(57)【要約】二量体化を阻害し、ＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断するように修飾された組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β単量体が記載される。組換えＴＧＦ−β単量体は、ＴＧＦ−βＩ型受容体（ＴβＭ）に結合しそれを動員する能力に欠けるが、高親和性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＭＩ）に結合する能力を保持し、場合によっては、ＴβＭＩに対するその親和性を高める変異を含む。組換えＴＧＦ−β単量体をコードする核酸分子およびベクターもまた記載される。Ｔ細胞などの単離された細胞は、単量体を分泌するようにＴＧＦ−β単量体コード核酸またはベクターで再プログラム化することができる。ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害するための、例えば、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する障害を処置するための、組換えＴＧＦ−β単量体および／または組換えＴＧＦ−β単量体を産生する細胞の使用もまた記載される。
2020500511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β単量体であって、
（ｉ）配列番号２の残基７７に対応するアミノ酸残基におけるシステインからセリンへの置換と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基５２〜７１に対応するα３ヘリックスの欠失と、
（ｉｉｉ）組換えＴＦＧ−β単量体の正味電荷を増加させる、野生型ＴＦＧ−β単量体と比べて少なくとも１個のアミノ酸置換と
を含む、組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項２】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）に対する前記組換えＴＧＦ−β単量体の親和性を高める、野生型ＴＦＧ−β２単量体と比べて少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項３】
ヒトＴＧＦ−β２単量体である、請求項１または請求項２に記載の組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項４】
前記単量体の正味電荷を増加させる前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号２の残基７３に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；または
配列番号２の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからアルギニンへの置換、および残基７３に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換の両方
を含む、請求項３に記載の組換えヒトＴＧＦ−β２単量体。
【請求項５】
ＴβＲＩＩに対する前記単量体の親和性を高める前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、配列番号２の残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９に対応するアミノ酸残基、またはそれらの２つもしくはそれよりも多い残基の任意の組合せにおいて置換を含む、請求項３または請求項４に記載の組換えヒトＴＧＦ−β２単量体。
【請求項６】
ＴβＲＩＩに対する前記単量体の親和性を高める前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７に少なくとも１個の置換、および残基８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９に少なくとも１個の置換を含む、請求項５に記載の組換えヒトＴＧＦ−β２単量体。
【請求項７】
ＴβＲＩＩに対する前記単量体の親和性を高める前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、残基２５におけるリジンからアルギニン、残基２６におけるアルギニンからリジン、残基８９におけるロイシンからバリン、残基９２におけるイソロイシンからバリン、残基９４におけるアスパラギンからアルギニン、残基９５におけるスレオニンからリジン、残基９８におけるイソロイシンからバリン、またはそれらの２つもしくはそれよりも多い任意の組合せを含む、請求項６に記載の組換えヒトＴＧＦ−β２単量体。
【請求項８】
残基２５におけるリジンからアルギニン、残基２６におけるアルギニンからリジン、残基８９におけるロイシンからバリン、残基９２におけるイソロイシンからバリン、残基９４におけるアスパラギンからアルギニン、残基９５におけるスレオニンからリジン、および残基９８におけるイソロイシンからバリンを含む、請求項７に記載の組換えヒトＴＧＦ−β２単量体。
【請求項９】
配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項３から８のいずれか一項に記載の組換えヒトＴＧＦ−β２単量体。
【請求項１０】
ヒトＴＧＦ−β１単量体である、請求項１または請求項２に記載の組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項１１】
前記単量体の正味電荷を増加させる前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、
配列番号１の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換；
配列番号１の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換；
配列番号１の残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換；または
配列番号１の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるイソロイシンからアルギニンへの置換、残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからリジンへの置換、および残基７５に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからセリンへの置換
を含む、請求項１０に記載の組換えヒトＴＧＦ−β１単量体。
【請求項１２】
配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１０または請求項１１に記載の組換えヒトＴＧＦ−β１単量体。
【請求項１３】
ヒトＴＧＦ−β３単量体である、請求項１または請求項２に記載の組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項１４】
前記単量体の正味電荷を増加させる前記少なくとも１個のアミノ酸置換が、
配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換；
配列番号３の残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換；
配列番号３の残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換；または
配列番号３の残基５１に対応するアミノ酸残基におけるロイシンからグルタミン酸への置換、残基７２に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからグルタミン酸への置換、および残基７４に対応するアミノ酸残基におけるアラニンからアスパラギン酸への置換
を含む、請求項１３に記載の組換えヒトＴＧＦ−β３単量体。
【請求項１５】
配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載の組換えヒトＴＧＦ−β３単量体。
【請求項１６】
ＰＥＧ化されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項１７】
グリコシル化または高グリコシル化されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体および異種タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項１９】
前記異種タンパク質がタンパク質タグを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記異種タンパク質がＦｃドメインを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記異種タンパク質がアルブミンまたはアルブミン結合ポリペプチドを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記異種タンパク質が、抗体、その抗原結合断片、または標的化部分を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
一本鎖ポリペプチドである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
二量体ポリペプチドを形成する、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ヘテロ二量体である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
多量体である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
放射線療法剤、化学療法のための細胞傷害剤、または薬物を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体、または請求項１８から２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
イメージング剤、蛍光色素、または蛍光タンパク質タグを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体、または請求項１８から２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体、または請求項１８から２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、組成物。
【請求項３０】
細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項２９に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物を、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を有する対象に投与することを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
対象における異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を処置する方法であって、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項２９に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、線維性障害である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、乳がん、脳がん、膵臓がん、前立腺がんまたは皮膚がんである、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、眼疾患である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、結合組織の遺伝性障害である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＧＦ−β単量体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３９】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
請求項３８または請求項３９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４１】
請求項３８または請求項３９に記載の核酸分子、または請求項４０に記載のベクターを含む単離された細胞。
【請求項４２】
Ｔリンパ球である、請求項４１に記載の単離された細胞。
【請求項４３】
対象における異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を処置する方法であって、請求項４１または請求項４２に記載の単離された細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、線維性障害である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、乳がん、脳がん、膵臓がん、前立腺がんまたは皮膚がんである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、眼疾患である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、結合組織の遺伝性障害である、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１１月１８日に出願された米国仮出願番号第６２／４２３，９２０号の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
分野
本開示は、高親和性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）に結合する能力を保持しながら二量体化を阻害するように修飾された、組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β単量体に関する。本開示はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する組換えＴＧＦ−β単量体の使用に関する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＧＭ０５８６７０の政府支援によりなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ＴＧＦ−βは、細胞増殖、遊走、分化、およびアポトーシスを含む細胞プロセスに対して多様な生物学的影響を有する多機能性サイトカインである。３つの哺乳動物ＴＧＦ−βアイソフォーム、ＴＧＦ−β１、−β２および−β３は、Ｉ型（ＴβＲＩ）およびＩＩ型（ＴβＲＩＩ）セリン／スレオニンキナーゼ受容体から構成される細胞表面受容体複合体を通じてその機能を発揮する。受容体活性化は、ＳＭＡＤタンパク質、ならびにＲａｓ、ＲｈｏＡ、ＴＡＫ１、ＭＥＫＫ１、ＰＩ３Ｋ、およびＰＰ２Ａを含む他の下流の標的の両方を誘導して、全面的なＴＧＦ−β応答をもたらす（RobertsおよびWakefield、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １００巻：８６２１〜８６２３頁、２００３年；DerynckおよびZhang、Nature  ４２５巻：５７７〜５８４頁、２００３年；Massague、Cell  １３４巻：２１５〜２３０頁、２００８年）。
【０００５】
ＴＧＦ−βタンパク質は、線維性障害および特定のタイプのがんの進行を促進することが公知である。線維性障害との関連において、ＴＧＦ−βは、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質の発現を強力に刺激する。ＥＣＭリモデリングの調節不全は、病理学的線維症につながり得る。がんにおけるＴＧＦ−βの役割は多面的である。ＴＧＦ−βアイソフォーム、ＴＧＦ−β１、−β２および−β３はまた、宿主の免疫監視を抑制し、上皮間葉転換を刺激し、がんの進行および転移を亢進することも公知である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】RobertsおよびWakefield、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １００巻：８６２１〜８６２３頁、２００３年
【非特許文献２】DerynckおよびZhang、Nature  ４２５巻：５７７〜５８４頁、２００３年
【非特許文献３】Massague、Cell  １３４巻：２１５〜２３０頁、２００８年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本明細書に記載されるのは、ＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断することができる操作されたＴＧＦ−β単量体である。操作された単量体は、ＴＧＦ−β二量体化およびＴβＲＩの動員を妨げることによりＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する。
【０００８】
本明細書で提供されるのは、アミノ酸残基７７におけるシステインからセリンへの置換；アミノ酸残基５２〜７１の欠失；および単量体の正味電荷を増加させる少なくとも１個のアミノ酸置換を含む組換えＴＧＦ−β単量体である。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β単量体は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）に対するＴＧＦ−β単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。ＴＧＦ−β単量体は、例えば、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３単量体、例えば、ヒト、ラット、マウスまたは他の哺乳動物ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３単量体であってもよい。
【０００９】
ＴＧＦ−β単量体および異種タンパク質を含む融合タンパク質も提供される。さらに提供されるのは、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体または融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物である。
【００１０】
さらに提供されるのは、細胞を、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物と接触させることにより、細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する方法である。いくつかの実施形態において、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。他の実施形態において、方法は、組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物を、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を有する対象に投与することを含むｉｎ  ｖｉｖｏ方法である。
【００１１】
また、提供されるのは、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体をコードする核酸分子およびベクターである。さらに提供されるのは、組換えＴＧＦ−β単量体コード核酸分子またはベクターを含む、単離されたＴリンパ球などの単離された細胞である。
【００１２】
開示された核酸またはベクターを含む単離された細胞（Ｔ細胞など）を対象に投与することにより、対象における異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を処置する方法が、さらに提供される。
【００１３】
本発明の前述のおよび他の目的、特徴、および利点は、添付図面を参照して進められる以下の詳細な記述からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ＡＢＣ】図１Ａ〜１Ｆ：ＴＧＦ−βシグナル伝達複合体の構造および界面のα−ヘリックスを欠く操作されたＴＧＦ−βバリアントの配列。（図１Ａ）ヒトＴＧＦ−β３ホモ二量体と、ヒトＴＧＦ−βＩ型およびＩＩ型受容体（ＴβＲＩおよびＴβＲＩＩ（ＰＤＢ  ２ＰＪＹ））の細胞外リガンド結合ドメインとの間で形成されるＴＧＦ−βシグナル伝達複合体を示す模式図（Groppeら、Mol  Cell  ２９巻、１５７〜１６８頁、２００８年）。ＴＧＦ−β単量体を連結する単一鎖間ジスルフィドを含むジスルフィド結合を示す。３−１／２回転α−ヘリックス（α３）によって形成されるヒールおよび各単量体を安定させるシスチンノットから伸長するβ鎖によって形成される４つのフィンガーとともに、ＴＧＦ−β単量体をカールする左手として示す。（図１Ｂ）１つのＴＧＦ−β３単量体のヒールα−ヘリックスから突出する疎水性残基と、対向するＴＧＦ−β３単量体のパーム領域からの疎水性残基とにより形成されるパッキング相互作用を示す拡大図。（図１Ｃ）ＴＧＦ−β３およびＴβＲＩＩの両方の単量体によって形成されるコンポジット界面でＴβＲＩを安定化させるイオン、水素結合および疎水的相互作用を示す拡大図。（図１Ｄ）鎖間のジスルフィド結合を通常は形成するＣｙｓ７７がセリンにより置換された単量体バリアント（ｍＴＧＦ−β２およびｍＴＧＦ−β３）、または、Ｃｙｓ７７がセリンにより置換され、残基５２〜７１が削除され、また２つまたは３つのさらなる残基が置換されたミニ単量体バリアント（ｍｍＴＧＦ−β１、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β３）を有するＴＧＦ−β１、−β２、および−β３の配列アラインメント。ｐＨ７．０における対応する単量体の正味電荷の計算値を右側に示す。（図１Ｅ）ＴβＲＩＩ結合領域のＴＧＦ−β１、−β３、−β２、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの配列アラインメント。ＴβＲＩＩ結合界面の残基を陰影によって示す。ｍｍＴＧＦ−β２と比較してｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍにおいて置換される残基がボックスによって示され、Ｋ２５Ｒ、Ｉ９２ＶおよびＮ９４Ｒを含むが、これらは高親和性でのＴβＲＩＩ結合に必要十分なことが過去に示されている（Baardsnesら、Biochemistry  ４８巻：２１４６〜２１５５頁、２００９年；De  Crescenzoら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年）。（図１Ｆ）ＴＧＦ−β３とＴβＲＩＩとの間の界面。
【図１ＤＥＦ】図１Ａ〜１Ｆ：ＴＧＦ−βシグナル伝達複合体の構造および界面のα−ヘリックスを欠く操作されたＴＧＦ−βバリアントの配列。（図１Ａ）ヒトＴＧＦ−β３ホモ二量体と、ヒトＴＧＦ−βＩ型およびＩＩ型受容体（ＴβＲＩおよびＴβＲＩＩ（ＰＤＢ  ２ＰＪＹ））の細胞外リガンド結合ドメインとの間で形成されるＴＧＦ−βシグナル伝達複合体を示す模式図（Groppeら、Mol  Cell  ２９巻、１５７〜１６８頁、２００８年）。ＴＧＦ−β単量体を連結する単一鎖間ジスルフィドを含むジスルフィド結合を示す。３−１／２回転α−ヘリックス（α３）によって形成されるヒールおよび各単量体を安定させるシスチンノットから伸長するβ鎖によって形成される４つのフィンガーとともに、ＴＧＦ−β単量体をカールする左手として示す。（図１Ｂ）１つのＴＧＦ−β３単量体のヒールα−ヘリックスから突出する疎水性残基と、対向するＴＧＦ−β３単量体のパーム領域からの疎水性残基とにより形成されるパッキング相互作用を示す拡大図。（図１Ｃ）ＴＧＦ−β３およびＴβＲＩＩの両方の単量体によって形成されるコンポジット界面でＴβＲＩを安定化させるイオン、水素結合および疎水的相互作用を示す拡大図。（図１Ｄ）鎖間のジスルフィド結合を通常は形成するＣｙｓ７７がセリンにより置換された単量体バリアント（ｍＴＧＦ−β２およびｍＴＧＦ−β３）、または、Ｃｙｓ７７がセリンにより置換され、残基５２〜７１が削除され、また２つまたは３つのさらなる残基が置換されたミニ単量体バリアント（ｍｍＴＧＦ−β１、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β３）を有するＴＧＦ−β１、−β２、および−β３の配列アラインメント。ｐＨ７．０における対応する単量体の正味電荷の計算値を右側に示す。（図１Ｅ）ＴβＲＩＩ結合領域のＴＧＦ−β１、−β３、−β２、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの配列アラインメント。ＴβＲＩＩ結合界面の残基を陰影によって示す。ｍｍＴＧＦ−β２と比較してｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍにおいて置換される残基がボックスによって示され、Ｋ２５Ｒ、Ｉ９２ＶおよびＮ９４Ｒを含むが、これらは高親和性でのＴβＲＩＩ結合に必要十分なことが過去に示されている（Baardsnesら、Biochemistry  ４８巻：２１４６〜２１５５頁、２００９年；De  Crescenzoら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年）。（図１Ｆ）ＴＧＦ−β３とＴβＲＩＩとの間の界面。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄ：ｍｍＴＧＦ−β２の構造。（図２Ａ）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、５％の２Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．７０、３７℃、８００ＭＨｚにおいて記録した、ｍｍＴＧＦ−β２の割り当てられた１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル。割り当てられたバックボーンアミドシグナルを、それらの残基番号および１文字アミノ酸コードによって示す。（図２Ｂ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２の結晶構造と、１．８ÅのＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からの１つの単量体との重なり。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループとともに、大きな構造的特徴を示す。（図２Ｃ）結晶学的非対称ユニットからの２つのｍｍＴＧＦ−β２鎖（鎖ＡおよびＢ）の重なり。他の詳細は図２Ｂのとおり。（図２Ｄ）図２ＢのｍｍＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β２の重なり。但し、アラインする部分は、それぞれ、フィンガー１／２および３／４の残基１８〜４５および６１〜８７に限定。
【図２ＢＣＤ】図２Ａ〜２Ｄ：ｍｍＴＧＦ−β２の構造。（図２Ａ）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、５％の２Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．７０、３７℃、８００ＭＨｚにおいて記録した、ｍｍＴＧＦ−β２の割り当てられた１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル。割り当てられたバックボーンアミドシグナルを、それらの残基番号および１文字アミノ酸コードによって示す。（図２Ｂ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２の結晶構造と、１．８ÅのＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からの１つの単量体との重なり。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループとともに、大きな構造的特徴を示す。（図２Ｃ）結晶学的非対称ユニットからの２つのｍｍＴＧＦ−β２鎖（鎖ＡおよびＢ）の重なり。他の詳細は図２Ｂのとおり。（図２Ｄ）図２ＢのｍｍＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β２の重なり。但し、アラインする部分は、それぞれ、フィンガー１／２および３／４の残基１８〜４５および６１〜８７に限定。
【図３ＡＢＣＤ】図３Ａ〜３Ｈ：ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結合特性。（図３Ａおよび３Ｂ）固定化ＴＧＦ−β２（図３Ａ）またはｍｍＴＧＦ−β２（図３Ｂ）に対する、ＴβＲＩＩの０．０４７〜１２μＭの２倍希釈系列の注入の際の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。（図３Ｃ〜３Ｈ）固定化ａｖｉ−ＴＧＦ−β３（図３Ｃ、３Ｅおよび３Ｇ）またはａｖｉ−ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ（図３Ｄ、３Ｆおよび３Ｈ）に対する、０．０１２〜３μＭのＴβＲＩＩ（図３Ｃおよび３Ｄ）、０．００８〜１．０２４μＭのＴβＲＩ（図３Ｅおよび３Ｆ）、またはランニング緩衝液および注入試料における２μＭのＴβＲＩＩの存在下での、０．００８〜１．０２４μＭのＴβＲＩＩ（図３Ｇおよび３Ｈ）の、２倍希釈系列の注入の際のＳＰＲセンサーグラム。図３Ｃ、３Ｄおよび３Ｇに示されるセンサーグラムは、１：１の結合モデルにフィットさせ、生データおよびフィットさせた曲線を示す。センサー表面への直接的なカルボジイミドベースのアミンカップリングによってＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２を固定化し、高い（約８０００応答単位（ＲＵ））密度でストレプトアビジンコーティングされたセンサーチップの表面上への、酵素的にビオチン化したタンパク質の捕捉によって、ａｖｉ−ＴＧＦ−β３またはａｖｉ−ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを固定化した。
【図３ＥＦＧＨ】図３Ａ〜３Ｈ：ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結合特性。（図３Ａおよび３Ｂ）固定化ＴＧＦ−β２（図３Ａ）またはｍｍＴＧＦ−β２（図３Ｂ）に対する、ＴβＲＩＩの０．０４７〜１２μＭの２倍希釈系列の注入の際の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。（図３Ｃ〜３Ｈ）固定化ａｖｉ−ＴＧＦ−β３（図３Ｃ、３Ｅおよび３Ｇ）またはａｖｉ−ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ（図３Ｄ、３Ｆおよび３Ｈ）に対する、０．０１２〜３μＭのＴβＲＩＩ（図３Ｃおよび３Ｄ）、０．００８〜１．０２４μＭのＴβＲＩ（図３Ｅおよび３Ｆ）、またはランニング緩衝液および注入試料における２μＭのＴβＲＩＩの存在下での、０．００８〜１．０２４μＭのＴβＲＩＩ（図３Ｇおよび３Ｈ）の、２倍希釈系列の注入の際のＳＰＲセンサーグラム。図３Ｃ、３Ｄおよび３Ｇに示されるセンサーグラムは、１：１の結合モデルにフィットさせ、生データおよびフィットさせた曲線を示す。センサー表面への直接的なカルボジイミドベースのアミンカップリングによってＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２を固定化し、高い（約８０００応答単位（ＲＵ））密度でストレプトアビジンコーティングされたセンサーチップの表面上への、酵素的にビオチン化したタンパク質の捕捉によって、ａｖｉ−ＴＧＦ−β３またはａｖｉ−ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを固定化した。
【図４ＡＢＣＤ】図４Ａ〜４Ｄ：ＴＧＦ−β２および単量体バリアントの溶解度。（図４Ａおよび４Ｃ）ＴＧＦ−β２およびｍＴＧＦ−β２（図４Ａ）、ならびにｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ（図４Ｃ）を、１００ｍＭ酢酸中の濃縮ストックから、７．４（中性ｐＨ）のＰＢＳまたは１００ｍＭの酢酸（酸性ｐＨ）に希釈し、３４０ｎｍの光散乱を測定した。（図４Ｂおよび４Ｄ）ＰＢＳまたは１００ｍＭの酢酸に希釈したＴＧＦ−β２およびｍＴＧＦ−β２（図４Ｂ）ならびにｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ（図４Ｄ）の試料を、２０，０００×ｇで５分間遠心分離し、２８０ｎｍのタンパク質吸光度を測定した。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅ：ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭおよびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の構造。（図５Ａ）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、５％の２Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．７０、３７℃、８００ＭＨｚにおいて記録した、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの割り当てられた１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル。割り当てられたバックボーンアミドシグナルを、それらの残基番号および１文字アミノ酸コードによって示す。（図５Ｂ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結晶構造と、１．８ÅのＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からの１つの単量体との重なり。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループとともに、大きな構造的特徴を示す。（図５Ｃ）結晶学的非対称ユニットからの３つのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの鎖（鎖Ａ、ＢおよびＣ）の重なり。破線は、弱い電子密度のため鎖Ｃ中の操作されたループ領域における欠失セグメントに対応する。他の詳細は図５Ｂのとおり。（図５Ｄ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の結晶構造と、３．０ÅのＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ：ＴβＲＩ複合体の結晶構造からの１つのＴＧＦ−β３単量体およびその結合するＴβＲＩＩとの重なり（ＰＤＢ  ２ＰＪＹ、ＴＧＦ−β３単量体およびＴβＲＩＩ；ＴβＲＩは明確化のため示さない）。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループを表す。（図５Ｅ）重なりは図５Ｂのとおりであるが、以前に高親和性ＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ結合にとって不可欠であることを示した臨界的な疎水性および水素結合／静電的相互作用にほぼ同一であることを示すために拡大した。
【図５ＢＣ】図５Ａ〜５Ｅ：ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭおよびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の構造。（図５Ａ）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、５％の２Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．７０、３７℃、８００ＭＨｚにおいて記録した、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの割り当てられた１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル。割り当てられたバックボーンアミドシグナルを、それらの残基番号および１文字アミノ酸コードによって示す。（図５Ｂ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結晶構造と、１．８ÅのＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からの１つの単量体との重なり。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループとともに、大きな構造的特徴を示す。（図５Ｃ）結晶学的非対称ユニットからの３つのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの鎖（鎖Ａ、ＢおよびＣ）の重なり。破線は、弱い電子密度のため鎖Ｃ中の操作されたループ領域における欠失セグメントに対応する。他の詳細は図５Ｂのとおり。（図５Ｄ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の結晶構造と、３．０ÅのＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ：ＴβＲＩ複合体の結晶構造からの１つのＴＧＦ−β３単量体およびその結合するＴβＲＩＩとの重なり（ＰＤＢ  ２ＰＪＹ、ＴＧＦ−β３単量体およびＴβＲＩＩ；ＴβＲＩは明確化のため示さない）。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループを表す。（図５Ｅ）重なりは図５Ｂのとおりであるが、以前に高親和性ＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ結合にとって不可欠であることを示した臨界的な疎水性および水素結合／静電的相互作用にほぼ同一であることを示すために拡大した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅ：ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭおよびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の構造。（図５Ａ）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、５％の２Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．７０、３７℃、８００ＭＨｚにおいて記録した、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの割り当てられた１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル。割り当てられたバックボーンアミドシグナルを、それらの残基番号および１文字アミノ酸コードによって示す。（図５Ｂ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結晶構造と、１．８ÅのＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からの１つの単量体との重なり。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループとともに、大きな構造的特徴を示す。（図５Ｃ）結晶学的非対称ユニットからの３つのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの鎖（鎖Ａ、ＢおよびＣ）の重なり。破線は、弱い電子密度のため鎖Ｃ中の操作されたループ領域における欠失セグメントに対応する。他の詳細は図５Ｂのとおり。（図５Ｄ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の結晶構造と、３．０ÅのＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ：ＴβＲＩ複合体の結晶構造からの１つのＴＧＦ−β３単量体およびその結合するＴβＲＩＩとの重なり（ＰＤＢ  ２ＰＪＹ、ＴＧＦ−β３単量体およびＴβＲＩＩ；ＴβＲＩは明確化のため示さない）。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループを表す。（図５Ｅ）重なりは図５Ｂのとおりであるが、以前に高親和性ＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ結合にとって不可欠であることを示した臨界的な疎水性および水素結合／静電的相互作用にほぼ同一であることを示すために拡大した。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅ：ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭおよびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の構造。（図５Ａ）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、５％の２Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．７０、３７℃、８００ＭＨｚにおいて記録した、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの割り当てられた１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル。割り当てられたバックボーンアミドシグナルを、それらの残基番号および１文字アミノ酸コードによって示す。（図５Ｂ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結晶構造と、１．８ÅのＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からの１つの単量体との重なり。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループとともに、大きな構造的特徴を示す。（図５Ｃ）結晶学的非対称ユニットからの３つのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの鎖（鎖Ａ、ＢおよびＣ）の重なり。破線は、弱い電子密度のため鎖Ｃ中の操作されたループ領域における欠失セグメントに対応する。他の詳細は図５Ｂのとおり。（図５Ｄ）１．８ÅのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の結晶構造と、３．０ÅのＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ：ＴβＲＩ複合体の結晶構造からの１つのＴＧＦ−β３単量体およびその結合するＴβＲＩＩとの重なり（ＰＤＢ  ２ＰＪＹ、ＴＧＦ−β３単量体およびＴβＲＩＩ；ＴβＲＩは明確化のため示さない）。ＴＧＦ−β２のパーム（α３）ヘリックスに代わるｍｍＴＧＦ−β２の操作されたループを表す。（図５Ｅ）重なりは図５Ｂのとおりであるが、以前に高親和性ＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ結合にとって不可欠であることを示した臨界的な疎水性および水素結合／静電的相互作用にほぼ同一であることを示すために拡大した。
【図６ＡＢ】図６Ａ〜６Ｂ：ＴＧＦ−β１およびバリアントのシグナル伝達活性。（図６Ａ）黒い丸、正方形および三角形でそれぞれ示すＴＧＦ−β１、ｍＴＧＦ−β３およびｍｍＴＧＦ−β２−７ＭのＴＧＦ−βルシフェラーゼレポーター活性。実線はフィットさせた曲線に対応し、ＥＣ５０を導く（ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍはこのバリアントのシグナル伝達活性の欠如のためフィットしなかった）。（図６Ｂ）亜飽和濃度（８ｐＭ）のＴＧＦ−β１で処理した細胞に、示されるＴＧＦ−β単量体バリアントの濃度を増加させて添加したときのＴＧＦ−βルシフェラーゼレポーター活性（ｍＴＧＦ−β３およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍをそれぞれ白四角および黒三角で示す）。実線は、ｍＴＧＦ−β３のフィット曲線に対応してＥＣ５０を導き、またｍＴＧＦ−β２−７Ｍのフィット曲線に対応してＩＣ５０を導く。
【図７ＡＢ】図７Ａ〜７Ｂ：ＴβＲＩ：ＴβＲＩＩ複合体のリガンド媒介性の会合についての、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ。（図７Ａ）Ｃ末端タグ、ならびにタグと会合する蛍光標識ドナーおよびアクセプタータンパク質を有する、ＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ：ＴβＲＩ複合体の構造。ＴβＲＩＩはＣ末端にヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を有し、Ｔｂ３＋−クリプテート標識抗ヘキサヒスチジンタグ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に結合する。ＴβＲＩはＣ末端にビオチン化されたａｖｉタグを有し、ＸＬ６６５標識ストレプトアビジン（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に結合する。ビオチン化された、ＴβＲＩ  Ｃ末端ａｖｉタグ中の単一リジン残基を「Ｋ−Ｂ」とする。（図７Ｂ）添加される示される成分からなる試料のＴＲ−ＦＲＥＴΔＦ値。全ての場合、緩衝液は、２５ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２ｎＭのＴｂ３＋−クリプテート標識抗ヘキサヒスチジンタグ抗体および３０ｎＭのＸＬ６６５標識ストレプトアビジンを含有した。ＴＲ−ＦＲＥＴΔＦは、４９０ｎｍでのドナー（Ｔｂ３＋−クリプテート）放出に対する、６６５ｎｍでのアクセプター（ＸＬ６６５）放出の比率に対応する。
【図８】本試験において使用するＴＧＦ−βのアミノ酸配列のアラインメント。図では、Ｎ末端メチオニン後の最初の残基が残基１となるように配列に付番している。
【図９ＡＢ】図９Ａ〜９Ｂ：ｍｍＴＧＦ−β２の二次構造予測およびバックボーンの１５Ｎ  Ｔ２弛緩時間。（図９Ａ）プログラムＰＥＣＡＮを使用し、バックボーンＨＮ、ＮＨ、ＣαおよびＣＯおよび側鎖Ｃβ原子に基づいて、二次構造予測を算出した。β鎖およびα−へリックスの予測を、それぞれ正および負の値としてプロットする。（図９Ｂ）１５Ｎ  Ｔ２弛緩時間を、残基数の関数としてプロットした。各グラフの上に示される二次構造は、ＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からのそれらに対応する。
【図１０ＡＢ】図１０Ａ〜１０Ｂ：ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの二次構造予測およびバックボーンの１５Ｎ  Ｔ２弛緩時間。（図１０Ａ）プログラムＰＥＣＡＮを使用し、バックボーンＨＮ、ＮＨ、ＣαおよびＣＯおよび側鎖Ｃβ原子に基づいて、二次構造予測を算出した。β鎖およびα−へリックスの予測を、それぞれ正および負の値としてプロットする。（図１０Ｂ）１５Ｎ  Ｔ２弛緩時間を、残基数の関数としてプロットした。各グラフの上に示される二次構造は、ＴＧＦ−β２（ＰＤＢ  ２ＴＧＩ）の結晶構造からのそれらに対応する。
【図１１】可逆的単量体−二量体モデルの、ｍＴＧＦ−β３の沈降速度実験への有限要素フィット。有限要素フィットにより重なり合った実験データを上部に示し、残余を下部に示す。
【図１２】可逆的単量体−二量体モデルの、ｍｍＴＧＦ−β２の沈降速度実験への有限要素フィット。有限要素フィットにより重なり合った実験データを上部に示し、残余を下部に示す。
【図１３】可逆的単量体−二量体モデルの、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの沈降速度実験への有限要素フィット。有限要素フィットにより重なり合った実験データを上部に示し、残余を下部に示す。
【図１４】ＴＧＦ−β：ＴβＲＩＩ：ＴβＲＩ複合体の会合を評価するためのＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ。テルビウム−クリプテート抗ヘキサヒスチジンタグ抗体ドナーフルオロフォアおよびストレプトアビジン−６６５アクセプターフルオロフォアの濃度を、それぞれ２ｎＭおよび３０ｎＭとした。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂ：ｍｍＴＧＦ−β２によるＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の阻害。一定濃度のＴＧＦ−β２（２０ｐＭ、図１５Ａ）またはＴＧＦ−β３（１０ｐＭ、図１５Ｂ）により、ならびにｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの濃度を増加させて処理した細胞におけるＴＧＦ−βルシフェラーゼ活性。実線はフィット曲線に対応し、ＩＣ５０を導く。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列表
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されるように、添付の配列表に列挙されるアミノ酸配列は、アミノ酸の標準的な３文字表記を使用して示される。配列表は、２０１７年１１月６日に作成の、１１．３ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、それは本明細書に参照により組み込まれる。添付の配列表の内容は以下のとおりである：
【００１６】
配列番号１は、野生型ヒトＴＧＦ−β１のアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号２は、野生型ヒトＴＧＦ−β２のアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号３は、野生型ヒトＴＧＦ−β３のアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号４は、Ｎ末端Ａｖｉタグを有するヒトＴＧＦ−β３のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号５は、ｍＴＧＦ−β２と称する操作されたヒトＴＧＦ−β２単量体のアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号６は、ｍＴＧＦ−β３と称する操作されたヒトＴＧＦ−β３単量体のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号７は、ｍｍＴＧＦ−β１と称する操作されたヒトＴＧＦ−β１単量体のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号８は、ｍｍＴＧＦ−β２と称する操作されたヒトＴＧＦ−β２単量体のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号９は、ｍｍＴＧＦ−β３と称する操作されたヒトＴＧＦ−β３単量体のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１０は、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍと称する操作されたヒトＴＧＦ−β２単量体のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１１は、Ｎ末端Ａｖｉタグを有するｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍのアミノ酸配列である。
【００２７】
詳細な説明
Ｉ．略号
ＡＵＣ  分析用超遠心法
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＥＣ５０  ５０％有効濃度
ＦＢＳ  ウシ胎児血清
ＩＣ５０  ５０％抑制濃度
ＮＭＲ  核磁気共鳴
ＲＵ  共鳴単位
ＳＰＲ  表面プラズモン共鳴
ＴβＲＩ  トランスフォーミング増殖因子−βＩ型受容体
ＴβＲＩＩ  トランスフォーミング増殖因子−βＩＩ型受容体
ＴＧＦ−β  トランスフォーミング増殖因子−β
ＴＲ−ＦＲＥＴ  時間分解蛍光共鳴エネルギー転移
【００２８】
ＩＩ．用語および方法
特に断りのない限り、専門用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin  Lewin、Genes  V、Oxford  University  Press刊、１９９４年（ISBN  0-19-854287-9）；Kendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、Blackwell  Science  Ltd.刊、１９９４年（ISBN  0-632-02182-9）；およびRobert  A.  Meyers（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference、VCH  Publishers,Inc.刊、１９９５年（ISBN  1-56081-569-8）に見出すことができる。
【００２９】
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語について以下の説明が提供される。
【００３０】
異常な（aberrant）（ＴＧＦ−βシグナル伝達）：異常な（abnormal）または調節不全のＴＧＦ−βシグナル伝達。本開示との関連において、「異常なＴＧＦ−βシグナル伝達」は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の過剰な（病理学的）活性化を指す。
【００３１】
投与：任意の有効な経路により、対象に治療剤（例えば組換えＴＧＦ−β）などの薬剤を提供する、または与えること。例示的な投与経路には、注射または注入（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、線条体内、頭蓋内および脊髄など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、経膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
接触：直接的な物理的結合に留置すること；固体および液体形態の両方が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ方法との関連において使用される場合、「接触」は投与も含む。
【００３３】
線維症：修復または反応過程中の臓器または組織における過剰な線維性結合組織の形成。線維症は、典型的には炎症または損傷の結果として、多くの異なる身体組織（心臓、肺および肝臓など）で生じ得る。線維性障害には、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、間質性肺疾患、肝硬変、腎線維症（糖尿病に起因する損傷由来など）、心房線維症、心内膜心筋線維症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄および強皮症が挙げられるが、これらに限定されない。線維症はまた、手術合併症、化学療法薬、放射線、傷害または熱傷の結果としても生じ得る。
【００３４】
融合タンパク質：２種類の異なる（異種の）タンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質。本明細書におけるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、タンパク質タグ、Ｆｃドメイン（ヒトＦｃドメインなど）またはアルブミンに融合されたＴＧＦ−β単量体を含む。
【００３５】
グリコシル化：アスパラギン（Ｎ−グリコシル化）、またはセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ−グリコシル化）への糖部分の共有結合の過程。グリコシル化のレベルおよびタイプは、組換え発現に使用される宿主生物によって異なり得る。新たなグリコシル化部位は、グリコシル化シークオンをタンパク質の溶媒曝露領域に導入して操作された配列であってもよい。例えば、Ｎ−グリコシル化シークオンＮＸ［Ｓ／Ｔ］が、本明細書に開示された特定の実施形態の配列内の１つまたは複数の場所で導入されてもよい。グリコシル化のタイプおよび程度を変えることは、溶解度、機能および半減期をモジュレートし、ならびに部位特異的な化学的結合を可能にする上で実用性を有する。
【００３６】
異種の：別個の遺伝源または種に由来すること。
【００３７】
単離された（isolated）：核酸、タンパク質（抗体を含む）またはオルガネラなどの「単離された」生物学的成分は、成分が天然に存在する環境（細胞など）における他の生物学的成分、すなわち、他の染色体ＤＮＡおよびＲＮＡならびに染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、およびオルガネラから実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。該用語はまた、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【００３８】
単量体：他の分子単位と結合して二量体またはポリマーを形成することができる単一分子単位（タンパク質など）。本開示との関連において、「ＴＧＦ−β単量体」は、野生型バージョンが他のＴＧＦ−β単量体に結合して二量体を形成することができる、単一ＴＧＦ−βポリペプチド鎖である。本明細書におけるいくつかの実施形態において、組換えＴＧＦ−β単量体は、二量体化を防ぐように操作されている。本明細書における他の実施形態において、直接二量体化を防ぐように操作されている組換えＴＧＦ−β単量体が、それ自体二量体化することができる異種タンパク質（例えば、ＩｇＧのＦｃドメイン）に融合され得る。
【００３９】
新生物、悪性腫瘍、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂の結果生じる組織または細胞の異常増殖である。新生物の増殖は、腫瘍をもたらす可能性がある。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲組織に浸潤する腫瘍および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。
【００４０】
ＰＥＧ化：薬物、治療用タンパク質または小胞などの分子およびマクロ構造への、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合および非共有結合の両方または融合の過程であり、次いでＰＥＧ化（またはペグ化）と呼ばれる。ＰＥＧ化は、標的分子とのＰＥＧの反応性誘導体のインキュベーションにより日常的に達成される。薬物または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合は、宿主の免疫系から薬剤をマスクし（免疫原性および抗原性の低減）、薬剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させることができ、腎クリアランスを低下させることにより循環時間を延長させる。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬物およびタンパク質に水溶性を与えることもできる。
【００４１】
ペプチドまたはポリペプチド：単量体がアミド結合を通じて連結しているアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のどちらかが使用され得、Ｌ−異性体が好ましい。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、任意のアミノ酸配列を包含し、修飾グロブリンタンパク質を含む修飾配列を含むことが意図される。用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質、および組換えによりまたは合成的に産生されるものを含むことが特に意図される。
【００４２】
保存的アミノ酸置換は、なされた場合、元のタンパク質の特性を妨げることが最も少ない、すなわち、タンパク質の構造および特に機能が保存され、そのような置換により大幅に変更されない置換である。保存的置換の例を以下に示す。
【表５】
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【００４３】
保存的置換は、（ａ）例えば、シート構造もしくはヘリックス構造としての、置換エリアのポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を概ね維持する。
【００４４】
一般に、タンパク質特性に最大の変化をもたらすことが予想される置換は、非保存的な、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンに（または、によって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に（または、によって）置換される；（ｃ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジンが、負電荷残基、例えば、グルタミンまたはアスパラギン酸に（または、によって）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を持たないもの、例えば、グリシンに（または、によって）置換される変化となる。
【００４５】
薬学的に許容される担体：有用な薬学的に許容される担体は、従来的なものである。E.W.  MartinによるRemington's  Pharmaceutical  Sciences、Mack  Publishing  Co.、Easton、PA、第１５版、１９７５年は、本明細書に開示された組成物の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。
【００４６】
一般に、担体の性質は、使用されている特定の投与方法に依存する。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料、およびｐＨ緩衝剤等（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）などの微量の非毒性補助物質を含有し得る。
【００４７】
疾患の予防（preventing）、処置（treating）または改善（ameliorating）：疾患の「予防」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置」は、疾患または病態が発症し始めた後に、腫瘍負荷の低減または転移サイズの数の減少など、疾患または病態の徴候または症状を改善する治療介入を指す。「改善」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
【００４８】
組換え：組換え核酸またはタンパク質は、天然に存在しない配列を有する、または２つの、さもなければ別々の配列セグメントの人工的組合せにより作られた配列を有するものである。この人工的組合せは、核酸の単離されたセグメントの化学合成または人工的操作により、例えば、遺伝子操作技法によりしばしば達成される。組換えという用語は、天然の核酸分子またはタンパク質の一部の付加、置換、または欠失により変更されている核酸およびタンパク質を含む。
【００４９】
配列同一性／類似性：２つもしくはそれよりも多くの核酸配列間、または２つもしくはそれよりも多くのアミノ酸配列間の同一性は、配列間の同一性または類似性によって表される。配列同一性は、同一性パーセンテージによって測定することができ、パーセンテージが高いほど配列はより同一である。配列類似性は、（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）類似性パーセンテージによって測定することができ、パーセンテージが高いほど配列はより類似している。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用して整列される場合、比較的高程度の配列同一性／類似性を有する。オーソロガスタンパク質またはｃＤＮＡが、関係がより近い種（ヒトとマウスの配列など）に由来する場合、関係がより遠い種（ヒトとＣ．ｅｌｅｇａｎｓの配列など）と比べて、この相同性はより顕著である。
【００５０】
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが記載されている：SmithおよびWaterman、Adv.  Appl.  Math.  ２巻：４８２頁、１９８１年；NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.  ４８巻：４４３頁、１９７０年；PearsonおよびLipman、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、Gene、７３巻：２３７〜４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、CABIOS  ５巻：１５１〜３頁、１９８９年；Corpetら、Nuc.  Acids  Res.  １６巻：１０８８１〜９０頁、１９８８年；Biosciences  ８巻、１５５〜６５頁、１９９２年のHuangら  Computer  Appls.；およびPearsonら、Meth.  Mol.  Bio.  ２４巻：３０７〜３１頁、１９９４年。Altschulら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年は、配列アライメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示している。
【００５１】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出すことができる。
【００５２】
対象：ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含むカテゴリーである脊椎生物を含む、生きている多細胞生物。
【００５３】
タグ：標識、検出または精製目的などのために、タンパク質または核酸に付加することができる分子。いくつかの実施形態において、タグはタンパク質タグである。いくつかの実施形態において、タンパク質タグは、親和性タグ（例えば、Ａｖｉタグ、ヘキサヒスチジン、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−転移酵素）、エピトープタグ（例えば、Ｖ５、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡまたはＦＬＡＧ）または蛍光タグ（例えば、ＧＦＰまたは別の周知の蛍光タンパク質）である。
【００５４】
治療有効量：処置されている対象において所望の効果を得るのに十分な、化合物または組成物、例えば、組換えＴＧＦ−β単量体の分量。例えば、これは、細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害または遮断するのに必要な量であってもよい。
【００５５】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）：増殖、細胞分化、およびいくつかの他の細胞機能を制御する、分泌された多機能性タンパク質。多くの細胞がＴＧＦ−βを合成し、ほとんど全ての細胞がＴＧＦ−βの受容体を発現する。用語「ＴＧＦ−β」は、それぞれ、遺伝子ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３によりコードされる３つの異なるタンパク質アイソフォーム、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を指す。
【００５６】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路：細胞増殖、分化およびアポトーシスなどの多くの細胞プロセスに関与するシグナル伝達経路。ＴＧＦ−β経路のメンバーには、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３ならびにＴＧＦ−β受容体Ｉ型およびＴＧＦ−β受容体ＩＩ型が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ＴＧＦ−β受容体：用語「ＴＧＦ−β受容体」は、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型（ＴＧＦＢＲ１によりコードされた）およびＴＧＦ−β受容体ＩＩ型（ＴＧＦＢＲ２によりコードされた）を含む。ＴＧＦ−β受容体は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。Ｉ型およびＩＩ型ＴＧＦ−β受容体は、ＴＧＦ−βに結合するとヘテロ二量体複合体を形成し、細胞表面から細胞質へＴＧＦ−βシグナルを伝達する。
【００５８】
特に説明のない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む（comprising）」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載れる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００５９】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
本明細書に開示されるのは、二量体化およびＩ型受容体結合を阻害するが、高親和性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）に結合する能力を保持するように修飾された組換えトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β単量体である。本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体は、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達により特徴付けられる疾患または障害、例えば線維性障害、眼疾患、特定のタイプのがん、または結合組織の遺伝性障害の処置などのために、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害するのに使用することができる。さらに、組換えＴＧＦ−β単量体をコードする核酸分子は、組換えタンパク質を過剰産生するようにＴ細胞を再プログラムするのに使用することができる。組換えＴＧＦ−β単量体を過剰発現するように操作されたＴ細胞は、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達により特徴付けられる疾患または障害の処置などのために、遺伝子治療用途において使用することができる。
【００６０】
本明細書で提供されるのは、アミノ酸残基７７におけるシステインからセリンへの置換（配列番号２に関して）；アミノ酸残基５２〜７１の欠失（配列番号２に関して）；および単量体の正味電荷を増加させる、野生型ＴＦＧ−β単量体と比べて少なくとも１個のアミノ酸置換（例えば、欠失残基の近位の置換）を含む組換えＴＧＦ−β単量体である。システインからセリンへの置換は、ＴＧＦ−β単量体間のジスルフィド結合形成を防ぐ。アミノ酸残基５２〜７１の欠失は、α−ヘリカル３（α３）領域（主要な二量体化モチーフ）、およびいくつかのフランキング残基（図１Ｄ）を除去する。残基５２〜７１が除去されると、残りの残基は極性残基および電荷残基を含有するループを形成する（図１Ｄおよび２Ｂ）。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β単量体は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物ＴＧＦ−β単量体である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β単量体は、ＴβＲＩＩに対するＴＧＦ−β単量体の親和性を高める、野生型ＴＦＧ−β２単量体と比べて少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β単量体は、ヒトＴＧＦ−β２単量体である。いくつかの例において、ヒトＴＧＦ−β２単量体の正味電荷を増加させる少なくとも１個のアミノ酸置換には、残基５１におけるロイシンからアルギニンへの置換；残基７３におけるアラニンからリジンへの置換；または残基５１におけるロイシンからアルギニンへの置換および残基７３におけるアラニンからリジンへの置換の両方が挙げられる（配列番号２に関して）。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＴβＲＩＩに対するヒトＴＧＦ−β２単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換には、配列番号２の残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９に対応するアミノ酸残基、またはそれらの２つもしくはそれよりも多い残基の任意の組合せにおける置換が挙げられる。いくつかの例において、ＴβＲＩＩに対する単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換は、残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７における少なくとも１個の置換、および残基８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９における少なくとも１個の置換を含む。特定の例において、ＴβＲＩＩに対するヒトＴＧＦ−β２単量体の親和性を高める少なくとも１個のアミノ酸置換には、残基２５におけるリジンからアルギニン、残基２６におけるアルギニンからリジン、残基８９におけるロイシンからバリン、残基９２におけるイソロイシンからバリン、残基９４におけるアスパラギンからアルギニン、残基９５におけるスレオニンからリジン、残基９８におけるイソロイシンからバリン、またはそれらの２つもしくはそれよりも多い、例えば、３つもしくはそれよりも多い、４つもしくはそれよりも多い、５つまたはそれよりも多い、または６つまたはそれよりも多い任意の組合せが挙げられる。１つの非限定的な例において、組換えヒトＴＧＦ−β２単量体は、残基２５におけるリジンからアルギニン、残基２６におけるアルギニンからリジン、残基８９におけるロイシンからバリン、残基９２におけるイソロイシンからバリン、残基９４におけるアスパラギンからアルギニン、残基９５におけるスレオニンからリジン、および残基９８におけるイソロイシンからバリンを含む。
【００６５】
いくつかの例において、ヒトＴＧＦ−β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号８または配列番号１０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。場合によっては、ヒトＴＧＦ−β２単量体は、配列番号８または配列番号１０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、保存的アミノ酸置換のみを含有する。特定の非限定的な例において、ヒトＴＧＦ−β２単量体のアミノ酸配列は、配列番号８もしくは配列番号１０を含む、または配列番号８もしくは配列番号１０からなる。
【００６６】
他の実施形態において、組換えＴＧＦ−β単量体は、ヒトＴＧＦ−β１単量体である。いくつかの例において、ヒトＴＧＦ−β１単量体の正味電荷を増加させる少なくとも１個のアミノ酸置換には、残基５１におけるイソロイシンからアルギニンへの置換；残基７４におけるアラニンからリジンへの置換；残基７５におけるアラニンからセリンへの置換；または残基５１におけるイソロイシンからアルギニンへの置換、残基７４におけるアラニンからリジンへの置換、および残基７５におけるアラニンからセリンへの置換が挙げられる（配列番号１に関して）。
【００６７】
いくつかの例において、ヒトＴＧＦ−β１単量体のアミノ酸配列は、配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。場合によっては、ヒトＴＧＦ−β１単量体は、配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、保存的アミノ酸置換のみを含有する。特定の非限定的な例において、ヒトＴＧＦ−β１単量体のアミノ酸配列は、配列番号７を含む、または配列番号７からなる。
【００６８】
他の実施形態において、組換えＴＧＦ−β単量体は、ヒトＴＧＦ−β３単量体である。いくつかの例において、ヒトＴＧＦ−β３単量体の正味電荷を増加させる少なくとも１個のアミノ酸置換には、残基５１におけるロイシンからグルタミン酸への置換；残基７２におけるアラニンからグルタミン酸への置換；残基７４におけるアラニンからアスパラギン酸への置換；または残基５１におけるロイシンからグルタミン酸への置換、残基７２におけるアラニンからグルタミン酸への置換、および残基７４におけるアラニンからアスパラギン酸への置換が挙げられる（配列番号３に関して）。
【００６９】
いくつかの例において、ヒトＴＧＦ−β３単量体のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。場合によっては、ヒトＴＧＦ−β３単量体は、配列番号９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、保存的アミノ酸置換のみを含有する。特定の非限定的な例において、ヒトＴＧＦ−β３単量体のアミノ酸配列は、配列番号９を含む、または配列番号９からなる。
【００７０】
本明細書におけるいくつかの実施形態において、組換えＴＧＦ−β単量体は、ＰＥＧ化、グリコシル化、高グリコシル化され、または循環時間を延長させる別の修飾を含む。
【００７１】
また、本明細書で提供されるのは、ＴＧＦ−β単量体および異種タンパク質を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質はタンパク質タグである。いくつかの例において、タンパク質タグは、親和性タグ（例えば、Ａｖｉタグ、ヘキサヒスチジン、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−転移酵素）、エピトープタグ（例えば、Ｖ５、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡまたはＦＬＡＧ）または蛍光タグ（例えば、ＧＦＰまたは別の周知の蛍光タンパク質）である。他の実施形態において、異種タンパク質は、マウスまたはヒトＦｃドメインなどのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、異種タンパク質は、融合タンパク質のホモ二量体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３由来のＦｃドメイン）、ヘテロ二量体（例えば、操作されたＦｃドメイン、Ｅ／Ｋコイルドコイル）、または多量体（例えば、ペンタボディ、ナノ粒子）状態への分子間会合を促進する。他の実施形態において、異種タンパク質は、アルブミン、アルブミン結合タンパク質もしくは薬剤、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β単量体の循環時間を増大させる別のタンパク質である。
【００７２】
また、提供されるのは、放射線療法剤、化学療法のための細胞傷害剤、または薬物を含む組換えＴＧＦ−β単量体または融合タンパク質である。さらに提供されるのは、イメージング剤、蛍光色素、または蛍光タンパク質タグを含む組換えＴＧＦ−β単量体または融合タンパク質である。
【００７３】
さらに本明細書で提供されるのは、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体または融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物などの組成物である。
【００７４】
また、本明細書で提供されるのは、細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する方法である。いくつかの実施形態において、方法は、細胞を、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物と接触させることを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。
【００７６】
他の実施形態において、方法はｉｎ  ｖｉｖｏ方法である。いくつかの例において、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法は、組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物を、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を有する対象に投与することを含む。いくつかの例において、組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内または腫瘍内注射などの注射により投与される。
【００７７】
また、提供されるのは、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を処置する方法である。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体、融合タンパク質または組成物を対象に投与することを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、間質性肺疾患、肝硬変、腎線維症（糖尿病に起因する損傷由来など）、心房線維症、心内膜心筋線維症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、強皮症、または手術合併症、化学療法薬、放射線、傷害もしくは熱傷に起因する線維症などの線維性障害であるが、これらに限定されない。
【００７９】
他の実施形態において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、乳がん、脳がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、膀胱がん、肝臓がん、卵巣がん、腎臓がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胃がん、皮膚がん（悪性黒色腫など）、または甲状腺がんである。
【００８０】
他の実施形態において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、眼疾患である。
【００８１】
他の実施形態において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、結合組織の遺伝性障害である。
【００８２】
さらに提供されるのは、本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体をコードする単離された核酸分子である。いくつかの実施形態において、核酸分子は、Ｔ細胞特異的プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。
【００８３】
また、提供されるのは、ＴＧＦ−β単量体コード核酸分子を含むベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【００８４】
本明細書に開示された組換えＴＧＦ−β単量体をコードする核酸分子またはベクターを含む単離されたＴ細胞などの（但し、これに限定されない）、単離された細胞がさらに提供される。細胞は、対象にとって自己であってもよく、または細胞は、異種（同種）であってもよい。単離された細胞および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。
【００８５】
さらに提供されるのは、対象における異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害を処置する方法である。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に開示された核酸分子、ベクターまたは単離された細胞を対象に投与することを含む。いくつかの例において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、線維性障害である。他の例において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、乳がん、脳がん、膵臓がん、前立腺がんまたは皮膚がんである。他の例において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、眼疾患である。さらなる他の例において、異常なＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する疾患または障害は、結合組織の遺伝性障害である。
【００８６】
ＩＶ．操作されたＴＧＦ−β単量体の投与
組換えヒトＴＧＦ−β単量体または融合タンパク質を含む、医薬組成物などの組成物が本明細書で提供される。また、提供されるのは、組換えヒトＴＧＦ−β単量体をコードするベクターを含む、Ｔ細胞などの単離された細胞を含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【００８７】
本開示において有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は、従来的なものである。例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、The  University  of  the  Sciences  in  Philadelphia、編者Lippincott、Williams、およびWilkins、Philadelphia、PA、第２１版（２００５年）参照。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等などの薬学的および生理学的に許容される流体媒体である注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）に関して、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料、ｐＨ緩衝剤等（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）などの微量の非毒性補助物質を含有し得る。含まれ得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物などの他のタンパク質である。
【００８８】
細胞の投与に関して、様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水等が、細胞を導入するために使用され得る。これらの溶液は滅菌であり、一般的に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法により滅菌することができる。組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる場合、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等）などの薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。これらの製剤における濃度は大きく異なり得、選択される特定の投与方法および対象のニーズに従って、主として流体体積、粘度、体重等に基づき選択される。
【００８９】
組成物の剤形は、選択された投与方法により決定される。例えば、注射可能な流体に加えて、局所、吸入、経口および座薬製剤が使用されてもよい。局所調製物には、点眼薬、軟膏、スプレー、パッチ等が挙げられ得る。吸入調製物は、液体（例えば、溶液または懸濁液）であってもよく、およびミスト、スプレー等が挙げられ得る。経口製剤は、液体（例えば、シロップ、溶液または懸濁液）、または固体（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル）であってもよい。座薬調製物も、固体、ゲル、または懸濁形態であってもよい。固体組成物に関して、従来の非毒性固体担体には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または当業者に明らかとなるであろう。
【００９０】
組換えヒトＴＧＦ−β単量体を含む、医薬組成物などの組成物は、正確な投与量の個々の投与に適した単位剤形で製剤化することができる。投与されるＴＧＦ−β単量体の量は、処置されている対象、病気の重症度、および投与態様によって決まり、処方医師の判断に委ねるのが最良である。これらの範囲内で、投与される製剤は、処置されている対象において所望の効果を達成するのに有効な量で活性成分の量を含有する。
【００９１】
ＴＧＦ−β単量体、またはその組成物は、それらが有効であるヒトまたは他の動物の組織に、局所、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔内、皮下、吸入または座薬などの様々な態様で投与することができる。特定の投与方法および投与レジメンは、症例の詳細（例えば、当該対象、疾患、病状、および処置が予防的であるかどうか）を考慮して、担当医師によって選択される。処置は、数日間から数ヶ月間、またはさらには数年間にわたる化合物の１日用量または複数の１日用量を必要とし得る。
【００９２】
以下の例は、特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの例は、記載された特定の特徴または実施形態に本開示を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
ドミナントネガティブとして機能するためにＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断する操作されたＴＧＦ−β単量体
本実施例は、ＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断できる操作されたＴＧＦ−β単量体を記載する。本明細書においてｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍと称する操作されたＴＧＦ−β単量体には、野生型の二量体ＴＧＦ−β２の単量体と比較して以下の３つの変化を有する：
（１）鎖間ジスルフィドを通常は形成するシステイン（Ｃｙｓ７７）がセリンにより置換された（図１Ｄ）；
（２）α３へリックスが除去され、極性および荷電残基を担持する短いループで置き換えられた（図１Ｄ）；
（３）ＴＧＦ−β２に対して７つの残基が置換され、これにより高親和性でのＴβＲＩＩ結合が可能になった（図１Ｅ）。
【００９４】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの特徴および本明細書に開示される他の操作されたＴＧＦ−βバリアントを以下に記載し、表１に列挙する。全ての操作されたＴＧＦ−βバリアントの配列を図８に示し、配列番号１〜１１として示す。
【００９５】
背景
以前の試験では、野生型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３単量体（鎖間ジスルフィドを通常は形成するシステイン残基Ｃｙｓ７７がセリンに置換される、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３単量体）が、天然のジスルフィド結合したホモ二量体と比較して約１０分の１〜１５分の１の効力であるにもかかわらず、約１５０ｐＭの中間点刺激強度（ＥＣ５０）と、顕著なシグナル伝達活性を保持していることを示した（Amatayakul-Chantlerら、J  Biol  Chem  ２６９巻：２７６８７〜２７６９１頁、１９９４年；Zunigaら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年）。
【００９６】
構造的研究に基づいた場合、増殖因子と結合する２つの不可欠な受容体のうちの１つであるＴＧＦ−βＩ型受容体（ＴβＲＩ）が、ＴＧＦ−βホモ二量体界面にまたがることによって結合することが示された（図１Ａ）（Groppeら、Mol  Cell  ２９巻：１５７〜１６８頁、２００８年）ため、ＴＧＦ−β１  Ｃｙｓ７７→ＳｅｒおよびＴＧＦ−β３  Ｃｙｓ７７→Ｓｅｒバリアントがなぜかかる顕著なシグナル伝達活性を保持するかが明確にならなかった。
【００９７】
ＴＧＦ−β単量体が非共有結合で二量化し、受容体に結合することによりシグナル伝達し、その結果（受容体のうちの少なくとも１つであるＴβＲＩが二量体界面全体に結合するという事実により）非共有結合性二量体を安定化させると仮定した。ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の刺激物質よりもむしろ、阻害剤として機能するＴＧＦ−β単量体を得るため、主要な二量体化モチーフである界面のα−ヘリックス（α３）を柔軟なループで置き換えた操作された単量体を産生した（図１Ａおよび１Ｄ）。これが、（ａ）疎水性の接触のため単量体が非共有結合的に二量化する可能性を制限し（図１Ｂ）、また（ｂ）ＴＧＦ−ベータ二量体界面にまたがることによって結合するＴＧＦ−βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のための接触面の大部分を除去する（図１Ｃ）ことにより、ＴＧＦ−βが二量体化してＴβＲＩを動員する能力を妨害すると考えられた。
【００９８】
方法
タンパク質の発現および精製
安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、プロドメインと結合した分泌タンパク質としてＴＧＦ−β１を発現させた。ＴＧＦ−β１を産生するために用いる細胞系、およびそれに続く馴化培地からの成熟型のジスルフィド結合したＴＧＦ−β１ホモ二量体を単離する方法は、先行文献に記載されている（ZouおよびSun、Protein  Expr  Purif  ３７巻、２６５〜２７２頁、２００４年）。ヒトホモ二量体ＴＧＦ−β２（ＴＧＦ−β２）、ヒトホモ二量体ＴＧＦ−β３（ＴＧＦ−β３）、ならびに、ａｖｉタグを有する（CullおよびSchatz、Methods  Enzymol  ３２６巻、４３０〜４４０頁、２０００年）ホモ二量体ＴＧＦ−β３（ＴＧＦ−β３−ａｖｉ）、単量体ＴＧＦ−β２（ｍＴＧＦ−β２）、単量体ＴＧＦ−β２（ｍＴＧＦ−β３）、ミニ単量体ＴＧＦ−β１（ｍｍＴＧＦ−β１）、ミニ単量体ＴＧＦ−β２（ｍｍＴＧＦ−β２）、ミニ単量体ＴＧＦ−β３（ｍｍＴＧＦ−β３）、高い親和性でのＴβＲＩＩ結合を可能にする７つの置換を有するミニ単量体ＴＧＦ−β２（ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ）、および高い親和性でのＴβＲＩＩ結合を可能にする７つの置換を有するａｖｉタグを有する（CullおよびSchatz、Methods  Enzymol  ３２６巻、４３０〜４４０頁、２０００年）ミニ単量体ＴＧＦ−β２（ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ）を含むバリアントを、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて発現させ、封入体から天然のフォールディング状態のジスルフィド結合したホモ二量体（ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β３−ａｖｉ）または単量体（ｍＴＧＦ−β１、ｍＴＧＦ−β２、ｍＴＧＦ−β３、ｍｍＴＧＦ−β１、ｍｍＴＧＦ−β２、ｍｍＴＧＦ−β３、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ−ａｖｉ）にリフォールディングさせ、文献の記載（HuangおよびHinck、Methods  Mol  Biol  １３４４巻、６３〜９２頁、２０１６年）に従い、高分解能カチオン交換クロマトグラフィーを使用して均一に精製した（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。本試験において使用する二量体および単量体ＴＧＦ−βの命名および主要な特徴を表１にまとめ、全配列を図８に示す。
【００９９】
【表１−１】
2020500511.tif 000004
【表１−２】
2020500511.tif 000005
【０１００】
成熟型受容体の残基１〜１０１にわたるヒトＴβＲＩ外部ドメイン（ＴβＲＩ）、または成熟型受容体の残基１〜８８にわたる、１５のアミノ酸ａｖｉタグ（CullおよびSchatz、Methods  Enzymol  ３２６巻、４３０〜４４０頁、２０００年）をＣ末端に有するバリアント（ＴβＲＩ−ΔＣ−Ａｖｉ）をＥ．Ｃｏｌｉにおいて発現させ、前述したように封入体からリフォールディングし、均一に精製した（Zunigaら、J  Mol  Biol  ３５４巻、１０５２〜１０６８頁、２００５年）。成熟型受容体の残基１５〜１３６にわたるヒトＴβＲＩＩ外部ドメイン（ＴβＲＩＩ）、またはそのＣ末端にヘキサヒスチジンタグを有するもの（ＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ）をＥ．Ｃｏｌｉにおいて発現させ、前述したように封入体からリフォールディングし、均一に精製した（Hinckら、J  Biomol  NMR  １８巻、３６９〜３７０頁、２０００年）。  
【０１０１】
溶解度アッセイ
ＴＧＦ−β二量体および単量体を、１００ｍＭ酢酸中で３００μＭまたはそれよりも高い濃度に濃縮し、１００ｍＭの酢酸またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に所定の濃度に希釈した。ＰＢＳに希釈した試料のｐＨを、ＮａＯＨの小アリコートを用いて最終ｐＨが７．４となるよう調整した。３４０ｎｍの試料の光散乱を、ＨＰ  ８４５２ダイオードアレイ分光光度計（ＨＰ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して測定した。試料をマイクロチューブへ移し、５分間２００００×ｇで遠心分離し、上清の２８０ｎｍの吸光度をＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定した。溶解度アッセイの結果を、図４Ａ〜４Ｄに示す。
【０１０２】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定
０．１％（ｗ／ｖ）の１５ＮＨ４Ｃｌ、または０．１％（ｗ／ｖ）の１５ＮＨ４Ｃｌおよび０．０３％（ｗ／ｖ）の１３Ｃ標識グルコースを含有するＭ９培地で細菌細胞を増殖させることにより、ＮＭＲ用の１５Ｎ、または１５Ｎおよび１３Ｃで放射性同位元素標識したｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの試料を調製した。全てのＮＭＲ試料を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭの３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、５％の２Ｈ２Ｏ、０．０２％のｗ／ｖアジ化ナトリウム中、０．２ｍＭ〜０．４ｍＭのタンパク質濃度で、ｐＨ４．７において調製した。全てのＮＭＲデータを、３７℃の試料温度で、７００または８００ＭＨｚで得た。高感度ＨＮＣＡＣＢ（WittekindおよびMueller、J  Magn  Reson  Ser  B  １０１巻：２０１〜２０５頁、１９９３年）、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ（Grzesiekら、J  Magn  Reson  Ser  B  １０１巻：１１４〜１１９頁、１９９３年）、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ（GrzesiekおよびBax、J  Biomol  NMR  ３巻：１８５〜２０４頁、１９９３年）、ＨＮＣＯ（Kayら、J  Magn  Reson  ８９巻：４９６〜５１４頁、１９９０年）により回収および分析し、１３Ｃ、１５Ｎ捕捉グリッドの位置において２５％のノンユニフォームサンプリング（ＮＵＳ）を有するデータセットとして、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍのバックボーン共鳴割り当てを得た。先行文献（Kayら、Biochemistry  ２８巻：８９７２−８９７９頁、１９８９年）に記載の１Ｈ検出パルス方式を使用して、７０．９５ＭＨｚの１５Ｎ周波数、３００°Ｋで、インターリービング方式でバックボーンアミド１５Ｎ  Ｔ２弛緩パラメータを測定した。１６〜１９２ｍｓで変化させる８〜１０の遅延時間を使用し、各Ｔ２データセットを回収した。Ｔ２遅延時間の関数としての相対ピークの強度を、指数関数的に壊変する２つのパラメータにフィットさせて、Ｔ２弛緩時間を得た。ＮＭＲＰｉｐｅを使用し、ＮＵＳデータセットの１３Ｃおよび１５Ｎディメンジョンのミッシングポイントの予測に用いられるＳＭＩＬＥアルゴリズム（Yingら、J.  Biomol.  NMR  ２０１６年）によりデータ処理した（Delaglioら、J  Biomol  NMR  ６巻：２７７〜２９３頁、１９９５年）。データ解析は、ＮＭＲＦＡＭ−ＳＰＡＲＫＹを使用して実行した（Leeら、Bioinformatics  ３１巻：１３２５〜１３２７頁、２０１５年）。
【０１０３】
ＳＰＲ結合測定
図３Ａ〜３Ｂに示されるＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２を用いたＳＰＲ測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００  ＳＰＲ（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）装置を使用して実行し、その際、ＣＭ５センサーチップ（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の表面上に、アミン（カルボジイミドベースの）カップリングキット（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用し、ＴＧＦ−β２またはｍｍＴＧＦ−β２を直接固定化した。ＴＧＦ−β３およびｍｍＴＧＦ−β２−７ｍを用いた、図３Ｃ、３Ｅおよび３Ｇ、ならびに図３Ｄ、３Ｆおよび３Ｈにそれぞれ示すＳＰＲ実験は、ストレプトアビジンコーティングされたＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上へ、適度な密度（５０〜２００ＲＵ）でビオチン化リガンドを捕捉させたＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｘ１００  ＳＰＲ装置（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して実行した。Ｎ末端の１５アミノ酸のａｖｉタグを有するＴＧＦ−β３またはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを発現させることによって、ビオチン化ＴＧＦ−β３またはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを作製した（CullおよびSchatz、Methods  Enzymol  ３２６巻、４３０〜４４０頁、２０００年）。ＴＧＦ−β３−ａｖｉまたはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ−ａｖｉを、ｐＨ８．０で１０ｍＭのビシン中でＴβＲＩＩと結合させ、細菌にて発現させた触媒量のＢｉｒＡリコンビナーゼ、ビオチンおよびＡＴＰと、記載（HuangおよびHinck、Methods  Mol  Biol  １３４４巻、６３〜９２頁、２０１６年）に従い、３７℃で２時間、インキュベートすることによってビオチン化した。ビオチン化されたａｖｉタグ付きＴＧＦ−β３またはａｖｉタグ付きＴＧＦ−β２−７ｍを、９４．９％の水／５％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸で平衡化したＣ４逆相カラムと結合させ、アセトニトリルの直線勾配によって溶出させた。
【０１０４】
図３Ａ〜３Ｅに示すＳＰＲ測定は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において、示される濃度範囲にわたる２倍希釈系列で示される受容体を注入して実施した。注入は２度行い、実験の開始時に１０の緩衝液ブランクの注入を含めた。結合は、１００ｍＬ／分の流速で、２〜３分間会合させ、続いて１分間またはそれよりも長く解離させて行った。各注入サイクル後、１０ｍｌの４Ｍのグアニジン・ＨＣｌ、２ＭのＮａＣｌにより再生させた。プログラムＳｃｒｕｂｂｅｒ２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用しブランクフローセルおよび緩衝液ブランクによる応答を減算してデータを処理した。データの動態フィッティングは、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２による、単純１：１結合モデルの仮定にて実行した。図３Ｇおよび３Ｈに示すＳＰＲ測定を同様に実行したが、その際、２μＭのＴβＲＩＩをランニング緩衝液および注入試料中に含有させた。ＳＰＲ測定の結果を表２および図３Ａ〜３Ｈに示す。
【０１０５】
【表２】
2020500511.tif 000006
【０１０６】
結晶化、構造決定および精密化
ｍｍＴＧＦ−β２の結晶は、２５℃で、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）中の７．９ｍｇ／ｍＬのタンパク質ストック液０．２μＬを、０．２μＬのウェルからの沈殿液、２０％のＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍのチオシアン酸ナトリウムと混合し、シッティングドロップにて形成させた。回収した結晶を、過剰な母液を除いた小さいナイロンループに装着し、データ収集前に、液体窒素でフラッシュ冷却した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＮＥ−ＣＡＴビームライン２４−ＩＤ−Ｃでデータを得、集積し、ＸＤＳ（Kabsch、Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  ６６巻、１２５〜１３２頁、２０１０年）を使用して解析した。サーチモデルとしてＰＤＢエントリー２ＴＧＩ（Daopinら、Science  ２５７巻、３６９〜３７３頁、１９９２年）の短縮バージョンを使用し、ＰＨＡＳＥＲ（McCoyら、J  Appl  Crystallogr  ４０巻、６５８〜６７４頁、２００７年）において実施される分子置換法により構造を決定した。座標はＰＨＥＮＩＸ（Adamsら、Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  ６６巻、２１３〜２２１頁、２０１０年）を使用して精密化し、その際、ねじれ角力学とのシミュレーテッドアニーリングを行い、またＣＯＯＴ（Emsleyら、Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  ６６巻、４８６〜５０１頁、２０１０年）を使用した手動リビルディングに置き換えた。データ収集および精密化統計処理を表３に示す。
【０１０７】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ複合体の結晶は、２５℃で、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）中の複合体の７．４ｍｇ／ｍＬストック液１．０μＬを、１．０μＬの０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、６０％のｖ／ｖ（＋／−）−２−メチル−２，４−ペンタンジオールと混合し、懸滴にて形成させた。回収した結晶をナイロンループに装着し、データ収集前に、液体窒素でフラッシュ冷却した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ２４−ＩＤ−Ｃでデータを得、集積し、ＨＫＬ２０００（OtwinowskiおよびMinor、Method  Enzymol  ２７６巻、３０７〜３２６頁、１９９７年）を使用して解析した。サーチモデルとしてＴβＲＩＩ（PDB  1M9Z；Boesenら、Structure  １０巻、９１３〜９１９頁、２００２年）およびｍｍＴＧＦ−β２を使用し、ＰＨＡＳＥＲ（McCoyら、J  Appl  Crystallogr  ４０巻、６５８〜６７４頁、２００７年）において実施される分子置換法により構造を決定した。座標はＰＨＥＮＩＸ（Adamsら、Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  ６６巻、２１３〜２２１巻、２０１０年）を使用して精密化し、その際、ＣＯＯＴ（Emsleyら、Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  ６６巻、４８６〜５０１頁、２０１０年）を使用した手動リビルディングに置き換えた。データ収集および精密化統計処理を表３に示す。
【０１０８】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの結晶は、２５℃で、２０ｍＭの酢酸中の１０ｍｇ／ｍＬタンパク質ストック液１．０μＬを、０．８μＬのウェルからの沈殿液、１００ｍＭの酢酸ナトリウム二塩基性三水和物（ｐＨ４．６）、２５％の２−プロパノールおよび４００ｍＭの無水塩化カルシウム、ならびに０．２μＬの５％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドと混合し、懸滴にて形成させた。回収した結晶をナイロンループに装着し、２０％のグリセロールを含むウェル緩衝液中で低温保存し、窒素流においてフラッシュ冷却した。１００Ｋにおいて、Ｓａｔｕｒｎ  ９４４  ＣＣＤ検出器を備えたＲｉｇａｋｕ  ＦＲ−Ｅ  Ｓｕｐｅｒｂｒｉｇｈｔ発生器を使用してデータを収集し、ＣＣＰ４（Winnら、Acta  Crystallogr  D  ６７巻、２３５〜２４２頁、２０１１年）においてＭＯＳＦＬＭを使用して処理した（Battyeら、Acta  Crystallogr  D  ６７巻、２７１〜２８１頁、２０１１年）。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの構造は、共結晶構造に由来するｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの構造を使用し、ＴβＲＩＩで分子置換することにより解析された。反復モデルの構築および精密化は、それぞれＣＯＯＴ（Emsleyら、Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  ６６巻、４８６〜５０１頁、２０１０年）およびＰＨＥＮＩＸを使用して実行した。データ収集および精密化統計処理を表３に示す。
【０１０９】
構造解析の結果を、図２Ａ〜２Ｄ、５Ａ〜５Ｅ、９Ａ〜９Ｂおよび１０Ａ〜１０Ｂに示す。
【０１１０】
【表３−１】
2020500511.tif 000007
【表３−２】
2020500511.tif 000008
【０１１１】
ルシフェラーゼアッセイ
ＣＡＧＡ１２  ＴＧＦ−βレポーターにより安定にトランスフェクトしたヒト胎生期腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、ルシフェラーゼレポーターアッセイに使用した（Thiesら、Growth  Factors  １８巻：２５１〜２５９頁、２００１年）。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、安定にトランスフェクトされたＣＡＧＡ１２  ＴＧＦ−βレポーターを含むＨＥＫ２９３細胞を維持した。ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、８ｐＭ；ＴＧＦ−β２、２０ｐＭ；ＴＧＦ−β３、１０ｐＭ）の一定の亜飽和濃度の存在した、ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ｍＴＧＦ−β３またはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ）の濃度系列、またはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの濃度系列とともに１６時間、細胞を処理した。０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＤＭＥＭにタンパク質を希釈した。１６時間後に、細胞をＴｒｏｐｉｘ溶解緩衝液によって溶解させ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘ照度計（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で測定した。ルシフェラーゼ活性を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイにより測定した全タンパク質レベルに正規化した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用し、データをリガンド活性（ＥＣ５０）およびリガンド阻害活性（ＩＣ５０）の標準モデルにフィットさせた（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。結果を図６Ａ〜６Ｂに示す。
【０１１２】
時間分解ＦＲＥＴアッセイ
以下の精製されたタンパク質を用いて、ＴβＲＩおよびＴβＲＩＩを含有する複合体の形成に対するリガンドの要件を検討した：ＴＧＦ−β３、ｍＴＧＦ−β３、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ、ビオチン化ＴβＲＩ−ΔＣ−ＡｖｉおよびＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ。最初に、ＴＧＦ−β３：ＴｂＲＩＩ−Ｈｉｓ（１：２）、ｍＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ（１：１）およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ（１：１）の二元複合体を、２０μＭで、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中で形成させ、４℃で保存した。抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（Ｔｂ−ａｎｔｉ−Ｈｉｓ、ＣｉｓＢｉｏ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で標識されたドナーテルビウムクリプテートから、アクセプターＸＬ６６５標識ストレプトアビジン（ＳＡ−６６５、ＣｉｓＢｉｏ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）への蛍光の近位依存的な転移に基づく時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを用い、三元リガンドＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ：ビオチン化ＴβＲＩ−ΔＣ−Ａｖｉ複合体の会合をモニターした。１００ｎＭまたは２５０ｎＭのＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ（１：２）、ｍＴＧＦ−β３：ＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ（１：１）およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ：ＴβＲＩＩ−Ｈｉｓ（１：１）複合体を含む５０μＬアッセイを、５０ｎＭのビオチン化ＴβＲＩ−ΔＣ−Ａｖｉとインキュベートした。各５０μｌ三元複合体形成アッセイではまた、２ｎＭのＴｂ−抗−Ｈｉｓおよび３０ｎＭ  ＳＡ−６６５を含み、室温で２時間インキュベートした。６つの複製物で各条件を試験した。緩衝液対照（ｎ＝６）は、２ｎＭ  Ｔｂ−抗−Ｈｉｓおよび３０ｎＭ  ＳＡ−ＸＬ６６５のみを含んだ。各アッセイの緩衝液条件は、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５とした。コーニングブラック３８４ウェルの低フランジマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）においてアッセイを実施した。２時間のインキュベートの後、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ  ＦＳマルチモードプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）上で、アッセイプレートにおけるテルビウム／ＸＬ−６６５  ＴＲ−ＦＲＥＴを測定した。３３７、４９０および６６５ｎｍのフィルタを備えた光学モジュールを用い、３３７／４９０（テルビウム放出）および３３７／６６５（ＸＬ−６６５）放出の生データを発生させるＴＲ−ＦＲＥＴをモニターした。６６５放出／４９０放出の比率を各条件で測定し、次に、試料対バックグラウンドのシグナルを反映する指標となるΔＦを算出するために用いた。ΔＦは、以下の方程式を使用して算出した：（Ｒａｔｉｏｓｉｇｎａｌ−Ｒａｔｉｏｎｅｇａｔｉｖｅ／Ｒａｔｉｏｎｅｇａｔｉｖｅ）×１００。Ｒａｔｉｏｓｉｇｎａｌとは、三元複合体または緩衝液対照を含むアッセイを意味する。Ｒａｔｉｏｎｅｇａｔｉｖｅとは、２つのアッセイ緩衝液対照（２ｎＭ  Ｔｂ−抗−Ｈｉｓおよび３０ｎＭ  ＳＡ−６６５）を意味する。緩衝液対照では、ΔＦを算出するため、陰性対照として、６つの複製物中２つを割り当てた。ΔＦは、残りの４つの緩衝液対照の複製物を用いて算出された。結果を図７Ａ、７Ｂおよび１４に示す。
【０１１３】
分析用超遠心分離
ｍＴＧＦ−β３、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを沈降速度によって分析し、単量体ＴＧＦ−βの自己会合によるホモ二量体形成の平衡定数を決定した。ｍＴＧＦ−β３、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを、クオーツウィンドウを装着したｅｐｏｎ  ２チャネルセンターピースにて２８０ｎｍで各々測定し、１００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ３．８に調整した１５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中２７時間、２０℃および４２，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＵＴＨＳＣＳＡのＣＡＵＭＡセンターにおいて、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ｉ分析用超遠心機を用い、強モードで３００のスキャンを収集した。データ解析は、ＵｌｔｒａＳｃａｎリリース２１３０によって実行し（DemelerおよびGorbet、Analytical  ultracentrifugation  data  analysis  with  Ultrascan-III、Analytical  Ultracentrifugation:  Instrumentation,  Software,  and  Applications（Uchiyama,  S.、Stafford,  W.、およびLaue,  T.編）、１１９〜１４３頁、Springer、２０１６年；Demelerら、A  comprehensive  data  analysis  package  for  analytical  ultracentrifugation  experiments、２０１６年）、Ｔｅｘａｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＣｅｎｔｅｒのＬｏｎｅｓｔａｒ−５で計算を実行した。（Demeler、Curr  Protoc  Protein  Sci  ７章、ユニット７  １３、２０１０年）に記載のように、最初に沈降速度データを二次元スペクトル分析にフィットさせ、生データから時間的および放射状の不変ノイズを除去し、メニスカス位置にフィットさせた。次にデータを、アダプティブ時空間有限要素法（CaoおよびDemeler、Biophys  J  ９５巻、５４〜６５頁、２００８年）およびパラメータ最適化のための遺伝的アルゴリズム（Demelerら、Macromol  Biosci  １０巻、７７５〜７８２頁、２０１０年）を用いて個々の単量体−二量体モデルにフィットさせた。単量体−二量体モデルは、質量作用および可逆的会合挙動の原因であり、ＫＤ（水力学的パラメータ）ならびに偏比容にフィットする一方、野性型または変異体のいずれかでは予測されたモル質量を仮定する。各データセットについてＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ分析（DemelerおよびBrookes、Colloid  Polym  Sci  ２８６巻、１２９〜１３７頁、２００８年）を１００回反復して実施し、フィッティング統計値を得た。緩衝液の密度および粘性を、緩衝液組成に基づきＵｌｔｒａＳｃａｎにより推定し、全ての水力学的値を、標準的な条件（２０℃および水）に対して補正した。フィッティングの結果、ランダムな残差および超低ＲＭＳＤ値を有する優れたフィットであった。全ての結果を表４および図１１〜１３にまとめる。
【０１１４】
【表４】
2020500511.tif 000009
【０１１５】
結果
操作されたミニ単量体ＴＧＦ−β（ｍｍＴＧＦ−β）のデザイン
ＴＧＦ−β受容体複合体の構造（Groppeら、Mol  Cell  ２９巻、１５７〜１６８頁、２００８年；Radaevら、J  Biol  Chem  ２８５巻：１４８０６〜１４８１４頁、２０１０年）、ならびに、それに伴うＴＧＦ−β３  Ｃ７７Ｓによる結合および架橋の研究（Zunigaら、J  Mol  Biol  ３５４巻、１０５２〜１０６８頁、２００５年；Groppeら、Mol  Cell  ２９巻、１５７〜１６８頁、２００８年；Huangら、EMBO  J  ３０巻：１２６３〜１２７６頁、２０１１年）は、単量体ＴＧＦ−βのシグナル伝達能力（ＴＧＦ−β１  Ｃ７７ＳまたはｍＴＧＦ−β１、ならびに、ＴＧＦ−β３  Ｃ７７ＳまたはｍＴＧＦ−β３）が、非共有結合的に二量体化するそれらの能力に由来し、それにより、それらの受容体に結合することを示唆した（図１Ａおよび１Ｃ）。これは、二量体形成およびＴβＲＩの結合に関与する残基を除去または変更することによって、単量体ＴＧＦ−βとの受容体複合体会合を減少させ、または完全に除去することが可能であるはずであるという仮説を生じさせるものであった。おそらく単量体の自己会合に最も大きく貢献する構造モチーフは、「ヒール」α−へリックス（α−ヘリックス３）である（図１Ａ））。このヘリックスは、非常に両親媒性が高く、対向する単量体の「パーム（掌）」を裏打ちする残基による多数の疎水的相互作用を有する（図１Ｂ）。このヘリックスはまた、ＴβＲＩの結合面の大部分を形成する（図１Ｃ）。したがって、α−ヘリックス３の除去が単量体の自己会合およびＴβＲＩの結合を妨害すると仮定されたが、これがα−ヘリックス３から遠く離れたリガンドフィンガーチップを通じて発生するため、ＴβＲＩＩ結合を損なわない（図１Ａ）。
【０１１６】
この仮説を評価するため、残基５２〜７１が除去され、Ｃｙｓ−７７がセリンで置換された、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３についての細菌発現構築物を作製した。これは全てのα−ヘリックス３、ならびにＮ末端上の５つのフランキング残基およびＣ末端上の３つのフランキング残基の欠失に対応する（図１Ｄ）。鎖４および５に架橋する拘束されないループを形成するために、β鎖４の最後の残基（Ｇｌｙ−４８）とβ鎖５の最初の残基（Ｃｙｓ−７７／Ｓｅｒ−７７）との間に十分な数の残基を残すように、欠失の長さを選択した。二次的な考慮ではあるが、２つの（ＴＧＦ−β２）、または３つの（ＴＧＦ−β１および−β３）ループ形成残基も置換し、ｐＨ７．０で全長ＴＧＦ−β１、−β２および−β３単量体全体の正味電荷が、α−ヘリックス３が削除された構築物では、それぞれ−０．９、＋１．１および＋４．４から、−３．１、＋３．９および＋６．１まで上昇した（図１Ｄ）。これより推論されることは、単量体の溶解度がホモ二量体のようにｐＨ４．５〜９．５で低い（図４Ａおよび４Ｂを参照）ことが、疎水性α−ヘリックス３の除去、およびｐＨ７．０での正味電荷を人工的に増加させること、の両方によって改善され得る、ということである。
【０１１７】
ｍｍＴＧＦ−β２の単離および物理学的特徴付け
ｍｍＴＧＦ−β１、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β３と称する上記のＴＧＦ−β１、−β２および−β３の「ミニ単量体」をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉにおいて発現させ、不溶性の封入体形で蓄積させた。封入体を単離し、変性剤中で再構成し、精製した後、ミニ単量体を、先行文献記載のようにｐＨ９．０のＣＨＡＰＳ含有緩衝液へ希釈して巻き戻した（Huangら、Methods  Mol  Biol  １３４４巻：６３〜９２頁、２０１６年）。ミニ単量体のフォールディングは大きく異なり、ｍｍＴＧＦ−β２の大部分は、フォールディングの間、可溶化されたままであり、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製の後、多量の単量体タンパク質が産生された一方、ｍｍＴＧＦ−β１およびｍｍＴＧＦ−β３では、少量のみがフォールディングの間可溶化されたままであり、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製の後、（ＴＧＦ−β１）単量体タンパク質は得られず、また（ＴＧＦ−β３）単量体タンパク質はごくわずかしか得られなかった。このパターンは、過去に全長野生型単量体からのＴＧＦ−βホモ二量体のフォールディングについて観察されたパターンを反映するものであり（Huangら、Methods  Mol  Biol  １３４４巻：６３〜９２頁、２０１６年）、またおそらく、各単量体に特異的な４つの分子内ジスルフィドを適切に形成する単量体の固有の傾向の違いを反映するものである。予想されたＴβＲＩＩの低い結合親和性のため、ｍｍＴＧＦ−β２は、最も望ましくないバリアントであった。しかしながらこれは、ＴＧＦ−β２のＬｙｓ−２５、Ｉｌｅ−９２およびＬｙｓ−９４の、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３の対応する残基への置換が、高い親和性でＴβＲＩＩに結合する能力をＴＧＦ−β２に付与することを証明した先行研究に基づく対応指定可能な課題と考えられた（Baardsnesら、Biochemistry  ４８巻：２１４６〜２１５５頁、２００９年；De  Crescenzoら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年）。
【０１１８】
ｍｍＴＧＦ−β２が上記の方法のさらなる開発に適するか否かを決定するため、フォールディング、溶解度および受容体結合特性に関して特徴付けを行った。フォールディングを評価するため、ｍｍＴＧＦ−β２の１５Ｎ標識サンプルを調製し、二次元１Ｈ−１５Ｎシフト相関スペクトルを記録することによって試験した（図２Ａ）。その結果、天然の状態でフォールディングされたタンパク質に特有の非常に分散したスペクトルを示した。スペクトルは完全に割り当てることができ、また二次構造傾向を同定する割り当てられた化学シフトの分析は、特にＴβＲＩＩが結合するシステインノットおよびフィンガー領域によって形成されるパーム領域において、タンパク質が予想される二次構造を有することを示した（図９Ａ）。この分析はさらに、残基４７および５６の間の新しく形成されたループには、α−ヘリックスまたはβ鎖を形成する確率がゼロに近いことを示し、逆平行の２つのβ鎖を連結するこの長さのループに期待されるように、このループがおそらく柔軟であることが示唆される。これは、バックボーン１５ＮのＴ２値の分析によって直接確認された。これらの値は、速い（ナノ秒〜ピコ秒）および中間の（マイクロ秒〜ミリ秒）の時間スケールでの動作に関する情報を提供するものであり、タンパク質の他の部分に対して新しく作製されたループに対応する領域において著しく増加しており（図９Ｂ）、すなわち、α−ヘリックス１およびβ鎖１を連結するＮ末端および短いループを除き、構造的に秩序立っていると考えられる。
【０１１９】
三次元構造を直接調べるため、ｍｍＴＧＦ−β２を結晶化させ、分子置換を使用し１．８Åの分解能でその構造を決定した（表３）。ｍｍＴＧＦ−β２の全体のフォールドは、新たに作製されたループを除き、以前にＴＧＦ−β２について決定されたものと非常に類似することが示され、それは予想されるα−ヘリックス３に代わることを示すものであった（図２Ｂ）。ｍｍＴＧＦ−β２の、ＴＧＦ−β２の構造からの単量体とのスーパーインポーズは、ｍｍＴＧＦ−β２のフィンガー領域においてＴＧＦ−β２と比較して最大約１．５Åの系統的置換があることを示す。フィンガーのみのスーパーインポーズが、０．２Å未満のバックボーン二乗平均平方根偏差およびフィンガーをパックし、安定化させるいくつかの残基の側鎖が同様の方向を向いていることで、それらが密接に対応することを示すため、かかる違いは、フィンガー領域の中心付近の単量体の屈曲の結果であって、フィンガー領域の構造の変化でないと考えられる（図２Ｄ）。かかる屈曲は、結晶学的非対称ユニットに存在するｍｍＴＧＦ−β２の２つの分子の重なりによってもサポートされ、またそれは、互いに関連してフィンガー領域の、小さいがまだ目立つ置き換えを示す（図２Ｃ）。ＮＭＲ分析と整合するように、新たに作製されたループに対応する領域の電子密度が顕著に弱いのみならず、非対称ユニットからの２つの分子が異なる方向を向いていることが示された（図２Ｃ）。
【０１２０】
ＴＧＦ−β２に対するｍｍＴＧＦ−β２の同様のフォールディングは、特にＴβＲＩＩ−結合フィンガー領域において、それがまた同様にＴβＲＩＩに結合することを示唆した。これを評価するために、別々のフローセルに固定化したＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２に対して、ＴβＲＩＩの同じ濃度系列を注入した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実施した（図３Ａおよび３Ｂ）。弱い結合のため親和性を数量化できなかったにもかかわらず、センサーグラムは同様な形状および濃度依存性を示した。これらのセンサーグラムは、以前の報告（Baardsnesら、Biochemistry  ４８巻：２１４６〜２１５５頁、２００９年）と整合するようにｍｍＴＧＦ−β２とＴβＲＩＩの結合が弱いことを示し、またそれが質的にＴＧＦ−β２と同様であることを示した。
【０１２１】
ｍｍＴＧＦ−β２の溶解度は、その試料が、ｐＨ７．０において目立った沈殿なく、２〜３ｍｇ／ｍｌの濃度で容易に調製できるため、ＴＧＦ−β２および全長ＴＧＦ−β２単量体（ｍＴＧＦ−β２）より顕著に良好であると考えられ、一方、後者の２つのタンパク質の試料は、これらの同じ条件では完全に沈殿した。溶解度を数量化するため、ＴＧＦ−β２、ｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２を１００ｍＭの酢酸（ｐＨ２．９）中の濃縮ストックとして調製したところ、それらは容易に溶解し、さらにそれをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。沈殿を評価するために３４０ｎＭでの光散乱を測定し、次にサンプルを遠心分離し、タンパク質濃度を評価するために２８０ｎＭの吸光度を測定した。これは、評価した全ての濃度範囲（７〜１００μＭ）にわたり、中性ｐＨでＴＧＦ−β２およびｍＴＧＦ−β２の両方が効果的に不溶性であることを証明した（図４Ａおよび４Ｂ）。これはＴＧＦ−βホモ二量体の公知の難溶性と整合しているが（Pellaudら、J  Biol  Chem  ２７４巻：７６９９〜７７０４頁、１９９９年）、それはこの特性が全長単量体ＴＧＦ−βにまで及ぶことを示す。ミニ単量体ＴＧＦ−β２（ｍｍＴＧＦ−β２）は対照的に、タンパク質濃度が４０μＭまたはそれよりも高いときに予想されるものと比較して、適度の光散乱および可溶タンパク質量の対応する適度の減少を示し、すなわち、実際には、完全ではなくとも、ｍｍＴＧＦ−β２が中性ｐＨで相当に可溶性であることを示した。これはＮＭＲスペクトルにおいて反映されており、１００〜２００μＭの１５Ｎ  ｍｍＴＧＦ−β２サンプルが容易に調製できるにもかかわらず、スペクトルが弱く、タンパク質の可撓性部分の残基、すなわちＮ末端、α−ヘリックス１とβ鎖１との間の露出したループ、ならびにβ鎖４と５と間で新たに作製されたループから生じる検出可能なシグナルが得られるのみであることを示した。シグナルがタンパク質の可撓性部分から検出できるだけであるという事実は、ｍｍＴＧＦ−β２がこれらの条件で大規模な可溶性の凝集物を形成することを示唆するものであった。試行錯誤により、これらの可溶性の凝集物が双性イオン界面活性剤ＣＨＡＰＳの添加によって除去できることが判明し、５ｍＭのＣＨＡＰＳ濃度で大部分のＮＭＲシグナルが現れ、またＮＭＲの全シグナルが１０ｍＭのＣＨＡＰＳで現れた。このように、図２Ａに示すものを含む全てのＮＭＲスペクトルは、１０ｍＭのＣＨＡＰＳの存在下で記録した。
【０１２２】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの単離および物理学的特徴付け
以上で示される結果は、ｍｍＴＧＦ−β２が、天然の状態でフォールディングされるのにもかかわらず、それがＴβＲＩＩに結合する固有の親和性が低いことを示す。ｍｍＴＧＦ−β２に対し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３と同等の高い親和性でＴβＲＩＩに結合する能力を与えるために、ＴβＲＩＩとの界面において異なることが以前示されたマウスＴＧＦ−β２の３つの残基Ｌｙｓ−２５、Ｉｌｅ−９２およびＡｓｎ−９４（De  Crescenzoら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年；Hartら、Nat  Struct  Biol  ９巻：２０３〜２０８頁、２００２年）を、ＴＧＦ−β１および−β３由来の対応する残基Ａｒｇ−２５、Ｖａｌ−９２およびＡｒｇ−９４により置換した（図１Ｅおよび１Ｆ）。これらの３つの残基の置換は、以前の研究において、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３と同等のＴβＲＩＩ結合親和性をＴＧＦ−β２に付与するのに十分なことが示されている（Baardsnesら、Biochemistry  ４８巻：２１４６〜２１５５頁、２００９年；De  Crescenzoら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年）。これにもかかわらず、ＴＧＦ−β１と比較してＴＧＦ−β２においては異なる、ＴβＲＩＩ−結合部位の周辺の４つのさらなる残基もまた、ＴＧＦ−β１の対応する残基で置換した（Ｒ２６Ｋ、Ｌ８９Ｖ、Ｔ９５ＫおよびＩ９８Ｖ）（図１Ｅおよび１Ｆ）。以前の結果は、これが厳密には必要でないことを示唆したにもかかわらず、ＴβＲＩＩに対するｍｍＴＧＦ−β２−結合部位の残基の実際の方向が、高親和性ＴＧＦ−βアイソフォームであるＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３のそれとできるだけ密接にマッチするか否かの確認を行った。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍと称する得られたこれら７つのアミノ酸置換を有する構築物を（図１Ｅ、図９および表１）、不溶性の封入体の形でＥ．Ｃｏｌｉにおいて発現させた。ｍｍＴＧＦ−β２と同様、タンパク質のほとんどは天然フォールディング緩衝液への再構成および希釈の後、溶液中に残っており、大量の均一な単量体が単離できた（Ｅ．Ｃｏｌｉ培地中４〜５ｍｇ／Ｌ）。
【０１２３】
単離されたｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍのフォールディングおよび均一性をＮＭＲによって評価した結果、ｍｍＴＧＦ−β２と同様、タンパク質が、２Ｄ  １Ｈ−１５Ｎシフト相関スペクトルにおける予想される数のシグナル（図５Ａ）、ならびにＮＭＲでの第２のシフトの分析により決定されるような二次構造（図１０Ａ）を有することがわかった。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの溶解度を前と同様評価した結果、示されるように、その挙動は同等か、またはおそらくｍｍＴＧＦ−β２のそれよりわずかに良好だった（図４Ｃおよび４Ｄ）。しかしながら、肉眼での溶解度のこのわずかな改善は、ＮＭＲ分析のように顕微鏡観察における溶解度を変化させず、すなわち１０ｍＭのＣＨＡＰＳを試料緩衝液に含有させてタンパク質中の全てのバックボーンのアミド共鳴のシグナルを検出することが未だ必要であったことを示した。
【０１２４】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの三次元構造を、２．７５Åの分解能で結晶学的に測定し（表３）、前述のとおり、全体のフォールドは、ＴＧＦ−β２と比較して維持され、唯一の違いとしては、ｍｍＴＧＦ−β２において記載したような単量体におけるわずかなヒンジの屈曲であった（図５Ｂおよび５Ｃ）。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの新たに形成されたループに対応する領域の１５Ｎ  Ｔ２弛緩時間の増加は、ｍｍＴＧＦ−β２のそれと同等だった（図１０Ｂ）。これは、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍにおいて新たに形成されたループに対応する領域における、非対称ユニットの３つの分子中の一部の鎖Ａおよび大部分鎖Ｃで観察された密度の喪失が、動力学の増加によるものではなく、他の因子、最も考えられるのがｍｍＴＧＦ−β２構造と比較したｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの構造の低い分解能であることを示唆した（表３）。
【０１２５】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍが高親和性でＴβＲＩＩに結合する否かを決定するため、ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭおよびＴＧＦ−β３のバリアントを、Ｎ末端ａｖｉタグ付きで産生させ、ストレプトアビジンコーティングしたＳＰＲセンサー上へのビオチン化および固定化の後、動力学的ＳＰＲ実験を行い、ＴβＲＩＩへのそれらの結合親和性を測定した（図３Ｃおよび３Ｄ）。得られたセンサーグラムは、以前にｍｍＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β２において得られたものと非常に異なっており、飽和の明白なパターンを示していた。センサーグラムはさらに、同様な形状ならびにＫＤ値（表２）を含むフィットしたパラメータを有することを示し、それは互いの実験誤差範囲内であり、またハイエンドにあるにもかかわらず、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に対するＴβＲＩＩの結合について以前報告されたＫＤ値と整合していた（Huangら、EMBO  J  ３０巻：１２６３〜１２７６頁、２０１１年；Baardsnesら、Biochemistry  ４８巻：２１４６〜２１５５頁、２００９年；De  Crescenzoら、J  Mol  Biol  ３５５巻：４７〜６２頁、２００６年）。
【０１２６】
高い親和性でのＴβＲＩＩ結合を可能にする相互作用が、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３と比較してｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍにおいて維持されたか否かを決定するため、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ・ＴβＲＩＩ複合体を結晶化し、その構造を１．８８Åの分解能で決定した（表３）。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ・ＴβＲＩＩ複合体の全体の構造は、ＴＧＦ−β３・ＴβＲＩＩ・ＴβＲＩ複合体の構造からの１つのＴβＲＩＩ結合単量体のそれと非常に類似していることが示され、そこでは、ＴβＲＩＩはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍのフィンガーチップと、ＴＧＦ−β３のそれと基本的に区別がつかない態様で結合していた（図５Ｄ）。高親和性結合に最も著しく貢献することが公知の相互作用は、これまでに決定されていたＴＧＦ−β１・ＴβＲＩＩおよびＴＧＦ−β３・ＴβＲＩＩ複合体と比較して、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ・ＴβＲＩＩ複合体においても完全に維持されることがさらに示された（１．８Åに決定されたＴＧＦ−β３・ＴβＲＩＩ複合体（Hartら、Nat  Struct  Biol  ９巻：２０３〜２０８頁、２００２年）が、現在までに決定された最も高い分解能の構造であることを示す）（図５Ｅ）。これは、ＴＧＦ−βフィンガー間の疎水性ポケットのＴβＲＩＩからのＩｌｅ−５３のパッキング、およびフィンガー１／２と３／４を連結させるループのチップ上の、それぞれＴＧＦ−βＡｒｇ−２５とＡｒｇ−９４との間に形成される水素結合のイオン対、およびＴβＲＩＩ（図５Ｅ）上のＧｌｕ−１１９とＡｓｐ−３２のカルボキシレート基、を含む。
【０１２７】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの阻害活性およびその根底にあるメカニズム
上記の結果は、ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭがＴＧＦ−βシグナル伝達のドミナントネガティブ阻害剤として機能するために必要となる必須の属性の１つを備えていることを示し、すなわちそれは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３のそれと同等の高い親和性でＴβＲＩＩに結合する能力である。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍがシグナルを発し得るか否か、もしそうでなければ、それが阻害剤として機能し得るか否かを直接判断するため、ＣＡＧＡ１２プロモーターの制御下のＴＧＦ−βルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＴＧＦ−βの濃度を増加させて処理することによってＴＧＦ−βシグナル伝達を評価した（Thiesら、Growth  Factors  １８巻：２５１〜２５９頁、２００１年）。その結果、二量体ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１）および全長単量体ＴＧＦ−β３（ｍＴＧＦ−β３）では、シグモイド状にルシフェラーゼ応答が増加し、約２５ｐＭのＴＧＦ−β１および２５０ｐＭのｍＴＧＦ−β３の濃度によって測定されるルシフェラーゼ応答がさらに増加しないことが示された。これは、（全長）単量体ＴＧＦ−β１および−β３が、それらの二量体相対物に対して効力が５分の１〜１５分の１であったことを示した以前の報告と整合している（Zunigaら、J  Mol  Biol  ３５４巻、１０５２〜１０６８頁、２００５年；Amatayakul-Chantlerら、J  Biol  Chem  ２６９巻：２７６８７〜２７６９１頁、１９９４年）。正規化されたルシフェラーゼ応答を、リガンド依存的な活性化の標準的モデルに容易にフィットさせることができ、ＴＧＦ−β１に対しては１２．４±１．５ｐＭ、ｍＴＧＦ−β３に対しては１８２±１６ｐＭのＥＣ５０値を得た。ＴＧＦ−β１およびｍＴＧＦ−β３での値は、以前ＴＧＦ−β１についてAmatayakul−Chantlerら（J  Biol  Chem  ２６９巻：２７６８７〜２７６９１頁、１９９４年）により、またｍＴＧＦ−β３についてのZunigaら（J  Mol  Biol  ３５４巻、１０５２〜１０６８頁、２００５年）により報告された値とほぼ一致した。ＴＧＦ−β１およびｍＴＧＦ−β３で観察された強力なサブナノモル濃度のシグナル伝達活性は、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍのそれとは対照的であり、後者は、ｍＴＧＦ−β３の飽和応答をもたらした濃度（約２００ｐＭ）、または最高４桁高い濃度で検出可能なシグナル伝達活性を有さなかった（図６Ａ）。したがって、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍはシグナル伝達活性が完全に失われたか、または、シグナル伝達活性を有してもｍＴＧＦ−β３の１０，０００分の１未満の効力であった。
【０１２８】
さらにｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの特性を解析するため、同じＨＥＫ２９３ルシフェラーゼレポーター細胞系を、一定のＥＣ５０濃度以下の二量体ＴＧＦ−β１（８．０ｐＭ）と、ｍＴＧＦ−β３またはｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの濃度を増加させて刺激する競合実験を行った。その結果、ｍＴＧＦ−β３がｍＴＧＦ−β３単独と同様の中間点濃度によりシグナル伝達をさらに刺激することを示した（図６Ｂ）。フィットさせたＥＣ５０値は、図６Ａに示されるデータの１８２±１６ｐＭのＥＣ５０、および図６Ｂに示されるデータの１９４±３６ｐＭのＥＣ５０により、これを確認するものである。ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの挙動は大きく異なり、１０ｎＭの濃度まで添加したとき、シグナル伝達活性の検出可能な変化がなく、濃度を１００ｎＭに増加させたとき、検出可能なシグナル伝達活性が激減してなくなった（図６Ｂ）。これは、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍがシグナル伝達活性を実際に有さず、完全にＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断し、阻害する機能を発揮できることを示す。正規化されたルシフェラーゼ反応を、リガンド依存的な阻害の標準的モデルに容易にフィットさせることができ、６８±７ｎＭのＩＣ５０値を得た。同様の実験から、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍもまた、他のＴＧＦ−βアイソフォーム、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３に対して強力な競合的阻害剤として機能することが示され、測定されたＩＣ５０値（ＴＧＦ−β２のＩＣ５０が１９±３ｎＭ、ＴＧＦ−β３のＩＣ５０が２１±８ｎＭ）は、ＴＧＦ−β１で測定された数値に対して２〜３倍であった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。これらのＩＣ５０値は、本明細書に報告されるｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを含む高親和性ＴＧＦ−βアイソフォームのＴβＲＩＩとの結合について報告された親和性の範囲の下限値にある（表２）。これは、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍが内因性ＴβＲＩＩに対して結合および遮断することによって、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害するよう機能することを示唆する。測定された効力が、最も強いＴβＲＩＩに対するＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３の結合親和性（１４０ｎＭ）であるとして以前に報告された（９）ものより強度であるという事実は、他の要因（例えば形質膜とのｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍの非特異的な会合）がその阻害活性の強化に役立ち得ることを示唆する。
【０１２９】
ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍが明らかなシグナル伝達活性を有さず、低ナノモル濃度でのＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能するという知見は、α−ヘリックス３の除去が、単量体の非共有結合的会合を減少させ、ＴβＲＩ結合を非常に減衰させ、または消失させることを示唆する。これを直接評価するため、ＳＰＲ実験を行い、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍが、ＴβＲＩＩの存在下でＴβＲＩを動員できるか否かを決定した。これを行うため、ＴβＲＩの濃度を増加させて、またＴβＲＩＩ（２μＭ）の略飽和量の存在下での同じＴβＲＩ濃度の系列を、上記のＴβＲＩＩ結合測定に使用した同じＴＧＦ−β３およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍを有するＳＰＲチップ表面に注入した。これは、ＴβＲＩ単独でのＴＧＦ−β３およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍへの結合がごくわずかであることを示したが（図３Ｅおよび３Ｆ）、ＴＧＦ−β３とは異なり、ＴβＲＩＩに結合したｍｍＴＧＦ−β２−７ＭはＴβＲＩを動員することができない（図３Ｇおよび３Ｈ）。これは、ＴβＲＩＩに結合したｍＴＧＦ−β３がＴβＲＩに結合しそれを動員するその能力に関して、著しく、または完全に損なわれたというHuangら（EMBO  J  ３０巻：１２６３〜１２７６頁（２０１１年））によって報告された過去の結果と整合している。これはまた、ＴβＲＩＩに結合したＴＧＦ−β単量体はＴβＲＩに結合しそれを動員することができないというさらなる証拠を提供するものであるが、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍがセンサーの表面に固定化されていたため、この結果のみでは、ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍが非共有結合で二量体化し、ＴβＲＩに結合しそれを動員し得るか否かについてのいかなる洞察も提供しない。
【０１３０】
これらの問題に直接対処するため、２つの溶液ベースの技術、すなわち分析用超遠心分離（ＡＵＣ）および時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ））を使用した。ＡＵＣ実験は、半径方向位置、およびｍＴＧＦ−β３、ｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍが単量体が完全に可溶化される酸性条件（ｐＨ３．８）で沈殿した時間の関数としての２８０ｎｍでの全ＵＶ吸収を測定することによって行った。ＡＵＣデータは、全３つの単量体について放物線状に形成されるｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ−Ｗｅｉｓｃｈｅｔ沈降係数分布プロットを示し、各々が、可逆的な自己会合により二量体または他の高次オリゴマーを形成することと整合していた。どの種が溶液に存在し得るかをより正確に決定するため、有限要素分析を用い、考えられる最も単純なモデル、すなわち個別の単量体−二量体平衡にデータをフィットさせた。フィッティング手順の結果、単純な単量体−二量体モデルへの全３つの単量体のほぼ完全なフィットがなされ、それは（ａ）時間的および放射状に不変のノイズ（黒）の除去後、生データによるフィットさせた曲線（赤）間の近接した重なり、および（ｂ）残差における任意の系統的偏差の欠如により示された（図１１〜１３）。フィットさせたパラメータはさらに、自己会合のためのＫＤがｍｍＴＧＦ−β２およびｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍと比較してｍＴＧＦ−β３では１桁高いことを示した。したがって、ヒールヘリックス（α３）の除去は二量体を形成する単量体の自己会合を減少させるが、それは二量体形成を完全に消失させない。
【０１３１】
ＴＲ−ＦＲＥＴを用いて、二量体および単量体のＴＧＦ−βの、ＴβＲＩおよびＴβＲＩＩに結合して一緒にする能力を評価した。これは、それぞれタグを付された形のＴβＲＩＩおよびＴβＲＩを作製し、蛍光ドナーおよびアクセプターで標識したタンパク質とこれらのタグを結合させることにより行った。ＴβＲＩＩにはＣ末端Ｈｉｓタグを付け、テルビウムクリプテート標識抗Ｈｉｓモノクローナル抗体蛍光ドナーに結合させ、またＴβＲＩにはＮ末端ａｖｉタグを付け、酵素的ビオチン化の後、それを色素標識（ＸＬ−６６５）ストレプトアビジン蛍光アクセプター（図７Ａ）に結合させた。タグを付された受容体に対するＴＧＦ−βの添加はそれらを一緒にし、結果としてアクセプターおよびドナー放出蛍光強度の比率として定義されるΔＦ値を大きく増加させる。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを図１４に示すデータによって示し、またＴＧＦ−β３全長単量体、ｍＴＧＦ−β３および高親和性でＴβＲＩＩに結合するＴＧＦ−β２ミニ単量体（ｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍ）の、ＴβＲＩおよびＴβＲＩＩに結合し一緒にする能力を比較するためにここで使用した。ｍＴＧＦ−β３についてのＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、ＴＧＦ−β３と同等の結果を示し、ＴＧＦ−β濃度が１００または２５０ｎＭであるか否かには依存しなかった（図７Ｂ）。ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭのＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、対照的に、緩衝液対照の誤差範囲内であり、これはＴＧＦ−β濃度に依存しなかった（図７Ｂ）。これらの結果は、これらの条件では、ｍＴＧＦ−β３が全ての能力を保持してＴβＲＩおよびＴβＲＩＩと非共有結合性の二量体複合体を構築するが、これらの同じ条件ではｍｍＴＧＦ−β２−７Ｍはその能力を有さないことを示すものである。これらの結果は、ＡＵＣの結果とともに、ヒールヘリックスの除去が予想される効果をもたらし、その除去が二量体形成を減少させたが排除はせず、二量体が形成される場合であっても、それらはＴβＲＩに結合しそれを動員することができないことを示す。
【０１３２】
考察
ＴＧＦ−βは、多くのヒト疾患の進行を促進する役割を果たすが（Dietzら、Nature、３５２巻、３３７〜３３９頁、１９９１年、Biernackaら、Growth  Factors、２９巻、１９６〜２０２頁、２０１１年、Massague、Cell、１３４巻、２１５〜２３０頁、２００８年、Loeysら、Pediatr  Endocrinol  Rev、１０巻、４１７〜４２３頁、２０１３年）、この２０年程の間、前臨床試験および臨床的試験において、ヒト用に承認された阻害剤はなかった。本明細書に示される結果は、操作されたＴＧＦ−β単量体（Ｃｙｓ−７７およびヒールα−ヘリックス（α３）を欠失）が、２０〜７０ｎＭの範囲のＩＣ５０値により強力にＴＧＦ−β１、−β２および−β３のシグナル伝達を遮断および阻害する機能を奏することを示す（図６Ｂおよび図１５）。この新規な阻害剤は、他の種類の阻害剤が有する限界、例えばＴＧＦ−βの天然の高い特異性を克服するいくつかの属性を有し、ゆえに、ＴβＲＩＩに対する阻害剤は、はるかにより無差別なＴＧＦ−βキナーゼ阻害剤と比較して、はるかにより高い特異性をＴＧＦ−βＩＩに付与することができ、したがって好ましくない副作用を低減する。さらに、阻害剤のサイズが小さい（約１０ｋＤａ）ことにより、ＴＧＦ−βが疾患の進行を亢進する腫瘍および他の高密度な組織を透過する能力が非常に高くなり、それは非常により大きく（約１５０ｋＤａ）、血管および高灌流器官の間隙のみを占める傾向があるＩｇＧ抗体と比較して明らかに有利である（Meibohm（２０１２年）、Therapeutic  Proteins:  Strategies  to  Modulate  Their  Plasma  Half-Lives（Kontermann  R.編）、２３〜３８頁、Wiley-Blackwell、Weinheim、Germany、Meibohmおよびraeckman（２００８年）、「Pharmacokinetics  and  Pharmacodynamics  of  Peptides  and  Protein  Drugs」、Pharmaceutical  Biotechnology:  Fundamentals  and  Applications（Crommelin  D.  J.  A.、Sindelar  R.  D.、およびMeibohm  B.編）、９５〜１２３頁、Informa  Healthcare、New  York）。この新規な阻害剤の他の利点としては、その高い固有の安定性が挙げられ、それは、４つのフィンガーをまとめる４つの分子内ジスルフィド結合、および天然型ＴＧＦ−β二量体または全長ＴＧＦ−β単量体と異なり、それが中性ｐＨの水における溶解度が非常に高いという事実によるものである。
【０１３３】
ＴＧＦ−β受容体複合体の構造は、過去に発表された化学的架橋データを考え合わせると、ＴＧＦ−β１  Ｃ７７ＳおよびＴＧＦ−β３  Ｃ７７Ｓの強力なシグナル伝達活性は、単量体が非共有結合的に二量体化し、次にそれらが（ＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ）２ヘテロ四量体に会合する能力に起因することを示唆した。本実施例の結果、すなわち非共有結合性の二量体形成を評価するために用いたＡＵＣ実験、およびＴβＲＩおよびＴβＲＩＩによる複合体会合体を評価するために用いたＴＲ−ＦＲＥＴ実験の結果は、このさらなる証拠を提供した。ＡＵＣデータは、全長単量体ＴＧＦ−β３、ｍＴＧＦ−β３が自己会合し、４．１μＭの二量体化定数により二量体を形成することを示した（表４）。ＴＲ−ＦＲＥＴデータは、ｍＴＧＦ−β３が、０．１または０．２５μＭの濃度で、適切な濃度のＴβＲＩおよびＴβＲＩＩ外部ドメインの存在下で、二量体ＴＧＦ−β３と同程度にＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ複合体を会合させることを示した（図７Ｂ）。これが、ｍＴＧＦ−β３濃度（０．１〜０．２５μＭ、図７Ｂ）が自己会合のためのＫＤ値より１桁超低い条件であっても生じる（４．１μＭ、表４）ということは、受容体結合もまた顕著にＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ複合体の会合に関与することを示す。したがって、ＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ複合体と、ｍＴＧＦ−β３および（おそらくｍＴＧＦ−β１も）との会合は、（タンパク質のフォールディングに非常に似た）協同プロセスであると考えられ、かかるプロセスでは、単量体−単量体、非共有結合性の二量体−受容体および受容体−受容体相互作用を含む複数の弱い相互作用が協働して、熱力学的に安定なＴＧＦ−β・ＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ複合体の形成を可能にする。この態様による協働的会合はおそらく、ｍＴＧＦ−β１およびｍＴＧＦ−β３の、単量体の自己会合ＫＤ値より４桁超低い（ＥＣ５０値約０．１ｎＭ  対  自己会合のためのＫＤ値４．１μＭ）濃度でシグナル伝達を誘導する能力に起因するものである。
【０１３４】
ＴＧＦ−β単量体からのヒールヘリックスの除去は、ＴＲ−ＦＲＥＴデータ（図７Ｂ）および細胞ベースのシグナル伝達データ（図６Ａおよび６Ｂ）で示すように、ＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ複合体の協働的会合を防ぐ観点から非常に効果的であることを示した。ＡＵＣデータは、ヒールヘリックスの除去が結果として単量体−単量体相互作用を１桁弱めることを示した（表４）。図３Ｇおよび３Ｈに示されるＳＰＲデータはさらに、ＴβＲＩＩが結合した形のｍｍＴＧＦ−β２−７ＭがＴβＲＩと結合しそれを動員することができないことを示し、それはＴＧＦ−βの両方の鎖ならびにＴβＲＩＩによって形成されるコンポジット界面とＴβＲＩとの結合を示す、報告されたＴＧＦ−β受容体複合体の構造に基づき予想される（Groppeら、Mol  Cell  ２９巻、１５７〜１６８頁、２００８年、Radaevら、J  Biol  Chem、２８５巻、１４８０６〜１４８１４頁、２０１０年）。したがって、そのデータは、操作された単量体が自己会合する傾向が低いことが、形成されたいかなる二量体へのＴβＲＩの結合が非常に弱いと予想されることと考え合わせると、ｍｍＴＧＦ−β２−７ＭがＴβＲＩ・ＴβＲＩＩ複合体をまとめられないことの原因となることを示す。これはシグナル伝達活性の欠如を説明し、またこれは、高い親和性でのＴβＲＩＩとの結合の保持と併せると、阻害的活性を説明するものである。
【０１３５】
他のＩＩ型受容体のファミリーであるアクチビンＩＩ型受容体ＩＩ、アクチビンＩＩ型Ｂ受容体、ＢＭＰＩＩ型受容体および抗ＭｕｌｌｅｒｉａｎホルモンＩＩ型受容体は、ＴβＲＩＩと同様、ＧＦナックルに結合し、ＧＦフィンガーチップには結合しないことが示され、またはそうであることが予測される（Hinckら、Cold  Spring  Harb  Perspect  Biol  ８巻：ａ０２２１０３、２０１６年）。にもかかわらず、それらは、全てのＩ型受容体のファミリーにおいて示され、または予測されるような、両方の単量体でなく単一のＧＦ単量体に由来する残基を接触させることでのみ結合するというＴβＲＩＩと同じ特性を共有する（Hinckら、Cold  Spring  Harb  Perspect  Biol  ８巻：ａ０２２１０３、２０１６年）。これは、本発明で報告した、単量体の全体構造に影響を及ぼすことなくα３を除去できることが示された構造と考え合わせると（図２Ｂ〜２Ｄおよび図５Ｂ〜５Ｅ）、阻害剤として機能するヒールヘリックスを欠失するファミリーの他のＧＦ単量体を作製し得ることを示唆するものである。このタイプの阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの特定のリガンドの役割を解析するための研究用ツールから、ファミリーの他のリガンドによる高活性シグナル伝達によって亢進される疾患（例えばアクチビンによるがん悪液質）を処置するための臨床的に有用な阻害剤に至るまで、幅広い利用可能性を有する（Coerverら、Mol  Endocrinol  １０巻、５３４〜５４３頁、１９９６年）。
【０１３６】
開示される発明の原理を適用できる多くの考えられる実施形態に鑑みて、この例示された実施例は、本発明の好適な例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないと認識すべきである。むしろ本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、これらの特許請求の範囲および技術思想に包含される全てを、本発明として特許請求する。
【図１ＡＢＣ】
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【図１ＤＥＦ】
2020500511.tif 000011
【図２Ａ】
2020500511.tif 000012
【図２ＢＣＤ】
2020500511.tif 000013
【図３ＡＢＣＤ】
2020500511.tif 000014
【図３ＥＦＧＨ】
2020500511.tif 000015
【図４ＡＢＣＤ】
2020500511.tif 000016
【図５Ａ】
2020500511.tif 000017
【図５ＢＣ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６ＡＢ】
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【図７ＡＢ】
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【図８】
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【図９ＡＢ】
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【図１０ＡＢ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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