(57)【要約】本発明の１つまたは複数の実施形態は、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを含み、上記マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している。ヒトＡＡＴのＰｉＺバリアントをコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスは、遺伝子改変されたＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであり得る。免疫不全マウスは、ヒト肝細胞などの異種肝細胞をさらに含み得る。ヒト肝疾患の推定上の処置は、本開示の態様に従って提供されるマウスにおいて評価することができる。
2020500014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、前記マウスは、前記ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、前記マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、免疫不全マウス。
【請求項２】
前記免疫不全マウスが、遺伝子改変されたＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスである、請求項１に記載の免疫不全マウス。
【請求項３】
前記免疫不全マウスの肝細胞が、Ｚ−ＡＡＴを発現する、請求項１に記載の免疫不全マウス。
【請求項４】
肝細胞を含む異種移植片または同種移植片をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫不全マウス。
【請求項５】
前記異種移植片が、ヒト肝細胞を含む、請求項４に記載の免疫不全マウス。
【請求項６】
前記ヒト肝細胞が、ヒト血清アルブミンを発現する、請求項５に記載の免疫不全マウス。
【請求項７】
前記異種移植片の前記肝細胞が、マーカータンパク質を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の免疫不全マウス。
【請求項８】
前記マーカータンパク質が、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体である、請求項７に記載の免疫不全マウス。
【請求項９】
前記マウスの前記肝細胞の少なくとも約２５％が、移植されたヒト肝細胞である、請求項４から８のいずれか一項に記載の免疫不全マウス。
【請求項１０】
前記ヒト血清アルブミンが、前記マウスの血液において検出可能である、請求項５から９のいずれか一項に記載の免疫不全マウス。
【請求項１１】
前記マウスの血清に存在する少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含む、請求項１０に記載の免疫不全マウス。
【請求項１２】
前記ヒト肝細胞が、野生型ヒトＡＡＴを発現する、請求項５から１１のいずれか一項に記載の免疫不全マウス。
【請求項１３】
前記マウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを含む、請求項１３に記載の免疫不全マウス。
【請求項１４】
前記異種移植片または同種移植片の前記肝細胞が、ゲノム編集された肝細胞である、請求項４から１３のいずれか一項に記載の免疫不全マウス。
【請求項１５】
移植された外因性の肝細胞を含む、遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された免疫不全マウスを提供するステップ；および
ヒトまたは同種異系の肝細胞を前記マウスに投与するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記ヒトまたは同種異系の肝細胞が、初代肝細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトまたは同種異系の肝細胞を前記遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップが、前記肝細胞を注入することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトまたは同種異系の肝細胞を前記遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップが、前記肝細胞の脾臓内投与を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記肝細胞が、マーカータンパク質を発現する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記マーカータンパク質が、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップをさらに含む、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップが、前記ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与するステップの前に行われ、前記減少させるステップが、肝毒素を前記遺伝子改変された免疫不全マウスに投与すること、前記遺伝子改変された免疫不全マウスにおいて少なくとも部分的な肝切除を実施すること、および肝毒素を投与することと少なくとも部分的な肝切除を実施することとの両方からなる群から選択される処置を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記肝毒素が、モノクロタリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与するステップの前に、約１０〜１００ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを前記遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップが、前記ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与するするステップの前、その間またはその後に行われ、前記減少させるステップが、抗マウスＣＤ９５抗体を前記遺伝子改変された免疫不全マウスに投与することを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
約０．１〜１０μｇの前記抗マウスＣＤ９５抗体を前記遺伝子改変された免疫不全マウスに投与することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、
請求項４から１４のいずれか一項に記載の免疫不全の遺伝子改変されたマウスを提供するステップ；
前記免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；および
前記マウスのヒト肝細胞における前記推定上の処置の効果を評価するステップ
を含む方法。
【請求項２８】
前記推定上の処置が、ウイルス遺伝子治療ベクターの投与を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記推定上の処置が、ゲノム編集されたヒト肝細胞の投与を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
実質的に本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全マウス。
【請求項３１】
実質的に本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法。
【請求項３２】
実質的に本明細書に記載されるヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、両方が２０１６年１０月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４１３，７３６号および６２／４１３，７４３号からの優先権を主張しており、その両方の全体の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号１Ｒ２４ＯＤ０１８２５９−０１、１Ｒ０１ＤＫ０９８２５２−０１、１Ｐ０１ＨＬ１３１４７１−０１、１Ｐ０１ＨＬ１３１４７１−０１およびＣＡ０３４１９６の下、政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般的にマウスモデルに関する。より具体的には、本開示は、ヒト肝細胞異種移植を受容するトランスジェニックマウスモデルに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
動物モデルは、実験室での研究において、ヒトの生物学的活性および疾患を模倣し、真似をし、または研究者に情報を与えるためにしばしば使用される。ヒト肝臓の機能および疾患のマウスモデルが引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。
【０００６】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。
【０００７】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。
【０００８】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。
【０００９】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００１０】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００１１】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００１２】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００１３】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００１４】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００１５】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００１６】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少している、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００１７】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップをさらに含む、方法が本明細書に記載される本開示の態様に従って提供される。遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップは、ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与するステップの前に行うことができ、前記減少させるステップは、遺伝子改変された免疫不全マウスに肝毒素を投与すること、遺伝子改変された免疫不全マウスにおいて少なくとも部分的な肝切除を行うこと、および肝毒素を投与することと少なくとも部分的な肝切除を行うこととの両方からなる群から選択される処置を含む。
【００１８】
投与される肝毒素は、特定の実施形態によるモノクロタリンである。本開示の態様によれば、移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法は、ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与する前に、約１０〜１００ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップを含む。
【００１９】
本開示の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップは、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与するステップの前、その間またはその後に行われ、前記減少させるステップは、抗マウスＣＤ９５抗体を遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップを含む。本開示の特定の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全マウスを処置して、内因性のマウス肝細胞を減少させるステップは、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前、投与中または投与後に行われ、前記減少させるステップは、約０．１〜１０μｇの抗マウスＣＤ９５抗体を遺伝子改変された免疫不全マウスに投与することを含む。
【００２０】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。
【００２１】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。
【００２２】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。
【００２３】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。
【００２４】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００２５】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００２６】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全マウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００２７】
ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスが本開示の態様に従って提供される。任意選択で、肝細胞はヒト肝細胞であり、さらなる選択肢では、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンを発現する。ヒト血清アルブミンは、本開示の態様によるマウスの血液において検出可能であり、特定の態様によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンがマウスの血清に存在する。態様によれば、本開示の免疫不全マウスの肝細胞の少なくとも約２５％は、移植されたヒト肝細胞である。本開示の態様によれば、含まれるヒト肝細胞は、野生型ヒトＡＡＴを発現し、任意選択でマウスの血清に存在する少なくとも約１００μｇ／ｍＬの野生型ヒトＡＡＴを発現する。さらなる選択肢では、異種移植片または同種移植片の肝細胞は、ゲノム編集された肝細胞である。
【００２８】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００２９】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００３０】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００３１】
移植された外因性の肝細胞を含む遺伝子改変された免疫不全マウスを作製する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現する、ステップ；およびヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスに投与するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞は、初代肝細胞である。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞を注入することを含む。ヒトまたは同種異系の肝細胞を本開示の遺伝子改変された免疫不全マウスに投与するステップは、任意選択で肝細胞の脾臓内投与を含む。投与された肝細胞は、任意選択で、緑色蛍光タンパク質またはその蛍光類似体などのマーカータンパク質を発現する。
【００３２】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３３】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３４】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３５】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、Ｚ−ＡＡＴを発現しない同じタイプの免疫不全マウスと比較して、マウス肝細胞数が減少しており、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３６】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３７】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３８】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全マウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００３９】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、ヒトα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアント（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）をコードする遺伝子を含むように遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスを本開示の態様に従って提供するステップであって、マウスは、肝細胞においてヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）を発現し、マウスは、ヒト肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する、ステップ、免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；およびマウスのヒト肝細胞における推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本開示の態様に従って提供される。
【００４０】
任意選択で、本開示の態様に従って提供されるヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法において施される推定上の処置は、ウイルス遺伝子治療ベクターの投与を含む。
【００４１】
任意選択で、本開示の態様によって提供されるヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法において施される推定上の処置は、ゲノム編集されたヒト肝細胞の投与を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】図１は、パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、およびｇとラベル付けされた７つのパネルからなる。図１のパネル（ａ）（図１ａ）は、２つのドナーマウス系統：ＰｉＺを発現するＧＦＰ標識されたマウス肝細胞を有するＢ６−ＰｉＺ−ＧＦＰ、およびＧＦＰ標識された野生型マウス肝細胞を有するＢ６−ＧＦＰの発生を示す。ドナーマウスからのＧＦＰ発現肝細胞を単離し、マウスあたり１，０００，０００個の細胞の脾臓内注入によって、ヒトＰｉＺ遺伝子を発現する免疫機能不全の雄性ＮＳＧ−ＰｉＺマウスに移植した。レシピエントマウスを移植後８週間で安楽死させ、その後の分析のために肝臓組織を得た。図１のパネル（ｂ）（図１ｂ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲにより決定された、ＰｉＺ−ＧＦＰドナー細胞および野生型ＧＦＰドナー細胞（ＷＴ−ＧＦＰ）で観察されたＺ−ＡＡＴ（ダークグレー）およびＧＦＰ（ライトグレー）の相対的ｍＲＮＡを示すグラフである。誤差バーは、１群あたりマウス３匹である平均の標準誤差に対応する。図１のパネル（ｃ）（図１ｃ）は、ゲノムＤＮＡに対して実施されたｄｄＰＣＲにより決定した、ＰｉＺ−ＧＦＰ肝細胞（ｎ＝３）またはＷＴ−ＧＦＰ肝細胞（ｎ＝４）を移植したＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおける二倍体ゲノムあたりのＧＦＰ陽性細胞パーセントを示すグラフである。ＷＴ−ＧＦＰドナー肝臓由来のゲノムＤＮＡを陽性対照として使用した（ｎ＝２）。エラーバーは標準誤差に対応する。図１のパネル（ｄ）（図１ｄ）は、ＰｉＺ−ＧＦＰ肝細胞移植片を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウスからの抗ＧＦＰ免疫染色された肝臓切片の画像である。図１のパネル（ｅ）（図１ｅ）は、ＰｉＺ−ＧＦＰ肝細胞移植片を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓切片の蛍光画像である。図１のパネル（ｆ）（図１ｆ）は、ＷＴ−ＧＦＰ肝細胞移植片を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウスからの抗ＧＦＰ免疫染色された肝臓切片の画像であり、これは図１ｄと比較して増加した染色を示す。図１のパネル（ｇ）（図１ｇ）は、ＷＴ−ＧＦＰ肝細胞移植片を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓切片の蛍光画像であり、これは図１ｅと比較して増加した蛍光を示す。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【００４３】
【図２−１】図２は、パネルａ、ｂ、ｃ、およびｄとラベル付けされた４つのパネルからなる。図２のパネル（ａ）（図２ａ）は、１，０００，０００個の成熟ヒト肝細胞で脾臓内移植を受けたＮＳＧマウス（丸；
【化１】
2020500014.tif 000003
）またはＮＳＧ−ＰｉＺマウス（三角；
【化２】
2020500014.tif 000004
）のいずれかにおいて測定された血清ヒトアルブミンの平均濃度を示すグラフである。ｘ軸は週の時間に対応し、ｙ軸は対数目盛での血清ヒトアルブミン濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対応する。誤差バーは標準誤差に対応する。ＮＳＧ−ＰｉＺマウスは、すべての時間点でＮＳＧマウスよりも有意に多いヒト血清アルブミンを示した。図２のパネル（ｂ）（図２ｂ）は、部分肝切除（Ｐｈｘ）を受け、続いて１，０００，０００個の成熟ヒト肝細胞で脾臓内移植を受けたＮＳＧマウス（丸；
【化３】
2020500014.tif 000005
）またはＮＳＧ−ＰｉＺマウス（三角；
【化４】
2020500014.tif 000006
）のいずれかにおいて測定された血清ヒトアルブミンの濃度を示すグラフである。ｘ軸は週の時間に対応し、ｙ軸は対数目盛での血清ヒトアルブミン濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対応する。誤差バーは標準誤差に対応する。ＮＳＧ−ＰｉＺマウスは、すべての時間点でＮＳＧマウスよりも有意に多いヒト血清アルブミンを示した。図２のパネル（ｃ）（図２ｃ）および（ｄ）（図２ｄ）は、部分的肝切除術および１，０００，０００個の成熟ヒト肝細胞での脾臓内移植の１０週間後のＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓の画像であり、ヒトアルブミンに対する免疫染色で示される。
【図２−２】同上。
【００４４】
【図３−１】図３は、パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆとラベル付けされた６つのパネルからなる。図３のパネル（ａ）（図３ａ）は、ＥＬＩＳＡによって定量化された、ＮＳＧ−ＰｉＺマウスの血清Ｚ−ＡＡＴ濃度を示すグラフである。ｘ軸は日数でのマウスの年齢に対応し、ｙ軸はマウスにおいて測定された平均血清Ｚ−ＡＡＴ濃度に対応する。誤差バーは標準誤差に対応する。５０日の群は、１０匹のマウス、６０日の群はｎ＝９、７２日の群はｎ＝２７、８５日の群はｎ＝１２、９５日の群はｎ＝１７、１１０日の群はｎ＝７、１１５日の群はｎ＝３、および１８５日の群はｎ＝５からなった。図３のパネル（ｂ）（図３ｂ）は、６週齢でジアスターゼ耐性過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳＤ）を使用して染色した、ＮＳＧ−ＰｉＺマウスの肝臓切片の代表的な画像である。染色の増加は、小球（例えば、Ｚ−ＡＡＴ凝集体を有する小球）の増加と相関する。図３のパネル（ｃ）（図３ｃ）は、１４週齢でＰＡＳＤを使用して染色された、ＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓切片の代表的な画像であり、これは６週齢と比較して少ない染色を示す。図３のパネル（ｄ）（図３ｄ）は、６週齢で抗ヒトＡＡＴ抗体で免疫染色された、ＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓切片の代表的な画像である。図３のパネル（ｅ）（図３ｅ）は、１４週齢で抗ヒトＡＡＴ抗体で免疫染色された、ＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓切片の代表的な画像であり、これは６週齢と比較して少ない染色を示し、Ｚ−ＡＡＴ凝集が少ないことを示唆する。図３のパネル（ｆ）（図３ｆ）は、ヒト肝細胞を移植した時点および移植から７週間後でのＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおけるＥＬＩＳＡによって定量された、測定された血清ヒトアルブミン濃度と測定された血清ヒトＺ−ＡＡＴ濃度との間の相関を示すグラフである。各データ点は、３０匹のマウスのうちの１匹に対応する。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００４５】
【図４−１】図４は、パネルａ、ｂ、ｃ、およびｄというラベル付けされた４つのパネルからなる。図４のパネル（ａ）（図４ａ）は、それぞれヒト肝細胞を投与されたＮＳＧ−ＰｉＺマウスの群の平均血清ヒトアルブミン濃度を示すグラフである。ｘ軸は週の時間に対応し、ｙ軸は対数目盛での血清ヒトアルブミン濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対応する。白丸（
【化５】
2020500014.tif 000007
）は、ヒト肝細胞に追加の選択的不利益を与えずに脾臓内移植（ＩＥ）を受けた５匹のＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおいて測定された平均血清ヒトアルブミン濃度に対応する。黒丸（
【化６】
2020500014.tif 000008
）は、部分肝切除（ＰＨｘ）後に脾臓内移植を受けた５匹のＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおいて測定された平均血清ヒトアルブミン濃度に対応する。Ｘ（
【化７】
2020500014.tif 000009
）は、５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内モノクロタリンの単回投薬（１×ＭＣＴ）を受けた７日後に脾臓内移植を受けた４匹のＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおいて測定された平均血清ヒトアルブミン濃度に対応する。三角（
【化８】
2020500014.tif 000010
）は、移植の１４日前および７日前に５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内モノクロタリンの２回投薬（２×ＭＣＴ）を受けた後に脾臓内移植を受けた６匹のＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおいて測定された平均血清ヒトアルブミン濃度に対応する。四角（
【化９】
2020500014.tif 000011
）は、移植時に１μｇの抗マウスＣＤ９５抗体（ＣＤ９５）とともに脾臓内移植を受けた４匹のＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおいて測定された平均血清ヒトアルブミン濃度に対応する。誤差バーは標準誤差に対応する。５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内モノクロタリンの２回投薬を受けたマウスは、最大血清ヒトアルブミン濃度を示した。図４のパネル（ｂ）（図４ｂ）は、移植前に５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内モノクロタリンを受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウスから移植の１０週間後に得られたマウス肝臓切片の画像である。切片を抗ヒトアルブミン抗体を使用して染色した。図４のパネル（ｃ）（図４ｃ）は、ヒト肝細胞異種移植片を受けたマウスに対して行われた２つのフローサイトメトリープロットからなる。右のフローサイトメトリープロットは、ｘ軸がヒトＨＬＡ−ＡＢＣ＋蛍光シグナル強度に対応し、ｙ軸が側方散乱パルス幅に対応する散布図である。示されるように、２５．７％の細胞がヒトＨＬＡ−ＡＢＣ＋としてゲート制御された。ゲート制御された細胞およびゲート制御されなかった細胞のＣＤ３２４＋蛍光シグナル強度は、それぞれ左のフローサイトメトリープロットの右トレースおよび左トレースに示される。左のフローサイトメトリープロットは、ｘ軸がＣＤ３２４＋蛍光シグナル強度に対応し、ｙ軸が細胞数に対応するヒストグラムである。図４のパネル（ｄ）（図４ｄ）は、ヒト肝細胞を移植した１０週間後の様々なマウスにおける測定された血清ヒトＡＡＴ濃度（ｍｇ／ｍＬ）（ｙ軸）を示すチャートである。ｘ軸ラベルは異なるマウス群に対応し、各データポイントは異なるマウスに対応する。水平の実線は各群の平均値を示し、誤差バーは標準誤差に対応する。点線は５７２μｇ／ｍＬに置かれた。「対照」マウスは、肝細胞異種移植片を受けなかったＮＳＧ−ＰｉＺマウスである。「ＩＥ」マウスは、マウス肝細胞に追加の選択的不利益を与えずに脾臓内移植（ＩＥ）を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウスである。「ＰＨｘ」マウスは、部分肝切除後に脾臓内移植を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウスである。「ＭＣＴ」マウスは、５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内モノクロタリンを受けた後に脾臓内移植を受けたＮＳＧ−ＰｉＺマウスである。
【図４−２】同上。
【００４６】
【図５−１】図５は、パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆのラベル付けされた６つのパネルからなる。図５のパネル（ａ）（図５ａ）は、ヒトＡＡＴを標的とする人工ｍｉＲＮＡおよびｃ−Ｍｙｃタグを有するｍｉＲＮＡ非標的化ヒトＡＡＴ配列を含有するプロモーターレスの二重機能カセットをパッケージした組換えＡＡＶ８ベクターの構成を示す漫画である。カセットは、アルブミン遺伝子座に１．１〜１．３キロベースの相同性アームが隣接している。図５のパネル（ｂ）（図５ｂ）は、ｄｄＰＣＲにより測定された、アルブミン−アルファ−１アンチトリプシン融合した転写物／マウスアルブミン転写物比を示すグラフである（対照ｎ＝３、１０ｗｋ  ｎ＝３、１６ｗｋ  ｎ＝５）。図５のパネル（ｃ）（図５ｃ）は、ＥＬＩＳＡによって測定され、年齢が一致した対照群の平均に対して標準化された相対的なＭ−ＡＡＴ−ｃ−Ｍｙｃ血清濃度を示すグラフである（対照ｎ＝６、処置ｎ＝１０）。図５のパネル（ｄ）（図５ｄ）は、各群から示された２匹の代表的なマウスとともに、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用して免疫染色されたマウス肝臓の画像からなる（スケールバー＝２ｍｍ）。図５のパネル（ｅ）（図５ｅ）は、抗ｃ−Ｍｙｃ免疫染色されたマウス肝臓において観察されたｃ−Ｍｙｃ陽性細胞数を示すグラフである（対照ｎ＝３、１０ｗｋ  ｎ＝３、１６ｗｋ  ｎ＝６）。図５のパネル（ｆ）（図５ｆ）は、ＥＬＩＳＡによって測定され、年齢が一致した対照群の平均に対して標準化され、サイレンシングのパーセンテージとして表される平均相対的Ｚ−ＡＡＴ血清濃度を示すグラフである（ｗｋ８、ｎ＝９、ｗｋ１１〜ｗｋ１６  ｎ＝１０）。各グラフの誤差バーは標準誤差に対応する。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、限定であることを意図せず、他に明示的に述べられていない限りまたは文脈が明らかに他のことを示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００４８】
本発明の様々な態様は、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアントを発現するように遺伝子改変された免疫不全マウスが、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアントを発現しないヒト肝細胞の移植にとって好ましい環境を提供するという発見に関する。本明細書において遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスと呼ばれる本発明のマウスは、例えば、ヒト肝機能および疾患のモデルとして有用である。本発明の遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、維持薬物療法なしで繁殖および生存し、また、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして使用されて、特定のＡＡＶキャプシドバリアントについての指向性においてマウス肝細胞と異なることが多いヒト肝細胞を形質導入するための最適なベクターを同定することができる。ヒト肝細胞異種移植片を含む本発明の遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏに指向進化研究のためのツールとして有用である。
【００４９】
本発明の遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、ヒトα−１アンチトリプシンのＧｌｕ３４２Ｌｙｓバリアントなどのα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のＰｉＺバリアントを発現する。
【００５０】
免疫不全マウスにおけるα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）の発現は、肝細胞異種移植片にとって驚くほど有用な選択的利点を提供することが見出された。
【００５１】
本発明のいくつかの態様は、Ｚ−ＡＡＴを発現し、外因性の肝細胞を含む、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。本発明のいくつかの態様は、Ｚ−ＡＡＴを発現し、ヒト肝細胞を含む、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。
【００５２】
本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。このような用語は、様々な標準的な参考文献において定義され、文脈において使用され、例示的には、Ａ．  Ｎａｇｙ、Ｍ．  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｋ．  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、Ｒ．  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年；１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０８；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第５版、２００２年；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ、２００２年；ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００４年；およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ  （編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年が含まれる。
【００５３】
用語「異種」とは、本明細書において、「異種」と呼ばれる材料が、宿主細胞または生物のものとは別の種に由来することを示すために、宿主細胞または生物に関して使用される。異種材料は、例えばヒト材料であり得、ヒトタンパク質をコードする遺伝子または実質的にヒトゲノムを有する細胞を含む。
【００５４】
用語「同種異系」は、本明細書において、「同種異系」と呼ばれる材料が宿主細胞または生物のものと同じ種に由来することを示すために、宿主細胞または生物に関して使用される。宿主マウスに導入される同種異系材料はマウス由来であり、例えば、マウスタンパク質をコードする遺伝子または実質的にマウスゲノムを有する細胞を含む。
【００５５】
用語「含むこと」とは、開放グループを意味し、例えば、メンバーＡ、Ｂ、およびＣを含むグループはまた、追加のメンバーを含み得る。用語「からなる」とは、閉鎖グループを意味し、例えば、メンバーＡ、Ｂ、およびＣからなるグループは、いずれもの追加のメンバーを含まない。
【００５６】
遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウス
【００５７】
遺伝子改変された免疫不全マウスであって、遺伝子改変された免疫不全マウスのゲノムは、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアント（Ｚ−ＡＡＴ）をコードし、ヒトα−１アンチトリプシンのＰｉＺバリアントは、ヒトα−１アンチトリプシンタンパク質のアミノ酸配列である配列番号１におけるアミノ酸位置３４２でグルタミン酸の代わりにリジン（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）の置換を有する、免疫不全マウスが本発明の態様に従って提供される。
【００５８】
配列番号１
【００５９】
ヒトＺ−ＡＡＴタンパク質（シグナルペプチドなし）−Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ
【化１０】
2020500014.tif 000012
【００６０】
特定の態様において、Ｚ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列は、マウスの細胞のゲノムに組み込まれる。例えば、Ｚ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列は、マウスの生殖系列細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、マウスの子孫へのＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列の継承が可能になる。
【００６１】
本発明の種々の態様は、そのゲノムがＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。ヒトα−１アンチトリプシン（Ｚ−ＡＡＴ）タンパク質のヒトＰｉＺバリアントは、本明細書において配列番号１として同定され、そのバリアントは本発明において有用である。
【００６２】
本発明の特定の態様は、そのゲノムが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。本発明の特定の態様は、そのゲノムが配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。
【００６３】
本発明の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＺ−ＡＡＴをコードするｍＲＮＡを発現する。特定の態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡを発現する。
【００６４】
本発明の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％またはそれを超える配列同一性を有するＺ−ＡＡＴタンパク質を発現する。本発明の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する。
【００６５】
本発明の態様による免疫不全ＰｉＺマウスは、そのゲノムに、プロモーターに作動可能に連結されたＺ−ＡＡＴをコードする核酸を含み、Ｚ−ＡＡＴは、配列番号１のアミノ酸配列、または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２にハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされるアミノ酸配列を含む。遺伝暗号の縮重性のために、代替の核酸配列がＺ−ＡＡＴおよびそのバリアントをコードし、このような代替の核酸が本明細書に記載される組成物および方法に使用され得ることは、当業者には理解される。
【００６６】
配列番号２
ヒトＺ−ＡＡＴタンパク質（シグナルペプチドなし）−Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓをコードする
【化１１】
2020500014.tif 000013
【００６７】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは、アライメントソフトウェアプログラムのデフォルトパラメータを使用して、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列に導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチドで占められている場合、それらの配列はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一である位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の整列位置の数÷整列位置の総数×１００％）。一部の実施形態では、２つの配列は同じ長さを有する。
【００６８】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することもできる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例は、例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜７７頁として改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：２２６４〜６８頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセット、例えば、スコア５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜０２頁に記載されるように使用することができる。あるいは、ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ  Ｂｌａｓｔを用いる場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用する（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。配列を比較するために用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用する。ソフトウェアプログラムのＣｌｕｓｔａｌスイートは、配列同一性パーセントを決定するために配列を整列させるためのさらなる方法を提供する。
【００６９】
２つの配列間の同一性パーセントは、可能なギャップを用いてまたは用いずに、上記のものと類似する技術を使用して決定する。同一性パーセントを計算する際に、典型的には、正確な一致だけをカウントする。
【００７０】
用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」とは、相補的な核酸の対合および結合を指す。ハイブリダイゼーションは、当該技術分野において周知であるように、核酸の相補性の程度、核酸の融解温度、Ｔｍ、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーなどの要因に応じて、２つの核酸間で異なる程度で起こる。「ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー」という用語は、ホルムアミドおよびデンハルト溶液などの特定の一般的な添加剤に関して、温度、イオン強度、およびハイブリダイゼーション媒体の組成の条件を指す。特定の核酸に関する具体的なハイブリダイゼーション条件の決定は日常的であり、例えば、Ｊ．  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２００１年；およびＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；第５版、２００２年に記載されるように、当該技術分野において周知である。高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションのみを可能にするものである。典型的には、約８５〜１００％の相補性を有する核酸は、高度に相補的であると考えられ、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。中間ストリンジェンシー条件は、中程度の相補性、約５０〜８４％の相補性を有する核酸、ならびに高い程度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件によって例示される。対照的に、低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、低い程度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件である。
【００７１】
「特異的ハイブリダイゼーション」および「特異的にハイブリダイズする」という用語は、試料中の標的核酸以外の核酸への実質的なハイブリダイゼーションを伴わない、特定の核酸の標的核酸へのハイブリダイゼーションを指す。
【００７２】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄条件は、当業者に周知であるように、プローブおよび標的のＴｍ、ならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のイオン強度を含むいくつかの要因に依存する。所望のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーションおよび条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年；およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．ら、（編）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、２００２年に記載されている。
【００７３】
突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な分子生物学的技術を使用して導入することができる。当業者は、Ｚ−ＡＡＴの機能的性質を変えることなく、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を導入できることを認識する。Ｚ−ＡＡＴをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列は、例えば、特定のマウスのコドン使用を最適化するために、あるいは制限部位を追加もしくは削除するため、またはクローン化、増幅、および／もしくは配列決定するためにチャレンジしている配列を改変するためなどの便宜のために、Ｚ−ＡＡＴをコードする遺伝子および／またはｍＲＮＡから変更することができる。
【００７４】
保存的アミノ酸置換をＺ−ＡＡＴタンパク質に行い、Ｚ−ＡＡＴバリアントを生成することができる。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸を同様の特徴を有する別のアミノ酸に置換することが当該技術分野において認識されている。例えば、各アミノ酸は、以下の特徴：電気陽性、電気陰性、脂肪族、芳香族、極性、疎水性、および親水性のうちの１つまたは複数を有するものとして記載することができる。保存的置換は、特定の構造的または機能的特徴を有するあるアミノ酸の、同じ特徴を有する別のアミノ酸への置換である。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸を含み；塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リジン、アルギニンを含み；脂肪族アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、およびバリンを含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含み；極性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、およびチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、およびトリプトファンを含み；保存的置換は、各群内のアミノ酸間の置換を含む。アミノ酸はまた、立体または相対的な大きさの観点からも記載することができ、例えば、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、スレオニン、セリン、およびバリンはすべて、典型的に小さいものと考えられる。
【００７５】
用語「核酸」とは、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む任意の形態の１を超えるヌクレオチドを有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。用語「ヌクレオチド配列」とは、核酸中のヌクレオチドの順序付けを指す。
【００７６】
Ｚ−ＡＡＴおよびそのバリアントをコードする核酸は、周知の方法論を使用して組換え的または合成的に単離するまたは生じさせることができる。
【００７７】
本発明の特定の態様において、Ｚ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、例えば、構成的プロモーターであり得る。特定の態様において、プロモーターは、宿主マウス（例えば、免疫不全マウス）において遺伝子発現を駆動することができる。例えば、プロモーターはＣＡＧプロモーターであり得る。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント（「Ｃ」）、ニワトリベータ−アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロン（「Ａ」）、ならびにウサギベータ−グロブリン遺伝子のスプライスアクセプター（「Ｇ」）を含む。ＣＡＧプロモーターは周知であり、マウス細胞において強固な発現を示す（例えば、Ｊｕｎ−ｉｃｈｉら、１９８９年、Ｇｅｎｅ、７９巻（２号）：２６９頁を参照されたい）。ＣＡＧプロモーターは、例えば、エクソンを除去するために修飾することができる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターを含む他のプロモーターがマウスにおいて強固な遺伝子発現を駆動することが公知であり、それらの各々は、本発明の種々の実施形態において使用され得る。トランスジェニック構築物において遺伝子を設計し、プロモーターを配置する方法は公知である（例えば、Ｈａｒｕｙａｍａら、２００９年、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９巻、１０頁を参照されたい）。
【００７８】
本発明の特定の態様において、遺伝子改変された免疫不全マウスは、そのゲノム内に、構成的プロモーターに作動可能に連結されたＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスであって、そのゲノムは、Ｚ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、そのヌクレオチド配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、マウスはコードされたＺ−ＡＡＴを発現する、免疫不全ＰｉＺマウスが本発明の態様に従って提供される。
【００８０】
用語「発現構築物」および「発現カセット」は、本明細書において使用され、所望のコード配列（例えば、Ｚ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列）を含み、および作動可能に連結されたコード配列の発現に必要でありまたは望ましい１つまたは複数の調節要素を含む二本鎖組換えヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「調節要素」という用語は、ヌクレオチド配列の発現のいくつかの態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例示的な調節要素は、例示的に、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、イントロン、複製起点、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、プロモーター、転写終結配列、および上流調節ドメインを含み、これらは、ヌクレオチド配列の複製、転写、および転写後プロセシングに貢献する。当業者は、日常的な実験だけで、発現構築物中のこれらのおよび他の調節要素を選択および使用することができる。発現構築物は、周知の方法論を使用して、組換え的にまたは合成的に生じさせることができる。
【００８１】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、第２のヌクレオチド配列と機能的な関係にあるヌクレオチド配列を指す。
【００８２】
発現カセットに含まれる調節要素は、プロモーターであり得る。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、所望のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列などの転写されるべきコーディングヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節ヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、一般的に、転写されるべきヌクレオチド配列の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。本発明の特定の態様では、プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。本発明の特定の態様では、プロモーターは、遍在的、組織特異的、または細胞型特異的な発現を提供する。
【００８３】
発現構築物に含まれ得る遍在的プロモーターとしては、限定されないが、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ−１）プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ−１）プロモーターをコードするＥＦ−１アルファ遺伝子、真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ−４Ａ１）プロモーター、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）プロモーター、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。
【００８４】
発現構築物に含めることができる組織特異的プロモーターとしては、限定されないが、肝細胞によって発現される遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００８５】
これらのおよび他のプロモーターは、Ａｂｂｏｕｄら、２００３年、Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、５１巻（７号）：９４１〜４９頁；Ｓｃｈｏｒｐｐら、１９９６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４巻（９号）：１７８７〜８８頁；ＭｃＢｕｒｎｅｙら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌ．  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、２００巻：２７８〜９３頁；およびＭａｊｕｍｄｅｒら、１９９６年、Ｂｌｏｏｄ、８７巻（８号）：３２０３〜１１頁に例示されているように当該技術分野において公知である。
【００８６】
プロモーターに加えて、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびＳＶ４０エンハンサーエレメントなどの１つまたは複数のエンハンサー配列を含めることができる。
【００８７】
本発明の様々な態様では、追加の含まれる配列には、ベータグロビンイントロンまたは包括的なイントロンなどのイントロン配列、転写終結配列、ならびに限定されないがＳＶ４０−ｐＡ、ベータ−グロビン−ｐＡ、およびＡＡＴ−ｐＡなどのｍＲＮＡポリアデニル化（ｐＡ）配列が含まれる。
【００８８】
本発明の様々な態様では、発現構築物は、選択マーカー（例えば、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子）および複製起点などの細菌細胞において増幅に必要な配列を含む。
【００８９】
周知の方法を使用して、発現構築物を受精マウス卵母細胞、着床前マウス胚またはマウス幹細胞（胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞）に導入して、遺伝子改変マウスを作製することができる。
【００９０】
マウスの着床前胚への発現構築物の導入方法に関して、発現構築物は、胚への注入前に線状化され得る。
【００９１】
好ましくは、発現構築物は、受精した卵母細胞に注入される。受精した卵母細胞は、交尾の翌日（性交の０．５日後）に過排卵雌から収集され、発現構築物が注入される。注入された卵母細胞を一晩培養するまたは性交偽妊娠雌の０．５日後の卵管に直接移入する。過剰排卵、卵母細胞の採取、発現構築物の注入、および胚移植のための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９に記載されている。ＰＣＲ、サザンブロット、またはヌクレオチド配列決定などのＤＮＡ分析によって、Ｚ−ＡＡＴ導入遺伝子の存在について子孫を試験することができる。導入遺伝子を保有するマウスは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析などによってタンパク質発現について試験することができる。
【００９２】
あるいは、発現構築物は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはリポフェクションなどの技術によって導入される。次に、細胞は、ＰＣＲ、サザンブロット、またはヌクレオチド配列決定などのＤＮＡ分析によって導入遺伝子の組み込みについてスクリーニングされる。正しい組み込みを有する細胞は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析を使用したＺ−ＡＡＴについてのタンパク質分析によって機能的発現について試験することができる。
【００９３】
胚性幹細胞は、特定の細胞株に対して最適化された培地中で増殖させる。典型的には、胚性幹細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）または合成もしくは半合成同等物、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよびストレプトマイシン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、および１０００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ（さらに、いくつかの細胞株については、分化の化学的阻害剤）を含む。詳細な説明は、当該技術分野において公知である（Ｔｒｅｍｍｌら、２００８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１章：Ｕｎｉｔ  １Ｃ．４）。胚性幹細胞分化の阻害剤の概説については、Ｂｕｅｈｒら、２００３年、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｂ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５８巻：１３９７〜１４０２頁を参照されたい。
【００９４】
発現構築物を組み込んだ選択された細胞を着床前胚に注入することができる。マイクロインジェクションのために、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞は、トリプシンおよびＥＤＴＡの混合物を使用して単一細胞にされた後、胚性幹細胞培地に再懸濁される。単一細胞群は、細く引き出されたガラス針（内径２０〜２５マイクロメートル）を使用して選択され、マイクロマニピュレータを装着した倒立顕微鏡を使用して胚の透明帯を通じて胚盤胞腔（胞胚腔）に導入される。幹細胞はまた、初期段階の胚（例えば、２細胞、４細胞、８細胞、前桑実、または桑実胚）に注入することができる。注入は、透明帯にレーザーまたはピエゾパルス穿孔を用いて補助され得る。およそ９〜１０個の選択された幹細胞（胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）を胚盤胞、または８細胞期胚あたり注入し、４細胞期胚あたり６〜９個の幹細胞、および２細胞期胚あたり約６個の幹細胞を注入する。幹細胞導入後、胚は、偽妊娠レシピエント雌に移植する前に、５％ＣＯ２、窒素中の５％Ｏ２で３７℃にて数時間回復させるか、または一晩培養される。幹細胞注入のさらなる代替法では、幹細胞を桑実胚期胚とともに凝集させることができる。これらの方法はすべて十分に確立されており、幹細胞キメラを生成するために使用することができる。より詳細な説明については、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、（Ｎａｇｙ、Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、およびＢｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；さらにＮａｇｙら、１９９０年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１０巻：８１５〜８２１頁；Ｋｒａｕｓら、２０１０年、Ｇｅｎｅｓｉｓ、４８巻：３９４〜３９９頁；米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、および同第７，２９４，７５４号）を参照されたい。
【００９５】
偽妊娠胚レシピエントは、当該技術分野において公知の方法を使用して調製される。簡単には、６〜８週齢の稔性雌性マウスを精管切除した雄または不妊雄と交尾させて、外科的に導入された胚の支持を促進するホルモン状態を誘導する。性交の２．５日後（ｄｐｃ）に、胚盤胞を含む幹細胞の最大１５個を子宮卵管接合部のすぐ近くで子宮角に導入する。初期段階の胚および桑実胚について、このような胚は、胚盤胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養されるか、または胚段階に従って０．５ｄｐｃもしくは１．５ｄｐｃの偽妊娠雌の卵管に移植される。着床胚からのキメラ仔は、着床時の胚年齢に応じて、移植後１６〜２０日で生まれる。キメラ雄が繁殖用に選択される。子孫は、例えば、コートカラーおよび／またはＰＣＲ、サザンブロット、もしくはヌクレオチド配列決定などの遺伝子分析によって、胚性幹細胞ゲノムの伝達について分析することができる。（例えば、Ｚ−ＡＡＴの）タンパク質発現は、タンパク質分析（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）または他の機能的アッセイによって分析することができる。Ｚ−ＡＡＴ導入遺伝子を発現する子孫は、導入遺伝子に対してホモ接合性のマウスを作製するために交雑することができる。トランスジェニックマウスを免疫不全マウスと交配させて、Ｚ−ＡＡＴ導入遺伝子を発現する共通遺伝子免疫不全系統を作製することができる。
【００９６】
Ｚ−ＡＡＴ導入遺伝子はまた、ＨｐｒｔまたはＲｏｓａ２６遺伝子座などの信頼性のある発現をもたらすことが公知である幹細胞ゲノムの特定の遺伝子座に標的化することができる。標的化トランスジェニックについて、組換えＤＮＡ技術を使用して標的化構築物を作製することができる。標的化構築物は、内因性の遺伝子標的と相同な５’および３’配列を任意選択で含み得る。標的化構築物は、任意選択で、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンなどの選択マーカー、Ｚ−ＡＡＴをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナルをさらに含むことができる。遺伝子をコードするヌクレオチド配列の正確な転写および翻訳を確実にするために、例えば、その配列は、内因性の遺伝子座とインフレームであるか、またはスプライスアクセプター部位および内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が含まれる。このような標的化構築物を幹細胞にトランスフェクトすることができ、幹細胞をスクリーニングして、ＰＣＲ、サザンブロット、またはヌクレオチド配列決定を使用して相同組換え事象を検出することができる。正しい相同組換え事象を有する細胞は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析などによるタンパク質分析によって導入遺伝子発現についてさらに分析することができる。所望であれば、例えば、幹細胞をＣｒｅリコンビナーゼで処理することによって、選択マーカーを除去することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼ処理後、細胞は、遺伝子をコードするヌクレオチド配列の存在について分析される。正しいゲノム事象を有する細胞を選択し、上記のように着床前胚に注入することができる。キメラ雄が繁殖用に選択される。子孫は、コートカラー、およびＰＣＲ、サザンブロット、またはヌクレオチド配列決定などの遺伝子分析によって胚性幹細胞ゲノムの伝達について分析することができ、それらはタンパク質分析（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）または他の機能的アッセイなどによってタンパク質発現について試験することができる。タンパク質を発現する子孫は、導入遺伝子についてホモ接合性のマウスを作製するために交雑することができる。トランスジェニックマウスを免疫不全マウスと交配させて、導入遺伝子を有する共通遺伝子免疫不全系統を作製することができる。
【００９７】
本発明の特定の実施形態は、それらの細胞の実質的にすべてにＺ−ＡＡＴ導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、加えてそれらの細胞のすべてではないが一部にＺ−ＡＡＴ導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスを提供する。本発明の特定の態様では、Ｚ−ＡＡＴ導入遺伝子の１つまたは複数のコピー（コンカテマーなど）をトランスジェニックマウスの細胞のゲノムに組み込むことができる。
【００９８】
様々な方法のいずれかを使用して、Ｚ−ＡＡＴ導入遺伝子をマウスに導入し、Ｚ−ＡＡＴを発現するトランスジェニックマウスを生成することができる。このような技術は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、前核マイクロインジェクションおよび胚性幹細胞の形質転換が挙げられる。使用することができるトランスジェニックマウスを作製する方法としては、限定されないが、ＳｕｎｄｂｅｒｇおよびＩｃｈｉｋｉ、（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｉｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６年；Ｈｏｆｋｅｒおよびｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ、（編）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年、１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０；Ｍｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７巻（３４号）：１５０２２〜２６頁に記載されているものが挙げられる。
【００９９】
相同性に基づく組換え遺伝子改変戦略を使用して、外因性タンパク質または複数のタンパク質をコードする核酸、例えば、ｈＳＣＦをコードするヌクレオチド配列、ｈＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列、ｈＩＬ−３をコードするヌクレオチド配列、およびｈＣＳＦ１をコードするヌクレオチド配列を免疫不全マウスのゲノムに導入するために、「ノックイン」によって免疫不全マウスを遺伝子改変することができ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）、クラスター化された規則的に散在した短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ、またはショウジョウバエ組換え関連タンパク質（ＤＲＡＰ）アプローチを使用した、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾン、ヌクレアーゼ媒介性プロセスが挙げられる。例えば、Ｃｅｒｂｉｎｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、２０１５年；１０巻（１号）：ｅ０１１６０３２；Ｓｈｅｎら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、８巻（１０号）：ｅ７７６９６；およびＷａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＆  Ｃｅｌｌ、２０１６年２月、７巻、２号、１５２〜１５６頁を参照されたい。
【０１００】
免疫不全
【０１０１】
用語「免疫不全マウス」とは、以下のうちの１つまたは複数によって特徴付けられるマウスを指す：Ｔ細胞およびＢ細胞などの機能的免疫細胞の欠如；ＤＮＡ修復欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再配列の欠陥；およびＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能性分子の欠如。免疫不全マウスは、Ｒａｇ１およびＲａｇ２などの免疫機能に関与する遺伝子における１つまたは複数の欠陥によって特徴付けることができる（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１５１７〜１５２３頁、１９９０年；およびＳｃｈａｔｚ，  Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ、５９巻：１０３５〜１０４８頁、１９８９年）。免疫不全マウスは、マウスにおいて異常な免疫機能をもたらすこれらのまたは他の欠陥のいずれかを有し得る。
【０１０２】
特定の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、インターロイキン−２受容体γサブユニット（ＩＬ−２ＲＧ）をコードする内因性の遺伝子に欠陥があり、それによりマウスは欠陥のある内因性のインターロイキン−２受容体γサブユニット、および／または減少した量の内因性のインターロイキン−２受容体γサブユニットを発現し、またはマウスは内因性のインターロイキン−２受容体γサブユニットを全く発現しない可能性がある。マウスは、任意選択でＩＬ−２ＲＧヌルであり得、そのため機能的な内因性のＩＬ−２ｒｇ遺伝子を欠如する。
【０１０３】
さらなる態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、触媒サブユニット（Ｐｒｋｄｃ）をコードする内因性の遺伝子に欠陥を有し、それによりマウスは欠陥のある内因性のＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、触媒サブユニット、および／もしくは減少した量の内因性のＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、触媒サブユニットを発現し、またはマウスは、内因性のＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、触媒サブユニットを全く発現しない可能性がある。マウスは、任意選択で、Ｐｒｋｄｃヌルであり得、そのため機能的な内因性のＰｒｋｄｃ遺伝子を欠如する。
【０１０４】
遺伝子およびそれらがコードするタンパク質に関して本明細書で使用される「内因性の」とは、それらの天然の遺伝子座でマウスのゲノム中に存在する遺伝子を指す。
【０１０５】
本発明の様々な態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、機能的な内因性のＩＬ−２ＲｇおよびＰｒｋｄｃ遺伝子を欠如している、ＩＬ−２ｒｇヌルおよび／またはＰｒｋｄｃヌルである。マウスは、任意選択で、Ｐｒｋｄｃノックアウトおよび／またはＩＬ−２ｒｇノックアウトを含み得る。本発明の様々な態様では、マウスは、ＩＬ−２ｒｇ、Ｐｒｋｄｃのいずれか、またはＩＬ−２ｒｇとＰｒｋｄｃとの両方を発現しない。
【０１０６】
本発明の様々な態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、重症複合免疫不全を有する。用語「重症複合免疫不全」または「ＳＣＩＤ」とは、Ｔ細胞の不存在およびＢ細胞機能の欠如によって特徴付けられる状態をいう。
【０１０７】
ＳＣＩＤの一般的な形態としては、ＩＬ−２ｒｇ遺伝子のガンマ鎖遺伝子突然変異、ならびにリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）および常染色体劣性ＳＣＩＤによって特徴付けられるＸ連鎖ＳＣＩＤが挙げられる。常染色体劣性ＳＣＩＤは、Ｊａｋ３遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）、ＡＤＡ遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（−）、ＩＬ−７Ｒアルファ鎖突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＣＤ３デルタまたはイプシロン突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、アルテミス遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、およびＣＤ４５遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）によって特徴付けられ得る。
【０１０８】
本発明の態様によれば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、一般的にｓｃｉｄ突然変異と呼ばれる重症複合免疫不全突然変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）を有する。ｓｃｉｄ突然変異は周知であり、Ｂｏｓｍａら、１９８９年、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２９巻：５４〜５６頁に記載されているようにマウスの第１６染色体に位置する。ｓｃｉｄ突然変異についてホモ接合性のマウスは、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の非存在、リンパ球減少症、低グロブリン血症、ならびに正常な造血微小環境によって特徴付けられる。ｓｃｉｄ突然変異は、例えば、ＰＣＲまたはフローサイトメトリーなどの周知の方法を使用したｓｃｉｄ突然変異についてのマーカーの検出によって検出することができる。
【０１０９】
本発明の態様による遺伝子改変された免疫不全マウスは、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖欠乏を有する。用語「ＩＬ−２受容体ガンマ鎖欠乏」は、減少したまたは機能不全のＩＬ−２受容体ガンマ鎖を指す。ＩＬ−２受容体ガンマ鎖の減少は、遺伝子の欠失または突然変異に起因する可能性がある。減少したＩＬ−２受容体ガンマ鎖は、例えば、周知の方法を使用して、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖遺伝子欠失もしくは突然変異の検出、および／または減少したＩＬ−２受容体ガンマ鎖発現の検出によって検出することができる。
【０１１０】
本発明の態様による遺伝子改変された免疫不全マウスは、重症複合免疫不全、または重症複合免疫不全と組み合わせたＩＬ−２受容体ガンマ鎖欠乏を有し、マウスのゲノムはＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
本発明の態様による遺伝子改変された免疫不全マウスは、ｓｃｉｄ突然変異、またはｓｃｉｄ突然変異と組み合わせたＩＬ−２受容体ガンマ鎖欠乏を有し、マウスのゲノムはＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
本発明の様々な態様では、免疫不全マウスは、遺伝子改変されたＮＳＧマウス、遺伝子改変されたＮＲＧマウスまたは遺伝子改変されたＮＯＧマウスであり、遺伝子改変されたＮＳＧ、ＮＲＧまたはＮＯＧマウスのゲノムは、Ｚ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
用語「ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ」、「ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇヌル」および「ＮＳＧ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：６４７７〜８９頁に詳細に記載されている周知の免疫不全マウス系統ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪを指す。ＮＳＧマウスは、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪバックグラウンドからの複数の免疫不全、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）突然変異、およびインターロイキン−２受容体ガンマ鎖の完全ノックアウトを組み合わせる。結果として、ＮＳＧマウスは、成熟マウスＴ、Ｂ、およびＮＫ細胞を欠如し、それらはマウスサイトカインシグナル伝達経路が欠損している。ＮＳＧマウスは、マウスＩＬ−２Ｒ−γ（ガンマｃ）発現の欠如、マウス血清免疫グロブリンが検出できない、マウス溶血性補体がない、成熟マウスＴリンパ球がない、および成熟マウスナチュラルキラー細胞がないことによって特徴付けられる。
【０１１４】
Ｚ−ＡＡＴを発現するＮＳＧマウスは「ＮＳＧ−ＰｉＺ」マウスと呼ばれ、これは遺伝子改変されたＮＳＧマウスのゲノムが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ−２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪバックグラウンド上にＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含むことを示し、マウスはＺ−ＡＡＴを発現する。
【０１１５】
ＮＲＧマウスは、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００８年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５４巻（２号）：２７０〜８４頁に詳細に記載されている、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪとして周知である。Ｚ−ＡＡＴを発現するＮＲＧマウスは「ＮＲＧ−ＰｉＺ」マウスと呼ばれ、これは遺伝子改変されたＮＲＧマウスのゲノムが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪバックグラウンド上にＺ−ＡＡＴをコードするヌクレオチド配列を含むことを示し、マウスはＺ−ＡＡＴを発現する。
【０１１６】
ＮＯＧマウスは、Ｉｔｏ，  Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１００巻、３１７５〜３１８２頁（２００２年）に詳細に記載されている、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃとして周知である。Ｚ−ＡＡＴを発現するＮＯＧマウスは「ＮＯＧ−ＰｉＺ」マウスと呼ばれ、これは遺伝子改変されたＮＯＧマウスのゲノムが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃバックグラウンド上のＺ−ＡＡＴトランスジェニックマウスをコードするヌクレオチド配列を含むことを示し、マウスはＺ−ＡＡＴを発現する。
【０１１７】
肝細胞異種移植片および同種移植片
【０１１８】
本発明の態様によれば、本発明の遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、肝細胞を含む異種移植片または同種移植片を有する。異種移植片は、例えば、ヒト肝細胞を含むヒト異種移植片であり得る。同種移植片は、例えば、異なるマウス由来のマウス肝細胞を含む同種移植片であり得る。
【０１１９】
肝細胞は、初代肝細胞または形質転換された肝細胞の細胞株などの様々な供給源のいずれかに由来し得る。
【０１２０】
本発明の様々な態様において、異種移植片または同種移植片の細胞は、マーカーをコードする発現構築物を含み、マーカーを発現する。マーカーは、例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質またはその蛍光バリアントであり得る。
【０１２１】
本発明の様々な態様は、ヒト肝細胞などの異種もしくは同種異系の肝細胞、または外因性マウス肝細胞などの同種異系の肝細胞を有する、本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。特定の態様では、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれを超えるマウスの肝細胞は、ヒト肝細胞などの異種の肝細胞、または外因性マウス肝細胞などの同種異系の肝細胞である。
【０１２２】
本発明の様々な態様は、対応する異種または同種血清アルブミンおよび対応する異種または同種野生型ＡＡＴなどの対応する異種または同種肝臓タンパク質を発現する移植された異種または同種肝細胞を含有する、本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに関する。例えば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、ヒト肝細胞を移植されており、ヒト肝細胞はヒト血清アルブミンおよび野生型ヒトＡＡＴを発現するため、マウスは検出可能なレベルのヒト血清アルブミンおよび野生型ヒトＡＡＴを発現する。
【０１２３】
本発明の態様によれば、移植された異種または同種異系の肝細胞を含有する本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、異種の肝細胞がヒト肝細胞である場合、例えば、少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍｇ／ｍＬ、またはそれを超えるヒト血清アルブミンなどの異種または同種の血清アルブミンを有する。特定の態様では、移植された異種または同種異系の肝細胞を含有する本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、異種または同種異系の肝細胞がヒト肝細胞である場合、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．０１〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５〜約５ｍｇ／ｍＬ、約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．１〜約１ｍｇ／ｍＬ、または約０．５〜約５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンなどの異種血清アルブミンを有する。マウスは、例えば、異種肝細胞がヒト肝細胞である場合、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５ｍｇ／ｍＬ、またはそれを超えるヒト血清アルブミンなどの異種または同種血清アルブミンを有することができる。
【０１２４】
本発明の態様によれば、移植された異種または同種異系の肝細胞を含有する本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、例えば、異種肝細胞がヒト肝細胞である場合、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、５７２、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００ｍｇ／ｍＬ、またはそれを超えるヒト野生型ＡＡＴなどの血清異種または同種野生型ＡＡＴを有する。本発明の特定の態様では、移植された異種または同種異系の肝細胞を含有する本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、異種肝細胞がヒト肝細胞である場合、約１００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、約１００〜約１０００ｍｇ／ｍＬ、約５００〜約５，０００ｍｇ／ｍＬ、約１０００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、約５７２〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、約５７２〜約９，０００ｍｇ／ｍＬ、約５７２〜約８，０００ｍｇ／ｍＬ、約６００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、約７００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、約２０００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、約２５００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬ、または約５０００〜約１０，０００ｍｇ／ｍＬのヒト野生型ＡＡＴなどの血清異種または同種野生型ＡＡＴを有する。移植された異種または同種異系の肝細胞を含有する本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、例えば、異種肝細胞がヒト肝細胞である場合、約１００、２００、３００、４００、５００、５７２、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００ｍｇ／ｍＬ、またはそれを超えるヒト野生型ＡＡＴなどの血清異種または同種野生型ＡＡＴを有し得る。
【０１２５】
移植された異種または移植された同種異系の肝細胞を含有する遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスを作製する方法
【０１２６】
本発明の様々な態様は、移植された異種または移植された同種異系の肝細胞を含有する遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスを作製する方法に関する。
【０１２７】
特定の態様では、本方法は、本明細書に記載される遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスを提供するステップ、およびヒトまたはマウス細胞の集団を遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与するステップを含む。
【０１２８】
特定の態様では、本方法は、遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ−ＰｉＺマウス、ＮＲＧ−ＰｉＺマウスまたはＮＯＧ−ＰｉＺマウスを提供するステップ、およびヒト肝細胞を含むヒト細胞集団を遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ−ＰｉＺマウス、ＮＲＧ−ＰｉＺマウスまたはＮＯＧ−ＰｉＺマウスに投与するステップを含む。
【０１２９】
特定の態様では、本方法は、遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ−ＰｉＺマウス、ＮＲＧ−ＰｉＺマウスまたはＮＯＧ−ＰｉＺマウスを提供するステップ、および同種異系マウス肝細胞を含む同種異系マウス細胞集団を遺伝子改変された免疫不全ＮＳＧ−ＰｉＺマウス、ＮＲＧ−ＰｉＺマウスまたはＮＯＧ−ＰｉＺマウスに投与するステップを含む。
【０１３０】
投与された細胞は、任意選択でマーカーを発現する。
【０１３１】
特定の態様では、本発明の方法は、約１０３（１０００）〜約１０６（１，０００，０００）、約１０３〜約１０５、約１０４〜約１０６、約１０５〜約１０７、約１×１０３〜約１×１０４、約５×１０３〜約５×１０４、約１×１０４〜約１×１０５、約５×１０４〜約５×１０５、約１×１０５〜約１×１０６、約５×１０５〜約５×１０６、約１×１０６〜約１×１０７、約２×１０５〜約５×１０６、または約５×１０５〜約２×１０６個のヒト肝細胞または同種異系の肝細胞（例えば、初代ヒト肝細胞または初代同種異系の肝細胞）を遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。特定の態様では、本発明の方法は、少なくとも約１×１０２、約２×１０２、約３×１０２、約４×１０２、約５×１０２、約６×１０２、約７×１０２、約８×１０２、約９×１０２、約１×１０３、約２×１０３、約３×１０３、約４×１０３、約５×１０３、約６×１０３、約７×１０３、約８×１０３、約９×１０３、約１×１０４、約２×１０４、約３×１０４、約４×１０４、約５×１０４、約６×１０４、約７×１０４、約８×１０４、約９×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５、約５×１０５、約６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、約５×１０６、約６×１０６、約７×１０６、約８×１０６、約９×１０６、約１×１０７個、またはそれを超えるヒト肝細胞または同種異系の肝細胞（例えば、初代ヒト肝細胞または初代同種異系の肝細胞）を遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。特定の態様では、本発明の方法は、少なくとも約１×１０２、約２×１０２、約３×１０２、約４×１０２、約５×１０２、約６×１０２、約７×１０２、約８×１０２、約９×１０２、約１×１０３、約２×１０３、約３×１０３、約４×１０３、約５×１０３、約６×１０３、約７×１０３、約８×１０３、約９×１０３、約１×１０４、約２×１０４、約３×１０４、約４×１０４、約５×１０４、約６×１０４、約７×１０４、約８×１０４、約９×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５、約５×１０５、約６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、約５×１０６、約６×１０６、約７×１０６、約８×１０６、約９×１０６、約１×１０７個、またはそれを超えるヒト肝細胞または同種異系の肝細胞（例えば、初代ヒト肝細胞または初代同種異系の肝細胞）を遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。
【０１３２】
本発明の方法の特定の態様では、ヒトまたは同種異系の肝細胞を遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することは、肝細胞を注入することを含む。肝細胞を投与することは、例えば、脾臓内注入などの脾臓内投与を含み得る。投与が、外因的に投与されたヒトまたは同種異系の肝細胞をマウスの肝臓に存在させ得る限り、投与経路は特に限定されない。
【０１３３】
本発明の特定の態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、その内因性の肝細胞の数を減らすために処置される。用語「内因性の肝細胞」とは、マウスにおいて天然に存在する、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに存在する肝細胞を指す。内因性の肝細胞は、ヒトもしくは同種異系の肝細胞を、遺伝子改変免疫不全ＰｉＺマウスに投与する前に、例えば、ヒト細胞をマウスに投与する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日前に、ヒトもしくは同種異系の肝細胞をマウスに投与するのとほぼ同時に、またはヒトもしくは同種異系の肝細胞をマウスに投与した後に減少させることができる。
【０１３４】
驚くべきことに、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスへの異種または同種異系の肝細胞の移植は、肝毒素またはアポトーシス促進抗体などの分子抗肝細胞剤を用いた処置によって促進され得る。分子抗肝細胞剤を用いた処置は、その後の肝細胞異種移植片を確立するために肝切除術より優れていることがわかった。したがって、特定の態様では、本発明の方法は、肝毒素またはアポトーシス促進抗体などの分子抗肝細胞剤による遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスの処置を含むが、外科的肝切除術（例えば、部分的または完全な肝切除）の実施を含まない。
【０１３５】
宿主細胞と異種移植片細胞との両方を標的とすることが多い肝毒素とは異なり、アポトーシス促進抗体は、種特異的であり得、したがって、アポトーシス促進抗体は、異種移植片の前に、異種移植片とともに、および／または異種移植片が投与された後に投与され得る。
【０１３６】
本発明の特定の態様では、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前に内因性の肝細胞の数を減少させることは、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスにモノクロタリンなどの肝毒素を投与することを含む。本発明の方法は、任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与する前に、約１〜約５００ｍｇ／ｋｇのモノクロタリン、例えば、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約４０〜約６０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。本発明の方法は、任意選択で、ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与する前に、約１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。
【０１３７】
本発明の特定の態様では、肝毒素（例えば、モノクロタリン）は、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前に、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに１回または１回を超えて投与される。肝毒素は、例えば、ヒトまたは同種異系の肝細胞を投与する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および／または２１日前に、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与され得る。
【０１３８】
本発明の一部の態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、（例えば、その体内または血流中に）モノクロタリンなどの肝毒素を含む。マウスは、例えば、（例えば、その体内または血流中に）約１〜約５００ｍｇ／ｋｇのモノクロタリン、例えば、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約４０〜約６０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを有することができる。マウスは、任意選択で、（例えば、その体内または血流中に）約１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを有することができる。
【０１３９】
本発明の特定の態様では、内因性の肝細胞の数を減少させることは、抗ＣＤ９５抗体などのアポトーシス促進剤を、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前、投与と同時、および／または投与後に、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。本発明の態様による方法は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０μｇの抗ＣＤ９５抗体を、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前、投与と同時、および／または投与後に、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。本発明のさらなる態様による方法は、約０．１〜約１０μｇ、約０．１〜約５μｇ、約０．１〜約２μｇ、約０．５〜約１０μｇ、約０．５〜約５μｇ、約０．５〜約２μｇ、約１〜約１０μｇ、または約１〜約５μｇの抗ＣＤ９５抗体を、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前、投与と同時、および／または投与後に、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。本発明のなおさらなる態様による方法は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０μｇの抗ＣＤ９５抗体を、ヒトまたは同種異系の肝細胞の投与前、投与と同時、および／または投与後に、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに投与することを含む。
【０１４０】
本発明の一部の態様では、アポトーシス促進剤（例えば、抗ＣＤ９５抗体）は、１回または１回を超えて投与される。アポトーシス促進抗体は、例えば、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスにヒト細胞を投与する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および／もしくは２１日前に、ヒト細胞が投与されるのとほぼ同時に、ならびに／またはヒト細胞をマウスに投与した約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および／もしくは２１日後に投与することができる。
【０１４１】
本発明の一部の態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、（例えば、その体内または血流中に）抗ＣＤ９５抗体などのアポトーシス促進剤を含む。アポトーシス促進抗体は、例えば、マウスのＺ−ＡＡＴ発現肝細胞におけるアポトーシスを増加させることができる（例えば、それによって異種移植肝細胞にさらなる選択的利点を提供する）。本発明の一部の態様では、遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスは、（例えば、その体内または血流中に）約１μｇの抗ＣＤ９５抗体を有する。例えば、マウスは、あるマウスであり得、マウスは、（例えば、その体内または血流中に）約１μｇの抗マウスＣＤ９５抗体を有する。マウスは、任意選択で、（例えば、その体内または血流中に）少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０μｇの抗ＣＤ９５抗体を有することができる。マウスは、任意選択で、（例えば、その体内または血流中に）約０．１〜約１０μｇ、約０．１〜約５μｇ、約０．１〜約２μｇ、約０．５〜約１０μｇ、約０．５〜約５μｇ、約０．５〜約２μｇ、約１〜約１０μｇ、または約１〜約５μｇの抗ＣＤ９５抗体を有することができる。マウスは、任意選択で、（例えば、その体内または血流中に）約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０μｇの抗ＣＤ９５抗体を有することができる。
【０１４２】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法
【０１４３】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法であって、本発明の遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスに移植されたヒト肝細胞を提供するステップ；免疫不全の遺伝子改変されたマウスにヒト肝障害の推定上の処置を施すステップ；マウスの移植されたヒト肝細胞に対する推定上の処置の効果を評価するステップを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。
【０１４４】
推定上の処置は、限定されないが、試験物質の投与を含む、ヒト肝障害の処置に使用するために提案される様々な処置のいずれでもよい。本発明の方法において使用される試験物質は、合成もしくは天然に存在する化合物、あるいは合成もしくは天然に存在する化合物、有機もしくは無機の小分子、タンパク質、ペプチド、核酸（遺伝子治療など）、炭水化物、オリゴ糖、脂質、またはこれらのいずれかの組合せの組合せを例示的に含む任意の化学物質であり得る。
【０１４５】
ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法の態様によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣｐｆ１などのヌクレオチド指向性エンドヌクレアーゼによる肝細胞のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでのゲノム編集は、本発明の免疫不全の遺伝子改変されたマウスにゲノム編集された肝細胞を投与することによって評価される。ヒト肝障害の推定上の処置の安全性および／または有効性を評価する方法の態様によれば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の組み込みに潜在的に関連するものなどのベクターに起因した発癌の可能性は、本発明の免疫不全の遺伝子改変されたマウスにｒＡＡＶを投与することによって評価される。
【０１４６】
本発明の遺伝子改変された免疫不全ＰｉＺマウスにおける移植異種または同種異系の肝細胞における試験化合物の効果を評価することには、本発明の方法の態様に従って肝細胞における試験物質の効果を決定するための標準に対する応答を比較することが含まれる。標準は、当該技術分野において周知であり、使用される標準は、任意の適切な標準であり得る。一例では、標準は、肝細胞に効果を与えることが公知である化合物である。さらなる例では、匹敵するマウスの非処置は、試験物質の効果を比較するために、処置なしで肝細胞の基準レベルの指標を提供する。標準は、個々の匹敵するマウスまたは匹敵するマウスの集団において以前に決定され、アッセイ結果の呼出しおよび比較のために印刷物または電子媒体に保存された、予想される肝細胞機能の参照レベルであり得る。
【０１４７】
アッセイ結果は、試験物質が肝細胞に効果を与えるかどうかを決定するための様々な方法のいずれかによる統計分析を使用して分析することができ、パラメトリック検定またはノンパラメトリック検定、分散分析、共分散分析、多変量分析のロジスティック回帰分析、フィッシャーの直接確率検定、カイ二乗検定、スチューデントＴ検定、マンホイットニー検定、ウィルコクソンの符号順位検定、マクネマー検定、フリードマン検定、およびページＬ傾向検定が例示される。これらのおよび他の統計的検定は、Ｈｉｃｋｓ，  ＣＭ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｓｔｓ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（出版社）；第５版、２００９年；およびＦｒｅｕｎｄ，  ＲＪら、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２０１０年に詳述されるように当該技術分野において周知である。
【０１４８】
ゲノム編集は肝臓表現型を向上させる
【０１４９】
ＡＡＴ欠乏を処置する方法であって、ＡＡＴ欠乏に罹患している個体の一部またはすべての肝細胞におけるＺ突然変異欠陥（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）の修正による欠乏の改善を含む、方法が本開示の態様に従って提供される。本開示の態様によれば、Ｚ突然変異欠陥を有する突然変異ＡＡＴタンパク質をサイレンシングすることによる欠乏を改善し、正常なＡＡＴ生成を増強して、それによりＡＡＴ欠乏に罹患している個体の一部またはすべての肝細胞におけるＺ突然変異欠陥を修正することを含む、ＡＡＴ欠乏を処置する方法が提供される。
【０１５０】
特定の態様によれば、内因性の対立遺伝子（Ｚ突然変異体をコードする）をサイレンシングするために野生型ＡＡＴおよび合成ｍｉＲＮＡを発現するプロモーターレスのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ヒトなどの罹患個体の肝細胞に発現される。任意選択で、ベクターは、罹患個体の肝細胞のゲノムに組み込まれる。この処置アプローチは、突然変異タンパク質をサイレンシングし、正常なＡＡＴ生成を増強し、肝臓病理学を向上させることによって、編集された肝細胞の選択的利点をもたらす。
【０１５１】
本発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例に例示されている。これらの実施例は、例証の目的で提供され、本発明の組成物および方法の範囲における限定と見なされない。
【実施例】
【０１５２】
実施例に関連する材料および方法
【０１５３】
ゲノム編集のためのベクター注入
【０１５４】
成体マウスの処置のために、５〜９週齢の雄は、総体積２００μＬ中の１Ｅ１２  ｇｃのベクターの静脈内注入を受けた。Ｐ１マウスの処置のために、雄と雌との両方は、２Ｅ１１  ｇｃのベクターを腹腔内注入された。動物は、本発明者らのプロトコールに従って下顎下穿刺により隔週で採血され、血清は、分析時まで−８０℃で保存された。終点では、本発明者らのプロトコールに従って、動物は、ＣＯ２窒息、それに続く頸椎脱臼によって安楽死された。肝臓組織を回収し、一貫した切片を組織学用に固定し、残りの組織を下流の分子分析用に瞬間凍結した。
【０１５５】
ゲノム編集実験に使用されたＢ６−ＰｉＺマウスは高い導入遺伝子のコピー数（＞１０）を有する。
【０１５６】
動物手順
【０１５７】
すべての動物手順は、研究機関の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のげっ歯類手術について示されたガイドラインに従って実施された。無菌技術および滅菌器具をすべての手順の間使用した。レシピエント動物はすべて６〜１０週齢の雄であり、密閉された換気室でイソフルラン吸入により麻酔をかけた。
【０１５８】
肝臓灌流／初代肝細胞の単離
【０１５９】
マウスを安楽死させ、腹腔を露出させるために腹部切開を行い、下大静脈を露出させるために内臓を配置した。カテーテル針を使用して下大静脈を穿刺し、下大静脈に約１ｃｍ挿入した。縫合シルクを適用してカテーテルを固定した。ポンプチューブをカテーテルの端部に取り付けた。門脈を流出させるためにスライスした。横隔膜を開き、下大静脈を肝臓の上に固定した。肝臓を灌流するために、肝臓灌流培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を最初に５０ｍＬについて循環系にポンプで送り込み、続いて肝臓消化培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５０ｍＬ送り込んだ。肝臓を取り出し、氷冷した肝細胞洗浄培地（ＨＷＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に浸して、肝細胞を溶液中に拡散させた。細胞懸濁液を吸い上げ、７０μｍメッシュを通じてピペットでとり、３分間、４℃にて５０ｇで遠心分離した。細胞をスピンダウンした後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない）中の１０ｍＬのＨＷＭおよび１０ｍＬの９０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、非生存細胞を除去するために溶液に添加された。肝細胞溶液を３０ｍＬのＨＷＭで３回洗浄した。
【０１６０】
ＥＬＩＳＡ
【０１６１】
マウス血清は、移植前後に隔週で回収され、ＥＬＩＳＡによって総ＡＡＴ、Ｚ−ＡＡＴ、ｃ−Ｍｙｃ、およびヒトアルブミンについて試験された。すべてのアッセイについて、高結合９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ４、Ｄｙｎａ−ｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬのＶｏｌｌｅｒ緩衝液中で適切な捕捉抗体により一晩、４℃で被覆された。特記しない限り、その後のインキュベーションはすべて、室温で１時間行われ、そのステップの間、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した。
【０１６２】
ヒトＡＡＴ  ＥＬＩＳＡ
【０１６３】
ブロッキングは１％ミルクで行われた。捕捉抗体は、ヒト特異的ヤギ抗ＡＡＴ（１：５００、カタログ番号５５１１１、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）である；検出抗体は、ヤギ抗ｈＡＡＴ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］；１：５，０００、カタログ番号ａｂ１９１３５０、Ａｂｃａｍ）である。標準はＡＡＴ（カタログ番号１６−１６−０１１６０９、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。
【０１６４】
Ｚ−ＡＡＴ  ＥＬＩＳＡ
【０１６５】
ブロッキングは、１％ミルクで行われた。捕捉抗体はカスタム抗体である；検出抗体は上記される。
【０１６６】
ｃ−Ｍｙｃ  ＥＬＩＳＡ
【０１６７】
すべてのインキュベーションは３７℃で行われた。ブロッキングは５％ＢＳＡで行われた。捕捉抗体は（１：１，０００、カタログ番号ａｂ１９２３４、Ａｂｃａｍ）である。
【０１６８】
ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ
【０１６９】
ヒトアルブミンレベルは、製造業者によって記載されているように、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量セット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ）を使用することによって、移植後に評価された。すべてのアッセイについて、ＨＲＰコンジュゲート抗体とともにインキュベートした後、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を適用し、１５〜３０分後に２ＮのＨ２ＳＯ４（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することによって反応を停止させた。プレートをＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で４５０ｎｍにて読み取った。
【０１７０】
免疫組織化学
【０１７１】
マウス肝臓を４μｍで連続切片にした。
【０１７２】
ヒトアルブミン染色
【０１７３】
切片を脱パラフィン化し、Ｃｉｔｒａ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）により９８℃で３０分間処理した。バックグラウンドスナイパー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を適用して、非特異的なバックグラウンド染色を減少させた。切片をウサギ抗ヒトアルブミン（１：４，０００、カタログ番号ａｂ２６０４、Ａｂｃａｍ）とともに１時間インキュベートした。染色は、Ｍａｃｈ２ヤギ×ウサギＨＲＰポリマー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）クロマゲン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）およびＣｈｕｒｕｋｉａｎ−Ａｌｌｉｓｏｎ−Ｔａｃｈａ（ＣＡＴ）ヘマトキシリン対比染色（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して可視化された。
【０１７４】
ヒトＡＡＴ染色
【０１７５】
スライドをキシレンで脱パラフィン化し、水に対するエタノールの濃度を減少させることによって再水和した。これは、内因性のペルオキシダーゼ活性（メタノール中の３％過酸化水素）をクエンチするための中間工程を含んだ。スライドを１×トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に移した。酵素誘導抗原検索のために、切片をＤｉｇｅｓｔ−ａｌｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浸しながら、５分間、３７℃で加熱した。続いてスライドを１×ＴＢＳ中で濯ぎ、ユニバーサルプロテインブロッカースナイパー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）とともに１５分間、室温（ＲＴ）でインキュベートした。スライドを１×ＴＢＳ中で濯ぎ、ヒト（マウスではない）ＡＡＴを認識する一次ウサギ抗体（１：６００、カタログ番号ＫＤＩ−Ａ１ＡＴＲＹＰａｂｒ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）とともに６０分間インキュベートした。スライドを１×ＴＢＳで濯ぎ、続いて３０分間、室温で、コンジュゲート二次抗体（Ｍａｃｈ  ２ヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を適用した。ＡＡＴの検出は、スライドを３’３’ジアミノベンジジン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中、１．５分間、室温でインキュベートすることによって達成された。スライドをヘマトキシリンで３０秒間、対比染色し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ  ＸＹＬ（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウントした。
【０１７６】
ＰＡＳ−Ｄ染色
【０１７７】
シッフ試薬を室温で少なくとも３０分間予熱した。切片を脱パラフィン化し、再水和した。アミラーゼをスライド上に室温で２０分間適用し、水で濯いだ。切片を０．５％過ヨウ素酸中で１０分間インキュベートし、濯いだ。シッフ試薬をスライドに１５分間適用した。次に、切片をぬるま湯の水道水で５分間洗浄した。ヘマトキシリン対比染色を１５秒間適用し、核を１分間青くした。アミラーゼ処理をしていない１枚のスライドを対照として作用させた。
【０１７８】
ＰＳＲ染色
【０１７９】
ＰＳＲ染色は、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号２４９０１−２５０、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して行われた。
【０１８０】
閾値分析
【０１８１】
分析は、フロリダ大学病理学コアの経験豊富な技術者によって盲目的に行われた。
【０１８２】
モデル最適化
【０１８３】
動物は、移植の７日前または１４日および７日前に５０ｍｇ／ｋｇのＭＣＴ（Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で腹腔内に前処理され、または１μｇの精製ＮＡ／ＬＥハムスター抗マウスＣＤ９５抗体（最初のアポトーシスシグナル［ＦＡＳ］、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で移植時に静脈内に処置された。
【０１８４】
フローサイトメトリーアッセイ
【０１８５】
解離後、細胞を、抗マウス／ヒトＣＤ３２４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体により氷上で３０分間染色して、ヒト肝細胞のパーセンテージを決定した。次に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、０．５％ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡが補足された１×ＰＢＳに再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ−ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．１；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）で分析した。
【０１８６】
ｄｄＰＣＲアッセイ
【０１８７】
ゲノムＤＮＡは、急速凍結した肝臓から単離され（Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット、ＱＩＡＧＥＮ）、ｄｄＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）は、製造業者の推薦に従って、インプットとして５０ｎｇのＤＮＡ、ならびにＧＦＰおよびＲＰＰ３０を検出するＴａｑＭａｎアッセイを使用して実施された。
【０１８８】
統計
【０１８９】
回帰分析の後に、両側ピアソンＲ検定を行った。二元配置ＡＮＯＶＡを実施して、時間および処置の効果を決定した。年齢を一致させた対照群と処置群との間の差の統計的有意性は、対応ｔ検定を用いて決定された。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５として定義された。
【０１９０】
（実施例１）
野生型マウス肝細胞はＮＳＧ−ＰｉＺマウスの肝臓を存在させることができる。
【０１９１】
正常な肝細胞がＰｉＺ肝臓を再生することができるかどうかを決定するために、ヒトＺ−ＡＡＴを発現するＰｉＺマウスから２つの新しいマウス系統を作製した。ＰｉＺマウスを最初にＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇヌル（ＮＳＧ）バックグラウンドに戻し交配した。重篤な免疫機能不全のＮＳＧ−ＰｉＺ系統は、これらのマウスが拒絶反応なしにヒトならびに同種異系マウス肝細胞を宿主とすることを可能にする。肝細胞ドナーマウスはまた、トランスジェニックＣ５７ＢＬ／ＴＧ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウス系統を野生型Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６−ＰｉＺトランスジェニックマウスのいずれかと交配することによって作製された。これらの交配は、ＰｉＺ突然変異体ヒトα−１アンチトリプシン遺伝子を伴う（ＰｉＺ−ＧＦＰ）または伴わない（野生型、ＷＴ−ＧＦＰ）ＧＦＰについて半接合性のＣ５７ＢＬ／ＴＧ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）−ＰｉＺ  Ｆ１同腹仔を生成した。図１ａを参照されたい。図１ｂに示されるように、ＰｉＺ−ＧＦＰマウスから単離された肝細胞は、ヒトＺ−ＡＡＴとＧＦＰ遺伝子との両方を発現したが、ＷＴ−ＧＦＰマウスはＧＦＰのみを発現した。次に、これらのマウス由来の肝細胞を使用して、１，０００，０００個のＰｉＺ−ＧＦＰまたはＷＴ−ＧＦＰドナー肝細胞の脾臓内注入によって雄性ＮＳＧ−ＰｉＺマウスに移植した。注入の８週間後に、レシピエントＮＳＧ−ＰｉＺマウスからの肝臓は、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）および免疫組織学によってドナー移植について調べられた。定量的ｄｄＰＣＲデータは、ＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおけるドナー肝細胞移植のレベルが、ドナー肝細胞がＺ−ＡＡＴを発現するかまたは発現しないかに依存することを裏付ける。図１ｃの結果は、マウスに野生型ＧＦＰを発現する正常肝細胞を移植した場合、ＮＳＧ−ＰｉＺ肝臓の平均４０％の肝細胞がＧＦＰ陽性であったのに対し、ドナー肝細胞がＧＦＰおよびＺ−ＡＡＴ（ＰｉＺ−ＧＦＰ）を発現している場合はわずか５％であったことを示す。これらの結果は、ＷＴ−ＧＦＰ肝細胞が、ＰｉＺ−ＧＦＰ肝細胞と比較して有意に高い比率で移植された宿主肝臓の免疫組織化学的（ＩＨＣ）および免疫蛍光染色によって確認された（図１ｄ〜ｇ）。画像のＧＦＰ免疫組織化学的染色および陽性画素数閾値分析は、３２％〜４８％のローブによって移植が異なることを示したが（表１）、全体として、組織学切片の陽性画素数分析は、ｄｄＰＣＲ結果を支持する。このデータは、野生型肝細胞が、Ｚ−ＡＡＴ含有肝細胞と比較して、増加した再生能力を有することを確認し、Ｚ−ＡＡＴ負荷された宿主肝臓が、野生型ドナー肝細胞に有意なレベルでそれを再度、存在させる能力を与えるのに十分な代謝回転を受けることを示唆する。
【表１】
2020500014.tif 000014
Ｂ６：Ｃ５７ＢＬ／６、ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質、ＷＴ：野生型、Ｓ：脾臓注入のみ、Ｓ＋ＰＨｘ：脾臓注入および部分肝切除、ｄｄＰＣＲ：液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応、ＩＨＣ：免疫組織化学、ＮＡ：該当なし。
【０１９２】
（実施例２）
ヒト肝細胞はＮＳＧ−ＰｉＺマウスの肝臓を存在させることができる。
【０１９３】
ＮＳＧ−ＰｉＺおよびＮＳＧ対照マウスに１，０００，０００個の成熟ヒト肝細胞を脾臓内注入した。ヒト肝臓移植の代用として、マウス血清試料中のヒトアルブミンレベルを予想してモニタリングした。図２ａにおける血清ヒトアルブミンレベルは、これらのマウスにおけるヒト肝細胞の移植の結果として肝臓キメラ現象が生じ、Ｚ−ＡＡＴを発現するＮＳＧマウス肝臓において達成されるヒト肝細胞移植のレベルが劇的に増加したことを確認する。これは、野生型肝細胞が優先的に拡大することができるニッチを作り出すことにおけるＺ−ＡＡＴ負荷の役割をさらに確認する。
【０１９４】
ヒト肝細胞はまたＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおける細胞分裂指数の増加から恩恵を受けていることを考慮すると、肝細胞代謝回転の増加は移植の増加へと導き得る。この仮説を試験するために、脾臓内注入時に部分肝切除を追加して実験を反復した。元の肝臓塊は、一般的に、７０％の部分肝切除後の約７日で再生するため、この増殖期は、移植の増加を示すものと仮定された。図２ｂに示されるように、部分肝切除は、循環血清ヒトアルブミンレベルの５〜１０倍の増加をもたらした。興味深いことに、ＮＳＧマウスでは、肝切除は移植の減少を引き起こした。この観察は、マウス肝臓との関連で、ヒト肝細胞と比較して野生型増殖マウス肝細胞の利点によって引き起こされ得る。ＮＳＧ−ＰｉＺマウス肝臓におけるヒトアルブミンの免疫組織化学染色（図２ｃ〜ｄ）は、ヒト肝細胞がＮＳＧ−ＰｉＺ肝臓のかなりの部分を移植できることを確認した。
【０１９５】
（実施例３）
ＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおけるＺ−ＡＡＴ負荷は年齢とともに減少し、肝細胞移植はＺ−ＡＡＴレベルと相関する。
【０１９６】
ＰｉＺトランスジェニックマウスは、より高いアポトーシスの発生率を有するＺ−ＡＡＴ小球含有肝細胞を有し、これらの細胞は、より低いＺ−ＡＡＴ小球負荷を有する肝細胞によって駆逐される傾向がある。この現象は、ＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおける野生型マウスまたはヒト肝細胞の競合的に有利な移植の根本的な根拠であり得る（ただし、本明細書において同定された推定または確認された機構は特許請求の範囲または本開示を制限するものではない）。ドナー肝細胞の非存在下でのこの正常な肝細胞代謝回転の結果をより明確に定義するために、代謝回転をＮＳＧ−ＰｉＺマウスで調べた。これもまた、おそらく、経時的に減少したＺ−ＡＡＴ小球負荷と相関する。これらのマウスにおける血清Ｚ−ＡＡＴレベルの予測分析は、マウスの年齢とＺ−ＡＡＴ血清レベルとの間に明確であり、強い逆相関（ｒ２＝０．８０、ｐ≦０．００３、両側）を示す（図３ａ）。ＮＳＧ−ＰｉＺマウスが加齢するにつれて、血清Ｚ−ＡＡＴ濃度は減少し、これはまた、６〜１４週齢の間の肝細胞の小球含有状態の減少によって組織学的に反映される。小球組織学は、例えば、ジアスターゼ耐性過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳＤ、図３ｂ〜ｃ）および異なる年齢の肝臓のヒトＡＡＴ染色（図３ｄ〜ｅ）によって可視化することができる。このデータは、移植された野生型肝細胞の非存在下では、ＮＳＧ−ＰｉＺマウスの肝臓は依然として、Ｚ−ＡＡＴの産生および蓄積が少ない肝細胞の生存および拡大を促進するのに十分な選択圧を発揮する。興味深いことに、マウスが加齢するにつれて、一部の肝細胞はＺ−ＡＡＴ小球を蓄積し続け、たとえそれらがより少なくても、それらの小球はより大きくなる傾向があるようである（図３ｂ）。Ｚ−ＡＡＴ負荷がマウスの年齢とともに減少するにつれて、正常なヒト移植肝細胞の増殖的な利点もまた減少する場合がある。ヒト肝細胞の持続性を調べるために、遡及的分析は、所与のマウスの平均血清ヒトアルブミン濃度を移植時の血清Ｚ−ＡＡＴ濃度と比較した。この分析は、平均ヒトアルブミン血清濃度によって決定した場合、Ｚ−ＡＡＴ血清濃度とヒト肝臓キメラ現象のレベルとの間に中程度であるが非常に有意な正の相関（ｒ２＝０．４６、ｐ≦０．０００３）を示した（図３ｆ）。
【０１９７】
（実施例４）
小分子および生物製剤による内因性のマウス肝細胞の減少
【０１９８】
増加したヒト肝細胞移植のためのさらなる方法を調査するために、肝臓異種移植片分野において使用される２つのアプローチ：モノクロタリン（ＭＣＴ）およびマウス特異的抗Ｆａｓ抗原（ＣＤ９５）抗体を試験した。ＭＣＴは、肺、肝臓、および腎臓において公知の内皮毒性を有するピロリジジン植物アルカロイドである。ＭＣＴ処置は、肝臓における細胞移植を増加させることが示されている。抗ＣＤ９５抗体はマウスＦａｓを認識し、マウス肝細胞および他の細胞のアポトーシスを誘導することによってマウスＦａｓを発現する細胞の細胞溶解活性へと導く。これら２つの肝損傷モデルを用いた様々なプロトコールが試験され、部分的肝切除を必要とせずに容易であり、再現可能に実施され得る「ツーヒット」プロトコールをもたらした。
【０１９９】
移植はこれらの介入の両方で有意に増加し、部分的肝切除術と同等またはそれを超えるレベルを達成した（図４ａ）。１または２用量のＭＣＴ（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを移植前に投与し、マウスが２つのＭＣＴ用量を受けた場合に最大の移植が達成された（図４ａ）。肝細胞送達時の抗ＣＤ９５抗体の単回腹腔内注入後の移植の動態は、血清ヒトアルブミン濃度によって決定されるように部分的肝切除とまさに同じくらい効率的であった（図４ａ）。ヒトアルブミンに対するＭＣＴおよびＣＤ９５処理されたマウス肝臓の染色は、ヒト肝細胞の移植を確認した（図４ｂ）。さらに、抗ＨＬＡ抗体を使用した定量的フローサイトメトリー分析は、ＭＣＴ処置マウスにおける全肝細胞の少なくとも２５％がヒト起源のものであることを示唆している（図４ｃ）。
【０２００】
ヒトＡＡＴのタンパク質増強についてのＦＤＡ承認治療血清閾値は、現在、１１μＭに設定されており、これは５７２μｇ／ｍｌに匹敵する。異種移植片実験からの結果は、この閾値が単純な肝細胞細胞療法アプローチで達成できることを初めて示す。ＮＳＧ−ＰｉＺマウスにおけるヒト肝細胞移植後の全ヒトＡＡＴレベルの定量化は、この治療閾値を達成することが可能であり、この戦略は部分肝切除術と組み合わせた場合に臨床的に関連し得ることを示す（図４ｄ）。
【０２０１】
（実施例５）
ゲノム編集された肝細胞の選択的拡大。
【０２０２】
雄性Ｂ６−ＰｉＺマウスは、生理食塩水またはＡＡＶ−ＧｅｎｅＲｉｄｅ−ＤｕａｌＦｕｎｃｔｉｏｎＡＡＴ（ＧＲ−ｄｆＡＡＴ）のいずれかを静脈内注入された。ＧＲ−ｄｆＡＡＴは、２Ａ−ペプチド配列とそれに続く脱標的化ｃ−Ｍｙｃタグ化ヒトＡＡＴ配列、およびＺ−ＡＡＴを標的とする人工ｍｉＲＮＡを含有するプロモーターレスカセットである（Ｍｕｅｌｌｅｒら、２０１２年、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０巻：５９０〜６００頁）。カセットは、Ｃ５７ＢＬ／６Ａｌｂ遺伝子座に相補的であり、相同組換えを可能にする２つの相同性アーム（１．１〜１．３ｋｂ）が隣接している。相同組換え後、ＡｌｂおよびＡＡＴは、単一のＡｌｂ−ＡＡＴ  ｍＲＮＡ（「融合転写物」）として同時に転写され、リボソームスキッピングによって２つのタンパク質を産生する（図５ａ）。
【０２０３】
ゲノム編集された対立遺伝子によって付与された発現を測定するために、注入後の１０週目および１６週目に、マウスのサブセットにおける正常なアルブミン転写物と比較して、融合されたｍＲＮＡ転写物の相対存在量をｄｄＰＣＲによって定量した（図５ｂ）。１０週目では、この比率は０．２％であり、１匹のマウスで１６週目には３％に増加して、１２．８％の大きさになった（図５ｂ）。この結果は、時間の関数としてのゲノム編集された肝細胞の拡大を示唆している。血清ｃ−Ｍｙｃタグ化されたＡＡＴ（Ｍ−ＡＡＴ−ｃ−Ｍｙｃ）濃度測定は、これらの結果を確証した。マウスを注入前およびその後、隔週で採血し、ＥＬＩＳＡによるＭ−ＡＡＴ−ｃ−Ｍｙｃ血清濃度のモニタリングを可能にした。Ｍ−ＡＡＴ−ｃ−Ｍｙｃの濃度は、１週目でわずかに増加し、１週目から１６週目までの期間にわたって平均１０倍増加した（図５ｃ）。この増加は、経時的に（ｐ＜０．０００１）および対照マウスと処置マウスとの間（ｐ≦０．０００２）の両方で統計的に有意である。
【０２０４】
結果は、注入後の１０および１６週目にｃ−Ｍｙｃについて染色された肝臓のサブセットにおける免疫組織化学によって裏付けられた（図５ｄ）。染色は、肝臓全体にわたる肝細胞のクラスターを示し（図５ｄ）、クラスターのサイズは２つの時間点の間で増加した。この定性的観察は、１０週目に１．６％および１６週目に２．６％のｃ−Ｍｙｃ陽性画素数のパーセンテージを計算する定量的閾値分析（図５ｅ）によって支持される。最後に、血清Ｚ−ＡＡＴのレベルをＥＬＩＳＡによって評価し、Ｚ−ＡＡＴサイレンシングのパーセンテージは経時的に増加し（図５ｆ）、これは１６週目で統計的に有意であった（ｐ≦０．０１８４）。興味深いことに、Ｚ−ＡＡＴサイレンシングの大きさは、ゲノム編集された肝細胞の量をはるかに超えていることを考慮すると、予想外であった。この知見は重要な意味を持ち、すべての肝細胞が同量のＺ−ＡＡＴを産生するわけではないことを示唆している。データは、ＧｅｎｅＲｉｄｅ（したがってＺ−ＡＡＴサイレンシング）についての最も高い程度の増殖的な利点が、大量のＺ−ＡＡＴを産生および保持し続ける肝細胞にあり得ることを示唆し得る。あるいは、データは、未編集の肝細胞における抗ＡＡＴ  ｍｉＲＮＡの逆方向末端反復（ＩＴＲ）駆動の発現を示唆し得る。まとめると、データは、相同組換えが肝臓全体の細胞で起こり、次に、ゲノム編集された肝細胞が拡大し、それらの拡大が経時的にＺ−ＡＡＴの付随する減少を伴う血清Ｍ−ＡＡＴの増加をもたらすという仮説を支持する。
【０２０５】
さらに、データは、ゲノム編集された肝細胞を使用した遺伝子治療のための前臨床モデルとしてのＮＳＧ−ＰｉＺマウスの使用を支持している。
【０２０６】
（実施例６）
ＮＳＧ−ＰｉＺマウスの開発。
【０２０７】
ＮＳＧ−ＰｉＺマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＬｅｏｎａｒｄ  Ｄ．Ｓｈｕｌｔｚの研究コロニーによって調製され、それらから入手された。ＦＶＢ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＥＲＰＩＮＡ１Ｅ３４２Ｋ＊）＃Ｓｌｃｗマウスは、セルピンペプチダーゼインヒビターのＰｉＺ対立遺伝子、クレードＡ（アルファ−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー１［ホモサピエンス］導入遺伝子を保有し、Ｄａｖｉｄ  Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から入手された。このトランスジェニックモデルは、ヒトＺ−ＡＡＴ発現を可能にするヒトアルファ−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１＊）導入遺伝子のＺバリアント（ＰｉＺ）対立遺伝子を有する。ＰｉＺ対立遺伝子は、ＮＳＧ株バックグラウンドへのマーカー支援スピードコンジェニックアプローチにより５世代戻し交配された。ＮＳＧ−Ｔｇ（ＳＥＲＰＩＮＡ１＊Ｅ３４２Ｋ）＃Ｓｌｃｗ／Ｓｚは、ＮＳＧ−ＰｉＺマウスと略される。ＰｉＺトランスジェニック半接合性マウスは、ＰｉＺ対立遺伝子をホモ接合性に固定するために交配された。ＮＳＧ−ＰｉＺホモ接合体は、ジャクソン研究所のＳＰＦバリアマウス室で飼育され、ホモ接合体の交配種の交雑によって維持された。移植実験に使用されるマウスは、Ｓｈｕｌｔｚら、２００５年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：６４７７〜８９頁に記載されるように、１週間おきに飲料水中のスルファメトキサゾール／トリメトプリムで飼育された。マウスは、Ｂｅｄ−ｏ’ｃｏｂ  １／４”の寝具（Ａｎｄｅｒｓｏｎｓ）上で１２時間の明／暗サイクルで飼育され、標準的な実験用飼料を与えられた。マウスは、いずれの手順の前にも絶食されなかった。すべての手順は明サイクル中に行われた。
【０２０８】
（実施例７）
外科手術：脾臓内注入および部分肝切除術。
【０２０９】
すべてのレシピエントマウスは雄であって、６〜１０週齢であり、それらは閉鎖された換気チャンバー中でイソフルラン吸入により麻酔された。脾臓内注入するために、脾臓を露出させるためにマウスの左腰椎窩に切開を施した。１／３ｍＬシリンジに接続された２５ゲージ針を使用して、５０μｌのハンクス平衡塩類溶液に懸濁させた１００万個の初代ヒト肝細胞（バイオレクラム化ＩＶＴ）を脾臓の下極に注入した。露出した脾臓を腹腔に戻し、切開部を吸収性縫合糸（４−０  Ｖｉｃｒｙｌ）で閉じた。Ｖｅｔ  Ｂｏｎｄを皮膚切開部を密封するために局所的に適用した。部分肝切除のために、正中線切開を行い、肝臓を露出させた。肝臓の中央葉および左側葉を４−０シルクブレイク編組縫合糸でしっかりと結んで切除した。肝臓全体の３分の２が部分肝切除術によって摘出された。残りの肝臓は穏やかに腹腔内に戻した。最後に、腹壁の対向する部分を腹側正中線に合わせ、吸収性縫合糸（４−０  Ｖｉｃｒｙｌ）を適用して切開部を閉じた。皮膚切開部をＶｅｔ  Ｂｏｎｄの局所適用により密封した。
【０２１０】
Ｚ−ＡＡＴを発現するマウスに投与されたヒト肝細胞は、肝臓細胞の約３５〜５０％がヒト肝細胞である肝臓を有するマウスをもたらした。これらのマウスは、＞０．１ｍｇ／ｍＬの血清ヒトアルブミンおよび＞５７２μｇ／ｍＬの血清ヒトＡＡＴを発現した。５７２μｇ／ｍＬ（すなわち、１１μＭ）は、特に、ヒトＡＡＴのタンパク質増強のためのＦＤＡ承認治療血清閾値である。
【０２１１】
（実施例８）
【０２１２】
ゲノム編集は肝臓表現型を改善する
【０２１３】
内因性の対立遺伝子をサイレンシングするために野生型ＡＡＴおよび合成ｍｉＲＮＡを発現するプロモーターレスのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをアルブミン遺伝子座に組み込んだ。この遺伝子編集アプローチは、突然変異体タンパク質をサイレンシングし、正常なＡＡＴ産生を増大させ、および肝臓の病理学を改善することによって、編集された肝細胞の選択的な利点へと導く。
【０２１４】
Ｚ−ＡＡＴ肝臓の病理学は、Ｚ−ＡＡＴタンパク質の重合および小球体中でのそれらのポリマーの蓄積によって引き起こされる。臨床的には、患者は肝線維症を呈し、これは肝硬変および肝細胞癌を導き得る。血清Ｚ−ＡＡＴのレベルをＥＬＩＳＡによって評価し、Ｚ−ＡＡＴサイレンシングのパーセンテージは経時的に増加し、成体処置マウスにおいて６カ月目から開始して統計的に有意であり（両側非対応ｔ検定、ｐ＜０．０００２）、Ｐ１処置マウスにおいて４カ月目から開始して統計的に有意である（両側非対応ｔ検定、ｐ＜０．０００１）。Ｍ−ＡＡＴ−ｃ−Ｍｙｃデータと一致して、サイレンシングは、成体処置動物よりもＰ１処置動物において高い（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１２）。興味深いことに、Ｚ−ＡＡＴサイレンシングの大きさは、ゲノム編集された肝細胞の量をはるかに超えていることを考慮すると、予想外であった。この知見は重要な意味を含み、すべての肝細胞が同量のＺ−ＡＡＴを産生するわけではないことを示唆しており、おそらく本発明者らのデータによって示唆されるように、ＧｅｎｅＲｉｄｅ（したがってＺ−ＡＡＴサイレンシング）についての最も高い程度の増殖的な利点が、大量のＺ−ＡＡＴを産生および保持し続ける肝細胞にあり得る。あるいは、これは、未編集の肝細胞における抗ＡＡＴ  ｍｉＲＮＡの逆方向末端反復（ＩＴＲ）駆動の発現を示し得る。
【０２１５】
肝臓表現型は、処置後の６カ月目および８カ月目で、Ｐ１処置マウスにおいてさらに特徴付けられた。過ヨウ素酸シッフ−ジアスターゼ（ＰＡＳ−Ｄ）染色が、マゼンタ球として現れるＺ−ＡＡＴ小球の量を評価するために、それらのマウスからの肝臓切片に対して行われた。定量化したように、ＰＡＳ−Ｄ＋細胞のパーセンテージは、処置後の６カ月目と８カ月目の両方で１００倍を超えて有意に減少した（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。
【０２１６】
肝臓線維症の尺度として、赤色に見えるコラーゲン線維の量を評価するために、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）免疫組織化学染色を雄性動物からの肝臓切片に対して行った。ＰＳＲ＋細胞の定量化は、処置後の８カ月で４０％を超える減少を示した（両側非対応ｔ検定、有意ではない）。ＰＡＳ−Ｄ染色およびＰＳＲ染色についての代表的な画像が得られた。
【０２１７】
まとめると、データは、ＨＲが肝臓全体の細胞において発生し、次に、ゲノム編集された肝細胞が選択的に拡大し、この拡大が、経時的にＺ−ＡＡＴの付随する減少とともに血清Ｍ−ＡＡＴの増加をもたらすという仮説を支持する。これは、肝臓の病理学の顕著な改善をもたらす。
【０２１８】
明確にするために、別々の実施形態との関連で説明されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態との関連で説明されている本発明の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供し得る。
【０２１９】
本明細書で言及されたすべての特許および刊行物は、あたかも各個々の刊行物が具体的に、および個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
本明細書に記載される組成物および方法は、現に、好ましい実施形態の代表例であって、例示的であり、本発明の範囲に対する制限として意図されない。当業者には修飾および他の使用法が想到される。このような修飾および使用は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１−１】
2020500014.tif 000015
【図１−２】
2020500014.tif 000016
【図１−３】
2020500014.tif 000017
【図１−４】
2020500014.tif 000018
【図２−１】
2020500014.tif 000019
【図２−２】
2020500014.tif 000020
【図３−１】
2020500014.tif 000021
【図３−２】
2020500014.tif 000022
【図３−３】
2020500014.tif 000023
【図４−１】
2020500014.tif 000024
【図４−２】
2020500014.tif 000025
【図５−１】
2020500014.tif 000026
【図５−２】
2020500014.tif 000027
【図５−３】
2020500014.tif 000028
【配列表】
2020500014000001.app
【国際調査報告】
2020500014.tif 000029
2020500014.tif 000030
2020500014.tif 000031
2020500014.tif 000032