(57)【要約】  高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズが提供される。この磁性ビーズは、ｐＨ２〜１４で化学安定性を維持することができ、５０ｍｇ／ｍＬ超の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合能を有する。更に、免疫グロブリンを精製及び／または検出するための方法であって、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズに、免疫グロブリンを含む試料を接触させるステップを含む方法が提供される。耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、処置時間を約８０％節約し、全精製コストを５０％削減して、免疫グロブリンの迅速な精製を実現することができる。加えて、耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、高い耐アルカリ性を有する。使用後の磁性ビーズを再生するためにアルカリ性インサイチュ浄化方法を行うことができる。この磁性ビーズは、迅速な磁気応答及び良好な分散性を有し、迅速な磁性ビーズの濃縮、浄化、及び溶出を実現する。この磁性ビーズは、自動化されたハイスループットかつ大規模な試料の精製を容易にする。
2020509076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ２〜１４で化学安定性を維持することができ、５０ｍｇ／ｍＬ超の免疫グロブリンＩｇＧ結合能を有する、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項２】
前記磁性ビーズが、ｐＨ１０〜１４のアルカリ溶液中で各回１５分間にわたり５０回超インサイチュ浄化した後に４０ｍｇ／ｍＬ超の免疫グロブリンＩｇＧ結合能を有する、請求項１に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項３】
前記磁性ビーズが、６０ｅｕｍ／ｇ超の比飽和磁化を有する、請求項１に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項４】
前記磁性ビーズが、２０ｎｍ〜２００ｎｍまたは３０μｍ〜２００μｍの範囲の粒径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項５】
前記磁性ビーズが磁性コア部分及びリガンド部分を含み、前記磁性コア部分の主成分がＦｅ３Ｏ４であり、前記リガンド部分が耐アルカリ性プロテインＡである、請求項１に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項６】
前記磁性コア部分がＦｅ２Ｏ３を更に含み、Ｆｅ２Ｏ３：Ｆｅ３Ｏ４の質量比が１：１〜１：１００である、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項７】
前記高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ上の前記耐アルカリ性プロテインＡの量が３ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項８】
前記磁性コア部分が超常磁性である、請求項５または６に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項９】
前記磁性コア部分が、シリカ、グルカン、アガロース、ポリスチレン、ポリグリシジルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリスチレン−グリシジルメタクリレート、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される無機材料または有機材料からなる被覆層で被覆されており、前記リガンド部分が前記被覆層にカップリングしている、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１０】
前記被覆層が、前記リガンドと架橋するために必要とされる反応基、または前記被覆層の表面上の化学活性化もしくはカップリングによって前記リガンドと架橋するために必要とされる反応基を有する、請求項９に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１１】
前記反応基が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、及びエポキシ基から選択される、請求項１０に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１２】
前記耐アルカリ性プロテインＡが、過酷なアルカリ性条件下で処置された後に免疫グロブリンＩｇＧに確実に結合できるように、ｐＨ１０〜１４の強アルカリ環境においてタンパク質高次構造の安定性を維持することができる、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１３】
前記耐アルカリ性プロテインＡが、免疫グロブリンＩｇＧに結合することができる２〜４つのドメインを含む、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１４】
前記耐アルカリ性プロテインＡが、前記アガロースにカップリングすることにより前記被覆層に結合している、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１５】
前記耐アルカリ性プロテインＡが、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１６】
前記耐アルカリ性プロテインＡが、前記アミノ酸配列の相同２〜４量体及び／または異種２〜４量体である、請求項１５に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１７】
前記耐アルカリ性プロテインＡが、組換え発現された融合タンパク質の形態である、請求項１６に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ。
【請求項１８】
免疫グロブリンを精製及び／または検出するための方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズに、前記免疫グロブリンを含む試料を接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを再生するための方法であって、前記高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを、０．１〜１時間にわたり、０．１Ｍ〜０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液もしくは水酸化カリウム溶液またはこれら両方の混合溶液に浸漬してから、前記磁性ビーズを純水もしくは緩衝液に浸すか、または前記磁性ビーズを３〜５回すすいで、前記アルカリ溶液を完全に除去することと、前記高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを平衡化緩衝液中で保存することとを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐アルカリ性磁性ビーズ、特に高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズに関する。本発明は、耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズを使用して抗体を精製するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーは、現在世界で最も急速に成長している先端技術の領域のうちの１つである。抗体薬は、バイオテクノロジーの分野のうちの１つとして、近年優れた市場実績を達成している。抗体薬は、基礎的な生物医学研究、ならびに疾患（例えばがん、臓器移植拒否反応、自己免疫疾患など）の診断及び処置において広く使用されてきた。多くの製薬会社、とりわけバイオテクノロジー製薬会社が、抗体薬の開発及び生産の分野に徐々に進出している。医療分野における多数の治療用医薬品抗体の出現に伴い、研究開発プロセスの加速及び生産プロセスの最適化がますます注目を集めている。
【０００３】
一般に、新たな抗体の開発では、１）抗体の初期ハイスループットスクリーニング及び２）抗体の大規模生産という２つの重要なプロセスにおいて精製技術が必要である。
【０００４】
免疫化された動物は、抗原免疫化に供され、ポリクローナル抗体が生成される。効果的なモノクローナル抗体細胞を得るためには、これらの抗体産生細胞のその後の処理及びスクリーニングが必要である。このセッションには、多数の抗体細胞スクリーニング作業が含まれる。従来のスクリーニング方法は、小量のモノクローナル細胞（５〜５０ｍＬ）を培養し、親和性樹脂を使用することにより細胞を精製し、細胞培養物から抗体を採取し、次に抗体の効果を試験することを含む。精製プロセスは、試料の遠心分離及び濾過、樹脂のカラム充填、負荷、洗浄、及び溶出などを含み、煩雑である。通常、１つの試料は１つのカラムに対応するため、ハイスループットかつ大規模な精製を達成することは困難である。磁性ビーズを用いた抗体の精製により、試料の遠心分離及び濾過、カラム充填などの煩雑な処理ステップを省くことができる。負荷及びインキュベーション、洗浄及び溶出などのプロセスを効率的に完了するため、迅速な磁気応答プロセスを自動化された装置と組み合わせて使用することにより、最大９６個の試料を同時に処理することができ、これにより迅速かつハイスループットのスクリーニングが達成される。抗体の従来の大規模生産において、精製は、精製樹脂を用いて行われる。樹脂を用いて大量の試料を精製する際にも、試料の遠心分離及び濾過、ならびに充填材料のカラム充填、ならびにカラムを通る流速の制限が原因で負荷、洗浄、及び溶出に必要とされる多くの時間及び労力を含む複雑なプロセスという、同じ問題が発生し得る。
【０００５】
ハイスループットかつ大規模な抗体精製は、概して、磁性ビーズを使用して素早く容易に達成することができる。しかしながら、市販の磁性ビーズは、静的負荷、磁気応答、及び分散性が不十分であり、主に小量の微小試料の濃縮のために使用されるため、抗体またはタンパク質の大規模精製用途を満たすことができない。従来型の樹脂の動的負荷は概して３５〜４５ｍｇ／ｍＬであり、試料の損失を防止するために、実際の試料負荷量は、実際に使用される負荷が２０〜３６ｍｇ／ｍＬに相当するよう、樹脂の動的負荷の６０％〜８０％に制御される。現在市販されている磁性ビーズは、最大でも３５ｍｇ／ｍＬの静的負荷を有する。樹脂と同じ精製能力を達成するために必要とされる磁性ビーズの量は、使用される樹脂の量と基本的に同等である。磁性ビーズの生産コストは樹脂の生産コストの２〜３倍であることが多いため、磁性ビーズは、精製における原材料のコスト面での利点を有しない。本発明の耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、５０ｍｇ／ｍｌ超の結合負荷を有する。本発明の磁性ビーズを用いれば、相対的なコスト面での利点が効果的に増加すると同時に、抗体のハイスループットかつ大規模な精製が素早く容易に実現される。
【０００６】
抗体は、細胞培養物から産生される。目的の抗体は細胞内で産生されるか、または周囲媒体中に分泌される。細胞を培養するプロセスでは、糖、アミノ酸、及び増殖因子などの補助因子を培養培地に添加することが要求されるため、ヒトのための治療剤として抗体を使用可能にするには、培養培地中の他の細胞成分から抗体を十分な純度まで分離させることが必要である。最も一般的に使用されている抗体精製方法は親和性クロマトグラフィである。親和性クロマトグラフィは、簡素、高速、かつ高度に選択的であるという利点を有し、その後の精製ステップを著しく低減させることができる。近代産業においては、低い生産コストを維持することも生産プロセスにおける重要な要件である。生産に必要とされる精製クロマトグラフィ媒体を繰り返し使用することができれば、抗体の生産コストが著しく低減し得る。しかしながら、クロマトグラフィ媒体を使用して抗体を精製する度に、溶出されないタンパク質、タンパク質凝集物、そして更にはウイルス及び内毒素といったヒトの身体に有害な物質が残留する場合があるため、クロマトグラフィ媒体を再利用する場合はこれを浄化しなければならない。現在、クロマトグラフィ媒体を回復させる最も効果的な方法は、インサイチュ浄化と呼ばれるアルカリ性プロセスである。この方法の標準的手順は、精製媒体を０．５Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で処置することを含む。この過酷な方法は不純物を効果的に除去することができるが、精製媒体を損傷する可能性が高い。本発明の耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズのリガンドは、ｐＨ１２〜１４の高アルカリ環境に耐えることができる、耐アルカリ性の高いプロテインＡである。したがって、本発明の磁性ビーズを使用することで、アルカリ性インサイチュ浄化モードが可能になり、不純物が効果的に除去され、磁性ビーズの高負荷結合特性が回復し、最大５０回またはそれ以上の反復使用の効果が達成される。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを提供する。この磁性ビーズは、ｐＨ２〜１４で化学安定性を維持することができ、５０ｍｇ／ｍＬ超の免疫グロブリンＩｇＧ結合能を有する。
【０００８】
一実施形態において、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズは、ｐＨ１０〜１４のアルカリ溶液中で各回１５分間にわたり５０回超インサイチュ浄化した後に４０ｍｇ／ｍＬ超の免疫グロブリンＩｇＧ結合能を有する。
【０００９】
一実施形態において、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズは、６０ｅｕｍ／ｇ超の比飽和磁化を有する。
【００１０】
一実施形態において、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズは、２０ｎｍ〜２００ｎｍまたは３０μｍ〜２００μｍの粒径を有する。
【００１１】
一実施形態において、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズは、磁性コア部分及びリガンド部分を含み、磁性コア部分の主成分はＦｅ３Ｏ４であり、リガンド部分は耐アルカリ性プロテインＡである。好ましくは、磁性コア部分はＦｅ２Ｏ３も含み、Ｆｅ２Ｏ３：Ｆｅ３Ｏ４の質量比は１：１〜１：１００である。
【００１２】
一実施形態において、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズ上の耐アルカリ性プロテインＡの量は３ｍｇ／ｍＬ以上である。
【００１３】
一実施形態において、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズの磁性コア部分は超常磁性である。
【００１４】
一実施形態において、磁性コア部分は、シリカ、グルカン、アガロース、ポリスチレン、ポリグリシジルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリスチレン−グリシジルメタクリレート、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される無機材料または有機材料からなる被覆層で被覆されており、リガンド部分は被覆層にカップリングしている。
【００１５】
一実施形態において、被覆層は、リガンドと架橋するために必要とされる反応基、または被覆層の表面上の化学活性化もしくはカップリングによってリガンドと架橋するために必要とされる反応基を有する。好ましくは、反応基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、及びエポキシ基から選択される。好ましくは、アガロースは、架橋アガロースである。
【００１６】
一実施形態において、耐アルカリ性プロテインＡは、過酷なアルカリ性条件下で処置された後に免疫グロブリンＩｇＧに確実に結合できるように、ｐＨ１０〜１４の強アルカリ環境においてタンパク質高次構造の安定性を維持することができる。
【００１７】
一実施形態において、耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、免疫グロブリンＩｇＧに結合することができる２〜４つのドメインを含む。
【００１８】
一実施形態において、耐アルカリ性プロテインＡは、アガロースにカップリングすることにより被覆層に結合している。
【００１９】
特定の一実施形態では、耐アルカリ性プロテインＡは、配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列の両方を含む。
【００２０】
特定の一実施形態では、耐アルカリ性プロテインＡは、前述のアミノ酸配列の共有結合により形成された相同２〜４量体及び／または異種２〜４量体、好ましくは二量体であり、これはホモ二量体及び／またはヘテロ二量体であり得る。
【００２１】
別の態様では、本願はまた、免疫グロブリンを精製及び／または検出するための方法であって、前述の高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズに、免疫グロブリンを含む試料を接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本願はまた、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを再生するための方法であって、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを、０．１〜１時間にわたり、０．１〜０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液もしくは水酸化カリウム溶液またはこれら両方の混合溶液に浸漬してから、磁性ビーズを純水もしくは緩衝液に浸すか、または磁性ビーズを３〜５回すすいで、アルカリ溶液を完全に除去することと、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを平衡化緩衝液中で保存することとを含む、方法を提供する。
【００２３】
本願による耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、５０ｍｇ／ｍＬ超の静的負荷を有する。本発明の耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズを使用することにより、処置時間を約８０％節約することができ、全精製コストを５０％削減することができる。加えて、本願による耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、高い耐アルカリ性、迅速な磁気応答、及び良好な分散性を有し、迅速な磁性ビーズの濃縮、浄化、及び溶出を実現し、自動化されたハイスループットかつ大規模な試料の精製を容易にする。
【００２４】
更に、本願による耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは耐アルカリ性を有するため、使用後の磁性ビーズを再生するためにアルカリ性インサイチュ浄化方法を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】免疫グロブリンの精製に関する本発明の耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズの効果を示すゲル電気泳動写真である。レーン１、２、３、及び４の負荷試料はそれぞれ、精製前の試料溶液（原液）、耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズによる吸着後の試料溶液（上清）、耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズを浄化した後の洗浄緩衝液（洗浄）、及び耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズを浄化した後の溶出緩衝液（溶出）である。Ｍは、分子量マーカーである。
【図２】アルカリ溶液で複数回浄化した後の本発明の磁性ビーズの負荷の変化を示すグラフである。耐アルカリ性磁性ビーズの実施例１、２、及び３はそれぞれ、独立して調製された３種の耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において使用される場合、「耐アルカリ性プロテインＡ」という用語は、高アルカリ性条件（例えば、ｐＨ１０〜１４）において三次構造が保持され、よってＩｇＧ結合活性が保持されるように、アミノ酸配列が人工的に変更されたプロテインＡを指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズ」という用語は、表面が上述の耐アルカリ性プロテインＡに結合する磁性ビーズを指す。耐アルカリ性プロテインＡは概して、磁性コア上の被覆層（例えば、アガロース）によって磁性ビーズに結合している。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「静的負荷」という用語は、結合させたい試料に磁性ビーズが十分に接触しているとき、磁性ビーズの単位量あたりに結合するＩｇＧ抗体の容量を指す。「高負荷」とは、結合能が５０ｍｇ／ｍＬ超であることを意味する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、耐アルカリ性プロテインＡの「ホモ二量体」とは、本願下記のアミノ酸配列１またはアミノ酸配列２によって形成された二量体を指す。「ヘテロ二量体」とは、本願下記のアミノ酸配列１及びアミノ酸配列２によって形成された二量体を指す。二量体を形成する様式としては、発現された融合タンパク質を組換え法によってタンデムに連結すること、ならびに合成されたアミノ酸配列１及び／またはアミノ酸配列２を小分子（例えば、短いペプチド、有機分子）により連結することなどが挙げられる。
【００３０】
耐アルカリ性磁性ビーズＡに関して使用される「化学安定性」という用語は、耐アルカリ性磁性ビーズＡが、アルカリ溶液における複数回のインサイチュ浄化後にその高い静的負荷を維持することを意味する。この化学安定性は、磁性ビーズの被覆層（例えば、アガロース）及び耐アルカリ性プロテインＡならびに耐アルカリ性プロテインＡと被覆層との間のカップリングの安定性を含む。
【００３１】
以下の具体的な実施例により、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００３２】
実施例１：磁性コアの調製
本願において言及される磁性ビーズは、主に四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）からなる。つまり、四酸化三鉄の量は５０％以上である。磁性コアは、機械的研磨法、沈殿法（化学的共沈法、酸化沈殿法、還元沈殿法）、マイクロエマルション法、ソルボサーマル法、ゾルゲル法、有機物熱分解、及び他の方法によって調製することができる。
【００３３】
例えば、１０ｎｍ〜５０ｎｍの粒径を有するＦｅ３Ｏ４磁性コアは、従来の化学的共沈法によって調製可能である。硫酸第一鉄七水和物及び塩化第二鉄六水和物を１：１〜１：２のモル比で混合し、０．５〜２モルの塩酸溶液に溶解させ、これに１０〜２５％のアンモニア水溶液をゆっくりと添加した。アンモニア水の添加中、撹拌パドルを使用して溶液を撹拌状態に保ち、撹拌パドルの回転速度は、高速かつ均一な混合を確実にするため１００〜５００ｒｐｍに維持した。アンモニア水を連続的に添加するにつれ、溶液のｐＨは徐々に上昇した。ｐＨが１３に達したとき、アンモニア水の添加を停止し、０．５〜２時間にわたり撹拌を続けた。純水で浄化することにより可溶物を除去した。沈殿物は、Ｆｅ３Ｏ４に富んだ磁性コアであった。
【００３４】
粒径がより大きい、例えば粒径が３０μｍ〜２００μｍの磁性コアは、ソルボサーマル法によって調製可能である。具体的に述べると、ポリエチレンビーカーにて適切な濃度のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及びＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏを１：１〜１：２のモル比で混合し、これに適量の尿素及び界面活性剤ＳＤＳを添加し、この混合物を均一に撹拌して、透明な溶液を得た。この溶液を高圧反応器に入れ、器本体の内壁とビーカーとの間に適量の水を加えて０．６の充填度とした。ナットを締め、反応器を密閉し、窒素ガスを（保護ガスとして）導入し、システムを３０分間パージした。反応器を１２５℃に加熱し、システム圧力を約５〜７ａｔｍに維持し、反応を一定期間持続させた。反応生成物を濾過し、洗浄し、乾燥させて、より大きな粒径を有する磁性コアを得た。
【００３５】
実施例２：シリカ被覆磁性ビーズの調製
実施例１で調製した磁性コアは超常磁性である。つまり、外部磁場の作用下で容易に磁化するが、ヒステリシスがなく、ある特定の条件下で化学安定性を有する。しかしながら、この磁性コアは容易に酸化してその超常磁性を失い、その溶液中の分散性は不十分である。酸化を阻止し、強酸及び強塩基に耐える能力を達成するためには、磁性コアを他の材料で被覆する必要がある。この実施例では、実施例１で調製した磁性コアが１つ以上のシリカ層で被覆されることを記載する。
【００３６】
シリカ被覆磁性ビーズは、ケイ酸ナトリウム加水分解法によって調製することができる。ケイ酸ナトリウムを原材料として使用して飽和ケイ酸を調製し、酸性またはアルカリ性条件下でケイ酸を更に縮合してシリカにし、これで磁性ナノ粒子の表面を覆った。ケイ酸ナトリウムをＦｅ３Ｏ４磁性粒子の分散システムに加え、ＨＣｌをゆっくりと滴加してｐＨを約６〜１０に調整し、１つ以上のシリカ層がＦｅ３Ｏ４磁性コアの表面を覆うようにした。
【００３７】
シリカ被覆磁性ビーズは、オルトケイ酸エチル加水分解法によって調製することもできる。適量のＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を秤量し、無水エタノールに分散させ、これに数滴のオレイン酸を滴加し、次にこの混合物を超音波によって１０分間分散させた。次に、この分散溶液を２５０ｍＬの三口フラスコに移し、オルトケイ酸エチルＳｉ（ＯＣ２Ｈ５）４（ＴＥＯＳ）及びＮＨ３・Ｈ２Ｏを１：２のモル比で三口フラスコに加え、この溶液を３時間撹拌して反応させた。反応が完了した後、磁場の引力下にて、溶液が清澄になるまで蒸留水を使用して洗浄を繰り返し、結果として得られた沈殿物を７０℃の真空下で乾燥させて、シリカ／四酸化三鉄複合体のナノ粒子磁性ビーズを最終的に得た。
【００３８】
実施例３：アガロース被覆磁性ビーズの調製
アガロース被覆磁性ビーズは、それぞれ、有機相としてのシクロヘキサン、Ｓｐａｎ８０（ＳＰ８０）、及び二重蒸留水、乳化剤、ならびに水相を使用した、逆相懸濁法によって調製される。
【００３９】
１０００ｍＬの三口フラスコに４００ｍＬのシクロヘキサンを加え、水浴にて加熱し（水浴の温度は６０℃に調整した）、５００ｒｐｍにて均一に撹拌した。適量のＳＰ８０を添加し、撹拌を３０分間から１時間にわたって続けた。同時に、アガロース溶液を調製した。４％〜６％のアガロース溶液を１５０〜２００ｍＬ調製し、実施例２で調製したシリカ被覆磁性ビーズを適量加え、電子レンジで加熱することによって溶解させた。完全に溶解した後、これを直ちにシクロヘキサン溶液に添加し、回転速度を１４００ｒｐｍに調整したスターラーで１０分間撹拌した。次に、温度を２５℃に低下させた。もう１５分間撹拌した後、フラスコ中の溶液をビーカーに移し、磁力の作用下で、９５％無水エタノール及び二重蒸留水を交互に用いた浄化を３回行った。最後に、沈殿物を回収してアガロース被覆磁性ビーズを得た。
【００４０】
実施例４：アガロース被覆磁性ビーズの表面活性化
耐アルカリ性プロテインＡなどの他のリガンドが実施例３で調製した磁性ビーズの表面に化学的カップリングによって結合できるようにするには、リガンドへのカップリングを達成するために、例えば、磁性ビーズの表面上のヒドロキシル基のエポキシ活性化により、磁性ビーズの表面を化学的に活性化させることが必要である。１００ｍＬのアガロース被覆磁性ビーズを１Ｌの三角フラスコに加え、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を同時に調製した。アガロース被覆磁性ビーズのＮａＯＨ溶液に対する体積比が１：１〜１：１．５になるように、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を三角フラスコに加え、この混合物を均一に振盪した。最後に、適量のエピクロロヒドリンを１Ｌの三角フラスコに加え、三角フラスコを振盪インキュベータに入れ、温度を３７℃に調整し、反応を１〜１．５時間持続させた。反応の最後に、表面が活性化されたアガロースビーズを得ることができた。
【００４１】
リガンド部分は、様々な反応基を介してカップリングすることができた。例えば、エピクロロヒドリン、水酸化ナトリウム、及び水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を、アガロース被覆磁性ビーズと共に、恒温振盪機においてある一定の温度でインキュベートすることにより、カップリングに必要とされるエポキシ反応基がもたらされた。エピクロロヒドリンに加えて、アリルグリシジルエーテル、臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）、ジメチルジヘプタジンジヒドロクロリド（ＤＭＰ）などを含むがこれらに限定されない他の手段によって、アガロース微粒子を用いた化学活性化反応を行うことにより、カップリングに必要とされるカルボキシル基及びアミノ基などの反応基がもたらされた。
【００４２】
実施例５：表面活性化磁性ビーズ及びプロテインＡのカップリング
耐アルカリ性プロテインＡは、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはスルフヒドリル基を介した共有結合により、活性化されたアガロース磁性ビーズにカップリングされ得る。例えば、耐アルカリ性プロテインＡを含むアガロース磁性ビーズは、耐アルカリ性プロテインＡ中の窒素含有基を有するアミノ酸をエポキシ活性化アガロースの表面に結合させることにより調製され得る。
【００４３】
１ｍＬの活性化アガロース磁性ビーズの表面にエポキシ基を介して約１０ｍｇの耐アルカリ性プロテインＡをカップリングするために、１００ｍＬの活性化アガロース磁性ビーズを１Ｌの三角フラスコに加えた。磁石で吸着することにより、磁性ビーズを二重蒸留水で４〜５回浄化した。１０〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度、８．５〜９．５のｐＨにて、耐アルカリ性プロテインＡ溶液を調製した。調製した耐アルカリ性プロテインＡ溶液１００ｍＬを１Ｌの三角フラスコに加え、温度を２８℃に調整した全温振盪インキュベータに三角フラスコを入れた。１２０ｒｐｍで２４時間おいた後、磁石で吸着することにより、二重蒸留水を使用して磁性ビーズを４〜５回浄化し、沈殿物である耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズを得た。
【００４４】
結果として得られた磁性ビーズは、総体積４ｍＬの２０％エタノール中の２５％懸濁液として保存した。
【００４５】
この実施例では、本発明者らが調製した耐アルカリ性プロテインＡ二量体を、活性化アガロース磁性ビーズにカップリングされるカップリングリガンドとして使用して、高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡ磁性ビーズを調製した。耐アルカリ性プロテインＡの特徴的な配列は次の通りである。
【００４６】
【化１】
2020509076.tif 000003
【００４７】
上記の配列１または配列２を有するプロテインＡのホモ二量体またはヘテロ二量体をリガンドとして使用すると、この実施例で調製した耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズに結合する耐アルカリ性プロテインＡの量は３ｍｇ／ｍＬ以上であり、したがって免疫グロブリンＩｇＧ（＞５０ｍｇ／ｍＬ）に結合する高い能力が得られる。
【００４８】
実施例６：耐アルカリ性プロテインＡにカップリングしたアガロース磁性ビーズを用いた免疫グロブリンの精製
実施例５で調製した高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインＡアガロース磁性ビーズを試験した。上記の磁性ビーズを均一に混合し、０．４ｍＬを１５ｍＬの遠心管に入れ、磁石（天然の永久磁石または電磁石）を使用し、約３０〜６０秒にわたって管壁内側に磁性ビーズを吸着させた。上清を捨てたか、またはピペットで除去した。磁石を外し、２ｍＬの二重蒸留水を遠心管に加え、十分に混合してビーズを浄化した。磁性ビーズを磁石によって吸着して管壁内側に定着させた。吸着時間は約３０〜６０秒であった。上清を捨てたか、またはピペットで除去した。このプロセスを２〜３回繰り返して残りのエタノールを除去した。同様に、磁性ビーズを１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液で２〜３回浄化し、緩衝液を除去した。
【００４９】
濃度１ｍｇ／ｍＬのヒト血清免疫グロブリン１０ｍＬを試験試料として使用し、この試料を上記の１５ｍＬ遠心管に加えた。試料の漏出を防ぐため、遠心管をパラフィルムで覆って密閉した。遠心管を回転混合ラック上で１〜４時間インキュベートした。磁性ビーズを磁石によって吸着して管壁内側に定着させた。吸着時間は約６０〜９０秒であった。上清を捨てたか、またはピペットで除去した。同様に、ビーズを１０ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液で２〜３回浄化して、未吸着試料及び不純物を除去した。目的のタンパク質を５００μＬの０．１Ｍグリシン溶出液（ｐＨ３．０）で３回溶出した後、ゲル濃度４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した。図１に示されるように、耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、高純度の免疫グロブリンを分離することができる。耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズの静的負荷は、最大６５ｍｇ／ｍＬと測定されている。市販のアガロース磁性ビーズの静的負荷はすべて３０ｍｇ／ｍＬ未満である（表１）。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例７：異なる数の結合ドメインを有するプロテインＡ磁性ビーズの結合能力の比較
免疫グロブリンＩｇＧに結合した２つのドメインを含むプロテインＡ、及び免疫グロブリンＩｇＧに結合した５つのドメインを含むプロテインＡを、上記のカップリング方法によってそれぞれアガロース磁性ビーズにカップリングした。沈殿した磁性ビーズを各種１００μｌ取り、２ｍＬの二重蒸留水と十分に混合して磁性ビーズを浄化した。５ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）２ｍＬを２０ｍＭ  ＰＢＳに溶解させ、前もって浄化した磁性ビーズと共に室温で１時間インキュベートした。次に、磁性ビーズを磁石によって吸着して管壁内側に定着させ、上清を除去した。磁性ビーズを１０ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液で２〜３回浄化して、未吸着試料及び不純物を除去した。最後に、目的のタンパク質を５００μＬの０．１Ｍグリシン溶出液（ｐＨ３．０）で３回溶出した。各溶離液中のｈＩｇＧの量を測定して、磁性ビーズの単位体積あたりの静的結合負荷を求めた。結果を以下の表に示す。２つのドメインを含むプロテインＡ磁性ビーズの負荷は、５つのドメインを含むプロテインＡ磁性ビーズの負荷よりも高い。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
実施例８：耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズの耐アルカリ性試験
上記の実施例５で調製した耐アルカリ性プロテインＡアガロース磁性ビーズを、アルカリ溶液中インサイチュ浄化によって試験した。まず、実施例６の手順に従って免疫グロブリンの精製を行った。ｐＨ３．０の０．１Ｍグリシン溶離液を用いて免疫グロブリンを溶出した後、インサイチュ浄化用アルカリ溶液としての０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液５ｍＬに磁性ビーズを１５分間浸漬してから、１０ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４を含む。ｐＨ７．０）を使用して３回浄化及び平衡化し、１試験サイクルのアルカリ溶液中インサイチュ浄化を完了した。耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズの免疫グロブリン結合能力は、各サイクルにおいて、溶離液中の免疫グロブリンの量に基づいて決定することができる。
【００５４】
図２に示されるように、アルカリ溶液中インサイチュ浄化による５０回の試験サイクルの後、リガンドとしての耐アルカリ性プロテインＡ磁性ビーズは、依然として良好な免疫グロブリン結合能力を維持する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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