(57)【要約】オリゴマー（例えば、モルホリノオリゴマー）を調製するための方法が、本明細書において提供される。本明細書において記載されている合成方法は、合成されるオリゴマーの全収率および純度を維持しながら、オリゴマー合成をスケールアップするために有利であり得る。一態様では、ルイス酸触媒を使用して、本明細書に記載の式（Ｉ）のオリゴマー化合物を調製するための方法が、本明細書において提供される。別の態様では、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物を調製するための連続的方法が、本明細書において提供される。
2020535141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のオリゴマー化合物：
【化１５４】
2020535141.tif 000171
であって、式中、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｔは、ＯＨまたは
【化１５５】
2020535141.tif 000172
であり、
各Ｒ２は、各出現について独立して、
【化１５６】
2020535141.tif 000173
からなる群より選択される、式（Ｉ）のオリゴマー化合物
を調製するための方法であって、
（ａ）式（Ａ１）の化合物：
【化１５７】
2020535141.tif 000174
であって、式中、
Ｂは、
【化１５８】
2020535141.tif 000175
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択される、式（Ａ１）の化合物
を、ブロック解除剤と接触させて、式（ＩＩ）の化合物：
【化１５９】
2020535141.tif 000176
であって、式中、Ｂは、
【化１６０】
2020535141.tif 000177
であり、
Ｒ１は、支持媒体である、式（ＩＩ）の化合物
を形成するステップと、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、式（Ａ２）の化合物：
【化１６１】
2020535141.tif 000178
であって、式中、Ｒ５は、
【化１６２】
2020535141.tif 000179
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１６３】
2020535141.tif 000180
からなる群より選択される、式（Ａ２）の化合物
と接触させて、式（Ａ３）の化合物：
【化１６４】
2020535141.tif 000181
であって、式中、
Ｂは、
【化１６５】
2020535141.tif 000182
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ５は、
【化１６６】
2020535141.tif 000183
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１６７】
2020535141.tif 000184
からなる群より選択される、式（Ａ３）の化合物
を形成するステップと、
（ｃ）式（Ａ３）の化合物を、ブロック解除剤と接触させて、式（ＩＶ）の化合物：
【化１６８】
2020535141.tif 000185
であって、式中、Ｂは、
【化１６９】
2020535141.tif 000186
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ６は、
【化１７０】
2020535141.tif 000187
であり、
Ｒ４は、
【化１７１】
2020535141.tif 000188
からなる群より選択される、式（ＩＶ）の化合物
を形成するステップと、
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物を、ルイス酸触媒の存在下、式（Ａ４）の化合物：
【化１７２】
2020535141.tif 000189
であって、式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１７３】
2020535141.tif 000190
からなる群より選択される、式（Ａ４）の化合物
と接触させて、式（Ａ５）の化合物：
【化１７４】
2020535141.tif 000191
であって、式中、Ｒ７は、式（Ａ５ａ）または式（Ａ５ｂ）：
【化１７５】
2020535141.tif 000192
のものであり、
Ｂは、
【化１７６】
2020535141.tif 000193
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１７７】
2020535141.tif 000194
から選択される、式（Ａ５）の化合物
を形成するステップと、
（ｅ）（ｅ１）直前のステップによって形成された生成物を、ブロック解除剤と接触させるステップ、および
（ｅ２）直前のステップによって形成された化合物を、ルイス酸触媒の存在下、式（Ａ８）の化合物：
【化１７８】
2020535141.tif 000195
であって、式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化１７９】
2020535141.tif 000196
からなる群より選択される、式（Ａ８）の化合物
と接触させて、
式（Ａ９）の化合物：
【化１８０】
2020535141.tif 000197
であって、式中、Ｒ８は、
【化１８１】
2020535141.tif 000198
であり、
Ｂは、
【化１８２】
2020535141.tif 000199
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１８３】
2020535141.tif 000200
からなる群より選択される、式（Ａ９）の化合物
を形成するステップ
の逐次的ステップのＹ回繰り返しを実施するステップであって、Ｙは、Ｒ７が式（Ａ５ａ）のものである場合、ｎ−１であるか、またはＹは、Ｒ７が式（Ａ５ｂ）のものである場合、ｎ−２であるステップと、
（ｆ）式（Ａ９）の化合物を、ブロック解除剤と接触させて、式（Ａ１０）の化合物：
【化１８４】
2020535141.tif 000201
であって、式中、Ｒ９は、
【化１８５】
2020535141.tif 000202
であり、
Ｂは、
【化１８６】
2020535141.tif 000203
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１８７】
2020535141.tif 000204
からなる群より選択される、式（Ａ１０）の化合物
を形成するステップと、
（ｇ）式（Ａ１０）の化合物を、開裂剤と接触させて、式（Ａ１１）の化合物：
【化１８８】
2020535141.tif 000205
であって、式中、
Ｒ９は、
【化１８９】
2020535141.tif 000206
であり、
Ｃは、
【化１９０】
2020535141.tif 000207
またはＨであり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１９１】
2020535141.tif 000208
からなる群より選択される、式（Ａ１１）の化合物
を形成するステップと、
（ｈ）式（Ａ１１）の化合物を、脱保護剤と接触させて、式（Ｉ）のオリゴマー化合物を形成するステップと
の逐次的ステップを含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）または（ｅ２）の一方が、直前のステップによって形成された化合物を、キャッピング剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）、（ｃ）、（ｅ１）および（ｆ）が、各ステップのブロック解除された化合物を、中和剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
式（Ａ４）および式（Ａ８）の化合物が、それぞれ独立して、Ｎ−エチルモルホリンおよびジメチルイミダゾリジノンを含む溶液中にある、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記開裂剤が、ジチオトレイトールおよび１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）〜（ｇ）について、Ｂが、
【化１９２】
2020535141.tif 000209
であり、ステップ（ｈ）について、Ｃが、
【化１９３】
2020535141.tif 000210
である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ１）、（ｅ２）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかが、バッチ式合成でまたは連続合成で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
式（Ａ１１）のオリゴマー化合物：
【化１９４】
2020535141.tif 000211
であって、式中、Ｒ９は、
【化１９５】
2020535141.tif 000212
であり、
Ｃは、
【化１９６】
2020535141.tif 000213
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１９７】
2020535141.tif 000214
からなる群より選択される、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物
を調製するための連続的方法であって、
（ａ）ブロック解除剤を、式（Ａ３）の化合物：
【化１９８】
2020535141.tif 000215
であって、式中、Ｂは、
【化１９９】
2020535141.tif 000216
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ５は、
【化２００】
2020535141.tif 000217
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択される、式（Ａ３）の化合物
と、反応容器内で接触させて、式（ＩＶ）の化合物：
【化２０１】
2020535141.tif 000218
であって、式中、Ｂは、
【化２０２】
2020535141.tif 000219
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ６は、
【化２０３】
2020535141.tif 000220
である、式（ＩＶ）の化合物
を形成するステップと、
（ｂ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を前記反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｃ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、洗浄溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、カップリング溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｅ）前記反応容器に、ルイス酸および式（Ａ４）の化合物：
【化２０４】
2020535141.tif 000221
であって、式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化２０５】
2020535141.tif 000222
からなる群より選択される、式（Ａ４）の化合物
を導入し、それにより、式（Ａ４）の化合物が、式（ＩＶ）の化合物と接触して、式（Ａ５）の化合物：
【化２０６】
2020535141.tif 000223
であって、式中、Ｒ７は、式（Ａ５ａ）または式（Ａ５ｂ）：
【化２０７】
2020535141.tif 000224
のものであり、
Ｂは、
【化２０８】
2020535141.tif 000225
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化２０９】
2020535141.tif 000226
から選択される、式（Ａ５）の化合物
を形成するようにするステップと、
（ｆ）式（Ａ５）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、カップリング溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｇ）（ｇ１）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、洗浄溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ２）ブロック解除剤を前記反応容器に導入し、それにより、それが直前のステップによって形成された生成物と接触するようにするステップ、
（ｇ３）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を前記反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ４）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、洗浄溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ５）直前のステップによって形成された生成物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、前記洗浄するステップが、カップリング溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ６）直前のステップによって形成された生成物を含有する前記反応容器に、ルイス酸および式（Ａ８）の化合物：
【化２１０】
2020535141.tif 000227
であって、式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化２１１】
2020535141.tif 000228
からなる群より選択される、式（Ａ８）の化合物
を導入し、それにより、式（Ａ８）の化合物が、直前のステップによって形成された化合物と接触して、式（Ａ９）の化合物：
【化２１２】
2020535141.tif 000229
であって、式中、Ｒ８は、
【化２１３】
2020535141.tif 000230
であり、
Ｂは、
【化２１４】
2020535141.tif 000231
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化２１５】
2020535141.tif 000232
からなる群より選択される、式（Ａ９）の化合物
を形成するようにするステップ
の逐次的ステップのＹ回繰り返しを実施するステップであって、Ｙは、ｎ−１であるステップと、
（ｈ）式（Ａ９）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄して、式（Ａ８）の化合物を除去するステップであって、前記洗浄するステップが、カップリング溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｉ）式（Ａ９）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄して、前記カップリング溶媒を除去するステップであって、前記洗浄するステップが、洗浄溶媒を前記反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｊ）ブロック解除剤を、式（Ａ９）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１０）の化合物：
【化２１６】
2020535141.tif 000233
であって、式中、Ｒ９は、
【化２１７】
2020535141.tif 000234
であり、
Ｂは、
【化２１８】
2020535141.tif 000235
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化２１９】
2020535141.tif 000236
からなる群より選択される、式（Ａ１０）の化合物
を形成するステップと、
（ｋ）開裂剤を、式（１０）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１１）の化合物を形成するステップと
の逐次的ステップを含む、方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）が、各それぞれのステップのブロック解除された化合物を、中和剤と接触させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄溶媒が、ハロゲン化溶媒である、請求項８から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カップリング溶媒が、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはＮ−メチル−２−ピロリドンである、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）〜（ｊ）について、Ｂが、
【化２２０】
2020535141.tif 000237
であり、ステップ（ｋ）について、Ｃが、
【化２２１】
2020535141.tif 000238
である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ１）、（ｇ２）、（ｇ３）、（ｇ４）、（ｇ５）、（ｇ６）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）のいずれかが、必要に応じてバッチ式方法で行われる、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、フロースルー反応器内で実施され、前記フロースルー反応器が、少なくとも、
（ａ）それぞれポンプが装備された１つまたは複数の供給ラインを備え、前記供給ラインの入口ゾーンが、中和剤、カップリング溶媒、ブロック解除剤、洗浄溶媒および式（Ａ８）の化合物：
【化２２２】
2020535141.tif 000239
であって、式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化２２３】
2020535141.tif 000240
からなる群より選択される、式（Ａ８）の化合物
を含む容器に独立して接続されており、式（Ａ８）の化合物が、カップリング溶媒に溶解されている、供給ゾーンと、
（ｂ）前記１つまたは複数の供給ラインの出口ゾーンに接続されており、ＰＭＯ合成樹脂を含有する、反応ゾーンと、
（ｃ）廃棄物ストリームまたは生成物が独立して収集され得る出口ゾーンと、
（ｄ）圧力制御デバイスと、
（ｅ）前記供給ゾーンおよび前記反応ゾーンの温度を独立して制御する手段と
を備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記フロースルー反応器が、エテプリルセンの調製に使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ブロック解除剤が、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
各ステップにおいて使用される前記ブロック解除剤が、ハロゲン化酸を含む溶液である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ルイス酸が、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩおよびＬｉＯＴｆからなる群より選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記中和剤が、ハロゲン化溶媒およびイソプロピルアルコールを含む溶液中にある、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記中和剤が、モノアルキル、ジアルキルまたはトリアルキルアミンである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５６２，７４１号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス技術は、選択的スプライス産物を含む１つまたは複数の特異的な遺伝子産物の発現をモジュレートするための手段を提供し、いくつかの治療的、診断的および研究適用において独自に有用である。アンチセンス技術の背後にある原理は、標的核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチドが、いくつかのアンチセンス機構のいずれか１つを通して、転写、スプライシングまたは翻訳等の遺伝子発現活性をモジュレートすることである。アンチセンス化合物の配列特異性は、それらを、標的検証および遺伝子機能化のためのツール、ならびに疾患に関与する遺伝子の発現を選択的にモジュレートするための治療薬として、魅力的なものにする。
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現における欠陥によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２００万個を超えるヌクレオチドにわたって広がる７９のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させる、あるいは停止コドンを導入する、あるいはフレームエクソン（単数または複数）の全体的な除去または１つもしくは複数のエクソンの複製により特徴付けられる、あらゆるエクソンの変異が、ＤＭＤをもたらす機能性ジストロフィンの産生を妨害する可能性を有する。
【０００４】
ＤＭＤの処置のためにスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の安全性および有効性を試験する最近の臨床試験は、スプライソソームの立体的遮断によってプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導するためのＳＳＯ技術に基づく（Ｃｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｋｉｎａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。しかしながら、これらの成功にもかかわらず、ＤＭＤを処置するために利用可能な薬理学的選択肢は限定されている。
【０００５】
エテプリルセンは、リードフレームを回復し、機能性のより短い形態のジストロフィンタンパク質を産生するエクソン５１スキッピングを受容可能なＤＭＤを有する患者において、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１をスキップするように設計されたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。エテプリルセンは、ＤＭＤの処置のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認を受けている。
【０００６】
アンチセンス技術の分野においては著しい進歩が為されてきたが、当該技術分野において、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを調製する方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を調製するための方法が、本明細書において提供される。本明細書において記載されている合成方法は、合成されるＰＭＯの全収率および純度を維持しながら、ルイス酸触媒を使用する効率的なＰＭＯ合成を可能にする。フロースルーＰＭＯ合成手順が本明細書においてさらに提供される。
【０００８】
したがって、一態様では、ルイス酸触媒を使用して、式（Ｉ）のオリゴマー化合物：
【化１】
2020535141.tif 000003
を調製するための方法が、本明細書において提供される。
【０００９】
別の態様では、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物：
【化２】
2020535141.tif 000004
を調製するための連続的方法が、本明細書において提供される。
【００１０】
ある実施形態では、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物を調製するための連続的方法は、フロースルー反応器内で実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、９０℃、１００℃、１１０℃および１５０℃における、ＬｉＢｒを加えたまたは加えないアデノシンモノマーの安定性を示す。
【図２】図２は、樹脂結合ＰＭＯの安定性を示す。
【図３】図３は、Ａ）コリジンＴＦＡ、Ｂ）ルチジンＴＦＡ、Ｃ）ピリジンＴＦＡ、およびＤ）４−シアノピリジンＴＦＡを使用する、９０℃での脱トリチル化を示す。
【図４】図４は、流動ＰＭＯ合成装置の完全な概略図を示す。
【図５−１】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、モデルテトラマー５’−テイル−ＡＣＧＴ−３’−Ｔｒｔの合成のための全イオンクロマトグラムを示す。
【図５−２】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、モデルテトラマー５’−テイル−ＡＣＧＴ−３’−Ｔｒｔの合成のための全イオンクロマトグラムを示す。
【図５−３】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、モデルテトラマー５’−テイル−ＡＣＧＴ−３’−Ｔｒｔの合成のための全イオンクロマトグラムを示す。
【図６Ａ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、エテプリルセン（１〜１０）の合成のための全イオンクロマトグラムを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルも示されている。
【図６Ｂ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、エテプリルセン（１〜１０）の合成のための全イオンクロマトグラムを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルも示されている。
【図６Ｃ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、エテプリルセン（１〜１０）の合成のための全イオンクロマトグラムを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルも示されている。
【図６Ｄ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、エテプリルセン（１〜１０）の合成のための全イオンクロマトグラムを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルも示されている。
【図６Ｅ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、エテプリルセン（１〜１０）の合成のための全イオンクロマトグラムを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルも示されている。
【図７】図７は、３つのポートを有する区分された試薬リザーバー上端のレンダリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
アンチセンス療法への適用に有用なモルホリノオリゴマーを調製するための方法が、本明細書において提供される。アンチセンス療法は、重篤な遺伝性疾患およびウイルス感染症を処置するための魅力的なルートである。アンチセンス治療薬は、相補的なワトソン−クリック塩基対合を介してｍＲＮＡに結合し、選択的スプライシングまたは翻訳の阻害を引き起こして、変更されたタンパク質またはタンパク質レベルの低減をもたらす、合成核酸塩基ポリマーである（Ｓ．  Ｃｉｒａｋ，  Ｖ．  Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ，  Ｍ．  Ｇｕｇｌｉｅｒｉ，  Ｌ．  Ｆｅｎｇ，  Ｓ．  Ｔｏｒｅｌｌｉ，  Ｋ．  Ａｎｔｈｏｎｙ，  Ｓ．  Ａｂｂｓ，  Ｍ．  Ｅ．  Ｇａｒｒａｌｄａ，  Ｊ．  Ｂｏｕｒｋｅ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｗｅｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１１，  ３７８，  ５９５−６０５）（Ｊ．  Ｈ．  Ｃｈａｎ，  Ｓ．  Ｌｉｍ，  Ｗ．  Ｆ．  Ｗｏｎｇ，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００６，  ３３，  ５３３−５４０）。このようにして、重大なウイルスタンパク質を不活性化させることができるか、致死的なフレームシフト変異を有するエクソンを切除して機能的な短縮されたタンパク質を産出することができるか、または発癌性遺伝子発現を抑制することができる。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）は、ＲＮＡの５員リボシル環が６員モルホリノ環で置き換えられており、ホスフェート連結が非荷電ホスホロジアミデートで置き換えられている、アンチセンス治療薬のクラスである（Ｊ．  Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，  Ｄ．  Ｗｅｌｌｅｒ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  １９９７，  ７，  １８７−１９５）。これらの修飾は、ＰＭＯをヌクレアーゼに対して耐性に（Ｒ．  Ｍ．  Ｈｕｄｚｉａｋ，  Ｅ．  Ｂａｒｏｆｓｋｙ，  Ｄ．  Ｆ．  Ｂａｒｏｆｓｋｙ，  Ｄ．  Ｌ．  Ｗｅｌｌｅｒ，  Ｓ．−Ｂ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｗｅｌｌｅｒ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  １９９６，  ６，  ２６７−２７２）、おそらく、裸のＲＮＡよりも細胞透過性にする（Ｖ．  Ａｒｏｒａ，  Ｄ．  Ｃ．  Ｋｎａｐｐ，  Ｍ．  Ｔ．  Ｒｅｄｄｙ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｗｅｌｌｅｒ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ２００２，  ９１，  １００９−１０１８）。ＰＭＯ−Ｘ（商標）として公知の第２世代構造的類似体およびＰＰＭＯとして公知のペプチド−ＰＭＯコンジュゲートを含むいくつかのＰＭＯが、現在調査中である。ファーストインクラスのデュシェンヌ型筋ジストロフィー薬、Ｅｘｏｎｄｙｓ  ５１（商標）（エテプリルセン）がＦＤＡによって最近承認され（Ｃ．  Ａ．  Ｓｔｅｉｎ，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１６，  ２４，  １８８４−１８８５）、デング熱（Ｋ．  Ｌ．  Ｈｏｌｄｅｎ，  Ｄ．  Ａ．  Ｓｔｅｉｎ，  Ｔ．  Ｃ．  Ｐｉｅｒｓｏｎ，  Ａ．  Ａ．  Ａｈｍｅｄ，  Ｋ．  Ｃｌｙｄｅ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  Ｅ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６，  ３４４，  ４３９−４５２）、マールブルグ熱（Ｐ．  Ｌ．  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  Ｔ．  Ｋ．  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｗｅｌｌｓ，  Ｎ．  Ｌ．  Ｇａｒｚａ，  Ｄ���  Ｖ  Ｍｏｕｒｉｃｈ，  Ｌ．  Ｓ．  Ｗｅｌｃｈ，  Ｒ．  Ｇ．  Ｐａｎｃｈａｌ，  Ｓ．  Ｂａｖａｒｉ，  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０１２，  ４，  ２８０６−３０）、エボラ（Ｐ．  Ｌ．  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  Ｔ．  Ｋ．  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｗｅｌｌｓ，  Ｎ．  Ｌ．  Ｇａｒｚａ，  Ｄ．  Ｖ  Ｍｏｕｒｉｃｈ，  Ｌ．  Ｓ．  Ｗｅｌｃｈ，  Ｒ．  Ｇ．  Ｐａｎｃｈａｌ，  Ｓ．  Ｂａｖａｒｉ，  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０１２，  ４，  ２８０６−３０）、およびインフルエンザウイルス感染症（Ｑ．  Ｇｅ，  Ｍ．  Ｐａｓｔｅｙ，  Ｄ．  Ｋｏｂａｓａ，  Ｐ．  Ｐｕｔｈａｖａｔｈａｎａ，  Ｃ．  Ｌｕｐｆｅｒ，  Ｒ．  Ｋ．  Ｂｅｓｔｗｉｃｋ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  Ｊ．  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ａ．  Ｓｔｅｉｎ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２００６，  ５０，  ３７２４−３３）の処置のために試験が進行中である。
【００１３】
潜在的な疾患標的の広さにもかかわらず、ＰＭＯの長期にわたる調製は、それらの探査および適用を限定する。この問題を緩和し、これらの組成物の効率的な同定および産生を可能にするために、ルイス酸を使用する効率的なＰＭＯ合成、およびフロースルーＰＭＯ合成手順が、本明細書において提供される。
【００１４】
定義
本開示を記載するために使用される種々の用語の定義を、以下に列挙する。これらの定義は、具体的な事例において別段限定されない限り、個々にまたはより大きい群の一部としてのいずれかで、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用される場合の用語に当てはまる。
【００１５】
「塩基保護された」または「塩基保護」は、段階的オリゴマー合成中における塩基対合基の反応または干渉を防止するために好適な保護基による、モルホリノサブユニット上の塩基対合基、例えば、プリンまたはピリミジン塩基の保護を指す。（塩基保護されたモルホリノサブユニットの例は、以下で示されるシトシンアミノ基上にＣＢＺ保護基を有する活性化Ｃサブユニット化合物（Ｃ）である。）
【００１６】
「活性化ホスホルアミデート基」は、典型的には、オリゴマーにおいて、最終的なホスホロジアミデート連結で窒素における望ましい置換を有するクロロホスホルアミデート基である。例は、（ジメチルアミノ）クロロホスホルアミデート、すなわち、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｃｌである。
【００１７】
用語「支持体結合」は、支持媒体に共有結合的に連結している化学実体を指す。
【００１８】
用語「支持媒体」は、その上でオリゴマーが付着もしくは合成され得る、またはオリゴマーの付着または合成のために修飾され得る、例えば、任意の粒子、ビーズまたは表面を含む、任意の材料を指す。代表的な基材は、無機支持体および有機支持体、例えば、ガラスおよび修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）等を含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカまたはシリコンおよび変性シリコンを含むシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、ならびに様々な他のポリマーを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態に特に有用な支持媒体および固体表面は、フロースルー反応器内に位置する。本明細書において記載されている方法の一部の実施形態では、支持媒体は、１％架橋ジビニルベンゼンを含むポリスチレンを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、代表的な支持媒体は、オリゴマーの付着または合成のための少なくとも１つの反応性部位を含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の支持媒体は、入来サブユニットまたはオリゴマーを付着もしくは合成するための他の活性化基と化学結合を形成することができる、１つまたは複数の末端アミノまたはヒドロキシル基を含む。
【００２０】
本明細書において記載されている方法に適している一部の代表的な支持媒体は、下記を含むがこれらに限定されない：制御細孔ガラス（ＣＰＧ）；オキサリル制御細孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１，  １９，  １５２７を参照）；多孔質ガラスビーズならびにトリクロロ−［３−（４−クロロメチル）フェニル］プロピルシランおよび多孔質ガラスビーズの反応によって形成されたようなシリカゲル等のシリカ含有粒子（Ｐａｒｒ  ａｎｄ  Ｇｒｏｈｍａｎｎ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌ．  Ｅｄ．  １９７２，  １１，  ３１４を参照、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  Ｍａｓｓ．，  ＵＳＡによって登録商標「ＰＯＲＡＳＩＬ  Ｅ」の下販売される）；１，４−ジヒドロキシメチルベンゼンおよびシリカのモノエステル（Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９７０，  ４５０３を参照、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによって登録商標「ＢＩＯＰＡＫ」の下販売される）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９３，  ３４，  ３３７３を参照）；架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマービーズマトリックス、またはＰＯＲＯＳ、ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）；ポリエチレングリコールＰＥＧ等の可溶性の支持媒体（Ｂｏｎｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２０００，  ４，  ２２５−２３１を参照）；ペンダント長鎖ポリスチレン（ＰＳ）グラフトを有するポリエチレン（ＰＥ）フィルムである、ＰＥＰＳ支持体（Ｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，１９８９，  １１１，  ８０２４および国際特許出願第ＷＯ１９９０／０２７４９号を参照）；公知の量のＮ−ｔｅｒｔブトキシカルボニル−ベータ−アラニル−Ｎ’−アクリロイルヘキサメチレンジアミンを含む、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンと架橋されたジメチルアクリルアミドのコポリマー（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９７５，  ９７，  ６５８４，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９７９，  ８，  ３５１およびＪ．  Ｃ．  Ｓ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ  ５３８  （１９８１）を参照）；疎水性架橋スチレンポリマーでコーティングされたガラス粒子（Ｓｃｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  Ｓｃｉ．，  １９７１，  ９，  ５７７を参照）；ポリスチレンがグラフトされたフッ素化エチレンポリマー（Ｋｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｉｓｒａｅｌ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  １９７８，  １７，  ２４３およびｖａｎ  Ｒｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９７４，  Ｙ．  Ｗｏｌｍａｎ，  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７５，  ｐｐ．  １１３−１１６を参照）；ヒドロキシプロピルアクリレートコーティングしたポリプロピレン膜（Ｄａｎｉｅｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９��９，  ４３４５）；アクリル酸グラフトされたポリエチレンロッド（Ｇｅｙｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８４，  ８１，  ３９９８）；伝統的に使用されるポリマービーズを含有する「ティーバッグ」（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８５，  ８２，  ５１３１）；ならびにそれらの組合せ。
【００２１】
用語「フロースルー反応器」は、それを横切って１つまたは複数の流体試薬（例えば、液体またはガス）が流れ得る表面（例えば、固体表面）を備えるチャンバーを指す。ある実施形態では、チャンバーは、接合ミキサー、混合容器、コイル反応器、管反応器、スピニングディスク反応器、スピニング管反応器、多重セル流反応器、振動流反応器、または微小反応器であり得るがこれらに限定されない。さらなる実施形態では、チャンバーは、固体支持された化学反応物を含有する。特定の実施形態では、固体支持された化学反応物は、フィルターによってチャンバー内に閉じ込められる。
【００２２】
用語「ブロック解除剤」は、保護基を除去するための化学酸または化学酸の組合せを含む組成物（例えば、溶液）を指す。ブロック解除剤において使用される例示的な化学酸は、ハロゲン化酸、例えば、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸を含む。一部の実施形態では、ブロック解除剤は、例えば、オリゴマー、支持体結合オリゴマー、支持体結合サブユニット、または他の保護された窒素もしくは酸素部分から、１つまたは複数のトリチル基を除去する。
【００２３】
用語「ハロゲン」および「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素からなる群より選択される原子を指す。
【００２４】
用語「キャッピング剤」は、入来サブユニットまたは他の活性化基と化学結合を形成する例えば支持媒体の反応性部位をブロックするために有用な、酸無水物（例えば、安息香酸無水物、無水酢酸、フェノキシ酢酸無水物等）を含む組成物（例えば、溶液）を指す。
【００２５】
用語「開裂剤」は、例えば、支持体結合オリゴマーを支持媒体から開裂するために有用な、化学塩基（例えば、アンモニアまたは１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン）または化学塩基の組合せを含む組成物（例えば、液体溶液またはガス状混合物）を指す。
【００２６】
用語「脱保護剤」は、保護基を除去するために有用な、化学塩基（例えば、アンモニア、１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エンまたは炭酸カリウム）または化学塩基の組合せを含む組成物（例えば、液体溶液またはガス状混合物）を指す。例えば、脱保護剤は、一部の実施形態では、塩基保護を、例えば、モルホリノサブユニット、モルホリノオリゴマーのモルホリノサブユニット、またはそれらの支持体結合バージョンから除去することができる。
【００２７】
用語「溶媒」は、溶質が溶解される溶液または混合物の成分を指す。溶媒は、無機または有機（例えば、酢酸、アセトン、アセトニトリル、アセチルアセトン、２−アミノエタノール、アニリン、アニソール、ベンゼン、ベンゾニトリル、ベンジルアルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉ−ブタノール、２−ブタノン、ｔ−ブチルアルコール、二硫化炭素、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルアミン、ジエチレングリコール、ジグリム、ジメトキシエタン（グリム）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ジメチルホルムアミド、フタル酸ジメチル、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、エタノール、エーテル、酢酸エチル、アセト酢酸エチル、安息香酸エチル、エチレングリコール、グリセリン、ヘプタン、１−ヘプタノール、ヘキサン、１−ヘキサノール、メタノール、酢酸メチル、メチルｔ−ブチルエーテル、塩化メチレン、１−オクタノール、ペンタン、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−ペンタノン、３−ペンタノン、１−プロパノール、２−プロパノール、ピリジン、テトラヒドロフラン、トルエン、水、ｐ−キシレン）であってよい。
【００２８】
語句「モルホリノオリゴマー」および「ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’−環外炭素に接合するホスホロジアミデート連結によって一緒に連結しているモルホリノサブユニットを有するオリゴマーを指す。各モルホリノサブユニットは、標的における核酸塩基に核酸塩基特異的水素結合によって結合するために有効な核酸塩基対合部分を含む。
【００２９】
用語「ＥＧ３テイル」は、例えばその３’または５’末端でオリゴマーにコンジュゲートされたトリエチレングリコール部分を指す。例えば、一部の実施形態では、オリゴマーの３’末端にコンジュゲートされた「ＥＧ３テイル」は、構造：
【化３】
2020535141.tif 000005
のものであり得る。
【００３０】
用語「約」または「およそ」は、概して、関連対象分野の当業者には、ある特定の状況を除いて、所与の値または範囲の±１０％以内または±５％以内を意味し得ると理解されている。
【００３１】
バッチ式または高速流動手順でモルホリノオリゴマーを調製するための方法
ルイス酸を使用する効率的なＰＭＯ合成が、本明細書において提供される。フロースルーＰＭＯ合成手順（本明細書においては、「連続合成」または「高速流動合成」とも称される）も、本明細書において提供される。
【００３２】
合成は、概して、支持媒体上で本明細書において記載されている通りに行われる。ある実施形態では、支持媒体に最初に付着される第１のシントン（例えば、モルホリノサブユニット等のモノマー）が、本明細書において提供され、次いで、オリゴマーは、ルイス酸触媒の存在下、サブユニットを支持体結合シントンに逐次的にカップリングさせることによって合成される。この反復伸長は、結局は、最終オリゴマー化合物をもたらす。この方法は、本明細書において記載されている高速流動合成を介して為され得る。高速流動の利点は、より速い反応、迅速な最適化、より清浄な生成物、簡単なスケールアップ、より安全な反応、および典型的には別個の方法の統合である。
【００３３】
好適な支持媒体は、可溶性もしくは不溶性であり得、または、成長する支持体結合ポリマーが所望の通りに溶液を出入りできるようにする、異なる溶媒中での可変溶解度を保有し得る。伝統的な支持媒体は、ほとんどの部分が不溶性であり、日常的に反応容器内に入れられ、その間、試薬および溶媒は、オリゴマーが標的長さに達するまで成長鎖と反応し、および／またはそれを洗浄し、その後、それを支持体から開裂し、必要ならば、さらにワークアップして、最終ポリマー化合物を産生する。より最近のアプローチは、可溶性ポリマー支持体を含む可溶性支持体を導入して、合成における所望の時点で反復合成された生成物を沈殿させることおよび溶解することを可能にした（Ｇｒａｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，  １９９７，  ９７，４８９−５１０）。
【００３４】
モルホリノオリゴマーを調製するための方法も、本明細書において提供される。
【００３５】
したがって、一態様では、式（Ｉ）のオリゴマー化合物：
【化４】
2020535141.tif 000006
［式中、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｔは、ＯＨまたは
【化５】
2020535141.tif 000007
であり、
各Ｒ２は、各出現について独立して、
【化６】
2020535141.tif 000008
からなる群より選択される］
を調製するための方法であって、
（ａ）式（Ａ１）の化合物：
【化７】
2020535141.tif 000009
［式中、
Ｂは、
【化８】
2020535141.tif 000010
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択される］
を、ブロック解除剤と接触させて、式（ＩＩ）の化合物：
【化９】
2020535141.tif 000011
［式中、Ｂは、
【化１０】
2020535141.tif 000012
であり、
Ｒ１は、支持媒体である］
を形成するステップと、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、式（Ａ２）の化合物：
【化１１】
2020535141.tif 000013
［式中、Ｒ５は、
【化１２】
2020535141.tif 000014
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１３】
2020535141.tif 000015
からなる群より選択される］
と接触させて、式（Ａ３）の化合物：
【化１４】
2020535141.tif 000016
［式中、
Ｂは、
【化１５】
2020535141.tif 000017
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ５は、
【化１６】
2020535141.tif 000018
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１７】
2020535141.tif 000019
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｃ）式（Ａ３）の化合物を、ブロック解除剤と接触させて、式（ＩＶ）の化合物：
【化１８】
2020535141.tif 000020
［式中、Ｂは、
【化１９】
2020535141.tif 000021
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ６は、
【化２０】
2020535141.tif 000022
であり、
Ｒ４は、
【化２１】
2020535141.tif 000023
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物を、ルイス酸触媒の存在下、式（Ａ４）の化合物：
【化２２】
2020535141.tif 000024
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化２３】
2020535141.tif 000025
からなる群より選択される］
と接触させて、式（Ａ５）の化合物：
【化２４】
2020535141.tif 000026
［式中、Ｒ７は、式（Ａ５ａ）または式（Ａ５ｂ）：
【化２５】
2020535141.tif 000027
のものであり、
Ｂは、
【化２６】
2020535141.tif 000028
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化２７】
2020535141.tif 000029
から選択される］
を形成するステップと、
（ｅ）（ｅ１）直前のステップによって形成された生成物を、ブロック解除剤と接触させるステップ、および
（ｅ２）直前のステップによって形成された化合物を、ルイス酸触媒の存在下、式（Ａ８）の化合物：
【化２８】
2020535141.tif 000030
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化２９】
2020535141.tif 000031
からなる群より選択される］
と接触させて、式（Ａ９）の化合物：
【化３０】
2020535141.tif 000032
［式中、Ｒ８は、
【化３１】
2020535141.tif 000033
であり、
Ｂは、
【化３２】
2020535141.tif 000034
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化３３】
2020535141.tif 000035
からなる群より選択される］
を形成するステップ
の逐次的ステップのＹ回繰り返しを実施するステップであって、Ｙは、Ｒ７が式（Ａ５ａ）のものである場合、ｎ−１であるか、またはＹは、Ｒ７が式（Ａ５ｂ）のものである場合、ｎ−２であるステップと、
（ｆ）式（Ａ９）の化合物を、ブロック解除剤と接触させて、式（Ａ１０）の化合物：
【化３４】
2020535141.tif 000036
［式中、Ｒ９は、
【化３５】
2020535141.tif 000037
であり、
Ｂは、
【化３６】
2020535141.tif 000038
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化３７】
2020535141.tif 000039
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｇ）式（Ａ１０）の化合物を、開裂剤と接触させて、式（Ａ１１）の化合物：
【化３８】
2020535141.tif 000040
［式中、
Ｒ９は、
【化３９】
2020535141.tif 000041
であり、
Ｃは、
【化４０】
2020535141.tif 000042
またはＨであり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化４１】
2020535141.tif 000043
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｈ）式（Ａ１１）の化合物を、脱保護剤と接触させて、式（Ｉ）のオリゴマー化合物を形成するステップと
の逐次的ステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３６】
ある実施形態では、ステップ（ｄ）または（ｅ２）の一方は、直前のステップによって形成された化合物を、キャッピング剤と接触させるステップをさらに含む。
【００３７】
別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｃ）、（ｅ１）または（ｆ）の少なくとも１つは、ブロック解除された化合物を、中和剤と接触させるステップをさらに含む。
【００３８】
さらに別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｃ）、（ｅ１）および（ｆ）は、各ステップのブロック解除された化合物を、中和剤と接触させるステップをさらに含む。
【００３９】
別の実施形態では、ブロック解除するステップは、室温〜１１０℃の間で実行される。
【００４０】
さらに別の実施形態では、ブロック解除するステップは、５０℃〜１００℃の間で実行される。
【００４１】
特定の実施形態では、ブロック解除するステップは、７０℃〜９０℃の間で実行される。
【００４２】
ある実施形態では、キャッピング剤は、Ｎ−エチルモルホリンおよびメチルピロリジノンを含む溶液中にある。
【００４３】
別の実施形態では、キャッピング剤は、酸無水物である。
【００４４】
特定の実施形態では、キャッピング剤は、安息香酸無水物である。
【００４５】
ある実施形態では、式（Ａ４）および式（Ａ８）の化合物は、それぞれ独立して、Ｎ−エチルモルホリンおよびジメチルイミダゾリジノンを含む溶液中にある。
【００４６】
別の実施形態では、開裂剤は、ジチオトレイトールおよび１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを含む。
【００４７】
さらに別の実施形態では、開裂剤は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを含む溶液中にある。
【００４８】
別の実施形態では、脱保護剤は、ＮＨ３を含む。
【００４９】
さらなる実施形態では、脱保護剤は、水溶液中にある。
【００５０】
ある実施形態では、支持媒体は、１％架橋ジビニルベンゼンを含むポリスチレンを含む。
【００５１】
ある実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｇ）において、Ｂは、
【化４２】
2020535141.tif 000044
であり、ステップ（ｈ）において、Ｃは、
【化４３】
2020535141.tif 000045
である。
【００５２】
別の実施形態では、方法は、バッチ式合成でまたは連続合成で行われる。
【００５３】
さらに別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ１）、（ｅ２）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかは、バッチ式合成でまたは連続合成で行われる。
【００５４】
特定の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｇ）および（ｈ）は、バッチ式合成で行われ、ステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｅ１）、（ｅ２）および（ｆ）は、連続合成で行われる。
【００５５】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、ハロゲン化酸を含む溶液である。
【００５６】
別の実施形態では、ブロック解除剤は、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される。
【００５７】
特定の実施形態では、ブロック解除剤は、トリフルオロ酢酸である。
【００５８】
ある実施形態では、ルイス酸は、カップリング溶媒に可溶性である。
【００５９】
別の実施形態では、ルイス酸は、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩおよびＬｉＯＴｆからなる群より選択される。
【００６０】
特定の実施形態では、ルイス酸は、ＬｉＢｒである。
【００６１】
ある実施形態では、中和剤は、ハロゲン化溶媒およびイソプロピルアルコールを含む溶液中にある。
【００６２】
別の実施形態では、ハロゲン化溶媒は、ジクロロメタンまたはジクロロエタンである。
【００６３】
さらに別の実施形態では、中和剤は、モノアルキル、ジアルキルまたはトリアルキルアミンである。
【００６４】
別の実施形態では、中和剤は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。
【００６５】
別の実施形態では、中和剤は、Ｎ−エチルモルホリンである。
【００６６】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【００６７】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【００６８】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【００６９】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【００７０】
モルホリノオリゴマーを調製するための連続的方法
モルホリノオリゴマーを調製するための連続的（フロースルー）方法が、本明細書において提供される。
【００７１】
したがって、ある態様では、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物：
【化４４】
2020535141.tif 000046
［式中、Ｒ９は、
【化４５】
2020535141.tif 000047
であり、
Ｃは、
【化４６】
2020535141.tif 000048
またはＨであり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化４７】
2020535141.tif 000049
からなる群より選択される］
を調製するための連続的方法であって、
（ａ）ブロック解除剤を、式（Ａ３）の化合物：
【化４８】
2020535141.tif 000050
［式中、Ｂは、
【化４９】
2020535141.tif 000051
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ５は、
【化５０】
2020535141.tif 000052
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化５１】
2020535141.tif 000053
からなる群より選択される］
と、反応容器内で接触させて、式（ＩＶ）の化合物：
【化５２】
2020535141.tif 000054
［式中、Ｂは、
【化５３】
2020535141.tif 000055
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ６は、
【化５４】
2020535141.tif 000056
であり、
Ｒ４は、
【化５５】
2020535141.tif 000057
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｂ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｃ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｅ）反応容器に、ルイス酸および式（Ａ４）の化合物：
【化５６】
2020535141.tif 000058
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化５７】
2020535141.tif 000059
からなる群より選択される］
を導入し、それにより、式（Ａ４）の化合物が、式（ＩＶ）の化合物と接触して、式（Ａ５）の化合物：
【化５８】
2020535141.tif 000060
［式中、Ｒ７は、式（Ａ５ａ）または式（Ａ５ｂ）：
【化５９】
2020535141.tif 000061
のものであり、
Ｂは、
【化６０】
2020535141.tif 000062
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化６１】
2020535141.tif 000063
から選択される］
を形成するようにするステップと、
（ｆ）式（Ａ５）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｇ）（ｇ１）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ２）ブロック解除剤を反応容器に導入し、それにより、それが直前のステップによって形成された生成物と接触するようにするステップ、
（ｇ３）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ４）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ５）直前のステップによって形成された生成物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ６）直前のステップによって形成された生成物を含有する反応容器に、ルイス酸および式（Ａ８）の化合物：
【化６２】
2020535141.tif 000064
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化６３】
2020535141.tif 000065
からなる群より選択される］
を導入し、それにより、式（Ａ８）の化合物が、直前のステップによって形成された化合物と接触して、式（Ａ９）の化合物：
【化６４】
2020535141.tif 000066
［式中、Ｒ８は、
【化６５】
2020535141.tif 000067
であり、
Ｂは、
【化６６】
2020535141.tif 000068
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化６７】
2020535141.tif 000069
からなる群より選択される］
を形成するようにするステップ
の逐次的ステップのＹ回繰り返しを実施するステップであって、Ｙは、Ｒ７が式（Ａ５ａ）のものである場合、ｎ−１であるか、またはＹは、Ｒ７が式（Ａ５ｂ）のものである場合、ｎ−２であるステップと、
（ｈ）式（Ａ９）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄して、式（Ａ８）の化合物を除去するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｉ）式（Ａ９）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄して、カップリング溶媒を除去するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｊ）ブロック解除剤を、式（Ａ９）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１０）の化合物：
【化６８】
2020535141.tif 000070
［式中、Ｒ９は、
【化６９】
2020535141.tif 000071
であり、
Ｂは、
【化７０】
2020535141.tif 000072
であり、
ｎは、１０〜４０の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化７１】
2020535141.tif 000073
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｋ）開裂剤を、式（１０）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１１）の化合物を形成するステップと
の逐次的ステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００７２】
ある実施形態では、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物：
【化７２】
2020535141.tif 000074
［式中、Ｒ９は、
【化７３】
2020535141.tif 000075
であり、
Ｃは、
【化７４】
2020535141.tif 000076
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化７５】
2020535141.tif 000077
からなる群より選択される］
を調製するための連続的方法であって、
（ａ）ブロック解除剤を、式（Ａ３）の化合物：
【化７６】
2020535141.tif 000078
［式中、Ｂは、
【化７７】
2020535141.tif 000079
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ５は、
【化７８】
2020535141.tif 000080
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択される］
と、反応容器内で接触させて、式（ＩＶ）の化合物：
【化７９】
2020535141.tif 000081
［式中、Ｂは、
【化８０】
2020535141.tif 000082
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ６は、
【化８１】
2020535141.tif 000083
である］
を形成するステップと、
（ｂ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｃ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｅ）反応容器に、ルイス酸および式（Ａ４）の化合物：
【化８２】
2020535141.tif 000084
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化８３】
2020535141.tif 000085
からなる群より選択される］
を導入し、それにより、式（Ａ４）の化合物が、式（ＩＶ）の化合物と接触して、式（Ａ５）の化合物：
【化８４】
2020535141.tif 000086
［式中、Ｒ７は、式（Ａ５ａ）または式（Ａ５ｂ）：
【化８５】
2020535141.tif 000087
のものであり、
Ｂは、
【化８６】
2020535141.tif 000088
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化８７】
2020535141.tif 000089
から選択される］
を形成するようにするステップと、
（ｆ）式（Ａ５）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｇ）（ｇ１）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ２）ブロック解除剤を反応容器に導入し、それにより、それが直前のステップによって形成された生成物と接触するようにするステップ、
（ｇ３）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ４）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ５）直前のステップによって形成された生成物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ６）直前のステップによって形成された生成物を含有する反応容器に、ルイス酸および式（Ａ８）の化合物：
【化８８】
2020535141.tif 000090
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化８９】
2020535141.tif 000091
からなる群より選択される］
を導入し、それにより、式（Ａ８）の化合物が、直前のステップによって形成された化合物と接触して、式（Ａ９）の化合物：
【化９０】
2020535141.tif 000092
［式中、Ｒ８は、
【化９１】
2020535141.tif 000093
であり、
Ｂは、
【化９２】
2020535141.tif 000094
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化９３】
2020535141.tif 000095
からなる群より選択される］
を形成するようにするステップ
の逐次的ステップのＹ回繰り返しを実施するステップであって、Ｙは、ｎ−１であるステップと、
（ｈ）式（Ａ９）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄して、式（Ａ８）の化合物を除去するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｉ）式（Ａ９）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄して、カップリング溶媒を除去するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｊ）ブロック解除剤を、式（Ａ９）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１０）の化合物：
【化９４】
2020535141.tif 000096
［式中、Ｒ９は、
【化９５】
2020535141.tif 000097
であり、
Ｂは、
【化９６】
2020535141.tif 000098
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化９７】
2020535141.tif 000099
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｋ）開裂剤を、式（１０）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１１）の化合物を形成するステップと
の逐次的ステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００７３】
ある実施形態では、ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）の少なくとも１つは、それぞれのステップのブロック解除された化合物を、中和剤と接触させるステップをさらに含む。
【００７４】
別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）は、各それぞれのステップのブロック解除された化合物を、中和剤と接触させるステップをさらに含む。
【００７５】
ある実施形態では、洗浄溶媒は、ハロゲン化溶媒である。
【００７６】
別の実施形態では、洗浄溶媒は、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｍｅｔｈａｎｅ）またはジクロロエタンである。
【００７７】
ある実施形態では、カップリング溶媒は、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはＮ−メチル−２−ピロリドンである。
【００７８】
ある実施形態では、開裂剤は、ＮＨ３を含む。
【００７９】
別の実施形態では、開裂剤は、水溶液中にある。
【００８０】
さらに別の実施形態では、支持媒体は、１％架橋ジビニルベンゼンを含むポリスチレンを含む。
【００８１】
ある実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ１）、（ｇ２）、（ｇ３）、（ｇ４）、（ｇ５）、（ｇ６）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）のいずれか１つは、７０℃〜９０℃の間で実行される。
【００８２】
別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ１）、（ｇ２）、（ｇ３）、（ｇ４）、（ｇ５）、（ｇ６）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）のそれぞれは、７０℃〜９０℃の間で実行される。
【００８３】
特定の実施形態では、ステップ（ｅ）および（ｇ６）のそれぞれは、７０℃〜９０℃の間で実行される。
【００８４】
ある実施形態では、ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）のそれぞれは、７０℃〜９０℃の間で実行され、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【００８５】
ある実施形態では、ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）のそれぞれは、７０℃〜９０℃の間で実行され、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【００８６】
別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）のそれぞれは、室温〜７０℃の間で実行され、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【００８７】
さらに別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｇ２）および（ｊ）のそれぞれは、室温〜７０℃の間で実行され、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【００８８】
ある実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｊ）において、Ｂは、
【化９８】
2020535141.tif 000100
であり、ステップ（ｋ）において、Ｃは、
【化９９】
2020535141.tif 000101
である。
【００８９】
ある実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ１）、（ｇ２）、（ｇ３）、（ｇ４）、（ｇ５）、（ｇ６）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）のいずれかは、必要に応じてバッチ式方法で行われる。
【００９０】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、ハロゲン化酸を含む溶液である。
【００９１】
別の実施形態では、ブロック解除剤は、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される。
【００９２】
特定の実施形態では、ブロック解除剤は、トリフルオロ酢酸である。
【００９３】
ある実施形態では、ルイス酸は、カップリング溶媒に可溶性である。
【００９４】
別の実施形態では、ルイス酸は、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩおよびＬｉＯＴｆからなる群より選択される。
【００９５】
特定の実施形態では、ルイス酸は、ＬｉＢｒである。
【００９６】
ある実施形態では、中和剤は、ハロゲン化溶媒およびイソプロピルアルコールを含む溶液中にある。
【００９７】
別の実施形態では、ハロゲン化溶媒は、ジクロロメタンまたはジクロロエタンである。
【００９８】
さらに別の実施形態では、中和剤は、モノアルキル、ジアルキルまたはトリアルキルアミンである。
【００９９】
別の実施形態では、中和剤は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。
【０１００】
別の実施形態では、中和剤は、Ｎ−エチルモルホリンである。
【０１０１】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【０１０２】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【０１０３】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【０１０４】
ある実施形態では、各ステップにおいて使用されるブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノールおよび水を含む溶液である。
【０１０５】
式（Ａ１１）のオリゴマー化合物のある実施形態では、ｎは、３０であり、Ｒ４は、１〜３０および５’から３’の各位置にある：
【表１−１】
2020535141.tif 000102
【０１０６】
式（Ａ１１）のオリゴマー化合物のある実施形態では、ｎは、１０であり、Ｒ４は、１〜１０および５’から３’の各位置にある：
【表１−２】
2020535141.tif 000103
【０１０７】
フロースルー反応器内でモルホリノオリゴマーを調製するための連続的方法
フロースルー反応器内でモルホリノオリゴマーを調製するための連続的（フロースルー）方法が、本明細書において提供される。
【０１０８】
したがって、ある態様では、式（Ａ１１）のオリゴマー化合物：
【化１００】
2020535141.tif 000104
［式中、Ｒ９は、
【化１０１】
2020535141.tif 000105
であり、
Ｃは、
【化１０２】
2020535141.tif 000106
またはＨであり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１０３】
2020535141.tif 000107
からなる群より選択される］
を調製するための連続的方法であって、
（ａ）ブロック解除剤を、式（Ａ３）の化合物：
【化１０４】
2020535141.tif 000108
［式中、Ｂは、
【化１０５】
2020535141.tif 000109
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ５は、
【化１０６】
2020535141.tif 000110
であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１０７】
2020535141.tif 000111
からなる群より選択される］
と、反応容器内で接触させて、式（ＩＶ）の化合物：
【化１０８】
2020535141.tif 000112
［式中、Ｂは、
【化１０９】
2020535141.tif 000113
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ６は、
【化１１０】
2020535141.tif 000114
であり、
Ｒ４は、
【化１１１】
2020535141.tif 000115
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｂ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｃ）式（ＩＶ）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｄ）式（ＩＶ）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｅ）反応容器に、ルイス酸および式（Ａ４）の化合物：
【化１１２】
2020535141.tif 000116
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１１３】
2020535141.tif 000117
からなる群より選択される］
を導入し、それにより、式（Ａ４）の化合物が、式（ＩＶ）の化合物と接触して、式（Ａ５）の化合物：
【化１１４】
2020535141.tif 000118
［式中、Ｒ７は、式（Ａ５ａ）または式（Ａ５ｂ）：
【化１１５】
2020535141.tif 000119
のものであり、
Ｂは、
【化１１６】
2020535141.tif 000120
であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、
【化１１７】
2020535141.tif 000121
から選択される］
を形成するようにするステップと、
（ｆ）式（Ａ５）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｇ）（ｇ１）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ２）ブロック解除剤を反応容器に導入し、それにより、それが直前のステップによって形成された生成物と接触するようにするステップ、
（ｇ３）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒および中和剤で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒および中和剤を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ４）直前のステップによって形成された生成物を、洗浄溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ５）直前のステップによって形成された生成物を、カップリング溶媒で洗浄するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップ、
（ｇ６）直前のステップによって形成された生成物を含有する反応容器に、ルイス酸および式（Ａ８）の化合物：
【化１１８】
2020535141.tif 000122
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化１１９】
2020535141.tif 000123
からなる群より選択される］
を導入し、それにより、式（Ａ８）の化合物が、直前のステップによって形成された化合物と接触して、式（Ａ９）の化合物：
【化１２０】
2020535141.tif 000124
［式中、Ｒ８は、
【化１２１】
2020535141.tif 000125
であり、
Ｂは、
【化１２２】
2020535141.tif 000126
であり、
ｎは、９〜３９の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１２３】
2020535141.tif 000127
からなる群より選択される］
を形成するようにするステップ
の逐次的ステップのＹ回繰り返しを実施するステップであって、Ｙは、Ｒ７が式（Ａ５ａ）のものである場合、ｎ−１であるか、またはＹは、Ｒ７が式（Ａ５ｂ）のものである場合、ｎ−２であるステップと、
（ｈ）式（Ａ９）の化合物を、カップリング溶媒で洗浄して、式（Ａ８）の化合物を除去するステップであって、洗浄するステップが、カップリング溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｉ）式（Ａ９）の化合物を、洗浄溶媒で洗浄して、カップリング溶媒を除去するステップであって、洗浄するステップが、洗浄溶媒を反応容器に通過させることを含む、ステップと、
（ｊ）ブロック解除剤を、式（Ａ９）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１０）の化合物：
【化１２４】
2020535141.tif 000128
［式中、Ｒ９は、
【化１２５】
2020535141.tif 000129
であり、
Ｂは、
【化１２６】
2020535141.tif 000130
であり、
ｎは、１０〜４０の整数であり、
Ｒ１は、支持媒体であり、
Ｒ４は、各出現について独立して、
【化１２７】
2020535141.tif 000131
からなる群より選択される］
を形成するステップと、
（ｋ）開裂剤を、式（１０）の化合物と、反応容器内で接触させて、式（Ａ１１）の化合物を形成するステップと
の逐次的ステップを含み、
方法が、フロースルー反応器内で実施され、フロースルー反応器が、少なくとも、
（ａ）それぞれポンプが装備された１つまたは複数の供給ラインを備え、供給ラインの入口ゾーンが、中和剤、カップリング溶媒、ブロック解除剤、洗浄溶媒および式（Ａ８）の化合物：
【化１２８】
2020535141.tif 000132
［式中、
Ｒ３は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチルからなる群より選択され、
Ｒ４は、式（Ａ８）の各化合物について独立して、
【化１２９】
2020535141.tif 000133
からなる群より選択される］
を含む容器に独立して接続されており、式（Ａ８）の化合物が、カップリング溶媒に溶解されている、供給ゾーンと、
（ｂ）１つまたは複数の供給ラインの出口ゾーンに接続されており、ＰＭＯ合成樹脂を含有する、反応ゾーンと、
（ｃ）廃棄物ストリームまたは生成物が独立して収集され得る出口ゾーンと、
（ｄ）圧力制御デバイスと、
（ｅ）供給ゾーンおよび反応ゾーンの温度を独立して制御する手段と
を備える、方法が、本明細書において提供される。
【０１０９】
ある実施形態では、中和試薬は、ハロゲン化溶媒およびイソプロピルアルコールを含む溶液中の、モノアルキル、ジアルキルまたはトリアルキルアミンである。
【０１１０】
別の実施形態では、モノアルキル、ジアルキルまたはトリアルキルアミンは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンまたはＮ−エチルモルホリンである。
【０１１１】
さらに別の実施形態では、ハロゲン化溶媒は、ジクロロメタンまたはジクロロエタンである。
【０１１２】
ある実施形態では、カップリング溶媒は、３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解された臭化リチウムである。
【０１１３】
別の実施形態では、ブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【０１１４】
さらに別の実施形態では、ブロック解除剤は、４−シアノピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【０１１５】
さらなる実施形態では、ブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【０１１６】
ある実施形態では、ブロック解除剤は、３，５−ジメチルピリジン、ジクロロエタン、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロエタノールを含む溶液である。
【０１１７】
ある実施形態では、洗浄溶媒は、ジクロロエタンまたはジクロロメタンである。
【０１１８】
別の実施形態では、式（Ａ８）の化合物は、３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはＮ−メチル−２−ピロリドンの溶液中にある。
【０１１９】
さらに別の実施形態では、ポンプは、ＨＰＬＣまたはシリンジポンプである。
【０１２０】
さらなる実施形態では、供給ゾーンおよび反応ゾーンは、ルアーロックコネクターによって接続されている。
【０１２１】
ある実施形態では、反応ゾーンは、反応容器および温度制御浴を備える。
【０１２２】
ある実施形態では、反応容器にはフリットが装備されており、それにより、ＰＭＯ合成樹脂は方法中に除去されない。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、反応容器には、２μｍのフリットが装備されている。
【０１２４】
さらなる実施形態では、圧力制御デバイスは、背圧調節器である。
【０１２５】
特定の実施形態では、フロースルー反応器は、エテプリルセンの調製に使用される。
【０１２６】
オリゴマー
モルホリノベースのサブユニットの重要な特性は、１）安定な非荷電または正に荷電された骨格連結によってオリゴマー形態で連結される能力；２）ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−メチル−シトシンおよびヒポキサンチン）を支持し、それにより、形成されたポリマーが、標的ＲＮＡを含む相補的塩基標的核酸とハイブリダイズすることができる能力；３）哺乳動物の細胞に能動的にまたは受動的に輸送されるオリゴマーの能力；ならびに４）ＲＮアーゼおよびＲＮアーゼＨ分解にそれぞれ抵抗する、オリゴマーおよびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二本鎖の能力を含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、塩基修飾または置換を含有する。例えば、ある特定の核酸塩基が、本明細書において記載されているアンチセンスオリゴマーの結合親和性を増大させるために選択されてよい。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃だけ増大させることが示されており、本明細書において記載されているアンチセンスオリゴマーに組み込まれてよい。一実施形態では、オリゴマーの少なくとも１つのピリミジン塩基は、５−置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される。一実施形態では、５−置換ピリミジン塩基は、５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴマーの少なくとも１つのプリン塩基は、ヒポキサンチンを含む。
【０１２８】
モルホリノベースのオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，２９９，２０６および同第８，０７６，４７６号、国際特許出願公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号および同第ＷＯ／２０１２／０４３７３０号、ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ７，  １８７−１９５）において詳述されており、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
本開示のオリゴマー化合物は、不斉中心、キラル軸およびキラル面を有してよく（例えば、Ｅ．  Ｌ．  Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓｔｅｒｅｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４，  ｐａｇｅｓ  １１１９−１１９０およびＭａｒｃｈ，  Ｊ．  ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３ｄ．  Ｅｄ．，  Ｃｈａｐ．  ４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８５）において記載されている通り）、ラセミ体、ラセミ混合物として、および個々のジアステレオマーとして、光学異性体を含むすべての考えられる異性体およびそれらの混合物とともに出現し得る。その立体化学のいかなる指示もない、本明細書において具体的に言及される本開示のオリゴマー化合物は、すべての考えられる異性体およびそれらの混合物を表すように意図されている。
【０１３０】
具体的には、いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、本開示のオリゴマー化合物は、本明細書において論じられる通り、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化１３０】
2020535141.tif 000134
［式中、Ｒ２は、式（ＶＩＩＩ）の各化合物について独立して、
【化１３１】
2020535141.tif 000135
からなる群より選択される］
等のそのような非限定的な例を含む活性化モルホリノサブユニットから調製される。
【０１３１】
上で言及した式（ＶＩＩＩ）の化合物のそれぞれは、例えば、以下で示される通り、対応するベータ−Ｄ−リボフラノシルから調製され得る：
【化１３２】
2020535141.tif 000136
【０１３２】
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ７：１８７−１９５  （１９９７）を参照されたい。いかなる特定の理論によっても拘束されないが、２個のキラル炭素の立体化学は、各モルホリノサブユニットのいくつかの考えられる立体異性体が、例えば、アルファ−Ｌ−リボフラノシル、アルファ（ａｌｐｈ）−Ｄ−リボフラノシル、ベータ−Ｌ−リボフラノシルまたはベータ−Ｄ−リボフラノシル出発材料の選択に基づいて産生され得るような合成条件下で保持される。
【０１３３】
例えば、一部の実施形態では、本開示の式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩａ）：
【化１３３】
2020535141.tif 000137
［式中、Ｒ２は、式（ＶＩＩＩａ）の各化合物について独立して、
【化１３４】
2020535141.tif 000138
からなる群より選択される］
のものであってよい。
【０１３４】
いかなる特定の理論によっても拘束されないが、１０〜４０個の式（ＶＩＩＩ）の化合物の、例えば、本開示のオリゴマー化合物への組み込みは、多数の考えられる立体異性体をもたらし得る。
【０１３５】
いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、本開示のオリゴマー化合物は、１つまたは複数のリン含有サブユニット間を含み、これは、各リンにおいてキラル中心を作出し、そのそれぞれは、当該技術分野において理解されている通り、「Ｓｐ」または「Ｒｐ」配置のいずれかとして指定される。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、このキラリティーは、立体異性体を作出し、これは、同一の化学組成を有するが、それらの原子の３次元配置は異なる。
【０１３６】
いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、各リンサブユニット間連結の配置は、例えば、本開示のオリゴマー化合物の合成中に無作為に出現する。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、合成方法は、本開示のオリゴマー化合物の指数関数的に多数の立体異性体を生成する。なぜなら、本開示のオリゴマー化合物は、多数のリンサブユニット間連結で構成され、各リンサブユニット間連結は、無作為なキラル配置を有するからである。具体的には、いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、追加のモルホリノサブユニットの各サブユニット間連結は、生成物の立体異性体の数を倍増させ、そのため、本開示のオリゴマー化合物の従来の調製は、実際に、２Ｎ種の立体異性体の非常に不均質な混合物であり、Ｎは、リンサブユニット間連結の数を表す。
【０１３７】
故に、別段の指示がない限り、ジアステレオマーおよびエナンチオマー混合物ならびに純粋なエナンチオマーおよびジアステレオマーを含むすべてのそのような異性体は、例えば、１つもしくは複数の立体中心から１つもしくは複数の結合が「−」もしくは「〜〜」または当該技術分野において理解されるであろう等価物によって示される場合等で含まれる。
【０１３８】
表１は、本明細書において記載されている方法において提供されるモルホリノサブユニットの種々の実施形態を示す。
【表１−３】
2020535141.tif 000139
【実施例】
【０１３９】
例証を目的として、本開示のある特定の具体的な実施形態を記載するために、実施例が以下で明記されている。しかしながら、特許請求の範囲は、本明細書において明記されている実施例によって決して限定されるものではない。開示されている実施形態への種々の変更および修正は、当業者に明らかであろうし、限定されないが、本開示の化学構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関連するものを含むそのような変更および修正は、本開示の趣旨および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、為され得る。本明細書におけるスキーム内の構造における変数の定義は、本明細書において提示される式中の対応する位置のものに見合っている。
【０１４０】
（実施例１）
ＮＣＰ２アンカー合成
１．メチル４−フルオロ−３−ニトロベンゾエート（１）の調製
【化１３５】
2020535141.tif 000140
１００Ｌのフラスコに１２．７ｋｇの４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸を投入し、４０ｋｇのメタノールおよび２．８２ｋｇの濃硫酸を添加した。混合物を還流状態（６５℃）で３６時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却した。３８℃で結晶が形成された。混合物を０℃で４時間保ち、次いで、窒素下で濾過した。１００Ｌのフラスコを洗浄し、濾過ケーキを、０℃に冷却した１０ｋｇのメタノールで洗浄した。固体濾過ケーキを漏斗上で１時間乾燥させ、トレイに移し、真空オーブン内、室温で乾燥させて、１３．６９５ｋｇの一定重量のメチル４−フルオロ−３−ニトロベンゾエートとした（１００％収率；ＨＰＬＣ９９％）。
【０１４１】
２．３−ニトロ−４−（２−オキソプロピル）安息香酸の調製
Ａ．（Ｚ）−メチル４−（３−ヒドロキシ−１−メトキシ−１−オキソブタ−２−エン−２−イル）−３−ニトロベンゾエート（２）
【化１３６】
2020535141.tif 000141
１００Ｌのフラスコに、以前のステップからの３．９８ｋｇのメチル４−フルオロ−３−ニトロベンゾエート（１）、９．８ｋｇのＤＭＦ、２．８１ｋｇのアセト酢酸メチルを投入した。混合物を撹拌し、０℃に冷却した。これに、３．６６ｋｇのＤＢＵを約４時間かけて添加し、その間、温度を５℃またはそれ未満で維持した。混合物を追加で１時間撹拌した。反応フラスコに、３７．５ｋｇの精製水中の８．１５ｋｇのクエン酸の溶液を添加し、その間、反応温度を１５℃またはそれ未満で維持した。添加後、反応混合物を追加で３０分間撹拌し、次いで、窒素下で濾過した。湿った濾過ケーキを、１４．８ｋｇの精製水とともに１００Ｌのフラスコに戻した。スラリーを１０分間撹拌し、次いで、濾過した。湿ったケーキを１００Ｌのフラスコに再度戻し、１４．８ｋｇの精製水で１０分間スラリー化し、濾過して、粗製の（Ｚ）−メチル４−（３−ヒドロキシ−１−メトキシ−１−オキソブタ−２−エン−２−イル）−３−ニトロベンゾエートとした。
【０１４２】
Ｂ．３−ニトロ−４−（２−オキソプロピル）安息香酸
【化１３７】
2020535141.tif 000142
粗製の（Ｚ）−メチル４−（３−ヒドロキシ−１−メトキシ−１−オキソブタ−２−エン−２−イル）−３−ニトロベンゾエートを、１００Ｌの反応フラスコに窒素下で投入した。これに、１４．２ｋｇの１，４−ジオキサンを添加し、撹拌した。混合物に、１６．６５５ｋｇの濃ＨＣｌおよび１３．３３ｋｇの精製水の溶液（６Ｍ  ＨＣｌ）を２時間かけて添加し、その間、反応混合物の温度を１５℃未満で維持した。添加が完了したら、反応混合物を還流状態（８０℃）で２４時間加熱し、室温に冷却し、窒素下で濾過した。固体濾過ケーキを１４．８ｋｇの精製水で研和し、濾過し、１４．８ｋｇの精製水で再度研和し、濾過した。固体を、３９．９ｋｇのＤＣＭとともに１００Ｌのフラスコに戻し、撹拌しながら１時間還流した。１．５ｋｇの精製水を添加して、残りの固体を溶解した。下部有機層を予め加温した７２Ｌのフラスコに分割し、次いで、清浄な乾燥した１００Ｌのフラスコに戻した。溶液を０℃に冷却し、１時間保ち、次いで、濾過した。固体濾過ケーキを、９．８ｋｇのＤＣＭおよび５ｋｇのヘプタンの溶液でそれぞれ２回洗浄し、次いで、漏斗上で乾燥させた。固体をトレイに移し、乾燥させて、１．８５５ｋｇの一定重量の３−ニトロ−４−（２−オキソプロピル）安息香酸とした。化合物１からの全収率４２％。ＨＰＬＣ９９．４５％。
【０１４３】
３．Ｎ−トリチルピペラジンスクシネート（ＮＴＰ）の調製
【化１３８】
2020535141.tif 000143
７２Ｌのジャケット付きフラスコに、窒素下、１．８０５ｋｇの塩化トリフェニルメチルおよび８．３ｋｇのトルエン（ＴＰＣ溶液）を投入した。混合物を、固体が溶解するまで撹拌した。１００Ｌのジャケット付き反応フラスコに、窒素下、５．６１ｋｇのピペラジン、１９．９ｋｇのトルエンおよび３．７２ｋｇのメタノールを添加した。混合物を撹拌し、０℃に冷却した。これに、ＴＰＣ溶液を小分けにして４時間かけてゆっくりと添加し、その間、反応温度を１０℃またはそれ未満で維持した。混合物を１０℃で１．５時間撹拌し、次いで、１４℃に加温した。３２．６ｋｇの精製水を７２Ｌのフラスコに投入し、次いで、１００Ｌのフラスコに移し、その間、内部バッチ温度を２０＋／−５℃で維持した。層を分割させ、下部水性層を分離し、貯蔵した。有機層をそれぞれ３２ｋｇの精製水で３回抽出し、水性層を分離し、貯蔵された水溶液と合わせた。
【０１４４】
残りの有機層を１８℃に冷却し、１０．８７ｋｇの精製水中の８４７ｇのコハク酸の溶液を、小分けにしてゆっくりと有機層に添加した。混合物を２０＋／−５℃で１．７５時間撹拌した。混合物を濾過し、固体を２ｋｇのＴＢＭＥおよび２ｋｇのアセトンで洗浄し、次いで、漏斗上で乾燥させた。濾過ケーキをそれぞれ５．７ｋｇのアセトンで２回研和し、濾過し、研和の間に１ｋｇのアセトンで洗浄した。固体を漏斗上で乾燥させ、次いで、トレイに移し、真空オーブン内、室温で乾燥させて、２．３２ｋｇの一定重量のＮＴＰとした。収率８０％。
【０１４５】
４．（４−（２−ヒドロキシプロピル）−３−ニトロフェニル（ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙＩ））（４−トリチルピペラジン−１−イル）メタノンの調製
Ａ．１−（２−ニトロ−４（４−トリチルピペラジン−１−カルボニル）フェニル）プロパン−２−オンの調製
【化１３９】
2020535141.tif 000144
１００Ｌのジャケット付きフラスコに、窒素下、２ｋｇの３−ニトロ−４−（２−オキソプロピル）安息香酸（３）、１８．３ｋｇのＤＣＭ、１．８４５ｋｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）を投入した。溶液を、均質混合物が形成されるまで撹拌した。３．０４８ｋｇのＮＴＰを室温で３０分間かけて添加し、８時間撹拌した。５．４４ｋｇの精製水を反応混合物に添加し、３０分間撹拌した。層を分離させ、生成物を含有する下部有機層を排液し、貯蔵した。水性層を５．６５ｋｇのＤＣＭで２回抽出した。合わせた有機層を、４．０８ｋｇの精製水中の１．０８ｋｇの塩化ナトリウムの溶液で洗浄した。有機層を１．０６８ｋｇの硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。硫酸ナトリウムを１．３ｋｇのＤＣＭで洗浄した。合わせた有機層を２５２ｇのシリカゲルでスラリー化し、２５２ｇのシリカゲルのベッドを含有する濾過用漏斗に通して濾過した。シリカゲルベッドを２ｋｇのＤＣＭで洗浄した。合わせた有機層を回転蒸発器で蒸発させた。４．８ｋｇのＴＨＦを残留物に添加し、次いで、ＴＨＦ中２．５体積の粗製の１−（２−ニトロ−４（４−トリチルピペラジン−１−カルボニル）フェニル）プロパン−２−オンに達するまで、回転蒸発器で蒸発させた。
【０１４６】
Ｂ．（４−（２−ヒドロキシプロピル）−３−ニトロフェニル）（４−トリチルピペラジン−１−イル）メタノン（５）の調製
【化１４０】
2020535141.tif 000145
１００Ｌのジャケット付きフラスコに、窒素下、以前のステップからの３６００ｇの４および９８００ｇのＴＨＦを投入した。撹拌溶液を５℃以下に冷却した。溶液を１１５２５ｇのエタノールで希釈し、１９４ｇの水素化ホウ素ナトリウムを５℃以下で約２時間かけて添加した。反応混合物を５℃以下で追加で２時間撹拌した。反応物を、約３ｋｇの水中の約１．１ｋｇの塩化アンモニウムの溶液で、温度を１０℃以下で維持するためにゆっくりと添加することによってクエンチした。反応混合物を追加で３０分間撹拌し、濾過して無機物を除去し、１００Ｌのジャケット付きフラスコに再投入し、２３ｋｇのＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、水性物をそれぞれ４．７ｋｇのＤＣＭでもう２回抽出した。合わせた有機層を、約３ｋｇの水中の約８００ｇの塩化ナトリウムの溶液で洗浄し、次いで、２．７ｋｇの硫酸ナトリウムで乾燥させた。懸濁物を濾過し、濾過ケーキを２ｋｇのＤＣＭで洗浄した。合わせた濾液を２．０体積に濃縮し、約３６０ｇの酢酸エチルで希釈し、蒸発させた。粗生成物を、ＤＣＭを詰めた４ｋｇのシリカのシリカゲルカラムに窒素下でロードし、７．２ｋｇのＤＣＭ中の２．３ｋｇの酢酸エチルで溶離した。合わせた画分を蒸発させ、残留物を１１．７ｋｇのトルエンに溶かした。トルエン溶液を濾過し、濾過ケーキをそれぞれ２ｋｇのトルエンで２回洗浄した。濾過ケーキを乾燥させて、２．２７５ｋｆの一定重量の化合物５とした（化合物３から４６％収率）  ＨＰＬＣ９６．９９％。
【０１４７】
５．２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１−（２−ニトロ−４−（４−トリフェニルメチルピペラジン−１カルボニル）フェニル）プロパン−２−イル）カーボネート（ＮＣＰ２アンカー）の調製
【化１４１】
2020535141.tif 000146
１００Ｌのジャケット付きフラスコに、窒素下、４．３ｋｇの化合物５（Ｈ１  ＮＭＲにより残留トルエンに基づいて調整された重量；以後、すべての試薬はそれに応じて調整した）および１２．７ｋｇのピリジンを投入した。これに、３．１６０ｋｇのＤＳＣを投入し（Ｈ１  ＮＭＲにより７８．９１重量％）、その間、内部温度を３５℃以下で維持した。反応混合物をアンビエンス（ａｍｂｉｅｎｃｅ）で約２２時間熟成させ、次いで、濾過した。濾過ケーキを２００ｇのピリジンで洗浄した。それぞれ濾液体積の１／２を含む２つのバッチで、濾液洗浄液を、約５０ｋｇの水中の約１１ｋｇのクエン酸の溶液を含有する１００Ｌのジャケット付きフラスコにゆっくりと投入し、３０分間撹拌して、固体沈殿を可能にした。固体を濾過用漏斗で収集し、洗浄１回につき４．３ｋｇの水で２回洗浄し、真空下、濾過用漏斗で乾燥させた。
【０１４８】
合わせた固体を１００Ｌのジャケット付きフラスコに投入し、２８ｋｇのＤＣＭに溶解し、４．３ｋｇの水中の９００ｇの炭酸カリウムの溶液で洗浄した。１時間後、層を分離させ、水性層を除去した。有機層を１０ｋｇの水で洗浄し、分離し、３．５ｋｇの硫酸ナトリウムで乾燥させた。ＤＣＭを濾過し、蒸発させ、真空下で乾燥させて、６．１６ｋｇのＮＣＰ２アンカーとした（１１４％収率）。
【０１４９】
（実施例２）
アンカー負荷樹脂合成
テフロン（登録商標）ストップコック付きの７５Ｌの固相合成反応器に、約５２ＬのＮＭＰおよび２３００ｇのアミノメチルポリスチレン樹脂を投入した。樹脂をＮＭＰ中で撹拌して、約２時間膨潤させ、次いで、排液した。樹脂を、洗浄１回につき約４ＬのＤＣＭで２回、次いで、洗浄１回につき３９Ｌの中和溶液で２回、次いで、洗浄１回につき３９ＬのＤＣＭで２回洗浄した。ＮＣＰ２アンカー溶液を、撹拌中の樹脂溶液にゆっくりと添加し、室温で２４時間撹拌し、排液した。樹脂を、洗浄１回につき３９ＬのＮＭＰで４回、洗浄１回につき３９ＬのＤＣＭで６回洗浄した。樹脂を、ＤＥＤＣキャッピング溶液の１／２で３０分間処理および撹拌し、排液し、ＤＥＤＣキャッピング溶液の第２の１／２で３０分間処理および撹拌し、排液した。樹脂を、洗浄１回につき３９ＬのＤＣＭで６回洗浄し、次いで、オーブン内で乾燥させて、３５７３．７１ｇの一定重量のアンカー負荷樹脂とした。
【０１５０】
（実施例３）
活性化ＥＧ３テイルの調製
１．トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製
【化１４２】
2020535141.tif 000147
ジクロロメタン中のＮＴＰの冷却懸濁物（６ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）に、水中の炭酸カリウム（３．２当量）の溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を添加した。この二相混合物に、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３当量）の溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）をゆっくりと添加した。反応混合物を２０℃に加温した。反応完了時（１〜２時間）、層を分離した。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５をアセトニトリルからの結晶化によって単離した。収率＝８０％
【０１５１】
２．カルバメートアルコール３６の調製
【化１４３】
2020535141.tif 000148
水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノンに懸濁した（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）。この懸濁物に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。得られたスラリーを９５℃に加熱した。反応完了時（１〜２時間）、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に、３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。生成物含有有機層を、ＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で逐次的に洗浄した。生成物３６をジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化によって単離した。収率＝９０％。
【０１５２】
３．ＥＧ３テイル酸３７の調製
【化１４４】
2020535141.tif 000149
テトラヒドロフラン中の化合物３６の溶液（７ｍＬ／ｇ  ３６）に、無水コハク酸（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱した。反応完了時（５時間）、混合物を２０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水性層中に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物をクエン酸水溶液でｐＨ３に調整した。生成物含有有機層を、ｐＨ＝３クエン酸緩衝液および飽和塩化ナトリウム水溶液の混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、単離することなく化合物３８の調製において使用した。
【０１５３】
４．活性化ＥＧ３テイル３８の調製
【化１４５】
2020535141.tif 000150
化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応完了時（４〜５時間）、混合物を２０℃に冷却し、１：１  ０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで逐次的に洗浄した。ジクロロメタン溶液に、アセトンへの、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を受けさせ、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和塩化ナトリウム水溶液中への沈殿によって単離した。粗生成物を水中で数回再スラリー化して、残留Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。収率＝化合物３６から７０％の活性化ＥＧ３テイル３８。
【０１５４】
（実施例４）
ジスルフィドアンカー合成
【化１４６】
2020535141.tif 000151
シラン化されたジャケット付きペプチド容器中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；−１．０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｎ２置換；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ、ＵＫ、品番１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、１〜２時間混合しながら、樹脂を膨潤させた。膨潤溶媒の排出後、樹脂を、ジクロロメタン（２×１〜２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％ジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分）およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最終洗浄液の排出後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン中のジスルフィドアンカー３４の溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、−２．５当量）で流動化し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応完了時に、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、樹脂を１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂をジクロロメタン中１０％（ｖ／ｖ）二炭酸ジエチルの溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂４０をＮ２ストリーム下で１〜３時間、次いで真空下で乾燥させて、一定重量（±２％）とした。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％。
【０１５５】
（実施例５）
エテプリルセン粗製薬物質の２５０ｍｇ固相合成
１．材料
【表２】
2020535141.tif 000152
【０１５６】
出発材料の化学構造：
Ａ．活性化ＥＧ３テイル
【化１４７】
2020535141.tif 000153
Ｂ．活性化Ｃサブユニット（調製については、米国特許第８，０６７，５７１号を参照）
【化１４８】
2020535141.tif 000154
Ｃ．活性化Ａサブユニット（調製については、米国特許第８，０６７，５７１号を参照）
【化１４９】
2020535141.tif 000155
Ｄ．活性化ＤＰＧサブユニット（調製については、ＷＯ２００９／０６４４７１を参照）
【化１５０】
2020535141.tif 000156
Ｅ．活性化Ｔサブユニット（調製については、ＷＯ２０１３／０８２５５１を参照）
【化１５１】
2020535141.tif 000157
Ｆ．アンカー負荷樹脂：ＮＣＰ２
【化１５２】
2020535141.tif 000158
［式中、Ｒ１は、支持媒体である］。
Ｇ．アンカー負荷樹脂：ジスルフィド
【化１５３】
2020535141.tif 000159
［式中、Ｒ１は、支持媒体である］。
【表３】
2020535141.tif 000160
【０１５７】
２．エテプリルセン粗製薬物質の残留物１〜１０の合成
Ａ．樹脂膨潤
２５０ｍｇのアンカー負荷樹脂およびＮＭＰを、シラン化された反応器に投入し、３時間撹拌した。ＮＭＰを排液し、アンカー負荷樹脂を、ＤＣＭで２回、３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで５回洗浄した。
【０１５８】
Ｂ．サイクル０：ＥＧ３テイルカップリング
アンカー負荷樹脂を３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで３回洗浄し、排液し、ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間洗浄し、排液し、再度ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間洗浄し、排液せずに、これに１：１  ＮＥＭ／ＤＣＭを投入し、懸濁物を２分間撹拌し、排液した。樹脂を中和溶液で５分間２回洗浄し、排液し、次いで、ＤＣＭでそれぞれ２回洗浄し、排液した。ＤＭＩ中の活性化ＥＧ３テイルおよびＮＥＭの溶液を樹脂に投入し、室温で３時間撹拌し、排液した。樹脂を、中和溶液で各洗浄につき５分間２回、ＤＣＭで１回洗浄し、排液した。ＮＭＰ中の安息香酸無水物およびＮＥＭの溶液を投入し、１５分間撹拌し、排液した。樹脂を中和溶液とともに５分間撹拌し、次いで、ＤＣＭで１回、３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄した。樹脂を３０％ＴＦＥ／ＤＣＭに懸濁し、１４時間保った。
【０１５９】
Ｃ．サブユニットカップリングサイクル１〜１０
ｉ．カップリング前処理
表４に記載されている通りの各カップリングサイクルの前に、樹脂を、１）３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで洗浄し、２）ａ）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、排液し、ｂ）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、これに、１：１  ＮＥＭ／ＤＣＭを添加し、撹拌し、排液し、３）中和溶液とともに３回撹拌し、４）ＤＣＭで２回洗浄した。表４を参照されたい。
【０１６０】
ｉｉ．カップリング後処理
各サブユニット溶液を表４に記載されている通りに排液した後、樹脂を、１）ＤＣＭで洗浄し、２）３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄した。次のカップリングサイクルの前に樹脂を一定期間保った場合、第２のＴＦＥ／ＤＣＭ洗浄液は排液せず、樹脂を前記ＴＦＥ／ＤＣＭ洗浄溶液中に保持した。表４を参照されたい。
【０１６１】
ｉｉｉ．活性化サブユニットカップリングサイクル
カップリングサイクルは、表４に記載されている通りに実施した。
【０１６２】
ｉｖ．最終ＩＰＡ洗浄
最終カップリングステップを表４に記載されている通りに実施した後、樹脂を、ＩＰＡで８回洗浄し、真空下、室温で約６３．５時間乾燥させて、１．８６ｇの乾燥重量とした。
【０１６３】
Ｄ．開裂
上記の樹脂結合エテプリルセン（Ｅｔｅｐｌｉｓｅｎ）粗製薬物質を２つのロットに分け、各ロットを次の通りに処理した。９２９ｍｇのロットの樹脂を、１）ＮＭＰとともに２時間撹拌し、次いで、ＮＭＰを排液し、２）３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで３回洗浄し、３）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間、および４）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、次いでこれに、ＮＥＭ／ＤＣＭの１：１溶液を添加し、２分間撹拌し、排液した。樹脂を中和溶液で３回処理し、ＤＣＭで６回、ＮＭＰで８回洗浄した。樹脂を、２．３ｍＬのＮＭＰ中の５１０ｍｇのＤＴＴおよび９９２ｍｇのＤＢＵの開裂溶液で２時間処理して、エテプリルセン粗製薬物質を樹脂から剥離した。開裂溶液を排液し、別個の容器内に保持した。反応器および樹脂を１．６ｍＬのＮＭＰで洗浄し、これを開裂溶液と合わせた。
【表４−１】
2020535141.tif 000161
【表４−２】
2020535141.tif 000162
【０１６４】
Ｅ．脱保護
合わせた開裂溶液およびＮＭＰ洗浄液を圧力容器に移し、これに、冷凍庫内で−１０℃〜−２５℃の温度に冷やした１３．３ｍＬのＮＨ４ＯＨ（ＮＨ３・Ｈ２Ｏ）を添加した。圧力容器を密閉し、４５℃に１６時間加熱し、次いで、２５℃に冷却させた。エテプリルセン粗製薬物質を含有するこの脱保護溶液を、精製水で３：１に希釈し、２Ｍリン酸でｐＨを３．０に、次いで、ＮＨ４ＯＨでｐＨ８．０３に調整した。
【０１６５】
３．エテプリルセン粗製薬物質の合成
エテプリルセンは、実施例５パート２において記載されている通りのステップＡ〜Ｅを使用し、以下の表５に示される情報を使用して、合成することができる。
【表５−１】
2020535141.tif 000163
【表５−２】
2020535141.tif 000164
【表５−３】
2020535141.tif 000165
【表５−４】
2020535141.tif 000166
【表５−５】
2020535141.tif 000167
【表５−６】
2020535141.tif 000168
【表５−７】
2020535141.tif 000169
【０１６６】
（実施例６）
流動合成装置の設計
流動ＰＭＯ合成装置を（図４）に示す。試薬リザーバーは、乾燥窒素の陽圧を維持し、溶媒の無水輸送を可能にするための頂部が装備されたＧＬ４５ネジ式培地ボトルであった。各試薬リザーバーを、４つの位置のＳｗａｇｅｌｏｋ  ＳＳ−４３ＺＦＳ２手動切換弁上の４つの選択可能なポートの１つに接続した。加圧溶媒の吸い上げを防止するために、使用しないときには接続を断つことができるＳｗａｇｅｌｏｋ（ＳＳ−ＱＭ２−Ｂ−２００ＫＲおよびＳＳ−ＱＭ２−Ｓ−２００）シャットオフクイックコネクトを介して、共通のポートをＨＰＬＣポンプに接続した。ＨＰＬＣポンプは、２５ｍｌ／分ステンレス鋼ポンプヘッド付きのＶａｒｉａｎ  ２１０であった。低圧（入口側）管状材料は、外径１／８インチ、内径１／１６インチのＰＦＡであった。ＨＰＬＣポンプ出口を、４０ｐｓｉ背圧調節器（Ｐ−７８５）およびオスルアーロッククイックコネクト（Ｉｄｅｘ  Ｐ−６５５）に、外径１／１６インチ、内径０．０３０インチのＰＦＡ管状材料を使用して接続した。ＨＰＬＣポンプを使用するときは、このクイックコネクトを、反応器入口ライン上のメスルアーロッククイックコネクトに嵌合させた。ＨＰＬＣポンプを使用しないときには、反応器入口ラインをシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＰｈＤ３０００）上のカップリング試薬のシリンジに付着させた。
【０１６７】
反応器入口ラインは、メスルアーロッククイックコネクト（Ｉｄｅｘ  Ｐ−６５８）、およびＳｗａｇｅｌｏｋ継手（ＳＳ−１００−６）を介して約１８インチの外径１／１６インチのＰＦＡ管状材料で５フィートのステンレス鋼予熱ループ（外径１／１６インチ、内径０．０３０インチ、Ｉｄｅｘ  Ｕ−１０７）に接合された逆止弁（Ｉｄｅｘ  ＣＶ−３３１６）からなっていた。この予熱ループは、ペプチド合成について以前に記載したものと同一の反応器に接続した。反応器出口を２５０ｐｓｉ背圧調節器（Ｉｄｅｘ  Ｐ−７８８）に接続し、これは、バイパス弁（Ｉｄｅｘ  Ｐ−７３３）を開くことによってバイパスすることができた。バイパス流路は、Ｔ（Ｐ−６３２）で背圧調節器の出口に再接合し、逆止弁（Ｉｄｅｘ  Ｐ−７８８）および６インチの管状材料を通過した後、メタンスルホン酸Ｔ（Ｓｗａｇｅｌｏｋ  ＳＳ−１００−３）に到達した。この時点で、ＤＣＭ中２０％ＭｅＨＳＯ４を、必要に応じて、５０ｍＬ／分チタンヘッド付きのＫｎａｕｅｒスマートラインＨＰＬＣポンプで注入して、脱保護のＵＶモニタリングのためにトリチルカチオンを再生した。次いで、混合流体を、ＵＶ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３１５Ｄ）、２０ｐｓｉ背圧調節器（Ｉｄｅｘ  Ｐ−７９１）に通過させ、廃棄した。
【０１６８】
記載されていない場合、ＨＰＬＣポンプおよびシリンジの下流の管状材料は、外径１／１６インチ、内径０．０３０インチのＰＦＡであった。すべての１／４−２８平底フィッティングは、Ｉｄｅｘスーパーフランジレス（ＸＰ−１３１およびＸＰ−１４１）であった。
【０１６９】
試薬リザーバー
試薬リザーバーに、孔付きＧＬ−４５キャップを用いて使用するための機械加工アダプター（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ）を提供した。これらのアダプターは、３つの１／４−２８ネジ式ポートを有していた（図７）。２つのポートは１／８インチの貫通孔を有し、第３のものは１／１６インチの貫通孔を有していた。第１の孔は試薬回収ラインに使用した。第２のものは充填ポートとして使用し、第３は窒素ガス供給（４ｐｓｉ）に使用した。試薬回収ラインは、試薬リザーバーの底部に挿入され、スーパーフランジレスフィッティング（Ｉｄｅｘ  ＸＰ−１３１）を用いて適所に密閉された、１／８インチのラインであった。窒素ガスを、１／１６インチの貫通孔に対して据え付けられ、スーパーフランジレスフィッティングを用いて密閉された、１／８インチのラインによって供給した。充填ポートは、外径１／８インチ、内径０．１インチの薄壁ステンレス鋼管からなり、これは、機械加工アダプターの底部の真下に挿入され、スーパーフランジレスフィッティングで適所に密閉された。自由側に、使用しないときには密閉されているがわずかに高い圧力下で無水溶媒の第２のリザーバーからリザーバーを充填するために使用され得る、シャットオフクイックコネクト（Ｓｗａｇｅｌｏｋ  ＳＳ−ＱＭ２−Ｂ−２００ＫＲ）を取り付けた。第２のリザーバーは同様の設計のものであり、１０ｐｓｉアルゴンを使用して、乾燥溶媒を移した。充填中に、窒素系を、５ｐｓｉ背圧調節器およびオイルバブラーを通じて通気した。
【０１７０】
（実施例７）
流動合成のための一般的手順
流動合成のために下記の手順を使用した。樹脂を、反応器にロードし、反応器をＨＰＬＣポンプに接続し、ハロゲン化洗浄溶媒を１０ｍＬ／分で送達して、空気を除去した。流動を停止し、樹脂を１０分間膨潤させた。流動プロトコールは、１０ｍＬ／分で６０秒間の初期ハロゲン化溶媒洗浄で開始した。脱トリチル化は、１００ｍＭのトリフルオロ酢酸ピリジンを用い、同じ流量で１２０秒間実施した。脱トリチル化ステップは、コリドン、ルチジンまたは４−シアノピリジンを使用して実施することもできる（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄ）。３０秒間のハロゲン化溶媒洗浄後、５％ＤＩＥＡまたはＮＥＭを用いて中和を６０秒間実施した。次いで、樹脂を、ハロゲン化溶媒およびＤＭＩで、６０秒間それぞれ１０ｍＬ／分で洗浄した。次いで、カップリングステップのためにＨＰＬＣポンプを止めた。カップリング溶液（乾燥ＤＭＩ中、０．２Ｍサブユニット、０．４Ｍ  ＤＩＥＡまたはＮＥＭ、および０．２１Ｍ  ＬｉＢｒ）を、１０ｍＬのシリンジに入れ、シリンジポンプを介し、３ｍＬ／分で１分間（０．５ｍｍｏｌモノマー）または２分間（１ｍｍｏｌモノマー）かけて送達した。モノマーは、臭化リチウムの存在下、９０℃〜１１０℃の間の温度で安定であることが決定された（図１）。溶液のすべてを送達する場合、ＨＰＬＣポンプは、ＤＭＩを３ｍＬ／分で３分間送達した。このプロトコールを、各残留物について合成が完了するまで繰り返した。完成した樹脂を反応器から除去し、フリットシリンジ（Ｔｏｒｖｉｑ）中のＤＣＭで５回洗浄し、真空下で乾燥させた。開裂を上記の通りに実施した。
【０１７１】
高温でのステップのために、反応器および予熱ループを恒温水浴に入れた。
【０１７２】
ＨＰＬＣ精製のために、樹脂を緩やかな条件（４：１  エタノール／水酸化アンモニウム）下で開裂し、次いで、固相抽出（ＳＰＥ）によって単離した。前記緩やかな条件を使用する開裂の前、樹脂結合ＰＭＯは、様々な反応条件に対して安定であった（図２）。最初に、開裂された樹脂を濾過し、メタノールで４回洗浄した。開裂溶液および洗浄液を収集し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮乾固した。ＳＰＥの前に、残留物を１０ｍＬのミリＱ水に溶解した。別個に、下記の手順を使用して、ＳＰＥカラムを調製し、コンディショニングした。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製の２０ｍＬのエコノパックカラムに、３〜４ｍＬのアンバークロムＣＧ−３００Ｍ樹脂を投入し、フリットで密閉した。次いで、８ｍＬの下記の溶液を順にカラムに添加し、排液した後、次の溶液を添加した：１％ＮＨ４ＯＨ中８０％ＡＣＮ、２０％ＥｔＯＨ中０．５Ｍ  ＮａＯＨ、ミリＱ水、８０％ＡＣＮ中５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、ミリＱ水、２０％ＥｔＯＨ中０．５Ｍ  ＮａＯＨ、ミリＱ水、１％ＮＨ４ＯＨ。コンディショニングが完了したら、カラムを、８ｍＬの１％ＮＨ４ＯＨ中、室温で使用するまで貯蔵した。カラムを１２ｍＬのミリＱ水で２回すすいだ後、カラムにＰＭＯをロードした。次いで、カラムを、３ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌで１回、続いて、１２ｍＬのミリＱ水で３回、３ｍＬの水中１０％アセトニトリルで１回すすいだ。次いで、ＰＭＯを、水中５０％アセトニトリルの３ｍＬすすぎ液２回で溶離した。５０％アセトニトリル洗浄液からの溶離液を、予め秤量した５０ｍＬのコニカル遠心分離管中に収集し、凍結乾燥して、粗製のＰＭＯを、ＬＣ／ＭＳ分析および／または分取ＨＰＬＣ精製に好適な白色粉末として得た。
【０１７３】
いくつかのＰＭＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６１３０シングル四重極質量分析計につないだＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ＨＰＬＣからなる質量指向精製システム（ｍａｓｓ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）で精製した（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅ）。精製に使用した溶媒混合物は、次の通りであった：Ａ＝５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ＝８）、Ｂ＝９０％アセトニトリル＋１０％５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ＝８）。精製は、下記の条件を使用して実施した：カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００−ＳＢ  Ｃ３（５μｍ、２１．２×１００ｍｍ）；流量：２０ｍＬ／分；勾配：０〜２分２％Ｂ、２〜６０分２〜６０％Ｂ、６０〜７０分７５％Ｂ。
【表６】
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【０１７４】
参照による組み込み
本出願全体を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む）の内容は、これによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般的に公知の意味と一致する。
【０１７５】
均等物
当業者ならば、日常実験以上のものを使用することなく、本明細書において記載されている開示の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または解明することができるであろう。そのような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されるように意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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