(57)【要約】アルボウイルスは、ｐｒＥ２またはｐｒＭなどの前駆体ポリタンパク質の増強された切断をもたらす、改変されたフリン切断部位を持つ。デング熱ウイルス粒子は、ｐｒＭのアミノ酸８０〜１３０内にアミノ酸改変を有することができる。ジカウイルス粒子は、フリン切断部位における、および／またはその周囲のアミノ残基に、改変を有することができる。該ウイルスは、昆虫細胞中で産生されることができる。該ウイルスは、哺乳類細胞において子孫ウイルスを形成しない。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆体ポリタンパク質中に機能不全フリンテトラペプチド切断部位を含み、前記部位から上流にあるアミノ酸の第１のストレッチにおける改変および／または前記部位から下流にあるアミノ酸の第２のストレッチにおける改変を含んでいてもよい、増殖制限アルボウイルスを含むアルボウイルス粒子。
【請求項２】
前記部位がＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：１６）のコンセンサス配列を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
ＸがＡｒｇを含む、請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
前記第１のストレッチが、前記部位に隣接する８アミノ酸を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
前記第１のストレッチにおける改変を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項６】
前記第２のストレッチにおける改変を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
前記ポリタンパク質がｐｒＭを含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項８】
前記ポリタンパク質がｐｒＥ２を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項９】
デング熱ウイルス（ＤＶ）を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項１０】
ジカウイルス（ＺＶ）を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項１１】
請求項１に記載の粒子と、医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の粒子を含む昆虫細胞。
【請求項１３】
前記昆虫が節足動物を含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記昆虫がマダニまたは蚊を含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の粒子を含む哺乳類細胞。
【請求項１６】
前記細胞がＤＶ抗原を発現する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、前記細胞の表面においてＤＶ抗原を発現する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞がＺＶ抗原を発現する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、前記細胞の表面においてＺＶ抗原を発現する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
ヒト細胞を含む、請求項１５に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は一般に、昆虫細胞およびヒト細胞において複製する類のない独特な特性を有する少数のウイルスの小群であるアルボウイルスに関する。本発明は、変異アルボウイルスおよび免疫原としてのその使用に関する。観点において、本発明は、改変アルボウイルスであって、哺乳類宿主細胞においてもはや再生しないが、昆虫細胞においては複製し続け、それから採取することができるが、なお、哺乳類免疫系においておよび哺乳類免疫系に対してアルボウイルス抗原を発現し提示し続ける、前記改変アルボウイルスに関する。
【０００２】
[0002]本発明は、ウイルスのアルボウイルス群に関する。アルボウイルスの基本的な特性は、哺乳類および昆虫細胞における複製である。多くのアルボウイルスは、マダニまたは蚊によって哺乳類に伝播される。１つの分類スキーム下において、アルボウイルスは、フラビウイルス属、アルファウイルス属、およびオルソブニヤウイルス属を包含する。別の分類スキーム下において、アルボウイルスは、ブニヤウイルス科、フラビウイルス科、レオウイルス科およびトガウイルス科を包含する。アルボウイルスの例としては、アフリカ豚コレラウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、ウマ脳症ウイルス、チクングニヤウイルス、デング熱ウイルス（ＤＶ）、ジカウイルス（ＺＶ）および西ナイルウイルスが挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
[0003]フラビウイルスは、部分的に、人体病理学に起因して研究されてきた。例えば、Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｋｕｎｏ編：Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ．Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９７；およびＰｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ；Ｅｘｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５参照。
【０００４】
[0004]フラビウイルスゲノムは、単一線状で一本鎖の＋センスＲＮＡからなる。＋鎖ＲＮＡは、適切な宿主細胞に感染する。全ゲノムは、１０〜１１ｋｂの範囲であることができる。３’ポリアデニル化はない。５’末端はメチル化キャップを有する。
【０００５】
[0005]フラビウイルスゲノムは、宿主リボソームに翻訳開始部位を提供する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有しない。代わりに、フラビウイルスは、タンパク質合成を開始するためにリボソームスキャニングを用いる。
【０００６】
[0006]フラビウイルスビリオンは、直径４０〜６５ｎｍの球であることができる。脂質エンベロープの下には、直径約２５〜３０ｎｍの二十面体カプシドコートがある。
[0007]デング熱ウイルス（１〜５型）、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルスは、ヒトにおける有意な罹患率および死亡率の原因因子である。
【０００７】
[0008]例えば、黄熱病ウイルスは、流行を引き起こすことができる。第１のサイクルにおいて、ウイルスはＡｅｄｅｓ  ａｆｒｉｃａｎｕｓおよび他のヤブ蚊（アフリカ）またはＨｅｍｏｇｏｇｕｓ蚊（アメリカ）によって伝播され；サルは保有体として働き、一般に、ヒト感染者は、森林およびジャングルの奥深くに入り、これらのベクターに暴露された人である。第２のサイクルでは、ヒトと密接に関係して生きている内地の蚊であるネッタイシマカが、ウイルスを、サイクル中の唯一の宿主であるヒトに、直接伝播することができる。
【０００８】
[0009]フラビウイルスは、他の疾患、例えば、マレーバレー脳炎、ロシオおよびポーワッサン脳炎のほか、より最近米国で観察されるように、西ナイル熱およびジカ熱を引き起こす。
【０００９】
[0010]ヒツジに神経疾患を引き起こす跳躍病ウイルス、ウマに脳炎を引き起こす西ナイルウイルス、同様にウマに脳炎を引き起こすほか、ブタに死産をもたらす日本脳炎ウイルスなど、いくつかのフラビウイルスは、商業的に重要な獣医病原体である。
【００１０】
[0011]アルボウイルス処置の緊急の必要性を考慮すると、安全かつ有効なアルボウイルス処置組成物を作製するための強固な方法が必要とされる。理論的には弱毒化生ワクチンがもっとも有効な長期特異的免疫を誘発するが、組換えサブユニットワクチンを含む不活化ウイルスワクチンは、より高いレベルの安全性を提供する。理想的なワクチンは、生ワクチンの有効性およびサブユニットワクチンの安全性をもたらすことができるワクチンであろう。
【００１１】
[0012]これらの目標は、哺乳類特異的増殖制限アルボウイルスを作製するための拡大可能(scalable)な方法の開発において達成された。対象の増殖欠損ウイルスは、アルボウイルス抗原に存在し、これを発現し、感染哺乳類においてアルボウイルス抗原（１以上）に対する免疫応答を誘発するが、哺乳類細胞において子孫ウイルスを産生しないので、感染細胞は哺乳類宿主において放射状に広がる細胞感染および病変に寄与しない。対象の増殖制限ウイルスの繁殖は、昆虫細胞においては妨害されない。したがって、対象の機能不全ウイルスは、昆虫細胞株において経済的に産生することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ．Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９７
【非特許文献２】Ｅｘｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５
【発明の概要】
【００１３】
[0013]本発明は、昆虫細胞中で複製し続けるが、哺乳類細胞（例えばヒト細胞）中ではもはや複製しない（または低レベルでしか複製しない）、したがって感染哺乳類細胞は子孫ウイルスを産生しない、増殖制限アルボウイルス粒子を作製するための材料および方法に関する。対象のアルボウイルスは、宿主哺乳類細胞に感染し、その宿主哺乳類細胞において複製して、哺乳類宿主免疫系によって認識されるアルボウイルスタンパク質を、例えば細胞性および／または体液性応答で産生することができるが、子孫アルボウイルス粒子を産生せず、放出しない。対象の欠損ウイルスはウイルスゲノム複製およびアルボウイルスタンパク質の産生を確実にするために必要なすべての遺伝子を含み、これらは感染細胞から放出されることができ、または宿主細胞の表面で発現することができるが、感染宿主哺乳類細胞から子孫ウイルスを産生しない。したがって、対象のアルボウイルス粒子は野生型ウイルスと同程度に免疫原性であることができるが、該粒子は感染宿主における疾患または病変に、仮に寄与するとしても、あまり寄与しないはずである。これは、対象の改変アルボウイルスは、哺乳類細胞において、複製するとしても減少した複製を示すためである。
【００１４】
[0014]対象の増殖制限アルボウイルスは、哺乳類細胞またはヒト細胞では容易に繁殖せず、同種の野生型アルボウイルスまたは増殖制限的となる処理前の試料の野生型アルボウイルスに感染した同タイプの細胞で産生される子孫ウイルスのレベルまたは量と比較して、４ｌｏｇ以下、５ｌｏｇ以下、６ｌｏｇ以下、７ｌｏｇ以下、８ｌｏｇ以下、９ｌｏｇ以下のウイルス粒子の減少、または子孫アルボウイルスのない状態をもたらし、放出する。  
【００１５】
[0015]一方、対象の増殖制限または増殖欠損アルボウイルスは、節足動物細胞などの昆虫細胞中では容易に繁殖して、同様の子孫アルボウイルスを産生する。昆虫細胞によって産生される子孫アルボウイルスのレベルは、同種、または同昆虫細胞において増殖制限的になるように処理するために使用される試料の適切な対照野生型アルボウイルスによって産生される子孫ウイルスのレベルまたは量とほぼ等しいか、またはそれを超えることができる。
【００１６】
[0016]態様において、対象の欠損アルボウイルスは、増強された（すなわち、同種の野生型アルボウイルスまたは増殖制限的となる処理前の試料の野生型アルボウイルスと比較して、より速い速度で切断されることができるか、より効率的に切断されることができるか、または両方であることができる）フリン活性を含む。前駆体ポリタンパク質のフリン切断は、アルボウイルス子孫粒子の成熟に必須であることができる。いくつかのアルボウイルスでは、フリン切断はｐｒとＭの接合部で起こる。したがって、対象の欠損アルボウイルスは、ｐｒＭタンパク質またはポリペプチドにおいて、その中、またはその周囲に、増強されたフリン活性を含む。いくつかのアルボウイルスでは、フリン切断はＥ３とＥ２の接合部で起こる。したがって、対象の欠損アルボウイルスは、前駆体Ｅ２タンパク質またはポリペプチドにおいて、その中、またはその周囲に、増強されたフリン活性を含む。
【００１７】
[0017]対象の増殖制限アルボウイルスは、例えばｐｒとＭの接合部においてであることができる、フリンコンセンサステトラペプチドにおける改変；コンセンサステトラペプチドの上流での改変（例えば、ｐｒポリペプチドにおけるアミノ末端方向）；コンセンサステトラペプチドの下流での改変（例えば、Ｍタンパク質におけるカルボキシ末端方向）；またはそれらの組み合わせを含む。
【００１８】
[0018]態様において、アルボウイルスは、ｐｒＭポリタンパク質を含むデング熱ウイルス（ＤＶ）である。
[0019]態様において、ｐｒとＭの間のフリン切断部位および／またはその周囲における１以上のアミノ酸置換は、ｐｒＭのフリン切断が増強されたウイルスをもたらし；昆虫細胞において繁殖し；そして哺乳類細胞またはヒト細胞において繁殖しない。
【００１９】
[0020]態様において、ＤＶにおける増強されたフリン活性は、以下の１以上によって得られる：１）ＤＶのｐｒＭポリペプチドのアミノ酸８０で始まるフリン認識および切断部位の上流（アミノ末端の方向）、すなわちｐｒＭのアミノ酸８０〜８７の８アミノ酸ストレッチにおける改変；２）テトラペプチドフリン認識部位における改変；３）フリン認識および切断部位の下流（カルボキシ末端の方向）、すなわちｐｒＭのアミノ酸９２〜１３０の３９アミノ酸ストレッチにおける改変；４）アミノ酸８０の上流での改変；および５）アミノ酸１３０の下流での改変。上記の任意の組み合わせが存在することができ、例えば、１）、２）および３）が存在することができる。改変１）、２）および３）が存在することができる。
【００２０】
[0021]態様において、ｐｒＭタンパク質におけるＤＶフリン切断部位、ＮＨ２−（８８）Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨ／（配列番号：１）［これに関し、切断はＬｙｓ−Ａｒｇ残基後に生じる（上記切断認識部位では“／”によって示す）］を、Ｇｌｕ部位において改変して、フリン切断を増強する。
【００２１】
[0022]態様において、Ｇｌｕは、任意のアミノ酸によって置換される。
[0023]態様において、Ｇｌｕを置換するアミノ酸は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＣｙｓなどの非酸性非中性アミノ酸である。態様において、置換アミノ酸は硫黄を含有しない。態様において、置換アミノ酸は、Ｒ基側鎖にヒドロキシル基を含有しない。態様において、置換アミノ酸は塩基性アミノ酸である。態様において、置換アミノ酸は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓである。態様において、置換アミノ酸はＡｒｇである。
【００２２】
[0024]態様において、対象の欠損ＤＶは、配列番号１の上流、例えばＡｒｇ−Ｇｌｕ残基の上流の８アミノ酸において、ポリペプチド配列の１以上の改変を含む。態様において、対象の欠損ＤＶは、配列番号１の下流、例えばＬｙｓ−Ａｒｇ残基から下流の３９アミノ酸において、ポリペプチド配列の１以上の改変を含む。改変はフリン認識または切断部位であることができ、またはその中であることができる。改変は、Ｍタンパク質中に存在することができる。改変は、膜タンパク質の最初の３９アミノ末端アミノ酸内に位置することができる。改変は、ｐｒポリペプチド中に存在することができる。改変は、ｐｒポリペプチドの最後の８カルボキシ末端アミノ酸内に位置することができる。
【００２３】
[0025]このような改変または改変の組み合わせは、感染哺乳類細胞からのＤＶの複製、成熟および放出を低減または無にする。したがって、感染哺乳類細胞は哺乳類宿主免疫系に対してＤＶ抗原を含有し、提示するが、感染哺乳類細胞は感染性の子孫ＤＶ粒子を放出しない。
【００２４】
[0026]しかしながら、このようなフリン切断部位またはその周囲の改変は、昆虫細胞における対象のＤＶの複製を無にせず、その結果、哺乳類細胞において感染するが複製しないために使用するための、本明細書中に開示する改変フリン部位を含むＤＶ粒子をもたらすための方法および手段を提供する。昆虫細胞における繁殖は強固であり、高いウイルス収率を提供し、そして昆虫細胞におけるＤＶの増殖または産生は、より大きな容量、量および反応においてウイルス粒子がもたらされるように拡大可能である。
【００２５】
[0027]態様において、アルボウイルスは、ｐｒＭポリタンパク質を含むジカウイルス（ＺＶ）である。
[0028]ＺＶのフリン切断部位は、ｐｒＭのアミノ酸９３の後に位置する。態様において、ＺＶフリン認識部位の上流にあり、該ＺＶフリン認識部位を包含するｐｒＭ配列、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／（配列番号：２）は、テトラペプチドフリン認識部位のセリン残基で変性され（切断は上記配列の４番目のＡｒｇの後に生じる）、フリン切断を増強するための５個のアルギニン残基の配列をもたらす。態様において、該領域のグルタミン酸残基は、フリン切断を増強するためにヒスチジンに改変されることができる。残基の上記配列に他の改変を加えることができる。改変は、アミノ酸８２の上流および／またはアミノ酸９３の下流で行うことができる。
【００２６】
[0029]ＺＶにおけるフリン活性の増強は、以下の１以上により得ることができる：（１）ＺＶフリン切断部位の上流の１以上のアミノ酸の改変、例えば、ｐｒＭのＮ末端から８２番目のアミノ酸残基から始まる８つの残基配列（すなわち、ｐｒＭのアミノ酸残基８２〜８９）においてであるが、アミノ酸８２の上流であってもよい；（２）ＺＶフリンテトラペプチド切断部位の改変；および（３）フリン切断部位の下流の１以上のアミノ酸残基の改変、すなわち、アミノ酸９４および下方、例えば、テトラペプチドの下流のアミノ酸の２６残基ストレッチにおける、１以上のアミノ酸残基の改変。（１）、（２）および（３）の任意の組み合わせが存在することができる。
【００２７】
[0030]哺乳類細胞における対象のＺＶの増殖は最小化されるか、実質的に存在しないが、その機能不全ＺＶの昆虫細胞における増殖は実質的に影響されない。
[0031]本発明のさらなる特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および図面に記載され、それらから明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】[0032]  図１は、野生型ＤＶでの攻撃に先立ち、対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または対象のＤＶ変異体（Ｄ２−８９Ｒ）を与えたマウスから得たデータを含む生存グラフを示す。
【図２】[0033]  図２は、野生型ＳＶでの攻撃に先立ち、対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または対象のＳＶ変異体（Ｍ２）を与えたマウスから得たデータを含む生存グラフを示す。
【図３】[0034]  図３は、野生型ＳＶまたはＳＶ  Ｍ２変異体のいずれかを与えたマウスから得たデータを含む安全性グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
[0035]本明細書中で使用される場合、“機能不全”またはその文法的形態は、変化または改変の前または変化または改変なしで観察される機能のレベルまたは特性の存在と比較して、その変化または改変から生じる特性または機能の増強を示す。例えば、改変され、機能不全である酵素部位は、酵素によって常に認識されるか、またはより速い速度で、より効率的に、などで同族の酵素によって切断される酵素部位であることができ、その結果は、酵素反応産物のレベルまたは量の増加である。例えば、態様において、機能不全のフリン切断部位は、増強された速度もしくは値、または機能不全でないフリン切断部位について観察される速度もしくは値を上回る速度または値で切断される。したがって、感染細胞中のｐｒＭの量またはレベルの低下が結果である。機能不全の同義語は、“欠損”またはその文法的形態である。
【００３０】
[0036]“増強された”またはその文法的変形は、基礎または参照レベルまたは測定基準を超える測定基準またはレベルである。基礎レベルは、いくつかの単位をサンプリングし、平均値をとることによって、または文献から導出された集団平均値を得ることによって、決定することができる。態様において、増強されたレベルは、対照試料で見いだされるレベルよりも高い任意のレベルである。したがって、バイオアッセイ、化学アッセイなどでは、例えば、２つの試料、すなわち、増強された測定基準が疑われる実験試料と、標準的で、改変されておらず、変異していないなどの、集団を代表する公知の野生型からの試料であることができる対照を、並行して試験することができ、より高い測定基準、例えば、より多量の産物、より速い動態、より大きな産物などが、実験試料において明らかにされる。態様において、基礎レベルは、野生型単位に見いだされるものである。態様において、増強は、酵素活性のレベルの増大を含む。態様において、増強は、触媒活性のレベルの増大を含む。態様において、増強は、溶解活性のレベルの増大を含む。態様において、増強は、フリンによるポリペプチド切断のレベルの増大を含む。態様において、増強されたフリン活性は、対象の変異体に感染した細胞からの試料および野生型ウイルスに感染した細胞からの試料中のｐｒＭの量を比較することによって、明らかにすることができる。態様において、増強されたフリン活性は、変異体と野生型との比較において、ｐｒＭのレベルの低下またはｐｒもしくはＭのレベルの増大によって明らかにすることができる。
【００３１】
[0037]“改変”またはその文法的形態は、１以上の残基における野生型アミノ酸配列の変化または変性である。したがって、改変ポリペプチドは、対立遺伝子を含むことができる。変化は、野生型配列の部位に２以上のアミノ酸を含むことができるアミノ酸置換、欠失または挿入であることができる。改変は、対象の機能不全ウイルスをもたらす。
【００３２】
[0038]“ストレッチ”またはその文法的形態は、核酸の連続したヌクレオチド、またはタンパク質の連続したアミノ酸を意味する。核酸の連続したヌクレオチド（ヌクレオチドのストレッチ）は、線状オリゴヌクレオチドとして重合される。タンパク質の連続するアミノ酸（アミノ酸のストレッチ）は、線状オリゴペプチドとして重合される。
【００３３】
[0039]“繁殖”またはその文法的形態は、ウイルスが適合性宿主細胞に感染し；その感染細胞内で複製して子孫ウイルスを産生し；感染細胞が子孫ウイルスを細胞外空間に放出するプロセスを含む。同義語としては、“再生”、“複製”、“増殖”などが挙げられる。
【００３４】
[0040]“免疫原性”またはその文法的形態は、宿主において免疫応答を発生または誘発することを含む。したがって、免疫原性は、態様において、エピトープまたは決定基を持つことを含む。態様において、例えば、免疫原性組成物は、エピトープまたは決定基を有する組成物であって、宿主に導入されたときに、宿主免疫系によるそのエピトープまたは決定基に対する免疫応答を誘発するものである。免疫応答は、ある程度宿主から免疫原性組成物を“除去する”ことができるものであり、これに関し、“除去すること”は、組成物を実際に破壊すること、すなわち、組成物の変質または消化；組成物が構造内に含有されて、組成物が不活性になるように、組成物を隔離すること；組成物を解毒すること；組成物を中和すること；組成物を生物学的に不活性にすること；宿主に対して、および宿主において組成物を安全にすること；などを含むことができる。免疫原性は、任意の１つの暴露宿主における免疫防御を意味または保証するものではない。免疫応答は、体液性、細胞性など、またはそれらの組み合わせであることができる。
【００３５】
[0041]“ヒトまたは哺乳類細胞中で複製しない”、“ヒトまたは哺乳類細胞中で繁殖しない”、“ヒトまたは哺乳類細胞中で増殖しない”、“ヒトまたは哺乳類細胞中で再生しない”、“ヒトまたは哺乳類細胞中で増殖制限されている”、“増殖制限されている”、“増殖欠損である”、これらの語句の等価物、これらの語句の文法的形態などは、本明細書に記載するように、同義的な用語または語句であり、同じ種、株、系統などの野生型アルボウイルスに感染した同じタイプの細胞により；または、本明細書に記載されるように、非機能不全ウイルスに感染した同様の細胞により；または、適切かつ許容しうる陰性対照により産生される子孫ウイルスのレベルまたは量と比較して、４ｌｏｇ以下、５ｌｏｇ以下、６ｌｏｇ以下、７ｌｏｇ以下、８ｌｏｇ以下、９ｌｏｇ以下の子孫アルボウイルスを産生するか、子孫アルボウイルスを産生しない、対象の変異ウイルスに感染したヒトまたは哺乳類細胞を含む。
【００３６】
[0042]“昆虫細胞中で複製する”、“昆虫細胞中で繁殖する”、“昆虫細胞中で増殖する”、“昆虫細胞中で再生する”、“昆虫細胞中で増殖制限されない”、“増殖欠損でない”、“増殖制限されない”、これらの語句の等価物、これらの語句の文法的形態などは、本明細書に記載するように、同義語または同義的な用語もしくは語句であり、同じ種、株、系統などの野生型アルボウイルスに感染した同タイプの昆虫細胞によって；本明細書に記載されるように、非機能不全ウイルスに感染した同様の細胞によって；または、適切かつ許容しうる陰性対照によって、産生される子孫ウイルスのレベルまたは量と比較して、ほぼ同程度以上の子孫アルボウイルスを産生する、対象の変異ウイルスに感染した昆虫細胞を含む。
【００３７】
[0043]“約”は、例えば、ある値に関し、範囲の限界が、ある値より１０％小さく、ある値を包含し、そしてある値より１０％大きい範囲を提供する、誤差または偏差に反映される変動量が存在するような、ある値に対する近似である。したがって、本明細書で使用されるように、約５０を引用することによって、その値は、４５〜５５の範囲であり得ることが理解される。同義的用語としては、“本質的に”および“実質的に”が挙げられる。
【００３８】
[0044]“拡大可能”またはその文法的形態は、ベンチまたは実験室規模で実施される方法であって、例えば、反応容器が数百または数千リットルの容量を有することができる食品、飲料、消費財、工業化学品などの商業的製造のために実施されるような、より大きな規模または提示(presentation)に翻訳することができる方法である。したがって、本発明の文脈において、昆虫細胞培養は、１０リットル代、１００リットル代または１０００リットル代、またはそれを超える容量、量、反応などで実施することができる。
【００３９】
[0045]“野生型”またはその文法的形態は、一般に集団におけるもっとも一般的または主要な形態、形質、遺伝子、タンパク質、表現型などである、自然発生的なアルボウイルスに関する。態様において、同義語は、“標準”または“参照”アルボウイルスである。集団の形質は、単一遺伝子座の１より多い対立遺伝子によるか、または多重遺伝子によって、決定することができる。したがって、対立遺伝子または多遺伝子は同じ形質または実質的に同じ形質を生じるので、対立遺伝子または多遺伝子のセットは本明細書中で等価であると考える。野生型アルボウイルスは、機能不全のフリン部位を含まず、対象の改変アルボウイルス中に存在するような増強されたフリン切断を生じる。態様において、本明細書中では、対象の機能不全フリン切断部位を含まない正常または野生型アルボウイルスに対する、対象の改変アルボウイルスの特性を実証するために、比較を行う。態様において、対象のアルボウイルスは、昆虫細胞における増殖など、正常、または参照アルボウイルスの特性とほぼ同じ特性を有する。例えば、態様において、参照ＤＶは、ＡＴＣＣ（受託番号ＶＲ−１５８４）から入手可能な血清型２、ニューギニア株である。したがって、本明細書中でのＤＶ  ｐｒＭおよびそのアミノ酸番号付けは、ＶＲ−１５８４のｐｒＭ；または、変異ＤＶの野生型形態のｐｒＭおよびそのアミノ酸番号付けと、比較することができる。態様において、参照ＺＶは、受託番号ＶＲ−１８３８でＡＴＣＣから入手可能である。したがって、本明細書中でのＺＶ  ｐｒＭおよびそのアミノ酸番号は、ＶＲ−１８３８のｐｒＭ；または、変異ＺＶの野生型形態のそれらと、比較することができる。野生型アルボウイルスと同様に、対象のアルボウイルスは昆虫細胞中で繁殖する。しかしながら、本明細書中のアミノ酸の番号付けに関し、固有の集団の変異、集団における多型または変動性に起因して、１つの株、系統、種などにおける番号付けは、別の株、系統種などにおける番号付けと直接対応しない場合がある。したがって、本明細書中の番号付けは、任意の１つのポリペプチド、切断部位などの位置に関して絶対的ではない。これは、番号付けは、自然発生的な変異に起因して、系統、株、種などの範囲内でさえ変動する可能性があるためである。したがって、本明細書で使用する番号付けは、特定の細胞、ウイルスなどに対するものであり、本明細書で提示するものと同じ番号付けをすべてのアルボウイルスにおいて有するすべてのアルボウイルスを絶対的に代表するものと解釈すべきでない。代わりに、さまざまな特徴は、部位を同定し、当業者が、設計上の選択として任意のアルボウイルスを用いて、特許請求される主題を実施することを可能にするための目印を提供する。例えば、ｐｒとＭの接合部、ｐｒの下流またはカルボキシ末端、Ｍの上流またはアミノ末端におけるフリンコンセンサステトラペプチドは、タンパク質の操作および改変を適応させるために使用することができる目印である。したがって、一態様において、番号付けは、テトラペプチドのアミノ酸の数を考慮に入れて、ｐｒおよびＭのサイズの変動性が存在するか否かを決定し、存在する場合、本明細書で教示されるものと、異なるアルボウイルスにおい��当業者によって使用されているものとの間の調整または相関付けを行って、適切な参照枠を提供する。
【００４０】
[0046]ＤＶの“ｐｒＭ”タンパク質またはポリペプチドはＤＶの血清型１〜４において１６６アミノ酸長であり、アミノ酸９１の後でフリンによって切断されて、ｐｒポリペプチドおよびＭタンパク質を生じる。ＤＶ２のＮＧＣ株の野生型ｐｒＭアミノ酸配列は、ＦＨＬＴＴＲＮＧＥＰ  ＨＭＩＶＳＲＱＥＫＧ  ＫＳＬＬＦＫＴＥＤＧ  ＶＮＭＣＴＬＭＡＭＤ  ＬＧＥＬＣＥＤＴＩＴ  ＹＮＣＰＬＬＲＱＮＥ  ＰＥＤＩＤＣＷＣＮＳ  ＴＳＴＷＶＴＹＧＴＣ  ＴＴＴＧＥＨＲＲＥＫ  ＲＳＶＡＬＶＰＨＶＧ  ＭＧＬＥＴＲＴＥＴＷ  ＭＳＳＥＧＡＷＫＨＡ  ＱＲＩＥＴＷＩＬＲＨ  ＰＧＦＴＩＭＡＡＩＬ  ＡＹＴＩＧＴＴＹＦＱ  ＲＶＬＩＦＩＬＬＴＡ  ＶＡＰＳＭＴ（配列番号：８）である。公知のように、天然の変異では、野生型株が、フリンによるｐｒＭ切断の崩壊または増強を伴わず、そして哺乳類細胞における繁殖の減少を伴わずに、配列番号８に提供される配列から１以上のアミノ酸変化を有することを見いだすことができる。対象の改変された配列番号８は、増強されたフリン切断；および昆虫細胞におけるウイルスの繁殖を示すが、哺乳類細胞におけるそのウイルスの繁殖はほとんどまたはまったく示さないものである。
【００４１】
[0047]ＺＶの“ｐｒＭ”タンパク質またはポリペプチドは１６８アミノ酸長であり、アミノ酸９３の後でフリンによって切断されて、ｐｒポリペプチドおよびＭタンパク質を生じる。野生型ｐｒＭアミノ酸配列は、ＡＥＩＴＲＲＧＳＡＹ  ＹＭＹＬＤＲＳＤＡＧ  ＫＡＩＳＦＡＴＴＬＧ  ＶＮＫＣＨＶＱＩＭＤ  ＬＧＨＭＣＤＡＴＭＳ  ＹＥＣＰＭＬＤＥＧＶ  ＥＰＤＤＶＤＣＷＣＮ  ＴＴＳＴＷＶＶＹＧＴ  ＣＨＨＫＫＧＥＡＲＲ  ＳＲＲＡＶＴＬＰＳＨ  ＳＴＲＫＬＱＴＲＳＱ  ＴＷＬＥＳＲＥＹＴＫ  ＨＬＩＫＶＥＮＷＩＦ  ＲＮＰＧＦＡＬＶＡＶ  ＡＩＡＷＬＬＧＳＳＴ  ＳＱＫＶＩＹＬＶＭＩ  ＬＬＩＡＰＡＹＳ（配列番号：９）である。公知のように、天然の変異では、野生型株が、フリンによるｐｒＭ切断の崩壊または増強を伴わず、そして哺乳類細胞における繁殖の減少を伴わずに、配列番号９に提供される配列から１以上のアミノ酸変化を有することを見いだすことができる。対象の改変された配列番号９は、増強されたフリン切断；および昆虫細胞におけるウイルスの繁殖を示すが、哺乳類細胞におけるそのウイルスの繁殖を示さないものである。
【００４２】
[0048]本明細書中で使用される場合、“フリン切断部位”、“フリン認識部位”、および“フリン認識および切断部位”は、一般に、フリンはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：１６）のコンセンサステトラペプチド［これに関し、Ｘは任意のアミノ酸（また、そのテトラペプチドの上流および／または下流の配列はフリン切断部位を含み得る）である］を認識し、テトラペプチドのカルボキシ末端側の下流またはカルボキシ末端側でペプチド結合を切断することが知られているように、交換可能かつ等価である。一般に、アルボウイルスでは、フリン切断部位がｐｒＭおよび前駆体Ｅ２（ｐｒＥ２）などの前駆体ポリタンパク質中の２つのポリペプチドの接合部に存在する。いくつかのアルボウイルスではフリン切断部位はｐｒとＭの接合部に存在する。ゲノム構成が異なる他のアルボウイルスではｐｒＭが含有されておらず、例えば、いくつかのアルファウイルスでは、フリン切断部位はＥ３とＥ２の接合部に存在する。
【００４３】
[0049]本明細書中で使用される場合、Ｘが有理数である場合の“Ｘｌｏｇまたはそれより低い”、“Ｘｌｏｇまたはそれ未満”、または“Ｘｌｏｇまたはそれより少ない”は、ウイルス粒子の数を記載するための対数尺度に関する。公知のように、該尺度は非線形であり、１０を底とする桁数に基づいている。対数尺度は、パラメータの値の範囲が広い場合に使用される。したがって、４ｌｏｇは１０４の２つの値の間の差を反映し、すなわち、１つの値は他の値よりも１００００単位小さいかまたは大きく、５ｌｏｇは１０５の２つの値の間の差を反映し、すなわち、１つの値は他の値よりも１０００００単位小さいかまたは大きい、などである。“より低い”、“未満”または“より少ない”によって、これらの語を含む語句は、値がより低い、数がより少ないなどの量に関連し、または本明細書中の文脈において、より少ない数のウイルス粒子に関連する。したがって、“４ｌｏｇまたはそれ未満”は、２つの値の間の差異が１０４、１０４．５、１０５などであることを意味し、これは、１つの試料で産生されるウイルス粒子の数が他の試料より１００００少ない、約３１６００少ない、または約１０００００少ないことを意味し、本明細書中の文脈において、１つの試料が他の試料より１００００少ないウイルス粒子を含有することを意味する。
【００４４】
[0050]本発明の焦点は、アルボウイルスゲノムを操作して、哺乳類細胞特異的増殖欠損アルボウイルスを産生することである。これに関し、このようなアルボウイルスに感染した哺乳類細胞は、成熟子孫ウイルスを放出しないが、哺乳類宿主によって認識され得るアルボウイルスエピトープおよび決定基、例えば、ＭおよびＥタンパク質によって発現される決定基などを発現し続ける。アルボウイルスに対する細胞性および／または体液性応答が、哺乳類宿主において発生する可能性がある。対象のアルボウイルスは本質的に野生型ウイルスに類似しており、したがって、哺乳類宿主免疫系に、野生型アルボウイルス中のアルボウイルスに見いだすことができるアルボウイルスエピトープの領域(universe)を提示する。対象のアルボウイルスは、宿主哺乳類細胞において単純に複製することができず、したがって、他の宿主哺乳類細胞の感染および宿主における病変または疾患に寄与することができない。
【００４５】
[0051]したがって、本発明は、構造タンパク質のすべてではないが大部分、あるいは、アルボウイルスに対する感染宿主によって発生する抗体または免疫細胞の決定基またはエピトープを含むポリペプチドの少なくとも大部分を含み、発現する、欠損または機能不全アルボウイルスに関する。したがって、例えば、フラビウイルスの場合、ｐｒ、Ｍおよび／またはＥタンパク質の大部分は、野生型ウイルスの免疫原性部位を含むので、それによって発現されることが好ましい。Ｃタンパク質は、宿主免疫系の標的よりも少なくてもよいが、存在していてもよい。
【００４６】
[0052]すべての公知のアルボウイルスは、適切なウイルス成熟および宿主細胞からの放出、例えば、いくつかのアルファウイルスにおけるｐｒＥ２のＥ３およびＥ２への切断、ならびにいくつかのフラビウイルスにおけるｐｒＭのｐｒおよびＭへの切断のために、適切なウイルス成熟および感染細胞からの子孫ウイルスの最終的な放出のために、前駆体ポリタンパク質のフリン切断を必要とする。
【００４７】
[0053]対象の変異アルボウイルスは、例えばｐｒＥ２またはｐｒＭにおける改変または機能不全フリン切断部位、および所望により、例えばｐｒＥ２またはｐｒＭのフリンコンセンサス切断部位の上流および／または下流の改変を含み、その結果、例えばｐｒＥ２またはｐｒＭのフリンによる切断が増強されて、昆虫細胞においては複製し続けるが、哺乳類（言うまでもなく、ヒトを包含する）細胞においてはもはや複製しないか非常に不十分にしか複製しないウイルスを産生する。したがって、例えば、アルボウイルスにおけるｐｒＥ２またはｐｒＭフリン切断部位における、および／またはその周囲の改変は、昆虫細胞においては増殖し続けるが、ヒトまたは哺乳類細胞においてはもはや増殖しないか、またはほとんど増殖しない、増殖制限ウイルスをもたらす。これに関し、増殖は子孫ウイルスが感染細胞によって放出されることを示す。
【００４８】
[0054]一般に、ゴルジ装置における初期フラビウイルス粒子の成熟の間に、未成熟粒子はｐｒＭおよびＥタンパク質の三量体を含むスパイクを提示し、これは、ゴルジ体を通過する間に、おそらくｐＨの変化に起因して、粒子上に滑らかな表面を形成するように再配列される。スパイクの再配列または形質転換は、ｐｒＭのフリン切断部位を暴露する。ｐｒＭはフリンによって切断され、おそらくゴルジ体中のｐＨに基づき、ｐｒ断片のいくつかは粒子と結び付いたままである。ｐｒ断片は膜融合を妨げると考えられる。初期粒子がゴルジ体から細胞外環境に放出されると、初期粒子からｐｒが放出されて、細胞からの放出のために細胞膜と融合することができる成熟粒子を形成する。成長中の粒子の一部は、成熟しない可能性がある。それにもかかわらず、ウイルスタンパク質は細胞内膜と結び付き、細胞膜へ組み込まれることになる可能性があり、ここで、ウイルスタンパク質は細胞表面に発現する。ウイルス粒子および成分は、細胞死および溶解時に環境中に放出されることができる。
【００４９】
[0055]理論に結び付けようとするものではないが、ｐｒＭの切断の増強を可能にするｐｒＭ中の改変フリン切断部位を含む対象の変異ウイルスゲノムは、おそらく異なるｐＨ条件下で、成長中のウイルス粒子がゴルジ装置に入る前にｐｒＭが切断されるように誘導することができ、結果として、粒子がゴルジ体に入って存在する際に、ｐｒは粒子表面と結び付かない。したがって、膜融合を妨げるｐｒがなければ、ウイルス粒子は、ゴルジ体を通過する間に適切に成熟することが妨げられ、ゴルジ体内に捕捉される。ｐｒＭがゴルジ体に入る前に時期尚早に切断されることにより、対象のアルボウイルス粒子はｐｒを含有せず、したがって、ゴルジ体中で適切に処理されることができず、その結果、ウイルス粒子はゴルジ体膜に結合し、融合し、そしてゴルジ体膜から放出されず、したがって、細胞から放出されることができない。
【００５０】
[0056]しかしながら、このプロセスは昆虫細胞においては改変されず、例えばｐｒＥ２またはｐｒＭのフリン切断のタイミングおよび／または効力は、適切なアルボウイルス粒子の成熟および宿主昆虫細胞からの放出に関連しないか、それを排除しない。したがって、感染昆虫細胞は、野生型ウイルスに感染した昆虫細胞において見いだされるのと同等、同じ、またはそれを超えるレベルで子孫アルボウイルスを産生する。
【００５１】
[0057]対象のアルボウイルスのフリンコンセンサステトラペプチド（Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ（配列番号：１６））は、例えば、Ｅ３とＥ２の接合部、およびｐｒポリペプチドとＭタンパク質の接合部に位置する。テトラペプチドのアミノ酸は、アミノ酸置換、そのアミノ酸をコードする核酸の部位特異的変異誘発などによって改変され、例えば、第２またはＸ部位としてＡｒｇを含有するようにテトラペプチドを構築するなどの公知の方法を実施する。改変フリン部位は、例えば、公知の方法を実施する相同組換えによって、例えば、全長核酸中に配置される。核酸操作はｃＤＮＡに対して行うことができ、その後、これを、本明細書中に教示するような改変フリン切断コード配列を含むウイルスＲＮＡを形成するように、当分野で公知の方法を実施して転写する。ウイルス核酸は、例えば、適切な宿主細胞へのウイルスＲＮＡのエレクトロポレーションによって、粒子に詰め込むことができる。トランスフェクト細胞を培養し、ウイルス粒子産生についてモニタリングし、改変フリン切断部位コード領域を含むＲＮＡを持つウイルス粒子を得る。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクター、宿主細胞などは公知であり、いくつかの試薬は市販されており、例えば、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｈｒｏｍｙｋｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５（１０）４６３３−４６４０，２００１；Ｇｅｈｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（６）８９２４−８９３３，２００３；およびＳｈｕｓｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１（２１）１１７３７−１１７４８，２００７も参照のこと。その後、ウイルス粒子を使用して適切な細胞を感染させ、当分野で公知のように培養する。子孫ウイルスの産生は、改変が哺乳類細胞ではウイルス複製に影響をおよぼすが昆虫細胞では影響をおよぼさないかどうか、および２つのタイプの細胞における繁殖がどの程度改変されるかを決定するために、本明細書中に教示する方法を使用してモニタリングする。
【００５２】
[0058]本発明は、部分的にフラビウイルスに関し、そのいくつかは、ｐｒＭポリタンパク質を含む。
[0059]態様において、本発明は、ＤＶ(例えば、血清型１〜５のいずれか１つ）に関する。
【００５３】
[0060]ＤＶゲノムは、単一線状で一本鎖の＋センスＲＮＡからなる。全ゲノムは、１０〜１１ｋｂの範囲であることができる。３’ポリアデニル化はない。５’末端はメチル化キャップを有する。ＤＶゲノムは、宿主リボソームに翻訳開始部位を提供する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有しない。代わりに、ＤＶは、タンパク質合成を開始するためにリボソームスキャニングを用いる。
【００５４】
[0061]デング熱ビリオンは、直径４０〜６５ｎｍの球である。脂質エンベロープの下には、直径約２５〜３０ｎｍの二十面体カプシドコートがある。
[0062]デング熱は、二相性発熱、頭痛、身体の様々な部分の痛み、虚脱、発疹、リンパ節症および白血球減少を特徴とする急性感染症である（Ｈｏｌｓｔｅａｄ，１９８０，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｏｇａｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，p．１０７−１７３，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（編集），“Ｔｈｅ  Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク；およびＳａｂｉｎ，１９５９，Ｄｅｎｇｕｅ，p．３６１−３７３，Ｒｉｖｅｒｓ  ＆  Ｈｏｒｓｆａｌｌ（編集），“Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍａｎ，”ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，フィラデルフィア）。ＤＶは蚊によって輸送される。１つのデング熱血清型による感染は、そのサブタイプに生涯にわたる免疫を提供することができるが、他の血清型に対する交差防御免疫は提供できない。
【００５５】
[0063]デング出血熱（ＤＨＦ）は、止血の異常および血管透過性の増大を特徴とする重度の熱性疾患であり、場合によっては、循環血液量減少性ショック症候群、デングショック症候群（ＤＳＳ）を生じる（ＷＨＯ：１９７５．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ，ジュネーブ，スイス）。ＤＨＦ／ＤＳＳの機序は、場合によって異なることができる。ＤＨＦ／ＤＳＳに寄与する主要な因子としては、ウイルス毒性、患者の健康状態、および異なる血清型ＤＶの二次感染を挙げることができる。
【００５６】
[0064]現在、ＤＶの５つの血清型、１、２、３、４および５が存在する。１つの血清型に対する免疫は一般に、別の血清型に対する免疫を付与しない。
[0065]不可解なことに、ヒトは、必ずしも個々の血清型に等しく反応するとは限らない。したがって、ＤＶの少なくとも２つの血清型に同時に感染した人は、１つの血清型に対してのみ免疫応答を開始するようである。さらに、一般に一次感染または以前の感染のものとは異なる血清型の、しかしまた最初の感染または以前の感染が良性、軽度または無症候性である場合の、後発感染は、より重度の疾患および病変を生じる可能性がある。
【００５７】
[0066]血清型の優勢性、選択性または干渉の原因は知られていない。ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、ウイルスの複製、増殖、成熟および宿主細胞からの放出、または抗原提示は、宿主免疫応答を特定の血清型に誘導することができる。
【００５８】
[0067]いずれにしても、予測できない宿主応答、血清型の干渉および無症候性感染は、有効な多価ワクチンの開発に多くの障害をもたらす。
[0068]現在の多価生ワクチンは、ワクチン中の各血清型の相対量が、歪んだ免疫応答を補う試みにおいて変動する場合でさえ、すべての血清型に対して同等の免疫をもたらす能力がない。
【００５９】
[0069]対象の主題の実施において、さまざまなＤＶゲノムを、ｐｒＭフリン切断部位のＧｌｕ残基において；コンセンサステトラペプチドの上流、例えば、コンセンサスに隣接する８アミノ酸上流ストレッチ、すなわち、アミノ酸８８〜９１において；コンセンサステトラペプチドの下流、例えば、アミノ酸８８〜９１のコンセンサスに隣接する３９アミノ酸下流ストレッチ、すなわち、アミノ酸９２〜１３０（すなわち、ｐｒＭのアミノ酸８０〜１３０以内）において、またはそれらの組み合わせにおいて、異なるアミノ酸置換を用いて構築した。アミノ酸変化（１以上）は、ｐｒＭのフリン切断を増強する。哺乳類宿主細胞に導入されると、ウイルス粒子の産生に伴い複製が起こり、発現が生じた。しかしながら、宿主細胞外への移動を意図した成熟粒子は得られなかった。したがって、対象の粒子は一旦哺乳類細胞に感染し、変異ウイルスゲノムが哺乳類宿主細胞において複製され、発現するが、成熟子孫ウイルス粒子は感染した宿主哺乳類細胞またはヒト細胞によって放出されない。
【００６０】
[0070]態様において、ｐｒＭタンパク質中のＤＶフリンテトラペプチド切断部位、ＮＨ２−（８８）Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨ（配列番号：１）［これに関し、切断はＬｙｓ−Ａｒｇ残基の下流で生じる］を、Ｇｌｕ部位において改変して、フリン切断を増強する。
【００６１】
[0071]態様において、Ｇｌｕは、任意のアミノ酸によって置換される。置換アミノ酸は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＣｙｓのような非酸性、非中性アミノ酸であることができる。態様において、置換アミノ酸は硫黄を含有しない。したがって、置換アミノ酸は、ＭｅｔまたはＣｙｓ以外の非酸性、非中性アミノ酸である。態様において、置換アミノ酸は、Ｒヒドロキシル基を含有しない。したがって、態様において、置換アミノ酸は、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＴｈｒではない。態様において、置換変異アミノ酸は塩基性アミノ酸である。態様において、置換アミノ酸は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓである。態様において、置換アミノ酸はＡｒｇである。
【００６２】
[0072]態様では、テトラペプチドコンセンサスの上流のアミノ酸が改変される。例えば、フリン切断部位のコンセンサスのすぐ上流（またはアミノ末端側）の８アミノ酸ストレッチ中のアミノ酸が、ｐｒＭのフリン切断を増強するように改変される（“改変上流部位”）。したがって、改変は、ｐｒＭポリペプチドのアミノ酸８０〜８７で生じることができる。
【００６３】
[0073]態様では、テトラペプチドコンセンサスの下流のアミノ酸が改変される。例えば、フリン切断部位のコンセンサスのすぐ下流（またはカルボキシ末端側）の３９アミノ酸ストレッチ中のアミノ酸が、ｐｒＭのフリン切断を増強するように改変される（“改変下流部位”）。この改変は、Ｍポリペプチドのアミノ酸９２〜１３０で生じることができる。
【００６４】
[0074]対象のＤＶは、以下の少なくとも１つを含む：（１）改変フリンテトラペプチド切断部位；（２）改変上流部位；および（３）改変下流部位。対象のＤＶは、（１）、（２）および（３）のいずれか２つの組み合わせを包含することができる。対象のＤＶは、３つの改変すべてを含むことができる。
【００６５】
[0075]態様において、アルボウイルスは、ｐｒＭポリタンパク質を含むＺＶである。
[0076] ＺＶゲノムは１０７９４塩基の単一線状で一本鎖のプラスセンスＲＮＡからなる（しかし、いくつかの分離株は異なるサイズである［例えば、Ｂａｒｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ  ２（３）１−２，２０１４］）。構造および非構造遺伝子とは別に、３’および５’非コード末端が存在する。
【００６６】
[0077]ＺＶには少量の多型が存在する。例えば、少なくとも２つのサブタイプ、すなわち、アフリカ系統のウイルスおよびアジア／南アメリカ系統のウイルスが認識されている。２つの系統は血清学的に区別することができ、すなわち、エンベロープタンパク質に多様性があると思われる。
【００６７】
[0078]ジカ熱の症状としては、発熱、目の充血、関節痛、頭痛および斑点状丘疹を挙げることができ、一般に持続期間は７日未満である。初期感染は正常な成人にとって致死的であるとは考えられないが、妊娠中の感染は成長中の胚および／または胎児において小頭症のような奇形および異常を引き起こす可能性がある。成人の感染はギラン・バレー症候群に関連している。
【００６８】
[0079]ＺＶは主に蚊媒介性である。２０１５年にブラジルでジカが大規模に発生した後、ＺＶはラテンアメリカとカリブ海を通じて、今では米国にまで広がっている。
[0080]ＺＶのライフサイクルは、宿主細胞の表面へのビリオン付着と、これに続く受容体媒介エンドサイトーシスによる細胞への侵入から始まる。現在理解されているように、エンドソーム小胞の酸性化は、ビリオンのコンホメーション変化、ウイルスと細胞膜の融合、および粒子の分解を引き起こす。ゲノムが細胞質に放出されると、プラスセンスＲＮＡは単一のポリタンパク質に翻訳され、これがウイルスおよび宿主プロテアーゼによって処理されて１０の遺伝子産物を生じる：３つの構造タンパク質、コアタンパク質（Ｃ）、前膜(premembrane)タンパク質（ｐｒＭ）およびエンベロープタンパク質（Ｅ）、ならびに７つの非構造（ＮＳ）タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５。
【００６９】
[0081]ＺＶのフリン切断部位は、ｐｒＭのアミノ酸９３の後に位置する。態様において、フリンテトラペプチド切断部位、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／(配列番号：２）の上流およびこれを含むｐｒＭタンパク質配列、これに関し、切断は末端Ａｒｇの後に生じ、スラッシュで示されており、セリン残基は、Ａｒｇ(テトラペプチド部位、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：１０））によって置換されて、フリン切断を増強するための５つのアルギニン残基の配列を提供する。さらに、上流ストレッチのグルタミン酸残基は、例えば、ヒスチジンに改変されて、フリン切断を増強することができる。上流ストレッチにおける残基の他の改変は、フリン切断を増強する。テトラペプチドの下流の交換は、フリン切断を増強する。例えば、改変は、テトラペプチドの２６アミノ酸ストレッチ下流のいずれかまたはすべてに対するものであることができ、フリン切断を増強する。
【００７０】
[0082]増強フリン活性は、以下の１以上によって得られる：（１）フリン切断部位の上流の１以上のアミノ酸、例えば、ＺＶのｐｒＭポリペプチドのＮ末端からアミノ酸残基８２で始まる８残基配列（すなわち、ｐｒＭのアミノ酸残基８２〜８９）への改変；（２）フリン切断部位における改変；および（３）フリン切断部位の下流（アミノ酸９４から下方）の１以上のアミノ酸残基、例えば、フリン切断部位の下流の２６残基配列における改変。（１）、（２）および（３）の任意の組み合わせが存在してもよい。
【００７１】
[0083]黄熱病ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、ウマ脳症ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、チクングニヤウイルス、アフリカ豚熱ウイルスおよび他のアルボウイルスに関し、フリンコンセンサステトラペプチド認識部位は、公知のコンセンサスフリン認識配列に基づいて位置しており、アミノ酸置換を行って、哺乳類細胞においてもはや繁殖しないかほとんど繁殖しない変異体を同定する。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変は同様に、フリンコンセンサス切断部位の上流および／または下流で行うことができる。
【００７２】
[0084]細胞株および動物におけるウイルスの作製、増殖および維持は公知である。分子技術を用いてコード配列を改変することによってアルボウイルス変異体を作製することは公知である。細胞におけるウイルスの増殖、細胞からの子孫ウイルスの産生を決定するためのさまざまな試験、および本発明の実施に使用される他のアッセイは公知であり、それらの選択（１以上）は、設計上の選択である。
【００７３】
[0085]本発明の他の目的は、対象の免疫原性アルボウイルス組成物を産生するための拡大可能なシステムを開発することである。この目標は、昆虫細胞株、例えば、ダニまたは蚊の細胞株などの節足動物細胞株においてフリンによって増強レベルで切断される機能不全フリン切断部位を発現する、対象のアルボウイルスを産生することによって達成された。これに関し、昆虫細胞によるウイルスの大規模生産のための材料および方法は公知であり、利用可能である。カイコ細胞株および蚊細胞株などの節足動物細胞系が市販されている。
【００７４】
[0086]対象のアルボウイルスは、昆虫細胞において障害なく増殖する。したがって、機能不全フリン切断部位を持つ対象のアルボウイルスは、増殖し、複製し、成熟し、そして宿主昆虫細胞によって、野生型アルボウイルスとほぼ同程度または同レベルで環境中に放出されることができる。したがって、対象のアルボウイルスは、昆虫細胞において、対象の機能不全フリン切断部位を含まないアルボウイルスと同程度またはそれよりも高いレベルで子孫ウイルスを産生することができる。
【００７５】
[0087]子孫ウイルス産生（または繁殖）の程度は、例えば、当分野で公知であり、そして本明細書中に教示されるように、プラークアッセイまたは赤血球凝集素アッセイにおいて評価することができる。ウイルス産生を評価するための容易かつ高感度の方法は、Ｄｒａｙｍａｎ  ＆  Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，“Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６．１１．１−２６．１１．７，２０１１に記載されているように、フローサイトメーターで蛍光標識細胞を計数することである。したがって、連続的に希釈された感染細胞を採取し、必要に応じて分離し、細胞を回収し、固定し、そして、ウイルスタンパク質に向けられた少なくとも１つの抗体および蛍光標識された少なくとも１つの抗体を有する１以上の抗体試薬に暴露した後、例えば、少なくとも約１００００細胞をフローサイトメーターによって読み取って、該ウイルスタンパク質を発現する蛍光標識細胞の数を明らかにする。したがって、対象のアルボウイルスは、Ｃ６／３６細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６６０）中の参照アルボウイルス（例えば、ＤＶ、血清型２、ニューギニア株、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１５８４）に感染した細胞によって、あるいは、増強フリン活性を含むか増強フリン切断もしくはｐｒＭを示す、対象の変異ウイルスを含まない、同じ株または系統の野生型ウイルスによって、産生される子孫ウイルスの量と比較して、ほぼ同じレベルもしくは量またはそれ以上の子孫ウイルスを産生することができる。
【００７６】
[0088]対象のアルボウイルスは哺乳類細胞において適切に成熟せず、粒子は宿主哺乳類細胞によって放出されない（または繁殖しない）が、代わりに、未成熟粒子が宿主哺乳類細胞内に捕捉され、蓄積する。したがって、対象のアルボウイルスは、ヒトまたは哺乳類細胞において子孫ウイルスをほとんどまたはまったく産生しない。対象のアルボウィルスは、野生型アルボウイルスと比較して少ない子孫ウイルスを産生し、例えば、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１２１）を使用したときに発生する子孫の量と比較して、例えば、４ｌｏｇ以下、５ｌｏｇ以下、６ｌｏｇ以下、７ｌｏｇ以下、８ｌｏｇ以下、９ｌｏｇ以下の子孫を産生するか、子孫を産生しない。
【００７７】
[0089]哺乳類細胞中で繁殖しない対象の変異ウイルスは、疾患または病変が最小限に抑えられるか、または回避されるので、望ましい。しかしながら、子孫ウイルスの放出が非常に少ないか、またはまったくないことは、必須ではなく、または必要ではない。哺乳類細胞に感染したときに、野生型ウイルスに感染した同様の細胞と比較して、例えば、４ｌｏｇ以下、５ｌｏｇ以下、６ｌｏｇ以下、またはそれより少ない子孫ウイルスを産生する機能不全ウイルスは、低量または少量の子孫ウイルスの放出にもかかわらず、宿主免疫系が最終的にウイルスおよびウイルス抗原を発現する細胞を除去するので、免疫原として使用することができる。
【００７８】
[0090]対象の改変された機能不全フリン部位を含むウイルスは、感染性であるが、哺乳類細胞の感染から感染性の子孫ビリオンを産生することはできないか、産生しない。したがって、非複製粒子は、宿主哺乳類細胞、例えばヒト細胞に感染するが、該宿主細胞が該感染から生じる子孫ウイルス粒子を産生または放出しない粒子である。しかし、その感染した哺乳類宿主細胞は、感染細胞の中および上でアルボウイルスエピトープを発現する。
【００７９】
[0091]対象の欠損ウイルスの独特の特徴は、有効かつ安全なアルボウイルス免疫原性組成物の供給源を提供し、大量のウイルスを、昆虫細胞中で対象のウイルスを増殖させることによって費用効果的に得ることができる。対象の機能不全ウイルスは、同じタイプの昆虫細胞に感染した場合、参照ウイルスとほぼ同じ量の子孫ウイルスを産生することができる。態様において、対象の機能不全ウイルスは、昆虫細胞から、同昆虫細胞タイプに感染した参照ウイルスと比較して、より多くのウイルスを産生する。態様において、対象の機能不全ウイルスは、参照ウイルスよりも少ないウイルスを産生する。高い免疫原性を示す機能不全ウイルス株は、アルボウイルスの自然感染プロセスを模倣し、哺乳類宿主が、最小限の病変の有無にかかわらず、長期にわたり広範なアルボウイルス免疫を産生することを可能にする。したがって、対象の改変アルボウイルスは、野生型アルボウイルスの野生型ｐｒＭ、ＭおよびＥタンパク質、そしてまたおそらくＣによって発現されるエピトープの多くまたはすべてを発現するための遺伝物質を含有するものである。
【００８０】
[0092]対象のアルボウイルスは、適切な滴定の後、すべてではないにしても、多くの感受性細胞に感染することができる。感染性の程度は、標準的かつ公知のアッセイを用いて評価することができる。例えば、６ウェル皿中のＶｅｒｏ細胞を連続希釈でアルボウイルスに感染させ、該細胞を３７℃のロッカープラットフォーム中で攪拌する。細胞培養液を４８時間で収集する。培養培地中に放出されるウイルスの数は、本明細書中に教示するような公知の方法を実施して決定することができる。
【００８１】
[0093]例えば、部分的に精製されたアルボウイルス粒子を調製するために、培養液を、例えば、４℃で１５分間、マイクロ遠心分離機で１６０００×ｇで遠心分離することによって清澄化し、粒子を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＯＴＤ５５Ｂ遠心分離機のＡＨ６５０ローター中、４℃で２時間にわたり４００００ｒｐｍで超遠心分離を行うことによって上清液からペレット化する。ペレットを５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、４℃でそのまま一晩溶解させる。
【００８２】
[0094]アルボウイルスの力価を決定するために、例えば、８ウェルチャンバースライド上のベビーハムスター腎（ＢＨＫ）−２１細胞を、５０μＬの連続１０倍希釈の細胞培養液または再懸濁されたペレット化材料で、３７℃において２時間感染させる。次いで、この流体を、２％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ最小必須培地１ｍＬで置き換える。細胞を３７℃で２４時間にわたりＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした後、アルボウイルス特異的ＡｂまたはｍＡｂ(市販されているか、当分野で公知のように作製したもの）、以下に記載するようなＨＭＡＦ、または必要な特異性を有するポリクローナル抗血清、検出可能なレポーターを持つウイルス特異的試薬とサンドイッチを形成する試薬、および適切な対照を使用して、免疫蛍光（ＩＦ）分析に付す。
【００８３】
[0095]採取された培養液（ＣＦ）中に存在するウイルスの力価（感染単位（ＩＵ）／ミリリットル）も、例えば、アカゲザル腎上皮細胞（例えば、ＬＬＣ−ＭＫ２（ＡＴＣＣ）細胞）の感染、およびこれに続く、アルボウイルス特異的試薬および標識試薬、例えば、ｍＡｂを含む過免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）での間接免疫蛍光分析（ＩＦ）によって決定した。
【００８４】
[0096]体液性抗体および細胞性免疫応答はともに、ＤＶ感染からの防御および回復に関与する。対象のアルボウイルスは、免疫応答の両方のアーム(arm)を誘導する。粒子は、ｐｒＭ、Ｍおよび／またはＥタンパク質から構成され、したがって、対象の粒子は広範な免疫原であり、野生型ウイルスによる感染をシミュレートする。しかし、対象の粒子は哺乳類宿主細胞に感染し、これらの細胞において、さらなるｐｒＭ、Ｍおよび／またはＥタンパク質が、宿主細胞において、または宿主細胞によって発現される。ｐｒＭ、Ｍおよび／またはＥタンパク質は、これらの細胞から放出されて、宿主にさらなる抗原刺激を提供することができるか、あるいは、感染宿主細胞表面で発現して、宿主にさらに他の様式の抗原刺激を提供することができる。対象のアルボウイルスは、所望により、ＮＳ１などの非構造タンパク質を発現することができる。以前の報告では、これらのＮＳウイルスタンパク質が防御的な免疫応答を誘発しうることが実証されている（Ｈｅｉｎｚ  ＆  Ｒｏｅｈｒｉｇ，１９９０，“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，”Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−ＮＹ−Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐ．２８９−３０５；Ｈｅｉｎｚ，１９８６，Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ３１：１０３−１６８；Ｂｒａｙ  ＆  Ｌａｉ，１９９１，Ｖｉｒｏｌ，１８５：５０５−５０８；Ｈｅｎｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：２１０１−２１０７；およびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６０：１１５３−１１５５）。
【００８５】
[0097]対象の医薬組成物の効力を試験するための適切なモデルとしては、アルボウイルス感染をシミュレートする動物モデルが挙げられる。例えば、マウスの免疫化およびその後のアルボウイルスでの攻撃に使用されるプロトコルが記載されている（Ｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：２８５３−２８５６）。簡潔には、各群１０匹のマウスにおいて、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週齢（１日目）で、そして再び１４日目に、ＤＶなどのウイルスの腹腔内（ｉｐ）接種によって免疫化する。対照動物には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を与える。すべての動物を、０日目および２１日目に採血する。ＤＶの場合、２２日目に、５０％致死量（ＬＤ５０）の１００倍のウィルスの脳内注射によってマウスを攻撃する。攻撃後、マウスを病理学的徴候について２１日間観察し、症状（脳炎、麻痺または死）を伴うマウスを毎日記録する。また、攻撃前の血清と比較するために、血清を生存個体から収集し、攻撃前の血清との比較を行う。
【００８６】
[0098]各ウイルスの用量を決定する。個々のアルボウイルスタンパク質に対する免疫化マウスの血清反応は、例えば、市販の標識化キットおよび抗体を使用して、標識化アルボウイルス抗原のＥＬＩＳＡまたは放射性免疫沈降によって分析する。プラーク減少アッセイを用いて、マウス血清中のアルボウイルス特異的中和抗体の力価を測定することができる。例えば、最初に、アッセイに用いられる約０．５ｍＬの血清試料を、５６℃で３０分インキュベートすることにより熱不活性化する。希釈剤として２％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地Ｍ１９９を用いて、１：１０の希釈から始めて、最終容量０．３ｍＬの血清の４倍希釈液を調製する。希釈血清の各０．３ｍＬアリコートに、１５０〜１８０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルスを含有する等容量の培地を添加する。ウイルスと血清を混合し、３７℃で３０分インキュベートする。各アッセイにおいて、無血清対照、および、例えば２つの希釈で各アルボウイルス型特異的Ａｂからなる対照も包含される。ウイルス／血清および対照の混合物を、例えば、Ｃｏｓｔａｒ６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク）中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞の融合性単層上に、０．２ｍＬ／ウェルでプレーティングする。２つのウェルを、各試料について感染させる。ウイルス吸着は、１５分おきに手動で揺動させながら室温で１時間行う。その後、ウェルを、アール平衡塩溶液中の１％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＬＥ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）と、必須ビタミンおよびアミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を６ｍＬ／ウェルで添加した１０％ＦＢＳとを含む培地で覆う。プレートを５％  ＣＯ２中３７℃で７日間インキュベートする。その後、ウェルを、１％アガロースを含有する４％ニュートラルレッド溶液（４ｍＬのニュートラルレッド溶液を９６ｍＬのＰＢＳに添加したもの）で覆う。プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。プラーク数の平均を用いて、プラーク数レベルの５０％減少を計算する。
【００８７】
[0099]態様において、対象のウイルス組成物は、多価、すなわち、二価、三価、四価などのものであり、宿主を、一般に、１つのウイルスの複数のアルボウイルス血清型に対し免疫するものであるが、複数の対象の変異ウイルスを含むものなど、複数のウイルス種由来の抗原を含んでいてもよい。１以上の他の血清型を犠牲にした１つの血清型の干渉または優勢は観察されない。これは、免疫原性がウイルス産生および新規ウイルスの持続的複製に依存しないためである可能性がある。
【００８８】
[00100]対象のアルボウイルスは、免疫学の分野で知られているように、免疫原として働くように投与するのに適した医薬組成物に組み込まれる。このような組成物は、典型的には、活性成分および薬学的に許容しうるキャリヤーを含む。本明細書中で使用される場合、用語“医薬的に許容しうるキャリヤー”は、医薬的投与に適合する、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することが意図される。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野において、設計上の選択として公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が意図される。補足的な薬理学的に活性な化合物、例えばアジュバントも、組成物に組み込むことができる。
【００８９】
[00101]本明細書中に開示されるような使用のための本発明の医薬組成物は、意図した投与経路と適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（例えば局所を含む）、経粘膜および直腸内投与が挙げられる。
【００９０】
[00102]非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤；および、塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性の調整のための薬剤。ｐＨは、酸または塩基、例えばＨＣｌまたはＮａＯＨで、調整することができる。非経口的調製物は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【００９１】
[00103]注射用の用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌した注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適したキャリヤーとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ニュージャージー州）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射能力が存在する程度に流動性を持つべきである。該組成物は製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防御されなければならない。キャリヤーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして、界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などによって、達成することができる。等張剤、例えば、糖類、マンニトールおよびソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に包含させることが好ましい場合がある。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを包含させることによって、もたらすことができる。
【００９２】
[00104]滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み込んだ後、濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上に列挙したものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥を包含し、あらかじめ滅菌濾過された溶液から活性成分および任意の追加的な望ましい成分の粉末を得る。
【００９３】
[00105]経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用キャリヤーを包含する。該組成物はゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができ、錠剤は、例えば、腸溶性組成物、遅延放出製剤などを提供するために、コーティングまたは処理することができる。経口的な治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、シロップ、エリキシルまたは液体製剤を得るために、またはマウスウォッシュとして使用するために、流体キャリヤーを使用して調製することができる。後者の場合、流体キャリヤー中の化合物は、経口的に施用し、クチュクチュして吐き出させるか、または飲み込ませる。
【００９４】
[00106]医薬的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として包含させることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含有することができる：微結晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどのバインダー；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；または、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料などの香味剤。対象の粒子は、胃環境を通過しても生き残る形態にカプセル化することができる。そのような形態は、腸溶コーティング製剤として一般に知られている。
【００９５】
[00107]吸入による投与の場合、化合物は、例えば、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザー、またはミストからのエアロゾルスプレーの形態で送達することができる。製剤は液体、乾燥、例えば、微粉砕粉末などであることができる。
【００９６】
[00108]全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によることができる。経粘膜または経皮的投与の場合、浸透させるバリヤーに適切な浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、一般に当技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは注腸剤の使用によって達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は当技術分野で一般に知られているように、軟膏、膏薬、フォーム、ゲルまたはクリームに製剤化することができる。この組成物は、皮膚に施用されるパッチを用いて送達させてもよい。
【００９７】
[00109]対象の組成物を有する坐剤の形態である場合、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含むことができる。
[00110]態様において、活性化合物は、身体からの迅速な排除から化合物を防禦するキャリヤーを用いて、例えば、埋め込み物およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤の状態に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。
【００９８】
[00111]そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  ＪｏｈｎｓｏｎおよびＥｎｃａｐｓｕｌａ  Ｎａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、テネシー州）などの商業的供給源から得ることができる。
【００９９】
[00112]リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体および他のそのような標的化分子で標的化されたリポソームを含む）もまた、医薬的に許容しうるキャリヤーとして使用することができる。それらは、例えば、米国特許公報第４５２２８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１００】
[00113]投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用される“単位剤形”は、処置される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位をさし；各単位は、必要とされる医薬キャリヤーと関連して望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０１０１】
[00114]医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、キットまたはディスペンサーに包含させることができる。
[00115]他の投与方法は、対象の化合物を、食品もしくは飲料中に、またはそれらと一緒に、食品サプリメントもしくは添加物として、またはビタミンと同様に予防ベースで服用される剤形として、添加することを含む。
【０１０２】
[00116]投薬量、例えば、好ましい投与経路および量は、当該分野で公知の方法を実施する前臨床および臨床研究から得られる経験的データに基づいて得ることができる。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が生じるまで、処置を持続する。しかしながら、他の投薬計画も有用であることができる。治療の進行は、従来の技術およびアッセイによってモニタリングする。代表的な投与計画は、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。本発明の投薬単位形態のための仕様は、活性化合物の独特の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにこのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存することができる。したがって、成人に投与されるウイルス粒子の数は、マウス、ラット、サルなどのモデル動物に送達される治療量から外挿することができる。例えば、マウスでの試験に基づいて、約１０６粒子（またはＩＵ）から、約１０７粒子から、約１０８粒子から、約１０９粒子から、またはそれより多くが、用量当たりまたは分割用量で投与されることができる。量または用量は、当技術分野で公知のように、経験的データが利用可能になっているので、調整することができる。
【０１０３】
[00117]対象のウイルスは、個体において有効な免疫応答を生じさせるために使用することができ、これに関し、有効とは、個体における症状または病変を最小限にすること、減少させること、または予防することを含む。宿主免疫応答は治療応答を得るのに決定的であり、これは、任意の１つの個体において採点することができるので、任意の薬物の場合のように、対象のウイルスは治療的であってもなくてもよく、ウイルスレシピエントから望ましい応答を得ることができてもできなくてもよい。投与、ウイルス提示経路および手段、アジュバントおよび他の免疫学的因子の使用は、個体における宿主免疫応答の欠如または中途半端な状態を解消することができる。
【０１０４】
[00118]この現象は集団レベルで明白であり、そして対象のウイルスの集団においてすべてのレシピエントが治療的免疫応答を開始するわけではなく、そして任意の１つの集団における応答者の数は、他の集団のものと異なっていてもよい。
【０１０５】
[00119]対象の機能不全ウイルスの有用性は、集団におけるより大きな割合の応答者、集団におけるより高レベルの免疫防御、商業的実行可能性、商業的成功などを条件とするが、１つの個体においては、対象の機能不全ウイルスは、症状または疾患を低減または防止する治療的免疫応答を発生する。
【０１０６】
[00120]ここで、本発明を、以下の非限定的な実施例において例示する。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
[00121]ＤＶビリオンは、６％のＲＮＡ、６６％のタンパク質、９％の炭水化物および１７％の脂質から構成される（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編集，“Ｔｈｅ  Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ニューヨーク，Ａｃａｄｅｍｉｃ，１９８０，ｐ．５０３−５２９；およびＴｒｅｎｔ  ＆  Ｎａｅｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｏｎａｔｈ編集，“Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，”ワシントンＤＣ，米国公衆衛生協会，１９８０，ｐ．１５９−１９９）。電子密度の高いヌクレオカプシドは、Ｃ（カプシド）タンパク質とゲノムＲＮＡから構成される。エンベロープタンパク質Ｅおよび膜（Ｍ）タンパク質は、Ｃ末端疎水性アンカーによって脂質二重層に包埋される。しかしながら、細胞内小胞内に見いだされる未成熟粒子は、未処理のＭ前駆体（ｐｒＭ）のみを含有し、放出されたビリオンよりも感染性が低い（Ｍｏｒｅｎｓ，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１９９４，１９：５００−５１２）。
【０１０８】
[00122]ＤＶのゲノムは均一であり、ゲノムのおよそ９５％を構成する単一ＯＲＦを含有する約１０〜１１ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡ分子である（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９０，４４：６４９−６８８）。全長ゲノムＲＮＡは、ＤＶ感染細胞における唯一のウイルス特異的メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子であると思われる。感染すると、ウイルスＲＮＡは、１０個の遺伝子産物に処理される約３４００アミノ酸のポリタンパク質に翻訳される：３つの構造タンパク質、すなわちＣ、ｐｒＭおよびＥ；ならびに７つの非構造（ＮＳ）タンパク質、すなわち１、２Ａ、２Ｂ、３、４Ａ、４Ｂおよび５（Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ  ＆  Ｙｏｋａｎ，Ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ，Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｋｕｎｏ編集，“Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ，”  Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９７，３６７−３７７頁；およびＦａｌｇｏｕｔ  ＆  Ｍａｒｋｏｆｆ，１９９５，Ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｐ．４７−６６，Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ，編集，“Ｅｘｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ロンドン，英国）。
実施例２
[00123]変異ＤＶは、ＤＶ２ニューギニアＣ株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５８４）の全長感染性ｃＤＮＡクローンから生じさせた。変異ＤＮＡ断片をＰＣＲによって作り出し、記載されるように相同組換えによって全長クローンに導入した（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８年９月；７２（９）：７５１０−２２）。変異はＤＮＡ塩基配列決定により確認した。変異ＤＶのＲＮＡを、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９７；７１（７）：５３６６−７４によって記載されているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって合成した。
【０１０９】
[00124]変異ＤＶの増殖動態は、感染Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）（ヒト）と感染Ｃ６／３６細胞（ＣＲＬ−１６６０）（蚊）との間でウイルス増殖の差を示した。野生型ＤＶ２（ＤＥＮＶ２)ｐｒＭ（配列番号：３）、および、フリン認識部位のＧｌｕ（ＤＥＮＶ２のＥ）がＡｒｇ（Ｒ）（Ｄ２−８９Ｒ、配列番号：４）、Ｖａｌ（Ｖ）（Ｄ２−８９Ｖ、配列番号：５）、Ｓｅｒ（Ｓ）（Ｄ２−８９Ｓ、配列番号：６）またはＧｌｙ（Ｇ）（Ｄ２−８９Ｇ）、配列番号：７）によって置換されている４つの変異体を、ヒトＶｅｒｏ細胞および蚊Ｃ６／３６細胞における増殖について試験した。
【０１１０】
[00125]ＧｌｕがＲによって置換されているＤ２−８９Ｒ変異体は、昆虫細胞において繁殖し、ヒト細胞では複製を示さない。
実施例３
[00126]変異体は、ＤＶ１、西太平洋、７４株（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ８８５３６）の全長感染性ｃＤＮＡクローンから、ＤＶの第２の血清型を用いてを生じさせた。変異ＤＮＡ断片をＰＣＲによって作り出し、記載されているように相同組換えによって全長クローンに導入した（Ｍａｒｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６（７）：３３１８−２８）。変異はＤＮＡ塩基配列決定により確認した。変異ＤＶのＲＮＡを、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌによって記載されているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって合成した。
【０１１１】
[00127]変異ＤＶの増殖動態は、感染Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）（ヒト）と感染Ｃ６／３６細胞（ＣＲＬ−１６６０）（蚊）との間でウイルス増殖の差を示した。
実施例４
[00128]以下の配列を含むＤＶ１変異体を、実施例２および３に記載したように作製した：
ＣＳＱＴＧＥＨＲＲＲＫＲＳＶＡＬＡＰＨＶＧＬＧＬＥＴＲＴＥＴＷＭＳＳＥＧＡＷＫＨＡＱＲＩＥＴＷＩＬＲＨ（配列番号：１７）.
[00129]該配列はＤＶ１ ｐｒＭポリペプチドのアミノ酸８０で始まり、コンセンサスフリンテトラペプチドにおいて、ＤはＲに変化した。切断は上記配列のＲとＳの間で起こる。
【０１１２】
[00130]変異ＤＶ１の増殖動態は、感染Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）（ヒト）と感染Ｃ６／３６細胞（ＣＲＬ−１６６０）（蚊）との間でウイルス増殖の差を示した。
実施例５
[00131]市販のＤＶ  ｐｒＭ  ｍＡｂを用いて公知の方法を実施し、バンド強度およびバンドサイズを比較して分子量を推測するウェスタンブロット解析により、変異ＤＶのフリン切断効率がＶｅｒｏ細胞（ＣＣＬ−８１）およびＣ６／３６細胞（ＣＲＬ−１６６０）の両方において増大したことが実証された。
実施例６
[00132]哺乳類細胞における変異ＤＶの増殖を、間接免疫蛍光染色によって調べた。ＡＴＣＣ（ＨＢ−１１２）からのｍＡｂ ４Ｇ２を、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌの方法において使用した。
【０１１３】
[00133]陽性蛍光は感染後１日目から３日目まで観察され、親ＤＶ２ウイルスを用いた陽性対照に対し、明るさが増大し、陽性細胞の数が増加した。他方、変異Ｄ２−８９Ｒに感染させた場合、蛍光を発する細胞の強度および数は、その期間にわたって漸進的に低減した。感染後１〜３日目に新たなコロニーは形成されなかった。
【０１１４】
[00134]したがって、変異Ｄ２−８９Ｒはヒト細胞において１回の感染のみを開始し、感染性子孫ウイルス粒子を産生しなかった。
実施例７
[00135]変異Ｄ２−８９Ｒがヒト細胞において増殖制限されることを検証するために、皮膚線維芽細胞（ＣＲＬ−２５２２、ＡＴＣＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＶ２またはＤ２−８９Ｒに感染させ、ウイルスエンベロープ抗原の存在を、本明細書に記載するように、感染後の異なる時間（時間）（ｈｐｉ）における免疫蛍光によって評価した。ＤＶ２はＣＲＬ‐２５２２細胞で繁殖し、子孫ウイルスを産生したが、変異Ｄ２‐８９Ｒではそのようなことは起こらなかった。
【０１１５】
[00136]野生型ＤＶ２ウイルスに感染させた細胞では、感染細胞における活性なウイルス複製を示す、経時的なウイルス粒子産生の漸増が観察された。
[00137]一方、変異Ｄ２−８９Ｒ感染細胞は、ウイルス子孫をまったく産生しなかった。
実施例８
[00138]ＤＶ攻撃に対する対象の変異ＤＶの哺乳類細胞特異的増殖制限の防御効果を評価するために、６週齢ＡＧ１２９マウスの群（Ｎ＝６匹／群）に、１０５感染単位（ＩＵ）の変異Ｄ２−８９Ｒの単回腹腔内免疫を与えた。対照群のマウスには、５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。
【０１１６】
[00139]２つの群のマウスは、免疫化後に、いかなる視覚的に異なる運動性および挙動も示さなかった。
[00140]免疫化の１０日後、Ｄ２−８９Ｒ注射マウスおよびＰＢＳ対照ＡＧ１２９マウスに、１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）（ＬＤ５０の１００倍の接種である）のＤＶ２を腹腔内注射した。
【０１１７】
[00141]ＤＶ２を接種したＰＢＳ注射対照マウスは、ウイルス血症を発症した。対照的に、変異Ｄ２−８９Ｒによる単一免疫化は、ＤＶ２攻撃に対して完全な防御を提供し、あらゆる時間点（Ｎ＝１０）において検出可能なウイルス血症（＜１００複製／ｍＬ）はみられなかった。
【０１１８】
[00142]さらに、すべてのＤ２−８９Ｒ暴露マウスは実験を通して健康であったが、ＰＢＳのみに暴露したマウスはすべてＤＶ２攻撃後に死亡した。図１参照。
実施例９
[00143]ＤＶ変異体の安全性を評価するために、ＡＧ１２９マウスを使用した。これは、ＡＧ１２９マウスが、１ＰＦＵほどのウイルスでＤＶ２に致死的に感染する可能性があるためである。
【０１１９】
[00144]６匹の成体ＡＧ１２９の群に、１０６ＩＵの変異Ｄ２−８９Ｒを腹腔内投与した。対照群については、１群当たり同数のマウスに、１０１、１０２および１０３ＰＦＵのＤＶ２を腹腔内注射した。ＤＶ２およびＤ２−８９Ｒ注射後のウイルス負荷をＲＴ−ＰＣＲによって定量した。
【０１２０】
[00145]ＤＶ２感染群のマウスは検出可能なウイルス血症を発症し、感染後にすべて死亡した。
[00146]一方、変異Ｄ２−８９Ｒに暴露したマウスは、検出可能なウイルス血症を有さず、すべて、実験期間（１５日間）の間、疾病の兆候および体重変化をまったく伴わずに生存した。
実施例１０
[00147]ＺＶの電子密度の高いヌクレオカプシドは、Ｃ（カプシド）タンパク質およびゲノムＲＮＡから構成される。エンベロープタンパク質Ｅおよび膜（Ｍ）タンパク質は、脂質二重層に包埋される（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編集，Ｔｈｅ  Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ニューヨーク：Ａｃａｄｅｍｉｃ；１９８０：５０３−５２９；およびＴｒｅｎｔ  ＆  Ｎａｅｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｏｎａｔｈ編集，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ．  ワシントンＤＣ：米国公衆衛生協会；１９８０  ｐ．１５９−１９９）。
【０１２１】
[00148]ＺＶゲノムは、ゲノムのおよそ９５％を構成する単一ＯＲＦを含有する約１０〜１１ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡ分子である（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９０，４４：６４９−６８８）。感染すると、感染性ウイルスＲＮＡは翻訳され、構造タンパク質および非構造タンパク質に処理される（Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ  ＆  Ｙｏｋａｎ：Ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ，Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｋｕｎｏ編集，Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ．  Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９７，３６７−３７７頁；およびＦａｌｇｏｕｔ  ＆  Ｍａｒｋｏｆｆ，１９９５，Ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｐ．４７−６６．：ＪＳ  Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ（編集），Ｅｘｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ロンドン，英国）。
実施例１１
[00149]ＡＴＣＣからのＺＶ  ＭＲ７６６の全長感染性ｃＤＮＡクローンを点変異に付して、哺乳類細胞において増殖制限を生じさせた。変異はＤＮＡ塩基配列決定により確認した。変異ＺＶゲノムＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって合成し、Ｃ６／３６蚊細胞を、製造者の説明書に従って、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）によって変異ウイルスＲＮＡでトランスフェクトした。変異ＺＶを、トランスフェクションの７日後に収集した。ウイルス増殖動態を、哺乳類（Ｖｅｒｏ）細胞およびＣ６／３６細胞の両方において決定した。
【０１２２】
[00150]点変異をＺＶゲノムに誘導して、以下のようにフルリン切断部位付近の配列を改変した：
野生型：ＨＨＫＫＧＥＡＲＲＳＲＲＡＶＴＬＰＳＨＳＴＲＫＬＱＴＲＳＱＴＷＬＥＳＲＥＹＴＫＨＩＫＶＥＮＷＩＦＲＮ（配列番号：１１）
変異体：ＨＨＫＫＧＥＡＲＲＲＲＲＡＶＴＬＰＳＨＳＴＲＫＬＱＴＲＳＱＴＷＬＥＳＲＥＹＴＫＨＩＫＶＥＮＷＩＦＲＮ（配列番号：１２）
[00151]セリンからアルギニンへの単一の改変はＶｅｒｏ細胞における繁殖の減少をもたらしたが、蚊細胞における繁殖は、対照から比較的変化しないままであった。
実施例１２
[00152]実施例１１の手順に従った。同じＳｅｒからＡｒｇへの置換を用いたほか、Ｇｌｕ（Ｅ）（ＧとＡの間）をＨｉｓ（Ｈ）で置換して、２つの点変異を有する変異体を得た。
【０１２３】
[00153]ヒト細胞における繁殖は実施例１１の変異体で観察されるよりも低いレベルまで低下し、昆虫細胞における複製に影響はなかった。
実施例１３
[00154]実施例１１の手順に従った。実施例１１に示す配列の最初の１２アミノ酸を、ＴＴＴＧＥＨＲＲＲＫＲＳ（配列番号：１３）に置換した。
【０１２４】
[00155]ヒト細胞における繁殖は実施例１１の変異体で観察されるよりも低いレベルまで低下し、昆虫細胞における複製に影響はなかった。
実施例１４
[00156]実施例１１の手順に従った。実施例１１に示す配列の最初の２２アミノ酸を、ＴＴＴＧＥＨＲＲＲＫＲＳＶＡＬＶＰＨＶＧＭＧ（配列番号：１４）で置換した。
【０１２５】
[00157]ヒト細胞における繁殖は実施例１１の変異体で観察されるよりも低いレベルまで低下し、昆虫細胞における複製に影響はなかった。
実施例１５
[00158]実施例１１の手順に従った。実施例１１に示す配列の最初の３７アミノ酸をＴＴＴＧＥＨＲＲＲＫＲＳＶＡＬＶＰＨＶＧＭＧＬＥＴＲＴＥＴＷＭＳＳＥＧＡＷ（配列番号：１５）で置換して、ＺＶ  Ｍ２変異体を形成した。
【０１２６】
[00159]ヒト細胞における繁殖は実施例１１の変異体で観察されるよりも低いレベルまで低下し、昆虫細胞における複製に影響はなかった。
実施例１６
[00160]ＳＶ攻撃に対する対象の変異ＳＶの哺乳類細胞特異的増殖制限の防御効果を評価するために、６週齢ＡＧ１２９マウスの群（Ｎ＝６匹／群）に、１０５感染単位（ＩＵ）の実施例１５の変異Ｍ２の単回腹腔内免疫を与えた。対照群のマウスには、５０μＬのＰＢＳを腹腔内注射した。
【０１２７】
[00161]２つの群のマウスは、免疫化後に、いかなる視覚的に異なる運動性および挙動も示さなかった。
[00162]免疫化の１４日後、Ｍ２注射マウスおよびＰＢＳ対照ＡＧ１２９マウスに、１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）（ＬＤ５０の１００倍の接種である）の野生型ＳＶを腹腔内注射した。
【０１２８】
[00163]ＳＶを接種したＰＢＳ注射対照マウスは、ウイルス血症を発症した。対照的に、変異Ｍ２による単一免疫化は、ＳＶ攻撃に対し完全な防御を提供し、あらゆる時間点（Ｎ＝１０）において検出可能なウイルス血症（＜１００複製／ｍＬ）はみられなかった。
【０１２９】
[00164]さらに、すべてのＭ２暴露マウスは実験を通して健康であったが、ＰＢＳのみに暴露したマウスはすべてＳＶ攻撃後に死亡した。図２参照。
実施例１７
[00165]対象の変異ＳＶの哺乳類細胞特異的増殖制限の安全性を評価するために、６週齢ＡＧ１２９マウスの群（Ｎ＝６匹／群）に、１０５感染単位（ＩＵ）の変異Ｍ２または野生型ＺＶの単回腹腔内免疫を与えた。
【０１３０】
[00166]Ｍ２暴露マウスは実験を通して健康であったが、ＰＢＳのみに暴露したマウスはすべてＳＶ攻撃後に死亡した。図３参照。
実施例１８
[00167]実施例２〜９の材料および方法を、黄熱病ウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１３１】
[00168]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、これにアミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸の改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１３２】
[00169]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかない黄熱ウイルス変異体が同定される。
実施例１９
[00170]実施例２〜９の材料および方法を、カリフォルニア脳炎ウイルスの標準を用いて実施する。
【０１３３】
[00171]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１３４】
[00172]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかないカリフォルニア脳炎ウイルス変異体が同定される。
実施例２０
[00173]実施例２〜９の材料および方法を、リフトバレー熱ウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１３５】
[00174]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１３６】
[00175]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかないリフトバレー熱ウイルス変異体が同定される。
実施例２１
[00176]実施例２〜９の材料および方法を、ダニ媒介脳炎ウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１３７】
[00177]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１３８】
[00178]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかないダニ媒介脳炎ウイルス変異体が同定される。
実施例２２
[00179]実施例２〜９の材料および方法を、西ナイルウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１３９】
[00180]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、哺乳類細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１４０】
[00181]昆虫細胞においては複製するが、哺乳類細胞における複製はあまりうまくいかない西ナイルウイルス変異体が同定される。
実施例２３
[00182]実施例２〜９の材料および方法を、ウマ脳症ウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１４１】
[00183]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、哺乳類細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１４２】
[00184]昆虫細胞においては複製するが、哺乳類細胞における複製はあまりうまくいかないウマ脳症ウイルス変異体が同定される。
実施例２４
[00185]実施例２〜９の材料および方法を、コロラドダニ熱ウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１４３】
[00186]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１４４】
[00187]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかないコロラドダニ熱ウイルスが同定される。
実施例２５
[00188]実施例２〜９の材料および方法を、チクングニヤウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１４５】
[00189]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１４６】
[00190]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかないチクングニヤウイルスが同定される。
実施例２６
[00191]実施例２〜９の材料および方法を、アフリカ豚コレラウイルスの標準株を用いて実施する。
【０１４７】
[00192]上記のように、そして当該分野で公知のように、ｐｒＭフリン認識部位を位置付け、アミノ酸置換を行う。本明細書中で上記したように、対象の変異体は、ヒト細胞においてもはや繁殖しないか低レベルでしか繁殖しない変異体として同定される。置換、挿入、欠失、化学修飾などのアミノ酸改変も、フリン切断部位の上流および／または下流で行われる。
【０１４８】
[00193]昆虫細胞においては複製するが、ヒト細胞における複製はあまりうまくいかないアフリカ豚コレラウイルスが同定される。
実施例２７
[00194]成体アカゲザルを、１群あたり４〜６匹の動物の実験群および対照群に割り当てた。実験群の動物には、実施例２の変異Ｄ２−８９Ｒを様々な用量（１０５〜１０１０ＩＵ）で与えた。対照群の動物には、等容量のＰＢＳを与えた。
【０１４９】
[00195]動物を４週間保持し、その間に、動物を、循環抗デング熱抗体、ウイルス負荷および細胞免疫蛍光について試験して、ウイルスの存在、程度および量ならびにそれに対する宿主応答を検出したほか、デング熱感染の任意の症状、例えば、発熱および体重減少についてモニタリングした。
【０１５０】
[00196]その後、動物を野生型ＤＶ２で攻撃し、発熱および体重減少などの症状、ならびにウイルス負荷およびデング熱抗体などの血清学的パラメーターについてモニタリングした。
【０１５１】
[00197]対照動物はデング熱感染の症状を示すが、対象の変異体を与えたサルは症状を示さない。
実施例２８
[00198]成体アカゲザルを、１群あたり４〜６匹の動物の実験群および対照群に割り当てた。実験群の動物には、実施例４のＤＶ１変異体を様々な用量（１０５〜１０１０ＩＵ）で与えた。対照群の動物には、等容量のＰＢＳを与えた。
【０１５２】
[00199]動物を４週間保持し、その間に、動物を、循環抗デング熱抗体、ウイルス負荷および細胞免疫蛍光について試験して、ウイルスの存在、程度および量ならびにそれに対する宿主応答を検出したほか、デング熱感染の任意の症状、例えば、発熱および体重減少についてモニタリングした。
【０１５３】
[00200]その後、動物を野生型ＤＶ１で攻撃し、発熱および体重減少などの症状、ならびにウイルス負荷およびデング熱抗体などの血清学的パラメーターについてモニタリングした。
【０１５４】
[00201]対照動物はデング熱感染の症状を示すが、対象の変異体を与えたサルは症状を示さない。
実施例２９
[00202]成体アカゲザルを、１群あたり４〜６匹の動物の２つの実験群および２つの対照群に割り当てた。実験群の動物には、実施例１４の変異ジカウイルスを様々な用量（１０５〜１０１０ＩＵ）で与えた。対照群の動物には、等容量のＰＢＳを与えた。
【０１５５】
[00203]動物を４週間保持し、その間に、動物を、循環抗ジカ抗体、ウイルス負荷および細胞免疫蛍光について試験して、ウイルスの存在、程度および量ならびにそれに対する宿主応答を検出したほか、ジカ感染の任意の症状、例えば、発熱、ウイルス血症、発疹および体重減少についてモニタリングした。
【０１５６】
[00204]その後、動物を野生型ＺＶで攻撃した。一対の実験群および対照群は野生型ＺＶアフリカ株で攻撃し、もう一対の実験群および対照群は野生型ＺＶアジア株で攻撃した。動物を、発熱、発疹および体重減少などの症状、ならびにウイルス負荷およびジカ抗体などの血清学的パラメーターについてモニタリングした。
【０１５７】
[00205]対照動物はジカ感染の症状を示すが、対象の変異体を与えたサルは症状を示さない。
実施例３０
[00206]成体アカゲザルを、１群あたり４〜６匹の動物の２つの実験群および２つの対照群に割り当てた。実験群の動物には、実施例１５の変異ジカウイルスを様々な用量（１０５〜１０１０ＩＵ）で与えた。対照群の動物には、等容量のＰＢＳを与えた。
【０１５８】
[00207]動物を４週間保持し、その間に、動物を、循環抗ジカ抗体、ウイルス負荷および細胞免疫蛍光について試験して、ウイルスの存在、程度および量ならびにそれに対する宿主応答を検出したほか、ジカ感染の任意の症状、例えば、発熱、ウイルス血症、発疹および体重減少についてモニタリングした。
【０１５９】
[00208]その後、動物を野生型ＺＶで攻撃した。一対の実験群および対照群は野生型ＺＶアフリカ株で攻撃し、もう一対の実験群および対照群は野生型ＺＶアジア株で攻撃した。動物を、発熱、発疹および体重減少などの症状、ならびにウイルス負荷およびジカ抗体などの血清学的パラメーターについてモニタリングした。
【０１６０】
[00209]対照動物はジカ感染の症状を示すが、対象の変異体を与えたサルは症状を示さない。
[00210]本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体を本明細書中で参考として援用する。
【０１６１】
[00211]本明細書中に記載する現在の好ましい態様への種々の変更および修正は、当業者には明らかであることを理解すべきである。そのような変更および修正は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつその意図された利点を損なうことなく、行うことができる。したがって、そのような変更および修正は、添付の請求項の範囲によって包含されることが意図されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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