(57)【要約】  本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含む、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療において使用するためのポリプレックスに関し、該ポリマー接合体は線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々が該１つ以上のリンカーのうちの１つを介して該１つ以上の標的化部分のうちの１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々が癌抗原に結合することができ、該癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である。さらに、本発明はＣＲＰＣの治療において使用するための医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含む、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療における使用のためのポリプレックスであって、
前記ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、
前記ＬＰＥＩは１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、前記１つ以上のＰＥＧ部分の各々が前記１つ以上のリンカーのうちの１つを介して前記１つ以上の標的化部分のうちの１つに接合し、
前記１つ以上の標的化部分の各々が、癌抗原に結合することができ、
前記癌抗原が前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、使用のためのポリプレックス。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡが、ポリイノシン−ポリシチジン酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である、請求項１に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項３】
前記ＬＰＥＩが、１つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合しているかまたは３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合している、請求項１または２に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項４】
前記リンカーがペプチド部分であり、前記ペプチド部分が３〜７個のアミノ酸残基からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項５】
前記ペプチド部分がアミノ酸残基−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−を含む、請求項４に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項６】
前記ペプチド部分が、
−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）、または
−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）である、請求項５に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項７】
前記ポリマー接合体が式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）から選択され、
（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ、
（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ、
（ｃ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、または
（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、
前記Ｔが前記標的化部分を表す、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項８】
前記ポリマー接合体が式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなる群より選択され、
2020535171.tif 000017
式中、Ｒ１は以下であり、
2020535171.tif 000018
2020535171.tif 000019
式中、Ｒ２は以下であり、
2020535171.tif 000020
2020535171.tif 000021
式中、Ｒ１は以下であり、
2020535171.tif 000022
2020535171.tif 000023
式中、Ｒ２は以下であり、
2020535171.tif 000024
前記Ｔは前記標的化部分を表し、
ｎは４０〜４５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項９】
前記標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ部分）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項１０】
ＣＲＰＣが非転移性ＣＲＰＣまたは転移性ＣＲＰＣであり、好ましくはＣＲＰＣが転移性ＣＲＰＣである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項１１】
前記ＣＲＰＣがアンドロゲン受容体（ＡＲ）非依存性ＣＲＰＣまたはＡＲ依存性ＣＲＰＣであり、好ましくは前記ＣＲＰＣがＡＲ非依存性ＣＲＰＣである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス
【請求項１２】
前記アンドロゲン受容体（ＡＲ）非依存性ＣＲＰＣが神経内分泌前立腺癌である、請求項１１に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項１３】
前記ポリプレックスが免疫細胞と組み合わせて使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項１４】
前記免疫細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）、腫瘍特異的改変Ｔ細胞、および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からなる群より選択される、請求項１３に記載の使用のためのポリプレックス。
【請求項１５】
去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体および請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリプレックスを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は前立腺癌治療の分野に関する。具体的には、本発明は、ポリプレックスおよび当該ポリプレックスを含む医薬組成物に関し、それらはいずれも、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療における使用のためのものである。該ポリプレックスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含み、該ポリマー接合体は線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは該１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々が該１つ以上のリンカーのうちの１つを介して該１つ以上の標的化部分のうちの１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々が癌抗原に結合することができ、該癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は世界的に男性で２番目に最も一般的に診断される種類の癌であると考えられる。放射線または外科手術による治療後に生化学的な再発が診断される場合、観察またはアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）のいずれかが標準的治療である。アンドロゲン除去による治療は短期寛解を達成するには非常に効果的であるが、ほとんどの患者はこの治療に抵抗性となり、疾患が進行し、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を発症する（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１６，３０（４）：３３６−４４、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１６，２７：１６８１−１６８９）。
【０００３】
転移性の去勢抵抗性前立腺癌を有する男性の緩和管理のために、ドセタキセルおよびプレドニソンは、寛容性に加えて生存の延長、腫瘍応答、疼痛減少および改善された生活の質に基づいて、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２００４年に承認された（Ｔａｎｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｐｌｕｓ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ｏｒ  ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｐｌｕｓ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００４，３５１（１５）：１５０２−１２）。ドセタキセルの承認にもかかわらず、無増悪生存期間の平均は依然として約６ヶ月であり、全体的な生存期間は化学療法を行って２年未満である（Ｂｅｌｌｍｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：ｎｅｗ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０，２（３）：１８９−２０７）。
【０００４】
ＦＤＡが第２相の転移性去勢抵抗性前立腺癌の治療として２０１０年にカバジタキセルを承認したので、さらなる進歩は見られた。しかしながら、多剤耐性および細胞傷害性剤の安全性の心配のために、前立腺癌の化学療法はなお望ましくないようである（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、前掲）。
【０００５】
救済化学療法の分野の努力は、プラチナ製剤および新規の微小管標的化剤を含む数種類の細胞傷害性剤に焦点を当ててきた。しかしながら、プラチナ製剤サトラプラチンのようなもともと有望な物質では統計的に有意な利益を欠いており、このことはこの疾患の化学療法単独の興味を減少させてきた。このことは、標的化剤単独または化学療法と組み合わせる方向への理論的根拠をつくる（Ｂｅｌｌｍｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１０、前掲）。
【０００６】
いくつかの治験薬は、前立腺癌の病原性、維持および進行の経路を標的化する。これらは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１経路を標的化する治療法を含む。前臨床的証拠がこれらの分子的経路の重要性を支持するとしても、ほとんどのこれらの薬物の臨床試験は未成熟なままである（Ｂｅｌｌｍｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１０、前掲）。
【０００７】
いくつかの小分子薬物接合体が報告されており、その中には前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的化するものもある。ＰＳＭＡは、正常な前立腺と比べて、前立腺癌細胞によって非常に高い割合で発現される細胞表面糖タンパク質である（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３，８１−８５）。
【０００８】
前立腺癌の標的画像化および化学療法のための小分子薬物接合体（Ｔ−ＳＭＤＣ）のセラノスティクデザインが開発された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）足場上に構築されたＴ−ＳＭＤＣの構造は、（ｉ）６８Ｇａの陽電子放出放射性同位体で標識された時の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像化のためのキレート部分、（ｉｉ）前立腺癌標的化のための前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）特異的リガンド、および（ｉｉｉ）化学療法のための細胞傷害性剤（ＤＭ１）からなる。概念実証のために、例えばＴ−ＳＭＤＣ、ＮＯ３Ａ−ＤＭ１−Ｌｙｓ−Ｕｒｅａ−Ｇｌｕが合成され、評価された（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、前掲）。
【０００９】
ＰＥＩ、ＰＥＧおよび標的化部分のポリプレックスを用いるｄｓＲＮＡ（ＰＥＩ−ＰＥＧ−標的化部分／ｄｓＲＮＡポリプレックス）の標的化送達が開発された。これらの接合体の標的化部分は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上記成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）であり得る癌抗原に結合する（ＷＯ  ２０１５／１７３８２４）。
【００１０】
したがって、去勢抵抗性前立腺癌の効果的な治療法の強い必要性がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、本明細書にこの要件を満たす新しい手法を提示し、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療を提供する。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含む去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療において使用するためのポリプレックスであって、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは該１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々は該１つ以上のリンカーの１つを介して該１つ以上の標的化部分の１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々は癌抗原に結合することができ、該癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、使用のためのポリプレックスに関する。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体、および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含む本発明のポリプレックスを含み、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは該１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々は該１つ以上のリンカーの１つを介して該１つ以上の標的化部分の１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明者らは驚くべきことに、本発明のポリプレックスがＣＲＰＣに効果的な治療であることを見出した。
【００１５】
標的化されたポリプレックスは、ｐｏｌｙＩＣ等のｄｓＲＮＡの、ＣＲＰＣの組織に含まれたＰＳＭＡ過剰発現細胞への選択的送達を許容する。ＤｓＲＮＡ特にポリイノシン−ポリシトシン（ポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ、ｐｏｌｙＩＣ）は、細胞系の複数の死亡経路を活性化する。癌細胞への取り込み後に、ｐｏｌｙＩＣはアポトーシスを誘導し、標的化癌細胞の急速かつ効果的なクリアランスをもたらす。さらに、ｐｏｌｙＩＣは、標的化細胞のならず、非標的化隣接腫瘍細胞を殺す、腫瘍に対する免疫系を活性化する「バイスタンダー効果」を誘導する。
【００１６】
両効果の組み合わせは、ＣＲＰＣを有する患者の強力な治療を提供し、これは異種の腫瘍の退行をもたらし、薬物耐性の発症を防ぐ。しかしながら、ネイキッドｄｓＲＮＡおよび特にｐｏｌｙＩＣは、高い毒性を有し、それ自体、全身性用途には好適でない。
【００１７】
そのため、発明者らは、ｐｏｌｙＩＣ等のｄｓＲＮＡの、ＰＳＭＡ過剰発現細胞への選択的送達のための標的化ポリプレックスを開発した。ＣＲＰＣ標的としてのＰＳＭＡを用いて、ｄｓＲＮＡを含む本発明のポリプレックスは、高度にＰＳＭＡを過剰発現するＣＲＰＣ細胞および組織に直接的かつ選択的に送達される。前立腺癌の初期段階と比べて、ＰＳＭＡ発現は高いステージの癌、転移性疾患およびホルモン不応性前立腺癌でさらに増加する。さらに、ＰＳＭＡ発現は、アンドロゲンレベルによって不可逆的に調節される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ−  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８，５８，４０５５−４０６０）。したがって、標的としてＰＳＭＡを用いることは、本発明のポリプレックスのＣＲＰＣ細胞への選択的送達を許容する。
【００１８】
ｐｏｌｙＩＣは全身的に投与されると非常に毒性が高いので、その使用は狭い治療濃度域に限定される。ｄｓＲＮＡをＣＲＰＣ細胞に選択的に標的化することによって、その能力を利用することができ、同時に全身的使用で典型的に受ける毒性を避ける。さらに、標的化送達は、非常に低用量が使用できるとの利点を提供し、これはｐｏｌｙＩＣの寛容性も改善する。
【００１９】
本発明のポリプレックスは、ｐｏｌｙＩＣのＣＲＰＣ細胞への選択的送達および内在化を許容し、アポトーシスを誘導し、サイトカイン分泌および免疫細胞（ヒト末梢血単核球、ＰＢＭＣ）の補充を許容する。アンドロゲン抵抗性前立腺癌のインビボ腫瘍モデルでは、腫瘍過剰発現ＰＳＭＡを有する部分的に再構築された免疫系を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、ｐｏｌｙＩＣを含む本発明のＰＳＭＡ標的化ポリプレックスで処置した。腫瘍成長は、本発明のポリプレックスの投与後に妨げられたかまたは退行した。したがって、本発明者らは、本発明のポリプレックスがＣＲＰＣの治療に顕著な効果を有することを示した。
【００２０】
証明されたインビボおよびインビトロ効果は、本発明のポリプレックスがＣＲＰＣ組織に送達されるのみならず、本発明のポリプレックスの設計が、ＣＲＰＣ組織を透過し、ＣＲＰＣ細胞に内在化し、ＣＲＰＣ細胞に対する抗腫瘍効果を有するようになされている、との結論を導いた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】Ａ．ＤＵＰＡ−ペプチドリンカーの構造、Ｂ．ＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０接合体のＰＳＭＡ過剰発現細胞への選択的取り込み。ＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０で処置後の培養されたＰＣ３−ＰＳＭＡおよびＬＮＣａＰ細胞または対照細胞ＭＣＦ７の顕微鏡画像（レーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡による視覚化）。蛍光Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０のシグナルを白で示す。
【図１Ｂ】Ａ．ＤＵＰＡ−ペプチドリンカーの構造、Ｂ．ＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０接合体のＰＳＭＡ過剰発現細胞への選択的取り込み。ＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０で処置後の培養されたＰＣ３−ＰＳＭＡおよびＬＮＣａＰ細胞または対照細胞ＭＣＦ７の顕微鏡画像（レーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡による視覚化）。蛍光Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０のシグナルを白で示す。
【図２Ａ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置で起こったＰＳＭＡ過剰発現細胞中における選択的細胞死およびアポトーシス。  Ａ．ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＰＣ３−ＰＳＭＡ、ＰＣ３およびＭＣＦ７細胞を、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれた０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩＣで処置した。対照：ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩまたはｐｏｌｙＩＣ単独で処置、あるいは非処置（ＵＴ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による処置の開始後９６時間での細胞生存率の測定（＊＊＊Ｐ≦０．００１  ＬＮＣａＰまたはＶＣａＰまたはＰＣ３−ＰＳＭＡ対ＭＣＦ７またはＰＣ３、＊＊＊＊Ｐ≦０．００１  １μｇ／ｍｌ  ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ対１μｇ／ｍｌ  ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩまたは１μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙＩＣ単独）。
【図２Ｂ】Ｂ．ＬＮＣａＰ細胞をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで処置した。表示の濃度はＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による細胞生存性の測定。
【図２Ｃ】Ｃ．ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置によるアポートーシスシグナル伝達経路の活性化。ＬＮＣａＰ細胞からの全細胞溶解物をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ（２μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙＩＣ）で処置し、開裂／完全長カスパーゼ３、開裂／完全長ＰＡＲＰ３およびＧＡＰＤＨの発現レベルをウェスタンブロットで検出した。
【図３Ａ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置による前炎症性および細胞障害性サイトカインの分泌。４８時間および７２時間（Ａ）、（Ｂ）または４時間および８時間（Ｃ）のＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでのＬＮＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞の処置。表示の濃度はＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。ランテスのタンパク質レベルの測定（活性化の調節、発現および分泌された正常Ｔ細胞）（Ａ）、およびＥＬＩＳＡアッセイによるＩＬ−１０の測定（Ｂ）およびｑＲＴ−ＰＣＲによるＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの測定（Ｃ）。
【図３Ｂ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置による前炎症性および細胞障害性サイトカインの分泌。４８時間および７２時間（Ａ）、（Ｂ）または４時間および８時間（Ｃ）のＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでのＬＮＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞の処置。表示の濃度はＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。ランテスのタンパク質レベルの測定（活性化の調節、発現および分泌された正常Ｔ細胞）（Ａ）、およびＥＬＩＳＡアッセイによるＩＬ−１０の測定（Ｂ）およびｑＲＴ−ＰＣＲによるＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの測定（Ｃ）。
【図３Ｃ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置による前炎症性および細胞障害性サイトカインの分泌。４８時間および７２時間（Ａ）、（Ｂ）または４時間および８時間（Ｃ）のＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでのＬＮＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞の処置。表示の濃度はＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。ランテスのタンパク質レベルの測定（活性化の調節、発現および分泌された正常Ｔ細胞）（Ａ）、およびＥＬＩＳＡアッセイによるＩＬ−１０の測定（Ｂ）およびｑＲＴ−ＰＣＲによるＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの測定（Ｃ）。
【図４Ａ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置によるヒトＰＢＭＣの走化性および活性化。表示濃度はＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。Ａ．走化性インデックス：（ｉ）処置細胞由来の調整培地の存在下で移動した細胞数の、（ｉｉ）非処置細胞由来の調整培地の存在下で移動した細胞数に対する比。Ｂ．処置ＬＮＣａＰ細胞由来の調整培地でインキュベート後のＰＢＭＣ中のＩＬ２、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γ  ｍＲＮＡ発現の測定。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで４８時間処置したＬＮＣａＰ細胞由来の調整培地で２４時間インキュベート後のＰＢＭＣからの総細胞ＲＮＡの単離。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ定量化。ＨＵＰＯのｍＲＮＡレベルへの標準化。
【図４Ｂ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置によるヒトＰＢＭＣの走化性および活性化。表示濃度はＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。Ａ．走化性インデックス：（ｉ）処置細胞由来の調整培地の存在下で移動した細胞数の、（ｉｉ）非処置細胞由来の調整培地の存在下で移動した細胞数に対する比。Ｂ．処置ＬＮＣａＰ細胞由来の調整培地でインキュベート後のＰＢＭＣ中のＩＬ２、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γ  ｍＲＮＡ発現の測定。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで４８時間処置したＬＮＣａＰ細胞由来の調整培地で２４時間インキュベート後のＰＢＭＣからの総細胞ＲＮＡの単離。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ定量化。ＨＵＰＯのｍＲＮＡレベルへの標準化。
【図５Ａ】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処置によって起こったバイスタンダー効果。細胞をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで処置し、表示濃度はｐｏｌｙＩＣの表示濃度でのＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣに含まれたｐｏｌｙＩＣを指す。ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による細胞生存率の測定。  Ａ．ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣの低用量によるＬＮＣａＰ細胞のクリアランス。処置開始後２４時間、ＰＢＭＣまたは細胞培地のみをさらに４８時間または７２時間、培地に加えた。
【図５Ｂ】ＢおよびＣ．直接およびＰＢＭＣ−介在バイスタンダー効果によってＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置によって誘導された非標的化細胞の死。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる培養ＬＮＣａＰ細胞またはＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞の処置。処置開始後２４時間、ＰＣ３−Ｌｕｃ細胞またはＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞を培地に加え、ＰＢＭＣまたは細胞培地のみを６時間後に培地に加えた。共培養物をさらに７２時間インキュベートした。
【図５Ｃ】ＢおよびＣ．直接およびＰＢＭＣ−介在バイスタンダー効果によってＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処置によって誘導された非標的化細胞の死。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる培養ＬＮＣａＰ細胞またはＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞の処置。処置開始後２４時間、ＰＣ３−Ｌｕｃ細胞またはＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞を培地に加え、ＰＢＭＣまたは細胞培地のみを６時間後に培地に加えた。共培養物をさらに７２時間インキュベートした。
【図６】ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置によるインビボモデルでのアンドロゲン抵抗性前立腺癌におけるＰＳＭＡ過剰発現腫瘍の後退。腫瘍担持マウスにＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ単独、ＰＢＭＣ単独またはＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣおよびＰＢＭＣで注射した（＊＊＊Ｐ≦０．００１、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ＋ＰＢＭＣ処置対非処置マウス。＊＊Ｐ≦０．０１、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ＋ＰＢＭＣ処置対ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ単独）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
第１の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含む去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療において使用するためのポリプレックスであって、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは該１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々は該１つ以上のリンカーの１つを介して該１つ以上の標的化部分の１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、使用するためのポリプレックスに関する。
【００２３】
本発明のポリプレックスは、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療方法において使用するためのものであり、該ポリプレックスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含み、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは該１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々は該１つ以上のリンカーの１つを介して該１つ以上の標的化部分の１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である。
【００２４】
生化学的な再発、すなわち前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の上昇レベルが放射線または外科手術による治療の試行後に起こる場合には、観察またはアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）のいずれかが治療の標準である。前立腺癌は１９４０年代の独創的研究においてアンドロゲン依存性であることが最初に示され、それ以降、前立腺癌細胞のアポトーシスおよび成長阻害をもたらすＡＤＴは進行した前立腺癌を治療するために必須となっている。外科手術または医薬的のいずれかである去勢は、＜５０ｎｇ／ｄＬの血漿テストステロンレベルをもたらす。前立腺癌は、血漿ＰＳＡレベルが上昇する時点および／または転移が現れる時点で、＜５０ｎｇ／ｄＬの血漿テストステロンレベルにもかかわらず、最終的にはほとんどすべての患者においてＡＤＴに抵抗性である（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１６、前掲）。
【００２５】
本明細書で使用される用語「去勢抵抗性前立腺癌」（ＣＲＰＣ）は典型的におよび好ましくは＜５０ｎｇ／ｄＬの血漿テストステロンレベル、および上昇する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルおよび／または検出可能な転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）または転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）によって定義される。
【００２６】
検出可能な転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）または転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）は、好ましくは臨床的にまたは画像化技術によって検出される。好ましい画像化技術は、Ｘ線撮影法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）である。
【００２７】
ＰＳＡレベルは好ましくは患者の血液または血清試料に基づいて試験され、好ましくは遊離のおよび結合されたＰＳＡの合計である総ＰＳＡが検出される。ＰＳＡレベルの測定は、典型的にはおよび好ましくは当業者に周知である標準的なＰＳＡ試験を用いて行われる。好ましくは、このような標準的なＰＳＡ試験は、免疫検定、より好ましくは化学ルミネセンス免疫検定、さらにより好ましくは例えばＲｏｃｈｅ  ＭＯＤＵＬＡＲ  Ｅ１７０を採用することによって行われる電気化学発光免疫検定である。本明細書で使用される上昇ＰＳＡの定義は、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ２（ＰＣＷＧ２）に由来し、最下点から２５％の増加であって、２ｎｇ／ｍＬの最小上昇のあるものを言い、その値は２回測定され、第１の値は第２の値によって確認されなければならず、典型的におよび好ましくは第１の値後１〜３週で得られる。
【００２８】
血清テストステロンレベルは好ましくは患者の血液または血清試料に基づいて試験され、好ましくは総テストステロンレベルが検出される。テストステロンレベルの測定は、典型的にはおよび好ましくは当業者に周知である標準的な試験を用いて行われる。好ましくは、このような標準的な試験は、ＥＬＩＳＡ、化学ルミネセンス免疫検定、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。
【００２９】
好ましい態様において、該ＣＲＰＣは、＜５０ｎｇ／ｄＬの血清テストステロンレベルおよび検出可能な転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）または転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）によって定義される。より好ましい態様において、ＣＲＰＣは、＜５０ｎｇ／ｄＬの血清テストステロンレベルおよび上昇する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルの存在によって定義される。
【００３０】
ＣＲＰＣを有する患者の画層化試験によって転移性傷害が検出され得ない場合には、この病態は、本明細書では好ましくはおよび典型的に「非転移性去勢抵抗性前立腺癌」（ｎｍＣＲＰＣ）と定義される。ＣＲＰＣを有する患者の画層化試験によって転移が検出され得る場合には、この病態は、本明細書では好ましくはおよび典型的に「転移性去勢抵抗性前立腺癌」（ｎｍＣＲＰＣ）と定義される。画層化試験は、典型的におよび好ましくは核医学テクネチウム−９９ｍシンチグラフィ（骨スキャン）ならびに胸、腹部および骨盤のコンピュータ断層撮影（ＣＴ）である（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１６、前掲）。ｎｍＣＲＰＣは、二次的ホルモン操作に応答するホルモン感受性ｎｍＣＲＰＣおよびホルモン治療に抵抗性であるホルモン不応性ｎｍＣＲＰＣを含む。
【００３１】
好ましい実施形態では、該ＣＲＰＣは非転移性ＣＲＰＣまたは転移性ＣＲＰＣである。好ましくは、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。別の実施形態では、該ＣＲＰＣは非転移性ＣＲＰＣである。
【００３２】
好ましい実施形態では、該ＣＲＰＣは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）非依存性（ＡＲ抵抗性とも称される）ＣＲＰＣまたはＡＲ依存性ＣＲＰＣである。より好ましくは、該ＣＲＰＣは神経内分泌前立腺癌等のＡＲ非依存性ＣＲＰＣである。
【００３３】
ＡＲ依存性ＣＲＰＣは、好ましくはアンドロゲン感受性ＣＲＰＣと定義される。ＡＲ依存性ＣＲＰＣは、アンドロゲンの全身性除去にもかかわらず、好ましくはＡＲシグナル伝達軸に依存性であり続ける。
【００３４】
ＡＲ非依存性ＣＲＰＣは、好ましくはアンドロゲン治療に抵抗性（すなわち、非感受性）であると定義される。
【００３５】
本発明の使用のためのポリプレックスは、核酸分子のポリアニオン性のために核酸分子と非共有結合的に縮合および会合する能力を有する線状ポリカチオンである線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）を含む。好ましい実施形態において、ＬＰＥＩはＬＰＥＩの１端または両端にヒドロキシル基を含む。好ましくは、該ヒドロキシル基はＬＰＥＩの末端−ＮＨ２基の代わりである。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、ＬＰＥＩは約１０〜３０ｋＤａの分子量を有する。より好ましくは、ＬＰＥＩは約２２ｋＤａの分子量を有する。
【００３７】
本発明の使用のためのポリプレックスは、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。本発明のＰＥＧ部分は、その分子量によって、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）部分としても知られる。本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール部分」（ＰＥＧ部分）は、典型的におよび好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の両端に２つの官能基を含むＰＥＧ部分を指す。該官能基は該ＬＰＥＩまたは該標的化部分のいずれかと反応することができる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態では、該少なくとも１つの該ＰＥＧ部分の各々は、約２〜８ｋＤａ、好ましくは２ｋＤａの分子量を有する。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＬＰＥＩは約１０〜３０ｋＤａの分子量を有し、該少なくとも１つのＰＥＧ部分は約２〜８ｋＤａの分子量を有する。より好ましい実施形態では、ＬＰＥＩは２２ｋＤａの分子量を有し（ＬＰＥＩ２２ｋ）、該少なくとも１つのＰＥＧ部分は２ｋＤａの分子量を有する（ＰＥＧ２Ｋ）。
【００４０】
好ましい実施形態では、ＬＰＥＩ２２ｋは１つのＰＥＧ２Ｋ部分または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合する。別の好ましい実施形態では、ＬＰＥＩ２２ｋは１つのＰＥＧ２Ｋに共有結合する。さらに好ましい実施形態では、ＬＰＥＩ２２ｋは３つのＰＥＧ２Ｋに共有結合する。
【００４１】
用語「ｄｓＲＮＡ」は、典型的におよび好ましくは１つ以上のリボヌクレオチドが対応する天然リボヌクレオチドの化学的アナログまたは修飾誘導体でよい任意の長さの二本鎖リボヌクレオチドポリマーを指す。用語「ｄｓＲＮＡ」はまた、典型的にはミスマッチｄｓＲＮＡを含む。
【００４２】
最も好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはポリイソシン酸−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。ＰｏｌｙＩＣは、１本鎖はイノシン酸のポリマーであり、もう１本鎖はシチジル酸のポリマーである二本鎖ＲＮＡである。
【００４３】
本発明の使用のためのポリプレックスのｐｏｌｙＩＣはｄｓＲＮＡからなってよく、各々の鎖は少なくとも２２、好ましくは少なくとも４５リボヌクレオチドからなる。ある実施形態では、各々の鎖は２０〜８０００リボヌクレオチドからなる。より好ましい実施形態では、各々の鎖は２００〜１０００リボヌクレオチドからなる。より好ましい実施形態では、該ｐｏｌｙＩＣは０．２ｋｂ〜１ｋｂの分子量を有する。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１」または「１つのＰＥＧ部分に共有結合されたＬＰＥＩ［．．．］」は、本明細書では交換的に使用され、ＬＰＥＩ対ＰＥＧのモル比を指し、ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１は、典型的におよび好ましくは、１モルＬＰＥＩ当たり約１モルのＰＥＧがポリマー接合体に含まれていることを意味する。本明細書で使用される用語「ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３」または「１つのＰＥＧ部分に共有結合されたＬＰＥＩ［．．．］」は、典型的におよび好ましくは、１モルＬＰＥＩ当たり約３モルのＰＥＧがポリマー接合体に含まれていることを意味する。値は好ましくは１Ｈ−ＮＭＲ分析によって決定される。好ましくは、ＰＥＧ（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）の水素原子の相対的整数値およびＬＰＥＩ（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−）の水素原子の整数値を用いて、１Ｈ−ＮＭＲによって値が決定される。本明細書における用語「約」は、約０％〜１０％、より好ましくは０％〜５％、さらに好ましくは０％〜２％の偏差を指す。
【００４５】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、本発明の使用のためのポリプレックスのポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。
【００４６】
好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）。この実施形態では、本発明のポリプレックスの該１つ以上のＰＥＧ部分は１つのＰＥＧ部分である。したがって、該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ部分に共有結合され、該１つのＰＥＧ部分は１つの標的化部分に１つのリンカーによって接合される。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。この実施形態では、本発明のポリプレックスの該１つ以上のＰＥＧ部分は３つのＰＥＧ部分である。したがって、該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ部分に共有結合され、該３つのＰＥＧ部分の各々は１つの標的化部分に１つのリンカーによって接合される。
【００４８】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、本発明の使用のためのポリプレックスのポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋである。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、本発明の使用のためのポリプレックスのポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）。
【００４９】
好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該１つ以上のＰＥＧ部分はＰＥＧ２Ｋである。好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）。好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。
【００５０】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、該１つ以上のＰＥＧ部分はＰＥＧ２Ｋ部分である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。
【００５１】
ＰｏｌｙＩＣは非共有または共有結合によってポリマー接合体に結合され、非共有結合が好ましい。好ましい実施形態では、該ＰｏｌｙＩＣはＬＰＥＩに非共有結合され、好ましくはイオン結合によって共有結合される。
【００５２】
本発明の使用のためのポリプレックスのポリマー接合体の該ＬＰＥＩは、１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合される。好ましい実施形態では、本発明の使用のためのポリプレックスのポリマー接合体の該ＬＰＥＩは、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）。より好ましい実施形態では、本発明の使用のためのポリプレックスのポリマー接合体の該ＬＰＥＩは、１つのＰＥＧ部分に共有結合される（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）。
【００５３】
好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に該ＬＰＥＩと−ＮＨ−ＣＯ−結合を形成する。
【００５４】
好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に該リンカーと−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、Ｓ−Ｃ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＣＯ−Ｏ−から選択される結合を形成する。好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に該リンカーと結合してジスルフィド結合を形成する。好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ−Ｓによって該リンカーと結合してジスルフィド結合を形成する。
【００５５】
好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は各々独立に該ＬＰＥＩと−Ｎ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−結合を形成する。
【００５６】
好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に該ＬＰＥＩと−Ｎ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−結合を形成し、該リンカーと−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、Ｓ−Ｃ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＣＯ−Ｏ−から選択される結合を形成する。好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に該ＬＰＥＩと−Ｎ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−結合を形成し、該リンカーと−Ｓ−Ｓ−結合を形成する。好ましい実施形態では、該１つ以上のＰＥＧ部分は、各々独立に該ＬＰＥＩおよび該リンカーと−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｎ−ＣＯ−結合を形成する。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明の使用のためのポリプレックスの該リンカーは、ペプチド部分である（本明細書ではペプチドリンカーとも称される）。用語「ペプチド」または「ペプチド部分」は、本明細書では交換的に使用され、典型的におよび好ましくはアミノ酸残基のポリマーを指す。用語「ペプチド部分」は、典型的におよび好ましくは、１つ以上のアミノ酸が対応する天然のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーも含む。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明のポリプレックスの該リンカーは、３〜７個のアミノ酸残基からなるペプチド部分である。
【００５９】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。
【００６０】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。
【００６１】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分であり、好ましくは該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなる。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明のポリプレックスの該リンカーは、６または７個のアミノ酸残基からなるペプチド部分である。
【００６３】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。
【００６４】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。
【００６５】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該リンカーはペプチド部分あり、好ましくは該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなる。
【００６６】
本明細書で交換可能に使用される用語「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、そのＬ−またはＤ−立体異性体における任意の天然または合成（すなわち、非天然）アミノ酸残基を指す。用語「アミノ酸残基」は、別のアミノ酸、すなわち、ペプチド部分等の異なった部分の末端に結合されたアミノ酸、または２つの異なった部分に結合されたアミノ酸、例えばペプチド鎖内に含まれたアミノ酸を含む。天然アミノ酸はタンパク質における天然の２０個のアミノ酸残基のいずれか１個であるが、合成／非天然アミノ酸という用語は、典型的におよび好ましくは、２０個の天然アミノ酸の１つでない、任意のアミノ酸、修飾アミノ酸および／またはそのアナログを指す。非天然アミノ酸の例には、オルニチン、ホモリジン、２，４−ジアミノブチル酸（ＤＡＢＡ）、２，３−ジアミノプロピオン酸ＤＡＰ）、８−アミノオクタン酸（ＥＡＯ）、ホモフェニルアラニン、ホモバリンまたはホモロイシンが含まれ、好ましくはこれらである。
【００６７】
ある実施形態では、該リンカーは、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンまたはホモフェニルアラニン等の少なくとも１つ、特に２つまたは３つの芳香族アミノ酸残基を含むペプチド部分である。
【００６８】
好ましい実施形態では、該リンカーはペプチド部分であり、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−を含む。より好ましい実施形態では、該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。
【００６９】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは好ましくはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ＰＥＧは好ましくはＰＥＧ２Ｋであり、該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは好ましくはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ＰＥＧは好ましくはＰＥＧ２Ｋであり、該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。別の好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは好ましくはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ＰＥＧは好ましくはＰＥＧ２Ｋであり、該ペプチド部分は３〜７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。
【００７０】
好ましい実施形態では、該リンカーはペプチド部分であり、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−を含む。より好ましい実施形態では、該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ残残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。
【００７１】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは好ましくはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合されるか（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、または３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ＰＥＧは好ましくはＰＥＧ２Ｋであり、該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは好ましくはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ＰＥＧは好ましくはＰＥＧ２Ｋであり、該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。別の好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは好ましくはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ＰＥＧは好ましくはＰＥＧ２Ｋであり、該ペプチド部分は６または７個のアミノ酸残基からなり、１個のアミノ酸残基は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−である。
【００７２】
好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）または−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）である。好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）である。好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）である。
【００７３】
好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）または−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、配列番号１または２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって該標的化部分または１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）または−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、配列番号１または２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって該標的化部分に結合される。好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）または−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、配列番号１または２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、配列番号１の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、該ペプチド部分は、−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、配列番号２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。
【００７４】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、好ましくは配列番号１の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、好ましくは配列番号２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。
【００７５】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、好ましくは配列番号１の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、好ましくは配列番号２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。
【００７６】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣあり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、好ましくは配列番号１の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、好ましくは配列番号２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。
【００７７】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、好ましくは配列番号１の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、好ましくは配列番号２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。
【００７８】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、好ましくは配列番号１の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、好ましくは配列番号２の該ペプチド部分はそのＣｙｓ残基のメルカプト基によって１つ以上のＰＥＧ部分に結合される。
【００７９】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分に共有結合され（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）、該ペプチド部分は−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）である。
【００８０】
本発明の使用のためのポリプレックスは、該ポリマー接合体が式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）から選択され、
（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ、
（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ、
（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、または
（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、
該Ｔは該標的化部分を表す。
【００８１】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８２】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８３】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）該標的化部分に結合された［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８４】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８５】
本発明の使用のためのポリプレックスは、該ポリマー接合体が式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）から選択され、
（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ、
（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ、
（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、または
（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、
該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、
2020535171.tif 000002
式中、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合される。
【００８６】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８７】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８８】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）該標的化部分に結合された［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００８９】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ａ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｂ）Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｃ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２Ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）の部分であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【００９０】
好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）から選択され、
2020535171.tif 000003
式中、Ｒ１は以下であり、
2020535171.tif 000004
2020535171.tif 000005
式中、Ｒ２は以下であり、
2020535171.tif 000006
2020535171.tif 000007
式中、Ｒ１は以下であり、
2020535171.tif 000008
2020535171.tif 000009
式中、Ｒ２は以下であり、
2020535171.tif 000010
該Ｔは該標的化部分を表し、ｎは４０〜４５である。
【００９１】
本発明の使用にためのポリプレックスにおいて、標的化部分は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である。標的化部分は野生型、天然または修飾リガンドまたはそのアナログ、または非天然リガンド、例えば抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または癌抗原のいずれか１つに対する抗体ミメティック、例えばアフィボディでもよい。
【００９２】
好ましい実施形態では、該標的化部分は、本明細書でＤＵＰＡ残基として称されるＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−である。
【００９３】
好ましい実施形態では、該標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）または−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）である。好ましい実施形態では、標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）である。好ましい実施形態では、該標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）である。
【００９４】
ＤＵＰＡのそのＰＳＭＡ結合部位へのアクセスは、深く、徐々に狭い２つの疎水性穴を有するチャネルを介する（Ｋｕｌａｒａｔｎｅ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ（９９ｍ）Ｔｃ−ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ６（３）：７９０−８００）。本発明のリンカー、特に配列番号１および２等のペプチドリンカーは、坑口の構造および化学に適合する。したがって、本発明のポリプレックスは、ｐｏｌｙＩＣのＰＳＭＡ過剰発現細胞、特にＣＲＰＣ細胞への選択的送達および内在化を成功裏にもたらす（図２Ａおよび６）。内在化の後に、ｐｏｌｙＩＣは８時間以内にアポトーシス経路を活性化し、９６時間後に細胞根絶を完了するように誘導する（図２Ｂ、Ｃ）。本発明のポリプレックスは、高い選択性および急速な死滅を組み合わせ、したがってそれらが抵抗性を発症する前に腫瘍細胞を消滅させ、毒性の副作用は実質的に減少すると予想される。
【００９５】
より好ましい実施形態では、該標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）から選択される。別のより好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）から選択される。
【００９６】
より好ましい実施形態では、該標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉ）または（ｉｉ）から選択される。別の好ましい実施形態では、該標的化部分は、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｉｉ）または（ｉｖ）から選択される。
【００９７】
好ましい実施形態では、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉ）の二接合体である。好ましい実施形態では、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉｉ）の二接合体である。好ましい実施形態では、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉｉｉ）の二接合体である。好ましい実施形態では、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉｖ）の二接合体である。
【００９８】
好ましい実施形態では、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉ）である。好ましい実施形態では、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｉ）である。好ましい実施形態では、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｉｉ）である。好ましい実施形態では、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｖ）である。
【００９９】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉ）または（ｉｉ）から選択される。別の好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｉｉ）または（ｉｖ）から選択される。
【０１００】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉ）の二接合体である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉｉ）の二接合体である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉｉｉ）の二接合体である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分は該ＤＵＰＡ残基であり、該ポリマー接合体は該ＤＵＰＡ残基に結合した式（ｉｖ）の二接合体である。
【０１０１】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉ）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｉ）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｉｉ）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｖ）である。
【０１０２】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは１つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。
【０１０４】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）である。
【０１０８】
好ましい実施形態では、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはＬＰＥＩはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。
【０１１０】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、１つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：１）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。
【０１１１】
好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（配列番号１）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。好ましい実施形態では、ポリプレックスの該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、ポリマー接合体の該ＬＰＥＩはＬＰＥＩ２２ｋであり、３つのＰＥＧ２Ｋ部分（ＬＰＥＩ−ＰＥＧ  １：３）に共有結合され、該リンカーは、ペプチド部分−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ）−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−（配列番号２）であり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ＣＲＰＣは転移性ＣＲＰＣである。
【０１１２】
好ましい実施形態では、本発明の使用のためのポリプレックスは、免疫細胞と組み合わせて使用される。好ましくは、該免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）、腫瘍特異的改変Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。好ましくは、該免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）または腫瘍特異的改変Ｔ細胞である。より好ましい実施形態では、該免疫細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。より好ましい実施形態では、該免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）である。より好ましい実施形態では、該免疫細胞は、腫瘍特異的改変Ｔ細胞である。
【０１１３】
さらなる態様では、本発明は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の治療において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含むポリプレックスとを含み、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、１つ以上のリンカー、および１つ以上の標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは該１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、該１つ以上のＰＥＧ部分の各々は該１つ以上のリンカーの１つを介して該１つ以上の標的化部分の１つに接合し、該１つ以上の標的化部分の各々は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、医薬組成物に関する。
【０１１４】
好ましい実施形態では、本発明の使用のための医薬組成物は、免疫細胞をさらに含む。好ましくは、該免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）、腫瘍特異的改変Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。好ましくは、該免疫細胞は、該免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）または腫瘍特異的改変Ｔ細胞である。より好ましい実施形態では、該免疫細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。より好ましい実施形態では、該免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）である。より好ましい実施形態では、該免疫細胞は、腫瘍特異的改変Ｔ細胞である。
【０１１５】
さらなる態様では、本発明は、去勢抵抗性前立腺癌の治療方法であって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含むポリプレックスをそれを必要としている患者に投与することを含み、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、リンカー、および標的化部分からなり、ＬＰＥＩは１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合し、各ＰＥＧ部分はリンカーを介して標的化部分に接合し、標的化部分は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、方法に関する。用語「患者」は交換的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれか、好ましくはヒトを指す。
【０１１６】
例えばポリプレックスまたは医薬組成物の投与方法は、非経口、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻腔内、舌下、膣内、直腸内、眼内）、髄腔内、局所および皮内経路を含むが、これらに限定されない。投与は全身性でも局所でもよい。ある実施形態では、医薬組成物は脳内投与に適している。好ましい実施形態では、ポリプレックスまたは医薬組成物は注射によって全身的に投与される。
【０１１７】
好適な担体、投与形式、投薬剤形等は当業者には周知である。用語「担体」は、活性物質が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。医薬組成物中の担体は、結合剤、例えば微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポピドン）、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物；崩壊剤、例えばアルギン酸、トウモロコシデンプン等；潤滑剤または界面活性剤、例えばステアリン酸マグネシウム、またはラウリル硫酸ナトリウム；および滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素を含んでよい。
【０１１８】
組成物は、ボーラス注射または連続注入のような注射による非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は、添加の保存料を含む、単位投薬剤形例えばアンプルまたはマルチドーズ容器で提供することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中で懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤等の製剤化物質を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、例えば発熱性物質除去蒸留水等の好適なビヒクルとの構成のために粉末形態でもよい。
【０１１９】
吸入による投与のためには、例えば鼻腔投与のためには、本発明の組成物は、好適な発射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからのアエロゾルスプレイ提示の形態で簡便に送達される。加圧されたアエロゾルの場合には、投薬単位は、計測された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用のためのゼラチン等のカプセルおよびカートリッジが製剤化されてもよく、それらは化合物およびラクトースまたはデンプン等の好適な粉末基剤の粉末混合物を含む。
【０１２０】
ある実施形態では、医薬組成物は、上記の任意の既知の方法によって投与のために製剤化される。本明細書において企図された特定の投与方法は、静脈内および脳内（大脳内）投与である。
【０１２１】
上で定義された実施形態のいずれか１つの医薬組成物は、静脈内、脳内（大脳内）、経口、皮内、筋肉内、皮下、経皮、経粘膜、鼻腔内または眼内投与のために製剤化することができる。
【０１２２】
さらなる態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー接合体を含むポリプレックスであって、該ポリマー接合体は、線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、３つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、３つのリンカー、および３つの標的化部分からなり、該ＬＰＥＩは３つのＰＥＧ部分の各々に共有結合し、該３つのＰＥＧ部分の各々は該３つのリンカーの１つを介して該３つの標的化部分の１つに接合し、該３つの標的化部分の各々は癌抗原に結合することができ、癌抗原は前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）であり、該ポリマー接合体は式（ｄ）であり、
（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、
該Ｔは標的化部分を表す。
【０１２３】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはポリイソシン酸−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。
【０１２４】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有する。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有する。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有する。
【０１２５】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有し、該ｄｓＲＮＡはポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有し、該ｄｓＲＮＡはポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有し、該ｄｓＲＮＡはポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。
【０１２６】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は式（ｄ）：
（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ
であり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、
2020535171.tif 000011
式中、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合される。
【０１２７】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１２８】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１２９】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、該標的化部分に結合された（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１３０】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によってＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１３１】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、本発明のポリプレックスのポリマー接合体は、式（ｉｖ）であり、
2020535171.tif 000012
式中、Ｒ２は以下であり、
2020535171.tif 000013
該Ｔは該標的化部分を表し、ｎは４０〜４５である。
【０１３２】
本発明のポリプレックスの標的化部分は、野生型、天然または修飾リガンドまたはそのパラログ、または非野生型リガンド、例えば抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または癌抗原のいずれか１つに対する抗体ミメティック、例えばアフィボディでもよい。
【０１３３】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該標的化部分は、本明細書でＤＵＰＡ残基と称されるＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−である。
【０１３４】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、ポリマー接合体は、式（ｄ）：
（ｄ）＼［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ
であり、該Ｔは該標的化部分ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）を表す。好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は式（ｄ）であり、該Ｔは該標的化部分ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）を表し、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１３５】
本発明のポリプレックスのより好ましい実施形態では、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｖ）を有する。別の好ましい実施形態では、該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣであり、該標的化部分はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−（ＤＵＰＡ残基）であり、該ポリマー接合体は式（ｉｖ）である。
【０１３６】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有する。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有する。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有する。
【０１３７】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有し、該ｄｓＲＮＡはポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有し、該ｄｓＲＮＡはポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は２ｋＤの分子量を有し、該ＬＰＥＩは２２ｋＤの分子量を有し、該ｄｓＲＮＡはポリイノシン−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）である。
【０１３８】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１３９】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１４０】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、該標的化部分に結合された式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１４１】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）であり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１４２】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、ポリマー接合体は式（ｄ）を有し、
（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ、
該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、
2020535171.tif 000014
式中、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合される。
【０１４３】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである
【０１４４】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１４５】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は、該標的化部分に結合された式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２ｋ］３−ＬＰＥＩであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１４６】
本発明のポリプレックスの好ましい実施形態では、該ポリマー接合体は式（ｄ）［Ｔ−（ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２ｋ］３−ＬＰＥＩ２２ｋであり、該Ｔは該標的化部分ＤＵＰＡ残基を表し、該ＰＥＧ部分は式（ｖ）のＰＥＧであり、ｎは４０〜４５であり、式（ｖ）のＰＥＧ部分はジスルフィド結合によって（ｄ）のＣｙｓ残基に結合され、好ましくは該ｄｓＲＮＡはｐｏｌｙＩＣである。
【０１４７】
本発明は以下の非限定的実施例によって例証されるだろう。
【実施例】
【０１４８】
実施例１−ポリプレックスの調製
ＬＰＥＩおよびＰＥＧ化の合成のための化学
約２ｋＤａの分子量を有するＰＤＰ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＰＤＰ：ピリジルジチオプロピオン酸エステル）とも称されるＮＨＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（オルト−ピリジルジスルフィド−ポリ−エチレングリコール−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル）をＣｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧｗｏｒｋｓ（Ｗｉｎｓｔｏｎ，ＵＳＡ）から購入した。ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、平均分子量（Ｍｎ）約５０ｋＤａ、および無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＳＯ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。無水エタノールをＲｏｍｉｃａｌ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。すべての溶媒はさらに精製することなく用いた。
【０１４９】
ＬＰＥＩ（遊離塩基形態）の合成
ＬＰＥＩの合成およびＬＰＥＩのＰＥＧ化は、先に記載したようにして行った（ＷＯ  ２０１５／１７３８２４；  Ｊｏｕｂｒａｎ，ｅｔ  ａｈ，２０１４，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２０１４，２５（９）：１６４４−１６５４）。
【０１５０】
８．０ｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）を１００ｍＬの濃ＨＣｌ（３７％）で加水分解し、４８時間リフラックスし、白色沈殿を得た。固体をインターグラスで減圧濾過して、水で数回洗浄した。得られたＬＰＥＩ塩酸塩を終夜風乾し、５０ｍＬの水に溶解し、凍結乾燥した（５ｇ、７８％、１Ｈ−ＮＭＲ、Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ：シングレット３．５ｐｐｍ）。得られたＬＰＥＩ塩（４．５ｇ）をＮａＯＨ水溶液（３Ｍ）を加えてアルカリ性にし、得られた白色沈殿を濾過し、中性になるまで水で洗浄した。次いで、固体を水に溶かし、さらに凍結乾燥し白色固体を得た（２ｇ、８１％）。
【０１５１】
ＬＰＥＩ−ＰＥＧ２ｋ−ＯＰＳＳ二接合体（二接合体１：１および１：３）の合成
識別的にＰＥＧ化コポリマーを作製するために、ＬＰＥＩ上の二級アミンをＰＥＧ上の末端ＮＨＳエステルオルトゴナル保護基に接合した。Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステルはＬＰＥＩの二級骨格アミンと自発的に反応性であり、ＬＰＥＩの効率的なＰＥＧ化をもたらす。さらに、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳとＰＥＩのアミンとの反応は、安定で不可逆的なアミド結合の形成をもたらす。
【０１５２】
１７４ｍｇ（８μｍｏｌ）のＬＰＥＩを２．７ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解し、室温で１５分間撹拌した。５倍モーラー過剰のＯＰＰＳ−ＰＥＧ２ｋ−ＣＯＮＨＳ  ７９ｍｇ，３９．５μｍｏｌ）を５００μｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、ＬＰＥＩ混合物に少量で加えた。反応混合物をボルテックススターラーで周囲温度で３時間約８００ｒｐｍで撹拌した。ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）で充填したＨＲ１０／１０カラムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーで異なったＰＥＧ置換ＬＰＥＩを分離した。分析  Ｖｙｄａｃ  Ｃ−８モノメリック５μｍカラム（３００Å、４．６×ｌ５０ｍｍ）を備えた逆相ＨＰＬＣを用い、１ｍＬ／分の流速で２５分での５〜９５％アセトニトリルの線形グラジエントを用いて、二接合体の溶出画分の純度を評価した。９５％以上の純度を有する画分を混合した。混合画分を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４にさらに透析した。二接合体中のＬＰＥＩに接合されたＰＥＧ２ｋ基の割合を１ＨＮＭＲで決定した。ＰＥＧ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−からの水素およびＬＰＥＩ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）−からの水素の整数値を用いて、２つの接合コポリマー間の比を決定した。カチオン交換から得られた様々な生成物のうちで、三接合体の作製のために、２つの生成物、ＬＰＥＩ−ＰＥＧ２ｋ−ＯＰＳＳ（二接合体１：１、ＬＰＥＩ対ＰＥＧのモーラー比約１：１）およびＬＰＥＩ−（ＰＥＧ２ｋ）３−（ＯＰＳＳ）３（二接合体１：３，モーラー比約１：３）が選択された。コポリマー濃度を評価するためにコッパーアッセイを用いた。要するに、コポリマーをＣｕＳ０４（１００ｍＬの酢酸バッファに２３ｍｇ溶解した）でインキュベートし、２８５ｎｍでのその吸収を測定した。
【０１５３】
ＤＵＰＡ−ペプチドリンカーの合成
ＤＵＰＡ部分の調製：ＤＵＰＡ部分はＫｕｌａｒａｔｎｅ  ＳＡ等（２００９）（Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ（９９ｍ）Ｔｃ−ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ６（３）：７９０−８００）にしたがって合成した。ペプチドリンカーの合成：Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ｗａｎｇ樹脂（商業的に入手可能）を固体支持体として使用し、標準的なＦｍｏｃ  ＳＰＰＳ手法（ローデング０．４７ｍｍｏｌ／ｇｍ、合成スケールは０．２５ｍｍｏｌである）によってペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ｗａｎｇ樹脂は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で２時間、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で２０分間膨潤した。Ｆｍｏｃの除去：Ｆｍｏｃを除去するために、Ｆｍｏｃ−ペプチジル樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ（１０ｍＬ）でインキュベートした（室温で１０分および１５分）。固体支持体をＤＭＦ（５×５ｍＬ）で濯ぐ前に、カイザー試験を用いてＦｍｏｃの完全な除去を確認した。ペプチドリンカーへのアミノ酸の結合：５等量のＦｍｏｃ−保護アミノ酸、４．５等量のＨＡＴＵおよび８等量のＤＩＰＥＡをＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解した。反応混合物を０℃で５分間活性化し、次いで遊離アミンを有するペプチド樹脂に添加した。この樹脂を約４５分間混合し、次いで、固体支持体をＤＭＦ（４×５ｍＬ）で濯いだ。結合が完了したことを確認するために、カイザー試験を再度用いた。無水酢酸によるキャッピング：未反応の遊離アミン官能基をブロックするために、第１アミノ酸結合後に無水酢酸で樹脂をインキュベートした。樹脂を無水酢酸（１０等量）およびＤＩＰＥＡ（８等量）のＤＭＦ溶液で２０分間処理し、ＤＭＦ（５×５ｍＬ）およびＤＣＭ（３×５ｍＬ）で濯いだ。ペプチドリンカーへのＤＵＰＡ部分の結合：遊離酸を有する完全に保護されたＤＵＰＡ部分（５等量）、ＨＡＴＵ（４．５等量）およびＤＩＰＥＡ（８等量）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解した。混合反応物を０℃で５分間活性化した。次いで、予め活性化されたＤＵＰＡ部分をＮ−又ン遊離アミンを担持するペプチド樹脂と混合した。この溶液を約６０分間混合し、ＤＭＦ（５×５ｍＬ）で濯いだ。ＤＵＰＡ部分の結合をカイザー試験で確認した。樹脂からのＤＵＰＡ−ペプチドリンカーの放出：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／ＴＤＷ（９５：２．５：２．５）の新しく調製された溶液（５ｍＬ）を０℃に冷却し、次いで２００ｍｇの樹脂結合ペプチド−ＤＵＰＡに添加した。この溶液を４時間ＲＴで混合し、濾過し、３ｍＬの濃ＴＦＡで濯いだ。この溶液に冷エーテルをゆっくりと混合することによって、得られたＤＵＰＡ−ペプチドリンカーを沈殿させ、次いで遠心分離し、冷エーテルで２回濯いだ。最小量の１：１ＡＣＮ／ＴＤＷ溶液を使用して、粗ＤＵＰＡ−ペプチドリンカーを溶解し、次いで凍結乾燥し、最終的にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ＤＵＰＡ−ペプチドリンカーの形成をＬＣ−ＭＳにより確認した。報告した手法（Ｋｅｌｄｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ���ｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｇｕｉｄｅｄ  ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２０１３，２４（６）：１０７５−１０８０）を用いて、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０接合を行った。
【０１５４】
ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＤＵＰＡ（ＰＰＤ）の合成
４．３７ｍｇ（１．２×１０−４ｍｍｏｌ）ＰＥＩ−ＰＥＧ（１：１）を９４０μｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）に溶かした。１ｍｇ（９．１×１０−４ｍｍｏｌ、約５等量）のＤＵＰＡ−ペプチドリンカーを２ｍｌの１：１  ＡＣＮ（ＨＰＬＣ等級）／（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）に溶かし、ＰＥＩ−ＰＥＧ溶液に滴下した。約１０％ＡＣＮの総濃度を得るために４ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４をこの溶液に添加した。Ｊｏｕｂｒａｎ等、２０１４（前掲）に記載のようにしてさらなる反応を行った。
【０１５５】
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ複合体の形成
窒素（ＰＰＤ由来）／リン酸塩（ｐｏｌｙＩＣ）比（Ｎ／Ｐ比）８で、ｐｏｌｙＩＣ（低分子量（ＬＭＷ）ｐｏｌｙＩＣ、例えばＩｎｖｉｖｏＧｅｎによる）とＰＰＤを複合体化した。ＬＭＷは０．２ｋｂ〜１ｋｂである。インビボ実験のために、ＨＢＧバッファ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，５％グルコース，ｗ／ｖ）を用いた。インビトロ実験のために、ＨＢＳバッファ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を用いた。ＰＰＤをｐｏｌｙＩＣに添加し、ＲＴで４５分間、ｐｏｌｙＩＣとインキュベートした。Ｊｏｕｂｒａｎ等、２０１４（前掲）に記載のようにＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ複合体の大きさを動的光散乱法によって測定した。複合体の大きさは１０５±１６．７ｎｍであることがわかった。
【０１５６】
実施例２−アッセイ
共焦点顕微鏡
ＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６８０を用いて、ＰＳＭＡ−過剰発現細胞のＤＵＰＡ部分の選択性を確認した。共焦点蛍光顕微鏡（ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ−１０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を用いてＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６８０の取り込みを監視した。先ず、細胞を８ウェルμスライド（Ｉｂｉｄｉ、型番８０８２６）に播き（８０００細胞／ウェル）、７２時間成長させた。次いで、ＤＵＰＡ−ペプチドリンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６８０（７０ｎＭ）およびスルホローダミン（緑）を含む新鮮培地を加えた。細胞をタイムラプス顕微鏡で５時間監視した。
【０１５７】
細胞生存性
ＰＣ３−ＰＳＭＡ、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＭＣＦ７およびＰＣ３細胞を播き（９６ウェルプレート、５０００細胞／ウェル、３連）、１日間成長させ、次いでＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩまたはｐｏｌｙＩＣ単独でインキュベートした。インキュベーション後、細胞生存率を定量した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１５８】
ウェスタンブロット分析
ＬＮＣａＰ細胞（６ウェルプレート、１×１０６細胞／ウェル）を播き、１日間成長させ、次いでＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートし、湯気を立てているレムリサンプルバッファで溶解させ、一次抗体抗カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、型番９６６２５）、抗開裂カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、型番９６６１５）および抗ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、型番９５４２５）を用いてカスパーゼ−３およびＰＡＲＰの開裂活性の研究のためにウェスタンブロットによって分析した。抗ＧＡＰＤＨを用いて、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ発現レベルをＧＡＰＤＨ発現に標準化した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２５７７８）。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡによるＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳサイトカインの定量化
ＰＣ３−ＰＳＭＡおよびＬＮＣａＰ細胞を播き（９６ウェルプレート、３連、ＰＣ３−ＰＳＭＡ：２，０００細胞／ウェル、ＬＮＣａＰ：１０，０００細胞／ウェル）、１日間成長させ、次いでＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。４８時間または７２時間後に、培地からサンプルを採取し、ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳの分泌されたサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で検出した。
【０１６０】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αの定量
ＰＣ３−ＰＳＭＡおよびＬＮＣａＰ細胞からの総ＲＮＡ抽出：ＰＣ３−ＰＳＭＡ（１００，０００細胞／ウェル）およびＬＮＣａＰ細胞（５００，０００細胞／ウェル）を播き、１日間成長させ、次いでＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。４時間または８時間後に、総ＲＮＡを単離した（ＥＺ−１０  ＤＮＡ  Ａｗａｙ  ＲＮＡ−  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ）。刺激ＰＢＭＣからの総ＲＮＡ抽出：ＬＮＣａＰ細胞を播き（１×１０６細胞／ウェル、ポリリジンプレコート６ウェルプレート）、１日間成長させ、次いでＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。４８時間後に、調整培地からのサンプルを播種し（６ウェルプレート、１×１０７細胞／ウェル）および新しく単離されたＰＢＭＣを成長させるために使用し、２４時間インキュベートした。次いで、総ＲＮＡをＰＢＭＣ（ＥＺ−１０  ＤＮＡ  Ａｗａｙ  ＲＮＡ−Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ）から単離した。
【０１６１】
ＲＮＡを逆に転写し（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、表１に列挙されたプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った（Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。サイトカイン転写物の相対量をＧＡＰＤＨまたはＨＵＰＯ転写物に標準化し、非処置細胞と比較した（ΔΔＣＴ法）。
2020535171.tif 000015
【０１６２】
走化性アッセイ
ＬＮＣａＰ細胞を播き（ポリリジンプレコート２４ウェルプレート、密度２５０，０００細胞／ウェル）、１日間成長させた。培養培地を０．１５％ＦＢＳのみを含む新鮮な培地と交換し、次いで細胞をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。４８時間後に調整培地からのサンプルをＰＢＭＣの走化性を刺激するその能力について試験した（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート、微孔性ポリカーボネート膜、０．５μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｓｔａｒ）。詳細には、調整培地をＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（０．１５％ＦＢＳのみで補充した培地）のより低いウェルにピペットし、新しく単離されたＰＢＭＣを各ウェルのより上部のＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートに播いた（１００μｌ培地／ウェル中、１×１０６細胞）。３７℃で４時間のインキュベーション後、移動したＰＢＭＣを含む培地をＦＡＣＳ、散乱ゲーティング（ｓｃａｔｔｅｒ−ｇａｔｉｎｇ）によって分析して、リンパ球亜群を列挙した。結果を、処置細胞由来の調整培地に向かって移動したＰＢＭＣ数の、新鮮な成長培地に向かって移動したＰＢＭＣ数に対する比として表す。
【０１６３】
実施例３−インビトロおよびインビボ試験
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置によって誘導されたバイスタンダー効果のインビトロ分析
共培養系を用いて、インビトロにおけるＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣバイスタンダー効果を分析した。処置ＰＳＭＡ過剰発現細胞を、ＰＢＭＣ単独またはＰＢＭＣおよび隣接癌細胞を提示しそうであるＰＳＭＡを発現していない細胞で共培養した。安定にルシフェラーゼを発現する細胞株を介してバイスタンダー効果を評価した（ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰまたはＭＣＦ７−Ｌｕｃ／ＧＦＰ）。これらの細胞の生存率を測定した（ルシフェラーゼ活性）（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１６４】
ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ−ＰＢＭＣの共培養系：ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を播き（１０，０００細胞／ウェル、ポリリジンでプレコートした９６ウェルプレート、３連）、１日間成長させ、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。２４時間後、新しく単離されたＰＢＭＣ（ウェルあたり１×ｌＯ５細胞）を培養物に加え、２４時間後にＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存率を検出した（ルシフェラーゼ活性）。
【０１６５】
ＬＮＣａＰ−ＰＢＭＣ−ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰの共培養系：ＬＮＣａＰ細胞（６，０００細胞／ウェル）を播き（ポリリジンでプレコートした９６ウェルプレート、３連）、１日間成長させ、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。１６時間後にＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞（４，０００細胞／ウェル）、およびさらに６時間後に新しく単離されたＰＢＭＣ（ウェルあたり１×１０５細胞）を培養物に加えた。４８時間後にＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存率を検出した（ルシフェラーゼ活性）。
【０１６６】
ＰＣ３−ＰＳＭＡ−ＰＢＭＣ−ＭＣＦ７−Ｌｕｃ／ＧＦＰの共培養系：ＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞（２，０００細胞／ウェル）を播き（ポリリジンでプレコートした９６ウェルプレート、３連）、１日間成長させ、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでインキュベートした。１６時間後にＭＣＦ７−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞（４，０００細胞／ウェル）、およびさらに６時間後に新しく単離されたＰＭＢＣ（ウェルあたり１ｋｘ１０５細胞）を培養物に加えた（ウェルあたり１×１０５細胞）。４８時間後にＭＣＦ７−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存率を検出した（ルシフェラーゼ活性）
【０１６７】
再構築された免疫系を有するアンドロゲン抵抗性前立腺癌異種移植モデル
アンドロゲン抵抗性（アンドロゲン独立性）前立腺癌細胞、ＰＣ３−ＰＳＭＡ（４．６×ｌ０＜６）をＮＯＤ−ＳＣＩＤ雄性マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に皮下注射した。１４日後に、腫瘍が１００ｍｍ３に達し、マウスは４群にランダムに分け（７マウス／群）、２群をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ（０．２５ｍｇ／ｋｇ、Ｎ／Ｐ比は８）の腹腔内注射で処置し、他の２群を非処置対照である。１つの処置群および１つの非処置群の各々においてそれぞれ、免疫系を部分的に再構築した（３日目および８日目での４ｘ１０６ヒトＰＢＭＣの静脈内投与）。腫瘍体積の計算：腫瘍幅Ｗ２×腫瘍長Ｌ／２。
【０１６８】
実施例４−インビトロ試験の結果
特定のペプチドリンカーによってＤｙｌｉｇｈｔ６８０に結合したＤＵＰＡの、ＰＳＭＡ過剰発現細胞への特異的結合および取り込み
この実施例は、ペプチドリンカーによって蛍光色素またはＰＥＩ−ＰＥＧ／ｐｏｌｙＩＣからなるポリプレックス等のさらなる化合物に結合されたＰＳＭＡリガンドＤＵＰＡがＰＳＭＡ過剰発現細胞を選択的に標的化し、これらの細胞に本発明のポリプレックスを送達することを証明した。
【０１６９】
ＤＵＰＡは、８−アミノオクタン酸の炭化水素鎖からなる特別に設計されたペプチドリンカーによって蛍光色素Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接合され、単鎖ペプチド部分は、ＰＳＭＡリガンドＤＵＰＡの立体障害から自由になる。この実施例で使用されたペプチドリンカーは、配列番号１（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、図１Ａ参照）のペプチド部分を含む。
【０１７０】
ＤＵＰＡ−リンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０接合体の癌細胞への結合を共焦点蛍光顕微鏡によって測定した。ＬＮＣａＰ細胞、ＰＳＭＡ過剰発現細胞ＰＣ３−ＰＳＭＡおよびＰＳＭＡ非過剰発現細胞ＭＣＦ７を、ＤＵＰＡ−リンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０で５時間処理した。ＤＵＰＡ−リンカー−Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０はうまく結合し、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞に入ったが、ＭＣＦ７細胞は入らなかった（図１Ｂ）。
【０１７１】
ＰＳＭＡへの結合は、２つの疎水性穴をもった深く狭いギャップによってのみ接近できる結合部位によって起こる。ＰＥＩ−ＰＥＧ／ｐｏｌｙＩＣからなるポリプレックスまたはＰＥＩ−ＰＥＧからなる接合体に接合されたＤＵＰＡの、ＰＳＭＡへの選択的結合を可能にするために、ＰＥＩ−ＰＥＧ／ｐｏｌｙＩＣポリプレックスまたはＰＥＩ−ＰＥＧ接合体とＤＵＰＡとの間の距離は、特定のペプチドリンカーを用いて伸長される。この実施例では、ＤＵＰＡは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−８−アミノオクタン酸からなるリンカーによって、ｐｏｌｙＩＣ結合部分ＰＥＩ−ＰＥＧ接合体（ＰＰ）に接合され（図１Ａ）、このことは、ＰＳＭＡ結合部位およびその入口部位の構造および結合特性に最適に適合する。
【０１７２】
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣはＰＳＭＡを過剰発現する前立腺癌細胞を選択的に全滅させる。
ＰＳＭＡ過剰発現前立腺癌細胞の選択的死滅は、ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＤＵＰＡ（ＰＰＤ）／ｐｏｌｙＩＣからなるポリプレックスを用いて証明された。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣを作製するために、本発明者らは、先に記載したように（Ｊｏｕｂｒａｎ  Ｓ，ｅｔ  Ａｌ，２０１４、前掲）、ペプチドリンカーによってポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール（ＰＰ）にＤＵＰＡを接合し、ＰＰＤ接合体にｐｏｌｙＩＣを結合した。
【０１７３】
有効性および選択性についてＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣを試験した。ＰＳＭＡ過剰発現細胞ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ、ならびにＰＳＭＡ非過剰発現細胞ＭＣＦ７およびＰＣ３を、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで４日間処理し、８０〜９５％のＰＳＭＡ過剰発現細胞ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞を効率的に殺したが、ＭＣＦ７およびＰＣ３細胞はインタクトのままであった（図２Ａ）。
【０１７４】
ＬＮＣａＰ細胞のＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ誘導死は、適用されたｐｏｌｙＩＣ濃度（０．５、１および２μｇ／ｍｌのＰＰＤに結合されたｐｏｌｙＩＣ、図２Ｂ参照）の任意の濃度による処理を開始してから２４時間後に明らかとなった。さらなるＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理の過程で、死細胞の数がさらに増加した。９６時間後、ほとんど１００％のＬＮＣａＰ細胞が適用された最低ｐｏｌｙＩＣ濃度によってさえ死滅した（０．５μｇ／ｍｌの、図２Ｂ参照）。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理の４時間および８時間後には、カスパーゼおよびＰＡＲＰの開裂がそれぞれ明らかとなった。この開裂はｐｏｌｙＩＣがアポトーシスによって細胞死を誘導したことを示唆している（図２Ｃ）。
【０１７５】
これらの結果は、（ｉ）ＰＰＤに結合したｐｏｌｙＩＣがＰＳＭＡ過剰発現細胞に選択的に送達された、（ｉｉ）ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処理がアポトーシスを起こし、ＰＳＭＡ過剰発現細胞の急速かつ効率的な死滅を誘導した（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）ことを証明した。ＣＲＰＣを有する患者において、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置によって誘導された急速かつ効率的な細胞死滅は、化学療法に対する耐性が発症し得る前に、腫瘍細胞の絶滅を可能にする。さらに、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣの高い細胞マーカー選択性は、ｐｏｌｙＩＣが全身的に投与された時にさもないと癌患者が苦しまなければならない毒性の副作用を最小限に抑える利益を有する。
【０１７６】
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣでの処理は実質的にサイトカイン分泌を増加させた。
細胞中での、ｄｓＲＮＡ、特にｐｏｌｙＩＣはサイトカインの産生および放出を誘発した。これらのサイトカインは、免疫細胞を刺激し、感染領域にそれらを補充した。本発明者らは、サイトカイン産生、およびＬＮＣａＰおよびＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞に対するＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理の効果を証明した。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理は、いずれも走化性サイトカインであるＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳの分泌を引き起こした（図３Ａ、Ｂ、ＥＬＩＳＡ）。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理を開始した４時間後に細胞傷害性サイトカインＩＦＮ−βを測定した（ｑＲＴ−ＰＣＲ、図３Ｃ）。
【０１７７】
ＣＲＰＣ等の悪性腫瘍は、免疫学的癌防御および癌細胞のクリアランスを害するメカニズムを発症することができる。本発明のポリプレックスは腫瘍細胞を直接死滅させるが（例えば、腫瘍細胞アポトーシスによって）、癌細胞に対して作用するように患者に免疫系を活性化もする（例えば、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ誘発産生およびサイトカインの放出）。本発明のポリプレックスを用いて、非標的化隣接癌細胞もバイスタンダー効果によって死滅された。ＰｏｌｙＩＣは、中でも、Ｔｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ３）への作動性結合、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）の活性化、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−１）およびメラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）のアップレギュレーションに作用する（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ  Ａ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  Ｆｉｇｈｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｈｏｍｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｅ／Ｃｙｔｏｓｉｎｅ（ＰｏｌｙＩＣ），Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２，２：４）。これらのシグナルタンパク質は異なったアポトーシス経路を同時に誘発し、また癌細胞を産生させ、免疫刺激性サイトカインを放出する。
【０１７８】
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処理は走化性およびＰＢＭＣ活性化を誘発した。
さらに、本発明のＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣポリプレックスは免疫細胞（走化性）およびＰＢＭＣ活性化の補充をもたらす。ＬＮＣａＰ細胞をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで４８時間処理した。非処理対照細胞由来の培地と比較して、これらのＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理細胞由来の調整培地は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増加した走化性をもたらした（５倍増加、図４Ａ）。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理細胞由来の調整培地は、ＩＬ−２の増加したレベルをもたらし、ＰＢＭＣに毒性の前炎症性サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦαを分泌するように誘発した（図４Ｂ）。ＴＮＦ−−αは特定の前立腺細胞株ＰＣ−３、ＤＵ−１４５およびＬＮＣａＰには細胞傷害性であり（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ  ９（ｌ）：４４−５２）、ＩＬ−２の上昇した発現はＰＢＭＣが調整培地によって活性化されたことを指摘している（Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７（１−２）：１３１−１３９）。
【０１７９】
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処理はバイスタンダー効果を誘発した。
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理によって誘発されたバイスタンダー効果は、安定にルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現する、ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ、ＰＣ３−ＬｕｃおよびＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞での共培養系で研究された。
【０１８０】
ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ細胞を低用量のＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで処理し、処置開始後７２時間に最大５０％の癌細胞死を起こす。予備処理ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ細胞にＰＢＭＣを４８時間添加すると、まさに癌細胞の１００％が死滅した。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで処理しなかった対照細胞はＰＢＭＣで影響を受けなかった（図５Ａ）。
【０１８１】
加えて、直接的なバイスタンダー効果は、（ｉ）ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＬＮＣａＰ細胞でＰＣ３−Ｌｕｃ細胞を共培養することによって、および（ｉｉ）またはＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＰＣ３−ＰＳＭＡでＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞を共培養することによって示された。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ単独での処理は、ＰＣ３−Ｌｕｃ細胞（図５Ｂ）でのＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞（図５Ｃ）でも何ら効果を示さなかった。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＬＮＣａＰ細胞でのＰＣ３−Ｌｕｃ細胞の共培養は、最大７０％≧のＰＣ３−Ｌｕｃ細胞の死をもたらし（図５Ｂ）、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＰＣ３−ＰＳＭＡでのＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞の共培養は、最大５０％のＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞の死をもたらした（図５Ｃ）。したがって、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＰＳＭＡ過剰発現細胞からの細胞傷害性サイトカインの分泌は、それ自体ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処理に反応しない共培養された細胞の減少を誘発した。
【０１８２】
本発明者らは、ＰＳＭＡを過剰発現しない細胞に対するＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理の直接的および間接的な合わせたバイスタンダー効果を試験した。再度、（ｉ）ＰＣ３−Ｌｕｃ細胞をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＬＮＣａＰ細胞と共培養し、および（ｉｉ）ＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞をＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＰＣ３−ＰＳＭＡと共培養し、細胞培養物の両方の種類にＰＢＭＣを添加した。ＰＢＭＣおよびＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＰＳＭＡ過剰発現細胞の組み合わせは、ＰＳＭＡを過剰発現しない実質的な数の細胞の死滅をもたらした。ＰＢＭＣをＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ−処理ＰＣ３−ＬｕｃまたはＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞と共培養すると、すなわちＰＳＭＡ過剰発現細胞なしで共培養すると、おそらく活性化ＰＢＭＣによってＬｕｃ過剰発現細胞の最大２０％≧が死滅した（図５Ｂ、Ｃ）。本発明者らは、標的化ｐｏｌｙＩＣを内在化することができないＰＣ３−ＬｕｃまたはＭＣＦ７−Ｌｕｃ細胞に対するこの効果は、培地中で蓄積しＰＢＭＣの活性化を誘発するＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによって誘導されると考えている。
【０１８３】
したがって、これらの実験は、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処理がそれ自体ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによって標的化されない共培養癌細胞の死をもたらすことを示している。直接的なバイスタンダー効果は、処理した標的化細胞から放出された毒性サイトカインによって誘発され、隣接の非標的化癌細胞の約７０％の死もたらした。この効果は、免疫細胞介在間接的バイスタンダー効果を誘発するＰＢＭＣを添加することによってさらに亢進することができた。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ単独の適用と比較すると、ＰＢＭＣの添加は、相当に低いＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ用量を用いて細胞死の増加したレベルをもたらした。このことは、抗癌免疫の亢進が全身的に投与されたｐｏｌｙＩＣの望ましくない副作用を減少させることができることを示している。
【０１８４】
実施例５−インビトロ試験の結果
ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣとＰＢＭＣとの組み合わせの全身性投与は。前立腺腫瘍異種移植片の退行を誘発する。さらに、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣのＣＲＰＣに対する効果は、アンドロゲン抵抗性前立腺癌の動物モデルにおいて研究された。雄性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、ヒトＰＳＭＡを過剰発現するＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞で皮下注射した。このようにして生じた腫瘍が約１００ｍｍ３の大きさを有していた時に処置を行った。免疫系に対するＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処理の効果および両方の組み合わせた効果を試験するために、動物の免疫系をヒトＰＢＭＣの投与によって一部再構築した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを３週間以内にＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣで繰り返し処置し、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置中にＰＢＭＣで２回注射した（図６Ａ）。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ非処置対照マウスおよびＰＢＭＣでのみ処置したマウスは、大きな腫瘍を発症し、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置が開始した３週間後に屠殺しなければならない。反対に、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置マウスでは、腫瘍成長は実質的に遅くなった。さらに、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ処置と免疫再構築（ＰＢＭＣの注射）との組み合わせは、腫瘍サイズの減少さえもたらした。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ＋ＰＢＭＣ処置を受けた７匹中４匹では、腫瘍は消えるか、または検出閾値を下回った（図６Ｂ）。したがって、組み合わせたＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ＋ＰＢＭＣ処置の効果は、単独で投与されたＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣの効果よりも顕著に優れていた。このことは、免疫細胞の存在下で引き出されたＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣ自体の直接的な殺腫瘍効果とバイスタンダー効果との組み合わせが、ＣＲＰＣにおける実質的な腫瘍後退をもたらしたことを示唆している。
【０１８５】
総合すれば、アンドロゲン抵抗性前立腺癌の異種移植片動物モデルにおいて、ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣによる処置は腫瘍成長の強力な減少をもたらした。ＰＰＤ／ｐｏｌｙＩＣとＰＢＭＣとの組み合わせ処置は腫瘍の大きさを減少させるかまたは腫瘍の根絶さえもたらした。
【０１８６】
ＰＢＭＣ誘発毒性を避けるために、少数の細胞のみを投与した。このような少数の細胞の強力な効果は、それらが腫瘍に直接に補充されたことを示している。この処置の高スピードおよび高い有効性はこの化学療法に対する抵抗性の発症を抑制するはずである。さらに、バイスタンダー効果によって、不均一腫瘍も効率的に治療しおよび根絶することができる。
【０１８７】
免疫欠損マウスとは異なり、ヒトＣＲＰＣ患者は活性な免疫系を有する。この背景の前には、上記の結果は、ＰＳＭＡ標的化ｐｏｌｙＩＣがインビボモデルのマウスよりヒトＣＲＰＣ患者においてさらにより効果的であろうと示唆している。
【０１８８】
実施例６−細胞培養
すべての組織培養培地は１０％胎児ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を含んだ。細胞株は５％Ｃ０２で、３７℃で培養した。細胞株は表２で指示した培地で成長した。
2020535171.tif 000016
【０１８９】
Ｌｕｃ／ＧＦＰを有するレンチウイルスを使用して、Ｚｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１６にしたがってＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞を感染させ、それによってＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰおよびＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰが産生された（Ｚｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＨＥＲ２−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｅ／Ｐｏｌｙｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１６，４（８）：６８８−６９７）。Ｓｈｉｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，２０１０によれば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離法によって血液バフィーコートからヒトＰＢＭＣが単離され、維持され（Ｓｈｉｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＧＦＲ−ｈｏｍｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ＥＧＦＲ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０，１７（５）：１０３３−１０４３）。
【図１Ａ】
2020535171.tif 000025
【図１Ｂ】
2020535171.tif 000026
【図２Ａ】
2020535171.tif 000027
【図２Ｂ】
2020535171.tif 000028
【図２Ｃ】
2020535171.tif 000029
【図３Ａ】
2020535171.tif 000030
【図３Ｂ】
2020535171.tif 000031
【図３Ｃ】
2020535171.tif 000032
【図４Ａ】
2020535171.tif 000033
【図４Ｂ】
2020535171.tif 000034
【図５Ａ】
2020535171.tif 000035
【図５Ｂ】
2020535171.tif 000036
【図５Ｃ】
2020535171.tif 000037
【図６】
2020535171.tif 000038
【配列表】
2020535171000001.app
【国際調査報告】
2020535171.tif 000039
2020535171.tif 000040
2020535171.tif 000041