(57)【要約】  本発明は、主要組織適合性複合体クラスＩ分子と結合して、対象において抗がん免疫応答を誘導することが可能なペプチド組成物に関する。特に、上記ペプチド組成物は、Ｆｏｕｒ−ｊｏｉｎｔｅｄ  Ｂｏｘ  １ペプチド及びメラノーマ抗原ファミリーＤ４ｂペプチドを少なくとも含む。本発明はさらに、対象において上記抗がん免疫応答を誘導するためのペプチド組成物及びペプチドワクチンの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｏｕｒ−ｊｏｉｎｔｅｄ  Ｂｏｘ  １（ＦＪＸ１）ペプチドと、メラノーマ抗原ファミリーＤ４ｂ（ＭＡＧＥＤ４ｂ）ペプチドと、を少なくとも含み、対象における抗がん免疫応答を誘導するための主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合することを特徴とするペプチド組成物。
【請求項２】
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）分子である、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項３】
前記ＦＪＸ１ペプチドが、配列番号１のペプチド配列を含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項４】
前記ＭＡＧＥＤ４ｂペプチドが、配列番号２の配列を含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項５】
前記ペプチド配列中の少なくとも１つのアミノ酸が欠失している、請求項３又は請求項４に記載のペプチド組成物。
【請求項６】
前記ペプチド配列中の少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、請求項３又は請求項４に記載のペプチド組成物。
【請求項７】
前記ペプチド配列中に少なくとも１つのアミノ酸が挿入されている、請求項３又は請求項４に記載のペプチド組成物。
【請求項８】
前記ペプチド組成物が、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合して、前記対象における前記抗がん応答を誘導するために、前記対象のサイトカイン分泌細胞を増加させる、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項９】
前記サイトカインが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及びグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）を含む、請求項８に記載のペプチド組成物。
【請求項１０】
前記抗がん免疫応答が、ＦＪＸ１及び／又はＭＡＧＥＤ４ｂががん細胞によって発現される場合に対象において誘導される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
【請求項１１】
前記がん細胞が、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、直腸がん細胞、肺がん細胞、及び前立腺がん細胞のうちいずれか１つであるか、又は２つ以上の組み合わせである、請求項１０に記載のペプチド組成物。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載のＦＪＸ１ペプチド及びＭＡＧＥＤ４ｂペプチドを少なくとも含むワクチン。
【請求項１３】
前記ワクチンが、がん治療法と組み合わせて使用され得る、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記抗がん免疫応答が、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、結腸がん、直腸がん、肺がん、及び前立腺がんのうちいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせに由来するがん細胞が前記対象において検出される場合に、誘導される、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
治療を必要とする対象における、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、大腸がん、直腸がん、肺がん、又は前立腺がんのいずれか１つ又はその組み合わせを治療するための薬剤の製造における有効量のＦｏｕｒ−ｊｏｉｎｔｅｄ  Ｂｏｘ  １（ＦＪＸ１）ペプチド及びメラノーマ抗原ファミリーＤ４ｂ（ＭＡＧＥＤ４ｂ）の使用であって、前記薬剤は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合して、前記対象において抗がん免疫応答を誘導することが可能である、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、必要とする患者において抗腫瘍応答を増強するためのペプチド組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）は、肺がん、乳がん、胃がん、結腸直腸がん及び肝臓がんに続いて６番目に多いがんである（Ｆｅｒｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。扁平上皮細胞は皮膚の外層及び粘膜に見られるため、ＨＮＳＣＣは口、鼻及び喉の粘膜に発生する。
【０００３】
現在、治療法の選択肢は、手術、放射線療法、及び化学療法に限定されている。比較的新しいタイプのがん治療オプションである標的療法には、がん細胞を標的とする薬物の使用が含まれる。現在、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）により唯一の承認されたＨＮＳＣＣの標的療法は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤として作用することによりがん細胞を標的とするセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）である。患者が化学療法とセツキシマブの併用治療を受けた場合、化学療法のみを受けた患者と比較して、全生存期間の中央値は２．６ヶ月改善した（Ｖｅｒｍｏｒｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００４】
これらの患者の生存期間がわずかしか改善されていないことを考慮すると、代替のがん治療が支持されてきた。免疫療法は、患者の免疫系に依存して免疫応答を刺激することでがんと闘う治療法であり、様々な様式で機能する種々の治療法が含まれる。一部の免疫療法による治療は、身体の免疫系の阻害を排除するために使用されるが、他の免疫療法による治療は、がん細胞を特異的に検出し攻撃するように免疫系を訓練するように働く。
【０００５】
ＨＮＳＣＣ患者における高い突然変異負荷と高レベルの腫瘍浸潤リンパ球の存在を示す新たな研究により、免疫療法は、ＨＮＳＣＣを治療するための妥当なアプローチであることが示されている。Ｎａｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２ではさらに、浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の高密度とヒトパピローマウイルス感染陽性（ＨＰＶ＋）及び陰性（ＨＰＶ−）両方の扁桃扁平上皮がん患者の臨床転帰との正の相関は、ＨＮＳＣＣの免疫原性を強調するものであると報告されている。
【０００６】
ＦＤＡ承認の免疫療法による治療の２つの例としては、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）とペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）があり、どちらも進行メラノーマ、非小細胞肺がん、及び腎細胞がんの治療に使用される抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）モノクローナル抗体である。これらの免疫チェックポイント阻害剤は、頭頸部がん患者の治療において有望な結果を示しており、ＨＮＳＣＣ患者群がニボルマブを投与された場合のＨＮＳＣＣ患者の全生存率は３６％であり、これに対して標準治療群の生存率は１６％であった。さらに、前者の群におけるこれらの患者は、後者の群の患者と比較して２．４ヶ月長く生存し、グレード３又はグレード４のイベントの報告はより少なかった（Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０００７】
再発又は転移性ＨＮＳＣＣの治療としてペンブロリズマブを投与された患者における客観的奏効率、つまり腫瘍サイズ縮小の完全奏効又は部分奏効は１６％であった。
【０００８】
これらの結果は朗報であるが、利用可能なチェックポイント阻害剤免疫療法の有望な有効性にもかかわらず、治療患者の大部分は治療にまだ応答していない。完全に理解されてはいないが、抗腫瘍免疫は腫瘍ステージに対する影響及び転移制御の点で重要であるため、対象における強力な既存の抗腫瘍免疫応答が存在しないと、薬物の効率を妨げる可能性があると考えられる。
【０００９】
したがって、対象における抗腫瘍免疫応答を増強可能であり、その結果、現在の免疫療法の有効性を高める代替免疫療法アプローチが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、患者における抗がん応答を誘発可能なペプチド組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、患者における腫瘍の増殖を遅らせることが可能なペプチド組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、患者における抗がん免疫応答を誘導するためのペプチドワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のこれら及び他の目的は、Ｆｏｕｒ−ｊｏｉｎｔｅｄ  Ｂｏｘ  １（ＦＪＸ１）ペプチドと、メラノーマ抗原ファミリーＤ４ｂ（ＭＡＧＥＤ４ｂ）ペプチドと、を少なくとも含むことを特徴とするペプチド組成物の使用により達成される。
【００１４】
より具体的には、本発明によれば、ペプチド組成物（ＰＶ１）は、ＦＪＸ１ペプチド（Ｆ１）とＭＡＧＥＤ４ｂペプチド（Ｍ６）とを含み、対象における抗がん免疫応答を誘導するための主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合する。
【００１５】
本発明の第２の態様は、ＰＶ１に係るペプチドワクチンに関し、ここで、上記ペプチドワクチンは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合することにより対象において抗がん免疫応答を誘導するためのＭ６ペプチド及びＦ１ペプチドを少なくとも含む。
【００１６】
本発明はさらに、治療を必要とする対象において、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、大腸がん、直腸がん、肺がん、前立腺がん、並びに、ＦＪＸ１及び／又はＭＡＧＥＤ４Ｂを発現している任意の他のがん種のうちいずれか１つであるか、又はその２つ以上の組み合わせを治療するための薬剤の製造における有効量のＦ１ペプチド及びＭ６ペプチドの使用であって、上記薬剤はＭＨＣクラスＩ分子と結合して、上記対象において抗がん免疫応答を誘導することが可能である、上記使用に関する。
【００１７】
Ｆ１ペプチド及びＭ６ペプチドはＭＨＣクラスＩ特異的であるため、上記ペプチド組成物は、一致するＨＬＡサブタイプを有する対象のみに提供されることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＨＮＳＣＣ試料におけるＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現に関する図である。図１（ａ）に、ＩＨＣ染色の強度スコアの代表的な画像を示す。図１（ｂ）に、ＦＪＸ１発現及びＭＡＧＥＤ４ｂ発現が見られる患者の割合を示す。
【図２】図２は、ＨＮＳＣＣ患者におけるペプチド特異的Ｔ細胞の集団を示す図である。非ペプチド負荷対照を差し引いた後の、ペプチド負荷二量体（ＣＤ８、ＴＣＲ、及びＩｇＧ１陽性Ｔリンパ球）を認識する抗原特異的Ｔ細胞の平均集団を示す。ＦＪＸ１ペプチド（Ｆ１）、ＭＡＧＥＤ４ｂペプチド（Ｍ６）、及びＰＶ１（Ｍ６及びＦ１）ペプチドを負荷した二量体タンパク質は、ＨＮＳＣＣ患者由来の固有のＴ細胞によって認識される。図２に見られるように、ＰＶ１ペプチドは、Ｆ１又はＭ６のいずれかの単一ペプチド単独と比較して、より大きなＴ細胞集団によって認識可能である。
【図３】図３は、ＰＶ１ペプチドによるインビトロ刺激後、ＨＮＳＣＣ患者により高レベルのサイトカインが分泌されることを示す図である。図３（ａ）はインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を示す図である。図３（ｂ）はエクスビボ細胞毒性（ＣＴＸ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）分泌を示す図である。
【図４】図４は、ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂを異なる発現レベルで発現する患者のＴ細胞応答を誘発するＰＶ１ペプチドの有効性を示す図である。図４（ａ）は、腫瘍組織のＦＪＸ１染色及びＭＡＧＥＤ４ｂ染色の異なる強度の代表的な画像を示す図である。図４（ｂ）は、細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＰＶ１刺激に応答したＩＦＮγ及びグランザイムＢの分泌を示図である。これらの分泌は患者の生検におけるＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４Ｂの発現レベルと相関している。図４（ｃ）は、腫瘍が少なくとも１つの標的抗原を高度に発現している患者のＰＢＭＣ／Ｔ細胞が刺激されやすく、ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の発現が無視できる腫瘍と比較して、ＰＶ１刺激に応答したＩＦＮγ及びグランザイムＢの分泌においてより高いレベルで分泌することを示す図である。
【図５】図５は、Ｇｒｉｅｓｓアッセイで測定したリポ多糖（ＬＰＳ）と比較して、Ｍ６ペプチド、Ｆ１ペプチド、及びＰＶ１ペプチドがマクロファージによる過剰な非特異的炎症反応を増加させなかったことを示す図である。
【図６】図６は、マウスで試験した場合のＰＶ１ペプチドの免疫原性を示す図である。図６（ａ）は、ＰＶ１をワクチン接種したマウスでは、非負荷及び非関連ペプチド負荷二量体に曝露した場合のベースラインのみ又は無視できる応答と比較して、ＰＶ１負荷二量体に対して反応できるＴ細胞の有意な増加を認めることを示す図である。図６（ｂ）は、ＰＶ１をワクチン接種したマウスがエクスビボＥＬＩＳＰＯＴでＰＶ１ペプチドを提示するＴ２細胞を認識し、用量依存的にＩＦＮγ分泌を誘導できることを示す図である。
【図７】図７（ａ）は、ワクチン接種期間中のワクチン接種マウスの体重を示す図である。図７（ｂ）は、ワクチン接種マウスの主要臓器（心臓、肺、腎臓、肝臓、及び脾臓）の画像を示す図である。
【図８】図８は、ビヒクル対照と比較した、ＰＶ１ペプチドをワクチン接種したマウスの腫瘍増殖を示す図である。
【図９】図９（ａ）及び図９（ｂ）は、それぞれＯＳＣＣ細胞株及びＮＰＣ細胞株のｍＲＮＡレベルでのＦＪＸ１タンパク質及びＭＡＧＥＤ４ｂタンパク質の過剰発現を示す図である。
【図１０】図１０は、タンパク質レベルでの様々ながん細胞株におけるＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現を示す図である。図１０（ａ）は、１６種のＯＲＬ細胞株（口腔がん細胞株）におけるＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現を示す図である。図１０（ｂ）は、不死化ＮＰ／ＮＰＣ細胞株（鼻咽頭細胞株又は鼻咽頭がん細胞株）でのＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現を示す図である。図１０（ｃ）は、ＭＡＧＥＤ４Ｂの発現が通常の口腔ケラチノサイトでは検出されないのに対し、ＦＪＸ１は低レベルで検出されることを示す図である。
【図１１】図１１（ａ）及び図１１（ｂ）は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ：ＴＡＴＡ−Ｂｏｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して正規化された、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に由来する一致した正常試料とＨＮＳＣＣ試料のセットにおけるトランスクリプトームレベルでのＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂの発現を示す図である。
【図１２】図１２は、肺がん細胞株（Ａ５４９）、前立腺がん細胞株（ＰＣ３）、結腸直腸がん細胞株（ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６）、及び乳がん細胞株（ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７）を含む複数のがん細胞株におけるタンパク質レベルでのＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明の実施形態をより詳細に説明することにより、好ましい実施形態の例及び本発明の範囲を当業者は十分に理解するであろう。しかしながら、本開示は、開示された通りの正確な形態に本発明を限定することを意図するものではなく、開示が十分かつ完全になることを意図して提供されるものであることを理解されたい。
【００２０】
免疫療法の一形態であるペプチドワクチンは、腫瘍形成抗原に基づいて設計されて、個体において同じ抗原を持つ腫瘍細胞に対する細胞傷害性免疫応答を刺激する働きをする。他の免疫療法に対するペプチドワクチン使用のいくつかの利点には、合成の容易さ、Ｔ細胞応答の誘導の有効性、及び多くの研究と試験で実証された安全性が含まれる（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ  ＣＬ，  Ｊｒ，２０１１）。
【００２１】
しかし、既存のペプチドワクチンは、Ｔ細胞応答の誘導の信頼性が高いにもかかわらず、臨床的腫瘍退縮の誘導には限られた成功しか収めておらず、単一抗原ペプチドワクチンの有効性を制限する抗原の不均一性と抗原損失に関する懸念があった。したがって、ＨＮＳＣＣでのペプチドワクチンの成功を改善するには、より広範な免疫応答、特に複数の抗原に応答できる免疫応答の適応が望まれている。
【００２２】
Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５では、標準治療のみを受けた患者と比較して、患者の生存期間が３．５か月から４．９か月と１．４か月延長したため、ＨＮＳＣＣにおける複数の多抗原性ワクチンの同時使用は実際に利点があることが示されていることが報告されている。さらに、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が生じるワクチン接種患者は、ＣＴＬ応答が陰性の患者と比較して、全生存期間が延長する。これもまた、ペプチドワクチン、特に多抗原性ペプチドワクチンが、腫瘍細胞に対する細胞傷害性殺傷効果を誘発することにより、腫瘍細胞に対する患者の免疫応答を高めることができることを強く示している。
【００２３】
しかしながら、多抗原性ペプチドワクチンの開発は、干渉があるため簡単な功績とはならない。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子は、獲得免疫系が外来分子を認識するために不可欠であり、適切なＴ細胞による認識のために細胞表面の病原体に由来する抗原に結合する働きをする。複数の多抗原性ペプチドワクチンを同時投与すると、低親和性ペプチドのＭＨＣ分子への結合が高親和性ペプチドによって競合的に阻害されるため、同じＭＨＣ分子に結合するワクチンのペプチドが互いに干渉する可能性がある。これまで、干渉が起こる可能性を減らすために、これらのワクチンを身体の異なる部位に投与することが提案されてきた。しかし、このアプローチは、特に患者に投与されるペプチドの数が増えると、非実用的である。
【００２４】
こうした事実にも関わらず、本願の発明者らは、口腔及び鼻咽頭がんの対象から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して動物モデルにおいてインビトロで抗腫瘍応答を誘導することで、以下「ＰＶ１」と称する二重抗原ペプチド組成物の免疫原性及び有効性を実証することに成功した。特に、ＰＶ１は、ＭＨＣクラスＩ分子と結合して、対象において抗がん免疫応答を誘導することが可能な少なくとも２つのペプチドを含む。これら少なくとも２つのペプチドは、Ｆｏｕｒ−ｊｏｉｎｔｅｄ  Ｂｏｘ  １（ＦＪＸ１）及びメラノーマ抗原ファミリーＤ４ｂ（ＭＡＧＥＤ４ｂ）に由来するペプチドを含む。
【００２５】
「ＦＪＸ１」又は「Ｆ１ペプチド」という用語は、その遺伝子、ＲＮＡ産物、又はタンパク質産物を意味し、互いに交換可能に使用できることが理解されよう。
【００２６】
「ＭＡＧＥＤ４ｂ」又は「Ｍ６ペプチド」という用語は、その遺伝子、ＲＮＡ産物、又はタンパク質産物を指し、互いに交換可能に使用できることがさらに理解されよう。
【００２７】
「ＰＶ１」、「ＰＶ１組成物」、及び「ＰＶ１ペプチド」という用語は、Ｍ６及びＦ１のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質産物の組み合わせを指し、互いに交換可能に使用できることも理解されよう。
【００２８】
この多抗原性ペプチド組成物の開発中に、口腔がん及び鼻咽頭がんの対象におけるＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現パターンが初めて特定された。ＨＮＳＣＣ腫瘍試料からなる組織マイクロアレイが得られ、ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂの発現レベルは、組織スライドを抗ＭＡＧＥＤ４ｂ抗体及び抗ＦＪＸ１抗体でプロービングすることにより、免疫組織化学（ＩＨＣ）法を使用して決定された。
【００２９】
ＨＮＳＣＣ腫瘍試料で測定されたＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂの発現レベルを以下に示す。
【００３０】
【表１】
2020515632.tif 000002
【００３１】
上記の表に見られるように、ほとんどすべての対象（９４．７％）の腫瘍組織試料において、口腔がん（ＯＳＣＣ）の対象から得られた場合でも、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）の対象から得られた場合でも、ＭＡＧＥＤ４ｂ又はＦＪＸ１の発現が示された。採取した９４個の組織のうち、５個のＮＰＣ組織のみがＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂのいずれの発現も示さなかった。ＯＳＣＣの対象の１００％がＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４ｂを発現した。
【００３２】
ＨＮＳＣＣ試料でのＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現を図１にさらに示す。これは、ＨＮＳＣＣ腫瘍組織試料でのＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現を示す。ＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１に対する抗体の免疫反応性を、陽性染色の腫瘍細胞の割合に基づいてスコア化した。強度０（陰性）、強度１（弱）、及び強度２〜３（強）の４点強度スコアリングシステムを図１（ａ）に示す。図１（ｂ）は、ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂが初期及び後期のＯＳＣＣ腫瘍試料及びＮＰＣ腫瘍試料の両方で８０％超発現していることが本発明者らによって明らかとなったことを反映している。
【００３３】
マレーシア特許番号第ＭＹ−１４８５４２−Ａ号及びマレーシア特許出願番号第ＰＩ  ２０１１００３２５９号（どちらも本願の発明者らによる出願）では、ＦＪＸ１が鼻咽頭がん患者で、ＭＡＧＥＤ４ｂが口腔がん患者でそれぞれ発現されることが示されたことについて考察している。
【００３４】
しかしながら、上述の通り、多抗原性ペプチド組成物における難しさは、これらのペプチドがＭＨＣ分子に結合するために互いに競合する可能性があり、これによりペプチド組成が無効となり得ることであると強調しておく。一方、本開示のＰＶ１組成物中のＦ１ペプチド及びＭ６ペプチドの組み合わせは正反対であり、実際にペプチド組成物の有効性を増加させることが成功裏に示されており、これについては以下に詳述する。
【００３５】
ＰＶ１は、以下の表２及び表３に記載のアミノ酸配列を有するＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂに由来するペプチドを含む。ペプチドの組み合わせの適合性を決定することとは別に、抗がん免疫応答を誘導するためにこれらのペプチドはＭＨＣクラスＩ分子と結合可能であったことも不可欠であった。
【００３６】
【表２】
2020515632.tif 000003
【００３７】
【表３】
2020515632.tif 000004
【００３８】
本出願によれば、ＦＪＸ１及びＭＡＧＤ４ｂのペプチド配列の構造は修飾又は改変されてもよく、修飾又は改変にはペプチド配列中のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入が含まれることが理解されるであろう。
【００３９】
ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂは両方ともヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）エピトープに基づいて設計されているため、ＨＬＡサブタイプが一致する血液試料の対象のみが本発明者らによって採用された。ＨＬＡ−Ａ２タイピングは、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を使用してＰＢＭＣ試料を染色することにより実施し、フローサイトメーターで分析した。
【００４０】
本研究の精度を維持するために、陽性対照、ＨＬＡ−Ａ２制限ＦｌｕＭ由来ペプチド、及び非関連ペプチド対照としてのＨＬＡ−Ａ２制限ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ペプチドを含めた。両方の対照のアミノ酸配列を以下に示す。
【００４１】
【表４】
2020515632.tif 000005
【００４２】
【表５】
2020515632.tif 000006
【００４３】
上記ペプチドの純度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定したところ、その全てが８０％超であった。
【００４４】
本発明によれば、上記ペプチドは、合成的に調整してもよく、自然発生した腫瘍又は病原性生物などの天然源から単離してもよい。
【００４５】
ＰＶ１の免疫原性の測定では、単離したＰＢＭＣ内の内因性ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を、Ｆ１ペプチド、Ｍ６ペプチド、及びＰＶ１ペプチドを使用して、ＦｌｕＭペプチド及びＨＩＶペプチドをそれぞれ陽性及び非関連ペプチド対照とし、二量体アッセイでまず試験した。ペプチド特異的二量体は、二量体ヒトＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質、β２−ミクログロブリン、及びペプチド（Ｆ１、Ｍ６、ＰＶ１、ＦｌｕＭ、又はＨＩＶ）の混合物を一晩インキュベートすることによりまず調製した。翌日、調製した二量体に新たに単離したＰＢＭＣを加えてインキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次に、ＰＢＭＣをＰＢＳに再懸濁し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＩｇＧ１、ＰＥ標識抗ＣＤ８、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＴＣＲα／β抗体で染色した。次に、ＰＢＭＣを洗浄してＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析にかけた。ここで、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体、ＣＤ８−ＰＥ抗体、及びＴＣＲα／β−ＡＰＣ抗体によって陽性染色して評価したＰＢＭＣによって、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定した。特定のペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、ペプチド無しの染色で得られた値を差し引いた後の、ペプチド二量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の値として計算した。
【００４６】
図２に見られるように、非ペプチド負荷対照を差し引いた後の、ペプチド負荷二量体を認識する抗原特異的Ｔ細胞の平均集団を示す。Ｆ１ペプチド、Ｍ６ペプチド、及びＰＶ１ペプチドを負荷した二量体タンパク質を、ＨＮＳＣＣの対象からの固有のＴ細胞によって認識することが可能であり、Ｔ細胞の７．１％がＰＶ１ペプチドを認識し、これは、単一ペプチドＭ６又はＦ１単独と比較して、最も大きなＴ細胞集団である。これは、両方のペプチドを組み合わせて使用すると、ＰＶ１の免疫原性がより強くなることを示す。
【００４７】
次に、エクスビボ細胞毒性酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを使用して、単一細胞レベルでＴ細胞を分泌するインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）サイトカイン及びグランザイムＢサイトカインの存在を評価し、それぞれ標的抗原を過剰発現している標的細胞株に対する、患者由来のペプチドパルスＣＴＬの応答を研究した。
【００４８】
エクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイ時に、ＰＢＭＣを培地中のインターロイキン７（ＩＬ−７）タンパク質及びインターロイキン１２（ＩＬ−１２）タンパク質と共にインキュベートした後、ＰＢＭＣを塩溶液で洗浄して完全培地に再懸濁した。次に、懸濁細胞をＦ１ペプチド、Ｍ６ペプチド、ＰＶ１ペプチド、ＦｌｕＭペプチド、及びＨＩＶペプチドとそれぞれ混合し、抗ヒトＩＦＮγ及びグランザイムＢでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートでインキュベートした。次に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、製造元の説明書を若干変更して実施した。具体的には、浮遊細胞をそれぞれのＥＬＩＳＰＯＴプレートに一晩載置して、放出されたサイトカインを捕捉した。ＩＦＮγ検出抗体及びグランザイムＢ検出抗体を、ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで希釈し、翌日それぞれのプレートでインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、希釈したストレプトアビジン標識二次抗体を添加し、さらにインキュベートした。次に、ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）と基質を加えて、サイトカイン分泌Ｔ細胞によって形成されたスポットを視覚化した。最後に、検出されたスポットを定量化及び分析した。ここでは、ペプチドに曝露されていないバックグラウンド対照ウェルで形成されたスポットを差し引くことで、ペプチド特異的ＣＴＬを計算し、ＦｌｕＭペプチド及びＨＩＶペプチドを、それぞれ陽性及び非関連ペプチド対照として使用した。
【００４９】
細胞毒性酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを使用して、それぞれ標的抗原を過剰発現している標的細胞株に対する、患者由来のペプチドパルスＣＴＬの応答を研究した。ＣＴＬを標的細胞と共培養し、この培養物をＩＬ−７タンパク質及びインターロイキン２（ＩＬ−２）タンパク質を添加した完全培地に再懸濁し、ＩＦＮγのＥＬＩＳＰＯＴプレート及びグランザイムＢのＥＬＩＳＰＯＴプレートに加えた。ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂを発現する標的細胞に対するＣＴＬの潜在的な殺傷能力を決定する前に、細胞懸濁液をさらにインキュベートしてＣＴＬと標的細胞株との相互作用を可能にした。
【００５０】
図３から、ＰＶ１ペプチドによるインビトロ刺激後、ＨＮＳＣＣ患者においてより高レベルのサイトカインが分泌されることが分かる。図３（ａ）及び図３（ｂ）のグラフは、エクスビボ細胞毒性（ＣＴＸ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＩＦＮγ及びグランザイムＢの分泌を示す。ペプチド刺激前は、Ｍ６、Ｆ１、及びＰＶ１に対する元々のＴ細胞応答は低い。Ｔ細胞がペプチドパルス樹状細胞によって刺激された後では、細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、ＰＶ１が標的細胞（１９５Ｍ及びＣ６６６．１Ｆ）に対して同等以上の細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し、より高いレベルでＩＦＮγ及びグランザイムＢを分泌することを示した。
【００５１】
ＭＡＧＥＤ４ｂ及び／又はＦＪＸ１を過剰発現した腫瘍を有する患者は、ＰＶ１の特異性を示すＭＡＧＥＤ４ｂ及び／又はＦＪＸ１を弱く発現している患者と比較して、ＰＶ１刺激後の応答が良好であることも見出された。
【００５２】
さらに詳しく説明すると、図４は、腫瘍組織のＦＪＸ１染色及びＭＡＧＥＤ４ｂ染色の強度に基づいた４群の対象を示す。図４（ａ）は、患者の腫瘍試料の染色におけるＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂの異なる発現レベルの代表的な画像を示す。腫瘍に高レベルのＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４ｂを発現する患者は、これらのタンパク質の発現が低い患者と比較して、ＰＶ１で刺激すると反応が良好になり、細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてより高いレベルのグランザイムＢ及びＩＦＮγを分泌することが、図４（ｂ）から理解できる。さらに、図４（ｃ）では、両方の抗原を高レベルで発現している患者は、ＰＶ１で刺激された後、標的細胞に対してより良好な反応を示すが、両方の抗原を低レベルで発現する患者は刺激に反応しないことから、ＰＶ１ペプチドワクチンの特異性が示唆されていることが理解できる。
【００５３】
上記ペプチドが細胞毒性又は非特異的炎症応答を引き起こすかどうかを評価するために、マクロファージによる炎症応答を測定するためのＧｒｉｅｓｓアッセイをまず用いて、Ｍ６ペプチド及びＦ１ペプチドによって誘発される炎症のレベルを評価した。マウスのマクロファージを、様々な濃度のＭ６ペプチド、Ｆ１ペプチド、及びＰＶ１ペプチドで処理した。ＰＢＳ中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を陰性対照として使用し、ＬＰＳを陽性対照として使用した。炎症の程度は、マウスマクロファージによって産生される誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のレベルに基づいて間接的に測定した。
【００５４】
図５（ａ）は、Ｍ６ペプチド又はＦ１ペプチドによって誘発されるマウスマクロファージの炎症の程度を示す。Ｍ６ペプチドの存在下でのマウスマクロファージによる亜硝酸塩の産生は、投与されたＭ６ペプチドの濃度に関係なく、ＬＰＳ刺激を受けたマウスマクロファージよりも７倍低かったことが分かる。同様に、これは、亜硝酸塩の放出量が陽性対照（ＬＰＳ）の量より１０倍少ないＦ１ペプチドの存在下におけるマウスマクロファージでも観察することができる。したがって、Ｍ６ペプチド及びＦ１ペプチドによる亜硝酸塩の低産生を考慮すると、ｉＮＯＳ発現のアップレギュレーションは上記ペプチドによって刺激されないことが示唆され、そしてＭ６ペプチド及びＦ１ペプチドによって誘発される炎症の程度が低かったことは、非抗原特異的応答を誘発することにより、望ましくない効果を引き起こすと予想されないことを示す。
【００５５】
図５（ｂ）に見られるように、Ｍ６ペプチド及びＦ１ペプチドをＰＶ１ペプチドとして組み合わせた場合、一貫性のある結果が示され、ｉＮＯＳ蓄積量はＬＰＳ処理群よりも有意に低かった。
【００５６】
次に、動物モデルでのＰＶ１組成物の評価を決定するために、さらなる評価を行った。
【００５７】
患者ＰＢＭＣを使用した二量体及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られた結果を活用して、ＰＶ１の免疫原性及び有効性を、ＨＬＡ−Ａ２提示抗原に対するヒトＴ細胞免疫応答のモデリングを可能にするトランスジェニックマウスモデルを使用して評価した。
【００５８】
以下の表に示すように、マウスにワクチン接種して異なる６つの治療群に分けた。
【００５９】
【表６】
2020515632.tif 000007
【００６０】
ここで、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＰＶ１はＭ６ペプチド及びＦ１ペプチドを含む組成物、ＩＦＡは不完全フロイントアジュバントである。
【００６１】
ワクチン接種期間後、マウスを安楽死させ、マウス脾臓から免疫細胞を採取した。ワクチン接種したマウスのＩＦＮγ分泌ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を、二量体アッセイを使用して決定し、ビヒクル対照群の結果と比較した。
【００６２】
次に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ワクチン接種後にペプチドを提示するがん細胞を殺傷するために細胞毒性機能を実行できるＴ細胞の集団を評価した。
【００６３】
図６（ａ）に見られるように、ＰＶ１を５００μｇという低濃度でワクチン接種したマウスでは、ビヒクル対照マウスと比較して、ＰＶ１負荷二量体に対する高い認識を実証することができた。ワクチン接種したマウスは、非負荷及び非関連ペプチド（ＨＩＶ）負荷二量体に曝露された場合にベースライン又は無視可能な応答を示したため、この応答はペプチド特異的である。
【００６４】
さらに、ワクチン接種マウスからの元々のＴ細胞は、ＰＶ１ペプチドを提示するＴ２細胞も認識することもでき、図６（ｂ）に示すように、エクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイで用量依存的にこれらのＴ２細胞に対して殺傷活性を発揮することができた。これもまた、ＰＶ１ワクチン接種が、これらのマウスにおいてＰＶ１認識Ｔ細胞を増加させ得るという示唆を示し、支持するものである。
【００６５】
有利なことに、ワクチン接種期間を通して、マウスの体重は週に１回測定されたことに留意されたい。この期間中に体重減少や有害事象は観察されなかった。さらに、心臓、肺、腎臓、肝臓、又は脾臓などの主要臓器は、ＰＶ１投与群すべてのマウスから採取されたが、これらのマウスでは局所毒性は観察されなかった。これについては、図７（ａ）及び図７（ｂ）でさらに説明する。
【００６６】
ＰＶ１の濃度が５００μｇである場合に免疫原性試験においてＰＶ１に対するＴ細胞認識を刺激することができたため、腫瘍増殖の遅延におけるＰＶ１の有効性を決定するために、その後の評価では１０００μｇで試験することを選択した。ヒトＨＬＡ−Ａ２（ＡＡＤ）遺伝子及びＭＡＧＥＤ４ｂ遺伝子を発現する同系Ｂ１６メラノーマ細胞を合計１  ｘ  １０６個、マウスの皮下に移植した。腫瘍サイズが３０〜５０ｍｍ３に達した後、マウスを２つの治療群にランダムに割り当てた。最初の群には、ＰＶ１ペプチドを１０００μｇ含むフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与した。一方、ビヒクル対照群には、５％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳを投与した。週に２回腫瘍サイズを測定した。
【００６７】
図８に示されるように、ＰＶ１及びアジュバントで治療したマウスは、ビヒクル対照群と比較して腫瘍増殖の遅延を示したことが分かる。したがって、これは、ＰＶ１が腫瘍増殖を遅らせることが可能であることを示している。
【００６８】
上記の結果に基づいて、ＰＶ１は、腫瘍増殖を遅らせるのに効率的であり、ワクチン接種したマウスの主要臓器への悪影響があったとしてもごくわずかであることが強く示される。
【００６９】
ＰＶ１ペプチドワクチンは、インビトロ及びインビボの両方で免疫原性があることが実証されている。最も重要なことは、ＰＶ１の使用が、インビトロでＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１を発現する標的がん細胞株に対して抗原特異的な細胞毒性を示し、インビボで腫瘍増殖を遅らせたことであり、ＨＮＳＣＣの治療用ワクチン候補としてのＰＶ１の可能性を示唆している。有益なことに、ＰＶ１はＨＮＳＣＣ患者だけでなく、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんを患う患者にも恩恵をもたらす可能性がある。以下の表７において、本願発明者らは、ＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１が、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんの患者の腫瘍組織でも発現していることを示す。
【００７０】
【表７】
2020515632.tif 000008
【００７１】
【表８】
2020515632.tif 000009
【００７２】
【表９】
2020515632.tif 000010
【００７３】
【表１０】
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【００７４】
【表１１】
2020515632.tif 000012
【００７５】
上記の表７から、ＦＪＸ１及び／又はＭＡＧＥＤ４ｂが９０％を超えるＯＳＣＣ試料及びＮＰＣ試料で発現していることが分かる。これらの２つの抗原は、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんの患者の組織でも発現した。これらのがん種にかかっている対象の約９７％は、ＭＡＧＥＤ４ｂ又はＦＪＸ１のいずれかを発現することが測定された［表７（ｄ）］。ＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１の発現は、これら５つのがん種の初期及び後期の両方の腫瘍で検出された（表７）。両方のタンパク質がこれらのがん種のほぼ半分で高度に過剰発現されていることを考えると、これは、ＨＮＳＣＣ対象だけでなく、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんにかかっている対象を治療するために、ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂを含むペプチド組成物を開発可能であることを強く示している。
【００７６】
本願によれば、上記ペプチド組成物はさらに、多抗原性ペプチドワクチンとして開発可能である。特に、少なくともＦＪＸ１ペプチド及びＭＡＧＥＤ４ｂペプチドを含むワクチンは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合することにより、対象の抗がん免疫応答を誘導する目的に開発可能である。好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である。
【００７７】
上記ペプチドワクチンは、利用可能ながん治療法と組み合わせて使用してもよい。免疫チェックポイント阻害剤を例にとると、単独で使用した場合、患者の免疫系を再活性化するには免疫チェックポイント阻害剤だけでは不十分な場合がある。しかし、ＰＶ１と組み合わせて使用すると、抗原特異的Ｔ細胞のレパートリーを増加させるアプローチにより、ＨＮＳＣＣ患者の反応率をさらに高めることが可能であると考えられる。
【００７８】
しかしながら、がん治療法は免疫チェックポイント阻害剤のみに限定されず、他のがん治療法を含み得ることが理解されるであろう。
【００７９】
加えて、ＰＶ１及びＰＶ１に対する免疫応答を高めるために選択されるがん治療法と組み合わせて、アジュバントを投与してもよい。フロイントアジュバントやヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのアジュバントの例が有用となり得る。
【００８０】
あるいは、上記ペプチド組成物は薬剤の製造にも使用可能である。特に、有効量のＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂは、それを必要とする対象のＨＮＳＣＣ、乳がん、結腸がん、直腸がん、肺がん、及び前立腺がんのうちいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを治療するための薬剤の製造に使用することが可能であり、ここで、上記薬剤は、ＭＨＣクラスＩ分子と結合して、上記対象に抗がん免疫応答を誘導することが可能である。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに開示するために含まれる。しかしながら、以下の実施例で使用される技術は、本発明の実施において良好に機能するために本願発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができる。当業者は、開示された特定の実施形態の変更を適応することが可能であり、本発明の範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を得ることが可能である。
【実施例】
【００８２】
実施例１
材料及び方法
患者試料
この研究には、マレーシアの４つの紹介病院（Ｐｅｎａｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ペナン；Ｔｅｎｇｋｕ  Ａｍｐｕａｎ  Ｒａｈｉｍａｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、セランゴール；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｌａｙａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クアラルンプール；及びＴｕｎｇ  Ｓｈｉｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クアラルンプール）から、新たに診断されたＨＮＳＣＣ患者が登録された。本プロジェクトは、マラヤ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｌａｙａ）歯学部の治験審査委員会［参考文献：ＤＦ  ＯＳ０９１０／００４９（Ｌ）］、及びマレーシア保健省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｍａｌａｙｓｉａ）の医学研究及び倫理委員会によって承認された（ＮＭＲＲ−０９−９４４−４８４８）。
【００８３】
本研究の目的を全患者に説明し、血液試料の採取前に書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００８４】
各患者のＨＬＡ分子タイプを決定するために血液試料を処理した。これについては、以下で詳細に説明する。全患者の人口統計情報を以下の表８に示す。
【００８５】
【表１２】
2020515632.tif 000013
【００８６】
細胞株
口腔がん細胞株（ＯＲＬ−４８、ＯＲＬ−１１５、ＯＲＬ−１３６、ＯＲＬ−１５０、ＯＲＬ−１５３、ＯＲＬ−１５６、ＯＲＬ−１６６、ＯＲＬ−１７４、ＯＲＬ−１８８、ＯＲＬ−１９５、ＯＲＬ−１９６、ＯＲＬ−２０４、ＯＲＬ−２０７、ＯＲＬ−２１４、ＯＲＬ−２１５、及びＯＲＬ−２４７）、鼻咽頭がん細胞株（ＮＰ６９、ＮＰ６４０、ＨＫ１、ＴＷ０１、Ｃ６６６．１、ＨｅＬａ／Ｓ、及びＨｅＬａ／Ｔ）、乳がん細胞株（ＭＣＦ−７及びＳＫＢＲ−３）、結腸がん細胞株（ＨＴ−２９及びＨＣＴ−１１６）、前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）、肺がん細胞株（Ａ５４９）、４つの正常口腔ケラチノサイト初代培養株（ＯＲＬ−２３１、ＯＲＬ−２９５、ＯＲＬ−２３５、及びＯＲＬ−２３２）、並びに２つの不死化鼻咽頭（ＮＰ）細胞株であるＮＰ６９及びＮＰ４６０が本願発明者らによって使用された。ＨｅＬａ／Ｓ及びＨｅＬａ／Ｔは、以前ＮＰＣ細胞株と間違えられたＨｅＬａ細胞のバリアントであった（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）。これらの細胞株を購入し（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州）及び１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）を添加した推奨培地（口腔がん細胞株にはＤＭＥＭ／Ｆ１２、鼻咽頭がん細胞株、乳がん細胞株、結腸がん細胞株、及び肺がん細胞株にはＲＰＭＩ−１６４０）で培養した。一方、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）を、正常な口腔ケラチノサイト及び非悪性鼻咽頭細胞株の培養に使用した。標的抗原であるＯＲＬ１９５−ＭＡＧＥＤ４Ｂ（１９５Ｍと称する）及びＨｅＬａ／Ｔ−ＦＪＸ１（ＨｅＬａ／Ｔ−Ｆと称する）を過剰発現する細胞株を、ウエスタンブロット実験の陽性対照として使用した。ＦＪＸ１を過剰発現するＣ６６６．１−Ａ２細胞株（Ｃ６６６．１Ｆと称する）（イタリアがん研究センター（Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｉ  Ｒｉｆｅｒｉｍｅｎｔｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃｏ）のＲｉｃａｒｄｏ  Ｄｏｌｃｅｔｔｉ博士より提供）及びＭＡＧＥＤ４Ｂを過剰発現するＯＲＬ−１９５（１９５Ｍと称する）を、以下でさらに説明する細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの標的細胞株として使用した。本研究で使用される全ての細胞株は、本研究での使用に先立ち認証されている。
【００８７】
ペプチド
本実施例で使用されるペプチドは、ＦＪＸ１（Ｆ１）及びＭＡＧＥＤ４ｂ（Ｍ６）に由来する２つのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドで構成されている。ＨＬＡ−Ａ２制限ＦｌｕＭ由来ペプチドを陽性対照として使用し、ＨＩＶペプチドを非関連ペプチド対照として使用した。上記ペプチドの配列は、表２〜表５に示すとおりである。本研究に使用された全てのペプチドは、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ドイツ、ベルリン）によって商業的に生産された。上記ペプチドの純度はＨＰＬＣを使用して決定及び保証され、ペプチドの純度結果は８０％を超えていた。
【００８８】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、ＯＳＣＣ細胞株及びＮＰＣ細胞株における２つの標的抗原であるＭ６抗原及びＦ１抗原のｍＲＮＡレベルを決定した。ＲＮＡ精製キット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、デューレン、ドイツ）を使用して、１６個のＯＳＣＣ細胞株及び７個ＮＰＣ細胞株の全てから全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）を使用したｃＤＮＡ合成に用いた。配列検出システム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７５００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ）を使用して、標準のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎプロトコルで定量的ＰＣＲを実行した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を増幅し、内部対照として使用した。
【００８９】
使用したプライマーを以下に示す：
ＦＪＸ１：
センス  ５’ＣＣＣＧＣＡＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴ３’及び
アンチセンス  ５’ＧＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＣＴ３’；
ＭＡＧＥＤ４ｂ：
センス  ５’ＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡ３’及び
アンチセンス  ５’ＣＣＡＡＡＡＴＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡ３’；
ＧＡＰＤＨ：
センス  ５’ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ３’及び
アンチセンス  ５’ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ３’。
【００９０】
正常な口腔組織及び鼻咽頭組織の発現レベルと比較した場合、相対発現の最小で２倍の増加を過剰発現しているとみなした。
【００９１】
ウエスタンブロット
１Ｘ  ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国イリノイ州）を添加したＲＩＰＡ溶解バッファー（５％ＮａＤＯＣ、１％ＳＤＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ＭのＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＤＴＴ）で細胞を氷上で溶解した。４℃で２０分間、１００００ｇで遠心分離した後、細胞溶解物を収集した。総タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国マサチューセッツ州）を使用して決定した。５０μｇの総タンパク質を１２％及び１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（それぞれＦＪＸ１タンパク質及びＭＡＧＥＤ４ｂタンパク質の検出用）にかけ、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国マサチューセッツ州）に転写した。ブロットを５％スキムミルク（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ））で１時間ブロックし、以下の一次抗体とさらにインキュベートした：抗ＭＡＧＥＤ４Ｂ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州）及び抗−ＦＪＸ１（１：２０００、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ社、米国カリフォルニア州）。ブロットを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含むＴＢＳバッファーで洗浄（各５分間、３回）し、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：１００００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国アラバマ州）と結合したそれぞれの二次抗体で１時間プローブした。洗浄（ＴＢＳ−Ｔ）後、イメージングシステム（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ＨＤ２  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社、米国カリフォルニア州）を使用して、高感度化学発光法により検出を行った。ブロットは、各実験のハウスキーピングコントロールとして、抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１０００、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社、米国メリーランド州）又は抗アクチン抗体（１：１０００、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、米国カリフォルニア州）でプローブした。
【００９２】
免疫組織化学
本研究に含まれる、ＮＰＣ（ｎ＝７４）、ＯＳＣＣ（ｎ＝４９）、及び１７９例の複数種のがん（乳がん：ｎ＝４１、結腸：ｎ＝３０、肺：ｎ＝４８、前立腺：ｎ＝４４、直腸：ｎ＝１６）から構成される組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）スライドを、Ｂｉｏｍａｘ社（米国メリーランド州）から購入した。標的タンパク質の発現レベルは、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋  Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  ＳｙｓｔｅｍＨＲＰ  （ＤＡＢ＋）キット（Ｄａｋｏ社、グロストルップ、デンマーク）を使用した検出システムに従って、抗ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗体（１：１００、カタログ番号ＨＰＡ００３５５４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州）及び抗ＦＪＸ１抗体（１：２００、カタログ番号ＨＰＡ０５９２２０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州）を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）により検出した。ＩＨＣ分析は、ＰＶ１の有効性評価のために登録された患者由来のアーカイブされたＦＦＰＥ  ＯＳＣＣ組織切片及びＮＰＣ組織切片でも実施した。上記２つの抗体の免疫反応性は、陽性染色の腫瘍細胞の割合及び４点強度スコアリングシステムに基づいてスコア化した：０＝陰性発現、１＝弱陽性、２＝中程度の陽性、３＝強い陽性（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。全てのＩＨＣ分析は、認定病理学者によって評価された。コアが欠落したか不完全な、又は評価するには腫瘍が少なすぎる組織マイクロアレイは、分析から除外した。
【００９３】
末梢血単核細胞の調製（ＰＢＭＣ）
ＯＳＣＣ患者又はＮＰＣ患者からの血液３５ｍＬをＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（バキュテナー）チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国）に採取し、製造元の説明書に従ってＰＢＭＣを分離した。次に、ＰＢＭＣをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）で洗浄し、５％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔ社、米国カリフォルニア州）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ：Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）を含む完全培地に再懸濁した。次いで、単離されたＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ二量体アッセイ、並びにエクスビボ細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの使用によるＨＬＡタイピングに使用したが、これについては以下で詳細に説明する。
【００９４】
血液検体のＨＬＡタイピング
ＦＪＸ１ペプチド及びＭＡＧＥＤ４ｂペプチドの両方がＨＬＡ−Ａ２特異的であることを考慮して、本発明者らは、一致するＨＬＡサブタイプを有する血液試料のみを利用した。ＨＬＡ−Ａ２ステータスは、フィコエリトリン（ＰＥ）標識マウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ２抗体（クローンＢＢ７．２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）を使用してＰＢＭＣ試料を染色することにより決定した。ＰＥ標識マウス抗ヒトＨＬＡ  ＩｇＧ２ｂ  ｋアイソタイプ（クローンＢＢ７．２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）及びマウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ（クローンＤＸ１７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）で染色したＰＢＭＣをそれぞれ陰性対照と陽性対照として使用した。染色用に、細胞を適切な抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、洗浄し、血球計算器（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ２  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州）で分析した。
【００９５】
二量体アッセイ
ＨＬＡ−Ａ２陽性ＮＰＡ患者及びＯＳＣＣ患者のＰＢＭＣにおける内因性ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４ｂ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を、ＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ二量体アッセイを使用して評価した。１μｇの可溶性組換え二量体であるヒトＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ組換えタンパク質（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）、０．２５μｇのβ２−ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州）、及び５μｇのペプチド（Ｆ１、Ｍ６、又はＰＶ１）を合わせてペプチド特異的二量体を調整し、３７℃で一晩インキュベートした。完全培地（ＣＭ）及びβ２−ミクログロブリンを負荷した二量体をバックグラウンド対照として使用し、ＨＩＶペプチド及びβ２−ミクログロブリンを負荷した二量体を非関連ペプチド対照として使用し、β２−ミクログロブリンを有するＦｌｕＭ負荷二量体を陽性対照として使用した。翌日、新たに単離したＰＢＭＣを、別々の丸底ポリプロピレンチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社、米国カリフォルニア州）の各ペプチド負荷二量体に加え、４℃で３０分間インキュベートし、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。その後、細胞を１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＩｇＧ１（クローンＡ８５−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州）、ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ８（クローンＨＩＴ８ａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州）、及びＡＰＣ結合マウス抗ヒトＴＣＲα／β（クローンＢＷ２４２／４１２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ドイツ）を用いて４℃で１時間染色した。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、血球計算器（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ２  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州）を使用してフローサイトメトリー分析にかけた。ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、ＩｇＧ１、ＣＤ８、及びＡＰＣに対して陽性であると評価された細胞によって決定した。特定のペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、ペプチド無しの染色で得られた値を差し引いた後の、ペプチド二量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の値として計算した。
【００９６】
エクスビボＥＬＩＳＰＯＴ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、単一細胞レベルでＴ細胞を分泌するサイトカイン（ＩＦＮγ及びグランザイムＢ）の存在を評価した。前述のように、エクスビボＥＬＩＳＰＯＴを使用して、上記ペプチドを認識する患者ＰＢＭＣからの固有Ｔ細胞を決定した（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。まず、ＰＢＭＣを５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２を含む培地で３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、細胞を４ｍＬのＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）で洗浄し、２００μＬの完全培地に再懸濁した。次いで、懸濁した細胞を５０μｇ／ｍＬのＦ１ペプチド、Ｍ６ペプチド、ＰＶ１ペプチド、ＦｌｕＭペプチド、及びＨＩＶペプチドと混合した。各混合物１００μＬを、抗ヒトＩＦＮγ／グランザイムＢでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートで一晩インキュベートした（Ｍａｂｔｅｃｈ社、スウェーデン）。一晩インキュベートした後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、若干修正した製造元の説明書に従って実施した。ＩＦＮγ検出抗体又はグランザイムＢ検出抗体をそれぞれのプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。これに続いて、洗浄及びストレプトアビジン標識二次抗体の添加を行い、プレートを３７℃で４５分間さらにインキュベートした。両方の抗体を、０．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、米国カリフォルニア州）を含むＰＢＳで１：５００に希釈した。基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ−ｐｌｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を加えて、サイトカイン分泌Ｔ細胞によって形成されたスポットを可視化した。検出されたスポットは、アナライザー（ＣＴＬ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社、米国オハイオ州）を使用して定量し、ソフトウェア（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社、米国オハイオ州）を使用して分析した。ペプチドに曝露されていないバックグラウンド対照ウェルで形成されたスポットを差し引くことで、ペプチド特異的ＣＴＬを計算し、ＦｌｕＭペプチド及びＨＩＶペプチドを、それぞれ陽性及び非関連ペプチド対照として使用した。
【００９７】
樹状細胞（ＤＣ）及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の分離と培養
患者由来の樹状細胞を分離し、抗原提示細胞として使用した。簡潔には、ＰＢＭＣをマクロファージ無血清培地（Ｍ−ＳＦＭ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国マサチューセッツ州）に再懸濁し、６ウェルプレートに播種し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣから非接着細胞を回収し、ＨＢＳＳでリンスし、ＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍＬ含む完全培地に再懸濁した。ウェルあたり約２〜５ｘ１０５個の細胞を、丸底９６ウェルプレートに播種した。その後、Ｔ細胞増殖のために、５０μｇ／ｍＬのペプチドを添加して３７℃で２〜５日間細胞をインキュベートした。インキュベーションから生じた接着細胞を、樹状細胞（ＤＣ）の分化を誘導するために、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４の存在下で、Ｍ−ＳＦＭで２〜５日間３７℃で培養した。細胞を培地を用いて除去することにより、分化したＤＣを培養皿から回収し、１．５ｍＬ遠心管に分注し、５０μｇ／ｍＬのペプチド（Ｆ１、Ｍ６、及びＰＶ１）と共に３７℃で２時間インキュベートした後、非接着ＰＢＭＣ由来の成熟Ｔ細胞に付与した。１８〜２４時間の共培養後、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２をＤＣ／Ｔ細胞培養に添加し、さらに２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＩＬ−２を含む培地を新鮮な完全培地に交換し、さらに３７℃で３〜５日間インキュベートして、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化した。その後、ＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４ｂ発現標的細胞に対する潜在的な殺傷能力を決定するために、ＣＴＬを増殖後細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで標的細胞（１９５Ｍ及びＣ６６６．１Ｆ）と共にインキュベートした。
【００９８】
細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、それぞれ標的抗原を過剰発現している標的細胞株に対する、患者由来のペプチドパルスＣＴＬの応答を研究した。ＣＴＬを、エフェクター対標的比２０：１で１９５Ｍ及びＣ６６６．１Ｆと共培養した。この培養物を２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７及びＩＬ−２を添加した２００μＬの完全培地に再懸濁し、次に、ＩＦＮγ又はグランザイムＢのＥＬＩＳＰＯＴプレートの各ウェルに１００μＬを付与した。次に、細胞懸濁液を３７℃で１６時間さらにインキュベートした。その後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを上記と同様に実施した。
【００９９】
結果
患者の人口統計
本研究で使用するために、４１人のＨＮＳＣＣ（ＮＰＣ及びＯＳＣＣ）患者から末梢血を採取した。これらのうち、約５０％（２０／４１人）がＨＬＡ−Ａ２陽性であり、その後の分析に使用した。これらの患者の中で、１６／２０人はＮＰＣ患者であり、４／２０人はＯＳＣＣ患者であった。これらのＨＬＡ−Ａ２陽性患者の８０％（１６／２０人）が進行性の病期（ステージＩＩＩ及びステージＩＶ）にあった。これらの患者の人口統計を表８に示す。２０人のＨＬＡ−Ａ２患者のうち、１５人の患者からの試料を二量体アッセイにかけ、１６人の患者からの試料を、エクスビボ細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにかけた。残りの試料は、ＰＢＭＣが不十分であったか、試料の品質が最適ではなかった（血液溶解）ため、実験から除外した。
【０１００】
ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１は、ＨＮＳＣＣで過剰発現する腫瘍抗原である
本発明者らは、ＭＡＧＥＤ４ｂ及びＦＪＸ１がそれぞれＯＳＣＣ及びＮＰＣで過剰発現しているのに対し、それぞれの正常な対応物では発現が無視できる程度であることを既に示した（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ａｈｍａｄ  Ｚａｂｉｄｉ  ＭＭ  ２０１１、Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。本研究では、ＨＮＳＣＣ試料の拡張セットでこれら２つの抗原の過剰発現をスクリーニングした。得られたデータは、ＦＪＸ１がＮＰＣとＯＳＣＣの両方の細胞株で過剰発現していることを示した。図９（ａ）に見られるように、それぞれ正常な口腔ケラチノサイト及び正常な鼻咽頭組織と比較した場合、ｍＲＮＡレベルで２倍以上の増加が５／１６株のＯＳＣＣ（ＯＲＬ−１５０、ＯＲＬ−１５３、ＯＲＬ−１５６、ＯＲＬ−１７４、及びＯＲＬ−４８）、６／７株のＮＰＣ（ＨＫ１、ＴＷ０１、ＴＷ０４、及びＣ６６６．１）、及び不死化ＮＰ（ＮＰ６９及びＮＰ４６０）で検出された。特に、全てのＯＳＣＣ（ＯＲＬ−１３６を除く）細胞株及びＮＰ／ＮＰＣ細胞株は、正常な口腔ケラチノサイト［図１０（ｃ）］と比較して、タンパク質レベルで顕著なレベルのＦＪＸ１を発現することが観察された［図１０（ａ）］。同様に、ＭＡＧＥＤ４Ｂの場合、ｍＲＮＡレベルはＯＳＣＣ細胞株ＯＲＬ−１５３、不死化ＮＰ６９、及びＮＰＣ細胞株Ｃ６６６．１で２倍を超えることが判明した［図９（ｂ）］。注目すべきことに、全てのＯＳＣＣ細胞株（ＯＲＬ−１９５及びＯＲＬ−４８を除く）及び全てのＮＰＣ細胞株は、陽性対照と比較してタンパク質レベルでＭＡＧＥＤ４Ｂのわずかな発現を示した［ＭＡＧＥＤ４Ｂを異所的に過剰発現する細胞、図１０（ａ）及び図１０（ｂ）］。正常な口腔ケラチノサイトの初代培養では、ＭＡＧＥＤ４Ｂの発現は検出されなかった［図１０（ｃ）］。また、本発明者らは、ＴＣＧＡデータベース（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｎ．２０１５）の正常データと一致する４３の頭頸部がんのＲＮＡｓｅｑデータを調査し、腫瘍コホートの６０％超でＦＪＸ１の有意な上昇レベルが認められ［図１１（ａ）、ｐ＜０．０１］、一致した正常データと比較した場合、コホートの約４０％でＭＡＧＥＤ４Ｂのレベルが上昇していた［図１１（ｂ）、ｐ＜０．０１］。
【０１０１】
本発明者らは次に、ＯＳＣＣコア及びＮＰＣコア（総称してＨＮＳＣＣとして知られる）からなる市販のＴＭＡにおけるＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１発現レベルに関するこれらの観察結果を検証した。代表的な染色を図１（ａ）に示す。概して、ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の両方の発現はタンパク質レベルで検出され、染色強度スコアは０、１、２、３の範囲であった。ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の発現は、ＯＳＣＣ試料の大部分で検出された（それぞれ４９／４９及び４７／４９）。一方、ＮＰＣの場合、両方のタンパク質（ＭＡＧＥＤ４Ｂ：５８／６３及びＦＪＸ１：６４／７４）の強い存在が検出された［表７（ａ）］。両方のＴＭＡをまとめて分析した結果、本発明者らは、これらのＨＮＳＣＣ試料の９４．７％（８９／９４）がＭＡＧＥＤ４Ｂ又はＦＪＸ１のいずれかを過剰発現し、５．３％（５／９４）の症例のみが両方の抗原に対して陰性であることを実証した［表７（ｂ）］。ただし、ＦＪＸ１の染色強度と組織の病期又は分化の程度との間に有意な相関は見られなかった。一方、ＭＡＧＥＤ４Ｂの発現レベルは、ＯＳＣＣ試料（ｐ＝０．０１６）及びＮＰＣ試料（ｐ＝０．００７）の分化度と有意な相関が認められるが、以下の表に示すように、病期とは相関していなかった。
【０１０２】
【表１３】
2020515632.tif 000014
【０１０３】
ＰＶ１を認識する内因性Ｔ細胞がＨＮＳＣＣ患者には存在する
ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１の両方がＨＮＳＣＣ患者に存在することが示されたため、ＭＡＧＥＤ４Ｂ及び／又はＦＪＸ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞も存在すると推定される。本発明者らは、ＰＶ１ペプチド（ＭＡＧＥＤ４Ｂペプチド及びＦＪＸ１ペプチド）を認識可能なＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＴＣＲ＋、ＩｇＧ１＋）の割合を二量体アッセイを使用して決定した。本発明者らが、分析した全てＨＮＳＣＣ試料（１５／１５）におけるＰＶ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を実証したところ、平均は非ペプチド負荷二量体対照で正規化した後に２．６％〜７．１％の範囲内であった（図２）。検出された平均内因性ＰＶ１特異的Ｔ細胞集団は、単一のＦ１（２．６％、ｐ＜０．００１）又はＭ６特異的Ｔ細胞（４．６％、ｐ＝０．１７７）集団と比較して高く（７．１％）、両方のペプチドを組み合わせて使用する場合に、より強い免疫原性が得られることを示した。非負荷二量体対照と比較した場合、ＨＩＶペプチド負荷二量体を認識するＴ細胞集団間に有意差は観察されなかった（ｐ＝０．１２５）。Ｔ細胞集団は陽性対照を認識しているが、ＦｌｕＭペプチド負荷二量体は、非負荷二量体対照と比較して有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【０１０４】
次に、本発明者らは、ＰＶ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在をＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の発現と相関させた。ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＦＪＸ１抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＭＡＧＥＤ４Ｂ−ＦＪＸ１抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージをカットオフとして使用して、患者を高抗原特異的Ｔ細胞及び低抗原特異的Ｔ細胞にグループ分けした。本発明者らは、Ｆ１、Ｍ６、及びＰＶ１負荷二量体を認識する高レベルの抗原特異的Ｔ細胞を有する患者の約３３％がＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４Ｂの両方を高レベルで発現していることを実証した。一方、両方の抗原を高度に発現する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルが低い患者はわずか１０％であった。驚くべきことに、以下の表に見られるように、ＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４Ｂの両方の発現が最小限である患者は、常にＦ１抗原特異的Ｔ細胞、Ｍ６抗原特異的Ｔ細胞、及びＰＶ１抗原特異的Ｔ細胞の割合が低かった。
【０１０５】
【表１４】
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【０１０６】
ＰＶ１ペプチドはインビトロでＨＮＳＣＣ患者のＴ細胞から細胞傷害性サイトカインの分泌を誘導する
次に、本発明者らは、ＰＶ１ペプチドの使用により細胞傷害性Ｔ細胞のレベルを増加させることが可能かどうか判定を試みた。ＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝１６、ＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ二量体アッセイで使用される試料と重複する１５個の試料）における細胞傷害活性の誘導におけるＰＶ１の有効性を決定するため、本発明者らは、Ｍ６、Ｆ１、又はＰＶ１（Ｆ１＋Ｍ６）のいずれかで、インビトロで患者のＴ細胞を刺激し、このＴ細胞をＭＡＧＥＤ４Ｂ（１９５Ｍ）又はＦＪＸ１（Ｃ６６６．１Ｆ）を発現する標的細胞に曝露した。刺激の前に、エクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ二量体アッセイでペプチド特異的Ｔ細胞が検出されたが、刺激前には、ＩＦＮγ及びグランザイムＢサイトカイン分泌細胞（ＣＳＣ）の集団は少なかった［図３（ａ）及び図３（ｂ）］。図３（ａ）及び図３（ｂ）に見られるように、Ｍ６、Ｆ１、又はＰＶ１のいずれかでのインビトロ刺激後、細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴ（ＣＴＸ  ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにより、細胞溶解活性が増加し、エクスビボＥＬＩＳＰＯＴでのサイトカイン分泌細胞集団と比較した場合、サイトカイン分泌細胞数がＩＦＮγとグランザイムＢの両方で増加したことが示された。全体として、Ｍ６ペプチド、Ｆ１ペプチド、又はＰＶ１ペプチドに対するＨＮＳＣＣ患者Ｔ細胞の反応は、以前のペプチド刺激と比較した場合、細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでサイトカイン分泌の２．４倍〜３９．７倍の増加を示している。ただし、ＨＩＶペプチドは刺激後のＩＦＮγ及びグランザイムＢ分泌のレベルの増加も引き起こしている。
【０１０７】
Ｔ細胞活性化のレベルは、腫瘍がＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１を高発現しているＨＮＳＣＣ患者でより高い
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで使用された１６の患者試料のうち、発明者らは１２／１６人の患者からアーカイブされたＦＦＰＥ腫瘍塊を取得できた。次に、ＩＨＣを実施して、これらの腫瘍におけるＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の発現を測定した。次に、発明者らは、ＩＨＣ染色強度に基づいて患者を４つの群（低ＦＪＸ１、高ＦＪＸ１、低ＭＡＧＥＤ４Ｂ、及び高ＭＡＧＥＤ４Ｂ）に分け［図４（ａ）］、ペプチドによる刺激後の細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける患者のＴ細胞応答を比較した。染色強度０は陰性、強度１は低発現、強度２〜３は高発現と分類される。ＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４Ｂの発現が高い患者は、ＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４Ｂの発現が低い患者と比較して、サイトカイン分泌細胞（ＩＦＮγ又はグランザイムＢのいずれか）の数が多いことが示された［図４（ｂ）］。また、本発明者らは、組織上でＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４Ｂの両方の発現レベルが低い患者は、腫瘍上でＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４Ｂのいずれかを高レベルで発現する患者と比較して、ＰＶ１刺激に対する反応が低いことを見出した［図４（ｃ）］。このデータは、高レベルのＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４Ｂを発現しているＨＮＳＣＣ患者の免疫系がＰＶ１ペプチドワクチンで刺激されやすいことを示唆している。
【０１０８】
ＰＶ１は他のがん患者に有益な効果を与える可能性がある
他のがんにおけるＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４Ｂの発現を調査し、ＰＶ１療法の恩恵を受ける可能性のある患者コホートを特定するために、本発明者らは５つの最も一般的ながん（乳がん、肺がん、大腸がん、前立腺がん、及び直腸がん）を含むＴＭＡのセットを使用してＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の発現を調査した。その結果、ＭＡＧＥＤ４Ｂの発現は５つのがんにおける全ての患者の８０％超で検出され、同様の観察がＦＪＸ１発現で見られたが、大腸がん患者については約５０％のみがＦＪＸ１陽性であったことが判明した。ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１の両方の発現をまとめて分析したところ、本発明者は、乳房、結腸、肺、前立腺、及び直腸の腫瘍組織の９０％超がＭＡＧＥＤ４Ｂ又はＦＪＸ１の発現を有することを示した［表７（ａ）］。全体として、ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１は、病期に関係なく、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんの腫瘍で過剰発現することが示された［表７（ｂ）］。これら５種類のがんの細胞株（Ａ５４９、肺がん；ＰＣ３、前立腺がん；ＨＴ−２９、結腸直腸がん；ＨＣＴ−１１６、結腸直腸がん；ＳＫＢＲ−３、乳がん；ＭＣＦ−７、乳がん）のウエスタンブロット分析の結果、ＭＡＧＥＤ４Ｂの発現はＡ５４９細胞株及びＰＣ３細胞株で高く、発現レベルはＨＣＴ−１１６、ＳＫＢＲ−３、及びＭＣＦ−７で弱いことが示された。一方、ＦＪＸ１は、ＰＣ３を除く６つの細胞株のうち５つ（Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、ＳＫＢＲ−３、及びＭＣＦ−７）で発現することが示され（図１２）、ＰＶ１は、ＭＡＧＥＤ４Ｂ及び／又はＦＪＸ１を発現するこれらのがんを標的にする可能性があることが示唆された。
【０１０９】
考察
多くの腫瘍は、精巣などの免疫特権部位（Ｉｎａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｇｊｅｒｓｔｏｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）及び胚発生時（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）にのみ通常発現するタンパク質の調節解除された発現を有する傾向がある。これらの抗原の特有な発現により、抗原ががん治療の良い標的となる。本発明者らの以前の研究では、そのような過程において２つの腫瘍抗原であるＦＪＸ１及びＭＡＧＥＤ４Ｂを同定した。これらは正常細胞では無視可能なレベルであるがＮＰＣ及びＯＳＣＣではそれぞれ過剰発現する（Ｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５、Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。本研究では、本発明者らは、コホートをより多くの細胞株及び腫瘍試料に費やした。ＩＨＣデータは、ほとんどのＯＳＣＣ腫瘍及びＮＰＣ腫瘍がＭＡＧＥＤ４Ｂ又はＦＪＸ１のいずれかの過剰発現を有することを実証した。ＦＪＸ１はＨＮＳＣＣ細胞株及び腫瘍組織の両方で過剰発現することが示されている。しかし、ＭＡＧＥＤ４Ｂについては、ＩＨＣ染色が多数のＨＮＳＣＣ腫瘍組織で陽性染色を示したにもかかわらず、検出されたＭＡＧＥＤ４Ｂの発現レベルはＨＮＳＣＣがん細胞株で低かった。これは、長期培養環境での抗原の損失によるものである可能性があった。さらなる相関研究により、ＭＡＧＥＤ４Ｂの発現は腫瘍分化の程度と相関していることが明らかになったが、本発明者らは上記２つの抗原の発現と患者の病期分類との間に有意な相関を見出せなかった。ＯＳＣＣ及びＮＰＣが頭頸部がん（ＨＮＳＣＣ）のほとんどの症例を占めたため、本発明者らはＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１の両方がＨＮＳＣＣの重要な標的になり得るという仮説を立てた。要約すると、本発明者らは、これらの２つの抗原がＨＮＳＣＣ患者の〜９０％で過剰発現し、ＨＮＳＣＣ患者の良好な治療標的として機能することを確認した。これに加えて、本発明者らは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ及びＦＪＸ１が、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんを含む他のがん種の腫瘍に存在することも明らかにし、この事はこれらの２つの抗原を標的とすることは、ＨＮＳＣＣ患者に恩恵をもたらすだけでなく、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び直腸がんを患う患者にも利益をもたらす可能性があることを示した。
【０１１０】
本発明者らは、それぞれＯＳＣＣ及びＮＰＣを標的とするＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的ペプチドワクチン及びＦＪＸ１特異的ペプチドワクチンを設計した。本発明者らは、それぞれＭＡＧＥＤ４Ｂ由来及びＦＪＸ１由来のペプチドワクチンでＯＳＣＣ患者及びＮＰＣ患者からのＰＢＭＣをパルスすることにより、標的がん細胞に対する細胞傷害性免疫応答を誘発できることを示した。しかし、腫瘍の不均一性、及びがん細胞が進行するにつれて抗原発現を失う可能性があること（Ｃｅｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）から、治療法として単一の腫瘍抗原を標的にすることは常に不十分である。このような制限を克服するためには、複数の抗原を標的にしてより広範な免疫応答を誘導し、ほとんどの腫瘍の根絶を確実にし、抗原陰性クローンの選択を回避（Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）すると同時に、より大きな患者コホートに恩恵があることが重要である。食道がん患者に関する以前の研究は、複数の抗原ペプチドワクチンが患者においてより強い免疫応答を誘発できることを示した。複数の抗原ペプチドワクチンに対するＣＴＬ応答を有する患者は、単一の抗原ペプチドに対するＣＴＬ応答を有する患者と比較して、全生存期間を改善する（Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。現在の研究では、本発明者らは、ＭＡＧＥＤ４ｂとＦＪＸ１（ＰＶ１と命名）の両方のペプチドを組み合わせて、頭頸部がん患者を標的とする二重抗原ペプチドワクチンとしてのＰＶ１の有効性の試験を試みた。
【０１１１】
本発明者の結果から、二重抗原ワクチンＰＶ１は単一のペプチドと比較して免疫原性が高いことが示された。二量体アッセイにおいて、Ｍ６又はＦ１ペプチドのみと比較した場合、より大きな固有Ｔ細胞集団がＰＶ１を認識可能である。本発明者らは、Ｔ細胞のＩＦＮγ及びグランザイムＢを分泌する能力はインビトロでのペプチド刺激の前に減退したものの、細胞傷害性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイではＩＦＮγ及びグランザイムＢを分泌するＴ細胞集団レベルが増加することを観察した。ＰＶ１刺激後のＩＦＮγ及びグランザイムＢ分泌は、単一のペプチドによる刺激と比較して、同じとはいかないまでも高かった。要約すると、頭頸部がんに対するＭＡＧＥＤ４Ｂペプチド及びＦＪＸ１ペプチドの両方を含む二重抗原ペプチドの使用は、患者に恩恵をもたらすための更なる開発を余儀なくすることを当然とする。本発明者らは、非関連ＨＩＶ−ｇａｇタンパク質ペプチドによるＴ細胞のプライミングについても観察し、Ｔ細胞から非特異的ＩＦＮγ及びグランザイムＢ分泌が誘導されることを観察した。Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４によって以前に報告されたように、本発明者らは、この非特異的刺激は、インビトロでの刺激時に偽陽性応答を誘発する難溶性ペプチドによるものであると仮定した。したがって、難溶性のＨＩＶペプチドは、ペプチド刺激後の細胞毒性ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの適切な非関連ペプチド対照とはなり得ない可能性がある。
【０１１２】
重要なことには、本発明者のデータは、抗原発現レベルが高い患者のＴ細胞が再感作されやすく、ＰＶ１刺激に対する反応が良好であることを示した。この有望なデータは、ＰＶ１が抗原特異的に機能することを示しており、腫瘍上のＭＡＧＥＤ４Ｂ又はＦＪＸ１の発現レベル又は存在に基づく患者スクリーニングは、ＰＶ１療法の重要な選択基準となり得る。
【０１１３】
最近、２つの免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＮＳＣＣの治療薬としてアメリカ食品医薬品局によって承認された。ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ＯＰＤＩＶＯ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）は２０１６年１１月に承認され、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｉｎｃ．社）は２０１６年８月に承認が加速された。ただし、これらの薬剤を投与されたＨＮＳＣＣ患者の奏効率は、それぞれわずか１３％（ＯＰＤＩＶＯ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）（Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）及び１６％（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．社）（アメリカ食品医薬品局、２０１６）であった。免疫の活性化と抑制の間のチェックとバランスを常に維持する免疫システムの複雑さにより（Ｃｈｅｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｓ  ＤＢ，２０１３）、免疫チェックポイント阻害剤のみを使用して免疫応答のブレーキを解除するだけでは、すでに減衰している患者の免疫システムを再活性化するには十分でないのかもしれない。腫瘍抗原に由来するがんワクチンなどの免疫原性免疫活性化因子との組み合わせは、エフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞の比率を変更し、抗原特異的Ｔ細胞を増加させることにより、免疫応答をより効率的に活性化することが報告されている（Ｍｏｒｓｅ  ａｎｄ  Ｌｙｅｒｌｙ，２０１５、Ｍｋｒｔｉｃｈｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ａｖｏｇａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｋａｒｙａｍｐｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。本発明者らによって実証されたように、二重抗原ＰＶ１ペプチドワクチンは免疫原性であり、ＨＮＳＣＣ患者において抗腫瘍免疫応答を誘導することが可能であり、免疫チェックポイント阻害剤とＰＶ１の組み合わせはＨＮＳＣＣ患者の奏効率を高める可能性があることを示唆している。
【０１１４】
ただし、異なるペプチドはＭＨＣ分子に対して異なる結合親和性を有する可能性があるため、エピトープへの結合の競合を引き起こす可能性がある。したがって、ＦＪＸ１ペプチドとＭＡＧＥＤ４Ｂペプチドの両方のエピトープを確実に提示するためのより優れた製剤、又は身体の異なる部位に投与するなどのワクチン投与のより優れた戦略を検討し、さらなる調査が必要となる。全体として、本発明者らの結果は、単一のペプチドと比較して、ＰＶ１が同等のレベル以上の優れた性能を発揮したことを示した。ＦＪＸ１又はＭＡＧＥＤ４Ｂのいずれかを発現している腫瘍を持つＨＮＳＣＣ患者は、上記ワクチンの恩恵を受けることができる。本発明者らのデータは、ＰＶ１が乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、直腸がんなどの他のがん種の患者にも恩恵をもたらす可能性があることも示唆している。全身腫瘍組織量を制御するための十分な免疫応答及びＰＶ１の有効性を生じさせる最適な用量は、現在、トランスジェニックインビボモデルを使用して評価中である。
【０１１５】
実施例２
動物モデルでのＰＶ１の評価
ＰＶ１は望ましくない炎症反応を増加させない
動物モデルを使用してＰＶ１免疫原性を評価する前に、炎症反応を測定するＧｒｉｅｓｓアッセイを使用して、Ｍ６及びＦ１ペプチドの毒性を評価した。マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を、様々な濃度のＭ６ペプチド、Ｆ１ペプチド、又はＰＶ１ペプチド（２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬ）で処理し、１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳを陰性対照として使用し、１ｎｇ／ｍＬのリポ多糖類（ＬＰＳ）を陽性対照として使用した。炎症の程度は、ＲＡＷ２６４．７細胞によって産生される誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のレベルに基づいて間接的に測定した。
【０１１６】
図５（ａ）は、ＲＡＷ２６４．７上のＭ６ペプチド又はＦ１ペプチドによって誘発される炎症の程度を示す。Ｍ６の存在下でのＲＡＷ２６４．７による亜硝酸塩の産生は、ＬＰＳ刺激を受けたものより少なくとも７倍低かった（Ｐ＜０．０１）。放出された亜硝酸塩の量が陽性対照よりも１０倍低かったＦ１治療群でも同じ傾向観察された（Ｐ＜０．０５）。これは、Ｍ６及びＦ１がｉＮＯＳ発現のアップレギュレーションを刺激しないことを示唆し、これらの２つの標的ペプチドによって誘導される炎症の程度が低かったことをさらに示した。Ｍ６とＦ１をＰＶ１として組み合わせると、ＰＶ１治療群のｉＮＯＳ蓄積量はＬＰＳ治療群のｉＮＯＳ蓄積量よりも有意に低いことが一貫して示された（１０倍差、Ｐ＜０．０５）［図５（ｂ）］。Ｇｒｉｅｓｓアッセイの結果からは、ＰＶ１がインビトロで炎症を誘発しなかったことが示された。
【０１１７】
ＰＶ１ワクチン接種は抗原特異的Ｔ細胞の活性化を増加させる
ＭＡＧＥＤ４Ｂペプチド６（Ｍ６）及びＦＪＸ１ペプチド１（Ｆ１）で構成される二重抗原ＰＶ１は、ＨＮＳＣＣ患者から抽出した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した試験により、免疫原性があることが示された。本研究は、トランスジェニックマウスモデルＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ２−Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊを使用してＰＶ１の免疫原性と有効性を評価することを目的としており、ＨＬＡ−Ａ２提示抗原に対するヒトＴ細胞免疫応答のモデリングを可能にする。
【０１１８】
上記の表６に示すように、５つの異なる治療群でマウスに３週間連続してワクチン接種した（３回分投与）。４週目に、マウスを屠殺し、マウスの脾臓から免疫細胞を採取した。ワクチン接種したマウスのＩＦＮγ分泌ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を、二量体アッセイを使用して決定し、媒体対照群と比較した。
【０１１９】
結果から、ＰＶ１が免疫原性であることが示された。わずか５００μｇのＰＶ１をワクチン接種した動物は、ビヒクル対照動物（５％ＤＭＳＯ含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））と比較して、ＰＶ１負荷二量体に対する高い認識を示した。ワクチン接種したマウスは、図６（ａ）に示すように、非負荷及び非関連ペプチド（ＨＩＶ）負荷二量体に曝露された場合にベースライン／無視可能な応答を示したため、この応答はペプチド特異的である。
【０１２０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、本発明者らは、ワクチン接種後にペプチドを提示するがん細胞を殺傷するために細胞毒性機能を実行できるＴ細胞の集団を評価した。ワクチン接種した動物は、ＰＶ１を提示するＴ２細胞を認識し、用量依存的にこれらのＴ２細胞に対する殺傷活性を発揮することができ［図６（ｂ）］、ＰＶ１ワクチン接種により、これらの動物におけるＴ細胞の認識が成功裏に増加したことを示唆している。
【０１２１】
ＰＶ１は安全であり、ワクチン接種したマウスでは有害事象は観察されなかった。
ワクチン接種期間中、動物の体重を週に２回測定した。本発明者らは、全ての治療群において、４週間の免疫期間中に体重減少又は有害事象を観察しなかった［図７（ａ）］。
【０１２２】
全ての治療群のマウスから採取した主要臓器（心臓、肺、腎臓、肝臓、及び脾臓）の病理学的報告では、全てのＰＶ１治療マウスが正常範囲内にあることが示された。これらの動物では局所毒性は観察されなかった［図７（ｂ）］。
【０１２３】
ＰＶ１はマウスの腫瘍増殖を遅らせた
以前の免疫原性研究で、本発明者らは、ＰＶ１が５００μｇという低濃度で抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できることを示した。したがって、マウスの全身腫瘍組織量の減少におけるＰＶ１の有効性を決定するために、１０００μｇのＰＶ１を後続のアッセイで使用した。
【０１２４】
ＡＡＤ遺伝子及びＭＡＧＥＤ４Ｂ遺伝子を発現する同系Ｂ１６メラノーマ細胞を合計１×１０６個、マウスに移植した。腫瘍サイズが３０〜５０ｍｍ３に達した後、マウスを２つの治療群にランダムに割り当てた。治療群には、ＰＶ１ペプチドを１０００μｇ含むＩＦＡを投与した。一方、ビヒクル対照群には、５％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳを投与した。
【０１２５】
腫瘍サイズを週に２回測定したところ、１０００μｇのＰＶ１＋ＩＦＡで処理したマウスは、ビヒクル対照（ＶＣ）群と比較して、腫瘍増殖遅延を示した（図８）。
【０１２６】
参考文献
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Ｌｉｍ  ＫＰ，  Ｃｈｕｎ  ＮＡ，  Ｇａｎ  ＣＰ，  Ｔｅｏ  ＳＨ，  Ｒａｈｍａｎ  ＺＡ，  Ａｂｒａｈａｍ  ＭＴ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ＭＡＧＥＤ４Ｂ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２０１４；１０（１１）：３２１４−２３  ｄｏｉ  １０．４１６１／ｈｖ．２９２２６．
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Ｃｈａｉ  ＳＪ，  Ｙａｐ  ＹＹ，  Ｆｏｏ  ＹＣ，  Ｙａｐ  ＬＦ，  Ｐｏｎｎｉａｈ  Ｓ，  Ｔｅｏ  ＳＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−Ｊｏｉｎｔｅｄ  Ｂｏｘ  １  （ＦＪＸ１）−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１５；１０（１１）：ｅ０１３０４６４  ｄｏｉ  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３０４６４．
Ｃｅｃｃｏ  Ｓ，  Ｍｕｒａｒｏ  Ｅ，  Ｇｉａｃｏｍｉｎ  Ｅ，  Ｍａｒｔｏｒｅｌｌｉ  Ｄ，  Ｌａｚｚａｒｉｎｉ  Ｒ，  Ｂａｌｄｏ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ／ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ：  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１１；１１（１）：８５−１０２．
Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  Ｕ，  Ｋａｔａｒｉ  Ｕ，  Ｃｈｒｉｓｔｉｎ  ＡＳ，  Ｃｒｕｚ  ＣＲ，  Ｔｒｉｐｉｃ  Ｔ，  Ｒｏｕｓｓｅａｕ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ＥＢＶ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１１；１９（１２）：２２５８−６８  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｍｔ．２０１１．１６７．
Ｋｏｎｏ  Ｋ，  Ｉｉｎｕｍａ  Ｈ，  Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，  Ｔａｎａｋａ  Ｈ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｎ，  Ｕｃｈｉｋａｄｏ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｅｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；１０：１４１  ｄｏｉ  １０．１１８６／１４７９−５８７６−１０−１４１．
ＦＤＡ  ＵＳ．  Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ  （ＫＥＹＴＲＵＤＡ）．  Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＯｎＤｒｕｇｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＤｒｕｇｓ／ｕｃｍ５１５６２７．ｈｔｍ；  ２０１６．  ｐ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＯｎＤｒｕｇｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＤｒｕｇｓ／ｕｃｍ５１５６２７．ｈｔｍ．
Ｃｈｅｎ  Ｌ，  Ｆｌｉｅｓ  ＤＢ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１３；１３（４）：２２７−４２  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｎｒｉ３４０５．
Ｍｏｒｓｅ  ＭＡ，  Ｌｙｅｒｌｙ  ＨＫ．  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１５；３３（５１）：７３７７−８５  ｄｏｉ  １０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１５．１０．０５７．
Ｍｋｒｔｉｃｈｙａｎ  Ｍ，  Ｎａｊｊａｒ  ＹＧ，  Ｒａｕｌｆｓ  ＥＣ，  Ａｂｄａｌｌａ  ＭＹ，  Ｓａｍａｒａ  Ｒ，  Ｒｏｔｅｍ−Ｙｅｈｕｄａｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１１；４１（１０）：２９７７−８６  ｄｏｉ  １０．１００２／ｅｊｉ．２０１１４１６３９．
Ａｖｏｇａｄｒｉ  Ｆ，  Ｚａｐｐａｓｏｄｉ  Ｒ，  Ｙａｎｇ  Ａ，  Ｂｕｄｈｕ  Ｓ，  Ｍａｌａｎｄｒｏ  Ｎ，  Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ−Ｃｙｍｅｒｍａｎ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４；２（５）：４４８−５８  ｄｏｉ  １０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１３−０２２０．
Ｋａｒｙａｍｐｕｄｉ  Ｌ，  Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ  Ｐ，  Ｓｃｈｅｉｄ  ＡＤ，  Ｋａｌｌｉ  ＫＲ，  Ｓｈｒｅｅｄｅｒ  Ｂ，  Ｋｒｅｍｐｓｋｉ  ＪＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４；７４（１１）：２９７４−８５  ｄｏｉ  １０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１３−２５６４．
【０１２７】
【化１】
2020515632.tif 000016
【０１２８】
【化２】
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【０１２９】
【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020515632.tif 000029
【図１２】
2020515632.tif 000030
【配列表】
2020515632000001.app
【国際調査報告】
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2020515632.tif 000033
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