(57)【要約】  本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物(ここで５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の対ナトリウムのモル比は１：１．５１〜１：２．５)ならびにその製造方法に関する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の対ナトリウムのモル比が１：１．５１〜１：２．５である５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項２】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の対ナトリウムのモル比が１：１．７５〜１：２．２５である請求項１に記載の結晶性塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の対ナトリウムのモル比が約１：２（モル／モル）である請求項１または２に記載の結晶性塩。
【請求項４】
前記塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、３．２、６．４、７．８、９．６、１２．７、１３．３、１３．９、１４．２、１４．７、１５．６、１６．３、１６．７、１７．２、１７．８、１８．２、１８．５、１９．３、１９．６、および２０．３（２Θ±０．３°２Θ （ＣｕＫα放射線）で表わしたときに）において少なくとも１つの特徴的なピークを有するＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１つに記載の結晶性塩。
【請求項５】
前記塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、３．２、６．４、７．８、９．６、１２．７、１３．３、１３．９、１４．２、１４．７、１５．６、１６．３、１６．７、１７．２、１７．８、１８．２、１８．５、１９．３、１９．６、２０．０、２０．３、２０．７ ２２．０、２２．９、２３．５、２４．０、２４．６、２５．０、２５．４、２７．２および２８．７（２Θ±０．３°２Θ （ＣｕＫα放射線）で表わしたときに）において少なくとも１つの特徴的なピークを有するＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１つに記載の結晶性塩。
【請求項６】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩が、実質的に図１、図２および／または図４に示されるようなＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１つの結晶性塩。
【請求項７】
少なくとも９９％またはそれ以上の化学的および立体異性的純度を有する、先行する請求項の１つに記載の結晶性塩。
【請求項８】
ａ）５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を、場合により適切な溶媒または溶媒の混合物中で準備する工程、
ｂ）工程ａ）の組成物への水酸化ナトリウムの添加する工程、
ｃ)必要に応じて、溶媒、溶媒の混合物および／または共塩形成剤を工程ｂ）の組成物に添加するか、または工程ｂ）の組成物を溶媒、溶媒の５つの混合物および／または共塩形成剤に添加する工程、
ｄ)結晶化工程、
ｅ)必要に応じて、より多くの溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、および
ｆ)得られた固体を単離する工程、
を含む、請求項１〜６の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩を得るための方法。  
【請求項９】
工程ｂ）における５−メチル−（６Ｓ）−１０テトラヒドロ葉酸と水酸化ナトリウムとのモル比が１：１．５１〜１：５であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）における５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と水酸化ナトリウムとのモル比が１：１．９〜１：３であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）、ｃ）および／またはｅ）による溶媒および／または溶媒の混合物が、水、水溶性アルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ベンジルアルコールおよびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項８〜１０の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｃ）の共塩形成剤が、６〜１１のｐＫａ値を有する有機塩基であることを特徴とする、請求項８〜１１の少なくとも１つに記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）の共塩形成剤が、７〜１０のｐＫａ値を有する有機塩基であることを特徴とする、請求項８〜１２の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｄ）２５において、温度が少なくとも１５℃であることを特徴とする請求項８〜１３の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）において種結晶が添加されることを特徴とする、請求項８〜１４の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜６の少なくとも１つに記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および任意選択で１種以上の許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物、食品添加物、ビタミンおよび／または他の製剤。
【請求項１７】
錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射または注入可能な溶液または懸濁液または坐剤の形態である請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの追加の治療薬をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与のための医薬組成物である請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜６の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の、薬物の製造のための成分としての、および／または食品添加物としての使用。
【請求項２１】
ホモシステイン低下、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、アルツハイマー病、認知障害および骨粗鬆症、ならびに／または低血漿および／もしくは低赤血球葉酸および／もしくは低脳脊髄液葉酸および／もしくは低末梢もしくは中枢神経系葉酸の食事管理における治療における使用のための、請求項１〜６の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（Ｎ−［４−［［（２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−５−メチル−４−オキソ−（６Ｓ）−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸）（本明細書ではＭＴＨＦと略す）の結晶性ナトリウム塩、およびそれを得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒドロ葉酸塩は主に５−ホルミルテトラヒドロ葉酸およびその塩（ロイコボリンおよびロイボロボリン）、５−メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩（メタフォリン：登録商標）、または５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸およびその塩（モデュフォリン：登録商標）として、葉酸拮抗薬、特にがん治療におけるアミノプテリンおよびメトトレキサートの適合性を増大させるための解毒剤として（「抗葉酸レスキュー」）、フッ素化ピリミジンの治療効果を増大させるために、ならびに乾癬および関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療のために、突然変異に対する特定の抗寄生虫の適合性を増大させるために、例えばトリメトプリム−スルファメトキサゾールとして、ならびに化学療法におけるジデアザテトラヒドロ葉酸塩の毒性を低減させるために使用される。
【０００３】
５−メチルテトラヒドロ葉酸は特に、薬物として、および食品添加物として、ビタミン調製物として、神経管欠損の予防のために、うつ病の治療のために、およびホモシステインレベルに影響を及ぼすために使用される。
【０００４】
５−メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩は極めて不安定であり、特に、酸化に対して非常に感受性であり［この点に関して、Ａ．ＬＦｉｔｚｈｕｇｈ、Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ ４（４），１８７−１９１（１９９３）も参照のこと］、したがって、医薬活性成分または食品添加物に許容される純度レベルで製造することが困難である。
【０００５】
５−メチルテトラヒドロ葉酸の不安定性を克服するために、可能な限り完全に酸素を排除する、またはアスコルビン酸もしくは還元型Ｌ−グルタチオンなどの酸化防止剤を添加するなどの様々な方法が使用されてきた。
【０００６】
米国特許第６，４４１，１６８号は、５−メチルテトラヒドロ葉酸の塩として使用されるアルカリ土類塩、特にカルシウム塩の使用、その結晶化およびその使用を開示している。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩は、４つの異なる結晶性変態で存在する。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の欠点は、それらが４つの変態で存在することであり、そのたるその各々を製造するプロセスを非常に正確に制御しなければならない。さらに、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水への溶解性は比較的低く、バイオアベイラビリティーの低下およびその適用可能な使用形態の制限につながる可能性がある。また、低い溶解度は、さらなる処理、例えば再結晶による精製のためにそのような化合物を溶解する必要がある場合、低い時間−体積収率をもたらす。さらに、米国特許第６，４４１，１６８号の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶塩も、５−メチルテトラヒドロ葉酸１当量当たり少なくとも１当量の結晶水を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
医薬的に有用な化合物の新しい結晶形態は、医薬製品の性能プロフィールを改善する機会を提供する。これは、製剤科学者が改善された特性を有する薬物の新たな剤形を設計するために利用可能な材料の蓄積を広げる。
【０００８】
本発明の根底にある技術的課題は、当該技術分野で知られている５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の欠点を克服する、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を含む結晶形態の提供である。
【０００９】
さらに、新しい結晶形態はしばしば、所望の異なる物理的および／または生物学的特性を示し、これは、規制の承認に必要とされる純度レベルおよび均一性についてまで、活性化合物の製造または処方を補助し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
技術的課題は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の対ナトリウムのモル比が１ ：１．５１〜１：２．５である５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および／またはその水和物および／または溶媒和物によって解決される。
【００１１】
本発明の固体形態は改善された薬理学的特徴、例えば、改善されたバイオアベイラビリティーを有し、従って、改善された薬物製品を調節および設計するための増強された可能性を提供する。
【００１２】
さらに、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は溶解度の増加、特に、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および最新技術で知られているそのそれぞれの塩に対する速度論的溶解度の増加を示す。本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の溶解度の増加、特に速度論的溶解度の増加は、例えば、より短い溶解時間のような異なる処理パラメーターをもたらし、それによって、生成物に対する酸化ストレスおよび／または最終的には急速可溶性粉末のような他の適用形態さえも少なくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩のＰＸＲＤを示す図である。
【図２】図２は、実施例１による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩のＰＸＲＤを示す図である。
【図３】図３は、実施例１による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩のラマンスペクトルを示す図である。
【図４】図４は、実施例５による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩のＰＸＲＤを示す図である。
【図５】図５は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の２５℃／６０％ｒｈでの長期安定性(% w/w)を示す図である。
【図６】図６は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の２５℃／６０％ｒｈでの長期安定性（主要分解生成物［ＭｅＦｏｘ］）(% w/w)を示す図である。
【図７】図７は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の４０℃／７５％ｒｈでの長期安定性(% w/w)を示す図である。
【図８】図８は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の４０℃／７５％ｒｈでの長期安定性（主要分解生成物［ＭｅＦｏｘ］）(% w/w)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のナトリウムに対するモル比が１ ：１．７５〜１ ：２．２５である結晶性塩および／または水和物および／またはその溶媒和物である。
【００１５】
さらに好ましい実施形態において、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の対ナトリウムのモル比は、約１ ：２である。
【００１６】
好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性二ナトリウム塩である。
【００１７】
好ましくは、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、３．２、６．４、７．８、９．６、１２．７、１３．３、１３．９、１４．２、１４．７、１５．６、１６．３、１６．７、１７．２、１７．８、１８．２、１８．５、１９．３、１９．６および２０．３において（２Θ±０．３°２Θ （ＣｕＫα放射線）で表わしたときに）、少なくとも１つの特徴的なピークを有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００１８】
さらにより好ましくは、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、３．２、６．４、７．８、９．６、１２．７、１３．３、１３．９、１４．２、１４．７、１５．６、１６．３、１６．７、１７．２、１７．８、１８．２、１８．５、１９．３、１９．６、および２０．３において、（２Θ±０．３°２Θ （ＣｕＫα放射線）で表わしたときに）少なくとも２つ、さらにより好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つの特徴的なピークを有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００１９】
好ましくは、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、３．２、６．４、７．８、９．６、１２．７、１３．３、１３．９、１４．２、１４．７、１５．６、１６．３、１６．７、１７．２、１７．８、１８．２、１８．５、１９．３、１９．６、２０．０、２０．３、２０．７、２１．５、２２．０, ２２．９、２３．５、２４．０、２４．６、２５．０、２５．４、２７．２および２８．７において（２Θ±０．３°２Θ （ＣｕＫα放射線）で表わしたときに）、少なくとも１つの特徴的なピークを有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００２０】
さらにより好ましくは、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、３．２、６．４、７．８、９．６、１２．７、１３．３、１３．９、１４．２、１４．７、１５．６、１６．３、１６．７、１７．２、１７．８、１８．２、１８．５、１９．３、１９．６、２０．０、２０．３、２０．７ ２２．０、２２．９、２３．５、２４．０、２４．６、２５．０、２５．４、２７．２および２８．７において（２Θ±０．３°２Θ （ＣｕＫα放射線）で表わしたときに）、少なくとも１つの特徴的なピークを有するＰＸＲＤパターンを有する 。
【００２１】
好ましくは、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩が実質的に図１、図２および／または図４に示すようなＰＸＲＤパターンを有する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、３０５５、２９２９、１６１ １、１５８２、１５３６、１４８３、１４６２、１４１８、１３８１、１３２９、１３１ １、１２７６、１９２、１０２１、９４９、８７５、８３５、７７６、６５１、６２１、４７９および３６３ｃｍ-1に少なくとも１つの特徴的なピーク（波数、ｃｍ-1で表され、±１〜２ｃｍ-1の実験的不確実性を有する）を有するラマンスペクトルを有する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩である。
本発明のなおさらなる態様は、本発明による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩が実質的に図３に示されるようなラマンスペクトルを示すことである。
【００２３】
本発明のさらなる態様は本発明による５−メチル−（６Ｓ）-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩を得るための方法であり、以下の工程を含む:
ａ)５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を、任意に適切な溶媒または溶媒の混合物中に準備する工程;
ｂ)工程ａ）の組成物に水酸化ナトリウムを添加する工程;
ｃ)工程ｂ）の組成物に溶媒、溶媒の混合物および／または共塩形成剤(co-salt former)を任意に添加するか、または工程ｂ）の組成物を溶媒、溶媒の混合物および／または共塩形成剤に添加する工程;
ｄ)結晶化工程； 
ｅ)必要に応じて、さらに溶媒または溶媒の混合物を添加する工程；および
ｆ）得られた固体を単離する工程。
【００２４】
好ましくは、工程ｂ）における５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と水酸化ナトリウムとのモル比が１：１．９〜１：３の範囲である。
【００２５】
好ましくは工程ａ）、ｃ）および／またはｅ）による溶媒および／または溶媒の混合物は水、水溶性アルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ベンジルアルコール、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２６】
本明細書で使用される共塩形成剤は、本発明による結晶性ナトリウム塩の形成を促進する化学物質である。本発明による共塩形成剤は典型的には濾過工程で除去されるか、または濾過後に容易に洗い流すことができるように、プロセス溶媒に十分に可溶性である有機塩基である。
【００２７】
好ましくは、工程ｃ）における共塩形成剤が６〜１１のｐＫａ値、さらにより好ましくは７〜１０のｐＫａ値を有する有機塩基である。
【００２８】
さらにより好ましくは、工程ｄ）において、温度は少なくとも１５℃である。
【００２９】
好ましくは、工程ａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）において、種結晶が添加される。さらにより好ましくは、種結晶が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の所望のナトリウム塩である。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、本発明による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩、および任意選択で１種以上の許容可能な賦形剤、ならびに薬物および／または食品添加物の製造のための構成成分としての本発明による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の使用を含む、医薬組成物、食品添加物ビタミンおよび／または他の調製物である。
【００３１】
ホモシステイン低下、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、アルツハイマー病、認知障害および骨粗鬆症、ならびに／または低血漿および／もしくは低赤血球葉酸および／もしくは低脳脊髄液葉酸および／もしくは低末梢または中枢神経系葉酸の食事管理における使用のための本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩もまた、本発明の一部である。
【００３２】
驚くべきことに、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、米国特許第６，４４１，１６８号に開示された結晶性カルシウム塩と比較して改善された動的溶解度を有する。速度論的溶解度の測定は、実験の部に記載したようにして行った。
【００３３】
本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の水（室温）中での溶解度は水１ｍｌあたり１００ｍｇより大きいが、カルシウム塩は水１ｍｌあたり１０ｍｇよりかなり小さい溶解度を示す。
【００３４】
本発明のナトリウム塩の溶解度が高いため、バイオアベイラビリティーははるかに良好である。これにより、薬剤または食品添加物の有効性を低下させることなく、活性成分の量を減少させることができる経口剤形が得られる。
【００３５】
本発明による医薬組成物は、あらゆる投与様式、好ましくは経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与に適用することができる。
【００３６】
要約すると、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩によって提供される特性のプロフィールは、薬剤または食品添加物としての使用に有利である。
【実施例】
【００３７】
実験
粉末Ｘ線回折
Mythen I K検出器を備えたStoe Stadi P;Cu−Ｋａ１放射線；標準測定条件：透過率；４０ｋＶおよび４０ｍＡ管出力；湾曲Ｇｅモノクロメーター；０．０２°２Θステップサイズ、４８秒ステップ時間、１．５〜５０．５°２θ 走査範囲検出器モード；ステップ走査；１°２Θ検出器ステップ；標準試料調製：１０〜２０ｍｇの試料を２つの酢酸箔の間に置き；試料ホルダー：Stoe透過試料ホルダー；測定中に試料を回転させた。全ての試料の調製および測定は、周囲空気雰囲気中で行った。
【００３８】
ラマン分光
ＦＴ−ラマンスペクトルは、１０６４ｎｍで動作する近赤外Ｎｄ：ＹＡＧレーザおよび液体窒素冷却ゲルマニウム検出器を用いて、Bruker MultiRAM FT−ＲａｍａｎまたはBruker RFS １００ ＦＴ−Ｒａｍａｎシステムで記録した。３５００〜−５０ｃｍ-1で、２ｃｍ-1分解能で６４回のスキャンが蓄積されたが、フィルターカットオフ効果のために、１００ｃｍ-1を超えるデータのみが評価された。公称レーザ出力は、典型的には１００または３００ｍＷである。
【００３９】
ＴＧ−ＦＴＩＲ
熱重量測定は、Bruker FTIR Spectrometer Vector ２２（ピンホールを有するサンプルパン、Ｎ２雰囲気、加熱速度１０ Ｋ／分）に連結したNetzsch Thermo−Microbalance TG ２０９を用いて行った。
【００４０】
実施例１：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質二ナトリウム塩から製造された５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩（５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩による播種）
２５０．９ｍｇの非晶質５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸二ナトリウム塩を、磁気撹拌棒を備えた２２ｍＬのＳｕｐｅｉｃｏガラスバイアルに秤量した。２．０ｍＬのエタノールを添加した。サンプルを１分間超音波処理し、室温で１２分間撹拌した。バイアルの気相を窒素で１分間パージした（約１００ｍＬ／分）。次いで、サンプルを８０℃で１０分間撹拌した。３．０ｍＬのエタノールを添加し（合計５．０ｍＬのエタノール中）、０．５ｍＬの水を添加した（水分活性約０．５０）。試料を室温で約１０秒間超音波処理し、再び８０℃で５分間撹拌した。試料に５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩約１ｍｇを播種し、８０℃で３分間撹拌した。純白ではない懸濁液が形成され、バイアルのガラス壁に付着した固体材料をスパチュラでこすり落とし、黄色の懸濁液が形成された。懸濁液を８０℃で約１７分間撹拌し、固体材料をスパチュラを用いてガラス壁から再び掻き取った。懸濁液は撹拌が容易であった。橙色の懸濁液に、３．０ｍＬのアセトニトリルを添加し、次いで懸濁液を８０℃で３０分間撹拌した。熱濾過を行った。フリットガラスフィルター（多孔度Ｐ４、Φ １ｃｍ）を用いて懸濁液を濾過し、フィルターケーキを３分間風乾した。
次いで、フィルターケーキを秤量紙に移し、さらに約４０％の相対湿度で約１２分間風乾した。固体生成物は、１７８ｍｇの微細な黄色がかった粉末であった。光学顕微鏡およびＰＸＲＤによる特徴付けにより、固体の結晶性を確認した。Ｈ−ＮＭＲ分光法により、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の化学的完全性が確認された。固体生成物は図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを示し、ピーク位置は表１に列挙される。ラマン分光法によるさらなる試験は、サンプルが表２に示されるピーク位置を有する図３に示されるようなラマンスペクトルを示した。
【００４１】
【表１】
2020515614.tif 000002
【００４２】
【表２】
2020515614.tif 000003
【００４３】
実施例２：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質二ナトリウム塩から製造された５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩（５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩を用いた播種）
非晶質５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸二ナトリウム塩の１．２０５５ｇを、マグネチックスターラーバーを備えた４０ｍLのＳｕｐｅｌｃｏガラスバイアル中に秤量した。１０．０ｍLのエタノール／水１０：１ｖ／ｖを添加した。懸濁液を室温で８分間撹拌し、１２ｍｇの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩を播種した。懸濁液を室温で５分間撹拌し、バイアルの気相を窒素で１分間パージした（約１００ ｍＬ／分）。追加の１０ｍLのエタノール／水１０：１ｖ/ｖ(水分活性約０．５０）を添加した。懸濁液はここで容易に撹拌された。それを１分間超音波処理し、室温で５０分間撹拌した。懸濁液の顕微鏡検査は、非晶質物質の存在を示した。バイアルの気相を再び窒素で１分間パージした（約１００ｍＬ／分）。次いで、サンプルを約７０℃で１０分間撹拌した。試料をさらに約７０℃で１０分間撹拌し、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩を再び播種し、約７０℃で８分間撹拌した。非常に弱い懸濁液が形成された。混合物の一部として粘着性の非晶質固体を含有しない懸濁液が形成されるまで、７０℃で約３時間撹拌を続けた。光学顕微鏡による工程内制御が試料が主に結晶質であることを示したらすぐに、熱濾過を行った。フィルターケーキを１５分間風乾した。微細な黄色の粉末（０．８４２４ｇ）をＴＧ−ＦＴＩＲにより検査した。質量損失が１５．４％（水およびいくらかのエタノール）であったので、サンプルを１５ｍｌのスペルコバイアルに移し、室温および約１０ｍｂａｒで２０分間さらに乾燥させた。約８００ｍｇの微細な黄色がかった粉末が得られた。光学顕微鏡およびＰＸＲＤによる特性評価により、固体の結晶性を確認した。Ｈ−ＮＭＲ分光法により、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の化学的完全性が確認された。
【００４４】
実施例３：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の速度論的溶解度
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩（実施例１による）５０ｍｇを、スクリューキャップ付きの４ｍＬガラスバイアル中に秤量する。次いで、０．５ｍＬの精製／脱イオン水を添加する。混合物を室温で激しく撹拌し、短時間超音波処理すると、透明なわずかに黄色の溶液が容易に得られる（数秒以内）。従って、溶解度は、水１ｍＬ当たり１００ｍｇより大きい。溶液は室温で数時間透明のままである。
【００４５】
参考例４：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の速度論的溶解度
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（約１１％の水を含有し、従って約２５ｍｇの乾燥重量に相当する）の結晶性カルシウム塩２７．９ｍｇを、スクリューキャップ付きの４ｍＬガラスバイアル中に秤量する。２．５３５ｍＬの精製／脱イオン水を、調整可能な容量ピペットを用いて固体に添加する。混合物を室温で激しく撹拌し、短時間超音波処理する。透明な溶液は得られず、かなり濃縮された懸濁液が持続する。したがって、ここで説明するように測定された速度論的溶解度は、水１ｍＬ当たり１０ｍｇ未満である。
【００４６】
実施例５：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸から出発する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性二ナトリウム塩の調製
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸１０ｇ（アッセイ５−メチルテトラヒドロ葉酸９５．５９% w/w)、水２０ｇおよび１． ７４の混合物 ｇの水酸化ナトリウムを、撹拌しながら、窒素雰囲気下、ガラス容器中で７２℃に加熱した。７２℃で、２００ｍＬのエタノール／５％ｖ／ｖ２−プロパノールを３．５時間以内に添加した。次に、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性二ナトリウム塩０．０５ｇを播種材料として添加した。７２℃で、追加の１００ｍＬエタノール／５％ｖ／ｖ２−プロパノールを３時間以内に添加した。混合物を１４時間以内に２５℃に冷却し、再び７２℃に加熱した。混合物を超音波で処理して、ガラス容器の壁に付着していた物質を除去したが、温度は６３℃に低下した。固体を、密閉濾過管中で窒素圧で濾過することによって分離し、１００ｍＬのエタノール／５％ｖ／ｖ２−プロパノールで洗浄した。固体を真空中３６℃で１４時間乾燥させて、１１．０３ｇを得た。 ９４．５％収率に相当する純白ではない粉末（分析５−メチルテトラヒドロ葉酸８１．８６% w/w)固体生成物は図４に示すようなＰＸＲＤパターンを示し、ＰＸＲＤは試料の結晶性を確認し、Ｈ−ＮＭＲ分光法は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の化学的完全性と一致した。TGA (熱重量分析）によるさらなる検査により、約６．１％の質量損失が明らかになった。IC (イオンクロマトグラフィー）により判明したナトリウム含量は８．０％であり、これは二ナトリウム塩と良好に一致した。ＨＰＬＣは９７．４％の純度を示した。
【００４７】
参考例６：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質モノナトリウム塩の調製
ＥＰ １７１６４３４９．７に従って調製した６．０ｇの結晶性５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸モノナトリウム塩を、室温で６００ｇの水に添加した。固体を吸引濾過により除去した。濾液を液体窒素で浴中で凍結し、０．０７ ｍｂａｒで真空中で凍結乾燥した。２日後、真空を窒素ガスで置換した。６．０ｇの無定形５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸モノナトリウム塩が、純度９５．２％面積、含水量８．８％ｗ／ｗ、分析イナトリウム４．５％ｗ／ｗで得られた。
【００４８】
実施例７：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の安定性
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩、本発明の化合物の長期安定性を、参考例６に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質モノナトリウム塩およびＥＰ １ ０４４ ９７５ Ｂ１に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の長期安定性と比較するために、それぞれの安定性データを種々の温度および湿度で得た。
【００４９】
(ａ)５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の２５℃／６０％ｒｈでの安定性
参考例６に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質モノナトリウム塩、文献手順（ＥＰ １ ０４４ ９７５ Ｂ１）に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩、および実施例１に開示したように調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩を、２５℃／６０％ｒｈで保存した。サンプル中に残存する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量(% w/w)を、周期的間隔でＨＰＬＣによって測定した。結果を表１ａおよび図５に示す。残存する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量も、調製時の初期値（％ｒｅｌ）と比較した。結果を表１ｂに示す。さらに、主要な分解生成物である４α−ヒドロキシ−５−メチル−ＴＨＦ（ＭｅＦｏｘ）のピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体の含有量を、周期的間隔でＨＰＬＣによって測定し、絶対値(% w/w)として開示した。結果を表２および図６に示した。
【００５０】
【表３】
2020515614.tif 000004
【００５１】
【表４】
2020515614.tif 000005
【００５２】
【表５】
2020515614.tif 000006
【００５３】
(ｂ)５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の４０℃／７５％ｒｈでの安定性
参考例６に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質モノナトリウム塩、文献手順（ＥＰ １ ０４４ ９７５ Ｂ１）に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩、および実施例１に開示したようにして調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩を、４０℃／７５％ｒｈで保存した。サンプル中に残存する５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸の含有量を、一定間隔(% w/w)でＨＰＬＣによって測定した。その結果を表３ａおよび図７に示す。残存する５メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量も、調製時の初期値（％rel）と比較した。結果を表３ｂに示す。さらに、主要な分解生成物である４ａ−ヒドロキシ−５−メチル−ＴＨＦ（ＭｅＦｏｘ）のピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体の含有量を、一定的間隔でＨＰＬＣによって測定し、絶対値(% w/w)として開示した。結果を表４および図８に示す。
【００５４】
【表６】
2020515614.tif 000007
【００５５】
【表７】
2020515614.tif 000008
【００５６】
【表８】
2020515614.tif 000009
【００５７】
表１〜４は、本発明に開示されるような５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の安定性データを用いて、ｉ）５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の非晶質モノナトリウム塩や結晶性カルシウム塩と比較して、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の安定性に顕著な差があること、およびｉｉ）５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩に匹敵する安定性を長期間にわたり示すことを明らかに示している。
【図１】
2020515614.tif 000010
【図２】
2020515614.tif 000011
【図３】
2020515614.tif 000012
【図４】
2020515614.tif 000013
【図５】
2020515614.tif 000014
【図６】
2020515614.tif 000015
【図７】
2020515614.tif 000016
【図８】
2020515614.tif 000017
【国際調査報告】
2020515614.tif 000018
2020515614.tif 000019