(57)【要約】  本発明は、ピペルロングミン化合物、例えばピペルロングミン並びにその類似体、誘導体及びプロドラッグが、一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）の可逆的アロステリックアンタゴニストであるという知見に関する。ピペルロングミン化合物を使用するＴＲＰＶ２発現を特徴とする病状を治療する方法及びそのような治療に使用されるピペルロングミン化合物が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）発現を特徴とする癌を治療する方法であって、それを必要とする患者にピペルロングミン化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ピペルロングミン化合物は、ＴＲＰＶ２の可逆的アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ピペルロングミン化合物は、ピペルロングミン、又はその類似体、誘導体若しくはプロドラッグである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ピペルロングミン化合物は、式１：
【化１】
2020535125.tif 000007
（式中、
Ｑ１は、Ｏ又はＳであり、
−Ａｒは、任意に置換されたアリール基であり、
−Ｄ−は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−及び−ＣＨ（ＳＨ）−から選択され、かつ、
−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は−Ｒ１及び−Ｒ２は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される）、並びにその塩、溶媒和物及び保護形を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｑ１はＯである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
−Ｄ−は、−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｓ）−、例えば−Ｃ（Ｏ）−である、請求項３又は５に記載の方法。
【請求項７】
−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環、例えばヘテロ環式環を形成する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘテロ環式環は、部分的に不飽和である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
−Ｄ−は、−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｓ）−であり、前記不飽和は−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｓ）−と共役している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘテロ環式環は、単環、例えば４員環〜９員環、例えば４員環〜６員環、例えば５員環又は６員環、例えば６員環である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、α，β−不飽和δ−ラクタムを形成し、例えば−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、５，６−ジヒドロピリジン−２−オン−１−イルである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ａｒ−は、任意に置換されたカルボアリール基、例えばフェニル、又は任意に置換されたヘテロアリール基、例えばピリジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル及びピロリルである、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ａｒ−は、任意に置換されたフェニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ａｒ−は、ハロゲン、シアノ、−ＲＳ１、−ＯＨ、−ＯＲＳ１、−ＳＨ、−ＳＲＳ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲＳ１、−ＮＲＳ１ＲＳ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲＳ１、−ＣＯＮＲＳ１ＲＳ２、−ＮＨＣＯＲＳ１、−Ｎ（ＲＳ１）ＣＯＲＳ１から選択される１個以上の基、例えば１個、２個又は３個の基で任意に置換されたアリール基であり、ここで、各−ＲＳ１及び各−ＲＳ２は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルであり、それらは任意にハロゲンで置換されている、又は−ＲＳ１及び−ＲＳ２は一緒になってヘテロ環式環を形成し得る、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ａｒ−は、−ＯＨ、−ＯＲＳ１、−ＳＨ及び−ＳＲＳ１、例えば−ＳＲＳ１及び−ＯＲＳ１、例えば−ＯＲＳ１から選択される１個以上の基、例えば１個、２個又は３個の基で任意に置換されたアリール基である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａｒ−は、トリアルコキシフェニル、例えばトリメトキシフェニルである、請求項４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピペルロングミン化合物は、ピペルロングミンである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者は、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有する又はそのリスクがあると以前に特定されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与の前に、前記患者を、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有する又はそのリスクがあると特定することを更に含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者における１つ以上の癌細胞は、コントロール細胞に対して高められたＴＲＰＶ２発現を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者における１つ以上の癌細胞中でのＴＲＰＶ２発現は、予め決められた閾値より大きい、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
癌は、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、脳癌又は血液癌である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記脳癌は、神経膠芽細胞腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経膠芽細胞腫は、原発性又は再発性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、転移性癌である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ピペルロングミン化合物は、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の治療剤は、抗癌化合物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗癌化合物は、アントラサイクリン、シタラビン、ビンクリスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、フィブロムン、ダカルバジン、メトトレキサート及び６−メルカプトプリン、クロラムブシル、アルキル化剤、シクロホスファミド、コルチコステロイド類、イマチニブ、クラドリビン、ペントスタチン、リツキシマブ、クロラムブシル、タキサン及びドキソルビシンから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ピペルロングミン化合物は、放射線照射と組み合わせて投与される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ピペルロングミン化合物は、ヒドロゲル中に封入されている、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒドロゲルはシクロデキストリンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）発現を特徴とする癌を治療する方法で使用されるピペルロングミン化合物。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）発現を特徴とする癌を治療する方法で使用される医薬の製造におけるピペルロングミン化合物の使用。
【請求項３４】
前記ピペルロングミン化合物は、シクロデキストリン中に封入されている、請求項３２に記載の使用のためのピペルロングミン化合物又は請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記封入されたピペルロングミン化合物は、ヒドロゲル中に含まれている、請求項３４に記載の使用のためのピペルロングミン化合物又は使用。
【請求項３６】
ピペルロングミン化合物で治療する癌患者を選択する方法であって、
癌患者から癌細胞の試料を準備することと、
前記癌細胞中のＴＲＰＶ２発現の存在を測定することと、
ＴＲＰＶ２を発現する癌細胞を有する癌患者を、前記ピペルロングミン化合物で治療するために選択することと、
を含む、方法。
【請求項３７】
癌患者の予後診断の方法であって、
癌患者から癌細胞の試料を準備することと、
前記癌細胞中のＴＲＰＶ２発現のレベルを測定することと、
を含み、前記ＴＲＰＶ２発現のレベルが、前記患者の予後診断の指標となる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピペルロングミン化合物を使用する一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）の阻害に関する。この化合物は、例えば癌の治療において有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
天然物（ＮＰ）、特にそれらのフラグメント様の（fragment-like）サブセットは、創薬のための優れた起点及び生物学的システムの調査のための探針となる１〜４。それらの生物学的に事前に検証されたアーキテクチャはしばしば、合成経路が困難であることを踏まえて、完全に合成された化学物質により網羅されない又は僅かしか活用されない分子骨格を含む５。さらに、ＮＰに関する標的受容体の実際の知識は限定的に留まり、ケミカルバイオロジー及び分子医学における天然物から発想を得た分子設計のための合理的なアプローチの展開を厳しく妨げる６。
【０００３】
リガンド中心のインフォマティクスは、表現型アッセイのリードアウトを巨大分子レベルにデコンボリューションするのに実行可能な基盤を提供する。特に、「ファジー」なファーマコフォア記述子を用いたツールは、ＮＰ空間における脱オーファン化及び標的同定に有用であることが証明されている７〜１０。強力な抗癌剤１１及びＴＲＰモジュレーター１２〜１４である（−）−エングレリンＡは、最近ではＣａｖ１．２アンタゴニストであることが報告されている１５。
【０００４】
ピペルロングミンが選択的抗癌剤として開示されて以来、ピペルロングミンがどの高分子標的に結合するかを発見するために多大な労力が払われてきた１６，１７。これらは最近、ＳＴＡＴ３の直接的な阻害を示す報告で最高潮に達した１８。それでもなお、フラグメント様のＮＰが多重の標的に結合することから、結果として複雑な多重薬理学ネットワークがもたらされることが示されている２，９。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、フラグメント様の抗癌アルカロイドであるピペルロングミン（１、図１Ａ）が、一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）の選択的アロステリックアンタゴニストであり、ピペルロングミンの抗癌活性が癌細胞におけるＴＲＰＶ２の発現と相関していることを見出した。
【０００６】
本発明の一態様は、一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）発現を特徴とする癌を治療する方法であって、それを必要とする患者にピペルロングミン化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【０００７】
好ましいピペルロングミン化合物は、ピペルロングミン、並びにその類似体、誘導体及びプロドラッグを含む。
【０００８】
ピペルロングミン化合物は、式１：
【化１】
2020535125.tif 000003
（式中、
Ｑ１は、Ｏ又はＳであり、
−Ａｒは、任意に置換されたアリール基であり、
−Ｄ−は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−及び−ＣＨ（ＳＨ）−から選択され、かつ、
−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は−Ｒ１及び−Ｒ２は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される）並びにその塩、溶媒和物及び保護形を有することができる。
【０００９】
本発明の別の態様は、一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）発現を特徴とする癌を治療する方法で使用されるピペルロングミン化合物を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）発現を特徴とする癌を治療する方法で使用される医薬の製造におけるピペルロングミン化合物の使用を提供する。
【００１１】
本発明の態様及び実施形態を、以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ピペルロングミン（１）及び（−）−エングレリンＡ（２）の構造並びに相互の標的結合の関係を示す図である。
【図１Ｂ】ピペルロングミンの癌細胞に対する効果を示す略図である。
【図２】ピペルロングミン（１）がＴＲＰＶ２を調節することを示す図である。ａ）蛍光ベースのアッセイを使用した、ＴＲＰＶ２に対する１の濃度応答曲線。ＩＣ５０＝４．６±０．１３対数単位、ｎ＝２；コントロール：トラニラスト、ＩＣ５０＝２．３±０．２５対数単位、ｎ＝２。ｂ）ＨｅｐＧ２細胞（０．５％ＤＭＳＯ）における１（５μＭ）によるカンナビジオール（ＣＢＤ、２０μＭ）に誘発されるカルシウム流入の阻害。定量化のために、各ウェル（ｎ＝３５個〜４５個の細胞）において最も応答の強い５個の細胞を分析して、ベースラインに正規化した。最も応答の強い５個の細胞の平均が記述されている。＊＊一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーのＨＳＤ事後検定：刺激１２０秒後でのコントロールと１との間の有意差（ｐ＜０．０１）及びコントロールとトラニラストとの間の有意差（ｐ＜０．０１）。１とトラニラストとの間に有意差なし。ｃ）ＨｅｐＧ２細胞（０．５％ＤＭＳＯ）における１（５μＭ）によるＣＢＤ（４μＭ）に誘発されるカルシウム流入の阻害。全ての試料の間で統計学的有意差は観察されない。ｄ）ＨＥＫ２９３細胞（０．５％ＤＭＳＯ）における１（５μＭ）によるＣＢＤ（４μＭ）に誘発されるカルシウム流入の阻害。ネガティブコントロール：ＣＢＤ（４μＭ）で刺激されたトランスフェクションされていないＨＥＫ２９３。定量化のために、１ウェル当たりの最も強い１０個のレスポンダーを分析し、ベースラインに正規化した（トランスフェクションされた細胞：ｎ＝７０〜８０、トランスフェクションされていない細胞：ｎ＝２０）。最も応答の強い１０個の細胞の平均が記述されている。＊＊一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーのＨＳＤ事後検定：刺激３００秒後でのコントロールと１との間の有意差（ｐ＜０．００１）、コントロールとトランスフェクションされていないＨＥＫ２９３細胞との間の有意差（ｐ＜０．００１）及びトランスフェクションされていないＨＥＫ２９３細胞と１との間の有意差（ｐ＜０．００１）。ｅ）ベースラインレベルに補正されたヒトＴＲＰＶ２−ＲＦＰ融合タンパク質でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３のカルシウムイメージング。ｆ）４μＭのＣＢＤ刺激の５分後のカルシウムレベル（カラーコード−青＝低カルシウムレベル、緑＝中カルシウムレベル、黄＝中高カルシウムレベル、赤＝高カルシウムレベル）。トランスフェクションされていない細胞はドットにより示される。人為結果（例えば、カルシウム振動）を示す細胞は矢印により示される。トランスフェクションされていない細胞は、強いカルシウム流入を示さない。ｇ）正方形で示された最も応答の強い１０個の細胞は、ＴＲＰＶ２−ＲＦＰを中レベルで発現する。ｈ）人工的に増強されたＲＦＰシグナル：選択された１０個の細胞全てがＴＲＰＶ２−ＲＦＰを発現する。ｉ）パッチクランプアッセイを使用したＴＲＰＶ２に対する１の濃度応答曲線。ＩＣ５０＝１μＭ±０．５２対数単位、ｎ＝２、刺激：４μＭのＣＢＤ。ｊ）パッチクランプアッセイを使用したＴＲＰＶ２に対する１の濃度応答曲線。ＩＣ５０＞１００μＭ、ｎ＝２、刺激：１０μＭのＣＢＤ。
【図３】ピペルロングミン（１）が選択的ヒトＴＲＰＶ２アロステリックアンタゴニストであることを示す図である。ａ）カンナビジオール（ＣＢＤ）活性化（４μＭ）ヒトＴＲＰＶ２電流に対する１（１００μＭ）の阻害効果を示す例示的なパッチクランプ経時変化トレース。１のウォッシュアウトが達成され、完全なＴＲＰＶ２活性が回復し得る；ｎ＝２。ｂ）薬物ウォッシュアウト実験の正規化された応答。ｃ）１の濃度を増加させた場合のＣＢＤについてのＥＣ５０プロット。ｄ）１のミカエリス・メンテン分析。ｅ）１についてのシルトプロット。
【図４】ＮＣＩ−６０スクリーニング及びバイオインフォマティクス分析を示す図である。ａ）組織起源によりグループ分けされたＮＣＩ−６０癌細胞系統全体にわたるピペルロングミン（１）のＧＩ５０値（−ｚスコア）の分布。水平の破線はパネル平均を表す。ｂ）組織起源によりグループ分けされたＮＣＩ−６０癌細胞系統全体にわたる１のＩＣ５０値（−ｚスコア）の分布。水平の破線はパネル平均を表す。ｃ）ＮＣＩ−６０パネル全体にわたる１のＧＩ５０（−ｚスコア）に応じたＴＲＰＶ２のｍＲＮＡ転写レベル（対数強度）。ＴＲＰＶ２を発現する細胞系統は、１に対してより感受性が高い（スピアマンの相関係数（ρ）＝０．２８、ｐ＜０．０５）。ｄ）ＮＣＩ−６０パネル全体にわたる１のＩＣ５０（−ｚスコア）に応じたＴＲＰＶ２のｍＲＮＡ転写レベル（対数強度）。ＴＲＰＶ２を発現する細胞系統は、１に対してより感受性が高い（ρ＝０．２９、ｐ＜０．０５）。ｅ）１の活性と相関した遺伝子の遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）。ＧＳＥＡ分析は、スピアマンの相関係数に従ってランク付けされた遺伝子に対して実行した。偽発見率が５％未満である、４１個の遺伝子セットが有意であるとみなされた。１の活性と正に相関した（暗灰色）及び負に相関した（明灰色）上位１０個の遺伝子セットが示されている。
【図５】ＨｅｐＧ２細胞を用いた創傷治癒アッセイを示す図である。ａ）ピペルロングミン（１）は、５μＭの濃度でＣａ２＋依存的に癌細胞の遊走を阻害する。Ｃ−０．５％のＤＭＳＯコントロール、Ｔｒ−トラニラスト（１０μＭ）。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。Ｃ：ｎ＝５〜７、１：ｎ＝１３〜１７、Ｔｒ：ｎ＝４〜６。ＤＭＳＯコントロールの間に有意差は見られなかった。ｂ）スクラッチの例示的画像（４０倍率）。ｃ）構成的なＴＲＰＶ２発現を示すＨｅｐＧ２細胞の蛍光支援細胞選別データ。赤：染色されていないコントロール（平均蛍光強度、ＭＦＩ＝５）、青：二次抗体のみ（ＭＦＩ＝６２）、緑：一次抗体及び二次抗体（ＭＦＩ＝１２６５）。ｄ）細胞遊走に関与する標的についてのＨｅｐＧ２のＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析。試験した１７５個の遺伝子から、ＴＲＰＶ２以上の発現レベルを有する遺伝子が、遺伝子ファミリーごとに色分けされて表されている。垂直の破線はＴＲＰＶ２発現レベルを表す。
【図６】低悪性度神経膠腫及び多形膠芽細胞腫におけるｈＴＲＰＶ２中央値発現に基づく患者の層別化についての全生存カプラン・マイヤープロットを示す図であり、ＴＲＰＶ２が脳腫瘍の予後マーカーであることが指摘される。生存率の差についてのログランク検定のｐ値が示される。
【図７】ＴＲＰＶ２がヒトびまん性神経膠腫のグリア細胞区画（白い矢印）及び内皮細胞区画（黒い矢印）の両方で発現され、特にＧＢＭの内皮細胞において明らかに異なるレベル及びパターンで発現されることを示す図である。ＧＢＭでの内皮細胞の細胞質膜の強い染色は、グレードＩＩ及びグレードＩＩＩの神経膠腫の内皮における弱い又は陰性の染色と対照的であり、グリア細胞での細胞質の斑点状染色と対照的である。正常な脳（腫瘍辺縁）でのＴＲＰＶ２発現は、神経網（アスタリスク）では細胞外にて散在性で弱く、幾つかのグリア細胞（白い矢印）及びニューロンでは斑点状である。
【図８】図８（左パネル）は、ＴＲＰＶ２が内皮細胞及びミクログリア／マクロファージ脳腫瘍細胞で発現されることを示す。細胞型によりグループ分けされた４つの多形膠芽細胞腫のヒト試料から得られた３５８９個の単一細胞全体にわたるＴＲＰＶ２発現（百万当たりのカウント（ＣＰＭ）のｌｏｇ２）。データは平均±標準誤差として示される。図８（右パネル）は、Ｕ２５１細胞におけるｈＴＲＰＶ２の一過性過剰発現が２４時間後にＰＬ毒性を増加させることを示す。ＤＭＳＯビヒクルで処理されたトランスフェクションされた細胞に対して結果を正規化し、種々のＰＬの濃度でトランスフェクション試薬のみで処理された細胞と比較した。
【図９】ＰＬが負荷されたヒドロゲルを使用したｉｎ  ｖｉｖｏでの多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）の治療のための実験の流れを示す図である。Ｕ２５１細胞を頭蓋内に注射し（ｎ＝５／群）、８日後に生着を生物発光イメージングで確認した。９日目にＰＬが負荷されたヒドロゲル又は負荷されていないヒドロゲルを埋没させた。生物発光イメージングを使用して一定の間隔で腫瘍増殖を評価した。
【図１０】ＰＬが負荷されたヒドロゲル（５０ｍｇ／ｋｇ）又は負荷されていないヒドロゲル（コントロール）で治療されたＵ２５１異種移植マウスの代表的な生物発光画像を示す図である。データは、指数関数的に腫瘍が増殖するコントロールと比較して、ＰＬ治療が２１日間の期間にわたって腫瘍体積を減少させることに成功することを示している。
【図１１】図１１（左パネル）は、ルシフェラーゼ活性によって測定されたＰＬが負荷されたヒドロゲル又は負荷されていないヒドロゲルで治療されたマウスの腫瘍負荷を示す。データは、各時点でのコントロール群の平均腫瘍サイズのパーセンテージとして表現され、群の平均±ＳＥＭを表す。データは、両方の群間の腫瘍負荷の有意差を示している（ｐ＝０．０１５９、ｎ＝５、マン・ホイットニー検定）。図１１（右のパネル）は、ＰＬが負荷されたヒドロゲルで治療されたマウス生存率が、コントロール群と比較して増加したことを示すカプラン・マイヤー生存曲線も示す（ｐ＝０．０４９４、ログランク（マンテル・コックス検定）。生存カットオフ基準には、ヒドロゲル埋没前に各マウスについて測定された当初のサイズと比較して５５４％の腫瘍サイズの増加が含まれていた。
【図１２】原発性ＧＢＭ及び再発性ＧＢＭにおけるＰＧＫ１に対するＴＲＰＶ２の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図１３】原発性ＧＢＭ及び再発性ＧＢＭにおける上位ランクの遺伝子セットの発現（特徴的酸化的リン酸化）についてのヒートマップを示す図である。
【図１４】ＰＰＡＲＧＣ１Ａの相互作用の略図を示す図である。
【図１５】原発性ＧＢＭ及び再発性ＧＢＭにおけるミトコンドリア生合成遺伝子の発現についてのヒートマップを示す図である。
【図１６】ＴＲＰＶ２発現が脳腫瘍の病期につれて増加することを示す図である。ＧＴＥｘ正常及びＴＣＧＡ腫瘍（ＬＧＧグレードＩＩ、ＬＧＧグレードＩＩＩ、ＧＢＭにグループ分け）脳試料全体にわたるＴＲＰＶ２発現（ＴＰＭのｌｏｇ２）。黒い点及び線は、中央値±標準偏差を表す。＊＊はｐ値＜０．０１を表し、＊＊＊＊はｐ値＜０．０００１（ウィルコクソン順位和検定）を表す。
【図１７】ＴＲＰＶ２が主に腫瘍微小環境で発現されることを示す図である。ＴＣＧＡのＧＢＭ試料及びＬＧＧ試料全体にわたる、ＴＲＰＶ２発現（ＲＳＥＭのｌｏｇ２）と腫瘍純度との間の負の相関を示す散布図（スピアマンの相関係数、それぞれρ＝−０．３６及び−０．４４７、ｐ＝３．１×１０−１４及び７．５×１０−２５）。青色の局所多項式回帰（ｌｏｅｓｓ）線の周りの灰色の陰は、その９５％の信頼区間を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ピペルロングミン化合物が一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）の可逆的アロステリックアンタゴニストであり、ＴＲＰＶ２発現に関連する病態の治療に有用であり得るという知見に関連する。
【００１４】
ピペルロングミン化合物は、ＴＲＰＶ２を阻害することができ、好ましくは、ＴＲＰＶ２の可逆的アンタゴニストであり得る。ピペルロングミン化合物は、ＴＲＰＶ２の選択的阻害剤であり、ＴＲＰＶ２を他のＴＲＰチャネルよりも大幅に阻害し得る。例えば、ピペルロングミン化合物は、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＶ５、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３又はＴＲＰＣ４の１つ以上、好ましくは全てよりも少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍又は少なくとも１００倍大きなＴＲＰＶ２の阻害を示し得る。
【００１５】
一過性受容体電位バニロイド２チャネル（ＴＲＰＶ２）（ＶＲＬ及びＶＲＬ１としても知られる）は、熱活性化カルシウムチャネルである。ＴＲＰＶ２はヒトＴＲＰＶ２であり得る。ヒトＴＲＰＶ２（遺伝子ＩＤ  ５１３９３）は、ＮＰ＿０５７１９７．２の参照アミノ酸配列を有し、参照ヌクレオチド配列ＮＭ＿０１６１１３．４によってコードされ得る。ＴＲＰＶ２活性を測定し、阻害活性をアッセイするための技術は、本明細書の他の場所に記載されており、Ｆｕｒａ２−ＡＭカルシウムプローブを使用したカンナビジオール誘発性カルシウム流入の測定を含む。
【００１６】
前記ピペルロングミン化合物は、式１：
【化２】
2020535125.tif 000004
（式中、
Ｑ１は、Ｏ又はＳであり、
−Ａｒは、任意に置換されたアリール基であり、
−Ｄ−は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−及び−ＣＨ（ＳＨ）−から選択され、かつ、
−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は−Ｒ１及び−Ｒ２は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される）並びにその塩、溶媒和物及び保護形を有することができる。
【００１７】
基Ｑ１はＯであることが好ましい。
【００１８】
基−Ａｒは、カルボアリール（carboaryl）又はヘテロアリールを含むアリールであり、アリール基は、単一の芳香環又は２つ以上の芳香環を有する縮合系であり得る。
【００１９】
カルボアリール基は、Ｃ６〜１４カルボアリール基、例えばフェニル又はナフチルであり得るが、最も好ましくはフェニルであり得る。
【００２０】
ヘテロアリール基は、Ｃ５〜１４ヘテロアリール基、例えばＣ５〜１０ヘテロアリール基、例えばＣ５〜６ヘテロアリール基、例えばＣ６ヘテロアリール基、例えばピリジニル及びピリミジニル、又はＣ５ヘテロアリール基、例えばフラニル、チオフェニル、及びピロリルであり得る。
【００２１】
アリール基は、６個の芳香環原子を有するアリール基、例えばフェニル又はピリジニルであり得る。
【００２２】
好ましくは、−Ａｒはカルボアリールであり、最も好ましくはフェニルである。
【００２３】
アリール基は、例えば１個以上の置換基で任意に置換されていてもよい。任意の置換基は、ハロゲン、シアノ、−ＲＳ１、−ＯＨ、−ＯＲＳ１、−ＳＨ、−ＳＲＳ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲＳ１、−ＮＲＳ１ＲＳ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲＳ１、−ＣＯＮＲＳ１ＲＳ２、−ＮＨＣＯＲＳ１、−Ｎ（ＲＳ１）ＣＯＲＳ１からなる群から選択されてもよく、ここで、各−ＲＳ１及び各−ＲＳ２は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキルであり、それらは任意にハロゲン、例えばフルオロで置換されている、又は−ＲＳ１及び−ＲＳ２は一緒になってヘテロ環式環を形成し得る。
【００２４】
アリール基は、任意に置換されていてもよく、例えば１個以上の基、例えば１個、２個又は３個の基で置換されていてもよい。
【００２５】
アリール基は、−ＯＨ、−ＯＲＳ１、−ＳＨ及び−ＳＲＳ１、例えば−ＳＲＳ１及び−ＯＲＳ１、例えば−ＯＲＳ１から選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【００２６】
各−ＲＳ１及び各−ＲＳ２は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニルから選択され、それらは各々、ハロゲン、例えばフルオロで任意に置換されている。
【００２７】
アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は線状又は分岐状であり得る。
【００２８】
−ＲＳ１又は−ＲＳ２がアルキルである場合に、これはＣ１〜６アルキル、例えばＣ１〜４アルキル、例えばメチル又はエチル、例えばメチルであり得る。
【００２９】
−ＲＳ１又は−ＲＳ２がアルケニルである場合に、これはＣ２〜６アルケニル、例えばＣ２〜４アルキル、例えばビニル又はアリルであり得る。
【００３０】
−ＲＳ１又は−ＲＳ２がアルキニルである場合に、これはＣ２〜６アルキニル、例えばＣ２〜４アルキニル、例えばプロパルギルであり得る。
【００３１】
−ＲＳ１又は−ＲＳ２がアリールである場合に、これはカルボアリール、例えばＣ６〜１０アリール、例えばフェニル、又はヘテロアリール、例えばＣ５〜１４ヘテロアリール基、例えばＣ５〜１０ヘテロアリール基、例えばＣ５〜６ヘテロアリール基、例えばＣ６ヘテロアリール基、例えばピリジニルであり得る。
【００３２】
−ＲＳ１又は−ＲＳ２がアラルキルである場合に、これはＣ１〜６アルケニル基、例えばＣ１〜２アルキレン基、例えばメチレンを介して連結された上記のようなアリール基であり得る。最も好ましいアラルキル基はベンジルである。
【００３３】
−ＲＳ１及び−ＲＳ２が一緒になってヘテロ環式環を形成する場合に、これはＣ５〜７ヘテロ環式環であり、ヘテロ環式環は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から選択される更なる環ヘテロ原子を任意に含み得る。
【００３４】
−Ａｒが６員のアリール基である場合に、これは３位、４位及び５位の１つ以上で置換されていてもよい。ここで、２位及び６位は非置換であってもよい。１つの実施形態では、３位、４位及び５位の２つ又はそれぞれが置換されている。ここで、アリール基の連結点が１位と解釈される。
【００３５】
基−Ａｒは、トリアルコキシフェニル、例えば３，４，５−トリアルコキシフェニルであり得る。
【００３６】
基−Ａｒは、トリメトキシフェニル、例えば３，４，５−トリメトキシフェニルであり得る。
【００３７】
基−Ｄ−は、好ましくは−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｃ（Ｓ）−から選択され、好ましくは−Ｃ（Ｏ）−である。ここで、基−Ｄ−は、それが結合している窒素及び−Ｃ（Ｑ１）−と一緒になってイミド又はチオイミドを形成する。
【００３８】
基−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する。ヘテロ環式環は単環であってもよく、又は更なる環に縮合された少なくとも１個のヘテロ環式環を有する縮合環系であってもよい。更なる環は、別のヘテロ環式環、シクロアルキル環又はアリール環であってもよい。
【００３９】
好ましくは、ヘテロ環式環は単環であり、別の環に縮合されていない。
【００４０】
前記ヘテロ環式環は、４員環〜９員環、例えば４員環〜６員環、例えば５員環又は６員環、例えば６員環であり得る。
【００４１】
ヘテロ環は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から選択され得る更なる環ヘテロ原子を含み得る。更なるヘテロ原子が存在する場合に、このヘテロ原子は−Ｎ−Ｄ−における窒素原子から少なくとも１個の炭素環原子だけ離れている。典型的には、更なるヘテロ原子は存在せず、残りの環原子は炭素環原子である。
【００４２】
ヘテロ環式環は飽和であってもよく、又は部分的に若しくは完全に不飽和であってもよい。ヘテロ環式環は芳香環であってもよいが、芳香環は好ましくはない。
【００４３】
好ましくは、ヘテロ環式環は部分的に不飽和である。例えば、ヘテロ環式環は、炭素−炭素二重結合である１つの二重結合を含み得る。誤解を避けるために、二重結合はヘテロ環内（すなわち、環内）にある。基−Ｄ−が−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｓ）−である場合に、二重結合が基−Ｄ−と共役していることが好ましい。
【００４４】
ヘテロ環式環は、−Ｄ−が−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｓ）−である場合にラクタムである。ラクタムが好ましい。
【００４５】
ラクタムは、部分的に又は完全に不飽和であってもよい。ラクタムは、α，β−不飽和であってもよく、第２の二重結合が存在する場合に更にγ，δ−不飽和であってもよい。
【００４６】
好ましくは、−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、α，β−不飽和δ−ラクタム（５，６−ジヒドロピリジン−２−オン−１−イル）を形成する。
【００４７】
代替的には、−Ｒ１及び−Ｒ２は、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になって、α，β−不飽和δ−ラクタムを形成する。
【００４８】
−Ｎ−Ｄ−と一緒になって−Ｒ１及び−Ｒ２により形成されるヘテロ環式環は、任意に置換されていてもよく、例えばアルキル又はハロゲン、例えばアルキルで任意に置換されていてもよい。好ましくは、ヘテロ環式環は、更に置換されていない。
【００４９】
代替的には、−Ｒ１及び−Ｒ２のそれぞれは、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び任意に置換されたシクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される。−Ｒ１及び−Ｒ２の一方は水素ではないことが好ましい。例えば、−Ｒ２は水素であり得る一方、−Ｒ１は水素以外である。
【００５０】
−Ｒ１及び−Ｒ２の両方が水素ではなくてもよい。
【００５１】
シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル及びアリール基は、任意にアルキル、例えばＣ１〜６アルキル、例えばメチルで置換され得る。
【００５２】
例えば−Ｒ２が水素である場合に、基−Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり得る。
【００５３】
−Ｒ１又は−Ｒ２がアルキル基である場合に、このアルキル基は、直鎖状又は分岐状のアルキル基、例えばＣ１〜１０アルキル基、例えばＣ１〜６、例えばＣ１〜４アルキル基、例えばＣ１〜２アルキルであり得る。例としては、メチル、エチル及びプロピルが挙げられる。
【００５４】
−Ｒ１又は−Ｒ２がアルケニル基である場合に、このアルケニル基は、１つ以上の、好ましくは１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖状又は分岐状のアルケニル基、例えばＣ２〜１０アルケニル基、例えばＣ２〜６アルケニル基、例えばＣ２〜４アルケニル基であり得る。例としては、ビニル及びアリルが挙げられる。
【００５５】
−Ｒ１又は−Ｒ２がアルキニル基である場合に、このアルキニル基は、１つ以上の、好ましくは１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖状又は分岐状のアルキニル基、例えばＣ２〜１０アルキニル基、例えばＣ２〜６アルキニル基、例えばＣ２〜４アルキニル基であり得る。一つの例はプロパルギルである。
【００５６】
シクロアルキル基に関して、これは、環式アルキル基、例えばＣ３〜７シクロアルキル基、例えばＣ５〜６シクロアルキル基であってもよい。シクロアルキル基は飽和であってもよく、又は部分的に若しくは完全に飽和であってもよいが、芳香族ではない。１つの例はシクロヘキシルである。
【００５７】
−Ｒ１又は−Ｒ２がヘテロアルキル基である場合に、このヘテロアルキル基は、１個又は２個の炭素原子がＯ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から選択されるヘテロ原子と置き換えられているアルキル基であってもよい。ヘテロアルキル基は、線状又は分岐状であってもよく、Ｃ２〜１０ヘテロアルキル基、例えばＣ２〜６ヘテロアルキル基、例えばＣ２〜４ヘテロアルキル基であってもよい。ヘテロアルキル基は、炭素原子又は存在する場合に窒素原子を介して連結され得る。１つの例はメトキシメチルである。
【００５８】
−Ｒ１又は−Ｒ２がヘテロシクリル基である場合に、このヘテロシクリル基は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）からそれぞれ独立して選択される１個又は２個のヘテロ原子を有する環式ヘテロ環式基であってもよい。ヘテロシクリル基は、Ｃ３〜１０ヘテロシクリル基、例えばＣ５〜７ヘテロシクリル基、例えばＣ５〜６ヘテロシクリル基であってもよい。ヘテロ環式基は飽和であってもよく、又は部分的に若しくは完全に飽和であってもよいが、芳香族ではない。ヘテロシクリル基は、炭素環原子又は存在する場合に窒素環原子を介して連結され得る。ヘテロ環式基は、ピロリジニル、モルホリニル及びピペリジニルであってもよい。
【００５９】
−Ｒ１又は−Ｒ２がアリール基である場合に、このアリール基は、カルボアリール又はヘテロアリールであり得る芳香族基であってもよい。カルボアリール基はフェニル又はナフチルであり得る。ヘテロアリール基はＣ５〜１０ヘテロアリール、例えばＣ５〜６ヘテロアリールであり得る。例としては、ピリジニル、イミダゾイル及びチアゾイルが挙げられる。
【００６０】
化合物は、溶媒和物、例えば水和物として提供され得る。
【００６１】
化合物は、例えば、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）官能基又はアミノ（例えば、−ＮＨ−又は−ＮＨ２）官能基が化合物内に存在する場合に、適宜、塩形で提供され得る。
【００６２】
化合物は、適宜、保護形として提供され得る。例えば、アミノ官能基（例えば、−ＮＨ−又は−ＮＨ２）が存在する場合に、このアミノ官能基は、カルバメート基、例えばＢｏｃ基で保護されていてもよく、ヒドロキシル官能基（−ＯＨ）が存在する場合に、このヒドロキシル官能基は、シリル基、例えばＴＢＤＭＳで保護されていてもよい。保護基の使用は当該技術分野でよく知られており、当業者は、必要に応じて他の官能基を保護することができ、必要に応じて他の保護基を使用することができることを十分に理解することができる。
【００６３】
式１の化合物の互変異性体もまた、本発明の範囲内である。
【００６４】
式１の化合物のプロドラッグ形もまた、本発明の範囲内である。例えば、化合物がカルボキシ（−ＣＯＯＨ）官能基又はヒドロキシ（−ＯＨ）官能基を有する場合に、これらの基はエステル形で提供され得る。そのようなエステルは生理学的条件下で不安定である。
【００６５】
ピペルロングミン化合物は、ピペルロングミン又はピペルロングミンの類似体、誘導体若しくはプロドラッグであり得る。ピペルロングミン（ＣＡＳ  ２００６９−０９−０４）は、商業的供給業者から入手することができ、標準的技術を使用して合成することができ、又は標準的方法に従ってヒハツ植物から単離することができる。例えば、Seo et al.（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 5727）は、ピペルロングミン誘導体の調製を記載している。
【００６６】
式１の化合物においては、ピペルロングミンは、Ｑ１がＯであり、−Ａｒが３，４，５−トリメトキシフェニルであり、かつ−Ｒ１及び−Ｒ２が、それらが結合している−Ｎ−Ｄ−と一緒になってα，β−不飽和δ−ラクタム（５，６−ジヒドロピリジン−２−オン−１−イル）を形成する化合物である。
【００６７】
本明細書に記載される治療に適した患者は、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有し得る。本明細書に記載の治療に適した癌は、任意の種類の固形若しくは非固形癌、又は悪性リンパ腫、特に白血病、肉腫、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵癌、腎癌、胃癌及び脳癌であり得る。癌は家族性又は孤発性であり得る。幾つかの好ましい実施形態において、癌は皮膚癌、乳癌、前立腺癌、脳癌、例えば神経膠腫若しくは神経膠芽細胞腫、又は血液癌であり得る。
【００６８】
幾つかの特に好ましい実施形態では、癌は、脳癌、例えば神経膠腫、例えばグレードＩＩの神経膠腫（びまん性星細胞腫又は星状細胞腫）、グレードＩＩＩの神経膠腫（退形成性星細胞腫又は星状細胞腫）又はグレードＩＶの神経膠腫（神経膠芽細胞腫）、例えば多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）であり得る。神経膠腫は、低グレード又は高グレードの神経膠腫であり得る。
【００６９】
神経膠芽細胞腫は、原発性膠芽細胞腫又は再発性膠芽細胞腫であり得る。
【００７０】
癌は、転移性癌であり得る。
【００７１】
ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌は、コントロール細胞に対してＴＲＰＶ２の発現が増加している患者における１つ以上の癌細胞を含み得る。例えば、患者における１以上の癌細胞でのＴＲＰＶ２の発現は、コントロール細胞での発現よりも大きい場合があり、又は予め決められた閾値よりも大きい場合がある。
【００７２】
ＴＲＰＶ２の発現を特徴とする癌は、任意の適切な技術により特定することができる。例えば、患者からの１つ以上の癌細胞でのＴＲＰＶ２の発現を測定することができる。細胞における標的遺伝子の発現を測定するのに適した技術は、当該技術分野でよく知られており、その技術としては、ＰＣＲベースの方法、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎ（商標）若しくはＴａｑＭａｎ（商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ）、マイクロアレイ、マルチアナライトプロファイル試験、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ若しくはスロットブロットアッセイ又はプロテオミクスベースの方法が挙げられる。幾つかの実施形態では、ＴＲＰＶ２の発現を特徴とする癌は、免疫組織化学により特定することができる。
【００７３】
患者は、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有すると以前に特定されていてもよく、又はＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有するリスクがあってもよく、若しくはその癌のリスクがあってもよい。
【００７４】
方法は、投与前に患者がＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有する又はその癌のリスクがあると特定することを含み得る。
【００７５】
上記の治療に適した個体は、哺乳動物、例えば齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えば、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ科（例えば、ウマ）、霊長類、類人猿（例えば、サル又は無尾猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、無尾猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）又はヒトであり得る。
【００７６】
幾つかの好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおいて治療効果を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えば、マウス、霊長類、ブタ、イヌ科又はウサギ科）を使用することができる。
【００７７】
幾つかの実施形態では、個体は、最初の癌治療の後に微小残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。
【００７８】
ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有する個体は、当該技術分野で既知の臨床的標準に従って、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を診断するのに十分な少なくとも１つの特定可能な徴候、症状又は検査所見を示し得る。そのような臨床的標準の例は、医学の教科書、例えばHarrison's Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001に見出すことができる。幾つかの場合に、個体における癌の診断は、個体から得られた体液又は組織の試料中の特定の細胞型（例えば、癌細胞）の特定を含み得る。幾つかの実施形態では、個体は、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌であると以前に特定若しくは診断されていてもよく、又は本発明の方法は、例えば個体においてＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌の指標となる特定可能な徴候、症状若しくは検査所見の存在を測定することにより、個体においてＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を特定若しくは診断することを含み得る。
【００７９】
ピペルロングミン等のピペルロングミン化合物を個体に単独で投与することは可能であるが、その化合物が医薬組成物又は製剤で存在することが好ましい。
【００８０】
医薬組成物は、ピペルロングミン化合物に加えて、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、添加剤、賦形剤、増量剤、緩衝剤、安定剤、防腐剤、滑沢剤又は当業者によく知られる他の材料を含み得る。そのような物質は無毒であるべきであり、活性化合物の効力を妨げるべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、以下で論じられるように、ボーラス、注入、注射又は他の任意の適切な経路によるものであり得る投与経路に依存することとなる。適切な材料は無菌かつパイロジェンフリーであり、適切な等張性及び安定性を備えている。例としては、滅菌生理食塩水（例えば、０．９％ＮａＣｌ）、水、デキストロース、グリセロール、エタノール等又はそれらの組み合わせが挙げられる。該組成物は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような補助物質を更に含有し得る。
【００８１】
適切な担体、添加剤等は、標準的な製剤学テキスト、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見出すことができる。
【００８２】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症なく被験体（例えば、ヒト）の組織との接触に使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物及び／又は剤形に関する。各担体、添加剤等は、製剤の他の成分と適合性があるという意味でも「許容可能」でなければならない。
【００８３】
製剤は、適切には単位剤形で存在してもよく、製薬分野でよく知られたあらゆる方法によって調製されてもよい。そのような方法は、活性化合物を１種以上の補助成分を構成する担体と混ぜる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体若しくは微粉固体担体又はその両方と均一かつ密接に混ぜて、その後に必要に応じて生成物を成形することにより調製される。
【００８４】
製剤は、液体、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、粉剤、カプセル、カシェ剤、丸剤、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏剤、ゲル剤、ペースト、クリーム剤、スプレー、ミスト、フォーム、ローション剤、油、ボーラス、舐剤、又はエアロゾルの形態であり得る。
【００８５】
ピペルロングミン化合物又はピペルロングミン化合物を含む医薬組成物は、限定されるものではないが、経口（例えば、摂取による）及び非経口、例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内、脊髄内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下及び胸骨内を含む注射による投与、デポーの、例えば皮下又は筋肉内での埋没による投与を含む、全身的／末梢的又は所望の作用部位での投与にかかわらず、任意の適切な投与経路によって被験体に投与することができる。通常、投与は経口経路によるものであるが、腹腔内、皮下、経皮、静脈内、鼻腔内、筋肉内又は他の適切な経路等の他の経路は除外されない。
【００８６】
ピペルロングミン化合物を含む医薬組成物は、意図された投与経路に適切な投与単位製剤に製剤化され得る。
【００８７】
経口投与（例えば、摂取による）に適した製剤は、それぞれ予め決められた量の活性化合物を含有するカプセル剤、カシェ剤若しくは錠剤等の個別の単位、粉剤若しくは顆粒剤、水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液、又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョン、ボーラス、舐剤、又はペースト剤として提供され得る。
【００８８】
錠剤は、従来の手段、例えば、任意に１種以上の補助成分と一緒に圧縮又は成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒等の易流動形の活性化合物を、任意に１種以上の結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、アカシア、ソルビトール、トラガカント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤又は賦形剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース、リン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）及び防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、アスコルビン酸）と混合して、適切な機械で圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、適切な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することによって作製することができる。錠剤は、任意にコーティングされてもよく又は刻み目が入れられてもよく、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを所望の放出プロファイルを提供するために様々な比率で使用して、その中の活性化合物の徐放性又は制御放出性をもたらすように製剤化することができる。錠剤には、胃以外の消化管部分での放出をもたらすように腸溶性コーティングを任意に設けることができる。
【００８９】
非経口投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む注射による）に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、安定剤、静菌剤及び製剤を対象のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る水性及び非水性の等張性のパイロジェンフリーの無菌注射液、並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液、並びに化合物が血液成分又は１つ以上の器官を標的化するように設計されたリポソーム又は他の微粒子システムが含まれる。そのような製剤での使用に適した等張性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、溶液中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌである。製剤は、単位投与用又は多回投与用密封容器、例えばアンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水を添加することだけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即席注射溶液及び懸濁液は、無菌粉剤、顆粒剤及び錠剤から調製され得る。製剤は、活性化合物が血液成分又は１つ以上の器官を標的化するように設計されたリポソーム又は他の微粒子システムの形であり得る。
【００９０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるピペルロングミン化合物は、例えば、シクロデキストリン等の環状オリゴ糖に封入され得る。封入されたピペルロングミン化合物は、例えば、手術後の埋没物として使用するためにヒドロゲル中に含まれていてもよい。
【００９１】
任意に、医薬組成物又は製剤中に他の治療剤又は予防剤が含まれていてもよい。
【００９２】
本明細書に記載されるピペルロングミン化合物は、癌、例えばＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌の治療に有用である。
【００９３】
治療は、ヒト又は動物のいずれかの（例えば、獣医学的用途での）幾らかの所望の治療効果、例えば病態の発症又は進行の抑制又は遅延が達成される任意の治療又は療法であってもよく、それには、進行速度の低下、進行速度の停止、転移の抑制、病態の改善、病態の治癒若しくは寛解（部分的又は全体的にかかわらず）、病態の１つ以上の症状及び／又は徴候の予防、遅延、軽減若しくは停止、又は治療をしていない場合に予想されるものを超える被験体若しくは個体の生存延長が含まれる。
【００９４】
癌の増殖とは、一般的に、より発達した形への癌内の変化を示す多数の指標のいずれか１つを指す。したがって、癌の増殖の阻害を測定するための指標には、癌細胞の生存の低下、腫瘍体積又は形態の低下（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査又は他の画像法を使用して測定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型皮膚過敏反応試験における成績向上、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性の増加、及び腫瘍特異抗原のレベルの減少が含まれる。本明細書に記載される癌を有する個体におけるＴＲＰＶ２の阻害は、個体が癌の増殖、特に既に被験体に存在する癌の増殖に抵抗する能力、及び／又は個体が個体における癌の増殖の傾向を減少させる能力を改善し得る。
【００９５】
本明細書に記載される治療には、予防的処置（すなわち、予防）が含まれ得る。すなわち、治療される個体は、治療時にＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌を有しなくても、又はその癌を有すると診断されていなくてもよい。例えば、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌の発生又は再発を受けやすい又はそのリスクがある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。そのような治療は、個体におけるＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌の発生若しくは再発を防止若しくは遅延させることができ、又は発生若しくは再発後のその症状若しくは重症度を軽減することができる。幾つかの実施形態では、個体は、一般集団と比較して、ＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌の感受性若しくはリスクが高まっていると以前に特定されていてもよく、又は方法はＴＲＰＶ２発現を特徴とする癌の感受性若しくはリスクが高まっている個体を特定することを含み得る。幾つかの実施形態では、予防的処置又は防止的処置が好ましい場合がある。
【００９６】
ピペルロングミン化合物は、本明細書に記載されるように、治療的有効量で投与され得る。
【００９７】
本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、合理的な利益／リスク比に見合った、幾らかの所望の治療効果をもたらすのに有効な、活性化合物又は活性化合物を含む組み合わせ物、材料、組成物若しくは剤形の量に関係する。
【００９８】
ピペルロングミン化合物の適切な投与量は、個体によって変動し得る。最適な投与量を決定するには、一般的に、あらゆる投与のリスク又は有害な副作用に対して治療上の利益の水準の釣り合いをとることが必要とされる。選択される投与量レベルは、限定されるものではないが、投与経路、投与時間、活性化合物の排泄速度、組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、並びに個体の年齢、性別、体重、病態、全体的健康及び以前の病歴を含む様々な要因に依存することとなる。一般的に投与量は、実質的な有害又は悪影響のある副作用を引き起こすことなく活性化合物の治療的な血漿濃度を達成することとなるが、活性化合物の量及び投与経路は最終的には医師の裁量に委ねられる。
【００９９】
一般に、活性化合物の適切な用量は、約１００μｇ／キログラム（被験体の体重）／日〜約４００ｍｇ／キログラム（被験体の体重）／日、好ましくは２００μｇ／キログラム（被験体の体重）／日〜約２００ｍｇ／キログラム（被験体の体重）／日の範囲内である。活性化合物が塩、エステル、プロドラッグ等の場合には、投与される量は、親化合物を基準にして計算されるため、使用される実際の重量は比例して増加する。例えば、５０ｍｇ〜１００ｍｇのピペルロングミン化合物が、カプセル剤又は錠剤の形で１日２回経口投与され得る。
【０１００】
ピペルロングミン化合物は、ＴＲＶＰ２の５０％超の阻害をもたらすレベルで血清濃度を維持するのに十分な量で経口投与され得る。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、連続的又は断続的に（例えば、適切な間隔で分割された用量で）１回の用量で行うことができる。
【０１０２】
最も有効な投与手段及び投与用量を決定する方法は当該技術分野でよく知られており、療法に使用される製剤、療法の目的、治療される標的細胞及び治療される被験体によって変化する。単回又は多回投与は、医師により選択される用量レベル及びパターンで行うことができる。
【０１０３】
ピペルロングミン化合物の多回の用量を投与することができ、例えば、２回、３回、４回、５回又は５回を超える用量を投与することができる。ピペルロングミン化合物の投与は、長期間にわたり継続し得る。例えば、ピペルロングミン化合物を用いた治療は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月又は少なくとも２ヶ月にわたり継続され得る。ピペルロングミン化合物による治療は、癌の症状を軽減する又は完全な寛解を達成するために必要である限り継続され得る。
【０１０４】
ピペルロングミン化合物は、個々の状況に応じて、単独で又は他の治療と組み合わせて、同時に又は逐次的に投与され得る。例えば、本明細書に記載されるピペルロングミン化合物は、１種以上の追加の活性化合物と組み合わせて投与され得る。
【０１０５】
ピペルロングミン化合物は、第２の治療剤と組み合わせて投与され得る。
【０１０６】
第２の治療剤は、抗癌化合物であってもよく、例えば、前記抗癌化合物は、アントラサイクリン、シタラビン、ビンクリスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、フィブロムン、ダカルバジン、メトトレキサート及び６−メルカプトプリン、クロラムブシル、アルキル化剤、シクロホスファミド、コルチコステロイド類、イマチニブ、クラドリビン、ペントスタチン、リツキシマブ、クロラムブシル、タキサン及びドキソルビシンから選択される。
【０１０７】
ピペルロングミン化合物は、放射線照射と組み合わせて投与され得る。癌病態の治療のための放射線照射の使用は、当該技術分野でよく知られている。
【０１０８】
ＴＲＰＶ２の発現は、ピペルロングミン化合物による治療に対して反応性（「感受性」）又は非反応性（「耐性」）である可能性が高い癌の特定においても、ピペルロングミン化合物による治療に適した患者の選択のためにも有用であり得る。ピペルロングミン化合物で治療する癌患者を選択する方法は、癌患者から癌細胞の試料を準備することと、前記癌細胞中のＴＲＰＶ２発現の存在又は量を測定することとを含む。
【０１０９】
ＴＲＰＶ２を発現し、閾値を上回るレベルで又はコントロール細胞より高いレベルでＴＲＰＶ２を発現する癌細胞を有する癌患者を、ピペルロングミン化合物による治療のために選択することができる。細胞におけるＴＲＰＶ２の発現の存在又は量を測定するのに適した技術は、当該技術分野でよく知られている。
【０１１０】
患者は、上記の癌、例えば神経膠芽細胞腫等の脳癌を有し得る。
【０１１１】
本発明者らはまた、ＴＲＰＶ２発現と、癌患者、特に神経膠芽細胞腫等の脳癌を有する患者における予後不良（例えば、３年間にわたる５０％未満の生存率）との間の相関関係を特定した。
【０１１２】
本発明の別の態様は、癌患者の予後診断の方法であって、癌患者から癌細胞の試料を準備することと、前記癌細胞中のＴＲＰＶ２発現の量を測定することとを含み、前記ＴＲＰＶ２発現のレベルが、前記患者の予後診断の指標となる、方法を提供する。
【０１１３】
患者は、上記の癌、例えば神経膠芽細胞腫等の脳癌を有し得る。
【０１１４】
癌細胞におけるＴＲＰＶ２の発現量は、任意の適切な技術を使用して測定され得る。
【０１１５】
本発明の他の態様及び実施形態は、「〜を含む」という用語が「〜からなる」という用語に置き換えられた上記態様及び実施形態と、「〜を含む」という用語が「〜から実質的になる」という用語に置き換えられた上記態様及び実施形態とを提供する。
【０１１６】
本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。
【０１１７】
上の実施形態の変形形態、更なる実施形態及びそれらの変形形態は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。
【０１１８】
本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。
【０１２０】
ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として、また上に記載される図面を参照して解説する。
【０１２１】
実験
方法
標的予測
ＳＰｉＤＥＲによる標的予測は、以前に報告２，１１，１４，２０されているように公的に利用可能なウェブサーバ（www.modlab-cadd.ethz.ch/software/spider）において実施した。要するに、ピペルロングミンをＣＯＢＲＡデータベース３１からの参照化合物と一緒に自己組織化マップに投影した。化学構造を、ＣＡＴＳ２３２及びＭＯＥ２Ｄ記述子で記述する前に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ、Chemical Computing Group社、カナダ、モントリオール）の「ｗａｓｈ」機能で処理する。ＣＯＢＲＡにおける参照化合物に対する分子のユークリッド距離を計算することにより、予測が行われる。出力はｐ＜０．０５の信頼水準での標的ファミリーを含む。異なる標的を結合するとアノテーションされた分子間の距離の事前に計算されたバックグラウンド分布に従って、距離をｐ値に変換する。これらのｐ値の算術平均は、標的予測のための信頼スコアとしての役割を果たす。信頼スコアのバックグラウンド分布により、各予測を、予測の統計学的有意性を示す別のｐ値に関連付けることができる１４。
【０１２２】
ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）
ヒト一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルにアノテーションされたリガンドをＣｈＥＭＢＬ２３３３から収集し、先に記載したようにフィルタリングした。ＣＡＴＳ２記述子３２及びＥＣＦＰ４様のＭｏｒｇａｎフィンガープリント（半径２、２０４８ビット）を、ＭＯＥ２０１８（Chemical Computing Group社、カナダ）及びＲＤＫｉｔをそれぞれ用いて、全てのＴＲＰリガンド及びピペルロングミンについて計算した。主成分分析をＣＡＴＳ２記述子及び拡張フィンガープリントについて個別に行った。データ分散の少なくとも８０％を記述する主成分を多様体学習のために保持した。ｔ−ＳＮＥのために、確率解析（１０００回の反復及び６００〜１０００の学習率）に先立って主成分をスケーリングした。解析はＮｕｍＰｙ  １．１３．３、Ｐａｎｄａｓ  ０．２１．０及びＳｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ  ０．１８．１のライブラリを用いてＰｙｔｈｏｎ  ２．７．１３において行った。Ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ  １．５．３を用いてプロットを計算した。
【０１２３】
蛍光細胞ベースのアッセイ
このアッセイは、SB Discovery社（英国、グラスゴー）でフィー・フォー・サービスに基づいて実施した。ヒトＴＲＰ細胞をトリプシン処理し、計数し、そして１００μＬの容量において１ウェル当たり５００００個の細胞の密度で黒い透明底の９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、細胞にｃａｌｃｉｕｍ５色素又は膜電位色素を加えた。ＴＲＰＶ１−５、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ３及びＴＲＰＭ８を、ｃａｌｃｉｕｍ５色素を用いて試験した。ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３−７、ＴＲＰＭ４−５を、膜電位色素を用いて試験した。両方の色素溶液は、ＨＥＰＥＳ緩衝化ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で作製した。色素溶液（９０μＬ）をウェルに加えて、３７℃で１時間インキュベートした。次に、試験化合物及び標準阻害剤（１０μＬ）をウェルに加え、室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎに配置し、１．５２秒ごとに蛍光をモニタリングした。２０秒後にアゴニストを添加し、ｃａｌｃｉｕｍ５色素及び膜電位色素についてそれぞれ４８５ｎｍ／５２５ｎｍ及び５３０ｎｍ／５６５ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）で蛍光を２分間モニタリングした。コントロール−ＴＲＰＶ１：カプサゼピン、ＴＲＰＶ２：トラニラスト、ＴＲＰＶ３：ルテニウムレッド、ＴＲＰＶ４：ルテニウムレッド、ＴＲＰＶ５：Ｇｄ３＋、ＴＲＰＡ１：ルテニウムレッド、ＴＲＰＣ１：Ｇｄ３＋、ＴＲＰＣ３：Ｐｙｒ３、ＴＲＰＣ４：ＭＬ２０４、ＴＲＰＣ５：ＭＬ２０４、ＴＲＰＣ６：ＭＬ２０４、ＴＲＰＣ７：ＳＫＦ９６３６５、ＴＲＰＭ２：２−ＡＰＢ、ＴＲＰＭ３：メフェナミン酸、ＴＲＰＭ４：クロトリマゾール、ＴＲＰＭ５：ＴＰＰＯ、ＴＲＰＭ８：２−ＡＰＢ。コントロールデータは、全ての場合において履歴範囲内であった。
【０１２４】
パッチクランプアッセイ
このアッセイは、SB Discovery社（英国、グラスゴー）でフィー・フォー・サービスに基づいて実施した。手動パッチクランプ法を使用して、濃度応答曲線及びウォッシュアウトアッセイを実施した。ＨＥＫ−２９３細胞を、SB Discovery社でのｈＴＲＰＶ２安定細胞系統のために適合された手順に従って増殖させ調製した。細胞を約２４時間血清飢餓状態にした後に、電気生理学的検査の前に血清含有培地に取り替えた。手動パッチクランプアッセイは、従来の電気生理学的ユニットを使用して室温で実施した。細胞は、細胞に血清含有培地を添加した後に２時間〜３時間以内に使用した。標準細胞外溶液は、１４５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭのグルコースを含んでいた。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整したところ、浸透圧は３１１ｍＯｓｍ／Ｌとして測定された。標準細胞内溶液は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＫＦ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＥＧＴＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含んでいた。ｐＨをＫＯＨで７．２に調整したところ、浸透圧は２８６ｍＯｓｍ／Ｌとして測定された。コントロール溶液（細胞外溶液）及び化合物溶液の添加時の電流をモニタリングするために、標準的なランププロトコルを使用した。電圧プロトコルは、−６０ｍＶの保持電位から、５秒ごとに−１００ｍＶから＋１００ｍＶまでの一連の電圧ランプからなっていた。解析のために＋１００ｍＶでの記録の間の最大外向き電流値を使用した。手動パッチクランプ実験は、Axon Instruments社のＡｘｏｎ  ２００Ｂ増幅器及びＤｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ取得システム（Molecular Devices社、米国）を使用して実施した。電気活動を刺激して記録するために、Axon Instruments社のソフトウェアプログラムｐＣｌａｍｐ（バージョン１０）を使用した。容量的過渡現象は電子的に記録から補償されているが、直列抵抗にわたる電圧降下及び液間電位差は補償されなかった。直列抵抗は一般的に１０ＭΩ未満であり、平均セル容量は約２５ｐＦであった。全てのグラフの分析及びプロットには、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５）ソフトウェアを使用した。アゴニスト（カンナビジオール；Abcam社の番号ａｂ１２０４４８）を１００％ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックとして調製し、試験前に生理溶液中で４μＭ又は１０μＭに希釈した。ピペルロングミンを１００％ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックとして調製し、４μＭ又は１０μＭカンナビジオールも含んでいる生理溶液（１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、１μＭ及び０．１μＭ）中で規定の濃度に希釈した。ルテニウムレッド（Sigma社、番号Ｒ２７５１）を１０ｍＭのストックイオン蒸留水として毎日調製し、生理溶液中で１００μＭに希釈した。
【０１２５】
細胞内カルシウムイメージング
細胞（ATCC）を、１０％ＦＢＳ（Gibco社）、ＧｌｕｔａＭａｘ（Gibco社）、ＭＥＭ及びＮＥＡＡ（Gibco社）、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ（Gibco社）中で５０％のコンフルエンシーまで増殖させた。細胞を、μ−ｉｂｉｄｉの８ウェルプレートに播種し、ＴＲＰＶ２−ＲＦＰ３４（日本の群馬大学の小島至教授の厚意による寄贈）でトランスフェクションした。４８時間インキュベートした後に、細胞をカルシウムイメージングにかけた。細胞内カルシウム測定は、Ｆｕｒａ−２ＡＭ（Life Technologies社）を用いて、以前に記載された研究１２からは修正して実施した。要するに、測定の１時間前に、４５分間かけて５μＭのＦｕｒａ−２−ＡＭを細胞に負荷した。細胞培地をタイロード液（１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｇ／Ｌのグルコース、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で置き換えた。同時にそれぞれの処理剤（最終濃度１％のＤＭＳＯ（コントロール）、５μＭのピペルロングミン及び１０μＭのトラニラスト）を細胞に加え、細胞を１５分間再調節させた。４μＭ又は２０μＭのカンナビジオール（ＣＢＤ）の添加によりＴＲＰＶ２を活性化する前に、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの励起からのＦｕｒａ−２ＡＭ発光を１分間記録した。画像解析はＭｅｔａＦｌｕｏｒ  Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して行った。統計分析はastatsa.comで行った。カルシウムイメージングの取得後に、細胞を直ちに４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ内に包埋した。試料をＬＳＭ  Ｚｅｉｓｓ  ８８０顕微鏡を用いてイメージングした。
【０１２６】
イムノブロッティング
ＨＥＫ２９３細胞をＴＲＰＶ２−ＲＦＰでトランスフェクションし、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）又はＴＲＰＶ２のｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）のいずれか一緒に同時トランスフェクションし、４８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社））で溶解させ、２５ｇのニードルを備えたシリンジに１０回通過させ、氷上で３０分間インキュベートし、１８０００ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した。上清を３容量のアセトンを用いて−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿したタンパク質ペレットを適切な容量の溶解バッファー中に再懸濁し、５×還元性ＳＤＳサンプルバッファーと混ぜて、１０分間煮沸した。タンパク質をＴｒｉｓ−グリシン緩衝化ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて分離し、ＰＶＤＦメンブレンに一定の３５０ｍＡで９０分間転写した。メンブレンを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中の１０％粉乳により１時間ブロッキングし、ＴＲＰＶ２に対する抗体（Atlas antibodies社）及びチューブリンに対する抗体（Thermofisher社）を用いて免疫検出を行った。
【０１２７】
動的光散乱
動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ、Malvern社、英国）を使用して、化合物のコロイド凝集を測定した。粒子サイズは２５℃で測定した。水溶性は、他の文献の記述に従い６０分以内での連続的測定で測定した３５。ピペルロングミンの１００ｍＭのストック溶液をＤＭＳＯ中で調製し、引き続き脱イオン水で希釈した後に１００μＭ（０．１％のＤＭＳＯ）の分析物溶液を得た。コロイド凝集を、連続希釈を通じて測定した。
【０１２８】
ピペルロングミン活性のＮＣＩ−６０スクリーニング
ピペルロングミンをＮＣＩ−６０  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｃｒｅｅｎにかけることで、その活性を５つの濃度レベル（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭ）で、５９種のＮＣＩ−６０細胞系統において４つの用量応答パラメーター（ＧＩ５０、ＩＣ５０、ＬＣ５０及びＴＧＩ）で測定した。ＮＣＩ−６０細胞系統におけるＴＲＰＶ２の正規化された遺伝子発現（５つのマイクロアレイプラットフォームから組み合わせたプローブ強度の平均値）を、ＣｅｌｌＭｉｎｅｒデータベース３６，３７からダウンロードした。スピアマンの相関を使用して、５７種の癌細胞系統に対するＴＲＰＶ２の発現レベルとピペルロングミンのＩＣ５０値との間の相互依存性を検定した。
【０１２９】
ピペルロングミン活性のＣＴＲＰスクリーニング
Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｐｏｒｔａｌ（ＣＴＲＰ）ｖ２から７７５種のヒト癌細胞系統についてのＴＲＰＶ２ロバストマルチアレイ平均法（ＲＭＡ）で正規化された発現及びピペルロングミン感受性データを取得した２３。用量応答曲線下面積（ＡＵＣ）を、１６点の濃度範囲にわたって測定されたピペルロングミンに対する細胞系統の感受性の尺度として使用した。ＡＵＣ値が低いほど、より高い薬物活性を意味する。スピアマンの相関を使用して、ＴＲＰＶ２の発現レベルとピペルロングミンのＡＵＣとの間の相互依存性を検定した。
【０１３０】
ヒト癌コホートにおけるＴＲＰＶ２の予後値の分析
正規化されたＴＲＰＶ２遺伝子発現（ＲＮＡ−ｓｅｑを通じて期待値最大化−ＲＳＥＭによって定量化される）３８及びＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの３０のコホートに属する９７８５個の腫瘍サンプルについての臨床データをＦｉｒｅｂｒｏｗｓｅからダウンロードした。ＴＲＰＶ２の中央値発現を使用して患者を２つのサブグループに分割することで、Ｒパッケージのｓｕｒｖｉｖａｌ３９によって、癌のタイプごとにカプラン・マイヤープロット及びログランク検定を用いて予後の有意性を推定した。
【０１３１】
ＧＴＥｘ−ＴＣＧＡ比較
ＴＣＧＡからの脳腫瘍（５０７個の低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）試料及び１５３個の多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）試料）とＧｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）プロジェクトからの正常脳組織（１１４１個の試料）との間でのＴＲＰＶ２遺伝子発現の比較を、Ｔｏｉｌ４０により計算されたＴＰＭ（百万当たりの転写物）値を用いて行った。
【０１３２】
ＴＣＧＡ腫瘍純度分析
ＴＩＭＥＲ（Ｔｕｍｏｒ  ＩＭｍｕｎｅ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）４１を使用して、ＬＧＧ試料及びＧＢＭ試料にわたるＴＲＰＶ２遺伝子発現（ＲＳＥＭのｌｏｇ２）と腫瘍純度との間の相関解析を行った。
【０１３３】
脳の単一細胞でのＴＲＰＶ２発現
４個のヒトＧＢＭ試料から得られた３５８９個の単一細胞における正規化されたＴＲＰＶ２遺伝子発現（百万当たりのカウントのｌｏｇ２）を公開データベース２６から取得した。成人のヒト脳の健康組織から種々の純化された細胞型における正規化されたＴＲＰＶ２発現（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  Ｍｉｌｌｉｏｎ−ＦＰＫＭ）を、（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＯｍｎｉｂｕｓデータセットアクセッションＧＳＥ７３７２１）４２から取得した。
【０１３４】
毒性アッセイ
５０００個の細胞／ウェルを、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを有する９６ウェルプレートに播種した。翌日、ピペルロングミンを様々な濃度で添加した。各ウェルにおける総ＤＭＳＯ濃度は１％を超過しなかった。２４時間、４８時間及び７２時間に培地を除去し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Promega社、培地中１：２０）と置き換えた。プレートを９０分間インキュベートした後に、蛍光強度を測定した。
【０１３５】
免疫組織化学染色
パラフィンで包埋された試料を切片化し、抗原賦活化を行った（Ｄａｋｏ  ＰＴ  ｌｉｎｋ、ｐＨ６、９５℃、２０分）。ＭｅＯＨ中の３％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロッキングした後に、切片を抗ＴＲＰＶ２（Atlas antibodies社のＨＰＡ０４４９９３、１：３００）と一緒に室温で１時間インキュベートし、引き続きＨＲＰコンジュゲート型二次抗体（Ｄａｋｏ  ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅ）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。切片をＤＡＢクロモゲン（３，３’−ジアミノベンジジン、Dako社）で現像し、ハリスヘマトキシリンで対比染色した。スライドガラスをＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ＳＱ（浜松ホトニクス株式会社）を用いてデジタル化した。
【０１３６】
ＨＥＫ２９３及びＵ２５１における過剰発現
７５０００個のＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、細胞をｈＴＲＰＶ２−ＲＦＰプラスミド（日本の群馬大学の小島至教授の厚意による寄贈）でトランスフェクションした。２４時間インキュベートした後に培地を交換し、５μＭ及び１０μＭでＰＬを添加した。２４時間後に、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｒｅ−Ｂｌｕｅ（Promega社）又はＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、７−ＡＡＤ染色を用いて評価した。トランスフェクション効率はフローサイトメトリーを用いて評価した。
【０１３７】
５００００個のＵ２５１細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、細胞をｈＴＲＰＶ２−ＲＦＰプラスミドでトランスフェクションした。４８時間インキュベートした後に培地を交換し、５μＭ及び１０μＭでＰＬを添加した。２４時間後に、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｒｅ−Ｂｌｕｅ（Promega社）を用いて評価した。トランスフェクション効率はフローサイトメトリーを用いて評価した。
【０１３８】
フローサイトメトリー
細胞を採取し、−２０℃、１０分間メタノールで固定してから、ＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）で洗浄した。試料を、抗ＴＲＰＶ２（Atlas Antibodies社、ＰＢＳ中１：１００）と一緒に２０分間インキュベートした後に、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ４８８（Abcam社、ａｂ１５００７７、ＰＢＳ中１：５００）二次抗体と一緒にインキュベートした。解析のためにＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを搭載したＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０を使用した。
【０１３９】
Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、７−ＡＡＤ生存率アッセイ
培地（ＨＥＫ２９３）又はＴｒｙｐＬＥ  ｅｘｐｒｅｓｓ（Gibco社）で洗浄することにより、プレートから細胞を採取した。遠心分離後に培地を除去し、細胞を結合バッファーで２回洗浄してから、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＡＰＣ（eBiosciences社、１：１００）及び７−ＡＡＤ（Pharmigen社、１：５０）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。試料を結合バッファーで希釈し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを搭載したＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０を用いてフローサイトメトリーにより分析した。単一の染色による試料をコントロールとして使用した。
【０１４０】
ピペルロングミンのβ−シクロデキストリン中への封入
エタノール中のピペルロングミン（abcr GmbH社）を、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Carbosynth Ltd社）と一緒に水中で１：２の比率でインキュベートし、室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を蒸発乾固させた。
【０１４１】
ピペルロングミンヒドロゲル足場の合成及びｉｎ  ｖｉｖｏ頭蓋内埋没
ヒドロゲル足場は、以前に記載２７〜３０されたように開発した。要するに、当量の１２．５％の固形分のデンドリマーアミン及び固形分５％のデキストランアルデヒドを混合して、予備硬化されたディスクを形成させた。ドープされた足場のために、ヒドロゲル形成の前に、β−シクロデキストリンで予め封入された５０ｍｇ／ｋｇのピペルロングミンをデキストラン溶液に添加した。予備硬化されたディスクを形成させて、ＧＢＭ腫瘍を有するマウスの右大脳半球に頭蓋内に埋没させた又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために使用した。
【０１４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒドロゲル足場からのピペルロングミンの放出
ヒドロゲル足場単独又はβ−デキストリンで予め封入されたピペルロングミンでドープされたヒドロゲル足場の予備硬化されたディスクを、ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした。種々の時点でＰＢＳから試料を収集し、放出されたピペルロングミンを液体クロマトグラフィー−質量分析法を使用して、ピペルロングミンに対応するピーク下面積を積分することにより定量化した。データを、各時間点について、ヒドロゲル中に封入された総ピペルロングミンのパーセンテージとしてプロットした。
【０１４３】
ピペルロングミンでドープされたヒドロゲルを用いた細胞生存率試験
２４ウェルプレートに、１ウェル当たり５００００個のＵ２５１細胞を播種した。２４時間後に、ヒドロゲル足場単独又はβ−デキストリンで予め封入されたピペルロングミンでドープされたヒドロゲル足場の予備硬化されたディスクを含むｔｒａｎｓｗｅｌｌパーミアブルサポート挿入物（６．５ｍｍ挿入物、８．０μｍのＰＥＴメンブレン、Ｃｏｓｔａｒ）をウェルに加えた。２４時間後、４８時間後及び７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Promega社、培地中１：２０）を使用して細胞生存率を測定した。
【０１４４】
Ｕ２５１−ＧＦＰ−ルシフェラーゼ細胞系統の調製
５００００個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。翌日、３ｍＬのレンチウイルス−ＧＦＰ−ルシフェラーゼ（Carlos Custodiaにより２０１６年１１月に製造された）及び４μＬのポリブレンをウェルに加えた。ウイルスを含む培地を４８時間後に除去し、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭで置き換えた。細胞を増殖させ、ＦＡＣＳを使用してソーティングした。コンフルエントな細胞のバイアルを、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に必要とされるまで凍結させた。
【０１４５】
異種移植マウスモデルにおけるＧＢＭのための治療剤としてのピペルロングミンでドープされたヒドロゲル
全てのマウスの研究は倫理委員会により承認され、実験はその規定及び方針に従って行った。神経膠芽細胞腫の異種移植片を、８週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウス（Charles River Laboratories社）において樹立させた。マウスをイソフルランで麻酔し、定位フレームに固定したら、右大脳の上のブレグマの２．５ｍｍ側方及び１．５ｍｍ後方に直径２．７ｍｍの穿頭孔を空けた。３μＬ容量のＰＢＳ中の２５００００個の神経膠芽細胞腫細胞（Ｕ２５１−ＧＦＰ−ｌｕｃ）を、鈍端のニードル及びハミルトン注射器を使用して２．５ｍｍの深さ（ニードルを３ｍｍ下げた後に、０．５ｍｍ後退させて細胞のためのポケットを作製した）で脳内に注射した。細胞の還流を最小限にするために、ニードルを５分間そのままにした。ニードルを取り出したら、切開部を縫合し、動物を回復させた。腫瘍導入の８日後に、マウスをＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステムを使用してイメージングした。マウスをそれらの生物発光シグナルに応じてランク付けし、２つの等しい群に分けた。腫瘍導入の９日後にマウスをメデトミジン及びケタミンの腹腔内注射により麻酔し、縫合を再び開いた。頭蓋骨内に孔を配置して、表面の組織を破壊した後にヒドロゲル（コントロール群のためのヒドロゲル足場単独又はβ−シクロデキストリンで予め封入されたピペルロングミン（５０ｍｇ／ｋｇ）でドープされたヒドロゲル足場の予備硬化されたディスク）を適用することで、該ヒドロゲルが脳組織と接触することを確実にした。皮膚を再縫合し、アチパメゾールで麻酔を拮抗した。マウスの体重評価を介したｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性の評価を、実験の間に全ての動物群に対して行った。ヒドロゲル埋没の３週間後に、腫瘍サイズが人道的エンドポイントを超えないようにマウスを屠殺した。脳及び脊髄を含む器官を組織学的評価のために採取した。腫瘍の組織切片（ｎ＝５）をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、免疫組織化学分析のために、腫瘍（ｎ＝５）を抗ＴＲＰＶ２抗体（Atlas antibodies社、ＨＰＡ０４４９９３、希釈１：２００）及び抗Ｋｉ６７抗体（Abcam社  ａｂ１５５８０、希釈１：２００）で染色した。生存曲線は、腫瘍導入の８日後にＩＶＩＳ  ｌｕｍｉｎａによって測定された当初の腫瘍サイズの５５４％増加のカットオフ値に基づいてプロットした。この値は以前の実験と同様に設定され、腫瘍は頭蓋骨が歪むほどの体積まで増殖し得た。これは、頭部の組織学的セクションが分析された後にのみ認識することができ、エンドポイントが人道的かつ臨床的に適切であることを確実にするために値を設定することに決めた。
【０１４６】
腫瘍増殖の分析
腫瘍の進行を非侵襲的に縦断的にモニタリングした後に、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ−生物発光及び蛍光イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ、Perkin Elmer社）でマウスをスキャンした。イメージングの１５分前に、ＰＢＳ（Lonza社）中の１５０μＬのＤ−ルシフェリン（３０ｍｇ／ｍＬ、Perkin Elmer社）をマウスに皮下注射した。動物全体のイメージングは、示された時点（ヒドロゲルのディスクの頭蓋内埋没の−１日後、３日後、６日後、１０日後、１３日後、１８日後及び２１日後）に実施した。
【０１４７】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
トータルＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬を使用して製造業者のプロトコル（Sigma社、ドイツ、ダルムシュタット）に従って単離した。５００ｎｇのＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Promega社、ドイツ、マンハイム）を用いてｃＤＮＡに変換し、定量的ＰＣＲの鋳型として２５ｎｇのｃＤＮＡを、ＧｏＴａｑ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Promega社、ドイツ、マンハイム）とともに使用した。ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓ検出システム（Applied Biosystems社、米国、フォスターシティー）を使用して、ＴＲＰＶ２について定量的ＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーの条件は、９５℃で２０分間、次に９５℃で３分間の４０サイクル、その後に６０℃で３０秒間であった。ｍＲＮＡの発現を２−ΔＣＴ法を使用して計算し、内部コントロールＰＧＫ１に対して正規化した。
【０１４８】
試料調製
他の文献の記述に従い、凍結組織切片からタンパク質を抽出した（Poschmann et al.[1]）。要するに、尿素バッファー中でＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Qiagen社、ドイツ、ヒルデン）を用いて細胞を均質化し、引き続き超音波処理を行った。１４０００×ｇ及び４℃で１５分間遠心分離した後に、上清を回収し、含まれるタンパク質を−２０℃で１：４（容量／容量）の比率でアセトンを用いて一晩沈殿させた。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Fischer Scientific社、ドイツ、シュベルテ）により測定し、試料当たり１０μｇのタンパク質を４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ、Thermo Scientific社、ドイツ、ダルムシュタット）において５０Ｖで１０分間の電気泳動により脱塩した。銀染色後に、タンパク質バンドを切り出し、還元させ、アルキル化し、そしてトリプシンで消化した後に、超音波処理を介してペプチド抽出を行った。ペプチドを１６μＬの０．１％ＴＦＡ（容量／容量）中に溶解し、ｏ−フタルジアルデヒドアッセイを適用してペプチド濃度を測定した。
【０１４９】
ＬＣ−ＭＳ分析
質量分光分析のために、試料当たり１５μＬのペプチド溶液をナノ高性能液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化質量分析計で分析した。分析システムは、ナノエレクトロスプレーイオン源（Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン）を介してＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓ質量分析計に接続されたＲＳＬＣｎａｎｏ  Ｕ３０００  ＨＰＬＣから構成されていた。注入されたペプチドを、トラッピングカラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｏ  Ｃ１８、２ｃｍ×１００μｍ×３μｍの粒子サイズ、１００Åの細孔サイズ、Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン）で０．１％のＴＦＡ（容量／容量）を用いて６μＬ／分の流速で１０分間濃縮及び脱塩した。引き続き、ペプチドを分析カラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  ＲＳＬＣ  Ｃ１８、２５ｃｍ×７５μｍ×２μｍの粒子サイズ、１００Åの細孔サイズ、Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン）で３００ｎＬ／分の一定の流速で１２０分間の勾配にわたり６０℃で分離した。４％→４０％の溶剤Ｂの勾配（溶剤Ａ：水中で０．１％（容量／容量）のギ酸、溶剤Ｂ：水中で０．１％（容量／容量）のギ酸、８４％（容量／容量）のアセトニトリル）を通じて分離が達成された。その後に、ペプチドを１４００Ｖの電圧でイオン化し、ポジティブモードで動作する質量分析計に導入した。ＭＳスキャンを７００００の解像度、３５０ｍ／ｚ〜２０００ｍ／ｚの範囲内でプロファイルモードにて記録し、一方でタンデム質量スペクトルを１７５００の解像度で記録した。タンデム質量スペクトルを、データ依存型Ｔｏｐ１０法及び３０％の正規化された衝突エネルギーで記録した。動的排除をリピートカウント１で１００ｍｓにわたりアクティブにした。
【０１５０】
コンピューター質量分析データ分析
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン２．１．０．８１、Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン）を、ペプチド／タンパク質同定のために、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ヒト、アイソフォームを含む、日付２０１８年５月１日）を使用してサーチエンジンとしてＭａｓｃｏｔ（バージョン２．４．１、Matrix Science、英国、ロンドン）を用いて適用した。ペプチドレベルで１％（ｐ≦０．０１）の偽発見率を同定閾値として設定した。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（バージョン２．０、Nonlinear Dynamics社、Waters Corporation社、英国、ニューカッスル・アポン・タイン）を用いてタンパク質を定量化した。
【０１５１】
経路分析
遺伝子セットは、ＧＯ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ、ＫＥＧＧ（２０１６年３月２４日）を含む幾つかのデータベースからの精選された経路から構成され、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（www.cytoscape.org、ｐ≦０．００１、ｑ≦０．０５、類似度のカットオフ０．５）を使用して視覚化した。質量分析データを原発性と再発性とのペアにおいて分析し、Ｔ値を使用してランク付け分析を実施した。インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシス（Ingenuity Pathway Analysis）（ＩＰＡ）は、対応ありのＴ検定からの有意な遺伝子を使用した（ｐ≦０．０５及び倍率変化±２）。ＩＰＡの有意性はｐ≦０．０５に基づいて決定した。ヒートマップ及び階層的クラスタリングを、標準偏差１で平均発現を０に正規化してＰａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ（Partek Incorporated社、米国、ミズーリ州）においてピアソンの非類似度アルゴリズム及び平均連結法を使用して実施した。
【０１５２】
本発明者らは、１と２との間のファーマコフォアの関係（図１Ａ）が、ＴＲＰ調節についての青写真、つまりその強力な抗癌活性及び／又は抗転移活性を部分的に説明することができる１についての今まで知られていなかった薬物標的ファミリーを包含するという仮説を立てた。さらに、本発明者らは、機械学習による信頼度の高い結合予測を通じて、ＴＲＰチャネルに対する１の試験に駆り立てられた。本発明者らが使用したリガンドベースのアルゴリズムの独特なアーキテクチャは、競合するツールでは見過ごされるＮＰについてのリガンド−標的の関係を認識するのに有効であることが明らかになった２。結合仮説を携えて、本発明者らは、蛍光性カルシウム検出プローブと組み合わせた細胞ベースの発現システムを使用して、バニロイド（ＴＲＰＶ）、カノニカル（ＴＲＰＣ）、メラスタチン（ＴＲＰＭ）及びアンキリン（ＴＲＰＡ）の相手を含む一連のヒトのリガンド依存性ＴＲＰチャネルに対するスクリーニングの取り組みを行った。注目すべきことに、１はアッセイされたチャネルを一切活性化せず、ＴＲＰＶ２を介するカンナビジオール誘発性カルシウム流入を用量依存的に強力に阻害したにすぎなかった（ＩＣ５０＝４．６μＭ±０．１３対数単位、リガンド効率＝０．３２、表１及び図２ａ）。本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞においてＦｕｒａ２−ＡＭカルシウムプローブを使用してカルシウムイメージング実験を行い、ＴＲＰＶ２の発現を確認した（図２ｂ、図２ｃ）。２０μＭのカンナビジオールによって誘発されるカルシウム流入は、１０μＭの濃度でのコントロール化合物トラニラストと同様に、５μＭの１での細胞処理に際して有意に阻害され得た（ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの事後検定）（図２ｂ）。興味深いことに、４μＭのカンナビジオールによる刺激は細胞内カルシウムの増加を誘発しないことから（図２ｃ）、ＨｅｐＧ２ではＴＲＰＶ２チャネルのコピー数が低く、それをモデルシステムとして使用するには制限があることが示唆される。
【０１５３】
次いで、本発明者らは、ＴＲＰＶ２−ＲＦＰ融合タンパク質の一過性過剰発現を可能にするために、ＨＥＫ２９３細胞に、必要とされるプラスミドＤＮＡをトランスフェクションさせた（図２ｄ〜図２ｈ）。引き続き、トランスフェクションされた細胞を４μＭのカンナビジオールで刺激し、１で処理して、以前に観察された機能的効果を確認した（図２ｄ）。ＴＲＰＶ２の活性化に加えて、カンナビジオールはＣＢ１  Ｇタンパク質共役受容体を調節し、マイクロモル濃度で複雑な多重薬理を示す１９。ＴＲＰＶ２以外の標的の調節によるカルシウム流入を除外するために、本発明者らはまた、トランスフェクションされていないＨＥＫ２９３をカンナビジオールで刺激した。実際、他の標的の調節にもかかわらず、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞における大部分のカルシウム流入はＴＲＰＶ２チャネルの結合により起こる。
【０１５４】
さらに、本発明者らのデータは、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞における１によるカルシウム流入の阻害が、トランスフェクションされていないコントロール細胞におけるカルシウム流入とは有意に異なることを示している（ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーのＨＳＤ事後検定）。このように、１により示される効果は、ＴＲＰＶ２調節によるものである。
【０１５５】
直交技術としてパッチクランプを使用して、本発明者らは、ＴＲＰＶ２チャネルへの結合及び４μＭのカンナビジオールによって誘発されるカルシウム電流の遮断による機能的拮抗作用を確認した（ＩＣ５０＝１μＭ±０．５２対数単位、図２ｉ）。重要なことには、１０μＭのカンナビジオールによりＴＲＰＶ２を事前に刺激すると、１による阻害効果は抑止される（ＩＣ５０（１）＞１００μＭ、ｎ＝２、ＥＣ５０（カンナビジオール）＝３．８μＭ、ｎＨｉｌｌ＝０．６、ｎ＝３、図２ｊ）。したがって、本発明者らのデータは、１による分子認識が特異的で指向性であること及びＴＲＰＶ２の人工的な阻害が存在しないことを示唆している。さらに、動的光散乱データは、偽陽性のリードアウトに一般的な現象であるコロイド凝集に誘発される阻害が存在しないことを裏付けている。
【０１５６】
１が見せる顕著な選択性は、部分的に予想外であった。１は既知のＴＲＰＶリガンドとの部分構造類似性が低いものの（平均Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数＝０．１０、Ｍｏｒｇａｎフィンガープリント、半径２、２０４８ビット）、ＣＡＴＳの自己相関トポロジカルファーマコフォア記述子（ＭＯＥ  ２０１６．１０、Chemical Computing Group社の実装）によれば、１は依然として、チャート化されたＴＲＰＶ生物活性空間を占めている。得られた活性プロファイルも興味深いものであり、早期発見プログラムにおける化学物質の優先順位付けのためのフラグ付けシステムに挑んでいる。ピペルロングミンは、一般的な部分構造ベースのフィルタ、例えばパンアッセイ干渉化合物（ＰＡＩＮＳ）２０におけるフィルタ、及び構造警告として、とりわけマイケルアクセプターを特定するｒａｐｉｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｉｌｌ（ＲＥＯＳ）２１により容易にフラグ付けされる。質量分析によって評価されるように、生体直交条件下で１をＮ保護及びＣ保護されたシステインと一緒にインキュベートすることで、安定したシステイン付加物が得られた。既にAdams et al.１７によって同様の観察がなされた。したがって、ヒトプロテオーム全体にわたる乱雑な標的結合挙動及び１と遊離のシステイン残基との一般的な反応性を考慮することが妥当であると考えられる。１のＴＲＰＶ２への不可逆的な結合の可能性に対処するために、本発明者らは、一連のインキュベーション及びウォッシュアウト実験を行った（図３ａ、図３ｂ）。喜ばしいことに、ＴＲＰＶ２の活性はウォッシュアウトに際して完全に回復し得たことから、結合が非共有結合である又は１がＴＲＰＶ２の共有結合的修飾後に素早い解離速度を表すという確固たる証拠が得られた。
【０１５７】
得られたデータに駆り立てられて、本発明者らは、次に１のＴＲＰＶ２への結合モードについて洞察を得ることに努め、そのために、本発明者らは、カンナビジオールとの同時インキュベーション実験を行った。１の濃度を増加させると、カンナビジオールのＥＣ５０曲線への最大効果が減少した。これは、非競合（アロステリック）拮抗作用に典型的である（図３ｃ）２２。さらに、１の濃度が５μＭより高いと、カンナビジオールの見掛けのｖｍａｘ値が減少し、これもまたアロステリック阻害と一致する。アゴニスト濃度の増加は１の機能的効果を超えることはできない（図３ｄ）。さらに、曲線及びヒルスロープの両方が本発明者らの以前のデータと完全に一致していることを考慮すると、シルトプロットにより、阻害の様式が裏付けられる（図３ｅ）。
【０１５８】
次いで、本発明者らは、等温滴定熱量測定を使用してウサギ、マッコウクジラ及びチルーのＴＲＰＶ２オーソログの種々の構築物に対して１００μＭで１をスクリーニングした。化合物１は、どの構築物にも結合しなかった。予備的ではあるが、データは分子認識の主要な特徴を示唆している。本発明者らは、研究された種のＴＲＰＶ２タンパク質配列をアライメントすることで、相違点を特定し、こうして１のための潜在的な結合ドメインを特定した。驚くべきことに、いわゆるＴＲＰＶ２ポアタレット領域は、オーソログ間でかなり異なっている。天然に存在するペプチドによるタレットへの結合は、ＴＲＰＶ１の結合に関連することが示された２３。しかし、ＴＲＰＶ２のリガンドについてはそのような関係が確立されていなかったことから、天然のヒトＴＲＰＶ２タレットをウサギの対応物と置き換えることによりＴＲＰＶ２キメラを構築することに更に駆り立てられた。重要なことに、キメラＴＲＰＶ２チャネルでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞は、カルシウムイメージング実験で４μＭのカンナビジオールに対して同様の感受性であったことから、その結合部位のトポロジーが乱されていないことが示される。
【０１５９】
次いで、本発明者らは、１によるＴＲＰＶ２の調節がその細胞増殖抑制活性と相関しているかどうかを調査した。そのために、１の推定抗増殖活性を、９種の異なる癌タイプを表すヒト癌細胞系統のＮＣＩ−６０パネル（図Ｓ３）２４に対して５つの異なる濃度で試験した。抗増殖活性パラメーターＧＩ５０及びＩＣ５０をそれらの−ｚスコアに変換した。これにより、高い値は１に対する細胞系統の感受性が高いことに相当する。全体として、血液、結腸及び皮膚の癌細胞系統が１に対して最も感受性が高いことが判明した（図４ａ、図４ｂ）。
【０１６０】
１の抗増殖効果に対するＴＲＰＶ２の役割を実証するために、１によって誘発される細胞増殖抑制効果とＴＲＰＶ２のｍＲＮＡ発現との間の相関を求めた。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析と一致して、ＴＲＰＶ２を発現する細胞系統は、ＧＩ５０（スピアマンの相関係数（ρ）＝０．２８、ｐ＜０．０５、図４ｃ）値及びＩＣ５０（ρ＝０．２９、ｐ＜０．０５、図４ｄ）値の両方に基づいて、１に非常に感受性が高かった。本発明者らの知る限りでは、ＴＲＰＶ２拮抗作用と癌細胞増殖の阻害との間にこれまでに関連性はなかった。しかしながら、ＴＲＰＶ２を発現していない細胞系統の１に対する感受性は、追加の標的の調節を示唆している。興味深いことに、１の他の既知の標的、すなわちＳＴＡＴ３１８，２５及びＮＦ−ｋＢ２６については、有意な相関は観察されなかった。なおも、ｍＲＮＡの発現レベルに対する本発明者らの分析は、これらのタンパク質の活性が他のレベルの調節、例えばＳＴＡＴ３リン酸化又はＮＦ−ｋＢ阻害剤の分解に対して高く依存していることを捕らえていない。引き続き、本発明者らは、ＮＣＩ−６０パネルについて公的に入手可能な全てのｍＲＮＡ発現データに向けて分析を拡大した。それらの発現と１のＧＩ５０との間のスピアマンの相関係数に従ってランク付けされた遺伝子を使用して、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔを実行した。
【０１６１】
濃縮分析（ＧＳＥＡ）２７，２８により、潜在的な標的（正の正規化濃縮スコア（ＮＥＳ）を有する遺伝子セット、図４ｅ）及び薬剤耐性（負のＮＥＳ、図４ｅ）機構を示唆する経路（偽発見率＜５％）を特定することが可能となる。ＲＮＡプロセシング、例えばスプライセオソーム、リボソーム、ＲＮＡ分解、ＲＮＡポリメラーゼは、正の関連を示す経路の１つであり（図４ｅ）、おそらく急速に分裂する細胞においてより活性化されるため、１の活性がより高い。正に濃縮された抗原プロセシング経路及び抗原提示経路における遺伝子は、ヒト免疫応答の中心的なメディエーターであるＮＦ−ｋＢの標的と重複しないことから２９、１が異なる免疫機構に影響を及ぼし得ることを示唆している。
【０１６２】
ＮＣＩ−６０パネル中の血液癌及び皮膚癌におけるＴＲＰＶ２のｍＲＮＡの高発現に興味をそそられて、本発明者らは、予後マーカー及び潜在的な薬物標的としてのＴＲＰＶ２の使用を調査した。Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプロジェクト３０，３１からのＲＮＡ−ｓｅｑデータを分析することにより、正常な皮膚組織中ではなく、血中でＴＲＰＶ２のより高い発現が確認された。さらに、本発明者らは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ、https://cancergenome.nih.gov/）の腫瘍試料全体にわたるＴＲＰＶ２発現を調査した。実際、ＴＲＰＶ２はヒトの血液癌及び皮膚癌において高度に発現しているが、両方のそれぞれのＴＣＧＡコホートでは正常組織についての発現データがないため、これらの癌タイプにおけるＴＲＰＶ２の過剰発現を試験することはできない。興味深いことに、肺は正常組織の中でも最高のＴＲＰＶ２の発現を示し、ＮＣＩ−６０癌細胞系統でも観察される、ＴＣＧＡ肺腫瘍試料における非常に低い発現レベルとは対照的である。したがって、生存分析により、ＴＲＰＶ２の予後値は４つの異なるコホートにおける肺癌タイプでのみ明らかになった（ｐ＜０．０５）３２〜３５。より低い発現は、患者の生存がより低いことと関連している。
【０１６３】
全体として、これらの結果により、ＴＲＰＶ２が肺癌の潜在的な予後マーカーであることが浮き彫りになった。遺伝子発現分析の注意点に留意すると、例えば、ｍＲＮＡレベルはタンパク質含有量に完全には置き換えられない場合があり、本発明者らのデータは指標であり、健全な懐疑論で解釈されるべきである。ＴＲＰＶ２がタンパク質レベルで、ＮＣＩ−６０パネルで試料採取された癌細胞系統及び段階以外の癌細胞系統及び段階で過剰発現していることが示されたことを考慮すると３６、１はＴＲＰＶ２調節の他の例を介して表現型の変化を誘発する可能性がある。
【０１６４】
ＴＲＰＶ２は、細胞遊走のメディエーターとして転移性乳癌及び前立腺癌に決定的に関与している３６〜３９。細胞遊走における化合物１−ＴＲＰＶ２の相互作用の重要性を調査するために、本発明者らは、最初に前立腺癌ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞系統を１に対する感受性について試験した。以前に測定されたＴＲＰＶ２に対するＩＣ５０値に沿って、５μＭ及び１０μＭの１で細胞を処理した。両方の場合に、細胞生存率は２４時間にわたり低下した。代わりに、ＴＲＰＶ２を発現するＨｅｐＧ２細胞系統を用いて２４時間の長さの創傷治癒スクラッチアッセイを行った。そこでは、実験の時間経過の間に５μＭの１での処理により、有意な細胞死は誘発されなかった。化合物１は、ＴＲＰＶ２阻害剤のコントロールであるトラニラストと同様に、ＨｅｐＧ２細胞の遊走を時間に伴って有意に減少させた（図５ａ〜図５ｃ）。それらの結果は、別の肝癌細胞系統であるＨｕｈ−７で再現可能であった。さらに、１により示される抗遊走効果は中程度のカルシウム濃度に依存することから、カルシウム輸送の破壊が１つの作用機構であることが示唆される４０，４１。ＨｅｐＧ２遊走の状況におけるＴＲＰＶ２調節の重要性を更に評価するために、本発明者らは、癌細胞の遊走と相関する一連の１７５個の巨大分子を手動で収集した４２〜４６。例えば、これらの巨大分子は、キナーゼ、ＧＰＣＲ、イオンチャネル及びカルシウムシグナル伝達で重要な役割を果たす転写因子を含んでいた（図５ｄ）。ＨｅｐＧ２  ＲＮＡ−ｓｅｑデータをＥＮＣＯＤＥ４７から収集し、平均遺伝子発現を各々の標的について計算した。本発明者らのデータは、分析されたターゲットの８９％と比較して、ＴＲＰＶ２が過剰発現していることを示している。多重薬理学は癌細胞遊走に対する１の正味の効果を説明しているが、ＴＲＰＶ２の阻害は、最も関連性の高い機構に位置づけられる。
【０１６５】
ｈＴＲＰＶ２はＧＢＭにおける予後不良のマーカーである
ピペルロングミン（ＰＬ）の抗増殖効果に対するｈＴＲＰＶ２の役割を実証するために、ＰＬによって誘発される細胞増殖抑制効果とｈＴＲＰＶ２のｍＲＮＡ発現との間の相関を求めた。そのために、癌細胞系統のＮＣＩ−６０パネルに対してＰＬをスクリーニングし、公的に利用可能なＣＴＲＰデータを分析した２３。喜ばしいことに、ｈＴＲＰＶ２を発現する細胞系統は、両方の薬物スクリーニングにおいてＰＬに対して非常に感受性が高く、これは、癌における薬物標的としてのｈＴＲＰＶ２の重要性を示唆している（ＮＣＩ−６０パネル及びＣＴＲＰパネルのそれぞれについて、スピアマンの相関係数、ρ＝０．２９及び０．２４、ｐ＝０．０３及び１．５×１０−１１、図４ｄ）。
【０１６６】
癌におけるｈＴＲＰＶ２の役割を更に調査するために、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの３０種のコホートで予後値を試験した。実際、高いｈＴＲＰＶ２発現は、別々の低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）２４及びＧＢＭ２５のコホートの両方を含む脳腫瘍において患者の生存が低いこと（ｐ＝４．３７×１０−１３、ログランク検定）と強く関連していることが判明した（ｐ＝０．０２８及び０．００８７、それぞれログランク検定、図６）。さらに、腫瘍の病期に付随するｈＴＲＰＶ２発現の有意な増加が見出された（図１６）。ＬＧＧ及びＧＢＭの試料内で、ｈＴＲＰＶ２発現は、腫瘍の純度に負の関連があることから（スピアマンの相関係数、それぞれｐ＝−０．４５及び−０．３６、ｐ＝７．５×１０−２５及び３．１×１０−１４、図１７）、こうしてｈＴＲＰＶ２は、主に腫瘍の微小環境で発現していることが示唆される。次に、ＧＢＭのグレードＩＩ〜ＩＶを表す一連の患者からの脳腫瘍組織試料においてｈＴＲＰＶ２の発現を分析した。免疫組織化学分析により、ｈＴＲＰＶ２が実際に腫瘍細胞（斑点状染色）において腫瘍辺縁よりも多く発現していることが明らかになった（図７）。最も重要なことには、高グレードのＧＢＭが、腫瘍内の上皮細胞の表面及び細胞質でｈＴＲＰＶ２を過剰発現することが観察された。全体として、これは、高いｈＴＲＰＶ２発現が血管新生及び腫瘍進行に役割を果たし、予後不良と関連するという事実と関連している。実際、本発明者らの結果は、完全に独立したデータセットのバイオインフォマティクス分析から得られた知見と類似している２６（図８の左パネル）。
【０１６７】
ｈＴＲＰＶ２の過剰発現はＰＬ毒性の増加をもたらす
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでｈＴＲＰＶ２発現とＧＢＭグレードとの間の相関が特定されたので、ｈＴＲＰＶ２が関与するシグナル伝達経路を悪化させることを目的として、ＴＲＰＶ２＋神経膠腫Ｕ２５１細胞にｈＴＲＰＶ２の一過性の過剰発現をもたらした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及び７−ＡＡＤ染色で評価した場合に、トランスフェクションされた細胞を５μＭのＰＬで処理することで、トランスフェクションされていないコントロールと比較して生存率の減少が示された（ｐ＝０．０００２、ｎ＝９、マン・ホイットニー検定）（図８の右パネル）。このデータは、本発明者らの分析を完全に裏付けており、ｈＴＲＰＶ２がＰＬの細胞標的であるだけでなく、リガンド−標的の結合により細胞死がもたらされることも確認している。重要なことに、Ｕ２５１細胞は、用量依存的かつ時間依存的にＰＬに感受性であり、それには、ｈＴＲＰＶ２の調節を考慮に入れることができる。ＴＲＰＶ２で一過性トランスフェクションされたＨＥＫ細胞でも同じ結果を得ることができた。
【０１６８】
ＧＢＭのための新しい局所治療剤としてのピペルロングミンでドープされたヒドロゲル
次に、本発明者らは、ＧＢＭの異種移植マウスモデルにおいてＰＬの治療効果を調査した。ＰＬを１：２の比率でシクロデキストリン中に封入したところ、その水溶性が劇的に改善した。さらに、治療効果を高めるために、本発明者らは、術後の投与に適した療法を編み出した。この目的のために、本発明者らは、β−シクロデキストリンに封入されたＰＬでドープされた埋没可能なヒドロゲルを考案した。この新しい材料を脳への局所的で持続的なＰＬ送達のために使用することで、腫瘍部位でＰＬの濃度が高いこと、並びに健康な組織及び器官への漏洩が最小限に抑えられることが達成された。腫瘍組織へのＰＬ放出を可能にし、隣接部位への物質移動及び放出を避けるために、以前に報告２７〜３０されているように、組織のアミンと相互作用して接着結合を形成するアルデヒド基でヒドロゲルを修飾した。生理学的条件下（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃）でのＰＬ放出率に関する本発明者らのヒドロゲル材料のプロファイリングにより、最初の４時間での有意な排出放出に続いて、少なくとも１９２時間にわたり少量のＰＬ（全体の３％）の安定した放出が示された。このデータにより、ＰＬでドープされたヒドロゲルが、Ｕ２５１細胞と一緒にちょうど２４時間インキュベートした後にほぼ完全な細胞死を誘発することができたというｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性実験に対する根拠が得られる。空のヒドロゲルは細胞生存率に対して一切影響を与えなかった。
【０１６９】
本発明者らは、ＧＢＭマウスモデルにおけるＰＬでドープされたヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果の研究に取り組んだ。ＰＬが負荷されたヒドロゲル足場を、２．５×１０５個のＵ２５１−ＧＦＰ−ｌｕｃ細胞による腫瘍導入の８日後に胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）の脳テント上領域に埋没させた（図９）。コントロール群では、埋没物として空のヒドロゲル、つまりＰＬ成分を欠いたヒドロゲルを使用した。次いで、腫瘍進行の阻害を、ルシフェラーゼを発現するＧＢＭ細胞系統の生物発光によりライブイメージングシステムを介して、ヒドロゲル埋没の２１日後で腫瘍導入の３０日後に規則的な間隔で測定した。ＰＬがドープされたヒドロゲルは、生物発光イメージングによって明らかなように（ｐ＝０．０１５９、ｎ＝５、マン・ホイットニー検定、図１０）、ヒドロゲル埋没の２１日後にほぼ完全な寛解をもたらした。実際に、２つの群間の生存の差は有意であり（ｐ＝０．０４９４、ログランク（マンテル・コックス検定）、図１１）、これはＧＢＭ療法における主要な成果に相当し得る。さらに、構築物の安全性を検証するために、ヒドロゲル埋没の２１日後にマウスから器官を採取し、病理学的分析のために染色した。本発明者らのデータは、ドープされたヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏでの適用が、空のヒドロゲルコントロール群と比較して、肺、肝臓、腎臓、脾臓、心臓及び腸に一切損傷を引き起こさなかったことを明確に示している。それにもかかわらず、治療後の腫瘍サイズの減少に一致するように、腫瘍組織は血管新生の大幅な減少を示す。安定した体重が維持されること及び投与部位での壊死がないことにより示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性又は他の生理学的合併症は、ヒドロゲル曝露後２１日間にわたり全ての動物群で観察されなかった。したがって、本発明者らのデータは、ＰＬが負荷されたヒドロゲルが生体適合性であることを指摘している。これらの結果に基づき、デキストランデンドリマーヒドロゲルを介したＰＬの頭蓋内投与が、ＧＢＭ治療の新しい選択肢を提供すると結論付けることができる。
【０１７０】
ＴＲＰＶ２は、再発性ＧＢＭのペアでより高度に発現する
ＴＲＰＶ２はより悪性の表現型に関連付けられているため、ＧＢＭの原発性と再発性とのペアをＴＲＰＶ２について試験することに決めた。１１個の原発性と再発性とのペアの試料を、ナノ高性能液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化質量分析計で分析した。ＴＲＰＶ２の調節は、原発性試料と再発性試料との間で相違がなかった。実際に、質量分析ではペプチドは検出されなかった。アーカイブされたデータを見ると、ＴＲＰＶ２が３２９９の保管されたヒトの研究のうち８８でのみ検出されることが分かるが、ＧＡＰＤＨは３３６回見ることができる。ＴＲＰＶ２は６つの膜貫通ドメインを有し、それらは疎水性が高いため、疎水性の特異的溶解バッファーを使用した研究でのみＴＲＰＶ２を検出することができる。したがって、ｍＲＮＡレベルを試験するためにｑＲＴ−ＰＣＲを実施したところ、実際、ＴＲＰＶ２は再発性集団でより高度に発現している（図１２）。シグナルの正規化後に、欠損値のあるタンパク質を除いて、対応ありのＴ検定を実施した。ランク付けされたＴ値は、プレランク付けされた遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を使用して分析したが、有意なタンパク質（ｐ≦０．０５及び倍率変化±１．５）は、インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシス（ＩＰＡ）を使用して処理した。原発性試料において、遺伝子及びｍＲＮＡの調節並びに接着及びタンパク質局在化に関する期間を観察した。両方ともカルシウム輸送に関与する酸化的リン酸化及び神経伝達物質シグナル伝達は、再発性試料において上方調節されたことから、ＴＲＰＶ２が再発性試料でより活性であることが示唆される。上位ランクの遺伝子セットである特徴的酸化的リン酸化のヒートマップが表示されており、こうして発現が実際に、但し個々の試料レベルで増加することが示される。次に、ＩＰＡの結果を確認することで、同様の調節されるカノニカル経路が観察された（図１３）。表２に見られるように、ミトコンドリア機能障害及び酸化的リン酸化がトップヒットである。次いで、上流分析を行い、ミトコンドリア機能障害に関与する上位４つの候補を選択した。ＲＩＣＴＯＲが原発性試料において活性であることが観察され、それにより、酸化的リン酸化に関与する遺伝子の抑制が引き起こされることが考えられる。しかしながら、タンパク質の約３分の１は下方調節されていないことから、ＲＩＣＴＯＲがミトコンドリア機能障害の上流レギュレーターではあり得ないことが示唆される。代わりに、本発明者らの結果は、ミトコンドリア生合成に関与するＰＰＡＲＧＣ１Ａ（図１４及び図１５のヒートマップに示される）が、再発性腫瘍におけるミトコンドリアの機能障害及び酸化的リン酸化の増加の原因となる潜在的な上流レギュレーターであることを示している。
【０１７１】
ＮＰ及びそれらの生物学的に事前に検証されたアーキテクチャは、ケミカルバイオロジー及び分子医学のためのプローブ及び薬物リードを開発するためのしばしば手つかずの機会を提供する。それにもかかわらず、ＮＰの一部のみが、特に表現型アッセイによって生物学的活性について試験されているにすぎない。したがって、情報に基づいた薬物設計を可能にするために、生物学的に適切な濃度で結合する標的を特定することが急務である。薬理学ネットワーク、つまりオンターゲットとオフターゲットとの相互接続の深い理解は、好ましい多重薬理学的プロファイルに対するリガンドを設計し、有害な薬物反応及び消耗につながり得る機能を軽減する解決策を提供する。化合物１は、構造的傾向にもかかわらず、有望な抗癌プロファイルを示した。ファーマコフォアの類似性の原理及び公的に利用可能な機械学習法を使用して、本発明者らは、ＴＲＰＶ２の機能的でリガンド効率的なアロステリックな拮抗作用に１を関連付けている。重要なことに、化合物１はＴＲＰチャネルファミリー内で絶妙な選択性を示し、合理的分子設計のための主なインスピレーションの源を提供し得る。さらに、ＮＰ化学空間内にＴＲＰＶ２アンタゴニストが以前に存在しないことを考慮すると、その結果は前例のないものである。本明細書で特徴付けられた機構は、観察された抗癌作用及び抗転移作用１６並びに潜在的な標的の扱いやすさについての今まで知られていなかった説明を提供する。ＴＲＰチャネルは、癌の関連で潜在的な薬物標的の新しく浮上しつつあるクラスであるが４８、ＴＲＰＶ２はほとんど未開拓のままである３６。化合物１は選択的なＴＲＰＶ２調節の機能を伴うが、化合物１はＴＲＰＶ２の化学的プローブとして直接使用されるべきではない。実際、同一濃度でのＳＴＡＴ３の結合１８は、アッセイのリードアウトの混乱をもたらす場合がある。
【０１７２】
計算的観点から見ると、本発明者らのアプローチは機械学習ツール、重ね合わせアルゴリズム及びエネルギー最小化力場に頼っている。したがって、偽陽性予測も予想されるはずである。それにもかかわらず、本発明者らの結果は、２Ｄ及び３Ｄのファーマコフォア記述子を能率的に使用することで、生物活性化学物質のための新しい生物学が提案及び解明され得ることを示している。
【０１７３】
本明細書に開示されるデータは、癌創薬の関連におけるＴＲＰＶ２の今後の調査のための基盤及び薬物リードとしての１の潜在的価値を提供する。最終的に、本発明者らは、複雑な表現型のリードアウトを巨大分子レベルにデコンボリューションするための関連する計算技術の広い範囲の主要な実用性を見越している。この計算技術及び関連する概念は、分子医学における薬理学ネットワークの確立を活用することにより、生物学における系統立てられた一般的なアプローチとしての利用可能性を見出すことができる。
【０１７４】
【表１】
2020535125.tif 000005
【０１７５】
【表２】
2020535125.tif 000006
【０１７６】
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【図１Ａ】
2020535125.tif 000008
【図１Ｂ】
2020535125.tif 000009
【図２】
2020535125.tif 000010
【図３】
2020535125.tif 000011
【図４】
2020535125.tif 000012
【図５】
2020535125.tif 000013
【図６】
2020535125.tif 000014
【図７】
2020535125.tif 000015
【図８】
2020535125.tif 000016
【図９】
2020535125.tif 000017
【図１０】
2020535125.tif 000018
【図１１】
2020535125.tif 000019
【図１２】
2020535125.tif 000020
【図１３】
2020535125.tif 000021
【図１４】
2020535125.tif 000022
【図１５】
2020535125.tif 000023
【図１６】
2020535125.tif 000024
【図１７】
2020535125.tif 000025
【国際調査報告】
2020535125.tif 000026
2020535125.tif 000027
2020535125.tif 000028
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2020535125.tif 000030