(57)【要約】宿主およびそのマイクロバイオータ個体群（複数可）における異物代謝の様々な相に関与する酵素を選択的に同定し、特性評価するために使用することができる活性ベースのプローブが記載されている。記載されている活性ベースのプローブは、異物代謝に関与するそれらの標的活性酵素のみを特異的に標識するため、転写量またはタンパク質量ではなく、真のタンパク質機能活性を測定することを可能にする。活性ベースのプローブは、これらの活性酵素のマルチモーダルプロファイリングも可能にする。活性ベースのプローブの調製方法、およびそれらの使用の例示的な方法も開示されている。
2020536874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩを満たす構造を有するプローブ
【化１】
2020536874.tif 000105
（式中、
ＥＲＧは、存在する場合、
【化２】
2020536874.tif 000106
；
Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、もしくはこれらのアニオン型；Ｐ（Ｏ（ＯＨ））２、もしくはこれらのアニオン型；ハロゲン；または−ＯＰｈ−ＣＨ２−ＯＮＯ２である；
ＥＢＧは、式ＩＩＡＥＢＧ〜ＩＩＪＥＢＧの１つまたは複数を満たす構造を有する
【化３】
2020536874.tif 000107
（式中、ＹはＣＨ３またはＣＦ３である；Ｙ´はＯ、ＮＯ２、または−Ｎ＝ＮＲ´´であり、Ｒ´´は色素または他のレポーティング部位である；ｍは０〜５から選択される整数である；Ｒ´はアルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、アシル、ハロゲン化アシル、シアノ、スルホン酸、ニトロ、ニトロソ、第４級アミン、ＣＦ３、ハロゲン化アルキル、またはそれらの組み合わせから選択される）；
Ｌｉｎｋｅｒａには、脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれる；
Ｌｉｎｋｅｒｂ、およびＬｉｎｋｅｒの各々には、存在する場合、独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれる；
Ｒは、存在する場合、カルバメートまたはカーボネートを含む基である；
各Ｔａｇは、存在する場合、独立して、検出可能なシグナルを発生させることができる官能基または分子を含む；
各ｐＴａｇは、Ｔａｇが存在しない場合に存在し、独立して、クリック可能な官能基を含む；
ｎ、ｍ、ｐ、およびｑの各々は独立して０または１である）。
【請求項２】
Ｌｉｎｋｅｒａが、式ＩＩＡＬｉｎｋｅｒａ〜ＩＩＨＬｉｎｋｅｒａの１つまたは複数を満たす構造を有するリンカー基である、請求項１に記載のプローブ
【化４】
2020536874.tif 000108
（式中、各ｎ´は独立して１〜５０の整数である；Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；Ｑは炭素、酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）。
【請求項３】
Ｌｉｎｋｅｒｂが存在し、ｎ´が１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ´−基；アミド基；またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
Ｌｉｎｋｅｒｃが存在し、式ＩＩＡＬｉｎｋｅｒｃまたは式ＩＩＢＬｉｎｋｅｒｃを満たす構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ
【化５】
2020536874.tif 000109
（式中、ｎ´は０〜５０の整数である；Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）。
【請求項５】
Ｒが存在し、１つまたは複数の式ＩＩＡＲ〜ＩＩＣＲを満たす構造を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ
【化６】
2020536874.tif 000110
（式中、ＺおよびＺ´は独立して酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；ｎ´は０〜５０の整数である）。
【請求項６】
１つまたは複数のＴａｇが存在し、各Ｔａｇが独立してフルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
１つまたは複数のＴａｇが独立してローダミン、フルオレセイン、またはビオチンである、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
１つまたは複数のｐＴａｇが存在し、各ｐＴａｇが独立してアジドまたはアルキンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項９】
前記化合物が式ＩＩＩＡを満たす構造を有する、請求項１に記載のプローブ
【化７】
2020536874.tif 000111
【請求項１０】
前記ＥＲＧが存在し、前記ＥＲＧがヨード；−ＯＰｈ−ＣＨ２−ＯＮＯ２；または
【化８】
2020536874.tif 000112
である、請求項９または１０に記載のプローブ。
【請求項１１】
Ｌｉｎｋｅｒａがエステル基、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ´ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−基、または−（ＣＨ２）ｎ´−基であって、各ｎ´が独立して１〜２０の整数であり、Ｒ´´´が水素、脂肪族、または芳香族である、請求項９〜１０のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１２】
ｍが１であり、Ｌｉｎｋｅｒｃが−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−基または−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）ＣＨ２［Ｏ（ＣＨ２）２］ｎ´ＯＣＨ２−基であって、各ｎ´が独立して１〜２０の整数であり、Ｒ´´´が水素、脂肪族、または芳香族である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１３】
ｍが１であり、各Ｔａｇが、存在する場合、独立してフルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素であるか；ｐＴａｇ基が存在する場合、各ｐＴａｇが独立してアルキンまたはアジドである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１４】
以下から選択されるプローブ
【化９−１】
2020536874.tif 000113
【化９−２】
2020536874.tif 000114
【化９−３】
2020536874.tif 000115
【化９−４】
2020536874.tif 000116
【請求項１５】
以下の工程を含む、方法：
被験体または試料を、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプローブに、前記プローブが異物代謝に関与する酵素と結合してプローブ−酵素コンジュゲートを形成するのに十分な時間さらす工程と；
前記プローブ−酵素コンジュゲートを、蛍光検出法、比色検出法、質量分析法、またはそれらの組み合わせを使用して分析する工程。
【請求項１６】
前記プローブ−酵素コンジュゲートをＴａｇ含有化合物にさらし、Ｔａｇ部位を含むプローブ−酵素コンジュゲートを形成する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブを光源にさらす工程をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体から被験体試料を抽出する工程と、前記被験体試料を、蛍光検出法、比色検出法、質量分析法、またはそれらの組み合わせを使用して分析する工程とをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブが以下から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法
【化１０−１】
2020536874.tif 000117
【化１０−２】
2020536874.tif 000118
【化１０−３】
2020536874.tif 000119
【請求項２０】
以下を含む、アッセイプラットフォーム：
基板と；
前記基板に共有結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１０月４日に出願された米国仮出願第６２／５６８，１５１号、および２０１７年１１月２８日に出願された米国仮出願第６２／５９１，６９７号の先の出願日の利益を主張する；これらの先行出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（政府支援の承認）
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号ＤＥ−ＡＣ０５−７６ＲＬ０１８３０の下で、政府の援助を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、ヒト宿主および微生物由来の両方の異物代謝酵素に関する。
【背景技術】
【０００４】
ゲノムまたはトランスクリプトームのみで微生物群集を特性評価することを避けたいという研究者の関心が高まっている。しかしながら、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用し、遺伝子含有量に基づいて微生物をマイクロバイオームからソーティングする現在の技法では、機能のみに基づいたソーティングメカニズムを提供することができないことがほとんどである。この技法またはその他多くの技法は、遺伝子またはアミノ酸の標識に基づいている；しかしながら、遺伝子またはアミノ酸の存在が必ずしも機能と一致するとは限らない。生物環境中に存在する分析対象種（例えば、微生物、酵素、毒素など）を同定、分離、定量し、そのような種とそれらの機能を決定することができる新しい技法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、異物代謝に関与する酵素の酵素活性をリアルタイムで検出、測定し、影響を与えることができる活性ベースのプローブに関する。プローブの式および構造は、本明細書に記載されている。プローブを使用するための方法実施形態も本明細書に開示され、この方法実施形態は、被験体または試料を、本明細書に記載のプローブ実施形態に、プローブが異物代謝に関与する酵素と結合してプローブ−酵素コンジュゲートを形成するのに十分な時間さらす工程と；プローブ−酵素コンジュゲートを、蛍光検出法、比色検出法、質量分析法、またはそれらの組み合わせを使用して分析する工程とを含むことができる。他の方法実施形態も記載されている。
【０００６】
本開示のプローブ実施形態を含むデバイスおよびキットも、そのようなデバイスおよびキットの使用方法とともに記載されている。いくつかの実施形態では、アッセイプラットフォームが記載されており、このプラットフォームは、本明細書に記載されているような基板およびプローブ実施形態を含むことができる。
【０００７】
本開示の上述かつ他の目的および特徴は、添付の図を参照して進む以下の発明を実施するための形態から、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第Ｉ相代謝および第ＩＩ相代謝を含む異物代謝の様々な段階、および腸内マイクロバイオームで起こる代謝事象を示す概略図である。
【図２】開示の活性ベースのプローブ（「ＡＢＰ」）の実施形態を使用して、群集（門）レベルの異物代謝、細胞／分類群レベルの異物代謝、および酵素レベルの異物代謝を含む、異物代謝中のすべてのレベルのタンパク質機能活性を測定し得る方法を示す概略図である。
【図３】本明細書に記載の特定のＡＢＰ実施形態の異物代謝酵素活性の概要を示す図であって、その活性を測定するための少なくとも１つの代表的なプローブ実施形態の構造を含む図である。
【図４】活性型グルタチオントランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）の機能の概略図であって、「Ｇ」および「Ｈ」部位結合によって安定化される生体異物（Ｘ）に還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を抱合するメカニズムを、本明細書に記載の代表的なプローブ実施形態によって示す。
【図５】ＡＢＰ実施形態を利用する本明細書に記載の方法実施形態の概略図である。
【図６】本明細書に記載のＡＢＰ実施形態を利用して様々なプローブによって標的化される様々な酵素を同定する、代表的なアッセイ実施形態の概略図である。
【図７】ＦＡＣＳ分析を使用する代表的な方法実施形態の概略図である。
【図８】図８Ａは、大腸菌の活性ＷＴ  ｂ−グルクロニダーゼを、本明細書に記載の代表的なプローブ実施形態で標識したときの結果を示す図であって、「＋」はプローブ１０μＭがある試料を示し、「−」はプローブがない対照を示し、Ｅ４１３Ａ／Ｅ５０５Ａ活性部位変異体は標識されていないことを示す図である。図８Ｂは、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ（Ｍ：ＭＷマーカー）で標識されたマウス大腸マイクロバイオームから単離されたタンパク質を示す図である。図８Ｃは、ＦＡＣＳによって収集された´プローブ陽性´および´プローブ陰性´個体群のマップである。図８Ｄは、分類群が、ＧｌｃＡ−ＡＢＰプローブ陽性（赤色三角形）個体群において、プローブ陰性（青色三角形）と比較して有意に富化されていることを示す図である（調整済みｐ値＜＝０．０５）。
【図９】図８Ａ〜８Ｄで説明したＡＢＰ＋／−個体群を単離するための一般的なゲーティング戦略を示す図であって、事象閾値用に側方散乱光およびＳＹＢＲゴールドシグナルを使用し、細胞を、前方散乱光および側方散乱光、パルス持続時間、破片を除去するためのＣＦ６４０−Ｒ、およびその後のＣＦ６４０−Ｒでゲーティングする；プローブなし対照試料中の事象の９５％超が´プローブ陰性´とみなされるようにゲーティングした。
【図１０】図１０Ａは、プローブ構造と、クリックケミストリーを介してテトラメチルローダミンアジドでタグ付けされたプローブ−β−グルクロニダーゼコンジュゲートの蛍光（上）およびクマシー染色（下）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の対応する結果とを示す図である。図１０Ｂは、ＩｍａｇｅＪを使用した標識強度の定量化を示す図であって、棒は平均値を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示し、＊＝調整済みｐ＝０．０２０３；および＊＊＝調整済みｐ＝０．００４７（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定（ｎ＝３）での反復測定１元配置ＡＮＯＶＡによる）を示す図である。図１０Ｃは、様々な濃度のプローブ実施形態で標識された大腸菌溶解液（ＷＴ  ＢＷ２５１１３、ΔｕｉｄＡ  ｐＥＴ３２ｃ、または相補的ΔｕｉｄＡ  ｐｕｉｄＡ）の結果を示す図であって、標識タンパク質は蛍光（左）を介して可視化されており、総タンパク質はクマシーブルー染色（右）を介してイメージングされている。図１０Ｄは、全細胞大腸菌をプローブ実施形態で標識し、標識細胞をＣＦ６４０−Ｒでタグ付けした実施形態の結果を示す。図１０Ｅは、大腸菌のみ（左上）、Ｌ．プランタラムのみ（真ん中上）、またはその２つの混合物（右上および下）を、プローブ実施形態、システイン反応性ＩＡＡプローブ、または溶媒のみ（ＤＭＳＯ）で標識した場合のヒストグラムを示す図である。
【図１１】ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋およびＧｌｃＡ−ＡＢＰ−分類群の系統発生分布であって、赤色三角形は、プローブ陽性個体群において有意に増加した存在量の分類群を示し；青色三角形は、プローブ陰性個体群において有意に増加した存在量の分類群を示し；白丸は、有意差のある存在量が観察されなかったことを示している系統的分布と；３つのＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋分類群（左および右上）ならびに１つのＧｌｃＡ−ＡＢＰ−分類群（左下）の例（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法がＷｅｌｃｈのｔ検定またはＧ検定（ｎ＝５）によりｐ＜０．０５と調整した場合に、分類群は差次的に多く存在するとみなされる）とを示す図である。
【図１２】すべてのマウス（上）、対照マウス（右下）、またはバンコマイシン処理マウス（左下）からのシーケンスされた個体群のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ非類似性分析を含む、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋およびＧｌｃＡ−ＡＢＰ−個体群についての投入量間のβ多様性を示す図である。
【図１３】図１３Ａは、バンコマイシン処理（シアン色四角）マウスと比較した対照マウス（赤色三角形）におけるＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋分類群の系統発生分布を示す図である（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法がＷｅｌｃｈのｔ検定またはＧ検定（ｎ＝３対）によりｐ＜０．０５と調整した場合に、分類群は差次的に多く存在するとみなされる）。図１３Ｂは、対照マウスまたはバンコマイシン処理マウスの腸内マイクロバイオームにおけるグルクロニダーゼ活性を示す図である（対の同腹仔（ｎ＝５）は線で結ばれており、＊：比率対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によってｐ＜０．０５であり、データは３回の実験の繰り返しの平均である）。図１３Ｃは、未処理（水）マウスおよびバンコマイシン処理マウスにおけるＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群の比較を示す図である（データは、５対の同腹仔を代表するものである）。図１３Ｄは、２つのＯＴＵの例について、正規化された対数存在量でのグルクロニダーゼ活性のピアソン相関プロットを示す図である（結果は、有意水準０．０５で有意であるとみなされた）。
【図１４】図１３Ａ〜１３Ｄで説明した実施形態について、各同腹仔対についての（綱レベルでの分類群の正規化された相対存在量での）バンコマイシン処理時の個体群シフトを示す図である。
【図１５】図１５Ａは、組換えヒトＧＳＴｍ１  １μＭを使用して、本明細書に記載のプローブ実施形態でグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＨおよびＧＳＴ）を標識した結果を示す図である。図１５Ｂは、マウス肝細胞質ゾル１μＭを使用して、本明細書に記載のプローブ実施形態でグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＨおよびＧＳＴ）を標識した結果を示す図である。
【図１６】図１６Ａは、プローブ富化およびプローブ競合マウス肝細胞質ゾル（ｎ＝３）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳケモプロテオミクスの結果を示す図であって、すべての試料を、代表的なプローブ実施形態１０μＭまたは同濃度の溶媒対照でインキュベートした；富化度は、プローブ富化試料のＡＭＴタグ量を、ＵＶなし（ＧＳＨ−ＡＢＰについて）またはＤＭＳＯのみ（ＧＳＴ−ＡＢＰについて）の対照で割ったものとして計算した；特に、図１６Ａは、ＧＳＨ−ＡＢＰ富化度のボルケーノプロットを示し、黒のドットは、プローブ標識の競合的阻害を示さなかったすべてのＧＳＴを表し、緑のドットは、プローブの２．５倍過剰の２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン（ジクロン）によってプローブ標識が競合的に阻害されたＧＳＴを表し、青のドットは、２．５倍過剰のジクロンおよび２．５倍過剰のＳ−ヘキシルグルタチオンによってプローブ標識が競合的に阻害されたＧＳＴを表している。図１６Ｂは、プローブ富化およびプローブ競合マウス肝細胞質ゾル（ｎ＝３）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳケモプロテオミクスの結果を示す図であって、すべての試料を代表的なプローブ実施形態１０μＭまたは同濃度の溶媒対照でインキュベートした；富化度は、プローブ富化試料のＡＭＴタグ量を、ＵＶなし（ＧＳＨ−ＡＢＰについて）またはＤＭＳＯのみ（ＧＳＴ−ＡＢＰについて）の対照で割ったものとして計算した；特に、図１６Ｂは、ＧＳＴ−ＡＢＰ富化度のボルケーノプロットを示し、黒のドットは、プローブ標識が競合的に阻害されなかったすべてのＧＳＴを表し、青のドットは、プローブ標識が２０倍のＳ−ヘキシルグルタチオンによって競合的に阻害されたＧＳＴを表し、赤のドットは、プローブ標識が１０倍のＮ−エチルマレイミドによって競合的に阻害されたＧＳＴを表す。
【図１７】Ｇ部位およびＨ部位結合を定めるためのマウス肝細胞質ゾルのＧＳＨ−ＡＢＰおよびＧＳＴ−ＡＢＰ標識の競合的阻害結果（ｎ＝３）についての結果を示す図であって、プローブ１０μＭを全試料に使用し、Ｓ−ヘキシルグルタチオンまたはエタクリン酸の濃度を増加させたものを、マウス肝細胞質ゾルと３０分間、プローブ標識の前に３０分間インキュベートした；その後、ローダミンをクリックケミストリーを介してプローブ−タンパク質複合体に結合させ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分解し、次いで蛍光ゲルイメージングおよびプローブ標識ＧＳＴバンドの定量（任意の単位）を行った（すべての複製物を、％標識タンパク質値に正規化した（阻害剤のないプローブ試料＝１００％）。
【図１８】図１８Ａは、ＧＳＨ−ＡＢＰおよびＧＳＴ−ＡＢＰを使用したＧＳＴ活性の器官分布と、ＧＳＨ−ＡＢＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛍光が示されているＧＳＴ活性アッセイとを示す図である。図１８Ｂは、ＧＳＨ−ＡＢＰおよびＧＳＴ−ＡＢＰを使用したＧＳＴ活性の器官分布と、ＧＳＴ−ＡＢＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛍光が示されているＧＳＴ活性アッセイを示す図である。図１８Ｃは、標識されたマウス肝臓、肺、腎臓、腸、脾臓、および心臓の細胞質ゾルの結果を示す図であって、総ＧＳＴ活性に対応する２４〜２８ｋＤａのバンドの総蛍光強度が示されている。図１８Ｄは、ＧＳＨ−ＡＢＰおよびＧＳＴ−ＡＢＰの肺および肝臓ＧＳＴ標的のベン図である。
【図１９】プローブ実施形態の前駆体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２０】プローブ実施形態の前駆体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２１】プローブ実施形態の前駆体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２２】本明細書に記載のプローブ実施形態の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２３】本明細書に記載のプローブ実施形態の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２４】プローブ実施形態の前駆体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２５】プローブ実施形態の前駆体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２６】プローブ実施形態の前駆体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２７】プローブ実施形態の前駆体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２８】本明細書に記載のプローブ実施形態の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２９】本明細書に記載のプローブ実施形態の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３０】多重プロービング実施形態にマイクロスフェアを使用する例示的な方法を示す図であって、機能ベースのプローブ（「Ｐ」）は蛍光ガラスマイクロスフェア上で官能基化されてフローサイトメトリーを可能にし、各フルオロフォアは、特定のプローブに適合する；マイクロスフェアを混合し、試料に追加し、生体試料などの複雑な生体試料の多機能特性評価を行うことができ、標識後、タンパク質−プローブ−マイクロスフェアをさらに分析することができる（例えば、分類された各試料の蛍光発光および／またはプロテオミクス分析に基づいて定量化された全体的な機能活性を決定し、機能的に活性な酵素の識別と、全体的な機能活性へのそれらの相対的寄与度とを提供する）。
【０００９】
（配列表）
添付の配列表に記載の核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §  １．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を使用して示されている。各核酸配列の１本鎖のみが示されているが、表示されている鎖への参照で相補鎖は含まれるものとして理解される。２０１８年１０月２日に作成され、本明細書とともに提出された２Ｋｂの配列リストは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において、
配列番号１は、プライマーｕｉｄＡ＿Ｆの配列である。
配列番号２は、プライマーｕｉｄＡ＿Ｒの配列である。
配列番号３は、プライマーｐＥＴ＿Ｆの配列である。
配列番号４は、プライマーｐＥＴ＿Ｒの配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（Ｉ．用語の説明および概要）
以下の用語の説明は、本開示をより良く説明し、本開示の実施において当業者を導くために提供される。本明細書で使用されるとき、「含む」は「含有する」を意味し、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。用語「または」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、記載の代替要素の単一要素、あるいは２つ以上の要素の組み合わせを指す。
【００１１】
別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または均等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、別段の指示がない限り、限定的なものであることを意図していない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１２】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値の間の各中間値、およびその記載の範囲内の任意の他の記載値または中間値が、本発明に包含されることが理解されよう。より小さい範囲に独立して含まれ得るこれらのより小さい範囲の上限値および下限値も、記載の範囲内の特に除外された制限値に従い、本発明に包含される。記載の範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれか一方または両方を除外した範囲も、本発明に包含される。
【００１３】
別段の指示がない限り、本明細書または特許請求の範囲で使用される、構成要素の量、分子量、パーセンテージ、温度、時間などを表すすべての数値は、「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、別段の指示がない限り、暗黙的にまたは明示的に、記載の数値パラメータは、求められる所望の特性および／または標準的な試験条件／方法の下での検出限界によって決まり得る近似値である。説明された先行技術からの実施形態を直接的かつ明示的に区別するとき、「約」という言葉が記載されない限り、実施形態の数値は近似値ではない。さらに、本明細書で記載されるすべての代替形態が均等であるとは限らない。
【００１４】
本明細書に開示される化合物は、立体中心、不斉軸などの１つまたは複数の不斉要素、例えば、不斉炭素原子を含んでいてもよく、その結果、化学的コンジュゲートは異なる立体異性形態で存在し得る。これらの化合物は、例えば、ラセミ体または光学活性形態であり得る。２つ以上の不斉中心を有する化合物では、これらの化合物はさらに、ジアステレオマーの混合物であり得る。不斉中心を有する化合物については、純粋な形態のすべての光学異性体およびそれらの混合物が包含される。これらの状況では、単一エナンチオマー、すなわち光学活性形態は、非対称合成、光学的に純粋な前駆体からの合成、またはラセミ体の分割によって得ることができる。ラセミ体の分割は、例えば、分割剤の存在下での結晶化、または、例えばキラルＨＰＬＣカラムを使用したクロマトグラフィーなどの従来方法によっても達成することができる。すべての形態は、それらを得るために使用される方法に関係なく、本明細書において企図される。
【００１５】
本明細書で使用される立体化学的な定義および慣例は、一般に、Ｓ．  Ｐ．  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  （１９８４）  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓ．，  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  （１９９４）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学活性形態で存在し、すなわち、平面偏光の平面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記述する際、接頭辞ＤおよびＬまたはＲおよびＳは、そのキラル中心（複数可）の周りの分子の絶対配置を表すために使用される。接頭辞ｄおよびｌ、または（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転の符号を表すために使用され、（−）または１は、その化合物が左旋性であることを意味する。接頭辞が（＋）またはｄの化合物は、右旋性である。
【００１６】
プローブのすべての形態（例えば、溶媒和物、光学異性体、エナンチオマー形態、多形体、遊離化合物および塩）は、単独でまたは組み合わせて採用され得る。
【００１７】
本開示の様々な実施形態のレビューを容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。特定の官能基の用語は、官能基の式の先頭に「−」記号を含む；この記号は、官能基の一部ではなく、官能基が本明細書に記載の式にどのように接続するかを示す。例えば、式「−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂ」の官能基は、「−」記号の隣にある官能基の酸素原子によって官能基化化合物の原子に結合している。
【００１８】
アシルオキシ：−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂであり、Ｒｂは水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００１９】
アルデヒド：−Ｃ（Ｏ）Ｈ。
【００２０】
脂肪族：少なくとも１個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ１−５０）、例えば１〜２５個の炭素原子（Ｃ１−２５）、または１〜１０個の炭素原子（Ｃ１−１０）を有する炭化水素基であって、アルカン（またはアルキル）、アルケン（またはアルケニル）、アルキン（またはアルキニル）が含まれ、それらの環状バージョンを含み、直鎖および分岐鎖の配列、ならびにすべての立体異性体および位置異性体をさらに含む。
【００２１】
脂肪族−芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得る芳香族基であって、芳香族基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２２】
脂肪族−アリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るアリール基であって、アリール基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２３】
脂肪族−ヘテロ芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロ芳香族基であって、ヘテロ芳香族基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２４】
脂肪族−ヘテロアリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロアリール基であって、ヘテロアリール基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２５】
アルケニル：少なくとも２個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ２−５０）、例えば２〜２５個の炭素原子（Ｃ２−２５）、または２〜１０個の炭素原子（Ｃ２−１０）、および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和一価炭化水素であって、不飽和一価炭化水素は、親アルケンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる。アルケニル基は、分岐鎖、直鎖、環状（例えば、シクロアルケニル）、シス、またはトランス（例えば、ＥまたはＺ）であり得る。
【００２６】
アルコキシ：−Ｏ−脂肪族、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、または−Ｏ−アルキニルなどであって、例示的な実施形態には、メトキシ、エトキシ、ｎ-プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ-ブトキシ、ｔ-ブトキシ、ｓｅｃ-ブトキシ、ｎ-ペントキシが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
アルキル：少なくとも１個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ１−５０）、例えば１〜２５個の炭素原子（Ｃ１−２５）、または１〜１０個の炭素原子（Ｃ１−１０）を有する飽和一価炭化水素であって、飽和一価炭化水素は、親化合物（例えば、アルカン）の１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる。アルキル基は、分岐鎖、直鎖、または環状（例えば、シクロアルキル）であり得る。
【００２８】
アルキニル：少なくとも２個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ２−５０）、例えば２〜２５個の炭素原子（Ｃ２−２５）、または２〜１０個の炭素原子（Ｃ２−１０）、および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和一価炭化水素であって、不飽和一価炭化水素は、親アルキンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる。アルキニル基は、分岐鎖、直鎖、または環状（例えば、シクロアルキニル）であり得る。
【００２９】
アルキルアリール／アルケニルアリール／アルキニルアリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るアリール基であって、アリール基は、それぞれアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基を介して結合しているか、結合することになる。
【００３０】
アルキルヘテロアリール／アルケニルヘテロアリール／アルキニルヘテロアリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロアリール基であって、ヘテロアリール基は、それぞれアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基を介して結合しているか、結合することになる。
【００３１】
アミド：−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、ＲｂおよびＲｃの各々は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３２】
アミン：−ＮＲｂＲｃであり、ＲｂおよびＲｃの各々は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３３】
芳香族：別段に指定されない限り、少なくとも１つの環が芳香族（例えば、ナフチル、インドリル、もしくはピラゾロピリジニル）である単環（例えば、フェニル、ピリジニル、もしくはピラゾリル）または複数の縮合環を有する、５〜１５個の環原子を有する環状共役基またはその部位；すなわち、少なくとも１つの環および任意選択の複数の縮合環は、連続的で、非局在化されたπ電子系を有する。典型的には、面外π電子の数はヒュッケル則（４ｎ＋２）に対応する。親構造への結合点は、典型的には縮合環系の芳香族部位を介している。例えば、
【化１】
2020536874.tif 000003
しかしながら、特定の例では、文脈または明示的な開示は、結合点が縮合環系の非芳香族部位を介していることを示し得る。例えば、
【化２】
2020536874.tif 000004
芳香族基または芳香族部位は、環内に、アリール基またはアリール部位のように、炭素原子のみを含んでいてもよく、あるいは、ヘテロアリール基またはヘテロアリール部位のように、１個または複数の環炭素原子と、孤立電子対を含む１個または複数の環ヘテロ原子（例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、またはＳｉ）とを含んでいてもよい。
【００３４】
アリール：少なくとも５個の炭素原子〜１５個の炭素原子（Ｃ５−Ｃ１５）、例えば５〜１０個の炭素原子（Ｃ５−Ｃ１０）を含む芳香族炭化水素環基であって、単環または複数の縮合環を有し、縮合環は、本明細書に開示の化合物の残りの位置への結合点が芳香族炭化水素環基の原子を介していることを条件に、芳香族であってもなくてもよい。アリール基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、他の官能基、またはそれらの任意の組み合わせで置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、アリール環は、フェニル、ナフチル、アントラセニル、インデニル、アズレニル、フルオレニル、テトラシアノアンタキノジメチルなどから選択されるが、これらに限定されない。
【００３５】
アゾ化合物：Ｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２基を含有する化合物であり、Ｒ１およびＲ２は典型的には芳香族基である。アゾ化合物は、例えば、食品、化粧品、医薬品およびその他の工業製品の着色剤として広く使用されている。
【００３６】
アゾレダクターゼ：細菌および真核生物酵素に見られる多様な酵素のグループであって、補因子としてのＮＡＤＨおよびＦＭＮによる電子供与によってアゾ結合を含有する化合物を還元的に切断することができるフラビン依存性（典型的にはフラビンモノヌクレオチド）酵素である。腸内細菌のいくつかの種は、Ｒｙａｎ，  Ａ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  （２０１７）  １７４：    ２１６１−７３に記載されているように、アゾレダクターゼ活性を有することが確認されている。
【００３７】
ベンジルカルボニル：−Ｃ（Ｏ）Ｐｈ。
【００３８】
結合：結合、およびその他の文法的形態は、化学物質間の永続的な引力を意味する。
【００３９】
結合特異性：結合特異性は、特定のパートナーに結合することと、他の分子に結合しないことの両方を含む。機能的に重要な結合は、低親和性〜高親和性の範囲で起こり得、設計要素は、望ましくない相互作用を抑制し得る。翻訳後の修飾も、相互作用の化学および構造を変化させ得る。「無差別結合」は、残基の異なるサブセットが異なるパートナーに結合するために重要であることをもたらし得る程度の構造的可塑性を伴い得る。「相対的結合特異性」とは、ある生化学系において、分子がその標的またはパートナーと差次的に相互作用し、それによって、個々の標的またはパートナーの同一性に応じて、それらに独特に影響を与えるという特性である。
【００４０】
カルボキシル：−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂであり、Ｒｂは脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、水素、およびそれらの任意の組み合わせである。
【００４１】
化学結合：結合した集合体が単位として機能することを可能にするのに十分強い原子間引力。様々な結合主要タイプには、金属結合、共有結合、イオン結合、および架橋結合が含まれる。「金属結合」は、結晶内のすべての原子核の、すべての利用可能な軌道間で非局在的に共有されている外殻電子への引力である。「共有結合」は、２つの原子核によって電子が共有されているときに最も多く生じる。従来の単一共有結合は、２個の電子の共有を伴う。４個の共有電子を持つ二重結合、６個の共有電子を持つ三重結合、および中間の多重度の結合もあり得る。共有結合は、２つの原子によって均等に共有されている電子を含む非極性から、結合電子が非常に不均等に共有されている非常に高い極性までの範囲があり得る。不均等共有の限界は、結合電子が原子のいずれか一方に常時あることでその原子を陰イオンにし、他方の原子を陽イオンの形で残すときに発生する。「静電（またはイオン）結合」は、反対に帯電したイオン間の静電引力である。「架橋結合または水素結合」は、水素が＋または−電荷のいずれかを持つ水素の化合物を伴う。
【００４２】
クリックケミストリー：効率的な試薬条件で結合することができ、温和な溶媒中、または蒸発、抽出、もしくは蒸留などの簡便な方法で除去もしくは抽出することができる溶媒中で行うことができる試薬を使用して化合物を作るための化学合成法である。これらの基準を満たす反応としては、エポキシドおよびアジリジンの求核的開環反応、ヒドラゾンおよびヘテロ環の形成などの非アルドール型カルボニル反応、エポキシドの酸化生成およびマイケル付加などの炭素−炭素多重結合への付加反応、ならびに環化付加反応などのいくつかの種類が確認されている。クリックケミストリーの代表的な例は、アジドとアルキンとを結合させてトリアゾールを形成する反応である。銅触媒によるアジド−アルキン環化反応（ＣｕＡＡＣ）は、無触媒の１，３−双極子付加環化反応に比べ、１０７〜１０８という大きな速度加速を特徴としている。それは広い温度範囲で成功し、水性条件および４〜１２のｐＨ範囲には影響を受けず、幅広い官能基に耐性がある。純粋な生成物は、簡単な濾過または抽出により単離することができ、クロマトグラフィーまたは再結晶を必要としない。
【００４３】
クリック可能な官能基：クリックケミストリーで使用して生成物を形成することができる官能基。いくつかの実施形態では、クリック可能な官能基はアジドまたはアルキンである。
【００４４】
接触：触れているもしくは近接している状態または条件。いくつかの例では、接触は、例えば、試料（細胞またはタンパク質を含有するものなど）に試薬を添加することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００４５】
対照：活性ベースのプローブを含まない試料。
【００４６】
ジクロロジオン：ある構造を有する基であって、その構造の少なくとも一部が
【化３】
2020536874.tif 000005
基を有する基。
【００４７】
差次的標識：単一の細胞または生物の構造、構成要素もしくはタンパク質を特性評価または対比するために使用される染色、色素、マーカー、または活性プローブ。
【００４８】
エステル：−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂであり、Ｒｂは水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００４９】
酵素結合基（すなわちＥＢＧ）：本明細書に記載のプローブの一部であって、酵素に共有結合することになる分子、もしくは官能基、またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＥＢＧは、酵素と反応するように、プローブから酵素反応基を除去することによって、および／またはＥＢＧを化学的に修飾することによって、例えばＥＢＧを還元すること、ＥＢＧを酸化すること、またはそれらの組み合わせによって活性化され得る。いくつかの追加の実施形態では、ＥＢＧを光化学的に活性化して酵素との結合を促進することができる。
【００５０】
酵素反応基（すなわちＥＲＧ）：本明細書に記載のプローブに結合し、酵素によって、例えば酵素的切断および／または化学的置換などでプローブから除去することができる分子、もしくは官能基、またはそれらの組み合わせ。特定の開示の実施形態では、ＥＲＧを除去する酵素は、異物代謝に関与する酵素である。酵素によって酵素切断され得るＥＲＧの代表的な例としては、糖類（グルクロン酸など）、硫酸、およびリン酸が挙げられる。酵素によって置換され得るＥＲＧの代表例としては、ハロゲン化物、フェノール含有分子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
酵素特異性：酵素は、触媒される反応とその基質に高度に特異的である。一般に、酵素特異性には４つの異なるタイプがある：（１）絶対特異性  −  酵素は１つの反応のみを触媒する；（２）基特異性  −  酵素はアミノ基、リン酸基およびメチル基などの特定の官能基を持つ分子にのみ作用する；（３）結合特異性  −  酵素は、分子構造の残りの部分に関係なく、特定のタイプの化学結合に作用する；（４）立体化学的特異性  −  酵素は特定の立体異性体または光学異性体に作用する。酵素は大きな特異性を示すが、補因子は多くのアポ酵素に作用し得る。例えば、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、多くのデヒドロゲナーゼ反応で水素受容体として働く補酵素である。
【００５２】
蛍光：一般に「フルオロフォア」または「蛍光色素」と呼ばれる特定の分子において、分子またはナノ構造が電気的に励起された後に基底状態に緩和するときに起こる３つの状態のプロセスの結果である。第１段階は光エネルギーの吸収によるフルオロフォアの励起を伴い、第２段階はエネルギーの損失に付随する過渡的励起寿命を伴い、第３段階は光の放出に付随してフルオロフォアが基底状態へ戻ることを伴う。
【００５３】
蛍光色素、フルオロクロームまたはフルオロフォア：分子を蛍光性にする分子の構成要素。この構成要素は、特定の波長のエネルギーを吸収し、異なる（が同じように特定の）波長のエネルギーを再放出する分子内の官能基である。放出されるエネルギーの量および波長は、色素および色素の化学環境の両方によって決まる。多くの色素が知られており、限定されないが、以下のものが挙げられる：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−テキサスレッドタンデム、ＰＥ−Ｃｙ５タンデム、プロピジウムヨードム、ＥＧＦＰ、ＥＹＧＰ、ＥＣＦ、ＤｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒＣｐ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、クマリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（３５０、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、クロモマイシンＡ３、ミトラマイシン、ＹＯＹＯ−１、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、臭化エチジウム、７−ＡＡＤ、アクリジンオレンジ、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＬＤＳ７５１、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、ＥＢＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＥＣＦＰ、ＧＦＰ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｙ７７Ｗ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＺｓＧｒｅｅｅｎｌ、ＺｓＹｅｌｏｗｌ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＨｃＲｅｄｌ、モノクロロビマン、カルセイン、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ、シアニン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＮＢＤ、ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲート、Ｒｅｄ  ６１３、フルオレセイン、ＦｌｕｏｒＸ、ＢＯＤＩＤＹ−ＦＬ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ¬ローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＴｒｕＲｅｄ、およびそれらの誘導体。
【００５４】
ハロゲン：フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードから選択される原子。
【００５５】
ヘテロ脂肪族：少なくとも１個のヘテロ原子〜２０個のヘテロ原子、例えば１〜１５個のヘテロ原子、または１〜５個のヘテロ原子を含む脂肪族基であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および基内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。例示的なヘテロ脂肪族基としては、エーテル、チオエーテル、エステル、アミン、カルボキシ、カルボニル、またはアミドを含む脂肪族基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
ヘテロ脂肪族−芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得る芳香族基であって、芳香族基はヘテロ脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００５７】
ヘテロ脂肪族−アリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るアリール基であって、アリール基はヘテロ脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００５８】
ヘテロアルキル／ヘテロアルケニル／ヘテロアルキニル：少なくとも１個のヘテロ原子〜２０個のヘテロ原子、例えば１〜１５個のヘテロ原子、または１〜５個のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、またはアルキニル基（これらは分岐鎖、直鎖、または環状であり得る）であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および基内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。
【００５９】
ヘテロ芳香族：少なくとも１個のヘテロ原子〜２０個のヘテロ原子、例えば１〜１５個のヘテロ原子、または１〜５個のヘテロ原子を含む芳香族基であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および基内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。
【００６０】
ヘテロアリール：少なくとも１個のヘテロ原子〜６個のヘテロ原子、例えば１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および環内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。そのようなヘテロアリール基は、単環または２つ以上の融合環を有していてもよく、その融合環は、結合点が芳香族ヘテロアリール基の原子を介していることを条件に、芳香族であってもなくてもよく、および／またはヘテロ原子を含んでいてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール環は、ピリジニル、キノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾキノリニル、ベンゾキノキサリニル、ベンゾキナゾリニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニルなどから選択されるが、これらに限定されない。
【００６１】
ヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロ芳香族基であって、ヘテロ芳香族基は、ヘテロ脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００６２】
ケトン：−Ｃ（Ｏ）Ｒｂであり、Ｒｂは脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００６３】
標識：分子の位置を空間的に特定するためや、分子を反応または精製スキームで追跡したりするために分子に組み込まれた追跡可能な構成要素。動詞としては、検出または測定することができるような基または原子を加えることをいう。
【００６４】
リアーゼ：酸化または水の添加に頼らずに、Ｃ−ＣまたはＣ−Ｘ結合（Ｘ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐまたはハロゲン化物）を切断する酵素。微生物多糖リアーゼ（ＰＬ）は、カルボン酸に対してβ位にグリコシド結合を含有する多糖類（例えば、アルギン酸、ペクチン、コンドロイチン、およびヘパラン）を修飾する。微生物Ｃ−Ｓ  β−リアーゼは、食品化合物と、肝臓酵素によって形成される生体異物のシステイン−Ｓ−抱合との両方に見られるＣ−Ｓ結合を切断する。これらの酵素は、ピリドキサール５−リン酸（ＰＬＰ）とシステイン由来の置換基のα−アミノ基との間にアルジミン結合を生成し、隣接するプロトンを酸性化する。β−脱離により、チオール含有代謝物およびアミノアクリレートが放出され、後者は自然に分解されてアンモニアおよびピルビン酸を形成する。微生物は、これらのチオールをさらに代謝し、その物理的性質および体内での局在を変化させることができる。例えば、腸内細菌Ｃ−Ｓ  β−リアーゼは、ポリ塩化ビフェニルのシステイン−Ｓ−抱合を切断してチオール代謝物を生成し、さらにメチル化されて親油性の宿主組織に蓄積する。
【００６５】
調節すること：特定の尺度または割合に調整すること、変更すること、適応させること、または調節すること。
【００６６】
ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）：ミクロソームのシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）、シトクロムｂ５、スクワレンモノオキシゲナーゼ、およびヘムオキシゲナーゼへの電子移動に関与するフラボタンパク質。ＰＯＲから、小さなミクロソームヘムタンパク質であるシトクロムｂ５への電子移動は、脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性をサポートしているため、脂肪酸代謝において重要である。シトクロムｂ５は、ミクロソームＰ４５０への電子伝達においても役割を果たしている。スクアレンモノオキシゲナーゼは、ＰＯＲから供与された電子を利用してステロール生合成をサポートする。追加の電子受容体は、ヘムをビリベルジン、鉄、一酸化炭素に分解する酵素であるヘムオキシゲナーゼである。ＰＯＲは、抗悪性腫瘍剤マイトマイシンＣおよびティラパザミンなどのプロドラッグの一電子還元的生物活性化を直接触媒することもできる。Ｒｉｄｄｉｃｋ，  ＤＳ  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  （２０１３）  ４１  （１）：    １２−２３。
【００６７】
ニトロレダクターゼ：ニトロ化合物を、合計６個の電子を必要とする一次アミン代謝物に還元する、例えば、ＲＮＯ２→ＲＮＯ→ＲＮＨＯＨ→ＲＮＨ２とする酵素（例えば、キサンチンオキシダーゼ、細胞質画分におけるアルデヒドオキシダーゼ；およびミクロソーム画分におけるＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ−４５０レダクターゼ）。各還元ステップは２個の電子を必要とする。Ｚｂａｉｄａ，  Ｓ．，  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈａｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｅ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ  （２００２），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，  ｃｈａｐｔｅｒ  １６，  ｐａｇｅｓ  ５５５−６６。
【００６８】
正常な健康対照：疾患の症状またはその他の臨床的証拠のない被験体。
【００６９】
リン酸：本明細書に記載のプローブ実施形態に結合しているときには構造−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を有し、プローブ実施形態に結合していないときには構造Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）３またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）３を有する官能基。アニオン性リン酸基は、対応する酸素原子上の負電荷のバランスをとる適切な対イオン、例えばＫ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋などのアルカリ金属イオン；アンモニウムイオン、または他の正に帯電したイオン化有機化合物を含むことができる。
【００７０】
光活性化：光などの照射を生じさせることができるエネルギー源を使用して、機能させること、作用させる（活性化させる）こと、または制御すること。
【００７１】
レポーティング部位：視覚的および／または手段として検出され得るシグナルを発生させることができる官能基または分子。特定の開示の実施形態では、レポーティング部位が酵素に共有結合することになるため、レポーティング部位は、適切な検出方法を使用して、酵素を視覚化する能力または検出する能力を提供する。
【００７２】
試料：生体分子、例えば核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡ）、タンパク質、および／または細胞を含有する生体標本。例示的な試料は、被験体からの細胞または細胞溶解物（細菌などの１つまたは複数の病原体を含み得る）、例えば末梢血（または血漿もしくは血清などのその一部）、尿、唾液、喀痰、組織生検、口腔スワブ、糞便検体（例えば、便試料）、呼吸器検体、手術検体、細針吸引、羊水穿刺試料、および剖検材料を含有するものである。一実施例では、試料は、被験体の胃、小腸、大腸、または直腸などの被験体の消化管から得ることができる。試料は、直接使用することができるが、開示の方法で分析する前に、濃縮、濾過、溶解、洗浄、および／または希釈することもできる。
【００７３】
被験体：脊椎動物、哺乳動物などの生物、例えばヒト。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。一実施例では、被験体は、非ヒト哺乳動物、例えばサルまたは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。いくつかの例では、被験体は爬虫類、両生類、魚または鳥である。被験体は、開示の方法およびデバイスを使用して分析される試料の供給源として機能することができる。
【００７４】
硫酸：本明細書に記載のプローブ実施形態に結合しているときには構造−ＳＯ２Ｏ−または−ＳＯ２ＯＨを有し、プローブ実施形態に結合していないときには構造ＳＯ２（Ｏ−）２またはＳＯ２（ＯＨ）２を有する官能基。アニオン性硫酸基は、対応する酸素原子上の負電荷のバランスをとる適切な対イオン、例えばＫ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋などのアルカリ金属イオン；アンモニウムイオン、または他の正に帯電したイオン化有機化合物を含むことができる。
【００７５】
毒性物質：人が作った毒物、または人的活動によって環境に投入された毒物、例えば殺虫剤。
【００７６】
生体異物：薬理学的、内分泌学的、または毒性学的に活性な化学物質で、それにさらされた生物の天然構成要素ではないもの。生体異物の例としては、食品、栄養補助食品、発がん性物質、毒素および薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
上記に示す用語の記載は、許容可能でない置換パターン（例えば、５個の異なる基で置換されたメチルなど）を含むことを意図するものではない。そのような許容可能でない置換パターンは、当業者によって容易に認識される。本明細書に開示される式および特定の化合物において、官能基または他の原子が図示されていない場合はいつでも、水素原子が存在し、形式的な価数要件を満たす（ただし、必ずしも図示されていなくてもよい）。例えば、
【化４】
2020536874.tif 000006
のように描かれているフェニル環は、「ａ」の炭素以外のフェニル環の各炭素原子に結合した水素原子を、そのような水素原子が図示されていなくても含んでいる。
【００７８】
本明細書に開示の任意の官能基および／または上記で定義された官能基は、本明細書に別段の記載がない限り、置換されていても、置換されていなくてもよい。本明細書で論じた刊行物は、本出願の出願日よりも前の開示のためだけに提供され、各々が参照によりその全体が組み込まれる。本明細書のいかなるものも、本開示が、そのような刊行物に先行する権利を、先行発明を理由に有していないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、記載されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、独自に確認する必要がある場合がある。
【００７９】
（ＩＩ．緒言）
Ａ．薬物代謝
生体膜の通過を促進し、その後の作用部位へのアクセスを促進する薬物の親油性特性は、体内からの排泄を妨げる。糸球体を通過して濾過された親油性化合物は、腎尿細管を通過する間に大部分が再吸収されて全身循環するため、未変化の薬物の腎排泄は、ほとんどの治療薬の全体的な排泄においてはわずかな役割しか果たしていない。したがって、薬物およびその他の生体異物をより親水性の高い代謝物に代謝することは、これらの化合物を体内から排除し、その生物活性を停止させるために不可欠である。代謝による生体内変換反応の多くは、ステロイド、ビタミン、脂肪酸などの内因性化合物にも同様に適用される。一般に、生体内変換反応では、排泄されやすい極性の高い不活性代謝物が生成されるが、場合によっては、強力な生物活性または毒性を有する代謝物が生成される。薬物の不活性代謝物につながる代謝生体内変換反応の多くは、内因性化合物の生物活性代謝物も生成する。(Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｈａｒｄｍａｎ，  ＪＧ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，  Ｌ．  Ｅｄｓ，  １０ｔｈ  Ｅｄ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｔｌ  Ｅｄｎ  （２００１）  ａｔ  １２  -  １５）。
【００８０】
薬物代謝の特徴は、個人間の大きなばらつきであり、それはしばしば顕著な違いをもたらし、その結果、薬物の排泄速度および血漿中濃度−時間プロファイルの他の特徴をもたらす。そのような変動性は、薬物の標準用量に対する患者の反応が異なる主な理由であり、特定の個人に対する投与レジメンを最適化する際に考慮しなければならない。遺伝因子、環境因子、および病状因子の組み合わせが薬物代謝に影響を与え、各々の相対的な寄与度は特定の薬物によって決まる。
【００８１】
（Ｂ．第I相および第II相代謝）
生体異物の代謝には通常、２つの異なる段階がある。第I相代謝は、ミクロソームのシトクロムＰ−４５０モノオキシゲナーゼによる生体異物の初期酸化、還元、または脱アルキル化を伴う（Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，  Ｆ．Ｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ４：    ３９１−４０７  （１９９１））；この工程は、第II相反応に不可欠なヒドロキシル基またはアミノ基を提供するためにしばしば必要とされる。酸化は最も一般的な第Ｉ相反応である。
【００８２】
第ＩＩ相代謝は、抱合、すなわち、イオン化された基の薬物への結合を含む。これらの基には、グルタチオン、メチル基またはアセチル基が含まれ、これらは、一般に、生体異物をより水溶性にし、生物活性を低下させる。よく関与する第ＩＩ相抱合反応は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｂｅｃｋｅｔｔ，  Ｇ．Ｊ．  ＆  Ｈａｙｅｓ，  Ｊ．Ｄ．，  Ａｄｖ．  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  ３０：  ２８１−３８０  （１９９３））、エポキシドヒドロラーゼ、スルホトランスフェラーゼ（Ｆａｌａｎｙ，  ＣＮ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １２：  ２５５−５９  （１９９１））、およびＵＤＰ−グルクロン酸トランスフェラーゼ（Ｂｏｃｋ，  ＫＷ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６：１２９−５０  （１９９１））によって触媒される。 
【００８３】
（生体内変換の部位）
生体異物の代謝変換は、一般的に酵素的な性質である。薬物の生体内変換に関与する酵素系は肝臓に局在しているが、検査したすべての組織が何らかの代謝活性を持っている。その他の代謝能力の高い臓器としては、消化管、腎臓および肺がある。薬物の非経口投与後、投与量のかなりの部分が、全身循環に到達する前に、腸管上皮または肝臓のいずれかで代謝的に不活性化され得る。この「初回通過」代謝は、高度に代謝される薬剤の経口投与を著しく制限する。(Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｈａｒｄｍａｎ，  ＪＧ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，  Ｌ．  Ｅｄｓ，  １０ｔｈ  Ｅｄ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｔｌ  Ｅｄｎ  （２００１）  ａｔ  １２  -  １５）。
【００８４】
所与の細胞内では、薬物代謝活性の大部分は小胞体および細胞質ゾルにあるが、薬物の生体内変換はミトコンドリア、核膜および形質膜でも起こりうる。第Ｉ相反応に関与する酵素系は主に小胞体に存在し、第ＩＩ相の抱合酵素系は主に細胞質ゾルに存在する。多くの場合、小胞体での第Ｉ相反応によって生体内変換された薬物は、この同じ部位または同じ細胞の細胞質画分で抱合される。
【００８５】
（Ｄ．シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼシステム）
シトクロムＰ４５０酵素は、すべての生物に広く分布するヘムチオレートタンパク質のスーパーファミリーである。この酵素は、生体異物を含む、多量の化学的に多様な内因性化合物および外因性化合物の代謝に関与している。通常、これらは多成分電子伝達鎖の末端酸化酵素として機能し、酸素分子の１原子を基質に導入し、もう１原子は水に取り込まれる。ミクロソームでは、電子は、平滑小胞体の脂質膜においてシトクロムＰ４５０と密接に会合しているシトクロムＰ４５０レダクターゼを介して、ＮＡＤＰＨから供給される。シトクロムＰ４５０は、芳香族および側鎖ヒドロキシル化；Ｎ−、Ｏ−およびＳ−脱アルキル化；Ｎ−酸化；Ｎ−ヒドロキシル化；スルホキシド化；脱アミノ化；脱ハロゲン化；および脱硫化を含む多くの酸化反応を触媒する。いくつかの還元反応も、通常は低酸素圧の条件下で、これらの酵素によって触媒される。
【００８６】
ヒトでは約５７種のシトクロムＰ４５０が機能的に活性であり、そのうち４０種が異物代謝に関与している。これらは１７のファミリーと多くのサブファミリーに分類されている。ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、およびＣＹＰ３ファミリーの約８〜１０のアイソフォームは主に、ヒトのすべての薬物代謝反応の大部分に関与している。ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５はともに、約５０％の薬物の代謝に関与している。他のファミリーのメンバーは、ステロイド、脂肪酸、ビタミンおよびその他の内因性化合物の生合成および分解に重要である。個々のＣＹＰアイソフォームは、基質の構造的特徴に基づいて特徴的な基質特異性を持っているように見えるが、かなりの重複が存在することが多い。
【００８７】
ＣＹＰ酵素系の他に、化学酸化のための代替酵素は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）としても知られるプロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）であり、これはアラキドン酸代謝およびプロスタグランジン、プロスタサイクリンおよびトロンボキサンなどのプロスタノイドの形成における初期酵素である。内因性基質であるヒドロペルオキシエンドペルオキシド（ＰＧＧ２）がヒドロキシエンドペルオキシド（ＰＧＨ２）に還元される過程で、ＰＧＨＳ酵素は生体異物を共酸化することができる。この反応では、フェノール化合物、芳香族アミン、および多環芳香族炭化水素など、幅広いスペクトルの化学物質が電子供与体として機能し得る。肝臓の多数のＣＹＰ酵素とは対照的に、ＰＧＨＳは肝外組織における異物代謝のための代替酵素である。Ｖｏｇｅｌ，  Ｃ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  （２０００）  １（４）：    ３９１−４０４。
【００８８】
（Ｅ．加水分解酵素）
ヒトの肝臓、腸、および他の組織の小胞体では、いくつかの非特異的エステラーゼおよびアミダーゼが同定されている。エステルおよびアミドの加水分解後に露出したアルコール基およびアミン基は、抱合反応に適した基質である。Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｈａｒｄｍａｎ，  ＪＧ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，  Ｌ．  Ｅｄｓ，  １０ｔｈ  Ｅｄ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｔｌ  Ｅｄｎ  （２００１）  ａｔ  １２  -  １５。
【００８９】
ミクロソームエポキシドヒドロラーゼは、基本的にすべての組織の小胞体に存在し、シトクロムＰ４５０酵素に近接している。エポキサイドヒドロラーゼは一般に解毒酵素とみなされており、シトクロムＰ４５０酸化反応で生成した反応性の高いアレーン酸化物を加水分解し、不活性な水溶性のトランスジヒドロジオール代謝物を生成する。
【００９０】
グリコシダーゼおよびスルファターゼは、薬物代謝に重要なさらなるヒドロラーゼである。これらは主にグリコサミノグリカンおよびステロイドなどの内因性基質を代謝するが、いくつかの生体異物基質も受け入れる；これは特にベータ−グルクロニダーゼに当てはまる。腸内細菌叢は、グルクロニドまたは硫酸エステルとして胆汁を介して排泄される化合物を脱抱合することができる；脱抱合生成物は、多くの場合腸から再吸収され、腸肝循環に至る。グリコシダーゼは、毒性を付与することが多い；天然物の毒性および突然変異原性は、グリコシドの糖部分によってマスキングされていることが多く、脱グリコシル化はその毒性効果をもたらす。Ｏｅｓｃｈ−Ｂｅｒｔｌｏｍｏｗｉｃｚ，  Ｆ．  Ｏｅｓｃｈ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ  （２００７）  ５：    １９３−２１４。有機硫酸エステルの開裂は、スルファターゼ酵素によって触媒され、対応するアルコールおよび無機硫酸塩の形成をもたらす。スルファターゼは、ＳＵＬＴの作用により形成された硫酸エステルの加水分解を触媒する。スルファターゼ酵素の３つのクラスが発見されており、触媒に利用される補因子の種類によって区別されている。アリールスルファターゼと呼ばれるグループＩの酵素は、古細菌、細菌、および真核生物に存在し、カルシウムイオンまたはマグネシウムイオンおよびホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）補因子を必要とする。ＦＧｌｙは、システインまたはセリン側鎖の翻訳後酸化によって形成されるタイプＩ型スルファターゼの活性部位にほぼ独占的に存在する触媒的に不可欠な残基である。Ａｐｐｅｌ，  ＭＪ，  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，  Ｃ．Ｒ．，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  （２０１５）  １０（１）：    ７２−８４。真核生物スルファターゼ酵素は、ステロイド、脂質、およびグリコサミノグリカンにおける硫酸エステル結合の加水分解など、多数のプロセスに関与している。Ｓｃｈｅｐａｒｔ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ，  ＪＢ，  ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＩＩ  （２０１０）  ８：  ６２５−６６１。
【００９１】
プロテアーゼおよびペプチダーゼ酵素は広く分布しており、ポリペプチド薬物の生体内変換に関与している。
【００９２】
（Ｆ．抱合反応。）
内因性化合物の活性型および適切なトランスフェラーゼ酵素の両方が、抱合代謝物の形成に必要である。
【００９３】
（Ｇ．グルクロン酸抱合）
グルクロン酸抱合は、ウリジン５´ジホスホグルクロン酸と、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−ＮＨ２、Ｒ−ＣＯＯＨなどのいくつかの可能な官能基のうちの１つとの反応を伴う。この反応は、多くの組織に存在するＵＧＴ（グルクロン酸トランスフェラーゼとも呼ばれる）によって代謝される。ＵＧＴは、シトクロムＰ４５０酵素とともに、代謝経路の８０％超を占めている。グルクロン酸抱合の部位は、一般に電子豊富な求核性ヘテロ原子（酸素、窒素、または硫黄）である。ＤｅＧｒｏｏｔ，  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ  （２００７）  ５：    ８０９−２５。ＵＧＴは２つの異なる遺伝子ファミリー：ＵＧＴ１およびＵＧＴ２に分類され、後者は遺伝子多型を示す。ヒトでは、サブファミリー１Ａおよび２Ｂに属する最大１６の異なる機能的ＵＧＴアイソフォームが特徴づけられている。
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｐｈａ．ｕｌａｖａｌ．ｃａ／ｕｇｔ−ａｌｌｅｌｅｓ−ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／）では、異なるが重複する基質特異性を持っている。フェノール類の広範囲のグルクロン酸抱合は、例えば、経口投与された薬剤の初回通過グルクロン酸抱合（またはＵＧＴによる早期クリアランス）が低い経口バイオアベイラビリティと有効性の欠如を通常もたらすため、経口バイオアベイラビリティにとって障害となり得る。Ｗｕ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ  （２０１１）  １００（９）：    ３６５５−８１。エゼチミブおよびモルヒネのグルクロニドは、親化合物と同等またはそれ以上の効力を有する。ダイズおよび他のマメ科植物（例えば、ダイゼインおよびゲニステイン）に見られるいくつかの天然イソフラボンフェノール類のグルクロニドは、エストロゲン受容体結合およびナチュラルキラー細胞活性化を含む、それらの非抱合型親の弱い生物活性を保持している。
【００９４】
（Ｈ．スルホン化）
生体異物ならびにステロイドおよび神経伝達物質などの小さな内因性基質のスルホン化は、自然界に広く分布しており、微生物から人間に至るまでの生物で行われる。スルホン化のプロセスは、通常アクセプター分子のヒドロキシルへのスルホ（ＳＯ３−）部位の移動を伴い、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）によって触媒される。これらの反応のための普遍的なスルホネート供与体は、３´−ホスホアデノシン５−ホスホスルホネート（ＰＡＰＳ）である。ほとんどの生体異物（例えば、アセトアミノフェン）および小さな内因性基質（例えば、ドーパミン）の場合、スルホン化は通常、より水溶性の高い生成物をもたらす解毒経路と考えられており、それによって腎臓または胆汁を介したそれらの排泄を助け、生物活性を低下させる。いくつかの生体異物、例えば、ヒドロキシル複素環式アミンおよびヒドロキシメチル多環芳香族炭化水素については、スルホン化は、変異原性かつ発癌性である非常に反応性の高い求電子体をもたらす。発毛促進剤ミノキシジルおよび神経内分泌ペプチドであるコレシストキニンのスルホン化は、それらの生物学的効果を誘発し、その水溶性を増加させ、生物活性を低下させる。Ｇａｍａｇｅ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉ．  （２００６）  ９０（１）：    ５−２２。ヒトでは、ＳＵＬＴ１、ＳＵＬＴ２、およびＳＵＬＴ４の３つのＳＵＬＴファミリーは、異なるが重複する基質特異性を有する少なくとも１３の異なるメンバーを含むことが確認されている。ＳＵＬＴＳの広い基質特異性は、これらの酵素の複数の形態が存在し、いくつかのアイソフォームの結合部位が可塑的であり、酵素が様々な構造を採用して小さな芳香族、Ｌ型芳香族、および縮合環化合物と相互作用することを可能にするという事実に起因している。
【００９５】
（Ｉ．アセチル化）
２つのＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ１およびＮＡＴ２）が、アミン、ヒドラジンおよびスルホンアミドのアセチル化に関与している。ほとんどの薬物抱合体とは対照的に、アセチル化された代謝物は親薬物よりも水溶性が低いことが多い。Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｈａｒｄｍａｎ，  ＪＧ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，  Ｌ．  Ｅｄｓ，  １０ｔｈ  Ｅｄ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｔｌ  Ｅｄｎ  （２００１）  ａｔ  １２  -  １５。
【００９６】
（Ｊ．グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼは、脂肪族、芳香族、または複素環ラジカルならびにエポキシドおよびアレーンオキシドのグルタチオン（ＧＳＨ）への付加を触媒する。これらのグルタチオン抱合体はその後、主に腎酵素によって切断されてシステイン誘導体となり、その後アセチル化され、こうしてＮ−アセチルシステイン誘導体を形成する。反応中間体に変換されてＧＳＨに結合する化合物の例としては、ブロモベンゼン、クロロホルム、およびアセトアミノフェンが挙げられるが、これらに限定されない。そのような毒性物質は、ＧＳＨを枯渇させる可能性がある。ＧＳＨの枯渇は、脂質過酸化に対する身体の防御能力を低下させる。グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）は、オキシドレダクターゼクラスの酵素であり、グルタチオンの酸化を介して過酸化水素および有機過酸化物の無害化還元を触媒する。ＧＳＨは酸化されてジスルフィド結合二量体（ＧＳＳＧ）となり、細胞外に積極的に排出され、還元型グルタチオンへの再変換用にはほとんど利用できなくなる。
【００９７】
ＧＳＨは、グルタチオンペルオキシダーゼの補因子でもある。したがって、グルタチオンが他の経路で再合成されない限り、酸化型グルタチオンの利用は、利用可能なグルタチオンの量の減少と関連する。
【００９８】
オキシドレダクターゼクラスのフラボタンパク質酵素であるグルタチオンレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）は、細胞性グルタチオンのその還元型での維持に不可欠である（Ｃａｒｌｂｅｒｇ  ＆  Ｍａｎｎｅｒｖｉｃｋ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５０：  ５４７５−８０  （１９７５））。それは、ＮＡＤＰＨの存在下で酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）から還元型グルタチオン（ＧＳＨ）への還元を触媒し、赤血球において約５００：１の高い細胞内ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を維持する。
【００９９】
ＧＳＨの合成にはシステインが必要であり、システインは、食事から、または食品由来のメチオニンをシスタチオナーゼ経路を介して変換することによって取得する必要がある条件付き必須アミノ酸である。システインの供給が十分であれば、正常なＧＳＨレベルが維持される。ＧＳＨの枯渇は、ＧＳＨ消費の増加を前にして、システインの供給がＧＳＨホメオスタシスを維持するのに不十分な場合に起こる。急性ＧＳＨ枯渇は、深刻な−しばしば致命的な−酸化および／またはアルキル化損傷を引き起こし、アセトアミノフェンなどのＧＳＨ枯渇薬の投与、またはＧＳＨを枯渇させる疾患および状態に起因する慢性的なあるいは緩慢に発生するＧＳＨ欠乏症も同様に、衰弱させるものとなり得る。
【０１００】
（Ｋ．レダクターゼ）
アルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）および短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ）は、生体異物のカルボニルを巻き込む酸化還元反応を触媒する主要な酵素である。ＡＫＲは、ＣＹＰまたは他の酵素系による代謝変換によって導入されたか、親生体異物に存在するカルボニルの酸化還元変換に関与する。ＡＫＲ１Ｂに関する研究を推進する主な起動力は、例えば、この酵素が高血糖損傷に関与している可能性と、糖尿病合併症の治療のための特異的ＡＫＲ１Ｂ１阻害剤への期待とである。Ｂａｒｓｋｉ，  Ｏ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｖ．  （２００８）  ４０（４）：    ５５３−６２４。
【０１０１】
（Ｌ．腸内マイクロバイオータによる代謝物生成）
生体異物の微生物代謝は、ヒト宿主で発生している同時進行の、しばしば競合する代謝プロセスに照らして理解されなければならない。経口摂取された化合物は上部消化管を通って小腸に至り、そこで消化酵素によって修飾され、宿主組織によって吸収される。容易に吸収された生体異物は、腸管上皮細胞間または腸管上皮細胞を通過し、そこで、門脈を介して肝臓に輸送される前に宿主酵素によって処理され得る。肝臓の豊富な代謝酵素にさらされた後、生体異物およびその代謝物は全身循環に入り、組織に分布し、遠位臓器に影響を及ぼす可能性がある。対照的に、静脈内投与された化合物は、この「初回通過」代謝を回避し、直ちに全身循環に導入される。循環系内の化合物は、最終的にさらに代謝および／または排泄され、これは通常は、胆管を経由して腸管腔に戻る（胆汁排泄）か、腎臓を経由して尿へ向かう。腸管腔に戻された代謝物は、大腸に進み、そこで最終的には糞便中に排泄されることになるか、腸肝循環として知られるプロセスを経て、小腸の宿主細胞によって再吸収される可能性がある。Ｋｏｐｐｅｌ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１７）  ３５６  （６３４４）：  １２４６  ＤＯＩ：    １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｇ２７７０。
【０１０２】
したがって、生体異物は、複数のルートを介して腸内微生物に行き当たることができる。小腸で吸収される化合物とは対照的に、吸収の悪い生体異物は小腸を通って大腸へと進み、腸内微生物によって変換され得る。容易に吸収された化合物および他の経路（例えば、静脈注射）で投与された化合物も、胆汁排泄を介して腸内微生物に到達することができる。腸内微生物代謝の産物は、宿主によって吸収されて全身循環するか、消化管を覆う上皮細胞と局所的に相互作用することができる。最終的に、これらの微生物代謝物は、糞便中に排泄されるか、腎臓で濾過されて尿中に排泄される。全体として、ヒトおよび微生物変換は複雑に絡み合った代謝ネットワークを生成し、宿主とマイクロバイオータのメンバーとの両方に影響を与えている。
【０１０３】
全身吸収に続く好ましい酸化的および抱合的代謝とは対照的に、腸内細菌による代謝は、ほとんどが還元的および加水分解的である（Ｋｌａａｓｓｅｎ  ＣＤ  ａｎｄ  Ｃｕｉ  ＪＹ，  （２０１５）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  ４３：１５０５-１５２１）。異物代謝に関連し、本明細書で注目した酵素クラス（ヒドロラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、およびトランスフェラーゼ）の多くが、シーケンスされた腸内微生物の間で広く分布している。したがって、多くの重要な生体異物の変換は、腸内微生物の複数の異なる系統発生群によって行われている可能性がある。しかしながら、配列の類似性が高い酵素は異なる化学反応を触媒し得るため、幅広いアノテーションは基質特異性を予測するものではないことに注意することが重要である。代謝活性は近縁の菌株間で不連続的に分布していたり、遺伝子の水平伝播によって獲得されたりすることもあるため、系統発生解析のみから腸内微生物の代謝能力を推測するのは問題がある。Ｋｏｐｐｅｌ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１７）  ３５６  （６３４４）：  １２４６；  ＤＯＩ：    １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｇ２７７０。
【０１０４】
薬物および異物代謝を行う第I相酵素（薬物／異物を酸化する酵素を含む）および第II相酵素（薬物／異物の抱合／修飾を促進して抱合種にする酵素を含む）の発現および活性は、ヒトなどの哺乳動物の全体的な薬物動態プロファイルの主要な決定要因であるため、ほぼすべての医薬品が、その代謝プロファイルについて、すなわち、第I相および第II相酵素によってその医薬品がどのように代謝されるかについて評価される必要がある。そのような酵素には、通常、肝臓および腸内マイクロバイオームの酵素が含まれる。同様に、潜在的に毒性のある生体異物（例えば、環境中の殺虫剤およびその他の化学汚染物質）も、ヒト代謝について評価される必要がある。
【０１０５】
ヒトの腸には、すべてのヒト個体群にまたがる微生物の明確なコアセットは存在しないが、健康な個人間にまたがるマイクロバイオータには、１，０００を超える微生物分類群の異なる組み合わせから生じる異物代謝に共通の機能がある。個人内であっても、マイクロバイオータの異物代謝は、一生の間に組成が変化しても、ほぼ維持される。これは、環境または薬理学的に誘発される毒性および疾患に対する腸内マイクロバイオータ対応感受性の分子基盤を理解することは、メタゲノムのみから容易には推測できないことを示唆している。また、系統発生的組成の個人差が異物代謝機能の違いを生み出しているとは限らないことも示唆している。微生物−生体異物相互作用のより正確なモデルは、異物代謝を３つの構造レベル：群集異物代謝、分類群レベル異物代謝、および酵素レベル異物代謝で考慮している。複雑な異物代謝経路は、これらの階層スケール内でのおよびそれらの間の相互作用を通じて出現することが多い。群集レベルでは、空間的かつ組成的な構造が特定の分類群の増殖、活性および生存に影響を与える。種レベルでは、異物代謝の酵素の発現が様々な調節機構によって制御される。最後に、酵素レベルでは、実際の生体内変換が行われる。
【０１０６】
現在、異物代謝は、肝臓マイクロソーム抽出物を生体異物とともに処理し、一定の培養期間後に存在する生体異物の代謝物を決定することで、大部分が決定されている。代謝物が決定された後、生体異物にどのような代謝が行われているかを推測することができる。存在するものとしては、これらの酵素ファミリーのタンパク質発現レベルを測定するための抗体が長い間存在していた。また、酵素ファミリーの活性を読み取ることができる比色法や蛍光活性測定法もあるが、個々の酵素の寄与度を読み取ることはできない。さらに、ＲＮＡまたはタンパク質の存在量が機能活性レベルと相関することはほとんどない。このように、異物代謝を評価する現在の方法では、個々の酵素の活性寄与度に関する十分な情報が得られない。さらに、メタゲノミクスおよびメタトランスクリプトームなどの、腸内マイクロバイオームにおける生体異物評価の現在のアプローチは、上述の３つの構造レベルのうち最初の２つのレベルに対応することができるが、３番目のレベルに対応することは本質的にできない。これらの技法は、活性を担う微生物または酵素を同定するのに十分ではない。例えば、マイクロバイオームの機能を解析する一般的なアプローチは、群集内の総活性を測定する一般的なアッセイを使用し、群集から採取したメタゲノムおよびメタトランスクリプトームを使用して、最も豊富な分類群および酵素を特定することである；これらは、観察された累積活性の主要な推進力であると推定される（図１）。
【０１０７】
ＲＮＡの処理および安定性、必要な翻訳後修飾、酵素の低分子もしくは酸化的阻害、または必要なタンパク質−タンパク質および補因子酵素の相互作用を含む多くの要因が、遺伝子または転写産物の量と酵素機能との直接的な相関を阻害する。転写量と酵素量との相関は４０％と低い。したがって、転写産物と酵素機能の相関はさらに低い。マイクロバイオーム内の特定の分類群および酵素に正確に機能を割り当てるためには、新しいアプローチが必要であり、特に、図２に示すように、すべてのレベルで機能活性を測定することができる方法が必要である。
【０１０８】
阻害、抗生物質の使用、宿主の食生活、腸内毒素症、残留解性有機汚染物質、またはその他のメカニズムによる腸内微生物の異物代謝に対する摂動は、特に腸内コロニー形成が損なわれる初期の生活において、宿主の健康に変化をもたらす可能性がある。健康に理想的なマイクロバイオーム組成を構成するものは明らかではないが、マイクロバイオームは宿主とともに一連の代謝機能を実行することができる必要があるというコンセンサスが高まっている。異物代謝に関与することが知られている酵素ファミリーには、β−グルクロニダーゼ、アゾレダクターゼ、ニトロレダクターゼ、スルファターゼ、およびｂ−システインリアーゼが挙げられる。重要なことは、生体異物ばく露は腸内マイクロバイオータの組成を変化させ、異物代謝活性を変化させる可能性があるということである。これは、複雑なフィードバックループをもたらし得る。例えば、有機汚染物質である２，３，７，８−テトラクロロジベンゾジオキシン（ＴＣＤＤ）を含むアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アゴニストは、宿主の代謝および免疫を変化させることができる。最新の知見は、ＡｈＲが腸内マイクロバイオームの組成を調節することもでき、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ  Ａｈｒ−／−マウスでは腸内組成と代謝活性が変化したことを示している。したがって、ＡｈＲの生体異物活性化は宿主の代謝および免疫を変化させ、腸内マイクロバイオームを変化させる。これは、腸内マイクロバイオータによる異物代謝の変化につながり、生理的恒常性を乱し、異物誘発性疾患の一因となる可能性がある。摂動を通してすべてのレベルの異物代謝を追跡するための戦略の開発は、マイクロバイオータ媒介性毒性および疾患感受性の機能的および分子基盤を定義し、ばく露リスク評価を改善し、毒性および感受性の機能的バイオマーカーを特定するために必要である。本発明者らは、そのような戦略を開発した。
【０１０９】
マイクロバイオータ−生体異物相互作用は代謝全体において重要な役割を果たしているが、その原因となる分子機構の理解には知識のギャップが存在する。実際、これまでのこの理解の多くは、抗生物質処理、ノトバイオート動物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを使用して、マイクロバイオータ全体の有無にかかわらず代謝物の終局を特定する実験に由来している。そのような研究では、活性酵素および微生物を特定することによる分子スケールでの解明を得ることはできない。メタゲノム研究およびメタトランスクリプトーム研究は、この解明を提供することができる；しかしながら、遺伝子の存在または発現は、必ずしもタンパク質が産生されていることや、タンパク質が活性であることを示すものではない。例えば、精製されたβ−グルクロニダーゼの活性の違いを考えると、うまく翻訳されたグルクロニダーゼであっても、グルクロン酸抱合代謝物に同じ影響を与えるとは考えにくい。これらの違いは、シーケンシング技術だけでは特定できないが、活性ベースの戦略と組み合わせることで、マイクロバイオータの機能的に活性な個体群が明らかになる。本発明者らは、強力な活性ベースの戦略を開発したが、これは、推論を超えてｉｎ  ｓｉｔｕでの機能活性の分子スケールでの測定に移行する必要性に直接対処するものであり、宿主、マイクロバイオータ、および生体異物がどのように相互作用するかをより完全に理解するための手段を提供するケミカルバイオロジーツールの有用性を強調するものである。
【０１１０】
（ＩＩＩ.プローブ実施形態）
本開示は、マイクロバイオータ媒介性毒性および疾患感受性の機能的および分子基盤を定義するのに有効な活性ベースのプローブ（本明細書では「ＡＢＰ」または「プローブ」とも呼ばれる）を提供する。開示のＡＢＰ実施形態は、触媒的に活性化された標的酵素によって活性化されると、その酵素と共有結合を形成する低分子基質である。プローブは、活性酵素が存在するときにのみ結合するため、ＡＢＰを使用して、溶解液、生細胞、または組織中の特定の酵素活性を実証することができる。例えば、標的酵素を含有する患者試料をプローブと反応させてから標的酵素−プローブ複合体を固相支持体に添加することができるため、プローブ上のクリック可能な官能基が、標的酵素−プローブ複合体の直接検出用のクリック可能官能基含有レポーター分子との反応に利用可能になることが企図されている。あるいは、プローブのクリック可能な官能基とクリック可能な官能基で誘導体化された固相支持体表面とを反応させてプローブをまず固定化し、プローブを固相支持体に結合させてから標的酵素を含有する患者試料と反応させることができ、次いで第２のレポーターを使用して標的酵素−プローブ結合の間接的な検出を可能にすることが企図されている。したがって、本開示は、プローブの樹脂もしくは支持体への結合を容易にする部位を含むプローブ、あるいはプローブを標識することにより、プローブが結合している酵素を富化してプロテオミクスによって測定することができるようにすること、および／またはプローブを標識することにより、プローブとプローブが結合している酵素とがさらなる分析（例えば、イメージング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または蛍光活性化細胞ソーティング（すなわち「ＦＡＣＳ」））を受けることができるようにすることを含む。
【０１１１】
本明細書に記載のＡＢＰは、上述したように、プローブを支持体または樹脂に結合させるために、またはプローブ（およびプローブが結合することになる酵素）を標識するために使用することができる、酵素結合基およびＴａｇ部位（またはその前駆体）を含む構造を有することができる。いくつかの実施形態によれば、ＡＢＰは、以下に図示する一般式Ｉを満たす構造を有し得る。
【化５】
2020536874.tif 000007
【０１１２】
ヒトおよび腸内マイクロバイオータ両方の標的を含む異物代謝に関与する標的酵素にプローブを結合させるための例示的なシナリオには、限定されないが、以下のものが含まれる：（１）酵素がプローブのＥＢＧからＥＲＧを切断し、これにより酵素に結合することができる活性化ＥＢＧが生成される；（２）標的酵素へのＥＢＧの選択的結合であって、プローブが、酵素によって化学修飾されて別の基を形成する基を含み、その基がＥＢＧを活性化することでプローブが酵素に結合することができるようになる；および（３）プローブのＥＢＧが酵素に結合するように、ＥＲＧ基が酵素によって置換されること。
【０１１３】
式Ｉに関して、「ＥＢＧ」は酵素結合基を表し、「Ｔａｇ」はプローブを可視化するために使用することができる標識部位を表し；「ｐＴａｇ」はＴａｇ部位に変換することができるか、またはプローブを支持体もしくは樹脂に結合させるために使用することができる前駆体部位を表す。式Ｉで例示するように、いくつかのＡＢＰ実施形態は、酵素反応基（すなわち「ＥＲＧ」）をさらに含むことができるが、この基は、すべての実施形態において存在する必要はない。ＥＲＧの任意の存在は、式Ｉにおいて破線で示されている。ＥＲＧが存在する実施形態では、ＥＲＧは、直接的または間接的にＥＢＧに結合し、酵素によってＥＢＧから切断され得るか、酵素によってプローブから置換され得る官能基または分子であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲＧが存在する場合、ＥＲＧは、直接的または間接的にＥＢＧに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＥＢＧは、直接的または間接的にＴａｇまたは代替的にｐＴａｇに結合することができる。「直接的に結合する」という表現は、言及する基が、それらの間に何もない状態で互いに化学結合することを意味する。「間接的に結合する」という表現は、言及する基が、別の部位（例えば、官能基、リンカー、またはそれらの組み合わせ）を介して互いに化学結合することを意味する。
【０１１４】
いくつかの実施形態によれば、式ＩのＥＢＧは、化学修飾時に酵素に結合することが可能な基であり得る。ＥＢＧの代表的な実施形態を本明細書に記載する。例示的に開示する実施形態では、ＥＢＧは、ＥＲＧを化学修飾するのと同じ酵素に結合することが可能な基であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＢＧは、酵素がプローブ実施形態のＥＲＧを切断した後に、酵素に共有結合することになる。ＥＲＧを切断するかまたはＥＲＧを置換することができる例示的な酵素には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼ活性のある酵素（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼ）、アルドケトレダクターゼ活性のある酵素（例えば、アルドケトレダクターゼ）、グルクロニダーゼトランスフェラーゼ、スルファターゼ、ホスファターゼ、およびプロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
いくつかの追加の実施形態によれば、酵素がＥＢＧの官能基を化学的に修飾した後（例えば、ＥＢＧの官能基を還元または酸化することによって）、ＥＢＧは酵素に共有結合することになる。ＥＢＧの官能基を化学修飾することによってＥＢＧ基を活性化することができる例示的な酵素には、アゾ官能基をアミンに還元するアゾレダクターゼ、例えば、限定されないが、フラビン依存性ＮＡＤＨ優先アゾレダクターゼ、フラビン依存性ＮＡＤＰＨ優先アゾレダクターゼ、フラビンフリーＮＡＤＰＨ優先アゾレダクターゼ、またはニトロ基をアミンに還元するニトロレダクターゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
いくつかの追加の実施形態によれば、ＥＢＧは、酵素とプローブを単に結合させることにより、酵素に共有結合した状態になることができる。このようにしてＥＢＧと反応することができる例示的な酵素には、β−システインリアーゼ活性のある酵素、例えばβ−システインリアーゼ）が含まれる。
【０１１７】
さらなる追加の実施形態によれば、ＥＢＧが酵素の官能基と共有結合を形成することができるほどの光化学反応をＥＢＧ内に誘導する光源にさらされた後に、ＥＢＧは酵素に共有結合した状態になることができる。そのような実施形態においてＥＢＧに結合することができる例示的な酵素には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、およびスルホトランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
Ｔａｇ（またはｐＴａｇ）部位は、プローブが酵素に結合する前または結合した後に、プローブをさらに修飾するためのハンドルを提供する。Ｔａｇ部位を含む実施形態では、Ｔａｇ部位は、生体試料での使用に適した検出技法を使用して検出することが可能なレポーティング部位であり得る。好適なＴａｇ部位は、蛍光検出技法、比色検出技法、結合アッセイ技法などを使用して検出可能なシグナルを発生させることができる官能基および／または分子を含む。例示的な開示の実施形態によれば、Ｔａｇ部位は、例えば、フルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、色素などであり得る。例えば、Ｔａｇ部位は、ビオチン部位、アビジンまたはストレプトアビジン部位、フルオレセイン部位、ローダミン部位、クマリン部位、キニーネ部位またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１１９】
プローブがｐＴａｇ部位を含む実施形態によれば、ｐＴａｇ部位はさらに修飾されてＴａｇ部位を提供することができ、および／またはプローブを支持体もしくは樹脂に固定するために使用することができる。そのような実施形態によれば、ｐＴａｇ部位は、典型的には、それ自体がＴａｇ部位を含む化学的結合パートナーか、または支持体もしくは樹脂に結合された化学的結合パートナーと化学結合することができる官能基である。例えば、ｐＴａｇ部位は、Ｔａｇ部位とクリック可能な官能基とを含む別個の化合物（Ｔａｇ含有化合物と呼ばれる）か、または支持体もしくは樹脂に結合したクリック可能な官能基を含む別個の化合物（支持体含有化合物と呼ばれる）に化学結合することができるクリック可能な官能基を含むことができる。ｐＴａｇＧ部位、Ｔａｇ含有化合物、および／または支持体含有化合物に選択され得る例示的なクリック可能な官能基には、アルキン基およびアジド基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔａｇ含有化合物は、フルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、色素などの少なくとも１つのＴａｇ部位を含むことができる。支持体含有化合物は、支持体または樹脂、例えば生物学的分析に典型的に使用されるものを含むことができ、支持体または樹脂の官能基は、直接的または間接的に（例えば、共有結合的に）クリック可能な官能基に結合する。単に例示として、いくつかのプローブ実施形態は、アルキンを含むｐＴａｇ部位を含むことができる。このプローブ実施形態は、それぞれ、Ｔａｇ部位とアジドとを含むＴａｇ含有化合物、または支持体とアジドとを含む支持体含有化合物と結合することができる。式Ｉで示されるＴａｇ部位を提供するように、アルキンおよびアジドを、クリックケミストリーを介して化学結合させることができる。そのようないくつかの実施形態によれば、タグ前駆体とタグ含有化合物のクリック可能な官能基は異なる；すなわち、一方がアルキンを含む場合、他方はアジドを含むため（またはその逆）、クリック化学を使用して２つの成分を結合させてプローブを形成することができる。いくつかの実施形態によれば、クリックケミストリーを使用して、プローブが酵素に結合する前または結合した後に、ｐＴａｇ部位と対応するＴａｇ含有化合物または支持体含有化合物とを結合させることができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、ＡＢＰは、複数のＴａｇ部位および／またはｐＴａｇ部位、例えば２つ以上のＴａｇ部位および／またはｐＴａｇ部位を含むことができる。そのようないくつかの実施形態によれば、２つ以上のＴａｇ部位および／またはｐＴａｇ部位は、ＥＢＧに（直接的または間接的に）結合している。いくつかのそのような実施形態によれば、プローブは、ＥＢＧに（直接的または間接的に）結合している２つのＴａｇ部位を含むことができる。そのようないくつかの実施形態によれば、各Ｔａｇ部位は、同じ部位であってもよいし、他の部位とは異なる部位であってもよい。さらに他の実施形態によれば、プローブは、ＥＢＧに（直接的または間接的に）結合している２つのｐＴａｇ部位を含むことができる。そのようないくつかの実施形態によれば、各ｐＴａｇ部位は、同じ部位であってもよいし、他の部位とは異なる部位であってもよい。単に例示として、一方のｐＴａｇ部位はアルキン基を含むことができ、他方のｐＴａｇ部位はアジド基を含むことができる；２つのｐＴａｇ部位の各々はアルキン基を含むことができる；または２つのｐＴａｇ部位の各々はアジド基を含むことができる。さらに他の実施形態によれば、プローブは、１つのＴａｇ部位と１つのｐＴａｇ部位とを含むことができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、プローブは、以下の式ＩＩを満たす構造を有し得る。
【化６】
2020536874.tif 000008
式ＩＩに関して、ＥＲＧは（存在する場合）、酵素によってＥＢＧから切断もしくは置換され得る官能基または分子である；ＥＢＧは、第ＩＩ相代謝に関与する酵素と共有結合することが可能な官能基であるか、または腸内マイクロバイオームに存在する官能基である；Ｌｉｎｋｅｒａには、脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれる；Ｌｉｎｋｅｒｂ、およびＬｉｎｋｅｒｃには（存在する場合）、各々独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれ得る；各Ｔａｇは（存在する場合）、独立して、検出可能なシグナルを発生させることができる官能基（または分子）である；各ｐＴａｇは（存在する場合、例えばＴａｇが存在しない場合など）、クリック可能な官能基を含む；ｎ、ｍ、ｐ、およびｑの各々は独立して０または１であり得る。ｎ、ｍ、ｐ、およびｑの任意の１つまたは複数が０である実施形態では、ｎ、ｍ、ｐ、またはｑで修飾されたその基は存在せず、元は間接的に結合していた基はもう直接結合していてもよい（例えば、ＥＢＧ−Ｔａｇ（またはｐＴａｇ））。ｑが０である例示的な実施形態では、Ｌｉｎｋｅｒａは、図示されているＴａｇ部位またはｐＴａｇ部位に直接結合している。
【０１２２】
ｎが１である例示的な実施形態では、ＥＲＧは存在し、ＥＢＧに結合している。いくつかのそのような例示的な実施形態によれば、ＥＲＧは、例えば酵素によってＥＢＧ基から切断され得るか置換され得る官能基または分子である。酵素切断され得るＥＲＧには、グルクロン酸部位、グルクロン酸誘導体（例えば、アジリジン官能基化グルクロン酸基、例えば
【化７】
2020536874.tif 000009
)、硫酸塩(またはスルホン酸)部位、リン酸塩(またはリン酸)部位などが挙げられるが、これらに限定されない。酵素によって置換され得る代表的なＥＲＧには、ハロゲン（例えば、Ｉ、Ｃｌ、Ｆ、もしくはＢｒ）または式−ＯＰｈのフェノール含有基であって、Ｐｈ基が水素以外の１つまたは複数の置換基を任意選択で含むフェノール含有基が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な開示の実施形態では、ＥＲＧは、以下から選択される：グルクロン酸(
【化８】
2020536874.tif 000010
）；酵素切断される前に、グルクロン酸部位とアジリジン環を形成する窒素原子を含むＥＲＧに結合しているグルクロン酸誘導体；硫酸塩（もしくはそのプロトン化されたバージョン）；リン酸塩（もしくはそのプロトン化されたバージョン）；ヨード、または−ＯＰｈであって、−ＯＰｈ基の酸素原子に対してフェニル環のオルト、メタ、またはパラ位に−ＣＨ２ＯＮＯ２基を任意選択で含む−ＯＰｈ。
【０１２３】
例示的な開示の実施形態では、ＥＢＧは、以下の官能基を含む：（ａ）最終的に共有結合することになる酵素によって化学修飾されることが可能である官能基；または（ｂ）酵素と反応するための活性化が、同じ酵素がＥＢＧに結合したＥＲＧを切断した後に可能となる官能基；または（ｃ）酵素との結合が、酵素がＥＢＧに結合したＥＲＧを置換させた後に可能となる官能基；または（ｄ）光源にさらされた後に、酵素と反応するための活性化が可能となる官能基；または（ｅ）酵素との結合が、酵素にさらされた際に可能となる官能基。例示的な開示の実施形態では、ＥＢＧは、アゾ基、ニトロ基、オルトもしくはパラキノンメチドを形成することができるオルトもしくはパラ置換フェノール基、オレフィン、アミド、ジクロロジオン基、またはベンジルカルボニル基を含むことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態によれば、ＥＢＧは、以下に示す式ＩＩＡＥＢＧ〜ＩＩＪＥＢＧの１つまたは複数を満たす構造を有する。単なる例示の目的のために、プローブの追加的構成要素（例えば、Ｌｉｎｋｅｒａ、Ｌｉｎｋｅｒｃ、および／またはＥＲＧ）は、接続性を示すために図示されている。
【化９】
2020536874.tif 000011
（式中、Ｙ´はＯ（この場合、ＥＲＧが存在する）、−Ｎ＝ＮＲ´´（Ｒ´´は色素または他のレポーティング部位である）、またはニトロである；ｍは０〜５から選択される整数である；各Ｒ´は独立してアルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、アシル、ハロゲン化アシル、シアノ、スルホン酸、ニトロ、ニトロソ、第４級アミン、ＣＦ３、ハロゲン化アルキル、またはそれらの組み合わせから選択される）；
【化１０】
2020536874.tif 000012
（式中、Ｙは−ＣＨ３または−ＣＦ３である）；
【化１１】
2020536874.tif 000013
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、Ｌｉｎｋｅｒａは、アルキレンオキシド、アミン、アミド、エステル、−（ＣＨ２）ｎ´−基（式中、ｎ´は１〜５０、例えば１〜２５、もしくは１〜１０、もしくは１〜５の整数、もしくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０である）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例示的な開示の実施形態では、Ｌｉｎｋｅｒａは、式ＩＩＡＬｉｎｋｅｒａ〜ＩＩＧＬｉｎｋｅｒａの任意の１つまたは複数を満たす構造を有し得る。単なる例示的な目的のために、プローブの追加的構成要素（例えば、ＥＢＧ、Ｒ、Ｔａｇ（もしくはｐＴａｇ）、および／またはＬｉｎｋｅｒｂ）は、接続性を示すために図示されている。
【化１２】
2020536874.tif 000014
（式中、ｎ´は１〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数；または０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０である）；
【化１３】
2020536874.tif 000015
（式中、ｎ´は０〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり、Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；
【化１４】
2020536874.tif 000016
（式中、ｎ´は１〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり、Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；
【化１５】
2020536874.tif 000017
（式中、ｎ´は１〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり、Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；
【化１６】
2020536874.tif 000018
（式中、各ｎ´は独立して１〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり、ＱはＣＨ２、Ｏ、またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；あるいは
【化１７】
2020536874.tif 000019
【０１２６】
Ｌｉｎｋｅｒｂを含む実施形態では、この部位は、−（ＣＨ２）ｎ´−基（式中、ｎ´は１〜５０、例えば１〜２５、もしくは１〜１０、もしくは１〜５の整数、もしくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０である）；アミド基；またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例示的に開示の実施形態では、Ｌｉｎｋｅｒｂ基は、−（ＣＨ２）ｎ´−基（ｎ´は１〜５（１、２、３、４、または５）である）、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ´´´ＣＨ２−基（カルボニル部分はＬｉｎｋｅｒａに結合しており、メチレン部分はＴａｇ（またはｐＴａｇ）に結合しており、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）であり得る。
【０１２７】
Ｌｉｎｋｅｒｃを含む実施形態では、この部位は、アミド、脂肪族基、アルキレンオキシド基、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例示的に開示の実施形態では、Ｌｉｎｋｅｒｃは、以下に示す式ＩＩＡＬｉｎｋｅｒｃまたは式ＩＩＢＬｉｎｋｅｒｃを満たす構造を有し得る。単なる例示的な目的のために、プローブの追加的構成要素（例えば、ＥＢＧ、Ｒ、Ｔａｇ（もしくはｐＴａｇ）、および／またはＬｉｎｋｅｒａ）は、接続性を示すために図示されている。
【化１８】
2020536874.tif 000020
（式中、ｎ´は０〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり、Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；あるいは
【化１９】
2020536874.tif 000021
（式中、ｎ´は０〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり、Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）。
【０１２８】
プローブがＲ基を含む例示的な実施形態では、Ｒ基は、Ｒ基をＬｉｎｋｅｒａに連結させるカルバメートまたはカーボネートを含む基であり得る。例示的な開示の実施形態では、Ｒ基は、式ＩＩＡＲ〜ＩＩＣＲの任意の１つまたは複数を満たす構造を有し得る。単なる例示的な目的のために、プローブの追加的構成要素（例えば、ＥＢＧ、Ｌｉｎｋｅｒａおよび／またはＬｉｎｋｅｒｂ）は、接続性を示すために図示されている。
【化２０】
2020536874.tif 000022
（式中、ＺおよびＺ´は独立して酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；
【化２１】
2020536874.tif 000023
（式中、ＺおよびＺ´は独立して酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）；
【化２２】
2020536874.tif 000024
（式中、ＺおよびＺ´は独立して酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族であり、ｎ´は０〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５の整数である）；あるいは
【化２３】
2020536874.tif 000025
【０１２９】
例示的な開示の実施形態では、プローブは、以下に示される構造のいずれかから選択される構造を有することができる。
【化２４−１】
2020536874.tif 000026
【化２４−２】
2020536874.tif 000027
【化２４−３】
2020536874.tif 000028
【化２４−４】
2020536874.tif 000029
【化２４−５】
2020536874.tif 000030
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、プローブは、式ＩＩＩＡを満たす構造を有し得る。
【化２５】
2020536874.tif 000031
式ＩＩＩＡに関して、以下の置換基の詳述が適用され得る：
ＥＲＧは、存在する場合、ハロゲン、フェノール、硫酸塩、リン酸塩、グルクロン酸、または２つのヒドロキシル基がＥＢＧの窒素原子によって置換されてアジリジンを形成しているグルクロン酸基であり得る；
ＥＢＧは、ジクロロジオン基、フェノール基、オレフィン、アゾ基、アミド基、カルボニル基、ニトロ基、または炭素原子を含む部位であり得る；
ＬｉｎｋｅｒａおよびＬｉｎｋｅｒｃの各々は、式ＩＩに関して上述した通りであり得る；
各Ｔａｇは、存在する場合、独立して、検出可能なシグナルを発生させる官能基または分子であり得る；代替的に、プローブがｐＴａｇ（「Ｔａｇ前駆体」）基を含む場合、各ｐＴａｇは独立してクリック可能な官能基を含むＴａｇ前駆体であり得る；
ｍは０または１であり得る。
【０１３１】
式ＩＩＩＡの例示的な開示の実施形態では、以下が適用され得る：
ＥＲＧは存在し、ヨード、−ＯＰｈ（Ｐｈ基が水素以外の１つもしくは複数の置換基、例えば−ＣＨ２ＯＮＯ２基を任意選択で含み得る）、または２つのヒドロキシル基がＥＢＧの窒素原子によって置換されてアジリジンを形成しているグルクロン酸基から選択される；
ＥＢＧが、式ＩＩＡＥＢＧ、ＩＩＢＥＢＧ、ＩＩＣＥＢＧ、ＩＩＤＥＢＧ、ＩＩＥＥＢＧ、ＩＩＧＥＢＧ、ＩＩＨＥＢＧ、ＩＩＩＥＢＧ、またはＩＩＪＥＢＧから選択される；
Ｌｉｎｋｅｒａはエステル基、−（ＣＨ２）ｎ´−基、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ´ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−基であって、各ｎ´は独立して１〜２０、例えば１〜１０、または１〜５の整数、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；
Ｌｉｎｋｅｒｃは、−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−基または−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）ＣＨ２［Ｏ（ＣＨ２）２］ｎ´ＯＣＨ２−基であって、各ｎ´は独立して１〜２０、例えば１〜１０、または１〜５の整数、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；
各Ｔａｇは、存在する場合、フルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素であり得る；代替的に、ｐＴａｇ基が存在する場合、各ｐＴａｇは独立してアルキンまたはアジドである；
ｍは１である。
【０１３２】
例示的な開示の実施形態では、式ＩＩＩＡを満たす化合物は、以下に示すアジドおよびアルキン含有化合物から選択され得る。
【化２６−１】
2020536874.tif 000032
【化２６−２】
2020536874.tif 000033
【化２６−３】
2020536874.tif 000034
【化２６−４】
2020536874.tif 000035
【０１３３】
いくつかの実施形態では、プローブは、式ＩＩＩＢを満たす構造を有し得る。
【化２７】
2020536874.tif 000036
式ＩＩＩＢに関して、以下の置換基の詳述が適用され得る：
ＥＢＧは、本明細書に記載のように、ＥＢＧを光源にさらした後に酵素に結合することになる光活性化可能な酵素結合基であり得る；
Ｌｉｎｋｅｒａはフェニル基であり得るか、または式ＩＩＤＬｉｎｋｅｒａを満たす構造を有し得る；
Ｌｉｎｋｅｒｂは−（ＣＨ２）ｎ´−であり、ｎ´は１〜５の整数である；
Ｔａｇは、存在する場合、検出可能なシグナルを発生させる官能基または分子であり得る；代替的に、プローブがｐＴａｇ（「Ｔａｇ前駆体」）基を含む場合、ｐＴａｇはクリック可能な官能基を含むＴａｇ前駆体であり得る；
Ｒは式ＩＩＡＲ、式ＩＩＢＲ、または式ＩＩＣＲを満たす構造を有し得る。
【０１３４】
式ＩＩＩＢのいくつかの例示的な実施形態では、以下の置換基の詳述が適用され得る：
ＥＢＧはジアジリジン、例えば
【化２８】
2020536874.tif 000037
；またはベンゾフェノン（例えば、
【化２９】
2020536874.tif 000038
）であり得る；
Ｌｉｎｋｅｒａはフェニル基または
【化３０】
2020536874.tif 000039
であり得る；
Ｌｉｎｋｅｒｂは、−（ＣＨ２）ｎ´−または−（ＣＨ２）ｍ［Ｏ（ＣＨ２）２］ｎ´ＯＣＨ２−であり得、各ｍは独立して０または１であり、各ｎ´は独立して１〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０の整数、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０である；
Ｔａｇは、存在する場合、フルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素であり得る；代替的に、ｐＴａｇ基が存在する場合、ｐＴａｇはアルキンまたはアジドである；
Ｒは以下の構造から選択され得る：
【化３１】
2020536874.tif 000040
（式中、ｎ´は０〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０の整数、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０である）。
【０１３５】
例示的な開示の実施形態では、式ＩＩＩＢを満たす化合物は、以下に示す化合物から選択され得る。
【化３２】
2020536874.tif 000041
2020536874.tif 000042
【０１３６】
独立して、プローブは、以下に示す化合物のいずれからも選択されない。
【化３３】
2020536874.tif 000043
（式中、Ｒは
【化３４】
2020536874.tif 000044
である）。それでも、そのような化合物を本明細書に記載の方法で使用することができる可能性がある。
【０１３７】
（Ａ．β−グルクロニダーゼおよびグルクロノシルトランスフェラーゼプローブ実施形態）
腸内マイクロバイオームによって調節される経路の一つがグルクロン酸抱合である。グルクロン酸抱合は、哺乳動物における生体異物の第ＩＩ相代謝およびクリアランスを促進し、これらはグルクロン酸の生体異物および内因性代謝物への抱合によって媒介され、それらの溶解度を高める。腸内に存在する微生物のβ−グルクロニダーゼは、この抱合体を加水分解して親化合物に戻すことができ、薬力学の変化、治療の失敗、または重篤な副作用につながる。最新の研究では、保存モチーフが特定され、β−グルクロニダーゼのアノテーション（バイオインフォマティクスでは、生物学的に関連する特徴の解明および記述を意味する；説明および注釈によって配列データベースに追加される生物学的配列に関する情報のテキストフィールド）が改善された；ただし、これらの遺伝子は腸内マイクロバイオータのメンバーに広く分布しているため、脱グルクロン酸抱合で活性の特定の分類群の予測は非常に困難である。
【０１３８】
第ＩＩ相代謝および腸内マイクロバイオームにおける機能活性を特性評価するという課題に対処するために、本発明者らは、β−グルクロニダーゼに特異的なＡＢＰ実施形態を開発した。いくつかの実施形態によれば、これらのＡＢＰ実施形態は、上述の式ＩＩまたは式ＩＩＡを満たす構造を有し得る；例示的に開示の実施形態では、これらのＡＢＰは、下記の式ＩＶＡ、ＩＶＢ、またはＩＶＣを満たす構造も有する。式ＩＶＡを満たす実施形態では、活性グルクロニダーゼがプローブと反応すると、求電子性のｏ−キノンメチドが形成され、近くにある酵素の求核性残基によって攻撃され、反応性基と酵素との間に共有結合を形成する。式ＩＶＣを満たす実施形態では、プローブへの酵素の結合は、蛍光ターンオン応答を引き起こす。プローブのアルキンハンドルは、上述したように、クリックケミストリーを介したＴａｇの結合および／または支持体もしくは樹脂結合を可能にする。
【化３５】
2020536874.tif 000045
活性化および蛍光「ターンオン」応答
【０１３９】
これらの式に関して、各Ｔａｇ部位は、存在する場合、および／または各ｐＴａｇ部位は、存在する場合、独立して、任意の上記の式ついて上述した通りであり得、ＬｉｎｋｅｒａおよびＬｉｎｋｅｒｃの各々は、任意の上記の式について上述した通りであり得る。いくつかの実施形態によれば、ＬｉｎｋｅｒａおよびＬｉｎｋｅｒｃの各々は独立して−ＣＨ２［Ｏ（ＣＨ２）２］ｎ´ＯＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｎ´−、または−（ＣＨ２）ｎ´Ｐｈ−から選択され得、各ｎ´は独立して１〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０の整数、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり得る。変数ｍ´は、１または０であり得る。ｍが０である実施形態では、炭素２は存在せず、炭素１がＬｉｎｋｅｒａ基に結合している。そのようなプローブの代表的な実施形態を以下に示し、特定の理論に限定されることなく、酵素結合のためにそのようなプローブ実施形態を活性化することができる方法の例示的な機構を図３に示す。以下の構造において破線結合（すなわち、”−−−−”）が使用されるとき、これは、破線結合で結合しているフッ素原子が任意に存在する（そうでない場合には、水素原子が存在する）ことを示している。
【化３６−１】
2020536874.tif 000046
【化３６−２】
2020536874.tif 000047
【化３６−３】
2020536874.tif 000048
【０１４０】
本発明者らはまた、現在不可逆的阻害剤が存在しない酵素であるグルクロノシルトランスフェラーゼに特異的に結合させるために使用することができるＡＢＰ実施形態を開発した。グルクロノシルトランスフェラーゼは、原薬および他の生体異物の第ＩＩ相代謝に関与する酵素である。これらの特定の酵素の１つを標的とし、かつ不可逆的結合を形成することにより、本明細書に記載のプローブ実施形態を使用して、これらの第ＩＩ相酵素の活性を決定するか、これらに影響を与えることができる。グルクロノシルトランスフェラーゼに結合可能なプローブは、上述したように、式ＩＩまたは式ＩＩＩＢを満たす構造を有し得る。例示的な開示の実施形態では、これらのプローブはまた、以下に示す式ＶＡ〜ＶＣの任意の１つまたは複数を満たす構造を有し得る。これらのプローブは、光活性化されて酵素と結合することができるＥＲＧを含む。光活性化され得る基としては、ベンゾフェノン基およびジアジリン基（例えば、脂肪族ジアジリンおよびトリフルオロメチルフェニルジアジリン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【化３７】
2020536874.tif 000049
式ＶＡ、ＶＢ、およびＶＣの各々に関して、Ｔａｇ（存在する場合）、またはｐＴａｇ（存在する場合）は、独立して式ＩＩＩＢについて上述した通りであり得る；ｎは、０〜５０、例えば１〜２５、または１〜１０、または１〜５から選択される整数であり得る；ｍは１または０であり得る。
【０１４１】
グルクロノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ）に不可逆的に結合することができる代表的なプローブ実施形態を以下に示す。
【化３８】
2020536874.tif 000050
（式中、各ｎ´は独立して０〜５０であり、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である）。
【０１４２】
（Ｂ．グルタチオンＳ−トランスフェラーゼプローブ実施形態）
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、それらの細胞内での位置によって、細胞質ゾル、ミトコンドリア、およびミクロソームのスーパーファミリーに分類され、これらは配列の相同性に基づいてさらにクラス分けされている。ＧＳＴは、ＧＳＨと結合する「Ｇ」部位および基質と結合する「Ｈ」部位を含む。トランスクリプトミクスおよび／またはグローバルプロテオミクスによって測定されるＧＳＴの発現は、それらの解毒性ＧＳＨトランスフェラーゼ活性とは相関しないことが多い。発現と活性との間のこの不一致は、既知の翻訳後修飾、代替酵素特異的非トランスフェラーゼ活性、およびタンパク質−タンパク質相互作用を変化させる活性に起因し得る。
【０１４３】
ＧＳＴのＧＳＨトランスフェラーゼ活性は、ＧＳＨ結合Ｇ部位および基質結合Ｈ部位の両方の活性に依存する（図４を参照）。本明細書に記載の特定のプローブ実施形態は、各部位を標的とし、ＧＳＴの活性を測定することができ、代表的な例が図４に示されている。例示的なプローブ実施形態は、以下の式ＶＩＡまたはＶＩＢのいずれか１つを満たす構造を有する。
【化３９】
2020536874.tif 000051
式ＶＩＡおよびＶＩＢに関して、以下の置換基の詳述が適用され得る：
各Ｘは、独立してハロゲンであり得る；
Ｌｉｎｋｅｒａには、脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれ得る；
Ｔａｇは、存在する場合、検出可能なシグナルを発生させる官能基または分子であり得る；代替的に、プローブがｐＴａｇ（「Ｔａｇ前駆体」）基を含む場合、ｐＴａｇはクリック可能な官能基を含むＴａｇ前駆体であり得る；
式ＩＩＩＥに関して、Ｙはハロゲンまたはグルタチオン部位であり得る。
【０１４４】
例示的な開示の実施形態では、以下の置換基の詳述が適用され得る：
各Ｘはクロロである；
Ｌｉｎｋｅｒａは、−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−、または−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）ＣＨ２［Ｏ（ＣＨ２）２］ｎ´ＯＣＨ２−であって、各ｎ´は独立して１〜２０、例えば１〜１０、または１〜５の整数、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；
Ｔａｇは、存在する場合、フルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素であり得る；代替的に、ｐＴａｇ基が存在する場合、ｐＴａｇはアルキンまたはアジドである；
式ＶＩＢに関して、Ｙはクロロまたはグルタチオンであり得る。
【０１４５】
例示的な開示の実施形態では、プローブは、以下に示す式ＶＩＣの構造を有し得る。
【化４０】
2020536874.tif 000052
式ＶＩＣに関して、Ｌｉｎｋｅｒａは、上記の式ＩＩＧＬｉｎｋｅｒａについて示した通りであり得る；ＥＢＧは、ジアジリジンまたはベンゾフェノンなどの光活性化可能な基であり得る；Ｌｉｎｋｅｒｂはアミドを含むことができる。Ｔａｇ（存在する場合）、またはｐＴａｇ（存在する場合）は、独立して上述した通りであり得る。
【０１４６】
グルタチオントランスフェラーゼに不可逆的に結合することができる例示的なアジドまたはアルキン含有プローブ実施形態を、以下に示す。
【化４１】
2020536874.tif 000053
【０１４７】
（Ｃ．レダクターゼプローブ実施形態）
いくつかの実施形態によれば、ＡＢＰは、アゾレダクターゼ、ニトロレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシレダクターゼ、またはアルドケトレダクターゼ（ＡＫＲ）などのレダクターゼ酵素に選択的に結合するプローブであり得る。そのようなプローブ実施形態は、式ＩＩまたは式ＩＩＩＡのような、上述の式の１つまたは複数を満たす構造を有し得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態によれば、プローブは、アゾレダクターゼに選択的に結合するＥＢＧを含む。そのようなプローブ実施形態は、アゾレダクターゼによって最初に化学修飾されてアミンを形成するアゾ基を含み、それによって（例えば、活性化キノンメチド種を形成することによって）ＥＢＧを活性化し、アゾレダクターゼがプローブに結合することができるようにする。アゾレダクターゼと結合することができる例示的なプローブ実施形態を以下に示す。特定の理論に限定されることなく、酵素結合のためのそのようなプローブ実施形態の活性化の例示的な機構を、図３に示す。
【化４２】
2020536874.tif 000054
【０１４９】
さらなる実施形態によれば、プローブは、ニトロレダクターゼに選択的に結合するＥＢＧを含む。そのようなプローブ実施形態はニトロ基を含み、このニトロ基はニトロレダクターゼによって還元されてアミンとなることができ、それによって上述のアゾレダクターゼプローブ実施形態に類似した活性化キノンメチド種を形成することができる。ニトロレダクターゼを標的とするのに有効なプローブの例示的な実施形態を以下に示す。特定の理論に限定されることなく、酵素結合のためのそのようなプローブ実施形態の活性化の例示的な機構を、図３に示す。
【化４３】
2020536874.tif 000055
【０１５０】
いくつかの実施形態によれば、プローブは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼに選択的に結合するＥＢＧを含む。そのようなプローブ実施形態はまた、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼによって置換されるＥＲＧ基を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＲＧは、エステル結合を介してＥＢＧに結合しているフェノール基であり得る。フェノールＥＲＧは、ＥＢＧがＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼに結合するように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼによって置換され得る。そのようなプローブの例示的な実施形態を以下に示す。
【化４４】
2020536874.tif 000056
【０１５１】
いくつかの実施形態によれば、以下に示すプローブを使用して、本明細書に記載の他のプローブの１つまたは複数と組み合わせて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼに結合させることもできる。
【化４５】
2020536874.tif 000057
【０１５２】
いくつかの実施形態によれば、プローブは、アルドケトレダクターゼ（ＡＫＲ）の活性部位システイン残基に選択的に結合するＥＢＧを含む。そのようなプローブ実施形態は、アルドケトレダクターゼによって切断されるＥＲＧ基も含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＲＧ基は、アルドケトレダクターゼのシステイン基によって置換される反応性ヨード基であり得る。そのようなプローブの例示的な実施形態を以下に図示す。
【化４６】
2020536874.tif 000058
【０１５３】
（Ｄ．スルファターゼおよびスルホトランスフェラーゼプローブ実施形態）
また、本明細書に記載されているのは、スルファターゼ酵素およびスルホトランスフェラーゼ酵素に選択的かつ不可逆的に結合することができるプローブ実施形態である。スルファターゼ酵素に結合することができるプローブ実施形態は、スルファターゼによってプローブのＥＢＧから最初に切断されるＥＲＧを含む。これにより、スルファターゼに結合することができる活性化ＥＲＧ（例えば、キノンメチド基）が生成される。好適なプローブは、上述したように、式ＩＩおよび／または式ＩＩＩＡを満たす構造を有し得る。スルファターゼを標的とする例示的なプローブ実施形態には、以下に示すものが含まれる。特定の理論に限定されることなく、酵素結合のためにそのようなプローブ実施形態を活性化することができる方法の例示的な機構を図３に示す。
【化４７】
2020536874.tif 000059
【０１５４】
いくつかの追加の実施形態によれば、プローブは、スルホトランスフェラーゼに選択的に結合することができる。そのような実施形態では、プローブは、光活性化して酵素に結合することができる光反応性ＥＢＧを含む。上述したように、光反応性ＥＢＧは、ベンゾフェノン部位またはジアジラン部位を含むことができる。好適なプローブは、上述したように、式ＩＩＩＣを満たす構造を有し得る。スルホトランスフェラーゼに結合するために使用することができる例示的なプローブ実施形態を以下に示す。
【化４８】
2020536874.tif 000060
【０１５５】
（Ｅ．システインリアーゼプローブ実施形態）
いくつかの実施形態によれば、プローブは、腸内マイクロバイオームで活性な酵素であるシステインリアーゼに選択的に結合することができる。そのようなプローブ実施形態は、システインリアーゼのシステイン部位と共有結合を形成するオレフィン含有ＥＢＧを含む。例示的な開示の実施形態では、ＥＢＧは、リアーゼのシステイン部位の硫黄原子と共有結合するオレフィンを含む。好適なプローブは、上述したように、式ＩＩまたは式ＩＩＡを満たす構造を有し得る。例示的なシステインリアーゼプローブ実施形態を以下に提供する。特定の理論に限定されることなく、酵素結合のためにそのようなプローブ実施形態を活性化することができる方法の例示的な機構を図３に示す。
【化４９−１】
2020536874.tif 000061
【化４９−２】
2020536874.tif 000062
【０１５６】
（Ｆ．プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）プローブ実施形態）
いくつかの実施形態によれば、プローブは、第ＩＩ相代謝において活性な酵素であるＰＧＨＳに選択的に結合することができる。そのようなプローブ実施形態は、ＰＧＨＳ酵素によって置換されたＥＲＧを含み、それによってＥＢＧを介してプローブと酵素とを結合させる。好適なプローブは、上述したように、式ＩＩまたは式ＩＩＩＡを満たす構造を有し得る。例示的なＰＧＨＳプローブ実施形態を以下に示す。
【化５０】
2020536874.tif 000063
【０１５７】
（ＩＶ．プローブ実施形態の作成方法）
本開示の活性ベースのプローブを作製する方法の例示的な実施形態を、以下に提供する。特定の実施形態に適した適切な試薬を、そのような試薬が明示的に言及されていなくても使用することができることが理解される。
【０１５８】
例示的な実施形態では、活性ベースのプローブを作製する方法は、スキーム１において以下に示す工程を含み得る。
【化５１】
2020536874.tif 000064
【０１５９】
スキーム１で上述した方法の例示的な実施形態を、以下のスキーム２ならびにスキーム３Ａおよび３Ｂに示す。
【化５２−１】
2020536874.tif 000065
【化５２−２】
2020536874.tif 000066
【０１６０】
いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、スキーム４において以下に示す工程を含み得る。スキーム４に関して、「ＰＧ」は、ニトロ含有出発物質のフェノール基を保護するために使用することができる保護基を表す。本開示の恩恵を受けて、保護されたフェノールのアルデヒドを変換するのに適切な還元剤と、得られた第一級アルコールをアミド含有結合パートナーと結合させるための結合条件とは、当業者によって認識されるであろう。
【化５３】
2020536874.tif 000067
【０１６１】
上記のスキーム４に示した方法の例示的な実施形態を、以下のスキーム５に示す。
【化５４】
2020536874.tif 000068
【０１６２】
追加の例示的な実施形態を、以下のスキーム６〜８に示す。
【化５５−１】
2020536874.tif 000069
【化５５−２】
2020536874.tif 000070
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、プローブ実施形態は、以下のスキーム９に記載の方法を使用して作製することができる。スキーム９に関して、スキーム９に示す出発構造などの光活性化可能なＥＢＧを含む前駆体を、好適なアミド結合パートナーと、例えば、示されているプロパルギルアミンなどのアルキン基を含むアミンと、アミド結合試薬を使用して反応させた。得られたアミド生成物の保護されたアミンを、塩基（例えば、ピペリジン）を使用することなどにより、アミン保護基（例えば、Ｆｍｏｃ）を除去するのに適した条件下で脱保護する。得られた第一級アミン生成物をヨード酢酸無水物に結合させ、ヨードアセトアミド生成物（例えば、化合物５）を形成する。次いで、ヨードアセトアミド生成物シスを還元されたグルタチオン部位と結合させ、プローブ（例えば、プローブＧＳＨ-ＡＢＰ−Ｇ）を形成する。
【化５６】
2020536874.tif 000071
【０１６４】
別の例示的な方法をスキーム１０に示す。
【化５７】
2020536874.tif 000072
【０１６５】
別の例示的な方法をスキーム１１に示す。
【化５８】
2020536874.tif 000073
スキーム１１に関して、使用することができる条件には、以下のものが含まれる：ａ）（ｉ）ＴｒＣｌ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ、（ｉｉ）ＮａＨ、ＢｎＢｒ、ＴＢＡＩ、ＤＭＦ  ０℃〜室温（ｉｉｉ）ｐ−ＴｓＯＨ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、；ｂ）Ｉ２、ＰＰｈ３、イミダゾール、ＴＨＦ、７０℃；ｃ）亜鉛末、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（９：１）、超音波処理、４０℃；ｄ）５，インジウム粉末、Ｌａ（ＯＴｆ）３、Ｈ２Ｏ、超音波処理；ｅ）第２世代Ｇｒｕｂｂｓ触媒、ＣＨ２Ｃｌ２、４０℃；ｆ）（ｉ）ＤＩＢＡＬ−Ｈ、ＴＨＦ、０℃〜ＲＴ、（ｉｉ）ＮａＢＨ４、Ｈ２Ｏ、ＥｔＯＡｃ；ｇ）（ｉ）Ｃｌ３ＣＮ、ＤＢＵ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃（ｉｉ）Ｉ２、ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ；ｈ）（ｉ）３７％ＨＣｌ、ジオキサン、６０℃、（ｉｉ）ＮａＨＣＯ３、ＭｅＯＨ、６０％、ｉ）Ｌｉ、ＮＨ３、ＴＨＦ、−６０℃；ｊ）Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、ハロゲンをさらに含む任意のアジドまたはアルキン含有基、８０℃；およびｋ）ＴＥＭＰＯ、ＮａＣｌＯ、ＮａＢｒ、ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ。
【０１６６】
別の例示的な方法をスキーム１２に示す。
【化５９】
2020536874.tif 000074
【０１６７】
別の例示的な方法をスキーム１３に示す。
【化６０】
2020536874.tif 000075
【０１６８】
本開示のプローブ実施形態を作製するためのさらに別の例示的な方法を、以下のスキーム１４に示す。
【化６１】
2020536874.tif 000076
【０１６９】
（Ｖ．例示的な方法）
活性ベースのプローブを、以下の例示的な方法で使用することができる。例えば、一態様によれば、本開示は、被験体から得た試料における異物代謝の１つまたは複数の標的酵素の活性を検出し、測定する方法を提供する。そのような方法は、以下の工程を含み得る：（ａ）被験体から試料を得る工程と；（ｂ）試料中の標的酵素の活性の検出を、（ｉ）クリックケミストリーによって活性化され、標的酵素に特異的かつ不可逆的に結合させるのに有効な活性プローブを試料に接触させて；（ｉｉ）活性プローブと標的酵素との間の結合を測定することにより行う工程。
【０１７０】
例えば、別の態様によれば、本開示は、被験体の腸内マイクロバイオータによる生体異物の代謝に対する個々の酵素の寄与を決定する方法を提供する。そのような方法は、以下の工程を含み得る：（ａ）被験体から得た試料に生体異物を接触させる工程と；（ｂ）試料を生体異物とインキュベーション期間インキュベートする工程と；（ｃ）試料を１つまたは複数の差次的に標識された酵素活性プローブにさらす工程であって、クリックケミストリーにより活性化された各酵素活性プローブと試料を接触させることにより、各プローブは効果的にその標的酵素に特異的かつ不可逆的に結合する、工程と；（ｄ）対照と比較して、各活性プローブとその標的酵素との間の結合を検出する工程、結合を測定する工程、またはその両方を行う工程と；（ｅ）生体異物の代謝に対する個々の標的酵素の寄与を決定する工程。
【０１７１】
例えば、別の態様によれば、本開示は、それを必要とする被験体の異物代謝に起因するマイクロバイオータ媒介性毒性を診断して治療する方法を提供する。そのような方法は、以下の工程を含み得る：（ａ）被験体から得た試料に生体異物を接触させる工程と；（ｂ）試料を生体異物とインキュベーション期間インキュベートする工程と；（ｃ）試料を１つまたは複数の差次的に標識された酵素活性プローブにさらす工程であって、クリックケミストリーにより活性化された各酵素活性プローブと試料を接触させることにより、各プローブは効果的にその標的酵素に特異的かつ不可逆的に結合する、工程と；（ｄ）対照と比較して、各活性プローブとその標的宿主酵素および標的マイクロバイオータ酵素との結合を検出して測定する工程と；（ｅ）マイクロバイオータ誘導性毒性で被験体を診断する工程と；（ｆ）（ｉ）マイクロバイオータ個体群を調節するのに有効であり、かつ（ｉｉ）毒性を低減するのに有効な抗菌剤で被験体を治療する工程。
【０１７２】
いくつかの実施形態によれば、「抗菌剤」という用語は、細菌および他の微生物の増殖を阻害する能力、またはそれらを破壊する能力を有する、主に感染症の治療に使用される任意の化学物質群を指すことを意味する。抗菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびフルオロキノロン。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペニシリンＧ；メチシリン；ナフシリン；オキサシリン；クロキサシリン；ジクロキサシリン；アンピシリン；アモキシシリン；チカルシリン；カルベニシリン；メズロシリン；アズロシリン；ピペラシリン；イミペネム；アズトレオナム；セファロチン；セファクロル；セフォキシチン；セフロキシム；セフォニシド；セフメタゾール；セフォテタン；セフプロジル；ロラカルベフ；セフェタメット；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフタジジム；セフェピム；セフィキシム；セフポドキシム；セフスロジン；フレロキサシン；ナリジクス酸；ノルフロキサシン；シプロフロキサシン；オフロキサシン；エノキサシン；ロメフロキサシン；シノキサシン；ドキシサイクリン；ミノサイクリン；テトラサイクリン；アミカシン；ゲンタマイシン；カナマイシン；ネチルマイシン；トブラマイシン；ストレプトマイシン；アジスロマイシン；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンコハク酸エチル；エリスロマイシングルコヘプトン酸塩；エリスロマイシンラクトビオン酸塩；エリスロマイシンステアリン酸塩；バンコマイシン；テイコプラニン；クロラムフェニコール；クリンダマイシン；トリメトプリム；スルファメトキサゾール；ニトロフラントイン；リファンピン；ムピロロシン；メトロニダゾール；セファレキシン；ロキシスロマイシン；コアモキシクラブアネート；ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ；ならびにそれらの種々の塩、酸、塩基および他の誘導体。
【０１７３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法を使用して、薬物および他の生体異物が第Ｉ相および第ＩＩ相酵素ならびに腸内マイクロバイオームの酵素によってどのように代謝されるか、薬物および生体異物がそのような酵素をどのように阻害（または活性化）するか、被験体摂動（例えば、肥満、化学物質ばく露、発育期のライフステージなど）が第Ｉ相および第ＩＩ相代謝ならびに／または腸内マイクロバイオームにどのように影響するかを決定することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態によれば、標的酵素は、第Ｉ相異物代謝において活性な酵素である。いくつかの実施形態によれば、標的酵素は、第ＩＩ相異物代謝において活性な酵素である。いくつかの実施形態によれば、標的酵素は、β−グルクロニダーゼおよびグルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、レダクターゼ酵素、例えば、アゾレダクターゼ、ニトロレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシレダクターゼ、またはアルドケトレダクターゼ（ＡＫＲ）、スルファターゼおよびスルホトランスフェラーゼ；システインリアーゼ、およびプロスタグランジンＨシンターゼから選択される１つまたは複数である。いくつかの実施形態によれば、標的酵素は、哺乳動物由来のもの、微生物由来のもの、またはその両方である。いくつかの実施形態によれば、触媒活性を示し得る前に活性化を必要とする酵素の場合、本方法は、プローブと酵素とのコンジュゲーションを促進するために、酵素活性化剤として機能する化合物（例えば、ＮＡＤＰＨ）に試料をさらす工程をさらに含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態によれば、異物代謝の酵素はβ−グルクロニダーゼであり、プローブは式ＩＶＡ、ＩＶＢ、またはＩＶＣのβ−グルクロニダーゼ特異的プローブである：
【化６２】
2020536874.tif 000077
【０１７６】
いくつかの実施形態によれば、式ＩＶＡまたはＩＶＢのβ−グルクロニダーゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化６３−１】
2020536874.tif 000078
【化６３−２】
2020536874.tif 000079
【０１７７】
いくつかの実施形態によれば、異物代謝の酵素はグルクロノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ）であり、プローブは、式ＩＩ、式ＩＩＩＢ、式ＶＡ、ＶＢ、またはＶＣのグルクロノシルトランスフェラーゼ特異的プローブである
【化６４】
2020536874.tif 000080
【０１７８】
いくつかの実施形態によれば、グルクロノシルトランスフェラーゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化６５】
2020536874.tif 000081
（式中、各ｎ´は独立して０〜５０であり、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である）。
【０１７９】
いくつかの実施形態によれば、異物代謝の酵素はグルタチオンＳトランスフェラーゼであり、プローブは式ＶＩＡ、式ＶＩＢ、または式ＶＩＣのグルタチオンＳトランスフェラーゼ特異的プローブである：
【化６６】
2020536874.tif 000082
【０１８０】
いくつかの実施形態によれば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化６７】
2020536874.tif 000083
【０１８１】
いくつかの実施形態によれば、異物代謝の酵素は、レダクターゼ酵素、例えば、アゾレダクターゼ、ニトロレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼ、またはアルドケトレダクターゼ（ＡＫＲ）であり、プローブはレダクターゼ特異的プローブである。いくつかの実施形態によれば、プローブは式ＩＩまたは式ＩＩＩＡのレダクターゼ特異的プローブである。
【化６８】
2020536874.tif 000084
【０１８２】
いくつかの実施形態によれば、酵素がアゾレダクターゼである場合、プローブはアゾ基を含み、アゾ基が最初にアゾレダクターゼによって化学修飾されてアミンを形成し、それによって酵素結合基が活性化されて活性化キノンメチドが形成され、アゾレダクターゼがプローブに結合できるようになる。
【０１８３】
いくつかの実施形態によれば、アゾレダクターゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化６９】
2020536874.tif 000085
【０１８４】
いくつかの実施形態によれば、酵素がニトロレダクターゼである場合、プローブはニトロ基を含み、ニトロ基はニトロレダクターゼによって還元されてアミンになることができ、それによって酵素結合基が活性化されて活性化キノンメチドが形成され、ニトロレダクターゼがプローブに結合できるようになる。
【０１８５】
いくつかの実施形態によれば、ニトロレダクターゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化７０】
2020536874.tif 000086
【０１８６】
いくつかの実施形態によれば、酵素はＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼであり、プローブは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼに選択的に結合するＥＢＧと、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼによって置換され得るフェノール性ＥＲＧ基とを含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態によれば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンオキシドレダクターゼ特異的プローブは、以下からなる群より選択される：
【化７１】
2020536874.tif 000087
【０１８８】
いくつかの実施形態によれば、酵素はアルドケトレダクターゼであり、アルドケトレダクターゼ特異的プローブは、アルドケトレダクターゼの活性部位システイン残基に選択的に結合するＥＢＧを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態によれば、アルドケトレダクターゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化７２】
2020536874.tif 000088
【０１９０】
いくつかの実施形態によれば、異物代謝の酵素はスルファターゼおよびスルホトランスフェラーゼ酵素であり、プローブはスルファターゼおよびスルホトランスフェラーゼ特異的プローブである。いくつかの実施形態によれば、プローブは、スルファターゼによってプローブのＥＢＧから最初に切断されるＥＲＧを含むスルファターゼおよびスルホトランスフェラーゼ特異的プローブである。
【０１９１】
いくつかの実施形態によれば、スルファターゼおよびスルホトランスフェラーゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化７３】
2020536874.tif 000089
【０１９２】
いくつかの実施形態によれば、異物代謝の酵素は、微生物由来のシステインリアーゼであり、プローブは、システインリアーゼ特異的プローブである。いくつかの実施形態によれば、システインリアーゼ特異的プローブは、システインリアーゼのシステイン部位と共有結合を形成するオレフィン含有酵素結合基を含む。いくつかの実施形態によれば、システインリアーゼ特異的プローブは、式ＩＩまたは式ＩＩＩＡである。
【化７４】
2020536874.tif 000090
【０１９３】
いくつかの実施形態によれば、システインリアーゼ特異的プローブは、以下から選択される：
【化７５】
2020536874.tif 000091
2020536874.tif 000092
【０１９４】
いくつかの実施形態によれば、酵素はプロスタグランジンＨシンターゼであり、プローブはプロスタグランジンＨシンターゼ特異的プローブである。いくつかの実施形態によれば、プロスタグランジンＨシンターゼ特異的プローブは、プロスタグランジンＨシンターゼによって置換されるＥＲＧを含み、それによってＥＢＧを介してプローブを酵素に結合させる。いくつかの実施形態によれば、プロスタグランジンＨシンターゼプローブは、以下から選択される：
【化７６】
2020536874.tif 000093
【０１９５】
いくつかの実施形態によれば、被験体は哺乳動物被験体である。いくつかの実施形態によれば、哺乳動物被験体はマウスである。いくつかの実施形態によれば、哺乳動物被験体はヒトである。いくつかの実施形態によれば、哺乳動物被験体は、非ヒト霊長類である。
【０１９６】
いくつかの実施形態によれば、被験体を生体異物にばく露した後に被験体から試料を得ることができ、次いで異物代謝に対する任意の酵素の寄与度を、非ばく露対照と比較することができる。いくつかの実施形態によれば、試料は、細胞試料（もしくはその抽出物、例えばタンパク質を含有するもの）、臓器試料（もしくはその抽出物）、または細菌試料（もしくはその抽出物）などの生体試料であり得る。いくつかの実施形態によれば、接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ヒト肝ミクロソームである。いくつかの実施形態によれば、試料は、体組織、体液、または身体排泄物の１つまたは複数に由来する。
【０１９７】
いくつかの実施形態によれば、生体異物は、食品、栄養補助食品、発がん性物質、毒性物質または薬物である。いくつかの実施形態によれば、生体異物は毒性物質である。例示的な毒性物質には、限定されないが、以下が挙げられる：ニトロソアミン、アルデヒド、および一酸化炭素を含み得るタバコの煙（能動的または受動的）；ブロモベンゼン；クロロホルム；アセトアミノフェン；殺虫剤（例えば、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾジオキシン（ＴＣＤＤ）；多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、有機材料の不完全燃焼または熱分解の間に形成される広範な環境汚染物質を意味し、例えば、ベンゾ［ａ］ピレン、典型的な発がん性ＰＡＨ、およびジベンゾ［ｄｅｆ，ｐ］クリセン（ＤＢＣ）は、あまり一般的ではないが非常に強力な経胎盤発がん性ＰＡＨであり、これらは両方とも、シトクロムＰ４５０酵素スーパーファミリーのアイソフォームによって代謝活性化され、反応性発がん性代謝物および細胞毒性代謝物を形成する。
【０１９８】
いくつかの実施形態によれば、試料と活性ベースのプローブとのインキュベーション時間は、プローブがその標的酵素と化学的に相互作用し、プローブが標的酵素に特異的に結合し、それによりプローブ−酵素コンジュゲートを形成するのに十分な時間または時間であり、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分、少なくとも１１分、少なくとも１２分、少なくとも１３分、少なくとも１４分、少なくとも１５分、少なくとも１６分、少なくとも１７分、少なくとも１８分、少なくとも１９分、少なくとも２０分、少なくとも２１分、少なくとも２２分、少なくとも２３分、少なくとも２４分、少なくとも２５分、少なくとも２６分、少なくとも２７分、少なくとも２８分、少なくとも２９分、少なくとも３０分、例えば２〜６０分、２〜３０分、２〜１０分、５〜１０分、または５〜１５分である。
【０１９９】
いくつかの実施形態によれば、活性ベースのプローブの標的酵素への結合は、光によって光活性化される。いくつかの実施形態によれば、光源は、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、または１０ｎｍ〜３７０ｎｍ、または１０ｎｍ〜３６５ｎｍの波長を有する光などのＵＶ光を供給する。
【０２００】
いくつかの実施形態によれば、検出、測定、またはその両方は、酵素に結合したプローブによって放出されるシグナルを介して行われる。いくつかの実施形態によれば、シグナルは、例えば、ビオチン−アビジンまたは酵素レポーター基（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）を酵素特異的プローブに結合させることによって増加または増幅される。いくつかの実施形態によれば、酵素に結合したプローブの検出は、蛍光（例えば、蛍光ゲル分析、蛍光活性化細胞ソーティング、フローサイトメトリー、量子ドット分析）；比色測定；ゲノムシーケンシング；または質量分析のうちの１つまたは複数によって行われる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の方法は、図５に模式的に示すように、当該技術分野で一般的に使用されている検出技法と組み合わせることができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態によれば、活性ベースのプローブは、Ｔａｇ含有化合物をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、プローブのｐＴａｇ部位は、プローブを支持体または樹脂に結合させるのに有効である。そのようないくつかの実施形態によれば、支持体または樹脂は、クリック可能な官能基を含み得るか、クリック可能な官能基を含むように修飾され得る。したがって、活性ベースのプローブを支持体または樹脂に結合させる方法は、支持体または樹脂のクリック可能な官能基をｐＴａｇ部位に結合させる工程を含み得る。代替実施形態では、支持体または樹脂をプローブに結合させてから、プローブをその標的酵素と反応させることができる。いくつかの実施形態によれば、本開示の活性ベースのプローブを使用して１つまたは複数の試料をハイスループットスクリーニングする方法は、各プローブを支持体または樹脂の不連続領域（例えば、マルチウェルプレートの１つのウェルもしくは複数のウェル）に個々に結合させる工程、または複数のプローブをマルチウェルプレートの同じ領域もしくはウェルに結合させる工程を含み得る。１つの試料または複数の試料をアッセイするための例示的な方法を、図６に模式的に示す。
【０２０２】
いくつかの実施形態によれば、標識がマイクロバイオーム試料中で行われていることを確認する方法は、以下の通りである。細菌は、嫌気性条件下で被験体の小腸および大腸から採取したばかりのものである。微生物の含有物は、糞便または糞便ペレットからも抽出することができる。腸または糞便からの生細胞を、プローブ（または比較目的の対照）にさらし、洗浄し、ビードビーティングを介して溶解し、次いで、本明細書に記載のクリックケミストリー試薬を使用して、Ｔａｇ含有化合物（例えば、アジドテトラメチルローダミン）に結合させる。最適な生細胞ＡＢＰ標識条件は、各ＡＢＰ実施形態について、蛍光標識されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥで得た最も高いシグナルノイズ比によって決定される。酵素活性アッセイをＡＢＰ標識の前後に使用し、ＡＢＰがマイクロバイオーム中の機能的に活性な酵素を標的としていることと、標識が酵素の不活性化をもたらすこととを確認する。
【０２０３】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、ＡＢＰ依存性の標識およびソーティング研究を使用することによってマイクロバイオームの異物代謝活性を階層的に標的化し、腸内マイクロバイオームの機能的なサブ個体群を構成する分類群を同定する工程を含む。そのような実施形態は、小腸および大腸試料ならびに対照のマイクロバイオームを標識する工程と；単離したＤＮＡを１６Ｓ  ｒＲＮＡ（Ｖ４）シーケンシングの鋳型として使用する工程と；ＡＢＰ処理したプローブ陽性試料に多く存在する分類群を同定し、その統計的有意性を評価する工程とを含む。いくつかの実施形態によれば、単離された分類群のゲノム中の異物代謝酵素の存在を確認する工程は、腸内マイクロバイオーム分離株と腸内メタゲノムのデータベースとのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析によるものである。いくつかの実施形態によれば、様々な異物代謝活性に関与する系統および分類群の分布を解明する工程は、特定の活性を実行している腸内微生物の機能的なサブ個体群に関する情報を提供し、異なる分類群間の特定の活性における機能的な冗長性のレベルを明らかにする細胞ソーティングによって行われる。
【０２０４】
階層的分析を完了するために、定量的プロテオミクスを使用し、異物代謝に関与する酵素を特性評価する。本方法は、同じＡＢＰ標識マイクロバイオーム試料をビードビーティングで溶解する工程と、アジドビオチン化合物などのＴａｇ含有化合物を、クリックケミストリーを使用してプローブ標識酵素に結合させる工程と、ストレプトアビジンアガロース上でビオチン化ＡＢＰ標識酵素を濃縮する工程と、タンパク質をトリプシンで消化する工程と、タンデムＭＳ測定を使用してＶｅｌｏｓまたはＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ  ＬＣ−ＭＳプラットフォーム上でトリプシンペプチドを分析する工程とを含む。得られたペプチドスペクトルを腸内メタゲノムに対して検索し、ＡＭＴタグを使用して標識酵素を定量することで、効率的に様々な異物代謝酵素の相対的な活性レベルを定量的に読み取ることができる。これにより、酵素の機能的特性評価とアノテーションとが可能となり、酵素が発現している種／分類群への酵素マッピングが容易になる。
【０２０５】
図７に模式的に示す酵素を同定し定量するための例示的な方法は、グルクロニダーゼ（例えば、大腸菌、Ｂ群溶血性レンサ球菌、ウェルシュ菌から得た、組換えによって発現され精製されたβ−グルクロニダーゼ）を含む試料を、グルクロニダーゼを標的とするように設計された１つまたは複数のプローブ実施形態を含む溶液にさらすことを含む。例示的なプローブは、活性グルクロニダーゼにのみ共有結合する（図８Ａ〜８Ｄ）。本方法は、以下の工程をさらに含み得る：プローブで生細胞を処理して細胞を溶解する工程；次いで、溶解した細胞混合物に、Ｔａｇ含有化合物、例えばローダミン含有アジド（または、Ｔａｇ基が反応する官能基次第では、ローダミン含有アルキン）を、上述したような適切なクリックケミストリー試薬とともに添加する工程；次いで、Ｔａｇをプローブに結合させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはフローサイトメトリーにより、プローブに共有結合した標識酵素を可視化する工程。いくつかの実施形態によれば、ＦＡＣＳと、活性β−グルクロニダーゼを有する細胞を標識して微生物の混合個体群からソーティングする方法との組み合わせは、微生物群集という状況の中での活性を研究するのに有用である。ゲノムシーケンシングを使用して群集のメンバーを同定することで、遺伝子または転写産物の形での潜在的な活性ではなく、真の活性に基づいて特定の分類群を明らかにし、宿主−微生物−生体異物相互作用の理解に対する主要な問題に対処することができる。
【０２０６】
（ＶＩ．キットおよびデバイス）
本明細書に記載のプローブ実施形態は、生体試料などの試料を分析するために使用され得るデバイスおよび／またはキットで使用するように構成され得る。デバイスおよびキットを使用して、試料中に存在する様々な種を評価し同定することができ、試料内のそのような種が関与する機能／プロセスを評価することもできる。特定の開示の実施形態では、デバイスは、１つまたは複数のプローブ実施形態と基板とを含むことができ、プローブ（または複数のプローブ）は、試料にさらされる前に基板に結合しているか、基板とプローブは試料にさらされた後に結合することができる。デバイスおよびキットの実施形態は、単一のデバイスまたはキットで多くの試料を分析することができるように、複数の使用が可能である。
【０２０７】
特定の実施形態では、デバイスの基板構成要素は、細胞試料などの試料にさらされるのに適切な基板である。代表的な基板には、プローブがガラスベースの基板の表面上に存在する官能基に結合するような、本明細書に記載のプローブ実施形態で官能基化され得るガラスベースの基板が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ガラスプレートおよび／またはガラスマイクロスフェアが基板構成要素として使用される。
【０２０８】
デバイスおよび／またはキットに使用されるプローブは、本明細書に開示の任意のプローブ実施形態から選択され得る。いくつかの実施形態では、プローブは、プローブをデバイスの基板構成要素に固定することができるｐＴａｇ基を含むか、または含むように修飾されている。特定の開示の実施形態では、ｐＴａｇ基は、クリックケミストリー反応を使用して基板表面に存在するクリック可能な官能基と反応させることができるクリック可能な官能基であり、それによってプローブを基板に共有結合させることができる。いくつかの実施形態では、プローブは、そのような技法を使用して、試料ばく露の前に基板に事前結合され得る。いくつかの追加の実施形態では、プローブは、プローブが試料にさらされた後に、そのような技法を使用して基板に事後結合され得る。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、デバイスは、プローブ実施形態が基板に事前結合され、試料の分析に使用される任意の追加の試薬がデバイス内に事前収容されているように、事前組み立てされている。いくつかの他の実施形態では、デバイスは、事前組み立てされたデバイスを含むキットの一部として提供されてもよく、試料の分析に使用される任意の追加の試薬は、キットの別個の構成要素として（例えば、試薬ボトル内などに）提供される。キットのこれらの構成要素を、使用者が使用前に合わせることができる。さらにいくつかの追加の実施形態では、キットは、適切な結合条件を使用してキット内の別個の試薬ボトルによって提供されるプローブ実施形態で処理され得る基板を含むことができ、それにより任意の所望のプローブ実施形態を基板に結合させ、装置を使える状態にする。
【０２１０】
本開示のデバイス実施形態を作製する方法も開示されている。いくつかの実施形態では、デバイスは、クリック可能な官能基などのｐＴａｇ基を含むプローブ実施形態に基板をさらすことによって作製され得る。さらに追加の実施形態では、ｐＴａｇは、基板の官能基に化学結合することが可能な別の官能基であり得る。プローブがクリック可能な官能基を含む実施形態では、基板は典型的にはその表面上に、プローブのクリック可能な官能基と反応することができるクリック可能な官能基も含む。いくつかの実施形態では、基板はヒドロキシル基を有する表面を含むガラス基板であり、ヒドロキシル基がアルコキシシラン分子で修飾され、シラン化された基板表面を提供することができる。いくつかの実施形態では、シラン化された基板表面は、クリック可能な官能基を含む試薬とさらに反応することができる。特定の開示の実施形態では、プローブのｐＴａｇ基は、基板表面の官能基（例えば、ヒドロキシル基、アルコキシシラン基、クリック可能な官能基など）と共有結合を形成する。例示的なアルコキシシラン分子には、アミノシラン（例えば、（３−アミノプロピル）−トリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、（３−アミノプロピル）−トリメトキシシランなど）、グリシドキシシラン（例えば、３−グリシドキシプロピル）−ジメチル−エトキシシランなど）、およびメルカプトシラン（例えば、（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）−メチル−ジメトキシシランなど）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、これらの代表的な基をさらに化学修飾し、アルコキシシランの１つまたは複数の官能基を、プローブの官能基と結合可能な官能基に変換することができる。単に例示として、アミノシランのアミン基をアジドに変換するか、またはアジド含有試薬に結合させて、プローブ上に存在するｐＴａｇ基（例えば、クリック可能なアルキン）とのクリックケミストリー反応が可能なクリック可能な基を提供することができる。特定の開示の実施形態では、プローブのｐＴａｇ基は、シラン化された基板表面上に存在する１つまたは複数の官能基と結合することができる官能基から選択され得る。例えば、プローブは、シラン化された基板表面上に存在する任意のアジド（またはアルキン）と反応し得る１つまたは複数のアルキン（またはアジド）部位；またはシラン化された基板表面上に存在する任意のアミンと反応し得る１つまたは複数のカルボン酸基；またはシラン化された基板表面上に存在する任意のエポキシドと反応し得る１つまたは複数の求核性官能基；あるいはシラン化された基板表面上に存在する任意のチオールと反応し得る１つまたは複数のアルケン部位を含み得る。基板表面および／またはシラン化された基板表面上に存在するヒドロキシル基に結合し得る追加のプローブｐＴａｇ基は、本開示の恩恵を受ける当業者によって認識されるであろう。
【０２１１】
代表的な実施形態では、ガラスプレートデバイスは、スライドガラスをアルコキシシラン試薬、例えばトリエトキシシランアミンで官能基化することにより作製される。次に、ＮＨＳ−エステル−ＰＥＧ−アジドなどのクリック可能な官能基を含む試薬の溶液をスライドガラスに添加し、基板表面をアジド部位で官能基化する。次いで、官能基化したガラススライドを、試料にさらす前にプローブ実施形態にさらすか、または最初に試料にさらしたプローブ実施形態にさらす。プローブは、基板のアジドと反応することができるクリック可能なアルキンなどのｐＴａｇ基を含む。プローブのアルキン基と基板のアジド基との間に形成されたトリアゾールによってプローブのスライドガラスへの共有結合を容易にする反応条件に、スライドガラスおよびプローブをさらす。本実施形態では、反応条件は、溶媒としてＤＭＳＯを用い、触媒としてＣｕＩを用い、塩基としてトリメチルアミン（またはジイソプロピルエチルアミン）を用いることを含む。
【０２１２】
別の例では、プローブ実施形態を蛍光ガラスマイクロスフェアに結合させ、本明細書に記載の方法で使用するデバイスを提供することができる。そのような実施形態では、単一のプローブ実施形態は、単一のマイクロスフェアに結合することができる。複数のマイクロスフィアは、複数のマイクロスフィアの各々を同じタイプのプローブ実施形態に結合させるか、または複数のマイクロスフィアの各々を異なるタイプのプローブ実施形態に結合させて作製され得る。上述のような類似の化学を使用して、プローブをマイクロスフェアに結合させることができる。蛍光ガラスマイクロスフェアに結合したプローブを含むデバイス実施形態は、単一の限定されたサイズの試料中の複数の異なる酵素標的に対して様々なプローブを使用することを可能にする。さらに、これらのデバイス実施形態は、図３０に模式的に描いているように、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）およびプロテオミクスを使用した標的酵素のタンデム直接定量を容易にする。特定の実施形態では、タンパク質−プローブ−蛍光マイクロスフィアは、ＦＡＣＳによってソーティングされ、定量される。次いで、フローサイトメトリー装置を使用して定量的蛍光プロファイルを提供することができるか、またはフルＦＡＣＳシステムを使用してプローブのタイプによってソーティングし、それに続いてプロテオミクス測定を行い、測定分解能を向上させることができる。そのような実施形態はまた、限られたサイズの試料中でプローブ−官能基化マイクロスフェアを多重化して標的酵素を標識する能力と、ＦＡＣＳを使用して所与の試料中の酵素標的の量を最初に定量し、その後に質量分析ベースのプロテオミクスを使用して特定の標的を同定してこれらの標的を定量する能力とを提供する。
【０２１３】
別の代表的な例では、クリック可能な官能基（例えば、アジド）で表面修飾されたウェルを有するウェルプレートを含むデバイスは、表面修飾されたウェルのクリック可能な官能基と反応してプローブを個々のウェルに共有結合させることができる少なくとも１つのｐＴａｇ基（例えば、アルキン）をそれぞれ含むプローブ実施形態にさらされる。いくつかの実施形態では、単一のウェルは、そこに共有結合している複数のプローブを含み得る。いくつかの実施形態では、ウェルプレートの別個のウェルは、別個のプローブ実施形態で官能基化され得る。
【０２１４】
（ＶＩＩ．いくつかの実施形態の概要）
本明細書に開示されているのは、式ＩＩを満たす構造を有するプローブの実施形態である
【化７７】
2020536874.tif 000094
（式中、
ＥＲＧは、存在する場合、
【化７８】
2020536874.tif 000095
；Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、もしくはこれらのアニオン型；Ｐ（Ｏ（ＯＨ））２、もしくはこれらのアニオン型；ハロゲン；または−ＯＰｈ−ＣＨ２−ＯＮＯ２である；
ＥＢＧは、式ＩＩＡＥＢＧ〜ＩＩＪＥＢＧの１つまたは複数を満たす構造を有する
【化７９】
2020536874.tif 000096
（式中、ＹはＣＨ３またはＣＦ３である；Ｙ´はＯ、ＮＯ２、または−Ｎ＝ＮＲ´´であり、Ｒ´´は色素または他のレポーティング部位である；ｍは０〜５から選択される整数である；Ｒ´はアルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、アシル、ハロゲン化アシル、シアノ、スルホン酸、ニトロ、ニトロソ、第４級アミン、ＣＦ３、ハロゲン化アルキル、またはそれらの組み合わせから選択される）；
Ｌｉｎｋｅｒａには、脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれる；
Ｌｉｎｋｅｒｂ、およびＬｉｎｋｅｒの各々には、存在する場合、独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、芳香族基、脂肪族−芳香族基、ヘテロ脂肪族−芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂肪族−ヘテロ芳香族基、またはヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族基が含まれる；
Ｒは、存在する場合、カルバメートまたはカーボネートを含む基である；
各Ｔａｇは、存在する場合、独立して、検出可能なシグナルを発生させることができる官能基または分子を含む；
各ｐＴａｇは、Ｔａｇが存在しない場合に存在し、独立して、クリック可能な官能基を含む；
ｎ、ｍ、ｐ、およびｑの各々は独立して０または１である）。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、Ｌｉｎｋｅｒａは、式ＩＩＡＬｉｎｋｅｒａ〜ＩＩＨＬｉｎｋｅｒａの１つまたは複数を満たす構造を有するリンカー基である
【化８０】
2020536874.tif 000097
（式中、各ｎ´は独立して１〜５０の整数である；Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；Ｑは炭素、酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）。
【０２１６】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、Ｌｉｎｋｅｒｂは存在し、ｎ´が１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ´−基；アミド基；またはそれらの組み合わせを含む。
【０２１７】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、Ｌｉｎｋｅｒｃは存在し、式ＩＩＡＬｉｎｋｅｒｃまたは式ＩＩＢＬｉｎｋｅｒｃを満たす構造を有する
【化８１】
2020536874.tif 000098
（式中、ｎ´は０〜５０の整数である；Ｚは酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である）。
【０２１８】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、Ｒは存在し、１つまたは複数の式ＩＩＡＲ〜ＩＩＣＲを満たす構造を有する
【化８２】
2020536874.tif 000099
（式中、ＺおよびＺ´は独立して酸素またはＮＲ´´´であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である；ｎ´は０〜５０の整数である）。
【０２１９】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、１つまたは複数のＴａｇが存在し、各Ｔａｇは独立してフルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＴａｇは独立してローダミン、フルオレセイン、またはビオチンである。
【０２２０】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、１つまたは複数のｐＴａｇが存在し、各ｐＴａｇは独立してアジドまたはアルキンである。
【０２２１】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、プローブは式ＩＩＩＡを満たす構造を有する
【化８３】
2020536874.tif 000100
【０２２２】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ＥＲＧは存在し、ＥＲＧはヨード；−ＯＰｈ−ＣＨ２−ＯＮＯ２；または
【化８４】
2020536874.tif 000101
である。
【０２２３】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、Ｌｉｎｋｅｒａはエステル基、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ´ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−基、または−（ＣＨ２）ｎ´−基であって、各ｎ´は独立して１〜２０の整数であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である。
【０２２４】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｍは１であり、Ｌｉｎｋｅｒｃは−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ´−基または−ＮＲ´´´Ｃ（Ｏ）ＣＨ２［Ｏ（ＣＨ２）２］ｎ´ＯＣＨ２−基であって、各ｎ´は独立して１〜２０の整数であり、Ｒ´´´は水素、脂肪族、または芳香族である。
【０２２５】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｍは１であり、各Ｔａｇは、存在する場合、独立してフルオロフォア、アフィニティベースの結合ペアの結合パートナー、量子ドット、または色素であるか；ｐＴａｇ基が存在する場合、各ｐＴａｇは独立してアルキンまたはアジドである。
【０２２６】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、プローブは、本明細書に開示のプローブ種のいずれかから選択され得る。
【０２２７】
また、本明細書に開示の方法の実施形態は、以下の工程を含む：被験体または試料を、上記の実施形態のいずれかまたはすべてに記載のプローブに、プローブが異物代謝に関与する酵素と結合してプローブ−酵素コンジュゲートを形成するのに十分な時間さらす工程と；プローブ−酵素コンジュゲートを、蛍光検出法、比色検出法、質量分析法、またはそれらの組み合わせを使用して分析する工程。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本方法は、プローブ−酵素コンジュゲートをＴａｇ含有化合物にさらし、Ｔａｇ部位を含むプローブ−酵素コンジュゲートを形成する工程を含む。
【０２２９】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、本方法は、プローブを光源にさらす工程をさらに含む。
【０２３０】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、本方法は、被験体から被験体試料を抽出する工程と、被験体試料を、蛍光検出法、比色検出法、質量分析法、またはそれらの組み合わせを使用して分析する工程とをさらに含む。
【０２３１】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、本方法で使用されるプローブは、本明細書に記載のプローブ種のいずれかから選択され得る。
【０２３２】
また、本明細書に開示のアッセイプラットフォームは、以下を含む：基板と、基板に共有結合している、上記の実施形態のいずれかまたはすべてに記載のプローブ実施形態。
【実施例】
【０２３３】
（ＶＩＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本明細書に記載のプローブおよび方法の実施形態を作製して使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示するものであり、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実行されたすべてのまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか大気圧に近い。
【０２３４】
（株、試薬、および基本的手順）
化学製品は特に断りのない限り、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。クローニング大腸菌株ＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手し、必要に応じて１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３７℃で培養した。大腸菌ＢＷ２５１１３は社内在庫から入手した。大腸菌ΔｕｉｄＡは、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した（株ＪＷ１６０９−１）。ラクトバチルスプランタラムＷＣＦＳ１はＡＴＣＣ（ＢＡＡ−７９３）から購入し、ＭＲＳ培地を使用して３７℃で培養した。ＣＦ６４０ＲピコリルアジドはＢｉｏｔｉｕｍ社から購入した。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に注文した。ｐＥＴ−３２ｃは実験室在庫から入手した。ｐｕｉｄＡは、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を使用して、プライマーｕｉｄＡ＿Ｆ（５’−ＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣ−３’）［配列番号１］、ｕｉｄＡ＿Ｒ（５’−ＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧ−３’）［配列番号２］、ｐＥＴ＿Ｆ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＣ−３’）［配列番号３］’およびｐＥＴ＿Ｒ（５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣ−３’）［配列番号４］で構築した。ｕｉｄＡの発現は、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１０μＭ）を使用して誘導した。
【０２３５】
（動物）
グルクロニダーゼ研究のために、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをジャクソン研究所から購入し、１２時間明／１２時間暗の光サイクルで飼育した。餌（ＰＭＩ  ５００２）および水は、自由摂取で供給した。マウスは、処理の開始前に７日間順応させた。この間、同腹仔を共に飼育した。この後、抗生物質処理のためにマウスを別々のケージに入れた。同腹仔の１セット（ｎ＝５）を、飲料水中のバンコマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）にばく露した。他のセットには通常の水を与えた。抗生物質に対する拒絶反応を監視するために、研究者はばく露中に処理群を盲検化することはできず、その後の分析でも盲検化しなかった。
【０２３６】
ＧＳＴ研究のために、３匹の成体雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをジャクソン研究所（カリフォルニア州サクラメント）から購入した。購入したマウスは６週齢であって、標準的な実験食を与えた。マウスを、個別に、２３±１℃および湿度５５±１０％に保った部屋で１２時間の明／暗サイクルで飼育し、餌および水を自由に摂取させた。マウスには、標準的な実験食（ＳＤ）を自由摂取で２週間与えた（脂質からのカロリー１０％、タンパク質からのカロリー２０％、炭水化物からのカロリー７０％、３．８３ｋｃａｌ／ｇ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｄ１２４５０Ｂｉ、ニュージャージー州ニューブランズウィック）すべての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する施設の指針に従って実施した。バテルリッチランド施設の動物管理と使用の委員会は、プロトコル＃２０１０−４５を承認した。
【０２３７】
（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛍光標識およびゲルイメージング）
精製タンパク質（５μＭ）または細胞溶解液（１ｍｇ／ｍＬ）を、様々な濃度のＧｌｃＡ−ＡＢＰで１時間３７℃で処理した。ローダミンは銅触媒アジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）を介して結合し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ−９５００を使用してゲルをイメージングし、ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量化した。
【０２３８】
（微生物の蛍光標識および細胞ソーティング）
一晩培養した培養物（５ｍＬ）を遠心分離により回収し、ＰＢＳ  １ｍＬに再懸濁し、１００μＬをアリコートに移した。アリコートを、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ  ５０μＭ、ヨードアセトアミドアルキン（ＩＡＡ）１０μＭ、または同量の溶媒（「プローブなし」；ＤＭＳＯ）で処理した。細胞を１時間３７℃で振とう培養した。細胞を、１０，０００ｇで５分間の遠心分離により収集し、脱酸素ＰＢＳ  １ｍＬで３回洗浄した。ペレットを、ＰＢＳ  １００μＬに再懸濁し、−２０℃の７０％エタノール（１ｍＬ）で一晩固定した。細胞を、ＰＢＳ  １ｍＬへの再懸濁と１０，０００ｇで５分間の遠心分離により２回洗浄した。細胞をＣｕＡＡＣ反応緩衝液２５０μＭ（ＣＦ６４０Ｒピコリルアジド１０μＭ、ＣｕＳＯ４  ８ｍＭ、ＴＨＰＴＡ  ２ｍＭ、ＰＢＳ中１０ｍＭアスコルビン酸：０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）に再懸濁した。プローブなし試料の２分の１を、蛍光なし対照（ＣＦ６４０Ｒを含まないＣｕＡＡＣ反応緩衝液）として使用した。細胞を暗所で回転させながら室温で１時間インキュベートし、上記のように遠心分離により回収した。細胞をＰＢＳ  １ｍＬ：０．５％ＢＳＡに再懸濁し、回転させながら５分間暗所で室温でインキュベートし、上記のように遠心分離することで４回洗浄した。細胞を、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含むＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；１：１０，０００）に再懸濁し、オートクレーブしたシース液とともにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩｕを使用して分析した。前方散乱および側方散乱（４８８ｎｍ）と、ＳＹＢＲゴールド（４８８ｎｍ励起；５３０／３０ｎｍ検出フィルタ）と、ＣＦ６４０Ｒ（６３３ｎｍ励起；６６０／２０ｎｍ検出フィルタ）とのパラメータを収集した。プローブなし試料の事象の９５％超がプローブ陰性に分類されるように、ゲートを描いた（図９）。ＦＡＣＳＤｉｖａ  ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏ  １０を使用して分析した。
【０２３９】
（腸内微生物の蛍光標識およびソーティング）
微生物細胞を収集し、既に説明したようにいくつかの修飾を加えてソーティングした。回腸から直腸への下部腸管を収集し、滅菌ガラスビーズ（直径３ｍｍ）約５ｍＬと脱酸素ＰＢＳ  ２０ｍＬとを含む５０ｍＬ円錐チューブに入れた。チューブをすぐに嫌気性チャンバーに移し、ジチオスレイトール１ｍＭを追加して微生物の回復を促進し、５分間インキュベートした。懸濁した腸内容物を新しいチューブに移し、３０秒間ボルテックスし、大きな組織片を５分間沈殿させた。上清を回収し、７００ｇで１５分間遠心分離した。上清を清潔な５０ｍＬ円錐に移し、８，０００ｇで１５分間遠心分離して細菌細胞を回収した。細菌細胞ペレットを脱酸素化ＰＢＳ  １ｍＬに再懸濁し、８，０００ｇで１５分間遠心分離することで１回洗浄した。その後細胞を、上記のように標識してソーティングした。
【０２４０】
（ＤＮＡの単離およびアンプリコンのシーケンシング）
可能な場合、２，０００，０００事象（閾値パラメータとして側方散乱光およびＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを使用）を、４方向純度ソーティングによりＵＶ照射したガラス管に収集した。ソーティングした細胞の少量のアリコートを再分析することにより富化度を確認し、最初の試料では２０％未満であったのに対し、回収された細胞の少なくとも５０〜６０％がプローブ陽性であった。細胞を１２，０００ｇで１０分間遠心分離して１．５ｍＬのチューブに収集し、溶解緩衝液（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、０．５％ＳＤＳ、および０．１％β−メルカプトエタノール）に再懸濁した。バックグラウンドＤＮＡコンタミネーションを制御するために、５０，０００個のビーズを別のチューブに採取し、各ソーティングで溶解緩衝液のみのチューブを１本調製した。チューブを４℃で３０分間インキュベートした後、液体窒素を使用して５回の凍結／解凍サイクルを経て溶解した。次いで、ＤＮＡを抽出し、精製した（Ｚｙｍｏｇｅｎ社ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−５）。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域のＰＣＲ増幅を、Ｅａｒｔｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔが開発したプロトコルを使用して以下のように行った：（ｉ）各試料を３連で増幅する、つまり、各試料を３回の２５μＬ  ＰＣＲ反応で増幅することを意味する；（ｉｉ）各試料の３連ＰＣＲ反応物を単一容量（７５μＬ）にプールする。この時点では、異なる試料のアンプリコンを合わせないこと；（ｉｉｉ）各試料のアンプリコンをアガロースゲルで泳動させる。５１５ｆ〜８０６ｒで予想されるバンドサイズは３００〜３５０ｂｐである。低バイオマス試料では、かすかなバンドが見えるか、バンドが見えない場合がある；Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒなどの代替方法を使用して、ＰＣＲ産物の存在を確認できる場合がある；（ｉｖ）Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のカタログ番号Ｐ１１４９６；製造元の指示に従うこと）を使用してアンプリコンを定量する；（ｖ）各試料からの同量のアンプリコン（２４０ｎｇ）を、１本の滅菌チューブに合わせる。最終プールがゲル分離する場合や、低バイオマス試料で行うときは、より多くの量を使用することができる。注記：複数の試料のプレートで行うときは、試料の各プレートに対してアンプリコンの単一チューブを作成するのが一般的である；（ｖ）ＭｏＢｉｏ  ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ  （カタログ番号１２５００；製造元の指示に従うこと）を使用してアンプリコンプールを洗浄する。９６個以上の試料で行う場合は、洗浄するためにプールを均等に分割してから再び合わせる必要がある場合がある。任意選択：（工程３で）偽バンドがゲルに存在する場合、最終プールの２分の１をゲルで泳動させ、ゲルを抽出して標的バンドのみを選択することができる；（ｖｉ）洗浄した最終プールの濃度とＡ２６０／Ａ２８０比とを測定する。最良の結果では、Ａ２６０／Ａ２８０比は１．８〜２．０となるはずである；（ｖｉｉ）シーケンシング用アリコートを、シーケンシングプライマーと一緒に送る。アンプリコンは、Ｉ��ｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑで５００サイクルＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２を使用し、製造元の指示に従ってシーケンシングした。
【０２４１】
（バイオインフォマティクス解析）
配列は社内パイプラインを使用して解析した。簡単に言うと、バーコード配列で許容されるミスマッチがゼロのＥＡ−Ｕｔｉｌｓを使用して、生配列リードを逆多重化した。ＢＢＤｕｋ２を使用してリードにクオリティフィルタリングを行い、アダプター配列と、ハミング距離１でｋｍｅｒ長３１ｂｐに一致するＰｈｉＸとを除去した。５１ｂｐより短いリードは破棄した。ＵＳＥＡＲＣＨを使用して、最小長のしきい値が１７５ｂｐで最大誤差率が１％のリードをマージした。配列を重複排除し（最小配列数は２）、ＵＳＥＡＲＣＨの距離ベースのグリーディクラスタリング法を使用して、操作的分類単位（ＯＴＵ）メンバー配列間のｂｌａｓｔ％ペアワイズ配列同一性でクラスタリングした。クラスタリング中にＵＳＥＡＲＣＨを使用してキメラ配列のｄｅ  ｎｏｖｏ予測を行った。ＢＬＡＳＴアラインメントを使用してＯＴＵ配列に分類を割り当て、その後、９９％でクラスタリングしたＳＩＬＶＡデータベースバージョン１２３間で最小共通祖先の割り当てを行った。ＯＴＵシード配列を９９％でクラスタリングしたＳＩＬＶＡデータベースバージョン１２３に対してフィルタリングし、ＵＳＥＡＲＣＨを使用してキメラＯＴＵを同定した。ソーティングされた細胞からの試料と比較して´ビーズ´または´対照´試料のリードカウントが高いＯＴＵを、さらなる分析から除外した。
【０２４２】
（差次的存在量分析）
各ＯＴＵおよび比較について、ＲのＡＬＤＥｘ２パッケージを使用した組成データ分析アプローチを使用して、アルゴリズムの典型的なｇｌｍを、同腹仔を考慮したランダム効果を含む混合効果モデルに置き換えて、差次的存在量検定を行った。さらに、２つのグループ間の存在／不在における系統的差異の定性ｇ検定を、各ＯＴＵおよび比較について実行した。調整済みｐ＜０．０５の差は有意とみなした。差次的に多く存在する分類群を、ＧｒａＰｈｌＡｎを使用してグラフ化した。
【０２４３】
（β−グルクロニダーゼ活性アッセイ）
腸内マイクロバイオータ研究では、マウスモデルは強力なツールであり、ヒト被験体にとっては侵襲性が高すぎるであろう実験を、交絡因子をよりよく制御しながら行う可能性を提供する。（Ｎｇｕｙｅｎ，  ＴＬＡ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ＆  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  （２０１５）  ｄｏｉ：      １０．１２４２／ｄｍｍ．０１７４００）例えば、腸内マイクロバイオータ研究に不可欠な操作には、宿主の遺伝的背景の操作（遺伝子ノックアウト）、腸内マイクロバイオータ組成の操作（無菌マウスへの管理された接種すなわちノトバイオートマウス、すなわち外部微生物を投与した無菌マウス）ならびに食事介入、抗生物質処理および便移植などの生態系介入が含まれる。多くのマウスモデルは、モデル化したヒト疾患を正確に再現しているわけではなく、モデルごとに異なる制限があり、これら制限は結果をヒトに変換する際に考慮される必要があるが、これらのモデルは、ヒトのマイクロバイオータを操作し、健康と疾患における腸内マイクロバイオータの役割の因果関係を評価するための貴重な洞察とユニークな可能性を提供してきた。
【０２４４】
マウス腸からの微生物細胞を、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｒｏｃｈｅ）を添加したＰＢＳに懸濁し、ビードビーティング（Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ）で溶解した。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（４−ＭＵＧ；１ｍＭ）を溶解液５０μＬ（総タンパク質０．９μｇ）に添加し、最終濃度が５００μＭになるようにした。特定の時点（０〜２４０分）で、各反応のアリコート１０μＬを０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＣＯ３  ９０μＬ（ｐＨ＝１０）に添加し、暗所に保存した。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して蛍光を測定し、加水分解された基質の量を標準曲線と比較して算出した。速度（ｍＭ／ｓ）を線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）により決定し、活性をタンパク質１μｇあたりの速度として計算した。３つの独立した複製物からの値を平均化し、比率対応のあるｔ検定を使用して生体複製物（ｎ＝５）間で活性を比較した。
【０２４５】
（相関分析）
グルクロニダーゼ活性は、対照およびバンコマイシン処理した試料の全個体群におけるＯＴＵ相対存在量と相関していた。水処理における１つの試料（同腹仔セットＥ対照）の高い活性値は、他のすべての値よりもはるかに大きく、統計結果に大きな影響を与えたため、これらの試料は分析から除外した。さらに、ゼロの数が多い（試料の２／３超が０カウントを観測した）ＯＴＵは、これらのＯＴＵからの結果が偽である可能性が高いため、除外した。残りのＯＴＵについては、正規化されたＯＴＵ存在量とグルクロニダーゼ活性との間のピアソン相関を算出し、有意性の仮説検定を行った。相関は、有意水準０．０５で有意とみなした。
【０２４６】
（組織細胞質ゾルの単離）
マウスの肝臓、肺、腎臓、腸、脾臓、および心臓組織を、ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅａｒｏｒを使用して氷上でミンチにし、その後のホモジナイズを、１Ｘ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１１．９ｍＭリン酸塩、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）緩衝液中の氷冷２５０ｍＭスクロース４ｍＬ中で、ガラス製ダウンス型ホモジナイザーを使用してｌｏｏｓｅとｔｉｇｈｔのペストルから１５パルスで行った。ホモジネートを１０，０００ｇ（４℃）で２５分間スピンさせ、その後上清を回収し、続いて上清を１００，０００ｇで９０分間４℃でスピンさせた。上清（細胞質画分）をペレット（ミクロソーム画分）から分離し、ＢＣＡアッセイによりタンパク質濃度を測定した。
【０２４７】
（ＧＳＴ活性アッセイ）
ＧＳＴ活性アッセイを、１ｍｇ／ｍｌのマウス肺、腎臓、腸、脾臓および心臓の細胞質ゾルと、０．５ｍｇ／ｍｌの肝細胞質ゾルとで実施した。組織タイプごとに４つの技術的複製物を測定した。アッセイは９６ウェルプレートで行った。各ウェルは、ＰＢＳアッセイ緩衝液１７２μＬ（ＩＸ  ＰＢＳ、ｐＨ６．５）、１Ｘ  ＰＢＳ中のＧＳＨ４μＬ（５０ｍＭ）、および１ｍｇ／ｍＬ（または０．５ｍｇ／ｍＬ）細胞質ゾル２０μＬから構成されていた。追加のＰＢＳアッセイ緩衝液２０μＬを、タンパク質なし対照ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中のジニトロクロロベンゼン４μＬ（ＤＮＣＢ）（５０ｍＭ）を各ウェルに添加し、アッセイを開始した。３４０ｎｍでの吸光度を１０分間３０秒ごとに測定した。各複製物の吸光度値の勾配を算出し、算出した各試料勾配からタンパク質なし対照の勾配を差し引いた。ＧＳＴ活性を決定するために、以下の式を適用した：（Ａｂｓ３４０／分）／０．００５０３μＭ（ＤＮＣＢ消光係数）＊（１ｍｇ／２０μｇ）＝ｎｍｏｌ  ＤＮＣＢ／分／ｍｇタンパク質。
【０２４８】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用のマウス肝臓およびＨｅｐＧ２プロテオームにおけるＧＳＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏ標識）
すべてのプローブ標識は、１ｍｇ／ｍＬプロテオーム５０μＬで行った。妥当な場合には、競合物質を添加し、試料を３７℃で３０分間、撹拌しながらインキュベートした。各試料に適切なプローブストック０．５μＬを添加した。ＤＭＳＯ  ０．５μｌをすべてのプローブなし対照に添加した。インキュベーション後、ＧＳＨ−ＡＢＰ標識試料（および対照）を氷上で７分間紫外線にさらした。プローブとのインキュベーション後、ＤＭＳＯ中のローダミン−アジド１．０μＬ（３ｍＭ）、アスコルビン酸ナトリウム１．０μＬ（５００ｍＭ）、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン０．５μＬ（２００ｍＭ）、およびＣｕＳＯ４  ２．０μＬ（１００ｍＭ）を各試料に添加し、ボルテックスし、迅速にスピンダウンさせた。すべての試料を室温で暗所にて９０分間インキュベートした。２Ｘ  ＳＤＳランニング緩衝液５０μＬと１０Ｘ還元剤１０μＬとを各試料に添加した。試料をボルテックスし、振とうさせながら９５℃で１０分間加熱した。その後タンパク質７．５μｇを、１０−２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙまたは４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルの各ウェルに投入し、１５０Ｖ、３５ｍＡで９０分間泳動した。次いで、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）またはＦｌｕｏｒＣｈｅｍＱ（Ａｌｐｈａ−Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）でイメージングした後、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色液でインキュベートし、続いてＧｅｌＤｏｃＥＺ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してイメージングした。ゲル画像分析はＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して行った。
【０２４９】
（プローブを介したストレプトアビジンの濃縮）
すべてのマウス肝細胞質ゾル試料を、ＰＢＳ緩衝液中のスクロース（２５０ｍＭ）で１ｍｇ／ｍＬプロテオーム５００μＬに正規化した。次いで、試料を、競合物質と一緒に（妥当な場合）、３０分間３７℃でインキュベートした。ＧＳＴ−ＡＢＰ、ＧＳＨ−ＡＢＰ、または等量のＤＭＳＯ対照をプロテオームと一緒に３０分間３７℃でインキュベートした。次にＧＳＨ−ＡＢＰ試料を、氷上で７分間、ＵＶ光（波長：３６５ｎｍ；１１５Ｖ、１５Ｗ−Ｆｉｓｈｅｒ  ＵＶＰ９５）にさらした。クリックケミストリー混合液は、ＤＭＳＯ中のビオチン−アジド（６０μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５ｍＭ）、テトラヒドロ無水フタル酸（ＴＨＰＴＡ）（２ｍＭ）、およびＣｕＳＯ４（４ｍＭ）の最終濃度を含有していた。各試薬をその順序で個別に添加し、ボルテックスし、スピンダウンし、室温で暗所にて９０分間インキュベートした。事前に冷却したＭｅＯＨ  ８００μＬを各試料に添加した。試料を−８０℃の冷凍庫に３０分間置き、タンパク質の沈殿を誘導した。試料を１４，０００ｇ、４℃で４分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５分間風乾させた。試料を再懸濁し、ＰＢＳ中のＳＤＳ  ５２０μＬ（１．２％）で超音波処理した；その後９５℃で２分間インキュベートした。試料を１４，０００ｇで４分間室温で遠心分離し、上清を新しいエッピー（ｅｐｐｉｅｓ）に移し、残留ペレットを残した。試料を室温（ｒｔ）に冷却した後、それらのタンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定し、試料を０．６ｍｇ／ｍＬで５００μＬの体積に正規化した。ストレプトアビジン−アガロースビーズ１００μＬを、ＰＢＳ中のＳＤＳ１ｍＬ（０．５％）で２回、ＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ）中の尿素１ｍＬ（６Ｍ）で２回、および１ＸＰＢＳ１ｍＬを使用して４回洗浄した。洗浄は、ＢｉｏＳｐｉｎ使い捨てクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して真空濾過で行った。ＰＢＳのアリコート２、１ｍＬを使用してビーズを４ｍＬクライオバイアルに移し、タンパク質試料を添加し、ビーズ／タンパク質混合液を３７℃で１時間反転させながらインキュベートした。試料をカラムに戻し、ＰＢＳ中の０．５％ＳＤＳのアリコート２、１ｍＬ、ＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ）中の新たに調製した尿素（６Ｍ）のアリコート２、１ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水のアリコート２、１ｍＬ、ＰＢＳのアリコート８、１ｍＬ、ＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ、ｐＨ８）のアリコート４、１ｍＬで洗浄した。ＰＢＳ  ５００μＬの２アリコートを使用して試料をＤＮＡ  ｌｏ−ｂｉｎｄチューブ（エッペンドルフ）に移し、１０，５００×ｇで５分間室温で遠心分離した。上清を廃棄し、ビーズをＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ）中の尿素（６Ｍ）４００μＬに再懸濁した。試料の還元は、３０分間ＴＣＥＰ（５ｍＭ）と３７℃でインキュベートすることで行った。試料をヨードアセトアミド（１０ｍＭ）で５０℃にて、ホイル下で４５分間アルキル化した。ビーズをカラムに移し、ＰＢＳ  １ｍＬで８回、ＮＨ４ＨＣＯ３  １ｍＬ（２５ｍＭ）で４回洗浄した。その後、ビーズをＤＮＡ  ｌｏ−ｂｉｎｄチューブ（エッペンドルフ）にＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ）２ｍＬとともに移した。試料を１０，５００×ｇで５���間室温で遠心分離し、上清を廃棄し、ＮＨ４ＨＣＯ３  ２００μＬ（２５ｍＭ、ｐＨ８）に再懸濁した。トリプシン０．０７５μｇを各ビーズ混合物に添加し、その後一晩３７℃で反転させながらインキュベートした。翌朝、ビーズを１０，５００ｇで５分間スピンダウンした。上清を回収し、試料を乾燥するまでｓｐｅｅｄｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ  ＳＣ１１００）上に置いた。２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ４０μＬを添加し、試料を３７℃で５分間加熱することによって、ペプチドを再構成した。試料を超遠心チューブに移し、１００，０００×ｇでスピンさせて破片を除去した。ガラスバイアルに２５μＬを添加し、分析するまで−２０℃で保存した。
【０２５０】
（プローブ富化マウス肝臓および肺細胞質ゾルのＬＣ−ＭＳ分析）
ＬＣ−ＭＳ用に調製したすべてのプロテオミクス試料を、Ｖｅｌｏｓ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳを使用して分析した。Ｓａｄｌｅｒ，  ＮＣ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２０１６）  ８２  （２４）：    ７２２７−３５。精密質量および時間（ＡＭＴ）タグアプローチを使用して、データを分析した。Ｚｉｍｍｅｒ，  ＪＳＤ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００６）：    ２５（３）：    ４５０−８２。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｕｎｉｐｒｏｔタンパク質データベースに対して検索した。これに続いて、ＭＳＧＦ＋アプローチを使用してデータを再スコアリングした。以下の基準でペプチドをさらにフィルタリングした：（ｉ）タンパク質カウント＝１、（ｉｉ）ＭＴユニーク度≧０．５、（ｉｉｉ）ＭＴ  ＦＤＲ≦１％。ペプチドをｌｏｇ２変換し、線形回帰により正規化した。次に、ＤＡｎｔＥを使用してペプチドをタンパク質レベルにロールアップした（Ｐｏｌｐｉｔｉｙａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  （２００８）  ２４（１３）：    １５５６−５８）。最低５つのタンパク質をＧｒｕｂｂ’ｓ検定に使用し、Ｐ値のカットオフは０．０５であった。プローブなしおよびプローブ標識試料、ならびに非競合および競合プローブ標識試料間の有意性は、対応のあるｔ検定および算出した倍数変化量を使用して決定した。
【０２５１】
（実施例１）
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏプローブ標識は、大腸菌、Ｂ群溶血性レンサ球菌、ウェルシュ菌からの組換えによって発現され精製されたβ−グルクロニダーゼを使用して実施した。β−グルクロニダーゼプローブ実施形態であるＧｌｃＡ−ＡＢＰで酵素を処理し、これをローダミン−アジドでタグ付けし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＧｌｃＡ−ＡＢＰ標識強度は、Ｗａｌｌａｃｅらによって報告されたこれらの酵素の触媒効率に相関していた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。触媒残基のグルタミン酸からアラニンへの変異はプローブ標識を廃止させ、ＧｌｃＡ−ＡＢＰプローブが活性依存的な様式でβ−グルクロニダーゼを標識することを確認した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。追加の結果を図１０Ｃ〜１０Ｆに示す。
【０２５２】
次に、腸内マイクロバイオータのグルクロニダーゼ活性メンバーを同定した。微生物をマウス消化管から単離し、嫌気性条件下でＧｌｃＡ−ＡＢＰプローブとともにインキュベートした。細胞を固定し、蛍光タグを付け、プローブ陽性（ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋）、プローブ陰性（ＧｌｃＡ−ＡＢＰ−）、および全細胞の個体群にソーティングした（図７；図９）。次に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアンプリコンシーケンシングにより各個体群の群集組成を決定し、対応のある定量分析および存在／不在分析の両方により、差次的に多く存在する分類群を同定した。ＧｌｃＡ−ＡＢＰ−画分と比較して、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋画分で統計的に存在量が増加した分類群をグルクロニダーゼ活性とみなした。グルクロニダーゼ活性分類群は、バクテロイデス、プロテオバクテリア、およびテネリクテスを含んで分類学的に多様であった；しかしながら、その分類群の大部分（３１／３７）はファーミキューテスであった（図１１）。最も多く存在する３つのＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋操作的分類単位（ＯＴＵ）も多様であり、リケネラ科、アネロプラズマ科、エリュシペロトリクス科を代表するものであった。一方、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋画分と比較して、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ−画分で存在量が有意に増加したＯＴＵは、グルクロニダーゼ不活性とみなした。この画分も分類学的に多様であり、バクテロイデス、プロテオバクテリア、およびファーミキューテスからの代表的な配列を有していた。最も多く存在するＧｌｃＡ−ＡＢＰ富化ＯＴＵは、ラクノスピラ科であった。これらの結果は、科レベルのあるいは属レベルでもいくつかの分類群はグルクロニダーゼ活性型ＯＴＵと非活性型ＯＴＵの両方を含んでいたことを示しており、したがって、系統発生的類似性だけに基づいてｉｎ  ｖｉｖｏ代謝活性を説明することはできないことを実証している。
【０２５３】
複数の系統発生的に異なる分類群が腸内のグルクロニダーゼ活性に寄与していることを考えると、腸内マイクロバイオータの破壊は必ずしもグルクロニダーゼ活性を無効にするのではなく、この活性に関与する分類群を変化させるのではないかという仮説が立てられた。そのため、同腹仔のペアを、腸内マイクロバイオータのファーミキューテスを標的とすることが知られている抗生物質であるバンコマイシンを含む水または含まない水にばく露した（図１２）。非処理マウスではファーミキューテスがほとんどのプローブ陽性分類群を構成していたため（図１１）、バンコマイシン処理によってＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群組成の変化を引き起こすと予想された。バンコマイシン処理は、同腹仔の５セット中４セットでグルクロニダーゼ活性を減少させたが、なくしはしなかった（図１３Ａ）。したがって、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋標識の強度も同様に減少した（図１３Ｂ）。抗生物質処理後に変化するグルクロニダーゼ活性分類群を同定するために、バンコマイシン処理（Ａｂｘ−ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋）同腹仔と未処理（ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋）同腹仔とのＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群を比較した。バンコマイシン処理は、ファーミキューテスの相対的存在量を劇的に減少させ、プロテオバクテリア、ウェルコミクロビウム、およびバクテロイデスの相対存在量の増加を伴った（図１４）。バンコマイシン処理したＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群と比較して、対照のＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群は、ファーミキューテス（具体的にはクロストリジウム）、バクテロイデス、テネリクテス、およびアクチノバクテリア門からのＯＴＵが有意に富化していた（図１３Ｃ）。対照的に、Ａｂｘ−ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群は、プロテオバクテリアに属するＯＴＵに有意に富化していた；さらに、抗生物質処理後のＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群において、２つのラクトバシラス分類群も有意により多く存在していた。そのような異種の分類群が異なる条件下（すなわち、抗生物質の摂動）で同じ機能を引き出す能力は、これら酵素の基質多様性と有用性とを浮き彫りにしている。β−グルクロニダーゼへのグルクロニドの結合は、代謝物ではなくグルクロン酸によって主に媒介され、微生物が複数の親代謝物からグルクロン酸の形で炭素およびエネルギーを抽出することを可能にしている。このように、β−グルクロニダーゼは、遺伝的に広く存在し、複数の基質を加水分解することができることから、高度の機能的冗長性を示す。その結果、群集構造の摂動は、機能を完全に排除することなく、機能的ギルドの組成を変化させる可能性がある。このことは、腸内の脱グルクロン酸活性の将来的な治療操作は、特定の分類群を追加または排除することによって可能になるのではなく、複数の腸内分類群の酵素を阻害することができる阻害剤を必要とするようになることを示唆している。遺伝的予測および腸内マイクロバイオータ分離株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が以前にこの結果を示唆していたが、本明細書に記載のアッセイは、初めて、ｉｎ  ｓｉｔｕ活性の検出と関与する機能的分類群を同定する能力とを組み合わせることにより、マイクロバイオームにおける分子スケールでの生化学的活性を確認する。
【０２５４】
さらに、総個体群における存在量がグルクロニダーゼ活性と正の相関があるＯＴＵを同定し、バンコマイシンばく露後に枯渇したＯＴＵと比較した。グルクロニダーゼ活性と有意な正の相関がある１２のＯＴＵを同定した。クロストリジウムに対応するＯＴＵ９２およびルミノコッカスに対応するＯＴＵ１６４の２つの例を示している（図１３Ｄ）。これら１２のＯＴＵのうち、１０のＯＴＵは、Ａｂｘ−ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群よりもＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋個体群に有意に多く存在しており（図１３Ｃ）、これらの分類群が未処理マウスのグルクロニダーゼ活性に関与しており、バンコマイシンばく露によって減少することを示唆している。残りの２つのＯＴＵのうち、１つのＯＴＵは、ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋およびＡｂｘ−ＧｌｃＡ−ＡＢＰ＋全体の単一試料でのみ発見され、統計分析を妨げていた。もう一方のＯＴＵはアッケルマンシアＯＴＵであった。興味深いことに、アッケルマンシアの劇的な増加は、バンコマイシン処理したマウスの１つ（セットＦ）で観察され、これは抗生物質処理後に増加したグルクロニダーゼ活性を示した唯一の同腹仔ペアでもあった。これらの結果は、腸内マイクロバイオームの代謝活性化された部分個体群内に機能的可塑性または冗長性があり、本明細書に記載のプローブおよびアッセイ実施形態を使用してこの情報にアクセスすることができることを裏付けるものである。
【０２５５】
（実施例２）
ＧＳＨ結合Ｇ部位と基質結合Ｈ部位におけるＧＳＴの活性ベースのタンパク質プロファイリングを可能にするために２つのプローブを開発し、哺乳動物モデル系におけるＧＳＴの活性を標的化し測定するそれらの能力を確証した。最初のプローブであるＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇは、ＧＳＨを模倣して、ＧＳＴのグルタチオン結合Ｇ部位を標的とするように設計された。光反応性ベンゾフェノンと末端アルキンをＧＳＨのチオールに付加した。これにより、ＵＶ照射時のＧＳＴ標的へのプローブの不可逆的な結合と、クリックケミストリーに続く標的タンパク質のその後の濃縮が可能になった。ＧＳＴ酵素はＧＳＨのペプチド構造を認識して結合するが、ＧＳＨチオールはＧＳＴが媒介する異物との結合のための求核剤として機能する。したがって、Ｇ部位を標的とするために、チオールをアルキンおよびベンゾフェノン含有リンカーで修飾した。Ｇ部位を標的とした光親和性プローブを補完するために、Ｈ部位の活性を特性評価するように設計したメカニズムベースのプローブを開発した。第２のプローブであるＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈは、ヒトおよびげっ歯類のＧＳＴアイソザイムの広範なスペクトルの不可逆的阻害剤であるジクロン（２，３ジクロロ−１，４−ナフトキノン）に由来する。ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈは、ジクロンの疎水性と求電子性というＨ部位結合分子の性質により、Ｈ部位に結合するのではないかと推測されていた。さらに、ジクロン部位は、ＧＳＴのＨ部位内に保存されている触媒チロシンと結合する能力もあることが示唆されている。
【０２５６】
組換えＧＳＴの濃度依存性標識を評価した（図１５Ａ）。２つのプローブ実施形態、ＧＳＨ−ＡＢＰ−ＧおよびＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈを漸増濃度で、哺乳動物肝臓で高度に発現されるＧＳＴアイソザイムである組換えヒトＧＳＴＭ１に加えた。３０分間のインキュベーション後、クリックケミストリーにより蛍光ローダミンレポーターを添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、両プローブが組換えＧＳＴＭ１酵素の濃度依存的な標的化を示すことが明らかになった（図１５Ａ）。次に、両プローブをマウス肝溶解液の細胞質画分に漸増濃度で加え、プローブの標的化をさらに試験した（図１５Ｂ）。両方のプローブは、２４ｋＤａで２つの異なるバンドを強く標識した。下側のバンドは、肝臓に非常に多く存在する２３．６ｋＤａのタンパク質であるＧＳＴＰ１である可能性が高い。上側のバンドは、分子量が約２６ｋＤａのミューおよびアルファクラスのＧＳＴ標的と考えられるものを示している。これらのタンパク質に加えて、ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈプローブは、様々な高分子量タンパク質の濃度依存性標識を示している。ＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇプローブ実施形態は、高い選択性を示しているが、ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈプローブ実施形態はオフターゲット標識を受けやすいように思われ、これはその強い求電子性質に起因する可能性が高い（図１５Ｂ）。各プローブによって標的とされる特定のＧＳＴアイソフォームを決定するために、マウス肝標識のＬＣ−ＭＳベースのプロテオミクス分析、および特定の阻害剤の存在下での標識を実施した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。プロテオミクスは、ＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇプローブ実施形態がＧＳＴに対して高い特異性を示すことを明らかにした（図１６Ａ）。２７のプローブ標的タンパク質は、紫外線ばく露なしの対照と比較して倍率変化３で、統計的に有意なＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇプローブ実施形態の標的であると決定した。これら２７のタンパク質のうち、８つは既知のＧＳＴであり、ミュー、アルファ、パイ、シータ、カッパ、およびゼータクラスのメンバーを含む。残りのタンパク質には、既知のＧＳＨ結合を持つ５つのタンパク質、既知の抗酸化活性および薬物結合活性を持つ１つのタンパク質、および既知のＧＳＨ結合活性を持たない肝臓に非常に多く存在する５つのタンパク質が含まれる。ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈプローブ実施形態は、ＧＳＴのミュー、アルファ、パイ、シータ、オメガ、カッパ、およびゼータクラスの１２メンバーの富化も促進した（図１６Ｂ）。しかし、ゲル研究と同様に、ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈプローブのプロテオミクスの結果は、ＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇプローブの場合よりもかなり多くのオフターゲット標識を示している。オフターゲットの評価から、これらのタンパク質の多くはＧＳＴと同様に既知の反応性チオールを持っていることが明らかになった。ＧＳＴの中では、ＧＳＨ−ＡＢＰ−ＧプローブはＧＳＴＭ２、Ｍ１、Ａ３、Ｐ１、Ｍ４、Ｔ１、Ｋ１、ＭＡＡＩ（Ｚ）に対して選択性を示し、ＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨプローブはＧＳＴＴ２、Ｔ１、およびＺアイソザイムに対して選択性を示した。これらの結果は、ほとんどの細胞質ゾルＧＳＴクラスの多くのメンバーのアイソザイム特異的標的化に対する両プローブの有効性を確証するものである。
【０２５７】
プローブの選択性と、包括的な存在量プロファイリングに対するＡＢＰアプローチの価値を実証するために、ＡＢＰ標識の結果を肝溶解液の包括的プロテオミクス分析と比較した。包括的解析では６つのＧＳＴのみが同定されたが、ＡＢＰ標識により、富化していない溶解液から検出されたすべてのＧＳＴを含む１２のＧＳＴが検出された。したがって、ＡＢＰは、活性で少量のＧＳＴの特性評価を可能にする。
【０２５８】
プローブの活性特異的な結合と一般的な反応性を区別し、ＧまたはＨ部位特異性へのそれらの選択性を特性評価するために、いくつかの関連する阻害剤に対してマウス肝溶解液のＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨおよびＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇ標識を競合させた。ＧＳＨ−ＡＢＰ−ＧプローブによるＧ部位標識を評価するために、ＧＳＨを過剰に添加してＧ部位結合を競合させた。ＧＳＨ競合プローブ標識のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳ分析では、有意な阻害は示されなかった（データは未掲載）。特定の理論に限定されることなく、阻害の欠如は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテオーム試料におけるグルタチオンジスルフィド（ＧＳ−ＳＧ）の形成に起因する可能性がある。活性を修飾する可能性のある還元剤の添加の必要性を回避してＧＳ−ＳＧ形成を防止するために、プローブ標識を、ジスルフィド結合を形成することができないＧＳＨ抱合体であるＳ−ヘキシルグルタチオンと競合させた。Ｓ−ヘキシルグルタチオンはＧＳＴのＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇ標識を濃度依存的に阻害し、有効濃度は１．７７μＭ（１０μＭプローブに対して）であり、ＧＳＨ−ＡＢＰ−ＧプローブのＧ部位特異性を確認することができた（図１７）。
【０２５９】
ＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨプローブがＧＳＴのＨ部位を標的とすることを確認するために、Ｇ部位阻害剤であるＳ−ヘキシルグルタチオンによるＧＳＴ−ＡＢＰ阻害の競合を、既知のＨ部位阻害剤であるエタクリン酸による競合と比較した。結果を図１７に要約する。Ｓ−ヘキシルグルタチオンは、４１．５μＭのＥＣ５０でＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈプローブ標識の有意な阻害を示した（図１７）。この競合は、Ｓ−ヘキシルグルタチオンの抱合ヘキシル部位とＧＳＴのＨ部位との間の既知の相互作用によるものであることはもっともらしい。Ｇ部位阻害剤はＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈ結合を減少させるが、Ｈ部位阻害剤であるエタクリン酸の方がはるかに効果的であると予想された。エタクリン酸は、Ｓ−ヘキシルグルタチオンと比較して、ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈ酵素標識の阻害において１２倍近く強力であり、ＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨがＧＳＴのＨ部位を選択的に標的としていることが示された（図１７）。ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｇ標識は、エタクリン酸とも競合した；それは０．４４μＭでＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｇ標識を阻害することがわかった（１０μＭプローブに対して）。したがって、エタクリン酸はＧＳＴＡ−ＡＢＰ−ＧとＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈの両方のＧ部位へのアクセスを遮断している可能性がある。また、Ｈ部位にエタクリン酸が存在すると、Ｈ部位にあると思われるＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｇのアルキンおよびベンゾフェノン部位が干渉される可能性がある。
【０２６０】
ＧＳＴおよびＧＳＨ結合タンパク質の特異的標識を決定するために、Ｓ−ヘキシルグルタチオン競合肝細胞質ゾル（図１６Ａおよび１６Ｂ）のプロテオミクス分析を行った。ＧＳＴＡ３、Ｍ１、およびＰ１のＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨおよびＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇ標識はＳ−ヘキシルグルタチオンによって有意に阻害され（倍率変化＞３．０、ｐ≦０．０５）、倍率変化抑制でソーティングしたときに阻害されたすべての標的の上位３つであり、両方のプローブがＧＳＴの活性部位を標識していることを示している。
【０２６１】
記載のプローブのサブサイト相補性は、各プローブの酵素特異性を調べるためのユニークなアプローチを提供する。ジクロンとの競合は、いくつかのＧＳＴのおおよその重量である２４ｋＤａのタンパク質の標識を選択的に阻害する。この阻害は、ジクロンとチオール付加アルキン／ベンゾフェノン部位との間のＨ部位占有に対する競合によるものと考えられる。したがって、これらの結果は、ＧＳＨ−ＡＢＰ−ＧがＧＳＴ活性部位内で結合していることを示唆するだけでなく、ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈ親分子であるジヒロンがＧＳＴ活性部位内で結合していることのさらなる証拠も提供する。ＬＣ−ＭＳを、ジクロン（２５μＭ）と競合するＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇ標識マウス肝細胞質ゾルで実施した（図１６Ａ）。ＧＳＴＰ１、Ｍ４、Ａ３、Ｍ１、Ｋ１、およびＭ２のＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇ標識は、ジクロンと競合したときに有意に阻害され（ＦＣ＞２、ｐ≦０．０５）、これは、ＧＳＴ−ＡＢＰ親分子が、ＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇと同じ結合領域の近くにある様々なＧＳＴクラスを選択的に阻害することを示し、ＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨがＧＳＴの活性部位に結合していることをさらに確認した。ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈのジクロン部位の反応性に対するアルキンクリック可能官能基の添加の効果を調べるために、マウス肝細胞質ゾルのＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈ標識をジクロンと競合させた。阻害により、測定可能なすべての蛍光バンドが減少し、アルキンを付加したクリック可能な官能基は反応性に有意な影響を与えないことが示された。
【０２６２】
ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈの一般的な反応性とその活性特異的な標識とを区別するために、タンパク質のシステイン残基のアルキル化に一般的に使用される試薬であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を使用した競合的プローブ標識を行った（図１６Ｂ）。１００μＭのＮＥＭ競合ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈ標識のプロテオミクス分析では、ほとんどのＧＳＴアイソザイムの結合を競合することができず、システイン結合がＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈによって標的とされる主要なアミノ酸ではない可能性があることを示している。以前の研究と組み合わせて、これらの結果は、チロシンがＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈによって不可逆的に結合される主要な残基であることを示唆している。
【０２６３】
次に、肝臓、肺、腎臓、腸、脾臓、および心臓の溶解物を含む、異物代謝に関連する臓器の部位特異的ＧＳＴ活性の変化を検出するプローブの能力を評価した。プローブ標識と蛍光ゲルイメージングにより決定したＧＳＴ活性を、ＧＳＴ活性の総集合体を測定する比色ＧＳＴ活性アッセイと比較した（図１８Ａ〜１８Ｄ）。ＡＢＰ標識の蛍光強度を蛍光シグナルの定量化によって決定した。肝臓ＧＳＴ活性はＡＢＰ標識で最も高く、肺および腎臓が続いた。これらの測定値は、比色アッセイによって決定された総ＧＳＴ活性と密接に対応している。肺溶解液のプロテオミクス研究をその後実施した。１１のＧＳＴアイソザイムがＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈによって富化され、３つのＧＳＴ酵素がＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇによって富化された（図１８Ｄ）。両方のプローブは、肝溶解液中ではどちらのプローブによっても有意に富化されなかったタンパク質である肺ＧＳＴＡ４の高い富化度を示した。ＧＳＴ−ＡＢＰ−ＨおよびＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇは肝臓でＧＳＴＭ４の富化を示すが、肺溶解液では活性は検出されなかった。ＧＳＴ−ＡＢＰ−Ｈは肝溶解液中でＧＳＴＭ６も富化するが、肺では富化しなかった。これは、ｍＲＮＡ発現解析と、これらの酵素が肝臓と比較してマウス肺では発現が低下していることを示すデータと一致している。このデータは、異物代謝におけるＧＳＴの組織特異的な寄与を調べる上での、これらの相補的プローブの有効性を示している。
【０２６４】
ＧＳＴ活性に生理学的に関連する変化をプローブが検出することを検証するために、標準飼料（１０％脂肪）または高脂肪、高肥満、固形飼料（６０％脂肪）を２０週間摂食させたマウスの腸内での、ＡＢＰで測定したＧＳＴ活性を比較した。食餌誘発性肥満に反応して、ミューおよびパイＧＳＴクラスのメンバーを含むいくつかのＧＳＴアイソザイムに統計的に有意な変化が見られた。肥満マウスにおける腸内ＧＳＴの活性増加は、肥満に起因する酸化ストレスへの応答である可能性が高い。
【０２６５】
（実施例３）
ＮＭＲスペクトルを、４９９．８ＭＨｚ  １Ｈ、１２５．７ＭＨｚ  １３Ｃ  ＮＭＲスペクトロメーターで２５℃で記録した。化学シフトは、ＮＭＲ溶媒の残留ピークを基準としたｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（ｐｐｍ  −  δ）で報告され、結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）であり、多重度は以下で示される：シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、ダブルダブレット（ｄｄ）、ダブルトリプレット（ｄｔ）、ダブルダブルダブレット（ｄｄｄ）、およびマルチプレット（ｍ）で記録された通り。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ精製システムを使用してすべての化合物を精製し、同様のためのプレパックカラムをＬｕｋｎｏｖａから入手した。試薬および溶媒は市販の供給業者から入手し、さらなる精製を行わずにそのまま使用した。必要に応じて、無水溶媒を社内の溶媒精製システムから入手した。すべての反応は、ＴＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＭＳを使用してモニターした。反応は必要に応じて窒素（Ｎ２）雰囲気下で行った。新規化合物の特性評価には、１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲ、１９ＦおよびＬＴＱ−ＭＳデータが含まれているが、既知化合物については１Ｈ  ＮＭＲデータのみが適切な文献参照とともに報告されている。
【０２６６】
ＧＳＴ−ＡＢ−Ｈプローブの合成プロセス：
【化８５】
2020536874.tif 000102
２，３−ジクロロ−５−ニトロナフタレン−１，４−ジオン。２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン（５ｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を発煙ＨＮＯ３（１５ｇ）と濃縮Ｈ２ＳＯ４（５０ｇ）の混合液にゆっくりと加え、３時間撹拌しながら７０℃で加熱した。暗褐色溶液を氷水（２００ｍＬ）に注いで明るい黄色固体を得て、これを濾過により回収し、水で洗浄した。ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２０：８０）を使用してフラッシュクロマトグラフィーで分離すると２つの画分が得られ、それらをアセトニトリルと水の溶液中で凍結後に凍結乾燥し、２，３−ジクロロ−５−ニトロナフタレン−１，４−ジオン（１、３．９１ｇ、７０％）と２，３−ジクロロ−６−ニトロナフタレン−１，４−ジオン（２、１．６８ｇ、２８％）との混合物を黄色固体として得た。化合物１：１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ８．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９，  １Ｈ，），  ７．９５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  １Ｈ）  ｐｐｍ  （ＦＩＧ．  １９）．；  化合物２：  １１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ９．００  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ８．６４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．５，  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ）（図２０）。
【０２６７】
５−アミノ−２，３−ジクロロナフタレン−１，４−ジオン。２，３−ジクロロ−５−ニトロナフタレン−１，４−ジオン（１）（０．５０１ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を濃塩酸（３０ｍＬ）に懸濁した。この混合液にＳｎＣｌ２（２．６１ｇ、１３．７８ｍｍｏｌ）を加え、７５℃で３０分間撹拌した。ＴＬＣで１の消失を確認した後、反応混合液を室温まで冷却した。内容物を氷を入れた５００ｍＬの三角フラスコに移し、氷浴に入れた。すべての発火が止まるまで、１０ＭのＮａＯＨ溶液を一定の撹拌下でゆっくりと加えた。この溶液のｐＨが９以上であることを確認した後、内容物を分液漏斗に移し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、紫色固体としてアミン３を（０．２１５ｇ、４８％）得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ７．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｂｒ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ（図２１）。
【０２６８】
Ｎ−（６，７−ジクロロ−５，８−ジオキソ−５，８−ジヒドロナフタレン−１−イル）ヘキサ−５−インアミド。３（０．０２５ｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．０３０ｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）を含むフラスコに加え、１０分間撹拌した。調製したばかりの５−ヘキシノイルクロリド（０．０３０ｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）を反応混合液に加え、２時間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＴＱ−ＭＳ（ｍ／ｚ  ３３６．０１  −  Ｍ＋Ｈ）による反応の完了後、反応を水でクエンチし、分液漏斗を使用してＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させ、オレンジ色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（１：１、ヘキサン：酢酸エチル）を使用した最終精製により、オレンジ色固体として４（２３ｍｇ、６５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  １１．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ９．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．６９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ），  ２Ｈ），  ２．３５  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ６．５，  ２．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．０１−１．９７  （不明瞭ｍ，  ３Ｈ），  ｐｐｍ  （ＦＩＧ．  ２２）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １２５  ＭＨｚ）  δ  １７９．５，  １７５．７，  １７２．２，  １４２．３，  １３６．９，  １３５．７，  １３４．１，  １３１．３，  １２６．８，  １２３．５，  １１４．７，  ８２．９，  ６９．５，  ３７．０，  ３３．７，  ２３．７，  ２２．８，  １７．８  ｐｐｍ  （図２３）；  ＬＴＱ−ＭＳ  Ｃ１６Ｈ１１Ｃｌ２ＮＯ２の計算値  -  ３３５．０１１；  実測値  ３３５．０１１。
【０２６９】
ＧＳＨ−ＡＢＰ−Ｇプローブの合成プロセス：
【化８６】
2020536874.tif 000103
２−アミノ−３−（４−ベンゾイルフェニル）−Ｎ−（プロパ−２−イン−１−イル）プロパンアミド。ＤＣＭ（１０ｍＬ）を含む丸底フラスコに、Ｆｍｏｃ−４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（１．００ｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＩＰＥＡ（３．５４ｍＬ、２０．３ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、続いてＨＡＴＵ（１．０８ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＭＦ（１．５０ｍＬ）を加え、試薬を完全に可溶化した。反応混合液を３０分間撹拌した。反応混合液にプロパルギルアミン（０．１５６ｍＬ、２．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間撹拌した。反応混合液をブライン溶液（１００ｍＬ）に加え、分液漏斗においてＤＣＭ（２０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ＤＣＭをロータリーエバポレーションで除去し、クルード黄色油を得た。この黄色油にＤＣＭ（８ｍＬ）を加え、続いてピペリジン（２．０ｍＬ、２０．２４ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。ＤＣＭをロータリーエバポレーションで除去し、生成物をＤＣＭからＭｅＯＨ（０−２０％ＭｅＯＨ）への直線グラジエントを使用して精製し、黄色油として４（０．２１ｇ、３４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ８．２７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７２  -  ７．６２  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．５７  -  ７．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４０  -  ７．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．８６  -  ３．８２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．０９  -  ３．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．０１  -  ２．６８  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ  （図２４）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  １２５  ＭＨｚ）：  δ  １９５．９７，  １６８．２１，  １４０．２７，  １３７．４４，  １３６．４６，  １３３．２２，  １３０．３３，  １３０．１８，  １３０．０１，  １２９．０５，  ８０．４８，  ７４．２７，  ５３．７９，  ３８．６８，  ２８．６５  ｐｐｍ  （図２５）；  ＬＴＱ−ＭＳ  Ｃ１９Ｈ１８Ｎ２Ｏ２の計算値  −  ３０６．１４；  実測値  ３０７．２２  （ＭＨ＋）。
【０２７０】
３−（４−ベンゾイルフェニル）−２−（２−ヨードアセトアミド）−Ｎ−（プロパ−２−イン−１−イル）プロパンアミド。丸底フラスコ中のＤＣＭ（１ｍＬ）に４（０．０３６ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を溶解した。このフラスコにヨード酢酸無水物（０．１０ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。反応混合液を、フラッシュクロマトグラフィーでＥｔＯＡｃからＭｅＯＨ（０−２０％ＭｅＯＨ）への直線グラジエントを使用して精製した。精製した画分から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、白色固体として５（０．０５３ｇ、９５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ８．４９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７２  -  ７．６１  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．５８  -  ７．５１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４３  -  ７．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５２  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ９．２，  ４．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８４  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ５．０，  ２．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．１１  -  ３．０９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．０７  -  ２．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７５  （ｓ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ  （図２６）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  １２５  ＭＨｚ）：  δ  １９５．９４，  １７１．２４，  １６９．６０，  １４３．７０，  １３７．６７，  １３５．５２，  １３２．９６，  １３０．００，  １２９．９２，  １２９．７９，  １２８．９８，  ８１．３５，  ７３．５４，  ５３．９２，  ３８．１４，  ２８．４４，  ２２．９２  ｐｐｍ  （図２７）；  ＬＴＱ−ＭＳ  Ｃ２１Ｈ１９ＩＮ２Ｏ３の計算値  −  ４７４．０４；  実測値  ４７５．０８  （ＭＨ＋）。
【０２７１】
Ｎ５−（３−（（２−（（３−（４−ベンゾイルフェニル）−１−オキソ−１−（プロパ−２−イン−１−イルアミノ）プロパン−２−イル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−１−（（カルボキシメチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）グルタミン。リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＬ、ｐＨ７．２）に５（０．０４８ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液に還元型グルタチオン（０．２０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合液を、逆相フラッシュクロマトグラフィーを使用してＨ２ＯからＡＣＮ（０−１００％ＡＣＮ）への直線グラジエントで精製した。精製画分をロータリーエバポレーションにかけ、凍結乾燥して白色固体としてＧＳＨ−ＡＢＰ（０．０１９ｇ、２８％）を得た。＋Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ７．６７  -  ７．５６  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．４７  -  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３４  -  ７．２８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５５  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ８．９，  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．３６  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １０．２，  ５．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８０  （ｑｄ，  Ｊ  ＝  １７．６，  ２．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６５  -  ３．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．１９  -  ２．９７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７０  -  ２．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４６  -  ２．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４０  -  ２．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．０６  -  １．９５  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ  （図２８）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  １２５  ＭＨｚ）：  δ  ２００．３４，  １７５．９４，  １７４．７７，  １７３．９０，  １７２．２８，  １７１．９８，  １７１．２９，  １４２．２１，  １３６．７０，  １３５．４６，  １３３．４４，  １３０．７２，  １３０．１６，  １２９．３１，  １２８．５０，  ７９．１７，  ７１．８３，  ５４．８０，  ５４．０８，  ５２．７６，  ４３．２８，  ３６．９９，  ３４．７６，  ３３．２２，  ３１．３８，  ２８．６９，  ２６．１４  ｐｐｍ  （図２９）；  ＬＴＱ−ＭＳ  Ｃ３１Ｈ３５Ｎ５Ｏ９Ｓの計算値  -  ６５３．２２；  実測値  ６５２．２８  （ＭＨ−）。
【０２７２】
【化８７】
2020536874.tif 000104
（２−（２−ホルミル−４−ニトロフェノキシ）−６−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリイルトリアセテート（３）の調製。）
撹拌子を備えた清潔で乾燥した１００ｍＬ丸底フラスコに、１（０．７４９ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンズアルデヒド（０．３１６ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）を充填し、５分間撹拌した。反応混合液にＡｇ２Ｏ（０．４３５ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を慎重に加え、室温で４時間撹拌した。所望の質量を与える濾過アリコートを使用してＬＴＱ−ＭＳ（ｍ／ｚ  ４８４；  Ｍ＋Ｈ）により反応の完了を確認した後、反応を停止させ、Ａｇ２Ｏをセライトベッドで濾過した。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、暗褐色のクルード生成物を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン：１：２）を使用してさらに精製し、淡黄色固体として所望のアルデヒド３（０．６２ｇ；６７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３；  ５００  ＭＨｚ）  δ  １０．３２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７０  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ８．４１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ７．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．９  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ５．４６−５．３９  （不明瞭ｍ，  ５Ｈ），  ３．７３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０２  （ｍ，  ９  Ｈ，）  ｐｐｍ。
【０２７３】
（２−（２−（ジフルオロメチル）−４−ニトロフェノキシ）−６−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリイルトリアセテート（４）の調製。）
化合物３（０．４０１ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、Ｎ２の一定のパージ下で５分間撹拌した。三フッ化ジエチルアミノ硫黄（ＤＡＳＴ）（０．６６ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解して反応混合液に滴下し、その後反応混合液を０℃で３時間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＴＱ−ＭＳで反応の完了を確認した後、ＮａＨＣＯ３  水溶液で反応をクエンチした。内容物を、ジクロロメタン５０ｍＬを含む分液漏斗に移し、有機層を水（３ｘ２５ｍＬ）とブライン（１ｘ２５ｍＬ）で洗浄した後、ジクロロメタン層を分離し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させてクルード生成物を得て、酢酸エチル：ヘキサン（１：２）を使用したフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製し、白色固体として４（０．３９ｇ、９２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ；  ５００  ＭＨｚ）  δ  ８．４２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０３−６．８１  （ｂｒ  ｔ，  Ｊ  ＝  ５４．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．６７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．５０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３２  （不明瞭ｔ，  １Ｈ），  ５．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｓ，  ３  Ｈ），  ２．０７−２．０３  （ｂｒ  ｓ，  ９  Ｈ，）  ｐｐｍ。
【０２７４】
（２−（２−（ジフルオロメチル）−４−（ヘキサ−５−インアミド）フェノキシ）−６−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリイルトリアセテート（６）の調製。）
撹拌子を備えた清潔で乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコをＮ２で５分間洗い流し、化合物４（０．２０１ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に溶解した。これに活性化した（１０５℃のオーブンで一晩加熱）Ｐｄ／Ｃ（０．４ｇ）を加え、反応混合液にＨ２ガスを（バルーンを介して）５分間バブリングすることで、反応混合液をパージした。その後、反応をＨ２のバルーン下で１５〜２０時間維持した。ＴＬＣ（２：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により反応の完了を確認した後、Ｈ２バルーンを慎重に取り外し、反応混合液をＮ２でパージした。Ｎ２フロー下で、溶媒としてジクロロメタンを使用し、内容物をセライトベッドで濾過した。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させることで濾液を濃縮し、淡黄色固体としてアミン５（０．１８０ｇ、９５％）を得て、ＬＴＱ−ＭＳ（ｍ／ｚ  ４７６；  Ｍ＋Ｈ）を使用して質量を確認し、化合物を精製せずに後続の工程で使用した。
【０２７５】
撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに５−ヘキシン酸（１．００ｇ）を加え、ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、これにＳＯＣｌ２（１０当量）を加えた。反応混合液を６時間還流させた後、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させ、ヘキシノイルクロリドをクルード油として得て、これをアミン５と反応させた。
【０２７６】
アミン５（０．１２５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をトリメチルアミン（０．０８０ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を含む無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解し、５分間撹拌した。塩化ヘキシノイル（０．０７０ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、反応混合液に５分間かけてゆっくりと滴下した。次に、得られた溶液を室温で１２時間撹拌し、最終的にＬＴＱ−ＭＳ（ｍ／ｚ  ５７０，  Ｍ＋Ｈ）を使用して完了を確認した。反応混合液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、内容物を分液漏斗に移した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（２×２５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２×３０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させることにより濃縮し、クルード生成物を得て、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー（１：１  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、白色固体として６（０．１６１ｇ、７７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ７．７７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９６−６．７４  （ｂｒ  ｔ，  Ｊ（Ｈ，Ｆ）  ＝  ５５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．４９−５．４４  （不明瞭ｄ，  １Ｈ），  ５．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２６−５．２０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．５０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３０−  ２．２７  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．０４−２．０３  （ｍ，  ９Ｈ），  １．９１−１．８７  （ｍ，  ２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  １２５  ＭＨｚ）：  δ  １７２．３，  １６９．９，  １６９．７，  １６７．４，  １３４．３，  １２３．３，  １１７．３，  １１６．０，  ９８．７，  ８２．６，  ７１．６，  ７１．５，  ７０．７，  ６９．３，  ６８．  ９，  ５１．９，  ３５．０，  ２４．１，  １９．０，  １８．９，  １７．２；  １９Ｆ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  ４７０  ＭＨｚ）  −１１１．２６，  −１１１．３８，  −１１１．９０，  −１１２．０２，  −１２１．２３，  −１２１．３４，  −１２１．８７，  −１２１．９８；  ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  （Ｍ＋  Ｈ）  Ｃ２７Ｈ２９Ｆ２ＮＯ１１の計算値：  ５６９．５１，  実測値：  ５７０．４９。
【０２７７】
（６−（２−（ジフルオロメチル）−４−（ヘキサ−５−インアミド）フェノキシ）−３，４，５−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボン酸（ＧｌｃＡ−ＡＢＰ）の調製。）
６（０．１０１ｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）を１００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、５分間撹拌した。メタノール中のＮａＯＣＨ３（２５％ｗｔ／ｖ；０．０３０ｇ、０．５３６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、シリンジでゆっくりと反応混合液に加えた。反応混合液を室温で３時間撹拌した。ＬＴＱ−ＭＳ（ｍ／ｚ  ４２８、Ｍ−Ｈ）により反応の完了を確認した後、反応を停止させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させ、クルード油を残した。１００％酢酸エチルを使用したフラッシュクロマトグラフィーによる最終精製により、黄褐色固体としてＧｌｃＡ−ＡＢＰ（０．０６１ｇ、８０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ８．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｂｒ  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２９  （不明瞭ｓ，  １Ｈ），  ７．２７−７．０６  （ｂｒ  ｔ，  Ｊ  ＝  ５５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ３．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５７−３．５５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５４−３．５１  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３０−２．２７  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９３−１．８７  （ｍ，  ２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  １２５  ＭＨｚ）：  δ  １７２．３，  １６９．８，  １６８．８，  １５１．５，  １４９．３，  １３５．０，  １３３．７，  １２３．３，  １１７．１，  １１６．８，  ８２．７，  ７６．３，  ７５．２，  ７３．２，  ７２．０，  ６８．８，  ３５．０，  ２４．２，  １７．２；  １９Ｆ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  ４７０  ＭＨｚ）  −１１４．７０，  −１１４．８１，  １１５．３４，  −１１５．４６，  −１１６．９８，  −１１７．０９，  −１１７．６２，  −１１７．７４；  ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  （Ｍ＋  ）  Ｃ１９Ｈ２１Ｆ２ＮＯ８の計算値：  ４２９．３７，  実測値：  ４２８．１１  ［Ｍ−Ｈ］。
【０２７８】
（実施例４）
本実施例では、代表的なデバイス実施形態は、以下の工程を使用して作られる。Ｆｉｓｈｅｒブランドの顕微鏡スライドを、２０％硝酸〜１００ｍＬに８５℃で２時間浸すことで洗浄する。次いでスライドを取り出し、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏに満ちたビーカーに入れる。１分間浸した後、スライドをｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏの新しいビーカーに移し、５分間放置する。次いでスライドを、３５％Ｈ２Ｏ２溶液に移し、７５℃で１時間置く。その後スライドを取り出し、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏに満ちたビーカーに入れる。１分間浸した後、スライドをｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏの新しいビーカーに移し、５分間放置する。スライドをメタノールのビーカーに移動し、５分間放置する。スライドを１１０℃のオーブンで（少なくとも）１時間乾燥させる。ウェルカバーをｍｉｌｌｉＱで湿らせ、スライドの表面に取り付ける。その後、しっかりと取り付けられたスライドをオーブン内に３０分間戻し、乾燥させる。表面に１．６ｍＬのｍｉｌｌｉＱを追加することにより、デバイスに漏れがあるかどうかをテストする。１０分経っても漏れがない場合は、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを捨て、オーブンに〜１５分間戻し、官能基化に直接進む。各スライドを、（酢酸で）ｐＨ〜＝４．５の３：１  ｍｉｌｌｉＱ：ＭｅＯＨ溶液１．５６８ｍＬ（合計１．６ｍＬ）中のトリエトキシシランアミン３２μＬで、室温で揺動させながら一晩官能基化する。スライドをＤＭＳＯで２回、エタノールで２回洗浄した後、オーブンに１時間入れた。ＤＭＳＯ  １．５ｍＬ＋ＴＥＡ  １００ｕＬ中のＮＨＳ−エステル−ＰＥＧ−アジド５ｍｇの溶液をスライドに加え、室温で一晩揺動させる。スライドをＤＭＳＯで３回洗浄する。クリックケミストリーを個々のスライドに対して、溶媒としてのＤＭＳＯ、１００μＭプローブ、および２０μＭ  ＣｕＩを含む総容量１．６ｍＬで実行する。室温で揺動させながら、反応を一晩進行させる。スライドをＤＭＳＯで３回洗浄する。
【０２７９】
（実施例５）
本実施例では、代表的なデバイスを使用して試料を分析する。具体的には、デバイス（例えば、上記実施例４の官能基化基板）を、生体試料を含む水溶液（例えば、ＰＢＳ）で２回洗浄する。試料を官能基化デバイス表面に３時間揺動させながら（室温または所望の温度）で塗布する。スライドをＰＢＳで１回洗浄する。次いで、室温で揺動させながらスライドを４％ＳＤＳで１回洗浄する（５分）。次いで、スライドをＤＭＳＯで２回洗浄する（５分、次いで３０分を揺動させながら）。次に、室温で揺動させながらスライドをＰＢＳで１回洗浄した後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄する（最初の洗浄は５分間、２回目の洗浄は３０分間）。その後、スライドを、室温で揺動させながら４％ＳＤＳで２回洗浄する（最初の洗浄は５分間、２回目の洗浄は一晩）。その後、スライドを、ＰＢＳで１回、ｍｉｌｌｉＱで１回洗浄する。その後、スライドを、室温で揺動させながら６Ｍ尿素で洗浄する（１時間）。その後、スライドを２回、１Ｍ  ＮａＣｌで２回（各１分）洗浄する。その後、スライドをｍｉｌｌｉＱで２回（各１分）洗浄する。次いで、スライドを２．５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）で１回洗浄する（揺動させながら５分）。次に、２．５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  １．５９ｍＬ（ｐＨ８）を各ウェルに添加する。２．５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  １００ｕＬ（ｐＨ８）で希釈したトリプシン２０ｕｇ（バイアル中）を調製し、トリプシン溶液１０ｕＬ（．２ｕｇ／ｕＬ）を各ウェル表面に添加する（合計２ｕｇ）。デバイスを室温で一晩揺動させる。試料を回収し、エッペンドルフチューブに入れる。試料を凍結して凍結乾燥し、２．５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ５０ｕＬ（ｐＨ８）に再懸濁する。Ｑｕａｎｔ−ＩＴアッセイ用に１０ｕＬを使用し、タンパク質濃度を測定する。また、試料４０ｕＬをガラス製超遠心チューブに移し、ＴＬＡ  １２０．１ローターで５３，０００ｒｐｍで２０分間スピンダウンさせた。上清２５ｕＬを収集し、ＭＳバイアルインサートに移して分析を行う。
【０２８０】
（実施例６）
本実施例では、ガラスマイクロスフィアを使用して多重化デバイスを提供する。エッペンドルフチューブ（最大１．５ｍＬ）中の溶解液または純粋なタンパク質（５０ｕＬ、典型的には１ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、二官能性プローブ（１００ｕＭ）を添加し、撹拌せずに３７℃で１時間インキュベートする。この溶液にＤＢＣＯ−ローダミン５４５（１００ｕＭ）を添加し、５００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートする。冷（−２０℃）ＭｅＯＨ（５００〜１０００ｕＬ）で洗浄し、１６ｘｇで４℃で２分間遠心する。上清（使用したフルオロフォアに基づいて、明るいピンク色になる）を除去し、これらの３工程を２回繰り返す。エッペンドルフの壁がピンク色になることがあるが、これは正常である。試料を乾燥させる。次いで、ＭｅＯＨ中の官能基化アジドマイクロスフェアの５〜１０％懸濁液を、タンパク質を含むエッペンドルフに添加する。ＭＳをピペットでチューブの底に入れ、完全に乾燥させる（容量に応じて〜３０分）。ＰＢＳ中の０．４％ＢＳＡ  １００ｕＬを戻し、マイクロスフェアを超音波によって再懸濁し、その後ボルテックスと手動撹拌（ベンチトップのチューブの底を叩くと上手くいく）を行う。マイクロスフェアを再懸濁した後、クリックケミストリー条件（５０ｕＬあたり、ＮａＡｓｃ  ２５０ｍｍ、０．５ｕＬ、ＴＨＰＴＡ  ２００ｍｍ、０．２５ｕＬ、ＣｕＳＯ４  １００ｍｍ、１ｕＬ）を使用し、試料を１５００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートする。この段階でのマイクロスフェアを洗浄し（実際にはＰＢＳ中０．４％ＢＳＡを２回必要とするのみ）、蛍光ベースの読み取りに使用する。完了したら、試料を次のように洗浄する：１回のＰＢＳ中０．４％ＢＳＡ、ＰＢＳ中４％ＳＤＳ、６Ｍ尿素、２Ｍ  ＮａＣｌ、その後容量（１００ｕＬ）２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８に戻す。プロテオミクス用に新しいトリプシン（１ｎｇ／ｕＬ）で試料を準備することができ、撹拌せずに３７°Ｃで１２〜２４時間インキュベートする。質量分析試料を調製する前に、ＢＣＡを実行してタンパク質量を測定することができる。
【０２８１】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示の実施形態は好ましい例に過ぎず、限定的と解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、その範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらのクレームの範囲および趣旨に含まれるすべてのものを本発明として主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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