(57)【要約】本発明は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチド、および前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを意図する。さらに、本発明は、ＶＨＨ含有重鎖抗体を産生するためのベクターを含むトランスジェニック哺乳動物に関する。さらに、本発明は、ＶＨＨ含有重鎖抗体、ならびにＶＨＨ含有重鎖抗体の産生およびクローニング方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ）ラクダ科ＶＨＨ領域、
ｂ）ラクダ科Ｄ領域、
ｃ）ラクダ科Ｊ領域、
ｄ）機能的なＣＨ４ドメインをもつＩｇＭ定常重鎖領域、
ｅ）ＣＨ１ドメインのないラクダ科定常重鎖領域
を含み、
前記ラクダ科ＶＨＨ領域、前記ラクダ科Ｄ領域および前記ラクダ科Ｊ領域は再配列されない、
前記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ラクダ科Ｄ領域が少なくとも２つのラクダ科Ｄ要素を含み、前記ラクダ科Ｄ要素が、好ましくは配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ラクダ科Ｊ領域が少なくとも２つのラクダ科Ｊ要素を含み、前記ラクダ科Ｊ要素が、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される、請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記定常重鎖領域が、
ａ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびに
ｂ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、
をコードする要素を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記定常重鎖領域が、δ領域および関連するスイッチ領域を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、前記ＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物に特異的な少なくとも１つのエンハンサーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ラクダ科ＶＨＨ領域が、少なくとも１つのラクダ科ＶＨＨ要素を含み、前記ラクダ科ＶＨＨ要素が、好ましくは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
膜近位のＣＨドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエクソンが、ＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物の対応するドメインをコードするエクソンによって交換される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ラクダ科動物がＬａｍａ種、好ましくはラマ・グラマである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが配列番号３０の配列またはそのフラグメントによってコードされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ベクターが好ましくは細菌人工染色体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項１１に記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、前記ポリヌクレオチドが異種であり、好ましくは前記哺乳動物がマウスまたはラットである、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
前記哺乳動物が、膜結合および／または可溶性バージョンとしてＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する、請求項１２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の製造のための方法であって、該哺乳動物において異種ＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する工程を含み、前記異種ＶＨＨ含有重鎖抗体を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの再配列によって形成されるＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードする、前記方法。
【請求項１５】
哺乳動物由来のＶＨＨ含有重鎖抗体をクローニングする方法であって、前記異種ＶＨＨ含有重鎖抗体を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの再配列によって形成されるＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチド、および前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを記載する。さらに、本発明は、ＶＨＨ含有重鎖抗体を産生するためのベクターを含むトランスジェニック哺乳動物に関する。さらに、本発明は、ＶＨＨ含有重鎖抗体、ならびにＶＨＨ含有重鎖抗体の産生およびクローニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体および組換え抗体は、医学およびバイオテクノロジーにおける重要なツールである。Ｌｌａｍａｓは、変異免疫グロブリン座をもち、それによって重鎖のみから構成される異常な抗体の発生が可能になる。これらの抗体の単一の可変ドメイン（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、またはナノボディと表示する）は、適応免疫系によって生成される最小の抗原結合ドメインである。長い相補性決定領域３（ＣＤＲ３）で、ＶＨＨは、酵素の活性部位またはウイルス表面上の受容体結合キャニオンのような機能的に興味深い部位を含め、従来の抗体には接近できないタンパク質の凹部に広がり得る。ＶＨＨは、従来の抗体の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を有する従来の抗体と比較して、より高い安定性、溶解性、発現収率、および再折畳み能、ならびにより良好なｉｎ  ｖｉｖｏ組織浸透を含む、多数の他の利点を提供する。さらに、従来の抗体のＶＨドメインとは対照的に、ＶＨＨは、軽鎖に結合する固有の傾向を示さない。これは、機能的軽鎖座の存在下での重鎖抗体の誘導を促進する。さらに、ＶＨＨはＶＬドメインに結合しないので、ＶＨＨを二重特異性抗体構築物に再構成することは、ＶＨドメインに基づく従来のＶＨ−ＶＬ対または単一ドメインを含む構築物よりもはるかに容易である。
【０００３】
これまでのところ、いくつかの欠点を有するラマなどのラクダ科動物では重鎖抗体が産生されており、ラクダ科動物は維持に費用がかかり、単純な遺伝子工学には適しておらず、その結果、遺伝子欠損のラクダ科動物が不足している。あるいはまた、ヒトまたはマウス要素に基づく従来の抗体、または重鎖抗体は、トランスジェニックマウスにおいて発現される。
【０００４】
現在まで、ラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｄ領域、ラクダ科Ｊ領域、およびラクダ科の定常重鎖領域を再配列せずに含む遺伝子構築物もトランスジェニック動物も入手できない。
【０００５】
特許文献１は、ラクダ化重鎖抗体の産生に関し、ここで、ＶＨＨ重鎖座は、機能的ＣＨ４ドメインを含まない。機能的なＣＨ４ドメインの欠如のために、機能的なＩｇＭ抗体は産生され得ず、それによって、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチが省略され、それは、自然の成熟プロセスがそれによって短縮されるので、不都合である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／０８５９４４  Ａ２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、軽鎖の欠如のみならず、抗原の深い凹部にも近づくことができる伸長したＣＤＲ領域、高い溶解性および高い安定性などのさらなる構造的特徴にもあるラマ抗体の独特の機能的および構造的特性を、げっ歯動物の遺伝子改変および改善の技術（例えば、利用可能であるノックアウトマウスの大きなレパートリー）と組み合わせる。
【０００８】
特に、本発明の遺伝子構築物およびトランスジェニック動物は、非常に効率的な標的特異的ＶＨＨ含有重鎖抗体をもたらす天然の成熟プロセスを完全に利用することを可能にする。
【０００９】
本発明の目的は、抗体産生のための改善されたプラットフォームを提供することである。特に、本発明の目的は、独特の機能的および構造的特性を有するＶＨＨ含有重鎖抗体、ＶＨＨ含有重鎖抗体を産生するためのトランスジェニック哺乳動物、ならびに哺乳動物生物の天然の組換えおよび選択機構、ならびに利用可能な遺伝子改変ツールとの組み合わせを利用することを可能にする対応する方法および構築物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の第一の態様は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ）ラクダ科ＶＨＨ領域、
ｂ）ラクダ科Ｄ領域、
ｃ）ラクダ科Ｊ領域、
ｄ）ＣＨ１ドメインのないラクダ科定常重鎖領域
を含み、
ラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｄ領域およびラクダ科Ｊ領域は再配列されない、
前記単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
ラクダ科動物の配列はＶＨＨ含有重鎖抗体の構造のために最適化されているので、ＶＨＨ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および定常重鎖領域を含む全ての要素がラクダ科動物のＶＨＨ含有重鎖抗体の構造的特徴を含むことが有利である。ポリヌクレオチド中の要素が再配列されない場合、再配列、体細胞高頻度突然変異およびクラススイッチがトランスジェニック動物において起こり得、それによって、天然の免疫系の利点が利用され得る。
【００１２】
ある実施形態において、ラクダ科Ｄ領域は、少なくとも２つのラクダ科Ｄ要素、好ましくは全てのラクダ科Ｄ要素を含む。好ましくは、ラクダ科Ｊ領域は、少なくとも２つのラクダ科Ｊ要素、好ましくは全てのラクダ科Ｊ要素を含む。これにより遺伝子的変異が増加する。さらに、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの合成Ｄ要素および／または少なくとも１つの合成Ｊ要素を含み得る。
【００１３】
好ましい態様において、定常重鎖領域は、ＣＨ４ドメインをコードする要素を含む。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＨ４ドメインを有するＩｇＭ領域を含む遺伝子構築物およびトランスジェニック動物が、標的特異的ＶＨＨ含有重鎖抗体を効率的に産生することを可能にするため、有利であることを見出した。本発明者らは、これは、広範な体細胞高頻度突然変異がＩｇＭ段階ですでに生じ得、ＣＨ４ドメインを含む構築物がＩｇＧだけでなくＩｇＭ抗体も産生することを可能にするという事実に起因し得ると仮定する。それによって、体細胞高頻度突然変異を含む生物における完全な成熟過程、ＩｇＭ抗体の選択、それに続くＩｇＧ抗体へのクラススイッチを利用することができる。その結果、抗体は完全成熟過程を通過するので、高度に有効な抗体を産生することができる。
【００１５】
典型的には、定常重鎖領域は、
ａ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびに／または
ｂ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン
をコードする要素を含む。
【００１６】
好ましい態様において、定常重鎖領域は、
ａ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびに
ｂ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン
をコードする要素を含む。
【００１７】
好ましい態様において、定常重鎖領域は、ＩｇＤ領域を欠いている。
【００１８】
したがって、特定の実施形態では、定常重鎖領域は、
ａ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびに
ｂ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン
をコードする要素を含み、重鎖領域はＩｇＤ領域を欠いている。
【００１９】
これまでのところ、再配列していないラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｄ領域およびラクダ科Ｊ領域、ならびに機能的なＣＨ１ドメインのないラクダ科定常重鎖領域を含み、さらにＣＨ４ドメインを含む遺伝子構築物もトランスジェニック動物も入手できない。
【００２０】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＨ４ドメインを有するＩｇＭ領域を含み、ＩｇＤ領域を欠く遺伝子構築物およびトランスジェニック動物が特に有利であることを見出した。ラクダ科動物のゲノムＩｇＤ領域は、他の哺乳動物の対応するゲノム領域と比較して明確な特徴を有する（Ａｃｈｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ラクダ科ＩｇＤのコード領域は非機能的であり、すなわち、エクソンは機能的ポリペプチドをコードしない。さらに、マウスおよびヒトＩｇＨ遺伝子座のＩｇＤ領域とは異なり、ラクダ科ＩｇＤ領域は、再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子の非機能性ＩｇＤ遺伝子へのクラススイッチ組換えを引き起こし得る明らかに未変化の上流スイッチ領域を含む。従って、本発明者らは、関連する上流スイッチ領域を含むラクダＩｇＤ領域の欠失が、これによって非機能的遺伝子座へのクラススイッチ組換えが排除されるので、重鎖抗体産生に対して有益な効果を有すると仮定する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、定常重鎖領域は、ラクダ科ＩｇＧ２ａ、ラクダ科ＩｇＧ２ｂ、ラクダ科ＩｇＧ２ｃ、ラクダ科ＩｇＧ３およびラクダ科ＩｇＭからなる群のうちの少なくとも１つをコードする要素を含む。特定の実施形態では、定常重鎖領域は、δ領域を含まない。
【００２２】
好ましい態様において、定常重鎖領域は、ラクダ科ＩｇＭをコードする要素、およびラクダ科ＩｇＧ２ａ、ラクダ科ＩｇＧ２ｂ、ラクダ科ＩｇＧ２ｃ、ラクダ科ＩｇＧ３からなる群のうちの少なくとも１つを含む。より好ましい態様において、定常重鎖領域は、ラクダ科ＩｇＭをコードする要素を含み、ラクダ科ＩｇＧ２ａ、ラクダ科ＩｇＧ２ｂ、ラクダ科ＩｇＧ２ｃ、ラクダ科ＩｇＧ３からなる群のうちの少なくとも１つは、ＩｇＤ偽遺伝子および上流スイッチ領域を含むδ領域を含まない。
【００２３】
特定の実施形態では、定常重鎖領域は、γ２ａ領域を含まない。
【００２４】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物に特異的な少なくとも１つのエンハンサーを含む。
【００２５】
ある実施形態において、ラクダ科ＶＨＨ領域は、少なくとも１個のラクダ科ＶＨＨ要素を含む。
さらに、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの合成ＶＨＨ要素を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ラクダＶＨＨ領域は、サメＶＮＡＲまたは合成ＶＮＡＲ様可変ドメインをコードする少なくとも１つの要素を含み得る。
【００２７】
特定の実施形態では、膜近位ＣＨドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン（複数可）、およびサイトゾルドメイン（複数可）をコードするエクソンは、ＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物の対応するドメインをコードするエクソンによって交換され得る。より具体的な実施形態では、膜近位ＣＨドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン（複数可）、および細胞質ドメイン（複数可）をコードするエクソンは、対応するマウスドメインをコードするエクソンによって交換され得る。
【００２８】
ラクダ科は、ラマ、ビクニャ（Ｖｉｃｕｇｎａ）またはカメラス（Ｃａｍｅｌｕｓ）から選択される科であってもよい。ラクダ科は、例えば、ラマ・パコス、ラマ・グアニコエ（Ｌａｍａ  ｇｕａｎｉｃｏｅ）、ビクグナ・パコス（Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）、カメロス・ドロメダリー（Ｃａｍｅｌｏｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅｓ）、カメロス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）であってもよい。１つの実施形態において、ラクダ科は、アルパカおよびラマ、好ましくはラマから選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列によってコードされる。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号３０の配列またはその断片によってコードされていてもよい。
【００３０】
典型的には、ラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｄ領域およびラクダ科Ｊ領域は、ＶＤＪコード配列を形成するように再配列することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ある実施形態において、ベクターは、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、コスミドまたは合成ＤＮＡ、好ましくは細菌人工染色体である。それによって、ラクダ科動物由来遺伝子座、特にラマ由来ＩｇＨ座の部位特異的改善のためのプラットフォームが提供される。
【００３２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチドを含むトランスジェニック哺乳動物、または本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチドを含むベクターに言及する。ポリヌクレオチドは内因性ではないが、トランスジェニック哺乳動物に対して異種である。好ましくは、哺乳動物は、機能的な内因性ＩｇＨ座を欠いている。
【００３３】
典型的には、トランスジェニック哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。トランスジェニック哺乳動物は、例えば、マウスまたはラットのようなげっ歯動物であり得る。それによって、トランスジェニックげっ歯動物、特にトランスジェニックマウスにおいてＶＨＨ含有重鎖抗体を生成することが可能である。これにより、免疫原またはそのそれぞれの相同分子種を遺伝子的に欠損した動物を免疫化する機会を含め、げっ歯動物の遺伝子的背景においてＶＨＨ含有重鎖抗体を生成することが可能になる。具体的な実施形態では、哺乳動物はマウスであり、ポリヌクレオチドはマウスＩｇ−アルファエンハンサーを含む。本明細書で定義されるポリヌクレオチドによってコードされる再配列した免疫グロブリンの発現により、哺乳動物はＶＨＨ含有重鎖抗体を発現し、それによって哺乳動物はＢ細胞を産生することが可能であり得る。特定の実施形態において、哺乳動物は、膜結合型および／または可溶性バージョンとしてＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの再配列したＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされるＶＨＨ含有重鎖抗体に関する。
【００３５】
本発明の別の態様は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の製造方法であって、当該哺乳動物において異種ＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する工程を含む前記方法に関し、ここで異種ＶＨＨ含有重鎖抗体は、本明細書中に定義されるようなポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされる。
【００３６】
さらに、本発明は、哺乳動物からＶＨＨ含有重鎖抗体をクローニングするための方法に関し、ここで異種ＶＨＨ含有重鎖抗体は、本明細書中に定義するポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされる。
【００３７】
従って、本発明は、本明細書に記載する方法によって産生されるＶＨＨ含有重鎖抗体に関する。
【００３８】
要約すると、本発明のプラットフォームは、以下に適している。
−  ラクダ科動物要素の特殊な特性を有するラクダ科動物由来重鎖のみの抗体、例えば、高溶解性、高安定性および機能的タンパク質凹部に近づくことができる広範なＣＤＲ領域を生成する、
−  免疫系の天然の再構成系を利用する、
−  特に、ＩｇＭ選択、体細胞高頻度突然変異および免疫系のＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ組換えを利用する、
−  トランスジェニック哺乳動物、特に内因性標的抗原を欠く哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体を生成する、
−  ラマ由来ＩｇＨ座の部位特異的改善。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ラマゲノムライブラリーから単離されたＢＡＣ  Ｖ０３およびＦ０７、ならびにラマ由来重鎖のみの抗体を産生する能力をトランスジェニックマウスに付与する基礎としてＢＡＣ  ＴＥ−０１を生成するためになされた遺伝子改変の模式図である。
【図２】ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１の生殖細胞系列伝播である。（Ａ）ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１および遺伝子型判定に用いたＰＣＲプライマーの位置の模式図である。（Ｂ）ＴＥ−０１保有創始マウスとＷＴマウスとの間の断面の子孫のＰＣＲ遺伝子型判定である。
【図３】ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１によるＢ細胞レスキューである。９〜１２週齢のマウスの末梢血細胞を、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ３（Ｔ細胞）およびＣＤ１９（Ｂ細胞）に対する蛍光色素結合抗体で染色した。Ｂ細胞は、ＩｇＨ−ＫＯ動物では発生しない。ＴＥ−０１導入遺伝子の導入は、ＩｇＨ−ＫＯ動物におけるＢ細胞の発生を救出する。
【図４】免疫化ＴＥ−０１マウスの脾臓、リンパ節および骨髄由来のＩｇＭおよびＩｇＧレパートリーのＰＣＲ増幅である。Ａ）ｃＤＮＡを、最終追加免疫の３日後に脾臓（レーン１、２）、リンパ節（レーン３、４）または骨髄（レーン５、６）から調製した。ＶＨＨレパートリーを、ＩｇＭ特異的プライマー（レーン１、３、５）またはＩｇＧ特異的プライマー（レーン２、４、６）でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、Ｒｏｔｉ−ｓａｆｅ（Ｒｏｔｈ）で染色した。Ｂ）予想されるサイズのＩｇＭおよびＩｇＧ特異的増幅産物に対応する帯域を、ゲルから切断し、精製し、第２ラウンドのＰＣＲに供し、その間Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を伸長した。
【図５】免疫化ＴＥ−０１トランスジェニックマウスの脾臓から得られたＶＨＨ−ＩｇＭ重鎖抗体のクローンのアミノ酸配列アラインメントは、広範な体細胞高頻度突然変異を示す。図は、最終追加免疫の３日後に免疫したＴＥ−０１マウスの脾臓から得たＶＨＨ−ＩｇＭ重鎖抗体のクローンの９つのメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す。再配列したクローンの生殖細胞系列構成のＤ要素によってコードされるアミノ酸残基に、下線を付す。Ｄ要素のＶＨＨおよびＪ遺伝子との結合は、広範なＮ結合ヌクレオチドの欠失および挿入を示す。体細胞高頻度突然変異により生殖系列配置と異なるＶＨＨ領域の残基を、灰色で強調する。同様に、体細胞突然変異によると思われるＣＤＲ３の変異型残基も、灰色で強調する。上面のアミノ酸残基の番号付けは、ＶドメインのＫａｂａｔ番号付けに対応する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）。フレームワークおよび相補性決定領域（ＦＲ１〜ＦＲ４、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を、アラインメントの下の括弧内に示す。保存された正準ジスルフィド架橋を媒介する２つのシステイン残基を、星印でマークし、灰色で強調する。
【図６】免疫化ＴＥ−０１トランスジェニックマウスの脾臓から得られたＶＨ−ＩｇＭ重鎖抗体クのローンのアミノ酸配列アラインメントは、広範な体細胞高頻度突然変異を示す。図は、最終追加免疫の３日後に免疫したＴＥ−０１マウスの脾臓から得たＶＨ−ＩｇＭ重鎖抗体のクローンの９つのメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す。再配列したクローンの生殖細胞系列構成のＤ要素によってコードされるアミノ酸残基に、下線を付す。Ｄ要素のＶＨおよびＪ遺伝子との結合は、広範なＮ結合ヌクレオチドの欠失および挿入を示す。体細胞高頻度突然変異により生殖系列配置と異なるＶＨ領域の残基を、灰色で強調する。同様に、体細胞突然変異によると思われるＣＤＲ３の変異型残基も、灰色で強調する。上面のアミノ酸残基の番号付けは、ＶドメインのＫａｂａｔ番号付けに対応する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）。フレームワークおよび相補性決定領域（ＦＲ１〜ＦＲ４、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を、アラインメントの下の括弧内に示す。保存された正準ジスルフィド架橋を媒介する２つのシステイン残基を、星印でマークし、灰色で強調する。
【図７】図は、最終追加免疫の３日後に免疫したＴＥ−０１マウスの脾臓から得たＶＨＨ−ＩｇＧ重鎖抗体のクローンの８つのメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す。再配列したクローンの生殖系列配置のＤ要素によってコードされるアミノ酸残基に、下線を付す。Ｄ要素のＶＨＨおよびＪ遺伝子との結合は、広範なＮ結合ヌクレオチドの欠失および挿入を示す。体細胞高頻度突然変異により生殖系列配置と異なるＶＨＨ領域の残基を、灰色で強調する。同様に、体細胞突然変異によると思われるＣＤＲ３の変異型残基も、灰色で強調する。上面のアミノ酸残基の番号付けは、ＶドメインのＫａｂａｔ番号付けに対応する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）。フレームワークおよび相補性決定領域（ＦＲ１〜ＦＲ４、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を、アラインメントの下の括弧内に示す。保存された正準ジスルフィド架橋を媒介する２つのシステイン残基を、星印でマークし、灰色で強調する。
【図８】一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ−６Ｅ細胞の上清中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色は、キメラＶＨＨ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体の効率的な製造を明らかにする。  ＨＥＫ−６Ｅ細胞を、免疫化ＴＥ−０１マウス由来の個々の重鎖抗体（ＶＨＨ−ウサギＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードする発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後に細胞上清を回収し、細胞上清中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析した。各レーンに１０μｌの細胞上清を負荷した。４０〜４５ｋＤの帯域は、還元型重鎖抗体に相当する。ＳＭ＝ＢＳＡ（１μｇ、６４ｋＤ）、ＩｇＧ重鎖（５００ｎｇ、５０ｋＤ）、ＩｇＧ軽鎖（２５０ｎｇ、２５ｋＤ）、リゾチーム（１００ｎｇ、１４ｋＤ）を含有する分子量マーカータンパク質。
【図９】ＥＬＩＳＡ分析により、抗原特異的ＶＨＨ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体が同定される。免疫化に用いた抗原（ＡＡＶ１）に対する重鎖抗体の特異的結合を、ＥＬＩＳＡで分析した。ウェルを、免疫原または対照抗原（ＢＳＡ、ＣＤ３８）で４℃で一晩コートした。その後、ウェルを、ＢＳＡで遮断した。ウェルを、個々のＮｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体（ＰＢＳで１：２０に希釈、１００μｌ／ウェル）を含有するＨＥＫ−６Ｅ細胞上清と共に６０分間インキュベートした。非結合タンパク質を洗浄により除去し、結合した重鎖抗体をペルオキシダーゼ結合二次抗体（ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＰＢＳ中１：５．０００、１００μｌ／ウェル）および基質としてのＴＭＢで検出した。１５分後に１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸収をプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ、米国）で測定した。無関係なＮｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体（ｓ＋１６ａ）を、負の対照として用いた。ＣＤ３８特異性Ｎｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体を、ＣＤ３８でコートしたウェルについての正の対照として用いた。
【図１０】免疫化したＴＥ−０１トランスジェニックマウスから得たＡＡＶ特定ＶＨＨ重鎖抗体クロのーンの２２要素の、最終追加免疫の３日後のアミノ酸配列アラインメント。再配列したクローン中の生殖系列配置のＤ要素によってコードされるアミノ酸残基に下線を付す。Ｄ要素とＶＨＨおよびＪ遺伝子との結合は、広範なＮ結合ヌクレオチドの欠失および挿入を示す。体細胞高頻度突然変異により生殖系列配置と異なるＶＨＨ領域の残基を、灰色で強調する。同様に、体細胞突然変異によると思われるＣＤＲ３の変異型残基も、灰色で強調する。上面のアミノ酸残基の番号付けは、ＶドメインのＫａｂａｔ番号付けに対応する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）。フレームワークおよび相補性決定領域（ＦＲ１−ＦＲ４、ＣＤＲ１−ＣＤＲ３）を、アラインメントの下の括弧内に示す。保存された正準ジスルフィド架橋を媒介する２つのシステイン残基を、星印でマークし、灰色で強調する。
【図１１】導入遺伝子ＴＥ−０２およびＴＥ−０３の模式図。ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０２およびＴＥ−０３の生成に用いられるＢＡＣ組換えの模式図。５つの追加のラクダ科動物または合成ＶＨＨ遺伝子をコードする合成ＤＮＡカセットを、ＴＥ−０１の５’末端に挿入した。マウス３’遺伝子座制御領域（αＥ＝αエンハンサー）の成分ＨＳ３ａおよびＨＳ１，２を、ＨＳ３ｂ／ＨＳ４の上流に挿入した（Ｐｉｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）”Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１８７−１９９）。最後に、ＴＥ−０３を生成するために、ラマＩｇＭ遺伝子座のＣＨ３−ＣＨ４−ＴＭ１−ＴＭ２領域を、マウスＩｇＭの対応する要素で置き換えた。
【図１２】Ｂ細胞を、ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０２およびＴＥ−０３によって救済する。９〜１２週齢のマウスの末梢血細胞を、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ３（Ｔ細胞）およびＣＤ１９（Ｂ細胞）に対する蛍光色素結合抗体で染色した。Ｂ細胞は、ＩｇＨ−ＫＯ動物では発生しない。ＴＥ−０２導入遺伝子またはＴＥ−０３導入遺伝子のいずれかの導入は、ＩｇＨ−ＫＯ動物におけるＢ細胞発生を救済する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明を、その好ましい実施形態のいくつかに関して詳細に説明する前に、以下の一般的定義を提供する。
【００４１】
以下に例示的に記載する本発明は、本明細書中に特に開示しないいかなる要素（単数）または要素（複数）、限定（単数）または限定（複数）もなく適切に実施され得る。
【００４２】
本発明を、特定の実施形態に関して、また特定の図を参照して記載するが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００４３】
用語「含む」を、本説明および特許請求の範囲において使用する場合、それは、他の要素を除外しない。本発明の目的のために、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下において、群が少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これをまた、好ましくは、これらの実施形態のみからなる群を開示すると理解するべきである。
【００４４】
本発明の目的のために、用語「得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」は、用語「得られる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下において、例えば、抗体が特定の供給源から得られると定義される場合、これをまた、この供給源から得られる抗体を開示すると理解するべきである。
【００４５】
単数形名詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」に言及する際に不定冠詞または定冠詞を用いる場合、他に何か具体的に述べない限り、これには当該名詞の複数形が含まれる。逆に、複数の名詞を使用する場合、他に何か具体的に述べない限り、これには単数形名詞も含まれる。本発明の文脈における用語「約」または「おおよそ」は、問題の特徴の技術的効果を依然として保証するために当業者が理解するであろう精度の間隔を示す。この用語は、典型的には、±１０％、好ましくは±５％の指示された数値からの偏差を示す。
【００４６】
専門用語を、それらの一般的な意味によって使用する。特定の意味を特定の用語に伝える場合、用語の定義は、用語を使用する文脈において以下に与えられる。
【００４７】
本発明は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドに関し、以下を含み：
ａ）ＶＨＨ領域、
ｂ）Ｄ領域、
ｃ）Ｊ領域、
ｄ）機能的ＣＨ１ドメインのない定常重鎖領域、
ＶＨＨ領域、Ｊ領域およびＤ領域は再配列されない。
【００４８】
本発明はまた、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドに関し、以下を含み：
ａ）ラクダ類のＶＨＨ領域、
ｂ）Ｄ領域、
ｃ）Ｊ領域、
ｄ）機能的なＣＨ１ドメインのない定常重鎖領域、
ラクダ類のＶＨＨ領域、Ｊ領域およびＤ領域は再配列されない。
【００４９】
本発明の文脈における「機能的ＣＨ１ドメインのない定常重鎖領域」は、発現される場合、定常重鎖領域が機能的ＣＨ１ドメインを発現しないこと、すなわち、ＣＨ１ドメインをコードするエクソンを欠くか、または１以上の欠陥スプライスシグナルを有するそのようなエクソンを含むことを意味する。
【００５０】
「ＶＨＨ含有重鎖抗体」という用語は、「ＶＨＨ含有重鎖のみの抗体」としても知られ、重鎖のみから構成され、いかなる軽鎖も含まない抗体を指す。典型的には、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖を含み、分泌型ＩｇＭ抗体は５つの抗体サブユニットを含み、従って１０の重鎖を含む。各重鎖は、可変領域（ＶＨＨ、ＤおよびＪ要素によってコードされる）および定常領域を含む。定常領域はさらに、いくつかのＣＨ（定常重鎖）ドメインを含み、有利には、ＩｇＭアイソタイプについての定常領域遺伝子によってコードされる３つのＣＨドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）と、ＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプについての２つのＣＨドメイン：（ＣＨ２、ＣＨ３）とを含む。本明細書で定義するＶＨＨ含有重鎖抗体は、機能的ＣＨ１ドメインを有しない。機能的ＣＨ１ドメイン（従来の抗体では軽鎖の定常ドメインに対するアンカー部位を有する）の欠如、およびＶＨドメインの代わりにＶＨＨドメインの存在が、本発明に従う重鎖抗体の軽鎖との会合不能およびそれらの従来の抗体の形成不能を説明する。
【００５１】
各重鎖は、可変領域（ＶＨＨ要素、Ｄ要素およびＪ要素によってコードされる）ならびに定常領域を含む。定常領域は多数の定常領域要素を含み、各要素は定常領域ＣＨドメインをコードする。本明細書で定義する抗体は、機能的ＣＨ１ドメインを有しない。機能的なＣＨ１ドメイン（従来の抗体では軽鎖の定常ドメインに対するアンカー部位を有する）の欠如は、本発明に従う重鎖抗体が軽鎖と会合して従来の抗体を形成することができないことを説明している。
【００５２】
本発明の文脈において、用語「異種」は、本明細書中に記載するポリヌクレオチドが当該哺乳動物に対して内因性でないことを意味する。例えば、哺乳動物がげっ歯動物である場合、発現は、ラクダ科動物のＤ要素が異種であるような、げっ歯動物内に通常は見出されないＤ要素の発現である。
【００５３】
本発明に係る「再配列ＶＨＨ−Ｄ−Ｊ領域」は、「ＶＨＨ要素」、「Ｄ要素」、「Ｊ要素」および再配列中に接合部に付加されるヌクレオチドから構成される。好ましくは、完全な再配列重鎖ヌクレオチド配列は、ＶＨＨ−Ｄ−Ｊ領域、およびＩｇＭアイソタイプについての３つの「定常重鎖要素」、ＩｇＧまたはＩｇＡアイソタイプについての２つの「定常重鎖要素」、およびＩｇＥアイソタイプについての３つの「定常重鎖要素」を含む。
【００５４】
特に、本発明は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドに関し、以下を含み：
ａ）ラクダ科ＶＨＨ領域、
ｂ）ラクダ科Ｊ領域、
ｃ）ラクダ科Ｄ領域、
ｄ）機能的なＣＨ１ドメインのないラクダ科定常重鎖領域、
ラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｊ領域およびラクダ科Ｄ領域は再配列されない。
【００５５】
「ラクダ類ＶＨＨ領域」は、少なくとも１つのラクダ類ＶＨＨ要素を含む配列に関係する。ラクダ科動物のＶＨＨ領域は、ラクダ科動物由来であるか、またはラクダ科動物のＶＨＨの特徴を含む合成ＤＮＡ断片である。あるいは、ＶＨＨ領域のＶＨＨ要素に隣接する配列は、少なくとも部分的にラクダ科動物起源のものとは異なる起源のものであり得る。隣接する配列は、例えば、ポリヌクレオチドが発現される哺乳動物の起源のものであり得る。ＶＨＨ要素（複数可）に隣接する配列は、例えば、エンハンサー、プロモーター、または抗体の分泌のような局在化を指令するシグナルペプチドのような調節要素を含み得る。ＶＨＨフランキング配列は、好ましくは、導入遺伝子が発現される哺乳動物、または密接に関連した哺乳動物、例えば、トランスジェニックラットのためのマウス隣接配列に由来する。
【００５６】
１つの実施形態において、ラクダ科ＶＨＨ領域は、１つのラクダ科ＶＨＨ要素を含む。好ましくは、ラクダ科ＶＨＨ領域は、少なくとも２つのラクダ科ＶＨＨ要素、より好ましくは少なくとも３つのラクダ科ＶＨＨ要素、さらにより好ましくは少なくとも４つのラクダ科の要素、例えば少なくとも５つのラクダ科の要素、最も好ましくは少なくとも５つのラクダ科ＶＨＨ要素、例えば実施例に示すＴＥ０２およびＴＥ０３構築物を含み得る。「ラクダ科ＶＨＨ領域」は、天然起源でないポリヌクレオチド配列を含む合成ＶＨＨ要素も含み得る。このような合成ＶＨＨ要素は、ラクダ科動物とは異なる哺乳動物の起源、特にヒト起源である配列ストレッチと組み合わせたラクダ科動物起源の配列ストレッチを含む「ヒト化ＶＨＨ要素」であり得る。特に好ましい態様において、ラクダ科ＶＨＨ領域は、５つのラクダ科ＶＨＨ要素およびヒト化ＶＨＨ要素を含む。合成ＶＨＨ要素の例は、配列番号１８である。合成ＶＨＨ要素は、配列番号１８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。
【００５７】
本発明の文脈における「ラクダＶＨＨ要素」は、得られた要素が、本発明に従って、Ｄ要素、Ｊ要素、および定常重鎖領域（いくつかの要素を含む）と組み換えられ、ポリヌクレオチドが発現される場合、本明細書中に定義するＶＨＨ含有重鎖抗体を生成する限り、ラクダおよびその任意の誘導体またはフラグメントにおいて見出される天然に存在するＶＨＨコード配列を記載する。ラクダ類ＶＨＨ要素は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択され得る。ラクダ類ＶＨＨ要素は、配列番号１５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。ラクダ類ＶＨＨ要素は、配列番号１６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。ラクダＶＨＨ要素は、配列番号１７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。ラクダＶＨＨ要素は、配列番号１９と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。ラクダ類ＶＨＨ要素は、配列番号２０と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。ＶＨＨ要素は、最終的な成熟抗体の構造の一部を形成するポリペプチドをコードする配列である。それは、ＶＨＨ要素が、純粋に調節配列である配列、または最終的な成熟抗体の構造に存在しないシグナルペプチドを含まないことを意味する。
【００５８】
１つの実施形態において、ＶＨＨ要素は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択され得る。
【００５９】
「ラクダ科Ｄ領域」領域は、少なくとも１つのラクダ科Ｄ要素を含む配列を指す。ラクダ科Ｄ領域は、ラクダ科起源の完全な領域を有し得る。あるいは、Ｄ領域のＤ要素に隣接する配列は、ラクダ科動物起源のものとは少なくとも部分的に異なる起源のものであり得る。フランキング配列は、例えば、ポリヌクレオチドが発現される哺乳動物または関連する哺乳動物の起源であり得る。Ｄ要素（複数可）に隣接する配列は、例えば、５’および３’組換えシグナル配列（ＲＳＳ）のような調節要素を含み得る。
【００６０】
「ラクダ科Ｄ要素」という用語は、ラクダ科および誘導体中に見出されるＤ要素の天然に存在する配列、ならびに得られた要素が組み換えられて本明細書中に記載するような重鎖抗体を生成し得る限り、そのフラグメントを指す。Ｄ要素は、天然に存在する供給源から誘導され得るか、またはそれらは、当業者が熟知しており、本明細書中に記載する方法を用いて合成され得る。Ｄ要素は、再配列の間に接合部に付加されるヌクレオチドと共に、最終的な成熟抗体の構造の一部を形成する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ポリペプチドをコードする配列である。これは、Ｄ要素が、純粋に調節配列である配列、または最終的な成熟抗体の構造中に存在しないシグナルペプチドを含まないことを意味する。
【００６１】
具体的な実施形態では、ラクダ科Ｄ領域は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つのラクダ科Ｄ要素を含む。好ましくは、ラクダＤ領域は、例えば、Ａｃｈｕｒら（２００８）「Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｃａｍｅｌｉｄ  ＩｇＧｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｎ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：２００１−２００９にアルパカについて記載されるように、全てのラクダＤ要素を含む。１つの実施形態において、ラクダ科Ｄ領域は、ラマ・グラマ由来の全てのＤ要素を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択され得る。Ｄ要素は、配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号９と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号１０と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号１１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号１２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号１３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。Ｄ要素は、配列番号１４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、さらなるＤ要素、例えば、げっ歯動物、ウマ、イヌ、ウシ、ウサギ、サメ、もしくは種々のラクダ科動物のような他の動物由来の相同Ｄ要素、または天然起源ではない配列を有する合成要素を含み得る。例えば、ラクダ科Ｄ領域は、Ｌａｍａ種およびＣａｍｅｌｕｓ種由来のＤ要素を含むことができる。１つの実施形態において、ラクダ科Ｄ領域は、ラマ・グラマ由来の全てのＤ要素およびさらなるＤ要素を含み得る。ポリヌクレオチドは、抗体中に通常見出されない構造ドメイン、例えば、コントキシンまたはコノトキシン様ペプチドをコードするＤ要素を含み得る。コノトキシンは、１０〜３０個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、典型的には１個以上のジスルフィド結合（ＰＦ０７３６５）を有する。ポリヌクレオチドは、システインノットまたはシステインノット様ペプチドをコードするＤ要素を含み得る。システインノットは、３つのジスルフィド架橋（Ｐｆａｍ  ＰＦ００００７）を含むタンパク質構造モチーフである。あるいは、ポリヌクレオチドは、コノトキシン様またはシステインノット様ペプチドのフラグメントをコードするＤ要素を含み得、残りのフラグメントは、適切に修飾��れたＶＨＨおよびＪ要素によってコードされる。
【００６２】
あるいは、ポリヌクレオチドは、Ｄ要素として合成Ｄ要素のみ、およびＪ要素として合成Ｊ要素のみを含み得る。このような合成ＤＮＡ要素は、コノトキシンもしくはコノトキシン様ペプチド、またはシステインノットもしくはシステインノット様ペプチドのようなドメインをコードし得る。
【００６３】
「ラクダ科Ｊ領域」領域は、少なくとも１つのＪ要素を含む配列を指す。ラクダ科Ｊ領域は、ラクダ科由来の完全な領域を有し得る。あるいは、Ｊ領域のＪ要素（複数可）に隣接する配列は、ラクダ科起源のものとは少なくとも部分的に異なる起源のものであり得る。隣接する配列は、例えば、ポリヌクレオチドが発現される哺乳動物または関連動物の起源であり得る。Ｊ要素（複数可）に隣接する配列は、例えば、５’組換えシグナル配列（ＲＳＳ）および３’ドナースプライス部位のような調節要素を含み得る。
【００６４】
用語「ラクダＪ要素」は、得られる要素が本明細書中に記載するような重鎖抗体を生成するために組み換えられ得る限り、ラクダおよびその誘導体およびフラグメント中に見出されるＪ要素の天然に存在する配列を指す。Ｊ要素は、天然に存在する供給源から誘導され得るか、またはそれらは、当業者が熟知しており、本明細書中に記載する方法を用いて合成され得る。Ｊ要素は、最終的な成熟抗体の構造の一部を形成するポリペプチドをコードする配列である。これは、Ｊ要素が、純粋に調節配列である配列、または最終的な成熟抗体の構造中に存在しないシグナルペプチドを含まないことを意味する。
【００６５】
具体的な実施形態では、ラクダ科Ｊ領域は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つのラクダ科Ｊ要素を含む。好ましくは、ラクダＪ領域は、例えば、Ａｃｈｕｒら（２００８）「Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｃａｍｅｌｉｄ  ＩｇＧｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｎ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：２００１−２００９のアルパカに記載されるように、全てのラクダＪ要素を含む。１つの実施形態において、ラクダ科Ｊ領域は、ラマ・グラマ由来の全てのＪ要素を含むことができる。Ｊ要素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択され得る。Ｊ要素は、配列番号１に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。Ｊ要素は、配列番号２に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。Ｊ要素は、配列番号３に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。Ｊ要素は、配列番号４に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。Ｊ要素は、配列番号５に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。Ｊ要素は、配列番号６に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。Ｊ要素は、配列番号７に示される配列の１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、さらなるＪ要素、例えば、げっ歯動物、ウマ、イヌ、ウシ、ウサギ、サメ、もしくは種々のラクダ科動物のような他の動物由来の相同Ｊ要素、または天然起源ではない配列を有する合成要素を含み得る。
【００６６】
「ラクダ科定常重鎖領域」という用語は、少なくとも２つのラクダ科ＣＨドメインを含む配列を指す。この用語は、得られた要素が、本発明に従うＶＨＨ要素、Ｄ要素、およびＪ要素と組み換えられ、ポリヌクレオチドが発現される場合、本明細書中に定義するＶＨＨ含有重鎖抗体を生成する限り、ラクダ科動物に見出される重鎖の定常領域およびその任意の誘導体または断片のコード配列を指し得る。ラクダ科の定常重鎖領域は、ラクダ科の起源の完全な領域を有していてもよい。あるいは、ラクダ科の定常重鎖領域のＣＨドメインコード配列に隣接する配列は、ラクダ科の起源のものとは少なくとも部分的に異なる起源のものであり得る。隣接する配列は、例えば、ポリヌクレオチドが発現される哺乳動物の起源のものであり得る。１つの実施形態において、膜近位ＣＨドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエクソンは、ＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物の対応するドメインをコードするエクソンによって交換される。
【００６７】
一般的に、ＣＨ遺伝子は、各定常重鎖ポリペプチドの異なるドメインをコードし、一般的に、３つのＣＨドメインは、単一のＩｇＭ重鎖抗体を構成し、２つのＣＨドメインは、本明細書中に記載するような単一のＩｇＧ重鎖抗体を構成する。ＶＨＨ含有重鎖抗体は、機能的なＣＨ１（軽鎖ドメインアンカー領域を含む）を有しない。従って、本発明に従うポリヌクレオチド、特に定常重鎖領域は、機能的ＣＨ１をコードする要素を含まない。本発明のポリヌクレオチドが由来する配列中に存在する機能性ＣＨ１ドメインを発現することができる要素は、機能性ＣＨ１ドメインが発現され得ないように、定常重鎖領域のＣＨ１要素の変異、欠失置換または他の処理によって欠失され得る。
【００６８】
本発明の文脈における「フラグメント」は、ヌクレオチド配列またはペプチド配列が、それが由来する配列よりも短いことを意味する。断片は、それが由来する配列の機能的特徴のままであり得る。フラグメントは、例えば、それが由来する配列より１％、３％、５％、６％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％短くてもよい。
【００６９】
本発明の文脈における「誘導体」は、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が修飾されていることを意味する。例えば、配列は、ヒト化、マウス化、またはラクダ化され得、これは、元の配列が、ヒト、マウス、またはラクダに特異的な配列モチーフを含むように改変され得ることを意味する。
【００７０】
各定常重鎖領域は、本質的に、少なくとも１つの定常領域重鎖遺伝子を含む。好ましくは、定常重鎖領域は、重鎖ＩｇＭの生成が起こり得るように、ＩｇＭ抗体の定常領域をコードするＣμ遺伝子を含む。定常重鎖領域はまた、ＩｇＧ抗体の定常領域をコードするＣγ遺伝子を含み得る。言い換えれば、定常重鎖領域は、ａ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびに／またはｂ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをコードする要素を含む。特定の実施形態では、定常重鎖領域は、ａ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびにｂ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをコードする要素を含む。
【００７１】
１つの実施形態において、定常重鎖領域は、ラクダ科ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ラクダ科ＩｇＧ２ｂ、ラクダ科ＩｇＧ２ｃ、ラクダ科ＩｇＧ３、すなわち、μ、γ２ａ、γ２ｂ、γ２ｃまたはγ３要素からなる群のうちの少なくとも１つをコードする要素を含む。１つの実施形態において、重鎖領域はγ２ａ領域を含まない。
【００７２】
好ましい態様において、定常重鎖領域は、関連するスイッチ領域を有するδ領域を含まない。これにより、ＩｇＤ偽遺伝子へのクラススイッチを回避することができる。
【００７３】
当業者は、領域または要素が天然源に由来してもよく、または当業者が熟知している方法を用いて合成してもよいことを理解するであろう。
【００７４】
「再配列されない」という用語は、ＶＨＨ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および定常重鎖領域が、重鎖抗体を発現することができる機能的配列を形成するように再配列されないヌクレオチド配列を指す。これは、ＶＨＨ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、および定常重鎖領域が、ヌクレオチド配列によって分離され、本明細書中に記載するように、トランスジェニック哺乳動物のゲノムに導入される場合、再配列可能であることを意味する。従って、ＶＨＨ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および定常重鎖領域の再配列は、ポリヌクレオチドが導入された哺乳動物において行われる。これにより、自然の組換え機構を利用することができる。ＶＨＨ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および定常重鎖領域を分離するヌクレオチドは、数百から数千のヌクレオチドを含み得る。例えば、ラマ・グラマの天然に存在する遺伝子座では、ＶＨＨ要素は５〜２０ｋｂの配列ストレッチによって分離されている。しかしながら、これらの配列ストレッチは、例えば、５０００ｂｐ未満、３０００ｂｐ未満、１０００ｂｐ未満を含むように縮小することができる。典型的には、分離配列は、５０ｂｐ超、１００ｂｐ超、２００ｂｐ超、３００ｂｐ超、４００ｂｐ超を含む。ＤセグメントおよびＪセグメントの天然に存在するクラスターにおいて、Ｄセグメント間または個々のＪセグメント間の距離は、約１００〜１０００ｂｐであり得るが、最大２０ｋｂに達し得る。好ましくは、ＶＨＨ、Ｄ、Ｊおよび定常重鎖領域に隣接する配列は、ラクダ科起源である。あるいは、これらの配列は、ＶＨＨ重鎖抗体が発現される哺乳動物、または関連する哺乳動物、例えば、トランスジェニックラットの場合のマウス配列に特異的であり得る。
【００７５】
上記のように、当業者は、本発明に従うラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｄ領域およびラクダ科Ｊ領域が、ＶＨＨ−Ｄ−Ｊコード配列を形成するように再配列可能であることを理解する。
【００７６】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのエンハンサーまたはその一部を含む。少なくとも１つのエンハンサーは、ＶＨＨ重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物に特異的であり得る。エンハンサーは、対応する転写因子が結合する配列（例えば、Ｉｇ−αに対するＨＳ３ａ、ＨＳ１、２、ＨＳ３ｂおよびＨＳ４）のような、Ｉｇ−αもしくはＩｇ−μエンハンサーまたはその一部であってよい。例えば、ＶＨＨ重鎖抗体がマウスにおいて発現される場合、ポリヌクレオチドは、マウスＩｇ−αエンハンサーまたはラットＩｇ−αエンハンサーを含み得る。従って、ＶＨＨ重鎖抗体がラットにおいて発現される場合、ポリヌクレオチドは、マウスＩｇ−αエンハンサーまたはラットＩｇ−αエンハンサーを含み得る。
【００７７】
ラクダ科は、Ｌａｍａ、ＶｉｃｕｇｎａまたはＣａｍｅｌｕｓから選択される科のものであってよい。ラクダ科の動物は、例えば、ラマ・パコス、ラマ・グアニコエ、ビクグナ・パコス、カメロス・ドロメダリー、またはカメルス・バクトリアヌスであり得る。１つの実施形態において、ラクダ科動物は、ラマ・パコスおよびラマ・グラマ、好ましくはラマ・グラマから選択される。
【００７８】
本発明の例示的なポリヌクレオチドは、図１に概略的に描かれたラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１である。ＴＥ−０１の配列は、配列番号３０に示されている。従って、本発明は、配列番号３０と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一であるポリヌクレオチドに関する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号３０に示される配列またはそのフラグメントによってコードされる。したがって、本発明の１つの実施形態は、ラクダ科ＶＨＨ要素、７つのラクダ科Ｄ要素、７つのラクダ科Ｊ要素、ＣＨ１コード化エクソンを欠くラクダ科μ領域、ラクダ科γ２ｂ領域、ならびにマウスαエンハンサー（ＨＳ３ｂおよびＨＳ４）の一部をコードするポリヌクレオチドに関する。特に、本発明の１つの実施形態は、配列番号１５に示すＶＨＨ要素、配列番号８〜１４に示すラクダ科Ｄ要素、配列番号１〜７に示すラクダ科Ｊ要素、配列番号２６に示すラクダ科ＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン、配列番号２７に示すラクダ科ＩｇＭ  ＣＨ３ドメイン、配列番号２８に示すラクダ科ＩｇＭ  ＣＨ４ドメイン、配列番号２９に示すラクダ科ＩｇＭ  膜貫通ドメイン（ＴＭ）１ドメイン、配列「ＧＴＧＡＡＧ」を有するラクダ科ＩｇＭ  ＴＭ２ドメイン、配列番号２１に示すラクダ科Ｉｇ２ｂドメイン、配列番号２２に示すラクダ科ＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン、配列番号２３に示すラクダ科Ｉｇ２ｂ  ＣＨ２ドメイン、配列番号２４に示すラクダ科Ｉｇ２ｂ  ＴＭ  １ドメイン、および配列番号２５に示すラクダ科Ｉｇ２ｂ  ＴＭ２ドメインをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００７９】
ＴＥ−０１構築物は、図１に模式的に示すＢＡＣ  Ｆ０７およびＢＡＣ  Ｖ０３の組み合わせに由来する。Ｆ０７の配列は配列番号３１に示され、Ｖ０３の配列は配列番号３２に示される。
【００８０】
従って、１つの実施形態において、本発明に従うポリヌクレオチドは、図１１に概略的に示し、本明細書中に記載するＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１、ＴＥ０２またはＴＥ０３からなる群より選択される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、図１１に示すような導入遺伝子ＴＥ０２またはＴＥ０３である。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、図１１に示すような導入遺伝子ＴＥ０３である。
【００８１】
本発明の別の態様は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００８２】
「ベクター」は、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る好適な宿主細胞中に核酸配列を運ぶ能力を有する任意の分子または組成物である。典型的に、かつ好ましくは、ベクターは、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、所望の核酸配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド）を組み込むように操作された核酸である。ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、または合成ＤＮＡであり得る。好ましくは、ベクターは、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＨＡＣ、コスミドまたは合成ＤＮＡであり、より好ましくはＢＡＣである。それによって、ラクダ科動物由来遺伝子座、特にラマ・グラマ由来ＩｇＨ座の部位特異的改善のためのプラットフォームが提供される。ＢＡＣを修飾する方法は、例えば、Ｐａｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．「ＢＡＣ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｒｉａｌ  ｏｒ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｒｅ／Ｌｏｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１，ｐｐ．１−１２（２０１０）およびＷａｒｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＢＡＣ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｌＫ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（４）：ｅ３６（２００５）に記載されている。
【００８３】
本発明の別の態様は、本明細書に記載する単離ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック哺乳動物、または単離ポリヌクレオチドを含む本明細書に記載するベクターに言及する。本発明に従うポリヌクレオチドは、トランスジェニック哺乳動物に対して内因性ではないが、異種である。当業者は、トランスジェニック哺乳動物が非ヒト哺乳動物であることを理解する。
【００８４】
トランスジェニック哺乳動物は、げっ歯動物（マウス、ラット、モルモット）、ラゴモルファ（ウサギ）、ラクダ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌおよび他の家畜または野生哺乳動物のような所望の抗原で免疫するのに適した任意の哺乳動物であり得る。トランスジェニック哺乳動物は、有利には、ラクダ科動物よりも小さく、所望の抗原で維持および免疫感作することがより容易である。本発明の文脈において、哺乳動物はヒトではない。理想的には、トランスジェニック哺乳動物は、モルモット、ラットもしくはマウスのようなげっ歯動物、またはウサギのようなラゴモルフである。マウスおよびラットが特に好ましい。好ましくは、哺乳動物は、ＶＨＨ含有重鎖抗体が産生されるべき免疫原またはそのそれぞれのオルソログを遺伝子的に欠損している。
【００８５】
従って、本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされるＶＨＨ含有重鎖抗体を有するトランスジェニック哺乳動物に関する。当業者は、本発明の文脈において、再配列がトランスジェニック哺乳動物において起こることを理解する。
【００８６】
好ましい態様において、哺乳動物は、機能的な内因性ＩｇＨ座を欠いている。当業者は、機能的な内因性ＩｇＨ座を欠く哺乳動物を達成する方法を知っている。好ましくは、哺乳動物は、Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｔ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」Ｃｅｌｌ  ７３（６）：１１５５−１１６４（１９９３）またはＭｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０：２９３２−２９４１に記載されるような、機能的な内因性ＩｇＨ座を欠くマウスまたはラットである。
【００８７】
本発明に従うポリヌクレオチドが哺乳動物において発現される場合、トランスジェニック哺乳動物は、Ｂ細胞を生成することができる。これは、特に、機能的な内因性ＩｇＨ座を欠き、従ってＢ細胞を生成できない哺乳動物を意味し、前記哺乳動物は、本発明のポリヌクレオチドの導入後、Ｂ細胞の生成を救済することができ、哺乳動物がＢ細胞を生成できることを意味する。
【００８８】
単離されたポリヌクレオチドを本明細書中に記載するように哺乳動物に導入する場合、トランスジェニック哺乳動物は、ＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する。具体的な実施形態では、哺乳動物は、膜結合型および／または可溶型としてＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する。
【００８９】
本発明の別の態様は、哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の製造方法であって、哺乳動物において異種ＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する工程を含む、前記方法に関し、ここで異種ＶＨＨ含有重鎖抗体は、本発明に従うポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされる。当業者は、本発明の文脈において、再配列がトランスジェニック哺乳動物において起こることを理解する。
【００９０】
さらに、本発明は、哺乳動物由来のＶＨＨ含有重鎖抗体をクローニングする方法であって、異種ＶＨＨ含有重鎖抗体が、本発明に従うポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされる、前記方法に関する。当業者は、本発明の文脈において、再配列がトランスジェニック哺乳動物において起こることを理解する。クローニングの方法は、当該哺乳動物を免疫化する工程、および当該哺乳動物由来のＶＨＨ含有重鎖抗体を発現するＢ細胞を、例えば、骨髄腫細胞への融合によって不死化する工程を含み得る。あるいは、この方法は、当該哺乳動物を免疫化する工程、および当該哺乳動物のＢ細胞からＶＨＨコード配列を得る工程を含み得る。ＶＨＨコード配列は、ＰＣＲのような増幅技術によって得られ、ファージディスプレイのような技術によって選択され得る。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、上記の段落に記載した方法によって産生されるＶＨＨ含有重鎖抗体に関する。
【００９２】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされるＶＨＨ含有重鎖抗体に関する。当業者は、本発明の文脈において、再配列がトランスジェニック哺乳動物において起こることを理解する。
【００９３】
特定の実施形態において、ＶＨＨ含有重鎖抗体は、配列番号５９〜８０に示す配列の群から選択される配列またはそのフラグメントを含み得る。
【００９４】
ＶＨＨ含有重鎖抗体は、ラクダ科ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、例えばＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３であり得る。
【００９５】
本明細書に記載するＶＨＨ含有重鎖抗体のフラグメント、特にナノボディもまた意図される。用語「ナノボディ」は、単一の再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊドメインを含む、典型的にはそれからなる分子を指す。
【００９６】
方法
ラマ・グラマゲノムＢＡＣライブラリーのクローニング
ラマ・グラマＩｇＨ座をクローニングするために、ラマの肝臓からゲノムＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、平均サイズ１５０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。断片をＢＡＣベクターｐＣＣ１（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）にクローニングし、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションしてゲノムライブラリーを得た。可変ドメインおよび定常ドメインに特異的なプローブを用いて、挿入サイズが９０〜２２０ｋｂの１７のＢＡＣを単離し、サザンブロット分析により検証した。個々のクローンのサイズを、ＮｏｔＩ消化ＢＡＣのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いて測定した。免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変および／または定数セグメントを有する２つの重複ＢＡＣ（Ｖ０３およびＦ０７）を、５ｋｂ断片に剪断し、Ｓａｎｇｅｒ技術により配列決定した。プライマー歩行によって隙間を埋め、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを用いて完全な配列を組み立てた。
【００９７】
ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１の生成
マウスにおける重鎖のみの抗体の発現を促進するために、ＢＡＣ  Ｖ０３を、ＢＡＣ組換えを用いて遺伝子的に改変した。マウス座制御領域（ＬＣＲ、αエンハンサー）の領域ＨＳ３ｂおよびＨＳ４を、ＢＡＣ  Ｖ０３の３’末端に挿入した。このために、ＨＳ３ｂおよびＨＳ４を、マウスＬＣＲの必須部分をコードするプラスミド（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｃｏｇｎｅ，Ｌｉｍｏｇｅｓ，Ｆｒａｎｃｅにより提供される）（Ｐｉｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）「Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１８７−１９９）から、ＢＡＣ挿入部位に相同な５０ｂｐオーバーハングを有するＰＣＲプライマーを使用して増幅した。増幅された構築物のＢＡＣ  Ｖ０３への挿入を、Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ組換え技術（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を用いて行った。
【００９８】
ラマ・グラマＣδ偽遺伝子および関連するスイッチ領域を、スペクチノマイシン耐性カセットによって置き換えた。選択カセットを、ラマ・グラマＣδ領域に隣接する配列に相同な５０ｂｐオーバーハングでＰＣＲ増幅した。増幅した選択カセットによるＣδ領域の交換を、Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ組換え技術を用いて行った。
【００９９】
Ｂ細胞発生の間の重鎖および軽鎖の対合を回避するために、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ  Ｃμ座のＣＨ１ドメインを、ＢＡＣ  Ｖ０３において欠失させた。このために、ＣＨ１ドメインを、２つのｌｏｘＰ変異体ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６が隣接するアンピシリン耐性カセットによって置き換えた（Ｐａｒｒｉｓｈら（２０１１）「ＢＡＣ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｒｉａｌ  ｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＣＲＥ／Ｌｏｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｊ  Ｍｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１：９２４０６８）。この構築物を、Ｃμ  ＣＨ１ドメインに隣接する配列に相同な５０ｂｐのオーバーハングで合成した。組換え株大腸菌ＳＷ１０６（Ｎｅａｌ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡにより提供される）（Ｗａｒｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）「Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＢＡＣ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｌＫ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３（４）：ｅ３６）を用いて組換えを行った。相同組換えに続いてＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えを行って、ＢＡＣ  Ｖ０３からアンピシリン選択カセットを欠失させた。
【０１００】
重鎖のみのＣγアイソタイプへのクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）を可能にするために、Ｃδ偽遺伝子の位置に以前に挿入されたスペクチノマイシン選択カセットを、ＢＡＣ  Ｆ０７から得られたＬａｍａ  ｇｌａｍａ  Ｃγ２ｂアイソタイプに置き換えた。このために、Ｃγ２ｂをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）／ＬＩＣにクローニングした。Ｃγ２ｂ座に相同性アームを備えるために、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）／ＬＩＣ適合性のクローニング部位（ＣｌａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ）に隣接する２つのホモロジー領域を有する遺伝子合成構築物を設計した。２７０ｂｐの３’−相同領域を、２つのｌｏｘＰ変異体ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６が隣接するアンピシリン選択カセットに遺伝子的に融合した。構築物を合成し、ベクターｐＵＣ５７にクローン化した。２８５ｂｐの５相同領域をＣｌａＩ制限消化により単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）／ＬＩＣのＣγ２ｂ座の上流のＣｌａＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドを、アンピシリン選択カセットに融合した２７０ｂｐ  ３’相同性アームの挿入のための標的ベクターとして使用した。この構築物をＢｓｔＺ１７Ｉ制限消化により単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）／ＬＩＣのＣγ２ｂ座の下流のＢｓｔＺ１７Ｉ部位にクローン化した。ＮｒｕＩ制限部位を含む２８５ｂｐサイズの５’相同性アームを、相補的プライマー配列として合成した。相補的な一本鎖ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、制限部位特定オーバーハングが生じ、Ｃγ２ｂ座の上流の相同性アームの部位特異的挿入が可能となった。第２のＮｒｕＩ制限部位を含む２７０ｂｐの３’相同性アームに融合した２つのｌｏｘＰ突然変異体ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６に隣接するアンピシリン耐性カセットを、二本鎖ＤＮＡとして合成し、Ｃγ２ｂ座の下流に挿入した。両方の相同性アームおよびフロックス処理したアンピシリン選択カセットを有する構築物全体を、相同性アームにコードされた平滑な末端ＮｒｕＩ制限部位を用いて単離した。組換え株大腸菌ＳＷ１０６を用いて組換えを行った。Ｃγ２ｂの下流のアンピシリン選択カセットを欠失させるために、相同組換えの後にＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えを行った。
【０１０１】
マウスの派生および繁殖
ＰｈａｓｅＰｒｅｐ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてラマ・グラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０１を精製した後、フェノール／クロロホルム抽出およびＮｏｔＩによる線状化を行った。Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３）により記載されたように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  ＣＢＡマウスの受精卵母細胞に前核注入により線状構築物を注入した。創始者マウスを、Ｉｇ欠損ＪＨ  Ｔ−マウス（Ｋｌａｕｓ  Ｒａｊｅｗｓｋｙにより供給される）Ｇｕら「Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｔ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ  ７３（６）：１１５５−１１６４（１９９３）に戻し交配した。
【０１０２】
トランスジェニックマウスのＰＣＲ遺伝子型判定
トランスジェニックマウスを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｂｌｕｅ  ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて耳クリップＤＮＡからＰＣＲにより同定した。５’および３’導入遺伝子端部に特異的なＰＣＲプライマーの対を用いて、３０ｘ（９５℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒）、７２℃１０分の条件下で生殖細胞系列伝播を確認した（図２）。
Ｉｇ欠損ＪＨ  Ｔマウスの内因性ＩｇＨ座のノックアウト（Ｊ要素およびμエンハンサーの欠失）を、同じＰＣＲ条件を用いて検証した。ＩｇＨ座の変異領域に特異的なプライマー対は、Ｓｔｏｃｋ  Ｎｏ：００２４３８（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のテクニカルサポートプロトコルに記載されている。
【０１０３】
血中リンパ球のフローサイトメトリー分析
導入遺伝子ＴＥ−０１によるＢ細胞発生の救済を確認するために、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃１００３１２）およびＣＤ１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃１１０１９３−８５）（図３）に特異的な蛍光色素結合抗体を用いて、ＴＥ−０１トランスジェニック、ＪＨＴおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血中からのリンパ球染色を実施した。ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ、フランス）を、分析に使用した。
【０１０４】
ＴＥ−０１マウスの免疫化および次世代シークエンシングによる誘導重鎖抗体レパートリーの解析
機能性ＩｇＭおよびＩｇＧ重鎖抗体を産生するＴＥ−０１トランスジェニックマウスの能力を検証するために、ＴＥ−０１トランスジェニックマウスを、精製タンパク質抗原で免疫化した。マウスは、３週間間隔で５回の免疫化を受けた。最終追加免疫の３日後、マウスを絶命させ、脾臓、リンパ節および骨髄から細胞を単離した。ｉｎｎｕＰＲＥＰ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ）を用いてＲＮＡを精製し、逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）およびランダムヘキサマープライマー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｃＤＮＡに転写した。
【０１０５】
ＶＨＨレパートリーを、ＩｇＭ特異的プライマーおよびＩｇＧ特異的プライマー（４サイクル：９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒、続いて２９サイクル：９８℃１０秒、６７℃２０秒、７２℃２０秒）を用いて、ｃＤＮＡ（５０ｎｇ／反応）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により分析した（図４Ａ）。ＩｇＭ特異的プライマーの場合、結果は、脾臓（レーン１）、リンパ節（レーン３）および骨髄（レーン５）からの第１段階ＰＣＲにおいて予想されるサイズの明確なバンドを示す。ＩｇＧ特異的プライマーの場合、脾臓からの第１段階のＰＣＲでは予想されるサイズの特異的バンドがほとんど検出されない（レーン２）。ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、第２のＰＣＲに供し、その間Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を伸長し、サンプル特定バーコードを加えた（図４Ｂ）。脾臓、リンパ節、および骨髄由来のＩｇＭ特異的産物から再増幅したサンプル（それぞれレーン１、３、５）において、予想されるサイズの明確で顕著な特異的バンドが認められた。ＩｇＧ特異的プライマーの場合、脾臓およびリンパ節由来のＩｇＧ特異的産物から再増幅したサンプルにおいて、予想されるサイズの特異的バンドが検出可能であった（レーン２および４）。最終ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動でサイズ分離し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてアンプリコンを精製した。最終ＰＣＲ産物の濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００で測定し、アンプリコン純度をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｅｂｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で制御した。ＮＧＳを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシーケンサー上で５００または６００サイクルシングルインデックスペアエンドランで実施した。
【０１０６】
逆多重化およびＦａｓｔｑフォーマットデータ出力を、ＭｉＳｅｑレポーターによって作成した。ＭｉＸＣＲ分析ツール（Ｂｏｌｏｔｉｎ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．ＭｉＸＣＲ：包括的適応免疫プロファイリング用ソフトウェア、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５；１２（５）：３８０−３８１）に基づいて、未加工配列をＩｇ  Ｖ（Ｄ）Ｊクロノタイプに加工し、ＶＤＪツール（Ｓｈｕｇａｙ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＶＤＪｔｏｏｌｓ：Ｕｎｉｆｙｉｎｇ  Ｐｏｓｔ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｐｅｒｔｏｒｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１１（１１）：ｅ１００４５０３）を用いて、配列サンプルを比較した。
【０１０７】
結果は、広範な結合ヌクレオチド挿入および欠失を伴う効率的なＶＨＨ−Ｄ−ＪおよびＶＨ−Ｄ−Ｊ組換えを確認するものである（図５、表１）。さらに、結果は、ＶＨＨまたはＶＨ遺伝子フラグメントのいずれかを有するＩｇＭ産生クローンにおけるクローン拡大および広範な体細胞高頻度突然変異を明らかにする（それぞれ図５の配列５−１〜５−９、すなわち、配列番号３３〜４１および図６の配列６−１〜６−９、配列番号４２〜５０）。さらに、体細胞高頻度突然変異は、ＩｇＧ産生クローニングファミリーにおいても観察された（図７の配列７−１〜７−８、配列番号５２〜５８）。これらの結果は、免疫化マウスにおけるＩｇＭからＩｇＧへの機能的クラススイッチを確認する。
【０１０８】
【表１】
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表１：リンパ節、脾臓および骨髄由来のＶＨＨレパートリーの次世代配列決定により、広範な結合ヌクレオチド挿入および欠失を伴う効率的なＶＨＨ−Ｄ−Ｊ組換えを示す特異的クローンの拡大が確認される。ＣＤＲ３に含まれるＣＤＲ３領域およびＤ要素のアミノ酸配列を、各クローン（すなわち、配列番号８１〜１０５）について示す。それぞれのＤ要素によってコードされるアミノ酸には下線を付してある。
【０１０９】
キメラナノボディ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体の産生および抗原特異的結合因子の同定
抗原特異的重鎖ＩｇＭおよびＩｇＧ応答の誘導を確認するために、ＶＨＨコード領域をＰＣＲ増幅し、ウサギＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするカセットの上流のｐＣＳＥ２．５発現ベクターにクローン化した（Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎら、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．２中（編、Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｓ．Ｄｕｅｂｅ）３８７−３９８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；２０１０））。個々のクローンを配列決定し、ＨＥＫ−６Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトした（Ｚｈａｎｇら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５，３２３−３３６（２００９））。トランスフェクションの６日後に細胞上清を回収した。細胞上清中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析した（図８）。その結果、大部分のＩｇＭクローニングからの重鎖抗体の効率的な製造が明らかになった。一般に、ＶＨＨ含有クローンは、ＶＨ含有クローンよりも高い発現収率を示した。大部分のＩｇＧクローニングについても効率的な製造が観察された。細胞上清を、ＥＬＩＳＡにより抗原特異的重鎖抗体について分析した。ウェルを、免疫化に用いた抗原または無関係な対照タンパク質で被覆した。ウェルをアルブミンで遮断し、次いで、Ｎｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体（ＰＢＳで１：２０に希釈）を含有する個々のＨＥＫ−６Ｅ細胞上清とインキュベートした。ウェルを洗浄し、結合したＮｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体を、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ）およびＴＭＢを基質として検出した（図９）。ＣＤ３８特定Ｎｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体およびＡＲＴＣ２特定Ｎｂ−ウサギＩｇＧ重鎖抗体を、対照として用いた。結果は、ＴＥ−０１トランスジェニックマウスの免疫化が、広範な体細胞高頻度突然変異を有するＢ細胞クローン由来の別個の抗原特異的ＶＨＨ含有重鎖抗体を誘導することを明らかにする（図１０、配列１０−０１〜１０−２２；配列番号５９〜８０）。
【０１１０】
ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０２の生成
図１１に模式的に示すように、ＢＡＣ  ＴＥ−０１でＢＡＣ組換えを行って、ＴＥ−０２およびＴＥ−０３ラマＩｇＨトランスジェニックマウスを作製した。マウス座制御領域の要素ＨＳ３ａおよびＨＳ１，２（パート１；Ｐ１）を、ＢＡＣ構築物ＴＥ−０１中のＨＳ３ｂ−ＨＳ４−カセット（パート２；Ｐ２）の上流に挿入した。このために、アンピシリン選択カセット、次いで要素ＨＳ３ａおよびＨＳ１，２を含むＤＮＡカセットを使用した。ＨＳ３ａおよびＨＳ１，２の配列を、マウスＬＣＲの必須部分をコードするプラスミドから得た（Ｐｉｎａｕｄら、（２００１）「Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１８７−１９９）。選択カセットは、２つのｌｏｘＰ突然変異体ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６に隣接した。構築物全体に、ＢＡＣ  ＴＥ−０１で修飾される領域に相同な、９０ｂｐの５’相同性アームおよび８６ｂｐの３’相同性アームを装備した。平滑末端ＳｎａＢＩ制限切断部位を、両方の相同性アームの外側末端に置いた。構築物を合成し、ベクターｐＵＣ５７にクローン化した。ＤＮＡカセットを、ＳｎａＢＩ制限消化により単離した。組換えを、大腸菌株ＳＷ１０６を用いて行った。相同組換えに続いて、ＨＳ３ａ−ＨＳ１，２カセットの上流のアンピシリン選択カセットを欠失させるためのＣｒｅ／ｌｏｘ組換えを行った。
【０１１１】
５つの付加的ＶＨＨ要素を有する合成ＤＮＡカセットを、ＢＡＣ導入遺伝子ＴＥ−０１の５’末端に挿入した。このために、５つのラクダＶＨＨ要素（配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０）を、頻繁に使用されるマウスＶＨ要素の隣接する配列に対応するマウスＩｇＨ−Ｖ座配列によって隣接させた。リーダーペプチド、リーダーペプチドとＶＨＨエクソンとの間のイントロン配列、およびＶＨＨエクソンの３’末端のＲＳＳ配列は、ラクダの生殖細胞系列構成に対応する。選択カセットは、２つのｌｏｘＰ突然変異体ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６に隣接し、全ＤＮＡカセットは、ＢＡＣ挿入部位に相同な２つの３９０ｂｐ相同性アームを備えた。構築物を合成し、ベクターｐＵＣ５７にクローン化した。相同性アームにコードされたＮｒｕＩ制限部位を介して全ＤＮＡカセットを単離した。組換えを、大腸菌株ＳＷ１０６を用いて行った。相同組換えに続いて、５つのＶＨＨ要素の上流のアンピシリン選択カセットを欠失させるためのＣｒｅ／ｌｏｘ組換えを行った。
【０１１２】
ラマＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０３の生成
導入遺伝子ＴＥ０２のラマ・グラマＩｇＭ座のＣＨ３−ＣＨ４−ＴＭ１−ＴＭ２領域を、マウス配列によって置き換えた。このために、ＣＨ３ドメインから膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）までのマウスＩｇＭ座のゲノム配列に、Ｌａｍａ  ＩｇＭ座上の対応する配列と一致する４５ｂｐの相同領域を隣接させた。２つのｌｏｘＰ変異体（ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６）が隣接するアンピシリン選択カセットを、エクソンＣＨ４とＴＭ１との間のイントロン配列に挿入した。各４５ｂｐ相同領域の外端は、ＳｎａＢＩ制限切断部位をコードした。構築物を合成し、ベクターｐＵＣ５７にクローン化した。ＤＮＡカセットを、ＳｎａＢＩ制限消化により平滑末端で単離した。組換えを、大腸菌株ＳＷ１０６を用いて行った。相同組換えに続いて、ＣＨ４エクソンとＴＭ１エクソンの間のイントロン配列中のアンピシリン選択カセットを欠失させるためのＣｒｅ／ｌｏｘ組換えを行った。
【０１１３】
受精卵母細胞へのＢＡＣ  ＴＥ−０２およびＴＥ−０３の注射、ＰＣＲによる生殖細胞系列伝播動物の検証、ＩｇＨ欠損マウスへの戻し交配、および末梢血液リンパ球のフローサイトメトリー分析を、ＴＥ−０１について記載したように行った。フローサイトメトリー分析の結果は、ｌａｍａ  ＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０２およびｌａｍａ  ＩｇＨ導入遺伝子ＴＥ−０３の両方によるマウスＩｇＨ欠損マウスにおけるＢ細胞発生の救済を確証する（図１２）。
【０１１４】
本発明はまた、以下の実施形態を含む。
実施形態１：哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ）ラクダ科ＶＨＨ領域、
ｂ）ラクダ科Ｄ領域、
ｃ）ラクダ科Ｊ領域、
ｄ）ＣＨ１ドメインのないラクダ科定常重鎖領域
を含み、
ラクダ科ＶＨＨ領域、ラクダ科Ｄ領域およびラクダ科Ｊ領域は再配列されない、
前記単離されたポリヌクレオチド。
【０１１５】
実施形態２：ＶＨＨ含有重鎖抗体が、機能的ＣＨ４ドメインを有するＩｇＭ定常重鎖領域を含む、実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１１６】
実施形態３：前記定常重鎖領域がＩｇＤ領域を欠いている、実施形態１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１１７】
実施形態４：前記ラクダ科Ｄ領域が、少なくとも２つのラクダ科Ｄ要素、好ましくは全てのラクダ科Ｄ要素を含む、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１１８】
実施形態５：前記ラクダ科Ｊ領域が、少なくとも２つのラクダ科Ｊ要素、好ましくは全てのラクダ科Ｊ要素を含む、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１１９】
実施形態６：前記定常重鎖領域が、
ａ）ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびに／または
ｂ）ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン
をコードする要素を含む、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２０】
実施形態７：前記定常重鎖領域が、ラクダ科ＩｇＧ２ａ、ラクダ科ＩｇＧ２ｂ、ラクダ科ＩｇＧ２ｃ、ラクダ科ＩｇＧ３およびラクダ科ＩｇＭからなる群のうちの少なくとも１つをコードする要素を含む、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２１】
実施形態８：前記定常重鎖領域が、前記ＩｇＤ偽遺伝子および前記関連するスイッチ領域を含むδ領域を含まない、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２２】
実施形態９：前記定常重鎖領域がγ２ａ領域を含まない、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２３】
実施形態１０：前記ポリヌクレオチドがＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物に特異的な少なくとも１つのエンハンサーを含む、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２４】
実施形態１１：前記ラクダ科ＶＨＨ領域が、少なくとも１つのラクダ科ＶＨＨ要素を含む、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２５】
実施形態１２：前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの合成ＶＨＨ要素をさらに含む、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２６】
実施形態１３：膜近位のＣＨドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエクソンが、ＶＨＨ含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物の対応するドメインをコードするエクソンによって交換される、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２７】
実施形態１４：前記ラクダ科動物がＬａｍａ種、好ましくはラマ・グラマである、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２８】
実施形態１５：前記ポリヌクレオチドが、配列番号３０と少なくとも８０％同一である配列によってコードされる、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１２９】
実施形態１６：前記ポリヌクレオチドが、配列番号３０の配列またはそのフラグメントによってコードされる、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１３０】
実施形態１７：前記ラクダ科ＶＨＨ領域、前記ラクダ科Ｊ領域、および前記ラクダ科Ｄ領域が、ＶＤＪコード配列を形成するように再配列することができる、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１３１】
実施形態１８：実施形態１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１３２】
実施形態１９：前記ベクターが、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、コスミドまたは合成ＤＮＡ、好ましくは細菌人工染色体である、実施形態１８に記載のベクター。
【０１３３】
実施形態２０：実施形態１〜１７の単離されたポリヌクレオチドまたは実施形態１８および１９のベクターを含むトランスジェニック哺乳動物であって、該ポリヌクレオチドが異種である、前記トランスジェニック哺乳動物。
【０１３４】
実施形態２１：再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされるＶＨＨ含有重鎖抗体、および実施形態１〜１７のポリヌクレオチドの定常ドメインをコードする配列が発現される、実施形態２０に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１３５】
実施形態２２：前記哺乳動物がげっ歯動物である、実施形態２０または２１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１３６】
実施形態２３：前記哺乳動物がマウスまたはラットである、実施形態２０〜２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１３７】
実施形態２４：前記哺乳動物がマウスであり、前記ポリヌクレオチドがマウスＩｇ−αエンハンサーまたはその断片を含む、実施形態２０〜２３のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１３８】
実施形態２５：前記哺乳動物が機能性内因性ＩｇＨ座を欠いている、実施形態２０〜２４のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１３９】
実施形態２６：実施形態１〜１６で定義したポリヌクレオチドによってコードされる再配列された免疫グロブリンの発現の際に、前記該哺乳動物がＢ細胞を産生することができる、実施形態２０〜２５のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１４０】
実施形態２７：前記哺乳動物が、単離された遺伝子配列の発現時にＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する、実施形態２０〜２６のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１４１】
実施形態２８：前記哺乳動物が、膜結合および／または可溶性バージョンとしてＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する、実施形態２０〜２７のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【０１４２】
実施形態２９：哺乳動物におけるＶＨＨ含有重鎖抗体の製造のための方法であって、該哺乳動物において異種ＶＨＨ含有重鎖抗体を発現する工程を含み、該異種ＶＨＨ含有重鎖抗体が、実施形態１〜１７において定義したポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列をコードする、前記方法。
【０１４３】
実施形態３０：哺乳動物由来のＶＨＨ含有重鎖抗体をクローニングするための方法であって、異種ＶＨＨ含有重鎖抗体は、実施形態１〜１７において定義したポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列をコードする、前記方法。
【０１４４】
実施形態３１：ＶＨＨ含有重鎖抗体であって、異種ＶＨＨ含有重鎖抗体が、実施形態１〜１７で定義したポリヌクレオチドの再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊ配列によってコードされる、前記ＶＨＨ含有重鎖抗体。
【０１４５】
実施形態３２：実施形態２９に記載の方法によって産生された、ＶＨＨ含有重鎖抗体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020508639.tif 000017
2020508639.tif 000018