(57)【要約】【課題】本発明は、細胞におけるＡｋｔ分子の過剰発現により抗腫瘍または抗ウイルス免疫細胞の生存および機能性を増強することができる方法に関する。【解決手段】本発明のＡｋｔシグナル伝達は免疫チェックポイントの発現を阻止し、免疫抑制微小環境において抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を消耗から救済した。本発明はまた、ＡＫＴ遺伝子が慢性ウイルス感染および悪性腫瘍の治療のための養子Ｔ細胞導入療法のＴ細胞工学において利用される可能性を有することを明らかにした。【選択図】図１
2020535818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｋｔ分子を過剰発現する改変細胞を含み、前記改変細胞は、
ａ．Ａｋｔアイソフォーム、および
ｂ．前記Ａｋｔアイソフォームを前記改変細胞の細胞膜に導くペプチド、
をコードするポリヌクレオチドで改変される、免疫寛容を低下させるための組成物。
【請求項２】
前記Ａｋｔアイソフォームが、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号７に記載のミリストイル化標的配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、キメラ抗原レセプタまたは組換えＴ細胞レセプタをコードするフラグメントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、前記Ａｋｔアイソフォームと前記キメラ抗原レセプタまたは組換えＴ細胞レセプタとの間のリンカーをコードするフラグメントをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記リンカーが、配列番号９に記載の２Ａペプチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記改変細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞または多能性幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む、ヒト以外の被験者のウイルス感染症を治療するためのウイルス感染症治療方法。
【請求項９】
前記ウイルス感染症が肝炎である、請求項８に記載のウイルス感染症治療方法。
【請求項１０】
有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む、ヒト以外の被験者のがんを治療するためのがん治療方法。
【請求項１１】
前記がんが肝がんである、請求項１０に記載のがん治療方法。
【請求項１２】
前記がんが肝細胞がん、胆管がん、肝血管肉腫および類上皮血管内皮腫を含む、請求項１１に記載のがん治療方法。
【請求項１３】
有効量の請求項４に記載の組成物を投与することを含む、ヒト以外の被験者のがんを治療するためのがん治療方法。
【請求項１４】
組換えウイルスまたはトランスポゾンベクターを標的細胞に導入し、前記標的細胞を増殖させることを含む、請求項１に記載の組成物の製造方法。
【請求項１５】
前記組換えウイルスまたはトランスポゾンベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他の関連ウイルスおよび他のトランスポゾン系を含み、トランス遺伝子の形質導入または組込みに用いることができる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記組換えウイルスまたは前記トランスポゾンベクターが、プラスミド増幅、in vitro転写またはin vitro合成によって増幅され得、エレクトロポレーション、リポソームまたはその他の化学ビヒクルによって前記標的細胞にトランスフェクトされ得る、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記標的細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞または多能性幹細胞を含む、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記標的細胞が、ウイルス形質導入およびＤＮＡまたはＲＮＡ形質移入によってさらに改変され得る、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記標的細胞の増殖を増強するために、可溶性・プレート結合性の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体、またはサイトカインの補充を伴う抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズで前記標的細胞を刺激することを含む、請求項１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）過剰発現免疫細胞を使用する養子細胞療法に関する。より具体的には、Ａｋｔ過剰発現免疫細胞は免疫抑制微小環境におけるウイルス感染および悪性腫瘍の治療に利用可能であることに関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０１７年９月２９日に出願された米国仮特許出願第62/565,820号の優先権を主張し、その全内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
抗原特異性を導入するため、または免疫細胞のエフェクタ機能または生存を増強するために遺伝子工学を利用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は実行可能であり、慢性感染症または悪性腫瘍治療にとって臨床的価値が高い。なぜなら、通常これらの慢性疾患を有するほとんどの患者では、ウイルスまたは腫瘍特異的免疫細胞応答は障害されるか欠落しているからである。
【０００４】
しかしながら、慢性ウイルス感染または悪性腫瘍の際は通常、モノクローナルＴ細胞応答が検出され、抗原特異的Ｔ細胞のほとんどが活性化後速やかに消耗し、またはアポトーシスを起こす。ウイルスまたは腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、持続性Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）シグナル伝達および適切な共刺激の欠如により、Ｔ細胞の消耗を起こすことがしばしば観察される。Ｔ細胞の消耗は、増殖能およびサイトカイン産生の漸減、細胞毒性の障害、種々の免疫チェックポイントの表面発現およびアポトーシス率の増加を特徴とする。
【０００５】
免疫チェックポイント、例えばＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４では、Ｔ細胞活性化の程度を制御するため、ＴＣＲシグナル伝達に応答してＴ細胞上で上方制御され、消耗したＴ細胞上で高度に発現される。Ｔ細胞上の免疫チェックポイントを介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化や分化時の代謝リプログラミングを障害しうることがいくつかの研究で示されている。
【０００６】
ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達によって、それぞれ活性化されるＰＰ２ＡおよびＳＨＰ２がＴＣＲ刺激時のＴ細胞のＡｋｔ活性化を抑制できることを除けば、免疫チェックポイントシグナルは、ほとんど解明されていない。
【０００７】
ＡｋｔはＴ細胞の成長、増殖、生存に大きな影響を及ぼすことが示されており、また、Ｆｏｘｏ、ｍＴＯＲおよびＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路の制御を介したＴ細胞分化のシグナルインテグレーターであることが実証されている。慢性ＬＣＭＶ（Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus）感染時には、ＣＴＬにおけるＡｋｔおよびｍＴＯＲシグナル伝達の活性化が障害され、ウイルス特異的ＣＴＬにおいてＰＤ−１シグナル伝達を介したＴ細胞の消耗が生じる。
【０００８】
したがって本発明は、抗ウイルスまたは抗腫瘍ＣＴＬにおけるＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路の強化がＴ細胞の消耗から患者を救う可能性があり、さらに悪性腫瘍または慢性ウイルス感染患者の治療として遺伝子改変Ｔ細胞の生存およびエフェクタ機能を増強するため、組換えＴＣＲ技術またはキメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）技術への適用可能性があることを実証する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＣＴＬにおけるＡｋｔ分子の過剰発現を通して、抗腫瘍または抗ウイルスＴ細胞の生存および機能性を増強できる方法を提供する。Ａｋｔ過剰発現ＣＴＬは、肝臓で抗原と遭遇する間、高い増殖能力と優れたエフェクタ機能を有することが示される。これは、Ａｋｔ分子が抑制性微小環境におけるＴ細胞の消耗を克服するため、ＣＴＬを助けることができることを示唆している。本発明者らはさらに、Ａｋｔ分子の発現が抗ウイルスおよび抗腫瘍ＣＴＬ応答（例えば、増殖、サイトカイン産生および細胞毒性）を促進し得ることを示す。さらに、本発明では、ＭＤＳＣによって誘発される増殖停止に対するＣＴＬの抵抗を可能にし、恒常的に活性化されたＡｋｔ分子の発現により、Ｔ細胞が免疫寛容誘発性の肝臓または腫瘍の微小環境で生存し、腫瘍またはウイルスを殺傷する能力を獲得することができる。活性型Ａｋｔ分子はＴＣＲシグナル伝達と組み合わせた場合にのみ、ＣＴＬの大量増殖応答を誘発できる。そのため、ＣＴＬのＴ細胞工学に適用しても安全である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１つの実施形態）
１つの実施形態において、本発明はミリストイル化Ａｋｔ分子を細胞膜上に固定することができ、またこれらがリン酸化され得ることを実証する。レシピエントマウスに養子移植された後、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２のＣＴＬ集団は肝臓および脾臓で活発に増殖する。これは、Ａｋｔの過剰発現が抗原刺激への応答としての肝内生存またはＣＴＬの二次的増殖に関係することを示す。
【００１１】
Ｔ細胞の消耗は、細胞表面へ様々な免疫チェックポイントが発現することで特徴付けられる。免疫チェックポイントの遮断はＣＴＬのＴ細胞を消耗から救い、抗腫瘍反応をさらに増強することができる。
別の実施形態において、本発明はＡｋｔシグナル伝達が免疫チェックポイント、特にＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）特異的ＣＴＬ上のＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴの発現を妨げることを実証した。
【００１２】
（いくつかの実施形態）
いくつかの実施形態において、本発明はＡｋｔ１／２発現ＣＴＬが２つの異なるモデルにおいて効率的に肝内のウイルス感染を排除し、回復した個体において持続し、防御記憶免疫を提供することを実証する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、Ａｋｔ２発現ＣＴＬは、がん遺伝子導入ＨＣＣマウスモデルにおいて作製された肝がんを根絶することができる。Ａｋｔシグナル伝達は免疫抑制微小環境において、ＣＴＬのＴ細胞の消耗現象を逆転させることができるため、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２遺伝子は、肝臓の慢性ウイルス感染および悪性腫瘍の治療のための養子Ｔ細胞導入療法のためのＴ細胞工学において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（Ａ〜Ｏ）はＨＢＶキャリアマウスへの養子移植後にＴ細胞の消耗を受けるＨＢＶ特異的ＣＴＬを示す。（Ａ）２×１０５のＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬの養子移植を受けたＡｄＨＢＶ感染マウスの血清ＨＢｅ抗原の動態。ＡｄＨＢＶ感染マウスへ養子移植後の、示された時点におけるＨＢＶキャリアマウスの肝臓および脾臓でのＣＤ４５．１＋移植ＣＴＬのゲーティング（Ｂ）および定量（Ｃ）。５２×１０５in vitro活性化ＨＢｃ９３−１００ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＡｄＨＢＶに感染させたＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに養子移植される。ヒストグラムは、養子移植後３、７および１４日目からのＡｄＨＢＶ感染マウスの肝臓および脾臓における、移植ＣＴＬ上のＰＤ−１（Ｄ、Ｈ、Ｌ）、ＴＩＭ−３（Ｅ、Ｉ、Ｍ）およびＬＡＧ−３（Ｆ、Ｊ、Ｎ）の発現を示す。アイソタイプ対照染色は黒灰色のヒストグラムで示される一方、特異的染色は白色のヒストグラムで示される。５×１０５ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬの養子移植後３日目（Ｇ）、７日目（Ｋ）および１４日目（Ｏ）のＡｄＨＢＶ感染マウスの肝臓および脾臓における内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞および養子移植ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｂに示すようなゲーティング）。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応のないスチューデントのｔ検定。以下、スチューデントのｔ検定）。
【図２】図２Ａ〜Ｆは異なるＡｋｔアイソフォームによる肝内ＣＴＬ増殖の制御を示す。（Ａ）Ｔ細胞工学に使用されるＭＳＣＶレトロウイルス構築物の概略図は５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）、Ｐ２Ａリンカーペプチド配列（２Ａ）（配列番号１０）、ＣＤ９０．１遺伝子およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）を含む。ｐＭＳＣＶ−ｍＡｋｔ１／Ａｋｔ２／Ａｋｔ３−２Ａ−ＣＤ９０．１プラスミドにおいて、ｓｒｃミリストイル化配列（ｍｙｒ）（配列番号８）およびマウスＡＫＴ１（配列番号２）、ＡＫＴ２（配列番号４）またはＡＫＴ３（配列番号６）遺伝子は２Ａ配列の上流に配置される。（Ｂ）２Ａ−ＣＤ９０．１、ｍＡｋｔ１−２Ａ−ＣＤ９０．１、ｍＡｋｔ２−２Ａ−ＣＤ９０．１、ｍＡｋｔ２−２Ａ−ＣＤ９０．１、ｍＡｋｔ３−２Ａ−ＣＤ９０．１を保有するレトロウイルスで形質導入されたin vitro活性化ＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉ細胞の形質導入効率。形質導入後２日目、形質導入成功のマーカーとしてのＣＤ９０．１の表面発現はフローサイトメトリー分析によって検出される。（Ｃ）コントロール（対照実験）、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解物中のホスホ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、β−アクチンおよびホスホ−Ｓ６タンパク質検出のためのウェスタンブロット。（Ｄ）同族抗原の肝内発現マウスの肝臓および脾臓における移植ＣＴＬの定量。１×１０５形質導入ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬを養子移植の１日前にアルブミンプロモーターの制御下で、オボアルブミンおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドの流体力学的注射（ＨＤＩ）を受けたレシピエントマウスに養子移植する。養子移植後７日目に肝臓関連リンパ球および脾細胞を単離し、移植ＣＴＬの割合および数のフローサイトメトリー分析に供する。同族抗原（卵白アルブミン）の肝内発現マウスの肝臓（Ｅ）および脾臓（Ｆ）における移植ＣＴＬの蓄積動態。１×１０５形質導入ＯＴ−Ｉ  ＣＴＬを養子移植の１日前にアルブミンプロモーターの制御下で、オボアルブミンおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドのＨＤＩを受けたレシピエントマウスに養子移植する。肝臓関連リンパ球および脾細胞を３、７および１５日目に単離し、移植ＣＴＬのパーセンテージおよび数のフローサイトメトリー分析に供する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図３】図３Ａ〜ＢはＡｋｔ２‐生着ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬの局所的増殖を示す。（Ａ）２Ａ−ｌｕｃ過剰発現（対照実験）ＯＴ−ＩまたはｍＡｋｔ２−２Ａ−ｌｕｃ過剰発現（Ａｋｔ２）ＯＴ−Ｉ細胞の養子移植の１日前にアルブミンプロモーターまたはコントロールベクター（対照実験）の制御下でＯＶＡをコードするプラスミドのＨＤＩを投与したマウスにおける肝in vivo生物発光の動態。個々のマウスの生物発光を養子移植後１、４、８、１０、１２、１５、１８および２５日目にモニターし、（Ｂ）にプロットする。
【図４】図４Ａ〜Ｔは肝臓におけるＴ細胞の消耗を克服したＡｋｔ導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬを示す。養子移植前のＡｋｔ１‐ＣＤ９０．１またはＣＤ９０．１工学（対照実験）ＣＴＬにおけるＰＤ‐１（Ａ）、ＴＩＧＩＴ（Ｂ）およびＬＡＧ‐３（Ｃ）の発現のヒストグラム。アイソタイプ対照染色は黒い灰色のヒストグラムで示される一方、特異的染色は白いヒストグラムで示される。（Ｄ）Ａ‐Ｃからの染色結果の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を棒グラフに示す。（Ｅ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる２４時間再刺激後のＣＤ９０．１遺伝子導入（対照実験）ＣＴＬおよびＡｋｔ１‐ＣＤ９０．１発現ＣＴＬ上のＰＤ‐１、（Ｆ）ＴＩＧＩＴおよび（Ｇ）ＬＡＧ‐３。アイソタイプ対照染色は黒い灰色のヒストグラムで示される一方、特異的染色は白いヒストグラムで示される。（Ｈ）Ｅ‐Ｇからの染色結果のＭＦＩを棒グラフに示す。ＡｄＨＢＶに感染させたＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに５×１０５Ａｋｔ１−ＣＤ９０．１−またはＣＤ９０．１過剰発現（対照実験）を養子移植する。養子移植後６日目または１９日目に肝臓関連リンパ球および脾細胞を単離し、移植されたＣＴＬによる免疫チェックポイントの発現のフローサイトメトリー分析に供する。ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋細胞をゲーティングし、移植されたＣＴＬと定義する。養子移植後６日目から移植ＣＴＬ上の免疫チェックポイント、ＰＤ‐１（Ｉ、Ｊ）、ＴＩＭ‐３（Ｍ、Ｎ）およびＬＡＧ３（Ｑ、Ｒ）の発現。養子移植後１９日目から移植されたＣＴＬ上での免疫チェックポイント、ＰＤ‐１（Ｋ、Ｌ）、ＴＩＭ‐３（Ｏ、Ｐ）およびＬＡＧ３（Ｓ、Ｔ）の発現。アイソタイプ対照染色は黒い灰色のヒストグラムで示される一方、特異的染色は白いヒストグラムで示される。染色結果のＭＦＩをＪ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、ＲおよびＴ（Ｎ＝３／群）に示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図５】図５Ａ〜Ｈはin vitroでの免疫チェックポイントの発現におけるＡｋｔシグナル伝達の影響を示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる３日間の刺激後の（Ａ）ＰＤ−１、（Ｂ）ＴＩＧＩＴおよび（Ｃ）ＬＡＧ−３のＣＤ９０．１工学（対照実験）ＣＴＬ、Ａｋｔ１−ＣＤ９０．１−およびＡｋｔ２−ＣＤ９０．１  ＣＴＬ上での発現のヒストグラム。アイソタイプ対照染色は黒い灰色のヒストグラムで示される一方、特異的染色は白いヒストグラムで示される。（Ｄ）Ａ‐Ｃからの染色結果のＭＦＩを棒グラフに示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる２４時間の再刺激後のＣＤ９０．１導入（対照実験）ＣＴＬおよびＡｋｔ２−ＣＤ９０．１導入ＣＴＬ上の（Ｅ）ＰＤ−１、（Ｆ）ＴＩＧＩＴおよび（Ｇ）ＬＡＧ−３の発現のヒストグラム。アイソタイプ対照染色は黒い灰色のヒストグラムで示される一方、特異的染色は白いヒストグラムで示される。（Ｈ）Ｅ‐Ｇからの染色結果のＭＦＩを棒グラフに示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図６】図６Ａ〜Ｆは持続性ＨＢＶマウスモデルにおけるＴ細胞の消耗を防止するＡｋｔ２導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬを示す。２×１０６Ａｋｔ２−ＣＤ９０．１−またはＣＤ９０．１−エンジニアリング（対照実験）を、ＡｄＨＢＶに感染させたＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに養子移植する。養子移植後１９日目に肝臓関連リンパ球および脾細胞を単離し、免疫チェックポイントの発現レベルのフローサイトメトリー分析に供する。養子移植後１９日目のレシピエントマウスの脾臓または肝臓における移植ＣＴＬ上のＰＤ−１（Ａ）、ＴＩＭ−３（Ｃ）およびＴＩＧＩＴ（Ｅ）の発現のヒストグラム。アイソタイプ対照染色は黒い灰色のヒストグラムで示され、一方、特異的染色は白いヒストグラムで示される。染色結果のＭＦＩをＢ、ＤおよびＦに示す（群当たりｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図７】図７Ａ〜Ｏは持続性ＨＢＶマウスモデルにおいてＨＢＶに対する防御免疫を発現したＡｋｔ導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬを示す。ＡｄＨＢＶ感染マウスへの養子移植後６日目（Ｂ）または１９日目（Ｃ）のＨＢＶキャリアマウスの肝臓および脾臓におけるＣＤ４５．１＋移植ＣＴＬのゲーティング（Ａ）および定量（Ｂ、Ｃ）。Ａｋｔ５×１０５Ａｋｔ１−ＣＤ９０．１−またはＣＤ９０．１エンジニアリング（対照実験）は、２．５ヶ月前にＡｄＨＢＶに感染したＣＤ４５．２＋レシピエントマウスに採用される。養子移植後６日目または１９日目に肝臓関連リンパ球および脾細胞を単離し、移植ＣＴＬの割合および数のフローサイトメトリー分析に供する。ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋細胞をゲーティングし、移植されたＣＴＬと定義する。（Ｄ）Ｃ．と同様にレシピエントマウスの血清ＨＢｅ抗原の動態。（Ｅ）Ｃ．と同様にレシピエントマウスの血清ＡＬＴの動態。（Ｆ）Ｂ．からの肝組織のヘマトキシリンとエオシン染色。ＨＢｃＡｇ（Ｇ）、切断カスパーゼ３（Ｈ）、Ｇｒ−１（Ｉ）およびＣＤ４５．１（Ｊ）の各免疫組織化学的分析。（Ｋ）Ｃ．からの肝組織のヘマトキシリンとエオシン染色。ＨＢｃ抗原（Ｌ）、切断カスパーゼ３（Ｍ）、Ｇｒ−１（Ｎ）およびＣＤ４５．１（Ｏ）の各免疫組織化学的分析（各群Ｎ＝３〜４）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。スケールバーは１００または４０μｍ。
【図８】図８Ａ〜Ｄは持続性ＨＢＶマウスモデルにおいてＨＢＶに対する防御免疫を発達させたＡｋｔ２導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬを示す。ＡｄＨＢＶ感染マウスへの養子移植後１９日目のＨＢＶキャリアマウスの肝臓および脾臓におけるＣＤ４５．１＋移植ＣＴＬのゲーティング（Ａ）および定量（Ｂ）。２×１０６Ａｋｔ２−ＣＤ９０．１−またはＣＤ９０．１過剰発現（対照実験）ＨＢｃ９３−１００特有のＣＴＬは、ＡｄＨＢＶに感染したＣＤ４５．２＋受容マウスに採用的に転送される。養子移植後１９日目に肝臓関連リンパ球および脾細胞を単離し、移植されたＣＴＬの割合および数のフローサイトメトリー分析に供する。ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋細胞をゲーティングし、移植されたＣＴＬと定義する。（Ｃ）Ｂと同様にレシピエントマウスの血清ＡＬＴの動態。（Ｄ）Ｂと同様にレシピエントマウスの血清ＨＢｅ抗原の動態。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図９】図９Ａ〜ＤはＨＢＶキャリアマウスへの養子移植後のＨＢＶ特異的ＣＴＬにおけるサイトカイン産生を示す。（Ａ）養子移植ＨＢＶ特異的ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内発現のゼブラプロット。５×１０５Ａｋｔ１−ＣＤ９０．１−またはＣＤ９０．１過剰発現（対照実験）ＨＢｃ９３−１００特有のＣＴＬは、ＡｄＨＢＶに感染したＣＤ４５．２＋受容マウスに採用的に転送される。肝臓関連リンパ球および脾細胞を養子移植後１９日目に単離し、ＨＢｃ＋ペプチドで６時間再刺激し、続いて表面マーカーおよび細胞内サイトカインを染色し、サイトカイン分泌ＣＴＬのパーセンテージをフローサイトメトリー分析する。ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋細胞をゲーティングし、移植されたＣＴＬと定義する。（Ｂ）ＩＦＮ−γ分泌ＣＴＬ（ＳＰ）の割合およびＩＦＮ−γとＴＮＦ−α（ＤＰ）の両方を分泌するＣＴＬの割合の棒グラフ。（Ｃ）養子移植ＨＢＶ特異的ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内発現のゼブラプロット。５×１０５Ａｋｔ２−ＣＤ９０．１−またはＣＤ９０．１過剰発現（対照実験）ＨＢｃ９３−１００特有のＣＴＬはＡｄＨＢＶに感染したＣＤ４５．２＋受容マウスに採用的に転送される。肝臓関連リンパ球および脾細胞を養子移植後１９日目に単離し、ＨＢｃ＋ペプチドで６時間再刺激し、続いて表面マーカーおよび細胞内サイトカインを染色し、サイトカイン分泌ＣＴＬのパーセンテージをフローサイトメトリー分析する。ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋細胞をゲーティングし、移植されたＣＴＬと定義する。（Ｄ）ＩＦＮ−γ分泌ＣＴＬ（ＳＰ）の割合およびＩＦＮ−γとＴＮＦ−α（ＤＰ）の両方を分泌するＣＴＬの割合の棒グラフ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図１０】図１０Ａ〜Ｊは、Ａｋｔシグナル伝達がＣＴＬの抗原依存性増殖および肝臓における抗原除去を促進することを示す。（Ａ）示された時点におけるＯＶＡ陽性マウスと同等の生物発光陽性マウスのパーセンテージ。同族抗原（卵白アルブミン）の肝内発現マウスの肝臓（Ｂ）および脾臓（Ｃ）における移植ＣＴＬの蓄積動態。１×１０５形質導入ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬを、養子移植の１日前にアルブミンプロモーターの制御下で、オボアルブミンおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドの流体力学的注射（ＨＤＩ）を受けたレシピエントマウスに養子移植した。肝臓関連リンパ球および脾細胞を３、７および１４日目に単離し、移植ＣＴＬの割合および数のフローサイトメトリー分析に供した。（Ｄ）１×１０５−２Ａ−ＣＤ９０．１‐生着（対照実験）またはｍＡｋｔ１−２Ａ−ＣＤ９０．１‐生着（Ａｋｔ１）ＯＴ‐Ｉ細胞の養子移植を受けたＯＶＡ‐Ｌｕｃ陽性マウスにおける血清ＡＬＴの動態。（Ｅ、Ｆ）Ａと同様にマウスの肝臓（Ｅ）および脾臓（Ｆ）における移植ＣＴＬの蓄積動態肝臓関連リンパ球および脾細胞を７、３０および６３日目に分離し、移植ＣＴＬの割合および数のフローサイトメトリー分析に供した。（Ｇ）Ｅ．からの肝組織のヘマトキシリンとエオシン染色。（Ｈ）ＯＶＡ−Ｌｕｃ陽性レシピエントマウスへの養子移植後７日目および６３日目のＡｋｔ１移植ＯＴ−Ｉ  ＣＴＬのＢｒｄＵ染色の代表的なヒストグラム。（Ｉ）ＯＶＡ−Ｌｕｃ陽性レシピエントマウスへの養子移植後７日目および６３日目のＢｒｄＵ＋移植Ａｋｔ１生着ＯＴ−Ｉ  ＣＴＬの頻度。レシピエントマウスに養子移植後６日目または６２日目に１ｍｇのＢｒｄＵを、腹腔内注射により与えた。肝臓関連リンパ球および脾細胞を７日目および６３日目に単離し、ＢｒｄＵ＋＋移植されたＣＴＬのパーセンテージのフローサイトメトリー分析に供した。（Ｊ）２Ａ−ＣＤ９０．１−生着（対照実験）またはｍＡｋｔ１−２Ａ−ＣＤ９０．１−生着（Ａｋｔ１）ＯＴ−Ｉ細胞の養子移植を受けたＯＶＡ−Ｌｕｃ陽性マウスの肝臓におけるＫｉ−６７の免疫組織化学的解析。肝臓を１×１０５ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬの養子移植後７日目、３２日目および６３日目に収集した。スケールバーは４０μｍ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）、尺度バーは１００または４０μｍ。
【図１１】図１１はＡｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬに毒性を有するマウスのin vivo生物発光を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、異なるウイルス用量でアルブミンプロモーターの制御下で卵白アルブミンおよびルシフェラーゼを発現する遺伝子を担持する組換えアデノウイルスを感染させる。感染マウスは感染後の所定の時点でＩＶＩＳにより肝臓におけるルシフェラーゼ発現をモニターされる。
【図１２】図１２Ａ〜ＧはＡｋｔ過剰発現ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶応答を示す。（Ａ）Ａｋｔ生着ＣＴＬのリコール応答の実験スキーム。（Ｂ）アルブミンプロモーター（Ａｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬ）およびコントロール（対照実験）またはＡｋｔ１−生着ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞（１×１０５）の制御下でＯＶＡおよびルシフェラーゼＯＲＦを保有するアデノウイルスを投与されたマウスにおける、養子移植後の示された時点での血清ＡＬＴの濃度。（Ｃ）Ａｄ‐Ａｌｂｐ‐ＯＬ、養子Ｔ細胞移植、および養子移植後６０日目のアルブミンプロモーター（ｐＥＮＴＲＹ‐Ａｌｂｐ‐ＯＬ）の制御下でのＯＶＡおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドの流体力学的注入（ＨＤＩ）を受けたマウスにおけるin vivo生物発光。（Ｄ）Ａｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬ感染および対照実験２Ａ−ＣＤ９０．１の養子移植を受けたマウスの肝臓および脾臓における移植ＣＴＬの定量化は、養子移植後６０日目にＯＴ−ＩまたはＡｋｔ１生着ＯＴ−Ｉに続いてｐＥＮＴＲＹ−Ａｌｂｐ−ＯＬのＨＤＩを生着させた。肝臓関連リンパ球および脾細胞をＨＤＩ後７日目に分離し、移植ＣＴＬ数のフローサイトメトリー分析に供した。（Ｅ）Ｄからの肝組織のヘマトキシリン・エオジン染色（Ｆ）。Ｄからの肝臓のＣＤ８の免疫組織化学的解析（Ｇ）。Ｄからの肝臓におけるＧｒ−１の免疫組織化学的解析。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）、スケールバーは１００または４０μｍ。
【図１３】図１３Ａ〜ＦはＡｋｔ過剰発現ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶応答を示す。マウスをＡｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬに感染させ、養子移植後６４日目にアルブミンプロモーター（ｐＥＮＴＲＹ−Ａｌｂｐ−ＯＬ）の制御下で、ＯＶＡおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドの養子Ｔ細胞移植およびＨＤＩを受ける。（Ａ）転送されたＣＴＬの定量化、（Ｂ）ＣＤ１１ｂ＋ＮＫ１．１−ミエロイド細胞、（Ｃ）ＮＫ１．１＋ＣＤ３−ＮＫ細胞、および（Ｄ）Ａｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬ感染および対照実験２Ａ−ＣＤ９０．１、Ａｋｔ１またはＡｋｔ２の引き抜かれたＯＴ−Ｉ  ＣＴＬの引き継ぎを受けたマウスの、肝臓および脾臓内のＮＫ１．１＋ＣＤ３＋ＮＫＴ細胞。養子移植後７日目に肝臓関連白血球および脾細胞を単離し、細胞数のフローサイトメトリー分析に供する。（Ｅ）Ａｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬおよび対照実験またはＡｋｔ２を移植したＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞（１×１０５）を与えたマウスにおける、養子移植後の指示された時点での血清中ＡＬＴ濃度。（Ｆ）Ａｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬ、養子Ｔ細胞移植、および養子移植後６４日目にアルブミンプロモーター（ｐＥＮＴＲＹ−Ａｌｂｐ−ＯＬ）の制御下でＯＶＡおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドのＨＤＩを受けたマウスにおけるin vivo生物発光。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図１４】図１４Ａ〜ＣはＨＣＣ腫瘍微小環境におけるＡｋｔ導入ＣＴＬの影響を示す。ＨＣＣ担がんマウスの肝／腫瘍におけるＣＤ８（Ａ）、Ｆ４／８０（Ｂ）、切断型カスパーゼ３（Ｃ）の免疫組織化学的解析。ＨＣＣの増殖は、ＨＤＩによって導入されたがん遺伝子ＡｋｔおよびＮ−ＲａｓＶ１２によって誘発される。ＨＣＣ誘発後３１日目に、マウスに腫瘍細胞上に導入された腫瘍抗原を認識し得るかまたは認識し得ない２×１０６のＡｋｔ２‐生着ＯＴ‐Ｉ  ＴＣＲ  ｔｇ  ＣＴＬを注射する（対照実験）。養子移植後１０日目に肝臓／腫瘍組織を収集する。
【図１５】図１５Ａ〜ＤはＡｋｔ導入ＣＴＬの抗腫瘍能力を示す。ＨＣＣの開発は、ＨＤＩによって導入されたがん遺伝子、ＡｋｔおよびＮ−ＲａｓＶ１２によって誘発される。マウスにおけるＨＣＣの増殖をＩＶＩＳによってモニターし、１０９光子／秒より大きい全流束を有するマウスを、養子Ｔ細胞導入療法を受けるレシピエントとして使用する。マウスに腫瘍細胞上の代理腫瘍抗原を認識し得る２×１０５対照実験、Ａｋｔ１−およびＡｋｔ２−生着ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬをそれぞれ注射する。（Ａ）養子Ｔ細胞移植を受ける前後のマウスのin vivo生物発光。肝臓／腫瘍組織は、（Ｂ）対照実験遺伝子組み換えＣＴＬ、（Ｃ）Ａｋｔ１遺伝子組み換えＣＴＬまたは（Ｄ）Ａｋｔ２遺伝子組み換えＣＴＬを養子移植後１９日目に受け取ったマウスから採取する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図１６】図１６Ａ〜Ｌは、Ａｋｔ分子の過剰発現によるＣＡＲ  Ｔ細胞の改善された腫瘍特異的増殖、サイトカイン産生および細胞傷害性を示す。（Ａ）Ｔ細胞工学に使用されるＭＳＣＶレトロウイルス構築物の模式図は５’および３’長末端反復配列（ＬＴＲ）、Ｐ２Ａリンカーペプチド配列（２Ａ）およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）を含む。ｐＭＳＣＶ−ｍＡｋｔ１／Ａｋｔ２−２Ａ−ＣＡＲプラスミドでは、ｓｒｃミリストイル化配列（ｍｙｒ）およびマウスＡＫＴ１またはＡＫＴ２遺伝子が２Ａ配列の上流に配置され、続いてキメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）ＯＲＦ、例えば抗ＨＢ  ＣＡＲ（Ｓ−ＣＡＲ）および抗ＣＥＡ  ＣＡＲが配置される。ｐＭＳＣＶ−ｈＡｋｔ１／ｈＡｋｔ２−２Ａ−ＣＡＲプラスミドでは、マウスＡＫＴ１またはＡＫＴ２遺伝子がヒトＡＫＴ１またはＡＫＴ２遺伝子に置換される。（Ｂ）Ａｋｔ１−生着（ｍＡｋｔ１）、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−生着（抗ＣＥＡ）およびＡｋｔ１−２Ａ−抗ＣＥＡ  ＣＡＲ（ｍＡｋｔ１−抗ＣＥＡ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。ｍＡｋｔ１／ｍＡｋｔ２−２Ａ−ＣＤ９０．１、抗ＣＥＡ  ＣＡＲまたはｍＡｋｔ１／ｍＡｋｔ２−２Ａ−抗ＣＥＡ  ＣＡＲ  ＯＲＦをそれぞれ保有するレトロウイルスを形質導入したin vitro活性化マウスＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＬＳ１７４Ｔ細胞と共培養する。ＥｄＵの取り込みおよび検出を適用し、共培養後２２時間〜２８時間の間Ｔ細胞のＤＮＡ合成をモニターする。共培養物の上清中のＩＦＮγ（Ｃ、Ｅ）およびＩＬ−２（Ｄ、Ｆ）をＥＬＩＳＡによって検出する。（Ｇ、Ｉ）ＬＳ１７４Ｔ細胞との共培養によるＣＴＬの細胞内ＩＦＮγおよびgranzyme B染色（Ｈ、Ｊ）を１日間行った。（Ｋ）ＭＤＳＣ存在下でのＣＴＬの増殖能力−２Ａ−ＣＤ９０．１−生着（対照実験）またはｍＡｋｔ１−２Ａ−ＣＤ９０．１−生着ＯＴ−Ｉ  ＣＴＬはＥＬ４担がんマウスに由来する異なる数のＭＤＳＣの存在下、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ビーズで再刺激される。（Ｌ）ＭＤＳＣ存在下でのＣＴＬの増殖能力−２Ａ−ＣＤ９０．１−生着（対照実験）またはｍＡｋｔ２−２Ａ−ＣＤ９０．１−生着ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬは、マウスＨＣＣ細胞塊に由来する異なる数のＭＤＳＣが存在する場合、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ビーズで再刺激される。ＥｄＵの取り込みおよび検出を行って、共培養後２２時間〜２８時間の間Ｔ細胞のＤＮＡ合成をモニターする。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１６】
本明細書で使用する「ＯＴ−Ｉ細胞」という用語は、オーバルブミン特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のトランスジェニック（遺伝子導入）系統を指す。トランスジェニックＴ細胞レセプタは、Ｈ‐２Ｋｂとの関連でオボアルブミン残基２５７‐２６４を認識するように設計され、陽性選択におけるペプチドの役割および抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を研究するために使用された。
【００１７】
用語「ＡｄＨＢＶ」は、本明細書中で使用される場合、ＨＢＶゲノムを保有するアデノウイルスをいう。ＨＢＶ感染マウスモデルは、ＨＢＶゲノムの尾静脈への流体力学的注入（ＨＤＩ）により確立できる。
【００１８】
本明細書で使用される「ＨＢｃＡｇ」という用語は、Ｂ型肝炎ウイルスの核カプシドコアの表面上に見出せる抗原で、Ｂ型肝炎ウイルスの蛋白質を指す。
【００１９】
本明細書中で使用される用語「ＨＢｅ抗原」は、ＡｄＨＢＶ感染により作製されたＨＢＶ感染マウスの血清中またはＨＢＶゲノムを有するプラスミドのＨＤＩ中で検出され得る抗原でＢ型肝炎ウイルスのタンパク質を指す。
【００２０】
本発明におけるＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、プラスミド増幅、in vitro転写またはin vitro合成によって増幅され得、そしてエレクトロポレーション、リポソームまたはその他の化学的ビヒクルによって標的細胞にトランスフェクトされ得る。
【００２１】
遺伝子改変のための前述の標的細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞および様々な種由来の多能性幹細胞であり得る。これらの細胞は、ウイルス形質導入またはＤＮＡ（またはＲＮＡ）トランスフェクションによって改変され得る。
【００２２】
組換えウイルスまたはトランスポゾンベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、その他の関連ウイルスおよび種々のトランスポゾン系を形質導入または組込みに用いることができる。
【００２３】
肝臓微小環境が、肝臓におけるウイルス特異的ＣＴＬ集団の二次増殖に影響を及ぼすメカニズムを調べるため、in vitroで活性化されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＢＶキャリアマウスに養子移植し、これらのマウスにおけるＨＢＶ抗原の血清レベルの変化を検出する。大部分のマウスは４２日以内に持続性ＨＢＶ感染を排除できなかったことがわかる。ＨＢＶキャリアマウスの肝臓および脾臓において、養子移植されたＣＴＬ上のＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３を含む消耗マーカーの細胞数および発現レベルをさらに検出する。養子移植ＨＢＶ特異的ＣＴＬの細胞数は肝臓で増加するが、脾臓では増加しない。肝臓および脾臓の両方におけるＨＢＶ特異的ＣＴＬは、内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高レベルのＰＤ−１およびＬＡＧ−３を発現するが、脾臓ＨＢＶ特異的ＣＴＬは肝臓内コンパートメントよりも低レベルのＰＤ−１、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３を発現する。これらの結果は、肝微小環境で発現したＨＢＶ抗原への曝露が、ＨＢＶ特異的ＣＴＬのＴ細胞の消耗を誘発することを示している。
【００２４】
免疫チェックポイントＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４はそれぞれ、ＳＨＰ−１／２の動員およびＰＰ２Ａ活性化を介して、ＴＣＲ誘発時のＡｋｔリン酸化／活性化を防止することが示されている。従って我々はＡｋｔシグナル伝達がＣＤ８＋Ｔ細胞の肝内増殖および分化に重要であるかどうかを調べる。マウスＡＫＴ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３遺伝子をそれぞれクローニングし、ＡＫＴ遺伝子の上流にｓｒｃミリストイル化配列を加えて、膜標的化およびＡｋｔ分子の恒常的活性化を確実にする。外因性ミリストイル化Ａｋｔアイソフォームの発現はＡｋｔ発現ＣＴＬではウェスタンブロット法により検出されるが、対照Ｔ細胞では検出されない。ＣＴＬはそれぞれ３種類のＡｋｔで生着する。いずれもＳｅｒ４７３でのＡｋｔリン酸化を示し、Ａｋｔ１で生着したもののみ、またはＡｋｔ２で生着したものみがＴｈｒ３０８でのＡｋｔリン酸化を示す。
【００２５】
Ａｋｔの過剰発現が、抗原刺激に応答した肝臓内生存またはＣＴＬの二次的増殖と関係するかどうかを調べるため、卵白アルブミン（ＯＶＡ）およびルシフェラーゼ発現が、ＯＶＡおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドの流体力学的注入（ＨＤＩ）によりレシピエントマウスの肝臓で誘発される。レシピエントマウスに養子移植された後、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２遺伝子組み換えＣＴＬ集団は肝臓および脾臓で活発に増殖する。養子移植後７日目の対照実験ＣＴＬのそれと比較すると、肝臓に見られるＡｋｔ１  ＣＴＬは２５０，０００倍以上、Ａｋｔ２‐ＣＴＬ細胞数は９５０，０００倍以上である。
【００２６】
本発明者らは、慢性ウイルス感染中の肝臓におけるＴ細胞の消耗に対する免疫チェックポイントの膨大な寄与によりＡｋｔシグナル伝達がＨＢＶ特異的ＣＴＬ自体に対する免疫チェックポイント分子の発現に影響を及ぼすかどうかを検討する。in vitro活性化および形質導入後、Ａｋｔまたは対照実験導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬをＡｄＨＢＶ感染マウスに養子移植し、養子移植後６日目および１９日目にＣＴＬ上の免疫チェックポイント分子の表層発現を分析する。肝臓対照実験ＣＴＬは養子移植後１９日目に高レベルのＰＤ‐１，ＴＩＭ‐３およびＬＡＧ‐３を発現したが、Ａｋｔ１‐ＣＴＬおよびＡｋｔ２‐ＣＴＬは養子移植後１９日目に有意に少ないＰＤ‐１，ＴＩＭ‐３およびＬＡＧ‐３を発現した。
【００２７】
これらのＡｋｔ−ＣＴＬが、肝臓における抑制メカニズムを克服して持続性ＨＢＶ感染の排除を媒介することができるかどうかをさらに調べるため、対照実験またはＡｋｔ１導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬをＨＢＶキャリアマウスに養子移植する。Ａｋｔ１−ＣＴＬは、ＨＢＶキャリアマウスに養子移植された後１４日以内に持続性ＨＢＶ感染を排除するが、対照実験ＣＴＬは排除しない。Ａｋｔ１−ＣＴＬは主に脾臓ではなく肝臓に存在し、抗原除去後に脾臓に分散する。ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞は少ないが、Ａｋｔ１‐ＣＴＬを投与したマウスの肝臓で検出された切断カスパーゼ３陽性アポトーシス肝細胞は、対照実験ＣＴＬを投与したマウスの肝臓よりも多かった。単核細胞は抗原除去後に減少し、ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞ならびに切断カスパーゼ３陽性肝細胞はＡｋｔ１‐ＣＴＬを投与されたマウスの肝臓ではもはや検出されない。対照実験ＣＴＬはＨＢＶを排除することができず、ＨＢＶキャリアマウスに養子移植した後に重大な炎症を誘発しない。Ａｋｔ２−ＣＴＬはin vivoで同族抗原に出会うと激しく膨張し、Ｔ細胞の消耗を防ぐ。またＡｋｔ２−ＣＴＬは強い細胞毒性機能を示し、対照実験ＣＴＬよりもＨＢＶ感染を除去するのに効率的である。
【００２８】
肝細胞がん（ＨＣＣ）殺傷におけるＡｋｔ遺伝子組み換えＣＴＬの能力についてさらに検討する。腫瘍抗原特異的Ａｋｔ２移植ＣＤ８＋ＣＴＬはＨＣＣ保有マウスへの養子移植後１０日目に、腫瘍部位および肝臓に蓄積することができる。これらのＡｋｔ２‐ＣＴＬは腫瘍微小環境を変化させ、腫瘍部位において周囲のＦ４／８０＋マクロファージを誘引または活性化する。さらに、多数の切断カスパーゼ３陽性腫瘍細胞がＡｋｔ２‐ＣＴＬを受けたマウスで検出されるが、対照実験マウスでは検出されない。Ａｋｔ２‐ＣＴＬを有するマウスにおける血清ＡＬＴの上昇も観察されるが、対照実験マウスでは観察されない（１１８．１Ｕ／Ｌ対２２．８Ｕ／Ｌ）。Ａｋｔ２の活性化はＣＴＬが強いエフェクタ機能を持ち、肝臓の腫瘍細胞を殺すことができるようにすると結論できる。これはおそらく、ＣＴＬ自身の細胞傷害能または腫瘍関連マクロファージの抗腫瘍機能を活性化するためのサイトカイン放出を介するものであろう。
【００２９】
がん免疫療法に対するＡｋｔ分子の潜在的応用を更に探索するため、ヒトまたはマウスのＡＫＴ１またはＡＫＴ２遺伝子および抗ＣＥＡ（がん胎児性抗原）キメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）を担持するプラスミドを構築する。ＣＥＡはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）細胞表面固定糖蛋白質であり、結腸がん細胞の播種に重要である。改変ＣＴＬを大腸腺がん細胞株ＬＳ１７４Ｔと共培養する。抗ＣＥＡ  ＣＡＲの移植を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は、どちらもＬＳ１７４Ｔの刺激に応答して増殖することができる。抗ＣＥＡ  ＣＡＲ移植Ｔ細胞におけるさらなる活性Ａｋｔ１発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞両方の増殖能力を促進し得る。ＬＳ１７４Ｔ細胞株と抗ＣＥＡ  ＣＡＲおよびＡｋｔ１またはＡｋｔ２分子を発現するＴ細胞との共培養の培地では、抗ＣＥＡ  ＣＡＲのみを発現するＬＳ１７４Ｔ細胞およびＴ細胞と比較すると、より多くのＩＬ−２およびＩＦＮγが検出される。ＬＳ１７４Ｔ細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγおよびgranzyme Bの細胞内染色はまた、Ａｋｔ１またはＡｋｔ２過剰発現がＣＴＬにおけるサイトカイン産生および細胞毒性を増強し得ることを証明する。驚くべきことに、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２過剰発現ＣＴＬはそれぞれ骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）によって誘発される増殖停止を克服する能力を有することが示される。このことはＴ細胞工学技術、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞に対するＡｋｔ分子の免疫療法への応用の可能性を強く示唆する。
【００３０】
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく、例示のために提示するものである。ｍＡｋｔアイソフォームは本発明における実証例としてマウスモデルにおいて利用されるが、本発明の範囲を限定することを意図したものでない。
以下、図中の“liver”は「肝臓」、“spleen”は「脾臓」、“ctrl”は「コントロール（対照実験）」、“adoptive transfer”は「養子移植」、“irrelevant”は「無関係の」、“cytokine-secreting cells”は「サイトカイン産生細胞」、“infection”は「感染」をそれぞれ意味する。
【００３１】
（実施例１：細胞傷害性Ｔリンパ球は肝臓で消耗する）
ＨＢＶゲノム（ＡｄＨＢＶ）を保有するアデノウイルスに感染させたコンジェニック（類遺伝子）系統のＣ５７ＢＬ／６マウスに、in vitro活性化ＣＤ４５．１Ｏ＋Ｈｃ９３−１００Ｏ特異的ＣＤ８ＯＤＴ細胞を養子移植し、これらのマウスにおけるＨＢｅＡｇの血清レベルの変化を検出する。ほとんどのマウスは４２日以内に持続性ＨＢＶ感染を排除できなかったことが見出された（図１Ａ）。
【００３２】
消耗マーカーの細胞数および発現レベルは養子移植後３日目、７日目および１４日目に、ＨＢＶキャリアマウスの肝臓および脾臓において養子移植されたＣＴＬ上のＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３を含め、さらに検出される。養子移植されたＨＢＶ特異的ＣＴＬの細胞数は肝臓では３日目から１４日目にかけて増加するが、脾臓では増加しない（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【００３３】
内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＢＶ特異的ＣＴＬ上のこれらの消耗マーカーの発現レベルの評価のための参照集団として使用する。肝臓および脾臓の両方におけるＨＢＶ特異的ＣＴＬは内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高レベルのＰＤ‐１およびＬＡＧ‐３を発現するが、養子移植後３日目および７日目にはＴＩＭ‐３を全くまたはほとんど発現しない（図１Ｄ〜１Ｋ）。
【００３４】
脾臓のＨＢＶ特異的ＣＴＬは、全ての時点で、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の低レベルを、血管内コンパートメントよりも発現する（図１Ｄ〜１Ｏ）。ＨＢＶ特異的ＣＴＬは採用移植後徐々にＴＩＭ−３を発現し、肺臓では１４日目に内生ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高レベルの発現に達するが、脾臓では発現しない（図１Ｅ、１Ｇ、１Ｉ、１Ｋ、１Ｍおよび１Ｏ）。
【００３５】
（実施例２：ＣＴＬにおける構成的に活性なＡｋｔアイソフォームの発現）
マウス幹細胞レトロウイルス（ＭＳＣＶ）系は、造血細胞系統を形質導入する効率が高いため、Ｔリンパ球への遺伝子送達のために選択される。ｐＭＳＣＶ−ＣＤ９０．１プラスミドは、ＣＤ９０．１遺伝子の３’非翻訳領域におけるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）によるＰ２Ａペプチド配列およびマウスＣＤ９０．１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によるヒグロマイシン耐性遺伝子の置換から生成され、導入遺伝子の発現を増強する。ＣＤ９０．１遺伝子およびＷＰＲＥ配列を、ｐＬＫＯ＿ＴＲＣ０２４プラスミド（RNAi core lab、Taipei、Taiwan）から増幅する。マウスＡＫＴ１（配列番号１）、ＡＫＴ２（配列番号３）、およびＡＫＴ３（配列番号５）の各遺伝子を、ＡＫＴ遺伝子の上流にＰＣＲプライマーによるｓｒｃミリストイル化配列を添加したマウス４Ｔ１乳がん細胞からのｃＤＮＡを用いるＰＣＲを通してそれぞれクローニングし、膜標的化およびＡｋｔ分子の構成活性を確保する。ミリストイル化配列およびＡＫＴ遺伝子はそれぞれ、ｐＭＳＣＶ−ＣＤ９０．１におけるＰ２Ａペプチド配列によってマウスＣＤ９０．１遺伝子に連結され、ｐＭＳＣＶ−ｍＡｋｔ１−ＣＤ９０．１、ｐＭＳＣＶ−ｍＡｋｔ２−ＣＤ９０．１およびｐＭＳＣＶ−ｍＡｋｔ３−ＣＤ９０．１をもたらす。発現カセットは、５’および３’ＭＳＣＶ長末端反復（ＬＴＲ）に隣接する。４つのプラスミドを用いて、それぞれマウスＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３または対照実験ＣＤ９０．１遺伝子を担持する組換えレトロウイルスを作製する（図２Ａ）。
【００３６】
脾臓卵白アルブミン特異的ＴＣＲ  ｔｇ  ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ビーズによって活性化し、続いて組換えレトロウイルスによって形質導入し、導入遺伝子発現のためのタグとしてＣＤ９０．１を認識する抗体を使用する表面マーカー染色に供し、続いてフローサイトメトリー分析に供する。エフェクタＣＤ８＋Ｔ細胞の約７５％〜９５％がＣＤ９０．１、ＡＫＴ１−ＣＤ９０．１またはＡＫＴ２−ＣＤ９０．１遺伝子を保有するレトロウイルスで形質導入され、またＣＤ９０．１陽性であるのに対し、低レベルのＣＤ９０．１を発現したＡＫＴ３−ＣＤ９０．１遺伝子を保有するレトロウイルスで形質導入されるのは細胞の２３％のみである（図２Ｂ）。
【００３７】
３つのＡｋｔアイソフォームの発現パターンが異なることが示されている。Ａｋｔ１（配列番号１）およびＡｋｔ２（配列番号３）がほぼ全ての組織において遍在的に発現される一方、Ａｋｔ３（配列番号５）は主に脳および精巣において発現される。Ａｋｔアイソフォームの組織特異的発現様式はＣＤ８＋Ｔ細胞によるＡｋｔ３の低発現を説明し得る。外因性ミリストイル化Ａｋｔアイソフォームの発現は、Ａｋｔ発現ＣＴＬではウェスタンブロット法により検出されるが、対照実験Ｔ細胞では検出されない。３種類のＡｋｔをそれぞれ移植したＣＴＬはすべてＳｅｒ４７３でのＡｋｔリン酸化を示し、Ａｋｔ１またはＡｋｔ２を移植したＣＴＬのみがＴｈｒ３０８でのＡｋｔリン酸化を示す（図２Ｃ）。
【００３８】
（例３：Ａｋｔシグナル伝達は、肝臓における抗原依存性のＣＴＬの増殖を促進する）
卵白アルブミン（ＯＶＡ）とルシフェラーゼ発現は、アルブミンプロモーター（ｐＥＮＴＲＹ‐Ａｌｂｐ‐ＯＬ）の制御下で、ＯＶＡとルシフェラーゼをコードするプラスミドの流体力学的注入（ＨＤＩ）によってレシピエントマウスの肝臓で誘発される。レシピエントマウスに養子移植された後、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２は肝臓および脾臓で活発に増殖したが、Ａｋｔ３遺伝子組み換えＣＴＬまたはＣＤ９０．１遺伝子組み換え（対照実験）集団は増殖しなかった。
【００３９】
これらのＡｋｔ１−またはＡｋｔ２−ＣＴＬは活発な拡散を受け、ＣＤＯ８＋Ｔ細胞の活性化はわずか０．１百万個であるにもかかわらず、肝臓の抗原刺激（図２Ｄ）後に、それぞれ総計２３百万個（Ａｋｔ１）および１１３百万個（Ａｋｔ２）の肝内ＣＴＬを得た。対照実験ＣＴＬの大部分はおそらく、共刺激、成長シグナルまたは抑制性肝微小環境の欠如のために養子移植後に消失する。
【００４０】
Ａｋｔ１‐またはＡｋｔ‐２‐ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬの大規模な増殖が、時間動態実験においてさらに確認される（図２Ｅおよび２Ｆ）。Ａｋｔ２−ＣＴＬは対照実験またはＡｋｔ１−ＣＴＬよりも肝臓および脾臓における膨張において強力であることがわかる（図２Ｄ−Ｆ）。さらに、Ａｋｔ１‐ＣＴＬは脾臓よりもむしろ肝臓に優先的に位置する（図２Ｄ〜Ｆ）。
【００４１】
従って、ＣＤ９０．１の代わりにルシフェラーゼの同時発現を有するＡｋｔ構築物は、Ａｋｔ過剰発現ＣＴＬの分布および増殖をモニターするために設計される。コントロール（対照実験）Ｌｕｃ−ＣＴＬおよびＡｋｔ２−Ｌｕｃ−ＣＴＬはそれぞれ肝臓でのＯＶＡ発現の有無にかかわらずマウスに送達され、肝臓ではＴＣＲシグナル伝達依存性Ａｋｔ２−Ｌｕｃ−ＣＴＬの蓄積のみが観察されたが、他の臓器や肝臓では抗原発現のないマウスでは観察されなかった（図３）このことは、恒常的活性型Ａｋｔを介したシグナル伝達がＴＣＲ誘発と組み合わせてのみ大量のＣＴＬ増殖を補助できることを示唆しており、これらのＡｋｔ−ＣＴＬは抗原の除去後にＴ細胞収縮を起こす。やはり、対照実験ＣＴＬは肝臓における抗原刺激に応答して増殖することができない（図３）。
【００４２】
（例４：Ａｋｔシグナル伝達はＣＴＬ上の免疫チェックポイント分子の発現を抑制する）
in vitro活性化および形質導入後、活性化後３日目のＨＢｃ９３−１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、種々の免疫チェックポイントのそれらの表面発現について分析する。構成的に活性なＡｋｔ１／２の過剰発現はＰＤ‐１およびＴＩＧＩＴの表面発現を変化させない（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｄ、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｄ）。しかしそれはＡｋｔ１‐およびＡｋｔ２‐ＣＴＬの表面上のＬＡＧ‐３の発現を有意に減少させる（図４Ｃおよび４Ｄ、図５Ｃおよび５Ｄ）。
【００４３】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ活性化後３日目のこれらのＣＴＬは、ＬＡＧ−３を除くＰＤ−１およびＴＩＧＩＴなどの免疫チェックポイントの低発現または無発現により、静止状態に戻った可能性がある。そこで再刺激後のＣＴＬ上のこれらの免疫チェックポイントの発現量を測定する。ＰＤ‐１の発現は対照実験‐、Ａｋｔ１‐およびＡｋｔ２‐ＣＴＬで迅速に検出され（図４Ｅおよび４Ｈ、図５Ｅおよび５Ｈ）、Ａｋｔ１‐ＣＴＬでは対照実験‐ＣＴＬよりもわずかに高い（図４Ｅおよび４Ｈ）。しかしながらＡｋｔ２‐ＣＴＬ上のＰＤ‐１の発現は対照実験‐ＣＴＬよりも低い（図５Ｅおよび５Ｈ）。特にＡｋｔ１‐またはＡｋｔ２‐ＣＴＬは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２４時間再刺激した後、対照実験‐ＣＴＬよりもＬＡＧ‐３およびＴＩＧＩＴの発現を比較的低い状態に維持する（図４Ｆ〜Ｈ、図５Ｆ〜Ｈ）。
【００４４】
Ａｋｔシグナル伝達によるＣＴＬ上の免疫チェックポイントの制御が肝臓微小環境でも起こるかどうかをさらに調べるため、Ａｋｔ１または過剰発現（対照実験）ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬをＡｄＨＢＶ感染マウスに養子移植し、養子移植後６日目および１９日目にＣＴＬ上の免疫チェックポイント分子の表層発現を分析する。調べたそれぞれの免疫チェックポイントの発現パターンは全く異なる。養子移植後６日目の肝内Ａｋｔ１および遺伝子組み換え対照実験ＣＴＬはいずれも、肝臓で同族抗原に遭遇すると高レベルのＰＤ−１を発現するが、養子移植後１９日目のＡｋｔ１−ＣＴＬではＰＤ−１発現が下方制御されている（図４Ｉ−Ｌ）。
【００４５】
ＨＢＶ曝露後６日目では、肝臓のＡｋｔ１−ＣＴＬがある割合で高レベルのＴＩＭ−３を発現したのに対し、肝臓の脾臓のＣＴＬおよび対照実験ＣＴＬはこの時点でＴＩＭ−３の発現量が低かった。これは対照実験ＣＴＬよりもＡｋｔ１−ＣＴＬのＴＣＲ誘発が強いことを示唆している（図４Ｍおよび４Ｎ）。しかし、６日目から１９日目にかけて、ＴＩＭ−３の発現は肝臓のＡｋｔ１−ＣＴＬでは減少するが、肝臓の対照実験ＣＴＬでは劇的に増加し、また脾臓のＣＴＬでは増加しない（図４Ｍ−Ｐ）。
【００４６】
肝臓対照実験‐ＣＴＬは養子移植後６日目および１９日目の両方で高レベルのＬＡＧ‐３を発現するが、Ａｋｔ１‐ＣＴＬは全期間の間、それらの表面上でより少ないレベルのＬＡＧ‐３しか発現しない（図４Ｒ〜Ｔ）。Ａｋｔ２‐ＣＴＬはまたＰＤ‐１、ＴＩＭ‐３およびＴＩＧＩＴの劇的な下方制御を示す（図６）。
【００４７】
これらのin vitroおよびin vivoデータは、Ａｋｔシグナル伝達がＰＤ‐１発現にほとんど影響を及ぼさないものの、初期ＴＣＲシグナル伝達中のＣＴＬ上のＴＩＭ‐３発現をまさに制御することを明確に示している。われわれはさらに、Ａｋｔシグナル伝達の増強が、ＨＢＶ持続感染中の肝臓におけるＣＴＬ上のＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴの発現を妨げることを証明した。このシグナル伝達の増強は、ＨＢＶに対するＡｋｔ−ＣＴＬの強固な拡張および強力なエフェクタ機能に寄与している可能性がある。
【００４８】
in vitroおよびin vivoでの再刺激後の対照実験ＣＴＬに比べてＰＤ‐１およびＴＩＭ‐３がＡｋｔ‐ＣＴＬで高発現することは、対照実験ＣＴＬに比べてＡｋｔ‐ＣＴＬでのより強いＴＣＲ誘発を強く示唆しており、またＬＡＧ‐３およびＴＩＧＩＴの下方制御をもたらすこの早期時点での抗原刺激の欠如も除外する。Ａｋｔ−ＣＴＬ上でのＴＩＭ−３の早期の発現には、さらにＡｋｔＣＴＬのＨＢＶ感染に対抗するためのエフェクタ機能の強化も含まれる可能性がある。後の時点でのＡｋｔ遺伝子組み換えＣＴＬ上の免疫チェックポイントの発現低下は、Ａｋｔ−ＣＴＬの強力なエフェクタ機能による抗原刺激の欠如に起因する可能性があり、これにより肝臓からのＨＢＶ抗原の早期除去が促進される。
【００４９】
（例５：ＣＴＬにおけるＡｋｔシグナル伝達はそれらのエフェクタ機能を増強し、ＨＢＶ除去を促進する）
ＨＢＶキャリアマウスの肝臓および脾臓における養子移植された対照実験またはＡｋｔ１過剰発現ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬの細胞数を測定すると、養子移植後６日目および１９日目の両方で肝臓から回収された対照実験‐ＣＴＬよりも多くのＡｋｔ１‐ＣＴＬが存在する（図７Ａ〜Ｃ）。
【００５０】
Ａｋｔ１−ＣＴＬはＨＢＶキャリアマウスに養子移植された後１４日以内に持続性ＨＢＶ感染を排除するが、対照実験ＣＴＬは排除しない（図７Ｄ）。これらのＡｋｔ１‐ＣＴＬは対照実験‐ＣＴＬよりも良好な細胞毒性機能を有し、これは３日目から７日目までの上昇した血清ＡＬＴレベルによって明らかにされる（図７Ｅ）。Ａｋｔ１‐ＣＴＬは養子移植後６日目に脾臓よりもむしろ主に肝臓にあり、抗原除去後に脾臓に分散される（図７Ｂおよび７Ｃ）。肝切片のＨ＆Ｅ染色から、６日目にＡｋｔ１−ＣＴＬを投与されたマウスの肝類洞内の膨大な数の単核細胞が、養子移植後に観察される（図７Ｆ）。
【００５１】
免疫組織化学染色を行い、ＨＢＶキャリアマウスの肝臓における肝細胞および免疫細胞によるＨＢｃＡｇまたは切断カスパーゼ３発現を可視化する。養子移植後６日目に対照実験ＣＴＬを投与したマウスの肝臓よりも、Ａｋｔ１−ＣＴＬを投与したマウスの肝臓で検出されたＨＢｃＡｇ陽性肝細胞が少ないが、切断されたカスパーゼ３陽性アポトーシス肝細胞は多い（図７Ｇおよび７Ｈ）。アポトーシス肝細胞またはＨＢｃＡｇ＋肝細胞は、ＨＢＶ感染肝細胞に対するこれらのＡｋｔ１‐ＣＴＬの細胞傷害性役割を示唆するＡｋｔ１‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓における単核細胞によって取り囲まれている（図７Ｇおよび７Ｈ）。６日目に対照実験‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓よりも、Ａｋｔ１‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓においてより多くのＧｒ‐１＋骨髄細胞および養子移植ＣＴＬ（ＣＤ４５．１＋）が検出される（図７Ｉおよび７Ｊ）。
【００５２】
抗原の除去後、肝組織像は正常に戻るように見える。Ａｋｔ１−ＣＴＬを投与されたマウスの肝臓では単核細胞が減少し、ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞ならびに切断されたカスパーゼ３陽性肝細胞もはや検出されない（図７Ｋ−Ｍ）。Ｇｒ‐１＋骨髄細胞の数も減少するが、有意な数のＣＤ４５．１＋養子移植ＣＴＬが依然としてＡｋｔ１‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓に存在する（図７Ｎおよび７Ｏ）。対照実験‐ＣＴＬはＨＢＶを除去することができず（図７Ｄ、７Ｇおよび７Ｌ）、ＨＢＶキャリアマウスに養子移植された後に有意な炎症を誘発することができない（図７Ｅ〜７Ｏ）。
【００５３】
また、Ａｋｔ２−ＣＴＬはin vivo（図８Ａおよび８Ｂ）での同種抗原に遭遇すると活発に膨張してＴ細胞の消耗を防ぎ（図６）、強い細胞毒性機能を示す（図８Ｃ）。よって対照実験ＣＴＬ（図８Ｄ）よりもＨＢＶをクリアするのに効率的である。Ａｋｔ１−およびＡｋｔ２−ＣＴＬは、特定のＨＢｃペプチド（図９Ａ〜Ｄ）でのex vivo再刺激後にＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを生成する能力がより高くなることが分かっている。これは、図７に見られるように炎症反応を誘発する能力と一致している。
【００５４】
（例６：Ａｋｔ１はＴＣＲシグナル伝達依存性拡張のみを駆動し、ＣＴＬの自己更新を容易にする）
さらにレシピエントマウスの肝臓における生物発光の測定により、肝臓から抗原を排除するための発現ＣＴＬの能力を調べた。生物発光の損失は肝臓からの抗原の除去を示した。本発明者らは、Ａｋｔ１‐ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬが対照実験ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬよりも効率的であり、肝臓からＯＶＡを排除することを見出した（図１０Ａ）。それらは７日以内に抗原を除去し、またこれは肝臓における細胞集団の増殖のピークでもあった（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。これらのＡｋｔ１−ＯＴ−Ｉ  ＣＴＬは対照実験ＣＴＬよりもＯＶＡ発現肝細胞に対して細胞毒性を実行する能力が高い。これは、養子移植後７日目にＡｋｔ１−ＣＴＬを投与されたマウスの血清ＡＬＴレベルの上昇によって明らかになった（図１０Ｄ）。
【００５５】
ＣＴＬにおけるＡｋｔ分子の過剰発現は形質導入細胞の潜在的な発がん特性を誘発する可能性があることを懸念し、著者らは、対照実験ＣＴＬおよびＡｋｔ１‐ＣＴＬを長期間投与されたマウスにおける肝内および脾臓への移行ＣＴＬ数および血清ＡＬＴレベルをモニターした。Ａｋｔ１−ＣＴＬを投与したマウスの血清ＡＬＴ濃度は、抗原の除去およびＡｋｔ１−ＣＴＬの細胞数も７日目から６３日目にかけて少なくとも５０００倍低下した後、正常レベルまで低下した（図１０Ｄ−Ｆ）。我々は養子移植後７日目にＡｋｔ１‐ＣＴＬを受けたが対照実験‐ＣＴＬを受けなかったマウスの肝類洞に存在する多くの単核細胞を検出した（図１０Ｇ）。Ａｋｔ１‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓の構造は、抗原の除去後３２日目および６３日目に正常に戻った（図１０Ｇ）。
【００５６】
我々はさらにこれらの養子移植されたＡｋｔ１‐ＣＴＬまたは内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力をそれぞれ７日目および６３日目に分析した結果、抗原の非存在下でさえ、Ａｋｔ１‐ＣＴＬは自己再生を維持するために、内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞が行ったよりも高いレベルでのＤＮＡ合成を依然として受け得ることを見出した。これは抗原の除去後の細胞数が維持されることを表す（図１０Ｈおよび１０Ｉ）。これにより、肝類洞内のこれらのＡｋｔ１−ＣＴＬは養子移植後７日目では全てＫｉ−６７陽性であって活発な増殖を行っている一方、養子移植後３２日目と６３日目では肝類洞内でほとんど検出されないことが実証された（図１０Ｊ）。
【００５７】
（例７：Ａｋｔシグナル伝達はＴ細胞記憶の発達を促進する）
ウイルス感染肝細胞はＣＴＬ誘発性細胞毒性に対して高い感受性を示すことが示されている。ＨＤＩ後の肝臓微小環境はウイルス感染中の微小環境と完全には類似していない可能性がある。そこで肝内持続性ウイルス感染状況下でのＣＴＬにおけるＡｋｔの機能を研究するため、アルブミンプロモーターの転写制御の下、肝臓のみでＯＶＡとルシフェラーゼを持続的に表現するアデノウイルス（Ａｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬ）ベースの肝臓感染モデルを確立した。著者らは最初に菌の投与量を標定し、それぞれＡｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬの２×１０８および４×１０８ｉｕによる免疫が２か月以上にわたってルシフェラーゼの安定した発現を誘発し得ることを見出した（図１１）。次にＡｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬの４×１０８ｉｕをマウスに感染させ、それぞれＡｋｔ−および対照実験ＣＴＬをマウスに養子移植し、図１２Ａに示した実験計画に従っていくつかの分析を行った。
【００５８】
ＨＤＩモデルからのデータと同様、養子移植後７日目のＡｄ−Ａｌｂｐ−ＯＬ感染マウスの肝臓および脾臓において検出された対照実験ＣＴＬよりも、Ａｋｔ１−またはＡｋｔ２−ＣＴＬの数は多かった（図１３Ａ）。Ａｋｔ１‐またはＡｋｔ２‐ＣＴＬにより誘発された炎症は自然免疫細胞応答をさらに促進した。本発明者らは、養子移植後７日目にＡｋｔ‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓においてより多くのＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を検出することができたが、ＮＫ  Ｔ細胞を検出することはできなかった（図１３Ｂ〜Ｄ）。Ａｋｔ１‐ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬを受けたマウスはＴ細胞の養子移植後７日目および１４日目にＡＬＴレベルの上昇を示し、７日目にはウイルスも除去した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。対照ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬを受けたマウスは養子移植後、ＡＬＴ上昇もウイルス除去も示さなかった（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。養子移植後６０日目に、マウスをＨＤＩ対照としてのｐＥＮＴＲＹ‐ＯＬまたはｐＥＮＴＲＹベクターのＨＤＩによってリチャレンジして、それらが抗原特異的Ｔ細胞記憶を発達させたかどうかを調べた。Ａｋｔ１‐ＣＴＬを投与したマウスは、再負荷後４日目から７日目の間にＡＬＴ上昇によって明らかになったように軽度の肝障害を示した。これらのマウスにおけるＡＬＴレベルはそれらの一次応答におけるものよりもはるかに低かった（図１２Ｂ）。Ａｋｔ１‐ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬを受けたマウスは６１日目にルシフェラーゼ活性によって示されるように抗原を再発現して３日以内に抗原を迅速に排除したが、対照実験‐ＯＴ‐Ｉ  ＣＴＬを受けたマウスはリチャレンジ後に抗原を排除することができなかった（図１２Ｃ）。
【００５９】
同様の結果がＡｋｔ２‐ＣＴＬを受けたマウスにおいて観察された（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。本発明者らはリチャレンジ後７日目にＡｋｔ１‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓における抗原特異的Ｔ細胞増殖を検出することができた（図１２Ｄ）。肝組織学的検査では、対照実験およびＡｋｔ１−ＣＴＬをそれぞれ投与したマウスとも、再投与後も肝臓に明らかな炎症は認められなかった（図１２Ｅ）。しかし、本発明者らはリチャレンジ後に、Ａｋｔ１‐ＣＴＬを受けたマウスの肝類洞においてより多くのＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＧｒ‐１ＯＯ骨髄細胞を検出することができた（図１２Ｆおよび１２Ｇ）。これらのデータは、Ａｋｔ遺伝子組み換えＣＴＬが強力なエフェクタ機能を有するだけでなくＴ細胞記憶を発達させるためにより効率的であり、抗原に再び遭遇したときに迅速に抗原を排除できることを示唆している。著者らは一次応答および再呼応答の間、組織損傷の反映および組織修復のためで有り得る肝臓への先天性免疫細胞の動員現象を観察した。Ｇｒ‐１＋骨髄細胞が一次応答および再呼び出し応答の間、ＣＴＬ集団の増殖に寄与する可能性もある。
【００６０】
（例８：ＣＴＬにおけるＡｋｔシグナル伝達はそれらの細胞毒性機能を増強し、腫瘍殺傷を促進する）
肝細胞がん（ＨＣＣ）殺傷に関するＡｋｔ導入ＣＴＬの能力をさらに試験し、腫瘍抗原特異的Ａｋｔ２移植ＣＤ８＋ＣＴＬがＨＣＣを有するマウスへの養子移植後１０日目に腫瘍部位および肝臓に蓄積し得ることを実証する（図１４Ａ）。これらのＡｋｔ２‐ＣＴＬは腫瘍微小環境を変化させ、腫瘍部位における周囲のＦ４／８０＋マクロファージを誘引または活性化する（図１４Ｂ）。
【００６１】
多くの切断されたカスパーゼ３陽性腫瘍細胞がＡｋｔ２‐ＣＴＬを受けたマウスで検出されるが、対照実験マウスでは検出されない（図１４Ｃ）。血清ＡＬＴは、Ａｋｔ２‐ＣＴＬを受けたマウスで養子移植後３日目から上昇するが、対照実験マウスでは上昇しない（１１８．１Ｕ／Ｌ対２２．８Ｕ／Ｌ）。Ａｋｔ２‐ＣＴＬを受けたマウスにおけるＡＬＴのレベルは養子移植後少なくとも１０日目まで連続的に増加している（５９０．５Ｕ／Ｌ）。
【００６２】
Ｃｔｒｌ−、Ａｋｔ１−およびＡｋｔ２−導入ＨＢｃ９３−１００特異的ＣＴＬをそれぞれＨＣＣ保有マウスに養子移植する。がん遺伝子導入ＨＣＣマウスモデルは、腫瘍においてルシフェラーゼおよび代理腫瘍抗原−ＨＢｃ＋ペプチドを発現するように改変される。腫瘍増殖はＩＶＩＳを用いてモニターすることができ、Ａｋｔ２‐ＣＴＬを受けたマウスの肝臓におけるin vivo生物発光の減少および腫瘍結節の消失によって示されるように、Ａｋｔ２‐ＣＴＬまたはＡｋｔ１‐ＣＴＬがＨＣＣを効果的に排除しないことを実証する（図１５Ａ〜Ｄ）。
【００６３】
Ａｋｔ２の活性化は、ＣＴＬが肝臓の腫瘍細胞を殺す強力なエフェクタ機能を持ち得ると結論できる。
【００６４】
（実施例９：Ａｋｔ導入キメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）Ｔ細胞の抗腫瘍能）
がん免疫療法に対するＡｋｔ分子の潜在的適用をさらに探索するため、ヒトまたはマウスＡｋｔ１またはＡｋｔ２遺伝子を有するプラスミドを構築し、抗ＣＥＡキメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦを構築する（図１６Ａ）。本発明において使用される組換え抗ＣＥＡキメラ抗原レセプタの構築は、Hombachらの論文（Hombach, A.; Wieczarkoweicz, A.; Marquardt, T.; Heuser, C.; Usai, L.; Pohl, C.; Seliger, B.; Abken, H.）および論文「組換え免疫レセプタによる腫瘍特異的Ｔ細胞活性化：ＣＤ３ζシグナル伝達およびＣＤ２８共刺激は効率的なＩＬ−２分泌のために同時に必要とされ、そして１つの組み合わされたＣＤ２８／ＣＤ３ζシグナル伝達レセプタ分子に組み込まれ得る」（J Immunol 2001, 167(11), 6123‐31）に記載されたものである。マウスＡＫＴ１遺伝子、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ  ＯＲＦまたはその両方を保有する組換えレトロウイルスによって活性化マウスＣＤ３＋Ｔ細胞を改変し、次にそれらの増殖能力、サイトカイン産生および細胞傷害性についてモニターする。
【００６５】
改変ＣＴＬをＣＥＡ、ＬＳ１７４Ｔの発現を有する結腸直腸腺がん細胞株と共培養し、ＣＴＬの増殖をチミジン類似体、ＥｄＵの取り込みの検出によりモニターする。抗ＣＥＡ  ＣＡＲの移植を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、どちらもＬＳ１７４Ｔの刺激に応答して増殖することができる。Ａｋｔシグナル伝達は抗ＣＥＡ  ＣＡＲ生着ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力をさらに増強する（図１６Ｂ）。
【００６６】
抗ＣＥＡ  ＣＡＲおよびＡｋｔ１またはＡｋｔ２分子を発現するＴ細胞とＬＳ１７４Ｔ細胞系との共培養の培養培地では、抗ＣＥＡ  ＣＡＲのみを発現するＴ細胞と比べてより高いレベルのＩＬ−２およびＩＦＮγが検出される（図１６Ｃ〜Ｆ）。ＬＳ１７４Ｔ細胞と共培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγおよびグランザイムＢの細胞内染色はまた、Ａｋｔ１またはＡｋｔ２の過剰発現がＣＴＬにおけるサイトカイン産生および細胞毒性を増強し得ることを実証する（図１６Ｇ〜Ｊ）。
【００６７】
Ａｋｔ１過剰発現およびＡｋｔ２過剰発現ＣＴＬは骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）によって誘発される増殖停止克服能力を有することが示されている（図１６Ｋおよび１６Ｌ）。これはＴ細胞工学の技術（例えば免疫療法のためのＣＡＲ  Ｔ細胞）に対するＡｋｔ分子の潜在的適用可能性を強く示唆する。
【００６８】
本発明は、ＣＴＬにおけるＡｋｔ分子の過剰発現によって抗腫瘍または抗ウイルスＴ細胞の生存および機能性を増強することができる方法を提供する。Ａｋｔ過剰発現ＣＴＬは肝臓で抗原と出会う間、高い増殖能力と優れたエフェクタ機能を有することが示される。このことはＡｋｔ分子が抑制性微小環境におけるＴ細胞の消耗を克服するため、ＣＴＬを助けることができることを示唆する。
本発明はさらに、Ａｋｔ分子の発現が抗ウイルスおよび抗腫瘍ＣＴＬ応答（例えば増殖、サイトカイン産生および細胞毒性）を促進し得ることを示す。これはさらにＭＤＳＣによって誘発される増殖停止に対するＣＴＬ耐性の可能性を示す。
要約すると、構成的に活性なＡｋｔ分子の発現により、Ｔ細胞が寛容原性の肝臓または腫瘍の微小環境で生存し、腫瘍細胞やウイルスを殺傷する能力を獲得することを可能にする。活性型Ａｋｔ分子はＴＣＲシグナル伝達と組み合わされる場合にのみＣＴＬの大量増殖応答を誘発できるため、ＣＴＬのＴ細胞工学に安全に適用可能である。よって本発明者らは、抗腫瘍または抗ウイルス改変Ｔ細胞を含む組成物、ならびに慢性ウイルス感染および悪性腫瘍の処置のためのその使用方法について特許出願する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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