(57)【要約】  本発明は、部分的に、Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質並びに癌及び／又は炎症性疾患のための免疫療法などの、疾患の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】図１４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｖセットの一部及びＶＳＩＧ８リガンドに結合できる免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）を含む第１のドメイン；
（ｂ）ＯＸ４０Ｌ受容体に結合できるＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の一部を含む第２のドメイン；並びに
（ｃ）前記第１のドメイン及び前記第２のドメインを連結するリンカー
を含む異種キメラタンパク質。
【請求項２】
前記第１のドメインが、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインの実質的に全てを含みかつ前記第２のドメインが、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインの実質的に全てを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３】
前記異種キメラタンパク質が、免疫抑制シグナルを阻害できる、請求項１又は請求項２に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４】
前記異種キメラタンパク質が、
（ａ）ＶＳＩＧ８の一部がそのリガンドに結合した時に免疫阻害シグナルを低減、破壊、若しくは除去できかつ／又は
（ｂ）ＯＸ４０Ｌの一部がその受容体に結合した時に免疫刺激シグナルを増加、刺激、若しくは活性化できる、
請求項１又は請求項２に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項５】
前記ＶＳＩＧ８リガンドが、Ｔ細胞活性化のＶ領域免疫グロブリン含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項６】
前記ＯＸ４０Ｌ受容体が、ＯＸ４０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項７】
前記異種キメラタンパク質が、ＶＳＩＧ８リガンド及びＯＸ４０Ｌ受容体に同時に結合でき、ＶＳＩＧ８リガンドが、ＶＩＳＴＡでありかつＯＸ４０Ｌ受容体が、ＯＸ４０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項８】
前記キメラタンパク質が、組換えヒトＯＸ４０及びヒトＶＩＳＴＡにインビトロで同時に結合できる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項９】
前記リンカーが、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されるポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１０】
前記リンカーが、ＩｇＧ４由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む、請求項９に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１１】
前記ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４由来である、請求項１０に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１２】
前記キメラタンパク質が、分泌可能で機能的な単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞により発現される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１３】
前記ＶＳＩＧ８の一部が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１４】
前記ＯＸ４０Ｌの一部が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１５】
前記リンカーが、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１６】
前記リンカーが、配列番号２８〜７４から独立して選択される結合リンカーなど、１以上の結合リンカーを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１７】
前記リンカーが、各々配列番号２８〜７４から独立して選択される２以上の結合リンカーを含み、１つの結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ＦｃドメインのＮ末端でありかつ別の結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ＦｃドメインのＣ末端である、請求項１６に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１８】
前記キメラタンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１９】
前記キメラタンパク質が、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍抗原の認識を増強する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２０】
前記キメラタンパク質が、必要に応じて血清中で、ＶＩＳＴＡを枯渇させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２１】
前記キメラタンパク質が、ＯＸ４０アゴニスト抗体及び／又はＶＳＩＧ８アンタゴニスト抗体と比較して増強された抗腫瘍効果を示す、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２２】
前記異種キメラタンパク質が、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団を増加させることができる又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の低下を防止できる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２３】
前記異種キメラタンパク質が、Ｔ細胞による腫瘍殺傷活性を増強できる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２４】
前記異種キメラタンパク質が、持続的な免疫調節効果を提供できる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２５】
前記異種キメラタンパク質が、抗原提示細胞の活性化を引き起こすことができる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２６】
前記異種キメラタンパク質が、抗原を提示する抗原提示細胞の能力を増強できる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２７】
前記キメラタンパク質が、腫瘍を保護する細胞とは反対に腫瘍を死滅させることができる細胞を優先して免疫細胞の比をシフトさせる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２８】
前記キメラタンパク質が、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２９】
前記キメラタンパク質が、免疫阻害シグナルの持続的なマスキング効果を提供する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３０】
前記キメラタンパク質が、前記キメラタンパク質の血清ｔ１／２と比較してより長いオンターゲット（例えば、腫瘍内）の半減期（ｔ１／２）を提供する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３１】
前記キメラタンパク質が、ＶＳＩＧ８及びＯＸ４０に対する抗体での治療と比較して毒性を低減する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３２】
前記キメラタンパク質が、細胞間で安定なシナプスを形成できる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３３】
前記細胞間で安定なシナプスが、腫瘍縮小に有利である空間的配向を提供する、請求項３２に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３４】
前記空間的配向が、腫瘍細胞を攻撃するようＴ細胞を位置づけかつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされるもの以外の負のシグナルを含む、負のシグナルの送達から腫瘍細胞を立体的に防ぐ、請求項３２又は請求項３３に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３５】
そのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメインのいずれか又は両方の結合が、受容体とそのリガンドの長い相互作用を提供する遅いオフ速度（Ｋｏｆｆ）で生じる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３６】
前記長い相互作用が、より長い正のシグナル効果を送達する、請求項３５に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３７】
前記より長い正のシグナル効果が、抗腫瘍効果のためにエフェクター細胞が十分に刺激されることを可能にする、請求項３６に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３８】
前記長い相互作用が、Ｔ細胞増殖を提供しかつ抗腫瘍攻撃を可能にする、請求項３６又は請求項３７に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３９】
前記長い相互作用が、刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４０】
前記刺激シグナルが、サイトカインである、請求項３９に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の治療有効量の異種キメラタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項４３に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
患者の免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする対象に請求項４３に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記患者のＴ細胞が、活性化される、請求項４４又は請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、腫瘍を有しかつ１以上の腫瘍細胞が、免疫抑制シグナルを伝達することを防止される、請求項４４又は請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
それを必要とする対象に有効量の医薬組成物を投与することを含む癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、前記医薬組成物が、
（ａ）ＶＳＩＧ８リガンドに結合できるコロニー刺激因子１受容体（ＶＳＩＧ８）の一部を含む第１のドメイン、
（ｂ）ＯＸ４０Ｌ受容体に結合できるＣＤ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の一部を含む第２のドメイン、並びに
（ｃ）前記第１のドメイン及び前記第２のドメインを連結するリンカー
を含む異種キメラタンパク質を含む、方法。
【請求項４９】
前記対象のＴ細胞が、前記異種キメラタンパク質の第２のドメインが結合した時に活性化されかつ、
（ａ）１以上の腫瘍細胞が前記異種キメラタンパク質の第１のドメインが結合した時に免疫抑制シグナルを伝達することを防止され、
（ｂ）前記対象の末梢血中の定量可能なサイトカイン応答が達成され、かつ／又は、
（ｃ）腫瘍成長がＯＸ４０ブロッキング抗体及び／若しくはＶＩＳＴＡブロッキング抗体で治療された対象と比較してそれを必要とする対象において低減される、
請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、ＯＸ４０シグナル伝達を刺激しかつ抗原提示細胞を活性化する、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が、未治療対象又はＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ及びＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８の１つを標的とする薬剤で治療された対象と比較して制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量又は活性を低下させる、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、未治療対象又はＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ及びＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８の１つを標的とする薬剤で治療された対象と比較して前記対象の流入領域リンパ節におけるエフェクターＴ細胞のプライミングを増加させる、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が、未治療対象又はＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ及びＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８の１つを標的とする薬剤で治療された対象と比較して免疫抑制細胞の全体的な減少及びより炎症性の腫瘍環境へのシフトを引き起こす、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
医薬としての使用のための請求項１〜４０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項５５】
癌の治療での使用のための請求項１〜４０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項５６】
炎症性疾患の治療での使用のための請求項１〜４０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項５７】
薬剤の製造における請求項１〜４０のいずれか一項に記載の異種キメラタンパク質の使用。
【請求項５８】
Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含む組換え融合タンパク質であって、式中、
（ａ）は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありかつＶＳＩＧ８リガンドに結合できるＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、
（ｂ）は、前記第１のドメイン及び前記第２のドメインを連結しかつヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメイン、及び必要に応じて配列番号２８〜７４の結合リンカー配列を含むリンカーであり、かつ
（ｃ）は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありかつＯＸ４０Ｌ受容体に結合できるＣＤ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、
組換え融合タンパク質。
【請求項５９】
前記リンカーが、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項５８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６０】
薬剤としての使用のための、請求項５８又は請求項５９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６１】
癌の治療での使用のための請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６２】
炎症性疾患の治療での使用のための、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６３】
薬剤の製造における、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１７年２月２７日出願の米国仮出願第６２／４６３，９９９号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に送信されたテキストファイルの説明
本出願は配列リストを含有する。配列リストは、「ＳＨＫ−００３ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」というタイトルのＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送信された。配列リストは８１，７５２バイトのサイズであり、２０１８年２月２７日頃に作成された。配列リストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、部分的に、Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質並びに癌及び／又は炎症性疾患のための免疫療法などの、疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
最近の臨床データは、例えば、ヤーボイＹＥＲＶＯＹ、キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、及びオプジーボ（ＯＰＤＩＶＯ）の承認につながった臨床試験を含む、免疫共阻害分子を標的とする薬剤への印象的な患者の応答を実証した。これらの免疫療法は、チェックポイント阻害剤として集合的に特徴付けられ、不運にも、これらの治療法は、癌患者の約１５〜３０％のみに臨床的利益を提供する。より広い癌患者の集団のための臨床応答率を改善するための１つの潜在的なアプローチは、別の治療法とチェックポイント阻害剤療法を組み合わせることを含む。そのような組み合わせは、複数の個々の治療薬を使用して適用される場合に、臨床上の利益の向上をもたらすが、開発が厄介である。さらに、多くの免疫療法は、治療のための患者の治療ウィンドウを大幅に狭める重篤な副作用を併発する。
【０００５】
単一薬物に複数の治療メカニズムを統合することを含む、効果的な免疫療法を提供する新規な方法及び組成物が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
概要
したがって、本発明は、部分的には、例えば、腫瘍微小環境において複数の抑制メカニズムを克服すること、及び免疫抗腫瘍メカニズムを刺激することによって、癌治療で使用される組成物及び方法を提供する。同様に、組成物及び方法は、炎症性疾患の治療に使用される。
【０００７】
実施形態において、本キメラタンパク質は、単一構築物で免疫阻害シグナルをマスクし、かつ／又は免疫刺激シグナルを増強する。実施形態において、そのような免疫調節効果は、直接的な受容体／リガンド相互作用を介して達成される。
【０００８】
例えば、本発明は、部分的には、同時に抗原提示細胞中でＶＩＳＴＡ／ＶＩＳＩＧ８シグナル伝達を阻害しかつＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を刺激することを可能にする組成物及び方法を提供する。そのような同時におこるＶＩＳＩＧ８遮断及びＯＸ４０アゴニズムは、とりわけ、免疫阻害細胞の全体的な減少及びより炎症性の環境へのシフト並びに抗腫瘍効果の増大を引き起こす。
【０００９】
態様において、本発明は、（ａ）Ｖセットの一部及びＶＳＩＧ８リガンドに結合できる免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）を含む第１のドメイン；（ｂ）ＯＸ４０Ｌ受容体に結合できるＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の一部を含む第２のドメイン；並びに（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインを連結するリンカー、を含む異種キメラタンパク質を提供する。態様において、本発明は、この異種キメラタンパク質で癌を治療する方法を提供する。態様において、本発明は、この異種キメラタンパク質で炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【００１０】
態様において、本発明は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造を含み、式中、（ａ）は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありＶＳＩＧ８リガンドに結合できるＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は第１のドメイン及び第２のドメインを連結しヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含むリンカーであり（例えば、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列と９５％同一である）、並びに（ｃ）は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありＯＸ４０Ｌ受容体に結合できるＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、組換え融合タンパク質を提供する。実施形態において、本発明は、この異種キメラタンパク質で癌を治療する方法を提供する。実施形態において、本発明は、この異種キメラタンパク質で炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【００１１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍又は任意の他の望ましくない細胞の免疫攻撃を優先して免疫細胞のバランスをシフトできるか、又はそれをシフトすることを伴う方法で使用される。例えば、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍を死滅させることができる細胞（例えば、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞）を優先し、かつ腫瘍を保護する細胞（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））に反して、臨床的に重要な部位で免疫細胞の割合をシフトさせることができる。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍抗原の認識を高め、かつ／又はこれらのＴ細胞による腫瘍浸潤を増強する。
【００１２】
態様において、本発明のキメラタンパク質及び／又は組換え融合タンパク質は、その必要がある患者に、キメラタンパク質を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌又は炎症性疾患を治療するための方法において使用される。癌治療の実施形態において、例えば、本発明のキメラタンパク質及び／又は組換え融合タンパク質は、免疫記憶応答をもたらす。
【００１３】
態様は、例えば、癌及び／又は炎症性疾患を治療するための、医薬の製造における、本発明のキメラタンパク質及び／又は組換え融合タンパク質の使用を含む。
【００１４】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】理論に縛られることなく、その３つのドメインのそれぞれがその予測された天然の状態にある、ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のコンピューター予測２次構造を示す。キメラタンパク質の予測分子量は約６８．１ｋＤａである。
【図１Ｂ】腫瘍細胞とＴ細胞の間にキメラタンパク質によって形成されたシナプスを示す。
【図２】非還元条件下、還元条件下、及び還元／脱グリコシル化（ＰＮＧアーゼ）条件下でのウェスタンブロット分析によるヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。具体的には、キメラ構築物の各個々のドメインを、抗ＶＳＩＧ８、抗Ｆｃ、又は抗ＯＸ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。ｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン２にロードした（β−メルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼを含まない）。全ブロットのレーン３の試料を、還元剤、β−メルカプトエタノールで処理し、全ブロットのレーン４の試料をアミダーゼペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ酵素で処理した。バンドサイズは、約６８．１ｋＤａの予想単量体分子量を裏付け、キメラタンパク質の天然の状態はグリコシル化二量体であることを示唆する。
【図３】ヒトＩｇＧ（左パネル）及び組換えＯＸ４０（右パネル）へのヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を実証する機能的ＥＬＩＳＡのグラフを示す。
【図４】ＯＸ４０発現細胞株（すなわち、ヒトＯＸ４０を過剰発現するように工学処理されたＪｕｒｋａｔ細胞）へのヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのインビトロ細胞結合を示すグラフである。結合をインビトロで行い、フローサイトメトリーによって分析した。
【図５】ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに対するｏｃｔｅｔの結合親和性を示すグラフである。ＯＸ４０へのＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を、市販の片面ヒトＦｃ−ＯＸ４０Ｌ対照又はタボリクマブ（ｔａｖｏｌｉｘｕｍａｂ）（抗ヒトＯＸ４０抗体）と比較して、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）により測定した。データは、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、７６７ｐＭ（上の曲線：タボリクマブ、中央の曲線：ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、下の曲線：片面ヒトＦｃ−ＯＸ４０Ｌ）で測定した時に、高親和性でヒトＯＸ４０に結合することを示す。
【図６】ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を用いる、インビトロＮＦ−κΒ／ＮＩＫシグナル伝達アッセイを示すグラフである。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＮＩＫシグナル伝達アッセイからのＵ２ＯＳ細胞を、３０μｇ／ｍＬの市販の片面Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、又はｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかと培養した。バーは、左から右へ、片面Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、抗ＯＸ４０抗体、及びｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質である。
【図７】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）スーパー抗原活性化／サイトカイン放出アッセイを示すグラフである。ヒトＰＢＭＣを、市販の片側ヒトＦｃ−ＯＸ４０Ｌ、市販の片側ＶＳＩＧ８−Ｆｃ、２つの片側分子の組み合わせ、又はヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の滴定のあり／なしで、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（２００ｎｇ／ｍＬ）と培養した。３日後に、上清を、ヒトＩＬ２に特異的なＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【図８】非還元条件下、還元条件下、及び還元／脱グリコシル化（ＰＮＧアーゼ）条件下でのウェスタンブロット分析によるヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。バンドサイズは、予想単量体分子量が約６８．１ｋＤａであることを裏付け、キメラタンパク質の天然の状態はグリコシル化二量体であることを示唆する。
【図９Ａ−Ｃ】それぞれの結合パートナーに対するマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す。図９Ａは、ＶＳＩＧ８の結合パートナーであるＶＩＳＴＡへのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出を示す。市販のｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ標準物質はないため、標準曲線を作成しなかった。図９Ｂは、プレートに結合した抗ヒトＩｇＧ抗体へのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＦｃ部分の結合及び検出を示す。マウスＩｇ（ｍＩｇ）を標準物質（円の記号）として使用した。検出は、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を介した。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて一般的に、中央Ｆｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出すると、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、標準物質（円の記号）と比較して低レベルのＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（四角の記号）が検出された。図９Ｃは、ＯＸ４０Ｌの結合パートナーである、プレートに結合した組換えマウスＯＸ４０への、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合及び検出、並びにＯＸ４０Ｌ特異的抗体を介する検出を示す。マウスＯＸ４０Ｌを標準物質（円の記号）として使用した。
【図１０Ａ−Ｂ】ＶＩＳＴＡ発現細胞株及びＯＸ４０発現細胞株へのマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのインビトロ細胞結合アッセイを示すグラフである。不死化細胞株を工学処理して（図１０Ａ）マウスＶＩＳＴＡ（ＥＬ４−ｍＶＩＳＴＡ）又は（図１０Ｂ）マウスＯＸ４０（ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０）を安定に発現させた。漸増濃度のｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを、各親細胞株及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出用の抗体で染色した。全ての工学処理細胞株は、低いｎＭのインビトロ細胞結合親和性で、濃度依存的にｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに結合した。ＣＨＯＫ１／ｍＯＸ４０へのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性は１６ｎＭであり、ＥＬ４／ｍＶＩＳＴＡへのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性は５６ｎＭであった。
【図１１】マウスＯＸ４０−Ｈｉｓに対するマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性のＯｃｔｅｔベース評価を示すグラフである。１０μｇ／ｍＬの市販のｍＦｃ−ＯＸ４０Ｌ（下の曲線）又はｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（上の曲線）のいずれかが、組換えマウスＯＸ４０−ｈｉｓでコーティングしたペンタｈｉｓバイオセンサーに結合した。
【図１２】マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を用いるインビトロＮＦ−κＢルシフェラーゼシグナル伝達アッセイを示すグラフである。ＮＦ−κＢルシフェラーゼ及びＯＸ４０を発現するように工学処理したＪｕｒｋａｔ細胞を、１８ｎＭの無関係のタンパク質（陰性対照、左のバー）、市販の片面Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（中央のバー）、又はｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（右のバー）のいずれかと培養した。
【図１３Ａ−Ｃ】マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置した腫瘍担持マウスからの免疫表現型を示す。マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を接種した。腫瘍が触知可能で、直径が少なくとも４〜６ｍｍになった時に、マウスを、１５０μｇのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の２回用量で処置した。免疫フェノタイピングを、腫瘍移植後１３日目に、各処置群からのマウスのサブセットの様々な組織にて行った。このデータは、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスが、脾臓、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）、及び腫瘍において全ＣＤ４＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージを示し（図１３Ａ）、この増加は、大部分がＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞における増加から構成されたことを実証する（図１３Ｂ）。さらなる分析を四量体染色によって行い、天然でＣＴ２６腫瘍により発現されるＡＨ１腫瘍抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を分析した。脾臓内と腫瘍内の両方で、他のグループと比較してより高い割合のこれらのＴ細胞が、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置したマウスにおいてＡＨ１腫瘍抗原を認識することが見出された（図１３Ｃ）。図１３Ａ〜図１３Ｃの各パネルについては、条件は、未処理か、又はマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌでの処理である。
【図１４Ａ−Ｃ】結腸直腸ＣＴ２６腫瘍に対するマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの抗腫瘍効果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を接種した。腫瘍成長の４日後に、腫瘍の直径が４〜５ｍｍに達したときに、マウスを、対照抗体又はｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかで処置した。処置を次いで、７日目に再度繰り返した。図１４Ａは、各処置群についての個々の腫瘍成長曲線を示し、図１４Ｂは、実験の５０日目までの全体的な生存率を示し、図１４Ｃは、各グループについてのグループサイズと治療結果をまとめた表である。
【図１５】マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＥＬＩＳＡベースの抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイを示すグラフである。
【図１６】例示的なキメラタンパク質（ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）の４つの潜在的な構成を示す。
【図１７】非還元条件下、還元条件下、並びに還元条件かつその後のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）による処理下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１８】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のクロマトグラフを示す。
【図１９】非還元条件下（「−」）又は還元条件下（「＋」）で泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２０】リンカー中にＦＣドメインを欠くＰＤ−１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】理論に縛られることなく、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーを形成する方法のモデルを示す。
【図２２】例示的なモジュラーリンカーに組み合わせることができる結合リンカー及びＦｃリンカーを示す表である。示される例示的なモジュラーリンカーは、本明細書に記載の任意のＩ型とＩＩ型タンパク質並びに／又は本明細書に記載のＩ型とＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインを組み合わされて、本発明のキメラタンパク質を形成できる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本発明は、アミノ末端付近にＶセット及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）の細胞外ドメインを含む工学処理キメラタンパク質の発見に一部基づいている。実施形態において、キメラタンパク質は、カルボキシ末端付近にＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の細胞外ドメインをさらに含む。実施形態において、２つの細胞外ドメインは、リンカーによって連結される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍細胞上の免疫阻害シグナルを癌の有効な治療のための免疫刺激シグナルと置き換えて腫瘍細胞上の免疫阻害シグナルをマスクする。
【００１７】
キメラタンパク質
実施形態において、本発明は、免疫阻害受容体Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）の細胞外ドメインを含むように工学処理したキメラタンパク質に関する。ＶＳＩＧ８は、Ｔ細胞活性化（ＶＩＳＴＡ）のＶ領域免疫グロブリン含有サプレッサーの受容体として機能する１回膜貫通Ｉ型膜タンパク質である。具体的には、ヒトＶＳＩＧ８タンパク質は、２１個のアミノ酸のシグナル配列、２４２個のアミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有する２つのＩｇ様Ｖタイプ（免疫グロブリン様）ドメイン、２１個のアミノ酸の膜貫通ドメイン、及び１３０個のアミノ酸の細胞質ドメインを含む４１４個のアミノ酸を含む。
【００１８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトのＶＳＩＧ８のドメイン、例えば、細胞外ドメインを含む。ヒトＶＳＩＧ８は、配列番号１のアミノ酸配列（配列番号２を含む細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する）を含む。
【００１９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＳＩＧ８（例えば、配列番号２）、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＳＩＧ８の細胞外ドメインのアミノ酸と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する上記のＶＳＩＧ８、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインの配列を含み得る。
【００２０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１に提供されるような）が別のシグナルペプチドと置き換えられるＶＳＩＧ８の変異体細胞外ドメインを含み得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）又はヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞などのタンパク質生成細胞での発現のためにコドン最適化されたｃＤＮＡから発現されるＶＳＩＧ８の変異体細胞外ドメインを含み得る。
【００２１】
実施形態において、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用できるタンパク質の部分を指す。実施形態において、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあるタンパク質の全アミノ酸配列である。実施形態において、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあり、当技術分野で公知の方法（例えば、インビトロリガンド結合及び／又は細胞活性化アッセイ）を用いてアッセイされ得るようなシグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列の一部である。
【００２２】
実施形態において、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインは、Ｔ細胞活性化のＶ領域免疫グロブリン含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に結合できるタンパク質の一部を指す。ＶＩＳＴＡは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む休止Ｔ細胞の活性化を抑制することに関与する負のチェックポイント調節因子である。ＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡの結合は、Ｔ細胞の活性化、増殖及び／又は免疫サイトカイン生成に対する抑制効果を誘導する。実施形態において、キメラタンパク質は、約１μΜ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約５ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＫＤでヒトＶＩＳＴＡに結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、又は約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ未満のＫＤでヒトＶＩＳＴＡに結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約２００ｐＭ〜約６００ｐＭのＫＤでヒトＶＩＳＴＡに結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。
【００２３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激分子ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）のドメイン、例えば、細胞外ドメインをさらに含む。ＯＸ４０Ｌは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。具体的には、ヒトＯＸ４０Ｌタンパク質は、アミノ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜２３）及びカルボキシ末端細胞外ドメイン（アミノ酸５１〜１８３）を含む１８３個のアミノ酸を含む。
【００２４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む。ヒトＯＸ４０Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列（配列番号４を含む細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する）を含む。
【００２５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載のＯＸ４０Ｌ（例えば、配列番号４）、又はその変異体若しくはその機能断片の細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、上記のＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する上に提供したＯＸ４０Ｌ、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインの配列を含み得る。
【００２６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、シグナルペプチド（例えば、配列番号３に提供されるような）が別のシグナルペプチドと置き換えられるＯＸ４０Ｌの変異体細胞外ドメインを含み得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞などのタンパク質生成細胞中での発現のためにコドン最適化されたｃＤＮＡから発現するＯＸ４０Ｌの変異体細胞外ドメインを含み得る。
【００２７】
実施形態において、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用できるタンパク質の部分を指す。実施形態において、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあるタンパク質の全アミノ酸配列である。実施形態において、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、細胞の外部又は細胞膜にあり、当技術分野で公知の方法を用いてアッセイされ得るシグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列の一部である。
【００２８】
実施形態において、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、ＯＸ４０受容体に結合できるタンパク質の一部を指す。他のＴＮＦスーパーファミリーメンバーと同様に、膜結合ＯＸ４０Ｌはホモ三量体として存在する。ＯＸ４０Ｌは、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞並びにいくつかのリンパ系及び非リンパ系細胞上で主に発現するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＯＸ４０に結合する。証拠は、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用の主要な機能は、後期共刺激シグナルを伝達して活性化Ｔ細胞の生存及び増殖を促進し免疫応答を延長することであることを示唆する。
【００２９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１μΜ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約５ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＫＤでヒトＯＸ４０に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、又は約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ未満のＫＤでヒトＯＸ４０に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。実施形態において、キメラタンパク質は、約２００ｐＭ〜約６００ｐＭのＫＤでヒトＯＸ４０に結合する（例えば、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法によって測定した場合に）。
【００３０】
実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に記載のタンパク質配列のいずれかに対して、１以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み得る。実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に開示されるキメラタンパク質のアミノ酸配列のいずれか１つに対して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００又はそれより多いアミノ酸変異を有する配列を含む。
【００３１】
実施形態において、１以上のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠損、及び切り詰めから独立して選択され得る。
【００３２】
実施形態において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、かつ保存的及び／又は非保存的置換を含み得る。
【００３３】
「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、大きさ、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関与するアミノ酸残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。２０個の天然アミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸のグループ：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅにグループ化できる。
【００３４】
本明細書で使用する「保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループの同じグループ内にリストされた別のアミノ酸とのアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド中に１つの負電荷を保持する。加えて、グリシン及びプロリンは、α−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。
【００３５】
本明細書で使用する「非保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループ（１）〜（６）の異なるグループにリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【００３６】
実施形態において、置換はまた、非古典的アミノ酸（例えば、一般的に、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノベンゾイン酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、及びアミノ酸類似体）を含み得る。
【００３７】
変異はまた、コドン縮重を考慮することを含む、遺伝コードを参照することによってキメラタンパク質のヌクレオチド配列に行われ得る。
【００３８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の変異体であり得、例えば、本発明のキメラタンパク質は、本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号５及び配列番号６の１以上と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有し得る。
【００３９】
実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含む。本明細書の他の場所で説明するように、ジスルフィド結合を形成できるそのような少なくとも１つのシステイン残基は、理論に縛られることなく、キメラタンパク質の適切な多量体状態を維持し効率的な生成を可能にすることに関与する。
【００４０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、（ａ）Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質８（ＶＳＩＧ８）の一部、例えば、ＶＩＳＴＡに結合できるＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン、を含む第１のドメイン、（ｂ）ＯＸ４０Ｌの一部、例えば、ＯＸ４０に結合できるＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン、を含む第２のドメイン、必要に応じて、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインを連結するリンカー、を含む。
【００４１】
実施形態において、キメラタンパク質は、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン（及び、必要に応じてリンカー）を有する単一のポリペプチドである。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、細胞中で単一単位として翻訳される。実施形態において、キメラタンパク質は、複数のポリペプチド、例えばインビトロで、（例えば、本明細書に記載の１以上の合成リンカーを用いて）連結されて単一単位をもたらす、例えば、本明細書に記載の複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質、を指す。実施形態において、キメラタンパク質は、１つのポリペプチドとして化学合成されるか、又は各ドメインが別々に化学合成され、次いで組み合わされ得る。実施形態において、キメラタンパク質の一部は翻訳され、一部は化学合成される。
【００４２】
実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。実施形態において、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来し得るか、又は例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｃｈｉｌｉら、（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２）：１５３−１６７，Ｃｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載の実験的リンカーである。実施形態において、リンカーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９及びＣｒａｓｔｏら，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３０９−３１２に記載のものなどのデータベース及びコンピュータプログラムを設計するリンカーを用いて設計され得る。
【００４３】
実施形態において、リンカーはＰＥＧなどの合成リンカーである。
【００４４】
実施形態において、リンカーはポリペプチドを含む。実施形態において、ポリペプチドは、約５００アミノ酸長、約４５０のアミノ酸長、約４００のアミノ酸長、約３５０のアミノ酸長、約３００のアミノ酸長、約２５０のアミノ酸長、約２００のアミノ酸長、約１５０のアミノ酸長、又は約１００のアミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、又は約２のアミノ酸長未満であり得る。実施形態において、リンカーは柔軟である。実施形態において、リンカーは硬い。
【００４５】
実施形態において、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）で構成される。
【００４６】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内で自由に移動することを可能にする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列と長さの両方が変化する。例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で変化する。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６〜２３１を包含し、それが自由に柔軟であるため、Ｆａｂ断片は、それらの対称の軸を中心に回転し２つの重鎖間のジスルフィド架橋の第１を中心とする球内を移動できる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２のアミノ酸残基及び４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠き、比較的短く、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された硬いポリプロリン二重らせんを含有する。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、その特有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスと異なり、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的離れており、分子により高い柔軟性を与える。ＩｇＧ３中の伸長したヒンジはまた、他のサブクラスと比較してより高いその分子量に関与する。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１及びＩｇＧ２の柔軟性の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順序で減少すると報告されている。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体化（Ｓ２２８Ｐを含む）又はＦｃＲｎ結合を増強するための１以上の変異を含有し得る。
【００４７】
結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、さらに３つの領域：上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域に機能的に細分化できる。Ｓｈｉｎら，１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域は、ＣＨ１のカルボキシル末端〜動きを制限するヒンジ中の第１の残基、一般に２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基、のアミノ酸を含む。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域は重鎖間ジスルフィド架橋を含有し、下部ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインのアミノ末端に結合し、ＣＨ２中の残基を含む。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、ジスルフィド結合形成によって二量体化すると、ピボットとして作用すると考えられる環状オクタペプチドを生じ、そのため柔軟性を与える、配列ＣＰＰＣ（配列番号４８）を含有する。実施形態において、本リンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の１つ、又は２つ、又は３つを含む。ヒンジ領域はまた、炭水化物結合のための部位のいくつかの構造的に別個の種類を含む１以上のグリコシル化部位を含有し得る。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含有し、分泌性免疫グロブリンに有利な性質と考えられる、腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの耐性を付与する。実施形態において、本発明のリンカーは、１以上のグリコシル化部位を含む。
【００４８】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増加及び結合の増強を示す。実施形態において、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、ＦｃＲｎへの結合を増強する１以上の変異を含む。理論に縛られることなく、ＦｃＲｎに対する親和性の増加及び結合の増強は、本発明のキメラタンパク質のインビボ半減期を増加させると考えられる。
【００４９】
実施形態において、Ｆｃドメインリンカーは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３又は４３４（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での１以上のアミノ酸置換、又はそれらの等価物を含有する。実施形態において、アミノ酸残基２５０におけるアミノ酸置換はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５４におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５６におけるアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０９におけるアミノ酸置換は、プロリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３１１におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８５におけるアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン又はグリシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８６におけるアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、又はメチオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８７におけるアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、又はアラニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８９におけるアミノ酸置換は、プロリン、セリン又はアスパラギンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４１６におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換は、ロイシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３３におけるアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、又はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、又はチロシンとの置換である。
【００５０】
実施形態において、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、又は４３６（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での置換などの１以上の変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、３つのＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異又はＹＴＥ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、３つのＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異又はＫＦＨ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＹＴＥ変異とＫＦＨ変異を含む。
【００５１】
実施形態において、本発明の改変されたヒト化抗体は、（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従って）アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４、及び４３５における１以上の変異を含有するＩｇＧ定常領域を含む。例示的変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａを含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異又はＬＳ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異又はＬＳ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異又はＱＬ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異又はＡＡＡ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異又はＩＨＨ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異とＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。
【００５２】
ＩｇＧ定常領域における追加の例示的変異は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｂｉｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７−６１５３，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４−２４，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１−８０，Ｋｏら，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）  ５１４：６４２−６４５，Ｇｒｅｖｙｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７−５０８、及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載される。
【００５３】
実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、配列番号２５（以下の表参照）、又は配列番号２５と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、安定性及び／又は半減期を増加させるために、変異が配列番号２５に行われる。例えば、実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、配列番号２６（以下の表参照）、又は配列番号２６と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的なＦｃ安定化変異体はＳ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本リンカーは、これらの変異体の１、又は２、又は３、又は４、又は５個を含み得る。実施形態において、リンカー中のＦｃドメインは、配列番号２７（以下の表参照）、又は配列番号２７と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５４】
さらに、１以上の結合リンカーは、リンカー中のＦｃドメイン（例えば、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７、又はそれらと少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するもののうちの１つ）と細胞外ドメインを連結するために使用され得る。例えば、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、又はそれらの変異体のうちの任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーを連結し得る。必要に応じて、配列番号２８〜７４、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーの間に置かれる。
【００５５】
配列番号２５〜７４のアミノ酸配列は、以下の表１に提供される。
【００５６】
【表１】
2020508066.tif 000003
2020508066.tif 000004
【００５７】
実施形態において、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）を含む。例えば、実施形態において、結合リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎは、約１〜約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８（それぞれ配列番号４９〜配列番号５６）である。実施形態において、結合リンカー配列はＧＧＳＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＳ（配列番号５７）である。追加の例示的な結合リンカーは、配列ＬＥ、（Ｇｌｙ）８（配列番号５８）、（Ｇｌｙ）６（配列番号５９）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号６０〜配列番号６２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号６３〜配列番号６６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号６７）、ＰＡＰＡＰ（配列番号６８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号６９）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号７０）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕである）を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。実施形態において、結合リンカーはＧＧＳである。
【００５８】
実施形態において、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号７１）、ＧＳＥＳＧ（配列番号７２）、ＧＳＥＧＳ（配列番号７３）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号７４）、及び４アミノ酸ごとの間隔でＧ、Ｓ、及びＥがランダムに配置される結合リンカーの１以上である。
【００５９】
実施形態において、キメラタンパク質は、図２２に示すモジュラーリンカーを含む。
【００６０】
実施形態において、リンカーは機能的であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明のキメラタンパク質の折りたたみ及び／又は安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、かつ／又は生理活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、特定の細胞型又は位置にキメラタンパク質を標的化するように機能し得る。
【００６１】
実施形態において、キメラタンパク質は、増強した安定性及びタンパク質半減期を示す。実施形態において、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎに結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、又は約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）に実質的に結合しない。
【００６２】
実施形態において、式ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２（式中、ＥＣＤ  １はＶＳＩＧ８であり、ＥＣＤ  ２はＯＸ４０Ｌである）を有するキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌとして本開示で言及され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、一方又は両方の結合リンカーを欠き、そのようなキメラタンパク質はまた、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌとして本開示で言及され得る。これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。例示的な結合リンカー１ｓ、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２ｓは、上記の表１に記載されており、キメラタンパク質を形成するのに有用であり特異的な結合リンカー１ｓ、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２ｓを含むモジュラーリンカーは、図２２に示される。
【００６３】
実施形態において、本方法は、例えば、再発を防止することが可能であり得る記憶応答をもたらす。
【００６４】
実施形態において、キメラタンパク質は、式Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端（式中、（ａ）はＶＳＩＧ８であり、（ｂ）はＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーであり、かつ（ｃ）はＯＸ４０Ｌである）を有する融合タンパク質であり、本開示ではＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌと呼ばれ得る。
【００６５】
実施形態において、キメラタンパク質は、マウスのリガンド／受容体に対し最適化され／それらを指向する。そのようなキメラタンパク質の例は、本明細書ではｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌとも呼ばれる、マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌである。
【００６６】
実施形態において、キメラタンパク質は、ヒトのリガンド／受容体に対し最適化され／それらを指向する。そのようなキメラタンパク質の例は、本明細書ではｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌとも呼ばれる、ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌである。
【００６７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８免疫阻害シグナル伝達経路を標的とする。実施形態において、キメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８へのＶＩＳＴＡの結合によって媒介される免疫阻害シグナルの伝達を破壊、阻止、低減、及び／又は阻害する。実施形態において、免疫阻害シグナルは、免疫応答を減少又は排除するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減少又は排除し得る。通常の生理的条件下で、阻害シグナルは、自己耐性の維持（例えば、自己免疫の予防）において、及び免疫系が病原性感染に反応しているときに組織を損傷から保護するためにも有用である。例えば、限定されないが、免疫阻害シグナルは、そのような阻害シグナルが遮断される場合に、細胞増殖、サイトカイン産生、細胞死滅活性又は食作用活性の増加を検出することによって特定され得る。
【００６８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８へのＶＩＳＴＡ又は他の結合パートナーの結合によって媒介される免疫阻害シグナルの伝達を破壊、遮断、低減、及び／又は阻害する。実施形態において、キメラタンパク質はＶＩＳＴＡに結合するが、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への阻害性シグナル伝達を破壊、遮断、低減、及び／又は阻害する。実施形態において、キメラタンパク質は、例えば、ＶＩＳＴＡを発現し免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への阻害性シグナル伝達を破壊、遮断、低減、及び／又は阻害するリンパ球細胞に作用する。
【００６９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害受容体／リガンド対であるＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８の結合を低減、破壊、又は除去できるか、又はそれを低減、破壊、又は除去することを含む方法で使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８及び／又はＶＩＳＴＡ若しくは他の結合パートナーとのＶＳＩＧ８の結合を阻止、低減、及び／又は阻害する。
【００７０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０へのＯＸ４０Ｌの結合によって媒介される免疫刺激シグナルを標的とする。実施形態において、キメラタンパク質は、ＯＸ４０へのＯＸ４０Ｌの結合によって媒介される免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激する。実施形態において、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは抗腫瘍免疫を増強し得る。例えば、限定されないが、免疫刺激シグナルは、Ｔ細胞のサブセットを含む、白血球の増殖、サイトカイン産生、死滅活性又は食作用活性を直接刺激することによって特定され得る。
【００７１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０へのＯＸ４０Ｌの結合によって媒介される免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激する。実施形態において、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に作用し、その免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への刺激シグナル伝達を増強、増加、及び／又は刺激する。
【００７２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激受容体／リガンド対であるＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌの結合を刺激又は増強できるか、又はそれを刺激又は増強することを含む方法で使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０及び／若しくはＯＸ４０Ｌの１以上とのＯＸ４０の結合を増加並びに／又は刺激する。
【００７３】
実施形態において、キメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインを含む。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬを含む。本発明は、キメラタンパク質、並びに以下のキメラタンパク質：ＶＩＳＩＧ８／４−１ＢＢＬ、ＶＩＳＩＧ８／ＣＤ３０Ｌ、ＶＩＳＩＧ８／ＣＤ４０Ｌ、ＶＩＳＩＧ８／ＦａｓＬ、ＶＩＳＩＧ８／ＧＩＴＲＬ、ＶＩＳＩＧ８／ＬＩＧＨＴ、ＶＩＳＩＧ８／ＴＬ１Ａ、及びＶＩＳＩＧ８／ＴＲＡＩＬを使用する方法をさらに含む  。実施形態において、キメラタンパク質は、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＣＤ３０Ｌ、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＦａｓＬ、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＶＩＳＩＧ８−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬの１つの一般構造を有する。
【００７４】
４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、２１、及び２３を含む。
【００７５】
実施形態において、キメラタンパク質は、それぞれ、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２２、及び２４を含む、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの１つの細胞外ドメインを含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、若しくはＴＲＡＩＬ、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、又はＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する上に提供する４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、若しくはＴＲＡＩＬ、又はその変異体若しくは機能断片の細胞外ドメインの配列を含み得る。
【００７６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の細胞外ドメインの変異体を含み、細胞外ドメイン、例えば、ヒト細胞外ドメイン、例えば、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２４の１以上の既知のアミノ酸又は核酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００７７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００７８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００７９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号１２）を含む。
【００８０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン（配列番号２）及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００８１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン（配列番号２）及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号１２）を含む。
【００８２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号２５、２６、又は２７）を含む。
【００８３】
実施形態において、キメラタンパク質は、図２２に示すモジュラーリンカーを含む。
【００８４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを使用する、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラは配列番号５である）。
【００８５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを使用する、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌキメラは配列番号６である）。
【００８６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害シグナルをマスキングする一方で、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に免疫刺激を送達する。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫活性化（例えば、Ｔ細胞活性化）の最終結果を有するシグナルを送達する。
【００８７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫活性化（例えば、腫瘍に対する）を促進でき、かつそれを促進することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害を抑制でき（例えば、腫瘍が生き残ることを可能にする）、かつそれを抑制することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、構築物のキメラ性質によって提供されるシグナル伝達の近接性に起因する免疫活性化の改善及び／又は免疫阻害の抑制の改善を提供する。
【００８８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫応答の増幅を調節すること、例えば、エフェクター出力のレベルを調節できるか、又はそれを調節することを含む方法で使用できる。実施形態において、例えば、癌及び／又は炎症性疾患の治療に使用される場合、本発明のキメラタンパク質は、サイトカインの生成、増殖又は標的殺傷能力のレベルの増加を刺激することを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞応答の増幅を増加させるために、免疫阻害と比較して免疫刺激の程度を変える。
【００８９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、阻害リガンドをマスクしその免疫阻害リガンドを免疫刺激リガンドに置き換えることができるか、又はそれをマスクし置き換えることを含む方法で使用される。例えば、（ｉ）ＶＳＩＧ８の細胞外ドメイン及び（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質構築物は、阻害性ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８シグナルの破壊及びそれを刺激性ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０シグナルと置換することを可能にする。したがって、本発明のキメラタンパク質は、実施形態において、阻害性免疫シグナルを低下させること若しくは除去すること、かつ／又は免疫刺激シグナルを増加すること若しくは活性化することができるか、又は阻害性免疫シグナルを低下させ若しくは除去するかつ／又は免疫刺激シグナルを増加することを含む方法で使用される。例えば、阻害シグナルを保有する（ひいては、免疫応答を回避する）リンパ球又は他の細胞は、次いで腫瘍細胞を攻撃できるＴ細胞上で結合する正のシグナルと置換され得る。したがって、実施形態において、阻害性免疫シグナルは、本発明の構築物によってマスクされ、刺激性免疫シグナルが活性化される。そのような有益な特性は、本発明のキメラタンパク質の単一構築アプローチによって増強される。例えば、シグナル置換をほぼ同時に行うことができ、シグナル置換は臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍微小環境）で局所的であるよう調整される。実施形態において、構築物は、これらの官能基を良好に連結するために、陽性免疫刺激シグナルを封鎖又は阻害シグナルの近くに局在化する。この局所的な連結効果は、例えば、ＶＩＳＴＡブロッキング抗体とＯＸ４０アゴニスト抗体の組み合わせと比較して、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物の優れた性能を説明し得る。
【００９０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫調節を増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激できるか、又はそれを増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激することを含む方法で使用される。実施形態において、本明細書に記載の本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含むが、これらに限定されない腫瘍細胞に対する１以上の免疫細胞の活性又は活性化を回復し、促進し及び／又は刺激する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、非限定的な例として、生存促進シグナル；オートクリン又はパラクリン成長シグナル；ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ、ＪＡＫ、ＡＫＴ若しくはＰＩ３Ｋ媒介性シグナル；抗アポトーシスシグナル；並びに／又は炎症性サイトカイン生成若しくはＴ細胞移動若しくはＴ細胞腫瘍浸潤の１以上を促進しかつ／又はそれに必要なシグナルを含む、１以上のＴ細胞固有シグナルを活性化し及び／又は刺激することを含み、Ｔ細胞の活性及び／若しくは活性化を増強し、回復し、促進し並びに／又は刺激する。
【００９１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍若しくは腫瘍微小環境中へのＴ細胞（限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１以上）の１以上の増加を引き起こすことができるか、又はそれを引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、キメラタンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に、腫瘍微小環境に浸潤したＴ細胞による腫瘍抗原の認識を強化する。
【００９２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、特に、腫瘍及び／若しくは腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の動員を阻害でき、かつ／又は動員の減少を引き起こすことができ、又はそれらの動員を阻害するかつ／又は動員の減少を引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、本療法は、Ｍ１マクロファージを優先するように腫瘍部位及び／又はＴＭＥでＭ１対Ｍ２マクロファージの比率を変更し得る。
【００９３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の有効量のキメラタンパク質を対象に投与することを含む、Ｔ細胞の不活性化及び／若しくは腫瘍に対する免疫耐性を阻害する並びに／又は低下させることができ、かつそれを阻害する並びに／又は低下させることを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２の１以上を含むが、これらに限定されない様々なサイトカインの血清レベルを増加させることができる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、治療対象の血清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦα又はＩＦＮγを増強できる。そのようなサイトカイン応答の検出は、示されたキメラタンパク質について最適な投与レジメンを決定するための方法を提供し得る。
【００９４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を阻害し、阻止し及び／若しくは低下させるか；又は腫瘍促進性Ｔ細胞の細胞死を刺激し、誘導し、及び／若しくは増加させる。Ｔ細胞枯渇は、増殖機能及びエフェクター機能の進行性喪失を特徴とするＴ細胞機能障害の状態であり、クローン欠失に至る。したがって、腫瘍促進性Ｔ細胞は、多くの慢性感染症、炎症性疾患、及び癌の間に生じるＴ細胞機能障害の状態を指す。この機能不全は、不十分な増殖機能及び／又はエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現及び機能性エフェクター又は記憶Ｔ細胞の転写状態とは異なる転写状態によって定義される。枯渇は、感染症及び腫瘍の最適な制御を妨げる。加えて、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を開始できるＴ細胞を指す。例示的な腫瘍促進性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ、１以上のチェックポイント阻害受容体を発現するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞を含むが、これらに限定されない。チェックポイント阻害受容体は、制御されない免疫応答を防止又は阻害する免疫細胞上で発現する受容体を指す。
【００９５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させることができ、それを含む方法で使用できる。例示的なエフェクターＴ細胞は、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）；ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；エフェクター記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋、ＣＣＲ７低）；中央記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋；又はＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋）；ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ６２Ｌ−）及び後期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７−ＣＤ６２Ｌ−）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）を含むＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）；ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（低／−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（−）ＣＤ２５（−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞記憶エフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋及びＣＣＲ５＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−１２Ｒ＋、ＩＦＮ−γＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋及びＣＣＲ８＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−４Ｒ＋、ＩＬ−３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ−１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）；ＴＨ９エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ−１Ｒ＋）；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（−）エフェクターＴ細胞；並びにＩＬ−２、ＩＬ−４及び／又はＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞を含む。例示的な制御性Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５高制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ−３＋ＰＤ−１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌセレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢ低制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、ＢＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパータイプ３（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型の制��性細胞（ＮＫＴｒｅｇ）、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８−制御性Ｔ細胞及び／又はＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ガレクチン−１、ＩＦＮ−γ及び／又はＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞を含む。
【００９６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞）の増加を引き起こす。実施形態において、キメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の減少を引き起こす。
【００９７】
実施形態において、キメラタンパク質は、例えば、再発を防止するか、又は再発から動物を保護し、かつ／又は転移を防止するか、若しくは転移の可能性を低下させることができる場合がある記憶応答をもたらす。そのため、キメラタンパク質で処置された動物は、後に、キメラタンパク質での初期の治療後に関連抗原に暴露された場合に、腫瘍細胞を攻撃し、かつ／又は腫瘍の発症を防ぐことができる。したがって、本発明のキメラタンパク質は、活性腫瘍破壊と、再発を防止できる記憶応答をプログラミングするのに不可欠である腫瘍抗原の免疫認識の両方を刺激する。
【００９８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的にエフェクター免疫細胞を刺激でき、かつそれを刺激することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的に制御性細胞若しくは免疫阻害細胞を枯渇させること又は阻害することができ、かつそれを枯渇させること又は阻害することを含む方法で使用できる。実施形態において、エフェクターＴ細胞の一過性刺激及び／又は免疫阻害細胞の一過性枯渇若しくは阻害は実質的に、患者の血流において、又は、例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、非リンパ組織などのリンパ組織を含む特定の組織／位置において、又は腫瘍微小環境において生じる。
【００９９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、使用の容易さ及び生成の容易さを含む利点を提供する。これは、２つの異なる免疫療法剤が、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスを可能にする単一生成物に組み合わされるためである。加えて、２つの別々の薬剤の代わりの単一薬剤の投与は、より容易な投与及びより多くの患者のコンプライアンスを可能にする。
【０１００】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、分泌可能で完全に機能する単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞中で生成可能である。
【０１０１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は予期せず、遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）で、それらのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメイン成分の結合を提供する。実施形態において、これは、受容体のリガンドへの予想外に長い相互作用を提供し、その逆も同様である。そのような効果は、持続的な負のシグナルマスキング効果を可能にする。また、実施形態において、これは、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にするために、より長い正のシグナル効果を送達する。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、Ｔ細胞増殖を提供し、抗腫瘍攻撃を可能にするのに十分なシグナル伝達を可能にする。さらなる例として、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、例えば、サイトカインなどの刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする。
【０１０２】
本発明の薬剤によって促進される細胞の安定なシナプス（例えば、負のシグナルを有する細胞と腫瘍を攻撃するために刺激され得るＴ細胞）は、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を位置付けることかつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされたものを超える負のシグナルを含む、腫瘍細胞が負のシグナルを送達するのを立体的に防ぐことなどの、腫瘍の縮小を優先する空間的な向きを提供する。
【０１０３】
実施形態において、これは、キメラタンパク質の血清Ｔ１／２と比較して、より長いオンターゲット（例えば、腫瘍内）半減期（ｔ１／２）を提供する。そのような性質は、キメラタンパク質の全身分布に関連する、オフターゲット毒性を低下させる利点の組み合わせを有し得る。
【０１０４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、迅速な応答及び潜在応答を提供する、二相免疫効果を提供する。例えば、ＯＸ４０を介する直接的なＴ細胞共刺激又はＶＳＩＧ８を介するシグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞（又は他の免疫細胞）によって媒介される抗腫瘍活性の即時の増強をもたらし、腫瘍の増殖及び拒絶の短期的な制御を向上させ得る。実施形態において、免疫細胞とＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの間の初期の二重の相互作用は、免疫プライミングの強度又は品質を変更し、長寿命の記憶Ｔ細胞免疫の発生の増強に寄与する。そのような事象は、確立された腫瘍の増強された長期の対照、又は平衡により腫瘍モデルにおいて明らかになり得る。場合によって、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処理することによりプログラムされた免疫応答は、分子の投与後長期において、遅延された腫瘍拒絶反応に寄与し得る。
【０１０５】
また、実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用の改善を可能にする相乗的な治療効果を提供する。
【０１０６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、オフサイト及び／又は全身の毒性を低下させる可能性を提供する。
【０１０７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、現在の免疫療法、例えば、本明細書に記載のチェックポイント分子に対する抗体に対し、低減された副作用、例えば、ＧＩ合併症を提供する。例示的なＧＩ合併症は、腹痛、食欲不振、自己免疫効果、便秘、けいれん、脱水、下痢、摂食問題、疲労、鼓腸、腹水（ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｄｏｍｅｎ）又は腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、消化管（ＧＩ）腸内毒素症、ＧＩ粘膜炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｄ及びＩＢＳ−Ｃ）、吐き気、痛み、便又は尿の変化、潰瘍性大腸炎、嘔吐、保持液からの体重増加、及び／又は衰弱を含む。
【０１０８】
疾患；治療方法、及び患者選択
実施形態において、本発明は、癌及び／又は腫瘍、例えば、癌及び／若しくは腫瘍の治療又は予防に関する。本明細書の他の場所で説明するように、癌の治療は、実施形態において、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するように本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを伴い得る。
【０１０９】
癌又は腫瘍は、身体の器官及びシステムの正常な機能を妨げる細胞の制御不能な増殖並びに／又は異常に増加した細胞生存率並びに／又はアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに休眠腫瘍又は微小転移が含まれる。免疫系によって妨げられない異常増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。癌は、原発性癌又は転移性癌であり得る。原発性癌は、臨床的に検出可能になる原発部位の癌細胞の領域であり、原発性腫瘍であり得る。対照的に、転移性癌は、ある器官又は部分から別の非隣接器官又は部分への疾患の広がりであり得る。転移性癌は、局所的な領域で周囲の正常組織に浸透及び浸潤する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされ得、新しい腫瘍を形成し、それは局所的な転移であり得る。癌はまた、リンパ及び／又は血管の壁を貫通する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされる可能性があり、その後、癌細胞は、体内の他の部位及び組織に血流を介して循環できる（それによって循環腫瘍細胞である）。癌は、リンパ性の又は血行性の広がりなどのプロセスに起因し得る。癌はまた、別の部位で停止し、血管又は壁を通って再浸透し、増殖し続け、最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。癌は、この新しい腫瘍であり得、それは転移性（又は続発性）腫瘍であり得る。
【０１１０】
癌は、転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得、それは続発性又は転移性腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍中のものと同様であり得る。一例として、乳癌又は結腸癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は、肝臓に存在する間、異常な肝細胞からではなく、異常な乳房又は結腸細胞から構成される。肝臓中の腫瘍はそのため、肝臓癌ではなく、転移性乳癌又は転移性結腸癌であり得る。
【０１１１】
癌は、任意の組織からの起源を有し得る。癌は、黒色腫、結腸、乳房、又は前立腺に由来し、そのため、それぞれ、元は皮膚、結腸、乳房、又は前立腺であった細胞から構成され得る。癌はまた、血液学的悪性腫瘍であり得、それは白血病又はリンパ腫であり得る。癌は、肝臓、肺、膀胱、又は腸などの組織に侵入し得る。
【０１１２】
本発明の代表的な癌及び／又は腫瘍は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腸骨の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化管癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；肝腫；上皮内新生物；腎臓癌又は腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺の扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞種；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮又は子宮内膜癌；尿系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低グレード／濾胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレードの拡散性ＮＨＬ；高グレードの免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードのリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレードの小さい非正円形細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びウォルデンストロームのマクログロブリン血症；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他の癌腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
実施形態において、キメラタンパク質は、治療−難治性癌を有する対象を治療するために使用される。実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の免疫調節剤に難治性である対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、治療の１２週間程度後に、治療に対する応答、或いはさらに進行を示さない対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、対象は、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２剤に難治性であり、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及び／又はＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）難治性患者を含む。例えば、実施形態において、対象は、抗ＣＴＬＡ−４剤に対して難治性であり、例えば、イピリムマブ（ヤーボイ（ＹＥＲＶＯＹ））難治性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、実施形態において、本発明は、１以上の免疫調節剤の単剤療法を含む、様々な治療に応答しない患者を救済する癌治療の方法を提供する。
【０１１４】
実施形態において、本方法は、追加の薬剤に難治性である患者にキメラタンパク質での治療を提供し、そのような「追加の薬剤」は本明細書の他の場所に記載されており、本明細書に記載の様々な化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の炎症性の疾患又は状態を治療、調節する又は予防するために使用される。炎症性疾患の非限定的な例は、にきび、急性炎症、アレルギー性鼻炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、常染色体劣性痙性失調症、気管支拡張症、セリアック病、慢性胆嚢炎、慢性炎症、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、家族性好酸球増加症（ｆｅ）、糸球体腎炎、グリセロールキナーゼ欠乏症、化膿性汗腺炎、過敏症、炎症、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、間質性膀胱炎、喉頭炎症性疾患、リー症候群、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、眼炎症性疾患、耳炎、疼痛、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、呼吸器疾患、再狭窄、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、珪肺症及び他の肺炎、移植拒絶反応、結核、及び血管炎を含む。
【０１１６】
様々な実施形態において、炎症性疾患は、多発性硬化症、糖尿病、ループス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、強皮症、グッドパスチャー症候群、ウェーゲナー肉芽腫症、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛、メニエール症候群；移植拒絶反応（例えば、同種移植片拒絶の予防）悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、及び他の自己免疫疾患などの自己免疫の疾患又は状態である。
【０１１７】
態様において、本発明のキメラ薬剤は、例えば、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを介してＴ細胞を活性化する方法において使用される。
【０１１８】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを介して、免疫抑制シグナルの細胞伝達を防止する方法において使用される。
【０１１９】
併用療法及びコンジュゲーション
実施形態において、本発明は、対象に追加の薬剤を投与することをさらに含むキメラタンパク質及び方法を提供する。実施形態において、本発明は、共投与及び／又は共製剤化に関する。本明細書に記載の組成物はいずれも、共製剤化及び／又は共投与され得る。
【０１２０】
実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、別の薬剤と共投与された場合に相乗的に作用し、そのような薬剤が単剤療法として使用される場合に一般的に使用される用量よりも低い用量で投与される。実施形態において、本明細書で参照される任意の薬剤は、本明細書に記載のキメラタンパク質のいずれかと組み合わせて使用され得る。
【０１２１】
実施形態において、本明細書に記載のＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、別のキメラタンパク質と同時投与される。実施形態において、本明細書に記載のＶＩＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、別のキメラタンパク質、例えば、適応免疫応答を調節するものと同時投与される。実施形態において、本明細書に記載のＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＧＩＴＲＬ、４−１ＢＢＬ、ＳＩＲＰα、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、及びＬＩＧＨＴの１以上を含むキメラタンパク質と同時投与される。理論に縛られることなく、適応免疫応答を誘導する本発明のキメラタンパク質及び自然免疫応答を誘導する１以上のキメラタンパク質の投与を含む併用レジメンは、相乗効果（例えば、相乗的抗腫瘍効果）を提供し得ると考えられる。
【０１２２】
自然免疫応答を誘導する任意のキメラタンパク質が、本発明で利用され得る。例えば、キメラタンパク質は、自然免疫応答を誘導する米国特許第６２／４６４，００２号に開示されたキメラタンパク質のいずれかであり得る。そのような実施形態において、キメラタンパク質は、Ｎ末端又はその近くにＩ型膜貫通タンパク質の第１の細胞外ドメイン及びＣ末端又はその近くにＩＩ型膜貫通タンパク質の第２の細胞外ドメインを含み、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号に開示されるように第１及び第２の細胞外ドメインの１つが免疫阻害性シグナルを提供し、第１及び第２の細胞外ドメインの１つが免疫刺激シグナルを提供する。例示的な実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメイン及びＣ末端にＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、Ｎ末端にＳＩＲＰαの細胞外ドメイン及びＣ末端にＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質である。
【０１２３】
実施形態において、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、自然免疫応答を刺激するためのキメラタンパク質（例えば、ＣＳＦ１Ｒベースのキメラタンパク質）を以前に投与されたことのある患者に投与される。例えば、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質は、１日後、又は２日後、又は３日後、又は４日後、又は５日後、又は６日後、又は１週間後、又は２週間後、又は３週間後、又は４週間後を含む、自然免疫応答を刺激するキメラタンパク質（例えば、ＣＳＦ１Ｒベースのキメラタンパク質）の後に投与され得る。
【０１２４】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例は、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコーン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ  １−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア；エンジイン系抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））を参照されたい；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロン酸塩などのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質（ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎ）エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシンドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チア���プリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（例えば、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール  パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、アブラクサン  クレモフォールを含まない、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びタキソテール  ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ジェムザール  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン  ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサル、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵ及びロイコボリンとのイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤  ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｆ、ＥＧＦＲの阻害剤（例え���、細胞増殖を低下させるエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）及びＶＥＧＦ−Ａ）並びに上記のいずれかの医薬として許容される塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されない。加えて、本治療方法は、放射線の使用をさらに含んでよい。加えて、本治療方法は、光力学療法の使用をさらに含んでよい。
【０１２５】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明の追加の薬剤は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１，ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（テセントリク、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ））、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及び／又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と４−１ＢＢリガンドの１以上の結合を増加及び／又は刺激する薬剤（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体）、並びにＣＴＬＡ−４の活性及び／又はＣＴＬＡ−４と、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１以上の結合及び／又はＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）から選択される１以上の免疫調節剤である。
【０１２６】
実施形態において、限定されないが、感染性疾患適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての抗感染剤に関する。実施形態において、抗感染剤は、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、及びホスカルネットを含むがこれらに限定されない抗ウイルス剤である。実施形態において、抗感染剤は、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テキン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、及びメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；及びカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、及びメロペネム）を含むがこれらに限定されない抗菌剤である。実施形態において、抗感染剤は、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、キニン、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメーター（ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）／ルメファントリン、アトバコン（ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）／プログアニル及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、ピランテルパモ酸塩、及びアルベンダゾールを含む。
【０１２７】
実施形態において、限定されないが、自己免疫適用を含み、追加の薬剤は、免疫抑制剤である。実施形態において、免疫抑制剤は、ステロイド系抗炎症剤又は非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に、副腎コルチコステロイド及びその合成類似体は、当技術分野で周知である。本発明に有用なコルチコステロイドの例は、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、ベータ−メチルベタメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンベンゾエート、ベタメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンバレレート、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾンジアセテート、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステル類のバランス、クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸塩を含むが、これらに限定されない。本発明で使用され得る（ＮＳＡＩＤ）は、サリチル酸、アセチルサリチル酸、メチルサリチル酸、グリコールサリチル酸、サリチルアミド（ｓａｌｉｃｙｌｍｉｄｅ）、ベンジル−２，５−ジアセトキシベンゾイン酸、イブプロフェン、スリンダク（ｆｕｌｉｎｄａｃ）、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、及びインドメタシンを含むが、これらに限定されない。実施形態において、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン（ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ）、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレート、及び小さな生物学的薬剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞分裂阻害剤であり得る。
【０１２８】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、修飾される誘導体、すなわち、共有結合が組成物の活性を防止しないような、組成物への任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定されないが、誘導体は、特に、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質溶解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾された組成物を含む。多数の化学修飾のいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、例示的な実施形態において、毒素、化学療法剤、放射性同位体、及びアポトーシス若しくは細胞死を引き起こす薬剤を含む、細胞傷害性薬剤をさらに含む。そのような薬剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートされ得る。
【０１２９】
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はしたがって、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質などの検出可能な部分、及び化学発光部分、又は、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、サイトトキシン、細胞傷害性薬剤、及び放射性物質などの機能的部分を付加するために翻訳後に修飾され得る。
【０１３０】
製剤
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される塩を形成するために、無機酸若しくは有機酸と反応できる十分に基本的な官能基、又は無機塩基若しくは有機塩基と反応できるカルボキシシル基を保有できる。医薬として許容される酸添加塩は、当技術分野で周知の医薬として許容される酸から形成される。そのような塩は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）並びに医薬塩のハンドブック；性質、選択、及び使用（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編集），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される医薬として許容される塩を含む。
【０１３１】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、医薬として許容される塩の形態である。
【０１３２】
また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される担体又はビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与できる。そのような組成物は、必要に応じて、適切な投与のための形態を提供するように、適量の医薬として許容される賦形剤を含んでよい。医薬用賦形剤は、水並びにピーナッツ油、大豆油、鉱物油、及びゴマ油などの、石油、動物、野菜、又は合成起源のものを含む油類などの、液体であり得る。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、及び尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用できる。実施形態において、医薬として許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。水は、本明細書に記載の任意の薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液がまた、特に注射可能な溶液のために、液体賦形剤として使用できる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールなども含む。本明細書に記載の任意の薬剤は、必要に応じて、微量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含んでよい。
【０１３３】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、及びＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない）に懸濁される。
【０１３４】
実施形態において、キメラタンパク質は、半減期を延長するか、又はそうでなければ、薬物力学的及び薬物動態学的性質を改善するために別の薬剤とコンジュゲート並びに／又は融合され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、及びトランスフェリンなどのうちの１以上と融合又はコンジュゲートされ得る。実施形態において、個々のキメラタンパク質のそれぞれは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５〜２３９に記載の薬剤のうちの１以上に融合される。
【０１３５】
投与、投薬、及び治療レジメン
本発明は、記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を様々な製剤中に含む。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、溶液、懸濁液、エマルション、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適する任意の他の形態をとり得る。タンパク質配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ構築物も使用され得る。実施形態において、組成物は、カプセルの形態にある（例えば、米国特許第５、６９８、１５５号を参照されたい）。適切な医薬賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集，第１９版、１９９５）に記載されている。
【０１３６】
適宜、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、可溶化剤も含んでよい。また、薬剤は、当技術分野で公知の適切なビヒクル又は送達装置により送達できる。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクル又は送達装置で共送できる。投与のための組成物は、必要に応じて、注射部位での痛みを軽減するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含んでよい。
【０１３７】
本発明のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、単位剤形で都合よく提示され、薬学の当技術分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。そのような方法は、一般に、１以上の付属成分を構成する担体と治療薬を結合させる工程を含む。典型的には、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、又はその両方と治療薬を均一かつ密接に結合させ、必要に応じて、所望の製剤の剤形に生成物を形成する（例えば、湿式又は乾燥造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で公知の従来の方法を用いて打錠する）ことによって調製される。
【０１３８】
実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。
【０１３９】
投与経路は、例えば、皮内、腫瘍内、筋肉内、経皮内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入による投与、又は局所的に、特に、耳、鼻、目、若しくは皮膚への投与を含む。実施形態において、投与は、経口又は非経口注射によってなされる。場合によって、投与は、血流への本明細書に記載の任意の薬剤の放出をもたらすか、或いは、薬剤は、活発な疾患部位に直接投与される。
【０１４０】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、経口投与できる。そのようなキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はまた、任意の他の便利な経路によって、例えば、静脈内注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与でき、かつ別の生物学的活性剤と共に投与できる。投与は、全身的又は局所的であり得る。様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、投与のために使用できる。
【０１４１】
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍に近位に位置する他の免疫細胞を含む腫瘍細胞を取り囲み、かつ／若しくは腫瘍細胞に栄養を与える、例えば、細胞、分子、細胞外マトリックス並びに／又は血管）又はリンパ節に投与され、かつ／又は腫瘍微小環境若しくはリンパ節を標的とする。実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍内に投与される。
【０１４２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ（ＯＰＤＩＶＯ）、キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ヤーボイ（ＹＥＲＶＯＹ）及びテセントリク（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）の１以上での治療）に見られる副作用よりも少ない副作用をもたらす二重効果を可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、低血圧、大腸炎、肝炎、肺炎、発疹、及びリウマチ性疾患などの、皮膚、消化管、腎臓、末梢神経系及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、目、膵臓、及び内分泌系を含む様々な組織並びに器官に影響を与える一般的に観察される免疫関連有害事象を低減又は予防する。また、本発明の局所投与、例えば腫瘍内投与は、標準的な全身投与、例えば、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ、キイトルーダ、ヤーボイ、及びテセントリクの１以上での治療）で使用されるようなＩＶ注入で見られる有害事象を未然に防ぐ。
【０１４３】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内への注射並びに注入）に適する剤形には、例えば、溶液、懸濁液、分散剤、及びエマルションなどを含む。それらはまた、使用直前に無菌注射培地に溶解又は懸濁できる無菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造され得る。それらは、例えば、当技術分野で公知の懸濁剤又は分散剤を含有し得る。
【０１４４】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量並びに投薬スケジュールは、治療される疾患、対象の全体的な健康、及び投与する医師の裁量を含むが、これらに限定されない様々なパラメータに依存し得る。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、それを必要とする対象への追加の薬剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）か、追加の薬剤の投与と同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与できる。実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質及び追加の薬剤は、１分間間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与される。
【０１４５】
実施形態において、本発明は、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質及び自然免疫応答を誘導する別のキメラタンパク質の同時投与に関する。そのような実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。例えば、キメラタンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態において、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質及び自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、１週間間隔で投与されるか、又は隔週で投与される（すなわち、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与は、その１週間後に、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含む本発明のキメラタンパク質などの投与を伴う）。
【０１４６】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量は、病態の重症度、病態が治療又は予防されるか否か、並びに治療される対象の年齢、体重、及び健康を含むいくつかの要因に依存し得る。さらに、特定の対象についての薬物ゲノムの（薬物動態、薬理力学的又は治療の有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響の）情報が、使用される投薬量に影響を与える可能性がある。また、正確な個々の投薬量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む様々な要因に依存して、幾分か調節できる。投薬量のいくつかのバリエーションが予想される。
【０１４７】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の非経口注射による投与について、投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、１日あたり約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日あたり約３ｍｇ〜約５ｍｇであり得る。一般に、経口又は非経口投与の場合、本明細書に記載の任意の薬剤の投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は１日あたり約２００〜約１、２００ｍｇ（例えば、１日あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）であり得る。
【０１４８】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、治療あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は治療あたり約２００〜約１、２００ｍｇ（例えば、治療あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）の投薬量での非経口注射によるものである。
【０１４９】
実施形態において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の適切な投薬量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、その間の全ての値と範囲を含む約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．２ｍｇ／ｋｇ体重、約１．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．４ｍｇ／ｋｇ体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６ｍｇ／ｋｇ体重、約１．７ｍｇ／ｋｇ体重、約１．８ｍｇ／ｋｇ体重、約１．９ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約４ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約６ｍｇ／ｋｇ体重、約７ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重、約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１５０】
実施形態において、送達は、小胞中で、特にリポソーム中であり得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら，感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ），Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ及びＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照されたい）。
【０１５１】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、制御放出手段若しくは持続放出手段によるか、又は当業者に周知の送達装置によって投与できる。例は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第３、８４５、７７０号、同第３、９１６、８９９号、同第３、５３６、８０９号、同第３、５９８、１２３号、同第４、００８、７１９号、同第５、６７４、５３３号、同第５、０５９、５９５号、同第５、５９１、７６７号、同第５、１２０、５４８号、同第５、０７３、５４３号、同第５、６３９、４７６号、同第５、３５４、５５６号、及び同第５、７３３、５５６号に記載のものを含むが、これらに限定されない。そのような剤形は、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、微小球、又はそれらの組み合わせを用いる１以上の活性成分の制御放出又は持続放出を提供するのに有用であり得る。活性成分の制御放出又は持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、光の適切な波長による刺激、酵素の濃度又は利用可能性、水の濃度又は利用可能性、又は他の生理学的条件若しくは化合物を含むが、これらに限定されない、様々な条件によって刺激できる。
【０１５２】
実施形態において、ポリマー材料を使用できる（制御放出の医学的用途（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ），Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；制御される薬物バイオアベイラビリティ、医薬品の設計と性能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ），Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。
【０１５３】
実施形態において、制御放出システムは、治療される標的領域の近くに配置でき、したがって、全身用量のほんの一部を必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、上記のＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２巻，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説で説明されている他の制御放出システムが使用され得る。
【０１５４】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、独立して、１日に１〜４回、又は月に１〜４回、又は年に１〜６回、又は２年、３年、４年若しくは５年に１回であり得る。投与は、１日又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であり得、さらには対象の寿命の間であり得る。
【０１５５】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を利用する投薬量レジメンは、対象の種類、種、年齢、体重、性別及び病状；治療される病態の重症度；投与経路；対象の腎機能又は肝機能；個人の薬理ゲノミクス構造；及び使用される本発明の特定の化合物を含む様々な要因に従って選択できる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、毎日の単回用量で投与でき、又は総１日投薬量は、１日２回、３回又は４回の分割用量で投与できる。また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、投薬量レジメン全体を通して断続的ではなく、連続的に投与できる。
【０１５６】
細胞及び核酸
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。実施形態において、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。実施形態において、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
【０１５７】
原核生物ベクターと真核生物ベクターの両方が、キメラタンパク質の発現に使用できる。原核生物ベクターは、大腸菌配列に基づく構築物を含む（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，６０：５１２−５３８を参照されたい）。大腸菌での発現に使用できる調節領域の非限定的な例は、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７及びλＰＬを含む。原核生物発現ベクターの非限定的な例は、λｇｔ１１などのλｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈら，「ＤＮＡクローニング技術（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｉ巻：実用的なアプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編），ｐｐ．４９−７８，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０，１８５：６０−８９）を含み得る。しかしながら、原核生物宿主ベクター系は、哺乳動物細胞の翻訳後処理の多くを行うことができない。そのため、真核生物宿主ベクター系が、特に有用であり得る。様々な調節領域を、哺乳動物宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現に使用できる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞に有用であり得る誘導性プロモーターは、限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子に関連するプロモーター、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，４９：２７３５−４２；及びＴａｙｌｏｒら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，１０：１６５−７５を参照されたい）。ヒートショックプロモーター又はストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現を促進するのに有利であり得る。
【０１５８】
実施形態において、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である、発現制御領域、若しくはその補体に作動可能に連結されたキメラタンパク質（及び／若しくは追加の薬剤）又はその補体をコードする核酸を含む。発現制御領域は、発現ベクターで形質転換されたヒト細胞でブロッキング剤及び／又は刺激剤が生成されるように、作動可能に連結されたブロッキング剤及び／又は刺激剤をコードする核酸の発現を促進できる。
【０１５９】
発現制御領域は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を与える、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（本明細書でエレメントと呼ばれることもある）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞中で作動可能に連結されたコード核酸を発現できる。実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。実施形態において、細胞は非腫瘍細胞である。実施形態において、発現制御領域は、作動可能に連結された核酸に調節可能な発現を与える。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結された核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、多くの場合、誘導性と呼ばれる。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、多くの場合、抑制可能と呼ばれる。典型的には、そのようなエレメントによって与えられる増減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増減が大きくなる。
【０１６０】
実施形態において、本発明は、合図に応答して一過的に高レベルの発現をもたらすことができる誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近くにある場合、そのような発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）用の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換細胞を適切な合図に暴露することによって高レベルの薬剤を一過的に生成するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域は、低分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。特定の例は、例えば、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５、９８９、９１０号、同第５、９３５、９３４号、同第６、０１５、７０９号、及び同第６、００４、９４１号の中で見つけることができる。
【０１６１】
発現制御領域及び遺伝子座制御領域は、天然のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの全長プロモーター配列、並びに全長若しくは非バリアンド機能の全て又は一部を保持するサブ配列又はポリヌクレオチドバリアントを含む。本明細書で使用する用語「機能的」及びその文法的異形は、核酸配列、サブ配列又は断片を参照して使用される場合に、配列が天然核酸配列（例えば、非バリアント又は非改変配列）の１以上の機能を有することを意味する。
【０１６２】
本明細書で使用する「作動可能な連結」は、それらが意図される様式で機能することを可能にすると説明される構成成分の物理的な並置を指す。核酸との作動可能な連結における発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。典型的には、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端（すなわち「上流」）付近に並置される。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン）に配置できる。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離（例えば、核酸から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、又はそれより多くのヌクレオチド）に配置できる。発現制御エレメントの具体的な例はプロモーターであり、それは転写される配列の５’側に通常は位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、それは転写される配列の５’側若しくは３’側又は転写される配列内に配置できる。
【０１６３】
ヒト細胞で機能する発現系は、当技術分野で周知であり、かつウイルス系を含む。一般的に、ヒト細胞中で機能的なプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合しｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）転写を開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端に通常位置する、転写開始領域及び典型的には、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。プロモーターはまた、典型的には、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流に典型的に位置する、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用できる。ウイルス遺伝子は高度に発現される場合が多く広い宿主範囲を有するので、プロモーターとして特に使用されるのは、哺乳動物ウイルスゲノム由来のプロモーターである。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターを含む。
【０１６４】
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そのため、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネータ及びポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。イントロンも、発現構築物中に含まれ得る。
【０１６５】
生存細胞に核酸を導入するために利用可能な様々な技術がある。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適する技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーベースのシステム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。インビボ遺伝子導入に関しては、リポソーム；キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクルを含むいくつかの技術及び試薬を用いてもよい。ウイルスベクターも、インビボ形質導入に適する。場合によっては、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又はリガンドなどの標的剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型を指向するカプシドタンパク質又はその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質を標的化し、かつ／又はその取り込みを促進するために使用され得る。受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。
【０１６６】
適宜、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達作用因子を用いることもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１−３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２−３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋら，ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３を参照されたい）。これらは、リコンビナーゼ及びトランスポサーゼを含む。例は、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６，１９８１）、ｌａｍｂｄａ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３−５４５，１９７４），Ｆｌｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ら，Ｃｅｌｌ，２９：２２７−２３４，１９８２），Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０−６１８，１９９０），ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）、マリナーファミリーのトランスポサーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋら、上記）、及びＡＡＶ、レトロウイルスなどのウイルスを組み込むための構成成分、並びにレトロウイルス又はレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する構成成分を有するアンチウイルス（Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３）を含む。加えて、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を挿入するために使用され得る。
【０１６７】
一態様において、本発明は、ウイルスベクターであるキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の発現用の発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが公知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１  １７，１２２，２００３を参照されたい）。例示的なウイルスベクターは、アンチウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものを含むが、他のウイルスベクターも使用され得る。インビボ使用の場合、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターが、αウイルス及びアデノウイルスなどの使用に適する。αウイルスの例示的な種類は、シンドビスウイルス、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）を含む。インビトロ使用の場合、レトロウイルス、ＡＡＶ、及びアンチウイルスなどの、宿主ゲノムに組み込むウイルスベクターが適する。実施形態において、本発明は、インビボでヒト細胞を形質導入する方法であって、インビボで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む方法を提供する。
【０１６８】
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【０１６９】
発現ベクターは、本発明のキメラタンパク質を生成するための宿主細胞に導入できる。細胞は、例えば、インビトロで培養されるか、又は遺伝子操作され得る。有用な哺乳動物宿主細胞は、限定されないが、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞を含む（例えば、「遺伝子導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」１９９０、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．を参照されたい）。これらは、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３、２９３−ＥＢＮＡ、又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，７７：４２１６）；ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８０，２３：２４３−２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）を含む。本明細書に記載のキメラタンパク質を発現させるための例示的癌細胞型は、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びそのオブアルブミン形質移入体、Ｅ．Ｇ７、マウス黒色腫細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、及びヒト小細胞肺癌細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７を含む。
【０１７０】
宿主細胞は、健康なヒト、癌患者、及び感染症患者を含む健常又は罹患している患者、民間研究室預託、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの公共の培養物コレクション、又は商業サプライヤーから入手できる。
【０１７１】
インビトロ、エクソビボ、及び／又はインビボで本発明のキメラタンパク質の生成に使用できる細胞は、限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に、造血幹細胞又は前駆細胞（例えば、骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などを含む。細胞型の選択は、治療若しくは予防される腫瘍の種類又は感染症に依存し、当業者が決定できる。
【０１７２】
対象及び／又は動物
実施形態において、対象及び／又は動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又はサル、チンパンジー、若しくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。実施形態において、対象及び／又は動物は、例えば、ゼブラフィッシュなどの非哺乳動物である。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光タグ付き細胞（例えば、ＧＦＰを有する）を含み得る。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
【０１７３】
実施形態において、対象及び／又は動物は、ヒトである。実施形態において、ヒトは小児のヒトである。実施形態において、ヒトは、成人のヒトである。実施形態において、ヒトは、老人のヒトである。実施形態において、ヒトは、患者と呼ばれ得る。
【０１７４】
ある実施形態において、ヒトは、生後約０ヶ月〜約６ヶ月、生後約６ヶ月〜約１２ヶ月、生後約６ヶ月〜約１８ヶ月、生後約１８ヶ月〜約３６ヶ月、約１歳〜約５歳、約５歳〜約１０歳、約１０歳〜約１５歳、約１５歳〜約２０歳、約２０歳〜約２５歳、約２５歳〜約３０歳、約３０歳〜約３５歳、約３５歳〜約４０歳、約４０歳〜約４５歳、約４５歳〜約５０歳、約５０歳〜約５５歳、約５５歳〜約６０歳、約６０歳〜約６５歳、約６５歳〜約７０歳、約７０歳〜約７５歳、約７５歳〜約８０歳、約８０歳〜約８５歳、約８５歳〜約９０歳、約９０歳〜約９５歳、又は約９５歳〜約１００歳の範囲の年齢を有する。
【０１７５】
実施形態において、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学での使用に関する。特定の実施形態において、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態において、非ヒト動物は家畜動物である。
【０１７６】
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化できるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形で含む。実施形態において、単位剤形は、殺菌できる予め充填された注射器などの容器であり、本明細書に記載の任意の薬剤及び医薬として許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する。キットは、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を説明するラベル又は印刷された説明書をさらに含んでよい。キットはまた、蓋スペキュラム、局所麻酔薬、及び投与場所のための洗浄剤を含み得る。キットはまた、本明細書に記載の１以上の追加の薬剤をさらに含んでよい。実施形態において、キットは、本明細書に記載のものなどの、有効量の本発明の組成物及び有効量の別の組成物を含有する容器を含む。
【０１７７】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０１７８】
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明される。
【０１７９】
実施例
実施例１：ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のコンピューターシミュレーション予測二次構造
６０３個のアミノ酸残基を有するヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のコンピューターシミュレーション構造予測を行い、ｐ値は５．３６×１０−１６であった。単量体タンパク質の分子量は約６８．１ｋＤａであると予測された。キメラタンパク質の構造を図１Ａに提供する。図１Ｂは、腫瘍細胞とＴ細胞の間で、キメラタンパク質によって形成されたシナプスを示す。
【０１８０】
キメラタンパク質の配列全体の二次構造予測は、タンパク質が０％のα−ヘリックス（Ｈ）、５８％のβ−シート（Ｅ）、及び４１％のコイル（Ｃ）の組成を有することを示した。絶対グローバル品質のＧＤＴ（グローバル距離検定）及びｕＧＤＴ（非正規化ＧＤＴ）も、キメラタンパク質について計算され、３６２（６０）の全体的なｕＧＤＴ（ＧＤＴ）を得た。タンパク質残基の溶媒アクセシビリティに関する３つの状態予測は、３３％の露出（Ｅ）、４７％の中間（Ｍ）、及び１９％の埋没（Ｂ）であった。
【０１８１】
実施例２：ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、詳細な説明で上に記載されるように、かつ内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号のように構築した。キメラタンパク質を、キメラタンパク質の各ドメインに対する、すなわち、抗ＶＳＩＧ８、抗ＦＣ、及び抗ＯＸ４０Ｌ抗体によるウェスタンブロット分析を行うことにより特徴付けた。
【０１８２】
ウェスタンブロットは、非還元レーン（βメルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼを含まない；図２、各ブロットのレーン２）における優勢な二量体バンドの存在を示し、これは、還元剤β−メルカプトエタノールの存在下で、グリコシル化単量体バンドに還元された（図２、各ブロットのレーン３）。図２、各ブロットのレーン４に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）とエンドグリコシダーゼペプチド：Ｎグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で、約６８．１ｋＤａの予測分子量で単量体として移動した。
【０１８３】
実施例３：ＥＬＩＳＡを用いるヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性の特徴付け
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを、ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの異なるドメインの、それぞれのｈＩｇＧ又は組換えＯＸ４０Ｌに対する結合親和性を実証するために開発した。具体的には、キメラタンパク質のＦｃ部分を、プレート結合ヒトＩｇＧへ捕捉しＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体により検出した（図３の左パネル）。キメラタンパク質のＯＸ４０ドメインを、プレート結合組換えＯＸ４０タンパク質へ捕捉し、抗ＯＸ４０特異的抗体により検出した（図３の右パネル）。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、中央Ｆｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出すると、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、このアッセイにおける標準物質と比較して低レベルのｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が検出された。
【０１８４】
実施例４：ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のインビトロ細胞結合親和性の特徴づけ
細胞結合アッセイを行って、哺乳動物細胞膜の表面上のそれらのそれぞれの結合パートナーに対するヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証した。
【０１８５】
細胞結合アッセイのために、不死化細胞株を、ヒトＯＸ４０（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０）を安定に発現するように工学処理した。漸増濃度のＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、過剰発現（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０）細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。
【０１８６】
図４に示すように、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、濃度依存的にかつ低いｎＭの親和性で、細胞表面上に存在するＯＸ４０に結合した。具体的には、図４に示すように、細胞結合アッセイは、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが、約３０ｎＭの親和性（ＥＣ５０計算による）でＯＸ４０に結合することを実証した。
【０１８７】
実施例５：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性の特徴付け
ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＯＸ４０Ｌドメインの結合親和性を、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６０システムを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。具体的には、ヒトＯＸ４０に対するキメラタンパク質の親和性を決定し、組換え対照タンパク質及びタボリクマブ（抗ヒトＯＸ４０抗体）と比較した。結果を図５及び以下の表に示す。
【表２】
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【０１８８】
ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、高い親和性でｈＯＸ４０に結合することが判明した。特に、ｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のオフ速度は、対照のＦｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質よりもはるかに遅いことが認められた。例えば、ＯＸ４０Ｌのキメラタンパク質のオフ速度は、Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質より１０倍遅かった。
【０１８９】
実施例６．インビトロでのＯＸ４０シグナル伝達の誘導
ヒトＯＸ４０の活性化は、ＮＦ−κＢとＮＩＫの両方の活性化を伴うシグナル伝達カスケードの誘導をもたらす。図６は、ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を用いるインビトロＮＦ−κＢ／ＮＩＫシグナル伝達アッセイからの例示的データを示す。ディスカバーＸ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）ＮＩＫシグナル伝達アッセイからのＵ２ＯＳ細胞を、市販の片面ｈＦｃ−ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ抗体（オキセルマブ）、抗ＯＸ４０抗体（タボリクマブ）、又はヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかの滴定と培養した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）は、示されるレジメンでの処理後に活性化されたＮＦ−κＢ／ＮＩＫシグナル伝達の相対強度を示す。ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＮＦ−κＢ及びＮＩＫを介し及び他の示されるレジメンのいずれかよりも大きな程度に強力に活性化されるシグナル伝達を有することが示される。
【０１９０】
実施例７：スーパー抗原サイトカイン放出アッセイにおけるヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能的活性
ヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を特徴付けるために行った別の機能アッセイは、スーパー抗原サイトカイン放出アッセイである。このアッセイでは、２００ｎｇ／ｍｌのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いて、様々な濃度の試験剤、すなわち、片面ヒトＦｃ−ＯＸ４０Ｌ、市販の片面ＶＳＩＧ８−Ｆｃ、２つの片面分子の組み合わせ、又はヒトＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の存在下でヒト末梢血白血球を活性化した。３日後に、上清を、ヒトＩＬ２に特異的なＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【０１９１】
図７に示すように、培養上清中に分泌されるＩＬ−２の量を、抑制性シグナル伝達事象を阻止するか、又は免疫活性化シグナルを共刺激する試験剤の能力の機能的読み出しとして監視した。０．５ｎｍを超える濃度で、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、任意の他の試験剤又は薬剤の組み合わせよりも高いレベルで、かつ任意の濃度で（最大５０ｎＭ）でＩＬ−２の分泌を誘導した。培地及びＩｇＧ対照を使用した。まとめると、これらの結果は、ｈＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が、インビトロで初代ヒト白血球細胞を機能的に活性化することを示唆する。
【０１９２】
実施例８：ＥＬＩＳＡを使用するＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパクの異なるドメインの結合親和性の特徴付け
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイを、マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの異なるドメインの、それらのそれぞれの結合パートナー（すなわち、ＶＩＳＴＡ、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、又はＯＸ４０）に対する結合親和性を実証するために開発した。具体的には、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＶＳＩＧ８ドメインを、プレート結合組換えマウスＶＩＳＴＡタンパク質へ捕捉し、ＯＸ４０Ｌ特異的抗体を用いて検出した。キメラタンパク質のＦｃ部分を、プレート結合ｈＩｇＧへ捕捉し、ＨＲＰコンジュゲート抗ｈＩｇＧ抗体により検出した。キメラタンパク質のＯＸ４０Ｌドメインを、プレート結合組換えマウスＯＸ４０タンパク質へ捕捉し、ＯＸ４０Ｌ特異的抗体により検出した。
【０１９３】
図８に示すように、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインは、高い親和性でそれらのそれぞれの結合パートナーと効果的に相互作用した。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、中央Ｆｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出することは、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、低レベルのＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が、このアッセイにおいて標準物質と比較して検出された。バンドのサイズは、予想単量体分子量が約６８．１ｋＤａであると確認され、キメラタンパク質の天然状態がグリコシル化二量体であることを示唆する。
【０１９４】
実施例９：マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパクの特徴付け
マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、詳細な説明で上に記載されるように、かつ内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号のように構築した。
【０１９５】
図９Ａ〜図９Ｃは、マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの、それらのそれぞれの結合パートナーに対する結合親和性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す。具体的には、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＶＳＩＧ８ドメインを、プレート結合組換えマウスＶＩＳＴＡタンパク質（ＶＳＩＧ８の結合パートナー）へ捕捉し、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体により検出した（図９Ａ）。市販のｍＶＳＩＧ８−Ｆｃの標準物質は利用できないため、標準曲線を作成しなかった。キメラタンパク質のＦｃ部分を、プレート結合マウスＩｇＧへ捕捉し、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体により検出した（図９Ｂ）。キメラタンパク質のＯＸ４０Ｌドメインを、プレート結合組換えマウスＯＸ４０タンパク質へ捕捉し、ＯＸ４０Ｌ特異的抗体により検出した（図９Ｃ）。図９Ａ〜図９Ｃは、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインが、高い親和性でそれらのそれぞれの結合パートナーと効果的に相互作用したことを示す。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、中央Ｆｃ領域を用いてキメラタンパク質を検出することは、試料中の実際のタンパク質含有量を過小評価する傾向があることが観察された。したがって、このアッセイにおいて、標準物質と比較して低レベルのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が検出された。
【０１９６】
実施例１０：ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のインビトロ細胞結合親和性の特徴付け
細胞結合アッセイを行って、哺乳動物細胞膜の表面上のそれらのそれぞれの結合パートナーに対するマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインの結合親和性を実証した。
【０１９７】
細胞結合アッセイのために、不死化細胞株を、マウスＶＩＳＴＡ（ＥＬ４−ｍＶＩＳＴＡ）及びマウス受容体ＯＸ４０（ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０）を安定に発現するように工学処理した。漸増濃度のｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを、各親細胞株（対照）及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。
【０１９８】
図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、濃度依存的にかつ低いｎＭの親和性で、細胞表面上に存在するｍＶＩＳＴＡ及びｍＯＸ４０に結合した。具体的には、図１０Ａに示すように、ＥＬ４親細胞株（下の曲線）は、それがＶＩＳＴＡを過剰発現しなかったので、漸増濃度のｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質に応答しなかった。比較して、ｍＶＩＳＴＡを過剰発現するように工学処理したＥＬ４−ｍＶＩＳＴＡ細胞株（上の曲線）は、濃度依存的にｍＶＳＩＧ８−ＦＣ−ＯＸ４０Ｌに結合した。同様に、図１０Ｂに示すように、ＣＨＯＫ１親細胞株（下の曲線）は、それがｍＯＸ４０を過剰発現しなかったので、漸増濃度のｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質に応答しなかった。対照的に、ｍＯＸ４０を過剰発現するように工学処理したＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０細胞株（上の曲線）は、濃度依存的にｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに結合した。細胞結合アッセイはまた、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが１６ｎＭの親和性でｍＯＸ４０に結合すること、及び５６ｎＭの親和性でｍＶＩＳＴＡに結合することを示した（ＥＣ５０計算による）。
【０１９９】
実施例１１：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合親和性の特徴付け
マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＯＸ４０Ｌドメインの結合親和性を、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６０システムを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。具体的には、マウスＯＸ４０のキメラタンパク質の親和性を決定し、市販の組換え対照タンパク質（ｍＦｃ−ＯＸ４０Ｌ）と比較した。結果を図１１に示す。ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、高い親和性でｍＯＸ４０に結合することが判明した。
【０２００】
実施例１２：インビトロでのＯＸ４０シグナル伝達の誘導
マウスＯＸ４０の活性化は、ＮＦ−κＢとＮＩＫの両方の活性化を伴うシグナル伝達カスケードの誘導をもたらす。図１２は、マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を用いたインビトロＮＦ−κＢ／ＮＩＫシグナル伝達アッセイからの例示的データを示す。ディスカバーＸ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）ＮＩＫシグナル伝達アッセイからのＵ２ＯＳ細胞を、無関係のタンパク質、市販の片面ｈＦｃ−ＯＸ４０Ｌ、又はｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかの滴定と培養した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）は、示されるレジメンでの処理後に活性化されたＮＦ−κＢ／ＮＩＫシグナル伝達の相対的強度を示す。ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＮＦ−κＢ及びＮＩＫを介して及び他の示されるレジメンのいずれよりも大きな程度に強力に活性化されるシグナル伝達を有することが示される。
【０２０１】
実施例１３：ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能アッセイ
インビボ機能アッセイを行って、マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の機能活性を実証した。マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を接種した。腫瘍が触知可能であり、直径が少なくとも４〜６ｍｍになった時に、マウスを１５０μｇのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の２回用量で処置した。免疫表現型検査を、腫瘍移植後１３日目に、マウスから収集した様々な組織で行った。
【０２０２】
図１３Ａ〜図１３Ｃは、インビボでの機能アッセイからの結果を示す。免疫プロファイリングを、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置した腫瘍担持マウスで行った。図１３Ａに示すように、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、未処置の対照マウスと比較した場合、脾臓、末梢リンパ節、及び腫瘍においてより高い割合の総ＣＤ４＋Ｔ細胞を示した。脾臓及び腫瘍内で、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団のこの増加は、ほとんどＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の増加に起因し、非制御性Ｔ細胞の活性化が関与していることを示唆した（図１３Ｂ）。処置マウスはまた、より低い割合のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を示し、制御性Ｔ細胞がキメラタンパク質によって抑制され得ることを示唆した（図１３Ｂ）。
【０２０３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍抗原の認識を刺激するキメラタンパク質の能力も分析した。具体的には、図１３Ｃは、ＣＴ２６腫瘍により天然に発現されるＡＨ１腫瘍抗原を認識したＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を決定するための四量体染色分析を示す。脾臓内において、未処理の対照マウスと比較した場合、より高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞が、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスにおいてＡＨ１腫瘍抗原を認識することが見出された。特に、未処置対照マウスと比較した場合、はるかにより高い割合のＡＨ１  四量体−陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、キメラタンパク質で処置したマウスの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）内で観察された。
【０２０４】
実施例１４：ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパクのインビボ抗腫瘍活性の特徴付け
ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を、ＣＴ２６マウス結腸直腸腫瘍モデルを用いて分析した。
【０２０５】
一組の実験で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、かつ／又は３０日目にＣＴ２６腫瘍細胞の２回目の接種を行った。腫瘍成長の４日後に、腫瘍が直径４〜５ｍｍに達すると、マウスを、対照抗体又は１５０μｇのマウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかで処置した。処置を７日目に繰り返した。腫瘍接種後４５日間にわたって腫瘍サイズの発達の分析を行った。
【０２０６】
図１４Ａに示すように、未処置マウスは大きな腫瘍を発症し、一方でｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスのほとんどは、検出可能なサイズの腫瘍を発症しなかった。図１４Ｂは、腫瘍接種後５０日にわたるマウスの全生存率を示す。未処置マウスの全ては腫瘍接種後２１日以内に死亡したが、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質で処置したマウスは、腫瘍接種後３０日目で１００％の生存率を示した。腫瘍接種後５０日目に、ｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ処置マウスの７５％超が生存したままであった。図１４Ｃは、各グループの治療結果をまとめたものである。図１４Ｃに示すように、キメラタンパク質での処置はまた、対照抗体での処置よりも有意に高い腫瘍拒絶をもたらした。特に、幾匹かのマウスは、腫瘍成長と抗腫瘍免疫の間の平衡効果と一致して、長期の腫瘍安定化を示した。この期間は、キメラタンパク質の最後の処理を十分に超えて延長し、記憶免疫が活性化された可能性を示唆する。興味深いことに、免疫平衡が観察された一部のマウスは、完全な腫瘍拒絶が遅れた。より具体的には、キメラタンパク質での処置は、原発性腫瘍の拒絶及び再負荷中に投与される腫瘍細胞の完全な拒絶をもたらし、記憶Ｔ細胞が関与し得ることを示唆した。
【０２０７】
上記のデータは、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質での処置がインビボで免疫記憶効果をもたらすことを示唆する。そのため、処置した動物は、キメラタンパク質での最初の処置後の再負荷時に、腫瘍細胞を後に攻撃し、かつ／又は腫瘍の発生を防止できる。
【０２０８】
実施例１５：マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＥＬＩＳＡベースの抗薬物抗体アッセイ
ＥＬＩＳＡベースの抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイを、マウスＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を用いて行った。高結合ＥＬＩＳＡプレートを、動物血清（青い線；出発の未希釈「ニート」）、次いで、１：２、１：４、及び１：８の希釈）又は組換えマウスＦｃ（黒線；５μｇ／ｍＬから出発し、次いで、１：２、１：４、１：８、１：１６、及び１：３２の希釈）のいずれかでコーティングし、１０μｇ／ｍＬのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質でプローブした。血清を、原発性と続発性の両方のＣＴ２６腫瘍を拒絶したマウスから採取し、次いで、９１日目に腹腔内（ＩＰ）注射により１５０μｇのｍＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を第３の用量で負荷した。血清を、９８日目の１週間後に採取した。キメラタンパク質を、ヤギ抗マウスＯＸ４０Ｌ抗体、続いて抗ヤギＨＲＰ三次抗体を用いて検出した。吸光度の値（ＯＤ４５０）及び各曲線の非線形フィットを、図１５に示す。
【０２０９】
実施例１６：キメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与の特徴付け
この実施例において、本発明のキメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与をアッセイした。ここで、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをＦｃ含有キメラタンパク質のモデルとして用いた。そのため、以下に示すデータは、本発明のキメラタンパク質に関連する。
【０２１０】
天然状態では、ＰＤ１は単量体として存在し、一方でＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用により二量体化する傾向がある。Ｆｃドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに結合する。まとめると、いくつかの分子間相互作用は、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの四次構造に寄与し得る。少なくとも、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの４つの潜在的な構造があり、キメラタンパク質は単量体、二量体、三量体、又は六量体として存在する。図１６を参照されたい。
【０２１１】
キメラタンパク質の単量体及び二量体の構造の存在を、キメラタンパク質を還元条件及び非還元条件に暴露し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動することによって試験した。非還元条件下（還元：「−」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２００ｋＤａの位置に移動した。ここで、ウェスタンブロットを、ＰＤ１、Ｆｃ、又はＯＸ４０Ｌに対する抗体でプローブし、それぞれ、図１７の左、真ん中、及び右のブロットに示した。キメラタンパク質の予測単量体分子量は５７．６ｋＤａであるので、２００ｋＤａ種は、少なくとも二量体であると予想された。しかしながら、ジスルフィド結合（例えば、Ｆｃドメイン間の）を還元する還元条件下（還元：「＋」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１００ｋＤａの位置に移動した。１００ｋＤａ種は予想よりも大きかったので、余分な質量はグリコシル化によるものと予測された。最後に、キメラタンパク質をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ「＋」）で処理し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。これらの条件下で、キメラタンパク質は約５７．６ｋＤａの位置に移動した。これらのデータは、キメラタンパク質がグリコシル化され、少なくとも二量体として天然に存在することを示唆しており、二量体化は、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合に起因する可能性が高い。
【０２１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル法は、高電荷及び／又は大きな分子量のタンパク質について分子量を正確に予測しない。そのため、キメラタンパク質を次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて特徴付けた。負電荷ＳＤＳがペプチド間の電荷ベースの相互作用を低下させるＳＤＳ−ＰＡＧＥとは異なり、ＳＥＣは界面活性剤又は還元剤を使用しない。ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をＳＥＣにかけると、約２００ｋＤａ付近にピークはなかった。これは、天然では、キメラタンパク質は二量体として存在しないことを示唆する。代わりに、６７０ｋＤａを超えるサイズを有するピークが検出された。図１８を参照されたい。このデータ及び以前のデータは、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がその天然状態で六量体として存在することを示唆する。
【０２１３】
上に示したように、非還元条件下又は還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動すると、試料及び／又は泳動緩衝液中のＳＤＳは、還元剤の有無にかかわらず、六量体のＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をそれぞれ優勢な二量体又は単量体に変換する。図１９（左ゲル）を参照されたい。ＳＤＳを欠くネイティブＰＡＧＥ上で泳動すると、還元剤の非存在下で、キメラタンパク質は六量体として存在する。しかしながら、還元剤（ジスルフィド結合を低下させる）の存在下で、ネイティブＰＡＧＥで泳動すると、キメラタンパク質は予想よりも重く移動した。図１９に示すように（右ゲル、レーン＃２）、キメラタンパク質は、実質的に、ローディングウェルから移動できなかった。このデータは、キメラタンパク質が、より高次のタンパク質にオリゴマー化したことを示唆する。そのため、キメラタンパク質において、ジスルフィド結合は、より高次のオリゴマー化を制御するのに重要であると思われる。
【０２１４】
これをさらに確認するために、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質、例えば、「ＰＤ１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ」を構築した。そのようなキメラタンパク質は、前述のキメラタンパク質中のＦｃドメイン間で生じるジスルフィド結合を有しない。図２０に示すように、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質をネイティブＰＡＧＥで泳動すると、実質的にどのタンパク質もそのローディングウェルから移動せず（レーン＃１〜＃４は、漸増ローディング濃度のＰＤ１−Ｎｏ  Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを示す）、再び、「Ｆｃを含まない」キメラタンパク質は、多数のタンパク質を含むコンカテマー様複合体を形成したことを示唆する。そのため、キメラタンパク質中のＦｃドメインの除去は、タンパク質凝集体の形成をもたらす。これらのデータは、例えば、異なるキメラタンパク質上のＦｃドメイン間の、ジスルフィド結合が、キメラタンパク質を安定化しかつ、それらが高次タンパク質／コンカテマーとしてではなく、六量体としてそれぞれ存在することを保証することを示す。言い換えれば、Ｆｃドメインは、驚くべきことに、キメラタンパク質複合体に秩序をもたらす。レーン＃１〜＃４はそれぞれ、ＰＤ１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを２．５μｇ、ＰＤ１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを５μｇ、ＰＤ１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを７．５μｇ、及びＰＤ１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを１０μｇ含む。
【０２１５】
図２１に示すのは、上記のデータをまとめ、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成される方法を示すモデルである。例示的なキメラタンパク質（ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）は、自然に六量体を形成する（ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用とＦｃドメインによる二量体化による）。しかしながら、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質について還元条件下で、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合の制御効果が存在せず、かつＰＤ１−Ｎｏ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ中にＦｃドメインが存在しないために、これらの後者のキメラタンパク質はコンカテマーを形成する。
【０２１６】
さらに、Ｆｃドメイン（本明細書に記載の）がフィコリン（キメラタンパク質間のジスルフィド結合に必要なシステイン残基を欠く）と置換されたキメラタンパク質を構築した。Ｆｃを含まないキメラタンパク質及びＦｃを含みネイティブＰＡＧＥで還元剤の存在下で泳動したキメラタンパク質（両方ともゲル中に移動しない凝集体を形成した）と同様に、フィコリンを含むキメラタンパク質もまた、高次格子を形成するように見え、ゲル中に移動しなかった。これらのデータは、ジスルフィド結合が本発明のキメラタンパク質の適切な折りたたみ及び機能にとって重要であるという結論を強化する。
【０２１７】
最後に、キメラタンパク質を、コイル状Ｆｃドメイン（ＣＣＤＦｃ）を用いて調製した。機能評価において、ほとんどの精製タンパク質は送達されなかった。
【０２１８】
したがって、キメラタンパク質のリンカー中にＦｃドメインを含めること（これはキメラタンパク質間のジスルフィド結合を形成できる）は、不溶性で、おそらく非機能的なタンパク質コンカテマー及び／又は凝集体の形成を回避するのに役立つ。
【０２１９】
実施例１７：他のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインを含む追加ＶＳＩＧ８含有キメラタンパク質の生成
この実施例で、本発明の追加のキメラタンパク質を記載する。そのような追加のキメラタンパク質は、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が作製される方法と同じように、例えば、詳細な説明で上に記載されるように、かつ内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６２／４６４，００２号のように作製される。
【０２２０】
これらの追加のキメラタンパク質は、一般式：ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２を有し、式中、ＥＣＤ  １はＶＳＩＧ８の細胞外ドメインであり、ＥＣＤ  ２は、ＯＸ４０Ｌ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインである。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ及びＴＲＡＩＬを含む。これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。例示的な結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２は、上の表１に記載されている。キメラタンパク質を形成するのに有用で、かつ特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図２２に示す。
【０２２１】
或いは、追加のキメラタンパク質は、一般式：Ｎ末端  −（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端（式中、（ａ）はＶＳＩＧ８であり、（ｂ）は、Ｆｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーであり、（ｃ）は、ＯＸ４０Ｌ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインである）を有する融合タンパク質である。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ及びＴＲＡＩＬを含む。例示的なリンカーを、上の表１に記載する。キメラタンパク質を形成するのに有用で、特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図２２に示す。
【０２２２】
４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ及びＴＲＡＩＬのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、２１、及び２３を含む。４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ及びＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２２、及び２４を含む。ＶＳＩＧ８のアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインは、配列番号２を含む。キメラタンパク質は、上記配列の変異体、例えば、上記の配列と少なくとも約９５％の同一性を含み得る。
【０２２３】
したがって、本発明は、（例えば、癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において）追加のキメラタンパク質：ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＣＤ３０Ｌ、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＦａｓＬ、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬを用いる、以下の追加のキメラタンパク質及び方法をさらに含む。
【０２２４】
追加のキメラタンパク質を、ＶＳＩＧ８−ＦＣ−ＯＸ４０Ｌを特徴付けるのに必要というよりむしろ追加のキメラタンパク質に特異的である試薬（例えば、結合パートナー、組換え標的細胞、及び癌細胞型／腫瘍型）と共にであるが、実施例１〜１５でＣＳＦ１Ｒ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌについて上に記載のように特徴付ける。そのため、例としてＶＳＩＧ８−Ｆｃ−４−１ＢＢＬを使用して、実施例２と同様のＶＳＩＧ８−Ｆｃ−４−１ＢＢＬの特徴付けを、ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに必要な抗ＶＳＩＧ８、抗Ｆｃ、及び抗ＯＸ４０Ｌ抗体よりむしろ、抗ＶＳＩＧ８、抗Ｆｃ、及び抗４−１ＢＢＬ抗体を用いて行うことができる。
【０２２５】
ＶＳＩＧ８−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質と同様に、追加のキメラタンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの１つの受容体／リガンドの活性化により、ＶＳＩＧ８を遮断し（免疫阻害性シグナル伝達を阻害し）、免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／若しくは刺激することによる癌の治療並びに／又は炎症性疾患の治療に有効である。さらに、追加のキメラタンパク質は、複数の抗体、例えば、ＶＩＳＴＡブロッキング抗体及び４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの１つの受容体／リガンドに対するアゴニスト抗体を含む治療に起因する毒性なしに、癌及び／又は炎症性疾患を治療することにおいてに有効である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１】
2020508066.tif 000017
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
2020508066.tif 000021
【図１４Ａ】
2020508066.tif 000022
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020508066.tif 000030
【図２１】
2020508066.tif 000031
【図２２−１】
2020508066.tif 000032
【図２２−２】
2020508066.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月6日(2019.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020508066000001.app
【国際調査報告】
2020508066.tif 000034
2020508066.tif 000035
2020508066.tif 000036