(57)【要約】天然低次抗原から細胞外でアセンブルした高次抗原を調製する方法であって、方法が以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び５つの条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原のアセンブルした高次抗原へのアセンブリを誘発すること；を含み、低次抗原の少なくとも１０％がステップ（ｉｉ）で高次の抗原に変換され、それにより、アセンブルした高次抗原が、低次抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示し、少なくとも１つの中和抗体との結合を保持する、方法。ワクチン組成物を生成する方法であって、方法のステップに従うこと、次に、アセンブルした高次抗原を薬学的または生理学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントと混合することを含む、方法。１５の高次の細胞外でアセンブルした抗原を含み、アセンブルした抗原が天然対照高次抗原と比較して非中和抗体との結合の低下を少なくとも示す組成物。免疫応答を刺激するための、または抗原に特異的なＢ細胞などの免疫細胞の検出及び／または単離のための、アセンブルした高次抗原の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然低次抗原から細胞外でアセンブルした高次抗原を調製する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること、
ならびに
（ｉｉ）前記還元剤を除去もしくは希釈するか、または前記還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原をアセンブルした高次抗原にアセンブリさせることを誘発すること；を含み、
前記低次抗原の少なくとも１０％がステップ（ｉｉ）で高次の抗原に変換され、それにより、前記アセンブルした高次抗原が、前記低次抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示し、少なくとも１つの中和抗体との結合を保持する、前記方法。
【請求項２】
低次抗原を高次抗原にアセンブリさせる方法の効率を向上させるために、第１ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）が、ステップ（ｉｉ）の残りの低次抗原を含む溶液と共に繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉ）中またはステップ（ｉ）の前に、低次抗原を含む前記溶液から、天然オリゴマーまたは高次抗原をほぼ枯渇させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記低次抗原の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上が、高次抗原に変換される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
天然対照高次抗原が１つ以上の中和抗体に結合するか、またはこれらを誘発する能力を、前記アセンブルした高次抗原が保持するか、または上回る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アセンブルした高次抗原が、ＨＣＶ  Ｅ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アセンブルした高次抗原が、超可変領域１（ＨＶＲ１）もしくはその一部、超可変領域２（ＨＶＲ２）もしくはその一部、及び／または遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ／ＶＲ３）もしくはその一部のうちの１つ以上などの超可変領域の全部または一部を欠いている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アセンブルしたオリゴマー抗原が、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、及びＣ５６９からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの１つ以上に、非システイン置換または変異を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ワクチン組成物の製造方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を含み、前記アセンブルした高次抗原が、薬学的または生理学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントと混合される、前記方法。
【請求項１０】
前記抗原が、ウイルスエンベロープ抗原または癌抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスエンベロープ抗原が、肝炎ウイルス抗原またはＨＩＶエンベロープ抗原である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により低次抗原から産生される、アセンブルした高次抗原またはそれを含む組成物。
【請求項１３】
組成物であって、高次の細胞外でアセンブルした抗原を含み、前記アセンブルした抗原が天然対照高次抗原と比較して非中和抗体との結合の低下を少なくとも示す、前記組成物。
【請求項１４】
前記アセンブルした高次抗原が、ＨＣＶ−Ｅ２またはＨＣＶ  Ｅ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｅ２高次抗原が、超可変領域１（ＨＶＲ１）もしくはその一部、超可変領域２（ＨＶＲ２）もしくはその一部、及び／または遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ／ＶＲ３）もしくはその一部のうちの１つ以上などの超可変領域の全部または一部を欠いている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｅ２抗原が、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、及びＣ５６９からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの１つ以上に、非システイン置換または変異を含む、請求項１４または１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的または生理学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗原と関連する状態もしくはＨＣＶ感染の処置もしくは予防における、またはこのための薬品の調製における、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
ＨＣＶ感染の診断もしくは監視または抗ＨＣＶ処置プロトコールの監視のための診断薬の調製における、請求項１２に記載のアセンブルした高次抗原または請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
対象または患者における免疫応答を誘発するための方法であって、前記方法が、免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下で、前記対象もしくは患者に、請求項１２に記載のアセンブルした高次抗原または請求項１３〜１７の１項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
ＨＣＶの感染に対して対象を免疫するための方法であって、請求項１２に記載のアセンブルしたオリゴマーＥ２抗原、または請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
対象のＨＣＶ感染症を処置または予防するための方法であって、ＨＣＶ  Ｅ２及びＨＣＶ感染などの抗原に関連する状態を処置または予防するのに十分な時間及び条件下で、請求項１２に記載のアセンブルしたオリゴマー抗原、または請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記アセンブルした高次抗原が検出可能なタグまたは精製タグを含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の高次のアセンブルした抗原に対する精製抗体を生成するための方法であって、対象に有効量の抗原を投与すること、及び産生された前記抗体を精製することを含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１２〜１６の１項に記載のアセンブルした抗原を特異的に認識する抗体。
【請求項２６】
請求項１２に記載のアセンブルした高次抗原、または請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物を含むキット、または固体もしくは半固体基質。
【請求項２７】
抗原特異的免疫細胞と結合する／これを検出するための、請求項１２に記載のアセンブルした高次抗原、または請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
前記抗原に特異的なＢ細胞などの免疫細胞の検出及び／または単離のための、請求項１２に記載のアセンブルした高次抗原、または請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
ＨＣＶに特異的な免疫細胞／Ｂ細胞の検出及び／または単離のための方法であって、
ｉ）請求項１３〜１６に記載のアセンブルした高次Ｅ２抗原を用いて、ＨＣＶに特異的な免疫細胞／Ｂ細胞を標識すること；ならびに
ｉｉ）前記標識された免疫細胞／Ｂ細胞をサイトメトリーで検出及び／または単離すること、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は一般に、ワクチン及び診断用組成物に関する。特に、本明細書は、ＨＣＶエンベロープ２（Ｅ２）糖タンパク質及びＨＩＶエンベロープタンパク質などの目的の高次形態の抗原の生成を容易にする。高次抗原は、ワクチン製造及びｅｘ  ｖｉｖｏ結合用途に適する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書の参考文献の書誌詳細は、本明細書の最後にも記載される。
【０００３】
本明細書におけるあらゆる先行技術への言及は、この先行技術があらゆる国において共通の一般知識の一部を形成するという知見または任意の形態の示唆でなく、それと見なされるべきではない。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルスは、世界人口の３％に慢性的に感染し、且つ慢性肝疾患の主要な原因である非常に多様な病原体である。ＨＣＶは、７の高度に分岐した遺伝子型（Ｇ１〜Ｇ７）及び６７を超えるサブタイプ（ａ、ｂ、ｃなど）として広がり、このために、予防ワクチンが利用できない。近年、直接作用型抗ウイルス薬（ＤＡＡ）が診療所に行き渡って、９５％を超える処置された個人において、ウイルス除去を達成することができている。しかし、ＤＡＡは再感染を予防することができず、高コストのために、医療制度に大きな経済的負担がかかる。さらに、推定５０００万人が感染症の診断を受けておらず、継続的なウイルス拡散の手段となっている。予防ワクチンは、新たな感染症、おそらく、再感染を防ぎ、ＤＡＡの使用を伴う除去プログラムを著しく強化するであろう。それ故、予防ワクチンは、開発にとって優先すべきものと、世界保健機関により認識されている。
【０００５】
主要な表面糖タンパク質Ｅ２は、宿主細胞受容体ＣＤ８１にビリオンを結合させ、遺伝子型特異的で広域（交差遺伝子型保護の）中和抗体（ｂＮＡｂ）を生じる。自然感染では、３０％の個人が、自発的に感染を除去し、これは、ｂＮＡｂの急速な誘導及び広範に反応性のあるＴ細胞応答と相関している。加えて、広域中和モノクローナル抗体（ＮＭＡｂ）のカクテルは、ＨＣＶの小動物モデルにおける確立されたＨＣＶ感染を予防及び除去し得る。しかし、全長または切断型のＥ２を含むワクチン及び第Ｉ相臨床試験の組み換えＨＣＶ糖タンパク質を使用して、動物で行われた従前のワクチン接種試験は、高力価ＮＡｂを誘発せず、非常に限られた交差遺伝子型の中和が観察された。ＨＣＶ  Ｅ２は、高度にグリコシル化され、急速な配列変化を受け、免疫回避に全て関与する複数の可変領域を有する。中和抗体の結合を阻害するために、非中和抗体が提案されている。
【０００６】
改良されたＨＣＶワクチンを開発する従来技術のアプローチは、ＣＤ８１結合を保持しながら、可変領域を除去するようにＥ２を改変することに焦点を当てている。最近、オリゴマー、特に、高分子量のオリゴマー（ＨＭＷ形態）が、所望の広域中和抗体応答を生じさせることにおいて、単量体よりも優れていると、本発明者らは結論付けた。本アプローチは、有望であるが、高分子量（ＨＭＷ）形態の野生型ＨＣＶ  Ｅ２、及び超可変領域（例えば、デルタ１２３  ＨＣＶ  Ｅ２）を欠いている改変Ｅ２は一般に、低収量で発現され、構造的に不均一であり、これにより、ワクチン生成のための課題が生じた。現在では、オリゴマーは、Ｅ２を発現させるプラスミドの宿主細胞へのトランスフェクションにより産生され、細胞にＥ２を天然オリゴマーへとフォールディングさせることが可能になる。次に、オリゴマーは、必要に応じて、他の構成要素から分離される。
【０００７】
この背景に対して、一部の実施形態では、コスト及び精製の複雑さの低減などの、市販のワクチン製造目的のためのいくつかの潜在的な利点を有するオリゴマー形態のＥ２を製造するための方策を、本発明者（複数可）は開発している。この方法は、任意の目的の抗原に、及びアセンブルした高次形態の抗原の製造に、広く適用可能である。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本開示は、天然低次抗原から、細胞外でアセンブルした高次抗原を調製する方法を可能にし、方法は以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原のアセンブルした高次抗原へのアセンブリを誘発すること、を含む。本方法の一実施形態では、少なくとも１０％の低次抗原が、ステップ（ｉｉ）で高次抗原に変換される。本方法の一実施形態では、アセンブルした高次抗原は、低次抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示す。本方法の一実施形態では、アセンブルした高次抗原は、少なくとも１つの中和抗体との結合を保持する。
【０００９】
一実施形態では、抗原は、ウイルスエンベロープ抗原である。一実施形態では、ウイルスエンベロープ抗原は、ＨＣＶまたはＨＩＶである。
【００１０】
別の実施形態では、抗原は、癌抗原である。
【００１１】
一実施形態では、高次癌抗原は、四量体、五量体、六量体、十量体など、最大２３量体である。
【００１２】
一実施形態では、天然低次抗原から細胞外でアセンブルした高次抗原を調製する方法が提供され、方法は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原のアセンブルした高次抗原へのアセンブリを誘発すること；を含み、低次抗原の少なくとも１０％は、ステップ（ｉｉ）で高次抗原に変換され、それにより、アセンブルした高次抗原は、低次抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示し、少なくとも１つの中和抗体との結合を保持する。
【００１３】
一実施形態では、高次抗原は、予防的または治療的ワクチンとして対象に送達される前に、精製され、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントと混合される。
【００１４】
一実施形態では、本開示は、天然低次ＨＣＶ  Ｅ２から細胞外でアセンブルした高次Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）抗原を調製する方法を可能にし、方法は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次Ｅ２を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元されたＥ２を酸化剤と接触させて、高次ＨＣＶ  Ｅ２への（ｉ）の低次Ｅ２のリアセンブリを誘発すること、を含む。本方法の一実施形態では、低次Ｅ２抗原の少なくとも２０％が、ステップ（ｉｉ）で高次抗原にアセンブルする。一実施形態では、アセンブルした高次ＨＣＶ  Ｅ２は、低次Ｅ２と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示し、少なくとも１つの中和抗体との結合を保持する。
【００１５】
従って、一実施形態では、本開示は、天然低次ＨＣＶ  Ｅ２から細胞外でアセンブルした高次Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）抗原を調製する方法を可能にし、方法は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次Ｅ２を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元されたＥ２を酸化剤と接触させて、高次ＨＣＶ  Ｅ２への（ｉ）の低次Ｅ２のリアセンブリを誘発すること、を含み、低次抗原の少なくとも２０％が、ステップ（ｉｉ）で高次抗原にアセンブルし、それにより、アセンブルした高次ＨＣＶ  Ｅ２は、低次Ｅ２と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示し、少なくとも１つの中和抗体との結合を保持する。
【００１６】
別の一実施形態では、本開示は、天然低次ＨＩＶ  ｅｎｖから細胞外でアセンブルした高次ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質抗原を調製する方法を可能にし、方法は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次ＨＩＶ  ｅｎｖを接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元されたＥｎｖを酸化剤と接触させて、高次ＨＩＶ  Ｅｎｖへの（ｉ）の低次Ｅｎｖのリアセンブリを誘発すること、を含み、低次抗原の少なくとも１０％は、ステップ（ｉｉ）で高次抗原にアセンブルする。
【００１７】
一実施形態では、低次抗原の高次抗原へのアセンブリの方法の効率を向上させるために、ステップ（ｉｉ）の残りの低次抗原を含む溶液を用いて、第１のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を繰り返す。
【００１８】
驚くべきことに、さらに、本明細書に記載の方法を使用する、Ａｌａ７構築物などのシステイン改変バージョンのＨＣＶ  Ｅ２単量体さえも、より高次形態にアセンブルする。Ａｌａ７などのシステイン改変形態は主に単量体型で組み換え発現されるので、例えば、ＨＣＶ  Ｅ２  ＲＢＤ形態またはデルタ１２３形態で通常生成されるような異なる形態の混合物から単量体形態を精製するよりもむしろこの物質から高次形態を生成するのに有用である。従って、本方法において、システイン改変形態もアセンブルするという知見により、低次または単量体の有用な供給源を提供することによりワクチン製造が容易になる。さらに、本明細書で決定されるように、最初に高次形態にアセンブルしなかった低次抗原は、方法を繰り返した時に、高次形態を形成して、高収率の高次形態さえ可能にすることができる。
【００１９】
本方法の一実施形態では、ステップ（ｉ）中またはステップ（ｉ）の前に、低次抗原を含む溶液は、天然オリゴマーまたは高次抗原がほぼ除去される。
【００２０】
一実施形態では、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上の低次抗原が高次抗原に変換される。
【００２１】
別の実施形態では、本発明者らは、高次抗原の収量における遺伝子型特異的な差異を見出した。従って、一実施形態では、方法は、最大収率のアセンブルしたオリゴマー抗原を生成するウイルスまたは抗原遺伝子型を選択することをさらに含む。
【００２２】
一実施形態では、アセンブルした高次抗原は、天然対照高次抗原が１つ以上の中和抗体に結合するか、またはこれを誘発する能力を保持するか、または上回る。
【００２３】
一実施形態では、アセンブルした高次抗原は、ＨＣＶ  Ｅ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。
【００２４】
一実施形態では、アセンブルした高次ＨＣＶ  Ｅ２抗原は、超可変領域１（ＨＶＲ１）もしくはその一部、超可変領域２（ＨＶＲ２）もしくはその一部、及び／または遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ／ＶＲ３）もしくはその一部のうちの１つ以上などの超可変領域の全部または一部を欠いている。
【００２５】
一実施形態では、アセンブルしたオリゴマー抗原は、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、及びＣ５６９からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの１つ以上に、非システイン置換または変異を含む。本明細書で検討されるように、システイン改変形態の使用は、驚くべきことに、高次形態にアセンブルすることが可能な低次抗原の供給源を提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原のアセンブルした高次抗原へのアセンブリを誘発すること、を含む本明細書に開示のアセンブリ方法を含むワクチン組成物を製造する方法を提供し、この後、アセンブルした高次抗原は、薬学的または生理学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントと混合される。
【００２７】
一部の実施形態では、抗原は、ウイルスエンベロープ抗原または癌抗原である。
【００２８】
一部の実施形態では、ウイルスエンベロープ抗原は、肝炎ウイルス抗原またはＨＩＶエンベロープ抗原である。
【００２９】
別の態様では、本開示は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原のアセンブルした高次抗原へのアセンブリを誘発すること、を含む本明細書に開示の方法により低次抗原から生成された、アセンブルした高次抗原、またはそれを含む組成物を提供する。
【００３０】
一実施形態では、高次の細胞外でアセンブルした抗原を含む組成物が可能である。一実施形態では、高次のアセンブルした抗原は、宿主細胞で産生される対応対照抗原と比較して、より好ましい免疫原性プロファイルを示す。一実施形態では、好ましい免疫原性プロファイルは、ウイルスエンベロープ抗原の、１つ以上の非中和エピトープが、より閉じ込められ、及び／または１つ以上の中和エピトープが、より露出することを含む。一実施形態では、好ましい免疫原性プロファイルは、宿主細胞の環境でアセンブルして高次抗原になる対応対照抗原と比較して、より有効な免疫応答を決定するアセンブルした抗原を含む。一実施形態では、好ましい免疫原性プロファイルは、対象の腫瘍発生を低減または防止することができる、より強い免疫応答を含む。一実施形態では、アセンブルした抗原は、天然対照高次（オリゴマー）抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を示すことで、天然対照高次抗原と区別可能である。結合の低下は、検出可能な結合を全く含まない（エピトープがアセンブルした抗原に閉じ込められて、非中和抗体と結合することができないが、エピトープが非中和抗体と結合する天然対照抗原に閉じ込められていない）。特に、抗体ＣＢＨ４Ｇにより認識されるエピトープは、本明細書に記載のアセンブルしたＥ２中に閉じ込められる。
【００３１】
別の実施形態では、本開示は、高次の細胞外でアセンブルしたＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質抗原を含む組成物を可能にし、アセンブルしたＥ２は、非中和抗体との結合の低下を示す。特に、非中和抗体ＣＢＨ４Ｇは、天然対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、アセンブルしたＥ２との結合の低下を示した。この抗体は、文献、例えば、Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：８（４）ｅ１００２６５３，Ａｐｒｉｌ  ２０１２に記載される。また、抗体２Ａ１２は、天然対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、アセンブルしたＥ２との結合の低下を示した。抗体パネル及びそれらの生成の仕方は、参照により本明細書に組み込まれるＶｉｅｔｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：５５（４），１１１７−１１３１，２０１７、ならびに、参考文献５、３３〜３６、１７、及び３７ならびに出版者から入手可能な補足資料などの本明細書で参照された参考文献に記載される。
【００３２】
従って、一実施形態では、アセンブルした抗原は、エピトープ及び／または抗体２Ａ１２もしくは抗体ＣＢＨ４Ｇにより結合されたエピトープ残基の露出を低下させているか、あるいは当該技術分野で既知の抗体２Ａ１２または抗体ＣＢＨ４Ｇなどの非中和抗体により認識されない。
【００３３】
別の実施形態では、本開示は、高次の細胞外でアセンブルした高次ウイルスエンベロープ抗原を含む組成物を可能にし、アセンブルしたウイルスｅｎｖ抗原は、天然対照高次ウイルスエンベロープ抗原と比較して非中和抗体との結合の低下を示す。
【００３４】
一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマー抗原は、
（ｉ）対照天然抗原形態または単量体形態と比較して、非中和抗体との結合が低下した、
（ｉｉ）対照天然抗原形態と比較して、中和抗体との結合が少なくともほぼ同じ、
（ｉｉｉ）対照天然抗原形態または単量体抗原と比較して、より低い力価の非中和抗体の産生を誘発する、
（ｉｖ）中和抗体の産生を誘発する、
（ｖ）広域中和抗体の産生を誘発する、
（ｖｉ）任意に、より高い力価の中和抗体の産生を誘発する、
（ｖｉｉ）任意に、より高い力価の広域中和抗体の産生を誘発する、
からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を示す。
【００３５】
別の実施形態では、本開示は、高次の細胞外でアセンブルした高次ＨＩＶエンベロープ抗原を含む組成物を可能にし、アセンブルしたＨＩＶ  ｅｎｖ抗原は、天然対照高次ＨＩＶエンベロープ抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を示す。
【００３６】
好適な対照は、本開示の文脈において当業者に十分に理解されるであろう。一実施形態では、対照抗原は、細菌もしくは哺乳動物、酵母、植物、または昆虫細胞などの宿主細胞中で組み換え産生された目的の試験抗原と同じ遺伝子型である。
【００３７】
一実施形態では、アセンブルした高次抗原は、ＨＣＶ  Ｅ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。
【００３８】
一実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗原は、超可変領域１（ＨＶＲ１）もしくはその一部、超可変領域２（ＨＶＲ２）もしくはその一部、及び／または遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ／ＶＲ３）もしくはその一部のうちの１つ以上などの超可変領域の全部または一部を欠いている。ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びｉｇＶＲ／ＶＲ３配列の例は、図１２に示される。
【００３９】
一部の実施形態では、Ｅ２抗原は、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、及びＣ５６９からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの１つ以上に、非システイン置換または変異を含む。一実施形態では、この文脈での１つ以上のアミノ酸への言及は、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸が、非システイン置換であるか、または欠失もしくは別の方法で変異していることを意味する。
【００４０】
一実施形態では、本開示は、アセンブルした高次ＨＣＶ  Ｅ２抗原（単量体Ｅ２からアセンブルした）ならびに薬学的または生理学的に許容される担体及び／または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００４１】
一実施形態では、組成物は、薬学的または生理学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む。一実施形態では、抗原は、ワクチン組成物に適する任意の形態の担体中で提示され得る。
【００４２】
一実施形態では、本開示は、ＨＣＶもしくはＨＩＶ感染などのウイルス感染、または癌、またはウイルスエンベロープもしくは癌抗原に関連する状態の処置または予防のための薬品の調製における、本明細書に記載の組成物の使用を提示する。
【００４３】
一実施形態では、本開示は、アセンブルした高次抗原の使用、または診断もしくはＥ２、ＨＣＶ感染などの抗原と関連する状態の監視もしくは抗ＨＣＶ処置プロトコールの監視のための診断薬の調製における組成物を提供する。
【００４４】
一実施形態では、本開示は、対象または患者において免疫応答を誘発するための方法を提供し、方法は、免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下で、有効量の本明細書に記載のアセンブルした高次抗原、または本明細書に記載の組成物を対象または患者に投与することを含む。
【００４５】
一実施形態では、本開示は、アセンブルしたオリゴマー抗原、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、ＨＣＶの感染に対して対象を免疫する方法を提供する。
【００４６】
一実施形態では、本開示は、ＨＣＶ感染を処置または予防するのに十分な時間及び条件下で、アセンブルしたオリゴマー抗原、または記載の組成物を対象に投与することを含む、対象のＨＣＶ感染を処置または予防するための方法を提供する。
【００４７】
一実施形態では、組成物は、異なる病原体由来の第２の高次抗原をさらに含む。
【００４８】
一実施形態では、アセンブルした高次抗原は、検出可能タグまたは精製タグを含む。
【００４９】
一実施形態では、本開示は、有効量の抗原を対象に投与すること、及び産生された抗体を精製することを含む、本明細書に記載の高次アセンブルした抗原に対する精製抗体の生成を提供する。
【００５０】
一実施形態では、本明細書に記載のアセンブルした高次抗原／Ｅ２抗原を特異的に認識する抗体が提供される。代わりにまたは加えて、天然のアセンブルしていない抗原、またはアセンブルした、且つ天然でない抗原に曝露されたエピトープを認識する抗体を同定することができる。
【００５１】
一実施形態では、本明細書に記載のアセンブルした高次抗原、または本明細書に記載の組成物を含むキット、または固体もしくは半固体基質が提供される。
【００５２】
一実施形態では、本開示は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の天然システインを還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、低次抗原を接触させること；ならびに、（ｉｉ）還元剤を除去もしくは希釈するか、または還元された低次抗原を酸化剤と接触させて、（ｉ）の低次抗原のアセンブルした高次抗原へのアセンブリを誘発すること、を含む本明細書に開示の方法により低次抗原から生成されたアセンブルした高次抗原の使用を提示し、組成物は、高次の細胞外でアセンブルした高次癌抗原またはウイルスエンベロープ抗原を含み、アセンブルしたウイルスｅｎｖ抗原は、抗原特異的免疫細胞と結合／これを検出するための天然対照高次ウイルスエンベロープ抗原と比較して、非中和抗体との結合の低下を示す。
【００５３】
一実施形態では、主題の高次のアセンブルした抗原は、抗原に特異的なＢ細胞などの免疫細胞の検出及び／または単離に適するか、またはそれに使用される。一実施形態では、免疫細胞は、抗原に特異的なＴ細胞である。
【００５４】
別の実施形態では、本開示は、ｉ）本明細書に記載のアセンブルした高次抗原を用いて、抗原に特異的な免疫細胞／Ｂ細胞を標識すること、ならびに、ｉｉ）標識された免疫細胞／Ｂ細胞をサイトメトリーで検出及び／または単離すること、を含む、抗原に特異的な免疫細胞／Ｂ細胞の検出及び／または単離のための方法を可能にする。
【００５５】
別の実施形態では、本開示は、ｉ）アセンブルした高次形態の抗原を用いて、ＨＣＶまたはＨＩＶなどの抗原に特異的な免疫細胞／Ｂ細胞を標識すること；ならびに、ｉｉ）標識された免疫細胞／Ｂ細胞をサイトメトリーで検出及び／または単離すること、を含む、ＨＣＶまたはＨＩＶなどの抗原に特異的な免疫細胞／Ｂ細胞の検出及び／または単離のための方法を可能にする。
【００５６】
この発明の概要は、本明細書に記載の全ての実施形態の網羅的列挙ではない。
【００５７】
一部の図は、色表現または実体を含有する。カラー版の図は、要求に応じて特許権者から、または適切な特許庁から入手できる。特許庁から取得した場合、手数料が課され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Δ１２３含有プラスミドのアガロースゲル電気泳動を示す。上のバンドは、ベクター骨格を表し、下のバンドは、Δ１２３インサートを表す。これらを、制限酵素での消化によりベクターから単離した。ｐｃＤＮＡ−Ｈ７７ｃΔ１２３−ＨＩＳ及びｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳを両方ともに、ＮｈｅＩ及びＸｂａＩで消化し、一方、ｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳを、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化した。Ｈ７７ｃ、Ｃｏｎ１、及びＳ５２Δ１２３含有プラスミドから放出されるインサートの予想される長さは、それぞれ、７６２ｂｐ、７５９、及び７１０ｂｐである。サイズマーカー（Ｍ）として、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｂ  ＤＮＡラダーを使用した。
【図２−１】Δ１２３のトランスフェクション及び精製を示す。（Ａ−Ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡにより分析された、ＦＳ２９３Ｆ細胞への、ｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳ（Ａ）及びｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳ（Ｂ）の一過性トランスフェクションのタンパク質発現。トランスフェクション後の３、５、７、及び９日目に採取した細胞培養上清を２倍希釈した後、これらの半対数段階希釈物を、二量体ＭＢＰ−ＣＤ８１−ＬＥＬ１１３−２０１でコーティングされた酵素免疫アッセイプレートに塗布した。単量体Ｈ７７ｃΔ１２３（１μｇ／ｍＬ）及び６×ＨＩＳタグを欠いているＨＩＶ  ｇｐ１４０を含有する細胞培養上清の半対数段階希釈物がまた、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として含まれた。これの後に、１／１０００に希釈されたウサギ抗ＨＩＳ抗体を添加し、１／１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ免疫グロブリンの単一希釈物を用いて検出した。（Ｃ−Ｄ）同様に行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析された、アフィニティークロマトグラフィー後のＣｏｎ１Δ１２３（Ｃ）及びＳ５２Δ１２３（Ｄ）。細胞培養上清に含まれるタンパク質を、コバルト荷電ＴＡＬＯＮビーズに適用して、６×Ｈｉｓタグ付けしたΔ１２３の結合を可能にし、ＴＡＬＯＮ相互作用後の上清をフルースローとして収集した。次に、タンパク質を洗浄し、３つの別々の画分に溶出させた。元の調製物と比較して、ＥＬＩＳＡについて量を等しくするために、全ての試料を必要に応じて希釈した。
【図２−２】図２−１と同様である。
【図３−１】Δ１２３のゲル濾過プロファイルを示す。（Ａ）ＦＳ２９３Ｆ細胞における安定なトランスフェクションから産生され、且つＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用したゲル濾過クロマトグラフィーにより分析された、アフィニティー精製されたＨ７７ｃΔ１２３糖タンパク質。点線及びピーク高さは、単量体（７８）、二量体（７０）、ＨＭＷ２（５９）、及びＨＭＷ１（４６）Δ１２３に対応する画分を示す。（Ｂ〜Ｃ）ＦＳ２９３Ｆ細胞へのラウンド１の一過性トランスフェクションから生成された、アフィニティー精製されたＣｏｎ１Δ１２３（Ｂ）及びＳ５２Δ１２３（Ｃ）の、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用するゲル濾過クロマトグラフィーを示す。点線及びピーク高さは、それぞれ、Ｃｏｎ１及びＳ５２の場合、番号７７、６８、６６、４６、及び７８、６９、６５、４６とラベル付けされた、それぞれ、単量体、二量体、ＨＭＷ２、及びＨＭＷ１に対応する画分を示す。（Ｄ−Ｅ）ＦＳ２９３Ｆ細胞への、Ｃｏｎ１Δ１２３（Ｄ）及びＳ５２Δ１２３（Ｅ）の一過性トランスフェクションを繰り返し（すなわち、ラウンド２）、生成されたΔ１２３糖タンパク質を、アフィニティー精製した後、ラウンド１と同様に、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分析にかけたことを示す。
【図３−２】図３−１と同様である。
【図４−１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された、分画されたΔ１２３のゲル濾過を示す。２つの連続した画分のそれぞれから２０ｕＬがプールされ、且つ５〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲル上にロードされ、ゲル濾過で分画した（Ａ）ＣＯＮ１Δ１２３及び（Ｂ）Ｓ５２Δ１２３の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色。１２％のアクリルアミドゲル上にロードされた非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同じ量で、ゲル濾過分画した（Ｃ）Ｃｏｎ１Δ１２３及び（Ｄ）Ｓ５２Δ１２３の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色。Ｂｉｏ−Ｒａｄの広範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードをマーカー（Ｍ）としてロードした。
【図４−２】図４−１と同様である。
【図５Ａ】ＭＡｂが単量体及びＨＭＷ１Δ１２３に結合する能力の一例を示す。陰性対照としての単量体Δ１２３（赤色）（２μｇ／ｍＬ）及びＨＭＷ１Δ１２３（青色）（５μｇ／ｍＬ）及びＢＳＡ（緑色）を酵素免疫アッセイプレートにコーティングした。次に、一次抗体の半対数段階希釈物を添加し、結合を適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体で検出した。次に、この技術を使用して、各結合曲線の中点を比較することにより、ＨＭＷ１Δ１２３に対するパネルＭＡｂの相対的結合を計算し、これを、最高の光学濃度値の半分とした。表７の作成のために、単量体及びＨ７７ｃ  ＨＭＷ１Δ１２３と比較して、結合の倍数差を計算した。
【図５Ｂ】ＭＡｂのパネルに対するΔ１２３の異なる株の反応性を示す。単一希釈点評価を実施し、それにより、Ｈ７７ｃ、Ｃｏｎ１、及びＳ５２Δ１２３単量体（５μｇ／ｍＬ）及び陰性対照としてのＢＳＡ（５μｇ／ｍＬ）を、酵素免疫アッセイプレートにコーティングした。一次抗体の単一希釈物を添加し、結合をＨＲＰコンジュゲート二次抗体に特異的な適切な種で検出した。
【図６】（Ａ）は、小規模のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）還元を示す。ＰＢＳ（ｐＨ９．６）中で調製された異なる濃度のＴＣＥＰ（０〜５００ｍＭ）を用いて、酵素イムノアッセイプレート上にコーティングされたＨ７７Δ１２３単量体を３７℃で３０分間還元した。立体配座依存性マウスＨ５３（１μｇ／ｍＬ）、ならびにそれぞれ陽性及び陰性対照を表す、ウサギ抗ＨＩＳ（１／１０００）及びヒト抗ＣＭＶ  Ｒ０４（１／１０００）を含む、一次抗体の単一希釈物を添加した。結合を適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体で検出した。一次抗体のそれぞれに対する反応を、三連で試験し、標準偏差を示すエラーバーを有する線グラフとして、平均光学濃度値をプロットした。（Ｂ）は、ＴＣＥＰ及びＢＭＯＥで処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３を示す。表８に記載される１〜７とラベル付けされた異なる条件下でのＴＣＥＰ還元及びＢＭＯＥ架橋剤を用いるリフォールディング後の単量体Ｈ７７ｃΔ１２３（１０μｇ）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色。Δ１２３試料を、対照としての単量体及びＨＭＷ１  Ｈ７７ｃΔ１２３（それぞれ、５μｇ）ならびに広範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカー（Ｍ）と一緒に、５〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルにロードした。
【図７−１】（Ａ）は、グルタチオンで処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３を示す。表９に記載される１〜５とラベル付けされた異なる条件下で、酸化還元シャフリングシステムを使用して、ＧＳＨ及びＧＳＳＧでリフォールディングした後の、単量体Ｈ７７ｃΔ１２３（１０μｇ）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色。対照としての単量体及びＨＭＷ１  Ｈ７７ｃΔ１２３（各５μｇ）ならびに広範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカー（Ｍ）と一緒に、Ｈ７７ｃΔ１２３試料を５〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルにロードした。（Ｂ）は、グルタチオンで処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３のゲル濾過プロファイルを示す。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用した、未処理単量体Ｈ７７ｃΔ１２３のゲル濾過クロマトグラフィー。（Ｃ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用した、１０μｇ／μＬの糖タンパク質を２ｍＭのＧＳＨ及び０．４ｍＭのＧＳＳＧで処理した後のＨ７７ｃΔ１２３のゲル濾過クロマトグラフィーを示す。点線及びピーク高さは、単量体（７８）及び二量体（６９）に対応する画分を示す。
【図７−２】図７−１と同様である。
【図８−１】（Ａ）は、小規模ＤＴＴ還元を示す。酵素イムノアッセイプレート上にコートされたＨ７７ｃΔ１２３単量体を、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中で調製された異なる濃度のＤＴＴ（０〜１０ｍＭ）で、３７℃で３０分間還元した。立体配座依存性マウスＨ５３（１μｇ／ｍＬ）、ならびにそれぞれ陽性及び陰性対照を表すウサギ抗ＨＩＳ（１／１０００）及びヒト抗ＣＭＶ  Ｒ０４を含む、一次抗体の単一希釈物を添加した。結合を適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体で検出した。一次抗体のそれぞれに対する反応を、三連で試験し、標準偏差を示すエラーバーを有する線グラフとして、平均光学濃度値をプロットした。（Ｂ）は、ＤＴＴで処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３を示す。異なる条件下（１〜１２とラベル付けされ、表３．６に記載される）でのＤＴＴ還元ならびに徐々に希釈する方法を使用したリフォールディング後の単量体Ｈ７７ｃΔ１２３（１０μｇ）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色。対照としての単量体及びＨＭＷ１  Ｈ７７ｃΔ１２３（各５μｇ）ならびに広範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカー（Ｍ）と一緒に、Ｈ７７ｃΔ１２３試料を５〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルにロードした。（Ｃ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用した未処理単量体Ｈ７７ｃΔ１２３のゲル濾過クロマトグラフィーを示す。（Ｄ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用して、１μｇ／μＬの糖タンパク質を１ｍＭのＤＴＴで処理した後のＨ７７ｃΔ１２３のゲル濾過クロマトグラフィーを示す。点線及びピーク高さは、単量体（７７〜７８）、二量体（６９）、及びＨＭＷΔ１２３（５９）に対応する画分を示す。
【図８−２】図８−１と同様である。
【図９−１】ＤＴＴ処理Δ１２３及びＡＬＡ７Δ１２３の抗原特性決定を示す。ＤＴＴ処理Δ１２３及びＡＬＡ７Δ１２３は、実施例１５に記載されるように、抗体（Ａ）ＡＲ３Ｃ（Ｂ）ＣＢＨ４Ｇ（Ｃ）ＨＣ８４．２７及び（Ｄ）ＨＣＶ１との結合の評価により特性決定されている。
【図９−２】図９−１と同様である。
【図１０】ゲル濾過クロマトグラフィーを使用した、ＤＴＴ処理Δ１２３のリフォールディングから生じた生成物の分析を示す。未処理単量体のプロファイルが示され、続いて、実施例１４に記載されるようなＤＴＴでの処理数（１、２、または３ヒット）を増加させる。
【図１１】実施例１４に記載されるようなゲル濾過クロマトグラフィーを使用した、プロテアーゼ阻害剤の存在下での非リフォールディングΔ１２３単量体のリフォールディング及びΔ１２３のリフォールディングから生じた生成物の分析を示す。
【図１２】使用したＨＣＶ分離株の対応するＥ２６６１領域のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを提示する。Ｈ７７ｃ（ＡＦ００９６０６、Ｇ１ａ、配列番号１１）、Ｊ６（ＡＦ１７７０３６、Ｇ２ａ、配列番号１６）、ｓ５２（ＧＵ８１４２６３、Ｇ３ａ、配列番号１３）、ＥＤ４３（ＧＵ８１４２６５、Ｇ４ａ、配列番号１０）、ＳＡ１３（ＡＦ０６４４９０、Ｇ５ａ、配列番号１２）、ＥＵＨＫ２（Ｙ１２０８３、Ｇ６ａ、配列番号１４）、ＱＣ６９（ＥＦ１０８３０６、Ｇ７ａ、配列番号１５）。ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びｉｇＶＲ／ＶＲ３は、赤／オレンジ色で示される。ＥＤ４３のアミノ酸残基ＧＦＬＡＳＬＦＹ、ＹＴＷＧＥＮＥＴＤ、及びＹＲＬＷＨＦに対応する残基は、ＣＤ８１結合領域である。
【図１３】Δ１２３Ａｌａ７コドン最適化に対するヌクレオチド構築物を示し；下線領域は、制限酵素部位ＧＧＴＡＣＣ＝ＫｐｎＩ、ＧＧＡＴＣＣ＝ＢａｍＨＩ、ＣＴＣＧＡＧ＝ＸｈｏＩ、及びΔ１２３Ａｌａ７のタンパク質配列に対応する。
【図１４−１】図１４〜図１４ｃは、タンパク質配列：ＡＦ００９６０６コード配列（配列番号６）、ＡＦ００９６０６全長Ｅ２（配列番号７）、ＡＦ００９６０６Ｅ２６６１（配列番号８）、ＷＴ＿Ｅ２６６１（配列番号４）、及びΔ１２３（配列番号３）のＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａアミノ酸アラインメントを示す。下線領域は、残基６３０〜６３５に対応する。
【図１４−２】図１４−１と同様である。
【図１４−３】図１４−１と同様である。
【図１４−４】図１４−１と同様である。
【図１４−５】図１４−１と同様である。
【図１４−６】図１４−１と同様である。
【図１４−７】図１４−１と同様である。
【図１４−８】図１４−１と同様である。
【図１４−９】図１４−１と同様である。
【図１４−１０】図１４−１と同様である。
【図１４−１１】図１４−１と同様である。
【図１５】（Ａ）は、異なる濃度のβメルカプトエタノールで還元されて、アセンブルした試料の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。精密サイズマーカーは、左側に示され、分子量は、ｋＤａで示される。右に示される単量体、二量体、及び高分子量形態の表示サイズ。（Ｂ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用した、１００ｍＭのＢＭＥで処理した後の単量体Δ１２３（破線）または未処理の単量体Δ１２３（実線）のゲル濾過クロマトグラフィーを示す。
【図１６】アセンブルしたＨＣＶタンパク質でワクチン接種された動物の抗体価を示す。表１５に列挙された抗原でワクチン接種された動物からの最終採血を、単量体Δ１２３タンパク質と結合する能力について分析した。各群の逆数抗体価を示す。横線は、平均値であり、上下バーは、標準偏差を表す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ独立ｔ検定を使用する２−Ｆ及び４−Ｆ＋５−Ｆの間の抗体価の差は統計的に有意であった（ｐ＝０．０２８１）。プリズムｖ７．０。
【図１７】アセンブルしたＨＣＶタンパク質でワクチン接種された動物のエピトープＩに対する抗体価を示す。表１５に列挙された抗原でワクチン接種された動物からの最終採血を、遺伝子型１ａ  Ｈ７７ｃ配列の残基４０９〜４２８を包含する合成ペプチドと結合するそれらの能力について分析した。各群の逆数抗体価を示す。横線は、平均値であり、上下バーは、標準偏差を表す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ独立ｔ検定を使用して、群間の抗体価の差を決定した。プリズムｖ７．０。
【図１８】アセンブルしたＨＣＶタンパク質でワクチン接種された動物のエピトープＩＩＩに対する抗体価を示す。表１５に列挙された抗原でワクチン接種された動物からの最終採血を、遺伝子型１ａ  Ｈ７７ｃ配列の残基５２３〜５４９を包含する合成ペプチドと結合するそれらの能力について分析した。各群の逆数抗体価を示す。横線は、平均値であり、上下バーは、標準偏差を表す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ独立ｔ検定を使用して、群間の抗体価の差を決定した。プリズムｖ７．０。
【図１９】アセンブルしたＨＣＶタンパク質でワクチン接種された動物の遺伝子型２ａエピトープＩに対する抗体価を示す。表１５に列挙された抗原でワクチン接種された動物からの最終採血を、遺伝子型２ａ  Ｊ６配列の残基４０９〜４２８を包含する合成ペプチドと結合するそれらの能力について分析した。各群の逆数抗体価を示す。横線は、平均値であり、上下バーは、標準偏差を表す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ独立ｔ検定を使用して、群間の抗体価の差を決定した。プリズムｖ７．０。
【図２０】免疫血清が、ＨＣＶ  Ｅ２及びその細胞内受容体ＣＤ８１の相互作用を阻害する能力を示す。表１５に列挙された抗原でワクチン接種された動物の最終採血を、（Ａ）Ｈ７７ｃ  Ｇ１ａ  Ｅ２及びＣＤ８１と（Ｂ）Ｊ６Ｇ２ａＥ２及びＣＤ８１との間の結合を阻害するそれらの能力について分析した。各群の逆数抗体価を示す。横線は、平均値であり、上下バーは、標準偏差を表す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ独立ｔ検定を使用して、群間の抗体価の差を決定した。プリズムｖ７．０。
【図２１】免疫血清が肝細胞の遺伝子型１ａウイルスによる感染を予防する能力を示す。表１５に列挙された抗原でワクチン接種された動物の最終採血を、Ｇ１ａ  ＨＣＶｐｐによる感染を予防するそれらの能力について分析した。各群の逆数抗体価を示す。横線は、その平均値である。
【図２２】ＨＭＷ１及び単量体免疫血清の特異性を示す。モルモット血清の段階希釈物を、一定量のＨＣＶ１（Ａ）、ＨＣ８４−２７（Ｂ）、ＡＲ３Ｃ（Ｃ）、及び２Ａ１２（Ｄ）に添加した。抗体を単量体Δ１２３に添加し、結合したＭＡｂを抗ヒトＦａｂ２で検出した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ検定（Ｐｒｉｓｍ  ｖ７）を使用して、群を比較した。
【図２３】アセンブルしたΔ１２３を使用した、選別されたＢ細胞集団のＦＡＣＳプロットを示す。ＣＤ１９陽性及び抗Ｅ２陽性Ｂ細胞を、抗ＣＤ１９  Ｃｙ７抗体及びアセンブルしたΔ１２３で検出した。
【図２４】アセンブルしたタンパク質のサイズを決定するサイズ排除クロマトグラフィー−マルチアングル光散乱を示す。アセンブルしたΔ１２３Ａ７（青）及びアセンブルしたΔ１２３（赤）試料のＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）シグナル及びモル質量の重ね合わせ。
【図２５】ＤＴＴでの第２ラウンドの変性にかけ、続いて、アセンブリした、ＤＤＴでの処置の後にＨＭＷ形態にアセンブルしていないΔ１２３Ａ７単量体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。単量体及びＨＭＷ種は、矢印で示され、それぞれの％は、表に示される。
【図２６】ＤＴＴでの変性にかけ、続いて、アセンブリしたＲＢＤ単量体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。単量体及びＨＭＷ種は、矢印で示され、それぞれの％は、表に示される。
【図２７】ＤＴＴでの変性にかけ、続いて、アセンブリしたＲＢＤＡ７単量体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。単量体及びＨＭＷ種は、矢印で示され、それぞれの％は、表に示される。
【図２８】ＤＴＴでの変性にかけ、続いて、アセンブリしたｅｎｖ単量体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ＨＭＷ種は、矢印で示される。
【００５９】
表の簡単な説明
表１は、一過性トランスフェクション条件を示す。
表２は、ＭＡｂのリストを示す。
表３は、ＤＴＴ還元のための条件を示す。
表４は、グルタチオンによるタンパク質のリフォールディングの条件を示す。
表５は、ＴＣＥＰ還元のための条件を示す。
表６は、異なるオリゴマー形態のΔ１２３の発現を示す。ゲル濾過曲線上のそれらの対応するピークの下の面積（図３Ｂ〜Ｅ）を全曲線下面積で除することにより、単量体、二量体、ＨＭＷ２、及びＨＭＷ１の百分率を計算した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＵＮＩＣＯＲＮ制御ソフトウェアを使用して、曲線下面積を定量した。
表７は、ＨＭＷ１Δ１２３の抗原特性を示す。
表８は、Δ１２３のＴＣＥＰ還元及びＢＭＯＥ媒介リフォールディングの条件を示す。
表９は、グルタチオンを用いるＨ７７ｃΔ１２３リフォールディング条件を示す。グルタチオン処理されたＨ７７ｃΔ１２３の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の単量体のデンシトメトリーを二量体のデンシトメトリーで除することにより、単量体対二量体の比を計算した（図７Ａ）。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを使用して、デンシトメトリーを定量した。
表１０は、グルタチオン処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３からの多量体形成の定量を示す。曲線下総面積の百分率として計算されたゲル濾過曲線上の単量体及び二量体のピーク下面積（図７Ｂ）、ならびに単量体のピーク下面積を二量体のもので除することにより計算された単量体対多量体の比。
表１１は、ＤＴＴで処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３からの多量体形成の定量を示す。曲線下総面積の百分率として計算されたゲル濾過曲線上の単量体及びＨＭＷのピーク下面積（図７Ｃ〜Ｄ）、ならびに単量体のピーク下面積を多量体のもので除することにより計算された単量体（７６分）対多量体（５８分）の比。
表１２は、ＤＴＴで処理された単量体Ｈ７７ｃΔ１２３からの多量体形成の定量を示す。曲線下総面積の百分率として計算されたゲル濾過曲線上の単量体及び多量体のピーク下面積（図７Ｂ）、ならびに単量体のピーク下面積を多量体のもので除することにより計算された単量体対多量体の比。
表１３は、抗原Δ１２３を使用して、リフォールディングタンパク質を生じた方法を示す。
表１４は、異なるリフォールディング方法により生じた％リフォールディングタンパク質を示す。
表１５は、免疫化群を示す。
表１６は、単量体Δ１２３に対する免疫血清反応性の統計分析を示す。
表１７は、免疫血清がＨ７７ｃエピトープＩと結合する能力の統計分析を示す。
表１８は、免疫血清がＨ７７ｃエピトープＩＩＩと結合する能力の統計分析を示す。
表１９は、免疫血清がＪ６エピトープＩと結合する能力の統計分析を示す。
表２０は、免疫血清がＨ７７ｃ  Ｇ１ａ  Ｅ２のＣＤ８１との結合をブロックする能力の統計分析を示す。
表２１は、免疫血清がＪＦＨ−１  Ｇ２ａ  Ｅ２のＣＤ８１との結合をブロックする能力の統計分析を示す。
表２２は、免疫血清がＨ７７ｃ  ＨＣＶウイルスの肝細胞への感染を予防する能力の統計分析を示す。
表２３は、免疫血清がＨＣＶ１の結合を防止する能力の統計分析を示す。
表２４は、免疫血清がＨＣ８４−２７の結合を防止する能力の統計分析を示す。
表２５は、免疫血清がＡＲ３Ｃの結合を防止する能力の統計分析を示す。
表２６は、免疫血清が２Ａ１２の結合を防止する能力の統計分析を示す。
表２７は、リアセンブルしたタンパク質のＳＥＣ−ＭＡＬＳを示す。
【００６０】
配列表のキー
配列番号１：コドン最適化Δ１２３Ａｌａ７に対するＤＮＡ構築物。
配列番号２：コドン最適化Δ１２３Ａｌａ７をコードするＤＮＡ配列。
配列番号３：アミノ酸配列Δ１２３Ａｌａ７。
配列番号４：ＷＴ  Ｅ２６６１をコードするアミノ酸配列（ＲＢＤ）。
配列番号５：Δ１２３  Ｅ２６６１。
配列番号６：ＡＦ００９６０６コード配列に対応するアミノ酸残基。
配列番号７：ＡＦ００９６０６全長Ｅ２タンパク質配列に対応するアミノ酸残基。
配列番号８：ＡＦ００９６０６Ｅ２６６１に対応するアミノ酸残基。
配列番号９：Ｎ末端シグナル配列。
配列番号１０：アミノ酸配列ＥＤ４３。
配列番号１１：アミノ酸配列Ｈ７７ｃ。
配列番号１２：アミノ酸配列ＳＡ１３。
配列番号１３：アミノ酸配列ｓ５２。
配列番号１４：アミノ酸配列ＥＵＨＫ２。
配列番号１５：アミノ酸配列ＱＣ６９。
配列番号１６：アミノ酸配列Ｊ６。
配列番号１７：Ｃ末端膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を欠いているＨＩＶ  ｅｎｖに対応するアミノ酸残基。
配列番号１８：Ｎ末端リーダー配列を有するＨＩＶ  ｅｎｖに対応するアミノ酸残基。
配列番号１９：コドンＨ７７ｃΔ１２３をコードするＤＮＡ配列。
配列番号２０：Ｃｏｎ１Δ１２３をコードするＤＮＡ配列。
配列番号２１：ｓ５２Δ１２３をコードするＤＮＡ配列。
配列番号２２：ヒトトリプシノーゲンシグナルペプチド。
配列番号２３：ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターシグナルペプチド（ｔＰＡ）。
配列番号２４：６Ｈｉｓタグ。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
主題の開示は、薬剤についての特定のスクリーニング手順、薬剤の特定の製剤、及び種々の医学的方法論に限定されず、それ自体は変わり得る。
【００６２】
本明細書の各実施形態は、別途明記のない限り、他の全ての実施形態に準用されるべきである。
【００６３】
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の物質及び方法を使用して、本発明を実施または試験することができる。実務家は、当該技術分野の定義及び用語ならびに当業者に既知の他の方法については、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（上掲），Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５−１９９７、特に、１章、５章、及び６章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８６；Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８；Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１；Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１９９６に導かれる。さらに、Ｓｔａｂｙ，Ｒａｔｈｏｒｅ  ａｎｄ  Ａｈｕｇａ，ｅｄｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｗｈｉｌｅｙ，２０１７、特に、３章及び７章が参照されてもよい。さらに、Ｗｅｎ，Ｅｌｌｉｓ，Ｐｕｊａｒ，ｅｄｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｗｉｌｅｙ，２０１４、特に、４章、６章、８章、１１章。さらに、方法及び物質については、ＷＯ２００８０２２４０１、ＷＯ２０１２０１６２９０、及びＷＯ２０１２０６８６３７が参照されてもよい。
【００６４】
定義
本明細書を通して、文脈に別途要求のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むが、他の任意の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。「からなる」は、「からなる」という語句の後に続くものはいかなるものを含み、且つそれに限定されることを意味する。従って、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であること、及び他の要素が全く存在し得ないことを示す。「から本質的になる」は、本語句の後に列挙された任意の要素を含み、且つ列挙された要素に対し開示で指定された活性または作用を阻害または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の態様を含む。従って、例えば、「１つの組成物」への言及は、単一の組成物及び２つ以上の組成物を含み；「薬剤」への言及は、１つの薬剤及び２つ以上の薬剤を含み；「本開示」への言及は、本開示の単一及び複数の態様などを含む。
【００６６】
実施例は、単量体ＨＣＶ  Ｅ２由来のオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２のアセンブリ及び単量体ＨＩＶ  ｅｎｖ由来のオリゴマーＨＩＶ  ｅｎｖのアセンブリを説明するが、本開示は、これらの特定の実施例に制限されず、ワクチン産生のための、またはｅｘ  ｖｉｖｏ結合用途におけるウイルスエンベロープタンパク質及び癌抗原のアセンブリに拡張する。これに関して、方法は、低次抗原からの高次抗原の産生を提示する。「高次」抗原への言及は、三量体以上の倍数を意味するが、「低次形態」は、単量体または二量体を意味する。「抗原」、「種」、及び「形態」という用語は、互換的に使用される。
【００６７】
「天然」への言及は、抗原が細胞内の細胞機序を使用してアセンブルしていることを意味する。「アセンブルした」及び「フォールディングした」または「リフォールディングした」という用語は、互換的に使用されるが、「アセンブルした」は、アセンブルした抗原の部分的なｄｅ  ｎｏｖｏ性質をもたらすために使用される。アセンブルしたへの言及は、「無細胞」アセンブルしたを意味する。一実施形態では、アセンブルした抗原は、それらの天然対応物と同程度に有効であるか、またはそれよりも有効である免疫原である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「非中和抗体」は、ウイルス抗原と結合するが、ウイルス侵入を減少させないか、または阻害しない抗体を指す。一実施形態では、それは、Ｅ２と結合するがウイルス侵入を減少させないか、または阻害しない抗体を指す。癌抗原に関して、非中和抗体への言及は、腫瘍細胞死滅を媒介しない抗体を意味する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「中和抗体」は、ウイルス抗原と結合し、且つ、結合時にウイルス侵入を阻害する抗体を指す。一実施形態では、Ｅ２と結合し、且つＥ２との結合時にウイルス侵入を阻害する抗体を指す。癌抗原に関して、中和抗体への言及は、直接的または間接的に腫瘍細胞死滅を媒介する抗体を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「広域中和抗体」は、抗原／ＨＣＶ抗原の複数の遺伝子型またはサブタイプに対して交差防御を提供する抗体を指す。
【００７１】
高次またはオリゴマー形態は、三量体及びより大きなフォールディング形態を含む抗原の構造形態である。高次抗原または形態または種は、低次形態、抗原、または種からアセンブルする。低次形態は、抗原の単量体または二量体形態を含む。
【００７２】
「制御」への言及は、当業者により理解されることになり、本発明との関係で意味がある結果を生じることになるか、またはそれを生じる可能性がある比較器（複数可）を用いることを意味する。通常は、対照は、宿主細胞または無細胞発現系で産生される対応物である。
【００７３】
本明細書に記載の方法を使用して、任意のウイルスエンベロープ抗原が操作されてもよい。ウイルスファミリーの非限定例としては、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、アフリカ豚コレラウイルス様ウイルス、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、アルテリウイルス、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、デルタウイルス、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅが挙げられる。特定のウイルスエンベロープ抗原は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅに由来する。
【００７４】
ウイルスエンベロープ抗原の非限定例は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）などの病原性ウイルス；Ｒ２サブタイプもしくはＨＩＶ−２  ｇｐ１２５を含むＨＩＶ−１糖タンパク質（ｇｐ）１２０などのレンチウイルス；ＳＡＲＳ  Ｓｉ糖タンパク質などのコロナウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ２などのパラミクソウイルス；またはデングウイルスのＥタンパク質などのフラビウイルスに由来する。
【００７５】
１つの重要な群の抗原は、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなどのヒトの一次全身性真菌病原体などの病原体に由来する。免疫不全宿主に依存する傾向がある重要な日和見性真菌病原体は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、及びＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ、ならびにＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐを含む。幅広い病原性真菌は、とりわけ、エイズを有する対象、化学療法誘発性好中球減少症を有する対象、または造血幹細胞移植を受けている患者を含む免疫不全対象と関連する。
【００７６】
一部の実施形態では、抗原は、細菌、真菌、ウイルス、藻類、寄生虫（外部寄生虫または内部寄生虫を含む）、プリオン、卵菌、粘菌、カビ、線虫、マイコプラズマなどを含む微生物に由来する。非限定例として、以下の：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（結核）、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ（コレラ）及びＹｅｒｓｉｎｉａ（伝染病）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、アフリカ豚コレラウイルス様ウイルス、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウイルス性出血熱、ラッサ熱）、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（アストロウイルス科）Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ（ラクロス）、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ（ノロウイルス）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（コロナウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ１９ウイルス）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス）、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、デルタウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（インフルエンザウイルス）、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、（パピローマウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ヒトＲＳウイルス、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（風邪ウイルス）、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ（天然痘ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、サル痘ウイルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（ロタウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（ヒト免疫不全ウイルス）、Ｐａｒｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス）、アルファウイルス、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（狂犬病ウイルス）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、ジアルジア、トリコモナス症、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、トキソプラズマ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍａ、Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ、Ｆａｓｃｉｏｌａ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｐｈｙｌｌｉｄｅａ（例えば、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、Ｃｙｃｌｏｐｈｙｌｌｉｄｅａ（例えば、Ｔａｅｎｉａ）の目、属、または種のうちの１つ以上から選択される。病原性線虫は、Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ（例えば、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａ（例えば、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、Ａｓｃａｒｉｄｉａ（例えば、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ）、Ｓｐｉｒｕｒｉｄａ（例えば、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ、Ｗｕｃｈｅｒｉａ）、ならびにＡｄｅｎｏｐｈｏｒｅａ（例えば、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ及びＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ、Ｐｆｉｅｓｔｅｒｉａ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ（酵母）、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｅｒａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、ならびにＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ目由来の種を含む。誤解を避けるために、病原体は、新たな病原体を含んでもよい。
【００７７】
例示的な癌抗原としては、ＣＤ抗原、糖タンパク質、糖脂質（ガングリオシド）、炭水化物（Ｌｅｗｉｓ−Ｙ）血管標的（ＶＥＧＦ／Ｒ）、成長因子及び間質または細胞外マトリックス抗原（ＦＡＰ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ）などが挙げられる。例えば、以下のもの：ＫＳ１／４汎癌腫抗原、卵巣癌腫抗原（ＣＡ１２５）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺特異抗原、メラノーマ関連抗原ｐ９７、メラノーマ抗原ｇｐ７５、高分子量のメラノーマ抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、多形上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＬＥＡ、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫抗原３８．１３、ＣＤ１９、ヒトＢリンパ腫抗原ＣＤ２０、ＣＤ３３、メラノーマ特異的抗原、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）、ウイルス誘導腫瘍抗原、Ｔ抗原ＤＮＡ腫瘍ウイルス、ＲＮＡウイルスウイルスのエンベロープ抗原、癌胎児性抗原−α−フェトプロテイン、大腸ＣＥＡ、膀胱腫瘍癌胎児性抗原、分化抗原、ヒト肺癌抗原Ｌ６、Ｌ２０、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＨＥＲ２抗原、多形上皮ムチン、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１、胎児赤血球に見出されたＩ抗原、一次内胚葉、成人赤血球に見出されたＩ抗原、着床前の胚、胃腺癌に見出されたＩ（Ｍａ）、Ｍ１８、乳房上皮に見出されたＭ３９、骨髄細胞に見出されたＳＳＥＡ−１、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ−Ｄ５、結腸腺癌で見出されたＤｕ５６−２２、ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）、結腸腺癌で見出されたＣ１４、肺腺癌で見出されたＦ３、胃癌で見出されたＡＨ６、Ｙハプテン、胎児性癌細胞で見出されたＬｅＹ、ＴＬ５（血液型Ａ）、Ａ４３１で見出された細胞ＥＧＦ受容体、膵癌で見出されたＥ１シリーズ（血液型Ｂ）、胎児性癌細胞で見出されたＦＣ１０．２、胃腺癌抗原、腺癌で見出されたＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）、腺癌で見出されたＮＳ−１０、ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）、Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体で見出されたＧ４９、結腸腺癌で見出されたＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）、結腸癌で見出された１９．９、胃癌ムチン、骨髄細胞で見出されたＴｓＡ７、メラノーマで見出されたＲ２４、胎児性癌細胞で見出された４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、及びＭ１：２２：２５：８を含む分化抗原、ならびに４〜８細胞期の胚で見出されたＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４が記載される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ヒト免疫不全ウイルス」または「ＨＩＶ」という用語は、レンチウイルス属のエンベロープ陽性一本鎖ＲＮＡメンバー及びＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーの一部を指す。経時的に、ＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす。本明細書で使用される場合、用語は、例えば、限定されないが、ＨＩＶ１もしくはＨＩＶ２、またはそれらの任意の群もしくはサブタイプを含む任意のＨＩＶ遺伝子型を指す。一実施形態では、ＨＩＶ−１は、Ｍ群、Ｎ群、Ｏ群、またはＰ群由来である。一実施形態では、ＨＩＶ−１は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、またはそれらの循環組み換え形態（ＣＲＦ）から選択されるサブタイプである。ＨＩＶは、エンベロープタンパク質糖タンパク質（ｇｐ）１２０及びｅｎｖをコードする。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」という用語は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーのヘパシウイルス属に属するエンベロープ陽性センス一本鎖ＲＮＡウイルスを指す。本明細書で使用される場合、用語は、任意の遺伝子型のＨＣＶ、例えば、限定されないが、ＨＣＶ遺伝子型１（Ｇ１）、ＨＣＶ遺伝子型２（Ｇ２）、ＨＣＶ遺伝子型３（Ｇ３）、ＨＣＶ遺伝子型４（Ｇ４）、ＨＣＶ遺伝子型５（Ｇ５）、ＨＣＶ遺伝子型６（Ｇ６）、ＨＣＶ遺伝子型７（Ｇ７）の株、を指し、それらの任意のサブタイプ、例えば、サブタイプａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅなどを含み得る。ＨＣＶは、宿主細胞へのウイルス侵入に必要とされる２つの糖タンパク質Ｅ１及びＥ２をコードする。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「Ｅ２」とも呼ばれる「ＨＣＶ  Ｅ２」は、ＨＣＶの任意の遺伝子型／サブタイプ由来のＥ２ポリペプチドを含む。一実施形態では、Ｅ２は、ＨＣＶ遺伝子型Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、またはそれらのキメラバージョンに由来する。由来するは、これらの遺伝子型のうちの１つ以上に直接的または間接的に基づくものを意味する。遺伝子型は、自然に変化し、人によりさらに改変され得、保存的変異を通常含む、このような機能的多様体が包含される。１つ以上のアミノ酸変異を含む機能的多様体は、当業者に既知であり、組み換えＥ２細胞外ドメインを含む機能的多様体を含んでもよい。用語は、例えば、受容体結合を媒介する全長Ｅ２ポリペプチドの一部、立体配座もしくは他のエピトープを認識し及び／またはＥ１Ｅ２二量体形成を媒介する１つ以上の抗体による抗体結合、を含む多様体をさらに含む。用語は、免疫原性を増加させるための改変（デルタ１２３形態）または単量体産生を増加させるための改変（例えば、「Ａｌａ７」）などのＥ２の改変形態を含む。
【００８１】
１つの例示的な親ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、遺伝子型Ｈ７７  １ａのアミノ酸３８４〜６６１（Ｅ２  ６６１もしくはＥ２ｅ）を含むＥ２ポリペプチドの受容体結合部分、または別のＨＣＶ遺伝子型由来の対応する部分である。従って、使用可能なＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインがない時、ＣＤ８１結合に必要とされる細胞外ドメインの全部または一部を含む。さらなる多様体は、切断または分泌に必要な配列の付加または欠失／破壊を含んでもよい。例えば、シグナルペプチド切断及び糖タンパク質分泌を改変するために、Ｅ３８４ＴＨが含まれるか、欠失しているか、または改変され得る（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。一実施形態では、Ｅ２ポリペプチドは、１つ以上の超可変領域またはその一部を欠いている。一実施形態では、Ｅ２は、超可変領域、例えば、超可変領域１（ＨＶＲ１）またはその一部、超可変領域２（ＨＶＲ２）またはその一部、及び遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ／ＶＲ３）またはその一部：のうちの１つ以上、を欠いている。
【００８２】
一実施形態では、Ｅ２は、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びｉｇＶＲ／ＶＲ３を欠いている。一実施形態では、Ｅ２は、Δ１２３である。一実施形態では、Ｅ２は、配列番号３、４、５、６、７、もしくは８に記載の配列；またはＣＤ８１結合活性を保持するそれらのフラグメント；またはそれらと少なくとも５０％、もしくは少なくとも５５％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも６５％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【００８３】
一実施形態では、Ｅ２は、０または１つ以上の変異型または破壊型システイン（複数可）を含む。従って、一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のシステインが欠失しているか、または破壊されている。一実施形態では、これらは、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、Ｃ５６９、及び／またはＣ６２０から選択される。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ４８６、Ｃ５８１、及びＣ６５２である。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ５８１、Ｃ５８５、及びＣ６５２である。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ４５２、Ｃ４８６、Ｃ５８１、及びＣ６５２である。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ５６９、Ｃ５８１、Ｃ５８５、及びＣ６５２である。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ４８６、Ｃ５８１、及びＣ６５２である。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ４５２、Ｃ４８６、Ｃ５６９、Ｃ５８１、Ｃ５８５、及びＣ６５２である。一実施形態では、変異型または破壊型システインは、Ｃ４５２、Ｃ４８６、Ｃ５６９、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ５９７、及びＣ６５２である。特許請求の範囲を含む本明細書を通して、ＨＣＶ糖タンパク質Ｅ２のポリペプチド残基の全ての番号付けは、図１４に示されるプロトタイプＨＣＶ−Ｈ７７ポリペプチド配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００９６０６（配列番号６）に基づく。Ｅ２の成熟形態は、配列番号７に別々に提示される、配列番号６のアミノ酸残基３８４〜７４６に包含される。配列番号６に示され、且つ図１４に示されるようなアミノ酸番号付けに関して、本明細書で言及され改変がなされる。
【００８４】
１つの例示的なシステイン変異バージョンのＥ２６６１は、以下のシステイン：Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ４８６、Ｃ４５２、Ｃ５９７、及びＣ５６９の変異または破壊を含む。この変異体は、「Ａｌａ７」と呼ばれる。さらなるシステイン改変バージョンのＥ２は、全体が本明細書に組み込まれている国際公開第ＷＯ２０１２／０１６２９０号に記載される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８１」は、テトラスパニンスーパーファミリーの膜貫通タンパク質であり、且つＨＣＶ宿主受容体である分化抗原群８１を指す。
【００８６】
ＨＣＶ  Ｅ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＣＤ８１結合モチーフを含み、異なるジスルフィド及びグリカン配置をそれぞれ含有する異なる種の領域へとフォールディング及びオリゴマー化する。単量体及び二量体ＷＴＥ２６６１及びΔ１２３Ｅ２６６１
上のジスルフィド結合配置を同定するためにかなりの作業を、本発明者（複数可）は行っており、このことは、これらのタンパク質の両方が、単量体タンパク質としてでさえ、実際に不均一であり、複数の交互に分子内でジスルフィド結合した形態で存在することを示唆する。
【００８７】
ＨＣＶ  Ｅ２が組み換え的に産生される時、用いられる遺伝子型に応じて（本明細書で決定されるように）、一般に２０〜３０％がオリゴマー性であり、およそ７０％が単量体性である。Ａｌａ７などのシステイン改変形態を用いて、より多くの単量体を産生する。
【００８８】
一例として、ＦＳ２９３Ｆ細胞へのデルタ１２３の遺伝子型１ａＨ７７ｃ配列の安定なトランスフェクションから生じた、「デルタ１２３」または「Δ１２３」と呼ばれる、超可変領域１（ＨＶＲ１）、超可変領域２（ＨＶＲ２）及び遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲまたはＶＲ３）が除去されているＥ２受容体結合ドメイン（残基３８４〜６６１）のおよそ２０％にすぎない形態のみが、単量体の場合の６４．９％と比較して、ＨＭＷ形態のものである（図３Ａ）。本明細書に示される場合、この百分率は、増加した量のオリゴマー形態を生成する遺伝子型を選択することにより増加させることができる。
【００８９】
従来、還元及びリフォールディング方法は、望ましくない凝集物から低次種を再生するために使用されている。本発明によれば、還元及びリフォールディングを用いて、単量体からオリゴマーを生じるか、または単量体及びオリゴマーからオリゴマーを生じる。
【００９０】
一実施形態では、本発明は、天然ＨＣＶ  Ｅ２からリフォールディングした組み換えオリゴマーＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）を調製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
（ｉ）１つ以上の天然システイン（またはジスルフィド結合）を還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、天然Ｅ２を接触させること；ならびに、
（ｉｉ）還元剤を除去するか、または還元された天然Ｅ２を酸化剤と接触させて、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２への還元された単量体Ｅ２のリフォールディングを誘発すること；を含み、
少なくとも２０％の単量体が、ステップ（ｉｉ）でオリゴマーに変換され、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、単量体Ｅ２と比較して非中和抗体との結合の低下を少なくとも示す。
【００９１】
一実施形態では、ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉｉ）の前に２回実施される。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の前に３回以上実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、２回以上繰り返される。
【００９２】
一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、以下：
（ｉ）対照天然ＨＣＶ  Ｅ２形態または単量体Ｅ２と比較して、非中和抗体との結合が低下した、
（ｉｉ）対照天然ＨＣＶ  Ｅ２形態と比較して、中和抗体との結合が少なくともほぼ同じ、
（ｉｉｉ）対照天然ＨＣＶ  Ｅ２形態または単量体Ｅ２と比較して、より低い力価の非中和抗体の産生を誘発する、
（ｉｖ）中和抗体の産生を誘発する、
（ｖ）広域中和抗体の産生を誘発する、
（ｖｉ）任意に、より高い力価の中和抗体の産生を誘発する、
（ｖｉｉ）任意に、より高い力価の広域中和抗体の産生を誘発する、
からなる群より選択される少なくとも１つの特性を示す。
【００９３】
天然ＨＣＶ  Ｅ２単量体は、異なるＨＣＶ  Ｅ２種の混合物から効率的に産生され、効果的に精製することができる。本明細書に記載の、または当技術分野で既知の、天然単量体ＨＣＶ  Ｅ２の産生。本明細書に記載の、または当該技術分野で既知の、天然単量体及びオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の産生。通常は、タンパク質は、ＨＣＶ  Ｅ２をコードする好適な発現ベクターで形質転換された宿主細胞において組み換え産生される。
【００９４】
好適な哺乳動物細胞株としては、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＦＳ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭＬ、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）及びＣＥＭＸ１７４が挙げられるが、これらに限定されず、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である。他の宿主細胞としては、酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａｐａ  ｓｔｏｒｉｓ、またはＳｆ９細胞などの昆虫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
細胞は、５００ｍＬ、１Ｌ、１．５Ｌ、２Ｌ、２．５Ｌ、または３Ｌの体積で培養され得る。一例では、細胞は、バッチ細胞培養プロセスを使用して培養される。一例では、細胞は、灌流細胞培養プロセスを使用して培養される。一例では、細胞は、種培地及び産生培地で培養される。一例では、細胞は、撹拌槽型反応器で培養される。一例では、反応器の容積は、約１Ｌ〜約２５００Ｌである。一例では、反応器は、１Ｌの反応器、１．５Ｌの反応器、２Ｌの反応器、２．５Ｌの反応器、または３Ｌの反応器である。一例では、細胞は、ウェーブバイオリアクターで培養される。一例では、細胞は、セルファクトリーシステム、例えば、Ｎｕｎｃセルファクトリーシステム、で培養される。
【００９６】
合成ＤＮＡは、好適なプロモーター及び他の好適な転写制御エレメントを含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組み換え発現させ、原核生物または真核生物宿主細胞に移して組み換えタンパク質を産生させ得る。このような操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８．に記載される。
【００９７】
例えば、酵母内で発現させるための構築物は、好ましくは、合成遺伝子を含有し、プロモーター（例えば、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、またはＰＧＫ）及び終結配列（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＨ１ターミネーター）などの関連転写及び翻訳制御配列が合成遺伝子に作動可能に連結される。酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅからなる群より選択することができる。Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９０も参照のこと。核酸分子は、当該技術分野で既知の酵母内での発現に最適化されたコドンとし得る（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｃｏｗｅ，Ｙｅａｓｔ，７：６５７−６７８，１９９１を参照）。所与の任意の細胞型に適するベクター及び制御エレメントは、本明細書の教示及び発現ベクターについて当該技術分野で既知の情報を考慮して当業者が選択することができる。
【００９８】
宿主細胞株におけるクローニング及び発現のために入手可能なベクター、当該技術分野で周知であり、哺乳動物細胞株または酵母（真菌）の細胞におけるクローニング及び発現のためのベクター、細菌細胞株におけるクローニング及び発現のためのベクター、ファージにおけるクローニング及び発現のためのベクター、ならびに、昆虫細胞株におけるクローニング及び発現のためのベクターを含むが、これらに限定されない。発現されたタンパク質は、標準的なタンパク質精製方法を使用して回収することができる。翻訳制御エレメントは、Ｍ．Ｋｏｚａｋ（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ，７（８）：５６３−７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．，７６（９）：８１５−２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ  ａｎｄ  Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，６０：３６０−３７５，１９７９）に概説されている。
【００９９】
ＨＣＶ  Ｅ２をコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列表に提示されており、配列番号１または２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
天然ＨＣＶ  Ｅ２は、１００ｋＤａを超えるか、または２００ｋＤａを超える分子量を有する形態（例えば、ＨＭＷ１またはＨＭＷ２形態）を含む、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、最大約２３ｍｅｒであり得る。単量体形態及びオリゴマー形態は、サイズ、ゲル濾過特性、抗体反応性などに基づいて選択され得る。発現タンパク質は、抗体アフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィーにより細胞構成要素から精製され得る。
【０１０１】
一実施形態では、方法は、本明細書に記載の方法で処理する前に、天然ＨＣＶ  Ｅ２と比較して、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の純度を増加させる。一実施形態では、方法は、細胞培養物から単離された天然オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の純度を増加させる。本明細書で使用される場合、「精製された」または「純粋」という用語は、汚染物質、すなわち、細胞またはウイルス汚染物質、例えば、限定されないが、タンパク質、脂質、核酸、及び炭水化物、からのオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の分離を指す。
【０１０２】
さらに、一実施形態では、方法は、試料中のオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の濃度を増加させ、すなわち、単量体ＨＣＶ  Ｅ２を含有する試料から、本明細書に記載の方法を用いる試料の処理は、オリゴマーのＨＣＶ  Ｅ２の濃度を少なくとも１０％の、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％増加させる。一実施形態では、方法は、二量体の濃度を少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％増加させる。一実施形態では、方法は、三量体及び／または高次形態の濃度を少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％増加させる。
【０１０３】
一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、天然対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、安定性の改善、すなわち、熱力学的安定性及び／または動的安定性の改善、を示す。一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、天然対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、安定性の増加を示す。
【０１０４】
一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、天然オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と同等の、非中和抗体との結合を示す。実施形態では、オリゴマーは、二量体、または三量体、または四量体、または五量体、最大２３ｍｅｒである。
【０１０５】
ＨＣＶ  Ｅ２単量体の部分還元が好ましい。立体構造エピトープを認識する抗体との一部の抗体反応性が保持される時、部分還元が達成される。例えば、１０％、２０％、または３０％のタンパク質立体配座は、本明細書で使用される部分還元プロトコールにおいて保持され得る。
【０１０６】
一実施形態では、還元条件は、使用される還元剤に応じて約７を超えるｐＨを含む。
【０１０７】
「オリゴマー」または「多量体」という用語は、三量体、四量体など、または高分子量（ＨＭＷ）形態としてフォールディングさせる抗原またはＥ２のバージョンを含む。異なる形態は、例えば、非還元ゲル電気泳動におけるそれらの移動パターンにより、またはゲル濾過クロマトグラフィーにより、もしくはそれらの抗体反応性により同定される。一実施形態では、単量体、二量体、ＨＭＷ２、及びＨＭＷデルタ１２３形態は、それぞれ、約４６、９７、２３９、及び２４００の分子量を有する。
【０１０８】
特定の一実施形態では、低次形態が二量体形態を含むか、または低次形態が単量体形態を含む。
【０１０９】
一実施形態では、オリゴマー形態は、三量体形態である。
【０１１０】
一実施形態では、オリゴマー形態は、三量体形態及び／または高次形態である。
【０１１１】
一実施形態では、オリゴマーは、本明細書に記載のＨＭＷ２もしくはＨＭＷ、または本明細書に記載のその改変型などの、より高次の形態を形成する。
【０１１２】
一実施形態では、天然Ｅ２は、受容体結合ドメインを含み、且つステム領域及び膜貫通ドメインを欠いているＥ２の改変形態である。
【０１１３】
当技術分野で知られている通り、膜貫通ドメインは、残基７１５〜７４６であり、ステム領域は、残基６６２〜７１４である。一実施形態では、この形態は、ＷＴ  Ｅ２６６１である。
【０１１４】
本明細書に記載されるように、ＨＣＶ  Ｅ２の全ての天然形態は、異なる分子内及び（二量体以上の場合）分子間ジスルフィド結合形態を含む。本開示の一実施形態によれば、単量体が還元されて、オリゴマーにリフォールディングするか、オリゴマーが還元されて、オリゴマーにリフォールディングするか、または単量体及びオリゴマーが還元されて、二量体またはオリゴマーにリフォールディングする。
【０１１５】
本方法の一実施形態では、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％の単量体が、オリゴマーに変換される。
【０１１６】
別の実施形態では、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、または少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％の単量体が、オリゴマーに変換される。
【０１１７】
一実施形態では、オリゴマーは、１００ｋＤａを超える見かけの分子量を有する。一実施形態では、オリゴマーは、２００ｋＤａを超える見かけの分子量を有する。一実施形態では、オリゴマーは、２０００ｋＤａを超える見かけの分子量を有する。
【０１１８】
一実施形態では、方法は、最大収量のリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を生じるＨＣＶ遺伝子型を選択することをさらに含む。一実施形態では、ＨＣＶ遺伝子型は、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、及び／または他のＨＣＶ遺伝子型から選択される。例示的で非限定的な実施形態では、ＨＣＶ遺伝子型は、Ｃｏｎ１またはＳ５２である。
【０１１９】
一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、単量体リフォールディングで調製されていない対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、抗体ＣＢＨ４Ｇとの結合の低下を示す。天然オリゴマーは、細胞外単量体のリフォールディングで調製されていない対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の例である。
【０１２０】
本方法の一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２が中和抗体に結合する能力をほぼ保持する。本方法の一実施形態では、オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２が広域中和抗体と結合する能力をほぼ保持する。
【０１２１】
一実施形態では、還元剤は、可逆的還元剤であり、例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸、または他のチオール含有剤から選択される。
【０１２２】
本方法の一実施形態では、還元剤は、約０．１〜１．０ｍＭで用いられて、天然Ｅ２の部分還元を引き起こすジチオスレイトールである。
【０１２３】
本方法の一実施形態では、溶液は、７〜９を超えるｐＨの緩衝液である。
【０１２４】
一実施形態では、抗原濃度は、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌである。０．６ｍｍのＤＴＴ（最終濃度）が使用され、インキュベーションは、３７℃で１時間である。溶液をｐＨ６．８のＰＢＳで徐々に希釈して、抗原濃度及び緩衝液をｐＨ６．８のＰＢＳと交換する。
【０１２５】
一実施形態では、天然Ｅ２（及びその結果としてリフォールディングしたオリゴマー）は、超可変領域１（ＨＶＲ１）もしくはその一部、超可変領域２（ＨＶＲ２）もしくはその一部、及び／または遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ／ＶＲ３）もしくはその一部のうちの１つ以上などの超可変領域の全部または一部を欠いている。
【０１２６】
受容体結合ドメインは、ウイルス侵入に必須ではない領域に免疫応答を集中させること及び広域中和抗体のエピトープを遮蔽することによる免疫回避に関与している可変領域ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びｉｇＶＲを含む。ＨＶＲ２及び／またはＩｇＶＲ及び／またはＨＶＲ１の少なくとも一部の欠失を生じさせて、広域中和抗体を誘発する保存エピトープに免疫応答を集中させる。
【０１２７】
ＲＢＤを含み、且つ３つ全ての可変領域を欠いている構築物は、ＷＯ２００８／０２２４０１に記載されるように、Ｅ２６６１デルタ１２３またはΔ１２３と呼ばれる。欠失した領域は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、及びＡｒｇ（例えば、ＧＳＳＧまたはＥＴＨＧＳＳＧ）を含む群より選択される残基を含む最大２０アミノ酸のペプチド配列などのＷＯ０８／０２２４０１（全体が本明細書に組み込まれる）に記載のフレキシブルなリンカー配列と任意に置換される。
【０１２８】
一実施形態では、天然Ｅ２は、精製を助けるシグナル配列またはタンパク質タグを含む。一実施形態では、シグナル配列は、細胞からのタンパク質の分泌もたらす。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号９に提示されるアミノ酸配列「ＭＮＰＬＬＩＬＴＦＶＡＡＡＬＡ」を含むＮ末端シグナル配列である。一実施形態では、タンパク質タグは、Ｃ末端Ｈｉｓタグである。一実施形態では、Ｃ末端Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列「ＨＨＨＨＨＨ」を含む。
【０１２９】
単量体Ｅ２でさえ不均一であり、異なる分子内ジスルフィド配置を示すことを、本発明者らは発見している。単量体の還元により、より均一なオリゴマーをリフォールディングするための良い出発点が提供されると、本発明者らは判断した。
【０１３０】
一実施形態では、天然Ｅ２は、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、Ｃ５６９、及び／またはＣ６２０から選択される１つ以上のアミノ酸残基に非システイン置換または変異を含む。驚くべきことに、（「Ａｌａ７」と呼ばれる）非システイン残基と置換された７つのシステイン残基であるＣ４５２、Ｃ４８６、Ｃ５６９、Ｃ５９７、Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２の非システイン置換を有するＨＣＶ  Ｅ２単量体でさえ、より高レベルのオリゴマーにリフォールディングする。
【０１３１】
Ｅ２は、糖タンパク質の三次構造を足場にするＥＲ中で９個の分子内ジスルフィド結合を形成する１８の高度に保存されたシステイン残基を含む。ＷＯ１２／０１６２９０（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、これらのジスルフィドの一部は、ＣＤ８１結合及びＭＡｂ  Ｈ５３結合には重要でない。また、７つのシステイン残基の除去を含むシステイン改変形態は、単量体産生を有意に増加させ、オリゴマーの産生を減少させる。通常、Ｅ２は、宿主細胞中で組み換え産生される時、異なる単量体及びオリゴマー形態の混合物を産生する。ＷＯ１２／０１６２９０は、種々のシステイン改変ＨＣＶ  Ｅ２の生成について記載していた。Ｃ４５２、Ｃ４８６、Ｃ５６９、及びＣ５９７から選択される２、３、または４つのシステインが変異または破壊されているＡｌａ置換形態などのＷＯ１２／０１６２９０に開示の他の構築物が本明細書では考えられる。Ｅ２６６１は、Ｃ６７７のシステインを欠いており、１７のシステインを有する。
【０１３２】
一部の実施形態では、天然ＨＣＶ  Ｅ２は、発現される時、天然形態中に少なくとも４０％の単量体及び７０％未満のオリゴマー、または、少なくとも５０％の単量体及び５０％未満のオリゴマーを組み換え産生するＡｌａ４、Ａｌａ５、Ａｌａ６、またはＡｌａ７改変形態のＨＣＶ  Ｅ２などのシステイン改変形態である。
【０１３３】
本明細書で決定されるように、Ｃ６２０−Ａｌａの変異導入は、高分子量のオリゴマー形成をブロックする。従って、高次形態の産生のための天然ＨＣＶ  Ｅ２形態は一般に、Ｃ６２０である。
【０１３４】
別の幅広い態様では、本明細書は、単量体エンベロープ糖タンパク質から組み換えオリゴマーウイルスエンベロープ糖タンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
（ｉ）１つ以上のジスルフィド結合を部分的に還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、天然Ｅ２を接触させること；ならびに
（ｉｉ）還元剤を除去するか、または（ｉ）のＥ２を酸化剤と接触させて、オリゴマーエンベロープ糖タンパク質への単量体Ｅ２のリフォールディングを誘発すること；を含み、
少なくとも２０％の単量体がステップ（ｉｉ）でオリゴマーに変換され、オリゴマーが単量体糖タンパク質と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示す。
【０１３５】
一実施形態では、ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉｉ）の前に２回実施される。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の前に３回実施される。
【０１３６】
別の実施形態では、本明細書は、本明細書で上述した還元及びリフォールディング方法により産生された、組み換えリフォールディングしたオリゴマーＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質を含む組成物を可能にする。
【０１３７】
一実施形態では、リフォールディングしたオリゴマータンパク質は、配列番号３、４、５、６、７、８のうちの１つに提示されるアミノ酸または切断バージョンもしくは改変バージョン、またはそれらの機能的多様体を含む。機能的多様体及び改変型は、前改変形態または任意の他の好適な対照と比較して、増強された免疫原性を示し得る。
【０１３８】
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載の還元及びリフォールディング方法で生成された組み換えリフォールディングしたオリゴマーＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質を含み、オリゴマーのＨＣＶ  Ｅ２は、単量体還元及びリフォールディングで調製されていない対照ＨＭＷ  Ｅ２と比較して、非中和抗体との結合の低下を示す。
【０１３９】
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載の還元及びリフォールディング方法で生成されたリフォールディングした組み換えオリゴマーＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２糖タンパク質を含み、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、単量体還元及びリフォールディングで調製されていない対照ＨＭＷ  Ｅ２と比較して、抗体ＣＢＨ４ＧまたはＡＲ３Ｃとの結合の低下を示す。
【０１４０】
一実施形態では、組成物は、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含み、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、単量体還元及びリフォールディングで調製されていない対照ＨＭＷ  Ｅ２と比較して、抗体ＣＢＨ４Ｇとの結合の低下を示す。一実施形態では、組成物は、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含み、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、単量体還元及びリフォールディングで調製されていない対照ＨＭＷ  Ｅ２と比較して、抗体ＡＲ３Ｃとの結合の低下を示す。
【０１４１】
一実施形態では、組成物は、単量体リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２、ならびに、薬学的または生理学的に許容される担体及び／または希釈剤を含む。
【０１４２】
一実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
【０１４３】
アジュバントは組成物が免疫応答を誘導する能力を増強する任意の薬剤とし得ることを、当業者は理解するであろう。一実施形態では、アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増加させることにより作用し得る。一実施形態では、アジュバントは、Ｔｈ１及び／またはＴｈ２免疫応答を増加し得る。一実施形態では、アジュバントは、Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ（２００４）及びＷｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）に記載されるようなミョウバン塩もしくは他のミネラルアジュバント；張力活性剤；細菌誘導体；ビヒクルもしくは徐放物質、またはサイトカインとし得る。一実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、リン酸カルシウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＦ−５９、サポニン、ＱＳ−２１、リポ多糖体（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、Ｔｈ１活性化ペプチド（例えば、ＩＭＰ３２１）、ＴＬＲ−２リガンド（例えば、ＯｓｐＡ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、マクロファージ活性化リポペプチド−２（ＭＡＬＰ−２）、ＣｐＧアジュバント、百日咳毒素、熱感受性毒素（ＬＴＫ６３及びＬＴ−Ｒ１９２Ｇ）、ジフテリア毒素、イミキモド、Ａｄｄａｖａｘ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＦＮ−ｇ、ＡＳ０４（ＭＰＬＡ及びＱＳ−２１を含有するリポソーム製剤）、グリセリン、ならびにパラフィン、鉱油、ラノリン、スクアレン、ＩＳＡ−７０、及びモンタニドなどの油性エマルションから選択され得る。例示的な一実施形態では、アジュバントは、サポニン系アジュバントである。関連する態様では、アジュバントは、コレステロール及びステロールをさらに含むサポニン系アジュバントであり、これの例示的実施例は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントである。例示的な一実施形態では、アジュバントは、ＭＦ５９である。例示的な一実施形態では、アジュバントは、Ａｄｄａｖａｘである。一実施形態では、アジュバントは、炭水化物アジュバント、例えば、グルカン、デキストラン、レンチナン、グルコマンナン、またはガラクトマンナンである。
【０１４４】
一実施形態では、本明細書は、ＨＣＶ感染の処置もしくは予防における、またはこのための薬品の調製における、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含む組成物の使用を提示する。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書は、ＨＣＶ感染の診断もしくは監視または抗ＨＣＶ処置プロトコールの監視における、あるいはこのための診断薬の調製における、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含む組成物の使用を提示する。
【０１４６】
一実施形態では、組成物は、７０重量％を超える、または８０重量％を超える三量体または三量体及び高次形態のＨＣＶ  Ｅ２を含む。
【０１４７】
一実施形態では、組成物は、７０重量％超える、または８０重量％超える二量体ＨＣＶ  Ｅ２を含む。
【０１４８】
一実施形態では、組成物は、７０重量％を超える、または８０重量％を超える高次形態のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質を含む。
【０１４９】
一実施形態では、本明細書は、方法は、対象または患者において免疫応答を誘発するための方法を提供し、方法は、免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下で、本明細書に記載のリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含む有効量の組成物を対照または患者に投与することを含む。
【０１５０】
これらの実施形態によれば、組成物は一般に、広域中和抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下で投与される。本発明の組成物は、単回投与または適用として投与され得る。あるいは、組成物は、反復投与または適用を含んでもよく、例えば、組成物は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上投与され得る。
【０１５１】
本発明はさらに、対象または患者において免疫応答を誘発するための方法を提供し、方法は、対象または患者に、本明細書に記載のリフォールディングオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含む組成物を有効量投与することを含む。さらに、本明細書に記載のリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含むＣ型肝炎ウイルスの感染に対して対象を免疫するための組成物、特に、ワクチン組成物が、本発明では考えられる。
【０１５２】
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、対象において免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的に活性な構成成分及び必ずしもそうとは限らないが、該活性構成成分の免疫学的活性を増強する１つ以上の追加の構成成分（例えば、アジュバント）を含む医薬組成物を指す。さらに、ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる構成成分を含んでもよい。ワクチンの免疫学的に活性な構成成分は、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２組成物などの高次のアセンブルした抗原を含む。「ワクチン」及び「ワクチン組成物」という用語は、本発明では互換的に使用される。
【０１５３】
本発明で考えられる「対象」は、ヒト、または実験室もしくは技術分野で認められた試験もしくはビヒクル動物を含む動物である。「患者」は、処置または予防処置を必要とするヒト対象を含む。
【０１５４】
一実施形態では、本明細書は、抗原に関連する状態に対して対象を免疫するための方法も可能にし、方法は、本明細書に記載のアセンブルまたはリフォールディングしたオリゴマー抗原を含む組成物を対象に投与することを含む。
【０１５５】
一実施形態では、本明細書はまた、本明細書に記載の細胞外でリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含む組成物を対象に投与することを含む、ＨＣＶの感染に対して対象を免疫する方法を可能にする。
【０１５６】
一実施形態では、本明細書はまた、ＨＣＶ感染を処置または予防するのに十分な時間及び条件下で、本明細書に記載の細胞外でリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２を含む組成物を対象に投与することを含む対象のＨＣＶ感染を処置または予防するための方法を可能にする。
【０１５７】
本明細書で使用される「治療的有効量」及び「予防的有効量」を含む「有効量」という用語は、一部の対象において望ましい治療的、予防的、または生理学的効果を提供する、単回投与での、または一連のもしくは徐放系の一部としての、本発明の組成物の十分な量を意味する。望ましくない効果、例えば、副作用は、望ましい治療効果と共に現れることがある：従って、実務家は、適切な「有効量」を決定する際に、潜在的なリスクに対する潜在的な利益のバランスをとる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢及び全身状態、投与様式などに応じて、対象ごとに変動するであろう。従って、正確な「有効量」を特定することが不可能であり得る。しかし、任意の個々の場合における適切な「有効量」は、日常的な技術または実験を使用して当業者により決定され得る。当業者は、組成物または他の薬剤の事前投与、対象のサイズ、対象の症状の重症度または感染集団における症状の重症度、ウイルス負荷、及び選択された特定の組成物または投与経路のような要因に基づいて必要量を決定することが可能であろう。
【０１５８】
「処置」という用語は、Ｅ２抗原などの抗原に関連する状態の１つ以上の症状及びＨＣＶ感染症の、またはＨＣＶの進行した症状を発症するリスクもしくは子孫に伝わるＨＣＶのリスクのある、少なくとも一部の対象における任意の測定可能なまたは統計的に有意な改善を指す。
【０１５９】
「予防」及び「予防処置」などの用語は、交換可能に使用され、ＨＣＶ感染に関連する状態または状態の兆候の、予防、またはその後の感染を減弱させること、または感染するリスクを低減すること、または重症度もしくは発症を低減させることのために、ＨＣＶに感染していることが知られていない対象への本発明の組成物の投与を含む。
【０１６０】
ワクチン組成物の投与は一般に、予防目的のためである。組成物の予防的投与は、その後のあらゆる感染を予防または減弱させるのに役立つ。一実施形態では、ワクチン組成物は、病原体による対象の再感染を予防するものである。「薬理学的に許容される」組成物は、レシピエント患者により忍容されるものである。有効量のワクチンが投与されると考えられる。「有効量」は、十分な体液性または細胞性免疫を誘導するなどの所望の生物学的効果を達成するのに十分な量である。これは、ワクチンの種類、レシピエントの年齢、性別、健康状態、及び体重に依存し得る。所望の生物学的効果の例としては、症状が生じないこと、症状の低減、組織中のウイルス価の低減、または鼻分泌物、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染に対する完全な防御、及びＣ型肝炎ウイルスによる感染に対する部分的な防御が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
一部の実施形態では、本発明のワクチンまたは組成物は、その存在が、感染性Ｃ型肝炎ウイルスの少なくとも１つの株に対する少なくとも１つの一次または二次体液性または細胞性免疫応答を増強するか、またはこれにおける増強を示すレシピエント患者の生理学の検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有意である。ワクチン組成物は、ウイルス感染を防ぐために投与される。「防御」は絶対的なものである必要はなく、すなわち、Ｃ型肝炎感染は、対照集団または患者群と比較して統計的に有意な改善がある場合、完全に予防または根絶される必要はない。防御は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の症状の重症度または発症の早さを低減することに限定され得る。
【０１６２】
一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、感染症の発症前に（予想される感染を防止または減弱させるように）、または感染の開始後のいずれかで、対象に提供され、それにより、ウイルス感染を防ぐ。一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、対象間のウイルス伝染を低減させるために、感染症の発症の前または後に対象に提供される。
【０１６３】
本発明の組成物は、Ｃ型肝炎感染もしくはＨＣＶ感染に関連する症状などのウイルス性もしくは癌状態を処置もしくは予防するために、単独で活性な医薬品として投与することができるか、または１つ以上の薬剤と組み合わせて使用することができることがさらに理解されるであろう。本発明の組成物または組成物の組み合わせと併用で投与されるべき他の薬剤としては、ＨＣＶ感染により引き起こされる疾患に対する療法、または直接的もしくは間接的な機序によりＨＣＶウイルス複製を抑制する療法が挙げられる。これらの薬剤としては、宿主免疫調節剤（例えば、インターフェロン−アルファ、ペグ化インターフェロン−アルファ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）；イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼなどの宿主細胞機能を阻害する抗ウイルス化合物（例えば、リバビリンなど）；免疫機能を調節するサイトカイン（例えば、インターロイキン２、インターロイキン６、及びインターロイキン１２）；１型ヘルパーＴ細胞応答の発生を増強する化合物；干渉ＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；ＨＣＶ抗原またはＨＣＶに対する抗原アジュバントの組み合わせを含むワクチン；ＨＣＶウイルス複製の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）開始翻訳ステップを阻害することにより、ウイルスタンパク質合成をブロックするために、または、ウイルス粒子の成熟をブロックするために、宿主細胞構成要素と相互作用する、且つ、例えば、ＨＣＶ  Ｐ７などの膜タンパク質のビロポリンファミリーを標的とする薬剤と共に放出する薬剤；ならびにＮＳ３／ＮＳ４Ａプロテアーゼ、ＮＳ３ヘリカーゼ、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、及びＮＳ５Ａタンパク質の阻害剤などの、ウイルス複製に関与するウイルスゲノムの他のタンパク質を標的とすることにより、ＨＣＶの複製を阻害し、及び／または他のウイルス標的の機能を干渉する任意の薬剤または薬剤の組み合わせ、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
さらに別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、限定されないが、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むＨＣＶライフサイクルにおける標的の他の阻害剤（複数可）をさらに含み得る。
【０１６５】
投与は一般に、Ｅ２特異的抗体の生成または細胞性免疫応答を含む免疫応答を誘発するのに十分な時間及び条件下のものである。免疫原性組成物は、経肺、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、もしくは座薬経路、または（例えば、徐放製剤を使用する）移植などによる都合の良い方法で投与され得る。投与は、全身または局所であり得る。但し、全身がより都合が良い。他の考えられる投与経路は、パッチ、細胞移植、インプラント、舌下、眼内、局所的、経口、直腸内、経膣、経鼻または経皮によるものである。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗体を生成すること及び組成物に対して免疫を高めることを含む、本発明の組成物の存在に対する身体全体の反応を指す。従って、抗原に対する免疫応答は、目的の抗原に対する体液性及び／または細胞性免疫応答の対象における向上も含む。「体液性免疫応答」は、形質細胞により産生される抗体により媒介される。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球及び／または他の白血球により媒介されるものである。本明細書で使用される場合、「抗体価」は、各対象について免疫前の試料の値よりも大きい値をもたらした、免疫後の血清中の最高希釈倍数として定義することができる。
【０１６７】
本発明の実施形態はまた、ＨＣＶ  Ｅ２などのリフォールディングしたオリゴマー抗原に対する免疫応答を評価するためのアッセイを提供する。アッセイは、抗体応答及び遅延型過敏反応を測定するためのアッセイなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを含み得る。一実施形態では、抗体応答を測定するためのアッセイは、主に、Ｂ細胞機能及びＢ細胞／Ｔ細胞相互作用を測定し得る。抗体応答アッセイのために、血液中の抗体価は、抗原チャレンジ後に比較され得る。
【０１６８】
本明細書は、対象にＨＣＶ  Ｅ２などのリフォールディングしたオリゴマー抗原を有効量投与すること、及び産生された抗体を精製することを含む、本明細書に記載のＨＣＶ  Ｅ２などのリフォールディングしたオリゴマー抗原に対する精製抗体を生成するための方法を提供する。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２などのリフォールディングしたオリゴマー抗原に対して惹起された抗体を提供する。特異的抗体は、天然抗原を認識できないが、アセンブルした抗原を認識し、及び／または、逆もまた同様で、抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルとし得る。さらに、抗体は、当業者らに既知の基準を通常使用して、診断、予後、治療、予防、及びスクリーニング目的のために選択され得る。
【０１７０】
「抗体」（複数可）という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、ならびに、限定されないが、全長抗体（例えば、インタクトなＦｃ領域を有する）を含む、モノクローナル抗体に由来する全ての種々の形態、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２フラグメントを含む抗原結合フラグメント、ならびに単鎖抗体などの組み換え方法を使用して産生される抗体由来ポリペプチドを含む。本明細書で使用される「抗体」（複数可）という用語は、例えば、トランスジェニック動物において、またはファージディスプレイを介して、産生されるヒト抗体、ならびに抗体、ヒトもしくはヒト化抗体、霊長類化抗体、または脱免疫化抗体を指す。それは、治療上許容され得る他の形態の抗体及びそれらの抗原結合フラグメント、例えば、軟骨性海洋動物もしくはＣａｍｅｌｉｄａｅ由来の、またはこのような抗体に基づくライブラリー由来の単一ドメイン抗体、も含む。フラグメント形態または改変形態の抗体の選択は、フラグメントまたは改変形態が、抗体またはフラグメントの半減期に与えるあらゆる影響を考慮することも含み得る。
【０１７１】
一部の実施形態では、抗体は、薬学的または薬理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に提供される。他の実施形態では、診断または予後のために、抗体が選択される。一部の実施形態では、リフォールディングしたオリゴマー形態のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質抗体を含むキットが提供される。
【０１７２】
「薬学的に許容される担体及び／または希釈剤」は、別の理由で望ましくないわけではない物質からなる医薬ビヒクルである。すなわち、それは、それ自体でまたは活性組成物と実質的に有害な反応を引き起こす可能性が低い。担体は全て、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張性を調整するための薬剤、吸収もしくはクリアランス速度を増加もしくは減少するための薬剤、ｐＨを維持するための緩衝剤、キレート剤、膜またはバリア横断剤を含み得る。薬学的に許容される塩は、別の理由で望ましくないものではない塩である。薬剤または薬剤を含む組成物は、酸付加塩または金属錯体などの薬学的に許容される無毒の塩の形態で投与され得る。
【０１７３】
経口投与のために、組成物は、カプセル剤、丸剤、錠剤、甜剤、散剤、懸濁剤、または乳剤などの固体または液体調製物に製剤化することができる。組成物を経口剤形に調製する際には、経口液体調製物（例えば、懸濁液、エリキシル剤、及び溶液）の場合には、例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香剤、防腐剤、着色剤、懸濁剤など通常の薬学的媒体；または、経口固体調製物（例えば、例えば、散剤、カプセル剤、及び錠剤）の場合には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体のいずれかが用いられてもよい。投与が容易であるので、錠剤及びカプセル剤は、最も有利な経口投薬単位形態に相当し、その場合には、固体の薬学的担体が当然用いられる。錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含有してもよい。必要に応じて、錠剤は、標準的な技術により糖衣または腸溶コーティングされ得る。活性組成物は、胃腸管を通過するのを安定させるためにカプセル化することができる。例えば、国際特許公開第ＷＯ９６／１１６９８号を参照のこと。
【０１７４】
非経口投与のために、組成物は、担体に溶解され、溶液または懸濁液として投与され得る。経粘膜または経皮（パッチを含む）送達のために、当該技術分野で既知の適切な浸透剤が、組成物を送達するために使用される。吸入のために、送達は、乾燥粉末エアロゾル、液体送達システム、エアジェットネブライザー、噴射剤システムなどの任意の都合の良いシステムを使用する。例えば、製剤はエアロゾルまたはミストの形態で投与することができる。組成物はまた、持続送達または持続放出形式で送達され得る。例えば、生分解性ミクロスフェアまたはカプセルまたは持続送達が可能な他のポリマー構造を製剤に含めることができる。製剤は、薬物動態及び生体内分布を変更するように改変することができる。薬物動態の一般的な考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ‘Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０（上掲）を参照のこと。一部の実施形態では、製剤は、リポソームまたはミセルなどの脂質単層または二重層に組み込まれ得る。当該技術分野で既知の標的化療法は、特定の種類の細胞または組織により特異的に薬剤を送達するために使用され得る。
【０１７５】
投与される活性剤の実際の量ならびに投与の速度及び時間経過は、疾患の性質及び重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば、投与量、時期など、の決定は、一般実務家または専門家の責任の範囲内であり、通常は、個々の患者の状態、送達の部位、投与方法、及び他の実務家に既知の要因を考慮に入れる。技術及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０（上掲）に見出すことができる。
【０１７６】
調製され得る徐放性調製物は、免疫応答を誘導するのに特に都合が良い。徐放性調製物の例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセタート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型のリポソームが使用され得、これの中で、脂質含有量がコレステロールの約３０％よりも大きく、選択された割合は、最適な療法のために調整される。
【０１７７】
タンパク質の安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を制御し、適切な添加剤を使用し、且つ特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成され得る。タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基などの他の要素の結合によることを含む、当該技術分野に既知の技術を使用して延長され得る。
【０１７８】
当該技術分野において開示されているようなプライムブースト免疫化方策が考えられる。例えば、国際公開第ＷＯ／２００３／０４７６１７号を参照のこと。従って、組成物は、ワクチン、初回免疫剤、または追加免疫剤の形態のものとし得る。
【０１７９】
一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるように、還元されて、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２形態を含む組成物を含むキット、または固体もしくは半固体の基質を提供する。
【０１８０】
「単離された」という用語は、その本来の状態でそれに通常付随する構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。例えば、「単離された核酸分子」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から単離された核酸またはポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から除去されているＤＮＡフラグメント、を指す。限定されないが、単離された核酸、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドは、精製により単離される天然配列、または組み換えもしくは合成手段により産生される配列を指すことができる。一部の実施形態では、精製リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、少なくとも９５〜９９％の純度である。
【０１８１】
本明細書に記載の方法により製造されたリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、例えば、以下のステップ：遠心分離、精密濾過、抗体精製、深層濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、沈殿、ビーズクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィー）、膜吸着剤（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー）のうちの１つ以上を含む、当業者に既知の任意の方法により精製できることを、当業者は理解するであろう。一例では、本明細書に記載の方法により生成されるリフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２の精製を助けるＨＩＳタグなどのタンパク質タグを含む。
【０１８２】
一実施形態では、本明細書は、組み換えＨＣＶ  Ｅ２のリフォールディングした組み換えオリゴマーＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）を調製する方法を可能にし、組み換えＥ２は、単量体Ｅ２であるか、または単量体及びオリゴマー組み換えＥ２の混合物を含み、該方法は、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の単量体ジスルフィド結合を還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、組み換えＥ２を接触させること；ならびに（ｉｉ）還元剤を除去するか、または単量体を酸化剤と接触させて、オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２への組み換えＥ２のリフォールディングを誘発すること；を含み、リフォールディングした組み換えオリゴマーＥ２は、リフォールディング（ｉｉ）前の組み換えＥ２よりも少なくとも２０％多いオリゴマーを含み、リフォールディングしたオリゴマーＨＣＶ  Ｅ２は、組み換え単量体Ｅ２と比較して、非中和抗体との結合の低下を示す。
【０１８３】
一部の実施形態では、リフォールディングしたオリゴマーＥ２は、二量体、三量体、及び／または高次形態のＥ２を含む。
【０１８４】
別の態様では、本明細書は、天然エンベロープ糖タンパク質から、リフォールディングした組み換えオリゴマーウイルスエンベロープ糖タンパク質を調製する、より一般的な方法を提供し、該プロセスは、以下のステップ：（ｉ）１つ以上の単量体ジスルフィド結合または天然システインを部分的に還元するのに十分な時間及び条件下で、還元剤を含む溶液と、天然Ｅ２を接触させること；ならびに
（ｉｉ）還元剤を除去するか、または還元された天然ＨＣＶ  Ｅ２を酸化剤と接触させて、オリゴマーエンベロープ糖タンパク質への還元された単量体エンベロープ糖タンパク質のリフォールディングを誘発すること；を含み、
単量体の少なくとも２０％は、ステップ（ｉｉ）で、リフォールディングしたオリゴマーに変換され、オリゴマーは、単量体糖タンパク質と比較して、非中和抗体との結合の低下を少なくとも示す。
【０１８５】
記載されるような一旦生成された高次抗原が、当業者に既知の任意の方法により精製され得ることを、当業者は理解するであろう。例えば、「精製すること」または「精製」は、以下のステップ：遠心分離（例えば、超遠心分離）、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくはアフィニティークロマトグラフィー）、及び／または膜吸着剤（例えば、イオン交換クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィー）、濾過（例えば、膜濾過、限外濾過、もしくは透析濾過）のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０１８６】
精製された高次抗原がワクチン組成物などの医薬製剤に製剤化され得ることを、当業者は理解するであろう。このような組成物は、アジュバント、賦形剤、結合剤、防腐剤、担体カップリング剤、緩衝剤、安定化剤、乳化剤、湿潤剤、非ウイルスベクター、及びトランスフェクション促進化合物のうちの１つ以上を含み得る。このようなワクチン組成物が凍結乾燥することができることを、当業者はさらに理解するであろう。一実施形態では、生成されたワクチン組成物は、ヒトでの使用に適する。別の実施形態では、ワクチンは、獣医学的使用に適する。
【０１８７】
本明細書に記載の高次抗原または組成物は、抗原特異的免疫細胞と結合する／これを検出するために使用され得る。一実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞である。一実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。抗原性免疫細胞の検出は、対象が抗原に関連する病原体に感染していること、及び／または対象が抗原でワクチン接種されていることを示す。一実施形態では、本明細書に記載の高次抗原、または本明細書に記載の組成物は、エンベロープウイルスに特異的なＢ細胞の検出及び／または単離のために使用され得る。一実施形態では、エンベロープウイルスは、ＨＣＶである。一実施形態では、エンベロープウイルスは、ＨＩＶである。
【０１８８】
本発明の高次抗原が診断アッセイ及び／または免疫細胞の単離での使用に適することを、当業者は理解するであろう。一実施形態では、高次抗原は、フローサイトメトリーにおける免疫細胞の染色またはマーカーとして使用され得る。一実施形態では、フローサイトメトリーを使用する検出を可能にするために、高次抗原は、マーカー、染料、または蛍光団と複合化される。一実施形態では、マーカーは、ｄ−ビオチンである。
【０１８９】
免疫細胞（複数可）の単離は、例えば、Ａｌｔｍａｎら（１９９６）、Ｖｏｌｌｅｒｓら、２００８年及びＤｏｌｔｏｎら、２０１５年に記載されるように、「四量体アッセイ」または「四量体染色」を含み得、本明細書に記載の高次抗原は、アッセイにおける主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）四量体の役割を置き換える。
【０１９０】
一実施形態では、本発明は、ｉ）本明細書に記載の高次抗原を用いて、ＨＣＶに特異的な免疫細胞／Ｂ細胞を標識すること；ならびに、ｉｉ）標識された免疫細胞／Ｂ細胞をサイトメトリーで検出及び／または単離すること、を含む、ＨＣＶに特異的な免疫細胞／Ｂ細胞の検出及び／または単離のための方法を提供する。
【０１９１】
多様体への言及は、部分、誘導体、及び化学的アナログを含む。考えられる化学的アナログは、側鎖の修飾、合成中の非天然アミノ酸及び／またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに、リンカーもしくはクロスリンカーまたはとりわけ、立体配座の制約を課す他の方法の使用を含む。
【０１９２】
本開示は、アセンブリ方法及びアセンブルした高次抗原の特徴の以下の非限定例で完了される。上述したように、本開示は、肝炎抗原及びＨＩＶエンベロープ抗原を使用して説明されるが、本発明は、主題の方法を使用して産生された抗原に拡張して、抗原の抗原性及び免疫原性を増強するために低次抗原から高次オリゴマーを形成する。本明細書に記載されるように、高次抗原は、当該技術分野で既知の一連の技術を使用してさらに特性決定される。しかし、今日までの分析は、本明細書に記載の還元及びアセンブリ方法により生成された、アセンブルしたオリゴマーが、細胞内で産生された対照抗原には見られない抗体結合プロファイルを示し、それにより、本組成物が、これに基づき、先行技術の抗原と区別することができることを示す。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：発現ベクター及びプラスミド
クローニング
ＨＣＶ  Ｅ２Δ１２３のＤＮＡ配列をＣ末端６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグ（配列番号２４）と融合させ、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｃｏｎ１遺伝子型１ｂ（Ｇ１ｂ）Δ１２３（配列番号２０）を、ＣＳＬによりクローニングした。Ｈ７７ｃ遺伝子型１ａ（Ｇ１ａ）Δ１２３（配列番号１９）もまた、ＣＳＬによるが、独自のＣＳＬ改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。得られたＨ７７ｃΔ１２３及びＣｏｎ１Δ１２３を含有するプラスミドを、それぞれ、ｐｃＤＮＡ−Ｈ７７ｃΔ１２３−ＨＩＳ及びｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳと命名した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、Ｓ５２  Ｇ３ａΔ１２３のＤＮＡ配列（配列番号２１）をｐｃＤＮＡ３．１のＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位にライゲーションして、ｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳを生成した。
【０１９４】
ＤＮＡの発現及び精製
ヒートショック法を使用して、ｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳ及びｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳをＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し（Ｆｒｏｇｅｒ及びＨａｌｌ、２００７）、次に、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）アガープレート上で成長させた。単一のコロニーを、アンピシリン含有（１００μｇ／ｍＬの）ＬＢブロス中で培養し、製造者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮプラスミドマキシプレップキットを使用して、ＤＮＡプラスミドを抽出した。クローン化プラスミドの良好なライゲーション及びスケールアップを確認するために、マキシプレップのｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳ及びｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳを、それぞれ、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ；ならびにＮｈｅＩ及びＸｂａＩ制限酵素で消化した。次に、得られた消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ＋システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  １−Ｄ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ゲルを観察して、予想される制限パターンを確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１化学を使用して、プラスミドを（Ｍｉｃｒｏｍｏｎにより）配列決定し、ＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＦｉｎｃｈＴＶ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ）を使用して、配列を解析した。
【０１９５】
実施例２：タンパク質発現及び精製
一過性トランスフェクション。
ヒト胚腎臓２９３細胞株由来のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ（ＦＳ２９３Ｆ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で１５０ｍＬ中１×１０６生細胞／ｍＬで播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（ＦＳ２９３）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。Ｓｔｅｒｉ−サイクルＣＯ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、４×相対遠心力（ＲＣＦ）で回転するオービタルシェーカー上で、細胞を８％のＣＯ２を伴う加湿雰囲気中３７℃でインキュベートした。表１に示される体積を使用して、製造者の使用説明書に従って、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＦＳ２９３Ｆ細胞への、ｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳ及びｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳの一過性トランスフェクションを実施した。トランスフェクション後１日目に、１００ｍＬのＦＳ２９３発現培地を添加し、総トランスフェクション容量を２５０ｍＬに上げた。さらに、細胞培養物に、０．５％のルピンペプトン（Ｓｏｌａｂｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ）を補充した。トランスフェクション後３、５、及び７日目に、半分の培地交換を実施し、それにより、３００×ＲＣＦで５分間遠心分離することにより、細胞培養上清の半分（１２５ｍＬ）を採取した。ペレット化された細胞を、１２５ｍＬの新しいＦＳ２９３発現培地に再懸濁させ、さらに、０．５％のルピンペプトン及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を補充し、次に、細胞培養フラスコに戻した。最後に、トランスフェクション後９日目に、細胞培養上清（２５０ｍＬ）の完全採取を実施した。回収した全ての上清を、１５，３４４×ＲＣＦで３０分間さらなる遠心分離にかけ、ペレットを廃棄して残留細胞及び細胞片を除去した。トリパンブルー染料排除法及び血球計を使用して、細胞計数を収集日ごとに実施して、細胞密度及び生存率を決定した。
【０１９６】
アフィニティークロマトグラフィー
分泌されたＨＩＳタグ化Δ１２３糖タンパク質を含有する細胞培養上清を、１０ｍＬ（すなわち、１カラム体積）のコバルト荷電ＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）に、室温（ＲＴ）のロッカーで２時間適用して、ＨＩＳタグ付きタンパク質の結合を可能にした。ビーズを、５ｍＬ／分の流速の洗浄緩衝液の２０カラム体積（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）で２回洗浄し、１ｍＬ／分の流速の５カラム体積の溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）で溶出した。３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出液中に含有されるタンパク質を濃縮し、塩酸（ＨＣｌ）を使用してｐＨ６．８に調整したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）（ｐＨ６．８のＰＢＳ）で洗浄し、使用するまで４℃で保存した。
【０１９７】
実施例３：ゲル濾過クロマトグラフィー
ＡＫＴＡ高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  １６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液として濾過及び脱気されたｐＨ６．８のＰＢＳを使用して、流出を流速０．５ｍＬ／分で行った。所望のオリゴマー種を含有する画分をプールし、次に、１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するアミコンウルトラ遠心式フィルターユニットを使用して濃縮し、使用するまで、ｐＨ６．８のＰＢＳの中に保存した。１ｃｍの経路長を有するキュベットを使用する２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）の光学密度の分光光度法により、タンパク質濃度を決定し、以下の式を使用して、ｍｇ／ｍｌで計算した。
吸光係数×ＯＤ２８０での吸光度
【０１９８】
Δ１２３のアミノ酸配列を使用して、吸光係数を決定した。以下の式を使用して、これを計算した。
分子量（Ｄａ）／（（５６９０×＃トリプトファン）＋（１２８０×＃チロシン））
【０１９９】
実施例４：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
必要に応じて、還元条件下または非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥを介してタンパク質を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元させるために、２％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含有する１×試料緩衝液中のタンパク質試料を１００℃で５分間加熱し、次に、広範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１２％のアクリルアミドゲルにロードした。１×ランニング緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭのグリシン、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）中で垂直電気泳動装置（ＣＬＰ）を使用して、電気泳動を１８０Ｖで約１．５時間行った。４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを用い、且つ試料緩衝液中にβ−メルカプトエタノールを含まない以外は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを同様に実施した。ゲルを０．２５％（ｖ／ｖ）のクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１０％（ｖ／ｖ）の酢酸、及び５０％（ｖ／ｖ）のメタノールで染色し、次に、１０％（ｖ／ｖ）の酢酸及び５０％（ｖ／ｖ）のメタノールで脱色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して、スキャンした。Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを使用して、バンド強度を定量した。
【０２００】
実施例５：抗体
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＡＲ３Ａ、ＡＲ３Ｂ、ＡＲ３Ｃ、及びＡＲ３Ｄは、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）のＭａｎｓｕｎ  Ｌａｗ博士からの親切な贈物であった。ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｄ、ＨＣ−１１、及びＨＣＶ−１は、Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ大学のＳｔｅｖｅｎ  Ｆｏｕｎｇ博士からの親切な贈物であった。Ｈ５２及びＨ５３は、Ｊｅａｎ  Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ博士及びＨａｒｒｙ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ博士の親切な贈物であった。ＭＡｂ１、７、１０、１２、１６、２０、２４、及び６０を、ＣＳＬ  Ｌｔｄと共同で発明者らの研究室で生成した（表２）。好適な抗体パネルは、文献、例えば、Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：８（４）ｅ１００２６５３，Ａｐｒｉｌ  ２０１２に記載される。また、抗体２Ａ１２は、天然対照オリゴマーＨＣＶ  Ｅ２と比較して、アセンブルしたＥ２との結合の低下を示した。抗体パネル及びそれらをどのように生成するかは、参照により本明細書に組み込まれるＶｉｅｔｈｅｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：６５（４），１１１７−１１３１，２０１７、ならびに、参考文献５、３３〜３６、１７、及び３７、ならびに出版者から入手可能な補足資料などの本明細書で参照された参考文献に記載される。
【０２０１】
実施例６：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
サンドイッチＥＬＩＳＡ。
良好なタンパク質発現及び精製を確認するために、Ｍａｘｉｓｏｒｂ平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。ウェルを、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中の５μｇ／ｍＬの二量体マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＣＤ８１−ＬＥＬ１１３−２０１でコーティングし、次に、４℃で一晩インキュベートした。このステップ及びその後の洗浄ステップで、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中でプレートを４回洗浄し、次に、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＢＳＡ１０ＰＢＳ）で１時間室温でブロックした。洗浄後、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（ＢＳＡ５ＰＢＳＴ）中で、組織培養上清の半対数段階希釈を実施し、続いて、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＢＳＡ５ＰＢＳＴ中のウサギ抗６×ＨＩＳエピトープタグ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の単一希釈物を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）の単一希釈物を添加した。洗浄後、製造者の使用説明書に従って、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ＥＬＩＳＡの発色を実施し、反応物を１ＭのＨＣｌで停止させた。最後に、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、光学濃度を４５０ｎｍで測定した。
【０２０２】
単一希釈点評価及び直接ＥＬＩＳＡ。
実施例５／表２に記載の抗体パネルなどの当該技術分野で既知の抗体のパネルに対するΔ１２３の反応性を評価するために、単一希釈点評価を最初に実施し、それにより、Ｍａｘｉｓｏｒｂ平底９６ウェルプレートを５μｇ／ｍＬの単量体Δ１２３で直接コーティングし、次に、４℃で一晩インキュベートした。ＢＳＡ１０ＰＢＳで洗浄及びブロッキングした後、一次抗体の単一希釈物、続いて、洗浄しながら二次抗体（Ｄａｋｏ）を添加し、各添加の間は室温で１時間インキュベーションした。サンドイッチＥＬＩＳＡのために、上記のように、プレートを発色させて測定した。直接ＥＬＩＳＡを同じ方法で実施したが、必要に応じて、ウェルを２μｇ／ｍＬの単量体Δ１２３または５μｇのＨＭＷ１Δ１２３のいずれかでコーティングし、一次抗体をＢＳＡ５ＰＢＳＴの半対数段階希釈にかけた。
【０２０３】
実施例７：タンパク質還元及びリフォールディング
小規模還元
タンパク質還元に使用される最適ＤＴＴ（Ｐｉｅｒｃｅ）濃度を決定するために、Ｍａｘｉｓｏｒｂ平底９６ウェルプレートを、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中の５μｇ／ｍｌの単量体Ｈ７７ＣΔ１２３でコーティングし、ＲＴで最低２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中で調製された異なる濃度のＤＴＴ（０〜１０ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、プレートを直ちにＰＢＳＴで６回洗浄して、ＤＴＴを除去し、続いて、ＢＳＡ１０ＰＢＳでブロッキングした。実施例６に記載のように、抗ＨＩＳ、Ｈ５３、及びＲ０４を含む一次抗体、続いて、適切な二次抗体を添加した。最後に、結合抗体を、実施例６に記載されるように、検出及び測定した。還元剤としてＴＣＥＰを使用して、同じ実験を繰り返した。
【０２０４】
溶液中のＤＴＴを用いる還元及びリフォールディング
炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中で調製したＨ７７ｃΔ１２３単量体を、異なる条件（表３）下でＤＴＴ還元にかけ、最適なＨＭＷΔ１２３形成のための要件を決定した。タンパク質のリフォールディングは徐々に希釈することにより行われた。ｐＨ６．８のＰＢＳを最初の試料量の半分である一定量で３回段階的に添加することにより、これを達成した。例えば、ｐＨ６．８のＰＢＳ  ４×２００μＬを、４００μＬの試料に添加する。各添加後、室温で１５分間インキュベートした。１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニットを使用して、ＤＴＴを除去し、続いて、ｐＨ６．８のＰＢＳ中で２回すすいだ。次に、リフォールディングしたタンパク質を、実施例４に記載のように非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。実施例３に記載されるように、多量体が良好に形成され、且つゲル濾過クロマトグラフィーにより分析された場合、より大規模なリフォールディングが行われた。
【０２０５】
酸化還元シャフリングシステムを使用する還元及びリフォールディング
１：５の比の酸化Ｌ−グルタチオン（ＧＳＳＧ、Ｐｉｅｒｃｅ）対還元Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ、Ｐｉｅｒｃｅ）を、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中で調製されたＨ７７ｃΔ１２３単量体に添加し、異なる条件（表４）を調べた。実施例７に記載されるように、Ｌ−グルタチオンを除去することにより反応を停止させ、次に、リフォールディングしたタンパク質を分析した。実施例３に記載されるように、多量体が良好に形成され、且つゲル濾過クロマトグラフィーにより分析された場合、より大規模なリフォールディングが行われた。
【０２０６】
ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）を用いるトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）還元タンパク質の架橋
異なる濃度のＴＣＥＰを、異なる濃度のｐＨ６．８のＰＢＳ中で調製されたＨ７７ｃΔ１２３単量体に添加し（表５）、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、使用直前にジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）に溶解させたＢＭＯＥ（Ｓｉｇｍａ）を、０．２ｍＭの最終濃度まで添加し、製造者の指示に従って、ＲＴで１時間インキュベートした。実施例７に記載されるように、ＢＭＯＥ及びＴＣＥＰを除去することにより、反応を停止させ、次に、リフォールディングしたタンパク質を分析した。
【０２０７】
実施例８：Δ１２３の産生
Ｈ７７ｃ株、Ｃｏｎ１株、及びＳ５２株由来のΔ１２３のＤＮＡ配列を、ｐｃＤＮＡ３．１系ベクターに組み込み、以下のプラスミド：ｐｃＤＮＡ−Ｈ７７ｃΔ１２３−ＨＩＳ、ｐｃＤＮＡ−Ｃｏｎ１Δ１２３−ＨＩＳ、及びｐｃＤＮＡ−Ｓ５２Δ１２３−ＨＩＳを生じさせた。これらのプラスミドは、アガロースゲル電気泳動で予想される制限パターンを示し、Ｈ７７ｃ、Ｃｏｎ１、及びＳ５２Δ１２３インサートを表すバンドは全て、それぞれ、７６２、７５９、及び７１０ｂｐの予想された長さに相当する（図１）。Ｈ７７ｃΔ１２３を独自のＣＳＬ改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングして、それぞれ同じ水平位置に移動したＣｏｎ１及びＳ５２を含有する標準Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターと比較して、観察されたより大きなベクターサイズを説明する（図１）。
【０２０８】
哺乳動物ＦＳ２９３Ｆ細胞への、Ｃｏｎ１及びＳ５２Δ１２３プラスミドの一過性トランスフェクションを実施して、Δ１２３糖タンパク質を産生した。細胞を流体力学的な力から保護するＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、及び成長効率を高めるためのルピナスペプトンが補充されたＦＳ２９３発現培地中、懸濁状態で、細胞を維持した。細胞を１×１０６生細胞／ｍＬで播種し、トランスフェクション後０〜９日目に、細胞生存率を約９０％に維持した。Δ１２３糖タンパク質の良好な発現を確認するために、細胞培養上清を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した（図２Ａ〜Ｂ）。トランスフェクション後の３、５、７、及び９日目に採取した上清の半対数段階希釈物を、二量体ＭＢＰ−ＣＤ８１−ＬＥＬ１１３−２０１でコーティングされた酵素免疫アッセイプレートに塗布し、捕捉されたΔ１２３糖タンパク質を、ウサギ抗ｈｉｓ抗体及びＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ免疫グロブリンで検出した。最初のウェルに１μｇ／ｍＬの濃度の単量体Ｈ７７ｃΔ１２３は、陽性対照として役立つが、最初のウェルで１／２に希釈したＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１４０含有上清は、陰性対照として役立つ。全ての細胞培養上清は、ＣＤ８１との陽性結合を示し、上清中のΔ１２３糖タンパク質の存在、それによる、良好なタンパク質発現を示す。さらに、細胞培養上清を表す曲線は、陽性対照より上に現れ、１μｇ／ｍＬを超えるΔ１２３糖タンパク質−Ｃｏｎ１及びＳ５２の場合、それぞれ、およそ４μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬの収率を示した。光学密度（ＯＤ）値は、５日目及び７日目で実施された採取について最も高く、タンパク質発現がこれらの中間時点で幾分より効率的であったことが示唆された。Ｓ５２Δ１２３トランスフェクションからの上清は、Ｃｏｎ１Δ１２３のものと比較して、より高いレベルのＣＤ８１結合を実証し、Ｓ５２株の場合、より効率的なタンパク質発現が示唆されたこと、またはＳ５２Δ１２３が、ＣＤ８１に対してより強い親和性を有することも認められていた。
【０２０９】
細胞培養上清からΔ１２３糖タンパク質を単離するために、コバルトを充填したセファロースマトリックスであるＴＡＬＯＮビーズを使用して、アフィニティークロマトグラフィーを実施し、これは、従来のニッケル親和性支持体よりも高い特異性でｈｉｓタグ化タンパク質と効率的に結合する。タンパク質精製の有効性も、細胞培養上清について行われたのと同じ方法で、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した（図２Ｃ〜Ｄ）。溶出液を３つの別々の画分に順次収集し、最初の画分に溶出されたタンパク質は、精製前の上清と同様のレベルのＣＤ８１結合を示し、画分１が大部分のΔ１２３糖タンパク質を含有したことが示された。画分２で溶出されたタンパク質は、ＣＤ８１結合の減少を示し、より少ない量のΔ１２３が存在したことが示されたが、画分３のものは、ごくわずかなＣＤ８１結合を示し、ＨＩＶ  ｇｐ１４０陰性対照と位置合わせされた曲線を生成した。精製後の上清（すなわち、フロースルー）及びＳ５２Δ１２３精製の洗浄液は、陽性対照と結合するＣＤ８１とほぼ同程度のレベルを示したが、Ｃｏｎ１Δ１２３のものに対して低いレベルが観察され、Ｃｏｎ１Δ１２３精製がより効果的に実施されたことが示された。
【０２１０】
実施例９：Δ１２３発現プロファイル
ゲル濾過クロマトグラフィーによりアフィニティー精製されたＨ７７ｃΔ１２３の発現の分析前の株由来のΔ１２３のＤＮＡ配列は、Ｈ７７ｃΔ１２３が異なるサイズの種の領域として存在することを明らかにした（図３Ａ）。これらは、それぞれ、４６、９７、２３９、及び２４０２ｋＤａの分子質量を有する単量体、二量体、ＨＭＷ２、及びＨＭＷ１Δ１２３から成り、抗原性及び免疫原性が変化する（Ｈ．Ｄｒｕｍｍｅｒ、未発表データ）。ＨＭＷ種は、ｂＮＡｂを誘導することができるが、単量体は、型特異的ＮＡｂを誘導する（Ｈ．Ｄｒｕｍｍｅｒ、未発表データ）。しかし、Ｈ７７ｃΔ１２３のＦＳ２９３Ｆ細胞への安定なトランスフェクション（本プロジェクトの開始前にＤｒ．Ｒｏｂ  Ｊ  Ｃｅｎｔｅｒで実施された）から生じたΔ１２３の２３．１３％のみが、モノマーの場合の６４．９０％と比較して、ＨＭＷ形態のものであった（図３Ａ及び表６）。
【０２１１】
任意の遺伝子型からのΔ１２３は、Ｅ２の最も保存された領域を含むので、ｂＮＡｂを同様に引き出すことができるはずである。しかし、ＷＴ  Ｅ２及びΔ１２３の発現プロファイルは、異なる遺伝子型間で変動するであろう。Ｃｏｎ１Δ１２３及び／またはＳ５２Δ１２３が、より高収率のＨＭＷ種を発現するかどうかを判定するために、ＦＳ２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクションからのアフィニティー精製されたΔ１２３糖タンパク質を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムを使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  １６／６００カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した。ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアを使用して、ピーク下面積を定量すると、Ｃｏｎ１（図３Ｂ）及びＳ５２（図３Ｃ）株の両方が実際に、より高い収率のＨＭＷΔ１２３を生じ、Ｈ７７ｃの２３．１３％と比較して、ＨＭＷ形態（組み合わせたＨＭＷ１及びＨＭＷ２）の、生成された全Δ１２３糖タンパク質の４６．０２％（Ｃｏｎ１）及び４４．８８％（Ｓ５２）であったことが明らかにされた。（表６）。
【０２１２】
これらの結果の再現性を評価するために、一過性トランスフェクション及びΔ１２３の精製を繰り返し、ゲル濾過クロマトグラフィーを再度実施して、Δ１２３発現を分析した。第２ラウンドでは、ｙ軸の目盛りで示されるように、Ｃｏｎ１Δ１２３の発現レベルは、ラウンド１のもののおよそ２倍であったが、Ｓ５２Δ１２３の発現レベルは、比較的安定したままであった（図３Ｄ〜Ｅ）。発現レベルの変動にもかかわらず、Ｃｏｎ１及びＳ５２Δ１２３の発現プロファイルは、ラウンド１及びラウンド２の両方に対して類似したままであったことに留意することが重要であった。Ｈ７７ｃと比較して、ＨＭＷΔ１２３の収率の改善が再び観察され、第２ラウンドで生成されたＨＭＷ種は、同様の割合であり、Ｃｏｎ１が４６．９８％、Ｓ５２が４１．５６％であった（表６）。
【０２１３】
ゲル濾過分画されたΔ１２３糖タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。５〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲル上での非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ゲル濾過クロマトグラフィーの結果を補強し、Δ１２３が種々のジスルフィド結合オリゴマー形態として存在することを再度実証し、バンド強度と分子量の反比例関係を示した（図４Ａ〜Ｂ）。さらに、ジスルフィド結合を破壊する還元剤であるβ−メルカプトエタノールを使用して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を１２％のアクリルアミドゲル上で行った。β−メルカプトエタノールは、順次、疎水性接触も破壊する、結果により、ジスルフィドがβ−メルカプトエタノールにより開裂されると、全てが単量体として移動するので、ジスルフィド結合は、高次構造の形成及び安定化に不可欠であることが明らかにされる（図４Ｃ〜Ｄ）。疎水性相互作用は、高次種の形成に寄与し得る。
【０２１４】
これらのデータにより、Ｃｏｎ１及びＳ５２株は実際に、Ｈ７７ｃと比較して、高収率のＨＭＷΔ１２３を発現することが明らかにされ、ＨＭＷΔ１２３産生を改善する１つの可能な方法を実証する。
【０２１５】
実施例１０：ＨＭＷΔ１２３の抗原特性決定
Ｃｏｎ１及びＳ５２株により生成されたＨＭＷΔ１２３が、Ｈ７７ｃのものの抗原性パターンを反復するかどうかを評価するために、３つの株全てのゲル濾過分画単量体及びＨＭＷ１Δ１２３を、ＥＬＩＳＡフォーマットで立体配座感受性及び非感受性ＭＡｂのパネルに対して試験した（図５Ａ）。迅速試験として単一希釈点評価（図５Ｂ）を最初に実施して、Ｈ７７ｃのΔ１２３ならびにＣｏｎ１及びＳ５２の一方または両方に対して、どのＭＡｂが陽性反応性を示すかを判定し、それにより、株間の抗原性を比較することが可能になった。この基準を満たすＭＡｂを直接ＥＬＩＳＡでさらに試験し、それにより、ＭＡｂの半対数段階希釈物を、単量体及びＨＭＷ１Δ１２３で別々にコーティングされた酵素免疫アッセイプレートに塗布し、続いて、適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体で検出した。次に、各結合曲線の中間点を比較することにより、最大光学濃度値の半分とされた、ＨＭＷ１Δ１２３に対する各ＭＡｂの相対結合を計算した（表７）。
【０２１６】
単一希釈点評価は、立体配座感受性マウスＨ５３及びＭＡｂ１、７、１２、１６、及び２０が全て、Ｈ７７ｃΔ１２３に対して陽性反応性を示したが、Ｃｏｎ１及びＳ５２Δ１２３に対してごくわずかな反応性が実証され、これらのＭＡｂｓの標的エピトープを認識できないようにし、且つこれらのＭＡｂが型特異的であるように、これらの２つの株のエピトープの完全性を変更したことが示された。この反対は、Ｃｏｎ１及びＳ５２Δ１２３に対する陽性反応性があるが、Ｈ７７ｃに対してはない場合、立体配座感受性ヒトＡＲ３Ａにより示された（図５Ｂ）。
【０２１７】
直接ＥＬＩＳＡでさらに試験された１１のＭＡｂのうちの、８つ（ＡＲ３Ｂ、ＡＲ３Ｃ、ＡＲ３Ｄ、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｄ、ＨＣ−１１、ＭＡｂ１０、及び６０）は、単量体形態（表７）と比較した時、Δ１２３のＨＭＷ形態との結合の低下を示し、標的エピトープがより閉じ込められていたことが示された。マウスＨ５２のみが、３つの株全てに対して、ＨＭＷ１Δ１２３と結合する能力の著しい増強を実証し（表７）、残基Ｃ６５２へのアクセスの改善が示唆された。
【０２１８】
各ＭＡｂがＨＭＷ形態のＣｏｎ１及びＳ５２に結合する能力を、Ｈ７７ｃのものと比較する時、試験された１１のＭＡｂのうち５つ（ＨＣＶ１、ＡＲ３Ｂ、ＡＲ３Ｃ、ＣＢＨ−４Ｄ、ＨＣ−１１）は、増加したまたは同等の結合レベルを示した。さらに、結合の増加が、ＡＲ３Ｄ及びＨ５２により実証されたが、Ｃｏｎ１Δ１２３に対してのみであり、一方、ＭＡｂ１０及び２４は、両方の株に対して結合のレベルの低下を示した（表７）。
【０２１９】
実施例１１：ＴＣＥＰ及びＢＭＯＥを使用したΔ１２３の還元及びリフォールディング
単量体Δ１２３を部分的に還元して、遊離スルフヒドリルを生じ、続いて、これらのスルフヒドリルを、多量体形成を媒介することになる分子間ジスルフィド結合に再共役させることにより、Δ１２３単量体を単量体にリフォールディングする能力を評価した。
【０２２０】
スルフヒドリルを含まない還元剤であるＴＣＥＰを使用したΔ１２３の小規模還元を迅速試験として試行して、Δ１２３の部分還元に必要なＴＣＥＰの最適濃度を決定した（図６）。酵素イムノアッセイプレート上にコーティングされた単量体Ｈ７７ｃΔ１２３を、異なる濃度のＴＣＥＰ（０〜５００ｍＭ）に３７℃で３０分間曝露させ、還元が起こる時間を与えることにより、これを実行した。ＴＣＥＰ還元から生じる構造変化の程度を判定するために、立体構造依存性マウスＨ５３抗体の単一希釈物をプレートに塗布し、結合をＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体で検出した。１０〜５００ｍＭのＴＣＥＰで処理されたＨ７７ｃΔ１２３は、Ｈ５３との結合が漸進的に低下し、全ての光学密度値は、Ｒ０４陰性対照（ヒトサイトメガロウイルスに対するヒトＭＡｂ）のものよりも大きかった。これらの結果は、Ｈ５３認識がある程度保持されているため、Δ１２３の立体配座が完全には破壊されていないことを示し、部分還元が達成され、且つ還元がＴＣＥＰ濃度の増加と共に漸進的に増加したことが示される。さらに、陽性抗ＨＩＳ結合は、異なる濃度のＴＣＥＰの存在下で一貫して起こり、結合Δ１２３の喪失がＨ５３結合の低下の原因となり得る可能性が排除された。Δ１２３立体配座の保持は、Δ１２３の抗原性及び免疫原性特性を保持し、且つＨＭＷΔ１２３への後続の再形成を可能にするために必要と考えられたので、１０〜２００ｍＭのＴＣＥＰ濃度がさらなるタンパク質還元実験に適していたことが判定された。
【０２２１】
酵素イムノアッセイプレート結合タンパク質における還元は、多数の試薬濃度の迅速な試験を可能にする。しかし、潜在的なワクチン生成の点から、溶液中の還元がより適切である。従って、ＴＣＥＰは、６〜８の範囲のｐＨで最も効果的であるので、Ｈ７７ｃΔ１２３単量体を、ｐＨ６．８のＰＢＳ中で調製した。最初に存在する異なる量のタンパク質が、単量体のＨＭＷ形態への変換効率に影響を与えるかどうかを調べるために、種々の濃度のΔ１２３も調製した。次に、従前の小規模還元実験により導かれた濃度で、ＴＣＥＰを添加した。続いて、部分還元されたΔ１２３単量体をＨＭＷΔ１２３に変換するために、還元後に、タンパク質リフォールディング、ジスルフィド再形成、及びリシャフリングを伴うプロセスが続いた。６．５〜７．５のｐＨ範囲で遊離スルフヒドリルと共にチオエーテル結合を形成する、短いホモ二官能性マレイミド架橋剤ＢＭＯＥの添加により、これを促進した。その結果、スルフヒドリル基が共役され、それにより、ジスルフィド再形成を再現する。また、ＴＣＥＰは、スルフヒドリルを含まず、それにより、スルフヒドリル反応性ＢＭＯＥ架橋剤と組み合わせて使用するのに適切であり、この実験では還元剤としてＴＣＥＰの使用が正当化される。
【０２２２】
リフォールディングしたΔ１２３糖タンパク質を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図６Ｂ）。全ての試料は、単量体対照及びモック対照と同様の移動パターンを示し、さらに、これを、ＴＣＥＰ及びＢＭＯＥの不存在下であったが、還元及びリフォールディング手順にかけた（図６Ｂ及び表８のレーン７）。ＨＭＷΔ１２３対照のバンドと位置合わせしたバンドはなく、ＴＣＥＰ還元及びＢＭＯＥを使用したリフォールディングが、単量体Δ１２３をＨＭＷΔ１２３に変換するのに失敗したことが明らかにされた。
【０２２３】
実施例１２：酸化還元シャフリングシステムを使用した還元及びリフォールディング
酸化還元シャフリングシステムを利用して、還元されたスルフヒドリル間の酸化を促進し、それにより、還元及びリフォールディングを、還元剤（ＧＳＨ）及び酸化剤（ＧＳＳＧ）の両方の存在下で同時に行った。高ｐＨ環境が、それぞれ、ＧＳＨ及びＧＳＳＧの還元能力及び酸化能力を促進するので、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中でＨ７７ｃΔ１２３単量体を調製することにより、これを実施した。凝集効率に対するタンパク質濃度の影響を調べるために、Ｈ７７ｃΔ１２３単量体も種々の濃度で調製した（表９）。次に、２ｍＭのＧＳＨ及び０．４ｍＭのＧＳＳＧの最終濃度と等しい５ＧＳＨ：１ＧＳＳＧの比を添加し、これらは、市販のタンパク質リフォールディングキットで通常使用される濃度であり、９０％を超えるタンパク質をリフォールディングすると報告されている（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより提供される情報）。次に、これらΔ１２３試料を３７℃で種々の時間インキュベートして（表９）、この直後に、ｐＨ６．８のＰＢＳで５０倍希釈し、遠心フィルターユニットを使用してグルタチオンを除去して、反応を停止させた。
【０２２４】
Δ１２３試料を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（図７Ａ）、これにより、二量体バンドの出現及び二量体よりもサイズが大きい高次構造の存在により示されるように、単量体Δ１２３の二量体Δ１２３及び高次種への良好なリフォールディングが明らかにされた。単量体対照及びモック対照はそれぞれ、予想通りに、単量体Δ１２３のサイズに対応するバンドを生成した。しかし、モック対照に対し、かすかな二量体バンドが観察された（図７Ａのレーン１）。これは、単量体Δ１２３のゲル濾過プロファイルと一致しており（図７Ｂ）、これは、少量の混入二量体Δ１２３も示した。未処理Δ１２３単量体を４℃で蓋付きチューブ中に予め保存していたので、二量体の検出は、空気またはより高温への曝露の結果としての自発的タンパク質凝集も示唆し得る。さらに、ゲルにロードする前に試料をボイルすると、凝集を促進することができる。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを使用して単量体及び二量体バンドのデンシトメトリーを定量すると、モック対照は、二量体の４．６５倍多い単量体を含有することが示された。１μｇ／μＬの単量体Δ１２３をグルタチオンで処理された時、大部分の単量体は高次種にリフォールディングすることができず、単量体は、モック対照に対して記録された量より多かった二量体の６．８９倍多い。対照的に、より高濃度（５及び１０μｇ／μＬ）を使用すると、多くの二量体形成がもたらされ、多量のタンパク質の存在下でのリフォールディングがΔ１２３凝集効率を増強したことが示された。インキュベーション時間を２時間から２４時間に増加させると、図７Ａの条件３及び５を並置することにより実証された、より多くの二量体の形成が誘導された。試験された全ての条件のうち、１０μｇ／μＬの単量体Δ１２３を２４時間グルタチオン処理にかけた時、単量体から二量体への変換が最も効率的であった。それ故、これらの条件を利用する実験のスケールアップした反復を実施し、ゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。
【０２２５】
反復実験のΔ１２３のゲル濾過プロファイルは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの結果（図７Ａ）と一致する単量体及び二量体のピークを示した（図７Ｃ）。二量体ピーク上のショルダーも観察され、高次種の一部の形成が示された。ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアを使用する曲線下面積の定量により、ほぼ半分のΔ１２３単量体が、多量体にリフォールディングして、二量体が大部分のタンパク質を含むことが明らかにされた（表１０）。全体として、これらの結果は、酸化還元シャフリングシステムの使用が実際に、グルタチオン還元Δ１２３単量体間の分子間ジスルフィド結合形成をもたらすことを実証した。主に、これらの実験は、二量体の形成をもたらした。
【０２２６】
実施例１３：ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用する還元及び徐々に希釈することによるリフォールディング
Δ１２３凝集についての本発明者らの研究を拡大するために、異なる還元剤及びリフォールディング技術：それぞれ、ＤＴＴ及び徐々に希釈することを用いた。ＴＣＥＰと同様に、ＥＬＩＳＡフォーマットにおけるΔ１２３の小規模ＤＴＴ還元を最初に試行して、Δ１２３の部分還元を達成するのに必要な最適ＤＴＴ濃度を決定した（図８Ａ）。酵素免疫アッセイプレート上にコーティングされたＨ７７ｃΔ１２３単量体を、異なる濃度のＤＴＴ（０〜１０ｍＭ）に、３７℃で３０分間曝露することにより、これを実行した。次に、プレートを洗浄してＤＴＴを除去し、それにより、さらなる還元を停止させ、続いて、ブロッキングし、一次抗体（抗ＨＩＳ、Ｈ５３、及びＲ０４）を添加し、適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体で検出した。２ｍＭを超えるＤＴＴを用いて、Δ１２３のほぼ完全な還元を達成した。０．１〜１．０ｍＭのＤＴＴで処理されたΔ１２３は、Ｈ５３結合の漸進的低下を示し、これらの濃度をその後のＤＴＴ還元実験でさらに調べた。均一な抗ＨＩＳ結合が全てのＤＴＴ濃度で観察され、Ｈ５３結合の低下の要因としての結合Δ１２３の喪失が排除された。
【０２２７】
次に、溶液中のＤＴＴ還元を調査し、それにより、種々の濃度のＨ７７ＣΔ１２３単量体（表１１）を、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中で調製し、ＤＴＴに曝露した。ＤＴＴは、７を超えるｐＨで還元能力を保持する。還元されたスルフヒドリルは最終的に、還元剤の不存在下で自発的酸化を受け、ジスルフィド結合の再形成がもたらされる。このプロセスを可能にするために、続いて、還元されたΔ１２３糖タンパク質を、徐々に希釈することによるリフォールディングにかけた。徐々に希釈することは、ｐＨ６．８のＰＢＳをΔ１２３試料に段階的に添加することを含む。さらに、この手順は、ｐＨ環境を徐々に中和することによりＤＴＴを希釈し、その活性を減弱させ、それにより、スルフヒドリルの酸化を促進する。
【０２２８】
リフォールディングしたΔ１２３糖タンパク質を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図８Ｂ）。二量体バンドが単量体対照において観察されなかったので、モック対照は、予想通りの単量体バンド、及び二量体またはおそらく自発的タンパク質凝集を含む低レベルの混入物を示す二量体Δ１２３に対応するおよそ１００ｋＤａのかすかなバンドを生じた。単量体及び二量体バンドのデンシトメトリーを定量すると、モック対照が二量体タンパク質の３．４１倍多い単量体タンパク質を含有することが示された（図８Ｂ及び表１１のレーン１）。全ての試験条件下で還元及びリフォールディングを受けたΔ１２３試料に対して増加した量のオリゴマーが記録され（図８Ｂ）、成功した分子間ジスルフィド結合形成の結果として、Δ１２３単量体の割合が実際に多量体に変換されたことが明らかにされた。ＤＴＴ添加後３０分間インキュベートされた試料に対して、単量体対二量体の比の有意な低下が記録され、これは、二量体タンパク質の２倍未満多い単量体をもたらした。２時間以上のインキュベーションは、３０分のインキュベーションと比較して、より多量体形成を生じさせなかったので、インキュベーション時間を延長したが、Δ１２３凝集を増強することはできなかった。グルタチオン処理からの結果とは対照的に、１μｇ／μＬの単量体Δ１２３をＤＴＴで処理した時、低い単量体対二量体の比が記録された。１μｇ／μＬの単量体Δ１２３を０．１ｍＭのＤＴＴで３０分間処理した時、１．３３の最低値が記録され（図８Ｂ及び表１１のレーン１１）、これらの条件を使用する二量体への変換が最も効率的であることが示された。１μｇ／μＬの単量体Δ１２３を１ｍＭのＤＴＴで３０分間処理した時、高次種の形成は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで最も明白であった（図８Ｂのレーン９）。
【０２２９】
多量体形成のための最適条件（３０分間、１ｍＭＤＴＴ）を使用して、スケールアップした反復実験を実施した。次に、リフォールディングしたΔ１２３糖タンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーで分析して、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの観察を補強し、生成されたオリゴマー種のそれぞれについて、より正確な測定値を得た（図８Ｃ〜Ｄ）。ＤＴＴ処理後の単量体ピークの保持により示されるように、単量体の割合は、影響を受けなかった。ゲル濾過プロファイルは、少量のタンパク質が二量体Δ１２３に対応する領域内に溶出したので、二量体Δ１２３の一部の形成も示し、これは、処理前のゲル濾過プロファイルのものよりも顕著である。最も重要なことには、ＨＭＷ２Δ１２３について観察された溶出時間と同様に、２００ｋＤａを超えるサイズに対応する広いピークがおよそ５９分で溶出し、より大きな多量体への良好なΔ１２３凝集が確認された。ピーク下面積を定量すると、およそ５分の１の単量体がＨＭＷΔ１２３に凝集したことが明らかにされた。単量体Δ１２３をＨＭＷΔ１２３に変換するために用いられた３つの方法のうち、ＤＴＴ還元、続いて、徐々に希釈することが最も効果的であった。
【０２３０】
実施例１４：リフォールディングＤＴＴ処理Δ１２３から生じた生成物のサイズの分析
以下のプロトコールを使用して、リフォールディングＤＴＴ処理Δ１２３から生じた生成物のサイズを分析した。
物質：
●単量体Δ１２３
●ｐＨ９．６の炭酸水素塩緩衝液
●ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
●ｐＨ６．８のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
【０２３１】
単量体Δ１２３を還元させるために、１ｍＬの単量体Δ１２３を、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中で５ｍＬの黄色の蓋付きチューブ中で１ｍＬの総体積に調製した。プロテアーゼ阻害剤の存在下でリフォールディングする場合、５μｇ／ｍＬのアプロチニン、８μｇ／ｍＬのロイペプチン、及び５μＭのキフェネンシンも添加した。ＤＴＴをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、０．３ｍＭの最終濃度（すなわち、１００ｍＭのＤＴＴ３μＬ）でチューブに添加した。次に、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。２回のＤＴＴ処理の場合、インキュベーション後、１００ｍＭのＤＴＴ３μＬをチューブに添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。３回のＤＴＴ処理の場合、２回目のインキュベーション後、１００ｍＭのＤＴＴ３μＬをチューブに添加し、混合物を３７℃で３０分間再度インキュベートした。
【０２３２】
リフォールディングのために、０．５ｍＬのＰＢＳを添加し、タンパク質を室温で１５分間インキュベートした。このステップを３回繰り返した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（１０ｋのＭＷＣＯ）を使用することによりＤＴＴを除去し、タンパク質をＰＢＳ中で２回すすいだ。
【０２３３】
サイズ分析のために、タンパク質は、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。次に、１６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅカラムを使用して、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。
【０２３４】
ＤＴＴ処理により、単量体Δ１２３が高次種にリフォールディングし、５９分及び５４分の溶出時間でピークを形成し得ることが明らかにされた（図１０）。ＤＴＴ処理数を増加させると、１ヒットで観察された５９分の溶出時間から、２または３ヒット後の５４分までのＨＭＷ様ピークの左へのシフトがもたらされた（図１０）。一方で、単量体ピークについて、１、２、及び３ヒット（複数可）に対してそれぞれ７７〜７６〜７５の溶出時間からの右へのわずかなシフトが観察された。プロテアーゼ阻害剤を添加すると、７５分で残りの単量体ピークの溶出（図１１、下の実施例）がもたらされ、リフォールディングした多量体が５４分で溶出し、プロテアーゼ阻害剤がこのプロセスに有益であり得ることが示唆された。
【０２３５】
残りのリフォールディングしていない単量体タンパク質がリフォールディングすることが可能かどうかを検討するために、２回のＤＤＴ処理で処理され、且つＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心式フィルターユニット（１０ＫのＭＷＣＯ）を使用して濃縮された、上記の実施例の残りの単量体種（プールされたゲル濾過画分７２〜８１）を収集した。試料を上記のようにＤＴＴで２回再処理し、リフォールディングを実施し、タンパク質をサイズ分析にかけた。
【０２３６】
リフォールディングしていない単量体Δ１２３をリフォールディングすると（図１１、上の実施例）、３７％の二量体形成及びわずかなＨＭＷ様形成がもたらされたが、６３％は単量体として残り、Δ１２３単量体の分集団のリフォールディングが困難であることが示された。単量体ピークの右への比較的短いピークの形成も認められた。しかし、プロテアーゼ阻害剤の存在下でリフォールディングさせると、このピークのサイズに減少をもたらした。
【０２３７】
結果は、本発明の方法を使用して少なくとも６０〜７０％のオリゴマー（１００ＭＷまたは２００ＭＷを超える）の収率が生じ得ることを実証している。
【０２３８】
実施例１５：ＤＴＴ処理Δ１２３及びＡＬＡ７Δ１２３の抗原性の特性決定
以下のプロトコールを使用して、下記の抗体のパネルを使用して、ＤＴＴ処理Δ１２３及びＡＬＡ７Δ１２３の抗原性を比較した。
物質：
試薬：
●ｐＨ９．４の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液
●ＥＬＩＳＡ洗浄液（ＰＢＳＴ）
●ＥＬＩＳＡ過酸化水素ブロック（ＢＳＡ１０ＰＢＳ）
●ＥＬＩＳＡ希釈剤（ＢＳＡ５ＰＢＳＴ）
●クエン酸リン酸緩衝液；３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
●塩酸（ＨＣｌ）
タンパク質：
●ＨＭＷ１Δ１２３
●リフォールディング前の単量体Δ１２３
●リフォールディング耐性Δ１２３
●リフォールディングした多量体Δ１２３
●リフォールディング前の単量体ＡＬＡ７Δ１２３
●リフォールディング耐性ＡＬＡ７Δ１２３
●リフォールディングした多量体ＡＬＡ７Δ１２３
●ＢＳＡ
抗体：
●一次抗体ＡＲ３Ｃ、ＣＢＨ４Ｇ、ＨＣ８４．２７、ＨＣＶ１
●二次抗体抗ヒトＨＲＰコンジュゲート
【０２３９】
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ平底９６ウェルプレートを、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中で調製した５μｇ／ｍＬの上記のタンパク質でコーティングし、４℃で一晩（一晩）インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＢＳＡ１０ＰＢＳで室温で１時間ブロックした。次に、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、資料中に列挙された１°抗体の半対数段階希釈を行い、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、資料に記載される２°抗体を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢで発色させ、続いて、５０μＬ／ウェルのＨＣｌを添加した。結果は、図９に示す通りである。リフォールディングしたΔ１２３は、単量体Δ１２３対照及びリフォールディング耐性Δ１２３対照と比較して、ＡＲ３Ｃ及びＣＢＨ４Ｇとの結合を低下させており、ＨＭＷΔ１２３に特有のプロファイルである、標的エピトープがリフォールディングしたΔ１２３中に、より閉じ込められていたことが示された。リフォールディングしたＡＬＡ７Δ１２３は、単量体ＡＬＡ７Δ１２３対照及びリフォールディング耐性ＡＬＡ７Δ１２３対照と比較して、ＡＲ３Ｃ及びＣＢＨ４Ｇとの結合を低下させており、高分子量形態のタンパク質に特有のプロファイルである、標的エピトープがリフォールディングしたＡＬＡ７Δ１２３中に、より閉じ込められていたことが示された。リフォールディングしたΔ１２３及びリフォールディングしたＡＬＡ７Δ１２３に対するＣＢＨ４Ｇの反応性の減少により、非中和エピトープが天然ＨＭＷ物質中よりも、リフォールディングした物質中に閉じ込められていることが示され得る。非中和抗体応答の発生が抑制される可能性があるので、これは、リフォールディングした物質が免疫原として使用される時、利点を提供し得る。
【０２４０】
実施例１６：リフォールディング実験
上記で行ったさらなるリフォールディング実験の結果は、表１３及び１４にまとめられる。
【０２４１】
要約すれば、アフィニティー精製されたΔ１２３のゲル濾過クロマトグラフィーにより、優勢な単量体形態に加えて、ジスルフィド結合二量体及び高次ＨＭＷ多量体の不均一混合物の存在が明らかなる。ＨＭＷΔ１２３は、魅力的なワクチン候補である。しかし、ＨＭＷ形態のΔ１２３の魅力は、比較的低い発現収率及び混入タンパク質の存在により幾分弱められる。ワクチン製造に有益であると思われるＨＭＷΔ１２３産生の収率を改善するいくつかの方法を調べた。
【０２４２】
ヒト由来のＦＳ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクションからのΔ１２３の発現を評価し、Δ１２３を捕捉するためにＣＤ８１−ＬＥＬ１１３−２０１を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、良好なΔ１２３産生及び精製を確認した。
【０２４３】
ゲル濾過クロマトグラフィーから得られた結果は、Ｃｏｎ１及びＳ５２株の両方が一貫して高い割合のＨＭＷΔ１２３を発現し、Ｃｏｎ１及びＳ５２についてそれぞれおよそ２３％及び２０％の増加を示し、Ｈ７７ｃ株により生成されるＨＭＷΔ１２３の割合をほぼ２倍にした。さらに、これらの結果は、異なるＨＣＶ株が様々な量のＨＭＷΔ１２３を産生することが明らかにされる。結果は、トランスフェクション及び精製の独立した２ラウンドから生成されたＣｏｎ１及びＳ５２Δ１２３の両方について再現性があった。
【０２４４】
コバルト荷電ＴＡＬＯＮビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーは細胞培養上清から分泌されたΔ１２３糖タンパク質を効率的に精製するが、これらのビーズからのコバルト浸出はワクチン生成に使用すると健康上の問題を引き起こし得る。より安全な代替法は、Δ１２３を精製する時、抗体アフィニティークロマトグラフィーを使用することであり得る。
【０２４５】
ＨＭＷΔ１２３の構造は未定義のままであるが、本明細書に記載の結果は、分子間ジスルフィド結合が、ＷＴ  Ｅ２及び単量体Δ１２３において予め接近可能であった非特異的及びタイプ特異的中和領域を閉じ込める独特のフォールディング配置を媒介することを示唆する。単量体がｂＮＡｂを生成しなかったが、ＨＭＷ形態が７つ全てのＨＣＶ遺伝子型を中和することができる抗体を誘発することが可能だったことを実証することにより、Ｈ７７ｃΔ１２３の免疫原性試験は、このことをサポートし、これらの抗体応答が、これらの領域の閉じ込めにより、非中和エピトープから離れる方向に向かい、従って、代わりに広域中和エピトープに標的化されることが示された（Ｈ．Ｄｒｕｍｍｅｒ、未発表データ）。
【０２４６】
単量体は、異なるΔ１２３種の不均一混合物から効率的に生成され、効果的に精製され得るので、単量体Δ１２３をＨＭＷ形態にリフォールディングするための方策を評価した。遊離スルフヒドリルを生じる単量体の部分還元、続いて、これらのスルフヒドリルの共役または再酸化は、Ｈ７７ｃ  ＨＭＷΔ１２３中のジスルフィド配置を再現するようにジスルフィド結合のリシャフリングをもたらすと仮定された。従来、望ましくないタンパク質凝集体から、特に、細菌封入体から低次種（単量体／二量体／三量体）を再生するために還元及びリフォールディング方法が採用される（Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｐａｎｄａ、２００５）。
【０２４７】
ホモ二官能性ＢＭＯＥ架橋剤は、遊離スルフヒドリルと反応して、それらの共役をもたらす。さらに、共役が個々のΔ１２３サブユニット間で起こる場合、ＨＭＷΔ１２３への凝集を媒介する分子間相互作用が確立されることになる。しかし、リフォールディングプロセスにおいてＢＭＯＥ架橋剤を利用すると、分子間ジスルフィド結合形成を促進することができなかった。これにより、おそらく立体障害または実験誤差のために、試行された条件に対してＢＭＯＥがΔ１２３単量体を架橋しなかったことが示唆される。さらに、ＢＭＯＥ処理陽性対照が存在しないと、これらのＢＭＯＥリフォールディング実験の有効性を評価することは非常に困難になった。これは、他の架橋剤が架橋多量体を生成せず、且つ生成に有用な方法ではないということではない。逆に、ＤＴＴ還元、続いて、徐々に希釈する方法、ならびにグルタチオンベースの酸化還元シャフリングシステムを使用すると、二量体及び高次種の形成がもたらされ、遊離スルフヒドリルが分子間ジスルフィド結合に酸化されたことが示された。具体的には、システイン残基４５２、４８６、５６９、及び５９７のスルフヒドリルは、個々のΔ１２３サブユニットを一緒に架橋することに直接関与し得るが、これは、これらの残基がＥ２  ＲＢＤの構造的完全性にとって必須ではないからである。
【０２４８】
試験した３つの方法のうち、ＤＴＴを使用した還元及び徐々に希釈することによるリフォールディングは、単量体Δ１２３をＨＭＷ種に変換することにおいて最も有効な方法であった。この方法は、およそ５分の１のΔ１２３単量体のＨＭＷ種への変換を可能にした。酸化還元シャフリングシステムを使用すると、二量体ではあるが、およそ５０％のΔ１２３単量体においてリフォールディングが達成された。
【０２４９】
実施例１７：β−メルカプトエタノール（βＭＥ）を使用した還元及びアセンブリ
βＭＥを使用した部分還元によるΔ１２３単量体の還元及び高分子量のオリゴマーへのアセンブリを評価した。
【０２５０】
単量体Δ１２３（２０μｇ）をＰＢＳ中で調製して、各チューブ中の総体積を２０μＬとした。βＭＥを、最終濃度が０〜１００ｍＭとなるように添加し、室温で１５分間インキュベートした。タンパク質をリアセンブルさせるために、１０μＬのＰＢＳを添加し、タンパク質を室温で７分間インキュベートし、２回繰り返した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（３０ｋのＭＷＣＯ）を使用して、βＭＥを除去し、タンパク質を、ＰＢＳで２回すすいだ。タンパク質を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。βＭＥ処理Δ１２３Δ１２３  ３及びＨＭＷ１  Δ１２３及び２μＬのタンパク質標準の試料をウェルに別々にロードし、次に、ゲル電気泳動を１２０Ｖで実施した。染料の先端が分離ゲルの頂部に移動すると、電圧を１６０Ｖに増加させた。クマシー（０．２５％のクマシーブリリアントブルーＧ−２５０、５０％のメタノール、及び１０％の酢酸）でゲルを１時間染色し、次に、ゲルの背景が透明になるまで脱色した（５０％のメタノール及び１０％の酢酸）。最終的に、Ｌｉ−ＣｏｒＯｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを使用して、ゲルを観察した。
【０２５１】
処理及び未処理タンパク質を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果（図１５Ａ）は、未処理の単量体Δ１２３がほとんどの場合は、単量体として移動し、少量の二量体が存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥへの添加前の試料のボイリングの結果の可能性があることを示す。高濃度のβＭＥでは、図１５Ａに示すように、より大きいＨＭＷオリゴマーを観察することができる。それらの存在を確認するために、Δ１２３単量体を１００ｍＭのβＭＥで還元し、ゲル濾過クロマトグラフィーでの分析前にアセンブルさせた。結果（図１５Ｂ）は、網掛け領域で示されるように、小さなショルダーが、１００ｍＭのβＭＥで処理されたΔ１２３単量体上に存在したことを示す。これは、非効率的ではあるが、βＭＥが、Δ１２３をより高次のオリゴマーにリアセンブルさせることができることを示唆する。
【０２５２】
実施例１８：アセンブルした糖タンパク質の免疫原性
アセンブルしたタンパク質が単量体抗原と比較して、動物において、より免疫原性であるかどうかを判定するために、アジュバントとしてＡｄｄａｖａｘを使用して、非近交系モルモットに３週間間隔で１００μｇのタンパク質を４回ワクチン接種した（表１５）。最終ワクチン接種の２週間後にモルモットから採血し、免疫血清を分析して、Δ１２３単量体タンパク質に対する抗体価を決定した。
【０２５３】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ平底９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルのｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中で調製された５μｇ／ｍＬの単量体Ｈ７７ｃ  Ｅ２Δ１２３でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＢＳＡ１０ＰＢＳで室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１／１００で開始するモルモット血清の半対数段階希釈物を、プレートに室温で２時間添加した。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１／１０００の抗ＨＩＳ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢで発色させ、続いて、５０μＬ／ウェルのＨＣｌを添加した。４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの時の光学密度は、連続希釈に対する（ｙ軸）をプロットし、０．５単位の光学濃度を得るために必要な逆数希釈を使用して、抗体価を決定した。群４−Ｆ及び５−Ｆはそれぞれ４匹の動物を有し、両方とも単量体バージョンのＨＣＶタンパク質を投与されるので、これらの群からの結果を、他の群との比較のために組み合わせた。
【０２５４】
結果は、リフォールディングしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７タンパク質でワクチン接種された動物が、これらのタンパク質の単量体形態でワクチン接種された動物よりも高い抗体価を生じたことを示す（組み合わされたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７単量体群の場合、Δ１２３＝４１８２６、Δ１２３Ａ７＝２８６８６対２１７５６）（図１６）。これらの群の平均力価もまた高かった。アセンブルしたΔ１２３群の場合、幾何平均抗体価は、天然Δ１２３ＨＭＷワクチン接種群より高かった（表１６）。アセンブルしたΔ１２３を投与された動物は、単量体抗原を投与された動物よりも統計的に有意に高い抗体価を有した（ｐ＝０．０２８６）（図１６）。
【０２５５】
実施例１９：抗体応答の特異性
アセンブルした抗原が抗体の異なる特異性を生じたかどうかを決定するために、ＨＣＶによる感染を予防する広域中和抗体の標的であるＥ２糖タンパク質の主要抗原領域を表す合成ペプチドに対して血清を試験した。エピトープＩは、残基４１２〜４２３にわたり、マウスＡＰ３３（Ｏｗｓｉａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｏｗｓｉａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；ラット３／１１（Ｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）；ヒトＨＣＶ１及び９５−２（Ｂｒｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）；ヒトＨＣ３３．１及び関連抗体（Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）；Ｈ７７．３９（Ｓａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）；ＭＲＣＴ１０．ｖ３６２及びｈｕ５Ｂ３．ｖ３（Ｐａｎｔｕａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）；ならびにＭＡｂ２４（Ａｌｈａｍｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）などの広域中和抗体のエピトープを包含する。合成ペプチドは、このような特異性及びスパン残基４０８〜４２８を検出するために使用され、モルモット血清中のポリクローナル抗体の反応性を特性決定するために以前に使用されている（Ｖｉｅｔｈｅｅｒら、２０１７）。
【０２５６】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ平底９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルのｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中で調製された５μｇ／ｍＬのＨ７７ｃエピトープＩペプチド（４０８〜４２８）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＢＳＡ１０ＰＢＳで室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、モルモット血清の半対数段階希釈物を、１／５から開始して加え、１時間結合させた。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、５０μＬ／ウェルの抗モルモットＨＲＰ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢで発色させ、続いて、５０μＬ／ウェルのＨＣｌを添加した。
【０２５７】
結果は、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物が、これらの単量体形態の抗原でワクチン接種された動物よりも有意に高い抗体価を有することを示す（図１７）。アセンブルしたΔ１２３の場合には、平均力価は、単量体群の１５倍高く、天然Δ１２３がワクチン接種された群の１．１５倍高かった。アセンブルしたΔ１２３Ａ７の場合、平均力価は、単量体群の５倍高かった。データは、自然にフォールディングした状態（この実施例では、ＨＣＶ  Ｅ２の単量体である）から高次オリゴマーに抗原をアセンブルすると、広域中和抗体エピトープに対する抗体の力価を増加させることにより抗原の免疫原性を有意に改善したことを示唆する。
【０２５８】
実施例２０：抗体応答エピトープＩＩＩの特異性
アセンブルした抗原が異なる特異性の抗体を生じたかどうかを決定するために、残基５２３〜５４９にわたるＣＤ８１結合ループを表す合成ペプチドに対して、血清を試験した。この抗原領域は、抗原領域３の一部を含み、中和抗体の標的である。
【０２５９】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ平底９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルのｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中で調製された５μｇ／ｍＬのＨ７７ｃエピトープＩＩＩペプチド（５２３〜５４９）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＢＳＡ１０ＰＢＳで室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、モルモット血清の半対数段階希釈物を、１／５から開始して加え、１時間結合させた。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、５０μＬ／ウェルの抗モルモットＨＲＰ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢで発色させ、続いて、５０μＬ／ウェルのＨＣｌを添加した。
【０２６０】
結果（図１８）は、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７を投与された動物が、Ｈ７７ｃエピトープＩＩＩに対する高力価の抗体を生じ、Δ１２３でワクチン接種された動物の平均及び幾何平均が、自然にフォールディングした単量体物質を投与された動物よりも高いことを示す（表１８）。加えて、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７タンパク質を投与される動物における抗体価は、単量体物質を投与される動物で観察された抗体価の広がりとは対照的に、一貫して高かった（Δ１２３及びΔ１２３Ａ７の場合の力価の５〜６倍の範囲、対、単量体の場合の２００倍）。これは、アセンブルしたタンパク質が、ワクチン接種された動物において一貫した免疫応答を誘導することができた一方、単量体出発物質が、この領域に特異的な抗体を一貫性なく生成したことを示唆する。
【０２６１】
実施例２１：エピトープＩに対する抗体応答の交差反応性
Ｈ７７ｃエピトープＩに対して生じた抗体が異なる遺伝子型の同等の配列と交差反応性であるかどうかを決定するために、残基４０８〜４２８にわたる遺伝子型２ａ  Ｊ６ペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡを実施した。
【０２６２】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ平底９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルのｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中で調製された５μｇ／ｍＬのＪ６エピトープＩペプチドでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＢＳＡ１０ＰＢＳで室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、モルモット血清の半対数段階希釈物を、１／５から開始して加え、１時間結合させた。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、５０μＬ／ウェルの抗モルモットＨＲＰ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢで発色させ、続いて、５０μＬ／ウェルのＨＣｌを添加した。
【０２６３】
結果（図１９）は、Δ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物において生じた抗体は、エピトープＩの遺伝子型２ａ株Ｊ６配列と交差反応性であり、これらの群の抗体の平均及び幾何平均力価は、天然単量体形態のこれらの抗原でのワクチン接種により達成されたものよりも高かったことを示す（表１９）。Δ１２３でワクチン接種された動物の平均抗体価は、Δ１２３タンパク質を発現するプラスミドがトランスフェクトされた２９３ＦＳ細胞から直接採取された天然高分子量形態のΔ１２３でのワクチン接種を介して達成されたもののほぼ２倍高かった（表１９）。
【０２６４】
実施例２２：ＨＣＶ  Ｅ２  ＣＤ８１阻害の特性決定
ＨＣＶ  Ｅ２は、細胞受容体ＣＤ８１を使用して細胞に結合する。本発明者らの研究室では、本発明者らは、免疫血清中に存在する抗体が可溶性Ｅ２の組み換えＣＤ８１への結合を妨げる能力を判定するためのアッセイを従前に用いている。
【０２６５】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ平底プレートを、ｐＨ９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液５０ｍＭ中で調製された５μｇ／ｍｌのＭＢＰ−ＣＤ８１ＬＥＬでコーティングし、４℃で一晩保存した。翌日、プレートを、１００μＬ／ウェルのＢＳＡ１０ＰＢＳで１時間ブロックし、ＰＢＳＴ中でＸ４回洗浄した。ＢＳＡ５ＰＢＳＴ中、１／５で開始するモルモット免疫血清の半対数段階希釈物５０μＬを、全てのウェルの１μｇ／ｍＬの分画されていないＥ２  ＲＢＤ（別々に、Ｇ１ａＨ７７ｃ及びＧ２ａ  ＪＦＨ１）５０μＬに添加し、次に、室温で１時間インキュベートした。８０μＬのＥ２  ＲＢＤ−血清混合物をＣＤ８１がコーティングされたプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、１／５００の５０μＬ／ウェルのマウス抗ＨＩＳを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢで発色させ、５０μＬ／ウェルの１ＭのＨＣｌを添加して、反応を停止させた。結果は、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物が、Ｈ７７ｃＧ１ａＥ２とＣＤ８１の相互作用を妨げることができる高力価の抗体を生じ、天然Δ１２３ＨＭＷタンパク質を投与されたマウスに存在するレベルと同様の、且つ単量体形態のこれらの抗原でワクチン接種されたマウスで達成された平均レベルと同様のレベルで存在したことを示す（図２０Ａ及び表２０）。
【０２６６】
免疫血清がＣＤ８１と結合するＧ２ａ  Ｅ２の結合を阻害する能力を評価した（図２０Ｂ）。アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物の抗体価は、これらの抗原の単量体形態でワクチン接種された動物及び天然Δ１２３ＨＭＷでワクチン接種された動物と同様であった。これらのデータは、アセンブルした形態のΔ１２３及びΔ１２３Ａ７が、細胞表面受容体ＣＤ８１への異種遺伝子型のＨＣＶの結合を妨げる交差反応性抗体を生じるのに、より有利であることを示唆する。
【０２６７】
実施例２３：相同遺伝子型１ａウイルスの中和
生じた抗体が肝細胞株のＨＣＶによる感染を防止する能力をもたらしたかどうかを判定するために、相同遺伝子型１ａ偽型ウイルスを使用して、中和アッセイを実施した。
【０２６８】
Ｇ１ａ由来のＥ１Ｅ２ヘテロ二量体を組み込むＨＣＶｐｐを産生するための発現ベクターは、ｐＥ１Ｅ２Ｈ７７ｃであった（Ｄｒｕｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ｐＮＬ４−３．Ｌｕｃ．Ｒ−．Ｅ−（ｐＮＬ４３）を、ｔｈｅ  ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨのＮａｔｈａｎｉｅｌ  Ｌａｎｄａｕ博士から入手した（Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。６μｇのＥ１Ｅ２Ｈ７７ｃ  ＤＮＡを、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で６μｇのｐＮＬ４３ＤＮＡと混合した。空ベクター対照のために、１μｇのｐｃＤＮＡ４ｃを１μｇのｐＮＬ４３ＤＮＡと混合した。３１２μＬのＦｕＧＥＮＥ６を５２００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（＋グルタマックス）に添加し、次に、室温で５分間インキュベートし、この混合物６００μＬをＤＮＡ混合物に添加した。１００μＬを空対照に添加した。これらを室温で２０分間インキュベートした。ＰＣ３実験室では、８本のチューブの内容物を、ステップ１の別々の２９３Ｔ細胞含有皿に滴加した。空対照を、ステップ１の２９３Ｔ細胞含有プレートの１つのウェルに添加した。Ｆｕｇｅｎｅ６／Ｏｐｔｉｍｅｍ／ＤＮＡ混合物を３７℃及び５％のＣＯ２で２０分間インキュベートした後、２９３Ｔ細胞に滴加した。細胞を５％のＣＯ２中３７℃で３日間インキュベートした。３日後、感染性Ｅ１Ｅ２偽型ウイルス（ＨＣＶＰＰ）または空ベクター偽型ウイルス（Ｅｍｐｔｙｐｐ）を含有する上清液を除去し、中和アッセイでの使用の準備ができている０．４５μＭのフィルターを通して濾過した。
【０２６９】
熱不活化モルモット血清の半対数段階希釈を、１／２０から開始して行い、２５０μＬの血清を、２５０μＬのＨＣＶｐｐに添加し、１時間インキュベートした。１５０μＬ／ウェルの血清−ウイルス混合物を３連でＨｕｈ７．５細胞に添加した。１５０μＬ／ウェルの空対照を、無抗原群のプレートの最下段に３連で添加した。次に、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０２７０】
４２時間後、培地をＨｕｈ７．５細胞から除去し、次に、これを１×ＰＢＳ中で１回洗浄した。５０μＬ／ウェルの１×細胞培養溶解試薬を添加し、細胞溶解物をＵ底９６ウェルプレートに移した。溶解物５μｌを３８４ウェル白色プレートに移し、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。３連の値の平均を血清希釈物に対してプロットし、非線形回帰分析を使用して、曲線フィッティングをし、ウイルス感染細胞の５０％の阻害用量を達成するのに必要な血清の逆数希釈を計算した（プリズムＶ７）。
【０２７１】
結果（図２１）は、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された８／８の動物が、Ｇ１ａ  ＨＣＶｐによる感染を予防することができる抗体を生じたことを示す。対照的に、単量体抗原を投与された群の７／８の動物のみが中和抗体を生じた。Δ１２３Ａ７を投与された群の平均及び幾何平均抗体価は、単量体抗原を使用して達成されたものよりも高く、アセンブリの方法により抗原のサイズを増加させると、免疫原性が改善されることが示唆された（表２２）。アセンブリを通じて達成された抗体中和価は、天然ＨＭＷ形態の抗原を使用して達成されたものと同様の範囲にあり（表２２）、本方法がＨＣＶの相同株に対して有効な中和抗体を生成する少なくとも同等の能力を有する抗原を産生し、且つ単量体抗原を超えて改善したことが示唆された。
【０２７２】
実施例２４：免疫血清がＥ２に対するヒトモノクローナル抗体の結合を阻害する能力
モルモットで生じた抗体が既知のヒト広域中和抗体のものと類似のエピトープを認識するかどうかに関して抗体応答の特異性をさらに調べるために、競合的酵素免疫アッセイを実施した。
【０２７３】
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダーの指示の下でＩｇＧ１を発現させるために、ＶＨ及びＶＬ領域（Ｇｅｎｅａｒｔ）の合成ならびにそれぞれｐｃＤＮＡ３−ｔＰＡ−ＬＣ及びｐｃＤＮＡ３−ｔＰＡ−ＨＣへのクローニングにより、ヒト抗体ＨＣＶ−１（Ｂｒｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＨＣ８４−２７（Ｋｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＡＲ３Ｃ（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、及び２Ａ１２（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を生成させた。重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを、ＩｇＧ産生のためにＦＳ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。
【０２７４】
一定量のＭＡｂ及び各モルモット血清の半対数段階希釈物をブロックされたウェルに同時に加え、プレート結合単量体Δ１２３に添加する前に室温で２時間インキュベートした。残留ＭＡｂ結合を抗ヒトＦａｂ２で検出した。曲線を、非線形回帰によりフィットし、各血清試料についてＩＤ５０を決定するために使用した。血清試料が試験した最高濃度（１：１０希釈、ｌｏｇ１０１）でＩＤ５０を達成できなかった場合、ｌｏｇ１００．５の値をその血清に割り当てた。
【０２７５】
結果は、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物が、４１２〜４２３領域を認識する抗体ＨＣＶ１のエピトープ（エピトープＩ）と重複する抗体のより高い平均及び幾何平均力価を有することを示す（表２３及び図２２Ａ）。ＨＣＶ１抗体は、チンパンジーのＨＣＶを予防及び処置することが示されている（Ｍｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、力価は天然ＨＭＷΔ１２３を使用して達成されたものと同様であり、本方法が同等の抗原を産生することが示される。Δ１２３を投与された動物における抗体価は、単量体ワクチン接種群におけるものよりも統計的に高かった（図２２Ａ）。
【０２７６】
結果は、単量体ワクチン接種者または天然ＨＭＷワクチン接種者と比較して、アセンブルしたΔ１２３でワクチン接種された動物は、Ｅ２の４３０〜４４６領域を認識し、且つ細胞受容体ＣＤ８１と接触している領域の一部を含む抗体ＨＣ８４−２７のエピトープと重複する抗体の、より高い平均及び幾何平均力価を有したことを示す（表２４及び図２２Ｂ）。この抗体特異性は、広域中和であり、ＨＣＶエスケープ変異体の生成を妨げる（Ｋｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。このデータは、アセンブリ方法が、ＨＣ８４．２７により認識されるエピトープと重複する抗体の生成に関して改善された抗原を生成することを示す。Δ１２３を投与された動物における抗体価は、単量体ワクチン接種群におけるものよりも統計的に高かった（図２２Ｂ）。
【０２７７】
結果は、単量体ワクチン接種者と比較して、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物が、抗体ＡＲ３Ｃのエピトープと重複する抗体の、より高い平均及び幾何平均力価を有したことを示す（表２５及び図２２Ｃ）。Δ１２３の場合、平均及び幾何平均力価は、同等の天然ＨＭＷ抗原で生成されたものよりも高かった（表２５）。
【０２７８】
結果は、単量体ワクチンと比較して、アセンブルしたΔ１２３及びΔ１２３Ａ７でワクチン接種された動物は、非中和抗体２Ａ１２の結合を妨げることができる抗体の、より低い平均及び幾何平均力価を有したことを示す（表２６及び図２２Ｄ）。データは、単量体Δ１２３及びΔ１２３Ａ７のアセンブリが、ＨＣＶの中和（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）及び中和抗体の生成（Ｖｉｅｔｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）を妨げることが示されている非中和エピトープを閉じ込めることを示唆する。
【０２７９】
実施例２５：Ｅ２特異的Ｂ細胞を検出するアセンブルしたタンパク質の使用
アセンブルしたＨＣＶタンパク質が、抗原に特異的な抗体を有する免疫細胞を同定するために使用することができるかを決定するために、慢性感染者から単離されたＰＢＭＣを使用して、以下のものを実施した。
凍結ＰＢＭＣからのＢ細胞の濃縮
試薬
【表１】
2020500837.tif 000002
【０２８０】
ＨＣＶ感染個体由来のＰＢＭＣを室温で解凍した。Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｋｉｔ（＃１３０−０９０−１０１  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、死細胞を除去した。総細胞１０７当たり、２０×結合緩衝ストック溶液０．２５ｍｌを４．７５ｍｌの滅菌水で希釈する。総細胞１０７当たり、１００ｕｌのＤｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートした。死細胞をＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒで除去した。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）：５０ｍｌの冷ＰＢＳ＋０．２５ｇのＢＳＡ、及び０．２ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ中に再懸濁させた。全細胞１０７当たり、ＭＡＣＳ緩衝液４０ｕｌ及び全細胞１０７当たりビオチン抗体カクテル１０ｕｌを添加し、冷却装置中で１０分間インキュベートした。総細胞１０７当たり、ＭＡＣＳ緩衝液３０ｕｌを添加する。２０ｕｌの抗ビオチンマイクロビーズを冷却装置中で２０分間添加した。５００ｕｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＭＡＣＳ  ＳｅｐａｒａｔｏｒのＭＳカラムで非Ｂ細胞集団を除去する。細胞は、以下の通りのＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  Ｓｏｒｔのための染色細胞であった。
【表２】
2020500837.tif 000003
【０２８１】
ＦＡＣＳ緩衝液中の１００ｕｌのＣＤ１９  ＰＥ−Ｃｙ７抗体（１：５０）で、細胞を標識した。よく混合し、冷却装置中で３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した後、再懸濁した細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液中の精製ＣＤ８１抗体（１：５０）１００ｕｌで４℃で３０分間染色した。２回洗浄した後、再懸濁した細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液１００ｕｌ中のデルタ３タンパク質２０ｕｇで４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液５００ｕｌで、３００ｇ、５分間２回洗浄した。再懸濁した細胞ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液中の１００ｕｌのＣＤ８１ＡＰＣ抗体（１：５０）及びＰｅｎｔａ−ＨＩＳ４８８（１：１００）で４℃で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液５００ｕｌで、３００ｇ、５分間２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液２００ｕｌで再懸濁させ、直ちに、ＦＡＣＳ  Ｓｏｒｔに進む。
【表３】
2020500837.tif 000004
【０２８２】
結果（図２３）は、Ｃ末端ｈｉｓタグの複数コピーを含有するアセンブルしたΔ１２３がＥ２反応性Ｂ細胞を効率的に検出することができることを示す。Ｂ細胞集団のおよそ０．５％が、Ｅ２特異的であった。これは、免疫マーカー検出のための多価タンパク質として作用するアセンブルしたタンパク質の使用を実証する。
【０２８３】
実施例２６：アセンブルしたタンパク質のサイズ
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析を使用して、アセンブルしたΔ１２３Ａ７及びアセンブルしたΔ１２３タンパク質のモル質量を決定した。
【０２８４】
試料ロード前に、Ｗｙａｔｔ  ＷＴＣ−０３０−Ｎ５  ４．６／３００カラムをＭＴ−ＰＢＳで平衡化した。流速は０．２ｍｌ／分であった。ＤＡＷＮ  Ｈｅｌｅｏｓ  ＭＡＬＳ検出器を、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＵＶダイオードアレイ検出器及びＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥｘ  ＲＩ検出器と直列にして使用した。ＢＳＡを使用して、ＭＡＬＳ検出器を正規化した。
【０２８５】
２６２〜６７５ｋＤａの範囲にわたるＭＷ種を含有するアセンブルしたΔ１２３Ａ７試料は、多分散である。重量平均モル質量は、４０９ｋＤａである。２１０〜７４４ｋＤａの範囲にわたるＭＷ種を含有するアセンブルしたΔ１２３試料は、多分散である。重量平均モル質量は、４０８．７ｋＤａである。アセンブルしたΔ１２３Ａ７試料中のＥ２プロトマーの範囲は、５〜１５であり、Δ１２３中では４〜１６であり、各場合で平均は９であった。
【０２８６】
実施例２７：タンパク質のアセンブリ
還元剤ＤＴＴを使用して達成することができるアセンブリの範囲を検討するために、複数の独立したアセンブリ実験を実施した。結果は、単量体Δ１２３Ａ７を最大８０％の効率でリフォールディングすることができるが、最大７１％のΔ１２３をＨＭＷ形態にアセンブルすることができることを示す。
【０２８７】
残存単量体種をＤＴＴで処理し、ＨＭＷ形態にアセンブルさせることができるかどうかを評価した。従前の実験からＨＭＷ形態にアセンブルしなかった単量体Δ１２３Ａ７の１ｍｇ／ｍｌの溶液を、０．６ｍＭのＤＴＴの最終濃度で３７℃で３０分間処理した。さらに３ｕｌの１００ｍＭのＤＴＴをタンパク質調製物に添加し、混合し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次に、１×ＰＢＳ（ｐＨ６．８）２５０ｕｌを添加し、室温で１５分間インキュベートし、さらに２回繰り返した。次に、タンパク質を緩衝液交換し、４ｍｌのＡｍｉｃｏｎウルトラ遠心式デバイス（３０ＫのＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、５００ｕｌの体積が達成されるまで、ｐＨ６．８の１×ＰＢＳで２回洗浄し、エッペンドルフチューブに移した。ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、処理されたタンパク質を分析した。結果は、残存単量体Δ１２３Ａ７の３０％が、ＨＭＷ形態にアセンブルすることができたことを示した（図２５）。これは、本方法を使用して、単量体ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質をＨＭＷ形態にアセンブルする能力に制限がなく、且つ実際には、最大１００％の単量体形態がアセンブルしたＨＭＷ形態に変換することができることを示唆する。
【０２８８】
実施例２８：他のタンパク質のアセンブリ
同じ方法を使用して、他の形態のＨＣＶ  Ｅ２をＨＭＷ種にアセンブルすることができるかどうかを検討した。実施例２５に記載のように、残基３８４〜６６１を含む単量体Ｈ７７ｃ  Ｅ２をＤＴＴで処理し、ＨＭＷ形態にアセンブルした。ゲル濾過クロマトグラフィーは、およそ４０％がＨＭＷ形態にアセンブルしていることを明らかにした（図２６）。Ｃ５８１、Ｃ５８５、Ｃ６５２、Ｃ６７７、Ｃ４９４、Ｃ４８６、Ｃ４５９、Ｃ４５２、Ｃ５６４、Ｃ５９７、及びＣ５６９（Ａ７）にＣｙｓ−Ａｌａ変異を含有する残基３８４〜６６１を含む単量体Ｈ７７ｃ  Ｅ２を同じ方法で処理したＲＢＤＡ７タンパク質を使用して、同じプロセスを実施した。本実施例では、およそ１０％をＨＭＷ形態にアセンブルした（図２７）。
【０２８９】
方法が他のタンパク質から高次種をアセンブルすることに広く適用可能であるかどうかを調べるために、上記方法を使用してＡＤ８配列からＣ末端膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を除去するように切断された大部分が単量体のＨＩＶエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を使用した。ＤＴＴでの処理及びアセンブリの後、ｅｎｖのＨＭＷ種の形成に対応する、ゲル濾過プロファイルのわずかなシフトが観察された（図２８）。高次オリゴマーは、広域中和抗体の結合を保持することが示されており、広域中和抗体の産生のための好ましいワクチン候補であるので、高次オリゴマー、特に、三量体の形成は、ＨＩＶにとって望ましい（ｄｅ  Ｔａｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。このデータは、方法が、単量体または低次種からの高次オリゴマーの形成が抗原産生にとって望ましい他のタンパク質に適用できることを示唆する。
【０２９０】
本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更が当業者らには明らかであろう。
【表４】
2020500837.tif 000005
【表５】
2020500837.tif 000006
【表６】
2020500837.tif 000007
【表７】
2020500837.tif 000008
【表８】
2020500837.tif 000009
【表９】
2020500837.tif 000010
【表１０】
2020500837.tif 000011
【表１１】
2020500837.tif 000012
【表１２】
2020500837.tif 000013
【表１３】
2020500837.tif 000014
【表１４】
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【表１５】
2020500837.tif 000016
【表１６】
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【表１７】
2020500837.tif 000018
【表１８】
2020500837.tif 000019
【表１９】
2020500837.tif 000020
【表２０】
2020500837.tif 000021
【表２１】
2020500837.tif 000022
【表２２】
2020500837.tif 000023
【表２３】
2020500837.tif 000024
【表２４】
2020500837.tif 000025
【表２５】
2020500837.tif 000026
【表２６】
2020500837.tif 000027
【表２７】
2020500837.tif 000028
【表２８】
2020500837.tif 000029
【表２９】
2020500837.tif 000030
【表３０】
2020500837.tif 000031
【０２９１】
参考文献
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【図１】
2020500837.tif 000032
【図２−１】
2020500837.tif 000033
【図２−２】
2020500837.tif 000034
【図３−１】
2020500837.tif 000035
【図３−２】
2020500837.tif 000036
【図４−１】
2020500837.tif 000037
【図４−２】
2020500837.tif 000038
【図５Ａ】
2020500837.tif 000039
【図５Ｂ】
2020500837.tif 000040
【図６】
2020500837.tif 000041
【図７−１】
2020500837.tif 000042
【図７−２】
2020500837.tif 000043
【図８−１】
2020500837.tif 000044
【図８−２】
2020500837.tif 000045
【図９−１】
2020500837.tif 000046
【図９−２】
2020500837.tif 000047
【図１０】
2020500837.tif 000048
【図１１】
2020500837.tif 000049
【図１２】
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【図１３】
2020500837.tif 000051
【図１４−１】
2020500837.tif 000052
【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
2020500837.tif 000060
【図１４−１０】
2020500837.tif 000061
【図１４−１１】
2020500837.tif 000062
【図１５】
2020500837.tif 000063
【図１６】
2020500837.tif 000064
【図１７】
2020500837.tif 000065
【図１８】
2020500837.tif 000066
【図１９】
2020500837.tif 000067
【図２０】
2020500837.tif 000068
【図２１】
2020500837.tif 000069
【図２２】
2020500837.tif 000070
【図２３】
2020500837.tif 000071
【図２４】
2020500837.tif 000072
【図２５】
2020500837.tif 000073
【図２６】
2020500837.tif 000074
【図２７】
2020500837.tif 000075
【図２８】
2020500837.tif 000076
【配列表】
2020500837000001.app
【国際調査報告】
2020500837.tif 000077
2020500837.tif 000078
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2020500837.tif 000082
2020500837.tif 000083
2020500837.tif 000084