(57)【要約】  リンパ腫を含めたＢ悪性腫瘍の治療のための個別化医療を提供する方法が記載される。この方法はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）技術を利用するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、
前記対象のリンパ腫細胞に発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと、
前記固有Ｂ細胞受容体を細胞内で発現させることと、
前記細胞とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることと、
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと、
前記対象に治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法。
【請求項２】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、
前記対象のリンパ腫細胞に発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと、
固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることと、
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと、
前記対象に治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法。
【請求項３】
前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドが、ペプチド、環状ペプチド、ペプトイド、環状ペプトイド、多糖、脂質、または小分子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固有Ｂ細胞受容体と前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとをＴ細胞内で共発現させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記検出方法が、前記Ｔ細胞の活性化を確認することを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞の活性化を確認することが、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現を測定することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ファージディスプレイによって、前記固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項９】
前記ライブラリーが、ファージと結合した推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固有Ｂ細胞受容体を固体支持体に結合させる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることが、固体支持体と結合した前記固有Ｂ細胞受容体を、前記ファージと結合した推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーで１ラウンドまたは複数ラウンドにわたってパニングすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記パニングの各ラウンドがネガティブ選択を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象がリンパ腫を有することを明らかにする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、
生検試料から細胞を得ることと、
前記細胞からＲＮＡを抽出することと、
抽出した前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
前記ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
３週間以内で実施する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記治療剤が放射性同位元素を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療用ＣＡＲを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記治療剤が化学療法を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記治療剤が免疫療法を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記対象に前記Ｂ細胞受容体またはそのフラグメントを前記治療剤と同時に投与する、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、
前記対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと、
前記固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを細胞内で共発現させることと、
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと、
前記対象に治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記固有Ｂ細胞受容体と前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとをＴ細胞内で共発現させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞が、前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出方法が、前記Ｔ細胞の活性化を確認することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞の活性化を確認することが、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現を測定することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象がリンパ腫を有することを明らかにする、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、
生検試料から細胞を得ることと、
前記細胞からＲＮＡを抽出することと、
抽出した前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
前記ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
３週間以内で実施する、請求項２３〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記治療剤が放射性同位元素を含む、請求項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療用ＣＡＲを含む、請求項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記治療剤が化学療法を含む、請求項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記治療剤が免疫療法を含む、請求項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、請求項２３〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象に前記Ｂ細胞受容体またはそのフラグメントを前記治療剤と同時に投与する、請求項２３〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
Ｂ細胞受容体リガンドを特定する方法であって、
Ｂ細胞受容体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のライブラリーをコードする核酸分子をＴ細胞集団に与え、前記ライブラリー内の各ＣＡＲが異なる推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むことと、
前記Ｂ細胞受容体と前記ＣＡＲのライブラリーとをＴ細胞内で共発現させることと、
前記Ｔ細胞の活性化を測定し、前記Ｂ細胞受容体と前記ＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、前記ＣＡＲのライブラリー由来のＣＡＲの前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが前記Ｂ細胞受容体のリガンドを含むことと、
活性化Ｔ細胞から前記ＣＡＲをコードする核酸分子を単離することと、
前記活性化Ｔ細胞由来の前記ＣＡＲをコードする前記核酸分子の前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインのシーケンシングを実施し、
それによりＢ細胞受容体リガンドを特定することと
を含む、方法。
【請求項４１】
前記Ｂ細胞受容体が癌細胞由来のものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌細胞が、例えばリンパ腫を有することが明らかにされている患者に由来する、リンパ腫細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
患者由来の腫瘍から前記リンパ腫細胞を得る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、３０アミノ酸以下のポリペプチドを含む、請求項４０〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＡＲが膜貫通ドメインを含む、請求項４０〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記膜貫通ドメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＣＡＲが細胞内領域を含む、請求項４０〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞内領域が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、および／またはＣＤ３ゼータを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＣＡＲがヒンジドメインを含む、請求項４０〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する、請求項４０〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
Ｊｕｎ、ＮＦ−κＢ、および／またはＲｅｌの制御下での蛍光タンパク質レポーター遺伝子の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する、請求項４０〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
リンパ腫を有する対象を前記Ｂ細胞受容体リガンドで治療することをさらに含み、前記Ｂ細胞受容体が前記対象由来の腫瘍内で発現し、
前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療剤と結合している、
請求項４０〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
リンパ腫を治療する方法であって、
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することを含み、
前記Ｂ細胞受容体リガンドが推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含み、前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むＣＡＲが、前記リンパ腫細胞の前記Ｂ細胞受容体と共発現したとき、Ｔ細胞を活性化する、
方法。
【請求項５７】
前記治療剤が放射性同位元素を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療用ＣＡＲを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療剤が化学療法を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記治療剤が免疫療法を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、３０アミノ酸以下のポリペプチドを含む、請求項５６〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、請求項５６〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む前記ＣＡＲまたは前記治療用ＣＡＲが、膜貫通ドメインを含む、請求項５６〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記膜貫通ドメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む前記ＣＡＲまたは前記治療用ＣＡＲが、細胞内領域を含む、請求項５６〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞内領域が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、および／またはＣＤ３ゼータを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む前記ＣＡＲまたは前記治療用ＣＡＲが、ヒンジドメインを含む、請求項５６〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する、請求項５６〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記対象に前記Ｂ細胞受容体またはそのフラグメントを治療剤と同時に投与する、請求項５６〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、
前記対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと、
前記固有Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリー由来のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをＴ細胞内で共発現させ、前記ライブラリー内の各ＣＡＲが、異なる推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むことと、
活性化Ｔ細胞を特定することによってＢ細胞受容体リガンドを特定し、前記Ｂ細胞受容体と前記ＣＡＲを発現する前記Ｔ細胞が活性化される場合、前記ＣＡＲのライブラリー由来の前記ＣＡＲの前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが前記固有Ｂ細胞受容体のリガンドを含むことと、
前記対象に治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法。
【請求項７２】
前記対象がリンパ腫を有することを明らかにする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、
生検試料から細胞を得ることと、
前記細胞からＲＮＡを抽出することと、
抽出した前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
前記ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項７１〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む、請求項７１〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを調製することをさらに含む、請求項７１〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
３週間以内で実施する、請求項７１〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｔ細胞が、前記ＣＡＲのオートクリンベースの活性化によって活性化される、請求項７１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
Ｂ細胞受容体リガンドを特定することが、
前記活性化Ｔ細胞から前記ＣＡＲをコードする前記核酸分子を単離することと、
前記活性化Ｔ細胞由来の前記ＣＡＲをコードする前記核酸分子の前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインのシーケンシングを実施することと
をさらに含む、請求項７１〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記治療剤が放射性同位元素を含む、請求項７１〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療用ＣＡＲを含む、請求項７１〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記治療剤が化学療法を含む、請求項７１〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記治療剤が免疫療法を含む、請求項７１〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、３０アミノ酸以下のポリペプチドを含む、請求項７１〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、請求項７１〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む前記ＣＡＲまたは前記治療用ＣＡＲが、膜貫通ドメインを含む、請求項７１〜８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記膜貫通ドメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む前記ＣＡＲまたは前記治療用ＣＡＲが、細胞内領域を含む、請求項７１〜８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞内領域が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤＩ  ５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む前記ＣＡＲまたは前記治療用ＣＡＲが、ヒンジドメインを含む、請求項７１〜９０のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する、請求項７１〜９０のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
前記対象に前記Ｂ細胞受容体またはそのフラグメントを前記治療剤と同時に投与する、請求項７１〜９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、
前記対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと、
前記固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを細胞内で共発現させることと、
推定固有Ｂ細胞受容体リガンドが固有Ｂ細胞受容体と相互作用する場合、それが前記固有Ｂ細胞受容体リガンドとする、検出方法によって、前記固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと、
前記対象に治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法。
【請求項９５】
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとをＴ細胞内で共発現させる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
細胞が、前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを含む、請求項９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記検出方法が、前記Ｔ細胞の活性化を確認することを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔ細胞の活性化を確認することが、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現を測定することを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象がリンパ腫を有することを明らかにする、請求項９４〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
前記対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、
生検試料から細胞を得ることと、
前記細胞からＲＮＡを抽出することと、
抽出した前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
前記ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項９４〜１００のいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む、請求項９４〜１００のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
３週間以内で実施する、請求項９４〜１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
前記治療剤が放射性同位元素を含む、請求項９４〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療用ＣＡＲを含む、請求項９４〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０６】
前記治療剤が化学療法を含む、請求項９４〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０７】
前記治療剤が免疫療法を含む、請求項９４〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、請求項９４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０９】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記対象に前記Ｂ細胞受容体またはそのフラグメントを前記治療剤と同時に投与する、請求項９４〜１０９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１１】
環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内領域と
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１１２】
前記ＣＡＲがＢ細胞受容体と共発現したとき、Ｔ細胞を活性化し、前記Ｂ細胞受容体のＢ細胞受容体リガンドが、前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む、請求項１１１に記載のＣＡＲ。
【請求項１１３】
前記膜貫通ドメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む、請求項１１１または１１２に記載のＣＡＲ。
【請求項１１４】
前記細胞内領域が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１３／４ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む、請求項１１１〜１１３に記載のＣＡＲ。
【請求項１１５】
ヒンジドメインを含む、請求項１１１〜１１４のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１１６】
前記Ｂ細胞受容体リガンドが、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１１１〜１１５のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１１７】
対象の癌を治療する方法であって、
ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と、
前記癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む、ワクチンと
を同時に投与することを含む、方法。
【請求項１１８】
前記癌特異抗原がＢ細胞受容体である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記癌がリンパ腫である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリペプチドまたは核酸が、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、またはそのフラグメントを含む、請求項１１７〜１１９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２１】
前記癌特異抗原が、前記癌内で発現し、体細胞変異を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記対象の非癌細胞が前記体細胞変異を有さない、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記変異が、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、読み過ごし変異、または遺伝子融合変異である、請求項１２１または１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記体細胞変異が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＥＡ、ＣＤ２２、ＬＩＣＡＭ、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ、ＣＤ１２３、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＦＲａ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、５Ｔ４、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＡＣＶＲ２Ｂ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＵＣ１、またはＭＵＣ１６の変異を含む、請求項１２１〜１２３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２５】
前記癌が腫瘍を含む、請求項１２１〜１２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２６】
前記ポリペプチドまたは核酸が前記体細胞変異を含む、請求項１２１〜１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
前記対象に前記同時投与を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回実施する、請求項１２１〜１２６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２８】
前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞を前記ワクチンの前に投与する、請求項１２１〜１２７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２９】
前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞を前記ワクチンの後に投与する、請求項１２１〜１２７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３０】
前記対象の前記癌特異抗原を特定することをさらに含む、請求項１２１〜１２９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３１】
前記癌特異抗原を特定することが、
（ｉ）対象から癌細胞を得ることと、
（ｉｉ）前記細胞からＤＮＡを抽出することと、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記癌特異抗原を特定することが、前記癌細胞から得たＤＮＡ配列と、非癌細胞から得た同じ遺伝子のＤＮＡ配列とを比較することをさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ＤＮＡを腫瘍細胞から単離する、請求項１３０または１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記癌特異抗原を特定することが、前記対象の循環血中無細胞ＤＮＡの単離とシーケンシングとを含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３５】
前記癌特異抗原を特定することが、
（ｉ）対象から癌細胞を得ることと、
（ｉｉ）前記細胞からＲＮＡを抽出することと、
（ｉｉｉ）抽出した前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
（ｉｖ）前記ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
前記癌特異抗原を特定することが、前記癌細胞から得たｃＤＮＡ配列と、非癌細胞から得た同じ遺伝子のｃＤＮＡ配列とを比較することをさらに含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ワクチンが、重複配列を有し、それぞれが前記癌特異抗原のフラグメントを発現する、２つ以上のポリペプチドを含む、請求項１２１〜１３６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３８】
（ｉ）癌に特異的な方法で前記癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを特定すること、および
（ｉｉ）前記抗原結合ドメインを含むＣＡＲをＴ細胞内で発現させること
によって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を準備することをさらに含む、請求項１２１〜１３７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３９】
前記ポリペプチドをＫＬＨとコンジュゲートする、請求項１２１〜１３８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４０】
前記ワクチンを静脈内投与、腹腔内投与、経粘膜投与、経口投与、皮下投与、経肺投与、鼻腔内投与、真皮内投与、または筋肉内投与によって投与する、請求項１２１〜１３９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４１】
前記ワクチンを腫瘍内に投与する、請求項１２１〜１４０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４２】
前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞を静脈内投与によって投与する、請求項１２１〜１４１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４３】
前記ＣＡＲが膜貫通ドメインを含む、請求項１２１〜１４２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４４】
前記膜貫通ドメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記ＣＡＲが細胞内領域を含む、請求項１２１〜１４４のいずれかに記載の方法。
【請求項１４６】
前記細胞内領域が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、および／またはＣＤ３ゼータを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ＣＡＲがヒンジドメインを含む、請求項１２１〜１４６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４８】
ＴＬＲ９アゴニストを投与することをさらに含む、請求項１２１〜１４７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４９】
前記癌特異抗原が０Ｘ４０である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
対象の癌を治療する組成物であって、
ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と、
前記癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸と
を含む、組成物。
【請求項１５１】
前記癌特異抗原がＢ細胞受容体である、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記ポリペプチドまたは核酸が、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、またはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記癌特異抗原が、前記癌内で発現し、体細胞変異を含む、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記対象の非癌細胞が前記体細胞変異を有さない、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記変異が、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、読み過ごし変異、または遺伝子融合変異である、請求項１５３または１５４に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記体細胞変異が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＥＡ、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ、ＣＤ１２３、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＦＲａ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、５Ｔ４、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＡＣＶＲ２Ｂ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＵＣ１、またはＭＵＣ１６の変異を含む、請求項１５３〜１５５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５７】
前記ポリペプチドまたは核酸が前記体細胞変異を含む、請求項１５３〜１５６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５８】
前記ワクチンが、重複配列を有し、それぞれが前記癌特異抗原のフラグメントを発現する、２つ以上のポリペプチドを含む、請求項１５０〜１５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５９】
前記ポリペプチドをＫＬＨとコンジュゲートする、請求項１５０〜１５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６０】
前記ＣＡＲが膜貫通ドメインを含む、請求項１５０〜１５９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６１】
前記膜貫通ドメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む、請求項１６０に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記ＣＡＲが細胞内領域を含む、請求項１５０〜１６１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６３】
前記細胞内領域が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、および／またはＣＤ３ゼータを含む、請求項１６２に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記ＣＡＲがヒンジドメインを含む、請求項１５０〜１６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６５】
ＴＬＲ９アゴニストを投与することをさらに含む、請求項１５０〜１６４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６６】
前記癌特異抗原が０Ｘ４０である、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１６７】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、前記対象に第一のＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を治療有効量投与することを含み、
（ｉ）前記第一のＣＡＲが、前記対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体と結合する環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、抗原結合ドメインを含み、
（ｉｉ）
（ａ）前記対象のリンパ腫細胞内で発現する前記固有Ｂ細胞受容体を特定すること、
（ｂ）前記固有Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリー由来の第二のＣＡＲとをＴ細胞内で共発現させ、前記ライブラリー内の各ＣＡＲが、前記環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む異なる推定リガンドドメインを含むこと、および
（ｃ）活性化Ｔ細胞を特定することによって前記第一のＣＡＲの前記抗原結合ドメインを特定し、前記Ｂ細胞受容体と前記第二のＣＡＲを発現する前記Ｔ細胞が活性化される場合、前記ＣＡＲのライブラリー由来の前記第二のＣＡＲの推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、前記第一のＣＡＲの前記抗原結合ドメインを含むことによって、前記抗原結合ドメインを特定し、
（ｉｉｉ）前記第一のＣＡＲが、対照よりも高い特異性および／または活性を有する、  方法。
【請求項１６８】
前記対照がＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が発現する前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、Ｂ細胞受容体以外のリガンドと結合する、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記抗原結合ドメインがＣＤ−１９と結合する、請求項１６８または１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記第一のＣＡＲと前記第二のＣＡＲが同じＣＡＲである、請求項１６７〜１７０のいずれかに記載の方法。
【請求項１７２】
前記第一のＣＡＲと前記第二のＣＡＲが異なるＣＡＲである、請求項１６９〜１７０のいずれかに記載の方法。
【請求項１７３】
活性が、対照と比較した前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性を含む、請求項１６９〜１７２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７４】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する前記ＣＡＲＴの前記細胞傷害性が、効果対標的比１：１〜１０：１で、％溶解による測定で前記対照より０％〜１０％高い、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する前記ＣＡＲＴの前記細胞傷害性が、エフェクター：標的比１０：１以上で、％溶解による測定で前記対照より少なくとも１０％高い、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７６】
前記対照が、前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞上に発現する前記Ｂ細胞受容体以外のリガンドと結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲを含む、請求項１７３〜１７５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７７】
特異性が、前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する細胞傷害性を含む、請求項１６９〜１７６のいずれかに記載の方法。
【請求項１７８】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する前記ＣＡＲＴの細胞傷害性が、％溶解による測定で１０％未満である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する前記ＣＡＲＴの細胞傷害性が、効果対標的比１０：１未満で、前記細胞上に発現するリガンドと結合する対照の前記細胞傷害性より０〜１０％低い、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８０】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する前記ＣＡＲＴの細胞傷害性が、効果対標的比１０：１以上で、前記細胞上に発現するリガンドと結合する対照の前記細胞傷害性より少なくとも１５％低い、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８１】
前記治療によって、対照で治療した対象と比較してサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が軽減する、請求項１６９〜１８０のいずれかに記載の方法。
【請求項１８２】
対象集団のリンパ腫を治療する方法であって、
リンパ腫を有する対象を選択することと、
各対象に各対象のリンパ腫細胞上に発現するＢ細胞受容体に固有の第一のＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を治療有効量投与することと
を含み、
（ｉ）前記第一のＣＡＲが、各対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体と結合する環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、抗原結合ドメインを含み、
（ｉｉ）
（ａ）前記対象のリンパ腫細胞内で発現する前記固有Ｂ細胞受容体を特定すること、
（ｂ）前記固有Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリー由来の第二のＣＡＲとをＴ細胞内で共発現させ、前記ライブラリー内の各ＣＡＲが、前記環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む異なる推定リガンドドメインを含むこと、および
（ｃ）活性化Ｔ細胞を特定することによって前記第一のＣＡＲの前記抗原結合ドメインを特定し、前記Ｂ細胞受容体と前記第二のＣＡＲを発現する前記Ｔ細胞が活性化される場合、前記ＣＡＲのライブラリー由来の前記第二のＣＡＲの前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、前記第一のＣＡＲの前記抗原結合ドメインを含むことによって、前記抗原結合ドメインを特定し、
（ｉｉｉ）前記第一のＣＡＲが、対照よりも高い特異性および／または活性を有する、
方法。
【請求項１８３】
前記対照がＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が発現する前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、Ｂ細胞受容体以外のリガンドと結合する、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記抗原結合ドメインがＣＤ−１９と結合する、請求項１８２または１８３に記載の方法。
【請求項１８６】
前記第一のＣＡＲと前記第二のＣＡＲが同じＣＡＲである、請求項１８２〜１８５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８７】
前記第一のＣＡＲと前記第二のＣＡＲが異なるＣＡＲである、請求項１８２〜１８５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８８】
活性が、対照と比較した前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性を含む、請求項１８２〜１８７のいずれかに記載の方法。
【請求項１８９】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する前記ＣＡＲＴの前記細胞傷害性が、効果対標的比１：１〜１０：１で、％溶解による測定で前記対照より０％〜１０％高い、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する前記ＣＡＲＴの前記細胞傷害性が、エフェクター：標的比１０：１以上で、％溶解による測定で前記対照より少なくとも１０％高い、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記対照が、前記固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞上に発現する前記Ｂ細胞受容体以外のリガンドと結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲを含む、請求項１８８〜１９０のいずれかに記載の方法。
【請求項１９２】
特異性が、前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する細胞傷害性を含む、請求項１８２〜１９１のいずれかに記載の方法。
【請求項１９３】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する前記ＣＡＲＴの細胞傷害性が、％溶解による測定で１０％未満である、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する前記ＣＡＲＴの細胞傷害性が、効果対標的比１０：１未満で、前記細胞上に発現するリガンドと結合する対照の前記細胞傷害性より０〜１０％低い、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９５】
前記固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する前記ＣＡＲＴの細胞傷害性が、エフェクター：標的比１０：１以上で、前記細胞上に発現するリガンドと結合する対照の前記細胞傷害性より少なくとも１５％低い、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９６】
Ｂ細胞リンパ腫に特異的なリガンド、例えばＢ細胞受容体リガンドと結合する個別化抗体を迅速に特定する方法であって、
Ｂ細胞リンパ腫細胞からＢ細胞受容体を特定することと、
前記Ｂ細胞受容体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のライブラリーをコードする核酸分子をＴ細胞集団に与え、前記ライブラリー内の各ＣＡＲが異なる推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むことと、
前記Ｂ細胞受容体と前記ＣＡＲのライブラリーとをＴ細胞内で共発現させることと、
前記Ｔ細胞の活性化を測定し、前記Ｂ細胞受容体と前記ＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、前記ＣＡＲのライブラリー由来のＣＡＲの前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが前記Ｂ細胞受容体のリガンドを含むことと、
活性化Ｔ細胞から前記ＣＡＲをコードする前記核酸分子を単離することと、
前記活性化Ｔ細胞由来の前記ＣＡＲをコードする前記核酸分子の前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインのシーケンシング実施し、
それによりＢ細胞受容体リガンドを特定することと、
を含む、方法。
【請求項１９７】
前記Ｂ細胞受容体リガンドを４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間以内に特定する、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記Ｂ細胞受容体リガンドを３週間以内に特定する、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
患者由来の腫瘍から前記Ｂ細胞リンパ腫細胞を得る、請求項１９６〜１９８のいずれかに記載の方法。
【請求項２００】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、３０アミノ酸以下のポリペプチドを含む、請求項１９６〜１９９のいずれかに記載の方法。
【請求項２０１】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、請求項１９６〜２００のいずれかに記載の方法。
【請求項２０２】
前記推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する、請求項１９６〜２０２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０４】
Ｊｕｎ、ＮＦ−ＫΒ、および／またはＲｅｌの制御下での蛍光タンパク質レポーター遺伝子の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する、請求項１９６〜２０２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０５】
リンパ腫を有する対象を前記前記Ｂ細胞受容体リガンドで治療することをさらに含み、前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療剤と結合している、請求項１９６〜２０４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０６】
対象のリンパ腫を治療する方法であって、
前記対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと、
前記固有Ｂ細胞受容体とファージディスプレイライブラリーとを接触させ、前記ファージディスプレイライブラリーが、ファージと結合した推定固有Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを含むことと、
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと、
前記対象に治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法。
【請求項２０７】
前記推定固有Ｂ細胞受容体リガンドが、ペプチド、環状ペプチド、ペプトイド、環状ペプトイド、多糖、脂質、または小分子を含む、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記固有Ｂ細胞受容体を固体支持体に結合させる、請求項２０６または２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることが、固体支持体と結合した前記固有Ｂ細胞受容体を、前記ファージと結合した推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーで１ラウンドまたは複数のラウンドにわたってパニングすることを含む、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２１０】
前記パニングの各ラウンドがネガティブ選択を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１１】
前記対象がリンパ腫を有することを明らかにする、請求項１９５〜２００のいずれかに記載の方法。
【請求項２１２】
前記対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする、請求項２００に記載の方法。
【請求項２１３】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、
生検試料から細胞を得ることと；
前記細胞からＲＮＡを抽出することと；
抽出した前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと；
前記ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む、請求項１９５〜２００のいずれかに記載の方法。
【請求項２１４】
固有Ｂ細胞受容体を特定することが、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む、請求項１９５〜２０２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１５】
３週間以内で実施する、請求項１９５〜２０３のいずれかに記載の方法。
【請求項２１６】
前記治療剤が放射性同位元素を含む、請求項１９５〜２０４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１７】
治療剤と結合した前記Ｂ細胞受容体リガンドが治療用ＣＡＲを含む、請求項１９５〜２０４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１８】
前記治療剤が化学療法を含む、請求項１９５〜２０４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１９】
前記治療剤が免疫療法を含む、請求項１９５〜２０４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１７年１０月４日に出願されたロシア特許出願第２０１７１３４４８３号、２０１８年４月４日に出願されたロシア特許出願第２０１８１１２００９号、および２０１８年１０月１日に出願されたロシア特許出願第２０１８１３４３２１号の優先権を主張するものであり、上記の各出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる．
【背景技術】
【０００２】
リンパ腫は、免疫系のリンパ細胞の癌である。リンパ腫は通常、リンパ系細胞の固形腫瘍として発現する。これらの悪性細胞は多くの場合、リンパ節に由来し、リンパ節の腫大、すなわち、腫瘍として発現する。リンパ腫は、他の器官にも影響を及ぼすことがあり、この場合、節外性リンパ腫と呼ばれる。節外部位としては、皮膚、脳、腸および骨が挙げられる。リンパ腫はリンパ性白血病とも密接な関係があり、リンパ性白血病もリンパ球に由来するものであるが、通常、それが及ぶ範囲は循環血および骨髄に限られ、静止腫瘍は通常形成しない（Ｐａｒｈａｍ，Ｐ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐ．４１４，２００５）。治療には、化学療法ならびに場合によっては  放射線療法および／または骨髄移植が含まれ、疾患の組織学的特徴、タイプおよびステージによっては治癒が可能なこともある。進行したリンパ腫の症例では抵抗性がみられ、したがって、新規な治療法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、個別化医療を用いてＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法を提供する。より具体的には、この方法は、対象のＢ細胞悪性腫瘍からＢ細胞受容体を単離し、Ｂ細胞受容体に対するリガンドを特定し、次いで、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンド、例えば、Ｂ細胞受容体リガンドが抗原結合ドメインを含むＣＡＲ  Ｔ細胞で対象を治療するものである。
【０００４】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、オートクリンベースのフォーマットを用いて腫瘍に特異的なＢ細胞受容体リガンドを特定するものである。Ｂ細胞受容体リガンドを特定したのち、治療剤と結合したリガンドで患者を治療し得る。診断から治療までの過程全体を短期間で、例えば数週間以内に完了できる。１つの例として、Ｔ細胞内で腫瘍由来のＢ細胞受容体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを共発現させることによってＢ細胞受容体リガンドを特定でき、この場合、ＣＡＲの細胞外ドメインはライブラリー由来のペプチドを含む。ＣＡＲによってＴ細胞が活性化することにより、ＣＡＲの細胞外ドメインがＢ細胞受容体と結合し、ペプチドライブラリー由来のペプチドがＢ細胞受容体リガンドであることがわかる。本明細書では別法として、Ｂ細胞受容体リガンドの特定にファージディスプレイを使用することが企図される。
【０００５】
本開示はまた、ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞、例えば、本明細書に記載されるＢ細胞受容体リガンドを含む抗原結合ドメインを有する、ＣＡＲと；および同じ癌特異抗原またはその癌特異的フラグメント、例えばＢ細胞受容体またはそのフラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む、ワクチンとを投与することによって、癌を治療する方法を提供する。驚くべきことに、癌抗原に特異的なＣＡＲおよびその同じ抗原を対象に投与すると、両者が腫瘍体積の減少に相乗効果を示すことが明らかになった。
【０００６】
一態様では、対象のリンパ腫を治療する方法が本明細書に提供される。この方法は、
対象のリンパ腫細胞に発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと；
固有Ｂ細胞受容体を細胞内で発現させることと；
細胞とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることと；
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと；
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、推定固有Ｂ細胞受容体リガンドは、ペプチド、環状ペプチド、ペプトイド、環状ペプトイド、多糖、脂質、または小分子を含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとをＴ細胞内で共発現させる。いくつかの実施形態では、細胞は、推定固有Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ファージディスプレイによって、固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させる。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ファージと結合した推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を固体支持体に結合させる。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることは、固体支持体と結合した固有Ｂ細胞受容体を、ファージと結合した推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーで１ラウンドまたは複数ラウンドにわたってパニングすることを含む。いくつかの実施形態では、パニングの各ラウンドはネガティブ選択を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記検出方法は、Ｔ細胞の活性化を確認することを含む。
【００１０】
別の態様では、対象のリンパ腫を治療する方法が本明細書に提供される。この方法は、
対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと；
固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを細胞内で共発現させることと；
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと；
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとをＴ細胞内で共発現させる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、推定固有Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記検出方法は、Ｔ細胞の活性化を確認することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、対象にＢ細胞受容体またはそのフラグメントを治療剤と同時に投与する。
【００１５】
別の態様では、Ｂ細胞受容体リガンドを特定する方法が本明細書に提供される。この方法は、
Ｂ細胞受容体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のライブラリーをコードする核酸分子をＴ細胞集団に与え、ライブラリー内の各ＣＡＲが異なる推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むことと；
Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリーとをＴ細胞内で共発現させることと；
Ｔ細胞の活性化を測定し、Ｂ細胞受容体とＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、ＣＡＲのライブラリー由来のＣＡＲの推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインがＢ細胞受容体のリガンドを含むことと；
活性化Ｔ細胞からＣＡＲをコードする核酸分子を単離することと；
活性化Ｔ細胞由来のＣＡＲをコードする核酸分子の推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインのシーケンシングを実施し、
それによりＢ細胞受容体リガンドを特定することと
を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体は癌細胞由来のものである。いくつかの実施形態では、癌細胞はリンパ腫細胞である。いくつかの実施形態では、患者由来の腫瘍からリンパ腫細胞を得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、リンパ腫を有する対象をＢ細胞受容体リガンドで治療することをさらに含み、Ｂ細胞受容体が対象由来の腫瘍に発現するものであり；Ｂ細胞受容体リガンドが治療剤と結合している。
【００１８】
いくつかの実施形態では、対象にＢ細胞受容体またはそのフラグメントを治療剤と同時に投与する。
【００１９】
別の態様では、リンパ腫を治療する方法が本明細書に提供される。この方法は、
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することを含み、
Ｂ細胞受容体リガンドが推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含み、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むＣＡＲが、リンパ腫細胞のＢ細胞受容体と共発現したとき、Ｔ細胞を活性化する。
【００２０】
別の態様では、対象のリンパ腫を治療する方法が本明細書に提供される。この方法は、
対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと；
固有Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリー由来のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをＴ細胞内で共発現させ、ライブラリー内の各ＣＡＲが、異なる推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むことと；
活性化Ｔ細胞を特定することによってＢ細胞受容体リガンドを特定し、Ｂ細胞受容体とＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、ＣＡＲのライブラリー由来のＣＡＲの推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが固有Ｂ細胞受容体のリガンドを含むことと；
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この方法は、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを調製することをさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲのオートクリンベースの活性化によって活性化される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体リガンドを特定することは、活性化Ｔ細胞からＣＡＲをコードする核酸分子を単離することと；活性化Ｔ細胞由来のＣＡＲをコードする核酸分子の推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインのシーケンシングを実施することとをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、対象にＢ細胞受容体またはそのフラグメントを治療剤と同時に投与する。
【００２５】
別の態様では、対象のリンパ腫を治療する方法であって、
対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと；
固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを細胞内で共発現させることと；
推定固有Ｂ細胞受容体リガンドが固有Ｂ細胞受容体と相互作用する場合、それが固有Ｂ細胞受容体リガンドであるとする、検出方法によって、前記固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと；
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法が本明細書に提供される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとをＴ細胞内で共発現させる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、細胞は、推定固有Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記検出方法は、Ｔ細胞の活性化を確認することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、対象にＢ細胞受容体またはそのフラグメントを治療剤と同時に投与する。
【００３０】
別の態様では、対象のリンパ腫を治療する方法であって、対象に第一のＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を治療有効量投与することを含み、
（ｉ）第一のＣＡＲが、対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体と結合する環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、抗原結合ドメインを含み、
（ｉｉ）
（ａ）対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定すること；
（ｂ）固有Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリー由来の第二のＣＡＲとをＴ細胞内で共発現させ、ライブラリー内の各ＣＡＲが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む異なる推定リガンドドメインを含むこと；および
（ｃ）活性化Ｔ細胞を特定することによって第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを特定し、Ｂ細胞受容体と第二のＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、ＣＡＲのライブラリー由来の第二のＣＡＲの推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを含むことによって、抗原結合ドメインを特定し；
（ｉｉｉ）第一のＣＡＲが、対照よりも高い特異性および／または活性を有する、
方法が本明細書に提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、対照はＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞が発現するＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞受容体以外のリガンドと結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインはＣＤ−１９と結合する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、第一のＣＡＲと第二のＣＡＲは同じＣＡＲである。いくつかの実施形態では、第一のＣＡＲと第二のＣＡＲは異なるＣＡＲである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、活性は、対照と比較した固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、効果対標的比１：１〜１０：１で、％溶解による測定で対照より０％〜１０％高い。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、エフェクター：標的比１０：１以上で、％溶解による測定で対照より少なくとも１０％高い。
【００３４】
いくつかの実施形態では、対照は、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞上に発現するＢ細胞受容体以外のリガンドと結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、特異性は、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、％溶解による測定で１０％未満である。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、効果対標的比１０：１未満で、細胞上に発現するリガンドと結合する対照の細胞傷害性より０〜１０％低い。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、効果対標的比１０：１以上で、細胞上に発現するリガンドと結合する対照の細胞傷害性より少なくとも１５％低い。
【００３６】
いくつかの実施形態では、対象にＢ細胞受容体またはそのフラグメントを治療剤と同時に投与する。
【００３７】
別の態様では、対象集団のリンパ腫を治療する方法であって、
リンパ腫を有する対象を選択することと；
各対象に各対象のリンパ腫細胞上に発現するＢ細胞受容体に固有の第一のＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を治療有効量投与することと
を含み、
（ｉ）第一のＣＡＲが、各対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体と結合する環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、抗原結合ドメインを含み、
（ｉｉ）
（ａ）対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定すること；
（ｂ）固有Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリー由来の第二のＣＡＲとをＴ細胞内で発現させ、ライブラリー内の各ＣＡＲが、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む異なる推定リガンドドメインを含むこと；および
（ｃ）活性化Ｔ細胞を特定することによって第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを特定し、Ｂ細胞受容体と第二のＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、ＣＡＲのライブラリー由来の第二のＣＡＲの推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが、第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを含むことによって、抗原結合ドメインを特定し；
（ｉｉｉ）第一のＣＡＲが、対照よりも高い特異性および／または活性を有する、
方法が本明細書に提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、対照はＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞が発現するＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞受容体以外のリガンドと結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインはＣＤ−１９と結合する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、第一のＣＡＲと第二のＣＡＲは同じＣＡＲである。いくつかの実施形態では、第一のＣＡＲと第二のＣＡＲは異なるＣＡＲである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、活性は、対照と比較した固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、エフェクター：標的比１：１〜１０：１で、％溶解による測定で対照より０％〜１０％高い。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、効果対標的比１０：１以上で、％溶解による測定で対照より少なくとも１０％高い。
【００４１】
いくつかの実施形態では、対照は、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞上に発現するＢ細胞受容体以外のリガンドと結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、特異性は、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、％溶解による測定で１０％未満である。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、効果対標的比１０：１未満で、細胞上に発現するリガンドと結合する対照の細胞傷害性より０〜１０％低い。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対するＣＡＲＴの細胞傷害性は、効果対標的比１０：１以上で、細胞上に発現するとリガンドと結合する対照の細胞傷害性より少なくとも１５％低い。
【００４３】
別の態様では、Ｂ細胞リンパ腫に特異的なリガンド、例えばＢ細胞受容体リガンドと結合する個別化抗体を迅速に特定する方法であって、
Ｂ細胞リンパ腫細胞からＢ細胞受容体を特定することと、
Ｂ細胞受容体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のライブラリーをコードする核酸分子をＴ細胞の集団に与え、ライブラリー内の各ＣＡＲが異なる推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むことと；
Ｂ細胞受容体とＣＡＲのライブラリーとをＴ細胞内で共発現させることと；
Ｔ細胞の活性化を測定し、Ｂ細胞受容体とＣＡＲを発現するＴ細胞が活性化される場合、ＣＡＲのライブラリー由来のＣＡＲの推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインがＢ細胞受容体のリガンドを含むことと；
活性化Ｔ細胞からＣＡＲをコードする核酸分子を単離することと；
活性化Ｔ細胞由来のＣＡＲをコードする核酸分子の推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインのシーケンシングを実施し；
それによりＢ細胞受容体リガンドを特定することと
を含む、方法が本明細書に提供される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体リガンドを４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間以内に特定する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体リガンドを３週間以内に特定する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、患者由来の腫瘍からＢ細胞リンパ腫細胞を得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、３０アミノ酸以下のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、Ｆｃ領域をさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する。いくつかの実施形態では、Ｊｕｎ、ＮＦ−Β、および／またはＲｅｌの制御下での蛍光タンパク質レポーター遺伝子の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、この方法は、リンパ腫を有する対象をＢ細胞受容体リガンドで治療することをさらに含み、Ｂ細胞受容体リガンドが治療剤と結合している。
【００４９】
別の態様では、
環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内領域と
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書に提供される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲがＢ細胞受容体と共発現したとき、Ｔ細胞を活性化し、Ｂ細胞受容体のＢ細胞受容体リガンドが、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体リガンドは、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００５１】
別の態様では、対象のリンパ腫を治療する方法であって、
対象のリンパ腫細胞内で発現する固有Ｂ細胞受容体を特定することと；
固有Ｂ細胞受容体とファージディスプレイライブラリーとを接触させ、ファージディスプレイライブラリーが、ファージと結合した推定固有Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを含むことと；
前記固有Ｂ細胞受容体と推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定することと；
対象に治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを治療有効量投与することと
を含む、方法が本明細書に提供される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、推定固有Ｂ細胞受容体リガンドは、ペプチド、環状ペプチド、ペプトイド、環状ペプトイド、多糖、脂質、または小分子を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を固体支持体に結合させる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体とライブラリー由来の推定固有Ｂ細胞受容体リガンドとを接触させることは、固体支持体と結合した固有Ｂ細胞受容体を、ファージと結合した推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーで１ラウンドまたは複数ラウンドにわたってパニングすることを含む。いくつかの実施形態では、パニングの各ラウンドはネガティブ選択を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、対象がリンパ腫を有することを明らかにする。
【００５６】
いくつかの実施形態では、対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする。
【００５７】
いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を特定することは、
生検試料から細胞を得ることと；
細胞からＲＮＡを抽出することと；
抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと；
ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することと
を含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を特定することは、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、この方法を３週間以内で実施する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、治療剤は放射性同位元素を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドは治療用ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、治療剤は化学療法を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は免疫療法を含む。
【００６１】
別の態様では、対象の癌を治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ発現Ｔ細胞と；癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む、ワクチンとを同時に投与することを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは核酸は、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、またはそのフラグメントを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原は、癌内で発現し、体細胞変異を含む。いくつかの実施形態では、対象の非癌細胞は体細胞変異を有さない。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、読み過ごし変異、または遺伝子融合変異である。いくつかの実施形態では、体細胞変異は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＥＡ、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ、ＣＤ１２３、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＦＲａ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、５Ｔ４、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＡＣＶＲ２Ｂ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＵＣ１、またはＭＵＣ１６の変異を含む。いくつかの実施形態では、癌は腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは核酸は体細胞変異を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、対象に同時投与を少なくとも２回，少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞をワクチンの前に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞をワクチンの後に投与する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、この方法は、対象の癌特異抗原を特定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原を特定することは、（ｉ）対象から癌細胞を得ることと；（ｉｉ）細胞からＤＮＡを抽出することと；（ｉｉｉ）ＤＮＡのシーケンシングを実施することとを含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原を特定することは、癌細胞から得たＤＮＡ配列と、非癌細胞から得た同じ遺伝子のＤＮＡ配列とを比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを腫瘍細胞から単離する。いくつかの実施形態では、癌特異抗原は、対象の循環血中無細胞ＤＮＡの単離とシーケンシングとを含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原を特定することは、（ｉ）対象から癌細胞を得ることと；（ｉｉ）細胞からＲＮＡを抽出することと；（ｉｉｉ）抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと；（ｉｖ）ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することとを含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原を特定することは、癌細胞から得たｃＤＮＡ配列と、非癌細胞から得た同じ遺伝子のｃＤＮＡ配列とを比較することをさらに含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、重複配列を有し、それぞれが癌特異抗原のフラグメントを発現する、２つ以上のポリペプチドを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを特定すること；および（ｉｉ）抗原結合ドメインを含むＣＡＲをＴ細胞内で発現させることによって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を準備することをさらに含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをＫＬＨとコンジュゲートする。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ワクチンを静脈内投与、腹腔内投与、経粘膜投与、経口投与、皮下投与、経肺投与、鼻腔内投与、真皮内投与、または筋肉内投与によって投与する。いくつかの実施形態では、ワクチンを腫瘍内に投与する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を静脈内投与によって投与する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＴＬＲ９アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原は０Ｘ４０である。
【００７２】
別の態様では、対象の癌を治療する組成物であって、ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と；癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸とを含む、組成物が本明細書に提供される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは核酸は、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、またはそのフラグメントを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原は、癌内で発現し、体細胞変異を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、対象の非癌細胞は体細胞変異を有さない。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、読み過ごし変異、または遺伝子融合変異である。いくつかの実施形態では、体細胞変異は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＥＡ、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ、ＣＤ１２３、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＦＲａ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、５Ｔ４、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＡＣＶＲ２Ｂ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＵＣ１、またはＭＵＣ１６の変異を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは核酸は体細胞変異を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、重複配列を有し、それぞれが癌特異抗原のフラグメントを発現する、２つ以上のポリペプチドを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをＫＬＨとコンジュゲートする。
【００７８】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＴＬＲ９アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原は０Ｘ４０である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、および／またはＣＤ１５４を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲは、細胞内領域を含む。いくつかの実施形態では、細胞内領域は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ２５／ＣＤ１８）、４−２９Ｂ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４２３、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１２９、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、３０４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１２３、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるＣＡＲは、ヒンジドメインを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、治療剤は放射性同位元素を含む。いくつかの実施形態では、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドは治療用ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、治療剤は化学療法を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は免疫療法を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を特定することは、：生検試料から細胞を得ることと；細胞からＲＮＡを抽出することと；抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと；ｃＤＮＡのシーケンシングを実施することとを含む。いくつかの実施形態では、固有Ｂ細胞受容体を特定することは、循環血中無細胞ＤＮＡのクローニングとシーケンシングとを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、３０アミノ酸以下のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、環状ペプチドライブラリー由来のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、Ｆｃ領域をさらに含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する。いくつかの実施形態では、Ｊｕｎ、ＮＦ−Β、および／またはＲｅｌの制御下での蛍光タンパク質レポーター遺伝子の発現増大によってＴ細胞活性化を測定する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、この方法を３週間以内で実施する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、対象がリンパ腫を有することを明らかにする。いくつかの実施形態では、対象がリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）を有することを明らかにする。
【００８８】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の態様をさらに明らかにするために含まれるものであり、１つまたは複数のこれらの図面を本明細書に示される具体的な実施形態の詳細な説明と併せて参照することによって理解を深めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】個別化濾胞性リンパ腫ＣＡＲ−Ｔ療法のためのリガンドを選択するワークフローを示す模式図である。濾胞性リンパ腫を有する患者由来のリンパ節生検試料を単離し、収集した腫瘍細胞を用いて悪性ＢＣＲ遺伝子を特定した後、それらを膜アンカーにＰＤＧＦＲを用いて膜結合型ＢＣＲとして再構成する。Ｊｕｒｋａｔ細胞系の表面に環状ペプチド−ＣＡＲライブラリーと共発現させた再構成悪性ＢＣＲを腫瘍細胞標的化リガンド選択のためのレポーター細胞システムとして使用する。数ラウンドのパニングの後、キメラ抗原受容体と融合した選択されたペプチドリガンドのシーケンシングを実施し、直ちに、腫瘍特異的ＣＡＲによって改変された治療用Ｔリンパ球の作製に使用し得る。配列は、上から下へ配列番号３１および３２に対応する。
【図２Ａ−２Ｃ】悪性ＦＬ−ＢＣＲリガンドのオートクリンベースの選択を示す図である。図２Ａはレポーターシステムフォーマットを示す。図２Ｂは、Ｍｙｃ−ＣＡＲ／抗Ｍｙｃ抗体ペアの相互作用によるレポーター細胞アッセイの妥当性を示すフローサイトメトリーのデータである。図２Ｃは、ＣＡＲ上の患者ＢＣＲ特異的ペプチドが、膜係留型濾胞性リンパ腫ＢＣＲによって形質導入したレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を活性化することを示す。
【図３Ａ−３Ｄ】選択されたペプチドリガンドがＦＬ−ＢＣＲと特異的に相互作用し、腫瘍細胞を死滅させるようＣＴＬを再び方向付けることを示すグラフである。図３Ａは、選択された環状ペプチドＣＩＬＤＬＰＫＦＣ（ＦＬ１）（配列番号１）、ＣＭＰＨＷＱＮＨＣ（ＦＬ２）（配列番号２）、およびＣＴＴＤＱＡＲＫＣ（ＦＬ３）（配列番号３）と、悪性ＢＣＲとの相互作用のＳＰＲ解析を示す、一連のヒストグラムである。リンパ腫ＢＣＲ  ｓｃＦｖを形質導入したＲａｊｉ細胞の合成ビオチン化ペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃに対する抗体による表面染色。ＩｇＧ  Ｆｃ染色には、同じＲａｊｉ細胞集団のフローサイトメトリーの結果を３つのヒストグラムの対照として用いた。図３Ｂは、％細胞溶解を示す一連のグラフである。ＦＬ−ＣＡＲＴと、様々なリンパ腫ＢＣＲを形質導入したＲａｊｉ細胞とを共培養した。偽形質導入Ｔ細胞およびＣＤ１９−ＣＡＲＴを比較に用いた。６時間後の乳酸デヒドロゲナーゼ放出を測定することによって、細胞傷害性を明らかにした。図３Ｃは、患者生検試料由来の細胞または対照Ｂ細胞が合成ビオチン化ＦＬ１ペプチドで染色されたことを示す。Ｂ２２０特異的抗体によりＢ細胞集団を特定し、ＦＬ１ペプチドをビオチンで標識し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンで検出した。図３Ｄは、ＦＬ１−ＣＡＲＴによるリンパ腫生検試料由来Ｂ細胞の溶解をＭｙｃ−ＣＡＲＴおよび偽形質導入Ｔ細胞と比較して示すグラフである。
【図４Ａ−４Ｆ】ＦＬ１−ＣＡＲによって再方向付けされたＣＴＬが、ｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ腫形成を抑制することを示す図である。図４Ａは、Ｒａｊｉ−ＦＬ１細胞５×１０６個のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスへの移植を示す実験計画を示す模式図である。第１５日に、マウス（１グループ当たり１２匹）を腫瘍体積に従って無作為化し、第１７日に、ＦＬ１−ＣＡＲＴ、ＣＤ１９−ＣＡＲ、またはＭｙｃ−ＣＡＲＴをマウス１匹当たり３×１０６個ｉ．ｖ．投与した。図４Ｂは、活性化し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで拡大したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＦＬ１−ＣＡＲ、Ｍｙｃ−ＣＡＲ、およびＣＤ１９−ＣＡＲ構築物を発現するレンチウイルスベースのベクターの形質導入の効果を示す、一連のグラフである。細胞をＩｇＧ１特異的抗体またはプロテインＬで染色した。図４Ｃは、Ｒａｊｉ−ＦＬを異種移植し、腫瘍注射後第１７日にＣＴＬ  ３×１０６個で治療したマウス（１グループ当たりのマウスｎ＝１２）の生存率を示すグラフである。カプラン・マイヤー法を用いて全生存率曲線をプロットし、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定（＊ｐ＜０．０１）を用いて比較した。図４Ｄは、Ｒａｊｉ−ＦＬ１注射後第１７日にＦＬ１−ＣＡＲＴ、ＣＤ１９−ＣＡＲＴ、またはＭｙｃ−ＣＡＲＴを３×１０６個ｉ．ｖ．投与することによって治療したマウスのグループ（ｎ＝１２）の腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＤ３＋特異的抗体によるフローサイトメトリー解析によって、後眼窩穿刺により採取した血液中の養子移入改変Ｔ細胞の絶対カウント数をモニターした（挿入図）。図４Ｅは、注射前および注射後第２１日のＦＬ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞表現型のフローサイトメトリー解析を示す。図４Ｆは、注射後第２１日のナイーブＣＡＲＴ、中枢記憶ＣＡＲＴ、およびエフェクター記憶ＣＡＲＴの相対的割合を示す。
【図５Ａ−５Ｃ】再構成悪性ＢＣＲの構造およびコンビナトリアル環状ペプチドライブラリーを示す図である。図５Ａは、キメラ抗原受容体シグナル伝達ドメインと融合したコンビナトリアル環状ペプチドライブラリーのアミノ酸配列を示す。配列は配列番号３３に対応する。図５Ｂは、ＩｇＧ１  Ｆｃヒンジおよび膜貫通ＰＤＧＦＲドメインと融合した再構成悪性ＢＣＲを示す。配列は配列番号３４に対応する。図５Ｃは分泌型分子の略図を示す。
【図６】ＦＬ−ＣＡＲＴが外来リンパ腫ＢＣＲのないＲａｊｉ細胞は除去しないことを示す図である。ＣＤ−１９  ＣＡＲＴだけが通常のＲａｊｉ細胞に殺作用を示した。ＦＬ  １−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＦＬ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、およびＦＬ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞とインキュベートしたところ、最小限の非特異的溶解が観察された。６時間後の乳酸デヒドロゲナーゼ放出を測定することによって、細胞傷害性を明らかにした。
【図７Ａ−７Ｃ】ＦＬ１−ＣＡＲによって再方向付けされたＣＴＬが、固形腫瘍に浸潤し、異種移植の転移を抑制することを示す図である。図７Ａは、ＣＤ１９−ＣＡＲＴ、ＦＬ１−ＣＡＲＴ、およびＭｙｃ−ＣＡＲＴにより治療したマウスにおける腫瘍移植後第３５日のＲａｊｉ−ＦＬ１細胞（緑色、矢印によって示されている）の器官特異的転移の生物発光撮像を示す。Ｒａｊｉ−ＦＬ１細胞の検出には、マウスにＤ−ルシフェリンのｉ．ｐ．注射を実施した。図７Ｂは、ＣＤ１９−ＣＡＲＴ、ＦＬ１−ＣＡＲＴ、またはＭｙｃ−ＣＡＲＴで治療した個体の腫瘍における組織病理学的変化の解析を示す。組織病理学的変化の確認には、腫瘍をヘマトキシリン−エオシンで染色した。好塩基性細胞質を有し、有糸分裂速度の速いリンパ腫Ｂ細胞が、右パネルの黒矢印で示されている。細胞残屑を含み、特徴的な「星空」の外観を呈するマクロファージが、右パネルの赤矢印で示されている。アポトーシスの状態にあると考えられる細胞が、左パネルの矢印で示されている。図７Ｃは、ＣＤ１９−ＣＡＲＴ、ＦＬ１−ＣＡＲＴ、またはＭｙｃ−ＣＡＲＴの腫瘍への浸潤（黒矢印）に関する免疫組織化学的解析を示す。ヒトＣＤ８特異的抗体をＣＡＲＴ染色に用いた。
【図８Ａ−８Ｅ】悪性Ｂ細胞受容体が自己抗原ミオフェルリンを認識することを示す図である。図８Ａは、ミオフェルリンによる自己反応性リンパ腫形成の略図を示す。図８Ｂは、ＦＬ患者１の生検試料のｂｃｌ−２再編成のＰＣＲ解析を示す。可溶性悪性ＢＣＲによるＨＥｐ−２細胞（図８Ｃ）およびミオフェルリン発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図８Ｄ）の染色が示されている。図８Ｅに示されているのは、特定された悪性特異的ペプチドＦＬ１と、タンパク質ミオフェルリンならびにストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）およびニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）由来の表面タンパク質のアミノ酸配列のアライメントである。配列は、上から下へ配列番号１、３５、３６、および３７に対応する。
【図９】移植後の様々な時点でのＰＢＭＣのリンパ系ゲート中のｈＣＤ４５＋リンパ球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合を示す図である。
【図１０】移植後の様々な時点でのＰＢＭＣ中のＣＤ４＋ヒトＴ細胞サブセットおよびＣＤ８＋ヒトＴ細胞サブセットの割合を示す図である。
【図１１】移植後の様々な時点でのヒト化マウス血漿中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを示す図である。
【図１２】実験群の腫瘍成長速度を示す図である。
【図１３】第３８日のＣＡＲ  Ｔ細胞の量を示す図である。
【図１４】ＰＢＭＣのリンパ系ゲート中のｈＣＤ４５＋リンパ球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合を示す図である。
【図１５】ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋ヒトＴ細胞サブセットおよびＣＤ８＋ヒトＴ細胞サブセットの割合を示す図である。
【図１６】移植後の様々な時点でのマウス血漿中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを示す図である。
【図１７】ＣＡＲ  Ｔレンチウイルスベクターを示す図である。
【図１８】実験群の腫瘍成長速度を示す図である。
【図１９】実施例３で用いたＰｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔに使用したシステインと隣接するＮＫコード部分を示す図である。配列は、上から下へ配列番号３８、３９、および４０に対応する。
【図２０】実施例３に記載される患者ＦＬ１のＢＣＲに対するＩ〜ＩＩＩラウンドのパニングで得られたファージと、患者ＦＬ１およびＦＬ５のＢＣＲとの結合に関するＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ファージ濃度は、示される各抗体のパニングの各ラウンドについて、左から右へ５ｍｋ／ウェル、２．５ｍｋ／ウェル、１．２５ｍｋ／ウェル、０．６３ｍｋ／ウェル、および０．３１ｍｋ／ウェルである。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本開示は、個別化医療を用いてＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法を提供する。より具体的には、この方法は、対象のＢ細胞悪性腫瘍からＢ細胞受容体を単離し、Ｂ細胞受容体に対するリガンドを特定し、次いで、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンド、例えば、Ｂ細胞受容体リガンドが抗原結合ドメインを含むＣＡＲ  Ｔ細胞で対象を治療するものである。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、オートクリンベースのフォーマットを用いて腫瘍に特異的なＢ細胞受容体リガンドを特定するものである。Ｂ細胞受容体と推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーとを共発現させることにより、Ｂ細胞受容体リガンドをそのＢ細胞受容体との結合によって特定できる。別法として、Ｂ細胞受容体リガンドをファージディスプレイによって特定できる。Ｂ細胞受容体リガンドは、Ｂ細胞受容体と結合することによって治療剤をＢ細胞悪性腫瘍に標的化できるため、治療剤と結合させると効果的な治療剤となり得る。Ｂ細胞腫瘍は、腫瘍の全細胞に存在し、かつ腫瘍の細胞のみに存在するＢ細胞受容体を有する、クローン集団であるため、本明細書に記載される方法は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に特に有用である。このことにより、オフターゲット効果が全くない、またはほとんどない個別化治療標的の特定が可能になる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、オートクリンシグナル伝達を用いるものである。したがって、本明細書に記載される方法は、オートクリンシグナル伝達を利用して、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する新規な治療剤を特定するものである。本明細書で使用される「オートクリンシグナル伝達」は細胞シグナル伝達の一形態を指し、この細胞シグナル伝達では、細胞がホルモンまたは化学メッセンジャー、例えば、その同じ細胞上にあるオートクリン受容体、例えばＢ細胞受容体と結合する抗原を分泌して、細胞に変化を引き起こす。
【００９２】
１つの例として、腫瘍由来のＢ細胞受容体とＣＡＲとをＴ細胞内で共発現させることによってＢ細胞受容体リガンドを特定でき、この場合、ＣＡＲの細胞外ドメインはコンビナトリアルペプチドライブラリー由来のペプチドを含む。ＣＡＲによってＴ細胞が活性化することにより、ＣＡＲの細胞外ドメインがＢ細胞受容体と結合し、ペプチドライブラリー由来のペプチドがＢ細胞リガンドであることがわかる。
【００９３】
Ｂ細胞受容体リガンドを特定したのち、治療剤と結合したリガンドで患者を治療しうる。治療剤は、化学療法薬、免疫療法、または放射性同位元素を含み得る。Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲは、治療剤を含み得る。ＣＡＲは、Ｂ細胞受容体リガンドの特定に使用したものと同じＣＡＲであってよく、それにより特に、迅速な個別化治療標的の特定および個別化医薬の合成が可能になる。
【００９４】
診断から治療までの過程全体を短期間で、例えば数週間以内に完了できる。
【００９５】
本開示はまた、ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞；および同じ癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む、ワクチンを投与することによって癌を治療する方法を提供する。驚くべきことに、癌抗原に特異的なＣＡＲおよびその同じ抗原を対象に投与すると、両者が腫瘍体積の減少に相乗効果を示すことが明らかになった。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、推定Ｂ細胞受容体リガンドを有するＣＡＲを含み、ワクチンは、Ｂ細胞受容体のフラグメントまたは全体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、癌細胞に特異的な抗原に対する抗体フラグメントを含み、ワクチンは、その同じ抗原のフラグメントまたは全体を含む。
【００９７】
Ｂ細胞受容体
Ｂ細胞受容体またはＢＣＲは、Ｂ細胞の外表面に存在する膜貫通受容体タンパク質である。受容体の結合部分は、あらゆる抗体と同じように、Ｖ（Ｄ）Ｊの組換えによって生じ、無作為に決定される固有の抗原結合部位を有する、膜結合抗体からなる。Ｂ細胞が、その受容体と結合する抗原（その「コグネイト抗原」）と初めて遭遇することによって活性化されると、細胞が増殖および分化して、抗体を分泌する血漿Ｂ細胞および記憶Ｂ細胞の集団が生じる。
【００９８】
ＢＣＲによって抗原が認識されると、ＢＣＲが膜貫通タンパク質であるＣＤ７９と複合体を形成し、シグナルを発生する。ＣＤ７９は２つの異なる鎖、ＣＤ７９ＡとＣＤ７９Ｂとからなり、この鎖が、Ｂ細胞上にジスルフィド結合によって安定化したヘテロ二量体を形成する。ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂはともに免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ７９は両鎖とも、細胞内尾部に免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）が含まれており、Ｔ細胞上でＴ細胞受容体が活性化したときにみられるＣＤ３生成シグナル伝達と同じように、そのＩＴＡＭを用いてＢ細胞内にシグナルを伝搬する。
【００９９】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）と軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）とを含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域と２つの軽（Ｌ）鎖可変領域とを含む。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびそのサブタイプ）の構造的特徴を有し得る。
【０１００】
ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれ、これより保存度が高く「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる領域が散在する、超可変性の領域に細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲については正確に定義されており（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７のほか、ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋも参照されたい）。本明細書ではＫａｂａｔの定義を用いる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ通常、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。
【０１０１】
抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖はさらに、重鎖定常領域または軽鎖定常領域を含み、それにより免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖をそれぞれ形成し得る。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖が、例えばジスルフィド結合によって、互いに連結している。ＩｇＧでは、重鎖定常領域は３つの免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。
【０１０２】
Ｂ細胞悪性腫瘍は、大部分の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、一部の白血病および骨髄腫を含めた多様な疾患群である。例としては、慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫が挙げられる。Ｂ細胞悪性腫瘍は、低悪性度のものまたは高悪性度のものとして特徴付けることができる。濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、および辺縁帯リンパ腫などの低悪性度悪性腫瘍は、成長速度が遅く、初期奏効率が高く、のちに再発性で進行性の疾患過程をたどることを特徴とする。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、およびバーキットリンパ腫などの高悪性度リンパ腫は、成長速度が速く、初期奏効率が低く、全生存期間（ＯＳ）が短いことを特徴とする。
【０１０３】
Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞のクローン集団であることを特徴とする。Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞のクローン集団であることから、癌細胞集団、例えば腫瘍内の癌細胞はそれぞれ同じＢ細胞受容体を有する。したがって、癌細胞上のＢ細胞受容体は、ＢＣＲのリガンド（または「抗原」）が標的とし得る腫瘍特異的抗原である。
【０１０４】
したがって、ＢＣＲリガンドを特定する方法が本明細書に開示される。ＢＣＲリガンドを特定したのち、これを例えば、癌治療として用いることができる。ＢＣＲとＢＣＲリガンドとの間の相互作用を介して治療剤を癌細胞に標的化できる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば癌細胞に発現するＢ細胞受容体を特定または準備することを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体を特定または準備することは、対象から試料を取得することを含む。いくつかの実施形態では、試料は体液試料、例えば血液である。いくつかの実施形態では、試料は組織試料である。いくつかの実施形態では、試料は、例えば腫瘍試料または生検試料を含む。いくつかの実施形態では、生検試料はリンパ節生検試料である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、試料は、癌を有するか、癌を有することが疑われる患者に由来するものである。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺＬ）または粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性中枢神経系リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫から選択される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、対象が本明細書に記載されるいずれかの癌を有することを明らかにする。いくつかの実施形態では、対象がＢ細胞悪性腫瘍を有することを明らかにする。いくつかの実施形態では、対象がリンパ腫を有することを明らかにする。いくつかの実施形態では、対象が癌、例えばＢ細胞悪性腫瘍および／またはリンパ腫に関連する１つまたは複数の一塩基多型を有することを明らかにする。本明細書で使用される「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、ある生物種のメンバー間または個体の染色体対の間でゲノム（またはその他の共通配列）内の単一のヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧが異なるときにみられる、ＤＮＡ配列のばらつきを指す。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体を特定または準備することは、試料の細胞からＲＮＡを抽出することを含む。細胞からＲＮＡを抽出する方法については当業者に周知であり、例えば、フェノール／クロロホルムベースの抽出法またはＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ社）が挙げられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体を特定または準備することは、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを含む。ｃＤＮＡを作製する方法については当業者に周知であり、逆転写酵素によるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ形成がこれに含まれる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体を特定または準備することは、ｃＤＮＡのシーケンシングを含む。実施するシーケンシングのタイプは、例えば、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、イオントレントシーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤ（商標））、および鎖停止シーケンシング（例えば、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング）であり得る。シーケンシング法については当該技術分野で公知であり、市販されている（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｕｈｌｅｎ，Ｍ；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ（１９９８）．“Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７５）：３６３；ａｎｄ  Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ，Ｓ；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ；Ｕｈｌｅｎ，Ｍ；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ（１９９６）．“Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ”．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４２（１）：８４−９．；ならびにＲｏｃｈｅ社（４５４プラットフォーム）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（ＨｉＳｅｑおよびＭｉＳｅｑシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ＰＡＣＢＩＯ  ＲＳＩＩ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）システムおよびＳＯＬｉＤ（商標）システム）から利用可能なサービスおよび製品を参照されたい）。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、Ｂ細胞受容体を発現ベクターにクローニングし、Ｔ細胞内でＢ細胞受容体を発現させる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ベクター、例えばｐＣｏｍｂ３Ｘベクターを用いて、Ｂ細胞受容体をｓｃＦｖフォーマットにクローニングする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ形態のＢ細胞受容体をベクターにクローニングし、可変領域が細胞膜内にあり、結合部位が溶媒に面している二量体として抗体分子を発現させる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ形態のＢ細胞受容体をリンカーが含まれるベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、リンカーは、血小板由来成長因子受容体の膜貫通ドメインに対する柔軟なリンカーである。いくつかの実施形態では、ベクターは抗体の定常ドメイン、例えばＦｃ、例えばＩｇＧ１  Ｆｃをさらに含む。
【０１１４】
Ｂ細胞受容体リガンドの特定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、Ｂ細胞受容体リガンドを特定することを含む。Ｂ細胞受容体を特定したのち、Ｂ細胞受容体を推定Ｂ細胞受容体リガンド、例えば推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーと接触させることによって、Ｂ細胞受容体のリガンドを特定する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞、例えばＴ細胞内でＢ細胞受容体と推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーとを共発現させ、Ｂ細胞受容体と推定Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定するものである。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、結合を検出することは、Ｂ細胞受容体シグナル伝達のレベルを測定することを含む。例えばＢ細胞内で、Ｂ細胞受容体と推定Ｂ細胞受容体リガンドをともに発現させる場合、推定Ｂ細胞受容体リガンドがＢ細胞受容体のリガンドであれば、Ｂ細胞受容体の結合によってシグナル伝達カスケードが開始する。いくつかの実施形態では、結合を検出することは、ＢＣＲシグナル伝達によって調節される遺伝子の発現を測定することを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、Ｂ細胞受容体と、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含むＣＡＲのライブラリーとをＴ細胞内で共発現させ、ＣＡＲによるＴ細胞の活性化を確認することによってＢ細胞受容体と推定Ｂ細胞受容体リガンドとの結合を検出し、それにより固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定するものである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞にＢ細胞受容体とＣＡＲをコードする核酸を形質導入またはトランスフェクトし、一定時間が経過した後、Ｔ細胞活性化を測定する。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクションの２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、１６時間後もしくは２０時間後、または１日後、１．５日後、２日後、２．５日後、３日後、３．５日後、４日後、４．５日後もしくは５日後、例えば、形質導入またはトランスフェクションの２日後にＴ細胞活性化を測定する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体とＣＡＲとを共発現させることは、Ｂ細胞受容体とＣＡＲをコードする核酸を形質導入またはトランスフェクトしたＴ細胞を培地で培養することを含む。Ｔ細胞を培養する培地については当業者に周知である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ培地で培養する。いくつかの実施形態では、培地にＦＢＳ、例えば５〜２０％ＦＢＳ、例えば１０％ＦＢＳを添加する。いくつかの実施形態では、培地にＨＥＰＥＳ、例えば１〜１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、例えば１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加する。いくつかの実施形態では、培地にペニシリン、例えば１０〜５００Ｕ／ｍｌペニシリン、例えば１００Ｕ／ｍｌペニシリンを添加する。いくつかの実施形態では、培地にストレプトマイシン、例えば１０〜５００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、例えば１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加する。いくつかの実施形態では、培地にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、例えば０．１〜１０ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、例えば２ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを添加する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化のレベルを測定することは、活性化Ｔ細胞内で発現した遺伝子の核酸またはタンパク質のレベルを測定することを含む。Ｔ細胞が活性化されるときにダウンレギュレートされる遺伝子の例としては、例えば、Ｌ−セレクチン、ＣＤ１２７、およびＢＣＬ−２が挙げられる。Ｔ細胞が活性化されるときにダウンレギュレートされる遺伝子の例としては、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、Ｋｉ６７、およびＫＬＲＧ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が活性化されると転写を活性化する転写因子の制御下に蛍光タンパク質レポーター遺伝子を含み、活性化を測定することは、産生された蛍光タンパク質の量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、Ｊｕｎ、ＮＦ−ΚΒ、またはＲｅｌである。
【０１２１】
ＲＮＡまたはタンパク質のレベルで遺伝子発現を測定できる。ＲＮＡを検出するアッセイとしては、特に限定されないが、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、シーケンシング技術、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて、試料中に存在するＲＮＡ分子をハイブリダイズさせる）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３，１７：６８３−９０；Ｋｏｍｍｉｎｏｔｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．１９９４，１９０：１０１７−２５に記載されているもの）、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（例えば、試料に由来するポリヌクレオチド配列と、固体表面（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、サンタクララ、カリフォルニア州）などのアドレス可能な場所を有するガラスウエハ）に結合させたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによるもの）が挙げられる。
【０１２２】
タンパク質レベルを検出するアッセイとしては、特に限定されないが、イムノアッセイ（本明細書では免疫ベースまたはイムノベースのアッセイと呼ぶ、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、近接伸長（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイ、およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）、質量分析、およびマルチプレックスビーズアッセイが挙げられる。タンパク質の検出法および定量法の他の例としては、例えば米国特許第６９３９７２０号および同第８１４８１７１号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０２５５７６６号に記載されている多重化イムノアッセイ、ならびに例えば米国特許出願公開第２００９／００８８３２９号に記載されているタンパク質マイクロアレイが挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞を特定したのち、Ｔ細胞内で発現するＣＡＲを特定する。したがって、いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞を特定するプロトコルにより、活性化Ｔ細胞を特定し、未活性化Ｔ細胞から活性化Ｔ細胞を分離する。このようなプロトコルの１つの例にフローサイトメトリーがある。当業者には、様々な特性に基づき細胞を分取する目的で一般にはフローサイトメトリー、具体的には蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用することが容易にわかる。ＦＡＣＳでは、各細胞の特定の光散乱特性および蛍光特性に基づき、不均一な生体細胞混合物を１度に細胞１個ずつ、２つ以上の容器に分取できる。これにより、例えば、細胞を蛍光マーカーに基づき分取することが可能になる。したがって、ある特定の実施形態では、蛍光で印または標識を付けた転写産物またはタンパク質のレベルによってＴ細胞活性化を測定できる。いくつかの実施形態では、細胞と、蛍光標識にカップリング、共有結合、または非共有結合した抗体とを接触させることによって、タンパク質、例えば細胞表面に局在するタンパク質、例えば本明細書に記載される活性化Ｔ細胞内でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるタンパク質の発現レベルを測定できる。いくつかの実施形態では、抗体は、活性化Ｔ細胞内でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるタンパク質を標的とするものである。これにより、活性化Ｔ細胞内でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるタンパク質の発現レベルに基づき細胞を分取し、それにより、未活性化Ｔ細胞から活性化Ｔ細胞を分離できる。ある例示的実施形態では、Ｔ細胞とＧＦＰ標識抗ＣＤ６９抗体との結合によって活性化Ｔ細胞を特定できる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドと、Ｂ細胞受容体を発現する細胞との間の結合を検出することは、推定Ｂ細胞受容体リガンドと、Ｂ細胞受容体を発現する細胞との結合を可視化することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドにタグを付けて、リガンドの局在の可視化を可能にする。適切なタグとしては、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなどの蛍光遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、当業者に公知の任意の適切な方法、例えば、蛍光顕微鏡法、免疫組織化学法、またはＦＡＣＳを用いて、Ｂ細胞受容体を発現する細胞への推定Ｂ細胞受容体リガンドの局在を評価できる。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体リガンドは、Ｂ細胞受容体を発現する細胞に結合し、Ｂ細胞受容体を発現していない同じ細胞型には結合しない。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ファージディスプレイによって、推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーをＢ細胞受容体に接触させる。
【０１２６】
「ファージディスプレイ」とは、バリアントポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ、粒子の表面にコートタンパク質との融合タンパク質として提示させる技術のことである。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化したタンパク質バリアントの大きなライブラリーを高い親和性で標的分子と結合する配列について、迅速かつ効率的に選別できることにある。何百万ものポリペプチドを特定の結合特性を有するポリペプチドについてスクリーニングするには、ファージ上でのペプチドおよびタンパク質のライブラリーの提示が用いられてきた。繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩとの融合により小型のランダムペプチドおよび小型のタンパク質を提示させるには、多価ファージディスプレイ法が用いられてきた。Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，１９９２，３：３５５−３６２および本明細書に引用される参考文献。一価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリーを遺伝子１１１またはその一部分と融合し、ファージ粒子が融合タンパク質を１コピー提示するか、１コピーも提示しないよう野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下、低レベルで発現させる。選別が内因性リガンドの親和性に基づくものになるよう結合活性作用を多価ファージより低く抑え、ＤＮＡ操作が容易になるファージミドベクターを使用する。Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ，１９９１，３：２０５−２１６。
【０１２７】
融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合物と作動可能に連結されている転写調節エレメントを含み複製可能なベクターのバリアントのファミリーを構築すること、適切な宿主細胞を形質転換すること、形質転換細胞を培養して、ファージ粒子表面に融合ポリペプチドを提示するファージ粒子を形成すること、粒子の少なくとも一部が標的と結合するよう組換えファージ粒子と標的分子とを接触させること、結合する粒子と結合しない粒子とを分離することを含む、タンパク質、ペプチド、およびその突然変異バリアントのファージディスプレイについては公知であり、本発明の形質転換法とともに用い得る。米国特許第５，７５０，３７３号；国際公開第９７／０９４４６号；米国特許第５，５１４，５４８号；同第５，４９８，５３８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，４３２，０１８号；国際公開第９６／２２３９３号；米国特許第５，６５８，７２７号；同第５，６２７，０２４号；国際公開第９７／２９１８５号；Ｏ’Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３６：３３８−３４７；Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，４７：１７５−１９０；Ｏ’Ｎｅｉｌ  ａｎｄ  Ｈｏｅｓｓ，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，５：４４３−４４９；Ｍａｋｏｗｓｋｉ，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２８：５−１１；Ｄｕｎｎ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，７：５４７−５５３；Ｃｈｏｏ  ａｎｄ  Ｋｌｕｇ，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，６：４３１−４３６；Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｃａｔｔａｎｅｏ，１９９５，ＴＩＮＳ，１８：２４２−２４９；Ｃｏｒｔｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，６：７３−８０；Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａ．，１９９５，ＴＩＢＳ，２０：５０９−５１６；Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ  ａｎｄ  Ｎａｄｅｒｉ，１９９５，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．，１７：３３−３９；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９９４，Ｔｉｂｔｅｃｈ，１２：１７３−１８４；Ｂａｒｂａｓ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ，４：５２６−５３０；ＭｃＧｒｅｇｏｒ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，６：１５５−１６２；Ｃｏｒｔｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ，７：６１６−６２１；ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２８：２９−３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを用いて、本明細書に記載されるＢ細胞受容体と結合することが可能な推定Ｂ細胞受容体リガンドを適切なライブラリーから単離する。例示的な推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーとしては、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーなどのファージ−ペプチドライブラリーが挙げられる。また、ペプチドライブラリーを作製し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法が米国特許第５，７２３，２８６号；同第５，４３２，０１８号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；および同第５，４９８，５３０号に開示されている。米国特許第５，７７０，４３４号；同第５，７３４，０１８号；同第５，６９８，４２６号；同第５，７６３，１９２号；および同第５，７２３，３２３号も参照されたい。選択工程では、通常、支持体上に保持することによって、推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを標的Ｂ細胞受容体またはそのフラグメントでプローブし、Ｂ細胞受容体と結合することが可能なライブラリーのメンバーを単離することができる。このようなスクリーニング工程は、（例えば、ポジティブ選択およびネガティブ選択の両方を含む）複数回のラウンドにより実施して、Ｂ細胞受容体と結合することが可能な推定Ｂ細胞受容体リガンドのプールを濃縮し得る。いくつかの実施形態では、パニングの各ラウンドでネガティブ選択を実施する。次いで、濃縮したプールの個々のクローンを単離し、さらに特徴付けて、所望の結合活性および生物活性を有するクローンを特定することができる。推定Ｂ細胞受容体リガンドの配列を従来の方法論により決定することもできる。
【０１２８】
１つの例として、ファージディスプレイでは通常、共有結合を用いてタンパク質（例えば、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメイン）成分とバクテリオファージコートタンパク質とを結合させる。この結合は、コートタンパク質と融合した推定Ｂ細胞受容体リガンドドメイン成分をコードする核酸の翻訳から生じるものである。結合には、柔軟なペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドン抑制の結果として組み込まれたアミノ酸が含まれ得る。ファージディスプレイについては、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／０９６９０号；国際公開第９０／０２８０９号；ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８およびＨｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）３４４−８に記載されている。推定Ｂ細胞受容体リガンドドメイン成分を提示しているバクテリオファージを増殖させ、標準的なファージ調製法、例えばＰＥＧ沈殿を用いて、増殖培地から回収できる。個々のディスプレイファージを選択したのち、選択したタンパク質成分をコードする核酸を増幅させた後、選択したファージを感染させた細胞、またはファージそのものからそれを単離できる。個々のコロニーまたはプラークを選択することができ、次いで、核酸を単離し、シーケンシングを実施し得る。
【０１２９】
標的抗原との結合に関してディスプレイライブラリーのメンバーを単離した後、単離した各ライブラリーメンバーについて、非標的分子との結合能を試験して、その結合特異性を評価してもよい。非標的分子の例としては、磁気ビーズ上のストレプトアビジン、ブロッキング剤、例えばウシ血清アルブミン、ウシ脱脂粉乳など、大豆タンパク質、任意の捕捉もしくは標的固定化モノクローナル抗体、または標的を発現しない非トランスフェクト細胞が挙げられる。例えば、ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いてデータを得ることができる。ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて、標的への各ライブラリーメンバーの結合に関して、および標的抗原の関連する標的またはサブユニットに対する異種間反応性に関して、また、ｐＨ６またはｐＨ７．５などの異なる条件下で、定量的データを得てもよい。非標的との結合と標的との結合に関するデータを（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを用いて）比較して、標的と特異的に結合するライブラリーメンバーを特定する。
【０１３０】
推定Ｂ細胞受容体リガンド
例えば癌治療のための固有Ｂ細胞受容体リガンドを特定する方法であって、推定固有Ｂ細胞受容体リガンドが固有Ｂ細胞受容体と結合することを確認することを含む、方法が本明細書に提供される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドはペプトイドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは環状ペプトイドを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは多糖を含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは脂質を含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは小分子を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、細胞タンパク質の一部または全部をコードするアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、細胞タンパク質の一部も全部もコードしないアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、長さが１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸、または４０アミノ酸であり、例えば、長さが９アミノ酸である。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、長さが２０アミノ酸未満、１５アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満である。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、長さが２〜２０アミノ酸、５〜１５アミノ酸、または７〜１０アミノ酸である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは配列ＹＸｎＺを含む。いくつかの実施形態では、ＹおよびＺは極性非荷電アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＹおよびＺは、ＣまたはＣの保存的置換、例えば、Ｓ、Ａ、Ｍ、またはＴである。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは配列ＣＸｎＣを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは配列ＳＸｎＳを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは配列ＣＸｎＳを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは配列ＳＸｎＣを含む。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＤＮＡによってコードされる２０種類のアミノ酸のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、例えば、ｎは７である。いくつかの実施形態では、ｎは、１５以下、１２以下、または９以下である。いくつかの実施形態では、ｎは、２〜１５、５〜１０、または６〜８である。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列番号１〜３のうちのいずれかを含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列ＣＸｎＣを有する環状ペプチドを含み、Ｎ末端またはＣ末端のＣｙｓがＣｙｓ−Ｃｙｓ相互作用を形成し、環状ペプチドを環状化する。
【０１３６】
本明細書にはまた、推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーが提供される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーから推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを作製し、各推定Ｂ細胞受容体リガンドは、ｃＤＮＡの一部または全部を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーはペプチドライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリーはコンビナトリアルペプチドライブラリーである。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリー内の推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列ＹＸｎＺを含み、推定Ｂ細胞受容体リガンドのＸｎ配列が異なる。いくつかの実施形態では、ＹおよびＺは極性非荷電アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＹおよびＺは、ＣまたはＣの保存的置換、例えば、Ｓ、Ａ、Ｍ、またはＴである。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリー内の推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列ＣＸｎＣを含み、推定Ｂ細胞受容体リガンドのＸｎ配列が異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリー内の推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列ＳＸｎＳを含み、推定Ｂ細胞受容体リガンドのＸｎ配列が異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリー内の推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列ＣＸｎＳを含み、推定Ｂ細胞受容体リガンドのＸｎ配列が異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリー内の推定Ｂ細胞受容体リガンドは、配列ＳＸｎＣを含み、推定Ｂ細胞受容体リガンドのＸｎ配列が異なる。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＤＮＡによってコードされる２０種類のアミノ酸のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、例えば、ｎは７である。いくつかの実施形態では、ｎは、１５未満、１２未満、または９未満である。いくつかの実施形態では、ｎは、２〜１５、５〜１０、または６〜８である。いくつかの実施形態では、Ｘ位に縮重ＮＮＮ、ＮＮＫ、またはＮＮＳコドンを有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりＸｎ配列を作製する。いくつかの実施形態では、縮重コドンはＮＮＫコドンである。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドは、例えばファージディスプレイライブラリーの成分として、ファージと結合している。
【０１４０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
Ｂ細胞受容体と、細胞外ドメインとして推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを有するＣＡＲとを共発現させることによって、Ｂ細胞受容体リガンドを特定し、Ｔ細胞活性化を測定する、方法が本明細書に開示される。
【０１４１】
また、ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞、および癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む、ワクチンで対象を治療することによって癌を治療する方法が本明細書に開示される。
【０１４２】
一態様では、本明細書に開示される例示的ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列と、細胞外推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、細胞内刺激ドメインとを含む。一態様では、例示的ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列と、細胞外推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、細胞内共刺激ドメインと、細胞内刺激ドメインとを含む。
【０１４３】
「キメラ抗原受容体」または別称「ＣＡＲ」という用語は、少なくとも細胞外リガンドドメインと、膜貫通ドメインと、のちに定義する刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ぶ）とを含む、組換えポリペプチド構築物を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチド構築物内のドメインは、同じポリペプチド鎖内にあり、例えばキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチド構築物内のドメインは、互いに隣接していない。
【０１４４】
抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは抗原結合ドメインを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、推定Ｂ細胞受容体リガンド、例えば本明細書に記載される推定Ｂ細胞受容体リガンドを含む、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインが異なる、ＣＡＲのライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ライブラリー内の各ＣＡＲは、異なる抗原結合ドメイン、例えば推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのライブラリーは、細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインは、抗原結合ドメイン、例えば本明細書に記載される推定Ｂ細胞受容体リガンドのライブラリーを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、推定Ｂ細胞受容体リガンドドメインは、重鎖定常領域のＣＨ２およびＣＨ３である、Ｆｃドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；具体的には、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される、重鎖定常領域に由来するものである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントを含む。「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体および抗体フラグメントを包含する。一実施形態では、抗体分子は多重特異性抗体分子であり、例えば、抗体分子は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、その複数のもののうち第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第一のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のもののうち第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第二のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、最大２つの抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに対する結合特異性を有する第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第二のエピトープに対する結合特異性を有する第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴とする。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、癌特異抗原と特異的に結合する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドと結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）を含む、ＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットを埋め、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、あらゆる有核細胞に恒常的に発現する。癌では、ウイルス特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体が免疫療法において固有のクラスの細胞表面標的となる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２では、ウイルスまたは腫瘍抗原に由来するペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が記載されている（例えば、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１１  ８５（５）：１９３５−１９４２；Ｓｅｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１  １１７（１６）−．４２６２−４２７２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０  １８４（４）：２１５６−２１６５；Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１  ８（２１）：１６０１−１６０８；Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１３  ５（１７６）：１７６ｒａ３３；Ｔａｓｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  １９（２）：８４−１００を参照されたい）。例えば、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーのスクリーニングからＴＣＲ様抗体を特定できる。
【０１５０】
抗原結合ドメインは、抗原と結合する任意のタンパク質であり得、特に限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに特に限定されないが、ラクダ科由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で公知の代替的足場、例えば組換えフィブロネクチンドメインなどを含めたその機能性フラグメントがこれに含まれる。いくつかの場合には、抗原結合ドメインが、最終的にＣＡＲを使用する種と同じ種に由来するのが有益である。例えば、ヒトに使用するには、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインのヒト残基またはヒト化残基を含むのが有益であり得る。
【０１５１】
一態様では、抗原結合ドメインはヒト抗体または抗体フラグメントを含む。
【０１５２】
一態様では、抗原結合ドメインはヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。
【０１５３】
特に限定されないが、ＣＤＲ移植（例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号を参照されたい）、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第５９２，１０６号および同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；ならびにＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３を参照されたい）、鎖シャッフリング（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）ならびに例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１  １９−２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００）、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７），Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４）、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）に開示されている技術を含めた当該技術分野で公知の様々な技術を用いてヒト化抗体を作製できる。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合を変化させる、例えば改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法によって、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定すること、および特定の位置で配列を比較して、通常ではないフレームワーク残基を特定することによって特定する。（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい。）
【０１５４】
ヒト化抗体または抗体フラグメントには、非ヒトである入手源に由来するアミノ酸残基が１個または複数個残存している。これらの非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、「重要な」残基と呼ばれ、これらは通常、「重要な」可変ドメインから取ったものである。本明細書に提供されるヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する１つまたは複数のＣＤＲと、フレームワーク領域とを含み、フレームワークを含むアミノ酸残基が全部または大部分、ヒト生殖系列に由来するものである。抗体または抗体フラグメントをヒト化する複数の技術が当該技術分野で周知であり、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒらの方法に従い（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換すること、すなわち、ＣＤＲ移植（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号；および米国特許第４，８１６，５６７号；同第６，３３１，４１５号；同第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第６，５４８，６４０号）によって実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントでは、実質的にインタクトのヒト可変ドメイン全体に満たない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。ヒト化抗体は多くの場合、一部のＣＤＲ残基、および可能性として一部のフレームワーク（ＦＲ）残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置換されている、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化についても、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）もしくはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４（１９９４）；およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４））または鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）によって実施できる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ディスプレイライブラリーに由来するものである。ディスプレイライブラリーとは、実体の集合体であり、各実体は、利用可能なポリペプチド成分と、そのポリペプチド成分をコードする、または特定する回収可能な成分とを含む。ポリペプチド成分は変化に富むため、様々なアミノ酸配列が示される。ポリペプチド成分は、任意の長さ、例えば３アミノ酸〜３００アミノ酸超のものであり得る。ディスプレイライブラリー実体は、２つ以上のポリペプチド成分、例えば、Ｆａｂの２つのポリペプチド鎖を含み得る。ある例示的な実施形態では、ディスプレイライブラリーを用いて抗原結合ドメインを特定できる。選択の際には、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド成分を抗原またはそのフラグメントでプローブし、ポリペプチド成分が抗原と結合すれば、通常、支持体上に保持されることによって、そのディスプレイライブラリーメンバーが特定される。
【０１５６】
保持されたディスプレイライブラリーメンバーを支持体から回収し、解析する。解析は、ほぼ同じ、または異なる条件下での増幅とそれに続く選択を含み得る。例えば、ポジティブ選択およびネガティブ選択を交互に実施し得る。解析はまた、詳細な特徴付けのため、ポリペプチド成分のアミノ酸配列決定およびポリペプチド成分の精製を含み得る。
【０１５７】
ディスプレイライブラリーには様々なフォーマットを使用できる。例としては、ファージディスプレイが挙げられる。ファージディスプレイでは通常、タンパク質成分とバクテリオファージコートタンパク質とを共有結合させる。この結合は、コートタンパク質と融合したタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じるものである。結合には、柔軟なペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドン抑制の結果として組み込まれたアミノ酸が含まれ得る。ファージディスプレイについては、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／０９６９０号；国際公開第９０／０２８０９号に記載されている。タンパク質成分を提示しているバクテリオファージを増殖させ、標準的なファージ調製法、例えばＰＥＧ沈殿を用いて、増殖培地から回収できる。個々のディスプレイファージを選択したのち、選択したタンパク質成分をコードする核酸を増幅させた後、選択したファージを感染させた細胞、またはファージそのものからそれを単離できる。個々のコロニーまたはプラークを選択し、核酸を単離し、シーケンシングを実施し得る。
【０１５８】
その他のディスプレイフォーマットとしては、細胞ベースのディスプレイ（例えば、国際公開第０３／０２９４５６号を参照されたい）、タンパク質−核酸融合（例えば、米国特許第６，２０７，４４６号を参照されたい）、リボソームディスプレイ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペリプラズムディスプレイが挙げられる。
【０１５９】
一態様では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインのアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）にリーダー配列を含む。一態様では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列が任意選択で、細胞内プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の過程で抗原結合ドメイン（例えば、ａａ  ｓｃＦｖ）から切断される。いくつかの実施形態では、リーダー配列はインターロイキン２シグナルペプチドである。
【０１６０】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、天然の入手源または組換えの入手源に由来するものであり得る。入手源が天然のものである場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであり得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的と結合すると必ず、細胞内ドメイン（１つまたは複数）にシグナルを伝達することが可能である。本発明に特に有用な膜貫通ドメインは少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域（１つまたは複数）を含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは少なくとも、例えば、ＫＩＲＤＳ２、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ｒｆＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦＩ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＣＤ１９の膜貫通領域（１つまたは複数）を含み得る。
【０１６１】
いくつかの場合には、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して、膜貫通ドメインをＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲのリガンドドメインと結合させることができる。例えば、一実施形態では、ヒンジはヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。
【０１６２】
細胞質ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞質領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化することが可能である。
【０１６３】
本発明のＣＡＲに使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体結合後に協働的に作用してシグナル伝達を開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と共受容体の細胞質配列およびこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびにこれと同じ機能を有する任意の組換え配列が挙げられる。
【０１６４】
Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始する配列（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、および抗原依存性に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを発生させる配列（二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）によって媒介されると言える。
【０１６５】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを発生させることができる。例えばＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞内の免疫エフェクター機能としては、サイトカイン分泌を含めた細胞溶解活性およびヘルパー活性が挙げられる。諸実施形態では、細胞内シグナルドメインがエフェクター機能シグナルを伝達し、専門化した機能を発揮するよう細胞に指令を出す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いてもよいが、多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分を用いる場合に限って言えば、そのような短縮された部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトの鎖の代わりにこれを用い得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むものとする。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子に由来するものを含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルまたは抗原依存性刺激を担う分子に由来するものを含む。例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含むものであり得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子に由来する細胞質配列を含み得る。
【０１６６】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、特に限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃｅＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。
【０１６７】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、単独で一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み得るか、本発明のＣＡＲにおいて有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン（１つまたは複数）と組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータ鎖部分と、共刺激シグナル伝達ドメインとを含み得る。
【０１６８】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体もしくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能性フラグメントを含み得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと結合し、それにより、特に限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、０Ｘ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１iｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒトＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大、エフェクター機能、および生存能を増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒトＴ細胞の持続性および抗腫瘍活性を増大させることが明らかにされている（Ｓｏｎｇｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。
【０１６９】
細胞内での発現
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば癌治療のためのＢ細胞受容体リガンドを特定するため、Ｂ細胞受容体と推定Ｂ細胞受容体リガンド、例えば、推定Ｂ細胞受容体リガンドを含むＣＡＲを細胞内、例えばＴ細胞内で発現させることを含む。本明細書に記載される方法はまた、癌治療のため、ＣＡＲをＴ細胞内で発現させることを含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＡＲを細胞内、例えばＴ細胞内で発現させるＤＮＡ構築物を包含する。所望の分子をコードする核酸配列は、当該技術分野で公知の組換え法を用いて、例えば、標準的な技術を用いて、遺伝子を発現する細胞由来のライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子を含むことがわかっているベクターから遺伝子を得ること、またはそれを含む細胞および組織から直接単離することなどによって得ることができる。例えば、本明細書に記載されるように、癌細胞からＢ細胞受容体の配列を得ることができる。本明細書で使用される組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術については当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ  “Ｍａｎｉａｔｉｓ”）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ  ＷＩＴＨ  ＧＥＮＥ  ＦＵＳＩＯＮＳ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；およびＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社が１９８７年に刊行したＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＮ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ；（上記の文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されている。
【０１７１】
あるいは、目的とする遺伝子をクローニングするのではなく、合成により作製できる。
【０１７２】
本開示はまた、本開示のＤＮＡを挿入するベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子を娘細胞内に長期間にわたって安定に組み込み、増殖させることが可能であることから、長期遺伝子導入を実施するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどの癌レトロウイルスに由来するベクターよりもさらに有利である。レンチウイルスベクターにはさらに、免疫原性が低いという利点もある。別の実施形態では、所望のΒ細胞受容体またはＣＡＲをトランスポゾンによって細胞内で発現させることができる。
【０１７３】
本明細書で使用される「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属の１つを指す。レンチウイルスは、レトロウイルスのなかでは珍しく、非分裂細胞に感染することが可能であり；宿主細胞のＤＮＡ内に相当量の遺伝情報を送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つとなっている。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶはいずれもレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで有意水準の遺伝子導入を実施する手段である。
【０１７４】
Β細胞受容体とＣＡＲをコードする天然核酸または合成核酸の発現は通常、Β細胞受容体もしくはＣＡＲ、またはその一部分を発現するポリペプチドをコードする核酸をプロモーターと作動可能に連結し、その構築物を発現ベクター内に組み込むことによって実施する。ベクターは、複製および真核生物内への組込みに適したものであり得る。典型的なクローニングベクターには、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターが含まれている。本開示の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いる核酸予防接種および遺伝子治療に使用し得る。遺伝子送達の方法については当該技術分野で公知である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本開示は遺伝子治療ベクターを提供する。
【０１７５】
核酸を多数のタイプのベクターにクローニングできる。例えば、特に限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含めたベクターに核酸をクローニングできる。特に目的とするベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシーケンシングベクターが挙げられる。
【０１７６】
さらに、発現ベクターをウイルスベクターの形態で細胞に与え得る。ウイルスベクター技術については当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにその他のウイルス学および分子生物学の手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルとしては、特に限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。適切なベクターは一般に、少なくとも１種類の生物体で機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限酵素部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含むものである（例えば、国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０１７７】
哺乳動物細胞への遺伝子導入には、ウイルスベースのシステムが多数開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに好都合なプラットフォームとなる。当該技術分野で公知の技術を用いて、選択した遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルスシステムが当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターを使用する。多数のレトロウイルスベクターが当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。
【０１７８】
ほかにもプロモーターエレメント、例えばエンハンサーが転写開始の頻度を調節する。これらは通常、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが明らかにされている。プロモーターエレメント間の間隔は柔軟性に富むことが多いため、エレメントを互いに逆にするか移動させても、プロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下する前にプロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐに増大させることができる。プロモーターによっては、個々のエレメントが協働的に、または独立して機能し、転写を活性化することができるように思われる。
【０１７９】
適切なプロモーターの１つの例に、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列がある。このプロモーター配列は、これと作動可能に連結されている任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターのまた別の例に伸長因子−１ａ（ＥＦ−ｌａ）がある。ただし、特に限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば特に限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどを含めた他の構成的プロモーター配列を用いてもよい。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導プロモーターも本開示の一環として企図される。誘導プロモーターの使用により、それと作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、必要なときにはオンにし、必要でないときにはオフにすることができる、分子スイッチがもたらされる。誘導プロモーターの例としては、特に限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターはＥＦ−１ａプロモーターである。
【０１８０】
Ｂ細胞受容体もしくはＣＡＲ、またはその一部分の発現を評価するため、細胞に導入する発現ベクターに選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子、またはその両方を含ませて、発現細胞の特定および選択を容易にしてもよい。他の態様では、選択マーカーを別個の一片のＤＮＡに搭載し、共トランスフェクション法に使用してもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子をともに適切な制御配列に隣接させて、宿主細胞内で発現させ得る。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子、およびＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなどの蛍光遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、治療法に使用するＣＡＲポリペプチドからレポーター遺伝子または選択マーカー遺伝子を除去する。
【０１８１】
トランスフェクトされた可能性のある細胞の特定および制御配列の機能性の評価にはレポーター遺伝子を使用する。レポーター遺伝子とは一般に、レシピエントの生物体または組織内に存在も発現もせず、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性、抗生物質耐性、または蛍光によって発現が示されるポリペプチドをコードする、遺伝子のことである。ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後の適切な時点で、レポーター遺伝子の発現をアッセイする。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質の遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適切な発現系については周知であり、既知の技術を用いて調製するか、市販のものを購入し得る。一般に、レポーター遺伝子の発現レベルが最も高い最小限の５’隣接領域を有する構築物がプロモーターであるとされる。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子と連結し、薬剤がプロモーター駆動性の転写を調節する能力を評価するのに使用し得る。
【０１８２】
細胞に遺伝子を導入して発現させる方法については当該技術分野で公知である。発現ベクターとの関連で言えば、当該技術分野の任意の方法によって、ベクターを宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターを物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。
【０１８３】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を作製する方法については当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０１８４】
目的とするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するのに最も広く用いられている方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来するものであり得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０１８５】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含めた脂質ベースの系が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで送達媒体として使用するコロイド系の例として、リポソーム（例えば、人工膜小胞）がある。
【０１８６】
細胞の入手源
いくつかの実施形態では、細胞にＢ細胞受容体および／またはＣＡＲを発現する核酸をトランスフェクトする。本明細書で使用される「トランスフェクト」、「形質転換」、または「形質導入」という用語は、宿主細胞に外来核酸を移入または導入する工程を指す。「トランスフェクト」、「形質転換」、または「形質導入」細胞とは、外来核酸をトランスフェクト、形質転換、または形質導入した細胞のことである。この細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。特定の実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【０１８８】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めた多数の入手源から入手できる。人工多能性幹細胞、造血幹細胞、または前駆細胞から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を作製してもよい。いくつかの実施形態では、特に限定されないがＴ細胞系を含めた任意の数の免疫細胞系、例えば、当該技術分野で利用可能なＨｅｐ−２細胞系、Ｊｕｒｋａｔ細胞系、およびＲａｊｉ細胞系を含めた細胞系を使用し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの任意の数の当業者に公知の技術を用いて、対象から採取した血液単位から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を入手できる。いくつかの実施形態では、アフェレーシスによって、個人の循環血から細胞を入手する。アフェレーシス産物には通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、その他の有核白血球を含めたリンパ球、赤血球、および血小板が含まれている。いくつかの実施形態では、アフェレーシスによって採取した細胞を洗浄して血漿画分を除去し、のちの処理段階のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れておくことができる。いくつかの実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の実施形態では、洗浄液にはカルシウムが含まれておらず、マグネシウムが含まれていなくてよく、あるいは、全部の二価陽イオンではないが、多数の二価陽イオンが含まれていなくてよい。ここでも同じく、驚くべきことに、カルシウムが不在の初期活性化段階により活性化が強まる。当業者には容易に理解されるように、当業者に公知の方法、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造業者の指示通りに用いることなどによって、洗浄段階を実施し得る。洗浄後、細胞を様々な生体適合緩衝液、例えば無Ｃａ２＋、無Ｍｇ２＋ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または緩衝剤の有無を問わない他の生理食塩水などに再懸濁させ得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁させてもよい。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により、または向流遠心分離により、単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を単離する。ポジティブ選択またはネガティブ選択技術によって、特定のＴ細胞亜群、例えばＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などをさらに単離できる。
【０１９０】
ネガティブ選択される細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮を実施できる。１つの方法が、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いる負磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞の分取および／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するには、モノクローナル抗体のカクテルは通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、通常ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節Ｔ細胞を濃縮するか、ポジティブ選択するのが望ましいことがある。
【０１９１】
あるいは、ある特定の実施形態では、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは同様の他の選択法によって調節Ｔ細胞を枯渇させる。
【０１９２】
治療法
本明細書で特定されるＢ細胞受容体リガンドを用いる治療法が本明細書に提供される。具体的には、Ｂ細胞悪性腫瘍を迅速に治療する方法が本明細書に提供される。例えば、本明細書に記載される方法は、推定Ｂ細胞受容体リガンドを有するＣＡＲとＢ細胞受容体とをＴ細胞内で共発現させ、Ｂ細胞の活性化によって推定Ｂ細胞受容体リガンドとＢ細胞受容体との結合を確認することによって、Ｂ細胞受容体リガンドの迅速な特定を可能にし、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体リガンドの特定に使用するものと同じＣＡＲを治療に使用し、Ｂ細胞悪性腫瘍の迅速な確認と治療を可能にする。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞リガンドを含むＣＡＲと、治療する対象のリンパ腫細胞のＢ細胞受容体とをＴ細胞内で共発現させたときにＴ細胞を活性化するＢ細胞受容体リガンドを用いる、治療法が本明細書に提供される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドで対象を治療する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドは、治療用ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるようにＴ細胞内で発現する本明細書に記載のＣＡＲ、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、治療用ＣＡＲは、Ｂ細胞受容体を特定する方法に使用するＣＡＲを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現Ｔ細胞により、対照よりも高い特異性および／または活性がもたらされる。いくつかの実施形態では、対照はＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、癌と無関係の抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、癌特異抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、活性および特異性を細胞傷害性によって示すことができる。いくつかの実施形態では、活性は、例えば％溶解により測定される、対照と比較した、固有Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態では、％溶解は、対照より０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれ以上高い。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、特異性は、例えば％溶解により測定される、固有Ｂ細胞受容体を発現しない細胞に対する細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態では、％溶解は、対照より０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれ以上低い。いくつかの実施形態では、％溶解を１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、またはそれ以上の効果対標的比で測定する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現Ｔ細胞で治療した対象には、対照で治療した対象と比較してサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の軽減がみられる。
【０１９９】
本明細書で使用される「結合」は、２つの分子が共有結合相互作用および非共有結合相互作用を介して、例えば、水素結合、イオン結合、またはファンデルワールス結合によって結合していることを指す。このような結合は、少なくとも２つの同じまたは異なる原子またはイオンの間で、これらの原子またはイオンの電子密度の再分布の結果として形成され得る。例えば、Ｂ細胞リガンドを融合タンパク質として治療剤と結合させ得る。
【０２００】
いくつかの実施形態では、治療剤は、放射性同位元素、例えばα放射体、β放射体もしくはγ放射体、またはβおよびγ放射体などを含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、治療剤は化学療法を含む。化学療法剤としては、例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤（タキサン）、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、ペプチド抗生物質、白金系薬剤、レチノイド、ビンカアルカロイドおよびその誘導体が挙げられる。非限定的な例としては、（ｉ）抗血管新生剤（例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン１、メタロプロテアーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６Ｋｄフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング成長因子ベータ、インターフェロンα、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、ならびにＣａｒｍｅｌｉｅｔおよびＪａｉｎ（２０００）によって挙げられているもの；（ｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤など、およびその任意の組合せ；ならびに（ｉｉｉ）化学療法化合物、例えばピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、およびシタラビン）、プリン類似体、葉酸アンタゴニストおよびその関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；ビンカアルカロイドなどの天然産物（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤、例えばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビンなど、エピジポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（エトポシドおよびテニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチネラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｈｎｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、ならびにエトポシド（ＶＰ１６））を含めた抗増殖／抗有糸分裂剤；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなど；酵素（全身性にＬ−アスパラギンを代謝し、自身のアスパラギ���を合成することができない細胞を除去するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびその類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびその類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン（ｔｒａｚｅｎｅ）−ダカルバジニン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）など；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体（メトトレキサート）など；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、およびその他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および成長因子阻害剤（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断剤；一酸化窒素供与体；抗センスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、およびイリノテカン）、副腎皮質ステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、およびプレドニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊剤などが挙げられる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、治療剤は免疫療法を含む。癌免疫療法とは、免疫系を用いて癌を拒絶することである。主な前提は、疾患の原因となる腫瘍細胞を攻撃するよう対象の免疫系を刺激することである。これは、対象自身の免疫系に腫瘍細胞を破壊するべき標的として認識させる場合には、対象に対する免疫感作によるものであり得、あるいは治療剤により対象の免疫系を動員して腫瘍細胞を破壊させる場合には、抗体などの治療剤を薬物として投与することによるものであり得る。癌免疫療法は、抗体ベースの治療法およびサイトカインベースの治療法を含む。
【０２０３】
これまで、多数の治療用モノクローナル抗体がヒトへの使用に関してＦＤＡによる承認を受けており、さらに多数のものが承認中である。癌免疫療法に対してＦＤＡにより承認されたモノクローナル抗体としては、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＥｒｂＢ２、血管内皮成長因子、および上皮成長因子受容体に対する抗体が挙げられる。癌治療にＦＤＡにより承認されたモノクローナル抗体の例としては、特に限定されないが、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）として市販されている）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）として市販されている）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−ＩＨ（商標）として市販されている）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）として市販）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標）として市販されている）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）として市販されている）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）として市販されている）、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）として市販されている）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（商標）として市販されている）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標）として市販されている）、オファツヌマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（商標）として市販されている）、ダクリズマブ（Ｚｉｎｂｒｙｔａ（商標）として市販されている）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標）として市販されている）、およびペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）として市販されている）が挙げられる。現時点で米国において癌治療に関するヒト臨床試験の段階にあるモノクローナル抗体の例としては、特に限定されないが、ＷＸ−Ｇ２５０（Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）として市販されている）、ザノリムマブ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４として市販されている）、ｃｈｌ４．１８、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒとして市販されている）、オレゴボマブ（Ｂ４３．１３、ＯｖａｌＲｅｘ（商標）として市販されている）、エドレコロマブ（ＩＧＮ−１０１、Ｐａｎｏｒｅｘ（商標）として市販されている）、１３Ｈ−ｃｈＴＮＴ−Ｉ／Ｂ（Ｃｏｔａｒａ（商標）として市販されている）、ペムツモマブ（Ｒ−１５４９、Ｔｈｅｒａｇｙｎ（商標）として市販されている）、リンツズマブ（ＳＧＮ−３３として市販されている）、ラベツズマブ（ｈＭＮ１４、ＣＥＡｃｉｄｅ（商標）として市販されている）、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ（商標）として市販されている）、ＣＮＴＯ３２８（ｃＣＬＢ８として市販されている）、３Ｆ８、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１、ニモツズマブ、ＳＧＮ−３０、チシリムマブ（ＣＰ−６７５２０６として市販されている）、エプラツズマブ（ｈＬＬ２、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（商標）として市販されている）、９０Ｙ−エプラツズマブ、ガリキシマブ（ＩＤＥＣ−１１４として市販されている）、ＭＤＸ−０６０、ＣＴ−０１１、ＣＳ−１００８、ＳＧＮ−４０、マパツムマブ（ＴＲＭ−Ｉとして市販されている）、アポリズマブ（ＨｕＩＤＩＯ、Ｒｅｍｉｔｏｇｅｎ（商標）として市販されている）、およびボロシキシマブ（Ｍ２００として市販されている）が挙げられる。
【０２０４】
癌免疫療法はまた、サイトカインベースの治療法を含む。サイトカインベースの癌治療法は、対象の免疫応答を調節する１つまたは複数のサイトカインを用いるものである。癌治療に有用なサイトカインの非限定的な例としては、インターフェロンα（ＩＦＮ−ａ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）が挙げられる。
【０２０５】
本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンド、ならびにコード核酸もしくは核酸のセット、それを含むベクター、またはベクターを含む宿主細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えばＢ細胞リンパ腫を含めた癌の治療に有用である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドを２つ以上、または治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドと別の適切な治療剤との組合せを、治療を必要とする対象に投与し得る。治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドはまた、薬剤の効果を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤とともに使用できる。
【０２０７】
本明細書ではまた、ＣＡＲが癌に特異的な方法で癌特異抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と；癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む、ワクチンとを同時に投与することを含む、治療法が企図される。いくつかの実施形態では、癌特異抗原はＢ細胞受容体を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるＢ細胞受容体リガンドを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される方法によって特定される、本明細書に記載のＢ細胞受容体リガンドを含む。
【０２０８】
「癌特異抗原」または「腫瘍抗原」という用語は、癌細胞の表面に全体が、またはフラグメントとして発現し（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）、薬理作用物質を癌細胞に対して優先的に標的化するのに有用な分子（通常、タンパク質、炭水化物、または脂質）を互換的に指す。いくつかの実施形態では、癌特異抗原はＢ細胞受容体を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるＢ細胞受容体リガンドを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される方法によって特定される、本明細書に記載のＢ細胞受容体リガンドを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞がともに発現するマーカー、例えば細胞系列マーカー、例えばＢ細胞上のＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞に正常細胞と比較して過剰発現する、例えば、正常細胞と比較して１倍過剰発現する、２倍過剰発現する、３倍過剰発現する、またはそれ以上過剰発現する、細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、体細胞変異を含む、例えば、癌細胞内で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞上に発現する分子と比較して欠失、付加、または変異を含む分子である。いくつかの実施形態では、癌特異抗原は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、読み過ごし変異、または遺伝子融合変異を含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＥＡ、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ、ＣＤ１２３、ＩＬ１３Ｒａ２、メソテリン、ＦＲａ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、５Ｔ４、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＡＣＶＲ２Ｂ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＵＣ１、またはＭＵＣ１６の変異を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞の細胞表面のみに全体が、またはフラグメントとして（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）発現し、正常細胞の表面には合成されることも発現することもない。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原は、癌に特異的な方法で癌特異抗原と結合する。いくつかの実施形態では、癌特異抗原が癌に特異的な方法で癌特異抗原と結合する場合、癌特異抗原は、非癌細胞の１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、ｌ０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上の親和性で癌細胞と結合する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象の癌特異抗原を特定することを含む。いくつかの実施形態では、癌特異抗原を特定することは、対象から癌細胞を得ることを含む。いくつかの実施形態では、癌細胞を生検試料から得る。いくつかの実施形態では、癌細胞は対象の血液中にある。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、癌細胞のＤＮＡを抽出し、シーケンシングを実施する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの配列、または１つもしくは複数の遺伝子の配列と、非癌細胞内の同じ配列とを比較する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、癌細胞のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡのシーケンシングを実施し、いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡの配列、または１つもしくは複数の遺伝子の配列と、非癌細胞内の同じ配列とを比較する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原を特定することは、対象の循環血中無細胞ＤＮＡの単離とシーケンシングとを含む。
【０２１４】
「同時に」は、２つ以上の物質を時間内で協関させる、好ましくは、免疫応答の調節をもたらすのに十分な時間内で協関させる方法で、対象に投与することを含む。諸実施形態では、２つ以上の物質を同じ剤形で投与することにより、同時投与を実施し得る。他の実施形態では、同時投与は、２つ以上の物質を異なる剤形で、ただし、特定の時間内に、好ましくは１か月以内、より好ましくは１週間以内、さらにより好ましくは１日以内、さらにより好ましくは１時間以内に投与することを包含し得る。「同時に」という用語の使用は、治療剤を対象に投与する順序を限定するものではない。ＣＡＲ−Ｔ細胞などの第一の治療剤を本明細書に記載されるワクチンなどの第二の治療剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）に、これと同時に、またはその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に対象に投与できる。したがって、第一の薬剤を第二の治療剤と別個に、逐次的に、または同時に投与できる。いくつかの実施形態では、対象に同時投与を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回実施する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞をワクチンの前に投与する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞をワクチンの後に投与する。
【０２１６】
本明細書に開示される方法を実施するには、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に、本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンド、ＣＡＲ、およびワクチンを適切な経路で、例えば、静脈内投与で例えばボーラスとして、もしくは一定時間にわたる持続注入によって、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、滑液嚢内経路、髄腔内経路、経口経路、吸入経路、または局所経路によって、有効量投与できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるワクチンを腫瘍内に投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈内に投与する。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた市販の液体製剤用の噴霧器が投与に有用である。液体製剤を直接噴霧することができ、また凍結乾燥粉末を再構成後に噴霧することができる。あるいは、本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンド、ＣＡＲ、およびワクチンを、フッ化炭素製剤および定量吸入器を用いてエアロゾル化するか、凍結乾燥させて粉砕した粉末として吸入することができる。
【０２１７】
本明細書に記載される方法によって治療する対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。哺乳動物としては、特に限定されないが、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが挙げられる。治療を必要とするヒト対象は、癌などの標的疾患／障害を有する、そのリスクがある、またはそれを有することが疑われる、ヒト患者であり得る。標的疾患または障害を有する対象は、ルーチンの医学的検査、例えば、臨床検査、臓器機能検査、ＣＴスキャン、または超音波によって特定できる。このような標的疾患／障害のいずれかを有することが疑われる対象には、その疾患／障害の１つまたは複数の症状がみられるものと思われる。疾患／障害のリスクがある対象は、その疾患／障害の１つまたは複数の危険因子を有する対象であり得る。
【０２１８】
本明細書に記載される方法および組成物を用いて、癌に関連する任意の疾患または障害を治療し得る。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺＬ）または粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性中枢神経系リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫から選択される。
【０２１９】
その他の癌としては、特に限定されないが、口腔：頬側口腔、口唇、舌、口腔、咽頭；心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、および奇形腫；肺：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、気管支原性肺癌（扁平上皮癌または類表皮癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸管：食道（扁平上皮癌、喉頭、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、直腸、結腸、結腸直腸；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：ヘパトーマ（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、胆道；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、軟骨肉腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫、および巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、頭頸部癌、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜包膜細胞腫、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファロピウス管（癌腫）、乳腺；血液学的：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］有毛細胞；リンパ系障害；皮膚：悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、角化棘細胞腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、甲状腺：甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌；甲状腺髄様癌、多発性内分泌腺腫症２Ａ型、多発性内分泌腺腫症２Ｂ型、家族性甲状腺髄様癌、褐色細胞腫、傍神経節腫；および副腎：神経芽腫が挙げられる。
【０２２０】
本明細書で使用される「有効量」は、単独で、または１つもしくは複数の他の活性薬剤と組み合わせて、対象に治療効果をもたらすのに必要な各活性薬剤の量を指す。いくつかの実施形態では、治療効果は癌進行の抑制である。ある量の本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたは本明細書に記載されるＣＡＲとワクチンにより治療効果が得られたかどうかの判定については、当業者には明らかであろう。有効量は、当業者によって認識されるように、治療する具体的な病態、病態の重症度、年齢、健康状態、大きさ、性別、および体重を含めた個々の患者のパラメータ、治療継続期間、現在実施している治療法の性質（実施している場合），具体的な投与経路など、医療関係者の知見および専門知識の範囲内にある因子によって異なる。これらの因子については当業者に周知であり、ルーチンの実験の範囲内で対処できる。一般に、最大用量の個々の成分またはその組合せ、つまり、妥当な医学的判断による最も高い安全用量を用いるのが好ましい。
【０２２１】
一般に、半減期などの実験的考慮事項が用量の決定に寄与する。投与頻度は、治療の過程で決定し、調整してよく、必ずというわけではないが一般に、標的疾患／障害の治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づくものである。
【０２２２】
１つの例では、分子の投与を１回または複数回実施した個人を対象として実験により用量を決定し得る。分子の用量を漸増させて個人に投与する。治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンの効果を評価するのに、疾患／障害の指標を追跡できる。
【０２２３】
本開示の目的には、適切な用量は、疾患／障害のタイプおよび重症度、本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンを予防目的で投与するか、治療目的で投与するか、これまでに実施した治療、患者の病歴および治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンに対する応答、ならびに主治医判断によって決まる。通常、臨床医が、所望の結果が得られる用量に達するまで、治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンを投与する。いくつかの実施形態では、所望の結果は癌の重症度の軽減である。ある用量によって所望の結果が得られたかどうかを判定する方法については、当業者には明らかであろう。１つまたは複数の治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンの投与は、例えば、被投与者の健康状態、投与目的が治療であるか、予防であるか、および熟練した実施者に知られている他の因子に応じて、連続的なものであっても、間欠的なものであってもよい。治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンの投与は、例えば、標的疾患または障害の発現前、発現時、または発現後に、基本的に予め選択した期間にわたって連続的なものであっても、間隔をあけた一連の投与であってもよい。
【０２２４】
本明細書で使用される「治療」という用語は、標的疾患または障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害の素因を有する対象に、障害、疾患の症状、または疾患もしくは障害の素因を治癒させる、治す、軽減する、緩和する、変化させる、是正する、寛解する、改善する、または影響を及ぼす目的で、１つまたは複数の活性薬剤を含む組成物を適用または投与することを指す。
【０２２５】
標的疾患／障害を軽減することは、疾患の発現もしくは進行を遅らせること、または疾患の重症度を軽減することを含む。疾患を軽減することは、必ずしも治癒という結果を必要とするわけでない。上で使用した、標的疾患または障害の発現を「遅らせる」は、疾患の進行を先に延ばすこと、妨げること、遅くすること、遅延させること、安定させること、および／または先延ばしにすることを意味する。この遅延は、治療する疾患および／または個人の病歴に応じて様々な長さの期間であり得る。疾患の発現を「遅らせる」もしくは軽減する、または疾患の発症を遅らせる方法とは、その方法を用いない場合と比較して、所与の時間枠内で疾患の１つもしく複数の症状が発現する確率を低く抑え、かつ／または所与の時間枠内の症状の程度を低く抑える方法のことである。このような比較は通常、統計的に有意な結果を得るのに十分な数の対象を用いた臨床試験に基づくものである。
【０２２６】
疾患の「発現」または「進行」は、疾患の初期徴候および／またはそれに続く進行を意味する。疾患の発現は、当該技術分野で周知の標準的な臨床技術を用いて検出および評価することが可能である。ただし、発現はまた、検出不可能であり得る進行を指す。本開示の目的には、発現または進行は、症状の生物学的過程を指す。「発現」は、発生、再発、および発症を指す。本明細書で使用される標的疾患または障害の「発症」または「発生」は、初発および／または再発を含む。
【０２２７】
本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンは、従来の経路で投与する、例えば、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内に、経鼻的に、頬側的に、経膣的に、または埋込みリザーバーから投与することができる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内への注射または注入技術を含む。さらに、１か月、３か月、または６か月のデポの注射可能な、または生分解性の材料および方法などを用いて、注射用デポによる投与経路で対象に投与できる。いくつかの例では、医薬組成物を眼球内または硝子体内に投与する。
【０２２８】
一実施形態では、本明細書に記載される治療剤と結合したＢ細胞受容体リガンドまたはＣＡＲとワクチンを部位特異的または標的化局所送達技術により投与する。部位特異的または標的化局所送達技術の例としては、様々な埋植可能な抗体のデポ供給源、または局所送達カテーテル、例えば注入カテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテルなど、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステント、またはその他の埋込装置、部位特異的担体、直接注入、または直接適用が挙げられる。例えば、国際公開第００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【０２２９】
アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達を用いてもよい。例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に受容体介在ＤＮＡ送達技術が記載されている。
【０２３０】
本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を用いて送達できる。遺伝子送達媒体は、ウイルス起源または非ウイルス起源のものであり得る（一般には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照されたい）。このようなコード配列発現は、外来性の哺乳動物または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーを用いて誘導できる。コード配列の発現は、構成的なもの、または調節的なものであり得る。
【０２３１】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞内での発現のためのウイルスベースのベクターについては当該技術分野で周知である。例示的なウイルスベースの媒体としては、特に限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号；同第９４／０３６２２号；同第９３／２５６９８号；同第９３／２５２３４号；同第９３／１１２３０号；同第９３／１０２１８号；同第９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号；英国特許出願公開第２，２００，６５１号；ならびに欧州特許第０３４５２４２を参照されたい）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、国際公開第９４／１２６４９号、同第９３／０３７６９号；同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号および同第９５／００６５５号を参照されたい）が挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されている死滅アデノウイルスと連結したＤＮＡの投与を用いてもよい。
【０２３２】
特に限定されないが、死滅アデノウイルス単独と連結した、または連結していないポリカチオン濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照されたい）；リガンド結合ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照されたい）；真核細胞送達媒体細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；国際公開第９５／０７９９４号；同第９６／１７０７２号；同第９５／３０７６３号；および同第９７／４２３３８号を参照されたい）、および核電荷中和または細胞膜との融合を含めた非ウイルス送達の媒体および方法を用いてもよい。ネイキッドＤＮＡを用いてもよい。国際公開第９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に例示的なネイキッドＤＮＡの導入方法が記載されている。米国特許第５，４２２，１２０号；国際公開第９５／１３７９６号；国際公開第９４／２３６９７号；国際公開第９１／１４４４５号；および欧州特許第０５２４９６８号には、遺伝子送達媒体としての役割を果たすことができるリポソームが記載されている。Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１には、さらなる方法が記載されている。
【０２３３】
本明細書に記載される方法に用いる具体的な投与レジメン、すなわち、用量、タイミング、および頻度は、具体的な対象およびその対象の既往歴によって決まる。
【０２３４】
標的疾患／障害に対する治療効果は、当該技術分野で周知の方法によって評価できる。
【０２３５】
本明細書で使用される「組合せ」という用語は、２つ以上の治療剤の使用を指す。「組合せ」という用語の使用は、対象に治療剤を投与する順序を限定するものではない。第一の治療剤を第二の治療剤の投与前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）に、投与と同時に、または投与後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に投与できる。したがって、第一の薬剤を第二の治療剤と別個に、逐次的に、または同時に投与できる。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ−Ｔ細胞およびワクチンをＴＬＲ９アゴニストと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【０２３７】
ワクチン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現Ｔ細胞をワクチンとともに投与する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、上記のように、癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸を含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、ワクチンは癌特異抗原の癌特異的フラグメントを含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原の癌特異的フラグメントは、１〜１０００アミノ酸長または１０〜５００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、癌特異抗原の癌特異的フラグメントは、１０アミノ酸長、２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長、６０アミノ酸長、７０アミノ酸長、８０アミノ酸長、９０アミノ酸長、１００アミノ酸長、２００アミノ酸長、３００アミノ酸長、４００酸長もしくは５００アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントは、上記のように体細胞変異を含み、例えば、点変異，スプライス部位変異，フレームシフト変異，読み過ごし変異，または遺伝子融合変異を含み、癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドまたは核酸は、体細胞変異を含む。
【０２４１】
ペプチドワクチン
いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現するポリペプチドを含む。
【０２４２】
特定の実施形態では、タンパク質ワクチンをコードするＤＮＡをプラスミドなどの発現ベクターに導入できる。制限酵素によって認識されるＤＮＡ配列を含む多重クローニング部位により、ベクターへのタンパク質ワクチンＤＮＡの挿入を容易にすることができる。特定の実施形態では、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ構築物（発現ベクターなど）を細胞に導入してタンパク質発現を誘導することができ、細胞を回収して、目的とするタンパク質を抽出できる。目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを、プロモーター配列などの遺伝子発現を制御する配列も含む発現ベクターに含ませることができる。発現を増強するため、タンパク質コード配列の上流および下流に５’非翻訳領域および３’非翻訳領域をコードさせることができる。例えば、５’非翻訳リーダー配列および３’ポリアデニル化配列を使用できる。特定の実施形態では、熱ショック形質転換によりタンパク質を発現させるのにＤＮＡを細胞に導入できる。特定の実施形態では、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インペールフェクション、または流体力学的送達によってタンパク質を発現させるのにＤＮＡを細胞に導入できる。特定の実施形態では、タンパク質発現に使用するＤＮＡをウイルスベクターの形態で送達できる。特定の実施形態では、溶解した細胞から目的とするタンパク質を回収し、精製できる。タンパク質精製は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、または６×ヒスチジンタグもしくはｃ−ｍｙｃタグなどのタンパク質タグに基づきタンパク質を単離するクロマトグラフィー技術によって実施できる。ヒスチジンタグをプロテアーゼによって認識され切断される配列に隣接してコードさせて、タンパク質精製後のヒスチジンタグの除去を容易にすることができる。タンパク質からヒスチジンタグを除去するのに使用できるプロテアーゼの例として、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼがある。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、重複配列を有し、それぞれが癌特異抗原のフラグメントを発現する、２つ以上のポリペプチドを含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドを担体タンパク質、例えば、ＯＶＡ、ＫＬＨ、またはＢＳＡとコンジュゲートする。
【０２４５】
ＤＮＡワクチン
いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現する核酸を含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。ＤＮＡワクチンは、「発現ベクター」または「発現カセット」、すなわち、タンパク質コード配列と適合性のある宿主内でのそのようなタンパク質コード配列の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を含み得る。発現カセットは、少なくともポリペプチドコード配列と作動可能に連結されているプロモーターを、任意選択で他の配列、例えば転写終止シグナルとともに含む。発現をもたらすのに必要な、または役立つほかの因子、例えばエンハンサーが含まれていてもよい。
【０２４７】
「作動可能に連結されている」は、コード配列の発現が可能なようにコード配列が制御配列と連結されていることを意味する。適切な宿主細胞内での所望のタンパク質の発現を指令する既知の制御配列を選択する。したがって、「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御エレメントを含む。このような制御配列については、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。
【０２４８】
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のプロモーター領域がＲＮＡポリメラーゼと結合し、「作動可能に連結されている」核酸配列の転写を促進する。本明細書で使用される「プロモーター配列」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖上にみられるプロモーターのヌクレオチド配列のことである。２つの核酸分子配列、例えばプロモーター配列とコード配列などは、両配列が同じＲＮＡ転写産物上に転写されるように、または一方の配列内で始まるＲＮＡ転写産物が第二の配列内に伸長するように互いに連結している場合、「作動可能に連結されている」ことになる。したがって、２つの配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡのプロモーター配列とコード配列などは、プロモーター配列で始まる転写により、作動可能に連結されているコード配列のＲＮＡ転写産物が生じる場合、作動可能に連結されていることになる。「作動可能に連結されている」ためには、直線状の配列の中で２つの配列が互いに直接隣接している必要がある。
【０２４９】
本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞内で作動可能なものでなければならず、真核プロモーターまたはウイルスプロモーターであり得る。適切なプロモーターは、誘導プロモーター、抑制プロモーター、または構成的プロモーターであり得る。「構成的」プロモーターとは、細胞の環境内で発生全体を通してみられる大部分の条件下で活性なプロモーターのことである。「誘導」プロモーターとは、環境または発生の調節下にあるプロモーターのことである。「組織特異的」プロモーターとは、生物体の特定の組織型において活性なプロモーターのことである。構成的プロモーターの例として、様々な細胞型において効率的かつ活性であり、大部分の他のプロモーターとは対照的に、停止細胞でも増殖細胞でも同じ増強活性がみられる、ウイルスプロモーターＭＳＶ−ＬＴＲがある。その他の好ましいウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルス由来）（Ｂａｓｈａｒｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１，１９８５）またはＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルス由来）（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７，１９８２）中に存在するプロモーターが挙げられる。また、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−８８，１９８２；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０，１９８１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６９７１−５，１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５，１９８４））が有用である。プロモーター領域に関連する転写因子ならびに転写因子の分離活性化およびＤＮＡ結合に関する他の例示的な記載としては、Ｋｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２３１：６９９，１９８６；Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５，１９８９；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｅｌｌ  ６１：９，１９９０；Ｌｅｗｉｎ，Ｃｅｌｌ  ６１：１１６１，１９９０；Ｐｔａｓｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３２９，１９９０；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７２：３０６，１９９３が挙げられる。
【０２５０】
プロモーター領域は、特定の組織中にみられる特定のタンパク質と相互作用することにより組織特異的エンハンサーとしても機能し得る、八量体領域をさらに含み得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトする標的細胞に特異的であるか、このような標的細胞の細胞因子によって大きく活性化される、エンハンサードメインである。例えば、Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１１２，７６７号にベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例が開示されている。エンハンサーおよび転写におけるその作用に関する全般的な考察については、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ  Ｍ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．５５２−５７６，１９９０（またはこれ以降の版）を参照されたい。特に有用なものがレトロウイルスエンハンサー（例えば、ウイルスＬＴＲ）であり、これと相互作用して遺伝子発現を刺激するプロモーターの上流にあるのが好ましい。レトロウイルスベクターとともに使用するには、内因性ウイルスＬＴＲをエンハンサーがない状態にし、組織特異性またはその他の所望の特性、例えば転写効率などを与える他の所望のエンハンサー配列に置き換え得る。
【０２５１】
したがって、発現カセットは、プラスミド、組換えウイルス、任意の形態の組換え「ネイキッドＤＮＡ」ベクターなどを含む。「ベクター」は、細胞に感染する、細胞をトランスフェクトする、細胞に一過性または恒久的に形質導入することができる、核酸を含む。ベクターは、ネイキッド核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体を形成した核酸であり得ることが認識されよう。ベクターは任意選択で、ウイルスまたは細菌の核酸および／またはタンパク質、ならびに／あるいは膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含む。ベクターは、ＤＮＡのフラグメントを結合させて複製させ得る、レプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。したがって、ベクターは、特に限定されないが、ＲＮＡ、自律自己複製環状または直線状ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばプラスミド、ウイルスなど（米国特許第５，２１７，８７９号）を含み、発現プラスミドおよび非発現プラスミドをともに含む。組換え細胞または培養物が「発現ベクター」の宿主であると記載する場合、これには染色体外環状ＤＮＡおよび直線状ＤＮＡ、ならびに宿主染色体（１つまたは複数）に組み込まれたＤＮＡがともに含まれる。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合、ベクターは、有糸分裂中の細胞によって自律的構造物として安定に複製され得るか、宿主のゲノム内に組み込まれている。
【０２５２】
使用し得る例示的ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ  Ｓ，Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０，ｐ．１６７９；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ  Ｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−２９，１９８８；Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｓ  Ｅ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ  Ｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８４，ｃｈａｐｔｅｒ  １１）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。ヒト遺伝子送達に対するアデノウイルスベクターの利点としては、組換えがまれであること、このようなウイルスに関連することが知られているヒト悪性腫瘍がないこと、アデノウイルスゲノムが、最大７．５ｋｂの大きさの外来遺伝子を許容するよう操作できる二本鎖ＤＮＡであること、およびアデノウイルスが安全なヒトワクチン生物体であることが挙げられる。本発明によるヒトの治療法にはアデノ随伴ウイルスも有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１，１９９１）。
【０２５３】
本発明のＤＮＡ分子を発現することができ、本発明の治療設定に有用なまた別のベクターとして、複製しないようにすることができるワクシニアウイルスがある（米国特許第５，２２５，３３６号；同第５，２０４，２４３号；同第５，１５５，０２０号；同第４，７６９，３３０号；Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２５４９−５３，１９９２；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：３４０３−９，１９８５）。異種ＤＮＡを含む組換えワクシニアウイルスおよびその他のウイルスならびに予防接種およびＤＮＡ療法へのその使用に関する記載が、Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ３：８６−９０，１９９３；Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３４５−６２，１９９２）で概説されている。
【０２５４】
使用し得るその他のウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミドベクターを含めたウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが挙げられる。例示的なウイルスのタイプとしては、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が挙げられる。
【０２５５】
ＤＮＡワクチンにもレプリコン、例えば、ＲＮＡレプリコン、自己複製ＲＮＡベクターを使用し得る。ＲＮＡレプリコンワクチンは一般に、アルファウイルスベクター、例えばシンドビスウイルス（Ｈａｒｉｈａｒａｎ，Ｍ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：９５０−８．）、セムリキ森林ウイルス（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３：１４８７−９５；Ｙｉｎｇ，Ｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：８２３−７）、またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏ，Ｐ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１）に由来するものであり得る。これらの自己複製性および自己抑制性のワクチンは、のちにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトした細胞内でＲＮＡレプリコンに転写される、（１）ＲＮＡまたは（２）ＤＮＡとして投与し得る（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：５６２−５；Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ｗ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１−５）。例示的セムリキ森林ウイルスにｐＳＣＡ１がある（ＤｉＣｉｏｍｍｏ，Ｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；２７３：１８０６０−６）。
【０２５６】
ネイキッドＤＮＡまたはウイルスベクターに加えて、操作した細菌をベクターとして使用し得る。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ＢＣＧ、およびリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＬＭ）を含めた多数の細菌株（Ｈｏｉｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：２３８−９，１９８１；Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：２５−３２，１９８８）：Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：３３６−８，１９８８；Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１：４５６−６０，１９９１；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４７９−８２，１９９１）。これらの生物体には、ワクチンベクターとして使用するのに有望な２つの特徴、すなわち、（１）経口ワクチン送達への可能性を開く腸内感染経路；および（２）単球／マクロファージに感染することによる専門ＡＰＣへの抗原の標的化といった特徴がみられる。
【０２５７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスを介する遺伝子導入に加えて、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，上記）および粒子銃による遺伝子導入（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  ８７：９５６８，１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ  Ｓ  ｅｔ  ａＬ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２７２６，１９９１；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８０：９４，１９９１；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２４４：６５，１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７：１  １，１９９１）を含めた当該技術分野で周知の物理的手段をＤＮＡの直接導入に用いることができる。さらに、遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に導入するためのよく知られた手段であるエレクトロポレーションを用いて、本発明によるＤＮＡ分子をｉｎ  ｖｉｖｏで組織に導入することができる（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０８８：１３１，１９９１）。
【０２５８】
「担体を介する遺伝子導入」についても記載されている（Ｗｕ，Ｃ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１６９８５，１９８９；Ｗｕ，Ｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３．１４６２１，１９８８；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  ８０：７１２８，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７８５１，１９８２；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：９６３，１９９２）。好ましい担体として、アシル化ｍＡｂを脂質二重層に組み込むことができる、イムノリポソームなどの標的化リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：１０６８，１９８３；Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，上記）がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。アシアロ糖タンパク質／ポリリジンなどのポリカチオン（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，上記）を用いてもよく、この場合、コンジュゲートは、標的組織認識分子（例えば、肝臓に対するアシアロ−オロソムコイド）と、損傷を起こさずにトランスフェクトするＤＮＡに結合するＤＮＡ結合性化合物、例えばポリリジンなどとを含む。次いで、このコンジュゲートと本発明のプラスミドＤＮＡとの複合体を形成させる。
【０２５９】
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションに使用するプラスミドＤＮＡは、当該技術分野で周知の方法を用いて、例えば、Ｑｉａｇｅｎ法（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い、次いで、既知の方法、例えば本明細書に例示する方法などを用いてＤＮＡ精製を実施して調製し得る。
【０２６０】
このような発現ベクターを用いて、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで）宿主細胞をトランスフェクトして、ＤＮＡを発現させ、融合タンパク質またはペプチドを含むコードタンパク質を産生させ得る。一実施形態では、ＤＮＡワクチンを細胞、例えば対象から得た細胞（例えば、抗原提示細胞）に投与するか、接触させ、対象に投与し、ここでは、細胞を対象に投与する前に、その後に、またはそれと同時に対象を治療する。
【０２６１】
ＲＮＡワクチン
いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントを発現する核酸を含み、核酸はＲＮＡである。
【０２６２】
本明細書に提供されるＲＮＡワクチンは、少なくとも１つの癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントをコードするオープンリーディングフレームを有する、少なくとも１つ(１つまたは複数)のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーはポリヌクレオチドと呼ばれる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然の、非天然の、または改変されたアミノ酸のポリマー）をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで翻訳されてコードポリペプチドを生じ得る、任意のポリヌクレオチドを指す。
【０２６４】
ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素は通常、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡテールを含む。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、核酸ベースの治療剤を用いる効果的なポリペプチド発現に関する既存の問題点を克服する役割を果たす、機能上および／または構造上の設計的特徴がある点で、野生型ｍＲＮＡと区別できる。
【０２６５】
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの癌特異抗原またはその癌特異的フラグメントをコードするオープンリーディングフレームを有する、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記ＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾を含む。
【０２６６】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態では、様々な（２つ以上の）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定の領域が１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物体に導入する修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ細胞または生物体内での分解が未修飾ポリヌクレオチドよりも抑えられる。いくつかの実施形態では、細胞または生物体に導入する修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ細胞または生物体内での免疫原性が低く抑えられ得る（例えば、自然応答が低く抑えられる）。
【０２６７】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態では、所望の機能または特性を得るためにポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入する、非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成またはポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端または鎖の他の任意の場所に導入し得る。ポリヌクレオチドのいずれの領域を化学修飾してもよい。
【０２６８】
本開示は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ぶ）とともに含む、化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、任意の有用な方法、例えば、化学的に、酵素により、または組換えにより、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを含ませる方法などによって合成し得る。ポリヌクレオチドは、結合したヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含み得る。このような領域は、可変性の骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含み得る。
【０２６９】
本開示の癌ワクチンは、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）などを含む。ｍＲＮＡは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写鋳型」と呼ばれる鋳型ＤＮＡから転写される。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲおよびポリＡテールをコードする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写鋳型の具体的な核酸配列組成および長さは、鋳型がコードするｍＲＮＡによって決まる。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは２００〜３，０００個のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００〜５００個、２００〜１０００個、２００〜１５００個、２００〜３０００個、５００〜１０００個、５００〜１５００個、５００〜２０００個、５００〜３０００個、１０００〜１５００個、１０００〜２０００個、１０００〜３０００個、１５００〜３０００個、または２０００〜３０００個のヌクレオチドを含み得る。
【０２７１】
他の態様では、本発明は、ＩＶＴ法によってｍＲＮＡ癌ワクチンを調製する方法に関する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）法では、ほぼあらゆる配列のＲＮＡ分子の鋳型による合成が可能である。ＩＶＴ法を用いて合成できるＲＮＡ分子の大きさは、短いオリゴヌクレオチドから数千塩基の長い核酸ポリマーまでの範囲である。ＩＶＴ法では、大量のＲＮＡ転写産物（例えば、マイクログラム〜ミリグラムの量）の合成が可能である（Ｂｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．７０３：２９−４１（２０１１）；Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１  １，２０５−２２０．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｏｆｆｅｒｙ  Ｍ．Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２００７．２６２−２９９）。ＩＶＴでは一般に、目的の配列の上流にあるプロモーター配列を特徴とするＤＮＡ鋳型を用いる。プロモーター配列はバクテリオファージ起源のもの（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列）が最も一般的であるが、他の多くのプロモーター配列は、ｄｅ  ｎｏｖｏで設計されたものを含ませても許容できる。ＤＮＡ鋳型の転写は通常、特定のバクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、最も良好に達成される。例示的ＲＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、とりわけＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＩＶＴは一般に、ｄｓＤＮＡから開始するが、一本鎖でも進行し得る。
【０２７２】
ワクチン組成物
いくつかの実施形態では、ワクチンは、最低でも抗原を含む。
【０２７３】
本開示による効果的なワクチンをさらに得るため、ワクチンの有効性を増強する材料および方法を用いることができる。このような方法の１つが、アジュバントを用いるものである。
【０２７４】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する材料を指し、本明細書では、この用語の慣例的な用法で使用する。すべてのアジュバントに関して正確な作用機序が理解されているわけではないが、このようによく理解されていないことが、タンパク質ベース、ＤＮＡベースを問わず、その多種多様なワクチンへの臨床使用を妨げるものではない。従来、一部のアジュバントは、抗原を注射部位で物理的に捕捉し、その部位への抗原存在を増強し、抗原の放出速度を遅くする。次いで、このことが、ＡＰＣ、この場合はｉＤＣなどの動員および活性化を延ばし、かつ／または増大させる。
【０２７５】
特定の実施形態では、スクアレンベースのアジュバントを使用する。スクアレンは、いずれも炭素分子が３０個の炭化水素であるトリテルペンとして知られる分子群の一部である。スクアレンは、コメ糠、コムギ胚芽、アマランサス種子、およびオリーブなどの特定の植物源のほかにも、サメ肝油などの動物源から得ることができる。特定の実施形態では、スクアレンベースのアジュバントは水中油型乳剤のＭＦ５９（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、バーゼル、スイス；Ｇｉｕｄｉｃｅ，ＧＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｓｅｐ；１３（９）：１０１０−３を参照されたい）である。ＭＦ５９（登録商標）と類似しているが、前臨床研究で使用するよう設計されているスクアレンベースのアジュバントの例にＡｄｄａｖａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）がある。ＭＦ５９は、インフルエンザワクチンへの使用がＦＤＡに承認されており、数件の試験により、妊娠中に使用しても安全であることが示されている（Ｔｓａｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１０．１７：２８（７）：１８７７−８０；Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１２．２０７（３）：１７７）。特定の実施形態では、スクアレンベースのアジュバントは、スクアレン油を０．１％〜２０％（ｖ／ｖ）含み得る。特定の実施形態では、スクアレンベースのアジュバントは、スクアレン油を５％（ｖ／ｖ）含み得る。特定の実施形態では、スクアレンベースのアジュバントは、水中油型乳剤中にαトコフェロールとスクアレンとポリソルベート８０とを含む、ＡＳ０３である（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；ｓｅｅ  Ｇａｒｃｏｎ  Ｎら  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２０１２  Ｍａｒ；１１（３）：３４９−６６）。
【０２７６】
特定の実施形態では、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）とも呼ばれる）を使用する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、免疫系を刺激する二本鎖ＲＮＡの合成類似体である。特定の実施形態では、ポリ−ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｉｎｏｌ）を使用する（Ａｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｆｅｂ；１４６：１２０−３１）。特定の実施形態では、ポリ−ＩＣ１２Ｕ（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）を使用する（Ｍａｒｔｉｎｓ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１５  Ｍａｒ；１４（３）：４４７−５９）。
【０２７７】
特定の実施形態では、アジュバントミョウバンを使用し得る。ミョウバンは、２つの硫酸基と、一価陽イオンと、アルミニウムまたはクロムなどの三価金属を含む塩のファミリーを指す。ミョウバンはＦＤＡ承認のアジュバントである。特定の実施形態では、ワクチンは、１〜１０００ｕｇ／用量または０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／用量の量のミョウバンを含み得る。
【０２７８】
特定の実施形態では、アジュバントＶａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｖｉｃａｌ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用し得る。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）は、ＤＮＡワクチンまたはタンパク質ワクチンに使用できる陽イオン性脂質ベースのアジュバントである。
【０２７９】
投与用の組成物。本開示のワクチンを投与用の医薬組成物に製剤化することができ、本開示のワクチンを様々な形態、例えば、液体、ゲル、凍結乾燥固体、または圧縮固体で製剤化できることがこれに含まれる。具体的な形態は、治療する具体的な適応症によって決まり、当業者には明らかであろう。
【０２８０】
医薬組成物の例として、非経口投与用に設計した溶液がある。医薬液剤は多くの場合、即時使用に適した液体形態で提供されるが、このような非経口製剤を凍結形態または凍結乾燥形態で提供してもよい。前者の場合、使用前に組成物を解凍しなければならない。後者の形態は、当業者には凍結乾燥調製物の方が一般に液体の対応物よりも安定であることが認識されるように、さらに多岐にわたる保管条件下で組成物中に含まれる活性化合物の安定性を増強するため使用されることが多い。このような凍結乾燥調製物は、使用前に、無菌注射用水または無菌生理食塩水などの１つまたは複数の適切な薬学的に許容される希釈剤の添加によって再構成する。
【０２８１】
非経口剤は、必要に応じて、所望の純度を有する組成物と、当該技術分野で通常使用される１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（いずれも「賦形剤」と呼ばれる）、例えば、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および／またはその他の種々の添加剤とを混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液として保管するよう調製できる。
【０２８２】
緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近い範囲に維持するためのものである。緩衝剤は通常、２ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本開示とともに使用するのに適した緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方ならびその塩、例えば、クエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム・クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸・クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸・クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例えば、コハク酸・コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸・水酸化ナトリウム混合物、コハク酸・コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例えば、酒石酸・酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸・酒石酸カリウム混合物、酒石酸・水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸・フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸・フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム・フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えば、グルコン酸・グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸・水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸・グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸・シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸・水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸・シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば、乳酸・乳酸ナトリウム混合物、乳酸・水酸化ナトリウム混合物、乳酸・乳酸カリウム混合物など）、および酢酸緩衝剤（例えば、酢酸・酢酸ナトリウム混合物、酢酸・水酸化ナトリウム混合物など）などが挙げられる。ほかに考えられるものとして、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、およびトリスなどのトリメチルアミン塩がある。
【０２８３】
微生物の増殖を遅らせるために保存剤を添加してもよく、通常、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の量を添加する。本開示とともに使用するのに適した例示的保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベンなど、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
【０２８４】
液体組成物の等張性を確保するため、等張剤を添加してよく、等張剤としては、多価糖アルコール、三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどが挙げられる。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮に入れて、０．１重量％〜２５重量％、通常、１重量％〜５重量％の量で存在し得る。
【０２８５】
安定剤は、機能の範囲が、ワクチンを安定化させる、または変性もしくは容器壁への付着を防ぐのに役立つ増量剤から添加剤までに及び得る、広い範疇の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙したもの）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、およびグリセロールなど；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウムなど；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、およびグルコースなど；二糖、例えばラクトース、マルトース、およびスクロースなど；ラフィノースなどの三糖、およびデキストランなどの多糖であり得る。安定剤は通常、ワクチンの組成に基づき０．１〜１０，０００重量部の範囲内で存在する。ほかの種々の賦形剤としては、増量剤または充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が挙げられる。
【０２８６】
例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、もしくはポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションにワクチン組成物を封入してもよい。このような技術については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【０２８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する非経口製剤は一般に、無菌状態である。無菌状態は、例えば、滅菌ろ過膜でろ過することによって、容易に達成される。
【０２８８】
徐放ワクチン組成物の適切な例としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス、フィルムまたはマイクロカプセルなどの適切な形態を有するマトリックスが挙げられる。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＰＲＯＬＥＡＳＥ（登録商標）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）技術またはＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドとからなる注射用マイクロスフェア；Ａｂｂｏｔｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ社、アボットパーク、イリノイ州）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を長期間、例えば１００日以上などにわたって放出することが可能であり、特定のヒドロゲルは、化合物をこれより短い期間にわたって放出する。
【０２８９】
（実施例）
実施例１
ここでは、濾胞性リンパ腫治療の有効性および安全性を大幅に増大させる新規なプラットフォームの開発について報告する。リンパ腫は多様化系のクローン性悪性腫瘍であるため、どの腫瘍も細胞表面の抗体が異なる。ＦＬ腫瘍細胞表面にあるこれらのＢ細胞受容体に特異的なリガンドを迅速に特定するのにコンビナトリアルオートクリンベースの選択を用いる。選択したリガンドを、ヒトＣＴＬを再方向付けるためにＣＡＲ−Ｔフォーマットに使用する。このフォーマットは基本的に、通常のＣＡＲ−Ｔプロトコルとは逆のものである。抗体をガイド分子にする代わりに、抗体そのものを標的とする。したがって、このような研究によって、数週間で得られる個人の抗体結合リガンを用いるリンパ腫の個別化治療の可能性が開ける。
【０２９０】
特殊な場合ではあるが、リンパ腫細胞上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は最も純粋な形態の腫瘍特異抗原である（１）。これは、リンパ腫が、各腫瘍が１０８種類の異なる抗体分子のうち１つの抗体のみを発現する多様化系の１つのメンバーの腫瘍であるためである（２）。したがって、これまで、ＢＣＲの結合に対して選択的な抗原が治療にもっと広く用いられてこなかったのは注目に値する（３、４）。その理由は、各患者に対して選択的抗原を発見するワークフローがほとんどの治療状況で不可能であるためであると考えられる。ここでは、臨床での使用に対応できるスピードで個人のＢＣＲに対して選択的なペプチド抗原を同定できる、オートクリンベースのフォーマットについて記載する。これらの選択した抗原は、ＣＡＲ−Ｔまたはその他の方法、例えば放射線療法などにガイド分子として使用できる。重要な点は、オートクリンベースの選択によって、リンパ腫の個別化療法を実現しようとする場合に必要とされるスピードおよび特異性がもたらされることである。
【０２９１】
材料および方法
リンパ腫細胞ＢＣＲの特定および再構成
Ｎ．Ｎ．Ｐｅｔｒｏｖ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（サンクトペテルブルク、ロシア）の厚意により、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）であると診断された患者のリンパ節生検試料の提供を受けた。術後直ちに、生検試料を４枚の等しいスライスに分け、そのうち２枚をＲＮＡｌａｔｅｒ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）に入れ、他の２枚を凍結保存した。フローサイトメトリーにより、リンパ腫細胞カウント数および表面Ｉｇの発現を明らかにした。約２５０，０００個の細胞を含む細胞懸濁液のアリコートを４本のチューブ内でモノクローナル抗体、すなわち、１．アイソタイプ対照；２．ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０−ＰＥ、ＣＤ３−ＰＣ５、ＣＤ１９−ＰＥ−Ｃｙ７；３．ＩｇＧ−ＰＥ−Ｃｙ５、ＩｇＭ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＰＥＣｙ７；および４．カッパ−ＦＩＴＣ、ラムダ−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥ−Ｃｙ７で染色した。ＳＳＣ／ＦＳＣおよびＣＤ１９Ｃを用いてゲートをかけたリンパ球上での免疫グロブリン発現を推定した。Ｍ重鎖またはＧ重鎖、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のモノクローナル免疫グロブリン発現を検出した。ＲＮＡｌａｔｅｒ処理した生検試料は、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた全ｍＲＮＡの単離に使用した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い、逆転写によって全ｃＤＮＡを合成した。フローサイトメトリーによって特定したＩｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の可変領域遺伝子を各遺伝子について別個に増幅した。高忠実度ＤＮＡ−ポリメラーゼ（Ｑ５、ＮＥＢ社）をファミリー特異的Ｖ遺伝子順方向プライマーとＣ遺伝子特異的逆方向プライマーのセットとともに使用するセミネステッドＰＣＲを用いた（表１）。第一段階のＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲルでのヘテロ二本鎖解析に供して、ホモ二本鎖（モノクローナルのＰＣＲ産物）と、移動速度の遅いヘテロ二本鎖のスメア（ポリクローナルのリンパ球に由来する）とを判別した。予想した大きさのＤＮＡフラグメントを抽出し、ＤＮＡを溶出した。第二段階の増幅およびシーケンシングには近位逆方向Ｃ遺伝子特異的プライマーを用いた。特定した濾胞性リンパ腫ＢＣＲの可変フラグメントを、膜係留型ヒト抗体ＦｃフラグメントをコードするレンチウイルスベクターｐＬＶ２−Ｆｃ−ＭＴＡにｓｃＦｖとしてクローニングした（５）（図５Ｂおよび５Ｃ）（ＦＬ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＲａｊｉ細胞にこれらのウイルスを形質導入した。形質導入したＪｕｒｋａｔ−ＦＬおよびＲａｊｉ−ＦＬをＦＡＣＳにより解析して、濾胞性リンパ腫ＢＣＲを保有する細胞を選択し、次いで、それをオートクリン選択または動物実験に使用した。
【０２９２】
【表１】
2020536115.tif 000002
2020536115.tif 000003
【０２９３】
ＣＡＲベースのコンビナトリアルペプチドライブラリーの構築
第三世代のキメラ抗原Ｔ細胞受容体をコードするＤＮＡフラグメンを合成し（ＧｅｎｅＣｕｓｔ社）、ＥＦ１ａプロモーターの制御下でｐＬＶ２レンチウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングした。遺伝子の配置は以下の順序である：Ｎ末端のインターロイキン２シグナルペプチド；改変ＰＥＬＬＧＧおよびＩＳＲモチーフを有するＩｇＧ１  Ｆｃスペーサードメイン；ＧＧＧＳリンカー；ＣＤ２８膜貫通および細胞内領域；ＯＸ−４０およびＣＤ３ｚｅｔｔａの細胞内ドメイン（図５Ａおよび５Ｃ）。コンビナトリアル環状ペプチドライブラリーを構築するため、縮重ＮＮＫコドンを有するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより、ＣＸ７Ｃのフォーマットのランダムペプチド（Ｘ＝２０種類の天然アミノ酸）をＦｃドメインのＮ末端に付加した。作製したライブラリーの多様性は、１０９メンバーであると推定された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、ライブラリープラスミドおよびパッケージングプラスミドとの共トランスフェクションにより、ＣＸ７Ｃ−Ｆｃ−ＣＡＲのレンチウイルスライブラリーを調製した。トランスフェクションから４８時間後、ウイルスが含まれる上清を収集した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてレンチウイルス調製物の力価を求めた。
【０２９４】
ＦＡＣＳベースの分取
Ｊｕｒｋａｔ−ＦＬ１細胞、Ｊｕｒｋａｔ−ＦＬ２細胞、およびＪｕｒｋａｔ−ＦＬ３細胞にレンチウイルス環状ペプチド−ＣＡＲライブラリーを形質導入した。感染２日後、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＣＤ６９ポジティブ細胞を分取した。ペプチド配列をコードする遺伝子のＰＣＲによって、分取した細胞からペプチド配列を直接決定し、レンチウイルスベクターにクローニングして、選択の次のラウンド用にライブラリーを構築した。４回の反復ラウンドの選択を実施した。
【０２９５】
細胞および培養条件
１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加した培地で細胞系を培養した。２９３Ｔレンチウイルスパッケージング細胞系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）およびＨＥｐ−２細胞系をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ＲＡＳ培養コレクション（サンクトペテルブルク、ロシア）からヒトＨＥｐ−２（ＣＣＬ−２３）細胞系、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＩＢ−１５２）細胞系、およびＲａｊｉ（ＣＣＬ−８６）細胞系を入手した。Ｊｕｒｋａｔ細胞系、Ｊｕｒｋａｔ−ＦＬ細胞系、Ｒａｊｉ細胞系、およびＲａｊｉ−ＦＬ細胞系をＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で密度勾配遠心分離により健常ドナーの血液からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、洗浄し、次いで、無血清ＲＰＭＩに再懸濁させた。
【０２９６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、拡大、および形質導入
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ヒトＰＢＭＣからＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。４０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２を含有する完全ＲＰＭＩ培地中、１：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を７２時間活性化した。ＦＬ１−ＣＡＲ、ＦＬ２−ＣＡＲ、ＦＬ３−ＣＡＲ、ＣＤ１９−ＣＡＲ、またはＭｙｃ−Ｆｃ−ＣＡＲを含むレンチウイルス上清に４０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む新鮮なＲＰＭＩ培地１ｍｌを加えたもの３ｍｌ当たり４００万個の細胞濃度で活性化Ｔ細胞を再懸濁させ、６ウェルプレートで培養した。プレートを１２００×ｇ、３２℃で９０分間遠心分離し、次いで、３７℃で４時間インキュベートした。２回目および３回目の形質導入をさらに２回実施した。
【０２９７】
動物実験
動物の処置はいずれも、実験動物の適切な使用および管理に関する推奨事項（ＥＣＣ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣ）に厳格に従い実施した。プロトコルはＩｎｔｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｂｅｒｉａｎ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢ  ＲＡＳ）の承認を受けたものである。実験はＳＢ  ＲＡＳのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＧｅｎｅｔｉｃｓにあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓで実施した。６〜８週齢、平均体重１６〜２０ｇの雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＣＢ  １７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）マウスを用いた。０．９％生理食塩水２００μｌ中５×１０６個のＲａｊｉ−ＦＬ１細胞をマウスの左側の皮下に接種することにより腫瘍を移植した。腫瘍が触知可能な少なくとも５０ｍｍ３の体積に達してから、マウスを実験群または対照群に無作為に割り付けた。腫瘍接種後第１７日に、３×１０６個のＦＬ１−ＣＡＲＴ  Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲＴ  Ｔ細胞、またはＭｙｃ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を担癌マウスの静脈内に（ｉ．ｖ．）注射した。カリパスで腫瘍体積を測定し、楕円体の式を用いて推定した。腫瘍結節の体積が２ｃｍ３に達したとき、マウスを屠殺した。腫瘍接種後第３８日（ＣＡＲＴ注入後第２１日）に、各実験群の個体を血液、脾臓、および骨髄細胞の単離に用いた。赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＣｂ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶解し、細胞をＣＤ３（血液試料用）、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＣＲ７に特異的な抗体で染色し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメータ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって解析した。腫瘍を４％中性緩衝ホルムアルデヒド中で２週間固定し、標準的なプロトコルを用いてパラフィン切片作製用に処理した。
【０２９８】
生体光測定による腫瘍撮像
新たに解凍したＤ−ルシフェリンカリウム塩（ＧＯＬＤＢＩＯ社）の水溶液１５０μｌ（マウス１匹当たり４．２９ｍｇ）をマウスの腹腔内に注射した。１０分後、マウスを屠殺し、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、および腫瘍を収集した。各器官をＰＢＳですすぎ、Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  ＭＳ  ＦＸ  ＰＲＯ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ社）を用いて生物発光強度を可視化した。
【０２９９】
組織学および免疫組織化学検査
肉眼による死後解析には、外表面、原発性腫瘍結節の外観、胸部の状態、腹腔および骨盤腔をその関連器官および組織とともに検査することを含めた。さらなる組織学的評価には、剖検時に各個体の腫瘍結節の標本を収集し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、漸増エタノールおよびキシロールで脱水し、ＨＩＳＴＯＭＩＸパラフィン（ＢｉｏＶｉｔｒｕｍ社）に包埋した。パラフィン切片（５ｐｍ）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡で検査し、スキャンした。Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ  ３５５Ｓミクロトーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で免疫組織化学的（ＩＨＣ）検査用の腫瘍切片（３〜４ｃｍ）を薄切し、さらに脱パラフィンおよび再水和を実施し；７００Ｗのマイクロ波オーブンで曝露した後、抗原回復を実施した。試料を製造者のプロトコルに従ってＣＤ８特異的抗体（Ｍ３１６４、Ｓｐｒｉｎｇ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）とインキュベートした。次に、切片を二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ検出システム）とインキュベートし、ＤＡＢ基質に曝露し、マイヤーのヘマトキシリンで染色した。Ａｘｉｏｃａｍ  ＭＲｃ５デジタルカメラを備えたＡｘｉｏｓｔａｒ  Ｐｌｕｓ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）を倍率１０倍、２０倍、および４０倍で用いて、画像を取得した。腫瘍の肉眼的検査には、腫瘍結節の大きさ、被嚢の有無、ならびに壊死および出血の有無の検査を含めた。腫瘍の顕微鏡検査には、壊死およびアポトーシスによる腫瘍組織の組織病理学的変化、有糸分裂の有無、およびＣＤ８リンパ球浸潤の有無の評価を含めた。
【０３００】
統計学的処理
ｅｘ  ｖｉｖｏ（フローサイトメトリー、細胞傷害性試験）で得たデータを、スチューデントのｔ検定（両側、対応なし）を用いて統計学的に処理した。腫瘍体積測定値を、一元配置ＡＮＯＶＡ（ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ  １０．０）を用いて統計学的に処理した。カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線を作成し、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定を用いて統計学的比較を実施した。ｐ≦０．０５を有意であるとした。
【０３０１】
細胞傷害性アッセイ
設計したＴ細胞の細胞傷害性および特異性を製造業者の推奨通りの標準的な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で評価した。偽形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＦＬ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＦＬ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＦＬ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＭｙｃ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を１０４個のＲａｊｉ−ＦＬ１細胞、Ｒａｊｉ−ＦＬ２細胞、Ｒａｊｉ−ＦＬ３細胞、または患者の生検試料由来の細胞とともに４０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を添加した完全ＲＰＭＩ培地中で６時間、共インキュベートした。ネガティブ対照にはＲａｊｉ細胞、または無関係なリンパ腫リンパ節生検試料から単離した細胞を用いた。いずれの実験も三重反復で実施した。
【０３０２】
フローサイトメトリー解析
この試験には以下の抗体、すなわち、抗ヒトＣＤ３  ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ヒトＣＤ８  ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ヒトＣＣＲ７  ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ  ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、マウス抗ヒトＣＤ６９  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ヒトＢ２２０  ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いた。抗ヒトＩｇＧ１  ＰＥ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）または合成ビオチン化環状ペプチド（ＧｅｎｅＣｕｓｔ社）、およびＦＩＴＣまたはＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてキメラＦＬ−ＢＣＲ発現を検出した。ＤｙＬｉｇｈｔ６５０とコンジュゲートしたヤギ交差吸収抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＣＡＲ分子を検出した。ビオチン化プロテインＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＦＩＴＣとコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＣＤ１９−ＣＡＲ（ＦＭＣ６３クローン）分子を検出した。
【０３０３】
ｂｃｌ−２転座の確認
濾胞性リンパ腫リンパ節生検試料のプロテイナーゼＫ消化により粗ＤＮＡ抽出物を調製した。（１４）に記載されている通りに、ＪＨに対するコンセンサスプライマーと、ｂｃｌ２遺伝子のｍｂｒｌ領域、ｍｃｒ２領域、またはｉｃｒ５領域の配列に相同な３種類のプライマーのうちの１つとを含むプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅を実施した。
【０３０４】
ＩＦＡ
（１５）に記載されている通りに、ＨＥｐ−２細胞およびＨＥＬ２９３Ｔ細胞を用い、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によりリンパ腫ＢＣＲの自己反応性を試験した。製造業者の指示通りに、組換えミオフェルリンをコードするプラスミドベクター（２２４４３、Ａｄｄｇｅｎｅ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。リンパ腫ＢＣＲを示す組換えＩｇおよび無関係なヒト抗体を２％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶かし、５０μｇ／ｍＬの濃度で使用し、細胞と１時間インキュベートした。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ  Ｕ顕微鏡を用い、抗ヒトＩｇ−ＰＥにより結合抗体の検出を実施した。
【０３０５】
結果
全体のワークフロー
これらの概念実証実験の目的は、リンパ腫細胞表面のＢＣＲと選択的に反応する抗原を発見することである（図１）。その中心となる考えは、ＢＣＲをクローニングし、多種多様なペプチドも発現する指標細胞の表面に発現させることができれば、そのシステムはオートクリンとなり、各細胞がそれ自体の選択システムとなるというものである。ＢＣＲが、共発現するリガンドのうちの１つと反応したときにシグナルを発生するようシステム全体を構築すれば、ＢＣＲとリガンドとの間の特異的相互作用をＦＡＣＳによって容易に確認できる。重要なのは、ここで使用するオートクリンベースの選択が、抗体とＣＡＲ上のペプチドとの結合によりシステムが活性化する機能的相互作用を選択するということである。
【０３０６】
悪性Ｂ細胞上のＢＣＲの特定
濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を有する患者３例のリンパ節生検試料を用いて、悪性細胞由来のＢＣＲのヌクレオチド配列を決定した。非悪性細胞由来のＢＣＲ遺伝子の存在量を抑えるため、腫瘍生検試料の中心部分を用いた。全ｍＲＮＡを逆転写反応の鋳型として使用し、次いで、Ｉｇ  Ｖ遺伝子をＰＣＲで増幅した。解析した配列の最大９５％がリンパ腫のクローン性により一致した。選択したＩｇ可変領域をｓｃＦｖフォーマットでｐＣｏｍｂ３Ｘベクターにクローニングした（５）。したがって、抗体（Ｆｃ）の定常ドメインと融合したＳｃＦｖが、柔軟なリンカーを介して血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の膜貫通ドメインと連結し、抗体分子が、その結合部位が溶媒側に面した状態で細胞膜内に二量体として組み込まれる（５）（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【０３０７】
悪性細胞上のＢＣＲに対するリガンドのオートクリンベースの選択
悪性細胞上のＢＣＲに特異的なリガンドを直接選択するオートクリンベースのレポーターシステム（図２Ａ）を用いた。この方法は、腫瘍標的化に使用し得るリガンドを直接選択することを可能にする。ＢＣＲと１０９のメンバーを含むコンビナトリアル環状ペプチドライブラリーの両方を感染させたＴ細胞をレポーターシステムとして用いた。不死ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球を、リンパ腫ＢＣＲと無作為化７アミノ酸環状ペプチドライブラリーと同時に発現するよう改変した。環状ペプチドライブラリーと、シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体とを融合した（図５Ａ〜５Ｃ）。ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインと融合したＩｇが環状ペプチドライブラリーのペプチドと反応すると、キメラ抗原性受容体のシグナル伝達ドメインがＴ細胞活性化カスケードを誘発する。活性化Ｔ細胞はＣＤ６９（初期Ｔ細胞活性化抗原）を発現し始め（６）、したがって、特異的蛍光標識抗体を用いて容易に検出され得る。
【０３０８】
最初に、モデルシステムを用いて、レポーター構築物の性能を確認した。ＣＡＲ上のｃ−Ｍｙｃエピトープおよび抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０クローン）の可変ドメインを膜結合ＢＣＲのモデルとして用いた。Ｍｙｃ−ＣＡＲを同時発現せずに膜結合抗Ｍｙｃ抗体のみを発現するＪｕｒｋａｔ細胞には、検出可能な活性化はみられなかった。しかし、膜結合抗Ｍｙｃ抗体とＭｙｃ−ＣＡＲをともに含む細胞は活性化された（図２Ｂ）。
【０３０９】
Ｍｙｃモデルシステムで得られた結果を受けて、リンパ腫を有する患者由来の実際のＢＣＲへとさらに進めた。再構成したリンパ腫ＢＣＲのペプチドリガンドを選択するため、数ラウンドの選択を実施し、患者３例に由来するＢＣＲ  ｓｃＦｖに特異的な３つの環状ペプチドＣＩＬＤＬＰＫＦＣ（ＦＬ１）（配列番号１）、ＣＭＰＨＷＱＮＨＣ（ＦＬ２）（配列番号２）、およびＣＴＴＤＱＡＲＫＣ（ＦＬ３）（配列番号３）を発見した。個々の選択されたペプチド−ＣＡＲ融合物を対応する膜係留型ＢＣＲにより共形質導入すると、ＣＤ６９膜発現による測定で、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＴ細胞活性化カスケードを誘発する（図２Ｃ）。
【０３１０】
リンパ腫細胞に対する特異的溶解活性
次に、ＦＬ１−ＣＡＲ構築物、ＦＬ２−ＣＡＲ構築物、およびＦＬ３−ＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞が、単離濾胞性リンパ腫Ｂ細胞受容体（ＦＬ−ＢＣＲ）を形質導入したＲａｊｉリンパ腫細胞系とインキュベートしたとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで殺作用活性を示すかどうかを試験した。Ｆｃならびにビオチン化ＦＬ１ペプチド、ＦＬ２ペプチド、およびＦＬ３ペプチドで染色することによって、悪性細胞由来の機能的ＢＣＲの表面発現を確認した（図３Ａ）。これらの試験により、ペプチドと結合することが可能なＢＣＲがこれらの細胞上に存在することが確認された。
【０３１１】
ＣＡＲ−Ｔを発現するＣＴＬが標的細胞を死滅させることができるかどうかを明らかにするため、ＦＬ１−ＣＡＲ、ＦＬ２−ＣＡＲ、ＦＬ３−ＣＡＲ、またはＣＤ１９−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入を実施した。ペプチド−ＣＡＲを露出している活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＤＨ放出による測定で、対応するリンパ腫由来ＢＣＲを発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ−ＦＬ１、Ｒａｊｉ−ＦＬ２、およびＲａｊｉ−ＦＬ３）を溶解させた（図３Ｂ）。注目すべきなのは、ＦＬ１−ＣＡＲ細胞、ＦＬ２−ＣＡＲ細胞、およびＦＬ３−ＣＡＲ細胞の特異的細胞傷害性が、最もよく研究されており、ＣＤ１９抗原を標的とするＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＦＭＣ６３−ＣＡＲ）と同等であるということである。これとは対照的に、対照ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた場合、最小限の溶解が観察された。また、ＦＬ１−ＣＡＲ、ＦＬ２−ＣＡＲ、およびＦＬ３−ＣＡＲを未改変Ｒａｊｉ細胞とインキュベートした場合、細胞溶解は全く観察されず、ＢＣＲ標的化ＣＡＲＴの治療可能性および安全性が高いことが示唆された（図６）。
【０３１２】
次に、患者１の初期生検試料由来の細胞に対するＦＬ１−ＣＡＲＴの細胞傷害性をｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。生検試料中の細胞のうち６０％超が、ＦＬ１ペプチドに特異的なＢ細胞であった（図３Ｃ、下パネル）。濾胞性リンパ腫を有する別の患者（患者４）に由来する対照生検試料の細胞には、ＦＬ１ペプチドによる有意な染色は全くみられなかった。ＣＴＬアッセイでは、ＦＬ１−ＣＡＲ−Ｔが生検試料由来の細胞を特異的に溶解させ、Ｍｙｃ−ＣＡＲ−ＴおよびＭｏｃｋ  Ｔ細胞には抗腫瘍溶解活性が全くみられないことがわかった（図３Ｄ）。
【０３１３】
ＦＬ１−ＣＡＲで再方向付けしたＣＴＬはｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ腫細胞を抑制する
ＦＬ１−ＢＣＲ（Ｒａｊｉ−ＦＬ１）を発現するＲａｊｉ細胞５×１０６個を移植した免疫不全ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）マウスを用いた濾胞性リンパ腫に関連するモデルでＦＬ１−ＣＡＲＴの効果を試験した（図４Ａ）。ＦＬ１−ＣＡＲ、Ｍｙｃ−ＣＡＲ、またはＣＤ１９−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入したところ、高効率の遺伝子導入が得られた（図４Ｂ）。ＦＬ１−ＣＡＲＴまたはＣＤ１９−ＣＡＲＴを５×ｌ０６個注射したところ、Ｍｙｃ−ＣＡＲＴにより治療した対照群よりも腫瘍量が有意に抑制され、生存率が改善した（図４Ｃおよび４Ｄ、図７Ａ〜７Ｃ）。第３７日、ＦＬ１−ＣＡＲＴ群およびＣＤ１９−ＣＡＲＴ群では８０％の個体が生存していたのに対し、対照Ｍｙｃ−ＣＡＲＴ群のマウスでは１００％が死亡した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＡＲで修飾されたＴ細胞が注入の２１日後にも末梢血中に存在し続け、ＦＬ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞がＭｙｃ−ＣＡＲ−Ｔ細胞よりも有意に多い量で存在することが示された（図４Ｄの挿入図）。予想通り、ＣＤ８＋ＣＡＲ発現Ｔ細胞の拡大は、エフェクター表現型に関連する表面マーカーの発現と相関していた（図４Ｅ）。興味深いのは、末梢血中のＦＬ１−ＣＡＲＴの集団は全般的に、エフェクター記憶サブセットからなるものであるが、脾臓および骨髄は、中枢記憶細胞サブセットによって拡大した（図４Ｆ）。後者の細胞は、抗腫瘍活性の継続および維持に重要なものであると考えられる。
【０３１４】
考察
免疫療法が拡大するにつれて、さらに多数の腫瘍抗原およびその特異的リガンドを発見する方法が必要とされる。現時点で、腫瘍抗原の「メニュー」は少ない（７〜１２）。しかし、リンパ腫の場合、腫瘍抗原は既にＢＣＲとして存在する。さらに、ＢＣＲは、生理学的役割を抗原との結合とする抗体である。このＢＣＲの特性によって、悪性ＢＣＲと相互作用するリガンドを探し求める問題が大幅に簡略化される。本明細書では「強制接近（ｆｏｒｃｅｄ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）」オートクリン法（１３）を用い、この方法では、各レポーター細胞が、細胞表面の大きいペプチドライブラリーのうちの１メンバーと、標的ＢＣＲとを共発現し、これらがレポーター細胞集団の膜に一緒に組み込まれる。オートクリンベースの選択を数ラウンド実施すれば、ＢＣＲに特異的なペプチドリガンドを発見できる。
【０３１５】
ＣＡＲと融合したこれらのペプチドによって改変したＴ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも、よく知られたＣＤ１９標的化ＣＡＲと同程度の効率で腫瘍細胞を除去することが明らかになった。
【０３１６】
この抗原選択法の利点の１つが、パニングを数ラウンド実施した後、選択されたペプチドリガンドが既に１つの構築物となっており、その中で、これらのペプチドリガンドがキメラ抗原受容体と融合している点である。これにより、腫瘍特異的ＣＡＲによって改変した治療用Ｔリンパ球が直ちに得られる。
【０３１７】
つまり、ここに報告するフォーマットは、通常のＣＡＲＴプロトコルとは逆のものである。ＣＡＲ−Ｔを有する細胞では通常、抗体によって方向性が与えられ、標的は腫瘍細胞の表面ペプチドまたはタンパク質となる。ここでは、ＣＡＲ−Ｔの結合がペプチドによって方向付けられ、標的が抗体となるという点で逆のことを用いる。さらに、抗体分子は巨大な多様化系の一部であるため、標的の領域は基本的に無限である。このように標的の領域が大きいことにより、特異性が高く、強固に結合するリガンドを選択する問題が大幅に簡略化される。
【０３１８】
試験する患者の数が増えるにつれて、選択したペプチド配列を用いて、それが由来するタンパク質、および推定により悪性形質転換の駆動力が明らかにされよう。このことに関連して、発見したペプチドが、ミオフェルリンの領域と相同であり、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）およびニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）由来の表面タンパク質の領域と同一であるのは興味深い（図８Ａ〜８Ｅ）。ＭＡＬＴなどの一部のリンパ腫が感染病原体への持続的曝露によって駆動されることが示唆されていることを考えれば、ＢＣＲと結合する抗原がさらに多数発見されるにつれて、リンパ性腫瘍を発生させる駆動力が検討されることになるであろう。最後に、標的としてＣＤ１９以外の配列を使用できれば、治療設定の選択の幅が広がるだけでなく、多数の患者にみられるようにＣＤ１９が存在しないか、ダウンレギュレートされている場合にも役立つものと思われる。
【０３１９】
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【０３２０】
実施例２
濾胞性リンパ腫
進行濾胞性リンパ腫があり、高用量化学療法およびＡＳＣＴを受ける予定の患者に由来するリンパ腫生検試料および患者単核細胞アフェレーシス材料をＮ．Ｎ．Ｐｅｔｒｏｖ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（サンクトペテルブルク、ロシア）から提供された。抗ヒトＣＤ３４マイクロビーズおよびＭＡＣＳ細胞分離技術を製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）通りに用いて、アフェレーシス材料からＣＤ３４＋ＨＳＣを単離した。ＭＡＣＳ分離後の細胞純度は、精製細胞を抗ＣＤ３４−ＰＥコンジュゲート（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で染色後にフローサイトメトリーにより求めたところ、９８％を上回っていた。残りの単核細胞画分をＣＤ８  Ｔ細胞の単離に用いた。ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞をともに、使用まで凍結保存した。生検により入手した新鮮な生存リンパ腫組織試料を３〜５ｍｍ３の小片に切り、６週齢の雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）４匹の複数の部位に皮下移植した（ＳＢ  ＲＡＳのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＧｅｎｅｔｉｃｓにあるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）。
【０３２１】
患者特異的ヒト化マウスの作製
５週齢の成体雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを少なくとも７日間順化させ、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０  Ｅｘａｃｔｏｒ（Ｂｅｓｔ  Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ社）で致死量未満の放射線（３２５ｒａｄ）を全身照射することにより、骨髄破壊を実施した。マウス１８匹に精製ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞を１個体あたり０．２５×１０６個、総体積２００ｍｋｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の形で尾静脈から注射した。移植を実施した全個体をＢＬ−２条件下で飼育し、高圧滅菌処理し、Ｂａｙｔｒｉｌ（エンロフロキサシン）を添加した水を与えた。
【０３２２】
患者特異的ヒト化マウスの免疫再構成の解析
幹細胞移植後のヒト免疫細胞による再構成のレベルを測定するため、無菌ランセット（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、マウスの下顎経路（頬袋）から採血した。血液を毎回、Ｋ２ＥＤＴＡコートＢＤ  ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒキャピラリー採血管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に約１００ｍｋｌ収集した。
【０３２３】
採血管を５００×ｇで５分間遠沈して血漿を分離した。細胞ペレットをＡＣＫ溶解緩衝液で処理してＲＢＣを溶解し、ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を含有するＭＡＣＳ緩衝液で十分に洗浄して、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を濃縮した。
【０３２４】
標準的なＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離技術に従って、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）で対照として用いるヒトＰＢＭＣを白血球除去血液の環から精製した。単核細胞を様々なヒト免疫細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８など）に特異的な蛍光色素コンジュゲート抗体で染色した後、ＬＳＲＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ニュージャージー州）を用いてマルチカラーフローサイトメトリーを実施することにより、免疫表現型検査を実施した。抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、またはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手した。ＦＡＣＳでは、前方および側方散乱プロファイルに基づき、生存リンパ系細胞について細胞にゲートをかけ、大部分の解析をリンパ系ゲート内の細胞に関して実施した。
【０３２５】
ヒトＣＤ４５＋と内因性マウスＣＤ４５＋の割合の比較を実施して、マウスの免疫再構成のレベルを測定した。対応するアイソタイプ対照または未移植個体から単離し染色した細胞を用いて、バックグラウンド染色を決定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．６．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）を用いてデータを解析した。
【０３２６】
移植後の特定の時点で、電気化学発光ベースのＭＳＤプラットフォーム（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いて、マウス血漿中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの具体的なレベルを測定した。ＭＳＤ  ９６ウェルＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｒａｙプレートを１ウェル当たり２０ｍｋｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＩｇＭまたは抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）５ｍｋｌで一晩、４℃でコートした。プレートをＰＢＳ／２％ウシ胎児血清で１時間ブロックした後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で繰り返し洗浄した。マウス血漿試料について、各試料を総体積で１ウェル当たり２０μｌ加え、ヒトＩｇＧレベルについては１：５０〜１：１００の希釈で、ヒトＩｇＭレベルについては１：５００〜１：１０００の希釈で、二重反復にて試験した。上に記載した通りにインキュベーションおよび洗浄した後、濃度２μｇ／ｍｌのＳＵＬＦＯ−Ｔａｇを有するヤギ抗ヒトＩｇ抗体を検出Ａｂとして１ウェル当たり２０μｌ使用し、プレートを室温で１時間インキュベートした。適切な基質を添加することによってプレートを発色させ、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００で製造業者のプロトコル通りに読み取った。ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧ標準品（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ社）を用いて標準曲線を取得し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムｖｅｒｓｉｏｎ  ５を用いてヒトＩｇレベルを算出した。その結果を図９〜１１にまとめる。
【０３２７】
悪性Ｂ細胞上のＢＣＲの特定についてはロシア特許出願第２０１７１３４４８３号に明記されている。悪性細胞上のＢＣＲに対するリガンドのオートクリンベースの選択については、ロシア特許出願第２０１７１３４４８３号に明記されている。レンチウイルスＣＡＲ  Ｔ構築物についてはロシア特許出願第２０１７１３４４８３号に明記されている。
【０３２８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、拡大、および形質導入
アフェレーシスによって収集した患者ＰＢＭＣ画分からのＣＤ８  Ｔ細胞の単離にＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。４０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２を含有する完全ＲＰＭＩ培地中、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を１：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で７２時間活性化した。ＦＬ１−ＣＡＲＴを含むレンチウイルス上清に４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮なＲＰＭＩ培地１ｍｌを加えたもの３ｍｌ当たり４００万個の濃度で活性化Ｔ細胞を再懸濁させ、６ウェルプレートで培養した。プレートを１２００×ｇ、３２℃で９０分間遠心分離し、次いで、３７℃で４時間インキュベートした。２回目および３回目の形質導入をさらに２回実施した。
【０３２９】
ＢＣＲワクチン接種
可溶型の患者濾胞性リンパ腫ＢＣＲを完全長抗体として得るため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＶＨおよびＶＬをｐＦＵＳＥ抗体発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）にクローニングし、産生させた。タンパク質をさらに精製し、Ｌｅｖｙによって記載されている（Ｒ．Ｌｅｖｙ．１９８７  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｉｏｔｙｐｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ［ｓＥｐｊｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＩｇＭ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２８２５．）通りに、０．１％グルタルアルデヒドを用いてキーホールリンペットヘモシアニンと結合させた。ヒトＩｇＧアイソタイプ対照抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１２０００Ｃ）をキーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートし、対照ワクチンとして使用した。フロイント完全アジュバントとＫＬＨ−ＩｇＧをＰＢＳに１００ｍｋｇ／ｍｌで等量乳濁させた乳濁液０．１ｍｌの皮下注射を用いてマウスを免疫感作した。
【０３３０】
動物実験
動物の処置はいずれも、実験動物の適切な使用および管理に関する推奨事項（ＥＣＣ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣ）に厳格に従い実施した。マウスの外科的処置および撮像はいずれも、５０％ケタミンと３８％キシラジンと１２％マレイン酸アセプロマジンの溶液０．０２ｍｌの筋肉内注射によりマウスに麻酔をかけて実施した。雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）マウスから患者Ｂ細胞ＦＬ腫瘍小結節を切り出し、明らかな壊死のない腫瘍断片を等しい３ｍｍ３の小片にスライスし、再構成した患者免疫系を有する１８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス１６匹の皮下に移植した。カリパスで腫瘍体積を測定し、式π／６×（長さ×幅×高さ）を用いて推定した。マウスを３つの実験群に分け、以下のように処置した：
−グループ１：移植後第１０日にＦＬ１−ＣＡＲＴ  ３×１０６個の静脈内注射
−グループ２：移植後第１日、第５日、第１５日にＫＬＨ−患者ＢＣＲワクチンの皮下接種
−グループ３：移植後第１０日にＦＬ１−ＣＡＲＴ  ３×１０６個の静脈内注射＋移植後第１日、第５日、第１５日にＫＬＨ−患者ＢＣＲワクチンの皮下接種
−グループ４：移植後第１０日にＦＬ１−ＣＡＲＴ  ３×１０６個の静脈内注射＋移植後第１日、第５日、第１５日にＫＬＨアイソタイプ対照ワクチンの皮下接種。
【０３３１】
移植後第３８日、マウスを屠殺した。実験群の腫瘍成長速度を図１２に示す。
【０３３２】
このように、静脈内ＦＬ１−ＣＡＲＴ療法と患者ＢＣＲワクチンを用いたワクチン接種を組み合わせることによって、相乗的な腫瘍成長の抑制がもたらされる。それとは逆に、静脈内ＦＬ１−ＣＡＲＴ療法とアイソタイプ対照ワクチンを組み合わせることによって、ＦＬ１−ＣＡＲＴ療法の効果が減少する。
【０３３３】
フローサイトメトリー解析
腫瘍接種後第３８日（ＣＡＲＴ注入後第２１日）に、各実験群の個体を用いて血液を単離した。ＲＢＣ溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で赤血球を溶解させた。合成ＡＣＩＬＤＬＰＫＦＣＧＧＧＳ−Ｂｉｏ（配列番号２９）環状ペプチド（ＧｅｎｅＣｕｓｔ社）およびＦＩＴＣとコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてキメラＦＬ−ＢＣＲの発現を検出し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメータ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により解析した。
【０３３４】
静脈内ＦＬ１−ＣＡＲＴ療法と患者ＢＣＲワクチンを用いたワクチン接種を組み合わせることによって、循環血中のＦＬ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のレベルが最も高くなり、アイソタイプ対照ワクチンとの同時ワクチン接種では、相乗効果は全く得られなかった。
【０３３５】
特異的抗体応答の中規模解析
終末相の血漿試料のＭＳＤ解析を実施して、患者特異的ＢＣＲおよびＩｇＧアイソタイプ対照に対する抗体応答を測定した。
【０３３６】
患者ＢＣＲ抗原およびアイソタイプ対照抗原を２０〜５０ｍｋｇ／ｍｌの濃度で１ウェル当たり５ｍｋｌ加えて高結合ＭＳＤ  ９６ウェルプレート上にコートし、４℃で一晩インキュベートした。１：８０の希釈で血漿試料を試験した。Ｓｕｌｆｏタグ化抗ヒトＩｇを検出抗体として使用し、電気化学発光（ＥＣＬ）基質を用いて反応を発色させ、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で読み取った。
【０３３７】
【表２】
2020536115.tif 000004
【０３３８】
それぞれの抗原に対する血漿反応性のＭＳＤ解析値を測定し、比較した。データを平均±ＳＥＭで表す。静脈内ＦＬ１−ＣＡＲＴ療法と患者ＢＣＲワクチンを用いたワクチン接種を組み合わせることによって、抗ＢＣＲ反応性のレベルがＢＣＲワクチン単独と比較して最大となる。
【０３３９】
上のデータは、両方が同じ個別化癌抗原を標的とするＣＡＲ  Ｔ養子免疫療法とワクチン接種との間に相当量の治療相乗効果（腫瘍成長の阻害ならびに個別化癌抗原に対して方向付けられたＣＡＲ  Ｔ細胞および免疫グロブリンのレベル）がみられることを明確に裏付けるものである。
【０３４０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異を保有するＮＳＣＬＣ
この観察結果をさらに裏付けるため、Ｋｉｒｏｖ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（サンクトペテルブルク）で腫瘍縮小術を受ける予定があり、生検材料のＩＣＨ染色によって腫瘍組織がＥＧＦＲｖＩＩＩ変異陽性であることが確認された進行ＮＳＣＬＣ患者を特定した。
【０３４１】
上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、神経膠腫、ならびに肺癌、乳癌および卵巣癌を含めた特定の他の癌の約３０％に発現する固有のタンパク質を産生する、新規な腫瘍特異的遺伝子の再配置の結果である。リガンド結合ドメインのセグメントの欠失により、ＥＧＦＲｖＩＩＩがリガンドの必要性を回避する。この欠失はエクソン２〜７に及び、融合接合部に新規なグリシン残基の導入をもたらす。この変異体はリガンドとは結合できず、細胞膜に存在し、腫瘍特異的変異を保有する十分に確立された個別化癌モデル抗原の一例である。
【０３４２】
外科手術の２週間前、１０ｍｋｇ／ｋｇのＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｅｏｓｔｉｍ、Ｐｈａｒｍｓｙｎｔｈｅｚ社）を１日１回、５日連続で皮下に投与することにより患者に動員を実施した。動員された末梢血幹細胞をＣｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓシステムで収集した。毎日収集する度に約３〜６体積の血液を処理し、これを最大１１時間継続した。患者に毎日のアフェレーシス処置を２回実施して、ＣＤ３４＋細胞を１ｋｇ当たり２×１０６個収集した。抗ヒトＣＤ３４マイクロビーズおよびＭＡＣＳ細胞分離技術を製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）通りに用いて、アフェレーシス材料からＣＤ３４＋ＨＳＣを単離した。ＭＡＣＳ分離後の細胞純度は、精製細胞を抗ＣＤ３４−ＰＥコンジュゲート（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で染色後にフローサイトメトリーにより求めたところ、９８％を上回っていた。残りの単核細胞画分をＣＤ８  Ｔ細胞の単離に用いた。ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞をともに、使用まで凍結保存した。患者の外科手術で入手した新鮮な生存腫瘍組織試料を３〜５ｍｍ３の小片に切り、６週齢の雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）４匹の複数の部位に皮下移植した（ＳＢ  ＲＡＳのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＧｅｎｅｔｉｃｓにあるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）。
【０３４３】
患者特異的ヒト化マウスの作製
５週齢の成体雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを少なくとも７日間順化させ、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０  Ｅｘａｃｔｏｒ（Ｂｅｓｔ  Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ社）で致死量未満の放射線（３２５ｒａｄ）を全身照射することにより、骨髄破壊を実施した。マウス１８匹に精製ＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞を１個体あたり０．２５×１０６個、総体積２００ｍｋｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の形で尾静脈から注射した。移植を実施した全個体をＢＬ−２条件下で飼育し、高圧滅菌処理し、Ｂａｙｔｒｉｌ（エンロフロキサシン）を添加した水を与えた。
【０３４４】
免疫再構成の解析
第６週、第１２週、および第１８週に、免疫再構成の解析を上記の通りに実施した。
データを図１４〜１６に示す。
【０３４５】
ＣＡＲ  Ｔレンチウイルスベクター
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇによって記載されている（Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｏｃｔ；２３（１０）：１０４３−１０５３）通りに、ＣＤ２８−４１ΒＢ−Ｃｕ３ζ由来のＴ細胞シグナル伝達ドメインに対するヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体１３１由来のｓｃＦｖ配列を用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化１３９−ｓｃＦｖ−ベースのＣＡＲベクターを組み立てた。ＣＤ２８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζをコードするＤＮＡフラグメントを合成し（ＧｅｎｅＣｕｓｔ社）、ｐＬＶ２レンチウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にＥＦ１ａプロモーターの制御下でクローニングした。遺伝子の配置は以下の順序である：ＩＬ２−シグナル配列、１３９−ｓｃＦｖ、ＧＧＧＳリンカー；ＣＤ２８膜貫通および細胞内領域；ＯＸ−４０およびＣＤ３ｚｅｔｔａの細胞内ドメイン。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｐＬＶ２−１３９−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−４１ＢＢ−ＣＤ３ｚｅｔｔａプラスミドおよびパッケージングプラスミド（第二世代）との共トランスフェクションによりレンチウイルスを調製した。トランスフェクションから４８時間後、ウイルスが含まれる上清を収集した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてレンチウイルス調製物の力価を求めた。
【０３４６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、拡大、および形質導入
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、アフェレーシスによって収集した患者ＰＢＭＣ画分からＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。４０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２を含有する完全ＲＰＭＩ培地中、１：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を７２時間活性化した。ＣＤ２８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを含むレンチウイルス上清に４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮なＲＰＭＩ培地１ｍｌを加えたもの３ｍｌ当たり４万個の細胞濃度で活性化Ｔ細胞を再懸濁させ、６ウェルプレートで培養した。プレートを１２００×ｇ、３２℃で９０分間遠心分離し、次いで、３７℃で４時間インキュベートした。２回目および３回目の形質導入をさらに２回実施した。
【０３４７】
ワクチン接種
Ｂｉｇｎｅｒによって記載されている（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｒｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ．Ｄａｒｅｌｌ  Ｄ．Ｂｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｊｕｌ  １５；５５（１４）：３１４０−８．）通りに、融合接合部のアミノ酸配列に対応する１４アミノ酸ペプチド（ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ）（配列番号３０）を合成し、精製し、キーホールリンペットヘモシアニンと結合させた。ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号３０）は、抗体１３９によって認識されるエピトープであり、１３９−ｓｃＦｖベースのＣＡＲの設計に使用される。フロイント完全アジュバントとＫＬＨ−ＬＥＥＫをＰＢＳに１００ｍｋｇ／ｍｌで等量乳濁させた乳濁液０．１ｍｌの皮下注射を用いてマウスを免疫感作した。
【０３４８】
動物実験
動物の処置はいずれも、実験動物の適切な使用および管理に関する推奨事項（ＥＣＣ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣ）に厳格に従い実施した。マウスの外科的処置および撮像はいずれも、５０％ケタミンと３８％キシラジンと１２％マレイン酸アセプロマジンの溶液０．０２ｍｌの筋肉内注射によりマウスに麻酔をかけて実施した。雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）マウスから患者ＮＳＣＬＣ腫瘍小結節を切り出し、明らかな壊死のない腫瘍断片を等しい３ｍｍ３の小片にスライスし、再構成した患者免疫系を有する１８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス１５匹の皮下に移植した。カリパスで腫瘍体積を測定し、式π／６×（長さ×幅×高さ）を用いて推定した。マウスを３つの実験群に分け、以下のように処置した：
−グループ１：移植後第１０日にＣＤ２８−４１ＢＢ−Ｃｕ３ζ−ＣＡＲＴ  ３×１０６個の静脈内注射
−グループ２：移植後第１日、第５日、第１５日にＫＬＨ−ＬＥＥＫワクチンの皮下接種
−グループ３：移植後第１０日にＣＤ２８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−ＣＡＲＴ  ３×１０６個の静脈内注射＋移植後第１日、第５日、第１５日にＫＬＨ−ＬＥＥＫワクチンの皮下接種。
【０３４９】
移植後第３８日に、マウスを屠殺した。実験群の腫瘍成長速度を図１８に示す。
【０３５０】
データは、両方が同じ個別化癌抗原を標的とするＣＡＲ  Ｔ養子免疫療法とワクチン接種との間に相当量の治療相乗効果がみられることを明確に裏付けるものである。
【０３５１】
実施例３
ファージディスプレイによるＢ細胞受容体リガンドの特定方法
悪性ＢＣＲ特異的部分の特定には、レポーター細胞に代わる一般的な代替物として、ファージディスプレイした環状ペプチドライブラリーのパニングを実施し得る。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社のＰｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーなどの市販のファージ−ペプチドライブラリーを使用し得る。Ｐｈ．Ｄ．（商標）−Ｃ７Ｃ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔは、無作為化のために、図１９に示すようにシステインと隣接するＮＮＫコード部分を用いるものである。本明細書では、悪性ＢＣＲ特異的ペプチドを特定するために改変したＮＥＢプロトコルを提供する。パニングの各ラウンドでネガティブ選択インキュベーションを実施することが推奨される。
【０３５２】
パニング手順：
１．ＬＢ＋Ｔｅｔ培地１０ｍｌに力価測定に使用するＥＲ２７３８を接種する。溶出ファージを同じ日に増幅する場合、２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ（５０ｍｌコニカルチューブは使用しない）に入れたＬＢ培地２０ｍｌにもＥＲ２７３８も接種する。両培養物を３７℃で激しく振盪しながらインキュベートする。ＥＲ２７３８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株Ｆ’ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｌａｃｌｑＡ（ｌａｃＺ）Ｍ１５  ｚｚｆ：：ＴｎｌＯ（ＴｅｔＲ）／ｆｈｕＡ２  ｇｌｎＶ  Ａ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｔｈｉ−１  Ａ（ｈｓｄＳ−ｍｃｒＢ）５である。
２．抗体の捕捉に適したアフィニティービーズの５０％水性懸濁液５０μｌを微量遠心管に移す。ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）１ｍｌを加える。遠心管を軽くタップしてレジンを懸濁させる。
３．磁気捕捉によってレジンをペレット化する。慎重にピペットで吸い出し、上清を捨てる。
４．ブロッキング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３（任意選択）。ろ過滅菌、４℃で保管）１ｍｌにレジンを懸濁させる。
５．時折かき混ぜながら、４℃で６０分間インキュベートする。
６．その間、ファージ２×１０９個とネガティブ選択抗体２ｍｋｇとを混合して、ＴＢＳＴで最終体積を２００μｌとする。
７．室温で２０分間インキュベートする。
８．段階４のブロッキング反応の後、段階３のようにレジンをペレット化し、ＴＢＳＴ  １ｍｌで４回洗浄し、毎回レジンをペレット化する。
９．レジンを１ｍｌで再懸濁させ、２本の別個の管（それぞれ５００ｍｋｌ）に等分する。
１０．洗浄済みレジンの入った第一の管にファージとネガティブ抗体の混合物を移す。穏やかにかき混ぜ、室温で１５分間、時折かき混ぜながらインキュベートする。
１１．段階３のようにレジンをペレット化し、上清を収集する。
１２．上清と悪性ＢＣＲ抗体２ｍｋｇとを混合する。
１３．室温で２０分間インキュベートする。
１４．段階３のようにレジンをペレット化し、上清を捨て、ＴＢＳＴ  １ｍｌで１０回洗浄し、毎回レジンをペレット化する。
１５．レジンをグリシン溶離緩衝液（０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）１ｍｌに再懸濁させることによって、結合したファージを溶離させる。
１６．室温で１０分間インキュベートする。
１７．１分間磁化することによってレジンをペレット化する。
１８．ペレット化したレジンを乱さないよう注意しながら、上清を新たな微量遠心管に慎重に移す。
１９．直ちに１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）１５０μｌで溶離液を中和する。
２０．残りの溶離液を段階１のＥＲ２７３８培養物（対数増殖期初期でなければならない；後期ではない）２０ｍｌに加え、３７℃で激しく振盪しながら４．５時間インキュベートすることによって増幅する。
２１．培養物を遠心管に移し、１２，０００ｇ、４℃で１０分間回転させる。上清を新たな管に移し、再び回転させる（ペレットを捨てる）。
２２．上清の上側８０％をピペットで新たな管に移し、それに６分の１体積の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加える。
２３．４℃で２時間または一晩、ファージを沈殿させる。
２４．ＰＥＧ沈殿物を１２，０００ｇ  ｒｐｍ、４℃で１５分間回転させる。
２５．上清を傾瀉して捨て、短時間再び回転させ、残った上清をピペットで除去する。
２６．ペレットをＴＢＳ  １ｍｌに懸濁させる。懸濁液を管に移し、４℃で５分間回転させて、残った細胞をペレット化する。
２７．上清を新たな微小遠心管に移し、６分の１体積の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌで再び沈殿させる。
２８．氷上で１５〜６０分間インキュベートする。
２９．１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間微量遠心分離する。
３０．上清を捨て、短時間再び回転させ、残った上清をマイクロピペットで除去する。
３１．ペレットをＴＢＳ  ２００μｌに懸濁させる。
３２．１４，０００ｒｐｍで１分間微量遠心分離して、残ったあらゆる不溶性物質をペレット化する。
３３．上清を新たな管に移す。これを増幅溶離液とする。
３４．第二ラウンドおよび第三ラウンドのパニングを実施する。
【０３５３】
ＥＬＩＳＡおよびシーケンシングのためのプラーク増幅：
１．ＥＲ２７３８の一晩培養物をＬＢで１：１００に希釈する。希釈した培養物１ｍｌを９６ウェルディープウェルプレート（＃２６０２５１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に分注する。特徴付けする各抗体に対してプレートを２つ使用する。
２．ファージプレートの青いプラークを穿刺する。
３．マイクロプレートテープシーラーを用いてプレートを覆う。
４．プレートを３７℃で振盪しながら４．５〜５時間インキュベートする。
５．プレートを２５０ｇ、室温で１０分間遠心分離する。
６．慎重に上清７００ｍｋｌを収集し、新たなプレートに移す。
７．これを増幅ファージストックとし、４℃で２日間保管できる。
【０３５４】
ファージＥＬＩＳＡ結合アッセイ：
１．ＥＬＩＳＡプレートウェルを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）中１００μｇ／ｍｌの悪性ＢＣＲ抗体またはネガティブ対照抗体１００μｌでコートする。
２．４℃で一晩インキュベートする。
３．各プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。
４．ＰＢＳＴ中５％のミルクでＥＬＩＳＡプレートウェルをブロックする。
５．室温で１時間インキュベートする。
６．各プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。
７．ブロックした別個のプレートで、ファージ上清の４倍段階希釈を実施する。
８．マルチチャンネルピペッターを用いて、各列の希釈したファージ１００μｌを抗体コートウェルの列に移す。
９．室温で攪拌しながら２時間インキュベートする。
１０．各プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。
１１．ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃２７−９４２１−０１）を製造業者が推奨する最終希釈率になるまでブロッキング緩衝液で希釈する。希釈したコンジュゲート２００μｌを各ウェルに加える。
１２．室温で攪拌しながら１時間インキュベートする。
１３．各ウェルに基質溶液５０μｌを加え、室温で穏やかに攪拌しながら１０〜６０分間インキュベートする。
１４．４１５ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いてプレートを読み取る。各ファージクローンについて、ネガティブ対照および悪性ＢＣＲ抗体で得られたシグナルを比較する。
【０３５５】
ファージＤＮＡのシーケンシング：
１．ファージが含まれる上清５００μｌを新たな微量遠心管に移す。
２．２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ  ２００μｌを加える。数回反転させて混合し、室温で１０〜２０分間静置する。
３．１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間微量遠心分離し、上清を捨てる。ファージペレットが見えないことがある。
４．短時間再び回転させる。残ったすべての上清をピペットで慎重に吸い出して捨てる。
５．管を激しくタップすることによって、ペレットをヨウ化物緩衝液１００μｌに十分に懸濁させる。
６．エタノール２５０μｌを加える。
７．室温で１０〜２０分間インキュベートする。
８．微量遠心機で１４，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間回転させる。
９．上清を捨てる。
１０．ペレットを氷冷７０％エタノール０．５ｍｌで洗浄する。
１１．ペレットをＴＥ緩衝液３０μｌに懸濁させる。
１２．ＴＥ緩衝液に溶かしたＤＮＡ  ５μｌをシーケンシングの鋳型として使用する。
１３．ＤＮＡシーケンシングに逆方向プライマー（ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＣＣ（配列番号４１））を使用する。
【０３５６】
パニングの結果を下の表に示す。ディスプレイには、ＩｇＧ１フォーマットの完全長濾胞性リンパ腫ＢＣＲを用いた。患者ＦＬ１については、実施例１に記載した通りである。
【０３５７】
表３に、示されるファージ濃度における、患者ＦＬ１のＢＣＲに対するＩ〜ＩＩＩラウンドのパニングで得られた増幅ファージと、患者ＦＬ１およびＦＬ５のＢＣＲとの結合に関するＥＬＩＳＡの結果を示す。図２０にも結果を示す。
【表３】
2020536115.tif 000005
【０３５８】
表４に、患者ＦＬ１のＢＣＲに対するＩＩＩラウンドのパニング後に個々のプラークから得られたファージと患者ＦＬ１のＢＣＲとの結合に関するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【表４】
2020536115.tif 000006
【０３５９】
表５に、患者ＦＬ１のＢＣＲに対するＩＩＩラウンドのパニング後に個々のプラークから得られたファージと、患者ＦＬ５のＢＣＲとの結合に関するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【表５】
2020536115.tif 000007
【０３６０】
表４のポジティブクローンを増幅し、シーケンシングを実施した。配列、表４での位置、およびＯＤを下の表６に示す。患者ＦＬ１のＢＣＲと結合することが確認されたペプチドはまた、実施例１でオートクリンシグナル伝達法を用いてＢＣＲリガンドであることが確認されたものである。
【０３６１】
【表６】
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【０３６２】
表６に示されるように、ＦＬ１患者のＢＣＲに特異的な環状ペプチドを特定した後、配列を第三世代ＣＡＲレンチウイルスベクターにクローニングした。ＥｃｏＲＩクローニング部位およびＮｈｅｌクローニング部位に隣接する選択した環状ペプチドをコードする２つの相補的なプライマーを合成した。
プライマー  ＦＬ１ペプチド  ＦＷ
ＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＧＧＣＴＡＧＣ（配列番号４３）
プライマー  ＦＬ１ペプチド  Ｒｅｖ
ＧＣＴＣＧＣＴＡＧＣＣＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡ（配列番号４４）
【０３６３】
増幅後、ＰＣＲ産物をｐＬＶ２−Ｆｃ−ＣＡＲベクターのＥｃｏＲＩ制限部位およびＮｈｅｌ制限部位にクローニングした。
【０３６４】
その他の実施形態
本明細書に開示される特徴はいずれも、任意の組合せで組み合わせ得る。本明細書に開示される特徴はそれぞれ、同じ、同等の、または同様の目的に適う代替的特徴に置き換え得る。したがって、別途明記されない限り、開示される特徴はそれぞれ、全般的な一連の同等の、または同様の特徴の一例に過ぎない。
【０３６５】
当業者には上の記載から、本発明に不可欠な特徴を容易に確認することが可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な改変および修正を施して、それを様々な使用および条件に適合させることが可能である。したがって、他の実施形態も請求項の範囲内にある。
【０３６６】
均等物
本明細書には、本発明の実施形態が複数記載および説明されているが、当業者には、機能を実施し、かつ／または本明細書に記載される結果および／または１つもしくは複数の利点を得るための様々な他の手段および／または構成が容易に想像され、このような変形および／または修正はそれぞれ、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲に内にあると見なされる。さらには、一般に、本明細書に記載されるパラメータ、寸法、材料、および配置はいずれも例示を意図するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または配置は、本発明の教示を用いる具体的な１つまたは複数の用途によって決まることが当業者に容易に理解されよう。当業者には、ルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される具体的な本発明の実施形態の均等物が多数認識される、または確認することが可能であろう。したがって、上記の実施形態が単なる例として示されるものであり、添付の請求項およびその均等物の範囲内において、具体的に記載および特許請求される以外の方法で、諸実施形態を実施し得ることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載される個々のそれぞれの特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関するものである。さらに、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに相容れないものでなければ、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組合せが本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０３６７】
本明細書で定義および使用される定義はいずれも、定義される用語の辞書での定義、参照により組み込まれる文献での定義、および／または通常の意味に対して支配的な位置にあることが理解されるべきである。
【０３６８】
本明細書に開示される参考文献、特許、および特許出願はいずれも、それが引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文献全体がそれに包含されることもある。
【０３６９】
本明細書および請求項で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【０３７０】
本明細書および請求項で使用される「および／または」という語句は、そのように等位結合される要素の「一方または両方」、すなわち、いくつかの場合には接続的に存在し、別の場合には選言的に存在する要素を意味するものであると理解されるべきである。「および／または」用いて列挙される複数の要素も同じように、すなわち、「１つまたは複数の」要素がそのように等位結合されていると解釈されるべきである。「および／または」節によって具体的に特定される要素以外にも、具体的に特定されるその要素と関係があるか、無関係であるかを問わず、任意選択で他の要素が存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言葉とともに「Ａおよび／またはＢ」と言う場合、それは、一実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指し得る。
【０３７１】
本明細書および請求項で使用される「または」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、１つのリストのなかの項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的なものである、すなわち、多数の要素または要素のリストのうち少なくとも１つの要素を含むだけでなく、２つ以上の要素、および任意選択で、列挙されていない他の項目を含むものと解釈されるべきである。「〜のうちの１つのみ」もしくは「〜のうちのちょうど１つ」、または請求項で使用される「〜よりなる」など、そうでないことが明記される用語に限り、多数の要素または要素のリストのうちちょうど１つの要素が含まれることを指す。一般に、本明細書で使用される「ｏｒ」という用語は、「いずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちの１つのみ」、または「〜のうちのちょうど１つ」などの排他的用語が先行する場合、排他的選択肢（すなわち、「一方または他方であって、両方ではない」）を示すものとのみ解釈されるべきである。請求項で使用される「〜より実質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【０３７２】
本明細書および請求項で１つまたは複数の要素のリストを指して使用される「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストのなかの要素のうちの任意の１つまたは複数のものから選択される、少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストのなかに具体的に列挙されている少なくとも１つの要素および全要素を必ずしも含むものではなく、要素のリストのなかの要素の任意の組合せを除外するものではないことが理解されるべきである。この定義はまた、任意選択で、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリストのなかで具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素と関係があるか、無関係であるかを問わず存在し得ることを認めるものである。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」も同様に、もしくは「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」も同様に）一実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＡが存在し、Ｂは存在しないこと（および任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＢが存在し、Ａは存在しないこと（および任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＡと、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＢ（および任意選択で、他の要素を含む）などを指し得る。
【０３７３】
また、本明細書で特許請求され、２つ以上の段階または行為を含む方法ではいずれも、そうでないことが明記されない限り、その方法の段階または行為の順序は、必ずしもその方法の段階または行為が記載されている順序に限定されないことが理解されるべきである。
【図１】
2020536115.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020536115.tif 000011
【図２Ｃ】
2020536115.tif 000012
【図３Ａ】
2020536115.tif 000013
【図３Ｂ】
2020536115.tif 000014
【図３Ｃ】
2020536115.tif 000015
【図３Ｄ】
2020536115.tif 000016
【図４Ａ】
2020536115.tif 000017
【図４Ｂ】
2020536115.tif 000018
【図４Ｃ】
2020536115.tif 000019
【図４Ｄ】
2020536115.tif 000020
【図４Ｅ】
2020536115.tif 000021
【図４Ｆ】
2020536115.tif 000022
【図５Ａ】
2020536115.tif 000023
【図５Ｂ】
2020536115.tif 000024
【図５Ｃ】
2020536115.tif 000025
【図６】
2020536115.tif 000026
【図７Ａ】
2020536115.tif 000027
【図７Ｂ】
2020536115.tif 000028
【図７Ｃ】
2020536115.tif 000029
【図８Ａ】
2020536115.tif 000030
【図８Ｂ】
2020536115.tif 000031
【図８Ｃ】
2020536115.tif 000032
【図８Ｄ】
2020536115.tif 000033
【図８Ｅ】
2020536115.tif 000034
【図９】
2020536115.tif 000035
【図１０】
2020536115.tif 000036
【図１１】
2020536115.tif 000037
【図１２】
2020536115.tif 000038
【図１３】
2020536115.tif 000039
【図１４】
2020536115.tif 000040
【図１５】
2020536115.tif 000041
【図１６】
2020536115.tif 000042
【図１７】
2020536115.tif 000043
【図１８】
2020536115.tif 000044
【図１９】
2020536115.tif 000045
【図２０】
2020536115.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月10日(2020.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020536115000001.app
【国際調査報告】
2020536115.tif 000047
2020536115.tif 000048
2020536115.tif 000049
2020536115.tif 000050
2020536115.tif 000051
2020536115.tif 000052
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