(57)【要約】  本発明は、抗Ｈｅｒ２ナノボディ及びそのコード序列と用途を提供する。具体的に、本発明は、ヒト上皮成長因子受容体−２（Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２）に対するナノボディを提供する。本発明は、このようなナノボディ及び前記ナノボディをコードする遺伝子序列、対応する発現担体及び前記ナノボディを発現することができる宿主細胞、ならびに本発明ナノボディの生成方法及びその関連する用途を開示する。本発明はまた、前記ナノボディの免疫コンジュゲート及びその応用、特にＨｅｒ２陽性腫瘍の診断及び治療における応用を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖であって、
前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０のいずれか１つに示されるとおりであることを特徴とする、前記抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖。
【請求項２】
抗Ｈｅｒ２ナノボディであって、
Ｈｅｒ２エピトープに対するナノボディであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０のいずれか１つに示されるアミノ酸序列のＶＨＨ鎖を有することを特徴とする、前記抗Ｈｅｒ２ナノボディ。
【請求項３】
ポリヌクレオチドであって、
請求項１に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または請求項２に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディからなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４１−８０のいずれか１つに示されるヌクレオチド序列を有することを特徴とする
請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
発現担体であって、
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記発現担体。
【請求項６】
宿主細胞であって、
請求項５に記載の発現担体を含むか、請求項３に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれることを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項７】
抗Ｈｅｒ２ナノボディの生成方法であって、
ナノボディの生成に適した条件の下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養して、前記抗Ｈｅｒ２ナノボディを含む培養物を獲得するステップ（ａ）と、及び
前記培養物から前記抗Ｈｅｒ２ナノボディを分離または回収するステップ（ｂ）とを含むことを特徴とする、前記抗Ｈｅｒ２ナノボディの生成方法。
【請求項８】
免疫コンジュゲートであって、
（ａ）請求項１に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または請求項２に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディと、及び
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される結合部分を含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
【請求項９】
Ｔｃ−９９ｍ、Ｇａ−６８、Ｆ−１８、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｃｕ−６４、Ｚｒ−８９、Ｃ−１１、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８８、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される（ｉ）診断用同位体と、および／または
Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０、Ａｃ−２２５、Ａｓ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｓ−１３７、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−６０、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｍ−２５５、Ａｕ−１９８、Ｈｏ−１６６、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｉｒ−１９２、Ｆｅ−５９、Ｐｂ−２１２、Ｍｏ−９９、Ｐｄ−１０３、Ｐ−３２、Ｋ−４２、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｓｍ−１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ−１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ−１４９、Ｔｈ−２２７、Ｘｅ−１３３  Ｙｂ−１６９、Ｙｂ−１７７、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される（ｉｉ）治療用同位体とを含むことを特徴とする
請求項８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０】
前記薬物は、細胞毒性薬物であり、好ましくは、前記細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬物、ＤＮＡ小溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする
請求項８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１１】
前記毒素は、オーリスタチン系（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、美坦西醇(maytansinoid)、リシン毒素、リシン毒素Ａ−鎖、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジヒドロキシアントラシンジオン（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅ  ｄｉｏｎｅ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−八連球菌、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、クルシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする
請求項８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１２】
Ｈｅｒ２タンパク質またはＨｅｒ２癌の検出試薬であって、
前記検出試薬は、請求項８に記載の免疫コンジュゲート及び検出学的に許容される担体を含むことを特徴とする、前記Ｈｅｒ２タンパク質またはＨｅｒ２癌の検出試薬。
【請求項１３】
前記検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬であることを特徴とする
請求項１２に記載の検出試薬。
【請求項１４】
抗Ｈｅｒ２ナノボディの使用であって、
（ａ）Ｈｅｒ２分子を検出するための試薬と、（ｂ）腫瘍を治療するための薬物とを調製するために使用されることを特徴とする、前記請求項２に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディの使用。
【請求項１５】
薬物組成物であって、
（ｉ）請求項１に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または請求項２に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディ、または請求項８に記載の免疫コンジュゲートと、及び
（ｉｉ）薬理学的許容される担体とを含むことを特徴とする、前記薬物組成物。
【請求項１６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体ＣＡＲを発現し、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、請求項１に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または請求項２に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディを有することを特徴とする、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１７】
製剤であって、
請求項１６に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞、及び薬理学的許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことを特徴とする、前記製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学または生物製薬技術分野に関し、より具体的には、Ｈｅｒ２に対するナノボディ及びそのコード序列と用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０またはｐ１８５とも呼ばれるヒト上皮成長因子受容体−２（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２：Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２）は、ヒトＨｅｒ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｈｅｒ２は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーに属するチロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）であり、４つの細胞外ドメイン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）と、チロシンキナーゼ活性ドメインと１つのチロシン残基および細胞内シグナル伝達分子のアンカーポイントを含むカルボキシ末端尾部を持つ１つの膜貫通領域とを含む１２５５個のアミノ酸で構成され、その分子量は、約１８５ｋＤである。ＥＧＦＲファミリーのメンバーは、細胞外ドメインＩおよびＩＩＩが受容体のリガンドへの結合に関与し、受容体の立体構造の変化により受容体活性化を引き起こし、細胞外ドメインＩＩおよびＩＶが受容体の二量化に関与する類似の構造を持っている。Ｈｅｒ２には特別なオープン構造があり、特異性リガンドの関与なしに自己活性化が発生する可能性があり、ホモダイマーを形成するか、ＥＧＦＲファミリーの他の受容体とヘテロダイマーを形成し、ファミリーのメンバーの間のヘテロ二量体化に好ましい分子である。
【０００３】
Ｈｅｒ２は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、肺癌などの複数の上皮細胞由来の悪性腫瘍で過剰に発現しているが、正常組織では発現が低いか、まったく発現しない。Ｈｅｒ２の発現が低い場合、受容体タンパク質は一般に単量体として存在し、そのチロシンキナーゼ活性は低い。Ｈｅｒ２が過剰発現すると、受容体チロシンキナーゼの長期的かつ強化された活性化を引き起こし、一連の下流カスケードを引き起こし、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼプロテインキナーゼＢ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ−ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ホスホリパーゼＣプロテインキナーゼＣ（ＰＬＣ−ＰＫＣ）および転写シグナル伝達と活性化タンパク質（ＳＴＡＴ）などの複数の主要なシグナル経路を活性化する。Ｈｅｒ２を介したシグナル伝達経路は、腫瘍関連遺伝子の発現を調節でき、例えば、血管内皮（細胞）成長因子、ウロキナーゼ型プラスミン活性化因子、シクロオキシゲナーゼ−２、ケモカインサイトカイン受容体ＣＸＣＲ−４などの発現をアップレギュレーションし、ＭＭＰ阻害因子ＲＥＣＫの発現をダウンレギュレーションし、腫瘍の侵入と転移を促進することができる。Ｈｅｒ２の増幅または過剰発現は、特異性浸潤性乳癌の発病と発展過程に重要な役割を果たし、乳癌の重要なマーカーおよび治療標的となった。
【０００４】
ヒト化組換えモノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子増幅と過剰発現を伴う乳癌患者向けの伝統的な標的治療薬物である。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、Ｈｅｒ２細胞外構造の膜近傍領域に結合し、エンドサイトーシスを引き起こして腫瘍細胞の核内に進入し、Ｈｅｒ２が細胞膜にリサイクルされるプロセスをブロックし、Ｈｅｒ２タンパク質のバイパス分解を加速し、それにより、Ｈｅｒ２による腫瘍細胞の悪性表現型への形質導入を阻害する。Ｈｅｒ２過剰発現に対する原発性浸潤性乳癌患者に非常に効果的である。Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂの抗原結合ポイントは、Ｈｅｒ２細胞外ドメインのＩＩサブ領域に位置し、Ｈｅｒ２と他のＥｒｂＢメンバー間の二量体の形成を妨害して、細胞シグナル伝達をブロックし、Ｈｅｒ２が過剰発現しているかどうかに関係なく、抗腫瘍効果を発揮することができる。
【０００５】
従来のモノクローナル抗体の製造プロセスは複雑で、コストが高すぎ、分子量が大きすぎ、組織に浸透できないため、腫瘍領域の有効濃度が低くなり、治療効果が不十分になる。従来の抗体は免疫原性が高く、修飾抗体は元の親和性に到達するのが困難である。なお、完全にヒト化された従来の抗体は、開発サイクルが長く、生産コストが高く、安定性が不十分などの臨床応用と普及を制限する他の多くの要因がある。しかし、ナノボディは現在最小の抗体分子であり、その分子量は通常の抗体の１／１０である。ナノボディは、モノクローナル抗体の抗原反応性に加えて、分子質量が小さく、安定性が強く、溶解性が良好で、発現し易く、免疫原性が弱く、浸透性が強く、ターゲティング性が強く、ヒト化が簡単で、調製のコストは低いなどのユニークな機能的特徴も備え、伝統的な抗体の開発サイクルが長く、安定性が低く、保管条件が厳しいなどの欠点をほぼ完全に克服する。さらに、放射性同位元素を標的とする担体としての特殊構造により、腫瘍組織結合標的に迅速かつ特異的に浸透し、非結合抗体は血液から迅速に除去されるため、身体の放射線量を減し、トレーサーや標的の内部放射線治療薬として、従来の抗体よりも多くの明らかな利点がある。
しかし、現在、当技術分野ではＨｅｒ２に対する満足のナノボディが不足している。したがって、当技術分野では、Ｈｅｒ２に対して有効な新しい特異性ナノボディを開発することが急務である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、Ｈｅｒ２に対して有効な特異性ナノボディを提供することである。
本発明の第１の態様では、ＶＨＨ鎖のアミノ酸序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０のいずれか１つに示されるとおりである抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖を提供する。
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：８、７、１５、１２、２７、１１、３２、１３、１４、９、２１、３０、１７、２４、１６、６、２８、２５、１０、１のいずれか１つに示されるとおりである。
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：８、７、１５、１２、２７、１１、３２、１３のいずれか１つに示されるとおりである。
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：９、１０、１３、１７、２２、２３、２６のいずれか１つに示されるとおりである。
【０００７】
別の好ましい例において、前記Ｈｅｒ２は、ヒトＨｅｒ２である。
なお、フレーム領域ＦＲと相補性決定領域ＣＤＲを含み、ここで、前記ＣＤＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０のいずれか１つの序列のうち対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、および前記ＣＤＲ１−３により分離されたＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４とを含む抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖をさらに提供する。
なお、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、３つのＣＤＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０のいずれか１つの序列のうち対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗ヒトＨｅｒ２抗体の重鎖可変領域をさらに提供する。
なお、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０に示されるアミノ酸序列のうち下線で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（それぞれのＶＨＨアミノ酸序列中の３つの下線部分は、順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を表す）を含む抗ヒトＨｅｒ２抗体の相補性決定領域ＣＤＲ領域をさらに提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様では、Ｈｅｒ２エピトープに対するナノボディであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０のいずれか１つに示されるアミノ酸序列のＶＨＨ鎖を有する抗Ｈｅｒ２ナノボディを提供する。
別の好ましい例において、好ましい抗Ｈｅｒ２ナノボディは、第１の態様で好ましいＶＨＨ鎖のアミノ酸序列を有する。
【０００９】
本発明の第３の態様では、第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディからなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を提供する。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４１−８０のいずれか１つに示されるヌクレオチド序列を有する。
【００１０】
本発明の第４の態様では、第３の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現担体を提供する。
別の好ましい例において、前記発現担体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス担体、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子導入システム、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、前記発現担体は、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、またはそれらの組み合わせなどのウイルス担体を含む。
【００１１】
本発明の第５の態様では、第４の態様に記載の発現担体を含むか、第３の態様に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれる宿主細胞を提供する。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞からなる群から選択される。
【００１２】
本発明の第６の態様では、
ナノボディの生成に適した条件の下で、第５の態様に記載の宿主細胞を培養して、前記抗Ｈｅｒ２ナノボディを含む培養物を獲得するステップ（ａ）と、及び
前記培養物から前記抗Ｈｅｒ２ナノボディを分離または回収するステップ（ｂ）とを含む抗Ｈｅｒ２ナノボディの生成方法を提供する。
別の好ましい例において、前記抗Ｈｅｒ２ナノボディは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０に示されるアミノ酸序列を有する。
【００１３】
本発明の第７の態様では、
（ａ）第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディと、及び
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される結合部分を含む免疫コンジュゲートを提供する。
【００１４】
別の好ましい例において、前記放射性核種は、
Ｔｃ−９９ｍ、Ｇａ−６８、Ｆ−１８、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｃｕ−６４、Ｚｒ−８９、Ｃ−１１、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８８、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される（ｉ）診断用同位体と、および／または
Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０、Ａｃ−２２５、Ａｓ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｓ−１３７、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−６０、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｍ−２５５、Ａｕ−１９８、Ｈｏ−１６６、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｉｒ−１９２、Ｆｅ−５９、Ｐｂ−２１２、Ｍｏ−９９、Ｐｄ−１０３、Ｐ−３２、Ｋ−４２、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｓｍ−１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ−１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ−１４９、Ｔｈ−２２７、Ｘｅ−１３３  Ｙｂ−１６９、Ｙｂ−１７７、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される（ｉｉ）治療用同位体とを含む。
【００１５】
別の好ましい例において、前記結合部分は、薬物または毒素である。
別の好ましい例において、前記薬物は、細胞毒性薬物である。
別の好ましい例において、前記細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬物、ＤＮＡ小溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１６】
特に有用な細胞毒性薬物系の例は、例えば、ＤＮＡ小溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、例えば、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）及びメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１及びＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピンを含有する薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１７】
別の好ましい例において、前記毒素は、
オーリスタチン系（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥ和ＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、美坦西醇(maytansinoid)、リシン毒素、リシン毒素Ａ−鎖、コンブレタスタチン、ズオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
別の好ましい例において、前記結合部分は、検出可能なマーカーである。
別の好ましい例において、前記コンジュゲートは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（電子コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な製品を生成できる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）、抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ−心筋細胞（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）、または任意の形態のナノ粒子などから選択される。
【００１９】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、本発明の第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディの多価（例えば、二価）ＶＨＨ鎖、本発明の第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディを含む。
別の好ましい例において、前記多価とは、前記免疫コンジュゲートのアミノ酸序列に本発明の第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディの複数の重複のＶＨＨ鎖、本発明の第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディを含むことを指す。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、特にＨｅｒ２を発現する腫瘍（即ち、Ｈｅｒ２陽性腫瘍）などの癌の診断または予後に使用される。
別の好ましい例において、前記検出は、生体内検出または生体外検出である。
【００２０】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、Ｈｅｒ２タンパク質を発現する腫瘍の診断および／または治療に使用される。
本発明の第８の態様では、（ａ）Ｈｅｒ２分子を検出するための試薬と、（ｂ）腫瘍を治療するための薬物とを調製するために使用される本発明の第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディ、または本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートを用途を提供する。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートの結合部分は、診断用同位体である。
【００２１】
別の好ましい例において、前記試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子及びイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
別の好ましい例において、前記Ｈｅｒ２分子を検出するための試薬は、（体内）Ｈｅｒ２分子を検出するための造影剤である。
別の好ましい例において、前記検出は、生体内検出または生体外検出である。
別の好ましい例において、前記検出は、フロー検出、細胞免疫蛍光検出む含む。
【００２２】
本発明の第９の態様では、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または本発明の第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディ、または本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートと、及び
（ｉｉ）薬理学的許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートの結合部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、細胞毒性薬物などの腫瘍を治療する他の薬物をさらに含む。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、Ｈｅｒ２タンパク質（即ち、Ｈｅｒ２陽性）を発現する腫瘍を治療するために使用される。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、注射剤である。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、腫瘍を治療するための薬物を調製するために使用され、前記腫瘍は、胃がん、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、リンパ腫、副腎腫瘍、または膀胱腫瘍からなる群から選択される。
【００２３】
本発明の第１０の態様では、本発明の第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディ、または本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートの１つまたは複数の用途を提供する、
（ｉ）ヒトＨｅｒ２分子を検出のために使用され、
（ｉｉ）フロー検出に使用され、
（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出に使用され、
（ｉｖ）腫瘍の治療のために使用され、
（ｖ）腫瘍の診断のために使用される。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、Ｈｅｒ２タンパク質（即ち、Ｈｅｒ２陽性）を発現する腫瘍である。
別の好ましい例において、前記用途は、非診断的と非治療的である。
【００２４】
本発明の第１１の態様では、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域ＶＨＨを有する抗体をさらに提供する。
別の好ましい例において、前記抗体は、Ｈｅｒ２タンパク質に特異的な抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、ナノボディである。
【００２５】
本発明の第１２の態様では、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域ＶＨＨの序列または本発明の第２の態様に記載のナノボディの序列と、及び
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ序列とを含む。
別の好ましい例において、前記タグ序列は、６ＨｉｓタグとＨＡタグを含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、Ｈｅｒ２タンパク質に特異的に結合する。
【００２６】
本発明の第１３の態様では、本発明の第１の態様に記載のＶＨＨ鎖、本発明の第２の態様に記載のナノボディ、または本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供し、それらは、医薬品、試薬、検出プレートまたはキットの製造に使用され、
ここで、前記試薬、検出プレートまたはキットは、サンプル中のＨｅｒ２タンパク質の検出のために使用され、
ここで、前記医薬品は、Ｈｅｒ２タンパク質（即ち、Ｈｅｒ２陽性）を発現する腫瘍を治療または予防するために使用される。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、黒色腫、胃がん、リンパ腫、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、または副腎腫瘍を含む。
【００２７】
本発明の第１４の態様では、サンプル中のＨｅｒ２タンパク質を検出する方法を提供し、前記方法は、
サンプルを本発明の第２の態様に記載のナノボディと接触されるステップ（１）と、及び
抗原−抗体複合体が形成されているかどうかを検出し、ここで、複合体が形成されるとサンプルにＨｅｒ２タンパク質が存在することを示すステップ（２）とを含む。
【００２８】
本発明の第１５の態様では、本発明の第２の態様に記載のナノボディまたは本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートを必要とする対象に投与する疾患を治療する方法を提供する。
別の好ましい例において、前記対象は、ヒトのような哺乳動物を含む。
【００２９】
本発明の第１６の態様では、本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲート及び検出学的許容される担体を含むＨｅｒ２タンパク質検出試薬を提供する。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートの結合部分は、診断用同位体である。
別の好ましい例において、前記検出学的許容される担体は、非毒性的、不活性的水性担体媒体である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、造影剤であり、前記造影剤は、イメージング用の他の製剤をさらに含む。
別の好ましい例において、前記造影剤は、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（電子コンピュータ断層撮影技術）に使用される造影剤である。
別の好ましい例において、前記イメージング剤は、Ｇａ−６８およびＧｄなどの２つまたは複数の信号を同時にキレートし、ＰＥＴ／ＣＴおよびＭＲＩに使用され、またはＴｃ−９９ｍおよび蛍光剤は、同時にＳＰＥＣＴ／ＣＴおよび蛍光検出に同時に使用される。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、生体内検出に使用される。
別の好ましい例において、前記検出試薬の剤形は、液体または粉末状（例えば、水剤、注射剤、凍結乾燥粉末、錠剤、バッカル剤、エアロゾル剤）である。
【００３０】
本発明の第１７の態様では、本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートと取扱説明書を含むＨｅｒ２分子を検出するためのキットを提供する。
別の好ましい例において、前記取扱説明書には、キットは、検出対象のＨｅｒ２の発現を非侵入的に検出するために使用されることが記載されている。
別の好ましい例において、前記キットは、Ｈｅｒ２タンパク質（即ち、Ｈｅｒ２陽性）を発現する腫瘍を検出するために使用される。
【００３１】
本発明の第１８の態様では、生体内でＨｅｒ２分子を検出ための造影剤を製造するための本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
別の好ましい例において、前記検出は、癌の診断または予後に使用される。
【００３２】
本発明の第１９の態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞を提供し、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体ＣＡＲを発現し、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本発明の第１の態様に記載のＶＨＨ鎖、または本発明の第２の態様に記載のナノボディを有する。
【００３３】
本発明の第２０の態様では、本発明の第２０の態様に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞、及び薬理学的許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む製剤を提供する。
別の好ましい例において、前記製剤は、液体製剤である。
別の好ましい例において、前記製剤の剤形は、注射剤を含む。
別の好ましい例において、前記製剤中のＣＡＲ−Ｔ細胞の濃度は、１×１０３−１×１０８個細胞／ｍｌであり、好ましくは、１×１０４−１×１０７個細胞／ｍｌである。
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下（例えば、実施例）に具体的に説明する各技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決手段を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】抗原タンパク質精製ＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。図の３つの電気泳動レーンは、左から右に核酸分子標準、精製したヒトＨｅｒ２（ＥＣＤ）−Ｆｃタンパク質、ＴＥＶ酵素分解後のヒトＨｅｒ２（ＥＣＤ）タンパク質であり、以上のタンパク質はすべてＨＥＫ２９３Ｆ細胞によって発現される。
【図２】ライブラリの構築及びその品質検出図である。図Ａは、第１のＰＣＲ増幅産物であり、サイズが約７００ｂｐの標的バンドをタッピングによって回収し、図Ｂは、第２のＰＣＲ増幅産物であり、サイズが約４００ｂｐのＶＨＨ遺伝子フラグメントを獲得し、図Ｃは、ライブラリーのライブラリー容量検出図であり、構築したライブラリーは勾配希釈した後にプレーティングされ、１／５の濃度で１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍のクローン数を希釈し、モノクローナル抗体の数を計算してライブラリーのサイズが２×１０９ＣＦＵであることを確認した。図Ｄは、ライブラリ挿入率の検出図であり、ライブラリの２４個のモノクローナル抗体をランダムに選択してＰＣＲ同定し、左から右へのＤＮＡバンドはそれぞれ第１のレーンは、ＤＮＡ分子標識、残りのウェルは、挿入フラグメント検出用のＰＣＲ産物であり、検出した結果前記ライブラリのＶＨＨ挿入率は１００％である。
【００３５】
【図３】Ｈｅｒ２ナノボディスクリーニング濃縮プロセスを示した。１回目のパンニングの後、ライブラリーは倍の濃縮を示さず、２回目のパンニングで３．７５倍の濃縮を示し、３回目のパンニングで１１０倍の濃縮を示した。
【図４】Ｈｅｒ２ナノボディの精製結果を示した。ナノボディは、ニッケルカラムイオンアフィニティクロマトグラフィーによって１ステップで調製および精製され、純度は９５％以上に達することができる。
【図５】Ｈｅｒ２ナノボディと異なる種Ｈｅｒ２との親和性を示した。ナノボディは、異なる勾配濃度でヒトおよびマウス抗原タンパク質Ｈｅｒ２と反応し、結果はナノボディがヒトＨｅｒ２にのみ結合することを示した。
【００３６】
【図６】ＨＥＲ−２高発現腫瘍を有するマウスにおけるＩ−１２５標識Ｈｅｒ２ナノボディのＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングの結果を示した。複数のナノボディは、Ｈｅｒ２高発現腫瘍を効果的に蓄積することができ、同時に非結合抗体は腎臓および膀胱を介して血液から迅速に除去される。
【図７】ＨＥＲ−２高発現腫瘍を有するマウスにおける９９ｍ−Ｔｃ標識Ｈｅｒ２ナノボディのＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングの結果を示した。ナノボディは、Ｈｅｒ２高発現腫瘍に特異的に蓄積することができ、非結合抗体は腎臓および膀胱を介して血液から迅速に除去され、同時にトラスツズマブまたはペルツズマブと競合しない。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明者は、広範囲にわたる綿密な研究および大量なスクリーニングにより、あるクラスの抗Ｈｅｒ２ナノボディを得ることに成功し、実験結果は、本発明によって得られたＨｅｒ２ナノボディがＨｅｒ２に効果的に結合できることを示す。
具体的に、本発明は、ヒト由来のＨｅｒ２抗原タンパク質を使用してラクダを免疫し、高品質の免疫ナノボディ遺伝子ライブラリーを獲得する。次に、Ｈｅｒ２タンパク質分子を酵素プレートに結合して、Ｈｅｒ２タンパク質の正しい空間構造を表示し、この形式の抗原を使用して、ファージディスプレイ技術を使用して免疫ナノボディ遺伝子ライブラリー（ラクダ重鎖抗体ファージディスプレイ遺伝子ライブラリー）をスクリーニングし、それによってＨｅｒ２特異的ナノボディ遺伝子を獲得した。次に、この遺伝子を大腸菌に導入して、大腸菌で効率的に発現できる高度に特異的なナノボディ株を獲得した。
【００３８】
本発明はまた、Ｈｅｒ２分子の検出に特に適した免疫コンジュゲートを初めて意外に発見し、前記免疫コンジュゲートは、特定の抗Ｈｅｒ２ナノボディＶＨＨ鎖と放射性核種を含み、検出対象のＨｅｒ２発現状況の非侵入的検出に使用できる。本発明の免疫コンジュゲートは、小さいサイズおよび高い特異性を有し、原発性腫瘍および転移性腫瘍を同時に標的化する全身検出に適し、精度が高く、放射線量が少ない。
なお、本発明は、Ｈｅｒ２陽性腫瘍を効果的に治療することができる免疫コンジュゲートをさらに提供する。
本明細書で使用される用語「本発明のナノボディ」、「本発明の抗Ｈｅｒ２ナノボディ」、「本発明のＨｅｒ２ナノボディ」は互換的に使用されることができ、すべてＨｅｒ２（ヒトＨｅｒ２を含む）を特異的に認識して結合するナノボディを指す。特に好ましいのは、ＶＨＨ鎖のアミノ酸序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０に示されたナノボディである。
【００３９】
本明細書で使用される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、２つの同じ軽鎖（Ｌ）および２つの同じ重鎖（Ｈ）からなる、同じ構造特性を有する約１５００００ダルトンのヘテロテトラグリカンタンパク質である。各軽鎖は共有ジスルフィド結合を介して重鎖に接続され、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖と軽鎖にも、一定の間隔で鎖内ジスルフィド結合がある。各重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）があり、他端に定常領域があり、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域の反対側にあり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域の反対側にある。特別なアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間に界面を形成する。
【００４０】
本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）」、「ナノボディ」（ｎａｎｏｂｏｄｙ）は、同じ意味を有し、抗体重鎖の可変領域をクローンすることを指し、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築し、これは完全な機能を持つ最小の抗原結合フラグメントを有する。通常、軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を自然欠缺の抗体を最初に取得した後、抗体の重鎖の可変領域をクローニングして、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築する。
【００４１】
本明細書で使用される用語「可変」は、抗体の可変領域のある部分が序列で異なり、その特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成することを意味する。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分布されていない。相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる軽鎖および重鎖の可変領域の３つのフラグメントに集中している。可変領域のより保存された部分は、フレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、それらは一般にb−折り畳まれた構成で、３つのＣＤＲで連結されて連結ループを形成し、場合によっては部分的なb折り畳まれた構造を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって密接に結合され、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら等、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．  Ｎｏ．  ９１−３２４２、巻Ｉ、６４７−６６９ページ（１９９１）を参照）。定常領域は、抗体と抗原の結合には直接関与しないが、抗体に関与する抗体依存性細胞毒性などの異なるエフェクター機能を示す。
【００４２】
当業者に知られているように、免疫コンジュゲートおよび融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素、および他の診断または治療分子と本発明の抗体またはそのフラグメントが結合することにより形成すされるコンジュゲートを含む。本発明はまた、前記抗Ｈｅｒ２タンパク質抗体またはそのフラグメントに結合した細胞表面マーカーまたは抗原を含む。
本明細書で使用される用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は、互換的に使用されることができる。
本明細書で使用される用語「可変領域」と「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）」は、互換的に使用されることができる。
【００４３】
本発明の一好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
本発明の一好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、前記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本発明において、用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は、互換的に使用されることができ、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドなどのＨｅｒ２タンパク質に特異的に結合するポリペプチドを指す。それらは出発メチオニンを含んでも含まなくてもよい。
【００４４】
本発明は、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現産物をさらに提供する。具体的に、本発明は、可変領域を含む重鎖を有する任意のタンパク質コンジュゲート及び融合発現産物（即ち、免疫コンジュゲートおよび融合発現産物）を含み、前記可変領域と本発明の抗体の重鎖可変領域が同一であるか、少なくとも９０％相同であり、好ましくは、少なくとも９５％相同である。
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖の可変領域にある３つの特定の領域によって説明することができる。前記セグメントを、４つのフレーム領域（ＦＲ）に分け、４つのＦＲのアミノ酸序列は、比較的保存的で、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲはループ構造を形成し、それらの間のＦＲによって形成されるβ折り畳みは、空間構造において互いに近接し、重鎖のＣＤＲと対応する軽鎖の対応するＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸序列を比較して、どのアミノ酸がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するかを決定することができる。
【００４５】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、それらの少なくとも一部が抗原の結合に関与しているため、特に興味深い。従って、本発明は、そのＣＤＲが本明細書で同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）相同である限り、ＣＤＲを持つ抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体と他の序列によって形成された融合タンパク質をさらに含む。従って、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体、および類似体をさらに含む。
【００４６】
本明細書で使用される用語「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」は、本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、ここで、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと、別の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどのポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチド、または（ｉｖ）追加のアミノ酸序列をこのポリペプチド序列に融合することにより形成されたポリペプチド（例えば、リーダー序列または分泌序列、またはこのポリペプチドまたはタンパク質を精製するために使用される序列、または６Ｈｉｓタグと形成された融合タンパク質）であることができる。本明細書の教示によれば、これらのフラグメント、誘導体、および類似体は、当業者に知られている範囲内にある。
【００４７】
本発明の抗体は、Ｈｅｒ２タンパク質結合活性を有し、前記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。この用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する前記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドのバリアントをさらに含む。これらのバリアントは、以下を含む（ただし、これらに限定されない）。１つまたは複数（通常は１個−５０個、好ましくは１個−３０個、より好ましくは１個−２０個、最も好ましくは１個−１０個）のアミノ酸欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端に１つまたは複数（通常２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸を付加。例えば、当該技術分野において、近接または類似の特性を有するアミノ酸で置換する場合、一般にタンパク質の機能を変化させない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端に１つまたは複数のアミノ酸を追加しても、通常、タンパク質の機能は変わらない。当該用語は、本発明の抗体の活性フラグメントおよび活性誘導体をさらに含む。
【００４８】
前記ポリペプチドのバリアントは、相同序列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、および高または低ストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコードＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡにコードされたタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用して得られたポリペプチドまたはタンパク質を含む。
本発明は、ナノボディまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質などの他のポリペプチドをさらに提供する。ほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のナノボディのフラグメントをさらに含む。一般に、前記フラグメントは、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を有する。
【００４９】
本発明において、「本発明抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸序列と比較して、最大１０個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大５個、最も好ましくは最大３個のアミノ酸を、近接または類似の特性を有するアミノ酸で置換することにより形成されるポリペプチドを指す。これらの保存的変異体ポリペプチドは、好ましくは表１によるアミノ酸置換により生成される。
【表１】
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【００５０】
本発明は、上記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であることができる。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であることができる。ＤＮＡは、コーディング鎖または非コーディング鎖であることができる。
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード序列と、成熟ポリペプチドのコード序列および様々な追加コード序列と、成熟ポリペプチドのコード序列（および任意の追加コード序列）および非コード序列を含む。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、前記ポリペプチドをコートするポリヌクレオチドであることができ、追加コードおよび／または非コード序列をさらに含むポリヌクレオチドであることもできる。
【００５１】
本発明はまた、上記序列にハイブリダイズし、２つの序列の間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、厳密な条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳密な条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃などの低イオン強度および高温でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または（２）ハイブリダイゼーション中に５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃などの変性剤の添加、または（３）２つの序列の間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％が以上である場合のみハイブリダイズが発生することを指す。また、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【００５２】
本発明の抗体のヌクレオチド全長序列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法、または人工合成法により獲得することができる。実行可能な方法は、特にフラグメントの長さが短い場合に、人工的な合成方法によって関連する序列を合成することである。通常、最初に複数の小さなフラグメントを合成し、次にそれらを連結することにより序列の長いフラグメントを獲得することができる。なお、重鎖のコード序列と発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合して融合タンパク質を形成することもできる。
一旦関連序列を獲得すると、組換え法を使用して関連序列を大量に獲得することができる。これは通常、担体にクローニングし、細胞に移し、その後、従来の方法で増殖した宿主細胞から分離して関連序列を獲得する。本発明による生体分子（核酸、タンパク質など）は、分離された形態で存在する生体分子が含む。
【００５３】
現在、本発明のタンパク質（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ序列は、化学合成により完全に獲得することができる。次いで、前記ＤＮＡ序列を、当該分野で公知のさまざまな既存のＤＮＡ分子（または担体など）および細胞に導入することができる。なお、化学合成により、本発明のタンパク質序列に突然変異を導入することもできる。
本発明はまた、上記の適切なＤＮＡ序列および適切なプロモーターまたは制御序列を含む担体に関する。これらの担体を使用して適切な宿主細胞を形質転換して、タンパク質を発現させることができる。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞、または哺乳動物細胞などの高等真核細胞であることができる。代表的な例は、大腸菌、ストレプトマイセスと、ネズミチフス菌の細菌細胞と、酵母などの真菌細胞と、ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞と、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞などの動物細胞がある。
【００５４】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術を使用して実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、指数関数的増殖期の後にＤＮＡを吸収できるコンピテント細胞を獲得し、ＣａＣｌ２法で処理し、使用されるステップは、当技術分野で周知である。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションにより形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどの従来の機械的方法などのＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる。
得られた形質転換体は、常法により培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択されることができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで成長した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）によって選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間培養する。
【００５５】
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内で、または細胞膜上で発現されるか、細胞外で分泌されることができる。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的、およびその他の特性を使用したさまざまな分離方法によって分離および精製することができる。これらの方法は、当業者に周知である。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧破壊、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびその他のさまざまな液体クロマトグラフィー技術、およびこれらの方法の組み合わせの結合を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、単独で使用することができ、または検出可能なマーカー（診断目的のため）、治療薬、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分、またはこれらのいずれかの組み合わせまたはコンジュゲートすることができる。
【００５６】
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（電子コンピューター断層撮影技術）造影剤、または検出可能な産物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体と組み合わせまたはコンジュゲートすることができる治療薬は、１、放射性核種、２、生物毒性、３、ＩＬ−２などのサイトカイン、４、金ナノ粒子／ナノロッド、５、ウイルス粒子、６、リポソーム、７、ナノ磁性粒子、８、薬物活性化酵素（例えば、ＤＴ−ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、９、治療薬（例えば、シスプラチン）または任意の種類のナノ粒子などを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
免疫コンジュゲート
本発明は、免疫コンジュゲートをさらに提供し、前記免疫コンジュゲートは、以下を含む。
（ａ）本発明の第１の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディのＶＨＨ鎖、または本発明の第２の態様に記載の抗Ｈｅｒ２ナノボディと及び
（ｂ）結合部分：放射性核種、酵素抗体、細胞、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される結合部分。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、本発明の第７の態様に記載のとおりである。
本発明の免疫コンジュゲートは、試験対象のＨｅｒ２発現を非侵入的に検出するために使用することができ、サイズが小さく、特異性が高く、原発性および転移性腫瘍を同時に標的とする全身検出に適し、精度が高く、放射線量が少ない。
【００５８】
細胞毒性
本発明の抗体コンジュゲート構成する結合部分は、細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素などの毒素を含み、そのフラグメントおよび／または変異体を含む。細胞毒性の例は、オーリスタチン系（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、美坦西醇、リシン毒素、リシン毒素Ａ−鎖、コンブレタスタチン、ズオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤及び糖質コルチコイドと他の化学療法薬、およびＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２とＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体などの放射性同位体を含むが、これらに限定されない。抗体は、プロドラッグをその活性型に変換することができる抗癌プロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせることもできる。
好ましい小分子薬物は、高い細胞毒性を有する化合物であり、好ましくは、モノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、カリケアマイシン、メイタンシノイド、またはそれらの組み合わせであり、より好ましくは、モノメチルオーリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチン−Ｄ（ＭＭＡＤ）、モノメチルオーリスタチン−Ｆ（ＭＭＡＦ）、またはそれらの組み合わせである。
【００５９】
薬物組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、薬物組成物であり、上記抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質または免疫コンジュゲート、及び薬理学的許容される担体を含む。通常、これらの物質を非毒性、不活性、および薬理学的に許容される水性担体媒体で製剤することができ、ここで、ｐＨは通常約５〜８、好ましくは約６〜８であり、ｐＨは、製剤化される物質の性質と治療する病気によって異なる場合がある。製剤化された薬物組成物は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（しかし、これらに限定されない）従来の経路により投与することができる。
本発明の薬物組成物は、Ｈｅｒ２タンパク質分子の結合に直接に使用することができるため、腫瘍を治療に使用することができる。なお、他の治療薬を同時に使用することもできる。
【００６０】
本発明の薬物組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１−９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１−９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１−８０ｗｔ％）の本発明の上記ナノボディ（またはそのコンジュゲート）及び薬理学的許容される担体または賦形剤を含む。このタイプの担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含む（しかし、これらに限定されない）。薬物製剤は、投与方法と合わせる必要がある。本発明の薬物組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いた従来の方法により、注射剤の形態で調製することができる。注射剤および液剤などの薬物組成物は、無菌条件下で製造されることが好ましい。活性成分の投与量は、治療有効量であり、例えば、１日当たり約１０ｎｇ／ｋ体重−約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ体重−約１ｍｇ／ｋｇ体重または１０μｇ／ｋｇ体重−約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
なお、本発明のポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、他の治療薬（例えば、抗腫瘍剤または免疫調節剤）とともに使用することもできる。
薬物組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、安全かつ有効な量は通常少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えず、好ましくは、投与量は約５０ｎｇ／ｋｇ体重−約１ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な投与量は、投与経路、患者の健康などの他の要因などの要因も考慮する必要があり、これらはすべて熟練した医師のスキルの範囲内である。
【００６１】
標識されたナノボディ
本発明の一好ましい例において、前記ナノボディは、検出可能なマーカーを有する。より好ましくは、前記マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、有色マーカーまたは蛍光着色マーカーからなる群から選択される。
コロイド金標識は、当業者に知られている方法を使用して実施することができる。本発明の一好ましい実施形態において、Ｈｅｒ２に対するナノボディをコロイド金で標識して、コロイド金標識のナノボディを獲得する。
本発明の抗Ｈｅｒ２ナノボディは、良好な特異性と高い力価を有する。
【００６２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞
本明細書で使用される用語「ＣＡＲ−Ｔ細胞」、「ＣＡＲ−Ｔ」、「本発明ＣＡＲ−Ｔ細胞」はすべて本発明の第１９の態様に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を指す。
本明細書で使用されるキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、任意のヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、任意のシグナルペプチドと標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインともよばれる）を含まれます。細胞内ドメインは、共刺激分子とζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子を含む細胞内ドメインの一部を指す。共刺激分子は、リンパ球が抗原に効果的に応答するために必要な細胞表面分子であり、抗原受容体またはそれらのリガンドではない。
【００６３】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」、「一本鎖抗体フラグメント」はすべて、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または単一Ｆｖフラグメントを指す。Ｆｖ抗体は、抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含むが、定常領域はなく、すべての抗原結合部位の最小の抗体フラグメントを有する。一般に、Ｆｖ抗体はＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーも含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。抗原結合ドメインは通常ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。一本鎖抗体は、好ましくは、ヌクレオチド鎖によりコードされるアミノ酸鎖序列である。本発明の好ましい実施形態として、前記ｓｃＦｖは、本発明の第１の態様に記載のＶＨＨ鎖、または本発明の第２の態様に記載のナノボディを含む。
【００６４】
ヒンジ領域および膜貫通領域（膜貫通ドメイン）については、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むようにＣＡＲを設計することができる。一実施形態において、ＣＡＲ中のドメインの１つと自然に関連する膜貫通ドメインを使用する。いくつかの例において、膜貫通ドメインの選択またはアミノ酸置換による修飾により、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑える。
【００６５】
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインの間にリンカーを組み込むことができる。本明細書で使用される用語「リンカー」は、通常、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外または細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。リンカーは、０〜３００個のアミノ酸、好ましくは、２〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは３〜５０個のアミノ酸を含むことができる。
ＣＡＲがＴ細胞で発現すると、細胞外セグメントは特定の抗原を認識することができ、このシグナルは細胞内ドメインを介して伝達され、細胞の活性化と増殖、細胞溶解毒性、ＩＬ−２やＩＦＮ−γなどのサイトカインの分泌を引き起こし、腫瘍細胞に影響を及ぼし、腫瘍細胞が成長しない、死に至る、または他の方法で影響を受け、患者の腫瘍負荷の軽減または排除をもたらす。抗原結合ドメインは、好ましくは、共刺激分子およびζ鎖の１つまたは複数からの細胞内ドメインと融合する。
【００６６】
検出方法
本発明はまた、Ｈｅｒ２タンパク質を検出する方法に関する。前記方法のステップはおよそ次のとおりです。細胞および／または組織サンプルの獲得、サンプルの媒体への溶解、前記溶解されたサンプルのＨｅｒ２タンパク質のレベルの検出。
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは特に限定されず、代表例は、細胞保存液中に存在する細胞含有サンプルである。
【００６７】
キット
本発明は、本発明の抗体（またはそのフラグメント）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の一好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝液などをさらに含む。
本発明は、Ｈｅｒ２レベルを検出するための検出キットをさらに提供し、前記キットは、Ｈｅｒ２タンパク質を認識する抗体、サンプルを溶解するためのクラッキング媒体、様々な緩衝液、検出標識、検出基質などの検出に必要な一般的な試薬および緩衝液を含む。前記検出キットは、生体内診断装置であることができる。
本発明は、本発明の免疫コンジュゲートを含むキットをさらに提供し、本発明の一好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、同位体トレーサー及び造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子とイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬をさらに含む。
好ましくは、本発明のキットは、被験者のＨｅｒ２発現を非侵入的に検出するための生体内診断キットである。
【００６８】
応用
上述のように、本発明のナノボディは、幅広い生物学的応用価値および臨床的応用価値を有し、その応用は、Ｈｅｒ２関連疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究などの多くの分野に関する。一好ましい応用は、Ｈｅｒ２に対する臨床診断および標的療法である。
【００６９】
本発明の主な利点は、以下を含む。
（ａ）本発明のナノボディは、正しい空間構造を有するヒトＨｅｒ２タンパク質に対して高度に特異的である。
（ｂ）本発明のナノボディの親和性は強い。
（ｃ）本発明のナノボディの製造は簡単である。
（ｄ）本発明のナノボディは、ヒト由来のＨｅｒ２に特異的に結合でき、Ｈｅｒ２高発現腫瘍モデルに効果的に蓄積でき、トラスツズマブまたはペルツズマブと競合しない。本発明のＨｅｒ２ナノボディは、Ｈｅｒ２標的癌診断および治療効果評価、ならびに新世代のＨｅｒ２の標的インビボ放射線療法に非常に適している。
【００７０】
以下、具体的な実施例に結び付けて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件のない実験方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載の条件、またはメーカーが推奨する条件に基づく。他に示されない限り、パーセンテージおよび部数は重量パーセントおよび重量部である。
【００７１】
実施例１：ヒトＨｅｒ２タンパク質の発現と精製
（１）ヒトＨｅｒ２のヌクレオチド序列をｐＣＤＮＡ３．１（−）担体に合成し、その後その細胞外フラグメント序列をｐＦＵＳＥ−ＩｇＧ１担体にサブクローニングし、ここで、ｈＨｅｒ２（ＥＣＤ）のＣ端にＴＥＶ酵素分解ポイントに導入して、ＦｃタグのないｈＨｅｒ２（ＥＣＤ）タンパク質の調製を容易にする。
（２）Ｏｍｅｇａプラスミド大抽出キットで構築されたｐＦＵＳＥ−ＩｇＧ１−ｈＨｅｒ２（ＥＣＤ）プラスミドを抽出した。
（３）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＯＤが２．０×１０６個／ｍＬになるまで培養した。
（４）プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを１：５に均一に混合した後、１０分間静置し、その後ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に加え、３７℃、６％  ＣＯ２シェイキングインキュベーターで５−６日間培養した。
（５）細胞上清を回収し、室温でプロテインＡビーズと１時間結合させた。
（６）ｐＨ７．０のリン酸緩衝液でビーズを洗浄した後、０．１ＭのｐＨ３．０グリシンでタンパク質を溶出した。
（７）溶出したタンパク質をＰＢＳで限外ろ過し、収量を測定した後、サンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出（テスト結果は、図１に示した通りである）し、前記抗原の純度は９５％を以上であり、後続の免疫反応に使用することができる。
（８）続いて、ＴＥＶ酵素を使用してタンパク質を酵素分解し、後続抗体スクリーニングのためにタグのない抗原タンパク質Ｈｅｒ２（ＥＣＤ）を獲得した。
【００７２】
実施例２：Ｈｅｒ２ナノボディライブラリの構築
（１）１ｍｇのｈＨｅｒ２（ＥＣＤ）−Ｆｃ抗原とフロイントアジュバント（ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を等量混合し、新疆バクトリアラクダを週に１回、３回免疫し、Ｂ細胞を刺激して抗原特異的ナノボディを発現させた。
（２）３回の免疫後、１００ｍＬのラクダ末梢血リンパ球を抽出し、トータルＲＮＡを抽出した。
（３）ｃＤＮＡを合成し、ネストされたＰＣＲを使用してＶＨＨを増幅した（図２のＡは、第１のＰＣＲ増幅産物であり、サイズが約７００ｂｐのＶＨＨ−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメントをタッピングによって回収し、図２のＢは、第２のＰＣＲ増幅産物であり、サイズが約４００ｂｐのＶＨＨフラグメントである）。
（４）制限酵素Ｐｓｔ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉを使用して、２０μｇのｐＭＥＣＳファージディスプレイベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒから提供）および１０μｇのＶＨＨを切断し、２つのフラグメントを連結した。
（５）連結産物をエレクトロコンピテント細胞ＴＧ１に形質転換し、Ｈｅｒ２ナノボディライブラリを構築し、保存容量を測定した。結果は、図２のＣに示した通りであり、構築したライブラリーは勾配希釈した後にプレーティングされ、１／５の濃度で１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍のクローン数を希釈し、モノクローナル抗体の数を計算してライブラリーのサイズが２×１０９ＣＦＵであることを確認した。
（６）同時に、コロニーＰＣＲ検出のために２４個のクローンをランダムに選択した。図２のＤはコロニーＰＣＲの結果を示し、結果は構築したライブラリのＶＨＨ挿入率は１００％であることを示した。
【００７３】
実施例３：Ｈｅｒ２ナノボディのスクリーニングと識別
抗体のスクリーニング
（１）１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２に溶解した１０μｇのｈＨｅｒ２（ＥＣＤ）−Ｆｃ抗原（１０μｇ  Ｆｃ  ｉｎ  ＮａＨＣＯ３を対象とする）をＮＵＮＣプレートにコンジュゲートし、４℃で一晩放置した。
（２）翌日に１００μＬの０．１％ＢＳＡを添加し、室温で２時間ブロックした。
（３）２時間後、１００μＬのファージ（２×１０１１ＣＦＵ免疫ラクダナノボディファージディスプレイ遺伝子ライブラリー）を加え、室温で１時間反応させた。
（４）０．０５％のＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄して、非特異的ファージを洗い流した。
（５）１００ｍＭのトリエタノールアミンでＨｅｒ２に特異的に結合するファージを分離し、対数期に増殖する大腸菌ＴＧ１細胞に感染させ、３７℃で１時間培養し、次のスクリーニングのためにファージを生成および精製した。同じスクリーニングプロセスを３回繰り返し、濃縮結果は、図３に示したとおりであり、３回のバイオパニング（ｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇ）プロセスの後、最終的に１１０倍の濃縮が現れた。
【００７４】
ファージの酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による特異的単一陽性クローンのスクリーニング：
（１）上記２−３回のスクリーニング後、ファージを含む細胞培養皿から６００個の個々のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＴＢ培地（１ＬのＴＢ培地には、２．３ｇのＫＨ２ＰＯ４、１２．５２ｇのＫ２ＨＰＯ４、１２ｇのペプトン、２４の酵母エキス、４ｍＬのグリセロールが含まれる）に接種し、対数期に成長した後、１ｍＭのＩＰＴＧ最終濃度で添加し、２８℃で一晩培養した。
（２）浸透法により粗抗体を得て、抗体を抗原被覆ＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１時間放置した。
（３）非結合抗体をＰＢＳＴで洗浄し、マウス抗ＨＡ抗体（北京康為世紀生物科技有限公司から購入）を加え、室温で１時間放置した。
（４）ＰＢＳＴで非結合抗体を洗浄し、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体を加え、室温で１時間放置した。
（５）非結合抗体をＰＢＳＴで洗浄し、アルカリホスファターゼ発色溶液を加え、ＥＬＩＳＡ装置において４０５ｎｍの波長で吸収値を読み取った。
（６）サンプルウェルのＯＤ値が対照ウェルのＯＤ値の３倍以上である場合（Ｒａｔｉｏ＋／−＞３）、陽性クローンウェルと判断される。  ＰＥ−ＥＬＩＳＡの結果、合計４８６の陽性クローンを示し、比率（比：＋／−）が３〜３０でしあり、その後、すべての陽性クローンをＬＡ培地に移して培養し、プラスミドを抽出してシーケンスを実行した。シーケンシング結果が多く、シーケンシング結果はほとんど繰り返しシーケンスであるため、表２に示すように、最終的に得られた４０ナノボディの対応するＥＬＩＳＡ結果のみを表示した。
【００７５】
【表２】
2020525048.tif 000003
上記の４０の抗体のＶＨＨ鎖のヌクレオチド序列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１−４０に示された。表３において、番号がｎであるＶＨＨ（ｎ＝１−４０の正の整数）のアミノ酸序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：ｎであり、対応するコーディング序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４０＋ｎである。
【００７６】
【表３】
2020525048.tif 000004
【００７７】
４０のナノボディの序列は以下の通りであり、４０のナノボディの３つのＣＤＲ領域は、それぞれ下線を引いだ。
【化１−１】
2020525048.tif 000005
【化１−２】
2020525048.tif 000006
【化１−３】
2020525048.tif 000007
【化１−４】
2020525048.tif 000008
【化１−５】
2020525048.tif 000009
【化１−６】
2020525048.tif 000010
【化１−７】
2020525048.tif 000011
【００７８】
実施例４：宿主細菌大腸菌におけるナノボディの発現、精製：
（１）実施例３のシーケンス分析で得られた異なるクローン（７つのナノボディをランダムに選択）について、対応する各プラスミドを大腸菌ＷＫ６に電気形質転換し、ＬＡ＋グルコース、即ちアンピシリンとグルコースを含む培養プレートにコーティングし、３７℃で一晩培養した。
（２）単一のコロニーを選び、５ｍＬのアンピシリンを含むＬＢブロスに接種し、３７℃でシェイキング培養した。
（３）１ｍＬの一晩培養した細菌を３３０ｍＬのＴＢ培地に接種し、３７℃でシェイキング培養し、ＯＤ値が０．６−１に達したら、ＩＰＴＧを加え、２８℃で一晩シェイキング培養した。
（４）遠心分離して細菌を収集した。
（５）浸透法により抗体粗抽出物を獲得した。
（６）ニッケルカラムイオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたナノボディを調製した。
精製結果は、図４に示したとおりであり、精製後、抗Ｈｅｒ２ナノボディの純度は９５％以上に達することができる。
【００７９】
実施例５：酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりナノボディと異なる種のＨｅｒ２の親和性を同定
（１）ヒトおよびマウス種の抗原タンパク質ＨＥＲ２をコーティング：ヒトおよびマウス種の抗原タンパク質Ｈｅｒ２を添加し、４℃で一晩放置した。
（２）翌日にＰＢＳＴで３回洗浄し、１％のＢＳＡを加えて室温で２時間ブロックした。
（３）精製したナノボディを勾配で希釈し、コーティングされたＨｅｒ２抗原と室温で１時間放置した。
（４）非結合抗体をＰＢＳＴで洗浄し、マウス抗ＨＡ抗体を加えて、室温で１時間放置した。
（５）非結合抗体をＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体を加え、室温で１時間放置した。
（６）非結合抗体をＰＢＳＴで洗浄し、アルカリホスファターゼ発色溶液を加え、ＥＬＩＳＡ装置において、４０５ｎｍの波長で吸収値を読み取り、吸収値に従ってナノボディの特異性を判断した。
検出結果は図５に示したように、本発明のナノボディは、ヒトＨｅｒ２にのみ結合する。
【００８０】
実施例６：フローサイトメトリーによるナノボディと細胞の結合の検出
（１）細胞タイプ：ＢＴ４７４及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１。ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。
（２）ナノボディをＰＢＳで０．１ｕｇ／ｕＬの濃度に希釈した。
（３）洗浄した細胞をウェルプレートに分注し、各サンプルの細胞数を３×１０５にした後、希釈したナノボディを各ウェルに加え、均一に混合し、４℃で２０分間放置した。
（４）細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞を１００ｕＬのＰＢＳで再懸濁し、マウス抗ＨＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗体を、サンプルあたり１ｕＬに加え、均一に混合し、４℃で２０分間放置した。
（５）細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００ｕＬのＰＢＳを含むフローチューブに細胞を再懸濁し、光から保護して氷上に置き、機械でテストした。
結果は、Ｈｅｒ２発現が高い（ＢＴ４７４）細胞株において、本発明のナノボディの陽性率は＞９９％であり、Ｈｅｒ２発現が低い（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞株において、ナノボディの陽性率は、６−１４％であり、２つの間の差は少なくとも約６倍であったことを示し、これは、本発明のナノボディがＨｅｒ２に対して非常に良好な特異性を有することをさらに示唆している。いくつかのナノボディの結果を表４に示した。
【表４】
2020525048.tif 000012
【００８１】
実施例７：Ｂｉａｃｏｒｅ  ３Ｋ親和性およびトラスツズマブとペルツズマブの競合の測定
（１）固定：固定相抗原タンパク質Ｈｅｒ２をカルボキシアミノ反応によりＣＭ−５センサーチップの表面に固定した。
（２）結合：ナノボディをＨＢＳバッファーで異なる濃度に希釈し、ナノボディとトラスツズマブまたはペルツズマブまたは抗原のみの結合プロセスを観察した。
（３）チップの再生：次の抗体測定を実行するとき、１０ｍＭグリシンですすいで、再生した。
結果は、本発明のナノボディがＨｅｒ２との親和性がナノモル濃度レベル以上に達し、トラスツズマブまたはペルツズマブと競合してＨｅｒ２に結合しないことを示した。いくつかのナノボディのデータを表５に示した。
【表５】
2020525048.tif 000013
【００８２】
実施例８  ナノボディＩ−１２５の標識、分離精製及びＳＰＥＣＴイメージングスキャン
（１）１５０μＬの抗体原液を取り、１００μＬの０．０２ｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．４リン酸緩衝液と５０μＬのＮａ１２５Ｉ溶液を加え、均一に混合し、２０μＬの５ｍｇ／ｍＬクロラミンＴ溶液を加え、ミキサーで室温で７０秒間反応させ、２００μＬのメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を加え、５分間作用させた。
（２）ＰＤ１０カラムで分離し、溶出液は０．０２ｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ  ７．４のリン酸緩衝液であり、チューブあたり１０滴を収集し、ペーパークロマトグラフィーを使用してＩ−１２５標識ナノボディの純度を確認した。
（３）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、細胞接種の１日前に右背中にエストロゲン錠剤を皮下移植し、右乳房脂肪パッドに１×１０７Ｈｅｒ２高発現（ＢＴ４７４）細胞を接種し、腫瘍が１５０−２００ｍｍ３に成長すると、正式な実験研究に使用した。
（４）担癌マウスをイソフルランで麻酔し、Ｉ−１２５標識ナノボディ（〜５０ｕｇ、５ＭＢｑ）を尾静脈に注射した。
（５）投与の３０分後にスキャンし、取得方法は静的１５分ＳＰＥＣＴおよび中解像度全身ＣＴである。
結果は、本発明の複数のナノボディが、Ｈｅｒ２高発現腫瘍モデルの効果的な蓄積に効果的であり、癌の診断および治療に適用されることを示した。同時に、非結合抗体は腎臓と膀胱を介して血液から迅速に除去され、身体の放射線量を減らす。
担癌マウスの一部のナノボディの３０分のＳＰＥＣＴスキャン写真と身体分布データを図６と表６に示した。
【表６】
2020525048.tif 000014
【００８３】
実施例９  ナノボディＴｃ−９９ｍ標識、分離精製及びＳＰＥＣＴイメージングスキャン
（１）それぞれ５．５ｍｇのＮａ２ＣＯ３、１５．２ｍｇの酒石酸カリウムナトリウム、及び２０．５ｍｇのＮａＢＨ４を１０ｍＬの滅菌ボトルに加え、２０分間のＣＯを通過させ、１ｍＬ（３５ｍＣｉ）のＮａ［９９ｍＴｃＯ４］を加え、反応ボトルを密閉し、８０℃で３０分間加熱した。
（２）５０μｌの抗体原液を取り、５００μｌの９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３反応溶液（６．５６ｍＣｉ）を加え、４５−５０℃で９０分間反応させた。
（３）ＰＤ１０カラムで分離し、溶離液は０．０２ｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液であり、薄層クロマトグラフィーにより９９ｍＴｃ標識ナノボディに放射純度を確認した。
（４）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、細胞接種の１日前の右背中にエストロゲンの丸薬を皮下移植し、右乳房脂肪パッドに１×１０７Ｈｅｒ２高発現（ＢＴ４７４）細胞を接種し、腫瘍が１５０−２００ｍｍ３に成長すると、正式な実験研究に使用した。
（５）担癌マウスをイソフルランで麻酔し、Ｔｃ−９９ｍ標識ナノボディ（〜１０ｕｇ、５ＭＢｑ）を尾静脈に注入するか、２０ｘ非標識ナノボディを同時に混合するか、７２時間前に２０ｘトラスツズマブまたは２０ｘペルツズマブ尾静脈注射により前処置した。
（６）投与の３０分後にスキャンし、取得方法は静的１５分ＳＰＥＣＴおよび中解像度全身ＣＴである。
結果は、本発明の複数のナノボディが、Ｈｅｒ２高発現腫瘍モデルの効果的な蓄積に効果的であり、トラスツズマブまたはペルツズマブと競合しないことを示した。Ｈｅｒ２をターゲットにした癌の診断と有効性の評価に使用でき、同時にＨｅｒ２をターゲットにした新世代の治療法を開発することができる。
担癌マウスの一部のナノボディの３０分のＳＰＥＣＴスキャン写真と身体分布データを図７と表７に示した。
【表７】
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【００８４】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれる。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内に入ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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