(57)【要約】  本発明は、融合誘導性タンパク質であるＭＩＮＩＯＮ（微小タンパク質融合誘導因子）に関連する新規な組成物、方法、および治療上の使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、９、１１、１３、１５、またはその変異体のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項２】
前記核酸が、１〜４個の変異を有する配列番号１を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号１からなるポリペプチドをコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記核酸が、１〜４個の変異を有する配列番号３を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号３からなるポリペプチドをコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
前記核酸が、タグと融合した配列番号１もしくは配列番号３またはその変異体を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
前記タグが、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号３２）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号３３）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号３４）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号３５）、Ｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号３６）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号３７）、ＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号３８）、ポリグルタミン酸タグ（ＥＥＥＥＥＥ、配列番号３９）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号４０）、ＳＢＰタグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号４１）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号４２）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号４３）、Ｓタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ、配列番号４４）、Ｓｏｆｔａｇ  １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ、配列番号４５）、Ｓｏｆｔａｇ  ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ、配列番号４６）、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号４７）、ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ、配列番号４８）、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ、配列番号４９）、ＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ、配列番号５０）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ、配列番号５１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、ＧＦＰタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、Ｈａｌｏタグ、またはチオレドキシンタグから選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号２または配列番号４を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号２または配列番号４からなる、請求項１に記載のベクター。
【請求項１０】
プロモーターをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】
ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
選択マーカーをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６】
前記第２の核酸が、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記第２の核酸が、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
前記第２の核酸が、配列番号１６を含むＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】
前記第２の核酸が、配列番号１６からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２０】
前記第２の核酸が、配列番号１７を含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２１】
前記第２の核酸が、配列番号１７からなる、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２２】
前記ベクターがさらに、前記第２の核酸の上流に配列内リボソーム進入部位または２Ａ配列を含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、配列番号５２〜６６のいずれか１つから選択される２Ａオリゴペプチドをコードする２Ａ配列を含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ベクターがさらに、前記第２の核酸の上流に第２のプロモーターを含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２５】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、ＲＮＡ、またはウイルスベクターから選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターが、次のウイルス：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオウイルス、ポックスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、粘液腫ウイルス、またはマラバウイルスのいずれかをベースにしたベクターから選択される、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の前記ベクターを含む細胞。
【請求項２８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の前記ベクターおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体をコードする第２の核酸を含む第２のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２７または２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、または腫瘍細胞から選択される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、検出可能なマーカーを発現する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むリポソーム。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載のリポソーム。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号１またはその変異体からなる、請求項３２に記載のリポソーム。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号３またはその変異体からなる、請求項３２に記載のリポソーム。
【請求項３６】
Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをさらに含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項３７】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のリポソーム。
【請求項３８】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３６に記載のリポソーム。
【請求項３９】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体を含む、請求項３６に記載のリポソーム。
【請求項４０】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体からなる、請求項３６に記載のリポソーム。
【請求項４１】
治療薬をさらに含み、前記治療薬が前記リポソーム中に被包される、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項４２】
前記治療薬が、核酸、タンパク質、低分子化合物、またはペプチド核酸から選択される、請求項４１に記載のリポソーム。
【請求項４３】
治療薬を細胞に送達する方法であって、前記方法が、請求項４１または４２に記載の前記リポソームを前記細胞と接触させる工程を含み、前記リポソームが前記細胞と融合し、それにより前記治療薬を前記細胞に送達する、方法。
【請求項４４】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、腫瘍細胞または機能障害性細胞である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法がインビトロで実施される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法がインビボで実施される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
第１の細胞を第２の細胞に融合する方法であって、前記方法が：
（ａ）ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現する第１の細胞をもたらす工程と；
（ｂ）前記第１の細胞を、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現する第２の細胞と接触させる工程とを含み、
前記第１の細胞が前記第２の細胞と融合する、方法。
【請求項４９】
第１の細胞を第２の細胞に融合する方法であって、前記方法が：
（ａ）ＭＩＮＩＯＮポリペプチドを発現する第１の細胞、および同型相互作用を媒介する受容体をもたらす工程と；
（ｂ）前記第１の細胞を、前記第１の細胞によって発現されるものと同一の前記受容体を発現する第２の細胞と接触させる工程とを含み、
前記第１の細胞が前記第２の細胞と融合する、方法。
【請求項５０】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１またはその変異体を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号３またはその変異体を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１またはその変異体からなる、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号３またはその変異体からなる、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４８および５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４８および５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体を含む、請求項４８および５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体からなる、請求項４８および５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
同型相互作用を媒介する前記受容体が、カドヘリン、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンから選択される、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
同型相互作用を媒介する前記受容体が、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリンから選択されるカドヘリンである、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の細胞および前記第２の細胞が、ヒト細胞である、請求項４８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の細胞および前記第２の細胞が、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞、または腫瘍細胞から選択される、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の細胞が、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、または樹状細胞から選択され、前記第２の細胞が、腫瘍細胞または機能障害性細胞である、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１の細胞が、検出可能なマーカーを発現する、請求項４８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｂ）がインビトロで実施される、請求項４８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
工程（ｂ）がインビボで実施される、請求項４８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の細胞がさらに、目的の遺伝子を含み、前記細胞の前記融合により、前記目的の遺伝子を前記第２の細胞に送達する、請求項４８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記目的の遺伝子が、前記第２の細胞の病理学的表現型を矯正する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第２の細胞がさらに、目的の遺伝子を含み、前記細胞の前記融合により、前記目的の遺伝子を前記第１の細胞に送達する、請求項４８〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記目的の遺伝子が、前記第１の細胞の病理学的表現型を矯正する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記目的の遺伝子が、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子である、請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記病理学的表現型が、ミトコンドリアＤＮＡ欠乏；ミトコンドリア心筋症；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス性てんかん（ＭＥＲＲＦ）；ミトコンドリア心筋症、脳筋症、乳酸性アシドーシス、脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ）；カーンズ−セイアー症候群（ＫＳＳ）；リー症候群（亜急性壊死性脳筋症）および母性遺伝のリー症候群（ＭＩＬＳ）；ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス性てんかん（ＭＥＲＲＦ）；ニューロパチー、運動失調および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）；またはピアソン症候群から選択される、請求項６９または７１に記載の方法。
【請求項７４】
対象における癌を治療する方法であって、前記方法が、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項７５】
対象における癌を治療する方法であって、前記方法が、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項７６】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１またはその変異体を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号３またはその変異体を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１またはその変異体からなる、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号３またはその変異体からなる、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７４および７６〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７４および７６〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体を含む、請求項７４および７６〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体からなる、請求項７４および７６〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
同型相互作用を媒介する前記受容体が、カドヘリン、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンから選択される、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
同型相互作用を媒介する前記受容体が、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリンから選択されるカドヘリンである、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、次のウイルス：腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性アデノ随伴ウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性ポックスウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性コクサッキーウイルス、腫瘍溶解性エンテロウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、または腫瘍溶解性マラバウイルスのいずれかから選択される、請求項７４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記腫瘍溶解性ウイルスが癌細胞を特異的に標的化する、請求項７４〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記腫瘍溶解性ウイルスが癌細胞において選択的に複製する、請求項７４〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、検出可能なマーカーを発現する、請求項７４〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍内、経皮的、経粘膜的、経口的、鼻腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは腹腔内、または経肺投与を介して前記対象に投与される、請求項７４〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記癌が、頭頸部癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、脳癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、リンパ腫、または白血病から選択される、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記癌が、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、未分化多形肉腫、または滑膜肉腫から選択される肉腫である、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９６】
前記ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質が、配列番号１または３の前記アミノ酸配列を含む、請求項９５に記載の抗体。
【請求項９７】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である、請求項９５または９６に記載の抗体。
【請求項９８】
対象における癌を治療する方法であって、前記方法が、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の癌ワクチンを前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項９９】
対象における癌を治療する方法であって、前記方法が、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む有効量の癌ワクチンを前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１００】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１またはその変異体を含む、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号３またはその変異体を含む、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号１またはその変異体からなる、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＭＩＮＩＯＮポリペプチドが、配列番号３またはその変異体からなる、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０６】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８および９９〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９８および９９〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体を含む、請求項９８および９９〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが、配列番号１６またはその変異体からなる、請求項９８および９９〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
同型相互作用を媒介する前記受容体が、カドヘリン、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンから選択される、請求項９９〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
同型相互作用を媒介する前記受容体が、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリンから選択されるカドヘリンである、請求項９９〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記癌ワクチンが、樹状細胞および腫瘍細胞に由来する樹状−腫瘍融合細胞を含む、請求項９８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記癌ワクチンが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をシミュレートする、請求項９８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記癌ワクチンが、１種以上の腫瘍関連抗原を提示する、請求項９８〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記癌ワクチンが、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ経路を介して１種以上の前記腫瘍関連抗原を提示する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記癌ワクチンが、検出可能なマーカーを発現する、請求項９８〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記樹状細胞が、自己の樹状細胞である、請求項１１２〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記樹状細胞が、同種の樹状細胞である、請求項１１２〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記腫瘍細胞が、自己の腫瘍細胞である、請求項１１２〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記腫瘍細胞が、同種の腫瘍細胞である、請求項１１２〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記樹状細胞が、活性化された樹状細胞である、請求項１１２〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記腫瘍細胞が、免疫原性の腫瘍細胞である、請求項１１２〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記腫瘍細胞が、癌幹細胞である、請求項１１２〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記癌ワクチンが、腫瘍内、経皮的、経粘膜的、経口的、鼻腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは腹腔内、または経肺投与を介して前記対象に投与される、請求項９８〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記癌が、頭頸部癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、脳癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、リンパ腫、または白血病から選択される、請求項９８〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記癌が、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、未分化多形肉腫、または滑膜肉腫から選択される肉腫である、請求項９８〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１２８】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋強直性筋ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（Ｏｃｕｌｏｐｈａｒｎｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＯＭＤ）、三好ミオパチー（ＭＭ）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、および遠位型ミオパチー（ＤＭ）からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４２１，５１４号の利益を主張するものであり、その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、融合誘導性タンパク質であるＭＩＮＩＯＮ（微小タンパク質融合誘導因子）に関連する組成物、方法、および治療上の使用を提供する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１７年１１月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製は、ＰＡＴ０５７２７９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ＿２０１７＿１１＿０８．ｔｘｔと命名され、サイズは７３，４４５バイトである。
【背景技術】
【０００４】
マウスのＭＩＮＩＯＮ（微小タンパク質融合誘導因子）タンパク質もまた、胚性幹細胞および生殖細胞特異的タンパク質（ＥＳＧＰ）として知られており、幹細胞の多能性の維持において重要な役割を果たす転写因子Ｏｃｔ−４によって調節される下流遺伝子として最初に同定された（Ｃｈｅｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２００５，３７（１２）：７８９−７９６）。マウスのＭＩＮＩＯＮは、性交後日数３．５（ｄｐｃ）の胚盤胞から１７．５ｄｐｃの胚の受精卵母細胞、ならびに成体マウスの精巣および卵巣組織において検出されたが、マウス胚性幹細胞の自己再生および分化にとって必ずしも必要ではない。（Ｃｈｅｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、マウスのＭＩＮＩＯＮタンパク質の機能は未知である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、微小タンパク質ＭＩＮＩＯＮが、筋前駆細胞の融合および骨格筋の発生に必要であり、かつＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒの異種共発現が、非筋細胞においてさえ迅速かつ均質な細胞融合を誘導するのに十分であるという知見に少なくとも部分的に基づく。マウスＭＩＮＩＯＮのヒトオルソログは、以前に報告されていない。本明細書に記載のように、本発明者らは、ＭＩＮＩＯＮのヒトオルソログのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列を同定し、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質もまた、融合誘導性活性を有することを見出したが、このことは、細胞融合におけるＭＩＮＩＯＮタンパク質の進化的に保存された役割を示唆している。したがって、本明細書では、融合誘導性タンパク質ＭＩＮＩＯＮに関連する組成物、方法、および治療上の使用が提供される。
【０００６】
一態様では、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、９、１１、１３、１５、またはその変異体のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、１〜４個の変異を有する配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、１〜４個の変異を有する配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１からなるポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３からなるポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２または配列番号４を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２または配列番号４からなる核酸を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、タグと融合した配列番号１もしくは配列番号３またはその変異体を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。タグは、ＨＡ−タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ  配列番号３２）、Ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ  配列番号３３）、ＦＬＡＧ−タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ  配列番号３４）、Ｈｉｓ−タグ（ＨＨＨＨＨＨ  配列番号３５）、Ｅ−タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ  配列番号３６）、Ｖ５−タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ  配列番号３７）、ＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ  配列番号３８）、ポリグルタミン酸タグ（ＥＥＥＥＥＥ  配列番号３９）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ  配列番号４０）、ＳＢＰタグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ  配列番号４１）、Ｓｔｒｅｐ−タグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ  配列番号４２）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ  配列番号４３）、Ｓ−タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ  配列番号４４）、Ｓｏｆｔａｇ  １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ  配列番号４５）、Ｓｏｆｔａｇ  ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ  配列番号４６）、カルモジュリン−タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ  配列番号４７）、ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ  配列番号４８）、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ  配列番号４９）、ＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ  配列番号５０）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ  配列番号５１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグ、蛍光タンパク質−タグ（例えば、ＧＦＰタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、またはチオレドキシン−タグから選択することができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの発現を調節するプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、発現ベクターはまた、ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターはまた、選択マーカーを含む。
【００１０】
本明細書ではまた、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドまたはその変異体およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体の両方を発現するための発現ベクターが提供される。したがって、発現ベクターは、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドまたはその変異体をコードする第１の核酸、およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体をコードする第２の核酸を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第２の核酸は、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、配列番号１６を含むＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、配列番号１６からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、配列番号１７からなる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、第２の核酸の上流に配列内リボソーム進入部位または２Ａ配列を含む。例えば、発現ベクターは、配列番号５２〜６６のいずれか１つから選択される２Ａオリゴペプチドをコードする２Ａ配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、第２のプロモーター（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーター）を第２の核酸の上流に含み、第２の核酸の発現を調節する。
【００１３】
発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ＲＮＡ、またはウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、次のウイルス：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオウイルス、ポックスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、粘液腫ウイルス、またはマラバウイルスのいずれかをベースにしたウイルスベクターである。
【００１４】
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載の発現ベクターのいずれかを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を発現するための発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、ヒトＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）の両方を発現するための発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を発現するための発現ベクター、およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、ヒトＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）を発現するための第２の発現ベクターを含む。このような細胞は、宿主細胞または治療用細胞であり得る。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ヒト細胞、例えば、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、または腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、このような細胞は、検出可能なマーカーを発現する。
【００１５】
別の態様において、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、本明細書に記載のＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列からなるＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書では、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１もしくは３、またはその変異体を含むタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１もしくは３、またはその変異体を含むタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。
【００１７】
別の態様において、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含むリポソームが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むリポソームが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むリポソームが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、またはその変異体からなるポリペプチドを含むリポソームが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号３、またはその変異体からなるポリペプチドを含むリポソームが提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドも含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１６、またはその変異体からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームはさらに、治療薬を含み、治療薬は、リポソームに被包される。治療薬は、核酸、タンパク質、低分子化合物、またはペプチド核酸から選択され得る。
【００２０】
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載のリポソームのいずれかを用いて治療薬を細胞に送達する方法が提供される。いくつかの実施形態では、このような方法は、細胞を、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよび治療薬を含むリポソームと接触させる工程を含み、リポソームが細胞と融合し、それにより治療薬を細胞に送達する。本方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞または機能障害性細胞である。
【００２１】
別の態様において、本明細書では、第１の細胞を第２の細胞に融合する方法が提供される。このような方法は、次の工程：（ａ）ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現する第１の細胞をもたらす工程と；（ｂ）第１の細胞を、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現する第２の細胞と接触させる工程であって、第１の細胞が第２の細胞と融合する工程とを含み得る。本方法の工程（ｂ）は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【００２２】
また、第１の細胞を第２の細胞に融合する方法が提供され、これは、（ａ）ＭＩＮＩＯＮポリペプチド、および同型相互作用を媒介する受容体を発現する第１の細胞をもたらす工程と；（ｂ）第１の細胞を、第１の細胞によって発現されるものと同じ受容体を発現する第２の細胞と接触させる工程であって、第１の細胞が第２の細胞と融合する工程とを含む。本方法の工程（ｂ）は、インビトロまたはインビボで実施することができる。同型相互作用を媒介する受容体は、カドヘリン、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンから選択され得る。いくつかの実施形態では、同型相互作用を媒介する受容体は、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリンから選択されるカドヘリンである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第１および第２の細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、第１および第２の細胞は、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞、または腫瘍細胞から選択される。いくつかの実施形態では、第１の細胞は、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、または樹状細胞から選択され、第２の細胞は、腫瘍細胞または機能障害性細胞である。いくつかの実施形態では、第１の細胞は、検出可能なマーカーを発現する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１の細胞はさらに、目的の遺伝子を含み、細胞の融合により、目的の遺伝子を第２の細胞に送達する。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、第２の細胞の病理学的表現型を矯正する。いくつかの実施形態では、第２の細胞はさらに、目的の遺伝子を含み、細胞の融合により、目的の遺伝子を第１の細胞に送達する。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、第１の細胞の病理学的表現型を矯正する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子であり、病理学的表現型は、ミトコンドリアＤＮＡ欠乏；ミトコンドリア心筋症；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス性てんかん（ＭＥＲＲＦ）；ミトコンドリア心筋症、脳筋症、乳酸性アシドーシス、脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ）；カーンズ−セイアー症候群（ＫＳＳ）；リー症候群（亜急性壊死性脳筋症）および母性遺伝のリー症候群（ＭＩＬＳ）；ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス性てんかん（ＭＥＲＲＦ）；ニューロパチー、運動失調および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）；またはピアソン症候群から選択される。
【００２６】
さらなる態様において、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することによって、対象における癌を治療する方法が提供される。あるいは、本明細書では、癌の治療において使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供される。癌は、頭頸部癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、脳癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、リンパ腫、または白血病であり得る。いくつかの実施形態では、癌は、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、未分化多形肉腫、または滑膜肉腫から選択される肉腫である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内、経皮的、経粘膜的、経口的、鼻腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは腹腔内、または経肺投与を介して対象に投与され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、このような方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、このような方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与する工程を含む。同型相互作用を媒介する受容体は、カドヘリン、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンから選択され得る。いくつかの実施形態では、同型相互作用を媒介する受容体は、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリンから選択されるカドヘリンである。
【００２８】
腫瘍溶解性ウイルスは、次のウイルス：腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性アデノ随伴ウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性ポックスウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性コクサッキーウイルス、腫瘍溶解性エンテロウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、または腫瘍溶解性マラバウイルスのいずれかから選択され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を特異的に標的化する。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞において選択的に複製する。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、検出可能なマーカーを発現する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、上記方法のいずれかにおいて記載されるＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、上記方法のいずれかにおいて記載されるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体からなる。
【００３１】
いくつかの態様において、本明細書では、対象において癌を治療する方法であって、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の癌ワクチンを対象に投与する工程を含む方法が提供される。さらに本明細書では、対象において癌を治療する方法であって、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む有効量の癌ワクチンを対象に投与する工程を含む方法が提供される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、同型相互作用を媒介する受容体は、カドヘリン、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンから選択される。いくつかの実施形態では、同型相互作用を媒介する受容体は、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリンから選択されるカドヘリンである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、樹状細胞および腫瘍細胞に由来する樹状−腫瘍融合細胞を含む。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をシミュレートする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、１種以上の腫瘍関連抗原を提示する。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ経路を介して１種以上の腫瘍関連抗原を提示する。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、検出可能なマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、自己の樹状細胞である。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、同種の樹状細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、自己の腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、同種の腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、活性化樹状細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、免疫原性腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、癌幹細胞である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、腫瘍内、経皮的、経粘膜的、経口的、鼻腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは腹腔内、または経肺投与を介して対象に投与される。いくつかの実施形態では、癌は、頭頸部癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、脳癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、リンパ腫、または白血病から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、未分化多形肉腫、または滑膜肉腫から選択される肉腫である。
【００３５】
別の態様において、本明細書では、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、本明細書に記載の細胞を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示されるベクターを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に開示されるベクター、およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体をコードする第２の核酸を含む第２のベクターを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、または腫瘍細胞から選択される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋強直性筋ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（Ｏｃｕｌｏｐｈａｒｎｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＯＭＤ）、三好ミオパチー（ＭＭ）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、および遠位型ミオパチー（ＤＭ）からなる群から選択される。
【００３６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面および以下の明細書に記述されている。本発明の他の特徴、対象、および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】図１：ＭＩＮＩＯＮが、筋発生および筋再生中に高度に発現される骨格筋特異的微小タンパク質であることを示す。図１Ａは、再生している成体マウスの前脛骨（ＴＡ）筋、および分化しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＭＢ）における微小タンパク質発現のＲＮＡ−ｓｅｑの重複を示すベン図である。ＣＴＸ、心臓毒；ＦＣ：未損傷の筋肉（左下）または未分化の筋芽細胞（右下）と比較した倍率変化。図１Ｂは、ＣＴＸ損傷後に上方制御される選択された遺伝子に関する１００万のマッピングされたリード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）の倍率変化を示す折れ線グラフである。値を未損傷の筋肉に対して正規化した。倍率変化の平均±ＳＤ、各時点につきｎ＝３。図１Ｃは、対照の未損傷（Ｃｔｌ）およびＣＴＸ損傷した再生している成体ＴＡ筋におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）は、ローディングコントロールの役割を果たした。図１Ｄは、胚性筋肉試料におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。成体ＴＡ筋におけるＣＴＸ処理から４日後を陽性対照として使用し、一方で、生理食塩水（ＮＳ）注射を陰性対照として使用した。Ｅ、胎生期；Ｐ：出生後。ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールの役割を果たした。図１Ｅは、指定の日数に関して、分化条件（ＤＭ）下でのＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭＩＮＩＯＮ、ミオゲニン、またはミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。ＭＨＣ、ミオシン重鎖。チューブリンは、ローディングコントロールの役割を果たした。図１Ｆは、マウスＭＩＮＩＯＮタンパク質（ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、配列番号５）と、他の哺乳動物種の推定上のオルソログ、例えば、ラットＭＩＮＩＯＮ（ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、配列番号９）、ヒトＭＩＮＩＯＮ（ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）、配列番号１）、サルＭＩＮＩＯＮ（アカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）、配列番号１５）、ネコＭＩＮＩＯＮ（ネコ（Ｆ．ｃａｔｕｓ）、配列番号１１）、およびブタＭＩＮＩＯＮ（イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）、配列番号１３）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１−２】上記のとおり。
【図１−３】上記のとおり。
【図１−４】上記のとおり。
【図１−５】上記のとおり。
【図１−６】上記のとおり。
【図２−１】図２：ＭＩＮＩＯＮが、心筋ではなく再生している成体骨格筋において特異的に発現されることを示す。図２Ａは、未損傷（左）または再生している（右、ＣＴＸ注射後３〜４日）ＴＡ筋から調製した横断切片におけるＭＩＮＩＯＮの免疫蛍光染色を示す。ＤＡＰＩを使用して核を対比染色した。スケールバー：２０μｍ。図２Ｂは、様々な成体骨格筋群および心筋におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための、指定の抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを示す。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。Ｃｔｌ：未損傷のＴＡ筋；ＣＴＸ：ＣＴＸ注射後４日目の再生しているＴＡ筋；ＴＡ：前脛骨筋；Ｇａｓｔｒ：腓腹筋；Ｑｕａｄ：大腿四頭筋；Ｄｉａｐｈｒ：横隔膜。図２Ｃは、様々な成体組織におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための、指定の抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを示す。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。図２Ｄは、ＲＮＡ−ｓｅｑによって検出された胚発生中のマウスＭｉｎｉｏｎの発現を示す（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ）（Ｍｏｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  （ＤＭＤＤ）：ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｅｔｈａｌ  ｍｉｃｅ．Ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ＆  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ６，５６２−５６６，２０１３；Ｐｅｔｒｙｓｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓ  ｕｐｄａｔｅ−−ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２，Ｄ９２６−９３２，２０１４）。数値はＲＮＡ発現レベル（ＦＰＫＭ）を示す。図２Ｅは、Ｅ１４．５におけるインサイチューハイブリダイゼーションによって検出された非体節筋におけるマウスｍｙｏｄ１（左）およびＭｉｎｉｏｎ（右）の発現を示す（Ｅｕｒｅｘｐｒｅｓｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ／ｅｅ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）（Ｄｉｅｚ−Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，ｅ１０００５８２，２０１１）。矢印は外眼筋および顔面筋において重複している発現を示す。
【図２−２】上記のとおり。
【図２−３】上記のとおり。
【図２−４】上記のとおり。
【図２−５】上記のとおり。
【図３−１】図３：ＭＩＮＩＯＮが発生している筋細胞において高度に発現し、膜結合性であることを示す。図３Ａは、増殖（ＧＭ）条件または分化（ＤＭ）条件下のＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭＩＮＩＯＮのｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲによる定量化を示す棒グラフである。マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、陽性対照の役割を果たした。図３Ｂは、分化しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＤＭにける１、３、５日目）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための、指定の抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを示す。チューブリンは、ローディングコントロールの役割を果たした。図３Ｃは、増殖（ＧＭ）条件または分化条件（ＤＭ；３日目）下のＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための、示された抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを示す。Ｐａｘ７は未分化細胞において豊富な転写因子であり、一方、デスミンは分化した筋細胞において豊富な中間径フィラメントタンパク質である。チューブリンは、ローディングコントロールの役割を果たした。図３Ｄは、対照ベクターまたはＣ末端３×ＦＬＡＧ−１×ＨＡタグＭｉｎｉｏｎを発現する３日目の分化しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞由来の濃縮された細胞培養上清（Ｓｕｐ）の代表的なウェスタンブロット分析を示す。タグされたＭｉｎｉｏｎ（＊）および内在性Ｍｉｎｉｏｎ（＊＊）の両方が、全細胞抽出物（ＷＣＥ）において検出される。ＴＧＦβおよび切断されたＮ−カドヘリン（＋＋）は陽性対照であり、他方で、ＧａｐｄｈおよびインタクトなＮ−カドヘリン（＋）は非分泌陰性対照である。ｎ＝３。図３Ｅは、ＭＩＮＩＯＮの細胞内位置を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。ウェスタンブロット分析は、指定の抗体を用いて実施された。４種の画分が試験された：Ｃｙｔｏ．、細胞質ゾル；Ｍｅｍ．、膜；Ｎｕｃ．、核；Ｃｙｔｏｓｋ．、細胞骨格。膜画分は、原形質膜およびＥＲ、ゴルジ体、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソームなどの細胞内膜の両方を含有する。ＧＡＰＤＨ：細胞質ゾル画分マーカー；Ｎ−カドヘリン：原形質膜マーカー；カルネキシン：ＥＲ膜マーカー；ヒストンＨ２Ｂ：核画分マーカー；ビメンチン：細胞骨格画分マーカー。
【図３−２】上記のとおり。
【図３−３】上記のとおり。
【図３−４】上記のとおり。
【図３−５】上記のとおり。
【図４−１】図４：ＭＩＮＩＯＮプロモーター構造が、筋調節因子ＭｙｏＤおよびミオゲニンによる調節と一致することを示す。図４Ａは、マウスｇｍ７３２５／ＭＩＮＩＯＮ遺伝子（配列番号９６）およびそのヒトオルソログＲＰ１−３０２Ｇ２．５（配列番号９７）周辺のゲノム領域の配列アラインメントを示す。ＭＩＮＩＯＮのＯＲＦが黒で強調されている。プロモーターおよび５’ＵＴＲ領域内の７つの保存されたＥボックスモチーフ（ＣＡＮＮＴＧおよびＣＡＮＮＴＴ）が灰色で強調されている。図４Ｂは、ＭＩＮＩＯＮゲノム遺伝子座周辺において増殖条件（ＧＭ）および３つの時点の分化条件（ＤＭ）下で試験されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞からのＭｙｏＤおよびミオゲニンＣｈＩＰ−ｓｅｑのＥＮＣＯＤＥデータを示す。黒色の棒は、図４Ａにおけるプロモーター領域内の最初の４つの保存されたＥボックスモチーフを示す。
【図４−２】上記のとおり。
【図５−１】図５：ＭＩＮＩＯＮ微小タンパク質が骨格筋発生に必要であることを示す。図５Ａは、二重ｓｇＲＮＡ法を用いたＭＩＮＩＯＮ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の変異誘発のための戦略を示す図である。灰色のボックス、ＭＩＮＩＯＮのＯＲＦ；白色のボックス、非コードエクソン；ｓｇＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ；ＦｗｄおよびＲｅｖ、フォワードおよびリバースジェノタイピングプライマー。図５Ｂは、ＭＩＮＩＯＮの野生型（＋／＋）および図５Ａに示される１３５ｂｐ欠失を保有するヘテロ接合型（Δ／＋）マウスの代表的なジェノタイピングＰＣＲ結果を示す。図５Ｃは、野生型（ＷＴ）アレル（配列番号９８）および１３５ｂｐの欠失を保有するノックアウト（ＫＯ）アレル（配列番号９９）からの代表的な配列トレースを示す。黒色の線は、欠失区間の５’境界を示す。図５Ｄは、皮をはがれたＭＩＮＩＯＮ＋／＋およびＭＩＮＩＯＮΔ／ΔＰ０マウスの写真のセットである。矢印およびアスタリスクは、それぞれ前肢および肋間筋系を示す。スケールバー：１ｍｍ。図５Ｅは、胚性舌骨格筋の組織学的分析および免疫蛍光分析を示す。上段：舌の矢状切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。挿入図は、示された切片の領域および向きを示す。下段：筋マーカーであるＭＨＣに対する免疫蛍光染色およびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による対比染色。スケールバー：１００μｍ。図５Ｆは、筋マーカーであるデスミンを染色し、ＤＡＰＩで対比染色した横隔膜筋の矢状切片の免疫蛍光画像のセットである。スケールバー：２００μｍ。図５Ｇは、室内気に１時間暴露した後のＥ１８．５マウス胚を用いる肺浮遊試験の定量化（棒グラフ、左）および代表的な画像（右）を示す。
【図５−２】上記のとおり。
【図５−３】上記のとおり。
【図５−４】上記のとおり。
【図５−５】上記のとおり。
【図５−６】上記のとおり。
【図５−７】上記のとおり。
【図６−１】図６：ＭＩＮＩＯＮ欠損ノックアウトマウスの周産期致死性を示す。図６Ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるゲノム編集によるＭＩＮＩＯＮ欠損動物の生成のための戦略を示す図である。ＭＩＮＩＯＮのＯＲＦ（暗灰色）内の（明灰色で印を付けられた）１３５ｂｐのインフレーム欠失を、二重ｓｇＲＮＡ法を用いて誘導した。ｇＲＮＡのゲノム上の標的配列を直線で示す。Ｆｗｄ：フォワードＰＣＲジェノタイピングプライマー；Ｒｅｖ：リバースＰＣＲジェノタイピングプライマー。図６Ａは、掲載の順にそれぞれ配列番号１００〜１０１を開示する。図６Ｂは、８４ＡＡの全長マウスＭＩＮＩＯＮ（配列番号１０２）および予測される３９ＡＡのトランケートされた形態（ＭＩＮＩＯＮΔ）（配列番号１０３）のタンパク質配列アラインメントを示す。トランケートされた形態は、本来の微小タンパク質のＮ末端の２６アミノ酸およびＣ末端の１２アミノ酸のみを含有すると予測される。図６Ｃは、ＭＩＮＩＯＮΔ／＋×ＭＩＮＩＯＮΔ／＋交雑（ヘテロ×ヘテロ）に由来するＥ１８．５胚の典型的なジェノタイピングＰＣＲ結果の代表的なアガロースゲル画像を示す。＋／＋：野生型（ＭＩＮＩＯＮ＋／＋）；Δ／＋：ヘテロ接合体（ＭＩＮＩＯＮΔ／＋）；Δ／Δ：ＭＩＮＩＯＮノックアウトホモ接合体（ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ）。図６Ｄは、ＭＩＮＩＯＮΔ／＋×ＭＩＮＩＯＮΔ／＋交雑に由来する後期胚および成体マウスの両方のジェノタイピングをまとめている表である。
【図６−２】上記のとおり。
【図６−３】上記のとおり。
【図６−４】上記のとおり。
【図７−１】図７：ＭＩＮＩＯＮ欠損動物におけるＭＩＮＩＯＮタンパク質発現の消失を示す。図７Ａは、指定の遺伝子型を有するＥ１６．５／Ｅ１７．５胚およびＰ０マウス由来の肢および舌におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。心臓毒注射（ＣＴＸ  ４ｄｐｉ）後４日目の成体ＴＡ筋を陽性対照として使用した。同じリター由来の胚を各々についての比較のために使用した。全長ＭＩＮＩＯＮは、ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚においては観察されず、予測される３９ＡＡのトランケートされたタンパク質も、同じ抗ＭＩＮＩＯＮ抗体を用いて観察されなかった。図７Ｂは、同じリターのＭＩＮＩＯＮ＋／＋およびＭＩＮＩＯＮΔ／＋Ｅ１８．５胚由来の前肢におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための、指定の抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを示す。
【図７−２】上記のとおり。
【図８−１】図８：ＭＩＮＩＯＮ欠損動物における発生異常を示す。図８Ａは、ＭＩＮＩＯＮΔ／＋およびＭＩＮＩＯＮΔ／ΔＥ１６胚の写真である。矢印は、脊椎の癒着および項部皮下の浮腫を示す。スケールバー：１ｍｍ。図８Ｂは、皮をはがれていない（上段）かまたは皮をはがれた（下段）ＭＩＮＩＯＮ＋／＋（左）およびＭＩＮＩＯＮΔ／Δ（右）Ｅ１７．５の写真のセットである。矢印は、予想される前肢筋系の位置を示す。スケールバー：１ｍｍ。図８Ｃは、帝王切開による出産後の空気呼吸後における指定の遺伝子型のＥ１８．５胚の写真のセットである。ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚はアトニー性であり、異常な脊柱弯曲を呈し、チアノーゼになり出産後すぐに死亡した。図８Ｄは、帝王切開による出産後のＥ１８．５胚の体重の定量化を示す棒グラフである。二重アスタリスク：ｐ＜０．００１；ｎｓ＝有意ではない。
【図８−２】上記のとおり。
【図８−３】上記のとおり。
【図８−４】上記のとおり。
【図９−１】図９：ＭＩＮＩＯＮ欠損が骨格筋形成の後期に影響を及ぼし、筋群のサイズの縮小をもたらすことを示す。図９Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色された、指定の遺伝子型を有するＥ１４．５胚の前肢横断切片の組織学的画像のセットである。筋群の数、位置またはサイズに関して各遺伝子型間で著しい相違は観察されなかった。スケールバー：１００μｍ。図９Ｂは、Ｈ＆Ｅにより染色された指定の遺伝子型のＥ１６．５前肢横断切片の組織学的画像のセットである。挿入図は、点線で印を付けた領域の拡大図を示す。メインパネルのスケールバー：１００μｍ；挿入図のスケールバー：１０μｍ。図９Ｃは、Ｈ＆Ｅにより染色された、指定の遺伝子型を有するＥ１９．５胚由来の前肢横断切片の組織学的画像のセットである。挿入図は、点線で印を付けた領域の拡大図を示す。メインパネルのスケールバー：１００μｍ；挿入図のスケールバー：１０μｍ。図９Ｄは、指定の遺伝子型を有するＥ１９．５胚由来の前肢横断切片のデスミン免疫蛍光画像のセットである。挿入図は、点線で印を付けた領域の拡大図を示す。デスミンは、胚における分化中の全ての筋芽細胞ならびに筋管および筋線維を標識する。核はＤＡＰＩにより標識された。メインパネルのスケールバー：１００μｍ；挿入図のスケールバー：１０μｍ。
【図９−２】上記のとおり。
【図９−３】上記のとおり。
【図９−４】上記のとおり。
【図１０−１】図１０：ＭＩＮＩＯＮ欠損が、肢および肋間の骨格筋形成の欠陥を引き起こすことを示す。図１０Ａは、Ｈ＆Ｅにより染色された指定の遺伝子型のＥ１９．５前肢縦断切片の組織学的画像のセットである。スケールバー：１００μｍ。図１０Ｂは、指定の遺伝子型を有するＥ１９．５胚についての前肢縦断切片におけるＭＨＣ発現を示す免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより染色された。スケールバー：１００μｍ。図１０Ｃは、指定の遺伝子型を有するＥ１９．５胚由来の肋間筋の矢状切片におけるデスミン発現を示す免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。
【図１０−２】上記のとおり。
【図１０−３】上記のとおり。
【図１１−１】図１１は、ＭＩＮＩＯＮの消失は、インビボにおいて骨格筋前駆細胞の分化に影響を及ぼさないが、多核線維の形成を阻止することを示す。図１１Ａは、指定の遺伝子型のＥ１６．５舌横断切片の舌切片のデスミン免疫蛍光画像のセットである。左の組織学的画像の黒色のボックスは、右の蛍光画像で示される領域を示す。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：２００μｍ。図１１Ｂは、指定の遺伝子型のＥ１９．５舌横断切片のデスミン免疫蛍光画像のセットである。左の組織学的画像の黒色のボックスは、右の蛍光画像で示される領域を示す。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：２００μｍ。図１１Ｃは、図１１Ｂに示される白色のボックスの領域の拡大図である。Ｅ１９．５  ＭＩＮＩＯＮΔ／Δの舌は、長い筋管の大幅な縮小を呈した。スケールバー：２００μｍ。
【図１１−２】上記のとおり。
【図１１−３】上記のとおり。
【図１２−１】図１２：ＭＩＮＩＯＮが筋前駆細胞の融合に関して特に必要であることを示す。図１２Ａは、分化培地中で３日後のＥ１８．５  ＭＩＮＩＯＮ＋／＋、ＭＩＮＩＯＮΔ／＋およびＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚から単離された初代胚性筋芽細胞のデスミン免疫蛍光画像のセットである。白色の矢じり：筋管；白色の矢印：伸長している筋芽細胞。図１２Ｂは、デスミン＋細胞における全ての核のうちデスミン＋筋管（３個以上の核）における核の％として算出された、図１２Ａにおける筋芽細胞の融合指数を示す棒グラフである。アスタリスク：Ｐ＜０．０５。図１２Ｃは、対照のルシフェラーゼを標的化するｓｈＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）とともにレンチウイルスで感染したか、またはＭＩＮＩＯＮの３’ＵＴＲを標的化する２つのｓｈＲＮＡを連続的にレンチウイルスで感染し（ＭＩＮＩＯＮＫＤ）、かつ増殖培地（ＧＭ）または分化培地（ＤＭ）において指定の日数培養したＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭＩＮＩＯＮ、ミオゲニンおよびＭＨＣの発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。チューブリンを、ローディングコントロールとして使用した。図１２Ｄは、分化培地で５日後の対照（Ｃｔｒｌ）およびＭＩＮＩＯＮＫＤ筋線維のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。図１２Ｅは、全ての核のうちのＭＨＣ＋細胞の核の％として算出された、図１２Ｄの分化指数を示す棒グラフである。ＮＳ＝有意ではない。図１２Ｆは、ＩＸＭイメージングによって撮影された２０倍の各画像内の全ての核の数と比較して、２個以上の核を有したＭＨＣ＋筋管内に含有された核の割合として算出された、図１２Ｄの融合指数を示す棒グラフである。二重アスタリスク：ｐ＜０．００１。図１２Ｇは、図１２Ｄに関する筋管毎の核の定量化を示す棒グラフである。筋管を、指定の総核数によってサブグループにビニングした。図１２Ｈは、分化培地において５日後、対照タンパク質（ＮａｎｏＬｕｃ）またはヒトＭｉｎｉｏｎオルソログのいずれかを発現するＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。
【図１２−２】上記のとおり。
【図１２−３】上記のとおり。
【図１２−４】上記のとおり。
【図１２−５】上記のとおり。
【図１２−６】上記のとおり。
【図１２−７】上記のとおり。
【図１２−８】上記のとおり。
【図１３】ＭＩＮＩＯＮの遺伝的消失がインビトロでの胚性筋芽細胞の融合を阻止することを示す、分化培地において３日後の指定の遺伝子型のＥ１７．５初代胚性筋芽細胞のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。
【図１４−１】図１４：マウスＭＩＮＩＯＮを標的化するレンチウイルスのｓｈＲＮＡコンストラクトの作製および検証を示す。図１４Ａは、下線の４つのｓｈＲＮＡコンストラクトの標的領域を有するマウスＭＩＮＩＯＮのゲノム遺伝子座を示す概略図である。黒塗りの棒はＭＩＮＩＯＮのＯＲＦを示し、白色の棒は非翻訳領域（ＵＴＲ）を示した。Ｃ１およびＣ２：コード配列を標的化するｓｈＲＮＡコンストラクト；Ｕ１およびＵ２：３’ＵＴＲを標的化するｓｈＲＮＡコンストラクト。図１４Ｂは、指定のレンチウイルスのｓｈＲＮＡコンストラクトで形質導入されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭＩＮＩＯＮ発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡコンストラクトを、陽性対照（Ｃｔｒｌ）として使用した。レンチウイルスの感染およびＧＦＰの局在化後、細胞を増殖させ、分化培地に５日間保持した。ＭＩＮＩＯＮの３’ＵＴＲを標的化する２つのｓｈＲＮＡコンストラクト（Ｕ１／Ｕ２）は、最も効率的にＭＩＮＩＯＮ発現を減少させることが見出された。図１４Ｃは、指定の日数増殖培地（ＧＭ）または分化培地（ＤＭ）のいずれかで培養された対照（Ｃｔｒｌ）またはＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞におけるＭｙｏＤ１およびデスミン発現を検出するための、指定の抗体を用いる代表的なウェスタンブロットを示す。
【図１４−２】上記のとおり。
【図１４−３】上記のとおり。
【図１５−１】図１５：初代筋芽細胞におけるＭＩＮＩＯＮのノックダウンが、筋芽細胞の融合および多核筋管の形成を阻止することを示す。図１５Ａは、分化培地で４日後に形成される、対照（Ｃｔｒｌ）およびＭＩＮＩＯＮＫＤ初代筋芽細胞由来の筋線維のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。図１５Ｂは、各領域における全ての核のうちのＭＨＣ＋細胞内の核の割合として算出される、図１５Ａに関する分化指数の定量化を示す棒グラフである。ｎｓ＝有意ではない。図１５Ｃは、各領域における全ての核のうちの２個以上の核を含有するＭＨＣ＋筋管内の核の割合として算出される、図１５Ａに関する融合指数の定量化を示す棒グラフである。二重アスタリスク：ｐ＜０．００１。図１５Ｄは、図１５Ａにおいてなされた実験に関する筋管の数の割合の定量化を示す棒グラフである。筋管を、示されるとおりの核の数によってビニングし、各サブグループ内の筋管の割合を算出した。
【図１５−２】上記のとおり。
【図１５−３】上記のとおり。
【図１５−４】上記のとおり。
【図１６−１】図１６：マウスＭＩＮＩＯＮまたはそのヒトオルソログの外因性の発現によって、ＭＩＮＩＯＮＫＤ筋芽細胞の融合欠損がレスキューされることを示す。図１６Ａおよび１６Ｂは、タグがないまたはＣ末端タグされたＭＩＮＩＯＮのレトロウイルスによる発現および分化培地での５日間の培養後のＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞においてＭＩＮＩＯＮの発現を検出するための代表的なウェスタンブロットである。全長マウスＭＩＮＩＯＮのＣＤＳ（コード配列）、Ｃ末端３×ＦＬＡＧ−１×ＨＡタグされたマウスＭＩＮＩＯＮのＣＤＳおよびＣ末端３×ＦＬＡＧ−１×ＨＡタグされたヒトＭＩＮＩＯＮオルソログのＣＤＳを保有するレトロウイルスベクターを再構成のために使用した。Ｃ末端１×ＦＬＡＧタグされたＮａｎｏｌｕｃレトロウイルスベクターを陰性対照として使用した。抗ＦＬＡＧ抗体は、３つのタグされたタンパク質を正しいサイズで認識するが（図１６Ａ）、抗ＭＩＮＩＯＮ抗体は、マウスＭＩＮＩＯＮタンパク質（タグありおよびタグなし）を認識するだけでなく、ヒトＭＩＮＩＯＮオルソログもまたわずかに認識する（図１６Ｂ）。注記：タグされたヒトおよびマウスＭＩＮＩＯＮのＣＤＳを保有するｐＣＩＧＡＲゲートウェイレトロウイルスベクターは、本来の開始コドンの５’末端にインフレームで追加の開始コドンを遺伝的に持っており、これによりわずかに大きなサイズの追加のバンド（アスタリスク）が生じる。図１６Ｃは、分化培地で５日後のタグされたＮａｎｏＬｕｃ、タグのないマウスＭＩＮＩＯＮ、タグされたマウスＭＩＮＩＯＮおよびタグされたヒトＭＩＮＩＯＮオルソログの外因性の発現を有するＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。
【図１６−２】上記のとおり。
【図１６−３】上記のとおり。
【図１７−１】図１７：マウスおよびヒトＭＩＮＩＯＮ転写物はｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）として機能しないことを示す。図１７Ａは、インタクトなマウス／ヒトＭＩＮＩＯＮのＣＤＳ、または開始コドン内で１ｂｐのフレームシフト（ＦＳ）変異を有するそれらのいずれかを含有する４つのレトロウイルスベクターを示す概略図である。これらの一塩基対変異は、ＲＮＡ配列を大幅に変えることなく全長マウス／ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質の発現を阻害すると予測される。図１７Ｂは、図１７Ａに示されるコンストラクトの外因性の発現を有し、かつ分化培地で５日後のＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。
【図１７−２】上記のとおり。
【図１８】空ベクター（陰性対照）、ＮａｎｏＬｕｃ（陰性対照）、全長マウスＭＩＮＩＯＮ、またはトランケートされた３９ＡＡのＭＩＮＩＯＮ変異体（１３５ｂｐのインフレーム欠失を含有するＭＩＮＩＯＮΔノックアウトアレルから予測される）のいずれかをコードするレトロウイルスのコンストラクトで形質導入されたＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットであり、これは、ＭＩＮＩＯＮΔノックアウトアレルから予測されるＭＩＮＩＯＮΔのトランケーション変異体が、ＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞で観察される融合欠損をレスキューしないことを示す。細胞は分化培地で５日間培養された。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。
【図１９−１】図１９：非筋原性の細胞−細胞融合の２つのモデルにおいてＭＩＮＩＯＮが検出不能であることを示す。図１９Ａは、ＭＩＮＩＯＮが、ＭＩＮＩＯＮΔ／＋およびＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚由来の胎盤ならびに胎盤周囲組織において検出不能であることを示す代表的なウェスタンブロットである。生理食塩水注射（ＮＳ；４日目）および心臓毒注射（ＣＴＸ；４日目）を伴うＴＡ筋を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。図１９Ｂは、マクロファージ系統Ｒａｗ２６４．７における可溶性ＲＡＮＫＬリガンド誘導性の細胞−細胞融合および破骨細胞形成においてＭＩＮＩＯＮが検出不能であることを示す代表的なウェスタンブロットである。増殖培地（ＧＭ）または５日間の分化培地（ＤＭ）のいずれかで培養されたＣ２Ｃ１２細胞を、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。
【図１９−２】上記のとおり。
【図２０】抗ヒトＭｙｏｍａｋｅｒ抗体が内在性マウスＭｙｏｍａｋｅｒを認識することを示す代表的なウェスタンブロットである。増殖条件（ＧＭ）、または３日間の分化条件（ＤＭ）のいずれかのもとで培養されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭｙｏｍａｋｅｒの発現；および未損傷または心臓毒で損傷されて再生している様々な時点（２日目、４日目、１０日目）でのＴＡ筋（ＣＴＸ）のＭｙｏｍａｋｅｒの発現を調べた。
【図２１−１】図２１：ＭＩＮＩＯＮとＭｙｏｍａｋｅｒの共発現が異種系において細胞融合を誘導するのに十分であることを示す。図２１Ａは、ＧＭ中の野生型Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞、または分化条件（ＤＭ）下で３日間培養された対照（Ｃｔｒｌ）もしくはＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＭｙｏｍａｋｅｒの発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。図２１Ｂは、分化培地で５日後の、ルシフェラーゼ（Ｃｔｒｌ）、ＭＩＮＩＯＮ、またはＭｙｏｍａｋｅｒを発現する対照（Ｃｔｒｌ）およびＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２筋芽細胞のＭＨＣ免疫蛍光画像のセットである。核はＤＡＰＩにより対比染色された。スケールバー：１００μｍ。図２１Ｃは、図２１Ｂに示される細胞株におけるＭｙｏｍａｋｅｒおよびＭＩＮＩＯＮの発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。図２１Ｄは、ルシフェラーゼ（Ｃｔｒｌ）、ＭｙｏｍａｋｅｒまたはＭＩＮＩＯＮを発現する１０Ｔ１／２線維芽細胞におけるＭｙｏｍａｋｅｒおよびＭＩＮＩＯＮの発現を検出するための代表的なウェスタンブロットを示す。図２１Ｅは、示されるとおりの様々な組合わせのタンパク質を発現する線維芽細胞におけるＧＦＰ＋融合細胞（４個以上の核を含有するものとして定義される）の定量化を示す棒グラフである。融合細胞の形成は、播種後２４時間でスコア化された。図２１Ｆは、特異的に標識された１０Ｔ１／２線維芽細胞を用いる細胞混合実験からの蛍光画像のセットである。細胞に、ＭＩＮＩＯＮ、Ｍｙｏｍａｋｅｒ、または対照の指定の組合わせ（簡単にするために、標識は省略される）をコードするレトロウイルスを連続的に感染させた。標識のためにＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＶｉｏｌｅｔおよびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ色素を使用した。矢じりは、Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ＋細胞およびＶｉｏｌｅｔ＋核の両方を含有する融合細胞を示す。矢印は、Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ＋細胞のみに由来する融合細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。図２１Ｇは、１個以上のＶｉｏｌｅｔ＋核を含有するＤｅｅｐ  Ｒｅｄ＋融合細胞（４個以上の核）の％として測定される、図２１Ｆ（下段のパネル）における融合の定量化を示す棒グラフである。
【図２１−２】上記のとおり。
【図２１−３】上記のとおり。
【図２１−４】上記のとおり。
【図２１−５】上記のとおり。
【図２１−６】上記のとおり。
【図２１−７】上記のとおり。
【図２２】示されるとおりのルシフェラーゼ、Ｍｙｏｍａｋｅｒ、またはＭＩＮＩＯＮをコードするレトロウイルスベクターに感染した１０Ｔ１／２線維芽細胞の免疫蛍光画像のセットであり、これは、ＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒを合わせると１０Ｔ１／２線維芽細胞における多核融合細胞の形成を誘導するのに十分であることを示す。全てのレトロウイルスベクターは、目的の遺伝子の下流にＩＲＥＳ−ＧＦＰを含有し、これにより感染細胞がＧＦＰを均一に発現する。ＧＦＰおよびＤＮＡに関するスプリットチャネルによるグレースケール画像が含まれる。データの定量化は図２１Ｅに示された。融合指数は、４個以上の核を含有するＧＦＰ陽性融合細胞内で見出される核の割合として算出された。スケールバー：１００μｍ。
【図２３−１】図２３：図２１Ｆにおいて示される細胞混合実験のスプリットチャネルによる蛍光画像のセットであり、これは、ＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒが線維芽細胞において細胞−細胞融合を誘導するのに十分であり、ＭＩＮＩＯＮは融合対の片側にのみ必要であることを示す。蛍光画像は、指定の組合わせのタンパク質を発現し、かつＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＶｉｏｌｅｔおよびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ色素の両方で標識した線維芽細胞を使用する細胞混合実験から示される。１０Ｔ１／２線維芽細胞に、ＭＩＮＩＯＮ、ｍｙｏｍａｋｅｒまたは対照ベクターのいずれか（簡単にするために、標識については省略される）をコードするレトロウイルスを連続的に感染させた。全てのベクターは、目的の遺伝子の下流にＩＲＥＳ−ＧＦＰを含有し、これにより感染細胞がＧＦＰを発現する。関連した細胞の色および発現されるタンパク質が上の各画像で示される。矢じりは、Ｍｙｏｍａｋｅｒのみ発現するか、またはＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒを合わせて発現する第２の細胞型由来のＶｉｏｌｅｔ＋核も含有するＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒを共発現するＤｅｅｐ  Ｒｅｄ＋細胞に由来する融合細胞を示す。矢印は、ＭＩＮＩＯＮのみ発現する第２の細胞型由来のＶｉｏｌｅｔ＋核を含有しないＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒを共発現するＤｅｅｐ  Ｒｅｄ＋細胞に由来する融合細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図２３−２】上記のとおり。
【図２３−３】上記のとおり。
【図２３−４】上記のとおり。
【図２３−５】上記のとおり。
【図２４−１】図２４：図２４Ａ−２４Ｂは、ＣｔｒｌおよびＭｉｎｉｏｎＫＤ筋芽細胞の同定およびソーティングのためのゲーティング戦略を示す。
【図２４−２】上記のとおり。
【図２５−１】図２５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集による第２のＭｉｎｉｏｎノックアウトアレルの作製を示す。図２５Ａは、２つの異なるｓｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ３（配列番号１０４）およびｇＲＮＡ４（配列番号１０５））を用いる二重ｓｇＲＮＡ法を用いるｇｍ７３２５／Ｍｉｎｉｏｎ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９変異誘発のための戦略を示す。灰色のボックス、ＭＩＮＩＯＮのＯＲＦ；白色のボックス、非コードエクソン；ｇＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ；明灰色のボックス、１５５ｂｐ欠失後の新たなコード領域；Ｆｗｄ−２（配列番号１０６）およびＲｅｖ−２（配列番号１０７）、１５５ｂｐ欠失を検出するためのフォワードおよびリバースジェノタイピングプライマー。図２５Ｂは、ＭｉｎｉｏｎΔ／＋×ＭｉｎｉｏｎΔ／＋交雑由来のＥ１６．５〜Ｅ１８．５胚を用いた典型的なジェノタイピングＰＣＲ結果の代表的なアガロースゲル写真である。＋／＋：野生型（Ｍｉｎｉｏｎ＋／＋）；Δ／＋：ヘテロ接合体（ＭｉｎｉｏｎΔ／＋）；Δ／Δ：Ｍｉｎｉｏｎノックアウトホモ接合体（ＭｉｎｉｏｎΔ／Δ）。ｎ＝５（合計で２６個のＥ１６．５〜Ｅ１８．５胚）。図２５Ｃは、皮をはがれていないＭｉｎｉｏｎΔ／＋およびＭｉｎｉｏｎΔ／ΔＥ１８．５胚の代表的な写真を示す。ｎ＝３。スケールバー：１ｍｍ。図２５Ｄは、８４ａａの全長マウスＭｉｎｉｏｎ（Ｍｉｎｉｏｎ−ＦＬ）（配列番号１０２）および予測される７４アミノ酸のトランケートされた形態（Ｍｉｎｉｏｎ−１５５ＫＯ）（配列番号１０８）のタンパク質配列アラインメントを示す。トランケートされた形態は、本来のタンパク質のＮ末端の１８アミノ酸（太字）のみを含有すると予測される。図２５Ｅは、ＭｉｎｉｏｎΔ／＋×ＭｉｎｉｏｎΔ／＋交雑由来の後期胚（Ｅ１６．５〜Ｅ１８．５）および成体マウスの両方のジェノタイピング結果の要約を示す。
【図２５−２】上記のとおり。
【図２５−３】上記のとおり。
【図２５−４】上記のとおり。
【図２５−５】上記のとおり。
【図２６−１】図２６：Ｍｉｎｉｏｎの欠損が非体節の骨格筋形成を阻止することを示す。図２６Ａは、指定の遺伝子型を有するＥ１８．５胚の矢状切片由来の非体節の顔面筋系の代表的な免疫蛍光画像を示す。デスミン染色が示される。左の組織学的画像の黒色のボックスは、右の蛍光画像で示される領域を示す。図２６Ｂは、指定の遺伝子型を有するＥ１９．５胚由来の横断切片の非体節の顎および顔面筋系の代表的な免疫蛍光画像を示す。ＭＨＣおよびＤＡＰＩ染色が示される。２つのリターの胚が試験され、各遺伝子型の同じリターの中の１〜２胚が実験の繰り返し毎に比較された。スケールバー、Ｈ＆Ｅ画像については１ｍｍ、および免疫蛍光画像については５００μｍ。
【図２６−２】上記のとおり。
【図２７−１】図２７：Ｍｉｎｉｏｎが、分化している筋芽細胞および発生期の筋管において発現されることを示す。図２７Ａは、ＤＭ中で３．５日後のＣｔｒｌならびにＭｉｎｉｏｎＫＤＣ２Ｃ１２筋芽細胞および筋管の代表的な免疫蛍光画像を示す。左：Ｍｉｎｉｏｎ、ＭＨＣおよびＤＡＰＩが示される；中央：Ｍｉｎｉｏｎのみのグレースケール画像；右：対照ＩｇＧについてのグレースケール画像。白色の点線によって印を付けた挿入図は、図２７Ｂにおいて拡大される。ｎ＝２。図２７Ｂは、図２７Ａの挿入図の拡大画像を示す。白色の矢じりは、融合した多核筋管を示し、黄色の矢印は、融合していない分化し、伸長している筋芽細胞を示し、これらの両方がＭｉｎｉｏｎタンパク質を発現する。図２７Ｃは、ＣＴＸ注射後３日の再生している成体（１０週齢）ＴＡ筋の縦断切片の代表的な免疫蛍光染色を示す。左：Ｍｉｎｉｏｎ、ラミニンおよびＤＡＰＩ；中央：Ｍｉｎｉｏｎのみ（グレースケール）；右：ＤＡＰＩ（グレースケール）。白色の矢じりは、発生期の筋管を示し、黄色の矢印は、融合していない分化し、伸長している筋芽細胞を示し、これらの両方がＭｉｎｉｏｎタンパク質を発現する。ｎ＝３。スケールバー：（図２７Ａ〜２７Ｂ）１００μｍおよび（図２７Ｃ）３０μｍ。
【図２７−２】上記のとおり。
【図２７−３】上記のとおり。
【図２８−１】図２８：ＭｉｎｉｏｎがＭｙｏｍａｋｅｒ媒介性の融合に必要であることを示す。図２８Ａは、分化培地で３日後の１０Ｔ１／２線維芽細胞と野生型Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（１：２比）の間での細胞混合の代表的な免疫蛍光画像を示す。分化している筋芽細胞および筋管がＭＨＣによって標識される。１０Ｔ１／２線維芽細胞に、ＧＦＰおよび目的のタンパク質（左、ＮａｎｏＬｕｃ対照；中央、マウスＭｙｏｍａｋｅｒ；右、マウスＭｉｎｉｏｎ）を発現するレトロウイルスを感染させた。ＤＡＰＩは核を標識する。Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する線維芽細胞は、野生型の分化している筋芽細胞および筋管と融合して、大型で厚い筋管（白色の矢じり）になったが、Ｍｉｎｉｏｎを発現する線維芽細胞はそのようにならなかった。白色の矢印は線維芽細胞に融合しないＭＨＣ陽性の筋管を示す。ｎ＝２（それぞれ８回の技術的反復）。０．７ｍｍ×０．７ｍｍの領域が示される。図２８Ｂは、ＤＭで３日後のＭｙｏｍａｋｅｒを発現する１０Ｔ１／２線維芽細胞とＣ２Ｃ１２筋芽細胞の間での細胞混合の代表的な免疫蛍光画像を示す。０．７ｍｍ×０．７ｍｍの領域が２０倍の倍率で示される。対照およびＭｉｎｉｏｎＫＤ筋芽細胞が使用された。分化している筋芽細胞および筋管がＭＨＣによって標識される。Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する１０Ｔ１／２線維芽細胞が、混合前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識された。Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する線維芽細胞は分化している対照の筋芽細胞（白色の矢じり）と融合したが、ＭｉｎｉｏｎＫＤ筋芽細胞には融合しなかった。ｎ＝２（それぞれ８回の技術的反復）。
【図２８−２】上記のとおり。
【図２９−１】図２９：Ｍｉｎｉｏｎと相互作用するタンパク質の同定に関する結果を示す。図２９Ａは、Ｍｉｎｉｏｎと結合するタンパク質は、ＦＬＡＧタグされたＭｉｎｉｏｎを発現する３．５日目の分化しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞（表５を参照のこと）からアフィニティー精製−ＭＳ分析により同定され、Ｐａｎｔｈｅｒ（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＡＮＴＨＥＲ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１：ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ，  ａｎｄ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５，Ｄ１８３−Ｄ１８９，２０１７）を用いてタンパク質クラスに分けられた。各クラスにおいて有意に濃縮されたタンパク質の数が示される。ｎ＝３。図２９Ｂは、ヒットした実例の代表的なウェスタンブロットによる確認を示す。ＭｉｎｉｏｎおよびＧａｐｄｈは、それぞれ陽性対照および陰性対照としての役割を果たした。
【図２９−２】上記のとおり。
【図３０−１】図３０：ＭｉｎｉｏｎおよびＭｙｏｍａｋｅｒ誘導性の融合には、細胞骨格の再構築が必要であることを示す。図３０Ａは、ＭｉｎｉｏｎおよびＭｙｏｍａｋｅｒを共過剰発現する１０Ｔ１／２線維芽細胞の代表的な蛍光画像を示す。Ｆ−アクチン（Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン）およびＤＡＰＩ染色が示される。白色の矢じりは、多核細胞の境界を指す。ｎ＝２（それぞれ６回の技術的反復、それぞれ５つの領域）。図３０Ｂは、ＭｉｎｉｏｎおよびＭｙｏｍａｋｅｒを共過剰発現し、ＤＭＳＯ対照、アクチン重合阻害剤ラトランクリンＢ（０．１μＭ）またはサイトカラシンＤ（０．３μＭ）（Ｂｏｔｈｅ  ＆  Ｂａｙｌｉｅｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２６，Ｒ７８６−Ｒ７９１，２０１６）で２４時間処理した１０Ｔ１／２線維芽細胞の代表的な蛍光画像を示す。ｎ＝２（それぞれ６回の技術的反復、それぞれ５つの領域）。スケールバー、１００μｍ（図３０Ａ〜３０Ｂ）。図３０Ｃは、ＭｉｎｉｏｎおよびＭｙｏｍａｋｅｒ誘導性の細胞−細胞融合について提案されるモデルを示す。本発明者らは、ＭｉｎｉｏｎおよびＭｙｏｍａｋｅｒが融合プロセスにおいて分離可能な役割を有することを提案する；Ｍｙｏｍａｋｅｒは、細胞−細胞認識および／または膜の付着などの融合前のポアに関するイベントを媒介する一方で、Ｍｉｎｉｏｎは、少なくとも部分的に細胞骨格の再編成の誘導を介して後期の融合ポア形成を媒介する。
【図３０−２】上記のとおり。
【図３０−３】上記のとおり。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、微小タンパク質ＭＩＮＩＯＮが、筋前駆細胞の融合および骨格筋の発生に必要であり、かつＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒの異種共発現が、非筋細胞においてさえ迅速かつ均質な細胞融合を誘導するのに十分であるという知見に少なくとも部分的に基づく。マウスＭＩＮＩＯＮのヒトオルソログは、以前に報告されていない。本明細書に記載のように、本発明者らは、ＭＩＮＩＯＮのヒトオルソログのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列を同定し、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質もまた、融合誘導性活性を有することを見出したが、このことは、細胞融合におけるＭＩＮＩＯＮタンパク質の進化的に保存された役割を示唆している。したがって、本明細書では、融合誘導性タンパク質ＭＩＮＩＯＮに関連する組成物、方法、および治療上の使用が提供される。
【００３９】
定義
用語「ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質」および「ヒトＭＩＮＩＯＮ微小タンパク質」は本明細書において互換的に使用され（微小タンパク質融合誘導因子、Ｇｍ７３２５、ＥＳＧＰ、胚性幹細胞および生殖細胞特異的タンパク質、またはＥＧ６５３０１６としても知られる）、配列番号１（アイソフォーム１）または配列番号３（アイソフォーム２）のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。「ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド」は、天然に存在するヒトＭＩＮＩＯＮ微小タンパク質（例えば、配列番号１もしくは配列番号３のタンパク質）またはその変異体を指す。ヒトＭＩＮＩＯＮアイソフォーム１またはアイソフォーム２のタンパク質およびｃＤＮＡ配列が、下の表１において提供される。
【００４０】
【表１−１】
2020500020.tif 000003
【００４１】
【表１−２】
2020500020.tif 000004
【００４２】
【表１−３】
2020500020.tif 000005
【００４３】
「マウスＭＩＮＩＯＮポリペプチド」は、天然に存在するマウスＭＩＮＩＯＮタンパク質またはその変異体を指す。２種の天然に存在するマウスＭＩＮＩＯＮタンパク質のアイソフォーム（配列番号５および配列番号７）が報告されている。マウスＭＩＮＩＯＮアイソフォームのアミノ酸およびヌクレオチド配列が、表１において示される。表１はまた、他の種、例えば、ラット（ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、サル（アカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ））、ネコ（ネコ（Ｆ．ｃａｔｕｓ））、およびブタ（イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ））のＭＩＮＩＯＮ配列を提供する。
【００４４】
用語「ＭＩＮＩＯＮポリペプチド」は、任意の種のＭＩＮＩＯＮタンパク質、またはその変異体の天然に存在する全てのアイソフォームを一括して指すために使用される。例えば、「ＭＩＮＩＯＮポリペプチド」は、表１に列記される任意のＭＩＮＩＯＮポリペプチドまたはその変異体であり得る。
【００４５】
Ｍｙｏｍａｋｅｒ（Ｔｍｅｍ８ｃまたはＴｍｅｍ２２６としても知られる）は、筋細胞において特異的に発現される膜貫通タンパク質である。「ヒトＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」は、天然に存在するヒトＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質（例えば、配列番号１６のタンパク質）またはその変異体を指す。ヒトＭｙｏｍａｋｅｒのタンパク質およびｍＲＮＡ配列が、表２において提供される。
【００４６】
【表２−１】
2020500020.tif 000006
【００４７】
【表２−２】
2020500020.tif 000007
【００４８】
【表２−３】
2020500020.tif 000008
【００４９】
【表２−４】
2020500020.tif 000009
【００５０】
【表２−５】
2020500020.tif 000010
【００５１】
【表２−６】
2020500020.tif 000011
【００５２】
【表２−７】
2020500020.tif 000012
【００５３】
【表２−８】
2020500020.tif 000013
【００５４】
【表２−９】
2020500020.tif 000014
【００５５】
【表２−１０】
2020500020.tif 000015
【００５６】
「マウスＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」は、天然に存在するマウスＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質（例えば、配列番号１８または２０のタンパク質）またはその変異体を指す。マウスＭｙｏｍａｋｅｒアイソフォームのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列は、表２において見出すことができる。表２はまた、他の種、例えば、ラット（ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、サル（アカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ））、ネコ（ネコ（Ｆ．ｃａｔｕｓ））、およびブタ（イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ））のＭｙｏｍａｋｅｒ配列を含む。
【００５７】
用語「Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」は、任意の種のＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質、またはその変異体の天然に存在する全てのアイソフォームを一括して指すために使用される。例えば、「Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」は、表２に列記される任意のＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体であり得る。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明確な断りがなければ、複数の対象を含む。例えば、用語「細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００５９】
全ての数の指定、例えば、範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、０．１単位で（＋）または（−）変化する近似値とする。いつも明確に提示されるとは限らないが、全ての数の指定に「約」という用語が付けられることを理解されたい。またいつも明確に述べられるとは限らないが、本明細書に記載される試薬は単に例であり、その等価物が当技術分野において知られていることも理解されたい。
【００６０】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡ、例えば、逆転写酵素などの酵素でｃＤＮＡにされる、細胞または生物体に存在するｍＲＮＡ分子を指す。「ｃＤＮＡライブラリー」は、細胞または生物体に存在するｍＲＮＡ分子の全てのコレクションであり、全ては酵素逆転写酵素でｃＤＮＡ分子に変えられ、その後「ベクター」（外来ＤＮＡの添加の後に複製し続けることができる他のＤＮＡ分子）に挿入される。ライブラリーのための例となるベクターとしては、バクテリオファージ（「ファージ」としても知られる）、細菌に感染するウイルス、例えば、ラムダファージが挙げられる。次に、ライブラリーは、目的とする特定のｃＤＮＡ（したがって、ｍＲＮＡ）について探索され得る。
【００６１】
用語「併用」は、１つの単位剤形での固定された併用、または組合わせ投与を指し、本発明の化合物および併用パートナー（例えば、後に説明するような、「治療薬」または「補助薬」とも呼ばれるもう１つの薬物）は、同時に独立して、または時間間隔内に個別に投与してもよく、特にこれらの時間間隔は、併用パートナーが、協同的効果、例えば相乗効果を示すことを可能にする。単一の成分は、キットにパッケージ化してもよく、または別々であってもよい。成分の一方または両方（例えば、粉末または液体）を再構成または希釈して、投与の前に所望の用量にしてもよい。本明細書で利用される場合、用語「同時投与」または「組合わせ投与」などは、選択された併用パートナーの、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）への投与を包含することを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路で、または同時に投与されない治療レジメンを含むことが意図される。本明細書で使用する場合、用語「薬学的併用」は、２種以上の活性成分を混合するか、または組合わせて得られる製品を意味しており、活性成分の固定された組合わせおよび固定されていない組合わせを含む。用語「固定された組合わせ」とは、活性成分、例えば、本発明の化合物と併用パートナーの両方が、単一の実体または投与量の形態で、患者に同時に投与されることを意味する。用語「固定されていない組合わせ」とは、活性成分、例えば、本発明の化合物と併用パートナーの両方が、個別の実体として、同時に、並行して、または特定の時間制限なく逐次的に患者に投与されることを意味しており、こうした投与は患者の体内で２種の化合物の治療上有効なレベルをもたらす。後者はまた、カクテル療法、例えば、３種以上の活性成分の投与にも当てはまる。
【００６２】
「有効量」は、有利なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成するものである。この量は、疾患または疾患症状の発症を予防するのに必要な量である予防有効量と同じであっても、異なってもよい。有効量を１回以上の投与、適用または投薬において投与することができる。治療用化合物の「治療有効量」（すなわち、有効な投与量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、１日当たり１回以上から、１日おきに１回を含む１週間当たり１回以上投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、一定の因子が対象を効果的に治療するのに必要な投与量および時機に影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本明細書に記載の治療用化合物による対象の治療は、１回の治療または一連の治療を含み得る。
【００６３】
用語「変異体」は、基準ポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一なヌクレオチド配列によってコードされ、かつ基準ポリペプチドの１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。例えば、変異体は、基準ポリペプチドに対して約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有することができ、一方、基準ポリペプチドの１つ以上の活性を保持することができる。
【００６４】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後で、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能な、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列を使用して、それらが関連する遺伝子のより大型の断片または全長コード配列を同定することができる。大型の断片配列を単離する方法は、当業者に知られている。
【００６５】
用語「単離されている」は、自然状態から変更されたか、または取り出された状態を指す。例えば、生きている動物内に自然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されていない」が、その自然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境において存在することができる。
【００６６】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマーを指す。特に限定しない限り、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列も暗示的に包含する。とりわけ、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実現してもよい（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００６７】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸数の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により連結した２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、本用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短鎖、ならびに当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれ、多くの種類が存在する長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組換えペプチドまたはこれらの組合わせを含む。「微小タンパク質」または「微小ペプチド」は、１００アミノ酸長未満のタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００６８】
用語「相同」または「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子間または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２つの配列間の相同性は、マッチした位置または相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニット中の５個の位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個のうち９個）がマッチしているかまたは相同である場合、２つの配列は９０％相同である。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され得るが、このとき比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の断片は、２つの配列の最適なアラインメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含む場合がある。パーセンテージは、両配列内で同一の酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、そのマッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出することができる。結果は、クエリー配列に対する対象配列の同一性パーセントである。
【００６９】
用語「対象」は、本発明の方法に従う治療が提供される動物、ヒトまたは非ヒトを指す。獣医学および非獣医学用途が考えられる。本用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、マウスおよびラットなどの齧歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含むがこれらに限定されない。典型的な対象としては、ヒト、家畜、ならびにネコおよびイヌなどの愛玩動物が挙げられる。
【００７０】
用語「治療する」または「治療」は、治療的処置および予防的または防止手段の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害を予防または遅らせることである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、病態の緩和または一時的軽減、および寛解（不完全かまたは完全のいずれにせよ）を含むが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して延びた生存期間を意味することができる。
【００７１】
統計的有意性は、当技術分野における任意の既知の方法によって判定され得る。例示的な統計検定としては、スチューデントのｔ検定、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定、およびウィルコクソンのノンパラメトリック統計検定が挙げられる。一部の統計的に有意な関係は、０．０５未満または０．０２未満のＰ値を有する。特定の結合タンパク質は、例えば、特異性または結合性において統計的に有意（例えば、Ｐ値＜０．０５または０．０２）である差異を示し得る。例えば、２つの状態の間の識別可能な定性的または定量的な差異を表す用語「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「高める」、「増加させる」、「減少させる」などは、差異、例えば２つの状態の間の統計的に有意な差異を指す場合がある。
【００７２】
ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびその断片または変異体
マウスＭＩＮＩＯＮ（ＥＳＧＰ）タンパク質は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされた（Ｃｈｅｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２００５，３７（１２）：７８９−７９６）。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載される８４アミノ酸のタンパク質は、配列番号５（アイソフォーム１）のアミノ酸配列を有する。マウスＭＩＮＩＯＮ（アイソフォーム２）のより長いアイソフォームもまた記載され、配列番号７のアミノ酸配列、およびアイソフォーム１と比較して異なるＮ末端を有する。マウスのＭＩＮＩＯＮアイソフォームの機能は未知である。
【００７３】
本発明者らは、マウスＭＩＮＩＯＮが筋発生および再生中に高度に発現される骨格筋特異的微小タンパク質であり（実施例２を参照のこと）、筋前駆細胞の融合および骨格筋発生に必要である（実施例３および４を参照のこと）ことを見出した。さらに、もう１つのタンパク質であるＭｙｏｍａｋｅｒとのＭＩＮＩＯＮの強制的な異種発現が、非筋細胞（例えば、線維芽細胞）においてさえ細胞融合を誘導するのに十分であることが見出された（実施例５を参照のこと）。このことは驚くべきことであり、というのもＭｙｏｍａｋｅｒ単独では、筋芽細胞に対する線維芽細胞の融合を促進することが可能であったが、線維芽細胞−線維芽細胞融合を促進することができなかったためである（Ｍｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；４９９（７４５８）：３０１−５）。
【００７４】
マウスＭＩＮＩＯＮのヒトオルソログは、以前に報告されていない。本明細書で記載されるように、本発明者らは、ＭＩＮＩＯＮのヒトオルソログが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列、および配列番号２または配列番号４のｃＤＮＡ配列を有することを見出した。本発明者らは、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質もまた融合誘導性活性を有することを見出したが、このことは、細胞融合においてＭＩＮＩＯＮタンパク質に関する進化的に保存された役割を示唆している。他の種、例えば、ラット（ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、サル（アカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ））、ネコ（ネコ（Ｆ．ｃａｔｕｓ））、およびブタ（イノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ））のＭＩＮＩＯＮのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列もまた、表１において提供される。
【００７５】
ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、天然に存在するＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、表１に列記される任意のＭＩＮＩＯＮタンパク質）の変異体であってもよい。例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、天然に存在するヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、配列番号１もしくは配列番号３のタンパク質、またはその天然に存在する別のアイソフォーム）の変異体であり得る。マウスＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、天然に存在するマウスＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、配列番号５もしくは配列番号７のタンパク質、またはその天然に存在する別のアイソフォーム）の変異体であり得る。
【００７６】
ＭＩＮＩＯＮ変異体は、例えば、天然に存在するＭＩＮＩＯＮタンパク質における１つ以上のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）によって、天然に存在するＭＩＮＩＯＮタンパク質と異なり得るが、ＭＩＮＩＯＮの生物学的活性、例えば、融合誘導性活性を保持している。ＭＩＮＩＯＮ変異体は、１つ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有し得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ変異体は、天然に存在するＭＩＮＩＯＮタンパク質に対して、非必須アミノ酸の１つ以上の変異（例えば、置換（例えば、保存的置換もしくは置換）、挿入、または欠失）を含む。「非必須」アミノ酸残基は、融合誘導性活性などの生物学的活性を無効にすることなく、またはより好ましくは、実質的に変えることなくＭＩＮＩＯＮタンパク質の野生型配列から変化され得る残基であるが、一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、生物学的活性の実質的な消失をもたらす。
【００７８】
ＭＩＮＩＯＮ変異体は、天然に存在するＭＩＮＩＯＮタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、または４、および１０、９、８、７、６、または５箇所以下の変異（例えば、置換（例えば、保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）、挿入、または欠失）を有し得る。特定の置換が許容されることになるか否か、すなわち、融合誘導性活性などの生物学的特性に悪影響を与えることにならないかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価すること、または活性アッセイによって予測することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ変異体は、天然に存在するＭＩＮＩＯＮタンパク質に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮ変異体は、配列番号１または配列番号３に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。マウスＭＩＮＩＯＮ変異体は、配列番号５または配列番号７に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。
【００８０】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（本用語は、本明細書において互換的に使用される）の計算は以下のように実施され得る。最適な比較目的のために２つの配列を整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。最適なアラインメントを、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを伴うＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用した最良のスコアとして決定する。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、分子は、当該位置で同一である（本明細書で使用されるように、アミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一の位置の数の関数である。
【００８１】
さらに、核酸セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、極めてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合に、実質的な同一性が存在する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物中、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ変異体は、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸を含むことができる。「天然ではコードされないアミノ酸」は、一般的なアミノ酸またはピロリジンまたはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。用語「天然ではコードされないアミノ酸」と同義に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「非天然のアミノ酸」「天然に存在しないアミノ酸」ならびに、それらの様々な位置にハイフンを挿入した、およびハイフン挿入のないバージョンである。用語「天然ではコードされないアミノ酸」はまた、天然でコードされるアミノ酸（２０種の一般的なアミノ酸またはピロリジンおよびセレノシステインを含むがこれらに限定されない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）により発生するアミノ酸であるが、それら自体は翻訳複合体により伸びるポリペプチド鎖中に自然に組み込まれるものではないアミノ酸を含むが、これらに限定されない。このような天然に存在しないアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
天然ではコードされないアミノ酸は、通常、２０種の天然アミノ酸で使用されるもの以外の任意の置換基側鎖を有する任意の構造である。天然ではコードされないアミノ酸は、通常、天然アミノ酸とは側鎖の構造においてのみ異なるため、天然ではコードされないアミノ酸は、限定されないが、天然でコードされる、または天然でコードされないものを含む他のアミノ酸と、天然に存在するポリペプチド中で形成されるのと同じ様式で、アミド結合を形成する。しかし、天然ではコードされないアミノ酸は、天然アミノ酸とは区別される側鎖基を有する。例えば、Ｒは、任意選択により、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など、またはこれらの任意の組合わせを含む。本発明での使用に好適であり得る他の天然に存在しないアミノ酸としては、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、共有結合でまたは非共有結合で他の分子と相互作用するアミノ酸、光ケージされたおよび／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化されたアミノ酸、例えば、糖置換セリン、他の炭水化物改変アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なおよび／または光切断可能なアミノ酸、限定されないが、ポリエーテルまたは限定されないが、約５または約１０炭素より長い炭素を含む長鎖炭化水素などの天然アミノ酸に比べて伸長した側鎖を有するアミノ酸、炭素結合型糖含有アミノ酸、酸化還元活性のあるアミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明での使用に好適であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である例示的な天然ではコードされないアミノ酸としては、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジドおよびアルキン反応性基を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、天然ではコードされないアミノ酸は、サッカライド部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸とサッカライドの間の天然に存在するＮ−またはＯ−結合が、限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含む通常は天然には見られない共有結合による連結によって置換されている例が挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、また、天然に存在するタンパク質には通常見られない糖類、例えば、２−デオキシグルコース、２−デオキシガラクトースなどが挙げられる。
【００８５】
天然に存在しないアミノ酸を製造する方法および天然に存在しないアミノ酸をタンパク質に導入する方法は、知られている。例えば、米国特許第７，０８３，９７０号明細書、および同第７，５２４，６４７号明細書を参照されたい。１つ以上の所望の非天然アミノ酸を含むタンパク質を作製するのに好適な直交翻訳系の生成についての一般原理は、直交翻訳系を生成するための一般的な方法であるため、当技術分野において知られている。例えば、各々の全体が本明細書に参照として組み込まれる、国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット；国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット；国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット；国際公開第２００５／００７８７０号パンフレット；国際公開第２００５／００７６２４号パンフレット；国際公開第２００６／１１０１８２号パンフレット；および国際公開第２００７／１０３４９０号パンフレットを参照されたい。非天然アミノ酸を組み込む直交翻訳系、およびそれらの産生および使用のための方法の議論のために、各々の内容全体が参照として組み込まれる、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ．」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４４：３４−６６；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）「Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）「Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５４８−５５４；およびＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ．」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ３５：２２５−２４９；Ｄｅｉｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ，（２００５）「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４；Ｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）「Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４：９０２６−９０２７；ならびに国際公開第２００６／０３４３３２号パンフレット（２００５年９月２０日出願）も参照されたい。さらなる詳細は、米国特許第７，０４５，３３７号明細書；同第７，０８３，９７０号明細書；同第７，２３８，５１０号明細書；同第７，１２９，３３３号明細書；同第７，２６２，０４０号明細書；同第７，１８３，０８２号明細書；同第７，１９９，２２２号明細書；および同第７，２１７，８０９号明細書において見出される。
【００８６】
例えば、インビボ半減期の延長するために、任意選択によりＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ポリペプチド鎖内部またはＮもしくはＣ末端のいずれか）に導入され得る別の種類の修飾は、ペグ化または長鎖ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）の組み込みである。ＰＥＧまたはＰＥＧの長鎖ポリマーの組み込みにより、本ポリペプチドの有効分子量が増大して、例えば、尿への迅速な濾過を防ぐ。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ配列中のリジン残基が、直接またはリンカーを介してＰＥＧにコンジュゲートされる。このようなリンカーは、例えば、Ｇｌｕ残基または適切に修飾されたＰＥＧ鎖への結合のためのチオール官能基を含有するアシル残基であり得る。ＰＥＧ鎖を導入するための代替の方法は、まずＣ末端に、または溶媒露出残基に、ＡｒｇまたはＬｙｓ残基の代用などのＣｙｓ残基を導入することである。このＣｙｓ残基は、次に、例えば、マレイミド官能基を含有するＰＥＧ鎖に部位特異的に結合される。ＰＥＧまたはＰＥＧの長鎖ポリマーを組み込むための方法は、当技術分野においてよく知られており（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  １０：１４５１−８（２００５）；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：２１７−５０（２００３）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５４：４５９−７６（２００２）などに記載されている）、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。当技術分野において知られているポリマーコンジュゲーションの他の方法も、本発明において使用することができる（例えば、国際公開第２００８／０９８９３０号パンフレット；Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．，１９：２１４４−５５  （２００８）；Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｂｉｏ−ｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４，５７４３−５）。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドを伴うホスホリルコリン含有ポリマーコンジュゲートを使用することができる。いくつかの実施形態では、ｐ−アジドフェニルアラニンを、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドに組み込み、そして、還元剤および銅イオンの存在下で、アセチレン部分を有するＰＥＧポリマーと反応させて、「ヒュスゲン［３＋２］付加環化」として知られる有機反応を促進することができる。当業者は、他の生体適合性ポリマーコンジュゲートを利用することができることを容易に理解するであろう。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの変異体は、タグまたは融合ドメインなどの異種ペプチドに融合したＭＩＮＩＯＮを含み得る。融合物は、異種ペプチド（例えば、タグまたは融合ドメイン）がＭＩＮＩＯＮポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端で融合するように構築され得る。タグまたは融合ドメインの例としては、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号３２）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号３３）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号３４）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号３５）、Ｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号３６）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号３７）、ＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号３８）、ポリグルタミン酸タグ（ＥＥＥＥＥＥ、配列番号３９）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号４０）、ＳＢＰタグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号４１）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号４２）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号４３）、Ｓタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ、配列番号４４）、Ｓｏｆｔａｇ  １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ、配列番号４５）、Ｓｏｆｔａｇ  ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ、配列番号４６）、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号４７）、ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ、配列番号４８）、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ、配列番号４９）、ＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ、配列番号５０）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ、配列番号５１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、ＧＦＰタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、Ｈａｌｏタグ、またはチオレドキシンタグが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
融合ドメインまたはタグは、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製の目的のために、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲートレジンなどのアフィニティークロマトグラフィー用の適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよびＨｉｓ６タグと用いて有用なＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形態で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、ＭＩＮＩＯＮタンパク質の検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、および通常、特定の抗体が利用可能である短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特定のモノクローナル抗体が容易に利用可能であるよく知られるエピトープタグとしては、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグが挙げられる。他の既知のタグとしては、上記のとおりＥタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、ポリグルタミン酸タグ、ＡｖｉＴａｇ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、カルモジュリンタグ、ＴＣタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇが挙げられる。
【００８９】
いくつかの場合において、タグまたは融合ドメインは、適切なプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化して、それにより融合タンパク質からＭＩＮＩＯＮポリペプチドを遊離させる、プロテアーゼ切断部位を有し得る。ある種の実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、インビボでタンパク質を安定化するドメイン（例えば、「安定化」ドメイン）と融合され得る。「安定化させること」とは、それが、分解の低減、腎臓による除去の低減またはその他の薬物動態的効果によるか否かにかかわらず血清半減期を増大させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合物は、広範囲のタンパク質に所望の薬物動態的特性を付与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との融合物は、所望の特性を付与することができる。選択され得る他の種類の融合ドメインとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび（所望の付加的な生物学的機能を付与する）機能ドメインが挙げられる。
【００９０】
さらに本明細書では、融合誘導性活性、Ｍｙｏｍａｋｅｒとの相互作用などの天然のＭＩＮＩＯＮポリペプチドの生物学的機能を保持するＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片が提供される。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、ＭＩＮＩＯＮの融合誘導性活性に必要であることが示された「ＡｘＬｙＣｘＬ」ドメイン（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｙｏｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．  ＰＮＡＳ  １１４，１１９５０（２０１７）、この内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）を含有するＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号１のアミノ酸４８〜５４を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号３のアミノ酸４８〜５４を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号５のアミノ酸４８〜５４を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号７のアミノ酸７２〜７８を含む。本開示のいくつかの実施形態は、Ｎ末端の疎水性領域（ヒトＭＩＮＩＯＮのアミノ酸５〜２５）、およびＮ末端の疎水性領域の後の最初のα−ヘリックス内の正に荷電したＡｒｇ残基（その破壊により融合誘導性活性の消失がもたらされ、Ｍｙｏｍａｋｅｒとの相互作用が不安定化した）（Ｂｉ  Ｐ，Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ａ，Ｌｉ  Ｈ，  Ｃａｎｎａｖｉｎｏ  Ｊ，ＭｃＡｎａｌｌｙ  ＪＲ，Ｓｈｅｌｔｏｎ  ＪＭ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｏｒｔｉｚ  Ｅ，Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  Ｒ，Ｏｌｓｏｎ  ＥＮ：Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｙｏｍｉｘｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５６，３２３（２０１７）、この内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）を含有するＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号１のアミノ酸５〜４６を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号３のアミノ酸５〜４６を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号５のアミノ酸５〜４６を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、配列番号７のアミノ酸２９〜７０を含む。ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、様々な長さを有することができる。例えば、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの断片は、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、５０アミノ酸、もしくは上記の値のいずれか２つの間の範囲であるか、その近似値であるか、少なくともその値であるか、その値を超える長さを有し得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮペプチド、その変異体またはその断片は、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、脂質修飾、糖鎖修飾、リン酸化などを含んでもよい。例は、以下のとおりである。ＧＰＳ（ｈｔｔｐ：／／ｇｐｓ．ｂｉｏｃｕｃｋｏｏ．ｏｒｇ／）を用いて予測されるようなハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＭＩＮＩＯＮにおけるリン酸化部位としては、セリン１２、セリン１５、セリン４１、セリン４２、セリン５１、セリン５８、セリン６５、セリン６９、およびセリン７４が挙げられる。ＧＰＳ−Ｌｉｐｉｄ（ｈｔｔｐ：／／ｇｐｓ．ｂｉｏｃｕｃｋｏｏ．ｏｒｇ／）を用いて、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＭＩＮＩＯＮにおけるシステイン５２のパルミトイル化が予測される。ＮｅｔＯＧｌｙｃ  ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）を用いて、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＭＩＮＩＯＮにおけるセリン６９とセリン７４のＯ−グリコシル化が予測される。
【００９２】
Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドおよび変異体
Ｍｙｏｍａｋｅｒ（Ｔｍｅｍ８ｃまたはＴｍｅｍ２２６としても知られる）は、胚形成および成体の筋再生中の骨格筋において特異的に発現される膜タンパク質である（Ｍｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３  Ｊｕｌ  １８；４９９（７４５８）：３０１−５）。Ｍｙｏｍａｋｅｒは、インビボおよびインビトロにおいて筋芽細胞の融合を促進するのに必要であり、かつ十分であると報告されている（Ｍｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｍｉｌｌａｙらはまた、Ｍｙｏｍａｋｅｒは線維芽細胞の筋芽細胞への融合を促進できるが、線維芽細胞−線維芽細胞融合は促進できないことを報告した。非筋細胞において外因性のＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質を発現することによって非筋細胞を筋細胞に融合する方法は、国際公開第２０１４／２１０４４８号パンフレットに記載されている。
【００９３】
Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、天然に存在するＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質（例えば、表２に列記される任意のＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質）の変異体であってもよい。例えば、ヒトＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、天然に存在するヒトＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質（例えば、配列番号１６のタンパク質、またはその天然に存在するアイソフォーム）の変異体であり得る。マウスＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、天然に存在するマウスＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質（例えば、配列番号１８もしくは配列番号２０のタンパク質、またはその天然に存在する別のアイソフォーム）の変異体であり得る。表２は、ヒト、マウス、ラット、サル、ネコ、およびブタのＭｙｏｍａｋｅｒのアミノ酸およびヌクレオチド配列を提供する。
【００９４】
Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、例えば、天然に存在するＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質における１つ以上のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）によって、天然に存在するＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質と異なり得るが、Ｍｙｏｍａｋｅｒの生物学的活性、例えば、融合誘導性活性を保持している。Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、１つ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有し得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、天然に存在するＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質に対して、非必須アミノ酸の１つ以上の変異（例えば、置換（例えば、保存的置換もしくは置換）、挿入、または欠失）を含む。「非必須」アミノ酸残基は、融合誘導性活性などの生物学的活性を無効にすることなく、またはより好ましくは、実質的に変えることなくＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質の野生型配列から変化され得る残基であるが、一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、生物学的活性の実質的な消失をもたらす。
【００９６】
Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、天然に存在するＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、または４、および１０、９、８、７、６、または５箇所以下の変異（例えば、置換（例えば、保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）、挿入、または欠失）を有し得る。特定の置換が許容されることになるか否か、すなわち、融合誘導性活性などの生物学的特性に悪影響を与えることにならないかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価すること、または活性アッセイによって予測することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、天然に存在するＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。例えば、ヒトＭｙｏｍａｋｅｒ変異体は、配列番号１６に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。マウスＭｙｏｍａｋｅｒ変異体は、配列番号１８または配列番号２０に対して、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。
【００９８】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（本用語は、本明細書において互換的に使用される）の計算は以下のように実施され得る。最適な比較目的のために２つの配列を整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。最適なアラインメントを、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを伴うＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用した最良のスコアとして決定する。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、分子は、当該位置で同一である（本明細書で使用されるように、アミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一の位置の数の関数である。
【００９９】
さらに、核酸セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、極めてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合に、実質的な同一性が存在する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物中、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、少なくとも１つの天然ではコードされないアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体は、インビボ半減期が延長されたペグ化されたＭｙｏｍａｋｅｒであり得る。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの変異体は、タグまたは融合ドメインに融合したＭｙｏｍａｋｅｒを含み得る。ＭＩＮＩＯＮ変異体に関して上に記載された例示的な天然ではコードされないアミノ酸、ペグ化方法、および融合パートナーはまた、Ｍｙｏｍａｋｅｒ変異体に適用可能である。
【０１０１】
ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸、発現ベクター、および細胞
本発明はまた、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）をコードする核酸、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）の発現のための発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含有する細胞を提供する。他の態様では、本発明は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【０１０２】
本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を発現するために使用され得る発現ベクターが提供される。用語「発現ベクター」は、所望のコード配列が、それが発現され得る細胞への導入のために挿入され得るキャリア核酸分子を指す。発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ＲＮＡ、ウイルスベクター、または人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５，１９９７を参照のこと）であり得る。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクターならびに他のタンパク質を発現するための、当技術分野において知られる多数のその他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、次のウイルス：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオウイルス、ポックスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、粘液腫ウイルス、またはマラバウイルスのいずれかをベースにしたウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、自律複製が可能であり得るか、または宿主ＤＮＡに組み込むことができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドコード配列（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドコード配列）を含有する組換えＤＮＡ分子であり得る。組換え発現ベクターは通常、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列の構成的な発現、ならびに組織特異的調節および／または誘導性配列を指示するものを含む。発現ベクターはまた、宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性および翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメント、および／またはヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドを発現する持続的な安定的細胞クローンを確立するための薬剤選択マーカーを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞、所望のタンパク質発現レベルなどの選択のような要素に依存し得る。このような組換え発現ベクターを作製するための一般的な方法は、とりわけ当技術分野で知られるＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；叢書Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００７  ｗｉｔｈ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに見出すことができる。
【０１０４】
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、調節タンパク質および分子が、例えばＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子として結合し得る遺伝的エレメントを含有し得る。語句「作動可能に位置付けられる」、「作動可能に連結される」、「制御下」、および「転写制御下」は、プロモーターが、当該配列の転写開始および／または発現を制御するための核酸配列に対して、適切な機能的位置および／または向きにあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と共に使用されてもよいし、または使用されなくてもよい。
【０１０５】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得るような、遺伝子または配列に自然に関連するものであってもよい。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、当該配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列に自然に関連するものであってもよい。あるいは、天然の環境において核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す組換えまたは異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを位置付けることによって、一定の利点が得られることになる。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その天然の環境において核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに任意の他の原核生物、ウイルス、または真核生物細胞から単離されるプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーが含まれてもよい。プロモーターまたはエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物と関連させて組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を用いて生成されてもよい（米国特許第４６８３２０２号明細書、米国特許第５９２８９０６号明細書を参照のこと、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指示する制御配列も同様に使用できることが企図される。
【０１０６】
使用されるプロモーターは、構成的、誘導性、組織特異的、かつ／または組換え体タンパク質および／またはペプチドの大規模生産に有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を導く適切な条件下で有用であり得る。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターを使用して、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）の恒常的な発現をもたらす。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下以外でのＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）の発現を妨げる。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。加えて、他の調節エレメントもまた、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）をコードする核酸の発現を向上させるために組み込まれる場合があり、例えば、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結配列などがある。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターを使用して、特定の組織においてのみＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）の発現をもたらす。組織特異的プロモーターまたはエレメントの性質、およびそれらの活性を特徴付けるためのアッセイは、当業者によく知られている。このような領域の例としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｇｅｎｅ，２３６（２）：２５９−２７１）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＥＥＳ  Ｌｅｔｔ．，４２８（３）：１６５−１７０）、マウスの精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１２）：８２８２−８２９０）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｉｒｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４４２（２−３）：１０９−１１９）、マウスの（ＸＩ型）コラーゲンα２（Ｔｓｕｍａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（３６）：２２８６１−２２８６４）、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，７４（２−３）：８６−９０）、インスリン様増殖因子ＩＩ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３３（１）：２２１−２２６）、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７（１２）：５４１１−５４２１）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９−９９）が挙げられる。
【０１０７】
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されることが必要であり得る。当業者は容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために望ましいコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことはよく知られている。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然または合成のいずれかであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって増強されてもよい。
【０１０８】
発現には、当技術分野において知られる任意の適切な宿主細胞を利用することができ、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、昆虫宿主細胞などである。原核生物および真核生物の両方の発現系が広く利用可能である。いくつかの実施形態では、発現系は、ＣＨＯ細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。いくつかの実施形態では、核酸は、所望の宿主細胞における発現を容易にするためにコドンが最適化されてもよい。発現のために選択した細胞型、オルガネラ、および生物体においてＤＮＡセグメントの発現を効率よく導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することは重要であろう。分子生物学の当業者は通常、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合わせの使用を知っており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）を参照されたい。
【０１０９】
大部分の転写された真核生物のＲＮＡ分子は、ＲＮＡスプライシングを受けて、一次転写物からイントロンが除去されることになる。真核生物のゲノム配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするためにドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（８）：３５９６−６０１を参照のこと）。
【０１１０】
本開示のベクターまたはコンストラクトは通常、少なくとも１つの終結シグナルを含むことになる。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列で構成されている。このように、ある種の態様において、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボにおいて必要である場合がある。真核細胞系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出するように新しい転写物の部位特異的切断を許容する特異的ＤＮＡ配列を含んでもよい。これは、一続きの約２００個のＡ残基（ポリＡ）を転写物の３’末端に付加するために、特殊化された内因性のポリメラーゼにシグナルを伝える。このポリＡテールによって修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であるように見え、より効率的に翻訳される。このように、真核生物が関与する他の態様において、ターミネーターは、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強するために、および／またはカセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするために役立ち得る。本開示における使用が企図されるターミネーターには、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、または例えばＳＶ４０ターミネーターなどのウイルスの終結配列が含まれるがこれらに限定されない、本明細書に記載される、または当業者に知られる任意の既知の転写ターミネーターが含まれる。ある種の実施形態では、終結シグナルは、配列のトランケーションによるなど、転写可能な配列または翻訳可能な配列の欠如であってもよい。
【０１１１】
発現、特に真核細胞の発現においては、通常、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルが含まれることになる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本開示の実施の成功にとって重大ではないと考えられ、かつ／または任意のそのような配列を使用してもよい。好ましい実施形態には、簡便で、かつ／または様々な標的細胞において十分に機能することが知られる、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大させる可能性があり、または細胞質輸送を促進する可能性がある。
【０１１２】
宿主細胞においてベクターを増やすために、それは、複製が開始される特異的核酸配列である１つ以上の複製開始点（しばしば、「オリ」と呼ばれる）を含有してもよい。あるいは、宿主細胞が酵母である場合、自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【０１１３】
本開示のある種の実施形態では、発現ベクターにマーカーを含めることによって、本開示の核酸コンストラクトを含有する細胞をインビトロまたはインビボにおいて同定してもよい。このようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にするであろう。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、陰性選択マーカーはその存在がその選択を防止するものである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
【０１１４】
通常、薬剤選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび同定において役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーの他に、基盤が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の種類のマーカーもまた企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。当業者はまた、場合によってはＦＡＣＳ分析とともに免疫マーカーを使用する方法を知っていると考えられる。用いられるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要ではないと考えられる。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者によく知られている。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、表１のＭＩＮＩＯＮポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体のいずれかから選択されるアミノ酸配列からなるＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４のいずれかから選択される核酸を含む発現ベクターが提供される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１もしくは配列番号３またはその変異体を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、１〜４個の変異を有する配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１からなるポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、１〜４個の変異を有する配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１からなるポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３からなるポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号４を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２からなる核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号４からなる核酸を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、プロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、選択マーカーを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、タグと融合した配列番号１または配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。タグは、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号３２）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号３３）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号３４）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号３５）、Ｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号３６）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号３７）、ＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号３８）、ポリグルタミン酸タグ（ＥＥＥＥＥＥ、配列番号３９）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号４０）、ＳＢＰタグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号４１）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号４２）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号４３）、Ｓタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ、配列番号４４）、Ｓｏｆｔａｇ  １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ、配列番号４５）、Ｓｏｆｔａｇ  ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ、配列番号４６）、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号４７）、ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ、配列番号４８）、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ、配列番号４９）、ＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ、配列番号５０）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ、配列番号５１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、ＧＦＰタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、Ｈａｌｏタグ、またはチオレドキシンタグから選択され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体をコードする第２の核酸を含む。したがって、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの両方を発現するための発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、表２のＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはその変異体をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体のいずれかから選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１、またはその変異体のいずれかから選択される第２の核酸を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１６を含むポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１６からなるポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１７を含む第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１７からなる第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、第２の核酸の上流に第２のプロモーターを含む。第２のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの両方を発現するための発現ベクターは、Ｍｙｏｍａｋｅｒコード配列の上流に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスし、内部部位での翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５）。ピコルナウイルスファミリーのうちの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、および哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。それぞれＩＲＥＳによって離れている多数のオープンリーディングフレームをともに転写して、ポリシストロニックメッセージを産生することができる。ＩＲＥＳエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近することができる。１つのメッセージを転写するための１つのプロモーター／エンハンサーを用いて、多数の遺伝子を効率よく発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５９２５５６５号明細書および第５９３５８１９号明細書を参照されたい）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの両方を発現するための発現ベクターは、Ｍｙｏｍａｋｅｒコード配列の上流に２Ａ配列を含む。２Ａオリゴペプチド配列は、プラス鎖ＲＮＡピコルナウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）から最初に特徴付けられ；かつＦＭＤＶ  ２ＡまたはＦ２Ａが、ＦＭＤＶポリタンパク質の上流（キャプシドタンパク質）ドメインと下流（ＲＮＡ複製タンパク質）ドメインの間で翻訳共役的「切断」を媒介することが示された（Ｒｙａｎ  ＭＤ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９４；１３４：９２８−９３３；Ｒｙａｎ  ＭＤ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９１；７２：２７２７−２７３２；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７；７８：１３−２１；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１；８２：１０１３−１０２５）。活性の２Ａ配列は、他の属のピコルナウイルス由来のウイルスのゲノムにおいて特徴付けられ、さらに「２Ａ様」配列が、様々な異なるＲＮＡウイルスおよび非ＬＴＲレトロトランスポゾンのゲノム内で見出された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１；８２：１０２７−１０４１；Ｈｅｒａｓ  ＳＲ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００６；６３：１４４９−１４６０；Ｌｕｋｅ  ＧＡ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００８；８９：１０３６−１０４２；Ｏｄｏｎ  Ｖ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０１３；３０：１９５５−１９６５；Ｌｕｋｅ  ＧＡ，Ｍｏｂ  Ｇｅｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ２０１４；３：ｅ２７５２５）。これらの２Ａまたは「２Ａ様」オリゴペプチド配列は、「リボソームスキッピング」、「ストップ・キャリーオン（ｓｔｏｐ  ｃａｒｒｙ−ｏｎ）」または「ストップ・ゴー（ｓｔｏｐ−ｇｏ）」翻訳と呼ばれる翻訳「リコーディング」イベントを媒介することが示された（Ａｔｋｉｎｓ  ＪＦ，ＲＮＡ  ２００７；１３：１−８）。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「２Ａ配列」は、２つのタンパク質間のリンカーとして機能する２Ａまたは「２Ａ様」オリゴペプチドをコードする任意の核酸配列を指し、ポリタンパク質の自律的リボソーム内自己プロセシングを可能にする（例えば、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）；ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ５：６１６−６２６（２００４）を参照のこと）。これらのオリゴペプチドにより、単一ベクターからの複数のタンパク質の共発現が可能になる。多くの２Ａエレメントが、当技術分野において知られている。例えば、ウイルスの２Ａ配列は、全てが参照として本明細書に組み込まれる米国特許第９１７５３１１号明細書、同第８８６５８８１号明細書、同第７９３９０５９号明細書、同第７９４７４９３号明細書において記載されている。例えば、ウイルスの２Ａ配列は、ピコルナウイルス、テトラウイルスの２Ａ配列、またはこれらの組合わせであり得る。ピコルナウイルスの２Ａ配列は、エンテロウイルスの２Ａ配列、ライノウイルスの２Ａ配列、カルジオウイルスの２Ａ配列、アフトウイルスの２Ａ配列、ヘパトウイルスの２Ａ配列、エルボウイルスの２Ａ配列、コブウイルスの２Ａ配列、テッショウウイルスの２Ａ配列、およびパレコウイルスの２Ａ配列のいずれか１つから選択され得る。テトラウイルスの２Ａ配列は、ベータテトラウイルスの２Ａ配列またはオメガテトラウイルスの２Ａ配列のいずれかから選択され得る。本明細書に開示される方法およびシステムにおいて使用することができる２Ａ配列の例としては、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎ウイルスＡ型（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、およびブタのテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）からの２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５２）もしくはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５３））、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５４）もしくはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５５））、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５６）もしくはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５７））、またはＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５８）もしくはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５９））から選択されるウイルスの２Ａオリゴペプチドをコードする。
【０１２４】
非ウイルスの２Ａ配列は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８９４５８７６号明細書に記載されている。例えば、非ウイルスの２Ａ配列は、ウニ（ムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ））の２Ａ配列（ＤＧＦＣＩＬＹＬＬＬＩＬＬＭＲＳＧＤＶＥＴＮＰＧＰ）（配列番号６０）；海綿（Ａｍｐｈｉｍｅｄｏｎ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃａ）の２Ａ配列（ＬＬＣＦＭＬＬＬＬＬＳＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号６１）もしくはＨＨＦＭＦＬＬＬＬＬＡＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号６２））；ギボシムシ（Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ）の２Ａ配列（ＷＦＬＶＬＬＳＦＩＬＳＧＤＩＥＶＮＰＧＰ（配列番号６３））；またはナメクジウオ（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ  ｆｌｏｒｉｄａｅ）の２Ａ配列（ＫＮＣＡＭＹＭＬＬＬＳＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号６４）もしくはＭＶＩＳＱＬＭＬＫＬＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６５））であり得る。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、２Ａコンセンサス配列Ｄ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−ＮＰＧＰ（配列番号６６）（Ｘは任意のアミノ酸残基）を含む天然に存在するか、または合成の配列である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号５２〜６６のいずれか１つから選択される２Ａオリゴペプチドをコードする２Ａ配列を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸はまた、ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように分泌シグナル配列をコードする配列を含んでもよい。このような配列は、ベクターによって、またはベクター中に存在するＭＩＮＩＯＮ核酸の一部としてもたらされ得る。
【０１２７】
発現ベクターの作製には、ベクターを消化するために標準的な組換え技術とともにいずれかを用いることができる多数の制限酵素部位を含有する核酸領域であるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むベクターを利用することができる。参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、およびＣｏｃｅａ，１９９７を参照されたい。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の部位でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。多くの場合、ベクターは、外因性配列をベクターにライゲートすることが可能なＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて線状化または断片化される。「ライゲーション」は、互いに隣接しても、隣接していなくてもよい２つの核酸断片間のホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素およびライゲーション反応を含む手法は、組換え技術の当業者によく知られている。
【０１２８】
目的のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の種類に応じて変わる。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは、一般的に原核生物の細胞に対して利用される一方で、その他の細胞宿主に対してはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る（一般に、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。その他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、注入および微量注入、遺伝子銃法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ウイルス粒子、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合、薬剤によるＤＮＡの取り込みの増強ならびにエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期にわたる高収率生産のためには、安定的な発現が所望されることが多い。例えば、本発明のポリペプチドを安定的に発現させる細胞株は、ウイルスの複製開始点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する本発明の発現ベクターを使用して作製することができる。
【０１２９】
また、本明細書では、本明細書に記載の発現ベクターのいずれかを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を発現するための発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、ヒトＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）の両方を発現するための発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を発現するための発現ベクター、およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、ヒトＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）を発現するための第２の発現ベクターを含む。このような細胞は、宿主細胞または治療用細胞であり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を特徴とする。宿主細胞を使用して、本明細書に記載のヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドを産生または発現することができる。用語「宿主細胞」および「組換え体宿主細胞」は、本明細書において互換的に使用され、これらは、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。一定の改変が変異または環境的影響のいずれかに起因して後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一であり得ないが、依然として本明細書において使用される用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、タンパク質は、細菌細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＶ−１  ｏｒｉｇｉｎ  ＳＶ４０細胞など；Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）において発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０１３１】
宿主細胞を使用して、本明細書に記載のヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドを産生または発現することができる。したがって、本開示はまた、宿主細胞を用いてヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドを産生するための方法を特徴とする。一実施形態では、方法は、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドが産生されるように、好適な培地中で宿主細胞（内部にタンパク質を発現する組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を含む。別の実施形態では、方法はさらに、培地または宿主細胞からヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドを単離する工程を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含む治療用細胞を特徴とする。本明細書で使用する場合、用語「治療用細胞」は、機能障害性細胞または腫瘍細胞に融合可能なポリペプチド、例えば、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド、例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチドを発現するように遺伝子改変された細胞を指す。このような治療用細胞は、ヒト細胞、例えば、筋芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、もしくは平滑筋細胞などのヒト筋細胞；または線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞、もしくは腫瘍細胞などのヒト非筋細胞であり得る。いくつかの実施形態では、治療用細胞は、本明細書に開示されるＭＩＮＩＯＮポリペプチド、その変異体または断片を発現する発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、治療用細胞は、本明細書に開示されるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、その変異体または断片を発現する発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、このような治療用細胞は、検出可能なマーカー、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、発光分子（例えば、ルシフェラーゼ）、放射性分子（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、もしくは３２Ｐ）、またはコロイド金もしくは着色ビーズなどの熱量測定ラベルを発現する。検出可能なマーカーを発現する細胞は、顕微鏡法、オートラジオグラフィー、および／または当技術分野で知られる他の画像化方法などの適切な検出方法によって追跡または可視化され得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、治療用細胞は、機能障害性細胞に融合することによって機能障害性細胞の機能を回復させることができる場合がある。本明細書で使用する場合、「機能障害性細胞」は、その正常な機能を、例えば、遺伝的異常、例えば、遺伝的変異のために部分的にまたは完全に失った細胞を指す。機能障害性細胞の非限定的な例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）の根底にある原因である細胞死を引き起こすジストロフィン遺伝子における変異を有する筋細胞；三好ミオパチー（ＭＭ）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、および遠位型ミオパチー（ＤＭ）を引き起こすジスフェリン遺伝子における変異を有する筋細胞、遺伝性高チロシン血症Ｉ型を引き起こすフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）をコードする遺伝子における変異を有する細胞などが挙げられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、治療用細胞は、目的の遺伝子、例えば、機能障害性細胞において変異した遺伝子の正常なバージョンを、機能障害性細胞に導入し、それにより、機能障害性細胞における遺伝的異常を矯正することによって、機能障害性細胞の機能を回復させる場合がある。例えば、治療用細胞は、ジストロフィン遺伝子の正常なバージョン、Ｆａｈをコードする遺伝子の正常なバージョンなどを含有し得る。治療用細胞は、自己または同種であり得る。治療用細胞が自己である実施形態では、治療用細胞の遺伝的異常は、当技術分野で知られる様々な遺伝子編集システムによって矯正され得る。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子編集システム」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインもしくは成分および１つ以上のＤＮＡ改変ドメインもしくは成分、または単離核酸、例えば、前記ＤＮＡ結合およびＤＮＡ改変ドメインもしくは成分をコードする１つ以上のベクターを含むシステムを指す。遺伝子編集システムは、標的遺伝子の核酸を改変するため、および／または標的遺伝子の発現を調節するために使用される。既知の遺伝子編集システムにおいて、例えば、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインまたは成分は、１つ以上のＤＮＡ改変ドメインまたは成分と関連付けられており、その結果、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインが、１つ以上のＤＮＡ改変ドメインまたは成分を特定の核酸部位に標的化する。
【０１３５】
遺伝子編集システムは当技術分野で知られており、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム、およびメガヌクレアーゼシステムを含むが、これらに限定されない。理論に束縛されるものではないが、既知の遺伝子編集システムは、治療的適用においてそれらの有用性にとって有害な望まれないＤＮＡ改変活性を示す場合があると考えられる。これらの懸念は、例えば、細胞をレンチウイルスまたはアデノウイルスベクタートランスフェクションを介するなどして遺伝子操作して、遺伝子編集システムの成分を構成的に発現する場合など、遺伝子または遺伝子発現のインビボ改変のための遺伝子編集システムの使用において特に明白である。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ」は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列のセット、またはこのような反復配列のセットを含むシステムを指す。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲに関連付けられたタンパク質を指す。多様なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを、それらのエフェクターモジュールの構成に従って２つのクラスに分けることができる：クラス１  ＣＲＩＳＰＲシステムは、いくつかのＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡを利用して、エフェクター複合体を形成する一方で、クラス２  ＣＲＩＳＰＲシステムは、干渉を媒介するｃｒＲＮＡと組合わせた大きな単一成分のＣａｓタンパク質を使用する。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一例は、Ｃｐｆ１（プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１由来のＣＲＩＳＰＲ）を使用する。例えば、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６３：７５９−７７１（２０１５）を参照されたい。本明細書で使用する場合、用語「Ｃｐｆ１」は全てのオルソログ、およびＣＲＩＳＰＲシステムにおいて使用できる変異体を含む。
【０１３７】
治療用細胞は、機能障害性細胞または腫瘍細胞と同じまたは異なる細胞型であり得ると考えられる。例えば、機能障害性細胞が筋細胞である実施形態において、治療用細胞は、筋芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、もしくは平滑筋細胞などの筋細胞；または線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞などの非筋細胞などであり得る。
【０１３８】
ＭＩＮＩＯＮに結合する抗体
本明細書では、ＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、表１のＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列からなるＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書では、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１もしくは３、またはその変異体を含むタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号１のヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号３のヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【０１４０】
ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）に特異的に結合する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）に特異的に結合する抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、全長抗体の重鎖配列および全長抗体の軽鎖配列を有する。天然に存在する抗体は通常、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記される）および重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインで構成されている。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記される）および軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインで構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、次の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列した、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合、または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分を含む因子への結合を媒介し得る。
【０１４２】
抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、またはキメラ抗体であり得る。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【０１４３】
軽鎖および重鎖は両方ともに、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。この点に関し、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移行性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠く離れるにつれて大きくなる。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。特に、用語「抗体」は、具体的にはＩｇＧ−ｓｃＦｖ形態を含む。
【０１４４】
用語「抗原結合断片」は、標的エピトープ、例えば、ＭＩＮＩＯＮエピトープの結合部位と（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体）の部分を指す。抗体断片の例としては、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性な表面群からなり、かつ通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。立体構造的なエピトープおよび非立体構造的なエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下において失われるという点で区別される。
【０１４６】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子でコードされるが、それらにＶＬおよびＶＨ領域が一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３を参照のこと）を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結され得る。
【０１４７】
このような一本鎖抗体はまた、用語「断片」、「エピトープ結合断片」または「抗体断片」の範囲内に包含されるものとする。これらの断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、完全抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【０１４８】
抗体断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む一本鎖分子に組み込むことができ（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）、また、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片を含むことができる。
【０１４９】
抗原結合断片はまた、当技術分野で知られるとおり、単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６を参照のこと）、二重特異性一本鎖ダイアボディ、または２つの異なるエピトープに結合するように設計された一本鎖ダイアボディを含む。抗原結合断片はまた、抗体様分子または抗体模倣体を含み、これらは、本発明の範囲内である、エピトープに特異的に結合するミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｙ）、Ｆｎ３系タンパク質足場、アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎとしても知られる）、ＶＡＳＰポリペプチド、トリ膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）、テトラネクチン、アフィリリン（Ａｆｆｉｌｉｌｉｎ）、ノッチン、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、テンダミスタット、ネオカルチノスタチン、プロテインＡドメイン、リポカリン、トランスフェリン、およびクニッツドメインを含むが、これらに限定されない。抗体断片は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場に移植することができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照のこと）。
【０１５０】
単離抗体は、一価抗体、二価抗体、多価抗体、二価抗体、バイパラトピック抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、組換えヒト抗体、または任意の他の種類の抗体もしくはそのエピトープ結合断片もしくは誘導体であり得る。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、語句「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）に特異的に結合する単離抗体は、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。しかし、標的分子に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来の同じ抗原に対して交差反応性を有し得る。例えば、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば配列番号１または３）に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＭＩＮＩＯＮ分子に結合する場合がある。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、用語「一価抗体」は、標的分子上の単一のエピトープに結合する抗体を指す。
【０１５３】
本明細書で使用する場合、用語「二価抗体」は、少なくとも２つの同一の標的分子上の２つのエピトープに結合する抗体を指す。二価抗体はまた、標的分子を互いに架橋し得る。「二価抗体」はまた、少なくとも２つの同一の標的分子上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
【０１５４】
用語「多価抗体」は、２以上の価数を有する単一の結合分子を指し、「価数」は、抗体コンストラクト１分子当たりに存在する抗原結合部分の数として説明される。そのため、単一の結合分子が、標的分子上の２つ以上の結合部位に結合することができる。多価抗体の例としては、二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体など、および二重特異性抗体およびバイパラトピック抗体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）については、多価抗体は、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）の２つのドメインに対する結合部分をそれぞれ有する。
【０１５５】
用語「多価抗体」はまた、２つの別個の標的分子に対して２つ以上の抗原結合部分を有する単一の結合分子を指す。例えば、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）およびＭＩＮＩＯＮではない第２の標的分子に結合する抗体がある。一実施形態では、多価抗体は、４つのエピトープ結合ドメインを有する四価抗体である。四価分子は、当該標的分子上の各結合部位に対して二重特異性であり、かつ二価であり得る。
【０１５６】
本明細書で使用する場合、用語「バイパラトピック抗体」は、単一の標的分子上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本用語はまた、少なくとも２つの標的分子の２つのドメインに結合する抗体、例えば、四価のバイパラトピック抗体を含む。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、用語「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる標的（例えば、ＭＩＮＩＯＮおよびＭＩＮＩＯＮではない標的）上の２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。
【０１５８】
本明細書で使用する場合、語句「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝源に由来する抗体、二重特異性抗体などを含むポリペプチドを指す。本用語はまた、単一分子組成物の抗体分子の製剤を含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、語句「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えばヒト生殖細胞系列の配列もしくはヒト生殖細胞系列の配列の変異型、または例えばＫｎａｐｐｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０００．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６，５７−８６）において記載されるヒトフレームワーク配列分析から導出されたコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および位置は、よく知られたナンバリングスキーム、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの組合わせを使用して定義してもよい（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１），ｅｄｓ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｌ  Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７３：９２７  ９４８を参照のこと）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８。
【０１６０】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発、もしくはインビボでの体細胞変異により導入される変異、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換）を含んでもよい。しかし、本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むように意図されていない。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、語句「組換えヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてのトランスジェニックもしくは染色体を移入した動物（例えば、マウス）から単離される抗体またはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部の配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離される抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離される全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それらと関係するが、インビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。
【０１６２】
本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、ＣＨ３、ＣＨ２、および抗体の定常ドメインにおけるヒンジ領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドを指す。任意選択により、Ｆｃ領域は、一部の抗体クラスに存在するＣＨ４ドメインを含んでもよい。Ｆｃ領域は、抗体の定常ドメインのヒンジ領域全体を含んでもよい。一実施形態では、本発明は、抗体のＦｃ領域およびＣＨ１領域を含む。一実施形態では、本発明は、抗体のＦｃ領域ＣＨ３領域を含む。別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域、ＣＨ１領域、および抗体の定常領域由来のカッパ／ラムダ領域を含む。一実施形態では、本発明の結合分子は、定常領域、例えば、重鎖定常領域を含む。一実施形態では、このような定常領域は、野生型定常領域と比較して修飾されている。すなわち、本明細書で開示される本発明のポリペプチドは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３）および／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）のうちの１つ以上に改変または修飾を含み得る。修飾の例としては、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の、付加、欠失、または置換が挙げられる。このような変化は、エフェクター機能、半減期などを最適化するように含まれ得る。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、用語「結合部位」は、抗体または抗原結合断片が選択的に結合する標的分子上の領域を含む。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンに高い親和性を有して結合可能な任意の決定基を指す。エピトープは、当該抗原を特異的に標的化する抗体によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体が直接接触する特定のアミノ酸を含む。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、一部の例において、核酸などの他の種類の分子上に存在することがある。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含み得、かつ特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。
【０１６５】
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で標的抗原上のエピトープに結合することになる。
【０１６６】
本明細書で使用する場合、用語「親和性」は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域が、多数の部位において、弱い非共有結合性の力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、親和性は強くなる。本明細書で使用する場合、ＩｇＧ抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ断片）についての用語「高親和性」は、標的抗原に関して１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、または１０−１３Ｍ以下のノックダウンを有する抗体を指す。しかし、高親和性結合は他の抗体アイソタイプに応じて変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する高親和性結合は、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のノックダウンを有する抗体を指す。
【０１６７】
本明細書で使用する場合、用語「アビディティー」は、抗体−抗原複合体の全体の安定性または強度の参考になる指標を指す。それは、３つの主要な要因：抗体エピトープ親和性；抗原と抗体の両方の価数；および相互作用部分の構造的配置によって制御される。最終的に、これらの要因が抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が的確な抗原エピトープに結合している可能性を定義する。
【０１６８】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当技術分野でよく知られる任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．，１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊを参照されたい。例えば、線状エピトープは、例えばタンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、そのペプチドが支持体に付着している間にペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。このような手法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号明細書；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載されている。同様に、立体構造的エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間的高次構造を決定することにより、容易に同定される。例えば、前出のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。タンパク質の抗原性領域も、標準的な抗原性およびハイドロパシープロット、例えばＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるプロットを用いて同定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルの決定のためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８）を採用し；ハイドロパシープロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）を採用している。
【０１６９】
モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の手法により作製可能である。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換または癌発生の形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの手法を採用することができる。
【０１７０】
ハイブリドーマを調製するための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび手法は当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合方法についても知られている。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はヒト化モノクローナル抗体である。本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体およびその抗原結合断片は、上記のように作製されるマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学的手法を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように遺伝子操作され得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を当技術分野で知られる方法を用いてヒト定常領域に連結することができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で知られる方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系の代わりにヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書中でそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称されるマウスを含み、本明細書中では「ヒトＩｇマウス」と一括して総称される。
【０１７３】
ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンの小さな遺伝子座を含有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照のこと）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはＫの発現の低下を示し、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチおよび体細胞変異を経て、高親和性のヒトＩｇＧ−κモノクローナルを産生する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４前出；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，１９９４  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１において概説される；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．，１９９５  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、ならびにＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，１９９５  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭＡｂマウスの作製および使用ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノム改変は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７９−５９１；およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１においてさらに記載されており、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書（全てはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、米国特許第５，５４５，８０７号明細書（Ｓｕｒａｎｉらに交付）；ＰＣＴ公開国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７１１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第９９／４５９６２号パンフレット（全てはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａ��に交付）；ならびにＰＣＴ公開国際公開第０１／１４４２４号パンフレット（Ｋｏｒｍａｎらに交付）を参照されたい。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、導入遺伝子およびトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスを用いて産生され得る。本明細書中で「ＫＭマウス」と称されるこのようなマウスは、石田らによるＰＣＴ公開国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
【０１７５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系は、当技術分野で利用可能であり、ＭＩＮＩＯＮ結合抗体およびその抗原結合断片を産生するために使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替のトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書、および同第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
【０１７６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソミック動物系は当技術分野で利用可能であり、その使用により、本発明のＭＩＮＩＯＮ結合抗体を産生することができる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができ、このようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載されている。さらに、当技術分野では、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有する雌ウシも記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本発明のＭＩＮＩＯＮ結合抗体を産生するために使用することができる。
【０１７７】
ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても作製可能である。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されているか、または下記実施例において記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
【０１７８】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫時にヒト抗体反応が生成され得るようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて作製され得る。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および同第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
【０１７９】
フレームワークまたはＦｃの遺伝子操作
本発明の遺伝子操作された抗体およびその抗原結合断片は、例えば抗体の特性を向上させるために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変が施されている場合の抗体を含む。通常は、このようなフレームワーク改変を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列の配列に「復帰変異する」ことである。より詳細には、体細胞変異を経ている抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系列の配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列の配列と比較することにより同定され得る。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、体細胞変異は、例えば部位特異的変異誘発による生殖細胞系列の配列への「復帰変異」であり得る。このような「復帰変異した」抗体も、本発明に包含されるものとする。
【０１８０】
フレームワーク改変の別の様式は、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫原性化」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
【０１８１】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に施された改変に加えてまたはこれに代えて、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内において通常は抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞障害を変化させる改変を含むように遺伝子操作され得る。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾され得るか（例えば、１つ以上の化学的成分が抗体に結合され得る）、またはその糖鎖修飾を変化させ、さらに抗体の１つ以上の機能特性を変化させるために修飾され得る。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基のナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１８２】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の集合が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
【０１８３】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域の変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が天然型ＦｃヒンジドメインのＳｐＡ結合と比較して低下するように、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
【０１８４】
別の実施形態では、抗体は改変されてその生物学的半減期が増大する。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の下記の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入することができる。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および同第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増大させるために、抗体は、ＣＨ１またはＣＬ領域内にＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有するように改変され得る。
【０１８５】
一実施形態では、Ｆｃ領域を、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することにより改変して、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して親和性の変化を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変化したエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書および同第５，６４８，２６０号明細書にさらに詳述されている。
【０１８６】
別の実施形態では、抗体の、Ｃ１ｑへの結合が改変されかつ／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低減または消失するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換され得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書にさらに詳述されている。
【０１８７】
別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体結合能が改変される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ結合分子は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ領域を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ結合分子のＦｃ領域は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減または消失を媒介する１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１の定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５は、Ａ２３４およびＡ２３５に置換される。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１の定常領域のアミノ酸残基Ｎ２６７は、Ａ２６７に置換される。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１の定常領域のアミノ酸残基Ｄ２６５およびＰ３２９は、Ａ２６５およびＡ３２９に置換される。ある種の実施形態では、Ｆｃ領域は、任意選択により、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低減を付与する変異または変異の組合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（全ての位置はＥＵナンバリングによる）のいずれかから選択されるエフェクター機能の低減を付与する変異または変異の組合わせを含む。
【０１９０】
さらに別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸の改変によるＦｃ領域の改変により、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力が増大し、かつ／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開国際公開第００／４２０７２号パンフレットにさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が向上した変異体についての記載がなされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７６：６５９１−６６０４を参照のこと）。例えば、Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２３６Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ａ３３９Ｔ、Ｐ３９６Ｌ（全ての位置はＥＵナンバリングによる）のいずれかから選択されるエフェクター機能の増大を付与する変異または変異の組合わせを含み得る。
【０１９１】
さらに別の実施形態では、抗体の糖鎖修飾が改変される。例えば、糖鎖修飾が失われた抗体が作製され得る（すなわち抗体が糖鎖修飾を欠く）。糖鎖修飾が改変されて、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大し得る。このような糖質修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上の糖鎖修飾部位を改変することにより達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされ得る結果、１つ以上の可変領域フレームワークの糖鎖修飾部位が消失し、それによりその部位での糖鎖修飾が失われる。このような糖鎖修飾の消失により、抗原に対する抗体の親和性が増大する場合がある。このようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳述されている。
【０１９２】
これに加えてまたはこれに代えて、糖鎖修飾の様式が改変された抗体、例えばフコシル残基を減らした低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃが増加した構造を有する抗体が作製され得る。このような糖鎖修飾パターンの改変により、抗体のＡＤＣＣ能が増強することが実証されている。このような糖質修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞は、当技術分野で記載がなされており、本発明の組換え抗体を発現し、それにより糖鎖修飾が改変された抗体を産生する宿主細胞として用いられ得る。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、このような細胞株内で発現した抗体は低フコシル化を示す。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結した糖質に結合する能力が低下した変異ＣＨＯ細胞株、ＬｅｃＩ３細胞について記載されており、それらはまた、その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０もまた参照のこと）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開国際公開第９９／５４３４２号パンフレットには、遺伝子操作された細胞株内で発現した抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように遺伝子操作された細胞株について記載されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照のこと）。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮ結合分子は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、（例えば、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比べて）１つ以上の変異を有するＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ（ＢｏｌｔＳ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：４０３−４１１）、Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２）、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ（ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２）、Ｐ２３８Ｓ（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，３４：２２０４−２２１０）、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ（ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２）、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｉ  Ｃｈｅｒｎ．２７６（９）：６５９１−６０４）、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ（Ｈｅｚａｒｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｖｉｒａｌ  ７５，１２１６１−１２１６８；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  ６４，７００−７０４）、Ｐ３３１Ｓ（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  ６４，７００−７０４）、Ｔ３９４Ｄ（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＭＡｂｓ  ５（３）：４０６−４１７）、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、および／またはＴ２５６Ｅから選択され、ここで、アミノ酸位置は、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従う。ある種の実施形態では、Ｆｃ領域はさらに、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従うグリシン２３６に相当する位置でのアミノ酸欠失を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従うＣ２２０Ｓ変異を含有する重鎖定常領域を有するＩｇＧ１アイソタイプを有する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はさらに、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従うＡ３３０Ｌ、Ｌ２３４Ｆ；Ｌ２３５Ｅ、および／またはＰ３３１Ｓから選択される１つ以上の追加の変異を含有する。
【０１９６】
ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２定常領域は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、１つ以上の改変を含有する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、（例えば、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比べて）１つ以上の変異を含有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｅ、Ｖ３０９Ｌ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｃ２３２Ｓ、Ｃ２３３Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、および／またはＴ２５６Ｅから選択され、ここで、アミノ酸位置は、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従う。
【０１９７】
ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４定常領域は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、１つ以上の改変を含有する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、（例えば、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比べて）１つ以上の変異を含有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ／Ａ  ｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２：１１９８０−１１９８４）、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３６Ｅ、Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ／，１６４：１９２５−１９３３；Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（１）：１０５−８；米国特許第８６１４２９９Ｂ２号明細書）、Ｔ３９４Ｄ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ａ、および／またはＮ２９７Ｑから選択され、ここで、アミノ酸位置は、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従う。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はさらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、および／またはＴ２５６Ｅから選択される１つ以上の追加の変異を含有し、ここで、アミノ酸位置は、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従う。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のＩｇＧ１変異体は、アミノ酸位置がＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従うＡ３３０Ｌ変異（Ｌａｚａｒｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０３：４００５−４０１０）、またはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、および／またはＰ３３１Ｓ変異の１つ以上（Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０５：２０１６７−２０１７２）と組合わされて、補体活性化を排除し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩｇＧ変異体は、１つ以上の変異と組合わされて、抗体のヒト血清における半減期（ｈａｌｆ−ｌｉＦｃ）を高め得る（例えば、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従うＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ変異）（Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｒｎ，２８１：２３５１４−２３５２４；およびＳｔｒｏｈｌ  ｅ  ａｌ．，（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：６８５−６９１）。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本開示のＩｇＧ４変異体は、ＥＵまたはＫａｂａｔナンバリングの方法に従うＳ２２８Ｐ変異（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５−１０８）および／またはＰｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｒｎ．１３；２８７（２９）：２４５２５−３３）に記載される１つ以上の変異と組合わされて、抗体の安定化を高め得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２のＦｃ領域、ＩｇＧ４のＦｃ領域、またはＩｇＧ２／ＩｇＧ４の複合型Ｆｃ領域から選択されるＦｃ領域を有する。
【０２０２】
改変抗体を遺伝子操作する方法
上述のように、本明細書で示されるＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖配列を有するＭＩＮＩＯＮ結合抗体を使用して、全長重鎖および／もしくは軽鎖配列、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、またはそれに結合する定常領域を改変することによって新たなＭＩＮＩＯＮ結合抗体を作製することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＭＩＮＩＯＮ結合抗体の構造的特徴を使用して、本発明の抗体およびその抗原結合断片の、ＭＩＮＩＯＮに結合するなどの少なくとも１つの機能的特性を保持する構造的に関連するＭＩＮＩＯＮ結合抗体を作製する。
【０２０３】
例えば、本発明の抗体およびその抗原結合断片の１つ以上のＣＤＲ領域、またはその変異を、既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換えにより組合わせて、上述のように、組換えにより遺伝子操作された追加の本発明のＭＩＮＩＯＮ結合抗体およびその抗原結合断片を作製することができる。他の種類の改変として、前段落に記載のものが挙げられる。遺伝子操作方法のための出発材料は、本明細書で提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＬ配列またはその１つ以上のＣＤＲ領域である。遺伝子操作された抗体を作製するために、本明細書で提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＬ配列またはその１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、配列内に含まれる情報を出発材料として使用し、元の配列に由来する「第二世代」配列が作製され、次に、「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
【０２０４】
改変された抗体配列はまた、固定されたＣＤＲ３配列または米国特許出願公開第２００５０２５５５５２号明細書に記載の最小の必須な結合決定基およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有する抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても作製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術などの、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするのに適した任意のスクリーニング技術に従って実施することができる。
【０２０５】
標準的な分子生物学的手法を用いて改変抗体配列の調製および発現が可能である。改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書に記載されるＭＩＮＩＯＮ結合抗体の機能特性のうちの１つ、いくつかまたは全てを保持する抗体であり、ここで、機能特性はＭＩＮＩＯＮタンパク質に特異的に結合することを含むがこれに限定されない。
【０２０６】
改変抗体の機能特性は、当技術分野で利用可能であり、かつ／または本明細書に記載される標準アッセイ、例えば実施例で示されるもの（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて評価可能である。
【０２０７】
本発明の抗体およびその抗原結合断片を遺伝子操作する方法のいくつかの実施形態では、変異を、ＭＩＮＩＯＮ結合抗体のコード配列の全部または一部にわたって、ランダムに、または選択的に導入することができ、結果として得られる改変ＭＩＮＩＯＮ結合抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能特性についてスクリーニングすることができる。変異方法については当技術分野で記載がなされている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開国際公開０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和変異法、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合わせを使用して、抗体の変異を作製し、スクリーニングするための方法について記載している。あるいは、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットは、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
【０２０８】
本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、様々な機能アッセイにより特徴付けることができる。例えば、それらは、ＭＩＮＩＯＮタンパク質（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮタンパク質、例えば、配列番号１または３のタンパク質）に結合するそれらの能力により特徴付けることができる。
【０２０９】
ＭＩＮＩＯＮに結合する抗体の能力は、目的の抗体を標識することにより直接的に検出することができ、または抗体を標識せずに、当技術分野で知られる様々なサンドイッチアッセイフォーマットを使用して、結合を間接的に検出してもよい。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明のＭＩＮＩＯＮ結合抗体およびその抗原結合断片は、基準ＭＩＮＩＯＮ結合抗体の、ＭＩＮＩＯＮタンパク質への結合を遮断するか、またはこれと競合する。これらは、上に記載した、ＭＩＮＩＯＮに特異的に結合する完全ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。それらはまた、基準抗体と同じＭＩＮＩＯＮ上のエピトープに結合する、他のヒト抗体、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。基準抗体の結合を遮断するか、またはこれと競合する能力は、被験下のＭＩＮＩＯＮ結合抗体が、基準抗体により規定されるエピトープと同じであるかもしくは類似のエピトープ、または基準ＭＩＮＩＯＮ結合抗体が結合するエピトープと十分に近位のエピトープに結合することを示す。このような抗体は、特に、基準抗体について同定される有利な特性を共有する可能性が高い。基準抗体を遮断するか、またはこれと競合する能力は、例えば、競合的結合アッセイにより決定され得る。競合的結合アッセイでは、被験下の抗体を、ＭＩＮＩＯＮタンパク質などの共通の抗原への基準抗体の特異的結合を阻害する能力について試験する。過剰量の試験抗体が基準抗体の結合を実質的に阻害する場合、試験抗体は、抗原への特異的結合について基準抗体と競合する。実質的な阻害とは、試験抗体が、基準抗体の特異的結合を、通常、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減することを意味する。
【０２１１】
抗体の、特定のタンパク質、この場合、ＭＩＮＩＯＮへの結合についての、基準抗体との競合について評価するのに使用することができる、いくつかの既知の競合的結合アッセイが存在する。これらは、例えば、直接的固相ラジオイムノアッセイまたは間接的固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接的固相酵素イムノアッセイまたは間接的固相酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３，１９８３を参照のこと）；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９，１９８６を参照のこと）；直接的固相標識アッセイ、直接的固相標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出を参照のこと）；Ｉ−１２５標識を使用する直接的固相標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５，１９８８を参照のこと）；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２，１９９０）；および直接的標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２，１９９０）を含む。通常、このようなアッセイは、非標識試験ＭＩＮＩＯＮ結合抗体および標識基準抗体のいずれかを保有する固体表面または細胞に結合させた精製抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗体の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、試験抗体は、過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体と、基準抗体が結合するエピトープと、立体障害が生じる程度に十分に近位の隣接エピトープに結合する抗体とを含む。
【０２１２】
選択されたＭＩＮＩＯＮ結合モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、市販の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ製の試薬）を使用して、各抗体がビオチン化され得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合試験は、ＭＩＮＩＯＮタンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して実施することができる。ビオチン化ＭＡｂの結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブにより検出することができる。精製ＭＩＮＩＯＮ結合抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡが実施され得る。例えば、マイクロ滴定プレートのウェルは、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧによりコーティングされ得る。１％のＢＳＡによるブロッキングの後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下のＭＩＮＩＯＮ結合モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次に、ウェルが、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブのいずれかと反応させられ得る。次に、プレートを現像および解析し、その結果、精製抗体のアイソタイプを決定することができる。
【０２１３】
ＭＩＮＩＯＮタンパク質を発現する生細胞へのＭＩＮＩＯＮ結合モノクローナル抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリーが使用され得る。略述すると、ＭＩＮＩＯＮを発現する細胞株（標準的な増殖条件下で増殖させた）は、０．１％のＢＳＡおよび１０％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中に様々な濃度のＭＩＮＩＯＮ結合抗体とともに混合され、３７℃で１時間インキュベートされ得る。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下で、フルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。試料を、光特性および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により解析して、一種類の細胞にゲートをかけることができる。蛍光顕微鏡法を使用する代替的なアッセイを、フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはこれの代わりに）使用してもよい。細胞は、上で記載したとおりに正確に染色し、蛍光顕微鏡法により試験することができる。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能とするが、抗原の密度に依存して感度が低下する場合がある。
【０２１４】
本発明のＭＩＮＩＯＮ結合抗体およびその抗原結合断片は、ウエスタンブロッティングにより、ＭＩＮＩＯＮタンパク質またはＭＩＮＩＯＮ抗原性断片との反応性についてさらに試験することができる。略述すると、精製ＭＩＮＩＯＮタンパク質もしくは融合タンパク質、またはＭＩＮＩＯＮを発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動の後、分離された抗原を、ニトロセルロース膜へと転写し、１０％のウシ胎仔血清でブロッキングし、被験モノクローナル抗体でプローブする。抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してヒトＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）で現像することができる。
【０２１５】
ＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含むリポソームおよび治療薬を送達する方法
本明細書ではまた、本明細書に記載されるＭＩＮＩＯＮポリペプチド、例えば、表１のＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含むリポソームが提供される。リポソームは、水性コアを被包する脂質二重層を特徴とする閉じた脂質キャリアである。リポソームは、治療薬用のキャリアとして使用することができる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドはリポソームの表面上で発現する。ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの融合誘導性活性は、リポソーム脂質と細胞膜の融合を誘導し、それにより、分解性のエンドサイトーシス移行経路をバイパスしてリポソームの内容物を細胞質に直接的に送達することができる。ＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含むリポソームは、広範囲の細胞型に融合し、それらを核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー）、タンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体、抗原、酵素、もしくは治療用ポリペプチド）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または低分子化合物などの多くの治療薬と適合させることができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなるＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１からなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号３からなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号５からなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号７からなるポリペプチドを含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームはまた、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、例えば、表２のＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドも含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１６からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号１８からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、配列番号２０からなるＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソームは、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびリポソームに被包された治療薬を含む。治療薬は、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー）、タンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体、抗原、酵素、もしくは治療用ポリペプチド）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または低分子化合物であり得る。このようなリポソームは融合誘導性であり、リポソーム脂質の細胞膜への融合を介して治療薬を標的細胞、例えばヒト細胞、例えば機能障害性細胞または腫瘍細胞に送達するために使用することができる。
【０２１９】
融合誘導性タンパク質を含むリポソームを作製する方法は、米国特許出願公開公報、例えば米国特許出願公開第２０１４０３１４８３１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１３４２３２号明細書、米国特許出願公開第２００９０２８０１６３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１４２２６７号明細書に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｉｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２３１（３）：２２３−４６；Ｒｉｇａｕｄ  ａｎｄ  Ｌｅｖｙ，２００３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｌｍｏｌ．，３７２：６５−８６；およびＴｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＥＭＢＯ  Ｊ，２４（１７）：２９８０−８などの出版物に概説される発想から導かれる界面活性剤除去法によってリポソーム膜に挿入される。略述すると、精製ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、界面活性剤で懸濁されたＭＩＮＩＯＮポリペプチドを界面活性剤であらかじめ飽和したリポソームと混合した後、界面活性剤を除去することによって、リポソーム中に再構成され得る。ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをリポソーム膜に挿入するプロセスを助けるために、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）が界面活性剤中で使用され得る。使用されるリポソームのサイズおよび種類に基づいて、０〜２．０％の最終体積濃度範囲にわたってリポソーム脂質の溶液にＯＧを徐々に添加することによってＯＧの最適な濃度が決定されるべきである。吸光度をλ６００ｎｍで検出することができ、吸光度対ＯＧ％からプロットが導かれる。最適な濃度は、リポソームの溶解をもたらす臨界ＯＧ濃度の直前である。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、静電相互作用または疎水性相互作用を介してリポソームと会合することができる。例えば、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドの正に荷電したアミノ酸（ＧｌｕまたはＡｓｐ）とリポソームの負に荷電したリン脂質膜との間の静電相互作用により、それらの間で会合をもたらすことができる。
【０２２１】
中性またはアニオン性リポソーム、およびカチオン性脂質は、内容物の宿主細胞への送達を促進することが知られている。これらの化合物は当業者が容易に利用可能であり；例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＲＣＰ  Ｎｅｗ  Ｅｄ，ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照されたい。リポソーム脂質は、カチオン性脂質、合成脂質、糖脂質、リン脂質、コレステロールまたはその誘導体、および当業者に知られる等価な分子を含み得る。アニオン性および中性リポソームは、当技術分野で知られており（例えば、リポソームを作製する方法の詳細な説明についてはＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＲＰＣ  Ｎｅｗ  Ｅｄ，ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照のこと）、広範囲の治療薬を送達するのに有用である。リン脂質は、好ましくは、様々な脂肪性アシル組成を有するホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、カルジオリピンおよびホスファチジルイノシトールを含み得る。
【０２２２】
カチオン性脂質もまた当技術分野で知られており、薬剤および遺伝子送達のために一般的に使用される。このような脂質としては、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）などのコレステロール誘導体が挙げられる。これらのカチオン性脂質の記載は、欧州特許第１８７，７０２号明細書、国際公開第９０／１１０９２号パンフレット、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、国際公開第９１／１５５０１号パンフレット、国際公開第９５／２６３５６号パンフレット、および米国特許第５，５２７，９２８号明細書に見出すことができる。ポリヌクレオチドの送達のためのカチオン性脂質は、好ましくは、例として国際公開第９０／１１０９２号パンフレットに記載されるＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）などの中性脂質と連携して使用される。カチオン性リポソームを含有する製剤は、任意選択により、他のトランスフェクション促進化合物を含有してもよい。それらのいくつかは、国際公開第９３／１８７５９号パンフレット、国際公開第９３／１９７６８号パンフレット、国際公開第９４／２５６０８号パンフレット、および国際公開第９５／０２３９７号パンフレットに記載される。それらは、核膜を介してＤＮＡの輸送を促進するのに有用なスペルミン誘導体（例えば、国際公開第９３／１８７５９号パンフレットを参照のこと）ならびにＧＡＬＡ、グラミシジンＳ、およびカチオン性胆汁酸塩などの膜透過性化合物（例えば、国際公開第９３／１９７６８号パンフレットを参照のこと）を含む。
【０２２３】
単層リポソームは、多層脂質小胞から調製することができる。例えば、ＤＯＰＣ：ＣＯＰＥ：コレステロール：ＤＣ−コレステロールの６０：３０：４：６のモル比の混合物を使用して、多層脂質小胞懸濁液を調製することができる。しかし、一定の状況において、ＰＥ−ＰＥＧ２０００および／またはＤＯＴＡＰを含有する脂質小胞が必要となることがある。多層脂質小胞は、ＦｅｎｓｋｅおよびＣｕｌｌｉｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９１：７−４０によって記載される薄膜法など、当業者に知られているであろういくつかの異なる方法によって調製することができる。
【０２２４】
単層リポソームは、ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃ（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ．Ｏｔｔａｗａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）などの気密性のガラスシリンジを用いる既定のポアサイズのポリカーボネート膜を通す手動の押し出しによって多層脂質小胞から押し出すことができる。この方法では、試料は、２つのシリンジ間で前後に試料を押すことによって膜を通過する。リポソームの特定の直径を得るために、多層脂質小胞懸濁液を、特定の直径のポアサイズを有するフィルターに通過させる。
【０２２５】
リポソームまたはリポソーム組成物の例としては、米国特許第４７８９６３３号明細書；同第４９０２５１２号明細書；同第４９２５６６１号明細書；同第４９８３３９７号明細書；同第５０１３５５６号明細書；同第５２９２５２４号明細書；同第５５３４２４１号明細書；同第５５９３６２２号明細書；同第５６４８４７８号明細書；同第５６７６９７１号明細書；同第５７５６０６９号明細書；同第５８３４０１２号明細書；同第５８４６４５８号明細書；同第５８９１４６８号明細書；同第５９４５１２２号明細書；同第６０４６２２５号明細書；同第６０５７２９９号明細書；同第６０５６９７３号明細書；同第６０７７８３４号明細書；同第６１２６９６６号明細書；同第６１５３５９６号明細書；同第６１９７３３３号明細書；同第６２２８３９１号明細書；同第６３１６０２４号明細書；同第６３８７３９７号明細書；同第６４１７３２６号明細書；同第６４７６０６８号明細書；同第６５８６５５９号明細書；同第６６２７２１８号明細書；同第６７２３３３８号明細書；同第６８９７１９６号明細書；同第６９３６２７２号明細書；同第７３８４９２３号明細書；米国特許出願公開第２００１／００３３８６０号明細書；同第２００１／００３８８５１号明細書；同第２００２／０１３６７０７号明細書；同第２００２／００３４５３７号明細書；同第２００３／０２２４０３７号明細書；同第２００３／０１１３２６２号明細書；同第２００３／００７２７９４号明細書；同第２００３／００８２２２８号明細書；同第２００３／０２１２０３１号明細書；同第２００３／０２０３８６５号明細書；同第２００３／０１７５２０５号明細書；同第２００３／０１６２７４８号明細書；同第２００３／０１３０１９０号明細書；同第２００３／００５９４６１号明細書；同第２００３／０２１５４９０号明細書；同第２００３／０１６６６０１号明細書；同第２００４／００２２８４２号明細書；同第２００４／０１４２０２５号明細書；同第２００４／００７１７６８号明細書；同第２００４／０２３４５８８号明細書；同第２００４／０２１３８３３号明細書；同第２００４／００２９２１０号明細書；同第２００５／０２７１５８８号明細書；同第２００５／０１３６０６４号明細書；および国際特許出願国際公開第９９／３０６８６号パンフレット；国際公開第０２／４１８７０号パンフレット；国際公開第００／７４６４６号パンフレット；国際公開第９６／１３２５０号パンフレット；国際公開第９８／３３４８１号パンフレット；Ａｌｉｍｉｎａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００４）３４（１）：７７−９６；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｌｕｌｏｓ  Ｄ，Ａｌｌｅｎ  Ｔ  Ｍ，Ｇｂｉｚｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．「Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９１）８８：１１４６０−１１４６４；Ａｌｌｅｎ  ＴＭ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｆ  Ｊ．「Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ」Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００４）３１：５−１５（ｓｕｐｐｌ  １３）；Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９８）１５：１５５２−１５５６に記載されるものが挙げられる。
【０２２６】
リポソームの循環半減期を延長し、細網内皮系による取り込みを回避するために、研究者らは、ポリエチレングリコールまたは他の親水性ポリマーの組み込みによって修飾されたリポソーム（例えば、成分脂質の１つ以上がＰＥＧの結合によって修飾されたＰＥＧリポソーム）を開発した。ＰＥＧ修飾リポソームはまた、「遮蔽された」リポソームと呼ばれることも多い。Ｄｏｘｉｌ．ＴＭ．（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤）は、細網内皮系（ＲＥＳ）を回避し、かつ薬物循環時間を延長するために利用される補助的なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を伴う、リポソームに被包されたドキソルビシンである。Ｖａｉｌ  Ｄ  Ｍ，Ａｍａｎｔｅａ  Ｍ  Ａ，Ｃｏｌｂｅｒｎ  Ｇ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．」Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．（２００４）３１（Ｓｕｐｐｌ  １３）：１６−３５を参照されたい。しかしながら、問題として認められた遅延性の血液貯溜（例えば、手足症候群、末梢系におけるＤｏｘｉｌ．ＲＴＭの有害作用など）によって有害作用もまた引き起こされる。
【０２２７】
ＰＥＧ修飾リポソームに加えて、研究者らは、様々な他の脂質を開発した。これらの誘導体化された脂質はまた、リポソームに組み込むことができた。例えば、国際特許出願国際公開第９３／０１８２８号パンフレット；Ｐａｒｋ  Ｙ  Ｓ，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ．「Ｓｏｍｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９９２）１１０８：２５７−２６０；Ａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３２９：３７０−３８２を参照されたい。
【０２２８】
ＰＥＧおよび他の親水性ポリマーによるリポソーム修飾に加えて、研究者らはまた、特定の細胞のための標的化因子（標的化リガンドとも呼ばれる）を組み込むことによって、特定の細胞型を特異的に標的化することを目的とするリポソームを開発した。標的化因子／リガンドの例としては、アシアロ糖タンパク質、葉酸塩、トランスフェリン、抗体などが挙げられる。一部の場合において、成分脂質の１つ以上が標的化因子の結合によって修飾され得る。
【０２２９】
標的化因子を含む脂質組成物の例としては、米国特許第５０４９３９０号明細書；同第５７８００５２号明細書；同第５７８６２１４号明細書；同第６３１６０２４号明細書；同第６０５６９７３号明細書；同第６２４５４２７号明細書；同第６５２４６１３号明細書；同第６７４９，８６３号明細書；同第６１７７０５９号明細書；同第６５３０９４４号明細書；同第７８２９１１３号明細書；同第８７５８８１０号明細書；米国特許出願公開第２００４／００２２８４２号明細書；同第２００３／０２２４０３７号明細書；同第２００３／１４３７４２号明細書；同第２００３／０２２８２８５号明細書；同第２００２／０１９８１６４号明細書；同第２００３／０２２０２８４号明細書；同第２００３／０１６５９３４号明細書；同第２００３／００２７７７９号明細書；国際特許出願国際公開第９５／３３８４１号パンフレット；国際公開第９５／１９４３４号パンフレット；国際公開第２００１０３７８０７号パンフレット；国際公開第９６／３３６９８号パンフレット；国際公開第２００１／４９２６６号パンフレット；国際公開第９９４０７８９号パンフレット；国際公開第９９２５３２０号パンフレット；国際公開第９１０４０１４号パンフレット；国際公開第９２／０７９５９号パンフレット；欧州特許第１３６９１３２号明細書；特開２００１００２５９２号公報；Ｉｉｎｕｍａ  Ｈ，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｏｎ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２００２）９９  １３０−１３７；Ｉｓｈｉｄａ  Ｏ，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ，Ｔａｎａｈａｓｈｉ  Ｈ，Ｉｗａｔｓｕｒｕ  Ｍ，Ｓａｓａｋｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）１８：１０４２−１０４８；Ｈｏｌｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．（１９８９）１６５（３）：１２７２−１２７８；Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）３１（１）：９５−１００；Ｎａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．（１９９９）６（６）：４２７−４３８が挙げられる。
【０２３０】
また、本明細書では、本明細書に記載されるＭＩＮＩＯＮポリペプチドを含むリポソームを細胞と接触させることによって治療薬を細胞（例えば、ヒト細胞、例えば、機能障害性細胞または腫瘍細胞）に送達する方法であって、リポソームが細胞と融合し、それにより治療薬を細胞に送達する方法が提供される。本方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【０２３１】
細胞を融合する方法および治療上の使用
本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド、例えば、表１のＭＩＮＩＯＮポリペプチドを使用して第１の細胞を第２の細胞に融合する方法が提供される。いくつかの実施形態では、このような方法は、（ａ）ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現する第１の細胞をもたらす工程と；（ｂ）第１の細胞を、Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する第２の細胞と接触させる工程であって、第１の細胞が第２の細胞と融合する工程とを含み得る。本方法の工程（ｂ）は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体からなる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、第１の細胞を第２の細胞に融合する方法は、（ａ）ＭＩＮＩＯＮポリペプチド、および同型相互作用を媒介する受容体を発現する第１の細胞をもたらす工程と；（ｂ）第１の細胞を、第１の細胞によって発現されるものと同じ受容体を発現する第２の細胞と接触させる工程であって、第１の細胞が第２の細胞と融合する工程とを含み得る。同型相互作用を媒介する受容体としては、例えば、カドヘリン（例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリン）、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンが挙げられるが、これらに限定されない。本方法の工程（ｂ）は、インビトロまたはインビボで実施することができる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２３５】
これらの方法を使用して、任意の種類の筋細胞、例えば、ヒト筋細胞；または非筋細胞、例えば、ヒト非筋細胞を融合することができる。したがって、第１および第２の細胞は、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞、または腫瘍細胞から選択され得る。いくつかの実施形態では、本方法を使用して、筋細胞または非筋細胞（例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、もしくは樹状細胞）を腫瘍細胞または機能障害性細胞と融合する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、第１の細胞は、検出可能なマーカー、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、発光分子（例えば、ルシフェラーゼ）、放射性分子（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、もしくは３２Ｐ）、またはコロイド金もしくは着色ビーズなどの熱量測定ラベルを発現することができる。検出可能なマーカーを発現する細胞は、顕微鏡法、オートラジオグラフィー、および／または他の画像化方法などの適切な検出方法によって追跡または可視化され得る。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、第１の細胞は、目的の遺伝子を含むことができ、第１および第２の細胞の融合により、目的の遺伝子を第２の細胞に送達する。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、第２の細胞の病理学的表現型を矯正する。いくつかの実施形態では、第２の細胞は、目的の遺伝子を含むことができ、第１および第２の細胞の融合により、目的の遺伝子を第１の細胞に送達する。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、第１の細胞の病理学的表現型を矯正する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子であり、本明細書に記載される方法を使用して、ミトコンドリア性疾患を治療することができる。例えば、病理学的表現型は、ミトコンドリアＤＮＡ欠乏；ミトコンドリア心筋症；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス性てんかん（ＭＥＲＲＦ）；ミトコンドリア心筋症、脳筋症、乳酸性アシドーシス、脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ）；カーンズ−セイアー症候群（ＫＳＳ）；リー症候群（亜急性壊死性脳筋症）および母性遺伝のリー症候群（ＭＩＬＳ）；ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス性てんかん（ＭＥＲＲＦ）；ニューロパチー、運動失調および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）；またはピアソン症候群から選択され得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）をコードする遺伝子であり、本明細書に記載される方法を使用して、遺伝性高チロシン血症Ｉ型を治療することができる。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ジストロフィンをコードする遺伝子であり、本明細書に記載される方法を使用して、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を治療することができる。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ジスフェリンをコードする遺伝子であり、本明細書に記載される方法を使用して、三好ミオパチー（ＭＭ）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、および遠位型ミオパチー（ＤＭ）を治療することができる。
【０２４０】
本明細書に記載される組成物および方法を使用して、癌、例えば、頭頸部癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、脳癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、リンパ腫、または白血病を治療することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、未分化多形肉腫、または滑膜肉腫から選択される肉腫を治療することができる。
【０２４１】
腫瘍溶解性ウイルスを使用して癌を治療する方法
本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス、例えば、腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することによって、対象における癌を治療する方法が提供される。代替的な実施形態において、本明細書では、癌の治療において使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス、例えば、腫瘍溶解性ウイルスが提供される。融合誘導性タンパク質をコードするウイルスによる細胞の感染は、広範囲の多核シンシチウム形成を引き起こし、ウイルスによって形質導入された細胞の面積および数を効率的に増加させることができる（Ｗｏｎｇ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５１５１６，Ｍａｒｃｈ  １７，２０１６）。融合している細胞の細胞質内容物の混合は、ベクター内にコードされた任意の遺伝子産物が、融合細胞に融合される全ての細胞に効率的に移行することを意味する。さらに、融合誘導性タンパク質は、融合のプロセスが最終的に細胞機能を損ない、細胞死を誘導するため、効果的な単剤療法として作用することができる。腫瘍溶解性ウイルスとの関係においては、ウイルスの放出をもたらす通常の腫瘍細胞溶解に加えて、感染細胞は、直接的な細胞−細胞融合を介してその感染性のペイロードを広めることができる（Ｗｏｎｇ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５１５１６，Ｍａｒｃｈ  １７，２０１６）。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、対象において癌を治療する方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与する工程を含み得る。代替的な実施形態において、本明細書では、対象における癌の治療で使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供され、ここで、有効量の腫瘍溶解性ウイルスが対象に投与される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体からなる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、対象において癌を治療する方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与する工程を含み得る。代替的な実施形態において、本明細書では、対象における癌の治療で使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供され、ここで、有効量の腫瘍溶解性ウイルスが対象に投与される。同型相互作用を媒介する受容体としては、例えば、カドヘリン（例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリン）、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２４６】
好適な腫瘍溶解性ウイルスは当技術分野で知られており、例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるＫａｕｆｍａｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１５；１４（９）：６４２−６６２に記載されるものがある。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは癌細胞を特異的に標的化し、例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に影響を及ぼさないか、または最小限の影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞において選択的に複製する。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞において選択的に複製することができ、かつ選択的に癌細胞の死を誘発するか、または選択的に癌細胞の増殖を遅くすることができる。腫瘍溶解性ウイルスとしては、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性アデノ随伴ウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性ポックスウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性コクサッキーウイルス、腫瘍溶解性エンテロウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、または腫瘍溶解性マラバウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４号明細書に記載のものなどの組換え体腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４号明細書に記載されるとおりの、免疫反応または炎症反応の阻害因子をコードする核酸配列（例えば、異種核酸配列）を含む。実施形態において、組換え体腫瘍溶解性ウイルス、例えば、腫瘍溶解ＮＤＶは、アポトーシス促進タンパク質（例えば、アポプチン）、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、インターフェロンγ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α）、免疫グロブリン（例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン（ｆｉｒｂｏｎｅｃｔｉｎ）に対する抗体）、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質（例えば、ＮＤＶ  ＨＮタンパク質およびＣＤ３もしくはＣＤ２８などのＴ細胞共刺激性受容体に対する二特異性抗体または抗体断片；またはヒトＩＬ−２およびＮＤＶ  ＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質）を含む。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるＺａｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７．３（２０１２）：３４７−６７を参照されたい。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８５９１８８１Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２２１８５Ａ１号明細書または米国特許出願公開第２０１４／０２７１６７７Ａ１号明細書に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞において排他的に複製するように設計される、条件的複製アデノウイルス（ＣＲＡｄ）を含む。例えば、Ａｌｅｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（２０００）：７２３−２７を参照されたい。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、全体として参照により本明細書に組み込まれるＡｌｅｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の７２５頁の表１に記載されるものを含む。
【０２４９】
例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、以下の：
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス（ＣｏｌｏＡｄ１）（ＰｓｉＯｘｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．）（例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０２０５３２２０を参照のこと）；
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ−１０２（旧称：ＣＧＴＧ−１０２）（Ｏｎｃｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１５９８１２９を参照のこと）；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝的に改変された腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ−０１（ＶＣＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓ．Ｌ．）（例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０２０４５６０２およびＮＣＴ０２０４５５８９を参照のこと）；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路が調節異常である癌細胞において選択的に複製されるように改変された、野生型ヒトアデノウイルス血清型５（Ｈａｄ５）に由来するウイルスである、条件的複製型アデノウイルスであるＩＣＯＶＩＲ−５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃａｔａｌａ  ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８６４７５９を参照のこと）；
腫瘍溶解性アデノウイルスであるＩＣＯＶＩＲ５を感染させた骨髄由来の自己間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むＣｅｌｙｖｉｒ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ  Ｎｉｎｏ  Ｊｅｓｕｓ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ／  Ｒａｍｏｎ  Ａｌｅｍａｎｒｙ）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８４４６６１を参照のこと）；
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが、必須のＥ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それにより、ウイルスの複製および細胞毒性をＲｂ経路欠損腫瘍細胞に制限する、条件的複製型腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）である、ＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ  Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２１４３８０４を参照のこと）；または
網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路欠損細胞において選択的に複製され、ある種のＲＧＤ結合インテグリンを発現する細胞により効率的に感染するように遺伝子操作されたアデノウイルスである、ＤＮＸ−２４０１（旧称：Ｄｅｌｔａ−２４−ＲＧＤ）（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ｎａｖａｒｒａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ｎａｖａｒｒａ／ＤＮＡｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１９５６７３４を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、検出可能なマーカー、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、発光分子（例えば、ルシフェラーゼ）、放射性分子（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、もしくは３２Ｐ）、またはコロイド金もしくは着色ビーズなどの熱量測定ラベルを発現することができる。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスは、注射、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内、経皮的、経粘膜的、経口的、鼻腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは腹腔内、または経肺投与を介して投与される。
【０２５２】
癌ワクチンおよび治療上の使用
腫瘍−樹状細胞ヘテロカリオンに基づく癌ワクチンは、クラスＩとクラスＩＩのＭＨＣの両方を介する腫瘍抗原の提示が亢進することによって強力に免疫を誘導することができ（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７，３：５５８−５６１、この内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）、Ｍｉｎｉｏｎ／ＭｙｏｍｅｒｇｅｒとＭｙｏｍａｋｅｒの共発現により、これらの複合型を形成する効率を劇的に向上させることができた。
【０２５３】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む樹状−腫瘍融合細胞を含む癌ワクチンが提供される。代替的な実施形態において、本明細書では、対象における癌の治療で使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む樹状−腫瘍融合細胞を含む癌ワクチンが提供され、ここで、有効量の癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む樹状−腫瘍融合細胞を含む癌ワクチンが提供される。代替的な実施形態において、本明細書では、対象における癌の治療で使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む樹状−腫瘍融合細胞を含む癌ワクチンが提供され、ここで、有効量の癌ワクチンが対象に投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体からなる。
【０２５６】
同型相互作用を媒介する受容体としては、例えば、カドヘリン（例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリン）、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５７】
癌ワクチンとしての樹状−腫瘍融合細胞を作製する方法は、当技術分野で知られている。例えば、樹状細胞（ＤＣ）および全腫瘍細胞を、化学的、物理的または生物学的手段によって融合することにより、樹状細胞に由来するＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、および共刺激性分子ならびに全腫瘍に由来する腫瘍関連抗原を含むヘテロカリオンを作製する。例えば、内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＫｏｉｄｏ，Ｓ．；Ｏｈａｎａ，Ｍ．；Ｌｉｕ，Ｃ．；Ｎｉｋｒｕｉ，Ｎ．；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｊ．；Ｌｅｒｎｅｒ，Ａ．；Ｇｏｎｇ，Ｊ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１１３，２６１−２６９；Ｇｏｎｇ，Ｊ．；Ｋｏｉｄｏ，Ｓ．；Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ，Ｓ．Ｋ．Ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ：Ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２００８，７，１０５５−１０６８；Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｍ．；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｋ．；Ｏｈｋｕｓａ，Ｔ．；Ｋｏｉｄｏ，Ｓ．Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｕｍｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ−Ｐａｓｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１５，７，１１１１−１１２２；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｋ．；Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｍ．；Ｉｔｏ，Ｚ．；Ｏｈｋｕｓａ，Ｔ．；Ｇｏｎｇ，Ｊ．；Ｋｏｉｄｏ，Ｓ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｔｕｍｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．２０１５，１９，１６９−１７４を参照されたい。ＤＣ−腫瘍融合アプローチは、抗腫瘍免疫反応を誘導するために以下の利点を提供する：（１）ＤＣ−腫瘍ＦＣは、全腫瘍に由来する抗原性ペプチドを提示し、個々の患者に対する抗原性ペプチドを同定する必要性を回避し；（２）広範な既知および未同定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をＤＣ−腫瘍ＦＣの表面上に同時に提示することができ、ポリクローナルな抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の発生頻度を増大させ、長期の効率的な抗腫瘍免疫をもたらし；（３）多数のＴＡＡが共刺激分子との関係において提示され、耐性誘導を防ぎ、効率的な抗腫瘍免疫反応をもたらし；かつ（４）ＤＣ−腫瘍ＦＣが流入領域リンパ節に移動し、リンパ節のＴ細胞領域においてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞とクラスターを形成し、その結果ＤＣ−腫瘍ＦＣは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するために外因性のＴＡＡを取り入れる必要がない。内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＫｏｉｄｏ  Ｓ．，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−Ｔｕｍｏｒ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１６，１７，８２８を参照されたい。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、樹状−腫瘍融合細胞は、樹状細胞と腫瘍細胞を融合させることによって作製されるが、一方で、樹状細胞と腫瘍細胞の融合は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの発現によって促進される。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、樹状細胞が、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含み、かつ腫瘍細胞が、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含むか、または逆もまた同様である。
【０２５９】
樹状細胞および／または腫瘍細胞は、自己または同種であり得る。例えば、同種のＤＣ−腫瘍ＦＣワクチンを作製するための同種のＤＣの入手先としての健常ドナー由来のＤＣの使用が調査された。例えば、内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＫｏｉｄｏ，Ｓ．；Ｈａｒａ，Ｅ．；Ｈｏｍｍａ，Ｓ．；Ｏｈｋｕｓａ，Ｔ．；Ｇｏｎｇ，Ｊ．；Ｔａｊｉｒｉ，Ｈ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００９，１，４９−６２を参照されたい。あるいは、同種の腫瘍細胞株が、自己腫瘍細胞の代わりに使用されて、自己の腫瘍特異的な抗腫瘍免疫反応が誘導された。例えば、内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＫｏｉｄｏ，Ｓ．；Ｈａｒａ，Ｅ．；Ｈｏｍｍａ，Ｓ．；Ｔｏｒｉｉ，Ａ．；Ｔｏｙａｍａ，Ｙ．；Ｋａｗａｈａｒａ，Ｈ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．；Ｙａｎａｇａ，Ｋ．；Ｆｕｊｉｓｅ，Ｋ．；Ｔａｊｉｒｉ，Ｈ．；ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，１１，７８９１−７９００；Ｋｏｉｄｏ，Ｓ．；Ｔａｎａｋａ，Ｙ．；Ｔａｊｉｒｉ，Ｈ．；Ｇｏｎｇ，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７，２５，２６１０−２６１９；Ｋｏｉｄｏ，Ｓ．；Ｈａｒａ，Ｅ．；Ｈｏｍｍａ，Ｓ．；Ｎａｍｉｋｉ，Ｙ．；Ｋｏｍｉｔａ，Ｈ．；Ｔａｋａｈａｒａ，Ａ．；Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｍ．；Ｓａｇａｗａ，Ｙ．；Ｍｉｔｓｕｎａｇａ，Ｍ．；ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ−ｖｅｒｓｕｓ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０，１３５，３８４−４００を参照されたい。さらに、同種のＤＣ株および同種の腫瘍細胞株を自己の細胞の代わりに使用してもよい。細胞株は十分に特徴付けがなされており、ＧＭＰ基準下でインビトロにおいて十分に増殖させることができる。十分な同種成分を有するＤＣ−腫瘍ＦＣワクチンは、臨床効果を誘導することが実証されている。内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＭａｅｒｔｅｎ，Ａ．；Ｒｅｎｏｔｈ，Ｓ．；Ｈｅｉｎｉｃｋｅ，Ｔ．；Ａｌｂｅｒｓ，Ｐ．；Ｐａｕｌｉ，Ａ．；Ｍｅｙ，Ｕ．；Ｃａｓｐａｒｉ，Ｒ．；Ｆｌｉｅｇｅｒ，Ｄ���；Ｈａｎｆｌａｎｄ，Ｐ．；ｖｏｎ  Ｒｕｅｃｋｅｒ，Ａ．；ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３，１４，４８３−４９４を参照されたい。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ＤＣは免疫調節され得るが、例えば、腫瘍細胞に融合される前にトール様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニストによって処理される。いくつかの実施形態では、ＤＣは、免疫原性の腫瘍細胞、例えば、加熱またはエタノールにより処理された腫瘍細胞に融合され得る。いくつかの実施形態では、ＤＣと免疫原性の全腫瘍細胞の融合が、高レベルのＩＦＮ−γを産生する抗原特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、ＤＣは、癌幹細胞（ＣＳＣ）に融合され得る。例えば、ＤＣは、ＯＣＴ３／４、ＡＢＣＧ２、ネスチン、ＳＯＸ２、Ｂｍｉ−１、ノッチ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、およびＣＤ１７７を含む１つ以上の幹細胞マーカーを発現するＣＳＣに融合され得る。いくつかの実施形態では、ＤＣは、サバイビン、ＭＵＣ１、ｈＴＥＲＴ、ＨＥＲ２、ＣＥＲＰ５５、ＣＯＡ−１、またはＷＴ１を過剰発現するＣＳＣに融合され得る。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、樹状−腫瘍融合細胞は、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む。例示的な腫瘍関連抗原としては、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソセリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＣＴ９、ＣＴ１０、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、β−カテニン、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、Ｂメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ）、ＣＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−６、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、肉腫抗原１（ＳＡＧＥ−１）、ＸＡＧＥ−１、ＸＡＧＥ−２、ＸＡＧＥ−３、Ｒａｓ、ｐ５３などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６３】
さらに、本明細書に開示される癌ワクチンを用いて対象における癌を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される癌ワクチンは、注射、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される癌ワクチンは、腫瘍内、経皮的、経粘膜的、経口的、鼻腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは腹腔内、または経肺投与を介して投与される。
【０２６４】
筋ジストロフィーを治療する方法
本明細書で開示される組成物および方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋強直性筋ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（Ｏｃｕｌｏｐｈａｒｎｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＯＭＤ）、三好ミオパチー（ＭＭ）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、遠位型ミオパチー（ＤＭ）などの筋ジストロフィーを治療するために使用され得る。ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおける初期の研究は、筋系列または造血系列のいずれかから生じる外因的に送達された細胞が、細胞融合を介する筋線維形成に寄与できたことを示唆した（Ｇｕｓｓｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９９，４０１：３９０−３９４；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ｔｏ  ａ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９９５，１０８（Ｐｔ  １）：２０７−２１４）。Ｍｙｏｍａｋｅｒの同定が細胞ベースの療法における融合誘導性の可能性を増大させる契機となり、それによって、それらの療法の補完の可能性が増大した。線維芽細胞および間葉系幹細胞など非筋由来細胞を利用する研究は、Ｍｙｏｍａｋｅｒの過剰発現が、インビボにおいてこれらの細胞の筋への融合を促進できたことを実際に実証した（Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｙｏｍａｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０１７，３１：４００−４１１）。
【０２６５】
したがって、本明細書では、本明細書で開示される組成物を用いて対象における筋ジストロフィーを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象において筋ジストロフィーを治療する方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の治療用細胞を対象に投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、対象において筋ジストロフィーを治療する方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸およびＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の治療用細胞を対象に投与する工程を含み得る。代替的な実施形態において、本明細書では、対象における筋ジストロフィーの治療で使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および／またはＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸を含む治療用細胞が提供され、ここで、有効量の治療用細胞が対象に投与される。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、配列番号１６またはその変異体からなる。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、対象において筋ジストロフィーを治療する方法は、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む有効量の治療用細胞を対象に投与する工程を含み得る。代替的な実施形態において、本明細書では、対象における筋ジストロフィーの治療で使用するためのＭＩＮＩＯＮポリペプチドをコードする核酸および同型相互作用を媒介する受容体をコードする核酸を含む治療用細胞が提供され、ここで、有効量の治療用細胞が対象に投与される。同型相互作用を媒介する受容体としては、例えば、カドヘリン（例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、またはＭ−カドヘリン）、セレクチン、クローディン、オクルーディン、接合部接着分子、またはトリセルリンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはその変異体から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号１またはその変異体からなる。いくつかの実施形態では、ＭＩＮＩＯＮポリペプチドは、配列番号３またはその変異体からなる。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、治療用細胞は、目的の遺伝子、例えば、機能障害性細胞において変異した遺伝子の正常なバージョンを、機能障害性細胞に導入し、それにより、機能障害性細胞における遺伝的異常を矯正することによって、機能障害性細胞の機能を回復させる場合がある。例えば、治療用細胞は、ジストロフィン遺伝子の正常なバージョンを含有し得る。治療用細胞は、自己または同種であり得る。治療用細胞が自己である実施形態では、治療用細胞の遺伝的異常は、当技術分野で知られる様々な遺伝子編集システムによって矯正され得る。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子編集システム」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインもしくは成分および１つ以上のＤＮＡ改変ドメインもしくは成分、または単離核酸、例えば、前記ＤＮＡ結合およびＤＮＡ改変ドメインもしくは成分をコードする１つ以上のベクターを含むシステムを指す。遺伝子編集システムは、標的遺伝子の核酸を改変するため、および／または標的遺伝子の発現を調節するために使用される。既知の遺伝子編集システムにおいて、例えば、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインまたは成分は、１つ以上のＤＮＡ改変ドメインまたは成分と関連付けられており、その結果、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインが、１つ以上のＤＮＡ改変ドメインまたは成分を特定の核酸部位に標的化する。
【０２７０】
遺伝子編集システムは当技術分野で知られており、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム、およびメガヌクレアーゼシステムを含むが、これらに限定されない。理論に束縛されるものではないが、既知の遺伝子編集システムは、治療的適用においてそれらの有用性にとって有害な望まれないＤＮＡ改変活性を示す場合があると考えられる。これらの懸念は、例えば、細胞をレンチウイルスまたはアデノウイルスベクタートランスフェクションを介するなどして遺伝子操作して、遺伝子編集システムの成分を構成的に発現する場合など、遺伝子または遺伝子発現のインビボ改変のための遺伝子編集システムの使用において特に明白である。
【０２７１】
本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ」は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列のセット、またはこのような反復配列のセットを含むシステムを指す。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲに関連付けられたタンパク質を指す。多様なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを、それらのエフェクターモジュールの構成に従って２つのクラスに分けることができる：クラス１  ＣＲＩＳＰＲシステムは、いくつかのＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡを利用して、エフェクター複合体を形成する一方で、クラス２  ＣＲＩＳＰＲシステムは、干渉を媒介するｃｒＲＮＡと組合わせた大きな単一成分のＣａｓタンパク質を使用する。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一例は、Ｃｐｆ１（プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１由来のＣＲＩＳＰＲ）を使用する。例えば、その全体が参照として本明細書に組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６３：７５９−７７１（２０１５）を参照されたい。本明細書で使用する場合、用語「Ｃｐｆ１」は全てのオルソログ、およびＣＲＩＳＰＲシステムにおいて使用できる変異体を含む。
【０２７２】
治療用細胞は、機能障害性細胞と同じまたは異なる細胞型であり得ると考えられる。例えば、治療用細胞は、筋芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、もしくは平滑筋細胞などの筋細胞；または線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞などの非筋細胞などであり得る。
【０２７３】
細胞運命およびリプログラミングを研究する方法
本明細書で開示される方法および組成物はさらに、細胞運命およびリプログラミングを研究、例えば、細胞分化中に発現されるか、または阻害される遺伝子を同定するために使用され得る。体細胞核リプログラミングの初期の研究は、ヘテロカリオン形成を誘導するためのＰＥＧ処理などの化学的方法に依存した（内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＢｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｃａｒｙｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  １９８３，３２：１１７１−１１８０）。条件的／誘導型の系を介するＭｙｏｍａｋｅｒおよびＭＩＮＩＯＮの一過性の発現は、はるかに高度な融合の制御を可能にすることになり、核リプログラミングの経時的な動態に洞察をもたらすと考えられる。
【０２７４】
したがって、本明細書で開示される方法および組成物は、第１の細胞と第２の細胞を融合して安定したヘテロカリオン作製するために使用され得、ここで、第１の細胞は第２の細胞によってリプログラミングされるが、例えば、第１の細胞における１つ以上の遺伝子の発現が第２の細胞によって調節される。いくつかの実施形態では、第１および第２の細胞は、筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞、肝細胞、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、樹状細胞、または腫瘍細胞から選択され得る。いくつかの実施形態では、第１の細胞および第２の細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタなどの様々な種に由来する。いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、融合前の第１の細胞の遺伝子発現プロファイルを安定したヘテロカリオンのものと比較することによって、調節される１つ以上の遺伝子を同定する工程を含み得る。
【０２７５】
医薬組成物
また、本明細書では、組成物、例えば、本明細書に記載される１種以上のＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、１種以上のヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）をコードする１種以上の核酸、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上のリポソーム、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上の治療用細胞、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上の腫瘍溶解性ウイルス、またはＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上の癌ワクチンを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は通常、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、薬剤の投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。医薬組成物は通常、その目的の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内）、経口、頭蓋内、髄腔内、鼻腔内（例えば、吸入）、皮内、皮下、または経粘膜の投与が挙げられる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの塩または電解質、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含む１種以上の薬学的に許容される担体を含む。
【０２７７】
好適な医薬組成物を製剤化する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２１ｓｔ  ｅｄ．，２００５；およびｔｈｅ  ｂｏｏｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ）を参照されたい。例えば、非経口、皮内、髄腔内、または皮下用途に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの浸透圧の調整用薬剤を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入され得る。
【０２７８】
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散体、および注射用滅菌溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末を含み得る。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合について、組成物は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度の流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）など）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【０２７９】
注射用滅菌溶液は、必要に応じて上掲の成分の１つまたは組合わせによる適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後滅菌濾過を施すことにより調製することができる。
【０２８０】
一般に、分散体は、塩基性分散媒体および上掲の成分由来の必要な他の成分を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分と任意の追加の所望成分の粉末を、予め滅菌濾過されたそれらの溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライである。
【０２８１】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入または負荷ボーラス用量に続いて維持用量であり得る。これらの組成物は特定の固定または可変的な間隔、例えば１日に１回、または「必要に応じた」原則で投与することができる。
【０２８２】
注射用の好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。抹消投与用の製剤は、滅菌水性溶液または滅菌非水性溶液、懸濁液、および乳剤を含む。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、例えば、水、アルコール性／水性溶液、乳剤または縣濁液を含み、生理食塩水および緩衝媒体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の生理食塩水を含む。他の一般的な非経口溶媒としては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内溶媒は、流体および栄養素補充液、電解質補充液、例えば、リンゲルデキストロースに基づくものなどを含む。保存剤および他の添加剤、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどもまた、存在してもよい。
【０２８３】
経口組成物は通常、不活性希釈剤または可食性の担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、うがい薬として使用するために、流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または同様な性質の化合物：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ着香料を含有することができる。
【０２８４】
吸入による投与のために、化合物を、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器またはディスペンサーまたはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達することができる。このような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されるものを含む。本明細書に記載される治療用化合物の全身投与は、経粘膜または経皮的な手段によることもできる。経粘膜または経皮投与のために、バリアを透過するために適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー剤または坐剤の使用により遂行することができる。経皮投与のためには、活性化合物が、当技術分野で一般的に知られている軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【０２８５】
一実施形態では、治療用化合物は、埋め込みおよびマイクロカプセル化された送達システムを含む制御放出製剤などの、身体からの急速な排出に対して治療用化合物を保護することになる担体を用いて調製される。
【０２８６】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与のための指示書と合わせて含まれ得る。
【０２８７】
非限定的な例において、少なくとも１種の医薬品を含有する医薬組成物が、液剤（例えば、熱硬化性液剤）として、固体の構成要素（例えば、粉末または生分解性生体適合性ポリマー（例えば、カチオン性生分解性生体適合性ポリマー））として、またはゲルの構成要素（例えば、生分解性生体適合性ポリマー）として製剤化される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の医薬品を含有する少なくとも組成物が、アルギン酸塩ゲル（例えば、アルギン酸ナトリウム）、セルロース系ゲル（例えば、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシエチルセルロース）、またはキトサン系ゲル（例えば、キトサングリセロホスフェート）の群から選択されるゲルとして製剤化される。本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを製剤化するために使用され得る薬物溶出性ポリマーの追加の非限定的な例としては、カラゲニン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコールと組合わされたデキストラン、ポリアクリル酸と組合わされたデキストラン、ポリガラクツロン酸、ガラクツロン多糖、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｓａｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリグリコール酸、タマリンドガム、キサンタムガム、セルロースガム、グアーガム（カルボキシメチルグアー）、ペクチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、Ｎ−イソプロピルポリアクリルアミド、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、プルロン酸、ポリ乳酸、シクロデキストリン、シクロアミロース、レジリン、ポリブタジエン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル、ポリデプシペプチド、ポリヒドロキシブチレート、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリエチレングリコール、ポリオルガノホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリビニルピロリドン、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ酸無水物、ポリサイラミン、ポリＮ−ビニルカプロラクタム、およびジェランが挙げられる。
【０２８８】
「有効量」は、有利なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成するものである。この量は、疾患または疾患症状の発症を予防するのに必要な量である予防有効量と同じであっても、異なってもよい。有効量を１回以上の投与、適用または投薬において投与することができる。治療用化合物の治療有効量（すなわち、有効な投与量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、１日当たり１回以上から、１日おきに１回を含む１週間当たり１回以上投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、一定の因子が対象を効果的に治療するのに必要な投与量および時機に影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本明細書に記載の治療用化合物による対象の治療は、１回の治療または一連の治療を含み得る。
【０２８９】
治療用化合物の投与量、毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物における、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％において致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用されることもあるが、感染されていない細胞を損傷する可能性を最小化して、それにより、副作用を低減するために、このような化合物を罹患した組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意が払われるべきである。
【０２９０】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを使用して、ヒトで使用するための投与量の範囲を製剤化することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法で使用される任意の化合物のために、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環する血漿中の濃度範囲を達成するように、動物モデルで製剤化され得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０２９１】
キット
また、本明細書に記載される１種以上のＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、１種以上のヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）をコードする１種以上の核酸、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上のリポソーム、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上の細胞、ＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上の腫瘍溶解性ウイルス、またはＭＩＮＩＯＮポリペプチド（例えば、ヒトＭＩＮＩＯＮポリペプチド）を含む１種以上の癌ワクチン、および使用のための指示書を含むキットが提供される。使用のための指示書は、疾患の診断または治療のための指示書を含み得る。本明細書で提供されるキットは、本明細書で記載される方法のいずれかに従って使用され得る。当業者は、本明細書で提供されるキットについて他の好適な用途を知っており、キットをそのような用途に用いることができるであろう。本明細書で提供されるキットはまた、分析用試料を、例えば研究室に返送するため使用することができる郵送用容器（例えば、郵便料金支払い済みの封筒または郵送パック）を含むことができる。キットは、試料のための１つ以上の容器を含むことができ、すなわち、試料は、標準的な血液収集バイアル中にあり得る。キットは、１つ以上のインフォームドコンセント用紙、試験要求用紙、および本明細書に記載される方法においてキットをどのように使用するかについての指示書を含むことができる。このようなキットを使用するための方法も本明細書に含まれる。１つ以上の用紙（例えば、試験要求用紙）および試料を保存する容器を、例えば、試料を提供した対象を同定するためのバーコードでコード化することができる。
【０２９２】
当業者は、本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の多くの方法および材料を認識し、それらを本発明の実施で使用することができるであろう。実際に、本発明は、記載された方法および材料に一切限定されることはない。
【実施例】
【０２９３】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は請求項に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２９４】
実施例１：材料および方法
以下の材料および方法は、実施例２〜６において使用される。
【０２９５】
動物
全ての動物実験はＧＮＦ  ＩＡＣＵＣによって承認されており、承認されたガイドラインに従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを自社での飼育により入手した。自社内で作製された遺伝子操作されたマウスに関する詳細については、後の「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集によるＭＩＮＩＯＮノックアウトマウスの作製」の項を参照されたい。
【０２９６】
心臓毒（ＣＴＸ）損傷モデル
心臓毒（ＣＴＸ）損傷モデルは、マウス骨格筋再生を研究するための十分に確立されたモデルである。ナジャ・モザンビカ・モザンビカ（Ｎａｊａ  ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ  ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）由来のＣＴＸ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ９７５９）を生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖのＮａＣｌ）中に溶解させて、１０μＭの標準溶液を作製し、これを等分し、−２０℃で保存した。イソフルラン（酸素中１．５％〜２％）によるマウスの麻酔後、成体マウスの後肢（８〜１０週のＣ５７ＢＬ／６）の前側面を７０％エタノールで滅菌し、剪毛して肌を暴露させ、約５０μＬのＣＴＸ溶液を前脛骨（ＴＡ）の筋腹中央部に０．３ｍｌ  Ｕ１００  ＢＤインスリンシリンジを用いて注射した。ＴＡ筋を採取し、ＣＴＸ後の様々な時点で調べた。ＣＴＸ注射をしていないか、または同量の生理食塩水を注射した同様の週齢の成体マウスを対照として使用した。
【０２９７】
マウス骨格筋のＲＮＡシーケンシング
１２匹の８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、上述のようにＣＴＸでＴＡ筋に注射し、それらのＴＡ筋を、ＣＴＸ注射後１、３、５、７日目に各時点につき３匹のマウスでそれぞれ採取した。３匹の８〜１０週齢の未損傷マウスのＴＡ筋もまた採取した。各筋試料の総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １５５９６０２６）によって製造業者の指示書に従って単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムによって精製した。ＲＮＡ試料（各時点につき３つの複製物）を、品質検査、ライブラリー調製、および次世代シングルリードシーケンシングのための社内のシーケンシングおよび発現解析中核（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ）に渡した。１マイクログラムの総ＲＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合性のシーケンシングライブラリーを作製し、ライブラリーを５０ｂｐのシングルリードを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  １０００上で配列決定した。リードをマウスのトランスクリプトーム（２０１３年３月時点のＲｅｆｓｅｑマウス転写物）にＢＷＡ（Ｈ．  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４，２００９）を用いてアラインメントした。１試料当たり平均で３６００万個のリードをマウスのトランスクリプトームにマッピングした。生データを解析するために、１００万のマッピングされたリード当たりの転写物のキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）を各時点の各遺伝子について算出し、ＣＴＸ後１、３、５、７日の各遺伝子のＲＰＫＭを未損傷筋のものに正規化し、結果を平均して発現レベルの倍率変化を生成した。次に、データを２つの方法で解析した：１）未損傷筋と比較してＣＴＸ後３日目の筋において１００倍超の増加を示した遺伝子を選択した；２）１００コドン未満のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有すると推定される遺伝子を選択した。次に、両基準を満たす遺伝子を選択し、さらに、未分化および分化初代筋芽細胞およびＣ２Ｃ１２不死化筋芽細胞由来の内製のＲＮＡ−Ｓｅｑデータに対して検討した。ｓＭＩＮＩＯＮは、動的に発現しただけでなく、未分化および分化筋芽細胞試料間で１０倍を超える倍率変化を示したごく小さなＯＲＦであった。
【０２９８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集によるＭＩＮＩＯＮノックアウトマウスの作製
４週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを５ＩＵの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）の腹腔内注射の後、４７時間後の５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の注射によって過剰排卵させた。ＨＣＧ注射の直後に雌マウスを１：１でＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスと交配した。翌朝、雌を交尾栓および交尾栓を持つ雌の輸卵管から採取した接合体について確認した。インビトロで転写されたＣａｓ９のｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）と２種のｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）を、受精した接合体の前核に同時注入した。注入処置を生き延びた接合体を（５０〜６０胚／輸卵管）の偽妊娠ＩＣＲ受容雌の１つの輸卵管に移植した。注入された胚から作製されたマウスの遺伝子型を同定し、配列決定して（後述のゲノム改変のためのアッセイを参照のこと）、ＭＩＮＩＯＮのゲノム領域内での変異の存在を判定した。次に、変異体を樹立した動物をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに交配し、子孫を生殖細胞系列伝達について解析した。
【０２９９】
インビトロで転写されたＣａｓ９のｍＲＮＡを作製するために、１０ｂｐのスペーサーとＴ７プロモーターを、内製のコンストラクト（ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ）からのＰＣＲ増幅によってストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のコード領域に付加し、増幅されたゲル精製Ｃａｓ９のＰＣＲ産物を、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  ＵＬＴＲＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるインビトロ転写のための鋳型として使用した。インビトロ転写されたｇＲＮＡを作製するために、最初に２つのオリゴヌクレオチドを合成した（ＩＤＴ）：
オリゴヌクレオチド１：
５’  ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−（ｇＲＮＡ  プロトスペーサー）−ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＧ
（それぞれ、配列番号６７および９５）
オリゴヌクレオチド２：
【化１】
2020500020.tif 000016
。
【０３００】
オリゴヌクレオチドのアニーリング後のＰＣＲ増幅の後に、５’末端に追加の「Ｇ」を有するＴ７プロモーター（オリゴヌクレオチド１を参照）をｇＲＮＡに付加した。増幅されたゲル精製ｇＲＮＡのＰＣＲ産物を、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるインビトロ転写の鋳型として使用した。Ｃａｓ９のｍＲＮＡとｇＲＮＡの両方を、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて精製し、ＲＮａｓｅフリー水に溶出した。マウスＭＩＮＩＯＮのＯＲＦ領域を標的化するｇＲＮＡのプロトスペーサー配列は次のとおりである：ｓｇＲＮＡ１：５’  ＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＧ（配列番号６９）；ｓｇＲＮＡ２：５’  ＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧ（配列番号７０）１３５ｂｐ欠失アレルの作製用；ｓｇＲＮＡ３：５’  ＧＧＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号１０４）；およびｓｇＲＮＡ４：５’  ＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧ（配列番号１０５）１５５ｂｐ欠失アレルの作製用。
【０３０１】
ゲノム改変および遺伝子型同定のためのアッセイ
注入された胚から生じるマウスにおける変異を検出するために、標的化された領域に隣接するプライマー：Ｓｅｑ−Ｆ：５’  ＦＧＡＧＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣ（配列番号７１）；Ｓｅｑ−Ｒ：５’  ＧＣＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧ（配列番号７２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示書に従ってＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおいて使用した。次に、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、選択された産物をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ−クローニングベクターにクローン化し、配列決定した。標的領域に変異を含有するマウスを交配して、生殖細胞系列伝達を確認した。変異を有するマウス系統の中で、ＭＩＮＩＯＮのＯＲＦ内に１３５ｂｐのインフレーム欠失を有するものをさらなる分析のために選択した。
【０３０２】
１３５ｂｐ欠失を有する次の子孫の遺伝子型同定のために、標的化される領域に隣接するプライマーセット：Ｆ０：５’−ＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧ−３’（配列番号７３）；Ｒ０：５’−ＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号７４）を使用して、ゲノムＤＮＡを増幅し、非改変アレル由来の約７６０ｂｐの産物および変異したアレル由来の約６２５ｂｐの産物をそれぞれ作製した。１５５ｂｐ欠失アレルを保有する子孫の遺伝子型同定のために、異なるプライマーセット：Ｆｗｄ−２：５’  ＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧ（配列番号１０６）；およびＲｅｖ−２：５’  ＴＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣ（配列番号１０７）を使用してゲノムＤＮＡを増幅し、非改変アレル由来の約５５５ｂｐの産物および変異体アレル由来の約４００ｂｐの産物をそれぞれ作製した。ＰＣＲ産物を、２％アガロース（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５３９）を用いるゲル電気泳動によって分離した。野生型マウスが、より大きなサイズの単一バンドを示す一方で、欠失を含有するホモ接合体は、より小さいサイズの単一バンドを示し、ヘテロ接合体は両方のバンドを示す。
【０３０３】
筋芽細胞の単離
マウス胚性筋芽細胞の単離のために、妊娠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを人道的に安楽死させ、その胚を迅速ではあるが丁寧に解剖し、１×抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ  １５２４００６２）を含むハムのＦ１０栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ  １１５５００４３）を含有する解剖緩衝液中に置いた。各胚について、遺伝子型同定用の番号付けしたチューブに尾部を保存し、一方で全ての四肢については、皮をはぎ、解剖し、４ｍｇ／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＬＳ００４１７６；使用前に新たに作製され、濾過される）を含む約１．５ｍｌの解剖緩衝液を含有する番号付けした２ｍｌのエッペンドルフチューブ中に置いた。筋が大部分消化され、骨と軟組織のみが残るまで、試料を８０ｒｐｍおよび３７℃で３０〜４５分間プラットフォームロッカー上で回転させた。一般に、初期胚はより短いインキュベーション時間が求められた。各段階の後に細胞懸濁液を顕微鏡で確認して、過剰な消化を回避した。不必要な組織を室温で定着させた後、上清を５０ｍｌコニカルチューブに移した。次に、ディスパーゼＩＩ（Ｇｉｂｃｏ  １７１０５０４１）を、１．２ｍｇ／ｍｌ以上の最終濃度（＞０．６Ｕ／ｍｌ）で両チューブに添加した：（１）５０ｍｌチューブ中の上清については、細胞を随時混合しながら３７℃で２０〜３０分間インキュベートした；（２）２ｍｌチューブ（４ｍｇ／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼと１．２ｍｇ／ｍｌ以上のディスパーゼＩＩを含む１．５ｍｌの新たに作製し濾過した解剖緩衝液）中に残存している組織については、チューブを８０ｒｐｍおよび３７℃で２０〜３０分間ロッカー上でさらに回転させて、さらに消化および解離させた。
【０３０４】
解離後、２ｍｌチューブ中の懸濁液を５０ｍｌチューブのものと混合した。次に、約４〜５倍の洗浄培地（ハムのＦ１０および１０％ウマ血清、濾過済み）を添加した後、消化された混合物を、細心に気泡を防ぎながら１０ｍｌの２０ゲージ針にゆっくりと丁寧に約４回通過させた。次に、さらなる洗浄培地を添加して、最終体積を３０ｍｌにした。この懸濁液を、新しい５０ｍｌのコニカルチューブの口上において予洗した４０μｍのナイロンメッシュフィルターで濾過し、フィルターを１０ｍｌの洗浄培地で同じチューブ中にすすいだ。次に、全ての５０ｍｌチューブを室温で５分間１２５ｇにより遠心分離し、上清を移して、１２５ｇで再度５分間スピンダウンした。２回の遠心分離から得たペレットを再懸濁し、２ｍｌの筋芽細胞単離培地中で混合した後、ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ  １１８８５０８４）とハムのＦ−１０栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ  １１５５００４３）の１：１混合物；２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ；１×抗生物質−抗真菌剤；および新たに添加された２．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ５０７１）を含有する２０ｍｌの培地を添加した。ＤＭＥＭを欠くが上記の残りの品目を含有する培地もまた、同様の結果をもたらした。
【０３０５】
まず、各胚から単離された細胞混合物を定型の１５０ｍｍＴＣ処理ディッシュに３７℃で３０分間蒔き（前プレートＩ）、線維芽細胞を排除するために別の１５０ｍｍディッシュに３７℃で３０分間再び蒔き（前プレートＩＩ）、次に、主に筋芽細胞を含有する上清を、２つの１００ｍｍコラーゲンコーティングディッシュに移した。翌日、細胞を調べて、継代の必要性を判定した。場合により、前プレートＩＩディッシュは幾分かの筋芽細胞も含有し、これらを、コラーゲンディッシュにおけるもののほかに、維持し、増殖させた。０．０５％のトリプシンが、ディッシュから細胞を解離するために使用された。数回の継代後、１×抗生物質−抗真菌剤を１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で置き換えた。培養液中の線維芽細胞の数が減少するにつれて、胚性筋芽細胞が非常にゆっくりと増殖し始め得るが、それらをより密に播種して、緩徐な増殖から回復させなければならない。
【０３０６】
成体マウスの筋芽細胞を、若干の変更はあるものの同様にして単離した：筋を骨から取り出し、小型のはさみで刻んだ；２ｍｌのチューブの代わりに１５ｍｌのコニカルチューブを使用し、２倍の体積の消化緩衝液を用いた；より長い消化時間および解離時間を用いた。
【０３０７】
インビトロ筋芽細胞分化アッセイ
胚および成体マウスの両方に由来する初代筋芽細胞については、５０μｌの筋芽細胞増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコースとハムのＦ−１０栄養混合物の１：１混合物；２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ；新たに添加された２．５ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ）中の約３０００個の細胞を、画像化のために３８４ウェルコラーゲンコーティングＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ（商標）プレート（６００７５５０）の各ウェルに播種した。翌日、分化培地（３％〜５％のウマ血清を含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）  １１９９５０７３））を細胞に添加した（ＤＭ０日目）。分化培地を毎日置き換えた。免疫蛍光染色のために、細胞をＤＭ３日目および４日目で固定した。Ｃ２Ｃ１２細胞については、約１５００〜２０００個の細胞を３８４ウェルプレート（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース）の各ウェルに播種し、約２×１０５個の細胞を、Ｃ２Ｃ１２増殖培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース）を用いて６ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、分化培地（２％のウマ血清を含むＤＭＥＭ高グルコース）を、細胞（ＤＭ０日目）に添加し、分化培地を同様に毎日置き換えた。細胞を、記載のとおり異なる時点で回収し、かつ固定した。
【０３０８】
組織学
胚の試料を有するパラフィン切片については、マウス胚（Ｅ１４．５以降）を断頭し、尾部を遺伝子型同定のために番号付けしたチューブに回収した。後期胚（Ｅ１７．５以降）における固定を向上させるために、試験される領域において胚の皮をはいだ。胚を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃１５７１４）を用いて、ＰＢＳ中４℃で緩やかに回転させながら一晩固定した。ＰＢＳで素早く２回すすいだ後、脱水および長期保存のために胚を７０％エタノール中に置いた。試験される組織／臓器については、適切な部分を切断し、常用のプロトコルを用いるパラフィン包埋および切片化にかけた。
【０３０９】
成体マウス組織の凍結切片については、骨格筋試料を解剖し、木製だぼ上で部分的にトラガカントゴム（Ｓｉｇｍａ  Ｇ１１２８；ＰＢＳ中１０％  ｗ／ｖ）に包埋し、液体窒素で冷却されたガラスビーカー中の２−メチルブタン中で凍結した。次に、新鮮な凍結筋試料を、−２０℃に冷却されたクリオスタットを用いて１０μｍ厚で切片にした。次に、これらの新鮮な凍結筋切片を、後の染色処置の前に、ＰＢＳで希釈された１％ＰＦＡ中において室温で５分間固定した。凍結切片およびパラフィン切片の両方を、常用のプロトコルに従ってヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０３１０】
組織切片の免疫蛍光染色
筋凍結切片については、上記のように１％ＰＦＡ／ＰＢＳによる固定の後、スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで希釈された０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により室温で１０分間透過処理し、続いて、ＰＢＳで再度洗浄した。切片を、ＰＢＳ中の１％加熱不活性化したロバ血清、１％ＢＳＡ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する新たに調製され、濾過された溶液を用いて、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングの後、切片を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、続いて、二次抗体とともに室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで５分間洗浄後、切片を、ＰＢＳ中において１：２０，０００に希釈した核染色ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄ１３０６；５ｍｇ／ｍｌ原液）とインキュベートし、スライドをＩｍｍｕＭｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ）およびカバーガラスを用いて、マウントし、密封した。胚性組織を含むパラフィン切片については、脱パラフィン化および再水和したスライドをＰＢＳ中の０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、ＰＢＳで再度洗浄した。次に、切片を、ＰＢＳ中の５％の加熱不活性化した正常ヤギ血清を含有する新たに作製され、濾過された溶液を用いて、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングの後、同様の手順を凍結切片について前述のとおりに実施した。
【０３１１】
免疫蛍光のために使用される一次抗体は：マウス抗ＭＨＣ（ＭＹ３２クローン、Ｓｉｇｍａ  Ｍ４２７６、パラフィン切片上で１：３００の希釈および凍結切片上で１：５００の希釈）；マウス抗デスミン（Ｄ３３クローン、ＤＡＫＯ  Ｍ０７６０、１：３００の希釈）；ヒツジ抗ＭＩＮＩＯＮ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ４５８０；１：２００希釈）であった。全ての二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ）を１：２５０の希釈で使用し、宿主種はロバまたはヤギのいずれかであった。同じ宿主種由来の二次抗体のみが、共染色のために一緒に使用された。
【０３１２】
接着細胞による免疫蛍光染色
線維芽細胞および筋芽細胞中のアクチンフィラメントの免疫蛍光染色のために、高親和性Ｆ−アクチンプローブＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６コンジュゲートファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２２２８３）を製造業者の指示書に従って使用した。略述すると、３８４ウェルＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒプレートを再び使用した。細胞をＰＢＳ中の４％ＰＦＡで８〜１０分間固定し、ＰＢＳで素早く２回洗浄し、その後、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理した。ＰＢＳによる１回の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ中の新たに作製し、濾過した５％の加熱不活性化した正常ヤギ血清で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳにより素早く２回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに室温で１〜２時間インキュベートした。ＰＢＳにより素早く３回洗浄した後、細胞をＤＡＰＩ（５ｍｇ／ｍｌ原液、ＰＢＳ中で１：２０，０００の希釈）とともに１０分間インキュベートした。次に、３８４ウェルプレートを、ＵｌｔｒａＶＩＥＷ共焦点画像化システムまたはＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（ＩＸＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）共焦点画像化システム（下記の顕微鏡法の部を参照のこと）のいずれかを用いて画像化した。
【０３１３】
使用された一次抗体は：マウス抗ＭＨＣ（ＭＹ３２クローン、Ｓｉｇｍａ  Ｍ４２７６、１：４００の希釈）；マウス抗デスミン（Ｄ３３クローン、ＤＡＫＯ  Ｍ０７６０、１：３００の希釈）であった。全ての二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ）を１：２５０の希釈で使用し、宿主種はロバまたはヤギのいずれかであった。同じ宿主種由来の二次抗体のみが、共染色のために一緒に使用された。
【０３１４】
顕微鏡法および画像化
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥＶＯＳ  ＦＬ  Ａｕｔｏ画像化システムを、免疫蛍光染色、ＧＦＰウイルス感染、および細胞標識の常用の試験のために使用した。スライドガラス上のＨ＆Ｅおよび免疫染色された組織切片の画像化のために、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒおよびＡｐｅｒｉｏ  ＶＥＲＳＡスキャナーを使用して、２０×対物レンズを用いてスライド全体の画像を取得した。３８４ウェルプレート中の免疫蛍光細胞試料の画像化のために、ＩＸＭ共焦点ハイコンテンツイメージングシステムを、１０×および２０×対物レンズとともに使用した。組織切片および細胞試料に対するより高解像度の画像を得るために、ＵｌｔｒａＶＩＥＷ  ＶｏＸ  ３Ｄ生細胞イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）スピニングディスク共焦点顕微鏡システムを、４０×および６０×対物レンズとともに使用した。全マウス胚の全ての写真を、Ｌｅｉｃａ  ＫＬ２００  ＬＥＤ解剖顕微鏡と組合わせたｉＰｈｏｎｅ  ５Ｓを用いて取得した。
【０３１５】
細胞培養
後期マウス胚および成体マウスから単離された初代筋芽細胞の培養のために、新たに添加された２．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦを含む濾過された筋芽細胞増殖培地（ＤＭＥＭ低グルコースとハムのＦ−１０栄養混合物の１：１混合物；２０％ＦＢＳ）を使用した。一般に、約２〜４×１０５個の細胞を、１００ｍｍコラーゲンコーティングディッシュに播種し、細胞を、増殖速度に応じて、２〜３日に１回、１：２〜１：４の比で分割した。０．０５％のトリプシンが、ディッシュから細胞を解離するために使用された。筋芽細胞は通常、大部分の線維芽細胞の除去後にクライシス期を経たが、この時点でより密に播種することができた。培養液中の初代筋芽細胞を毎日監視し、必要に応じて新鮮な培地と置き換えた。不死化Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ）の培養のために、濾過されたＣ２Ｃ１２増殖培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース）を使用した。約１〜１．５×１０５個の細胞を、１００ｍｍの組織培養処理済みディッシュに播種し、細胞を２日おきに分割した。０．２５％のトリプシンを細胞の解離のために使用した。不死化１０Ｔ１／２線維芽細胞株の培養のために、濾過された線維芽細胞増殖培地（１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース）を使用した。約１×１０５個の細胞を、１００ｍｍの組織培養処理済みディッシュに播種し、細胞を３日おきに１回分割した。０．２５％のトリプシンを細胞の解離のために使用した。不死化ＲＡＷ２６４．７マクロファージ株の培養のために、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコースを含有する濾過された増殖培地を使用した。約２〜３×１０６個の細胞を、１７５ｃｍ２フラスコに播種した。細胞を、それらが約６０〜７５％コンフルエントであった場合に、２〜３日に１回分割した。細胞の取り出しを確実にし、細胞死を減少させるために、０．２５％のトリプシンおよびセルスクレーパーを組合わせて使用した。多核破骨細胞様細胞の形成を誘導するために、５０ｎｇ／ｍｌのｓＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１７４アミノ酸）を、細胞とともに３日間インキュベートした。１２９マウス由来のＣＪ７胚性幹細胞の培養のために、１５％ＦＰＳならびに３つの阻害剤：培地に付いてくるＧＳＫ３β阻害剤；ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ１８４３５２（終濃度０．８μＭ）；およびＦＧＦＲ阻害剤  ＰＤ１７３０７４（終濃度０．１μＭ）を含むＥＳＧＲＯ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＰＬＵＳ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＦ００１−５００Ｐ）からなる、新たに作製され、濾過された増殖培地を使用した。通常、細胞は、標準的な手順に従って、マウス胚性線維芽細胞と共培養されたが、ＲＮＡおよびタンパク質の単離のために、線維芽細胞フィーダー層を有しないゼラチンコーティングディッシュに播種された。約１×１０６個の細胞を、各１００ｍｍディッシュに播種した。培地を毎日置き換えた。細胞を、実験的必要性に応じて１：５〜１：１０の比で２日に１回分割した。０．０５％のトリプシンを細胞の解離のために使用した。全ての細胞培養培地は、他に断りがなければ、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有した。
【０３１６】
タンパク質分析のための組織および細胞溶解物の調製
胚性と成体の両方のマウス組織試料を計量し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。タンパク質溶解物の調製のために、８倍量の氷冷溶解緩衝液（２×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１×Ｒｏｃｈｅ  ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテルを新たに添加した、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）ならびに１〜２３ｍｍのタングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を、１．５ｍｌまたは２．０ｍｌのエッペンドルフチューブ中の各試料に添加した。次に、これらをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩを使用して４℃で３〜８分間、３０サイクル／秒でホモジナイズした。次に、溶解物に、最終濃度０．１％のＳＤＳ、０．１％のデオキシコール酸ナトリウムおよび１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００まで界面活性剤を添加し、試料を４℃で２〜４時間回転させた。次に、溶解物を新しいチューブに移し、４℃で１０分間、１５０００〜２１０００ｇでスピンダウンした。多量の脂質を含有する臓器については、上清を移し、４℃で１０分間、１５０００〜２１０００ｇで再度スピンダウンした。
【０３１７】
細胞試料のために、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ製の緩衝液（Ｊ６０４２３）を通常は使用した（上記のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）。細胞をＤＰＢＳで素早くすすぎ、続いて、約３００μＬの氷冷溶解緩衝液を、６ウェルプレートの各ウェルに添加した。氷上での５分間のインキュベーション後、細胞をピペッティングし、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、１０分おきに１秒間のボルテックスを行いながら氷上で３０分間インキュベートした。次に、試料を４℃で１０分間、１５０００〜２１０００ｇでスピンダウンした。イオン性界面活性剤を含まない第２の緩衝液を一部の実験に使用し（上記のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）、同様の結果を得た。ＢＳＡ標準液によるＢｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質アッセイを実施して、上清のタンパク質濃度を測定した。溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（ＮＰ０００７）およびジチオスレイトール（終濃度１００ｍＭ）と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に９４℃で１０分間煮沸した。
【０３１８】
細胞内分画分析
分化培地で３日間インキュベートされたＣ２Ｃ１２細胞を、製造業者の指示書に従ってＱｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔシステム（Ｑｉａｇｅｎ、３７５０２）を用いる細胞内分画試験のために使用した。まず、細胞をディッシュから解離し、その後キットの第１緩衝液を添加した。細胞質ゾル／膜／核／細胞骨格画分を細胞から抽出し、各画分からの約１０μｇのタンパク質溶解物をウェスタンブロットに対してロードした。
【０３１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
約１０〜３０μｇの細胞溶解物および４０〜６０μｇの組織溶解物を各ウェルにロードした。タンパク質の分離のためにＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘゲル電気泳動システムを使用した。ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（ＮＰ０００２）および４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス−Ｔｒｉｓゲルを使用した。タンパク質を、ｉＢｌｏｔ転写システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に転写した。通常、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）中に新たに調製された５％ミルクを、ＰＶＤＦおよびニトロセルロース膜の両方と用いるブロッキング緩衝液として使用した。しかし、ヒツジで産生された一次抗体を用いるＭＩＮＩＯＮの検出については、ＴＢＳＴ中に新たに作製し、濾過された１０％ロバ血清を、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ、０．２  μｍポアサイズ）と用いるブロッキング緩衝液として使用した。ウェスタンブロットにおいて使用される一次抗体および二次抗体の情報は、下の表（表３）において列記される。異なる感度を有する２種のＥＣＬ基質を、示されるとおりに使用した。本発明者らは、抗ヒトＴＭＥＭ８Ｃ抗体が、マウス初代筋細胞および培養細胞の溶解物の両方において内因性ならびに過剰発現されたＭｙｏｍａｋｅｒタンパク質を認識するが（図２０、２１Ｃ〜２１Ｄ）、長時間にわたる抗体インキュベーションおよび露光時間が必要となることを見出した。
【０３２０】
【表３−１】
2020500020.tif 000017
【０３２１】
【表３−２】
2020500020.tif 000018
【０３２２】
ＲＮＡの調製およびＲＴ−ｑＰＣＲ
製造業者の指示書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １５５９６０２６）を用いて、異なる細胞株試料から総ＲＮＡを単離した。製造業者の指示書に従ってｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。ＰＣＲのために、約５ｎｇのＲＮＡからのｃＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３６７６５９）を含む１２．５μｌの反応において使用した。ＲＮＡのみを有する反応が陰性対照として調製された。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを、以下のプライマーとともに使用した：ＭＩＮＩＯＮ（５’−ＧＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号７５）および５’−ＧＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＧＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号７６）およびＧＡＰＤＨ（５’−ＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ−３’（配列番号７７）および５’−ＴＧＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号７８）。比較ＣＴ法を用いて相対定量を実施した。ＭＩＮＩＯＮ遺伝子のＣＴ値を、式：２ΔΔＣＴを用いて同じ試料中の基準遺伝子ＧＡＰＤＨのものに正規化した。
【０３２３】
肺浮遊試験
肺浮遊試験を、以前に記載された方法（Ｚ．Ｊａｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｐｒｅｎａｔａｌｌｙ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｉｎｆｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｂｉｒｔｈ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１１，８１５，２０１４；およびＭ．Ｂｏｒｅｎｓｚｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｏｄ  ａｎｄ  Ｈ１９−Ｉｇｆ２  ｌｏｃｕｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｄｉａｐｈｒａｇｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４０，１２３１，２０１３）から適合させた。ＭＩＮＩＯＮΔ／＋×ＭＩＮＩＯＮΔ／＋交雑由来のＥ１８．５胚を、人道的に屠殺した妊娠雌から帝王切開によって迅速に単離し、乾燥キムワイプ上に置いた。体温を維持するために、これらの新生仔を手のひら、続いて、３７℃のチャンバーでインキュベートした。出産後、子を標準の室内気に曝し、少なくとも１時間監視した。ＭＩＮＩＯＮΔ／Δの新生仔は、一律にアトニー性で無呼吸であり、出産のほとんど直後にチアノーゼになった。ＭＩＮＩＯＮ＋／＋とＭＩＮＩＯＮΔ／＋マウスの大多数は、正常な呼吸を呈し、十分な灌流を示す桃色の体色を示した。空気呼吸の少なくとも１時間後、子に麻酔をかけ、計量し、遺伝子型同定のために尾を切り取り、断頭し、肺を解剖し、浮遊試験のために１５ｍｌのコニカルチューブまたは２ｍｌのエッペンドルフチューブ内のＰＢＳ中に置いた。次に、肺を、１５分間を超えて監視し、その後、浮遊または沈降のいずれかとしてスコア化した。約５０匹のＥ１８．５の早産新生仔を調べた。
【０３２４】
プラスミドおよびクローニング
ｓｈＲＮＡコンストラクトのクローニングのために、１９〜２１ヌクレオチドの標的配列を、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および内製の最適化されたアルゴリズムの両方を用いて選択した。マウスＭＩＮＩＯＮ遺伝子のために、コード配列を標的化する２つと３’ＵＴＲを標的化する２つの、４つのｓｈＲＮＡ標的配列を最初に選択した。ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクターにおいて存在するが、マウストランスクリプトームにおいて類似の配列を欠くホタル（フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））のルシフェラーゼ遺伝子を標的化する対照配列を使用した。各ｓｈＲＮＡのために、２つの５５〜５９ｎｔのオリゴヌクレオチドを下に示すとおりに設計し、合成した（ＩＤＴ）。各々がセンスおよびアンチセンス標的配列、９ｎｔの介在性のヘアピンループ、ならびに突出末端クローニングのための５’末端のＴＴＴＧと３’末端のＧＡＴＣを含有するオリゴヌクレオチドをアニールした。次に、これらをＢｂｓＩ／ＳｐｅＩで消化されたｐＧＷＬ−ｓｉ２／Ｕ６ベクターにライゲートした。その後、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを使用して、これらのｓｈＲＮＡカセットを、マウスＵ６プロモーター下でｓｈＲＮＡを発現する第３世代のレンチウイルスゲートウェイベクターであるベクターｐＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７−ＧＷ（ｐＬＬ３．７−ＧＷ）にクローン化した。ＣＭＶ−ＥＧＦＰレポーターカセットが、発現を監視するためにベクターに含まれた。
【０３２５】
【表４】
2020500020.tif 000019
【０３２６】
ｃＤＮＡコンストラクトのクローニングのために、マウスＭＩＮＩＯＮ（８４ａａアイソフォーム用）、ヒトＭＩＮＩＯＮオルソログ、マウスｔｍｅｍ８ｃ（ｍｙｏｍａｋｅｒ）、ｎａｎｏｌｕｃ（対照Ａ）、ルシフェラーゼ（対照Ｂ）、１ｂｐ挿入を有するマウスＭＩＮＩＯＮ、１ｂｐ欠失を有するヒトＭＩＮＩＯＮ、およびマウスＭＩＮＩＯＮトランケーション（３９ａａ形態）のコード配列（ＣＤＳ）を、両末端のａｔｔＢ部位および開始コドンの前のコンセンサスコザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ（配列番号９４））とともに合成した（ＩＤＴ）。マウスおよびヒトＭＩＮＩＯＮのＣＤＳのために、タグのないバージョンおよびＣ末端に３×ＦＬＡＧ−１×ＨＡタグされた（３Ｆ１Ｈ）バージョンを作製した。ｎａｎｏｌｕｃのＣＤＳについては、Ｃ末端１×ＦＬＡＧタグを付加した。Ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １１７８９０２０）を用いて、合成されたＤＮＡ配列をｐＤＯＮＲ２２１ベクターにクローン化し、続いて、配列が確認されたエントリーベクターを、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘを用いてｐＣＩＧＡＲゲートウェイレトロウイルスベクターにクローン化した。ｐＣＩＧＡＲベクターは、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰのすぐ上流の導入遺伝子のＧａｔｅｗａｙ媒介性の挿入組換えを可能にするために改変されたＭＳＣＶ系のバイシストロニックなレトロウイルスベクターである。加えて、空ｐＣＩＧＡＲベクター（ＭＣＳバージョン）を、さらなる対照ベクター（対照Ｃ）として使用した。２つの３Ｆ１ＨタグされたマウスおよびヒトＭＩＮＩＯＮコンストラクトの発現試験の後に、２つのバンドが抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロットによって検出されたことが認められた（図１６）。これは、実際の開始コドンとともにｐＣＩＧＡＲベクターの５’末端に受け継いだインフレームの追加の開始コドンの存在を反映しており、アスタリスクによって示される、Ｎ末端に追加の１６アミノ酸を有する産物をもたらす。実際の開始コドンの前に６ｎｔのコンセンサスコザック配列が付加されたため、目的の産物の強度がより一層強くなっている。したがって、他の全てのｃＤＮＡベクターは、上流での転写開始を回避するために、コザック配列の直前に追加のＴヌクレオチドを含有した。
【０３２７】
初代および形質転換した筋芽細胞におけるレンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウンアッセイ
レンチウイルス粒子を、第３世代レンチウイルスパッケージングシステムおよびＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において作製した。トランスフェクションの１日後に新鮮な培地を置き換え、翌日、上清培地を回収した。培地を短時間遠心分離して死細胞を除去し、純粋なウイルスを、８μｇ／ｍｌのポリブレンとともに２９３Ｔ細胞に対する逆感染の方法によるＱＣ感染のために使用した（スピンインフェクションなしの一晩のインキュベーション）。感染の３日後のＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の分析は概して、約１×１０６ｖｐ／ｍＬの力価を示した。純粋なウイルスをさらに、１００ｋＤａの遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて約１００倍に濃縮し、等分し、−８０℃で保存した。
【０３２８】
マウスＭＩＮＩＯＮ転写物のノックダウン効率を試験するために、ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを使用してＣ２Ｃ１２細胞に感染させた。ウイルスを、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する増殖培地に希釈し、その後、Ｃ２Ｃ１２細胞とともに３７℃で短時間インキュベーションし、２４ウェルまたは１２ウェルプレートのいずれかを用いて１ラウンドのスピンインフェクションを３２℃で１〜１．５時間、１１００ｇで実施した。概算された１×１０８ｖｐ／ｍｌのウイルス力価（２９３Ｔ細胞で測定された）に基づいて、２９３Ｔ細胞のＭＯＩ３０に相当するウイルス量をＣ２Ｃ１２細胞で使用した。翌日、新鮮な培地を置き換え、２日後、ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳによってソートした（図２４のゲーティング戦略を参照のこと）。未分化のＣ２Ｃ１２細胞におけるＧＦＰシグナルは、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡法によってかろうじて識別可能であったが、ＦＡＣＳ分析で判断されたように７０〜８５％の感染効率が常に達成された。ソートされたＧＦＰ＋Ｃ２Ｃ１２細胞を回収し、増殖させ、インビトロ分化アッセイのために６ウェルプレートに播種した。ＤＭの４〜６日目に、細胞溶解物を回収し、ＭＩＮＩＯＮタンパク質の発現をウェスタンブロットによって調べた。ＭＩＮＩＯＮの３’ＵＴＲ（Ｕ１／Ｕ２）を標的化する２つのｓｈＲＮＡコンストラクトが、ＭＩＮＩＯＮの発現を最も効率的に減少させることが見出され（図１４Ｂ）、Ｃ２Ｃ１２および初代筋芽細胞における次の実験のために、細胞をＵ１およびＵ２のｓｈＲＮＡウイルスのみで感染させた。ＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞を作製するために、Ｕ１に感染したＧＦＰ＋のソートされた細胞をＵ２  ｓｈＲＮＡウイルスで再感染させ、ＧＦＰシグナルによって再ソートした（上位３０〜５０％）。同様に、野生型Ｃ２Ｃ１２細胞を、対照ｓｈＧＬ３ウイルス（Ｃｔｒｌ）で２回のラウンドにおいて感染させ、２回ソートしてＣｔｒｌＫＤ細胞を得た。これらのＭＩＮＩＯＮＫＤおよびＣｔｒｌＫＤＣ２Ｃ１２細胞を増殖させ、３８４ウェルおよび６ウェルプレートにおけるインビトロ分化アッセイのために使用した。ＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞はまた、ｃＤＮＡレトロウイルスを用いるインビトロ再構成アッセイのためのバックグラウンドとしても使用された。
【０３２９】
同様の感染工程を、成体マウスに由来する初代筋芽細胞においてＭＩＮＩＯＮをノックダウンするために追従したが、ただし、初代筋芽細胞はポリブレン処理に対してより感受性が高いように見えるため、６μｇ／ｍｌのポリブレンを使用し、ポリブレンを欠く新鮮な培地が、翌日ではなくその日の終わりに添加された。感染し、ソートされたこれらの初代細胞を増殖させることは困難であるため、１ラウンドのウイルス感染をＣｔｒｌウイルスまたはＵ１とＵ２ウイルスの１：１比の混合物のいずれかを用いて実施し、細胞を２〜３日後のＧＦＰシグナルによってソートした。Ｃ２Ｃ１２細胞で使用されたウイルスの約３分の１または２分の１量を、初代筋芽細胞において使用した。ソートされた初代筋芽細胞を３日間回収し、次に、インビトロ分化アッセイのために３８４ウェルプレートに播種した。
【０３３０】
Ｃ２Ｃ１２細胞および１０Ｔ１／２細胞のレトロウイルス感染
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＣＩＧＡＲレトロウイルスベクターおよびｐＣＬ−ＥｃｏまたはｐＣＬ−１０Ａ１パッケージングベクターによりＨＥＫ２９３細胞をコトランスフェクトすることによって、ｃＤＮＡをコードするレトロウイルスを作製した。トランスフェクションの１日後に培地を置き換え、翌日、上清培地を回収した。死細胞を排除するための短時間の遠心分離後、純粋なウイルスを、８μｇ／ｍｌのポリブレンとともにＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ｐＣＬ−Ｅｃｏパッケージ化ウイルス用）または２９３Ｔ細胞（ｐＣＬ−１０Ａ１パッケージ化ウイルス用）に対する逆感染の方法による３８４ウェルプレートにおけるＱＣ感染のために使用した（スピンインフェクションなしの一晩のインキュベーション）。ＧＦＰ発現を、感染の３日後にＦＡＣＳによって分析し、通常、０．３〜１．２×１０６ｖｐ／ｍｌの力価が得られた。
【０３３１】
Ｃ２Ｃ１２細胞および１０Ｔ１／２細胞を感染させるために、純粋なウイルスを８μｇ／ｍｌのポリブレンと３７℃で１０分間インキュベートし、続いて細胞に添加し、次に３７℃で１５分間インキュベートした。２４ウェルまたは１２ウェルプレートを用いて１ラウンドのスピンインフェクションを３２℃で１〜１．５時間、１１００ｇで実施した。４〜６時間後、ポリブレンを含む新鮮で純粋なウイルスを添加し、２ラウンド目のスピンインフェクションを実施した。新鮮な培地を感染した細胞に添加してポリブレンを希釈した。翌日培地を置き換え、２〜３日後、感染した細胞は通常、顕微鏡法によって非常に強力なＧＦＰ蛍光を呈した。この２ラウンドの感染方法の感染効率は、広範なウイルス濃度にわたって概して９５％を超えたが、そのため、ＦＡＣＳは通常必要ではなかった。この強力なＧＦＰシグナルを使用して、位相コントラストイメージングおよび核マーカーに加えて、細胞の境界を目立たせた（図２２、２３Ａ〜２３Ｆ）；さらに、４％ＰＦＡで固定されたが界面活性剤で透過処理されなかった細胞において、ＧＦＰシグナルは核領域においてより高く、細胞境界および核の両方の明確な標示が可能になった。
【０３３２】
感染の各ラウンドのために、３Ｔ３または２９３Ｔ細胞におけるＭＯＩ３〜６に相当するウイルス量を、ＭＩＮＩＯＮＫＤＣ２Ｃ１２細胞に対して使用し、感染した細胞を増殖させ、分化培地におけるインビトロ再構成アッセイのために使用した。野生型１０Ｔ１／２細胞およびＣ２Ｃ１２細胞における共発現ならびに細胞混合実験のために、３Ｔ３または２９３Ｔ細胞におけるＭＯＩ２〜４に相当するウイルス量を使用した。各比較のために、同じパッケージングプラスミドおよび同様のＭＯＩで作製されたウイルスを感染のために使用した。異なる種類の対照ウイルス（ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃ−ＦＬＡＧ、空ベクター）を用いて実験を繰り返した。共発現および混合実験のために、上述の２ラウンドのスピンインフェクションプロトコルを用いて１種のｃＤＮＡレトロウイルスで細胞を感染させ、数日間増殖させ、続いて、同じ方法を用いて第２のｃＤＮＡをコードするレトロウイルスで感染させた。最終感染の翌日、細胞を異なる色素で標識し、混合し、後述のとおり３８４ウェルまたは２４ウェルプレートに播種した。
【０３３３】
細胞標識および混合実験
一連の細胞浸透性蛍光色素の性能を、複数の希釈にわたり異なる標識方法を使用して１０Ｔ１／２線維芽細胞およびＣ２Ｃ１２筋芽細胞に対して試験し、シグナル強度およびパターンを少なくとも４日間顕微鏡法によって連続的に監視した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃ３４５６５、最終１：２５０）およびＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃ３４５７１、最終１：５００）を後の実験のために選択し、これらは、単核細胞の細胞質および核領域を標識することが観察された。しかし、融合した多核細胞においては（図２１Ｆ、２３Ａ〜２３Ｆ）、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ色素は、色素で本来標識された核において強い濃縮を呈し、他のｖｉｏｌｅｔ標識されていない核に拡散しなかったが、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ色素は、核周囲の濃縮を示し、細胞境界を認識するのに有用であった。これらの特徴により融合効率の容易な定量化が可能になった（図２１Ｇ）。
【０３３４】
細胞標識は、若干の改変を伴う製造業者の指示書に従って実施された。細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄し、２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、遠心分離し、０．８〜１×１０６細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳにおいて再懸濁した。２×細胞標識溶液を蛍光色素（Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ色素  １：１２５およびＶｉｏｌｅｔ色素  １：２５０）を含むＰＢＳに個別に調製し、短時間のボルテックスによって十分に混合した。２×標識溶液と細胞懸濁液の等量（通常、各々２５０μＬ）を混合し、随時混合しながら３７℃で４０〜４５分間インキュベートした。次に、標識細胞を１ｍｌの新鮮な培地と混合し、３７℃で５分間インキュベートし、１５０ｇで遠心分離した。この時点で、標識細胞を新鮮な培地を用いてさらに３回洗浄し、３７℃で１０〜１５分間インキュベーションし、１５０×ｇで遠心分離した。最後の洗浄の後、細胞を計数し、３８４ウェルまたは２４ウェルプレートにおける最終の混合実験のために必要な濃度に希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。これらの追加の洗浄およびインキュベーション工程を用いて、細胞懸濁液および細胞表面において未結合の残留色素を排除したが、これは、同日に実施される細胞混合実験にとって極めて重要であった。インキュベーションの後、Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ色素で標識された細胞を、Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識されたものと１：１の比で混合し、１ウェル当たり８００〜４０００細胞が試験される濃度範囲で３８４ウェルまたは２４ウェルプレートに播種した。３８４ウェルプレートにおける細胞を、異なる時点（２４〜４８時間）において室温で１０分間４％ＰＦＡにより固定し、画像化前にＰＢＳで洗浄した。１０％〜１５％のＦＢＳを含有する増殖培地を、１０Ｔ１／２とＣ２Ｃ１２細胞の両方における全ての実験のために使用した。
【０３３５】
分化指数および融合指数
いくつかの指数を使用して、インビトロ分化中のＣ２Ｃ１２細胞ならびに成体および胚性初代筋芽細胞の融合効率を調べた。Ｃ２Ｃ１２（図１２Ｆ）および成体初代筋芽細胞（図１５Ｂ）において示される分化指数は、ＩＸＭ共焦点ハイコンテンツイメージングによって得られる各２０×画像内の総核数と比較した、単核および多核細胞の両方を含む全てのＭＨＣ＋細胞内に含有される核の割合として算出された。別個の複製ウェルからの少なくとも６個の別々の領域を、各遺伝子型について定量化した。Ｃ２Ｃ１２（図１２Ｇ）および成体初代筋芽細胞（図１５Ｃ）において示される融合指数は、ＩＸＭイメージングによって得られる各２０×画像内の総核数と比較した、２個以上の核を有したＭＨＣ＋筋管内に含有される核の割合として算出された。別個の複製ウェルからの少なくとも６個の別々の領域を、各遺伝子型について定量化した。胚性初代筋芽細胞（図１２Ｃ）において示される融合指数は、各２０×ＩＸＭ画像上の全てのデスミン＋細胞内の核の数と比較した、３個以上の核を有するデスミン＋筋管内に含有される核の割合として算出された。別個の複製ウェルからの少なくとも６個の別々の領域を、各遺伝子型について定量化した。線維芽細胞が依然としてこれらの早期継代初代培養において存在したため、デスミン＋細胞における総核数のみが定量化のために含まれた。Ｃ２Ｃ１２細胞（図１２Ｈ）および成体初代筋芽細胞（図１５Ｄ）における融合効率を調べるための別の指数は、筋管に着目した。筋管を、各管内に含有される核の数：２個の核、３〜５個の核、６〜１０個の核、または１０個を超える核の数によって３〜４つのサブグループに分割した（図１２Ｈ）。各サブグループの割合は、筋管の総数との比較において、各遺伝子型について算出された。別個の複製ウェルからの少なくとも６個の別々の領域を、各遺伝子型について定量化した。
【０３３６】
１０Ｔ１／２細胞における共発現実験のために、２つの指標を使用して融合効率を調べた。第１の融合指数（図２１Ｅ）は、図２２に示される実験に基づき、総核数と比較した、４個以上の核を含有するＧＦＰ＋融合細胞内の核の割合として算出された。異なる複製ウェルからの少なくとも４つの別個の１０×ＩＸＭ画像が、各遺伝子型の定量化のために使用された。ＭＩＮＩＯＮのみまたはＭｙｏｍａｋｅｒのみを発現する細胞がＭＩＮＩＯＮとＭｙｏｍａｋｅｒを共発現する細胞に融合する能力を調べるために、第２の指数を使用して（図２１Ｇ）、４つの異なる組合わせにおいてＤｅｅｐ  Ｒｅｄ色素標識細胞とＶｉｏｌｅｔ色素標識細胞間の融合効率を算出した（図２１Ｆ、２３Ａ〜２３Ｆ）。これらの組合わせにおいて、全てのＤｅｅｐ  Ｒｅｄ色素標識細胞は、ＭｙｏｍａｋｅｒとＭＩＮＩＯＮのどちらのタンパク質が感染によって最初に発現されたとしてもこれらの共発現を有し、これらの細胞はそれら自体で融合することができ、Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ＋融合細胞になった。Ｖｉｏｌｅｔ色素標識細胞は、ＭｙｏｍａｋｅｒおよびＭＩＮＩＯＮのいずれも（ＭｙｏｍａｋｅｒまたはＭＩＮＩＯＮのいずれかが最初に発現された）；Ｍｙｏｍａｋｅｒのみ（空ベクター対照とともに）；またはＭＩＮＩＯＮのみ（ルシフェラーゼ対照とともに）を発現した。１個以上のＶｉｏｌｅｔ色素標識核を含有するＤｅｅｐ  Ｒｅｄ＋融合細胞（４個以上の核を含有する）の割合を、各１０×ＩＸＭ画像のＤｅｅｐ  Ｒｅｄ＋融合細胞の総数と比較した。別個の複製ウェルからの少なくとも１２個の別々の領域を、各遺伝子型について定量化した。
【０３３７】
実施例２：ＭＩＮＩＯＮは、筋再生、筋発生および筋分化中に高度に発現される骨格筋特異的微小タンパク質である
筋発生は、時間的に調節された幹細胞活性化および分化、シンシチウムの筋管を形成するための前駆細胞の融合、ならびに収縮性筋線維を生成するための筋管の成熟を必要とする。このプロセスの早期および後期が集中的に研究されてきたが（Ｃｏｍａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１０：１，２０１４；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２８：２２５，２０１４）、細胞融合を制御する機構および調節因子についての本発明者らの理解は、特に、哺乳動物において不十分である（Ｈｉｎｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｆｕｓｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ６，ｒｅ２，２０１３；Ｈｏｃｈｒｅｉｔｅｒ−Ｈｕｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＢＡＩ１  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｎｅｗ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｆｕｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，２６３，２０１３）。近年、膜貫通タンパク質Ｔｍｅｍ８ｃ／Ｍｙｏｍａｋｅｒが同定され、筋芽細胞の融合に必要であり、分化している筋芽細胞への非筋芽細胞の融合に十分であることが示された（Ｍｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｏｍａｋｅｒ  ｉｓ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：３０１，２０１３）。しかし、重要なことに、Ｍｙｏｍａｋｅｒの発現は、非筋細胞の別の非筋細胞への融合を駆動するには不十分であった。
【０３３８】
遺伝子をコードする標準的に定義されたタンパク質に加えて、近年の研究は、筋における調節因子の新たなクラスの存在を示した。これらの小さなＯＲＦ（ｓｍＯＲＦ）は転写され、翻訳されるが、それらのサイズのために大部分はバイオインフォマティクス的にサイレントであり、アミノ酸（ａａ）長が１００未満の微小タンパク質を通常コードする。推定量は広く変動するが、ヒトおよびマウスのゲノムは、少なくとも数千のこれらの「隠れた」遺伝子を含有すると考えられる（Ｓａｇｈａｔｅｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍＯＲＦ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １１，９０９，２０１５）。興味深いことに、今日まで報告された少数の哺乳動物の微小タンパク質の中のいくつかは筋において同定されており、これらの全ては、サルコリピンおよびホスホランバンなどの既知のＳＥＲＣＡ調節タンパク質に対して構造的類似性を有する筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）のための調節因子をコードする（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｎｎｏｔａｔｅｄ  ａｓ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＳＥＲＣＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１，２７１，２０１６；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｉｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．  Ｃｅｌｌ  １６０，５９５，２０１５；Ｍａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１１１６，２０１３）。
【０３３９】
未損傷および再生している筋の全トランスクリプトームＲＮＡ−ｓｅｑ分析が実施されて、骨格筋発生および再生において重要な役割を果たす新規の微小タンパク質が同定された（Ｂｅｎｔｚｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，２０１２）。本発明者らは、強力な時間的調節（損傷後３日目の上方制御）、アノテートされた１００コドン未満のＯＲＦ長、およびインビトロでのマウス筋芽細胞分化中における類似した動的パターンの調節を示す転写物を探索した（図１Ａ）。予測された遺伝子７３２５（Ｇｍ７３２５）が、全ての基準を満たす唯一の遺伝子であったが、これはＥＳ細胞中で発現する可能性があるが機能が知られていない推定上の８４ａａの微小タンパク質をコードしている（Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＥＳＧＰ，ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ａｃｔａ  ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ３７：７８９，２００５）。後述の理由から、本発明者らは、この遺伝子をＭＩＮＩＯＮ（微小タンパク質融合誘導因子）と命名した。ＭＩＮＩＯＮ発現の時間的パターンは、Ｍｙｏｍａｋｅｒのものと非常に類似したが、２つの他のｓｍＯＲＦであるｃｃｌ３またはサルコリピンのものとは異なっていた（図１Ｂ）。
【０３４０】
ウェスタンブロットにより、ＭＩＮＩＯＮ転写物が翻訳され；ＭＩＮＩＯＮタンパク質が未損傷前脛骨（ＴＡ）筋には存在しないが再生中に強力に誘導され、損傷後３〜４日目にピークを迎えることが確認された（図１Ｃ）。免疫蛍光分析は、発生期に再生している筋線維内でのＭＩＮＩＯＮ発現を実証したが（図２Ａ）、ＭＩＮＩＯＮタンパク質は、未損傷の成体筋（図２Ｂ）でも他の非筋組織（図２Ｃ）でも検出できなかった。早期胚発生のＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、体節期１５に早くも検出できたが、肢および尾芽形成後の体節期３６まで大幅に増加したＭｉｎｉｏｎ発現を明らかにした（図２Ｄ）。ＭＩＮＩＯＮの発生上の発現は、マウスの肢および舌（両者とも骨格筋を含有する）において見られたが、胚または新生仔の心筋においては見られなかった（図１Ｄ、図２Ｅ）。ＭＩＮＩＯＮのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方が、インビトロでの筋芽細胞分化中に急速に増大した（図１Ｄおよび図３Ａ〜３Ｃ）。全長タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列および支配的なアルファヘリックスの二次構造を含有すると予測されたが（図１Ｅ）、過剰発現および上清濃度は、タンパク質分泌の証拠を示さなかった（データは示さず）。しかし、細胞内分画により、膜結合画分（原形質膜、ＥＲ、およびゴルジ体を含む）内で大幅な濃縮が確認されたが、これは、膜コンパートメントへの挿入または膜コンパートメントとの結合を示唆している（図３Ｄ）。
【０３４１】
ＴＢＬＡＳＴＮ検索により、長鎖非コードＲＮＡ（ＲＰ１−３０２Ｇ２．５；ＬＯＣ１０１９２９７２６）としての転写物の先のアノテーションにもかかわらず、８４コドンのインタクトなＯＲＦを有する推定上のヒトＭＩＮＩＯＮホモログが明らかになった（図４Ａ）。進化的な保存が哺乳動物種にわたって見られたが（図１Ｆ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）または他の無脊椎動物においては有力な配列ホモログは見出されなかった。サルコリピン、ホスホランバン、または近年報告された微小タンパク質ＤＷＯＲＦ（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｎｎｏｔａｔｅｄ  ａｓ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＳＥＲＣＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１，２７１，２０１６）に対する配列類似性は見られなかった。Ｍｉｎｉｏｎの発現は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子であるミオゲニンの発現をわずかに追跡したが（図１Ｆ）、これは標準的な筋調節因子（ＭＲＦ、例えば、ＭｙｏＤおよびミオゲニン）による制御を示唆している。実際に、ヒトおよびマウスＭＩＮＩＯＮ遺伝子座の上流の調節領域の分析により、ＭＲＦに対する進化的に保存されたＥ−ボックス結合部位が明らかになった（図４Ａ）。ＭｙｏＤおよびミオゲニンの両方は、ＥＮＣＯＤＥ全ゲノムＣｈＩＰ−ｓｅｑによって示されるとおり、分化している筋芽細胞におけるこれらの部位に特異的に結合した（図４Ｂ）（Ｓｌｏａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＮＣＯＤＥ  ｄａｔａ  ａｔ  ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  ｐｏｒｔａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４，Ｄ７２６，２０１６も参照のこと）。
【０３４２】
要するに、これらのデータは、ＭＩＮＩＯＮが、急速な増殖時および幹細胞由来筋芽細胞の融合時に発生および再生している骨格筋において特異的に発現される膜結合微小タンパク質であることを示す。
【０３４３】
実施例３：ＭＩＮＩＯＮ微小タンパク質は骨格筋発生に必要である
ＭＩＮＩＯＮの空間的および時間的発現パターンおよびＭＩＮＩＯＮ調節配列における機能的ＭＲＦ結合Ｅ−ボックスの存在は、骨格筋発生における役割を示唆した。これを試験するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ＭＩＮＩＯＮ欠損マウスを作製した（図５Ａ）。単一のコードエクソンを標的化する２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を胚に同時注入し、Ｆ０の子を変異に関してスクリーニングした（図５Ａおよび６、図２５）。小さな挿入／欠失変異およびｇＲＮＡ標的部位間のより大きな欠失を同定し（図６Ａ）、１３５ｂｐインフレーム欠失（ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ；図５Ａ〜５Ｃ、図６Ｂ）または１５５ｂｐフレームシフト欠失（図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｄ）のいずれかを含有する変異体を樹立した２つの系統をさらに特徴付けた。別段の言及がない限り、後の実験は１３５ｂｐ欠失アレルを伴う。ヘテロ接合型ＭＩＮＩＯＮΔ／＋動物は生存可能であり、予想されたメンデル比で回復し、後期ホモ接合型変異体ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚もまた得られ、生存ホモ接合型ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ動物は、周産期致死性と一致して出生後に回復しなかった（図６Ｃ〜６Ｄ）。ＭＩＮＩＯＮタンパク質の消失は、ＭＩＮＩＯＮ欠損動物由来の胚および周産期の肢ならびに舌骨格筋において確認された（図７Ａ〜７Ｂ）。
【０３４４】
後期ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚は、そのサイズおよび重量の縮小、肢の直径の縮小、脊柱弯曲、およびアトニー、ならびに早期における特徴的な背部および項部皮下浮腫によって識別可能であった（図８Ａ〜８Ｃ）。ＭＩＮＩＯＮΔ／ΔＥ１７．５胚およびＰ０新生仔期の子の分析により、早期胎仔期に明らかな欠陥はなかったにもかかわらず、肢筋系の小さな外見（図５Ｄ、８Ｂ）、および筋群の全体サイズの縮小（図９Ａ〜９Ｄ）が実証された。骨格筋形成における明らかな異常は、筋細胞マーカー（ＭＨＣおよびデスミン）に対する組織学および免疫蛍光染色の両方によってＥ１８．５〜１９．５で見られた；一方で、対照の舌骨格筋は、大量の伸長した多核筋管を含有し、ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ筋は、発生期の短い線維および未融合の単核細胞の両方の蓄積とともに、融合した線維の著しい減少を示した（図２Ｄ、図９Ａ〜９Ｄ）。同様の欠陥はＭＩＮＩＯＮΔ／Δ前肢、横隔膜および肋間筋系においても存在したが（図１０Ａおよび１０Ｂ、図２６、図５Ｆ、図９Ｄ、図１０Ｃ）、後者の観察により、ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ周産期致死性は呼吸機能の欠如を反映する可能性があることを示唆している。したがって、後期胎仔は帝王切開によって出産され、室内気に曝され、１時間監視された後、肺を解剖され、浮遊試験にかけられた。Ｅ１８．５ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚は、心収縮および反射反応を示したが（データは示さず）、空気への暴露後すぐに死亡した。横隔膜および肋間筋形成の著しい減少に一致して、対照動物ではないＭＩＮＩＯＮΔ／Δ由来の肺は浮遊しなかったが、これは、出生後の肺浮遊の欠如（図５Ｇ）およびおそらくは骨格筋機能不全に関連した周産期致死性を示している。
【０３４５】
累積的に、これらのデータは、ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ胚が、骨格筋機能不全の結果のために周産期で死亡することを示唆する。
【０３４６】
実施例４：ＭＩＮＩＯＮ微小タンパク質は筋前駆細胞の融合に必要である
ＭＩＮＩＯＮΔ／Δ筋における多核筋線維の欠如は、ＭＩＮＩＯＮが筋芽細胞の融合に特異的に必要であり得ることを示唆する。実際に、ＭＩＮＩＯＮΔ／Δまたは対照の筋に由来する初代胚性筋芽細胞における分化および融合の誘導により、ＭＩＮＩＯＮ欠損細胞において特異的に、多核筋芽細胞（３個以上の核）の形成にほぼ完全に失敗することを実証した（図１２Ａ〜１２Ｂ、図１３）。重要なこととして、筋原性への拘束および最終分化のマーカーは通常、インビボおよびインビトロの両方においてＭＩＮＩＯＮΔ／Δ筋芽細胞において誘導されたが（図６Ｅ、図１０Ａ〜１０Ｂ、図１１Ａ〜１１Ｃ、図１３）、これは、筋形成の異常が、前駆細胞の分化それ自体で阻止されることに起因しなかったことを示唆している。本発明者らはさらに、ＭＩＮＩＯＮコード配列および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的化するｓｈＲＮＡによる安定したレンチウイルスの形質導入を介する不死化マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞における機能喪失体を用いてこれを確認した（図１４Ａ）。ＭＩＮＩＯＮ発現のほぼ完全な抑制は、個々のｓｈＲＮＡを用いて達成され（図１４Ｂ）、２つのほとんど活性なｓｈＲＮＡの組合わせにより、分化細胞において検出感度以下のタンパク質レベルをもたらした（ＭＩＮＩＯＮＫＤ；図１２Ｃ）。野生型およびＭｉｎｉｏｎＫＤ筋芽細胞の両方の免疫蛍光染色は、分化している単核筋芽細胞および発生期の多核筋管の両方においてＭｉｎｏｎタンパク質の内因性の発現を示した（図２７Ａ〜２７Ｂ）。この発現パターンはさらに、心臓毒（ＣＴＸ）注射の３日後の再生している肢筋の縦断切片の免疫蛍光染色によって確認された（図２７Ｃ）。ミオゲニン、ＭｙｏＤ、デスミン、ＭＨＣ発現の分析により、ＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞における任意の分子的な分化異常が存在しないこと（図１２Ｃ、１２Ｅおよび１４Ｃ）および筋芽細胞の融合に対する著しい妨害の存在（図１２Ｄ、１２Ｆおよび１２Ｇ）の両方が確認された。興味深いことに、ＭＩＮＩＯＮ欠損筋芽細胞は、融合できないにもかかわらず正常に伸長し整列したが（図１２Ｄ）、これは、筋芽細胞の接着は影響を及ぼされなかったことを示唆している。同様の結果は、初代非不死化成体マウス筋芽細胞のレンチウイルスのｓｈＲＮＡ形質導入を用いて得られた（図１５Ａ〜１５Ｄ）。
【０３４７】
ＭＩＮＩＯＮ転写物を標的化するために使用されるｓｈＲＮＡは３’ＵＴＲを認識するため、本発明者らは、ＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞の融合欠損を相補する様々なｃＤＮＡの能力を試験した（図１６Ａ〜１６Ｂ）。全長のＣ末端タグされたマウスＭＩＮＩＯＮおよびタグのないマウスＭＩＮＩＯＮは両方ともに、融合を頑強にレスキューしたが（図１６Ｃ）、これは、ＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞において観察される細胞融合がオフターゲット作用の結果ではなかったことを実証している。次に、先に長鎖非コードＲＮＡ（ＧＲＣｈ３７ゲノムアセンブリ）としてアノテートされた推定上のヒトＭｉｎｏｎオルソログは、同様の相補性アッセイにおいて試験されたが、これは、タグのないヒトＭｉｎｉｏｎのＯＲＦおよびＣ末端エピトープタグされたヒトＭｉｎｉｏｎのＯＲＦの両方が、ＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞における細胞融合を強力に再構成したことを実証している（図１２Ｈ、図１６Ｃ）。タンパク質コーディングを介してこれらのＯＲＦの機能を最終的に立証するために、単一ヌクレオチドの挿入または欠失を、タグのないマウスおよびヒトＭｉｎｉｏｎのｃＤＮＡにそれぞれ導入した。これらのフレームシフト点変異体は、融合欠損を相補することができなかったが（図１７Ａおよび１７Ｂ）、これは、転写物が非コードＲＮＡとしてではなく、微小タンパク質として機能することを確証している。ＭＩＮＩＯＮΔ／Δマウスにおいて見出される１３５ｂｐ欠失アレルを同様に模倣するｃＤＮＡによるＭＩＮＩＯＮＫＤの再構成では、融合欠損をレスキューできなかったが（図１８）、これが真の機能喪失アレルに相当することを確証している。
【０３４８】
上記の結果は、ＭＩＮＩＯＮタンパク質が、発生している筋における細胞融合に必要であることを実証する。興味深いことに、この作用は筋特異的であるように見えるが、それは、ＭＩＮＩＯＮ発現が、胎盤または融合するマクロファージ系列細胞などの生理的細胞融合の他の状況において検出可能ではなかったためである（図１９Ａ〜１９Ｂ）。
【０３４９】
実施例５：ＭＩＮＩＯＮとＭｙｏｍａｋｅｒの共発現は異種系において細胞融合を誘導するのに十分である
ＭＩＮＩＯＮに関連した細胞融合の機構をより理解するために、ＭＩＮＩＯＮとＭｙｏｍａｋｅｒの間の機能的関連性を調査した。Ｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質は、ＭＩＮＩＯＮのレベルが同様に高い場合に（図１Ｂおよび１Ｅ）、再生している筋および分化しているマウス筋芽細胞において容易に検出可能であった（図２０）。
【０３５０】
Ｍｙｏｍａｋｅｒが線維芽細胞の分化している筋芽細胞への融合を誘導するのに十分であることは以前に報告されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＳＥＲＣＡ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．９，ｒａ１１９，２０１６）、したがって、本発明者らは、Ｍｉｎｉｏｎが線維芽細胞において発現された場合に同様の表現型を呈するかどうかを調べた。Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２線維芽細胞を、ＧＦＰおよび対照、ＭｙｏｍａｋｅｒまたはＭｉｎｉｏｎのいずれかをコードするレトロウイルスで感染させ；次に、ＧＦＰ陽性線維芽細胞を、野生型Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞と混合し、分化培地で３〜４日間維持した。分化している筋芽細胞および筋管は、ＭＨＣ発現によって標識され、ＧＦＰ陽性線維芽細胞の筋管への融合は、Ｍｉｎｉｏｎまたは対照ではなくＭｙｏｍａｋｅｒが発現された場合に、容易に検出された（図２８Ａ）。しかし、Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する線維芽細胞は、分化しているＭｉｎｉｏｎＫＤ筋芽細胞に融合できなかった（図２８Ｂ）。ＭＩＮＩＯＮ発現の消失は、分化している筋芽細胞におけるＭｙｏｍａｋｅｒ発現を低下させず（図２１Ａ）、ｍｙｏｍａｋｅｒの過剰発現は、ＭＩＮＩＯＮＫＤ細胞における融合欠損をレスキューすることができなかった（図２１Ｂ〜２１Ｃ）。共免疫沈降では、検出可能な物理的相互作用が明らかにならなかった（データは示さず）。
【０３５１】
以前の研究は、ｍｙｏｍａｋｅｒ単独では非筋原細胞間の融合を誘導できないことを実証した（Ｍｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，３０１，２０１３）。１０Ｔ１／２線維芽細胞において異種性に発現される場合、ＭｙｏｍａｋｅｒもＭｉｎｉｏｎも単独では（図２１Ｄ）線維芽細胞間の細胞融合を駆動するのに十分ではなかった（図２１Ｆ、２２、および示されないデータ）。しかし、注目すべきことに、ＭＩＮＩＯＮとＭｙｏｍａｋｅｒの共発現は、形質導入された線維芽細胞の相互の迅速かつ均一な融合を駆動して、大型の多核融合細胞を形成した（図２１Ｅおよび図２２）。同様の結果は、増殖条件下で培養された筋芽細胞において観察された（データは示さず）。ＭＩＮＩＯＮおよび／またはＭｙｏｍａｋｅｒを発現し、かつ蛍光色素で特異的に標識された細胞集団を用いる細胞混合実験は、これが不完全な細胞質分裂ではない真の細胞融合を表し、かつこれらの条件下での細胞融合は、融合対の一方のみでのＭＩＮＩＯＮの発現を必要とする一方で、Ｍｙｏｍａｋｅｒの発現は両方の融合細胞内で必要とされることを実証した（図２１Ｆ〜２１Ｇ、図２３Ａ〜２３Ｅ）。
【０３５２】
したがって、ＭＩＮＩＯＮは、分化している筋芽細胞との細胞融合を媒介するＭｙｏｍａｋｅｒにとって必要であり、ＭＩＮＩＯＮおよびＭｙｏｍａｋｅｒは合わせて、筋細胞および非筋細胞、例えば、線維芽細胞などの非融合誘導性系列の両方における融合の誘導のための最小のプログラムに相当する。
【０３５３】
実施例６：Ｍｉｎｉｏｎに誘導された融合は細胞骨格の再構築を必要とする
機構的に、微小タンパク質内の小さなサイズの機能ドメインおよび機能ドメインの欠如は、それらが主としてタンパク質−タンパク質相互作用を介して機能するという示唆をもたらした（Ｍａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８８，３９６７−３９７５，２０１６）。Ｍｉｎｉｏｎの機能に関する最も単純なモデルはＭｙｏｍａｋｅｒとの物理的相互作用であるが、このようなモデルは機能喪失表現型における差異を説明しないであろう（それぞれ、整列の欠如および整列の存在）。実際に、タグされたバージョンのＭｉｎｉｏｎおよびタグのないバージョンのＭｉｎｉｏｎの両方を用いる、内因性および過剰発現されたＭｙｏｍａｋｅｒとの共免疫沈降での広範な試行は、ウェスタンブロットによって判定されるとおり（データは示さず）、分化している筋細胞における２つのタンパク質間の検出可能な物理的相互作用を明らかにしなかった。したがって、本発明者らは、分化している筋芽細胞において発現されるＦＬＡＧタグされたＭｉｎｉｏｎを用いたアフィニティー精製に続く質量分析（ＡＰ−ＭＳ）を実施した。Ｍｙｏｍａｋｅｒは特異的に相互作用するタンパク質として再度回収されなかったが、細胞骨格タンパク質を含む複数のクラスの高度に濃縮された相互作用するタンパク質が同定された（図２９Ａ〜２９Ｂ；表５）。実際に、本発明者らは、ＭｉｎｉｏｎとＭｙｏｍａｋｅｒの共発現によって誘導される多核線維芽細胞が、細胞周辺部でのアクチン壁の形成を伴う著しい細胞骨格の再編成を呈したことを観察した（Ｄｕａｎ  Ｒ．＆  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｐ．Ｊ．Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｎ  ｗａｌｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｍｕｓｃｌｅ  ｍｙｏｓｉｎ  ＩＩＡ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３２５，３７４−３８５  ２００９）（図３０Ａ）。細胞骨格の再構築を妨害する２つの異なるアクチン重合阻害剤による処理は、この最小の２つの因子の系においてアクチンの再構築および細胞融合の両方を阻止した（図３０Ｂ）。本発明者らは、Ｍｉｎｉｏｎは、分化している骨格筋への細胞の融合を媒介するＭｙｏｍａｋｅｒに必要とされるこれまで未知であった因子であり、かつＭｉｎｉｏｎとＭｙｏｍａｋｅｒは、融合をもたらす細胞骨格の再編成の誘導のための最小のプログラムとして一緒に機能することができると結論づける（図３０Ｃ）。
【０３５４】
【表５−１】
2020500020.tif 000020
【０３５５】
【表５−２】
2020500020.tif 000021
【０３５６】
【表５−３】
2020500020.tif 000022
【０３５７】
【表５−４】
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【０３５８】
本明細書で提供されるデータは、微小タンパク質ＭＩＮＩＯＮおよび膜貫通タンパク質Ｍｙｏｍａｋｅｒによって媒介される細胞融合のための進化的に保存された経路を明らかにする。本発明者らの研究は、融合対内で、細胞融合を駆動するために両方の細胞がＭｙｏｍａｋｅｒを発現しなければならないが、一方の細胞のみでＭＩＮＩＯＮを発現する必要があるという予期しない極性を明らかにした。これは、脊椎動物の筋形成が、創始細胞の別個の集団と融合能力のある筋芽細胞との間で融合が起こる、以前は認識されていない無脊椎動物との類似性を有することを示唆する（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｖｅｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：３６９，２００５）。この非対称性に基づいて、本発明者らは、脊椎動物の筋発生のモデルを提案し、その中で、融合は、細胞膜の付着または接着を誘導し得る膜貫通タンパク質（Ｍｙｏｍａｋｅｒ）と、ポア形成を駆動するアルファヘリックスの疎水性融合ペプチドとして機能し得る融合誘導性タンパク質のＭＩＮＩＯＮとの協調的な作用を要する。
【０３５９】
筋生物学に対する示唆以上に、本明細書の既定の２つの成分によるシステムは、プログラム可能であり、かつ潜在的な標的化した細胞融合への契機となり、癌細胞の腫瘍溶解性の融合（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２，３３１，２００４を参照のこと）、免疫療法における樹状細胞の癌細胞への融合（Ａｖｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ／ｔｕｍｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：２８７，２０１２を参照のこと）、再生医療における使用（Ｄｉｔｔｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７１４：１，２０１１を参照のこと）、およびヘテロカリオンに基づく核リプログラミングの研究（Ｂｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：７５８，１９８５を参照のこと）を含む様々な治療および研究応用を見出し得る。最後にかつ重要なこととして、本発明者らの研究は、本発明者らが知るところでは、必須の哺乳動物微小タンパク質ＭＩＮＩＯＮの最初の報告となる。したがって、それらは、本クラスの小さな、ほとんど研究されておらず、かつ大部分はバイオインフォマティクス的にサイレントであるタンパク質が脊椎動物の生物学において重大な意味を持ち、かつ探索されていない機能を有するという、現在までで最も有力な証拠に相当する。
【０３６０】
特に他に定義されない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は、本開示の属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
【０３６１】
特に指示がない限り、特に詳細に記載されていない全ての方法、工程、手法および操作は、それ自体、当業者には明らかで知られている様式で実施することができ、また実施されてきた。例えば、ここでもまた、本明細書で言及される、標準的な手引き書、および一般的な背景技術、ならびにその中で引用されている、さらなる参考文献が参照される。特に指示がない限り、本明細書で引用される参考文献の各々は、参照によりその全体において組み込まれる。
【０３６２】
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的なものであり、下記に提示される。
【０３６３】
本明細書では、特定の態様および特許請求の範囲について、詳細に開示してきたが、これは、例示のみを目的とする例としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、または任意の、対応する、将来の適用についての、特許請求の範囲の対象事物の範囲に関して、限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定される、本開示の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本開示に対して、多様な代替、改変、および変更が施され得ることを想定する。核酸の出発材料、目的のクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書で記載される態様について通じた当業者には、通例の事項であると考えられる。他の態様、利点、および変更も、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。当業者であれば、まさしく常用の実験を使用して、本明細に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。後で出願される対応する出願における請求項の範囲の書き直しは、種々の国の特許法による制限に基づくこともあり、請求項の対象事物の放棄と解釈されるべきではない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−５】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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