(57)【要約】  本発明は、ヘムの細胞外生成能を有する微生物変異体に関し、より詳細には、代謝工学的に操作されたヘムの細胞外生成能を有する微生物変異体、およびそれを用いたヘムの製造方法に関する。本発明によれば、ポルフィリン症の治療、健康食品または食品補助剤としての使用が増加している錯塩であるヘムを、従来の化学合成や酵素合成ではなく、微生物変異体を用いて高収率で細胞外に生産することができる効果がある。
2020509740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子とを有している微生物において、ヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子が過発現されていることを特徴とする、ヘムを細胞外へ分泌させることができる微生物変異体。
【請求項２】
前記微生物は、炭素源からグルタミン酸を生成することができる微生物であることを特徴とする請求項１に記載の微生物変異体。
【請求項３】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子とが過発現されていることを特徴とする請求項１に記載の微生物変異体。
【請求項４】
前記５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路は、Ｃ５生合成経路であることを特徴とする請求項３に記載の微生物変異体。
【請求項５】
前記Ｃ５生合成経路に関与する遺伝子は、グルタミル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲＳをコードするｇｌｔＸ遺伝子 、グルタミル−ｔＲＮＡ還元酵素（ＧｌｕＴＲ）をコードするｈｅｍＡ遺伝子 、およびグルタメート−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＧＳＡＭ）をコードするｈｅｍＬ遺伝子で構成された群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の微生物変異体。
【請求項６】
前記ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子は、ポルホビリノーゲン合成酵素（ＰＢＧＳ）をコードするｈｅｍＢ遺伝子、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）をコードするｈｅｍＣ遺伝子、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ合成酵素（ＵＲＯＳ）をコードするｈｅｍＤ遺伝子、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ＵＲＯＤ）をコードするｈｅｍＥ遺伝子、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯ）をコードするｈｅｍＦ遺伝子、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするｈｅｍＧ遺伝子、およびフェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）をコードするｈｅｍＨ遺伝子で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の微生物変異体。
【請求項７】
前記Ｃ５生合成経路に関与する遺伝子として、グルタミル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲＳをコードするｇｌｔＸ遺伝子 、グルタミル−ｔＲＮＡ還元酵素（ＧｌｕＴＲ）をコードするｈｅｍＡ遺伝子 、およびグルタメート−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＧＳＡＭ）をコードするｈｅｍＬ遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つが過発現されており、前記ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子として、ポルホビリノーゲン合成酵素（ＰＢＧＳ）をコードするｈｅｍＢ遺伝子、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）をコードするｈｅｍＣ遺伝子、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ合成酵素（ＵＲＯＳ）をコードするｈｅｍＤ遺伝子、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ＵＲＯＤ）をコードするｈｅｍＥ遺伝子、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯ）をコードするｈｅｍＦ遺伝子、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするｈｅｍＧ遺伝子、およびフェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）をコードするｈｅｍＨ遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つが過発現されていることを特徴とする請求項４に記載の微生物変異体。
【請求項８】
ヘムまたはヘム中間体分解酵素をコードする遺伝子が欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の微生物変異体。
【請求項９】
ｙｆｅＸ遺伝子が欠失されていることを特徴とする請求項７に記載の変異体。
【請求項１０】
Escherichia coli、Bacillus sp.、Corynebacterium sp.、Lactobacillus sp.、Lactococcus sp.、Pseudomonas sp.、Anacystis sp.、Anabena sp.、Chlorobium sp.、Chloroflexus sp.、Clostridium sp.、 Methanobacteria、Propionibacterium sp.、Rhodopsueomonas sp.、Rhodobacter sp.、Rhodovulum sp.、Streptococcus sp.、Saccharomyces sp.、Schizosaccharomyces sp.、Yarrowia sp.、およびAspergillus sp.で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の微生物変異体。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物変異体を培養してヘムを生成させるステップと、
（ｂ）前記生成されたヘムを回収するステップと、を含むヘムの製造方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ａ）の培養時に窒素源をさらに添加することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムの細胞外生成能を有する微生物変異体に関し、より詳細には、代謝工学的に操作されたヘムの細胞外生成能を有する微生物変異体、およびそれを用いたヘムの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘム（ｈｅｍｅ）は、鉄イオン（Ｆｅ２＋）とプロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）から構成されているポルフィリン誘導体であり、殆どの原核細胞および真核細胞で発見されるものであって、酸素を運び、活性酸素種を除去し、電子を伝達してエネルギーを生成させる役割を果たす錯塩である。ヘムは、健康管理および食品補助剤の産業において、生体利用が可能な鉄供給剤として広く用いられている。特に、ヘミン（ｈｅｍｉｎ）は、塩化リガンドを有する３価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を含有する、酸化された形態のヘム誘導体であって、急性間欠性ポルフィリン症の治療に用いられているため、ヘムに対する需要が増加している。したがって、ここ数十年間、ヘムの効率的な生産が、大きい関心の対象となっている。
【０００３】
従来の化学合成によるヘムの合成、および有機物抽出または酵素加水分解により植物組織および動物血液からヘムを分離する方法は、複雑であり、収率が低く、時間が長くかかるだけでなく、環境にやさしくないという欠点がある。したがって、組換え微生物、中でも、大腸菌を用いた生合成方法によりヘムを生産しようとするいくつかの試みがあった。しかし、生産されたヘムが細胞内に蓄積されるため、後で用いるためには、細胞からヘムを抽出することが不可避であって、従来のヘム生産における限界を克服していない。微生物を用いて生産したヘムを、ヘムタンパク質やヘムペプチドの形態で細胞外で生産しようとする試みがあったが（ＥＰ０，６３１，６３１；ＵＳ５，６８１，７２５；およびＵＳ２０１６−０３４０４１１）、フリーヘムを生産するためには、依然として、細胞外へ分泌されたヘムタンパク質やヘムペプチドからの抽出が必要である。したがって、フリーヘムを、環境にやさしく、経済的・産業的に生産するためには、フリーヘムの細胞外生産を実現する必要がある。
【０００４】
ヘムは、ほぼ全ての微生物に必須な化合物であるが、高濃度で存在する場合には、種々の微生物で毒性を誘発する(Anzaldi et al., Infect.Immun.78, 4977-4989, 2010)。一部の微生物は、ヘムや、ヘムが蓄積されて生じる毒性代謝物質を細胞外へ能動的に輸送することで、ヘム耐性を獲得する。大腸菌では、細胞内で合成されたフリーヘムを周りの細胞質に分泌し、シトクロムｃの生合成に関与するタンパク質にヘムを供給するヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子ｃｃｍＡＢＣが知られている(Feissner et al., Mol. Microbiol. 61:219-231, 2006)。該遺伝子がフリーヘムによる毒性耐性に関与するかについては報告されていないが、本発明者らは、フリーヘムの生合成を増進させることで、ｃｃｍＡＢＣ遺伝子から発現したヘムエクスポーターによる細胞外へのヘムの分泌を促進させ、これにより、細胞外フリーヘムの生産が可能であると判断した。
【０００５】
ヘムの生合成は、５−アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ）（ＡＬＡ）の生合成から始まる(図１)(Layer G. et al., Protein Sci. 19:1137-1161, 2010)。ＡＬＡは、種によって２つの異なる経路（Ｃ４またはＣ５経路）を介して合成され、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、植物、および殆どのバクテリアは、グルタミル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲＳ）、グルタミル−ｔＲＮＡ還元酵素（ＧｌｕＴＲ）、およびグルタメート−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＧＳＡＭ）により触媒される一連の反応により、Ｌ−グルタメートをＡＬＡに転換させるＣ５経路を有している。一方、ヒトを始めとする動物、菌類、および紅色非硫黄光栄養細菌は、ＡＬＡ合成酵素（ＡＬＡＳ）によってＬ−グリシンおよびスクシニル−ＣｏＡをＡＬＡに転換させるＣ４経路を有している。微生物を用いてＡＬＡを生産するための２つの経路が両方とも活発に研究されてきたが(Ding et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 44:1127-1135, 2017.; Zhang et al., Sci. Rep. 5:8584, 2015; Kang et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 33 doi: 10.1007/s11274-017-2366-7, 2017)、ヘムの生産において、Ｃ５のＡＬＡ生合成経路を用いた報告はない。
【０００６】
ヘムの生合成経路の下流では、Ｃ４もしくはＣ５経路を介して合成されたＡＬＡの２つの分子が、ポルホビリノーゲン合成酵素（ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＰＢＧＳ）によって縮合され、ポルホビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ、ＰＢＧ）を形成する。４分子のＰＢＧは、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＰＢＧＤ）によって１−ヒドロキシメチルブタン（ＨＭＢ）に縮合され、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ合成酵素（Ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＵＲＯＳ） によってＨＭＢの環化が起こる（図１）。引き続き、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ＵＲＯＤ）、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ  ｏｘｉｄａｓｅ、ＣＰＯ）、およびプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ、ＰＰＯ）により触媒された脱カルボキシル化および酸化反応を含む後続反応により、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ（ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ）をプロトポルフィリンＩＸに転換させる。最後に、フェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）は、第１鉄（Ｆｅ２＋）を挿入してプロトポルフィリンＩＸをヘムに転換させる。
【０００７】
大腸菌を操作してヘムを生産しようとするいくつかの試みがあったが、第一の研究としては、Ｃ４経路のＡＬＡＳをコードするＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のｈｅｍＡ遺伝子（ｈｅｍＡＲｃａ）を始めとし、大腸菌由来のｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．由来のｈｅｍＦ、並びにバチルスサブチリス由来のｈｅｍＨ、およびｈｅｍＨを含む８個の遺伝子を恒常的に過発現させた大腸菌変異体を製作した。前記大腸菌変異体は、ＬＢ培地で３．３±０．３μＭ（２．０３±０．１８ｍｇ／Ｌ）のヘムを生産した(Kwon S. J. et al., Appl. Environ. Microbiol. 69: 4875-4883, 2003)。しかしながら、この方法は、前駆体（Ｌ−ｇｌｙｃｉｎｅとｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ）の供給が制限されており、最適ではないヘムの生合成経路を用いるため、収率が低かった。
【０００８】
他の研究では、ＡＬＡＳをコードするＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のｈｅｍＡ遺伝子（ｈｅｍＡＲｓｐ）、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸脱水素酵素をコードする内因性ｍａｅＢ、およびジカルボン酸トランスポーターをコードする内因性ｄｃｔＡを大腸菌でともに発現させた。この菌株は、１０ｇ／Ｌのコハク酸および２ｇ／Ｌのグリシンを添加したＬＢ培地で、６．４ｍｇ／Ｌのヘムを生産した(Kwon O. H. et al., J. Microbiol. Biotechnol. 19:604-609, 2009)。この菌株を用いた追加の研究で、内在的なｃｏａＡ（パントテン酸キナーゼをコードする）、ｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、およびｈｅｍＥ遺伝子を過発現させる場合、０．４９μｍｏｌのｇＤＣＷ−１のヘムが生産され、実際のヘムの濃度は、バイオマス濃度が記載されていないため分からなかった(Lee M. J. et al.  J. Microbiol. Biotechnol. 23:668-673, 2013)。最近の研究において、前記研究者らは、連続培養により、２５０ｍＬ容量の培養器で９．１μｍｏｌのｇＤＣＷ−１ヘム（ここでも、バイオマスの濃度が分からない）を生産した(Pranawidjaja S. et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25:880-886, 2015)。上述の組換え大腸菌菌株によってヘムが生成され得るが、最終的なヘムの収率が非常に低く、細胞外へのフリーヘムの分泌が報告されていない。前記研究でヘムの生産量が低いことは、主として、ヘム生合成のためのヘム前駆体を供給するにあたり、最適経路ではない代謝経路を用いたためである。また、L−グリシンおよびコハク酸の添加は、大規模生産において好ましくない。
【０００９】
したがって、ヘムの効率的な生産のための高性能のヘム生産微生物を製造し、ヘム生産量の増加による細胞外へのヘムの分泌を確認して、細胞外フリーヘムを効果的に生産する組換え微生物を製造する必要がある。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ヘムを高収率で生産し、生成されたヘムを細胞外へ分泌することができる変異体を開発するために鋭意努力した結果、大腸菌でヘムの前駆体である５−アミノレブリン酸の生産を増加させることができるＣ５経路とヘム生合成経路を過発現させた変異体が、従来のヘム生成菌株に比べて著しい収率でヘムを生成するだけでなく、ヘムを細胞外生産するということを確認し、ヘムを細胞外へ分泌する遺伝子であるｃｃｍＡＢＣを追加的に過発現させることで、ヘムの生産量をより向上させ、細胞外へのフリーヘムの分泌もさらに向上させることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ヘムを高収率で生産し、生成されたヘムを細胞外へ分泌することができる微生物変異体を提供するところにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記微生物変異体を用いたヘムの製造方法を提供するところにある。 
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子を有している微生物で、ヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子が過発現されていることを特徴とする、ヘムを細胞外へ分泌させることができる微生物変異体を提供する。 
【００１４】
また、本発明は、（ａ）前記微生物変異体を培養してヘムを生成させるステップと、（ｂ）前記生成されたヘムを回収するステップと、を含むヘムの製造方法を提供する。 
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るヘムの生成のための生合成経路を示した図である。太く表示された項目は、本発明に係るＨＥＭＥ７菌株で、該当遺伝子が過発現されたことを示す。
【図２】本発明に係る大腸菌でヘムを高収率で生産するための戦略を示した図である。
【図３】本発明に係るＨＥＭＥ１、ＨＥＭＥ２、ＨＥＭＥ３、ＨＥＭＥ４、ＨＥＭＥ５、およびＨＥＭＥ６菌株のフラスコ培養によるＡＬＡおよびヘムの生産量を示した図である。
【図４】本発明に係るＨＥＭＥ６菌株の、ＴＢ、ＴＢ−Ｆｅ７．５、ＬＢ、ＬＢ−Ｆｅ７．５、ＭＲ−Ｆｅ０、ＭＲ−Ｆｅ７．５培地を用いたフラスコ培養によるヘムの生産量を示した図である。
【図５】本発明に係るＨＥＭＥ６菌株の培養に用いた培地中のＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏの濃度を変化させることによる、フラスコ培養によるヘムの生産量を示した図である。
【図６】本発明に係るＨＥＭＥ６菌株の培養温度を変化させることによる、フラスコ培養によるヘムの生産量を示した図である。
【図７】本発明に係るＨＥＭＥ６菌株の回分培養によるヘムの生産量を示した図である。
【図８】本発明に係るＨＥＭＥ６菌株の流加培養によるヘム生産量を示した図であって、培養時における流入溶液の成分を次のように変化させて培養したものである：（ａ）７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；（ｂ）７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；（ｃ）７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｇ／Ｌ  ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ。
【図９】本発明に係るＨＥＭＥ７菌株の流加培養によるヘム生産量を示した図であって、培養時における流入溶液の成分を次のように変化させて培養したものである：（ａ）７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；（ｂ）７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ，２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｇ／Ｌ  ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１７】
ヘムは、健康管理および食品補助剤の産業で広く応用されている錯塩であって、従来は、化学的合成、有機物抽出または酵素加水分解により製作されているが、複雑で、且つ収率が低いため、微生物を用いて高収率でヘムを生成するために、大腸菌変異体を製作した。また、生産したヘムを細胞内に蓄積する従来の大腸菌変異体とは異なって、生産したフリーヘムを細胞外へ分泌することで、後程のフリーヘムの回収を容易にする、大腸菌変異体を製作した。
【００１８】
ヘムは、微生物に必須な化合物であるが、高濃度で存在する場合には毒性を誘発するため、一部の微生物は、ヘムや、ヘムの蓄積により蓄積される毒性代謝物質を細胞外へ能動的に輸送することで、ヘム耐性を獲得する。大腸菌の場合、シトクロムｃの生合成に関与するタンパク質にヘムを供給するヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子ｃｃｍＡＢＣが知られている（Feissner et al., Mol. Microbiol. 61:219-231, 2006）が、該遺伝子がフリーヘムによる毒性耐性に関与するかについては報告されていない。それにもかかわらず、本発明者らは、フリーヘムの生合成を増進させることで、ｃｃｍＡＢＣ遺伝子から発現されたヘムエクスポーターによる細胞外へのヘムの分泌を促進させ、これにより、細胞外フリーヘムの生産が可能であると判断した。
【００１９】
従来、大腸菌を用いたヘム生産変異体は、Ｌ−グリシンとコハク酸の供給とともに、Ｃ４経路を提供する５−アミノレブリン酸によりヘムを生産するように設計されていたが、最終的なヘム生産収率は非常に低かった。本発明者らは、ヘムをより効率的に生産するために、Ｌ−グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を５−アミノレブリン酸に転換させるＣ５経路を用いた、工学的に設計された大腸菌菌株を製作し、様々な戦略を用いて大腸菌におけるヘムの生産を向上させた（図２）。
【００２０】
第一に、前駆物質を供給せずにＡＬＡを生産するＣ４およびＣ５経路の容量を調べ、Ｃ４経路に比べてＣ５経路で優れた性能を示すことを確認した後、Ｃ５経路の代謝遺伝子およびヘムの生合成のための下流経路を過発現させた。次に、ヘムの生合成に関連する代謝経路は、関連遺伝子の発現レベルを調節して最適化させた。さらなるヘム生産性の向上のために、ヘム分解酵素をコードする遺伝子として推定されるｙｆｅＸとラクテートおよびアセテート合成経路を欠失させ、回分発酵により、高収率でヘムが生成されることを確認した。また、生成されたヘムが細胞外へ分泌されることを確認した。さらに、ヘムを細胞外へ分泌するヘムエクスポーターをコードするｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現した大腸菌変異体を製造し、回分発酵により、ヘムがさらに高効率で生成されることを確認した。また、生成されたヘムにおいて、より多い割合が細胞外へ分泌されることを確認した。
【００２１】
したがって、本発明は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子を有している微生物で、ヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子が過発現されていることを特徴とする、ヘムを細胞外へ分泌させることができる微生物変異体に関する。
【００２２】
本発明において、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子を有している微生物は、 野生型として、前記遺伝子を有している微生物だけでなく、 前記遺伝子が導入されている微生物を含む。
【００２３】
本発明において、前記微生物変異体は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産する生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子が過発現されていることを特徴とする。
【００２４】
ヘムを生合成するためには、前駆体である５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）が必要であり、ＡＬＡの生合成経路には、Ｃ４経路とＣ５経路が存在する。ＡＬＡの生産のための微生物変異体にＣ４経路とＣ５経路が用いられた事例は両方ともあるが、ヘムを生合成するための変異体にＣ５経路を適用したことは、本発明が最初である。
【００２５】
本発明において、 前記微生物は、炭素源からグルタミン酸を生成することができる微生物が用いられてもよいが、これに限定されない。
【００２６】
従来のＣ４経路を採用した、ヘム生合成能を有する微生物の場合、培養時に、ＡＬＡの前駆体であるコハク酸およびグリシンを添加しなければならなかったが、グリシンは細胞毒性を有するため、高濃度で添加することができないという問題があった。また、コハク酸およびグリシンを添加しても、最終的なヘム生産量は、６．４ｍｇ／Ｌ程度に過ぎなかった。
【００２７】
本発明では、ヘム生産性の高い微生物変異体を製作するために、Ｃ４経路とＣ５経路を有する微生物変異体をそれぞれ製造し、ヘム生成能を確認した。
【００２８】
本発明で使用可能な微生物菌株としては、バクテリア、古細菌、酵母、カビ、原生動物（鞭毛虫類、アメーバ類、襟鞭毛虫類、リザリア、クロムアルベオラータ）、動物細胞、微細藻類、植物細胞などが挙げられ、好ましくは、
Escherichia coli、Bacillus sp.、Corynebacterium sp.、Lactobacillus sp.、Lactococcus sp.、Pseudomonas sp.、Anacystis sp.、Anabena sp.、Chlorobium sp.、Chloroflexus sp.、Clostridium sp.、methanobacterium、Propionibacterium sp.、Rhodopsueomonas sp.、Rhodobacter sp.、Rhodovulum sp.、Streptococcus sp.、Saccharomyces sp.、Schizosaccharomyces sp.、Yarrowia sp.、Aspergillus sp.挙げられ、より好ましくは、 Escherichia coli、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus casei、Lactobacillus reuteri、Lactococcus lactis、Aspergillus niger、Saccharomyceses cerevisiae、Saccharomyces pombeなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の一態様において、Ｃ４経路とＣ５経路をそれぞれ導入した大腸菌を培養時に、前駆体を添加せずに培養する場合、Ｃ５経路で、より多くのＡＬＡが生産された。したがって、本発明では、ヘムの生合成にＣ５経路を用いた。
【００３０】
本発明において、前記Ｃ５生合成経路に関与する遺伝子は、グルタミル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲ）をコードするｇｌｔＸ 、グルタミル−ｔＲＮＡ還元酵素（ＧｌｕＴＲ）をコードするｈｅｍＡ、およびグルタメート−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＧＳＡＭ）をコードするｈｅｍＬであり、前記ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子は、ポルホビリノーゲン合成酵素（ＰＢＧＳ）をコードするｈｅｍＢ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）をコードするｈｅｍＣ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ合成酵素（ＵＲＯＳ）をコードするｈｅｍＤ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ＵＲＯＤ）をコードするｈｅｍＥ、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯ）をコードするｈｅｍＦ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするｈｅｍＧ、およびフェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）をコードするｈｅｍＨであること特徴とすることができる。
【００３１】
本発明において、前記変異体は、ヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子が過発現されていること特徴とすることができる。
【００３２】
本発明において、前記物変異体は、ヘムまたはヘム中間体分解酵素をコードする遺伝子が欠失されているものであってもよく、前記ヘムまたはヘム中間体分解酵素をコードする遺伝子は、ｙｆｅＸ遺伝子であること特徴とすることができる。
【００３３】
本発明の他の態様において、Ｃ５経路をそれぞれ導入した大腸菌で、ヘム生合成経路の遺伝子をともに過発現させ、各酵素の発現に用いたベクターを最適化し、酢酸および乳酸の生産に関与する遺伝子を欠失させ、従来にヘムの分解に関与するか否かについての議論があったｙｆｅＸ遺伝子を欠失させた大腸菌変異体の場合、７．５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏを添加したＬＢ培地を用いたフラスコ培養で、７．１３ｍｇ／Ｌのヘムが生産された。
【００３４】
したがって、本発明では、ｙｆｅＸ遺伝子のノックアウトが、ヘム生産量を増加させるということを最初に確認した。
【００３５】
本発明の他の態様は、ＡＬＡのＣ４経路が過発現された微生物でｙｆｅＸ遺伝子が欠失されている変異体に関する。
【００３６】
尚、本発明のさらに他の態様では、前記製作した大腸菌変異体菌株を、５ｇ／Ｌの酵母エキス（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）が添加されＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏの濃度が７．５ｍｇ／Ｌに調整されたＭＲ培地でフラスコ培養した場合、７．４５ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、培養時間および温度の最適化を行い、ＩＰＴＧによるタンパク質の過発現を誘導した後、３０℃で６０時間培養した結果、７．７８ｍｇ／Ｌのヘムが生産された。
【００３７】
本発明のさらに他の態様では、本発明に係る前記大腸菌変異体および最適化条件を用いて、回分発酵を行った結果、５６時間培養した時に総１４．２４ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１．１８ｍｇ／Ｌ（８．２９％）のヘムが細胞外で確認された。
【００３８】
本発明のさらに他の態様では、本発明に係る前記大腸菌変異体を流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）した結果、５６時間目に、４９．１８ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１６．７７ｍｇ／Ｌ（３４．１０％）のヘムが細胞外で確認された。
【００３９】
本発明のさらに他の態様では、ヘムの一分子当り４個のＮ原子が必要であるため、窒素欠乏（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）の懸念を解消するために、（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加して流加培養した結果、１０４．９０ｍｇ／Ｌのヘムが生産された。そのうち５４．６１ｍｇ／Ｌ（５２．０６％）のヘムが細胞外で確認された。
【００４０】
本発明のさらに他の態様では、（ＮＨ４）２ＳＯ４に代えて、Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路の前駆体であるL-グルタメート(L-ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を添加して培養した結果、６４時間目に、２２８．４６ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１３１．９０ｍｇ／Ｌ（５７．７３４％）のヘムが細胞外で確認された。
【００４１】
上記のような結果を考慮すると、生産されたヘムの総量が増加するにつれて、細胞外へ分泌されるヘムの割合が増加することが分かる。これは、細胞内の高いヘム濃度が細胞に毒性を引き起こすため、本発明者らが立てた仮説のように、ヘムエクスポーターの機能もしくは発現が促進されたことによると判断した。したがって、ヘムエクスポーターをコードすると知られたｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現させると、細胞外へのヘムの分泌がさらに促進され、その結果、細胞内におけるフリーヘムによる毒性が減少して、ヘム生産量も増加するはずであると判断し、ｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現させる方法を試した。
【００４２】
したがって、本発明は、他の観点において、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生産するＣ５生合成経路に関与する遺伝子と、ＡＬＡからヘムを合成する経路に関与する遺伝子が過発現されていて、ヘムエクスポーター（ｈｅｍｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子が過発現されていることによって、ヘムを細胞外へ分泌させることができる微生物変異体を培養してヘムを生成させるステップと、前記生成されたヘムを回収するステップと、を含むことを特徴とするヘムの製造方法に関する。
【００４３】
本発明の一態様では、前記ヘム生成変異大腸菌菌株で、ヘムエクスポーターをコードするｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現させた菌株を、（ＮＨ４）２ＳＯ４の存在下で流加培養した結果、培養６４時間に１１４．７９ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち７１．９１ｍｇ／Ｌ（６２．６４％）のヘムが細胞外で確認された。
【００４４】
本発明の他の態様では、本発明の菌株を、ｇｌｕｔａｍａｔｅの存在下で流加培養した結果、培養７２時間に２４６．６９ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１６４．１２ｍｇ／Ｌ（６６．５３％）のヘムが細胞外で確認された。
【００４５】
本発明の微生物変異体を用いたヘムの生産では、一実施例において、前駆体の添加有無によって、１１４．７９ｍｇ／Ｌまたは２４６．６９ｍｇ／Ｌのヘムが生産された。これは、従来のヘム生成大腸菌変異体が６．４ｍｇ／Ｌのヘムを生成していたことに比べて、それぞれ１７．９倍または３８．５倍の収率を示すことである。
【００４６】
また、本発明では、微生物のヘム生産量が増加するにつれて、細胞外ヘムの割合も増加するということを最初に確認し、ヘムエクスポーター遺伝子ｃｃｍＡＢＣを過発現させる場合、細胞外ヘムの割合が増加するだけでなく、細胞全体のヘム生産量が増加するということを最初に確認した。
【００４７】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４８】
本実施例および下記実施例において使用した制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国）およびＥｎｚｙｎｏｍｉｃｓ（大韓民国）から、ＰＣＲ重合酵素はＢＩＯＦＡＣＴ（大韓民国）から、ＤＮＡ連結酵素（ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）はＥｌｐｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（大韓民国）からそれぞれ購入した。それ以外については、別に示した。
【００４９】
実施例１：高効率でヘムを生産するためのＡＬＡ生合成経路の選定
１−１：Ｃ４およびＣ５  ＡＬＡ生合成遺伝子を発現するベクター（ｐＲＳＦ−Ｃ４およびｐＲＳＦ−Ｃ５）の製作
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）(Studier et al.,, J. Mol. Biol. 189:113-130, 1986)でＣ４およびＣ５  ＡＬＡ生合成遺伝子を発現することができるベクターｐＲＳＦ−Ｃ４およびｐＲＳＦ−Ｃ５を、次のような過程を経て製作した。
【００５０】
Ｃ４  ＡＬＡ生合成遺伝子を発現することができるベクターｐＲＳＦ−Ｃ４は、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクター(Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国)に、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１から由来したアミノレブリン酸シンターゼ（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＡＬＡＳ）の遺伝子（ｈｅｍＡＲｓｐ）とＥ．ｃｏｌｉから由来したｍａｅＢおよびｃｏａＡ遺伝子を挿入して製作した。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１から由来したｈｅｍＡＲｓｐ遺伝子を増幅するために、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）に基づいてコドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｈｅｍＡＲｓｐ遺伝子（配列番号１）を合成して（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）テンプレートを準備し、配列番号２および配列番号３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。Ｅ．ｃｏｌｉから由来したｍａｅＢ（配列番号４）およびｃｏａＡ遺伝子（配列番号５）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、それぞれ配列番号６と配列番号７のプライマー、および配列番号８と配列番号９のプライマーを用いて増幅した。
【００５１】
この際、増幅過程で用いた配列番号７のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅されたｃｏａＡ遺伝子の５’末端にＲＢＳの配列が添加された。
【００５２】
【表１】
2020509740.tif 000003
【００５３】
増幅した配列は、それぞれＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ、ＳａｃＩとＳａｌＩ、そしてＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に順に挿入することで、最終的にｐＲＳＦ−Ｃ４を製作した。
【００５４】
Ｃ５  ＡＬＡ生合成遺伝子を発現することができるベクターｐＲＳＦ−Ｃ５は、Ｅ．ｃｏｌｉから由来したｇｌｔＸ（配列番号１０）、ｈｅｍＬ（配列番号１１）、およびネガティブフィードバック抵抗性ｈｅｍＡ（ｈｅｍＡｆｂｒ）遺伝子（配列番号１２）を挿入して製作した。各遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、それぞれ配列番号１３と配列番号１４のプライマー、配列番号１５と配列番号１６のプライマー、および配列番号１７と配列番号１８のプライマーを用いて増幅した。
【００５５】
この際、増幅過程で用いた配列番号１５のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅された ｈｅｍＬ 遺伝子の５’末端にＲＢＳの配列が添加された。また、配列番号１７のプライマーに含まれたスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）とロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）をコードする塩基配列により、ＢＬ２１（ＤＥ３）由来のｈｅｍＡ遺伝子がネガティブフィードバック抵抗性ｈｅｍＡ（ｈｅｍＡｆｂｒ）に転換された。
【００５６】
【表２】
2020509740.tif 000004
【００５７】
増幅したｇｌｔＸ、ｈｅｍＡｆｂｒ、ｈｅｍＬ遺伝子配列は、それぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩ、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、そしてＳａｃＩとＮｏｔＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に順に挿入することで、最終的にｐＲＳＦ−Ｃ５を製作した。
【００５８】
１−２：Ｃ４およびＣ５  ＡＬＡ生合成遺伝子を過発現したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のＡＬＡ生産能の比較
Ｃ４およびＣ５  ＡＬＡ生合成経路を導入した菌株に、各経路が用いる前駆体（Ｃ４  ＡＬＡ生合成経路の場合、ｇｌｙｃｉｎｅとｓｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路の場合、ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を供給せずに培養した際に、ＡＬＡ生産能を比較するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に、実施例１−１で製作したｐＲＳＦ−Ｃ４およびｐＲＳＦ−Ｃ５ベクターをそれぞれ導入してＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ４菌株およびＣ５菌株を製作した（表３）。陰性対照群としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた（表３）。
【００５９】
【表３】
2020509740.tif 000005
【００６０】
表３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で、１２時間培養した。前記菌株を用いてＡＬＡを生産するために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した同一培地５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）でＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間培養した。
【００６１】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告されている方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)により、サンプルを前処理および分析した。その結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株（陰性対照群）とＣ４菌株およびＣ５菌株で、それぞれ０．０２ｇ／Ｌ、０．３１ｇ／Ｌ、および１．７４ｇ／ＬのＡＬＡが生産され、前駆体を供給しない場合、Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路が、Ｃ４  ＡＬＡ生合成経路よりも５倍以上高いＡＬＡを生産すると示された（図２（ａ））。したがって、これから、ヘム生産菌株を製作するに際し、ＡＬＡの生合成のためにＣ５  ＡＬＡ生合成経路を用いると決定した。
【００６２】
実施例２：Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路を導入したヘム生産菌株の製作
２−１：ヘム生産のための過発現標的遺伝子の選定
ＡＬＡ生合成経路を介して生産されたＡＬＡからヘムを生産するには、ｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、ｈｅｍＧ、ｈｅｍＨ遺伝子から発現された酵素が必要である（図１）。Ｅ．ｃｏｌｉは、内在的に前記遺伝子を有しているため、野生型菌株もヘムを生産することができるが、生存に必須な分のヘムのみを生産するため、生産されたヘムは、殆どがタンパク質と結合した形態で存在する。そのため、野生型菌株では、フリーヘムを検出しにくい。したがって、フリーヘムを過生産するためには、前記遺伝子を過発現させ、ＡＬＡからヘムを生産するのに含まれる代謝の流れを増加させるべきである。しかし、前記遺伝子を全て過発現させる場合、タンパク質の過度な過発現により、ヘム生産菌株の代謝に過負荷が発生し得ると判断した。したがって、ヘムを過生産するにあたり、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の固有の発現強度が十分でないため追加的な過発現が必須な遺伝子のみを選定し、最小限のヘム生合成遺伝子のみを選択的に過発現させることで、タンパク質の過発現による菌株の過負荷を最小化し、ヘムの過生産を極大化することとした。
【００６３】
（ａ）ヘムの生産のためのｈｅｍＢおよびｈｅｍＨ遺伝子の過発現必要性の確認
ヘム生合成遺伝子のうち、ｈｅｍＢ遺伝子（配列番号１９）およびｈｅｍＨ遺伝子（配列番号２０）を過発現させる場合、ヘムの生産に前駆体として用いられるＡＬＡの生産量が減少し(Zhang et al., Sci. Rep. 5, 8584, 2015)、逆に、前記２つの遺伝子の発現量を減少させる場合、ＡＬＡからヘムを生産する代謝経路の代謝量が減少するという報告がある(Li et al., FEMS Microbiol. Lett. 350, 209-215, 2014)。したがって、効果的なヘムの過生産のためには、ｈｅｍＢおよびｈｅｍＨ遺伝子の過発現が必須であると判断した。
【００６４】
前記２つの遺伝子を過発現し、且つＣ５  ＡＬＡ生合成経路を過発現させるプラスミドと干渉を起こさないベクターｐＥＴ−ｈｅｍＢＨは、次のような過程を経て製作した。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＢとｈｅｍＨ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号２１と配列番号２２のプライマーおよび配列番号２３および配列番号２４のプライマーを用いた。
【００６６】
【表４】
2020509740.tif 000006
【００６７】
増幅した配列は、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター(Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国)にそれぞれ挿入することで、ｐＥＴ−ｈｅｍＢおよびｐＥＴ−ｈｅｍＨを製作した。
【００６８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡから配列番号２５と配列番号２６のプライマーを用いてｈｅｍＢ遺伝子を増幅し、増幅した配列は、それぞれ ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴ−ｈｅｍＨベクターに挿入することで、最終的にｐＥＴ−ｈｅｍＢＨを製作した。
【００６９】
NcoIとBamHI
【表５】
2020509740.tif 000007
【００７０】
前記製作したｐＥＴ−ｈｅｍＢ、ｐＥＴ−ｈｅｍＨ、およびｐＥＴ−ｈｅｍＢＨを組換えＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ５菌株にそれぞれ導入することで、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ５−Ｂ、Ｃ５−Ｈ、およびＣ５−ＢＨ菌株を製作した（表６）。
【００７１】
【表６】
2020509740.tif 000008
【００７２】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡ、ヘム、およびヘム生合成中間体（ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ、ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ、ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ）の生産プロフィールを確認するために、表６に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O)５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【００７３】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告された方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)によりサンプルを前処理および分析した。
【００７４】
また、ヘム生産量を確認するために、各培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法により、ヘムの濃度を測定した(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)。
【００７５】
ヘム生合成中間体の確認には、ヘム生産量の確認に用いたものと同一のサンプルを使用し、ＨＰＬＣ−ＭＳを用いる従来に報告された方法(Pranawidjaja et al., J. Microbiol.Biotechnol. 25, 880-886, 2015; Bu et al., J. Chromatogr. B Analyt.Technol. Biomed. Life Sci. 783, 411-423, 2003)を用いた。
【００７６】
その結果、予想通り、Ｃ５−ＢＨ菌株が、他の２つの菌株に比べて多量のヘム生合成中間体であるｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩおよびｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩを生産した（表７）。また、Ｃ５−ＢおよびＣ５−Ｈに比べて、Ｃ５−ＢＨでより少量のＡＬＡが確認された。しかし、表６に記載の３つの菌株の何れでも、フリーヘムは検出されなかった。
【００７７】
【表７】
2020509740.tif 000009
【００７８】
（ｂ）ヘムの過生産のためのｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、およびｈｅｍＧ遺伝子の過発現必要性の確認
ヘム生合成遺伝子において、ｈｅｍＢおよびｈｅｍＨ遺伝子を除いた残りの５つの遺伝子(ｈｅｍＣ (配列番号 ２７), ｈｅｍＤ (配列番号 ２８), ｈｅｍＥ (配列番号 ２９), ｈｅｍＦ (配列番号 ３０), およびｈｅｍＧ (配列番号 ３１)) のうち、ヘムの過生産のために必須に過発現させるべき遺伝子を選別するために、Ｃ５−ＢＨ菌株で前記５つの遺伝子をそれぞれ過発現させた後、ヘムの生産およびヘム生合成中間体の生産のプロフィールを分析した。前記５つの遺伝子をそれぞれ過発現させるプラスミドｐＣＤＦ-ｈｅｍＣ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＤ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＥ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＦ、およびｐＣＤＦ-ｈｅｍＧを、次のような過程を経て製作した。
【００７９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、およびｈｅｍＧ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号３２と配列番号３３のプライマー、配列番号３４と配列番号３５のプライマー、配列番号３６と配列番号３７のプライマー、配列番号３８と配列番号３９のプライマー、および配列番号４０と配列番号４１のプライマーを用いた。
【００８０】
【表８】
2020509740.tif 000010
【００８１】
増幅した配列は、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、およびＮｃｏＩとＳａｃＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター(Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国)にそれぞれ挿入することで、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＣ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＤ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＥ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＦ、およびｐＣＤＦ-ｈｅｍＧを製作した。
【００８２】
前記製作したｐＣＤＦ-ｈｅｍＣ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＤ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＥ、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＦ、およびｐＣＤＦ-ｈｅｍＧを組換えＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ５-ＢＨ菌株にそれぞれ導入することで、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ５−ＢＣＨ、Ｃ５−ＢＤＨ、Ｃ５−ＢＥＨ、Ｃ５−ＢＦＨ、およびＣ５−ＢＧＨ菌株を製作した（表９）。
【００８３】
【表９】
2020509740.tif 000011
【００８４】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡ、ヘム、およびヘム生合成中間体（ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ、ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩ、ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ）の生産プロフィールを確認するために、表９に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，７．５  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【００８５】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告された方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)によりサンプルを前処理および分析した。
【００８６】
また、ヘム生産量を確認するために、各培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法により、ヘムの濃度を測定した(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)。
【００８７】
ヘム生合成中間体の確認には、ヘム生産量の確認に用いたものと同一のサンプルを使用し、ＨＰＬＣ−ＭＳを用いる従来に報告された方法(Pranawidjaja et al., J. Microbiol.Biotechnol. 25, 880-886, 2015; Bu et al., J. Chromatogr. B Analyt.Technol. Biomed. Life Sci. 783, 411-423, 2003)を用いた。
【００８８】
その結果、前記５つの菌株では、何れもヘムが検出されなかったが（図２ｂ）、Ｃ５−ＢＨ菌株（表７）に比べて、Ｃ５−ＢＣＨおよびＣ５−ＢＤＨ菌株ではｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩの信号が、Ｃ５−ＢＤＨ、Ｃ５−ＢＥＨ、およびＣ５−ＢＦＨ菌株ではｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＩＩの信号がさらに高く検出された。特に、Ｃ５−ＢＤＨ菌株では、Ｃ５−ＢＨ菌株では検出されなかったｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸが検出された。前記結果に基づき、効果的なヘムの過生産のために、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、およびｈｅｍＦ遺伝子の過発現が必須であるという結論を得た。
【００８９】
【表１０】
2020509740.tif 000012
【００９０】
これに対し、Ｃ５−ＢＧＨ菌株は、Ｃ５−ＢＨ菌株（表７）に比べて、ＡＬＡおよびヘム生合成中間体の生産量において著しい差が認められなかった（表１０）。ヘムの過生産のためにｈｅｍＧの過発現が必須であるかを再び確認するために、Ｃ５−ＢＨ菌株をベースとしてｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、およびｈｅｍＦ遺伝子を過発現させる菌株ＨＥＭＥ１と、Ｃ５−ＢＨ菌株をベースとしてｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、およびｈｅｍＧ遺伝子を全て過発現させる菌株ＨＥＭＥ２を次のような過程を経て製作した。
【００９１】
前記ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、およびｈｅｍＦ遺伝子を過発現させるプラスミドｐＣＤＦ-ｈｅｍＣＤＥＦを、次のような過程を経て製作した。
【００９２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、およびｈｅｍＦ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号４２と配列番号４３のプライマー、配列番号４４と配列番号４５のプライマー、配列番号４６と配列番号４７のプライマー、および配列番号４８と配列番号４９のプライマーを用いた。 
【００９３】
この際、増幅過程で用いた 配列番号４４と配列番号４８のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅されたｈｅｍＤおよびｈｅｍＦ遺伝子の５´末端にＲＢＳの配列が添加された。
【００９４】
【表１１】
2020509740.tif 000013
【００９５】
増幅した配列は、ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩ、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ、ＮｃｏＩとＳａｃＩ、およびＳａｃＩとｐｓｔＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター(Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国)に順に挿入することで、ｐＣＤＦ-ｈｅｍＣＤＥＦを製作した。 
【００９６】
前記ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、およびｈｅｍＧ遺伝子を過発現させるプラスミドｐＣＤＦ-ｈｅｍＣＤＥＦＧを、次のような過程を経て製作した。
【００９７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＧ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号５０と配列番号５１のプライマーを用いた。この際、増幅過程で用いた 配列番号５０のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅されたｈｅｍＧ遺伝子の５´末端にＲＢＳの配列が添加された。
【００９８】
【表１２】
2020509740.tif 000014
【００９９】
増幅した配列は、ｐｓｔＩとＮｃｏＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＣＤＦ−ベクター(Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国)に挿入することで、最終的にプラスミドｐＣＤＦ-ｈｅｍＣＤＥＦＧを製作した。
【０１００】
前記製作したｐＣＤＦ-ｈｅｍＣＤＥＦおよびｐＣＤＦ-ｈｅｍＣＤＥＦＧを組換えＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ５-ＢＨ菌株にそれぞれ導入することで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ１およびＨＥＭＥ２菌株を製作した（図２（ｃ）および表１３)）。
【０１０１】
【表１３】
2020509740.tif 000015
【０１０２】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡおよびヘムの生産プロフィールを確認するために、表１３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O)５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【０１０３】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、サンプルを前処理および分析した。
【０１０４】
また、ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを用いてヘムの濃度を測定した。
【０１０５】
その結果、ＨＥＭＥ１およびＨＥＭＥ２菌株で、それぞれ０．１４ｍｇ／Ｌおよび０．５３ｍｇ／Ｌのヘムが検出された（図３）。ＨＥＭＥ１菌株に比べて、ｈｅｍＧを追加で過発現させたＨＥＭＥ２菌株で３倍以上のヘムがより多く生産されたことから、効果的なヘムの過生産のために、Ｃ５−ＢＨ菌株でｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、およびｈｅｍＧ遺伝子を全て過発現させるべきであるという結論を得た。
【０１０６】
２−２：ヘムの増産のためのヘム生合成遺伝子の過発現レベルの調整
実施例２−１で製作したＨＥＭＥ２のＡＬＡ生産量（３０８ｍｇ／Ｌ）が、ヘム生産量（０．５３ｍｇ／Ｌ）より著しく高いことから、ＡＬＡ生合成経路の代謝の流れが過度であると判断した。菌株で過発現させることができるタンパク質の総量が有限であるという判断下、過度なタンパク質の過発現を減らすことで、不足なタンパク質の過発現を増進させてヘムを増産するために、次のような過程を経て、相対的に不足なＡＬＡからヘムを生産する経路の代謝量を増進させ、相対的に過度なＡＬＡ生産経路の代謝量を減少させることにより、ヘムを増産した。
【０１０７】
（ａ）プラスミドｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬの製作
プラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔ−１よりもプラスミド複製数が少ないプラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−１(Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国)をベースとし、Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路の遺伝子を過発現することで、ｐＲＳＦ−Ｃ５を利用する場合に比べてＡＬＡ生合成遺伝子の発現量を減少させ、結果として、該当経路の代謝量も低めるようにした。また、Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路で、グルタメートをｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡに転換するｇｌｕｔａｍｙｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧｌｕＲＳ）の遺伝子ｇｌｔＸを過発現させないことにより、他のタンパク質の過発現量が増進されるようにした。ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１をベースとし、Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路を過発現させるプラスミドｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬを次のような過程を経て製作した。
【０１０８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＬおよびネガティブフィードバック抵抗性ｈｅｍＡ（ｈｅｍＡｆｂｒ） 遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号１５と配列番号１６のプライマーおよび配列番号１７および配列番号１８のプライマーを用いた。
【０１０９】
この際、増幅過程で用いた配列番号１５のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅された ｈｅｍＬ 遺伝子の５´末端にＲＢＳの配列が添加された。また、配列番号１７のプライマーに含まれたスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）とロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）をコードする塩基配列により、ＢＬ２１（ＤＥ３）由来のｈｅｍＡ遺伝子がネガティブフィードバック抵抗性ｈｅｍＡ（ｈｅｍＡｆｂｒ）に転換された。
【０１１０】
増幅した配列は、それぞれＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、およびＳａｃＩとＮｏｔＩ で切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に順に挿入することで、最終的にｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬ を製作した。
【０１１１】
（ｂ）プラスミドｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤの製作
プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１よりもプラスミド複製数が多いプラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔ−１をベースとし、ＡＬＡからヘムを生産する代謝経路の上流部に関与する遺伝子ｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤを過発現することで、ＡＬＡからヘムを生産する代謝経路の流れが増進されるようにした。ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１をベースとし、ｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ遺伝子を過発現させるプラスミドｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤを次のような過程を経て製作した。
【０１１２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号２５と配列番号２６のプライマー、配列番号４２と配列番号４３のプライマー、および配列番号４４と配列番号４５のプライマーを用いた。
【０１１３】
この際、増幅過程で用いた配列番号４４のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅された ｈｅｍＤ遺伝子の５´末端にＲＢＳの配列が添加された。 
【０１１４】
増幅した配列は、それぞれＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩ、および ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に順に挿入することで、最終的にｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤを製作した。 
【０１１５】
（ｃ）プラスミドｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨの製作
プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−１よりもプラスミド複製数が多いプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１をベースとし、ＡＬＡからヘムを生産する代謝経路下流部に関与する遺伝子ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、ｈｅｍＧ、およびｈｅｍＨを過発現することで、ＡＬＡからヘムを生産する代謝経路の流れが増進されるようにした。ｐＥＴＤｕｅｔ−１をベースとし、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、ｈｅｍＧ、およびｈｅｍＨ遺伝子を過発現させるプラスミドｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨを次のような過程を経て製作した。 
【０１１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、ｈｅｍＧ、およびｈｅｍＨ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号４６と配列番号４７のプライマー、配列番号４８と配列番号４９のプライマー、配列番号５０と配列番号５１のプライマー、および配列番号２３と配列番号２４のプライマーを用いた。 
【０１１７】
この際、増幅過程で用いた配列番号４８と配列番号５０のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅されたｈｅｍＦおよびｈｅｍＧ遺伝子の５´末端にＲＢＳの配列が添加された。
【０１１８】
増幅した配列は、それぞれＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩとＳａｃＩ、ＳａｃＩとｐｓｔＩ、ｐｓｔＩとＮｏｔＩ 、およびＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に順に挿入することで、ｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨを製作した。 
【０１１９】
（ｄ）組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ３の製作
前記製作したプラスミドｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬ、ｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤ、およびｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にともに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ３菌株を製作した（図２の（ｄ）および表１４）。
【０１２０】
【表１４】
2020509740.tif 000016
【０１２１】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡおよびヘムの生産プロフィールを確認するために、表１４に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，７．５  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【０１２２】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告された方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)によりサンプルを前処理および分析した。
【０１２３】
また、ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１２４】
その結果、ＨＥＭＥ２菌株(０. ５３ｍｇ／Ｌ)に比べて、ＨＥＭＥ３菌株ではヘム生産量が３．７９ｍｇ／Ｌに増産された（図２（ｄ）および図３）。すなわち、ヘム生合成経路遺伝子の発現量を調整することで、ヘムを増産することができた。
【０１２５】
実施例３：ヘムの増産のための競争代謝回路の欠失
ヘムの増産のために、ヘム生合成経路と競争関係にある代謝経路を欠失させることができる。先ず、ぶどう糖からＣ５  ＡＬＡ生合成経路の前駆体であるグルタメート(ｇｌｕｔａｍａｔｅ）までの代謝の流れを増加させるために、該当過程の代謝産物が酢酸や乳酸などの副産物に転換されることを防ぐことができる。また、生成されたヘムが分解されることを防ぐことで、ヘムの生産量を高めることができる。
【０１２６】
３−１：ヘムの増産のためのｌｄｈＡおよびｐｔａ遺伝子の欠失
Ｃ５  ＡＬＡ生合成経路を用いる本発明の菌株内でぶどう糖がグルタメートに転換される収率および代謝量を高めるために、該当過程の代謝産物であるピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ）およびアセチル−ＣｏＡがそれぞれ乳酸および酢酸に転換されることを防ぐ必要がある。ピルベートを乳酸に転換するのに関与するｌｄｈＡ遺伝子、およびアセチル−ＣｏＡを酢酸に転換するのに関与するｐｔａ遺伝子を欠失させることで、グルタメートの生産量を高めることができるという従来の報告(Vuoristo et al., AMB Express 5, 61, 2015)にしたがって、次のような過程を経てＨＥＭＥ３からｌｄｈＡおよびｐｔａ遺伝子を欠失させた。
【０１２７】
（ａ）遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の製作
従来に報告されたλ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ技法(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を用いて、ｌｄｈＡおよびｐｔａ遺伝子を欠失させるために、遺伝子欠失に必要なＤＮＡ断片を製作した。プラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘ(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)からｌｄｈＡ遺伝子を欠失させるのに用いるべきのＤＮＡ断片（ΔｌｄｈＡ：：ｃａｔ）と、ｐｔａ遺伝子を欠失させるのに用いるべきのＤＮＡ断片（Δｐｔａ：：ｃａｔ）を増幅するために、それぞれ配列番号５２と配列番号５３のプライマーおよび配列番号５４と配列番号５５のプライマーを用いた。
【０１２８】
【表１５】
2020509740.tif 000017
【０１２９】
（ｂ）ＢＬ２１（ＤＥ３）からｌｄｈＡ遺伝子の欠失
前記製作したＤＮＡ断片を用いてｌｄｈＡ遺伝子を欠失させるために、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を導入した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養した菌体および培地１ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのアラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）が添加された１００ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、ＯＤ６００が約０．６に達するまで、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体は回収後、０℃に冷却された１０％のグリセロールで２回洗浄した後、同水溶液１５０μＬにさらに解離した。その後、穿孔法により前記製作したｌｄｈＡ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（ΔｌｄｈＡ：：ｃａｔ）を前記菌体に導入した後、ｌｄｈＡ遺伝子が欠失されながらｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）が導入されたコロニを、８．５μｇ／ｍＬのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌが含まれたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，  １０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で、３７℃で培養して選別した。
【０１３０】
コロニの選別のための３７℃培養中に、前記選別されたコロニからプラスミドｐＫＤ４６が除去されたことを確認した後、さらにプラスミドｐＪＷ１６８（Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２３，５５−６６、１９９８）をコロニに導入し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧが添加されたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で３０℃で培養し、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）を除去した。製作された菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡ（表１６）において、ｌｄｈＡ遺伝子の欠失はシーケンシングにより確認した。
【０１３１】
【表１６】
2020509740.tif 000018
【０１３２】
（ｃ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡからｐｔａ遺伝子の欠失
前記製作したＤＮＡ断片を用いてｐｔａ遺伝子を欠失させるために、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を導入した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養した菌体(the cultured cells)および培地１ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのアラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）が添加された１００ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、ＯＤ６００が約０．６に達するまで、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体（ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ）は回収後、０℃に冷却された１０％のグリセロールで２回洗浄した後、同水溶液１５０μＬにさらに解離した。その後、穿孔法により前記製作したｐｔａ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（Δｐｔａ：：ｃａｔ）を前記菌体に導入した後、ｐｔａ遺伝子が欠失されながらｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）が導入されたコロニを、８．５μｇ／ｍＬのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌが含まれたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，  ５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で、３７℃で培養して選別した。
【０１３３】
コロニの選別のための３７℃培養中に、前記選別されたコロニからプラスミドｐＫＤ４６が除去されたことを確認した後、さらにプラスミドｐＪＷ１６８（Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２３，５５−６６、１９９８）をコロニに導入し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧが添加されたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で３０℃で培養し、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）を除去した。製作された菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δｐｔａ ΔｌｄｈＡにおいて、ｐｔａ遺伝子の欠失はシーケンシングにより確認した。
【０１３４】
【表１７】
2020509740.tif 000019
【０１３５】
（ｄ）組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ５の製作
前記表１７に記載の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δｐｔａ ΔｌｄｈＡに実施例２−２で製作したｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬ、 ｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤ、およびｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨをともに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ５菌株を製作した（表１８）。
【０１３６】
【表１８】
2020509740.tif 000020
【０１３７】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡおよびヘムの生産プロフィールを確認するために、表１４に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，７．５  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【０１３８】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告された方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)によりサンプルを前処理および分析した。
【０１３９】
また、ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１４０】
その結果、ＨＥＭＥ３菌株(３. ７９ ｍｇ／Ｌ)に比べて、ＨＥＭＥ５菌株ではヘム生産量が４．１７ｍｇ／Ｌに増産された（図３）。
【０１４１】
３−２：ヘムの増産のためのｙｆｅＸ遺伝子の欠失
従来の研究で、ｙｆｅＸ遺伝子から発現されたタンパク質が、ヘムからＦｅ２＋イオンを除去するヘムデケラターゼ（ｈｅｍｅ  ｄｅｃｈｅｌａｔａｓｅ）であるという報告(Letoffe et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 106, 11719-11724, 2009)があったが、他の報告では、ｙｆｅＸ遺伝子の発現産物がヘムデケラターゼ（ｈｅｍｅ  ｄｅｃｈｅｌａｔａｓｅ）ではなく、ポルフィリノーゲン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ）をポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）に転換するペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）であると報告されている(Dailey et al., mBio 2, e00248-00211, 2011)。しかし、さらに他の研究では、ｙｆｅＸ遺伝子を過発現させる場合、ヘム恒常性が崩れると報告された(Turlin et al., Microbiology Open 3, 849-859, 2014)。ｙｆｅＸ遺伝子の正確な機能はまだ明らかになっていないが、ｙｆｅＸ遺伝子を欠失させた際に、ヘムが増産される可能性があると判断し、ｙｆｅＸ遺伝子の欠失がヘム生産量に及ぶ影響を次のような過程を経て確認した。
【０１４２】
（ａ）遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の製作
従来に報告されたλ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ技法(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を用いて、ｙｆｅＸ遺伝子を欠失させるために、遺伝子欠失に必要なＤＮＡ断片を製作した。プラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘ(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)からｙｆｅＸ遺伝子を欠失させるのに用いるべきのＤＮＡ断片（ΔｙｆｅＸ：：ｃａｔ）を増幅するために、それぞれ配列番号５６と配列番号５７のプライマーを用いた。
【０１４３】
【表１９】
2020509740.tif 000021
【０１４４】
（ｂ）ＢＬ２１（ＤＥ３）からｙｆｅＸ遺伝子の欠失
前記製作したＤＮＡ断片を用いてｙｆｅＸ遺伝子を欠失させるために、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を導入した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養した菌体および培地１ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのアラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）が添加された１００ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、ＯＤ６００が約０．６に達するまで、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体は回収後、０℃に冷却された１０％のグリセロールで２回洗浄した後、同水溶液１５０μＬにさらに解離した。その後、穿孔法により前記製作したｙｆｅＸ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（ΔｙｆｅＸ：：ｃａｔ）を前記菌体に導入した後、ｙｆｅＸ遺伝子が欠失されながらｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）が導入されたコロニを、８．５μｇ／ｍＬのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌが含まれたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で、３７℃で培養して選別した。
【０１４５】
コロニの選別のための３７℃培養中に、前記選別されたコロニからプラスミドｐＫＤ４６が除去されたことを確認した後、さらにプラスミドｐＪＷ１６８（Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２３，５５−６６、１９９８）をコロニに導入し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧが添加されたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で３０℃で培養し、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）を除去した。製作された菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｙｆｅＸ（ 表２０）において、ｙｆｅＸ遺伝子の欠失はシーケンシングにより確認した。
【０１４６】
【表２０】
2020509740.tif 000022
【０１４７】
（ｃ）組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ４の製作
前記表２０に記載の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｙｆｅＸに実施例２−２で製作したｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬ、 ｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤ、およびｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨをともに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ５菌株を製作した（表２１）。
【０１４８】
【表２１】
2020509740.tif 000023
【０１４９】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡおよびヘムの生産プロフィールを確認するために、表２１に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，７．５  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【０１５０】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告された方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)によりサンプルを前処理および分析した。
【０１５１】
また、ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１５２】
その結果、ＨＥＭＥ３菌株(３. ７９ ｍｇ／Ｌ)に比べて、ＨＥＭＥ４菌株ではヘム生産量が６．２１ｍｇ／Ｌに増産された（図３）。
【０１５３】
３−３：ヘムの増産のためのｐｔａ、ｌｄｈＡ、およびｙｆｅＸ遺伝子の欠失
実施例３−１および３−２に記載のように、ＨＥＭＥ３菌株（３．７９ｍｇ／Ｌ）に比べて、ｐｔａおよびｌｄｈＡ遺伝子を欠失させた菌株ＨＥＭＥ５（４．１７ｍｇ／ｍＬヘム）と、ｙｆｅＸ遺伝子を欠失させた菌株ＨＥＭＥ４（６．２１ｍｇ／ｍＬヘム）で、ヘムが増産された。したがって、実施例３−１および実施例３−２の遺伝子欠失戦略をともに用いる場合、ヘムを追加増産できるかを確認するために、前記３種類の遺伝子を全て欠失させた菌株を次のような過程を経て確認した。
【０１５４】
（ａ）遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の製作
従来に報告されたλ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ技法(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を用いて、ｙｆｅＸ遺伝子を欠失させるために、遺伝子欠失に必要なＤＮＡ断片を製作した。プラスミドｐＥＣｍｕｌｏｘ(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)からｙｆｅＸ遺伝子を欠失させるのに用いるべきのＤＮＡ断片（ΔｙｆｅＸ：：ｃａｔ）を増幅するために、それぞれ配列番号５６と配列番号５７のプライマーを用いた。 
【０１５５】
（ｂ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐＬからｙｆｅＸ遺伝子の欠失
前記製作したＤＮＡ断片を用いてｙｆｅＸ遺伝子を欠失させるために、ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐＬ菌株にプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)を導入した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加された５ｍＬのＬＢ培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養した菌体(the cultured cells)および培地１ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのアラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）が添加された１００ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、ＯＤ６００が約０．６に達するまで、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体(the cultured cells)は回収後、０℃に冷却された１０％のグリセロールで２回洗浄した後、同水溶液１５０μＬにさらに解離した。その後、穿孔法により前記製作したｙｆｅＸ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（ΔｙｆｅＸ：：ｃａｔ）を前記菌体に導入した後、ｙｆｅＸ遺伝子が欠失されながらｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）が導入されたコロニを、８．５μｇ／ｍＬのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌが含まれたＬＢ−ａｇａｒ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１５ｇ／Ｌ  ａｇａｒ）上で、３７℃で培養して選別した。
【０１５６】
コロニの選別のための３７℃培養中に、前記選別されたコロニからプラスミドｐＫＤ４６が除去されたことを確認した後、さらにプラスミドｐＪＷ１６８（Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２３，５５−６６、１９９８）をコロニに導入し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧが添加されたＬＢ−ａｇａｒ培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)上で３０℃で培養し、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ｃａｔ）を除去した。製作された菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δｐｔａ ΔｌｄｈＡ ΔｙｆｅＸ（表２２）において、ｙｆｅＸ遺伝子の欠失はシーケンシングにより確認した。
【０１５７】
【表２２】
2020509740.tif 000024
【０１５８】
（ｃ）組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ６の製作
前記表２２に記載の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δｐｔａ ΔｌｄｈＡ ΔｙｆｅＸ に実施例２−２で製作したｐＣＤＦ−ｈｅｍＡＬ、 ｐＲＳＦ−ｈｅｍＢＣＤ、およびｐＥＴ−ｈｅｍＥＦＧＨをともに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ６菌株を製作した（図２（ｅ）および表２３）。
【０１５９】
【表２３】
2020509740.tif 000025
【０１６０】
前記製作したＥ．ｃｏｌｉ菌株のＡＬＡおよびヘムの生産プロフィールを確認するために、表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、同一の抗生剤が含まれたＬＢ−Ｆｅ７．５培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O)５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。 
【０１６１】
前記培養後、ＡＬＡ生産量を分析するためにサンプルを取った後、既に報告された方法(Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)によりサンプルを前処理および分析した。
【０１６２】
また、ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１６３】
その結果、ＨＥＭＥ３菌株(３. ７９ ｍｇ／Ｌ)、ＨＥＭＥ５菌株（４．１７ｍｇ／ｍＬ）、およびＨＥＭＥ４（６．２１ｍｇ／ｍＬ）に比べて、ＨＥＭＥ６菌株ではヘム生産量が７．１３ｍｇ／Ｌに増産された（図２（ｅ）および図３）。
【０１６４】
実施例４：ヘムの増産のための培養条件の最適化
４−１：ヘム生産培地の最適化：基本培地組成の選別
実施例３で製作したＨＥＭＥ６菌株のヘム生産量を追加増産させるために、菌株の培養に用いる培地の組成を最適化した。ＬＢ培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)、ＴＢ培地(16.43g/L K2HPO4・3H20, 2.31g/L, KH2PO4, 4g/L glycerol, 12g/L tryptone 12g/L, 24g/L yeast extract 24g/L)、およびＭＲ−Ｆｅ０培地(6.67g/L KH2PO4, 4g/L (NH4)2HPO4, 0.8g/L MgSO47H2O, 0.8g/L citric acid, 5 g/L yeast extract, 5 mL/L trace metal solution, pH7.0)に７．５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏを添加したＬＢ−Ｆｅ７．５、ＴＢ−Ｆｅ７．５、およびＭＲ−Ｆｅ７．５培地で、ＨＥＭＥ６菌株をそれぞれ培養してヘム生産量を測定した。 但し、trace metal solution Iの組成は、次のとおりである: 0.5 M HCl, 2g/L CaCl2, 2.2g/L ZnSO47H2O, 0.5g/L MnSO44H2O, 1g/L CuSO45H2O, 0.1g/L (NH4)6Mo7O244H2O, 0.02g/L Na2B4O710H2O.
【０１６５】
前記培地で培養されたＨＥＭＥ６菌株のヘムの生産プロフィールを確認するために、表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された前記６つの培地５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【０１６６】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１６７】
その結果、ＭＲ−Ｆｅ７．５培地でＨＥＭＥ６菌株を培養した場合（７．４５ｍｇ／Ｌ）に、最も多量のヘムが生産されることを確認した（図４）。
【０１６８】
４−２：ヘム生産培地の最適化：鉄イオン濃度の選別
実施例４−１で選別したＭＲ−Ｆｅ７．５培地でのヘム生産量と、ＭＲ−Ｆｅ０培地でのヘム生産量との差が著しく生じるという結果から、鉄イオンの濃度がヘム生産量に大きく影響するか否かを確認した。したがって、培地の鉄イオン濃度を最適化することで、ＨＥＭＥ６菌株のヘム生産量を追加増進させようとした。実施例４−１のＭＲ−Ｆｅ０培地を基準としてＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏをそれぞれ０、１０、２０、４０、６０、１００ｍｇ／Ｌ添加してＭＲ−Ｆｅ０、ＭＲ−Ｆｅ１０、ＭＲ−Ｆｅ２０、ＭＲ−Ｆｅ４０、ＭＲ−ＦＥ６０、ＭＲ−Ｆｅ１００培地を製作した。
【０１６９】
前記培地で培養されたＨＥＭＥ６菌株のヘムの生産プロフィールを確認するために、表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された前記６つの培地５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で菌体を培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間菌体を培養した。
【０１７０】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。 
【０１７１】
その結果、 ２０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏを含む場合(ＭＲ−Ｆｅ２０培)に、最も多量のヘムが生産された（図５）。
【０１７２】
４−３：培養温度の最適化
ＨＥＭＥ６菌株を用いてヘムを生産するにおいて、最適の培養温度を選定するために、次のような過程を経て菌株を培養した。
【０１７３】
表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリ（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地５０ｍＬに接種した後、２５０−ｍＬの三角フラスコでＯＤ６００が約０．６に達するまで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で菌体を培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培養培地に添加した後、２４℃、３０℃および３７℃、２００ｒｐｍの条件で７２時間菌体を培養し、添加後、 最初の２４時間は６時間おきに、以後には１２時間おきにサンプリングをした。 
【０１７４】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１７５】
その結果、菌体を１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で、３０℃で６０時間培養した場合に、最も多量（７．７８ｇ／Ｌ）のヘムが生産されたことを確認した（図６）。
【０１７６】
実施例５：回分発酵および流加培養式発酵による細胞外フリーヘムの生産
５−１：回分発酵による細胞外フリーヘムの生産
ヘムの生産のために、発酵器を用いた発酵を行った事例が報告されたことがないため、実施例４で最適化した培養条件に基づき、ＨＥＭＥ６菌株を用いた回分発酵を行った。
【０１７７】
表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地２００ｍＬに接種した後、５００−ｍＬの三角フラスコで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した。その後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２０ｇ／Ｌのぶどう糖が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地（ｐＨ７．０）１．８Ｌが、２００ｒｐｍの撹拌および２Ｌ／ｍｉｎ流速の空気供給により空気飽和された状態および３０℃で入れられている６．６−ＬのＢｉｏｆｌｏ３０００発酵器(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)に、前記培養体を接種した。発酵中の温度は３０℃に維持し、５０％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。また、空気飽和度は、撹拌速度を最大１０００ｒｐｍまで増加させ、初期空気飽和度の４０％程度を維持した。ＯＤ６００が５に達した時に１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ヘム生産量を分析するために８時間おきにサンプリングをした。
【０１７８】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備した培地および破砕したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１７９】
その結果、５６時間目に、最も多量である総１４．２４ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１．１８ｍｇ／Ｌのヘム（８．２９％）が培地で検出された。５６時間の間の全体生産性は０．２５ｍｇ／Ｌ／ｈであった（図７）。本実施例の回分発酵により、１ｍｇ／Ｌ以上の細胞外フリーヘムが検出できたということに大きい意義がある。
【０１８０】
５−２：流加培養式発酵による細胞外フリーヘムの生産
実施例５−１の回分発酵の結果に基づき、より多量のヘムを生産するために、流加培養式発酵を行った。
【０１８１】
表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地２００ｍＬに接種した後、５００−ｍＬの三角フラスコで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した。その後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２０ｇ／Ｌのぶどう糖が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地（ｐＨ７．０）１．８Ｌが、２００ｒｐｍの撹拌および２Ｌ／ｍｉｎ流速の空気供給により空気飽和された状態および３０℃で入れられている６．６−ＬのＢｉｏｆｌｏ３０００発酵器(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)に、前記培養体を接種した。発酵中の温度は３０℃に維持し、５０％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。また、空気飽和度は、撹拌速度を最大１０００ｒｐｍまで増加させ、初期空気飽和度の４０％程度を維持した。流加培養中にぶどう糖を供給し続けるために、ｐＨ調整技法を利用して流入溶液（７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）を供給した。ＯＤ６００が５に達した時に１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ヘム生産量を分析するために８時間おきにサンプリングをした。
【０１８２】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備した培地および破砕したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１８３】
その結果、５６時間目に、最も多量である総４９．１８ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１６．７７ｍｇ／Ｌのヘム（３４．１０％）が培地で検出された。ＯＤ６００は、３２時間目に最大値である６７．２に達した（図８（ａ））。
【０１８４】
５−３：（ＮＨ４）２ＳＯ４を供給した菌株の流加培養式発酵による細胞外フリーヘムの生産
ヘムの一分子を生産するのに４個の窒素原子が必要であるという事実に着目し、窒素源を供給することでヘムを増産できるはずであると判断した。仮説を検証するために、（ＮＨ４）２ＳＯ４を窒素源として供給して流加培養式発酵を行った。
【０１８５】
表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地２００ｍＬに接種した後、５００−ｍＬの三角フラスコで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した。その後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２０ｇ／Ｌのぶどう糖が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地（ｐＨ７．０）１．８Ｌが、２００ｒｐｍの撹拌および２Ｌ／ｍｉｎ流速の空気供給により空気飽和された状態および３０℃で入れられている６．６−ＬのＢｉｏｆｌｏ３０００発酵器(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)に、前記培養体を接種した。発酵中の温度は３０℃に維持し、５０％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。また、空気飽和度は、撹拌速度を最大１０００ｒｐｍまで増加させ、初期空気飽和度の４０％程度を維持した。流加培養中にぶどう糖を供給し続けるために、ｐＨ調整技法を利用して流入溶液（７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）を供給した。ＯＤ６００が５に達した時に１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ヘム生産量を分析するために８時間おきにサンプリングをした。
【０１８６】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備した培地および破砕したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１８７】
その結果、５６時間目に、最も多量である総１０４．９０ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち５４．６１ｍｇ／Ｌのヘム（５２．０６％）が培地で検出された。ＯＤ６００は、４８時間目に最大値である９３． ８に達した（図８（ｂ））。 
【０１８８】
５−４：グルタメートを供給した菌株の流加培養式発酵による細胞外フリーヘムの生産
本発明で製作したＨＥＭＥ６菌株は、前記実施例で検証されたように、ＡＬＡ生産前駆体を供給しなくても世界最高のヘム生産量を示すという利点があり、価格が比較的高く細胞毒性のあるＣ４  ＡＬＡ生合成経路の前駆体であるグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）と異なって、ＨＥＭＥ６菌株が用いるＣ５  ＡＬＡ生合成経路の前駆体であるグルタメートは、比較的安価であるだけでなく、細胞毒性を有しない。したがって、本発明で製作したＨＥＭＥ６菌株の最大ヘム生産能を試験するために、グルタメートを窒素源として供給して流加培養式発酵を行った。
【０１８９】
表２３に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地２００ｍＬに接種した後、５００−ｍＬの三角フラスコで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した。その後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２０ｇ／Ｌのぶどう糖が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地（ｐＨ７．０）１．８Ｌが、２００ｒｐｍの撹拌および２Ｌ／ｍｉｎ流速の空気供給により空気飽和された状態および３０℃で入れられている６．６−ＬのＢｉｏｆｌｏ３０００発酵器(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)に、前記培養体を接種した。発酵中の温度は３０℃に維持し、５０％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。また、空気飽和度は、撹拌速度を最大１０００ｒｐｍまで増加させ、初期空気飽和度の４０％程度を維持した。流加培養中にぶどう糖を供給し続けるために、ｐＨ調整技法を利用して流入溶液（７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０ｇ／Ｌ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を供給した。ＯＤ６００が５に達した時に１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ヘム生産量を分析するために８時間おきにサンプリングをした。
【０１９０】
ヘム生産量を確認するために、培養培地からサンプル１ｍＬを取り、遠心分離により回収した細胞を、１ＭのＮａＯＨ水溶液５００μＬにさらに解離し、超音波粉砕法により細胞を融解させた。準備した培地および破砕したサンプルを濾過した後、ＨＰＬＣを利用する既知の方法(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)により、ヘムの濃度を測定した。
【０１９１】
その結果、６４時間目に、最も多量である総２２８． ６ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１３１．９０ｍｇ／Ｌのヘム（５７．７３４％）が培地で検出された。ＯＤ６００は、４８時間目に最大値である１７２． ８に達した（図８（ｃ））。
【０１９２】
実施例６：ヘムエクスポーター過発現によるヘムの増産および細胞外へのヘム分泌の増進
６−１：ヘムエクスポーター遺伝子ｃｃｍＡＢＣを過発現する菌株の製作
実施例５で、ヘムの総生産量が増加するにつれて、細胞外へ分泌されたヘムの割合が徐々に増加することを確認することができた。これは、細胞毒性のあるヘム(Anzaldi et al., Infect. Immun. 78, 4977-4989, 2010)が過量生産される場合、ヘムエクスポーターＣｃｍＡＢＣによる細胞外へのヘム分泌(Schulz et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96, 6462-6467, 1999)が促進され、細胞外フリーヘムを生産することができるはずであるという、本発明の仮説を裏付ける。同じ脈絡で、ｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現すると、細胞外へのヘム分泌をさらに促進させるのであろうと判断し、次のような過程を経てｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現する菌株を製作した。
【０１９３】
（ａ）プラスミドｐＡＣＹＣ−ｃｃｍＡＢＣの製作
ヘムエクスポーターをコードする遺伝子ｃｃｍＡ（配列番号５８）、ｃｃｍＢ（配列番号５９）、およびｃｃｍＣ遺伝子（配列番号６０）を過発現させるプラスミドｐＡＣＹＣ−ｃｃｍＡＢＣを次のような過程を経て製作した。
【０１９４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡからｃｃｍＡ、ｃｃｍＢ 、およびｃｃｍＣ遺伝子を増幅するために、それぞれ配列番号６１と配列番号６２のプライマー、配列番号６３と配列番号６４のプライマー、および配列番号６５と配列番号６６のプライマーを用いた。 
【０１９５】
この際、増幅過程で用いた配列番号６５のプライマーに含まれたリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）の配列により、増幅されたｃｃｍＣ遺伝子の５’末端にＲＢＳの配列が添加された。
【０１９６】
【表２４】
2020509740.tif 000026
【０１９７】
増幅した配列は、それぞれＮｃｏＩとＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ とＳａｃＩ、およびＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に順に挿入することで、ｐＡＣＹＣ−ｃｃｍＡＢＣを製作した。
【０１９８】
（ｂ）組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ７の製作
前記製作したプラスミドｐＡＣＹＣ−ｃｃｍＡＢＣを表２３に記載のＨＥＭＥ６菌株にともに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＭＥ７菌株を製作した（表２５）。
【０１９９】
【表２５】
2020509740.tif 000027
【０２００】
６−２：（ＮＨ４）２ＳＯ４を供給したＨＥＭＥ７菌株の流加培養式発酵による細胞外フリーヘムの生産
実施例６−１で製作した、ヘムエクスポーター遺伝子ｃｃｍＡＢＣを過発現するＨＥＭＥ７菌株のヘム生産能を確認するために、（ＮＨ４）２ＳＯ４を窒素源として供給して流加培養式発酵を行った。
【０２０１】
表２５に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、および1７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および1７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地２００ｍＬに接種した後、５００−ｍＬの三角フラスコで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した。その後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０ｇ／Ｌのぶどう糖が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地（ｐＨ７．０）１．８Ｌが、２００ｒｐｍの撹拌および２Ｌ／ｍｉｎ流速の空気供給により空気飽和された状態および３０℃で入れられている６．６−ＬのＢｉｏｆｌｏ３０００発酵器(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)に、前記培養体を接種した。発酵中の温度は３０℃に維持し、５０％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。また、空気飽和度は、撹拌速度を最大１０００ｒｐｍまで増加させ、初期空気飽和度の４０％程度を維持した。流加培養中にぶどう糖を供給し続けるために、ｐＨ調整技法を利用して流入溶液（７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０  ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ，５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を供給した。ＯＤ６００が５に達した時に１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ヘム生産量を分析するために８時間おきにサンプリングし、ヘム生産量を確認した。
【０２０２】
その結果、６４時間目に、最も多量である総１１４．７９ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち７１．９１ｍｇ／Ｌのヘム（６２．６４％）が培地で検出された。ＯＤ６００は、５６時間目に最大値である７６．９に達した（図９（ａ））。実施例５−３の流加培養式発酵の結果と比較すれば、本実施例での仮説のとおり、ｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現させることで、細胞外へのヘム分泌率を１０．５８％増進させることができるとともに、ヘムの総生産量も９．８９ｍｇ／Ｌ増進させることができた。
【０２０３】
６−３：グルタメートを供給したＨＥＭＥ７菌株の流加培養式発酵による細胞外フリーヘムの生産
実施例６−１で製作した、ヘムエクスポーター遺伝子ｃｃｍＡＢＣを過発現するＨＥＭＥ７菌株のＣ５  ＡＬＡ生合成経路の前駆体が供給された時におけるヘムの最大生産能を確認するために、グルタメートを窒素源として供給して流加培養式発酵を行った。
【０２０４】
表２５に記載の菌株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、および1７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）が添加された５ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。ヘムの生産のための本培養のために、前記培養した菌体が育成されている培養液１ｍＬを、新しく準備した、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および1７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地２００ｍＬに接種した後、５００−ｍＬの三角フラスコで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した。その後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０ｇ／Ｌのぶどう糖が添加されたＭＲ−Ｆｅ２０培地（ｐＨ７．０）１．８Ｌが、２００ｒｐｍの撹拌および２Ｌ／ｍｉｎ流速の空気供給により空気飽和された状態および３０℃で入れられている６．６−ＬのＢｉｏｆｌｏ３０００発酵器(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)に、前記培養体を接種した。発酵中の温度は３０℃に維持し、５０％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。また、空気飽和度は、撹拌速度を最大１０００ｒｐｍまで増加させ、初期空気飽和度の４０％程度を維持した。流加培養中にぶどう糖を供給し続けるために、ｐＨ調整技法を利用して流入溶液（７００ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２０ｇ／Ｌ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を供給した。ＯＤ６００が５に達した時に１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ヘム生産量を分析するために８時間おきにサンプリングし、ヘム生産量を確認した。
【０２０５】
その結果、７２時間目に、最も多量である総２４６．６９ｍｇ／Ｌのヘムが生産され、そのうち１６４．１２ｍｇ／Ｌのヘム（６６．５２９％）が培地で検出された。ＯＤ６００は、６４時間目に最大値である１４２．８に達した（図９（ｂ））。実施例５−４の流加培養式発酵の結果と比較すれば、ｃｃｍＡＢＣ遺伝子を過発現させることで、細胞外へのヘム分泌率を８．７５９％増進させることができるとともに、ヘムの総生産量も１８．２３ｍｇ／Ｌ増進させることができた。 
【０２０６】
実施例７：コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）でのヘムの生産
フリーヘムを生産して細胞外に分泌する大腸菌を開発するために用いた戦略が、他の菌株でもヘムを生産するにおいても適用可能であるかを確認するために、人体に無害であることが立証され、グルタミン酸を始めとするアミノ酸の生産に広く用いられているコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)でＣ５  ＡＬＡ生合成経路を導入し、ヘムを生産した。
【０２０７】
グルタミン酸を過生産する好気性微生物であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、大腸菌と類似に、グルタメートからＡＬＡを生産するＣ５生合成経路、およびＡＬＡからヘムを生産するヘム生合成経路を有している。Ｃ５生合成経路に相応するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｈｅｍＡおよびｈｅｍＬ遺伝子を過発現させるために、産業Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のゲノムＤＮＡから、配列番号６７と６８のプライマー、配列番号６９と７０のプライマーを用いて、それぞれｈｅｍＡとｈｅｍＬ遺伝子を増幅した。この過程で、ｈｅｍＡ遺伝子から発現されるタンパク質の二番目のアミノ酸と三番目のアミノ酸との間に２つのアミノ酸リシンが挿入され、ＨｅｍＡタンパク質がネガティブフィードバックに抵抗性を示すように（ＨｅｍＡｆｂｒ）ｈｅｍＡ遺伝子の配列が修正された。増幅された２つの遺伝子は、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）によりｐＥＫＥｘ１プラスミドのＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅにともにクローニングすることで、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入された時にＨｅｍＡｆｂｒおよびＨｅｍＬタンパク質を発現するｐＥＫＥｘ１−ｈｅｍＡＬプラスミドを製作した。
【０２０８】
【表２６】
2020509740.tif 000028
【０２０９】
また、前記実施例２−１の（ａ）のように、ＡＬＡからヘムを生産するのに関与するタンパク質の遺伝子のうちｈｅｍＢおよびｈｅｍＨ遺伝子の過発現を先に試験するために、ｈｅｍＢとｈｅｍＨ遺伝子を過発現するベクターを構築した。そのために、配列番号７１と７２、７３と７４を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のゲノムＤＮＡからそれぞれｈｅｍＢとｈｅｍＨ遺伝子を増幅した。また、ｐＣＥＳ２０８−ｓｐｃプラスミドを、配列番号７５および７６のプライマーを用いて増幅した後、ギブソンアセンブリにより、前記増幅されたｈｅｍＢおよびｈｅｍＨ遺伝子と結合させてｐＣＥＳ−ｈｅｍＢＨプラスミドを製作した。
【０２１０】
【表２７】
2020509740.tif 000029
【０２１１】
産業用菌株であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｓ１１２菌株に、上記で製作したプラスミドｐＥＫＥｘ１−ｈｅｍＡＬもしくは２つのプラスミドｐＥＫＥｘ１−ｈｅｍＡＬとｐＣＥＳ−ｈｅｍＢＨを導入することで、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｓ１１２−ＡＬおよびＳ１１２−ＡＬ−ＢＨ菌株を製作した。
【０２１２】
【表２８】
2020509740.tif 000030
【０２１３】
上記で製作した２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株Ｓ１１２−ＡｌとＳ１１２−ＡＬ−ＢＨのヘムの生成能を確認するためのフラスコ培養のために、２５０ｍＬのバッフル付フラスコに入れられた、表２９の組成を有するｓｅｅｄ培地１０ｍＬに前記菌株をそれぞれ接種し、ＯＤ６００が２０に達するまで約１２時間、３０℃、２００ｒｐｍの条件で培養した。
【０２１４】
【表２９】
2020509740.tif 000031
【０２１５】
その後、培養液１００μＬを、２５０ｍＬのバッフル付フラスコに入れられた、表３０の組成を有する主培地１０ｍＬに接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間培養した。
【０２１６】
【表３０】
2020509740.tif 000032
【０２１７】
その結果、ヘム生合成に関連する遺伝子を過発現しないＣ．ｇｌｕｔｍｉｃｕｍ  Ｓ１１２ではヘムが生産されないのに対し、Ｓ１１２−ＡＬおよびＳ１１２−ＡＬ−ＢＨ菌株では、細胞内に、ヘムがそれぞれ０．７７±０．２３および１．６４±０．３０ｍｇ／Ｌ（培養液の体積を基準とする）ずつ蓄積されることを確認した。このことから、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでも、Ｃ５生合成経路およびヘム生合成経路を過発現させることで、ヘムを生産することができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明によれば、ポルフィリン症の治療及び健康食品または食品補助剤としての使用が増加している錯塩であるヘムを、従来の化学合成や酵素合成ではなく、微生物変異体を用いて高収率で細胞外に分泌・生産することにより、生産したヘムを用いるために必要な精製過程を、環境にやさしく、経済的に且つ容易に行うことができる効果がある。
【０２１９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
2020509740.tif 000033
【図２】
2020509740.tif 000034
【図３】
2020509740.tif 000035
【図４】
2020509740.tif 000036
【図５】
2020509740.tif 000037
【図６】
2020509740.tif 000038
【図７】
2020509740.tif 000039
【図８】
2020509740.tif 000040
【図９】
2020509740.tif 000041
【配列表】
2020509740000001.app
【国際調査報告】
2020509740.tif 000042
2020509740.tif 000043
2020509740.tif 000044
2020509740.tif 000045
2020509740.tif 000046
2020509740.tif 000047