(57)【要約】本発明は、がん抗原ＭＵＣ１およびＴ細胞抗原ＣＤ３に対する多重特異的抗体構築物に関する。特に、多重特異的抗体構築物は、Ｔ細胞をがんの部位に動員する。多重特異的抗体構築物の設計は、強い抗原結合および高いＴ細胞活性化を示す。驚くべきことに、本発明者らは、ＭＵＣ１およびＣＤ３に結合する多重特異的抗体構築物の特異的設計が、かなりより強いＣＤ３結合だけでなく、著しく増加したＴ細胞活性化ももたらすことを見出した。この優れた設計では、抗ＣＤ３抗原結合性断片は、抗ＭＵＣ１抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１つの抗体重鎖を含む抗ＭＵＣ１抗体モジュール、および
（ｉｉ）抗ＣＤ３抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
【請求項２】
前記抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、
（ａ）ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを各々含む２つの重鎖；ならびに
（ｂ）ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む２つの軽鎖
を含む、請求項１に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項３】
前記抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープに特異的に結合し、
（ｉ）配列番号７、８および９のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、または配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセット
を含む抗体重鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項４】
前記抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、ＴＦαに特異的に結合し、
（ｉ）配列番号２７〜３２のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２または２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号２４、２５または２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセット
を含む抗体重鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項５】
前記抗ＣＤ３抗原結合性断片が、ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよび前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインの間のペプチドリンカーを含み、そして前記抗ＣＤ３抗原結合性断片が、特にｓｃＦｖ断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項６】
前記抗ＣＤ３抗原結合性断片が、ＣＤ３εに特異的に結合し、
（ｉ）配列番号４６のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセット
を含む抗体重鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項７】
前記抗体モジュールの異なる重鎖のＣ末端に各々融合している２つの抗ＣＤ３抗原結合性断片を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項８】
前記抗体モジュールがＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含まない、請求項１から７のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項９】
前記抗体モジュールが前記抗体重鎖のＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項１０】
前記抗体モジュールが、前記抗体重鎖のＣＨ２ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、前記多重特異的抗体構築物の組成物中の前記抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％である、請求項９に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項１１】
前記抗体モジュールが、前記抗体重鎖のＣＨ２ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、前記多重特異的抗体構築物の組成物中の前記抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％もしくはそれ未満である、請求項９に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項１２】
前記多重特異的抗体構築物にコンジュゲートしているさらなる作用物質を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物ならびに溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物。
【請求項１４】
医療で使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生性感染症などの感染症、炎症性疾患、例えば自己免疫性疾患および炎症性腸疾患、移植片対宿主病、ならびに免疫欠損などの免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後診断、診断および／またはモニタリングで使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
乳房、結腸、胃、肝臓、膵臓、腎臓、血液、肺および卵巣のがんからなる群より選択されるがんの処置で使用するための、請求項１５に記載の多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の分野に関する。がん抗原および免疫細胞抗原に対する多重特異的抗体構築物が提供される。特に、多重特異的抗体構築物は、ＣＤ３に結合することによってＴ細胞を、がん抗原ＭＵＣ１に結合することによってがんの部位に動員する。多重特異的抗体構築物の設計は、提供される特定の状況における別々の利点、特に強い抗原結合および高いＴ細胞活性化を示す。特定の実施形態においては、本発明は、これらの多重特異的抗体構築物の治療および診断的使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍関連抗原に対する抗体は、がんに対して広く使用されている治療薬である。今日、多くの抗がん抗体がヒト治療のために承認されている。これらの抗体のいくつかは、特異的がん細胞の生存または増殖のために重要である、ある特定のシグナル伝達経路を遮断することによって作用する。他の抗がん抗体は、例えばナチュラルキラー細胞を介した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を開始することによって、標的化がん細胞に対する患者の免疫応答を活性化する。この機構は、抗体のＦｃ部分を免疫細胞上のＦｃ受容体に結合することによって誘導される。
【０００３】
興味深く、重要な抗体の群は、ムチンタンパク質に対する抗体の群である。ムチンは、脊椎動物において多くの上皮組織により生成される高分子量、高グリコシル化タンパク質のファミリーである。それらは、細胞膜中での保持に有利である疎水性膜貫通ドメインと粘膜表面上へと分泌されるか、または分泌されて唾液成分になるムチンとの存在のために、膜結合型のムチンタンパク質に細分することができる。ヒトムチンタンパク質ファミリーは、膜結合型ＭＵＣ１を含む多くのファミリーメンバーからなる。
【０００４】
膵がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がんなどを含む多くの腺癌において、ムチン生成の増大が起こる。ムチンはまた、肺疾患、例えば、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患または嚢胞性線維症において過剰発現される。２つの膜ムチン、ＭＵＣ１およびＭＵＣ４は、疾患過程におけるそれらの病理学的関連に関して広範に研究されてきた。さらに、ムチンはまた、診断マーカーとしてのそれらの可能性について調査されている。ムチンタンパク質、特に、ＭＵＣ１に対するいくつかの抗体が、当該分野で公知である。しかし、それらの治療有効性は、なお改善することができる。
【０００５】
これを考慮すれば、治療用の抗ＭＵＣ１抗体構築物に増加した治療有効性を与える必要性が当技術分野にある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、それらを抗ＣＤ３抗原結合性断片と組み合わせることによって、抗ＭＵＣ１抗体を改善することができることを見出した。ＣＤ３はＴ細胞の特徴的な表面タンパク質であり、それは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と一緒にＴＣＲ−ＣＤ３複合体を形成する。抗がん抗原ＭＵＣ１およびＴ細胞抗原ＣＤ３の同時結合は、腫瘍部位への細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の動員を可能にする。それらは抗腫瘍作用を媒介する最も強力な細胞の１つであるので、ＣＴＬの動員は興味深い。驚くべきことに、本発明者らは、ＭＵＣ１およびＣＤ３に結合する多重特異的抗体構築物の特異的設計が、かなりより強いＣＤ３結合だけでなく、著しく増加したＴ細胞活性化ももたらすことを見出した。この優れた設計では、抗ＣＤ３抗原結合性断片は、抗ＭＵＣ１抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している。実験的に実証されるように、この構築物設計はＣＤ３により強く結合し、抗ＣＤ３抗原結合性断片が抗ＭＵＣ１抗体モジュールの軽鎖のＣ末端に融合している類似の抗体構築物と比較して、増加したＴ細胞媒介ＡＤＣＣおよびＴ細胞増殖を誘導する。
【０００７】
したがって、第１の態様においては、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの抗体重鎖を含む抗ＭＵＣ１抗体モジュール、および
（ｉｉ）抗ＣＤ３抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している、多重特異的抗体構築物を目的とする。
【０００８】
第２の態様においては、本発明は、本発明による多重特異的抗体構築物をコードする核酸を提供する。さらに第３の態様においては、本発明による核酸を含む発現カセットまたはベクターおよび前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーター、第４の態様においては、本発明による核酸または発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０００９】
第５の態様においては、本発明は、本発明による多重特異的抗体構築物を含む医薬組成物を対象とする。
【００１０】
第６の態様によれば、本発明は、医療で、特にがん、感染症、移植片対宿主病または自己免疫性疾患の処置において使用するための、本発明による多重特異的抗体構築物または医薬組成物を提供する。
【００１１】
上記態様を組み合わせることができる。本発明の他の目的、フィーチャ、利点、および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし、本願の好適な実施形態を示す以下の記載、添付の特許請求の範囲、および具体例は、実例としてのみ示されていることが理解されるべきである。開示した発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改変は、以下を読むことから当業者に容易に明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本明細書において使用する場合、以下の表現は一般に、これらが使用されている脈絡が別段に示す程度を除き、以下に示す意味を好ましくは有するように意図されている。
【００１３】
表現「含む」は、本明細書において使用する場合、その文字通りの意味に加えて、表現「から本質的になる」および「からなる」も含み、具体的に指す。したがって、表現「含む」は、具体的に列挙されたエレメントを「含む」主題がさらなるエレメントを含まない実施形態、ならびに具体的に列挙されたエレメントを「含む」主題がさらなるエレメントを包含する場合があり、かつ／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、表現「有する」は、表現「含む」として理解されるべきであり、表現「から本質的になる」および「からなる」も含み、具体的に指す。用語「から本質的になる」は、可能であれば、特に主題がそれから本質的になる明確に列挙されたエレメントに加えて、主題が２０％もしくはそれ未満、特に１５％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満または特に５％もしくはそれ未満のさらなるエレメントを含む実施形態を指す。
【００１４】
用語「抗体」は、特に、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも２本の重鎖および２本の軽鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。重鎖定常領域は、３つ、またはＩｇＭもしくはＩｇＥタイプの抗体の場合では、４つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含み、第１の定常ドメインＣＨ１は、可変領域に隣接しており、ヒンジ領域によって第２の定常ドメインＣＨ２に接続されている場合がある。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインのみからなる。可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とともに散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、各可変領域は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。重鎖定常領域は、γ−、δ−、α−、μ−またはε−型重鎖などの任意の型のものであってもよい。好ましくは、抗体の重鎖は、γ−鎖である。さらに、軽鎖定常領域はまた、κ−またはλ−型軽鎖などの任意の型のものであってもよい。好ましくは、抗体の軽鎖は、κ−鎖である。用語「γ（δ、α、μまたはε）型重鎖」および「κ（λ）型軽鎖」は、天然に存在する重鎖または軽鎖定常領域アミノ酸配列、特にヒト重鎖または軽鎖定常領域アミノ酸配列由来の定常領域アミノ酸配列を有する抗体重鎖または抗体軽鎖をそれぞれ指す。特にγ型（特にγ１型）重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は、ヒトγ（特にヒトγ１のアロタイプの１つ）抗体重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一である。さらにκ型軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は、ヒトκ抗体軽鎖のアロタイプの１つの定常ドメインのアミノ酸配列と、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一である。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体は、例えば、ヒト化、ヒト、またはキメラ抗体であり得る。
【００１５】
抗体の抗原結合性部分は、通常、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の全長または１つもしくは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の結合性断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された、それぞれが同じ抗原に結合する２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；およびＶＨドメインからなるｄＡｂ断片が含まれる。
【００１６】
抗体の「Ｆａｂ部分」は特に、重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、ならびに重鎖および軽鎖定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１およびＣＬ）を含む抗体の部分を指す。抗体がこれらの領域のすべてを含まない場合では、用語「Ｆａｂ部分」は、抗体中に存在する領域ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬのもののみを指す。好ましくは、「Ｆａｂ部分」は、抗体の抗原結合性活性を含有する、パパインで天然抗体を消化することによって得られる断片に対応する抗体の部分を指す。特に、抗体のＦａｂ部分は、抗原結合部位またはその抗原結合能を包含する。好ましくは、Ｆａｂ部分は、抗体の少なくともＶＨ領域を含む。
【００１７】
抗体の「Ｆｃ部分」は特に、重鎖定常領域２、３、および適用可能な場合、４（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含む抗体の部分を指す。特に、Ｆｃ部分は、これらの領域のそれぞれのうちの２つを含む。抗体がこれらの領域のすべてを含まない場合では、用語「Ｆｃ部分」は、抗体中に存在する領域ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４のもののみを指す。好ましくは、Ｆｃ部分は、抗体の少なくともＣＨ２領域を含む。好ましくは、「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原結合性活性を含有しない、パパインで天然抗体を消化することによって得られる断片に対応する抗体の部分を指す。特に、抗体のＦｃ部分は、Ｆｃ受容体に結合することができ、したがって例えば、Ｆｃ受容体結合部位またはＦｃ受容体結合能を含む。
【００１８】
本明細書で用いる用語「抗体」および「抗体構築物」は、ある特定の実施形態では、同じ種類の抗体または抗体構築物の集団をそれぞれ指す。特に、集団の全ての抗体または抗体構築物は、その抗体または抗体構築物を定義するために使用される特徴を示す。ある特定の実施形態では、集団の中の全ての抗体または抗体構築物は、同じアミノ酸配列を有する。特定の種類の抗体または抗体構築物、例えばＭＵＣ１のエピトープおよびＣＤ３のエピトープに特異的に結合する多重特異的抗体構築物への言及は、この種の抗体または抗体構築物の集団を特に指す。
【００１９】
本明細書で使用される用語「抗体」はまた、前記抗体の断片および誘導体を含む。抗体の「断片または誘導体」は、特に、前記抗体に由来し、その抗体と同じ抗原に、特に、同じエピトープに結合することができるタンパク質または糖タンパク質である。かくして、本明細書で抗体の断片または誘導体は一般に、機能的断片または誘導体を指す。特に好ましい実施形態においては、抗体の断片または誘導体は、重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の断片または誘導体の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、重鎖および軽鎖各々の可変領域および第１の定常ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームの重鎖および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片；（ｖ）ｓｃＦｖ断片、単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片；（ｖｉ）共に共有結合された２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；ならびに（ｖｉｉｉ）重鎖および軽鎖可変領域の会合が分子間でのみ生じることができ、分子内では生じ得ないような様式で共に共有結合された重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるマルチボディ（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）がある。抗体の誘導体は、特に親抗体と同じ抗原に結合するが、それが由来する親抗体とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を含む。これらの抗体断片および誘導体は、当業者に公知の従来技術を使用して得られる。
【００２０】
標的アミノ酸配列が、その全長にわたって、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の参照アミノ酸配列の対応する部分と相同性または同一性を共有する場合、標的アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」。「対応する部分」は、例えば、標的抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲＨ１）が参照抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１に対応することを意味する。特定の実施形態では、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」標的アミノ酸配列は、その全長にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と１００％相同、または特に、１００％同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、参照配列の全長にわたって、または相同性もしくは同一性が定義される配列に対応する参照配列の対応する部分の全長にわたって、本発明によって好ましくは決定される。特定のＣＤＲ配列または特定の可変領域配列などの１つまたは複数のアミノ酸配列によって定義される親抗体に由来する抗体は、特に親抗体のそれぞれのアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同または同一、特に同一であるＣＤＲ配列または可変領域配列などのアミノ酸配列を有する抗体である。ある特定の実施形態においては、親抗体に由来する抗体（すなわちその誘導体）は、親抗体と同じＣＤＲ配列を有するが、可変領域の残りの配列において異なる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「抗体」はまた、多価および多特異的抗体、すなわち、各々同じエピトープに結合する２つよりも多い結合部位を有する抗体構築物と、第１のエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位および第２のエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位ならびに必要に応じて、さらなるエピトープに結合するまたさらなる結合部位を有する抗体構築物とを指す。
【００２２】
「特異的結合」は、好ましくは、抗体などの作用物質が、別の標的への結合性と比較して特異的であるエピトープなどの標的により強く結合することを意味する。作用物質は、これが第２の標的の解離定数（Ｋｄ）より低い解離定数で第１の標的に結合する場合、第２の標的と比較して第１の標的により強く結合する。好ましくは、作用物質が特異的に結合する標的の解離定数は、作用物質が特異的に結合しない標的の解離定数より１００倍超、２００倍、５００倍、または１０００倍超低い。さらに、用語「特異的結合」は特に、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１のＫａを有する結合パートナー間の結合親和性を示す。ある特定の抗原に特異的な抗体とは、特に、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１の親和性定数Ｋａを有する親和性で前記抗原に結合することができる抗体を指す。例えば、用語「抗ＭＵＣ１抗体」とは、特に、ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体を指し、好ましくは、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１のＫａを有する親和性でＭＵＣ１に結合することができる。
【００２３】
本明細書で言及される「抗体モジュール」は、抗体に由来し、抗原に特異的に結合することが可能であるポリペプチド構築物を指す。特に、抗体モジュールは、少なくとも１つの、特に２つの抗体重鎖を含み、必要に応じて少なくとも１つの、特に２つの抗体軽鎖を含む。
【００２４】
本明細書で用いる用語「抗原結合性断片」は、抗体に由来し、抗原に特異的に結合することが可能であるが、天然抗体の全てのエレメントを含むとは限らないポリペプチド構築物を指す。特に、抗原結合性断片は抗体の定常ドメインの一部もしくは全部を含まず、２つの抗原結合性部位の代わりに１つだけを含むことができる。
【００２５】
「ＣＤ３」は、Ｔ細胞共受容体ＣＤ３（表面抗原分類３）、特にヒトＣＤ３を指す。それは、４つの別々のポリペプチド鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖および２つのＣＤ３ε鎖で一般的に構成される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と一緒に、ＣＤ３はＴＣＲ−ＣＤ３複合体を形成することができる。
【００２６】
用語「ＭＵＣ１」は、タンパク質ＭＵＣ１を指し、ムチン−１、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）またはがん抗原１５−３としても公知であり、特にヒトＭＵＣ１を指す。ＭＵＣ１はムチンファミリーのメンバーであり、膜結合型のグリコシル化リンタンパク質をコードする。ＭＵＣ１は１２０〜２２５ｋＤａのコアタンパク質質量を有し、それは、グリコシル化で２５０〜５００ｋＤａまで増加する。それは、細胞の表面から２００〜５００ｎｍを越えて伸長する。このタンパク質は、膜貫通ドメインによって多くの上皮細胞の頂端膜側に固定されている。細胞外ドメインは、２０個のアミノ酸の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）ドメインを含み、リピート数は、異なる個体において２０〜１２０で変動する。これらのリピートは、セリン、トレオニンおよびプロリン残基を豊富に含み、これらは高Ｏ−グリコシル化を可能にする。ある特定の実施形態では、用語「ＭＵＣ１」は、腫瘍関連ＭＵＣ１（「ＴＡ−ＭＵＣ１」）を指す。ＴＡ−ＭＵＣ１は、がん細胞に存在するＭＵＣ１である。このＭＵＣ１は、そのかなりより高い発現レベル、その局在化およびそのグリコシル化において、非がん細胞に存在するＭＵＣ１と異なる。特に、ＴＡ−ＭＵＣ１はがん細胞の細胞表面全体に無極性的に存在するが、非がん細胞では、ＭＵＣ１は厳密に頂端性の発現を有し、したがって、全身投与される抗体にとってアクセス可能でない。さらに、ＴＡ−ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１タンパク質主鎖の上で新しいペプチドエピトープを、および新しい炭水化物腫瘍抗原、例えばトムゼン−フリーデンライヒ抗原アルファ（ＴＦα）を曝露させる異常なＯ−グリコシル化を有する。
【００２７】
トムゼン−フリーデンライヒ抗原アルファまたはＣｏｒｅ−１とも呼ばれる「ＴＦα」は、癌腫細胞においてタンパク質のヒドロキシアミノ酸セリンまたはトレオニンにアルファ−アノマー配置でＯ−グリコシドにより連結する二糖Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃを指す。
【００２８】
用語「シアル酸」は、特に、ノイラミン酸の任意のＮ−またはＯ−置換誘導体を指す。それは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸および５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸の両方を指す場合があるが、好ましくは５−Ｎ−アセチルノイラミン酸のみを指す。シアル酸、特に、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、好ましくは２，３−または２，６−結合により炭水化物鎖に結合する。好ましくは、本明細書に記載の抗体調製物において、２，３−および２，６−結合シアル酸の両方が存在する。
【００２９】
本発明による「グリカンの相対量」は、抗体調製物の、または抗体を含む組成物中の、それぞれ、抗体に結合したグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。特に、グリカンの相対量は、抗体中に含まれ、かくして、抗体調製物中の、または抗体を含む組成物中の、抗体のポリペプチド鎖に結合したすべてのグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。グリカンの１００％は、抗体集団の、または抗体を含む組成物中の、それぞれ、抗体に結合したすべてのグリカンを指す。例えば、１０％の二分岐ＧｌｃＮＡｃを担持するグリカンの相対量は、抗体に含まれ、かくして前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に結合したすべてのグリカンの１０％が、二分岐ＧｌｃＮＡｃ残基を含むが、抗体に含まれ、かくして前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に結合したすべてのグリカンの９０％が、二分岐ＧｌｃＮＡｃ残基を含まない、抗体を含む組成物を指す。１００％を表すグリカンの対応する基準量は、組成物中の抗体に結合したすべてのグリカン構造またはすべてのＮ−グリカン、すなわち組成物中の抗体のアスパラギン残基に結合したすべてのグリカン構造またはすべての複合体型グリカンのいずれかであってよい。グリカン構造の参照群は、一般に明確に示されるまたは当業者によって状況から直ちに導き出せる。
【００３０】
用語「Ｎ−グリコシル化」は、タンパク質のポリペプチド鎖のアスパラギン残基に結合したすべてのグリカンを指す。これらのアスパラギン残基は、一般に、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有するＮ−グリコシル化部位の一部であり、式中Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい。同様に「Ｎ−グリカン」は、ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に結合したグリカンである。用語「グリカン」、「グリカン構造」、「炭水化物」、「炭水化物鎖」および「炭水化物構造」は、一般に本明細書において同意語として使用される。一般にＮ−グリカンは、２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基および３個のマンノース残基からなる一般的コア構造を有し、Ａｓｎがポリペプチド鎖のアスパラギン残基である構造Ｍａｎα１，６−（Ｍａｎα１，３−）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎを有する。Ｎ−グリカンは、３つの異なる種類、すなわち複合体型グリカン、ハイブリッド型グリカンおよび高マンノース型グリカンにさらに細分される。
【００３１】
本明細書で与えられる数値、特に、特異的グリコシル化特性の相対量は、好ましくは概数として理解されるべきである。特に、数値は、好ましくは最大で１０％高い、および／または低い、特に、最大で９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％高い、および／または低い場合がある。
【００３２】
用語「核酸」は、１本鎖および２本鎖核酸およびリボ核酸およびデオキシリボ核酸を含む。天然に存在するおよび合成のヌクレオチドを含んでよく、例えばメチル化、５’および／または３’キャッピングによって天然でまたは合成的に改変されてよい。
【００３３】
用語「発現カセット」は、特にそれに導入されたコード核酸配列の発現を可能にでき、制御できる核酸構築物を指す。発現カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサーおよび遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を制御する他の調節エレメントを含んでよい。発現カセットの正確な構造は、種または細胞型の機能によって変動する場合があるが、一般にＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。さらに詳細には、５’非転写発現調節配列は、作動可能に繋がれた核酸の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現カセットは、エンハンサー配列または上流活性化配列も含む場合がある。
【００３４】
本発明によれば、用語「プロモーター」は、発現される核酸配列の上流（５’）に位置付けられ、ＲＮＡポリメラーゼのための認識および結合部位を提供することによって配列の発現を調節する核酸配列を指す。「プロモーター」は、遺伝子の転写の制御に関与するさらなる因子のためのさらなる認識および結合部位も含んでよい。プロモーターは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を調節できる。さらにプロモーターは、「誘導性」である場合がある、すなわち誘導剤への応答で転写を開始する、または転写が誘導剤によって調節されない場合は「構成的」である場合がある。誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子は、誘導剤が存在しない場合は、発現されないまたは少量発現されるのみである。誘導剤の存在下で遺伝子は、スイッチがオンになるまたは転写のレベルが増大される。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
【００３５】
用語「ベクター」は、その最も一般的な意味で本明細書において使用され、核酸が、例えば原核生物および／または真核生物細胞に導入され、適切な場合はゲノムに組み込まれるようにする、核酸に関する任意の中間ビヒクルを含む。この種類のベクターは、細胞において好ましくは複製されるおよび／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。本明細書において使用される用語「プラスミド」は一般に、染色体ＤＮＡとは無関係に複製できる染色体外遺伝子材料の構築物、通常環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
【００３６】
本発明によれば、用語「宿主細胞」は、外来性核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る任意の細胞に関する。用語「宿主細胞」は、本発明によれば、原核生物細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。特に好ましいのは、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギまたは霊長類からの細胞などの哺乳動物細胞である。細胞は、多様な組織型に由来してよく、初代細胞および細胞株を含む。核酸は、単一のコピーまたは２つもしくはそれより多いコピーの形態で宿主細胞中に存在してよく、一実施形態においては、宿主細胞において発現される。
【００３７】
本発明による用語「患者」は、ヒト、非ヒト霊長類または別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはマウスおよびラットなどのげっ歯類などの哺乳動物を意味する。特に好ましい実施形態においては、患者はヒトである。
【００３８】
本発明による用語「がん」は、特に、白血病、精上皮腫、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液のがん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、結腸がん、胃がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がんおよび肺がんならびにそれらの転移を含む。本発明による用語がんはまた、がん転移を含む。
【００３９】
「腫瘍」とは、誤調節された細胞増殖により形成される細胞群または組織を意味する。腫瘍は、構造的組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、明確な組織塊を形成する場合があり、それは、良性である場合も、悪性である場合もある。
【００４０】
「転移」とは、身体のその元の部位から別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、通常、原発性腫瘍からのがん細胞の剥離、体内循環への進入および身体の他の場所の正常組織内で定着して増殖することを含む。腫瘍細胞が転移する場合、新しい腫瘍は、続発性または転移性腫瘍と呼ばれ、その細胞は通常、元の腫瘍内の細胞に似ている。このことは、例えば、乳がんが肺へと転移した場合、続発性腫瘍は、異常な乳房細胞から構成されており、異常な肺細胞から構成されているわけではないことを意味する。そこで、肺における腫瘍は、転移性乳がんと呼ばれ、肺がんとは呼ばれない。
【００４１】
用語「医薬組成物」は特に、ヒトまたは動物に投与するのに適した組成物、すなわち、薬学的に許容される成分を含有する組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤、または薬学的賦形剤、例えば、緩衝剤、保存剤および張度修飾物質などと一緒に、活性化合物、またはその塩またはプロドラッグを含む。
【００４２】
本明細書に記載の数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。本明細書に提供される表題は、全体として本明細書を参照することによって読むことができる本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。一実施形態によれば、方法の場合に、ある特定のステップを含むとして、または組成物の場合に、ある特定の成分を含むとして本明細書に記載される主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載の好適な態様および実施形態を選択し、組み合わせることは好適であり、好適な実施形態のそれぞれの組み合わせから生じる特定の主題も本開示に属する。
【００４３】
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ断片がＭＵＣ１を標的にする抗がん抗体に融合している、二重特異的抗体構築物の開発に基づいている。確立された抗ＭＵＣ１抗体は、腫瘍関連ＭＵＣ１に結合し、細胞傷害性免疫細胞を動員、活性化することによってそれらの抗がん活性を発揮する。免疫細胞、特にナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の結合および活性化は、抗体のＦｃ部分と、免疫細胞上のＦｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩａとの相互作用を介して達成される。活性化の際に、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が開始される。腫瘍細胞の殺滅は、高度に効率的な細胞傷害性Ｔリンパ球によって媒介することもできる。これを考慮すれば、本発明者らは、これらの抗体に抗ＣＤ３結合性断片を結合させることによって、確立された抗ＭＵＣ１抗体の有効性をさらに改善した。ＣＤ３は細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞表面タンパク質であり、抗ＣＤ３結合性断片は、抗ＭＵＣ１抗体が標的にする腫瘍部位に前記細胞傷害性Ｔリンパ球を動員する。
【００４４】
本発明者らは、これに関して、抗ＭＵＣ１抗体の重鎖のＣ末端への抗ＣＤ３結合性断片の結合が、有意に改善したＣＤ３結合およびＴ細胞活性化、例えば、Ｔ細胞媒介ＡＤＣＣ活性およびＴ細胞増殖をもたらすことを驚くべきことに見出した。対照的に、抗ＭＵＣ１抗体の軽鎖のＣ末端に抗ＣＤ３結合性断片を含む二重特異的構築物は、低減したＣＤ３結合およびＴ細胞活性化を示した。関連した技術分野ではＴ細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離が強く有利であったので、これは非常に意外であった（例えば、Ｂｌｕｅｍｅｌ，  Ｃ．ら（２０１０年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ５９巻：１１９７〜１２０９頁；Ｃｈａｍｅｓ，  Ｐ．およびＢａｔｙ，  Ｄ．（２００９年）ｍＡｂｓ１巻（６号）：５３９〜５４７頁を参照）。これと対照的に、結合性ドメインの間の距離は、抗ＣＤ３結合性断片が軽鎖のＣ末端に結合している構築物と比較して、抗ＣＤ３結合性断片が重鎖のＣ末端に結合している、本発明の抗体構築物においてかなりより大きい。腫瘍抗原ＨＥＲ２およびＣＤ３を標的にする対照構築物では、実際、２つの結合性部位の間の短い距離は当技術分野で教示されるように有利であった。ここでは、Ｔ細胞活性化は、重鎖Ｃ末端と比較して軽鎖Ｃ末端にＣＤ３結合性部位を有する構築物でより強かった。
【００４５】
この教示は、２つの異なる抗ＭＵＣ１抗体で検証された。ＰａｎｋｏＭａｂは、腫瘍細胞の上だけでアクセス可能である、ＭＵＣ１の細胞外リピート領域の中のＴＡ−ＭＵＣ１エピトープに特異的に結合する。ＫａｒｏＭａｂは、同様に腫瘍細胞の上だけでアクセス可能である、ＭＵＣ１の上に存在する炭水化物構造体であるトムゼン−フリーデンライヒ抗原に結合する。抗がん抗体ＰａｎｋｏＭａｂおよびＫａｒｏＭａｂの場合、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ断片が抗がん抗体の重鎖のＣ末端に融合している抗体構築物で、優れたＣＤ３結合およびＴ細胞活性化が得られた。
【００４６】
これらの知見から、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの抗体重鎖を含む抗ＭＵＣ１抗体モジュール、および
（ｉｉ）抗ＣＤ３抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している、多重特異的抗体構築物を提供する。
【００４７】
多重特異的抗体構築物は、異なる抗原に特異的に結合する２つまたはそれより多くの異なる抗原結合性部位を含むタンパク質構築物である。少なくとも１つの抗原結合性部位がＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合し、少なくとも１つの他の抗原結合性部位がＣＤ３に特異的に結合する。多重特異的抗体構築物はＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する１つより多い抗原結合性部位を含むことができ、その抗原結合性部位は同じアミノ酸配列を有することができる。特に、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する全ての抗原結合性部位は、抗ＭＵＣ１抗体モジュールの一部である。さらに、多重特異的抗体構築物はＣＤ３に特異的に結合する１つより多い抗原結合性部位を含むことができ、その抗原結合性部位は同じアミノ酸配列を有することができる。ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合性部位は、同じ抗原結合性断片の一部であってもよく、または別個の抗原結合性断片に存在してもよい。
【００４８】
抗原結合性部位は、少なくとも１つの抗体可変領域、特に抗体重鎖可変領域を含む。特定の実施形態においては、抗原結合性部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。抗原結合性部位の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、ペプチドリンカーを介して互いに融合させることができる。ある特定の実施形態では、抗原結合性部位は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。
【００４９】
抗ＭＵＣ１抗体モジュール
抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する少なくとも２つの、特に厳密には２つの抗原結合性部位を含む。これらの抗原結合性部位は異なってもよく、または同一であってもよく、特に同じアミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態においては、抗体モジュールの抗原結合性部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、少なくとも１つの抗体重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、２つの抗体重鎖を含む。抗体重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを特に含む。ある特定の他の実施形態では、抗体重鎖はＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むが、ＣＨ１ドメインを含まない。さらなる実施形態では、重鎖の１つまたは複数の定常ドメインは、他のドメイン、特に類似のドメイン、例えばアルブミンと置き換えることができる。抗体重鎖は、γ、α、ε、δおよびμ鎖を含む任意のタイプであってよく、好ましくは、γ１、γ２、γ３およびγ４鎖を含むγ鎖、特にγ１鎖である。したがって、抗体モジュールは、好ましくはＩｇＧ型の抗体モジュール、特にＩｇＧ１型の抗体モジュールである。
【００５１】
好ましい実施形態では、抗体モジュールは、Ｆｃ領域を含む。抗体モジュールは、特に、ドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を各々含む２つの重鎖ならびにドメインＶＬおよびＣＬを各々含む２つの軽鎖を含む完全抗体であってよい。抗体モジュールは、１つまたは複数のヒトＦｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体ＩＩＩＡに結合することが特に可能である。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩＡに結合しないかまたは顕著には結合しない。これらの実施形態では、抗体モジュールは、ＣＨ２ドメインにおいてグリコシル化部位を特に含まない。
【００５２】
特に、抗体モジュールは、少なくとも１つの抗体軽鎖、特に２つの抗体軽鎖をさらに含む。抗体軽鎖は、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを特に含む。抗体軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であってもよく、特にκ鎖である。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含む。
【００５３】
代わりの実施形態では、抗体モジュールは、抗体軽鎖を含まない。これらの実施形態では、抗体モジュールの抗体重鎖は、軽鎖可変領域をさらに含むことができる。特に、軽鎖可変領域は重鎖のＮ末端に融合しているか、または重鎖可変領域のＣ末端側に挿入される。軽鎖可変領域を重鎖の残りの部分と繋ぐために、ペプチドリンカーが存在してもよい。
【００５４】
抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する。エピトープはＭＵＣ１に特異的であってよく、すなわち、それは他の分子の上に存在しないか、またはそれは他の分子の上にも見出されるエピトープであってもよい。
【００５５】
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、グリコシル化依存的にＭＵＣ１に結合する。特に、それがグリコシル化される場合、特に細胞外タンデムリピートにおいてグリコシル化される場合、抗体モジュールはＭＵＣ１により強く結合する。特定の実施形態においては、それがＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリルα２−６Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴｎ）、ガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）またはガラクトースβ１−３（シアリルα２−６）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴＦ）、好ましくはＴｎまたはＴＦでＯ−グリコシル化される場合、抗体モジュールはＭＵＣ１により強く結合する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ＭＵＣ１の細胞外タンデムリピートのエピトープに特異的に結合する。特に、抗体モジュールは、前記タンデムリピートがＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリルα２−６Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴｎ）、ガラクトースβ１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）またはガラクトースβ１−３（シアリルα２−６）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴＦ）により、好ましくはＴｎまたはＴＦにより、トレオニン残基でグリコシル化された場合、より強く結合する。好ましくは、炭水化物部分は、α−Ｏ−グリコシド結合によってトレオニン残基に結合される。
【００５７】
特定の実施形態においては、抗体モジュールは、アミノ酸配列ＰＤＴＲ（配列番号１９）またはＰＤＴＲＰ（配列番号２０）を含むＭＵＣ１のタンデムリピートドメインのエピトープに特異的に結合することができる。このエピトープへの結合は、好ましくは、上記のように、グリコシル化依存的であり、特に、上記の炭水化物部分が、それぞれ、配列ＰＤＴＲまたはＰＤＴＲＰ（配列番号１９および２０）のトレオニン残基に結合している場合、結合が増大する。
【００５８】
ある特定の実施形態においては、抗体モジュールは、腫瘍関連ＭＵＣ１エピトープ（ＴＡ−ＭＵＣ１）に特異的に結合する。ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープは、特に、腫瘍細胞上に存在するが、正常細胞上には存在しない、かつ／または腫瘍細胞上に存在する場合のみ宿主循環中の抗体によってアクセス可能であるが、正常細胞上に存在する場合アクセス可能でない、ＭＵＣ１のエピトープを指す。上記のエピトープ、特に、ＭＵＣ１のタンデムリピートドメインに存在するエピトープは、腫瘍関連ＭＵＣ１エピトープであり得る。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの、ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープを発現する細胞への結合は、正常な非腫瘍ＭＵＣ１を発現する細胞への結合より強い。好ましくは、前記結合は、少なくとも１．５倍強く、好ましくは少なくとも２倍強く、少なくとも５倍強く、少なくとも１０倍強く、または少なくとも１００倍強い。特に、ＴＡ−ＭＵＣ１は、その細胞外タンデムリピート領域において少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはガラクトースβ１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）によりグリコシル化される。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはガラクトースβ１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）を含むＴＡ−ＭＵＣ１の細胞外タンデムリピート領域のこのエピトープに特異的に結合する。特に、前記エピトープは、ＭＵＣ１タンデムリピートの少なくとも１つのＰＤＴＲ配列（配列番号１９）またはＰＤＴＲＰ配列（配列番号２０）を含み、好ましくはα−Ｏ−グリコシド結合を介して、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはガラクトースβ１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）によりＰＤＴＲ配列（配列番号１９）またはＰＤＴＲＰ配列（配列番号２０）のトレオニンでグリコシル化される。ＴＡ−ＭＵＣ１結合について、抗体モジュールは、結合強度が、同一の長さおよび同一のペプチド配列の非グリコシル化ペプチドへの結合と比較して、少なくとも２倍、好ましくは４倍または１０倍、最も好ましくは２０倍増大するように、好ましくはグリコシル化ＭＵＣ１腫瘍エピトープに特異的に結合する。
【００５９】
以下において、ＴＡ−ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールの特定の実施形態が記載される。
【００６０】
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む、または配列番号２のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む、少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する重鎖可変領域は、配列番号７、８もしくは９のアミノ酸配列または前記配列のうちの１つと少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの重鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号５のアミノ酸配列を有するか、またはＣＤＲ−Ｈ１が配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する１組のＣＤＲを含み、（ｉｉ）配列番号７、８および９、特に９のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む。
【００６１】
抗体モジュールは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３、または配列番号１１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、少なくとも１つの軽鎖可変領域をさらに含むことができる。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する軽鎖可変領域は、配列番号１６、１７、１８、５２もしくは５３のアミノ酸配列または前記配列のうちの１つと少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの軽鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、またはＣＤＲ−Ｌ１が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１５のアミノ酸配列を有する１組のＣＤＲを含み、（ｉｉ）配列番号１６、１７、１８、５２および５３、特に１８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む。
【００６２】
特定の好ましい実施形態では、抗体モジュールは、配列番号９のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの、特に２つの重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの、特に２つの軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の１つまたは複数を含む抗体、特に、例えば、ＷＯ２００４／０６５４２３およびＷＯ２０１１／０１２３０９に記載されるそのキメラのもしくはヒト化されたバージョンの抗体ＰａｎｋｏＭａｂ、または抗体ガチポツズマブ（Ｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）に由来する。
【００６３】
特定の実施形態においては、抗体モジュールは、トムゼン−フリーデンライヒ抗原ＴＦαに特異的に結合する。ＴＦαは、癌腫細胞においてタンパク質のヒドロキシアミノ酸セリンまたはトレオニンにα−アノマー配置でＯ−グリコシドにより連結する二糖構造Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃである。がん細胞におけるＴＦαの主な担体の１つは、ＭＵＣ１である。ＴＦαは、ＭＵＣ１の細胞外領域の中のタンデムリピートのＯ−グリコシル化部位に特に存在する。したがって、抗体モジュールは、ＭＵＣ１の上のＴＦαに特に結合する。
【００６４】
以下において、ＴＦαに特異的に結合する抗体モジュールの特定の実施形態が記載される。
【００６５】
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２または２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号２４、２５または２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む、少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号２１、２２および２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する重鎖可変領域は、配列番号２７〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列または前記配列のうちの１つと少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの重鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号２４または２５のアミノ酸配列を有する１組のＣＤＲを含み、（ｉｉ）配列番号２７〜３２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む。
【００６６】
抗体モジュールは、配列番号３３、３４または３５のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３６または３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３８または３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、少なくとも１つの軽鎖可変領域をさらに含むことができる。特に、重鎖可変領域は、配列番号３３、３６および３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する軽鎖可変領域は、配列番号４０、４１および４２のいずれか１つのアミノ酸配列または前記配列のうちの１つと少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの軽鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号３３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号３６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号３８のアミノ酸配列を有する１組のＣＤＲを含み、（ｉｉ）配列番号４０、４１および４２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む。
【００６７】
特定の好ましい実施形態では、抗体モジュールは、配列番号２７、２９、３０または３１のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの、特に２つの重鎖可変領域、および配列番号４０、４１または４２のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの、特に２つの軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の１つまたは複数を含む抗体に由来する。
【００６８】
抗ＣＤ３抗原結合性断片
抗ＣＤ３抗原結合性断片は、ＣＤ３に特異的な少なくとも１つの抗原結合性部位を含む。特に、抗原結合性断片は、抗体重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含む。特定の実施形態においては、抗原結合性断片は、ＶＨドメインと一緒に抗原結合性部位を形成する、抗体軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）をさらに含む。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、同じポリペプチド鎖によって、または別個のポリペプチド鎖によって形成することができる。特に、それらは同じポリペプチド鎖によって形成され、特に、抗原結合性断片は単鎖の断片である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ペプチドリンカーによって互いに連結することができる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを互いに連結するために、本明細書に記載されるペプチドリンカーを使用することができる。単一のポリペプチド鎖によって形成されるＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗原結合性断片では、ＶＨドメインはＶＬドメインのＮ末端またはＣ末端であってよく、特にＶＬドメインのＮ末端である。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、ＣＤ３に特異的に結合する単鎖の可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。
【００６９】
抗ＣＤ３抗原結合性断片は１つより多い抗原結合性部位を含むことができるが、特に１つの抗原結合性部位だけを含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片はいかなる抗体定常領域ドメインも含まない。
【００７０】
抗原結合性断片は、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合する。特に、抗原結合性断片は、ＣＤ３εに特異的に結合する。特定の実施形態においては、抗原結合性断片は、特にそれがＣＤ３δと複合体を形成している場合だけ、コンホメーション依存的にＣＤ３εに特異的に結合する。
【００７１】
ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、配列番号４３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む、少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。一実施形態によれば、抗原結合性断片に存在する重鎖可変領域は、配列番号４６のアミノ酸配列または前記配列のうちの１つと少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、抗原結合性断片の重鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号４３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号４４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号４５のアミノ酸配列を有する１組のＣＤＲを含み、（ｉｉ）配列番号４６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む。
【００７２】
抗原結合性断片は、配列番号４７のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、少なくとも１つの軽鎖可変領域をさらに含むことができる。一実施形態によれば、抗原結合性断片に存在する軽鎖可変領域は、配列番号５０のアミノ酸配列または前記配列のうちの１つと少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、抗原結合性断片の軽鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号４８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号４９のアミノ酸配列を有する１組のＣＤＲを含み、（ｉｉ）配列番号５０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む。
【００７３】
特定の好ましい実施形態では、抗原結合性断片は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの、特に１つの重鎖可変領域、および配列番号５０のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの、特に１つの軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の１つまたは複数を含む抗体に由来する。
【００７４】
さらなる実施形態では、抗原結合性断片は、任意の抗ＣＤ３抗体に由来することができる。抗原結合性断片が由来することができる抗ＣＤ３抗体の適する例には、ＷＯ２００８／１１９５６７Ａ２に開示される、ＯＫＴ３、ＴＲ６６、ＵＣＨＴ１、ＣＬＢ−Ｔ３、Ｌ２Ｋ、ＤｉＬ２Ｋおよび抗ＣＤ３抗体が含まれる。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、そのアミノ酸配列がこれらの抗ＣＤ３抗体のいずれか１つの重鎖可変領域と少なくとも８５％、特に少なくとも９０％または少なくとも９５％、特に１００％同一である、重鎖可変領域を含む。好ましくは、抗原結合性断片は、そのアミノ酸配列が同じ抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域と少なくとも８５％、特に少なくとも９０％または少なくとも９５％、特に１００％同一である、軽鎖可変領域をさらに含む。
【００７５】
多重特異的抗体構築物
多重特異的抗体構築物は、少なくとも１つの抗ＭＵＣ１抗体モジュールを特異的に、および少なくとも１つの抗ＣＤ３抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、少なくとも２つ、特に厳密には２つの抗ＣＤ３抗原結合性断片を含む。抗原結合性断片は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。抗原結合性断片の少なくとも１つは、抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している。
【００７６】
多重特異的抗体構築物が２つの抗原結合性断片を含む特定の実施形態においては、抗体モジュールは、２つの重鎖も含み、抗原結合性断片の各々は、抗体モジュールの異なる重鎖のＣ末端に融合している。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合し、さらなる抗原結合性断片が、第１の抗原結合性断片のＣ末端に融合している。抗体モジュールが２つの重鎖を含む場合、これはこれらの重鎖の両方についてあてはまり得る。
【００７７】
抗原結合性断片は、ペプチド結合を介して直接的にまたはペプチドリンカーを介して間接的に、抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合することができる。直接的融合とは、それらの２つの配列の間にいかなる中間のアミノ酸もなしで、抗原結合性断片の配列が抗体モジュールの重鎖の配列に直接的に続く実施形態を指す。ペプチドリンカーを介した融合とは、１つまたは複数のアミノ酸が抗体モジュールの重鎖の配列と抗原結合性断片の配列の間に存在する実施形態を指す。これらの１つまたは複数のアミノ酸は、抗体モジュールの重鎖と抗原結合性断片の間でペプチドリンカーを形成する。
【００７８】
抗体モジュールの重鎖のＣ末端への抗原結合性断片の結合を特異的に設計することによって、多重特異的抗体構築物の安定性を改善することができることが見出された。特に、ある特定のストレス条件下では、抗体モジュールの重鎖および抗原結合性断片を含む融合ポリペプチドは変性する可能性があり、抗原結合性断片が、抗体モジュールの重鎖から切断される可能性がある。実施例に実証されるように、これは重鎖のＣ末端の変異によって予防することができる。ある特定の実施形態、特に抗体モジュールがＩｇＧ型の抗体モジュールである、および／またはγ型の重鎖を有する実施形態では、抗体モジュールの重鎖のＣ末端アミノ酸残基は、リシン残基でない。一般的に、ＩｇＧ抗体のγ型の重鎖は、Ｃ末端の最後のアミノ酸としてリシン残基を有する。このリシン残基の置換または欠失は、融合ポリペプチドの分解を阻害する。特定の実施形態においては、抗体モジュールのγ型の重鎖のＣ末端のリシン残基は欠失しているかまたは別のアミノ酸によって置換され、好ましくは欠失している。
【００７９】
ペプチドリンカーは、抗体モジュールの重鎖および抗原結合性断片を連結するのに適する、任意の数のアミノ酸および任意のアミノ酸配列を原則として有することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３、好ましくは少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、５０もしくはそれより少ない、好ましくは４５もしくはそれより少ない、４０もしくはそれより少ない、３５もしくはそれより少ない、３０もしくはそれより少ない、２５もしくはそれより少ない、または２０もしくはそれより少ないアミノ酸を含む。特に、ペプチドリンカーは、５から２５のアミノ酸、特に１０から２０のアミノ酸を含む。特定の実施形態においては、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリン残基からなる。グリシンおよびセリンは、２対１、３対１、４対１または５対１（グリシン残基の数対セリン残基の数）の比で、ペプチドリンカーに存在することができる。例えば、ペプチドリンカーは４グリシン残基と続く１セリン残基の配列を、特に、１、２、３、４、５または６リピートのこの配列を含むことができる。具体例は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の２つのリピート、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の３つのリピートおよびアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の４つのリピートを含むかまたはそれからなるペプチドリンカーである。特に、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の３つまたは４つのリピートからなるペプチドリンカーを使用することができる。特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、抗体モジュールの重鎖のＣ末端と抗原結合性断片のＮ末端の間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカー、および／または抗原結合性断片のＶＨドメインとＶＬドメインの間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカーを含む。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトにおいて全くまたは少しの免疫原性能力しか示さない配列、好ましくはヒト配列または天然に存在する配列である配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ペプチドリンカーおよび隣接するアミノ酸は、全くまたは少しの免疫原性能力しか示さない。上記のペプチドリンカーは、１つの抗原結合性断片に存在する重鎖可変領域および軽鎖可変領域などの、多重特異的抗体構築物の他のエレメントを連結するために使用することもできる。
【００８０】
多重特異的抗体構築物は、特に二重特異的抗体構築物である。二重特異的抗体構築物は、ＭＵＣ１のエピトープおよびＣＤ３のエピトープに特異的に結合するが、別の抗原に特異的に結合するいかなるさらなる抗原結合性部位も含まない。代替の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、他の抗原に特異的に結合する１つまたは複数のさらなる抗原結合性部位を含む。これらのさらなる抗原結合性部位は、多重特異的抗体構築物の任意の場所に存在することができる。ある特定の実施形態では、さらなる抗原結合性部位は、抗体モジュールの抗体軽鎖のＣ末端に融合している。特に、抗体モジュールが２つの抗体軽鎖を含む場合は、１つまたは複数の抗原結合性部位、特に１つの抗原結合性部位が抗体モジュールの抗体軽鎖の各々のＣ末端に融合している。これらの抗原結合性部位は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。さらなる抗原結合性部位は、任意の抗原に、特に腫瘍関連抗原または免疫細胞のチェックポイント抗原に特異的に結合することができる。そのような抗原の適する例は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４０、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４、ＴＦａ、ＬｅＹ、ＣＤ１６０、ガレクチン−３、ガレクチン−１からなる群より選択することができる。
【００８１】
ある特定の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、それにコンジュゲートしている１つまたは複数のさらなる作用物質を含む。さらなる作用物質は、多重特異的抗体構築物へのコンジュゲーションに適する任意の作用物質であってよい。１つより多いさらなる作用物質が多重特異的抗体構築物に存在する場合は、これらのさらなる作用物質は同一であっても異なってもよく、特に全て同一である。多重特異的抗体構築物へのさらなる作用物質のコンジュゲーションは、当技術分野で公知である任意の方法を使用して達成することができる。さらなる作用物質は共有結合的に、特に融合もしくは化学的カップリングによって、または非共有結合的に多重特異的抗体構築物に結合させることができる。ある特定の実施形態では、さらなる作用物質は、特にリンカー部分を介して、多重特異的抗体構築物に共有結合している。リンカー部分は、多重特異的抗体構築物にさらなる作用物質を結合させるのに適する任意の化学実体であってよい。
【００８２】
ある特定の実施形態では、さらなる作用物質は、タンパク質のポリペプチドである。このポリペプチドまたはタンパク質は、抗体モジュールのポリペプチド鎖に、または抗原結合性断片のポリペプチド鎖に特に融合させることができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質は、抗体モジュールの抗体軽鎖のＣ末端に融合している。抗体モジュールが２つの抗体軽鎖を含む実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質は、２つの抗体軽鎖の各々のＣ末端に融合させることができる。ポリペプチドまたはタンパク質は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。ポリペプチドまたはタンパク質であるそのようなさらなる作用物質の適する例は、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合性断片、酵素および相互作用ドメインからなる群より選択することができる。
【００８３】
さらなる作用物質は、疾患、特にがんの療法、診断、予後診断および／またはモニタリングにおいて好ましくは有益である。例えば、さらなる作用物質は、放射性核種、化学療法剤、検出可能な標識、毒素、細胞溶解性成分、免疫調節物質、イムノエフェクターおよびリポソームからなる群より選択することができる。
【００８４】
多重特異的抗体構築物のグリコシル化
抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、１つまたは複数の抗体重鎖にＣＨ２ドメインを含むことができる。ＩｇＧ型の天然のヒト抗体は、ＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含む。抗体モジュールに存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含んでも含まなくてもよい。
【００８５】
ある特定の実施形態では、抗体モジュールに存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含まない。特に、抗体モジュールは、ＩＭＧＴ／Ｅｕ番号付けシステムによる２９７位に対応する重鎖の位置に、アスパラギン残基を含まない。例えば、抗体モジュールは、重鎖にＡｌａ２９７変異を含むことができる。これらの実施形態では、多重特異的抗体構築物は、Ｆｃγ受容体への結合を介して、好ましくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力が強く低減しているかまたはその能力を完全に欠いている。これに関して強く低減した能力とは、そのＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含み、ヒト細胞株またはＣＨＯ細胞株における生成によって入手できるものなどの一般的な哺乳動物グリコシル化パターン、例えば本明細書に記載されるグリコシル化パターンを有する、同じ多重特異的抗体構築物と比較して、１０％もしくはそれ未満の、特に３％もしくはそれ未満の、１％もしくはそれ未満の、または０．１％もしくはそれ未満の活性への低減を特に指す。
【００８６】
抗体モジュールのＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含まない多重特異的抗体構築物が、それにもかかわらずナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を活性化することが可能であるが、これらの構築物はＮＫ細胞のＦｃγ受容体に結合することが可能でないことが驚くべきことに見出された。多重特異的抗体構築物はＴ細胞を動員し、活性化し、次にそれはＮＫ細胞を活性化すると考えられている。
【００８７】
代替の実施形態では、抗体モジュールに存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含む。このグリコシル化部位は、特に、Ｋａｂａｔの番号付けによる重鎖のアミノ酸２９７位に対応するアミノ酸位置にあり、アミノ酸配列モチーフＡｓｎ  Ｘａａ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であってもよい）を有する。Ａｓｎ２９７のＮ結合グリコシル化は、哺乳動物ＩｇＧならびに他の抗体アイソタイプの相同領域において保存されている。可変領域または他の配列改変の中に存在してもよい必要に応じたさらなるアミノ酸のため、この保存されたグリコシル化部位の実際の位置は、抗体のアミノ酸配列中で変化してもよい。好ましくは、抗体モジュールに結合したグリカンは、好ましくは、少なくとも以下の構造：
Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２
（式中、Ａｓｎは抗体モジュールのポリペプチド部分のアスパラギン残基であり；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｍａｎはマンノースである）
を含む、二分岐型（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合型Ｎ−結合炭水化物構造である。末端のＧｌｃＮＡｃ残基は、必要に応じてシアル酸残基を担持してもよい、ガラクトース残基をさらに担持してもよい。さらなるＧｌｃＮＡｃ残基（二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃと命名される）を、ポリペプチドに最も近いＭａｎに結合させることができる。フコースを、Ａｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃに結合することができる。
【００８８】
好ましい実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）または検出可能な量のＮｅｕＧｃを含まない。さらに、多重特異的抗体構築物はまた、好ましくはＧａｌｉｌｉエピトープ（Ｇａｌα１，３−Ｇａｌ構造）または検出可能な量のＧａｌｉｌｉエピトープを含まない。特に、ＮｅｕＧｃおよび／またはＧａｌα１，３−Ｇａｌ構造を担持するグリカンの相対量は、多重特異的抗体構築物の集団中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の０．１％未満またはさらには０．０２％未満である。
【００８９】
特に、多重特異的抗体構築物は、ヒトグリコシル化パターンを有する。これらのグリコシル化特性のために、副作用を誘導する外来性免疫原性非ヒト構造は存在せず、このことは、ある特定の外来糖構造、例えば両方ともげっ歯類生成系について公知の免疫原性非ヒトシアル酸（ＮｅｕＧｃ）もしくはＧａｌｉｌｉエピトープ（Ｇａｌ−Ｇａｌ構造）、または例えば酵母系から公知の免疫原性高マンノース構造のような他の構造により引き起こされることが公知の、望ましくない副作用または不利益が避けられることを意味する。
【００９０】
特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、二分岐ＧｌｃＮＡｃ残基を担持する検出可能な量のグリカンを有する抗体モジュールのＣＨ２ドメインでのグリコシル化パターンを含む。特に二分岐ＧｌｃＮＡｃ残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも０．５％、特に少なくとも１％である。さらにある特定の実施形態においては、ＣＨ２ドメインでのグリコシル化パターンは、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも３０％の少なくとも１個のガラクトース残基を担持するグリカンの相対量を含む。特に少なくとも１個のガラクトース残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも４０％、特に少なくとも４５％または少なくとも５０％である。
【００９１】
多重特異的抗体構築物は、高い量のコアフコースまたは低い量のコアフコースを有する抗体モジュールのＣＨ２ドメインでのグリコシル化パターンを有する場合がある。ＣＨ２ドメインでのフコシル化の量の低減は、ＡＤＣＣを誘導する多重特異的抗体構築物の能力を増大させる。ある特定の実施形態においては、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％もしくはそれ未満、特に３０％もしくはそれ未満または２０％もしくはそれ未満である。代替の実施形態においては、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％、特に少なくとも６５％または少なくとも７０％である。
【００９２】
抗ＭＵＣ１抗体モジュールのＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化部位の存在または不在、および前記グリコシル化部位のグリカン構造におけるフコースの存在または不在を介して、抗体モジュールのＦｃ部分を介してＡＤＣＣを誘導する多重特異的抗体構築物の能力、および前記ＡＤＣＣ誘導の強さを制御することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介されるＡＤＣＣは、腫瘍部位への前記Ｔリンパ球の動員によって既に開始されている。これは多重特異的抗体構築物の２つの結合性部位、腫瘍細胞に結合する抗ＭＵＣ１抗体モジュールおよび細胞傷害性Ｔリンパ球に結合する抗ＣＤ３抗原結合性断片、によって達成される。Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される全体のＡＤＣＣ活性は、抗体モジュールのＦｃ部分のグリコシル化によって、および前記グリコシル化におけるフコシル化の量を低減することによってさらに増加させることができる。Ｆｃグリコシル化で、特に低いフコシル化で、ＮＫ細胞によって媒介されるＡＤＣＣがＴ細胞によって媒介されるＡＤＣＣに加えられる。ある特定の適用では、ＡＤＣＣ活性の微調整が重要である。したがって、ある特定の状況では、抗体モジュールのＣＨ２ドメインにグリコシル化部位のない多重特異的抗体構築物、抗体モジュールのＣＨ２ドメインにグリコシル化部位があり、多量のフコシル化のある多重特異的抗体構築物、または抗体モジュールのＣＨ２ドメインにグリコシル化部位があり、少量のフコシル化がある多重特異的抗体構築物が最も有利であるかもしれない。
【００９３】
多重特異的抗体構築物は、好ましくは宿主細胞において組換え生成される。多重特異的抗体構築物の生成に使用される宿主細胞は、抗体生成に使用され得る任意の宿主細胞であり得る。好適な宿主細胞は、特に、真核生物宿主細胞、特に、哺乳動物宿主細胞である。宿主細胞の例としては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞株などの酵母細胞、ＳＦ９およびＳＦ２１細胞株などの昆虫細胞、植物細胞、ＥＢ６６アヒル細胞株などの鳥類細胞、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０およびＹＢ２／０細胞株などのげっ歯類細胞ならびにＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ、ＣＡＰ−Ｔ、ＡＧＥ１．ＨＮ、Ｍｕｔｚ−３およびＫＧ１細胞株などのヒト細胞がある。
【００９４】
ある特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、ヒト血液細胞株において、特に、ヒト骨髄性白血病細胞株において組換え生成される。多重特異的抗体構築物の生成に使用され得る好ましいヒト細胞株および好適な生成手技は、ＷＯ  ２００８／０２８６８６  Ａ２で説明されている。特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、およびＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２からなる群より選択されるヒト骨髄性白血病細胞株における発現により得られる。これらの細胞株は、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によりＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）にブダペスト条約の要件に従って、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０６（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８；２００６年９月１５日に寄託された）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０７（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６；２００６年１０月５日に寄託された）およびＤＳＭ  ＡＣＣ２８５６（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２；２００７年８月８日に寄託された）の下で寄託された。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８細胞は、高度のシアル酸付加、高度の二分岐ＧｌｙｃＮＡｃ、高度のガラクトシル化および高度のフコシル化を有するグリコシル化パターンを提供する。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６およびＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２細胞は、フコシル化の程度が非常に低いことを除いてＮＭ−Ｈ９Ｄ８細胞と同様のグリコシル化パターンを提供する。他の好適な細胞株としては、米国培養細胞系統保存機関に存在するヒト骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）および上記の細胞株に由来する細胞株がある。
【００９５】
核酸、発現カセット、ベクター、細胞株および組成物
さらなる態様においては、本発明は、多重特異的抗体構築物をコードする核酸を提供する。前記核酸の核酸配列は、多重特異的抗体構築物をコードするために好適な任意のヌクレオチド配列を有し得る。しかし、好ましくは核酸配列は、核酸が発現される宿主細胞または生物の特定のコドン使用頻度、特にヒトコドン使用頻度に少なくとも部分的に適応される。核酸は、２本鎖または１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはｃＤＮＡなどの２本鎖ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの１本鎖ＲＮＡであってよい。それは連続的な核酸分子であってよく、またはそれは多重特異的抗体構築物の異なる部分をそれぞれコードしているいくつかの核酸分子からなってよい。
【００９６】
多重特異的抗体構築物が抗体モジュールの軽鎖および重鎖などの１つより多い異なるアミノ酸鎖からなる場合、核酸は、別々のアミノ酸鎖を産生するためにＩＲＥＳエレメントなどの調節エレメントによって好ましくは分離された、例えば多重特異的抗体構築物のアミノ酸鎖の１つをそれぞれコードするいくつかのコード領域を含有する単一の核酸分子であってよく、または核酸は、各核酸分子が多重特異的抗体構築物のアミノ酸鎖の１つをそれぞれコードする１つまたは複数のコード領域を含むいくつかの核酸分子からなってよい。多重特異的抗体構築物をコードするコード領域に加えて核酸は、例えば、他のタンパク質をコードできる、コード領域（複数可）の転写および／もしくは翻訳に影響を与えることができる、核酸の安定性もしくは、他の物理的もしくは化学的特性に影響を与えることができる、またはまったく機能を有さない場合があるさらなる核酸配列または他の改変も含む場合がある。
【００９７】
さらなる態様においては、本発明は、本発明による核酸および前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーターを含む発現カセットまたはベクターを提供する。さらに発現カセットまたはベクターは、さらなるエレメント、特に核酸の転写および／もしくは翻訳、発現カセットもしくはベクターの増幅および／もしくは再生成、宿主細胞のゲノムへの発現カセットもしくはベクターの組み込み、ならびに／または宿主細胞中の発現カセットもしくはベクターのコピー数に影響を与えるおよび／または制御することができるエレメントを含んでよい。抗体を発現するためのそれぞれの発現カセットを含む好適な発現カセットおよびベクターは、先行技術において周知であり、かくして本明細書でさらなる記載を必要としない。
【００９８】
さらに本発明は、本発明による核酸または本発明による発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の宿主細胞であってよい。それは、単離された細胞または組織に含まれる細胞であってよい。好ましくは宿主細胞は、培養細胞、特に初代細胞または確立された細胞株の細胞、好ましくは腫瘍由来細胞である。好ましくは、それは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属細胞、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞または哺乳動物細胞、特に腫瘍由来ヒト細胞などのヒト細胞、ＣＨＯなどのハムスター細胞もしくは霊長類細胞である。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は、ヒト骨髄性白血病細胞由来である。好ましくは、それは、次の細胞または細胞株：Ｋ５６２、ＫＧ１、ＭＵＴＺ−３またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株または前述の細胞の少なくとも１つを含む細胞もしくは細胞株の混合物から選択される。宿主細胞は、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ  Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２および前記宿主細胞のいずれか１つに由来する細胞もしくは細胞株または前述の細胞の少なくとも１つを含む細胞もしくは細胞株の混合物からなる群から好ましくは選択される。これらの細胞株およびそれらの特性は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０２８６８６Ａ２に詳細に記載されている。好ましい実施形態においては、宿主細胞は、特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質、特に抗体の発現のために最適化される。好ましくは、本発明による核酸のコード領域ならびに／または発現カセットもしくはベクターのプロモーターおよびさらなるエレメントにおけるコドン使用頻度は、使用される宿主細胞の種類に適合性であり、より好ましくは最適化されている。好ましくは、多重特異的抗体構築物は、上に記載のとおり宿主細胞または細胞株によって生成される。
【００９９】
別の態様においては、本発明は、多重特異的抗体構築物、核酸、発現カセットもしくはベクター、または宿主細胞を含む組成物を提供する。組成物は、１つを超えるこれらの成分を含有する場合もある。さらに組成物は、溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される１つまたは複数のさらなる成分を含んでよい。好ましくは、組成物は、医薬組成物である。本実施形態においては、組成物の成分は、好ましくはすべて薬学的に許容される。組成物は、固体または液体組成物、特に好ましくは水溶液、エマルジョンもしくは懸濁物または凍結乾燥粉末であってよい。
【０１００】
医薬における使用
特に多重特異的抗体構築物は、医療において、特に疾患、特に本明細書に記載される疾患、好ましくはがん、感染症、炎症性疾患、移植片対宿主疾患および免疫不全の治療、診断、予後診断および／またはモニタリングにおいて有用である。
【０１０１】
したがって、さらなる態様においては、本発明は、医療における使用のための多重特異的抗体構築物、核酸、発現カセットもしくはベクター、宿主細胞または組成物を提供する。好ましくは医療における使用は、例えばがんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生生物感染症などの感染症、自己免疫疾患および炎症性腸疾患などの炎症性疾患、および免疫不全などの免疫活性の低減に関連する疾患などの疾患の処置、予後診断、診断および／またはモニタリングにおける使用である。好ましい実施形態では、疾患はがんである。好ましくは、がんは、卵巣がん、乳がん、例えばトリプルネガティブ乳がん、肺がんおよび膵臓がんからなる群より選択される。がんは、結腸がん、胃がん、肝がん、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｘ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、胃腸がんおよび血液がんからさらに特に選択することができる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる。炎症性疾患は、炎症性腸疾患、骨盤腹膜炎、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、喘息、尋常天疱瘡および皮膚炎／湿疹から選択することができる。自己免疫性疾患は、セリアック病、１型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、白斑、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、強皮症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、ギランバレー症候群、自己免疫性肝炎および強直性脊椎炎からなる群より選択することができる。ある特定の実施形態では、疾患は、ＭＵＣ１を発現する細胞を含むかまたはそれと関連する。例えば、処置されるがんはＭＵＣ１陽性である、すなわち、ＭＵＣ１を発現するがん細胞を含む。
【０１０３】
特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、別の治療剤、特に別の抗がん剤と組み合わせて使用される。前記さらなる治療剤は、任意の公知の抗がん薬であってよい。多重特異的抗体構築物と組み合わせることができる好適な抗がん治療剤は、化学療法剤、抗体、免疫賦活剤、サイトカイン、ケモカインおよびワクチンであってよい。さらに、多重特異的抗体構築物による療法は、放射線療法、手術および／または伝統的な漢方薬と組み合わせることができる。
【０１０４】
具体的な実施形態
以下において、本発明の具体的な実施形態が記載される。
実施形態１．（ｉ）少なくとも１つの抗体重鎖を含む抗ＭＵＣ１抗体モジュール、および
（ｉｉ）抗ＣＤ３抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のＣ末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
実施形態２．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを各々含む２つの重鎖を含む、実施形態１による多重特異的抗体構築物。
実施形態３．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを各々含む２つの軽鎖を含む、実施形態１または２による多重特異的抗体構築物。
実施形態４．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、重鎖のＣ末端にリシン残基を必要に応じて有しない、ＩｇＧ型の抗体モジュール、特にＩｇＧ１型の抗体モジュールである、実施形態１〜３のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態５．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、κ鎖を有する、実施形態１〜４のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態６．抗ＭＵＣ１抗体モジュールがＴＡ−ＭＵＣ１エピトープに特異的に結合する、実施形態１〜５のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態７．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、または配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態６による多重特異的抗体構築物。
実施形態８．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号７、８および９のいずれか１つと少なくとも８０％同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態６または７による多重特異的抗体構築物。
実施形態９．抗ＭＵＣ１抗体モジュールがＴＦαに特異的に結合する、実施形態１〜５のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１０．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２または２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号２４、２５または２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態９による多重特異的抗体構築物。
実施形態１１．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号２７〜３２のいずれか１つと少なくとも８０％同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態９または１０による多重特異的抗体構築物。
実施形態１２．抗ＣＤ３抗原結合性断片が少なくとも１つのＶＨドメインおよび必要に応じて少なくとも１つのＶＬドメインを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１３．抗ＣＤ３抗原結合性断片がいかなる抗体定常領域ドメインも含まない、実施形態１〜１２のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１４．抗ＣＤ３抗原結合性断片がｓｃＦｖ断片である、実施形態１〜１３のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１５．抗ＣＤ３抗原結合性断片がＣＤ３εに特異的に結合する、実施形態１〜１４のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１６．  抗ＣＤ３抗原結合性断片が、配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態１〜１５のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１７．  抗ＣＤ３抗原結合性断片が、配列番号４６のいずれか１つと少なくとも８０％同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１８．抗ＣＤ３抗原結合性断片がＶＨドメインとＶＬドメインの間にペプチドリンカーを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態１９．抗体モジュールの異なる重鎖のＣ末端に各々融合している２つの抗ＣＤ３抗原結合性断片を含む、実施形態１〜１８のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態２０．抗体モジュールの重鎖のＣ末端と抗原結合性断片の間にペプチドリンカーを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態２１．二重特異的抗体構築物である、実施形態１〜２０のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態２２．抗体モジュールがＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含まない、実施形態１〜２１のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態２３．抗体モジュールが抗体重鎖のＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含む、実施形態１〜２１のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態２４．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインに、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態２３による多重特異的抗体構築物
（ｉ）組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも０．５％の、二分岐ＧｌｃＮＡｃ残基を担持するグリカンの相対量；
（ｉｉ）組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも３０％の、少なくとも１つのガラクトース残基を担持するグリカンの相対量；
（ｉｉｉ）組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％の、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量。
実施形態２５．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインに、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態２３による多重特異的抗体構築物
（ｉ）組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも０．５％の、二分岐ＧｌｃＮＡｃ残基を担持するグリカンの相対量；
（ｉｉ）組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも３０％の、少なくとも１つのガラクトース残基を担持するグリカンの相対量；
（ｉｉｉ）組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％もしくはそれ未満の、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量。
実施形態２６．それにコンジュゲートしているさらなる作用物質を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態２７．さらなる作用物質が、抗体モジュールのポリペプチド鎖に、または抗原結合性断片のポリペプチド鎖に融合しているポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態２６による多重特異的抗体構築物。
実施形態２８．抗体モジュールが少なくとも１つの抗体軽鎖を含み、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質が前記抗体軽鎖のＣ末端に融合している、実施形態２７による多重特異的抗体構築物。
実施形態２９．さらなる作用物質が、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合性断片、酵素および結合性ドメインからなる群より選択される、実施形態２６〜２８のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態３０．実施形態１〜２９のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物をコードする核酸。
実施形態３１．実施形態３０による核酸および前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーターを含む発現カセットまたはベクター。
実施形態３２．実施形態３０による核酸または実施形態３１による発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞。
実施形態３３．実施形態１〜２９のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物ならびに溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物。
実施形態３４．医療で使用するための実施形態１〜２９のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物または実施形態３３による医薬組成物。
実施形態３５．がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生性感染症などの感染症、炎症性疾患、例えば自己免疫性疾患および炎症性腸疾患、移植片対宿主病、ならびに免疫欠損などの免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後診断、診断および／またはモニタリングで使用するための、実施形態１〜２９のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物または実施形態３３による医薬組成物。
実施形態３６．乳房、結腸、胃、肝臓、膵臓、腎臓、血液、肺および卵巣のがんからなる群より選択されるがんの処置で使用するための、実施形態３５による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態３７．細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生生物感染症からなる群より選択される感染症の処置で使用するための、実施形態３５による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態３８．セリアック病、１型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスからなる群より選択される自己免疫性疾患の処置で使用するための、実施形態３５による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態３９．
（ｉ）２つのヒトγ型抗体重鎖および２つのヒトκ型抗体軽鎖を含む抗ＭＵＣ１抗体モジュールであって、各重鎖はＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、各軽鎖はＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む抗ＭＵＣ１抗体モジュール；ならびに
（ｉｉ）ＶＨドメイン、ペプチドリンカーおよびＶＬドメインを各々含む２つの抗ＣＤ３抗原結合性断片
を含む多重特異的抗体構築物であって、各抗原結合性断片は、ペプチドリンカーを介して抗体モジュールの異なる重鎖のＣ末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
実施形態４０．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号７、８および９のいずれか１つと少なくとも８０％同一である、特に１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、または配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態３９による多重特異的抗体構築物。
実施形態４１．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＬドメインが、配列番号１６、１７および１８のいずれか１つと少なくとも８０％同一である、特に１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３、または配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態４０による多重特異的抗体構築物。
実施形態４２．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号２７〜３２のいずれか１つと少なくとも８０％同一である、特に１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２または２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号２４、２５または２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態３９による多重特異的抗体構築物。
実施形態４３．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＬドメインが、配列番号４０〜４２のいずれか１つと少なくとも８０％同一である、特に１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号３３、３４または３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３６または３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３８または３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態４２による多重特異的抗体構築物。
実施形態４４．各抗ＣＤ３抗原結合性断片のＶＨドメインが、配列番号４６と少なくとも８０％同一である、特に１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態３９〜４３のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態４５．各抗ＣＤ３抗原結合性断片のＶＬドメインが、配列番号５０と少なくとも８０％同一である、特に１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３による重鎖ＣＤＲ配列のセットを含む、実施形態４４による多重特異的抗体構築物。
実施形態４６．抗体モジュールの重鎖のＣ末端と抗原結合性断片のＮ末端の間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカー、および抗原結合性断片のＶＨドメインとＶＬドメインの間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）の３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態３９〜４５のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態４７．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの重鎖がγ１型の重鎖である、実施形態３９〜４６のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態４８．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが重鎖のＣ末端にリシン残基を含まない、実施形態３９〜４７のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態４９．抗体モジュールが各抗体重鎖のＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含まない、実施形態３９〜４８のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態５０．抗体モジュールが、ＩＭＧＴ／Ｅｕ番号付けシステムによる２９７位に対応する重鎖の位置にアスパラギン残基を含まず、特に、重鎖にＡｌａ２９７変異を含む、実施形態４９による多重特異的抗体構築物。
実施形態５１．抗体モジュールが各抗体重鎖のＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含む、実施形態３９〜４８のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態５２．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、多重特異的抗体構築物の組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％、特に、少なくとも６５％または少なくとも７０％である、実施形態５１による多重特異的抗体構築物。
実施形態５３．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、多重特異的抗体構築物の組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％もしくはそれ未満、特に、３０％もしくはそれ未満、または２０％もしくはそれ未満、である、実施形態５１による多重特異的抗体構築物。
実施形態５４．がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物感染症などの感染症、炎症性疾患、自己免疫性疾患、移植片対宿主病および免疫欠損の処置で使用するための、実施形態３９〜５３のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態５５．卵巣がん、乳がん、例えばトリプルネガティブ乳がん、肺がんまたは膵臓がんの処置で使用するための、実施形態３９〜５３のいずれか１つによる多重特異的抗体構築物。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、抗ＭＵＣ１抗体の軽鎖のＣ末端（αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκ）または重鎖のＣ末端（αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３）に結合している抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ断片を含む二重特異的抗体構築物を示す。
【０１０６】
【図２−１】図２は、二重特異的構築物によるＴ細胞の活性化および増殖を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在下で、Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを異なるＭＵＣ１発現レベルの標的細胞とインキュベートした。標的細胞なしおよび単一特異的αＭＵＣ１抗体を、対照として使用した。Ｔ細胞の活性化はＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の発現によって決定し、増殖は分裂した細胞（Ｃ）の数によって決定した。
【図２−２】図２は、二重特異的構築物によるＴ細胞の活性化および増殖を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在下で、Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを異なるＭＵＣ１発現レベルの標的細胞とインキュベートした。標的細胞なしおよび単一特異的αＭＵＣ１抗体を、対照として使用した。Ｔ細胞の活性化はＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の発現によって決定し、増殖は分裂した細胞（Ｃ）の数によって決定した。
【図２−３】図２は、二重特異的構築物によるＴ細胞の活性化および増殖を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在下で、Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを異なるＭＵＣ１発現レベルの標的細胞とインキュベートした。標的細胞なしおよび単一特異的αＭＵＣ１抗体を、対照として使用した。Ｔ細胞の活性化はＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の発現によって決定し、増殖は分裂した細胞（Ｃ）の数によって決定した。
【０１０７】
【図３−１】図３は、二重特異的構築物によるＮＫ細胞の活性化および増殖を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在下で、ＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣを異なるＭＵＣ１発現レベルの標的細胞とインキュベートした。標的細胞なしおよび単一特異的αＭＵＣ１抗体を、対照として使用した。ＮＫ細胞の活性化はＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の発現によって決定し、増殖は分裂した細胞（Ｃ）の数によって決定した。
【図３−２】図３は、二重特異的構築物によるＮＫ細胞の活性化および増殖を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在下で、ＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣを異なるＭＵＣ１発現レベルの標的細胞とインキュベートした。標的細胞なしおよび単一特異的αＭＵＣ１抗体を、対照として使用した。ＮＫ細胞の活性化はＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の発現によって決定し、増殖は分裂した細胞（Ｃ）の数によって決定した。
【図３−３】図３は、二重特異的構築物によるＮＫ細胞の活性化および増殖を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在下で、ＮＫ細胞を含有するＰＢＭＣを異なるＭＵＣ１発現レベルの標的細胞とインキュベートした。標的細胞なしおよび単一特異的αＭＵＣ１抗体を、対照として使用した。ＮＫ細胞の活性化はＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の発現によって決定し、増殖は分裂した細胞（Ｃ）の数によって決定した。
【０１０８】
【図４】図４は、二重特異的構築物のそれらの標的抗原への結合を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３およびαＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκは、それぞれの抗原を発現するが、二重特異的構築物の他の特異性の抗原を発現しない細胞株とインキュベートした。ＨＥＲ２およびＣＤ３に対するさらなる二重特異的構築物ならびにそれぞれの腫瘍抗原に対する単一特異的抗体を、対照として使用した。ＭＵＣ１（Ａ）、ＨＥＲ２（Ｂ）およびＣＤ３（Ｃ）への結合を決定した。
【０１０９】
【図５−１】図５は、二重特異的構築物によって開始された、標的細胞に対するＴ細胞媒介ＡＤＣＣを示す。事前活性化Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）または非事前活性化Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣ（Ｃ、Ｄ）を、ＭＵＣ１＋またはＨＥＲ２＋標的細胞の存在下で、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３およびαＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκ（Ａ、Ｃ）またはαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３およびαＨＥＲ２−αＣＤ３−Ｃκ（Ｂ、Ｄ）とそれぞれインキュベートした。二重特異的抗体構築物の濃度に依存する標的細胞の比溶解を、決定した。それぞれの標的抗原に対する単一特異的抗体を、対照として使用した。
【図５−２】図５は、二重特異的構築物によって開始された、標的細胞に対するＴ細胞媒介ＡＤＣＣを示す。事前活性化Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）または非事前活性化Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣ（Ｃ、Ｄ）を、ＭＵＣ１＋またはＨＥＲ２＋標的細胞の存在下で、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３およびαＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκ（Ａ、Ｃ）またはαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３およびαＨＥＲ２−αＣＤ３−Ｃκ（Ｂ、Ｄ）とそれぞれインキュベートした。二重特異的抗体構築物の濃度に依存する標的細胞の比溶解を、決定した。それぞれの標的抗原に対する単一特異的抗体を、対照として使用した。
【０１１０】
【図６】図６は、ＴＦαを標的にする二重特異的構築物によって開始された、標的細胞に対するＴ細胞媒介ＡＤＣＣを示す。事前活性化Ｔ細胞を、ＴＦα−ＭＵＣ１＋標的細胞の存在下で、αＴＦα−αＣＤ３−ＣＨ３とインキュベートした。二重特異的抗体構築物の濃度に依存する標的細胞の比溶解を、決定した。ＴＦαに対する単一特異的抗体を、対照として使用した。
【０１１１】
【図７】図７は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３およびＭＵＣ１を標的にしない類似の二重特異的抗体のＣＤ３＋細胞への結合を示す。
【０１１２】
【図８】図８は、標的細胞の存在に依存するαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３で刺激された免疫細胞のサイトカイン放出を示す。ＭＵＣ１＋ＭＣＦ−７標的細胞の存在下または不在下における、異なる濃度のαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３との４８時間のインキュベーションの後の、ＰＢＭＣの上清中のＩＦＮ−γ、ＴＦＮ−αおよびＩＬ−６の濃度を示す。
【０１１３】
【図９−１】図９は、標的細胞の存在に依存するαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３のＴ細胞活性化を示す。活性化マーカーＣＤ６９（Ａ、Ｃ）およびＣＤ２５（Ｂ、Ｄ）に陽性であるＣＤ４＋（Ａ、Ｂ）またはＣＤ８＋（Ｃ、Ｄ）Ｔ細胞の百分率は、ＭＵＣ１＋ＭＣＦ−７標的細胞の存在下または不在下におけるαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３またはＭＵＣ１を標的にしない対照二重特異的抗体とのインキュベーションの後のフローサイトメトリーを介して決定した。
【図９−２】図９は、標的細胞の存在に依存するαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３のＴ細胞活性化を示す。活性化マーカーＣＤ６９（Ａ、Ｃ）およびＣＤ２５（Ｂ、Ｄ）に陽性であるＣＤ４＋（Ａ、Ｂ）またはＣＤ８＋（Ｃ、Ｄ）Ｔ細胞の百分率は、ＭＵＣ１＋ＭＣＦ−７標的細胞の存在下または不在下におけるαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３またはＭＵＣ１を標的にしない対照二重特異的抗体とのインキュベーションの後のフローサイトメトリーを介して決定した。
【０１１４】
【図１０】図１０は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３抗体による腫瘍部位へのＴ細胞動員を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３の存在下または不在下においてＰＢＭＣと共培養された腫瘍スフェロイドの組織切片を示す（Ａ）。Ｔ細胞は、暗色に染色されている。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３の存在に依存する腫瘍スフェロイドあたりのＣＤ８＋Ｔ細胞の数を決定した（Ｂ）。
【０１１５】
【図１１】図１１は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３で処置した腫瘍細胞におけるＴＡ−ＭＵＣ１の上方制御を示す。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３の存在下または不在下において培養された腫瘍スフェロイドの組織切片を示す。ＴＡ−ＭＵＣ１＋細胞は、暗色に染色されている。
【０１１６】
【図１２−１】図１２は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３によるバイスタンダー免疫細胞の刺激を示す。標的細胞の存在下または不在下において、ＰＢＭＣをαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３とインキュベートした。それらのそれぞれの活性化マーカーに陽性である特異的免疫細胞の百分率は、フローサイトメトリーを介して決定した。（Ａ）Ｂ細胞、（Ｂ）単球、（Ｃ）ナチュラルキラーＴ細胞、（Ｄ）ナチュラルキラー細胞。
【図１２−２】図１２は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３によるバイスタンダー免疫細胞の刺激を示す。標的細胞の存在下または不在下において、ＰＢＭＣをαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３とインキュベートした。それらのそれぞれの活性化マーカーに陽性である特異的免疫細胞の百分率は、フローサイトメトリーを介して決定した。（Ａ）Ｂ細胞、（Ｂ）単球、（Ｃ）ナチュラルキラーＴ細胞、（Ｄ）ナチュラルキラー細胞。
【０１１７】
【図１３】図１３は、二重特異的αＣＤ３−ＣＨ３抗体の安定性分析を示す。抗体の重鎖を単離し、その分子量をＵＰＬＣ−ＭＳにより分析した。上パネル：重度のストレスに曝露させたαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３；中央パネル：ストレスなしで生成したαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３；下パネル：重度のストレスに曝露させた、抗体重鎖のＣ末端リシンが欠失しているαＴＦα−αＣＤ３−ＣＨ３。Ｃ末端αＣＤ３−ｓｃＦｖのあるインタクトな重鎖の分子質量：約７７ｋＤａ；Ｃ末端αＣＤ３−ｓｃＦｖのない重鎖の分子質量：約４９ｋＤａ。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１：ＭＵＣ１およびＣＤ３に特異的に結合する二重特異的抗体構築物の生成。）
ＭＵＣ１特異的結合性部分およびＣＤ３結合性部分からなる二重特異的Ｔ細胞係合構築物を作製した。ＭＵＣ１結合性部分は、一般的な抗体Ｙ形状のヒト化完全長ＩｇＧ１分子である。ＣＤ３結合は、αＭＵＣ１  ＩｇＧの各Ｃκ−（αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκ）またはＣＨ３−ドメイン（αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３）への抗ＣＤ３単鎖可変断片の融合によって実現される。構築物の一般構造は、図１に示す。
【０１１９】
構築物αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ｗｔでは、抗ＴＡ−ＭＵＣ１抗体ＰａｎｋｏＭａｂ（ガチポツズマブ）がＭＵＣ１結合性部分として使用され、抗ＣＤ３抗体ＴＲ６６の可変領域を有するｓｃＦｖ構築物がＣＤ３結合性部分として使用される。抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを介してＰａｎｋｏＭａｂのＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。構築物αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκ−ｗｔは、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖがＰａｎｋｏＭａｂのＣκドメインのＣ末端に融合していること以外は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ｗｔと同一である。
【０１２０】
構築物αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡは、ＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化部位を無効にするＰａｎｋｏＭａｂ重鎖におけるＡｓｎ２９７Ａｌａ変異を除いて、「ｗｔ」構築物に対応する。したがって、「ＮＡ」構築物は、ＰａｎｋｏＭａｂのＦｃ部分においてグリコシル化されていない。
【０１２１】
構築物はヒト骨髄性白血病由来の細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８５６）において発現され、ｗｔ構築物のＰａｎｋｏＭａｂ  ＣＨ２ドメインの約１０％の少量のフコシル化を有するヒトグリコシル化パターンで構築物を生成した。さらに、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ｗｔ構築物は関連した細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０６）でも生成され、ＰａｎｋｏＭａｂ  ＣＨ２ドメインの約９０％の多量のフコシル化を有するグリコシル化構築物をもたらした。
【０１２２】
ＭＵＣ１結合性部分としてＰａｎｋｏＭａｂの代わりに抗ＴＦα抗体ＫａｒｏＭａｂを使用して、類似の構築物が生成された。
【０１２３】
無血清培地を使用した生成収量は、以降の精製、生化学的評価およびがん細胞株に対する二重特異的抗体の作用機構の生物機能的評価に十分であった。さらに、多量のαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３を生成するための実現可能性を評価するために、無血清条件下で高生産性の細胞クローンをバイオリアクター内で培養した。
【０１２４】
治療的二重特異的抗体の１つの主要な難題は、十分な量の組換えタンパク質の生産である。大規模な医薬品製造品質管理基準（ＧＭＰ）生産に適合する条件下での高収量生産の実現可能性を調査するために、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３産生細胞を２Ｌバイオリアクター内で培養した。無血清培地による連続灌流プロセスを使用した制御環境で、高い細胞密度に到達した。最大細胞濃度は生存可能細胞数３×１０７／ｍＬであって、これは撹拌培養における最大細胞密度より約１０倍高い。より重要なことに、培養が最大灌流速度に到達したならば、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３力価は最高５０μｇ／ｍＬに到達し、灌流プロセスの持続期間にわたる平均力価は２８μｇ／ｍＬであった。したがって、２Ｌ／日の灌流速度で、プロセスは１日につき平均して４７ｍｇのαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３を与えた。上清は、３０日にわたって収集した。細胞生存度は、９０％を上回った。生存可能細胞数３×１０７／ｍＬを超える細胞濃度を回避し、培養のための十分な栄養供給を確実なものにするために、浸出（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって細胞をバイオリアクターから除去した。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３抗体の総収量は、３０日以内の培養で１．４ｇであった。
【０１２５】
αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３をプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＬＣ−ＭＳを使用してインタクトな抗体鎖の分子量について分析した。比較して、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３は、４０日を超える例外的に長いバイオリアクター試行の終わりに収集された最終上清からも精製された。
【０１２６】
（実施例２：Ｔ細胞活性化および増殖）
二重特異的構築物によるＴ細胞活性化を調査するために、４８時間後の活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡまたは対照としてαＭＵＣ１と、示した濃度で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＰＢＭＣを収集し、蛍光標識されたαＣＤ４５、αＣＤ４、αＣＤ８、αＣＤ２５、αＣＤ６９、αＣＤ５６、αＣＤ１４およびαＣＤ１９抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。細胞は、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。Ｔ細胞活性化は、エフェクター細胞と標的細胞の間の５：１の比において、ＭＵＣ１発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で分析した。
【０１２７】
Ｔ細胞活性化の他に、Ｔ細胞を動員する二重特異体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）の別の作用機構は、Ｔ細胞増殖の誘導である。Ｔ細胞増殖を測定するために、健康なドナーからのＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、エフェクター細胞と標的細胞の間の５：１の比において、ＭＵＣ１発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で５日間、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡまたは対照としてαＭＵＣ１とインキュベートした。Ｔ細胞が増殖するとき、増殖細胞の世代ごとにＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）色素は希釈される。５日後、ＰＢＭＣを収集し、蛍光標識されたαＣＤ４５、αＣＤ４、αＣＤ８、αＣＤ５６、αＣＤ１４およびαＣＤ１９抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、７−ＡＡＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。細胞は、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。
【０１２８】
結果は、ＭＵＣ１＋細胞株およびＴ細胞上のＣＤ３の同時結合によって、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３がＴ細胞活性化およびＴ細胞増殖を誘導することができることを実証する。ＣＤ４＋Ｔ細胞について示すように、複数のＭＵＣ１＋細胞株およびαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３とのインキュベーションは、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（図２Ａ）およびＣＤ２５（図２Ｂ）の発現の増加につながる。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞について示すように、ＭＵＣ１＋細胞株およびＴ細胞上のＣＤ３の同時結合によって、Ｔ細胞増殖が誘導される（図２Ｃ）。
【０１２９】
（実施例３：ＮＫ細胞活性化および増殖）
ＮＫ細胞活性化を調査するために、４８時間後の活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡと、示した濃度で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＰＢＭＣを収集し、蛍光標識されたαＣＤ４５、αＣＤ４、αＣＤ８、αＣＤ２５、αＣＤ６９、αＣＤ５６、αＣＤ１４およびαＣＤ１９抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。細胞は、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。ＮＫ細胞活性化は、エフェクター細胞と標的細胞の間の５：１の比において、ＭＵＣ１発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で分析した。
【０１３０】
ＮＫ細胞が活性化されるならば、それらは増殖を開始する。ＮＫ細胞増殖を測定するために、健康なドナーからのＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、エフェクター細胞と標的細胞の間の５：１の比において、ＭＵＣ１発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で５日間、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡまたは対照としてαＭＵＣ１とインキュベートした。ＮＫ細胞が増殖するとき、増殖細胞の世代ごとにＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）色素は希釈される。５日後、ＰＢＭＣを収集し、蛍光標識されたαＣＤ４５、αＣＤ４、αＣＤ８、αＣＤ５６、αＣＤ１４およびαＣＤ１９抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、７−ＡＡＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。細胞は、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。
【０１３１】
結果は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡが、ＮＫ細胞活性化およびＮＫ細胞増殖を誘導することができることを実証する。Ａｓｎ２９７にＮ−グリカンのないαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡは、αＣＤ３結合性部分を介してＴ細胞に結合することができるだけであり、ＮＫ細胞結合を示さない。驚くべきことに、ＭＵＣ１＋細胞株およびαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡの存在に依存するＮＫ細胞活性化および増殖が観察された。おそらくＴ細胞のαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３媒介活性化および刺激性サイトカインの以降の放出のために、ＮＫ細胞のさらなる活性化が誘導される。したがって、活性化マーカーＣＤ６９（図３Ａ）およびＣＤ２５（図３Ｂ）の上方制御ならびにＮＫ細胞増殖（図３Ｃ）が示すように、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３−ＮＡとのインキュベーションは、直接的なＮＫ細胞結合がないにもかかわらず、ＮＫ細胞活性化につながる。
【０１３２】
（実施例４：特異的抗原の結合）
αＭＵＣ１、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣκおよびαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３ならびにαＨＥＲ２、αＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκおよびαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３のヒトＴＡ−ＭＵＣ１およびＨＥＲ２発現腫瘍細胞への結合特性を、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＡ−ＭＵＣ１およびＨＥＲ２結合を決定するために、強いＴＡ−ＭＵＣ１および中間的なＨＥＲ２発現を有するがＣＤ３発現を欠く乳がん細胞株ＺＲ−７５−１を使用した。ＣＤ３結合を分析するために、ＣＤ３＋であるがＴＡ−ＭＵＣ１およびＨｅｒ２陰性のジャーカット細胞を使用した。簡潔には、標的細胞を収集し、段階希釈の示した抗体とインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、暗所において二次ヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＲＰＥコンジュゲート抗体と４℃でインキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターでのフローサイトメトリーを介して分析した。
【０１３３】
αＭＵＣ１、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣκおよびαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３は、ＴＡ−ＭＵＣ１＋細胞株ＺＲ−７５−１の同等の結合を示した（図４Ａ）。ＣκドメインまたはＣＨ３ドメインへのαＣＤ３  ｓｃＦｖの追加は、いずれもＴＡ−ＭＵＣ１の結合に影響しない。αＨＥＲ２、αＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκおよびαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３は、ＨＥＲ２＋細胞株ＺＲ−７５−１の同等の結合を示したので、類似の結果が、ＨＥＲ２標的化構築物で得られた（図４Ｂ）。対照的に、ＣＤ３＋ジャーカット細胞への結合の分析では、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３ならびにαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３は、それらのそれぞれのＣκ融合対応物αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣκおよびαＨＥＲ２−αＣＤ３−Ｃκと比較して、ＣＤ３の結合の増加を示した（図４Ｃ）。
【０１３４】
（実施例５：ＡＤＣＣアッセイ）
Ｔ細胞媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、Ｔ細胞係合抗体の主な機構である。ＴＡ−ＭＵＣ１またはＨＥＲ２結合の後、二重特異的抗体はそれらの表面でＣＤ３に結合することによってＴ細胞を動員し、ＴＡ−ＭＵＣ１＋またはＨＥＲ２＋腫瘍細胞の細胞死を促進するパーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の放出をもたらす。エフェクター細胞として事前活性化Ｔ細胞を使用すると、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣκおよびαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３（図５Ａ）ならびにαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκおよびαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３（図５Ｂ）は、ＴＡ−ＭＵＣ１＋およびＨＥＲ２＋乳がん細胞株Ｔ−４７Ｄの有効な溶解を示した。驚くべきことに、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３によって媒介されるＴ細胞ＡＤＣＣは、αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκと比較して増強された（図５Ａ）が、αＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκはαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３と比較してより強いなＴ細胞ＡＤＣＣ活性を示した（図５Ｂ）。腫瘍細胞膜とＴ細胞のより緊密な近接はＴ細胞活性化および媒介される細胞傷害を増強すると記載されているので（例えば、Ｂｌｕｅｍｅｌ，  Ｃ．ら（２０１０年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ５９巻：１１９７〜１２０９頁；Ｃｈａｍｅｓ，  Ｐ．およびＢａｔｙ，  Ｄ．（２００９年）ｍＡｂｓ１巻（６号）：５３９〜５４７頁を参照）、ＨＥＲ２結合性構築物で得られた結果は、Ｔ細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離を強く支持する近年の報告書と一致している。これと対照的に、抗ＣＤ３結合性断片が重鎖のＣ末端に結合しているαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３の結合性ドメインの間の距離は、抗ＣＤ３結合性断片が軽鎖のＣ末端に結合しているαＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκと比較してかなり大きい。それにもかかわらず、αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκと比較して、Ｔ−４７Ｄ細胞の比溶解の増加がαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３によって誘導された。ＴＡ−ＭＵＣ１およびＨＥＲ２標的化構築物に類似して、αＴＦα−αＣＤ３−ＣＨ３および事前活性化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用すると、前立腺がん細胞株ＤＵ−１４５の比溶解が誘導された（図６）。予想されるように、事前活性化Ｔ細胞がエフェクター細胞として使用されたとき、Ｔ細胞を動員しない親の抗体αＭＵＣ１（図５Ａ）、αＨＥＲ２（図５Ｂ）およびαＴＦα（図６）のいずれも比溶解を誘導しなかった。
【０１３５】
事前活性化Ｔ細胞によるＴ細胞ＡＤＣＣアッセイでは、Ｔ細胞を磁気ビーズ分離技術（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＴ細胞キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によって先ず単離し、その後、単離したＴ細胞を５日間活性化した（Ｔ細胞増大および活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。異なるアッセイで分析されたＴ細胞活性化における潜在的な差を排除して、細胞死につながる、ＴＡ−ＭＵＣ１への結合ならびにパーフォリンおよびグランザイムの放出の過程だけに基づく結果を得るために、Ｔ細胞事前活性化のこの方法を選択した。活性化されたＴ細胞は、ＴＡ−ＭＵＣ１またはＨＥＲ２を標的にする異なる二重特異的構築物を比較するために次に使用した。アッセイは、ユウロピウム放出アッセイとして実行した。簡潔には、エレクトロポレーションによって標的細胞にユウロピウム（Ｅｕ３＋）を負荷し、二重特異的構築物の存在下で１０：１のエフェクター細胞対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）において事前活性化Ｔ細胞と５時間インキュベートした。上清へのユウロピウム放出（抗体媒介細胞死を示す）は、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ）を使用して定量化した。最大放出は標的細胞のトリトン−Ｘ−１００とのインキュベーションによって達成され、標的細胞だけを含有し、抗体およびＰＢＭＣを含有しない試料において自発的放出を測定した。
【０１３６】
比細胞傷害を以下の通りに計算した：
比溶解％＝（実験による放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００。
【０１３７】
Ｔ細胞媒介ＡＤＣＣを事前活性化Ｔ細胞で分析した後、エフェクター細胞として未刺激ＰＢＭＣを使用した異なるアッセイセットアップを確立した。したがって、ＴＡ−ＭＵＣ１またはＨＥＲ２結合ならびにパーフォリンおよびグランザイムの放出と一緒に、このアッセイセットアップは、Ｔ細胞活性化の差をさらに説明する。エフェクター細胞として未刺激ＰＢＭＣを使用して、事前活性化Ｔ細胞で得られた結果を確認した。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣκおよびαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３（図５Ｃ）ならびにαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκおよびαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３（図５Ｄ）は、ＴＡ−ＭＵＣ１＋およびＨＥＲ２＋乳がん細胞株ＭＣＦ−７の有効な溶解を示した。再度、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３によって媒介される比溶解は、αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκと比較して増強された（図５Ｃ）が、αＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκはαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３と比較してより強い細胞傷害活性を示した（図５Ｄ）。再度、ＨＥＲ２結合性構築物で得られた結果は、Ｔ細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離を強く支持する近年の報告と一致している。これと対照的に、αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκと比較して、Ｔ−４７Ｄ細胞の比溶解の増加がαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３によって誘導された。未刺激ＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用されたとき、Ｔ細胞を動員しない親の抗体αＭＵＣ１（図５Ｃ）およびαＨＥＲ２（図５Ｄ）のいずれも比溶解を誘導せず、この実験で使用された低いＥ：Ｔ比では、Ｔ細胞が細胞傷害を媒介する主なエフェクター細胞集団であることを示す。
【０１３８】
ＰＢＭＣ  ＡＤＣＣアッセイは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイとして実行した。したがって、溶解アッセイの前日に、ＴＡ−ＭＵＣ１＋およびＨＥＲ２＋ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。翌日、ＰＢＭＣを健康なドナーバフィーコートから単離し、αＭＵＣ１、αＭＵＣ１−αＣＤ３−Ｃκ、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３、αＨＥＲ２、αＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣκおよびαＨＥＲ２−αＣＤ３−ＣＨ３と一緒に１０：１の最終Ｅ：Ｔ比で標的細胞に加えた。２４時間〜４８時間後、標的細胞の死滅を細胞上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の定量化によって評価した（細胞傷害検出キット（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ）。最大放出は標的細胞のトリトン−Ｘ−１００とのインキュベーションによって達成され、標的細胞およびＰＢＭＣだけを含有し、抗体を含有しない試料において抗体非依存性細胞死を測定した。
【０１３９】
（実施例６：オフターゲット作用）
二重特異的抗体の安全性プロファイルを分析するために、抗体の特異的標的細胞の存在に依存する免疫細胞のサイトカイン放出を決定した。標的細胞の不在下での免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出は、ヒト患者において有害な副作用につながることがある、オフターゲット作用である。
【０１４０】
ＭＵＣ１＋ＭＣＦ−７細胞の有る無しで、ＰＢＭＣをαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３と４８時間インキュベートした。４８時間後、上清を収集し、サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の濃度を分析した。ＭＵＣ１＋標的細胞の存在下で、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３媒介Ｔ細胞活性化は、用量依存的サイトカイン放出につながる（図８を参照）。標的細胞の不在下で、サイトカイン放出は検出されなかった。したがって、二重特異的抗体は、特に低いオフターゲット作用を有する非常に優れた標的特異性を示す。
【０１４１】
別の実験では、ＭＵＣ１に結合しないが、さもなければαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３と同一である、非標的化Ｔ細胞係合二重特異的抗体を使用して二重特異的抗体の特異性を分析した。
【０１４２】
ＣＤ３＋ジャーカット細胞との結合は、両方の二重特異的抗体がＣＤ３発現免疫細胞に同一の親和性を有することを実証した（図７を参照）。しかし、標的化二重特異的抗体αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３だけが、免疫細胞を活性化することができる。標的化または非標的化二重特異的抗体およびＭＵＣ１＋ＭＣＦ−７細胞とのＰＢＭＣのインキュベーションは、標的化αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３の存在下でのみＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示した（図９を参照）。これは、二重特異的抗体αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３による標的細胞への特異的結合および免疫細胞の動員だけが免疫細胞を活性化することを実証する。
【０１４３】
（実施例７：Ｔ細胞動員）
腫瘍部位への免疫細胞の動員を実証するために、３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを確立した。ＰＢＭＣを腫瘍スフェロイドに加え、共培養を二重特異的抗体で刺激した。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３による処置の後、腫瘍スフェロイドにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数は著しく増加した（図１０を参照）。したがって、二重特異的抗体は、腫瘍部位に免疫細胞を有効に動員する。
【０１４４】
（実施例８：ＭＵＣ１の上方制御）
標的腫瘍における腫瘍関連ＭＵＣ１の発現に及ぼす二重特異的抗体による処置の影響を、実施例７の３Ｄモデルを使用して分析した。ＰＢＭＣを腫瘍スフェロイドに加え、共培養を二重特異的抗体αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３で刺激した。抗体による処置の後、ＴＡ−ＭＵＣ１の上方制御が観察された（図１１を参照）。したがって、療法の開始後、腫瘍細胞において上方制御されたＴＡ−ＭＵＣ１発現によって腫瘍の標的化はさらに改善する。
【０１４５】
（実施例９：バイスタンダー免疫細胞活性化）
二次作用として、ＣＤ３＋免疫細胞、特にＴ細胞の活性化は、二重特異的抗体によるさらなる免疫細胞の活性化ももたらす。これを実証するために、ＭＵＣ１＋標的細胞の存在下でＰＢＭＣをαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３と４８時間インキュベートした。４８時間の後、異なる免疫細胞サブセットをフローサイトメトリーによって特異的活性化マーカーの発現について分析した（図１２を参照）。標的細胞なしのインキュベーションを、陰性対照として使用した。
【０１４６】
グラフに示すように、αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３は、ＭＵＣ１＋標的細胞の存在下でＢ細胞、単球、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化した。これらの標的細胞の不在下では、免疫細胞の活性化は観察されなかった。これらの結果は、ＭＵＣ１＋標的細胞の存在下でαＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３がバイスタンダー免疫細胞も活性化することを実証する。
【０１４７】
（実施例１０：ＬＣ−ＭＳによるインタクトな抗体鎖の分子量の分析）
二重特異的抗体の安定性を分析した。αＭＵＣ１−αＣＤ３−ＣＨ３およびαＴＦα−αＣＤ３−ＣＨ３は、上で実施例１に記載の通り生成した。さらに、同じ二重特異的フォーマットであるが重鎖のＣ末端とリンカー配列の間に変異した配列を有する（Ｆｃ部分の最後のアミノ酸（Ｋ４４７）が欠失している）参照抗体を、類似の方法で生成した。ストレス下にある試料を、スピナーフラスコにおける長期バッチ生産の上清からの抗体の精製によって生成した。
【０１４８】
抗体試料を変性させ、ＤＴＴで処理してジスルフィド架橋を還元した。以降の脱グリコシル化は、Ｒａｐｉｄ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＮＥＢ）とのインキュベーションによって達成される。試料をＣ４カラムに注入し、０．１％ギ酸によるＨ２Ｏ／ＡｃＮ勾配を用いるＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した。ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ（ＩｍｐａｃｔＨＤ、Ｂｒｕｋｅｒ）で、質量スペクトルを取得した。軽鎖（約２４ｋＤａ）および重鎖（約７７ｋＤａ）の予想される質量範囲を反映する２０〜８０ｋＤａの間のチャージデコンボリューションのために０．７のバックグラウンド減算およびＭａｘＥｎｔアルゴリズムを用いたＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ）で、生じたスペクトルを処理した。
【０１４９】
二重特異的抗体のインタクトな重鎖のシグナル（７６．８ｋＤａ）および４９．３ｋＤａの質量をもたらす重鎖のＫ４４７位のαＣＤ３単鎖断片の潜在的喪失を考慮に入れた。結果は、図１３に要約する。実証されるように、実施例１に記載の通りに生成された二重特異的抗体（「通常」）は、重鎖のいかなる分解も示さない。しかし、高い程度の死細胞を有する培養後期に由来するストレス下の二重特異的抗体は、分解断片（「ストレス下にある」）を示す。αＴＦα−αＣＤ３−ＣＨ３抗体のために実行した配列変異（重鎖におけるＫ４４７の欠失）は、断片が検出不能である（「ストレス下のＫ４４７ｄｅｌ」）ので、構築物を安定化する。
【０１５０】
寄託された生体材料の識別
細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８０６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８０７およびＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８５６は、以下の表に示す日付に、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によりＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に寄託された。
【表１】
2020515532.tif 000002
【図１】
2020515532.tif 000003
【図２−１】
2020515532.tif 000004
【図２−２】
2020515532.tif 000005
【図２−３】
2020515532.tif 000006
【図３−１】
2020515532.tif 000007
【図３−２】
2020515532.tif 000008
【図３−３】
2020515532.tif 000009
【図４】
2020515532.tif 000010
【図５−１】
2020515532.tif 000011
【図５−２】
2020515532.tif 000012
【図６】
2020515532.tif 000013
【図７】
2020515532.tif 000014
【図８】
2020515532.tif 000015
【図９−１】
2020515532.tif 000016
【図９−２】
2020515532.tif 000017
【図１０】
2020515532.tif 000018
【図１１】
2020515532.tif 000019
【図１２−１】
2020515532.tif 000020
【図１２−２】
2020515532.tif 000021
【図１３】
2020515532.tif 000022
【配列表】
2020515532000001.app
【国際調査報告】
2020515532.tif 000023
2020515532.tif 000024
2020515532.tif 000025
2020515532.tif 000026