(57)【要約】  本発明は、組換え酵素産物、特に食品酵素産物の製造及び精製方法、並びにその使用に関する。本発明は、分離法、酵素的処理、及び濾過手順により、微生物発酵ブロスから得られた酵素産物を処理する方法に特に関する。
2020519312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え酵素処方物を製造する方法であって、
（ｉ）組換え酵素、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Ｉを提供するステップと、
（ｉｉ）前記核酸を分解するために前記組成物Ｉにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素、分解された核酸、及び任意選択で前記細胞デブリを含む組成物ＩＩを提供し、
（ｉｉｉ）前記分解された核酸と複合体化させるために、組成物ＩＩに前記分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップと、これにより前記酵素、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で前記細胞デブリを含む組成物ＩＩＩを提供し、
（ｉｖ）任意選択で、固体／液体分離により前記組成物ＩＩＩを精製するステップと、これにより前記複合体化した分解された核酸、及び任意選択で前記細胞デブリを含む分離固相、並びに前記酵素を含む液体組成物ＩＶを提供し、
（ｖ）マイクロ濾過により前記組成物ＩＩＩ又は前記組成物ＩＶを精製するステップと、これにより前記酵素を含む組成物Ｖを提供する、
を含む方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ／エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼが、配列番号１又は配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉ）において、前記ヌクレアーゼが、組成物ＩＩのバイオマス当量１グラム当たり５０Ｕ〜２０００Ｕ、５０Ｕ〜１０００Ｕ、５０Ｕ〜５００Ｕ、１００Ｕ〜３００Ｕ、１５０Ｕ〜３００Ｕ、及び好ましくは２００Ｕ〜３００Ｕの量で添加される、請求項１項から３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
前記組換え酵素が、
−  酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され、及び好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、キシロースイソメラーゼからなる群から選択され、並びに／或いは
−  （ｂ−１）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等；（ｂ−２）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等；及び（ｂ−３）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等からなる群から選択され、並びに／或いは
−  炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する、
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え酵素が、野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術により派生した改良型バリアントである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｖ）における前記マイクロ濾過が、残留固体及び／又は酵素よりも高い分子量を有するコンポーネントの除去を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｖ）における前記マイクロ濾過が、
ａ）粒径排除限界が
−  １０００ｋＤａを超える、５００ｋＤａを超える、４００ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超える、２００ｋＤａを超える、１５０ｋＤａを超える、１００ｋＤａを超える、９０ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、７０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、若しくは２０ｋＤａを超える、及び／又は
−  ５μｍを超える、４μｍを超える、３μｍを超える、２μｍを超える、１μｍを超える、０．５μｍを超える、０．４μｍを超える、０．３μｍを超える、０．２μｍを超える、若しくは０．１μｍを超える
メンブレン、或いは
ｂ）同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、いずれの場合にも、前記組成物Ｖが、前記マイクロ濾過の濾液である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｖｉ）追加のマイクロ濾過又は限外濾過により前記組成物Ｖを精製するステップであって、これにより前記酵素を含む組成物ＶＩを提供する追加のステップを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｖｉ）における前記追加のマイクロ濾過又は限外濾過が、
ａ）１００ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、１５ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、５ｋＤａを超える、若しくは１ｋＤａを超える粒径排除限界を有するメンブレン、又は
ｂ）同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、及び前記組成物ＶＩが、前記マイクロ濾過の濾液又は前記限外濾過の保持液である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記沈殿剤が、カチオン性ポリマーである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記沈殿剤が、キトサン、ポリアミン、ポリアミノ酸、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記沈殿剤が、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、及びポリ−Ｎ−メチルビニルアミンからなる群から選択されるポリアミンである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記沈殿剤が、ポリアルギニン及びポリリジンから選択されるポリアミノ酸である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記沈殿剤が、
−  好ましくはジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー、及びジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマーからなる群から選択される、カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、並びに
−  好ましくはホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド、及びアクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマーからなる群から選択される、カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、並びに
−  陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、好ましくはアクリルアミド−アクリル酸コポリマー、並びに
−  硫酸アンモニウム、並びに
−  塩化カルシウム
からなる群から選択される凝集剤である、又はそれを含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｖｉ）の前記限外濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる前記保持液（組成物ＶＩ）の処理を含まない、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｖｉ）の前記マイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる前記濾液（組成物ＶＩ）の処理を含まない、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｖ）の前記マイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる前記濾液（組成物ＶＩ）の処理を含まない、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記液体／固体分離ステップの後、前記マイクロ濾過ステップの後、及び／又は前記限外濾過ステップ後のそれぞれにおいて、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ前記清澄化したライセート、前記濾液、又は前記保持液の処理を含まない、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｉｉ）の他に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる任意の追加の処理を含まない、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｉ）が、
（ｉ−ａ）前記酵素の遺伝子を発現ベクターにクローニングするサブステップ、
（ｉ−ｂ）前記遺伝子を有する前記発現ベクターを微生物宿主に導入するサブステップ、
（ｉ−ｃ）微生物宿主において前記酵素を細胞内発現させるサブステップ、すなわち前記組換え酵素を細胞内発現させる条件下で、前記微生物宿主を発酵させるサブステップ、及び
（ｉ−ｄ）細胞破壊により、前記微生物宿主から前記酵素を放出させるサブステップ、これにより前記組成物Ｉを提供する、すなわち、前記組換え酵素を放出させるために、細胞破壊により前記発酵させた細胞を破壊するサブステップ、これにより組換え酵素産物を含む未精製のライセートをもたらす、
のうちの１つ又は複数を含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物宿主が
−  大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株、及び最も好ましくはＬＥ１Ｂ１０９であり、並びに／或いは
−  酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−１−ホスフェートホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、α，α−トレハロースホスフェートシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−Ｎ−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−Ａ−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−４−デオキシ−４−ホルムアミド−Ｌ−アラビノーストランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（非加水分解型）、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート−２−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）微生物宿主において組換え酵素を細胞内発現させるステップと、
ｂ）細胞破壊により前記組換え酵素を放出させるステップと、これにより未精製のライセートをもたらし、
ｃ）プロセス溶液を含有する前記酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
ｄ）核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップと、これにより複合体化したライセートをもたらし、
ｅ）液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために液体／固体分離を行うステップと、これにより清澄化したライセートをもたらし、
ｆ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップと、これにより濾液をもたらす、
を含む、食品グレードの酵素産物を製造する方法。
【請求項２５】
前記液体／固体分離ステップｅ）の後、及び／又は前記マイクロ濾過ステップｆ）の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ前記未精製のライセート又は前記濾液の処理を含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組換え酵素産物を製造する方法であって、
ａ）酵素産物遺伝子を発現ベクターにクローニングするステップ、
ｂ）前記酵素産物遺伝子を有する前記発現ベクターを微生物宿主に導入するステップ、
ｃ）前記組換え酵素産物を細胞内発現させる条件下で、ステップｂ）の微生物宿主を発酵させるステップ、
ｄ）前記組換え酵素産物を放出させるために、細胞破壊によりステップｃ）の発酵させた細胞を破壊するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する未精製のライセートをもたらし、
ｅ）前記清澄化したライセートに由来する核酸を分解するために、前記清澄化したライセートをヌクレアーゼと共にインキュベートするステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
ｆ）核酸と複合体形成するように沈殿剤を前記ライセートに添加するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する複合体化したライセートをもたらし、
ｇ）前記液相から細胞デブリ及び核酸と沈殿剤の複合体を取り除くために前記複合体化したライセートの液体及び／又は固体分離を行うステップ、これにより組換え酵素産物を含有する清澄化したライセートをもたらし、並びに
ｈ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くために、前記酵素処理されたライセートをマイクロ濾過ステップに供するステップ、
のうちの１つ又は複数のステップを含む方法。
【請求項２７】
前記液体／固体分離ステップｇ）の後、及び／又は前記マイクロ濾過ステップｈ）の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ前記未精製のライセート又は前記濾液の処理を含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物宿主が、大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株であり、及び最も好ましくはＬＥ１Ｂ１０９である、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現ベクターが、ベクターｐＲＳＦ−１ｂに基づく、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現ベクターが、抗生物質耐性遺伝子を有しない、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２４のステップ（ａ）において、又は請求項２６のステップ（ｃ）において適する消泡剤が添加され、前記消泡剤が、ポリプロピレングリコール（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５３２２−６９−４）、ポリグリセロールポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．７８０４１−１４−２）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−１１−６）、ポリプロピレングリセロールモノブチルエーテル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−１３−８）、ポリジメチルシロキサン（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６３１４８−６２−９；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６８０８３−１８−１）、シリカ（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．７６３１−８６−９；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６３２３１−６７−４）、ステアリン酸（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．５７−１１−４）、セスキオレイン酸ソルビタン（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．８００７−４３−０）、グリセロールモノステアレート（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１２３−９４−４）、ポリソルベート（ポリソルベート６０（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−６７−８）、ポリソルベート６５（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−７１−４）、及びポリソルベート８０（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−６５−６）のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、菜種油モノ及びジグリセリド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９３７６３−３１−６）、及び白色鉱油（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６４７４２−４７−８）の消泡剤からなる群から選択される、
請求項２４から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２４のステップ（ｄ）において、又は請求項２６のステップ（ｆ）において、１つ又は複数の適する凝集剤が添加され、前記凝集剤が、好ましくは
ａ）カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８８−９７−０）、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．３１５６８−３５−１）、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．４２７５１−７９−１）等、
ｂ）カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６７９５３−８０−４）、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６９４１８−２６−４）等、
ｃ）陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８７−３０−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−０６−９）等、
ｄ）硫酸アンモニウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−０１−３）、
ｅ）塩化カルシウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００３５−０４−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−５２−４）、
の凝集剤からなる群から選択される、請求項２４から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記沈殿剤が、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）７８１Ｇ、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ４４８、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ５８１Ｇ、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ７５２、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）ＳＤ−２０８１、及びポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の沈殿剤からなる群から選択される、請求項１から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
使用される前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ／エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
使用される機能的に活性なヌクレアーゼが、配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一である、請求項１から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
発酵ブロス１ｍｌ当たりの使用されるヌクレアーゼの量が、２００Ｕを超える、１００Ｕを超える、５０Ｕを超える、４０Ｕを超える、３０Ｕを超える、２０Ｕを超える、１５Ｕを超える、１０Ｕを超える、５Ｕを超える、３Ｕを超える、２Ｕを超える、１Ｕを超える、０．５Ｕを超える、又は０．１Ｕを超える、請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２４のステップ（ｆ）又は請求項２６のステップ（ｈ）に対応する前記マイクロ濾過ステップにおいて、１０００ｋＤａを超える、５００ｋＤａを超える、４００ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超える、２００ｋＤａを超える、１５０ｋＤａを超える、１００ｋＤａを超える、９０ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、７０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、又は２０ｋＤａを超える粒径排除限界により特徴づけられるメンブレンが使用され、及び前記組換え酵素産物が、前記マイクロ濾過ステップの前記濾液内で得られる、請求項２４から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２４のステップ（ｆ）又は請求項２６のステップ（ｈ）に対応する前記マイクロ濾過ステップにおいて、メンブレンが、５μｍを超える、４μｍを超える、３μｍを超える、２μｍを超える、１μｍを超える、０．５μｍを超える、０．４μｍを超える、０．３μｍを超える、０．２μｍを超える、又は０．１μｍを超える粒径排除限界を有し、及び前記組換え酵素産物が、前記マイクロ濾過ステップの前記濾液内で得られる、請求項２４から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２４のステップ（ｆ）又は請求項２６のステップ（ｈ）に対応する前記マイクロ濾過ステップの後に、任意選択で、１００ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、１５ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、５ｋＤａを超える、又は１ｋＤａを超える粒径排除限界を有するメンブレンの使用により特徴づけられる追加の限外濾過ステップが適用され、及び前記組換え酵素産物が前記限外濾過ステップの前記保持液内で得られる、請求項２４から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２４のステップ（ｅ）又は請求項２６のステップ（ｇ）に対応する前記固体／液体分離ステップが、遠心分離、フィルタープレス、及び／又はマイクロ濾過の技術により達成される、請求項２４から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも５つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも３つ、なおいっそうより好ましくは少なくとも２つ、及び最も好ましくは少なくとも１つの細胞内タンパク質を発現させる、請求項１から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
製造株から発現する１つ又は複数の組換え酵素が、単独で又は総合して、前記酵素産物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも３０％、よりいっそう好ましくは少なくとも２０％、及び最も好ましくは少なくとも１０％を占める、請求項１から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記酵素産物が、食品酵素である、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素産物が、
ａ）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される、請求項１から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する、請求項１から４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記組換え酵素が、野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術により派生した改良型バリアントである、請求項１から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記微生物製造用宿主が、例えば、酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−１−ホスフェートホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、α，α−トレハロースホスフェートシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−Ｎ−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−Ａ−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−４−デオキシ−４−ホルムアミド−Ｌ−アラビノーストランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（非加水分解型）、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート−２−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、１つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている、請求項１から４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ａ）組換え酵素産物を含有する細胞破壊未精製ライセートを、ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、
ｂ）核酸を複合体化させるために、沈殿剤を添加するステップと、
ｃ）液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために、液体／固体分離を行うステップと、
ｄ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くために、マイクロ濾過ステップを実施するステップと
を含む、請求項１から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
Ａ）大腸菌株を提供するステップと、
Ｂ）任意選択で、栄養培地を添加するステップと、
Ｃ）発酵させるステップと、これにより発酵ブロスを取得し、
Ｄ）任意選択で、前記発酵ブロスの固体／液体分離を行うステップと、これによりバイオマスを取得し、
Ｅ）任意選択で、ホモジナイゼーションするステップと、
Ｆ）ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、
Ｇ）固体／液体分離を行うステップと、これにより上清を取得し、
Ｈ）任意選択で、濾過を行うステップと、これにより前記酵素調製物を取得する、
を含む、酵素調製物を製造する方法。
【請求項５２】
請求項１から５１のいずれか１項に記載の方法により取得可能な組換え酵素調製物。
【請求項５３】
０ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又はより好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満、又は最も好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満の残留ＤＮＡ濃度により特徴づけられる、請求項５２に記載の調製物。
【請求項５４】
請求項１から５１項のいずれか１項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、０．０１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇの間、及び好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇの間、又はより好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満、又は最も好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満の残留ＤＮＡ濃度により特徴づけられる調製物。組換えＤＮＡ濃度は、サイズが少なくとも１００塩基対の組換えＤＮＡを含む代表的なＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応に基づく増幅に準拠する方法により決定されるものである。較正は、製造用宿主に由来する全ＤＮＡ調製物を用いて実施される。
【請求項５５】
請求項１から５１のいずれか１項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される調製物。
【請求項５６】
請求項１から５１のいずれか１項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、
ａ）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される調製物。
【請求項５７】
請求項１から５１のいずれか１項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、前記酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する調製物。
【請求項５８】
前記組換え酵素が、野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術により派生した改良型バリアントである、請求項５２から５７のいずれか１項に記載の酵素調製物。
【請求項５９】
５０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡ濃度で細胞内で発現させた組換え酵素産物の酵素調製物であって、前記酵素調製物の総タンパク質含有量の少なくとも１０％を占める、製造用宿主の少なくとも３つの異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する、酵素調製物。
【請求項６０】
前記製造用宿主が、大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株であり、及び最も好ましくは、ＬＥ１Ｂ１０９である、請求項５２から５９のいずれか１項に記載の酵素調製物。
【請求項６１】
前記発現させた酵素産物を含有し、及び配列番号１又は配列番号２のヌクレアーゼに対して少なくとも７０％の同一性を有する検出可能な量のヌクレアーゼを更に含有する、請求項５２から６０のいずれか１項に記載の酵素調製物。
【請求項６２】
前記組換え酵素が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項５２から６１のいずれかに１項に記載の酵素調製物。
【請求項６３】
前記組換え酵素産物が
ａ）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される、請求項５２から６２のいずれかに１項に記載の酵素調製物。
【請求項６４】
前記組換え酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する、請求項５２から６３のいずれかに１項に記載の酵素調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年５月１５日に出願された米国特許出願シリアル番号第６２／５０６，３５７号；２０１７年１１月６日に出願された米国特許出願シリアル番号第６２／５８１，８８０号；２０１７年１１月８日に出願された欧州特許出願第１７  ２００  ５７２．０号；及び２０１８年３月１６日に出願された欧州特許出願第１８  １６２  ４２０．６号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、組換え酵素産物、特に食品酵素産物の製造及び精製方法、並びにその使用に関する。本発明は、特に、分離法、酵素的処理、及び濾過手順により、微生物発酵ブロスから酵素産物を処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
菌株からの組換え酵素の製造は、最新技術分野において広範に説明されている。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、研究室スケールから工業的スケールにおける組換え酵素用の発現宿主としてよく知られている。
【０００４】
酵素産物、特に食品又は製薬用途で使用される酵素産物を製造するには、そのような酵素産物の安全且つ承認された使用に関する特別な仕様要件を達成する必要がある。
【０００５】
規制要求に起因して、食品用途で使用するように意図された酵素産物は、組換えＤＮＡを全く含まないか、抑制されるべきである。多くの酵素は、その分泌が不可能であり、従って細胞内酵素として発現される必要がある。発現宿主から酵素を放出させるために、細胞破壊ステップが必要とされる。この細胞破壊は、発現宿主に由来する大量のＤＮＡの放出と関係する。そのようなＤＮＡ放出を伴う組換え製造プロセスの場合、組換えＤＮＡも放出される。この組換えＤＮＡもやはり除去される必要がある。
【０００６】
ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ  ＧＲＮ  Ｎｏ．１２６は、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）内の３つの微生物に由来するハイブリッドα−アミラーゼをコードする遺伝子を発現するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｂｉｏｖａｒ  Ｉからのα−アミラーゼ酵素調製物の製造について記載する。α−アミラーゼ酵素調製物は、食用スターチを加水分解して様々なスターチ加水分解生成物を生成し、またアルコール飲料用の蒸留エタノールの製造で使用される発酵可能な糖を生成させるための酵素として使用される。
【０００７】
組換え製造に由来する酵素産物は、食品産業において幅広く使用されている。酵素産物として提供される酵素クラスには、とりわけ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる酵素クラス群に属する酵素が含まれ、そして例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、又はキシロースイソメラーゼからなる群から選択される。特にそのような酵素産物は、炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等；及び脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等であり得る。
【０００８】
更に、食品酵素産物は、ある種の二糖、三糖、又はオリゴ糖のような食品配合物を製造するための特定の基質の酵素的変換で通常使用される。酵素のそのような酵素的変換用途は、本明細書では、以後「下流の酵素的変換」とも呼ばれる。
【０００９】
規制承認に適合するため、及び酵素産物の安全性を向上させるため、及び下流の酵素的変換でそれを使用するために、製造用宿主及び／又は発酵ブロスから酵素産物を製造及び処理する場合、各規制要求事項への適合を実現させるためのいくつかの個々のステップを必要とする。工業的酵素製造では、費用のかかる精製ステップ、例えばクロマトグラフィーのようなステップを回避するのが望ましい。未精製の酵素調製物であっても使用可能であるのが理想的である。細胞内で酵素を発現させるとき、組換えＤＮＡを含まない酵素産物の製造を可能にする有効且つ低コストの下流処理が必要とされる。しかし、先行技術のプロセスは、あらゆる観点において満足の行くものではなく、また順守すべき規制当局から課される義務及び前提条件が増していることを考慮して、酵素産物の有効且つ遵法的な製造及び処理プロセスに対する要求が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、酵素産物の製造方法及び処理方法を改善することである。
【００１１】
この問題は、特許請求の範囲の主題、配列ファイル、及び図面により解決された。
【００１２】
配列番号１は、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に由来するヌクレアーゼのアミノ酸配列である。配列番号２は、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に由来するヌクレアーゼのアミノ酸配列であるが、そのＮ末端において１つのメチオニンが追加されている。配列番号３は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するスクロースシンターゼ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１９７５８３．１）であり、配列番号４は、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）に由来するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ０６９１２．１）であり、及び配列番号４は、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）に由来するβ−Ｄ−グリコシルクロベチン−β−１，６グリコシルトランスフェラーゼ様酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００４２５０４８５．１）である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、酵素産物の製造方法に関するスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
いくつかのプロセスデザインは、省コスト及び規制要求事項を満たすのに十分なやり方で、組換えＤＮＡ含有量を低下させるのに適するとは言えないことが判明し得る。驚くべきことに、下記の３つのプロセスステップ：
１．ＤＮＡを加水分解するために、ヌクレアーゼ（すなわち、ヌクレアーゼ酵素）により処理するステップ、
２．沈殿剤及び／又は凝集剤を使用するステップ、これにより、不溶性複合体を形成させることにより、加水分解されたＤＮＡを析出させる、及び
３．後続するマイクロ濾過ステップを実施するステップ
を組み合わせた場合にのみ、組換えＤＮＡの所望の低下を実現することが明らかとなった：
【００１５】
任意選択で、ステップ２において形成された不溶性複合体は、ステップ３の前に、液体／固体分離技術により除去され得る。
【００１６】
組換え酵素を発現させるために使用されてきた宿主細胞の操作は、処理添加剤、例えば、塩、化学添加物、酵素又はその他の加工助剤が、培養培地又は発酵ブロスに添加され、該発酵ブロスが、稀釈若しくは濃縮、又は例えば、超音波処理により物理的若しくは機械的に処理され得る様々なステップを一般的に伴う。いくつかのそのような慣習的に加えられる処理添加物及び処理は、ヌクレアーゼを阻害するおそれがあり、例えばこのようなヌクレアーゼの酵素触媒反応の下で生ずるＤＮＡ（及び／又はＲＮＡ）の望ましい加水分解が、このような添加物の存在及びプロセス条件に起因して抑制され得ること、又は少なくとも有意に阻害され得ることが、今回驚くべきことに見出された。従って、そのような従来型の処理添加物を利用する前に、全体的な操作手順の比較的初期のステップにおいてそのようなヌクレアーゼを利用すると、ヌクレアーゼによる望ましいＤＮＡ（及び／又はＲＮＡ）の酵素加水分解が有意に改善し得ることが驚くべきことに見出された。
【００１７】
更に、そのようなヌクレアーゼの初期の使用と沈殿剤（例えば、凝集剤）とを組み合わせてＤＮＡ（及び／又はＲＮＡ）の加水分解された断片を円滑に除去すると、全体的操作手順が更に改善し得ることが驚くべきことに見出された。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、酵素産物、好ましくは食品グレードの酵素産物を製造する方法に関する。
【００１９】
好ましくは、本発明による組換え酵素処方物を製造する方法は、
（ｉ）組換え酵素、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Ｉを提供するステップと、
（ｉｉ）核酸を分解するために組成物Ｉにヌクレアーゼを添加し、これにより酵素、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩを提供するステップと、
（ｉｉｉ）分解された核酸を複合体化させるために、組成物ＩＩに分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップと、これにより酵素、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩＩを提供し、
（ｉｖ）任意選択で、固体／液体分離により組成物ＩＩＩを精製するステップと、これにより複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む分離固相、並びに酵素を含む液体組成物ＩＶを提供し、
（ｖ）マイクロ濾過により組成物ＩＩＩ又は組成物ＩＶを精製するステップと、これにより酵素を含む組成物Ｖを提供する、
を含む。
【００２０】
ステップ（ｉ）において提供される組成物Ｉ中の細胞デブリの存在は、任意選択である。ステップ（ｉ）において提供される組成物Ｉは、後続するステップ（ｉｉ）においてヌクレアーゼが添加される微生物宿主の分解された細胞を含有し得る。或いは、ステップ（ｉ）において提供される組成物Ｉは、後続するステップ（ｉｉ）においてヌクレアーゼが添加される微生物宿主の未処理細胞を含有し得る。微生物宿主の細胞の破壊は、次に好ましくはヌクレアーゼの存在下、例えば超音波処理により実施される．
【００２１】
ステップ（ｉｖ）は、任意選択である。従って、本発明による方法は、少なくともステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）；好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）を含む。
【００２２】
方法は、バッチ方式で又は連続的に実施され得る。先行するステップが終了する前に後続するステップが開始することは原理的に可能であるが、個々のステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）は、好ましくは、先行するステップが完全に終了した後に後続するステップが開始するように、番号順で連続的に実施される。但し、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）には記載されない追加の中間ステップが、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）のいずれかの間で実施されることも考えられる。追加の中間ステップは、例えば、組成物のなんらかの物理的又は化学的処理、例えば、温度、ｐＨ値の調節、又は組成物の稀釈若しくは濃縮、又は組成物のバッファー組成の変更と関係し得る。従って、ステップ（ｉｉ）におけるヌクレアーゼ処理は、好ましくは、ステップ（ｉ）の後、及びステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）のいずれよりも前に実施される。
【００２３】
好ましくは、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ／エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。好ましくは、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方を加水分解し得る。好ましくは、ヌクレアーゼは、国際生化学分子生物学連合により帰属されたＥＣ番号のＥＣ３．１．１１．２、ＥＣ３．１．１１．５、ＥＣ３．１．１１．６、ＥＣ３．１．１３．４、ＥＣ３．１．１４．１、ＥＣ３．１．２１．１、ＥＣ３．１．２１．２、ＥＣ３．１．２１．３、ＥＣ３．１．２１．４、ＥＣ３．１．２１．６、ＥＣ３．１．２５．１、ＥＣ３．１．２６．３、ＥＣ３．１．２６．４、ＥＣ３．１．２６．５、ＥＣ３．１．２６．８、ＥＣ３．１．２６．９、ＥＣ３．１．２６．１１、ＥＣ３．１．２７．１、ＥＣ３．１．２７．３、ＥＣ３．１．２７．５、ＥＣ３．１．３０．１、ＥＣ３．１．３０．２、ＥＣ３．１．３１．１を有するヌクレアーゼから選択され、好ましくはＥＣ３．１．３０．２である。
【００２４】
好ましくは、ヌクレアーゼは、配列番号１又は配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。
【００２５】
好ましくは、ステップ（ｉｉ）において、ヌクレアーゼは、組成物ＩＩのバイオマス当量１グラム当たり、５０Ｕ〜２０００Ｕ、５０Ｕ〜１０００Ｕ、５０Ｕ〜５００Ｕ、１００Ｕ〜３００Ｕ、１５０Ｕ〜３００Ｕ、及び好ましくは２００Ｕ〜３００Ｕの量で添加される。
【００２６】
好ましくは、組換え酵素は、
−  酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され、及び好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、キシロースイソメラーゼからなる群から選択され；並びに／或いは
−  （ｂ−１）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等；（ｂ−２）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等；及び（ｂ−３）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等からなる群から選択され；並びに／或いは
−  炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する。
【００２７】
好ましくは、組換え酵素は、公知の酵素エンジニアリング技術により改善された、野生型酵素に由来するバリアントである。
【００２８】
好ましくは、ステップ（ｖ）におけるマイクロ濾過は、残留固体及び／又は酵素よりも高い分子量を有するコンポーネントの除去を含む。
【００２９】
好ましくは、ステップ（ｖ）におけるマイクロ濾過は、
ａ）サイズ排除限界が
−  １０００ｋＤａを超える、５００ｋＤａを超える、４００ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超える、２００ｋＤａを超える、１５０ｋＤａを超える、１００ｋＤａを超える、９０ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、７０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、若しくは２０ｋＤａを超える；及び／又は
−  ５μｍを超える、４μｍを超える、３μｍを超える、２μｍを超える、１μｍを超える、０．５μｍを超える、０．４μｍを超える、０．３μｍを超える、０．２μｍを超える、若しくは０．１μｍを超える
メンブレン；或いは
ｂ）同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、いずれの場合にも、組成物Ｖは、マイクロ濾過の濾液である。
【００３０】
好ましくは、本発明による方法は、
（ｖｉ）追加のマイクロ濾過又は限外濾過により組成物Ｖを精製し、これにより酵素を含む組成物ＶＩを提供する
追加のステップを含む。
【００３１】
好ましくは、ステップ（ｖｉ）における追加のマイクロ濾過又は限外濾過は、
ａ）１００ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、１５ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、５ｋＤａを超える、若しくは１ｋＤａを超えるサイズ排除限界を有するメンブレン；又は
ｂ）同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、及び組成物ＶＩは、マイクロ濾過の濾液又は限外濾過の保持液である。
【００３２】
好ましくは、ステップ（ｉｉ）の他に、本発明による方法は、ヌクレアーゼ酵素による追加の処理のいずれも含まない。好ましくは、ステップ（ｉｉ）の他に、本発明による方法は、それぞれ、ステップ（ｖ）のマイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液（組成物ＶＩ）の処理を含まず、及び／又はステップ（ｖｉ）のマイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液（組成物ＶＩ）の処理を含まず、及び／又はステップ（ｖｉ）の限外濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる保持液（組成物ＶＩ）の処理を含まない。
【００３３】
好ましくは、本発明による方法は、液体／固体分離ステップ、マイクロ濾過ステップの後、及び／又は限外濾過ステップ後のそれぞれにおいて、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ清澄化したライセート（細胞溶解液）、濾液、又は保持液の処理を含まない。
【００３４】
沈殿剤は、好ましくはキトサン；ポリアミン、例えばポリアリルアミン（例えば、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ｐＤＡＤＭＡＣ））、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、又はポリ−Ｎ−メチルビニルアミン（ＰＭＶＡ）等；ポリアミノ酸、例えばポリアルギニン又はポリリジン等；及びポリアクリルアミドからなる群から選択されるカチオン性ポリマーである、又はそれを含むことが好ましい。
【００３５】
沈殿剤は、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ｐＤＡＤＭＡＣ）からなる群から選択される、又はそれを含むことが好ましい。
【００３６】
沈殿化剤は、凝集剤であるか、又はそれを含むことが好ましい。好ましい凝集剤として、
ａ．カチオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８８−９７−０）、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．３１５６８−３５−１）、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．４２７５１−７９−１）等；並びに
ｂ．カチオン性ポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６７９５３−８０−４）、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６９４１８−２６−４）等；並びに
ｃ．陰イオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８７−３０−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−０６−９）等；並びに
ｄ．硫酸アンモニウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−０１−３）；並びに
ｅ．塩化カルシウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００３５−０４−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−５２−４）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
好ましくは、ステップ（ｖ）で得られる組成物Ｖ、及び／又は任意選択のステップ（ｖｉ）で得られる組成物ＶＩは、０ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び  好ましくは０ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、及び０ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又はより好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満、及び最も好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満の残留ＤＮＡ濃度により特徴づけられる。
【００３８】
好ましくは、ステップ（ｉ）は、
（ｉ−ａ）酵素の遺伝子を発現ベクターにクローニングするサブステップ、
（ｉ−ｂ）遺伝子を有する発現ベクターを微生物宿主に導入するサブステップ、
（ｉ−ｃ）微生物宿主において酵素を細胞内発現させるサブステップ、すなわち組換え酵素を細胞内発現させる条件下で、微生物宿主を発酵させるサブステップ、及び
（ｉ−ｄ）細胞破壊により、微生物宿主から酵素（及び核酸）を放出させるサブステップ、これにより組成物Ｉを提供する；すなわち組換え酵素を放出させるために、細胞破壊により発酵させた細胞を破壊するサブステップ、これにより組換え酵素産物を含む未精製のライセートをもたらす
のうちの１つ又は複数を含む。
【００３９】
従って、この好ましい実施形態によれば、微生物宿主の細胞は、ステップ（ｉ）、サブステップ（ｉ−ｄ）において破壊され、そしてヌクレアーゼが後続するステップ（ｉｉ）において添加される。
【００４０】
但し、微生物宿主の細胞を、例えば、ヌクレアーゼを含有する細胞溶解バッファー中に懸濁させ、次に例えば、すでにヌクレアーゼが存在する中で超音波処理により破壊することについても代替的に検討される。従って、この実施形態によれば、ステップ（ｉｉ）は、好ましくは、
（ｉｉ−ａ）組成物Ｉにヌクレアーゼを添加するサブステップ、
（ｉｉ−ｂ）核酸を分解し、これにより組換え酵素を含む組成物ＩＩ、分解された核酸、及び細胞デブリを提供するために、細胞破壊により微生物宿主から組換え酵素及び核酸を放出させるサブステップ；すなわち組換え酵素及び核酸を放出させるために細胞破壊により発酵させた細胞を破壊して、組換え酵素、分解された核酸、及び細胞デブリ（及びヌクレアーゼ）を含む未精製のライセートをもたらすサブステップ
を含む。
【００４１】
好ましくは、微生物宿主は、
−  大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株、及び最も好ましくはＬＥ１Ｂ１０９であり、並びに／或いは
−  酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−１−ホスフェートホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、α，α−トレハロースホスフェートシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−Ｎ−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−Ａ−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−４−デオキシ−４−ホルムアミド−Ｌ−アラビノーストランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（非加水分解型）、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート−２−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている。
【００４２】
好ましくは、例えば、本発明の第１の態様の第１の実施形態、又は条項１において、本発明は、
ａ．微生物宿主において組換え酵素を細胞内で発現させるステップと、
ｂ．細胞破壊により組換え酵素を放出させて、未精製ライセートをもたらすステップと、
ｃ．プロセス溶液を含有する酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらす、
ｄ．核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップ、これにより複合体化したライセートをもたらす、
ｅ．液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために液体／固体分離を行うステップ、これにより清澄化したライセートをもたらす、
ｆ．残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップ、これにより濾液をもたらす
を含み、上記方法は、好ましくは、それぞれヌクレアーゼ酵素を用いて、ステップｅの液体／固体分離の後に行われる清澄化したライセートの処理、又はマイクロ濾過ステップｆの後に行われる濾液の処理を含まない、食品グレード酵素産物を製造する方法に関する。
【００４３】
方法は、バッチ方式で又は連続的に実施され得る。先行するステップが終了する前に、後続するステップが開始することも原理的には可能であるが、個々のステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、及びｆ）は、好ましくはアルファベット順で連続的に実施され、後続するステップは、先行するステップが完全に終了した後に開始する。しかし、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、及びｆ）には記載されない追加の中間ステップが、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、及び／又はｆ）のいずれかの間で実施されることも考えられる。
【００４４】
好ましくは、本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、本発明は、組換え酵素処方物を製造する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）組換え酵素産物、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Ｉを提供するステップと、
（ｉｉ）核酸を分解するために組成物Ｉにヌクレアーゼを添加するステップ、これにより酵素産物、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩを提供する、
（ｉｉｉ）分解された核酸を複合体化させるために、組成物ＩＩに分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップ、これにより酵素産物、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩＩを提供する、
（ｉｖ）任意選択で、固体／液体分離により組成物ＩＩＩを精製するステップ、これにより、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む分離固相、並びに酵素産物を含む液体組成物ＩＶを提供する、
（ｖ）マイクロ濾過により組成物ＩＩＩ又は組成物ＩＶを精製するステップ、これにより酵素産物を含む組成物Ｖを提供する
を含み、上記方法は、それぞれ、液体／固体分離ステップ（ｉｖ）の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる清澄化したライセート（組成物ＩＶ）の処理、又はマイクロ濾過ステップ（ｖ）の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液（組成物Ｖ）の処理を含まないことが好ましい。
【００４５】
好ましくは、本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、本発明は、組換え酵素処方物を製造する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）組換え酵素産物、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Ｉを提供するステップと、
（ｉｉ）核酸を分解するために組成物Ｉにヌクレアーゼを添加するステップ、これにより酵素産物、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩを提供する、
（ｉｉｉ）分解された核酸と複合体化させるために、組成物ＩＩに分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップ、これにより酵素産物、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩＩを提供する、
（ｉｖ）任意選択で、固体／液体分離により組成物ＩＩＩを精製するステップ、これにより主に複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリ、及び任意選択で組成物ＩＩＩに由来する酵素産物の残渣物を含む分離固相、並びに主に酵素産物、及び任意選択で細胞デブリの残渣物、組成物ＩＩＩに由来する複合体化した分解された核酸を含む液体組成物ＩＶを提供する、
（ｖ）マイクロ濾過により組成物ＩＩＩ又は組成物ＩＶを精製するステップ、これにより酵素産物を含む組成物Ｖを提供する
を含み、上記方法は、それぞれ、液体／固体分離ステップ（ｉｖ）の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる清澄化したライセート（組成物ＩＶ）の処理、又はマイクロ濾過ステップ（ｖ）の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液（組成物Ｖ）の処理を含まないことが好ましい。
【００４６】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態、又は第１の態様の任意の実施形態では、本発明は、ステップ（ｖ）の後に、追加のマイクロ濾過又は限外濾過により組成物Ｖを精製し、これにより酵素産物を含む組成物ＶＩを提供する追加のステップ（ｖｉ）を含む、組換え酵素産物を製造する方法に関する。
【００４７】
ステップ（ｖ）のマイクロ濾過の後、及び／又はステップ（ｖｉ）のマイクロ濾過の後に、酵素産物を含有する濾液（組成物Ｖ又は組成物ＶＩ）が得られるが、それは本発明の範囲に含まれる。ステップ（ｖｉ）の限外濾過の後に、酵素産物を含有する保持液（組成物ＶＩ）が得られるが、それも本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
好ましくは、方法は、ステップ（ｖ）のマイクロ濾過の後に、それぞれ、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液（組成物ＶＩ）の処理を含まず、及び／又はステップ（ｖｉ）のマイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液（組成物ＶＩ）の処理を含まず、及び／又はステップ（ｖｉ）の限外濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる保持液（組成物ＶＩ）の処理を含まない。
【００４９】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態、又は第１の態様の任意の実施形態では、本発明は、組換え酵素産物を製造する方法であって、該酵素産物が、該酵素産物の調製物内にＤＮＡ断片が存在しないことにより、その他の調製物から区別され得る方法に関する。
【００５０】
組成物Ｉ及び未精製のライセートという用語、組成物ＩＩ及び酵素処理されたライセートという用語、組成物ＩＩＩ及び複合体化したライセートという用語、及び組成物ＩＶ及び清澄化したライセートという用語は、それぞれ同等であるとみなされ、及び同等に使用され、及び本発明の同一の要素を記載するが、それは本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
用語「酵素産物」及び「組換え酵素処方物」は同等であるとみなされ、及び同等に使用され、及び本発明の同一の要素を記載するが、それは本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明の酵素産物は、液体組成物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＩＶに含まれ、並びに好ましくは本発明の酵素産物は、液体組成物Ｖ、組成物ＶＩ、又はそれに由来する任意のその他の液体、凍結乾燥された、若しくは安定化された処方物であるが、それも更に本発明の範囲に含まれる．
【００５３】
本発明の第１の態様の第２の実施形態又は条項２は、第１の態様の第１の実施形態及び任意のその他の実施形態のうち１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２の実施形態又は条項２では、本発明は、組換え酵素産物を製造する方法に関し、
ａ．酵素産物遺伝子を発現ベクターにクローニングするステップ、
ｂ．酵素産物遺伝子を有する発現ベクターを微生物宿主に導入するステップ、
ｃ．組換え酵素産物を細胞内発現させる条件下で、上記ステップ（ｂ）の微生物宿主を発酵させるステップ。
ｄ．組換え酵素産物を放出させるために、細胞破壊により上記ステップ（ｃ）の発酵させた細胞を破壊するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する未精製のライセートをもたらす、
ｅ．未精製のライセートに由来する核酸を分解するために、未精製のライセートをヌクレアーゼと共にインキュベートするステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらす、
ｆ．核酸と複合体形成するように沈殿剤を酵素処理されたライセートに添加するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する複合体化したライセートをもたらす、
ｇ．液相から細胞デブリ及び核酸と沈殿剤の複合体を取り除くために複合体化したライセートの液体及び／又は固体分離を行うステップ、これにより組換え酵素産物を含有する清澄化したライセートをもたらす、並びに
ｈ．残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くために、酵素処理され、及び任意選択で清澄化したライセートをマイクロ濾過ステップに供するステップ、
のうちの１つ又は複数のステップを含むことを特徴とし、
上記方法は、それぞれ、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる、ステップｇの液体／固体分離後の清澄化したライセートの処理、又はステップｈのマイクロ濾過後の濾液の処理を含まないことが好ましい。
【００５４】
方法は、バッチ方式で又は連続的に実施され得る。先行するステップが終了する前に、後続するステップが開始することも原理的には可能であるが、個々のステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、及びｈ）は、好ましくはアルファベット順で連続的に実施され、後続するステップは、先行するステップが完全に終了した後に開始する。しかし、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、及びｈ）には記載されない追加の中間ステップが、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、及びｈ）のいずれかの間で実施されることも考えられる。
【００５５】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、第１の態様の任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、本発明は、組換え酵素産物を製造する方法であって、ステップ（ｉｖ）、ステップ（ｅ）（条項１の場合）、又はステップ（ｇ）（条項２の場合）の固体／液体分離が省略される方法に関する。
【００５６】
方法は、その複数のステップのうちの１つ又は複数のを含み得るが、それは本発明の第１の態様の第１、第２、及び任意のその他の実施形態の開示に含まれる。方法は、その複数のステップのそれぞれを含むが、それも本発明の第１の態様の第１、第２、及び任意のその他の実施形態の開示に含まれる。ステップ（ｃ）、又は（ｉｉ）におけるヌクレアーゼ処理のステップは、ステップ（ａ、ｂ）又は（ｉ）のいずれにおいてもその後、及びステップ（ｄ、ｅ、ｆ）又は（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ）のいずれにおいてもその前に生じることが必須であるが、それは本発明の第１の態様の第１の実施形態及び任意のその他の実施形態の開示に含まれる。ステップ（ｅ）におけるヌクレアーゼ処理のステップは、ステップ（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）のいずれにおいてもその後、及びステップ（ｆ、ｇ、ｈ）のいずれにおいてもその前に生じることが必須であるが、それも本発明の第１の態様の第２の実施形態の開示に含まれる。
【００５７】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、第１の態様に関連する任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、本発明は、液体／固体分離の後、及びマイクロ濾過ステップの後、及び限外濾過ステップの後のそれぞれにおいて、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ清澄化したライセート、濾液、又は保持液の処理を含まない。好ましくは、第１の態様の第１の実施形態のステップ（ｃ）又は（ｉｉ）は、本発明の第１の態様の第１の実施形態のステップ（ｆ）又は（ｖ）の後に達成され、そして好ましくは第１の態様の第２の実施形態のステップ（ｅ）は、第１の態様の第２の実施形態のステップ（ｈ）の後に達成される。
【００５８】
本発明の目的に照らせば、本発明の第１の態様の第１の実施形態の条項１に関するステップ（ｂ）若しくは（ｉ）において、又は第２の実施形態の条項２に関するステップ（ｄ）において得られる未精製のライセートは酵素産物であり、それは、細胞内発現させた酵素の未精製組換え酵素調製物であり、組換え酵素を細胞内タンパク質として発現する微生物細胞の破壊後に取得される酵素調製物として定義される。未精製のライセートは、組換え酵素産物の他に、例えば宿主特異的免疫アッセイ法により検出可能である生体分子及び／又は細胞内宿主細胞タンパク質のいずれかに由来する、例えば脂質、代謝物、炭水化物、メンブレン断片、誘導体を含有し得る。宿主細胞タンパク質、例えば大腸菌に由来するタンパク質を標的とする対応する抗体は、異なる起源から入手可能である。ウェスタンブロットが適用され得る。タンパク質レベルに基づく未精製組換え酵素調製物の純度は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ準拠法により決定可能であり、≦５０％、好ましくは≦６０％、より好ましくは≦７０％、よりいっそう好ましくは≦８０％、及び最も好ましくは≦９０％である。
【００５９】
本発明の目的に照らせば、発酵条件は、６〜８の間のｐＨ、及び２５℃〜３７℃の間の温度である。発酵プロセスは、研究室のテストデータが、所望の酵素生産収率を示すまで継続される。そして、通常少なくとも１５時間後に発酵は中止される。後続する回収プロセスにおいて、酵素はバイオマスから単離される。第１の固体／液体分離において、バイオマスは、培養ブロスから標準的な技術により分離される（例えば、遠心分離及び／又は濾過される）。バイオマスは、細菌細胞を破壊するためにホモジナイズされ、そして細胞破壊の際に放出されたＤＮＡ／ＲＮＡ核酸を分解するためにヌクレアーゼで処理される。これには、細胞デブリ及びその他の不溶物を更に取り除くために、固体／液体分離ステップが後続する。細胞を含まない上清は、精製された酵素調製物を取得するために濾過される。発酵及び回収で使用されるすべての原材料は、食品グレード品質の原材料、又はその意図した使用に適合することが評価済みの原材料である。取得された酵素産物は、下流の酵素的変換の対象となり得る。図１は、本明細書で以下に記載する酵素産物の製造スキームを示す。
【００６０】
本発明の第１の態様の第３の実施形態は、本発明の第１の態様の第１、及び第２の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第３の実施形態では、本発明は、微生物宿主が大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株であり、及び最も好ましくはＬＥ１Ｂ１０９である方法に関する。
【００６１】
好ましくは、本発明は、組換え酵素が、
−  酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され、及び好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、キシロースイソメラーゼからなる群から選択され、並びに／或いは
−  （ｂ−１）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等；（ｂ−２）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等；及び（ｂ−３）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等からなる群から選択され、並びに／或いは
−  炭水化物修飾酵素であり、且つ、糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属し、
微生物宿主大腸菌内で、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株内で、及び最も好ましくはＬＥ１Ｂ１０９内で、発現された方法とも関連する。
【００６２】
好ましくは、微生物宿主大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株、最も好ましくはＬＥ１Ｂ１０９において発現させた組換え酵素は、公知の野生型酵素、又は公知の酵素エンジニアリング技術によりそれから派生した任意の改良型バリアントである。
【００６３】
製造株ＬＥ１Ｂ１０９は、研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株であり、それは本発明の第１の態様の第３の実施形態の開示に含まれる。
【００６４】
Ｋ−１２株、特にＷ３１１０亜株が、５０年を超え、研究室用微生物として安全に使用されており、また最も幅広く特徴づけられている細菌の１つである（Ｂａｃｈｍａｎｎ、１９７２；Ｊｅｎｓｅｎ、１９９３）。
【００６５】
大腸菌Ｋ−１２は、特別製の化学物質及びヒト用薬物の工業的生産において安全使用の長い歴史を有する（米国ＥＰＡ、１９９７年）。例えば、遺伝的に改変された大腸菌Ｋ−１２株から得られる食品酵素調製物（キモシン）は、１９９０年に米国ＦＤＡによりＧＲＡＳとして確認され（Ｆｌａｍｍ，１９９１；Ｏｌｅｍｐｓｋａ−Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、またチーズ製造用として全世界で安全に使用されてきた。欧州連合内では、現在のところ、大腸菌Ｋ−１２に由来する３つの食品酵素調製物が、規制（ＥＣ）１３３１／２００８（欧州委員会、２０１６年）に基づく承認要求事項の一環として、ＥＦＳＡにより評価されている。そのうちの１つ、Ｄ−アルロース−３−エピメラーゼが、最近、ＧＲＡＳ通知の対象となったが、米国ＦＤＡから質問提示されていない（米国ＦＤＡ、２０１６年）。大腸菌Ｋ−１２に由来する他の２食品酵素調製物である２つの異なるシクロマルトデキストリングルコトランスフェラーゼが、新規の食品配合物、α−及びγ−シクロデキストリンの製造において長年安全に使用されており、欧州委員会により２００８年及び２０１２年にそれぞれ承認されている。
【００６６】
大腸菌Ｋ−１２は、ヒト又は動物の病原体とはみなされておらず、従ってＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ、２０１６年）ではリスク群１に属するものとして分類される。更に、大腸菌Ｋ−１２は、病原性大腸菌株の病原性因子を試験する際に、非病原性参照菌として多くの場合使用される（Ｂｌａｎｃ−Ｐｏｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。大腸菌Ｋ−１２及びその派生物は、実質的に哺乳動物の胃腸管内で定着することができず、摂取時に疾病を引き起こす毒素を、志賀毒素を含め産生せず、また水又は土壌のいずれにおいても存続することができない（Ｂｏｇｏｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；米国ＥＰＡ、１９９７年）。親の研究室株Ｗ３１１０は、抗菌剤耐性導入遺伝子のいずれも有しない。大腸菌Ｋ−１２、特に亜株Ｗ３１１０の完全なゲノムが配列決定され、毒素産生能力の欠如が確認されている（Ｂｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００６７】
親株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０は、エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の十分定義された分類上のファミリーに属する。大腸菌の主要生息場所は、温血動物の下部消化管であり、その主要な好気性微生物を代表する。宿主も主に病原体の定着を阻止することにより若干の有益な効果をもたらすものの、大腸菌の非病原性株は共生生物と考えられる（Ｔｅｎａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００６８】
製造株ＬＥ１Ｂ１０９を創出するために、親株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０が、遺伝的安定性、特にプラスミドの安定性、並びに発現及び下流の酵素的変換の効率に関して、製造目的に適合させるために、異なる染色体遺伝子座において部位特異的な組換えにより改変されているが、それは本発明の範囲に含まれる。いくつかのプロテアーゼの発現が、対応する遺伝子の欠損により取り除かれている。目標クローンの抗生物質を用いない選択が、１つの遺伝子の欠損を通じて可能となった。更に１つの遺伝子が、望ましくない組換え効果を防止するために除去された。大腸菌Ｔ７ファージに由来するＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、及び大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０中に天然に存在するリプレッサーであるｌａｃＩの別の遺伝子コピーが、強力で制御された酵素発現を実現するためにＷ３１１０のゲノムに挿入されている。
【００６９】
酵素産生株大腸菌ＬＥ１Ｂ１０９は、親株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の派生体であるが、好ましくは、それは本発明の範囲に含まれる。使用する前に、そのゲノムが分析され、そして食品酵素法令要求事項を満たすように、抗生物質耐性遺伝子又は任意のその他の懸念される配列が存在しないことが確認されている。酵素産生株は、Ｐａｒｉｚａ及びＪｏｈｎｓｏｎにより開発されたデシジョンツリー（２００１年）を使用して評価されたが、酵素的変換の最終製品がＪＥＣＦＡ規格を満たすとする結論に基づき許可された。食品品質要求事項に適合させるために、製品仕様書に基づき、酵素バッチ毎に、最終酵素産物調製物内に製造用微生物が存在しないことが実証される。
【００７０】
副次反応を回避するために、製造株は、下流の酵素変換において所定の反応物質又は中間体が分解することに関連する、内因性酵素遺伝子の所定の欠損を有し得るが、それも更に本発明の範囲に含まれる。染色体ＤＮＡの欠損は、相同的組換え技術により標的遺伝子を除去することによって、例えば抗生物質耐性遺伝子又はその他の選択マーカーを有するプラスミドに基づく断片を組み込むことによって一般的に実施される。同様に、必要であれば、新しい遺伝子の挿入も可能である。適正な染色体突然変異体を選択した後、耐性遺伝子は一時的に発現させた酵素により切除される。或いは、望ましくない配列（例えば、プラスミドによりコードされる遺伝子又は全プラスミド）を失った細胞は、ネガティブ選択圧力、例えば、自殺マーカーの発現により選択され得る。食品酵素要求事項に適合するには、残留ベクター配列又は抗生物質耐性遺伝子が最終細胞内に残留してはならない。
【００７１】
酵素産物のための製造プロセスにおいて、対応する対象酵素に応じた発現ベクターを有する大腸菌製造株ＬＥ１Ｂ１０９が、発酵栄養源としてグルコース及び定義されたミネラルコンポーネントから構成される滅菌処理済みの培養培地内にイノキュレーションされ、そして発酵されるが、それは第１の態様の第３の実施形態の開示に含まれる。
【００７２】
本発明の第１の態様の第４の実施形態は、本発明の第１の態様の第１、及び第２及び第３の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第４の実施形態では、本発明は、発現ベクターが周知されたベクターｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に基づく方法に関する。本発明の目的に照らせば、酵素産物の遺伝子は、発現ベクター中にクローン化され、そして遺伝子の発現は、酵素発現用の誘導物質としてイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充することにより、発酵期間中に誘発される。
【００７３】
特定の酵素の製造で使用される最終的な産生株は、所望の酵素の特定の遺伝子を有する発現ベクターを導入することにより、ＬＥ１Ｂ１０９受容菌株から創出されるが、それは本発明の第１の態様の第４の実施形態及び任意のその他の実施形態の開示に含まれる。大腸菌受容菌株を形質転換するのに使用されるプラスミドは、周知のベクターｐＲＳＦ−１ｂに基づく。プラスミドは完全に配列決定されており、抗生物質耐性遺伝子又は任意のその他の懸念される配列を有しない。その後、抗生物質耐性遺伝子又は任意のその他の懸念される配列が存在しないことを確認するために、製造系統ＬＥ１Ｂ１０９が配列決定される。
【００７４】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、その任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、特定の酵素の製造で使用される最終的製造株は、相同的組換え技術に基づき、適する組込みベクター又はＤＮＡ断片を使用して、所望の酵素の特定の遺伝子をＬＥ１Ｂ１０９のゲノム中に組み込むことにより、ＬＥ１Ｂ１０９受容菌株から創出される。
【００７５】
本発明の第１の態様の第５の実施形態は、本発明の第１、及び第２、及び第３、及び第４の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第５の実施形態では、本発明は、発現ベクターが抗生物質耐性遺伝子又は任意のその他の懸念される配列を有しない方法に関する。
【００７６】
本発明の第１の態様の第６の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第６の実施形態では、本発明は、第１の態様の第１の実施形態（条項１）のステップ（ａ）において、又は第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｃ）において適する消泡剤が添加される方法に関する。本発明の目的に照らせば、酵素産物の製造における特別な品質要求事項に適合するような消泡剤が選択される。特に、米国ＦＤＡ２００３年９月１１日付け、ＦＴＡへの書簡には、消泡剤が、酵素産物の製造において使用するのにふさわしいものとして掲載されているが、それは本発明の開示に含まれる。本発明の目的に照らして、消泡剤は、ポリプロピレングリコール（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５３２２−６９−４）、ポリグリセロールポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．７８０４１−１４−２）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−１１−６）、ポリプロピレングリセロールモノブチルエーテル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−１３−８）、ポリジメチルシロキサン（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６３１４８−６２−９；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６８０８３−１８−１）、シリカ（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．７６３１−８６−９；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６３２３１−６７−４）、ステアリン酸（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．５７−１１−４）、セスキオレイン酸ソルビタン（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．８００７−４３−０）、グリセロールモノステアレート（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１２３−９４−４）、ポリソルベート（ポリソルベート６０（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−６７−８）、ポリソルベート６５（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−７１−４）、及びポリソルベート８０（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−６５−６）のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、菜種油モノ及びジグリセリド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９３７６３−３１−６）、及び白色鉱油（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６４７４２−４７−８）の消泡剤からなる群から選択され得る。
【００７７】
本発明によれば、好ましい沈殿剤は、凝集剤である。本発明の第１の態様の第７の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第７の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の適する凝集剤が、好ましくは第１の態様の第１の実施形態（条項１）のステップ（ａ）若しくはステップ（ｄ）において、又は好ましくは第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｃ）若しくはステップ（ｆ）において添加される方法に関する。本発明の目的に照らせば、酵素産物の製造に関する特別な品質要求事項に適合するような凝集剤が選択される。特に、米国ＦＤＡ２００３年９月１１付け、ＦＴＡへの書簡には、凝集剤が、酵素産物の製造において使用するのに許可されるものとして掲載されているが、それは本発明の開示に含まれる。
【００７８】
本発明の目的に照らして、凝集剤は、
ａ．カチオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８８−９７−０）、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．３１５６８−３５−１）、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．４２７５１−７９−１）等；並びに
ｂ．カチオン性ポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６７９５３−８０−４）、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６９４１８−２６−４）等；並びに
ｃ．陰イオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８７−３０−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−０６−９）等；並びに
ｄ．硫酸アンモニウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−０１−３）；並びに
ｅ．塩化カルシウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００３５−０４−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−５２−４）
の凝集剤からなる群より選択される。
【００７９】
本発明の第１の態様の第８の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第８の実施形態では、本発明は、沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される方法に関する。
【００８０】
本発明の第１の態様の第９の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第９の実施形態では、本発明は、沈殿剤が、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）７８１Ｇ、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ４４８、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ５８１  Ｇ、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ７５２、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）ＳＤ−２０８１、及びポリエチレンイミンのＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の沈殿剤からなる群から選択される方法に関する。
【００８１】
本発明の好ましくは第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態では、第１の態様の第１の実施形態（条項１）のステップ（ｂ）、又は第１の態様の第１の実施形態（条項２）のステップ（ｄ）に基づく組成物Ｉを提供するために、微生物宿主から酵素を放出させることは、例に過ぎないが、ホモジナイゼーション、フレンチプレス、ビーズミル、化学的処理、酵素的処理、凍結−解凍サイクル、又は超音波処理を含む、最新技術において公知の細胞破壊技術により達成される。
【００８２】
ホモジナイゼーションにより取得された組成物Ｉは発酵ブロスに直接由来し得るが、それは本発明の範囲に含まれる。発酵ブロスが、細胞破壊前に更に処理され得ること、特により高い細胞密度（単位容積当たりの細胞量）まで濃縮され得る、又はより低い細胞密度まで稀釈され得ることもやはり本発明の範囲に含まれる。得られた「濃縮された細胞」調製物又は「稀釈された細胞」調製物は、次に本発明による組成物Ｉを提供するために、細胞破壊の対象とすることができる。
【００８３】
本発明による細胞破壊技術により取得された組成物Ｉは、細胞ホモジネート、又はそのような細胞ホモジネートに由来する任意のその他の部分的に又は完全に精製された無細胞調製物を構成し得るが、それは本発明の範囲に含まれる。
【００８４】
本発明の第１の態様の第１０の実施形態は、第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９の実施形態、並びに任意のその他の本発明の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１０の実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼが添加される方法であって、該ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又はエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの混合物からなる群から選択される方法に関する。好ましくは、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方を加水分解することができる。好ましくは、ヌクレアーゼは、国際生化学分子生物学連合により帰属されたＥＣ番号のＥＣ３．１．１１．２、ＥＣ３．１．１１．５、ＥＣ３．１．１１．６、ＥＣ３．１．１３．４、ＥＣ３．１．１４．１、ＥＣ３．１．２１．１、ＥＣ３．１．２１．２、ＥＣ３．１．２１．３、ＥＣ３．１．２１．４、ＥＣ３．１．２１．６、ＥＣ３．１．２５．１、ＥＣ３．１．２６．３、ＥＣ３．１．２６．４、ＥＣ３．１．２６．５、ＥＣ３．１．２６．８、ＥＣ３．１．２６．９、ＥＣ３．１．２６．１１、ＥＣ３．１．２７．１、ＥＣ３．１．２７．３、ＥＣ３．１．２７．５、ＥＣ３．１．３０．１、ＥＣ３．１．３０．２、ＥＣ３．１．３１．１、及び好ましくはＥＣ３．１．３０．２を有するヌクレアーゼから選択される。
【００８５】
いくつかのヌクレアーゼ酵素は先行技術において公知であり、３’若しくは５’末端から、又は内部において、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子を切断することができ、或いは両方の活性を示す。本発明の目的に照らせば、ヌクレアーゼは、マイクロ濾過及び／又は限外濾過処理のいずれかを問わず、その前にＤＮＡ／ＲＮＡを効率的に切断することができる。核酸の切断又は分解とは、トリ、ジ、又はモノヌクレオチドサイズに低下した任意の長さの短縮したポリヌクレオチド、及び／又はオリゴヌクレオチドの形成を引き起こす、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマー間エステル結合の加水分解性の切断を意味するものとする。ポリヌクレオチドは、デゾキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、デゾキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドの任意の化学修飾、又はそのいずれかの組み合わせを含み得るが、それは本発明の範囲に含まれる。
【００８６】
本発明の第１の態様の第１１の実施形態は、本発明の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１１の実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼが添加され、該ヌクレアーゼが、配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも７０％同一である方法に関する。本発明のヌクレアーゼは、本発明のヌクレアーゼを標的とする抗体を利用する免疫アッセイ法を用いて検出可能である。例えば、対応するＥＬＩＳＡキットが、Ｍｅｒｃｋ社から市販されている。
【００８７】
本発明によるヌクレアーゼは、本発明の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列に対して、定義された同一性を有するようなアミノ酸配列を含み、それは本発明の範囲に含まれる。これは、本発明によるヌクレアーゼが、前記アミノ酸配列をその全体的なアミノ酸配列の部分配列として含み得ること、又は本発明によるヌクレアーゼが、前記アミノ酸配列から実質的に構成され得ることを意味する。本発明によるヌクレアーゼが、その全体的なアミノ酸配列の部分配列として前記アミノ酸配列を含むとき、前記全体的なアミノ酸配列は延長され得る、すなわち追加のアミノ酸残基を、前記部分配列のＮ末端において、及び／又はＣ末端において含み得る。そのような延長は、例えば、ヌクレアーゼが、例えば精製目的で固体支持体上に固定化されるとき、有利であり得る。更に、そのような延長は、配列番号１及び／又は配列番号２の成熟したヌクレアーゼ酵素の酵素前駆体分子においても、例えば酵素の、天然における又は付加されたシグナルペプチド配列若しくはプロペプチド配列においても生じ得る。特に、本発明によるヌクレアーゼは、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のＮ末端において、１個のメチオニン（追加のアミノ酸）により延長され得るが、そのメチオニン残基は、大腸菌のような微生物宿主における個々のヌクレアーゼ、すなわち配列番号２の組換え発現に由来し得る。
【００８８】
アミノ酸残基のポリマーの同一性及び相同性がそれぞれどのように決定されるか、その方式は公知である。本発明の目的に照らして、相同性及び同一性は類義語として理解される。同一性の割合（％）は以下のように計算される：配列同一性［％］＝一致数／Ｌ×１００、但し式中、Ｌはアライメントされた位置、すなわち一致及び非一致の数（もしあれば、ギャップを含む）である。本発明の意図するところでは、同一性は、好ましくは下記のアルゴリズムパラメーター：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト（Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ）：既存（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１エクステンション（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：１、期待閾値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：１０、及びワードサイズ（Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）：６を用いて、ＢＬＡＳＴＰを使用して計算されることが好ましい（例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ“，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｅ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｅｒｔｚ，Ｒｉｃｈａ  Ａｇａｒｗａｌａ，Ａｌｅｋｓａｎｄｒ  Ｍｏｒｇｕｌｉｓ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ａｎｄ  Ｙｉ−Ｋｕｏ  Ｙｕ（２００５）“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ．”ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：５１０１−５１０９）を参照）。結果は、配列について３５％を超えるクエリ範囲でフィルター処理される。ＢｌａｓｔＰは、ＮＣＢＩホームページ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ｐｒｏｇｒａｍ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈＬＩＮＫ＿ＬＯＣＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）においてオンラインアクセス可能である。その他のプログラム設定は、例えば、
−  「Ｅｎｔｅｒ  Ｑｕｅｒｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」欄：クエリサブレンジ：無し
−  「Ｃｈｏｏｓｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｔ」欄：データベース：非冗長性のタンパク質配列（ｎｒ）；任意選択のパラメーター：無し
−  「Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」欄：アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）
−  アルゴリズムパラメーター：「Ｇｅｎｅｒａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ」欄：最大標的配列：１００〜２００００、好ましくは２００００；ショートクエリ：短いインプット配列についてパラメーターを自動的に調整する；期待閾値：１０；ワードサイズ：６；クエリ範囲内の最大一致：０
−  アルゴリズムパラメーター：「Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ」欄：マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：既存：１１エクステンション：１；組成調整（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ）：条件成分に応じたマトリックス調整（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）
−  アルゴリズムパラメーター：「Ｆｉｌｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｋｉｎｇ」欄：フィルター：無し；マスク：無し
の設定を使用して望み通り調節可能である。
【００８９】
好ましくは、ヌクレアーゼは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９３．１％、少なくとも９３．２％、少なくとも９３．３％、少なくとも９３．４％、少なくとも９３．５％、少なくとも９３．６％、少なくとも９３．７％、少なくとも９３．８％、少なくとも９３．９％、より好ましくは少なくとも９４％、少なくとも９４．１％、少なくとも９４．２％、少なくとも９４．３％、少なくとも９４．４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９４．６％、少なくとも９４．７％、少なくとも９４．８％、少なくとも９４．９％、なおもより好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９５．１％、少なくとも９５．２％、少なくとも９５．３％、少なくとも９５．４％、少なくとも９５．５％、少なくとも９５．６％、少なくとも９５．７％、少なくとも９５．８％、少なくとも９５．９％、いっそうより好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９６．１％、少なくとも９６．２％、少なくとも９６．３％、少なくとも９６．４％、少なくとも９６．５％、少なくとも９６．６％、少なくとも９６．７％、少なくとも９６．８％、少なくとも９６．９％、なおいっそうより好ましくは少なくとも９７％、少なくとも９７．１％、少なくとも９７．２％、少なくとも９７．３％、少なくとも９７．４％、少なくとも９７．５％、少なくとも９７．６％、少なくとも９７．７％、少なくとも９７．８％、少なくとも９７．９％、最も好ましくは少なくとも９８％、少なくとも９８．１％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．３％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、及び特に少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、本発明の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列から実質的に構成されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、本発明の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列から構成される。
【００９０】
好ましい実施形態では、本発明によるヌクレアーゼは、本発明の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列の融合タンパク質であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に融合している任意のその他のアミノ酸、オリゴ又はポリペプチドを有する。最も好ましくは、本発明によるヌクレアーゼは、Ｎ末端に融合しているメチオニンを有する融合タンパク質である。
【００９１】
本発明の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列の融合タンパク質内の任意のＮ末端又はＣ末端アミノ酸延長部は、延長されたアミノ酸配列と延長されていないアミノ酸配列の間の配列一致性を計算する際に無視されること、及び融合配列は、本明細書に記載するアルゴリズムを使用して、非融合タンパク質と融合タンパク質の間の配列一致性を計算する場合、それに寄与してはならないことは、本発明の範囲に含まれる。
【００９２】
本発明の第１の態様の第１２の実施形態は、本発明の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１２の実施形態において、本発明は、発酵ブロス、細胞濃縮物、ホモジネート、又は本明細書に開示する任意のその他の調製物を含む、処理済みの調製物、好ましくは組成物ＩＩの１ｍｌについて使用されるヌクレアーゼの量が、１，０００Ｕを超える、９００Ｕを超える、８００Ｕを超える、７００Ｕを超える、６００Ｕを超える、５００Ｕを超える、４００Ｕを超える、３００Ｕを超える、２００Ｕを超える、１００Ｕを超える、５０Ｕを超える、４０Ｕを超える、３０Ｕを超える、２０Ｕを超える、１５Ｕを超える、１０Ｕを超える、５Ｕを超える、３Ｕを超える、２Ｕを超える、１Ｕを超える、０．５Ｕを超える、若しくは０．１Ｕを超える；又は調製物１ｍＬ当たり０．１Ｕ〜１０００Ｕ、０．１Ｕ〜９００Ｕ、０．１Ｕ〜８００Ｕ、０．１Ｕ〜７００Ｕ、０．１Ｕ〜６００Ｕ、０．１Ｕ〜５００Ｕ、０．１Ｕ〜４００Ｕ、０．１Ｕ〜３００Ｕ、０．１Ｕ〜２００Ｕ、０．１Ｕ〜１００Ｕ、０．１Ｕ〜９０Ｕ、０．１Ｕ〜８０Ｕ、０．１Ｕ〜７０Ｕ、０．１Ｕ〜６０Ｕ、０．１Ｕ〜５０Ｕ、０．１Ｕ〜４０Ｕ、０．１Ｕ〜３０Ｕ、０．１Ｕ〜２０Ｕ、０．１Ｕ〜１９Ｕ、０．１Ｕ〜１８Ｕ、０．１Ｕ〜１７Ｕ、０．１Ｕ〜１６Ｕ、０．１Ｕ〜１５Ｕ、０．１Ｕ〜１４Ｕ、０．１Ｕ〜１３Ｕ、０．１Ｕ〜１２Ｕ、０．１Ｕ〜１１Ｕ、０．１Ｕ〜１０Ｕ、０．１Ｕ〜９Ｕ、０．１Ｕ〜８Ｕ、０．１Ｕ〜７Ｕ、０．１Ｕ〜６Ｕ、０．１Ｕ〜５Ｕ、０．１Ｕ〜４Ｕ、０．１Ｕ〜３Ｕ、０．１Ｕ〜２Ｕ、０．１Ｕ〜１Ｕ、若しくは５Ｕ〜１０００Ｕ、５Ｕ〜９００Ｕ、５Ｕ〜８００Ｕ、５Ｕ〜７００Ｕ、５Ｕ〜６００Ｕ、５Ｕ〜５００Ｕ、５Ｕ〜４００Ｕ、５Ｕ〜３００Ｕ、５Ｕ〜２００Ｕ、５Ｕ〜１００Ｕ、５Ｕ〜９０Ｕ、５Ｕ〜８０Ｕ、５Ｕ〜７０Ｕ、５Ｕ〜６０Ｕ、５Ｕ〜５０Ｕ、５Ｕ〜４０Ｕ、５Ｕ〜３０Ｕ、５Ｕ〜２０Ｕ、５Ｕ〜１９Ｕ、５Ｕ〜１８Ｕ、５Ｕ〜１７Ｕ、５Ｕ〜１６Ｕ、５Ｕ〜１５Ｕ、５Ｕ〜１４Ｕ、５Ｕ〜１３Ｕ、５Ｕ〜１２Ｕ、５Ｕ〜１１Ｕ、５Ｕ〜１０Ｕ、若しくは１０Ｕ〜１０００Ｕ、１０Ｕ〜９００Ｕ、１０Ｕ〜８００Ｕ、１０Ｕ〜７００Ｕ、１０Ｕ〜６００Ｕ、１０Ｕ〜５００Ｕ、１０Ｕ〜４００Ｕ、１０Ｕ〜３００Ｕ、１０Ｕ〜２００Ｕ、１０Ｕ〜１００Ｕ、１０Ｕ〜９０Ｕ、１０Ｕ〜８０Ｕ、１０Ｕ〜７０Ｕ、１０Ｕ〜６０Ｕ、１０Ｕ〜５０Ｕ、若しくは５０Ｕ〜１０００Ｕ、５０Ｕ〜９００Ｕ、５０Ｕ〜８００Ｕ、５０Ｕ〜７００Ｕ、５０Ｕ〜６００Ｕ、５０Ｕ〜５００Ｕ、５０Ｕ〜４００Ｕ、５０Ｕ〜３００Ｕ、５０Ｕ〜２００Ｕ、５０Ｕ〜１５０Ｕ、若しくは１００Ｕである方法に関する。
【００９３】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、第１の態様の任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その実施形態では、本発明は、本明細書の開示に従い処理されるバイオマス当量、好ましくは発酵ブロス、細胞濃縮物、ホモジネート、又は本明細書に開示する任意のその他の調製物、好ましくは組成物ＩＩのバイオマス当量１グラム当たりの使用されるヌクレアーゼの量が、２，０００Ｕを超える、１９００Ｕを超える、１８００Ｕを超える、１７００Ｕを超える、１６００Ｕを超える、１５００Ｕを超える、１４００Ｕを超える、１３００Ｕを超える、１２００Ｕを超える、１１００Ｕを超える、１，０００Ｕを超える、９００Ｕを超える、８００Ｕを超える、７００Ｕを超える、６００Ｕを超える、５００Ｕを超える、４００Ｕを超える、３５０Ｕを超える、３００Ｕを超える、２５０Ｕを超える、２００Ｕを超える、１５０Ｕを超える、１００Ｕを超える、５０Ｕを超える、２５Ｕを超える、１０Ｕを超える、５Ｕを超える、３Ｕを超える、２Ｕを超える、１Ｕを超える、０．５Ｕを超える、若しくは０．１Ｕを超える；又はバイオマス当量１グラム当たり０．１Ｕ〜２０００Ｕ、０．１Ｕ〜１９００Ｕ、０．１Ｕ〜１８００Ｕ、０．１Ｕ〜１７００Ｕ、０．１Ｕ〜１６００Ｕ、０．１Ｕ〜１５００Ｕ、０．１Ｕ〜１４００Ｕ、０．１Ｕ〜１３００Ｕ、０．１Ｕ〜１２００Ｕ、０．１Ｕ〜１１００Ｕ、０．１Ｕ〜１０００Ｕ、０．１Ｕ〜９００Ｕ、０．１Ｕ〜８００Ｕ、０．１Ｕ〜７００Ｕ、０．１Ｕ〜６００Ｕ、０．１Ｕ〜５００Ｕ、０．１Ｕ〜４００Ｕ、０．１Ｕ〜３５０Ｕ、０．１Ｕ〜３００Ｕ；若しくは５Ｕ〜２０００Ｕ、５Ｕ〜１９００Ｕ、５Ｕ〜１８００Ｕ、５Ｕ〜１７００Ｕ、５Ｕ〜１６００Ｕ、５Ｕ〜１５００Ｕ、５Ｕ〜１４００Ｕ、５Ｕ〜１３００Ｕ、５Ｕ〜１２００Ｕ、５Ｕ〜１１００Ｕ、５Ｕ〜１０００Ｕ、５Ｕ〜９００Ｕ、５Ｕ〜８００Ｕ、５Ｕ〜７００Ｕ、５Ｕ〜６００Ｕ、５Ｕ〜５００Ｕ、５Ｕ〜４００Ｕ、５Ｕ〜３５０Ｕ、５Ｕ〜３００Ｕ；若しくは１０Ｕ〜２０００Ｕ、１０Ｕ〜１９００Ｕ、１０Ｕ〜１８００Ｕ、１０Ｕ〜１７００Ｕ、１０Ｕ〜１６００Ｕ、１０Ｕ〜１５００Ｕ、１０Ｕ〜１４００Ｕ、１０Ｕ〜１３００Ｕ、１０Ｕ〜１２００Ｕ、１０Ｕ〜１１００Ｕ、１０Ｕ〜１０００Ｕ、１０Ｕ〜９００Ｕ、１０Ｕ〜８００Ｕ、１０Ｕ〜７００Ｕ、１０Ｕ〜６００Ｕ、１０Ｕ〜５００Ｕ、１０Ｕ〜４００Ｕ、１０Ｕ〜３５０Ｕ、１０Ｕ〜３００Ｕ；若しくは５０Ｕ〜２０００Ｕ、５０Ｕ〜１９００Ｕ、５０Ｕ〜１８００Ｕ、５０Ｕ〜１７００Ｕ、５０Ｕ〜１６００Ｕ、５０Ｕ〜１５００Ｕ、５０Ｕ〜１４００Ｕ、５０Ｕ〜１３００Ｕ、５０Ｕ〜１２００Ｕ、５０Ｕ〜１１００Ｕ、５０Ｕ〜１０００Ｕ、５０Ｕ〜９００Ｕ、５０Ｕ〜８００Ｕ、５０Ｕ〜７００Ｕ、５０Ｕ〜６００Ｕ、５０Ｕ〜５００Ｕ、５０Ｕ〜４００Ｕ、５０Ｕ〜３５０Ｕ、５０Ｕ〜３００Ｕ；及び好ましくは１００Ｕ〜３００Ｕ、１２０Ｕ〜３００Ｕ、１５０Ｕ〜３００Ｕ、２００Ｕ〜３００Ｕ、及び最も好ましくは２２０Ｕ〜２８０Ｕ、及び究極に好ましくは２５０Ｕである方法に関する。
【００９４】
本発明の目的に照らして、「バイオマス当量」とは、発酵ブロスから最初に収集された「バイオウェットマス」として採取されたバイオマスの量（グラム）、及び任意のホモジネート、無細胞調製物、又はそのような最初に収集された採取後のバイオマスに由来する、任意のその他の部分的に若しくは完全に精製された調製物に含まれるそのような採取されたバイオマスに由来するそれぞれの同等の量（グラム）を意味するものとし、そのような発酵ブロス、ホモジネート、無細胞調製物、又はその他の調製物の比体積を問わず、及びそのような発酵ブロス、ホモジネート、無細胞調製物、又はその他の調製物が、稀釈され、濃縮されているか、又はいずれもされていないかを問わない。本発明が意味する「バイオウェットマス」は、発酵ブロスからペレット化され、そして上清から分離されるが、しかしそのようなペレット化された細胞の特別な乾燥はなされない細胞の重量（グラム）を意味するものとする。念のために、測定後のバイオウェットマスが発酵ブロス１Ｌ当たり２００ｇである発酵ブロスは、細胞ホモジナイゼーションするために３倍に濃縮されて、６００ｇ／Ｌのバイオマス当量の細胞濃縮物となり得るが、また得られたホモジネートは、ヌクレアーゼ酵素により処理するために１．５倍に稀釈されて、４００ｇ／Ｌのバイオマス当量のホモジネートとなり得る。
【００９５】
本発明の目的に照らせば、Ｕはユニットを意味する。１ユニットのヌクレアーゼは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ中、ｐＨ８．０及び温度３７℃において、３０分間のΔ２６０ｎｍが１に等しい１μｍｏｌの酸可溶性オリゴ糖をサケ精子ＤＮＡから遊離させるヌクレアーゼ量として定義される。
【００９６】
本発明の第１の態様の第１３の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１３の実施形態では、本発明は、第１の態様の第１の実施形態（条項１）のステップ（ｆ）又はステップ（ｖ）に対応し、及び第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップが、メンブレンに基づく若しくはフィルターに基づく方法、又は液体の粒径依存性分離を行うためのその他の適する方法と関係する方法に関する。１０００ｋＤａを超える、５００ｋＤａを超える、４００ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超える、２００ｋＤａを超える、１５０ｋＤａを超える、１００ｋＤａを超える、９０ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、７０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、若しくは５ｋＤａを超える粒径排除限界により特徴づけられるメンブレンが使用され、及び／又は同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルターが使用され、そして組換え酵素産物がマイクロ濾過ステップの濾液内で得られるが、それは本発明の範囲に含まれる。本発明の目的に照らせば、ｋＤａとはキロダルトンを意味する。
【００９７】
本発明の第１の態様の第１４の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１４の実施形態では、本発明は、第１の態様の第１の実施形態（条項１）のステップ（ｆ）又は（ｖ）に対応し、及び第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップは、メンブレンに基づく若しくはフィルターに基づく方法、又は液体の粒径依存性分離を行うためのその他の適する方法を含む方法に関する。５μｍを超える、４μｍを超える、３μｍを超える、２μｍを超える、１μｍを超える、０．５μｍを超える、０．４μｍを超える、０．３μｍを超える、０．２μｍを超える、若しくは０．１μｍを超える粒径排除限界を有するメンブレンが使用され、及び／又は同等の粒径排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルターが使用され、そして組換え酵素産物が、マイクロ濾過ステップの濾液内に得られるが、それは本発明の範囲に含まれる。
【００９８】
本発明の第１の態様の第１５の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１５の実施形態では、本発明は、第１の実施形態（条項１）のステップ（ｆ）又は（ｖ）に対応し、及び第２の実施形態（条項２）のステップ（ｈ）に対応するマイクロ濾過ステップの後に、任意選択で、追加の限外濾過ステップが適用され、その限外濾過は、メンブレンに基づく若しくはフィルターに基づく方法、又は液体の粒径依存性分離を行うためのその他の適する方法を含む方法に関する。１００ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、１５ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、５ｋＤａを超える、若しくは１ｋＤａを超える粒径排除限界を有するメンブレンが使用され、及び／又は同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルターが使用され、及び組換え酵素産物が、限外濾過ステップの保持液内に得られるが、それは本発明の範囲に含まれる。
【００９９】
好ましくは、本発明は、第１の実施形態（条項１）のステップ（ｆ）又は（ｖ）に対応し、及び第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップの後に、任意選択で追加の限外濾過ステップが適用され、その限外濾過ステップは、メンブレンに基づく若しくはフィルターに基づく方法、又は液体の粒径依存性分離を行うためのその他の適する方法に関する。０．１μｍを超える、０．０９μｍを超える、０．０８μｍを超える、０．０７μｍを超える、０．０６μｍを超える、０．０５μｍを超える、０．０４μｍを超える、０．０３μｍを超える、０．０２μｍを超える、若しくは０．０１μｍを超える粒径排除限界を有するメンブレンが使用され、及び／又は同等の粒径排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルターが使用され、及び組換え酵素産物が、マイクロ濾過ステップの濾液内で得られるが、それは本発明の範囲に含まれる。
【０１００】
好ましくは、第１の実施形態（条項１）のステップ（ｆ）又は（ｖ）に対応し、及び第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップについて、並びに／或いは任意選択の限外濾過ステップについて、最新技術において公知の濾過方法が使用され得る。
【０１０１】
濾過方法は、例えば、適するフィルター又はメンブレン材料を用いたタンジェンシャルフロー濾過、クロスフロー濾過、中空糸型濾過、フィルタープレスを含め、メンブレンに基づく又はフィルターに基づく技術を含む。マイクロ濾過は、０．１μｍよりも高い（＞０．１μｍ）粒径排除カットオフ範囲を有する濾過を通常カバーする一方、限外濾過は、０．１μｍ未満（＜０．１μｍ）の粒径排除カットオフ範囲を有する濾過を通常カバーする。
【０１０２】
本発明の第１の態様の第１６の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１６の実施形態では、本発明は、第１の実施形態（条項１）のステップ（ｅ）又は（ｉｖ）に対応し、及び第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｇ）に基づく固体／液体分離ステップが、遠心分離、フロー遠心分離、フィルタープレス、濾過方法の技術、及び／又は固相から液相を部分的若しくは完全に分離するのに適する任意のその他の技術により達成される方法に関する。ステップ内で処理される容積スケールに基づき、方法が選択される。
【０１０３】
好ましくは、第１の実施形態（条項１）のステップ（ｅ）又は（ｉｖ）に対応し、及び第１の態様の第２の実施形態（条項２）のステップ（ｇ）に基づくプロセスの固体／液体分離ステップは、第１の実施形態のステップ（ｄ）又は（ｉｉｉ）に対応し、及び本発明の第１の態様の第２の実施形態のステップ（ｆ）に基づく沈殿剤を添加するステップに後続する。
【０１０４】
本発明の第１の態様の第１７の実施形態は、本発明の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１７の実施形態では、本発明は、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも３つ、なおいっそうより好ましくは少なくとも２つ、及び最も好ましくは少なくとも１つの細胞内タンパク質（複数可）を発現させる方法に関する。
【０１０５】
本発明の第１の態様の第１８の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１８の実施形態では、本発明は、製造株から発現する１つ又は複数の組換え酵素が、単独で又は総合して、酵素産物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも２０％、よりいっそう好ましくは少なくとも１０％、なおもより好ましくは少なくとも５％、なおもより好ましくは少なくとも１％、及び最も好ましくは少なくとも０．１％を占める方法に関する。
【０１０６】
本発明の第１の態様の第１９の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７、及び第１８の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第１９の実施形態では、本発明は、酵素産物が食品酵素である方法に関する。本発明の目的に照らせば、食品酵素とは、食料品に添加され、食料品を調製若しくは処理するための処理剤として使用される酵素、又は食品配合物を製造するための下流の酵素的変換において使用される酵素を意味する。食品酵素の場合、例えば、食品用化学薬品集（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、又は同等の国際的な食品標準若しくは薬局方標準［例えば、ＪＥＣＦＡ、食品用公定化学品集（ＦＣＣ）、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）］、食品用ｃＧＭＰに定める規格及び推奨される純度基準、及び／又は重要管理点のハザード分析の原理（ＨＡＣＣＰ）を含む、特定の規格への適合を要求する製造品質標準が定義されている。
【０１０７】
本発明の第１の態様の第２０の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７、及び第１８、及び第１９の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２０の実施形態では、本発明は、酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される方法に関する。そのようなクラスに由来する酵素は、最新技術分野において、例えば特許出願国際公開第２００８／１５１８０７号、同第２０１２／０４８８６５号、同第２０１５／１６２０６４、同第２０１６／１９８６６０号、又は同第２０１６／１９８６６５号の配列番号において十分に記載されているが、その配列番号は、本明細書において、本発明の開示に対する参考資料として導入されている。
【０１０８】
本発明の第１の態様の第２１の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７、及び第１８、及び第１９、及び第２０の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２１の実施形態では、本発明は、酵素産物が、
ａ．炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ．アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ．脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される方法に関する。
【０１０９】
本発明の目的に照らせば、炭水化物修飾酵素は、（ｉ）炭水化物若しくは炭水化物誘導体である、又は（ｉｉ）触媒活性を有し、その触媒活性に伴う生成物として炭水化物又は炭水化物誘導体を形成する基質に対してその触媒活性を発揮する酵素である。炭水化物修飾酵素は、食品産業にとって非常に有用な酵素である。同酵素は、例えば下流の酵素変換において、炭水化物食品配合物の合成に使用可能である。
【０１１０】
本発明の第１の態様の第２２の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７、及び第１８、及び第１９、及び第２０、及び第２１の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２２の実施形態では、本発明は、酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスうちの少なくとも１つに属する方法に関する。
【０１１１】
本発明の第１の態様の第２３の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７、及び第１８、及び第１９、及び第２０、及び第２１、及び第２２の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２３の実施形態では、本発明は、微生物製造用宿主が、例えば、酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−１−ホスフェートホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、α，α−トレハロースホスフェートシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−Ｎ−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−Ａ−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−４−デオキシ−４−ホルムアミド−Ｌ−アラビノーストランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（非加水分解型）、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート−２−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、１つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている方法に関する。
【０１１２】
組換え酵素の未精製酵素調製物は、製造用宿主の代謝に由来する酵素の副次活性を含有する。炭水化物修飾酵素の場合、そのような妨害性の副次的酵素活性は、炭水化物代謝に由来し得るが、例えばアデノシン、ウリジン、シチジン、グアノシンといったヌクレオチドのヌクレオチドモノ、ジ、又はトリホスフェートとリンクしている炭水化物部分の活性化を必要とする酵素の場合、そのような妨害性の副次的酵素活性は、炭水化物及び／又はヌクレオチド代謝に由来し得る。好ましい実施形態では、宿主に由来する、対応する炭水化物修飾酵素遺伝子が、遺伝子工学又はＤＮＡ編集法により除去及び不活性化される。そのような遺伝子の欠損又は不活性化は、例えば、酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−１−ホスフェートホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、α，α−トレハロースホスフェートシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−Ｎ−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−Ａ−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−４−デオキシ−４−ホルムアミド−Ｌ−アラビノーストランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（非加水分解型）、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート−２−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、１つ又はいくつかの遺伝子を含み得る。
【０１１３】
本発明の第１の態様の第２４の実施形態は、第１の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、及び第６、及び第７、及び第８、及び第９、及び第１０、及び第１１、及び第１２、及び第１３、及び第１４、及び第１５、及び第１６、及び第１７、及び第１８、及び第１９、及び第２０、及び第２１、及び第２２、及び第２３の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２４の実施形態では、本発明は、
ａ．組換え酵素産物を含有する細胞破壊未精製ライセートを、ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、これにより組換え酵素産物、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩを提供し、
ｂ．核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップ、これにより酵素産物、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物ＩＩＩを提供し、
ｃ．液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために液体／固体分離を行うステップと、これにより、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む分離固相、並びに酵素産物を含む液体組成物ＩＶを提供し、
ｄ．残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップ、これにより酵素産物を含む組成物Ｖを提供する、
を含む方法に関する。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、組換え酵素処方物の製造方法であって、ステップ（ｉｖ）における固体／液体分離後、分離固相が、複合体化した分解後の核酸、及び任意選択で細胞デブリ、及び任意選択で組成物ＩＩＩに由来する酵素産物の残留物を主に含み；並びに取得された分離後の液相、特に組成物ＩＶが、酵素産物、及び任意選択で細胞デブリの残留物、及び組成物ＩＩＩに由来する複合体化した分解後の核酸を主に含む製造方法に関する。
【０１１５】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、第１の態様のこれまでに記載した実施形態のいずれかを問わず、そのうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、方法は、
ａ．組成物Ｉとの比較において、組成物Ｖ中の核酸含有量が低下していること、及び／又は
ｂ．組成物Ｉとの比較において、組成物Ｖ中の酵素産物の触媒活性が回復していること
により特徴づけられる。
【０１１６】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、本明細書のこれまでに記載した実施形態のいずれかを問わず、そのうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、方法は、組成物Ｉとの比較において組成物Ｖ中の、又は任意選択で組成物ＶＩ中の核酸含有量が２〜１億、２〜５０００万、２〜３０００万、２〜２０００万、２〜１５００万、２〜１０００万、１００〜１億、１００〜５０００万、１００〜３０００万、１００〜２０００万、１００〜１５００万、１００〜１０００万、１０００〜１億、１０００〜５０００万、１０００〜３０００万、１０００〜２０００万、１０００〜１５００万、１０００〜１０００万、１０，０００〜１億、１０，０００〜５０００万、１０，０００〜３０００万、１０，０００〜２０００万、１０，０００〜１５００万、１０，０００〜１０００万、１００，０００〜１億、１００，０００〜５０００万、１００，０００〜３０００万、１００，０００〜２０００万、１００，０００〜１５００万、１００，０００〜１０００万、１００万〜１億、１００万〜５０００万、１００万〜３０００万、１００万〜２０００万、１００万〜１５００万、１００万〜１０００万分の一に低下していることにより特徴づけられる。
【０１１７】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、本明細書のこれまでに記載した実施形態のいずれかを問わず、そのうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、方法は、酵素産物、組成物Ｖ中の、又は任意選択で組成物ＶＩ中の核酸含有量により特徴づけられ、すなわち酵素産物、又は組成物Ｖ、又は組成物ＶＩの単位重量当たりのＤＮＡ濃度が、０．０１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又は好ましくは０．００１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０．００１ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又はより好ましくは０ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及びより好ましくは０ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、又は０ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、及び最も好ましくは０ｎｇ／ｇ〜０．０９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．０１ｎｇ／ｇ、及び最も好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満，又は究極に好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満であることにより、酵素産物、組成物Ｖ、若しくは組成物ＶＩそのもの、又はそれに由来する任意の液体、凍結乾燥若しくは安定化された処方物それぞれにおいて特徴づけられる。
【０１１８】
本発明の好ましくは第１の態様の好ましい実施形態は、本明細書のこれまでに記載した実施形態のいずれかを問わず、そのうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、方法は、組成物Ｉと比較して組成物Ｖにおいて、又は任意選択で組成物ＶＩにおいて、少なくとも１％〜最大１００％、少なくとも５％〜最大１００％、少なくとも１０％〜最大１００％、少なくとも１５％〜最大１００％、少なくとも２０％〜最大１００％、少なくとも２５％〜最大１００％、少なくとも３０％〜最大１００％、少なくとも３５％〜最大１００％、少なくとも４０％〜最大１００％、少なくとも４５％〜最大１００％、少なくとも５０％〜最大１００％、少なくとも５５％〜最大１００％、少なくとも６０％〜最大１００％、少なくとも６５％〜最大１００％、少なくとも７０％〜最大１００％、少なくとも７５％〜最大１００％、少なくとも８０％〜最大１００％、少なくとも８５％〜最大１００％、少なくとも９０％〜最大１００％、少なくとも９５％〜最大１００％、又は少なくとも９６％〜最大１００％、少なくとも９７％〜最大１００％、少なくとも９８％〜最大１００％、少なくとも９９％〜最大１００％、より好ましくは少なくとも２５％〜最大９９％、少なくとも３０％〜最大９９％、少なくとも３５％〜最大９９％、少なくとも４０％〜最大９９％、少なくとも４５％〜最大９９％、少なくとも５０％〜最大９９％、少なくとも５５％〜最大９９％、少なくとも６０％〜最大９９％、少なくとも６５％〜最大９９％、少なくとも７０％〜最大９９％、少なくとも７５％〜最大９９％、少なくとも８０％〜最大９９％、少なくとも８５％〜最大９９％、少なくとも９０％〜最大９９％、少なくとも９５％〜最大９９％、又は少なくとも９６％〜最大９９％、少なくとも９７％〜最大９９％、少なくとも９８％〜最大９９％、なおいっそうより好ましくは少なくとも２５％〜最大９５％、少なくとも３０％〜最大９５％、少なくとも３５％〜最大９５％、少なくとも４０％〜最大９５％、少なくとも４５％〜最大９５％、少なくとも５０％〜最大９５％、少なくとも５５％〜最大９５％、少なくとも６０％〜最大９５％、少なくとも６５％〜最大９５％、少なくとも７０％〜最大９５％、少なくとも７５％〜最大９５％、少なくとも８０％〜最大９５％、少なくとも８５％〜最大９５％、少なくとも９０％〜最大９５％、なおいっそうより好ましくは少なくとも５０％〜最大９０％、少なくとも５５％〜最大９０％、少なくとも６０％〜最大９０％、少なくとも６５％〜最大９０％、少なくとも７０％〜最大９０％、少なくとも７５％〜最大９０％、少なくとも８０％〜最大９０％、少なくとも８５％〜最大９０％、なおいっそうより好ましくは少なくとも５５％〜最大８５％、少なくとも６０％〜最大８５％、少なくとも６５％〜最大８５％、少なくとも７０％〜最大８５％、少なくとも７５％〜最大８５％、少なくとも８０％〜最大８５％、最も好ましくは少なくとも６０％〜最大８０％、少なくとも６５％〜最大８０％、少なくとも７０％〜最大８０％、少なくとも７５％〜最大８０％、酵素産物の触媒活性が回復していることにより特徴づけられる。
【０１１９】
本発明は、本発明による方法により取得可能な組換え酵素調製物とも関連する。
【０１２０】
好ましくは、調製物は、残留ＤＮＡ濃度が０ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ，０ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ，０ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ，０ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又はより好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満、又は最も好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満であることにより特徴づけられる。
【０１２１】
本発明の第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物に関する。
【０１２２】
好ましくは、例えば、本発明の第２の態様の第１の実施形態では、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物であって、該酵素産物、又は組成物Ｖ、又は組成物ＶＩ中の残留ＤＮＡ濃度が、該酵素産物、組成物Ｖ、若しくは組成物ＶＩそのもの、又はそれに由来する任意の液体、凍結乾燥若しくは安定化された処方物に関して０．０１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又はより好ましくは０．００１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０．００１ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０．００１ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又はなおいっそうより好ましくは０ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇ、及び好ましくは０ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇ、０ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇ、又は最も好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満、又は究極に好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満であることにより特徴づけられる調製物に関する。
【０１２３】
本発明の目的に照らして、組換えＤＮＡ濃度は、サイズが少なくとも５０〜５，０００塩基対、又は少なくとも１００〜５，０００塩基対、又は少なくとも１，０００〜５，０００塩基対、又は完全な酵素遺伝子配列の組換えＤＮＡを含む代表的なＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応に基づく増幅（ＰＣＲ）に準拠する方法により決定されるものである。較正は、製造用宿主に由来する全ＤＮＡ調製物を用いて実施される。リアルタイムＰＣＲを含む標準的なＰＣＲ技術が、組換えＤＮＡ濃度を決定するのに使用され得るが、その場合、ＰＣＲプライマーは、微生物宿主ＤＮＡ及び／又は発現ベクターＤＮＡを標的とし得る。
【０１２４】
製品又は調製物内の残留ＤＮＡの濃度は、最新技術において確立された方法により更に決定することができる。食品酵素の調製物の場合、例えば、実現する可能性のある方法又は将来的にＥＦＳＡにより公表され得るあらゆる文書更新は、ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１；９（６）：２１９３に記載されている。
【０１２５】
本発明の残留ＤＮＡ濃度は、本明細書において参照として導入されているＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１；９（６）：２１９３に掲載されたガイダンスから選択される又はそれに基づく方法の使用により決定されるが、それは本発明の範囲に含まれる。
【０１２６】
本発明の好ましくは第２の態様の好ましい実施形態において、又は第２の態様の実施形態のうちのいずれかにおいて、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のうちのいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物であって、酵素産物の調製物内にＤＮＡ断片が存在しないことにより、酵素産物はその他の調製物から区別することができる調製物に関する。
【０１２７】
本発明の第２の態様の第２の実施形態は、第２の態様の第１の実施形態及び任意のその他の実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２の実施形態では、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物であって、該酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される調製物に関する。
【０１２８】
本発明の第２の態様の第３の実施形態は、第２の態様の第１及び第２の実施形態、並びに任意のその他の実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第３の実施形態では、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物であって、該酵素産物が、
ａ．炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ．アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、及び
ｃ．脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される調製物に関する。
【０１２９】
本発明の第２の態様の第４の実施形態は、第２の態様の第１、及び第２、及び第３の実施形態、並びに任意のその他の実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第４実施形態では、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物であって、該酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する調製物に関する。
【０１３０】
好ましくは、本発明は、本発明の第１の態様、又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに基づき製造された酵素産物の調製物であって、該酵素産物が、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（２．４．１．Ｘ）、又はスクロースシンターゼ（ＥＣ２．４．１．１３）である調製物に関する。好ましくは、酵素産物は、公知の野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術によりそれから派生した任意の改良型バリアントである。
【０１３１】
本発明の使用により製造された酵素産物は、公知の野生型酵素であり得る、又は酵素エンジニアリング技術によりそれから派生した任意の改良型バリアントであり得、それは本発明の範囲に含まれる。
【０１３２】
本発明は、
Ａ）大腸菌株を提供するステップと、
Ｂ）任意選択で、栄養培地を添加するステップと、
Ｃ）発酵させるステップと、これにより発酵ブロスを取得する、
Ｄ）任意選択で、発酵ブロスの固体／液体分離を行うステップと、これによりバイオマスを取得する、
Ｅ）任意選択で、ホモジナイゼーションするステップと、
Ｆ）ヌクレアーゼを用いて処理するステップ；任意選択で、その後に沈殿剤を添加するステップと、
Ｇ）固体／液体分離を行うステップと、これにより上清を取得する、
Ｈ）任意選択で、濾過を行うステップと、これにより酵素調製物を取得する、
を含む、酵素調製物を製造する方法とも関連する。
【０１３３】
本発明の第３の態様では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物に関する。
【０１３４】
好ましくは、例えば、本発明の第３の態様の第１の実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、５０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡ濃度を含有し、及び酵素調製物の総タンパク質含有量の少なくとも０．１％を占める、製造用宿主の少なくとも１つの異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する酵素調製物に関する。
【０１３５】
本発明の好ましくは第３の態様の好ましい実施形態は、第１の態様の第１の実施形態の実施形態でもあるが、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、５０ｎｇ／ｇ未満、４０ｎｇ／ｇ未満、３０ｎｇ／ｇ未満、２０ｎｇ／ｇ未満、１０ｎｇ／ｇ未満、５ｎｇ／ｇ未満、１ｎｇ／ｇ未満、及び好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ未満、０．４ｎｇ／ｍｌ未満、０．３ｎｇ／ｍｌ未満、０．２ｎｇ／ｍｌ未満、０．１ｎｇ／ｍｌ未満、及び最も好ましくは０．０９ｎｇ／ｍｌ未満、０．０８ｎｇ／ｍｌ未満、０．０７ｎｇ／ｍｌ未満、０．０６ｎｇ／ｍｌ未満、０．０５ｎｇ／ｍｌ未満、０．０４ｎｇ／ｍｌ未満、０．０３ｎｇ／ｍｌ未満、０．０２ｎｇ／ｍｌ未満、０．０１ｎｇ／ｍｌ未満、及び究極に好ましくは０ｎｇ／ｍｌの組換えＤＮＡ濃度を含有する酵素調製物に関する。
【０１３６】
本発明の好ましくは第３の態様の好ましい実施形態は、第１の態様の第１の実施形態、及び任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、少なくとも１つ若しくは複数、少なくとも２つ若しくはそれ超、少なくとも３つ若しくはそれ超、少なくとも４つ若しくはそれ超、又は少なくとも５つ若しくはそれ超の異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有し、及び好ましくは１、２、３、４、又は５つの異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する酵素調製物に関する。
【０１３７】
本発明の好ましくは第３の態様の好ましい実施形態は、第１の態様の第１の実施形態、及び任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、酵素調製物の総タンパク質含有量の少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％を占める、少なくとも１つ又は複数の異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する酵素調製物に関する。
【０１３８】
本発明の好ましくは第３の態様の好ましい実施形態は、第１の実施形態の実施形態、及び任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、その好ましい実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、５０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡ濃度を含有し、及び酵素調製物の総タンパク質含有量の少なくとも１０％を占める、製造用宿主の少なくとも３つの異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する酵素調製物に関する。
【０１３９】
本発明の第３の態様の第２の実施形態は、第３の態様の第１の実施形態及び／又は任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第２の実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、製造用宿主大腸菌内での産生により製造される酵素調製物に関する。
【０１４０】
本発明の第３の態様の第３の実施形態は、第３の態様の第１、及び第２の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第３の実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、発現させた酵素産物を含有し、及び配列番号１又は配列番号２のヌクレアーゼに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレアーゼを、検出可能な量で更に含有する酵素調製物に関する。
【０１４１】
本発明の好ましくは第３の態様の好ましい実施形態、又は第３の態様の実施形態のいずれかにおいて、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、酵素産物内にＤＮＡ断片が存在しないことによりその他の酵素調製物から区別することができる酵素調製物に関する。
【０１４２】
本発明の第３の態様の第４実施形態は、第３の態様の第１、及び第２、及び第３の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第４の実施形態では、本発明は、細胞内で発現させた組換え酵素の酵素調製物であって、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される酵素調製物に関する。
【０１４３】
本発明の第３の態様の第５の実施形態は、第３の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４の実施形態、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第５の実施形態では、本発明は、
ａ．炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ．アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ．脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される酵素調製物に関する。
【０１４４】
本発明の第３の態様の第６の実施形態は、第３の態様の第１、及び第２、及び第３、及び第４、及び第５、並びに任意のその他の実施形態のうちの１つの実施形態でもあるが、好ましくは、例えば、第６の実施形態では、本発明は、組換え酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する酵素調製物に関する。
【０１４５】
本発明の更に好ましい実施形態及びその相互の組み合わせを、下記の条項１〜条項３２として要約する。
【０１４６】
条項１：下記のステップ
ａ）微生物宿主において組換え酵素を細胞内発現させるステップと
ｂ）細胞破壊により組換え酵素を放出させるステップと、これにより未精製のライセートをもたらし、
ｃ）プロセス溶液を含有する酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
ｄ）核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップと、これにより複合体化したライセートをもたらすステップと、
ｅ）液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために液体／固体分離を行うステップと、これにより清澄化したライセートをもたらし、
ｆ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップと、これにより濾液をもたらす、
を含み、好ましくは、液体／固体分離ステップｅ）の後、及び／又はマイクロ濾過ステップｆ）の後に、未精製のライセート若しくは濾液のいずれについてもヌクレアーゼ酵素を用いて行われる処理を含まない、食品グレード酵素産物を製造する方法。
【０１４７】
条項２：下記のステップ
ａ）酵素産物遺伝子を発現ベクターにクローニングするステップ、
ｂ）酵素産物遺伝子を有する発現ベクターを微生物宿主に導入するステップ、
ｃ）組換え酵素産物を細胞内発現させる条件下で、ステップ（ｂ）の微生物宿主を発酵させるステップ、
ｄ）組換え酵素産物を放出させるために、細胞破壊によりステップｃの発酵させた細胞を破壊するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する未精製のライセートをもたらす；
ｅ）清澄化したライセートに由来する核酸を分解するために、清澄化したライセートをヌクレアーゼと共にインキュベートするステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらす、
ｆ）核酸と複合体形成するように沈殿剤をライセートに添加するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する複合体化したライセートをもたらす、
ｇ）液相から細胞デブリ及び核酸と沈殿剤の複合体を取り除くために複合体化したライセートの液体及び／又は固体分離を行うステップ、これにより組換え酵素産物を含有する清澄化したライセートをもたらす、並びに
ｈ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くために、酵素処理されたライセートをマイクロ濾過ステップに供するステップ
のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする、組換え酵素産物を製造する方法であって、
好ましくは、液体／固体分離ステップｇの後、及び／又はマイクロ濾過ステップｈの後に、未精製のライセート又は濾液のいずれについても、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる処理を含まない方法。
【０１４８】
条項３：微生物宿主が、大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０の遺伝的に改変された派生株であり、及び最も好ましくは、ＬＥ１Ｂ１０９である、条項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
条項４：発現ベクターが、ベクターｐＲＳＦ−１ｂに基づく、条項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【０１５０】
条項５：発現ベクターが、抗生物質耐性遺伝子を有しない、条項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【０１５１】
条項６：条項１のステップ（ａ）において、又は条項２のステップ（ｃ）において適する消泡剤が添加され、消泡剤が、ポリプロピレングリコール（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５３２２−６９−４）、ポリグリセロールポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．７８０４１−１４−２）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−１１−６）、ポリプロピレングリセロールモノブチルエーテル（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−１３−８）、ポリジメチルシロキサン（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６３１４８−６２−９；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６８０８３−１８−１）、シリカ（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．７６３１−８６−９；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６３２３１−６７−４）、ステアリン酸（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．５７−１１−４）、セスキオレイン酸ソルビタン（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．８００７−４３−０）、グリセロールモノステアレート（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１２３−９４−４）、ポリソルベート（ポリソルベート６０（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−６７−８））、ポリソルベート６５（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−７１−４）、及びポリソルベート８０（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００５−６５−６）のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、菜種油モノ及びジグリセリド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９３７６３−３１−６）、並びに白色鉱油（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６４７４２−４７−８）の消泡剤からなる群から選択される、条項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【０１５２】
条項７：条項１のステップ（ｄ）において、又は条項２のステップ（ｆ）において、１つ又は複数の適する凝集剤が添加され、凝集剤が、
ａ）カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８８−９７−０）、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．３１５６８−３５−１）、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．４２７５１−７９−１）等、
ｂ）カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６７９５３−８０−４）、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．６９４１８−２６−４）等、
ｃ）陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．２５９８７−３０−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．９００３−０６−９）等、
ｄ）硫酸アンモニウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−０１−３）、
ｅ）塩化カルシウム（ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００３５−０４−８；ＣＡＳ  Ｒｅｇ  Ｎｏ．１００４３−５２−４）
の凝集剤からなる群より選択される、条項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【０１５３】
条項８：沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、条項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５４】
条項９：沈殿剤が、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）７８１Ｇ、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ４４８、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ５８１Ｇ、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）Ｃ７５２、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）ＳＤ−２０８１、及びポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の沈殿剤からなる群から選択される、条項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【０１５５】
条項１０：使用されるヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ／エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、条項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【０１５６】
条項１１：使用される機能的に活性なヌクレアーゼが、配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一である、条項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１５７】
条項１２：発酵ブロス１ｍｌ当たりの使用されるヌクレアーゼの量が、２００Ｕを超える、１００Ｕを超える、５０Ｕを超える、４０Ｕを超える、３０Ｕを超える、２０Ｕを超える、１５Ｕを超える、１０Ｕを超える、５Ｕを超える、３Ｕを超える、２Ｕを超える、１Ｕを超える、０．５Ｕを超える、又は０．１Ｕを超える、条項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１５８】
条項１３：条項１のステップ（ｆ）に対応し、及び条項２のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップにおいて、１０００ｋＤａを超える、５００ｋＤａを超える、４００ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超える、２００ｋＤａを超える、１５０ｋＤａを超える、１００ｋＤａを超える、９０ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、７０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、又は２０ｋＤａを超える粒径排除限界により特徴づけられるメンブレンが使用され、及び組換え酵素産物が、マイクロ濾過ステップの濾液内で得られる、条項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１５９】
条項１４：条項１のステップ（ｆ）に対応し、及び条項２のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップにおいて、メンブレンが、５μｍを超える、４μｍを超える、３μｍを超える、２μｍを超える、１μｍを超える、０．５μｍを超える、０．４μｍを超える、０．３μｍを超える、０．２μｍを超える、又は０．１μｍを超える粒径排除限界を有し、及び組換え酵素産物が、マイクロ濾過ステップの濾液内で得られる、条項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【０１６０】
条項１５：条項１のステップ（ｆ）に対応し、及び条項２のステップ（ｈ）に基づくマイクロ濾過ステップの後に、任意選択で、１００ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、１５ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、５ｋＤａを超える、又は１ｋＤａを超える粒径排除限界を有するメンブレンの使用により特徴づけられる追加の限外濾過ステップが適用され、及び組換え酵素産物が、限外濾過ステップの保持液内で得られる、条項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【０１６１】
条項１６：条項１のステップ（ｅ）に対応し、及び条項２のステップ（ｇ）に基づく固体／液体分離ステップが、遠心分離、フィルタープレス、及び／又はマイクロ濾過の技術により達成される、条項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【０１６２】
条項１７：少なくとも５つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも３つ、なおいっそうより好ましくは少なくとも２つ、及び最も好ましくは少なくとも１つの細胞内タンパク質を発現させる、条項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【０１６３】
条項１８：製造株から発現する１つ又は複数の組換え酵素が、単独で又は総合して、酵素産物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも３０％、更により好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも１０％を占める、条項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【０１６４】
条項１９：酵素産物が、食品酵素である、条項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【０１６５】
条項２０：酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される、条項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【０１６６】
条項２１：酵素産物が、
ａ）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される、条項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【０１６７】
条項２２：酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する、条項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【０１６８】
条項２３：微生物製造用宿主が、例えば、酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−１−ホスフェートホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、α，α−トレハロースホスフェートシンターゼ（ＵＤＰ形成型）、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−Ｎ−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−Ａ−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−４−デオキシ−４−ホルムアミド−Ｌ−アラビノーストランスフェラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（非加水分解型）、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェート−２−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、１つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている、条項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【０１６９】
条項２４：下記のステップ
ａ）組換え酵素産物を含有する細胞破壊未精製ライセートを、ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、
ｂ）沈殿剤を添加するステップと、これにより核酸を複合体化させ、
ｃ）液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために、液体／固体分離を行うステップと、
ｄ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くために、マイクロ濾過ステップを実施するステップと
を含む、条項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【０１７０】
条項２５：条項１〜２４のいずれか１項に基づき製造される酵素の調製物であって、０．０１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜４０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜３０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜２０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜９ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜８ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜７ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜６ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜５ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜４ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜３ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜２ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜１ｎｇ／ｇの間、及びより好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ〜０．９ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．８ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．７ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．６ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．５ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．４ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．３ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．２ｎｇ／ｇの間、０．０１ｎｇ／ｇ〜０．１ｎｇ／ｇの間、又は最も好ましくは０．１ｎｇ／ｇ未満、又は究極に好ましくは０．０１ｎｇ／ｇ未満の残留ＤＮＡ濃度により特徴づけられる調製物。組換えＤＮＡ濃度は、サイズが少なくとも１００塩基対の組換えＤＮＡを含む代表的なＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応に基づく増幅に準拠する方法により決定されるものである。較正は、製造用宿主に由来する全ＤＮＡ調製物を用いて実施される。
【０１７１】
条項２６：条項１から２４のいずれか１項に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される調製物。
【０１７２】
条項２７：条項１から２４のいずれか１項に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、
ａ）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される調製物。
【０１７３】
条項２８：条項１から２４のいずれか１項に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する調製物。
【０１７４】
条項２９：細胞内で発現させた組換え酵素産物の酵素調製物であって、組換えＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／ｇ未満であり、酵素調製物の総タンパク質含有量の少なくとも１０％を占める、製造用宿主の少なくとも３つの異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する酵素調製物。
【０１７５】
条項３０：製造用宿主が大腸菌である、条項２９に記載の酵素調製物。
【０１７６】
条項３１：発現させた酵素産物を含有し、及び配列番号１又は配列番号２のヌクレアーゼに対して少なくとも７０％の同一性を有する検出可能な量のヌクレアーゼを更に含有する、条項３０に記載の酵素調製物。
【０１７７】
条項３２：組換え酵素が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される、条項２９から３１のいずれか１項に記載の酵素調製物。
【０１７８】
条項３３：組換え酵素産物が、
ａ）炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
ｂ）アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
ｃ）脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される、条項２９から３２のいずれか１項に記載の酵素調製物。
【０１７９】
条項３４：組換え酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はＮ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも１つに属する、条項２９から３３のいずれか１項に記載の酵素調製物。
【０１８０】
下記の実施例は、本発明を更に例証するが、しかしその範囲を限定するものとはみなされない。
【実施例】
【０１８１】
［実施例１］
＜組成物Ｉを用いた組換え酵素産物の処理＞
発現プラスミドｐＬＥ１Ａ２７（よく知られたベクターｐＲＳＦ−１ｂの派生体）上にコードされるスクロースシンターゼ遺伝子を有し、スクロースシンターゼを細胞内で発現する組換え発現宿主ＬＥ１Ｂ１０９のバイオマスのホモジナイゼーションにより、シロイヌナズナから組換えスクロースシンターゼの未精製細胞抽出物（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１９７５８３．１，配列番号３３）を調製する。ホモジナイズされるバイオマスは、発酵ブロスの濃縮により取得された濃縮済みの細胞調製物であり、６００ｇ／Ｌのバイオマス当量に調整される。ホモジナイゼーション後に、組成物Ｉが得られる。
【０１８２】
この組成物Ｉは、分離したフラクションに分割され、その各フラクションは、本発明の第１の態様に基づくプロセスステップに対応する下記のプロセス処理の１つに、表示する番号順で、独立して提供される。
【表１】
2020519312.tif 000003
【０１８３】
簡潔に記載すると、フラクション番号１の場合、１５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加することにより、最終濃度が５ｍＭのＭｇＣｌ２となるように組成物Ｉを稀釈する。稀釈された組成物Ｉに、ＮｕＣＬＥＡＮａｓｅ（ｃ−ＬＥｃｔａ  ＧｍｂＨ社、Ｌｅｉｐｚｉｇ）を添加して、最終濃度をバイオマス当量１ｇ当たり２００Ｕ／ｇ〜３００Ｕ／ｇとし、そして室温又は２５℃で６時間インキュベートする。調製物を２倍に稀釈し、そして、調製物中、最終濃度が０．１％〜２％（ｗ／ｖ）となるように、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を添加する。調製物を、室温で３０分〜９０分間インキュベートする。溶液を、次に１２，０００×ｇにおいて６０分間遠心分離して、固相／液相分離する。液相を単離し、そして０．１〜０．８μｍのカットオフ値を有するデプスフィルターを使用して、室温でマイクロ濾過を行う。次に、以下に示すように、調製物を、得られた他のすべてのフラクションと共に更なる分析用として調製する。
【０１８４】
簡潔に記載すると、フラクション番号２の場合、組成物Ｉを３倍に稀釈し、これにより最終濃度を５ｍＭのＭｇＣｌ２に調整する。調製物中、最終濃度が０．１％〜２％（ｗ／ｖ）となるように、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を調製物に添加する。調製物を、室温で３０分〜９０分間インキュベートする。溶液を、次に１２，０００×ｇにおいて６０分間遠心分離して、固相／液相分離する。液相を単離し、そして０．１〜０．８μｍのカットオフ値を有するデプスフィルターを使用して、室温でマイクロ濾過を行う。次に、以下に示すように、調製物を、得られた他のすべてのフラクションと共に更なる分析用として調製する。
【０１８５】
簡潔に記載すると、フラクション番号３の場合、１５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加することにより、最終濃度が５ｍＭのＭｇＣｌ２となるように組成物Ｉを稀釈する。稀釈された組成物Ｉに、ＮｕＣＬＥＡＮａｓｅ（ｃ−ＬＥｃｔａ  ＧｍｂＨ社、Ｌｅｉｐｚｉｇ）を添加して、最終濃度をバイオマス当量１ｇ当たり２００Ｕ／ｇ〜３００Ｕ／ｇとし、そして室温又は２５℃で６時間インキュベートする。調製物を２倍に稀釈する。溶液を、次に１２，０００×ｇにおいて６０分間遠心分離して、固相／液相分離する。液相を単離し、そして０．１〜０．８μｍのカットオフ値を有するデプスフィルターを使用して、室温でマイクロ濾過を行う。次に、以下に示すように、調製物を、得られた他のすべてのフラクションと共に更なる分析用として調製する。
【０１８６】
簡潔に記載すると、フラクション番号４の場合、１５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加することにより、最終濃度が５ｍＭのＭｇＣｌ２となるように組成物Ｉを稀釈する。稀釈された組成物Ｉに、ＮｕＣＬＥＡＮａｓｅ（ｃ−ＬＥｃｔａ  ＧｍｂＨ社、Ｌｅｉｐｚｉｇ）を添加して、最終濃度をバイオマス当量１ｇ当たり２００Ｕ／ｇ〜３００Ｕ／ｇとし、そして室温又は２５℃で６時間インキュベートする。調製物を２倍に稀釈し、そして、調製物中、最終濃度が０．１％〜２％（ｗ／ｖ）となるように、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を添加する。調製物を、室温で３０分〜９０分間インキュベートする。溶液を、次に１２，０００×ｇにおいて６０分間遠心分離して、固相／液相分離する。次に、以下に示すように、調製物を、得られた他のすべてのフラクションと共に、更なる分析用として調製する。
【０１８７】
簡潔に記載すると、フラクション番号５の場合、組成物Ｉを３倍に稀釈する。調製物に、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を添加して、調製物中、最終濃度を０．１％〜２％（ｗ／ｖ）とする。調製物を、室温で３０分〜９０分間インキュベートする。溶液を、次に１２，０００×ｇにおいて６０分間遠心分離して、固相／液相分離する。液相を、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を使用して、最終濃度が５ｍＭのＭｇＣｌ２となるように調整し、次にＮｕＣＬＥＡＮａｓｅ（ｃ−ＬＥｃｔａ  ＧｍｂＨ社、Ｌｅｉｐｚｉｇ）を添加して、最終濃度をバイオマス当量１ｇ当たり２００Ｕ／ｇ〜３００Ｕ／ｇとし、そして室温又は２５℃で６時間インキュベートする。液相を単離し、そして０．１〜０．８μｍのカットオフ値を有するデプスフィルターを使用して、室温でマイクロ濾過を行う。次に、以下に示すように、調製物を、得られた他のすべてのフラクションと共に、更なる分析用として調製する。
【０１８８】
簡潔に記載すると、フラクション番号６の場合、組成物Ｉを３倍に稀釈し、これによりＭｇＣｌ２の最終濃度を５ｍＭに調整する。調製物に、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を添加して、調製物中、最終濃度を０．１％〜２％（ｗ／ｖ）とする。調製物を室温で３０分〜９０分間インキュベートする。溶液を、次に１２，０００×ｇにおいて６０分間遠心分離して、固相／液相分離する。液相を単離し、そして０．１〜０．８μｍのカットオフ値を有するデプスフィルターを使用して、室温でマイクロ濾過を行う。液相を、次にＮｕＣＬＥＡＮａｓｅ（ｃ−ＬＥｃｔａ  ＧｍｂＨ社、Ｌｅｉｐｚｉｇ）を添加して、最終濃度をバイオマス当量１ｇ当たり２００Ｕ／ｇ〜３００Ｕ／ｇとし、そして室温又は２５℃で６時間インキュベートする。次に、以下に示すように、調製物を、得られた他のすべてのフラクションと共に、更なる分析用として調製する。
【０１８９】
調製物の最終容積を調整して比較解析を保証するために、フラクション番号１〜フラクション番号６から得られたすべての酵素調製物を、同一のプロトコールに基づき更に処理する。処理は、３０ｋＤａの排除サイズを使用して限外濾過するステップにサンプルを提供し、そしてすべてのフラクションについて、約５〜最大１０倍の、調整された容積まで濃縮することにより達成される。或いは、フラクション番号１〜フラクション番号６から得られた酵素調製物は、類似した容積のフラクションをそれぞれ凍結乾燥し、そして後続するＤＮＡ及び活性分析に適する、同一容積のバッファー中に凍結乾燥物を再溶解することにより処理される。
【０１９０】
処理済みのフラクション番号１〜フラクション番号６から得られた最終的な組換え酵素調製物について、微生物宿主ＤＮＡを標的とする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ技術を使用してＤＮＡ検出を行う。
【０１９１】
更に、個々のフラクションの処理から得られる中間調製物又は最終調製物の組換え酵素処方物は、スクロースシンターゼによりスクロースがフルクトースとＵＤＰ−活性化グルコース（ＵＤＰ−グルコース）に非加水分解的に分解するのを測定する共役式の光測定アッセイ法を使用して、酵素活性について分析される。形成されたフルクトースは、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ−ＤＨ）を用いた共役反応において検出される。Ｇ６Ｐ−ＤＨ反応において形成されるＮＡＤＰＨは、３４０ｎｍにおいて光測定検出により測定される。
【０１９２】
結果を、下記の表に示す。
【表２】
2020519312.tif 000004
【０１９３】
結果から明らかなように、フラクション１のプロセス処理は、他のプロセス処理よりも優れている。
【０１９４】
［実施例２］
＜野生型シロイヌナズナのスクロースシンターゼの発現及びその処方物＞
野生型シロイヌナズナのスクロースシンターゼをコードする遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１９７５８３．１、配列番号３３）を、発現ベクターｐＬＥ１Ａ１７（ｐＲＳＦ−ｌｂの派生体、Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローン化する。得られたプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換に使用する。
【０１９５】
細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）が添加されたＺＹＭ５０５培地（Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１（２００５）２０７−２３４）内、３７℃で培養する。遺伝子の発現を、対数増殖期において、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）、３０℃、且つ２００ｒｐｍで１６〜１８時間、誘発する。
【０１９６】
細胞を、遠心分離（３２２０×ｇ、４℃、２０分間）により回収し、そして細胞溶解バッファー（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；２ｍＭのＭｇＣ１２、ＤＮＡヌクレアーゼ（２０Ｕ／ｍＬ）、リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍＬ））を用いて、２００の光学濃度（６００ｎｍ（ＯＤ６００）において測定する）に再懸濁する。細胞を、次に超音波処理により破壊する。次に、調製物に、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を、調製物中、０．１％〜２％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加する。未精製の抽出物を、遠心分離（１８０００×ｇ、４℃、４０分間）により細胞デブリから分離する。上清を０．２μｍのフィルターを通じた濾過により滅菌処理し、酵素的に活性な調製物を得る。
【０１９７】
［実施例３］
＜野生型トマトのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの発現及びその処方物＞
野生型トマトのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＵＧＴＳＬ２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００４２５０４８５．１、配列番号５５）を、発現ベクターｐＬＥ１Ａ１７（ｐＲＳＦ−１ｂの派生体、Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローン化する。得られたプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換に使用する。
【０１９８】
細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）が添加されたＺＹＭ５０５培地（Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１（２００５）２０７−２３４）内、３７℃で培養する。遺伝子の発現を、対数増殖期において、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）、３０℃且つ２００ｒｐｍで１６〜１８時間、誘発する。
【０１９９】
細胞を、遠心分離（３２２０×ｇ、４℃、２０分間）により回収し、そして細胞溶解バッファー（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；２ｍＭのＭｇＣ１２、ＤＮＡヌクレアーゼ（２０Ｕ／ｍＬ）、リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍＬ））を用いて、２００の光学濃度（６００ｎｍ（ＯＤ６００）において測定する）に再懸濁する。細胞を、次に超音波処理により破壊する。調製物に、次にポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を、調製物中、０．１％〜２％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで補充する。未精製の抽出物を、遠心分離（１８０００×ｇ、４℃、４０分間）により細胞デブリから分離する。上清を０．２μｍのフィルターを通じた濾過により滅菌処理し、酵素的に活性な調製物を得る。
【０２００】
［実施例４］
＜野生型ステビア・レバウディアナのグリコシルトランスフェラーゼの発現及びその処方物＞
野生型ステビア・レバウディアナのグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＵＧＴ７６Ｇ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＲ０６９１２．１、配列番号４）を、発現ベクターｐＬＥ１Ａ１７（ｐＲＳＦ−１ｂの派生体、Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローン化する。得られたプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換に使用する。
【０２０１】
細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）が添加されたＺＹＭ５０５培地（Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１（２００５）２０７−２３４）内、３７℃で培養する。遺伝子の発現を、対数増殖期において、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）、３０℃且つ２００ｒｐｍで１６〜１８時間、誘発する。
【０２０２】
細胞を、遠心分離（３２２０×ｇ、４℃、２０分間）により回収し、そして細胞溶解バッファー（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；２ｍＭのＭｇＣ１２、ＤＮＡヌクレアーゼ（２０Ｕ／ｍＬ）、リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍＬ））を用いて、２００の光学濃度（６００ｎｍ（ＯＤ６００）において測定する）に再懸濁する。細胞を、次に超音波処理により破壊する。調製物に、ポリエチレンイミンＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）の群から選択した適する沈殿剤、又はＳｕｐｅｒｆｌｏｃ（登録商標）シリーズから選択した任意の正に荷電した沈殿剤を、調製物中、０．１％〜２％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで補充する。未精製の抽出物を、遠心分離（１８０００×ｇ、４℃、４０分間）により細胞デブリから分離する。上清を０．２μｍのフィルターを通じた濾過により滅菌処理し、酵素的に活性な調製物を得る。
【図１】
2020519312.tif 000005
【配列表】
2020519312000001.app
【国際調査報告】
2020519312.tif 000006
2020519312.tif 000007
2020519312.tif 000008