(57)【要約】【課題】潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の便中カルプロテクチンレベルを減少させ、臨床的再発を防止する方法に関する。【解決手段】本発明は、ＵＣ患者において、便中カルプロテクチンレベルを減少させ、臨床的再発の危険性を減少させるための、高純度の、遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の有効量を投与する方法に関する。遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）は、少なくとも９５％の純度を有し、更に好ましくは少なくとも９９％の純度を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
潰瘍性大腸炎を有する被験者において便中カルプロテクチンレベルおよび再発を減少させる方法であって、便中カルプロテクチンレベルを１５０μｇ／ｇ未満に減少させるのに有効な治療量の、少なくとも９５％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを前記被験者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが少なくとも９９％の純度を有する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記便中カルプロテクチンレベルが約１１０μｇ／ｇ以下に減少される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記精製されたＥＰＡ−ＦＦＡが、薬学的に許容されるキャリアと一緒に、またはそれなしで、投与される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記治療量が、一日当たり約２５０ｍｇから４ｇの量である、請求項１の方法。
【請求項６】
前記治療量が、一日当たり約１０００ｍｇから２ｇの量である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記治療量が、毎日、週に一度、および／または１〜８か月、投与される、請求項６の方法。
【請求項８】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する被験者において便中カルプロテクチンレベルおよび再発を減少させるための方法であって、便中カルプロテクチンレベルを１５０μｇ／ｇ未満に減少させるのに有効な治療量の、少なくとも９５％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを、ＵＣ治療に使用される別の治療剤と組み合わせて、前記被験者に投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡと組み合わされてよい前記別の治療剤が、アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、コルチコステロイド、免疫調節剤、抗生物質、および生物学的治療剤からなる群から選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが、少なくとも９９％の純度を有する、請求項８の方法。
【請求項１１】
便中カルプロテクチンレベルが、約１１０μｇ／ｇ以下に減少される、請求項８の方法。
【請求項１２】
前記治療量が、一日当たり約２５０ｍｇから４ｇの量である、請求項８の方法。
【請求項１３】
前記治療量が、一日当たり約１０００ｍｇから２ｇの量である、請求項８の方法。
【請求項１４】
前記治療量が、毎日、週に一度、および／または１〜８か月、投与される、請求項８の方法。
【請求項１５】
ＵＣ治療に使用される別の治療剤と組み合わせて、便中カルプロテクチンレベルを１５０μｇ／ｇ未満に減少させるのに有効な量の、少なくとも９９％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを含む、組成物。
【請求項１６】
前記別の治療剤が、アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、コルチコステロイド、免疫調節剤、抗生物質、および生物学的治療剤からなる群から選択される、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
便中カルプロテクチンレベルを糞便１ｇ当たり１１０ｕｇ未満に減少させるのに有効な治療量の、少なくとも９５％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡの使用。
【請求項１８】
前記治療量が、一日当たり５００ｍｇから約２ｇである、請求項１７の使用。
【請求項１９】
高純度のＥＰＡ−ＦＦＡを投与する前に約１５０μｇ／ｇ超から約２００μｇ／ｇの便中カルプロテクチン（ＦＣ）レベルを有する患者で測定されるＦＣ量と比較して、３〜６か月間にわたって、ＦＣ量を約１００μｇ／ｇ以上減少させる方法。
【請求項２０】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが、少なくとも９５％の純度を有する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが、一日当たり約２５０ｍｇから一日当たり４ｇの治療量で投与される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
高純度のＥＰＡ−ＦＦＡを投与する前に約１５０μｇ／ｇ超から約２００μｇ／ｇの便中カルプロテクチン（ＦＣ）レベルを有する患者で測定されるＦＣ量と比べて、３〜６か月間にわたって、ＦＣ量を少なくとも１００μｇ／ｇ以上減少させるための、高純度のＥＰＡ−ＦＦＡの使用。
【請求項２３】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが、少なくとも９５％の純度を有する、請求項２２の使用。
【請求項２４】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが、一日当たり約２５０ｍｇから一日当たり４ｇの治療量で投与される、請求項２２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照としてその全体が本明細書に援用される、２０１７年２月９日出願の米国仮特許出願第６２／４５６，８１６号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、潰瘍性大腸炎の被験者における糞便カルプロテクチンレベルおよび再発を減少させるための、高純度の、遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とは、活動期と寛解期が交替で現れることを特徴とする、大腸に影響を及ぼす慢性の炎症状態である１。臨床活性に先立って、進行性の無症候粘膜炎症がしばしば生じる。前臨床状態の効果的な治療は臨床的再発を予防する場合もあり、ＵＣ管理において重要な役割を演じる可能性がある。
【０００４】
３６キロダルトンのカルシウム結合及び亜鉛結合蛋白質である便中カルプロテクチン（ＦＣ）は、顆粒球中の総細胞質蛋白量の６０％までを占める。ＦＣは、最高７日間糞便中で安定であり、顆粒球の便中排泄と高い相関関係を有しており、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者における粘膜炎症の有用なマーカーでもある２。特に、ＵＣ患者においては、１５０μｇ／ｇを超えるＦＣレベルは、内視鏡的活性３および組織学的活性４と関連しており、臨床的再発を予想するのに有用である５〜７。
【０００５】
長鎖食用ｎ−３系多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ｎ―３系魚油の主要成分）は、いくつかの慢性炎症疾患に有益である８。ＥＰＡは、免疫学的反応および炎症反応の調整に関係している。ＥＰＡは、ｎ−６ＰＵＦＡを置換することにより細胞膜組成を調節し、細胞シグナル伝達における脂質ラフト形成へ影響を及ぼし９、レゾルビン、ディフェンシン、マレシンなどの抗炎症仲介物質の生産をもたらす８。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
実験的証拠は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）におけるｎ−３ＰＵＦＡの役割の生物学的蓋然性を暗に示してはいるが、ＩＢＤにおけるｎ−３ＰＵＦＡ効果の臨床データは、未だに論争の的となっており、相反している（クローン病（ＣＤ）に関しては特にそうである）１０〜１２。特に、最近の疫学研究は、ｎ−３ＰＵＦＡがＵＣの進行に対して保護を提供し得ることを示唆しているが１３〜１５、結果は矛盾している。
【０００７】
従って、インビボでの安定性および純度が更に高く、効力および活性も更に高いオメガ３ＰＵＦＡの必要性が求められている。特に、潰瘍性大腸炎の被験者における便中カルプロテクチンレベルおよび再発を減少させる能力を有する、遊離脂肪酸形態の単離／精製オメガ３ＰＵＦＡ使用が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、便中カルプロテクチンレベルが１５０μｇ／ｇ以上として定義される臨床的再発の危険性のある無症候性のＵＣ患者グループにおいて、便中カルプロテクチンレベルを減少させ再発を予防する面での、高純度のエイコサペンタエン酸（遊離脂肪酸として）（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の効果を示すことに関する。遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸は、少なくとも９０％の純度を有することが好ましく、少なくとも９５％であることが更に好ましく、少なくとも９９％であることが最も好ましい。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、６か月期間中に、便中カルプロテクチンレベルを１５０μｇ／ｇ以下に減少させる、更に好ましくは糞便１ｇ当たり１１０ｕｇ以下に減少させる、最も好ましくはＦＣを約１００μｇ／ｇ以上減少させるのに効果的な量で、少なくとも９０％の純度、更に好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを潰瘍性大腸炎の被験者に投与することにより、該被験者における便中カルプロテクチンレベルおよび再発を減少させる方法を提供する。重要な点であるが、本発明は、結果が示すように、高純度のＥＰＡ−ＦＦＡを６か月間投与することにより、ＦＣを少なくとも１００μｇ／ｇ減少させることを証明している。精製されたＥＰＡ−ＦＦＡは、薬学的に許容されるキャリアと一緒に、またはそれなしで投与できる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、６か月期間中に、便中カルプロテクチンレベルを糞便１ｇ当たり１５０μｇ以下に減少させる、更に好ましくは１１０ｕｇ以下に減少させる、最も好ましくは８５ｕｇ以下に減少させるのに効果的な治療量で、少なくとも９０％の純度、更に好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを、単独で、またはＵＣの治療に使用される別の治療剤と組み合わせて、潰瘍性大腸炎の被験者に投与することにより、該被験者における便中カルプロテクチンレベルおよび再発を減少させる方法を提供する。ＥＰＡ−ＦＦＡと組み合わせてもよい治療剤には、スルファサラジン、メサラミン、オルサラジン、バルサラジドなどのアミノサリチル酸(aminosalicylates)（５−ＡＳＡ）、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ブデソニドなどのコルチコステロイド、メトロニダゾール、アンピシリン、シプロフロキサシンなどの抗生物質、および抗体などの生物学的治療剤が含まれる。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、便中カルプロテクチンレベルを糞便１ｇ当たり１５０μｇ以下に減少させる、更に好ましくは１１０ｕｇ以下に減少させるのに効果的な治療量の、少なくとも９０％の純度、更に好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを、単独で、またはＵＣの治療に使用される別の治療剤と組み合わせて有している組成物を提供する。ＥＰＡ−ＦＦＡと組み合わせてもよい治療剤には、スルファサラジン、メサラミン、オルサラジン、バルサラジドなどのアミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ブデソニドなどのコルチコステロイド、メトロニダゾール、アンピシリン、シプロフロキサシンなどの抗生物質、および抗体などの生物学的治療剤が含まれる。
【００１２】
更に別の態様において、本発明は、便中カルプロテクチンレベルを糞便１ｇ当たり１５０μｇ以下に減少させる、更に好ましくは１１０ｕｇ以下に減少させるのに効果的な治療量の、少なくとも９０％の純度、更に好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有するＥＰＡ−ＦＦＡを含有する組成物の使用を提供する。治療量は、一日当たり約２５０ｍｇから一日当たり４ｇが好ましく、一日当たり約１０００ｍｇから２ｇが更に好ましい。加えて、ＥＰＡ−ＦＦＡは、スルファサラジン、メサラミン、オルサラジン、バルサラジドなどのアミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ブデソニドなどのコルチコステロイド、メトロニダゾール、アンピシリン、シプロフロキサシンなどの抗生物質、および抗体などの生物学的治療剤と組み合わせてもよい。
【００１３】
別の態様において、本発明は、高純度のＥＰＡ−ＦＦＡを投与する前に約１５０μｇ／ｇ超から約２００μｇ／ｇの便中カルプロテクチン（ＦＣ）レベルを有する患者で測定されるＦＣ量と比較して、６か月期間中に、ＦＣ量を約１００μｇ／ｇ以上減少させる方法を提供する。ＥＰＡ−ＦＦＡは、少なくとも９０％の純度、更に好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有し、一日当たり約２５０ｍｇから一日当たり４ｇの治療量、更に好ましくは一日当たり約１０００ｍｇから２ｇの治療量である。
【００１４】
更に、本発明は、高純度のＥＰＡ−ＦＦＡを投与する前に約１５０μｇ／ｇ超から約２００μｇ／ｇの便中カルプロテクチン（ＦＣ）レベルを有する患者で測定されるＦＣ量と比較して、６か月期間中に、ＦＣ量を約１００μｇ／ｇ以上減少させる高純度のＥＰＡ−ＦＦＡの使用を提供する。ＥＰＡ−ＦＦＡは、少なくとも９０％の純度、更に好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有し、一日当たり約２５０ｍｇから一日当たり４ｇの治療量、更に好ましくは一日当たり約１０００ｍｇから２ｇの治療量である。
【００１５】
本発明の上記長所および特徴並びに他の長所および特徴は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明により更に十分に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、試験プロファイルを示す。ＥＰＡ−ＦＦＡ＝エイコサペンタエン酸（遊離脂肪酸）。
【図２】図２は、主要評価項目(endpoint)（Ａ）および副次評価項目（Ｂ）を達成した患者の割合を示す。ＣＩ＝信頼区間、ＥＰＡ−ＦＦＡ＝エイコサペンタエン酸（遊離脂肪酸）、ＯＲ＝オッズ比。
【図３】図３は、３か月目および６か月目の累積無再発生存率（カプランマイヤー法）を示す。ＥＰＡ−ＦＦＡ＝エイコサペンタエン酸（遊離脂肪酸）。
【図４】図４は、治療タイプによる、ベースライン、３か月目、および６か月目における便中カルプロテクチンレベル中央値を示す。ＥＰＡ−ＦＦＡ＝エイコサペンタエン酸（遊離脂肪酸）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
臨床的再発の防止は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の治療における主要な成果である。高レベルの便中カルプロテクチンは粘膜炎症を示し、ＵＣ患者の多くのグループにおいて臨床的再発の予想となることが示されている。最近の疫病研究は、ｎ−３多価不飽和脂肪酸によりＵＣの進行が防止されることを示している。ｎ−３魚油の主要成分であるエイコサペンタエン酸は、慢性炎症疾患において抗炎症特性を有することが証明されている。本発明の目標は、便中カルプロテクチンレベルが１５０μｇ／ｇ以上で定義される臨床的再発の危険性のある無症候性のＵＣ患者グループにおいて、便中カルプロテクチンレベルを減少させ再発を予防する面での、高純度のエイコサペンタエン酸（遊離脂肪酸として）（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の効果を明確にすることであった。
【００１８】
本明細書に記載されるように、高純度ＥＰＡ−ＦＦＡの投与により６か月間治療を受けた６０人のＵＣ患者におけるプラセボ対照試験によって、重篤な有害事象なしに便中カルプロテクチンレベルが減少することが見出された。従って、高純度ＥＰＡ−ＦＦＡは治療患者の便中カルプロテクチンレベル（ＦＣ）の量の減少に有用であり、斯かる物質の使用は、高純度ＥＰＡ−ＦＦＡを用いたＵＣ患者において、効果試験を行うことが可能であり得、また、無症候寛解の特定も可能であり得る。
【００１９】
本発明は、ＥＰＡ−ＦＦＡの投与が便中カルプロテクチンの予防または便中カルプロテクチンレベルの減少にインビボで有効であるという知見に基づいている。
【００２０】
本発明の医療用製剤、医薬品、または組成物を調製するのに使用されるＥＰＡ−ＦＦＡは、少なくとも９０％の純度を有し、任意の他の多価不飽和脂肪酸は、最低限か、または薬学的に僅かな量しか含んでいないことが好ましい。９５％超の純度が推奨され、任意の他の多価不飽和脂肪酸を実質的に含まない商業的に入手可能な最高グレードの素材（純度約９９％）が最も好ましい。
【００２１】
従って、本発明の１つの態様によれば、遊離脂肪酸としての高純度エイコサペンタエン酸は、治療対象の被験者において便中カルプロテクチンを減少させるための医療用製剤または医薬品の調製に使用される。
【００２２】
ＥＰＡは、遊離脂肪酸として魚油、植物、または微生物中に見出され、あるいはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、または糖脂質などのコンジュゲートとして見出され、当業界で周知の種々の手段により抽出されてよい。斯かる手段には、メタノールやクロロホルムなどの有機溶媒による抽出、超音波処理、二酸化炭素などを使用する超臨界流体抽出、圧搾などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが含まれる。必要であれば、水層を酸性化して負荷電部分をプロトン化し、それにより、有機層への目的産物の分配を増大させてもよい。抽出後、窒素流下に有機溶媒を蒸発させ除去してもよい。コンジュゲートとして単離される場合は、目的産物を酵素的または化学的に切断し、遊離脂肪酸またはより複雑性の減った目的コンジュゲートを放出させ、それを更なる操作の対象とすることにより、望ましい最終産物を製造してもよい。
【００２３】
更なる精製が必要な場合には標準的方法が使用できる。斯かる方法には、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、あるいは斯かる技術の組み合わせが含まれる。酸やアルケニル基などの反応基の保護は、アルキル化やヨウ素化などの周知の技術を用いて任意の工程で行ってよい。保護基は任意の工程で除去してよい。ＥＰＡを含む画分の精製は、初期エステル化、尿素処理、超臨界流体抽出、およびクロマトグラフィーを実施して遊離脂肪酸を単離することにより達成するのが望ましい。
【００２４】
トリグリセリドからＥＰＡを単離するには、加水分解またはエステル交換により脂肪酸を遊離させて、精製を成功させる必要がある。精製は、分別蒸留、分子蒸留、クロマトグラフィーなどの技術で達成できる。特に望ましいクロマトグラフィー法では、欧州特許ＥＰ  ０７１２  ６５１などに記載されるように、超臨界流体を使用し、移動相として二酸化炭素が用いられる。斯かる技術を使用することにより、ＥＰＡを１００%近くのレベルまで精製できることが見出された。実際的には、ＥＰＡはエチルエステルまたはメチルエステルとして精製し、それを加水分解することにより、遊離脂肪酸の形態へ戻してもよい。精製することにより、高度に濃縮された産物、最終産物には望ましくない他の脂肪酸を含まない産物を調製できる。加えて、他の化学物質、例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、炭化水素、農薬残留物などが除去できる。毒素、嗜好性の悪さに寄与する化合物、または飽和脂肪酸などの望ましくない脂肪酸のレベルが実質的に減少しているので、高純度のＥＰＡは人が消化するのに適している。遊離脂肪酸形態のＥＰＡは、予め酵素変換する必要なく、消化管で容易に吸収できる。斯かる方法を使用することにより、約１５０ｋｇの未精製ＥＰＡは、実質的に純粋なＥＰＡ−ＦＦＡ（少なくとも純度９０％）５０ｋｇに変換できる。
【００２５】
更なる精製が必要な場合には標準的方法が使用できる。斯かる方法には、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、あるいは斯かる技術の組み合わせが含まれる。酸やアルケニル基などの反応基の保護は、アルキル化やヨウ素化などの周知の技術を用いて任意の工程で行ってよい。保護基は任意の工程で除去してよい。ＥＰＡを含む画分の精製は、初期エステル化、尿素処理、超臨界流体抽出、およびクロマトグラフィーを実施して遊離脂肪酸を単離することにより達成するのが望ましい。
【００２６】
好ましいＥＰＡ遊離脂肪酸は、ＡＬＦＡ（商標）の商標名で商業的に入手可能（Ｓ．Ｌ．Ａ．  Ｐｈａｒｍａ社、英国）である。このＰＵＦＡは遊離脂肪酸形態の９９％純粋なＥＰＡであり、小腸でｐＨ５．５で内容物が確実に放出されるように設計されたｐＨ依存性腸溶コーティングカプセル形態に製剤化できる。他の成分としては、ＡＡ（０．５％以下）および微量の他の脂肪酸が含まれる。斯かるＥＰＡ調製物の主な利点は、多くの魚油製品と比べて純度が高いこと、全身での生物利用能を最大化する遊離脂肪酸であること、５００ｍｇのカプセル入りなので投与量設定が容易であること、および消化管の副作用を最小化する遅延放出の特徴を有していることである。
【００２７】
純度９９％のＥＰＡ−ＦＦＡは、一日当たり約２５０ｍｇから４ｇの量で投与されるのが好ましく、一日当たり約１０００ｍｇから約２ｇの量であるのが更に好ましい。毎日投与されるのが好ましいが、投与量次第では、一日おき、一週間に一度、またはより長い期間に一度、約１か月から８か月投与し得る。特に、純度９９％ＥＰＡのＡＬＦＡ（商標）カプセルの忍容性は素晴らしく、主に小腸でのＥＰＡの送達は、他の魚油製剤を用いた以前の治療において妨げとなっていた不快な味や臭いを最大限抑えるものである。
【００２８】
ＥＰＡ−ＦＦＡは、単独でまたはＵＣの治療に使用される別の治療剤と組み合わせて、複数の送達形式で製剤化してもよい。活性成分は、液体または固体組成物として経口で投与してもよい。経口投与に適した組成物には、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、粉末などの固体形態、および液体、シロップ、エリクシル剤、懸濁物などの液状形態が含まれる。非経口投与に役立つ形態には、滅菌溶液、乳濁液、懸濁液などが含まれる。
【００２９】
固体組成物の形態は、固体キャリア、および香味剤、潤滑剤、溶解剤、懸濁剤、充填剤、滑剤、圧縮剤、結合剤、または錠剤崩壊剤として作用する１つ以上の物質を含んでもよいし、カプセル化用の素材を含んでもよい。粉末の場合、キャリアは、微粉化状態の活性成分と混合された微粉化状態の固体である。錠剤の場合、活性成分は、必要な圧縮特性を有するキャリアと適切な割合で混合され、望ましい形状およびサイズに成形される。適切な固体キャリアには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、イオン交換樹脂などが含まれる。
【００３０】
溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリクシル剤、および加圧組成物を調製するのに、液体キャリアが使用される。活性成分は、水、有機溶媒、両者の混合物、または薬学的に許容されるオイルまたは脂質などの薬学的に許容される液体キャリアに溶解または懸濁してもよい。液体キャリアは、溶解剤、乳化剤、緩衝液、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘性調整剤、安定化剤、浸透圧調節剤などの他の適切な医薬品添加物を含んでもよい。経口投与および非経口投与用の液体キャリアの適切な例には、水（部分的には上記の添加物、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム液を含む）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、並びにオイル（例えば、分留ココナッツオイルおよび落花生油）が含まれる。非経口投与に関しては、キャリアはオレイン酸エチルやミリスチン酸イソプロピルなどの油状エステルであってもよい。非経口投与用の滅菌液体組成物において、滅菌液体キャリアは有用である。加圧組成物用の液体キャリアは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進薬であってよい。
【００３１】
本発明を詳細に記載したが、添付の請求項に規定された本発明の範囲を逸脱することなく、変更および変形が可能であることは明白である。更に、以下の実施例は非限定的な例として提供されている点は理解されるべきである。
【００３２】
本発明は、二重盲検、無作為、プラセボ対照試験を提供する。便中カルプロテクチンレベル１５０μｇ／ｇ以上で、少なくとも試験前の３か月間安定した治療状態にある６０人のＵＣ患者を、６か月間、毎日２ｇのＥＰＡ−ＦＦＡ（５００ｍｇ徐放カプセル２用量、毎日２回）か、あるいはプラセボ（カプリン酸およびカプリル酸の５００ｍｇ徐放カプセル２用量、毎日２回）を投与するため、１対１の割合で無作為化した。患者はベースラインにおいて全結腸内視鏡検査を受けた。便中カルプロテクチンレベル、臨床評価、および実験的評価を、ベースライン、３か月目および６か月目、または臨床的再発が生じた時点（部分的Ｍａｙｏスコア２以上の増加を伴う症状および／または治療の変更が必要な症状の発生として定義された）で行った。再発を生じた患者は内視鏡評価を受けた。
【００３３】
コホート集団は、臨床的特性および人口学的特性の面で違いのないことが分かった。しかし、驚いたことに、便中カルプロテクチンレベルは、プラセボグループと比較して、ＥＰＡ−ＦＦＡグループにおいて有意に減少した（ｐ＝０．００４）。治療企図解析において、ＥＰＡ−ＦＦＡグループの患者の７６．７％およびプラセボグループの患者の５０％が、６か月の治療で臨床的寛解を維持した（χ２、ｐ＝０．０３）。二値ロジスティック回帰分析は、ＥＰＡ−ＦＦＡが再発した患者数に影響を及ぼした唯一の要因であることを示した（ＨＲ０．３０、９５％ＣＩ０．１０−０．９２、ｐ＝０．０３）。３か月目および６か月目の累積無再発生存率は、それぞれプラセボグループにおける８０％および５０％に対し、ＥＰＡ−ＦＦＡグループにおいては、それぞれ８６．７％および７６．７％であった（ログランク試験、ｐ＝０．０４）。両方の治療とも安全で忍容性良好であり、主な副作用は生じなかった。従って、驚いたことに並びに予期せぬことに、ＥＰＡ−ＦＦＡは便中カルプロテクチンレベルを減少させること、並びにＵＣ患者における無症候寛解の維持の面で安全かつ許容できる治療であることが見出された。
【００３４】
材料および方法
（試験デザインおよび患者）
適格な患者は、ＦＣレベル１５０μｇ／ｇ以上の定義による粘膜活性を有し、少なくとも過去３か月間に部分的Ｍａｙｏスコア２未満で定義される安定な臨床的寛解にある１６、臨床的基準、内視鏡的基準、および組織学的基準に基づいてＵＣの診断を受けた１８歳以上の個人であった。過去３か月間変更のない、ＵＣ併用療法の使用（経口メサラジン、免疫調節剤、および生物学的治療剤など）は容認された。除外基準は、１）最近のステロイド使用（３か月未満）、局所メサラジン（３か月未満）、または他の実験的医薬品（３か月未満）、２）非ステロイド抗炎症剤および／または抗凝固剤の併用使用、３）直腸炎、４）妊娠または授乳、５）ＥＰＡまたはｎ−３ＰＵＦＡへの既知のまたは疑わしい過敏症、および６）重度の併存疾患（重度の心肺疾患、肝疾患、腎疾患、神経障害、精神病、糖尿病、または出血性障害）である。患者全員が同意説明書を提出した。
【００３５】
選択基準を満足させた患者は、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）（通常の上限５ｍｇ／Ｌ）を含む血液検査およびベースラインで複数の生検を有する全結腸内視鏡検査を受けた。次に、彼らは、６か月間、一日当たり２ｇのＥＰＡ−ＦＦＡ（２ｘ５００ｍｇの胃耐性徐放性カプセル、毎日２回）または２ｇのプラセボ（２ｘ５００ｍｇの、分画植物脂肪酸のトリグリセリドであるカプリン酸およびカプリル酸の胃耐性徐放性カプセル、毎日２回）を投与するため、１対１の割合で無作為化された。病院の治験薬サービスユニット（ＩＤＳ）において、無作為化リストをコンピュータ作成したが、患者全員、調査担当者、および研究チーム全体が治療割り当てに関しては知らされていなかった。
【００３６】
主要評価項目は、６か月目にＦＣレベルのベースラインから１００ポイントの減少（１００μｇ／ｇ以上）を達成した患者の割合であった。副次評価項目は、６か月目に、安定な部分的Ｍａｙｏスコア２未満で定義される臨床的寛解の維持を治療の変更なしに達成した患者数であった。主要評価項目および副次評価項目を達成した患者数からなる総合評価項目も計算した。
【００３７】
３か月目および６か月目、または臨床的再発が生じた時点（部分的Ｍａｙｏスコア２以上の増加を伴う症状および治療の変更が必要な症状の発生として定義される）において、臨床的評価、ＦＣ測定、および血液検査を繰り返した。治療の変更は、ステロイドおよび／または免疫抑制的な生物学的治療剤の導入により進行中の治療を拡大させるものとして定義された。臨床的再発を生じた患者だけが第二内視鏡評価を受けた。食習慣の変更（ビーガンまたは菜食主義者の食事への変更を含む）は、各試験来院の際に確認した。治療遵守はカプセル数によって評価した。容認可能なレベルの遵守は、処方されたカプセルの８０〜１００％が外来クリニックに返却されなかった場合に達成されたものと評価した。
【００３８】
（便中カルプロテクチン定量化）  
便中カルプロテクチン分析は、スクリーニング段階、３か月目および６か月目、または臨床的再発が生じた時点（結腸内視鏡検査の２４時間前）に行った。ＦＣカットオフレベルである１５０μｇ／ｇ以上を、内視鏡的活性および／または組織学的活性を示すもの、並びに以前証明されたように４−７、初期臨床的再発を示すものと考えられた。斯かる推定に基づき、ＦＣの１００ポイント低下（μｇ／ｇ）は臨床的に意味のある変化と考えられる。
【００３９】
（内視鏡評価および組織学的評価）
ベースライン時点および臨床的再発が生じた時点で、複数の大腸検査を伴う結腸内視鏡検査を行った。内視鏡的粘膜炎症のグレーディングをＭａｒｏ内視鏡サブスコアに従って記録した１６。内視鏡的活性は、Ｍａｙｏ内視鏡サブスコアがゼロを越える場合と定義した１７。生検サンプルは、カットオフ値３．１以上を活性な組織学的炎症を示すものとして、Ｇｅｂｏｅｓグレーディングシステムに従って採点した１８。
【００４０】
（便中カルプロテクチン定量化）
朝最初の便通における糞便サンプルを、分析を行う前の最高２４時間、冷蔵庫に２〜８℃で保存した。ＦＣレベルの定量化を、定量的酵素結合免疫吸着測定（Ｃａｌｐｒｅｓｔ、Ｅｕｒｏｓｐｉｔａｌ社、トリエステ、イタリア）を用いて、製造元の指示に従って行った。既知の濃度のカルプロテクチンを用いた標準を参照として使用した。測定範囲は１５〜３０００μｇ／ｇであった。
【００４１】
（内視鏡評価および組織学的評価）
生検が異なるレベルの活性を示した場合に、最高レベルの炎症を考慮した。評価対象の時点は、内視鏡検査官および病理学者には知らされなかった（ベースライン対再発）。
【００４２】
（統計学的分析）
ＥＰＡ−ＦＦＡグループの患者の少なくとも７０％およびプラセボグループの患者の３０％においてＦＣがベースラインから１００ポイント減少した（４０％の差）と仮定すると（有意水準５％、パワー８０％、フィッシャーの正確検定（両側検定））、登録されるべき患者数は５６人である。脱落率を７％と仮定すると、６０人の患者を登録させる必要があった。治療のために無作為化され試験薬剤を少なくとも１用量投与された患者全員が治療企図（ＩＴＴ）解析に含まれた。有害事象（ＡＥ）または他の理由で試験を中断した患者は、非応答者とみなした。各グループについて記述統計（標準偏差（ＳＤ）を有する平均値または四分位範囲（ＩＱＲ）を有する中央値）が報告された。主要目的、副次目的、および総合目的を評価するのに、二値ロジスティック回帰分析を実行した。ＦＣの正規分布が推定できなかったので、各時点におけるグループ間のＦＣレベルの差を比較するのにノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を使用し、３か月目および６か月目におけるベースラインからのＦＣ変化を各グループ内で評価するのに、フリードマン検定による分散分析を使用した。フリードマン検定で有意に至る場合、事後ウィルコクソン符号順位検定（ボンフェローニ補正）を実行した。３か月目および６か月目において、各処置グループの無再発生存（ＲＦＳ）を推定するのにカプランマイヤー法を用い、それらを比較するのにログランク検定を使用した。０．０５未満のｐ値を有意と見なした。統計分析を行うのに、ＩＢＭ  ＳＰＳＳバージョン２３．０（シカゴ、イリノイ州、ＵＳＡ）を使用した。
【００４３】
結果
（試験対象集団）
６０人が選択基準を満足させ、登録され、ＩＴＴ母集団に含まれ、そのうち３０人が活性物質グループに、３０人がプラセボグループに含まれた（図１）。２つの処置グループはベースライン人口学的特性および臨床的特性を十分満足させた（表１）。ベースラインの中央値ＦＣレベルは、計画されたＥＰＡ−ＦＦＡグループおよび計画されたプラセボグループにおいて、それぞれ１７７（ＩＱＲ１６１．５−２１０．３）μｇ／ｇおよび１８１（ＩＱＲ１５４．５−２０８．３）であった。ベースラインの結腸内視鏡検査において、患者全員が１以下のＭａｙｏ内視鏡サブスコアを示し、ＥＰＡ−ＦＦＡグループおよびプラセボグループにおいて、それぞれ３０人の患者中２４人（８０％）および３０人の患者中１９人（６３．３％）がＭａｙｏ内視鏡サブスコア１を示した。患者全員の組織学的Ｇｅｂｏｅｓスコアは３．１と４．１の間にあった。
【００４４】
（主要評価項目：６か月目におけるＦＣレベルの１００ポイント減少）
３か月目に、プラセボグループの患者３０人中４人（１３．３％）に比べ、ＥＰＡ−ＦＦＡグループの患者３０人中１６人（５６．３％）がＦＣレベルの１００ポイント減少を達成した（オッズ比（ＯＲ）７．５９、９５％信頼区間（ＣＩ）２．０４−２８．１５、ｐ＝０．００２）。６か月目に、ＥＰＡ−ＦＦＡグループにおいて３０人の患者中１９人（６３．３％）およびプラセボグループにおいて３０人の患者中４人（１３．３％）がＦＣレベルの１００ポイント減少を達成した（ＯＲ１２．０、９５％ＣＩ３．１２−４６．２４、ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。
【００４５】
（副次評価項目：６か月目における臨床的寛解の維持）
６か月目に、６０人の患者中３８人が臨床的寛解を維持した。内訳は、ＥＰＡ−ＦＦＡグループにおいて３０人の患者中２３人（７６．７％）、プラセボグループにおいて３０人の患者中１５人（５０％）であった（ＯＲ３．２９、９５％ＣＩ１．０８−９．９５、ｐ＝０．０３５）（図２Ｂ）。３か月目および６か月目の累積ＲＦＳはＥＰＡ−ＦＦＡグループにおいてそれぞれ８６．７％および７６．７％、プラセボグループにおいてそれぞれ８０％および５０％であった（ログランクｐ＝０．０４）（図３）。
【００４６】
（総合評価項目：６か月目におけるＦＣレベルの１００ポイント減少および臨床的寛解の維持）
６か月目に、ＥＰＡ−ＦＦＡグループおよびプラセボグループにおいて、３０人の患者中１９人（６３．３％）および３０人の患者中４人（１３．３％）が、それぞれＦＣレベルの１００ポイント減少および臨床寛解の維持の両方を達成した（ＯＲ１３、９５％ＣＩ２．７１−６２．９、ｐ＝０．００１）。
【００４７】
（治療グループ間および治療グループ内のＦＣレベルの比較）
３つのＦＣ測定が利用可能な副次評価項目を達成した患者（ＥＰＡ−ＦＦＡおよびプラセボグループにおいて、それぞれｎ＝２３およびｎ＝１５）だけを考慮すると、３か月目および６か月目において、ＥＰＡ−ＦＦＡグループの中央値ＦＣレベルは、プラセボグループのそれよりも有意に低かった（マン・ホイットニー、それぞれｐ＝０．００２およびｐ＜０．００１）。３か月目および６か月目においてＦＣレベルがベースラインから有意に減少したのはＥＰＡ−ＦＦＡグループ内だけであった（フリードマン：χ２（ｄｆ２）＝２４．０２、ｐ＝０．００１）。ボンフェローニ補正を伴う事後ウィルコクソン符号順位検定では、ｐ＜０．０１７（３比較）で有意水準が設定された。ＥＰＡ−ＦＦＡグループにおいて、ベースライン、３か月目、および６か月目における中央値（ＩＱＲ）ＦＣレベルは、それぞれ１７６（１６０−２０７）μｇ／ｇ、５３（４０−１１７）μｇ／ｇ、および４０（１６−６４）μｇ／ｇであった。ベースラインから３か月目（Ｚ＝−３．３６２、ｐ＝０．００１）およびベースラインから６か月目（Ｚ＝−３．７１１、ｐ＜０．００１）で中央値ＦＣレベルにおいて統計学的に有意な減少があった。３か月目と６か月目の間のＦＣレベルには、統計学的に有意な減少は何ら観測されなかった（Ｚ＝−１．４２９、ｐ＝０．１５３）。しかし、プラセボグループ内では、ベースラインと、３か月目と、６か月目との間に、ＦＣレベルにおいて、何ら統計学的に有意な減少は観測されなかった（フリードマン：χ２（ｄｆ２）＝３．７３、ｐ＝０．１５５）（図４）。
【００４８】
（治療グループ間のＣＲＰレベルの比較）
中央値ＣＲＰレベルは、３か月目および６か月目において、２つの処置グループ間に有意な差は見られず（マン・ホイットニー、それぞれｐ＝０．８およびｐ＝０．５５）、各グループ内においても、試験中に有意な変化はなかった（フリードマン：ＥＰＡ−ＦＦＡおよびプラセボに関して、それぞれχ２（ｄｆ２）＝０．４４、ｐ＝０．８０およびχ２（ｄｆ２）＝０、ｐ＝１）。
【００４９】
（再発を経験した患者の特徴）
脱落した４人の患者（妊娠が１人、軽度のＡＥ（有害事象）が３人）を除き、１８人の患者が臨床的再発（平均フォローアップ４．７８か月目、９５％ＣＩ４．１１−５．４５）を経験した。再発当時の中央値（ＩＱＲ）ＦＣレベルは、プラセボグループ（ｎ＝１３）よりもＥＰＡ−ＦＦＡグループ（ｎ＝５）において有意に低かった（それぞれ４１２μｇ／ｇ（３７４−４９５）および５３５μｇ／ｇ（４７６．５−７３８）（マン・ホイットニー、ｐ＝０．０１）。再発時に、部分的Ｍａｙｏスコア、Ｍａｙｏ内視鏡サブスコア、およびＧｅｂｏｅｓスコアにおいて、グループ間に差は観測されなかった（表２）。
【００５０】
（安全性およびコンプライアンス）
軽度のＡＥの所為で３人の患者が試験を中断した。２人（各処置グループから１人ずつ）はそれぞれ処置開始から１か月目および３か月目に下痢を起こし、１人（ＥＰＡ−ＦＦＡグループ）は３か月目に腫脹(bloating)が生じたからである。いずれの処置グループにおいても重篤なＡＥは報告されなかった。試験を完了した患者全員が、（処方されたカプセルの８０〜１００％が外来クリニックに返却せず）順守基準(adherence criteria)を満足させた。
【００５１】
考察
今回の試験は、ＦＣレベルで表される粘膜炎症の減少およびＵＣ患者における症状再発の防止における高純度ＥＰＡ−ＦＦＡの有益効果を証明する最初の臨床試験である。選択された主要評価項目はＦＣの減少であるが、これは臨床的寛解を示す組織炎症減少のマーカーとして使用された。斯かる評価項目を有する最初の無作為プラセボ対照試験において、ＦＣレベルの１００ポイント減少の選択は恣意的ではあるが、１５０μｇ／ｇ未満のＦＣ値は組織学的に低い活性を示すことを、公表された文献データが示している４。
【００５２】
最近の疫学データは、ＵＣの発生を減少させるｎ−３ＰＵＦＡの潜在的有益効果を示している。Ａｎａｎｔｈａｋｒｉｓｈｎａｎらは２６年に亘る大規模なコホート研究においてＵＣの症例を先見の明を持って分析（看護師研究調査）し、高用量のｎ−３ＰＵＦＡの摂取がＵＣ発生のリスク減少に関連していることを見出した１４。更に、ｎ−３ＰＵＦＡに対する、炎症誘発性のｎ−６ＰＵＦＡの比が高い消費は、ＵＣのリスク増大に関連している１５、１９。
【００５３】
しかし、魚油誘導体を用いた以前のＵＣ臨床試験は様々な結果を報告している２０、２１。斯かる研究は、いくつかの有益効果（炎症の減少、ステロイド使用の必要性の減少など）を報告してはいるが、臨床的再発防止における魚油誘導体による明確な保護効果は証明できていない。斯かる様々な結果が生じる理由は、研究デザインの違い、使用されたｎ−３ＰＵＦＡの処方、用量範囲の広さ、患者の遵守率の低さ、投与時間の不適正、プラセボとしてのオリーブ油または他のＰＵＦＡの使用などに関係しているのかもしれない２２。
【００５４】
本研究において、活性ｎ−３ＰＵＦＡを、胃耐性カプセルを用いて、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）形態の２ｇの高純度ＥＰＡ（９５％超）として処方した。ｎ−３ＰＵＦＡのＦＦＡ形態は、エチルエステルおよびトリグリセリド製剤と比べ、製薬学的に最も好ましい特徴を提供することが以前の研究で証明されている２３−２５。更に、毎日２ｇのＥＰＡ−ＦＦＡを８週間摂取したＩＢＤ患者および健康なボランティアによる研究において、ＥＰＡは血漿リン脂質および赤血球細胞膜に一貫して取り入れられた。ＥＰＡ−ＦＦＡは、ドコサペンタノン酸を通してドコサヘキサノン酸に迅速に変換される。ＥＰＡは、ｎ−３ＰＵＦＡの「ユニバーサルな供給源」と見なし得る２６。
【００５５】
今回の試験は、予防治療の適格患者を選択するのに、迫り来る臨床的再発の代用としてＦＣを用いた最初の試験である。ＦＣは粘膜炎症に関して非常に信頼できるマーカーであり、内視鏡スコア３、５、組織学的炎症段階４、および臨床的再発の予測能力５−７と高い相関関係を有していることが、以前公表された強力なデータにより既に確立されている。ＦＣは、新しい治療への応答の予測因子として高品質で十分に設計された臨床試験にますます多く取り入れられている２７。症状再発の高リスク患者を短期間で特定するための最適なＦＣカットオフレベルはまだ論争中の課題ではあるが、他の公表データ６、７に支持されるの以前の経験５は、１５０μｇ／ｇが斯かる目的のための妥当なカットオフ値であることを示している。再発のリスクを抱える患者を正確に特定するのは重要であろう。ＦＣおよび本明細書記載の結果は、症状が起きる前に、斯かるサブグループの患者を特定および治療する方法を提供し、急性の病巣拡大エピソード、入院、毒性のより高い薬剤の必要性、患者の身体障害などを減少させるものである。（リスク患者特定の面で）最適でないマーカーによる負の影響は、ＥＰＩＣ １試験２８で確認されている。ＣＤ再発を予防するためのｎ−３ＰＵＦＡの使用を調査する大規模試験では２８、臨床的寛解にある３６３人のＣＤ患者が含まれており、再発リスクの唯一の基準として、以前の寛解期間（３か月と１２か月の間）が用いられた２９。１年間のフォローアップ後の結果は、同程度の低い率の再発を示していた（活性物質グループ３１．６％、プラセボグループ３５．７％）。斯かる失敗の理由は、再発の高リスクを抱える患者を特定するための基準レベルが低かったのかもしれない。試験登録時における、ＣＤ用の信頼のおける炎症マーカー（ＣＲＰなど）を使用すれば、再発の高リスクを抱える患者をより良く分類できたかもしれない。
【００５６】
粘膜／組織学的炎症はＵＣの悪化経過の予測因子であるが３０、低レベルのＦＣは継続的な臨床的寛解を予測するものである３１。斯かる知見と関連するが、ＦＣレベルの有意な減少は、無症状疾病経過を延長させるための重要な評価項目であることも本明細書は示している。進行中のＵＣ治療へのＥＰＡ−ＦＦＡの添加は軽度の粘膜炎症を軽減し、疾病の臨床活動も安定化させるという概念を、本明細書のデータは支持している。更に、長期のＵＣを患う２０人の患者を対象に行われた予備調査において、同用量のＥＰＡ−ＦＦＡが内視鏡的／組織学的炎症を改善し、杯細胞の分化を刺激した３２。
【００５７】
本発明においてプラセボ治療群において再発率が高いことが決定されており（６か月で５０％）、再発の高リスクを抱える患者の特定にＦＣが有効であることを支持している５。臨床経過６、７および疾病パターンの予測因子としてＦＣを試験した他の研究によれば、ＣＲＰは、研究期間全体を通して有意に変化することがなく、従って、ＵＣ疾病活動をモニターするにあたり、ＦＣと比べ低い感度であることが確認されている３３。
【００５８】
本試験の結果には、登録した患者数が少ない、単一センターの設計である、フォローアップ期間が比較的短いなど、いくつかの限界がある。しかし、ＦＣ増加の患者における臨床的再発の症例の大多数はフォローアップの最初の６か月間に生じている３４。ＦＣは粘膜炎症を評価する信頼できるマーカーであるが、疾病活動の確実な証拠を提供するため、ベースラインおよび臨床的再発の時点で、結腸内視鏡検査が複数の生検を伴って追加的に行われた。スクリーニング段階と比べて安定したＦＣレベルを有しており試験の最終段階で無症候を維持する患者は、Ｍａｙｏ内視鏡サブスコアも変わっていないと推測するのは妥当であるが、治療の終わりに生検を伴う第二結腸内視鏡検査を行わいことは本試験の相対的限界である。選択された主要評価項目は、組織炎症の減少（臨床的寛解を示す）のマーカーとして、ＦＣレベルの減少を使用することであった。斯かる評価項目を有する最初の無作為プラセボ対照試験において、ＦＣレベルの１００ポイント減少の選択は自由裁量によるものではあるが、１５０μｇ／ｇ未満のＦＣ値は組織学的に低い活性を示すことを、公表された文献データが示している４。
【００５９】
結論として、ＥＰＡ−ＦＦＡの使用はＵＣの重要な炎症マーカーである便中カルプロテクチンレベルを減少させること、並びにＵＣ患者の無症状寛解を維持するための安全かつ有望な治療であることを、斯かる心強いデータが証明している。
【００６０】
（参考文献）
【化１−１】
2020508285.tif 000003
【化１−２】
2020508285.tif 000004
【化１−３】
2020508285.tif 000005
【化１−４】
2020508285.tif 000006
【００６１】
表１．患者の人口学的特性およびベースライン特性
【表１】
2020508285.tif 000007
【００６２】
表２．臨床的再発における患者の特性（ｎ＝１８）
【表２】
2020508285.tif 000008
【図１】
2020508285.tif 000009
【図２】
2020508285.tif 000010
【図３】
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【図４】
2020508285.tif 000012
【国際調査報告】
2020508285.tif 000013
2020508285.tif 000014
2020508285.tif 000015