(57)【要約】  本発明は、糖尿病及び関連する障害の治療又は予防のためのペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン非依存性脂肪細胞グルコース輸送を誘発させるペプチドであって、
−  タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のセグメントの配列を含み、
−  少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを含み、
−  少なくとも８個のアミノ酸且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有し、及び
−  ＰＫＣのセグメントの前記配列内に１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る、ペプチド。
【請求項２】
好ましくは、アルファヘリカルコンフォメーションを採用する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ステープリングなどの化学的架橋プロセスによって修飾されている、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチド配列は、以下の式：
Ｍ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｒ、又はＭ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｒ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｐ
（式中、ｍ及びｎは、１〜２０の整数であり、ｍ＋ｎは、３０未満であり、且つＸは、任意のアミノ酸である）
の１つに記載の配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
以下の式：
Ｍ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＭ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｒ
（式中、ｍ、ｎ及びＸは、請求項２で定義された通りである）
の１つに記載の配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
ｍ＋ｎは、２０未満であり、且つｍ及びｎは、２〜１５、好ましくは２〜７の整数である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ＰＫＣは、アルファ−ＰＫＣ（αＰＫＣ）、βＩ及びβＩＩ  ＰＫＣを含むベータ−ＰＫＣ（βＰＫＣ）、デルタ−ＰＫＣ、シータ−ＰＫＣ、エータ−ＰＫＣ及びイプシロン−ＰＫＣからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ＰＫＣは、配列番号１のαＰＫＣである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチド配列は、
−  ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、
−  ＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号３）、
−  ＲＬＹＦＶＭＥＹＶＮＧＧＤＬＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰ（配列番号４）、
−  ＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲ（配列番号５）、
−  ＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲＧＩＩＹＲＤＬＫＬＤＮＶＭ（配列番号６）、
−  ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）、及び
−  ＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含み、場合により、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチド配列は、
−  ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、
−  ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）、
−  ＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含み、場合により、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチド配列は、
−  ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号９）、
−  ＭＣＫＥＨＭＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰＤ（配列番号１０）、
−  ＳＩＣＫＧＬＭＴＫＨＰＡＫＲＬＧＣＧＰＥＧ（配列番号１１）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２１）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＮＨ２（配列番号２２）、
−  Ｈ−ＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２３）、
−  Ｈ−Ｍ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２４）、
−  Ｃｂｚ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２５）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬ−ＯＨ（配列番号２６）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴ−ＯＨ（配列番号２７）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦ−ＯＨ（配列番号２８）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰ−ＯＨ（配列番号２９）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤ−ＯＨ（配列番号３０）、
−  Ｈ−ＶＥ（ＡＡＢ）ＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３１）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴ（ＡＡＨ）−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３２）、
−  Ｈ−ＶＥ（ＡＡＢ）Ｔ（ＡＡＨ）−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３３）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ水素化（配列番号３４）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｓ５−ＥＫＲ−Ｓ５−ＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３５）、及び
−  Ｈ−ＬＰＨＥＴ−Ｒ８−ＲＬＳＱＫＶ−Ｓ５−ＴＫＬＤＣＬＭＦＶＥＰＡ−ＯＨ（配列番号３６）
からなる群から選択される配列を含むか又はそれにおいて存在し、場合により、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
−
【化１】
2020525504.tif 000013
、
−
【化２】
2020525504.tif 000014
、
−
【化３】
2020525504.tif 000015
、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２１）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＮＨ２（配列番号２２）、
−  Ｈ−ＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２３）、
−  Ｈ−Ｍ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２４）、
−  Ｃｂｚ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２５）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬ−ＯＨ（配列番号２６）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴ−ＯＨ（配列番号２７）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦ−ＯＨ（配列番号２８）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰ−ＯＨ（配列番号２９）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤ−ＯＨ（配列番号３０）、
−  Ｈ−ＶＥ（ＡＡＢ）ＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３１）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴ（ＡＡＨ）−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３２）、
−  Ｈ−ＶＥ（ＡＡＢ）Ｔ（ＡＡＨ）−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３３）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ水素化（配列番号３４）、
−  Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｓ５−ＥＫＲ−Ｓ５−ＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３５）、及び
−  Ｈ−ＬＰＨＥＴ−Ｒ８−ＲＬＳＱＫＶ−Ｓ５−ＴＫＬＤＣＬＭＦＶＥＰＡ−ＯＨ（配列番号３６）
からなる群から選択される配列において存在し、太字であり且つ下線が施されている前記残基は、前記ステープリングを担持し、及び場合により、前記ペプチドは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
ヒドロキシル末端基を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
メチル末端基を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
糖尿病、高血糖症、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延において使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドは、好ましくは、インスリン、メトホルミン、スルホニル尿素、アルファ−グリコシダーゼ阻害薬、チアゾリジンジオン、メグリチニド、インクレチン模倣薬、グルカゴン様ペプチド類似体、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害薬、アミリン類似体、ナトリウムグルコース輸送体阻害薬又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される別の抗糖尿病薬と併用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項１５に記載の医薬組成物、又は請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野に関する。より詳細には、本発明は、糖尿病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ（ｍｅｌｌｉｔｕｓ））は、膵臓が十分なインスリンを産生しないか、又は細胞が産生されるインスリンに応答しないかのいずれかの理由で人が高血糖を有する代謝性疾患の群である。
【０００３】
糖尿病には２つの主要な型がある：
−  １型は、身体がインスリンを産生する機能が不全であることから生じ、現在、人がインスリンを注射するか又はインスリンポンプを装着する必要がある。
−  ２型は、細胞がインスリンに適切に応答しない状態であるインスリン抵抗性から生じる。
【０００４】
２型糖尿病の割合は、肥満症と並行して１９６０年から著しく増加している。２０１４年現在、この疾患を有する人々は、１９８５年のおよそ３，０００万人と比べて世界中におよそ４億２，２００万人存在した。糖尿病による長期合併症としては、心臓疾患、卒中、糖尿病性網膜症、慢性腎不全、肢切断をもたらす末梢血管疾患が挙げられる。
【０００５】
残念ながら、短期間で血糖値を低下させ得る既存の糖尿病治療は、一般的に、より長い期間にわたって正常血糖を維持することができず、患者の血糖値のコントロールに努め且つそれを維持するために、患者の治療により多くの血糖低下剤を徐々に追加する必要がある結果となる。それでもなお、複数の血糖低下剤で組み合わせて治療する場合でも、多くの糖尿病患者は、なお良好な血糖コントロールを達成していない。加えて、スルホニル尿素又はインスリンなどの現行の血糖低下剤は、重症の且つ更に生命を脅かす低血糖症のリスクを増大させ、これにより現行の治療を用いて理想的な糖尿病コントロールを達成する難しさを増大させている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、糖尿病の全ての様相を逆転させるか又はその進行性の性質を予防することができる単一薬剤は、存在しない。２型糖尿病の進行性の性質は、多くの患者が、最終的に、場合によりインスリン及び／又はインクレチンベースの注射と共に経口血糖低下剤の組み合わせを必要とすることを意味する。２型糖尿病における高血糖症に対抗するために、インスリン抵抗性を低減させるように作用する（ビグアナイド及びチアゾリジンジオン）か、又はインスリン分泌を増強させるように作用する（スルホニル尿素、グリニド、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害薬、グルカゴン様ペプチド１受容体作動薬）抗糖尿病薬が開発されている。しかしながら、これらの医薬品の多くは、低血糖症、吐き気、下痢、体重増加、末梢性浮腫、うっ血性心不全及び骨粗鬆症性骨折を含む有害な副作用を有することが示されている。長期使用による現行の血糖低下剤の有効性の喪失に関連する主要な問題もある。したがって、糖尿病及び関連する状態の治療のための代替の良好の医薬品が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
当該技術分野は、脂肪組織のみが毎日のグルコース取り込み及び産生の２０％未満の処理を担当することを教示しているが、本発明者らは、持続するインスリン非依存性グルコース輸送を誘発し、驚くべきことに糖尿病の個体における上昇したグルコースレベル及び他の代謝障害の持続的低下を提供する新規ペプチドを設計した。
【０００８】
脂肪細胞へのインスリン非依存性グルコース取り込みの誘発が高血糖症及びその下流の代謝結果を逆転させることができるという新規且つ驚くべき発見は、インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みを特異的に標的化する新規な糖尿病療法の設計を可能にする。本発明者らは、本開示の新規のペプチドを設計し、これらのペプチドの脂肪組織への注入が、低血糖を誘発させるか又は体重を変化させることなく、糖尿病の個体の正常血糖を回復させ得ることを示した。
【０００９】
したがって、本発明は、特にインスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みを通した糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害、高インスリン血症又はこれらの組み合わせの治療又は予防のための新規のペプチド組成物に関する。
【００１０】
第１の態様では、本発明は、インスリン非依存性脂肪細胞グルコース輸送を誘発させる１つ以上のペプチドに関し、
−  ペプチド配列は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のセグメントの配列を含み、
−  ペプチドは、少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを含み、
−  ペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有し、及び
−  ペプチド配列は、ＰＫＣのセグメントの前記配列内に１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。
【００１１】
一実施形態では、ペプチドは、アルファヘリカルコンフォメーションを採用する。
【００１２】
別の実施形態では、ペプチドは、ステープリングなどの化学的架橋プロセスによって修飾されている。
【００１３】
更に別の実施形態では、ペプチド配列は、以下の式：Ｍ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｒ、又はＭ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｒ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、好ましくはＭ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＭ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｒの１つに従う配列を含む。これらの配列において、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｍ及びｎは、１〜２０、好ましくは２〜１５、更により好ましくは２〜７の整数であり、且つｍ＋ｎは、３０未満であり、好ましくは、ｍ＋ｎは、２０未満である。
【００１４】
一実施形態では、前記ＰＫＣは、アルファ−ＰＫＣ（αＰＫＣ）、βＩ及びβＩＩ  ＰＫＣを含むベータ−ＰＫＣ（βＰＫＣ）、デルタ−ＰＫＣ、シータ−ＰＫＣ、エータ−ＰＫＣ及びイプシロン−ＰＫＣからなる群から選択され、配列番号１のαＰＫＣがより好ましい。
【００１５】
別の実施形態では、ペプチド配列は、ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、ＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号３）、ＲＬＹＦＶＭＥＹＶＮＧＧＤＬＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰ（配列番号４）、ＭＹＨＩＱＱＶＧＫ−ＦＫＥＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲ（配列番号５）、ＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲＧＩＩＹＲＤＬＫＬＤＮＶＭ（配列番号６）、ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）及びＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）からなる群から選択される配列、好ましくはＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、ＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号３）、ＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲＧＩＩＹＲＤＬＫＬＤＮＶＭ（配列番号６）、ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）及びＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）からなる群から選択される配列、更により好ましくはＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）及びＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）からなる群から選択される配列を含む。場合により、ペプチドは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み、好ましくは１、２又は３個の置換を含む。
【００１６】
更に別の実施形態では、ペプチド配列は、ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号９）、ＭＣＫＥＨＭＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰＤ（配列番号１０）及びＳＩＣＫＧＬＭＴＫＨＰＡＫＲＬＧＣＧＰＥＧ（配列番号１１）からなる群から選択される配列を含み、場合により、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み、好ましくは１、２又は３個の置換を含む。特に、ペプチド配列は、ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号９）、ＭＣＫＥＨＭＭＤＧＶＴＴ−ＲＴＦＣＧＴＰＤ（配列番号１０）及びＳＩＣＫＧＬＭＴＫＨＰＡＫＲＬＧＣＧＰＥＧ（配列番号１１）からなる群から選択される配列において存在することができる。
【００１７】
更に別の実施形態では、本開示のペプチドは、ステープリングなどの化学的架橋プロセスによって修飾されており、好ましくは、ステープルドペプチド配列は、
【化１】
2020525504.tif 000002
、
【化２】
2020525504.tif 000003
、及び
【化３】
2020525504.tif 000004
からなる群から選択される配列からなり、太字であり且つ下線が施されている残基は、ステープリングを担持する。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、本開示のペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明は、薬物として使用するための本開示のペプチドにも関する。
【００１９】
第３の態様では、本発明は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延、好ましくは２型糖尿病の治療又はその進行若しくは発症の遅延において使用するための、本開示によるペプチド及び本開示による医薬組成物に関する。
【００２０】
一実施形態では、本開示によるペプチド又は本開示による医薬組成物は、好ましくは、インスリン、メトホルミン、スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリブリド（グリベンクラミドとも呼ばれる）、グリメピリド、グリピジド、グリカジド、グリコピラミド及びグリキドン）、アルファ−グリコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース、ミグリトール及びボグリボース）、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン及びロシグリタゾン）、メグリチニド（例えば、レパグリニド及びナテグリニド）、インクレチン模倣薬、グルカゴン様ペプチド類似体及び作動薬（例えば、エキセノチド、タスポグルチド及びリラグルチド）、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害薬（例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン及びセプタグリプチン）、アミリン類似体（例えば、プラムリンチド）、グリコ尿酸類（ｇｌｙｃｏｓｕｒｉｃｓ）（例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン及びエンパグリフロジン）又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される別の抗糖尿病薬又は体重減少剤と組み合わせて使用される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本技法のペプチドは、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２１）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＮＨ２（配列番号２２）、Ｈ−ＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２３）、Ｈ−Ｍ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２４）、Ｃｂｚ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号２５）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬ−ＯＨ（配列番号２６）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴ−ＯＨ（配列番号２７）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦ−ＯＨ（配列番号２８）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰ−ＯＨ（配列番号２９）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤ−ＯＨ（配列番号３０）、Ｈ−ＶＥ（ＡＡＢ）ＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３１）、Ｈ−ＶＥＣＴ（ＡＡＨ）−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３２）、Ｈ−ＶＥ（ＡＡＢ）Ｔ（ＡＡＨ）−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３３）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｒ８−ＥＫＲＶＬＡ−Ｓ５−ＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ水素化（配列番号３４）、Ｈ−ＶＥＣＴＭ−Ｓ５−ＥＫＲ−Ｓ５−ＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ−ＯＨ（配列番号３５）及びＨ−ＬＰＨＥＴ−Ｒ８−ＲＬＳＱＫＶ−Ｓ５−ＴＫＬＤＣＬＭＦＶＥＰＡ−ＯＨ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のステープルドペプチドについて、ステープリングは、Ｒ８及びＳ５残基上に位置付けられている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】ＦＡマウスの代謝特性評価である。（Ａ）６ヶ月齢の雄マウスからの平均体重である。（Ｂ）Ａｄｉｐｏ−ｒｅｄで染色した６ヶ月齢の雄マウスからの内臓脂肪組織である。スケールバー：２５μＭ。（Ｃ）６ヶ月齢の雄マウスからのインスリン負荷試験（ＩＴＴ）及び曲線下面積（Ａ．Ｕ．Ｃ．）ｐ＜０．００１）を示す対応するヒストグラムである。（Ｄ）２ヶ月齢の雄マウスからの平均体重である。（Ｅ）Ａｄｉｐｏ−ｒｅｄで染色した２ヶ月齢の雄マウスからの内臓脂肪組織である。スケールバー：２５μＭ。（Ｆ）２ヶ月齢の雄マウスからのＩＴＴ及びＡ．Ｕ．Ｃ．を示すヒストグラムである。（Ｇ）異なる器官；肝臓、心臓、ヒラメ筋、腓腹筋、ＥＤＬ（長指伸筋）、ＷＡＴ（白色脂肪組織）、ｖＷＡＴ（内臓ＷＡＴ）、脳における２ヶ月齢のマウスでのインスリン刺激でオキシグルコース取り込みレベルの測定である。（１遺伝子型当たりｎ＝６〜８匹のマウス）。
【図１−２】ＦＡマウスの代謝特性評価である。（Ａ）６ヶ月齢の雄マウスからの平均体重である。（Ｂ）Ａｄｉｐｏ−ｒｅｄで染色した６ヶ月齢の雄マウスからの内臓脂肪組織である。スケールバー：２５μＭ。（Ｃ）６ヶ月齢の雄マウスからのインスリン負荷試験（ＩＴＴ）及び曲線下面積（Ａ．Ｕ．Ｃ．）ｐ＜０．００１）を示す対応するヒストグラムである。（Ｄ）２ヶ月齢の雄マウスからの平均体重である。（Ｅ）Ａｄｉｐｏ−ｒｅｄで染色した２ヶ月齢の雄マウスからの内臓脂肪組織である。スケールバー：２５μＭ。（Ｆ）２ヶ月齢の雄マウスからのＩＴＴ及びＡ．Ｕ．Ｃ．を示すヒストグラムである。（Ｇ）異なる器官；肝臓、心臓、ヒラメ筋、腓腹筋、ＥＤＬ（長指伸筋）、ＷＡＴ（白色脂肪組織）、ｖＷＡＴ（内臓ＷＡＴ）、脳における２ヶ月齢のマウスでのインスリン刺激でオキシグルコース取り込みレベルの測定である。（１遺伝子型当たりｎ＝６〜８匹のマウス）。
【図１−３】ＦＡマウスの代謝特性評価である。（Ａ）６ヶ月齢の雄マウスからの平均体重である。（Ｂ）Ａｄｉｐｏ−ｒｅｄで染色した６ヶ月齢の雄マウスからの内臓脂肪組織である。スケールバー：２５μＭ。（Ｃ）６ヶ月齢の雄マウスからのインスリン負荷試験（ＩＴＴ）及び曲線下面積（Ａ．Ｕ．Ｃ．）ｐ＜０．００１）を示す対応するヒストグラムである。（Ｄ）２ヶ月齢の雄マウスからの平均体重である。（Ｅ）Ａｄｉｐｏ−ｒｅｄで染色した２ヶ月齢の雄マウスからの内臓脂肪組織である。スケールバー：２５μＭ。（Ｆ）２ヶ月齢の雄マウスからのＩＴＴ及びＡ．Ｕ．Ｃ．を示すヒストグラムである。（Ｇ）異なる器官；肝臓、心臓、ヒラメ筋、腓腹筋、ＥＤＬ（長指伸筋）、ＷＡＴ（白色脂肪組織）、ｖＷＡＴ（内臓ＷＡＴ）、脳における２ヶ月齢のマウスでのインスリン刺激でオキシグルコース取り込みレベルの測定である。（１遺伝子型当たりｎ＝６〜８匹のマウス）。
【図２−１】ＡＬＭＳ１の特異的脂肪組織再活性化（Ａｌｍｓｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ）の生成及びその代謝特性評価である。（Ａ）ネオマイシン遺伝子（ＮＥＯボックス）の停止配列がＡＬＭＳ遺伝子のイントロン領域に導入され、次いで２つのＬｏｘＰ部位で挟まれた状態で、Ｃｒｅ活性を通して標的化組織におけるＡＬＭＳ活性の特異的再導入を生成するためのクローニング戦略を表す概略図である。（Ｂ）Ｃｒｅ活性について、ＬｏｘＰに挟まれた領域が、ＡＬＭＳ１発現を再活性化する停止コドンを含まない１つのＬｏｘＰ部位のみを残して除去される。（Ｃ）アジポネクチン−Ｃｒｅマウス系の脂肪細胞のみに対する特異性評価である。アジポネクチン−ＣｒｅをＲｏｓａ  ＴｏｍａｔｏｅＧＦＰ受容体系と交配することにより、蛍光を発する組織のみがＣｒｅ活性を示す。（Ｄ）所与の遺伝子型を有する異なる標的組織におけるＡｌｍｓ１発現レベルの定量的ＰＣＲ分析である。ＷＴマウスでは、全ての試験した組織は、ＡＬＭＳ１を発現しており、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎでは、発現レベルは、検出されない一方、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−では、脂肪組織のみがＡＬＭＳ１を発現している。（Ｅ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎが肥満化することを示す、指示された遺伝子型を有する雄マウスについての成長曲線である。（Ｆ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎがグルコース不耐性であるが、脂肪組織中でのみＡＬＭＳ１を回復し、耐糖能を回復するのに十分であることを表示する、指示された遺伝子型を有する雄マウスにおけるグルコース負荷試験である。
【図２−２】ＡＬＭＳ１の特異的脂肪組織再活性化（Ａｌｍｓｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ）の生成及びその代謝特性評価である。（Ａ）ネオマイシン遺伝子（ＮＥＯボックス）の停止配列がＡＬＭＳ遺伝子のイントロン領域に導入され、次いで２つのＬｏｘＰ部位で挟まれた状態で、Ｃｒｅ活性を通して標的化組織におけるＡＬＭＳ活性の特異的再導入を生成するためのクローニング戦略を表す概略図である。（Ｂ）Ｃｒｅ活性について、ＬｏｘＰに挟まれた領域が、ＡＬＭＳ１発現を再活性化する停止コドンを含まない１つのＬｏｘＰ部位のみを残して除去される。（Ｃ）アジポネクチン−Ｃｒｅマウス系の脂肪細胞のみに対する特異性評価である。アジポネクチン−ＣｒｅをＲｏｓａ  ＴｏｍａｔｏｅＧＦＰ受容体系と交配することにより、蛍光を発する組織のみがＣｒｅ活性を示す。（Ｄ）所与の遺伝子型を有する異なる標的組織におけるＡｌｍｓ１発現レベルの定量的ＰＣＲ分析である。ＷＴマウスでは、全ての試験した組織は、ＡＬＭＳ１を発現しており、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎでは、発現レベルは、検出されない一方、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−では、脂肪組織のみがＡＬＭＳ１を発現している。（Ｅ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎが肥満化することを示す、指示された遺伝子型を有する雄マウスについての成長曲線である。（Ｆ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎがグルコース不耐性であるが、脂肪組織中でのみＡＬＭＳ１を回復し、耐糖能を回復するのに十分であることを表示する、指示された遺伝子型を有する雄マウスにおけるグルコース負荷試験である。
【図２−３】ＡＬＭＳ１の特異的脂肪組織再活性化（Ａｌｍｓｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ）の生成及びその代謝特性評価である。（Ａ）ネオマイシン遺伝子（ＮＥＯボックス）の停止配列がＡＬＭＳ遺伝子のイントロン領域に導入され、次いで２つのＬｏｘＰ部位で挟まれた状態で、Ｃｒｅ活性を通して標的化組織におけるＡＬＭＳ活性の特異的再導入を生成するためのクローニング戦略を表す概略図である。（Ｂ）Ｃｒｅ活性について、ＬｏｘＰに挟まれた領域が、ＡＬＭＳ１発現を再活性化する停止コドンを含まない１つのＬｏｘＰ部位のみを残して除去される。（Ｃ）アジポネクチン−Ｃｒｅマウス系の脂肪細胞のみに対する特異性評価である。アジポネクチン−ＣｒｅをＲｏｓａ  ＴｏｍａｔｏｅＧＦＰ受容体系と交配することにより、蛍光を発する組織のみがＣｒｅ活性を示す。（Ｄ）所与の遺伝子型を有する異なる標的組織におけるＡｌｍｓ１発現レベルの定量的ＰＣＲ分析である。ＷＴマウスでは、全ての試験した組織は、ＡＬＭＳ１を発現しており、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎでは、発現レベルは、検出されない一方、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−では、脂肪組織のみがＡＬＭＳ１を発現している。（Ｅ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎが肥満化することを示す、指示された遺伝子型を有する雄マウスについての成長曲線である。（Ｆ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎがグルコース不耐性であるが、脂肪組織中でのみＡＬＭＳ１を回復し、耐糖能を回復するのに十分であることを表示する、指示された遺伝子型を有する雄マウスにおけるグルコース負荷試験である。
【図２−４】ＡＬＭＳ１の特異的脂肪組織再活性化（Ａｌｍｓｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ）の生成及びその代謝特性評価である。（Ａ）ネオマイシン遺伝子（ＮＥＯボックス）の停止配列がＡＬＭＳ遺伝子のイントロン領域に導入され、次いで２つのＬｏｘＰ部位で挟まれた状態で、Ｃｒｅ活性を通して標的化組織におけるＡＬＭＳ活性の特異的再導入を生成するためのクローニング戦略を表す概略図である。（Ｂ）Ｃｒｅ活性について、ＬｏｘＰに挟まれた領域が、ＡＬＭＳ１発現を再活性化する停止コドンを含まない１つのＬｏｘＰ部位のみを残して除去される。（Ｃ）アジポネクチン−Ｃｒｅマウス系の脂肪細胞のみに対する特異性評価である。アジポネクチン−ＣｒｅをＲｏｓａ  ＴｏｍａｔｏｅＧＦＰ受容体系と交配することにより、蛍光を発する組織のみがＣｒｅ活性を示す。（Ｄ）所与の遺伝子型を有する異なる標的組織におけるＡｌｍｓ１発現レベルの定量的ＰＣＲ分析である。ＷＴマウスでは、全ての試験した組織は、ＡＬＭＳ１を発現しており、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎでは、発現レベルは、検出されない一方、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−では、脂肪組織のみがＡＬＭＳ１を発現している。（Ｅ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎが肥満化することを示す、指示された遺伝子型を有する雄マウスについての成長曲線である。（Ｆ）Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎがグルコース不耐性であるが、脂肪組織中でのみＡＬＭＳ１を回復し、耐糖能を回復するのに十分であることを表示する、指示された遺伝子型を有する雄マウスにおけるグルコース負荷試験である。
【図３−１】ヒトαＰＫＣアイソフォームに由来する可能性のあるペプチドの同定に結び付くＡＬＭＳ１及びαＰＫＣのインシリコモデル化である。（Ａ）３つの重要なアミノ酸：アルギニン、メチオニン及びプロリンの同定に結び付くＡＬＭＳ１及びαＰＫＣのインシリコモデル化である。（Ｂ）ヒトαＰＫＣアイソフォーム配列に由来する可能性のあるペプチドの同定である。これらの可能性のあるペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ＡＰＫＣ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＡＬＭＳ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（糖尿病のＡＬＭＳを標的とするＡＰＫＣのペプチド）の略語であるＰＡＴＡＤペプチドと称することができる。
【図３−２】ヒトαＰＫＣアイソフォームに由来する可能性のあるペプチドの同定に結び付くＡＬＭＳ１及びαＰＫＣのインシリコモデル化である。（Ａ）３つの重要なアミノ酸：アルギニン、メチオニン及びプロリンの同定に結び付くＡＬＭＳ１及びαＰＫＣのインシリコモデル化である。（Ｂ）ヒトαＰＫＣアイソフォーム配列に由来する可能性のあるペプチドの同定である。これらの可能性のあるペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ＡＰＫＣ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＡＬＭＳ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（糖尿病のＡＬＭＳを標的とするＡＰＫＣのペプチド）の略語であるＰＡＴＡＤペプチドと称することができる。
【図４−１】２つのペプチドのそれらのグルコース吸収惹起能力についてのインビトロ特性評価である。（Ａ）ヒト脂肪細胞中のＦＡＭ標識ステープルドペプチドＡ（配列番号９）及びＢ（配列番号１１）の混合の細胞侵入評価を表示する代表的な写真である。左パネルには、生細胞の取得のためのＤＩＣ：微分干渉コントラストモードが示されている。右パネルには、標識細胞膜（ＰＭ）を用いたＦＡＭ標識ペプチドの蛍光検出が示されている。（Ｂ）図３で同定されたＰＡＴＡＤペプチドの細胞取り込みの３Ｄ画像であり；ペプチドＡ（左パネル）又はペプチドＢ（右パネル）のいずれかで処置された脂肪細胞が脂肪細胞内部のペプチドの内部のスポットを表示している。（Ｃ）ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせによる処置後の、脂肪細胞中のＩＮＳの不在下での２−ＮＢＤＧの吸収を示す写真である。（Ｄ）指示されたペプチド処置（１群当たりｎ＝８）後の、脂肪細胞中のＩＮＳの不在下での細胞内グルコース類似体２−ＮＢの定量化である。（Ｅ）指示されたペプチド処置（１群当たりｎ＝８）後の、脂肪細胞中のＩＮＳの存在下での細胞内グルコース類似体２−ＮＢの定量化である。
【図４−２】２つのペプチドのそれらのグルコース吸収惹起能力についてのインビトロ特性評価である。（Ａ）ヒト脂肪細胞中のＦＡＭ標識ステープルドペプチドＡ（配列番号９）及びＢ（配列番号１１）の混合の細胞侵入評価を表示する代表的な写真である。左パネルには、生細胞の取得のためのＤＩＣ：微分干渉コントラストモードが示されている。右パネルには、標識細胞膜（ＰＭ）を用いたＦＡＭ標識ペプチドの蛍光検出が示されている。（Ｂ）図３で同定されたＰＡＴＡＤペプチドの細胞取り込みの３Ｄ画像であり；ペプチドＡ（左パネル）又はペプチドＢ（右パネル）のいずれかで処置された脂肪細胞が脂肪細胞内部のペプチドの内部のスポットを表示している。（Ｃ）ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせによる処置後の、脂肪細胞中のＩＮＳの不在下での２−ＮＢＤＧの吸収を示す写真である。（Ｄ）指示されたペプチド処置（１群当たりｎ＝８）後の、脂肪細胞中のＩＮＳの不在下での細胞内グルコース類似体２−ＮＢの定量化である。（Ｅ）指示されたペプチド処置（１群当たりｎ＝８）後の、脂肪細胞中のＩＮＳの存在下での細胞内グルコース類似体２−ＮＢの定量化である。
【図５−１】脂肪組織関連内分泌様相及びそれらの全身的影響である。（Ａ）ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせによる皮下注射前及びペプチド注射から１週間後の、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウス及び糖尿病マウスにおけるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）である。（Ｂ）ＤＩＯマウスにおけるペプチド処置についての実験設定の概略図である。（Ｃ）注射部位から得られた脂肪組織の内部の標識細胞膜（ＰＭ）を用いたＦＡＭ標識ペプチドＡ及びＢ（矢印が示した）の蛍光検出である。（Ｄ）ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせによる注射前の及びペプチドの皮下注射から１週間後の、機能的ＡＬＭＳ１を欠如するＡｌｍｓｆｏｚ／ｆｏｚマウスにおけるＧＴＴである。
【図５−２】脂肪組織関連内分泌様相及びそれらの全身的影響である。（Ａ）ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせによる皮下注射前及びペプチド注射から１週間後の、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウス及び糖尿病マウスにおけるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）である。（Ｂ）ＤＩＯマウスにおけるペプチド処置についての実験設定の概略図である。（Ｃ）注射部位から得られた脂肪組織の内部の標識細胞膜（ＰＭ）を用いたＦＡＭ標識ペプチドＡ及びＢ（矢印が示した）の蛍光検出である。（Ｄ）ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせによる注射前の及びペプチドの皮下注射から１週間後の、機能的ＡＬＭＳ１を欠如するＡｌｍｓｆｏｚ／ｆｏｚマウスにおけるＧＴＴである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
驚くべきことに、当該技術分野は、脂肪組織のみが毎日のグルコース取り込み及び産生の２０％未満の処理を担当することを教示しているが、本発明者らは、インスリン非依存性脂肪細胞のグルコース取り込みを誘発させること自体が、肥満糖尿病の個体における正常血糖を回復させ、下流の代謝障害を修正することを見出した。脂肪細胞へのインスリン非依存性グルコース取り込みの単純な誘発が全身肥満関連高血糖症及びその下流の代謝結果を逆転させることができるという新規且つ驚くべき発見は、インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みを特異的に標的化する新規の糖尿病療法の設計を可能にする。本発明者らは、引き続いて本開示の新規のペプチドを設計し、それらの標的のＡｌｍｓ１が細部内タンパク質であるにもかかわらず、驚くべきことに、これらのペプチドの脂肪組織への注入が、高血糖症を誘発するか又は体重を変化させることなく、糖尿病の個体において正常血糖を回復させ得ることを示した。
【００２４】
したがって、本発明は、インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みの誘発を通した高血糖症の治療及び予防のための方法に関する。
【００２５】
定義
ＡＬＭＳ１、アルシュトレーム症候群タンパク質１は、ＡＬＭＳ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＡＬＭＳ１遺伝子中の突然変異は、アルシュトレーム症候群を引き起こすことが判明している。これは、いくつかのデータベース、すなわちＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ  Ｑ８ＴＣＵ４；Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ  ７８４０、ＨＧＮＧ  ＩＤ  Ｎｏ  ４２８に記載されている。参照配列は、ｍＲＮＡについてＮＭ＿０１５１２０．４で、タンパク質についてＮＰ＿０５５９３５．４でＧｅｎｂａｎｋに開示されている。
【００２６】
現在Ａｓ１６０とも呼ばれているＴＢＣ１Ｄ４（ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー４）は、ＲＡＢ２Ａ、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢ１０及びＲＡＢ１４に対してＧＴＰアーゼ活性化タンパク質として作用すると予測されている。これは、いくつかのデータベース、すなわちＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ  Ｏ６０３４３、Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ  ９８８２、ＨＧＮＧ  ＩＤ  Ｎｏ  １９１６５に記載されている。参照配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、ｍＲＮＡについてＮＭ＿０１４８３２．３で、タンパク質について（カノニカル配列として選択されたアイソフォーム１について）ＮＰ＿０５５６４７．２で開示されている。６７８位〜７４０位のアミノ酸の欠落によってアイソフォーム１と異なり、Ｎｏ  Ｏ６０３４３−２でＵｎｉＰｒｏｔにおいて参照されるアイソフォーム２は、細胞膜におけるインスリン誘発性グルコース輸送体ＳＬＣ２Ａ４／ＧＬＵＴ４の転移を促進し、したがってグルコース取り込みを増加させる。
【００２７】
「タンパク質キナーゼＣ」及び「ＰＫＣ」（ＥＣ  ２．７．１１．１３）という用語は、他のタンパク質の機能を、これらのタンパク質上のセリン及びスレオニンアミノ酸残基のヒドロキシル基のリン酸化により制御することに関与するタンパク質キナーゼ酵素のファミリーに相当し且つそれらを指す。ＰＫＣは、典型的には、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）又はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の濃度の増加などのシグナルによって活性化される。ＰＫＣは、いくつかのシグナル伝達カスケードで重要な役割を果たす。
【００２８】
ＰＫＣファミリーは、ヒトにおいて少なくとも１５個のアイソザイムを含み、これらは、３つの主なサブファミリー、従来型（又は古典型）ＰＫＣ、新型ＰＫＣ及び非典型ＰＫＣに分割される。
【００２９】
従来型（ｃ）ＰＫＣは、アイソフォームα、βＩ、βＩＩ及びγを含む。これらのＰＫＣは、活性化のためにＣａ２＋、ＤＡＧ及びホスファチジルセリンなどのリン脂質を必要とする。
【００３０】
新型（ｎ）ＰＫＣは、δ、ε、η及びθアイソフォームを含む。これらのＰＫＣは、活性化のためにＤＡＧを必要とするが、Ｃａ２＋を必要としない。
【００３１】
非典型（ａ）ＰＫＣは、ζ、ι及びλアイソフォームを含む。これらのＰＫＣは、活性化のためにＣａ２＋もジアシルグリセロールも必要としない。
【００３２】
αＰＫＣ、ＰＫＣ−Ａ又はＰＫＣ−アルファとも呼ばれるタンパク質キナーゼＣアルファ型は、カルシウム及び二次メッセンジャーのジアシルグリセロールによって活性化され得るセリン特異的及びスレオニン特異的タンパク質キナーゼのファミリーに属する。これは、いくつかのデータベース、すなわちＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｎｏ  Ｐ１７２５２、Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ  ９３９３、ＨＧＮＧ  ＩＤ  Ｎｏ  ５５７８に記載されている。参照配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、ｍＲＮＡについてＮＭ＿０２７３７．２で、タンパク質についてＮＰ＿００２７２８．１で開示されている。ヒトαＰＫＣのタンパク質配列は、配列番号１で開示されている。
【００３３】
「からなる」、「から本質的になる」又は「実質的に含む」：１つ又は複数の要素への言及などの用語を用いる本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書での記述は、特に明記しない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から本質的になる」又はそれを「実質的に含む」本発明の類似の態様又は実施形態に対して支援を与えることを意図している。例えば、特定の配列を含むとされる本明細書に記載のペプチド又はタンパク質は、特に明記しない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、その配列からなるペプチド又はタンパク質も記述しているものとして理解されるべきである。「から本質的になる」とは、ペプチド又はタンパク質がその配列からなるが、それが、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、付加、欠失又はこれらの混合、好ましくは１、２、３、４又は５個の置換、付加、欠失又はこれらの混合も含み得ることを意図している。特に、「〜において本質的に存在する」とは、ペプチドが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の追加のアミノ酸をＮ及び／又はＣ末端で含み得、好ましくは１、２、３、４又は５個の追加のアミノ酸及び／又は１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得ることを意図することができる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「置換」とは、ペプチド配列における単一のアミノ酸の別のアミノ酸による交換を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「欠失」とは、ペプチド配列における単一のアミノ酸の除去を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「挿入」又は「付加」とは、ペプチド配列における単一のアミノ酸の付加に相当し且つそれを指す。
【００３７】
本明細書に開示されるペプチド配列において、アミノ酸は、以下の命名法に従い、それらの１つの文字コードで表される：Ａ：アラニン；Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファン及びＹ：チロシン。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」は、２つのペプチドのアミノ酸とアミノ酸との正確な対応を指す。同一性のパーセントは、配列を整列させ、２つの整列させた配列間の正確な一致数を計数し、より短い配列の長さで割って、結果に１００を乗じることによって２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定することができる。
【００３９】
配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを用いる２つのペプチド配列のアライメントによって決定することができる。同様な長さの配列は、長さ全体にわたって配列を最適に整列させるグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を用いて整列させることが好ましい一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いて整列させることが好ましい。次いで、配列は、これらが少なくとも特定の最小割合の配列同一性を共有するとき（例えば、デフォルトパラメータを用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列されるとき）、「実質的に同一」又は「本質的に同様」と称され得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを用いて、２つの配列をそれらの長さ全体（完全長）にわたって整列させ、一致数を最大化し、且つギャップ数を極小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が同様な長さを有する場合、配列同一性を決定するために適切に使用される。
【００４０】
「増加した」、「増加させる」又は「増強させる」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された測定値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ増加した測定値を指すことを意図している。「減少した」又は「減少させる」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された測定値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ減少した測定値を指すことを意図している。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」又は「治療すること」という用語は、疾患の治癒、軽減又は遅延など、患者の健康状態を改善することを意図する任意の行為を指す。これは、予防的処置及び治療的処置を含む。治療という用語は、特に耐糖能異常の修正、遅延又は低減を明示している。「治療」という用語は、グルコース取り込み（例えば、脂肪細胞によるグルコースの捕捉）の向上又は上昇した血糖若しくはインスリン抵抗性のあらゆる悪影響の逆転も明示している。本発明に関連して、「血糖値を制御する」又は「血糖値の制御」という用語は、異常なレベル（すなわち正常なグルコース恒常性を有する対応する哺乳動物対象について既知の基準値、中央値又は平均値を下回るか又は上回るレベル）を有する哺乳動物対象における血糖値又は血漿グルコースレベルの正常化又は調節を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症、好ましくは糖尿病、更により好ましくは２型糖尿病を治療するか又はその進行若しくは発症を遅延させる、本開示のペプチドの量又は本開示の医薬組成物の量を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」、「活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」及び「医薬品有効成分」という用語は、治療効果を有する医薬組成物の構成成分に相当し且つそれを指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症、好ましくは糖尿病、更により好ましくは２型糖尿病を治療するか又はその進行若しくは発症を遅延させることができる、本開示のペプチドなどの有効成分又は本開示による医薬組成物によって誘発された効果を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「賦形剤又は薬学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物中に存在する有効成分以外の任意の成分を指す。その添加は、特定の一貫性又は他の物理的若しくは味覚的特性を最終生成物に付与することを目的とし得る。賦形剤又は薬学的に許容される担体は、有効成分とのいかなる相互作用、特に化学的相互作用も欠いている必要がある。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」又は「患者」は、置き換え可能であり、動物、好ましくは哺乳動物、更により好ましくは成人、児童、新生児及び出生前のヒトを含むヒトを指す。
【００４７】
本明細書では、「約」という用語は、所定値の±１０％の値の範囲を指す。例えば、「約５０」は、５０の±１０％の値、すなわち４５〜５５の範囲にある値を含む。好ましくは、「約」という用語は、所定値の±５％の値の範囲を指す。
【００４８】
ペプチド
本開示によるペプチドは、脂肪細胞へのインスリン非依存性グルコース取り込みを誘発し、これにより糖尿病の個体において正常血糖を回復させるか、又は糖尿病の個体における血糖症を改善することができる。
【００４９】
本開示によるペプチドは、少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを含む。
【００５０】
一態様では、本開示のペプチドは、アルファヘリックスコンフォメーションを有する。本明細書で使用される場合、「アルファヘリックス」、「α−ヘリックス」、「古典型ポーリング−コリー−ブランソンα−ヘリックス」及び「３．６１３−ヘリックス」は、互いに同等であり且つ互いを指す。「アルファヘリックス」という用語は、全ての骨格Ｎ−Ｈ基が、水素結合を、タンパク質配列に沿って３〜４個の残基前に位置するアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基に提供する、右巻き又はらせんコンフォメーション（ヘリックス）である、タンパク質の二次コンフォメーションにおける共通モチーフを指す。アルファヘリックスは、約３．６個の残基の１ヘリックスターン当たりの残基の平均数を有し、１３個の原子が水素結合によって形成された環に含まれる。
【００５１】
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、アルファヘリックスコンフォメーションを有し、且つ／又はアルファヘリックスコンフォメーションと予測される配列を有する。ペプチドのコンフォメーションを決定するための方法、例えば円二色性又はＮＭＲは、当業者に周知である。同様に、ペプチドのアルファヘリックスコンフォメーションを予測するための方法も当業者に周知であり、例えばＳＴＲＩＤＥ（Ｆｒｉｓｈｍａｎ  Ｄ．，Ａｒｇｏｓ  Ｐ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．２３，ｎｏ  ４、１９９５，ｐ．５６６−５７９）；ＤＥＦＩＮＥ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｆ．Ｍ．，Ｋｕｎｄｒｏｔ  Ｃ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．３，ｎｏ  ２，１９８８，ｐ．７１−８４）；ＤＳＳＰ（Ｔｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１５；４３：Ｄ３６４−Ｄ３６８；Ｋａｂｓｃｈ＆Ｓａｎｄｅｒ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．１９８３，２２，２５７７−２６３７）である。
【００５２】
別の特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、それをアルファヘリックスコンフォメーションで維持するために設計又は修飾される。当該技術分野において既知であるように、これは、生物学的効果に重要ではないアミノ酸の置換によるアミノ酸の修飾、非天然アミノ酸の使用、ペプチド環化及びペプチド骨格への修飾若しくはペプチド鎖のアミノ酸間の化学結合の付加を含む様々な方法を介して達成することができる。このような修飾は、例えば、それらの熱安定性及びプロテアーゼ安定性を増大させるために行うことができる。
【００５３】
特に、本開示のペプチドは、化学的架橋によって修飾される。例えば、本ペプチドは、ステープルドペプチドである。一実施形態では、本開示のペプチドは、ステープル化されている。「ステープルドペプチド」又は「ステッチドペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド二次コンフォメーションが、ペプチド中の隣接するα−ヘリックスのターンを接続する１つ以上の人工的な分子架橋（ブリッジ）で安定化されている、人工的に修飾されたペプチドを指す。ステープルドペプチドを調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれるＶｅｒｄｉｎｅ＆Ｈｉｌｉｎｓｋｉ（２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，５０３，３−３３）、国際公開第１００３３６１７号パンフレット及び国際公開第１００１１３１３号パンフレットに記載されている。
【００５４】
一実施形態では、本開示のステープルドペプチドの架橋は、ｉ＋３、及び／又はｉ＋４、及び／又はｉ＋７架橋である。ペプチドにおいて、「ｉ＋３架橋」は、アミノ酸、「ｉ」アミノ酸と、ｉアミノ酸から３個のアミノ酸残基の距離で存在する別のアミノ酸との間の架橋である。ペプチドにおいて、「ｉ＋４架橋」は、アミノ酸、「ｉ」アミノ酸と、ｉアミノ酸から４個のアミノ酸残基の距離で存在する別のアミノ酸との間の架橋である。ペプチドにおいて、「ｉ＋７架橋」は、アミノ酸、「ｉ」アミノ酸と、ｉアミノ酸から７個のアミノ酸残基の距離で存在する別のアミノ酸との間の架橋である。
【００５５】
特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、環式ペプチドである。本明細書で使用される場合、「環式ペプチド」又は「環状ペプチド」は、Ｎ末端及びＣ末端、又はＮ末端及び別のアミノ酸の側鎖、好ましくはＣ末端アミノ酸、又はＣ末端及び別のアミノ酸の側鎖、好ましくはＮ末端アミノ酸、あるアミノ酸の側鎖及び別のアミノ酸の側鎖、好ましくはＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸が共有結合で連結され、環コンフォメーションを生成するペプチドに相当し且つそれを指す。本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」、「アミノ末端」、「ＮＨ２末端」、「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）」及び「アミン末端」という用語は、ペプチドの最初のアミノ酸に存在する遊離アミノ基（−ＮＨ２）に相当し且つそれを指す。本明細書で使用される場合、「Ｃ末端」、「カルボキシル末端」、「カルボキシ末端」、「Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）」及び「ＣＯＯＨ末端」という用語は、ペプチドの最後のアミノ酸に存在する遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に相当し且つそれを指す。
【００５６】
本ペプチドは、以下の式：Ｍ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｒ、又はＭ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｒ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、好ましくはＭ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＰ−（Ｘ）ｍ−Ｒ−（Ｘ）ｎ−Ｍ、又はＲ−（Ｘ）ｍ−Ｍ−（Ｘ）ｎ−Ｐ、又はＭ−（Ｘ）ｍ−Ｐ−（Ｘ）ｎ−Ｒの１つに従う配列を含み得、式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｍ及びｎは、１〜３０の整数であり、且つｍ＋ｎは、５０未満である。
【００５７】
これらの配列において、ｍ及びｎは、１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１５、なおより好ましくは２〜１０、更により好ましくは２〜７に含まれる整数である。或いは、ｍ及びｎは、３〜５に含まれる整数であり得る。
【００５８】
これらの配列において、ｍ＋ｎは、５０未満、好ましくは３０未満、より好ましくは２０未満である。或いは、ｍ＋ｎは、１５未満であり得る。
【００５９】
一実施形態では、ｍ及びｎは、１〜２０の整数であり、且つｍ＋ｎは、３０未満である。
【００６０】
これらの配列において、Ｘは、Ｍ、Ｒ又はＰを含む任意のアミノ酸であり得る。或いは、Ｘは、Ｍ、Ｒ及びＰを除く任意のアミノ酸であり得る。
【００６１】
特に、Ｘは、α−ヘリックス二次コンフォメーションに好ましいアミノ酸であり得る。例えば、このようなアミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択することができ、好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択することができる。
【００６２】
本開示によるペプチドは、１２０個未満のアミノ酸の長さを有する。一実施形態では、本開示によるペプチドは、８０個未満のアミノ酸、より好ましくは６０個未満のアミノ酸、なお好ましくは４０個未満のアミノ酸及び更により好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さを有する。特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、２５個未満のアミノ酸の長さを有する。別の特定の実施形態では、２０個未満のアミノ酸、より好ましくは１５個未満のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、本ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個を超えるアミノ酸の最小長さを有する。例えば、本ペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有する。
【００６３】
特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、以下の特徴の２つ、３つ、４つ又は全てを提示する：
−  これがインスリン非依存性脂肪細胞グルコース輸送を誘発させること、
−  これが少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを含むこと、
−  これが少なくとも８個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
−  これが、ヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次コンフォメーションを採用すること。
【００６４】
より具体的な実施形態では、本開示によるペプチドは、以下の特徴を提示する：
−  これがインスリン非依存性脂肪細胞グルコース輸送を誘発させること、
−  これが少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを含むこと、
−  これが少なくとも８個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
−  これが、ヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次コンフォメーションを採用すること、
−  これが架橋によって安定化されること。
【００６５】
別の特定の実施形態では、本開示によるペプチド配列は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のセグメントの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在する。一実施形態では、ＰＫＣは、従来型ＰＫＣ、新型ＰＫＣ及び非典型ＰＫＣから選択される。特定の実施形態では、ＰＫＣは、従来型ＰＫＣから選択される。なお好ましくは、ＰＫＣは、α、βＩ、βＩＩ及びγＰＫＣからなる群から選択される。更に好ましくは、ＰＫＣは、α、βＩ及びＢＩＩＰＫＣからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、ＰＫＣは、αＰＫＣであり、好ましくはヒトαＰＫＣであり、より好ましくは配列番号１のヒトαＰＫＣである。
【００６６】
一実施形態では、ＰＫＣのセグメントの前記配列は、配列番号１の３３６位〜６７２位の配列に属する。例えば、ＰＫＣのセグメントの配列は、配列番号１の３３６位〜４３２位の配列、配列番号１の４３４位〜５４４位の配列又は配列番号１の５６８位〜５９６位の配列に属し得る。
【００６７】
一実施形態では、ＰＫＣのセグメントの配列は、以下の残基：配列番号１のＦ１１４、Ｄ１１６、Ｃ１１８、Ｌ１２１、Ｎ１３８、Ｑ１４２、Ｉ１４５、Ｐ１４８、Ｇ４３３、Ｅ５４５、Ｓ５６２、Ｓ５６６、Ｆ５９７、Ｄ６０１、Ｗ６０２、Ｋ６０４、Ｅ６０６、Ｇ６２０、Ｔ６３１、Ｖ６６４及びＩ６６７、好ましくは配列番号１のＧ４３３、Ｅ５４５、Ｓ５６２、Ｓ５６７、Ｆ５９７、Ｄ６０１、Ｗ６０２、Ｋ６０４、Ｅ６０６、Ｇ６２０、Ｔ６３１、Ｖ６６４及びＩ６６７を含まない。
【００６８】
好ましくは、ＰＫＣのセグメントの前記配列は、本ペプチドの配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％に相当する。特定の実施形態では、本開示によるペプチド配列は、配列番号１のセグメントの配列において存在する。
【００６９】
好ましくは、前記少なくとも１つのメチオニン、及び／又は１つのプロリン、及び／又は１つのアルギニンは、ＰＫＣのセグメントの配列中に含まれる。より好ましくは、前記少なくとも１つのメチオニン、及び１つのプロリン、及び１つのアルギニンは、ＰＫＣのセグメントの配列に含まれる。
【００７０】
本開示によるペプチドは、置換、欠失及び／又は付加を含み得る。
【００７１】
好ましくは、本ペプチドは、２０個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは１０個以下の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む。特に好ましい実施形態では、本ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、好ましくは１、２、３、４又は５個、より好ましくは１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。これらの置換、欠失、付加は、前記少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンの位置で導入されない。
【００７２】
代替実施形態では、本ペプチドは、ＰＫＣのセグメントの配列、好ましくは配列番号１の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有する。一実施形態では、配列番号１に相当するペプチドの配列の一部は、配列番号１のセグメントの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有する。
【００７３】
別の特定の実施形態では、本開示によるペプチドの配列は、
−  ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、
−  ＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号３）、
−  ＲＬＹＦＶＭＥＹＶＮＧＧＤＬＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰ（配列番号４）、
−  ＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲ（配列番号５）、
−  ＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲＧＩＩＹＲＤＬＫＬＤＮＶＭ（配列番号６）、
−  ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）、
−  ＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）、及び
−  ＲＫＧＴＥＥＬＹＡＩＫＩＬＫＫＤＶＶＩＱＤＤＤＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号１２）、
−  ＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号１３）、並びに
−  ＲＴＦＣＧＴＰＤＹＩＡＰＥＩＩＡＹＱＰＹＧＫＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭ（配列番号１４）
からなる群から選択される配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在することができ、場合により、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む。好ましくは、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。より好ましくは、それは、１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。好ましくは、置換、欠失、付加は、少なくとも１つのＭ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。より好ましくは、置換、欠失、付加は、Ｍ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。加えて、置換、欠失、付加の数は、配列番号１のセグメントの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を保持するように選択される。
【００７４】
一態様では、本開示によるペプチドの配列は、
−  ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、
−  ＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号３）、
−  ＲＬＹＦＶＭＥＹＶＮＧＧＤＬＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰ（配列番号４）、
−  ＭＹＨＩＱＱＶＧＫＦＫＥＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲ（配列番号５）、
−  ＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲＧＩＩＹＲＤＬＫＬＤＮＶＭ（配列番号６）、
−  ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）、及び
−  ＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、場合により、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む。好ましくは、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。より好ましくは、それは、１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。好ましくは、置換、欠失、付加は、少なくとも１つのＭ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。より好ましくは、置換、欠失、付加は、Ｍ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。加えて、置換、欠失、付加の数は、配列番号１のセグメントの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を保持するように選択される。
【００７５】
別の態様では、本開示によるペプチドの配列は、
−  ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、
−  ＰＦＬＴＱＬＨＳＣＦＱＴＶＤＲＬＹＦＶＭ（配列番号３）、
−  ＰＱＡＶＦＹＡＡＥＩＳＩＧＬＦＦＬＨＫＲＧＩＩＹＲＤＬＫＬＤＮＶＭ（配列番号６）、
−  ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）、
−  ＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、場合により、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む。好ましくは、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。より好ましくは、それは、１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。好ましくは、置換、欠失、付加は、少なくとも１つのＭ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。より好ましくは、置換、欠失、付加は、Ｍ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。加えて、置換、欠失、付加の数は、配列番号１のセグメントの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を保持するように選択される。
【００７６】
特定の態様では、本開示によるペプチドの配列は、
−  ＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰ（配列番号２）、
−  ＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰ（配列番号７）、
−  ＭＴＫＨＰＡＫＲ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、場合により、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む。好ましくは、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。より好ましくは、それは、１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。好ましくは、置換、欠失、付加は、少なくとも１つのＭ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。より好ましくは、置換、欠失、付加は、Ｍ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。加えて、置換、欠失、付加の数は、配列番号１のセグメントの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を保持するように選択される。
【００７７】
或いは、本開示によるペプチドの配列は、
−  ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号９）、
−  ＭＣＫＥＨＭＭＤＧＶＴＴＲＴＦＣＧＴＰＤ（配列番号１０）、及び
−  ＳＩＣＫＧＬＭＴＫＨＰＡＫＲＬＧＣＧＰＥＧ（配列番号１１）
からなる群から選択される配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、場合により、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含む。好ましくは、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。より好ましくは、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。好ましくは、置換、欠失、付加は、少なくとも１つのＭ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。より好ましくは、置換、欠失、付加は、Ｍ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。加えて、置換、欠失、付加の数は、配列番号１のセグメントの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を保持するように選択される。
【００７８】
特定の態様では、本ペプチドは、
−
【化４】
2020525504.tif 000005
、
−
【化５】
2020525504.tif 000006
、及び
−
【化６】
2020525504.tif 000007
からなる群から選択される配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、太字であり且つ下線が施されている残基は、ステープリングを担持する。場合により、本開示によるペプチドは、上で列挙した配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を更に含む。好ましくは、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。より好ましくは、それは、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得る。置換、欠失、付加は、少なくとも１つのＭ、Ｐ及びＲと、ステープリングに使用された２つの残基とが保存されるように選択される。より好ましくは、置換、欠失、付加は、Ｍ、Ｐ及びＲが保存されるようになされる。
【００７９】
本開示によるペプチドは、その細胞内取り込み又は侵入を容易にするための部分、特にＰＴＤ（タンパク質導入ドメイン）を更に含み得る。ＰＴＤは、一般的に、１０〜２０個のアミノ酸の特定のアミノ酸配列を含む（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ，（２００５），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８３，３２４−３２８；Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，２００８，１７８６，１２６−１３８）。ＰＴＤは、主にアルギニン又はリジンなどの塩基性アミノ酸から構成され、ＰＴＤの代表的な例としては、ポリＲ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１５））又は（ＲＲＰＲＲＰＲＲＰＲＲＰＲＲＰ（配列番号１６））などのアルギニンリッチペプチド、（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１７））又はＨＩＶ−Ｔａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１８））などのアンテナペディア若しくはペネトラチンペプチドが挙げられる。
【００８０】
本開示によるペプチドは、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸から作ることができ、好ましくは、少なくとも１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンは、天然アミノ酸である。「非天然アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸（すなわちアラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、プロリン、スレオニン、システイン、メチオニン）の類似体又は誘導体と定義される。これらは、修飾された側鎖、例えばより短いか、より長いか、又は異なる官能基を有する側鎖を提示する。特に、Ｄ異性体がプロテアーゼに感じやすくないため、Ｄ異性体及びＬ異性体が企図される。加えて、タンパク質分解耐性を増加させるために、ペプチド結合の一部又は全てにおける修飾も企図され、特に（−ＣＯ−ＮＨ−）よる、（−ＣＨ２−ＮＨ−）、（−ＮＨ−ＣＯ−）、（−ＣＨ２−Ｏ−）、（−ＣＨ２−Ｓ−）、（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、（−ＣＯ−ＣＨ２−）、（−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−）、（−Ｎ＝Ｎ−）及び／又は（−ＣＨ＝ＣＨ−）によるものである。ペプチドは、カルボキシルＣ末端（−ＣＯＯ−）及びアミド末端（−ＣＯＮＨ２）を提示することができる。本ペプチドは、本明細書に開示されるにように、ペプチドのＤ−レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列でもあり得る。Ｎ末端は、特にアセチルラジカルで修飾され得る。
【００８１】
場合により、本ペプチドは、その安定性を増加させるために、ペグ化することができる。更に、場合により、本ペプチドは、プロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどの非水性のプロトン性溶媒中で製剤化することができる。本ペプチドは、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体ミクロスフェアデポー製剤にもパッケージ化され得る。多くの徐放性送達システムが存在し、これらの多くは、本開示で使用するのに適切である。例えば、ＰＬＧＡ、ポリ乳酸又はポリグリコール酸などの分解性ポリマーに基づくポリマーベースの徐放性組成物は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／１１７８３０号パンフレット及び／又は国際公開第２００６／０７５１２４号パンフレットに記載されるものなど、脂質ベースのデポー製剤として好適である。活性剤の生体分解性ポリマーデポー製剤への製剤化は、十分に確立されており、且つ当該技術分野において周知であり、したがって、本開示のペプチドは、これらの既知の方法を用いて製剤化され得る。好ましくは、本開示の組成物は、ペプチドを機能的濃度で少なくとも１ヶ月間放出することができる。
【００８２】
追加の態様では、本開示によるペプチドは、インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みを誘発させる。インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みは、当業者に既知である任意の方法によって評価することができる。特に、これは、実施例のセクションで記載される方法によって評価される。インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みを誘発させるペプチドは、当該技術分野において既知の任意の技術、特に細胞培養中のグルコースの脂肪細胞への輸送を測定するのに好適な任意の方法を用いて便利にスクリーニングすることができる。ペプチドの効果を評価するための特定の技術は、脂肪細胞内部のグルコース又はグルコース類似体の量を蛍光的に、又は放射活性的に、又は比色分析によるかのいずれかで測定することである。
【００８３】
本発明者らは、脂肪細胞のインスリン非依存性グルコース取り込みを誘発させるための好ましい方法が、ＡＬＭＳ１に結合し、それにより内因性αＰＫＣとＡＬＭＳ１との間の脂肪細胞における相互作用を阻止するペプチド又は化合物を使用することであることを見出した。したがって、一実施形態では、本ペプチドは、αＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合を防止又は解除することができる。次いで、これは、脂肪細胞のインスリン非依存性グルコース取り込みを惹起させる。ペプチド又は化合物のαＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合を阻止するための能力を決定するために、当業者に既知の任意の技術、特にタンパク質相互作用を決定するのに好適な任意の方法を実行することができる。例えば、組換え又は精製されたネイティブＡＬＭＳ１若しくはαＰＫＣを、表面プラズモン共鳴チップ及びチップの上を流れる他の分子に結合させて、例えばＢｉａｃｏｒｅ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，ＵＳＡ）機において結合親和性を評価することができる。同じアプローチを使用して、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの結合親和性を測定することができる。
【００８４】
αＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合に及ぼす本ペプチドの効果は、試験分子の不在下及び存在下でのαＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合を測定することにより、且つαＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合を比較することにより決定される。ＡＬＭＳ１が大きいサイズであるため、本発明者らは、スクリーニング法に細胞系を使用することを選択している。好ましくは、この細胞系は、インスリンに反応性の細胞系である。例えば、細胞系は、間葉系細胞株、間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び脂肪細胞の中から選択することができる。好ましくは、この細胞は、ヒト細胞である。次いで、αＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合についての結合決定をインスリンの不在下又は存在下、好ましくはインスリンの不在下で実行することができる。
【００８５】
第１の態様では、ＡＬＭＳ１を餌（ｂａｉｔ）として用いる免疫沈降アッセイを、特に実験セクションで詳説されるように行うことができる。例えば、このアッセイは、インスリンの不在下で及び／又は存在下、好ましくはインスリンの不在下で培養した細胞、特に脂肪細胞を用いて実行することができる。試験されるペプチドを培養基中に添加する。次いで、αＰＫＣを免疫検出する。
【００８６】
一実施形態では、αＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合の量を決定し、試験ペプチドの不在下、特にインスリンの不在下での量と比較する。ＡＬＭＳ１に結合したαＰＫＣの量が試験ペプチドの存在下で減少している場合、このペプチドが選択される。
【００８７】
第２の態様では、質量分析法に連結した親和性精製を特に化学架橋後に実行することができる。例えば、細胞は、メチオニン及びロイシンを欠いているが、光活性型メチオニン及びロイシンを含む培地中で培養することができる。次いで、タンパク質複合体を安定化させるために細胞にＵＶ照射し、タンパク質複合体を質量分析法によって分析する。
【００８８】
「増加した」、「増加させる」又は「増強させる」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された結合値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ増加した結合値を指すことを意図している。「減少した」又は「減少させる」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された結合値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ減少した結合値を指すことを意図している。
【００８９】
治療適応症
本発明は、上で定義されたペプチドと、薬学的に許容される担体／賦形剤と、場合により別の有効成分とを含む医薬組成物に更に関する。本発明は、薬物として使用するための上で定義されたペプチド又は上で定義されたペプチドの医薬品の製造のための使用にも関する。
【００９０】
糖尿病は、高血糖症によって特徴付けられる。より詳細には、２型糖尿病は、高血糖症及びインスリン抵抗性によって特徴付けられる。この疾患に遺伝的にかかりやすい人々において、肥満症が２型糖尿病の主な原因であると考えられている。糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害は、糖尿病及びインスリン抵抗性に関連する周知の障害である。
【００９１】
本発明の発見は、脂肪細胞グルコース取り込みを誘発させる本開示のペプチドが、肥満症によって引き起こされる高血糖症を逆転する上で驚くほど有効であることである。本発明者らは、本明細書に開示されるペプチド及び医薬組成物の、特に脂肪細胞によるグルコース取り込みを誘導し、これにより、改善された血糖コントロールをもたらすための使用を提案する。更にまた、本ペプチド及び約組成物は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延に好適である。
【００９２】
本発明は、本発明は、本開示によるペプチド又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む、特にインスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みの誘発を通した高血糖症の治療又は予防のための方法に関する。インスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みの誘発は、糖尿病の個体において正常血糖を回復し、下流の代謝障害を修正し得ることが示されている。本発明は、本開示によるペプチド又はそれを含む医薬組成物、特にインスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みの誘発を通して高血糖症を治療又は予防するための医薬品の製造のための使用にも関する。加えて、本発明は、特にインスリン非依存性脂肪細胞グルコース取り込みの誘発を通した高血糖症の治療又は予防に使用するための、本開示によるペプチド又はそれを含む医薬組成物に関する。
【００９３】
本発明は、対象の糖尿病を治療するために使用される場合にインスリンの用量を低減させるか、又はインスリン治療を停止させるための、本開示によるペプチド又はそれを含む医薬組成物、本開示によるペプチドの、対象の糖尿病を治療するために使用される場合にインスリンの用量を低減させるか、又はインスリン治療を停止させるための医薬品の製造のための使用又は対象の糖尿病を治療するための方法であって、治療有効量の本開示によるペプチド又は医薬組成物は、インスリンの用量が減少されたか、又はインスリン治療が不在の対象に投与される、方法に関する。より一般的には、本開示によるペプチド又は医薬組成物は、抗糖尿病薬の用量を低下させるために使用することができる。本発明は、本ペプチドの製薬的使用又は獣医学的使用に関する。したがって、対象は、任意の哺乳動物、好ましくは成人、児童、新生児又は出生前のヒトを含むヒト対象であり得る。特定の実施形態では、対象は、肥満症に冒されている対象である。場合により、対象は、検出可能な抗膵島抗体を有さず、且つ膵臓の異常を有さない。獣医学的用途に関して、対象は、動物であり、好ましくは哺乳動物であり、特にイヌ、ネコ、ウマ、ロバ、ウサギ、フェレット、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ラット、マウス又はモルモットなどの愛玩動物であり得る。
【００９４】
本開示によるペプチドは、特に、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延のために、１つ以上の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬又は抗肥満症薬と組み合わせて使用することができる。
【００９５】
したがって、本発明は、本開示によるペプチドと、１つ以上の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬とを含む医薬組成物にも関する。
【００９６】
本発明は、特に、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症、リポジストロフィー、インスリン欠乏、ベータ細胞機能障害又は高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延のための、本開示による医薬組成物と、１つ以上の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬とを同時、別個若しくは逐次使用のための併用製剤として含有するか、又は本開示によるペプチドと１つ以上の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬とを同時、別個若しくは逐次使用のために含む併用製剤を含有する製品又はキットに更に関する。
【００９７】
本発明は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症及び高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延に使用するための、１つ以上の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬と組み合わせた、本開示による医薬組成物に更に関する。
【００９８】
本発明は、特に、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症及び高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延のための医薬品の製造のための、本開示による医薬組成物及び１つ以上の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬に更に関する。
【００９９】
最後に、本発明は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症及び高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延のため方法に関し、治療有効量の本開示による医薬組成物が治療有効量又は治療有効量以下の追加の活性薬物、好ましくは抗糖尿病薬と組み合わせて投与される。「治療量以下」とは、例えば、従来の治療薬量（特に同じ適応症且つ同じ投与経路についての）の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０％であり得る量を指すことを意図する。
【０１００】
特に、追加の活性薬物は、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、冠状動脈疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、インスリン抵抗性、高血糖症、肥満症及び高インスリン血症の治療又はその進行若しくは発症の遅延のために使用される薬物である。例えば、追加の薬物は、血糖降下薬又は抗高血糖薬などの抗糖尿病薬であり得る。これは、インスリン、メトホルミン、スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド、グリカジド、グリコピラミド及びグリキドン）、アルファ−グリコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース、ミグリトール及びボグリボース）、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン及びロシグリタゾン）、メグリチニド（例えば、レパグリニド及びナテグリニド）、インクレチン模倣薬、グルカゴン様ペプチド類似体及び作動薬（例えば、エキセノチド、タスポグルチド及びリラグルチド）、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害薬（例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン及びセプタグリプチン）、アミリン類似体（例えば、プラムリンチド）、グリコ尿酸類（ｇｌｙｃｏｕｒｉｃｓ）（例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン及びエンパグリフロジン）又はこれらの任意の組み合わせを含む制限列挙において選択され得る。
【０１０１】
医薬組成物の剤型、投与の経路、投与量及びレジメンは、当然ながら、治療される病態、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【０１０２】
本開示の医薬組成物又は治療用組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与などに製剤化することができる。
【０１０３】
本開示の医薬組成物で使用されるペプチドは、治療有効量で存在する。
【０１０４】
本ペプチドを含む医薬組成物は、当業者に既知である標準的な医薬品実践規範（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００  ａｎｄ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って製剤化される。
【０１０５】
一態様では、本発明は、ペプチド又はその塩を含む、本開示による医薬組成物の非経口注射のための安定な製剤を提供し、このペプチドは、乾燥され、次いで使用前に溶媒中で再構成される。本ペプチド（又は製剤が２つ以上のペプチドを含む実施形態では、ペプチドのそれぞれ）は、非揮発性緩衝液と混合され、乾燥ペプチド粉末に乾燥される。好適な緩衝液としては、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝液は、グリシン緩衝液である。別の実施形態は、緩衝液は、クエン酸緩衝液とリン酸緩衝液との混合物である。製剤が２つ以上のペプチドを含むいくつかの実施形態では、第１の緩衝液と第２の緩衝液とは、同じである。製剤が２つ以上のペプチドを含むいくつかの実施形態では、第１の緩衝液と第２の緩衝液とは、異なる。或いは、本開示による医薬組成物は、水溶液状態で保存され得る。この溶液は、必要に応じて、更なる添加剤又は賦形剤を含有し得、更なる添加剤又は賦形剤は、有効成分と適合性がなければならず、これらが凍結乾燥段階中に除去されない場合、これらは、投与の経路とも適合性がなければならない。非経口投与について、本組成物は、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内注射され得る。これは、好ましくは、体内に埋め込まれた浸透圧ミニポンプ又は他の制御送達装置を用いて配置され得る。好ましくは、これは、他の化合物と混合されて、徐放性デポー製剤を作製することができる。好ましい投与経路は、インスリンペンに類似する使い捨て又はマルチユニット分配装置を用いる皮下注射である。
【０１０６】
一実施形態では、本開示のペプチドは、他の化合物と混合されて、徐放性デポー製剤を作製し得る。次いで、これが皮下注射されて、徐放性デポーを形成することができる。
【０１０７】
経口投与について、本組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤及びシロップ剤、エリキシル剤並びに濃縮滴剤などの液状製剤などの従来の経口剤形に製剤化することができる。例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩などを含む非毒性固体担体又は希釈剤が使用され得る。圧縮錠剤について、粉末状材料に粘着性を付与する薬剤である結合剤も必要である。例えば、デンプン、ゼラチン、乳糖又はデキストロースなどの糖類及び天然又は合成ガムは、結合剤として使用することができる。錠剤の崩壊を容易にするために、錠剤では崩壊剤も必要である。崩壊剤としては、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、ガム及び架橋ポリマーが挙げられる。更に、製造プロセス中の錠剤材料の表面への接着を防止し、製造中の粉末材料の流動特性を改善するために、滑沢剤及び流動促進剤も錠剤中に含まれる。コロイド状二酸化ケイ素は、流動促進剤として最も一般的に使用され、タルク又はステアリン酸などの化合物は、滑沢剤として最も一般的に使用される。
【０１０８】
経皮投与について、本組成物は、軟膏剤、クリーム剤又はゲル剤の剤型に製剤化することができ、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド及びジメチルホルムアミドなどの適切な浸透剤又は洗浄剤を用いて浸透を容易にすることができる。
【０１０９】
経粘膜投与について、鼻腔スプレー、肺内吸入、直腸又は膣坐剤を使用することができる。一実施形態では、本発明は、当該技術分野において既知の方法に従って肺内薬物送達装置を使用して投与される乾燥粉末又は液体製剤のいずれかを用いる肺内経路によって投与され得る。活性化合物は、当該技術分野において既知の方法により、既知の坐剤基剤のいずれかに組み込むことができる。このような基剤の例としては、ココアバター、ポリエチレングリコール（カーボワックス）、ポリエチレンソルビタンモノステアレート及びこれらと、融点又は溶出速度を修正するための他の適合性材料との混合物が挙げられる。
【０１１０】
本開示による医薬組成物は、活性薬物を実質的に投与時に放出するか、又は投与後の任意の所定の時間若しくは期間に放出するように製剤化され得る。
【０１１１】
本開示による医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体と共に、本開示の１つ以上のペプチドを含むことができる。これらの賦形剤及び／又は担体は、上に記載した投与の剤型に従って選択される。
【０１１２】
特定の実施形態では、本開示による医薬組成物は、１０ｎｇ〜１０ｇの本開示のペプチドを含む。一実施形態では、本開示による医薬組成物は、０．０１ｍｇ〜１ｇの本開示のペプチドを含む。
【０１１３】
科学論文及び研究要約、公開された特許出願、付与された特許又は任意の他の文献を含む、本出願で引用された全ての文献は、これらの文献の全ての結果、表、図及びテキストを含む全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
異なる意味を有するが、「含む」、「有する」、「〜において存在する」及び「含有する」は、本出願全体において一方を他方に置き換えることができる。
【０１１５】
本開示の更なる態様及び利点は、以下の実施例で記載されるが、実施例は、例示的なものであり、非限定的なものとして解釈されたい。
【実施例】
【０１１６】
材料及び方法
動物の飼育
動物試験を地元の倫理委員会の勧告に従って実施した。Ａｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚ（ｆａｔ  Ａｕｓｓｉｅ、ＦＡ）マウス及びＡｌｍｓ１＋／＋（ＷＴ）同腹仔を、病原生物が存在しない条件下、１２時間ごとの明／暗周期においてＣ５７ＢＬ／６Ｊのバックグランドで維持した。マウスを、水及び正常食を自由に摂取できるようにした。ｆｏｚ突然変異に隣接するプライマー：フォワードＡＣＡ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＴ（配列番号１９）；リバースＴＴＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＡＡＡ（配列番号２０）をＰＣＲジェノタイピングのために使用した。食餌誘発性肥満及び耐糖能障害のマウスについて、Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ  ６雄マウスを、水及び６０％の高脂肪／高糖食餌を自由に摂取できるようにした。
【０１１７】
インスリン負荷試験（ＩＴＴ）及びグルコース負荷試験（ＧＴＴ）
マウスをＩＴＴ及び腹腔内ＧＴＴによりインスリン抵抗性について試験した。ＩＴＴは、４時間絶食したマウスで実施した。インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，ＵＳＡ）を０．９％の生理食塩水（Ｐｆｉｚｅｒ，ＵＳＡ）中、０．５Ｕ／ｋｇ体重でｉ．ｐ．注射した。ＧＴＴは、１８時間絶食したマウスで実施した。グルコースを０．９％の生理食塩水中、２ｇ／ｋｇ体重で注射した。尾を採血のために切り取り、血漿グルコースをＧＴＴ中の０、１５、３０、６０及び１２０分に血糖値測定器（Ｏｐｔｉｕｍ  Ｘｃｅｅｄ，Ａｂｂｏｔｔ，ＵＳＡ）を用いて決定した。或いは、顎下出血を介して４時間絶食したマウスの意識のある動物で採取した血液を用いて血漿インスリン測定を実施し、市販の超感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて空腹時インスリンを分析した。
【０１１８】
脂肪組織のＡｄｉｐｏＲｅｄ染色
生後６０日目及び１２０目のマウスの脂肪組織を単離し、ＰＢＳ（３．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で簡単に洗浄した。次いで、試料を４％のパラホルムアルデヒド（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２中）中に１５分間配置し、ＰＢＳで洗浄し、３０μＭのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含むＡｄｉｐｏＲｅｄ染料（１／２５；Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、試料をスライドグラス上に載せ、ＢＸ５０経口顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を用いて写真を撮影した。
【０１１９】
インスリン依存性グルコース取り込み
高脂肪食餌（特殊飼料；ＳＦ０３−０２０；ＡＩＮ９３Ｇに基づく、２３％の脂肪、０．１９％のコレステロール、単純糖質）を与えられたマウスを実験開始前３〜６時間絶食させた。インスリン０．７５Ｕ／ｋｇを３μＣｉの２−［１−Ｃ１４］デオキシ−Ｄ−グルコース（ＤＯＧ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と組み合わせて、尾静脈を介してｉ．ｖ．注射した。注射後、０、５、１０、１５、２０、４０及び６０分に血糖及び試料を尾から採取した。マウスを犠死させて（頸椎脱臼）、肝臓、筋肉（両側ヒラメ筋及びＥＤＬ＝解糖筋；左大腿）、心臓、皮下脂肪組織、内臓脂肪組織（腎周囲）を単離し、氷冷したＰＢＳ中で濯ぎ、フリントフリーティッシュペーパー上で迅速に乾燥させて、秤量した。次いで、単離組織片を小片に細かく切り刻んで、再度秤量し、次いで１ＮのＮａＯＨ中、６０℃で１時間ホモゲナイズし、次いでＨＣｌ（１Ｍ）で中和した。ホモジネートの一部を用いて、６％の過塩素酸（ＰＣＡ）でタンパク質を沈殿させて上清をシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定することにより、デオキシグルコース＋デオキシグルコース−６−Ｐを決定した。他の部分を０．３ＮのＺｎＳＯ４と混合して、デオキシ−グルコース−６−Ｐと反応させて、複合体を０．３ＮのＢａ（ＯＨ）２で沈殿させ、上清をシンチレーション測定に使用した。
【０１２０】
Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−グルコースフェノタイピング
これまで、ＡＬＭＳ変異体マウスの脂肪組織のみが、注入された放射活性グルコースを吸収していないという本発明者らの以前の発見に支えられていたため、本発明者らのアプローチは、脂肪組織のグルコース再吸収を標的化することに基づいてきた。ＡＬＭＳマウスにおける糖尿病表現型を推進するのが脂肪組織及び脂肪組織のみであることを完全に実証するために、本発明者らは、脂肪組織におけるＡＬＭＳ１遺伝子を特異的に不活性化し、その後、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を実施する予定である。このようにして、本発明者らは、脂肪組織が循環グルコースのわずか２０％を吸収するに過ぎないとはいえ、全身性血糖を制御するために大きい役割を果たすことを証明し、したがってグルコース恒常性を回復するために脂肪組織を標的化する本発明者らのペプチドアプローチが適切なアプローチであることを確立するであろう。
【０１２１】
ＡＬＭＳ１モデリング
ホモロジーモデリングプログラムのモデラー（Ｍｏｄｅｌｅｒ）によるセグメントモデリング法を用いて、ＡＬＭＳ１の３Ｄモデルを構築した。Ａｌｍｓ１の各エクソンについてのアミノ酸配列を、ＰＩＳＲＥＤサーバにおいて利用可能なプロファイルベースのスレッディングアルゴリズムに投入し、好適な鋳型を同定した。次いで、これらの同定した鋳型タンパク質を対応のエクソン配列と整列させて、モデラーを用いて各エクソンを別々にモデル化した。エネルギー最適化及びモデルの選択を離散最適化タンパク質エネルギースコアに基づいて実行した。最後に、モデルを組み立てて、完全長Ａｌｍｓ１のコンフォメーションを構築し、完全長タンパク質を、分子動力学シミュレーションプログラムＮＡＭＤを用いてコンフォメーション緩和し、且つ極小化させた。
【０１２２】
脂肪細胞中のペプチド発現の効果のインビトロ特性評価
ヒト白色内臓脂肪前駆細胞（カタログ番号Ｃ−１２７３２、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を購入した。脂肪前駆細胞を製造元のプロトコルに従って播種し、脂肪前駆細胞増殖培地（カタログ番号Ｃ−２７４１０、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中でコンフルエンスまで培養した。コンフルエンスに達したら、培地の交換により脂肪細胞形生成化を惹起させ、成熟ヒト脂肪細胞を得た。インスリンなしの培養について、インスリンを含まない脂肪細胞基本培地（カタログ番号Ｃ−２４３１、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を５ｇ／Ｌのデオキシグルコース、８μｇ／ｍＬのｄ−ビオチン、４００ｎｇ／ｍＬのデキサメタゾンで補足した（製造元の手順に従って）。天然ペプチド及びそれらのステープルした対応物並びにスクランブルペプチド（アミノ酸の同じセットであるが、ランダムに再配置されたものに相当する）をＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから購入した。各ペプチドを生理食塩水中で希釈し、インビトロ試験のために細胞培養物表面積１０平方ｃｍ当たり２．５ｎｇの用量で使用するか、又はマウス１匹当たり２．５ｎｇの各ペプチド（Ａ及びＢ）を注射した。
【０１２３】
蛍光撮像実験
細胞をｐｅｒｍａｎｏｘ  ８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩチャンバースライド（カタログ番号１７７４４５、ＮＵＮＣ）上に播種した。細胞を、指示されたように処理した。次いで、メタノール固定及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による透過処理後、細胞及び組織の両方の凍結切片をタンパク質検出のために処理した。顕微鏡スライドにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を載せた。膜結合タンパク質を可視化するために、細胞を１５分間ホルマリン固定し、直接ブロックし、続いて免疫染色し、正立Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ２顕微鏡を用いて取得した。画像解析、３Ｄ再構成並びにタイムラプス実験及びエンドソーム追跡実験を、対応する３Ｄ及びＴｒａｃｋｉｎｇ  Ｚｅｉｓｓモジュールを用いたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎプログラム又はＺｅｉｓｓ  Ｚｅｎ  ２０１２撮像プラットフォームのいずれかを用いて実施した。インビトログルコース吸収について、細胞を蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤＧと共に核対比染色のためのＤＡＰＩと３０分間インキュベートした。次いで、細胞を通常の培養基で洗浄して、写真を取得した。
【０１２４】
選択されたペプチドについてのグルコース吸収のインビトロ評価
成熟脂肪細胞を９６ウェルプレートで培養した。脂肪細胞に対し、異なるペプチドを上記に示した濃度で受容させた。２４時間後、Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎからのグルコース吸収比色アッセイキット（カタログ番号Ｋ６７６−１００）を用いて、処理された細胞のグルコース吸収能を評価した。
【０１２５】
異なるマウスモデル（食餌誘発性糖尿病ＷＴ、対照の非肥満の通常食餌飼育のＦＡマウス）プロトコルにおける２つのペプチドについての急性耐性試験
作業ストックは、生理食塩水中の各試験ペプチド１０ｎｇ／ｍＬである。
グルコース２２％（１：２グルコース；ＮａＣｌ）又はＮａＣｌの０．９％溶液を作製する。
ペプチド注射の前にマウスを４〜５時間絶食させる。
各マウスを秤量し、平均値を算出し、マウスの数（２匹多いマウスを数える）を乗じる。
ペプチド注射についてマウス１匹当たり２．５μＬのペプチドＡ及び２．５μＬのペプチドＢを注射する。
マウスの平均値×（マウスの数＋２）＝Ｘ１
Ｘ１×１０＝総容量（ＴＶ）
グルコース２２％の容量＝ＴＶ−（２．５ペプチドＡ×（マウスの数＋２））＋（２．５ペプチドＢ×（マウスの数＋２））
各マウスに対して１００μＬ／１０ｇの容量の注射器を準備する。
尾を１ｍｍ切除し、血糖値測定器「Ｓｔａｒｔｒｉｐ」を用いて血糖を測定する（Ｔ０）。
グルコースを各動物に注射し、注射は、右側腹腔内でなければならず、針を約１ｃｍ挿入する。
血糖測定器による測定は、３０分ごとに１２０分まで行われる。
ペプチドの抗糖尿病効果を監視するためのＧＴＴに続いて、本発明者らは、マウスを安楽死させて、異なる組織をサンプリングした。ホルマリン固定後に固定した脂肪組織をＡｄｉｐｏＲｅｄ及びＤＡＰＩと共に３０分間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、脂肪組織をスライドグラス上に載せ、画像を取得した。他の組織について、凍結切片化を実施し、脂肪組織と同様の方法で染色した。
【０１２６】
実施例１：Ａｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚマウスのグルコースフェノタイピング
アルシュトレーム症候群のマウスモデル、Ａｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚは、６ヶ月齢で肥満となり（図１Ａ）、脂肪組織の肥大（図１Ｂ）と共に重度のインスリン抵抗性（図１Ｃ）を提示する。２ヶ月齢で試験すると、肥満表現型も脂肪組織肥大も発症していないにもかかわらず、Ａｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚは、重度インスリン抵抗性を示し（図１Ｆ）、糖尿病表現型が肥満表現型に対して二次的でないことを示している。インスリン刺激性デオキシグルコース取り込みの研究は、筋肉による代償的に増加したデオキシグルコース吸収を伴うＡｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚのＷＡＴに制限される取り込み障害を示し（図１Ｈ）、脂肪細胞グルコース輸送における特異的な欠陥をＡｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚマウスのインスリン抵抗性の主な部位として指摘した。
【０１２７】
実施例２：Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎアジポネクチンＣｒｅグルコースのフェノタイピング
次に、本発明者らは、Ａｌｍｓ１対立遺伝子が、示されるように（図２Ａ）Ｆｒｔ又はＬｏｘＰ部位のいずれかで隣接されるｌａｃＺ及びネオマイシンコード配列を特異的に導入する構築物で標的化されるマウス系を生成した。ＡＬＭＳ対立遺伝子中のこの配列の導入は、その適切な発現を妨害し、したがってＡＬＭＳ遺伝子についてのノックアウトマウスモデル（Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ）をもたらす。他方では、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ技法を用いることにより、ネオマイシンコード配列を除去することができ（図２Ｂ）、したがって、完全なＡＬＭＳ遺伝子の発現を回復することができる。Ａｄｉｐｏ−Ｃｒｅマウスの脂肪細胞のみを標的化する特異性の検証に関して、本発明者らは、Ｃｒｅ活性時に緑色に変色し、この結果が、脂肪組織中のＡＬＭＳ１発現の特異的再活性化に一致する脂肪細胞中の特異的Ｃｒｅ活性を示す、レポーターマウス系ＲｏｓａＴｏｍａｔｏｅＧＦＰを使用した（図２Ｃ）。異なる標的組織中のＡｌｍｓ１の正規化された発現レベルについての定量的ＰＣＲは、Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−マウスの脂肪組織を除く異なる組織におけるＡＬＭＳ１の完全な不活性化を明らかにした（図２Ｄ）。経時的な体重についてのＡｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎマウスの代謝フェノタイピング及びＧＴＴを２ヶ月目に実施した。Ａｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎマウスは、肥満及びグルコース不耐性になった（図２Ｅ〜Ｆ）。脂肪組織にけるＡＬＭＳ１の特異的回復を有するＡｌｍｓ１ｆｌｉｎ／ｆｌｉｎ；アジポネクチン−Ｃｒｅ＋／−マウスは、肥満症及びグルコース不耐性に対して防御され、脂肪組織におけるＡＬＭＳ１の役割がグルコース恒常性にとって重要であることを示している。
【０１２８】
実施例３：ＡＬＭＳに対するαＰＫＣ結合のインシリコ予測
ＡＬＭＳ１によるαＰＫＣのインシリコモデリングに基づいて、本発明者らは、３つの重要なアミノ酸残基、すなわちメチオニン、アルギニン及びプロリンを同定した。これらの３つのアミノ酸残基を完全なαＰＫＣタンパク質配列中で探し出すことにより、３つの可能性のあるペプチド配列を最終候補とした（配列番号９、配列番号１１及び配列番号１０のペプチド、それぞれペプチドＡ、ペプチドＢ及びペプチドＣと呼ばれる）。
【０１２９】
実施例４：ヒト脂肪細胞におけるグルコース吸収に及ぼすペプチドの効果のインビトロ特性評価
天然ペプチドをステープリング技法によって安定化させ、Ｎ末端においてＦＡＭ（緑色）で標識付けした。ヒト脂肪細胞上のペプチドＡ及びＢの細胞浸透率を、赤色に染色された膜及び青色に染色された核を撮像することによって評価した（図４Ａ）。２つのＦＡＭ標識された異なるペプチドＡ及びＢを細胞内侵入について試験し、脂肪細胞の３Ｄ画像は、ペプチドの細胞内局在化を示した（図４Ｂ）。
【０１３０】
図４Ｃでは、蛍光画像は、ペプチドＡ及びＢがインスリンの不在下で脂肪細胞における蛍光グルコース類似体の細胞内侵入を媒介することを示している。
【０１３１】
図４Ｄ〜Ｅは、ペプチドＡ及びＢがそれらの天然型又はステープルド型のいずれかで脂肪細胞におけるグルコース侵入を惹起させる有効性評価を表示している。天然条件下でのペプチドＡ及びＢの両方に、インスリンの不在下で脂肪細胞中への著しいグルコース侵入を惹起させることができる。分解に対して抵抗性であり、したがってより安定なステープルドペプチドは、インスリンの不在下でより高い活性を有する。
【０１３２】
実施例５：抗糖尿病特性についてのペプチドのインビボ試験
食餌誘発性糖尿病ＷＴマウスの脂肪組織中のステープルドペプチドＡ及びＢ注射による効果のインビボ評価を行った。マウスに、確定された高脂肪／高糖食餌を、マウスがグルコース不耐性になるまで給餌した（図５Ａ、注射前）。マウスがグルコース不耐性になったら、これらのマウスに、ステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせを皮下脂肪中に直接注射することで受容させ、図５Ｂに表示するように１週間後にＧＴＴを再度実施した。ペプチド注射後、このマウスで行ったＧＴＴは、フルコース耐性の著しい改善を示した（図５Ａ、１週間後）。図５Ｃは、ＦＡＭで標識付けされたステープルドペプチドＡ及びＢの組み合わせを受容した脂肪組織の写真を表示している（白い矢印で示された緑色の点）。図５Ｄでは、Ａｌｍｓ１ｆｏｚ／ｆｏｚの脂肪組織中のペプチドの注射は、全身血糖に効果を有さず、これは、ペプチドによって標的化される脂肪組織中の活性ＡＬＭＳ１がないという単純な理由のためである。
【０１３３】
様々な修飾されたステープルドペプチドを設計し、ペプチド配列の修飾の脂肪細胞中へのインスリン非依存性グルコース取り込みに及ぼす効果を試験した。ペプチドは、ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
【０１３４】
本技法の個々のペプチドについてのヒト一次脂肪細胞における追加のインビトロ２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸（ＤＧ６Ｐ）の取り込み結果を表１〜３に提供する。
【０１３５】
【表１】
2020525504.tif 000008
【０１３６】
【表２】
2020525504.tif 000009
【０１３７】
【表３】
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【０１３８】
これらの結果は、本技法のペプチドが、糖尿病の治療など、細胞内グルコース取り込みを刺激するための方法において有用であることを実証している。
【０１３９】
実施例６：ＰＡＴＡＤペプチド変異体のインシリコ分子モデリング及びＡＬＭＳタンパク質を用いた分子ドッキング研究
この実施例は、ＡＬＭＳ１タンパク質のＰＫＣ結合部位にドッキングされる場合のＰＫＣのＡＬＭＳ１結合部位に由来するステープルドペプチドの結合を予測するためのインシリコモデリングの使用を実証するものである。
【０１４０】
ペプチドモデリング：ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａのビルドツールを用いてペプチドをモデル化し、Ａｖｏｇａｄｒｏソフトウェアを用いてステープリングを行った。
【０１４１】
エネルギー極小化：拡張型極小化及び平衡プロトコルを全てのモデルに適用し、ペプチドをエネルギー的に好ましい状態に向かってコンフォメーション緩和させ、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａソフトウェアを用いて安定性を得た。
【０１４２】
分子ドッキング：ステープルドペプチド及び天然ペプチドを有するＡＬＭＳタンパク質のドッキング解析を、ＨＥＸ  ８．０．０ドッキングソフトウェアを用いて実行し、このソフトウェアは、タンパク質とペプチドとの対の最低自由エネルギーで実現可能なドッキングモードを算出且つ表示するためのＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍである。ドッキングプロセスに使用されたパラメータを表４に列挙する。
【０１４３】
【表４】
2020525504.tif 000011
【０１４４】
生成したモデル化ペプチドを、上記パラメータを用いて、ＡＬＭＳ１タンパク質のコンフォメーションモデルとドッキングさせた。
【０１４５】
可視化：ドッキングした複合体を、Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェアを用いて解析して可視化し、初期状態とドッキング状態との間の差異を解析した。ステープルドペプチドのモデル化コンフォメーションも、このコンフォメーションにおけるステープリングがペプチド活性に重要である可能性が高いと考えられるため、厳密に解析した。
【０１４６】
結果：全てのモデル化されたステープルドペプチド及び天然ペプチドを、ＡＭＢＥＲ  ｆｆ９９ＳＢ力場を用いる最急降下及び共役勾配ステップを使用して、１０，０００ステップに対してエネルギー極小化した。全てのエネルギー極小化コンフォメーションをｐｄｂフォーマットに保存し、ＨＥＸ８．０．０ソフトウェアにおけるＡＬＭＳ１タンパク質のコンフォメーションモデルとのドッキングに更に使用した。
【０１４７】
非ステープルドペプチド及びステープルドペプチドを有するＡＬＭＳ１タンパク質のドッキングスコアを表５に示している。
【０１４８】
【表５】
2020525504.tif 000012
【０１４９】
天然ペプチド及びステープルドペプチドのドッキングスコアの等級付けは、ステープリングがＡｌｍｓ１への予測された結合に大きい影響を及ぼし得ることを示している。全体としては、ステープリングは、ペプチドの安定性を増加させて、それらをＡＬＭＳ１により結合し易くする。全体としては、ＰＫＣとの最高の相同性を有するステープルドペプチドがＡＬＭＳ１に対する最適なドッキングスコアを有した。このペプチド上の末端ＯＨ又はＮＨ２基は、末端ヒドロキシル基が最高のドッキングスコアを提供して、ドッキングスコアに影響を与えた。
【図１−１】
2020525504.tif 000016
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
2020525504.tif 000025
【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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