(57)【要約】  ヒトまたは非ヒト動物の糞便試料から真核生物の核酸を単離するための材料および方法を本明細書に提供する。ヒトまたは非ヒト動物の糞便試料中に存在する真核生物バイオマーカーの分析方法も提供する。【選択図】図４
2020500551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便試料から真核生物の核酸を単離する方法であって、
ａ）懸濁物を形成するために、前記試料を緩衝液、界面活性剤、およびリボヌクレアーゼ阻害剤と混合する工程と、
ｂ）前記懸濁物を真核細胞に富む部分と細菌細胞に富む部分とに分離する工程および前記真核細胞に富む部分を保持する工程と、
ｃ）溶解物を形成するために、前記真核細胞に富む部分にカオトロピック剤および任意選択的に界面活性剤を添加する工程と、
ｄ）前記溶解物を、細胞片層、真核生物の核酸を含む層、および脂質層に分画する工程と、
ｅ）前記真核生物の核酸を含む層および任意選択的に前記脂質層を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
糞便試料を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糞便試料がヒトの糞便試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記糞便試料が非ヒト動物の糞便試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非ヒト動物が、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、反すう動物、クマ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、水牛、シカ、エルク、ムース、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、厚皮動物、サイ、およびチンチラからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ヒト動物がイヌである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト動物がネコである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記分離工程が遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分離工程がカラムベースの方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離工程が、真核細胞に結合する標的指向化プローブを利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離工程が示差的濾過を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａおよびｂが、１、２、３、４回またはそれ以上繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分画工程が遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分画工程が、真核生物の核酸に特異的に結合する標的指向化プローブを利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分画工程が示差的濾過を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｄおよびｅが２回以上繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核生物の核酸を含む層が小口径チップを使用して回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
回収された前記真核生物の核酸を含む層から前記真核生物の核酸を抽出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抽出方法が、磁性粒子ベース、カラムベース、フィルタベース、ビーズベース、または有機溶媒ベースの方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、もしくはｓｎｏＲＮＡ、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、もしくはｓｎｏＲＮＡのうちのいずれかの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
糞便試料中の真核生物バイオマーカーを検出する方法であって、請求項１に記載の抽出された核酸をマイクロアレイ配列決定、分子バーコード化、プローブ捕捉、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｄｄＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、または核酸配列決定によって分析する工程を含む、方法。
【請求項２２】
前記真核生物バイオマーカーが、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙されたバイオマーカーから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核生物バイオマーカーが、Ｂ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、または免疫グロブリンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
対象に大腸癌の危険性があるかどうかを判定する方法であって、
ａ）前記対象由来の生物学的試料中の、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかから選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記生物学的試料中の前記２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の前記２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、前記対照中の前記２つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルに対する前記生物学的試料中の前記２つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルにおける差は、前記対象に大腸癌の危険性があることを示す、工程と
を含む、方法。
【請求項２５】
前記生物学的試料が、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って単離されたヒト核酸を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図５Ａに示される２００個の示差的に発現される転写物クラスター内に含まれ、かつ図５Ｂに示される大腸癌に関連する共通経路内に含まれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙されたバイオマーカーから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
大腸癌を有するかまたはその危険性がある対象についての臨床計画を選択する方法であって、
ａ）前記対象由来の生物学的試料中の、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかから選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記生物学的試料中の前記２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の前記２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、前記対照中の前記２つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルに対する前記生物学的試料中の前記２つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルにおける差は、前記対象が大腸癌を有するかまたはその危険性があることを示す、工程と、
ｃ）工程ｂに基づいて臨床計画を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項２９】
前記生物学的試料が、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って単離されたヒト核酸を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図５Ａに示される２００個の示差的に発現される転写物クラスター内に含まれ、かつ図５Ｂに示される大腸癌に関連する共通経路内に含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙されたバイオマーカーから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
非ヒト動物に胃腸障害の危険性があるかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象由来の生物学的試料中の１つ以上のＢ細胞、Ｔ細胞、または免疫グロブリン遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記試料中の前記１つ以上のＢ細胞、Ｔ細胞、または免疫グロブリン遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の１つ以上のＢ細胞、Ｔ細胞、または免疫グロブリン遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、前記対照中の前記１つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルに対する前記生物学的試料中の前記１つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルにおける差は、前記対象に胃腸障害の危険性があることを示す、工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
前記生物学的試料が、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って単離された非ヒト動物核酸を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記胃腸障害が、胃腸リンパ腫または炎症性腸疾患を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記非ヒト動物がネコである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記非ヒト動物がイヌである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物学的試料が糞便試料を含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１３，７０８号、２０１７年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５２３，５１１号、および２０１７年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５４７，０４６号の優先権を主張し、それらの開示内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、糞便試料からの真核生物の核酸の抽出、ならびに腸疾患の診断および治療のための当該核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
胃腸障害、例えば、胃腸癌ならびに炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、およびクローン病などの他の消化器疾患が広まっている。米国では、胃腸障害は、年間６０００万人〜７０００万人が罹患していると推定されている。一部の疾患では、早期のスクリーニングおよび診断により、死亡率が低下し、患者の生活の質が向上した。しかしながら、結腸鏡検査などの標準的な診断方法は、侵襲的で、時間がかかり、かつ比較的高い費用を伴う。胃腸障害はまた、動物、例えば、ネコおよびイヌなどのペットとして飼われている動物にも影響を及ぼし得る。そのような障害についてスクリーニングする獣医学的方法も、同様に侵襲的であり、かつ費用がかかる。ヒトおよび動物の両方において胃腸障害を診断するための非侵襲的方法に対する継続的な必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
概要
糞便試料から真核生物の核酸を単離するための材料および方法を本明細書に提供する。本方法は、懸濁物を形成するために、試料を緩衝液、界面活性剤、およびリボヌクレアーゼ阻害剤と混合する工程と、懸濁物を真核細胞に富む部分と細菌細胞に富む部分とに分離する工程および、真核細胞に富む部分を保持する工程と、溶解物を形成するために、真核細胞に富む部分にカオトロピック剤および任意選択的に界面活性剤を添加する工程と、溶解物を、細胞片層、真核生物の核酸を含む層、および脂質層に分画する工程と、真核生物の核酸を含む層および任意選択的に脂質層を回収する工程と、を含み得る。糞便試料は、ヒトまたは非ヒト動物の糞便試料であり得る。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の糞便試料は、イヌまたはネコから得られた試料であり得る。本方法は、回収された真核生物の核酸を含む層から真核生物の核酸を抽出する工程をさらに含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、もしくはｓｎｏＲＮＡ、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、もしくはｓｎｏＲＮＡのうちのいずれかの組み合わせを含み得る。
【０００５】
糞便試料中の真核生物バイオマーカーを検出するための材料および方法も提供する。本方法は、抽出された核酸をマイクロアレイ配列決定、分子バーコード化、プローブ捕捉、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｄｄＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、または核酸配列決定によって分析する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、真核生物バイオマーカーは、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙されたバイオマーカーから選択される。いくつかの実施形態では、真核生物バイオマーカーは、Ｂ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、または免疫グロブリンであり得る。
【０００６】
対象に大腸癌の危険性があるかどうかを判定するための方法も提供する。本方法は、対象由来の生物学的試料中の、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかから選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程と、試料中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、対照中の２つ以上の遺伝子の測定された発現レベルに対する生物学的試料中の２つ以上の遺伝子の測定された発現レベルにおける差は、対象に大腸癌の危険性があることを示す、比較する工程と、を含み得る。いくつかの実施形態では、結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子は、図５Ａに示される２００個の示差的に発現される転写物クラスター内に含まれ得、かつ図５Ｂに示される大腸癌に関連する共通経路内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子は、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙されたバイオマーカーから選択され得る。
【０００７】
大腸癌を有するかまたはその危険性がある対象についての臨床計画のための材料および方法も提供する。本方法は、対象由来の生物学的試料中の、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかから選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程と、試料中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、対照中の２つ以上の遺伝子の測定された発現レベルに対する２つ以上の遺伝子の測定された発現レベルにおける差は、対象が大腸癌を有するかまたはその危険性があることを示す、工程と、対照中の２つ以上の遺伝子の測定された発現レベルに対する２つ以上の遺伝子の測定された発現レベルにおける差は、対象が大腸癌を有するかまたはその危険性があることを示すことに基づいて臨床計画を選択する工程と、を含み得る。
【０００８】
非ヒト動物に胃腸障害の危険性があるかどうかを判定するための方法も提供する。本方法は、対象由来の生物学的試料中の１つ以上のＢ細胞、Ｔ細胞、または免疫グロブリン遺伝子の発現レベルを測定する工程と、試料中の１つ以上のＢ細胞、Ｔ細胞、または免疫グロブリン遺伝子の測定された発現レベルを、対照中の１つ以上のＢ細胞、Ｔ細胞、または免疫グロブリン遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、対照中の１つ以上の遺伝子の測定された発現レベルに対する生物学的試料中の１つ以上の遺伝子の測定された発現レベルにおける差は、対象に胃腸障害の危険性があることを示す、工程と、を含み得る。胃腸障害は、胃腸リンパ腫または炎症性腸疾患であり得る。非ヒト動物はネコまたはイヌであり得る。生物学的試料は糞便試料であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、同様の番号が同様の部分を指す添付の図面と共に考慮されるべきである本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において、より十分に開示されるか、または明らかになるであろう。
【００１０】
【図１】電気泳動ファイル実験である。電気泳動分析を使用して、抽出されたＲＮＡの質を調べた。
【図２】電気泳動図である。電気泳動図を使用して、抽出されたＲＮＡの質を調べた。
【図３】抽出の要約である。これは、実施例２に記載される抽出方法を使用して評価された１２０個の試料についての品質チェックの要約を図示する。
【図４】図４Ａは、総ＲＮＡ抽出方法を比較した実験の結果を図示するグラフである。図４Ａは、実施例２に記載される抽出方法を使用して品質チェックに合格した試料の総数を示す。図４Ｂは、様々な抽出方法による５回の電気泳動実験を図示する。
【図５】図５Ａは、示差的に発現される転写物クラスターを示すヒートマップである。示されるように、ヒートマップは、１８７個の異なる遺伝子にマッピングされた２００個の転写物クラスターを使用して生成され、２６５個の試料が、訓練セットにおいて分析された。試料は、癌（赤）、前癌性腺腫（オレンジ）、正常（緑）の群によって順序付けされる。図５Ｂは、ＧＡＧＥ  Ｒパッケージを使用して示差的に発現されるＧＯ用語および経路を示す（ｐ＜０．０５）。各バーの高さは、各経路内の濃縮遺伝子の設定サイズを詳述しており、青い線は、各経路に対する−ｌｏｇ（ｐ値）を示す。赤い点線は、有意性を示す（ｐ＝０．０５）。
【図６】結腸直腸新生物において示差的に発現されると同定された遺伝子のリストを示す。
【図７】図７Ａは、４つの個々のネコ試料および４つの個々のイヌ試料を示す電気泳動実験を図示する。図７Ｂは、４つの個々のネコ試料および４つの個々のイヌ試料についてのＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）、ならびに８つすべての試料の平均を示す。図７Ｃは、４つの個々のネコ試料および４つの個々のイヌ試料についての電気泳動実験からの推定真核生物ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）、ならびに８つすべての試料についての平均質量を示す。
【図８】図８Ａは、イヌ試料中のリンパ球関連転写物の存在を同定するためのＩｇＭ  Ｃμ重鎖領域についてのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を図示する。図８Ｂは、イヌ試料中のＴ細胞受容体ガンマ領域の２つの組み換えについてのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を図示する。
【図９】ネコ試料中のアクチン−ＢについてのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を図示する。
【図１０】図１０Ａは、アフィメトリクスヒトトランスクリプトームアレイを使用した７０，５２４個の転写物クラスター発現レベルの４つの技術的複製物を図示する。図１０Ｂは、アフィメトリクスヒトトランスクリプトームアレイを使用した７０，５２４個の転写物クラスター発現レベルの４つの生物学的複製物を図示する。図１０Ｃは、アフィメトリクスヒトトランスクリプトームアレイを使用した７０，５２４個の転写物クラスター発現レベルを分析するために６ヶ月間隔で試験された６つの技術的複製物を図示する。
【図１１】図１１Ａは、アフィメトリクスヒトトランスクリプトームアレイを使用した５，１４９個の転写物クラスター発現レベルの４つの技術的複製物を図示する。図１１Ｂは、アフィメトリクスヒトトランスクリプトームアレイを使用した５，１４９個の転写物クラスター発現レベルの４つの生物学的複製物を図示する。図１１Ｃは、アフィメトリクスヒトトランスクリプトームアレイを使用した５，１４９個の転写物クラスター発現レベルを分析するために６ヶ月間隔で試験された６つの技術的複製物を図示する。
【図１２】図１２Ａは、文献中の抽出方法から実験された比較電気泳動図および電気泳動ファイルを図示する。図１２Ｂは、実施例２に記載される抽出方法から実験された電気泳動図および電気泳動ファイルを図示する。
【図１３】結腸直腸新生物において示差的に発現されると同定された遺伝子、ならびに癌、結腸直腸新生物、および／または胃腸の健康に関与している遺伝子のリストを示す。
【図１４】生物学的複製物の中での真核生物および原核生物のＲＮＡ指標の一貫性を実証する、４匹の個々のネコに由来する８つの試料についての電気泳動ファイル実験を図示する。
【図１５Ａ】イヌ試料のＲＴ−ｑＰＣＲ分析に使用されるプライマーを示す表である。
【図１５Ｂ】ネコ試料のＲＴ−ｑＰＣＲ分析に使用されるプライマーを示す表である。
【図１６】図１６Ａは、イヌ試料中のリンパ球特異的転写物の存在を同定するためのＢ細胞免疫グロブリンの２つの再配列についてのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を図示する。図１６Ｂは、ネコ試料中のリンパ球特異的転写物の存在を同定するためのＴ細胞受容体ガンマ領域の６つの再配列についてのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
好ましい実施形態のこの説明は、添付の図面と関連して読まれることを意図されており、それらの図面は、この発明の記載された説明全体の一部と見なされるべきである。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、本発明の特定の特徴は、明瞭さおよび簡潔さのために、誇張された縮尺で、またはやや概略的な形で示されている場合がある。本説明では、「水平」、「垂直」、「上方」、「下方」、「上」および「下」などの相対用語、ならびにそれらの派生語（例えば、「水平に」、「下向きに」、「上向きに」等）は、そのとき記載されているような、または検討中の図面に示されているような向きを指すと解釈されるべきである。これらの相対用語は説明の便宜上のものであり、通常特定の方向を必要とすることを意図するものではない。「内向きに」対「外向きに」、「長手方向」対「横方向」などを含む用語は、必要に応じて、互いに対して、または伸長軸、または回転軸もしくは回転中心に対して、解釈されるべきである。「接続された」および「相互接続された」などの取り付け、連結などに関する用語は、別段明示的に記載されない限り、構造が介在構造を通して直接的もしくは間接的のいずれかで互いに固定または取り付けられた関係、ならびに可動もしくは剛性の両方の取り付けもしくは関係を指す。「動作可能に接続された」という用語は、関連する構造がその関係によって意図されたように動作することを可能にする、そのような取り付け、連結、または接続である。単一の機械のみが例示される場合、「機械」という用語は、本明細書で検討される方法論のうちの任意の１つまたは複数を実施するために１セット（または複数セット）の命令を個別にまたは共同で実行する任意の機械の集合も含むものと解釈される。特許請求の範囲において、ミーンズプラスファンクション条項は、使用される場合、構造上の等価物だけでなく等価な構造も含む、列挙された機能を実施するための記述もしくは図面によって説明、示唆、または明白にされる構造を網羅することを意図する。
【００１２】
本発明は、糞便試料、例えば、哺乳動物から得られた糞便試料中の真核細胞を細菌細胞から分離するための方法の本発明者らの開発に一部基づく。結腸内には、腸内容物１グラム当たり約１０１２個の細菌細胞が存在する。この結腸内細菌叢は、３００〜１０００種を含み得る。糞便または便試料は、胃腸管の腸管腔から剥落した真核細胞だけでなく、細菌および任意の胃腸寄生虫を含む微生物、非消化非吸収食品残渣、腸細胞からの分泌物、ならびに粘膜および顔料などの排泄物を含む、複雑な高分子混合物である。通常の糞便は、約７５％の水および２５％の固形物で構成されている。細菌は、糞便の総乾燥質量の約６０％を占めている。高い細菌負荷は、糞便試料から真核生物バイオマーカーを検出するための好ましくない信号対雑音比に寄与し得る。さらに、真核生物信号は、著しく低下する可能性がある。そのような真核生物の核酸の抽出および処理は、分解を促進または加速させる可能性があり、これはさらなる分析を厳しく限定する。
【００１３】
本明細書に開示される方法および材料は、糞便試料から真核生物の核酸を単離するための方法を含む。そのような真核生物の核酸は、真核生物、例えば哺乳動物における胃腸障害または疾患の指標となり得る特定のバイオマーカーのレベルについて評価することができる。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、反すう動物、クマ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、水牛、シカ、エルク、ムース、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、厚皮動物、サイ、およびチンチラであり得る。
【００１４】
本発明者らは、真核生物の糞便試料中の真核細胞を細菌細胞から効果的に分離することができることを見出した。本発明者らはまた、そのような真核細胞から単離されたＲＮＡ中の真核生物バイオマーカーを検出することができることも見出した。このようなバイオマーカーは、胃腸障害、例えば、大腸癌、セリアック病、クローン病、胃炎、胃腸炎、胃癌、胃潰瘍、壊死性腸炎、胃腸間質腫瘍、胃腸リンパ腫、胃腸腫瘍、リンパ腫、腺癌、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、膵臓新生物、肝新生物、胆管癌、大腸炎、ネコ白血病ウイルス、ウシウイルス性下痢、空腸出血症候群、胃腸炎、悪性カタル熱、ネコ汎白血球減少症、小腸結腸症、浸潤性結腸疾患、クリプトスポリジウム症、コクシジウム症、および他の人畜共通感染症、またはコロナウイルス、パルボウイルス、アストロウイルス、ノロウイルス、もしくはロタウイルス感染症の検出に有用であり得る。対象、例えば、ヒト、イヌ、もしくはネコが胃腸疾患、例えば、大腸癌、リンパ腫、もしくは炎症性腸疾患または他の疾患の危険性があるかどうかを判定するための材料および方法を本明細書に提供する。疾患の診断のための材料および方法、ならびに対象の健康状態を同定する方法も提供する。
【００１５】
本明細書に開示される方法および組成物は、胃腸の健康状態の検出、診断、および治療に一般的かつ様々に有用である。検出方法は、胃腸障害を有するかまたは胃腸障害を有すると疑われる対象、例えば患者由来の試料中の１つ、２つ、またはそれ以上のバイオマーカーの糞便試料中の発現レベルを測定する工程と、測定された発現を、対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルと比較する工程と、を含み得る。対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルに対する、対象の試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルにおける差は、対象が胃腸障害を有することの指標である。いくつかの実施形態では、対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルに対する、対象の試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルにおける差は、対象、例えば患者が胃腸障害の危険性があることの指標である。
【００１６】
別の実施形態では、疾患の検出方法は、相対的発現レベルの割合、例えば、対象の糞便試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの相対比を測定する工程と、これらのバイオマーカーの相対的割合を、対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの相対的な発現レベルの割合と比較する工程と、を含み得る。対照に対する対象の試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された相対的な発現レベルの割合における差は、対象が胃腸疾患を有することの指標である。いくつかの実施形態では、対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルの割合に対する、対象の試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルの割合における差は、対象に胃腸障害の危険性があることの指標である。
【００１７】
本方法は、２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のレベルが対照中の同じ２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のレベルに対して異なるかどうかを判定することによって、患者から得られた糞便試料から単離されたヒトＲＮＡ中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを判定することを含み得る。例示的な結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子を、図６（パネルＡ）および図１３（パネルＢ）に示す。図６（パネルＡ）および図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいくつかまたはすべてが、パネルを形成することができる。いくつかの実施形態では、図６（パネルＡ）および図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子はまた、結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のサブセットを含み得る。組成物は、本明細書に開示されるマーカーのパネルの特異的検出のために構成された遺伝子アレイおよびプローブセットを含み得る。組成物はまた、本明細書に開示されるマーカーのパネルの特異的検出のために構成された遺伝子アレイおよびプローブセットを含むキットも含み得る。
【００１８】
大腸癌または前癌性病変の診断に使用するための結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子および結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のパネルを本明細書に提供する。バイオマーカーは、一般に、客観的に測定および定量化され得、かつ生物学的プロセス、例えば、結腸直腸新生物の発症、進行、寛解、および再発を評価するために使用され得る特徴である。バイオマーカーは、核酸、ポリペプチド、代謝産物、または物理的もしくは生理学的パラメータを含む多くの形態をとることができる。
【００１９】
これらの真核細胞由来のバイオマーカーは、ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列、ｂ）リボ核酸（ＲＮＡ）の配列、ｃ）タンパク質の骨格を含むアミノ酸の予測された配列、ｄ）リボ核酸バイオマーカーの発現レベル、ｅ）アミノ酸配列の予測された発現レベル、またはｆ）上記の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、Ｔ細胞マーカーまたはＢ細胞マーカーであり得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、Ｔ細胞またはＢ細胞のクローン増殖の検出に有用であるバイオマーカーであり得る。例示的なバイオマーカーは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、Ｔ細胞ガンマ受容体、Ｔ細胞アルファ受容体、Ｔ細胞ベータ受容体、Ｔ細胞デルタ受容体領域、またはＢ細胞相補性決定領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＧＡＤＰＨなどのバイオマーカーを正規化のために使用することができる。いくつかの実施形態では、上皮細胞の検出のためにアクチン−Ｂを使用すること、またはリンパ球の検出のためにＩｇＭ  Ｃ−ｍｕを使用することなど、特異的細胞型の検出のためにバイオマーカーを使用することができる。いくつかの実施形態では、リンパ球のクローン増殖の検出のためのＴ細胞受容体ガンマの検出など、疾患の特異的マーカーの検出のためにバイオマーカーを使用することができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、キャプシド、キャプソメア、レプリカーゼ、およびオーシスト壁タンパク質のためのものを含む、ウイルスおよび寄生虫の検出のためのものを含み得る。
【００２０】
生物学的試料は、核酸もしくは他の分析物を得ることができる細胞もしくは他の細胞材料を含む試料であり得る。生物学的試料は、対照または実験試料であり得る。生物学的試料は、糞便試料であり得る。生物学的試料は、便器内、地上、または回収デバイス内への排便直後に得られ得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、浣腸または内視鏡検査などの手順に従って得られ得る。生物学的試料は、直後に試験され得る。代替的に、生物学的試料は、試験前に、緩衝液、例えば、水性緩衝液、グリセロール系緩衝液、極性溶媒系緩衝液、浸透圧バランス緩衝液、または生物学的試料を保存するのに十分な他の緩衝液に保存することができる。加えて、または代替的に、生物学的試料を回収し、試験前に、例えば、４℃で冷蔵保存され得るか、または例えば、０℃、−２０℃、−８０℃、−１４０℃以下で冷凍保存され得る。生物学的試料は、試験前に、１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年またはそれ以上保存され得る。
【００２１】
生物学的試料は、真核生物、例えば哺乳動物に由来し得る。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、反すう動物、クマ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、水牛、シカ、エルク、ムース、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、厚皮動物、サイ、およびチンチラであり得る。
【００２２】
方法
真核生物の核酸に富む生物学的試料、例えば糞便試料から核酸を単離するのに有用な方法を本明細書に提供する。本方法は、糞便試料を緩衝液で破砕することを含み得る。試料は、ボルテックス、振とう、撹拌、回転、または固形物および糞便細菌を分散させるのに十分な他の撹拌方法にかけることができる。撹拌および遠心分離工程が実行される温度は、例えば、約４℃〜約２０℃に、約４℃〜約１℃に、約４℃〜約１０℃に、約４℃〜約６℃に変化し得る。破砕後、試料を１回以上の遠心分離にかけることができる。いくつかの実施形態では、破砕工程および遠心分離は、さらに１回、２回、３回またはそれ以上繰り返され得る。市販の試薬、例えばＮｕｃｌｉｓｅｎｓ（登録商標）ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）試薬は、糞便の破砕、洗浄、および細胞溶解のために使用され得る。溶解緩衝液はまた、真核細胞を溶解するためのものであり得る。溶解物をさらに遠心分離し、上清を自動ＲＮＡ単離機、例えばＥａｓｙＭａｇ（登録商標）機器へと投入するために使用することができる。いくつかの実施形態では、抽出された核酸をＤＮａｓｅで処理して、ＤＮＡの溶液を除去することができる。機械的または酵素的細胞破砕、その後のカラムクロマトグラフィーもしくは有機溶媒による抽出などの固相法、例えば、フェノール−クロロホルムもしくはチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出を含む、他の方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸を官能化ビーズ上に抽出することができる。いくつかの実施形態では、官能化ビーズは、磁気コア（「磁気ビーズ」）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、官能化ビーズは、荷電部分で官能化された表面を含み得る。荷電部分は、アミン、カルボン酸、カルボン酸塩、四級アミン、硫酸塩、スルホン酸塩、またはリン酸塩から選択することができる。
【００２３】
核酸の抽出のために、糞便試料を、緩衝液、界面活性剤、およびリボヌクレアーゼ阻害剤のうちの１つ以上の存在下で破砕して、懸濁物を形成し得る。緩衝液は、生物学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス平衡塩溶液、アルセバー溶液、アール平衡塩溶液、ゲイ平衡塩溶液、リン酸緩衝食塩水、パック平衡塩溶液、リンガー平衡塩溶液、シム平衡塩溶液、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、またはタイロード平衡塩溶液であり得る。界面活性剤は、イオン性または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、またはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００であり得る。リボヌクレアーゼ阻害剤は、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲＮＡｓｅＯＵＴ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＮＴＩ−ＲＮａｓｅ、組み換えＲＮａｓｅ阻害剤、またはクローン化ＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、溶媒ベースの方法、タンパク質ベースの方法、またはＲＮＡ破砕を防止するための他の種類の方法であり得る。糞便試料は、様々な方法で、例えば、ボルテックス、振とう、撹拌、回転、または固形物および糞便細菌を分散させるのに十分な他の撹拌方法によって破砕することができる。いくつかの実施形態では、糞便試料は、コーティングされたビーズ、磁気ビーズ、またはガラス棒、金属棒、木の棒、もしくは木刃などの撹拌用具を使用して破砕することができる。
【００２４】
次に、懸濁物を液体部分と固体部分に分離することができる。分離は、例えば、遠心分離、濾過、真核細胞に特異的に結合する標的指向化プローブ、抗体、カラムベースの濾過、ビーズベースの濾過、またはクロマトグラフィー法によって実行することができる。液体部分は、細菌核酸に富み、廃棄することができる。固体部分は、界面活性剤の存在下または不在下およびリボヌクレアーゼの存在下または不在下のいずれかで、緩衝液中に再懸濁され得る。分離工程は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上繰り返され得る。
【００２５】
破砕および分離工程が実行される温度は、例えば、約４℃〜約２０℃に、約４℃〜約１５℃に、約４℃〜約１０℃に、約４℃〜約６℃に変化し得る。
【００２６】
分離工程から得られたペレットを、溶解緩衝液、例えば、カオトロピック剤および任意選択的に界面活性剤を含む緩衝液に懸濁して、溶解物を形成することができる。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、チオシアン酸グアニジウムであり得、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００であり得る。いくつかの実施形態では、溶解緩衝液は、トリス−ＨＣｌ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ノニデットＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウム、またはジチオトレイトールを含み得るか、またはこれらを除外し得る。
【００２７】
溶解物は、真核生物の核酸に富む部分に分画することができる。分画は、例えば、遠心分離、濾過、真核生物の核酸に特異的に結合する標的指向化プローブ、抗体、カラムベースの濾過、ビーズベースの濾過、またはクロマトグラフィー法によって実行することができる。いくつかの実施形態では、遠心分離による分画は、細胞片を含む底層（ペレット）、真核生物の核酸を含む親水性中間層、ならびに脂質および膜画分を含む疎水性最上層の形成をもたらし得る。中間層を回収することができる。いくつかの実施形態では、中間層および最上層を一緒に回収することができる。小口径オリフィスを通して、中間層を回収することができる。小口径オリフィスは、ピペットチップまたは針を装着した注射器であり得る。ピペットチップは、例えば、１、５、１０、２０μＬまたは１００μＬのピペットチップであり得る。針は、例えば、１８ゲージまたは１５ゲージの針であり得る。
【００２８】
真核生物の核酸を含む回収された層は、さらなる抽出に供され得る。さらなる抽出方法は、様々であり得る。例示的な方法としては、磁性粒子ベースの方法、カラムベースの方法、フィルタベースの方法、ビーズベースの方法、または有機溶媒ベースの方法が挙げられる。磁性粒子ベースの方法は、市販の試薬、例えばＮｕｃｌｉｓｅｎｓ（登録商標）ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）試薬（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を含み得る。
【００２９】
抽出された核酸は、胃腸障害または胃腸細胞に関連する真核生物バイオマーカーについて分析することができる。バイオマーカーは、個体、すなわち対象の健康に関する情報を提供することができる。これらの真核細胞由来のバイオマーカーは、ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列、ｂ）リボ核酸（ＲＮＡ）の配列、ｃ）タンパク質の骨格を含むアミノ酸の予測された配列、ｄ）ＲＮＡバイオマーカーの発現レベルもしくは発現レベルの割合、ｅ）アミノ酸配列の予測された発現レベルもしくは予測された発現レベルの割合、またはｆ）上記の任意の組み合わせを含み得る。真核細胞からのバイオマーカーの単離は、実験試料と対照との間の比較を可能にし得る。真核細胞からのこれらのバイオマーカーの単離は、実験試料中の腸疾患の検出のための方法を提供することができる。比較は、ａ）ＤＮＡ配列における変動、ｂ）ＲＮＡ配列における変動、ｃ）予測されるアミノ酸配列における変動、ｄ）ＲＮＡバイオマーカーの発現レベルにおける変動もしくは発現レベルの割合の変動、ｅ）アミノ酸配列の予測された発現レベルの変動もしくは予測発現レベルの割合の変動、またはｆ）上記の任意の組み合わせを構成する変動に対する評価を含み得る。実験試料の測定されたバイオマーカーが対照中の測定されたバイオマーカーと異なる場合に、変動を判定することができる。
【００３０】
本方法は、実験試料および対照、例えば糞便試料を得ることを含み得る。糞便試料は、バイオマーカーについて評価することができる剥落した真核細胞を含有する。いくつかの実施形態では、真核細胞は、腸細胞、リンパ球、エンテロクロミフィン様細胞、腸内分泌細胞、神経内分泌細胞、膵臓細胞、肝細胞、胃細胞などであり得る。本方法は、糞便試料中の真核細胞を真核生物バイオマーカーについて評価することができる方法を提供する。バイオマーカーは、ＤＮＡの配列、ＲＮＡの配列、予測されるアミノ酸の配列、ＲＮＡバイオマーカーの発現レベルもしくは発現レベルの割合、アミノ酸配列の予測される発現レベルもしくは予測される発現レベルの割合、または上記の任意の組み合わせを含み得る。一態様では、評価工程は、任意の種類のマイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉から構成される。
【００３１】
本方法および組成物はまた、腸疾患を罹患している個体のための臨床計画を選択するのにも有用である。この方法を通して、臨床計画は、さらなる診断手順の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、臨床計画は、治療方法を含み得る。
【００３２】
真核生物バイオマーカーのレベルは、様々な方法を使用して評価することができる。発現レベルは、核酸レベル、例えば、ＲＮＡレベルまたはポリペプチドレベルのいずれかで判定することができる。ＲＮＡ発現は、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡの発現を包含し得る。ＲＮＡレベルでの発現は、関連するＲＮＡに対応するｃＤＮＡのレベルを測定することによって直接的または間接的に測定することができる。代替的に、または加えて、ＲＮＡによってコードされるポリペプチド、関連する転写因子をコードする遺伝子のＲＮＡ調節因子、および転写因子ポリペプチドのレベルもまたアッセイされ得る。ｍＲＮＡレベルで遺伝子発現を判定するための方法としては、例えば、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ブロッティング、デジタルバーコード定量化アッセイに基づくハイブリダイゼーション、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、デジタルドロップＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＵＶ分光法、ＲＮＡ配列決定、次世代配列決定、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｌｅｘなどの分岐ＤＮＡ信号増幅を利用した溶解物ベースのハイブリダイゼーションアッセイ、および分岐ＤＮＡ分析方法が挙げられる。デジタルバーコード定量化アッセイは、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ｘＭＡＰシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＨＴＧ）分子、ＢｉｏＭａｒｋ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）、またはＷａｆｅｒｇｅｎマイクロアレイを含み得る。アッセイには、ＤＡＳＬ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＴｒｕＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、およびＴａｑＭａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が含まれ得る。
【００３３】
我々は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語を互換的に使用して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および核酸類似体を含むＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指し、それらのうちのいずれも、本発明のポリペプチドをコードし得、それらのすべてが本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、本質的にあらゆる三次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であってもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびその一部分、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体が含まれる。本発明の文脈において、核酸は、バイオマーカーの断片、例えば、Ｂ細胞もしくはＴ細胞クローン増殖のためのバイオマーカー、またはそれらの生物学的に活性な変異体をコードすることができる。
【００３４】
「単離された」核酸は、例えば、ゲノム中のそのＤＮＡ分子のすぐ隣に通常見出される核酸配列のうちの少なくとも１つが除去されているか、または存在しないという条件で、ＤＮＡ分子もしくはその断片であり得る。したがって、単離された核酸は、他の配列とは無関係に、別個の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成核酸、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）を含むが、これらに限定されない。単離された核酸はまた、ベクター、自律複製プラスミド、ウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を指す。加えて、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの遺伝子操作された核酸を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライス内の他の核酸のうちの多数（例えば、数十個、または数百〜数百万個）の間に存在する核酸は、単離された核酸ではない。
【００３５】
単離された核酸分子は、種々の方法で産生することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を得ることができる。ＰＣＲを使用して、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を含む、ＤＮＡならびにＲＮＡからの特異的配列を増幅させることができる。一般に、対象となる領域の末端またはそれ以降の配列情報を用いて、増幅される鋳型の反対の鎖と配列が同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。部位特異的ヌクレオチド配列修飾を鋳型核酸に導入することができる、様々なＰＣＲ戦略もまた利用可能である。
【００３６】
単離された核酸はまた、単一の核酸分子として（例えば、ホスホルアミダイト技術を使用して３’〜５’方向への自動ＤＮＡ合成を使用して）または一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで化学合成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされたときに二本鎖が形成されるように、各対が相補性の短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含む、所望の配列を含む一対以上の長いオリゴヌクレオチド（例えば、＞５０〜１００ヌクレオチド）を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長し、その結果、オリゴヌクレオチド対当たり一本鎖の二本鎖核酸分子が得られ、次に、これをベクターに結紮することができる。
【００３７】
それらがコードする２つの核酸またはポリペプチドは、互いにある程度の同一性を有するものとして記載され得る。例えば、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）から選択される結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子およびその生物学的に活性な変異体は、ある程度の同一性を示すものとして記載され得る。アライメントは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＰＩＲ）サイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ）で短い配列を見つけ、続いてＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）上の「短いほぼ同一の配列」のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを用いて分析することによって組み立てることができる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性」という用語は、任意の所与のクエリ配列と対象配列との間の同一性の程度を指す。例えば、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子配列は、クエリ配列であり得、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子配列の断片は、対象配列であり得る。同様に、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子配列の断片は、クエリ配列であり得、その生物学的に活性な変異体は、対象配列であり得る。
【００３９】
配列同一性を判定するために、クエリ核酸もしくはアミノ酸配列を、コンピュータプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して、それぞれ１つ以上の対象核酸もしくはアミノ酸配列に整列させることができ、これにより、全長にわたって実行される核酸もしくはタンパク質配列のアラインメント（グローバルアラインメント）を可能にする。
【００４０】
本明細書に記載される核酸およびポリペプチドは、「外因性」と呼ばれる場合がある。「外因性」という用語は、核酸またはポリペプチドが組み換え核酸構築物の一部であるか、それによってコードされるか、またはその天然の環境にはないことを示す。例えば、外因性核酸は、別の種に導入されたある種由来の配列、すなわち、異種核酸であり得る。典型的には、そのような外因性核酸は、組み換え核酸構築物を介して他の種に導入される。外因性核酸はまた、生物に固有のものであり、かつその生物の細胞に再導入されたものであり得る。天然配列を含む外因性核酸は、外因性核酸につなげられた非天然配列、例えば、組み換え核酸構築物中の天然配列に隣接する非天然調節配列の存在によって天然配列と区別することができることが多い。加えて、安定的に形質転換された外因性核酸は、典型的には、天然配列が見出される位置以外の位置に組み込まれる。
【００４１】
本発明の核酸は、図６（パネルＡ）もしくは図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカーのうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸、または図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された核酸と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％同一である核酸配列を含み得る。
【００４２】
標的核酸に特異的な核酸、例えばオリゴヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）は、好適な条件下で標的核酸にハイブリダイズするであろう。オリゴヌクレオチド一本鎖が規定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対合を介して相補鎖とアニーリングするプロセスとしてのハイブリダイゼーションまたはハイブリダイズを指す場合がある。それは、２つの相補的ポリヌクレオチド間の特異的な、すなわち非ランダムな相互作用である。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件の厳密性、および形成される分子の融解温度（Ｔｍ）などの要因によって影響を受ける。ハイブリダイゼーション生成物は、溶液中または固体支持体上の標的と共に形成された二本鎖または三本鎖であり得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、核酸は、図６または１３に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の分析および定量化のために有用な短い核酸配列を含み得る。そのような単離された核酸は、オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加によってＤＮＡ合成の開始点として機能することができる、図６または１３に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかのヌクレオチド配列である。プライマーの３’ヌクレオチドは、一般に、最適な伸長および／または増幅のために対応するヌクレオチド位置で標的配列と同一であるべきである。プライマーは、例えば、ペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ロック解除核酸プライマー、および／またはホスホロチオエート修飾プライマーを含む多くの形態をとることができる。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーは、ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的なプライマーであり得、リバースプライマーは、ｄｓＤＮＡのセンス鎖に相補的なプライマーであり得る。また、プライマー対を指す場合もある。いくつかの実施形態では、５’標的プライマー対は、標的ヌクレオチド配列の５’領域を増幅させる、少なくとも１つのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのリバースプライマーを含むプライマー対であり得る。いくつかの実施形態では、３’標的プライマー対は、標的ヌクレオチド配列の３’領域を増幅させる、少なくとも１つのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのリバースプライマーを含むプライマー対であり得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、以下に検討されるように、検出可能な標識を含み得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は定量化可能な標識であり得る。
【００４４】
本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドプライマーは、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子配列のうちのいずれかの増幅に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書に開示される結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちの２つ以上、例えば、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子に相補的であり得る。プライマー長は、プローブのヌクレオチド塩基配列および特異的核酸配列の組成、ならびにプローブが使用される特定の方法に応じて変化し得る。一般に、有用なプライマー長は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド塩基であり得る。有用なプライマー長は、８ヌクレオチド塩基〜約６０ヌクレオチド塩基、約１２ヌクレオチド塩基〜約５０ヌクレオチド塩基、約１２ヌクレオチド塩基〜約４５ヌクレオチド塩基、約１２ヌクレオチド塩基〜約４０ヌクレオチド塩基、約１２ヌクレオチド塩基〜約３５ヌクレオチド塩基、約１５ヌクレオチド塩基〜約４０ヌクレオチド塩基、約１５ヌクレオチド塩基〜約３５ヌクレオチド塩基、約１８ヌクレオチド塩基〜約５０ヌクレオチド塩基、約１８ヌクレオチド塩基〜約４０ヌクレオチド塩基、約１８ヌクレオチド塩基〜約３５ヌクレオチド塩基、約１８ヌクレオチド塩基〜約３０ヌクレオチド塩基、約２０ヌクレオチド塩基〜約３０ヌクレオチド塩基、約２０ヌクレオチド塩基〜約２５ヌクレオチド塩基の範囲であり得る。
【００４５】
プローブ、すなわち、図６（パネルＡ）および図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子配列のうちのいずれかに選択的に結合し、かつそれと相補的である、単離された核酸断片も提供する。プローブは、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖、およびヌクレオチド塩基または骨格のいずれかにおける天然もしくは修飾されたものであり得る。プローブは、化学合成または酵素合成を含む様々な方法によって産生され得る。
【００４６】
プローブ長は、プローブのヌクレオチド塩基配列および特異的核酸配列の組成、ならびにプローブが使用される特定の方法に応じて変化し得る。一般に、有用なプローブ長は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１４０、１５０、１７５、または２００ヌクレオチド塩基であり得る。一般に、有用なプローブ長は、約８〜約２００ヌクレオチド塩基、約１２〜約１７５ヌクレオチド塩基、約１５〜約１５０ヌクレオチド塩基、約１５〜約１００ヌクレオチド塩基、約１５〜約７５ヌクレオチド塩基、約１５〜約６０ヌクレオチド塩基、約２０〜約１００ヌクレオチド塩基、約２０〜約７５ヌクレオチド塩基、約２０〜約６０ヌクレオチド塩基、約２０〜約５０ヌクレオチド塩基の範囲の長さであろう。いくつかの実施形態では、プローブセットは、図６（パネルＡ）および図１３（パネルＢ）の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５個もしくはそれ以上、またはすべてを対象とするプローブを含み得る。
【００４７】
本明細書に開示されるプライマーおよびプローブは、検出可能に標識され得る。標識は、検出され得るか、または検出可能な応答を導き得る分子部分もしくは化合物であり得、これは、直接的または間接的に核酸に接合され得る。直接標識化は、共有結合、非共有相互作用（水素結合、疎水性およびイオン性相互作用）、またはキレートもしくは配位錯体を含む、結合と相互作用を使用して標識とプローブとをつなげることができる。間接標識化は、直接的または間接的に標識化されて信号を増幅させることができる。架橋部分またはリンカー（例えば、抗体、オリゴマー、または他の化合物）を使用することができる。標識は、任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、ビオチンもしくはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応基、発色団（検出可能な染料、粒子、またはビーズ）、発蛍光団、または発光化合物（生物発光、燐光、または化学発光標識）を含む。標識は、混合物中の結合標識プローブが、非結合形態からの結合の物理的分離を必要とせずに、非結合標識プローブのものと比較して検出可能な変化、例えば、安定性または段階的分解を示す均質アッセイにおいて検出可能であり得る。
【００４８】
好適な検出可能な標識は、それ自体が検出可能である分子（例えば、蛍光部分、電気化学的標識、金属キレートなど）、ならびに検出可能な反応生成物の産生によって、またはそれ自体が検出可能であり得る特異的結合分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジントロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）によって、間接的に検出され得る分子（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素）を含み得る。上記に検討されるように、検出可能な標識への１つ以上のリガンドモチーフおよび／またはリガンドの連結は、直接または間接的であり得る。検出は、インサイチュ、インビボ、インビトロで、組織切片上でまたは溶液中などであり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本方法は、アルカリホスファターゼ共役ポリヌクレオチドプローブの使用を含む。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）共役ポリヌクレオチドプローブを使用する場合、ファストブルーまたはファストレッド基質などの適切な基質を順次添加した後、ＡＰは基質を分解して沈殿物を形成し、それによって特異的標的ＲＮＡ分子のインサイチュ検出が可能になる。アルカリホスファターゼは、いくつかの基質、例えば、ファストブルー、ファストレッド、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）と共に使用することができる。例えば、米国特許第５，７８０，２７７号および米国特許第７，０３３，７５８号に一般的に記載されているものを参照されたい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、フルオロフォア共役プローブは、蛍光染料共役標識プローブであり得るか、または３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）のような基質を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ共役プローブの使用など、発色検出経路のためのアルカリホスファターゼに加えた他の酵素アプローチを利用し得る。
【００５１】
共役標識プローブに使用される蛍光染料は、典型的には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体、クマリンおよびその誘導体、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）およびその誘導体、ルシファーイエローおよびその誘導体、ＢＯＤＩＰＹおよびその誘導体などに分類され得る。例示的なフルオロフォアとしては、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−３５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ（商標））、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ（商標））、ＬＩＺ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（商標）、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎなどが挙げられる。フルオロフォアおよびそれらの使用の説明は、とりわけ、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，９ｔｈ  ｅｄ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．、Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００３），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３／２００４  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．、Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、およびＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｌｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｍｅａｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍｓ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐに見出され得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、真核生物バイオマーカーのレベルは、遺伝子アレイ上で分析することができる。マイクロアレイ分析は、カスタマイズされた遺伝子アレイ上で実施することができる。代替的に、または加えて、マイクロアレイ分析は、製造元の指示およびプロトコルに従って市販のシステムを使用して実行することができる。例示的な市販のシステムには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州サンタクララ）、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ技術、ＮＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）分析システム（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＢｅａｄＡｒｒａｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）が含まれる。糞便試料から抽出された核酸は、遺伝子アレイ上のプローブとハイブリダイズすることができる。プローブ−標的ハイブリダイゼーションは、化学発光によって検出されて、特定の配列の相対存在量を判定することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、プローブおよびプローブセットは、遺伝子アレイとして構成され得る。マイクロアレイまたは遺伝子チップとしても知られる遺伝子アレイは、複雑な生物学的試料の並行分析を可能にする核酸の規則正しいアレイである。典型的には、遺伝子アレイは、固体基板、例えば、マイクロチップ、スライドガラス、またはビーズに付着されているプローブを含む。付着は、一般に、基板とプローブとの間に共有結合をもたらす化学的連結を伴う。アレイ内のプローブの数は様々であり得るが、各プローブは、アレイまたはマイクロチップ上の特定のアドレス可能な場所に固定される。いくつかの態様では、プローブは、約１８ヌクレオチド塩基、約２０ヌクレオチド塩基、約２５ヌクレオチド塩基、約３０ヌクレオチド塩基、約３５ヌクレオチド塩基、または約４０ヌクレオチド塩基の長さであり得る。いくつかの実施形態では、プローブセットは、図６（パネルＡ）および図１３（パネルＢ）の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０個もしくはそれ以上、またはすべてを対象とするプローブを含む。プローブセットは、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００個またはそれ以上の異なるプローブを含む、高密度アレイに組み込まれ得る。
【００５４】
遺伝子アレイ合成の方法は様々であり得る。例示的な方法としては、プローブの合成、その後のインサイチュ合成である「スポット」による、例えばフォトリソグラフィー、または微小電極アレイ上での電気化学を使用した、アレイ表面への堆積が挙げられる。
【００５５】
真核生物バイオマーカーのレベルは、様々な方法を使用して評価することができる。発現レベルは、核酸、例えば、ＲＮＡレベルまたはポリペプチドレベルのいずれかで判定され得る。ＲＮＡ発現は、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡの発現を包含し得る。ＲＮＡレベルでの発現は、関連するＲＮＡに対応するｃＤＮＡのレベルを測定することによって直接的または間接的に測定することができる。代替的に、または加えて、ＲＮＡによってコードされるポリペプチド、関連する転写因子をコードする遺伝子のＲＮＡ調節因子、および転写因子ポリペプチドのレベルもまたアッセイされ得る。ｍＲＮＡレベルで遺伝子発現を判定するための方法としては、例えば、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ブロッティング、デジタルバーコード定量化アッセイに基づくハイブリダイゼーション、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、デジタルドロップＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＵＶ分光法、ＲＮＡ配列決定、次世代配列決定、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｌｅｘなどの分岐ＤＮＡ信号増幅を利用する溶解物ベースのハイブリダイゼーションアッセイ、および分岐ＤＮＡ分析方法が挙げられる。デジタルバーコード定量化アッセイは、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ｘＭＡＰシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＨＴＧ）分子、ＢｉｏＭａｒｋ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）、またはＷａｆｅｒｇｅｎマイクロアレイを含み得る。アッセイには、ＤＡＳＬ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＴｒｕＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、およびＴａｑＭａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が含まれ得る。
【００５６】
真核生物バイオマーカーのレベルはまた、ＤＮＡ配列決定によって分析され得る。ＤＮＡ配列決定は、標的指向化配列決定、全ゲノム配列決定、またはエクソーム配列決定などの配列決定方法によって実施することができる。配列決定方法は、サンガー配列決定またはハイスループット配列決定を含み得る。ハイスループット配列決定は、合成による配列決定、パイロ配列決定、ライゲーションによる配列決定、リアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、およびサンガー配列決定を含み得る。いくつかの実施形態では、単離されたＲＮＡを使用して、対応するｃＤＮＡを生成することができ、そのｃＤＮＡを配列判定することができる。
【００５７】
本明細書に記載される配列決定方法は、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるように多重形式で実行され得る。いくつかの実施形態では、異なる標的核酸を共通の反応容器中または特定の基質の表面上で処理することができ、これにより、配列決定試薬の便利な送達、未反応試薬の除去、および多重様式での組み込み事象の検出が可能になる。表面結合標的核酸が関与するいくつかの実施形態では、標的核酸は、アレイ形式であり得る。アレイ形式では、標的核酸は、典型的には、空間的に区別可能な様式で表面に連結され得る。例えば、標的核酸は、直接共有結合、ビーズもしくは他の粒子への付着、または表面に付着されたポリメラーゼもしくは他の分子と関連する付着によって結合され得る。アレイは、各部位に標的核酸の単一のコピー（特徴部とも呼ばれる）を含み得るか、または同じ配列を有する複数のコピーが各部位もしくは特徴部に存在し得る。多重コピーは、ブリッジ増幅、ＰＣＲ、またはエマルジョンＰＣＲなどの増幅方法によって産生される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、正規化工程を使用して、核酸回収率および試料間の変動性を制御することができる。いくつかの実施形態では、規定量の外因性対照核酸を、抽出真核生物の核酸に添加（「混入」）することができる。外因性対照核酸は、１つ以上の真核生物配列に対応する配列を有する核酸であり得る。代替的に、または加えて、外因性対照核酸は、別の種に見られる配列に対応する配列、例えば、Ｂａｃｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ配列などの細菌配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のハウスキーピング遺伝子のレベルを判定することを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカーの発現レベルをハウスキーピング遺伝子のレベルに正常化することを含み得る。
【００５９】
本方法は、実験試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルが、対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルと異なるかどうかを判定する工程を含む。別の実施形態では、本方法は、実験試料中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルが、対照中の１つ、２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定された発現レベルの割合と異なるかどうかを判定する工程を含む。発現レベルにおける差または発現レベルの割合は、増加または減少であり得る。
【００６０】
本明細書に開示される組成物は、大腸癌の検出、診断、および治療に一般的かつ様々に有用である。検出の方法は、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）のうちのいずれかに列挙されたバイオマーカーから選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカーの糞便試料中の発現レベルを測定する工程と、試料中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程と、を含み得る。対照中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルに対する、患者の試料中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルにおける差は、患者が大腸癌を有することの指標である。いくつかの実施形態では、対照中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルに対する、患者の試料中の２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルにおける差は、患者が前癌性病変を有し、かつ／または大腸癌の危険性があることの指標である。これらの方法は、結腸直腸新生物、例えば、大腸癌もしくは前癌性病変を有するかまたは結腸直腸新生物を発症する危険性がある対象（例えば、患者、より具体的には、ヒト患者）を同定する工程をさらに含み得る。
【００６１】
結腸直腸新生物は、任意の形態の大腸癌を含み得る。結腸直腸新生物はまた、ポリープ、例えば前癌性病変を含み得る。大腸癌は、典型的には、ポリープと呼ばれる、結腸または直腸の内腔内膜における増殖として始まる。結腸直腸ポリープは、一般に、２つのカテゴリー：腺腫とも呼ばれる腺腫性ポリープ、および過形成性かつ炎症性ポリープに分類される。腺腫性ポリープは、大腸癌を引き起こす可能性がある。大腸癌の最も一般的な形態である腺癌は、結腸および／または直腸の内側に並ぶ腸腺細胞から発生する。腺癌は、有茎性茎上の腺癌である尿細管腺癌、および結腸の表面に平らに存在する腺癌である絨毛腺癌を含み得る。他の大腸癌は、それらの起源となる組織によって区別される。これらには、カハール間質細胞から生じる消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、血液細胞から生じる原発性結腸直腸リンパ腫、結合組織または平滑筋から生じる肉腫である平滑筋肉腫、メラノサイトから生じるメラノーマ、重層扁平上皮組織から生じ、かつ直腸に限局している扁平上皮癌、および一般的に予後不良と関連する上皮癌である粘液癌が含まれる。
【００６２】
大腸癌の症状には、下痢もしくは便秘を含む排便習慣の変化、または４週間を超えて続く糞便の硬さの変化、直腸出血もしくは糞便中の血液、けいれん、ガス、もしくは痛みなどの持続性腹部不快感、腸が完全に空にならないという感覚、脱力感もしくは疲労、および原因不明の体重減少が含まれるが、これらに限定されない。大腸癌を有すると疑われる患者は、全血球計算（ＣＢＣ）、便潜血検査（ＦＯＢＴ）、肝機能分析、便免疫化学検査（ＦＩＴ）、ならびに／または特定の腫瘍マーカーの他の分析、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＣＡ１９−９を含む、末梢血検査を受ける場合がある。大腸癌は、結腸鏡検査に基づいて診断されることが多い。結腸鏡検査の間、ポリープが大腸癌細胞または前癌性変化を受けた細胞を含有するかどうかを判定するために、注目されるいかなるポリープも除去、生検、および分析される。上記に列挙された特定の癌のそれぞれは、内視鏡を通して見たときに異なって見える可能性がある。絨毛腺腫メラノーマ、および扁平上皮癌は、典型的には、平らであるか、または固着性であり、管状腺腫、リンパ腫、平滑筋肉腫、およびＧＩＳＴ腫瘍は、典型的には、有茎性である。しかしながら、結腸鏡検査の間に、平らで固着性の腺腫は、消化器科医が見逃す可能性がある。生検試料は、特定の遺伝子の遺伝的変化またはマイクロサテライト不安定性に基づいてさらなる分析を受ける可能性がある。
【００６３】
他の診断方法としては、Ｓ状結腸鏡検査、画像検査、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴまたはＣＡＴ）スキャン、超音波、例えば、腹部、直腸内、または術中超音波、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、例えば、直腸内ＭＲＩが含まれ得る。大腸癌が転移したかどうかを判断するために、血管造影法および胸部Ｘ線検査などの他の検査を実行することができる。
【００６４】
大腸癌を病期分類するための様々な方法が開発されている。最も一般的に使用されているシステムであるＴＮＭシステムは、３つの要因：１）原発性腫瘍（Ｔ）が腸壁および近くの領域へと増殖した距離、２）腫瘍が近くの所属リンパ節（Ｎ）に拡がっているかどうか、３）癌が他の臓器（Ｍ）に転移しているかどうかに基づく。他の病期分類法には、デュークス病期分類およびＡｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ分類が含まれる。
【００６５】
ＴＮＭシステムは、大腸癌の４段階分類を提供する。ステージ１（Ｔ１）の大腸癌では、腫瘍は結腸壁の層にまで増殖しているが、結腸壁の外側またはリンパ節には拡がっていない。癌が尿細管腺腫ポリープの一部である場合、単純切除が実施され、患者は将来の癌の発症のために日常的な検査を受け続けることができる。癌が高悪性度または平らな／固着性ポリープの一部である場合、より多くの手術が必要となる可能性があり、より大きなマージンが取られ、これには、結腸の切片を切除した部分結腸切除術が含まれる。ステージ２（Ｔ２）の大腸癌では、腫瘍は結腸壁にまで増殖しており、潜在的に近くの組織にまで増殖するが、近くのリンパ節には拡がっていない。腫瘍の外科的切除および部分結腸切除術が、一般に実施される。補助療法、例えば、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、またはカペシタビンなどの薬剤を用いた化学療法を施すことができる。そのような腫瘍は再発する可能性は低いが、患者のスクリーニングを増やすことが一般に必要である。ステージ３（Ｔ３）の大腸癌では、腫瘍は近くのリンパ節に拡がっているが、体の他の部分には拡がっていない。結腸の切片およびすべての罹患リンパ節を除去する手術が必要となるであろう。オキサリプラチンと組み合わされた５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、またはカペシタビンなどの薬剤による化学療法が、典型的に推奨される。放射線療法はまた、患者の年齢および腫瘍の悪性に応じて使用され得る。ステージ４（Ｔ４）の大腸癌では、血液を通して結腸から遠隔の臓器に腫瘍が拡がっている。大腸癌は、最も頻繁には、肝臓、肺、および／または腹膜に転移する。手術によってこれらの癌が治癒する可能性は低く、化学療法およびまたは放射線療法は、一般に、生存率の向上のために必要である。
【００６６】
本明細書に開示される方法は、一般に、大腸癌の診断および治療に有用である。２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のレベルは、生物学的試料、すなわち、対象由来の試料において測定される。対象は、患者が大腸癌の危険性があることを示すであろう、上記に記載される症状のうちの１つ以上を有する患者であり得る。対象はまた、症状がないが、年齢（例えば、５０歳超）、家族歴、肥満、食事、アルコール摂取、タバコ使用、結腸直腸ポリープの以前の診断、人種および民族的背景、炎症性腸疾患、ならびに大腸癌の危険性がより高いことに関連する、家族性腺腫性ポリポーシス、ガードナー症候群、リンチ症候群、ターコット症候群、ポイツ・イェガース症候群、およびＭＵＴＹＨ関連ポリポーシスなどの遺伝的症候群に基づいて大腸癌の危険性があり得る患者でもあり得る。本明細書に開示される方法はまた、寛解を監視し、かつ癌の再発を検出するために、以前に大腸癌について診断および治療された患者を監視するのにも有用である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、対象、すなわち、ヒトまたは非ヒト動物の患者の病状は、病理学的評価によって判定される。例えば、大腸癌などの１つの種類の疾患では、疾患の程度は、ステージ１（Ｔ１）、ステージ２（Ｔ２）、ステージ３（Ｔ３）、およびステージ４（Ｔ４）として分類される。大腸癌は、尿細管腺癌、絨毛腺癌、胃腸間質腫瘍、原発性結腸直腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫、扁平上皮癌、または粘液癌であり得る。炎症性腸疾患などの別の種類の疾患では、疾患状態は、腸管に沿った疾患の場所、ならびに肉芽腫、白血球浸潤、および／または陰窩膿瘍などの組織学的特徴によって判定される。医師の判定、身体症状、便潜血検査、便免疫化学検査、Ｓ状結腸鏡検査、ＦＩＴ−ＤＮＡ、ＣＴコロノグラフィ、または結腸鏡検査などの他の病状を判定するための方法もまた、本明細書に開示される方法と併せて使用することができる。
【００６８】
対象に腸疾患の危険性があるかどうかを判定する方法も提供される。腸疾患には、腸癌、大腸癌、前癌性変化を示す腺腫性ポリープ、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、または他の腸疾患が含まれ得る。対象に腸疾患の危険性があるかどうかを判定する方法は、本発明を使用して、ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列、ｂ）リボ核酸（ＲＮＡ）の配列、ｃ）タンパク質の骨格を含む予測アミノ酸配列、ｄ）リボ核酸バイオマーカーの発現レベル、ｅ）アミノ酸中の配列の変化における予測、またはｆ）上記のいずれかの組み合わせを検出することによって判定することができ、対照と実験試料との間の差は、対象が腸疾患の危険性があることを示し得る。
【００６９】
方法および組成物はまた、腸疾患を罹患している対象についての臨床計画を選択するためにも有用である。この方法を通して、臨床計画は、さらなる診断手順の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、臨床計画は、治療方法を含み得る。
【００７０】
図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）から選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のレベルは、大腸癌の危険性があるか、またはこれを有する対象において分析することができる。いくつかの実施形態では、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）から選択される１つ、２つまたはそれ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のレベルは、大腸癌の危険性があるか、またはこれを有する対象において分析することができる。図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子は、パネルを形成し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のバイオマーカーは、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）のマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０個またはそれ以上の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、示差的に発現される転写物クラスターおよび／または大腸癌に関連する共通経路内に含まれ得る。例示的な経路には、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、染色体不安定性（ＣＩＮ）、およびＣｐＧアイランドメチル化剤表現型（ＣＩＭＰ）が含まれる。いくつかの実施形態では、経路は、細胞成分経路、ストレスに対する細胞応答、ストレス、およびＲＮＡ結合経路であり得る。
【００７１】
診断、状態、または治療に対する反応を判定するためのアルゴリズムは、例えば、特定の臨床状態について判定することができる。本明細書で提供される方法において使用されるアルゴリズムは、限定されないが、医療デバイス、臨床評価スコア、または生物学的試料の生物学的／化学的／物理的試験を使用して定量化することができる複数のパラメータを組み込んだ数学関数であり得る。各数学関数は、選択された臨床状態に関連すると判定されたパラメータのレベル（例えば、測定されたレベル）の重み付け調整された表現であり得る。複数のマーカーパネルの重み付けおよび評価に関連する技術のために、合理的な計算能力を有するコンピュータを使用してデータを分析することができる。
【００７２】
したがって、診断方法は、大腸癌の危険性があるか、またはその疑いがある患者から糞便試料を採取することと、図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）から選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現を判定することと、予め定義された係数を有する結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のパネルのうちのいずれかから選択される複数の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子を組み込んだ機械学習アルゴリズムによって試験値を提供することと、を含み得る。例示的な機械学習アルゴリズムには、サポートベクターマシン、グラジエントブースト、アダプティブブースト、ランダムフォレスト、ナイーブベイズ、ディシジョンツリー、およびｋ最近傍が含まれる。対照、例えば健康な個体の集団に対する複数の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現の有意な変化は、患者が大腸癌および／または前癌性病変を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態では、試料中で測定された発現レベルを使用して、確率または信頼性スコアを導出または計算する。この値は、発現レベルから導出することができる。代替的に、または加えて、値は、発現値と他の要因、例えば、患者の病歴、年齢、および遺伝的背景との組み合わせから導出することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、検査値を患者に伝達する工程をさらに含み得る。
【００７３】
本明細書に記載される方法を実施するために、例えば、本明細書に記載される値を判定するために必要な計算を実施するために、標準的なコンピューティングデバイスおよびシステムを使用および実装する、例えば、好適にプログラムすることができる。コンピューティングデバイスには、ラップトップ、デスクトップ、モバイルデバイス、ワークステーション、パーソナルデジタルアシスタント、サーバ、ブレードサーバ、メインフレーム、および他の適切なコンピュータなどの様々な形態のデジタルコンピュータが含まれる。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、携帯情報端末、携帯電話、スマートフォン、タブレット、または他の同様のコンピューティングデバイスなどのモバイルデバイスである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、コンピュータを使用して、例えば医療従事者に情報を伝達することができる。情報は、その情報を電子的に利用可能にすることによって（例えば、安全な様式で）専門家に伝達することができる。例えば、健康管理専門家が情報にアクセスできるように、情報をコンピュータデータベースに配置することができる。加えて、情報は、専門家の代理人として働く病院、診療所、または研究施設に伝達することができる。オープンネットワーク（例えば、インターネットまたは電子メール）を介して転送される情報は、暗号化することができる。患者の遺伝子発現データおよび分析は、暗号化してクラウド内に保存することができる。改ざん防止機能を備えた２５６ビットＡＥＳ方式は、ディスクの暗号化に使用することができ、ＳＳＬプロトコルは、データ転送における保護を確実にすることができ、鍵管理技術ＳＨＡ２−ＨＭＡＣは、データへの認証されたアクセスを許可することができる。他の安全なデータ記憶手段も、使用することができる。
【００７５】
上記のそのような分析の結果は、担当臨床医による追跡および治療の基礎となり得る。図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）から選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルが、対照における同じ２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカーの発現レベルと有意に異ならない場合、臨床医は、患者が現在大腸癌または前癌性病変の危険性がないと判定し得る。そのような患者は、再スクリーニングのために将来来訪することを奨励される可能性がある。本明細書に開示される方法を使用して、結腸直腸新生物マーカーのレベルの経時的な任意の変化を監視することができる。対象は、最初のスクリーニングおよび／または診断後の任意の期間にわたって監視され得る。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０ヶ月もしくはそれ以上、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０年もしくはそれ以上の間監視され得る。
【００７６】
本明細書に開示される方法および組成物は、結腸直腸新生物の危険性があるか、またはそれを罹患している対象についての臨床計画を選択するために有用である。臨床計画は、さらなる診断手順の投与、例えば、便潜血検査、便免疫化学検査、またはポリープもしくは前癌性病変を除去するための結腸鏡検査を含み得る。いくつかの実施形態では、臨床計画は、治療方法を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、大腸癌を有する対象についての治療を選択する方法を含む。図６（パネルＡ）または図１３（パネルＢ）から選択される２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルが、対照中の同じ２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルと有意に異なる場合、患者は大腸癌を有する可能性がある。これらの例では、さらなるスクリーニング、例えば、本明細書に開示される方法を使用したスクリーニングの頻度の増加、ならびに胎児潜血検査、便免疫化学検査、および／または結腸鏡検査が推奨され得る。いくつかの実施形態では、例えば、ポリープの除去を伴う結腸鏡検査、化学療法、または腸切除などの手術を含む治療が推奨され得る。したがって、本方法を使用して、２つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを判定し、次に、治療方針を判定することができる。対象、すなわち患者は、臨床的に有益な結果が起こるときはいつでも効果的に治療される。これは、例えば、疾患の症状の完全な解消、疾患の症状の重症度の低下、または疾患の進行の遅延を意味し得る。これらの方法はさらに、ａ）大腸癌を有する対象（例えば、患者、より具体的にはヒト患者）を同定する工程と、ｂ）抗癌治療、例えば、治療薬、外科手術、または放射線療法を対象に提供する工程と、を含み得る。疾患の症状の完全な解消、疾患の症状の重篤度の低下、または疾患の進行の遅延をもたらす対象に提供される治療薬の量は、治療上効果的な量と見なされる。本方法はまた、投薬およびスケジューリングを最適化し、ならびに結果を予測するのを助けるための監視工程を含み得る。監視を使用して、薬物耐性の発症を検出し、応答性の患者を非応答性の患者から迅速に区別し、または癌の再発を評価することもできる。抵抗性もしくは無反応性の徴候がある場合、臨床医は、腫瘍が追加の逃避機構を発症する前に代替もしくは補助剤を選択し得る。
【００７７】
本明細書に開示される方法はまた、大腸癌の診断および治療に対する従来の方法と組み合わせて使用することもできる。したがって、診断方法は、大腸癌の標準的な診断方法と一緒に使用することができる。例えば、本方法は、便潜血検査、便免疫化学検査、または結腸鏡検査と組み合わせて使用することができる。本方法はまた、他の大腸癌マーカー、例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ｐ５３、ＭＳＬ、ＤＣＣ、およびＭＭＲと共に使用することもできる。
【００７８】
本明細書に開示される診断方法はまた、大腸癌治療と組み合わせて使用することもできる。大腸癌の治療法は、いくつかの一般的なカテゴリー：外科手術、化学療法、放射線療法、標的指向化療法、および免疫療法に分類される。外科手術には、結腸切除術、部分肝切除術を伴う人工肛門形成術、または保護術が含まれ得る。化学療法は、全身化学療法、または化学療法剤が罹患臓器に直接近接して配置される局所化学療法であり得る。例示的な化学療法剤には、５−フルオロウラシル、オキサリプラチンもしくはその誘導体、イリノテカンもしくはその誘導体、ロイコボリン、またはカペシタビン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、およびドキソルビシンが含まれ得る。放射線療法は、放射線を癌に向けるための機械を使用する外部放射線療法、または放射性物質を大腸癌の中に直接または近くに配置する内部放射線療法であり得る。標的薬としては、ベバシズマブ）もしくはＥＧＦＲ阻害剤モノクローナル抗体（セツキシマブ、パニツムマブ）、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）、アフリベルセプト、レゴラフェニブ、トリフルリジン−チピラシルなどの抗血管新生剤、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。標的薬はまた、標準的な化学療法薬と組み合わせることもできる。免疫療法は、特異的抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ−１抗体、およびｔｉｍｅ−ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２７抗体、癌ワクチン、養子細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、アジュバント免疫療法、ならびにサイトカインベースの療法の投与を含み得る。他の治療方法としては、幹細胞移植、温熱療法、光線力学療法、血液製剤の提供および輸血、またはレーザー治療が挙げられる。
【００７９】
本発明者らは、「増加された」、「増加」、または「上方調節された」という用語を、一般に、統計的に有意な量によるバイオマーカーのレベルの増加を意味するために使用する場合がある。いくつかの実施形態では、増加は、対照と比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大１００％を含む増加、または対照と比較して１０〜１００％の間の任意の増加、または少なくとも約０．５倍、もしくは少なくとも約１．０倍、もしくは少なくとも約１．２倍、もしくは少なくとも約１．５倍、もしくは少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、あるいは１．０倍〜１０倍またはそれ以上の間の任意の増加であり得る。
【００８０】
本発明者らは、「減少」、「減少された」、「低下された」、「低下」、または「下方調節された」という用語を、統計学的に有意な量による真核生物バイオマーカーのレベルの減少を指す。いくつかの実施形態では、減少は、対照と比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大１００％を含む減少（すなわち、対照と比較して存在しないレベル）、または対照と比較して１０〜１００％の間の任意の減少、または少なくとも約０．５倍、もしくは少なくとも約１．０倍、もしくは少なくとも約１．２倍、もしくは少なくとも約１．５倍、もしくは少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の減少、あるいは対照と比較して１．０倍〜１０倍の間の任意の減少であり得る。
【００８１】
真核生物バイオマーカーの増加または真核生物バイオマーカーの減少の統計的有意性は、ｐ値として表現することができる。特定の真核生物バイオマーカーに応じて、ｐ値は、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、０．００２未満、０．００１未満、または０．０００５未満であり得る。
【００８２】
対照は、患者または患者群から得られた生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態では、対照は、基準値であり得る。対照は、健康であると診断された個体または個体の集団から得ることができる。健康な個体には、例えば、前年以内に便寄生虫検査、便細菌検査、または内視鏡検査で陰性と判定された個体が含まれ得る。対照は、罹患していると診断された個体または個体の集団から得ることができる。罹患している個体には、例えば、前年以内に便寄生虫検査、便細菌検査、または内視鏡検査で陽性と判定された個体が含まれ得る。対照は、先に罹患していると診断されたが、現在は寛解しているか、または現在は疾患を罹患していない個体または個体の集団から得ることができる。対照は、一つ、二つまたはそれ以上の時点で個体から得ることができる。例えば、対照は、より以前の時点で対象から得られた生物学的試料であり得る。対照は、特定のバイオマーカーに対する標準的な基準値であり得る。標準的な基準値は、同年齢、性、性別、体格、種族、民族的背景、または一般的な健康状態の個人を評価することに基づいて導出することができる。
【００８３】
実験試料は、対象から得られた生物学的試料であり得る。実験試料は、既知または未知の健康状態を有する対象から得られ得る。いくつかの実施形態では、対象の健康状態は、例えば、実験試料の分析、生検、身体検査、臨床検査結果、目視検査、または遺伝子分析によって判定され得る。実験試料を介して判定され得る対象の健康状態は、罹患しているか、疾患の危険性があるか、または健康であり得る。
【００８４】
製造品
生物学的試料、例えば糞便試料中の選択された結腸直腸新生物バイオマーカーを検出および定量化するためのキットも提供する。したがって、包装された製品（例えば、本明細書に記載される組成物のうちの１つ以上を含み、かつ濃縮または使用準備の整った濃度で貯蔵、出荷、または販売用に包装されている滅菌容器）およびキットも、本発明の範囲内である。製品は、本発明の１つ以上の組成物を含有する容器（例えば、バイアル、ジャー、ボトル、バッグ、マイクロプレート、マイクロチップ、またはビーズ）を含み得る。加えて、製造品は、例えば、包装材料、使用説明書、注射器、送達デバイス、緩衝液、または他の制御試薬をさらに含み得る。
【００８５】
キットは、生物学的試料中の、図６（パネルＡ）もしくは図１３（パネルＢ）から選択される結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちの２つ以上に対応するＲＮＡを検出することができる化合物もしくは薬剤、標準器、および任意選択的に、検出、定量化、もしくは増幅を実施するために必要な１つ以上の試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、生物学的試料中のＢ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、もしくは免疫グロブリンのうちの２つ以上に対応するＲＮＡを検出することができる化合物もしくは薬剤、標準器、および任意選択的に、検出、定量化、もしくは増幅を実施するために必要な１つ以上の試薬を含み得る。化合物、薬剤、および／または試薬は、好適な容器に包装され得る。キットはさらに、核酸を検出および定量化するためにキットを使用するための説明書を含み得る。例えば、キットは、（１）図６（パネルＡ）もしくは図１３（パネルＢ）から選択される結腸直腸バイオマーカー遺伝子のうちの２つ以上、またはＢ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、もしくは免疫グロブリンに対応する核酸配列にハイブリダイズする、プローブ、例えば、オリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、あるいは（２）図６（パネルＡ）もしくは図１３（パネルＢ）から選択される結腸直腸バイオマーカー遺伝子のうちの２つ以上、またはＢ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、もしくは免疫グロブリンに対応する核酸分子を増幅させるのに有用な一対のプライマーを含み得る。キットはさらに、１つ以上のハウスキーピング遺伝子を増幅させるのに有用なプローブおよびプライマーを含み得る。キットはまた、緩衝剤、保存料、および／または核酸もしくはタンパク質安定化剤を含み得る。キットはまた、検出可能な薬剤（例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含み得る。キットはまた、アッセイされ得、かつ含有された試験試料と比較され得る、対照または一連の対照を含み得る。キットを使用して実施されたアッセイの結果を解釈するための説明書と共に、キットの各構成要素を個々の容器内に封入することができ、様々な容器のうちのすべてを単一のパッケージ内に入れることができる。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の対照マーカーに特異的なプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、図６（パネルＡ）もしくは図１３（パネルＢ）から選択される結腸直腸バイオマーカーのうちの２つ以上、またはＢ細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、もしくは免疫グロブリンの定量化に特異的な試薬を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、キットは、細菌細胞および他の糞便成分からのヒト細胞の分離、ならびに患者の糞便試料からのヒトｍＲＮＡの抽出に特異的な試薬を含み得る。したがって、キットは、緩衝液、エマルジョンビーズ、シリカビーズ、安定化試薬、および遠心分離用の様々なフィルタおよび容器を含み得る。キットはまた、試料の汚染を最小限に抑え、かつ糞便試料中のヒトｍＲＮＡの安定性を確実にするための糞便取り扱いのための説明書を含み得る。キットはまた、試料の保存を確実にするためのアイテム、例えば、冷却剤またはヒートパックを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、糞便回収デバイスを含み得る。
【００８７】
製品はまた、説明文（例えば、印刷された標識もしくは挿入物、または製品の使用を記載する他の媒体（例えば、音声もしくはビデオテープまたはコンピュータ読み取り可能媒体））を含み得る。説明文は、容器に関連付けられ（例えば、容器に固定され）、試薬が使用され得る様式を記載することができる。試薬は、使用準備の整っている（例えば、適切な単位で存在する）ことができ、かつ１つ以上の追加のアジュバント、担体、または他の希釈剤を含み得る。代替的に、試薬は、希釈剤および希釈のための説明書と共に濃縮形態で提供され得る。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ヒト糞便試料調達
ヒト糞便回収：患者は、便座の上に適合するバケツ内に排便するように依頼され、得られた試料は、それらがハリコフ国立医学大学（ウクライナ国ハリコフ）に輸送されるまで冷凍庫に保存された。糞便を５０ｍＬコニカルチューブに分注し、−８０℃で保存した。試料は、ドライアイス上でハリコフ国立医科大学からＣａｐｉｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）に出荷され、すぐに−８０°Ｃの冷凍庫に移された。そこから、試料は、それらが抽出まで−８０°Ｃの冷凍庫に保存されたＢｉｏＧｅｎｅｒａｔｏｒ  Ｌａｂｓ（米国ミズーリ州セントルイス）にドライアイス上で出荷された。
【００８９】
ヒト試料の種類：直腸結腸癌患者１９５人（ステージＩ〜ＩＶ）、前癌性腺腫患者１２６人、結腸鏡検査で陰性の所見患者１２５人、良性ポリープ患者８人から糞便試料を得、結果として４５４の集約試料を得た。健康な個体は、大腸癌、炎症性腸疾患、セリアック病、過敏性腸症候群、過去２０日以内の下痢、または任意の他の胃腸疾患の病歴のない患者であった。罹患している個体は、大腸癌および前癌性ポリープと診断された患者であった。大腸癌患者は、前月内に結腸鏡検査およびその後の生検によりＩ期〜ＩＶ期の大腸癌と診断されており、かつ化学療法、放射線療法、および／または外科手術を含み得るいかなる生検後治療をまだ受けていない。結腸鏡検査を受ける前に、ポリープ患者は糞便試料を提供し、医師は、その後の生検および組織学的評価によって前癌性であると考えられたポリープを検出した。健康な個体は、性別および年齢の階層（５０〜６０歳、６０〜７０歳、７０〜８０歳、および８０〜９０歳）に基づいて、ポリープおよび癌患者とマッチングされた。この研究に使用された患者は、Ｃａｐｉｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって同意された。Ｓｃｈｕｌｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄは、この研究の倫理的監督を提供した。
【００９０】
実施例２：ヒト核酸抽出
総核酸抽出：各糞便試料を５０ｍＬコニカルチューブ内に置いた。各チューブに、約１，０００〜２５，０００ｍｇの糞便を添加した。追加の２０〜４０ｍＬの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０００２％ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との混合物を含有した。糞便を溶液中に懸濁し、０〜１０分間、約０〜１０℃で回転させた。溶液を１０分間４℃にて１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。約４〜１０ｍＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をペレットに添加し、ペレットを溶液に再懸濁した。溶液を、１０〜１５分間２０〜２５℃にて２５００〜３５００ｒｐｍで遠心分離した。分画遠心分離の間に、溶液は３層に分離した。最下層は固体の細胞破片を含み、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。上部の２層は、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移し、溶液を再び１０分間２０〜２５℃にて２５００ｒｐｍで遠心分離した。この遠心分離工程による結果は、３層への分離であった：最下層は固体の細胞破片であり、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。溶液から大きな破片をふるい分けるために、２０μＬピペットチップを１ｍＬピペットチップ上に置き、２ｍＬの親水性層を１５ｍＬチューブからピペットで移し、ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に移した。加えて、６０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを０．５〜１分間溶液中に混合した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は７０μＬであった。この核酸溶液を１．５ｍＬチューブにピペットで移し、氷上に置いた。次に、前の工程で使用されたものと同じＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に、同じ大きな破片をふるい落とす技術を使用して、前に使用された１５ｍＬチューブ中の同じ溶液からの２ｍＬの追加の親水性層を再装填した。追加の２０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを０．５〜１分間溶液中に混合した。上記に記載されるように、ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は７０μＬであった。この核酸溶液を、最初の７０μＬの溶出液を既に含有している元の１．５ｍＬチューブにピペットで移し、合わせた溶液を氷上に置いた。
【００９１】
ＤＮＡｓｅ処理：１４０μＬの溶液を、ベースラインゼロＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いて３５〜４０℃で２０〜４０分間処理した。ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液の１〜２ｍＬアリコートをＤＮＡｓｅ処理溶液に添加し、試料を新しいＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジに移した。溶液全体を６０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカと共に新しいカートリッジに添加した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従ってＥａｓｙＭａｇ（登録商標）ジェネリックプロトコルを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は２５μＬであった。この核酸溶液を１．５ｍＬチューブにピペットで移し、０〜６℃で保存した。
【００９２】
実施例３：ヒト糞便試料中のヒト核酸レベルの測定
抽出結果：上記で抽出された試料を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、総核酸およびＲＮＡ完全性について１μＬを評価した。試料を定性的および定量的に分析した。電気泳動分析を使用して、抽出されたＲＮＡの質を調べた。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの出力の結果を、図１および図２に示されるように、ゲル電気泳動によって分析した。電気泳動ファイル（図１）は、各試料のバンドをＲＮＡラダーのサイズマーカーで表されるバンド（電気泳動図の最初のレーンに示される）と比較し、かつ１８Ｓおよび２８ＳのリボソームＲＮＡバンドを同定することによって読み取られた。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、標準化ラダー上の２，０００個のヌクレオチドマーカーの周りの２つの大きく目立つバンドである。定性的には、適切なバンド形成およびより暗いバンド強度は、十分な無傷の核酸が、マイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉などのさらなる分析に利用可能であることを示した。図２は、電気泳動図の例を示す。電気泳動図は、総ＲＮＡ質量、ＲＩＮ、および総ｒＲＮＡ質量の定量化を伴う各電気泳動のグラフ表示である。ゲル電気泳動分析は、総核酸およびＲＮＡ完全性についての情報を提供した。試料が下流の分析に適格であるかどうかを判定するために、電気泳動ダイヤグラムおよび電気泳動図を各試料について分析した。一例では、本発明に記載される方法を使用して抽出された１２０個の試料を、分析された１２０個の試料のうちの１１０個がＲＮＡ完全性およびＲＮＡ質量に関して品質チェックに合格するようにＲＮＡ品質について分析した（図３）。
【００９３】
電気泳動図および電気泳動トレースを使用して、文献に記載されたＲＮＡ抽出方法と比較して、本発明に記載されるＲＮＡ抽出方法を使用して品質チェックに合格した試料を比較した。文献に記載されたプロトコルと比較して、上記に記載される核酸抽出法は、４．８８（ｎ＝１６８）まで平均ＲＩＮを増加させた。加えて、プロトコルを完了するために必要な合計時間は、３日間〜５時間に短縮された。総ＲＮＡ抽出法は、文献に記載されるような５０％からのトランスクリプトーム解析に適格な試料の数を、リボゾームＲＮＡ完全性および質量によって測定されるような記載されるプロトコル（ｎ＝１６８、ｐ＜０．０００１）において９８．２％まで増加させた（図４）。
【００９４】
実施例４：ＲＮＡ転写物の分析
総ＲＮＡ抽出に供された４５４個の試料のうち、これらの試料のうちの３９９個の試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用したリボソームＲＮＡバンドの直接可視化に基づくトランスクリプトーム分析に適格であった。続いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０（米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して全トランスクリプトーム分析を行うために、３９９個の利用可能な試料から３４２個の試料を無作為に選択した。これらの３４２個の試料のうち、４個の試料は増幅に失敗し、８人のポリープ患者は、その後の生検で過形成良性ポリープを有すると判定された。これら１２個の試料を分析から除外し、最終分析用に３３０個の試料を得た。
【００９５】
製造者のプロトコルに従って、その後のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０へのハイブリダイゼーションと共に、約１００ｎｇのＤＮａｓｅを含まない便ＲＮＡをＡｍｂｉｏ  ＷＴ−ｐｉｃｏキットで増幅させた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（商標）を用いた信号スペーストランスフォーメーションロバストマルチアレイ分析（ＳＳＴ−ＲＭＡ）を使用して、すべての試料を正規化した。
【００９６】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ中の７０，５２３個の転写物クラスターのうち、３，９７７個の遺伝子に対応する５，１４９個の転写物クラスターのサブセットを予め選択して、示差的発現について評価した。この最初の選択は、誤った発見率を減らし、癌の発症および進行において既知の機能を持たない遺伝子を除外した。結腸直腸新生物の検出のために、７つの機械学習分類器（サポートベクターマシン、グラジエントブースト、アダプティブブースト、ランダムフォレスト、ナイーブベイズ、ディシジョンツリー、およびｋ最近傍）を調べた。
【００９７】
３３０人の個人を２６５人の個人の訓練セットと６５人の個人の試験セットに分けた。訓練セットを使用して、示差的に発現される遺伝子を同定し、かつ計算モデルを構築し、試験セットを使用して、計算モデルの検出精度を判定した。標準的なＬＩＭＭＡパッケージを使用して、前癌性腺腫またはＣＲＣのいずれかを有する個体と結腸鏡検査で所見がない個体との間で示差的に発現されるＲＮＡ転写物クラスターのサブセットを同定した。すべてのバイオマーカーを対数オッズスコアに従ってランク付けし、２００個の最高ランクのバイオマーカー（ｐ＜０．０５）を、機械学習モデルを構築する際の特徴として役立てた（図４）。これらの遺伝子の階層的クラスター化を記載するヒートマップを図５Ａに要約し、示差的に発現される遺伝子に関連する重要な経路を図５Ｂに要約する。結腸直腸新生物を有する個体を健康な個体から分離するために、３つの集団内で示差的に発現される転写物に関連する５つの遺伝子クラスターがあった。示差的に発現される経路は、大部分（７７．７％）が細胞成分経路の上方調節である２２個の一般的なＧｅｎｅＧＯ標準経路についての濃縮を示した。最も注目に値するのは、ストレスに対する細胞応答、ストレスに対する応答、およびＲＮＡ結合の上方調節であった。疾患に関連する一般的な経路を、ＧＡＧＥソフトウェアを用いて、示差的に発現される上位２００個の転写物クラスターを分析することによって同定した。この疾患に関連する経路を図５Ｂに示す。サポートベクターマシンモデル（ν−ＳＶＭ）とＲＢＦカーネルを、モデル開発のために選択した。カーネル関数は、明示的に計算されていない、より高次元の空間に特徴を拡張することによって、個人間の距離の計算を可能にする。ＳＶＭは、標識グループを区切る最大マージン超平面を見つける。パラメータνは、最大マージンを判定するために使用される個人の割合の下限を規定する。ＳＶＭモデルは、訓練セット内の２６５人すべての個体からの２００個の転写物についての発現レベルを使用して訓練された。この複数標的ＲＮＡバイオマーカーアルゴリズムは、試験セット内の６５人の個人に使用され、スクリーニング結腸鏡検査で陽性所見を示した全個人の７９％（４３人中３４人）を検出した。このアルゴリズムは、５ｍｍ〜１２ｍｍの範囲のサイズの前癌性腺腫を有する個体の９５％、Ｉ期の大腸癌を有する個体の５７％、ＩＩ期の大腸癌を有する個体の７５％、ＩＩ期の大腸癌を有する個体の６６％、およびＩＶ期の大腸癌を有する個体の８３％を正確に予測した。大腸癌に対するモデルの感度は、サイズと直接相関しており、そのため、３．５ｃｍ以下の腫瘍の６０％が正確に検出され、一方、５．０ｃｍ以上の腫瘍の８３％が正確に検出された。このモデルは５９％の特異度を達成し、それによって結腸鏡検査で陰性の所見を有する２２人の個人のうちの１３人がモデルによって正確に同定された。全体として、このモデルは、７９％の結腸直腸新生物に対する感度、９５％の前癌性腺腫に対する感度、および５９％の特異度を達成した。
【００９８】
技術的および生物学的複製物は、すべての遺伝子について発光レベルに関して高い一致を示した（図１０）。ＲＮＡを単離し、同じ日に評価したところ、完璧な技術的複製物は、最高レベルの一致（Ｒ２＞０．９９０）を示した（図１０Ａ）。時間的に分離された技術的複製物もまた、高レベルの一致（Ｒ２＞０．９８９）を示した。これらの複製物は、同じ日に両方の複製物についてＲＮＡを抽出することによって得られたが、１つの複製物は０日目に分析され、２つ目の複製物は６ヶ月後に分析された（図１０Ｂ）。最後に、生物学的複製物もまた、高レベルの一致（Ｒ２＞０．９８６）を示した。これらの生物学的複製物は、同じ個体に由来する糞便の異なるセグメントから試料を採取することによって開発された（図１０Ｃ）。ＲＮＡを別々に抽出し、異なる日に分析した。
【００９９】
大腸癌の発症または進行に関与している５，１４９個の遺伝子のみを分析すると、全トランスクリプトームのサブセット、調整されたＲ二乗値は、３つの複製物のコホートすべてについて改善された。これらの複製物は、上記に記載されるような同程度のレベルの一致を示した（図１１Ａ〜Ｃ）。
【０１００】
実施例５：動物糞便試料調達
糞便回収：試料は、ネコおよびイヌの飼い主によって米国ミズーリ州セントルイスの地元で回収された。ネコがトイレに排便後、ネコの所有者は、−２０℃で５０ｍＬコニカルチューブ中に試料を移し、チューブを保存するように依頼された。イヌが屋外で排便後、イヌの所有者は、−２０℃で５０ｍＬコニカルチューブ中に試料を移し、チューブを保存するように依頼された。回収の一週間以内に、試料を回収し、それらを抽出まで−８０℃の冷凍庫に保存されたＢｉｏＧｅｎｅｒａｔｏｒ  Ｌａｂｓ（米国ミズーリ州セントルイス）に手動で移した。
【０１０１】
試料の種類：糞便試料はすべて、年齢、品種、および性別の異なる健康な動物から採取された。４匹の異なるネコから４つの試料を採取し、４匹の異なるイヌから追加の４つの試料を採取し、８つの凝集体試料を得た。１匹のネコが最近白癬と診断されたが、他のすべての動物は無症候性であり、最後の３０日以内に胃腸の苦痛の徴候を全く示さなかった。
【０１０２】
実施例６：動物核酸抽出
総核酸抽出：各糞便試料を５０ｍＬコニカルチューブ内に置いた。各チューブに、約１，０００〜２５，０００ｍｇの糞便を添加した。追加の２０〜４０ｍＬの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０００２％ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との混合物を含有した。糞便を溶液中に懸濁し、０〜１０分間、約０〜１０℃で回転させた。溶液を１０分間４℃にて１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。約４〜１０ｍＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をペレットに添加し、ペレットを溶液に再懸濁した。溶液を、１０〜１５分間２０〜２５℃にて２５００〜３５００ｒｐｍで遠心分離した。分画遠心分離の間に、溶液は３層に分離した。最下層は固体の細胞破片を含み、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。上部の２層は、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移し、溶液を再び１０分間２０〜２５℃にて２５００ｒｐｍで遠心分離した。この遠心分離工程による結果は、３層への分離であった：最下層は固体の細胞破片であり、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。溶液から大きな破片をふるい分けるために、２０μＬピペットチップを１ｍＬピペットチップ上に置き、２ｍＬの親水性層を１５ｍＬチューブからピペットで移し、ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に移した。加えて、６０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを０．５〜１分間溶液中に混合した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は７０μＬであった。この核酸溶液を１．５ｍＬチューブにピペットで移し、氷上に置いた。次に、前の工程で使用されたものと同じＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に、同じ大きな破片をふるい落とす技術を使用して、前に使用された１５ｍＬチューブ中の同じ溶液からの２ｍＬの追加の親水性層を再装填した。追加の２０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを０．５〜１分間溶液中に混合した。上記に記載されるように、ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は７０μＬであった。この核酸溶液を、最初の７０μＬの溶出液を既に含有している元の１．５ｍＬチューブにピペットで移し、合わせた溶液を氷上に置いた。
【０１０３】
ＤＮＡｓｅ処理：１４０μＬの溶液を、ベースラインゼロＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いて３５〜４０℃で２０〜４０分間処理した。ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液の１〜２ｍＬアリコートをＤＮＡｓｅ処理溶液に添加し、試料を新しいＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジに移した。溶液全体を６０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカと共に新しいカートリッジに添加した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従ってＥａｓｙＭａｇ（登録商標）ジェネリックプロトコルを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は２５μＬであった。この核酸溶液を１．５ｍＬチューブにピペットで移し、０〜６℃で保存した。
【０１０４】
実施例７：動物糞便試料中の核酸レベルの測定
抽出結果：上記で抽出された試料を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、それぞれ１μＬの総核酸およびＲＮＡ完全性について評価した。試料を定性的および定量的に分析した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの出力の結果を、図７に示されるように、ゲル電気泳動によって分析した。図７のパネルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキットを使用して実験された８つの試料からの１μＬのＲＮＡのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースを示す。ゲル電気泳動分析は、総核酸ならびにＲＮＡ完全性および質量に関する情報を提供した。電気泳動ファイルは、各試料のバンドをＲＮＡラダー内のサイズマーカーによって表されるバンド（電気泳動図の最初のレーンに示される）と比較し、かつ１８Ｓおよび２８Ｓ真核生物リボソームＲＮＡバンドを同定することによって読み取られた。定性的には、適切なバンド形成およびより暗いバンド強度は、十分な無傷の核酸が、マイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉などのさらなる分析に利用可能であることを示した。試料の品質も、ＲＮＡ完全性数を使用して定性的に分析した。図７Ｂは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキットを使用して実験された同じ８つの試料それぞれのＲＮＡ完全性値を示す。試料質量も定量的に分析した。図７Ｃは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキットを使用して実験された同じ８つの試料からの推定真核生物ＲＮＡ濃度（μｇ／μＬ）を示す。真核生物のＲＮＡ濃度を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒトレースの曲線下面積を使用して推定した。図７Ｂ〜Ｃに示されるように、すべての試料についての平均ＲＩＮは４．２であり、すべての試料についての平均真核生物質量は６１．４ｎｇ／μＬであった。定量的および定性的測定は、すべての試料がバイオマーカー発現分析に適格である（ｎ＝８）ことを示した。
【０１０５】
実施例８：動物糞便試料中のＲＮＡ転写物の分析
バイオマーカー発現分析に適格である（ｎ＝４）すべてのイヌ試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して評価した。これら４つのイヌ試料について、５つのプライマーを設計して、イヌゲノムの一部分を評価した。イヌＴ細胞上のＩｇＭの重鎖を評価することによって陽性対照として作用するように２つのプライマーを設計した。３つの追加のプライマーを設計し、イヌリンパ球前駆体において起こり得る２つの別々の再配列を評価してＴ細胞特異的ＲＮＡを検出した。各ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１０μＬの２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１μＬの２０Ｘ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＬの１０μＭフォワードプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、０．８μＬの１０μＭリバースプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１μＬの２０Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２μＬのＲＮＡ、および４．４μＬの分子生物学グレードＨ２Ｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５  ｑＰＣＲ装置を使用して、核酸を増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった：ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するために５５℃で２５分、９５℃で１分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために９５℃で１０秒および６０℃で４５秒の６０サイクル、ならびに次に、７０℃〜９５℃の融解曲線。総ＲＮＡ抽出に供された４つのイヌ試料のうち、７５％の試料が陽性対照（Ｃ−ｍｕ  ＩｇＭ）の増幅を示した（図８Ａ）。陽性対照の増幅を示した個体のうち、１００％（ｎ＝３）が両方のＴ細胞特異的ＲＮＡ転写物の増幅を示した。Ｔ細胞特異的転写物の一方は３５サイクルで増幅し、他方のＴ細胞特異的転写物は５０サイクルで増幅した（図８Ｂ）。
【０１０６】
バイオマーカー発現分析に適格であった（ｎ＝５）すべてのネコ試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して評価した。これら４つのネコ試料について、２つのプライマーを陽性対照として作用するように設計した。これらのプローブは、ネコアクチンＢを評価して、核酸抽出物中にネコＲＮＡが存在するかどうかを判定した。各反応は以下を含んだ：１０μＬの２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１μＬの２０Ｘ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＬの１０μＭフォワードプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、０．８μＬの１０μＭリバースプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１μＬの２０Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２μＬのＲＮＡ、および４．４μＬの分子生物学グレードＨ２Ｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。溶液をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５  ｑＰＣＲ装置を用いて増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった：ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するために５５℃で２５分、９５℃で１分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために９５℃で１０秒間および次に６０℃で４５秒間の６０サイクル。総ＲＮＡ抽出に供された４つのネコ試料のうち、７５％の試料（ｎ＝４）が陽性対照（ネコアクチンＢ）の増幅を示した（図９）。
【０１０７】
実施例９：イヌＢ細胞転写物の分析
バイオマーカー発現分析に適格である（ｎ＝４）すべてのイヌ試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して評価した。これら４つのイヌ試料について、６つのプライマーセットを設計して、リンパ球に関連するイヌゲノムの一部分を評価した（図１５Ａ）。設計された６つのプライマーセットのうち、１つのプライマーセットを使用して、イヌリンパ球前駆体において起こり得る２つの別々の再配列を評価してＢ細胞特異的ＲＮＡを検出した。各反応は、１０μＬの２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１μＬの２０Ｘ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＬの１０μＭフォワードプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、０．８μＬの１０μＭリバースプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１μＬの２０Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２μＬのＲＮＡ、および４．４μＬの分子生物学グレードＨ２Ｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５  ｑＰＣＲ装置を使用して、溶液を増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった：ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するために５５℃で２５分、９５℃で１分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために９５℃で１０秒および６０℃で４５秒の６０サイクル、ならびに次に７０℃〜９５℃の融解曲線。これらの増幅反応の例を図１６Ａに示す。各試料について２つのＢ細胞特異的ＲＴ−ｑＰＣＲ反応があり（ｎ＝８）、これらの反応のうち、８７．５％（８つのうちの７つ）がＢ細胞関連転写物の増幅を示した。Ｂ細胞特異的転写物は、３０〜３５サイクルの間に増幅した（図１６Ａ）。
【０１０８】
実施例１０：ネコ試料複製物の抽出
糞便回収：試料は、ネコの飼い主によってミズーリ州セントルイスの地元で回収された。ネコがトイレに排便後、ネコの所有者は、−２０℃で５０ｍＬコニカルチューブ中に試料を移し、チューブを保存するように依頼された。産生の一週間以内に、試料を回収し、それらを抽出まで−８０°Ｃの冷凍庫に保存されたＢｉｏＧｅｎｅｒａｔｏｒ  Ｌａｂｓ（米国ミズーリ州セントルイス）に手動で移した。
【０１０９】
試料の種類：糞便試料はすべて、年齢、品種、および性別の異なる健康な動物から採取された。４匹の異なるネコから８つの試料を回収した。一部のネコでは、最大３つの生物学的複製物を回収した。我々は、生物学的複製物を別々の腸の動きから回収された同じネコ由来の糞便試料と呼ぶ。１匹のネコが最近白癬と診断されたが、他のすべての動物は無症候性であり、最後の３０日以内に胃腸の苦痛の徴候を全く示さなかった。
【０１１０】
総核酸抽出：各糞便試料を５０ｍＬコニカルチューブ内に置いた。各チューブに、約１，０００〜２５，０００ｍｇの糞便を添加した。追加の２０〜４０ｍＬの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０００２％ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との混合物を含有した。糞便を溶液中に懸濁し、０〜１０分間、約０〜１０℃で回転させた。溶液を１０分間４℃にて１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。約４〜１０ｍＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をペレットに添加し、ペレットを溶液に再懸濁した。溶液を、１０〜１５分間２０〜２５℃にて２５００〜３５００ｒｐｍで遠心分離した。分画遠心分離の間に、溶液は３層に分離した。最下層は固体の細胞破片を含み、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。上部の２層は、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移し、溶液を再び１０分間２０〜２５℃にて２５００ｒｐｍで遠心分離した。この遠心分離工程による結果は、３層への分離であった：最下層は固体の細胞破片であり、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。溶液から大きな破片をふるい分けるために、２０μＬピペットチップを１ｍＬピペットチップ上に置き、２ｍＬの親水性層を１５ｍＬチューブからピペットで移し、ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に移した。加えて、６０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを０．５〜１分間溶液中に混合した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は７０μＬであった。この核酸溶液を１．５ｍＬチューブにピペットで移し、氷上に置いた。次に、前の工程で使用されたものと同じＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に、同じ大きな破片をふるい落とす技術を使用して、前に使用された１５ｍＬチューブ中の同じ溶液からの２ｍＬの追加の親水性層を再装填した。追加の２０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを０．５〜１分間溶液中に混合した。上記に記載されるように、ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は７０μＬであった。この核酸溶液を、最初の７０μＬの溶出液を既に含有している元の１．５ｍＬチューブにピペットで移し、合わせた溶液を氷上に置いた。
【０１１１】
ＤＮＡｓｅ処理：１４０μＬの溶液を、ベースラインゼロＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いて３５〜４０℃で２０〜４０分間処理した。ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液の１〜２ｍＬアリコートをＤＮＡｓｅ処理溶液に添加し、試料を新しいＥａｓｙＭａｇ（登録商標）使い捨てカートリッジに移した。溶液全体を６０μＬのＥａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカと共に新しいカートリッジに添加した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従ってＥａｓｙＭａｇ（登録商標）ジェネリックプロトコルを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は２５μＬであった。この核酸溶液を１．５ｍＬチューブにピペットで移し、０〜６℃で保存した。
【０１１２】
実施例１１：ネコ試料複製物中の核酸レベルの測定
抽出結果：上記で抽出された試料を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、それぞれ１μＬの総核酸およびＲＮＡ完全性について評価した。試料を定性的および定量的に分析した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの出力の結果を、図１４に示されるようにゲル電気泳動によって分析した。図１４は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキットを使用して実験された８つの試料からの１μＬのＲＮＡ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースを示す。これは４匹の個々のネコを含んだ。ゲル電気泳動分析は、総核酸ならびにＲＮＡ完全性および質量に関する情報を提供した。電気泳動ファイルは、各試料のバンドをＲＮＡラダー内のサイズマーカーによって表されるバンド（電気泳動図の最初のレーンに示される）と比較し、かつ１８Ｓおよび２８Ｓ真核生物リボソームＲＮＡバンドを同定することによって読み取られた。定性的には、適切なバンド形成およびより暗いバンド強度は、十分な無傷の核酸が、マイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉などのさらなる分析に利用可能であることを示した。試料のうちの１００％が、ＲＮＡ完全性数および真核生物細胞質量の量に基づく分析に適格であった。真核生物の濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースの１８Ｓおよび２８Ｓの真核生物のリボソームＲＮＡバンド下の面積に基づいて推定された。図１４は、４匹の個々のネコについての生物学的複製物を示す。生物学的複製物と個々のネコについての明確なバンド形成との間に同様のバンド形成があった（図１４）。
【０１１３】
実施例１２：ネコ試料複製物中のＲＮＡ転写物の分析
バイオマーカー発現分析に適格であった（ｎ＝５）すべての個々のネコ試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して評価した。合計４つのプライマーセットを設計して、リンパ球関連転写物および上皮細胞関連対照を評価した（図１５Ｂ）。１つのプライマーセットを設計し、ネコリンパ球前駆体において起こり得る再配列を評価してＴ細胞特異的ＲＮＡを検出した。各反応は、１０μＬの２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１μＬの２０Ｘ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＬの１０μＭフォワードプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、０．８μＬの１０μＭのリバースプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１μＬの２０Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２μＬのＲＮＡ、および４．４μＬの分子生物学グレードＨ２Ｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５  ｑＰＣＲ装置を使用して、溶液を増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった：ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するために５５℃で２５分、９５℃で１分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために９５℃で１０秒間および次に６０℃で４５秒間の６０サイクル。これらの増幅事象の例を図１６Ｂに示す。選択されたＴ細胞再配列について分析された５つのネコ試料のうち、合計１２個の反応において、７５％の反応がＴ細胞関連転写物の増幅を示した。試験されたすべてのＴ細胞再配列は、少なくとも１匹のネコにおいて増幅を示した（図１６Ｂ）。
【０１１４】
実施例１３：ナノストリング分析
ヒト大腸癌および前癌性腺腫に関連する遺伝子をさらに分析するために、追加の７０個のヒト試料を上記に記載されるＲＮＡ抽出法に供した。抽出されたＲＮＡは、遺伝子発現の直接多重測定に基づくデジタルカラーコードバーコード技術を利用するナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムを使用して分析された。７０個の試料のうち、４８個を、ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＲＡＳ、細胞周期、アポトーシス、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｗｎｔ、ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、転写調節、クロマチン修飾、およびＴＧＦ−βを含む１３個の癌関連標準経路からの７７０個の遺伝子を含む、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ経路パネルを使用して分析した。残りの２２個の試料を、血管新生、細胞外マトリックスリモデリング（ＥＣＭ）、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、および転移を含む癌進行プロセスの各段階からの７７０個の遺伝子を含む、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ進行パネルを使用して分析した。これら２２個の試料を、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＢＭＰ３、ＣＤ２７４、ＣＤ８Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、Ｎ−ＢＬＲ、ＮＤＲＧ４、およびＲＮＵ２−１を含む１０個の「スパイクイン」遺伝子についても評価した。
【０１１５】
上位２００個の示差的に発現される遺伝子である、図６（パネルＡ）で同定された遺伝子のリストに加えて、我々はまた、大腸癌および前癌性腺腫に関連する追加の遺伝子も分析した。我々はまた、ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム上で高度に発現されるか、または示差的に発現されると同定されたすべての遺伝子を分析した。この分析には、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ経路パネル、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ進行パネル、および「スパイクイン」遺伝子の使用が含まれた。我々は、この上方を使用して、大腸癌および前癌性腺腫（図１３（パネルＢ））のための４００個の遺伝子のＲＮＡバイオマーカー指標を開発した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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