(57)【要約】  本発明は特に、マイクロ粒子及びナノ粒子の分野、より特にコーティングされたナノ粒子に関する。本発明のコーティングは特に、サーファクタントタンパク質B（SP-B）と1つ以上の脂質とを含む。本発明は、薬剤として使用され、特に様々な障害の治療において使用される、このようにコーティングされた粒子及びそれを含む組成物に更に関する。さらに、本発明は、低分子干渉RNA（siRNA）分子等の1つ以上の作用物質を標的組織又は細胞に送達するための本発明の組成物の使用を提供する。【選択図】図1
2020500203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む細胞内薬物送達組成物であって、該粒子が1つ以上の活性剤とタンパク脂質組成物とを含み、該タンパク脂質組成物が（a）サーファクタントタンパク質B（SP-B）と（b）1つ以上の脂質とからなり、前記粒子がカチオン性リポソームではなく、該薬物送達組成物がSP-Cを含まない、組成物。
【請求項２】
前記1つ以上の脂質がリン脂質である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記リン脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（SOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DLPC）、L-α-ホスファチジルコリン（(egg)PC）、L-α-ホスホエタノールアミン（(egg)PE）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルグリセロール（DOPG）、L-α-ホスファチジルグリセロール（(egg)PG）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸（DOPA）、L-α-ホスファチジン酸（(egg)PA）又はそれらの組合せを含むリストから選択される、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
前記リン脂質が、1つ以上の両性イオン性リン脂質と1つ以上のアニオン性リン脂質との組合せである、請求項2又は3に記載の組成物。
【請求項５】
前記リン脂質がDPPC:(egg)PGの組合せ（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール）、DPPC:(egg)PAの組合せ（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸）、DOPC:(egg)PGの組合せ（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール）又はDOPC:(egg)PAの組合せ（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸）である、請求項3又は4に記載の組成物。
【請求項６】
前記DPPC:(egg)PG、DPPC:(egg)PA、DOPC:(egg)PG又はDOPC:(egg)PAが約85:15の比率である、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記SP-B、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチドが、全タンパク脂質組成物に対して約0.1 wt%〜約5.0 wt%、又は約0.4 wt%〜約1.6 wt%の重量比で存在する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記粒子がデキストランナノゲル又はカチオン性デキストランナノゲルである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記1つ以上の活性剤が治療剤、生物活性剤又は診断用イメージング剤を含むリストから選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記活性剤が核酸又はsiRNAである、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記粒子が標的化リガンド、イメージング剤、蛍光剤、ペグ化脂質又は官能化脂質を更に含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
被験体において細胞膜を通して活性剤（複数の場合もある）を送達するための請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記組成物を吸入によって前記被験体に投与する、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
粒子又はデキストランナノゲルをコーティングするためのサーファクタントタンパク質B（SP-B）と1つ以上の脂質とからなるタンパク脂質組成物の使用であって、前記粒子がカチオン性リポソームではない、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ粒子及びナノ粒子の分野、より特に肺サーファクタントタンパク質B（SP-B）と1つ以上の脂質とを含む粒子に関する。本発明は、薬剤として使用され、特に様々な障害の治療において使用される、かかる粒子及びそれを含む組成物に更に関する。さらに、本発明は、低分子干渉RNA（siRNA）分子等の1つ以上の作用物質を標的組織又は細胞に送達するための本発明の組成物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、サイズが小さいことから、様々なタイプの薬物、例えば抗癌薬及び免疫調節薬の細胞内送達に極めて有望である。加えて、ナノ粒子は、薬物の治療指数を改善することを目的として、その薬物動態及び組織分布を変更するために適用されることが多い。実際に、ナノ粒子は、それらの物理化学的特性を改変し、及び／又は抗体若しくは他のリガンドでそれらを修飾する（decorating）ことによって特定の器官、組織及び細胞を標的とするように設計することができる。加えて、ナノ粒子は、それらのペイロードを所望の動態で放出するように適合させることができる。このように、ナノ粒子は、局所投与（例えば、吸入療法、粘膜薬物送達等）の利益も納得のいくように実証されているが、全身送達用途について調査されることが多い。ナノ粒子に加えて、マイクロ粒子も食細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞）によって内在化させることで、かかる細胞型への細胞内薬物送達を可能にすることができる。代替的には、マイクロ粒子は、例えば噴霧乾燥によって作製されるマイクロ粒子状粉末を意味する場合もある。細胞内薬物送達の分野における初期研究は、デオキシリボ核酸（DNA）の送達について行われているが、同様に細胞活性を変調する他の分子の細胞内送達のためのマイクロ粒子及びナノ粒子の使用への関心が高まっている。
【０００３】
さらに、マイクロ粒子及びナノ粒子は、イメージングプローブ及び造影剤をカプセル化するか、又はそれらにコンジュゲートすることができ、診断用途での独自の特性がもたらされる。核磁気共鳴画像法（MRI）、光学イメージング、放射性核種ベースのイメージング等による非侵襲的イメージングにより、マイクロ粒子及びナノ粒子は、in vitro及びin vivoの両方での（細胞）生物学的過程のプロービング及び画像誘導薬物送達において有用なものとなっている。さらに、粒子イメージングプローブは、非侵襲的手段によるin vivoでの細胞トラッキングのための移植細胞の標識化に適用することができ、これは細胞療法の治療有効性のモニタリングにも重要である。
【０００４】
RNA干渉（RNAi）は、低分子干渉RNA（siRNA）と称される短いRNA二重鎖が配列特異的mRNA切断のエフェクター分子として機能し、それにより遺伝子サイレンシングを転写後レベルで誘導する強力な遺伝子サイレンシング機構を意味する。合成siRNAが哺乳動物細胞におけるRNAi経路を活性化することができ、ほぼ全てのヒト遺伝子を標的とするように設計することができることから、RNAiは、ヒトにおいて治療目的で遺伝子発現を抑制するための興味深い方法となっている。種々の標的組織及び投与方法が既にRNAiについて評価されている。
【０００５】
siRNA等の細胞内標的を有する高分子は、殆どが標的細胞の細胞質への送達を必要とする。残念なことに、細胞膜は主にこの種の治療剤について不透過性である。上述のように、細胞送達は通例、これらの薬物をポリマー又は脂質ベースのマイクロ粒子及びナノ粒子中に配合することによって促進される。マイクロ粒子及びナノ粒子は、エンドサイトーシスにより高分子を細胞内へと誘導することができるが、エンドソーム内腔からサイトゾルへの流出が依然として細胞内薬物送達の大きな障害となっている。細胞膜及びエンドソーム膜の両方が高分子及び他の膜不透過性薬物の効率的な送達の大きな妨げとなる。
【０００６】
近年、siRNA担持デキストランナノゲル（siNG）コアと肺サーファクタントシェルとからなるコア−シェルナノ構造を有する生体模倣ハイブリッドナノ粒子が開発された（非特許文献1）。非特許文献1では、外側シェルは、脂質成分及びタンパク質成分の複雑な混合物から構成される天然由来肺サーファクタントであるCurosurf（商標）からなるものであった（非特許文献2）。この複雑な組成は、望ましくないバッチ間変動性の一因となっている。さらに、これらの成分の多くが過剰であるか、又は更には細胞送達の観点から好ましくないと考えられ、送達配合物の複雑性を低減する必要性が強調される。
【０００７】
本発明では、好適な薬物送達プラットホームの設計に極めて重要な特定の脂質成分及びタンパク質成分を提示する。興味深いことに、配合物中のサーファクタントタンパク質B（SP-B）の存在がsiRNA送達の改善に極めて重要であることが実証された。
【０００８】
本明細書で実証される肺サーファクタントシェルは、細胞培養における生物学的効率を増大し、それによりモデル標的の実質的な遺伝子サイレンシングが低siRNA用量であっても達成された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】De Backer et al., 2015
【非特許文献２】Parra et al., 2015
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、サーファクタントタンパク質B（SP-B）、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチドと、1つ以上の脂質とを含む組成物の使用に関する。特に、上記脂質は、粒子の作製又はコーティングのための多量の不飽和又は飽和脂質を含有する。特定の脂質及びタンパク質成分を含む上記粒子は、非常に効率的な送達プラットホームであることが実証される。
【００１１】
本発明は、粒子を含む組成物であって、該粒子が1つ以上の活性剤と脂質組成物とを含み、該脂質組成物が（a）（肺）サーファクタントタンパク質B（SP-B）、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチドと、（b）1つ以上の脂質とからなる、組成物を提供する。本明細書で提供される組成物は、in vivo、in vitro若しくはex vivoのいずれかで生体膜（細胞膜及び／又はエンドソーム膜等）を通して活性剤を送達し、及び／又は例えば遺伝子サイレンシング等によって細胞機能を改変することが可能である。
【００１２】
一実施の形態では、本発明は、（a）サーファクタントタンパク質B（SP-B）、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチドと、（b）1つ以上の脂質とを含むマイクロ粒子又はナノ粒子に関する。より具体的には、粒子は、少なくとも1つの活性剤とタンパク脂質組成物とを含み、該タンパク脂質組成物は、（a）サーファクタントタンパク質B（SP-B）、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチドと、（b）1つ以上の脂質とから本質的になる。特に、粒子はポリマー粒子、より特にデキストランナノゲル、より特にカチオン性デキストランナノゲルである。具体的な実施の形態では、サーファクタントタンパク質B（SP-B）、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチド、及び1つ以上の脂質は、粒子の外層又はコーティングの一部である。
【００１３】
更なる実施の形態では、脂質はリン脂質、特に1つ以上の両性イオン性リン脂質と1つ以上のアニオン性リン脂質との組合せである。任意に、脂質の1つがコレステロールである。特に有用なリン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（SOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DLPC）、L-α-ホスファチジルコリン（(egg)PC）、L-α-ホスホエタノールアミン（(egg)PE）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルグリセロール（DOPG）、L-α-ホスファチジルグリセロール（(egg)PG）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸（DOPA）、L-α-ホスファチジン酸（(egg)PA）、又はそれらの組合せ、例えばDOPC:(egg)PGの組合せ（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール）、DOPC:(egg)PAの組合せ（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸）、DPPC:(egg)PGの組合せ若しくはDPPC:(egg)PAの組合せを含むリストから選択される。
【００１４】
更なる実施の形態では、上記SP-B、又は上記SP-B関連タンパク質若しくはペプチドは、粒子の全脂質組成物に対して約0.1 wt%〜約5.0 wt%、より具体的には約0.4 wt%〜約1.6 wt%の重量比で存在する。
【００１５】
本発明の粒子は細胞、組織又は被験体への作用物質の標的化送達、特に作用物質の細胞内送達の方法に特に有用である。したがって、一実施の形態では、粒子に治療剤、生物活性剤又は診断用イメージング剤を含むリストから選択される作用物質を担持させるか、又はそれらを結合する。より特に、作用物質は小分子又は高分子、特に核酸、更により特にsiRNAである。任意に、粒子は標的化リガンド、イメージング剤、蛍光剤、ペグ化脂質又は官能化脂質を更に含む。
【００１６】
本発明は、粒子を含む医薬組成物、又は本明細書で提供されるこれらの粒子と、薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤とを含む組成物にも関する。
【００１７】
更なる実施の形態では、本発明は、薬剤として使用され、特に被験体において細胞膜を通して作用物質を送達するのに使用され、及び／又は細胞機能を変調させ、それにより疾患を改善若しくは治療するのに使用される粒子又はそれを含む組成物を包含する。したがって、本発明は、被験体への作用物質の細胞内送達の方法であって、該被験体に作用物質を担持させた又は作用物質に結合した粒子を含む組成物を投与することを含み、上記粒子が（a）サーファクタントタンパク質B（SP-B）と、（b）1つ以上の脂質とからなる脂質組成物を含むか、又は上記粒子が、（a）サーファクタントタンパク質B（SP-B）、若しくはSP-B関連タンパク質若しくはペプチドと、（b）1つ以上の脂質とからなる外層若しくはコーティングを特徴とする、方法に関する。特定の実施の形態では、粒子の脂質組成物は、天然起源肺サーファクタントの組成物よりも複雑でなく、それとは異なる。
【００１８】
本発明は、マイクロ粒子又はナノ粒子を作製する方法であって、
作用物質を予め担持させた又は担持させない粒子を準備する工程と、
上記粒子をサーファクタントタンパク質B（SP-B）、又はSP-B関連タンパク質若しくはペプチドと、1つ以上の脂質とからなる脂質組成物でコーティングする工程と、
を含む、方法にも関する。
【００１９】
図面を具体的に参照するが、個々に示されるものは例示であり、本発明の様々な実施形態の説明的な論述を目的とするものであることが強調される。図面は、本発明の原理の最も有用で簡単な記載及び概念的態様と考えられるものを提供するために示されている。これに関して、本発明の根本的な理解のために必要である以上に詳細な本発明の構造の細部を示すことは試みられていない。図面と併せた記載により、本発明の複数の形態が実現され得る方法が当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】タンパク脂質混合物を含有するサーファクタントタンパク質でコーティングされたsiNGの生物活性を示す図である。フローサイトメトリーによって決定されたH1299_eGFP細胞におけるsiNGの（a）細胞取込み及び（b）遺伝子サイレンシング能の評価。siNGにCurosurf（商標）を成層するか（コーティングsiNG（CS））、又はDPPC:POPC:eggPGを成層した（50 wt%:35 wt%:15 wt%；コーティングsiNG（LIP））。このLIP外層に、SP-B（0.4 wt%）及び／又はSP-C（0.7 wt%）を組み込んだ。取込み実験では、NGに蛍光標識対照siRNA（siCy5）を担持させ、これに関し、コーティング配合物の値を取り込まれる粒子の最大量に対して、すなわち非コーティングsiNG（100%）に対して示す。eGFP標的化siRNA（siEGFP）で処理した細胞のeGFP発現は、対照siRNA（siCTRL）で処理した細胞の発現に対して正規化した。全ての実験を一定のNG濃度（30 μg/mL）及びsiRNA濃度（50 nM）で行った（n=3、1回の独立反復（independent repeat））。
【図２】siNG生物活性に対するタンパク脂質外層中の主要リン脂質の影響を示す図である。フローサイトメトリーによって決定されるH1299_eGFP細胞におけるsiNGの（a）細胞取込み及び（b）遺伝子サイレンシング能の評価。siNGにDPPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）又はDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）をSP-B（0.8 wt%）の非存在下又は存在下で成層した。取込み実験では、NGに蛍光標識対照siRNA（siCy5）を担持させ、これに関し、コーティング配合物の値を取り込まれる粒子の最大量に対して、すなわち非コーティングsiNG（100%）に対して示す。eGFP発現は、対照siRNA（siCTRL）で処理した細胞の発現に対して正規化した。全ての実験を一定のNG濃度（30 μg/mL）及びsiRNA濃度（50 nM）で行った（n=3、2回の独立反復；*p≦0.05、***p≦0.001）。
【図３】フローサイトメトリーによって決定されるH1299_eGFP細胞におけるsiNGの細胞取込み（a、c）及び遺伝子サイレンシング能（b、d）の評価を示す図である。（a、b）siNGにDPPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）又はDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）をSP-B（0.4 wt%）の非存在下又は存在下で成層した。これらの実験は、50 nM siRNA（1ウェル当たり15 pmolのsiRNA）を用いて行った。（c、d）siNGにDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）又はDOPC:eggPA（85 wt%:15 wt%）を成層した。これらの実験は、10 nM siRNA（1ウェル当たり3 pmolのsiRNA）を用いて行った（n=3、技術的反復試験（technical replicates））。取込み実験では、NGに蛍光標識siRNA（siCy5）を担持させた。eGFP発現は、対照siRNAで処理した細胞の発現に対して正規化した。全ての実験を一定のNG濃度（30 μg/mL）で行った。
【図４】種々のサーファクタントタンパク質の組合せを添加したDOPC:eggPG混合物でコーティングしたsiNGの生物活性を示す図である。フローサイトメトリーによって決定されるH1299_eGFP細胞におけるsiNGの（a）細胞取込み及び（b）遺伝子サイレンシング能の評価。siNGにCurosurf（商標）を成層するか（コーティングsiNG（CS））、又はDOPC:eggPGを成層した（85 wt%:15 wt%；コーティングsiNG（LIP））。このLIP外層に、SP-B（0.4 wt%）及び／又はSP-C（0.7 wt%）を組み込んだ。取込み実験では、NGに蛍光標識siRNA（siCy5）を担持させ、これに関し、コーティング配合物の値を取り込まれる粒子の最大量に対して、すなわち非コーティングsiNG（100%）に対して示す。eGFP発現は、対照siRNA（siCTRL）で処理した細胞の発現に対して正規化した。全ての実験を一定のNG濃度（30 μg/mL）及びsiRNA濃度（50 nM）で行った（n=3、3回の独立反復）。SP-Cを単独で用いたサイレンシング実験は、2回の独立反復に基づく（****p≦0.0001）。
【図５】外層中のコレステロールの影響を示す図である。フローサイトメトリーによって決定されるH1299_eGFP細胞におけるsiNGの（a）細胞取込み及び（b）遺伝子サイレンシング能の評価。siNGにDOPC:eggPGを成層した（85 wt%:15 wt%；コーティングsiNG（LIP））。単離SP-B（0.8 wt%）及び2.5 wt%、5 wt%から10 wt%まで変化させた漸増量のコレステロールを脂質外層中に組み込んだ。取込み実験では、NGに蛍光siRNA（siCy5）を担持させた。eGFP発現は、対照siRNAで処理した細胞の発現に対して正規化した。全ての実験を一定のNG濃度（30 μg/mL）及びsiRNA濃度（100 nM）で行った（n=3、技術的反復試験）。
【図６】タンパク脂質コーティングsiNGの生物活性に対するSP-Bの供給源及び濃度の影響を示す図である。種々の供給源から単離されたSP-Bを組み込んだコーティングsiNGの（a）細胞取込み及び（b）遺伝子サイレンシング能の評価。siNGにDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）を成層した。3つの異なる未変性ブタ肺（SP-B 1；SP-B 2；SP-B 3）又はCurosurf（商標）（SP-B 4）から単離されたSP-B（0.4 wt%）を脂質外層中に組み込んだ（n=3、1回の独立反復）。種々の濃度のSP-Bを組み込んだコーティングsiNGの（c）細胞取込み及び（d）遺伝子サイレンシング能の評価。siNGにDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）及び未変性ブタ肺から単離されたSP-Bを成層した。取込み実験では、NGに蛍光標識siRNA（siCy5）を担持させ、これに関し、コーティング配合物の値を取り込まれる粒子の最大量に対して、すなわち非コーティングsiNG（100%）に対して示す。eGFP発現は、対照siRNA（siCTRL）で処理した細胞の発現に対して正規化した。全ての実験を一定のNG濃度（30 μg/mL）及びsiRNA濃度（10 nM）で行った（n=3、4回の独立反復；****p≦0.0001）。
【図７】マウス急性肺傷害（ALI）モデルにおける相対TNFαサイレンシングを示す図である。（a）実施した実験の概略図。（b）TNFαレベルをLPS刺激の24時間後、ひいては種々のsiCTRL及びsiTNFαを担持させたNPの滴下の48時間後に抽出したBAL液中で定量化した。siTNFαを担持させたsiNGを用いて得られたTNFαレベルを、対照siRNA（siCTRL）を与えたマウスのBAL中のレベルに対して正規化した。マウスを、1 μgのNG当たり1 pmolのsiTNFα又はsiCTRLを担持させた一定のNG用量（100 μg）で処理した（n=4、実験は1回に1群当たり4匹のマウスを用いて行った；*p≦0.05、***p≦0.001）。
【図８】（a）タンパク脂質コーティングにおける最小必要SP-B濃度の評価。H1299_eGFP細胞におけるsiNG-LIPの遺伝子サイレンシング能を、フローサイトメトリーによって決定した。siNGにDOPC:eggPGを成層した（85 wt%:15 wt%；コーティングsiNG（LIP））。このLIP外層に、0.1 wt%〜0.4 wt%の濃度範囲のSP-Bを組み込んだ。（b）合成サーファクタントペプチドKL4及び脂質でコーティングされたsiNGの生物活性。siNGにDOPC:eggPGを成層した（85 wt%:15 wt%；コーティングsiNG（LIP））。このLIP外層に、SP-B（0.04 mol%、約0.4 wt%に相当する）又は種々の濃度の合成サーファクタントペプチドKL4を組み込んだ。グラフは、2回の独立実験のデータを有する（n=2、独立実験；*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001、****p≦0.0001）。
【図９】H1299_eGFP細胞における0.4 wt% SP-Bを添加した及び添加しないDOTAP:DOPE（1:1のモル比）カチオン性リポソームの（a）細胞取込み及び（b）eGFP遺伝子サイレンシング能を示す図である。細胞取込みを、リポソーム配合物にCy5標識siRNAを複合させることによって決定した。取込み及び遺伝子サイレンシングの両方をフローサイトメトリーによって定量化した。eGFP標的化siRNA（siEGFP）で処理した細胞のeGFP発現は、対照siRNA（siCTRL）で処理した細胞の発現に対して正規化した。データを平均±SDとして表す（n=3、技術的反復試験）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここで、本発明を更に説明する。以下の節では、本発明の種々の態様をより詳細に規定する。そのように規定される各態様は、明らかに反対の指定がない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせることができる。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、数量を指定していない単数形（singular forms "a", "an", and "the"）は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示対象を含む。例としては、「化合物（a compound）」は、1つの化合物又は2つ以上の化合物を意味する。本明細書及び本明細書の特許請求の範囲全体を通して、「含む」という単語（word "comprise" and other forms of the word, such as "comprising" and "comprises,"）は、含むが、それに限定されないことを意味し、例えば、他の添加剤、成分、整数又は工程を除外することを意図するものではない。本明細書において使用される上記及び他の用語は、当業者に十分に理解される。本明細書において引用される全ての参照文献及び具体的に言及される教示は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００２２】
本発明は、生体膜を通して活性剤を移動させることが可能な組成物を提供する。本発明は、治療剤、生物活性剤又は診断剤を細胞内に送達するために使用することができるマイクロ粒子及びナノ粒子、並びにそれらを含む組成物に関する。粒子は、細胞トラッキング及び薬物送達のために同時に使用することができる。粒子又は組成物は、概して膜不透過性分子（高分子化合物だけでなく、小分子も）の細胞送達のための治療薬として使用することができる。高分子化合物には、ペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ糖、多糖等が含まれ得る。粒子及び組成物の適用は、局所的（例えば肺送達）だけでなく、全身的（例えば、静脈内投与）とすることもできる。さらに、粒子及び組成物は、例えば炎症状態、神経変性状態、癌、心血管病理、代謝病理及び感染性疾患の治療に使用することができる。
【００２３】
本発明のマイクロ粒子及びナノ粒子は、サーファクタントタンパク質B（SP-B）と1つ以上の脂質とを含む、それらから本質的になる、又はそれらからなるタンパク脂質組成物を特徴とする。
【００２４】
本明細書で使用される「粒子」という用語は、サイズが約5 nm〜約100 μmの粒子を指す。本明細書で使用される「マイクロ粒子」という用語は、サイズが約1 μm〜約100 μmであり、マイクロスフェア、コア−シェルマイクロ粒子、高分子電解質マイクロ粒子、金属マイクロ粒子、有機金属構造体（metal-organic framework；MOF）マイクロ材料、エマルション及びマイクロ粒子状粉末（例えば、噴霧乾燥によって得られる）を含むが、これらに限定されない粒子を意味する。本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、1つ以上の寸法がナノメートルスケールの粒子、すなわち1つ以上の寸法が約5 nm〜約1000 nm、特に約5 nm〜約500 nm、より特に5 nm〜300 nmの粒子を意味するとみなされる。ナノ粒子の例としては、ポリマーナノ粒子、脂質ナノ粒子、ウイルスナノ粒子、細胞外小胞、ミセル、有機金属構造体（MOF）ナノ材料、カーボンナノ材料、セラミックナノ粒子、エマルション、金属粒子、量子ドット等が挙げられる。粒子はサイズ、表面電荷、及び任意の標的化部分の付着等の点で個別調整することができる。任意のタイプのマイクロ粒子及びナノ粒子を本発明において使用することができる。ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子であるのが好ましい。本発明の粒子は、生分解性であっても又は生分解性でなくてもよい、任意の好適な生体適合性材料から形成することができる。好適な生分解性材料の例として、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ヒアルロン酸、デキストラン、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（フマル酸プロピル）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリエステル、生分解性ポリウレタン、ポリ（セバシン酸グリセロール）、特に弾性ポリ（セバシン酸グリセロール）、及び多糖類が挙げられる。非生分解性であるが、生体適合性である材料として、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリウレア、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、及びポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。これがマイクロ粒子及びナノ粒子の作製に適切な材料の包括的なリストではなく、例示的なリストであることが当業者には認識される。
【００２５】
特定の実施形態では、「粒子」という用語は、カチオン性リポソーム等のカチオン性脂質ベースの粒子を含まない。カチオン性リポソームは、相当な割合のカチオン性脂質、特に少なくとも5 mol%のカチオン性脂質、より特に少なくとも10 mol%のカチオン性脂質、更により特に少なくとも20 mol%、30 mol%、40 mol%、60 mol%又は80 mol%のカチオン性脂質が脂質組成物中に組み込まれたリポソームとして規定することができる。
【００２６】
より具体的には、本発明のポリマー粒子は特に、粒子コア内及び／又は粒子の表面上に包埋されたカチオン性作用物質を含む。粒子を治療剤としての核酸と複合させる場合、正に帯電した粒子が負に帯電したDNA/RNA分子と静電相互作用すると考えられ、これは治療剤の複合体形成を容易にするだけでなく、治療剤を酵素的分解から保護し得る。好ましくは、カチオン性作用物質は、限定されるものではないが、キトサン、プロタミン、ペプチド（ポリ(L-リシン)、ポリ(L-アルギニン)等）、ペプチド誘導体（ポリ(L-リシン)-パルミチン酸等）、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドエチレンイミン)及びポリ(アミドアミン)等のポリカチオン性作用物質であり得る。好ましいポリカチオン性作用物質は、反応性（メタ）アクリレート部分で官能化され、続いて2-アミノエチルメタクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート、2-N-モルホリノエチルメタクリレート、2-(tert-ブチルアミノ)エチルメタクリレート、2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート又は[2-(メタクリロイルオキシ)-エチル]トリメチルアンモニウムクロリド等のカチオン性（メタ）アクリレートモノマーと共重合されるポリマー、好ましくは多糖、より好ましくはデキストランである。
【００２７】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、De Backer et al., 2013（引用することにより本明細書の一部をなす）において記載され、作製されるカチオン性デキストランナノゲルである。したがって、本発明は、サーファクタントタンパク質Bと1つ以上の脂質とからなるコーティングを有するカチオン性デキストランナノゲルに関する。
【００２８】
「サーファクタントタンパク質-B」（SP-B）は、例えばOlmeda et al., 2013に記載されるように、肺サーファクタント中に見られる必須脂質会合タンパク質である。このタンパク質は、市販されているか、組換え若しくは合成により作製するか、又は肺サーファクタント、臨床サーファクタント調製物若しくは動物の肺から単離することができる。単離プロトコルは通例、例えばOlmeda et al., 2015に記載されるように、有機溶媒抽出又は界面活性剤可溶化工程、続いてサイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む。市販の改質サーファクタント調製物は例えば、ブタ肺に由来するポラクタントアルファ（poractant alfa）（Curosurf（商標））、仔ウシ／ウシ肺洗浄液から抽出されたカルファクタント（calfactant）（Infasurf（商標））及びボバクタント（bovactant）（Alveofact（商標））、並びに化学的に改質された天然ウシ肺抽出物であるベラクタント（beractant）（Survanta（商標））である。さらに、SP-B類似体又はSP-B模倣物等の未変性SP-Bタンパク質のカチオン性及び両親媒性特性を模倣するSP-B関連ペプチド又はタンパク質を使用することもできる。SP-B模倣物としては、国際公開第2014/079898号（引用することにより本明細書の一部をなす）及び国際公開第2013/120058号（引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される（ポリ）ペプチド；肺胞II型細胞において形成される成熟SP-Bの前駆体（複数の場合もある）（例えば、pro-SP-B）；Mini-B、すなわちSP-BのN末端及びC末端ヘリックス領域から構成される内部ジスルフィド連結を有する34残基のペプチド；Mini-BのN末端に付着した未変性SP-B残基（残基1〜7）を有するSuper Mini-B；SP-BのN末端ドメイン（残基1〜25を含有する）に由来する合成ペプチドであるSP-B（1-25）、並びに未変性SP-Bタンパク質のカチオン性及び両親媒性特性を模倣する合成ペプチドであるKL4が挙げられるが、これらに限定されない。Pro-SP-Bは、組換えによっても作製することができる。「サーファクタントタンパク質SP-Bの類似体」という用語は、未変性タンパク質又は上記のSP-B模倣物（mimics）と比較して、場合により1つ以上のアミノ酸が除外されるか又は他のアミノ酸によって置き換えられたアミノ酸配列を有するが、リン脂質混合物等の脂質混合物中で、例えばバブルサーファクトメーター（bubble surfactometer）を用いて分析される界面活性特性を依然として示す（ポリ）ペプチドを含む。より具体的には、SP-Bの類似体は、未変性SP-Bと少なくとも70%、特に少なくとも80%、より特に少なくとも90%の配列同一性を有する。本明細書で実証されるように、脂質コーティング中のSP-Bの存在のみがサイトゾルsiRNA送達を刺激し、標的（例えば、eGFP）遺伝子抑制をもたらした。薬物送達の主な推進力としてのサーファクタントタンパク質Bの特定により、多様な薬物送達系においてその送達性能を増進するためにこの成分を用いる機会がもたらされる。したがって、マイクロ粒子及びナノ粒子を、例えばCurosurf（商標）中に見られる複雑な組成物と比較して低下した複雑性、低下したバッチ間変動性及び改善された特定の粒子組成の制御を伴って作製し、それにより治療用途及び／又は診断用途に用いる場合に、改善された生物学的性能及び生体適合性をもたらすことができることが本発明の特定の利点である。
【００２９】
特定の実施形態では、サーファクタントタンパク質Bは、全脂質組成物に対して0.1 wt%〜10 wt%、0.1 wt%〜5 wt%、0.1 wt%〜1 wt%又は0.1 wt%〜0.5 wt%、より特に約0.2 wt%〜約5 wt%、更により特に約0.4 wt%〜約3 wt%の重量比で存在する。好ましい実施形態では、重量比は、少なくとも又は約0.2 wt%、0.3 wt% 0.4 wt%、0.5 wt%、0.6 wt%、0.8 wt%、1 wt%、1.2 wt%、1.4 wt%、1.6 wt%、2 wt%、2.5 wt%、3 wt%、3.5 wt%又は4 wt%、及びそれらの間の全ての値である。
【００３０】
本明細書で言及される1つ以上の「脂質」は、早産児におけるサーファクタント置換療法について臨床的に認可された市販のサーファクタント調製物、例えばCurosurf（商標）（ポラクタントアルファ）、Infasurf（商標）、Survanta（商標）又はAlveofact（商標）について指定される以外の任意の脂質組成物を含む。より具体的には、1つ以上の脂質は飽和若しくは不飽和脂質、又はそれらの組合せのいずれかである。飽和脂質は、C-C単結合のみからなる脂肪酸アシル鎖を有することを特徴とする。不飽和脂質は、少なくとも1つの脂肪酸アシル鎖が少なくとも1つのC=C二重結合を含有する脂質（例えば、不飽和中性脂質、不飽和スフィンゴ脂質（例えば、不飽和スフィンゴミエリン）、不飽和グリセロ脂質（例えば、不飽和モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はトリアシルグリセロール）及び不飽和脂肪酸）として規定される。代替的には、少なくとも1つのC=C二重結合を有する中性脂質は、コレステロールを含む。更により具体的には、1つ以上の脂質はリン脂質、特に少なくとも1つの脂肪酸アシル鎖が少なくとも1つのC=C二重結合を含有するリン脂質である「不飽和リン脂質」であり、両性イオン性リン脂質又はアニオン性リン脂質、及びそれらの組合せのいずれかを含む。不飽和リン脂質の具体例として、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（SOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、L-α-ホスファチジルコリン（(egg)PC）、L-α-ホスファチジルエタノールアミン（(egg)PE）（両性イオン性不飽和リン脂質の例）及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルグリセロール（DOPG）、L-α-ホスファチジルグリセロール（(egg)PG）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸（DOPA）、L-α-ホスファチジン酸（(egg)PA）（陰イオン性不飽和リン脂質の例）及びそれらの組合せが挙げられるが、これに限定されるものではない。代替的な実施形態において、脂質組成物の脂質は主に、C-C単結合のみからなる脂肪酸アシル鎖を有する「飽和リン脂質」である。具体例として、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DLPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）（両性イオン性飽和リン脂質の例）及び1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルグリセロール（DPPG）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸（DPPA）（陰イオン性飽和リン脂質の例）が挙げられる。特定の実施形態において、脂質はホスファチジルコリン（PC）リン脂質である。マイクロ粒子又はナノ粒子のタンパク脂質組成物中の上記飽和又は不飽和（リン）脂質の濃度（重量%）は、特に少なくとも60%、特に少なくとも65%、更により特に少なくとも70%、75%、80%、85%又は90%、更には100%近くまで、すなわち99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%である。粒子のコーティング中の（リン）脂質の重量%の特定の範囲は70%〜99.8%、特に85%〜99.8%、より特に90%〜99.8%である。組成物又はコーティング中に多量の不飽和リン脂質又は飽和リン脂質のいずれかと組み合わせてSP-Bを使用することで遺伝子サイレンシングが顕著に促進されることが本明細書で実証されている。このことは、通例、より低レベルの飽和又は不飽和のいずれかのリン脂質を含有する市販のサーファクタント組成物とは対照的である。したがって、特定のタンパク脂質組成物中にサーファクタントタンパク質Bと多量の不飽和又は飽和（リン）脂質との両方を有することで、生体適合性及び生物学的性能の両方が増大する。
【００３１】
相当な割合のサーファクタントタンパク質Cからなり、比較的限られた濃度の飽和又は不飽和リン脂質を含むCurosurf（商標）とは極めて対照的に、本発明のナノ粒子又はそれを含む組成物は、サーファクタントタンパク質Cを含有せず、相当なより多量の飽和及び／又は不飽和（リン）脂質を含有する。さらに、一実施形態では、Curosurf（商標）のごく一部しか占めないDOPCが、SP-Bと組み合わせて効率的なコーティング成分であると証明されることが見出された。別の実施形態では、SP-Bと組み合わせて多量のDPPCを含む脂質組成物を含む粒子が効率的な標的遺伝子抑制をもたらすことが実証された。Curosurf（商標）は、最大56 wt%のDPPCを含有し、PC脂質画分中の脂肪酸パターンは、オレイン酸と比較して6倍〜7倍多い量のパルミチン酸を示す（Blanco and Perez-Gil, 2007）。
【００３２】
一実施形態において、リン脂質は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、L-α-ホスファチジルグリセロール（eggPG）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、L-α-ホスファチジン酸（eggPA）、及びそれらの組合せから選択される。より具体的には、リン脂質はDOPC:PG（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール）、DOPC:PA（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸）、DPPC:PG（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール）又はDPPC:PA（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸）の組合せであり、より具体的にはDOPC:eggPG（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール（鶏卵））、DOPC:eggPA（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸（鶏卵））、DPPC:eggPG（（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジルグリセロール（鶏卵））又はDPPC:eggPA（（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、L-α-ホスファチジン酸（鶏卵））の組合せである。
【００３３】
特に、上記DOPC:(egg)PG又はDPPC:(egg)PGの比は約75:25、約85:15、又は約90:10であり、或いは上記DOPC:(egg)PA又はDPPC:(egg)PAの比は約75:25、約85:15、又は約90:10である。
【００３４】
更なる実施形態では、粒子のタンパク脂質組成物は、SP-Bと、少なくとも5 mol%、より具体的には少なくとも15 mol%、又は更により具体的には少なくとも30 mol%のコレステロールを含む脂質組成物とからなる。30 mol%を超えるコレステロール濃度については、いわゆる秩序液体相（liquid ordered phase）が優勢であり、コレステロールが混合されたリン脂質（複数の場合もある）の主要相転移は、もはや広範囲の温度にわたって観察することができない。このことは、脂質ナノ粒子について、高濃度のコレステロール（30 mol%超）が、例えばホスファチジルコリンと組み合わせて、静脈内投与後のリポソーム安定性、薬物滞留性及び循環時間を増大することが実証されていることから、このようなコレステロールの量を粒子タンパク脂質組成物に添加する上で利点であり得る。本明細書で実証されるように、siRNA送達に対するコレステロールの負の影響は観察されなかった。かかる組成物は、この場合も、コレステロール及びコレステロールエステルのような中性脂質が液体ゲルクロマトグラフィーにより最終生成物から除去されるCurosurf（商標）とは極めて対照的である。また、他の臨床サーファクタント調製物は通例、5重量%以下のコレステロール画分を含有するため（Blanco and Perez-Gil, 2007）、かかる組成物はそれらとは極めて対照的である。
【００３５】
本明細書に記載されるマイクロ粒子又はナノ粒子は、治療剤、生物活性剤又は診断用（イメージング）剤等の作用物質を担持するか、又はそれらと結合する。
【００３６】
したがって、粒子は、任意の薬物又は（治療）剤との使用に好適である。作用物質は、粒子にカプセル化しても、又はその表面（単数又は複数）に付着させ、コンジュゲートを形成してもよい。粒子は、生物活性脂質又は親油性／両親媒性の小分子化合物若しくは薬物を含有していてもよい。特定の一例は、ワクチン接種戦略のためのモノホスホリルリピドA（MPLA）等の両親媒性TLRアゴニストの封入である。
【００３７】
場合によっては、治療剤のカプセル化は、表面に付着させるよりも高濃度の薬物をカプセル化することができることから有利である。マイクロ粒子又はナノ粒子の作製、及び粒子内への治療剤のカプセル化に好適な方法は、当業者に既知であり、静電錯体化（electrostatic complexation）、共有結合、疎水性相互作用、パッシブローディング（passive loading）、リモートローディング（remote loading）、塩析、ナノ沈殿（nanoprecipitation）、エマルション拡散、溶媒蒸発、噴霧乾燥及び乳化重合を含むが、これらに限定されず、本実施例において実証される。通例、かかる方法は、粒子の作製に用いられる材料及び選ばれる作用物質に応じて適合させることができ、この適合は当業者の権限内にある。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療剤」はタンパク質、ペプチド、脂質、化学化合物、遺伝物質（すなわち、核酸）又は任意の他の活性分子であり得る。
【００３９】
本明細書に記載のマイクロ粒子又はナノ粒子によって細胞内に送達することができるタンパク質治療剤の例としては、酵素、ペプチド、抗体及びタンパク質モジュレーターが挙げられる。
【００４０】
代替的には、治療剤は、特にダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、パクリタキセル、アムホテリシンB、モルヒネ、デキサメサゾン、レチノイン酸及びヒスタミン等の小分子であってもよい。小分子の細胞内送達の特異性を増大させることで、副作用だけでなく、薬物の必要量、その結果としてコストが低減する。本明細書に記載のマイクロ粒子及びナノ粒子は、同様に小分子の細胞内送達の特異性を増大することができる。このことは、特に潜在的副作用を最小限に抑え、薬物耐性を克服することが重要である抗癌剤等にとって有利であり得る。
【００４１】
特定の実施形態では、治療剤はプラスミドDNA、メッセンジャーRNA（mRNA）、DNAアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、短鎖非コードRNA（例えば、siRNA又はmiRNA）、及び長鎖非コードRNA等の遺伝物質（すなわち、核酸）であってもよい。ナノ粒子とsiRNAとの複合体が特に好ましい。RNA干渉（RNAi）は、約21 ntのRNA二重鎖、すなわちsiRNAが配列特異的mRNA切断のエフェクター分子として機能し、それにより配列特異的遺伝子サイレンシングを転写後レベルで誘導する強力な遺伝子サイレンシング機構を意味する。合成siRNAは、RNAi経路を活性化することが示されており、ほぼ全てのヒト遺伝子を標的とするように設計することができることから、RNAiは、治療目的で遺伝子発現を抑制するために選択される方法となっている。
【００４２】
さらに、タンパク脂質組成物の脂質は、修飾するか（例えば、ポリエチレングリコールにより）又は官能化する（例えば、反応性基により）ことができ、これによりコロイド安定性及び循環時間を高めることができ、又は粒子の表面が標的化部分、イメージング剤等で修飾される。
【００４３】
更なる実施形態では、マイクロ粒子又はナノ粒子は、イメージング剤を含む。本明細書で使用される場合、「イメージング剤」という用語は、核磁気共鳴画像法（MRI）、超音波、光学イメージング（蛍光、生物発光）、共焦点顕微鏡検査等を用いて非侵襲的に追跡することができる任意の作用物質を意味し得る。好適なイメージング剤としては、例えば当業者に既知のパーフルオロカーボン（PFC）等のフッ素化合物、及び蛍光色素等の蛍光標識が挙げられる。好適な蛍光標識の例としては、フルオレセイン（フルオレセインアミン又はフルオレセインイソチオシアネート（FITC）等）、ローダミン、Alexa Fluor（商標）色素、DyLight（商標） Fluor色素、ATTO色素、ホウ素−ジピロメテン（BODIPY）色素等が挙げられる。
【００４４】
粒子が少なくとも1つのイメージング剤を含むことは、粒子をin vitro及び／又はin vivoにて細胞内で追跡することを可能とすることから利点であり得る。イメージング剤は、カプセル化、共有結合コンジュゲーション、物理的固定化（例えば、静電錯体化、疎水性相互作用等による）、交互積層（layer-by-layer；LBL）吸着等を含む任意の好適な手段によって粒子中に封入することができる。用いられる特定の方法は、選択される特定のイメージング剤及びマイクロ粒子又はナノ粒子に応じて異なり、かかる方法論は当業者の権限内にある。
【００４５】
さらに、本明細書に記載のマイクロ粒子及びナノ粒子は、当該技術分野において記載されるように、リガンド、又は核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、ERシグナルペプチド、ER回収配列等の細胞内輸送剤（cell trafficking agent）を含み得る。
【００４６】
本発明のマイクロ粒子及びナノ粒子は治療用途、診断用途又はセラノスティクス用途等の医療用途に特に有用である。本発明の組成物は、生体膜を通した、特に細胞の細胞質又は核内への作用物質の通過又は移動を容易にする。上記組成物を用いた種々の生物活性剤の細胞内送達によって、より効果的に細胞内事象に影響を及ぼし、細胞内事象を調節することができる。これらの活性剤により細胞機能を改変若しくは正常化することができ、又は必要に応じて不要な細胞を除去することができる。細胞機能性の変化は、細胞の物理化学的特性の変化、細胞の増殖性の変化、細胞の生存能の変化、細胞の分泌能の変化、細胞の移動特性の変化及び／又は細胞の形態学的表現型特性の変化を含み得る。したがって、多くの臨床用途を想定することができる。例えば、担持させた粒子又は本発明の粒子で標識した細胞を、疾患又は障害を患う患者に投与することで、該疾患と関連する症状又は病態の発症を予防、遅延、軽減、停止又は阻害することができる。
【００４７】
特定の実施形態では、粒子は核酸療法、及び／又はアレルギー関連疾患及び免疫関連疾患、皮膚疾患、心疾患、内分泌疾患、代謝性疾患、血液疾患、胃腸疾患、結腸直腸疾患、感染性疾患、癌、腎疾患、肺関連疾患（pulmonary related diseases）、リウマチ疾患、神経系疾患、骨疾患（osteopathic diseases）、整形外科的疾患、眼科疾患、耳鼻咽喉関連疾患（otolaryngology related diseases）、泌尿器疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【００４８】
このため、本発明は、本明細書に記載されるマイクロ粒子又はナノ粒子と、薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物及び送達系を提供する。本発明は、マイクロ粒子又はナノ粒子、組成物及びトランスフェクト細胞の第1の及び更なる医学的使用を提供する。より特に、本発明は作用物質、特に膜不透過性の作用物質又は疎水性の作用物質若しくは薬物、特に核酸の細胞内送達に使用されるマイクロ粒子及びナノ粒子を提供する。核酸をex vivo又はin vitroで好適な細胞に投与することができ、次いで核酸を含有する細胞を患者に移植することができる。代替的には、核酸をin vivoで標的器官、組織及び細胞に投与する。
【００４９】
粒子又はそれを含む組成物は、疾患の治療、改善又は予防のための単独療法（すなわち、活性剤の使用）に用いられ得る薬剤に使用することができる。代替的には、粒子又はそれを含む組成物は、疾患の治療、改善又は予防に用いられ得る既知の療法の補助として又はそれと組み合わせて使用することができる。例えば、或る特定の実施形態では、癌の治療が本発明の粒子を単独で投与することを含む。或る特定の実施形態では、治療は、被験体に抗癌剤又は治療、例えば化学療法剤又は放射線を与えることを更に含む。本明細書に記載される粒子と既知の薬剤との併用について相乗的治療効果を見ることができる。
【００５０】
マイクロ粒子又はナノ粒子を含む組成物は、多数の方法で、例えば経口投与、吸入、鼻腔内投与、注射（血流中に又は治療を必要とする部位に直接）によって、局所使用として、又は持続放出若しくは遅延放出デバイスに組み込んで投与することができる。特定の実施形態では、粒子を含む組成物は、肺関連疾患の治療のために吸入によって投与される。注目すべきことに、カチオン性デキストランナノゲルとは対照的に、siRNAと複合したカチオン性リポソームが、おそらくは脂質混合のために肺サーファクタントに適合せず、複合siRNAの（早期）放出をもたらすことが文献（De Backer et al., 2013）中に記載されている。好ましい実施形態では、本発明の粒子を吸入により投与する。
【００５１】
さらに、組成物は筋肉内、静脈内（ボーラス又は点滴）、動脈内（ボーラス又は点滴）、皮下（ボーラス又は点滴）又は皮内（ボーラス又は点滴）に注射することができる。投与の頻度は、治療される被験体における活性剤の半減期によっても影響を受ける。投与すべき最適用量は、当業者が決定することができ、使用される特定のマイクロ粒子若しくはナノ粒子又は細胞、投与方法及び疾患の進行度（advancement）によって異なる。被験体の年齢、体重、性別、食生活及び投与時期を含む、治療される特定の被験体に応じた付加的な因子により、投与量を調整する必要性が生じる。
【００５２】
粒子は、治療すべき疾患、障害又は病態の発現の前、その最中又はその後に投与することができる。一日量は、単回投与（例えば、1日1回の注射）として与えることができる。代替的には、粒子は、1日2回以上の投与を必要とする場合もある。
【００５３】
記載の治療用途に使用されるナノ粒子は、本明細書に記載されるナノ粒子のいずれであってもよい。ナノ粒子は、SP-B及び1つ以上の脂質、特に少なくとも70%の飽和又は不飽和リン脂質でコーティングされたカチオン性デキストランナノゲルのコアを含むのが好ましい。具体的には、治療剤はsiRNAである。
【００５４】
本明細書で使用される「被験体」は脊椎動物、哺乳動物又は飼育動物であり得る。したがって、本発明による組成物又は薬剤は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、愛玩動物の治療に用いることができ、又は他の獣医学用途に用いることができる。最も好ましくは、被験体はヒトである。
【００５５】
本明細書で言及される「薬学的に許容可能な賦形剤」は、医薬組成物の配合において有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物又は既知の化合物の組合せである。一実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は固体であってもよく、組成物は粉末又は錠剤の形態であってもよい。薬学的に許容可能な固体賦形剤は着香料、滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤（compression aids）、不活性結合剤、甘味料、保存料、コーティング又は錠剤崩壊剤としても作用することができる1つ以上の物質を含み得る。賦形剤は、カプセル化材料を含んでいてもよい。粉末では、賦形剤は、本発明による微粉活性剤と混合される微粉固体である。好適な固体賦形剤としては、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、医薬ビヒクルがゲルであってもよく、組成物はクリーム等の形態であってもよい。加えて、医薬賦形剤は液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態であってもよい。液体賦形剤は溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル及び加圧組成物の作製に使用される。本発明による粒子又は作用物質は水、有機溶媒、その両方の混合物等の薬学的に許容可能な液体賦形剤、又は薬学的に許容可能な油若しくは脂肪に溶解又は懸濁することができる。液体賦形剤は可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、着香料、懸濁化剤、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定化剤又は浸透圧調節剤等の他の好適な医薬添加剤を含有していてもよい。経口投与及び非経口投与のための液体賦形剤の好適な例としては、水（上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体を部分的に含有する、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びその誘導体、並びに油（例えば分留（fractionated）ヤシ油及びラッカセイ油）が挙げられる。非経口投与については、賦形剤は、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピル等の油性エステルであってもよい。滅菌液体賦形剤が非経口投与のための滅菌液体形態の組成物に有用である。
【００５６】
滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、例えば皮下、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に筋肉内注射によって用いることができる。
【００５７】
本発明は、更なる態様では、（医薬）組成物を作製するプロセスであって、活性剤とマイクロ粒子又はナノ粒子、及び薬学的に許容可能な賦形剤とを組み合わせることを含む、プロセスも提供する。より具体的には、本明細書に記載される粒子を作製する特定の方法は、
作用物質を予め担持させた又は担持させない粒子を準備する工程と、
上記粒子に、サーファクタントタンパク質Bと1つ以上の脂質、特にリン脂質、より特に少なくとも70%の不飽和又は飽和リン脂質とからなるコーティング組成物を成層又はコーティングする工程と、
を含む。
【００５８】
代替的な実施形態では、粒子を作製する方法は、
サーファクタントタンパク質Bと1つ以上の脂質、特にリン脂質、より特に少なくとも70%の不飽和又は飽和リン脂質とからなるタンパク脂質組成物を含む作用物質を予め担持させた又は担持させない粒子を直接作製する工程と、
を含む。
【００５９】
本明細書に記載される特徴の全て（任意の添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）、及び／又はそのように開示される任意の方法又はプロセスの工程の全てを、かかる特徴及び／又は工程の少なくとも一部が相互排他的である組合せを除き、上記の態様のいずれかと任意の組合せで組み合わせることができる。
【実施例】
【００６０】
材料及び方法
低分子干渉RNA
in vitro実験のために、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）に対して標的化された21ヌクレオチド（nt）の低分子干渉RNA（siRNA）二重鎖（以下、siEGFPと略される）及び非標的化陰性対照二重鎖（siCTRL）をEurogentec（Seraing，Belgium）から購入した。siEGFPについては、センス鎖は5'-CAAGCUGACCCUGAAGUUCtt-3'（配列番号1）であり、アンチセンス鎖は5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUGtt-3'（配列番号2）である。siCTRLについては、センス鎖は5'-UGCGCUACGAUCGACGAUGtt-3'（配列番号3）であり、アンチセンス鎖は5'-CAUCGUCGAUCGUAGCGCAtt-3'（配列番号4）である（大文字はリボヌクレオチドを表し、小文字は2'-デオキシリボヌクレオチドを表す）。蛍光実験のために、siCTRL二重鎖のセンス鎖の5'末端をCy（商標）5色素で標識した（siCy5）。蛍光修飾は、Eurogentecによって行われ、検証された。ヌクレアーゼフリー水（Ambion（商標）-Life Technologies，Ghent，Belgium）中のsiRNAストック溶液の濃度を、Nanodrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，DE，USA）を用いた260 nmでの吸収測定（1 OD260＝40 μg/mL）によって算出した。in vivo実験のために、マウス腫瘍壊死因子（TNF）αに対して標的化された安定化21 nt siRNA二重鎖（siSTABLE）（以下、siTNFαと略される）及び非標的化陰性対照二重鎖（siCTRL）をGE Healthcare Dharmacon（Diegem，Belgium）から購入した。siTNFαのセンス鎖は5'-CAAAUGGCCUCCCUCUCAUUU-3'（配列番号5）であり、アンチセンス鎖は5'-AUGAGAGGGAGGCCAUUUGUU-3’（配列番号6）である。安定化siCTRLの配列は機密であり、掲載することはできなかった。
【００６１】
デキストランナノゲルの合成及びsiRNAの担持
カチオン性デキストランナノゲルを、以前に報告されている逆相ミニエマルション光重合（inverse miniemulsion photopolymerization）法を用いて作製した。簡潔に述べると、置換度が5.2の150 mgのデキストランヒドロキシエチルメタクリレート（dex-HEMA）を、97.5 μLのIrgacure 2959（水中10 mg/mL、Sigma-Aldrich，Bornem，Belgium）、180 μLのヌクレアーゼフリー水及び195 μLのカチオン性メタクリレートモノマーである[2-(メタクリロイルオキシ)-エチル]トリメチルアンモニウムクロリド（TMAEMA、80 wt%水溶液；Sigma-Aldrich）を含有する溶液に溶解した。得られるdex-HEMA溶液を、サーファクタントABIL EM 90（0.5 mL）（Evonik Goldschmidt GmbH，Essen，Germany）を添加した5 mLの鉱油（Sigma Aldrich）中で、超音波処理（90秒、振幅15%；Branson Digital Sonifier（商標）、Danbury，USA）により乳化した。形成された乳化ナノ液滴を即座にUV照射（900秒、Bluepoint 2.1 UV源、Hoenle UV technology，Graefelfing，Germany）によって冷却下（4℃）で架橋させた。得られるdex-HEMA-co-TMAEMAナノゲル（以下、NGと略される）をアセトン中での沈殿によって回収し、アセトン：ヘキサン（1:1）で4回洗浄した。微量の有機溶媒を真空蒸発によって除去し、ペレットを5 mLのヌクレアーゼフリー水中に再分散させた。長期安定性を確実にするために、NGを凍結乾燥し、乾燥状態で保管した。in vitro実験のためのsiRNAを担持させたNG（siNG）を得るために、NGストック（2 mg/mL）を、秤量した量の凍結乾燥粒子を氷冷ヌクレアーゼフリー水中に分散させ、続いて短時間の超音波処理（3×5秒、振幅10%；Branson Digital Sonifier（商標）、Danbury，USA）を行うことによって作製した。続いて、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）バッファー（pH 7.4、20 mM）中の同量のNG及びsiRNAの希釈物を混合し、4℃で15分以上インキュベートして、複合体形成を行った。in vivo実験のために、NGストック（10 mg/mL）を上記のように作製した。NGストックは、Endosafe（商標）-PTS（商標）アッセイ（Charles River International，Lecco，Italy）によって測ったところ、0.5 EU/mL未満のリポ多糖（LPS）を含有していた。NG及びsiRNAは、混合及びインキュベーションの前にヌクレアーゼフリー水で希釈した。加えて、in vivo実験のための全ての作製工程を、LPSフリー条件下でLPSフリー材料を用いて行った。siRNA希釈物の濃度は、意図する用量に応じて調整した。
【００６２】
疎水性サーファクタントタンパク質の単離、分析及び定量
未変性ブタ肺サーファクタント又はCurosurf（商標）（市販のブタ肺サーファクタント調製物；Chiesi Farmaceutici，Parma，Italy）からのSP-B及びSP-Cの単離は、以前にPerez-Gil et al. 1993によって記載されているように行った。未変性ブタ肺からの抽出については、肺を初めに細かく切り刻み、慎重に洗浄した。次に、混合物を濾過し、遠心分離した（4℃にて1000×gで15分間）。上清を再び遠心分離し（4℃にて3000×gで2時間）、大きな脂質／タンパク質PS複合体に富んだ単離ペレットから、脂質及び疎水性サーファクタントタンパク質を含む疎水性成分をBligh & Dyer法に従い、クロロホルム／メタノール混合物を用いて抽出した。Sephadex LH-20（GE Healthcare，Machelen，Belgium）における有機抽出物のクロマトグラフィー分離により、疎水性タンパク質画分がサーファクタント脂質画分から分離された。その後のSephadex LH-60におけるクロマトグラフィー工程によりSP-B及びSP-Cが精製され、これをクロロホルム／メタノール溶液中で保管した。タンパク質サンプルのリン脂質混入を、リン定量（Rouser et al. 1970）によって定量化した。タンパク質の単離プールの純度及び性質を、ポリアクリルアミドゲルにおけるドデシル硫酸ナトリウム（SDS）電気泳動、並びにその後の抗SP-B及び抗SP-C一次抗体（Seven Hills，Cincinnati，OH，USA）を用いたウエスタンブロットによって分析した。単離されたSP-B及びSP-Cの量の定量をアミノ酸分析によって行った。
【００６３】
Curosurf（商標）でコーティングされたsiRNA担持ナノゲルの作製
Curosurf（商標）肺サーファクタントコートの形成の前に、上記のようにNGにsiRNAを担持させた。非処理Curosurf（商標）分散液（80 mg/mL）をHEPESバッファーで4.5 mg/mLまで希釈し、同量のsiNGと共に、15 mg/mgのCurosurf（商標）対NG重量比を用いて4℃で10分間インキュベートした。続いて、siNG上のサーファクタントコートを超音波処理（3×10秒、振幅10%；Branson Digital Sonifier（商標）、Danbury，USA）によって形成した。これにより、Curosurf（商標）コーティングsiNGと更に表されるハイブリッドナノ粒子が得られた。
【００６４】
タンパク脂質でコーティングされたsiRNA担持ナノゲルの作製
以下のリン脂質をsiNGコーティングに使用した：1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、L-α-ホスファチジルグリセロール（eggPG）及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）。全てのリン脂質をAvanti Polar Lipids, Inc.（AL，USA）から購入した。リン脂質を、クロロホルム中で実験的必要性に応じて異なる重量比で混合した。SP-B及び／又はSP-Cをリン脂質外層に組み込むために、単離疎水性タンパク質をクロロホルム中でリン脂質と指定濃度で合わせた。（タンパク）脂質フィルムを真空下にて37℃で有機溶媒の回転蒸発によって形成した。乾燥（タンパク）脂質フィルムをHEPESバッファー中で機械撹拌によって再水和させ、4.5 mg/mLの最終（タンパク）脂質濃度を得た。水和（タンパク）脂質フィルムを上記のようにコーティング手順に使用し、この際に（タンパク）脂質混合物対NGの比率を15 mg/mg（in vitro実験）又は10 mg/mg（in vivo実験）とした。in vivo投与のための（タンパク）脂質-siNG混合物は、超音波処理の前にヌクレアーゼフリー水中で2倍希釈した。これにより、タンパク脂質コーティングsiNGと更に表されるハイブリッドナノ粒子が得られた。
【００６５】
細胞株及び培養条件
細胞培養実験を、eGFPを安定して発現するヒト肺上皮細胞（H1299）（H1299_eGFP）を用いて行った。H1299_eGFP細胞を、2 mMグルタミン、10%ウシ胎仔血清及び100 U/mLペニシリン／ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640及びDMEMのそれぞれにおいて37℃にて5% CO2を含有する加湿雰囲気中で培養した。細胞を、サブコンフルエンシー（sub-confluency）を維持するために、0.25%トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を用いて3日に1回継代した。H1299_eGFP細胞を、選択のために1 mg/mL Geneticin（商標）を含有する培地で1ヶ月に1回処理した。Hyclone（商標）（GE Healthcare，Machelen，Belgium）によって供給される血清を除き、全ての材料をGibco（商標）-Life Technologiesから購入した。
【００６６】
フローサイトメトリーによるH1299_eGFP細胞におけるin vitro細胞siRNA内在化の定量化
フローサイトメトリーによってsiRNAの細胞取込みを定量化するために、H1299_eGFP細胞を24ウェルプレート（Greiner Bio-One GmbH，Kremsmuenster，Austria）に2×104細胞/cm2の密度で播種し、一晩定着させた。NGに種々の量のsiCTRL:siCy5（100 mol%:0.75 mol%）を担持させ、上記のコーティング手順を用いてCurosurf（商標）又はタンパク脂質混合物をコーティングした。Opti-MEM（商標）中での5倍希釈（30 μg/mLの最終NG濃度）後に、粒子を細胞と共に4時間（37℃、5% CO2）インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をデキストラン硫酸ナトリウム塩（PBS中0.1 mg/mL）で洗浄し、細胞表面に結合した蛍光物質を除去した。次に、細胞をトリプシン処理（トリプシン／EDTA 0.25%）によって採取し、250 μLのフローバッファー（1%ウシ血清アルブミン及び0.1%アジ化ナトリウムを添加したPBS）に再懸濁し、フローサイトメトリー分析まで氷上でインキュベートした。トランスフェクションを1回の独立反復につき技術的三連（technical triplicate）（n=3）で行い、各測定において最低104個の細胞を、FACSCalibur（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences，Erembodegem，Belgium）を用いて分析した。データ分析を、FlowJo（商標）分析ソフトウェア（Treestar，Costa Mesa，USA）を用いて行った。
【００６７】
フローサイトメトリーによる肺上皮細胞株におけるin vitro eGFPサイレンシングの定量化
H1299_eGFP細胞を24ウェルプレート（Greiner Bio-One GmbH；1.85×104細胞/cm2）に播種した。NGに様々な量のsiCTRL又はsiEGFPを担持させた。次に、上記のコーティング手順を用いて、siNGをCurosurf（商標）又はタンパク脂質混合物でコーティングした。Opti-MEM（商標）中での5倍希釈（30 μg/mLの最終NG濃度）後に、粒子を細胞と共に4時間（37℃、5% CO2）インキュベートした。インキュベーション後に、非内在化ナノ粒子をPBSで洗い流し、細胞を1 mLの新鮮細胞培養培地と共に48時間インキュベートした。次いで、細胞を上記のようなフローサイトメトリーによる分析のために準備した。トランスフェクションを1回の独立反復につき技術的三連（n=3）で行い、各測定において最低2×104個の細胞を上記のように分析した。
【００６８】
SP-Bを用いたカチオン性リポソームの作製及びsiRNAの複合体形成
カチオン性リポソームを脂質フィルム水和法によって作製した。全ての脂質をAvanti Polar Lipids（USA）からクロロホルム溶液として入手した。DOTAP:DOPEリポソーム（LPS）を、適切な容量の脂質溶液を丸底フラスコ内で混合し、1:1のモル比を得ることによって作製した。SP-Bを含有するリポソームを、適切な容量のSP-Bのクロロホルム溶液をDOTAPとDOPEとの混合物に添加し、0.4 wt%の最終SP-B濃度を得ることによって作製した。真空下にて40℃での回転蒸発により脂質フィルムを生じさせ、続いて1 mLのHEPESバッファー（pH 7.4、20 mM）を用いて水和させた。得られた混合物をボルテックスし、10%振幅で1分間超音波処理し、単分散LPS分散液を得た。トランスフェクションの直前にLPSをsiRNAと複合させた。これに関して、HEPESバッファー中のLPSの適切な希釈物をsiRNAの適切な希釈物と共にインキュベートした。混合物を4℃で30分間複合させた後、Opti-MEMで更に希釈し、トランスフェクションを行った。LPSを8に等しい電荷比でsiRNAと複合させ、適用した1ウェル当たりの最終siRNA濃度は0.5 nM、1 nM及び5 nMとした。
【００６９】
種々の免疫細胞型によるsiRNA取込みのex vivo定量化、並びにナイーブBALB/cマウスにおける急性in vivo毒性及び細胞流入の評定
雌性BALB/cマウスをCharles River Italyから購入し、特定病原体除去条件下で12時間の昼夜サイクルに制御した個別換気ケージ内に収容し、食餌及び水を自由に摂取させた。全てのマウスが実験開始時に8週齢であった。動物に関わる全ての手順が、欧州ガイドラインに従うゲント大学の倫理委員会によって認可された（認定番号LA1400536、Belgium）。投与のための（タンパク脂質コーティング）siNG及び対照懸濁液を上記のように作製し、続いて2倍濃縮PBS中で2倍希釈した。マウス1匹につき、1 μgのNG当たり1 pmolのsiTNFαを担持させた100 μgのNGの用量を投与した。マウスの気管吸引をNP投与に用いた。簡潔に述べると、イソフルランによる鎮静（導入のために4%、維持のために3%の吸入）後に、個々のマウスをほぼ直立の姿勢にした。動物の舌を直線鉗子（lined forceps）により伸ばし、80 μLのNP懸濁液を咽頭の後部に滴下した。分散液が肺に吸入されるまで舌を適所に保持した。対照マウスには80 μLのPBSを投与した。NP投与の24時間後に、マウスに80 μLのPBS中5 μgのリポ多糖（LPS）用量を気管吸引によって与えた。NP投与の48時間後、従ってLPS投与の24時間後に、致死量のNembutal（商標）（ペントバルビタール、PBS中200 mg/kg；Ceva，Brussels，Belgium）の腹腔内注射によってマウスを屠殺した。死亡直後に、潅注カニューレ（lavage cannula）を小切開から気管内に入れた。肺を、0.05 mM EDTA（Sigma-Aldrich）を添加した1 mLのCa2+及びMg2+を含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS; Invitrogen（商標）-Life Technologies）で1回洗った。得られたBALを続いて遠心分離し（400×g、7分間、4℃）、細胞画分を上清から分離した。BAL上清を、Bio-Plex（商標）サスペンションアレイシステム（Biorad，Hercules，USA）を用いて上記のようにマウスTNFαについて定量化した。
【００７０】
統計分析
全てのデータを平均±標準偏差（SD）として示す。統計分析は、One-way ANOVAに続くテューキーの多重比較検定により、GraphPad Prismソフトウェアバージョン6を用いて行った。全ての実験のエラーバーはSDを表す。in vivoサイレンシングのエラーバーは、平均値の標準誤差（SEM）を表す。
【００７１】
結果
サーファクタントタンパク質の評価
siRNA送達効率の増強に関与する肺サーファクタント層の成分を特定するために、、サーファクタントタンパク質（SP）であるSP-B及びSP-Cを未変性ブタ肺抽出物及びCurosurf（商標）の両方から単離した（Perez-Gil et al., 1993）。
【００７２】
両方のサーファクタントタンパク質の重要性を区別するために、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン：1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン：L-α-ホスファチジルグリセロール（DPPC:POPC:eggPG；50 wt%:35 wt%:15 wt%）から構成される脂質混合物に、Curosurf（商標）について記録されているものと同等の重量比（すなわち、0.4 wt% SP-B及び0.7 wt% SP-C）を用いて、単離SP-B及び／又はSP-Cを添加した（非特許文献2）。
【００７３】
図1aに示されるように、脂質又は脂質−タンパク質外層の存在が、組成とは独立して、H1299_eGFPにおけるsiNGの取込みを著しく低減した。重要なことには、外層がモデルリン脂質混合物（コーティングsiNG（LIP））のみからなる場合、siNGの遺伝子サイレンシング能は完全に阻害された（図1b）。このことは、Curosurf（商標）コーティングsiNG（コーティングsiNG（CS））とは全く対照的である。
【００７４】
興味深いことに、単離サーファクタント会合タンパク質は、ハイブリッド配合物を用いて得られる遺伝子ノックダウンのレベルに顕著に影響を及ぼすことができる（図1b）。コーティングsiNG（LIP）と比較して同様の低い細胞内siRNA取込みレベルにも関わらず、脂質コートへのSP-B又はSP-Cの組込みによりeGFPの下方調節の顕著な差が観察された。明らかなことに、外層におけるSP-Bの存在のみがサイトゾルsiRNA送達を顕著に刺激し、40%のeGFP遺伝子抑制をもたらした。一方、SP-Cの存在は、コーティングsiNG（LIP）の遺伝子サイレンシング能を顕著に変化させなかった。結果として、以下の実験では、脂質外層における単離SP-Bの使用に焦点を合わせた。
【００７５】
飽和リン脂質対不飽和リン脂質の評価
初めに、siNGコーティングに用いる脂質混合物を、二成分リン脂質混合物まで縮小した場合に同様の生物学的効果を達成することができるかを評価した。加えて、膜流動性の影響を評定するために、DPPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）を成層したsiNGの有効性と、DOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）を成層したsiNGの有効性とを比較することにした。どちらも負に帯電したeggPG（カチオン性siNGとの相互作用及びカチオン性siNGのコーティングに必要とされる）とホスファチジルコリン（PC）リン脂質との組合せである。唯一の違いは、DPPCが飽和脂肪酸鎖のみを含み、DOPCには不飽和脂肪酸のみが存在することである。結果から、適用されるリン脂質混合物とは独立し、またSP-Bの存在とは独立して、コーティング後にsiNGの細胞内在化が著しく阻害されたことが示される（図2a）。後者は、SP-Bの非存在下でごく僅かな遺伝子ノックダウンしか生じなかった。SP-Bを添加したDPPC:eggPG混合物によるsiNGのコーティングは、DPPC:POPC:eggPG（LIP）についての先の結果と比較して同様のレベルのノックダウンを生じた。DOPCを含むタンパク脂質組成物の使用は、遺伝子サイレンシングを顕著に促進し、非コーティングsiNG又はCurosurf（商標）コーティングsiNGについて測定されたものと同等のノックダウンレベルに達した（図2b）。
【００７６】
アニオン性リン脂質の評価
eggPGを別のアニオン性リン脂質、すなわちL-α-ホスファチジン酸（eggPA）に置き換えることは、細胞内在化に影響を有さず、遺伝子サイレンシング能に対して僅かな負の影響しか有しなかった（図3）。注目すべきことに、DOPC:eggPG:SP-B配合物について得られる最大遺伝子サイレンシングから（図2b）、本実験では、準最適量のsiRNA（siRNA用量の5分の1までの減少）を用いることで、限界効果をより正確にモニタリングした。これにより、DOPC:eggPGでコーティングされたsiNGについてSP-Bの存在下で観察される最大遺伝子サイレンシングが、図3bにおける90%の低減と比較して、図3dにおいて60%まで低減した理由が説明される。
【００７７】
不飽和リン脂質コートを有するサーファクタントタンパク質の評価
SP-Bを収容し、最適ノックダウンレベルを達成するための不飽和リン脂質の重要性が確立されたことから、次に、かかるリン脂質組成物に用いられる場合のSP-Cと比較されるSP-Bの重要な役割を確認しようとした。この目的で、SP-B（0.4 wt%）、SP-C（0.7 wt%）又は両方のサーファクタントタンパク質の組合せを添加したDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）脂質コートをsiNGに成層した。図4において明らかに実証されるように、SP-Bがタンパク脂質コート中に存在する場合にのみ、実質的な遺伝子ノックダウンを認めることができ、不飽和リン脂質と組み合わせる場合に、SP-Bを配合物に封入することが絶対必要であり、SP-Cの送達促進効果は見られないことが確認される。
【００７８】
コレステロールの評価
未変性肺サーファクタント中では、コレステロールは、リン脂質間に介在し、それらの分子運動性を高めることから、重要な役割を果たす。臨床的に認可されたCurosurf（商標）の作製時に除去され、先に評価した合成外層組成物中に存在しないコレステロールの影響は、未だ調査されていない。未変性肺サーファクタントにおけるコレステロール含量は、±3〜8 wt%に等しい（非特許文献2）。したがって、2.5 wt%、5 wt%又は10 wt%のコレステロールをDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）と0.4 wt% SP-Bとからなる外層に組み込んだ。siNG取込み及びタンパク質ノックダウンレベルのどちらについても顕著な負の影響は観察されなかった（図5）。
【００７９】
サーファクタントタンパク質の供給源の評価
種々の単離SP-B画分の細胞効果を直接比較した。1つの画分をCurosurf（商標）から単離し、他の3つのSP-B画分を3つの異なる未変性ブタサーファクタントサンプルから単離した。異なるSP-B画分を合成二成分リン脂質混合物DOPC:eggPGに添加し、0.4 wt%のSP-Bとした。細胞取込み及びモデル標的遺伝子サイレンシングに対して観察される影響が、SP-Bを単離する供給源に全く又は限定的にしか影響されないことを図6a及び図6bから明らかに導き出すことができる。
【００８０】
サーファクタントタンパク質Bの濃度の評価
先の実験では、低濃度での本発明者らにより開発されたハイブリッドNPのsiRNA送達効率に対するSP-Bの顕著な影響が観察された。本発明者らの第1の実験については、Curosurf（商標）中のSP-Bの存在に基づいて、0.4 wt% SP-Bを外層に適用することにした。以下の実験では、コーティングNPの外層中のより高濃度のSP-Bについても検討し、生物活性に対する影響を評価した。図6cでは、細胞内在化データから、外層中のより高い割合のSP-BがH1299_eGFPによるコーティングsiNGの取込みを更に減少させることが示されるが、タンパク質ノックダウンについて顕著な差を観察することはできなかった（図6d）。
【００８１】
急性肺傷害（ALI）のマウスモデルにおけるin vivo TNFαノックダウンの評価
SP-Bタンパク脂質でコーティングされたナノゲルによる有望な遺伝子ノックダウンの結果に更に基づいて、次に、急性肺傷害（ALI）のマウスモデルにおけるin vivo概念実証を得ようとした。ナイーブBALB/cマウスを、気管吸引によるLPSでの刺激の24時間前に、TNFα標的化siRNA（siTNFα）を担持させた種々のNP配合物で予防的に処理した。LPS曝露により、ナイーブBALB/cマウスにおいてTNFαレベルがPBS対照及びNP投与と比較して20倍超増大した。siRNAにより誘導されるTNFαノックダウンを定量化するために、siTNFα処理マウスのBALにおけるTNFαレベルを、非活性対照siRNA（siCTRL）を担持させた同一の配合物について測定されたTNFαレベルに対して正規化した。
【００８２】
DPPC:eggPGコートは、SP-Bを添加した場合にLPS曝露マウスのBALにおいて相対TNFαレベルを低減することができた（図7）。
【００８３】
最小必要SP-B濃度及びKL4によるSP-Bの置換えの評価
SP-Bの最小必要濃度を評定するために、siNGに様々な濃度のSP-B（0.1 wt%〜0.4 wt%）を組み込んだDOPC:eggPG（85 wt%:15 wt%）脂質コートを成層した。ここで、明らかな濃度依存効果が観察された。既に0.1 wt%のSP-B濃度で、SP-Bを含まないコーティング配合物と比較して遺伝子サイレンシングの有意な増強が認められた。しかしながら、所与の実験条件下では、最適効果を達成するために0.2 wt%のSP-Bがタンパク脂質コート中に必要であった（図8a）。付加的に、SP-Bの最も重要な物理化学的特性を模倣することを意図する合成カチオン性両親媒性ペプチドであるKL4によるSP-Bの置換えを試みた。試験した濃度でKL4ペプチドが付加的な遺伝子サイレンシングを誘導せず、未変性SP-Bを用いて観察された効果を再現することができなかったことが図8bに示される本発明者らの実験から明らかである。
【００８４】
カチオン性リポソームによるsiRNA送達に対する低いSP-B濃度の影響
SP-Bがカチオン性リポソームによるsiRNA送達を同様に改善するかを評価するために、カチオン性DOTAP:DOPE（1:1 モル比）リポソーム中にSP-B（0.4 wt%）を封入した。リポソーム配合物へのSP-Bの封入は、H1299_eGFP細胞における細胞取込みに影響を及ぼさなかった（図9a）。0.5 nMのsiRNAと複合させたリポソームは既に顕著なeGFPノックダウンを誘導したが、siRNAの用量を1 nMまで倍増することで、サイレンシング効果が更に改善した。しかしながら、脂質でコーティングされたデキストランナノゲルを用いた本発明者らの観察結果とは対照的に、0.4 wt%のSP-Bをカチオン性リポソーム配合物に組み込むことで、同等のレベルの細胞内在化にも関わらず、付加的な遺伝子サイレンシングは生じなかった（図9b）。これらのデータから、SP-Bがカチオン性リポソーム配合物中に組み込んだ場合に細胞siRNA送達を促進することができないことが示唆される。
【符号の説明】
【００８５】
図面訳
図1
Uptake  取込み
Coated siNGs  コーティングsiNG
eGFP expression  eGFP発現
図2
Uptake  取込み
eGFP expression  eGFP発現
図3
Uptake  取込み
eGFP expression  eGFP発現
図4
Uptake  取込み
Coated siNGs  コーティングsiNG
eGFP expression  eGFP発現
図5
Uptake  取込み
siNGs coated  コーティングsiNG
wt% cholesterol  コレステロールのwt%
eGFP expression  eGFP発現
図6
Uptake  取込み
Coated siNGs  コーティングsiNG
eGFP expression  eGFP発現
図7
TNFα expression  TNFα発現
図8
eGFP expression  eGFP発現
図9
Liposomes  リポソーム
eGFP expression  eGFP発現
【００８６】
参考文献
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Rouser G., et al., Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots, Lipids, 1970, 5: 494-496.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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