(57)【要約】  本発明は、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）菌およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、反芻動物における呼吸器疾患に対する経口ワクチンに関する。ＰＶＰの添加は、チャレンジ感染後の肺スコアに対するワクチン接種の防御効果を著しく改善する。さらに、ＰＶＰは、集団投与の方法による、例えば飲料を介した経口経路などによるワクチン接種を可能にする。加えて、本発明は、かかるワクチンの調製方法、かかるワクチンを使用した反芻動物のワクチン接種方法、およびＭ．ヘモリチカ菌を含む組成物の医学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｉｔｉｃａ）菌および薬学的に許容される担体を含み、またポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）も含む、反芻動物における呼吸器疾患に対する経口ワクチン。
【請求項２】
生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌が、病原性のロイコトキシンＡタンパク質を発現することができない、請求項１に記載の経口ワクチン。
【請求項３】
反芻動物が、ウシ属動物である、請求項１または２に記載の経口ワクチン。
【請求項４】
ＰＶＰの濃度が、約０．３から約３％  ｗ／ｖの間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の経口ワクチン。
【請求項５】
凍結乾燥形態である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の経口ワクチン。
【請求項６】
ＰＶＰが、ＰＶＰのタイプの組み合わせのものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の経口ワクチン。
【請求項７】
少なくとも１つの追加の免疫活性成分も含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の経口ワクチン。
【請求項８】
少なくとも１つの追加の免疫活性成分が、生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）菌である、請求項７に記載の経口ワクチン。
【請求項９】
生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌および薬学的に許容される担体をＰＶＰと混合するステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の経口ワクチンの調製方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の経口ワクチンを経口経路により反芻動物に投与するステップを含む、呼吸器疾患に対する前記反芻動物のワクチン接種方法。
【請求項１１】
経口ワクチンが、乳と混合されて反芻動物に給餌される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
反芻動物への飲料としてのまたは飼料を伴った投与のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の経口ワクチン。
【請求項１３】
飲料が、若年反芻動物への給餌による投与のための乳中のワクチン希釈物である、請求項１２に記載の経口ワクチン。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の経口ワクチンの希釈物を含む、呼吸器疾患に対する若年反芻動物の給餌によるワクチン接種のための乳飲料。
【請求項１５】
呼吸器疾患に対する若年反芻動物の給餌によるワクチン接種のための乳飲料の製造のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の経口ワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物用ワクチン学の分野に関し；詳細には、本発明は、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）菌を含む、反芻動物における呼吸器疾患に対する経口ワクチンに関する。加えて、本発明は、かかるワクチンの調製方法、かかるワクチンを使用した反芻動物のワクチン接種方法、およびＭ．ヘモリチカ菌を含む組成物の医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
反芻動物の畜産において、主な獣医学的問題の１つは呼吸器疾患である。これは、動物福祉および運営経済に対して重大なマイナスの効果を有する複雑な疾病症候群である。いくつかの原因が反芻動物の呼吸器疾患（ＲＲＤ）に関連すると考えられ：その根拠は１または複数の細菌およびウイルスによる感染であり、これは環境ストレス因子により促進されて悪化する。かかるストレスは、収容条件、例えば熱、渇水、密集、換気不十分（埃およびアンモニア）などに；社会的要因、例えば離乳および新たなグループに混じり合うことなどに；同様に取り扱いおよび輸送に起因する可能性がある。これは、ＲＲＤがしばしば「輸送熱肺炎」と呼ばれる理由である。
【０００３】
関与する病原体は、細菌、中でも：マンヘミア・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）およびヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）；ならびにウイルス、中でも：ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、パラインフルエンザ−３（ＰＩ３）ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）および感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）の原因となるウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ１）である。ウシにおける呼吸器疾患複合についての総説は：Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ（２０１０，Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍａｌｓ，ｖｏｌ．２６，ｐ．５７−７１）およびＧｒｉｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２９，ｐ．７７０−７８０）である。
【０００４】
ＲＲＤを予防または緩和するため、いくつかの獣医学的処置が利用可能であり、しばしば抗生物質との、ならびにウイルス性および細菌性病原体用のワクチンとの組み合わせが用いられる。
【０００５】
ＲＲＤに関与する細菌性病原体用の商業的ワクチンのうち、大半は、バクテリン（不活化細菌）またはトキソイド（解毒された毒素）の形態のＭ．ヘモリチカおよびＰ．ムルトシダの抗原を有する不活化アジュバントワクチンである。かかるワクチンは、筋肉内または皮下経路による非経口的注射が意図される。例えば：Ｂｏｖｉｐａｓｔ（商標）およびＯｖｉｐａｓｔ（商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｒｉｓｐｏｖａｌ（商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｐｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）ならびにＲｅｓｐｉｓｈｉｅｌｄ（商標）（Ｍｅｒｉａｌ）である。細菌性ＲＲＤに対するほんの少数のワクチンのみが、生きた弱毒化細菌を含む。理由は、かかる生きた弱毒化細菌ワクチンは抗生物質の予防的使用と容易に組み合わせることができないためである。例は：Ｏｎｓｅｔ（商標）、ＯＮＣＥ（商標）、Ｖｉｓｔａ（商標）およびＲｅｓｐａｖｉｒ（商標）（全てＭｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈからのもの）である。これらの生きた弱毒化ワクチンは、皮下または鼻腔内経路により投与される。これらの経路はいずれも、動物にとってかなりストレスの多いものであり、その理由は、鼻腔内経路は典型的に、ヒトによるまたは機械的手段による、動物、特にその頭の物理的拘束を必要とするためである。
【０００６】
さらに、液体の鼻腔内投与は、明らかに非常に不快である。また、鼻腔内に適用されたワクチンはくしゃみで再度出ることがあるので、動物はワクチンの全用量を受けることができなかった。その結果として、この分野において、より簡便でストレスの少ない方法で投与することができるＲＲＤに対する生きた弱毒化細菌ワクチンへの至急のニーズがある。
【０００７】
ＲＲＤに関与する細菌性病原体のうち、Ｍ．ヘモリチカが疾患の主な原因である。これは、反芻動物において上気道の共生物であるが、機会があればＲＲＤにおける肺炎性パスツレラ症に関連する主要な細菌性病原体となることができる。疾患の典型的な臨床症状は、発熱、抑うつおよび呼吸頻度の増加である。病理組織学的兆候は、特徴的な肺病変、例えば壊死、血栓症および滲出などである。
【０００８】
Ｍ．ヘモリチカは、パスツレラ科のメンバーであり、以前はパスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）と呼ばれていた（Ａｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．４９，ｐ．６７−８６）。
【０００９】
パスツレラ科は、グラム陰性、桿状、非運動性の通性嫌気性菌である。パスツレラ科は、一般に、それらの莢膜抗原に基づいて血清型に細分される。ＲＲＤにおける最も卓越したＭ．ヘモリチカの血清型は、Ａ１およびＡ６である。主な病原性因子は、その莢膜多糖およびロイコトキシンである。異なる弱毒化変異を含む、Ｍ．ヘモリチカの生きた弱毒化株は、例えば：Ｃｈｅｎｇａｐｐａ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ（１９７９，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４０，ｐ．４４９−４５０）、ＷＯ１９９９／０１５６７０およびＷＯ２００４／０６４７７６中に記載される。
【００１０】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、１９３０年代から知られている合成ポリマーであり、種々の目的のために：食料品においては安定剤（Ｅ１２０１）として；原体においては例として塗料または接着剤の中で；ならびに化粧品および医薬品においてはバインダー、増粘剤、乳化剤または崩壊剤として、広く用いられる。
【００１１】
ＷＯ９４／２００７０は、「粘膜表面での免疫原の送達におけるポリマー性粘膜付着剤（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ａｔ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ）」というタイトルである。これは、「粘膜付着剤として作用すると考えられる」化合物のリストを提示しており、その中にＰＶＰがある。’０７０は、カルボキシメチルセルロースおよびアジュバントの使用を好む。試験された唯一の抗原は不活化Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスであり、これは、マウスに経口または胃内経路により投与される。全ての実験が防御を示したわけではなく、セロコンバージョンを示した試料は、後に細菌汚染されていることが見出された。これは、次いで「細菌アジュバント」に割り当てられた。‘０７０は、粘膜付着剤を伴うが細菌アジュバントを伴わないウイルス抗原は、経口免疫により著しい免疫応答を提供することはできなかったと結論している（‘０７０、２４ページ、下から９〜３行目）。
【００１２】
ＷＯ００／５００７８は、「抗原の粘膜送達のための生物付着剤およびアジュバントの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）」というタイトルであり、ヒトのためのインフルエンザに対する鼻腔内ワクチンを開発することを目的とする。‘０７８は、ＰＶＰおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を生物付着剤として挙げている。生物付着剤は、抗原をその上に吸着したマイクロスフェア、または抗原をその球体内部に捕捉したマイクロスフェアであることが好ましい。記載された唯一の実験は、細菌毒素をアジュバントとして、およびポリカルボフィル、カーボポールまたはＨＰＭＣを生物付着剤として用いて、インフルエンザＨＡ抗原の鼻腔内投与をウサギに適用している。
【００１３】
Ｗ０２００５／００３３０は、飼料または飲料水を介して投与される生きた弱毒化ワクチンとして用いられる、Ｐ．ムルトシダの無莢膜欠失変異株を記載する。‘３３０は、筋肉内注射によるシチメンチョウの免疫、および皮下経路または飼料を介した経口経路による仔ウシの免疫を記載する。任意の他の賦形剤の使用または必要性は、記載または示唆されていない。
【００１４】
Ｂｕｈｌｅｒ（‘Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ’，ＩＳＢＮ  ３−５４０−２３４１２−８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ，２００５中のもの）は、真皮および粘膜表面への医薬化合物の送達のための生物付着剤としてのＰＶＰの適合性を記載する（上のＢｕｈｌｅｒ，ｐ．１２０，セクション２．４．９．２）。しかしながら、うがい薬などにおける使用のためのＰＶＰの適合性は、歯のエナメル質への口腔内細菌の付着のその低減、それゆえに微生物的な抗付着剤としてのその使用に由来することが記載される（上のＢｕｈｌｅｒ：ｐ．１２４，セクション２．４．９．９）。
【００１５】
ＷＯ９３／１６６８０もまた、歯磨剤におけるＰＶＰの微生物的な抗付着効果を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ１９９９／０１５６７０
【特許文献２】ＷＯ２００４／０６４７７６
【特許文献３】ＷＯ９４／２００７０
【特許文献４】ＷＯ００／５００７８
【特許文献５】Ｗ０２００５／００３３０
【特許文献６】ＷＯ９３／１６６８０
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，２０１０，Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍａｌｓ，ｖｏｌ．２６，ｐ．５７−７１
【非特許文献２】Ｇｒｉｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２９，ｐ．７７０−７８０
【非特許文献３】Ａｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．４９，ｐ．６７−８６
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇａｐｐａ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ，１９７９，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４０，ｐ．４４９−４５０
【非特許文献５】Ｂｕｈｌｅｒ，‘Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ’，ＩＳＢＮ  ３−５４０−２３４１２−８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、従来技術における不利益を克服すること、および有効な免疫防御をなお誘導しながらもより簡便でストレスの少ない投与経路により投与することができる、反芻動物の呼吸器疾患に対する生きた弱毒化細菌ワクチンを提供することによって、この分野におけるニーズに対応することである。
【００１９】
ワクチンの集団適用の１つの一般的方法は、経口経路によるものである。しかしながら、本発明者らが、鼻腔内経路による投与のために処方された現存の生きた弱毒化細菌ワクチンを直接的に経口適用することを試みたとき、これは成功しなかった。経口経路は、Ｐ．ムルトシダ菌については有効だが、驚くべきことに近縁のＭ．ヘモリチカについては成功しなかった。これは、生産することができる最大レベルに近い用量の細菌（１動物用量あたり１０＾９超の細菌）が適用されたときであっても、細菌学的生産のためのリッチな培養培地および最新の工業システムを使用しても、そうであった。本発明者らは次いでＭ．ヘモリチカ培養物の濃縮を試みたが、これは単に生きた細菌の最終力価を低減させただけであった。本発明者らは、この問題をどのように克服するかについて従来技術からの指示を何ら持たなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
驚くべきことに、経口経路により投与することができる、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｉｔｉｃａ）菌を含むＲＲＤに有効なワクチンを提供することによって、この目的を満たし、その結果として従来技術の１または複数の不利益を克服することができることが見出された。これは、ポリビニルピロリドンをワクチンに添加することによって達せられた。
【００２１】
新規ワクチンの有利な効果は、経口経路によるその投与が、特に飲料としてまたは飼料と共に適用されるときに、動物の安価で有効な集団ワクチン接種を可能にすることである。これは、動物の追加の取り扱いをもはや必要としないので、動物への不必要なストレスを低減させ、加えて労働および獣医サービスのための費用をかなり節約する。ストレスはＲＲＤにおいてそのような重要な因子であるので、したがって、集団投与の方法を用いたワクチン接種による動物へのストレスの低減は、ＲＲＤの発症を低減させるのに役立つ。
【００２２】
ＰＶＰは、有効であることが見出された濃度範囲において生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌に対して非毒性であることが見出された。
【００２３】
ＰＶＰの添加が経口経路による生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカの投与を可能にする理由は、現状、不明である。本発明者らは、これらの知見を説明し得る何らかの理論またはモデルに拘束されることを望むものではないが、ＰＶＰが何らかの方法または他の方法でワクチンの中で細菌と会合し、これが、これらの細菌がより効果的に上気道定着を確立することを可能にし、および／または免疫系へのこれらの細菌の良好な曝露をもたらすものと推測する。
【００２４】
したがって、１つの態様において、本発明は、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｉｔｉｃａ）菌および薬学的に許容される担体を含み、またポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）も含む、反芻動物における呼吸器疾患に対する経口ワクチンに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のため、「経口（ｏｒａｌ）」とは、動物の口腔を介した、典型的に：口を介した、経口（ｐｅｒ  ｏｓ）としても知られる標的反芻動物への投与経路を指す。中でも、これは、頬側、舌（舌下）、口唇（口唇下）、喉頭、口腔咽頭、扁桃または口腔粘膜と名付けられる投与経路を包含する。さらに、これはまた、口腔への間接的投与、例えば反芻動物の鼻口部領域への投与などを指し；なめることによって、または別の反芻動物をなめることによってさえ、自身を清浄にする動物の自然の傾向が、次いで接種物を口腔に到達させる。
【００２６】
実際には、経口とは何らかの摂食または飲水方法によるワクチンの摂取を指すが、液体または粉末のスプレーまたは噴霧（ｎｅｂｕｌｉｓａｔｉｏｎ）も含み得る。
【００２７】
「ワクチン」は、医学的効果を持つ組成物であることが周知である。ワクチンは、免疫学的活性成分および薬学的に許容される担体を含む。「免疫学的活性成分」は、１または複数の抗原性分子（複数可）であり、本明細書では：標的の免疫系によって認識され、防御的な免疫学的応答を誘導する、生きたＭ．ヘモリチカ菌である。応答は、標的の自然免疫系および／または獲得免疫系を起源とし得て、細胞型および／または液性型のものであり得る。
【００２８】
ワクチンは一般に、宿主反芻動物における病原性Ｍ．ヘモリチカ菌の負荷を低減させること、または複製の持続時間を短縮することによって、標的病原体による感染のレベルまたは程度を低減させることに効果的である。
【００２９】
また、あるいはおそらくその結果として、ワクチンは一般に、かかる感染もしくは複製によって、またはその感染もしくは複製への動物の応答によって引き起こされ得る疾患の（臨床）症状を低減もしくは回復させるのに有効である。
【００３０】
本発明による経口ワクチンの効果は、反芻動物における病原性Ｍ．ヘモリチカによる感染の、および／またはかかる感染もしくは複製に関連した１もしくは複数の呼吸器疾患兆候の予防または低減である。かかる（臨床的）兆候は：発熱、呼吸数の増加、鼻汁、および典型的病変を引き起こすいくつかのタイプの肺への炎症性疾病である。その結果として、本発明による経口ワクチンは、Ｍ．ヘモリチカにより引き起こされる肺病変の数および／または重症度の低減において検出可能であるように、Ｍ．ヘモリチカにより引き起こされる呼吸器疾患の低減における援助である。
【００３１】
かかるＭ．ヘモリチカワクチンは、口語的に、Ｍ．ヘモリチカ「に対する」ワクチン、肺炎性パスツレラ症「に対する」ワクチンまたは「Ｍ．ヘモリチカワクチン」とも呼ばれる。
【００３２】
本発明による経口ワクチン、その生産およびその使用の実施形態および詳細は、本明細書中で下に記載される。
【００３３】
本発明のための「呼吸器疾患」とは、反芻動物の気道の任意の疾患を指す。典型的に、これは、病原性Ｍ．ヘモリチカ菌での感染の帰結であり、一般に１または複数の細菌またはウイルスによる感染と組み合わされる。説明については、獣医学ハンドブック、例えば：“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ  ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）などを参照されたい。かかる疾患の例は：輸送熱または肺炎性パスツレラ症である。
【００３４】
本発明のための「反芻動物」は、反芻亜目（Ｒｕｍｉｎａｎｔｉａ）に割り当てられる動物および／または反芻プロセスを適用してその飼料を消化する動物である。
【００３５】
本発明のための用語「生きた」および「弱毒化された」とは、生きている、これは複製性を意味し、および弱毒化されていないより病原性の細菌株と比較して特定の宿主における感染または疾患を誘導する能力が低減された細菌を指す。同義語は：改変された生きた（ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｌｉｖｅ）である。弱毒化の効果は、細菌は標的動物において依然として複製することができるので関連する抗原が標的の免疫系に提示されるが、それ自体が標的に（重篤な）疾患を引き起こさないことである。これは、弱毒化されていないバージョンの細菌での感染（の帰結）から、標的を効果的に防御する。
【００３６】
ワクチン接種における生きた弱毒化細菌の使用は、１８８０年代から知られている。安定的に弱毒化された細菌は、複製能または感染能に欠損を誘導する遺伝的変異、例えばそれらの外部細胞小器官、それらのコートもしくはカプセルの、病原因子の発現の、またはそれらの内部組織の変異などを保有する。弱毒化された細菌は、インビトロで、多種多様な方法で、例えば定方向のまたは非特異的な（ａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）変異誘導方法などを通じて作製することができる。例は、続けての継代（インビボまたはインビトロ）；変異誘発物質、例えば化学物質もしくは電離放射線などの使用；または組換えＤＮＡ技術である。また細菌は、その天然の宿主種に感染したときは完全に病原性であっても、特定の標的種への感染に対して弱毒化されたと考えることができる。
【００３７】
「Ｍ．ヘモリチカ」は、パスツレラ科の細菌である。それらは、その分類学的グループのメンバーを特徴づける特徴、例えば形態的、ゲノム的および生化学的な特性など、同様に生物学的特性、例えば生理的、免疫的または病理的な挙動などを呈する。当該分野において知られるように、微生物の分類は、かかる特徴づける特徴の組み合わせに基づく。したがって、本発明の範囲はまた、それから何らかの方法で、例えば亜種、株、分離株、遺伝子型、変異株、亜型、血清型または亜群などとして下位分類されるＭ．ヘモリチカ菌を包含する。
【００３８】
本発明のための特定のＭ．ヘモリチカ菌は現在、ある具体的な種および属に分類され得るが、新たな見識が新たなまたは異なる分類学的群への再分類につながり得ることから、かかる分類学的分類はやがて変わることができることは、当業者に明らかである。これは、以前はパスツレラ・ヘモリチカとして分類されていたＭ．ヘモリチカにとりわけ当てはまる。かかる再分類は、その微生物自体、その遺伝的もしくは抗原性レパトワ、または他の細菌への遺伝的関連性のレベルを変えず、その科学的名称または分類のみを変える。したがって、かかる再分類された細菌は、なお本発明の範囲内にある。
【００３９】
「薬学的に許容される担体」は、例えば液体、例えば水、生理的塩類溶液またはリン酸緩衝生理食塩水などである。より複雑な形態において、担体は、例としてさらなる添加剤、例えば安定剤または保存剤などを含むバッファーであることができる。
【００４０】
本明細書中で用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」（同様にバリエーション、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」）は、この用語が用いられるテキストセクション、段落、特許請求の範囲などによってカバーされるまたはこれらの中に包含される全ての要素および本発明のために想像できるあらゆる可能な組み合わせを、かかる要素または組み合わせが明示的に挙げられていなくても指すことを意図し；かかる要素（複数可）または組み合わせのいずれの除外も意図しない。
【００４１】
したがって、任意のかかるテキストセクション、段落、特許請求の範囲などはまた、したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」（またはその変形）が例えば「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語により置き換えられた１または複数の実施形態（複数可）に関するものであることができる。
【００４２】
「ポリビニルピロリドン」は、１−ビニル−２−ピロリジノン単位の合成ポリマーである。この化合物のＣＡＳ番号は９００３−３９−８であり、ＰＶＰと略され、いくつかの同義語、例えば：ポリビドンおよびポビドンなどがある。ＰＶＰは、品質および純度の異なるレベルのものが、商業的に幅広く入手可能である。周知のブランドは、例えば：Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（商標）およびＬｕｖｉｔｅｃ（商標）、いずれもＢＡＳＦまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能；Ｌｕｖｉｓｋｏｌ（商標）、ＢＡＳＦ；Ｐｅｒｉｓｔｏｎ（商標）、ＢＣＭ；およびＰｌａｓｄｏｎｅ（商標）、Ａｓｈｌａｎｄからのものである。
【００４３】
ＰＶＰは、ポリマーの重量平均分子量で２．５００から２００００００ダルトンの間でポリマーサイズが異なるものが利用可能である。あるいはＰＶＰ製品は、フィケンチャーＫ値により特徴づけることができる。これは、ポリマーの分子量の尺度としての、溶媒の粘度に対するポリマー希釈溶液の粘度を表す経験的な値（ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １６２８−１中に言及されている）である。
【００４４】
ＰＶＰについてのＫ値と対応する重量平均分子量範囲との間の関係についてのいくつかの指標は：Ｋ  １２：２．０００〜３．０００；Ｋ  １７：７．０００〜１１．０００；Ｋ  ２５：２８．０００〜３４．０００；Ｋ  ３０：４４．０００〜５４．０００；Ｋ  ６０：３５０．０００〜５５０．０００；およびＫ  ９０：１．０００．０００〜１．５００．０００である（Ｖ．Ｂｕｈｌｅｒ：Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏ−ｌｉｄｏｎｅ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＩＳＢＮ  ３−５４０−２３４１２−８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ，２００５；ｐ．２５，表１７）。
【００４５】
ＰＶＰは１９３０年代から知られており、種々の目的のために：食料品においては安定剤（Ｅ１２０１）として；原体においては例として塗料または接着剤の中で；ならびに化粧品および医薬品においてはバインダー、増粘剤、乳化剤または崩壊剤として、広く用いられる。これは、薬局方の中に、例としてＰｈＥｕｒ  ８中のモノグラフ６８５に登録されている。
【００４６】
本発明による経口ワクチンの、例えばその組成、量、力価および物理的形態に関して異なる実施形態は、本明細書中で下に開示される。
【００４７】
本発明による経口ワクチンの調製および使用の際、いくつかの中間組成物、例えばプレミックス、多少濃縮された作業溶液、粗回収物などが作られ、用いられる。これらは、その組成および濃度が完成したワクチンと異なるが、完成したワクチンは製造業者によって販売および商業的使用のために発売されるためである。また、発売されるワクチンは、ワクチンが上市された形態に応じて、投与の準備ができる前にさらなる調製を必要とし得る。実際には、これは、ワクチンが製造業者によって液体形態で発売されるときはワクチンは直接投与のために準備済みであり得て、または濃縮形態で上市されるときは希釈を必要とし得ることを意味する。あるいは、ワクチンが製造業者によって凍結乾燥形態で発売されるときはワクチンは顆粒または粉末として適用され得る。より頻繁には、凍結乾燥ケークは、投与の準備ができる前に、最初に推奨量の適切な希釈剤で再構成される。
【００４８】
したがって、本発明による経口ワクチンの、本明細書中に記載される実施形態および詳細は、反芻動物標的への投与のために準備済みであるワクチンの最終版を指す。
【００４９】
これは、本発明による経口ワクチンの「反芻動物への投与のために準備済みであるワクチンの最終版」でさえも、さらなる調製のために、例として集団投与を可能にするために飼料または飲料中に取り入れることによって用いられ得るという事実にもかかわらずである。結果として、それらのさらなる希釈物、混合物などは、ワクチン（のいくつかの要素）を本明細書中に記載される（好ましい）実施形態の外側にし得る。これは全て本発明の範囲内にある。
【００５０】
本発明による経口ワクチンにおける使用のための生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌は、本発明において安全であるが効果的なそれらの使用を提供する任意の方法で弱毒化を達成する異なる方法で、天然の分離物として、またはインビトロでの操作および選抜からの結果として、得ることができる。好ましい弱毒化方法は、細菌ゲノム中に安定な遺伝的基礎を持つものであり；かかる安定な変異は、ワクチン細菌株が受けなければならない多くの回数の複製をしても弱毒化を多少なりとも変えない。かかる回数の複製の例は、マスターストック供給物および作業用ストック供給物の作製、次に生産ランの間の複製、および最後に標的動物における有効な免疫感染を確立するための回数の複製である。典型的に、最も安定な変異は、標的化された組換えＤＮＡ技術によって導入されたもの、および１つよりも多いまたは数個のヌクレオチドの変化を組み込むものである。
【００５１】
世界の多くの国において結果として得られたワクチンの販売許可を容易にするため、かかる変異細菌は、好ましくは何らかの外来ＤＮＡを含有すべきでなく、とりわけその発現が抗生剤への抵抗性を提供する何らかの遺伝子を含有すべきでない。
【００５２】
本発明における使用のための好ましい生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌は、Ｃｈｅｎｇａｐｐａ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ（１９７９，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４０，ｐ．４４９−４５０）、ＷＯ２００４／０６４７７６中に記載される細菌、またはロイコトキシンオペロン中に変異を含む細菌である。
【００５３】
より好ましいのは、非病原性形態のロイコトキシンＡタンパク質を発現する生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌である。
【００５４】
この点で：Ｍ．ヘモリチカのロイコトキシンＡタンパク質の非病原性は、発現したロイコトキシンＡタンパク質のサイズが野生型タンパク質のサイズよりも短いことに由来し得て、またはそのタンパク質が翻訳後活性化を達成しないことに由来し得る。いずれにせよ、かかる非病原性ロイコトキシンＡタンパク質を発現する細菌は生存可能で複製性のままであり、発現した形態のロイコトキシンＡタンパク質は免疫応答をなお刺激することができるが、ロイコトキシンＡの野生型バージョンよりも著しく少ない病状を引き起こす。かかる変異は、例えばＷＯ１９９７／０１６５３１中に、およびＷＯ１９９９／０１５６７０中に記載される。
【００５５】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌は、非病原性形態のロイコトキシンＡタンパク質を発現する。
【００５６】
なおより好ましいのは、ロイコトキシンＡ遺伝子における、そうでなければ野生型ロイコトキシンＡタンパク質のアミノ酸番号３４〜３７８をコードするヌクレオチドの欠失を含む、ＷＯ１９９９／０１５６７０中に記載される生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌である。最も好ましい生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカは、ＷＯ１９９９／０１５６７０中に記載される、ＮＡＤＣ  Ｄ１５３  ΔｌｋｔＡという名称のＭ．ヘモリチカ血清型１の変異株である。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明のための「反芻動物」は、獣医学または商業的農業活動に関連する任意の反芻動物に関する。好ましくは、これは、ウシ属動物、ヤギ属動物、ヒツジ属動物またはシカ属動物を指す。
【００５８】
シカおよびヤギ、およびとりわけヒツジの商業的農業があるが、ウシ属、とりわけウシ農業の経済的関連性は、最大の世界的関連性を持つ。
【００５９】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、反芻動物はウシ属動物である。
【００６０】
好ましい実施形態において、ウシ属動物は、タウリンウシ（ｔａｕｒｉｎｅ  ｃａｔｔｌｅ）（ボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））、コブウシ（ボス・インディクス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ））、スイギュウ、バイソン、ヤクまたはヨーロッパバイソンである。
【００６１】
ウシ属は任意のタイプ：乳牛もしくは肉牛、または乳牛もしくは肉牛のための親家畜のタイプのものであることができる。
【００６２】
本発明者らは、本発明による経口ワクチンにおいてＰＶＰが有効である範囲はかなり幅広いことを観察した。ただの実際的な制限はＰＶＰ濃度がより高いものであり、または平均分子量範囲が大きいタイプのＰＶＰを用いるときには、ＰＶＰを完全に溶解して他の成分との完全な混合を達成するためにより多くの時間がかかることがある。
【００６３】
本発明による有効な経口ワクチンは、約０．０１から約１０％  ｗ／ｖ  ＰＶＰの間の濃縮物をワクチン中に含ませることによって得ることができる。上記のように、これは、反芻動物への投与のために準備済みである本発明による経口ワクチンの最終版を指す。
【００６４】
好ましくは、本発明による経口ワクチン中のＰＶＰの濃度は、好ましい順に、約０．０５から約７％  ｗ／ｖ  ＰＶＰの間；０．１から５の間；０．２から４の間；またはさらには約０．３から３％  ｗ／ｖ  ＰＶＰの間である。
【００６５】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、ＰＶＰの濃度は、約０．３から約３％  ｗ／ｖの間である。
【００６６】
本発明のため、用語「約」と共に指し示される数字は、好ましい順に、指示された値の前後±２５％の間で変動することができることを意味し；好ましくは：約は指示された値の前後±２０％を意味し、より好ましくは：約は指示された値の前後±１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２％を意味し、またはさらには：約は指示された値の前後±１％を意味する。
【００６７】
本発明による経口ワクチンのより好ましい実施形態において、ＰＶＰの濃度は、約１．３％  ｗ／ｖである。
【００６８】
ある実施形態において、本発明による経口ワクチンは、好適な保存剤、例えばチメロサール、メルチオレートまたは安息香化合物などを、有効であるが生きたワクチン微生物によっても許容される量で含む。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明による経口ワクチンは、液体形態である。液体は、一般に水性であり得て、これは水のようなものであることを意味するが、より液体の少ない半固体、例としてシロップ、ゲル、分散物、エマルションまたはペーストのようなものであることもできる。
【００７０】
液体形態で発売されるとき、ワクチン製剤は、生きた弱毒化細菌の長期保存を可能にする安定剤を含む。例えば：液体ワクチンが０℃未満の温度で凍結保存されることが意図されるとき、安定剤は、−２０℃以下の温度での長期間の保存を可能にする凍結保護物質、例えばグリセロールである。あるいは、液体ワクチンを０℃より高い温度で保存するとき、好適な液体安定剤は、例えばＷＯ２０１４／１４０２３９またはＵＳ９，３９３，２９８中に記載されるように選択され得る。
【００７１】
１つの実施形態において、本発明による経口ワクチンは凍結乾燥形態（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ  ｆｏｒｍ）であり、これは凍結乾燥形態（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ  ｆｏｒｍ）としても知られる。この形態は、より軽く、したがって輸送により経済的であることから、液体形態のワクチンよりも多数の利点を持つ。さらに、凍結乾燥ワクチンは通常、凍結状態を保つことを必要とせず、より経済的な２〜８℃で保存することができる。
【００７２】
凍結乾燥のための手法は当業者に周知であり、種々のスケールの凍結乾燥のための装置が商業的に利用可能である。
【００７３】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、ワクチンは凍結乾燥形態である。
【００７４】
本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンは、それ自体で、例えば速溶投薬形態として、または凍結乾燥ケークからの粉砕粉末として、反芻動物に投与することができる。より一般的なのは、凍結乾燥ケークを最初に希釈剤中で再構成し、次いで反芻動物への投与のために準備済みであるものである。
【００７５】
「凍結乾燥形態」は、それ自体は任意の形態、例えばボトル内の層として、錠剤として、または球状の物体、例えばＥＰ７９９．６１３中に記載されるようなリオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）としての形態であることができる、凍結乾燥されたケークである。
【００７６】
典型的に、かかる凍結乾燥ケークは、防湿包装中で、例えば真空下もしくは窒素ガス下の密封ガラスボトル中で、または金属薄板もしくは金属ラミネートの包装中に包装されて、保存される。
【００７７】
典型的に、凍結乾燥ワクチンは、ワクチン中の生きた弱毒化微生物を保存中の経時的な腐敗から、それだけでなく凍結乾燥プロセスそれ自体の冷却および加熱サイクルの間にも保護する凍結乾燥安定剤を含有する。周知の凍結乾燥安定剤は、増量剤、例えばアミノ酸、例としてグリシンもしくはアルギニンなど；非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンもしくは加水分解物、例としてＮＺアミンなど；および／またはポリマー、例えばデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎｅ）もしくはゼラチンなどを含有する。
【００７８】
ある実施形態において、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンは、凍結乾燥安定剤としてショ糖を含む。これは良好な安定化を提供するだけでなく、その甘味が経口ワクチンの摂取を反芻動物にとってより心地よいものにするという追加の利点があり、これは反芻動物にとってのワクチン接種のストレスをさらに低減させることを助ける。
【００７９】
したがって、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンのある実施形態において、ワクチンはショ糖を含む。
【００８０】
ショ糖は、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチン中に、好ましい順に、使用準備済ワクチンの約１から約２０％  ｗ／ｖの間の濃度で；好ましくは約２から約１５％の間、約３から約１０の間、またはさらには使用準備済ワクチンの約４から約８％  ｗ／ｖの間の濃度で存在する。
【００８１】
より好ましくは、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンは、約６％  ｗ／ｖの濃度のショ糖を含む。
【００８２】
加えて、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンは、さらなる賦形剤、例えば微生物（複数可）の培養培地からの持ち込み化合物をワクチン中に含み得る。本発明のＭ．ヘモリチカの場合、それは、酵母エキス、ブドウ糖、ペプトンなどを含む細菌培養培地の残渣であり得る。かかる化合物は、追加の増量剤として安定化において役立つことさえあり得る。
【００８３】
凍結乾燥ワクチンを再構成するため、凍結乾燥ケークを生理学的に許容される希釈剤中で再懸濁することが一般的である。これは一般に、ワクチンの最良の品質を確実にするため、標的への投与の直前に行われる。希釈剤は典型的に水性であり、例として滅菌水または生理的塩類溶液であることができる。
【００８４】
希釈剤は、さらなる賦形剤、例えば安定剤またはアジュバントなどを含み得る。
【００８５】
凍結乾燥形態の経口ワクチンのための希釈剤は、別々の容器中で、凍結乾燥ワクチンと共にまたはこれとは別に供給することができる。一緒に提供されるとき、凍結乾燥ワクチンおよび希釈剤（各々それら自体の容器中のもの）は、本発明による経口ワクチンの実施形態であるパーツキットを形成する。
【００８６】
したがって、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンのある実施形態において、ワクチンは、１つの容器が凍結乾燥ワクチンを含み、１つの容器が希釈剤を含む、少なくとも２つの容器を有するパーツキットである。
【００８７】
ある実施形態において、本発明による経口ワクチンは、着色剤を含む。これは、反芻動物が既にワクチン接種を受けたかの視覚的指標として働くことによって、投与を容易にすることができる。かかる着色剤は、もちろん、薬学的に許容される、例として食品着色剤である必要がある。また着色剤は、生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌にとって、および包含され得る任意の他の微生物、抗原または生物学的活性分子にとって非毒性である必要がある。
【００８８】
本発明による経口ワクチンのある実施形態において、ワクチンは、青色の着色剤、例としてＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１（Ｅ１３３）を含む。
【００８９】
本発明のための着色剤は、液体、半固体であるとき、または凍結乾燥形態であるときに、製造業者によって発売されるワクチン中に含ませることができる。
【００９０】
本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンのある実施形態において、着色剤は、凍結乾燥ケークの再構成のために製造業者によって推奨され、凍結乾燥ワクチンと一緒にまたは別に、例としてパーツキット中に提供され得る希釈剤中に含まれる。
【００９１】
本発明による経口ワクチンは、免疫学的に有効な量の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含む。
【００９２】
本発明のため、「免疫学的に有効な」とは、反芻動物標的において病原性Ｍ．ヘモリチカ菌での感染の帰結を低減させる能力のある防御免疫応答を誘導する能力のある、生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌の量を意味し；とりわけ、それは、マンヘミア・ヘモリチカにより引き起こされる呼吸器疾患の低減における援助である。本発明の分野における当業者は、例としてワクチン接種の後もしくはチャレンジ感染後の免疫学的応答をモニターすることによって、例として標的の疾患兆候、臨床スコアをモニターすることによって、または病原体の再分離によって本発明による経口ワクチンの有効性を決定する能力、およびこれらの結果をモックのワクチン接種動物において見られるワクチン接種−チャレンジ応答と比較する能力を十二分に有する。
【００９３】
試料中の細菌の数を決定する方法は、当該技術分野で周知である。寒天プレート上にコロニーを形成することができる細菌の場合、好ましい方法は、好適な寒天プレート上に試料の段階希釈物を播種すること、それらを好適な条件下（例として時間、温度、湿度、酸素の存在などに関するもの）でインキュベートすること、および形成されたコロニーをカウントすることによるものである。（対比）染色が必要とされるときは、視認性を向上させるために適用され得る。これから、元の試料中の細菌の力価を計算することができる。その結果として、かかる力価は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）で表される。
【００９４】
Ｍ．ヘモリチカは、例えば、トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）の寒天プレート上にストリークすること、および約３６℃で１６〜２４時間のインキュベーションによって、カウントすることができる。
【００９５】
本発明者らは、本発明による経口ワクチンにおけるＰＶＰの使用が経口経路による有効な防御に必要とされる１動物用量あたりのＭ．ヘモリチカ菌の力価を今や約１０＾８  ＣＦＵ／用量以下の範囲内にすることを知って驚いた；これは、Ｍ．ヘモリチカの経口ワクチンの経済的生産を最初に実現可能にする。
【００９６】
したがって、ある実施形態において、本発明による経口ワクチンは、反芻動物標的への投与のために準備済みである最終版のワクチンの１動物用量あたり、少なくとも約１×１０＾７  ＣＦＵの、本発明のために記載される生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含む。
【００９７】
好ましくは、経口ワクチンは、１動物用量あたり少なくとも約３×１０＾７  ＣＦＵの生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含む。より好ましくは、１動物用量あたり、好ましい順に少なくとも約５×１０＾７、６×１０＾７、７×１０＾７、８×１０＾７、９×１０＾７、１×１０＾８、２×１０＾８、３×１０＾８、４×１０＾８、４×１０＾８、５×１０＾８、６×１０＾８、またはさらには少なくとも約７×１０＾８  ＣＦＵの、本発明のために記載される生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌である。
【００９８】
より好ましくは、本発明による経口ワクチンは、１動物用量あたり約１×１０＾８から約７×１０＾８  ＣＦＵの間の、本発明のために記載される生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含む。かかる用量範囲のＭ．ヘモリチカ菌は免疫学的に有効であり、経済的に生産することができ、生産、製剤および保存の間の力価損失に対する十分な余裕を提供する。
【００９９】
本発明による経口ワクチンの１動物用量の体積は、製造業者またはユーザー、例えば獣医または動物世話人などの観点から実用的な体積である。加えて、１動物用量を構成するものの体積は、ワクチン接種を受ける反芻動物標的のタイプおよび齢に依存することができる。記載されるように、１動物用量の体積とは、反芻動物標的への投与のための準備済みである最終版の経口ワクチンを指す。また用量の体積とは、液体形態であるときのワクチン、またはかかる体積から生じる凍結乾燥ケークを指す。
【０１００】
本発明による経口ワクチンのある実施形態において、１動物用量の体積は、約０．１から約１０ｍｌの間である。
【０１０１】
好ましくは、１動物用量の体積は、好ましい順に、約０．２から約８ｍｌの間；より好ましくは約０．５から約６ｍｌの間；約０．７から約４ｍｌの間；またはさらには約１から約３ｍｌの間である。
【０１０２】
より好ましくは、１動物用量の体積は約２ｍｌである。
【０１０３】
商業的な反芻動物ワクチンを動物一頭用の包装で発売することは可能であるが、それは非常に費用効率が良くないし、多数の動物に対する使用のために実用的ではない。したがって、反芻動物ワクチンの商業的包装形態は、２、５、１０、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００またはさらには１０００頭の動物用の動物用量を含む容器中にあることができる。例えば、５０動物用量のための本発明による経口ワクチンの容器は、元の量が約３０ｍｌのワクチン製剤の凍結乾燥ペレットを含有し得る。これは、各々２ｍｌの５０用量を提供するため、１００ｍｌの希釈剤中に溶解することができる。
【０１０４】
本発明者らは、本発明の有利な効果を達成するために異なるタイプのＰＶＰを用いることができることを見出し、例えば彼らは、例えばＫ  １２およびＫ  ６０などのタイプのＰＶＰを用いていた。Ｋ値はポリマーの重量平均分子量の指標であって、上記のように粘度測定によって決定される。また、ＰＶＰのタイプの組み合わせ、例えばＫ  １２タイプおよびＫ  ６０タイプの組み合わせなどが試験されており、有効であることが見出された。その結果として、本発明のために用いられるＰＶＰは、単一タイプのＰＶＰからなることができるが、ＰＶＰのタイプ、例として２つ、３つまたはさらなる多くのタイプの組み合わせであることもできる。
【０１０５】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、ＰＶＰはＰＶＰのタイプの組み合わせのものである。
【０１０６】
本発明のため、ＰＶＰの「タイプ」とは、用いられるＰＶＰポリマーの重量平均分子量のサイズ分類を指す。かかるサイズ分類は、ある一定のサイズ平均分子量または分子量範囲により、またはＫ値により指し示すことができる。
【０１０７】
本発明による経口ワクチンのある実施形態において、ＰＶＰのタイプは、Ｋ  １２、Ｋ  １７、Ｋ  ２４、Ｋ  ２５、Ｋ  ３０、Ｋ  ６０、Ｋ  ７０、Ｋ  ８０、Ｋ  ９０およびＫ  １２０よりなる群から選択される１または複数である。
【０１０８】
これらの異なるタイプのＰＶＰは、種々の供給者から商業的に入手可能である。これらはまた、種々の品質および純度で入手可能である。医薬品グレードのＰＶＰの使用が好ましい。
【０１０９】
そのＫ値により指し示されるＰＶＰのタイプは、例としてＫ  ６０、Ｋ６０、Ｋ−６０などの異なるレイアウトで書かれることがある。これらの全ては本発明の範囲内にある。
【０１１０】
驚くべきことに、ＰＶＰの使用は、本発明による経口ワクチンの製剤フェーズ；具体的には凍結乾燥プロセスにおいても利点を提供することが見出された。例えば：ＰＶＰ  Ｋ  １２は、凍結乾燥プロセスにおいてＭ．ヘモリチカ菌の生存率改善を提供することが見出された。
【０１１１】
さらに：ＰＶＰ  Ｋ  ６０は、凍結乾燥プロセスの効率を改善することで、全凍結乾燥サイクルを完了するために必要な時間を短くすることが見出された。
【０１１２】
加えて、ＰＶＰ  Ｋ  ６０は、本発明による凍結乾燥形態の経口ワクチンにおいて、Ｍ．ヘモリチカ菌の保存安定性を改善することが見出された。
【０１１３】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、ＰＶＰのタイプはＫ  １２であるか、またはＰＶＰのタイプはＫ  ６０であるか、またはＰＶＰはＫ  １２およびＫ  ６０の組み合わせである。
【０１１４】
本発明による経口ワクチンにおいて１より多くのタイプのＰＶＰを組み合わせる方法の例は、生産ステージの間に１または複数のタイプのＰＶＰを培養培地中に組み込むこと、および最終製剤のステージにおいてまたは希釈剤を介して、１または複数のさらなるタイプを加えることによるものである。培養培地中のＰＶＰは次いで、これらの細菌がその後の製剤のために回収されるときに、細菌および培地と共にワクチンへと持ち込まれる。本発明による経口ワクチンの調製において、相当量の培養培地、例として培養体積の２０％またはそれより多くをワクチン中に取り入れることができる。
【０１１５】
本発明による経口ワクチンは、好都合には、１または複数の他の抗原、微生物または生物学的活性分子と組み合わせて組み合わせワクチンにすることができる。しかしながら、組み合わせは、複製ワクチン成分の生存率、ならびに組み合わせワクチン全体の安定性および効力を守るように注意を伴って作る必要がある。かかる選択は、当業者の通例の能力の範囲内である。
【０１１６】
したがって、ある実施形態において、本発明による経口ワクチンは、少なくとも１つの追加の免疫活性成分を含む。
【０１１７】
「追加の免疫活性成分」は、抗原、微生物もしくはその一部、生物学的活性分子、免疫増強物質および／またはワクチンであり得て、これらのいずれもアジュバントを含み得る。抗原の形態であるときの追加の免疫活性成分は、獣医学的に重要な任意の抗原性成分からなり得る。好ましくは、追加の免疫活性成分は、反芻動物に対して病原性であるさらなる微生物に基づく、またはこれに由来する。これは例えば、生物学的なまたは合成の分子、例えばタンパク質、炭水化物、リポ多糖、タンパク質性抗原をコードする核酸などを含み得る。また、かかる核酸を含む宿主細胞、またはかかる核酸を含有する生きた組換えキャリア微生物は、核酸または追加の免疫活性成分を送達または発現させる方法であり得る。あるいは、追加の免疫活性成分は、分画したまたは死滅させた微生物、例えば寄生生物、細菌もしくはウイルスまたはその一部など、例えば抽出物、画分または超音波処理物などを含み得る。
【０１１８】
追加の免疫活性成分（複数可）はまた、免疫増強物質、例としてケモカイン、または免疫賦活性核酸であり得る。あるいは、本発明によるワクチンは、生存率および効力を確実にしながら、それ自体がワクチンに加えられ得る。
【０１１９】
好ましい追加の免疫活性成分は、反芻動物に対して病原性である微生物に基づく、またはこれに由来する。かかる微生物の例は以下である。
【０１２０】
ウシの場合：ネオスポラ属種（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃ．）、ジクチオカウルス属種（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、クリプトスポリジウム属種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、オステルタギア属種（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｓｐｅｃ．）、ウシロタウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシコロナウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ウシヘルペスウイルス１）、ウシパラミクソウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータングウイルス、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、マンヘミア属種（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｅｃ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｅｃ．）およびフゾバクテリウム属種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）。
【０１２１】
ヒツジおよびヤギの場合：トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、小反芻動物病ウイルス、ブルータングウイルス、シュマレンベルクウイルス、マイコバクテリウム属種、ブルセラ属種、クロストリジウム属種、コクシエラ属種（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、Ｅ．コリ、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属種、パスツレラ属種およびマンヘミア属種。
【０１２２】
シカの場合：流行性出血熱ウイルス、ブルータングウイルス、パピローマウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）およびトゥルエペレラ・ピオゲネス（Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）。
【０１２３】
反芻動物に対して病原性である好ましい微生物は、パスツレラ・ムルトシダ、マイコプラズマ・ボビス、ヒストフィルス・ソムニ、ウシコロナウイルス、パラインフルエンザ−３ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスおよびウシヘルペスウイルス１よりなる群から選択される１または複数である。
【０１２４】
反芻動物に対して病原性であるより好ましい微生物は、生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ菌である。
【０１２５】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、少なくとも１つの追加の免疫活性成分は、生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ菌である。
【０１２６】
本発明のために好ましい生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダ菌は、無莢膜のものであり、これは細菌がその正常なヒアルロン酸莢膜を発現することができないことを意味する。
【０１２７】
無莢膜の表現型は、莢膜生合成のためのＰ．ムルトシダ  ゲノム遺伝子座中の任意の変異から生じ得る。例えば、その表面多糖のトランスポーターの１つをコードする領域の中；ｈｙａ遺伝子の１つをコードする領域の中；またはリン脂質置換に関与するタンパク質をコードする領域の中である；Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６６，ｐ．２８９−２９６）を参照されたい。いずれの方法でも、無莢膜のＰ．ムルトシダ菌は生存可能で複製性のままであり、免疫応答をなお刺激することができるが、莢膜を持つＰ．ムルトシダが引き起こすことができるものよりも著しく少ない病状を引き起こす。
【０１２８】
したがって、本発明による追加の免疫活性成分として生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダ菌を含む経口ワクチンのある実施形態において、生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダ菌は無莢膜である。
【０１２９】
なおさらに好ましいのは、ｈｙａＥ遺伝子の全部または一部の欠失を含む、ＷＯ２００５／００３３３０中に記載される生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダである。
【０１３０】
最も好ましい生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダは、ＷＯ２００５／００３３３０中に記載される、１０６２  ΔｈｙａＥという名称のＰ．ムルトシダ血清型Ａ３の変異株である。
【０１３１】
本発明による経口ワクチンは、病原性Ｍ．ヘモリチカによる感染の確立および進行の両方を妨げることから、予防的処置として、または治療的処置として、または両方で用いることができる。
【０１３２】
本発明による経口ワクチンのさらなるまたは追加の実施形態は、当業者に想像でき、完全に達成することができる。また、これらのさらなる実施形態は、既に記載された実施形態への１または複数の組み合わせ（複数可）で適用され得る。
【０１３３】
したがって、本発明による経口ワクチンのある実施形態において、以下よりなる群から選択される１つ、複数または全ての条件が適用される：
−  生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌が、非病原性形態のロイコトキシンＡタンパク質を発現し、
−  生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカが、ＷＯ１９９９／０１５６７０中に記載される、ＮＡＤＣ  Ｄ１５３  ΔｌｋｔＡという名称のＭ．ヘモリチカ血清型１の変異株であり、
−  反芻動物が、ウシ属、ヤギ属、ヒツジ属またはシカ属であり、
−  反芻動物が、ウシ属動物であり、
−  ウシ属動物が、タウリンウシ（ボス・タウルス）、コブウシ（ボス・インディクス）、スイギュウ、バイソン、ヤクまたはヨーロッパバイソンであり、
−  経口ワクチンが、着色剤を含み、
−  ＰＶＰの濃度が、約０．３から約３％  ｗ／ｖの間であり、
−  ＰＶＰの濃度が、約１．３％  ｗ／ｖであり、
−  ＰＶＰが、タイプの組み合わせのものであり、
−  ＰＶＰのタイプが、Ｋ  １２、Ｋ  １７、Ｋ  ２４、Ｋ  ２５、Ｋ  ３０、Ｋ  ６０、Ｋ  ７０、Ｋ  ８０、Ｋ  ９０およびＫ  １２０よりなる群から選択される１または複数であり、
−  ＰＶＰのタイプがＫ  １２であるか、またはＰＶＰのタイプがＫ  ６０であるか、またはＰＶのタイプがＫ  １２およびＫ  ６０の組み合わせであり、
−  経口ワクチンが、１動物用量あたり少なくとも約１×１０＾７  ＣＦＵの生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含み、
−  経口ワクチンが、１動物用量あたり約１×１０＾８  ＣＦＵ  約５×１０＾８  ＣＦＵの間の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含み、
−  １動物用量の体積が、約０．１から約１０ｍｌの間であり、
−  １動物用量の体積が、約２ｍｌであり、
−  経口ワクチンがまた、少なくとも１つの追加の免疫活性成分も含み、
−  追加の免疫活性成分が、反芻動物に対して病原性である微生物に基づき、またはこれに由来し、
−  反芻動物に対して病原性である微生物が、生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ菌であり、
−  生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダ菌が無莢膜であり、
−  生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダが、ＷＯ２００５／００３３３０中に記載される、１０６２  ΔｈｙａＥという名称のＰ．ムルトシダ血清型Ａ３の変異株であり、
−  経口ワクチンが、凍結乾燥形態であり、
−  凍結乾燥形態の経口ワクチンが、ショ糖を含み、
−  凍結乾燥形態の経口ワクチンが、約６％  ｗ／ｖの濃度のショ糖を含み、
−  凍結乾燥形態の経口ワクチンが、１つの容器が凍結乾燥ワクチンを含み、１つの容器が希釈剤を含む、少なくとも２つの容器を有するパーツキットであり、ならびに
−  凍結乾燥形態の経口ワクチンが、希釈剤中に含まれる着色剤を含む。
【０１３４】
本発明による経口ワクチンのある実施形態において、生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカは、ＷＯ１９９９／０１５６７０中に記載される、ＮＡＤＣ  Ｄ１５３  ΔｌｋｔＡという名称のＭ．ヘモリチカ血清型１の変異株であり；反芻動物はウシであり；ＰＶＰの濃度は約１．３％  ｗ／ｖであり；ＰＶＰのタイプはＫ  １２およびＫ  ６０の組み合わせであり；経口ワクチンは１動物用量あたり約１×１０＾８から約７×１０＾８  ＣＦＵの間の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌を含み；経口ワクチンは加えて、ＷＯ２００５／００３３３０中に記載される、１０６２  ΔｈｙａＥという名称のＰ．ムルトシダ血清型Ａ３の変異株である生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダを含み；経口ワクチンは凍結乾燥形態であり；ならびに約６％  ｗ／ｖの濃度のショ糖を含む。
【０１３５】
本発明による経口ワクチンは、生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌から、当該技術分野で周知であり、かつ当業者の通例の能力の範囲内である方法により、調製することができる。例えば：Ｍ．ヘモリチカを、発酵槽の中で、標準的培養培地、例としてＴＳＢを用いて、温度をモニタリングしながら、ならびに可変の撹拌速度および酸素レベルを使用しながら、培養する。完了した培地を適切な時間に、例えば、例として光学密度によって測定可能な特定の培養密度に達したときなどに回収する。細菌を次いで例えば遠心分離によって回収し、薬学的に許容される担体、例えば必要な安定剤と組み合わされた注射用水などに取り入れる。
【０１３６】
次にある量のＰＶＰを加え、これを穏やかに撹拌し、完全に混ざるのに十分な時間を与える。これはかなりの時間を取ることもあり；例えば４５％液体ストックから１．３％  ＰＶＰ  Ｋ  ６０を使用する実験において、ＰＶＰを他の液体の中に完全に混合させるために室温で最大２４時間撹拌することもある。
【０１３７】
好都合には、ＰＶＰは、滅菌ストック溶液として加えることができる。次に、ワクチン製品を適切なサイズの容器の中に配分し、これを例えば凍結乾燥などによってさらに製剤化することができ、または製品は液体もしくは半固体形態で市場で発売することができる。
【０１３８】
製造プロセスの様々なステージが、適当な試験によって、例えば細菌または任意のさらなる抗原の品質および量についての微生物学的および免疫学的試験によって；外来性の剤の不存在についての試験によって；ならびに最終的にワクチンの効力および安全性を決定するためのインビトロまたはインビボ実験によって、モニターされる。これらの全ては当業者に周知であり、政府規定、例えば薬局方などの中に、ならびにハンドブック、例えば：“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）などの中に規定される。
【０１３９】
したがって、さらなる態様において、本発明は、生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌および薬学的に許容される担体をＰＶＰと混合するステップを含む、本発明による経口ワクチンの調製方法に関する。
【０１４０】
ＰＶＰの混合は、生産効率またはワクチン特性を最適化するため、異なる方法で、かつ異なる時に行うことができる。
【０１４１】
１つの選択肢は、記載されるように、生産ステージの間にＰＶＰ（１つのタイプのものまたは複数のタイプのもの）をＭ．ヘモリチカ菌の培養物に加えることである。
【０１４２】
本発明による経口ワクチンが凍結乾燥形態で提供されるとき、さらなる実施形態が可能であり；ＰＶＰを凍結乾燥ケークの再構成のための希釈剤中に含ませることができる。このＰＶＰを有する希釈剤は、凍結乾燥ワクチンと一緒にまたは別に提供され得る。
【０１４３】
しかしながら、ＰＶＰ  Ｋ  ６０は、好ましくは凍結乾燥プロセスの前に本発明によるワクチンに加えられる。これは、凍結乾燥サイクルの効率向上に対する、および保存期間中のＭ．ヘモリチカ菌の安定化に対するＰＶＰ  Ｋ  ６０の好ましい効果を完全に生かしたものである。
【０１４４】
この方法の異なる時点で、追加のステップが、例えば追加の処理のために、例えば精製または保存などのために、加えられ得る。
【０１４５】
次に、調製方法は、さらなる薬学的に許容される賦形剤、例えば安定剤、担体、アジュバント、希釈剤、エマルションなどとの混合を伴うことができる。
【０１４６】
前記のように、本発明による経口ワクチンは、異なる形態で、例えば液体または半固体として生産することができ、濃縮物であること、または投与のために使用準備済みであることができる。あるいは、ワクチンは、凍結乾燥形態に製剤化することができる。これらのバリエーション、および任意選択でより多くのものを、本発明による調製方法における適切な時点でのさらなるステップとして組み込むことができる。
【０１４７】
したがって、本発明による調製方法は、本発明による経口ワクチンのために本明細書中に記載される実施形態のいずれか（好ましいものまたはそうでないもの）を、または本発明による経口ワクチンのそれらの実施形態のうちの２つもしくはそれより多くの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１４８】
本発明による経口ワクチンは、本発明による調製方法によって作ることができ、標的反芻動物に、効力および安全性が保たれる限り、異なる方法で、かつその生涯の異なる時点で投与することができる。例えば、当業者に明らかであるように、標的反芻動物は、例として飼料または注射可能物を介したワクチン接種時間の前後に、ワクチン細菌が感受性である相当量の抗生物質を何ら受けないことが好ましい。
【０１４９】
適切な場合、反芻動物標的は、その後の生涯においてブースターワクチン接種を与えられ得るが、好ましくは、本発明による経口ワクチンは１頭の反芻動物標的あたり１回のみ投与される、すなわちこれは単回用量ワクチンである。
【０１５０】
本発明による経口ワクチンは、反芻動物標的への投与のための準備済みであるワクチンの最終版において、好都合には、必要とされる体積の１動物用量を動物の口内に直接投与することによって、反芻動物に投与される。動物への液体のかかる経口投与は、一般に飲薬と呼ばれる。あるいは、半固体形態であるとき、経口ワクチンは、例としてペーストまたはゲルとして経口投与することができる。便利な投薬および経口投与のための多種多様なツールが商業的に利用可能である。典型的に、これは、動物の口内に配置することができるノズルを備えた何らかのアプリケーター、例えばシリンジまたは注射器などである。かかるアプリケーターはまた、多数の動物を処置するときに、反復投与のために利用可能である。
【０１５１】
この投与経路は、一般に動物を拘束することを必要としないか、または鼻腔内投与のために必要とされるのと同程度ではなく、これは経口ワクチン接種を鼻腔内よりもストレスの少ないものにする。また、ワクチンがくしゃみで再度出される危険がない。さらに、記載されるようにワクチンがショ糖を含む場合、心地よい味が経口ワクチン接種を容易にする。
【０１５２】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による経口ワクチンを経口経路により反芻動物に投与するステップを含む、呼吸器疾患に対する前記反芻動物のワクチン接種方法に関する。
【０１５３】
標的反芻動物への、本発明による投与方法のための投与レジメンは、単回用量または複数回用量で、ワクチンの製剤化および畜産の実際的な態様に適合する様式であることができる。
【０１５４】
好ましくは、本発明による投与方法のためのレジメンは、動物へのストレスをさらに低減させるため、および作業コストを低減させるため、標的反芻動物が必要とし得る他のワクチンについての現存のワクチン接種スケジュールに組み込まれる。これらの他のワクチンは、同時に、並行して、または逐次的に、登録されたそれらの使用に適合する様式で投与することができる。
【０１５５】
したがって、本発明による反芻動物のワクチン接種方法のある実施形態において、ワクチンは、別の反芻動物ワクチンと組み合わせて投与される。
【０１５６】
本発明による経口ワクチンの利点の１つは、経口経路は集団投与方法の使用を可能にすることである。かかる方法は、動物にストレスがなく、適用が非常に安価である。
【０１５７】
これらの集団投与方法の中でも最も卓越したものは、飲料としてのまたは飼料を伴う投与である。
【０１５８】
したがって、本発明による反芻動物のワクチン接種方法のある実施形態において、ワクチンは、飲料としておよび／または飼料と共に標的反芻動物に投与される。
【０１５９】
飼料を伴う投与は、好ましくは、飼料のいわばトップドレッシング（ｔｏｐ−ｄｒｅｓｓｉｎｇ）に関し、これは給餌直前にワクチンを飼料に加えることである。これは、飼料中に既に混合された使用と比較して、ワクチンの安定性にとって有利である。給餌による代替的投与はまた、ベイト、ごちそう、噛むものまたは舐めるものとしてである。
【０１６０】
本発明による経口ワクチンの好ましい集団投与方法は、飲料としての、例として飲料水を伴う投与である。
【０１６１】
飲料水を介した投与は、好都合には、農場に存在する水設備、例えば標的動物に合わせたドリンカーを有する飲料水配給のためのリングシステムなどを用いることによって成し遂げることができる。本質的にこれは飲料水中での本発明による経口ワクチンの希釈を意味し、ワクチン接種を受ける動物が正しい量のワクチン希釈物を摂取することを確実にする。
【０１６２】
飲料水によって本発明による経口ワクチンの集団投与を適用するため、例えば以下のものなどのいくつかの実際的な問題が考慮される必要があり、これは全て当業者の通例の能力の範囲内である。
【０１６３】
−  水は、ワクチンの生存率を、全ての標的がそれらの割り当てられた量の水中ワクチン希釈物を摂取するまでの十分な時間、例として１〜２時間維持するために十分な品質である必要がある。この点で、水質は、水源によって、または水消毒剤の使用によっての両方で決定される。
【０１６４】
−  不十分な品質であるとき、ワクチンの添加の前に水ラインをすすぐこと、または水に何らかの安定剤、例えば例として１リットルあたり２グラムのスキムミルク粉末などを加えることが必要とされ得る。
【０１６５】
−  飲料水中のワクチンの希釈物は、各々の標的動物が（平均して）ワクチンの全用量を受け取るために適切な量の飲料水を摂取することを確実にする希釈である必要がある。
【０１６６】
−  ワクチンおよび飲料水の組み合わせは、異なる方法で、例として薬剤タンクまたは投薬ポンプを用いて行うことができ；薬剤タンクは典型的に処置に必要とされる薬用水の全てを含有し、このタンクからの水流は次いで、ワクチン接種期間中、外部の水流に置き換えられる。投薬ポンプの使用はワクチンの事前希釈物の水ラインへの注入を意味し、これは次いで自然に混合されることでワクチン希釈物を形成する。いずれの形式においても、ワクチンの（事前）希釈は、各動物が（平均して）ワクチンの全用量を受け取ることを達成するように慎重に計算されることが必要である。
【０１６７】
−  水ラインを通じたワクチンの配分、および動物による取り込みをモニターするため、ワクチン中に既に存在し得るものに加えて、着色剤を加えることができる。
【０１６８】
したがって、本発明による反芻動物のワクチン接種方法のある実施形態において、飲用水中のワクチンが標的反芻動物に投与される。
【０１６９】
本発明による経口ワクチンを投与する１つの好ましい機会は、例えば育成農場（ｇｒｏｗｅｒ  ｆａｒｍ）または最終農場（ｆｉｎｉｓｈｅｒ  ｆａｒｍ）への輸送のための反芻動物の準備中である。かかる輸送および混じり合いは反芻動物にとってかなりストレスが多く、しばしば数週間後にＲＲＤの発生が続く。かかるワクチン接種のタイミングは、計画された輸送の約１〜２週間前に、例として離乳前に、または肥育農場への輸送前に行うように最適化することができる。
【０１７０】
したがって、本発明による反芻動物のワクチン接種方法のある実施形態において、ワクチンは、計画された反芻動物輸送の１〜２週間前に標的反芻動物に投与される。好ましくは、かかるワクチン接種は、飲料を介して投与される。
【０１７１】
本発明によるワクチン接種のための標的反芻動物の齢、体重、性別、免疫学的状態などは決定的ではないが、健康な標的にワクチン接種することが望ましく、病原性Ｍ．ヘモリチカによる早期感染（の帰結）を防ぐためにできる限り早期にワクチン接種することが望ましい。
【０１７２】
したがって、本発明による反芻動物のワクチン接種方法のある実施形態において、本発明による経口ワクチンは、若年の反芻動物に投与される。
【０１７３】
用語「若年」とは、反芻動物の生涯におけるその離乳までの期間を指す。この期間は、様々な種の反芻動物について異なり；ウシの場合、離乳は典型的に約６〜８週齢であり、ヒツジの場合、離乳は約４〜６週齢である。好ましくは「若年」とは、０〜８週齢、より好ましくは０〜６週齢を指す。
【０１７４】
本発明による経口ワクチンの好ましい集団投与方法は、例として飲料水を使用するものである。
【０１７５】
本発明による飲料としての投与によった反芻動物ワクチン接種の１つの有利な方法は、ワクチンを乳と混合し、この混合物を反芻動物に給餌することによって、反芻動物に経口ワクチンを投与することである。全ての齢の反芻動物が乳を飲むことを好み、したがってかかる投与は動物にとって全くストレスがない。これは、好都合には、飲料トラフもしくはバケツ、または若年の反芻動物の場合は吸い込みニップルを有するボトルを用いて、適切な量の乳中ワクチン希釈物を反芻動物に給餌することによって行うことができる。ワクチン希釈物を有する乳飲料は、好都合には、一度に調製して多数の反芻動物に投与することができる。
【０１７６】
さらなる利点は、Ｍ．ヘモリチカ菌が乳中でかなり安定であることである。
【０１７７】
したがって、飲料としての投与によった本発明による反芻動物のワクチン接種方法のある実施形態において、本発明による経口ワクチンは、乳と混合されて反芻動物に給餌される。
【０１７８】
本発明による経口ワクチンとの混合のために用いられる「乳」は、全乳であることができ、好ましくは標的と同種からのものである。あるいは、乳は粉乳、例えば代用乳などから調製することができる。商業的な代用乳は、一般的な異種間使用のための、または種特異的な使用のための両方の、種々のタイプのものが利用可能である。乳は、明らかに良好な品質であることが必要であり、乳中でのワクチンの希釈物は、好ましくは、給餌による投与の直前に調製される。
【０１７９】
乳中ワクチン希釈物の給餌は、若年反芻動物標的の通常の乳給餌プログラムに組み込むことができ、そのタイミングおよび量は、その種および齢に依存する。
【０１８０】
乳中のワクチンに適用される希釈度はおそらく飲料水投与ほど大きくないが、これは依然として約１０から１０００倍の間であることができる。例えば、本発明による経口ワクチンの１動物用量は、好都合には、１リットルの乳中で仔ウシに投与することができ、これは、例として１動物あたり２ｍｌの所定の動物用量体積への１：５００のその後の希釈を表す。
【０１８１】
乳中または飲料水中のワクチン希釈物は、本発明による経口ワクチン自体から、または中間希釈物から調製することができる。例えば、凍結乾燥形態であって既にＰＶＰを含有するとき、ワクチンは、少量の水または乳の中に、続いてより多い量の水または乳の中に溶解することができる。あるいは、凍結乾燥形態のワクチンがまだＰＶＰを含有していないとき、これは、最初に希釈剤含有ＰＶＰの中に、次いで水または乳の中に溶解すべきである。
【０１８２】
いずれも本発明による、経口ワクチンの実施形態および反芻動物のワクチン接種方法の実施形態を記載するために、代わりの言葉を用いることができる。
【０１８３】
さらなる態様において、本発明は、反芻動物への飲料としてのまたは飼料を伴った投与のための、本発明による経口ワクチンに関する。
【０１８４】
好ましい実施形態において、飲料は、給餌により若年の反芻動物に投与するための、乳中のワクチン希釈物である。
【０１８５】
「乳飲料」は、上記のように構成され、調製される。
【０１８６】
さらなる態様において、本発明は、本発明による経口ワクチンの希釈物を含む、呼吸器疾患に対する若年反芻動物の給餌によるワクチン接種のための乳飲料に関する。
【０１８７】
さらなる態様において、本発明は、呼吸器疾患に対する若年反芻動物の給餌によるワクチン接種のための乳飲料の製造のための、本発明による経口ワクチンの使用に関する。
【０１８８】
さらなる態様において、本発明は、反芻動物への本発明による経口ワクチンの投与を含むことを特徴とする、前記反芻動物におけるＭ．ヘモリチカの感染または関連した疾患兆候の低減方法に関する。
【０１８９】
本発明による感染の低減方法の好ましい実施形態において、ワクチンは、標的反芻動物に飲料としておよび／または飼料と共に投与される。
【０１９０】
本発明は、次の限定されない例により、ここにさらに記載される。
【実施例】
【０１９１】
実施例１：ＰＶＰを含むＭ．ヘモリチカに対する経口ワクチンの効力試験
１．１．  概要
この実験は、ＰＶＰ中に比較的低用量の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカを含む経口ワクチンの、２から３週齢の仔ウシをＭ．ヘモリチカでの重篤なチャレンジ感染により引き起こされる呼吸器疾患から防御する効力を実証した。
【０１９２】
約２週齢の、初乳を欠乏させた４０頭の仔ウシを、２つの処置群へとランダム化した。群Ａ中の２０頭の仔ウシに、１用量あたり約２×１０＾８  ＣＦＵのＭ．ヘモリチカ  ＮＡＤＣ  Ｄ１５３  ΔｌｋｔＡ株および約１×１０＾９  ＣＦＵの生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダ抗原、１０６２  ΔｈｙａＥ株を含有する代用乳中の試験ワクチンを経口投与した。第２の群である群Ｂ中の２０頭の仔ウシは、同様に、生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダ抗原のみを含有する対照ワクチンを受けた。ワクチン接種の４週間後、全ての動物の気管内に病原性Ｍ．ヘモリチカの培養物をチャレンジした。１分間あたりの呼吸数および直腸温度についての臨床モニタリングを包含した７日の観察期間の後、動物を安楽死させ、剖検し、肺の肺炎性病変をスコア付けした。
【０１９３】
データを統計解析することで２つの処置群間の肺病変スコア（ＬＬＳ）の差を決定した。ワクチン群Ａ中の動物のＬＬＳ（平均ＬＬＳ  １１．５）は、対照群Ｂ中のそれ（平均ＬＬＳ  ２８．４）よりも有意に低かった；これは、１．８×１０＾８  ＣＦＵ／用量のＭ．ヘモリチカ力価を有するワクチンの経口投与の結果として、ＰＶＰの効力が経口ワクチンを増強することを実証した。
【０１９４】
１．２．  ワクチン
群Ａのためのワクチンは、マスターシードからの継代数＋５のＭ．ヘモリチカおよびＰ．ムルトシダ菌を含有した。ワクチンは、凍結乾燥製剤から滅菌水で、１動物用量あたり２ｍｌに再構成した。
【０１９５】
群Ｂ（ワクチン群Ａに対する対照群）のためのワクチンは、Ｐ．ムルトシダ菌のみを含有した。ワクチンＢの組成は、水／ショ糖／ＰＶＰ中のＭ．ヘモリチカ菌の体積をＴＳＢにより置き換えたことを除いてワクチンＡのそれと同じであった。
【０１９６】
Ｍ．ヘモリチカ菌は、１％  ＰＶＰ  Ｋ  １２を用いて、それらの増殖培地中で培養した。全培養物を回収し、製剤化されたワクチンは細菌および培養培地からのその体積の８０％を含有し、これは０．８％  ｗ／ｖのＰＶＰ  Ｋ  １２をワクチンに提供した。これを次いでショ糖およびＰＶＰ  Ｋ  ６０を含有する安定剤と混合して、６％ショ糖および１．３％  ｗ／ｖ総ＰＶＰ（０．８％  Ｋ  １２および０．５％  Ｋ  ６０）の最終濃度にした。これを標準的なプロトコールに従って凍結乾燥し、凍結乾燥品を２〜７℃で保存した。ＰＶＰ  Ｋ  ６０は、Ａｓｈｌａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から４５％  ｗ／ｖ水溶液として得た。
【０１９７】
１．３．  試験デザイン：
１．３．１．  実験動物：
群ＡおよびＢは各々、全て同じ起源からの、ホルスタイン種の、性別混合の２０頭の仔ウシを含有した。仔ウシは初乳を欠乏させて育てられ、個別に標識された。仔ウシはワクチン接種時に健康であって、Ｍ．ヘモリチカまたはＰ．ムルトシダに対するワクチン接種の前歴はなかった。
【０１９８】
仔ウシを処置群の１つにランダムに割り当て、ワクチン接種前の約１４日間、順化させた。仔ウシに２リットルの、後に３リットルの代用乳を１日２回、最初はボトルから、後にバケツから給餌した。水は自由摂取で、齢に適した飼料を提供した。
【０１９９】
一般的な健康についての毎日の獣医学的モニタリングは、仔ウシが現場に到着したときに開始し、試験の間ずっと継続した。ワクチン接種前、直腸温度および呼吸数を全ての動物について−１日目および０日目に記録し、血液試料を採取した。これらの読み取りは全て、トライアルの妥当な実施についての確認として働いた。
【０２００】
チャレンジ前、チャレンジ感染のために仔ウシを混ぜ合わせ、囲いを超えてランダムに分けた。チャレンジ感染を投与する人員、および肺病変スコアリングを実施する人員には、群分けコードを伏せた。
【０２０１】
１．３．２．  ワクチン接種：
ワクチンのアンプルを滅菌水中で再構成し、プールした。それぞれのワクチンの動物１頭あたり２ｍｌの用量を、仔ウシに乳を給餌する直前に約３リットルの代用乳と混合した。１動物用量あたりの平均力価を確認するため、細菌の滴定をプールワクチンに対して５倍で行った。
【０２０２】
ワクチン接種後、動物を毎日観察した；ワクチン接種後２０日目の対照群Ｂにおける１頭の死は、実験に関係ない原因のものであった。
【０２０３】
１．３．３．  チャレンジ：
チャレンジの−２、−１および０日前に、ベースラインパラメーターを確立するため、全仔ウシについて直腸温度および呼吸数を記録した。−１日目に血液試料を採取した。
【０２０４】
チャレンジ接種物は、病原性Ｍ．ヘモリチカ、ＯＳＵ株の活性培養物であって、これは３７℃で穏やかに撹拌しながらＴＳＢ中で増殖させ、ＯＤ約０．７７で回収したものである。チャレンジ前、培養物を滅菌ＴＳＢ中で適切な標的用量へと希釈した。
【０２０５】
全ての仔ウシを、ワクチン接種後２８日目に、３×１０＾８  ＣＦＵの病原性Ｍ．ヘモリチカ菌を含有する３０ｍｌのＴＳＢの気管内接種によってチャレンジした。ＣＦＵで表される力価を５倍で、段階希釈物を標準的な血液寒天プレート上にストリークすることによって決定した。
【０２０６】
チャレンジ後、仔ウシを毎日だいたい同じ時間に観察した。直腸温度および呼吸数を７日間記録した。
【０２０７】
チャレンジ後１〜４日の間に数頭の仔ウシが死亡し、または担当獣医の勧めに基づいて安楽死させた。それらの仔ウシに対して剖検を実行し、全ての症例において所見は：線維素膿性気管支肺炎であった。
【０２０８】
チャレンジ後７日目に、生存個体から血液試料を採取した。次に、全ての生き残った仔ウシを安楽死させ、処置群を識別せずに剖検を実行した。肺を仔ウシから回収し、正常な肺組織に対する肺炎性肺組織のパーセンテージを、Ｊｅｒｉｃｈｏ  ＆  Ｌａｎｇｆｏｒｄ  （１９８２，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．４６，ｐ．２８７−２９２）により記載される手法に従って決定した。簡潔には：分離された肺のうち、冒された肺葉領域（視認できる硬化）を同定し、グリッドパターンを用いて両方の肺について、ならびに腹側および背側の両方について書き留める。次に葉の罹患の程度をグリッドの数からカウントし、これを次いでその葉によって通常表される全肺の割合によって乗算する。全ての計算値を加え、最大スコアは１００％である。
【０２０９】
肺病変のスコアリングはかなり困難であり、観察される病変はかなり変わりやすいので、スコアリングは２名の観察者によって独立して実行し、２つのスコアを平均した。冒された肺葉の組織試料を細菌の再分離のために収集した。
【０２１０】
１．４．  結果：
１．４．１．  ワクチン用量の確認：
滴定結果は、ワクチンＡ中のＭ．ヘモリチカ力価が１．８１×１０＾８  ＣＦＵ／２ｍｌであることを指し示した。Ｐ．ムルトシダ力価は２×１０＾９  ＣＦＵ／２ｍｌ用量であった。
【０２１１】
１．４．２．  肺病変スコア：
全ての仔ウシからの肺病変データの解析は、ワクチン群Ａについての平均ＬＬＳは１１．４６であり、対照群Ｂについての平均ＬＬＳは２８．３５であることを示した。これらのＬＬＳの比（ワクチン／対照）は０．４であり、これは０．５を下回っており、このことは（実施例３中に記載されるように）チャレンジ防御が効果的であったことを指し示す。
【０２１２】
１．４．３．  臨床所見：
全ての仔ウシの直腸温度に関して、対照群Ｂからの１９頭の動物のうち１３頭、およびワクチン接種群Ａからの２０頭の動物のうち１５頭で、チャレンジ後の少なくとも１日、温度＞４０℃であった。
【０２１３】
全ての仔ウシの呼吸数に関して、対照からの１９頭の動物のうち１４頭、およびワクチン接種群からの２０頭の動物のうち１９頭で、チャレンジ後の少なくとも１日、呼吸数＞４０回／分であった。
【０２１４】
これらの読み取りはいずれも、このワクチン接種−チャレンジトライアルの妥当な遂行を確認する。
【０２１５】
１．４．４．  死亡率分析：
チャレンジ後期間中、対照群Ｂからの１９頭の動物のうち１０頭、およびワクチン接種群Ａからの２０頭の動物のうち５頭が死亡し、チャレンジが重篤であったことを指し示した。明らかに、対照群Ｂと比較して、ワクチン接種群Ａにおいて死亡した仔ウシは有意に少なかった。
【０２１６】
１．４．５．  細菌の分離：
分離が試みられた３９個の肺組織試料のうち、３７個の試料から増殖が観察された。ワクチン群Ａから１８個の陽性分離株、対照群Ｂから１９個であった。全ての陽性試料はＭ．ヘモリチカと同定された。
【０２１７】
１．５．  結論：
−  ２週齢でＰＶＰを有する生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカワクチンを経口でワクチン接種され、４週間後に病原性Ｍ．ヘモリチカでの重篤なチャレンジに供されたウシは、チャレンジ前に対照ワクチン接種を受けた仔ウシと比較して、肺病変スコアが有意に低減した。
【０２１８】
−  経口ワクチンは、２ｍｌの１動物用量あたり１．８１×１０＾８  ＣＦＵのＭ．ヘモリチカおよび１．３％  ｗ／ｖの総ＰＶＰを含み、３リットルの代用乳中で投与された。
【０２１９】
−  データは、ワクチンが「健康なウシの経口ワクチン接種の場合、マンヘミア・ヘモリチカにより引き起こされる呼吸器疾患の低減における援助として、２週齢以上」という適応に従うことを証明する。
【０２２０】
実施例２：ＰＶＰを伴う／伴わないＭ．ヘモリチカに対する経口ワクチンに関する試験の収集結果
実施例１および２中に記載される実験の前に、いくつかのより早期のワクチン接種−チャレンジ試験を仔ウシにおいて実施した。これらは、異なる量の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカを含むがＰＶＰを含まないいくつかの経口ワクチンを試験した。これらの実験は、一般に実施例１中に記載されるように実施した。
【０２２１】
一般的結果は、非常に高用量の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ株を適用したときにのみチャレンジに対する有効な防御を達成することができ、より低い用量は防御的でなかったことであった。
【０２２２】
ワクチンへのＰＶＰの導入後にのみ、より低用量のＭ．ヘモリチカも有効になった。
【０２２３】
これらの実験の代表的なセットの組み合わせ結果は、下の表１中に表され、これは病原性Ｍ．ヘモリチカでのチャレンジに対する有効な防御の最も重要なパラメーターとして、肺病変の相対的な低減に焦点を当てている。
【０２２４】
表１：仔ウシにおけるＭ．ヘモリチカワクチン接種−チャレンジ実験の組み合わせ結果
【表１】
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【０２２５】
表１中で用いられる表示は：「ｅｘｐ．ｎｒ」＝実験番号；「Ｍ．ｈａｅｍ用量」＝経口ワクチン中の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカ菌の用量／動物；「Ｃｈａｌｌ．−ｐｒｏｔ．  ｔｏ  Ｍ．ｈａｅｍ．」＝Ｍ．ヘモリチカチャレンジに対する防御；「Ｅｘｐｌ．１」は実施例１中に記載される実験を指す。
【０２２６】
肺病変の相対的低減の解釈を容易にするため、ワクチン接種個体の肺病変スコアの、対照のそれに対する比（「Ｖ／Ｃ比」）が指し示される。これは、これらの実験に適用された高度な統計解析の簡略化である。それにもかかわらず、この比は防御の迅速な指標を与える：この比が０．５以下であるとき、試験動物は病原性Ｍ．ヘモリチカでの重篤なチャレンジから防御されていると考えることができる。
【０２２７】
表１は、病原性Ｍ．ヘモリチカに対する反芻動物のための経口ワクチンにおける、異なる濃度のＰＶＰの使用の有利な効果を明確に説明する。
【０２２８】
また、ワクチンに添加されたＰＶＰを受けたまたは受けなかった、本明細書中で実施例１および２中に記載される実験からの群の間で、さらなる比較を行った。具体的には、実施例１からのＰＶＰを伴うワクチンを受ける群を、表１中に収載された試験からのＰＶＰを伴わない群と、いずれも１×１０＾８  ＣＦＵ／用量のワクチン用量の場合に比較した。他の状況は同じであった：ワクチンを１リットルの代用乳中で経口投与し、チャレンジ用量は、３０ｍｌのチャレンジ用量で２×１０＾８  ＣＦＵ／ｍｌであった。
【０２２９】
チャレンジ誘発性の肺スコアに対するワクチン接種の効果を、これらの両群についてワクチン接種していない対照と比較した。この比較は、ＰＶＰを加えると印象的な改善が達せられることを、すなわち：ＰＶＰがないと、ワクチン接種は、ワクチン接種されていない対照と比較して肺スコアを２１％改善し；一方、１．３％  ＰＶＰを加えると、（同じ用量の細菌での）ワクチン接種は、対照と比較して肺スコアを６２％改善することを実証する。その結果として、ＰＶＰの添加は、肺スコアに対するワクチン接種の防御効果を３倍改善する！
実施例３：免疫トライアルの持続時間
この実験は現在進行中であり、本発明による経口ワクチンによって誘導される免疫の持続時間を確認するものである。
【０２３０】
この実験のレイアウトは、実施例１中に記載されるものと大部分同じである：
２から３週齢の、少なくとも４０頭の初乳を欠乏させた仔ウシを、各々２０頭の２つの処置群へとランダム化する。１つの群（群Ａ）に、約１．８×１０＾８  ＣＦＵ／用量の力価の生きた弱毒化Ｍ．ヘモリチカおよび約２．３×１０＾８  ＣＦＵ／用量のＰ．ムルトシダ菌を含有する全乳または代用乳（約３リットル）と混合した２ｍｌ用量の経口ワクチンを経口投与する。ワクチンは、１．３％  ｗ／ｖ総ＰＶＰ（Ｋ  ６０およびＫ  １２）および青色着色剤を含み、６％ショ糖と共に凍結乾燥した。対照群Ｂは乳中の同じワクチンを経口で受けるが、これはＰ．ムルトシダ菌のみを含む。
【０２３１】
ワクチン接種の４月後、動物を混じり合わせ、病原性Ｍ．ヘモリチカ培養物を気管内にチャレンジする。７日の観察期間の後、動物を安楽死させ、剖検して、肺炎性病変についてスコア付けする。データを統計解析することで２つの処置群間の肺病変スコアの差を決定する。
【０２３２】
この試験は、本発明による経口ワクチンを使用して４ヶ月の免疫持続期間を得ることができることを実証する。
【０２３３】
実施例４：免疫トライアルの持続時間、実施されたもの
４．１．  導入：
この試験は、上で実施例３として既に記載された実験の完了である。この試験の目的は、Ｍ．ヘモリチカにより引き起こされる呼吸器疾患に対する、２週齢の仔ウシへの経口投与の４月後の、本発明によるＭ．ヘモリチカワクチンの持続的効力を実証することであった。用いられたワクチンは、Ｍ．ヘモリチカＮＡＤＣ  Ｄ１５３  ΔｌｋｔＡ株を含有する改変された生ワクチンであって、実施例１および３において上で記載されたように、１．３％  ｗ／ｖ総ＰＶＰ（Ｋ  ６０およびＫ  １２）を有して製剤化された。群Ａのためのワクチンは、Ｍ．ヘモリチカおよびＰ．ムルトシダの両方の生きた弱毒化細菌を含有した；群Ｂのための対照ワクチンは、生きた弱毒化Ｐ．ムルトシダのみを含有した。
【０２３４】
仔ウシは、２つの出荷で受け取り、組み合わせ、２つの処置群にわたってランダム化した：群Ａ（ワクチン接種）中に２１頭および群Ｂ（対照）中に２０頭。ワクチン接種の４月後、仔ウシにチャレンジ感染を与え、チャレンジの１週間後、仔ウシを安楽死させ、肺を評価し、肺炎性病変についてスコア付けした。
【０２３５】
４．２．  材料と方法
４．２．１．  動物および収容
仔ウシを２４頭および２０頭の２つの出荷で受け取り、各出荷内で、仔ウシを２つの処置群へとＥｘｃｅｌｌ（商標）のＲＡＮＤ機能を用いてランダムに割り当てた。全仔ウシは同じ起源からのもので、ブロッキング係数は用いなかった。２つの処置群中の仔ウシを、個々の小屋の中に別々に収容した。２月後、それらを異なる建物に移動させ、処置群に基づいて囲いの中に別々に収容したが、これにより同等の数のワクチン接種個体および対照個体が各建物の中にいた。仔ウシをチャレンジ前に混じり合わせ、試験の終わりまで混じり合わせたままにした。
【０２３６】
チャレンジを投与する人員、肺病変スコアリングを実施する人員、および肺組織からの細菌分離を実施する人員には、試験群分けコードを伏せた。
【０２３７】
仔ウシは両方の性別であり、初乳を欠乏させたホルスタイン品種であった。識別は耳のタグにより、全ての動物はワクチン接種時に健康であって、Ｍ．ヘモリチカに対するワクチン接種の前歴はなかった。
【０２３８】
生後第１週の間、仔ウシに少なくとも２リットルの代用乳を１日２回、ボトルで給餌した。第２週以降、約８週齢になるまで、仔ウシに少なくとも２．５リットルの代用乳を１日２回、バケツで給餌した。水を自由摂取で提供した。離乳後、それらはこの齢の動物にとって標準的な飼料を受けた。
【０２３９】
全仔ウシを、ワクチン接種前の少なくとも１３日間順化させた。全ての動物は、獣医および動物世話人によって毎日観察された。
【０２４０】
４．２．２．  ワクチン
群Ａのためのワクチンは、Ｍ．ヘモリチカ  ＮＡＤＣ  Ｄ１５３  ΔｌｋｔＡ株を含有する凍結乾燥試料であった。また、ワクチンＡはパスツレラ・ムルトシダの無莢膜変異株である、ΔｈｙａＥ変異を有する１０６２株を含有した。ワクチンＡの１用量は、２ｍＬ用量あたり約１．８×１０＾８  ＣＦＵのＭ．ヘモリチカ、および２ｍＬ用量あたり約１×１０＾９  ＣＦＵのＰ．ムルトシダを含有した。両方の細菌は、それらのマスターシードからの第５継代レベルであった。
【０２４１】
対照群Ｂのためのワクチンは、Ｍ．ヘモリチカを含有しないがＰ．ムルトシダを含有し、その他の点はワクチンＡと同様に調製された。両方のワクチンについて、Ｂｌｕｓｈａｄｏｗ（商標）希釈剤を、凍結乾燥ワクチンを再水和するために用いた。
【０２４２】
各標的について、計画された処置に応じて、ワクチンＡまたはワクチンＢのプールから２ｍｌの試料を採取した。これを約２．５リットルの代用乳と混合し、これを単回用量として仔ウシに完全に給餌した。ワクチンプールを逆滴定することで、用量が実際に適用されたかを検証した。
【０２４３】
一般的な健康について動物を毎日観察し、所見を記録した。ワクチン接種後の期間中、実験に関係ない原因のため、数頭の動物が死亡した。実験および周辺の処置ステップの間、血液試料を採取し、直腸温度および呼吸数を書き留めた。
【０２４４】
４．２．３．  チャレンジ
チャレンジ材料は、病原性Ｍ．ヘモリチカ（ＯＳＵ株）の活性培養物であって、これは３７℃で穏やかに撹拌しながらトリプチックソイブロス中で増殖させた。チャレンジ前、培養物を滅菌ＴＳＢ中で適切な標的用量へと希釈したが、これはＯＤ値とＣＦＵカウントとの間の予め確立した相関に基づくものであった。
【０２４５】
チャレンジをワクチン接種後１２３日目に投与した。試験中の各仔ウシの気管内に、少なくとも１×１０＾８の病原性Ｍ．ヘモリチカ菌を含有する４０ｍＬのＴＳＢを１回接種した。
【０２４６】
このチャレンジ用量を、標準的な細菌滴定によって、用いられたチャレンジ材料の５倍で決定した。
【０２４７】
チャレンジ後、仔ウシを毎日だいたい同じ時間に観察した。直腸温度および（１分間あたりの）呼吸数をチャレンジの後の７日間（チャレンジ後１から７日まで）記録した。観察されたら咳を、および異常な呼吸パターンを記録した。仔ウシを、一般的な健康および何らかの疾患の徴候について観察した。
【０２４８】
チャレンジの後に群Ｂ中の５頭の仔ウシは「肺炎」により死亡したが、それはチャレンジ感染によって生じたものであることが見出された。
【０２４９】
チャレンジ後７日目に、全ての生き残った仔ウシを安楽死させた。剖検を実行し、肺を仔ウシから回収した。肺炎性肺組織のパーセンテージを評価し、肺病変のパーセント（スコア）をＪｅｒｉｃｈｏおよびＬａｎｇｆｏｒｄ（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ，１９８２，ｖｏｌ．４６，ｐ．２８７−２９２）により記載される手法に従って計算した。肺病変スコアリングを２名の観察者によって独立して実行し、２つのスコアを平均した。
【０２５０】
ワクチンプール中の細菌の滴定を、トリプチックソイ寒天プレート上で行った。ワクチンＡおよびＢの１０倍段階希釈物を滅菌ＴＳＢ中で作った。各希釈物を５枚のプレート上にストリークした。プレートを３６℃で１６〜２４時間インキュベートした。Ｍ．ヘモリチカのコロニーは直接カウントすることができ；Ｐ．ムルトシダのプレートは室温で追加で１６〜２４時間のさらなるインキュベーションを必要とした。Ｍ．ヘモリチカをカウントするためのプレートは、Ｐ．ムルトシダの増殖を阻害するために０．００１％ナフシリンを含有し；Ｐ．ムルトシダをカウントするためのプレートは、Ｍ．ヘモリチカの増殖を阻害するために０．００１５％テルル酸カリウムを含有した。
【０２５１】
Ｍ．ヘモリチカのチャレンジ材料は、標準的な血液寒天プレート上で滴定した。
【０２５２】
４．３．  結果
４．３．１．  ワクチン用量の確認
滴定結果は、ワクチンＡが２ｍＬ用量あたり１．６４×１０＾８のＭ．ヘモリチカを含有したことを指し示した。
【０２５３】
４．３．２．  チャレンジ用量の確認
滴定結果は、各動物が本試験において、気管内経路により投与された４０ｍＬ用量の中の約４．０６×１０＾８のＭ．ヘモリチカ生物を受けたことを指し示した。
【０２５４】
４．３．３．  死亡率分析：
Ｍ．ヘモリチカのチャレンジにより引き起こされたパーセント死亡を、予防画分（ＰＦ）法およびＰＦについての９５％信頼区間によって評価した。ＰＦおよび関連する信頼区間は、ＳＡＳ（商標）  ９．３を使用して、ＳｔａｔＸａｃｔ  １０  Ｐｒｏｃｓ  ｆｏｒ  ＳＡＳからのＢＩＮＯＭＩＡＬ手法を用いて計算した。
【０２５５】
チャレンジ後の期間中、対照群からの１５頭の動物のうち５頭が死亡した。チャレンジの後、ワクチン接種群における死亡はなかった。予防画分は１．００であって、０．５という、より低い９５％最高密度信頼限界を有していた。
【０２５６】
４．３．４．  肺病変スコア：
Ｍ．ヘモリチカ感染により引き起こされた病変を有する肺組織のパーセントを、関連する９５％最高密度信頼区間を伴った緩和画分（ｍｉｔｉｇａｔｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＭＦ）法によって評価した。ＭＦおよび関連する信頼区間は、ＳＡＳ（商標）  ９．３を使用して、Ｒモジュールを有するＰＲＯＣ＿Ｒ手法を用いて計算した。
【０２５７】
データの解析は、対照群Ｂについての平均ＬＬＳは２４．３２であり、ワクチン接種群Ａについての平均ＬＬＳは１．０２であることを示した。緩和画分は０．７４であって、０．５という、より低い９５％最高密度信頼限界を有していた。
【０２５８】
４．３．５．  臨床所見：
全ての仔ウシの直腸温度に関して、対照群Ｂからの１５頭の動物のうち５頭、およびワクチン接種群Ａからの１８頭の動物のうち３頭で、チャレンジ後の少なくとも１日、温度が４０℃超であった。
【０２５９】
全ての仔ウシの呼吸数に関して、対照群Ｂからの１５頭の動物のうち１０頭、およびワクチン接種群Ａからの１８頭の動物のうち４頭で、チャレンジ後の少なくとも１日、呼吸数が４０回超／分であった。
【０２６０】
４．４．  結論
チャレンジ後の期間中、対照群Ｂからの１５頭の動物のうち５頭が死亡し、ワクチン接種群Ａにおける死亡はなかった。死亡率は、対照群において有意であった（ｐ＝０．００９２）。
【０２６１】
また、２つの処置群間で肺病変スコアの有意な差が観察され、対照群Ｂの動物は２４．３２のＬＬＳとスコア付けされ、群Ａからのワクチン接種動物はたった１．０２のＬＬＳとスコア付けされた（ｐ＝０．０００３）。また、最大呼吸数に関しても対照群とワクチン接種群との間に有意差があった（ｐ＝０．００６３）。
【０２６２】
その結果として、本発明による経口Ｍ．ヘモリチカワクチンは、経口経路によって与えられた１．６４×１０＾８  ＣＦＵ／２ｍＬ用量の用量で、重篤なチャレンジ感染に対して防御的であることが実証された。この実験の結果は、ワクチン接種の最大４月後でさえ、マンヘミア・ヘモリチカ感染により引き起こされる呼吸器疾患に対する仔ウシの防御における本発明によるワクチンの効力を、説得力をもって実証する。チャレンジの後、ワクチン接種群Ａ中の仔ウシは、それらの死亡率およびＬＬＳのスコアがはるかに低いことにより指し示されるように、感染および疾患が有意に少なかった。
【０２６３】
さらに、群ＡおよびＢによって誘導された防御において見出された差もまた、Ｍ．ヘモリチカのチャレンジに対する防御は、Ｐ．ムルトシダワクチン接種によってではなく、Ｍ．ヘモリチカでのワクチン接種によってのみ提供することができることを、説得力をもって実証する。
【国際調査報告】
2020500913.tif 000003
2020500913.tif 000004