(57)【要約】本発明は、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用されるベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクターであって、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む、ベクター。
【請求項２】
該ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症が、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）および脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）の群から選択される、請求項１に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項３】
該ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症が、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）である、請求項１に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項５】
配列番号１の核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項６】
アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項７】
ＡＡＶベクターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項８】
ＡＡＶ９ベクター、またはＡＡＶｒｈ．１０、好ましくはＡＡＶｒｈ．１０などのＡＡＶ１０ベクターである、請求項７に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項９】
患者の脳内へ直接投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項１０】
小脳、脳幹、黒質、線条体、前頭側頭葉および／または視覚皮質、好ましくは小脳に投与される、請求項９に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項１１】
患者の脊髄内へ投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項１２】
血管内、静脈内、鼻腔内、脳室内またはくも膜下腔内注射により投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクター。
【請求項１３】
ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するための医薬組成物であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の治療有効量のベクターを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）は、しばしば、手、発話および眼球運動の不良な協調に関連する、ゆっくり進行する歩行の協調不能および平衡障害を特徴とする神経変性障害の群に属する。脊髄小脳失調症は、筋肉の動きのわずかな協調の失敗により、体の不安定で不器用な動きをもたらす。
【０００３】
脊髄小脳失調症は、小脳内に位置する神経系細胞の一部の進行性の消失と関連しており、小脳の萎縮につながる。脊髄小脳失調症は、異なる遺伝子変化に関連する遺伝障害である。現在、多くの型の脊髄小脳失調症が知られており、それに関して特定の遺伝情報が利用可能である。最初の運動失調遺伝子は１９９３年に優性遺伝型として同定され、「脊髄小脳失調症１型」（ＳＣＡ１）と呼ばれた。その後、追加の優性遺伝子が見つかったため、それらはＳＣＡ２、ＳＣＡ３などと呼ばれた。通常、「ＳＣＡの型番号」は、該遺伝子が見つかった順序を指す。現時点では、少なくとも２９個の異なる遺伝子変異が見出されている。
【０００４】
最も一般的な変化は、異なる染色体内に位置するいくつかの遺伝子内のトリヌクレオチドシトシンアデニングアニン（ＣＡＧ）の過剰な繰り返し（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ）上にある。ポリＣＡＧ拡張を有するそれらの運動失調は、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症と称される。遺伝子内のＣＡＧの過剰な繰り返しは、異常なタンパク質を産生する、該遺伝子によりコードされるタンパク質内のグルタミンの繰り返しにつながってもよい。
【０００５】
例として、Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病（ＭＪＤ）とも呼ばれる脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）は、アタキシン３（ＡＴＸＮ３）遺伝子のコード領域内に異常に拡張したポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）領域をもたらす（Kawaguchi et al., 1994）、ＭＪＤ１遺伝子のコード領域内のＣＡＧ反復拡張により引き起こされる、進行性の常染色体優性遺伝成人発症神経変性障害（Durr et al., 1996）である。それは、神経細胞内に異常に蓄積する拡張したＡＴＸＮ３タンパク質に毒性の機能的利得を与え、ゆえに不溶性核内包含物の形成を促進する（Orr and Zoghbi, 2007; Schols et al., 2004）。ＳＣＡ３は、線条体、黒質および脳神経運動核の変性と予測不可能に関連する一連の進行性小脳機能障害として臨床的に明らかにされ（Alves et al., 2008b; Durr et al., 1996; Klockgether et al., 1998; Rub et al., 2008）、したがって、他の症状とともに、運動失調、運動協調の欠如、姿勢不安定、パーキンソン病、錐体路兆候および神経障害などの広い範囲の症状をもたらす（(Burk et al., 1999; Rub et al., 2006; Schols et al., 1997; Schols et al., 2004）。脊髄関与も記載されている（Lukas et al., 2008）。
【０００６】
ＳＣＡの一般的な有病率は１２５．０００に対して１だが、アゾレス諸島などの世界の一部において、ＳＣＡ３の有病率は１４０に対して１である。
【０００７】
現在まで、ＳＣＡのための既知の治療法はない。処置は通常、症状を和らげることに限定される。ゆえに、一般にＳＣＡ、特にポリグルタミン反復脊髄小脳失調症（ＰｏｌｙＱ  ＳＣＡ）における治療のための新しい戦略を開発する強い必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、ＰｏｌｙＱ  ＳＣＡを有する患者におけるコレステロール代謝の機能障害を示した。該発見に基づいて、本発明者らは、標的細胞内でコレステロール２４−ヒドロキシラーゼを発現するコレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含むベクターの使用により、ＰｏｌｙＱ  ＳＣＡに対抗する治療戦略として該コレステロール代謝経路の調節に取り組む可能性をうまく研究した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するためのベクターを提供することである。
【００１０】
一実施形態において、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症は、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）および脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）の群から選択される。
【００１１】
一実施形態において、ベクターは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。あるいは、該ベクターは配列番号１の核酸配列を含む。
【００１２】
一実施形態において、ベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、好ましくはＡＡＶベクター、より好ましくはＡＡＶ９またはＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ．１０）ベクター、さらにより好ましくはＡＡＶｒｈ．１０の群から選択される。
【００１３】
一実施形態において、ベクターは、患者の脳内へ、好ましくは小脳、線条体、脳幹、前頭側頭葉および／または視覚皮質へ、より好ましくは小脳へ、直接投与される。あるいはまたはさらに、該ベクターは患者の脊髄内へ投与される。
【００１４】
本発明の別の目的は、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含むベクターを含む、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に使用するための医薬組成物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＭＪＤトランスジェニックマウス（ｎ＝６）対野生型対照（ｎ＝６）の小脳および「該脳の残り」におけるＨＡタグのレベルを示す代表的なウェスタンブロット。６９個のＣＡＧ反復および６匹の同年齢の対照同腹仔とともに、Ｎ末端切断型ヒトＡＴＸＮ３を発現する６匹のＭＪＤトランスジェニックマウスからの凍結生検を使用した；
【００１６】
【図２】ＭＪＤマウス（ｎ＝６）および野生型対照（ｎ＝６）の脳におけるＣＹＰ４６Ａ１タンパク質のレベルを示す代表的なウェスタンブロット。対照同腹仔と比較して、ＭＪＤマウスからの小脳生検における、ＣＹＰ４６Ａ１タンパク質レベルにおける２４．３％の減少（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定；ｐ＝０．０２６）を明らかにする光学的デンシトメトリー（ＡおよびＢ）。ＭＪＤマウスおよび対照における「該脳の残り」からの生検において、統計的に有意な差は見られなかった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定；ｐ＝０．１３）（ＣおよびＤ）；
【００１７】
【図３】対照同腹仔と比較して、ＭＪＤマウスにおけるコレステロール代謝経路の障害を示す、ＭＪＤＱ６９マウス（ｎ＝６）および同年齢の同腹仔（ｎ＝６）からの小脳抽出物および「該脳の残り」からの生検における、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によるステロールおよびオキシステロールの両方の定量的測定；
【００１８】
【図４】ＡＡＶベースのＣＹＰ４６Ａ１過剰発現は、注射後２ヶ月のＭＪＤのＬＶベースのマウスモデルにおける神経病理を緩和する。Ａ）ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したＬＶ−ＭＪＤマウスにおいてＨＡタグの存在を検出するが、ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射した対照群においては検出しない代表的な免疫組織化学；ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射したマウスにおいて、マウス線条体における広範なＧＦＰ免疫反応性が検出されるが、ＨＡシグナルは検出されない。（１Ｈ９抗体を用いて明らかになった）突然変異体アタキシン３陽性包含物に対する免疫組織化学および定量分析（Ａ）は、対照群（ＧＦＰ同時注射マウス；６６８４±７１７．２包含；ｎ＝８；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．０００２）と比較して、アタキシン３陽性包含物（２７５１±２６７．８；ｎ＝８）の数の統計的に有意な減少（〜５９％）を明らかにした（Ｂ）。対照ＡＡＶｒｈ.１０−ＧＦＰを注射したＬＶ−ＭＪＤマウス（１１１．４±３．９６ａ.ｕ.；ｎ＝８；スチューデントのＴ検定、Ｐ＜０．０００１）と比較して、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１処置ＬＶ−ＭＪＤマウス（５９．２９±４．６７任意単位（ａ.ｕ.）；ｎ＝８）における包含物のサイズの統計的に有意な減少（〜４７％）が観察された（Ｃ）。対照ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射したＬＶ−ＭＪＤマウスと比較して、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したＬＶ−ＭＪＤマウスにおけるユビキチン化された包含物の数の減少を実証した抗ユビキチン染色（定性分析）（Ａ）。対照ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射したＬＶ−ＭＪＤマウス（０．９１±０．１４ｍｍ３；ｎ）と比較して、ＤＡＲＰＰ−３２枯渇領域（０．４８±０．７７ｍｍ３；ｎ＝８）スチューデントのＴ検定；Ｐ＝０．０１５）の統計的に有意な減少（〜４８％）につながったＣＹＰ４６Ａ１過剰発現。
【００１９】
【図５】ＭＪＤトランスジェニックマウスの運動協調障害におけるＡＡＶ−ＣＹＰ４６Ａ１発現の効果。非注射野生型マウス（ＷＴ）およびＣＹＰ４６Ａ１（ＣＹＰ）またはＧＦＰ（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ１０を注射したＭＪＤトランスジェニックマウスが、運動協調性能について１０週間にわたって評価された。マウスは、Ａ）一定速度でのロタロッド、Ｂ）加速したロタロッド、およびＣ）後肢ベーステスト（足跡テスト）についてテストされた。対照マウス（ＧＦＰ）と比較して、ＣＹＰ４６Ａ１で処置したトランスジェニックＭＪＤマウスにおける運動能力の有意な改善が観察された。データは平均値±ＳＥＭとして示される。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を使用した２因子ＡＮＯＶＡ分析；＊ｐ＜０．０５。ＣＹＰ：ｎ＝１０；ＧＦＰ：ｎ＝９；ＷＴ：ｎ＝４。
【００２０】
【図６】ＡＡＶ−ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現は、ＭＪＤトランスジェニックマウスの小脳における凝集を減少させ、プルキンエ細胞の損失を軽減する。ＣＹＰ４６Ａ１（ＣＹＰ）またはＧＦＰ（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ１０を注射したＭＪＤトランスジェニックマウスにおける免疫組織化学は、ユビキチン化凝集体の減少を実証する（Ａ）。対照ベクター（ＡＡＶ１０−ＧＦＰ）で処置したＭＪＤトランスジェニックマウスと比較して、ＡＡＶ１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したＭＪＤトランスジェニックマウスは、プルキンエ細胞の平均数の増加（Ｂ）および小脳の体積の増加（Ｃ）を示す。
【００２１】
【図７】Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＣＹＰ４６Ａ１過剰発現時の突然変異体ＡＴＸＮ３のレベルを示す代表的なウェスタンブロット（Ａ）。光学デンシトメトリー分析は、ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現時の、突然変異体ＡＴＸＮ３凝集体（Ｂ）および可溶性レベル（Ｃ）のそれぞれ６６％および９０％の減少を明らかにした（スチューデントのＴ検定、ｐ＝０．００３３；ｎ＝４）。
【００２２】
【図８】Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＣＹＰ４６Ａ１過剰発現時のオートファジーマーカーＬＣ３Ｂ−ＩＩのレベルを示す代表的なウェスタンブロット（Ａ）。光学デンシトメトリー分析は、オートファジー阻害剤クロロキンの有無に関わらず、対照条件と比較したＬＣ３Ｂ−ＩＩの増加により強調されたＣＹＰ４６Ａ１過剰発現によるオートファジーの増加を明らかにした（Ｂ）。さらに、ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現は、対照レベルと比較して、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの正味フラックスの増加を誘発し、オートファジーフラックスの活性化を示唆する（Ｃ）。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スチューデントのＴ検定；ｎ＝４）。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子を発現するベクターをポリグルタミン反復脊髄小脳失調症のマウスモデルの脳内へ運搬することは、神経機能障害、特に小脳発作の有意な減少をもたらすことを実証した。
【００２４】
これに基づいて、本発明者らは、中枢神経系の細胞においてＣＹＰ４６Ａ１を発現する、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置のためのウイルスベクターを提供する。
【００２５】
ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症
具体的には、本発明は、疾患関連タンパク質（すなわち、アタキシン−１、アタキシン−３など）がｐｏｌｙＱまたは「ＣＡＧトリヌクレオチド反復」疾患と呼ばれる異常な数のグルタミン残基の反復を含有する場合に引き起こされるポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置に関する。
【００２６】
本発明の文脈において、「処置」、「処置する」または「処置すること」なる語は、本明細書において、（１）かかる語が適用される病状または状態の症状の進行、悪化、または悪化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を減速または停止させること；（２）かかる語が適用される病状または状態の症状を緩和することまたはその改善をもたらすこと；および／または（３）かかる語が適用される病状または状態を逆転または治癒させること、を目的とする治療方法またはプロセスを特徴付けるために使用される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」なる語は、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは成人および子供を含むヒトを指す。しかしながら、「対象」なる語は、非ヒト動物、特にマウスなどの哺乳動物、および非ヒト霊長類をも指すことができる。
【００２８】
好ましくは、本発明は、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）および脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）の群から選択されるポリグルタミン反復脊髄小脳失調症に関する。
【００２９】
ＳＣＡ１、またはＳＣＡ１型は、アタキシン１タンパク質をコードする遺伝子（ＡＴＸＮ１）における異常なＣＡＧ反復により特徴付けられる。該伸長の長さは可変である。ＳＣＡ１を引き起こすことが示されている最短の反復長は３９個の連続したＣＡＧトリプレットであり、これまでに観察された最長のものは８３個の反復を含有する。より長い反復領域（ｔｒａｃｔ）は、より早い発症年齢およびより速い進行と相関している。突然変異体ＡＴＸＮ１タンパク質は、プルキンエ神経細胞の核内で自発的にミスフォールドし、凝集体を形成する。
【００３０】
ＳＣＡ２、またはＳＣＡ２型は、対応するタンパク質における伸長ポリグルタミン領域を産生するＡＴＸＮ２遺伝子のコード領域の異常なＣＡＧ反復により特徴付けられる。該拡張された反復は、サイズが可変で不安定であり、通常、連続した世代に伝達されるとサイズが増加する。該遺伝子座は、１２番染色体にマップされており、病気の対立遺伝子は、通常３４から５２個のＣＡＧ反復を含有するが、わずか３２または１００を超えて含有することができることが決定されている。
【００３１】
Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病（ＭＪＤ）とも呼ばれるＳＣＡ３、またはＳＣＡ３型は、アタキシン３タンパク質をコードする遺伝子（ＡＴＸＮ３）における異常なＣＡＧ反復により特徴付けられる。正常な１３〜３６から異常な６８〜７９個へのこれらの反復の拡張は、ＭＪＤの原因である。発症年齢とＣＡＧ反復数との間には逆相関がある。
【００３２】
ＳＣＡ６、またはＳＣＡ６型は、Ｃａｖ２．１Ｐ／Ｑ電圧依存的カルシウムチャネルをコードするＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のコード領域を４〜１６から２１〜２８個のＣＡＧ反復を含むように拡張する挿入により特徴付けられる。
【００３３】
ＳＣＡ７、またはＳＣＡ７型は、ＡＴＸＮ７遺伝子のコード領域における異常なＣＡＧ反復により特徴付けられ、対応するタンパク質（ＡＴＸＮ７）における伸長ポリグルタミン領域を産生する。
【００３４】
ＳＣＡ１７、またはＳＣＡ１７型は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）をコードする遺伝子のコード領域における異常なＣＡＧ繰り返しにより特徴付けられる。ＴＢＰは、タンパク質のＮ末端内のグルタミンの長いストリングにより特徴付けられる。該領域は、Ｃ末端のＤＮＡ結合活性を調節し、ＤＮＡ結合の調節は、転写複合体の形成および転写の開始の速度に影響する。ゆえに、ＣＡＧ反復の数の拡張は、グルタミンストリングの長さを増加させ、それによりＴＢＰのＤＮＡ結合活性に影響する。
【００３５】
ＣＹＰ４６Ａ１配列
本発明の第一の目的は、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸の全配列を含むＰｏｌｙＱ  ＳＣＡの処置に使用するためのベクターに関する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」なる語は、転写または翻訳後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１個のオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「コード配列」または「特定のタンパク質をコードする配列」なる語は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列を意味する。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含むことができるが、これらに限定されない。
【００３８】
ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子は、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする。該酵素は、酵素のチトクロームＰ４５０スーパーファミリーのメンバーである。該酵素は、コレステロールを２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２４Ｓ−ＯＨ−Ｃｈｏｌ）に変換し、ＢＢＢを動的に通過し、末梢循環を体外に排出し（Bjorkhem et al., 1998）、ゆえにコレステロールの恒常性を維持する。ＣＹＰ４６Ａ１に対するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ０９４４８０（配列番号１）に開示される。アミノ酸配列は配列番号２に示される。
【００３９】
本発明は、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置のための、配列番号１の配列またはその変異体を含む核酸構築物の使用を作る。
【００４０】
例えば、変異体は、個体間の対立遺伝子変異（例えば、多型）、選択的スプライシング形態などに起因する天然変異体を含む。変異体なる語は、他のソースまたは生物からのＣＹＰ４６Ａ１遺伝子配列も含む。変異体は、好ましくは、配列番号１と実質的に相同である、すなわち、典型的に少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列番号１とのヌクレオチド配列同一性を示す。ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子の変異体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記で定義された配列（またはその相補鎖）にハイブリダイズする核酸配列も含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃を超える、好ましくは３５℃を超える、より好ましくは４２℃を超える温度、および／または約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満の塩分を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度を変更することにより、当業者により調整されてもよい。
【００４１】
非ウイルスベクター
一実施形態において、本発明によるベクターの使用は、非ウイルスベクターである。典型的に、該非ウイルスベクターは、ＣＹＰ４６Ａ１をコードするプラスミドであってもよい。該プラスミドは、直接またはリポソーム、エキソソームまたはナノ粒子を介して投与できる。
【００４２】
ウイルスベクター
本発明の実施に有用な遺伝子運搬ウイルスベクターは、分子生物学の分野で周知の方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは、該導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な制御要素、および細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生に必要な要素から組み立てられる。
【００４３】
「遺伝子導入」または「遺伝子運搬」なる語は、外来ＤＮＡを宿主細胞中へ確実に挿入するための方法またはシステムを指す。かかる方法は、非統合の（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）導入されたＤＮＡの一過性発現、染色体外複製および導入されたレプリコン（例えばエピソーム）の発現、または導入された遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への統合をもたらすことができる。
【００４４】
ウイルスベクターの例は、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
【００４５】
かかる組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクションまたはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一過性トランスフェクションなどの、当技術分野で既知の技術により産生されてもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などを含む。かかる複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８において見いだされてもよい。
【００４６】
好ましい実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが使用される。
【００４７】
「ＡＡＶベクター」により、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、例えばＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（Benjamin E. Deverman et al., 2016）などを含むが、これらに限定されない、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターが意味される。ＡＡＶベクターは、全体または一部を欠失した１以上のＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を有するが、機能的隣接ＩＴＲ配列を維持することができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、パッケージングのために必要である。ゆえに、ＡＡＶベクターは、本明細書では、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要な配列を少なくとも含むと定義される。該ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的なレスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、削除、または置換により変化されてもよい。ＡＡＶ発現ベクターは、既知の技術を使用して構築され、転写の方向に動作可能に連結されたコンポーネントとして、転写開始領域を含む制御要素、目的のＤＮＡ（すなわち、ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子）および転写終結領域を少なくとも提供する。自己相補的な構築物として、目的のＤＮＡの２個のコピーが含まれることができる（McCarty et al., 2001）。
【００４８】
より好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ．１０）ベクター、またはこれらの血清型の１つに由来するベクターである。最も好ましい実施形態において、該ＡＡＶベクターはＡＡＶｒｈ．１０ベクターである。
【００４９】
制御要素は、哺乳類細胞において機能的であるように選択される。動作可能に連結されたコンポーネントを含有する、結果として生じる構築物は、機能的なＡＡＶＩＴＲ配列と結合される（５’および３’）。「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶＩＴＲ」により、ＤＮＡ複製の起点およびウイルスのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端に見られる当技術分野で認識されている領域が意味される。ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶｒｅｐコード領域と共に、哺乳類細胞ゲノム中へ２個の隣接するＩＴＲの間に挿入されたヌクレオチド配列からの効率的な切除およびレスキュー、およびその統合を提供する。ＡＡＶＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。（ＡＡＶ−２配列については、例えば、Kotin, 1994 ; Berns, KI "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.）を参照）。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を含むわけではないが、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により変化されてもよい。さらに、該ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ６などを含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。さらに、ＡＡＶベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、意図されたように、すなわち、宿主細胞のゲノムまたはベクターから目的の配列を切除およびレスキューできるように、そしてＡＡＶＲｅｐ遺伝子産物が該細胞中に存在するとき、異種配列のレシピエント細胞ゲノム中への統合を可能にするように機能する限り、必ずしも同一である必要も、また同じＡＡＶ血清型または分離株由来である必要もない。
【００５０】
哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞、特にニューロンに対する向性およびそれにおける高い形質導入効率を有するＡＡＶ血清型に由来するベクターが、特に好ましい。異なる血清型の形質導入効率のレビューおよび比較は、Davidson et al. , 2000において提供される。１つの好ましい例において、ＡＡＶ２ベースのベクターは、ＣＮＳ、好ましくは形質導入ニューロンにおける導入遺伝子の長期発現を誘導することが示されている。他の非限定的な例において、好ましいベクターは、ＣＮＳの細胞に形質導入することも示されている（Davidson et al、上記）、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５血清型に由来するベクターを含む。特に、該ベクターは、ＡＡＶ５由来のゲノム（特にＩＴＲはＡＡＶ５ＩＴＲである）およびＡＡＶ５由来のカプシドを含むＡＡＶベクターであってもよい。別の非限定的な例において、好ましいベクターは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂのようなｃｒｅ組換えベースのＡＡＶ標的進化（ＣＲＥＡＴＥ）の使用により得られるベクターを含む。
【００５１】
本発明の特定の実施形態において、ベクターは偽型ＡＡＶベクターである。具体的には、偽型ＡＡＶベクターは、第一のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムおよび第二のＡＡＶ血清型に由来するカプシドを含む。好ましくは、該ＡＡＶベクターのゲノムはＡＡＶ２に由来する。さらに、該カプシドは、好ましくはＡＡＶ５に由来する。偽型ＡＡＶベクターの特定の非限定的な例は、ＡＡＶ５に由来するカプシド中のＡＡＶ２に由来するゲノムを含むＡＡＶベクター、ＡＡＶｒｈ．１０に由来するカプシド中のＡＡＶ２に由来するゲノムを含むＡＡＶベクターなどを含む。
【００５２】
選択されたヌクレオチド配列は、インビボで対象において転写または発現を誘導する制御要素に作動可能に連結されている。かかる制御要素は、選択された遺伝子に通常関連する制御配列を含むことができる。特に、かかる制御要素は、ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子のプロモーター、特にヒトＣＹＰ４６Ａ１遺伝子のプロモーターを含んでもよい（Ohyama Y et al., 2006）。
【００５３】
あるいは、異種制御配列が使用できる。一般に、有用な異種制御配列は、哺乳類またはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどを含むが、これらに限定されない。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も本明細書で使用されるだろう。かかるプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（サンディエゴ、ＣＡ）から市販されている。本発明の目的のために、異種プロモーターおよびＣＮＳ特異的誘導性プロモーター、エンハンサーなどのような他の制御要素の両方が特に有用であるだろう。
【００５４】
異種プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーターを含む。ＣＮＳ特異的プロモーターの例は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、シナプシン（例えば、ヒトシナプシン（ｓｙｓｎａｐｓｉｎ）１遺伝子プロモーター）、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）からの遺伝子から単離されたものを含む。
【００５５】
誘導性プロモーターの例は、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素症、およびオーフィン（ａｕｆｉｎ）のためのＤＮＡ応答要素を含む。
【００５６】
ＡＡＶ  ＩＴＲにより結合された目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列を、そこから切除された主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有しているＡＡＶゲノム中へ直接挿入することにより構築できる。複製およびパッケージング機能を可能にするのに十分なＩＴＲの部分が残っている限り、該ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失されることができる。かかる構築物は、当該分野で周知の技術を使用して設計できる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１７３，４１４および５，１３９，９４１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日に公開）およびＷＯ９３／０３７６９(１９９３年３月４日に公開); Lebkowski et al., 1988; Vincent et al., 1990; Carter, 1992 ; Muzyczka, 1992; Kotin,1994; Shelling and Smith, 1994;およびZhou et al., 1994を参照のこと。あるいは、ＡＡＶ  ＩＴＲは、それを含むウイルスゲノムから、またはＡＡＶベクターから切除し、標準的なライゲーション技術を使用して別のベクター中に存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合できる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ｎｏ．５，１３９，９４１に記載されている。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）からアクセッション番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、および５３２２６の下で入手可能ないくつかのＡＡＶベクターが、そこに記載されている。さらに、キメラ遺伝子は、１以上の選択された核酸配列の５’および３’に配置されるＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように合成的に産生できる。哺乳類のＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現に好ましいコドンが使用できる。完全なキメラ配列は、標準的な方法により調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。（例えば、Edge, 1981; Nambair et al., 1984; Jay et al., 1984を参照）。ｒＡＡＶビリオンを産生するために、トランスフェクションなどの既知の技術を使用して、ＡＡＶ発現ベクターは、適切な宿主細胞中へ導入される。多くのトランスフェクション技術が、一般に当技術分野で知られている。（たとえば、Graham et al., 1973; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、および Chu et al., 1981を参照）。特に適切なトランスフェクション法は、リン酸カルシウム共沈（Graham et al., 1973）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Capecchi, 1980）、エレクトロポレーション（Shigekawa et al., 1988）、リポソーム媒介遺伝子導入（Mannino et al., 1988）、脂質媒介形質導入（Felgner et al., 1987）、および高速微小発射体を使用した核酸運搬（Klein et al., 1987）を含む。
【００５７】
例えば、ＡＡＶｒｈ．１０などの好ましいウイルスベクターは、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に加えて、ＡＡＶ−２に由来するＩＴＲを有するＡＡＶベクターの骨格、マウスＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子またはサイトメガロウイルス即時遺伝子からのエンハンサーからなるサイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）などのプロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子からのプロモーター、スプライスドナーおよびイントロン、ウサギβ−グロビンからのスプライス受容体、または、野生型または変異型のウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）の有無に関わらず、ドーパミン−１受容体またはドーパミン−２受容体のプロモーターなどの任意の神経プロモーターを含む。
【００５８】
ベクターの運搬
コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含むベクターを必要とする患者に投与することを含む、ポリグルタミン反復脊髄小脳失調症の処置方法が開示される。該ベクターは、直接、または血管内、静脈内、鼻腔内、脳室内、またはくも膜下腔内注射により、該患者の脳内へ運搬されてもよい。
【００５９】
特定の実施形態において、以下を含む、対象においてポリグルタミン反復脊髄小脳失調症（ＰｏｌｙＱ  ＳＣＡ）を処置する方法が提供される：
（ａ）コレステロール２４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む上記で定義されたベクターを提供すること；および
（ｂ）ベクターが脳内の細胞を形質導入するように、そしてコレステロール２４−ヒドロキシラーゼが治療有効レベルで該形質導入細胞により発現されるように、対象の脳に該ベクターを運搬すること。
【００６０】
有利には、ベクターは、ウイルスベクター、より有利にはＡＡＶベクター、さらに有利にはＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶｒｈ.１０などのＡＡＶ１０ベクターである。
【００６１】
特定の実施形態において、ベクターは、小脳、線条体、脳幹、前頭側頭葉、および/または視覚皮質、脊髄、好ましくは少なくとも小脳へ運搬される。特定の実施形態において、ベクターは小脳へ独占的に運搬される。
【００６２】
ニューロンおよび／または星状細胞および／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはミクログリアへのウイルスベクターの運搬または投与の方法は、一般に、選択されたシナプス接続された細胞集団の細胞の少なくとも一部が形質導入されるように、直接または造血細胞形質導入を介した、該細胞へのベクターの運搬に適した任意の方法を含む。該ベクターは、中枢神経系の細胞、末梢神経系の細胞、またはその両方に運搬されてもよい。好ましくは、該ベクターは脳の細胞に運搬される。一般に、該ベクターは、例えば脳幹（髄、橋、および中脳）、小脳、黒質、線条体（尾状核および被殻）、前頭側頭葉、視覚皮質、脊髄またはそれらの組み合わせ、または好ましくはそれらの任意の適切な亜集団を含む脳の細胞へ運搬される。
【００６３】
ベクターを脳の特定の領域および特定の細胞集団に特異的に運搬するために、ベクターは定位マイクロインジェクションにより投与されてもよい。たとえば、患者は、定位置に固定された（頭蓋骨内にねじ込まれた）定位フレームベースを有する。定位フレームベース（基準マークと互換性のあるＭＲＩ）を有する脳は、高解像度ＭＲＩを使用して画像化される。次いで、該ＭＲＩ画像は、定位ソフトウェアを実行するコンピューターに移行される。一連の冠状、矢状、および軸方向画像を使用して、標的（ベクター注射の部位）および軌跡を決定する。該ソフトウェアは、該軌跡を該定位フレームに適した３次元座標に直接変換する。バリ穴は入り口上に開けられ、該定位装置は針が所与の深さに埋め込まれた状態で配置される。次いで、該ベクターは、標的部位に注射され、最終的に造影剤と混合される。該ベクターはウイルス粒子を産生するのではなく、該標的細胞中に統合されるため、該ベクターのその後の広がりは小さく、主に、統合の前の、注射の部位からの受動的拡散および、もちろん所望のシナプス間輸送の機能である。拡散の程度は、ベクターと液状担体の比率を調整することで制御されてもよい。
【００６４】
追加の投与経路は、直接視覚化下でのベクターの局所適用、例えば、表層皮質適用、鼻腔内適用、または他の非定位的適用も含んでもよい。
【００６５】
本発明のベクターの標的細胞は、ＰｏｌｙＱ  ＳＣＡに罹患した対象の脳の細胞、好ましくは神経細胞である。好ましくは、対象は人間であり、一般に成人であるが、子供または幼児であってもよい。
【００６６】
しかしながら、本発明は、疾患の生物学的モデルへベクターを運搬することを包含する。その場合、該生物学的モデルは、運搬時の発達の任意の段階にある、例えば、胚、胎児、乳児、少年または成人、好ましくは成人であってもよい任意の哺乳類である。さらに、標的細胞は、本質的に、任意のソース、特にヒト以外の霊長類およびげっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔａ）（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）、肉食目（猫、犬）、および偶蹄目（Ａｒｔｅｒｉｏｄａｃｔｙｌａ）（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の哺乳類、ならびにその他の人間以外のシステム（ゼブラフィッシュモデルシステムなど）からであってもよい。
【００６７】
好ましくは、本発明の方法は、定位注射による脳内投与を含む。しかしながら、他の既知の運搬方法も本発明に従って適合されてもよい。例えば、脳全体にベクターをより広く分布させるために、それは、例えば、腰椎穿刺、大槽または心室穿刺により、脳脊髄液中へ注射されてもよい。該ベクターを脳に誘導するために、それは、脊髄または末梢神経節、または対象の目的の身体部分の肉（皮下または筋肉内に）に注射されてもよい。特定の状況において、該ベクターは血管内アプローチにより投与できる。たとえば、血液脳関門が乱されている状況において、該ベクターは動脈内（頸動脈）に投与できる。さらに、よりグローバルな運搬のために、該ベクターは、マンニトールを含む高張液の注射または超音波局所運搬により達成される血液脳関門の「開口」中に投与できる。
【００６８】
本明細書で使用されるベクターは、運搬のための任意の適切なビヒクルにおいて処方されてもよい。例えば、それらは薬学的に許容される懸濁液、溶液またはエマルジョン中に入れられてもよい。適切な培地は、生理食塩水およびリポソーム製剤を含む。より具体的には、薬学的に許容される担体は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含んでもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補給剤、（Ringerのデキストロースに基づくものなどの）電解質補給剤などを含む。
【００６９】
例えば、防腐剤および、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの他の添加物も存在してもよい。
【００７０】
コロイド分散システムも、標的遺伝子の運搬に使用されてもよい。コロイド分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームまたはエキソソームを含む脂質ベースのシステムを含む。
【００７１】
好ましい用量およびレジメンは医師により決定され、そして対象の年齢、性別、体重、および疾患の病期に依存してもよい。例として、ウイルス発現ベクターを使用したコレステロール２４−ヒドロキシラーゼの運搬のために、コレステロール２４−ヒドロキシラーゼ発現ベクターの各単位投与量は、薬学的に許容される液体中でウイルス発現ベクターを含む２．５〜１００μｌの組成物を含んでよく、組成物１ｍｌあたり１０１０から１０１５個までのコレステロール２４−ヒドロキシラーゼ発現ウイルス粒子を提供する。
【００７２】
医薬組成物
本発明のさらなる目的は、治療有効量の本発明によるベクターを含むＰｏｌｙＱ  ＳＣＡの処置に使用するための医薬組成物に関する。
【００７３】
「治療有効量」により、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益/リスク比でＰｏｌｙＱ  ＳＣＡを処置するのに十分な量の本発明のベクターが意味される。
【００７４】
本発明の化合物および組成物の総１日投与量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが理解されるであろう。特定の患者に対する特定の治療有効用量レベルは、処置中の障害および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定の化合物の排泄速度；処置期間；使用される特定のポリペプチドと組み合わせて、または同時に使用される薬物；および医学の分野で周知の同様の要因を含むさまざまな要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。しかしながら、製品の１日あたりの投与量は、１日あたり成人１人あたり広い範囲で変化してもよい。投与されるべき本発明のベクターの治療有効量、ならびに本発明のウイルス粒子または非ウイルス粒子および／または医薬組成物の数を有する病的状態の処置のための投与量は、患者の年齢および状態、障害または障害の重症度、投与の方法および頻度、および使用する特定のペプチドを含む多数の要因に依存するだろう。
【００７５】
本発明によるベクターを含有する医薬組成物の提示は、筋肉内、脳内、鼻腔内、くも膜下腔内、脳室内または静脈内投与に適した任意の形態であってもよい。筋肉内、鼻腔内、静脈内、脳内、くも膜下腔内または脳室内投与のための本発明の医薬組成物において、有効成分は、単独でまたは別の有効成分と組み合わせて、従来の医薬支持体との混合物として、単位投与形態で、動物および人間へ投与できる。
【００７６】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に等張、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムなど、またはかかる塩の混合物）、または、場合に応じて滅菌水または生理食塩水の添加時に滅菌注射可能溶液の構成を許す乾燥した、特に凍結乾燥組成物であってもよい。
【００７７】
処方時、溶液は投与製剤に適合する様式において、そして治療的に有効な量において投与されるだろう。該処方は、注射可能な溶液のタイプなどのさまざまな投与形態において容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用できる。
【００７８】
複数回用量が投与されることもできる。
【００７９】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるだろう。しかしながら、該実施例および添付の図は、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されるべきではない。
【００８０】
実施例
ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現の治療上の利点を、ＰｏｌｙＱ脊髄小脳失調症の２つのマウスモデル：ＭＪＤ／ＳＣＡ３のレンチウイルスベースの動物モデルおよび深刻な確立された病変を有するＰｏｌｙＱのトランスジェニックマウスモデルにおいて評価した。
【００８１】
材料および方法
動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（スペイン）により得られた２カ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）および３か月齢のトランスジェニックＭＪＤ  Ｑ６９マウス（ｎ＝６）および同年齢の野生型同腹子（ｎ＝６）(Oue et al., 2009; Torashima et al., 2008)を使用した。ＭＪＤトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）は、Ｌ７プロモーターにより小脳プルキンエ細胞において特異的に駆動される、６９個のＣＡＧ反復およびＮ末端血球凝集素（ＨＡ）タグエピトープを含有するＮ末端切断型ヒトＡＴＸＮ３を過剰発現する（Oue et al., 2009）。該切断されたＡＴＸＮ３フラグメントは、ユビキチン−プロテアソームドメイン（Ｊｏｓｅｐｈｉｎドメイン）およびユビキチン相互作用モチーフ（ＵＩＭ）を含有するＮ末端２８６アミノ酸を欠く。したがって、該切断されたタンパク質は、それぞれＮ末端およびＣ末端に４および４２個のアミノ酸のみを有する６９個のポリＱ領域から構成される。これらのトランスジェニックマウスのコロニーを、コインブラのＣｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙで確立した。マウスを、温度管理された部屋に収容し、１２時間の明暗サイクルで維持した。食料および水は自由に入手できた。該実験を、実験動物のケアおよび使用のためのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施した。
【００８２】
レンチウイルスベクターの産生
ヒト変異体アタキシン−３（ＬＶ−ＰＧＫ−Ａｔｘ−３  ７２Ｑ）をコードするレンチウイルスベクターを、以前に記載されたように（Alves et al., 2008b）、４プラスミドシステムを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株において産生した。レンチウイルス粒子を、滅菌ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中で再懸濁した。バッチのウイルス粒子含有量は、ＥＬＩＳＡ（Ｒｅｔｒｏ  Ｔｅｋ、Ｇｅｎｔａｕｒ、パリ、フランス）によりＨＩＶ−１  ｐ２４抗原レベルを評価することにより評価した。濃縮ウイルスストックを、使用するまで−８０℃で保存した。
【００８３】
ＡＡＶプラスミド設計およびベクター産生
ＡＡＶベクターを、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｇｅｎｅ療法（ＩＮＳＥＲＭ  Ｕ１０８９、ナント、フランス）により産生および精製した。ベクター産生は、他で記載されている（Hudry et al., 2010）。ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰおよびＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１のためのウイルス構築物は、ＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に囲まれたＣＭＶ初期エンハンサー／チキンβ−アクチン（ＣＡＧ）合成プロモーター（ＣＡＧ）により駆動される、ＧｆｐまたはヒトＣｙｐ４６ａ１遺伝子のいずれかからなる発現カセットを含有した。該ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＡＧ−ＧＦＰベクターをも生成し、そして対照として使用した。
【００８４】
マウス脳における定位的注射
５週齢のマウスを、アベルチン（腹腔内に１４ｍｌ  ｇ／１および２５０ｍｇ  ｋｇ／１）で麻酔した。各４匹の動物に対し、ＡＴＸＮ３  ７２Ｑをコードするレンチウイルスベクターのｐ２４抗原４００，０００ｎｇ（ＭＵＴ  ＡＴＸＮ３）および３．１０１２ｖｇ／ｍＬのＣＹＰ４６Ａ１をコードするＡＡＶｒｈ．１０または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；対照）最終容量２μｌを、以下の座標において線条体中へ定位的に共注射した（０．２μｌ／ｍｉｎ）：前後：＋０．６ｍｍ、側方：±１．８ｍｍ、腹側：−３．３ｍｍおよび歯バー（ｔｏｏｔｈ  ｂａｒ）：０。注射後、ゆっくりと上げる前にさらに５分、注射針を定位置に放置した。６−０  Ｐｒｏｌｅｎｅ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、ブリュッセル、ベルギー）を使用して皮膚を閉じた。小脳注射に対し、６週齢のトランスジェニックＭＪＤ  Ｑ６９マウス（ｎ＝２５）および同年齢の野生型同腹仔（ｎ＝１０）を、０．２５ｕｌ／ｍｉｎのＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１またはＡＡＶｒｈ１０−ＧＦＰ（２μｌ；４．１０９ｖｇ）で小脳虫部中へ、以下の座標で注射した：−３．３に設定されたマウスバーを用いて、ラムダへ−１．６ｍｍ吻側、０ｍｍ正中線、および頭蓋骨表面へ１ｍｍ腹側。
【００８５】
脳試料
トランスジェニックＭＪＤ  Ｑ６９マウス（ｎ＝６）および同年齢の野生型同腹仔（ｎ＝６）を、年齢３ヶ月で屠殺した。ペントバルビタールナトリウムの過剰投与を与えられた動物を、脳抽出の前に氷冷ＰＢＳ  ０．１Ｍを用いて経心的に灌流した。ウェスタンブロット処理のため、左大脳半球の小脳および「該脳の残り」を解剖し、ホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）およびプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）阻害剤を含有する溶解バッファー（ＴＢＳ、ＮａＣｌ１５０ｍＭおよびＴｒｉｔｏｎ  １％）中で均質化した。遠心分離（２０分、１３，０００ｒｐｍ、４°Ｃ）後、上清を回収し、タンパク質濃度を定量した（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）。溶解物のアリコート（３ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、使用するまで−８０°Ｃで保存した。左大脳半球の小脳および「該脳の残り」を解剖し、ＧＣ−ＭＳ分析まで−８０°Ｃで保存した。さらに、ウイルスベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８）を、氷冷ＰＢＳ  ０．１Ｍで、その後脳抽出前に０．１Ｍ  ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、経心的に灌流した。脳を、０．１Ｍ  ＰＢＳ中の４％ＰＦＡで３日間後固定し、２０％スクロース／０．１Ｍ  ＰＢＳ溶液中でインキュベートすることにより凍結保護した。冠状脳切片（２５μｍ）を凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ヴェッツラー、ドイツ）上で切断し、連続して収集し、免疫組織化学処理まで０．０２％アジ化ナトリウムＰＢＳ中に浮遊させて４°Ｃで保存した。ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１またはＡＡＶｒｈ１０−ＧＦＰを注射したトランスジェニックＭＪＤ  Ｑ６９マウスおよび同年齢の野生型マウスの脳を摘出し、４％ＰＦＡ中で２４時間後固定し、２５％スクロース／リン酸緩衝液中で４８時間インキュベートすることにより凍結保護した。続いて、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ  ＣＭ３０５０  Ｓ）を使用して、脳を凍結し、矢状切片（４０μｍ切片）にした。
【００８６】
トランスジェニックＭＪＤマウスの行動テスト
ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現の運動表現型への影響を評価するために、トランスジェニックＭＪＤマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）にＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１（ｎ＝１０）またはＡＡＶｒｈ１０−ＧＦＰ（対照）（ｎ＝９）を注射した。さらに、４匹の同腹の野生型動物を使用した。マウスを、年齢５〜６週間で始まり、注射後２週目から注射後１０週目まで４週ごとに実施される一連の運動テストで訓練した。実験を、経験豊富なオペレーターにより盲検的な様式で評価した。すべてのテストを、順応の３０分後に同じ暗室内で実施した。
【００８７】
ロタロッド
Ｒｏｔａｒｏｄ装置（Ｌｅｔｉｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、運動協調およびバランスを評価した。マウスを、Ｒｏｔａｒｏｄ装置（Letica Scientific Instruments）上に最大５分間一定速度（５ｒｐｍ）で、および／または加速速度（４〜４０ｒｐｍ、５分）で置き、落下までの潜時を記録した。すべてのテストを、順応の３０分後に同じ暗室内で実施した。マウスは、各時点で４回の試行を実施し、試行の間は１５〜２０分休憩した。分析のために、３つの試行の該Ｒｏｔａｒｏｄから落下する平均潜時を使用した。マウスを訓練し、該処置開始の１０週間後まで２／４週間ごとに該テストを実施した。経験豊富なオペレーターが、盲検的な様式で該テストを実行した。
【００８８】
足跡パターン分析
ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したマウスの歩行とＡＡＶｒｈ１０−ＧＦＰを注射したマウスの歩行を比較するために、足跡パターン（ウォーキングトラック）テストを使用した。ゆえに、後足および前足を、それぞれ赤および青の非毒性塗料でコーティングした。動物を滑走路の床（高さ１５ｃｍの壁を有する）に置き、長さ１００ｃｍ、幅１０ｃｍの白い紙の上を歩かせた。足跡パターンを、歩行方向に直交して測定された後肢の連続する足跡間の距離について分析した。後ろの足跡の中心とその前の後ろの足跡の中心との間のベース（後肢ベース）を、走りの開始時および終了時にできた足跡を除き、一連の５個の連続するステップにわたって記録した。
【００８９】
コレステロールおよびオキシステロールの測定
コレステロールおよびオキシステロールの分析を「ゴールドスタンダード」法（Dzeletovic et al., 1995）に従い、自動酸化アーチファクトの形成を最小限にした。簡単に説明すると、マウス線条体組織試料の重量を測定し、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、５０μｇ／ｍｌ）およびＥＤＴＡ（０．５Ｍ）を含有する５００μｌ溶液中でＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ装置（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して均質化した。該時点で、内部標準の混合物［エピコプロスタノール、２Ｈ７−７−ラトステロール、２Ｈ６−デスモステロール、２Ｈ６−ラノステロールおよび２Ｈ７−２４（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシコレステロール］（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を添加した。アルカリ加水分解を、室温で２時間、０．３５ＭエタノールＫＯＨを使用してＡｒ下で実施した。リン酸による該溶液の中和後、ステロールをクロロホルムで抽出した。下相を収集し、窒素流下で乾燥させ、残渣をトルエンに溶解した。次いで、１００ｍｇ  Ｉｓｏｌｕｔｅシリカカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ）上で、コレステロールおよびその前駆体からオキシステロールを分離し；コレステロールを、ヘキサン中の０．５％プロパン−２−オールで、続いてオキシステロールを、ヘキサン中の３０％プロパン−２−オールで溶出した。ステロール画分およびオキシステロール画分を、前述のように（Chevy et al., 2005）、Ｒｅｇｉｓｉｌ（登録商標）＋１０％ＴＭＣＳ［ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド＋１０％トリメチルクロロシラン］（Ｒｅｇｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で独立してシリル化した。ステロールおよびオキシステロールのトリメチルシリルエーテル誘導体を、中極性キャピラリーカラムＲＴＸ−６５（６５％ジフェニル３５％ジメチルポリシロキサン、長さ３０ｍ、直径０．３２ｍｍ、フィルム厚０．２５μｍ；Ｒｅｓｔｅｓｋ）におけるガスクロマトグラフィー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０シリーズ）により分離した。該ガスクロマトグラフィーと直列の質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５不活性ＸＬ）を、陽イオンの検出のためにセットアップした。イオンを、電子衝撃モードで７０ｅＶで産生した。それらを、スキャニングモードのフラグメントグラムにより識別し、適切な内部および外部標準［エピコプロスタノール（ｅｐｉｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌ）  ｍ／ｚ  ３７０、２Ｈ７−７−ラトステロール  ｍ／ｚ  ４６５、２Ｈ６−デスモステロール  ｍ／ｚ  ３５８、２Ｈ６−ラノステロールｍ／ｚ  ５０４、２Ｈ７−２４（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシコレステロール  ｍ／ｚ  ５５３、コレステロール  ｍ／ｚ  ３２９、７−ラトステロール  ｍ／ｚ、７−デヒドロコレステロールｍ／ｚ  ３２５、８−デヒドロコレステロール  ｍ／ｚ  ３２５、デスモステロール  ｍ／ｚ  ３４３、ラノステロール  ｍ／ｚ  ３９３および２４（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシコレステロール  ｍ／ｚ  ４１３］での正規化およびキャリブレーションの後、特定のイオンの選択的モニタリングにより定量化した。
【００９０】
ウェスタンブロット
総タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。等量の総タンパク質抽出物（３０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ  ｍｉｄｉ  ｇｅｌ  １５  ｏｒ  ２６  ｗｅｌｌｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、米国）で電気泳動分離し、ニトロセルロース膜に移行させた。ブロックされた膜（ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％脱脂粉乳）を一次抗体とともに４°Ｃで一晩インキュベートし、ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔ−ＢＳＴ）で１０分間３回洗浄した。次いで、膜を、対応する各一次抗体に対して上げられる二次ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体で標識した。Ｔ−ＢＳＴでの３回の洗浄後、供給者の指示に従って、膜をＥＣＬ化学発光試薬（Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ基質；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性を、カメラシステムＦｕｓｉｏｎ  ＴＸ７（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出した。正規化を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  １Ｄ画像解析ソフトウェア（バージョン４．４；Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を使用したデンシトメトリー解析により行った。光学密度を、「標準タンパク質」（ＧＡＰＤＨ）に関して正規化した。分配率を計算し、１として定義された最高値を有する試料に対して正規化した。
【００９１】
一次抗体
ウェスタンブロット（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析において使用される抗体を、以下の表１に列挙する。
【００９２】
2020515284.tif 000002
【００９３】
免疫染色
免疫組織化学的手順を、３７℃で２５分間、フェニルヒドラジン中で浮遊切片をインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼをクエンチすることにより開始した。３回の洗浄後、切片を１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で、ＲＴで１時間ブロックした。次いで、切片を、それぞれの一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。３回の洗浄後、該切片を、ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％ＮＧＳ中で希釈した対応するビオチン化二次抗体（１：２５０；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）とともに、室温で２時間インキュベートした。３回の洗浄後、結合した抗体をＡＢＣ増幅システム（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、米国）および３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ペルオキシダーゼ基質キット、ＤＡＢ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、米国）により視覚化した。該切片をマウントし、エタノールおよびトルオール溶液に２回通すことにより脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ（登録商標）（Ｏ.Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＧｍｂＨ＆ＣＯ、フライブルク、ドイツ）でカバースリップした。
【００９４】
画像取得
免疫染色切片の画像を、Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３１０ＦＸデジタルカメラを備えた明視野Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ５０００Ｂ顕微鏡で、室温で、Ｚ６  ＡＰＯ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）およびＬＡＳ  Ｖ３．８（Ｌｅｉｃａ）ソフトウェアで取得した。比較のための写真を、画像取得の同一条件下で撮影し、明るさおよびコントラストのすべての調整をすべての画像に均一に適用した。
【００９５】
ＭＪＤのＬＶベースモデルにおけるＡＴＸＮ３凝集体およびＤＡＲＰＰ−３２枯渇の免疫組織化学的定量分析
脳切片を、ＲＴでＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡（ＣＣＤカラーデジタルＡｘｉｏｃａｍ  ＨＲｃカメラ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で、５倍（空気対物レンズ、Ｆｌｕａｒ、０．２５  ＮＡ）および２０倍倍率（空気対物レンズ、ＬＤ−ＰｌａｎＮｅｏｆｌｕａｒ、０．４  ＮＡ）で分析および画像化した。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアのＭｏｚａｉＸ機能を使用して、完全凝集体含有またはＤＡＲＰＰ−３２枯渇領域の合成画像を自動的に取得した。ＡＴＸＮ３陽性凝集体の定量化およびＤＡＲＰＰ−３２枯渇の面積の決定を、各マウスに対し７〜８個の切片において行い、線条体の前後に広がり、２００μｍで区切った。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して、各半球の２０倍拡大画像上でＡＴＸＮ３陽性凝集体のカウントを実行した。認識可能なＡＴＸＮ３陽性の蓄積が検査に含まれるように画像を手動でしきい値処理した後、３μｍ２を超える粒子を自動的に分析およびカウントし（スケール：２ピクセル／μｍ）、線条体全体の総凝集体数の推定計算を、以前に記載されているように（Alves et al., 2008a; Alves et al., 2010）実行した。線条体のＭＵＴ  ＡＴＸＮ３病変の範囲を、スライドスキャナーで線条体の完全な吻側尾部サンプリングを得るために、選択された動物ごとに６〜８個のＤＡＲＰＰ−３２染色切片（厚さ２５μｍの切片の間に２００μｍ）をデジタル化することおよび、抗体反応性が低下した領域を手動で定義し、その面積を定量化する（スケール：０．５ピクセル／μｍ）ために、半自動画像解析プログラム（ＩｍａｇｅＪソフトウェア、ＮＩＨ、ＭＤ、ＵＳＡ）で病変の面積を定量化することにより分析した。線条体全体の切片を分析した。ＤＡＲＰＰ−３２染色の消失を示す線条体の領域を、操作者に依存しないマクロで各動物について測定した。次いで、次の式を使用して体積を推定した：体積＝ｄ（ａ１＋ａ２＋ａ３＋・・）、ｄは連続切片間の距離（２００μｍ）であり、ａ１、ａ２、ａ３などは個々の連続切片に対するＤＡＲＰＰ−３２−枯渇領域である（Alves et al., 2008b）。損傷領域で測定されたすべてのピクセルの平均濃淡値を、各枯渇領域について記録した。結果を、各動物のＤＡＲＰＰ−３２枯渇領域の体積の計算値として提示する。すべての場合において、イメージング、測定、および定量化を、処置に対して盲検的に実施した。
【００９６】
ＭＪＤトランスジェニックマウスにおける免疫組織化学定量分析
小脳体積の定量化：小脳の全範囲をカバーするクレシルバイオレットで染色された８個の切片における葉（ｌｏｂｅ）あたりの面積をスキャンすることにより、小脳体積を盲検的に評価した。該小脳体積を、総面積に連続切片間の距離（３２０μｍ）を掛けることにより得た。
【００９７】
顆粒層および分子層のサイズの定量化：２０倍の対物レンズを使用して盲検的に、小脳の前後に広がる４個のクレシルバイオレット染色切片にわたって、定量化を行った。各切片について、（葉のサイズに応じた）３〜５回の異なる測定において、葉ごとに層のサイズを盲検的に評価した。
【００９８】
プルキンエ細胞の定量化：抗カルビンジンおよびＤＡＰＩで染色した小脳全体をカバーする８個の矢状切片の蛍光画像を、２０倍の対物レンズを使用してＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ２顕微鏡で取得した。各切片およびプルキンエ細胞の数を、盲検的な方法で各小脳葉について手動でカウントした。データを、小脳全体または葉ごとのプルキンエ細胞数の平均値として表す。
【００９９】
ユビキチン凝集体の定量化：２０倍の対物レンズを使用してＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ２顕微鏡で取得した、抗ユビキチンおよびＤＡＰＩで染色した小脳全体をカバーする８個の矢状切片の蛍光画像から、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアを使用して、ユビキチン凝集体の数を葉９および１０において自動的に評価した。適用された分析モジュールは、すべての動物および画像について同じであった。データを、切片ごとのユビキチン凝集体の平均数として表す。
【０１００】
クレシルバイオレット染色
小脳切片をクレシルバイオレットで２分間染色し、酢酸緩衝液ｐＨ３．８から４（２．７２％酢酸ナトリウムおよび１．２％酢酸；１：４ｖ／ｖ）において識別し、エタノールおよびトルオール溶液に２回通すことにより脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ（登録商標）（Ｏ．Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＧｍｂＨ＆ＣＯ.フライブルク、ドイツ）でマウントした。
【０１０１】
神経芽腫細胞の培養およびトランスフェクション
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂａｎｋ（ＣＣＬ−１３１）から取得したマウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２ａ細胞）を、５％ＣＯ２／空気雰囲気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。８４個のグルタミンを有するヒト完全長変異体Ａｔｘ３（ｐＥＧＦＰ−Ａｔｘ３Ｑ８４；（Chai et al., 2002））を、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）および総濃度０．５  ｍｇの各ＤＮＡを使用してＮｅｕｒｏ２Ａ細胞にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクション後の４８時間のブロット処理のために溶解した。
【０１０２】
オートファジーフラックス測定
オートファジーフラックスを、リソソームに運搬されるＬＣ３Ｂ−ＩＩの量を定量化するために使用されるＬＣ３Ｂ代謝回転アッセイにより測定した（Aveleira et al., 2015）。そのために、ＬＣ３Ｂ−ＩＩのレベルを、自己リソソーム分解の阻害剤であるクロロキン（ＣｈＱ、ＳＩＧＭＡ、１００μｍ）の存在下および非存在下で測定した。該オートファジーフラックスを、クロロキンなしの試料（ＬＣ３Ｂ−ＩＩ−ＣｈＱ）におけるＬＣ３Ｂ−ＩＩの濃度測定値を、各条件のクロロキン（ＬＣ３Ｂ−ＩＩ＋ＣｈＱ）で処理した対応する試料から差し引くことにより計算した。
【０１０３】
統計分析
統計分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定および、複数の比較のために対応のあるまたは対応のないスチューデントのＴ検定またはＡＮＯＶＡを使用して実行した。結果を平均±ＳＥＭとして表す。本文において定義されているように、有意な閾値を、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１に設定した。すべての分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、米国）を使用して実行した。
【０１０４】
結果
ＭＪＤトランスジェニックマウスの小脳における低下したＣＹＰ４６Ａ１タンパク質レベル
ＣＹＰ４６Ａ１のレベルを、６９個のＣＡＧ反復を有するＮ末端切断型ヒトＡＴＸＮ３を発現する６匹のＭＪＤトランスジェニックマウスおよび６匹の同年齢の対照同腹仔からの凍結生検において、ウェスタンブロットにより評価した。特に、変異ヒトアタキシン−３が小脳プルキンエ細胞において特異的に発現されたため、ＣＹＰ４６Ａ１タンパク質レベルを小脳において分析した（Oue et al., 2009）。対照領域として、「該脳の残り」（小脳を除くすべての脳組織）を使用したが、変異ヒトアタキシン−３の発現を検出しなかった（図１）。ウェスタンブロット分析は、対照同腹仔と比較して、ＭＪＤマウスからの小脳生検におけるＣＹＰ４６Ａ１タンパク質レベルにおける２４．３％の減少を実証した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定；ｐ＝０．０２６）（図２ＡおよびＢ）。対照的に、ＭＪＤマウスおよび対照同腹仔の「脳の残り」からの抽出物において、統計的に有意な差を見出さなかった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定；ｐ＝０．１３）（図２ＣおよびＤ）。
【０１０５】
全体として、これらのデータは、コレステロール代謝経路における重要な酵素であるＣＹＰ４６Ａ１の、ヒト脊髄小脳失調症、特にＭＪＤにおける治療標的としての関連性を支持する。
【０１０６】
ＭＪＤトランスジェニックマウスの脳におけるコレステロール代謝経路の制御解除
ＭＪＤにおけるＣＹＰ４６Ａ１欠乏の影響を決定するために、ＭＪＤ  Ｑ６９マウスおよび同年齢の同腹仔からの小脳抽出物のガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によるステロールおよびオキシステロールの両方の定量的測定を実施することにより、コレステロール代謝を分析した。したがって、Ｋａｎｄｕｔｓｃｈ−Ｒｕｓｓｅｌｌ（ラトステロール）およびＢｌｏｃｈ（デスモステロール）経路からのコレステロール中間体とともに、コレステロール代謝経路の最初のステロールであるラノステロールを測定した。コレステロールおよび２４Ｓ−ＯＨＣの含有量を最初に比較し、野生型同腹仔（２６．１９±０．７８μｇ／ｇ；ｎ＝６、スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．００２）と比較して、ＭＪＤ  Ｑ６９マウス（２０．６２±１．１４μｇ／ｇ；ｎ＝６）の２４Ｓ−ＯＨＣのレベルにおいて統計的に有意な減少（２１．３％）を観察した（図３Ａ）。ＭＪＤマウスと野生型マウスの間で小脳コレステロール含有量に統計的に有意な差を観察しなかった（図３Ａ）。オキシステロール２５Ｓ−ＯＨＣおよび２７Ｓ−ＯＨＣ、および残りのステロール（ラノステロール、７−ラトステロール、デスモステロール、７−ＤＨＣおよび８−ＤＨＣ）について統計的に有意な差を見出さなかった（図３Ａ）。
【０１０７】
変異体ヒトアタキシン−３は、小脳プルキンエ細胞においてのみ発現されるため、「脳の残り」を使用して、上記のオキシステロールおよびステロールのレベルを測定した。驚くべきことに、対照同腹仔（４．６８±０．３７μｇ／ｇ；ｎ＝６；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．０１３）と比較して、ＭＪＤＱ６９マウス（６．３２±０．４０μｇ／ｇ；ｎ＝６）からの「脳の残り」における２４Ｓ−ＯＨＣのレベルにおける統計的に有意な増加を検出した（図３Ｂ）。統計的に有意な増加を、野生型マウス（８．６８±０．５３ｍｇ／ｇ；ｎ＝６；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．０１１）と比較して、ＭＪＤＱ６９マウス（１０．７４±０．４１ｍｇ／ｇ；ｎ＝６）のコレステロールのレベルにおいても見出した（図３Ｂ）。コレステロール前駆体デスモステロールのレベル、ならびに７−ラトステロールのレベル（正常マウスにおいて４．６８±０．３７μｇ／ｇ；ｎ＝６  対  ＭＪＤＱ６９マウスにおいて６．３２±０．４０μｇ／ｇ；ｎ＝６；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．０５４）は、野生型マウス（１７２．５±１４．６μｇ／ｇ；ｎ＝６；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．００７）と比較して、ＭＪＤＱ６９マウス（２４３．０±１４．９３μｇ／ｇ；ｎ＝６）において増加した（図３Ｂ）。同じ系統において、ラノステロールのレベルは、野生型マウス（３．４６±０．２９μｇ／ｇ；ｎ＝６、スチューデントのＴ検定）と比較して、ＭＪＤＱ６９マウス（４．３０±０．３０μｇ／ｇ；ｎ＝６、Ｐ＝０．０７）においてわずかに増加した（図３Ｂ）。７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）および８−デヒドロコレステロール（８−ＤＨＣ）について、統計的に有意な差を見出さなかった。さらに、オキシステロール２７−ＯＨＣのレベルは、野生型マウス（０．６０±０．０７μｇ／ｇ；ｎ＝６；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．０００６）と比較して、ＭＪＤＱ６９マウス（０．２１±０．０３５μｇ／ｇ；ｎ＝６）において減少した。ＭＪＤＱ６９および野生型マウスの間で、２５−ＯＨＣレベルについて差を観察しなかった（図３Ｂ）。
【０１０８】
全体として、これらの結果は、小脳のようなＭＪＤの影響を受ける領域（変異型ＡＴＸＮ３が特異的に発現している）および変異型ＡＴＸＮ３が検出されない領域（該脳の残り）におけるコレステロール代謝経路における変化を示唆する。
【０１０９】
ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現は、ＭＪＤ  ＬＶベースのマウスモデルにおける神経病理を緩和する
次いで、本発明は、ＣＹＰ４６Ａ１のレベルの増加を介したコレステロール代謝経路の上方制御が、変異体アタキシン−３クリアランスを改善し、したがってＭＪＤ関連神経病理の確立を遅らせることができるかどうかを調査した。次に、ＭＪＤのＬＶベースのマウスモデルにおけるＣＹＰ４６Ａ１過剰発現の治療効果を評価した(Alves et al., 2008b; Nobrega et al., 2013）。該目的のために、変異体ヒトアタキシン−３をコードするＬＶおよびＣＹＰ４６Ａ１をコードするＡＡＶを、ＭＪＤマウスモデルの線条体において共発現させ、注射の２ヶ月後に該マウスを犠牲にした。ＨＡ−誘導免疫組織化学は、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したＬＶ−ＭＪＤマウスにおけるＨＡタグの存在を明らかにしたが、ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射した対照グループにおいてはそうではなかった（図４Ａ）。逆に、ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射したマウスにおいて、該マウス脳における強力で広範囲のＧＦＰ免疫反応性を検出したが、ＨＡ陽性シグナルを検出しなかった（図４Ａ）。
【０１１０】
ＭＪＤマウスモデルにおいて、（１Ｈ９抗体を用いた）免疫組織化学および突然変異体アタキシン３陽性包含物の定量分析（図４Ａ）は、対照群（ＧＦＰ共注射マウス；６６８４±７１７．２包含物；ｎ＝８；スチューデントのＴ検定、Ｐ＝０．０００２）と比較して、アタキシン３陽性包含物（２７５１±２６７．８；ｎ＝８）の数における統計的に有意なＣＹＰ４６Ａ１を介した減少（〜５９％）を明らかにした（図４Ｂ）。包含物の表面も分析し、対照ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射したＬＶ−ＭＪＤマウス（１１１．４±３．９６ａ.ｕ.；ｎ＝８；スチューデントのＴ検定、Ｐ＜０．０００１）と比較して、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１処置ＬＶ−ＭＪＤマウス（５９．２９±４．６７任意単位（ａ.ｕ.）；ｎ＝８）の包含物のサイズにおける統計的に有意な減少（〜４７％）を実証した（図４Ｂ）。これらの結果を、対照ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＦＰを注射したＬＶ−ＭＪＤマウスと比較して、ＡＡＶｒｈ．１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したＬＶ−ＭＪＤマウスにおけるユビキチン化された包含物の数における減少を示す抗ユビキチン免疫染色で完了した（図４Ａ）。これらの結果を考慮して、変異体ヒトアタキシン−３クリアランスがＬＶ−ＭＪＤマウスモデルにおける神経保護を付与するかどうかを次に検査した。マウス線条体におけるＬＶベースの変異体アタキシン−３の過剰発現は、正確に定量化できる神経マーカーＤＡＲＰＰ−３２の枯渇を促進することが報告されている（Alves et al., 2008b）。したがって、ＤＡＲＰＰ−３２に対する免疫組織化学を実施した（図４Ｄ）。ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現は、対照ＡＡＶｒｈ.１０−ＧＦＰを注射したＬＶ−ＭＪＤマウス（０．９１±０．１４ｍｍ３；ｎ＝８）スチューデントのＴ検定；Ｐ＝０．０１５）と比較して、２か月での減少したＤＡＲＰＰ−３２枯渇領域（０．４８±０．７７ｍｍ３；ｎ＝８）により評価されるように、神経機能障害の統計的に有意な減少（〜４８％）につながった。
【０１１１】
全体として、これらのデータは、ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現が治療特性を有し、これがミスフォールド変異体ヒトアタキシン−３のクリアランスを促進し、したがってＬＶ−ＭＪＤマウスモデルにおける神経マーカーの保存および神経保護をもたらすことを支持する。
【０１１２】
ＡＡＶ媒介ＣＹＰ４６Ａ１遺伝子治療はＭＪＤトランスジェニックマウスにおける神経病理および運動協調を改善する
トランスジェニックＭＪＤマウスモデル(Torashima et al., 2008）を使用することにより、ＣＹＰ４６Ａ１の上方制御が疾患発症後に運動および小脳障害（ｄｅｆｉｃｉｔ）を緩和するかどうかの次の調査を実施した。該モデルは、強力な運動および神経病理学的表現型を特徴とし、分子療法のテストに特に適する(Nobrega et al., 2014; Mendonca et al., 2015; Nobrega et al., 2015）。重度の運動機能障害を有するＭＪＤトランスジェニックマウスの運動表現型を改善するＣＹＰ４６Ａ１過剰発現の可能性を評価するため、ＣＹＰ４６Ａ１またはＧＦＰ（対照）をコードするＡＡＶｒｈ１０を成体ＭＪＤトランスジェニックマウスの小脳に注射し、ウイルス注射後１０週間まで２／４週間ごとに、運動能力を評価した。一定速度でのロタロッドテスト（図５Ａ）および加速ロタロッドテスト（図５Ｂ）を使用して、該注射時、野生型マウス（ＷＴ）と比較して、ＭＪＤトランスジェニックマウスはすでに顕著な運動障害を示すことを観察した。さらに、研究全体を通して、ＧＦＰマウスと比較して、ＣＹＰ４６Ａ１を発現するマウスはより良い運動能力を有するが、両方のロタロッドテストについて、ＡＡＶ注射後わずか１０週間で、ＣＹＰ４６Ａ１およびＧＦＰを発現するマウス間で観察される異なる落下までの潜時は有意になった（図５Ａ、ＣＹＰ５３．０７ｓ対ＧＦＰ１７．４８ｓ）。運動機能における該改善を、足跡パターンテスト、すなわち後肢ベーステストでさらに分析した。ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１で処置したマウスは、ウイルス注射の１０週間後により良い後肢ベース性能の傾向を有することを観察した（図５Ｃ、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１：３．１７±０．０７ｃｍ対ＡＡＶｒｈ１０−ＧＦＰ：３．４０±０．１１ｃｍ）；しかしながら、該テストでは両グループ間に有意な差を観察しなかった。
【０１１３】
運動機能の改善がニューロンの改善とも関連しているかどうかを調査するために、注射されたマウスの凝集体数および小脳神経病理を次に評価した。(Nobrega et al., 2013b; Nobrega et al., 2014）におけるように、小脳皮質の葉ＩＸおよびＸ上でウイルスベクターの形質導入を優先的に検出した。行動データによれば、ＡＡＶｒｈ１０−ＧＦＰを注射した対照と比較して、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したマウスにおける形質導入された葉において、ユビキチン凝集体の平均数が有意に減少した（図６）。該トランスジェニックマウスモデルは、プルキンエ細胞の損失および小脳皮質の強力な解体を特徴とする（Oue et al., 2009）。重要なことに、プルキンエ細胞の平均数は、対照と比較して、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射した動物において有意に高かった（図６）。さらに、小脳の体積は、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１を注射したマウスの葉ＩＸおよびＸ、ならびに顆粒層の厚さにおいて高かった（図６）。全体としてこれらのデータは、ＣＹＰ４６Ａ１の上方制御が、重度の進行性ＭＪＤトランスジェニックマウスモデルにおける運動表現型および神経病理学的異常の強力な緩和を仲介することを示す。
【０１１４】
ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞においてオートファジーを誘発し、変異型ＡＴＸＮ３を除去する
次に、ＣＹＰ４６Ａ１作用の分子メカニズムおよび、変異ＡＴＸＮ３（ＥＧＦＰ−Ｑ８４）を発現するＮｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるその影響を調査した。ウェスタンブロットによる変異体ＡＴＸＮ３種レベルの分析は、可溶性タンパク質（１±０．０ｖｓ０．０９±０．０６；ｎ＝４；図７Ｃ）におけるのと同様、両方の凝集体（１±０．０対０．４４９±０．１１；ｎ＝４；図７Ｂ）において、ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現が、対照条件（図７Ａ）と比較して、そのレベルを有意に減少させることを明らかにした。これらの結果に基づいて、次に、ＣＹＰ４６Ａ１が凝集種を除去するための主な細胞経路としてオートファジーを介して変異型ＡＴＸＮ３を減少させているかどうかを決定するために、調査を実施した（図８Ａ）。実際、ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現は、対照条件（１±０．０；ｎ＝４）と比較して、ＬＣ３Ｂ−ＩＩレベルを有意に増加させる（２．１２±０．３５；ｎ＝４）ことを見出した。ＬＣ３Ｂ−ＩＩレベルにおける該増加は、飢餓状態（オートファジー陽性対照；１．５８±０．０２；ｎ＝４）と比較して、ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現時にさらにより高くなった（図８Ｂ）。さらに、オートファジー阻害剤（クロロキン−ＣｈＱ）の存在下で観察された結果は、同じ傾向、つまり対照条件（２．８３±０．４４；ｎ＝４）と比較した、ＣＹＰ４６Ａ１過剰発現時のＬＣ３Ｂ−ＩＩレベルにおける増加（６．７４±１．３１；ｎ＝４）に沿う（図８Ｂ）。さらに、ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現は、オートファジーフラックスを有意に増加させ、これは対照条件（１±０．０；ｎ＝４）と比較した、ＬＣ３Ｂ−ＩＩ正味フラックスにおける増加（２．８０±０．１６；ｎ＝４）により強調される（図８Ｃ）。
【０１１５】
全体としてこれらの結果は、ＣＹＰ４６Ａ１が変異ＡＴＸＮ３の強力なモジュレーターであり、オートファジー経路の強力な活性化によりそのレベルが低下することを示す。
【０１１６】
ゆえに、ＣＪ４６Ａ１レベルが、ＭＪＤ／ＰｏｌｙＱマウスからの小脳抽出物において減少することを実証した。ＭＪＤのレンチウイルスベースの動物マウスモデルにおけるＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現は、ニューロンマーカーの保存に関連する変異体ヒトアタキシン−３の蓄積を減少させることにより神経保護を付与することも示した。このことを、小脳ＡＡＶｒｈ１０−ＣＹＰ４６Ａ１の過剰発現が、ＭＪＤ関連神経病理の緩和、特に小脳におけるミスフォールドタンパク質の減少およびプルキンエ細胞損失および細胞層収縮の減少と相関する運動行動障害の注目に値する緩和を誘発する、成体ＭＪＤトランスジェニックマウスにおいて確認した。ゆえに、ＡＡＶ−ＣＹＰ４６Ａ１は、ＭＪＤ関連神経病理を軽減するミスフォールドアタキシン３の蓄積を減少させ、したがって運動行動欠陥を改善する。
【０１１７】
驚くべきことに、ＣＹＰ４６Ａ１がオートファジーを活性化して変異ＡＴＸＮ３沈着を減少させることを、神経芽細胞腫細胞において実証した。
【０１１８】
したがって、これらの結果は、ＳＣＡのための治療標的としてのＣＹＰ４６Ａ１を支持する。
【０１１９】
参考文献
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【０１２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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