(57)【要約】新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤。製剤は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及びＸの莢膜多糖類（Ｍｅｎ  Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ）であって、前記各多糖類が別々に破傷風トキソイド（ＴＴ）キャリアタンパク質にコンジュゲートされてＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ−ＴＴコンジュゲートを得る、液体または凍結乾燥または液体・凍結乾燥複合の５価製剤であり、製剤は、薬学上許容できる成分／賦形剤と一緒にアジュバントの有無にかかわらず、１以上の緩衝液を伴うものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤であって、
前記製剤は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及びＸの莢膜多糖類（Ｍｅｎ  Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ）であって、各前記多糖類が別々に破傷風トキソイド（ＴＴ）キャリアタンパク質にコンジュゲートされてＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ−ＴＴコンジュゲートを得てなる、液体のまたは凍結乾燥のまたは液体・凍結乾燥複合の５価の製剤であり、前記製剤は、薬学上許容できる成分／賦形剤と一緒にアジュバントの有無にかかわらず１以上の緩衝液を伴い、前記製剤は所望の浸透圧、所望のｐＨ、高い安定性及び所望の免疫原性を提供する、新規のワクチン製剤。
【請求項２】
前記液体ワクチン製剤が、以下の成分：
【数１】
2020525495.tif 000020
を含む請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項３】
前記液体ワクチン製剤が、以下の成分：
【数２】
2020525495.tif 000021
を含む請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項４】
前記液体製剤が、以下の成分：
【数３】
2020525495.tif 000022
を含む請求項１に記載の新規ワクチン。
【請求項５】
前記液体製剤が、以下の成分：
【数４】
2020525495.tif 000023
を含む請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項６】
前記凍結乾燥製剤が、以下の成分：
【数５】
2020525495.tif 000024
を含む請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項７】
前記液体・凍結乾燥複合製剤が、以下の成分：
【数６】
2020525495.tif 000025
を含む請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項８】
前記ＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ−ＴＴコンジュゲートがコンジュゲート化学の最適化された組み合わせを用いて得られる請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項９】
前記少なくとも１つのコンジュゲートを得るためのコンジュゲート化学がカルバメート化学である請求項８に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１０】
前記カルバメート化学を用いた前記少なくとも１つのコンジュゲートが好ましくはＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲートである請求項９に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのコンジュゲートを得るためのコンジュゲート化学がシアニル化化学である請求項８に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１２】
前記シアニル化化学を用いた前記少なくとも１つのコンジュゲートが好ましくは、前記ＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−ＴＴコンジュゲートである請求項１１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１３】
ＨＰＬＣ  ＰＷＸＬ４０００及び５０００のカラムを連続して用いて分子サイズ分布を調べる場合、各前記莢膜多糖類が０．３８±０．１Ｋｄのサイズ範囲、好ましくは０．３８±０．０６Ｋｄのサイズ範囲で分解されて高い抗原性、高い免疫原性及び高い安定性を持つコンジュゲートを得る請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１４】
前記多糖類と前記キャリアタンパク質との間でリンカーアームを有する前記コンジュゲートが製造され、リンカーが前記多糖類または前記キャリアタンパク質のいずれか、または前記多糖類とキャリアタンパク質の双方に連結される請求項１及び８に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１５】
前記リンカーがアジピン酸ジヒドラジドまたはヒドラジンから選択される請求項１４に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１６】
前記ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲートがヒドラジンリンカーを有し、且つ前記ＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−ＴＴコンジュゲートがアジピン酸ジヒドラジドリンカーを有する請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１７】
各前記コンジュゲートが０．３〜１．０の間のキャリアタンパク質の多糖類に対する比を有する請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１８】
前記薬学上許容できる賦形剤が、単独でまたは組み合わせでアジュバント、緩衝液、保存剤、安定剤、界面活性剤から選択される請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項１９】
前記賦形剤が、単独でまたは可変の組み合わせでスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンから選択される請求項６に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２０】
前記希釈剤が、単独でまたは可変の組み合わせで、水、５〜２０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水、５００〜１５００μｇのＡｌ＋＋＋／ｍＬとしてのリン酸アルミニウムから選択される請求項６に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２１】
前記凍結乾燥（ｌｙｏ）部分が、単独でまたは可変の組み合わせで、ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを含有する請求項７に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２２】
前記賦形剤が、単独でまたは可変の組み合わせで、スクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンから選択される請求項７に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２３】
前記希釈剤が、単独でまたは可変の組み合わせでＭｅｎＣ−ＴＴ、ＭｅｎＹ−ＴＴ、ＭｅｎＸ−ＴＴ、ＭｅｎＷ−ＴＴを含有する水、５〜２０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水、５００〜１５００μｇのＡｌ＋＋＋／ｍＬとしてのリン酸アルミニウムから選択される請求項７に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２４】
前記製剤が、保存剤の有無にかかわらず、単回用量または複数回用量の投薬計画を伴う液体製剤または凍結乾燥製剤またはそれらの複合である請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２５】
血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及びＸの最適なヒト用量が、用量当たり血清型当たり２〜１０μｇの間の多糖類にわたり、好ましくは血清型Ａ及びＸの各５〜１０μｇの多糖類、ならびに血清型Ｃ、Ｙ及びＷの各５μｇの多糖類にわたる請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２６】
製剤の前記所望の浸透圧が２４０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２７】
製剤の前記所望のｐＨが６．５〜７．５である請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２８】
凍結乾燥製剤または液体・凍結乾燥製剤の前記凍結乾燥部分が３％以下の水分含量を有する請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項２９】
前記ワクチン製剤が３７±２℃の高温で少なくとも２１日間、且つ２５±２℃で少なくとも３ヵ月間安定であり、４０％未満の遊離の多糖類を示す請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項３０】
前記ワクチン製剤が高い抗原性及び高い免疫原性を示す請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項３１】
前記ワクチン製剤が、３７±２℃での７日間の曝露の後でさえ、リアルタイム保存条件で保存された製剤と比べて同等に免疫原性である請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項３２】
前記製剤が好ましくは、保存剤の有無にかかわらず、単回用量または複数回用量の投薬計画を伴った液体の５価髄膜炎菌コンジュゲートワクチン製剤である請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【請求項３３】
前記製剤及び前記組成物が、液体または凍結乾燥または液体・凍結乾燥の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ混合ワクチンの製造で使用することができる請求項１に記載の新規ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、薬学上許容できる成分／賦形剤と併せた破傷風トキソイド（ＴＴ）キャリアタンパク質にコンジュゲートしたＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及びＸの莢膜多糖類（ＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ）の５価コンジュゲートワクチン製剤に関する。本発明の５価コンジュゲートワクチン製剤は液体形態または凍結乾燥形態またはそれらの組み合わせである。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンの製造及び組成は複雑であり、厳しく規制されて個体の安全を確保し、有効性及び安定性を最大限高める。ワクチンはすべて、防御免疫反応を生成する有効成分を含有する。ワクチンはまた薬学上許容できる追加の成分も含有して製剤の安定性を高め、及び／または強力な防御免疫反応のための免疫原性を高める。
【０００３】
世界保健機関は、ワクチンで予防可能な疾患の罹患率が中程度から高いまたは頻繁な大流行がある国は定期的にワクチン接種を行うべきであると勧告している。疾患のリスクが低い国では、彼らは高リスク群が免疫されるべきであると勧告している。
【０００４】
髄膜炎菌性疾患は、細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因で発生する急性の重篤な可能性がある病気である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）は主として１３の血清型、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、２９Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ及びＺに血清学的に分類されている好気性のグラム陰性細菌である。型分類はその生物の莢膜多糖類に基づく。
【０００５】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは世界中で細菌性髄膜炎の最も一般的な原因の１つであり、髄膜炎の大流行を発生させることができる唯一の細菌であることがＷＨＯの公式ウェブサイトで言及されている。１００，０００人の住民当たり１０００症例までの発生率での大規模流行は、特にサハラ以南のアフリカで報告されている。
【０００６】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは患者または健常ヒトキャリアの呼吸分泌物との噴霧接触または直接接触によって伝染する。流行性疾患は３〜１２ヵ月齢の乳児での最高の発病率で主として小児や青年期の若者で発生するのに対して、病気の流行には年長児や若年成人がさらに含まれ得る。しかしながら、髄膜炎菌性疾患の急速な進行は発症後１〜２日以内での死亡を生じることが多く、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染はワクチン接種によって防ぐことができる。
【０００７】
免疫は髄膜炎疾患を制御する唯一の理に適ったアプローチである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する最も効果的なワクチンは、活性がある多糖類への活性化されたタンパク質の共有結合によって形成される多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチンである。ネイティブ多糖類のほとんどは活性化がないとキャリアタンパク質に化学的に効率的に結合することができないので、多糖類はキャリアタンパク質への連結に先立って「活性化」プロセスとして知られる若干の化学的修飾を受ける。
【０００８】
多糖類をタンパク質に共有結合するのに採用されている多数のコンジュゲート反応がある。さらに一般に採用される方法のうちの３つには、
（１）反応の一方の成分におけるアルデヒド基またはケトン基が他方の成分におけるアミノ基またはヒドラジド基と反応し、そのように形成されたＣ＝Ｎ二重結合がその後還元剤によってＣ−Ｎ単結合に還元される還元的アミノ化；
（２）多糖類を臭化シアン（ＣＮＢｒ）またはテトラフルオロホウ酸１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム（ＣＤＡＰ）によって活性化してヒドロキシル基にシアン酸基を導入し、それがタンパク質成分の付加の際にアミノ基またはヒドラジド基への共有結合を形成するシアニル化コンジュゲート；及び
（３）カルボジイミドがコンジュゲート反応の一方の成分におけるカルボキシル基を活性化し、活性化されたカルボキシル基が他方の成分におけるアミノ基またはヒドラジド基と反応するカルボジイミド反応
が挙げられる。また、これらの反応を用いてコンジュゲート反応に先立ってコンジュゲートの成分を活性化することも多い。
【０００９】
出版物の１つによれば、歴史的に血清型Ａ（ＭｅｎＡ）はサハラ以南のアフリカにおける流行性疾患の最も一般的な原因となっている。血清型Ｂ及びＣは開発途上国における大半の症例に関与し、残りの症例は血清型Ｗ１３５及びＹが原因となっている。血清型Ｃの症例はサハラ以南のアフリカでは最近観察されているが、その血清型はそこでは歴史的にさほど流行していなかった。血清型Ｘも近年少数の国で出現している。Ｘｉｅ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ，“Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  Ｘ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａ：ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３，Ｊｕｎ．１２；３１（２７）：２８５２−６によれば、血清型Ｘの髄膜炎菌は散発性髄膜炎の稀な原因であると以前見なされていたが、２００６〜２０１０年の間に血清型Ｘの髄膜炎の大流行がニジェール、ウガンダ、ケニヤ、トーゴ及びブルキナファソで発生し、後者は報告された６７３２症例のうち少なくとも１３００症例が血清型Ｘの髄膜炎だった。
【００１０】
別のＮＣＢＩの出版物によれば、トーゴでは２００６〜２００９年の間に血清型Ｘの髄膜炎菌は確認された細菌性髄膜炎症例７０２のうちの１６％を占めた。Ｋｏｚａｈ地方は２００７年３月に血清型Ｘの髄膜炎菌の大流行を経験し、血清型Ｘの髄膜炎菌の季節的な累積発生率は３３／１００，０００だった。ブルキナファソでは、２００７〜２０１０年の間に血清型Ｘの髄膜炎菌は確認された細菌性髄膜炎症例７７８のうち７％を占め、２００９年から２０１０年までで増加した（それぞれ確認された全症例の４％から３５％に）。２０１０年では、血清型Ｘの髄膜炎菌の流行はブルキナファソの北部及び中央部の領域で発生し；血清型Ｘの髄膜炎菌の地方別の最高累積発生率は３月〜４月で１３０／１００，０００と推定された。
【００１１】
上記の事実に基づいて、ヒト神経細胞で見いだされた分子とのＭｅｎＢ莢膜多糖類の構造的類似性のゆえにコンジュゲートワクチンの可能性がわずかである血清型Ｂを除いて、５価の髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチンが髄膜炎菌性疾患に対するさらに広い被域を提供することができた。現在、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の多糖類コンジュゲートを含む種々の１価または多価のワクチンが市場での販売のために認可されている。当該技術の現状は、キャリアタンパク質とコンジュゲートされたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ血清型Ｂ（Ｈｉｂ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ、Ｙから得られた糖類断片を含む免疫原性組成物を開示している米国特許出願番号ＵＳ２０１５／００４４２５３のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ及びＹを含む種々の血清型の予防のためのワクチンを開示している。しかしながら、ＵＳ２０１５／００４４２５３では、カルバミン酸リンカーがキャリアタンパク質のアミノ基に直接連結され、それは低いコンジュゲート効率を生じる。
【００１２】
インド特許出願２８１／ＭＵＭ／２０１２は凍結乾燥した５価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ多糖類・タンパク質のコンジュゲート組成物を開示している。しかしながら、適用は特定のＭｅｎＸ株に制約され、複数のキャリアタンパク質を使用する。
【００１３】
ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６１８８は、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹの少なくとも１つに由来する髄膜炎菌莢膜多糖類を含む免疫原性組成物を教示しているが、それは免疫原性組成物におけるＭｅｎＸのコンジュゲートを教示していない。
【００１４】
利用できる多価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンはコストが高く、複雑な処方を有する。従来技術のいずれも、コンジュゲート化学の最適化された組み合わせを用いた液体または凍結乾燥の形態またはその組み合わせでのＭｅｎＸコンジュゲートを伴ったＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ多糖類・タンパク質コンジュゲート製剤を教示していない。
【００１５】
高い均質性、高い免疫原性、低いコストを有し、製剤化し、投与するのに簡単である髄膜炎菌コンジュゲートワクチンの緊急のニーズがある。
【発明の概要】
【００１６】
当該技術の現状における欠点を取り除くために、本発明の主な目的は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、コンジュゲートがコンジュゲート化学の最適化された組み合わせを用いて製造される新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、組成物がそれぞれキャリアタンパク質としての破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型ＡＣＹＷＸ多糖類を含有する５価の髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴの混合ワクチンの製造で使用することができる、新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン前記組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、薬学上許容できる成分／賦形剤と共に多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む多糖類・タンパク質のコンジュゲート組成物の新規のワクチン製剤を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、薬学上許容できる成分／賦形剤と共に５価の髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む多糖類・タンパク質のコンジュゲート組成物の新規のワクチン製剤を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、前記５価の髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ製剤が液体のまたは凍結乾燥したワクチン製剤であるまたは凍結乾燥された部分と液体部分の組み合わせとしての新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、組成物が最適化されたコンジュゲート化学を用いて調製されたコンジュゲートの新規の組み合わせを有する新規の５価の髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ多糖類・破傷風トキソイドキャリアタンパク質のコンジュゲートワクチンの前記組成物及び製剤を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートのそれぞれの最適投与量を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、高温で安定であり、高い免疫原性及び抗原性を示す５価のワクチン製剤を提供することである。
【００２５】
従って、本発明は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物及びその製剤を提供する。さらに詳しくは、本発明はコンジュゲート化学を用いて製造される多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含むコンジュゲートワクチン製剤に関する。使用されるコンジュゲート化学には、カルバメート化学及び／またはシアニル化化学のうちの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の製剤は５価の髄膜炎菌混合ワクチンの製造に使用することができる。
【００２６】
本発明のコンジュゲートを調製するのに使用される多糖類は最適化された発酵プロセスを介して得られる。
【００２７】
多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物の新規のワクチン製剤は薬学上許容できる成分／賦形剤と共に多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートはすべて同一のキャリアタンパク質を有する。本発明は５価のワクチン製剤を提供する。
【００２８】
本発明の新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は５つの多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。多糖類は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに属するグラム陰性細菌の莢膜血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及びＸの多糖類から選択される。破傷風トキソイドはコンジュゲートすべてを調製することにおいてキャリアタンパク質として使用される。
【００２９】
莢膜多糖類はキャリアタンパク質とのコンジュゲートに好適な小さなサイズに分解されて高い抗原性及び高い免疫原性を持つコンジュゲートを得る。莢膜多糖類は、ＨＰＬＣ  ＰＷＸＬ４０００及び５０００のカラムを連続して用いて分子サイズ分布について調べた場合、０．３８±０．１Ｋｄのサイズ範囲に分解される。莢膜多糖類は好ましくは０．３８±０．０６Ｋｄのサイズ範囲にある。多糖類及びキャリアタンパク質は双方ともコンジュゲートの前に活性化される。ヒドラジンまたはアジピン酸ジヒドラジドをリンカーとして持つコンジュゲートが得られる。
【００３０】
サイズ指定して分解された莢膜多糖類（サイズ指定した莢膜多糖類）は破傷風トキソイドキャリアタンパク質とコンジュゲートされる。製剤は、１以上の血清型、さらに好ましくは血清型Ｘの多糖類について最適化されたカルバメート化学によって、及び１以上の血清型、好ましくは血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷの多糖類のそれぞれについてシアニル化化学によって調製されるコンジュゲートを含有する。
【００３１】
薬学上許容できる賦形剤は、単独でのまた組み合わせでのアジュバント、緩衝液、保存剤、安定剤、界面活性剤であることができる。本発明の製剤は、保存剤の有無にかかわらず単回用量投薬計画または複数回用量投薬計画で液体である、または凍結乾燥される、または液体製剤と凍結乾燥製剤の組み合わせ（液体・凍結乾燥製剤）である。
本発明はまた、ワクチン組成物及びワクチン製剤にてコンジュゲートのそれぞれの最適な投与量も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１ａ】５±３℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンのリアルタイム安定性試験を示す図である。
【図１ｂ】５±３℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンのリアルタイム安定性試験を示す図である。
【図１ｃ】５±３℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンのリアルタイム安定性試験を示す図である。
【図１ｄ】５±３℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンのリアルタイム安定性試験を示す図である。
【図１ｅ】５±３℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンのリアルタイム安定性試験を示す図である。
【図２ａ】２５±２℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンの加速された安定性試験を示す図である。
【図２ｂ】２５±２℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンの加速された安定性試験を示す図である。
【図２ｃ】２５±２℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンの加速された安定性試験を示す図である。
【図２ｄ】２５±２℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンの加速された安定性試験を示す図である。
【図２ｅ】２５±２℃での液体の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンの加速された安定性試験を示す図である。
【図３ａ】３７±２℃での液体の５価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンのストレス安定性試験を示す図である。
【図３ｂ】３７±２℃での液体の５価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンのストレス安定性試験を示す図である。
【図３ｃ】３７±２℃での液体の５価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンのストレス安定性試験を示す図である。
【図３ｄ】３７±２℃での液体の５価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンのストレス安定性試験を示す図である。
【図３ｅ】３７±２℃での液体の５価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンのストレス安定性試験を示す図である。
【図４ａ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図４ｂ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図４ｃ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図４ｄ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図４ｅ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図５ａ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチンまたは溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌ウサギＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図５ｂ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチンまたは溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌ウサギＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図５ｃ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチンまたは溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌ウサギＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図５ｄ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチンまたは溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌ウサギＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図５ｅ】ライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチンまたは溶媒対照と比べたアジュバント添加及びアジュバント非添加の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する２回目の投与後の抗髄膜炎菌ウサギＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図６ａ】ＶＶＭ７アジュバント添加液体５価ワクチン及びライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する３回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図６ｂ】ＶＶＭ７アジュバント添加液体５価ワクチン及びライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する３回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図６ｃ】ＶＶＭ７アジュバント添加液体５価ワクチン及びライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する３回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図６ｄ】ＶＶＭ７アジュバント添加液体５価ワクチン及びライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する３回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【図６ｅ】ＶＶＭ７アジュバント添加液体５価ワクチン及びライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチン及び／または溶媒対照と比べたアジュバント添加液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンに対する３回目の投与後の抗髄膜炎菌マウスＩｇＧ及びＳＢＡの力価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
従って、本発明は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物及びその製剤を提供する。さらに詳しくは、本発明はコンジュゲート化学を用いて製造される多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含むコンジュゲートワクチン組成物に関する。使用されるコンジュゲート化学には最適化されたカルバメート化学及びシアニル化化学の組み合わせが挙げられる。本発明の組成物は５価の混合ワクチンの製造に使用することができる。
【００３４】
本発明のコンジュゲートの製造に使用される多糖類は動物成分を含まない発酵プロセスを介して得られる。
【００３５】
本発明の新規のワクチン製剤は薬学上許容できる成分／賦形剤と共に多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートはすべて同一のキャリアタンパク質を有する。本発明は５価のワクチン製剤を提供する。
【００３６】
本発明の新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチンの組成物及び製剤は５つの個々の多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。多糖類はグラム陰性細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及びＸの莢膜多糖類から選択される。コンジュゲートすべてを調製するのに使用されるキャリアタンパク質は破傷風トキソイド（ＴＴ）である。
【００３７】
莢膜多糖類をキャリアタンパク質とのコンジュゲートに好適な小さなサイズに分解して高い抗原性、高い免疫原性及び高い安定性を持つコンジュゲートを得る。莢膜多糖類は、ＨＰＬＣ  ＰＷＸＬ４０００及び５０００のカラムを連続して用いて分子サイズ分布について調べた場合、０．３８±０．１Ｋｄ、好ましくは０．３８±０．０６Ｋｄのサイズ範囲に分解される。多糖類及びキャリアタンパク質はコンジュゲートの前に活性化される。多糖類とタンパク質の部分の間にリンカーアームを有するコンジュゲートが製造される。リンカーは多糖類もしくはキャリアタンパク質のいずれか、または多糖類及びキャリアタンパク質の双方に連結される。
【００３８】
本発明の新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、それぞれ個々に破傷風トキソイドにコンジュゲートされた髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘの多糖類（ＭｅｎＡＣＹＷＸ−ＴＴ）を含み、その際、血清型Ｘの多糖類は最適化されたカルバメート化学を用いて破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷの多糖類は最適化されたシアニル化化学を用いてコンジュゲートされる。各前記コンジュゲートは０．３〜１．０の間のタンパク質の多糖類に対する比を有する。
【００３９】
本発明の新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、アジュバントの有無にかかわらず、１以上の緩衝液及び１以上の薬学上許容できる賦形剤と混合されたそれぞれ個々に破傷風トキソイドにコンジュゲートされた髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘの多糖類（ＭｅｎＡＣＹＷＸ−ＴＴ）を含む。
【００４０】
薬学上許容できる賦形剤は、単独でのまた組み合わせでのアジュバント、緩衝液、保存剤、安定剤、界面活性剤であることができる。本発明の製剤は、保存剤の有無にかかわらず単回用量投薬計画または複数回用量投薬計画で液体製剤である、または凍結乾燥製剤である、または液体・凍結乾燥の組み合わせである。本発明のワクチン製剤は高温で安定である。４０％の遊離ＰＳを最大目標と見なして、製剤は３７±２℃の高温にて少なくとも２１日間、２５±２℃にて少なくとも３ヵ月間、及び５±３℃で少なくとも９ヵ月間安定性を示す。
【００４１】
最良の実施形態の１つでは、本発明の新規の５価液体多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、
【数１】
2020525495.tif 000002
を含む。
成分は室温にて０．５〜２時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、２〜８℃で保存する。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の新規の５価液体多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、
【数２】
2020525495.tif 000003
を含む。
成分は室温にて０．５〜２時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、２〜８℃で保存する。
【００４３】
所望の浸透圧及び所望の安定性及び所望の免疫原性を提供するアジュバントを伴った製剤の最良の実施形態の１つは、
【数３】
2020525495.tif 000004
を含む。
成分は室温にて０．５〜２時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、２〜８℃で保存する。
【００４４】
所望の浸透圧及び所望の安定性及び所望の免疫原性を提供するアジュバントを含まない製剤の別の実施形態は、
【数４】
2020525495.tif 000005
を含む。
成分は室温にて０．５〜２時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、２〜８℃で保存する。
【００４５】
本発明の製剤はアジュバントの有無にかかわらず、浸透圧、安定性及び免疫原性について調べられている。遊離の多糖類の含量の上昇をチェックするために製剤は３７±２℃の高温（ＶＶＭ）に２１日間曝露された。５価ワクチン製剤における遊離の多糖類の含量は、デオキシコール酸（ＤＯＣ）沈殿及び濾過法によって分離され、パルス電流測定検出器を伴った高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）法によって推定されている。
【００４６】
製剤は高温で安定である。４０％の遊離のＰＳを最大目標と見なして、製剤は３７±２℃の高温で少なくとも２１日間、２５±２℃で少なくとも３ヵ月間、５±３℃で少なくとも９ヵ月間安定性を示す。
【００４７】
本発明の製剤は液体形態または凍結乾燥形態またはそれらの組み合わせである。本発明はまた、ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートのそれぞれの最適な投与量も提供する。最適な用量は、アジュバントなしで、またはヒト用量当たりリン酸アルミニウムアジュバントの形態での５００μｇのＡｌ＋＋＋を伴ってヒト用量当たり５〜１０μｇの血清型Ａ及びＸの多糖類及び５μｇの血清型Ｃ、Ｙ及びＷの多糖類である。
【実施例】
【００４８】
実施例１：プラセボ液体製剤の調製
ＮａＣｌを様々な緩衝液と混合して３００±３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲での緩衝液の浸透圧を達成した。以下の表１のように製剤の浸透圧濃度を知るためにリン酸アルミニウムを様々な緩衝液及びＮａＣｌと共に混合することによって髄膜炎菌血清型（有効抗原）を含まないプラセボ製剤が調製されている：
【表１】
2020525495.tif 000006
上記製剤（プラセボ）は浸透圧及びｐＨについて分析されてＮａＣｌの好適な濃度を決定し、最終製剤における所望の浸透圧を達成している。製剤の浸透圧は表２で提供されている。
【表２】
2020525495.tif 000007
表２は、表１の製剤の浸透圧が２４０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの予想された限界よりも高いことを示唆しているということは、浸透圧を下げるためにＮａＣｌの濃度を下げることを示している。ＮａＣｌのモル濃度を下げて製剤の所望の浸透圧を達成している。
【００４９】
実施例２：ＮａＣｌ濃度を下げることによるプラセボ液体製剤の調製
ＮａＣｌの濃度を表１のＮａＣｌ濃度と比べて半分に、すなわち、１００ｍＭから５０ｍＭに低下させて以下の表２のような所望の範囲内での浸透圧指標を得ている。
【表３】
2020525495.tif 000008
５０ｍＭに近いＮａＣｌによって、製剤の浸透圧は、製剤の所望の浸透圧の範囲内である２７５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜２８２ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲で実現した。
【００５０】
実施例３：様々な賦形剤及び緩衝液の存在下で製品安定性を確立するための様々な５価髄膜炎菌液体製剤の調製
抗原をＭＥＳ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような緩衝液及びヒスチジンと混合することによって種々の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ製剤が調製されている。たとえば、グリシン、デキストロース、ヒスチジン、マンニトール及びポリソルベート８０のような様々な賦形剤の組み合わせが、３７±２℃の高い温度にさらした際の薬剤製品の安定性を評価するために試みられた。製剤は以下の表４のとおりに調製されている。
【表４】
2020525495.tif 000009
【００５１】
上記製剤を３７±２℃の温度に１４日間さらし、製品の安定性特性における緩衝液及び賦形剤の影響を評価した。髄膜炎菌コンジュゲート製剤について安定性を示すパラメーターは遊離ＰＳの経時的な生成である。７日目及び１４日目に試料を回収し、全ＰＳ及び遊離ＰＳの％についてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（Ｄｉｏｎｅｘ）法によって分析した。結果は以下の表５及び表６のように経時的に生成された遊離の多糖類についてまとめられている。
【表５】
2020525495.tif 000010
【表６】
2020525495.tif 000011
【００５２】
実施例４：リン酸アルミニウムを含まない様々な５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ液体製剤の調製
リン酸アルミニウムを添加しないで５価髄膜炎菌製剤を調製している。製剤はすべてＰＢＳにて調製した。以下のマトリクスを用いて様々な製剤を調製した。
【表７】
2020525495.tif 000012
上記製剤を浸透圧及びｐＨについて分析し、製剤の基本的な特徴を確認している。
【表８】
2020525495.tif 000013
上記の結果は、所望の浸透圧とｐＨの値に見合っている。
【００５３】
実施例５：高い用量のＭｅｎＡ及びＭｅｎＸを伴った５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ液体製剤の調製
５μｇ／０．５ｍＬの用量でＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ、ＭｅｎＷの用量を保ちながら、血清型ＭｅｎＡ及びＭｅｎＸについて１０μｇ／０．５ｍＬの高い用量で製剤を調製した。
【表９】
2020525495.tif 000014
上記製剤を多糖類の含量、遊離の多糖類の％、浸透圧及びｐＨについて分析し、製剤の基本的な特徴を確認した。
【表１０】
2020525495.tif 000015
【表１１】
2020525495.tif 000016
【００５４】
実施例６：様々な賦形剤及び緩衝液の存在下で製品の安定性を確立するための様々な凍結乾燥５価髄膜炎菌製剤の調製
抗原をＭＥＳ緩衝液及びＰＢＳ緩衝液のような緩衝液と混合することによって種々の５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ製剤を調製した。室温でのｐＨ、浸透圧及び水分含量を評価し、凍結乾燥後の所望の水分含量を達成するために、たとえばスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンのような種々の賦形剤の組み合わせを試みた。
【００５５】
所望の浸透圧及びｐＨは賦形剤（単独または組み合わせでの）の様々な組み合わせと共に１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で達成されたが、その際、凍結乾燥後の水分含量は３％以下であり、ケーキの質は申し分ない（表１２）。
【表１２】
2020525495.tif 000017
【００５６】
実施例７：液体・凍結乾燥複合製剤
【数５】
2020525495.tif 000018
液体・凍結乾燥製剤では、凍結乾燥（ｌｙｏ）部分は、ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを単独で、または可変の組み合わせで、単独もしくは可変の組み合わせでのスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンから選択される賦形剤と共に含有する。希釈剤は、ＭｅｎＣ−ＴＴ、ＭｅｎＹ−ＴＴ、ＭｅｎＸ−ＴＴ、ＭｅｎＷ−ＴＴを単独でまたは可変の組み合わせで含有する水、５〜２０ｍＭのリン酸で緩衝化した生理食塩水、５００〜１５００μｇのＡ＋＋＋／ｍＬとしてのリン酸アルミニウムから選択される。
【００５７】
実施例８：凍結乾燥サイクル（非限定例）
凍結、一次乾燥及び二次乾燥を介して５価製剤を凍結乾燥している。凍結乾燥サイクルを表１３に示す。凍結乾燥サイクル−３が３％未満の水分含量と良質のケーキの安定な製剤が得られる最良の方式である。
【表１３】
2020525495.tif 000019
【００５８】
実施例９：ストレス条件、加速条件及びリアルタイム条件での５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴ液体製剤の安定性
ある期間にわたって種々の温度条件にさらした場合での５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンの安定性を調べる。特定の期間にわたる温度の影響を得るために試験を実施した。安定性試験は、３つの温度パラメーター、すなわち、５±３℃でのリアルタイム保存条件、２５±２℃での高温、及び３７±２℃でのストレス条件を用いて実施した。結果は図１〜３（図１ａ〜１ｅ、２ａ〜２ｅ、３ａ〜３ｅ）に述べられている。
【００５９】
ａ．５±３℃でのリアルタイム保存条件―推奨される保存温度（リアルタイム安定性試験）（図１ａ〜１ｅ）。
ｂ．２５±２℃での高温―保存のために推奨されるものより高い（加速した安定性試験）（図２ａ〜２ｅ）。
ｃ．３７±２℃でのストレス条件―極端な条件（ストレス安定性試験）（図３ａ〜３ｅ）。
【００６０】
試料をストレス条件下で２１日の期間、加速条件下で６ヵ月間、及びリアルタイム保存条件で３年間（進行中の試験、９ヵ月までデータは利用可）、保存した。試料を計画通りに回収し、経時的な遊離ＰＳの％含量のパラメーターを示す最良の安定性について分析した。
【００６１】
実施例１０：液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチン製剤によるマウス及びウサギの免疫
８匹のメスのマウス及び４匹のメスのウサギ（６〜９週齢）の群を、新規液体のアジュバント添加したまたは添加しない５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチン、バルクコンジュゲートを含まない溶媒対照、またはライセンスを受けたＡＣＹＷコンジュゲートワクチンのいずれかによって２週間間隔で免疫した。新規の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンも製剤の安定性の評価のために３７℃で７日間（ＶＶＭ７）保存した後、マウスのモデルで使用した。免疫はすべてマウスでは皮下経路及びウサギでは筋肉内経路を介したワクチンの投与によって実施されている。各マウスは血清型当たり１μｇの多糖類に等しい製剤で免疫したのに対して、各ウサギは意図される完全なヒト用量で免疫した。血清型に特異的な抗髄膜炎菌ＩｇＧ抗体の力価は、間接ＥＬＩＳＡ、及び２回目と３回目の投与の後回収した血清における血清殺菌アッセイによる機能的抗体価によって推定した。新規の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンについての２回目及び３回目の投与後の結果は、マウス及びウサギ双方のモデルにおける溶媒対照と比べて有意に高い免疫原性力価を、及び双方の動物モデルにおけるライセンスを受けたワクチンＩｇＧ及びＳＢＡの力価に対して劣らない力価を示す（図４ａ〜４ｅ、５ａ〜５ｅ、６ａ〜６ｅ）。さらに、新規の液体５価髄膜炎菌ＡＣＹＷＸ−ＴＴコンジュゲートワクチンは３７℃に７日間されされたとき、免疫原性力価で低下を示さなかった（図６ａ〜６ｅ）。
【００６２】
実施例１１：間接ＥＬＩＳＡによる抗髄膜炎菌多糖類血清型に特異的なＩｇＧ力価の測定
ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．３±０．１における５μｇ／ｍＬのＰＳとｍ−ＨＳＡの混合物をウェル当たり１００μＬ加えることによって９６穴プレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を血清型特異的な標準の髄膜炎菌ＰＳでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳにおける０．１％のＢｒｉｊ３５、ｐＨ７．３±０．１）で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳにおける０．１％のＢｒｉｊ３５、ｐＨ７．３±０．１）における５％ＦＢＳ溶液のウェル当たり２００μＬで３７℃にて１時間ブロックした。各インキュベート工程にはＰＢＳ緩衝液による３回の洗浄が続いた。参照及び試験の血清試料をＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳにおける０．１％のＢｒｉｊ３５、５％ＦＢＳ、ｐＨ７．３±０．１）で希釈し、コーティングし、ブロックしたプレートに移し（２００μＬ）、２倍連続希釈した後、４℃で一晩インキュベートした。次いで、任意で希釈したペルオキシダーゼを結合した抗マウス／ウサギＩｇＧをウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間放置した。発色のために基質である３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン−Ｈ２Ｏ２をウェル当たり１００μＬ加えた。２５℃での発色の１０分後、５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を止め、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍでＯＤを読み取った。Ｃｏｍｂｉｓｔａｔソフトウェアを用いて、各製剤についての抗ＭｅｎＣ多糖類ＩｇＧ濃度（ＥＬＩＳＡの単位／ｍＬという点で）を評価し、幾何平均濃度（ＩｇＧ  ＧＭＣ）を図４〜６（図４ａ〜ｅ、５ａ〜ｅ、６ａ〜ｅ）にて代表的な試験及び製剤の比較について示した。
【００６３】
実施例１２：血清型特異的な機能的抗体価の測定についての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）
Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型特異的な細菌ストックをヒツジ血液寒天プレートにて３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩増殖させた。単離したコロニーを採取し、別のヒツジ血液寒天プレートの表面にて３７℃で５％ＣＯ２と共にインキュベートした。第２のプレートからの増殖した細菌を各血清型について最適化したＳＢＡ緩衝液に浮遊させた。浮遊液の光学密度（ＯＤ６５０）を作業細菌ストックで調整してアッセイの終了時でスポット当たり６０〜２５０のコロニー総数を達成した。品質管理（ＱＣ）血清及び試験血清の試料を５６℃で３０分間、熱非働化した。マイクロウェルプレートにて、２倍連続希釈した試験血清２０μＬを作業希釈での１０μＬの細菌及び１０μＬの幼若ウサギの補体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）と共に混合した。陰性対照については、別々のウェルにて細菌を試験血清なしで活性がある幼若ウサギ補体と共に、及び試験血清と熱非働化幼若ウサギ補体と共にインキュベートした。アッセイプレートを軽くたたくことによってウェルの内容物を混合し、３７℃で５％ＣＯ２と共に１時間プレートをインキュベートした。平板画線法によって各ウェルからの１０μＬの試料を血液寒天プレートに播いた。血液寒天プレートを３７℃で５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートし、コロニーを数えた。各活性がある補体対照と比べた、反応混合物との細菌のインキュベートの後のコロニー形成単位で≧５０％の低下を示す最高の血清希釈をＳＢＡ力価と見なした。代表的な試験及び製剤の比較についての結果を図４〜６（図４ａ〜ｅ、５ａ〜ｅ、６ａ〜ｅ）に提示する。
【図１ａ】
2020525495.tif 000026
【図１ｂ】
2020525495.tif 000027
【図１ｃ】
2020525495.tif 000028
【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
2020525495.tif 000031
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
2020525495.tif 000036
【図３ｂ】
2020525495.tif 000037
【図３ｃ】
2020525495.tif 000038
【図３ｄ】
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【図３ｅ】
2020525495.tif 000040
【図４ａ】
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【図４ｂ】
2020525495.tif 000042
【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
2020525495.tif 000049
【図５ｅ】
2020525495.tif 000050
【図６ａ】
2020525495.tif 000051
【図６ｂ】
2020525495.tif 000052
【図６ｃ】
2020525495.tif 000053
【図６ｄ】
2020525495.tif 000054
【図６ｅ】
2020525495.tif 000055
【国際調査報告】
2020525495.tif 000056
2020525495.tif 000057