用水で２回洗浄し、次いで凍結および凍結乾燥した。
【００２６】
凍結乾燥物について、脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析を実施した。
【００２７】
培養は、０．０３および０．０７ｇ／Ｌの微細藻類を用いて開始した（図１および２）。培養の２１日では、最良の結果は、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）ＵＭＡ５（０．４１ｇ／Ｌであった）およびＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）ＵＭＡ５（０．４２ｇ／Ｌであった）とラベルされた培養物の微細藻類バイオマスの世代において得られた。培養物ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）Ｆ／２、ＭＥＯ  Ｆ／２、ＭＥＯ  ＵＭＡ５、ＭＣＨＯ（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）Ｆ／２の間では、何ら差異は確認されず、全てのこれらの場合に得られた結果は、０．３１ｇ／Ｌであった。
【００２８】
実施例２：チリ産の微細藻類株およびスペイン産の微細藻類株の屋外培養。海水中での屋外培養を評価するべく、ＭＥ３５  ＵＭＡ５およびＭＣＨ３５  ＵＭＡ５を選択した。培養は以下の結果を示した：０．２６ｇ／Ｌおよび０．４１ｇ／Ｌ（図１）。Ｆ／２を加えた海水中の結果（０．２０ｇ／Ｌおよび０．３１ｇ／Ｌ（図２）と対比して、前のものは良好ではあるが、培地とその他との間で、値の増加が有意であるようには見えない。
【００２９】
別の評価は、同じ株および条件を用いて実施されたが、しかし今回は、前の評価におけるよりも高くなるべき初回接種濃度であって、かつそれ故に、大量生産および生産性最適化に適した最小限の濃度である０．５ｇ／Ｌより高い微細藻類増殖を確保するための、該初回接種濃度を評価する。
【００３０】
図４は、日がたつにつれて減少するリンの消費を示しており、これは微細藻類培養においては正常である。図３は、微細藻類バイオマス中に存在する生化学化合物のパーセントを示す。培養の２３日後、灰分のパーセント値は、灰分のパーセント値が灰分１１．６４％であるＭＥ３５  Ｆ／２を除き、全ては類似し、かつ２．８２％から６．７２％の範囲内で異なっている。
【００３１】
タンパク質のパーセントは、１２．９１％から４４．１３％までの変異を示し、ＵＭＡ５およびＦ／２培地の双方を用いて海水中で増殖されたスペイン産株の場合の３０％よりも高く、かつ同様の手段を用いた淡水中での作物の場合の４０％よりも高い。双方の培地および淡水および海水中で培養されたチリ産株は、１３％の平均タンパク質値を示した。
【００３２】
脂質のパーセントは、１４．０９％から５３．６７％の変異を示し、Ｆ／２を用いて培養された淡水および海水におけるスペイン産株が、ＵＭＡ５中の淡水中のスペイン産株のように４０％より高い脂質含量をもつことがわかる。残りの培養物は、１５％の平均脂質パーセントを有する。
【００３３】
ルテインのパーセントは、０．１５％から０．６７％の範囲内である。４つの収穫物は、０．５５％よりも高い値を示した。培地Ｆ／２およびＵＭＡ５において海水中で増殖されたチリ産株と、ＵＭＡ５を用いた淡水中およびＵＭＡ５を用いた海水中で増殖されたスペイン産株とである（図４）。０．５５％ルテインというこの基準値は、この化合物の最高のパーセントがその株から得られた、セネスデムス・アルメリエンシス（Ｓｃｅｎｅｓｄｅｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ）から得られる。現在ルテインが抽出される供給源は、タゲテス・エレクタ（チャイニーズカーネーションまたはマリーゴールド）の花であり、その０．０３％が得られる（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００８年）。このように、ムリエロプシスｓｐの海水中での培養物がルテインの生産を可能にすることが確認される。
【００３４】
実施例３：ＵＭＡ５培地において海水および淡水を用いた初回接種濃度の評価
チリ産株ムリエロプシスｓｐの海水中（ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ））および淡水中（ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ））における初回接種濃度。スペイン産ムリエロプシスｓｐの株もまた評価された。海水中（ＭＥ３５）および淡水中（ＭＥＯ）のスペイン産株。研究は、既知の濃度の培養物（ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＥ３５、およびＭＥＯ）から実施した。これらを、１リットルバルーンへ、以下の体積：１６７ｍＬ、３３３ｍＬ、および５００ｍＬで添加し、次に海水および淡水をそれぞれ用いて９５０ｍＬとして、以下の作物を定義した：接種濃度０．２ｇ／Ｌの、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＥ３５、およびＭＥＯ（０．２ｇ／Ｌ）；、接種濃度０．３ｇ／Ｌの、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＥ３５、およびＭＥＯ（０．３ｇ／Ｌ）；接種濃度０．４ｇ／Ｌの、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＣＨＯ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＥ３５、およびＭＥＯ（０．４ｇ／Ｌ）。これらの培養にはＵＭＡ５培地を使用した。
【００３５】
各バルーンの１００ｍＬを採取して、乾燥重量分析と、硝酸塩およびリン酸塩の測定とを実施し、バルーンに８５０ｍＬを残し、そして蒸発水をオートクレーブされた飲用水で自動的に置き換えた。培養の３、６、および１３日に、５０ｍＬを採取して、乾燥重量、硝酸塩、およびリン酸塩の分析を実施した。実験の終わりに、培養物をデカンテーションし、全てのボールのペレットを収集し、各培養物のトリプリケートを合わせて６サンプルとし、これらを飲用水で２回洗浄し、そして遠心分離した。次にペレットを、脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析用に凍結および凍結乾燥した。図５は、初回濃度が０．１９７７ｇ／Ｌ；０．３３１０ｇ／Ｌ；０．３９１０ｇ／Ｌの株ＭＥ３５の、０日における平均および標準偏差を示す。株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）は、０日において、０．２１４３ｇ／Ｌ；０．３３８０ｇ／Ｌ；および０．４４２３ｇ／Ｌの初回濃度を有する。目標は０．２ｇ／Ｌ；０．３ｇ／Ｌ、および０．４ｇ／Ｌにおいて接種することであったが、バルーンはもう少し多いバイオマスが、しかし予想範囲内で接種された。培養の１３日に、海水中で増殖されたスペイン産株のムリエロプシスｓｐ培の培養においては、０．２ｇ／Ｌの初回濃度を用いたバルーンを０．３ｇ／Ｌおよび０．４ｇ／Ｌの初回濃度を用いたバルーンに対して比較した場合、有意差が観察された。しかしながら、０．３ｇ／Ｌと０．４ｇ／Ｌの初回濃度を用いたバルーンの間では、何ら差異がない。海水中で増殖されたチリ産のムリエロプシスｓｐの株（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）の場合、スペイン産株と同様の傾向が見られ、すなわち、０．２ｇ／Ｌの初回濃度を用いた培養物と、０．３ｇ／Ｌおよび０．４ｇ／Ｌの初回濃度を用いたものとの間には有意差が存在する。しかしながら、０．３ｇ／Ｌと０．４ｇ／Ｌの初回濃度を用いた培養物の間では、何ら差異がない。
【００３６】
最高の値は、１．０７４０ｇ／Ｌに達するＭＥ３５（初回濃度０．４ｇ／Ｌ）において、および１．１３６０ｇ／Ｌに達するＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ、初回濃度０．３ｇ／Ｌ）において見出された。図６は、スペイン産株の生産性に関しては、３つの初回接種濃度に何ら差異がないらしいことを示している。一方、０．３ｇ／Ｌで接種されたチリ産株（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）については、０．２ｇ／Ｌの初回濃度に対し１５％多い生産性がある。初回接種濃度は、１３日では最終産物に比例していない。例えば、０．２ｇ／Ｌのスペイン産株を接種する場合、培養の１３日において１．０２ｇ／Ｌが得られる。一方、０．４ｇ／Ｌを接種する場合、２．０４ｇ／Ｌは得られず、しかし１．０７ｇ／Ｌが得られる。それ故、スペイン産株については、３つの接種濃度のいずれにおいても使用できる。一方、チリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）については、０．２と０．３ｇ／Ｌの間の接種が使用できる。
【００３７】
２つの株の間では、何ら有意差は観察されず、平均は、スペイン産株の３つの培養物の間では０．０５２ｇ／Ｌであり、チリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）については０．０５５ｇ／Ｌであった。
【００３８】
入手可能な文献の大多数には、微細藻類の近似プロフィールに何らかの変化を誘導するためには、栄養素の剥奪があることから、硝酸塩およびリン酸塩の含量は、初回接種濃度がこれら２つの主要栄養素の消費に影響するかどうかの評価を可能にする。本明細書では、代わりにカロテノイド生成を誘導することが必要である。
【００３９】
したがって、バイオマスの濃度がＮおよびＰの消費に直接には関係しないことが示される。例えば、図１を見れば、株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ、０．３ｇ／Ｌ）およびＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ、０．４ｇ／Ｌ）について、培養の１３日では、両者はほぼ同じ濃度のバイオマスを有しており（図５参照）、それ故それらのＮおよびＰの消費は非常に類似しているはずであるが、しかし培養の１３日に対しては起こっておらず（図７参照）、株ＭＣＨ３５（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ、０．４ｇ／Ｌ）におけるより大きいＮの消費を裏付けており、そのことは、いかなる理論にも囚われるものではないが、バルーンが光源に対して置かれていた距離に起因するものかもしれない。
【００４０】
図８は、日が経つにつれて減少するリンの消費を示しており、これは微細藻類培養においては正常なことである。
【００４１】
図９は、培養の１３日後の微細藻類バイオマス中に存在する生化学化合物のパーセントを示す。灰分については、全てのパーセントは類似しており、８．２１％から１０．５７％の範囲内である。タンパク質のパーセントについては、値は４４．７４％から５１．４５％の範囲内である。脂質のパーセントは、９．６２％から１５．４０％の範囲内である。ルテインのパーセントは、０．１０％から０．５５％の範囲内である。
【００４２】
全ての培養物の近似分析に従えば、それは、２つのタイプの水（淡水および海水）および３つの接種濃度（０．２ｇ／Ｌ；０．３ｇ／Ｌ、および０．４ｇ／Ｌ）における、２つの株についてである。それ故、海水中でのスペイン産株の培養は、タンパク質の生成を可能にするのに対し、淡水中での培養は、脂質の生成を可能にする。その一方で、海水中でのチリ産株（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）を用いた培養は、ルテインの生成を可能にする。
【００４３】
図１０は、淡水中での作物における結果を示す。ＭＥＯ株の平均および標準偏差は、０日において観察され、初回濃度：０．２１２７ｇ／Ｌ；０．２９２７ｇ／Ｌ；および０．３９１７ｇ／Ｌである。一方、株ＭＣＨ０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）は、０日では初回濃度：０．２４０７ｇ／Ｌ；０．３５７３ｇ／Ｌおよび０．４０８３ｇ／Ｌにとどまっていた。目標は０．２ｇ／Ｌ；０．３ｇ／Ｌ、および０．４ｇ／Ｌを接種することであり、バルーンはもう少し多いバイオマスが、しかし予想された範囲内で接種された。
【００４４】
培養の１３日においては、初回濃度０．２ｇ／Ｌと０．３ｇ／Ｌの間、および０．３と０．４ｇ／Ｌの間で、淡水を用いて培養されたスペイン産ムリエロプシスｓｐ株には、何ら有意差が観察されなかった。しかしながら、０．２ｇ／Ｌと０．４ｇ／Ｌの初回濃度を用いたバルーンの間では差異が見られた。淡水を用いて培養されたチリ産ムリエロプシスｓｐ（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）の場合には、初回濃度０．２ｇ／Ｌ；０．３ｇ／Ｌ、および０．４ｇ／Ｌの間で、培養物に何ら有意差は観察されなかった。同じ方法で、用いた接種物の濃度に関し、２つの独立した株の間でかなりの差異が観察され、ＭＥＯ（０．２ｇ／Ｌ）において最低の値０．４７ｇ／Ｌが、そしてＭＣＨＯ培養（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ、０．４ｇ／Ｌ）において最高の値１．２１ｇ／Ｌが得られた。
【００４５】
図１１は、スペイン産株についての生産性を示しており、３つの初回接種濃度には何ら差異が見られない。同じことがチリ産株についても言え、初回接種物の増減は生産性の増減に影響しない。２つの株間で、顕著な差異が観察される場合、スペイン産株の３つの培養物の間の平均は０．０２１ｇ／Ｌであり、チリ産株（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）については０．０６２ｇ／Ｌである。
【００４６】
生成されたバイオマスの濃度は、ＮおよびＰの消費に直接関係づけられる必要がある。図１２において、スペイン産株の培養の１３日では、微細藻類による窒素消費が示されず、そのことは、培養の１３日のスペイン産株が、チリ産株が生成するバイオマスの濃度の半分を示す図６において反映されている。いかなる理論にも囚われるものではないが、このことは栄養素の欠如に起因するのかもしれない。また、図１３では、０日において、スペイン産株のリン酸塩がチリ産株に比較して低いことが観察される。全ての作物において、リンの消費は日がたつにつれて減少しており、そのことは微細藻類培養物においては正常である。
【００４７】
図１４は、培養１３日後の微細藻類バイオマス中に存在する生化学化合物（灰分、脂質、タンパク質、ルテイン）のパーセントを示す。生化学化合物のパーセントは、全て類似している。灰分のパーセントは、７．４９％から１１．９４％の範囲内である。タンパク質のパーセントは、１４．４５％から１４．８０％の範囲内である。脂質のパーセントは、１５．４６％から３９．１６％の範囲内である。ルテインのパーセントは、０．１３％から０．３１％の範囲内である。
【００４８】
実施例４：４００リットルの海水および淡水の屋外培養系における、スペイン産ムリエロプシスｓｐ株およびチリ産株（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）の評価。
バイオマス生産を、海水中（ＭＣＨ３５）および淡水中（ＭＣＨ０）のチリ産ムリエロプシスｓｐ（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）と、海水中（ＭＥ３５）および淡水中（ＭＥＯ）のスペイン産ムリエロプシスｓｐとを用いて評価した。このため、チリ産ムリエロプシスｓｐ（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）およびスペイン産株を、４００リットルのバッグ内で、半量のＵＭＡ５を用いて淡水および海水中で培養した。標識された培養物は、以下の形態に置かれた：ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＣＨ０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）、ＭＥ３５、およびＭＥＯ。サンプルを２４および２５日に採取して、屋外（４００リットル系）における株の増殖曲線を実施した。乾燥重量測定を実施し、実験の終わりに培養物をデカンテーションし、ペレットを系から収集した。デカントを遠心分離し、飲用水で２回洗浄し、ペレットを凍結および凍結乾燥して、次に続く脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析用とした。半量のＵＭＡ５を用いた４００リットルの系において増殖された、２つの株（チリ産（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）株およびスペイン産株）の増殖曲線が得られた（図１４参照）。１５日後で初めて培養物は、ＭＥＯおよびＭＣＨ０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）についてそれぞれ０．４０および０．２９ｇ／Ｌのバイオマス濃度に達する。これらの値は、低いバイオマス生産の値であるが、しかし、飲料水が海水よりも高価であることを常に考慮すれば、その入手しやすさの故に、微細藻類は海水中で増殖するように増殖される。株が淡水作物に由来しても、それは非常に良好に海水に適応する（図５参照）。これらの作物のその天然の環境（淡水）におけるベースラインを得るべく、増殖曲線が実施され、次にそれらが１４ｍ３の開放プールに移行される。
【００４９】
図１５には、０．１ｇ／Ｌの初回接種を用いた培養の２４日間の、海水中で増殖された２つの株の増殖曲線が示されている。３日間の潜伏期間が存在し、培養１７日には、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５において、値は０．４６ｇ／Ｌおよび０．３２ｇ／Ｌである。２４日には、バッチまたはバッチ式で、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５について、０．６４ｇ／Ｌおよび０．４４ｇ／Ｌの値が達成される。生産期間において、２４日が望ましくない期間であることを考慮して、図１６に示されたさらなるバッチまたはバッチが、０．２ｇ／Ｌの初回接種を用いて実施され、それにより５日間の潜伏期間と、１７日の培養によりＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５について０．５５ｇ／Ｌおよび０．５２ｇ／Ｌが達成されたこととが示された。
【００５０】
また本発明者らは、培養の１２日において、株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＥ３５が４１．５および４１．３％以上のバイオマス；それぞれ０．５３および０．４６ｇ／Ｌを示したことを指摘するべきである。０．２ｇ／Ｌの微細藻類を接種した場合、そのことは培養の日数の削減をもたらし、バイオマスの収穫を早く始めることができる。
【００５１】
図１８は、培養の１３日および１４日に得られたバイオマスについて実施された近似分析の値を示しており、これらの日にちが選ばれたのは、バッチまたはバッチ期間が終わり、半連続的な収穫物が開始される平均日数であるからである。次に、これらの日数の培養によるバイオマスの、品質を確認することが必要である。灰分のパーセントは、５．０５％から９．６２％の間である。タンパク質のパーセントは、双方とも海水中で増殖されたチリ産およびスペイン産の株において９．４％と９．９％の間であり、淡水中で増殖された株におけるタンパク質のパーセントは、２０．３６％と３０．４６％の間である。脂質のパーセントは、４つの培養物、海水および淡水中の双方の株、において類似しており、８．４２％のパーセントを示す。ルテインのパーセントは、０．５３％；０．５０％；０．３９％；および０．５７％である。これは、セネスデムス・アルメリエンシスの０．５５％に比較して良好なパーセントのルテインであり、かつタゲテス・エレクタの花の０．０３％を充分に上回る。株ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）およびＭＣＨ０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）は、それらの増殖、生産性、およびルテイン生産を調べるべく、開放プールへ接種される（後に本文において示される表３から７の統計分析を参照）。
【００５２】
最後に、図１９において、ＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）ＵＭＡ５、およびＭＣＨ３５（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）Ｆ／２における３つの実験のルテインパーセントの要約が示されており、それらは０．６７％および０．５２％ルテインであり、逆に０．３１ｇ／Ｌおよび０．４１ｇ／Ｌのバイオマスがそれぞれ生産される。前述のものは、１リットルの培養あたりそれぞれ２．０７ｍｇおよび２．１３ｍｇのルテインが生産されたことを示している。互いを比較して、これらの値には重要な差異がないように見えるが、大規模、例えば１５，０００リットルの培養では、ほぼ１グラムのルテインの差が生まれることは、商業的に非常に重大である。表１における、４００リットル系において増殖された株の場合、ルテイン生産は、バッチ培養またはバッチ別の最後に到達したバイオマス濃度（ｇ／Ｌ）とルテインの生産（ｇ／Ｌ）とのパーセントで観察される。ＭＣＨ３５（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）は、海水中で培養された場合に最も高いルテイン生産を示すことから選ばれた。それは、５および１５立方メートルの系にスケールされた。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
【表３】
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【００５５】
表３の分散分析ＡＮＯＶＡによれば、テストＦのＰ値は、０．０５よりも小さい０．０１３２であり、それ故、たんぱく質の平均間には、９５％の信頼度レベルで統計的な有意差がある。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
表４によれば、海水中で増殖されたチリ産とスペイン産のムリエロプシス（ＭＣＨ−３５（ＢＥＡＪＤＡ  ００６３Ｂ）−ＭＥ３５）の間には何ら統計的有意差がなく、また淡水中で増殖されたチリ産とスペイン産のムリエロプシス（ＭＣＨ−０（ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６３Ｂ）−ＭＥＯ）の間にも差異はないことが観察される。しかし、海水および淡水で増殖された株の間には差異がある。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
表５の分散分析ＡＮＯＶＡによれば、Ｆ比のＰ値は、０．０５よりも大きい０．５０１０であり、それ故、脂質含量の点では、作物間には、９５．０％信頼度レベルで統計的な有意差はない。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
表６の分散分析ＡＮＯＶＡによれば、Ｆ比のＰ値は、０．０５よりも大きい０．５４７２であり、それ故、脂質含量の点では、作物間には、９５．０％の信頼度のレベルで統計的な有意差はない。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
表７の分散分析ＡＮＯＶＡによれば、Ｆ比のＰ値は、０．０５よりも大きい０．３０４０であり、それ故、脂質含量の点では、作物間には、９５．０％の信頼度レベルで統計的な有意差はない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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