(57)【要約】  本出願人が提供する新規化合物は、フマル酸サリチル誘導体であり、その一般構造式は：【化１】2020515536.tif 000018であり、式中、Ｒ１は、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、又はＮＨ４＋の内の１つであり、Ｒ２はフマル酸エステル生成物の１つである。その化合物は、エステル化反応を介してサリチル酸とフマル酸とを結合した一般構造式を有する。出願人は、実験により、このカテゴリーの化合物が神経変性疾患の治療において優れた効果を有することを実証した。【選択図】図３
2020515536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式（Ａ）のフマル酸サリチル誘導体：
【化１】
2020515536.tif 000014
式中、Ｒ１は、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、又はＮＨ４＋の内の１つであり、Ｒ２はフマル酸エステル生成物の１つである。
【請求項２】
フマル酸エステルが、フマル酸モノメチル、フマル酸モノエチル、フマル酸モノプロピル、フマル酸モノイソプロピル、フマル酸モノブチル、又はフマル酸モノｔｅｒｔ−ブチルの内の１つである、請求項１に記載のフマル酸サリチル誘導体。
【請求項３】
下記構造式のフマル酸サリチルメチルである、請求項２に記載のフマル酸サリチル誘導体。
【化２】
2020515536.tif 000015
【請求項４】
下記構造式のフマル酸サリチルエチルである、請求項２に記載のフマル酸サリチル誘導体。
【化３】
2020515536.tif 000016
【請求項５】
請求項１に記載のフマル酸サリチル誘導体の製造方法において：
１）ｔｅｒｔ−ブチルアルコールとサリチル酸とのエステル化反応を実施し、サリチル酸のカルボキシ基を保護して、中間生成物Ｉを得るステップ；
２）中間生成物Ｉとフマル酸誘導体とのエステル化反応を実施して、中間生成物ＩＩを得るステップ；及び
３）酸性条件下で中間生成物ＩＩのｔｅｒｔ−ブタノールを除去して、目的生成物ＩＩＩを得るステップ；
を含み、その化学反応式が：
【化４】
2020515536.tif 000017
である、方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のフマル酸サリチル誘導体を含む、パーキンソン病の治療に使用するための医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規クラスの化合物を提供するものであり、より詳細には、フマル酸サリチル誘導体（salicyl fumarate derivative）、並びにパーキンソン病（以下、ＰＤとも称する）の治療におけるその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、脳及び脊髄におけるニューロンが徐々に失われるカテゴリーの疾患を意味する。脳及び脊髄はニューロンにより構成され、それらニューロンは、運動を制御する、感覚情報を処理する、及び意思決定を行うなど、様々な機能を有する。脳及び脊髄における細胞は通常は再生されず、したがって、ニューロンへの過度の損傷は破壊的でかつ不可逆的なものとなり得る。神経変性疾患は、ニューロン又はそれらの髄鞘の損失により生じ、それは時間と共に悪化して機能障害を引き起こす。神経変性疾患は主に２つの態様に現れる：１つは、小脳性運動失調などの運動障害であり、もう一方は記憶機能障害及びそれに関連する痴呆である。
【０００３】
高齢化が進むにつれ、神経変性疾患の発症割合も上昇している。神経変性疾患は、脳及び脊髄におけるニューロンが失われる疾患状態であり、ニューロン細胞は通常再生しない。過度な損傷は破壊的でかつ不可逆的なものとなり得る。神経変性疾患は時間と共に悪化し、最終的に機能障害を引き起こす。アルツハイマー病及びパーキンソン病は、最も高い罹患率を有する２つの疾患であり、患者並びにその家族をひどく苦しめる。
【０００４】
以前の研究は、ニューロンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルの両方で、注入したα−シヌクレインタンパク質を吸収して、ＰＤの特徴であるレヴィー小体タンパク質を形成し得ることを示している。２０１４年にＲｅｃａｓｅｎｓらは、ＰＤ患者の黒質から抽出したレヴィー小体をマウス及びアカゲザルの黒質又は線条体に注入した場合に、α−シヌクレインタンパク質が宿主のニューロンに蓄積したことを発表した。４〜１７か月後、ドーパミン作動性ニューロンの末端は、ＰＤの病理と同様に、神経変性しているように見えた。彼らは、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０１４）（非特許文献１）にその研究結果を発表した。
【０００５】
同年に、Ｕｎｔｅｒｂｅｒｇｅｒらは、ＰＤにおいてどのようにα−シヌクレインがニューロンの間で広がるのかについて新たな機序を提案した。このチームは、どのように病的なタンパク質が周辺のニューロンに移動するのかを確認するために、正常なα−シヌクレインと異常なα−シヌクレインとを区別できる抗体を用いた。同じチームはまた、抗体を用いて、脳脊髄液中の異常なα−シヌクレインタンパク質を検出した。この方法は、早期のＰＤ診断、及び他のα−シヌクレイン疾患の診断を助けるであろう。それは、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）（非特許文献２）に発表された。
【０００６】
Ｃｈａｏ  Ｊは、ある種のフマル酸及びその誘導体に関する技術的スキームを提供し、米国特許の承諾を得た（特許文献１）。その技術的スキームにおいて、Ｃｈａｏ  Ｊが提供したフマル酸誘導体は、式（Ｉ）に示す特定の構造式を有する。Ｃｈａｏ  Ｊは、示したフマル酸誘導体が、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症、ＰＤ、ハンチントン病又はアルツハイマー病などの神経変性疾患に対する治療特性を有することを主張した。
【化１】
2020515536.tif 000003
【０００７】
米国ＦＤＡは、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を治療するのに用いられる、１日２回経口投与する新規薬物フマル酸ジメチル（ＤＭＦ、商品名テクフィデラ（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ）として知られている）を承認した。ＤＭＦは、ＭＳに対する多くの承認された治療法の１つとなっている。全米多発性硬化症協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）の公文書によると、２つの剤形のインターフェロンβ−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ及びＲｅｂｉｆ）、並びに２つの剤形のインターフェロンβ−１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ及びＥｘｔａｖｉａ）が、ＲＲＭＳ治療に関してすでに承認されている。他の承認薬物として、酢酸ガラティラメル（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、及びテリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）が挙げられる。ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）も承認を受けているが、条件制限がある。ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）は二次進行型、進行性再発、再発寛解型のＭＳを治療することについて承認されている。ダルファムプリジン（Ａｍｐｙｒａ）は、ＭＳ患者の動きを改善することに関して承認されている。
【０００８】
バイオジェン・アイデック（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）は、ＤＥＦＩＮＥと称される試験において、ＭＳ患者におけるＤＭＦの使用者が、再発及び障害の発生における４９％及び３８％の減少を示したが、ＣＯＮＦＩＲＭと称される試験では、ＤＭＦの使用者は再発の３４％の減少を示した。両方の試験は、プラセボと比較して、ＤＭＦが脳の損傷を有意に低減し得ることを示す。クリーブランドクリニックのＭｅｌｌｅｎ多発性硬化症センターのＲｏｂｅｒｔ  Ｆｏｘ博士は、バイオジェン・アイデックのレポートにおいて：「臨床試験において、患者が初期段階のＭＳ患者かより進行した患者かにかかわらず、プラセボ群と比較して、ＤＭＦ患者における疾患の活動性は低下する。この薬物は、医師に、様々な段階のＭＳ患者を標的とする別の重要な治療選択肢を提供する。」と主張した。
【０００９】
しかしながら、ＤＭＦの使用者で感染症の増加を示唆する証拠はないものの、ＦＤＡは、ＤＭＦがリンパ球数を低下させ得ることに言及する。彼らは、治療の前後で患者のリンパ球数を監視することを提案する。潮紅及び胃腸障害が最も一般的な副作用である。
【００１０】
Ａｈｕｊａ  Ｍらは、ＤＭＦ及びその活性代謝産物であるフマル酸モノメチル（ＭＭＦ）の、Ｎｒｆ２シグナル伝達経路に対する作用、並びに１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）誘導ＰＤマウスモデルに対する作用を実証した。それら試験は、ＤＭＦ及びＭＭＦが、ＰＤマウスモデルにおいてＭＰＴＰの神経毒性に対する保護効果を示すことを確認した。これは、それら独特のＮｒｆ２媒介の抗酸化作用、抗炎症作用、及びミトコンドリア機能の増強によるものである。ＤＭＦとは異なり、ＭＭＦはグルタチオンを消費せず、またミトコンドリア及び解糖機能を阻害しない。ＰＤの病因として、酸化的損傷。炎症、及びミトコンドリア機能障害が挙げられる。Ａｈｕｊａ  Ｍらは、ＭＭＦがＰＤを治療するための真の有効成分であると主張する。彼らの研究結果は、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  ２０１６（非特許文献３）に発表された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，７７０，６５２号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Recasens A, Dehay B, Bove J, et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Annals of Neurology. 2014,75:351-362
【非特許文献２】Unterberger U, Lachmann I, Voitlander T. et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Neurobiology of Disease. 2014, 33:329-334
【非特許文献３】Manuj Ahuja, Navneet Ammal Kaidery, Lichuan Yang, Noel Calingasan, Natalya Smirnova, Arsen Gaisin, Irina N. Gaisina, Irina Gazaryan, Dmitry M. Hushpulian, Ismail Kaddour-Djebbar, Wendy B. Bollag, John C. Morgan, Rajiv R. Ratan, Anatoly A. Starkov, M. Flint Beal, and Bobby Thomas. Distinct Nrf2 Signaling Mechanisms of Fumaric Acid Esters and Their Role in Neuroprotection against 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine Induced Experimental Parkinson’s-Like Disease. The Journal of Neuroscience. 2016, 36(23): 6332-6351
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
初期の研究結果に基づき、またＤＭＦの副作用を考慮して、本発明者は、新規クラスの化合物を発明し、アルツハイマー病（ＡＤ）及びハンチントン病（ＨＤ）などの他の神経変性疾患にも適用され得るパーキンソン病（ＰＤ）モデルにおいて、その化合物が優れた活性を有することを確認した。
【００１４】
本出願人が提供する新規化合物は、フマル酸サリチル誘導体である。その一般構造式（Ａ）は：
【化２】
2020515536.tif 000004
である。
【００１５】
構造式（Ａ）において、Ｒ１は、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、又はＮＨ４＋の内の１つであり、Ｒ２はフマル酸エステルである。
【００１６】
本出願人はさらに、上記の構造式において、Ｒ２基のフマル酸エステルが、フマル酸メチル、フマル酸モノエチル、フマル酸モノプロピル、フマル酸モノイソプロピル、フマル酸モノブチル、フマル酸モノｔｅｒｔ−ブチルの内の１つである化合物を、試験において確認した。
【００１７】
Ｒ２基を決定することを前提として、本出願人はさらに、フマル酸サリチル誘導体が、フマル酸サリチルメチルであり、その構造は：
【化３】
2020515536.tif 000005
であることを確認した。
【００１８】
Ｒ２基を決定することを前提として、本出願人はさらに、フマル酸サリチル誘導体が、フマル酸サリチルエチルであり、その構造は：
【化４】
2020515536.tif 000006
であることを確認した。
【００１９】
上記のフマル酸サリチル誘導体のすべてに関して、Ｒ１基は、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、又はＮＨ４＋のうちの１つであってよい。これは、フマル酸サリチル誘導体の特定の用途を目的とする出願人が、アルカリ化合物とフマル酸サリチル誘導体との間の反応を利用して塩形態を作成する必要があるか否かに依存する。出願人がフマル酸サリチル誘導体と反応させるためにアルカリ化合物を使用しない場合は、Ｒ１はＨ＋となるであろう。その反応がＮａＯＨ溶液との反応である場合は、Ｒ１基はＮａ＋であろう。Ｒ１基への他の変更も同様である。出願人による現在の研究は、Ｒ１基を置換することによるフマル酸サリチル誘導体の活性に対する直接の影響はないことを示す。それでもなお、Ｒ１基を置換すると、フマル酸サリチル誘導体の溶解性を変化させ、従って、胃腸管によるフマル酸サリチル誘導体の吸収性に影響を及ぼし得る。
【００２０】
フマル酸サリチル誘導体の製造方法論に関して、この方法はエステル化反応により行われる。しかしながら、サリチル酸は、ヒドロキシ基とカルボキシ基の２つの基を有し、正常な状態において、カルボキシ基の安定性は乏しいため、化学的指向性反応（chemical directional reaction）を達成するために、出願人は、ｔｅｒｔ−ブタノールのサリチル酸とのエステル化反応を最初に用いてカルボキシ基を保護するように実験を設計した。その後、その生成物をモノエステル化フマル酸と反応させる。最後に、ｔｅｒｔ−ブタノールを除去することにより、目的生成物を得る。出願人は、以下のステップを含む方法論を提供する：
１）ｔｅｒｔ−ブタノールとサリチル酸とのエステル化反応を実施し、サリチル酸のカルボキシ基を保護して、中間生成物Ｉを得る；
２）中間生成物Iとフマル酸誘導体とのエステル化反応を実施して、中間生成物ＩＩを得る；
３）酸性条件下で中間生成物ＩＩからｔｅｒｔ−ブタノールを除去して、目的生成物ＩＩＩを得る。
【００２１】
その化学反応式は以下のとおりである：
【化５】
2020515536.tif 000007
【００２２】
薬理学的実験により、出願人は、ＰＤ治療における新規な治療化合物としてのフマル酸サリチル誘導体の用途を実証した。
【００２３】
本発明の技術的に有益な効果は：本発明が、エステル化を介してサリチル酸とフマル酸エステル誘導体とを結合する一般構造式を含む、フマル酸サリチル誘導体を製造することである。出願人は、薬理学的実験により、この種の化合物が神経変性疾患の治療において保護活性を有することを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】化合物Ａ（フマル酸サリチルメチル（ＭＳＦ））のＭＲスペクトログラム
【図２】化合物Ｂ（フマル酸サリチルエチル（ＥＳＦ））のＭＲスペクトログラム
【図３】マウスにおけるドーパミン作動性ニューロン損傷のＭＰＴＰ誘導モデルでのＭＳＦ及びＥＳＦの用量反応性保護効果及び安全性試験
【図４】マウスにおける慢性的なドーパミン作動性ニューロン損傷のＭＰＴＰ誘導モデルでのドーパミン作動性ニューロンに対するＭＳＦ及びＥＳＦの保護効果
【図５】ＭＰＴＰの代謝産物であるＭＰＰ＋の濃度に対するＭＳＦ及びＥＳＦの影響
【図６】マウス血液サンプル中のＭＳＦのＨＰＬＣクロマトグラム
【図７】マウス血液サンプル中のＥＳＦのＨＰＬＣクロマトグラム
【図８】１００ｍｇ／ｋｇのＭＳＦ及びＥＳＦを投薬したマウスの血中薬物濃度
【図９】１００ｍｇ／ｋｇのＭＳＦ及びＥＳＦを投薬したマウスの肝臓の薬物濃度
【図１０】１００ｍｇ／ｋｇのＭＳＦ及びＥＳＦを投薬したマウスの脳の薬物濃度
【図１１】ＭＳＦ及びＥＳＦの異なる投薬量でのマウス線条体における薬物濃度
【図１２】ＭＰＴＰ誘導ドーパミン作動性ニューロン損傷を有するＮｒｆ２ノックアウトマウスにおけるドーパミン作動性ニューロンに対する保護効果
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験での細胞内グルタチオン濃度に対するＭＳＦ及びＥＳＦの影響
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図面において、図１及び図２は、装置ワークステーションにより作成したＮＭＲスペクトログラムである：もとはカラーであった。白黒に調整した後、多少のテキストと画像の重なりがあった。この具体的な情報は下記の実施例１に記載している。
【実施例】
【００２６】
実施例１：フマル酸サリチル誘導体の合成
【００２７】
１．サリチル酸のカルボキシ基の保護
０℃（氷水浴）の条件下で、サリチル酸（４５ｇ、７９５．９ｎｍｏｌ、１当量）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４５０ｍｌ）に溶解させ、Ｎ’Ｎ−カルボニルジイミダゾール（６３．５ｇ）を添加する。室温で１時間混合し、同時にＤＢＵ（５８．５ｍｌ）及びｔｅｒｔ−ブタノール（６３ｍｌ）をゆっくり滴下する。その後、室温で２時間混合する。反応を行った後、ＬＣ−ＭＳを用いて検出する（生成物スペクトログラムを添付の図１に示す）。反応物質を水（５００ｍｌ）中に入れ、酢酸エチルを用いて３回抽出する（３ｘ８００ｍｌ）。有機相を合わせ、水で３回洗浄する（３ｘ８００ｍｌ）；次に、生理食塩水（１０００ｍｌ）で１回洗浄する；その後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する；次に、濾過する；その後、有機溶媒残留物がなくなるまで濾液を濃縮する。生成濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィ（移動相として、石油エーテル：酢酸エチル＝１００：１）により精製し、生成物（生成物５２ｇ、収率８２．５％）を得る。生成物は、淡黄色で油状である（名称：化合物Ａ３）。化学反応式は以下のとおりである：
【化６】
2020515536.tif 000008
【００２８】
２．化合物Ａ３を用いたフマル酸モノメチルのエステル化（化合物Ａ４）
ＤＣＭ（１００ｍｌ）をフマル酸モノメチル（１０．４ｇ）に添加し、次いでＨＡＴＵ（４５．６ｇ）とＤＩＥＡ（３１ｇ）の混合溶液を添加する。反応混合物を３０分間攪拌し、その後、室温で化合物Ａ３（１０ｇ）を反応混合物に添加し、室温で１６時間攪拌し、ＬＣ−ＭＳが反応の完了を示す。反応混合物を水（２００ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（２ｘ２００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、その後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する；次に、濾過する；その後、有機溶媒残留物がなくなるまで濾液を濃縮する。生成濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィ（移動相として、石油エーテル：酢酸エチル＝３０：１）により精製し、生成物（生成物１２．６ｇ、収率７９．９ｇ）を得る。生成物は、淡黄色で油状である（名称：化合物Ａ４）。化学反応式は以下のとおりである：
【化７】
2020515536.tif 000009
【００２９】
３．フマル酸サリチルメチル（化合物Ａ）の調製
０℃（氷水浴）の条件下で、化合物Ａ４（５．６ｇ）をＤＣＭ（１００ｍｌ）、２Ｎ  ＨＣｌ及びＥｔ２Ｏ（２５ｍｌ）の混合溶液に添加する。混合物を室温で一晩攪拌して反応させ、ＴＣＬが反応の完了を示す。反応溶媒を除去し、水（１００ｍｌ）を添加し、次いで、ＤＣＭで３回抽出する（３ｘ１５０ｍｌ）。有機相を合わせ、その後、塩水で洗浄する；次に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）で精製し、粗生成物を得る。粗生成物をｎ−ヘキサンと一晩混合し（結晶化）、濾過して純粋な生成物Ａ（生成物４．５ｇ、収率９８．４％）を得る；ＭＲ及びＭＳアッセイで分析し、純粋な生成物Ａがフマル酸サリチルメチルとして同定される。反応式は以下のとおりである：
【化８】
2020515536.tif 000010
【００３０】
４．化合物Ａ３を用いたフマル酸モノエチルのエステル化（化合物Ｂ２）
フマル酸モノエチル（１０．４ｇ）をＤＣＭ（１００ｍｌ）に添加し、次いでＨＡＴＵ（４５．６ｇ）及びＤＩＥＡ（３１ｇ）を混合溶液に添加する。反応混合物を３０分間攪拌し、その後、室温で化合物Ａ３（１０ｇ）を反応混合物に添加し、室温で１６時間攪拌し、ＬＣ−ＭＳが反応の完了を示す。反応混合物を水（２００ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（２ｘ２００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、その後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する；次に、濾過する；その後、有機溶媒残留物がなくなるまで濾液を濃縮する。生成濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィ（移動相として、石油エーテル：酢酸エチル＝３０：１）により精製し、生成物（生成物１２．８ｇ、収率７９．９％）を得る。生成物は、淡黄色で油状である（名称：化合物Ｂ２）。化学反応式は以下のとおりである：
【化９】
2020515536.tif 000011
【００３１】
５．フマル酸サリチルエチル（化合物Ｂ）の調製
０℃（氷水浴）の条件下で、化合物Ｂ２（５．６ｇ）をＤＣＭ（１００ｍｌ）、２Ｎ  ＨＣｌ及びＥｔ２Ｏ（２５ｍｌ）の混合溶液に添加する。混合物を室温で一晩攪拌して反応させる。ＴＣＬが反応の完了を示す。反応溶媒を除去し、水（１００ｍｌ）を添加し、次いで、ＤＣＭで３回抽出する（３ｘ１５０ｍｌ）。有機相を合わせ、その後、塩水で洗浄する；無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）で精製し、粗生成物を得る。粗生成物をｎ−ヘキサンと一晩混合し（結晶化）、濾過して純粋な生成物Ｂ（生成物４．０ｇ、収率８６．５％）を得る；ＭＲ及びＭＳアッセイで分析し、純粋な生成物Ｂがフマル酸サリチルエチルとして同定される。反応式は以下のとおりである：
【化１０】
2020515536.tif 000012
【００３２】
６．化合物Ａ及び化合物Ｂを分析し、具体的なデータは以下のとおりである：
ＭＲスペクトロメトリーアッセイ
化合物Ａ：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１３．１８（ｓ，１Ｈ），７．９８〜７．９６（ｍ，１Ｈ），７．７１〜７．６７（ｍ，１Ｈ），７．４６〜７．４２（ｍ，１Ｈ），７．３２〜７．３０（ｍ，１Ｈ），６．９９〜６．９８（ｍ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ）；（図１に示すＮＭＲクロマトグラム）。ＭＲスペクトロメトリーは、化合物Ａをフマル酸サリチルメチルと証明する。
【００３３】
化合物Ｂ：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１３．１６（ｓ，１Ｈ），７．９８〜７．９６（ｍ，１Ｈ），７．７０〜７．６７（ｍ，１Ｈ），７．４５〜７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３１〜７．２９（ｍ，１Ｈ），６．９７〜６．９６（ｍ，２Ｈ），４．２７〜４．２２（ｍ，２Ｈ），１．２９〜１．２６（ｍ，３Ｈ）；（図２に示すＮＭＲクロマトグラム）。ＭＲスペクトロメトリーは、化合物Ｂをフマル酸サリチルエチルと証明する。
【００３４】
７．出願人は、上記と同じ合成経路を用いてサリチル酸とフマル酸エステルとのエステル化を行った。フマル酸サリチルプロピル（化合物の構造式をＣとして示す）、フマル酸サリチルイソプロピル（化合物の構造式をＤとして示す）、及びフマル酸サリチルブチル（化合物の構造式をＥとして示す）をそれぞれ得た。フマル酸サリチルプロピル、フマル酸サリチルイソプロピル、及びフマル酸サリチルブチルの薬理学的活性が、予備実験を通して、フマル酸サリチルメチル及びフマル酸サリチルエチルの活性よりも低かったことを鑑みて、これら３つの化合物の薬理試験はこの出願において示していない。
【００３５】
しかしながら、それら５つの化合物、フマル酸サリチルメチル、フマル酸サリチルエチル、フマル酸サリチルプロピル、フマル酸サリチルイソプロピル、及びフマル酸サリチルブチルの合成経路から、サリチル酸のカルボキシ基を有効に保護できれば、フマル酸サリチル誘導体を合成できることが分かる。したがって、本出願人が提供する合成経路はフマル酸サリチル誘導体の有効な合成に広く一般に適用可能であることが証明される。
【化１１】
2020515536.tif 000013
【００３６】
実施例２：ドーパミン作動性ニューロンに対するＭＳＦ及びＥＳＦの保護的役割
ＭＳＦ及びＥＳＦを用いて、広く受け入れられているＭＰＴＰ誘導ドーパミン作動性ニューロン損傷ＰＤマウスモデルで治療的研究を実施する。フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）を陽性対照薬物として用い、ＤＭＦについて６つの用量群を用いた。ＭＳＦ及びＥＳＦの実験群に関して、各薬物について１０の用量群を用いた。各群１０匹のマウスであった。実験群及び対照群の両方で腹腔内投与を用いた。対照群はＤＭＦで処置した。実験群は様々な用量のＥＳＦ及びＭＳＦで処置した（図３に示す）。ドーパミンニューロンの統計的に有意な保護効果が見いだされ、また用量−効果関係が観察された。保護効果の最低投与量（１０ｍｇ／ｋｇ／日）、至適投与量（１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日）、及び毒性効果が出現し始める投与量（＞５００ｍｇ／ｋｇ／日）が明らかとなった。ＤＭＦの結果と比較して、ＭＳＦ及びＥＳＦはより有意な保護効果を有していた。更に、ＤＭＦが保護効果を示した投与量（５０ｍｇ／ｋｇ／日）は、ＭＳＦ及びＥＳＦよりも高く、かつＤＭＦが毒性効果を示した投与量（＞２００ｍｇ）はＭＳＦ及びＥＳＦよりも低かった。したがって、ＭＳＦ及びＥＳＦは、より有効かつ安全な治療用量域を有する（図３に示す）。
【００３７】
ＭＳＦ及びＥＳＦ（２００ｍｇ／ｋｇ／日）は、マウスにおける慢性ＭＰＴＰ誘導ドーパミンニューロン損傷のモデルにおいて、有意なドーパミンニューロンの保護も示し、ドーパミンニューロンの保護はブランク対照レベルに近かった（図４に示す）。
【００３８】
脳組織におけるＭＰＴＰの代謝産物であるＭＰＰ＋の濃度をＨＰＬＣにより決定した。ＭＰＴＰを注射したマウスモデルに関して、ＥＳＦ（５００ｍｇ／ｋｇ）投与群及びブランク群は、線条体における同じＭＰＰ＋含量を有しており、したがって、ＭＳＦ及びＥＳＦがｉｎ  ｖｉｖｏで脳におけるＭＰＴＰの取り込み及び代謝に影響を及ぼした可能性を排除して、それらの神経保護効果を確認した（図５に示す）。
【００３９】
高信頼度の高速液体クロマトグラフィによるＭＳＦ及びＥＳＦの分析法（図６及び７に示す）を確立して、末梢血、肝臓及び脳組織におけるＭＳＦ及びＥＳＦのレベルを決定し、ＭＳＦ及びＥＳＦが、マウスに腹腔内注射した後に血液脳関門を通過して脳に入ることができることを実証した。更には、ＭＳＦ及びＥＳＦの分子構造は脳内で未変化のままであり（図８〜１１に示す）、ＭＳＦ及びＥＳＦ分子が、それらのもとの分子構造により直接、神経保護薬理活性をもたらすことが推測される。異なって機能する陽性対照薬物のＤＭＦとは違っていた。ＤＭＦは、体内に入り、薬理活性をもたらす活性形態であるモノメチル代謝産物のフマル酸モノメチル（ＭＭＦ）の形態に迅速に代謝される必要がある。
【００４０】
ＭＳＦ及びＥＳＦは、陽性対照薬物のＤＭＦと同様に、従来のフマル酸（フマル酸塩）活性化標的Ｎｒｆ２を有し、Ｎｒｆ２の活性化は細胞内抗酸化ストレスの機構の活性化をもたらす。Ｎｒｆ２遺伝子をノックアウトしたトランスジェニックマウスにおいてＭＰＴＰ実験を行うことにより、ＤＭＦは、その有効標的を失うためドーパミン作動性ニューロン保護効果を失うが、ＭＳＦ及びＥＳＦは、このモデルでもまだ有意に保護効果を示す（図１２に示す）；したがって、ＭＳＦ及びＥＳＦは、Ｎｒｆ２標的に対して作用することに加えて、別の神経保護標的に対しても作用することを確認する。それらの分子構造内にサリチルを含むことから推測して、この新規な標的は抗神経炎症（anti-neuroinflammation）に関連する可能性がある。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞実験の結果は、陽性対照薬物のＤＭＦが、グルタチオン（ＧＳＨ、内因性抗酸化ポリペプチド）を枯渇させる効果を有することを示し、それはＤＭＦの明らかな毒性及び副作用の原因となり得る。ＭＳＦ及びＥＳＦは、細胞におけるグルタチオンの濃度に影響を及ぼさない（図１３に示す）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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