(57)【要約】本発明は、治療及び処置に関連するＴ細胞組成物、及び、それを使用する方法に関する。特に、本発明は、未改変のＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇が認められる条件下で機能性を維持するように改変したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を提供する。本明細書に開示した組成物及び方法は、（例えば、ＣＡＲ表面発現を調節することで）ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を阻害し、または、逆転させて、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を増強する用途をもたらす。本発明の組成物及び方法を、例えば、生物学、免疫学、医学、及び、腫瘍学の分野において、臨床及び研究の双方の状況下で使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記細胞外リガンド結合ドメインが、腫瘍抗原に対して特異的に結合する、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記腫瘍抗原が、ジシアロガングリオシドＧＤ２である、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記細胞外リガンド結合ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記ｓｃＦｖが、ＧＤ２に対して特異的に結合する抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
ＧＤ２に対して特異的に結合する前記抗体が、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、ｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ＨＭ３Ｆ８、ＵＮＩＴＵＸＩＮ、及び、ＤＭＡｂ−２０からなる群より選択される、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記細胞質ドメインが、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記細胞質ドメインが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記細胞質ドメインが、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記細胞質ドメインが、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及び、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記ＲＤＤが、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
前記ＲＤＤが、ヒトＤＨＦＲ不安定化ドメインを含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記ＲＤＤが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）不安定化ドメインを含む、請求項１記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記ＲＤＤが、ヒトＦＫＢＰ１２不安定化ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記細胞外結合ドメインが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
前記膜貫通ドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ドメイン、及び、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
前記ＣＤ３−ゼータドメインが、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
前記ＲＤＤが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
前記キメラ抗原受容体が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含む、遺伝子操作したＴ細胞であって、前記単離した核酸配列が、
ａ）細胞外リガンド結合ドメインの核酸配列：
ｂ）共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列：
ｃ）ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）の核酸配列を含む、前記遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項２４】
前記細胞外リガンド結合ドメインが、腫瘍抗原に対して特異的である、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項２５】
前記腫瘍抗原が、ジシアロガングリオシドＧＤ２である、請求項２４に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項２６】
前記細胞外リガンド結合ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項２７】
前記ｓｃＦｖが、ＧＤ２に対して特異的に結合する抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含む、請求項２６に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項２８】
前記核酸配列が、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列である、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項２９】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３０】
前記細胞質ドメインが、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３１】
前記細胞質ドメインが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３２】
前記細胞質ドメインが、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３３】
前記ＲＤＤが、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３４】
前記ＲＤＤが、ヒトＤＨＦＲ不安定化ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３５】
前記ＲＤＤが、ＦＫＢＰ不安定化ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３６】
前記ＲＤＤが、ヒトＦＫＢＰ１２不安定化ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３７】
前記細胞外結合ドメインが、配列番号３９の核酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３８】
前記膜貫通ドメインが、配列番号４７の核酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項３９】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号４９の核酸配列を含むＣＤ２８ドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項４０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号４９の核酸配列を含むＣＤ２８ドメイン、及び、配列番号５１の核酸配列を含むＣＤ３−ゼータドメインを含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項４１】
前記ＣＤ３−ゼータドメインが、配列番号５１の核酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項４２】
前記ＲＤＤが、配列番号６９の核酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項４３】
前記キメラ抗原受容体が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作したＴ細胞。
【請求項４４】
哺乳動物におけるＴリンパ球細胞（Ｔ細胞）エフェクター機能を改善、及び／または、持続させる方法であって、
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞を前記哺乳動物に導入することを含む、前記方法。
【請求項４５】
がんに罹患している哺乳動物を処置する方法であって、
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞を前記哺乳動物に導入することを含む、前記方法。
【請求項４６】
哺乳動物における標的細胞の集団または組織を、Ｔ細胞が媒介した免疫応答で刺激する方法であって、哺乳動物に対して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作したＴ細胞を有効量にて投与することを含み、前記ＣＡＲが、
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、前記方法。
【請求項４７】
哺乳動物に抗がん免疫応答を提供する方法であって、前記方法は、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作したＴ細胞を有効量にて前記哺乳動物に投与することを含み、前記ＣＡＲが、
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記がんを、神経芽腫、神経膠芽腫、正中神経膠腫、骨肉腫、肉腫、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、白血病及びリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、及び、小児急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
患者のがんを処置する、または、その進行を遅延させる方法であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作した治療有効量のＴ細胞を前記患者に投与することを含み、前記ＣＡＲが、
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、前記方法。
【請求項５０】
前記投与が、前記患者のがん細胞の数を減少させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与が、前記患者の前記全身腫瘍組織量を減らし、及び／または、前記腫瘍を除去する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＣＡＲを発現するように遺伝子操作したＴ細胞を含む治療有効量の組成物であって、前記ＣＡＲが、対象のがんを処置する、または、その進行を遅延させるために使用する、
ａ）細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、前記組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、以下の効果、
前記対象でのがん細胞の数を減らす、
前記対象の全身腫瘍組織量を減らし、及び／または、腫瘍を除去する、
の１つ以上を提供する、請求項５２に記載の使用のための組成物。
【請求項５４】
ａ）腫瘍抗原に対して特異的な細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；
ｃ）１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン；及び
ｄ）調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項５５】
前記腫瘍抗原を、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＣＤ１９、及び、Ｈｅｒ２からなる群より選択する、請求項５４に記載のＣＡＲ。
【請求項５６】
前記腫瘍抗原に対して特異的なリガンド結合ドメインが、抗原非依存性持続性シグナル伝達を示す、請求項５４に記載のＣＡＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年３月３１日に出願した、米国仮出願第６２／４７９，９３０号の利益を主張し、本明細書の一部を構成するものとして、同出願の全内容を援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞枯渇を処置する方法に関する。特に、本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を一時的に阻害して、Ｔ細胞機能を回復することによって、Ｔ細胞枯渇を予防または逆転する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞は、抗原に結合した後に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達、及び、共刺激を介して活性化を受ける免疫細胞である。Ｔ細胞受容体を介した生理的活性化により、Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍効果、及び／または、抗感染効果を媒介できるようになる。急性炎症応答が消滅していく間に、活性化したエフェクターＴ細胞のサブセットは、寿命の長い記憶細胞へと分化する。対照的に、慢性感染症、または、がんの患者において、Ｔ細胞は、機能不全の状態に向かう病理学的分化、別名、Ｔ細胞枯渇になり得る。Ｔ細胞枯渇は、代謝機能、転写プログラミング、エフェクター機能の喪失（例えば、サイトカイン分泌、殺傷能力）、及び、複数の表面阻害受容体の共発現の著しい変化によって、特徴決定をする。Ｔ細胞枯渇の根本原因は、連続的なＴＣＲシグナル伝達に至る持続的な抗原曝露である。Ｔ細胞の枯渇の予防または逆転は、長らくの間、（例えば、がん、または、慢性感染症の患者において）Ｔ細胞の有効性を高める手段として追い求められていた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を、一時的に阻害することによって、Ｔ細胞Ｔ細胞枯渇を処置する方法に関する。ある態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞枯渇の予防に使用する組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、未改変のＣＡＲ  Ｔ細胞が機能不全になる（例えば、枯渇を示す）条件下で、機能性を維持するように改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を提供する。本発明の改変したＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ表面発現の調節を介して）、同細胞を含む組成物、及び、同細胞を使用する方法は、例えば、がん、または、感染症に対する活性を含むＴ細胞機能を増強する。
【０００５】
一部の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を、ＣＡＲ表面発現の調節を介して、阻害または逆転する。一部の実施形態では、ＣＡＲ表面発現の調節は、調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）のＣＡＲ  Ｔ細胞への融合を介して可能になる。一部の実施形態では、当該ＲＤＤは、リガンド調節可能な不安定化ドメインである。例えば、一部の実施形態では、当該ＣＡＲをＲＤＤと融合することによって、ＣＡＲ発現の調節が達成されると、得られる改変したＣＡＲタンパク質は、不安定になり、プロテアソーム分解を受けやすくなる。小分子または薬物などのリガンド（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ−１、または、トリメトプリム（ＴＭＰ））を追加することで、改変したＣＡＲタンパク質は、分解を受けにくくなり、そして、ＲＤＤを含むＣＡＲ構築物を安定的に発現する（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６：９９５−１００４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：１１２３−１１２７；Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １７：９８１−９８８を参照されたい）。
【０００６】
一部の実施形態では、当該ＲＤＤは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ＲＤＤに由来する結合ドメインを含む。一部の実施形態では、当該ＤＨＦＲ由来のＲＤＤは、細菌ＤＨＦＲ由来の結合ドメインを含む。一部の実施形態では、当該細菌ＤＨＦＲは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨＦＲである。一部の実施形態では、当該ＤＨＦＲ由来のＲＤＤは、ヒトＤＨＦＲ由来の結合ドメインを含む。一部の実施形態では、当該ＲＤＤは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する結合ドメインを含む。一部の実施形態では、当該ＦＫＢＰは、ＦＫＢＰ１２である。一部の実施形態では、ＦＫＢＰ  ＤＤの核酸配列は、配列番号１に記載の配列を含む。ある実施形態では、ＦＫＢＰ  ＤＤは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲのＦＫＢＰ  ＤＤ部分は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、ｅｃＤＨＦＲ不安定化ドメインを使用する。一部の実施形態では、ｅｃＤＨＦＲ  ＤＤの核酸配列は、配列番号３に記載の配列を含む。ある実施形態では、当該ｅｃＤＨＦＲ  ＤＤは、配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲのｅｃＤＨＦＲ  ＤＤ部分は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、ｅｃＤＨＦＲ  ＤＤの核酸配列は、配列番号５に記載の配列を含む。ある実施形態では、当該ｅｃＤＨＦＲ  ＤＤは、配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲのｅｃＤＨＦＲ  ＤＤ部分は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明は、リガンドの種類に対して制限がない。一部の実施形態では、Ｓｈｉｅｌｄ−１またはトリメトプリム（ＴＭＰ）を使用して、ＤＨＦＲ  ＲＤＤまたはＦＫＢＰ  ＲＤＤを含む融合タンパク質の安定した表面発現を、安定化、及び、促進する。
【０００９】
一部の実施形態では、分解（例えば、ユビキチンが媒介した分解、及び／または、プロテオソーム分解）のための、ＣＡＲに標識されるＲＤＤ（例えば、ＣＡＲに融合したもの）を含むＣＡＲを発現するように遺伝子操作したＴ細胞を提供することで、当該ＲＤＤと直接に相互作用（例えば、結合）する安定化小分子薬の添加または存在が、ＣＡＲの分解を妨げ、かつ、当該ＲＤＤと直接に相互作用する安定化小分子薬の除去（例えば、代謝クリアランスによる）または不存在が、ＣＡＲ分解の発生を許容する。本発明を実施する上でメカニズムの理解は必要ではなく、また、本発明は特定のメカニズムに限定されるものではないが、一部の実施形態では、あらゆるＣＡＲタンパク質の表面発現レベルを、持続性ＣＡＲシグナル伝達を可能にするのに必要な濃度よりも小さくなるように、ＣＡＲタンパク質の分解または破壊を可能にすることで、持続性ＣＡＲシグナル伝達を妨げる。一部の実施形態では、当該ＣＡＲに、かようなＲＤＤ「担持薬物」の使用を介したＣＡＲタンパク質レベル、及び、ＣＡＲ表面発現の調節（例えば、抑制）は、持続性ＣＡＲシグナル伝達に起因するＴ細胞枯渇の特徴を既に示している枯渇したＴ細胞を再活性化する。例えば、安定化小分子に曝されているＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｔ細胞枯渇の表現型及び機能の特徴のすべてを実証している。しかしながら、安定化小分子を除去し、そして、ＣＡＲタンパク質レベルをタンパク質分解で低下させると、Ｔ細胞枯渇の表現型及び機能指標は逆転し、また、エフェクターＴ細胞機能は回復する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含む遺伝子操作したＴ細胞を提供するものであり、当該単離した核酸配列は、腫瘍抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、ｓｃＦｖ）の核酸配列（例えば、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列）、膜貫通ドメインの核酸配列、１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列、及び、ＲＤＤドメインの核酸配列を含む。
【００１１】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含むベクターをさらに含んでおり、当該単離した核酸配列は、腫瘍抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、ｓｃＦｖ）の核酸配列（例えば、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列）、膜貫通ドメインの核酸配列、１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列、及び、ＲＤＤドメインの核酸配列を含む。
【００１２】
加えて、本発明は、がんを有する対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を含む。この方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含む遺伝子操作したＴ細胞を有効量にて当該対象に投与することを含んでおり、当該単離した核酸配列は、腫瘍抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、ｓｃＦｖ）の核酸配列（例えば、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列）、膜貫通ドメインの核酸配列、１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列、及び、ＲＤＤドメインの核酸配列を含み、それにより、当該対象に抗腫瘍免疫を提供する。一部の実施形態では、当該対象は、ヒトである。
【００１３】
さらに、本発明は、対象における細胞集団、腫瘍または組織に対して、有効に、及び／または、治療的にＴ細胞が媒介した免疫応答を刺激する方法を含む。この方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含む遺伝子操作したＴ細胞を有効量にて当該対象に投与することを含んでおり、当該単離した核酸配列は、腫瘍抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、ｓｃＦｖ）の核酸配列（例えば、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列）、膜貫通ドメインの核酸配列、１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列、及び、ＲＤＤドメインの核酸配列を含み、それにより、当該対象におけるＴ細胞が媒介した免疫応答を刺激する。
【００１４】
対象におけるがんを処置する方法も本明細書で提供する。この方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含む遺伝子操作したＴ細胞を治療有効量にて、がんを有する対象に投与することを含んでおり、当該単離した核酸配列は、腫瘍抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、ｓｃＦｖ）の核酸配列（例えば、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列）、膜貫通ドメインの核酸配列、１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列、及び、ＲＤＤドメインの核酸配列を含み、それにより、当該対象のがんを処置する。
【００１５】
本発明は、がんと診断された対象において、遺伝子操作したＴ細胞（例えば、記憶Ｔ細胞）の持続性集団を生成する方法をさらに含み、当該方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離した核酸配列を含む遺伝子操作したＴ細胞を有効量にて当該対象に投与することを含んでおり、当該単離した核酸配列は、腫瘍抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、ｓｃＦｖ）の核酸配列（例えば、ヒト、マウス、または、ヒト化マウス核酸配列）、膜貫通ドメインの核酸配列、１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインの核酸配列、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの核酸配列、及び、ＲＤＤドメインの核酸配列を含み、投与後の当該対象において、遺伝子操作したＴ細胞の持続性集団が（例えば、数週間、１か月、数か月間など）持続する。一部の実施形態では、遺伝子操作したＴ細胞の持続性集団は、投与後の少なくとも３ヶ月間は、ヒトで持続する。
【００１６】
本発明は、ＲＤＤを含むＣＡＲを発現する手段に対して制限がない。一部の実施形態では、ＣＡＲを、構成的に発現する。その他の実施形態では、ＣＡＲを、調節した様式で発現する（例えば、小分子を介して発現を調節するシステムを使用し、または、内因的に調節を受けるシステムを使用する）。別の実施形態では、ＣＡＲを、レトロウイルス、レンチウイルス、または、その他のウイルスベクターを使用して、または、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとしたシステムを介して、細胞ＤＮＡに遺伝的に組み込む。なおも別の実施形態では、ＣＡＲを、ＲＮＡ、または、腫瘍溶解性ウイルス、または、当該技術分野で公知のその他の一過性発現系を介して発現する。ＣＡＲは、養子移入のためにエクスビボでＴ細胞に送達することができ、または、インビボでの遺伝子導入を介して送達することができる。
【００１７】
本発明は、本発明のＣＡＲを発現、及び／または、含有するように遺伝子操作したＴ細胞のタイプに対して制限がない。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、及び／または、ＣＤ８＋  Ｔ細胞）である。特定の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。その他の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、アルファベータＴ細胞である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋とＣＤ８Ｔ＋細胞との組み合わせである（例えば、ＣＤ３＋）。特定の実施形態では、当該Ｔ細胞は、記憶Ｔ細胞である。特定の実施形態では、当該記憶Ｔ細胞は、中枢記憶Ｔ細胞である。その他の実施形態では、当該記憶Ｔ細胞は、エフェクター記憶Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。特定の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及び／または、ガンマデルタＴ細胞の組み合わせである。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞は、サイトカイン誘導性キラー細胞である。
【００１８】
一部の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍抗原を認識して応答するＣＡＲで遺伝子操作した末梢血由来Ｔ細胞を含む。そのような受容体は、一般的に、腫瘍抗原に特異的な一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメインから構成される（例えば、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、１０２（５２）：１９０５１−１９０５６を参照されたい）。その他の実施形態では、当該Ｔ細胞は、腫瘍抗原を認識するヒトまたはマウス起源のＣＡＲを発現するように操作している。本発明は、認識する腫瘍抗原のタイプに対して制限がない。実際のところ、腫瘍抗原を認識するあらゆるＣＡＲには、本発明の組成物及び方法において用途がある。例として、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒα、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＥｒｂＢ３／４、糖脂質Ｆ７７、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１）、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソセリン、ＴＡＧ７２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、ＧＤ３、チロシンプロテインキナーゼＭｅｔ（ｃ−Ｍｅｔ）、または、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、メラノーマ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）ファミリーメンバーＡ３（ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＨＬＡ−ＡＩ、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、Ｆｅｔａｌ  ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＧＰ１０００、ｐ５３、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質または抗原、または、腫瘍が発現するその他のウイルス関連抗原、から選択される抗原を認識するＣＡＲがあるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、ＣＡＲのタイプに対して制限がない。実際のところ、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原、または、その他のタイプの抗原）に対して特異的に結合するＣＡＲを、本明細書に開示及び記載したようにして操作して、ＣＡＲの表面発現を調節し得る。特定の実施形態では、当該ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、当該抗原結合ドメインは、所望の抗原に対して特異的に結合する重鎖及び軽鎖可変領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲは、膜貫通ドメインと、１つ以上の免疫受容体チロシンをベースとした活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むシグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、当該膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及び、ＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、当該細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢポリペプチドの機能的シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータポリペプチドの機能的シグナル伝達ドメイン、または、その双方を含む。一部の実施形態では、当該ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、Ｔ細胞活性化を刺激する第２のシグナルを提供するドメイン）を含む。本発明は、共刺激ドメインのタイプに対して制限がない。実際のところ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９、高親和性免疫グロブリンＥ受容体−ガンマサブユニット（ＦｃεＲＩγ）、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、インターロイキン２サブユニットベータ（ＩＬＲβ）またはＣＤ１２２、サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ（ＩＬ−２Ｒγ）またはＣＤ１３２、及び、ＣＤ４０など、当該技術分野で公知のあらゆる共刺激ドメインを使用し得るが、これらに限定されない。ある実施形態では、当該共刺激ドメインは、４−１ＢＢである。
【００２０】
本発明は、特定のＲＤＤ、または、当該ＲＤＤが融合するＣＡＲ内のドメインに対して制限がない。一部の実施形態では、当該ＲＤＤは、ＣＡＲ抗原結合ドメインに融合する。その他の実施形態では、当該ＲＤＤは、ヒンジ、または、膜貫通ＣＡＲドメインに融合する。なおもさらなる実施形態では、当該ＲＤＤは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０などの細胞質ＣＡＲ刺激ドメインに融合するが、これらに限定されない。さらにその他の実施形態では、当該ＲＤＤは、ＣＡＲ  ＣＤ３ゼータドメインに融合する。実際のところ、本発明の方法及び組成物では、ＲＤＤを含むＣＡＲを含む細胞は、ＣＡＲが抗原特異的活性を有する限りは、ＣＡＲのあらゆる部分に付着したＲＤＤを有し得る。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＲＤＤを含む、または、ＲＤＤに融合したＣＡＲを含む有効量のＣＡＲ  Ｔ細胞を、疾患または病態を有する対象（例えば、患者）に投与することを含む、対象の疾患または病態を処置する方法を提供する。本発明は、処置する疾患または病態のタイプに対して制限がない。実際のところ、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与を介して処置可能な（例えば、処置の際に疾患の徴候または症状を改善する）あらゆる疾患または病態は、本発明の組成物及び方法を使用して、改善され、かつ、より効果的な方法で処置することができる。ある実施形態では、当該疾患または病態は、がんである。別の実施形態では、当該疾患または病態は、感染症である。本発明は、がんのタイプ、または、感染症のタイプに対して制限がない。実際のところ、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を処置に使用する当技術分野で公知のあらゆるがんまたは疾患は、本発明の組成物及び方法で処置し得る。例えば、本発明の組成物及び方法を使用して、治療用ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲにＲＤＤを遺伝的に導入することで、当技術分野で公知のあらゆるＣＡＲ  Ｔ細胞療法を改変することができる。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞を有効量にて、疾患または病態を有する対象（例えば、患者）へ投与すると、（例えば、ＤＤを欠いた同量のＣＡＲ  Ｔ細胞を投与された対象と比較して）患者のＴ細胞の枯渇を阻害または逆転する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＣＡＲ細胞表面発現の選択的調節（例えば、抑制）を介して、ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、そうしなければ、疾患または病態を処置する状況において、抗原誘導的持続性シグナル伝達と枯渇とを示すＣＡＲ  Ｔ細胞）の機能を、維持、回復、または、強化する方法を提供する。一部の実施形態では、ＲＤＤを当該ＣＡＲに組み込むことで、インビトロまたはエクスビボでのＴ細胞の培養及び増殖の間のＣＡＲ発現の調節（例えば、抑制）が可能となり、これにより、対象の疾患または病態を処置する状況において、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能（例えば、エフェクター機能）を強化する。本発明は、維持、回復、または、強化する機能の種類に対して制限がない。一部の実施形態では、当該機能性は、抗原誘発性サイトカイン産生である。その他の実施形態では、当該機能性は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性（例えば、腫瘍標的の認識の増大）である。さらにその他の実施形態では、当該機能性は、記憶細胞形成の増加、及び／または、抗原に応答した増殖の増大である。一部の実施形態では、ＣＡＲ細胞表面発現の調節（例えば、抑制）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び、ＬＡＧ−３などを含むがこれらに限定されない、枯渇を示すマーカーの測定可能な減少をもたらす。その他の実施形態では、ＣＡＲ細胞表面発現の調節（例えば、抑制）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞プログラム細胞死のレベルの減少をもたらす。なおもさらなる実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞でのＣＡＲ細胞表面発現の調節（例えば、抑制）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の臨床的有効性を著しく高める。
【００２３】
別の態様では、本発明は、患者のがんを処置する、または、その進行を遅延する方法を提供するものであり、同方法は、ＲＤＤを含む、または、ＲＤＤに融合したＣＡＲを発現するように改変した（例えば、遺伝子操作した）ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を治療有効量にて患者に投与することを含む。特定の実施形態では、治療有効量の、改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、そのような処置を終えた患者でのがん細胞の数を減らす。特定の実施形態では、治療有効量の、改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、そのような処置を終えた患者での全身腫瘍組織量を、減少、及び／または、消滅する。特定の実施形態では、この方法は、当該患者に放射線療法を行う、ことをさらに含む。特定の実施形態では、当該放射線療法は、治療有効量の、改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を当該患者が摂取する前、摂取すると同時、及び／または、摂取の後に行う。特定の実施形態では、当該方法は、１つ以上の抗癌剤、及び／または、１つ以上の化学療法剤を患者に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、１つ以上の抗癌剤、及び／または、１つ以上の化学療法剤を、治療有効量の、改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を当該患者が摂取する前、摂取と同時、及び／または、摂取した後に投与する。特定の実施形態では、治療有効量の改変したＣＡＲ  Ｔ細胞、及び、一連の抗癌剤を用いて処置した患者では、改変したＣＡＲ  Ｔ細胞、または、抗癌剤／放射線だけで処置した患者と比較して、前出の患者では、明確な腫瘍応答と臨床的利益とが認められる。すべての承認済み抗癌剤及び放射線処置の用量は公知であるので、本発明は、それらと改変したＣＡＲ  Ｔ細胞との様々な組み合わせを企図している。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の、本開示にしたがって改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む（例えば、対象におけるがんの処置、または、進行の遅延における使用のための）組成物を提供する。本明細書に記載したように、当該組成物は、その他のタイプのがんの処置（例えば、化学療法、がんの外科的切除、または、放射線療法）の前、処置の最中、または、処置の後に投与し得る。また、本発明は、細胞周期停止、及び／または、アポトーシスを誘導するための組成物の使用を提供する。また、本発明は、アポトーシス、及び／または、細胞周期停止の誘導因子、及び、細胞周期停止の誘導による正常細胞の化学保護など、さらなる作用物質（複数可）に対して細胞を感作するための当該組成物の使用に関する。本発明の組成物は、あらゆるタイプのがん、または、感染症、さらには、アポトーシス細胞死の誘導に応答するあらゆる細胞の障害など（例えば、がんなどの過剰増殖性疾患を含むアポトーシスの調節不全を特徴とする障害）の処置、改善、または、予防に有用である。特定の実施形態では、当該組成物を使用して、がん療法に対する抵抗性をさらに特徴とするがん（例えば、化学療法抵抗性、放射線抵抗性、ホルモン抵抗性などを有するがん細胞）を処置、改善、または、予防することができる。また、本発明は、医薬として許容される担体に本発明の改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物（例えば、免疫療法組成物）を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、患者のがんを処置する、または、がんの進行を遅らせる方法を提供するものであって、同方法は、治療有効量の、本開示にしたがって改変した（例えば、遺伝子操作した）ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を、治療有効量のＴＣＲシグナル伝達の阻害剤（例えば、Ｔ細胞の枯渇を防ぐためのもの）と組み合わせて、患者に投与することを含む。複数のサイクルの処置を、対象に対して投与し得る。特定の実施形態では、ＴＣＲシグナル伝達の当該阻害剤を、標準的な投与計画に従って（例えば、毎日または断続的に）投与する。別の実施形態では、ＴＣＲシグナル伝達の当該阻害剤を、少なくとも部分的なＴ細胞機能を回復するのに十分な期間をかけて投与し、その後に中止する。
【００２６】
本発明のこれらの実施形態、及び、その他の実施形態は、当業者であれば、本明細書の開示を考慮することで容易に想到する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  ＣＡＲの特徴決定。Ｔ細胞に、活性化して１日後に、ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスを形質導入し、次いで、増殖培地で様々な濃度のＳｈｉｅｌｄ−１と共に培養した。７日目に、ＦＡＣＳを介して、ＣＡＲ発現を定量した。
【図２】培養培地からＳ１を除去すると、Ｔ細胞枯渇マーカーの表面発現が逆転する。
【図３】培養培地からＳ１を除去すると、ＣＤ６２Ｌの発現を維持し、また、アポトーシスを予防する。
【図４】培養培地からＳ１を除去すると、機能Ｔ細胞の枯渇が逆転する。
【図５】表面ＣＡＲを除去すると、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１遮断と比較して、Ｔ細胞枯渇を、より効果的に予防する。
【図６】表面ＣＡＲを除去すると、わずか４日後に、ＰＤ−１／ＴＩＭ−３／ＬＡＧ−３トリプルポジティブＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇が回復する。
【図７】ダサチニブは、腫瘍抗原に応答して、ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン分泌を阻害する。
【図８】ダサチニブは、枯渇マーカーの発現と共発現とを逆転する。
【図９】ダサチニブ処置は、ＣＤ６２Ｌ発現を維持する。
【図１０】ダサチニブ処置は、腫瘍抗原に応答して、ＩＬ−２及びＩＦＮγの分泌を増大する。
【図１１】本発明のある実施形態でのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概略図を示す。例えば、当該ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））、及び、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８、または、４−１ＢＢドメインを含む）、細胞内ＣＤ３ゼータドメイン、及び、調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含む。
【図１２】Ｃ末端位置で融合したＲＤＤを含む複数のサイズの幾つかの異なるＣＡＲの用量依存性調節を示す。Ａ）ＦＫＢＰ１２ＤＤに融合したＣＡＲは、ラパログｓｈｉｅｌｄ−１で調節できる。Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＨＦＲ  ＤＤに融合したＣＡＲは、トリメトプリムで調節できる。
【図１３】安定化薬／小分子の存在下または非存在下それぞれでの迅速なＣＡＲタンパク質の安定化または不安定化を示す。一般的に、ＩＣ５０、すなわち、表面ＣＡＲの５０％を分解するのに要した時間は、２時間未満であった。
【図１４】安定化薬が、ＲＤＤ−ＣＡＲの抗腫瘍活性を調節することを示す。安定化薬が存在しないと、安定化薬、及び、大きなＣＡＲ表面発現の存在下で培養したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、インビトロでのＣＡＲ表面発現が小さくなり、また、腫瘍に応答したサイトカイン分泌の減弱と細胞毒性の減弱とを伴う。
【図１５】トリメトプリムが、インビボで、ＣＡＲ表面発現、及び、ＤＨＦＲ  ＤＤ−ＣＡＲの活性を調節することを示す。図１５Ａは、ＣＡＲ発現が、インビボで調節可能であり、また、インビトロで達成されるＣＡＲ表面発現のダイナミックレンジが、インビボで認められるものと同様であることを示す。図１５Ｂは、安定化薬トリメトプリム（ＴＭＰ）の注射を受けたマウスが、ＣＡＲ発現を示すのみならず、このグループでの高発現ＣＡＲ  Ｔ細胞もより高いＣＤ６９表面発現を示しており、このことは、インビボで腫瘍に応答して活性化したことを示す。図１５Ｃは、ビヒクルを毎日注射したマウスと、ＴＭＰを注射したマウスとの全身腫瘍組織量の違いを示す。ＴＭＰの注射を受け、そして、表面にＣＡＲを発現したマウスは、モック及びビヒクルコントロールよりも腫瘍成長を制御する能力が高いことを示す。
【図１６】ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚにおける持続性シグナル伝達を、融合ＲＤＤを介して予防または逆転することを示す。ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  ＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞表面で発現すると、腫瘍抗原の非存在下で持続的にシグナルを送ることを、ウエスタンブロッティングでＣＡＲ  ＣＤ３ゼータドメインが、ベースラインでリン酸化されていることで証明した。この持続性シグナル伝達は、Ｔ細胞の枯渇につながり、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞の効果が低下する。安定化薬の非存在下で、ＲＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を増殖すると、持続性シグナル伝達が予防される。ＣＡＲの発現が抑制または阻害され、そして、Ｔ細胞表面で発現されなかった場合（ｓｈｉｅｌｄ−１が非存在の場合、ＣＡＲは常にＯＦＦである）、または、ＣＡＲがある時点で発現した後に、７２時間後に表面から除去した場合（ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７）、ＣＤ３ゼータリン酸化の減弱を認めた。
【図１７】ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰでの標準的な枯渇マーカーの共発現は、培養培地からｓｈｉｅｌｄ−１を除去すると、急速にダウンレギュレートし、そして、持続性シグナル伝達の予防または逆転は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇表現型を改善する、ことを示す。ＰＤ−１／ＴＩＭ−３／ＬＡＧ−３の共発現は、エフェクター機能の低下と相関している。ＣＡＲが常に発現される場合（ｓｈｉｅｌｄ−１で培養した、「ＣＡＲは常にＯＮ」）、これらのマーカーは、大部分の細胞で共発現する。しかしながら、ＣＡＲが表面で発現しない場合（ｓｈｉｅｌｄ−１なし、「ＣＡＲは常にＯＦＦ」）、または、ｓｈｉｅｌｄ−１で７日間培養してから除去すると、枯渇マーカーを共発現する細胞の一部のみが認められる。図１７Ｂは、Ｔ細胞の枯渇と相関する転写因子であるＴｂｅｔとＢｌｉｍｐ−１を共発現する細胞の同様の傾向を示す。
【図１８】持続性シグナル伝達の阻害または除去が、記憶表現型を救済することを示す。Ｔ細胞の枯渇は、Ｔ細胞の記憶形成能力を阻害する。枯渇した（ＣＡＲは常にＯＮ）細胞は、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の割合が大きく、そして、幹細胞記憶（Ｔｓｃｍ）の割合が小さい。逆に、非枯渇細胞（ＣＡＲは常にＯＦＦ）、または、培養物から安定化薬を除去して枯渇を逆転させた細胞（ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７またはＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ１０）は、幹細胞記憶区画の増大を示す。
【図１９】融合ＦＫＢＰ、または、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＨＦＲ不安定化ドメイン（ＤＤ）を介したＣＡＲ表面発現の時間依存性調節を示す。枯渇したＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍に応答してエフェクターサイトカインＩＬ−２及びＩＦＮγを分泌することができない。しかしながら、枯渇が予防または逆転したＣＡＲ  Ｔ細胞では、ＩＬ−２及びＩＦＮγを分泌する能力が強化されている。
【図２０】枯渇したＣＡＲ  Ｔ細胞が、細胞毒性を顕著に低下させたことを示す。しかしながら、枯渇が予防または逆転したＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞毒性の増強を示す。
【図２１】安定化薬の反復投与に曝したマウスを示す。ＴＭＰの代わりにビヒクルを注射して、４日間、Ｔ細胞を「休止」させた。その後、ＴＭＰ注射を、さらに３日間、再開した。データは、「休止」期間の前よりも、「休止」期間の後において全身腫瘍組織量が低く、機能の救済が十分であることを示している。
【図２２】様々な調節可能なＤＤ−ＣＡＲの用量反応曲線とＥＣ５０値を示す。ＣＡＲ中央値蛍光強度（ＭＦＩ）は、まず、ＣＡＲ＋及びＣＡＲ−細胞をゲーティングし、次に、ＣＡＲ＋集団のＭＦＩから、ＣＡＲ−集団のＭＦＩを差し引いて計算した。数値を、薬物滴定研究で、最大ＣＡＲ  ＭＦＩに正規化し、そして、非線形回帰、及び、最小二乗適合曲線を生成した。各曲線のＥＣ５０値を、棒グラフにプロットする。ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ、ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ、ＧＤ２．２８ｚ．ｅｃＤＨＦＲについては、ｎ＝３ドナーである。ＣＤ１９．２８ｚ．ＦＫＢＰ、ＣＤ１９．２８ｚ．ｅｃＤＨＦＲ、及び、ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ｅｃＤＨＦＲについては、ｎ＝２ドナーである。
【図２３】特定の不安定化ドメインが、薬物依存性調節ＣＡＲ発現に最適であることを示す。（Ａ）Ｔ細胞にレンチウイルスを形質導入して、ＧＤ２．２８ｚ．ｅｃＤＨＦＲを発現させ、当該ｅｃＤＨＦＲドメインは、Ｒ１２Ｈ、Ｎ１８Ｔ、Ｖ１９Ａ、及び、Ｇ６７Ｓの変異を含んでいた。Ｔ細胞を培養物から取り出し、そして、蛍光標識抗イディオタイプ抗体で染色し、続いて、ＦＡＣＳを介してＣＡＲ表面発現を評価した。安定化薬の非存在下での高いバックグラウンド発現が故に、薬物依存性が僅かなＣＡＲ調節が認められた。（Ｂ）Ｔ細胞にレンチウイルスを形質導入して、ＧＤ２．２８ｚ．ｅｃＤＨＦＲを発現させたところ、当該ｅｃＤＨＦＲドメインは、Ｒ１２Ｙ、Ｇ６７Ｓ、Ｙ１００Ｉの変異を含んでいた。Ｔ細胞を再び培養物から取り出し、抗イディオタイプ抗体で染色し、そして、ＦＡＣＳを介してＣＡＲ発現を評価した。異なるｅｃＤＨＦＲドメインを、このＤＤ−ＣＡＲを反復して組み込むと、ＣＡＲ表面発現の薬物依存性調節が認められた。双方の図面内の点線は、０ｕＭ  ＴＭＰと１０ｕＭ  ＴＭＰとの間のＣＡＲ発現レベルの違いを強調するように描いた。
【図２４】融合ＦＫＢＰ  ＤＤを介したＨｅｒ．２８ｚ  ＣＡＲの薬物依存性調節を示す。このＦＫＢＰ１２  ＤＤドメインは、Ｈｅｒ２．２８ｚ  ＣＡＲの遠位ｃ末端に融合した。Ｔ細胞にレンチウイルスを形質導入して、Ｈｅｒ２．２８ｚ．ＦＫＢＰを発現させた。活性化の７日後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下または非存在下で培養した。薬物を添加して２４時間後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、プロテインＬで染色し、そして、ＦＡＣＳを使用してＣＡＲの発現を評価した。ＣＡＲ＋細胞とＣＡＲ  ＭＦＩの双方のパーセンテージ（ヒストグラムで定量）は、０．１ｕＭまたはｌｕＭのＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓ１）のいずれかとインキュベーションすると増加した。
【図２５】本明細書に記載した本発明の実施形態において有用な核酸及びアミノ酸配列の表を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
この明細書を解釈するために、以下の定義を適用するものとし、適切な場合には常に、単数形で使用した用語は複数形を含むものとし、その逆も同様である。以下に記載したあらゆる定義が、本明細書の一部を構成するものとして援用するあらゆる文献と矛盾する場合には、以下に記載した定義を優先する。
【００２９】
また、本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を意図するものではない、ことも理解されたい。
【００３０】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、当該冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素のことを意味する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「約」とは、量、一時的期間などの測定可能な数値を指す場合には、特定の数値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、なおもより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味しており、そのような変化は、本明細書に開示した方法を実行する上で適切である。
【００３２】
「Ｔ細胞枯渇」とは、感染（例えば、慢性感染）、または、疾患の結果として起こり得るＴ細胞機能の低下のことを指す。Ｔ細胞の枯渇は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び、ＬＡＧ−３の発現の増加、アポトーシス、及び、サイトカイン分泌の抑制に関連している。したがって、用語「Ｔ細胞の枯渇を改善する」、「Ｔ細胞の枯渇を抑制する」、「Ｔ細胞の枯渇を減らす」などは、次に述べる、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び、ＬＡＧ−３の１つ以上の発現、及び／または、発現レベルの低下；記憶細胞形成の増大、及び／または、記憶マーカー（例えば、ＣＤ６２Ｌ）の維持；アポトーシスの予防；抗原誘導性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の産生、及び／または、分泌の増大；向上した細胞毒性／死滅能力；表面抗原が少ない腫瘍標的の認識の改善；抗原に応答して増進した増殖、の１つ以上を特徴とするＴ細胞の機能が回復した状態のことを意味する。
【００３３】
本明細書で使用する「ＧＤ２結合ドメイン」などの用語「抗原結合ドメイン」とは、当業者に公知のあらゆる抗原特異的結合ドメイン（例えば、ＧＤ２特異的結合ドメイン）のことを指し得る。ある例では、ＧＤ２結合ドメインは、ＧＤ２に対して特異的に結合する抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。抗ＧＤ２抗体、抗体断片、及び、それらの変異体は、当該技術分野で周知であり、例えば、１４Ｇ２ａ、ｃｈｌ４．１８、ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、ｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ＨＭ３Ｆ８、ＵＮＩＴＵＸＩＮ、ＤＭＡｂ−２０、または、ＧＤ２に対して特異的に結合するその他の抗体がある。ある実施形態では、当該ＧＤ２結合ドメインは、抗ＧＤ２抗体の相同体、変異体、異性体、または、機能的断片である。各々の可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３４】
本明細書で使用する用語「活性化」とは、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激したＴ細胞の状態のことを指す。活性化は、誘導したサイトカイン産生、及び、検出可能なエフェクター機能とも関連付けができる。用語「活性化Ｔ細胞」とは、とりわけ、細胞分裂を受けているＴ細胞のことを指す。
【００３５】
本明細書で使用する用語「抗体」とは、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子のことを指す。抗体は、自然界での供給源、または、組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンとすることができ、また、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分とすることができる。抗体は、個々の免疫グロブリン分子の多量体とし得る。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、ならびに、一本鎖抗体、ヒト抗体、及び、ヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６を参照されたい）。
【００３６】
用語「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部のことを指し、好ましくは、インタクトな抗体の抗原決定可変領域のことを指す。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び、Ｆｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び、抗体断片から形成した多重特異性抗体があるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用する用語「抗体重鎖」とは、自然界に存在する立体配座で、すべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の内の大きい方を指す。本明細書で使用する「抗体軽鎖」とは、自然界に存在する立体配座で、すべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の内の小さい方を指す。カッパ及びラムダ軽鎖とは、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプのことを指す。
【００３８】
本明細書で使用する用語「合成抗体」とは、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージにより発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成する抗体のことを意味する。また、この用語は、抗体、すなわち、当該抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成した抗体を意味するものと解釈すべきであり、そして、そのＤＮＡ分子は、抗体タンパク質、または、当該抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、当該ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、利用可能で、かつ、当該技術分野で周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して取得する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「抗原」または「Ａｇ」とは、免疫応答を惹起する分子として定義する。この免疫応答は、抗体産生、または、特定の免疫学的コンピテント細胞の活性化、または、その双方を含む。当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる高分子が、抗原として機能できることを理解する。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来することができる。したがって、当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、その用語が、本明細書で使用する用語「抗原」をコードすることを理解する。さらに、当業者であれば、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がない、ことを理解する。さらに、当業者であれば、抗原が、「遺伝子」によってコードされる必要が全くない、ことを理解する。抗原を、生成、合成できること、または、生体試料から誘導できることは自明である。そのような生体試料として、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液があり得るが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用する用語「抗腫瘍効果」とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、または、がんの病態に関連する様々な生理学的症状の改善によって示すことができる生物学的効果のことを指す。「抗腫瘍効果」は、そもそも、腫瘍の発生の予防における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、抗体（または、その抗原結合部分）、及び、ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力によって、明らかにすることもできる。
【００４１】
本明細書で使用する用語「自己免疫疾患」とは、自己免疫応答に起因する障害として定義する。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切で過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例として、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎などがあるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用する用語「自己」とは、後に再導入される個体と同じ個体に由来するあらゆる材料を指すことを意味する。「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片のことを指す。「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。
【００４３】
本明細書で使用する用語「がん」とは、異常細胞の急速かつ制御されない成長を特徴とする疾患として定義する。がん細胞は、局所的に、または、血流やリンパ系を介して身体のその他の部位に拡がることができる。様々ながんの例として、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などがあるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用する用語「共刺激リガンド」として、Ｔ細胞の同種共刺激分子に対して特異的に結合する抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞など）での分子があり、それにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを担持したＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化など、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドとして、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及び、Ｂ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドがあるが、これらに限定されない。また、共刺激リガンドは、とりわけ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及び、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど、これらに限定されない、Ｔ細胞に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も含む。
【００４５】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖など、これらに限定されないが、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞の同族結合パートナーのことを指す。共刺激分子として、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、及び、Ｔｏｌｌリガンド受容体があるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用する、「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖、及び／または、重要な分子のアップレギュレーション、または、ダウンレギュレーションをもたらすシグナルのことを指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「有効量」とは、治療的または予防的利益を提供する量のことを意味する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「治療」とは、処置、及び／または、予防のことを意味する。治療効果は、病状の抑制、寛解、または、根絶として得られる。
【００４９】
用語「治療有効量」とは、研究者、獣医師、医師、または、その他の臨床医が追い求めている組織、システム、または、対象の生物学的または医学的応答を引き起こす対象化合物の量のことを指す。用語「治療有効量」とは、投与した場合に、処置した障害または疾患の１つ以上の徴候または症状の発症を予防するか、または、ある程度まで緩和するのに十分な化合物の量を含む。当該治療有効量は、化合物、疾患、及び、その重篤度、ならびに、処置を受ける対象の年齢、体重などに応じて変化する。
【００５０】
本明細書で使用する用語、疾患を「処置する」とは、対象が経験した疾患または障害の少なくとも１つの兆候または症状の頻度または重篤度を低下させる、ことを意味する。
【００５１】
「コードする」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチドの配列に固有の特性を指すものであり、定義したヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び、ｍＲＮＡ）、または、定義したアミノ酸の配列、及び、それらに起因する生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスでのその他のポリマー及び高分子の合成のテンプレートとして機能する。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞またはその他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、遺伝子は、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ配列と同一であり、かつ、通常は配列表に記載されているコーディング鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用する非コーディング鎖との双方は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質、または、その他の産物をコードすることを指すことができる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「内因性」とは、生物、細胞、組織、または、システムから、または、その内部で生成されるあらゆる材料のことを指す。本明細書で使用する用語「外因性」とは、生物、細胞、組織、またはシステムの外部から導入または外部で生成するあらゆる材料のことを指す。
【００５３】
本明細書で使用する用語「発現」とは、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写、及び／または、翻訳に関する。「また、発現は、細胞表面のタンパク質の存在も指す（例えば、Ｔ細胞の表面でのＣＡＲ発現）。
【００５４】
本明細書で使用する用語「トランスフェクトした」または「形質転換した」または「形質導入した」とは、外因性核酸を、宿主細胞に移入または導入するプロセスのことを指す。「トランスフェクトした」または「形質転換した」または「形質導入した」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または、形質導入した細胞である。当該細胞には、初代対象細胞と、その子孫を含む。
【００５５】
「ベクター」は、単離した核酸を含み、かつ、単離した核酸を、細胞の内部に送達するために使用できる物質の組成物である。無数のベクターが当該技術分野で公知であり、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物、プラスミド、及び、ウイルスに関連するポリヌクレオチドがあるが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。また、この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物を含む、と解釈すべきである。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されない。
【００５６】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に結合した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み；発現のための他の要素は、宿主細胞、または、インビトロ発現系で供給することができる。発現ベクターとして、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソームに含有させたもの）、及び、ウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルス）など、当該技術分野で公知のすべてのものがある。
【００５７】
本明細書で使用する「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科の属のことを指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でもユニークである。レンチウイルス由来のベクターは、大量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。
【００５８】
「相同」とは、２つのポリペプチドの間、または、２つの核酸分子の間での配列類似性または配列同一性のことを指す。比較をした２つの配列の双方の位置に、同じ塩基、または、アミノ酸モノマーサブユニットがある場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置にアデニンがある場合、それらの分子は、その位置で相同である。２つの配列の間での相同性の割合とは、２つの配列が共有した、一致した位置の数、または、相同な位置の数を、比較した位置の数で割ったものに、１００を乗じる関数のことである。例えば、２つの配列の１０箇所の内の６箇所が、一致または相同である場合、２つの配列は、６０％の相同性である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有している。一般的に、２つの配列を並べて最大の相同性を得るときに、比較を行う。
【００５９】
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」とは、抗体として機能するタンパク質のクラスとして定義される。Ｂ細胞が発現する抗体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、または、抗原受容体と称する場合もある。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥである。ＩｇＡとは、唾液、涙、母乳、消化管分泌物、気道及び泌尿生殖路の粘液分泌物など、身体分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧとは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭとは、大抵の対象での主要な免疫反応で産生される主要な免疫グロブリンである。このものは、凝集、補体結合、及び、その他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、また、細菌、及び、ウイルスに対する防御において重要である。ＩｇＤとは、抗体機能は不明であるが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥとは、アレルゲンへ曝露すると、マスト細胞及び好塩基球からメディエーターを放出して、即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００６０】
「単離した」とは、自然状態から改変または取り出したことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離した」ものではないが、その自然状態で共存する材料から部分的または完全に分離した同じ核酸またはペプチドは「単離した」ものである。単離した核酸またはタンパク質を、実質的に精製した形で存在させることができ、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境下に存在させることができる。
【００６１】
本明細書で使用する「実質的に精製した」細胞とは、その他の細胞型を本質的に含まない細胞のことである。また、実質的に精製した細胞とは、その自然発生状態で通常付随しているその他の細胞型から分離した細胞のことを指す。一部の事例では、実質的に精製した細胞の集団とは、細胞の均質な集団のことを指す。その他の事例では、この用語は、単に、それらの自然状態に自然に関連付けられている細胞から分離した細胞のことを指す。一部の実施形態では、これらの細胞を、インビトロで培養する。その他の実施形態では、これらの細胞は、インビトロで培養しない。
【００６２】
特に断りがない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重したバージョンであり、かつ、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、何らかのバージョンでイントロン（複数可）を含み得る程度にまでイントロンをも含み得る。
【００６３】
用語「作動可能に結合した」とは、調節配列と異種核酸配列との間の機能的結合のことを指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に結合する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を与える場合、当該プロモーターは、当該コード配列に作動可能に結合する。一般的に、機能的に結合したＤＮＡ配列は連続しており、そして、必要に応じて、２つのタンパク質コーディング領域を結合するために、同じリーディングフレーム内にある。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用する核酸とポリヌクレオチドは、互換可能である。当業者であれば、核酸が、ポリヌクレオチドであり、単量体の「ヌクレオチド」に加水分解できる、という一般的な知識を持ち合わせている。単量体ヌクレオチドは、加水分解されてヌクレオシドになることができる。本明細書で使用するポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能なあらゆる手段によって得られるすべての核酸配列を含むが、これらに限定されず、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術、及び、ＰＣＲなどを使用して、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列のクローニング、及び、合成をする手段などがあるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用する用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は互換的に使用しており、そして、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基からなる化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドには、少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、そして、タンパク質またはペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、これらの用語は、例えば、当該技術分野において一般的にペプチド、オリゴペプチド、及び、オリゴマーとも称されている短鎖のもの、及び、当該技術分野において一般的にタンパク質と称されている長鎖のものの双方のことを指し、数多くの種類がある。「ポリペプチド」として、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質がある。これらのポリペプチドとして、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または、それらの組み合わせがある。
【００６６】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要な細胞の合成機構、または、導入をした合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。本明細書で使用する用語「プロモーター／調節配列」とは、プロモーター／調節配列に作動可能に結合した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列のことを意味する。一部の事例では、この配列を、コアプロモーター配列とすることができ、その他の事例では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列とその他の調節要素とを含み得る。当該プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方法で遺伝子産物を発現し得る。「構成的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合すると、細胞での大半またはすべての生理学的条件下で、細胞内で遺伝子産物を産生するヌクレオチド配列のことである。「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に結合すると、実質的に、プロモーターに対応する誘導因子が細胞に存在する場合にのみ、遺伝子産物を細胞で産生させるヌクレオチド配列のことである。「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子をコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合すると、実質的に、当該細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列のことである。
【００６７】
用語「過剰発現した」腫瘍抗原、または、当該腫瘍抗原の「過剰発現」とは、その組織または臓器由来の正常細胞での発現レベルに対して、患者の特定の組織または臓器での固形腫瘍などの疾患領域由来の細胞における腫瘍抗原の異常な発現レベルを示す、ことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当該技術分野で公知の標準的なアッセイによって決定することができる。
【００６８】
本明細書で使用する用語「調節する」とは、対象での活性レベル（例えば、対象の応答、または、細胞のタンパク質の発現）の検出可能な増加または減少を媒介することを指す。活性レベルの調節は、処置または化合物の存在下で、または、処置または化合物の非存在下で起こり得る。例として、調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含むＣＡＲで遺伝子操作したＣＡＲ  Ｔ細胞の表面でのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現のレベルを調節することは、小分子／薬物の非存在下でのＣＡＲ発現レベルと比較して、ＲＤＤを安定化する当該小分子／薬物に対して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の曝露を介して、ＣＡＲ発現を増大させることを意味する。同様に、調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を含むＣＡＲで遺伝子操作したＣＡＲ  Ｔ細胞の表面でのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現のレベルを調節することは、小分子／薬物の存在下でのＣＡＲ発現レベルと比較して、ＲＤＤを安定化する当該安定化小分子／薬物の排除を介して、ＣＡＲ発現を抑制させることで可能となる。この用語は、自然のシグナル、または、応答、または、非調節発現を、攪乱し、及び／または、影響を与えることを含み、それにより、対象、好ましくは、ヒトにおける有用な治療応答を媒介する。
【００６９】
免疫原性組成物の「非経口」投与として、例えば、皮下（ｓ．ｃ）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ）、または、胸骨内注射、または、注入技術がある。
【００７０】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書で互換的に使用しており、免疫応答を引き起こすことができる生きている生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及び、それらのトランスジェニック種がある。
【００７１】
抗体に関して本明細書で使用する用語「特異的に結合する」とは、特定の抗原を認識するが、試料に含まれるその他の分子を実質的に認識または結合しない抗体のことを意味する。例えば、ある種の抗原に対して特異的に結合する抗体は、１つ以上の種の抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性それ自体は、抗体の特異的分類を変えることはない。別の例では、抗原に対して特異的に結合する抗体は、当該抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかし、そのような交差反応性それ自体は、抗体の特異的分類を変更しない。一部の事例では、「特異的な結合」または「特異的に結合する」とは、抗体、タンパク質、または、ペプチドと、第２の化学種との相互作用に関して、当該相互作用が、当該化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基、または、エピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体は、タンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合すること、を意味するために使用することができる。抗体が、エピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」と抗体とを含む反応におけるエピトープＡ（または、遊離の非標識Ａ）を含む分子の存在は、当該抗体に結合した標識Ａの量を減らす。
【００７２】
用語「刺激」とは、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）と、その同族リガンドとの結合によって誘導される一次応答のことを意味しており、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達など、これに限定されないシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−γの発現増強、及び／または、細胞骨格構造の再編成など、特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
【００７３】
本明細書で使用する用語「刺激分子」とは、抗原提示細胞に存在する同種の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞での分子のことを意味する。
【００７４】
本明細書で使用する用語「刺激性リガンド」とは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞など）に存在すると、Ｔ細胞にて同族結合パートナー（本明細書で「刺激分子」と称する）と特異的に結合することができ、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖など、これらに限定されないＴ細胞による一次応答を媒介するリガンドのことを意味する。刺激性リガンドは当該技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチド、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及び、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を担持したＭＨＣクラスＩ分子を含む。
【００７５】
本明細書で使用する用語「感作する（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）」及び「感作する（ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）」とは、第１の作用物質の投与を介して作成した動物または動物内の細胞を、第２の作用物質の生物学的効果（例えば、細胞機能の態様の進化または停滞として、細胞分裂、細胞成長、増殖、浸潤、血管新生、壊死、または、アポトーシスなどがあるが、これらに限定されない）に対して、感受性及び応答性を高めることを指す。標的細胞に対する第１の作用物質の感作効果を、当該第１の作用物質の投与を用いて、または、用いずに、第２の作用物質を投与した時に認められる、意図した生物学的効果（例えば、細胞機能の態様の進化または停滞として、細胞成長、増殖、浸潤、血管新生、または、アポトーシスなどがあるが、これらに限定されない）の差異として測定することができる。感作細胞の応答は、当該第１の作用物質の非存在での応答に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、または、少なくとも約５００％は、増大させることができる。
【００７６】
本明細書で使用する用語「がんを有する疑いのある対象」とは、がんであることを示す１つ以上の症状（例えば、顕著なしこり、または、腫瘤）が存在している、あるいは、がんであると（例えば、定期健康診断で）スクリーニングされている対象のことを指す。がんを有する疑いのある対象は、がんを発症する１つ以上のリスク因子を有し得る。がんを有する疑いのある対象は、一般的に、がんの検査を受けていない。しかしながら、「がんを有する疑いのある対象」は、予備診断（例えば、腫瘤を示すＣＴスキャン）を受けたが、確認検査（例えば、生検、及び／または、組織学）が行われていない、または、がんの種類、及び／または、病期が不明な個体を含む。さらに、この用語は、以前にがんに罹患していた者（例えば、寛解状態の個体）を含む。「がんを有する疑いのある対象」は、がんと診断されることもあれば、がんが見つからないこともある。
【００７７】
本明細書で使用する用語「がんと診断した対象」とは、検査を受け、そして、がん細胞を有することが判明した対象のことを指す。がんは、生検、Ｘ線、血液検査など、これらを含むがこれらに限定されない適切な方法を使用して診断し得る。
【００７８】
本明細書で使用する用語「がんのリスクのある対象」とは、特定のがんを発症する１つ以上のリスク因子を有する対象のことを指す。リスク因子として、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露、及び、がんの既往、既存の非がん性疾患、ライフスタイルなどがあるが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書で使用する用語、「対象のがんの特徴決定を行う」とは、対象におけるがん試料の１つ以上の特性の同定のことを指し、同特性として、良性、前がん性、または、がん性組織の存在、及び、がんの病期があるが、これらに限定されない。
【００８０】
詳細な説明
本発明は、ＴＣＲシグナル伝達の一時的な阻害または調節が、ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）表面発現の調節を介して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を予防または逆転させ、そして、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を回復させることができる、という発見に基づいている。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、受容体のクラスター化によって抗原非依存性の持続性シグナル伝達を受け、そして、高レベルのＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び、ＬＡＧ−３発現に示されるように、Ｔ細胞枯渇の基礎生物学を再現して、抗原誘導性サイトカインの産生、及び、過剰なプログラム細胞死を減少させた。ＦＫＢＰ１２不安定化ドメイン（ＤＤ）に融合したＧＤ２．２８ｚ  ＣＡＲ（ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ）が生成され、そして、制御可能なＤＤ（ＲＤＤ）により、ＣＡＲが不安定になり、また、ＣＡＲタンパク質の急速な分解を誘導した（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｃｅｌｌ  ２００６を参照されたい）。表面発現は、トリメトプリムまたは安定化ラパログｓｈｉｅｌｄ−１（Ｓ１）を培地に加える、または、培地から取り除くことで、迅速かつ用量依存的に調節されることが認められた。ＣＡＲに融合したＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨＦＲ変異体（ＧＤ２．２８ｚ．ＤＨＦＲ）を用いて、ＣＡＲ発現の同様の調節可能性をも達成しており、このものは、トリメトプリムで用量依存的に調節した（実施例１及び２、図２、１２〜１３、２２〜２４を参照されたい）。
【００８１】
持続性シグナル伝達は、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ受容体レベルに大きく依存しているため、ＣＡＲ発現レベルの制御を使用して、持続性シグナル伝達のレベルを調節することができる（例えば、インビトロ、または、インビボで）。持続性シグナル伝達は、ＣＡＲ受容体レベルに大きく依存しているため、ＣＡＲ発現レベルの正確な制御も、持続性シグナル伝達のレベルを正確に調節した。したがって、ＣＡＲ発現レベルの薬物調節制御により、ＧＤ２．２８ｚ  ＣＡＲ持続性シグナル伝達の期間と強度の調節が可能となった。このシステムを使用すると、ＣＡＲシグナル伝達が停止すると、枯渇に伴う表現型と機能の変化が逆転した（実施例１及び２を参照されたい）。培養培地からの小分子または薬物の除去（Ｓ１またはトリメトプリム）、及び、結果として、活性化の７日後に表面ＣＡＲを除去すると、標準的な枯渇マーカー発現が、１０日までにコントロールレベルへと逆転した（実施例１、図２を参照されたい）。このことは、機能不全で枯渇したＴ細胞に非常に特異的なＰＤ−１／ＴＩＭ−３／ＬＡＧ−３トリプル発現細胞のレベルを測定することで説明された。１０日目までに、枯渇した細胞の三重発現レベルが増加したが、７日目にＳ１が取り除かれると、１０日目までに、これらのレベルが正常化された。同様の結果を、１４日目に得た（実施例１を参照されたい）。
【００８２】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＣＡＲの表面発現の調節を介して、ＣＡＲ  Ｔ細胞シグナル伝達、及び／または、活性を正確に制御する能力を提供する。例えば、本明細書で詳述する通り（実施例２を参照されたい）、本発明は、安定化薬物の用量を滴定する能力を提供し、その結果、ＣＡＲ発現の急速な抑制をもたらし、これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞シグナル伝達、及び／または、活性を阻害、及び／または、排除する。
【００８３】
したがって、一部の実施形態では、調節可能なＤＤ−ＣＡＲ技術を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の分野が現在直面している幾つかの重要な課題に対処することができる。まず、薬物に応答したＤＤ−ＣＡＲ表面発現の迅速なオン／オフ切り替えは、ＣＡＲ活性の正確な調節を可能にし、それにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞毒性（例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、または、標的抗原を発現している正常細胞まで攻撃する毒性）を緩和する機会を与え、その一方で、毒性に対処できれば、治療を継続する選択肢を残す（実施例２を参照されたい）。次に、安定化薬の非存在下でのＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖は、ＣＡＲ持続性シグナル伝達を妨げ、次いで、これらの細胞の機能的能力を高める（実施例２を参照されたい）。最後に、反復薬物投与を介したインビボでのＤＤ−ＣＡＲ発現の切り替えは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を予防または逆転させ、及び／または、記憶を誘導できる１つの方法であり得る（実施例２を参照されたい）。
【００８４】
したがって、本発明は、ＲＤＤに融合したＣＡＲを発現するように改変したＣＡＲ  Ｔ細胞）（例えば、ＦＫＢＰ  ＲＤＤ、または、ＤＨＦＲ  ＲＤＤ）を提供し、用量、及び、時間依存的に、ＣＡＲ  Ｔ細胞の表面でのＣＡＲ発現を制御する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の表面でのＣＡＲ発現を制御する能力は、未改変のＣＡＲ  Ｔ細胞（すなわち、ＲＤＤドメインに融合したＣＡＲを欠いているＣＡＲ  Ｔ細胞）が、Ｔ細胞の枯渇、または、機能の欠如を示す条件下で、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を維持する能力を実現する。このようにして、本発明の組成物及び方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇、及び、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能性の強化（例えば、がん、または、感染症に対する活性）の予防に用途が認められる。
【００８５】
本発明は、維持した、回復した、または、強化した（例えば、持続した）ＣＡＲ  Ｔ細胞機能のタイプに対して制限がない。実際のところ、ＲＤＤドメインに融合したＣＡＲを発現するように改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物、及び、それを利用する方法は、腫瘍細胞に対する細胞毒性活性；ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存と機能の増進；Ｔ細胞の生存を促進するインターロイキン−２（ＩＬ−２）の発現、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及び／または、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の発現などのサイトカイン発現を誘導して、腫瘍細胞アポトーシスを誘導すること、及び／または、インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマを誘導して、先天性の免疫応答（例えば、がんに対するもの）を活性化すること；及び／または、細胞周期停止、及び／または、アポトーシスの誘導を増強するなど、これらに限定されない、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を維持、回復、または増強するために使用し得る。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、がん細胞を感作して、このような誘導刺激に対して通常は抵抗性を示す細胞などでの細胞周期停止、及び／または、アポトーシスを誘導する。
【００８６】
ＲＤＤドメインに融合したＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、変異体ＦＫＢＰまたはＤＨＦＲ）の修飾は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を誘導する条件に曝したＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を大幅に強化した（例えば、実施例１及び２を参照されたい）。本発明を実施する上でメカニズムの理解は必要ではなく、また、本発明は特定の作用メカニズムに限定されないが、ＣＡＲ  Ｔ細胞表面でのＣＡＲの発現の抑制は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇に関連したＣＡＲ  Ｔ細胞の機能不全を予防する。一部の実施形態では、本発明のＲＤＤを含むＣＡＲを発現するように改変したＴ細胞の使用は、同じＣＡＲを発現するが、ＲＤＤを持たないＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍応答を持続する。
【００８７】
したがって、本発明は、ＲＤＤドメイン（例えば、ＦＫＢＰ１２、または、突然変異体ＤＨＦＲ）に融合したＣＡＲを発現するように改変され、それにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞表面でのＣＡＲ発現のレベルを厳密に調節する能力をもたらすＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞枯渇を減らす組成物及び方法を提供する。本発明は、本発明の改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して処置することができる疾患または病態に対して制限がない。実際のところ、本明細書で提供する組成物及び方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を高めることで治療的利益を提供し得る、あらゆる疾患の処置において有用であり得る。
【００８８】
したがって、本発明は、ＲＤＤドメインに融合したＣＡＲを発現するように改変したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を提供する。本発明は、改変したＣＡＲ  Ｔ細胞のタイプに対して制限がない。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、及び／または、ＣＤ８＋  Ｔ細胞）である。特定の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。その他の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、アルファベータＴ細胞である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、及び、ＣＤ８  Ｔ＋細胞の組み合わせである（例えば、ＣＤ３＋である）。特定の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、記憶Ｔ細胞である。特定の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、アルファベータＴ細胞、及び／または、ガンマデルタＴ細胞の組み合わせである。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、サイトカイン誘導性キラーＴ細胞である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍抗原特異的ＣＡＲを発現するように操作している。別の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、感染症抗原に特異的なＣＡＲを発現するように操作している。一部の実施形態では、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗腫瘍Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該組成物は、医薬として許容される担体（例えば、緩衝剤）をさらに含む。
【００８９】
したがって、ある態様では、本発明は、その他の疾患の中でも、がんを処置するための組成物及び方法を提供する。当該がんは、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発腫瘍または転移性腫瘍とし得る。本発明の組成物及び方法を使用して処置可能なその他の疾患として、ウイルス感染、細菌感染、及び、寄生虫感染、ならびに、自己免疫疾患がある。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作したＴ細胞を提供し、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗腫瘍特性を示す。本発明のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作することができる。本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞で発現すると、抗原結合特異性に基づいて、抗原認識を変更することができる。例示的な抗原は、ＧＤ２であり、これはすなわち、この抗原は、神経芽腫、骨肉腫、及び、一部の肉腫を含む様々ながんで発現するからである（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１６．１１（３）：ｐ．ｅ０１５２１９６；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５．２１（６）：ｐ．５８１−５９０；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６．  ４（１０）：ｐ．８６９−８８０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１０．３６３（１４）：ｐ．１３２４−３４；Ｐｅｒｅｚ  Ｈｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１６．８（９）：ｐ．１０９７−１１７；Ｈｅｃｚｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙを参照されたい）。しかしながら、本発明は、ＧＤ２を標的とする、ことに限定されない。むしろ、本発明は、その同族抗原に結合すると、腫瘍細胞に影響を及ぼして腫瘍細胞が成長しなくなる、死滅するように促され、さもなければ、影響を受けて患者の全身腫瘍組織量を減少または消滅させる、あらゆる抗原結合部分を含む。抗原結合部分は、好ましくは、共刺激分子、ＣＤ３ゼータ鎖、及び、ＲＤＤのうちの１つ以上に由来する細胞内ドメインと融合する。
【００９１】
本発明は、細胞外及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、完全にヒトである。当該細胞外ドメインは、標的特異的結合要素、別名、抗原結合部分を含む。当該細胞内ドメイン、さもなければ、細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域、及び、ゼータ鎖部分を含む。当該共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の当該細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体、または、それらのリガンド以外の細胞表面分子のことである。
【００９２】
当該ＣＡＲの当該細胞外ドメインと当該膜貫通ドメインとの間、または、当該ＣＡＲの当該細胞質ドメインと当該膜貫通ドメインとの間には、スペーサードメインを組み込み得る。本明細書で使用する用語「スペーサードメイン」とは、一般的に、ドメインを（例えば、当該膜貫通ドメインを、当該ポリペプチド鎖の当該細胞外ドメイン、または、当該細胞質ドメインに）結合するように機能する、あらゆるオリゴまたはポリペプチドのことを意味する。スペーサードメインは、最大で３００個のアミノ酸、好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは、２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。
【００９３】
キメラ抗原受容体構築物
本明細書に記載したように、ＲＤＤに融合したＣＡＲを発現するように遺伝子操作した本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的特異的結合要素、別名、抗原結合部分を含むＣＡＲを含み得る。成分の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの種類と数に依存している。例えば、当該抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞での細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択し得る。当該ＣＡＲの抗原部分ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例として、ウイルス、細菌、及び、寄生虫感染、自己免疫疾患、及び、がん細胞に関連するものがある。
【００９４】
本明細書で使用する用語「抗原」とは、抗体またはＴ細胞受容体で結合可能な分子のことを指す。抗原は、体液性免疫応答、及び／または、細胞性免疫応答をさらに誘導して、Ｂ及び／またはＴリンパ球を産生することができる。本発明の実施形態は、免疫原性を低下させるためにヒト化したＣＡＲ（ｈＣＡＲ）など、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸などの核酸、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン、及び／または、ＣＤ３ゼータ）、及び、ＲＤＤドメインに関係している。ヒトＣＡＲ核酸として、ヒト患者の細胞免疫療法を強化するヒト遺伝子を企図している。特定の実施形態では、当該ＣＡＲは、１つ以上の抗原間の共有空間から構成されたエピトープを認識する。一部の実施形態では、当該ＣＡＲは、炭水化物抗原に特異的である。
【００９５】
一般的に、非ヒト抗原結合領域を、キメラ抗原受容体の構築に使用する。しかしながら、マウスモノクローナル抗体などの非ヒト抗原結合領域の使用に伴う潜在的な問題は、ヒトエフェクター機能の欠如である。さらに、非ヒトモノクローナル抗体を、外来タンパク質として、ヒト宿主は認識することができるので、そのような外来抗体の反復注射は、有害な過敏症反応を招く免疫応答の誘導をもたらすことになり得る。マウスをベースとしたモノクローナル抗体では、大抵の場合、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と称する。したがって、一部の実施形態では、（例えば、強いＨＡＭＡ応答を引き起こさないので）ヒト抗体の抗原結合領域を使用する。一部の実施形態では、当該抗原結合ドメインを、キメラ（すなわち、ヒト／マウスキメラ）、または、ヒト化して、そのような免疫原性を最小限にし得る。しかしながら、その他の実施形態では、マウス抗体の抗原結合領域を使用する。
【００９６】
一部の実施形態では、当該ＣＡＲは、ａ）抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）ＲＤＤを含む。例えば、一部の実施形態では、当該ＣＡＲは、抗ＧＤ２抗原結合ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、及び／または、４−１ＢＢ刺激ドメイン、及び、ＲＤＤ（例えば、ＤＨＦＲまたはＦＫＢＰ  ＤＤ）を含む。本明細書で詳述するように、ＲＤＤを含む数多くの異なるＣＡＲ、及び、それを使用する方法を可能にする。ある実施形態では、当該ＣＡＲは、ａ）配列番号４４を含む抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）配列番号４８を含む膜貫通ドメイン、ｃ）配列番号５０及び／または配列番号５２を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）配列番号５４を含むＲＤＤを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ａ）配列番号６０を含む抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）配列番号６４を含む膜貫通ドメイン、ｃ）配列番号６６及び／または配列番号６８を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）配列番号：７０を含むＲＤＤを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ａ）配列番号７６を含む抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）配列番号８０を含む膜貫通ドメイン、ｃ）配列番号８２及び／または配列番号８４を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）配列番号８６を含むＲＤＤを含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、ａ）配列番号９２を含む抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）配列番号９６を含む膜貫通ドメイン、ｃ）配列番号９８及び／または配列番号１００を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）配列番号１０２を含むＲＤＤを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ａ）配列番号１０８を含む抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）配列番号１１２を含む膜貫通ドメイン、ｃ）配列番号１１４及び／または配列番号１１６を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）配列番号１１８を含むＲＤＤを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ａ）配列番号１２４を含む抗原結合領域を含む細胞外ドメイン、ｂ）配列番号１３０を含む膜貫通ドメイン、ｃ）配列番号１３２及び／または配列番号１３４を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、及び、ｄ）配列番号１３６を含むＲＤＤを含む。
【００９７】
抗原結合領域
特定の実施形態では、当該結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、モノクローナル抗体の可変領域、及び／または、その抗原結合断片を含む。ＣＤＲは、抗原を補完する抗原受容体（例えば、免疫グロブリン、及び、Ｔ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに認められる短いアミノ酸配列であり、したがって、その特定の抗原に対する特異性を受容体に付与する。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３）を含む。一般的に、当該抗原受容体は、２つのポリペプチド鎖で構成されており、各重鎖及び軽鎖には３つのＣＤＲが含まれているので、抗原と接触することができる各抗原受容体（例えば、抗体またはＴＣＲ）には６つのＣＤＲがある。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体に関連するほとんどの配列変異はＣＤＲに認められるので、これらの領域を、超可変ドメインとも称する。
【００９８】
ＣＡＲは、腫瘍細胞での抗原に対して特異的に結合する所望の抗原結合部分を操作することで、目的の腫瘍抗原を標的とするように操作し得る。本明細書で使用する「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」または「がん抗原」とは、がんなどの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原のことを指す。本明細書で言及する例示的な抗原を、例として含む。これらの例を、排他的なものとする意図はなく、また、当業者であれば、さらなる例は自明である。
【００９９】
腫瘍抗原は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を引き起こす腫瘍細胞によって産生される部分（例えば、タンパク質、炭水化物など）である。したがって、抗原結合部分は、処置を受ける特定の種類のがんに基づいて選択することができる。腫瘍抗原は、当該技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン、及び、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、メソテリン、及び、本明細書に記載した、または、当該技術分野で公知のその他の腫瘍抗原がある。
【０１００】
腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原性がん抗原／エピトープを含み得る。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得る数多くのタンパク質を発現する。これらの分子として、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ−１）、メラノーマのチロシナーゼ及びＧＰ１００、ならびに、前立腺癌の前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異的抗原があるが、これらに限定されない。その他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子のグループに属する。標的抗原のさらに別のグループは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、当該腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有の真の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及び、ＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫の標的抗原のその他の候補である。
【０１０１】
また、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、または、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とし得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有のものであり、また、身体内のその他の細胞では発生しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に固有のものではなく、代わりに、当該抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で、幾つかの正常細胞に発現する。当該腫瘍での当該抗原の発現は、当該免疫系を当該抗原に反応可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡを、当該免疫系が未熟で応答すらできない発育過程の胎児での正常細胞に発現する抗原とし得る、または、正常細胞では通常は非常に低レベルで存在するが、腫瘍細胞では遙かに高レベルで発現する抗原とし得る。
【０１０２】
ＴＳＡまたはＴＡＡの例として、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、及び、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５などの腫瘍特異的多系統抗原などの分化抗原；ＣＥＡなどの過剰発現胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどの過剰発現がん遺伝子、及び、変異腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因するユニークな腫瘍抗原；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；及び、エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡ、及び、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７などのウイルス抗原などがあるが、これらに限定されない。その他の大きなタンパク質をベースとした抗原として、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐｌ  ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ２７．２９１＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及び、ＴＰＳがある。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＨＡ−１、サバイビン、ＷＴ１、及び、ｐ５３などの細胞内腫瘍関連抗原を標的とする。このことは、ＨＬＡの関連で細胞内腫瘍関連抗原に由来する加工したペプチドを認識するＴ細胞で発現するＣＡＲにより達成することができる。
【０１０４】
標的とする所望の抗原に応じて、ＣＡＲは、所望の抗原標的に特異的な適切な抗原結合部分を含むように操作することができる。例えば、ＧＤ２が標的とする所望の抗原である場合、ＧＤ２の抗体（例えば、１４Ｇ２ａ、ｃｈｌ４．１８、ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、ｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ＨＭ３Ｆ８、ＵＮＩＴＵＸＩＮ、ＤＭＡｂ−２０、または、ＧＤ２に対して特異的に結合するその他のあらゆる抗体）を、本発明のＣＡＲに組み込むための抗原結合部分として使用することができる。
【０１０５】
一部の実施形態では、当該抗原は、病原体特異的抗原である。本発明は、病原体特異的抗原の種類に対して制限がない。病原体特異的抗原は、真菌、細菌、または、ウイルスを含むあらゆる病原体に由来し得るものであるが、これらに限定されない。例示的なウイルス病原体として、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶ科のウイルス、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、及び、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅの科にあるウイルス病原体がある。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、及び、風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌として、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、及び、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓがある。例示的な病原性細菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、及び、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａがある。ある実施形態では、病原体受容体Ｄｅｃｔｉｎ−１を使用して、真菌の細胞壁の炭水化物構造を認識するＣＡＲを生成する。Ｄｅｃｔｉｎ−１の特異性に基づいてＣＡＲを発現するように遺伝子改変したＴ細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを認識して、菌糸の成長を標的にする（例えば、阻害する）。別の実施形態では、ウイルス決定因子（例えば、ＣＭＶ、または、エボラ由来の糖タンパク質）を認識する抗体に基づいてＣＡＲを作成して、ウイルス感染と病状を妨げる。
【０１０６】
一部の実施形態では、本発明は、全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡ、または、コード領域を含む。当該抗原結合領域またはドメインは、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の内容を援用する、米国特許第７，１０９，３０４号；第８，８２２，１９６号；第９，８６８，７７４号；第９，７９０，２８２号；第９，７６５，３４２号；第９，６２４，３０６号；第９，５２２，９１５号；第９，３５９，４４７号；第９，８４５，３６２号；第９，８１５，９０１号；第９，７７７，０６１号；第９，５９８，４８９号；第９，３９４，３６８号；第９，４４６，１０５号；及び、第９，３３４，３３０号に記載されたような特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖の断片を含むことができる。また、当該断片を、ヒト抗原特異的抗体のあらゆる個数の異なる抗原結合ドメインとし得る。より具体的な実施形態では、当該断片は、ヒト細胞での発現のためのヒトコドン使用のために最適化した配列によってコードした抗原特異的ｓｃＦｖである。
【０１０７】
当該抗体を、ダイアボディまたはマルチマーなどの多量体とすることができる。これらのマルチマーは、軽鎖と重鎖の可変部分を、ダイアボディと称する箇所で交差してペアリングして形成できる（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９６  Ｍａｒ；９（３）：２９９−３０５を参照されたい）。当該構築物のヒンジ部分は、全体が削除されることから、最初のシステインを維持すること、セリンではなくプロリンを置換すること、最初のシステインまで切断をすること、などの複数の選択肢を持つことができる。当該Ｆｃ部分は削除できる。安定化、及び／または、二量体化するあらゆるタンパク質は、この目的に向けて役目を果たすことができる（例えば、Ｆｃドメインのいずれか一方、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかを使用できる）。二量体化を改善するために修飾したヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域も使用することができる。
【０１０８】
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原に結合するあらゆるドメインとすることができ、同ドメインとして、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び、それらの断片があるが、これらに限定されない。一部の事例では、当該抗原結合ドメインにとって、当該ＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用については、当該ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒト抗体またはその断片を含むことが有益であり得る。したがって、ある実施形態では、当該抗原結合ドメイン部分は、ヒト抗体またはその断片を含む。
【０１０９】
ヒトでの抗体のインビボでの使用については、好ましくは、ヒト抗体を使用し得る。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置において特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法、ならびに、これらの技術の改良を含む、当該技術分野で公知の様々な方法で作製することができる。本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、米国特許第４，４４４，８８７号、及び、第４，７１６，１１１号；及び、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、及び、ＷＯ９１／１０７４１も参照されたい。また、重鎖及び軽鎖がヒトＤＮＡの１つ以上の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードした抗体を、ヒト抗体とすることができる。
【０１１０】
機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗体を産生することもできる。例えば、当該ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または、相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入し得る。あるいは、当該ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、当該ヒト可変領域、定常領域、及び、多様性領域を、マウス胚性幹細胞に導入し得る。当該マウスの重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別個に、または、同時に機能しないようになり得る。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらす、との説明がされている。改変した胚性幹細胞を増殖して、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを作出する。次に、当該キメラマウスを交配して、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を作出する。当該トランスジェニックマウスを、選択した抗原で通常の方法で免疫処置する。腫瘍抗原に対する抗腫瘍抗原抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫処置したトランスジェニックマウスから取得することができる。当該トランスジェニックマウスが保有する当該ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配置し、その後に、クラススイッチと体細胞変異を受ける。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な説明、及び、そのような抗体を産生するためのプロトコルは、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９８／２４８９３号、ＷＯ  ９６／３４０９６、及び、ＷＯ  ９６／３３７３５；及び、米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；及び、第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、及び、Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）などの企業は、上記したものと同様の技術を使用して、選択した抗原に対するヒト抗体の提供に寄与することができる。抗原接種時にヒト抗体の産生をもたらす生殖細胞系突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入の具体的な説明については、例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：３３（１９９３）；及び、Ｄｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。
【０１１１】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから誘導することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９（１９９６））。ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、免疫処置していないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロで、ヒト抗体及び抗体断片を生成できる。この技術では、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状性バクテリオファージの主要な、または、主要でないコートタンパク質遺伝子のインフレームにてクローン化し、そして、ファージ粒子の表面に機能的な抗体断片として表示される。当該糸状性粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、当該抗体の機能特性に基づいた選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択にもつながる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で実行することができる；それらの評価については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源は、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫処置をしていないマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムなコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置をしていないヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、そして、本質的に、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、または、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載された技術に従って、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。また、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、米国特許第５，５６５，３３２号、及び、第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０１１２】
ヒト抗体は、インビトロで活性化したＢ細胞でも産生し得る（本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、米国特許第５，５６７，６１０号、及び、第５，２２９，２７５号を参照されたい）。また、ヒト抗体は、Ｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：１４０−１６７（１９８６））に記載されているものなど、これに限定されない、ハイブリドーマ技術を用いてインビトロでも産生し得る。
【０１１３】
あるいは、一部の実施形態では、非ヒト抗体を、ヒト化して、当該抗体の特定の配列または領域を、ヒトで自然に産生される抗体との類似性を高めるために修飾する。ある実施形態では、当該抗原結合ドメイン部分を、ヒト化する。
【０１１４】
ヒト化抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて生成することができ、同技術として、ＣＤＲ移植（例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、欧州特許第ＥＰ  ２３９，４００号；国際公開公報第ＷＯ  ９１／０９９６７号；及び、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、及び、第５，５８５，０８９号を参照されたい）、ベニアリングまたはリサーフェシング（例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、欧州特許第ＥＰ  ５９２，１０６号、及び、第ＥＰ  ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，  １９９１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；及び、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＰＮＡＳ，  ９１：９６９−９７３を参照されたい）、鎖シャッフリング（例えば、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）、及び、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開公報第ＷＯ  ９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６９：１１１９−２５（２００２），  Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  １３（５）：３５３−６０（２０００），  Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０（３）：２６７−７９（２０００），  Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７），  Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  ９（１０）：８９５−９０４（１９９６），  Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５），  Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５（８）：１７１７−２２（１９９５），  Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，  Ｇｅｎｅ，  １５０（２）：４０９−１０（１９９４）、及び、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２３５（３）：９５９−７３（１９９４）に開示された手法があるが、これらに限定されない。多くの場合、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変更するため、好ましくは、改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリングと、特定の位置にある異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較で同定する（例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，５８５，０８９号；及び、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８���，  Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい）。
【０１１５】
ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から、そこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、一般的には、「インポート」可変ドメインから取得する。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の１つ以上のＣＤＲ、及び、ヒト由来のフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は、当該技術分野において周知であり、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列を、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列へと置換すること、すなわち、ＣＤＲ移植（本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の全内容を援用する、ＥＰ  ２３９，４００；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ  ９１／０９９６７号；及び、米国特許第４，８１６，５６７号；第６，３３１，４１５号；第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第６，５４８，６４０号）によって行うことができる。そのようなヒト化キメラ抗体では、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインを、非ヒト種由来の対応する配列で置換する。実際のところ、ヒト化抗体は、一般的には、一部のＣＤＲ残基、及び、おそらくは一部のフレームワーク（ＦＲ）残基が、齧歯動物抗体における類似部位由来の残基で置換したヒト抗体である。また、抗体のヒト化を、ベニアリングもしくはリサーフェシング（ＥＰ  ５９２，１０６号；ＥＰ  ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，  １９９１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；及び、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ９１：９６９−９７３（１９９４））、または、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）によって達成することができ、そして、これらの全内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１１６】
一部の事例では、ヒトｓｃＦｖも、酵母ディスプレイライブラリーに由来し得る。
【０１１７】
ヒト化抗体を作製する上で用いられる、軽鎖および重鎖の双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させることを目的とする。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。続いて、齧歯動物のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  １９６：９０１（１９８７）、本明細書の一部を構成するものとして、これらの全内容を援用する）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に用いることができる（（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１：２６２３（１９９３）、本明細書の一部を構成するものとして、これらの全内容を援用する）。
【０１１８】
抗体は、標的抗原に対する高い親和性、及び、その他の有利な生物学的特性を保ったままでヒト化することができる。本発明のある態様では、親配列、及び、ヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列、及び、様々な概念上のヒト化産物の分析の過程で、ヒト化抗体を調製する。免疫グロブリンの三次元モデルは一般的に入手可能であり、そして、当業者に周知のものである。選択した候補免疫グロブリン配列に関して可能性のある三次元立体構造を図示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を検討することで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考え得る役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンが、標的抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、当該標的抗原に対する親和性の増大といった所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択して、組み合わせることができる。一般的に、当該ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに、直接的かつ最も実質的に関与している。
【０１１９】
「ヒト化」抗体は、当初の抗体と同様の抗原特異性、すなわち、本発明では、ヒトＧＤ２に結合する能力を保持している。しかしながら、特定のヒト化方法を用いると、ヒトＧＤ２に対する抗体の結合の親和性、及び／または、特異性を、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２９４：１５１（１９９９）に記載された「定方向進化」の方法を用いて、高めることができる。
【０１２０】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合部の部分は、ＧＤ２を標的とする。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合部の部分は、完全ヒト抗ＧＤ２  ｓｃＦＶである。一部の実施形態では、抗ＧＤ２  ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号４３に記載の配列を含む。ある実施形態では、抗ＧＤ２  ｓｃＦＶは、配列番号４４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗ＧＤ２  ｓｃＦＶ部分は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、抗ＧＤ２  ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号８７に記載の配列を含む。ある実施形態では、抗ＧＤ２  ｓｃＦＶは、配列番号８８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗ＧＤ２  ｓｃＦＶ部分は、配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
その他の態様では、本発明のＣＡＲの抗原結合部の部分は、Ｈｅｒ２を標的とする。一部の実施形態では、抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号１２３に記載の配列を含む。ある実施形態では、抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦＶは、配列番号１２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦＶ部分は、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
その他の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合部の部分は、ＣＤ１９を標的とする。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号１１に記載の配列を含む。ある実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶは、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ部分は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、当該ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むようにデザインすることができる。ある実施形態では、当該ＣＡＲにおけるドメインの１つと自然に関連する膜貫通ドメインを使用する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換で選択または修飾して、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体のその他のメンバーとの相互作用を最小限に抑える。
【０１２４】
膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源のいずれかに由来し得る。当該供給源が天然の場合、当該ドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明で特定の用途が認められる膜貫通領域として、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、または、ＣＤ１５４のアルファまたはベータ鎖に由来する（すなわち、少なくとも、その膜貫通領域（複数可）を含む）膜貫通領域があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジなど、様々なヒトヒンジを使用することができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、当該膜貫通ドメインは合成物であり、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。一部の実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及び、バリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に認められる。任意に、好ましくは、２〜１０個の間のアミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、当該ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成する。
【０１２６】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。ある実施形態では、当該ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５の核酸配列を含む。ある実施形態では、当該ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、当該ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、ＣＤ２８ヒンジ領域は、当該ＣＡＲのＣＤ２８膜貫通ドメインに付着している。ある実施形態では、当該ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１３の核酸配列を含む。ある実施形態では、当該ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、当該ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
細胞内または細胞質ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が配置されているＴ細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」とは、分化細胞の特殊な機能のことを指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、または、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性とし得る。ナイーブ、記憶、または、記憶型Ｔ細胞のエフェクター機能は、抗原依存性増殖を含む。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、そして、特殊な機能を実行するように当該細胞に指示するタンパク質の部分のことを指す。通常であれば、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用するが、大抵の場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインから切り取った部分が使用できる限りは、そのような切り取った部分は、エフェクター機能シグナルを依然として伝達する限りは、インタクトな鎖の代わりに使用し得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインから切り取った部分を含む、ことを意味する。
【０１２９】
細胞内シグナル伝達ドメインの例として、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び、抗原受容体の関与に続いてシグナル伝達を開始するように協同して作用する共受容体の細胞質配列、ならびに、これらの配列、及び、同じ機能性能を有する合成配列のあらゆる誘導体または変異体があるが、これらに限定されない。ＴＣＲのみを介して生成するシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、また、二次または共刺激シグナルも必要である、ことが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲ（一次細胞質シグナル伝達配列）を介して抗原依存性の一次活性化を開始する配列と、二次または共刺激シグナル（二次細胞質シグナル伝達配列）を提供する抗原非依存的に作用する配列とを媒介することができる。
【０１３０】
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的方法、または、阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列として、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、または、ＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０１３１】
本発明で特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例として、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及び、ＣＤ６６ｄに由来するものを含む。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲでの当該細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
【０１３２】
当該ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含むように、または、本発明のＣＡＲとの関連で有用なあらゆるその他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせてデザインすることができる。例えば、当該ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分と、共刺激シグナル伝達領域またはドメインとを含むことができる。当該共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む当該ＣＡＲの一部のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体、または、それらのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ８３−Ｈ３、ＣＤ８３に対して特異的に結合するリガンドなどがある。一部の実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲは、共刺激シグナル伝達要素としてＣＤ２８または４−１ＢＢと組み合わせたＩＴＡＭ含有ＣＤ３−ゼータドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲは、少なくとも１つのその他の共刺激ドメインと組み合わせて、ＩＴＡＭ含有ＣＤ３−ゼータドメインを含み、そして、それらは本発明の範囲内である。
【０１３３】
細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータ、または、あらゆるその相同体（例えば、イータ、デルタ、ガンマ、または、イプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ  ＲＩＩＩ、Ｆｃ  ＲＩ、及び、ＣＤ３−ゼータやＣＤ２８などのシグナル伝達分子の組み合わせ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、及び、これらの組み合わせを含み得る。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩなど、活性化タンパク質ファミリーのその他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用することができる（これらの代替膜貫通及び細胞内ドメインを使用したｃＴＣＲの開示に関する、Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｓｔａｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、及び、Ｈｅｋｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）を参照されたい）。
【０１３４】
本発明のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、あらゆる順序で互いに連結し得る。任意に、好ましくは２〜１０個のアミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。この抗原特異的細胞外ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＩｇＧ４ＦＣヒンジ及びＦｃ領域などの膜貫通ドメインによって結合し得る。代替手段として、当該ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、当該ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、当該ヒトＣＤ３−ゼータ膜貫通ドメイン、または、システイン変異ヒトＣＤ３−ゼータ膜貫通、または、ＣＤ１６及びＣＤ８などのその他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質由来のその他の膜貫通ドメイン、及び、エリスロポエチン受容体がある。
【０１３５】
一部の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体複合体のあらゆる部分を、当該細胞内ドメインで利用する。１つまたは複数の細胞質ドメインを使用することで、いわゆる第三世代ＣＡＲは、例えば、相加効果または相乗効果のために互いに融合した少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有し得る。
【０１３６】
ある実施形態では、当該細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含む。別の実施形態では、当該細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインと、４−１ＢＢ、及び／または、ＯＸ−４０のシグナル伝達ドメインとを含む。
【０１３７】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインとを含み、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号１７に記載の核酸配列を含み、かつ、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１９に記載の核酸配列を含む。ある実施形態では、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
調節可能な不安定化ドメイン
本発明のＣＡＲの調節可能な不安定化ドメイン（ＲＤＤ）を、時間、及び／または、用量依存的にＴ細胞の表面でのＣＡＲの発現を調節する（例えば、抑制させる）ために利用する。このようにして、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を、予防／阻害し、または、逆転して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能の維持、回復、または、強化（例えば、持続したエフェクター機能）をもたらすことができる。
【０１３９】
例えば、一部の実施形態では、ＲＤＤを含むＣＡＲを発現するように遺伝子操作した（例えば、ＣＡＲに融合した）ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ユビキチン媒介分解についてＣＡＲをマークし、その結果、ＲＤＤに結合する安定化小分子の存在下で、ＣＡＲの分解を予防し、そして、ＲＤＤに結合する安定化小分子の除去または非存在が、ＣＡＲの分解を招く。一部の実施形態では、ＣＡＲに対するＲＤＤの融合を介したＣＡＲタンパク質レベル、及び、ＣＡＲ表面発現の調節は、持続的なＣＡＲシグナル伝達に起因するＴ細胞枯渇の特徴が既に明確となったＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を逆転する。例えば、安定化小分子に曝されているＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｔ細胞枯渇の表現型と機能面の特徴のすべてを実証している。しかしながら、安定化小分子を除去し、かつ、ＣＡＲタンパク質レベルがタンパク質分解を受けて低下すると、Ｔ細胞枯渇の表現型、及び、機能指標が逆転し、そして、Ｔ細胞機能は回復する。
【０１４０】
本発明は、特定のＲＤＤに対して制限がない。実際のところ、あらゆるＲＤＤ、すなわち、同族の小分子の存在によって当該ＲＤＤが安定化されないと、迅速なＣＡＲタンパク質分解が起こるようにＣＡＲを不安定にし、ＣＡＲにおけるその構造または存在が、ＣＡＲ機能を撹乱をもしないＲＤＤを本発明で使用し得る。ＲＤＤの例として、本明細書でＦＫＢＰ  ＤＤと称するＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に由来するＲＤＤ（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００６を参照されたい）があるが、これに限定されない。ＦＫＢＰ  ＲＤＤを含むＣＡＲの表面発現は、安定化ラパログｓｈｉｅｌｄ−１（Ｓ１）を、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対して、または、ＦＫＢＰ  ＤＤを含むＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した生物に対して添加をする、または、そこから取り去ることで、迅速かつ用量依存的に制御できる。ＲＤＤの別の例として、本明細書でＤＨＦＲ  ＤＤと称しており、安定化小分子薬トリメトプリムで迅速かつ用量依存的に調節できる、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に由来するものがあるが、これに限定されない。本明細書に記載したように、一部の実施形態では、ＣＡＲ発現は、臨床的に確立されており、かつ、十分に許容される用量のトリメトプリムを使用して、インビボで達成されている（Ｋｒｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７４  Ｆｅｂ−Ｍａｒ；１４（２）：１１２−７を参照されたい）。例えば、トリメトプリムで制御したＤＨＦＲ  ＲＤＤを含むＣＡＲの最大発現は、約５００ｎＭのトリメトプリムで発生しており、当該化合物のＥＣ５０である５０ｎＭの範囲内である。これは、１日２回、１６０ｍｇを摂取した場合のトリメトプリムの平均定常状態血漿濃度（１．７２μｇ／ｍＬ、約６μΜ）の範囲内である。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現は、臨床的に確立したトリメトプリムの用量を下回る用量を使用して、インビボで達成する。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＤＨＦＲ  ＤＤは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨＦＲに由来する。一部の実施形態では、当該ＤＨＦＲ  ＤＤは、ヒトＤＨＦＲに由来する。同様に、本発明は、使用するＲＤＤのタイプに対して制限がない。例えば、ＤＨＦＲドメイン、及び、それに付着したタンパク質の不安定化を達成する突然変異を含む、あらゆるＤＨＦＲを使用し得る。例えば、あらゆるＲＤＤ（ＤＨＦＲまたはＦＫＢＰ  ＤＤ）、すなわち、例えば、トリメトプリムまたはＳ１を使用しても、当該ＲＤＤが安定化されないと、迅速なタンパク質分解を招く不安定性／不安定化をもたらし、ＣＡＲにおけるその構造または存在が、ＣＡＲエフェクター機能を攪乱をもしない当該ＲＤＤを使用することができる。一部の実施形態では、配列番号６の、アミノ酸１２及び１００に変異を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨＦＲ  ＤＤを使用する。
【０１４２】
本発明は、ＣＡＲにおけるＲＤＤの位置に対して制限がない。例えば、一部の実施形態では、ＲＤＤは、当該ＣＡＲのＮ末端またはＣ末端に融合（例えば、遺伝子操作して結合）している。ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞内成分に融合した、当該ＣＡＲの細胞外成分に融合した、または、ヒンジまたは膜貫通領域に融合したＲＤＤで発現することができる。当該ＣＡＲの細胞内成分の例として、共刺激ドメイン、または、ＣＤ３−ゼータドメインがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、当該細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータドメインである。
【０１４３】
当該ＣＡＲの細胞内成分（例えば、ＣＤ３−ゼータ）は、ランダムな順序、または、指定した順序で、ＲＤＤに結合する。任意に、好ましくは、２〜１０個のアミノ酸の長さの短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、結合を形成し得る。
【０１４４】
ＣＡＲ発現ベクターと遺伝子操作したＴ細胞
本発明は、ＣＡＲの配列を含むＤＮＡ構築物を含み、当該配列は、ＲＤＤの核酸配列に作動可能に結合した細胞内ドメインの核酸配列に作動可能に結合した抗原結合部分（例えば、腫瘍抗原結合ドメイン、または、病原体抗原結合ドメイン）の核酸配列を含む。本発明のＣＡＲで使用できる細胞内ドメインの例として、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８などの細胞内ドメインがあるが、これらに限定されない。一部の事例では、当該ＣＡＲを、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどのあらゆる組み合わせを含むことができる。本発明のＣＡＲで使用できるＤＤの例として、ＤＨＦＲ  ＤＤ及びＦＫＢＰ  ＤＤがあるが、これらに限定されない。
【０１４５】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲは、抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ２８ヒンジ、及び、膜貫通ドメイン、ならびに、ＣＤ２８及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、当該抗ＧＤ２  ｓｃＦｖは、完全にヒトである。ある実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号７に記載の核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号２３に記載の核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号３９に記載の核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
さらにその他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号５５に記載の核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号５６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
さらにその他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号７１に記載の核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号７２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号８７に記載の核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号８８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号１０３に記載の核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号１０４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号１１９に記載の核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号１２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。その他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、本発明は、ＲＤＤに融合したＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ単離した核酸セグメント、及び、発現カセットを提供する。本発明のベクターは、主に、調節した真核生物プロモーター、例えば、ＥＦｌαプロモーターＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、または、ユビキチンプロモーターの制御下で、免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞に所望の遺伝子を送達するようにデザインする。また、その他の理由がない限り、それらのベクターは、選択マーカーを含んでおり、インビトロでの操作を容易にし得る。その他の実施形態では、当該ＣＡＲは、ＤＮＡテンプレートからインビトロで転写したｍＲＮＡから発現することができる。
【０１５４】
ＲＤＤに融合したＣＡＲ分子は、組換え体であり、そして、抗原に結合し、細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを伝達する、という双方の能力で区別される。抗原結合部分（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成したもの）を利用するＣＡＲ構築物は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質が提示した抗原を必要としないという点でＨＬＡに依存しておらず、むしろ、ＨＬＡに依存しない方法で標的細胞表面の天然抗原に結合する、というさらなる利点をもたらす。
【０１５５】
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、同配列を含むことが公知であるベクターから遺伝子を誘導すること、または、標準技術を使用して、同配列を含む細胞及び組織から直接に単離することで、取得することができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローン化するのではなく、合成的に生成することができる。
【０１５６】
また、本発明は、本発明のＤＮＡを挿入したベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した組み込みと、娘細胞でのその増殖が可能であるため、長期の遺伝子導入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりもさらなる利点を有する。また、免疫原性が低い、という利点もある。別の実施形態では、当該所望のＣＡＲは、トランスポンソンによって、それらの細胞内で発現し得る。
【０１５７】
ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般的には、ＣＡＲポリペプチド、または、その部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に結合し、そして、当該構築物を発現ベクターに組み込むことで達成する。これらのベクターは、複製及び真核生物への組込に適し得る。一般的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び、プロモーターを含む。
【０１５８】
また、本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫処置と遺伝子療法に使用し得る。遺伝子送達の方法は、当該技術分野において公知である。例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の内容を援用する、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
【０１５９】
核酸は、数多くのタイプのベクターにクローン化することができる。例えば、当該核酸は、ベクターにクローン化することができ、同ベクターとして、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及び、コスミドがあるが、これらに限定されない。特に関心のあるベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び、配列決定ベクターがある。
【０１６０】
さらに、当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供し得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびに、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列、使い勝手の良い制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択可能なマーカーを含む（例えば、ＷＯ  ０１／９６５８４；ＷＯ  ０１／２９０５８；及び、米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０１６１】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、数多くのウイルスをベースとしたシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子は、当該技術分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入され、そして、レトロウイルス粒子に格納することができる。次いで、組換えウイルスを単離し、そして、インビボまたはエクスビボのいずれかで、当該対象の細胞に送達することができる。数多くのレトロウイルスシステムが、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。その他の実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。数多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で公知である。
【０１６２】
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーを使用して、転写開始の頻度を調節することができる。一般的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近になって、数多くのプロモーターが、当該開始部位の下流にも機能的要素を含んでいることが明らかにされている。プロモーター要素間の間隔は頻繁に変化するので、要素が互いに反転または移動しても、プロモーター機能は維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーター要素間の間隔を５０ｂｐにまで広げることができる。個々の要素は、転写を活性化するために、協働的に、または、独立して機能する。
【０１６３】
一部の実施形態では、当該ベクターは、プロモーターを含む。一部の実施形態では、当該プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、当該構成的プロモーターは、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列を含む。このプロモーター配列は、そこに作動可能に結合したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。一部の実施形態では、当該構成的プロモーターを、真核生物翻訳伸長因子−１アルファプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、当該構成的プロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、及び、ラウス肉腫ウイルスのプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、当該構成的プロモーターを、アクチンＩプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及び、クレアチンキナーゼプロモーターからなる群から選択する。一部の実施形態では、当該プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に、作動可能に結合したポリヌクレオチド配列の発現をオンにする、または、発現が望まれない場合に発現をオフにする、ことができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例として、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及び、テトラサイクリンプロモーターがあるが、これらに限定されない。
【０１６４】
ＣＡＲポリペプチド、または、その一部分の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクターに、選択可能なマーカー遺伝子、または、レポーター遺伝子、または、その双方を取り込ませて、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとした細胞の集団から、発現細胞の同定及び選択を促すことができる。その他の態様において、当該選択可能なマーカーを、ＤＮＡの別個の断片に保持させ、そして、同時トランスフェクション手順で使用し得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の双方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列を隣接させ得る。有用な選択可能なマーカーとして、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子がある。
【０１６５】
レポーター遺伝子を、潜在的にトランスフェクトした細胞を特定するために、また、調節配列の機能を評価するために使用する。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せず、または、それらによって発現されない遺伝子であり、その発現が、幾つかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後の適切な時間にアッセイする。適切なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または、緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適切な発現系は周知であり、それらは、公知の技術を使用して調製し、あるいは、市販品から入手し得る。一般的に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を持つ当該構築物を、プロモーターとして同定する。そのようなプロモーター領域を、レポーター遺伝子に連結し、そして、プロモーター駆動転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用し得る。
【０１６６】
遺伝子を細胞に導入及び発現させる方法は、当該技術分野で公知である。発現ベクターに関連して、当該ベクターは、当該技術分野でのあらゆる方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または、昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、当該発現ベクターは、物理的、化学的、または、生物学的手段によって、宿主細胞に導入することができる。
【０１６７】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどがある。ベクター、及び／または、外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムのトランスフェクションである。
【０１６８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段として、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散システム、及び、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及び、リポソームを含む脂質をベースとしたシステムがある。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するためのコロイド系の例として、リポソーム（例えば、人工膜小胞）がある。
【０１６９】
非ウイルス性送達システムを利用する事例では、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤の使用を、核酸の宿主細胞への（インビトロ、エクスビボ、または、インビボでの）導入のために企図している。別の態様では、当該核酸は、脂質と会合し得る。脂質が会合した核酸を、リポソームの水性内部にカプセル化し、リポソームの脂質二重層内に散在させ、リポソームとオリゴヌクレオチドの双方に会合する連結分子を介してリポソームに付着させ、リポソームに閉じ込め、リポソームと複合体化させ、脂質を含有する溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と組み合わせ、脂質を含む懸濁液として含有させ、ミセルを含有させ、または、ミセルと複合体化させ、または、脂質と関連させ得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または、脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液内の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして、または、「崩壊した」構造を備えた二層構造で存在し得る。また、それらは、単に溶液にて点在し得るものであり、大きさまたは形状が均一ではない凝集体を形成している可能性がある。脂質は、天然または合成の脂質とし得る脂肪物質である。例えば、脂質として、細胞質に自然に存在している脂肪滴、ならびに、脂肪酸、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類、及び、アルデヒド類などの長鎖脂肪族炭化水素、及び、その誘導体を含む化合物のクラスがある。
【０１７０】
使用に適した脂質は、市販品から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手することができる；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手することができる；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができる；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、及び、その他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から入手することができる。「リポソーム」とは、封入した脂質二重層または凝集体の生成によって形成した、様々な単一、及び、多重脂質ビヒクルを含む総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体とを備えた小胞構造を有する、ことを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離した複数の脂質層を有する。リン脂質を過剰な水溶液に懸濁すると、それらは自然に形成する。それらの脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再配列を起こし、そして、脂質二重層の間に水と溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる溶液構造を有する組成物も含まれる。例えば、それらの脂質は、ミセル構造のものとなるか、あるいは、脂質分子の不均一な凝集体として単に存在し得ることとなる。リポフェクタミン−核酸複合体も企図している。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物をコードする核酸を、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用して細胞に送達する。担体として形質導入細胞を使用して、または、カプセル化した、結合した、または、裸のベクターの無細胞局所送達または全身送達を使用して、ＣＡＲを発現するレンチウイルスまたはアデノウイルスベクターを、様々な種類の真核細胞、ならびに、組織及び生物全体に送達することができる。使用する方法は、安定した発現が必要または十分となる、あらゆる目的に供することができる。
【０１７２】
別の実施形態では、当該所望のＣＡＲを、トランスポンソンにより細胞内で発現することができる。
【０１７３】
がん、幹細胞、急性及び慢性感染症、及び、自己免疫疾患の分野において、ここに開示した方法を遺伝子操作したＴ細胞の能力の評価をし、標的がん細胞を死滅させることを含む、基礎研究及び治療におけるＴ細胞活性の調節に適用することができる。
【０１７４】
Ｔ細胞のタイプと供給源
ある態様では、本明細書で提供するＣＡＲ  Ｔ細胞は、自己ＣＡＲ  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該自己ＣＡＲ  Ｔ細胞は、処置を受ける対象または患者から得たＴ細胞から製造する。一部の実施形態では、当該対象から得たＴ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び、腫瘍を含む試料から単離する。特定の実施形態では、当該技術分野で入手可能なあらゆる数のＴ細胞株を使用し得る。本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に公知の幾つもの技術を使用して、対象から回収した血液の単位から得ることができる。一部の実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスで得る。一般的に、アフェレーシス産物は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、及び、血小板などのリンパ球を含む。ある実施形態では、アフェレーシスで回収した当該細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、そして、その後の処理ステップのために適切な緩衝剤または培地に細胞を入れることができる。本発明のある実施形態では、これらの細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の実施形態では、当該洗浄溶液は、カルシウム、マグネシウム、及び、その他の二価カチオンを含んでいない。洗浄後に、例えば、Ｃａ２＋不含、Ｍｇ２＋不含のＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または、緩衝剤を含む、または、含まないその他の生理食塩水など、様々な生体適合性緩衝剤に対して、これらの細胞を再懸濁し得る。あるいは、当該アフェレーシス試料での望ましくない成分を除去し、そして、これらの細胞を、培養培地に直接に再懸濁し得る。
【０１７５】
別の実施形態では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離、または、対向流遠心溶出法によって、赤血球を溶解し、そして、単球を枯渇させることで、Ｔ細胞を末梢血リンパ球から単離する。
【０１７６】
Ｔ細胞の特定の亜集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって、さらに分離することができる。Ｔ細胞の例示的な亜集団として、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及び、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞がある。例えば、ある実施形態では、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な期間で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合ビーズを用いたインキュベーションでＴ細胞を単離する。ある実施形態では、当該期間は、約３０分である。さらなる実施形態では、当該期間は、３０分から３６時間以上の範囲と、その間のすべての整数値の時間である。さらなる実施形態では、当該期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または、６時間である。さらに別の好ましい実施形態では、当該期間は、１０〜２４時間である。好ましいある実施形態では、インキュベーション期間は、２４時間である。白血病患者からのＴ細胞の分離については、２４時間などの長時間のインキュベーション時間を使用すると、細胞収量を増やすことができる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、腫瘍組織または免疫不全の個体から分離する場合など、その他の細胞タイプと比較してＴ細胞が少ない状況では、長時間のインキュベーションを行ってＴ細胞を分離し得る。さらに、長時間のインキュベーションを行うと、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を向上させることができる。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合する時間を単に短縮または延長することで、及び／または、Ｔ細胞に対するビーズの比率を増減することで、培養開始時に、または、プロセスにおけるその他の時点で、Ｔ細胞の亜集団を、優先的または非優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたはその他の表面での抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増減させることで、培養開始時に、または、その他の望ましい時点で、Ｔ細胞の亜集団を、優先的または非優先的に、選択することができる。当業者であれば、複数回の選択も、本発明の関係で使用できることを認識する。特定の実施形態では、選択手順を実行し、そして、活性化、及び、増殖プロセスで「選択しなかった」細胞を使用する、ことが望ましい場合もあり得る。「選択しなかった」細胞を、さらなる選択ラウンドに供することもできる。
【０１７７】
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブに選択した細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせで達成することができる。ある方法は、ネガティブに選択した細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した、細胞選別、及び／または、選択である。例えば、ネガティブ選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するのであれば、モノクローナル抗体カクテルは、一般的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及び、ＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態では、一般的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及び、ＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮し、あるいは、ポジティブに選択することが望ましい場合もあり得る。あるいは、特定の実施形態では、Ｔ調節細胞は、抗Ｃ２５共役ビーズ、または、その他の同様の選択方法によって枯渇する。
【０１７８】
Ｔ細胞は、洗浄ステップの後に凍結することもできる。一部の実施形態では、凍結と、その後の解凍ステップは、細胞集団内の顆粒球と単球とをある程度まで除去することで、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後に、これらの細胞を、凍結溶液に懸濁し得る。
【０１７９】
特定の実施形態では、本明細書に記載したようにして凍結保存した細胞を、解凍及び洗浄し、そして、本発明の方法に従って、使用前に室温で（例えば、１時間以上）放置する。
【０１８０】
また、本発明に関連して企図しているものは、本明細書に記載した増殖細胞を必要とし得る前の期間において、対象から血液試料またはアフェレーシス産物を回収することである。したがって、増殖を受ける細胞の供給源は、必要に応じてあらゆる時点で取り寄せることができ、そして、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離及び凍結して、本明細書に記載したような、Ｔ細胞療法の恩恵を受ける数多くの疾患または病態に対するＴ細胞療法で、後に使用することができる。ある実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、一般的に健康な対象から採取する。特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが、疾患を未だ発症していない一般的に健康な対象から採取し、そして、目的とする細胞を、単離し、後に使用するために凍結する。特定の実施形態では、Ｔ細胞を増殖し、凍結し、そして、後に使用し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後であるが、処置を行う前に、患者から試料を回収する。
【０１８１】
Ｔ細胞の活性化と増殖
望ましいＣＡＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子改変の前後に関係なく、当該Ｔ細胞は、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの個々の内容を援用する、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；及び、米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載された方法を使用して、一般的には、活性化及び増殖し得る。
【０１８２】
一般的に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質と、Ｔ細胞の表面の共刺激分子を刺激するリガンドとが付着した表面との接触により増殖する。特に、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体、または、その抗原結合断片、または、表面に固定化した抗ＣＤ２抗体との接触、または、カルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触など、本明細書に記載したようにして刺激し得る。Ｔ細胞の表面のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、Ｔ細胞の集団を、抗ＣＤ３抗体、及び、抗ＣＤ２８抗体と接触させて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、または、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、抗ＣＤ３抗体、及び、抗ＣＤ２８抗体のいずれかの増殖を刺激することができる。Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）などの抗ＣＤ２８抗体の例は、当該技術分野で一般的に公知のその他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（ｌ−２）：５３−６３，１９９９を参照されたい）。
【０１８３】
特定の実施形態では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナル、及び、共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供し得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液に含まれているか、あるいは、表面に結合し得る。表面に結合する場合、これらの作用物質は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）結合し、または、別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合し得る。あるいは、一方の作用物質を表面に結合させ、そして、他方の作用物質を溶液で結合し得る。ある実施形態では、当該共刺激シグナルを提供する作用物質は、細胞表面に結合し、そして、当該一次活性化シグナルを提供する作用物質は溶液に含まれており、あるいは、表面に結合している。特定の実施形態では、双方の作用物質は、溶液に含まれ得る。別の実施形態では、当該作用物質は、可溶性形態であり、次いで、Ｆｃ受容体、または、抗体、または、当該作用物質に結合するその他の結合作用物質を発現する細胞などの表面に架橋し得る。このことに関しては、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化及び増殖する際の使用を企図している人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号、及び、第２００６００３４８１０号を参照されたい。
【０１８４】
ある実施形態では、２つの作用物質を、同じビーズ、すなわち「シス」、または、別個のビーズ、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズに固定化する。例として、当該一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体、または、その抗原結合断片であり、そして、当該共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ２８抗体、または、その抗原結合断片であり；及び、双方の作用物質を、等価の分子量で同じビーズに共固定化する。
【０１８５】
本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞を、作用物質で被覆したビーズと組み合わせ、当該ビーズと当該細胞は、その後に分離し、次いで、細胞を培養する。別の実施形態では、培養の前に、当該作用物質で被覆したビーズ及び細胞は分離せずに、一緒に培養する。さらなる実施形態では、まず、当該ビーズと当該細胞を、磁力などの力を与えて濃縮を行って、細胞表面マーカーの連結を増やし、それにより、細胞刺激を誘発する。
【０１８６】
例えば、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３、及び、抗ＣＤ２８が付着する常磁性ビーズをＴ細胞に接触させることで、連結し得る。ある実施形態では、当該細胞（例えば、１０４〜１０９  Ｔ細胞）、及び、ビーズ（例えば、１：１の比率のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ）を、緩衝剤、好ましくは、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオン不含）と組み合わせる。したがって、あらゆる細胞数が、本発明の範囲内にある。特定の実施形態では、粒子と細胞とを一緒に混合して体積を著しく減少させて（すなわち、細胞の濃度を高めて）、それらの細胞と粒子の最大の接触を保証することが望ましい場合もある。例えば、ある実施形態では、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度を使用する。別の実施形態では、１億個／ｍｌを超える細胞を使用する。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または、１億個の細胞／ｍｌからの細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１億２５００万、または、１億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。
【０１８７】
本発明のある実施形態では、当該混合物は、数時間（約３時間）〜約１４日間、または、その間のあらゆる整数値の時間で培養し得る。別の実施形態では、当該混合物は、２１日間培養し得る。本発明のある実施形態では、当該ビーズと当該Ｔ細胞は、約８日間、一緒に培養する。別の実施形態では、当該ビーズと当該Ｔ細胞は、２〜３日間、一緒に培養する。Ｔ細胞の培養時間を６０日以上とするには、数サイクルの刺激が望ましい場合があり得る。Ｔ細胞培養に適した条件として、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、及び、ＴＮＦ−α、または、当業者に公知の細胞の成長のためのその他の添加物など、増殖及び生存に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ、または、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０、または、Ｘ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））がある。細胞の成長のためのその他の添加物として、界面活性剤、プラスマネート、及び、Ｎ−アセチル−システインや２−メルカプトエタノールなどの還元剤があるが、これらに限定されない。培地として、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、及び、Ｘ−Ｖｉｖｏ  ２０、オプティマイザーがあり、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及び、ビタミンを添加したもの、無血清のもの、または、適量の血清（または、血漿）、または、所定のホルモンのセット、及び／または、Ｔ細胞の成長と増殖に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充したものを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンも含み得る。これらの標的細胞を、成長を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）、及び、雰囲気（例えば、空気と５％ＣＯ２）で維持する。
【０１８８】
本明細書に記載したように、ＣＡＲをＴ細胞表面で発現すると、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍抗原の非存在下で持続的にシグナル伝達する。持続性シグナル伝達は、ウエスタンブロット法でＣＡＲ  ＣＤ３−ゼータドメインが、ベースラインでリン酸化を受けることを実証する（実施例２、図１６を参照されたい）。持続性シグナル伝達は、Ｔ細胞の枯渇を招いて、ＣＡＲ  Ｔ細胞を無効なものにする。持続性シグナル伝達は、安定化薬の非存在下で、ＲＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を増殖することで妨げられた。ＣＡＲの発現を、抑制し、または、阻害され、そして、Ｔ細胞表面で発現しない場合（適切な小分子、この場合、ｓｈｉｅｌｄ−１が非存在であると、当該ＣＡＲは、細胞表面で発現しない−「常にＯＦＦ」）、または、ＣＡＲがある時点では発現したが、その後の一定期間（例えば、７２時間−ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７）に表面から外れた場合に、ＣＤ３−ゼータのリン酸化の減衰が認められた。さらに、ＣＡＲが表面で発現していない場合（ｓｈｉｅｌｄ−１なし、「ＣＡＲは常にＯＦＦ」）、または、ｓｈｉｅｌｄ−１で７日間培養してから除去すると、枯渇マーカーを共発現する細胞の一部のみが認められた（例２、図１７を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、本発明のＲＤＤ−ＣＡＲを使用したＣＡＲ発現の阻害が、ＣＡＲ持続性シグナル伝達を予防または逆転することで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の転写レベルでの調節に大きな効果をもたらす、ことを本発明は示している。
【０１８９】
したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原の非存在下で（例えば、培養の間に）持続的にシグナル伝達をするので、当該表面でのＣＡＲ発現を阻害するように薬物を安定化せずにＲＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を増殖させると、ＣＡＲを継続的に発現しているＴ細胞と比較して（例えば、インビトロ、または、エクスビボで増殖した場合）、患者を処置するために治療的に使用した場合に、ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を増強する。
【０１９０】
一部の実施形態では、インビトロでの増殖の間でのＣＡＲ発現の抑制は、インビトロでの増殖の間にＣＡＲ発現の抑制を受けていないＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、より健全で、機能的な（例えば、正常なエフェクター機能を有する）ＣＡＲ  Ｔ細胞を、生成、及び／または、導く。したがって、一部の実施形態では、薬物を添加して発現を強め、あるいは、薬物を除去して発現を弱めることで、培養及び増殖の間にＲＤＤ（例えば、トリメトプリムによって調節されるＤＨＦＲ  ＤＤ）を含む本発明のＣＡＲを含有するＴ細胞においてＣＡＲ発現を調節する（例えば、抑制させる）。一部の実施形態では、培養及び／または増殖の間にＣＡＲ発現を抑制すると、持続性シグナル伝達が阻害されなかったＴ細胞と比較して、対象の病態または疾患の処置に関連して、優れたエフェクター機能を有するＴ細胞を誘導または生成する持続性シグナル伝達をインビトロで阻害する。
【０１９１】
様々な刺激時間に曝したＴ細胞は、異なる特性を示し得る。例えば、一般的な血液またはアフェレーシスな末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（Ｔｃ、ＣＤ８＋）よりも大きなヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激してＴ細胞のエクスビボ増殖を行うと、約８〜９日前では、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生成し、一方で、約８〜９日後でのＴ細胞の集団は、ますます多くのＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利となり得る。同様に、Ｔｃ細胞の抗原特異的サブセットを単離しているのであれば、このサブセットをさらに増殖することが有益となり得る。
【０１９２】
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、その他の表現型マーカーはかなり異なるものではあるが、大部分は、細胞増殖プロセスの過程で再現可能である。したがって、そのような再現性は、特定の目的のための活性化Ｔ細胞産物を調製することを可能ならしめる。
【０１９３】
治療への応用
本発明は、一部の実施形態では、特定の抗体の抗原認識ドメインを、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、または、これらのあらゆる組み合わせの細胞内ドメイン、及び、ＲＤＤと組み合わせるＣＡＲを発現するように改変した細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。したがって、その標的抗原の存在下で、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ媒介Ｔ細胞応答を誘発する。
【０１９４】
本発明は、ＣＡＲの使用を提供して、初代Ｔ細胞の特異性を腫瘍抗原に対して改めて付与する。したがって、本発明は、対象の標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法も提供し、ＣＡＲを発現するＴ細胞を対象に投与するステップを含み、当該ＣＡＲは、例えば、ヒトＣＤ３−ゼータの細胞内ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及び、ＲＤＤを含むゼータ鎖部分である所定の標的と特異的に相互作用する結合部分を含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、本発明は、ＲＤＤを含むＣＡＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子操作しており、かつ、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する細胞療法を提供する。当該注入した細胞は、当該レシピエントでのＣＡＲ  Ｔ細胞の標的抗原を発現している腫瘍細胞を死滅させることができる。その他の生物学的療法とは異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで複製することができ、その結果、持続的な腫瘍制御を可能にする長期的な持続をもたらす。一部の実施形態では、ＲＤＤを含むＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞は、（例えば、ＲＤＤを欠いたＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して）長期の抗腫瘍応答を示す。一部の実施形態では、ＣＡＲにＲＤＤを含めると、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性／機能性を阻害する（例えば、ＣＡＲ毒性を軽減する）タイプの安全スイッチとして機能する。例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞から安定化小分子または薬物（例えば、トリメトプリム）を除去すると、ＣＡＲ  Ｔ細胞の表面でのＣＡＲの発現を急速に抑制または阻害し、それにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的指向性及びエフェクター機能を効果的にシャットダウンまたは予防する。特に、実施例２に示したように、ＩＣ５０（表面ＣＡＲの５０％を分解するのに要する時間）は、安定化薬物／分子の非存在下では、２時間未満である、と認められた（実施例２、図１３を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、ＤＤ−ＣＡＲを摂取する患者から安定化薬を除去することは、迅速で可逆的な安全スイッチとして役立つ。したがって、本発明は、一部の実施形態では、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、または、標的抗原を発現している正常細胞まで攻撃する毒性など、これらに限定されない、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法で起こり得る毒性事象を緩和または排除する能力を提供する。さらに、一部の実施形態では、標的抗原を発現している正常細胞まで攻撃する毒性に関連して、本発明は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法が、所望の標的（例えば、腫瘍抗原）を認識するが、健康な組織は認識しない安定化薬の用量の滴定を可能にする。
【０１９６】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで強力なＴ細胞増殖を受け、そして、長期間にわたって持続する。別の実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、再活性化することができる特定の記憶Ｔ細胞へと進化して、あらゆるさらなる腫瘍の形成または成長を阻害する。例えば、本発明のＧＤ２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで強力なＴ細胞増殖を受け、そして、血液及び骨髄において長時間にわたって高レベルで持続し、次いで、特異的記憶Ｔ細胞を形成することができる。
【０１９７】
当該ＣＡＲ改変Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答または受動免疫応答であり得る。加えて、当該ＣＡＲ媒介免疫応答を、ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＣＡＲの抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部とし得る。例えば、ＧＤ２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＤ２を発現する細胞に対して特異的な免疫応答を誘発する。
【０１９８】
本明細書に開示したデータは、抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ（例えば、１４Ｇ２ａ  ｓｃＦｖ）、ＣＤ２８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン、及び、ＦＫＢＰまたはＤＨＦＲのＲＤＤを含むレンチウイルスベクターを具体的に説明しているが、本発明は、本明細書のその他の箇所に記載した構築物の各成分のあらゆる個数の変形を含むものと解釈すべきである。すなわち、本発明は、ＣＡＲのあらゆる抗原結合部分を使用して、抗原結合部分に特異的なＣＡＲ媒介性のＴ細胞応答を生成することを含む。例えば、本発明のＣＡＲの抗原結合部分は、がんを処置する目的で、腫瘍抗原を標的とすることができる。同様に、本発明は、ＣＡＲのあらゆるヒンジ、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び／または、調節可能な不安定化ドメインを使用して、ＣＡＲ媒介性のＴ細胞応答を生成する。実際のところ、本明細書に記載した方法は、所望のエフェクター機能を有し、かつ、ＣＡＲへのＲＤＤの組み込みを介した調節が可能である、ＣＡＲ  Ｔ細胞の特徴決定を行い、かつ、同定する能力を提供する。
【０１９９】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合部の部分を、特定のがんを処置するようにデザインする。ＧＤ２は、神経芽腫、骨肉腫、及び、一部の肉腫などの様々ながんで発現する（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１６．１１（３）：ｐ．ｅ０１５２１９６；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５．２１（６）：ｐ．５８１−５９０；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６．４（１０）：ｐ．８６９−８８０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１０．３６３（１４）：ｐ．  １３２４−３４；Ｐｅｒｅｚ  Ｈｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１６．  ８（９）：ｐ．１０９７−１１７；Ｈｅｃｚｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙを参照されたい）。したがって、ＧＤ２を標的とするようにデザインしたＣＡＲは、ＧＤ２を表示または過剰発現する細胞、及び／または、組織を特徴とする、神経芽細胞腫、骨肉腫、及び、その他の肉腫などのあらゆる疾患または障害の処置に使用することができる。しかし、本発明は、ＧＤ２を標的とする、ことに限定されない。実際のところ、本発明は、その同族抗原に結合すると、腫瘍細胞に影響を及ぼして腫瘍細胞の成長を妨げて、死滅に向かわせるか、さもなければ、患者の全身腫瘍組織量を減少または消滅するように影響を及ぼす、あらゆる抗原結合部分を含む。例えば、ＦＲαは、様々な上皮性悪性腫瘍のがん細胞表面で過剰発現するグリコシルホスファチジルイノシトール固定タンパク質であるが、正常組織では限られている。そのため、ＦＲαを標的とするようにデザインしたＣＡＲは、ＦＲαの過剰発現を示す細胞、及び／または、組織を特徴とする上皮癌など、これらに限定されない、あらゆる疾患または障害を処置するために使用することができる。例えば、ＦＲαを標的とするようにデザインしたＣＡＲは、卵巣癌、肺癌、乳癌、腎癌、大腸癌、その他の固形癌など、これらに限定されない、がん及び障害を処置するために使用することができる。
【０２００】
また、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫処置、及び／または、インビボ療法のための一種のワクチンとして有用であり得る。好ましくは、当該哺乳動物は、ヒトである。エクスビボ免疫処置に関して、当該細胞を哺乳動物に投与する前に、次の：ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、及び／または、ｉｉｉ）細胞の凍結保存、の少なくとも１つをインビトロで生じる。
【０２０１】
エクスビボ手順は、当該技術分野で周知である。要するに、それらの細胞を、哺乳動物（好ましくは、ヒト）から単離し、そして、本明細書に開示したＣＡＲを発現するベクターで遺伝子操作（すなわち、インビトロで形質導入、または、トランスフェクト）する。ＣＡＲで改変した細胞を、哺乳動物のレシピエントに投与して、治療的有用性を提供することができる。当該哺乳動物のレシピエントを、ヒトとし、そして、当該ＣＡＲ改変細胞を、レシピエントに対して自己由来とすることができる。あるいは、これらの細胞を、当該レシピエントに対して同種、同系、または、異種とし得る。
【０２０２】
造血幹細胞及び前駆細胞をエクスビボで増殖するための手順は、本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、また、本発明の細胞に適用することができる。本発明は、これらの細胞のエクスビボ増殖のためのあらゆる特定の方法に限定されない。要するに、Ｔ細胞のエクスビボでの培養と増殖は、（１）末梢血回収物または骨髄外植片から哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を採取し、及び、（２）そのような細胞をエクスビボで増殖する、ことを含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載された細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、及び、ｃ−ｋｉｔリガンドなどのその他の因子を、これらの細胞の培養及び増殖のために使用することができる。
【０２０３】
エクスビボ免疫処置に関して細胞をベースとしたワクチンを使用することに加えて、本発明は、患者の抗原に対する免疫応答を誘発するためのインビボ免疫処置のための組成物及び方法も提供する。
【０２０４】
特に、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞を、がんの処置に使用する。特定の実施形態では、本発明の細胞を、がんを発症するリスクのある患者の処置に使用する。したがって、本発明は、それを必要とする対象に対して、治療有効量の、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞を投与することを含む、がんの処置または予防のための方法を提供する。
【０２０５】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、それ単独で、または、希釈剤、及び／または、その他の成分である、ＩＬ−２、または、その他のサイトカイン、または、細胞集団など、と組み合わせた医薬組成物として投与し得る。要するに、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載したＣＡＲ  Ｔ細胞を、医薬として許容される、または、生理学的に許容される担体、希釈剤、または、賦形剤の１つ以上と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、または、デキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド、または、グリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ、または、グルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び、防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化する。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、処置（または、予防）をする疾患に対して適切な方法で投与し得る。投与の量と頻度は、患者の病態、患者の疾患の種類と重篤度などの要素によって決定するが、適切な用量は、臨床試験で決定され得る。
【０２０７】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または、「処置量」を示す場合、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び、病態の個人差を考慮した医師は、投与する本発明の組成物の正確な量を決定することができる。本明細書に記載したＣＡＲ  Ｔ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９個の細胞／体重ｋｇ、好ましくは、１０５〜１０６個の細胞／体重ｇであって、それらの範囲内にある全数値の用量で投与することができる。また、Ｔ細胞組成物も、これらの投与量で、複数回投与し得る。当該細胞を、免疫療法で一般的に公知の注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ３１９：  １６７６，  １９８８を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量、及び、処置計画は、当業者であれば、疾患の徴候について患者をモニターし、そして、それに応じて処置を講ずることで、容易に決定することができる。
【０２０８】
特定の実施形態では、遺伝的に改変したＴ細胞を対象に投与し、続いて、改めて血液を採取し（または、アフェレーシスを実施し）、本発明に従って、そこからＴ細胞を活性化させ、及び、これらの活性化及び増殖したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに、複数回実施することができる。
【０２０９】
本明細書に記載した組成物の投与は、あらゆる好都合な方法で実施し得る。一部の実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射で投与する。しかしながら、当該投与は、この経路に限定されない。当該Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または、感染部位に直接に注射し得る。本明細書に記載した組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または、腹腔内で投与し得る。また、組成物は、例えば、注射、輸血、埋め込み、または、移植によって投与し得る。
【０２１０】
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載した方法、または、Ｔ細胞を治療レベルにまで増殖する当該技術分野で公知のその他の方法を使用して、活性化及び増殖した細胞を、あらゆる数の（例えば、がんまたは感染症疾患のための）処置法を併用して、（例えば、その前、それと同時、または、その後に）患者に対して投与する。例示的な処置法として、抗ウイルス療法、シドフォビル及びインターロイキン−２、シタラビン（別名、ＡＲＡ−Ｃ）、または、ＭＳ患者のナタリズマブ処置、または、乾癬患者のエファリズマブ処置などの作用物質を用いた処置があるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及び、ＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、または、ＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体などの他の免疫除去剤、または、その他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び、放射線治療と組み合わせて使用し得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン、及び、ＦＫ５０６）、または、成長因子誘導シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）のいずれかを阻害する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５、１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６−３２１、１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３−７７３，  １９９３）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物を、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または、ＯＫＴ３やＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用して、骨髄移植、Ｔ細胞除去療法と併用して、（例えば、その前、それと同時、または、その後に）患者に対して投与する。別の実施形態では、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法の後に投与する。例えば、ある実施形態では、対象は、高用量化学療法と、それに続く末梢血幹細胞移植による標準処置を受け得る。特定の実施形態では、移植の後に、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増殖した細胞を、手術の前または後に投与する。
【０２１１】
本明細書に記載した方法のいずれかの有効性は、臨床モデルまたは前臨床モデルなどの当該技術分野で公知の様々なモデルで試験し得る。適切な前臨床モデルを、本明細書に例示している。例示的なモデルでは、腫瘍を成長させた後に、処置またはコントロールの処置を受けている処置グループに、マウスをランダムに補充する。腫瘍の大きさ（例えば、腫瘍の体積）を、処置の間に測定し、そして、全体的な生存率もモニターする。
【０２１２】
一部の実施形態では、処置に対する応答を測定するためのベースラインとして、Ｔ細胞で処置する前に（例えば、単独で、または、本明細書に記載の別の療法と組み合わせて）試料を得る。一部の実施形態では、当該試料は、（例えば、ホルマリン固定した、及び、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した、保存の（ａｒｃｈｉｖａｌ）、新鮮な、または、凍結した）組織試料である。一部の実施形態では、当該試料は、全血である。一部の実施形態では、当該全血は、免疫細胞、循環腫瘍細胞、及び、それらのあらゆる組み合わせを含む。
【０２１３】
処置に対する応答性とは、生存期間の延長（全生存、及び、無進行生存など）；客観的応答の結果（完全な応答、または、部分的な応答など）、または、がんの徴候または症状の改善、の１つ以上のことを指し得る。一部の実施形態では、応答性とは、がん患者での腫瘍の状態、すなわち、応答している、安定化している、または、進行している、ことを判定するための、公表された一連のＲＥＣＩＳＴガイドラインでの１つ以上の因子の改善のことを指し得る。これらのガイドラインの詳細については、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；４５：２２８−４７；Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６６：２４４３−５４；Ｗｏｌｃｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：７４１２−２０；及び、Ｔｈｅｒａｓｓｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−１６（２０００）を参照されたい。応答性対象とは、例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいた１つ以上の因子に従って、がん（複数可）の改善を示す対象のことを指し得る。非応答性対象とは、例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいた１つ以上の因子に従って、がん（複数可）の改善を示さない対象のことを指し得る。
【０２１４】
従来の応答基準は、免疫療法薬の抗腫瘍活性を特徴決定するのに十分ではない場合があり、新しい病変の出現など、当初の明らかな放射線学的進行を先行させてしまう遅延反応を招きかねない。これを受けて、新しい病変の出現の可能性を考慮し、そして、その後の評価で放射線学的進行を確認できるようにする、修正した応答基準が作成された。したがって、一部の実施形態では、応答性とは、免疫関連応答基準２（ｉｒＲＣ）での１つ以上の因子の改善のことを指し得る。例えば、Ｗｏｌｃｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：７４１２−２０を参照されたい。一部の実施形態では、新たな病変を、定義をした全身腫瘍組織量に加え、そして、その後の評価の際に、例えば、放射線学的進行などを追跡する。一部の実施形態では、非標的病変の存在は、完全な応答の評価に含まれているが、放射線学的進行の評価には含まれない。一部の実施形態では、放射線学的進行は、測定可能な疾患のみに基づいて決定し得るものであり、及び／または、最初に記録した日から４週間を超える連続評価で確認し得る。
【０２１５】
本発明は、本発明の要旨、または、本質的な特徴事項から逸脱することなく、その他の特定の形態で具現化し得る。それ故に、前出の実施形態は、本明細書に記載した本発明を限定するものではなく、あらゆる点で例示のものとして見なすべきである。したがって、本発明の範囲は、前出の説明ではなく、添付した特許請求の範囲によって示されるものであり、特許請求の範囲の均等の意味、及び、範囲内にあるすべての変更は、同範囲に含まれることを意図する。本明細書で引用したすべての刊行物、特許、及び、特許出願は、あらゆる目的において、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。
【実施例】
【０２１６】
以下の実施例は、本発明の化合物、組成物、及び、方法を例示するものであって、これらを限定するものではない。臨床療法で通常から普通に認識されており、かつ、当業者に自明である様々な条件及びパラメーターについてのその他の適切な変更及び適応は、本発明の要旨及び範囲内にある。
【０２１７】
実施例１
ＴＣＲシグナル伝達を阻害または調節することで、Ｔ細胞の枯渇を予防または逆転する方法
導入
我々は、ＧＤ２−ＣＡＲを発現するＴ細胞が、培養で１０日以内に機能的枯渇になり、そして、抑制性受容体の共発現、腫瘍抗原に応答したサイトカイン分泌不全、及び、異常な代謝機能を特徴とする、ことを以前に報告した（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１５）。コントロールの培養物は、非形質導入Ｔ細胞（モック）、及び、ＣＤ１９−ＣＡＲを発現するものを含むが、これらは、インビトロで持続性シグナル伝達を発現することはなく、枯渇する。このシステムで枯渇を招くためにはゼータ鎖が必要であり、また、ＣＤ２８シグナル伝達が枯渇を誘発するシグナル伝達刺激の効力を高めることを、以前の研究で示した。このモデルシステムを使用して、Ｔ細胞の枯渇について、堅牢で、操作可能で、かつ、再現可能なインビトロでのヒトモデルを最適化して、Ｔ細胞の枯渇を予防または逆転する方法を評価する。
【０２１８】
結果
我々が遺伝子操作をして作り出したＦＫＢＰ１２変異体不安定化ドメインに融合したＧＤ２．２８ｚ．ＣＡＲ（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００６）（ＧＤ２．２８ｚ．  ＦＫＢＰ）は、当該ＣＡＲに不安定性を付与し、そして、急速なタンパク質分解を誘発する。我々は、培養培地に対して、安定化ラパログｓｈｉｅｌｄ−１（Ｓ１）を添加する、または、そこから取り去ることで、表面発現を迅速かつ用量依存的に調節できることを認めた（図１）。ＣＡＲ発現の同様の調節可能性は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨＦＲ変異体（ＧＤ２．２８ｚ．ＤＨＦＲ、図示せず）を用いて行うことができ、このものは、臨床で一般的に使用されている抗生物質であるトリメトプリムで制御することができる。
【０２１９】
持続性シグナル伝達は、ＧＤ２−ＣＡＲ受容体レベルに大きく依存しているので、ＣＡＲ発現レベルの正確な制御も、持続性シグナル伝達のレベルを正確に制御する。したがって、ＣＡＲ発現のレベルを薬物調節する制御は、ＧＤ２．２８ｚ持続性シグナル伝達の持続時間と強度の調節も可能にした。このシステムを使用して、我々は、枯渇に関連する表現型、及び、機能の変化が、ＣＡＲシグナル伝達の停止時に逆転することを実証した。図２に示したように、培養培地からのＳ１薬物の除去と、それに続く、活性化して７日後の表面ＣＡＲの除去により、標準的な枯渇マーカーの発現を、１０日目までに、コントロールのレベルにまで逆転する（図２、ｎ＝３）。このことは、機能不全的に枯渇したＴ細胞に対して非常に特異的なＰＤ−１／ＴＩＭ−３／ＬＡＧ−３トリプル発現細胞のレベルを測定することで顕著に表れる。我々は、１０日目で、枯渇細胞のトリプル発現レベルの増加を明瞭に誘発するが、７日目にＳ１を除去すると、１０日目までに、これらのレベルが正常化することを実証した。７日目または１０日目にＳ１を培養培地から除去した細胞については、同様の結果を、１４日目で得た（図示せず）。
【０２２０】
加えて、７日目または１０日目にＳ１を除去すると、ＣＡＲタンパク質が一時的に分解を受けて、記憶マーカー（例、ＣＤ６２Ｌ）を維持し、そして、当該培養（Ｓ１）の全期間においてＳ１を受け入れたＴ細胞と比較して、１４日目までに、アポトーシスの予防（すなわち、アネキシンＶ染色）（図３）を可能にする。
【０２２１】
表現型マーカーは、Ｔ細胞機能を完全に予測し得ないので、我々は、培養物にて一時的な薬物曝露に供したＣＡＲ  Ｔ細胞の機能実験も実施した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を洗浄し、Ｓ１を含む培地に再懸濁し、表面ＧＤ２を安定して発現するＮａｌｍ６白血病細胞と１：１の比率で混合した。培養上清を、約２４時間後に回収し、そして、サイトカインレベルをＥＬＩＳＡで評価した。
【０２２２】
不安定化ドメインを欠いており、それ故に、高レベルのＣＡＲシグナル伝達が持続するＧＤ２．２８ｚ  ＣＡＲと同様に、連続的な薬物処置を施したＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  ＣＡＲを発現する細胞（図４、灰色バー）は、Ｔ細胞の枯渇と符合するように、活性化して１０日後と１４日後の双方で、最小量のＩＬ−２を分泌した。また、培養期間に薬物に曝露しなかったが故に、持続性シグナル伝達を受けなかったＣＡＲ  Ｔ細胞（黒色バー）は、ＩＬ−２産生によって測定される顕著な生物活性を示した。最後に、培養の最初の７日間または１０日間に薬物に曝露したが故に、Ｔ細胞枯渇の表現型及び機能の証拠を得たが、７日目または１０日目に培養培地から薬物を除去したＣＡＲ  Ｔ細胞（それぞれ、青色バーと赤色バー）では、腫瘍抗原に応答してＩＬ−２を分泌する能力が回復したことを示した。
【０２２３】
驚くべきことに、１０日目に枯渇したＴ細胞（灰色バー、１０日目のＥＬＩＳＡ）は、培養培地からＳ１を除去することで再活性化し、わずか４日間「休止」していた（赤色バー、１４日目のＥＬＩＳＡ）。同様に、培養培地からＳ１を除去した条件下でのＩＦＮγ分泌でも、劇的にまで至らない増加が認められた。これらの機能データは、すべてのグループが、この共培養アッセイの終了時に同様のレベルの表面ＣＡＲを示したため、示差的ＣＡＲ表面発現に起因するものではない（図示せず）。
【０２２４】
次に、我々は、表面ＣＡＲの除去によるＴ細胞枯渇の予防または逆転が、十分に特徴決定された抗ＰＤ−１チェックポイント阻害薬であるニボルマブ（Ｎｉｖｏ）を用いた処置よりも、どの程度の効果を奏するのかについて比較をした。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、当該共培養アッセイの時まで、連続Ｓ１（つまり、継続的に持続性シグナル伝達を示す）、連続Ｓ１＋ニボルマブ、または、Ｓ１なしで処置をした。興味深いことに、ニボルマブ処置では、１０日目には僅かなＩＬ−２分泌の増加を示し、これが１４日目まで持続しており、このことは、ニボルマブが、このシステムではＴ細胞の枯渇の開始を部分的ではあるが予防したことを示唆している（図５）。
【０２２５】
逆に、Ｓ１なしでＣＡＲ  Ｔ細胞を培養し、次いで、当該共培養アッセイの直前に当該培地に戻すと（左側の図、青色バー）、連続Ｓ１を与えたＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−２分泌が、５〜１０倍にまで増加しており、枯渇の予防に非常に優れている結果を生じた（黒色バー）。さらに、当該培養培地からＳ１を除去して、７日目に持続性シグナル伝達を除去すると、連続Ｓ１を与えたＣＡＲ  Ｔ細胞、及び、連続Ｓ１を与え、かつ、同時にＳ１で処置をしたＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、優れたＩＬ−２分泌を生じた。まとめると、これらのデータは、持続性シグナル伝達の調節は、ＰＤ−１阻害と比較して、枯渇の予防または逆転に関して、より強力な効果を示すことを実証している。
【０２２６】
我々の研究室を含む幾つかのグループが行った機能研究は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び、ＬＡＧ−３（トリプルポジティブ、ＴＰ）の共発現が、高度の機能不全にある枯渇細胞サブセットを示す、ことを確認した。したがって、我々は、この細胞サブセットにおける持続性シグナル伝達の停止が、表現型を逆転させ、そして、腫瘍抗原に応答してＩＬ−２を分泌する能力を回復できるかどうかについて分析を試みた。ＧＤ２．２８ｚ  ＣＡＲの高親和性バージョン（ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ）は、さらに劇的に枯渇した表現型を示し、その表面発現を制御するために、ＦＫＢＰ１２変異体不安定化ドメインに融合した。活性化して１０日後に、連続的Ｓ１処置を受けたＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を選別して、純粋なＰＤ−１／ＴＩＭ−３／ＬＡＧ−３枯渇集団を単離した。次に、「トリプルポジティブ」枯渇細胞を、Ｓ１の有無に関係なく再培養をして、持続性シグナル伝達の除去が、その機能を回復できるかどうかについて、試験をした。ＦＡＣＳ及び共培養アッセイは、４日後に実施した。
【０２２７】
Ｓ１の除去は、枯渇した表現型の劇的な逆転をもたらした。Ｓ１を含まない当該培地で、僅か４日後に、予め選別したトリプルポジティブ細胞は、ＣＤ４＋、及び、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の双方で、枯渇マーカーの発現が遙かに少ないことを示した（図６）。重要なことに、Ｓ１を除去すると、１０〜１４日目から継続的にＳ１処置を受けたトリプルポジティブ細胞と比較して、ＩＬ−２分泌が２倍にも増加したので、これらの表現型の変化は、ＩＬ−２分泌の機能的増加をも実現した（図６）。
【０２２８】
ＣＡＲシグナル伝達にも不可欠であるＴＣＲシグナル伝達経路におけるキナーゼを単に阻害することで、表面ＣＡＲを除去し、ひいては、持続的にシグナル伝達するという効果を再現できる、という仮説を我々は立てた。そのようなキナーゼの１つがＬｃｋであり、ＴＣＲまたはＣＡＲライゲーションに応答して、ＣＤ３−ゼータをリン酸化するように作用する。強力な受容体型チロシンキナーゼ阻害剤であり、ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬であるダサチニブも、低濃度でＬｃｋに結合して阻害することで、Ｔ細胞の活性化、増殖、及び、サイトカイン分泌を阻害することが報告されている（Ｓｃｈａｄｅ  ｅｔ．ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００８  及び  Ｌｅｅ  ｅｔ．ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１０）。
【０２２９】
１００ｎＭ、及び、１μΜ濃度で、ダサチニブは、活性化して１４日後に腫瘍抗原に応答して、ＣＤ１９．２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞サイトカイン分泌を強力に阻害しており（図７）、このことは、ダサチニブが、ＣＡＲシグナル伝達を撹乱することを証明している。
【０２３０】
次に、我々は、活性化して１０〜１４日後に、ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をダサチニブで処置することで、一過性のダサチニブ曝露が、Ｔ細胞の枯渇を回復できるかどうかを確認した。これらの細胞を、ダサチニブで４日間処置し、次いで、薬物を当該培地から徹底的に洗浄し、そして、これらの細胞を、さらに２４時間再培養してから、ＦＡＣＳ及び腫瘍共培養アッセイで、表現型と機能を調べた。興味深いことに、ダサチニブで４日間の処置をしたところ、枯渇マーカーの発現と共発現を、用量依存的に逆転した（図８）．
【０２３１】
さらに、ダサチニブ処置は、ＣＤ６２Ｌ発現の維持を介して、用量依存的にＴ細胞記憶を保存した（図９）。
【０２３２】
最後に、表面ＣＡＲの除去と同様に、ダサチニブ処置したＣＡＲ  Ｔ細胞が、ダサチニブを受けたことが全くないＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、腫瘍抗原に応答して多くのＩＬ−２（及び、比較的規模は小さいが、ＩＦＮγ）を分泌したため、機能的に顕著な方法で、枯渇Ｔ細胞を再活性化した（図１０）。
【０２３３】
まとめると、これらのデータは、ＴＣＲシグナル伝達の選択的阻害または調節が、がんまたは慢性感染症に関して、連続的な抗原曝露を受けて枯渇したＴ細胞の機能を大幅に増強できる、ことを実証している。今後の研究で、我々は、この状況での枯渇の逆転の実現可能性と、そのような逆転が、マウスモデルの抗腫瘍効果を高めることができるかについて評価をするインビボ研究を実施する。
【０２３４】
実施例２
ＣＡＲへの不安定化ドメインの導入を介した、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇の予防と、ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の強化
ＣＡＲ  Ｔ細胞の表面発現を調節して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を制御できるかどうかを試験するための実験を行い、細胞を完全に除去せずに毒性を被った患者で、（自殺スイッチとは全く対照的に）ＣＡＲ  Ｔ細胞をオフにする方法を提供した。表面ＣＡＲの非存在下でのＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロでの増殖が、ＣＡＲ持続性シグナル伝達の緩和を可能にし、より健康的で、より効果的な注入産物を得られるかどうかを決定するための実験を、本発明の実施形態を開発している間にも行った。最後に、調節可能な薬物感受性不安定化ドメインを使用するＣＡＲ表面発現の調節が、Ｔ細胞枯渇の予防または逆転、及び／または、Ｔ細胞記憶の維持／誘導を可能にするかどうかを試験するために、実験を行った。
【０２３５】
材料と方法
細胞と培養条件
ＮＡＬＭ６−ＧＬ（ＧＦＰ及びルシフェラーゼで安定にトランスフェクトした急性リンパ芽球性白血病株）、及び、ＮＡＬＭ６−ＧＬ−ＧＤ２（ＧＤ２シンテターゼを過剰発現するように安定にトランスフェクトした）細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０で培養した。２９３Ｔ及び１４３Ｂ細胞株を、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。ＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０には、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。
【０２３６】
初代ヒトＴ細胞は、Ｐａｎ  Ｔ細胞ネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なドナーバフィーコートから得た。次に、ドナーＴ細胞を、等分し、そして、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む液体窒素に保存した。Ｔ細胞を、５％熱不活性化ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び、１００ｕ／ｕＬ組換えヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＡｉｍＶ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。特に断りのない限り、Ｓｈｉｅｌｄ−１、及び、乳酸トリメトプリム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、または、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を、１μΜで培養した。
【０２３７】
レンチウイルス産生とＴ細胞形質導入
すべてのＤＤ−ＣＡＲレンチウイルス上清を、２９３Ｔ細胞株の一過性トランスフェクションを介して産生した。要するに、ＣＡＲをコードするプラスミドと、パッケージングタンパク質Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ＲＥＶ、及び、エンベロープタンパク質ＶＳＶＧをコードするプラスミドとを用いて、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションをして２４時間後、及び、４８時間後に上清を回収し、そして、直ちに凍結するか、あるいは、超遠心分離にて３０，０００ＲＰＭで遠心して最初の濃縮を行い、その後、−８０℃で凍結保存する。
【０２３８】
解凍後、１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｔ細胞を、３：１のビーズ：細胞比で活性化した。活性化して１日後に、レンチウイルスを、Ｔ細胞に直接加えた。活性化して４日後に、磁気ビーズを培養物から除去し、その後、毎日、Ｔ細胞を、０．５×１０６個の細胞／ｍＬで培養した。ＩＬ−２と安定化薬とを補充した培地を、２日ごとに交換した。導入効率は、すべてのＣＡＲで、常に７０〜９０％であった。
【０２３９】
フローサイトメトリー
すべての試料を、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、または、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、そして、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。１×１０６個／ｍＬの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして、染色剤を含むＰＢＳで標識した後に、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ及び０．４％  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ）で、２回洗浄した。ＧＤ２  ＣＡＲを、１４ｇ２ａ抗イディオタイプ抗体（クローン１Ａ７）で検出した。ＣＤ１９  ＣＡＲを、ＦＭＣ６３抗イディオタイプ抗体（クローン１３６．２０．１）で検出した。Ｔ細胞の表現型を、ＣＤ４（ＯＫＴ４，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（ＳＫ１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＤ−１（ｅＢｉｏＪ１０５，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＩＭ−３（Ｆ３８−２Ｅ２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＬＡＧ−３（３ＤＳ２２３Ｈ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＣＲ７（１５０５０３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６９（ＦＮ５０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−２（ＭＱ１−１７Ｈ１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び、ＩＦＮγ（４Ｓ．Ｂ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を介して評価した。サイトカイン産生の評価を行った共培養アッセイでは、１：１０００モネンシン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で、少なくとも６時間、腫瘍細胞とＣＡＲ  Ｔ細胞とを共培養した。ＩＬ−２とＩＦＮｙとを評価する場合、細胞を表面染色し、次いで、細胞内抗体とのインキュベーションの前に、固定及び透過化した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型データを表示するすべてのＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ＋細胞に関してプレゲートした。モック−形質導入したＴ細胞については、すべてのＴ細胞集団を分析に使用した。
【０２４０】
ＣｙＴＯＦ
Ｔ細胞を培養物から取り出し、室温で、１０分間、２％ＰＦＡに固定し、ペレット化し、そして、−８０℃で凍結した。解凍した後、各試料に対して、２０−プレックスＰｄバーコードキット（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）でバーコードを付けた。次いで、細胞試料をプールし、そして、表面マーカー発現のために、室温で、３０分間、重金属結合抗体で染色した。次に、細胞にメタノールを浸透させ、続いて、重金属結合抗ヒトＴ−ｂｅｔ（４Ｂ１０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び、抗ヒトＢｌｉｍｐ−１（ＲＯＳ１９５Ｇ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で、室温で、３０分間、染色した。試料を、Ｈｅｌｉｏｓ質量サイトメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に適用し、そして、Ｃｙｔｏｂａｎｋオンラインソフトウェアを使用して分析を完了した。
【０２４１】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイ
５０，０００個のＮＡＬＭ６−ＧＬ−ＧＤ２腫瘍細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに、ＩＬ−２を補充していない２００μＬの完全ＡｉｍＶ培地に、１：２または１：８のＥ：Ｔ比でＴ細胞と共培養した。プレートをｉｎｃｕｃｙｔｅにロードし、そして、４８時間から７２時間の間、２時間ごとに、４８８ｎｍの蛍光画像を撮った。ＧＦＰ＋腫瘍細胞を、大きさと蛍光強度マスクで同定し、そして、計数したすべての腫瘍細胞の合計ＧＦＰ強度を、個々のウェルごとに定量した。数値を、ｔ＝０に正規化し、データ表示のために複製ウェルを平均した。
【０２４２】
ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  Ｔ細胞を、ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下で増殖する実験については、腫瘍細胞と共培養する１８〜２４時間前に、１μＭのｓｈｉｅｌｄ−１を、ＣＡＲ  Ｔ細胞に加えた。
【０２４３】
サイトカイン放出アッセイ
５０，０００個のＮＡＬＭ６−ＧＬ−ＧＤ２腫瘍細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに、ＩＬ−２を補充していない２００μＬの完全ＡｉｍＶ培地に、１：１のＥ：Ｔ比でＴ細胞と共培養した。２４時間後に、上清を除去し、−２０℃で保存した。ＩＬ−２及びＩＦＮγの分泌を、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で評価した。
【０２４４】
ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  Ｔ細胞を、ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下で増殖する実験については、腫瘍細胞と共培養する１８〜２４時間前に、１μＭのｓｈｉｅｌｄ−１を、ＣＡＲ  Ｔ細胞に加えた。
【０２４５】
ウエスタンブロット
２×１０６個のＣＡＲ−Ｔ細胞を、培養物から取り出し、ペレット化し、そして、ホスファターゼ、及び、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を加えた１００ｕＬのＲＩＰＡ溶解緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、４℃で２０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離して、上清を除去した。透明な溶解物でのタンパク質濃度を、比色反応（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。
【０２４６】
１５μｇのタンパク質溶解物を、６×ローディング緩衝剤と混合し、そして、ミニタンパク質電気泳動システム（ＢｉｏＲａｄ）に組み込まれた１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動を、ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝剤（ＢｉｏＲａｄ）にて、１００Ｖで、２０分間行い、その後、５０分間で、１５０Ｖにまで上げた。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ  ＰＶＤＦ膜へのタンパク質移動を、ｔｒｉｓ−グリシン緩衝剤（ＢｉｏＲａｄ＃１６１０７７１）で、１時間、１００Ｖで行った。ＣＤ３−ゼータ（細胞シグナル伝達）、及び、ｐＹ１４２−ＣＤ３−ゼータ（細胞シグナル伝達）を標的とする一次抗体を使用した。Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ−ＣＯＲ）イメージングシステム、ＬＩ−ＣＯＲ緩衝剤、及び、（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−８００ＣＷ−結合した、及び、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−６８０ＬＴ−結合した）ＬＩ−ＣＯＲ二次抗体を、タンパク質検出のために使用した。
【０２４７】
インビボ実験
６〜８週齢のＮＳＧマウスに、静脈内注射で、１×１０６個のＮＡＬＭ６−ＧＬ−ＧＤ２を生着させた。生後７日目に、１〜５×１０６個のＧＤ２．２８ｚ．ＤＨＦＲ、または、ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＤＨＦＲ  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、静脈内に注入した。ＮＡＬＭ６−ＧＬ−ＧＤ２全身腫瘍組織量は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。マウスに対して、まず、３ｍｇ  Ｄ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内に注射し、次いで、３０秒の露光時間で４分後に画像化するか、あるいは、３０秒でシグナルが飽和に達する場合は、「自動」露光を選択した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、発光画像を分析した。
【０２４８】
トリメトプリムで処置したマウスには、３００ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内注射した。ビヒクルで処置したマウスには、等量の水を腹腔内注射した。
【０２４９】
血液試料を、眼窩後部から採血し、そして、ＥＤＴＡでコーティングしたＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ（Ｋｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に短時間保存した。脾臓を、７０−μｍフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させて機械的に粉砕した。血液と脾臓の双方を、ＡＣＫ溶解緩衝剤（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で５分間溶解し、続いて、ＦＡＣＳ分析用の表面マーカー抗体で染色した。
【０２５０】
ＣＡＲベクターの構築
すべてのＣＡＲ配列を、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下で、ｐＥＬＮＳレンチウイルスバックボーンに挿入した。ＣＤ３ｚドメインの下流への不安定化ドメイン配列の挿入は、（内在性ＢｍｇＢＩ制限部位で始まる）ＣＤ３ｚ配列の一部、それに続く、不安定化ドメイン配列、停止コドン、及び、ＳａｌＩ制限部位を含むカスタム遺伝子断片（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をサブクローニングして行った。ＣＤ３ｚまたはＤＤ配列のいずれにも存在しない他の制限部位は回避した。
【０２５１】
各ＣＡＲは、シグナルペプチド、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び、細胞内ＣＤ３−ゼータドメインを含む。
【０２５２】
結果
まず、ＤＤ−ＣＡＲ表面発現の用量依存的調節を、２つの異なるＲＤＤと融合した３つの異なるＣＡＲについて試験をした。ＣＤ１９．２８ｚ、ＧＤ２．２８ｚ、及び、高親和性ＧＤ２．２８ｚ（ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ）を、それぞれ、１２ｋＤａ  ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ＤＤまたはＥ．ｃｏｌｉ由来のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ＤＤに融合した。別の実験では、当該ＦＫＢＰ  ＤＤに融合したＨｅｒ２．２８ｚ  ＣＡＲの調節も試験した（図２４）。ラパログｓｈｉｅｌｄ−１（Ｓ１）を使用してＦＫＢＰ融合ＣＡＲを安定化し、一方で、ＦＤＡが承認した抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）を使用してＤＨＦＲ融合ＣＡＲを安定化した。ＦＡＣＳを介して表面ＣＡＲ発現を評価する前に、安定化薬を、少なくとも４８時間、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞とインキュベートした。データは、試験した７つのＣＡＲすべてについて、表面ＣＡＲの正確な用量依存的調節を実証している（図１２、２４を参照されたい）。ＤＤ−ＣＡＲの異なるＥＣ５０値（図２２Ｂ）は、ＣＡＲが融合したＤＤとは関係なく、当該安定化薬に対する所定のＤＤ−ＣＡＲタンパク質の感受性が不均一であることを実証している。また、これらの研究は、各ＤＨＦＲ融合ＣＡＲが、そのＦＫＢＰ融合対応物と比較して、安定化薬物に対して高い感受性を示したので、ＤＤの本質的な差異を実証している（図２２を参照されたい）。さらに、すべてのＲＤＤが、ＣＡＲタンパク質を不安定にするものではなく、たとえ、その他のタンパク質を不安定にするものであっても、そうはならない、ことが認められた（図２３を参照されたい）。以前に報告されたＤＨＦＲ  ＤＤの２つの反復（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７、９８１−９８８（２０１０）を参照されたい）を、ＧＤ２．２８ｚ  ＣＡＲに関して試験を行っており、そのうちの一方は、薬物依存性調節を可能にした（図１２、２２、３３を参照されたい）。
【０２５３】
次に、ＤＤ−ＣＡＲの薬物依存性調節の動態を試験して、特徴決定を行った。ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、１ｕＭの安定化薬の存在下または非存在下で、少なくとも４８時間培養した。薬物の非存在下で培養したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞については、薬物を培養物に導入し、そして、４８時間にわたって試料を除去してＣＡＲ表面発現の増加を評価した（図１３、各プロットの左側を参照されたい）。逆に、薬物の存在下で培養したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞については、我々は、培養物から薬物を除去してＣＡＲ表面発現の低下を評価した（図１３、各プロットの右側を参照されたい）。これらの研究は、ＤＤ−ＣＡＲの表面発現が、薬物へ曝露して２４時間にわたって徐々に増加する、ことを示した。しかしながら、薬物を除去すると、最初の２時間で、当該ＤＤ−ＣＡＲ表面発現の約半分が急速に失われ、その後の４６時間にわたって、残りの表面ＣＡＲが徐々に失われた。ＤＤ−ＣＡＲの急速な「オフ」動力学は、このＣＡＲ制御の方法が、臨床状況で、ＣＡＲ毒性を緩和する現実的な治療機会を提供する、ことを示した。
【０２５４】
次に、ＤＤ−ＣＡＲ表面発現の違いが、特異的抗腫瘍反応を誘発するかどうかを決定した。つまり、ＤＤ−ＣＡＲ表面発現の薬物依存性調節が、Ｔ細胞活性化の調節も可能にするかどうかを評価した。実際のところ、薬物の非存在下でＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を抗原担持腫瘍細胞と共培養すると、安定化薬の存在下で共培養したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、無視できるレベルのサイトカイン分泌（図１４Ａを参照されたい）、及び、細胞毒性が認められた（図１４Ｂを参照されたい）。インビボ状況でも実験を行った。
【０２５５】
マウスに抗原担持腫瘍を移植し、続いて、ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入した。次いで、マウスに対して、毎日、安定化薬またはビヒクルコントロールのいずれかを注射した。安定化薬物を１回だけ投与した後に、ＣＡＲ発現の薬物依存性アップレギュレーションが認められ、インビトロで認められたものと同様のものであった（図１５Ａを参照されたい）。安定化薬を投与したマウスでは、高レベルのＣＤ６９が認められており、このことは、表面発現が高いＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍に反応してさらに活性化していることを示している。最後に、ＣＡＲを注入して７日後に、安定化薬を投与したマウスでは、ビヒクルコントロールを投与したマウスと比較して、全身腫瘍組織量が劇的に減少していた。まとめると、これらのデータは、ＣＡＲ表面発現が、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性に密接に関連しており、したがって、ＲＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞活性が、安定化薬の投与を介して（または、それを欠いて）正確に調節できる、ことを示している。
【０２５６】
本明細書に記載したように、数多くの構成的に発現したＣＡＲは、抗原の非存在下で、持続性シグナル伝達を示し、結果的に、それらを枯渇させる（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１、５８１−５９０（２０１５）を参照されたい）。安定化薬の非存在下でＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を増殖させると、この持続性シグナル伝達が緩和され、その結果、健康的で、かつ、強力なＣＡＲ  Ｔ細胞注入産物を得られるかどうか、について決定をした。持続性シグナル伝達に関する１つの読み取り事項は、抗原の非存在下でのＣＡＲ  ＣＤ３−ゼータドメインの構成的リン酸化である。ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｓ１の存在下で培養したときに、この表現型を示した（図１６、ＣＡＲは常にＯＮ、を参照されたい）。しかしながら、ＣＤ３−ゼータリン酸化は、Ｓ１の非存在下で培養したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞には存在しておらず（ＣＡＲは常にＯＦＦ）、このことは、ＣＡＲ表面発現が小さいと、持続性シグナル伝達を軽減することを示している。当初はＳ１で培養を行ったが、培養の７日目に薬物を除去して認められた、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ３−ゼータリン酸化の欠如から明らかなように、この表現型も可逆的である（図１６、ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７）。
【０２５７】
次に、ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＦＫＢＰを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞における持続性シグナル伝達の予防または逆転が、それらの枯渇表現型を変化させるかどうかを決定した。薬物の存在下で増殖したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲは常にＯＮ）は、複数の阻害性受容体（図１７Ａを参照されたい）、及び、Ｔ細胞枯渇に一般的に関連する転写因子の同時発現を示した（図１７Ｂ）。しかしながら、薬物の非存在下で増殖したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲは常にＯＦＦ）、または、１〜７日目から薬物において増殖したが、その後は増殖をしなかった細胞（ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７）では、枯渇マーカーの共発現が顕著に少なかった（図１７）。同様に、薬物の存在下で増殖した枯渇したＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、文献で認められたものと同様に、高頻度のエフェクターＴ細胞、及び、付随する低頻度の記憶細胞を示した（図１８）（Ｗｈｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５，ｎｒｉ３８６２（２０１５）を参照されたい）。しかしながら、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の記憶における救済は、少なくとも４日間、安定化薬の非存在下で細胞を単純に増殖することで認められており、このことは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性シグナル伝達の緩和により、枯渇を防ぎ、また、記憶形成を促進できる、ことを示している。
【０２５８】
次に、持続性シグナル伝達を緩和したときに認められた劇的な表現型の変化が、Ｔ細胞機能の増強と符合するかどうか、を決定した。このことを試験するために、安定化薬の存在下（ＣＡＲは常にＯＮ）、または、非存在下（ＣＡＲは常にＯＦＦ）のいずれかで、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を増殖させた。枯渇したＣＡＲ  Ｔ細胞の可塑性を調べて再活性化させるために、細胞を、薬物の存在下で、７または１０日間増殖し、その後、薬物を除去してＴ細胞を「休止」させた（それぞれ、ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７、及び、ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ１０）。次に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２４時間、抗原担持腫瘍と共培養し、そして、サイトカイン分泌をＥＬＩＳＡで評価し（図１９）、または、ｉｎｃｕｃｙｔｅで７２時間共培養し、その間に、細胞毒性を評価した（図２０）。重要なことに、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養する条件に関係なく、当該アッセイにおいてＣＡＲ発現の正常化を確実にするために、当該共培養アッセイの１８〜２４時間前に、各条件において薬物を加えた。薬物（ＣＡＲは常にＯＮ）で増殖したＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍に反応して低レベルのＩＬ−２及びＩＦＮγを分泌し（図１９）、そして、枯渇したＴ細胞の表現型と符合する細胞毒性障害を示した（図２０）。逆に、薬物の非存在下で成長したＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜１０倍ものサイトカインを分泌し（図１９）、そして、腫瘍成長を制限することができており（図２０）、このことは、持続性シグナル伝達の軽減が、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を大幅に増強したことを示す。さらに、７または１０日間にわたって持続性シグナル伝達を受けたが、共培養アッセイの前に４〜７日間の「休止」を与えられたＣＡＲ  Ｔ細胞は、機能的に再活性化した（図１９及び２０、ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ７、及び、ＣＡＲ  ＯＦＦ  Ｄ１０）。これらの観察は、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＤＤ−ＣＡＲ発現が低く、かつ、細胞が静止して記憶を形成することができる「休止」の期間の恩恵を受ける、ことを示した。
【０２５９】
インビトロでの機能研究に基づいて、インビボでのＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞発現の切り替えが、慢性抗原曝露を制限し、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を緩和することで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍応答を延長する機会を提供できるかどうかを決定した。このことを試験するために、抗原担持腫瘍細胞をＮＳＧマウスに移植し、その後、２−５Ｅ６  ＨＡ−ＧＤ２．２８ｚ．ＤＨＦＲ発現Ｔ細胞を注入した。その後、マウスに対して、毎日、ＴＭＰを投与した。
【０２６０】
ＤＤ−ＣＡＲを注入すると、急速な抗腫瘍応答が認められたが、最終的には当該疾患が再発してしまい、このことは、当該ＣＡＲ  Ｔ細胞が、機能不全または枯渇し得る、ことを示唆した（図２１を参照されたい）。次いで、マウスに対してビヒクルを、４日間、投与して、ＤＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、回復できる期間を提供した（図２１、「休止」を参照されたい）。この期間において、全身腫瘍組織量は、以前のＴＭＰ投与期間と比較して、より急速に増加しており、このことは、実際のところでは、当該抗腫瘍反応が抑制されていた、ことを示している。ＴＭＰを３日間再注入すると（図２１、「再刺激」）、インビトロで認められたもの（図１９、２０）と同様に、試験したすべてのマウスで、抗腫瘍応答の強力な再活性化が認められた。さらに、３匹の内の２匹のマウスは、ＴＭＰの再注入をした後に、休止期間前よりも全身腫瘍組織量が小さくなっており、このことは、反復薬物投与の利点が、ビヒクル注入の間の腫瘍成長の一時的な加速よりも重要であり得る、ことを示している。
【０２６１】
上記した明細書に記載したすべての刊行物及び特許を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。本発明の範囲及び要旨から逸脱せずに、説明を行った本発明の方法及びシステムに対して様々な修正及び変更を加えることは、当業者には自明である。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明をしてきたが、特許請求の範囲に記載の本発明は、かような特定の実施形態にまで過度に限定されるべきではない、ことを理解されたい。実際のところ、本発明を実施するために記載したモードの様々な修正は、当業者に自明であり、以下の特許請求の範囲内にあることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２５−６】
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【図２５−７】
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【図２５−８】
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【図２５−９】
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【図２５−１０】
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【図２５−１１】
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【図２５−１２】
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【図２５−１３】
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【図２５−１４】
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【図２５−１５】
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【図２５−１６】
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【図２５−１７】
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【図２５−１８】
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【図２５−１９】
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【図２５−２０】
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【図２５−２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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