(57)【要約】  ワクチン組成物、特に、抗原提示のための多価二十面体組成物が、本明細書に開示される。開示された組成物は、組換え融合タンパク質で構成されたＳ粒子を含み得る。組換え融合タンパク質は、ノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質、ノロウイルスＳドメインタンパク質に作動可能に連結されたリンカータンパク質ドメイン、および該リンカーに作動可能に連結された抗原タンパク質ドメインを含み得る。【選択図】図１
2020515531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ粒子を含む抗原提示のための多価二十面体組成物であって、前記Ｓ粒子が、
ａ）ノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質と、
ｂ）前記ノロウイルスＳドメインタンパク質に作動可能に連結されたリンカータンパク質ドメインと、
ｃ）前記リンカーに作動可能に連結された抗原タンパク質ドメインと、を含む組換え融合タンパク質を含む、多価二十面体組成物。
【請求項２】
前記組成物が、二十面体対称構造を有する、請求項１に記載の多価二十面体組成物。
【請求項３】
前記組成物が、抗原提示のための６０個の部位を含む、請求項１または２に記載の多価二十面体組成物。
【請求項４】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、前記ＮｏＶ  Ｓドメインタンパク質のプロテイナーゼ切断部位に変異を含み、前記変異が、前記部位をトリプシン切断に対して耐性を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項５】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、前記プロテイナーゼ切断部位に対する変異を含み、前記変異が、６９位または７０位にあり、前記変異が、前記部位をトリプシン切断に対して耐性を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項６】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、前記プロテイナーゼ切断部位に対する変異を含み、前記変異が、Ｒ６９位で発生し、好ましくは前記変異が、前記プロテイナーゼ切断部位を破壊するのに十分なＫ以外の任意のアミノ酸であり、より好ましくは、前記変異が、Ｒ６９Ａである、請求項１〜５のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項７】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、前記プロテイナーゼ切断部位に対する変異を含み、前記変異が、Ｎ７０位で発生し、好ましくは前記変異が、前記プロテイナーゼ切断部位を破壊するのに十分なＰ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項８】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、非天然ジスルフィド結合の結合部位を提供するのに十分な変異を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項９】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、前記多価二十面体Ｓ粒子の隣接するＳドメインタンパク質間に、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合の結合部位、または少なくとも２つの非天然ジスルフィド結合の結合部位、または少なくとも３つの非天然ジスルフィド結合の結合部位を提供するのに十分なシステイン残基に立体的に互いに近い少なくとも２つのアミノ酸の変異を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１０】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合形成部位を提供するのに十分な変異を含み、前記変異が、Ｖ５７Ｃ、Ｑ５８Ｃ、Ｓ１３６Ｃ、Ｍ１４０Ｃ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１１】
前記ノロウイルスＳドメインタンパク質が、カリシウイルスのものであり、前記カリシウイルスが、単一カプシドタンパク質を１８０コピー有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが、前記Ｓドメインタンパク質粒子と提示された抗原との間に空間および特定の柔軟性を提供するのに十分な長さのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多価二十面体組成物。
【請求項１３】
前記リンカーが、３〜６個のアミノ酸を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１４】
前記抗原タンパク質ドメインが、８個のアミノ酸から最大約３００個のアミノ酸までのサイズ、または８個のアミノ酸から最大約４００個のアミノ酸までのサイズ、または８個のアミノ酸から最大約５００個のアミノ酸までのサイズを有する抗原を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１５】
前記抗原タンパク質ドメインが、ロタウイルス（ＲＶ）抗原を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１６】
前記抗原タンパク質ドメインが、ＲＶスパイクタンパク質抗原（ＶＰ８抗原）を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１７】
前記抗原タンパク質ドメインが、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）のＴＳＲ抗原、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１タンパク質およびＭ２ｅエピトープの受容体結合ドメイン、Ｅ型肝炎のＰドメイン抗原、アストロウイルスの表面スパイクタンパク質、およびそれらの組み合わせから選択される抗原を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の多価二十面体組成物。
【請求項１８】
組換え融合タンパク質であって、
ａ）好ましくはプロテアーゼ部位を破壊するための１つ以上の変異、より好ましくはプロテアーゼ部位を破壊し、かつ１つまたは２つまたは３つのシステイン残基を導入するための１つ以上の変異を有する、ノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質と、
ｂ）前記ノロウイルスＳドメインタンパク質に作動可能に連結されたリンカータンパク質ドメインと、
ｃ）前記リンカーに作動可能に連結された抗原タンパク質ドメインと、を含む、組換え融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載の多価二十面体構造を作製する方法であって、ａ）改変されたＮｏＶ  Ｓドメインタンパク質を含む第１の領域を作製するステップであって、前記改変が、露出されたプロテアーゼ切断部位を破壊するのに十分な変異であって、前記変異がタンパク質分解を防止する変異、好ましくはＲ６９Ａ変異であり、Ｓドメイン間タンパク質ジスルフィド結合を形成するのに十分な前記ノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質中に１つ以上の変異を導入する変異、好ましくは、Ｖ５７Ｃ、Ｑ５８Ｃ、Ｓ１３６ＣおよびＭ１４０Ｃ、ならびにそれらの組み合わせから選択される変異を含む、作製するステップと、ｂ）リンカーおよび抗原を用いて、前記第１の領域を組換え発現するステップと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記組成物が、Ｅ．ｃｏｌｉで産生される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
免疫応答の誘発を、それを必要としている個体において行う方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップ、好ましくは、前記組成物を、２回以上、または３回以上、または４回以上投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物の少なくとも１用量を含む容器。
【請求項２３】
請求項２２に記載の１つ以上の容器、送達装置、および前記組成物の投与のための説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／４７７，４８１号の優先権および利益を主張するものであり、上記出願の内容は、その全体および全ての目的のために組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されるＸＪへのＲ２１  ＡＩ０９２４３４−０１Ａ１およびＲ５６  ＡＩ１１４８３１−０１Ａ１の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＶは、主に乳児および幼児に重度の急性胃腸炎を引き起こし、毎年世界で５歳未満の小児に約２０万人の死亡、２３０万人の入院、および２，４００万人の外来患者をもたらす［２５〜２７］。現在の２つのＲＶワクチン、ＲｏｔａＴｅｑ（Ｍｅｒｃｋ）およびＲｏｔａｒｉｘ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ＧＳＫ）は、多くの先進国で重度のＲＶ症例から子供を保護するのに効果的である［２８、２９］。しかしながら、ＲＶのほとんどの感染症、罹患率、および死亡率が発生するアフリカならびにアジアのほとんどの発展途上国で、これらが満足のいく効果を示していないため［３０〜３２］、ＲＶワクチンは最も必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
ワクチン組成物、特に、抗原提示のための多価二十面体組成物が、本明細書に開示される。開示された組成物は、組換え融合タンパク質で構成されたＳ粒子を含み得る。組換え融合タンパク質は、ノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質、ノロウイルスＳドメインタンパク質に作動可能に連結されたリンカータンパク質ドメイン、および該リンカーに作動可能に連結された抗原タンパク質ドメインを含み得る。開示された組成物は、提供するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
本出願のファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて、特許庁によって提供されるであろう。
【０００６】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を多少なりとも限定することを意図するものではない。
【０００７】
【図１】粒子または複合体に低効率で集合された天然のノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質である。（Ａ）トロンビン切断部位およびヒンジの位置を示す、ＧＳＴ−Ｓドメイン融合タンパク質の発現構築物の概略図である。（ＢおよびＣ）ＧＳＴ−Ｓ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｓ、約５１ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析であり（Ｂ）、および遊離Ｓタンパク質（約２５ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である（Ｃ）。（Ｄ）集合したＳ粒子をほとんど示さない、Ｓタンパク質のＥＭ顕微鏡写真（矢印）である。（Ｅ）サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）を介したＳタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーの溶出曲線である。ゲル濾過カラムは、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔおよび精製された組換えＮｏＶ  Ｐ粒子［２１、２２］、小Ｐ粒子［２０］、およびＰダイマー［１１］によって較正された。青色デキストラン２０００（約２０００ｋＤａ、ボイド）、Ｐ粒子（約８３０ｋＤａ）、小Ｐ粒子（約４２０ｋＤａ）、Ｐダイマー（約６９ｋＤａ）、およびアプロチニン（約６．５ｋＤａ）の溶出位置が示されている。（Ｆ）２つのピーク、ピーク１（画分＃１５および１６）ならびにピーク２（画分＃２８および２９）からのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。全てのＳＤＳ  ＰＡＧＥで、レーンＭは、指定された分子量の染色済みタンパク質マーカーである。約４２ｋＤａ、および約１６ｋＤａでの微量のＳタンパク質バンドが、それぞれ（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｆ）で見られた。
【図２】Ｓドメインの露出したプロテアーゼ部位の特定である。（Ａ）プロテアーゼで切断されたＳタンパク質のＮ末端配列決定により、ペンタ残基配列であるＮＡＰＧＥをもたらした。（Ｂ）Ｓドメイン配列は、同じプロテアーゼ残基配列ＮＡＰＧＥ（下線部）を示し、プロテアーゼ切断部位（星印）を示している。Ｃ末端ヒンジ（下線部）、４残基リンカー（ＧＧＧＧ）、および末端融合Ｈｉｓｘ６ペプチドが示されている。この組換えＳドメインタンパク質の計算された分子量も示されている。（Ｃ）全てのＧＩＩノロウイルスの表現間の配列アライメントにより、プロテアーゼ部位が高度に保存されていることが示された（強調表示された６９位および７０位）。（Ｄ）３回軸での異なる色のカートーン表現における部分的ＧＩＩ  ＮｏＶシェル構造の精査により、Ｒ６９（赤色）−Ｎ７０（シアン色）によって形成された露出したプロテイナーゼ部位を球体表現で示す。左パネル：上面図、右パネル：側面図である。
【図３】ＳＲ６９Ａタンパク質およびＳ６０粒子の産生および特性評価である。（Ａ）ヒンジ、リンカー（ＧＧＧＧ）、およびＨｉｓｘ６ペプチド（Ｈとしてラベル付けされたオレンジ色のボール）を示すＳＲ６９Ａタンパク質の発現構築物の概略図である。その完全な配列を図２Ｂに示す。（Ｂ）ＳＲ６９Ａタンパク質（約２５ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１〜５は、ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎからの溶出画分であった。レーンＭは、指定された分子量の染色済みタンパク質マーカーを表している。（Ｃ）統一サイズの自己集合化Ｓ６０粒子を示すＳＲ６９Ａタンパク質のＥＭ顕微鏡写真である。（ＤおよびＥ）ゲル濾過クロマトグラフィーによるＳＲ６９Ａタンパク質の分析（Ｄ）であり、その後の溶出ピークのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析（Ｅ）である。（Ｄ）サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、１０／３００  ＧＬ）を介したＳＲ６９Ａタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーの溶出曲線である。ゲル濾過カラムは、図１Ｅで行われたように較正された。青色デキストラン２０００（約２０００ｋＤａ）、Ｐ粒子（約８３０ｋＤａ）、Ｐダイマー（約６９ｋＤａ）、およびアプロチニン（約６．５ｋＤａ）の溶出位置は、（ｘ）により、それぞれ１、２、３、および４で示されている。（Ｅ）ゲル濾過の３つの主要なピーク（Ｄ）のＳＲ６９Ａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析であり、ここで、レーンＣは、サイズ排除カラムにロードされる前の対照ＳＲ６９Ａタンパク質であり、レーンＭは、指定された分子量の染色済みタンパク質マーカーであり、レーン８および９は、ピーク１の画分＃８および９からのものであって、レーン１６は、ピーク２の画分＃１６からのものであって、一方、レーン１９は、ピーク３の画分＃１９からのものであった。（Ｆ）ＳＲ６９Ａタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）分析である。ＥＳＩ−ＭＳは、８０μＭのＳＲ６９Ａタンパク質（モノマーに基づく）の酢酸アンモニウム水溶液（２００ｍＭ、ｐＨ  ６．８および２５℃）の陽イオンモードで取得した。ＳＲ６９Ａドメインモノマー（２５．０４７ｋＤａ）とダイマー（５０．０９５ｋＤａ）の両方が検出された。ｍ／ｚ約１５，５００を中心とする広範な特徴が観測された。質量分解能は電荷状態を確立するには不十分であったが、これらのイオンのＭＷは、報告されている大きなタンパク質複合体のｍ／ｚ［６１］に基づいて、およそ１．４７ＭＤａであると推定され、これは６０価のＳ６０粒子に相当する。
【図４】６０価のネコカリシウイルスＶＬＰの既知の結晶構造（ＰＤＢ＃：４ＰＢ６）に基づくＳ６０粒子の構造モデリングである。（Ａ）Ｓ６０粒子を示すＥＭ顕微鏡写真である。（Ｂ〜Ｄ）カートーン表現でのＳＲ６９Ａタンパク質モノマーの構造（オレンジ色）（Ｂ）と、表面表現での、５回軸（Ｃ）および２回軸（Ｄ）のそれぞれでのＳ６０粒子の構造である。露出したＣ末端ヒンジ（表面表示）は、緑色で示されている。（Ｅ〜Ｇ）ドット表現でのＣ末端融合リンカー（マゼンタ）およびＨｉｓｘ６ペプチド（空色）を伴うアートーン表現でのＳＲ６９Ａタンパク質モノマー（オレンジ）の構造（Ｅ）と、それぞれ５回軸（Ｆ）および２回軸（Ｇ）での得られたＳ６０の表面表現での構造である。露出したＣ末端のヒンジ、リンカー、およびＨｉｓｘ６ペプチドがドット表示で示されている。
【図５】Ｓ６０−ＶＰ８キメラ粒子の特性評価である。（Ａ）ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８キメラタンパク質の概略図である。ロタウイルスのＶＰ８抗原（緑色）は、リンカー（ＨＨＨＨ）を介してヒンジに融合させた。Ｈｉｓｘ６ペプチド（オレンジ）は、ＶＰ８抗原のＣ末端に融合させた。（Ｂ）ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質（約４５ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。（Ｃ）サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、１０／３００  ＧＬ）を介したＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーである。カラムは、図１Ｅで行われたように較正された。青色デキストラン２０００（約２０００ｋＤａ）、Ｐ粒子（約８３０ｋＤａ）、Ｐダイマー（約６９ｋＤａ）、およびアプロチニン（約６．５ｋＤａ）の溶出位置は、それぞれ１、２、３、および４でラベル付けされた（ｘ）で示されている。（Ｄ）ゲル濾過のピーク１（Ｃ）からのＳ６０−ＶＰ８粒子のＥＭ顕微鏡写真である。（Ｆ）ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）分析である。ＥＳＩ−ＭＳは、８０μＭのＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質（モノマーに基づく）の酢酸アンモニウム水溶液（２００ｍＭ、ｐＨ  ６．８および２５℃）の陽イオンモードで取得した。ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８モノマー（４４．９５０ｋＤａ）と分解産物（１９．９９０ｋＤａ）の両方が検出された。ｍ／ｚ約２３，７００を中心とする広範な特徴が観測された。質量分解能は電荷状態を確立するには不十分であったが、これらのイオンのＭＷは、報告されている大きなタンパク質複合体のｍ／ｚ［６１］に基づいて、およそ３．４ＭＤａであると推定され、これは６０価のＳＲ６９Ａ−ＶＰ８粒子のＭＷに相当する。
【図６】Ｓドメイン間ジスルフィド結合の導入によるＳ６０−ＶＰ８粒子のさらなる安定化である。（ＡおよびＢ）ＧＩＩ．４シェル構造の構造解析である。（Ａ）３回軸でのＧＩＩＩ．４  ＮｏＶの部分的シェル構造（Ｗ．Ｊ．、未公開データ）は、ＳドメインのＶ５７とＱ５８とが、それぞれ、隣接するＳドメインのＭ１４０’とＳ１３６’とに立体的に近いことを明らかにした。６つのＳドメインは灰色のカートーン表現で示され、前述の４つのアミノ酸は異なる色の球体表現で示されている。（Ｂ）１つのＳドメインのＶ５７（赤）／Ｑ５８（シアン）と、距離５．７〜５．９Åを有する隣接ＳドメインのＳ１３６’（緑）／Ｍ１４０’（オレンジ）の間の立体的関係の大写し図である。（Ｃ〜Ｅ）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０Ｃ−ＶＰ８タンパク質の特性評価である。（配列番号３１に示されるタンパク質配列。）（Ｃ）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０Ｃ−ＶＰ８タンパク質の発現構築物である。（Ｄ）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０Ｃ−ＶＰ８タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。レーン１、２、３、および４は、アフィニティカラムからの４つの溶出タンパク質画分である。１５μｌの各画分を各レーンにロードした。Ｍは、染色済みタンパク質マーカーである。（Ｅ）サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、１０／３００  ＧＬ）を介したＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０Ｃ−ＶＰ８タンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーの溶出曲線である。ゲル濾過カラムは、図１Ｅで行われたように較正された。青色デキストラン２０００（約２０００ｋＤａ）、Ｐ粒子（約８３０ｋＤａ）、Ｐダイマー（約６９ｋＤａ）、およびアプロチニン（約６．５ｋＤａ）の溶出位置は、それぞれ１、２、３、および４でラベル付けされた（ｘ）で示されている。（Ｆ〜Ｊ）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質の特性評価である。（配列番号３２に示されるタンパク質配列）（Ｆ）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質の発現構築物である。（Ｇ）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。レーン１、２、および３は、アフィニティカラムからの３つの溶出タンパク質画分である。１０μｌの各画分を各レーンにロードした。（Ｈ）サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、１０／３００  ＧＬ）を介したＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質のゲル濾過分析である。ゲル濾過カラムは、図１Ｅで行われたように較正された。異なるＭＷを有する４つのタンパク質の溶出位置は、（Ｅ）で示されている。（Ｉ）ゲル濾過のピーク１（Ｈ）からのＳ６０−ＶＰ８粒子のＥＭ顕微鏡写真である。（Ｊ）ピーク１（画分＃７〜１０）、ピーク２（画分＃２１）、およびピーク３（画分＃２３）のタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。レーンＣは、カラムにロードする前の対照タンパク質である。
【図７】Ｓ６０−ＶＰ８粒子の構造である。（Ａ〜Ｃ）Ｓ６０−ＶＰ８粒子の３次元構造を、ｃｒｙｏＥＭ技術によって再構築した。（Ａ）５回軸でのＳ６０−ＶＰ８粒子の表面構造である。（ＢおよびＣ）外部および内部構造を示している、Ｓ６０−ＶＰ８粒子の中央スライスのスライス構造（Ｂ）と、後半（Ｃ）のスライス構造である。内部のＳ６０粒子（Ｓ）と突起ＶＰ８抗原が示されている。配色に基づく半径が示されている。「５」は５回軸を指示する。（Ｄ〜Ｆ）Ｓ６０−ＶＰ８粒子のｃｒｙｏＥＭ密度マップ（透明な灰色）への６０価のＦＣＶシェル構造（赤、カートーン表現）のフィッティングである。フィッティングの結果は、正面から見たＳ６０−ＶＰ８粒子の前半（Ｄ）、中央スライス（Ｅ）、後半（Ｆ）を示す３つの透明なスライス図で示されている。（ＧおよびＨ）Ｐ［８］ＲＶのＶＰ８結晶構造（ＰＤＢコード：２ＤＷＲ）の６０コピーの、Ｓ６０−ＶＰ８粒子ｃｒｙｏＥＭ密度マップの突起領域へのフィッティングである。Ｓ６０−ＶＰ８粒子のＳ６０粒子領域内の適合ＦＣＶシェル結晶構造は、カートーン表現（赤）で示され、一方突起領域内の適合ＶＰ８結晶構造は、青色のカートーン表現で示されている。（Ｉ）上記のフィッティング結果に基づくＳ６０−ＶＰ８粒子モデルである。内部のＳ６０粒子は赤色のカートーン表現で示され、６０個の突起ＶＰ８抗原は水色のドット表現で示されている。
【図８】ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離後にピークを形成したＳ６０−ＶＰ８粒子である。Ｓ６０−ＶＰ８粒子をＣｓＣｌ密度勾配にロードした。超遠心分離後、分画された勾配のＳ６０−ＶＰ８粒子を、それぞれＰ［８］ＲＶ  ＶＰ８（Ａ）およびＧＩＩ．４  ＮｏＶ  ＶＬＰ（Ｂ）に特異的な抗体によって検出した。どちらの場合でも、Ｓ６０−ＶＰ８粒子の定義されたピークが勾配の中央で検出された。
【図９】Ｓ６０粒子提示ＶＰ８が、リガンド結合機能を保持することを示した。（Ａ）グリカン結合アッセイは、Ｓ６０−ＶＰ８粒子がＨ１およびＬｅｂ抗原を表す合成オリゴ糖に結合したが、Ｌｅｙ抗原を表すものには結合しないことを示した。ＶＰ８を含まないＳ６０粒子は、３つの抗原のいずれにも結合しなかった。
【図１０】Ｓ６０−ＶＰ８粒子が、提示されたＲＶ  ＶＰ８抗原に対する免疫原性を高めたことを示す。同じ用量／投与量のＳ６０−ＶＰ８粒子、遊離ＶＰ８抗原、およびＶＰ８を含まないＳ６０粒子で、それぞれマウスを免疫化し（Ｎ＝６）、続いてＶＰ８特異的ＩｇＧ応答（Ａ）、ならびに得られたマウス血清のＲＶ  ＶＰ８−リガンド相互作用に対する５０％ブロッキング力価（ＢＴ５０）（Ｂ）およびＲＶ感染に対する中和活性（Ｃ）の測定を行った。（Ａ）Ｓ６０−ＶＰ８粒子、遊離ＶＰ８抗原、およびＳ６０粒子によってそれぞれ誘発されたＶＰ８特異的ＩｇＧ応答である。（Ｂ）それぞれ同じ３つの免疫原でのワクチン接種後のマウス血清によるＲＶ  ＶＰ８リガンド相互作用に対するＢＴ５０である。（Ｃ）それぞれ同じ３つの免疫原で免疫化した後のマウス血清による培養細胞のＲＶ感染に対する中和活性である。データ群間の統計的差異は、星印で示されている（＊Ｐ<０．０５、＊＊Ｐ<０．０１、＊＊＊Ｐ<０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
特に明記しない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来の用法に従って理解されるべきである。矛盾する場合は、定義を含む本書が優先する。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書で開示される材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【０００９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及には複数のそのような方法が含まれ、「用量」への言及には、１つ以上の用量および当業者に知られているその同等物への言及などが含まれる。
【００１０】
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、値の測定または決定方法、例えば測定システムの制限に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例により、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所定の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。本出願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容誤差範囲内の「約」という用語を想定する必要がある。
【００１１】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果を示すのに十分な１つまたは複数の活性成分の量を意味する。これには、治療効果と予防効果の両方が含まれる。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、この用語はその成分のみを指す。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせて投与されるか、連続して投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の合計量を指す。
【００１２】
用語「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」は、治療、観察および／または実験の対象である動物を指すために交換可能に使用される。一般的に、この用語はヒト患者を指すが、方法および組成物は他の哺乳動物などの非ヒト対象にも等しく適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、これらの用語はヒトを指す。さらなる実施形態では、この用語は子供を指してもよい。
【００１３】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、以下で定義される「免疫原」および「免疫原性抗原」という用語と交換可能に使用され得る。技術的に言えば、抗原とは免疫応答の産物と結合することができる物質であるが、必ずしも免疫応答を誘発することはできず（つまり、全ての免疫原は抗原であるが、その逆は当てはまらない）、しかし、本発明の主題として本明細書で議論される抗原は、抗原と称される場合であっても、免疫原性抗原であると想定される。
【００１４】
「融合タンパク質」という用語は、融合遺伝子の翻訳によって作成されたタンパク質を意味し、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドをもたらす。
【００１５】
「免疫」という用語は、感染、疾患、または疾患を引き起こす原因となる生物による他の生物学的侵入を回避するのに十分な生物学的防御を有する状態を意味する。
【００１６】
「免疫原性」という用語は、体液性および／または細胞性免疫応答を誘発する免疫原の能力を意味する。
【００１７】
「免疫原」および「免疫原性抗原」という用語は、１つ以上の抗体の産生という形で適応免疫応答を誘導または誘発することができる特定の種類の抗原を意味する。
【００１８】
「免疫原性応答」および「免疫応答」という用語は、免疫原に応答した生物の免疫系の反応性の変化を意味する。これは、抗体産生、細胞性免疫の誘導、補体活性化または後天性免疫の発達、または特定の疾患もしくは病原体に対する免疫寛容を伴い得る。
【００１９】
「免疫化」および「ワクチン接種」という用語は、意図的な免疫応答の誘導を意味し、免疫系の自然な特異性、ならびにその誘導性の効果的な操作を伴う。免疫の背後にある原理は、病気を引き起こす生物に由来する抗原を導入することであり、それは免疫系を刺激してその生物に対する防御免疫を発達させるが、抗原自体はその生物の病原性効果を引き起こさない。
【００２０】
「感染」という用語は、病原体による動物または植物の宿主組織への侵入、ならびに体内での病原体の増殖、病原体およびそれが産生する可能性のある毒素に対する身体の反応を意味する。
【００２１】
「ノロウイルス」、「ＮｏＶ」、「ノーウォーク様ウイルス」、または「ＮＬＶ」という用語は、カリシウイルス科のノロウイルス属のウイルスを指し、ノーウォークウイルス（「ＮＶ」）、ＭＯＨ、メキシコ、ＶＡ２０７、ＶＡ３８７、０２−１４１９、Ｃ５９、ＶＡ１１５、ハワイ、スノーマウンテン、ヒリントン、トロント、リーズ、アムステルダム、アイダホフォールズ、ローズデール、グリムスビー、サウサンプトン、デザートシールド、バーミンガム、およびホワイトリバーキャップが挙げられるが、これらに限定されない。ＮｏＶは、ヒトに急性胃腸炎を引き起こす。
【００２２】
本明細書で使用される場合、文字「Ｓ」は、記載された粒子との関連で、例えばＳ６９Ａ／５８Ｃ／１４０Ｃ−ＶＰ８で使用される場合、「Ｓドメイン」を意味し、これは６９Ａ／５８Ｃ／１４０Ｃ変異を有するＳ−ＶＰ８タンパク質を意味する。他の態様では、使用される命名法は、例えば、「６９Ａ／５８Ｃ／１４０Ｃ」が上付き文字として示されるＳであり得る。
【００２３】
「ワクチン」という用語は、特定の疾患に対する免疫を改善する生物学的製剤または組成物を意味する。ワクチンは、レシピエントに免疫応答を誘導するために意図的に投与される免疫原性抗原の例である。
【００２４】
「多価ワクチン（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ」および「多価ワクチン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）」という用語は、同じ微生物（ＮｏＶなど）の２つ以上の株、または２つ以上の異なる微生物に対して免疫化するように設計されたワクチンを意味する。
【００２５】
ノロウイルス（ＮｏＶ）は、カリシウイルス科のノロウイルス属のメンバーであり、重大な罹患率および死亡率を示すヒトの流行性急性胃腸炎を引き起こす［４、５］。構造的には、ＮｏＶビリオンは、単一の主要な構造タンパク質であるキャプシドタンパク質またはウイルスタンパク質１（ＶＰ１）で構成されるタンパク質キャプシドによってカプセル化されている。ＮｏＶキャプシドの結晶構造は、ＮｏＶ  ＶＰ１が２つの主要なドメイン、Ｎ末端シェル（Ｓ）およびＣ末端突起（Ｐ）ドメインを含み、短いヒンジで連結されていることを明らかにした［６］。Ｓドメインは、ＮｏＶビリオンの基本的な足場を支える内部の二十面体シェルを構築し、一方Ｐドメインは、ＮｏＶキャプシドを安定化させ、細胞表面グリカンを宿主付着因子または受容体［１１〜１４］として認識するダイマー突起［７〜１０］を構成する。
【００２６】
真核生物系を介した完全長ＮｏＶ  ＶＰ１のｉインビトロ発現は、本物のウイルスキャプシ［６、１５］と構造的および抗原的に類似した１８０価のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己形成をもたらし、一方Ｅ．ｃｏｌｉ系を介したＰドメインの産生は、ＮｏＶキャプシドのものと構造的に区別できないＰダイマーを形成した［７〜１１、１６〜１９］。加えて、改変ＮｏＶ  Ｐドメインは、１２価の小さなＰ粒子［２０］、２４価のＰ粒子［２１、２２］、および３６価のＰ複合体［２３］を含む、異なる高次の粒子または複合体に集合した。
【００２７】
Ｐドメインとは異なり、Ｓドメインはあまり研究されていなかったが、「薄層」Ｓ粒子は、ＮｏＶキャプシドの１８０価のシェルとおそらくは同等である、バキュロウイルス／昆虫細胞系のＳドメインの発現を通じて報告されている［１１、２４］。この研究では、出願人は、単純なＥ．ｃｏｌｉ系を介して、Ｓ６０粒子と称される統一された６０価のＳ粒子を産生する新しい技術を開発し、それらをロタウイルス（ＲＶ）およびその他の病原体に対するサブユニットワクチン開発のための抗原提示用の多機能性ワクチンプラットフォームとして適用した。
【００２８】
ＲＶは、主に乳児および幼児に重度の急性胃腸炎を引き起こし、毎年世界で５歳未満の小児に約２０万人の死亡、２３０万人の入院、および２，４００万人の外来患者をもたらす［２５〜２７］。現在の２つのＲＶワクチン、ＲｏｔａＴｅｑ（Ｍｅｒｃｋ）およびＲｏｔａｒｉｘ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ＧＳＫ）は、多くの先進国で重度のＲＶ症例から子供を保護するのに効果的である［２８、２９］。しかしながら、ＲＶのほとんどの感染症、罹患率、および死亡率が発生するアフリカならびにアジアのほとんどの発展途上国で、これらが満足のいく効果を示していないため［３０〜３２］、ＲＶワクチンは最も必要とされている。出願人の最近の研究は、発展途上国でのＲＶワクチンの低有効性が、中低所得国で優勢なＲＶ  Ｐタイプの変化に伴うワクチンのＰタイプのミスマッチによる可能性があることを示唆した［３３、３４］。加えて、現在の弱毒生ワクチンはいずれも高価なままであり、経口投与後の腸内でのワクチンＲＶの複製は、ワクチン接種を受けた子供の腸重積症のリスク増加の原因となる可能性がある［３５〜４１］。したがって、２つの現在のＲＶ生ワクチンの前述の制限を克服できる新生代のＲＶワクチンが求められている。
【００２９】
ＲＶのＰタイプは、ＲＶビリオンのスパイクタンパク質を構成するウイルスタンパク質４（ＶＰ４）によって決定される。構造的に、各スパイクタンパク質には、ＶＰ５によって形成された柄部と、ＶＰ８によって構築された遠位頭部の２つの主要部分とを含有する［４２］。ＶＰ５およびＶＰ８は、トリプシンによるＶＰ４の切断産物である。ＶＰ８は、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）を含む、細胞表面グリカンのグループであるＲＶホスト付着因子または受容体との相互作用に関与している［３３、４３〜４５］。以前の研究は、ＶＰ８抗原が、ＲＶ感染および培養細胞での複製を阻害し、免疫化マウスをＲＶ感染から保護する中和抗体を誘発し［４６、４７］、したがって、ＶＰ８抗原が、ＲＶに対する重要なワクチン標的である［４６〜４９］ことを示した。
【００３０】
しかしながら、ＲＶ  ＶＰ８を含む多くの定義された中和抗原は、それらの低い価数の小さいサイズのため、非複製ワクチン開発の免疫原性が低いという一般的な問題に直面している。この問題は、抗原の免疫原性を高めるための大きな多価タンパク質プラットフォームへの融合または複合体化によって解決することができる。この研究では、出願人は、有効なワクチンプラットフォームとしてＮｏＶ  Ｓ６０粒子によって提示された後に、ＲＶ  ＶＰ８抗原の免疫原性の大幅な増強を支援する確かな証拠を提供した。出願人のデータは、Ｓ６０−ＶＰ８粒子が容易に生成され、安定で、提示されたＲＶ  ＶＰ８抗原に対して高度に免疫原性であり、したがってＲＶ感染に対する有望なサブユニットワクチンであることを示している。
【００３１】
ウイルスキャプシドタンパク質の同型相互作用は一般的であり、ウイルスキャプシドの自己形成を促進する。ノロウイルスキャプシドの内部シェルを自然に構築するノロウイルスシェル（Ｓ）ドメインのこのような相互作用を利用することにより、出願人は、単純なＥ．ｃｏｌｉ系を介した６０価の二十面体Ｓ６０粒子の生産方法を開発した。これは、Ｓドメインへのいくつかの改変、例えば、露出したプロテイナーゼ切断部位を破壊するＲ６９Ａ変異およびＳドメイン間相互作用を強化するためのＳドメイン間ジスルフィド結合を確立する三重システイン変異（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ）によって達成することができる。６０個の露出したＳドメインＣ末端を有する多価Ｓ６０粒子は、ワクチン開発用に提示された抗原に対する免疫原性を改善するための抗原提示の理想的なプラットフォームをもたらす。これは、主要なＲＶ中和抗原である６０個のロタウイルス（ＲＶ）ＶＰ８タンパク質を提示するキメラＳ６０粒子を構築することで証明された。これらのＳ６０−ＶＰ８粒子は容易に産生され、提示されたＶＰ８抗原に対して、マウスにおいて高いＩｇＧ応答を誘発した。Ｓ６０−ＶＰ８粒子による免疫化後のマウス抗血清は、そのグリカンリガンドへのＲＶ  ＶＰ８結合に対する高い遮断と、培養細胞におけるＲＶ感染に対する高い中和活性を示した。Ｓ６０およびＳ６０−ＶＰ８粒子の３次元構造を研究した。最後に、Ｓ６０粒子は他の抗原も提示できるため、Ｓ６０粒子は多機能性ワクチンプラットフォームであるという概念を裏付けている。
【００３２】
本明細書では、特に改変ノロウイルスＳ粒子を使用して、多価ワクチン組成物を形成するために使用することができる方法および組成物を開示する。
【００３３】
一態様では、抗原提示のための多価二十面体組成物が開示される。本組成物は、Ｓ粒子を含むことができ、このＳ粒子は、ノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質、ノロウイルスＳドメインタンパク質に作動可能に連結されたリンカータンパク質ドメイン、およびリンカーに作動可能に連結された抗原タンパク質ドメインを含む組換え融合タンパク質を含み得る。
【００３４】
本組成物は通常、二十面体対称構造を有している。一態様では、本組成物は、６０個の抗原提示のための部位を含む。
【００３５】
一態様では、ノロウイルスＳドメインタンパク質は、カリシウイルスのものである。カリシウイルスは、単一のキャプシドタンパク質の１８０コピーを有することを特徴とし得る。
【００３６】
一態様では、ノロウイルスＳドメインタンパク質は、ＮｏＶ  Ｓドメインタンパク質のプロテイナーゼ切断部位に変異を含み、変異は、この部位をトリプシン切断に対して耐性を示す。変異がトリプシン切断部位を効果的に破壊することを条件に、部位に１つ以上の変異を行うことができる。このような効果を達成する部位への改変は、当業者によって容易に理解されるであろう。一態様では、変異は６９位または７０位にあってもよい。一態様では、変異はＲ６９位で起こり得る。ある特定の態様では、変異は、プロテイナーゼ切断部位を破壊するのに十分なＫ（リジン）以外の任意のアミノ酸への変化であり得る。ある特定の態様では、変異はＲ６９Ａである。他の態様では、変異はＮ７０位で起こってもよく、例えば、変異はプロテイナーゼ切断部位を破壊するのに十分なＰ（プロリン）以外の任意のアミノ酸にあり得る。
【００３７】
一態様では、ノロウイルスＳドメインタンパク質は、非天然ジスルフィド結合の結合部位を提供するのに十分な変異を含み得る。ノロウイルスＳドメインタンパク質は、多価二十面体Ｓ粒子の隣接するＳドメインタンパク質間に、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合の結合部位、または他の態様では、少なくとも２つの非天然ジスルフィド結合の結合部位、または少なくとも３つの非天然ジスルフィド結合の結合部位を提供するのに十分なシステイン残基に（立体的に互いに近い）少なくとも２つのアミノ酸の変異を含んでもよい。ある特定の態様では、変異は、Ｖ５７Ｃ、Ｑ５８Ｃ、Ｓ１３６Ｃ、Ｍ１４０Ｃ、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【００３８】
一態様では、リンカーは、Ｓドメインタンパク質粒子と提示された抗原との間に空間および特定の柔軟性を提供するのに十分な長さのアミノ酸配列を含み得る。リンカーは通常、ＳドメインのＣ末端を提示された抗原に接続する、１〜１０個のアミノ酸単位、または３〜６個のアミノ酸の短いペプチドである。リンカーは、Ｓ６０粒子と提示された抗原との間に空間と一定の柔軟性を提供し、Ｓドメインと提示された抗原の独立した折り畳みを助ける。必要に応じて、より長いリンカーが使用されてもよい。リンカーのアミノ酸の長さは、タンパク質ドメインの柔軟性が請求された組成物を形成できるようにするのに十分でなければならない。
【００３９】
開示された組成物は、抗原の提示に理想的に適している。好適な抗原は、当業者によって容易に決定され得る。例示的な抗原は、本明細書に開示されている。ある特定の態様では、抗原タンパク質ドメインは、免疫原性に加えてサイズによって選択されてもよく、８個のアミノ酸から最大約３００個のアミノ酸まで、または８個のアミノ酸から最大約４００個のアミノ酸まで、または８個のアミノ酸から最大約５００個のアミノ酸までのサイズを有する抗原をコードすることができる。当業者によって容易に理解されるように、抗原のサイズは大きく変動する可能性があり、本組成物は、免疫応答を誘発するための様々な異なる抗原の提示に使用され得る。
【００４０】
一態様では、多価二十面体組成物は、ロタウイルス（ＲＶ）抗原である抗原タンパク質ドメインを含み得る。一態様では、抗原タンパク質ドメインは、ＲＶスパイクタンパク質抗原（ＶＰ８抗原）を含み得る。さらなる態様では、抗原は、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）のＴＳＲ抗原、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１タンパク質およびＭ２ｅエピトープの受容体結合ドメイン、Ｅ型肝炎のＰドメイン抗原、アストロウイルスの表面スパイクタンパク質、およびそれらの組み合わせを含むことができる。繰り返すが、このような抗原は単なる例示であり、このような列挙は特許請求の範囲を限定することを意図していない。例示的な配列としては、配列番号３４および配列番号３５のもの：ヒトロタウイルスＶＰ８抗原、配列番号４２および配列番号４３：Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のＰドメイン抗原、配列番号４４および配列番号４５：鳥類ＡｓｔＶの表面スパイクタンパク質抗原（例えば、（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ＃：ＮＰ９８７０８８、残基４２３−６３０）を参照されたい）、配列番号４６および配列番号４７：Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１抗原（Ｈ７）、配列番号４８および配列番号４９：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト表面タンパク質のＴＳＲ抗原、ならびに配列番号５０および配列番号５１：Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２Ｅエピトープが挙げられる。抗原ペプチドを生成するために使用される抗原配列は、結果として得られる抗原が、抗原を有する組成物を投与された個体において少なくとも部分的な免疫応答を誘発するという条件で、参照核酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有し得ることが理解されよう。
【００４１】
組換え融合タンパク質は、開示されたワクチン組成物のサブユニットである。本明細書でさらに開示されるのは、多価二十面体組成物の基礎を形成し得る組換え融合タンパク質である。融合タンパク質は、上記のトリプシン部位および上記の付加されたシステイン部位への変異を有するノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質と、前述の変異を有する該ノロウイルスＳドメインタンパク質に作動可能に連結されたリンカータンパク質ドメインと、リンカーに作動可能に連結された抗原タンパク質ドメインと、を含み得る。融合タンパク質の各部分の特徴は上記のとおりである。
【００４２】
上記のＳ粒子に加えて、開示された組成物は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤ならびに抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含み得る１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。開示されたＳ粒子は、生理食塩水中に提供されてもよい。任意選択で、例えばゲンタマイシン、メルチオレートなどのような抗菌活性剤などの保護剤を含めることができる。組成物はさらに、例えば、糖類、トレハロース、マンニトール、サッカロースなどの安定剤を含んで、製品の貯蔵寿命を延長および／または維持してもよい。当業者であれば、本明細書の組成物が既知の注射可能な生理学的に許容できる滅菌溶液を組み込み得ることを理解するであろう。非経口注射または注入用のすぐに使用できる溶液を調製するために、例えば、生理食塩水または対応する血漿タンパク質溶液などの等張水溶液を容易に入手することができる。加えて、本発明の免疫原性組成物およびワクチン組成物は、希釈剤、等張剤、安定剤、またはアジュバントを含むことができる。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、および乳糖を挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミン、およびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。好適なアジュバントは、当業者によって理解されるであろう。
【００４３】
一態様では、本明細書で開示される免疫原性組成物の少なくとも１用量を含む容器が開示される。容器は、免疫原性組成物の１〜２５０用量、または他の態様では、免疫原性組成物の１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、または２５０用量を含んでもよい。一態様では、容器のそれぞれは、免疫原性組成物の２回以上の用量を含むことができ、さらに抗菌活性剤を含むことができる。これらの薬剤としては、例えば、ゲンタマイシンおよびメルチオレートなどの抗生物質を挙げることができる。
【００４４】
さらなる態様は、キットに関する。キットは、上記の容器のいずれか、および上記の免疫原性組成物の送達に関する情報を含む取扱説明書を含んでもよい。例えば、少なくとも１用量の筋肉内適用に関する指示書は、本明細書に開示される抗原の感染に関連する臨床症状の重症度を軽減するために提供され得る。キットおよび／または組成物は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または不完全フロイントアジュバント（ＫＬＨ／ＩＣＦＡ）などの免疫刺激剤をさらに含んでもよい。当業者に既知の他の免疫刺激剤も使用することができる。
【００４５】
一態様では、開示された多価二十面体構造を作製する方法が開示されている。本方法は、ａ）改変されたＮｏＶ  Ｓドメインタンパク質を含む第１の領域を作製するステップであって、該改変が、露出されたプロテアーゼ切断部位を破壊するのに十分な変異を含み（変異が、タンパク質分解、好ましくはＲ６９Ａ変異を防止し）、Ｓドメイン間タンパク質ジスルフィド結合を形成するのに十分なノロウイルス（ＮｏＶ）Ｓドメインタンパク質中に１つ以上の変異、例えば、Ｖ５７Ｃ、Ｑ５８Ｃ、Ｓ１３６Ｃ、およびＭ１４０Ｃ、ならびにそれらの組み合わせから選択される変異を導入する、第１の領域を作製するステップと、ｂ）リンカーおよび抗原を用いて、改変されたＮｏＶ  Ｓドメインタンパク質を有する第１の領域を組換え発現するステップと、を含む。ある特定の態様では、組成物はＥ．ｃｏｌｉ中で効果的に産生され得る。
【００４６】
一態様では、免疫応答の誘発を、それを必要とする個体において行う方法が開示される。この態様では、本方法は、上記で開示されたワクチン組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含み得る。開示された組成物は、当該分野において既知の任意の方法に従って個体に投与され得、最適な投与（経路および量を含む）は過度の実験を必要としないことが容易に理解される。ワクチン組成物は、ワクチン組成物に組み込まれた抗原への将来の曝露を疑われる個体に予防的に投与され得る。ある特定の態様では、組成物を受け取った個体を感染から保護する、または感染に関連する臨床症状の重症度を低減または軽減する免疫応答を提供する方法が提供される。感染としては、例えば、マラリア、Ａ型インフルエンザ、Ｅ型肝炎、およびアストロウイルス感染を挙げることができる。投薬レジメンは、組成物の単位剤形が異なる時間に投与される単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュール（例えば、追加投与を含む）であってもよい。本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象の単位用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果を生じるのに十分な量の本明細書に開示される抗原組成物の所定量を含有し、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤（例えば、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクル）と関連付けて提供される。ワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与されてもよい。
【実施例】
【００４７】
本明細書に開示される本発明の実施形態をさらに説明するために、以下の非限定的な実施が提供される。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが見出されたアプローチを表し、したがって、その実施のためのモードの例を構成するとみなされ得ることを当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
【００４８】
生物工学による新しい生体材料の生成は、現代医学で急速に成長している分野である。典型的な例としては、ウイルスキャプシドタンパク質の自己形成機能を利用して構築された様々な多価タンパク質ナノ粒子および複合体が挙げられる［１〜３］。ウイルスキャプシドタンパク質は、ウイルスのライフサイクル、特にウイルスの付着と侵入に必要な多くの基本的な機能に関与しているため、ヒトおよび動物への免疫化後にウイルス感染に対する中和抗体を誘発することができる。これは、ウイルスキャプシドタンパク質が対応するウイルス病原体に対する優れたワクチン標的であるという概念を裏付けている。実際、様々なキャプシドタンパク質粒子および複合体が開発され、非複製サブユニットワクチンとして使用され、毎年数百万人の命を奪う種々の感染症と戦っている［１〜３］。感染性ビリオンの培養を必要とし、したがって特定の安全性の懸念に関連する従来の弱毒化生ワクチンおよび不活化ウイルスワクチンとは異なり、生物工学によるウイルスキャプシドタンパク質に由来する非複製サブユニットワクチンは感染性因子に関与しないため、従来のワクチンよりも安全でかつ製造コストが低い。したがって、非複製サブユニットワクチンは、革新的なワクチン戦略の新世代を表している。
【００４９】
材料および方法
プラスミド構築物。１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグ付きＳドメインタンパク質の発現構築物。ＧＩＩ．４  ＮｏＶ株ＶＡ３８７のヒンジコード配列を有するＳドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ＃：ＡＹ０３８６００．３；残基１〜２２１）を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＧＳＴ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の複数のクローニング部位に、ＢａｍＨ１／Ｓａｌ  Ｉ部位を介して挿入した。得られたＳドメインタンパク質は、間にトロンビン切断部位を有するＮ末端ＧＳＴを有していた。２）Ｈｉｓｘ６融合ＳＲ６９Ａドメイン発現用のプラスミド構築物。Ｒ６９Ａ変異を有する同じＮｏＶ  Ｓドメインヒンジコード配列を、ｐＥＴ−２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の複数のクローニング部位に、ＢａｍＨ１／Ｎｏｔ  Ｉ部位を介して挿入した。得られたＳドメインタンパク質は、Ｃ末端が融合したＨｉｓｘ６ペプチドを有していた。３）ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８キメラタンパク質発現用のＤＮＡ構築物。ＷＡ株のＶＰ８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ＃：ＶＰＸＲＷＡ）の６４から２３１のアミノ酸配列に相当する、Ｐ［８］ヒトＲＶ株ＢＭ１４１１３のＲＶ  ＶＰ８コード配列を含むＤＮＡフラグメントを、ＳＲ６９Ａドメインの末端−ヒンジにそれらの間にリンカー（４つのヒスチジン）を挟んだ状態で融合させた。ＲＶ株ＢＭ１４１１３は、ＲＶ陽性の便試料から直接単離された［４５］。Ｈｉｓｘ６−ペプチドを精製目的でＶＰ８抗原のＣ末端に付加した。４）ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０Ｃ−ＶＰ８、ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８、およびＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ／Ｍ１４０Ｃ−ＶＰ８キメラタンパク質の発現構築物。このＤＮＡ構築物は、ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８キメラタンパク質の発現構築物に、他の２つ（Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０Ｃ）、３つ（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ）、または４つ（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ／Ｍ１４０Ｃ）の変異を、部位特異的突然変異誘発によって導入することによって作製した。５）。ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ｍＶＰ８キメラタンパク質発現用のプラスミド構築物。この構築物には、ＳＲ６９Ａ／Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８構築物のようなＤＮＡ配列が含まれていたが、ＶＰ８コード配列が、ネズミＲＶ  ＥＤＩＭ（乳児マウスの流行性下痢）株のＶＰ８をコードする配列に置き換えられた［５０］。加えて、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生体３Ｄ７株のスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）の表面ＴＳＲ抗原（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ＃：ＣＡＢ３８９９８、残基３０９〜３７５）を含む、様々な病原体の抗原を提示する他のＳＲ６９ＡＶ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃベースのキメラ粒子用に構築されたＤＮＡ［５１］、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２ｅエピトープ［５２、５３］、およびＥ型肝炎ウイルスのＰドメイン抗原［５４〜５６］  を、ＲＶ  ＶＰ８コード配列が、対応する抗原をコードするものに置き換えられているＳＲ６９Ａ  Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６Ｃ−ＶＰ８キメラタンパク質を、出発構築物として用いて構築した。
【００５０】
組換えタンパク質の産生および精製。組換えＧＳＴ融合およびＨｓｔｘ６融合タンパク質を、以前に記載されているように（１１、４７、５３、５６）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１、ＤＥ３）中で発現させた。得られた組換えタンパク質は、製造元の指示に従って、ＧＳＴタグ付きについては、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ精製樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、およびＨｉｓｘ６−ペプチド融合タンパク質については、ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いて精製した。ＧＳＴ融合タンパク質は依然として精製樹脂に結合していながら、トロンビン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の切断により、ＧＳＴを標的タンパク質から除去することができる。
【００５１】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質の定量。精製タンパク質は、１０％分離ゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質は、同じゲル上の標準として連続希釈ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで定量した［４６］。
【００５２】
ゲル濾過クロマトグラフィー。これは、サイズ除外カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、１０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＡＫＴＡ  Ｆａｓｔ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５Ｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、以前に記載されたようにタンパク質およびタンパク質複合体のサイズ分布を分析するために実行した［１１、５３、５７］。カラムを、以前に記載されたように、ゲル濾過校正キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および精製されたＮｏＶ  Ｐ粒子（約８３０ｋＤａ）［５７］、小さなＰ粒子（約４２０ｋＤａ）［２０］、およびＰダイマー（約６９ｋＤａ）［１１］によって校正した［５３、５５］。溶出ピークのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００５３】
塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心分離。０．５ｍＬの樹脂精製Ｓ６０−ＶＰ８粒子を、１．３００ｇ／ｍＬの密度を有するＣｓＣｌ溶液１１ｍＬと混合し、１２ｍｌのｌ遠心管に充填した。ＳＷ４１Ｔｉローターを使用してＯｐｔｉｍａ  Ｌ−９０Ｋ超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で２８８，０００ｇにて４５時間遠心分離した後、グラジエントを底部穿刺により各０．５ｍＬの２３画分に分画した。画分のＣｓＣｌ密度を、屈折率に基づいて決定した。画分中のＳ６０−ＶＰ８粒子をＥＬＩＳＡで分析し、このＥＬＩＳＡでは、個々の画分をＰＢＳで２０倍に希釈し、マイクロタイタープレートにコーティングした。コーティングされたタンパク質を、ＮｏＶ  ＶＬＰ特異的抗体およびＲＶ  ＶＰ８特異的抗体によって検出した。
【００５４】
電子顕微鏡法。１％モリブデン酸アンモニウムを染色溶液として使用して、粒子形成の電子顕微鏡（ＥＭ）検査用にタンパク質試料を調製した［２２］。被検査物を、ＥＭ１０  Ｃ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で、８０ｋＶにて、１０，０００倍から４０，０００倍の倍率で観察した。
【００５５】
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）。全てのＥＳＩ−ＭＳ測定は、ナノフローＥＳＩ（ｎａｎｏＥＳＩ）ソースを備えたＳｙｎａｐｔ  Ｇ２Ｓ四重極イオン移動度分離飛行時間（Ｑ−ＩＭＳ−ＴＯＦ）質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を使用して陽イオンモードで実行した。各試料溶液を、２００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．８、２５℃）中で調製し、Ｐ−１０００マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を使用して約５μｍに引き伸ばしたホウケイ酸キャピラリー（外径１．０ｍｍ、内径０．６８ｍｍ）から生成したｎａｎｏＥＳＩ先端部にロードした。  ＥＳＩを実行するために、プラチナワイヤをｎａｎｏＥＳＩ先端部に挿入し、１．１０ｋＶの電圧を印加した。６０℃のソース温度を使用した。コーン、トラップ、およびトランスファー電圧は、それぞれ５０Ｖ、５Ｖ、および２Ｖであって、トラップガス流量は、６０ｍＬ・分−１であって、他の全てのパラメーターを、デフォルト値に設定した。データの収集および処理は、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．１）を使用して実行した。
【００５６】
Ｎ末端アミノ酸配列。切断されたＳドメインタンパク質を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルスライスを切り取り、アイオワ州立大学のタンパク質施設（ｈｔｔｐ：／  ／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｉａＳｔａｔｅ．ｅｄｕ／）において、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．からの４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ／１４０Ｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行った。
【００５７】
マウスの免疫化。３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、以下の免疫原（１０μｇ／マウス）：１）Ｓ６０−ＶＰ８キメラ粒子、２）遊離ＶＰ８タンパク質、３）ＶＰ８抗原を含まないＳ６０粒子、および４）同量の希釈液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で免疫化するために、４つの群（Ｎ＝６）に分けた。免疫化を、Ｉｎｊｅｃｔ  Ａｌｕｍアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５０μｌ／マウス）で２週間間隔で３回、筋肉内で行った。３回目の免疫化の２週間後に血液を採取し、標準プロトコルを使用して血液試料から血清を調製した。
【００５８】
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）。以前に説明されているように、異なる免疫原で免疫化した後のマウス血清の抗体価を測定するために、ＥＩＡを実施した［４６］。１μｇ／ｍＬのゲル濾過精製遊離ＶＰ８抗原を、９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングし、連続希釈したマウス血清とインキュベートした［４７］。結合した抗体を、ヤギ抗マウス二次抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）によって検出した。抗体力価は、ＯＤ４５０＝０．１のカットオフシグナル強度を有する限界希釈法によって定義された。
【００５９】
ＨＢＧＡ結合アッセイ。合成オリゴ糖および唾液ベースのＨＢＧＡ結合アッセイを実行して、ＶＰ８を提示するＳ６０粒子のそれらのＨＢＧＡリガンドへの結合機能を測定した［４５］。簡単に言うと、Ｈ１、Ｌｅｂ、およびＬｅｙ抗原をそれぞれ表す合成オリゴ糖（２μｇ／ｍＬ）、またはＨ１および／もしくはＬｅｂ陽性またはＨ１およびＬｅｂ陰性である煮沸した唾液試料（１：１０００希釈）を、９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングし、様々なＳ６０−ＶＰ８粒子またはＲＶ  ＶＰ８を含まないＳ６０粒子とともに、指示された濃度でインキュベートした。結合タンパク質を、モルモット抗ＶＰ８抗血清（Ｓ６０−ＶＰ８粒子の場合）またはＧＩＩ．４Ｎｏｖ  ＶＬＰに対するモルモット過免疫血清（Ｓ６０粒子の場合）、続いてＨＲＰ結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のインキュベーションによって測定した。
【００６０】
ＲＶ  ＶＰ８−ＨＢＧＡリガンド付着に対する血清ブロッキング力価。これは、前述のように、代理中和アッセイとして実施した［４７］。煮沸し、陽性Ｈ１およびＬｅｗｉｓ  ｂ（Ｌｅｂ）抗原である、Ｐ［８］ＲＶ［４５、５８］のリガンドで希釈した（１：１０００）ヒト唾液試料を、マイクロタイタープレートにコーティングした。ＰＰ−ＶＰ８をコーティングされた唾液試料に添加する前に、様々な免疫原（Ｓ６０−ＶＰ８粒子、遊離ＶＰ８抗原、Ｓ６０粒子、ＰＢＳ）で免疫化した後、６２５ｎｇ／ｍＬのＰ粒子提示ＲＶ  ＶＰ８（ＰＰ−ＶＰ８）［４６］を免疫後血清とともに異なる希釈度でプレインキュベートした。５０％ブロッキング力価（ＢＴ５０）は、ブロックされていない陽性対照と比較して、ＰＰ−ＶＰ８粒子のＨＢＧＡ／唾液試料への結合に対して少なくとも５０％の低下を引き起こす最低血清希釈度として定義された。
【００６１】
ＲＶ中和アッセイ：これは以前に記載されたように実施した［５３］。簡単に言うと、ＭＡ１０４細胞を６ウェルプレートで培養し、組織培養に適応したＲＶ  Ｗａ株（Ｇ１Ｐ［８］）を力価約５０ＰＦＵ／ウェルで接種材料として使用した。トリプシン処理したＷａ  ＲＶを、指示された免疫原（上記参照）で１時間免疫化した後、マウス血清とインキュベートし、その後細胞に添加した。プレートに、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．８％アガロースを含む培地を重ねた。４日間のインキュベーション後、プラークを染色し、計数した。血清の中和率（％）を、未処理の対照ウェルの数に対する抗血清で処理したウェルのプラーク数の減少によって計算した。
【００６２】
Ｓ６０粒子の構造モデリング。Ｈｉｓｘ６ペプチドを含むかまたは含まないＳ６０粒子およびＳ６０−ＶＰ８キメラ粒子の構造を、ソフトウェアＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．８．２．０（Ｓｃｈｒｏｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）使用して、６０価のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）ＶＬＰ［５９］  の結晶構造（ＰＤＢ＃：４ＰＢ６）をテンプレートとして使用してモデル化した。全ての結晶構造ベースの画像は、このソフトウェアによって作成された。
【００６３】
ｃｒｙｏＥＭによるＳ６０−ＶＰ８キメラ粒子の構造再構築。これは、出願人の以前の研究［２０、２１、４６］で説明されている同様のｃｒｙｏ−ＥＭアプローチを使用して実行した。簡単に言うと、ゲル濾過精製したＳ６０−ＶＰ８キメラ粒子のアリコート（３〜４μＬ）を、Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッド上で瞬間凍結し、次いで、それを顕微鏡にロードした。低電子（ｅ）線量画像（約２０ｅ／Å２）を、公称倍率×５０，０００、およびデフォーカス範囲２．０〜４．０μｍでＣＭ２００低温顕微鏡を使用してフィルムに記録させた。顕微鏡写真を、Ｎｉｋｏｎ  Ｓｕｐｅｒ  ＣｏｏｌＳｃａｎ  ９０００ＥＤスキャナーを６．３５μｍ／ピクセルのステップサイズで使用して、選択およびデジタル化した。スキャンされた画像をビニングし、２．４９Å／ピクセルで画像の最終サンプリングをもたらした。Ｓ６０−ＶＰ８キメラ粒子の画像を、ＥＭＡＮのボクサープログラムを使用して選択した。選択した画像を手動でフィルタリングして、偽陽性を除外した。ＥＭＡＮのｃｔｆｉｔプログラムを使用して、同じ顕微鏡写真に由来する粒子画像のセットに関連付けられたコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）パラメーターを手動で決定した。粒子の初期モデルを、ＥＭＡＮのｓｔａｒｔｏｃｔプログラムを使用して作成した。次いで、ＥＭＡＮの精製プログラムを使用して、未加工粒子の中心および方向を繰り返し決定し、収束するまでＥＭＡＮのｍａｋｅ３ｄプログラムによって２Ｄ画像から３Ｄマップを再構築した。Ｓ６０−ＶＰ８キメラ粒子の再構築中に、二十面体対称性を付与した。Ｓ６０粒子モデル（上記参照）およびＰ［８］ＲＶ  ＶＰ８（２ＤＷＲ）のフィッティングを含むｃｒｙｏ−ＥＭモデルの分析を、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａソフトウェア（バージョン１．１２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｂｖｉ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｃｈｉｍｅｒａ）を使用して実施した。
【００６４】
統計的分析。データセット間の統計的差異を、対応のないノンパラメトリックｔ検定を使用して、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）によって計算した。Ｐ値は、有意差があるについては０．０５（Ｐ<０．０５）、非常に有意差があるについては０．０１（Ｐ<０．０１）、および極めて有意差があるについては０．００１（Ｐ<０．００１）に設定した。
【００６５】
倫理的声明。この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイド（２３ａ）の推奨事項に厳密に従って実施した。プロトコルは、シンシナティ小児病院研究財団（動物福祉保証番号Ａ３１０８−０１）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【００６６】
【００６７】
結果
天然ＮｏＶ  Ｓドメインの低粒子形成効率。出願人の研究は、発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を使用したＥ．ｃｏｌｉ中でのＧＩＩ．４  ＮｏＶ（ＶＡ３８７）のヒンジを有する天然のＳドメインの産生から開始し、約５１ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有するＧＳＴ−Ｓドメイン融合タンパク質をもたらした（図１、ＡおよびＢ）。ＧＳＴがセファロースビーズに結合したままである間、ＧＳＴを含まない約２５ｋＤａの遊離Ｓドメインタンパク質（図１Ｃ）を、トロンビン切断により得た。Ｓタンパク質のＥＭ観察により、集合したＳ粒子と同等である可能性が最も高い、直径約２０ｎｍの薄い層のリング状構造がほとんどないことが明らかになった（図１Ｄ）。Ｓ粒子形成効率を決定するために、Ｓドメインタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーを実施し、２つの広いピークが明らかになった（図１Ｅ）。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（図１Ｆ）に続いてＮｏＶ  ＶＬＰ過免疫血清［１５］を使用したウェスタン分析（データ図示せず）およびＮ末端配列決定（図２、以下を参照）により、両方のピークがＳタンパク質であることを確認した。８００ｋＤａを超える高ＭＷを有するピーク１は、自己集合化Ｓ粒子または複合体を表すはずであり、一方ピーク２は、Ｓドメインモノマー（約２５ｋＤａ）および／またはダイマー（約５０ｋＤａ）であるはずである。
【００６８】
出願人はまた、ＧＳＴ−Ｓ融合タンパク質（図１Ｂ、４２ｋＤａ）および遊離Ｓタンパク質（図１Ｃ、１６ｋＤａ）とそれぞれ同時発生するより低いＭＷを有する微量のタンパク質バンドも観察し、これらの微量タンパク質バンドが、ＮｏＶ  ＶＬＰ特異的抗体と反応し（データ図示せず）、Ｓドメイン配列を示したため、これらはＳタンパク質のプロテイナーゼ切断型であるはずである（図２、下記参照）。出願人はさらに、Ｓ粒子または複合体に集合したＳドメインタンパク質が、ほとんどがより小さなＳドメインタンパク質に消化されたことに留意した（図１ＥおよびＦ、ピーク１、画分＃１５および＃１６）。対照的に、集合していないＳタンパク質は無傷のままであり（図１ＥおよびＦ、ピーク２、画分＃２８および＃２９）、集合したＳ粒子または複合体は、プロテイナーゼに対して感受性であったが、集合していないＳタンパク質はそうではなかったことを示唆している。ピーク１が総Ｓタンパク質のごく一部（<２５％）に過ぎないという事実から、出願人は、天然のＮｏＶ  Ｓドメインタンパク質が低効率で粒子に集合したと結論付けた。
【００６９】
Ｓタンパク質中の露出したプロテアーゼ切断部位の特定。上記の発見により、我々はプロテアーゼ切断部位を特定するよう促された。これは、約１６ｋＤａの２つの切断されたＳタンパク質バンドのＮ末端配列決定により達成され（図１、ＣおよびＦ）、同じ５残基のＮＡＰＧＥ配列をもたらした（図２Ａ）。このペンタ残基は、Ｓドメイン配列Ｎ７０〜Ｅ７４と一致しており、切断部位がＲ６９とＮ７０との間にあり、これがトリプシトリプシン／クロストリパイナ認識部位であることを示している（図２Ｂ）。ＮｏＶ  ＶＰ１配列の遺伝子解析により、このプロテアーゼ部位は、全てのＧＩＩ  ＮｏＶの間で高度に保存されていることを示した（図２Ｃ）。ＧＩＩ  ＮｏＶシェル構造の構造解析（Ｗｅｎ  Ｊｉａｎｇ、未公開データ）は、このプロテアーゼ部位がシェル表面に露出していることを示した（図２Ｄ）。
【００７０】
高いＳ粒子形成効率のためのプロテアーゼ部位の破壊。上記のデータに基づいて、出願人はプロテイナーゼ切断部位を破壊するためにＲ６９Ａ変異を導入し、ＳＲ６９Ａタンパク質をもたらした。さらに、出願人は、Ｃ末端に連結されたＨｉｓｘ６ペプチドを使用してＧＳＴタグを置換し、単純化された精製手順のためのトロンビン切断ステップを回避した（図３Ａ）。出願人はまた、Ｓ粒子の抗原提示の概念を証明するために、Ｈｉｓｘ６ペプチドに柔軟性を持たせるために、ヒンジとＨｉｓｘ６ペプチドの間に短いリンカー（ＧＧＧＧ）を挿入した。
【００７１】
ＳＲ６９Ａタンパク質（約２５ｋＤａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ系で十分に産生され、Ｈｉｓｘ６結合ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎによって非常に高い収率（>４０ｍｇ  ／  細菌培養１リットル細菌培養）かつ高い安定性で精製できた（図３Ｂ）。ＥＭ観察は、約２２ｎｍの直径の自己集合化Ｓ粒子を表す、サイズが統一された多くのリング状構造を示した（図３Ｃ）。ゲル濾過は、Ｓ粒子（>１ｍＤａ）、Ｓダイマー（約５０ｋＤａ）、Ｓモノマー（約２５ｋＤａ）をそれぞれ表すはずである１つの大きなピークと２つの小さなピーク（図３、ＤおよびＥ）を、ＥＭ観察およびＥＳＩ−ＭＳ分析（下記）によって支援された、それらのＭＷに基づいて、明らかにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、しばしば、ＮｏＶ  ＶＬＰ特異的抗体と反応する、約５０ｋＤａ（図３、ＢおよびＥ）における小さなピークを明らかにしており、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、これらが完全に変性されていないＳドメインダイマーであることを示している。これは、ダイマー（ピーク２：＃１６））およびモノマー（ピーク３：＃１９）画分と比較して、ゲル濾過クロマトグラフィー（図３、ＤおよびＥ）のＳ粒子画分（ピーク１：画分＃８および＃９）で特に明白であった。これらのデータは、ＳＲ６９Ａタンパク質の大部分が統一されたＳ粒子に集合したことを示した。
【００７２】
ＳＲ６８Ａタンパク質の６０価のＳ６０粒子への自己集合。次に、出願人はＥＳＩ−ＭＳ分析を実行して、ＳＲ６９Ａタンパク質の複雑さを決定し、３つのタンパク質形態：１）２５．０４７ｋＤａでのＳモノマー、２）５０．０９５ｋＤａのＳダイマー、および３）約１．４７ｍＤａでのＳ粒子を明らかにした（図３Ｆ）。組換えＳドメインタンパク質の計算されたＭＷは２４５８５．８９ダルトンであるため（図２Ｂ）、観察された自己集合化Ｓ粒子はそれに応じてＳ６０粒子と表記される６０価でなければならない。約１．４７ｍＤａを超えるシグナルが観察されなかったという事実は、従来の１８０価のＳ粒子が集合しなかったことを示しており、ＥＭで観察された統一粒子サイズと一致した（図３Ｃ）。これらの６０価のＳ６０粒子は、ｃｒｙｏＥＭ技術によるＳ６０−ＶＰ８キメラ粒子の構造再構築によってさらに確認された（図７、下記参照）。
【００７３】
Ｓ６０粒子の構造モデリング。６０価のＮｏＶカプシドまたはその内部シェルの詳細な構造は不明のままであるが、６０価のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）ＶＬＰの結晶構造が報告されており［５９］、Ｓ６０粒子をモデル化して構造を理解する方法を提供している。Ｓ６０粒子の構造モデルを、６０価ＦＣＶ  ＶＬＰ（ＰＤＢ＃：４ＰＢ６）の結晶構造をテンプレートとして使用して構築した（図４、Ｂ〜Ｄ）。モデル化されたＳ６０粒子は、５回軸または２回軸でそれぞれ幾分五角形（図４Ｃ）および六角形（図４Ｄ）の形状を呈した。これらの五角形および六角形の形状は、ＥＭ顕微鏡写真のＳ６０粒子間で容易に認識できる（図４Ａおよび図３Ｃ）。加えて、Ｓ６０粒子モデルは、Ｓ６０−ＶＰ８粒子のｃｒｙｏＥＭ密度マップのＳ６０粒子領域（図７、Ｄ〜Ｆ）に十分に適合し、６０価のＦＣＶシェルとＮｏＶ  Ｓ６０粒子との間の構造的な類似性を裏付けている。予想通り、６０個のＣ末端ヒンジが各Ｓ６０粒子の表面に露出しており（図４、Ｂ〜Ｄ））、Ｓ６０粒子によって提示される外来抗原への優れた融合点を提供している。
【００７４】
出願人はまた、Ｓ６０粒子による抗原提示を模倣するために、Ｃ末端リンカー（ＧＧＧＧ）およびＨｉｓｘ６ペプチドを用いてＳ６０粒子をモデル化した（図４、Ｅ〜Ｇ）。結果として得られたモデルは、６０個のＨｉｓｘ６ペプチドが各Ｓ６０粒子の表面上に提示されたことを示しており、Ｃ末端結合Ｈｉｓｘ６ペプチドを有するＳ６０粒子がＨｉｓｘ６結合樹脂によって効率的に精製されたという事実を裏付けている（図３Ｂ）。したがって、他の病原体からの様々な抗原も、Ｓタンパク質の露出したＣ末端に融合することにより、Ｓ６０粒子によって提示され得ると十分に考えられる。
【００７５】
Ｓ６０−ＶＰ８キメラ粒子の産生および特性評価。免疫原性を高める抗原提示のためのプラットフォームとしてのＳ６０粒子の実現可能性を証明するために、出願人は、主要なＲＶ中和抗原であるＲＶ  ＶＰ８タンパク質を提示するＳ６０−ＶＰ８キメラ粒子を産生した。これは、リンカーを介してＲＶ  ＶＰ８タンパク質をＳＲ６９Ａタンパク質のＣ末端に融合させることにより達成した（図５Ａ）。Ｈｉｓｘ６ペプチドを精製目的でＶＰ８タンパク質のＣ末端に付加した。ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８キメラタンパク質（約４５ｋＤａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ系で>３０ｍｇ  ／１リットルの細菌培養物の高収量で良好に発現された（図５Ｂ）。Ｓ  Ｒ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質のゲル濾過分析は、分子量に基づいて、それぞれＳＲ６９Ａ−ＶＰ８粒子（ピーク１）、ダイマー（ピーク２）、およびモノマー（ピーク３）を表す可能性が最も高い、３つの典型的なピークを明らかにした（図５Ｃ）。３つのピークの保持比較は、ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質の約半分が粒子に自己集合化したことを示した（ピーク１対ピーク２およびピーク３）。
【００７６】
ピーク１からのタンパク質のＥＭ観察は、表面がＶＰ８タンパク質を提示するために認識可能な突起を有する統一サイズの多くのＳＲ６９Ａ−ＶＰ８粒子（Ｓ６０−ＶＰ８粒子と称される）が明らかにしており（図５Ｄ）、これはＳ６０粒子の比較的滑らかな表面とは異なる粗な表面をもたらす（図３Ｃおよび４Ａ）。ピーク１タンパク質のＥＳＩ−ＭＳ分析は、分子量が約３．４ｍＤａの予想される６０価のＳ６０−ＶＰ８粒子を明らかにした（図５Ｅ）。これもまた、同じタンパク質の顕微鏡写真上のＳ６０−ＶＰ８粒子の統一サイズと一致して、１８０価の粒子のシグナルは観察されなかった（図５Ｄ）。しかしながら、ＥＳＩ−ＭＳ分析は、ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質のモノマー（４４．９５０ｋＤａ）および１９．９０ｋＤａの微量の分解産物を明らかにしており、Ｓ６０−ＶＰ８粒子がモノマーに分解できることを示した。
【００７７】
Ｓ６０−ＶＰ８粒子のさらなる安定化。ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質による比較的低い粒子形成効率は、Ｓ粒子内の隣接するＳドメイン間の分子間相互作用を増加させることにより改善の余地があることを示した。ＧＩＩ．４シェル構造（Ｗ．Ｊ．、未公開データ）の精査により、ＳドメインのＶ５７およびＱ５８はそれぞれ、隣接するＳドメインのＭ１４０およびＳ１３６に立体的に近く、距離は５．７〜５．９Åであることを示した（図６、ＡおよびＢ）。これは、２つのペア残基が、Ｓドメイン間ジスルフィド結合を導入してＳ６０−ＶＰ８粒子形成をさらに強化するのに適した位置であることを示唆した。
【００７８】
ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質のＶ５７およびＭ１４０がシステインに変異した場合（図６Ｃ）、Ｓ６９Ａ／５８Ｃ／１４０Ｃ−ＶＰ８タンパク質は、>５０ｍｇ／細菌培養１リットルの非常に高い収量で良好に発現された（図６Ｄ）。ゲル濾過分析は、タンパク質の大部分（約７０％）がＳ６０−ＶＰ８粒子に集合していることを示し（図６Ｅ）、これはＥＭ観察によって確認された（データ図示せず）。Ｓモノマーを表すピーク３は完全になくなっており、ジスルフィド結合の導入後のＳ間ドメイン相互作用の増加を裏付けていることが留意された。
【００７９】
ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質のＶ５７、Ｑ５８、およびＳ１３６がシステインに変異した場合（図６Ｆ）、Ｓ６９Ａ／５７Ｃ／５８Ｃ／１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質は、>４０ｍｇ／細菌培養１リットルの高い収量で産生され得る（図６Ｇ）。ゲル濾過分析（図６、ＨおよびＪ）は、Ｓ６９Ａ／５７Ｃ／１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質の大部分（>９０％）がＥＭ観察によって確認されたＳ６０−ＶＰ８粒子に自己集合したことを示した（図６Ｉ）。注目すべきことに、Ｓダイマーとモノマーをそれぞれ表すピーク２と３の両方が消失し（図６、ＨおよびＪ）、Ｓドメイン間ジスルフィド結合の結果として、Ｓ６０−ＶＰ８粒子形成効率が劇的に増加したという概念を裏付けている。出願人はまた、ＳＲ６９Ａ−ＶＰ８タンパク質の４つ全てのＶ５７、Ｑ５８、Ｓ１３６、およびＭ１４０に四重システイン変異を実施し、タンパク質収量およびＳ６０−ＶＰ８粒子形成効率の結果は、Ｓ６９Ａ／５７Ｃ／５８Ｃ／１３６Ｃ−ＶＰ８タンパク質のものと同様であって（データ図示せず）、四重システイン変異が非常に安定したＳ６０−ＶＰ８粒子を産生するのに十分に良好であったことを示した。
【００８０】
Ｓ６０−ＶＰ８粒子の構造。出願人は、ｃｒｙｏ−ＥＭ技術（材料および方法を参照）によりＳ６０−ＶＰ８粒子の三次元（３−Ｄ）構造を１４Åの解像度で構築し、６０個のＳ−ＶＰ８タンパク質を含むＴ＝１対称性を示した（図７）。Ｓ６０−ＶＰ８粒子の表面構造（図７Ａ）は、ＶＰ８抗原がＳ６０−ＶＰ８粒子の表面上に提示され、内部Ｓ６０粒子から延びる突起を形成した。Ｓ６０−ＶＰ８粒子の中央スライス（図７Ｂ）および後半のスライス構造（図７Ｃ）は、外部ＶＰ８抗原（シアン色ならびに部分的な緑色）および内部Ｓ６０粒子（赤色、黄色ならびに部分的な緑色）の構造を示した。二十面体Ｓ６０粒子の５回軸を認識することができる（図７Ｃ）。Ｓ６０−ＶＰ８キメラ粒子の直径は、約２８ｎｍである。
【００８１】
６０価のＦＣＶシェル（ＰＤＢ＃：４ＰＢ６）の結晶構造がＳ６０−ＶＰ８粒子ｃｒｙｏＥＭ密度マップのＳ６０粒子部分に適合した場合、両方の構造が非常によく適合した（図７、Ｄ〜Ｆ）。Ｓ６０−ＶＰ８粒子の前半（図７Ｄ）、中央スライス（図７Ｅ）、後半（図７Ｆ）の適合ＦＣＶシェル構造を用いた透明なｃｒｙｏＥＭ密度マップは、ＦＣＶの６０価のシェル構造とＳ６０−ＶＰ８粒子のＮｏＶ  Ｓ６０粒子領域との間の優れた適合性を証明し、出願人のＳ６０粒子（図４）およびＳ６０−ＶＰ８粒子の６０価の二十面体構造を確認した。
【００８２】
次に、出願人は、Ｐ［８］ＲＶ  Ｗａ株のＶＰ８結晶構造（ＰＤＢコード：２ＤＷＲ）の適合した６０コピーを、Ｓ６０−ＶＰ８粒子ｃｒｙｏＥＭ密度マップの突起領域にフィッティングした（図７、ＧおよびＨ）。適合したＶＰ８結晶構造を有するＳ６０−ＶＰ８粒子の前半（図７Ｇ）および中央スライス（図７Ｈ）の透明なｃｒｙｏＥＭ密度マップは、Ｓ６０−ＶＰ８粒子の突起領域と６０個のＶＰ８構造との優れた適合性を示し、Ｓ６０粒子の表面上のＶＰ８抗原の構造と配向をさらに確認した。この適合結果に基づいて、出願人は、６０価のＦＣＶシェルの結晶構造およびＰ［８］ＲＶの６０個のＶＰ８を使用して、Ｓ６０−ＶＰ８粒子モデルを作成した（図７Ｉ）。
【００８３】
ＶＰ８を提示したＳ６０粒子は、リガンド結合機能を保持している。出願人の以前の研究は、Ｐ［８］ＲＶのＶＰ８がＨ１抗原に結合したが、Ｌｅｙ抗原には結合しなかったことを示している［４５］。唾液ベースの結合アッセイは、Ｓ６０−ＶＰ８粒子がＨ１および／またはＬｅｂ抗原陽性の唾液試料に結合したが、Ｈ１およびＬｅｂ抗原に陰性の唾液試料には結合しなかったことを示した。これらのデータは、Ｓ６０粒子を提示したＶＰ８抗原がリガンド結合機能と正しく収められており、Ｓ６０−ＶＰ８粒子がＲＶワクチン候補として有効であることを示している。
【００８４】
Ｓ６０粒子が提示されたＶＰ８抗原に対する改善された免疫原性。Ｓ６０−ＶＰ８粒子をマウスに免疫化し（Ｎ＝６）、比較用の対照として遊離ＶＰ８抗原を使用してＶＰ８特異的免疫応答を測定した。３回の免疫化の後、Ｓ６０−ＶＰ８粒子による免疫化後のＶＰ８特異的ＩｇＧ応答は、遊離ＶＰ８によって誘導された応答よりも１１．６倍高かった（Ｐ＝０．０００４）（図１０Ａ）。陰性対照としてのＳ６０粒子は、ＶＰ８特異的ＩｇＧ応答を誘発しなかった。これらのデータは、Ｓ６０粒子が提示されたＲＶ  ＶＰ８抗原の免疫原性を改善できることを示した。
【００８５】
Ｓ６０−ＶＰ８粒子誘発抗血清は、ＶＰ８リガンド結合に対する遮断を強化した。ＶＰ８のＲＶホストリガンドまたは受容体への結合は、ＲＶ感染の重要な段階である［４３］。したがって、ＲＶ  ＶＰ８タンパク質のＨＢＧＡへの結合に対するインビトロブロッキングアッセイは、代理ＲＶ中和アッセイとして開発された［４７］。出願人は、以前に開発されたＰ−ＶＰ８粒子［４７］およびＲＶリガンドとしてのＬｅｂ陽性唾液試料［４５］を使用して、このようなブロッキングアッセイを実施した。出願人は、Ｓ６０−ＶＰ８粒子で免疫化した後のマウス抗血清は、遊離ＶＰ８抗原で免疫化した後の抗血清のものよりも２２．８倍高い５０％ブロッキング力価（ＢＴ５０）を示したことを見出し（Ｐ＝０．０００３）（図１０Ｂ）、Ｓ６０粒子が提示されたＲＶ  ＶＰ８抗原の免疫原性を大幅に改善するという見解をさらに裏付けた。陰性対照として、ＶＰ８抗原を含まないＳ６０粒子で免疫化した後のマウス血清は、このような遮断を明らかに示さなかった。
【００８６】
Ｓ６０−ＶＰ８粒子誘発抗血清は、ＲＶ感染に対する中和を強化しました。出願人はまた、従来の細胞培養に基づく中和アッセイを実施して、細胞培養に適応した（Ｐ［８］）ＲＶ  Ｗａ株の感染に対するＳ６０−ＶＰ８粒子誘発抗血清の中和活性を決定した。ＢＴ５０（上記参照）と一致して、Ｓ６０−ＶＰ８粒子での免疫化後のマウス抗血清は、３種類の異なる血清希釈（１：７５、１：１５０、および１：３００）で、遊離ＶＰ８抗原で免疫化された後の抗血清のものよりも著しく高い中和活性を示した（それぞれＰ＝０．０００３、Ｐ＝０．０００１、およびＰ＝０．００１６）（図１０Ｃ）。ＶＰ８抗原を含まないＳ６０粒子で免疫化した後のマウス血清は、このような中和活性を明らかに示さなかった。これらのデータは、Ｓ６０粒子が、提示されたＲＶ  ＶＰ８抗原の免疫原性を増加させるための有力なワクチンプラットフォームであり、Ｓ６０−ＶＰ８粒子がＲＶ感染に対する有望なワクチン候補であるという概念をさらに裏付けた。
【００８７】
多機能ワクチンプラットフォームとしてのＳ６０粒子。ＲＶ  ＶＰ８抗原に加えて、出願人は、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２ｅエピトープ、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）のＴＳＲ抗原、およびＥ型肝炎ウイルスのＰドメインを含むリンカーを介して、同じ露出ＳドメインＣ末端を介してＳ６０粒子にいくつかの他のエピトープと抗原を融合することができた（表１）。したがって、人工的に開発されたＳ６０粒子は、新規ワクチン開発のための多機能プラットフォームとして機能する。
【表１】
2020515531.tif 000003
【００８８】
１Ｍ２ｅエピトープは、Ａ型インフルエンザウイルスのプロトン選択性イオンチャネルを形成するマトリックス−２（Ｍ２）タンパク質の外部ドメインである。２ＴＳＲ／ＣＳＰ抗原は、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの宿主細胞侵入において重要な役割を果たすスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）の主要な表面タンパク質のＣ末端抗原である。３完全ＲＶ  ＶＰ８は、ヒトＰ［８］ロタウイルスのスパイクタンパク質の完全長ＶＰ８ドメインである。３ネズミＲＶ  ＶＰ８は、ネズミロタウイルスのスパイクタンパク質のコア部分である。４ＨＥＶ  Ｐドメインは、Ｅ型肝炎ウイルスキャプシドの突起ドメインである。
【００８９】
考察
この研究では、出願人は、単純な細菌発現系を介して高効率で統一された６０価のＮｏＶ  Ｓ６０粒子を産生するための新しい技術を開発した。これは、ＮｏＶキャプシドの内部シェルを自然に構築するＮｏＶ  ＶＰ１  Ｓドメインのホモタイプの相互作用、ならびにＳドメインタンパク質を安定化させ、Ｓドメイン間相互作用を強化するためのいくつかの改変を活用することによって達成された。具体的には、出願人は、Ｒ６９Ａ変異を導入して、そうでなければ、Ｓタンパク質の容易な分解をもたらす、天然のシェル上の露出したプロテアーゼ切断部位を破壊した。加えて、出願人は、三重（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ）または四重（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ／Ｍ１４０’Ｃ）ステイン変異を、２つの隣接するＳドメイン間の立体的に近い残基の２つの対（Ｖ５７／Ｍ１４０’およびＱ５８／Ｓ１３６’、図６）に導入して、Ｓドメイン間ジスルフィド結合を確立して、天然のＮｏＶシェルで示すものよりも強いＳドメイン間相互作用を確立した。最終的に、生物工学によって作られたＳドメインは、簡単なＥ．ｃｏｌｉ系によって高収率で容易に産生され、Ｓ６０粒子の高効率での自己形成をもたらした。
【００９０】
６０個の柔軟に露出したＳドメインＣ末端を有する自己集合化された多価Ｓ６０粒子は、ワクチン開発用に提示された抗原に対する免疫原性を改善するための抗原提示の理想的なプラットフォームである。この考えは、主要なＲＶ中和抗原である６０個のＲＶ  ＶＰ８タンパク質を提示するキメラＳ６０粒子を構築することにより、この研究で大部分が証明された。Ｓ６０−ＶＰ８粒子は、高い安定性で簡単に産生することができる。これらは、提示されたＶＰ８抗原に対するマウスで、遊離ＶＰ８タンパク質によって誘導されるものよりも有意に高いＩｇＧ応答を誘発した。Ｓ６０−ＶＰ８粒子によるワクチン接種後のマウス抗血清は、そのグリカンリガンドへのＲＶ  ＶＰ８の結合に対して有意に強い遮断を示し、遊離ＶＰ８抗原による免疫化後の血清よりも、培養細胞におけるＲＶ感染および複製に対する有意に高い中和活性を示した。Ｓ６０−ＶＰ８粒子ワクチンの保護効果は、出願人の研究室でネズミＲＶチャレンジモデルを使用して決定されているが、この報告の提示データは、Ｓ６０−ＶＰ８粒子がＲＶ感染に対する有望なワクチン候補であり、したがってＳ６０粒子が、新規ワクチン開発のための抗原提示のための優れたプラットフォームであるとの見解を強く裏付けた。
【００９１】
天然のＮｏＶキャプシドは、ＮｏＶの単一の主要な構造タンパク質である１８０個のＶＰ１によって作製される。真核生物系を介したＮｏＶ  ＶＰ１のインビトロ発現は、多くの場合、１８０価と６０価のＶＬＰの混合物をもたらし、２つのＶＬＰ形式は、人工変性および再生処置によって交換可能であった［６０］。まだ完全には研究されていないが、バキュロウイルス／昆虫細胞系を介した短縮型Ｓドメインの以前の発現は、１８０価のＳ粒子を自己集合化するように思われた［１１、２４］。しかしながら、発現システムを介して統一された６０価のＮｏＶ  ＶＬＰまたはＳ粒子は、これまで産生されたことはない。したがって、単純なＥ．ｃｏｌｉ系を介した統一ＮｏＶ  Ｓ６０粒子の出願人の産生技術は、生物工学の進歩を表している。統一されたＳ６０粒子の自己形成は、大幅に改変されたＳドメインと原核生物のＥ．ｃｏｌｉ発現系のユニークな畳み込みとの組み合わせ効果から生じ得る。ワクチンの複雑さとサイズのばらつきは、ワクチンの予防接種結果のばらつきにつながるため、ワクチン候補の均質な複雑さとサイズとは、品質管理のための重要な考慮事項である。
【００９２】
人工的に導入された分子間ジスルフィド結合は、ウイルスタンパク質の粒子または複合体を安定化させる一般的なアプローチとして使用され得る。出願人の以前のＮｏＶ  Ｐ粒子の構築中に、出願人は、システイン含有ペプチドをＮｏＶ  Ｐドメインの末端に付加すると、Ｐ間ダイマージスルフィド結合を介してＰ粒子形成が促進かつ安定化することを見出した［２０〜２３］。この現在の研究では、Ｓ６０粒子は効率的に自己集合したが（図３Ｄ）、ＶＰ８抗原の添加により、Ｓ６０−ＶＰ８粒子の元のバージョンの形成効率は比較的低かった（図５Ｃ）。注目すべきことに、Ｓ６０−ＶＰ８粒子の自己形成効率は、Ｓドメイン間ジスルフィド結合を導入することにより大幅に向上した。これは、２つの基本的なステップで達成された。まず、出願人はＧＩＩ．４  ＮｏＶ（Ｗｅｎ  Ｊｉａｎｇ、未公開データ）のシェル構造を分析して、２つの隣接するＳドメイン間の２対の立体的に近い（５．７〜５．９Å）残基（Ｖ５７／Ｍ１４０’およびＱ５８／Ｓ１３６’）を特定した（図６、ＡおよびＢ）。次に、これらの残基のうちの２〜４個を異なる組み合わせで同時にシステインに変異させ：１）Ｖ５７Ｃ／Ｍ１４０’Ｃ、２）Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ、３）Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ、４）Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１４０’Ｃ、および５）Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ／Ｓ１４０’Ｃ、続いて、これらを産生して、得られたＳ６０−ＶＰ８粒子の自己形成効率の測定を行った。
【００９３】
これらの変異の中で、三重システイン変異（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ）を伴うＳ６０−ＶＰ８粒子は、Ｓ−ＶＰ８タンパク質がＳ６０−ＶＰ８粒子に自己集合する９５％を超える最高の粒子形成効率を示した（図６、Ｆ〜Ｊ）。変異したＳ−ＶＰ８タンパク質のダイマーおよびモノマー形態は完全になくなった（図６Ｈを図５Ｃおよび図Ｅと比較して）。出願人はまた、四重システイン変異（Ｖ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ／Ｓ１４０’Ｃ）を伴うＳ６０−ＶＰ８粒子は、三重システイン変異を伴うものとほぼ同じ高効率のＳ６０−ＶＰ８粒子形成を示したことにも注目した（データ図示せず）。しかしながら、様々なシステイン変異の組み合わせの間でこれらの異なる結果の背後にある詳細な構造基盤またはメカニズムは、理解しにくいままである。これらの結果および出願人のＰ粒子に関する以前の研究［２０〜２３］は、分子間ジスルフィド結合の導入が、ウイルスタンパク質粒子または複合体形成を促進かつ安定化する一般的なアプローチとして利用できることを示唆した。これらのデータにしたがって、Ｒ６９ＡおよびＶ５７Ｃ／Ｑ５８Ｃ／Ｓ１３６’Ｃ変異を有するＳ６０−ＶＰ８粒子を使用して下流実験を行い、これと同時に、同じ変異を有する改変Ｓドメインを使用して下流実験を行い、他の抗原を提示するためのプラットフォームとしての安定したＳ６０粒子を産生するために使用されることになる。
【００９４】
この研究におけるＳ６０粒子およびＳ６０−ＶＰ８粒子は、ＳドメインまたはＳ−ＶＰ８タンパク質の露出したＣ末端に結合された小さなＨｉｓｘ６ペプチドを介して精製された。出願人のデータは、ＧＳＴタグがＳ６０およびＳ６０−ＶＰ８粒子の産生に適していないことを示し、なぜなら、これが大きく（２２０個の残基）、Ｓ６０粒子の形成を妨害し、余分なトロンビン切断ステップによって除去される必要があり、精製手順を複雑にするためである。加えて、タグフリー精製法の可能性も試験した。出願人は、Ｓ６０およびＳ６０−ＶＰ８粒子の両方が、硫酸アンモニウムによって選択的に沈殿し、ＰＢＳおよび他の緩衝液で分解できることを発見した（データ図示せず）。最後に、出願人は、Ｓ６０およびＳ６０−ＶＰ８粒子がゲル濾過サイズ排除カラムおよび陰イオン交換クロマトグラフィーで単一ピークとして溶出されることを発見した（データ図示せず）。これらのデータは、総じて、Ｓ６０およびＳ６０−ＶＰ８粒子、および最も可能性の高い他のＳ６０抗原キメラ粒子が、タグなしのアプローチで精製できることを示している。
【００９５】
６０個の自由に露出したＣ末端は、Ｓ６０粒子が有用なワクチンプラットフォームであることを促進する別の特徴である。外来の抗原またはエピトープは、組換えＤＮＡ技術により柔軟なリンカーを介してＳドメインの末端に簡単に融合することができる。この研究は、Ｓ６０−Ｈｉｓｘ６およびＳ６０−ＶＰ８粒子の構造的安定性によって、ならびにそれらのＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎ（Ｈｉｓｘ６）およびＨ１ならびにＬｅｂリガンド（ＲＶ  ＶＰ８）への優れた結合能力によって示されるように、Ｈｉｓｘ６ペプチドおよびＲＶ  ＶＰ８抗原がＳ６０粒子によって十分に提示され得ることを明らかに示した。加えて、他のいくつかの試験された抗原またはエピトープが、Ｓ６０粒子によって十分に提示され得るという事実は、Ｓ６０粒子が多機能ワクチンプラットフォームであることを示している。
【００９６】
Ｓ６０粒子のモデリング、６０価のＦＣＶ  ＶＬＰＰの結晶構造を使用したＳ６０−Ｈｉｓｘ６、およびｃｒｙｏＥＭ技術によるＳ６０−ＶＰ８粒子の３次元構造の再構築は、Ｓ６０粒子がどのようにＨｓｉｘ６ペプチドおよびＲＶ  ＶＰ８抗原を提示するかという構造的基盤に新しい洞察を提供する。Ｓ６０粒子モデルの構造をＳ６０粒子領域に適合させること、ならびにＶＰ８抗原の６０コピーをＳ６０−ＶＰ８粒子のｃｒｙｏＥＭ密度マップの突起領域に適合させることは、Ｓ６０粒子とそれらの提示される抗原の構造的関係をさらに明らかにするに違いない。これらの構造データは、Ｓ６０粒子による他の外来抗原の将来の提示の設計および理解に役立つであろう。最後に、これらの構造研究はまた、Ｓ６０粒子およびＳ６０−ＶＰ８粒子の６０価のＴ＝１の二十面体対称性も確認した。
【００９７】
要約すると、我々は、容易な産生、高い安定性、および高い免疫原性を特徴とし、抗原提示のための理想的なプラットフォームとして機能する、自己集合化多価タンパク質ナノ粒子を開発した。概念の証明として、ＶＰ８抗原を中和するＲＶの６０コピーを提示するキメラＳ６０粒子が構築された。出願人のデータは、高度に免疫原性のあるＳ６０−ＶＰ８粒子が、ＲＶ感染に対する有望なワクチン候補であること、およびＳ６０粒子が異なる病原体に対する新規ワクチン開発のための様々な抗原の免疫原性を高める多機能プラットフォームであることを示した。
【００９８】
参考文献
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［１８］Ｓｈａｎｋｅｒ  Ｓ，Ｃｚａｋｏ  Ｒ，Ｓａｎｋａｒａｎ  Ｂ，Ａｔｍａｒ  ＲＬ，Ｅｓｔｅｓ  ＭＫ，Ｐｒａｓａｄ  ＢＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  Ｉ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１４；８８：６１６８−８０。
【０１１６】
［１９］Ｈａｎｓｍａｎ  ＧＳ，Ｂｉｅｒｔｕｍｐｆｅｌ  Ｃ，Ｇｅｏｒｇｉｅｖ  Ｉ，ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＧＩＩ．１０  ａｎｄ  ＧＩＩ．１２  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｓｔｏ−Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｄｅｔａｉｌｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１１；８５：６６８７−７０１。
【０１１７】
［２０］Ｔａｎ  Ｍ，Ｆａｎｇ  ＰＡ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｃｈａｃｈｉｙｏ  Ｔ，Ｊｉａｎｇ  Ｗ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ．  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｕｌｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｕｂｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  Ｐ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１１；４１０：３４５−５２。
【０１１８】
［２１］Ｔａｎ  Ｍ，Ｆａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｃｈｉｙｏ  Ｔ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｆａｎｇ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｒｏｖｉｒａｌ  Ｐ  ｐａｒｔｉｃｌｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ−ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００８；３８２：１１５−２３。
【０１１９】
［２２］Ｔａｎ  Ｍ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ．Ｔｈｅ  ｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｓｕｂｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５；７９：１４０１７−３０。
【０１２０】
［２３］Ｂｅｒｅｓｚｃｚａｋ  ＪＺ，Ｂａｒｂｕ  ＩＭ，Ｔａｎ  Ｍ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，ｖａｎ  Ｄｕｉｊｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｎａｔｉｖｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２；１７７：２７３−８２。
【０１２１】
［２４］Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ  Ａ，Ｗｈｉｔｅ  ＬＪ，Ｃｈｅｎ  Ｒ，Ｐｒａｓａｄ  ＢＶ，Ｅｓｔｅｓ  ＭＫ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２；７６：４０４４−５５。
【０１２２】
［２５］Ｔａｔｅ  ＪＥ，Ｂｕｒｔｏｎ  ＡＨ，Ｂｏｓｃｈｉ−Ｐｉｎｔｏ  Ｃ，Ｓｔｅｅｌｅ  ＡＤ，Ｄｕｑｕｅ  Ｊ，Ｐａｒａｓｈａｒ  ＵＤ，ｅｔ  ａｌ．２００８  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｏｆ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｙｏｕｎｇｅｒ  ｔｈａｎ  ５  ｙｅａｒｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１２；１２：１３６−４１。
【０１２３】
［２６］Ｐａｒａｓｈａｒ  ＵＤ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＣＪ，Ｂｒｅｓｓｅ  ＪＳ，Ｇｌａｓｓ  ＲＩ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００６；１２：３０４−６。
【０１２４】
［２７］Ｗａｌｋｅｒ  ＣＬ，Ｒｕｄａｎ  Ｉ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｎａｉｒ  Ｈ，Ｔｈｅｏｄｏｒａｔｏｕ  Ｅ，Ｂｈｕｔｔａ  ＺＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１３；３８１：１４０５−１６。
【０１２５】
［２８］Ｖｅｓｉｋａｒｉ  Ｔ，Ｉｔｚｌｅｒ  Ｒ，Ｍａｔｓｏｎ  ＤＯ，Ｓａｎｔｏｓｈａｍ  Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ＣＤ，Ｃｏｉａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｒｅｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ（１１  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００７；１１  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２９−３５。
【０１２６】
［２９］Ｙｅｎ  Ｃ，Ｔａｔｅ  ＪＥ，Ｐａｔｅｌ  ＭＭ，Ｃｏｒｔｅｓｅ  ＭＭ，Ｌｏｐｍａｎ  Ｂ，Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：  ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｇｌｏｂａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ．Ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２０１１；７：１２８２−９０。
【０１２７】
［３０］Ｚａｍａｎ  Ｋ，Ｄａｎｇ  ＤＡ，Ｖｉｃｔｏｒ  ＪＣ，Ｓｈｉｎ  Ｓ，Ｙｕｎｕｓ  Ｍ，Ｄａｌｌａｓ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｖｅｒｅ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  Ａｓｉａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０；３７６：６１５−２３。
【０１２８】
［３１］Ｍａｄｈｉ  ＳＡ，Ｃｕｎｌｉｆｆｅ  ＮＡ，Ｓｔｅｅｌｅ  Ｄ，Ｗｉｔｔｅ  Ｄ，Ｋｉｒｓｔｅｎ  Ｍ，Ｌｏｕｗ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｉｎｆａｎｔｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０；３６２：２８９−９８。
【０１２９】
［３２］Ａｒｍａｈ  ＧＥ，Ｓｏｗ  ＳＯ，Ｂｒｅｉｍａｎ  ＲＦ，Ｄａｌｌａｓ  ＭＪ，Ｔａｐｉａ  ＭＤ，Ｆｅｉｋｉｎ  ＤＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｖｅｒｅ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａｎ  Ａｆｒｉｃａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０；３７６：６０６−１４。
【０１３０】
［３３］Ｌｉｕ  Ｙ，Ｒａｍｅｌｏｔ  ＴＡ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌｉ  Ｚ，Ｆｅｉｚｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐ［１９］Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｏｓｅ  ｏｆ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１６；９０：９９８３−９６。
【０１３１】
［３４］Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｔａｎ  Ｍ．  Ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ｎｅｗ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  &  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ２０１７；６。
【０１３２】
［３５］Ｄｅｓａｉ  Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ  ＭＭ，Ｍｅｌｔｚｅｒ  ＭＩ，Ｓｈａｎｋａｒ  Ｍ，Ｔａｔｅ  ＪＥ，Ｙｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  ｒｉｓｋ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｔｈｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１３；３２：１−７。
【０１３３】
［３６］Ｂａｕｃｈａｕ  Ｖ，Ｖａｎ  Ｈｏｌｌｅ  Ｌ，Ｍａｈａｕｘ  Ｏ，Ｈｏｌｌ  Ｋ，Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｋ，Ｂｕｙｓｅ  Ｈ．Ｐｏｓｔ−ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｓａｆｅｔｙ  ２０１５；２４：７６５−７０。
【０１３４】
［３７］Ｙｕｎｇ  Ｃ−Ｆ，Ｃｈａｎ  ＳＰ，Ｓｏｈ  Ｓ，Ｔａｎ  Ａ，Ｔｈｏｏｎ  ＫＣ．Ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ：Ｓｅｌｆ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｃａｓｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ−Ｂｅｎｅｆｉｔ  Ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２０１５；１６７：１６３−８．ｅ１。
【０１３５】
［３８］Ｒｏｓｉｌｌｏｎ  Ｄ，  Ｂｕｙｓｅ  Ｈ，  Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ＬＲ，  Ｎｇ  Ｓ−Ｐ，  Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  ＦＲ，  Ｂｒｅｕｅｒ  Ｔ．Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｌｉｃｅｎｓｕｒｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｔｈｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１５；３４：７６３−８。
【０１３６】
［３９］Ｙｉｈ  ＷＫ，Ｌｉｅｕ  ＴＡ，Ｋｕｌｌｄｏｒｆｆ  Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｄ，ＭｃＭａｈｉｌｌ−Ｗａｌｒａｖｅｎ  ＣＮ，Ｐｌａｔｔ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  ｒｉｓｋ  ａｆｔｅｒ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ．Ｓ．ｉｎｆａｎｔｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４；３７０：５０３−１２。
【０１３７】
［４０］Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ＥＳ，Ｂａｇｇｓ  Ｊ，Ｄｕｆｆｙ  Ｊ，Ｖｅｌｌｏｚｚｉ  Ｃ，Ｂｅｌｏｎｇｉａ  ＥＡ，Ｉｒｖｉｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４；３７０：５１３−９。
【０１３８】
［４１］Ｇｌａｓｓ  ＲＩ，Ｐａｒａｓｈａｒ  ＵＤ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ――ｂａｌａｎｃｉｎｇ  ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ  ｒｉｓｋｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４；３７０：５６８−７０。
【０１３９】
［４２］Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ  ＥＣ，Ｃｈｅｎ  ＪＺ，Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ  ＰＲ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ  Ｎ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ．Ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０１１；３０：４０８−１６。
【０１４０】
［４３］Ｈｕ  Ｌ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＳＥ，Ｃｚａｋｏ  Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓ−Ｐｅｎｆｉｅｌｄ  ＮＷ，Ｓｍｉｔｈ  ＤＦ，Ｌｅ  Ｐｅｎｄｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ８＊  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａ−ｔｙｐｅ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２；４８５：２５６−９。
【０１４１】
［４４］Ｈｕ  Ｌ，Ｒａｍａｎｉ  Ｓ，Ｃｚａｋｏ  Ｒ，Ｓａｎｋａｒａｎ  Ｂ，Ｙｕ  Ｙ，Ｓｍｉｔｈ  ＤＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｏｖｉｎｅ−ｈｕｍａｎ  ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１５；６：８３４６。
【０１４２】
［４５］Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｔａｎ  Ｍ，Ｚｈｏｎｇ  Ｗ，Ｗｅｉ  Ｃ，Ｗａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ８＊  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ａ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１２；８６：４８３３−４３。
【０１４３】
［４６］Ｔａｎ  Ｍ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｆａｎｇ  ＰＡ，Ｚｈｏｎｇ  Ｗ，ＭｃＮｅａｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１１；８５：７５３−６４。
【０１４４】
［４７］Ｘｉａ  Ｍ，Ｗｅｉ  Ｃ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃａｏ  Ｄ，Ｍｅｎｇ  ＸＪ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ，ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ａｎｄ  ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１６；６：２５７３５。
【０１４５】
［４８］Ｇｒｏｏｍｅ  ＭＪ，Ｋｏｅｎ  Ａ，Ｆｉｘ  Ａ，Ｐａｇｅ  Ｎ，Ｊｏｓｅ  Ｌ，Ｍａｄｈｉ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｐ２−ＶＰ８−Ｐ［８］ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｔｏｄｄｌｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１７；１７：８４３−５３。
【０１４６】
［４９］Ｗｅｎ  ＸＢ，Ｃａｏ  ＤＪ，Ｊｏｎｅｓ  ＲＷ，Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｙ，Ｙｕａｎ  ＬＪ．Ｔａｎｄｅｍ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ＶＰ８＊ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｓ  ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ．Ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  &  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２０１５；１１：２４８３−９。
【０１４７】
［５０］Ｄｕ  Ｊ，Ｌａｎ  Ｚ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌｉ  Ｙ，Ｌｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔａｉｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ＥＤＩＭ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１７；２２８：１３４−４０。
【０１４８】
［５１］Ｄｏｕｄ  ＭＢ，Ｋｏｋｓａｌ  ＡＣ，Ｍｉ  ＬＺ，Ｓｏｎｇ  Ｇ，Ｌｕ  Ｃ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＴＡ．Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｆｏｌｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２０１２；１０９：７８１７−２２。
【０１４９】
［５２］Ｘｉａ  Ｍ，Ｔａｎ  Ｍ，Ｗｅｉ  Ｃ，Ｚｈｏｎｇ  Ｗ，Ｗａｎｇ  Ｌ，ＭｃＮｅａｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｕａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１；２９：７６７０−７。
【０１５０】
［５３］Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｆａｎｇ  Ｈ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｚｈｏｎｇ  Ｗ，ＭｃＮｅａｌ  ＭＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１３；３４：４４８０−９２。
【０１５１】
［５４］Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃａｏ  Ｄ，Ｗｅｉ  Ｃ，Ｍｅｎｇ  ＸＪ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｔａｎ  Ｍ．  Ａ  ｄｕａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１４；３２：４４５−５２。
【０１５２】
［５５］Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｘｉａ  Ｍ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｆａｎｇ  Ｈ，Ｃａｏ  Ｄ，Ｍｅｎｇ  ＸＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１４；３５：８４２７−３８。
【０１５３】
［５６］Ｘｉａ  Ｍ，Ｗｅｉ  Ｃ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃａｏ  Ｄ，Ｍｅｎｇ  ＸＪ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ，ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ａｎｄ  ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１６；３４：９０５−１３。
【０１５４】
［５７］Ｔａｎ  Ｍ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ．Ｔｈｅ  ｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｓｕｂｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５；７９：１４０１７−３０。
【０１５５】
［５８］Ｌｉｕ  Ｙ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｔａｎ  Ｍ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｂｉｅｓｉａｄａ  Ｊ，Ｍｅｌｌｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ＶＰ８＊：ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ，ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１２；８６：９８９９−９１０。
【０１５６】
［５９］Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ  ＷＰ，Ｂｕｉｓｓｏｎ  Ｍ，Ｅｓｔｒｏｚｉ  ＬＦ，Ｓｃｈｏｅｈｎ  Ｇ，Ｂｉｌｌｅｔ  Ｏ，Ｈａｎｎａｓ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｌｉｎｅ  ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ａ  ｐｓｅｕｄｏ−ｏｃｔａｈｅｄｒａｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５；１０：ｅ０１１９２８９。
【０１５７】
［６０］Ｗｈｉｔｅ  ＬＪ，Ｈａｒｄｙ  ＭＥ，Ｅｓｔｅｓ  ＭＫ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌｅｒ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄｓ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７；７１：８０６６−７２。
【０１５８】
［６１］Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ＧＫ，ｖａｎ  Ｄｕｉｊｎ  Ｅ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＳＥ，Ｕｅｔｒｅｃｈｔ  Ｃ，Ｂａｃｌａｙｏｎ  Ｍ，Ｒｏｏｓ  ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  &  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ  ２０１０；９：１７４２−５１。
【０１５９】
全てのパーセンテージおよび比率は、特に指定がない限り、重量で計算される。
【０１６０】
全てのパーセンテージおよび比率は、特に指定がない限り、総組成に基づいて計算される。
【０１６１】
本明細書全体で与えられる全ての最大数値限界には、あたかもそのような低い数値限界が本明細書で明示的に書かれているかのように、全ての低い数値限界が含まれることを理解されたい。本明細書全体で与えられる全ての最大数値限界には、あたかもそのような高い数値限界が本明細書で明示的に書かれているかのように、全ての高い数値限界が含まれるであろう。本明細書を通して与えられる全ての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が全て本明細書で明示的に書かれているかのように、そのようなより広い数値範囲内に入るより狭い数値範囲を全て含むであろう。
【０１６２】
本明細書に開示される寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されると理解されるべきではない。代わりに、特に指定がない限り、このような各寸法は、列挙された値とその値を囲む機能的に同等な範囲の両方を意味することを意図している。例えば、「２０ｍｍ」として開示されている寸法は、「約２０ｍｍ」を意味することを意図している。
【０１６３】
任意の相互参照または関連する特許もしくは出願を含む、本明細書で引用される全ての文書は、明示的に除外ないしは別の方法で制限されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。文書の引用は、本明細書で開示もしくは請求された発明に関する先行技術であること、または単独で、または他の参考文献（単数または複数）との組み合わせで、このような発明を教示、示唆、または開示することを認めるものではない。さらに、この文書内の用語の意味または定義が参照により組み込まれた文書内の同じ用語の意味または定義と矛盾する限りにおいて、この文書でその用語に割り当てられた意味または定義が適用される。
【０１６４】
本発明の特定の実施形態を例示および説明したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく他の様々な変更および修正を行えることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更および修正を、添付の特許請求の範囲で網羅することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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