(57)【要約】  その場段階希釈を用いて、試料中の分析物の濃度を判断する方法が提供される。本明細書には、その場段階希釈により、試料中の分析物の濃度を判断する方法が記載されている。本方法は、これに限定されるものではないが、試料中の抗体の力価を判断し、抗原濃度を判断し、検量線を生成することを含む。開示された方法は、免疫診断試験に利用できる。試料を、個別の管でなく、その場又は試験装置で直接（例えば、ゲル試験カード）希釈する方法が見出された。意外なことに、試験装置で試料の希釈を行う間、インキュベーションチャンバと反応チャンバの間のエアギャップは維持され、試験装置で希釈されている間、試料は、試験装置の試薬による汚染を受けなかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その場段階希釈により試料中の分析物の濃度を判断する方法であって、
免疫診断試験カードを提供することを含み、前記試験カードは、複数の縦配列のマイクロチューブを支持する実質的に平坦な支持体を含み、各マイクロチューブは、前記試料を受けるインキュベーションチャンバと分離マトリックスを含む反応チャンバとを有し、
前記インキュベーションチャンバの少なくとも１つに希釈剤を添加し、
希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中で直接、前記試料を段階希釈し、
希釈剤及び／又は試料が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれに、前記分析物と錯化して、試薬−分析物錯体を形成可能な試薬を添加し、
重力及び／又は遠心分離により、試料と試薬の混合物を沈降させ、
前記分離マトリックス上又は中で試薬−分析物錯体が検出される前記試料の最高希釈度を判断することにより、前記分析物の前記濃度を判断する、方法。
【請求項２】
前記分析物の前記濃度を判断するステップは、抗体の力価を判断することを含み、前記力価は、「＋」の反応強度に対応して試薬−抗体錯体が観察される前記試料の前記最高希釈度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体の終点を判断することをさらに含み、前記抗体の終点は、可視の試薬−抗体錯体を有する前記試料の前記最高希釈度である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗体力価スコアを判断することをさらに含み、前記抗体力価スコアは、各反応に割り当てられたスコア値の合計である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物の濃度を判断するステップは、抗原の濃度を判断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分離マトリックスは、高分子電解質ゲルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記高分子電解質ゲルは、デキストランアクリルアミドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応チャンバは、網状化剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記網状化剤は、二次抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記二次抗体は、抗ヒトグロブリン又は抗ヒトＩｇＡ抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を段階希釈するステップは、同じ試験カード中の、又は複数の試験カード間の前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中で直接、前記試料を段階的に希釈することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬は、抗原又は抗体を有する赤血球又はコート粒子を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、赤血球抗原に対するものである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、抗Ｄ抗体、抗Ｃ抗体、抗ｃ抗体、抗Ｅ抗体、抗ｅ抗体、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｋｅｌｌ抗体、抗ｋ抗体、抗Ｋｐａ抗体、抗Ｋｐｂ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｎ抗体、抗Ｓ抗体及び抗ｓ抗体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各マイクロチューブは、前記インキュベーションチャンバと前記反応チャンバとの間にエアギャップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
各マイクロチューブは、前記インキュベーションチャンバと前記反応チャンバとの間に低密度非混和性化合物をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記低密度非混和性化合物は、合成油、有機油、鉱油及びパラフィン油からなる群から選択される油を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
希釈剤及び／又は試料が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれに前記試薬を添加するステップの後、前記試薬と前記試料を混合することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
希釈剤及び／又は試料が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれに前記試薬を添加するステップの後、前記試験カードをインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記試料を前記段階希釈するステップは、希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中での前記試料の少なくとも２倍の段階希釈を含む、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記試料を前記段階希釈するステップは、希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中での前記試料の２倍未満の段階希釈を含む、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記試料を前記段階希釈するステップは、希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中での前記試料の２倍の段階希釈することを含む、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、血漿、血清及びキャリブレータからなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
前記分析物は、抗体又は抗原である、請求項１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
段階希釈により、試料中の分析物濃度を判断する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
血液バンクにおいて、新生児又は胎児の溶血性疾患を生じる可能性のある臨床的に重大な抗体が妊婦で検出されると、抗体滴定を行って、抗体価（又は半定量濃度）が判断される。妊娠中、母体の抗体滴定を繰り返して、抗体価又は濃度の上昇があるか判断する。３回以上の希釈で力価の上昇があると、臨床的に重大と考えられ、胎児赤血球（ＲＢＣ）が対応する抗体に対する抗原を有していることが示唆される。力価が臨床閾値に達したら、胎児は少なくとも８週の在胎週数、超音波、ドップラー超音波検査、羊水検査、心臓穿刺等の追加の検査を行う。これらの手順は、胎児の貧血のレベルをモニターし、子宮内輸血やその他介入が必要なことを示すものである。
【０００３】
抗体滴定はまた、多数の抗体の分離、抗体同定、ＡＢＯの境界を超えて移植されるアファレシスドナーの血小板ドナー又は組織へのＡＢＯ同種赤血球凝集素滴定を行う際、臨床的に示される。抗体滴定はまた、（ｉ）赤血球試薬の抗原部位密度を評価する、（ｉｉ）新たな抗血清の特徴を評価したり、前のバッチと新たなバッチを比較する、（ｉｉｉ）いわゆる高力価低反応性（ＨＴＬＡ）抗体（例えば、ノップス血液型系に属することが知られた抗体）を調査する、（ｉｖ）温式抗体自己免疫性溶血性貧血（ＷＡＩＨＡ）における自己抗体の相対的特異性を判断する、（ｖ）可溶性血液型物質分泌からの唾液の調査を行う、（ｖｉ）試薬が入手不可能だったり、存在型の細胞からＩｇＧの除去がうまくいかないとき、直接抗グロブリン試験（ＤＡＴ）陽性細胞の抗原状態を判断する、（ｖｉｉ）寒冷自己抗体、例えば、抗体Ｉの力価、特異性及び温度振幅を判断する。
【０００４】
患者の血小板の段階２倍希釈を行い、対応の抗体を含む選択した赤血球（ＲＢＣ）との反応強度の格付けにより、抗体は、通常、滴定される。力価の結果は、肉眼的凝集を示す血小板の最高希釈度の逆数として記録される。患者の血小板又は血清の希釈は、試験装置の試薬による試料の汚染を防ぐために、免疫診断試験装置で直接行うよりも、個別の試料管で行う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書には、その場段階希釈により、試料中の分析物の濃度を判断する方法が記載されている。本方法は、これに限定されるものではないが、試料中の抗体の力価を判断し、抗原濃度を判断し、検量線を生成することを含む。開示された方法は、免疫診断試験に利用できる。試料を、個別の管でなく、その場又は試験装置で直接（例えば、ゲル試験カード）希釈する方法が見出された。意外なことに、試験装置で試料の希釈を行う間、インキュベーションチャンバと反応チャンバの間のエアギャップは維持され、試験装置で希釈されている間、試料は、試験装置の試薬による汚染を受けなかった。
【０００６】
一実施形態において、その場段階希釈により試料中の分析物の濃度を判断する方法が提供される。本方法において、複数の縦配列のマイクロチューブを支持する実質的に平坦な支持体を含む免疫診断試験カードが提供される。試験カードの各マイクロチューブは、試料を受けるインキュベーションチャンバと分離マトリックスを含む反応チャンバとを有する。希釈剤を、少なくとも１つのインキュベーションチャンバに添加する。試料は、希釈剤が中に入ったインキュベーションチャンバで直接段階的に希釈される。分析物と錯化可能で、試薬−分析物錯体を形成する試薬を、希釈剤及び／又は試料が中に入った各インキュベーションチャンバに添加する。試料と試薬の混合物を、重力及び／又は遠心分離により沈降する。試薬−分析物錯体が、分離マトリックスで検出される試料の最高希釈度を判断することにより、分析物の濃度を判断する。
【０００７】
他の実施形態において、その場段階希釈により試料中の分析物の濃度を判断する方法は、複数の縦配列のマイクロチューブを支持する実質的に平坦な支持体を含む免疫診断試験カードを提供することを含む。各マイクロチューブは、試料を受けるインキュベーションチャンバと、分離マトリックス及び分析物と錯化して、試薬−分析物錯体を形成する試薬を含む反応チャンバとを有する。希釈剤は、少なくとも１つのインキュベーションに添加される。試験カードが重力及び／又は遠心分離により沈降させられる。分離マトリックス上又は中で試薬−分析物錯体が検出される試料の最高希釈度を判断することにより、分析物の濃度を判断する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態による方法に用いることのできる免疫診断試験カードの正面図である。
【図２Ａ】実施例１に記載した抗Ｄ滴定実験（抗Ｄ血漿は５００倍に予め希釈される）の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図２Ｂ】実施例１に記載した抗Ｄ滴定実験（抗Ｄ血漿は５００倍に予め希釈される）の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図３Ａ】実施例１に記載した抗Ｋｅｌｌ滴定実験（抗Ｋｅｌｌは５０倍に予め希釈される）の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図３Ｂ】実施例１に記載した抗Ｋｅｌｌ滴定実験（抗Ｋｅｌｌは５０倍に予め希釈される）の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図４Ａ】実施例１に記載した抗Ｆｙｂ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図４Ｂ】実施例１に記載した抗Ｆｙｂ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図４Ｃ】実施例１に記載した抗Ｆｙｂ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図４Ｄ】実施例１に記載した抗Ｆｙｂ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図５Ａ】実施例１に記載した抗Ｍ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図５Ｂ】実施例１に記載した抗Ｍ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図６Ａ】実施例１に記載した抗Ｃ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図６Ｂ】実施例１に記載した抗Ｃ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図６Ｃ】実施例１に記載した抗Ｃ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図６Ｄ】実施例１に記載した抗Ｃ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図６Ｅ】実施例１に記載した抗Ｃ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図６Ｆ】実施例１に記載した抗Ｃ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図７Ａ】実施例１に記載した抗Ｋｐｂ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図７Ｂ】実施例１に記載した抗Ｋｐｂ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図８Ａ】実施例１に記載した抗Ｊｋａ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図８Ｂ】実施例１に記載した抗Ｊｋａ滴定実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図８Ｃ】実施例１に記載した抗Ｊｋａ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図８Ｄ】実施例１に記載した抗Ｊｋａ滴定実験の結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図９Ａ】実施例１に記載した抗ＤインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図９Ｂ】実施例１に記載した抗ＤインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる（すなわち、ゲルで汚染し、使用前に遠心分離した）参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図９Ｃ】実施例１に記載した抗ＤインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１０Ａ】実施例１に記載した抗ＫｅｌｌインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１０Ｂ】実施例１に記載した抗ＫｅｌｌインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１０Ｃ】実施例１に記載した抗ＫｅｌｌインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１０Ｄ】実施例１に記載した抗ＫｅｌｌインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１０Ｅ】実施例１に記載した抗ＫｅｌｌインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１０Ｆ】実施例１に記載した抗ＫｅｌｌインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１１Ａ】実施例１に記載した抗ＦｙｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１１Ｂ】実施例１に記載した抗ＦｙｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１１Ｃ】実施例１に記載した抗ＦｙｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１１Ｄ】実施例１に記載した抗ＦｙｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１１Ｅ】実施例１に記載した抗ＦｙｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１１Ｆ】実施例１に記載した抗ＦｙｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１２Ａ】実施例１に記載した抗ＳインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１２Ｂ】実施例１に記載した抗ＳインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１２Ｃ】実施例１に記載した抗ＳインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１２Ｄ】実施例１に記載した抗ＳインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１２Ｅ】実施例１に記載した抗ＳインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１２Ｆ】実施例１に記載した抗ＳインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１３Ａ】実施例１に記載した抗ＭインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１３Ｂ】実施例１に記載した抗ＭインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１３Ｃ】実施例１に記載した抗ＭインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ａ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｂ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｃ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｄ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｅ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｆ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｇ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｈ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１４Ｉ】実施例１に記載した抗ＣインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１５Ａ】実施例１に記載した抗ＫｐｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１５Ｂ】実施例１に記載した抗ＫｐｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１５Ｃ】実施例１に記載した抗ＫｐｂインキュベーションチャンバＡＨＧ汚染実験の結果であり、汚染ウェルによる試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１６Ａ】実施例１に記載した３つの血漿Ａ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第１の血漿Ａ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１６Ｂ】実施例１に記載した３つの血漿Ａ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第１の血漿Ａ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１６Ｃ】実施例１に記載した３つの血漿Ａ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第２の血漿Ａ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１６Ｄ】実施例１に記載した３つの血漿Ａ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第２の血漿Ａ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１６Ｅ】実施例１に記載した３つの血漿Ａ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第３の血漿Ａ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１６Ｆ】実施例１に記載した３つの血漿Ａ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第３の血漿Ａ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ａ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第１の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｂ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第１の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｃ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第１の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｄ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第１の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｅ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第２の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｆ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第２の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｇ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第２の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｈ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第２の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｉ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第３の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１７Ｊ】実施例１に記載した３つの血漿Ｏ試料による間接試験実験の結果であり、各試料は、参照方法及び試験カード方法における希釈により試験し、第３の血漿Ｏ試料についての試験カード結果の画像である。
【図１８Ａ】実施例２に記載した、キャリブレータを管で希釈又は試験カードで直接希釈する実験の結果であり、管で段階希釈によりキャリブレートする参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１８Ｂ】実施例２に記載した、キャリブレータを管で希釈又は試験カードで直接希釈する実験の結果であり、試験カード方法で希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【図１９Ａ】実施例３に記載した、抗原（ヒトＩｇＡ）の濃度を判断する実験結果であり、参照方法を用いた試験カード結果の画像である。
【図１９Ｂ】実施例３に記載した、抗原（ヒトＩｇＡ）の濃度を判断する実験結果であり、試験カード方法における希釈を用いた試験カード結果の画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
段階希釈により、試料中の分析物濃度を判断する方法が提供される。
【００１０】
Ｉ．定義
「１つ」という用語は「１つ以上」を意味する。「含む」という用語は、ステップや要素を列挙する前のときは、さらなるステップや要素の追加は任意であり、排除されるものではないことを意味する。本明細書に記載したものと同様又は等価の方法、装置及び材料は、本発明を実施するのに用いることができる。以下の定義は、本明細書でよく使われる用語の理解を深めるために提供されるものであり、本開示の範囲を限定するものではない。
【００１１】
「抗体」という用語は、非共有結合、可逆的、特異的に対応の抗体に結合可能な免疫グロブリン系列のポリペプチド又は免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを指す。この用語には、限定されるものではないが、アイソタイプクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのポリクローナル又はモノクローナル抗体が含まれる。
【００１２】
「抗原」という用語は、抗体により認識される、すなわち、抗体により特異的に結合し得る分子、化合物又は錯体を指す。この用語は、抗体により特異的に認識可能な任意の分子、限定されるものではないが、タンパク質（例えば、血液型タンパク質、天然タンパク質、天然タンパク質のフラグメント又は組み換えタンパク質）、ポリペプチド、多糖類、リピド、タンパク質又は多糖類で錯化したリピド、炭水化物、化学部分又はこれらの組み合わせを指す。
【００１３】
「タンパク質」という用語は、アミノ酸ポリマー、或いは一組の２つ以上の相互作用する、又は結合したアミノ酸ポリマーを指す。
【００１４】
「段階希釈」という用語は、溶液中の物質を段階的に希釈することを指す。各ステップは、必ずしも同じ希釈係数を有していなくてもよい。
【００１５】
「免疫診断試験カードを提供する」という用語は、免疫診断試験カードを用いて方法を実施するということを指す。
【００１６】
ＩＩ．方法
試料（例えば、血漿、血清、キャリブレータ／標準）のその場段階希釈により、試料中の分析物の濃度を判断する方法について説明する。ある実施形態において、分析物は、赤血球抗原に対する抗体であり、抗体としては、限定されるものではないが、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体（又は抗ＡＢＯ抗体）、抗Ｃ抗体、抗ｃ抗体、抗Ｄ抗体、抗Ｅ抗体、抗ｅ抗体、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｊｋａ抗体、抗Ｋｅｌｌ抗体、抗ｋ抗体、抗Ｋｐａ抗体、抗Ｋｐｂ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｎ抗体、抗Ｓ抗体及び抗ｓ抗体が挙げられる。特定の実施形態において、分析物は抗原である。ある実施形態において、分析物は、抗原コートマイクロフェアに対する抗体である。特定の実施形態において、分析物は、抗体コートマイクロスフェアにより捕捉された抗原である。ある実施形態において、分析物は、その他リガンド、例えば、ビオチンやストレプトアビジンである。本明細書で用いる「リガンド」は、生物分子と錯体を形成して、生物学的用途に用いられる物質である。
【００１７】
一実施形態において、本方法は、免疫診断試験カード１００（図１）を提供することを含む。試験カード１００は、複数の縦配列のマイクロチューブ（又は試験ユニット）１０４（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８）を支持する実質的に平坦な支持体１０２を含み、各マイクロチューブは、試料を受けるインキュベーションチャンバ１０６と分離マトリックス１１０を含む反応チャンバ１０８とを有する。試験カード１００及びマイクロチューブ１０４は、限定されるものではないが、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル又はポリスチレンをはじめとする材料で形成することができる。マイクロチューブ１０４は、試験カード１００の上部に糊付け又は溶接したり、例えば、ブリスターパッケージングにより試験カードと一体製造することができる。マイクロチューブ１０４は、反応チャンバ１０８より大きい直径を有するインキュベーションチャンバ１０６を備えた略円筒形である。ある実施形態において、インキュベーションチャンバ１０６と反応チャンバ１０８との間のマイクロチューブ１０４の一部は、テーパーのある直径１１２を有する。
【００１８】
ある実施形態において、反応チャンバ１０８は、少なくとも１つの分離マトリックス（例えば、ゲル）及び上澄み（例えば、上澄み液）を含む。ある実施形態において、反応チャンバ１０８は、試薬をさらに含む。ある実施形態において、試薬（又は試薬の少なくとも１つ）が上澄みに存在する。試薬は、分析物（又は分析物の１つ）と錯化（例えば、結合）可能で、試薬−分析物錯体が形成される。ある実施形態において、試薬は、抗原、抗体又はその他分析物リガンド（例えば、ストレプトアビジン）を有するコート粒子（例えば、ラテックス粒子、マイクロスフェアや微粒子）や赤血球（ＲＢＣ）を含む。ＲＢＣの抗原は、滴定される抗体に応じて異なる。例えば、抗体が、抗Ｄ抗体である実施形態において、ＲＢＣの抗原は、Ｄ抗原である。ある実施形態において、反応チャンバ１０８は、網状化剤をさらに含み、例えば、上澄みや分離マトリックス１１０に存在させ得る。本明細書で用いる、網状化剤は、増感赤血球や増感ラテックス粒子を架橋する生物分子である。例示の網状化剤としては、限定されるものではないが、二次抗体（例えば、抗ヒトグロブリンや抗ヒトＩｇＡ抗体）、タンパク質Ａ及びリガンド（例えば、ストレプトアビジン）が挙げられる。
【００１９】
ある実施形態において、分離マトリックス１１０は、ゲル、例えば、デキストランアクリルアミドを含む高分子電解質ゲルである。ある実施形態において、分離マトリックス１１０は、限定されるものではないが、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリデキストラン、スチレン−ジビニルベンゼンポリマー又はガラスビーズをはじめとする不活性材料である。
【００２０】
ある実施形態において、マイクロチューブ１０４は、分離マトリックス１１０の上（例えば、インキュベーションチャンバ１０６と反応チャンバ１０８の間）にエアギャップ１０８をさらに含む。ある実施形態において、マイクロチューブ１０４は、分離マトリックス１１０の上に油層（又は、低密度非混和性化合物、例えば、特許出願ＷＯ２０１６／１８４９２４号に開示された低密度非混和性化合物）を含む。油層の油としては、限定されるものではないが、合成油、有機油、鉱油やパラフィン油が挙げられる。ある実施形態において、マイクロチューブ１０４は、インキュベーションチャンバ１０６と反応チャンバ１０８の間にエアギャップと油層を含む。
【００２１】
本方法の次のステップは、希釈剤（例えば、バッファ、ＡＢ血漿、ＡＢ血清、０．９％塩化ナトリウムと６％ウシ血清アルブミンを有する溶液）を、試験カード１００のインキュベーションチャンバ１０６の少なくとも１つに添加することを含む。ある実施形態において、５〜２００マイクロリットルの希釈剤を、インキュベーションチャンバ１０６の少なくとも１つに添加する。インキュベーションチャンバに添加される希釈剤の最大容積は、インキュベーションチャンバの容量と希釈係数に応じて異なる。
【００２２】
本方法の次のステップにおいて、試料は、希釈剤が中に入った各インキュベーションチャンバ１０６で直接、段階希釈される。ある実施形態において、試料は、多数の試験カードのインキュベーションチャンバで希釈される。ある実施形態において、段階希釈は、２倍以下の希釈である（例えば、１：０．１、１：０．５、１：０．７５等）。ある実施形態において、段階希釈は、２倍以上の段階希釈（例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３以上の希釈）である。典型的な２倍の段階希釈の実施形態において、５〜２００マイクロリットル（又は希釈剤の量に等しい容積）の試料を、第１の２つのインキュベーションチャンバに添加する。第２のインキュベーションチャンバにおいて、試料は、例えば、２〜５回以上ピペットで吸い上げ、吐出させることにより（手動又は自動で）、試料を希釈剤と混合する。インキュベーションチャンバと反応チャンバとの間にエアギャップや油層がある実施形態において、試料は、エアギャップや油層を乱すことなく、希釈剤と混合される。キャリーオーバーを防ぐために、正常なピペット先端を用いて、第２のインキュベーションチャンバからある容積（例えば、５〜２００マイクロリットル）の混合物を、次のインキュベーションチャンバに添加し、混合し、５〜２００マイクロリットルが除去及び廃棄される最後のインキュベーションチャンバまで続ける。例えば、一実施形態において、１０マイクロリットルの混合物を、第２のインキュベーションチャンバから除去し、次のインキュベーションチャンバに添加して混合する。第３のインキュベーションチャンバの１０マイクロリットルの混合物を、次のインキュベーションチャンバに移し、１０マイクロリットルが除去及び廃棄される最後のインキュベーションチャンバまで続ける。インキュベーションチャンバの典型的な結果としての希釈係数は、１ｘ、２ｘ、４ｘ、８ｘ、１６ｘ及び３２ｘである。
【００２３】
反応チャンバ１０８が試薬を含まないある実施形態において、本方法の次のステップは、試薬を各インキュベーションチャンバ１０６に添加することを含む。ある実施形態において、インキュベーションチャンバ１０６に添加した後、試薬を希釈試料と混合する。ある実施形態において、コートマイクロスフェアや微粒子を用いて、対応の抗体や抗原を捕捉する。
【００２４】
本方法の次のステップにおいて、試験カード１００を任意で、３７℃、室温又は４度で、適切な時間（例えば、５〜１５分）インキュベートして、試薬を希釈試料と相互作用させる。試験カード１００を、沈降（例えば、遠心分離又は重力により）して、サイズに基づいて、非凝集ＲＢＣから凝集ＲＢＣを分離する。一実施形態において、試験カード１００を適切な時間、十分な速度で（例えば、８５ｘｇで５〜１０分）遠心分離して、非凝集ＲＢＣから凝集ＲＢＣを分離する。凝集ＲＢＣは、分離マトリックス１１０の上部又はその中で捕捉され、非凝集ＲＢＣは、マイクロチューブ１０４の下部でペレットを形成する。
【００２５】
抗体の力価を求める実施形態において、本方法の最後のステップは、（例えば、凝集体）が、分離マトリックス１１０で、又はその中で検出される（例えば、試薬−抗体錯体の目視による検出は、対応の試験カードの使用の指示に基づく）試料の最高希釈度を判断することを含む。ある実施形態において、抗体力価は、「＋」の反応強度に対応して、試薬−抗体錯体が観察される試料の最高希釈である。ある実施形態において、試薬−抗体錯体は、目視により、又は光学的に検出される。特定の実施形態において、本方法は、各希釈ごとに反応段階を判断することをさらに含む。ある実施形態において、本方法は、抗体力価スコアを判断することをさらに含む。抗体力価スコアは、各反応に割り当てられたスコア価の合計である。
【００２６】
抗原の濃度が判断される実施形態において、本方法の最後のステップは、抗ヒトグロブリン−抗原錯体が、分離マトリックス１１０で、又はその中で検出される試料の最高希釈を判断することを含む。特定の実施形態において、抗ヒトグロブリン−抗原錯体は、目視により、又は光学的に検出される。
【００２７】
追加の開示及び請求可能な主題
項目１  その場段階希釈により試料中の分析物の濃度を判断する方法であって、
免疫診断試験カードを提供することを含み、前記試験カードは、複数の縦配列のマイクロチューブを支持する実質的に平坦な支持体を含み、各マイクロチューブは、試料を受けるインキュベーションチャンバと分離マトリックスを含む反応チャンバとを有し、前記反応チャンバは、分析物と錯化して、試薬−分析物錯体を形成可能な試薬を含み、
前記インキュベーションチャンバの少なくとも１つに希釈剤を添加し、
希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中で直接、前記試料を段階希釈し、
重力及び／又は遠心分離により前記試験カードを沈降させ、
前記分離マトリックス上又は中で試薬−分析物錯体が検出される前記試料の最高希釈度を判断することにより、前記分析物の前記濃度を判断する、方法。
項目２  前記分析物の前記濃度を判断するステップは、抗体の力価を判断することを含み、前記力価は、「＋」の反応強度に対応して試薬−抗体錯体が観察される前記試料の前記最高希釈度である、項目１に記載の方法。
項目３  抗体の終点を判断することをさらに含み、前記抗体の終点は、可視の試薬−抗体錯体を有する前記試料の前記最高希釈度である、項目２の方法。
項目４  抗体力価スコアを判断することをさらに含み、前記抗体力価スコアは、各反応に割り当てられたスコア値の合計である、項目２又は３に記載の方法。
項目５  前記分析物の濃度を判断するステップは、抗原の濃度を判断することを含む、項目２に記載の方法。
項目６  前記分離マトリックスは、デキストランアクリルアミドを含むゲルである、項目１〜５のいずれか１つに記載の方法。
項目７  前記反応チャンバは、網状化剤を含む、項目１〜６のいずれか１つに記載の方法。
項目８  前記網状化剤は、二次抗体である、項目７に記載の方法。
項目９  前記二次抗体は、抗ヒトグロブリン又は抗ヒトＩｇＡ抗体である、項目８に記載の方法。
項目１０  前記試料を段階希釈するステップは、同じ試験カードの中の、又は複数の試験カード間のインキュベーションチャンバのそれぞれの中で直接、前記試料を段階的に希釈することを含む、項目１に記載の方法。
項目１１  前記試薬は、抗原又は抗体を有する赤血球又はコート粒子を含む、項目１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
項目１２  前記抗体は、赤血球抗原に対するものである、項目２〜４のいずれか１つに記載の方法。
項目１３  前記抗体は、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、抗Ｄ抗体、抗Ｃ抗体、抗ｃ抗体、抗Ｅ抗体、抗ｅ抗体、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｋｅｌｌ抗体、抗ｋ抗体、抗Ｋｐａ抗体、抗Ｋｐｂ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｎ抗体、抗Ｓ抗体及び抗ｓ抗体からなる群より選択される、項目１２に記載の方法。
項目１４  各マイクロチューブは、前記インキュベーションチャンバと前記反応チャンバとの間にエアギャップをさらに含む、項目１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
項目１５  各マイクロチューブは、前記インキュベーションチャンバと前記反応チャンバとの間に低密度非混和性化合物をさらに含む、項目１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
項目１６  前記低密度非混和性化合物は、合成油、有機油、鉱油及びパラフィン油からなる群から選択される油を含む、項目１５に記載の方法。
項目１７  希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中で直接、前記試料を段階希釈するステップの後、希釈剤及び／又は試料が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれに、分析物と錯化して、試薬−分析物錯体を形成可能な追加の試薬を添加することをさらに含む、項目１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
項目１８  希釈剤及び／又は試料が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれに、前記追加の試薬を添加するステップの後に、前記試験カードをインキュベートすることをさらに含む、項目１７に記載の方法。
項目１９  前記試料を前記段階希釈するステップは、希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中での前記試料の少なくとも２倍の段階希釈を含む、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
項目２０  前記試料を前記段階希釈するステップは、希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中での前記試料の２倍未満の段階希釈を含む、項目１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
項目２１  前記試料を前記段階希釈するステップは、希釈剤が中に入った前記インキュベーションチャンバのそれぞれの中での前記試料の２倍の段階希釈を含む、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
項目２２  前記試料は、血漿、血清及びキャリブレータからなる群から選択される、項目１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
項目２３  前記分析物は、抗体又は抗原である、項目１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００２８】
ＩＩＩ．実施例
実施例１−マイクロチューブでの試料の直接希釈と、参照の希釈方法の比較
本例において、マイクロチューブでの試料の直接希釈を、個別の管での試料の希釈と比較した。
【００２９】
材料
１．ＩＤ−カード
・ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓ（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
・ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集素（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
２．試薬  赤血球
・ＩＤ−ＤｉａＣｅｌｌ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
・ＩＤ−ＤｉａＣｅｌｌ  ＡＢＯ（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
３．希釈媒体−ＩＤ−滴定溶液（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
４．試料
・０．９％ＮａＣｌ／６％ＢＳＡで１：５００に希釈した、ヒトの患者からの抗Ｄ
・ＩＤ滴定溶液で１：５０に希釈した抗Ｋｅｌｌ
・ヒトの患者からの抗Ｆｙｂ、抗Ｓ、抗Ｍ、抗Ｃ、抗Ｋｐｂ、抗Ｊｋａ
・ドナーからの新鮮な血漿：３血漿Ａ及び３血漿Ｏ
５．希釈管−溶血ガラス管、Ｒａｔｉｏｌａｂ（Ｒｅｆ．２６００１３１）
【００３０】
方法
１．希釈の参照方法
ａ．実施する希釈ステップの数に従って、懸濁液の管を確認した。例えば、管１（非希釈試料、１／１）、管２（希釈１／２）、管３（希釈１／４）等。
ｂ．管１（非希釈）以外は、各懸濁液の管において、ＩＤ滴定溶液５００μｌを分配した。
ｃ．管１及び管２において、試料５００μｌを分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることにより管２の中身を混合した。
ｄ．この混合物から、５００μｌ取り出し、管３に分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることにより管３の中身を混合した。
ｅ．清浄な先端を用いて、同じプロセスを全ての希釈物について続け、各希釈物を混合し、移した。最後の管から、希釈した試料５００μｌを取り出し、さらに希釈が必要な場合に備え保管した。
２倍の段階希釈（ここでは、５００μｌ）を行うために用いた容積は、同じ容積の試料及び用いられる懸濁液の管に合わせて変えなければならない。
ｆ．以下の通り、すぐに、ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓ又はＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集試験に進んだ。
・適切な希釈について、ＩＤ−カードマイクロチューブを確認
・各マイクロチューブの試薬赤血球５０μｌに続き、最高希釈から最低希釈まで、各希釈試料２５μｌ（ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓ）又は５０μｌ（ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集）を移した。
・ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／ＣｏｏｍｂｓについてはＩＤ−インキュベータにて３７℃で１５分、ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集についてはＲＴで１０分インキュベートした。
・ＩＤ−遠心分離機にて、ＩＤ−カードを１０分間遠心分離した。
・反応結果を読み取り記録した。
【００３１】
２．試験カード方法での希釈
ａ．適切な希釈について、ＩＤ−カードマイクロチューブを確認した。
ｂ．第１のマイクロチューブ（非希釈試料）以外は、各ＩＤ−カードマイクロチューブにおいて、ＩＤ滴定溶液２５μｌ（ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓについて）又は５０μｌ（ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集について）を分配した。
ｃ．ＩＤ−カードマイクロチューブ１及び２において、試料２５μｌ（ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓについて）又は５０μｌ（ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集について）を分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることによりマイクロチューブ２の中身を混合した。
ｄ．この混合物から、２５μｌ（ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓについて）又は５０μｌ（ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集について）取り出し、管３に分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることにより管３の中身を混合した。
ｅ．清浄な先端を用いて、同じプロセスを全ての希釈物について続け、各希釈物を混合し、移した。最後のマイクロチューブから、希釈した試料２５μｌ（ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓについて）又は５０μｌ（ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集について）を取り出した。
ｆ．希釈直後、各マイクロチューブに、５０μｌの試薬赤血球を添加した。
ｇ．ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／ＣｏｏｍｂｓについてはＩＤ−インキュベータにて３７℃で１５分、ＩＤ−カード  ＮａＣｌ、酵素試験及び寒冷凝集についてはＲＴで１０分インキュベートした。
ｈ．ＩＤ−遠心分離機にて、ＩＤ−カードを１０分間遠心分離した。
ｉ．反応結果を読み取り記録した。
【００３２】
３．インキュベーションチャンバＡＨＧ汚染
・ゲル及び上澄みがインキュベーションチャンバで目視観察されるまで、試験カードを振とうすることにより、ＬＩＳＳ／ＣｏｏｍｂｓのＡＨＧで、インキュベーションチャンバを人工的に汚染した。その後、サプライヤ推奨通り、使用前に、８５ｘｇで１０分間遠心することによりＩＤ−カードを回収した。
【００３３】
結果
反応段階及び試料希釈を図２Ａ〜１７Ｊに示す。試験は全て、参照方法と同時に行った。間接抗グロブリン（抗体スクリーニング）滴定試験カードの画像を図２Ａ〜８Ｄに示す。ウェルをＡＨＧにより汚染した後、間接抗グロブリン滴定試験カードで用いる前に遠心分離した試験カードの画像を図９Ａ〜１５Ｃに示す。リバースタイピング試験カードの画像を図１６Ａ〜１７Ｊに示す。発明者は、インキュベーションチャンバにおいて段階希釈を行いながら、インキュベーションチャンバと反応チャンバとの間のエアギャップが容易に維持されることを観察した。
【００３４】
各滴定についての力価及び凝集スコア結果を表１に示す。力価は、「＋」反応を生成する最高希釈の逆数であり、反応強度は、ＡＡＢＢテクニカルマニュアル（各希釈物について、スコア値は、反応投球に基づいて記録され、全希釈物についてまとめられた）に記載された通りにスコアされた。終点は、目視凝集物の最高希釈の逆数である。
【００３５】
【表１（ａ）】
2020525784.tif 000002
【００３６】
【表１（ｂ）】
2020525784.tif 000003
表１の結果によれば、インキュベーションチャンバ内で抗血清を混合すると（すなわち、試験カード方法における希釈）、個別の試験官における滴定（すなわち、参照方法）と同じ性能を示したことが分かる。結果によればまた、例えば、搬送条件のために、ＡＨＧによるインキュベーションチャンバの汚染は、試験前にカードを遠心分離しておけば、ゲルの性能に影響しなかったことも分かる。このように、表１に示す結果は、方法間の力価、スコア及び終点に大きな差がなく、抗体力価を判断するための希釈を、試料をゲル試薬で汚染することなく、ゲル試験カードのインキュベーションチャンバ内で実施できることを示している。
【００３７】
実施例２−検量線の生成
本実施例において、キャリブレータ（又は標準）を試験カードで直接希釈して、検量線を生成する実現可能性について試験した。
【００３８】
材料
１．ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓ（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
２．ＩＨ−ＱＣ１（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（上澄みは、０．０５ＵＩ／ｍＬで抗Ｄを含有している）。抗Ｄ０．０５ＩＵ／ｍｌは、外部の認定リファレンスラボラトリにより制御された世界保健機関０１／５７２国際標準に対して標準化されている。）
３．ＩＤ−ＤｉａＣｅｌｌ  Ｉ（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
４．ＩＤ−滴定溶液（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
５．希釈管−溶血ガラス管、Ｒａｔｉｏｌａｂ（Ｒｅｆ．２６００１３１）
【００３９】
方法
１．希釈の参照方法−ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓを用いた実施例１と同じ方法を用いた。ＩＨ−ＱＣ１（抗Ｄ０．０５ＵＩ／ｍＬ）は、希釈用試料であった。
２．試験カード方法における希釈−ＩＤ−カード  ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓを用いた実施例１と同じ方法を用いた。ＩＨ−ＱＣ１（抗Ｄ０．０５ＵＩ／ｍＬ）は、希釈用試料であった。
【００４０】
結果
結果を図１８Ａ及び１８Ｂに示す。反応段階及び試料希釈を図に示す。両方法について同様の結果が得られ、検量線は、試験カードのインキュベーションチャンバにおいて直接キャリブレータを希釈することにより生成することができることが示された。
【００４１】
実施例３−抗体の濃度の判断
本実施例において、コート粒子を用いて、抗原濃度を判断する実現可能性について試験した。
【００４２】
材料
１．ＩＤ−カード  ＩｇＡ欠乏試験（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
２．ＩＤ−ＰａＧＩＡ  ＩｇＡ欠乏粒子（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
３．ＣｈｒｏｍｏＰｕｒｅヒトＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（４．８ｍｇ／ｍＬ）
４．ＩＤ−滴定溶液（ＤｉａＭｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ヒトＩｇＡは、ＩＤ−滴定溶液中１μｇ／ｍＬで希釈される。この試料もキャリブレータと考えられる。）
５．希釈管−溶血ガラス管，Ｒａｔｉｏｌａｂ（Ｒｅｆ．２６００１３１）
【００４３】
方法
１．参照希釈方法
ａ．実施する希釈ステップの数に従って、懸濁液の管を確認した。例えば、管１（非希釈試料、１／１）、管２（希釈１／２）、管３（希釈１／４）等。
ｂ．管１（非希釈）以外は、各懸濁液の管において、ＩＤ滴定溶液５００μｌを分配した。
ｃ．管１及びマイクロチューブ２において、ヒトＩｇＡ５００μｌを１μｇ／ｍＬで分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることにより管２の中身を混合した。
ｄ．この混合物から、５００μｌ取り出し、管３に分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることにより管３の中身を混合した。
ｅ．清浄な先端を用いて、同じプロセスを全ての希釈物について続け、各希釈物を混合し、移した。最後の管から、希釈した試料５００μｌを取り出し、さらに希釈が必要な場合に備え保管した。
段階２倍希釈（ここでは、５００μｌ）を行うために用いた容積は、同じ容積の試料及び用いられる懸濁液の管に合わせて変えなければならない。
ｆ．以下の通り、すぐに、ＩＤ−カード  ＩｇＡ欠乏試験に進んだ。
・適切な希釈について、ＩＤ−カードマイクロチューブを確認
・ＩＤ−ＰａＧＩＡ  ＩｇＡ欠乏粒子５０μｌに続き、各マイクロチューブにおける最高希釈から最低希釈まで、各希釈試料１０μｌを移した。
・室温で５分インキュベートした。
・ＩＤ−遠心分離機にて、ＩＤ−カードを１０分間遠心分離した。
・反応結果を読み取り記録した。
【００４４】
２．試験カード方法での希釈
ａ．適切な希釈について、ＩＤ−カード  ＩｇＡ欠乏試験マイクロチューブを確認した。
ｂ．第１のマイクロチューブ（非希釈試料）以外は、各ＩＤ−カードマイクロチューブにおいて、ＩＤ滴定溶液１０μｌを分配した。
ｃ．ＩＤ−カードマイクロチューブ１及び管２において、ヒトＩｇＡ１０μｌを、１μｇ／ｍＬで分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることによりマイクロチューブ２の中身を混合した。
ｄ．この混合物から、１０μｌ取り出し、マイクロチューブ３に分配した。先端を変えて、４〜５回ピペットで吸い上げ、吐出させることによりマイクロチューブ３の中身を混合した。
ｅ．清浄な先端を用いて、同じプロセスを全ての希釈物について続け、各希釈物を混合し、移した。最後のマイクロチューブから、希釈した試料１０μｌを取り出した。
ｆ．希釈直後、各マイクロチューブに、５０μｌのＩＤ−ＰａＧＩＡ  ＩｇＡを添加した。
ｇ．室温で５分インキュベートした。
ｈ．ＩＤ−遠心分離機にて、ＩＤ−カードを１０分間遠心分離した。
ｉ．反応結果を読み取り記録した。
【００４５】
結果
結果を図１９Ａ及び１９Ｂに示す。反応段階及び試料希釈を図に示す。両方法について同様の結果が得られ、試験カードのインキュベーションチャンバにおいて抗原を直接希釈することにより、抗原濃度を求められることが示された。
【００４６】
本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示のためのみであり、様々な修正や変更が当業者には示唆され、本明細書の精神や範囲及び請求項に含まれるものと考えられる。本明細書で引用した特許、特許出願、インターネットソース及びその他公開参考資料は、その全てが参考として援用される。本明細書で引用した参考資料又は一般的な先行技術と、本明細書の明白な教示との間にある相違は、本明細書の教示を支持することにより、解決されるものとする。これには、文言や語句の業界で認識されている定義と、同じ文言や語句の本明細書に明白に示された定義との間にある相違も含まれる。
【図１】
2020525784.tif 000004
【図２Ａ】
2020525784.tif 000005
【図２Ｂ】
2020525784.tif 000006
【図３Ａ】
2020525784.tif 000007
【図３Ｂ】
2020525784.tif 000008
【図４Ａ】
2020525784.tif 000009
【図４Ｂ】
2020525784.tif 000010
【図４Ｃ】
2020525784.tif 000011
【図４Ｄ】
2020525784.tif 000012
【図５Ａ】
2020525784.tif 000013
【図５Ｂ】
2020525784.tif 000014
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【国際調査報告】
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