(57)【要約】  アフィニティー及びカチオン交換クロマトグラフィーにおける使用のために界面活性剤を含む洗浄緩衝液は、対象となるタンパク質をタンパク質凝集物から精製し、ウイルスを除去する、及び／または不活化する。抗体などの、対象となるタンパク質の精製のためにアフィニティーまたはカチオン交換クロマトグラフィー中に使用されるときに、洗浄緩衝液は、この調製物からのウイルス排除を有意に改善すると同時に、宿主細胞由来タンパク質及びタンパク質凝集物のレベルをも低下させる。洗浄緩衝液によるアフィニティーまたはカチオン交換クロマトグラフィー後に、対象となるタンパク質は、他のクロマトグラフィー及びろ過操作を使用してさらに精製されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液をカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー支持体に適用することを含む、前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体に結合される対象となるタンパク質を精製する方法。
【請求項２】
前記対象となるタンパク質を前記支持体から溶出させ、前記対象となるタンパク質を含む精製された溶出液を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物を充填し、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液によって前記支持体を洗浄した後に、前記対象となるタンパク質を前記支持体から溶出させることにより、前記対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成することを含む、前記対象となるタンパク質を精製する方法。
【請求項４】
ＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物を充填し、１つ以上の界面活性剤を含む水性洗浄液によって前記支持体を洗浄して、前記支持体から前記１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを溶出させた後に、前記対象となるタンパク質を前記支持体から溶出させることにより、前記対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成することを含む、前記対象となるタンパク質を精製する方法。
【請求項５】
前記１つ以上の界面活性剤は、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｔｒｉｔｏｎ１００、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、スルホベタイン−１２（ＳＢ−１２）、スルホベタイン−１４（ＳＢ−１４）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の界面活性剤は、双性イオン界面活性剤を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記双性イオン界面活性剤は、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、もしくはコカミドプロピルヒドロキシスルタイン（ＣＡＨＳ）、またはそれらの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の界面活性剤は、第四級アンモニウム塩を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第四級アンモニウム塩は、セトリモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）またはジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の界面活性剤は、アルキルフェノールエトキシレートを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルキルフェノールエトキシレートは、ノノキシノール、任意選択でノナエチレングリコールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の界面活性剤は、エトキシレートを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の界面活性剤は、アルキルポリグルコシド、任意選択でデシルグルコシドを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の界面活性剤は、アミノオキシドを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の界面活性剤は、ホスフィンオキシドを含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の界面活性剤は、非イオン界面活性剤を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の界面活性剤は、アニオン界面活性剤を含み、任意選択で前記アニオン界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記洗浄液は、約０．０１ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％の前記１つ以上の界面活性剤を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記洗浄液は、約０．０５ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％の前記１つ以上の界面活性剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記洗浄液は、約０．１ｗ／ｖ％の前記１つ以上の界面活性剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記洗浄液は、約０．２ｗ／ｖ％の前記１つ以上の界面活性剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記洗浄液は、約０．５ｗ／ｖ％の前記１つ以上の界面活性剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、セファロースマトリックスレジンである、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、合成ポリマーマトリックスレジンである、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、親水性レジンではない、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、Ｅｓｈｎｕｍｏ  Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ、及びＮｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅからなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象となるタンパク質を前記支持体から溶出させる前に、後続の洗浄液を前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用することをさらに含む、請求項２から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記後続の洗浄液は、界面活性剤を含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記後続の洗浄液は、前記界面活性剤を前記支持体から除去する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記後続の洗浄液を適用することは、前記後続の洗浄液を適用しないことと比較して、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）除去を増加させる、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上の界面活性剤を含む前記洗浄液を前記支持体に適用する前に、収穫細胞培養液（ＨＣＣＦ）を前記支持体上に充填することをさらに含む、請求項１、２、及び５から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む前記混合物は、ＨＣＣＦである、請求項３から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法は、プロテインＡ精製を含まない、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の界面活性剤を含む前記洗浄液を前記支持体に適用する前に、クロマトグラフィーステップの前記溶出液を前記支持体上に充填することをさらに含む、請求項１、２、及び５から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む前記混合物は、クロマトグラフィーステップの溶出液である、請求項３から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記クロマトグラフィーステップの前記溶出液は、アフィニティークロマトグラフィーステップの溶出液である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アフィニティークロマトグラフィーステップは、プロテインＡ精製である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記プロテインＡ精製は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液によってプロテインＡ支持体を洗浄することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プロテインＡ精製は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液によってプロテインＡ支持体を洗浄することを含まない、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記洗浄液は、ＬＲＶによって測定されるようなウイルスを排除する、請求項１から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）対象となるタンパク質及び１つ以上の混入物、凝集物及び／またはウイルスを含む混合物をプロテインＡクロマトグラフィー支持体上に充填すること、
ｂ）１つ以上の界面活性剤を含むプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液によって前記支持体を洗浄し、前記１つ以上の混入タンパク質、凝集物及び／またはウイルスを前記プロテインＡクロマトグラフィー支持体から除去すること、
ｃ）前記対象となるタンパク質を前記プロテインＡクロマトグラフィー支持体から溶出させること、
ｄ）前記対象となるタンパク質を含む前記溶出液をカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー支持体上に充填すること、
ｅ）前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体を、１つ以上の界面活性剤を含むＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液によって洗浄し、前記１つ以上の混入タンパク質、凝集物及び／またはウイルスを前記支持体から除去すること、ならびに
ｆ）前記対象となるタンパク質を前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体から溶出させることにより、前記対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成すること、
を含む、タンパク質精製方法。
【請求項４２】
前記混入タンパク質は、宿主細胞由来タンパク質である、請求項３から３０、３２、３３、及び３５から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞由来タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロテインＡ洗浄液は、対数減少値（ＬＲＶ）によって測定されるようなウイルスを排除する、請求項４１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＥＸ洗浄液は、ＬＲＶによって測定されるようなウイルスを排除する、請求項４１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＬＲＶは、約１．０から約１０．０ｌｏｇ１０の間にある、請求項４０、４４、及び４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＬＲＶは、約１．０から約５．０ｌｏｇ１０の間にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＬＲＶは、約４．０から約８．０ｌｏｇ１０の間にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ１０である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ１０である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ１０である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＬＲＶは、約６．０ｌｏｇ１０である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＬＲＶは、定量的ＰＣＲによって測定される、請求項４０及び４４から５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＬＲＶは、感染アッセイを使用して測定される、請求項４０及び４４から５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＬＲＶは、１カラム容量（ＣＶ）の前記洗浄を適用することによって達成される、請求項４０及び４４から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＬＲＶは、２ＣＶの前記洗浄を適用することによって達成される、請求項４０及び４４から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＬＲＶは、３ＣＶの前記洗浄を適用することによって達成される、請求項４０及び４４から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＬＲＶは、４ＣＶの前記洗浄を適用することによって達成される、請求項４０及び４４から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＬＲＶは、５ＣＶの前記洗浄を適用することによって達成される、請求項４０及び４４から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つ以上の界面活性剤を含む前記洗浄液を前記支持体に適用する前に、界面活性剤を含まない洗浄液を前記支持体に適用することをさらに含む、請求項１から５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象となるタンパク質の前記精製された溶出液を、透析ろ過、限外ろ過、または透析ろ過及び限外ろ過の両方によって処理することをさらに含む、請求項２から６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象となるタンパク質の前記精製された溶出液をメンブレンクロマトグラフィー支持体上に充填すること、及びさらに精製された溶出液を含むフロースルーを前記メンブレンクロマトグラフィー支持体から収集することをさらに含む、請求項２から６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法は、アニオン交換クロマトグラフィーステップを含まない、請求項１から６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記溶出液にウイルス不活化ステップを受けさせることをさらに含む、請求項２から６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルス不活化は、低ｐＨウイルス不活化によって達成され、ウイルス不活化調製物を形成する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ｐＨは、約２．５から約５の間まで低下する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ウイルスを不活化するのに十分な一定期間、前記対象となるタンパク質の前記精製された溶出液の前記ｐＨを低下させることをさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象となるタンパク質の前記精製された溶出液をろ過し、ウイルスを除去することをさらに含む、請求項２から６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、前記対象となるタンパク質の前記精製された溶出液を製剤化することをさらに含む、請求項２から６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも約２５０リットルの容量を有するバイオリアクターにおいて前記対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質を発現させることをさらに含む、請求項１から６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記バイオリアクターは、少なくとも約５００リットル、少なくとも約２０００リットル、または少なくとも約５０００リットルの容量を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象となるタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその融合タンパク質コンストラクトを含む、請求項１から７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）任意選択で前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号５または６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する、
（ｂ）任意選択で前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する、または
（ｃ）任意選択で前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＣＤ３８に特異的に結合する、
請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
洗浄液は、１つ以上の界面活性剤を含む、カチオン交換（ＣＥＸ）支持体に結合される対象となるタンパク質を精製するためにＣＥＸクロマトグラフィー中の前記洗浄液の使用。
【請求項７５】
界面活性剤を含む、カチオン交換（ＣＥＸ）支持体に結合される対象となるタンパク質を精製するためのＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液。 
【請求項７６】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．１ｗ／ｖ％から約０．６ｗ／ｖ％の前記界面活性剤を含む、請求項４６から７５のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項７７】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．２ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％の前記界面活性剤を含む、請求項４６から７６のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項７８】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．２ｗ／ｖ％の前記界面活性剤を含む、請求項４６から７７のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項７９】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．３ｗ／ｖ％の前記界面活性剤を含む、請求項４６から７７のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８０】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．５ｗ／ｖ％の前記界面活性剤を含む、請求項４６から７７のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８１】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．６ｗ／ｖ％の前記界面活性剤を含む、請求項４６から７６のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８２】
前記界面活性剤は、非イオン界面活性剤である、請求項４６から８１のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８３】
前記界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００である、請求項４６から８２のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８４】
約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む、請求項８３に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８５】
約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む、請求項８３に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８６】
前記界面活性剤は、ＰＳ８０である、請求項４６から８２のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８７】
約０．３％のＰＳ８０を含む、請求項８６に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８８】
約０．６％のＰＳ８０を含む、請求項８６に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項８９】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、アルギニンをさらに含み、任意選択で前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約２５ｍＭのアルギニンを含む、請求項１から８８のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９０】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、ヒスチジンをさらに含み、任意選択で前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１から８９のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９１】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、任意選択で塩化ナトリウムをさらに含み、前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５ｍＭから約１５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１から９０のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９２】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約１０ｍＭの塩化ナトリウム、または約１１ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項９１に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９３】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、リン酸ナトリウムをさらに含み、任意選択で前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１から９２のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９４】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、酢酸ナトリウムをさらに含み、任意選択で前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約２０ｍＭから約５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、請求項１から９３のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９５】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、または約５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、請求項９３または９４のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９６】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、
（ａ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、
（ｂ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、
（ｃ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．３％のＰＳ８０、または
（ｄ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．６％のＰＳ８０、
を含む、請求項１から４及び２３から７５のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９７】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、
（ａ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．３％のＰＳ８０、
（ｂ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．６％のＰＳ８０、
（ｃ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、
（ｄ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、
（ｅ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．３％のＰＳ８０、
（ｆ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．６％のＰＳ８０、
（ｇ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、または
（ｈ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、
を含む、請求項１から４及び２３から７５のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９８】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５．０から７．０のｐＨを有する、請求項１から９７のいずれか１項に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項９９】
前記プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液または前記ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５．５または約６．３のｐＨを有する、請求項９８に記載の使用、方法または洗浄液。
【請求項１００】
請求項１から７３及び７６から９９のいずれか１項に記載の方法によって生成される対象となるタンパク質の調製物。
【請求項１０１】
請求項１から７３及び７６から９９いずれか１項に記載の方法によって生成される、対象となるタンパク質のウイルス不活化調製物。
【請求項１０２】
前記対象となるタンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１００または１０１に記載の調製物。
【請求項１０３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）任意選択で前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する、
（ｂ）任意選択で前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する、または
（ｃ）任意選択で前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＣＤ３８に特異的に結合する、
請求項１０２に記載の調製物。
【請求項１０４】
請求項１から７３及び７６から１００のいずれか１項に記載の方法によって生成される対象となるタンパク質の調製物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
【請求項１０５】
請求項１から７３及び７６から１００のいずれか１項に記載の方法によって生成される、対象となるタンパク質のウイルス不活化調製物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
【請求項１０６】
水性担体及び組換え発現またはハイブリドーマ発現抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物であって、
前記組成物は、ウイルス粒子が実質的になく、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合し、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、
（ｂ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、または
（ｃ）ＣＤ３８に特異的に結合し、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、
前記組成物。
【請求項１０７】
前記組成物は、ウイルス粒子がない、請求項１０６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、または
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、
請求項１０６または１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
方法によって調製される、水性担体及び組換え発現またはハイブリドーマ発現抗体を含む組成物であって、
ａ）前記抗体及び１つ以上の混入物、凝集物及び／またはウイルスを含む混合物をプロテインＡクロマトグラフィー支持体上に充填すること、
ｂ）１つ以上の界面活性剤を含むプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液によって前記支持体を洗浄し、前記１つ以上の混入タンパク質、凝集物及び／またはウイルスを前記プロテインＡクロマトグラフィー支持体から除去すること、
ｃ）前記抗体を前記プロテインＡクロマトグラフィー支持体から溶出させること、
ｄ）ステップｃ）からの前記溶出液をカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー支持体上に充填すること、
ｅ）前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体を、１つ以上の界面活性剤を含むＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液によって洗浄し、前記１つ以上の混入タンパク質、凝集物及び／またはウイルスを前記支持体から除去すること、ならびに
ｆ）前記抗体を前記ＣＥＸクロマトグラフィー支持体から溶出させることにより、前記抗体の精製された溶出液を形成すること、
を含む、前記方法により調整される前記組成物。
【請求項１１０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合し、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、
（ｂ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、または
（ｃ）ＣＤ３８に特異的に結合し、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、
請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記組成物は、ウイルス粒子が実質的にない、請求項１０９または１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記組成物は、前記ＣＥＸクロマトグラフィーの前に、アニオン交換クロマトグラフィーを受けていない、請求項１０９から１１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記組成物は、前記ＣＥＸクロマトグラフィーの前に、いかなるイオン交換クロマトグラフィーも受けていない、請求項１０９から１１２のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般に、タンパク質生化学の分野に関する。さらに特に、本発明は、標的タンパク質、たとえば、抗体をタンパク質凝集物から精製し、ウイルスを除去する、及び／または不活化する、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて使用される洗浄緩衝液に関する。カチオン交換クロマトグラフィー支持体を、１つ以上の界面活性剤を含む緩衝液によって洗浄することは、タンパク質調製物からのウイルス排除を実質的に改善することがわかっている。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質は、宿主細胞中で発現し、一連のクロマトグラフィー及びろ過ステップによって一般的に精製される。慣習的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）精製プロセスフローは、３つのクロマトグラフィーカラムから構成される。各クロマトグラフィーカラムの主な機能は、下記の、
・生成物回収及び宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）除去のためのプロテインＡ（ＰｒｏＡ）；
・ＤＮＡ、ＨＣＰ及び凝集物除去のためのカチオン交換（ＣＥＸ）；ならびに
・さらなるＤＮＡ及びＨＣＰ除去、及びウイルス排除のためのアニオン交換（ＡＥＸ）、が挙げられる。
一般的な精製スキームは、ダウンストリームカスケードとしても知られているが、アフィニティークロマトグラフィーを用いた後に、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いた後に、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を伴う。ＣＥＸクロマトグラフィー及びＡＥＸは、ポリッシングステップと通常みなされる（たとえば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．（２００６）．Ｐｒｏｃｅｓｓ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ．ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／  Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３１４７５０９１３７１２／ｌｉｔｄｏｃ２８９０３７１６＿２０１３０５０７２１２４４９．ＰＤＦを参照）。加えて、典型的なダウンストリーム精製スキームは、適切なウイルス排除を確保するために、ウイルス不活化ステップ及びウイルスろ過ステップをも含む。
【０００３】
残念ながら、追加の各クロマトグラフィーステップは、全体のタンパク質収量を一般的に低下させる。さらに、追加のクロマトグラフィーステップの使用は、費用、及びプロセスの操作の複雑さを増加させる。
【０００４】
カチオン交換クロマトグラフィーステップの性能を向上させることによって、ポリッシングクロマトグラフィーステップを縮小させる、または排除することは、開発の労力及び製造コストを有意に低減させ、標的生成物回収を改善し、製造工程を単純化することが可能である。しかしながら、唯一のポリッシングステップとしてＣＥＸを使用することの主な懸念のうちの１つは、それがロバストなウイルス排除ステップとみなされないことである（複数の研究からのメタデータ分析に示されるように；Ｍｉｅｓｅｇａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１０；１０６：２３８−２４６）。
【０００５】
適切なプロセス性能、そして特に、有効なウイルス排除を達成するＣＥＸステップについて、プロセスパラメータの点から操作設計空間は、有意に制限される（Ｍｉｅｓｅｇａｅｓ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２；１０９：２０４８−２０５８  ２、及びＣｏｎｎｅｌｌ−Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２；１０９：１５７−１６５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．（２００６）
【非特許文献２】Ｍｉｅｓｅｇａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１０；１０６：２３８−２４６
【非特許文献３】Ｍｉｅｓｅｇａｅｓ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２；１０９：２０４８−２０５８  ２
【非特許文献４】Ｃｏｎｎｅｌｌ−Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２；１０９：１５７−１６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、カチオン交換ステップに適用される洗浄手順を提供し、クロマトグラフィー性能、特に、このステップのウイルス排除能力を向上させる。洗浄手順の適用、及びその関連したロバストなウイルス排除能力は、ＡＥＸなどの、ある特定の他のポリッシングクロマトグラフィーステップの除去を可能にし、必要とされるクロマトグラフィーステップの数を減少させることができる。
【０００８】
また、本明細書に記述される洗浄手順の適用は、ウイルス不活化ステップの除去を可能にすることができ、これは、一般的なウイルス不活化条件（たとえば低ｐＨ）下において、またはウイルス不活化を実行することが難しい可能性がある（たとえば、連続して処理している）プロセスにおいて、安定しない分子に特に有用であり、なおかつクロマトグラフィーのダウンストリームユニット操作及びウイルスろ過ステップから適切なウイルス排除を達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＣＥＸ支持体上でのウイルス排除能力を向上させることによって、ＡＥＸクロマトグラフィーステップを除去し、タンパク質、たとえば、抗体などの製造工程全体を単純化することが可能であることがわかった。ＣＥＸにおいて界面活性剤を洗浄緩衝液に加えることは、不純物排除能力を損なうことなく、ウイルス排除能力を向上させる。ＣＥＸカラムのウイルス排除能力におけるこの改善は、ＣＥＸがポリッシングステップとして利用される（すなわち、たとえば、ＰｒｏＡなどの上での、一次生成物回収または捕獲ステップ後に）か、一次回収ステップ自体として利用されるかに無関係に観察される。
【００１０】
洗浄液は、上述されるような多段階タンパク質精製方法などの、タンパク質精製方法において使用されることができる。別の態様において、本開示は、組換え発現による、またはハイブリドーマ発現によるものを含む、細胞から発現する、対象となるタンパク質を精製する方法を特徴とする。一般に、この方法は、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入するウイルスの混合物を充填し、界面活性剤を含む水性洗浄液によって支持体を洗浄した後に、対象となるタンパク質を支持体から溶出させることにより、対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成することを含み、精製された溶出液は、混入するウイルスを含まない（またはＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に充填する混合物と比較してその減少した数を含む）。任意選択で、この方法は、界面活性剤洗浄ステップ後に、そして溶出ステップ前に、界面活性剤を含まない中間洗浄緩衝液によって支持体を洗浄するステップを含む。この中間洗浄緩衝液は、溶出ステップの前に、先行する洗浄からのいかなる残留界面活性剤をも支持体から除去する。
【００１１】
対象となる当該タンパク質の混合物は、前のクロマトグラフィーステップの溶出液、たとえば、アフィニティークロマトグラフィーカラムの溶出液、任意選択でプロテインＡクロマトグラフィーカラムなどであることができる。別の実施形態において、対象となる当該タンパク質の混合物は、収穫細胞培養液（ＨＣＣＦ）である。この実施形態において、タンパク質精製方法は、アフィニティークロマトグラフィーステップを含まなくてもよい（すなわち、本明細書に記述されるＣＥＸクロマトグラフィーステップはアフィニティークロマトグラフィー、たとえば、プロテインＡステップに取って代わることができる）。水性洗浄液は、下記の節に記述されるこれらの洗浄液を含む、本明細書に記述される、または例証されるいずれかのこれらのような溶液であってよい。中間洗浄緩衝液は、界面活性剤を含まない条件の下で、ＣＥＸ平衡化緩衝液などの、いずれかの水性ＣＥＸ洗浄緩衝液、または本明細書に記述されるＣＥＸ洗浄液のいずれかであることができる。１つの実施形態において、中間洗浄緩衝液は、界面活性剤を含まない、本明細書に記述されるＣＥＸ洗浄液のうちのいずれか１つと同一の組成物のものである。 
【００１２】
さらに、この方法は、対象となるタンパク質を含む精製された溶出液を酸性化し（たとえば、この溶出液のｐＨを低下させ）、この溶出液中のいかなる残留ウイルスをも不活化することを含むことができる。ｐＨを低下させることは、溶出液中のウイルスを不活化するのに十分な一定期間、行われた後に、ｐＨは、より中性のｐＨに上昇する。さらに、この方法は、対象となるタンパク質の精製された溶出液をろ過し、不活化されたウイルスを含む、ウイルスを除去することを含むことができる。さらに、この方法は、対象となるタンパク質の精製された溶出液を、透析ろ過、限外ろ過、または透析ろ過及び限外ろ過の両方によって処理することを含むことができる。この方法は、薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、対象となるタンパク質の精製された溶出液を製剤化することをさらに含むことができる。この方法は、薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、対象となるタンパク質のさらに精製された溶出液を製剤化することをさらに含むことができる。いくつかの態様において、タンパク質精製方法は、アニオン交換（カラムまたはメンブレン）クロマトグラフィーステップを含まない。いくつかの態様において、タンパク質精製方法は、別のポリッシングクロマトグラフィーステップを含まない。いくつかの態様において、タンパク質精製方法は、ウイルス不活化ステップを含まない。
【００１３】
いくつかの態様において、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー支持体に結合される対象となるタンパク質を精製する方法は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用することを含む。いくつかの態様において、この方法は、対象となるタンパク質を支持体から溶出させ、対象となるタンパク質を含む精製された溶出液を形成することをさらに含む。
【００１４】
いくつかの態様において、対象となるタンパク質を精製する方法は、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物を充填し、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液によってこの支持体を洗浄した後に、対象となるタンパク質を支持体から溶出させることにより、対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成することを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、対象となるタンパク質を精製する方法は、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物を充填し、１つ以上の界面活性剤を含む水性洗浄液によって支持体を洗浄して、支持体から１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを溶出させた後に、対象となるタンパク質を支持体から溶出させることにより、対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成することを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ１００、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、スルホベタイン−１２（ＳＢ−１２）、スルホベタイン−１４（ＳＢ−１４）、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、双性イオン界面活性剤を含む。いくつかの態様において、双性イオン界面活性剤は３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、もしくはコカミドプロピルヒドロキシスルタイン（ＣＡＨＳ）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、第四級アンモニウム塩を含む。いくつかの態様において、第四級アンモニウム塩は、セトリモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）またはジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）である。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、アルキルフェノールエトキシレートを含む。いくつかの態様において、このアルキルフェノールエトキシレートは、ノノキシノール、任意選択でノナエチレングリコールである。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、エトキシレートを含む。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、アルキルポリグルコシド、任意選択でデシルグルコシドを含む。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、アミノオキシドを含む。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、ホスフィンオキシドを含む。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、非イオン界面活性剤を含む。いくつかの態様において、１つ以上の界面活性剤は、アニオン界面活性剤を含み、任意選択で、このアニオン界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００１７】
いくつかの態様において、この洗浄液は、約０．０１ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％の１つ以上の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、この洗浄液は、約０．０５ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％の１つ以上の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、この洗浄液は、約０．１ｗ／ｖ％の１つ以上の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、この洗浄液は、約０．２ｗ／ｖ％の１つ以上の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、この洗浄液は、約０．５ｗ／ｖ％の１つ以上の界面活性剤を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、セファロースマトリックスレジンである。いくつかの態様において、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、合成ポリマーマトリックスレジンである。いくつかの態様において、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、親水性レジンではない。いくつかの態様において、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体は、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、Ｅｓｈｎｕｍｏ  Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ、及びＮｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅからなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの態様において、この方法は、対象となるタンパク質を支持体から溶出させる前に、後続の洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用することをさらに含む。いくつかの態様において、この後続の洗浄液は、界面活性剤を含まない。いくつかの態様において、この後続の洗浄液は、界面活性剤を支持体から除去する。いくつかの態様において、この後続の洗浄液を適用することは、この後続の洗浄液を適用しないことと比較して、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の除去を増加させる。
【００２０】
いくつかの態様において、この方法は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液を支持体に適用する前に、収穫細胞培養液（ＨＣＣＦ）を支持体上に充填することをさらに含む。いくつかの態様において、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物は、ＨＣＣＦである。
【００２１】
いくつかの態様において、この方法は、プロテインＡ精製を含まない。
【００２２】
いくつかの態様において、この方法は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液を支持体に適用する前に、クロマトグラフィーステップの溶出液を支持体上に充填することをさらに含む。いくつかの態様において、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物は、クロマトグラフィーステップの溶出液である。いくつかの態様において、クロマトグラフィーステップの溶出液は、アフィニティークロマトグラフィーステップの溶出液である。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーステップは、プロテインＡ精製である。いくつかの態様において、プロテインＡ精製は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液によってプロテインＡ支持体を洗浄することを含む。いくつかの態様において、プロテインＡ精製は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液によってプロテインＡ支持体を洗浄することを含まない。
【００２３】
いくつかの態様において、洗浄液は、ＬＲＶによって測定されるようなウイルスを排除する。
【００２４】
いくつかの態様において、タンパク質精製方法は、ａ）プロテインＡクロマトグラフィー支持体上に、対象となるタンパク質及び１つ以上の混入物、凝集物、及び／またはウイルスを含む混合物を充填すること、ｂ）１つ以上の界面活性剤を含むプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液によって支持体を洗浄して、プロテインＡクロマトグラフィー支持体から１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを除去すること、ｃ）対象となるタンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー支持体から溶出させること、ｄ）対象となるタンパク質を含む溶出液をカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー支持体上に充填すること、ｅ）１つ以上の界面活性剤を含むＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液によってＣＥＸクロマトグラフィー支持体を洗浄し、１つ以上の混入タンパク質、凝集物及び／またはウイルスをこの支持体から除去すること、ならびにｆ）対象となるタンパク質をＣＥＸクロマトグラフィー支持体から溶出させることにより、対象となるタンパク質の精製された溶出液を形成することを含む。
【００２５】
いくつかの態様において、混入タンパク質は、宿主細胞由来タンパク質である。いくつかの態様において、宿主細胞由来タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に由来する。
【００２６】
いくつかの態様において、プロテインＡ洗浄液は、対数減少値（ＬＲＶ）によって測定されるようなウイルスを排除する。いくつかの態様において、ＣＥＸ洗浄液は、ＬＲＶによって測定されるようなウイルスを排除する。
【００２７】
いくつかの態様において、このＬＲＶは、約１．０から約１０．０ｌｏｇ１０の間にある。いくつかの態様において、このＬＲＶは、約１．０から約５．０ｌｏｇ１０の間にある。いくつかの態様において、このＬＲＶは、約４．０から約８．０ｌｏｇ１０の間にある。いくつかの態様において、このＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ１０である。いくつかの態様において、このＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ１０である。いくつかの態様において、このＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ１０である。いくつかの態様において、このＬＲＶは、約６．０ｌｏｇ１０である。
【００２８】
いくつかの態様において、このＬＲＶは、定量的ＰＣＲによって測定される。いくつかの態様において、このＬＲＶは、感染アッセイを使用して測定される。
【００２９】
いくつかの態様において、このＬＲＶは、１カラム容量（ＣＶ）の洗浄を適用することによって達成される。いくつかの態様において、このＬＲＶは、２ＣＶの洗浄を適用することによって達成される。いくつかの態様において、このＬＲＶは、３ＣＶの洗浄を適用することによって達成される。いくつかの態様において、このＬＲＶは、４ＣＶの洗浄を適用することによって達成される。いくつかの態様において、このＬＲＶは、５ＣＶの洗浄を適用することによって達成される。
【００３０】
いくつかの態様において、この方法は、１つ以上の界面活性剤を含む洗浄液を支持体に適用する前に、界面活性剤を含まない洗浄液を支持体に適用することをさらに含む。
【００３１】
いくつかの態様において、この方法は、対象となるタンパク質の精製された溶出液を、透析ろ過、限外ろ過、または透析ろ過及び限外ろ過の両方によって処理することをさらに含む。
【００３２】
いくつかの態様において、この方法は、対象となるタンパク質の精製された溶出液をメンブレンクロマトグラフィー支持体上に充填すること、及びさらに精製された溶出液を含むフロースルーをメンブレンクロマトグラフィー支持体から収集することをさらに含む。
【００３３】
いくつかの態様において、この方法は、アニオン交換クロマトグラフィーステップを含まない。
【００３４】
いくつかの態様において、この方法は、溶出液にウイルス不活化ステップを受けさせることをさらに含む。いくつかの態様において、ウイルス不活化は、低ｐＨウイルス不活化によって達成され、ウイルス不活化調製物を形成する。いくつかの態様において、このｐＨは、約２．５から約５の間まで低下する。いくつかの態様において、この方法は、ウイルスを不活化するのに十分な一定期間、対象となるタンパク質の精製された溶出液のｐＨを低下させることをさらに含む。
【００３５】
いくつかの態様において、この方法は、対象となるタンパク質の精製された溶出液をろ過し、ウイルスを除去することをさらに含む。
【００３６】
いくつかの態様において、この方法は、薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、対象となるタンパク質の精製された溶出液を製剤化することをさらに含む。
【００３７】
いくつかの態様において、この方法は、少なくとも約２５０リットルの容量を有するバイオリアクターにおいて対象となるタンパク質及び１つ以上の混入タンパク質を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において、このバイオリアクターは、少なくとも約５００リットル、少なくとも約２０００リットル、または少なくとも約５０００リットルの容量を有する。
【００３８】
いくつかの態様において、この対象となるタンパク質は、抗体、またはその抗原結合フラグメント、またはその融合タンパク質コンストラクトを含む。いくつかの態様において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）任意選択で抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する、（ｂ）任意選択で抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する、または（ｃ）任意選択で抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＣＤ３８に特異的に結合する。
【００３９】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、ＣＥＸ支持体に結合される対象となるタンパク質を精製するためのカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー中の洗浄液の使用であり、この洗浄液は、１つ以上の界面活性剤を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、界面活性剤を含む、カチオン交換（ＣＥＸ）支持体に結合される対象となるタンパク質を精製するためのＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液である。
【００４１】
本明細書に提供される使用、方法または洗浄のいくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．１ｗ／ｖ％から約０．６ｗ／ｖ％の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．２ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．２ｗ／ｖ％の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．３ｗ／ｖ％の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．５ｗ／ｖ％の界面活性剤を含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約０．６ｗ／ｖ％の界面活性剤を含む。
【００４２】
本明細書に提供される使用、方法または洗浄のいくつかの態様において、界面活性剤は、非イオン界面活性剤である。いくつかの態様において、界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００である。いくつかの態様において、この洗浄は、約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。いくつかの態様において、この洗浄は、約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。いくつかの態様において、界面活性剤は、ＰＳ８０である。いくつかの態様において、この洗浄は、約０．３％のＰＳ８０を含む。いくつかの態様において、この洗浄は、約０．６％のＰＳ８０を含む。
【００４３】
本明細書に提供される使用、方法または洗浄のいくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、アルギニンをさらに含み、任意選択でプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約２５ｍＭのアルギニンを含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、ヒスチジンをさらに含み、任意選択でプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５ｍＭのヒスチジンを含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、任意選択で塩化ナトリウムをさらに含み、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５ｍＭから約１５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約１０ｍＭの塩化ナトリウム、または約１１ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、リン酸ナトリウムをさらに含み、任意選択でプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、酢酸ナトリウムさらに含み、任意選択でプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約２０ｍＭから約５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、または約５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。
【００４４】
本明細書に提供される使用、方法または洗浄のいくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、（ａ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、（ｂ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、（ｃ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．３％のＰＳ８０、または（ｄ）約１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約０．６％のＰＳ８０を含む。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、（ａ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．３％のＰＳ８０、（ｂ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．６％のＰＳ８０、（ｃ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、（ｄ）約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭのヒスチジン、約１１ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、（ｅ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．３％のＰＳ８０、（ｆ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．６％のＰＳ８０、（ｇ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、または（ｈ）約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの塩化ナトリウム及び約０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【００４５】
本明細書に提供される使用、方法または洗浄のいくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５．０から７．０のｐＨを有する。いくつかの態様において、プロテインＡクロマトグラフィー洗浄液またはＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液は、約５．５または約６．３のｐＨを有する。
【００４６】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるいずれかの方法によって生成される対象となるタンパク質の調製物である。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるいずれかの方法によって生成される、対象となるタンパク質のウイルス不活化調製物である。いくつかの態様において、この対象となるタンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）任意選択でこの抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する、（ｂ）任意選択で抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する、または（ｃ）任意選択で抗体もしくはその抗原結合フラグメントは配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含み、ＣＤ３８に特異的に結合する。
【００４７】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるいずれかの方法によって生成される対象となるタンパク質の調製物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物である。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるいずれかの方法によって生成される、対象となるタンパク質のウイルス不活化調製物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物である。
【００４８】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、水性担体及び組換え発現またはハイブリドーマ発現抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物であり、この組成物は、ウイルス粒子が実質的になく、抗体またはその抗原結合フラグメントは（ａ）ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合し、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、（ｂ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、または（ｃ）ＣＤ３８に特異的に結合し、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの態様において、この組成物は、ウイルス粒子がない。いくつかの態様において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、または（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
【００４９】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、ａ）プロテインＡクロマトグラフィー支持体上に、抗体及び１つ以上の混入物、凝集物及び／またはウイルスを含む混合物を充填すること、ｂ）１つ以上の界面活性剤を含むプロテインＡクロマトグラフィー洗浄液によってこの支持体を洗浄して、プロテインＡクロマトグラフィー支持体から１つ以上の混入タンパク質、凝集物、及び／またはウイルスを除去すること、ｃ）抗体をプロテインＡクロマトグラフィー支持体から溶出させること、ｄ）ステップｃ）からの溶出液をカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー支持体上に充填すること、ｅ）１つ以上の界面活性剤を含むＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液によってＣＥＸクロマトグラフィー支持体を洗浄し、１つ以上の混入タンパク質、凝集物及び／またはウイルスをこの支持体から除去すること、ならびにｆ）抗体をＣＥＸクロマトグラフィー支持体から溶出させることにより、抗体の精製された溶出液を形成することを含む、方法によって調製される水性担体及び組換え発現またはハイブリドーマ発現抗体を含む組成物である。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合し、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、（ｂ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む、または（ｃ）ＣＤ３８に特異的に結合し、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨの１つ以上のＣＤＲ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬの１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの態様において、この組成物は、ウイルス粒子が実質的にない。いくつかの態様において、この組成物は、ＣＥＸクロマトグラフィーの前に、アニオン交換クロマトグラフィーを受けていない。いくつかの態様において、この組成物は、ＣＥＸクロマトグラフィーの前に、いかなるイオン交換クロマトグラフィーも受けていない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本明細書に提供される方法を使用する例示的なタンパク質精製プロセスの概略図である。作業例において実証されるように、「界面活性剤洗浄」は、ウイルス粒子を実質的に除去することが可能であり、また、界面活性剤を含まない洗浄を使用するものと比較して、収量を増すことが可能である。「洗浄３」、中間洗浄ステップは、界面活性剤を除去することにより、界面活性剤を除去する洗浄ステップを含まず、界面活性剤を含む初期溶出画分を破棄することを代替に必要とするプロセスと比較して、収量を増すことが可能である。この概略に示されるこれらの方法は、プロテインＡ精製ステップなしで、またはプロテインＡ精製ステップ（たとえば、ダウンストリームの）と組み合わせて、使用されることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
ＣＥＸ洗浄液中の界面活性剤の包含がＣＥＸクロマトグラフィー精製中にタンパク質調製物からのウイルス排除を実質的に増強することを本開示に従い観察した。これは、タンパク質精製方法におけるＡＥＸクロマトグラフィーステップの省略を可能にするため有利である。驚いたことに、界面活性剤が対象となるタンパク質上に有害な影響を有さなかったことがわかった。さらに、ＣＥＸ洗浄液がタンパク質調製物から宿主細胞由来タンパク質の除去を増加させたことがわかった。また、界面活性剤含有洗浄後であるが、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体からタンパク質の溶出前に、中間洗浄の使用がＣＥＸクロマトグラフィー支持体からいかなる残留界面活性剤をも除去することに加えて、溶出液中の対象となるタンパク質の収量を驚くほど向上させ、ＨＣＰ排除を改善したことがわかった。
【００５２】
ＨＣＰ除去及びウイルス排除のレベルは、相当なものだったので、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによる後続の精製ステップをタンパク質精製スキームから除外することができたことが観察された。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質精製方法は、ＡＥＸステップを含まない。このようなタンパク質精製方法は、本明細書に記述されるようなＣＥＸクロマトグラフィーステップを後に伴う、アフィニティークロマトグラフィーステップを含むことができる。
【００５３】
本開示は、アフィニティー及びＣＥＸクロマトグラフィー洗浄組成物、これらのような組成物を利用するタンパク質精製スキーム、ならびに高純度を有する、たとえば、これらのような組成物または精製スキームの使用によって精製されているような、タンパク質調製物を特徴とする。組成物及び精製スキームは、ハイブリドーマ発現または組換え発現モノクローナル抗体に特によく適しているが、ＣＥＸクロマトグラフィーによって精製されるいずれかの組換え発現タンパク質の調製物に使用されることもできる。
【００５４】
したがって、本明細書に提供されるのは、アフィニティー及びカチオン交換クロマトグラフィー洗浄組成物、これらのような組成物を利用するポリペプチド精製スキーム、ならびに高純度を有する、たとえば、これらのような組成物または精製スキームの使用によって精製されているような、ポリペプチド調製物である。
【００５５】
Ｉ．定義
本明細書と請求項にわたって、本発明の態様に関連する様々な用語が用いられている。別段に示されていない限り、このような用語には、当該技術分野における通常の意味を付与するものとする。具体的に定義されているその他の用語は、本明細書に示されている定義と一致する形で解釈されるものとする。
【００５６】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別段に明示的に定められない限り、複数の指示対象を含む。
【００５７】
用語「水を含む溶液」は、用語「水溶液」と互換的に使用される。
【００５８】
用語「宿主細胞由来タンパク質」、「ＨＣＰ」、「宿主細胞由来タンパク質混入物」及び「宿主細胞由来タンパク質不純物」は、本明細書において互換的に使用される。
【００５９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「対象となるポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。この定義に同様に含まれるのは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含むポリペプチド、及び当技術分野で既知の他の修飾である。本開示のポリペプチドは抗体に基づいているため、ある特定の実施形態では、該ポリペプチドは、一本鎖または結合鎖として存在し得ることが理解される。好ましくは、この対象となるタンパク質は、抗体、またはその抗原結合フラグメント、または抗体コンストラクトである。
【００６０】
用語「抗ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）」は、ＴＬ１ａに結合することができるいずれかのタンパク質を指す。抗ＴＬ１ａタンパク質は、たとえば、抗ＴＬ１ａ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。この抗体は、米国公開第２０１４／０２５５３０２号に記述される、いずれかの抗体であることができ、参照により本明細書に援用される。この抗体は、米国仮出願第６２／２２０，４４２号に記述されるいずれかの抗体であることができる。
【００６１】
用語「抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）」は、ＣＧＲＰに結合することができる、いずれかのタンパク質を指す。抗ＧＣＲＰタンパク質は、たとえば、抗ＣＧＲＰ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。この抗体は、米国公開第２００９／０２２０４８９号またはＰＣＴ公報第ＷＯ２００７／０５４８０９号に記述される、いずれかの抗体であることができる。
【００６２】
用語「抗ＣＤ３８」は、ＣＤ３８に結合することができる、いずれかのタンパク質を指す。抗ＣＤ３８タンパク質は、たとえば、抗ＣＤ３８抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。この抗体は、米国公開第２０１６／００６８６１２号または米国公開第２０１５／０３１３９６５号に記述される、いずれかの抗体であることができ、これらのそれぞれは、本明細書に参照により援用され、これらの出版物に記述されるような減弱したインターフェロン分子にさらに融合される抗体を含む。
【００６３】
本明細書に使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、技術用語であり、本明細書において互換的に使用されることが可能であり、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。
【００６４】
「抗体」という用語は、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはこれらの組み合わせを、当該免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して認識しこれに結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される、「抗体」という用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及び当該抗体が所望の生物活性を示すということであれば任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、５つの主な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元構造を有する。抗体はそのままでもよいし、毒素や放射性同位体等の他の分子と結合されてもよい。本明細書で使用される、「抗体」という用語は、二重特異性及び多重特異性抗体を包含する。
【００６５】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指す。「抗原結合断片」とは、抗原に結合する無傷の抗体の一部を指す。抗原結合性断片は、無傷の抗体の抗原決定可変領域を含み得る。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、及び一本鎖抗体が挙げられるがこれらに限定されない。「抗原結合断片」は、二重特異性または多重特異性抗原結合断片であり得る。
【００６６】
用語「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片とは、単一の抗原決定基、すなわち、エピトープの抗原特異性の高い認識及び結合に関与する均質な抗体または抗原結合断片集団を指す。これは、通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片という用語は、無傷かつ完全長のモノクローナル抗体同様、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、及びトランスジェニック動物が挙げられるがこれらに限定されないあらゆる方法で作製される抗体及びその抗原結合断片を指す。
【００６７】
「ヒト化」抗体またはその抗原結合断片という用語は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含む特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体または抗原結合断片を指す。通常、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリンであって、その相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び機能を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられている（「ＣＤＲグラフト」）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）は、所望の特異性、親和性、及び機能を有する非ヒト種由来の抗体または断片における対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体またはその抗原結合断片を、Ｆｖフレームワーク領域及び／または置き換えられた非ヒト残基内でのさらなる残基の置換によってさらに修飾し、抗体またはその抗原結合断片の特異性、親和性、及び／または機能を改善及び最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてを含む、少なくとも１つ、通常は２つまたは３つの可変ドメインの実質的にすべてを含むが、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス領域のものである。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、通常はヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことができる。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９−９７３（１９９４）、及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５−９０４（１９９６）に記載されている。いくつかの実施形態において、「ヒト化抗体」は、表面再形成抗体である。
【００６８】
抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独でまたは組み合わせて指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によってつながれた４つのフレームワーク領域からなる。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲにより極めて近接して一緒に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するために少なくとも２つの技術、すなわち、（１）異種間配列変化に基づく方法（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））、及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））がある。さらに、当技術分野ではこれら２つの方法の組み合わせを用いてＣＤＲを決定することもある。
【００６９】
「ヒト抗体」という用語は、ヒトが産生する抗体、または当技術分野で既知の任意の技術を用いて製造されるヒトが産生する抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。このヒト抗体の定義には、無傷もしくは完全長抗体、その断片、及び／または、少なくとも１つのヒト重鎖及び／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体等が含まれる。
【００７０】
用語「ハイブリドーマ発現」は、免疫学的起源の不死化細胞株及び抗体産生細胞の融合によって生成されるハイブリッド細胞株に発現する対象となるタンパク質を指す。用語「ハイブリドーマ」は、トリオーマ細胞株として一般に知られている、血漿細胞とその後に融合される、ヒト細胞及びマウス骨髄腫細胞株との融合の結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の子孫を包含する。さらに、用語「ハイブリドーマ」は、抗体、たとえば、クアドローマなどを産生するいずれかの不死化ハイブリッド細胞株を含むことを意味する（たとえば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３を参照する）。ハイブリッド細胞株は、ヒト及びマウスを含む、いずれかの種のものであることが可能である。
【００７１】
用語「組換え発現」は、遺伝子的に改変されているか、または組み換えプラスミドもしくはベクター等の外因性ポリヌクレオチドの導入よって遺伝子的に改変されることができる「組換え宿主細胞」中に発現する対象となるタンパク質を指す。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すように意図されることを理解されたい。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語「組換え宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【００７２】
用語「アミノ酸」は、天然起源の、及び／または非天然のアミノ酸残基を指す。用語「天然起源のアミノ酸」は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌを指す。用語「塩基性アミノ酸」は、アルギニン、リジン、グリシン及びヒスチジンを指す。アミノ酸には、天然及び非天然アミノ酸のＤ型も含まれる。「Ｄ−」は、天然型（「Ｌ−」）アミノ酸における配置に対立するものとして、「Ｄ」（右旋性の）配置を有するアミノ酸を示す。天然及び非天然アミノ酸は、商業的に入手（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）してもよいし、当技術分野で既知の方法を用いて合成してもよい。
【００７３】
用語「ウイルス排除」は、用語「ウイルス除去」、及び「ウイルスの除去」と互換的に使用される。用語「ウイルス不活化」は、混合物に含まれるウイルスを非機能性にすることを指す。ウイルスは、抗体産生、ダウンストリーム処理ステップまたは製造条件の原料に起源をもつことができる。ウイルスを非機能性にする、またはウイルスを除去する方法は、熱活性化、ｐＨ不活化、化学的不活化剤などを含む。用語「ｐＨウイルス不活化」は、ウイルスを非機能性にするのに十分なｐＨ、たとえば、約２．５から５．０の間のｐＨにウイルスをさらすことを含む。
【００７４】
用語「ｌｏｇ１０減少係数（ＬＲＦ）」、「ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）」、及び「対数クリアランス」は、互換性であり、出発物質における、また関連している生成物画分におけるウイルス力価の計算された比率を指す。減少係数は、ウイルスを除去する、またはウイルスを不活化するプロセスステップの可能性または能力を説明する適切なパラメータである。いずれかのプロセスステップのＬＲＶは、生成物、たとえば、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）を混入する可能性があるウイルスに似ている、いずれかの既知のモデルウイルスを使用して測定されることが可能である。また、レトロウイルス様粒子（ＲＶＬＰ）によってＬＲＶを測定することが可能である。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、または感染アッセイ（たとえば、ＴＣＩＤ５０を測定する）を使用して、ＬＲＶを計算することが可能である。
【００７５】
本発明は、本発明の方法のいずれかを使用するウイルス排除研究によって測定されるような、ウイルス粒子が「実質的にない」対象となるタンパク質を含む、精製された溶出液、及び組成物を提供する。本明細書に使用される場合、用語「ウイルス粒子が実質的にない」は、対象となるタンパク質がウイルス粒子から分離されている、対象となるタンパク質を含む精製された溶出液及び組成物を指す。用語「実質的にない」は、約０．０００５％から約０．００１％を下回るウイルス粒子を含有する対象となるタンパク質を含む、溶液または組成物を指す。好ましくは、この組成物が約０．０００５％を下回るウイルス粒子を含むときに、この組成物は、「実質的にない」。
【００７６】
本発明は、本発明の方法のいずれかを使用するウイルス排除研究によって測定されるような、ウイルス粒子が「ない」対象となるタンパク質を含む、精製された溶出液、及び組成物を提供する。本明細書に使用される場合、用語「ウイルス粒子のない」は、約０．０００１％未満を有する組成物を指す。このウイルス粒子が最高感度の条件下でのウイルス排除研究によって検出されることが不可能であるときに、この組成物は、ウイルス粒子がない。
【００７７】
用語「カラム」、「支持体」、「リガンド」、及び「レジン」は、本明細書において互換的に使用される。
【００７８】
用語「組成物」及び「精製された組成物」は、互換的であり、担体及び対象となるポリペプチドを含む組成物を指す。この担体は、好ましくは水溶性であり、薬学的に許容可能な担体であることができる。この担体は、緩衝液を含むことができ、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。この組成物は、薬学的組成物と称されることができる。
【００７９】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」または「アフィニティー精製」は、固体支持体に固定化される、または結合されるリガンドと、その結合パートナーとの間の特異的結合相互作用に基づく分離方法を指す。複合混合物がカラムを通過するときに、リガンドへの特異的結合親和性を有するこれらの分子は、結合するようになる。他の試料組成物を洗い流した後に、結合された分子は、支持体から取り除かれ、元の混合物からその精製をもたらす。各特異的親和性システムは、当業者に知られている、それ自体の条件セットを必要とする。
【００８０】
用語「親和性リガンド」は、金属類（たとえば、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２、Ｃｕ＋２、Ｇａ＋３、Ｆｅ＋３、Ｎｉ＋２、及びＺｎ＋２）、色素類（たとえば、シバクロンブルー及びそのバリアント）、グルタチオン、スブチリシン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、ボロネート、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、抗ｃ−Ｍｙｃ、抗ＨＡ、ヌクレオチド類、コエンザイム類、抗体類、ヘパリン、抗原類（特に、既知の特異性を有する抗体類について）、及び他の既知の親和性リガンド類を指す。
【００８１】
ＩＩ．精製のための対象となるタンパク質及びそれらの調製物を含む組成物
本明細書において実証されるように、タンパク質を精製する方法は、界面活性剤含有洗浄（たとえば、ＣＥＸクロマトグラフィーカラム洗浄）の使用を通して改善されることが可能である。これらの方法を使用して、たとえば、収穫細胞培養液（ＨＣＣＦ）から直接に、組換え発現タンパク質を捕獲し、精製することが可能である。また、これらの方法を使用して、組換え発現タンパク質、たとえば、すでに部分的に精製されているタンパク質をＨＣＣＦから（たとえば、プロテインＡ精製を介して）さらに精製する（ポリッシュする）ことが可能である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントを好ましくは含む。いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質は、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する抗体である。ＴＬ１ａに特異的に結合する抗体は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列（または９０％、９５％、もしくは９９％のそれへの同一性を有する配列）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号７のアミノ酸配列（またはそれへの９０％、９５％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する抗体である。ＣＧＲＰに特異的に結合する抗体は、配列番号１のアミノ酸配列（または９０％、９５％、もしくは９９％のそれへの同一性を有する配列）を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列（または９０％、９５％、もしくは９９％のそれへの同一性を有する配列）を有するＶＬを含むことができる。いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体である。ＣＤ３８に特異的に結合する抗体は、配列番号３のアミノ酸配列（または９０％、９５％、もしくは９９％のそれへの同一性を有する配列）を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列（または９０％、９５％、もしくは９９％のそれへの同一性を有する配列）を有するＶＬを含むことができる。ＣＤ３８に特異的に結合する抗体は、インターフェロンアルファ分子を含み、減弱したインターフェロンアルファ分子を含む、インターフェロン分子への融合をさらに含むことができる。
【００８３】
対象となるタンパク質の発現は、タンパク質を符号化する遺伝子によって形質転換されることができる、いずれかの適切な宿主細胞において実行されることができる。宿主細胞は、真核生物または原核生物であることができ、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。哺乳類細胞が好ましい。適切な哺乳類細胞の非限定的な例は、抗体発現ハイブリドーマ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、及びマウスハイブリドーマＮＳ０細胞などの発現宿主を含む。発現したポリペプチドは、細胞から細胞培養培地に分泌されることができる、または細胞内にあることができる。細胞培養は、バイオリアクター（たとえば、発酵）中で行われることができる。典型的なバイオリアクター細胞の培養液は、基本培地によって開始され、培養開始後に、培養の完了まで栄養分が定期的に注入される。この注入は、一般的にフィード培地のものであり、タンパク質発現フェーズ中に細胞培養を維持する。大体、フィード培地注入は、ボーラス注入を介して実行され、濃縮されたフィード培地は、通常１日１回、設定された時点で細胞培養液中に迅速に加えられる。ボーラスフィードへの代替に、バイオリアクター細胞培養液は、延長した、または連続したフィードを使用して注入されることができる。市販のフィード培地は、バイオリアクター栄養分注入に適している。
【００８４】
このバイオリアクターは、少なくとも約２５０リットルの容量を有することができる。いくつかの態様において、このバイオリアクターは、少なくとも約５００リットルの容量を有する。いくつかの態様において、このバイオリアクターは、少なくとも約２０００リットルの容量を有する。いくつかの態様において、このバイオリアクターは、少なくとも約５０００リットル、または１０，０００リットル、または１５，０００リットルの容量を有する。
【００８５】
発現後に、たとえば、宿主細胞及び粒子状デブリを除去するために、ポリペプチドを含む培地（たとえば、細胞培養培地）を清澄化することができる。清澄化は、ろ過、遠心分離、またはそれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、珪藻土及びセルロース繊維を介する深層ろ過を使用することができる。いずれかの市販の膜フィルタを使用する、たとえば、０．２μｍのフィルタを通す、膜ろ過を用いて、いかなる微生物混入物をも除去することができる。
【００８６】
発現、そして清澄化後に用いる場合、アフィニティークロマトグラフィーを介して対象となるポリペプチドを精製し、混入する宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を除去することができる。アフィニティークロマトグラフィーは、対象となるポリペプチドの精製に適している、いずれかの親和性リガンド類を含むことができる。アフィニティークロマトグラフィーリガンド類の非限定的な例は、金属類（たとえば、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２、Ｃｕ＋２、Ｇａ＋３、Ｆｅ＋３、Ｎｉ＋２、及びＺｎ＋２）、色素類（たとえば、シバクロンブルー及びそのバリアント）、グルタチオン、スブチリシン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、ボロネート、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、抗ｃ−Ｍｙｃ、抗ＨＡ、ヌクレオチド類、コエンザイム類、抗体類、ヘパリン、抗原類（特に、既知の特異性を有する抗体類について）、及び他の既知の親和性リガンド類を含む。親和性リガンドは、複数の既知で一般的な支持体がある、固体支持体上に一般的に固定化される。本発明の１つの実施形態において、本明細書に記述される洗浄液を含むＣＥＸクロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーのステップに取って代わることができる。この実施形態において、発現、そして清澄化後に用いる場合、事前のアフィニティークロマトグラフィーなしで、対象となるポリペプチドを含む水溶液をＣＥＸ支持体上に充填することができる。
【００８７】
ＩＩＩ．ＣＥＸ精製
アフィニティークロマトグラフィー後に（用いられるときに）、タンパク質調製物をＣＥＸ支持体上に充填することにより、対象となるタンパク質をこの支持体に結合する。この支持体は、高いタンパク質結合能力を有する。ポリペプチド調製物によって充填する前に、この支持体を好ましくは平衡化する。平衡化は、緩衝液によって好ましくは行われる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ支持体は、セファロースマトリックスレジンである。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ支持体は、合成ポリマーマトリックスレジンである。例示的なＣＥＸ支持体は、ＧＥ  Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、Ｅｓｈｎｕｍｏ  Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ及びＢｉｏｒａｄ  Ｎｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ支持体は、セファロースベースのスルホプロピルの強カチオン交換である。ＣＥＸ支持体は、たとえば、ＳＰＦＦレジンであることが可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ支持体は、スルホプロピルリガンドによって架橋されたポリ（スチレンジビニルベンゼン）ポリマーマトリックスを含む。このＣＥＸ支持体は、たとえば、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂であることが可能である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ支持体は、高分子イオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ（商標）ＸＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ支持体は、第四級アンモニウム（Ｑ）の強アニオン交換基（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）によって架橋される６％のアガロースビーズである。
【００９３】
ポリペプチド調製物のＣＥＸクロマトグラフィー支持体上への充填は、支持体への対象となるポリペプチドの吸着を可能にするのに適した温度で、容量中に、そして時間に実行される。支持体に結合しない望ましくないＨＣＰ及びウイルスは、クロマトグラフィー中に支持体を通り流れる。本明細書において記述され、例証される洗浄液を使用して、ウイルス、凝集物及びＨＣＰを含む混入物の除去に向けて、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体を洗浄する。中間洗浄緩衝液による洗浄後に、対象となるタンパク質をＣＥＸ支持体から溶出させる。溶出緩衝液は、ＣＥＸ支持体及び対象となるポリペプチドの種類に一般的に合わせられ、その結果、異なる可能性がある。溶出は、対象となるタンパク質の最大溶出収量を可能にするのに適した温度で、容量中に、そして時間に実行されることができる。このタンパク質の溶出は、このタンパク質を含むＣＥＸクロマトグラフィー溶出液を生成する。抗体または抗体コンストラクトの溶出は、抗体または抗体コンストラクトを含むＣＥＸ溶出液を生成する。
【００９４】
ＨＣＰ及び凝集物含有量を減少させると同時に、本発明のＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液を使用して、対象となるタンパク質を含む組成物において、ウイルスのレベルを低下させる、またはウイルスを不活化することができる。典型的な従来技術の精製プロセスは、アニオン交換を使用した後に、さらなる酸性化処置を伴い、タンパク質（たとえば、抗体）精製方法中に、ウイルスのレベルを低下させる、またはウイルスを不活化する。驚いたことに、本発明者らは、本発明のＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液の使用がアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、またはウイルス不活化ステップを省略するのに十分なウイルスのレベルに低下させることを見出した。
【００９５】
ＩＶ．界面活性剤洗浄及び他の方法を使用するウイルス排除
タンパク質をＣＥＸクロマトグラフィー支持体上に充填する前に、タンパク質溶液（たとえば、ポリペプチドを含む、または抗体もしくは抗体コンストラクトを含む）は、溶出液中に存在するいかなる残留するウイルスも不活化する処理によってさらに処理されることができる。ウイルス不活化は、溶出液中に存在するいかなるウイルスをも不活化するのに十分な温度で、一定期間、溶出液を酸性化することを含むことができる。この酸性化は、たとえば、所望のｐＨを達成するまで、酢酸、クエン酸、塩酸、ギ酸、リン酸、カプリル酸、他の適切な酸類、またはそれらの組み合わせを溶出液に加えることを含むことができる。低ｐＨウイルス不活化後に、溶出液をｐＨ３．０から７．５に中和することができる（プロセスの必要性に応じて）。いくつかの実施形態において、溶出液は、約３．０から約３．５のｐＨ、約３．０から約４．０のｐＨ、約３．５から約４．５のｐＨ、約４．０から約５．５のｐＨ、約４．５から５．５のｐＨ、約６．０から約７．０のｐＨ、または約６．０から約７．５のｐＨに中和される。いくつかの実施形態において、この溶出液は、約３．０のｐＨ、約３．５のｐＨ、約４．０のｐＨ、約４．５のｐＨ、約５．０のｐＨ、約５．５のｐＨ、約６．０のｐＨ、約６．５のｐＨ、約７．０のｐＨまたは約７．５のｐＨに中和される。中和ステップ中に、混濁は、不純物（または生成物）の沈殿が原因で生成物プール中にみられる可能性がある。深層ろ過を使用して、ｐＨを調整した調製物をろ過し、混濁及び不純物を除去することができる。
【００９６】
対象となるタンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活化する単位操作は、保持タンク中で実行されることが可能であり、この保持タンクは、約２．５から５．０の間の、約３．５から約４．５の間の、約３．５から約４．２５の間の、約３．５から約４．０の間の、約３．５から約３．８の間の、または約３．７５のｐＨで、少なくとも２５分間、約３０分から１．５時間の間、約３０分から１．２５時間の間、約０．７５時間から１．２５時間の間、または約１時間、組換え治療用タンパク質を含む流体をインキュベートすることができる。
【００９７】
代替の実施形態において、ウイルス不活化ステップは、当該技術において知られている他の方法を使用して実行されることができる。たとえば、ウイルス不活化ステップは、さまざまな実施形態において、酸、洗剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線光、ガンマ放射線、加熱、またはこの目的のために有用である当該技術において知られているいずれかの他のプロセスによる処理を含むことができる。
【００９８】
ウイルスをろ過によって除去することが可能である。たとえば、深層フィルタを通して組換えタンパク質を流すステップの前に、及び／または後に、ウイルスろ過を実行することが可能である。米国特許第６，３６５，３９５号に記載されているような、ノーマルフローフィルタ（ＮＦＦ）、またはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）フィルタのいずれか一方によって、組換えタンパク質を含む溶液からウイルスを除去することが可能である。ＴＦＦモードまたはＮＦＦモードのいずれか一方において、膜を通して組換えタンパク質の通過を可能にしながら、２０から１００ナノメートル（ｎｍ）の直径を一般的に有する、ウイルスをこの膜の表面上に保持する条件下でろ過を行う。
【００９９】
ウイルス排除研究の目的は、ウイルスを不活化する／除去する際に有効であるとみなされることが可能であるプロセスステップ（複数可）を評価すること、及びプロセスステップ（複数可）によって得られるウイルス減少の全体的なレベルを定量的に推定することである。さまざまなプロセスステップ後に得られる、対象となるタンパク質を含む混合物へのウイルスの有意な量の追加（「添加」）によってウイルス減少のレベルを得た後に、後続のステップ中にウイルスの除去または不活化を実証することができる。ウイルス粒子の除去、またはウイルス感染の不活化によって、ウイルス感染の減少を達成することができる。ウイルス排除研究を実行し、混合物中に存在することが知られているウイルスの排除を実証する。減少係数は、対数目盛（ｌｏｇ１０）上で通常表される。排除評価研究についてのモデルウイルスは、対象となるタンパク質を含む混合物に混入する可能性があるウイルスに似ているように選択される。対象となる細胞株由来タンパク質のウイルス排除妥当性確認のために、異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕｌＶ）及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）などの、モデルウイルスを使用することが多い。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、対象となるタンパク質を含む混合物からの、ウイルス排除を増加させる、またはウイルスを不活化する。いくつかの実施形態において、洗浄液は、プロテインＡクロマトグラフィーステップ中にウイルス排除を増加させる。いくつかの実施形態において、洗浄液は、ＣＥＸクロマトグラフィーステップ中にウイルス排除を増加させる。ウイルス排除は、ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）において測定されることが可能である。いくつかの実施形態において、この洗浄液は、ＬＲＶが約１．０から約１０．０ｌｏｇ１０の間にあるウイルス排除を増加させる。いくつかの実施形態において、洗浄液は、ＬＲＶが約１．０から約５．０ｌｏｇ１０の間にある、ＬＲＶが約１．０から約３．０ｌｏｇ１０の間にある、ＬＲＶが約２．０から約４．０ｌｏｇ１０の間にある、ＬＲＶが約３．０から約５．０ｌｏｇ１０の間にある、またはＬＲＶが約５．０ｌｏｇ１０から６．０ｌｏｇ１０の間にある、ウイルス排除を増加させる。いくつかの実施形態において、ＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約２．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約６．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約７．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約８．０ｌｏｇ１０である、ＬＲＶは、約９．０ｌｏｇ１０である、またはＬＲＶは、約１０．０ｌｏｇ１０である。ＬＲＶは、１カラム容量（ＣＶ）の洗浄、２ＣＶの洗浄、３ＣＶの洗浄、４ＣＶの洗浄、または５ＣＶの洗浄を適用することによって達成されることが可能である。
【０１０１】
Ｖ．界面活性剤含有洗浄を使用して精製されるタンパク質のさらなる処理、及びそれから生成される組成物
ウイルス不活化後に、またはウイルス不活化を含まない場合にＣＥＸクロマトグラフィーからの溶出後に、対象となるタンパク質は、たとえば、非ヒト動物への、またはヒトへの、処置投与に適している形態にさらに処理されることができる。このようなさらなる処理は、対象となるタンパク質の精製された調製物の、限外ろ過、ナノろ過、濃度、及び透析ろ過のいずれかの組み合わせを有することができる。
【０１０２】
限外ろ過は、対象となるタンパク質の調製物を濃縮するためのプロセスである。膜孔径または分子量カットオフに基づき溶液中の他の分子からタンパク質をろ過する。透析ろ過を使用して、対象となるタンパク質を所望の緩衝液に交換する（たとえば、溶出緩衝液から安定した処方緩衝液中へ）。限外ろ過及び透析ろ過は、タンジェンシャルフローろ過を一般的に用いる。
【０１０３】
本発明のＣＥＸクロマトグラフィー洗浄緩衝液の使用を有する、精製スキーム後に、対象となるタンパク質は、組成物中に好ましくは存在する。この組成物は、担体、及び対象となるタンパク質を好ましくは含む。この担体は、好ましくは水溶性であり、薬学的に許容可能な担体であることができる。この担体は、緩衝液を含むことができ、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。この組成物は、薬学的組成物と称される場合がある。用語「組成物」及び「精製された組成物」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１０４】
タンパク質がいくつかの実施形態において、本明細書に記述される、または例証される方法に従い精製される、対象となる精製されたタンパク質を含む組成物を提供する。これらのような組成物は、対象となるタンパク質、及び最小量のレトロウイルス様粒子（ＲＶＬＰ）を含み、後者が対象となるタンパク質と同時発現するが、本明細書に記述される洗浄液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーを介して対象となるタンパク質からほぼ分離される。
【０１０５】
いくつかの態様において、組成物中の対象となるポリペプチドは、抗体、または抗体コンストラクトである。抗体または抗体コンストラクトは、形質転換した宿主細胞（たとえば、抗体または抗体コンストラクトを符号化する遺伝子を含む宿主細胞）によって、組換えで発現することができる、またはハイブリドーマ細胞を介して発現することができる。抗体または抗体コンストラクトは、ヒトＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）上でエピトープに特異的に結合することができる。抗体または抗体コンストラクトは、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）上でエピトープに特異的に結合することができる。抗体または抗体コンストラクトは、ヒトＣＤ３８上でエピトープに特異的に結合することができる。
【０１０６】
いくつかの態様において、組成物は、ＣＧＲＰに特異的に結合する精製された抗体または抗体コンストラクトを含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２のアミノ酸配列を有することができる。この組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及びＶＬを含む抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトがＣＧＲＰに特異的に結合する。この組成物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬ、及びＶＨを含む抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトがＣＧＲＰに特異的に結合する。この組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトがＣＧＲＰに特異的に結合する。この抗体は、米国公開第２００９／０２２０４８９号またはＰＣＴ公報第ＷＯ２００７／０５４８０９号に記述される、いずれかの抗体であることができる。
【０１０７】
いくつかの態様において、この組成物は、ＴＬ１ａに特異的に結合する精製された抗体または抗体コンストラクトを含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。この抗体は、参照により本明細書に援用される、米国公開第２０１４／０２５５３０２号に記述される、いずれかの抗体であることができる。この抗体は、米国仮出願第６２／２２０，４４２号に記述される、いずれかの抗体であることができる。
【０１０８】
いくつかの態様において、この組成物は、ＣＤ３８に特異的に結合する精製された抗体または抗体コンストラクトを含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。抗ＣＤ３８抗体は、第二ポリペプチド分子にさらに融合される、たとえば、ポリペプチド毒素に融合される、またはインターフェロンアルファなどのインターフェロンポリペプチドに融合されることができる。重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号３のアミノ酸配列を有することができる。軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４のアミノ酸配列を有することができる。この組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及びＶＬを含む抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトはＣＤ３８に特異的に結合する。この組成物は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ、及びＶＨを含有する抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトはＣＤ３８に特異的に結合する。この組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトはＣＤ３８に特異的に結合する。この抗体は、米国公開第２０１６／００６８６１２号または米国公開第２０１５／０３１３９６５号に記述される、いずれかの抗体であることができ、これらのそれぞれは、本明細書に参照により援用され、これらの出版物に記述されるような減弱したインターフェロン分子にさらに融合される抗体を含む。 
【０１０９】
いくつかの態様において、この組成物は、ＴＬ１ａに特異的に結合する精製された抗体または抗体コンストラクトを含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列を有することができる。ＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を有することができる。ＶＬは、配列番号７のアミノ酸配列を有することができる。したがって、ＶＨは、配列番号５を含むことができ、ＶＬは、配列番号７を含むことができる、またはＶＨは、配列番号６を含むことができ、ＶＬは、配列番号７を含むことができる。この組成物は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及びＶＬを含む抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトはＴＬ１ａに特異的に結合する。この組成物は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ、及びＶＨを含有する抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトはＴＬ１ａに特異的に結合する。この組成物は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ含有する抗体または抗体コンストラクトを含むことができ、この抗体または抗体コンストラクトはＴＬ１ａに特異的に結合する。この抗体は、米国出願第１５／２６７，２１３号または米国公開第２０１４／０２５５３０２号に記述される、いずれかの抗体であることができ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【０１１０】
いくつかの好ましい態様において、これらの抗体（たとえば、抗ＴＬ１ａ、抗ＣＧＲＰ、及び抗ＣＤ３８）は、ヒトＩｇＧ定常領域を含む。ヒトＩｇＧ定常領域は、ヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＧ４定常領域であることができる。これらの抗体（たとえば、抗ＴＬ１ａ、抗ＣＧＲＰ、及び抗ＣＤ３８）は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であることができる。
【０１１１】
ＶＩ．洗浄液
本明細書に提供されるような、界面活性剤を含む洗浄液は、タンパク質を精製する方法に使用されることが可能である。界面活性剤含有洗浄液は、ウイルスを除去する際に驚くほど有効である。これらのような洗浄は、たとえば、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて使用されることが可能であり、これは、プロテインＡクロマトグラフィーステップによって進められても、進められなくてもよい。プロテインＡクロマトグラフィーステップは、界面活性剤含有洗浄液も使用することが可能である、または界面活性剤を含まない洗浄によって実行されることが可能である。
【０１１２】
洗浄液中の界面活性剤は、たとえば、非イオン界面活性剤であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤は、たとえば、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＨＳ（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルヒドロキシスルタイン）またはＳＢ−１２Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−３−プロパンスルホン酸などの双性イオン界面活性剤；ＣＴＡＢ（セトリモニウムブロミド）またはＤＯＤＡＢ（ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド）などの第四級アンモニウム塩；ノノキシノール（たとえば、ノナエチレングリコール）などのアルキルフェノールエトキシレート；エトキシレート；デシルグルコシド、アミンまたはホスフィンオキシドなどのアルキルポリグルコシド；及び／またはＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）などのアニオン界面活性剤であることが可能である。
【０１１３】
洗浄液中の界面活性剤は、たとえば、Ｔｒｉｔｏｎ１００、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、スルホベタイン−１２（ＳＢ−１２）、スルホベタイン−１４（ＳＢ−１４）、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、またはそれらの組み合わせであることが可能である。
【０１１４】
洗浄液中の界面活性剤は、たとえば、Ｔｒｉｔｏｎ１００、ＮＰ４０、ＬＤＡＯ、ＳＢ−１２、及び／またはＳＢ−１４であることが可能である。
【０１１５】
ある特定の例において、洗浄液は、界面活性剤の所定の濃度を有する。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．０１ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．０５ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．１ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．２ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．５ｗ／ｖ％から約１ｗ／ｖ％であることが可能である。
【０１１６】
洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．０１ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．０５ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．１ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．２ｗ／ｖ％から約０．５ｗ／ｖ％であることが可能である。
【０１１７】
洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．０１ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．０５ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．１ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．２ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約０．５ｗ／ｖ％であることが可能である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は、たとえば、約１ｗ／ｖ％であることが可能である。
【０１１８】
界面活性剤に加えて、洗浄液は、たとえば、酢酸ナトリウム（たとえば、２５ｍＭの濃度で）及び／または塩化ナトリウム（たとえば、１０ｍＭの濃度で）を含むことが可能である。このような洗浄液は、たとえば、約５．５のｐＨを有することが可能である。
【０１１９】
界面活性剤に加えて、洗浄液は、たとえば、リン酸ナトリウム（たとえば、１０ｍＭの濃度で）を含むことが可能である。このような洗浄液は、たとえば、約６．３のｐＨを有することが可能である。
【０１２０】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１２１】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１２２】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．３％のＰＳ８０を含む。
【０１２３】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．６％のＰＳ８０を含む。
【０１２４】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１２５】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１２６】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．３％のＰＳ８０を含む。
【０１２７】
１つの実施形態において、この洗浄液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．６％のＰＳ８０を含む。
【０１２８】
１つの実施形態において、この洗浄液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、５ｍＭのヒスチジン、１１ｍＭの塩化ナトリウム及び０．３％のＰＳ８０を含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、この洗浄液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、５ｍＭのヒスチジン、１１ｍＭの塩化ナトリウム及び０．６％のＰＳ８０を含む。
【０１３０】
１つの実施形態において、この洗浄液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、５ｍＭのヒスチジン、１１ｍＭの塩化ナトリウム及び０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１３１】
１つの実施形態において、この洗浄液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、５ｍＭのヒスチジン、１１ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１３２】
１つの実施形態において、この洗浄液は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．３％のＰＳ８０を含む。
【０１３３】
１つの実施形態において、この洗浄液は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．６％のＰＳ８０を含む。
【０１３４】
１つの実施形態において、この洗浄液は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１３５】
１つの実施形態において、この洗浄液は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。
【０１３６】
１つの実施形態において、本開示は、１つ以上の界面活性剤を含む、ＣＥＸクロマトグラフィー溶液を特徴とする。いくつかの実施形態において、本開示は、塩基性アミノ酸、塩、非イオン界面活性剤、または緩衝液（たとえば、有機リン酸塩）、及び界面活性剤を含む、ＣＥＸクロマトグラフィー洗浄液を特徴とする。いくつかの実施形態において、緩衝液は、リン酸ナトリウムであり、非イオン界面活性剤は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）である。いくつかの実施形態において、緩衝液は、有機リン酸塩、任意選択でリン酸ナトリウムであり、非イオン界面活性剤は、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）である。いくつかの実施形態において、塩基性アミノ酸は、アルギニンであり、塩は、塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００である。いくつかの実施形態において、非イオン界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００であり、洗浄液は、ヒスチジンをも含む。いくつかの実施形態において、非イオン界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００であり、洗浄液は、ヒスチジン及び酢酸ナトリウムをも含む。いくつかの好ましい実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウムであり、塩は、塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００である。いくつかの好ましい実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウムであり、塩は、塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤は、ＰＳ８０である。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５．０から約７．０の範囲のｐＨを有する。１つの実施形態において、洗浄液は、約５．０のｐＨ、約５．５のｐＨ、約６．０のｐＨ、約６．５のｐＨ、または約７．０のｐＨを有する。１つの実施形態において、洗浄液は、約６．３のｐＨを有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、０ｍＭを上回り約７５ｍＭを下回るアルギニン、０ｍＭを上回り約３０ｍＭを下回る塩化ナトリウム、及び５ｍＭを上回り約３０ｍＭを下回るアニオン界面活性剤を含む。洗浄液は、約５ｍＭから約１０ｍＭのアルギニン、約５ｍＭから約１５ｍＭのアルギニン、約５ｍＭから約２０ｍＭのアルギニン、約５ｍＭから約２５ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭから約３０ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭから約４０ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭから約５０ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭから約６０ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭから約７５ｍＭのアルギニン、約２０ｍＭから約５０ｍＭのアルギニン、または約２０ｍＭから約７５ｍＭのアルギニンを含むことができる。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭのアルギニン、約１５ｍＭのアルギニン、約２０ｍＭのアルギニン、約２５ｍＭのアルギニン、約３０ｍＭのアルギニン、約４０ｍＭのアルギニン、約５０ｍＭのアルギニン、約６０ｍＭのアルギニン、または約７５ｍＭのアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、０ｍＭを上回り約２５ｍＭを下回るヒスチジン、約５ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約５ｍＭから約２０ｍＭのヒスチジン、約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約１０ｍＭから約２０ｍＭのヒスチジンを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５ｍＭのヒスチジンを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約１０ｍＭのヒスチジン、約１５ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭのヒスチジン、または約２５ｍＭのヒスチジンを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、０ｍＭ超から約１００ｍＭの塩化ナトリウム、約１０ｍＭから約２５ｍＭの塩化ナトリウム、約１５ｍＭから約２５ｍＭの塩化ナトリウム、約２５ｍＭから約５０ｍＭの塩化ナトリウム、約５０ｍＭから７５ｍＭの塩化ナトリウム、または約７５ｍＭから約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約１１ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５ｍＭの塩化ナトリウム、約１５ｍＭの塩化ナトリウム、約２０ｍＭの塩化ナトリウム、約２５ｍＭの塩化ナトリウム、約３０ｍＭの塩化ナトリウム、約３５ｍＭの塩化ナトリウム、約４０ｍＭの塩化ナトリウム、約４５ｍＭの塩化ナトリウム、約５０ｍＭの塩化ナトリウム、約５５ｍＭの塩化ナトリウム、約６０ｍＭの塩化ナトリウム、約６５ｍＭの塩化ナトリウム、約７０ｍＭの塩化ナトリウム、約７５ｍＭの塩化ナトリウム、約８０ｍＭの塩化ナトリウム、約８５ｍＭの塩化ナトリウム、約９０ｍＭの塩化ナトリウム、約９５ｍＭの塩化ナトリウム、または約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、約０．００％（ｗ／ｖ）から約１．０％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．１％（ｗ／ｖ）から約０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．０５％（ｗ／ｖ）から約０．１５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．１％（ｗ／ｖ）から約０．１５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．０５％（ｗ／ｖ）から約０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、または約０．１％（ｗ／ｖ）から約０．５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、または約０．５％（ｗ／ｖ）から約１．０％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約０．０１％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．０５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．１５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．２％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．２５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．３％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．３５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．４％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．４５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約５．０％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．５５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．６％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．６５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．７％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．７５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．８％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．８５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．９％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、約０．９５％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤、または約１．０％（ｗ／ｖ）の非イオン界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、非イオン界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む。いくつかの実施形態において、非イオン界面活性剤は、ＰＳ８０を含む。いくつかの実施形態において、非イオン界面活性剤は、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）である。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、０ｍＭ超から約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約５ｍＭから約２０ｍＭの酢酸ナトリウム、約５ｍＭから約３０ｍＭの酢酸ナトリウム、約５ｍＭから約４０ｍＭの酢酸ナトリウム、約５ｍＭから約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭから約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、または約１５ｍＭから約３０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２０ｍＭから約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５ｍＭから約４０ｍＭの酢酸ナトリウム、約３５ｍＭから約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約４０から約６５ｍＭの酢酸ナトリウム、約４５ｍＭから約７０ｍＭの酢酸ナトリウム、約６５ｍＭから約８０ｍＭの酢酸ナトリウム、約７５ｍＭから約１００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約２５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約２０ｍＭの酢酸ナトリウム、約３０ｍＭの酢酸ナトリウム、約３５ｍＭの酢酸ナトリウム、約４０ｍＭの酢酸ナトリウム、約４５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約５５ｍＭの酢酸ナトリウム、約６０ｍＭの酢酸ナトリウム、約６５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７０ｍＭの酢酸ナトリウム、約７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約８０ｍＭの酢酸ナトリウム、約８５ｍＭの酢酸ナトリウム、約９０ｍＭの酢酸ナトリウム、約９５ｍＭの酢酸ナトリウム、または約１００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、約０ｍＭ超から約３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。１つの好ましい実施形態において、洗浄液は、約１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５ｍＭから約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約５ｍＭから約１５ｍＭのリン酸ナトリウム、約５ｍＭから２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１０ｍＭから２５ｍＭのリン酸ナトリウム、または約１０ｍＭから３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、約５ｍＭのリン酸ナトリウム、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１５ｍＭのリン酸ナトリウム、約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２５ｍＭのリン酸ナトリウムまたは約３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄液またはＰｒｏＡ洗浄液は、約０ｍＭ超から約１００ｍＭのリン酸ナトリウム、及び０．０％超から約１．０％の非イオン界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、洗浄液は、０ｍＭ超から約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、０ｍＭ超から約１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０％超から約０ｍＭ及び約５００ｍＭ未満のアルギニン、０ｍＭ超から約１００ｍＭの塩化ナトリウム、０ｍＭ超及び約２５ｍＭ未満のヒスチジン、０ｍＭ超から約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び０．０％超から約１．０％の非イオン界面活性剤を含む。
【０１４３】
本発明の洗浄液のいずれかは、ＣＥＸクロマトグラフィー支持体を使用して対象となるタンパク質を精製するために使用されることができる。
【０１４４】
ある特定の態様において、１から１０カラム容量（ＣＶ）の洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から９ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から８ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から７ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から６ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から５ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から４ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から３ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、１から２ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。
【０１４５】
ある特定の態様において、１ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、２ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、３ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、４ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、５ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。
【０１４６】
本明細書に提供される方法のある特定の態様において、界面活性剤を含む溶液によって洗浄することは、たとえば、対象となるタンパク質を溶出させる前に、界面活性剤を含まない溶液によって洗浄することを後に伴うことが可能である。界面活性剤を含まない溶液によって洗浄することは、界面活性剤を除去することが可能である。界面活性剤を除去する溶液によって洗浄することは、たとえば、溶出の第一画分が界面活性剤を含むためにこの第一画分を破棄することが不要になることによって、収量を増加させることが可能であり、ＣＥＸクロマトグラフィーのＨＣＰ排除性能を改善することも明らかにされている。
【０１４７】
ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から１０カラム容量（ＣＶ）の洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から９ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から８ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から７ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から６ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から５ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から４ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から３ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１から２ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。
【０１４８】
ある特定の態様において、界面活性剤を含まない１ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない２ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない３ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない４ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。ある特定の態様において、界面活性剤を含まない５ＣＶの洗浄液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に適用する。
【０１４９】
本明細書に提供される方法のある特定の態様において、界面活性剤を含む溶液によって洗浄することは、溶出前に界面活性剤を含まない溶液によって洗浄することなく、対象となるタンパク質を溶出させることを後に伴わない。これらのような態様において、界面活性剤を含む可能性がある、溶出の第一画分を破棄することが可能である。
【０１５０】
本開示の実施形態は、対象となるタンパク質の精製のための、本開示の洗浄液の調製、及び本開示の洗浄液を使用するための方法を詳細に記述する、下記の非限定的な例への参照により、さらに定義されることが可能である。材料及び方法の両方への、多くの修正形態が本開示の範囲から逸脱することなく実施されることが可能であることが当業者に明らかである。
【実施例】
【０１５１】
本明細書に記載される実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０１５２】
実施例１−ウイルス排除のためのプロテインＡ洗浄液
材料及び方法
材料及び機器。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して、これらの実施例に使用されたモノクローナル抗体を発現した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（登録商標）プロテインＡレジンをＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水質浄化システムから得られた超純水を使用して、すべての緩衝液を調製した。緩衝液及び溶液調製のために使用される化学物質をＪＴ  Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から得た。Ａｋｔａ  Ａｖａｎｔ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上で、すべてのクロマトグラフィー実験を実行した。この機器は、一体型ＵＶ及び電気伝導度監視システムを含む。システム制御及び試料採取のために、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用した。
【０１５３】
プロテインＡクロマトグラフィー。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（登録商標）クロマトグラフィーカラムを５ＣＶ（カラム容量）に対して１ＸＰＢＳによって平衡化した。平衡化後に、１リットルのレジンあたり４０グラムのｍＡｂの充填容量で、収穫細胞培養液（ＨＣＣＦ）をこのカラム上に充填した。充填適用後に、３ＣＶの１ＸＰＢＳの緩衝液によってカラムに第一の洗浄を行い、５ＣＶの候補洗浄緩衝液による第二の洗浄を後に伴った。５ｍＭのコハク酸、ｐＨ５．８の緩衝液の５ＣＶを使用する第三の洗浄によって、カラムをその後に洗浄した。２５ｍＭのグリシン、１０ｍＭのコハク酸、ｐＨ３．７の緩衝液の５ＣＶを使用するカラムから、ｍＡｂを溶出させた。生成後に、適所での洗浄を適用した。
【０１５４】
定量的ＥＬＩＳＡ−宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）。宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）は、製造元のプロトコルに従い、ＣＨＯ宿主細胞由来タンパク質第三世代キット（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、カタログ＃Ｆ５５０，Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）によって決定された。４５０／６５０ｎｍでの吸光度データは、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）上で取得され、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏ６．４．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって分析された。ＨＣＰ値は、ＣＨＯ宿主細胞由来タンパク質第三世代キットに含まれる標準物質から作成された標準曲線の４つのパラメータのロジスティック適合度から計算された。
【０１５５】
ウイルス排除結果
７つの選択された洗浄液をプロテインＡクロマトグラフィー洗浄中のＲＶＬＰ排除について研究し、結果を表１に要約している。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００は、インビトロＲＶＬＰ排除において非常に有効であった。
【表１】
2020525445.tif 000002
【０１５６】
さらに、選択された洗浄液からのウイルス排除は、スパイクイン研究により、２つのモデルウイルス：異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕｌＶ）及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）を使用することによって評価された。これらの組成物及び結果を表２に示す。これらの結果は、５ｍＭのコハク酸のｐＨ５．８での対照洗浄液と比較して、Ｘ−ＭｕｌＶ排除における１．７−ｌｏｇ（アルギニン）または０．８−ｌｏｇ（アルギニン＋グアニジン）の改善、及びアルギニン−またはアルギニン＋グアニジンのいずれか一方を含有する洗浄液によるＭＶＭ排除における１．３−ｌｏｇの改善があったことを示す。 
【表２】
2020525445.tif 000003
【０１５７】
実施例２−カチオン交換クロマトグラフィー用の洗浄液
材料及び方法
高分子イオン交換クロマトグラフィーレジン（Ｐｏｒｏｓ（商標）ＸＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、及び第四級アンモニウム（Ｑ）の強アニオン交換基（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）によって架橋された６％のアガロースビーズから構成されたレジンをＣＥＸクロマトグラフィーに利用した。本研究に使用されたすべての緩衝液は、水質浄化システム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）から得られた超純水を使用して調製された。緩衝液及び溶液調製のために使用された化学物質をＪＴ  Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から得た。Ａｋｔａ  Ａｖａｎｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上で、すべてのクロマトグラフィー実験を実行した。
【０１５８】
カチオン交換クロマトグラフィーカラムを５ＣＶ（カラム容量）についてｐＨ５．５、低い電気伝導度（＜５ｍＳ／ｃｍ）の平衡化緩衝液によって平衡化した。平衡化後に、ｐＨを調整したプロテインＡに精製された生成物プール（ｐＨ５．５）を、１リットルのレジンあたり５０〜８０グラムのｍＡｂの充填容量でカラム上に充填した。充填適用後に、カラムは、３ＣＶのＥＱ緩衝液によって最初に洗浄され、５ＣＶの候補洗浄緩衝液による洗浄２を後に伴った。その後、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ６．０の緩衝液の５ＣＶを使用した洗浄３によってカラムを洗浄した。２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０の緩衝液の５ＣＶを使用して、カラムからｍＡｂを溶出させた。生成後に、適所での洗浄を適用した。
【０１５９】
定量的ＥＬＩＳＡ−宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）
宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）は、製造元のプロトコルに従い、ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎキット（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｆ５５０，Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）によって決定された。４５０／６５０ｎｍでの吸光度データは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー上で取得され、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ６．４．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって分析された。ＨＣＰ値は、ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎキットに含まれる標準物質から作成された標準曲線の４つのパラメータのロジスティック適合度から計算された。
【０１６０】
ＨＰＬＣ−ＳＥＣ
生成物試料の純度は、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラム（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、１０μｍ平均粒径、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）上でＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（２６９５分離モジュール及び２９９６フォトダイオードアレイ検出器）を使用するＨＰＬＣ−ＳＥＣ方法によって分析された。ｐＨ６．８のＰＢＳ緩衝液を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で移動相として使用した。注入量は、１００〜１２５μｇのタンパク質であった。
【０１６１】
結果及び考察
本研究に使用された対象となるタンパク質は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗ＴＬ１ａ抗体であった。合計４つの洗剤を含む洗浄液を本研究において調査した。本研究は、抗ＣＧＲＰ抗体（配列番号１のＶＨ、配列番号２のＶＬ）、及び抗ＣＤ３８抗体（配列番号３のＶＨ、配列番号４のＶＬ）によって基本的に繰り返された。洗浄２の緩衝液の配合表、及び結果を表３から８に示す。
【表３】
2020525445.tif 000004
【表４】
2020525445.tif 000005
【表５】
2020525445.tif 000006
【表６】
2020525445.tif 000007
【表７】
2020525445.tif 000008
【表８】
2020525445.tif 000009
【０１６２】
界面活性剤を含まなかった対照条件と比較して、４つの界面活性剤含有洗浄のすべては、抗ＴＬ１ａ、抗ＣＧＲＰ及び抗ＣＤ３８抗体分子について同様の不純物排除を達成した。溶出プール中に残留界面活性剤を観察しなかった。界面活性剤洗浄を使用して、精製されたｍＡｂの品質を維持しながら、ウイルス排除を改善することが可能である。
【表９】
2020525445.tif 000010
【０１６３】
本研究は、界面活性剤洗浄が生成物品質を低下させないことを実証した。残留界面活性剤及び宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の両方は、界面活性剤洗浄を使用して生成物から排除されることが可能である。
【０１６４】
実施例３−ウイルス排除のためのポリッシングカラム及び捕獲カラムとしてのカチオン交換
材料及び方法
カチオン交換クロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラムを最初に平衡化した後に、４０〜１００ｍｇ／ｍｌのレジンの充填容量で充填材料をカラム上に充填した。カラムを洗浄した後に、溶出緩衝液を使用してモノクローナル抗体（ｍＡｂ）生成物をカラムから溶出させた。適所での洗浄（ＣＩＰ）及び適所での衛生化（ＳＩＰ）手順を生成物溶出後に適用した。
【０１６５】
ＨＰＬＣプロテインＡ力価
２．１ｍｍ×３０ｍｍの分析用アフィニティーカラム（ＰｏｒｏｓＡアフィニティーカラム、ＡＢＩ．Ｐ／Ｎ：２−１００１−００）及び適切な標準物質を使用して、抗体価をＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム上で定量化した。標準物質の含量は、１０μＬの注入量中で１から１００μｇに及んだ。標準物質及び試料を１０μＬで注入した。移動相Ａは、１ＸＰＢＳの緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃：１００１００７２）であった。移動相Ｂは、１２ｍＭのＨＣｌであった。流量は、２．５ｍｇ／ｍＬであった。抗体は、２．５分間、０〜７０％の移動相Ｂの勾配でカラムから溶出した。溶出ピークを積分した。溶出ピークの面積を、これらの面積、及び標準物質の含量から導出された線形標準曲線に対してプロットし、抗体価を決定した。
【０１６６】
Ｓｏｌｏ  ＶＰＥタンパク質濃度測定
タンパク質濃度をＳｏｌｏ  ＶＰＥシステム（Ｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）において測定した。Ａ２８０値について、典型的に５０〜２００μＬの試料を小さなシリカ容器中に加えた。タンパク質濃度を分子吸光係数に基づきＳｏｌｏ  ＶＰＥシステムによって計算した。
【０１６７】
ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
抗体純度モノマーパーセント（％）は、６．０ｍｍ×４．０ｃｍのガードカラム（ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇｕａｒｄ  ＳＷｘｌ，Ｐ／Ｎ：０８５４３）によって先行された、７．８ｍｍ×３０ｃｍのサイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ，Ｐ／Ｎ：０８５４１）を使用した、サイズ排除クロマトグラフィーによってＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムにおいて分析された。典型的な試料を３０μＬ中に５．０ｍｇ／ｍＬで注入した。均一濃度移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５であった。流量は、０．５ｍｇ／ｍＬであった。高分子量種、二量体、単量体、及び小分子量種を３５分で分離させた。各種のパーセンテージは、すべてのピークの合計面積によって除算されたピーク面積によって決定された。
【０１６８】
定量的ＥＬＩＳＡ−宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）
試料中のＨＣＰレベルは、製造元のプロトコルに従い、Ｃｙｇｎｕｓ  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．＃：Ｆ５５０）を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって決定された。
【０１６９】
Ｘ−ＭｕＬＶスパイクイン研究
この実施例において上述されたＣＥＸ条件は、Ｘ−Ｍｕｌｖウイルスを添加した充填材料を使用して実行された。充填及び溶出試料中のウイルス含有量は、セルベースの感染アッセイ、ＴＣＩＤ５０によって分析された。各実行のＬＲＶは、充填試料のｌｏｇ１０の合計ＰＦＵから溶出試料のｌｏｇ１０の合計ＰＦＵを減算することによって計算された。
【０１７０】
ＲＶＬＰ  ｑＰＣＲアッセイ
ＲＶＬＰ（レトロウイルス様粒子）は、ｑＰＣＲによって定量化された。製造元のプロトコルに従い、ＭａｇＭＡＸ（商標）ウイルスＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃ＡＭ１９３９）を使用して、すべての核酸を試料から単離した。すべての核酸は、ｅｓＤＮａｓｅによって最初に処理された（ゲノムＤＮＡを除去するために）後に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ  ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｅｚＤＮａｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃ＡＭ１９３９）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。ｃＤＮＡ試料は、ＲＶＬＰ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  アクセッション＃：Ｕ０９１０４．１）の３０２７から３１２５ｂｐ領域を標的とする、ＴａｑｍａｎベースのｑＰＣＲを受けた。ｑＰＣＲに使用されたプライマーは、ＣＣＴＧＡＧＴＣＡＣＣＧＧＡＣＴＧＣＡＴ（配列番号８）、及びＡＣＣＡＧＴＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号９）であった。それらは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から購入された。ｑＰＣＲに使用されたプローブは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入された、５−ＦＡＭ−ＡＧＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＣＧＧ−ＭＧＢＮＦＱ−３（配列番号１０）であった。ｑＰＣＲについての標準物質は、アンプリコン領域を被覆する二本鎖ＤＮＡフラグメントであった。ｑＰＣＲアッセイは、Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃４３５２０４６）を使用して、７５００ＦＡＳＴシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で実行された。
【０１７１】
残留Ｔｒｉｔｏｎ−１００
残留Ｔｒｉｔｏｎ−１００の濃度は、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ：９９３９６７−９０２）を使用したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム上のＨＰＬＣによって定量化された。試料を等しい容量の１００％メタノールと混合し、４℃、２５，０００Ｘｇで３０分間遠心分離した。ＨＰＬＣ注入に対する試料の上澄みを保存した。ＨＰＬＣ注入前に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の標準物質を５０％メタノール中で希釈した。７８％から１００％のメタノールの勾配を用いて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を溶出させた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のピークを積分した。試料中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は、対応するピーク面積をこれらの標準物質に対してプロットすることによって計算された。
【０１７２】
ポリッシングカラムとしてのＣＥＸ
ポリッシングカラムとしてのＣＥＸの有効性を評価するために、界面活性剤の存在または非存在下で、異なる抗体、レジン、平衡化緩衝液、及び洗浄条件を使用して、２つのアッセイを行った。
【０１７３】
第一アッセイにおいて、表１０に列挙されるプロセス条件を、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＳＰＦＦ）レジン上に適用し、抗ＣＧＲＰ  ＩｇＧ２抗体を精製した。このレジンは、ＧＥによって生成されたセファロースベースのスルホプロピルの強カチオン交換クロマトグラフィーである。同様のレジンは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−、及びＣａｐｔｏ  Ｓを含む。
【表１０】
2020525445.tif 000011
【０１７４】
ウイルスを添加した充填材料を使用したウイルススパイクイン研究を行った。試験された洗浄２の条件、及びこれらの結果を表１１に示す。
【表１１】
2020525445.tif 000012
【０１７５】
これらの結果は、洗浄２における０．５％のＴｒｉｔｏｎの追加がＸ−ＭｕＬＶの対数クリアランスを有意に改善することを実証する。
【０１７６】
また、生成物品質は、表１２に要約される条件下でプロテインＡが精製したｍＡｂを充填材料として使用して評価され、これらの結果も、この表に報告されている。
【表１２】
2020525445.tif 000013
【０１７７】
表１２におけるこれらの結果は、洗浄２における０．５％のＴｒｉｔｏｎの追加がモノマー％または残留宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）のいずれか一方の観点から生成物品質を低下させていないことを実証する。また、これらの結果は、洗浄３が検出不可能なレベルまで残留界面活性剤を除去することが可能であることを実証する。
【０１７８】
第二アッセイにおいて、表１３に列挙されるプロセス条件をＰｏｒｏｓ  ＸＳレジン  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に適用し、抗ＴＬ１ａ  ＩｇＧ１抗体を精製した。このレジンは、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）ポリマーマトリックスをスルホプロピルリガンドによって架橋した。
【表１３】
2020525445.tif 000014
【０１７９】
ウイルスを添加した充填材料を使用したウイルススパイクイン研究を行った。試験された洗浄２の条件、及びこれらの結果を表１４に示す。
【表１４】
2020525445.tif 000015
【０１８０】
これらの結果は、アッセイ１の場合、洗浄２における０．５％のＴｒｉｔｏｎの追加がアッセイ２においてＸ−ＭｕＬＶの対数クリアランスを有意に改善することを実証する。加えて、洗浄２の終了時に３０分の小休止を有しても、有さなくても、６超ｌｏｇのウイルス排除を５カラム容量（ＣＶ）の洗浄において達成することが可能であった。
【０１８１】
また、表１５に要約される条件下でプロテインＡが精製したｍＡｂを充填材料として使用する、生成物品質を評価し、これらの結果も、この表に報告されている。
【表１５】
2020525445.tif 000016
【０１８２】
表１５におけるこれらの結果は、アッセイ１の場合、洗浄２における０．５％のＴｒｉｔｏｎの追加がアッセイ２においてモノマーの％または残留宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）のいずれか一方の観点から生成物品質を低下させないことを実証する。しかしながら、おそらくＰｏｒｏｓ  ＸＳが疎水性レジンであるため、洗浄３なしで残留界面活性剤を効率的に除去しなかった。いかなる場合においても、洗浄３の追加は、検出の限界を下回るまで界面活性剤レベルを低下させた。
【０１８３】
捕獲カラムとしてのＣＥＸ
捕獲カラムとしてのＣＥＸ上での界面活性剤の効果の有効性を評価するために、界面活性剤の存在または非存在下で、異なるレジン、平衡化緩衝液、及び洗浄条件を使用して、２つのアッセイを行った。
【０１８４】
第一アッセイにおいて、表１６に列挙されるプロセス条件を、ＳＰＦＦレジン上に適用した。
【表１６】
2020525445.tif 000017
【０１８５】
レトロウイルス様粒子（ＲＶＬＰ）排除は、充填材料としてＨＣＣＦを使用して評価され、これらの条件は、表１７に列挙されている。
【表１７】
2020525445.tif 000018
【０１８６】
これらの結果は、洗浄２における０．５％のＴｒｉｔｏｎの追加が２ｌｏｇまでＲＶＬＰ排除を改善し、ＨＣＰ排除も有意に増加させることを実証する。洗浄２の容量は、ウイルス排除の有効性に影響せず、１カラム容量（ＣＶ）は、洗浄２に十分であった。しかしながら、洗浄２の容量を増加させたことは、ＨＣＰ排除を改善しなかった。また、洗浄３を有したことは、ＨＣＰ排除を改善した。
【０１８７】
追加の試験は、表１８に要約されるように、洗浄２の条件を変更して行われた。これらの試験において、５カラム容量（ＣＶ）の洗浄２、及び５ＣＶの洗浄３を適用した。また、これらの結果を表１７に報告する。
【表１８−１】
2020525445.tif 000019
【表１８−２】
2020525445.tif 000020
【０１８８】
表１８中のこれらの結果は、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ、＞０．２％のＳＢ−１２、＞０．２％のＳＢ−１４、＞０．５％のＮＰ−４０及び＞０．０５％のＬＤＡＯの追加がＲＶＬＰ排除に対してすべて有効であったことを実証する。それらは、以降の検出までＲＶＬＰを排除することが可能であった。また、ＬＤＡＯ、ＳＢ−１２、及びＳＢ−１４は、ＨＣＰ排除を有意に改善することが可能である。
【０１８９】
第二アッセイにおいて、表１９に列挙されるプロセス条件を、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳレジン上に適用した。
【表１９】
2020525445.tif 000021
【０１９０】
レトロウイルス様粒子（ＲＶＬＰ）排除は、充填材料としてＨＣＣＦを使用して評価され、これらの条件は、表２０に列挙される。これらの結果もこの表に示す。
【表２０】
2020525445.tif 000022
【０１９１】
これらの結果は、洗浄３なしよりも洗浄３ありのＨＣＰが有意に低いことを実証する。
【０１９２】
追加の試験は、表２１に要約されるように、洗浄２の条件を変更して行われた。これらの試験において、５カラム容量（ＣＶ）の洗浄２、及び５ＣＶの洗浄３を適用した。また、これらの結果を表２１に報告する。
【表２１】
2020525445.tif 000023
【０１９３】
表２１中のこれらの結果は、少なくとも０．１％のＴｒｉｔｏｎの濃度がウイルス排除に有効であることを実証する。
【０１９４】
要約すると、本明細書の実施例３に記述されるこれらの結果は、ＣＥＸをポリッシングステップに使用していても、ＣＥＸを捕獲ステップに使用していても、ＣＥＸ洗浄（洗浄２）への界面活性剤の追加がレトロウイルス排除を改善することを実証する。界面活性剤の追加は、ＨＣＰまたはモノマー純度（％）のいずれか一方の観点からプロセス収量または生成物品質に不利に影響しない。この界面活性剤ベースのウイルス除去は、セファロースマトリックスレジン及び合成ポリマーマトリックスレジン上で達成されることが可能であり、１カラム容量は、有効なＲＶＬＰ排除を達成するのに十分である。さらに、洗浄３は、ＨＣＰ排除を改善し、ＬＤＡＯ及び０．５％のＴｒｉｔｏｎは、セファロースベースのレジン上でのＨＣＰ排除をそれぞれ改善する。
【０１９５】
本発明は、上記に説明され、例証される実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲内に変形及び修正が可能である。
【０１９６】
本明細書全体を通じて、様々な出版物（特許、特許出願、アクセッション番号、技術論文及び学術論文を含む）が引用されている。これらの引用された出版物のそれぞれは、その全体において、またすべての目的のために、参照により本明細書に援用される。
配列表
抗ＣＧＲＰ  ＶＨ（配列番号１）
１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＮＹＷＩＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥ    ５０
５１  ＩＲＳＥＳＤＡＳＡＴ  ＨＹＡＥＡＶＫＧＲＦ  ＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳ  ＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡ  ＥＤＴＡＶＹＹＣＬＡ  １００
１０１  ＹＦＤＹＧＬＡＩＱＮ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳ
抗ＣＧＲＰ  ＶＬ（配列番号２）
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＫＡＳＫＲＶＴ  ＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰ  ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧ    ５０
５１  ＡＳＮＲＹＬＧＩＰＡ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ  ＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱ  ＳＹＮＹＰＹＴＦＧＱ  １００
１０１  ＧＴＫＬＥＩＫ
抗ＣＤ３８  ＶＨ（配列番号３）
１  ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ  ＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩ  ＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴ  ＤＳＶＭＮＷＶＱＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷ    ５０
５１  ＩＤＰＥＹＧＲＴＤＶ  ＡＥＫＦＱＧＲＶＴＩ  ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹ  ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＴＫ  １００
１０１  ＹＮＳＧＹＧＦＰＹＷ  ＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ３８  ＶＬ（配列番号４）
１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＫＡＳＱＮＶＤ  ＳＤＶＤＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫ    ５０
５１  ＡＳＮＤＹＴＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＩＡＴＹＹＣＭＱ  ＳＮＴＨＰＲＴＦＧＧ  １００
１０１  ＧＴＫＶＥＩＫＲ
抗ＴＬ１ａ  ＶＨ１（配列番号５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＬＮＰＮＳＧＮＴＧＹ
ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＡＤＲＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＶＰＥＴＡＡＦＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＴＬ１ａ  ＶＨ２（配列番号６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＬＮＰＮＳＧＹＴＧＹ
ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＡＤＲＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＶＰＥＴＡＡＦＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ 
抗ＴＬ１ａ  ＶＬ（配列番号７）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＳＳＳＳＤＩＧＡＸＸＧＶＸＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＥＧＹＹＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＴＩＴＧＬＬＰＥＤＥＧＤＹＹＣＱＳＸＤＧＴＬＳＡＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ
Ｘａａ３２は、ＧまたはＡである。
Ｘａａ３３は、ＬまたはＳまたはＱである。
Ｘａａ３６は、ＨまたはＬである。
Ｘａａ９３は、ＹまたはＦまたはＷである。
【図１】
2020525445.tif 000024
【国際調査報告】
2020525445.tif 000025
2020525445.tif 000026
2020525445.tif 000027
2020525445.tif 000028
2020525445.tif 000029