(57)【要約】電気泳動カセットは、サンプルウェルと、分離ゲルを含むゲルカラムと、ゲルカラムに隣接して配置された溶出モジュールを含みうる。サンプルは電気泳動カセットに提供されてもよく、高分子量ＤＮＡはサンプルから分離されてもよい。単一コピーＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の反復領域の両側で開裂されて、開裂されたサンプルを生成し、その後ゲル電気泳動を使用して分画されうる。ＤＮＡ分画は分離ゲルの連続セクションから分離されて、また前記ＤＮＡ分画に対してＰＣＲアッセイを実施して、ＤＮＡ分画内の単一コピー配列が検出されてもよく、前記単一コピー配列は反復拡張配列を含む。対象のＤＮＡ分画は、電気泳動溶出されて複数の溶出モジュールにしうる。反復拡張配列を有するＤＮＡ分画のサイズが決定されてもよい。また、サイズが通常の反復サイズ範囲を超えているかどうかの判定もなされる。
2020515250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
電気泳動カセットを提供する工程であって、
少なくとも一つのサンプルウェルと、
分離ゲルを含む少なくとも一つのゲルカラムと、
前記少なくとも一つのゲルカラムに隣接して配置された複数の溶出モジュールとを含み、
サンプルを前記電気泳動カセット内に提供する工程と、
前記サンプルから高分子量ＤＮＡを単離する工程と、
前記ＤＮＡ配列の反復領域の両側にある単一コピーＤＮＡ配列を開裂して、開裂されたサンプルを生成する工程と、
ゲル電気泳動を使用して、開裂されたサンプルを分画する工程と、
前記分離ゲルの連続したセクションからＤＮＡ分画を分離する工程と、
前記ＤＮＡ分画に対してＰＣＲアッセイを実施して、前記ＤＮＡ分画内の単一コピー配列を検出する工程であって、前記単一コピー配列が、反復拡張配列を含む工程と、
前記対象のＤＮＡ分画を電気泳動溶出して、複数の溶出モジュールにする工程と、
前記反復拡張配列を有するＤＮＡ分画のサイズを決定する工程と、
反復拡張配列を有するＤＮＡ分画のサイズが、通常の反復サイズ範囲より大きいかどうかを判定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記開裂が制限酵素によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限酵素がＤＮＡの反復含有断片内で切断されないように構成されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記開裂がカスタマイズ可能なＲＮＡまたはＤＮＡ依存性開裂を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性開裂が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、およびＮｇＡｇｏのうち一つ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
複数の溶出モジュール内に電気泳動溶出された対象のＤＮＡ分画が電気泳動緩衝液内に配置されるように、複数の溶出モジュール内に液体電気泳動緩衝液を提供する工程と、
前記ＤＮＡ分画を伴う前記電気泳動緩衝液をＰＣＲ反応に加える工程と、
前記反復拡張配列内の単一コピー配列標的について前記ＰＣＲ反応させたＤＮＡ分画を評価する工程とをさらに含む、方法。
【請求項７】
前記電気泳動の条件を変更することが、前記ＤＮＡ分画の可動性を変化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記電気泳動条件が、ゲル濃度、電圧、電圧波形、緩衝液組成、および実行時間のうちの一つ以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
電気泳動条件が変化されて、ＤＮＡ断片が所定の長さにわたり少なくとも一つのゲルカラムの中まで電気泳動するのを遅くする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
システムであって、
サンプルから高分子量ＤＮＡを分離するための電気泳動カセットであって、前記電気泳動カセットが、
少なくとも一つのサンプルウェルと、
分離ゲルを含む少なくとも一つのゲルカラムと、
前記少なくとも一つのゲルカラムに隣接して配置された複数の溶出モジュールとを含むものと、
前記ＤＮＡの反復領域の両側にある単一コピーＤＮＡ配列を開裂して、開裂されたサンプルを生成する開裂剤と、
前記ＤＮＡ分画内の単一コピー配列を検出するよう構成されたＰＣＲアッセイとを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月７日に出願された「統合型電気泳動ＤＮＡ精製を使用する遺伝子構造変異のシステムおよび方法」と題される米国仮特許出願第６２／４８３，２６１号の優先権および利益を主張する。本出願は、上記参照の出願の開示を参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多くの遺伝性疾患は、単純なＤＮＡ配列反復を含む染色体領域の長さの拡張に起因する。例えば、精神遅滞症候群（脆弱Ｘ）は、遺伝子ＦＭＲ１の５’端付近での（ＣＧＧ）ｎ配列の拡張によって引き起こされ、この拡張は最も影響しなかった個体での５０  ＣＧＧコピー未満から、最も影響のあった個体での２００コピー超までであった（Ｎｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。同様に、ＡＬＳに関連して最もよく突然変異を起こす遺伝子Ｃ９ｏｒｆ７２において、第一のイントロン内での８未満の反復から３００以上の反復での、（Ｇ４Ｃ２）ｎ反復の拡張が病状に関連している（Ｓｕｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。少なくとも２２の遺伝性神経疾患が、このような反復拡張突然変異によって引き起こされる（Ｌａ  Ｓｐａｄａ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，  ２０１０）。
【０００３】
こうした反復拡張突然変異の検出および分析は、幾つかの要因によって複雑でありうる。まず、長さが２〜１０  ｂｐの単純配列反復を含む領域のＰＣＲ増幅は、エラーが発生しやすく、反復単位の数が異なるアンプリコン生成物の系統群を通常生成する。多くの反復拡張はまた、極めてＧＣが豊富で、ＰＣＲアッセイの開発をさらに困難にしている。特定のゲノム座位を慎重に最適化することで、有用な診断アッセイを得ることができるように、これらの問題を最小化することができるが、このようなアッセイの最適化は、大変な労力と時間を要し、一つの反復拡張タイプの条件を他のアッセイに移すことができないことがよくある。
【０００４】
ＰＣＲアッセイに関する別の難題は、一部の反復拡張のサイズが２０ｋｂを超えることができ（Ｎｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、これは一般的には５〜１０ｋｂ程度であるＰＣＲアッセイの典型的なサイズ範囲を超える。つまり、非常に大きい拡張を伴う対立遺伝子が、ＰＣＲアッセイで検出されない可能性があることを意味する。
【０００５】
これらの複雑さを避けるために、サザンブロット分析がまだ多くの場合に使用され、特に反復拡張のサイズが数ｋｂになりうる場合に使用される。ところが、サザンブロットの日常的な使用は大変な労力と時間を要し、結果が出るまでの時間は、ブロット分析時間を含め２〜４日となりうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
様々な装置、システム、および方法が本明細書で説明されている。一部の実施形態において、電気泳動カセットが提供されうる。電気泳動カセットは、少なくとも一つのサンプルウェルと、分離ゲルを含む少なくとも一つのゲルカラムと、その少なくとも一つのゲルカラムの隣に配置された複数の溶出モジュールとを含みうる。サンプルは電気泳動カセット内に提供されてもよい。高分子量ＤＮＡは、同一のものから単離することができ、また単一コピーＤＮＡ配列はＤＮＡの反復領域の両側で開裂されることができ、それによって、開裂されたサンプルを生成できる。開裂されたサンプルは、ゲル電気泳動を使用して分画されてもよく、ＤＮＡ分画は分離ゲルの連続したセクションから分離されてもよい。ＤＮＡ分画は、ＤＮＡ分画内の単一コピー配列を検出するためのＰＣＲアッセイを受けてもよく、前記反復拡張配列は反復拡張配列を含み、また対象のＤＮＡ分画は複数の溶出モジュールへと電気泳動溶出されてもよい。反復拡張配列を有するＤＮＡ分画のサイズが決定されてもよい。反復拡張配列を有するＤＮＡ分画のサイズが、通常の反復サイズ範囲より大きいかどうかを判定することができる。
【０００７】
開裂は制限酵素によって実施されてもよく、これらの酵素はＤＮＡの反復含有断片内で切断しないように構成されてもよい。別の方法として、および／または追加的に、開裂は、カスタマイズ可能なＲＮＡまたはＤＮＡ依存性開裂によって実施されてもよく、これはＣａｓ９、Ｃｐｆ１、およびＮｇＡｇｏを含みうる。
【０００８】
一部の実施形態において、ＰＣＲアッセイを受けたＤＮＡ分画が、複数の溶出モジュールへと電気泳動溶出されて、電気泳動緩衝液内に配置されるように、液体電気泳動緩衝液が電気泳動カセットの複数の溶出モジュール内に提供されてもよい。ＤＮＡ分画を有する電気泳動緩衝液をＰＣＲ反応に加えることができ、これは反復拡張配列内の単一コピー配列標的のために評価されてもよい。
【０００９】
ゲル濃度、電圧、電圧波形、緩衝液組成、および実行時間などの電気泳動の条件を変更することは、ＤＮＡ分画の可動性を変更しうる。条件は変更されて、ＤＮＡ断片が所定の長さにわたり少なくとも一つのゲルカラムの中まで電気泳動するのを遅くしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、一部の実施形態による、配列反復領域の拡張を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、一部の実施形態による、配列の挿入を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、一部の実施形態による、配列の逆位を示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、一部の実施形態による、未拡張反復および単一コピーフランキング配列の長さを示す。図２Ｃは、一部の実施形態による、拡張反復および単一コピーフランキング配列の長さを示す。
【図３】図３は、一部の実施形態による、例示的なフロー図を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、一部の実施形態による、単一コピーｑＰＣＲ検出アンプリコンの場所を示す。
【図５】図５Ａは、一部の実施形態による、ＤＮＡサイズ分離とその後の電気泳動溶出のためのＳａｇｅＥＬＦカセットを示す。図５Ｂは、一部の実施形態による、分離電気泳動から分画／電気泳動溶出までの例示的なＳａｇｅＥＬＦワークフローを示す。
【図６】図６は、一部の実施形態による、例示的なＳａｇｅＨＬＳカセットを示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、様々な実施形態による、例示的なワークフローを示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、様々な実施形態による、例示的なワークフローを示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、様々な実施形態による、例示的なワークフローを示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、様々な実施形態による、例示的なワークフローを示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、一部の実施形態による、ＳａｇｅＨＬＳカセット上の電気泳動条件を示す。
【図１２】図１２は、一部の実施形態による、例示的な概略図を示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、一部の実施形態による、実施例１で達成された結果のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
幅広いサイズの柔軟性のサザンブロットアッセイをＰＣＲによる検出と組み合わせた反復拡張突然変異を特徴付けるための手順が本明細書に開示されている。多くのアッセイ用途では、ワークフローは１日未満で完了できる。
【００１２】
図１Ａは、単一コピー配列Ａ  １１０と、単純配列反復１１５を含む染色体領域と、単一コピー配列Ｂ  １２０とを有する、拡張１０５前のゲノムＤＮＡを示す。拡張１０５前のゲノムＤＮＡは長さ１２５を有する。単純配列反復１１５を含む染色体領域が拡張すると、結果として病状が生じうる１３０。拡張した単純配列反復領域１３０は、一方の側で単一コピー配列Ａ  １１０’によって囲まれ、他方の側で単一コピー配列Ｂ  １２０’によって囲まれる。拡張Ａ−Ｂ断片１２５’の長さは、Ａ−Ｂ断片１２５の長さよりも長い。
【００１３】
図で示されている通り、「＞」は単純配列反復単位であることを示す。例えば、これはＡＬＳ遺伝子Ｃ９ｏｒｆ７２内のＧ４Ｃ２であってもよい。Ｃ９ｏｒｆ７２において、疾患表現型と関連付けられたＧ４Ｃ２の反復数の閾値は、３０〜７０の範囲内であると推定されるが、影響を受ける多くの個体は、数十キロベース（数千の反復単位）程度の反復拡張を有することができる。
【００１４】
図１Ｂは、一部の実施形態による、配列の挿入を示す。ここで、挿入１３５前のゲノムＤＮＡは、単一コピー配列Ａ  １４０と、挿入イベント１４５の染色体標的部位と、単一コピー配列Ｂ  １５０とを有する。Ａ−Ｂ断片は長さ１５５を有する。次に、配列が標的部位１６０に挿入される。挿入後、単一コピー配列Ａ  １４０’は、挿入された配列１６０の一方の側にあり、単一コピー配列Ｂ  １５０’は他方の側にある。挿入後のＡ−Ｂ断片１５５’の結果的な長さは、Ａ−Ｂ断片１５５の長さより長い。
【００１５】
図１Ｃは、一部の実施形態による、配列の逆位を示す。図示されている通り、ゲノムＤＮＡ  １６５は、単一コピー配列Ａ  １７０および単一コピー配列Ｂ  １７５を有する。単一コピー配列Ａ  １７０は、逆位切断点１８０の左端と逆位切断点１８５の右端との間に構成されうる。単一コピー配列Ｂ  １７５は、逆位切断点１８０、１８５の外側に構成されうる。Ａ−Ｂ断片は長さ１９０を有しうる。逆位切断点１８０の左端と逆位切断点１８５の右端との間のセクションは、反転１９５しうる。結果として得られるゲノムＤＮＡ１６５’は、反転後のＡ−Ｂ断片の長さ１９０’がＡ−Ｂ断片の長さ１９０とは異なるように、単一コピー配列Ａ  １７０’および単一コピー配列Ｂ  １７５’を有しうる。一部の実施形態（例えば図１Ｃに示されたもの）において、反転後のＡ−Ｂ断片の長さ１９０’は、反転前のＡ−Ｂ断片の長さ１９０より長くてもよい。一部の実施形態において、反転後のＡ−Ｂ断片の長さ１９０’は、反転前のＡ−Ｂ断片の長さ１９０より短くてもよい。
【００１６】
図２Ａは、開裂前の特異的開裂部位Ａ  ２０５および特異的開裂部位Ｂ  ２１０を有するゲノムＤＮＡ  ２００を示す。反復２１５を含む染色体領域は、開裂部位Ａ  ２０５と開裂部位Ｂ  ２１０の間に構成される。未拡張反復および単一コピーフランキング配列の長さ２２０が示されている。図２Ｂにおいて、ゲノムＤＮＡ  ２００は、開裂されたセクションが長さ２２０を有するように、開裂部位Ａ  ２０５および開裂部位Ｂ  ２１０で開裂されている。図２Ｃは、特異的開裂部位Ａ  ２０５’および特異的開裂部位Ｂ  ２１０’を拡張反復領域２２５とともに示す。拡張反復および単一コピーフランキング配列は、長さ２２０’を有する。
【００１７】
例示的な実施形態を図３に示す。サンプル３０５が提供されてもよく、ＨＭＷ  ＤＮＡはサンプル３１０から分離されてもよい。特異的開裂は、ＨＭＷ  ＤＮＡ  ３１５の反復領域の両側の単一コピー配列で実施されうる。開裂されたサンプルは分画されてもよい。一部の実施形態において、開裂されたサンプルは、ゲル電気泳動を使用して分画される。電気泳動サイズ選択は、未拡張反復を有するゲノム断片を、拡張反復３２０を有する断片から効率的に分解する条件を使用して実施されうる。ＤＮＡは、分離ゲルおよび／またはゲルレーン３２５の逐次／連続セクションから分離されてもよい。ＤＮＡ分画はＰＣＲ  ３３０を受けてもよい。ＰＣＲは、反復配列をフランキングする、切除された反復領域内の単一コピー配列中のアンプリコンに対するアッセイであってもよい。溶出分画内の位置からの反復拡張領域についてプラスのスコアの溶出分画内のＤＮＡサイズが決定３３５されてもよく、また通常の反復サイズ範囲３４０よりも大きいゲノム断片内で任意のアンプリコンが検出されるかどうかが判定されてもよい。
【００１８】
一部の実施形態において、アッセイの基礎は、反復拡張領域の両側で一意の単一コピーＤＮＡ配列を開裂することによって生成されるＤＮＡ断片の長さを測定することである（図１Ａ、図２Ａ〜図２Ｂ）。未拡張反復に由来する断片は、拡張反復に由来する断片よりも短くなる。開裂されたサンプルは、ゲル電気泳動によって分画されるサイズであり、ＤＮＡは分離ゲルの連続セクションから分離され、これはサンプルＤＮＡによって占められたすべてのゲル領域を含む。精製されたＤＮＡ分画は、反復拡張配列を含む特異的に放出された断片内の単一コピー配列を検出するように設計された、ＰＣＲアッセイを受ける（図４Ａ〜４Ｃ）。
【００１９】
図４Ａに図示されている通り、ゲノムＤＮＡ  ４００は、特異的開裂部位Ａ  ４０５および特異的開裂部位Ｂ  ４１０とともに示されている。反復１４０を含む染色体領域は、特異的開裂部位Ａ  ４０５と特異的開裂部位Ｂ  ４１０の間に構成される。図４Ｂは、特異的開裂部位Ａ  ４０５および特異的開裂部位Ｂ  ４１０での開裂を示す。特異的開裂部位Ａ  ４０５と反復４１５を含む染色体領域との間は、単一コピーｑＰＣＲ検出アンプリコン４２０の場所である。図４Ｃは、特異的開裂部位Ａ  ４０５’と特異的開裂部位Ｂ  ４１０’の間の拡張反復領域４２５を示す。単一コピーｑＰＣＲ検出アンプリコン４２０’の場所を示す。
【００２０】
開示全体を通して考察される開裂（フランキング単一コピー配列を含む）図２Ａ〜２Ｃ））は、反復含有断片内の他の場所で切断されないように、制限酵素によって達成することができる。これらの開裂はまた、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＮｇＡｇｏなどのカスタマイズ可能なＲＮＡまたはＤＮＡ依存性開裂を用いて達成することができる。
【００２１】
一部の実施形態において、消化されたゲノムＤＮＡ断片はサイズ分離されて、電気泳動カセットで電気泳動溶出され、これは図５Ａ、図５Ｂに図示されていて、米国特許第９，５９９，５９０号（参照により本明細書に組み込まれる）または図６に記載されていて、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５８３３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。サイズ分画の後、分離ゲルのＤＮＡ含有量全体は、分離ゲルカラムの一方の側に配置された連続的な一連の溶出モジュール内に側方に電気泳動溶出される。分画されたＤＮＡは、溶出モジュール内の液体電気泳動緩衝液に電気泳動溶出され、ＰＣＲ反応に直接加えることができ、切除された反復拡張断片内の単一コピー配列標的について評価されうる。各溶出部分内のＤＮＡのサイズは、電気泳動条件（例えば、ゲルパーセント値、緩衝液、実行時間、電圧など）によって決定されるため、溶出分画内の正のＰＣＲ信号の場所は、検出された反復領域対立遺伝子のサイズに直接関連しうる。
【００２２】
一部の実施形態において、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５８３３号に記載されている装置、方法、およびシステムが、すべての予備ＰＣＲ工程を達成するために採用される。模範的ワークフローを図７Ａ〜１０Ｂに示す。ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５８３３に記載されている通り、高分子量ゲノムＤＮＡは、最小限のユーザー介入で、統合された一つのワークフローで抽出され、消化されうる。検出可能な反復拡張断片を生成するための特異的開裂は、従来のＤＮＡ制限酵素など（図７Ａ〜７Ｅおよび図８Ａ〜８Ｂ）のＤＮＡ制限酵素によって、または化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（図９Ａ〜９Ｅおよび図１０Ａ〜１０Ｂ）などのＲＮＡ依存性開裂によって達成することができる。解離した組織サンプルから得られた精製された白血球、未分画の全血、および細胞懸濁液（または核）などの入力材料を使用することができる。
【００２３】
図１Ｂおよび図１Ｃに図示されている通り、本明細書に開示されたシステムおよび方法はまた、挿入および逆位の再配列の検出にも有用である。両方の場合において、再配列は、再配列の一つの切断点（すなわち、挿入点図１Ｂ、または逆位の一つの切断点図１Ｃ）に隣接する一意の開裂部位間の距離を変化させる。
【００２４】
導入で説明されている通り、一部の反復拡張による疾患において、拡張はかなり長く、かつ非常に可変でありうる。この問題に対処するために、電気泳動の条件（例えば、ゲル濃度、電圧、電圧波形、緩衝液組成物、実行時間）は、特定の長さよりも大きいすべてのＤＮＡ分子が、制限的な低可動性の分画として一緒に移動するように、調整されうる。これは、長さ（すなわち、リン酸バックボーンからの電荷の増加）によって生じる電気泳動可動性の増加が、より大きい分子の抗力の増加によって生じる電気泳動可動性の減少によって打ち消される時に発生する。この制限的低可動性点での分子のサイズは、ゲルパーセント値、電圧、および緩衝液組成の複合的な関数である。しかしながら、所定の緩衝液およびゲル濃度については、ＤＮＡについての制限的低可動性は、１０００  ｂｐから数万ｂｐまでの範囲のアガロースゲル内で調節されうる。図１１Ａ〜１１Ｂは、１０，０００  ｂｐで始まる低可動性バンドが溶出モジュール番号２で溶出されることができる、ＳａｇｅＨＬＳカセット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５８３３号に記載）上での電気泳動の条件を示す。
【００２５】
一部の実施形態において、特異的反復拡張座位についての電気泳動の条件は、未拡張反復断片がゲルカラムの底部近くで溶出され、中程度の拡張反復断片が溶出分画の中間範囲にある未拡張分画の上の分画で分解され、非常に大きい拡張を有する断片がゲルカラムの上部の近くの制限的な低可動性圧縮バンドで溶出するように、調整されてもよい（図８Ａ〜８Ｂおよび図１０Ａ〜１０Ｂ）。
【００２６】
実施例１．  特異的染色体座位について、統合された抽出、Ｃａｓ９消化、電気泳動溶出、およびｑＰＣＲアッセイのためのＳａｇｅＨＬＳワークフローの実証
【００２７】
本実施例は、入力細胞サンプルから高分子量ゲノムＤＮＡを精製し、Ｃａｓ９開裂を使用して特異的１９８  ｋｂゲノムＤＮＡ断片をＢＲＣＡ１座位から選択的に切除し、最終的に、ＢＲＣＡ１を含有する断片を一つの統合ワークフローでサイズ選択し、溶出するための、ＳａｇｅＨＬＳの使用を図示したものである。次に、ＨＬＳ溶出分画は、ＢＲＣＡ１断片について、ｐＰＣＲによって評価された。
【００２８】
緩衝液定義：
電気泳動緩衝液、０．５×ＫＢＢ（５１  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（塩基）、２９  ｍＭ  ＴＡＰＳ（酸）、０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡ（酸）、ｐＨ  ８．７）としても知られる
ＦＳＥ緩衝液：１５％  ｗ／ｖ  フィコール４００、０．２５×ＫＢＢ緩衝液、８０  ｍｇ／ｍＬ  スクロース、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＥＲＢ緩衝液：０．５×ＫＢＢに３２  ｍｇ／ｍｌ  のベータシクロデキストリンを加えたもの、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０  μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
ＨＬＳ溶解緩衝液：１×ＫＢＢ、２％グリセロール、３％  ＳＤＳ、２．５  μｇ／ｍｌ  ブロモフェノールブルー、２．５  μｇ／ｍｌフェノール赤
【００２９】
ヒト培養細胞（Ｒａｊｉ細胞株）を、低速遠心分離によって数回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁した。最終洗浄後、細胞を７０マイクロリットル当たり細胞数１．５Ｘ１０６個の濃度でＦＳＥ緩衝液中に再懸濁した。ＦＳＥ中に再懸濁した細胞の７０マイクロリットルサンプル二つを、ＳａｇｅＨＬＳカセットの二つのサンプルウェルの各々に装填した（０．７５％アガロース）。両レーンの試薬ウェルを空にし、ＨＬＳ溶解緩衝液（約２３０マイクロリットル）で再充填し、３０°Ｃ、５５  Ｖで１時間、電気泳動を行った。
【００３０】
精製電気泳動後、サンプルウェルおよび試薬ウェルを空にした。試薬ウェルをＥＲＢ緩衝液（酵素なし）で再充填した。二つのレーンの一つではサンプルウェルを、二部分から成る５つのガイドＲＮＡ（それぞれ５マイクロモルの濃度）の等モル混合物と組み合わせられた１マイクロモル重量のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む８０  ｕｌのＥＲＢで再充填した。他のレーンでは、酵素を含まないＥＲＢを模擬消化対照としてサンプルウェルに装填した。ＨＬＳ機器のサンプルウェルヒーターを３７°Ｃに調整し、およびＣａｓ９混合物を５５Ｖで１分間、電気泳動してゲルにした。１分間の電気泳動後、サンプルウェルを空にし、酵素なしのＥＲＢ緩衝液で再充填した。カセットを電気泳動することなく、サンプルウェルを３７°Ｃにして、３０分間培養し、精製されたＤＮＡのＣａｓ９消化を可能にした。
【００３１】
消化後、試薬ウェルを空にし、ＨＬＳ溶解緩衝液で再充填し、２００  ｋｂ  ＢＲＣＡ１消化生成物を溶出モジュール３（ＨＬＳ−ＣＡＴＣＨ  １００−４００  ｋｂ用のステージ３プログラム、ＳａｇｅＨＬＳユーザーマニュアル、Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．）に移動するよう設計された、４時間にわたるパルスフィールドプログラムを使用して、サイズ分離電気泳動を実施した。サイズ分離後、電気泳動溶出を連続的な磁場電圧５０Ｖで１．５時間実施した。
【００３２】
二つの部分から成るガイドＲＮＡは、ＩＤＴ（ＡＬＴ−Ｒ（商標）ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃＲＮＡ）から注文された。ｇＲＮＡは、５’側および３’側に十分なフランキング配列を有するＢＲＣＡ１座位全体を含む１９８ｋｂ断片を切り取るために選択された（図１２を参照）。次の三つのｃｒＲＮＡが、遺伝子の右側について設計された：ＢＲＣＡ１Ｇｒ６７：ＧＣＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＡ；ＢＲＣＡ１Ｇｒ６８：ＣＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＡＴ；およびＢＲＣＡ１Ｇｒ６９：ＡＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＧＧ。次の二つのｃｒＲＮＡが、遺伝子の左側について設計された：ＢＲＣＡ１ｇＬＬ１：ＣＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡ；およびＢＲＣＡ１ｇＬＬ３：ＧＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣ（図１２）。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃＲＮＡ（ＩＤＴ）をＩＤＴ重複緩衝液中に溶解し、５０マイクロモルのｔｒａｃＲＮＡおよびそれぞれ１０マイクロモルの五つのｃｒＲＮＡ（合計５０マクロモルのｃｒＲＮＡ）を含む混合物を、９５°Ｃで５分間培養し、作業台上でラボの環境温度で１５分間冷却することによってアニールした。ＥＲＢ緩衝液（上記参照）中に最終反応混合物を組み合わせることによって、アニールしたｇＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を組み合わせて、その混合物をＨＬＳカセットに加える前に３７°Ｃで１０分間培養した。
【００３３】
溶出後、溶出された生成物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０で１：１０に希釈し、ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ遺伝子を非標的ＤＮＡの参照座位として使用して、ＢＲＣＡ１遺伝子ＤＮＡ用Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲによって評価した。（ＡＢＩ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ部品番号：＃４４００２９１  −  ＢＲＣＡ１コピー数アッセイ（Ｈｓ００３００６６６−ｃｎアンプリコン、小）；  ＃４４０３３２６  −  ＲＮａｓｅＰコピー番号参照アッセイ；  ＃４３７１３５５  −  Ｔａｑｍａｎ  ＧＴマスターミックス；  ｑＰＣＲ計器；  ＡＢＩ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３）。図１３Ａ〜１３Ｂの結果は、１．５ｘ１０６コピーのＢＲＣＡ１断片がＣａｓ９消化カセットレーンの分画３で回収されたが、疑似消化カセットレーンでは背景信号のみが見られたことを示す。
【００３４】
実施例２．  高分子構造バリアントの検出に有用なゲル圧縮の実証。
【００３５】
ＤＮＡマーカー（１ｋｂ伸長マーカー、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のサンプルを、ＳａｇｅＨＬＳカセットの二つのレーンのサンプルウェルに装填した。ＤＮＡを分離し、以下の電気泳動条件を用いて電気泳動溶出した：０．７５％アガロース、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２９  ｍＭ  ＴＡＰＳ、０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．７、５５  Ｖ連続場（ＤＣ）、５０分、ゲル温度３０°Ｃ。すべての溶出ウェルからの電気泳動溶出分画を、分析用アガローススラブゲルで分析した（図１１Ａ〜１１Ｂ）。ＨＬＳ分離実行における電気泳動可動性圧縮の証拠は、分画＃２で見られる（すなわち、断片１０〜４８．５  ｋｂが共遊走し、分画＃２で一緒に見いだされ、また分画＃１ではＤＮＡが見いだされない）。従って、圧縮現象のため、これらの条件下で、１０ｋｂを超えるすべてのＤＮＡが分画＃２で見いだされる。分画＃５および＃６は、１〜２  ｋｂの範囲の断片を含む。
【００３６】
参考資料
Ｌａ  Ｓｐａｄａ  Ａ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｕｚｚｌｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２４７−２５８．  
Ｎｏｌｉｎ  Ｓ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒａｇｉｌｅ  Ｘ  ＣＧＧ  Ｒｅｐｅａｔ  ｉｎ  Ｆｅｍａｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ａｌｌｅｌｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７２：４５４−４６４，  ２００３．  
６〜５０  影響を受けなかった    １８〜１５０  ｂｐ
６０〜２００「前突然変異」    １８０〜６００  ｂｐ
全突然変異  ＞２００    ＞６００  ｂｐ
Ｓｕｈ，  Ｅ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ９ｏｒｆ７２  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｉｚｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １３０（３）：  ３６３−３７２，  ２０１５．  
影響を受けなかった  ２〜８（１２〜４８  ｂｐ）  影響を受けた  ３００〜３８００（１８００〜２２８００  ｂｐ）
【００３７】
本出願に提示された特許、特許出願、論説、ウェブページ、書籍などを含むがこれに限定されない刊行物またはその他の文書へのすべての参照は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３８】
装置、システムおよび方法の例示的な実施形態を本明細書で説明してきた。他の箇所で注記した通り、これらの実施形態は例示目的のみで説明してきたものであり、限定するものではない。その他の実施形態が可能であり、本開示の範囲に含まれ、これは本明細書に含まれている教示から明らかとなる。それ故に、本開示の幅および範囲は、上述の実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、本開示およびその等価物によって裏付けられた特許請求の範囲に従ってのみ定義されるべきである。さらに、本主題の開示の実施形態は、任意の他の開示された方法、システム、および装置からの任意およびすべての要素（分子処理に対応する任意およびすべての要素を含む）をさらに含みうる方法、システムおよび装置を含みうる。言い換えれば、開示された一つまたは別の実施形態からの要素は、開示された他の実施形態からの要素と代替可能でありうる。さらに、開示された実施形態の一つ以上の特徴／要素は除外されることができ、それでも依然として特許性のある主題をもたらしうる（それ故に、本主題の開示のさらなる実施形態をもたらす）。それに応じて、本開示の一部の実施形態は、先行技術で開示されたシステム、装置および／または方法の一つ以上の要素／特徴を具体的に欠くことによって、一つおよび／または別の参照／そのような先行技術と特許的に異なる場合がある。言い換えれば、特定の実施形態に対する特許請求の範囲は、特徴／要素を含む先行技術と特許的に異なる実施形態を実施する一つ以上のそのような要素／特徴を具体的に除外する負の制限を含みうる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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