(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の免疫刺激マクロライドを提供する。本マクロライドは、細胞内細菌、真菌及び原虫感染の処置において有用である。
2020508305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2020508305.tif 000015
又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３】
医学において使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
細胞内感染の処置での使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
細胞内感染が、細菌、原虫及び真菌感染から選択される、請求項４に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
細胞内感染が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリアが引き起こす非定型疾患、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）及びＭ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体又はＭＡＣとしても知られる）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴルジナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｉｎａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ゲニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｕ．パルブム（Ｕ．ｐａｒｖｕｍ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）により引き起こされる細菌感染から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
細胞内感染が、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ビバクス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）及びリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）によって引き起こされる原虫感染から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
細胞内感染が、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びエンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）によって引き起こされる真菌感染から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
ウイルス感染により引き起こされる疾患の処置又は予防を必要とするヒト又は動物対象に、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を投与することを含む、ウイルス感染により引き起こされる疾患を処置又は予防するための方法。
【請求項１０】
３−ヒドロキシル位置でグリコシル化する生体内変換株の培養物への、式（ＩＩ）
【化２】
2020508305.tif 000016
を有するアグリコンの添加を含む、請求項１に記載の化合物を調製するための方法。
【請求項１１】
生体内変換株が、配列番号１（ＡｎｇＭＩＩ）又は配列番号２（ＡｎｇＭＩＩＩ）と７０％以上の相同性を有するグリコシルトランスフェラーゼを発現する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系を刺激可能である新規マクロライド化合物を提供する。本発明は、特に細胞内細菌、真菌及び原虫感染の治療における、及び免疫系の刺激が有益である場合のウイルス性疾患、慢性炎症状態及び癌の同時処置における、医学での使用のための新規化合物に関する。本化合物は、ワクチン接種における免疫調節アジュバントとしても使用され得る。新規マクロライドは、免疫系の調整効果を最大化する一方で、治療上望ましくない直接的な抗菌効果を最小限に抑える。本発明はまた、本発明の化合物を調製するための方法、及び医学における本化合物の使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内細菌、真菌及び原虫感染は、健常者では無症状であるように見えるため、又は症状が軽度なので感染者が医療支援を求める傾向がないため、健常者では診断されないことが多い。このように、細胞内感染が潜在的に持続し得るか、又は疾患状態に進行し得る。正常なＴ細胞機能を妨害する状態は通常、潜伏感染から疾患進行につながり、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）などの細胞内感染は、ＨＩＶ感染がＡＩＤＳに進行した患者における一般的な死因である。このように、細胞内感染を処置する方法及び手段が当技術分野で大いに必要とされている。
【０００３】
Ｍｔｂなどの細胞内病原体は、単球及びマクロファージの細胞内区画内に隠れる能力があり、これにより持続感染が引き起こされる。Ｍｔｂは肺におけるＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞によって認識され、適切な応答が開始されるものの、系は菌を死滅させる免疫を作り出せない（ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ，２０１２）。宿主による免疫認識を逃れるために、ＭｔｂはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に対するＭＨＣクラスＩＩポケットで提示されるＭｔｂペプチドの認識を阻害する一連の機序を発達させてきた。Ｔｏｌｌ様受容体２はＭｔｂによって阻害されることが実証されており、同様にして、ＩＦＮ−γ誘導性ＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害する（Ｎｏｓｓ  ２００１）。加えて、データから、おそらくインバリアント鎖関連機序によって、Ｍｔｂがファゴソームプロセシング及び成熟を阻害する能力を有することが示唆される（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ  ２００１）。したがって、Ｍｔｂにより産生される免疫回避因子ゆえに、Ｍｔｂ由来のＭＨＣクラスＩＩペプチドの正常な抗原プロセシング、搭載及び提示が損なわれる。
【０００４】
エンドソームリソソーム経路は、病原体を取り込み、それらを１２〜１５ａａ長のペプチドにプロセシングし、ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭによるインバリアント鎖ペプチドＣＬＩＰの除去後、ＭＨＣクラスＩＩポケットに搭載されるように設計されている。抗原搭載後、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の特異的Ｔ細胞受容体に対する提示のための、細胞表面へのＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体の輸送が起こる（Ｒｏｃｈｅ  ２０１５）。最近、Ｍｔｂにより発現されるタンパク質ＥｓｘＨは、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）機構を直接阻害することが報告された（Ｐｏｒｔａｌ−Ｃｅｌｈａｙ  ２０１６）。ＥｓｘＨは、抗原提示単球及びマクロファージがＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を活性化する能力を阻害する。インタクトなＥＳＣＲＴ機構はＴ細胞の抗原プロセシング、提示及び活性化に必要であると思われるので、ＥｓｘＨは、ＭＨＣクラスＩＩ経路を妨害することによってＭｔｂ誘導性免疫回避を説明する連結部である。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩＩ提示の重要性は、原発性免疫不全症（ＰＩＤ）の患者においても実証されている。ＩＦＮＧＲ及びＩＬ−１２が関与するＩＦＮ−γ回路に欠陥があるＰＩＤ患者は、ＴＢＣ及び非定型マイコバクテリア感染に陥るリスクが高くなる。ＭＨＣクラスＩＩの発現はＩＦＮ−γの発現に依存し、ＩＦＮ−γ発現により制御され、ＩＦＮ−γ回路の欠陥の結果、ＭＨＣクラスＩＩ発現がさらに減少し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の活性化が不十分となる。
【０００６】
トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの原虫は、偏性的な細胞内寄生生物として細胞内に隠れることによって免疫認識を回避するための機序を発達させてきた。この機序は、ＭＨＣクラスＩＩ発現の妨害を含み、したがって特異的なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に対して提示されるべきトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）の量が減少する。詳細な機序は、ＭＨＣクラスＩＩのＩＦＮ−γ誘導性発現を阻害するトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）によって発現される可溶性タンパク質に依存する（Ｌｅｒｏｕｘ  ２０１５）。
【０００７】
さらに、異なる真菌感染がＭＨＣクラスＩＩ発現に依存することが実証されている。クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｏｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）は、ＨＩＶを含む免疫不全の患者において生命を脅かす脳感染を引き起こし得る。クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｏｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）感染のマウスモデルでの研究から、ＩＦＮ−γ依存的に、ミクログリア細胞の活性化及びそれらのＭＨＣクラスＩＩの上方制御が生存に不可欠であることが実証されている（Ｚｈｏｕ  ２００７）。
【０００８】
したがって、Ｍｔｂ及び他の細胞内細菌、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの原虫、又はクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）により代表される真菌によって誘発される免疫回避機序を克服するために、単球、マクロファージ、ミクログリア又は他の感染細胞の細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩの発現増加は、病原体の免疫認識及び排除に有益であると思われる。
【０００９】
エリスロマイシン及びアジスロマイシンなどのマクロライドは、細菌感染の処置に長年使用されてきた。エリスロマイシンは、放線菌サッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）の発酵によって産生されるポリケチド天然物マクロライドである。アジスロマイシンは、エリスロマイシンの半合成アザライド誘導体である。エリスロマイシンなどのマクロライドの抗菌活性を記載する多くの参考文献が存在する。この抗菌機序は、分子が細菌の５０Ｓ細菌リボソーム上のＰ部位に結合し、ゆえにｔＲＮＡ結合を妨害することを通じて達成される。
【００１０】
多くの参考文献は、半合成及び生合成工学を介したエリスロマイシンの類似体の生成を記載している。特に、エリスロマイシン、デソサミン及びミカロース／クラジノース上のグリコシル基の半合成的除去のための方法が記載されている。別のグリコシル基をエリスロマイシンアグリコンに付加するための生体内変換について、さらなる方法が記載されている（例えば、Ｇａｉｓｓｅｒら、２０００，Ｓｃｈｅｌｌら、２００８及び国際公開第２００１０７９５２０号パンフレットを参照）。しかし、この公表されている研究の主な焦点は、抗菌性エリスロマイシン類似体を生成させることであった。
【発明の概要】
【００１１】
直接的な抗菌活性を欠くマクロライドからの免疫刺激活性は、以前は報告されていなかった。驚くべきことに、発明者らは、本発明の化合物（化合物１、図１）が、免疫系のいくつかの細胞型において強力な免疫刺激効果を有することを発見した。１μＭ化合物１による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロ刺激２４〜４８時間後（図１）、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＢ細胞において活性化マーカーＣＤ６９が上方制御された（図２）。発明者らは、Ｔ細胞及びＢ細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−ＡＢＣ）の上方制御も観察し（図３）、このことから、細胞内感染に由来する抗原の抗原提示における影響が示された。化合物１によるＰＢＭＣ集団中の単球の刺激は、共刺激分子ＣＤ８０ならびに抗原提示分子ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の上方制御につながった（図４）。マクロファージに分化した単球は、化合物１による刺激に応答してＣＤ８０も上方制御した（図５）。さらに、化合物１で刺激したＰＢＭＣは、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生増加を伴うサイトカインプロファイル変化を発現し、このことから、ある一定の条件下での免疫阻害効果が示された（図６）。フローサイトメトリーで測定して、化合物１の免疫学的効果をさらに分析したところ、６日間の刺激後の、Ｔ細胞のサイトカイン推進性増殖プロファイルの変化が明らかになった（図７）。さらに、ウイルス特異的Ｔ細胞増殖は化合物１により影響を受けた。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原及び化合物１の存在下で培養したＣＭＶ感染ドナー由来のＰＢＭＣは、ＩＬ−７受容体α（ＣＤ１２７）の発現増加とともに、活性化ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型の変化を示した（図８）。ＣＤ１２７はＴ細胞のホメオスタシス、分化及び機能に非常に重要であり、発現の低下はＨＩＶ及び他の慢性ウイルス性疾患の重症度と相関する（Ｃｒａｗｌｅｙら、Ｓｅｍ  Ｉｍｍ  ２０１２）。要約すると、化合物１は、抗原提示、共刺激及びＴ細胞活性化及び増殖に影響を与えることにより、免疫応答を特異的に活性化及び修飾する驚くべき能力を有する。これらの研究の多くにおいて、化合物２、（化合物２０として）以前にＳｃｈｅｌｌら２００８で発表された、グリコシル化が変化した別の関連マクロライドエリスロマイシン類似体は、本アッセイにおいて殆ど又は全く活性を示さなかったので含めた。
【００１２】
したがって、本発明の一態様において、本明細書中で定義されるような実質的な抗菌活性のない式（Ｉ）の免疫刺激マクロライド（化合物１としても知られる。）が提供される：
【化１】
2020508305.tif 000003
【００１３】
式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩、水和物、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーも本発明の範囲内である。
【００１４】
本発明の別の態様において、３−ヒドロキシル位置でグリコシル化する生体内変換株の培養物に式ＩＩを有するアグリコンを添加することを含む、式（Ｉ）の化合物を作製するための方法が提供される。
【化２】
2020508305.tif 000004
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、生体内変換株は、ＡｎｇＭＩＩ（配列番号１）又はＡｎｇＭＩＩＩ（配列番号２）に対して７０％以上の相同性、例えば７５％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性、例えば１００％の相同性など、を有するグリコシルトランスフェラーゼを発現する。
【００１６】
２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の相同性は、パラメーター「同一性」によって述べられる。配列のアライメント及び相同性スコアの計算は、例えばタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方に有用な、完全なＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを使用して行われ得る。初期設定のスコア行列ＢＬＯＳＵＭ５０及び単位行列は、それぞれタンパク質及びＤＮＡアライメントに使用される。ギャップにおける最初の残基に対するペナルティは、タンパク質に対しては−１２、ＤＮＡに対しては−１６であり、一方、ギャップにおける追加残基のペナルティは、タンパク質に対しては−２、ＤＮＡに対しては−４である。アライメントはＦＡＳＴＡパッケージバージョンｖ２０ｕ６で生成させ得る。タンパク質配列の多重アライメントは、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」を使用して生成させ得る。タンパク質アライメントを鋳型として使用し、ＤＮＡ配列からの対応するコドンでアミノ酸を置き換えて、ＤＮＡ配列の多重アライメントを行い得る。あるいは、アミノ酸配列及びＤＮＡ配列を整列させるために異なるソフトウェアを使用し得る。２つのアミノ酸配列のアライメントは、例えばＥＭＢＯＳＳパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン２．８．０からのＮｅｅｄｌｅプログラムを使用することにより決定される。使用される置換行列はＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始ペナルティは１０、ギャップ伸長ペナルティは０．５である。
【００１７】
一般的な化学的方法
当業者は、本発明の化合物が、既知のように、様々な方法で調製され得ることを認識するであろう。以下の経路は、式（Ｉ）の化合物の合成に使用され得るいくつかの方法の単なる例示である。
【００１８】
１つの一般的な経路において、エリスロマイシンＡに半合成操作を行い、アジスロマイシンを生成させる。この変換のための方法は公知であるが（米国特許第３４７８０１４号明細書；米国特許第４３２８３３４号明細書；米国特許第４４７４７６８号明細書；Ｇｌａｎｓｄｏｒｐら、２００８）、これらの経路又は他の経路での変形物が同じ目的に対して使用され得る。ミカロース／クラジノース及び／又はデソサミンは、グリコシド切断など、さらなる化学的方法によって除去される。簡潔に述べると、一方法において、酸での処理により糖を除去し得る。アミノ糖の除去を促進するために、最初にジメチルアミンを酸化してＮ−オキシドを形成させ、次いでこれを熱分解により除去することが必要である。次いで、結果として得られる５−Ｏ糖及び３−Ｏ糖を酸性分解により除去し得る。適切な方法は、ＬｅＭａｈｉｅｕ（１９７４）及びＤｊｏｋｉｃ，Ｓ．ら（１９８８）によって教示される。最後に、本化合物は、アミノ糖を付加する細菌株を使用して生体内変換される。
【００１９】
本発明の化合物の一般的使用
本明細書中に記載のような化合物は、医学、医学研究において、又はそのような使用のための組成物の製造において使用され得る。したがって、以下において、「本発明の化合物」という用語が医学的用途又は医薬組成物に関連して使用される場合、この用語は、この化合物が、このような用途について知られていないという条件で、式（Ｉ）の化合物を含むことも意図される。
【００２０】
本発明の化合物は、直接的な抗菌効果を最小限に抑えるように設計されているが、むしろ免疫活性化特性に焦点を合わせている。化合物１を細菌Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）又はＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の培養物に添加する場合、抗菌効果は全く認められないか又は最小限しか認められない。宿主細胞に影響を及ぼす単独の免疫刺激特性がある化合物を有することの長所は、細菌耐性の発達が回避されることである。さらに、下痢及び偽膜性大腸炎を引き起こすクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の過剰増殖のリスクを伴う、腸内細菌叢に影響を与えるマクロライドの周知の副作用が回避される。多くの細胞内病原体、例えばＭｔｂ、ならびにウイルス及び癌は、すなわち、Ｔ細胞による検出を回避するため、ＨＬＡ発現を下方制御することによって、免疫認識を回避するための機序を発達させている。介入の本化合物の機序は、感染細胞でのＨＬＡ分子の活性化及び発現上昇に依存する。ＨＬＡ分子は、感染細胞の排除を可能にするＴ細胞に対する認識シグナルを提示するために、細胞内感染病原体由来のペプチドを搭載し、提示する。
【００２１】
本明細書中で開示される本発明の化合物は、細胞内細菌、真菌及び原虫感染、例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリアが引き起こす非定型疾患、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）及びＭ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体又はＭＡＣとしても知られる。）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴルジナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｉｎａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ゲニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｕ．パルブム（Ｕ．ｐａｒｖｕｍ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）により引き起こされる細菌感染など、例えばトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ビバクス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）及びリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）により引き起こされる原虫感染など、及びヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びエンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）により引き起こされる真菌感染などの処置において使用され得る。
【００２２】
本発明の化合物は、これらの感染が単独で、又はウイルス性病原体又はウイルス性疾患が付随して、又は原発性もしくは二次的免疫不全の他の原因が付随して起こる場合の、細胞内細菌、真菌及び原虫感染の処置に使用し得る。原発性免疫不全の原因としては、遺伝性の遺伝的欠損及び体細胞突然変異が挙げられるが、一方で二次的免疫不全は、上記のものなどのウイルス感染により、又は糖尿病などの遺伝性もしくは非遺伝性状態又は栄養失調により、又は免疫抑制剤などの薬剤、薬物乱用又は他の環境要因により引き起こされ得る。
【００２３】
さらに、本発明の化合物は、ウイルス病原体又は、ウイルス性疾患、例えばＨＩＶ、アデノウイルス、アルファウイルス、アルボウイルス、ボルナ病、ブニヤウイルス、カリシウイルス、コンジローマ・アクミナータ（Ｃｏｎｄｙｌｏｍａ  Ａｃｕｍｉｎａｔａ）、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、伝染性膿瘡、エプスタイン−バーウイルス、伝染性紅斑、ハンタウイルス、ウイルス性出血熱、ウイルス性肝炎、単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、伝染性単核球症、インフルエンザ、ラッサ熱ウイルス、麻疹、耳下腺炎、モルスクム・コンタギオサム（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  Ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）、パラミクソウイルス、サシチョウバエ熱、ポリオーマウイルス、リフトバレー熱、風疹、スローディジーズウイルス（Ｓｌｏｗ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ）、天然痘、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスに感染している患者を処置する場合など、免疫応答刺激が有用である、疾患、障害、状態及び症状に対する処置又は同時処置として使用され得る。
【００２４】
さらに、本発明の化合物は、癌、特に副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、基底及び扁平上皮細胞皮膚癌、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍の同時処置での使用に適していることが企図される。
【００２５】
したがって、先行技術のマクロライドを超える本発明の化合物の有利な特性としては、以下のもの：
−直接的な抗菌活性の低下
−ＭＨＣクラスＩ刺激の改善
−免疫調節の改善
−抗原提示細胞の活性化の改善
−Ｔ細胞応答の改善
−抗ウイルス活性の改善
−ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示の改善
のうち１つ以上が挙げられ得る。
【００２６】
本発明の化合物を含む医薬組成物
本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤又は担体と一緒に本発明の化合物を含む医薬組成物も提供する。同様に、本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に本発明の化合物を含む少なくとも１つの医薬組成物を含む医療用キットも提供する。本発明はまた、１つ以上の美容上又は獣医学上許容可能な賦形剤と一緒に本発明の化合物を含む美容用又は獣医用組成物にも関する。
【００２７】
本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬、美容もしくは獣医用組成物は、非経口、経口、局所、又は粘膜（頬、舌下、経皮、膣、直腸、鼻腔、眼などを含む。）を介して、医療装置（例えばステント）を介して、又は吸入によって、などであるが限定されない、何らかの従来の経路によって投与し得る。処置は、単回投与又はある期間にわたる複数回投与からなり得る。
【００２８】
本発明の化合物及び本発明の医薬組成物の投与計画は、問題となる化合物又は組成物の薬学的特性に応じて変動し得る。投与計画は、単回投与又は１回以上の期間にわたる複数回投与からなり得る。投与は、特定の用途、処置しようとする疾患及び、治療しようとする患者の体調及び特徴（性別、体重及び年齢など）に応じて、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、より少ない頻度、又はより多い頻度であり得る。処置はまた、連続投与、例えば点滴を介した静脈内投与又はデポーもしくは徐放製剤を介したものなどでもあり得る。
【００２９】
本発明の化合物をそのまま投与することは可能であるが、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と一緒にそれを医薬組成物として与えることが好ましい。賦形剤は、本発明の化合物と適合性があり、その受容者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。適切な賦形剤の例を以下でさらに詳細に記載する。
【００３０】
本医薬組成物は、単位剤型を含む適切な剤型で好都合に提供され得、薬学の技術分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。このような方法は、本発明の化合物を１つ以上の賦形剤との会合に至らせる段階を含む。一般に、本医薬組成物は、本発明の化合物を賦形剤と均一かつ十分に混合し、次いで、必要に応じて、得られた組成物を、例えば錠剤に成形することにより調製される。
【００３１】
本発明の化合物は、通常、経口又はいずれかの非経口経路など、いずれかの従来の投与経路によって、本発明の化合物を含む医薬組成物の形態で、場合によっては薬学的に許容可能な塩の形態で、薬学的に許容可能な剤型で投与される。治療しようとする障害及び患者、ならびに投与経路に応じて、本医薬組成物は、様々な用量及び／又は頻度で投与され得る。
【００３２】
本医薬組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず；したがって、必要に応じて、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。溶液、分散液、エマルジョン及び懸濁液などの液体処方物の場合、賦形剤は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、植物油及びそれらの適切な混合物などであるが限定されない溶媒又は分散媒ならびに、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）及び植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。
【００３３】
例えば、本発明の化合物は、香味料又は着色剤を含有し得る、錠剤、カプセル剤、フィルム、坐剤（ｏｖｕｌｅｓ）、エリキシル剤、液剤、エマルジョン又は懸濁剤の形態で、経口、頬側又は舌下投与され得る。
【００３４】
経口投与に適した本発明の医薬組成物は、それぞれが所定量の本発明の化合物を含有する、カプセル、カシェ剤又は錠剤などの別個の単位として；例えば錠剤又はカプセル剤の形態で複数単位として；粉剤又は顆粒剤として；水性液体もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として；又は水中油液体エマルジョンもしくは油中水液体エマルジョンとして、提供され得る。本医薬組成物は、ボーラス、舐剤又はペーストとしても提供され得る。
【００３５】
経口投与に適した本発明の化合物の液剤又は懸濁剤は、水、アルコール、ポリオールなどを含む１つ以上の溶媒、ならびにｐＨ調整剤、安定化剤、界面活性剤、可溶化剤、分散剤、防腐剤、香料などの１つ以上の賦形剤も含有し得る。具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール及びＰｈｏｓａｌ５０ＰＧ（ホスファチジルコリン、大豆脂肪酸、エタノール、モノ／ジグリセリド、プロピレングリコール及びパルミチン酸アスコルビルからなる。）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、エマルジョンの形態でもあり得、ここで式（Ｉ）による化合物は、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンなどのエマルジョンで提供され得る。油は、天然油もしくは合成油、又は何らかの油様物質、例えば大豆油又はベニバナ油又はそれらの組み合わせであり得る。
【００３６】
錠剤は、賦形剤、例えば、微結晶セルロース、ラクトース（例えばラクトース一水和物又は無水ラクトース）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシン、ブチル化ヒドロキシトルエン（Ｅ３２１）、クロスポビドン、ヒプロメロース、デンプンなどの崩壊剤（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及びある種の複合ケイ酸塩及び、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、マクロゴール８０００、スクロース、ゼラチン及びアカシアなどの造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクなどの滑沢剤が含まれ得る。
【００３７】
錠剤は、本発明の化合物を、場合によっては１つ以上の賦形剤とともに圧縮又は成形することにより作製され得る。圧縮錠剤は、適切な機械において、粉末又は顆粒などの自由流動形態の本発明の化合物を圧縮し、場合によっては結合剤（例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤及び／又は分散剤と混合することにより調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化した本発明の化合物の混合物を適切な機械で成形することにより作製され得る。錠剤は、場合によっては、コーティングするか又は切れ目を入れてもよく、所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して、それに含有される本発明の化合物の徐放又は制御放出を提供するためにさらに処理又は加工（ｔｒｅａｔｅｄ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）し得る。
【００３８】
同様のタイプの固形医薬組成物は、ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用され得る。これに関して好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシルの場合、本発明の化合物は、様々な甘味料又は香味料、着色物質又は染料と、乳化剤及び／又は懸濁剤と、及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンなどの希釈剤及びそれらの混合物と組み合わせられ得る。
【００３９】
口腔での局所投与に適した本発明の医薬組成物としては、風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中で本発明の化合物を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中で本発明の化合物を含むトローチ；及び適切な液体担体中に本発明の化合物を含む洗口液が挙げられる。
【００４０】
局所投与に適合した本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁剤、ローション、粉剤、液剤、ペースト、ゲル、含浸包帯、スプレー、エアロゾル又は油、経皮装置、散布剤などとして調製され得る。このような組成物は、本発明の化合物を含有する従来の方法を介して調製され得る。したがって、それらはまた、保存剤、薬物浸透を助ける溶媒、クリーム又は軟膏中の皮膚軟化剤及びローション中のエタノール又はオレイルアルコールなどの適合性の賦形剤も含み得る。賦形剤は、本組成物の約１％ｗ／ｗ〜約９８％ｗ／ｗを構成し得る。好ましくは、賦形剤は、本組成物の約８０％ｗ／ｗ以下を構成する。単なる例示として、クリーム又は軟膏は、所望の粘稠度を有するクリーム又は軟膏を生成させるのに十分な量で、約５〜１０％ｗ／ｗの化合物を含有する十分な量の親水性物質及び水を混合することにより調製される。
【００４１】
経皮投与に適合した本発明の医薬組成物は、長期間にわたり受容者の表皮と密接に接触したままであることが意図された個別のパッチとして与えられ得る。例えば、本発明の化合物は、イオン導入によりパッチから送達され得る。
【００４２】
外部組織、例えば口及び皮膚への適用のために、本発明の医薬組成物は、好ましくは局所軟膏又はクリームとして適用される。軟膏中で処方される場合、本発明の化合物は、パラフィン又は水混和性の軟膏基剤のいずれかとともに使用され得る。
【００４３】
あるいは、本発明の化合物は、水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤とともにクリーム中で処方され得る。
【００４４】
非経口投与の場合、本発明の化合物と、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油などであるが限定されず水が好ましい無菌ビヒクルと、を含む液体単位剤型が調製される。本発明の化合物は、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中で、コロイド状にし得るか、懸濁し得るか、又は溶解し得るかのいずれかである。溶液の調製において、本発明の化合物を注射用水中で溶解させ、適切なバイアル又はアンプルに充填して密封する前に、濾過滅菌し得る。
【００４５】
有利には、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤などの薬剤をビヒクル中で溶解させ得る。安定性を高めるために、バイアルに充填した後、医薬組成物を凍結させ得、次いで真空下で水を除去し得る。次いで、乾燥した凍結乾燥粉末をバイアル中で密封し、使用前に液体を再構成するために付随の注射用水バイアルを供給し得る。
【００４６】
注射用途に適した本発明の医薬組成物は無菌水溶液又は分散液を含む。さらに、このような医薬組成物は、そのような無菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末の形態であり得る。全ての場合において、最終注射形態は無菌でなければならず、容易な注射針通過可能性のために効果的に流動性でなければならない。
【００４７】
非経口懸濁液は、本発明の化合物を溶解させる代わりにビヒクル中で懸濁し、滅菌が濾過によって達成され得ないことを除いて、溶液と実質的に同じように調製される。本発明の化合物は、無菌ビヒクル中で懸濁する前にエチレンオキシドに曝露することにより滅菌し得る。有利には、本発明の化合物の均一な分布を促進するために、界面活性剤又は湿潤剤が本医薬組成物中に含まれる。
【００４８】
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の医薬組成物は、問題の処方物のタイプを考慮して、当技術分野で従来のものである他の薬剤を含み得ることを理解されたい。例えば、経口投与に適した医薬組成物は、香味料を含み得る。当業者は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０又はその最新版からの指針に基づいて、適切な処方物を選択する方法及びそれを調製する方法を知っている。当業者はまた、適切な投与経路及び投与量を選択する方法も知っている。
【００４９】
本発明の化合物の個々の投与量の最適な量及び間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位及び処置される特定の対象の年齢及び状態によって決定され、医師が最終的に使用しようとする適切な投与量を決定することは当業者により認められる。この投与量は必要に応じて何度も繰り返し得る。副作用を発症した場合、通常の臨床業務に従って、投与量及び／又は投与頻度を変更し得るか又は減少させ得る。
【００５０】
文脈上別段の要求がない限り、本明細書中で言及される％値は全て％ｗ／ｗである。
【００５１】
定義
冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書中で、冠詞の文法的対象の１つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「類似体」は、１つの類似体又は複数の類似体を意味する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「本発明の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ｓ）  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は交換可能に使用され、式（Ｉ）の化合物を指す。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「直接的な抗菌効果」という用語は、細菌のｒＲＮＡ複合体への結合を通じて生じるエリスロマイシン及び類似体の抗菌活性を指す。この効果は、何れの宿主免疫系成分の存在も必要とせず、したがって、インビトロ最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイ及びディスク阻害アッセイなどの標準的な抗菌アッセイにおいて明らかである。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「実質的な抗菌活性なく」という用語は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カセイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）及びＢ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）におけるその抗菌活性について本明細書中の例２に従って試験した場合、本発明の化合物のＭＩＣ値が＞６４μｇ／ｍＬであることを意味するものとする。
【００５５】
本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩としては、薬学的に許容可能な無機もしくは有機酸又は塩基から形成される従来の塩、ならびに四級アンモニウム酸付加塩が挙げられる。適切な酸性塩のより具体的な例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ギ酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルモイック酸（ｐａｌｍｏｉｃ）、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化水素酸、リンゴ酸、ステロイック酸（ｓｔｅｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、タンニンなどが挙げられる。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容可能ではないが、本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容可能な塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において有用であり得る。適切な塩基性塩のより具体的な例としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカイン塩が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】マクロライド、エリスロマイシンＡ、化合物１、化合物２、化合物３及びＥＭ７０３の構造。
【図２】Ｔ細胞及びＢ細胞でのＣＤ６９上方制御。ＰＢＭＣを化合物１、化合物２及び活性化対照ＬＰＳ及びＩＦＮ−γで２４時間処理した。初期活性化マーカーＣＤ６９の発現は、フローサイトメトリーでＣＤ４＋Ｔ細胞集団（左）及びＣＤ１９＋Ｂ細胞集団（右）において測定した。値は、３つ組の試料における、平均蛍光強度、ＭＦＩ及びエラーバー標準偏差を表す。
【図３】Ｔ細胞及びＢ細胞でのＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ上方制御。ＰＢＭＣを化合物１又は２及び活性化対照ＬＰＳ及びＩＦＮ−γで２４時間処理した。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現は、フローサイトメトリーでＣＤ４＋Ｔ細胞集団（左）及びＣＤ１９＋Ｂ細胞集団（右）において測定した。値は、３つ組の試料における、平均蛍光強度、ＭＦＩ及びエラーバー標準偏差を表す。
【図４】血液単球でのＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの上方制御。ＰＢＭＣを化合物１又は２ならびに活性化対照ＬＰＳ及びＩＦＮ−γで２４時間処理した。ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの発現は、フローサイトメトリーで単球細胞集団において測定した。値は、３つ組の試料における、平均蛍光強度、ＭＦＩ及びエラーバー標準偏差を表す。
【図５】血液単球でのＣＤ８０上方制御。ＰＢＭＣを化合物１又は２ならびに活性化対照ＩＦＮ−γで２４時間処理した。ＣＤ８０の発現は、フローサイトメトリーで単球細胞集団において測定した。値は、３つ組の試料における、平均蛍光強度、ＭＦＩ及びエラーバー標準偏差を表す。
【図６】ＥＬＩＳＡで測定した、化合物１での４８時間又は１週間にわたる刺激後のＰＢＭＣからのＩＬ−１０の産生。
【図７】増殖色素（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｙｅ）Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーで測定した、化合物１での６日間の刺激後のＣＤ４  Ｔ細胞増殖。未処理細胞（ＵＮＴ）又は化合物２を対照として使用した。
【図８】フローサイトメトリーで測定した、化合物１との温置後のＣＭＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞上のＩＬ−７受容体α（ＣＤ１２７）の上方制御。
【図９】化合物１又は２の存在下又は非存在下で５日間、ＣＭＶペプチドを用いて増殖させたＰＢＭＣ由来（ＣＭＶ＋ドナー由来）のインターフェロンγ分泌（サイトメトリービーズアッセイにより測定した場合）。
【図１０】指定された化合物で４８時間刺激したマクロファージからのインターフェロンγ分泌（サイトメトリービーズアッセイにより測定した場合）。
【図１１】指定された化合物で４８時間刺激したＰＢＭＣ又はマクロファージからのケモカインＲＡＮＴＥＳ分泌（サイトメトリービーズアッセイにより測定した場合）。
【図１２】指定された化合物で４８時間刺激したＰＢＭＣ又はマクロファージからのＩＬ１２ｐ７０分泌（サイトメトリービーズアッセイにより測定した場合）。
【図１３】指定された化合物で４８時間刺激したＰＢＭＣ、マクロファージ又はＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＬ  １ｂ分泌（サイトメトリービーズアッセイにより測定した場合）。
【図１４】指定された用量の化合物１を２４時間前に注射したＣ５７ｂｌ／６マウスの血中の％ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞。ＣＤ２５発現は、フローサイトメトリーにより測定した。
【図１５】指定された化合物を２４時間前に注射した３匹の個別のＣ５７ｂｌ／６マウスの脾臓における％ＭＨＣクラスＩ高ＣＤ１１ｂ＋細胞。ＭＨＣクラスＩ及びＣＤ１１ｂの発現は、フローサイトメトリーにより測定した。
【００５７】
実験
材料
別段の指示がない限り、以下の例で使用する試薬は全て、市販品を入手する。
【００５８】
抗体
抗ＣＤ８０  Ｖ４５０、抗ＣＤ６９  ＰＥ、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＡＰＣ−Ｒ７００、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ及び抗抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ  ＦＩＴＣはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ｔ細胞増殖アッセイ用のＣｅｌｌｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＥＬＩＳＡ抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００５９】
培地
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【００６０】
一般的な生物学的方法
免疫刺激に対する本発明の化合物の効果は、以下に記載の方法の１つ以上を使用して試験し得る：
一般的な化合物の方法
化合物分析−溶液中の溶解度及び安定性
【００６１】
発酵ブロス及び化合物の分析
以下に記載のように得られた発酵ブロスのアリコートを、等体積の酢酸エチルとともに３０分間激しく振盪し、次いで遠心分離によって分離するか、又は既に単離された化合物をメタノール：水（９：１、０．１ｍｇ／ｍＬ）中で溶解させ、次に遠心分離によって分離した。上清をＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、４０℃で加熱したＬｕｎａ  ＨＰＬＣカラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ，ＵＫ））を使用して、塩基不活性化Ｌｕｎａ  Ｃ１８逆相シリカ（粒径５ミクロン）でクロマトグラフィーを行った。クォータナリポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン及び、Ｂｒｕｋｅｒ  ＥｓｑｕｉｒｅイオントラップＭＳに接続されたダイオードアレイ検出器から構成されるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム。
【００６２】
移動相Ａ＝水中０．１％ギ酸
移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸
【００６３】
勾配：Ｔ＝０分、Ｂ＝５０％；Ｔ＝４．５分、Ｂ＝５０％；Ｔ＝７分、Ｂ＝１００％；Ｔ＝１０．５分、Ｂ＝１００％；Ｔ＝１０．７５分、Ｂ＝５０％；Ｔ＝１３分、Ｂ＝５０％。
【００６４】
化合物はＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより内部標準に対して定量した。
【００６５】
フローサイトメトリーによるマーカー発現の分析
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離で健常ドナーから精製した。３７℃、５％ＣＯ２で２４〜７２時間にわたり、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で細胞を培養し、漸増濃度の化合物１及び２で刺激した。次に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用してフローサイトムトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｔｅｒｙ）で分析した。全試料を２つ組で試験した。
【００６６】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）培養
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離で健常ＣＭＶ陽性ドナーから精製した。ＰＢＭＣは、ＰＢＳ中の５μＭ  ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１５分間標識し、次いで完全細胞培養培地で洗浄した。３７℃、５％ＣＯ２で６〜８日間、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給したＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質にまたがるペプチドライブラリ（１μｇペプチド／ｍＬ、ＪＰＴ）の存在下で標識ＰＢＭＣを培養した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーで細胞増殖を評価した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ
完全ＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、２．５μＭの化合物１及び１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに４８時間及び７日間温置した後、上清ＩＬ−１０を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ（抗体は全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）で測定した。
【００６８】
ＴＬＲ２アッセイ
試料及び対照は、標準的なアッセイ条件を使用したＩｎｖｉｖｏｇｅｎでの細胞レポーターアッセイを使用して、組み換えＨＥＫ−２９３−ＴＬＲ細胞株上で二つ組で試験した。これらの細胞株は、ヒトＴＬＲ２タンパク質ならびに分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）であるレポーター遺伝子を機能的に過剰発現する。このレポーター遺伝子の産生は、ＮＦκＢ誘導性プロモーターによって推進される。ＴＬＲレポーター細胞株の活性化の結果は、陰性対照と比較した、光学密度値として与える（ＯＤ）。
【００６９】
２０μＬの各試験品を使用して、２００μＬの最終反応体積でｈＴＬＲ２レポーター細胞株を刺激した。少なくとも２つの試験濃度−２０μＭ及び１０μＭで試料を２つ組で試験した。
【００７０】
細胞透過性の評価（双方向）
Ｃａｃｏ−２細胞単層の先端（Ａ）面に１０μＭの試験品を添加し（３７℃の、０．３％ＤＭＳＯ及び５μＭ  ＬＹ入りのＨＢＳＳ緩衝液中）、９０分間の温置後に側底（Ｂ）区画への化合物透過性を測定した。能動輸送を調べるために逆方向（側底から先端側）でもこれを行った。試験化合物及び標準対照化合物の両方のレベルを定量化するためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する。流出比は、ＢからＡへの透過性をＢからＡへの透過性により除することによって計算した。
薬物透過性：Ｐａｐｐ＝（ＶＡ／（面積×時間））×（［薬物］アクセプター／（（［薬物］初期、供与体）×希釈係数）。
【００７１】
代謝安定性の評価（ミクロソーム安定性アッセイ）
ミクロソームにおける代謝率は次のように試験した：
ヒト肝臓ミクロソームを緩衝液Ｃ（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で２．５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ミクロソーム安定性試験は、３０μＬの１．５μＭ化合物添加溶液をウェルに（１．５μＬの５００μＭ添加溶液（１０μＬの１０ｍＭ  ＤＭＳＯ保存溶液を１９０μＬ  ＡＣＮに添加して最終的に１μＭの最終試験濃度にする。）及び１８．７５μＬの２０ｍｇ／ｍＬの肝臓ミクロソームを４７９．７５μＬの緩衝液Ｃに）添加することにより行った。全試料を３７℃でおよそ１５分間予備温置した。これに続いて、穏やかに混合しながら１５μＬのＮＡＤＰＨ溶液（６ｍＭ）を添加することにより反応を開始させた。アリコート（４０μＬ）を０、５、１５、３０及び４５分で取り出し、内部標準を含有するＡＣＮ（１３５μＬ）でクエンチした。タンパク質を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分）により取り出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより化合物濃度について試料プレートを分析した。次に、標準的方法により半減期を計算し、分析物の濃度を元来存在する量と比較した。
【００７２】
例
例１
化合物１の生成
ａｚ−ＡＧの生成
アジスロマイシンアグリコンは、文献（Ｄｊｏｋｉｃ，Ｓ．ら１９８８）に記載の方法を使用して作製した。簡潔に述べると、アジスロマイシンは３−Ｏ及び５−Ｏ糖の酸性除去によりアジスロマイシンアグリコンに変換される。５−Ｏアミノ糖を最初に酸化し、熱分解して開裂を促進する。
【００７３】
エリスロマイシンアグリコン（エリスロノリド）をグリコシル化可能な生体内変換株の作製
Ｓ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）１８Ａ１（ｐＡＥＳ５２）の作製
ａｎｇＡＩ、ａｎｇＡＩＩ、ａｎｇＣＶＩ、ａｎｇ−ｏｒｆ１４、ａｎｇＭＩＩＩ、ａｎｇＢ、ａｎｇＭＩ及びａｎｇＭＩＩをａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４  ｐａｃｔＩ／ＩＩＩ発現系（Ｒｏｗｅら、１９９８）とともに含有する発現プラスミド、ｐＡＥＳ５２を以下のように作製した。
【００７４】
アンゴラマイシン糖生合成遺伝子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から入手したＳ．ユーリセルムス（Ｓ．ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）ＡＴＣＣ２３９５６株のコスミドライブラリから増幅させた。生合成遺伝子クラスター配列は、ＥＵ０３８２７２、ＥＵ２２０２８８及びＥＵ２３２６９３として寄託された（Ｓｃｈｅｌｌら、２００８）。
【００７５】
生合成遺伝子カセットを前述のようにベクターｐＳＧ１４４において構築し（Ｓｃｈｅｌｌら、２００８，ＥＳＩ）、糖生合成に必要な８個が得られるまで連続遺伝子を追加し、プラスミドｐＡＥＳ５２を作製した。
【００７６】
ｐＡＥＳ５２を１８Ａ１株に形質転換した（国際公開第２００５０５４２６５号パンフレット）。
【００７７】
Ｓ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）１８Ａ１へのｐＡＥＳ５２の形質変換
標準的方法を使用して、Ｓ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）１８Ａ１に、プロトプラストにより、ｐＡＥＳ５２を形質転換した（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９７）。得られた株はＩＳＯＭ−４５２２と命名し、２０１７年１月２４日にＮＣＩＭＢにおいて受入番号ＮＣＩＭＢ４２７１８で寄託された。
【００７８】
Ｓ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２の作製（ｐＡＥＳ５４）
ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４  ｐａｃｔＩ／ＩＩＩ発現系（Ｒｏｗｅら、１９９８）とともにａｎｇＡＩ、ａｎｇＡＩＩ、ａｎｇＣＶＩ、ａｎｇ−ｏｒｆ１４、ａｎｇＭＩＩＩ、ａｎｇＢ、ａｎｇＭＩ及びａｎｇＭＩＩを含有する発現プラスミド、ｐＡＥＳ５４を以下のように作製した。
【００７９】
アンゴラマイシン糖生合成遺伝子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から入手したＳ．ユーリセルムス（Ｓ．ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）ＡＴＣＣ２３９５６株のコスミドライブラリから増幅させた。生合成遺伝子クラスター配列は、ＥＵ０３８２７２、ＥＵ２２０２８８及びＥＵ２３２６９３として寄託された（Ｓｃｈｅｌｌら、２００８）。
【００８０】
生合成遺伝子カセットを前述のようにベクターｐＳＧ１４４において構築し（Ｓｃｈｅｌｌら、２００８，ＥＳＩ）、糖生合成に必要な８個が得られるまで連続遺伝子を追加し、プラスミドｐＡＥＳ５２を作製した。
【００８１】
プラスミドｐＡＥＳ５４は、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４  ｐａｃｔＩ／ＩＩＩプロモーター系を含有する１１，５４１ｂｐ  ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片を連結することによって作製され、ｐＧＰ９からの５，０８７ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片とともに、８個のａｎｇ遺伝子がｐＡＥＳ５２から切り出され、これは、アプラマイシン耐性遺伝子、ｏｒｉＣ、放線菌における移入のためのｏｒｉＴ及び統合型形質転換のためのａｔｔＰ部位を有するｐｈｉＢＴ１インテグラーゼを含有する。（適合性のＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位をライゲーション中に削除した。）
【００８２】
次に、ｐＡＥＳ５４をＳ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２に形質転換した（Ｇａｉｓｓｅｒら、２０００，国際公開第２００５０５４２６５号パンフレット）。
【００８３】
Ｓ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２へのｐＡＥＳ５４の形質転換
標準的方法を使用して接合によりＳ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２にｐＡＥＳ５４を移入した。簡潔に述べると、標準的な手順を介してＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＴ１２５６７  ｐＵＺ８００２に対してｐＡＥＳ５４で形質転換を行い、アプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３３μｇ／ｍＬ）選択で２ＴＹ上に広げた。このプレートを３７℃で一晩温置した。これ由来のコロニーを使用して、新鮮な液体２ＴＹ培養物を用意し、これを対数期後期に達するまで３７℃で温置した。細胞を回収し、洗浄し、Ｓ．エリスレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２の胞子と混合し、Ｒ６のプレート上に広げ、２８℃で温置した。２４時間後、これらのプレートに３ｍｇアプラマイシン及び２．５ｍｇナリジクス酸を含有する１ｍＬの滅菌水を重ね、２８℃でさらに５〜７日間温置した。このプレート上の接合完了体を、アプラマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＲ６の新鮮なプレートに移した。
【００８４】
代替的な生体内変換株
あるいは、ＢＩＯＴ−２９４５（Ｓｃｈｅｌｌら、２００８）を生体内変換株として使用し得るが、それは、これによってもまたアンゴロサミンがエリスロノリドに付加されるからである。
【００８５】
アジスロマイシンアグリコンの生体内変換
ＳＶ２培地（４０ｍＬ）及び８μＬチオストレプトン（２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するエーレンマイヤーフラスコ（２５０ｍＬ）に、ＩＳＯＭ−４５２２株の胞子ストック０．２ｍＬを接種し、３０℃で温置し、２．５ｃｍスロー（ｔｈｒｏｗ）を用いて３００ｒｐｍで４８時間振盪した。
【００８６】
【表１】
2020508305.tif 000005
【００８７】
ＥｒｙＰＰ培地（７ｍＬ）を含有する無菌のバンジされた（ｂｕｎｇｅｄ）ファルコンチューブ（５０ｍＬ）を準備し、抗生物質不含の種フラスコからの培養物（ファルコンチューブあたり０．５ｍＬ）を接種した。ファルコンチューブを３０℃で温置し、２４時間２．５ｃｍスロー（ｔｈｒｏｗ）を用いて３００ｒｐｍで振盪した。
【００８８】
【表２】
2020508305.tif 000006
【００８９】
２４時間後、アジスロマイシンアグリコン（ＤＭＳＯ中０．５ｍＭ、５０μＬ）を各ファルコンチューブに添加し、さらに６日間、２．５ｃｍスロー（ｔｈｒｏｗ）を用いて３００ｒｐｍで温置を続けた。
【００９０】
化合物１の単離
全ブロスをｐＨ９．５に調整し、１体積の酢酸エチルで２回抽出した。遠心分離（３，５００ｒｐｍ、２５分）後、吸引により有機層を回収した。有機層を合わせ、真空下で減量したところ、化合物１を含有した茶色のゴム状物質が出現した。この抽出物を酢酸エチル（２００ｍＬ）と塩化アンモニウム水溶液（２０ｍＬの５０％濃縮溶液）との間で分配した。分離後、有機層をさらなる体積（２００ｍＬ）の塩化アンモニウム水溶液で抽出した。次に、合わせた水層を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、次いで１体積当量の酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、真空下で減量して茶色の固形物を得た。次に、この抽出物をシリカカラムに適用し、次のもので段階的に（５００ｍＬロットで）溶出した。
【表３】
2020508305.tif 000007
【００９１】
化合物１は主にＦ及びＧにあった。これらの溶媒を合わせ、真空下で減量し、化合物１を含有する茶色の固形物を得た。次に、この物質を分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８  Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸカラム、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、溶媒として２０ｍＭ酢酸アンモニウム及びアセトニトリル使用）により精製した。標的化合物を含有する分画をプールし、乾固させ、その後Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジ上で脱塩した。
【００９２】
例２
直接的な抗菌活性の評価
最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイを使用して、一般的な腸内細菌（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）及びビフィドバクテリウム・ロングム亜種インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）及び一般的な哺乳類の皮膚分離株ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）の４種類の菌株に対するマクロライド化合物の生物学的活性を評価した。ＮＣＩＭＢから入手したＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）を除き、ＤＳＭＺ（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から細菌株を購入し、−８０℃にて２０％グリセロール中で保存した。陽性対照（アジスロマイシン及びエリスロマイシン）及び試験化合物１及び２の保存溶液（１００％ＤＭＳＯ）をブロス中で希釈して、２５６μｇ／ｍＬの作業用ストック濃度にした（最終アッセイ試験濃度は１２８μｇ／ｍＬ〜０．００３９１μｇ／ｍＬの範囲）。全ての他の化合物の保存溶液をブロス中で希釈して、１２８μｇ／ｍＬの作業用ストック濃度にした（最終アッセイ試験濃度は６４μｇ／ｍＬ〜０．００１９５μｇ／ｍＬの範囲）。３７℃にて好気的に温置したＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）を除き、細菌株を３７℃にて嫌気性チャンバーにおいて適切なブロス中で培養した。１８時間培養物をブロス中でＯＤ５９５が０．１になるように希釈し、次いでさらに１：１０希釈した。９６ウェルプレートにおいて、二つ組で、試験化合物の２００μＬの作業用ストックをウェル１に移し、ブロス中で連続希釈（１：２）した。１００μＬの細菌懸濁液を各ウェルに分注し、完全に混合した。適切な無菌対照を含め、プレートを嫌気性チャンバー中で、又は好気的に（Ｍ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ））３７℃で１８時間温置した。ＭＩＣは、目に見える増殖がない最初のウェル中の試験化合物の濃度であるものとした。
【表４】
2020508305.tif 000008
【００９３】
表１で示されるデータから見られ得るように、化合物１、は、試験した菌株の何れに対しても抗菌活性を示さないが、一方でエリスロマイシン及びアジスロマイシンは、多くの株に対して強力な活性を示す。
【００９４】
例３
免疫刺激活性の評価
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離で健常ドナーから精製した。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で細胞を培養した。組織培養プレート中の化合物１及び２の濃度を上昇させ、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間（試験１〜４）又は４８時間〜１週間（試験５）、細胞を刺激した。細胞をプレートから取り出し、ＰＢＳで洗浄し、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのモノクローナル抗体及びＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーで、細胞特異的表面マーカー及びＭＨＣクラスＩの発現について分析した。
【００９５】
完全ＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、２．５μＭの化合物１及び１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに４８時間及び７日間温置した後、上清ＩＬ−１０を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ（抗体は全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）で測定した。
【００９６】
試験１：１μＭ化合物１による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２４時間のインビトロ刺激後（図１）、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞において活性化マーカーＣＤ６９が上方制御された（図２）。
【００９７】
試験２：発明者らは、Ｔ細胞及びＢ細胞における分子ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）の上方制御も観察し（図３）、このことから、ウイルス抗原の抗原提示における影響が示された。
【００９８】
試験３：化合物１によるＰＢＭＣの刺激は、単球における、共刺激分子ＣＤ８０ならびに抗原提示分子ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の上方制御につながった（図４）。
【００９９】
試験４：マクロファージに分化した単球は、化合物１による刺激に応答してＣＤ８０も上方制御した（図５）。
【０１００】
試験５：４８時間及び７日間、化合物１で刺激したＰＢＭＣは、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定して、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生増加を伴うサイトカインプロファイル変化を発現した。これは、ある一定の条件下での免疫抑制効果を示す（図６）。
【０１０１】
試験６：ＰＢＭＣを化合物１で刺激し、ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にてＲＰＭＩ培地中で６日間培養した。フローサイトメトリーにより増殖を測定した。化合物１の免疫学的効果を分析したところ、Ｔ細胞のサイトカイン推進性の増殖プロファイルの変化が明らかになった（図７）。
【０１０２】
試験７：ＣＭＶウイルス特異的Ｔ細胞増殖も化合物１により影響を受けた。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原及び化合物１の存在下で６日間にわたり培養したＣＭＶ感染ドナー由来のＰＢＭＣは、フローサイトメトリーで測定して、ＩＬ−７受容体α（ＣＤ１２７）の発現増加とともに、活性化ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型の変化を示した（図８）。ＣＤ１２７はＴ細胞のホメオスタシス、分化及び機能に非常に重要であり、発現の低下はＨＩＶ及び他の慢性ウイルス性疾患の重症度と相関する（Ｃｒａｗｌｅｙら、Ｓｅｍ  Ｉｍｍ  ２０１２）。
【０１０３】
見られ得るように、化合物１は、抗原提示、共刺激及びＴ細胞活性化及び増殖に影響を与えることにより、免疫応答を特異的に活性化及び修飾するという驚くべき能力を有する。これらの研究の多くにおいて、化合物２、（化合物２０として）以前にＳｃｈｅｌｌら２００８で発表された、グリコシル化が変化した別の関連マクロライドエリスロマイシン類似体が含まれ、本アッセイでは活性を殆ど又は全く示さなかった。
【０１０４】
試験８：未処理であるか又は化合物１もしくは化合物２に３日間曝露したかのいずれかでの、ＣＭＶ抗原の存在下で培養したＣＭＶ感染ドナーからのＰＢＭＣ。化合物１への曝露は、高レベルのＩＦＮ−γの分泌を誘導したが、一方で抗原培養単独又は化合物２と合わせられた抗原は、ＩＦＮ−γ分泌を誘導しなかった（図９）。
【０１０５】
試験９：化合物１又は２に４８時間曝露した、健常ドナーからのマクロファージ。化合物１に曝露されたマクロファージのみがＩＦＮ−γを分泌し、一方で未処理マクロファージ及び化合物２に曝露したマクロファージはＩＦＮ−γを分泌しなかった（図１０）。したがって、化合物１は、健常ドナーからのマクロファージにおいＩＦＮ−γ分泌を誘導可能である。
【０１０６】
試験１０：化合物１又は２に２日間にわたり曝露したＰＢＭＣ及びマクロファージ（図１１）。ＰＢＭＣでのＲＡＮＴＥＳの基底発現は、化合物２による影響を受けなかったが、一方で化合物１は発現の２倍の上方制御を誘導した。ＲＡＮＴＥＳの発現はマクロファージではごく僅かであり、化合物１は高発現を誘導した。
【０１０７】
試験１１：化合物１及び２に２日間にわたり曝露したＰＢＭＣ及びマクロファージ。ＰＢＭＣ及びマクロファージは化合物１に応答してＩＬ−１２ｐ７０を分泌したが、一方で化合物２は未処理細胞を超える分泌を誘導できなかった（図１２）。
【０１０８】
試験１２：化合物１及び２に２日間にわたり曝露したＰＢＭＣ、マクロファージ及びＣＤ４＋Ｔ細胞。ＩＬ−１β分泌は、化合物１により、マクロファージでは増加し、ＰＢＭＣでは僅かに増加し、一方でＣＤ４＋Ｔ細胞ではＩＬ−１βは誘導されなかった（図１３）。
【０１０９】
試験１３：０．１６５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで化合物１をＣ５７ｂｌ／６マウスにｉ．ｖ．投与した。同じ群中の体重と同様に（示さない。）、５ｍｇ／ｋｇの最大用量を投与した動物ではＣＤ２５＋細胞の量が増加した（図１４）。
【０１１０】
試験１４：化合物１又は２をＣ５７ｂｌ／６マウスにｉ．ｖ．投与した。２４時間後、脾臓を摘出し、ＣＤ１１ｂ＋脾臓細胞でのＭＨＣクラスＩ発現を評価したところ、化合物１は、高いＭＨＣ  Ｉ発現を伴う脾臓細胞の増加を誘導したが、一方で化合物２を注射したマウスからの脾臓細胞では効果は観察されなかった。
【０１１１】
例４
ＴＬＲ２に対する活性の評価
ＴＬＲ２受容体の刺激について測定したＴＬＲ２レポーターアッセイ（一般的な方法を参照）を使用して、化合物を試験した。刺激効果は、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の放出による陰性対照と比較した場合の光学密度の上昇（ＯＤ）として測定し、表２で示す。
【表５】
2020508305.tif 000009
【０１１２】
見られ得るように、化合物１は５μＭまで下げた濃度でＴＬＲ２を刺激し、一方、エリスロマイシンＡ、アジスロマイシンならびに化合物２及び３、（化合物１７及び２０として）Ｓｃｈｅｌｌら、２００８年で以前発表されたグリコシル化が変化した関連マクロライドエリスロマイシン類似体は、２０μＭまでの濃度で刺激を殆ど又は全く示さなかった。
【０１１３】
例５
ｃａｃｏ−２透過性の評価
標準的なｃａｃｏ−２双方向透過性アッセイ（一般的な方法を参照）を使用して、化合物を試験した。生成されたデータを表３で示す。
【表６】
2020508305.tif 000010
【０１１４】
表３のデータから見られ得るように、化合物１は、アジスロマイシン及びＥＭ７０３の両方よりも、細胞透過性が高く、流出率が低い（例えば欧州特許第１３５０５１０号明細書を参照）。
【０１１５】
例６
代謝安定性の評価
本発明の化合物の代謝安定性を標準的なヒトミクロソーム安定性アッセイにおいて評価した（一般的な方法を参照）。半減期が長い化合物ほど、投与後の半減期が長くなることが予想され、これは投与頻度を減少させるのに有用であり得る。半減期が短い化合物ほど、活性物質が患者の系に入ると急速に分解する「ソフトドラッグ」としての使用に有用であり得る。評価した化合物の半減期は、以下の表４で示す：
【表７】
2020508305.tif 000011
【０１１６】
参考文献
2020508305.tif 000012
2020508305.tif 000013
【０１１７】
特許及び特許出願を含む本出願において言及される全ての参考文献は、可能な限り最大限に参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列表１  ＜２２３＞ＡｎｇＭＩＩ
配列表２  ＜２２３＞ＡｎｇＭＩＩＩ
【０１１９】
2020508305.tif 000014
【図１】
2020508305.tif 000017
【図２】
2020508305.tif 000018
【図３】
2020508305.tif 000019
【図４】
2020508305.tif 000020
【図５】
2020508305.tif 000021
【図６】
2020508305.tif 000022
【図７】
2020508305.tif 000023
【図８−１】
2020508305.tif 000024
【図８−２】
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【図９】
2020508305.tif 000026
【図１０】
2020508305.tif 000027
【図１１】
2020508305.tif 000028
【図１２】
2020508305.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
2020508305.tif 000031
【図１５】
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【配列表】
2020508305000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月19日(2018.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2020508305.tif 000033
又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３】
医学において使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
細胞内感染の処置での使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
細胞内感染が、細胞内細菌、細胞内原虫及び細胞内真菌感染から選択される、請求項４に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
細胞内感染が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリアが引き起こす非定型疾患、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）及びＭ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体又はＭＡＣとしても知られる）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴルジナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｉｎａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ゲニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｕ．パルブム（Ｕ．ｐａｒｖｕｍ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）により引き起こされる細胞内細菌感染から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
細胞内感染が、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ビバクス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）及びリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）によって引き起こされる細胞内原虫感染から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
細胞内感染が、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びエンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）によって引き起こされる細胞内真菌感染から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
細胞内感染により引き起こされる疾患の処置又は予防を必要とするヒト又は動物対象に、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を投与することを含む、細胞内感染により引き起こされる疾患を処置又は予防するための方法。
【請求項１０】
３−ヒドロキシル位置でグリコシル化する生体内変換株の培養物への、式（ＩＩ）
【化２】
2020508305.tif 000034
のアグリコンの添加を含み、前記生体内変換株が、ＡｎｇＭＩＩ（配列番号１）又はＡｎｇＭＩＩＩ（配列番号２）に対して７０％以上の相同性を有するグリコシルトランスフェラーゼを発現する、請求項１に記載の化合物を調製するための方法。
【国際調査報告】
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