(57)【要約】  選択した遺伝子のＮＫ細胞での過小発現の検出を用いて、通常はＮＫ細胞のＡＤＣＣおよび細胞傷害性細胞殺作用に対して抑制性である低酸素腫瘍微小環境を確認する。中でも、低酸素がＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１αの制御下にある遺伝子をアップレギュレートすることがわかっているが、腫瘍微小環境での低酸素は、ＨＩＦ−１αを含む選択した遺伝子の過小発現をもたらした。したがって、ＮＫ細胞における特定の遺伝子の遺伝子発現解析を用いて、ｈａＮＫ細胞の使用の必要を示す腫瘍の状態を検出することができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有すると診断された患者のＮＫ細胞を試験して低酸素腫瘍微小環境の存在を確認する方法であって、
前記患者から血液を得て、前記患者の血液からＮＫ細胞を単離することと、
前記ＮＫ細胞における少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の発現を定量化することと、
正常酸素状態でのＮＫ細胞における前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の発現レベルと比較して前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を同定することと
を含む、方法。
【請求項２】
磁気分離およびＮＫ細胞に特異的な抗体を用いて前記ＮＫ細胞を単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
定量的ｒｔＰＣＲまたはＲＮＡｓｅｑを用いて発現の定量化を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子がＨＩＦ−１αである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９およびＭＩＲ２８６１からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が少なくとも２．０のｌｏｇ２変化倍率で過小発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を同定する工程の後に、
（１）前処置していない同じＮＫ細胞に比して低酸素状態での細胞殺作用の阻害が低減されている前処置したＮＫ細胞、
（２）同種ｈａＮＫ細胞および
（３）ＳＴＡＴ３阻害剤
のうちの少なくとも１つを投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を診断し治療する方法であって、
患者から血液試料を得て、前記患者の血液試料からＮＫ細胞を単離することと、
単離した前記ＮＫ細胞における少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を検出することと、
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現が検出された場合、前記患者が低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を有すると診断することと、
診断した前記患者に有効量の同種異系ｈａＮＫ細胞を投与することと
を含む、方法。
【請求項１０】
磁気分離およびＮＫ細胞に特異的な抗体を用いてＮＫ細胞を単離する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
定量的ｒｔＰＣＲまたはＲＮＡｓｅｑを用いて発現の定量化を実施する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子がＨＩＦ−１αである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９およびＭＩＲ２８６１からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が少なくとも２．０のｌｏｇ２変化倍率で過小発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記同種異系ｈａＮＫ細胞が、高親和性変異型のＣＤ１６を発現する改変ＮＫ９２細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を治療する方法であって、
患者から血液試料を得て、前記患者の血液試料からＮＫ細胞を単離することと、
単離した前記ＮＫ細胞における少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を検出することと、
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現が検出された場合、前記患者が低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を有すると診断することと、
診断した前記患者に有効量のＳＴＡＴ３阻害剤を投与することと
を含む、方法。
【請求項１８】
磁気分離およびＮＫ細胞に特異的な抗体を用いてＮＫ細胞を単離する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
定量的ｒｔＰＣＲまたはＲＮＡｓｅｑを用いて発現の定量化を実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子がＨＩＦ−１αである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９およびＭＩＲ２８６１からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が少なくとも２．０のｌｏｇ２変化倍率倍数で過小発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＴＡＴ３阻害剤が、ＳＨ２ドメイン結合阻害剤、二量体化阻害剤およびＤＮＡ結合ドメイン阻害剤からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍を治療する方法であって、
患者に腫瘍血管新生を低減させる薬物を投与し、前記薬物を、低酸素腫瘍微小環境を生じさせるのに有効な量およびスケジュールで投与することと、
前記低酸素腫瘍微小環境の存在の決定に基づいて、
１．前処置していない同じＮＫ細胞に比して低酸素状態での細胞殺作用の阻害が低減されている前処置したＮＫ細胞；
２．同種ｈａＮＫ細胞および
３．ＳＴＡＴ３阻害剤
のうちの少なくとも１つを投与することと
を含む、方法。
【請求項２６】
前記腫瘍血管新生を低減させる薬物が、ＶＥＧＦシグナル伝達を遮断する薬物、内皮細胞の細胞増殖および細胞遊走を阻害する薬物、血管新生刺激因子をダウンレギュレートし、内皮細胞の細胞遊走を阻害する薬物、血管新生刺激因子の結合を阻害する薬物ならびに内皮細胞のアポトーシスを誘導する薬物のうちの少なくとも１つである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍血管新生を低減させる薬物がベバシズマブである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の発現レベルの定量化を用いて前記低酸素腫瘍微小環境の存在を決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９、ＭＩＲ２８６１、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記前処置したＮＫ細胞をＩＬ−２で前処置する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記同種異系ｈａＮＫ細胞が、高親和性変異型のＣＤ１６を発現する改変ＮＫ９２細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＳＴＡＴ３阻害剤が、ＳＨ２ドメイン結合阻害剤、二量体化阻害剤およびＤＮＡ結合ドメイン阻害剤からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
さらなる化学療法薬を投与すること、または前記腫瘍に放射線照射することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学療法薬または放射線照射を、前記腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を増大させるのに有効なスケジュールおよび量で実施する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
投与すること、または放射線照射することが、任意選択で規則的に低用量投与または低線量照射する工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍を治療する方法であって、
患者に腫瘍血管新生を低減させる薬物を投与し、前記薬物を、低酸素腫瘍微小環境を生じさせるのに有効な量およびスケジュールで投与することと、
患者から血液試料を得て、前記患者の血液試料からＮＫ細胞を単離することと、
単離した前記ＮＫ細胞の少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を検出することと、
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現が検出された場合、前記腫瘍が前記低酸素腫瘍微小環境を有すると診断することと、
診断後に有効量の同種異系ｈａＮＫ細胞を投与することと
を含む、方法。
【請求項３７】
前記腫瘍血管新生を低減させる薬物が、ＶＥＧＦシグナル伝達を遮断する薬物、内皮細胞の細胞増殖および細胞遊走を阻害する薬物、血管新生刺激因子をダウンレギュレートし、内皮細胞の細胞遊走を阻害する薬物、血管新生刺激因子の結合を阻害する薬物ならびに内皮細胞のアポトーシスを誘導する薬物のうちの少なくとも１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍血管新生を低減させる薬物がベバシズマブである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９、ＭＩＲ２８６１、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記同種異系ｈａＮＫ細胞が、高親和性変異型のＣＤ１６を発現する改変ＮＫ９２細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
腫瘍微小環境における低酸素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法への少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の使用であって、前記方法が、単離したＮＫ細胞における前記低酸素関連遺伝子の遺伝子発現を定量化する工程を含み、前記単離したＮＫ細胞が、血液から単離される、使用。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの低酸素関連遺伝子が、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９、ＭＩＲ２８６１、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される、請求項４１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年３月８日に出願された同時係属米国特許仮出願第６２／４６８，８６３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関連する様々な組成物および方法、特に、腫瘍微小環境内の低酸素状態で活性を保持するＮＫ細胞に関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景の記載には、本発明を理解するうえで有用となり得る情報が含まれる。本明細書に提供されるいかなる情報も本願で特許請求される発明の先行技術である、もしくはそれに関連するものであること、また具体的もしくは明示的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
本明細書の刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ具体的かつ個別に参照により組み込まれることが明示された場合と同様に、参照により組み込まれる。組み込まれる参考文献での用語の定義または使用が本明細書に記載されるその用語の定義と一致しない、またはそれに反している場合、本明細書に記載されるその用語の定義が提供され、参考文献のその用語の定義は適用されない。
【０００５】
癌の免疫療法は、少なくともいくつかの症例において好ましい治療転帰が得られていることから、近年大いに注目を集めつつある。しかし、腫瘍微小環境が免疫を回避する何らかの変化を受けることがあるということも明らかになってきている。明らかにされている機序のなかでも特に、免疫監査機構からの逃避は、免疫抑制性サイトカインの分泌、１つまたは複数の可溶性免疫チェックポイントリガンドおよび／またはＮＫＧ２Ｄリガンドの分泌、ケモカインによるサプレッサー細胞の誘引ならびに上皮間葉転換によって媒介され得る。これらの要因は代謝の欠乏および低酸素とも相互作用し、このことが、腫瘍微小環境中でのＮＫ細胞の活性を顕著に低下させることがわかっている。例えば、低酸素は、ＮＫ細胞媒介性標的細胞殺作用に関与する活性化受容体の発現をダウンレギュレートすることが示されている（例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３．４３：２７５６−２７６４を参照されたい）。さらに、低酸素は可能性がある様々な直接的機序および間接的機序で、腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドをダウンレギュレートし（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ（２０１５）２０：１３９−１４７）、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を顕著に損なう、またはさらに遮断する（例えば、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５，６：４８２を参照されたい）ことも証明された。
【０００６】
細胞傷害性を改善するため、様々な試みがなされてきた。例えば、ＩＬ−１２は、様々な固形腫瘍および血液系腫瘍の細胞株に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、ＮＫ細胞によるインターフェロンガンマ分泌を促進することがｉｎ  ｖｉｔｒｏで示された（例えば、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ａｕｇ；６９（８）：４９０−５００を参照されたい）。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いたＩＬ−１２濃度は、ｉｎ  ｖｉｖｏで達成可能なレベル、またはさらに望ましいレベルを必ずしも反映する必要はない。これと同じように、ドキソルビシンとＩＬ−１２の併用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄの発現を特異的に増大させるが、ＮＫＧ２Ｄを自然に発現するＮＫ細胞を含む他のタイプの免疫細胞では発現を増大させないことがｉｎ  ｖｉｔｒｏで示された（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４  １３：３４を参照されたい）。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してはｉｎ  ｖｉｖｏで少なくともある程度有効であるが、ＮＫ細胞に対しては有意な効果は示されなかった。多発性骨髄腫に対するＮＫ細胞の細胞傷害性の低酸素による低下は、ＮＫ細胞のＩＬ２活性化によって克服することができる（例えば、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（５）：ｅ６４８３５を参照されたい）。残念なことに、ＩＬ２は、全身投与では、ＮＫ細胞を再活性化させるのに必要な用量の忍容性が不良である。低酸素の腫瘍微小環境に関連するなおさらなる複合的な難題に対しては、腫瘍における低酸素を同定する信頼し得る方法はない。
【０００７】
このため、腫瘍微小環境中での低酸素およびそれに付随するＮＫ細胞活性の低減を同定するための組成物および方法ならびにそのような微小環境で低酸素耐性ＮＫ細胞を利用する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の主題は、低酸素腫瘍微小環境を有する患者を発見および治療する様々な方法に関する。最も好ましくは、ＮＫ細胞における選択した遺伝子の過小発現を検出することにより低酸素を検出する。予想外に、しかも周知の事実とは異なり、腫瘍微小環境の低酸素は、ＮＫ細胞においてＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１αによって調節される遺伝子の発現の減少に関連した。したがって、腫瘍微小環境の低酸素が検出される場合、低酸素状態に対する感受性が顕著に低減された同種異系組換えＮＫ細胞の投与または影響を受けたＮＫ細胞において正常な発現レベルを回復させる薬物の投与などの適切な対策を講じることができる。あるいは、またはこれに加えて、腫瘍を低酸素状態に追い込み（例えば、ベバシズマブを用いて）、次いで、同種異系組換えＮＫ細胞またはそうでなければ低酸素状態に対する感受性が顕著に低減されたＮＫ細胞で治療してもよい。
【０００９】
例えば、本発明の主題の一態様では、本発明者らは、腫瘍があると診断された患者のＮＫ細胞を検査する方法の方法であって、患者から血液を得て、患者の血液からＮＫ細胞を単離する工程（例えば、磁気分離およびＮＫ細胞に特異的な抗体を用いて）を含む、方法を企図する。さらなる工程では、ＮＫ細胞の少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の発現を定量化し（例えば、定量的ｒｔＰＣＲまたはＲＮＡｓｅｑを用いて）、正常酸素状態でのＮＫ細胞における低酸素関連遺伝子の発現レベルと比較して低酸素関連遺伝子の過小発現を同定する。
【００１０】
特に企図される態様では、低酸素関連遺伝子は、ＨＩＦ−１α、またはＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９およびＭＩＲ２８６１からなる群より選択される低酸素関連遺伝子、またはＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭからなる群より選択される低酸素関連遺伝子である。本発明の主題を限定するわけではないが、低酸素関連遺伝子は通常、少なくとも１．５、少なくとも１．７または少なくとも２．０のｌｏｇ２変化倍率で過小発現する。望ましい場合、企図される方法は、（少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を同定する工程の後に）、（１）前処置していない同じＮＫ細胞に比して低酸素状態での細胞殺作用の阻害が低減されている前処置したＮＫ細胞；（２）同種異系ｈａＮＫ細胞；および（３）ＳＴＡＴ３阻害剤のうちの少なくとも１つを投与する工程も含み得る。
【００１１】
したがって、本発明者らは、低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を診断および治療する方法も企図する。このような方法は一般に、患者から血液試料を得て、患者の血液試料からＮＫ細胞を単離する工程；および単離したＮＫ細胞における少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を検出するさらなる工程；少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現が検出される場合、患者を、低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を有すると診断する別の工程；および診断された患者に有効量の同種異系ｈａＮＫ細胞（例えば、高親和性変異型のＣＤ１６を発現する改変ＮＫ９２細胞）を投与するさらなる工程を含む。ＮＫ細胞の単離、発現の定量化および低酸素関連遺伝子に関して上記と同じ検討を行う。
【００１２】
また別の例では、本発明者らは、低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を治療する方法であって、患者から血液試料を得て、患者の血液試料からＮＫ細胞を単離する工程；単離したＮＫ細胞における少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を検出する工程；少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現が検出された場合、患者を、低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を有すると診断するさらなる工程；および有効量のＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ＳＨ２ドメイン結合阻害剤、二量体化阻害剤および／またはＤＮＡ結合ドメイン阻害剤）を投与するさらなる工程を含む方法を企図する。ここでも同じく、ＮＫ細胞の単離、発現の定量化および低酸素関連遺伝子に関して上記と同じ検討を行う。
【００１３】
したがって、本発明者らは、腫瘍を治療する方法であって、患者に腫瘍血管新生を低減させる薬物を投与する、低酸素腫瘍微小環境を生じさせるのに効果的な量およびスケジュールで薬物を投与する工程；ならびに低酸素腫瘍微小環境の存在の決定に基づいて、（１）前処置していない同じＮＫ細胞に比して低酸素状態での細胞殺作用の阻害が低減されている前処置したＮＫ細胞；（２）同種異系ｈａＮＫ細胞；および（３）ＳＴＡＴ３阻害剤のうちの少なくとも１つを投与するさらなる工程を含む、方法も企図する。
【００１４】
最も典型的には、腫瘍血管新生を低減させる薬物は、ＶＥＧＦシグナル伝達を遮断する薬物、内皮細胞の細胞増殖および細胞遊走を阻害する薬物、血管新生刺激因子をダウンレギュレートし、内皮細胞の細胞遊走を阻害する薬物、血管新生刺激因子の結合を阻害する薬物ならびに／または内皮細胞のアポトーシスを誘導する薬物である。例えば、腫瘍血管新生を低減させる特に好ましい薬物はベバシズマブである。また、少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の発現レベルの定量化を用いて低酸素腫瘍微小環境の存在を決定することも好ましい。特に好ましい低酸素関連遺伝子としては、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９、ＭＩＲ２８６１、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭが挙げられる。
【００１５】
前処置したＮＫ細胞はＩＬ−２で前処置したＮＫ細胞である、または同種異系ｈａＮＫ細胞は高親和性変異型のＣＤ１６を発現する改変ＮＫ９２細胞であることが企図される。適切なＳＴＡＴ３阻害剤としては、ＳＨ２ドメイン結合阻害剤、二量体化阻害剤およびＤＮＡ結合ドメイン阻害剤が挙げられる。必要に応じて、化学療法剤を投与してもよく、または腫瘍に放射線を照射してもよい（例えば、腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を増大させるのに有効なスケジュールおよび用量で、および／または任意選択で規則的に、低用量投与もしくは低線量照射を用いて）。
【００１６】
したがって、本発明者らは、また別の例では、腫瘍を治療する方法であって、低酸素腫瘍微小環境を生じさせるのに有効な量およびスケジュールで薬物を投与する、腫瘍血管新生を低減させる薬物を患者に投与する工程；患者から血液試料を得て、患者の血液試料からＮＫ細胞を単離する工程；および単離したＮＫ細胞における少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現を検出するさらなる工程を含む、方法も企図する。次いで、少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の過小発現が検出された場合、腫瘍が低酸素腫瘍微小環境を有すると診断し、別の工程において、診断に基づいて有効量の同種異系ｈａＮＫ細胞を投与する。薬物および低酸素関連遺伝子に関して、上記と同じ検討を行う。
【００１７】
したがって、腫瘍微小環境における低酸素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法での少なくとも１つの低酸素関連遺伝子の使用が企図され、この方法は、単離したＮＫ細胞における低酸素関連遺伝子の遺伝子発現を定量化する工程を含む。前の場合と同様に、好ましい低酸素関連遺伝子としては、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９、ＭＩＲ２８６１、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭが挙げられる。
【００１８】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同じ数字が同じ構成要素を表す添付図面と共に以下の好ましい実施形態の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】正常酸素状態（．２０）と低酸素状態（．０）の例示的ドナーＮＫ細胞（９６２、９９６、９５０）および正常酸素状態（．２０）と低酸素状態（．０）のｈａＮＫ細胞の間のペアワイズ相対距離を示すグラフである。
【図２】図１の全細胞において最も変動がみられた遺伝子を示すグラフである。
【図３】図１の全細胞について正常酸素状態と低酸素状態の間でみられた最上位の遺伝子発現の変化を示すグラフである。
【図４】条件間で変化した可能性が最も高い例示的な企図される低酸素関連遺伝子セットを示すグラフである。
【図５】最上位の差次的発現遺伝子およびＩＦＮ関連ＤＮＡ損傷耐性シグネチャー（ＩＲＤＳ）シグネチャー遺伝子についてドナーＮＫ細胞と比較したｈａＮＫ細胞遺伝子発現の例示的な転写の差を示すグラフである。
【図６】低酸素シグネチャーおよび選択したタンパク質に関してドナーＮＫ細胞と比較したｈａＮＫ細胞遺伝子発現の例示的な転写の差を示すグラフである。
【図７】図１の細胞に関して低酸素関連遺伝子セットの遺伝子発現の差を示す別の例示的なグラフである。
【図８】ＮＫ細胞の低酸素に関連して企図される調節作用を示す例示的なグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
本発明者らは、低酸素腫瘍微小環境でもＮＫ細胞が活性であることが決定されれば、または低酸素腫瘍微小環境でそのようなＮＫ細胞を、活性を回復もしくは保持するよう処置すれば、腫瘍が低酸素腫瘍微小環境を有する場合でもＮＫ細胞ベースの癌治療が腫瘍に適していることを発見した。低酸素腫瘍微小環境の決定は、のちにさらに詳細に示すように、ＮＫ細胞における特定の低酸素関連遺伝子セットに基づくのが最も好ましい。容易に理解される通り、腫瘍における低酸素状態および低酸素状態でのＮＫ活性の回復／維持を知ることは、ＮＫ細胞ベースの治療に有利であるばかりでなく、腫瘍に低酸素状態を生じさせる薬物（例えば、ベバシズマブ）を患者に投与する場合にも有益である。
【００２１】
本発明者らの発見は少なくとも部分的には、低酸素状態（より典型的には、Ｏ２が０．５％未満などの厳しい低酸素状態）では従来の常識に反して、ＮＫ細胞において特定の低酸素関連遺伝子がダウンレギュレートされる（過小発現される）という予想外の観察結果に基づくものである。既知の実験条件下では、低酸素は典型的に、複数の組織において、低酸素誘導プロモーター（例えば、ＨＲＥ、低酸素応答エレメント）の制御下でアップレギュレートされる遺伝子の転写因子であるＨＩＦ−１αの産生を誘導した。これとは対照的に、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１αによって調節される選択された遺伝子は、ＮＫ細胞では正常酸素（２０％Ｏ２）状態と比較して強く過小発現されることが見出され、したがって、これらは腫瘍微小環境における低酸素の存在（およびおそらく重症度）に関する特異的指標となる。
【００２２】
したがって、腫瘍微小環境における低酸素の検出に基づいて、そのような腫瘍を有する対象を、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）および細胞傷害性細胞殺作用（典型的に、グランザイムおよびグラニュリシンを介する）が低酸素による影響を受けないことが示されているＮＫ細胞で治療することができ、またはＡＤＣＣおよび細胞傷害性細胞殺作用を回復するようＩＬ２で予め前処置したＮＫ細胞で治療することができ、および／または影響を受けたＮＫ細胞の過小発現を正常酸素状態でのＮＫ細胞に関連する発現レベルに戻す薬剤で治療することができる。したがって、異なる観点からみれば、これまで低酸素腫瘍微小環境の存在のため（例えば、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ、腫瘍細胞上のＮＫＧ２ＤリガンドのダウンレギュレーションならびにＡＤＣＣおよび細胞傷害性細胞殺作用の不活性化のため）軽視されてきたＮＫ細胞ベースの治療選択肢を、現在では実施することが可能であることを理解するべきである。同様に、これまで腫瘍が低酸素微小環境を有するかどうか不確実であった場合でも、現在、企図されるシステムおよび方法によって低酸素微小環境を比較的簡便に決定することが可能となる。
【００２３】
組織中の酸素の関数としての差次的遺伝子発現を同定する試みで、本発明者らは、正常酸素（２０体積％）および低酸素（０体積％）の酸素状態でいくつかのＮＫ細胞株を試験し、様々なオミクス解析を実施した。より具体的には、被験細胞株は、のちにさらに詳細に記載するように、市販のｈａＮＫ細胞（ＮａｎｔＫｗｅｓｔ社）および３人の異なる健常ドナーのＮＫ細胞であった。本発明者らは予想外にも、厳しい低酸素状態下では、低酸素および／またはＨＩＦ−１α発現に関連する多数の遺伝子が有意にダウンレギュレートされる（過小発現される）ことを発見した。特に、Ｏ２レベルが極めて低いとき（例えば、２体積％以下、１体積％以下、０．５体積％以下または０．１体積％以下）にはＨＩＦ−１α発現が過小発現したが、穏やかな低酸素状態は、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１αの制御下にある遺伝子の発現を増大させることは公知である。このような酸素依存性の遺伝子特異的な発現のダウンレギュレーションは実際、ＮＫ細胞がＡＤＣＣおよび細胞傷害性細胞殺作用の能力を失うという事実を説明し得る。
【００２４】
のちにさらに詳細に示すように、低酸素状態でＮＫ細胞において過小発現される遺伝子には、ＨＩＦ−１α（ＨＩＦ１Ａ）、ＡＲＬ１７Ｂ、ＰＹＨＩＮ１、ＲＰＳ２４、ＣＤ５２、ＲＰＬ３４、ＨＳＰＡ８、ＳＬＩＲＰ、ＲＰＳ１１、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ２７、ＭＹＬ１２Ｂ、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ３Ａ、ＰＴＰＲＣ、ＮＡＭＰＴ、ＣＡＬＭ２、ＲＧＳ１、ＫＬＲＢ１ＵＳＰ１６、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＰＬ２６、ＲＰＳ１５Ａ、ＣＣＬ２、ＩＦＩ１６、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＴＡＮＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＲＰＳ２１、ＫＬＲＫ１、ＲＰＳ２９ＣＸＣＬ８、ＹＰＥＬ５、ＥＶＩ２Ｂ、ＧＬＩＰＲ１、ＭＡＲＣＨ７、ＫＬＲＦ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＣＯＸ７Ｂ、ＳＥＣ６１Ｇ、ＮＡＣＡ、ＳＡＭＳＮ１、ＵＳＭＧ５、ＰＳＭＡ４、ＧＡＰＴ、ＣＸＣＬ１０、ＲＰＬ２１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＭＴＲＮＲ２Ｌ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ９、ＭＩＲ２８６１、ＧＺＭＡ、ＬＡＭＰ１、ＧＺＭＨ、ＰＲＦ１、ＢＡＭＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＫＬＲＫ１、ＧＺＭＫおよびＧＺＭＭが含まれていた。特に、これらの遺伝子の少なくとも一部は、細胞傷害性細胞殺作用ＮＫ細胞に機能的影響を及ぼすことが公知である（例えば、グランザイム関連遺伝子）。したがって、本明細書に示す遺伝子のうち１つまたは複数のものに関してＮＫ細胞において遺伝子発現の解析（例えば、ＲＮＡｓｅｑ、定量的ｒｔＰＣＲ、定量的プロテオミクスなど）を実施することにより、低酸素腫瘍微小環境の存在を迅速に評価することが可能になる。
【００２５】
本発明者らは予想外にも、のちにさらに詳細に示すように、ある特定のＮＫ細胞が上記の遺伝子（および特定の他の遺伝子、下を参照されたい）の過小発現を示さないが、これらのＮＫ細胞が上記の遺伝子の（正常酸素状態と比較して）中程度の過剰発現さえ示すことをさらに発見した。特に、これらの細胞は、低酸素状態で殺作用活性（ＡＤＣＣおよび細胞傷害性殺作用）を低減させなかった。例えば、低酸素による影響を受けなかったこのようなＮＫ細胞には、ｈａＮＫ細胞（カリフォルニア州９０２３２、カルバーシティー、ジェファーソン大通り９９２０のＮａｎｔＫｗｅｓｔからｈａＮＫ細胞として市販されており、高親和性変異型のＣＤ１６および細胞内ＩＬ２を発現する遺伝子改変ＮＫ９２細胞）が含まれていた。したがって、腫瘍が低酸素微小環境を有することが決定された場合、腫瘍の治療にはｈａＮＫ細胞が特に適していることに留意するべきである。
【００２６】
これに関連して、低酸素状態での細胞傷害活性に関して企図されるこのような試験および知見は、腫瘍血管新生を妨害し、腫瘍微小環境に低酸素状態をもたらし得る薬物で患者を治療するのにも有用であることを理解するべきである。例えば、ベバシズマブは腫瘍微小環境を低酸素状態にすることが公知であり、そのような状態ではＮＫ細胞の殺作用が阻害される傾向があるため、望ましくないものと考えられていた。逆に、ベバシズマブを投与した場合、ＮＫ細胞治療の使用は典型的に推奨されなかった。したがって、低酸素状態でのＡＤＣＣおよび／または細胞傷害性細胞殺作用の阻害に耐えることができるＮＫ細胞を使用または作製すれば、低酸素状態を生成し得る薬物の使用を大きく促進することができる。下の表１に、腫瘍血管新生を妨害することが公知である治療剤およびその他の薬剤を例示する。
【００２７】
【表１】
2020509750.tif 000003
2020509750.tif 000004
【００２８】
したがって、本発明者らは健常ドナーＮＫ細胞とｈａＮＫ細胞の間の転写の差およびさらなる観察結果（下を参照されたい）に基づき、ＮＫ細胞を事前に前処置した後、そのように処置したＮＫ細胞の低酸素に対する感受性を低くする、またはさらにこれを非感受性にする１つまたは複数の薬剤とともに投与し得ることも企図する。例えば、適切な選択肢のなかでも特に、発現が低減されたＮＫ細胞を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−２またはＩＬ２アナログにより再活性化させ、それにより、ダウンレギュレートされた遺伝子の発現を増大させ得ることが企図される。同様に、細胞を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＴＡＴ３阻害剤により（例えば、ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインを標的とするペプチド阻害剤および非ペプチド阻害剤、ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合ドメインを標的とする阻害剤、ＳＴＡＴ３のＮ末端ドメインを標的とする阻害剤などを用いて）再活性化させ、それにより、ダウンレギュレートされた遺伝子の発現を増大させてもよい。さらに別の態様では、ＮＫ細胞にＳＴＡＴ３、ＩＬ２またはＩＬ２アナログをコードする組換え核酸をトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞において恒久的または一時的に細胞内発現させ（すなわち、分泌させない）てもよい。事前に前処置した後、遺伝子の発現の定量解析を用いて過小発現遺伝子の発現を正常なレベルに回復させることができる。次いで、このように処置した細胞を患者に再導入することができる。あるいは、低酸素腫瘍微小環境を有すると診断された患者にｈａＮＫ細胞を投与してもよい。
【００２９】
事前の前処置に適したＮＫ細胞に関して、ＮＫ細胞は患者の自己ＮＫ細胞であり得、このような自己ＮＫ細胞は、全血から単離するか、当該技術分野で公知の方法を用いて前駆細胞または幹細胞から培養し得ることが一般に企図される。さらに、ＮＫ細胞は自己ＮＫ細胞である必要はなく、同種異系ＮＫ細胞または異種ＮＫ細胞であってもよいことを理解するべきである。しかし、本発明の主題の特に好ましい態様では、ＮＫ細胞は、１つもしくは複数の望ましい形質を獲得するように遺伝子操作され、ＮＫ９２細胞またはＮＫ９２細胞の誘導体である。例えば、本発明の主題の特に好ましい一態様では、遺伝子操作したＮＫ細胞は、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が低減されるかまたは消失するように改変され、そのような細胞が（阻害の欠如または低減により）構成的に活性化されるようにしたＮＫ９２誘導体である。
【００３０】
ＮＫ９２細胞は通常とは異なる受容体発現プロファイルを示し、比較的多数の活性化（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、２Ｂ４、ＮＫＧＤ、ＣＤ２８）受容体を発現する。逆に、ＮＫ９２細胞はまた、抑制性受容体（例えば、ＮＫＧＡ／Ｂ、低レベルのＫＩＲ２ＤＬ４、ＩＬＴ−２）をほとんど発現せず、正常ＮＫ細胞においてクローン性に発現されるキラー抑制性受容体（ＫＩＲ）の大部分が欠如している。さらに、ＮＫ９２は、パーフォリン−グランザイム細胞溶解経路に関与する分子ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであるＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＮＦアルファを含むさらなる細胞傷害性エフェクター分子を比較的高レベルで発現し、このことは、代替的機序により殺作用を発揮することができることを示している。さらに、ＮＫ９２細胞は、ＮＫ殺作用におけるその関係性が不明である免疫エフェクター細胞の調節に関与するその他の分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ）も発現する。
【００３１】
さらに、適切なＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を低減させるまたは除去するよう変異した１つまたは複数の改変ＫＩＲを有し得る。当然のことながら、１つまたは複数のＫＩＲを欠失させてもよく、発現を抑制してもよい（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどにより）ことに留意するべきである。最も典型的には、２つ以上のＫＩＲを変異、欠失または沈黙化させ、特に企図されるＫＩＲとしては、２つまたは３つのドメインを有し、細胞質テールが短いまたは長いＫＩＲが挙げられる。異なる観点からみれば、改変ＫＩＲ、沈黙化ＫＩＲまたは欠失ＫＩＲとしては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３およびＫＩＲ３ＤＳ１が挙げられる。このような改変細胞は当該技術分野で周知のプロトコルを用いて調製し得る。あるいは、このような細胞をＮａｎｔＫｗｅｓｔ社（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍを参照されたい）からａＮＫ細胞（「活性化ナチュラルキラー細胞」）として購入してもよい。
【００３２】
本発明の主題の別の好ましい態様では、遺伝子操作したＮＫ細胞はまた、高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を発現するよう改変されたＮＫ９２誘導体であってもよい。Ｆｃγ受容体の高親和性変異型の配列は当該技術分野で周知であり（例えば、Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１３：３７１６−３７２５を参照されたい）、全ての作製方法および発現方法が本明細書の使用に適しているものと考えられる。このような受容体を発現させることによって、患者の腫瘍細胞（例えば、ネオエピトープ）、特定の腫瘍タイプ（例えば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなど）に特異的な抗体、または癌に関連する（例えば、ＣＥＡ−ＣＡＭ）抗体を用いて腫瘍細胞を特異的に標的とすることが可能になると考えられる。このような抗体は、市販されており、細胞とともに使用する（例えば、Ｆｃγ受容体と結合させる）ことができる点で有利である。あるいは、このような細胞をＮａｎｔＫｗｅｓｔ社からｈａＮＫ細胞（「高親和性ナチュラルキラー細胞」）として購入してもよい。
【００３３】
本発明の主題のなおさらなる態様では、遺伝子操作したＮＫ細胞を、キメラＴ細胞受容体を発現するよう遺伝子操作してもよい。特に好ましい態様では、キメラＴ細胞受容体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原および癌ネオエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ部分またはその他の外部ドメインを有する。上記の通り、このようなキメラＴ細胞受容体を発現するようにＮＫ細胞を遺伝子操作する方法は多数存在し、いずれの方法も本明細書の使用に適しているものと考えられる。あるいは、このような細胞をＮａｎｔＫｗｅｓｔ社からｔａＮＫ細胞（「標的活性化ナチュラルキラー細胞」）として購入してもよい。
【００３４】
したがって、異なる観点からみれば、本明細書で企図されるＮＫ細胞は全て、非分泌型の（例えば、ＥＲ区画内に保持される）ＩＬ−２を発現するよう遺伝子改変してもよい。ＮＫ細胞をＩＬ−２および／またはＩＬ−１２で前処置する場合、当該技術分野で周知の生理的なまたは一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ濃度を用いることが一般に企図される。例えば、適切なＩＬ−２および／またはＩＬ−１２の濃度としては、１〜１００Ｕ／ｍｌ、１００〜１，０００Ｕ／ｍｌまたは１０〜１０，０００Ｕ／ｍｌおよびさらに高い濃度が挙げられる。一方、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１２を細胞内の組換え核酸から発現させてもよく、組換えタンパク質は分泌されてもよく、またはより典型的には細胞内に保持されてもよい。
【００３５】
本発明の主題のさらに別の態様では、このように改変したＮＫ細胞を医薬組成物において使用してよく、典型的に、投与単位当たり１０４〜１０１１個の細胞、より典型的には１０５〜１０９個の細胞を含む無菌注射用組成物として製剤化し得る。しかし、別の製剤も本明細書の使用に適しているものと考えられ、全ての既知の投与経路および投与様式が本明細書で企図される。本明細書で使用される医薬組成物または薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物または薬物の直接的投与および間接的投与の両方を指し、医薬組成物または薬物の直接的投与は典型的に、医療専門家（例えば、医師、看護師など）によって実施され、間接的投与は、医薬組成物を医療専門家が（例えば、腫瘍内注射、注入、経口送達、局所送達などにより）直接的投与に使用できるように提供または作製する工程を含む。
【００３６】
最も典型的には、企図される治療は、腫瘍組織上にＮＫＧ２Ｄリガンドを誘導する（規則的な）低用量化学療法／低線量照射も含み得る。例えば、好ましい治療は、最大耐量の５０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下の用量で典型的に実施される低用量化学療法および／または低線量放射線療法を含む。さらに、このような低用量治療は、規則的に、例えば、隔日もしくは３日毎に、または週１回で数週間にわたって実施するのが好ましい。
【００３７】
したがって、本発明者らは、腫瘍を有すると診断された患者のＮＫ細胞を試験する様々な方法、ならびに低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を診断し治療する方法ならびに低酸素腫瘍微小環境を有する腫瘍を治療する方法を企図する。上記の通り、腫瘍微小環境における低酸素の存在は、患者のＮＫ細胞（典型的に、血液から単離する）における選択した遺伝子の発現レベルの決定により確認することができる。少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも５種類または少なくとも１０種類の遺伝子が正常酸素状態と比較して過小発現していることが低酸素を示す。検出後、対策を投与してもよく、特に好ましい化合物または組成物としては、ｈａＮＫ細胞および／または前処置していない同じＮＫ細胞に比して低酸素状態での細胞殺作用の阻害が少ない前処置した（例えば、ＩＬ−２またはＳＴＡＴＥ３阻害剤で）ＮＫ細胞が挙げられる。あるいは、ＳＴＡＴ３阻害剤を患者に直接投与してもよい。
【００３８】
（実施例）
２つの条件（正常酸素、２０％Ｏ２；および低酸素、０％Ｏ２）下で培養したＮＫ株の２つのドナー集団およびｈａＮＫ株（ＮａｎｔＫｗｅｓｔから購入したもの）由来の凍結ＲＮＡを下流の解析に用いた。ＫＡＰＡ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲｉｂｏＥｒａｓｅ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を用いてＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で目標深度２００Ｍリードまでシーケンシングした。Ｂｏｗｔｉｅ２  ｖ２．２．６を用いて試料をＲｅｆＳｅｑ  ｂｕｉｌｄ  ７３トランスクリプトームに対して整列させ、ＲＳＥＭ  ｖ１．２．２５を用いて１００万当たりの転写産物数（ＴＰＭ）に定量化した。Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ２．７．６にｎｕｍｐｙ  ｖ１．１１．１、ｓｃｉｐｙ  ｖ０．１７．１およびｐａｎｄａｓ  ｖ０．１８．１を用い下流の解析を実施した。
【００３９】
正常酸素状態および低酸素状態の両方で、全細胞株について発現レベルの総合比較を実施し、図１に例示的結果を示す。ここでは、患者ドナー試料のペアから得たＲＮＡのｌｏｇ２−ＴＰＭデータのペアワイズピアソン相関から、患者間の変動が他のドナーＮＫ株およびｈａＮＫ細胞のセットよりはるかに大きいことが示された（平均試料内ｒ＝０．９６８、平均試料間ｒ＝０．８５７）。試料間に差がみられるものの、０％酸素状態と２０％酸素状態とで比較すると、患者ドナーＮＫ株はｈａＮＫ株より互いに類似していた（平均ｈａＮＫ対患者ｒ＝−０．００３１７、平均患者ｒ＝０．５７５）。実際、ｈａＮＫ細胞株では、正常酸素状態と低酸素状態とを比較するペアワイズ相関に実質的な影響を受けないままであったが、ドナーＮＫ細胞集団は全て、正常酸素状態と低酸素状態との間に大きな差を示すことが観察された。
【００４０】
正常ＮＫドナー株と比較した特異的低酸素転写変化を同定するため、ＮＫ  ＴＰＭを正常ドナー細胞のｌｏｇ２−ＴＰＭの差に対して正規化した。正常試料の中心ＴＰＭ比（ｌｏｇ２の差）の全体的分布に基づいて各遺伝子のＺスコアを算出し、平均値０および標準偏差０．４５３を得た。図２に、両方の条件の間で発現に最も変動がみられた遺伝子の例示的結果を示す。同定された最上位の転写産物の多くは、ドナーＮＫ株では発現の有意な減少を示したが、ｈａＮＫ系では活性が保持されており、低酸素状態にもかかわらずｈａＮＫ細胞が複製し続けることが示された。細胞周期を超えて、ＨＩＦ１Ａ、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２に関連する転写産物は、同様に低酸素による影響は受けないがドナーＮＫ細胞では有意に減少する最も差次的に発現する遺伝子の一部であるように思われた。すでに公開されている報告（ＰＭＩＤ：２２６１５４５１）では、ＳＴＡＴ１経路の継続的発現が細胞傷害性因子に対する耐性に極めて重要であることが示されている。
【００４１】
図３に、様々な細胞株での正常酸素状態と低酸素状態の間での選択した遺伝子の発現レベルの差（ｌｏｇ２倍数差）を示す。図３から容易にわかるように、選択した遺伝子の発現レベルは比較的影響を受けることはなく、場合によっては増大することもあったが、３つの健常ドナー集団（９５０、９６２、９６６）の発現の差は大部分が有意に負であった。図４に、ＮＫ細胞に主として関連するマーカー（例えば、ＨＩＦ１Ａおよびグランザイム遺伝子ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＺＭＭ）の実質的な差次的発現レベルのセットを示す。選択した遺伝子の差次的発現に関するさらなるデータ比較（ｌｏｇ２倍数差）を図５に最上位の差（左パネル）およびＩＦＮ関連ＤＮＡ損傷耐性シグネチャー（ＩＲＤＳ、右パネル）として示す。ここでも同じく、ｈａＮＫ細胞とドナー細胞との間の差は大きく、差次的に発現した遺伝子の大部分がドナー細胞株では低酸素状態でダウンレギュレートされた。ＨＩＦ−１およびＳＴＡＴ１に関連するサブネットワークを、ドナー細胞と比較したｈａＮＫ細胞での遺伝子の発現の相対的有意性を示す対応するｚスコアとともに図６に例示する。
【００４２】
図７に示すように、ドナー細胞とｈａＮＫ細胞との間で最上位の差次的遺伝子を解析したところ、低酸素下でｈａＮＫ細胞においてアップレギュレートされる遺伝子はＮＫ細胞の機能に関連するが、ドナー細胞においてアップレギュレートされる遺伝子はストレス反応に関連する遺伝子であることが明らかになった。同様に、低酸素遺伝子セットを解析したところ、グランザイム遺伝子、パーフォリン遺伝子およびＨＩＦ１Ａ遺伝子がｈａＮＫ細胞では強くアップレギュレートされ、ドナー細胞では有意に過小発現するのが観察された。
【００４３】
図８に、ＨＩＦ１ＡおよびＩＬ２に影響を及ぼす調節サブネットワークを、図８に示す因子の潜在的主要調節因子であると想定されるＳＴＡＴ３とともに模式的に示す。このように、ＳＴＡＴ３は上で観察された変化によって様々な遺伝子の調節に関与することから、本発明者らは、ＳＴＡＴ３阻害剤が上記の遺伝子の低酸素依存性過小発現を逆転させる可能性を秘めているものと考える。
【００４４】
したがって、患者のＮＫ細胞における遺伝子の発現レベルを定量化する試験は、患者自身のＮＫ細胞が低酸素状態で活性を保持するかどうか、また、患者がｈａＮＫ細胞の投与により利益を得るかどうかを決定するのに有用であり得ることを理解するべきである。あるいは、患者のＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２および／またはＳＴＡＴ３阻害剤で前処置して、患者のＮＫ細胞に低酸素状態での細胞傷害活性の阻害に対するより大きな耐性を誘導してもよい。例えば、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内因性のＩＬ−２活性化（例えば、１６時間、１０００ＩＵ／ｍｌ）によってＮＫ細胞溶解活性を一部救出できることに注目した。このように処置したＮＫ細胞は１％Ｏ２でもＡＤＣＣ能を保持していた。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および特許請求するのに使用される成分、濃度などの特性、反応条件などの量を表す数値が、一部の例において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、説明および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮し、通常の丸め法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を記載する数値範囲および数値パラメータは近似値であるものの、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態に示される数値は、それぞれの試験測定値にみられる標準偏差から必然的に生じる誤差をある程度含み得る。文脈上そうでないことが示されない限り、本明細書に記載される全ての範囲は、その終点を含むと解釈されるべきであり、制限のない範囲は、商用化できる値を含むと解釈されるべきである。同様に、値のリストは全て、文脈上そうでないことが示されない限り、中間の値を含むものと見なされるべきである。
【００４６】
本明細書の記載で、およびのちの請求項全体を通して使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の記載で使用される「ｉｎ」の意味は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。さらに、文脈上そうでないことが示されない限り、「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ（〜と結合している）」という用語は、直接的結合（互いに結合している２つの要素が互いに接触している）および間接的結合（２つの要素の間に少なくとも１つのほかの要素がある）の両方を含む。したがって、「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ」と「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ（〜と結合している）」という用語は同義的に用いられる。
【００４７】
当業者には、本明細書の本発明の概念から逸脱することなく、既に記載したもの以外に多数のさらなる改変が可能であることが明らかなはずである。したがって、本発明の主題は、添付の請求項の範囲の範囲を除き、制限されることはない。さらに、明細書および請求項を解釈するにあたっては、全ての用語は、文脈に一致する可能な限り最も広い意味で解釈されるべきである。特に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（ともに「含む」という意味）という用語は、要素、成分または工程を包括的に指し、言及される要素、成分または工程が、明示的に言及されていない他の要素、成分または工程とともに存在してもよく、または使用されてもよく、または組み合わせてもよいことを示すものと解釈されるべきである。本明細書の特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群より選択されるもののうちの少なくとも１つに言及する場合、その文は、その群のＡとＮまたはＢとＮなどではなく１つの要素のみを必要とするものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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