(57)【要約】本発明は、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害する薬剤を患者に投与することにより、患者のTNBCを治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、該薬剤は、小分子阻害剤、ポリヌクレオチド（例えば、shRNA、siRNA）、またはタンパク質（例えば、抗体）であってよい。いくつかの実施形態において、該薬剤はCDK8の発現または活性を阻害しない。
2020534354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプルネガティブ乳癌（TNBC）と診断された患者を治療する方法であって、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害し、悪液質の減少、生存時間の増加、腫瘍進行までの時間の延長、腫瘍量の減少、全身腫瘍組織量の減少および/または腫瘍転移までの時間、腫瘍再発までの時間、腫瘍応答、完全応答、部分的応答、安定した疾患、進行性の疾患、または無増悪生存の延長の少なくとも一つを達成する薬剤の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
トリプルネガティブ乳癌（TNBC）と診断された患者を治療する方法であって、該癌が、EpCAMmed/high/CD10-/low上皮細胞を含む腫瘍であることを特徴とし、該方法が、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含み、その際、該治療により腫瘍内のEpCAMmed/highおよびCD10-/low細胞の数が減少し、腫瘍の単位体積あたりのEpCAMmed/highおよびCD10-/low細胞の数が減少し、または腫瘍内の正常な細胞に対するEpCAMmed/highおよびCD10-/low上皮細胞の比率が低下する、方法。
【請求項３】
CDK19の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含む、患者におけるTNBCの転移を減少させる方法。
【請求項４】
患者が、（a）CDK19の発現または活性を阻害する薬剤と（b）放射線療法および／または化学療法とを含む併用療法で治療される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
治療を開始する前または後に、患者からの組織試料中のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞を検出することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該薬剤が、CDK19の発現または活性を阻害するが、CDK8の発現または活性を有意に阻害しない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該薬剤が、CDK19の発現または活性を、それがCDK8の発現または活性を阻害するよりも大きく阻害する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該薬剤が核酸である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該薬剤がタンパク質である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該薬剤がCRISPR/Cas9システムである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該薬剤が、CDK19標的shRNAまたはCDK19標的siRNAである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該薬剤が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11から選択されるCDK19標的shRNAまたはsiRNAである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
該薬剤が、CDK19の5'UTRに相補的または実質的に相補的であるがCDK8の5'UTRには相補的または実質的に相補的でない、CDK19標的shRNAまたはsiRNAである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
該薬剤が、CDK19の3'UTRに相補的または実質的に相補的であるがCDK8の3'UTRには相補的または実質的に相補的でない、CDK19標的shRNAまたはsiRNAである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
該薬剤が、CDK19のコード領域に相補的または実質的に相補的であるがCDK8のコード領域には相補的または実質的に相補的でない、CDK19標的shRNAまたはsiRNAである、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
該薬剤が、乳房上皮細胞の細胞質中のCDK19に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
CDK19標的薬剤に対するTNBCを有する対象の起こり得る治療応答性を予測する方法であって、
（a）対象から得られた腫瘍試料中のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞を定量し、
（b）（a）のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の量をCDK19標的療法に応答する腫瘍に特徴的な参照値と比較し、ついで
（c）EpCAMmed/high/CD10-/low細胞の量が参照値に等しいかそれ以上である場合に患者をCDK19の発現または活性の阻害剤で処置する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、2017年9月18日に提出された米国仮特許出願第62/560,140に対する優先権の利益を主張し、これは、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
この明細書に記載されている研究は、NIH/NCI 5R01 CA100225、国防総省の助成金W81XWH-11-1-0287、国防総省/乳癌研究プログラム（BCRP）イノベーター賞W81XWH-13-1-0281およびNIH S10 Share Instrument Grant (1S10RR02933801)によってサポートされた。
【０００３】
本発明は、生物医学、例えば腫瘍学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
トリプルネガティブ乳癌（TNBC）は、若い女性に過度に影響を及ぼし、予後不良に関連する炎症性乳癌サブタイプである。Bauerら、"Descriptive analysis of estrogen receptor (ER)-negative, progesterone receptor (PR)-negative, and HER2-negative invasive breast cancer, the so-called triple-negative phenotype: a population-based study from the California cancer Registry" Cancer 109, 1721-1728, doi:10.1002/cncr.22618 (2007)を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
すべての乳癌患者の20％が罹患しているにもかかわらず、現在これらの患者を対象とした臨床的に承認された標的療法は存在しない。当技術分野では、TNBCを治療する効果的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害する薬剤を患者に投与することにより、患者のTNBCを治療する方法に関する。
【０００７】
一つの側面において、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害し、悪液質の減少、生存時間の増加、腫瘍進行までの時間の延長、腫瘍量の減少、全身腫瘍組織量の減少および/または腫瘍転移までの時間、腫瘍再発までの時間、腫瘍応答、完全応答、部分的応答、安定した疾患、進行性の疾患、または無増悪生存の延長の少なくとも一つを達成する薬剤の治療有効量を投与することによる、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）と診断された患者を治療する方法を特徴とする。
【０００８】
別の側面では、本発明は、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）と診断された患者を治療する方法であって、該癌が、EpCAMmed/high/CD10-/low上皮細胞を含む腫瘍であることを特徴とする方法を特徴とする。この方法は、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含み、その際、該治療により腫瘍内のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の数が減少し、腫瘍の単位容積あたりのEpCAMmed/high/CD10-/lowの数が減少し、または腫瘍内の正常な（EpCamHi/CD10-）上皮細胞に対するEpCAMmed/high/CD10-/low上皮細胞の比率が低下する。
【０００９】
さらに別の側面において、本発明は、CDK19の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することによる、患者におけるTNBCの転移を減少させる方法を特徴とする。
【００１０】
本明細書に記載される本発明のすべての側面のいくつかの実施形態では、患者は、（a）CDK19の発現または活性を阻害する薬剤と（b）放射線療法および／または化学療法とを含む併用療法で治療される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療を開始する前または後に、患者からの組織試料中のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞を検出することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で患者に投与される薬剤は、CDK8の発現または活性を有意に阻害しない。いくつかの実施形態では、該薬剤は、CDK19の発現または活性を、それがCDK8の発現または活性を阻害するよりも大きく阻害する。
【００１３】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、該薬剤は核酸である。いくつかの実施形態では、該薬剤はタンパク質である。いくつかの実施形態では、該薬剤はCRISPR/Cas9システムである。
【００１４】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、該薬剤は、CDK19標的shRNAである。
【００１５】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、該薬剤は、CDK19標的siRNAである。
【００１６】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、該薬剤は、CDK19の3'UTRに相補的または実質的に相補的であるがCDK8の3'UTRには相補的でない、CDK19標的shRNAまたはsiRNAである。
【００１７】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、該薬剤は、CDK19のコード領域に相補的または実質的に相補的であるがCDK8のコード領域には相補的でない、CDK19標的shRNAまたはsiRNAである。
【００１８】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、該薬剤は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11から選択されるCDK19標的shRNAまたはsiRNAである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、該薬剤は、乳房上皮細胞の細胞質中のCDK19に結合する。
【００２０】
別の側面において、本発明はまた、CDK19標的薬剤に対するTNBCを有する対象の起こり得る治療応答性を予測する方法を特徴とする。この方法は、（a）対象から得られた腫瘍試料中のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞を定量し、（b）（a）のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の量をCDK19標的療法に応答する腫瘍に特徴的な参照値と比較し、EpCAMmed/high/CD10-/low細胞の量が参照値に等しいかそれ以上である場合に患者をCDK19標的薬剤で処置することを含む。いくつかの実施形態では、CDK19標的薬剤は、CDK19の発現または活性の阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａは、RNAiドロップアウト生存率（RNAi dropout viability）スクリーニングの概略図である。TNBC PDX（PDX-T1）で2つの別個のスクリーニングを行った。1つの実験の細胞は、インビトロでオルガノイドコロニーとして増殖させ、もう1つの実験では、NSGマウス中のPDXとしてインビボで増殖させた。図１Ｂ〜１Ｄは、対照shRNAまたはCDK19標的shRNA（shCDK19-1、shCDK19-2）による形質導入の4日後に評価された、CDK19ノックダウンがTNBC細胞（図１Ｂ：MDA-MB231細胞；図１Ｃ：MDA-MB468細胞；および図１Ｄ：HS578T細胞）の生存率を有意に低下さることを示すグラフである。図１Ｅは、CDK19ノックダウンがPDX-T1においてオルガノイドコロニーの形成を有意に減少させたことを示すグラフである。図１Ｆは、CDK19ノックダウンが非形質転換ヒト乳房上皮細胞（HMEC）の生存率を低下させないことを示すグラフである。図１Ｇ〜１Ｊは、CDK19ノックダウンがNSGマウスで増殖させたPDX腫瘍（図１Ｇ：PDX-T1；図１Ｈ：PDX-T2；図１Ｉ：PDX-T3；および図１Ｊ：PDX-T4）の増殖を有意に阻害することを示すグラフである。図１Ｋおよび図１Ｌは、CDK19ノックダウンが、形質導入された（RFP陽性）TNBC細胞（図１Ｋ：PDX-T1および図１Ｌ：PDX-T4）がマウスで肺への転移を防止したことを示す棒グラフである。図１Ｍは、CDK19 shRNAで形質導入されたPDX腫瘍（2行目と3行目の画像）では、RFP（最後の列の画像）がほとんど見えないことを示している。これらの腫瘍は主に、形質導入されていないGFP陽性腫瘍細胞で構成されている（中央の列の画像）。PDX腫瘍細胞は最初に緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識され（中央の列）、その後CDK19 shRNAまたは対照shRNAのいずれかに感染した細胞は、赤色蛍光タンパク質（RFP）でさらに標識された（右の列）。図１Ｎは、PDX-T1転移を伴うマウス肺の代表的な画像を示す。対照shRNA（上段）、shCDK19-1（中段）またはshCDK19-2（下段）でPDXが導入されたマウスの肺を示す。通常は肺に転移するPDX-T1では、CDK19ノックダウンにより、これらの細胞による肺転移の検出が排除された。明視野画像（左の列）は全体的な肺の形態を示し、FITC画像（中央の列）はGFPで標識された転移性腫瘍細胞を識別し、その後CDK19 shRNAまたは対照shRNAのいずれかに感染した転移性腫瘍細胞はさらに赤い蛍光タンパク質（RFP）で標識した（右の列）。
【００２２】
【図２】図２Ａは、細胞表面マーカーとしてEpCAMとCD49f（左）またはEpCAMとCD10（右）を使用したTNBC（PDX-T1）の代表的なフローサイトメトリー分析のデータを示す。図２Ｂは、EpCAMmed/high/CD10-/lowおよびEPCAMlow/med/CD10low/+細胞亜集団のオルガノイドコロニー形成能力を比較するグラフである。図２Ｃは、６つのグループのPDX腫瘍細胞について形成された腫瘍の数および実施された注射の数を示す表である。腫瘍が形成された集団および注射は太字で示されている。PDX腫瘍細胞を、EpCAMおよびCD10の発現に基づいてフローサイトメトリーにより単離した（図２Ａ、右のように）。図２Ｄ〜２Ｇは、PDX-T1、PDX-T2、およびPDX-T8においてEPCAMlow/med/CD10low/+細胞と比較して、EpCAMmed/high/CD10-/low細胞のCDK19発現が高いことを示す棒グラフである。
【００２３】
【図３】図３Ａは、CDK19ノックダウン、CDK8ノックダウンによって、またはCDK19とCDK8の両方（オーバーラップ領域）によってアップレギュレーションされた（上方の図）およびダウンレギュレーションされた（下方の図）遺伝子の数を示すベン図を含む。図３Ｂは、GSEAによって決定された、CDK19ノックダウン、CDK8ノックダウン、またはCDK19とCDK8の両方のノックダウン（オーバーラップ領域）によってアップレギュレーションされた（上方の図）またはダウンレギュレーションされた（下方の図）遺伝子全体で富んでいる特徴（Hallmark）遺伝子セットのベン図である。図３Ｃおよび３Ｄは、CDK19KD-H3K27AcUPおよびCDK19KD-H3K27AcDOWN領域にわたるCHIP-Seqシグナルが、対照と比較してCDK19ノックダウン試料において有意に異なることを示すグラフである。図３Ｅおよび３Ｆは、平均されたCDK19ノックダウンvs対照発現データを使用した、CDK19KD-EnhancerUPおよびCDK19KD-EnhancerDOWN遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）を示すグラフである。図３Ｇは、CDK19KD-EnhancerUPの「コア」遺伝子（上部および中央のバー）およびCDK19KD-EnhancerDOWNの「コア」遺伝子（下部のバー）のMetascape分析で富んでいると識別された特徴的な遺伝子セットを示すグラフである。各特徴遺伝子セットのエンリッチメントに寄与する個々の遺伝子は、各バーの右側に示してある。
【００２４】
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、inducCDK19KD-PDX-T1細胞において、ドキシサイクリンの添加によるCDK19 shRNAの誘導が、対照と比較してドキシサイクリン処置群においてオルガノイドコロニーの数を有意に減少させたことを示すグラフである。ドキシサイクリン処理開始後の0日目（図４Ａ）および16日目（図４Ｂ）のオルガノイドコロニーの数を示す。図４Ｃおよび４Ｄは、事前に確立された腫瘍におけるCDK19 shRNAの誘導が腫瘍増殖を損なったことを示すグラフである。ドキシサイクリン摂食NSGマウスおよび対照NSGマウスにおける事前に確立された腫瘍の増殖を、inducCDK19KD-PDX-T1（図４Ｃ）およびinducCDK19KD-PDX-T3（図４Ｄ）について示す。図４Ｅは、CDK19ノックダウンがPDX-T1腫瘍を有するNSGマウスの生存を延長することを示すグラフである。図４Ｆは、CDK19およびCDK8の経口で生物学的に利用可能な選択的阻害剤であるCCT251921の化学構造を示す。図４Ｇは、毎日の強制経口投与によるCCT251921によるマウスの処置が、事前に確立されたPDX-T1異種移植腫瘍の増殖を有意に損なったことを示すグラフである。
【００２５】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、インビボ増殖実験試料におけるshRNA数ｖｓベースライン試料におけるshRNA数（図５Ａ）およびインビトロ増殖実験試料におけるshRNA数ｖｓベースライン試料におけるshRNA数（図５Ｂ）を示すグラフである。図５Ｃは、インビトロスクリーニングおよびインビボスクリーニングからのヒットの最初のリストを46個の候補遺伝子に絞り込むために使用される基準の概略図である。図５Ｄは、５Ｃに示される基準でフィルタリングした後のインビトロスクリーニングおよびインビボスクリーニングから決定された46の候補遺伝子のリストである。CDK19は囲んである。
【００２６】
【図６】図６Ａは、TNBCサブタイプを有する患者からのTCGA乳癌試料が、他のサブタイプと比較して、CDK19コピー数増幅またはCDK19 mRNAアップレギュレーションが富んでいることを示す棒グラフである。図６Ｂは、サイトケラチン8（CK8）抗体（左から1番目の画像）、CDK19抗体（2番目の画像）、およびDAPI（3番目の画像）で染色したPDX-T1の共焦点免疫蛍光画像を含む。前記3つすべての画像から構成される合成画像を右端に表示する（画像は3つの独立した実験の代表である）。
【００２７】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、CDK19標的shRNAが、TNBC細胞株においてCDK19を効果的にサイレンシングすることを示す棒グラフである。対照shRNA、shCDK19-1、およびshCDK19-2で形質導入された細胞のRT-qPCRによって決定されたMDA-MB231（図７Ａ）またはMDA-MB468（図７Ｂ）におけるCDK19の発現。図７Ｃは、CDK19標的shRNAが、TNBC PDXにおいてCDK19を効果的にサイレンシングすることを示す棒グラフである。対照shRNA、shCDK19-1、およびshCDK19-2で形質導入された細胞のRT-qPCRによって決定されたPDX-T1におけるCDK19の発現。図７Ｄは、組織試料の画像およびPDX-T4転移を有するマウス肺の代表的な画像を含む。対照shRNA（上段）、shCDK19-1（中段）、またはshCDK19-2（下段）でPDXが導入されたマウスの肺を示す。明視野画像（左の列）は全体的な肺の形態を示し、FITC画像（中央の列）はGFPで標識された転移性腫瘍細胞を識別し、Texas-Red画像（右の列）はRFPで標識されたshRNA形質導入転移細胞を識別する。
【００２８】
【図８】図８Ａは、EpCAMおよびCD49fを使用したTNBC（PDX-T1）のフローサイトメトリー分析およびEpCAMmed/high/CD10-/low（1）、EPCAMlow/med/CD10low/+（3）およびEpCAM-/CD10-（（2））サブ母集団のオーバーラップを示すグラフである。図８Ｂは、ドキシサイクリンによるCDK19 shRNAの誘導がinducCDK19KD-PDX-T1細胞においてCDK19を効果的にサイレンシングすることを示す棒グラフである。RT-qPCRで測定された、対照inducCDK19KD-PDX-T1細胞（黒いバー）およびドキシサイクリン処理したinducCDK19KD-PDX-T1細胞（灰色のバー）におけるCDK19の発現。図８Ｃは、限界希釈アッセイにおいて、CDK19ノックダウンが異種移植腫瘍の増殖を効果的に防止することを示す。図８Ｄは、図８ＣからのデータのELDA（Huら、Journal of Immunol. Methods 347:70-78, 2009）分析を示すグラフであり、ドキシサイクリン群（Group +Dox）および対照群（Group NoDox）の腫瘍開始頻度を決定する。ELDAソフトウェアによって決定されたP値。
【００２９】
【図９】図９は、CDK19とCDK8との間の84％の配列相同性を示すアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸位置は配列の上に示してある。アライメントは、MegAlign（DNAStar）でClustal W法を使用して行う。
【００３０】
【図１０】図１０は、CDK19ノックダウンまたはCDK8ノックダウンのいずれかによってアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた遺伝子の、GSEAによって富んでいることが見出された特徴遺伝子セットを示す表である。
【００３１】
【図１１】図１１は、同定されたすべてのH3K27Acピーク領域にわたるゲノム全体のH3K27Ac CHIP-Seqシグナルが、CDK19ノックダウン、CDK8ノックダウン、および対照試料間で有意差がないことを示すグラフである。CDK19ノックダウン（1）、CDK8ノックダウン（2）、および対照（3）試料でのすべてのH3K27Acピーク領域にわたる正規化H3K27Ac CHIP-Seqシグナルの集約プロット（nsはP>0.05、すべての試料n=3、実験は3回行った）。
【００３２】
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、CDK19KD-EnhancerUP「コア」遺伝子（図１２Ａ）およびCDK19KD-EnhancerDOWN「コア」遺伝子（図１２Ｂ）の発現のヒートマップを示す。CDK19ノックダウンおよび対照試料の各生物学的複製における各遺伝子の正規化された発現を示す。
【００３３】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｄは、CDK19ノックダウンがH3K27Acシグナルの変化および対応する遺伝子発現の変化をもたらす代表的な遺伝子を示すグラフである。選択したCDK19KD-EnhancerUP「コア」（図１３Ａおよび図１３Ｂ）およびCDK19KD-EnhancerDOWN「コア」遺伝子（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）の遺伝子座におけるH3K27Acシグナルを表す代表的な遺伝子トラック（gene tracks）。図１３Ｅは、対照およびCDK19ノックダウン試料における３つの生物学的複製のそれぞれにわたるELF3、ETV7、CHI3L2、およびCRTAMの正規化された遺伝子発現のヒートマップである。
【００３４】
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、inducCDK19KD-PDX-T1（平均±標準偏差、n=5、実験は２回行った）（図１４Ａ）およびinducCDK19KD-PDX-T3（平均±標準偏差、n=5、実験は１回行った）（図１４Ｂ）の腫瘍実験において、マウスの総体重が、標準的な齧歯類の餌を与えられたマウス（対照群）と比較して、ドキシサイクリンの齧歯類の餌を与えられたマウス（ドキシサイクリン群）で有意差がなかったことを示すグラフである。図１４Ｃは、マウスの総体重が、ビヒクルと比較して、CCT251921で経口強制投与を受けたマウスで有意差がなかったことを示すグラフである（平均±標準偏差、n=5、実験は１回行った）。
【００３５】
【図１５】図１５は、実験で使用された患者由来の異種移植腫瘍の病理学的特徴および患者情報を示す表である。
【００３６】
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、CDK8およびCDK19の3'UTRの核酸アラインメントを示す。下線および太字のテキストは、重複する領域を示す。
【００３７】
【図１７】図１７は、CDK8およびCDK19の5'UTRの核酸アラインメントを示す。下線および太字のテキストは、重複する領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
１．はじめに-CDK19はトリプルネガティブ乳癌（TNBC）の増殖に必要である
本発明者らは、TNBC細胞株または乳癌患者由来の異種移植片におけるCDK19の発現または活性をマウスにおいて低下させると、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）腫瘍の増殖と転移が阻害されることを見出した。以下の§4（実施例）を参照。本発明者らはまた、CDK19の生物学的機能はそのパラログCDK8の生物学的機能とは異なること、およびTNBC腫瘍に対するCDK19を介した効果はCDK8活性とは無関係であることも示した。これらのデータは、TNBCが、CDK19を阻害するがCDK8を阻害しない薬剤、またはCDK8と比較してCDK19を優先的に阻害する薬剤によって治療できることを示している。CDK19の阻害がTNBCの増殖と転移の抑制に必要かつ十分であるという発見は、一つには、治療標的としてのCDK19の潜在的な利点のために重要である。CDK8、CDK9、およびBRD4などの他のユビキタスな転写補因子と比較して、CDK19の組織分布はより限定的であり、CDK19阻害剤の毒性の低下とより広い治療ウィンドウを示唆している。
【００３９】
CDK19ノックダウンが腫瘍増殖阻害効果を有することを示すことに加えて、CDK19発現は、腫瘍形成性の低い細胞、例えばEPCAMlow/med/CD10low/+発現を有する細胞と比較して腫瘍形成開始細胞、例えばEpCAMmed/high/CD10-/low発現を有する腫瘍形成性細胞において富んでいることも示された（実施例４を参照）。さらなる研究はまた、CDK19ノックダウンが腫瘍開始頻度を有意に減少させることを示した（図８Ｄ）。この発見は、他の薬剤と比較して、CDK19を標的とすることが、腫瘍形成性の高い（例えば、腫瘍開始）細胞に対してより顕著で有意な効果をもたらすことを示している。これらの発見はまた、CDK19標的療法に応答する可能性が高い特定のTNBC患者を同定するためのセラノスティック法の開発を可能とする。
【００４０】
２．定義
２．１：トリプルネガティブ乳癌（TNBC）
トリプルネガティブ乳癌（TNBC）は、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、およびヒト上皮成長因子受容体2（Her2）の発現の欠如を特徴とする乳癌サブタイプである。受容体の発現は、免疫組織化学染色または他の方法で測定できる。TNBCは通常、除外診断される。これらの受容体を標的とする広く使用されている乳癌治療は、TNBCに対して効果的ではなく、TNBC治療を特に困難にしている。
【００４１】
２．２：サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）
サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）は、Broudeら、Curr. Cancer Drug Targets 15:739, 2015およびSatoら、Molecular Cell 14:685-691, 2004に記載されている。CDK19は、細胞周期の進行よりもRNAポリメラーゼII（RNAPII）転写の調節（Galbraithら、Transcription 1: 4-12, 2010）に一層関連すると報告されているCDKファミリーのサブセットに属する。UniProtエントリNP_055891.1；GenbankエントリAY028424＆AL603914を参照。CDK19のmRNA配列も本明細書に開示されている（例えば、配列番号12〜15）。
【００４２】
２．３：サイクリン依存性キナーゼ8（CDK8）
CDK8は、CDK19と84％のアミノ酸配列相同性を持つCDK19のパラログである。図９を参照。CDK8はBroudeら、Curr. Cancer Drug Targets 15:739, 2015およびSatoら、Molecular Cell 14:685-691, 2004に記載されている。UniProtエントリCAA59754.1；GenbankエントリX85753およびAL590108を参照。CDK8のmRNA配列も本明細書に開示されている（例えば、配列番号16〜18）。
【００４３】
２．４：薬剤
本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、CDK19の発現または活性を低下または阻害することができる生体分子（例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体）または（例えば、分子量が1000未満、通常500未満の）小さな有機分子をいう。
【００４４】
２．５：阻害剤
本明細書で使用する場合、CDK19の文脈で使用される「阻害剤」という用語は、CDK19の発現または活性を低下させる化合物、組成物またはシステムをいう。薬剤はまた、CDK19の発現または活性をCDK8のものよりも選択的に阻害し得る。
【００４５】
２．６：ノックダウン
本明細書で使用する場合、「ノックダウン」という用語は、CDK19遺伝子の発現レベルの低下を指す。CDK19遺伝子発現レベルをノックダウンするには、該遺伝子に対応するmRNA転写産物の量を減らし、CDK19タンパク質の発現レベルを低下させる。CDK19遺伝子発現レベルをノックダウンすることは、CDK19タンパク質の量を減らすことによっても達成できる。ノックダウン剤は阻害剤の例である。
【００４６】
２．７：ノックアウト
本明細書で使用する場合、「ノックアウト」という用語は、CDK19遺伝子の機能を妨害する仕方で細胞内のCDK19遺伝子のすべてまたは一部を欠損させることをいう。例えば、ノックアウトは、CDK19配列を変更することで実現できる。当業者は、CDK19遺伝子またはその一部をノックアウトするために、様々な遺伝的アプローチ、例えばCRISPR/Casシステムをどのように使用するかを容易に理解するであろう。ノックアウト剤は阻害剤の例である。
【００４７】
２．８：参照レベルと比較した減少
本明細書で使用する場合、「減少（decrease）」、「減少した（reduced）」、「減少（reduction）」、および「減少する（decreasing）」という用語はすべて、参照レベルと比較して少なくとも10％の減少、例えば少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％ 、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％または100％までおよび100％（すなわち、参照試料と比較して存在しないレベル）の減少、または参照レベルと比較して10〜100％の間の減少をいう。
【００４８】
２．９：核酸
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むか、または当該技術で既知の方法により修飾されて、ポリヌクレオチドをヌクレアーゼに対して耐性にする、標的細胞または組織へのポリヌクレオチドの送達を改善する、安定性を改善する、分解を減らす、組織分布を改善する、または他の有利な特性を与えることができる。例えば、DNAまたはRNAポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド骨格（例えば、ホスホロチオエート修飾）、糖（例えば、ロックされた糖）、または核酸塩基上の１つ以上の修飾を含み得る。ヌクレオチド構造への修飾は、存在する場合、オリゴヌクレオチドの組み立ての前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。オリゴヌクレオチドはさらに、標識成分、標的化成分、または他の成分との結合などによって、重合後にさらに修飾することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖分子であり得る。さらに、オリゴヌクレオチド送達を改善するために、DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドは、脂質分子（例えば、脂質ナノ粒子）にパッケージ化され得るか、または細胞透過性ペプチドに結合され得る。
【００４９】
２．１０：治療
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止することに関して予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、疾患の抑制をもたらす、すなわちその進行を阻止する治療；および疾患を和らげる、すなわち疾患を後退させることを含む。例えば、癌の場合、治療への応答には、悪液質の減少、生存時間の増加、腫瘍進行までの時間の延長、腫瘍量の減少、全身腫瘍組織量の減少および/または腫瘍転移までの時間、腫瘍再発までの時間、腫瘍応答、完全応答、部分的応答、安定した疾患、進行性の疾患、無増悪生存の延長、全生存期間が含まれ、それぞれ新薬の承認のために国立癌研究所および米国食品医薬品局によって設定された基準によって測定され、および/またはEisenhauer, EA1ら、“New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1)”European journal of cancer 45.2 (2009):228-247に記載されている。
【００５０】
２．１１：投与
本明細書で使用する場合、「投与する」または「投与」という用語は、TNBCと診断された対象にCDK19の発現または活性を阻害する薬剤を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、薬剤の送達に適した任意の経路によって実施することができる。したがって、送達経路は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下送達を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば腫瘍中への注射によって、腫瘍に直接投与される。
【００５１】
２．１２：治療有効量
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、対象または患者に所望の生物学的効果を誘発するか、または本明細書に記載のTNBCを有する患者を治療するのに有効な量、例えば医薬用量を指す。「治療有効量」という用語は、疾患、障害、または状態、例えばTNBCをある程度治療し、治療される疾患の1つまたはそれ以上の症状を軽減する、投与される活性剤の量、および／または治療される対象が有するまたは発症するリスクがある疾患の1つまたはそれ以上の症状をある程度防止する量をいう。例えば、所定のパラメーター（例えば、腫瘍容積、腫瘍直径、転移など）について、治療有効量は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％、または少なくとも1倍、2倍、または3倍の治療効果の増加または減少を示すであろう。治療有効量は、通常、数日、数週間、または数ヶ月の期間にわたって延在する可能性がある治療過程にわたって送達される。薬剤の治療有効量は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて摂取され得る。場合によっては、CDK19阻害剤の治療有効量は、TNBC患者の部分的な応答を達成するのに十分な量（例えば、病変の測定可能な直径が20％以上減少、時には30％以上減少）である。
【００５２】
２．１３：患者または対象
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、例えば非ヒト霊長類のいずれかを含むことが意図されている。最も好ましくは、対象または患者はヒトである。
【００５３】
２．１４：アンチセンス鎖
「アンチセンス鎖」は、標的配列（例えば、5'UTR、オープンリーディングフレーム（ORF）のエクソン、または3'UTRを含むヒトCDK8またはCDK19 mRNA）に相補的または実質的に相補的である領域を含む二本鎖RNAi剤（siRNAまたはshRNA）の鎖を指す。「相補的」または「実質的に相補的」な領域は標的配列に完全に相補的である必要はなく、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％の配列％同一性または％類似性であってよい。
【００５４】
２．１５：センス鎖
本明細書で使用される「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域に相補的または実質的に相補的である領域を含むRNAi剤（siRNAまたはshRNA）の鎖を指す。
【００５５】
３．治療方法
１つのアプローチにおいて、本発明は、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含む、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）と診断された患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療により、治療開始から6ヶ月以内に腫瘍容積が少なくとも10％減少する。
【００５６】
１つのアプローチにおいて、本発明は、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）と診断された患者を治療する方法を提供し、ここで該癌はEpCAMmed/high/CD10-/low上皮細胞を含む腫瘍であることを特徴とし、該方法は、サイクリン依存性キナーゼ19（CDK19）の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含み、当該治療により、腫瘍において正常な細胞に対してEpCAMの発現レベルが中レベルから高レベルでありCD10の発現レベルが低い細胞の比が低下する。いくつかの実施形態では、該方法は、治療を開始する前または後に、患者からの組織試料中のEpCAMmed/high/CD10-/low上皮細胞を検出する工程を含む。
【００５７】
腫瘍の表現型を決定するため、または治療の予後を評価するために、TNBCと診断された患者から生検が行われてよい。生検は針生検でもよいし、乳房に供給される血管および／またはリンパ節、たとえば内胸動脈、側胸動脈、胸肩峰動脈、腋窩リンパ節から採取される液体生検でもよい。
【００５８】
以下の§4で説明するように、CD10およびEpCAMバイオマーカーは、TNBCの腫瘍開始細胞（TIC）の3つの異なる亜集団、EpCAMmed/high/CD10-/low、EPCAMlow/med/CD10low/+、およびEpCAM-/CD10を識別する。TNBC患者における癌細胞の表現型は、当技術分野で既知の方法を使用して決定することができる。１つのアプローチにおいて、組織を患者から得、細胞表現型を、免疫組織化学、質量分析、蛍光活性化細胞分類（FACS）または他の方法を使用して決定する。細胞表現型は、健康または癌性組織に特徴的な標準値と比較して割り当てることができる。1つのアプローチでは、正常な乳房上皮細胞に対するEpCAMmed/high/CD10-/lowの比を治療開始前に決定して、CDK19標的療法に対する患者の応答しやすさを評価する。1つのアプローチでは、正常細胞に対するEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の比率の変化、または組織の容積あたりのEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の量の変化を治療の開始後に検出する。
【００５９】
１つのアプローチにおいて、本発明は、患者におけるTNBCの転移を低減するための方法を提供し、この方法は、CDK19の発現または活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、炎症性TNBCまたは化学療法抵抗性であるTNBCを治療するために使用され得る。他の実施形態において、本発明の方法は、TNBCの転移を減速または防止するために使用され得る。さらなる実施形態では、CDK19遺伝子またはその対応するタンパク質を標的とする本明細書に記載の方法は、P53シグナル伝達、KRASシグナル伝達、アンドロゲン応答、NOTCHシグナル伝達、TGFベータシグナル伝達、およびIL6-JAK-STAT3シグナル伝達などのCDK19によって調節される臨床的に関連するTNBC経路をさらに調節し得（図３Ｂ）、それらを癌治療に対してより治療的に感受性にする。
【００６１】
３．１：治療剤（阻害剤）
３．１．１：ポリヌクレオチド
実施例で示されるように、CDK19遺伝子はTNBCの増殖に不可欠である。本明細書に記載されるような対象におけるTNBCを治療する方法は、CDK19遺伝子の発現を減少または阻害するために対象にポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を投与することにより達成され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、DNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、CRISPR/Casシステムで使用されてよい。CDK19遺伝子の発現を阻害または減少させるオリゴヌクレオチドは、対象においてCDK19遺伝子（例えば、TNBC細胞におけるCDK19遺伝子）をノックアウトまたはノックダウンすることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、shRNAまたはmiRNAであり得る。 いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、CDK19遺伝子のmRNA転写物のRNアーゼH依存性切断を媒介し得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、CRISPR/Casシステムで使用してもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、CDK19遺伝子のmRNA転写物は、切断および分解の標的となり得る。mRNA転写物の異なる部分を標的として、CDK19遺伝子の発現を減少または阻害することができる。いくつかの実施形態では、DNAオリゴヌクレオチドを使用して、mRNA転写物を標的とし、mRNA転写物とDNA:RNA二本鎖を形成することができる。次に二本鎖が認識され、mRNAが細胞内の特定のタンパク質によって切断される。他の実施形態では、RNAオリゴヌクレオチドを使用して、CDK19遺伝子のmRNA転写物を標的とすることができる。
【００６４】
３．１．１．１：shRNA
ショートヘアピンRNAまたはスモールヘアピンRNA（shRNA）は、ヘアピンターンを備えた人工的なRNA分子であり、細胞内で生成された低分子干渉RNA（siRNA）を介して標的遺伝子の発現を抑制することができる。例えば、Fireら、Nature 391:806-811, 1998; Elbashirら、Nature 411:494-498, 2001; Chakrabortyら、Mol Ther Nucleic Acids 8:132-143, 2017;Bouardら、Br. J. Pharmacol. 157:153-165, 2009を参照。細胞におけるshRNAの発現は、典型的にはプラスミドの送達によって、またはウイルスベクターまたは細菌ベクターを介して達成される。適切な細菌ベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターが宿主ゲノムに組み込まれると、プロモーターの選択に応じて、shRNAがポリメラーゼIIまたはポリメラーゼIIIによって核で転写される。その結果生じるプレshRNAは、核から転出され、ついでダイサーによってプロセシングされ、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）にロードされる。センス鎖はRISCによって分解され、アンチセンス鎖はRISCを相補的な配列を持つmRNAに誘導する。次に、RISC中のAgo2と呼ばれるタンパク質がmRNAを切断するか、場合によっては、mRNAの翻訳を抑制し、その結果、その破壊およびmRNAによってコードされるタンパク質の最終的な減少に導く。したがって、shRNAは標的遺伝子のサイレンシングにつながる。shRNAは、分解および代謝回転の速度が比較的遅いという点で、siRNAの有利なメディエーターである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、shRNAを使用して対象のTNBCを治療することを含む。この方法は、対象に治療有効量のベクターを投与することを含み、該ベクターは、CDK19遺伝子のmRNA転写物の一部にハイブリダイズすることができるshRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターはまた、例えば、プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター）、エンハンサー、および転写ターミネーターを含む、当該分野で公知の適切な発現制御エレメントを含み得る。ベクターがTNBC細胞に送達されると、shRNAが細胞のゲノムに組み込まれ、ダイサーおよびRISCによるダウンストリームプロセッシングを受けて（本明細書でさらに詳細に説明）、最終的にCDK19遺伝子のmRNA転写産物にハイブリダイズし、mRNAの切断および分解につながる。いくつかの実施形態では、shRNAは、GCGAGAATTGAAGTACTCTAA（配列番号１）の配列またはACCAGCAAATATCTCTAGTAAT（配列番号２）の配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、shRNAは、CDK19遺伝子のmRNA転写物のN末端のアミノ酸を標的とし得る。他の実施形態では、shRNAは、CDK19遺伝子のmRNA転写物の内部領域のアミノ酸を標的とすることができる。
【００６６】
実施例、例えば、図１Ｇ〜図１Ｊに示されるように、CDK19遺伝子を標的とする両shRNA（GCGAGAATTGAAGTACCTTAA（配列番号1）およびACCAGCAAATATCCTAGTAAT（配列番号2））は、該遺伝子をノックダウンすることができ、3つのすべてのTNBC PDXからの腫瘍においてRFP陽性細胞のパーセンテージを大幅に低下させた。さらに、CDK19ノックダウンはまた、化学療法抵抗性の炎症性乳癌を有する患者の脳転移から得られる悪性のPDXの増殖を阻害したが（図１Ｊ）、この化学療法抵抗性の炎症性乳癌は悪性であり、治療が困難であり、予後が極めて悪いことが知られていた。腫瘍成長の阻害に加えて、shRNAはまた、マウスにおけるこれらの腫瘍の肺転移も阻害した（図１Ｌ）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GCGAGAATTGAAGTACCTTAA（配列番号1）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、ACCAGCAAATATCCTAGTAAT（配列番号2）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GCTTGTAGAGAGAGATTGTACTT（配列番号3）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GAGGACTGATAGTTCTTCTTT（配列番号4）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GATATTAGAAAGATGCCAGAA（配列番号5）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GCCAACAGTAGCCTCATAAAG（配列番号6）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、CGTTCGTATTTATCTAGTTTC（配列番号7）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GCATGACTTGTGGCATATTAT（配列番号8）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GCTTGTAGAGAGAGATTGCACTT（配列番号9）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、AGGACTGATAGCTCTTCTTTA（配列番号10）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。さらに他の実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするshRNAは、GTATGGCTGCTGTTTGATTAT（配列番号11）に対して少なくとも85％の配列同一性（例えば、87％、89％、91％、93％、95％、97％、または99％の配列同一性）を有し得る。当業者は、CDK19遺伝子の異なる部分（例えば、5'UTR領域または3'UTR領域）を標的とし、遺伝子の発現の所望の低減を達成するshRNAを設計する知識および能力を有する。例えば、shRNAを設計するために利用可能なツールには、例えば、Project Insilico、Genomics and Bioinformatics Group、LMP、CCR、NIHが含まれる。いくつかの実施形態では、shRNAは、CDK19遺伝子をノックアウトするように設計され得る。
【００６８】
CDK8およびCDK19 shRNA：
shRNAの有効性に影響を与える可能性のある多数の構造要素がある。所望の標的遺伝子の特定のRNAiノックダウンのために、その複数の構造要素を考慮してshRNAを設計することができる。一般に、shRNAは約80ヌクレオチドの長さであり、shRNAのヘアピン構造を作るために（5'から3'へ）次の構造要素で構成されるように設計されている：（1）センス鎖（たとえば、上部ステム）；（2）続いてヘアピンループ；（3）標的mRNAに完全にまたはほぼ完全に相補的であり、標的mRNAに対してアンチセンスであるアンチセンス鎖（例えば、下部ステムまたはガイド鎖）；（4-5）ガイド鎖の最初の位置での「U」または「UH」、およびガイド鎖のテール領域での「UUC」または「CUUC」などの2つの切断モチーフ；および（6）ガイド鎖の最初のヌクレオチド「U」モチーフとヘアピンループの間、およびセンス鎖の最後のヌクレオチドとヘアピンループの間の、長さが約2ヌクレオチドの任意のスペーサーヌクレオチド。ステムを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが約19〜29ヌクレオチドの範囲からなるように設計することができ、これがステムを形成する。ループ構造は、長さが約2〜15ヌクレオチドの範囲からなるように、そして好ましくはいかなる内部二次構造も含まないように設計され得る。ヘアピンループを作製するために使用することができる配列のいくつかの例には、配列（TTCAAGAGA）を含む9ヌクレオチドループ、および配列（TCAAGAG）を含む7ヌクレオチドループが含まれるが、これらに限定されない。その他の設計戦略は、Ros XB-D、Gu S、miRNAベースのshRNAの最適設計に関するガイドライン.Methods (San Diego, Calif) 2016;103:157-166（これは、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の関連する開示に記載されている。Sigma-AldrichやThermo-Fisher Scientificから入手できるBroad InstituteのRNAi Consortiumソフトウェアなどのいくつかの設計プログラムも利用できる。
【００６９】
多くのmRNAが同様の配列を共有できるため、標的配列の特異性も考慮する必要がある。遺伝子特異的なノックダウンを可能にするために、ゲノム内の他の遺伝子との配列相同性が低い標的配列の選択には注意が必要である。遺伝子に複数の形態がある場合、遺伝子発現の完全なノックダウンを達成するには、shRNAは標的mRNAのすべてのアイソフォーム間で共有される配列を標的にする必要がある。
【００７０】
CDK19およびCDK8 mRNA配列のアラインメントは、同一ではないか低いパーセントの同一性または類似性のヌクレオチド配列領域を識別でき、該領域はCDK19 mRNAを標的とするがCDK8を標的としないという選択性を有するshRNAの設計に使用できる。例えば、図１６および図１７の3'UTRおよび5'UTRのアラインメントを参照。
【００７１】
いくつかの実施形態では、CDK8 mRNA転写物ではなくCDK19 mRNA転写物を標的とするshRNAを設計することができる。1つのアプローチでは、National Center for Biotechnology Information（NCBI、Pubmed.govにある）からのヒトCDK19およびCDK8のmRNA配列およびアライメントを行う（例えば、LALIGNなどのペアワイズアライメントプログラムを使用）。長さが約19〜29の連続したヌクレオチドの領域（例えば、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-27、19-28、または19-29）を、低い配列同一性（例えば、75％未満の同一性、時には70％未満の同一性、時には60％未満の同一性）に基づいて選択する。いくつかの実施形態では、19〜29ntの領域は非常に低い（例えば、40％未満、30％未満または20％未満）配列同一性を有する。連続した配列は、タンパク質コード領域、5'-UTR、3'-UTRにあってよく、または2つの領域にまたがることができる。
【００７２】
一実施形態では、CDK19の標的特異的ノックダウンは、CDK19の3'UTR領域（配列番号42）に相補的であり、CDK8の3'UTR（配列番号44）との相同性が低いか全くないガイド鎖を有するshRNAを設計することによって達成できる。ガイド鎖は、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29ヌクレオチド長であり得る。CDK19 shRNAの設計に使用できるいくつかの例示的な配列領域には、CTCCAGCTCCCGTTGGGCCAGGCCAGCCC(配列番号20)、AGCCCAGAGCACAGGCTCCAGCAATATGT(配列番号21)、CTGCATTGAAAAGAACCAAAAAAATGCAA(配列番号22)、ACTATGATGCCATTTCTATCTAAAACTCA(配列番号23)、TACACATGGGAGGAAAACCTTATATACTG(配列番号24)、AGCATTGTGCAGGACTGATAGCTCTTCTT(配列番号25)、TATTGACTTAAAGAAGATTCTTGTGAAGT(配列番号26)、TTCCCCTATCTCAGCACCCCTTCCCTGCA(配列番号27)、TGTGTTCCATTGTGACTTCTCTGATAAAG(配列番号28)、CGTCTGATCTAATCCCAGCACTTCTGTAA(配列番号29)、またはCCTTCAGCATTTCTTTGAAGGATTCTATC(配列番号30)が含まれるが、これらに限られない。この開示によって導かれる当業者は、3'UTRにおける他の低い相同性配列領域もまた使用され得ることを理解する。例えば、図１６Ａ〜Ｄ、（1-1186）および（2418-4570）からの低相同性配列領域を参照。一実施形態では、shRNAは、CDK19の上流、CDK19の下流、またはCDK19のエクソンを標的とするように設計することができる。いくつかの場合に、CDK19 shRNAの発現により、CDK19の少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％のノックダウンとなる。別の実施形態では、CDK19 shRNAの発現は、CDK8と比較してCDK19を優先的にノックダウンすることができる。
【００７３】
CDK19を優先的に標的とするshRNAを作成するため、CDK19の独自の領域、他のCDK（たとえば、CDK8）またはゲノム内の他のmRNAと有意な相同性を持たない領域を特定する。この配列を使用して、この標的に対してアンチセンスであり、19〜29ヌクレオチド長を含むガイド鎖を作製する。発現カセットを作成するため、カセットの最初にpolIIまたはpolIIIプロモーターなどの適切なプロモーターを追加し、その後に相補的センス鎖（例えば、標的ガイド鎖に相補的）を追加し、その後に約2〜15ヌクレオチド長のループ構造を追加する。さらに、2つのAgo切断モチーフ、「U」または「UH」をガイド鎖の最初の位置に含め、「UUC」または「CUUC」をループ構造の終わりの1-2スペーサーヌクレオチドに沿ってガイド鎖のテール領域に含める必要がある。例えば、米国出願番号US2008/0293142およびRos XB-D、Gu S、miRNAベースのshRNAの最適設計に関するガイドライン.Methods (San Diego, Calif) 2016;103:157-166（すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
【００７４】
別の実施形態では、CDK8の標的特異的ノックダウンは、CDK8の5'UTR（配列番号43）に相補的であり、CDK19の5'UTR（配列番号41）との相同性が低いか全くないガイド鎖を有するshRNAを使用することにより達成できる。ガイド鎖は、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29ヌクレオチド長であり得る。CDK8 shRNAの設計に使用できるいくつかの例示的な配列には、TGGGCCGCCCGCCGCTCCCGCCGCAGCAG（配列番号31）、GAGCAGAACGCGCGGCCGGAGAGAGCGGC（配列番号32）、GGAGGCGCGCCCAGGGAGCCCGCGGGGA（配列番号33）、CAAGGGCAGAGACACCGCTCCCCACCCCC（配列番号34）、AGCCCTCGTCCCTCGGCTCTCCTTCGCCG（配列番号35）、GGGGATCCTCCCCGTTCCTCCACCCCCGG（配列番号36）、CCGGCCTCTGCCCCGCCGTCCCCCTGGAT（配列番号37）、GTCCCTGGCGCTTTCGCGGGGCCTCCTCC(配列番号38)、TGCTCTTGCCGCATCAGTCGGGCTGGTGC(配列番号39)、またはTGCGGCCGGCGGGCGTAGAGCGGGCGGGT(配列番号40)が含まれるが、これらに限られない。当業者は、5'UTRにおける他の低い相同性配列領域もまた使用され得ることを理解するであろう。例えば、図１７、（1-33）および（223-504）からの低相同性配列領域を参照。別の実施形態では、shRNAは、CDK8の上流、CDK8の下流、またはCDK8のエクソンを標的とするように設計することができる。いくつかの場合に、CDK8 shRNAの発現により、CDK8の少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％のノックダウンとなる。
【００７５】
CDK8を優先的に標的とするshRNAを作成するため、CDK8の独自の領域、他のCDK（たとえば、CDK19）またはゲノム内の他のmRNAと有意な相同性を持たない領域を特定する。この配列を使用して、この標的に対してアンチセンスであり、19〜29ヌクレオチド長を含むガイド鎖を作製する。発現カセットを作成するため、カセットの最初にpolIIまたはpolIIIプロモーターなどの適切なプロモーターを追加し、その後に相補的センス鎖（例えば、標的ガイド鎖に相補的）を追加し、その後に約2〜15ヌクレオチド長のループ構造を追加する。さらに、2つのAgo切断モチーフ、「U」または「UH」をガイド鎖の最初の位置に含め、「UUC」または「CUUC」をループ構造の終わりの1-2スペーサーヌクレオチドに沿ってガイド鎖のテール領域に含める必要がある。例えば、米国出願番号US2008/0293142およびRos XB-D、Gu S、miRNAベースのshRNAの最適設計に関するガイドライン.Methods (San Diego, Calif) 2016;103:157-166（すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
【００７６】
shRNAまたはsiRNAの特異性またはノックダウンレベルは、mRNAレベルについてはリアルタイムPCR分析を用いて、またはタンパク質レベルについてはELISAアッセイを用いて確認できる。ノックダウンを評価するために、実験対照を並行して実行する。使用できる実験対照のいくつかの例には、モック感染またはモックトランスフェクションされた試料、空のベクター、スクランブルされた標的またはシード領域をコードするshRNA、ハウスキーピング遺伝子GAPDHまたはアクチンなどの完全に別の遺伝子を標的とするshRNA、またはGFP陽性対照などが含まれるが、これらに限られない。
【００７７】
siRNAまたはshRNA（例えば、RNAi剤）がCDK8よりもCDK19を優先的に標的とするかどうかを決定するため、細胞株または他の発現系でGFPなどのマーカーにタグ付けされたshRNAまたはsiRNAをトランスフェクションまたは形質導入し、GFP陽性細胞（例えば、形質転換細胞）を選択し、RNAi剤によるトランスフェクションまたは形質導入なしの細胞系におけるCDK19発現と比較したCDK19ノックダウンのレベルを決定することができる。いくつかの実施形態では、RNAの発現を測定する。他の実施形態では、タンパク質の発現を測定する。一例では、mRNAは、当該技術分野で既知の任意のPCRベースのアッセイ（例えば、RT-PCRまたはqRT-PCRなど）によって測定され得る。一例では、タンパク質レベルは、イムノアッセイ（例えば、ELISAアッセイまたは当技術分野で知られている任意の抗体ベースの方法）によって測定することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、標的化CDK19 shRNAまたはsiRNAは、トランスフェクションまたは形質導入なしのシステムと比較して、約30％未満のCDK19発現および約70％を超えるCDK8をもたらす。他のいくつかの実施形態では、標的化CDK19 shRNAまたはsiRNAは、約50％未満のCDK19発現および約95％を超えるCDK8をもたらす。いくつかの実施形態では、標的化CDK19 shRNAまたはsiRNAは、約5％のCDK19発現および約80％を超えるCDK8をもたらす。いくつかの実施形態では、標的化CDK19 shRNAまたはsiRNAは、約1％未満のCDK19発現および約60％を超えるCDK8をもたらす。いくつかの実施形態では、標的化CDK19 shRNAまたはsiRNAは、約0.5％未満のCDK19発現および約90％を超えるCDK8をもたらす。いくつかの実施形態では、標的化CDK19 shRNAまたはsiRNAは、約0％のCDK19発現および約100％のCDK8をもたらす。いくつかの実施形態では、RNAの発現を測定する。他の実施形態では、タンパク質の発現を測定する。
【００７９】
CDK8およびCDK19 siRNA：
本開示はまた、トリプルネガティブ乳癌の患者においてCDK8およびCDK19の発現を阻害するためのsiRNAベースの治療法を提供する。二本鎖RNAi治療薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む。siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長であり得る。siRNAベースの治療薬のアンチセンス鎖は、CDK8またはCDK19をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含む。治療用siRNAを作製するためのさらなる方法は、米国特許第9399775号に見出すことができ、これは、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００８０】
場合によっては、CDK19 siRNAの発現により、少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％のCDK19がノックダウンされる。別の実施形態では、CDK19 siRNAの発現は、CDK8と比較して優先的にCDK19をノックダウンする。場合によっては、CDK8 siRNAの発現により、少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％のCDK8がノックダウンされる。
【００８１】
好ましい実施形態では、CDK19 siRNAは、少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のCDK19のノックダウンおよび少なくとも約10％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、 27％、28％、29％、または30％のCDK8のノックダウンをもたらす。
【００８２】
shRNAおよびsiRNA送達：
一過性かまたは安定した発現のいずれが望ましいかに応じて、適切な送達ベクターを選択することができる。本開示で使用され得る送達ベクターの例は、ウイルスベクター、プラスミド、エキソソーム、リポソーム、細菌ベクター、またはナノ粒子である。本開示はまた、当技術分野で公知の任意の手段による送達を提供する。
【００８３】
トリプルネガティブ乳癌細胞への標的化送達のため、当業者は、送達ベクターが特定の細胞型または組織型を標的とするように遺伝子改変され得ることを理解するであろう。標的化送達ベクターまたはプラスミドを作成するため、トリプルネガティブ乳癌で発現されまたは関連する独自の分子（例えば、受容体、タンパク質、糖タンパク質、またはそれらの組み合わせ）を特定し、ついでこれらマーカーを、好ましくは送達ベクターまたはプラスミドの外側（例えば、細胞質ゾルに面する）に保持または発現する送達ベクターまたはプラスミドを作成する。さらに、必要な治療期間に応じて、Sliva K, Schnierle BS. Selective gene silencing by viral delivery of short hairpin RNA. Virology Journal. 2010に記載されているように、ウイルス送達ベクターを遺伝子改変して、継続的に複製、複製欠陥、または条件付きで複製することができる。
【００８４】
一実施形態では、CDK8またはCDK19のshRNAまたはsiRNAは、アデノウイルスベクターによって送達することができる。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドと線状dsDNAゲノムを持つエンベロープのないウイルスである。アデノウイルスは哺乳動物細胞の核内で複製することができるが、宿主のゲノムに効率的に組み込まれないため、挿入変異誘発のリスクは最小限に抑えられるが長期治療には不十分である。
【００８５】
別の実施形態では、CDK8またはCDK19のshRNAまたはsiRNAは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）によって送達することができる。AAVは最小のウイルスの1つで、Dependovirus属に属する。AAVは小さな一本鎖DNAゲノムを持ち、約8個の個別のshRNAを収容できる。AAVは侵入のリターゲティング（entry retargeting）を可能にし、特定の細胞または組織型へのshRNAの送達を可能にする。さらなる実施形態では、本開示は、トリプルネガティブ乳癌細胞または組織型への送達のために標的化した改変AAVを提供する。
【００８６】
別の実施形態では、CDK8またはCDK19のshRNAまたはsiRNAは、レトロウイルスベクターによって送達することができる。レトロウイルスは、Retroviridae科に属し、二本鎖DNA中間体を介して複製する一本鎖RNAウイルスである。それらは宿主のゲノム中に組み込まれることができ、それによりshRNAの長期発現を可能にする。Envタンパク質は、レトロウイルスを標的細胞に標的化する上で中心的な役割を果たす。さらなる実施形態において、本開示は、トリプルネガティブ乳癌細胞または組織型への送達のための改変されたenv遺伝子またはそのタンパク質産物を有するレトロウイルスベクターを提供する。さらなる実施形態では、本開示は、プロテアーゼ活性化Envタンパク質を有するレトロウイルスベクターを使用した、siRNAのCDK8またはCDK19 shRNAの送達を提供する。
【００８７】
別の実施形態では、CDK8またはCDK19のshRNAまたはsiRNAは、レンチウイルスベクターによって送達することができる。レンチウイルスは、大量のDNAを収容できるLentivirinae属のレトロウイルスのサブクラスである。いくつかの応用では、「SIN」ベクターとして知られる「自己不活性化」されるように設計されたレンチウイルスベクターを使用することが好ましい。さらなる実施形態において、本開示は、トリプルネガティブ乳癌細胞または組織型への送達のための改変されたenv遺伝子またはそのタンパク質産物を有するレンチウイルスベクターによるCDK8またはCDK19 shRNAの送達を提供する。
【００８８】
別の実施形態では、shRNAまたはsiRNAは、ナノ粒子によって送達することができる。本開示で使用することができるナノ粒子の例には、エキソソーム、リポソーム、有機ナノ粒子、または無機ナノ粒子が含まれるが、これらに限られない。ナノ粒子の他の非限定的な例には、例えば、Hong, Cheol Am,およびYoon Sung Nam. "Functional Nanostructures for Effective Delivery of Small Interfering RNA Therapeutics." Theranostics 4.12 (2014): 1211-1232. PMC. Web. 13 Sept. 2018（あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）で提供されるものが含まれるが、これに限られない。いくつかの実施形態では、shRNAまたはsiRNAの送達は、トリプルネガティブ乳癌細胞に存在するかまたは特異的である受容体、タンパク質、糖タンパク質またはそれらの組み合わせによって媒介される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、siRNA CDK19治療薬は、溶液で投与される。siRNAは非緩衝液で投与することができる。一実施形態では、siRNAは水中で投与される。他の実施形態では、siRNAは、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、またはリン酸緩衝液またはそれらの任意の組み合わせなどの緩衝液と共に投与される。いくつかの実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００９０】
３．１．１．２：RNase H-媒介mRNA分解/アンチセンス
RNase H依存アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、標的mRNAの相補配列に結合し、RNase Hを介した標的RNAの切断とリボソームの立体障害との両者による翻訳の阻害との両方によって遺伝子発現を低下させる一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドである。
【００９１】
RNase Hは、RNA:DNA二本鎖においてRNAの切断を触媒するエンドヌクレアーゼ酵素である。この酵素の最もよく研究されている内因性機能は、細胞分裂中のDNA複製の準備に使用される岡崎フラグメント（小さなRNA）の除去である。いくつかの実施形態では、分解のためにCDK19遺伝子のmRNA転写物を標的化するために、該mRNAの一部にハイブリダイズすることができる核酸（例えば、DNAオリゴヌクレオチド）を対象に投与する。細胞（例えば、TNBC細胞）の内部に入ると、DNAオリゴヌクレオチドはその標的mRNA転写産物と塩基対を形成する。RNase Hは、得られた二本鎖に結合し、mRNA転写産物を1箇所または複数の箇所で切断する。DNAオリゴヌクレオチドは、他のmRNA転写産物にさらに結合して、RNase H分解の標的とする。したがって、CDK19遺伝子の発現は、TNBCのある対象では大幅に減少する。
【００９２】
CDK19遺伝子のmRNA転写産物にハイブリダイズできるDNAオリゴヌクレオチドは、例えば、10〜30ヌクレオチド（例えば、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、または30ヌクレオチド）を含み得る。いくつかの実施形態では、DNAオリゴヌクレオチドは、それが結合するmRNA転写物の一部に対して100％の相補性を有し得る。他の実施形態では、DNAオリゴヌクレオチドは、それが結合するmRNA転写物の一部に対して100％未満の相補性（例えば、95％、90％、85％、80％、75％、または70％の相補性）を有し得るが、それでもなお安定なRNA:DNA二本鎖を形成してRNase HがmRNA転写産物を切断することができる。DNAオリゴヌクレオチドは、CDK19遺伝子のmRNA転写産物の5'UTRまたは3'UTRに結合する。
【００９３】
さらに、CDK19遺伝子のmRNA転写産物にハイブリダイズできるDNAオリゴヌクレオチドは、5'末端と3'末端に修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。末端の修飾ヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチドの内部をヌクレアーゼ分解から保護し、標的mRNA転写産物に対する結合親和性を高めるように機能する。いくつかの実施形態では、末端の修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基（例えば、５-メチルシトシン）および／または修飾糖（例えば、ロックされた糖）を含み得る。いくつかの実施形態では、DNAオリゴヌクレオチドの5'および3'各末端の3〜5ヌクレオチドが修飾され得る。
【００９４】
３．１．１．３：miRNA
マイクロRNA（miRNA）は、RNAサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節で機能する小さな非コードRNA分子である。miRNAは、mRNA転写産物内の相補的な配列と塩基対を形成する。その結果、mRNA転写産物は、mRNA鎖の切断、ポリ（A）テールの短縮によるmRNAの不安定化、およびリボソームによるmRNA転写産物のタンパク質への翻訳効率の低下などの1つまたはそれ以上の機構によってサイレンシングされる。いくつかの実施形態では、miRNAは、それ自体が折り返されて短いヘアピンを形成するRNA転写産物の領域に由来することを除いて（これは、pri-miRNAとも呼ばれる）、shRNA経路のsiRNAに似ている。pri-miRNAとして転写されると、ヘアピンはDroshaと呼ばれる酵素によって核内の一次転写産物から開裂される。ついで、ヘアピンまたはpre-miRNAは、核からサイトゾルに輸送される。サイトゾルでは、ヘアピンのループがDicerと呼ばれる酵素によって切断される。結果として得られる産物は、3'末端にオーバーハングを持つ二本鎖RNAとなり、RISCに組み込まれる。RISCに入ると、2番目の鎖は破棄され、現在RISCにあるmiRNAは成熟したmiRNAであり、相補的な配列を持つmRNAに結合する。
【００９５】
miRNAとshRNA経路からのsiRNAとの違いは、miRNAとの塩基対形成がシード配列とも呼ばれるmiRNAの5'末端から行われることである。シード配列が短いため、各miRNAはより多くのmRNA転写産物を標的にすることができる。いくつかの実施形態では、CDK19遺伝子を標的とするmiRNAを本明細書に記載される方法で使用してよい。
【００９６】
３．１．２：CRISPR/CASシステム
いくつかの実施形態では、CDK19遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは、CRISPR/Casシステムなどの遺伝子編集システムを使用して実行される。SandersおよびJoung, Nature Biotechnol 32:347-355, 2014, Huangら、J Cell Physiol 10:1-17, 2017およびMitsunobuら、Trends Biotechnol 17:30132-30134, 2017を参照。CRISPR/Casシステムは、Casタンパク質と、Casタンパク質をCDK19配列内の標的モチーフに誘導し、ハイブリダイズできる少なくとも1つまたは2つのリボ核酸を含む。次にCasタンパク質は標的モチーフを切断し、二本鎖切断または一本鎖切断をもたらす。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更できるいかなるCRISPR/Casシステムも本明細書で説明する方法で使用できる。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPR I型システムである。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPR II型システムである。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムは、CRISPR V型システムである。
【００９７】
本明細書に記載の方法で使用されるCasタンパク質は、天然に存在するCasタンパク質またはその機能的誘導体であり得る。「機能的誘導体」は、それらが対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含むが、これらに限定されない。本明細書で企図される生物活性は、機能的誘導体がDNA基質（例えば、CDK19遺伝子）を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾、およびそれらの融合の両方を包含する。Casタンパク質の適切な誘導体またはその断片には、Casタンパク質の変異体、融合、または共有結合修飾が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるCasタンパク質は、Cas9またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質はストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）に由来する。Cas9は、crRNAに非相補的な標的DNAを切断するRuvC様ドメインと、crRNAに相補的な標的DNAを切断するHNHヌクレアーゼドメインの2つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。Cas9の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性はまた、プロトスペーサー関連モチーフ（PAM）として知られる短い保存された配列（例えば、2〜5ヌクレオチド）が、標的配列中の標的モチーフの3'末端の直後に続くことを必要とする。
【００９９】
いくつかの実施形態では、Casタンパク質はTNBC細胞にポリペプチドの形態で導入される。特定の実施形態では、Casタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドにコンジュゲートされ得る。細胞透過性ペプチドの非限定的な例には、例えば、Millettiら、Drug Discov. Today 17: 850-860, 2012（その関連する開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において提供されるものが含まれるが、これに限られない。他の実施形態では、TNBC細胞は、Casタンパク質を産生するように遺伝子操作され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、Casタンパク質がガイドRNAによって向けられるCDK19遺伝子中の標的モチーフは、15〜25ヌクレオチド長（例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長）であってよい。いくつかの実施形態では、標的モチーフは少なくとも20ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、CDK19遺伝子中の標的モチーフは、Casタンパク質によって認識される、プロトスペーサー関連モチーフ（PAM）として知られる短い保存された配列の直前にある。いくつかの実施形態では、PAMモチーフはNGGモチーフである。いくつかの実施形態では、CDK19遺伝子中の標的モチーフは最初のエクソン内にある。いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムのオフターゲット効果を最小化するように標的モチーフを選択することができる。当業者は、様々な技術を使用してオフターゲット効果を最小化するために適切なターゲットモチーフを選択できることを理解するであろう（例えば、バイオインフォマティクス分析）。
【０１０１】
Casタンパク質をCDK19遺伝子中の標的モチーフに誘導してハイブリダイズできるリボ核酸は、シングルガイドRNA（「sgRNA」）と呼ばれる。当業者に理解されるように、sgRNAは、使用される特定のCRISPR/Casシステム、および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて選択することができる。いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択され得る。いくつかの実施形態では、1つまたは2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフにすぐ隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。ガイドRNAはまた、利用可能なソフトウェア、例えば、CRISPR Design Tool（マサチューセッツ工科大学）を使用して設計することもできる。いくつかの実施形態では、1つまたはそれ以上のsgRNAを、当技術分野で知られている方法に従って、TNBC細胞にトランスフェクションすることができる。
【０１０２】
治療目的での抗体の使用は、癌を治療するために使用されてきた。受動免疫療法には、癌治療におけるモノクローナル抗体（mAb）の使用が含まれる（例えば、Devita, Hellman, And Rosenberg's Cancer: Principles & Practice Of Oncology, 第8版(2008), DeVita, V.ら編、Lippincott Williams & Wilkins, フィラデルフィア、ペンシルベニア州、pp. 537-547, 2979-2990を参照）。これらの抗体は、腫瘍細胞の増殖または生存の直接阻害、および身体の免疫系の自然な細胞殺傷活性を動員する能力の両方によって、固有の治療的生物学的活性を持つことができる。抗体は、単独で、または放射線または化学療法剤と組み合わせて投与することができる。乳癌の治療が承認されたトラスツズマブはそのような治療法の一例である。あるいは、抗体が薬物に連結され、腫瘍に特異的に結合することによりその薬剤を腫瘍に向けることができる抗体薬物複合体を作製するために抗体を使用することができる。トラスツズマブエムタンシン（Ado-Trastuzumab emtansine (T-DM1)）は、乳癌の治療に使用される承認された抗体薬物複合体の例である（Dengら、Curr. Med. Chem., Vol. 24(23), 2505-2527 (2017)を参照）。別のタイプの免疫療法は、特定の癌（例えば、TNBC細胞）に存在する抗原、または抗原の発現を指示するDNA構築物による能動免疫療法またはワクチン接種であり、これにより、対象において免疫応答を誘発させ、対象に自分の癌に対する抗体を能動的に産生するように誘導する。
【０１０３】
抗体は、疾患に関与する細胞表面タンパク質の標的化に非常に効果的である。それらの大きなサイズ、複雑な構造、およびジスルフィド結合への構造的依存が細胞内適用を妨げると一般に考えられているが、in situで発現した（例えば、MierschおよびSidhu, F1000Res doi: 10.12688/f1000research.8915.1, 2016参照）および機能的な細胞内活性を維持することが示されている外因的に供給された全抗体の両方が文献に存在する（Bioccaら、Expression and targeting of intracellular antibodies in mammalian cells. EMBO J. (1990); 9(1): 101-8およびSteinbergerら、Functional deletion of the CCR5 receptor by intracellular immunization produces cells that are refractory to CCR5-dependent HIV-1 infection and cell fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. (2000); 97(2): 805-10参照）。細胞内適用のために抗原結合フラグメント（Fab）や一本鎖可変フラグメント（scFv）などの一層小さく複雑でない結合タンパク質を使用する試みは、細胞質タンパク質に結合して機能を調節する能力において同様に成功を収めている（例えば、Marascoら、Design, intracellular expression, and activity of a human anti-human immunodeficiency virus type 1 gp120 single-chain antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. (1993); 90(16): 7889-93参照）。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、無傷の抗体）を包含するが、これらに限定されない。天然の抗体は通常、2つの同一の軽（L）鎖と2つの同一の重（H）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。通常、各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖と軽鎖には、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋もある。各重鎖の一端には可変ドメイン（V（H））があり、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖には、一端に可変ドメイン（V（L））があり、他端に定常ドメインがある；軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる2つの明確に区別できるタイプの1つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主要なクラスがあり：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG-1、IgG-2、IgG-3、およびIgG-4;IgA-1およびIgA-2に分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ミューと呼ばれる。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、提供された抗体との特異的相互作用が可能な任意の決定基を含むことを意味する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸や糖側鎖などの化学的に活性な分子の表面基で構成され、通常、特定の3次元構造特性と特定の電荷特性を持っている。抗体が認識するエピトープの同定は以下のように行う。まず、モノクローナル抗体が認識する標的分子の様々な部分構造を用意する。部分構造は、分子の部分ペプチドを調製することによって調製される。そのようなペプチドは、例えば、既知のオリゴペプチド合成技術によって、または所望の部分ポリペプチドをコードするDNAを適切な発現プラスミドに組み込むことによって調製される。発現プラスミドは、大腸菌などの適切な宿主に送達され、ペプチドを産生する。例えば、標的分子のC末端またはN末端から機能する、適切に長さが短縮された一連のポリペプチドは、確立された遺伝子工学技術によって調製することができる。どのフラグメントが抗体と反応するかを確立することにより、エピトープ領域が同定される。エピトープは、確立されたオリゴペプチド合成技術を使用して、さまざまなより小さなペプチドまたはペプチドの変異体を合成することにより、より厳密に同定される。より小さいペプチドは、例えば、特定のペプチドが標的分子への抗体の結合を妨害するかどうかを決定するための競合阻害アッセイで使用される。もしそうなら、該ペプチドは抗体が結合するエピトープである。SPOTs Kit（Genosys Biotechnologies、Inc.、The Woodlands、TX）などの市販のキットと、マルチピン合成法に基づく一連のマルチピンペプチド合成キット（Chiron Corporation、Emeryvile、CA）を使用して、非常にさまざまなオリゴペプチドを得ることができる。
【０１０６】
抗体またはそのフラグメントという用語は、二重または複数の抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、およびハイブリッドフラグメントを含む、F(ab’)2、Fab’、Fabなどのフラグメントをも包含する。したがって、その特定の抗原に結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、CDK19結合活性を保持する抗体のフラグメントは、抗体またはそのフラグメントという用語の意味に含まれる。そのような抗体およびフラグメントは、当技術分野で公知の技術によって作製でき、抗体を産生し、特異性および活性について抗体をスクリーニングする一般的な方法に従って、特異性および活性についてスクリーニングできる（HarlowおよびLane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, ニューヨーク(1988)を参照）。
抗体またはそのフラグメントの意味には、例えば米国特許第4,704,692号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されている抗体フラグメントと抗原結合タンパク質（一本鎖抗体）の複合体も含まれる。
【０１０７】
一実施形態では、任意の正常な（非癌性）組織では存在しないかまたは低レベルでのみ存在する、乳癌、特にTNBC細胞に存在する抗原に対して特異性を有する治療抗体（または抗体フラグメント）を、当技術分野で公知の方法を使用して調製できる。したがって、治療抗体はTNBC細胞に対して生物活性を有し、免疫系の反応を動員して疾患を治療することができる。治療抗体は、治療薬として単独で、または現在の治療法（化学療法、放射線、白金ベースの治療など）と組み合わせて投与することができ、または薬物などの毒性物質に結合した免疫複合体の調製に使用できる。
【０１０８】
当該分野で公知の方法によって作製された、CDK19に対するモノクローナル抗体（例えば、抗CKD19抗体）は、診断または治療の目的で、乳房組織における癌性細胞の有無を同定するために使用され得る。抗CKD19抗体はまた、固形腫瘍からの放出後に血液中を循環している癌性細胞の有無またはそのレベルを同定するために使用され得る。そのような循環抗原は、無傷のCDK19抗原、または本明細書で教示される方法に従って検出される能力を保持するそのフラグメントを含み得る。そのような検出は、例えば、当技術分野で一般に使用されている標準的な方法を使用したFACS分析によって行うことができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、CDK19を標的とする方法は、それを必要とする対象に、乳癌の治療、特にTNBCの治療のためにCDK19に免疫応答性である治療有効量の抗体（例えば抗CKD19抗体）を投与することを含み得る。一実施形態では、CDK19に対して免疫応答性を有する抗体は、細胞表面分子とは対照的に、キナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子を標的とし、それによって抗体の特異性は、CDK8上には存在しないCDK19上に存在するエピトープを中和することによって提供される。別の実施形態では、抗CDK19抗体は、PI3K/mTOR/AKT経路またはERK5を標的とすることができる（OcanaおよびPandiella, Oncotarget, 8(13), 22218-22234 (2017)を参照）。一実施形態では、抗CDK19抗体は、複数の細胞内シグナル伝達分子、例えば、PI3K/mTORおよびJAK/STAT経路を標的とすることができる。さらに別の実施形態では、抗CDK19抗体は、CDK8上には存在せずCDK19上に存在する中和エピトープに結合する操作されたタンパク質を含み得る。
【０１１０】
一実施形態では、CDK19を標的とする方法は、それを必要とする対象に、TNBCの治療のための腫瘍抗原（TA）特異的モノクローナル抗体の治療有効量を投与することを含み得る。一実施形態では、TA特異的mABは、TNBCに関連する細胞内抗原に向けることができる（例えば、Wangら、Molecular Oncology, Vol. 9(10), (2015) 1982-1993およびJust, FEBS letters, 2:21 (2014), 350-355を参照）。
【０１１１】
一実施形態では、乳癌を有する対象を治療する方法が提供され、該方法は、対象に、CDK19標的化薬剤を含む組成物の薬学的有効量を投与する工程を含む。CDK19標的化薬剤は、CDK19標的化抗体、CDK19標的化ペプチド、CDK19標的化小分子、CDK19標的化RNA分子、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの例では、CDK19標的化薬剤は治療剤に結合され得る。場合によっては、該方法は、第2の形態の癌療法（例えば、化学療法または放射線療法）を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、乳癌はTNBCである。別の局面において、乳癌細胞においてCDK19遺伝子の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、CDK19遺伝子を発現する乳癌細胞を合成CDK19標的化RNA分子と接触させる工程を含む。
【０１１２】
別の実施形態では、以下の工程を含む、癌を有する対象のCDK19標的薬剤に対する応答性を評価する方法が提供される：（a）対象からの腫瘍試料でCDK19の量を測定する；（b）対象が高レベルのCDK19発現を有するとして特徴付けられる癌を有するかどうかを決定する；ついで（c）対象の癌が高レベルのCDK19発現を有するとして特徴付けられる場合、対象がCDK19標的薬剤に応答する可能性が高いか、または対象の癌が低レベルのCDK19発現を有するとして特徴付けられる場合、対象がCDK19標的薬剤に応答する可能性が低いことを示す。
【０１１３】
一側面では、癌を有する対象を治療する方法が提供され、該方法は、CDK19標的薬剤を含む薬学的有効量の組成物を患者に投与することを含む。CDK19標的薬剤は、CDK19タンパク質またはCDK19 mRNAに特異的に結合する薬剤である。CDK19標的薬剤には、CDK19タンパク質またはCDK19 mRNAに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ペプチド、小分子、およびポリヌクレオチド（RNA分子など）が含まれる。組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。場合によっては、CDK19タンパク質に結合するCDK19標的薬剤は、CDK19活性を直接阻害する。他の例では、CDK19 mRNAに結合するCDK19標的薬剤は、CDK19発現を阻害し、それによりCDK19活性を阻害する。
【０１１４】
一例では、CDK19標的薬剤は、CDK19標的抗体を含む。CDK19標的抗体は、モノクローナル抗体であってよい。いくつかの例では、CDK19標的抗体はヒト化抗体であってよい。別の例では、CDK19標的薬剤は、CDK19標的ペプチドであってよい。さらに別の例では、CDK19標的薬剤は、CDK19標的小分子であってよい。CDK19標的ペプチドおよび小分子は、以下でさらに考察されるように、様々な仕方で由来してよい。場合によっては、ペプチドは、CDK19標的抗体の配列に由来する。
【０１１５】
場合によっては、本明細書に記載の方法で対象を治療することは以下の少なくとも一つを阻害する：対象における腫瘍の形成、腫瘍細胞の増殖（proliferation）、腫瘍細胞の増殖（growth）、または腫瘍細胞の転移。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で対象を治療すると、腫瘍サイズが減少し、場合によっては、対象の１つまたはそれ以上の腫瘍が排除される。
【０１１６】
３．１．４：小分子阻害剤
１つのアプローチにおいて、TNBCを治療する方法は、CDK19活性の小分子阻害剤を使用して、CDK19タンパク質を標的化することを含む。CDK19の小分子阻害剤の例は、米国特許第9,321,737号、米国特許公開第US20170071942号、Mallingerら、J. Med. Chem. 59:1078, 2016、およびCzodrowskiら、J. Med. Chem. 59:9337, 2016に記載されている。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、CDK19のATP結合部位に結合してその活性を阻害する。
【０１１７】
CDK19の小分子阻害剤は、CDK19のATP結合部位に共有結合または非共有結合してその活性を阻害する。他の実施形態では、小分子阻害剤は、ATP結合部位の外側でCDK19の他の部分に結合してよい。例えば、小分子阻害剤は、ATP結合部位の外側のアミノ酸（例えば、メチオニン、チロシン、またはセリン）と共有相互作用を形成して、CDK19活性を阻害することができる。ATP結合を占有してキナーゼ活性を阻害することに加えて、小分子阻害剤はまた、CDK19に結合して、CDK19が機能するのを妨げるCDK19の構造変化を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、CDK8よりも高い親和性でCDK19に結合することができる。図９に示すように、CDK19とCDK8とのアミノ酸の違いの大部分はC末端ドメインにある。いくつかの実施形態では、いかなる理論にも拘束されることなく、小分子阻害剤は、CDK8の対応するアミノ酸または部分とは異なる、CDK19のC末端ドメインのアミノ酸または部分に結合して、CDK8に対するCDK19の選択的阻害を達成することができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、米国特許第9,321,737号に記載されている化合物以外のものである。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、米国特許公開第US 20170071942号に記載されている化合物以外のものである。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、Mallingerら、J. Med. Chem. 59:1078, 2016に記載されている化合物以外のものである。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、Czodrowskiら、J. Med. Chem. 59:9337, 2016に記載されている化合物以外のものである。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、コルチスタチンA（Cortistatin A）、ソラフェニブ（Sorafenib）、リニファニブ（Linifanib）、ポナチニブ（Ponatinib）、セネキシンB（Senexin B）、CCT251545、およびCCT251921からなる群から選択される1つまたは複数の化合物以外のものである。
【０１１９】
３．１．５：CDK8の発現または活性を有意に阻害しないか、またはCDK8の発現または活性を阻害するよりもCDK19の発現または活性を一層阻害するCDK19阻害剤
CDK19の発現または活性を阻害するがCDK8の発現または活性を阻害しない薬剤、またはCDK8の発現または活性が阻害されるよりもCDK19の発現または活性を一層阻害する薬剤は、CDK19およびCDK8タンパク質およびそれらに対応する遺伝子およびmRNAの配列および構造の違いに基づいて設計することができる。例えば、CDK19およびCDK8 mRNA配列のアラインメントは、shRNAまたはCDK19 mRNAと関連するがCDK8配列とは関連しない他の核酸物質を設計するために使用できる非同一または低同一性ヌクレオチド配列を同定できる（図１６および１７を参照）。同様に、CDK19およびCDK8アミノ酸配列のアラインメントは、相違する領域を特定でき、CDK19タンパク質に特異的に結合する抗体または他の結合剤を生成できる。同様に、CDK19活性を特異的に阻害するかまたはCDK19活性をCDK8活性よりも一層阻害する小分子薬剤を（合理的な薬物設計またはスクリーニングによって）同定することができる。
【０１２０】
本明細書で使用される「CDK19活性を阻害するがCDK8の活性を有意に阻害しない」という用語は、最小のCDK19活性がインビボまたはインビトロで検出されるように、CDK19の活性に特異的に結合および阻害することができる薬剤を指す；一方、該薬剤は、同じ条件下でCDK8活性の有意な低下を引き起こさない。例えば、CDK19の活性を阻害する薬剤は、CDK19に特異的に結合し、インビボまたはインビトロでCDK19活性を完全にまたは有意に阻害することができる。場合によっては、CDK19阻害剤は、CDK19遺伝子またはCDK19遺伝子産物に優先的に結合し、CDK19の発現または活性を完全に阻害する能力によって同定できる。CDK19の阻害は、薬剤への暴露時のCDK19活性が、対照の存在下または薬剤の不在下でのCDK19活性よりも少なくとも約70％少ない、例えば、少なくとも約75％、80％、90％、または95％少ないときに生じる。CDK8活性が薬剤への曝露時に、薬剤の不在下でのCDK8活性に比べて少なくとも約90％、例えば、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、または100％である場合、CDK8活性の有意な減少は生じない。本明細書に記載されるように、薬剤は、小分子化学阻害剤などの小分子（すなわち、1000ダルトン以下の式量を有する分子）またはsiRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはタンパク質などの大分子を含み得る。
【０１２１】
CDK19および／またはCDK8活性に対する薬剤の効果を決定することは、限定されないが、最大阻害濃度の半分（IC50）、解離定数（KD）、および阻害定数（KI）を含む、当該分野で公知の1つ以上の方法を使用して測定され得る。例えば、IC50は、特定の生物学的または生化学的機能を阻害する上での物質の有効性の尺度である。この値は、特定の生物学的プロセス（または生物学的プロセスの成員）を半分に阻害するのに必要な物質の濃度を示す。IC50値は通常、モル濃度として表される。食品医薬品局（FDA）によると、IC50はインビトロで50％の阻害に必要な薬物の濃度を表す。一実施形態では、CDK19活性を阻害するがCDK8の活性を有意に阻害しない薬剤は、同じ条件下でCDK8活性に作用するのに必要な薬剤の濃度よりも少なくとも約2倍、5倍、10倍、50倍、75倍、または100倍低いIC50を有する。別の実施形態では、CDK19活性を阻害する薬剤のIC50は、CDK8の活性を阻害する薬剤のIC50よりも少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％低い。
【０１２２】
別の実施形態では、CDK19およびCDK８活性に対する薬剤の効果は、各CDKに対する薬剤の平衡解離定数（KD）を計算することによって決定することができる。例えば、CDK19の活性を阻害するがCDK8の活性を有意に阻害しない薬剤は、同じ条件下でのCDK8に対する薬剤のKDより少なくとも約2倍、5倍、10倍、50倍、または100倍低いKDを有する。一実施形態では、（CDK19への）薬剤のKDは、（CDK8への）薬剤のKDより少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％低い。好ましい実施形態では、CDK19への薬剤のKDはCDK8への薬剤のKDと比較して低い。言い換えれば、（CDK8への）薬剤の平衡解離定数は、（CDK19への）薬剤の平衡解離定数よりも大きい。一実施形態では、薬剤は、マイクロモル（10-6）からナノモル（10-7〜10-9）の範囲のKD値を有する抗体を含むことができる。別の実施形態では、薬剤は、ナノモル範囲（10-9）からピコモル（10-12）範囲のKDを有する抗体を含むことができる。さらに別の実施形態では、薬剤は、CDK19に対してナノモル（nM）の平衡解離定数およびCDK8に対してマイクロモル（μM）の平衡解離定数を有することができる。米国特許公開第US20120071477号は、単一濃度（2,000nM）の化合物がATPポケット結合を阻害するキナーゼ阻害アッセイを記載している。
【０１２３】
別の実施形態では、CDK19およびCDK８活性に対する薬剤の効果は、各CDKに対する薬剤の阻害定数（KI）を計算することによって決定することができる。KIは、阻害剤が如何に強力であるかの指標である；それは、最大阻害の半分を生み出すのに必要な濃度である。KIが低いほど、薬剤とCDK遺伝子との結合親和性が高くなる。例えば、CDK19の活性を阻害するがCDK8の活性を有意に阻害しない薬剤は、同じ条件下での（CDK8への）薬剤のKIより少なくとも約2倍、5倍、10倍、50倍、75倍、または100低い。一実施形態では、CDK19に対する薬剤のKIはCDK8に対する薬剤のKIよりも少なくとも約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％低い。好ましい実施形態では、CDK19への薬剤のKIはCDK8への薬剤のKIと比較して低い。言い換えれば、CDK8への薬剤の阻害定数は、CDK19への薬剤の阻害定数よりも大きい。例えば、CDK19の活性を阻害する薬剤は、CDK19に結合し、インビボまたはインビトロでCDK19活性を有意に阻害することができる。場合によっては、CDK19阻害剤は、CDK19に優先的に結合し、CDK19の活性を完全に阻害する能力によって同定できる。CDK19の阻害は、薬剤にさらされたときのCDK19活性が、対照の存在下または薬剤の不在下でのCDK19活性よりも少なくとも約70％少ない、例えば、少なくとも約75％、80％、90％、または95％少ないときに生じる。CDK8活性が薬剤への曝露時に、薬剤の不在下でのCDK8活性に比べて少なくとも約90％、例えば、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、または100％である場合、CDK8活性の有意な減少は生じない。
【０１２４】
本明細書で使用する「CDK8の活性を阻害するよりもCDK19の活性を一層阻害する薬剤」という用語は、同じ条件下でのCDK8の活性の阻害に対する薬剤の効果よりも有意に大きくCDK19の活性に結合して阻害することができる薬剤を指す。例えば、CDK8の活性を阻害するよりも大きくCDK19の活性を阻害する薬剤は、CDK19活性が、本発明の薬剤への暴露時に、インビトロまたはインビボでの同じ条件下でのCDK8の活性よりも少なくとも約10％少なく、例えば、少なくとも約15％、20％、30％、40％、または50％少ないときに生じる。好ましい実施形態では、観察されたCDK19の活性が同じ条件下でのCDK8の活性よりも少なくとも10％低い場合に、薬剤はCDK8の活性を阻害するよりもCDK19の活性を一層阻害する。別の実施形態では、同じ条件下でCDK8活性と比較して少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍少ないCDK19活性が観察された場合に、薬剤はCDK8の活性を阻害するよりもCDK19の活性を一層阻害する。阻害の程度（すなわち、CDK19活性をCDK8活性と比較すること）は、本明細書の実施例セクションに記載されているアッセイ、例えば「対照のパーセント（POC）」または「正規化パーセント阻害（NPI）」を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の1つ以上の方法を使用して決定できる。POCおよびNPIは、データを正規化する方法であり、複数の薬剤（例えば、種々の抗体および小分子）を複数の標的（例えば、CDK19およびCDK8）と比較するときによく使用される。例えば、POCは、プレートに存在する1つまたはそれ以上の対照に対する薬剤の測定値を正規化することにより、プレート間の変動（例えば、ハイスループット薬物スクリーニングにおける）を補正する方法である。各薬剤の生の測定値は、プレート内対照の「平均」で割ることができる。NPIは、対照ベースの方法であり、薬剤の測定値と陽性対照の平均値との差を、陽性対照の測定値の平均と陰性対照の測定値の平均との差で割ったものである（Maloら、Nature Biotechnology, Vol. 24, 167-175 (2006)）。観察された阻害の程度を正規化することにより、検討中の各標的の活性の阻害にどの薬剤が効果的であるかに関して正確な結論を下すことができる。
【０１２５】
３．１．６：併用療法
1つのアプローチでは、患者は、CDK19の発現または活性を阻害する薬剤および（a）放射線療法および／または化学療法を含む併用療法で治療される。1つのアプローチでは、放射線または化学療法は腫瘍塊の大部分を排除し、CDK19阻害剤は生存可能な癌幹細胞（例えば、EpCAMmed/high/CD10-/low）細胞の数を減らす。1つのアプローチでは、化学療法は、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンまたはエピルビシン）、タキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）、代謝拮抗物質（例えば、カペシタビンまたはゲムシタビン）、プラチナ剤（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）、ビノレルビン、またはエリブリンの投与を含む。
【０１２６】
３．２：治療効果の評価または予測方法
CDK19阻害剤による一連の治療は、例えば腫瘍容積の減少、転移の減少、および表現型EpCAMmed/highおよびCD10-/lowを有する腫瘍細胞の減少など、患者にとって有益な結果になる。
【０１２７】
腫瘍容積は、当技術分野で既知の方法を使用して測定することができる。例えば、Wapnirら、Breast Cancer Res Treat 41:15-19, 1996;Sapiら、PLoS One 10:e0142190, 2015を参照。CDK19阻害剤による単剤療法または他の薬剤または治療との併用の一連の治療後、腫瘍容積は少なくとも10％、任意で少なくとも20％、時には少なくとも50％減少する。いくつかの実施形態では、腫瘍容積の減少（例えば、腫瘍容積の少なくとも10％、20％、または30％の減少）は、治療を開始してから早くも1ヶ月以内に観察され得る。他の実施形態では、腫瘍容積の減少（例えば、腫瘍容積の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、または60％の減少）は、治療を開始してから2、3、4、5、または6か月間で観察され得る。他の実施形態では、本明細書に記載のTNBCを治療するための方法はまた、腫瘍のさらなる増殖を減速または阻害し得る。いくつかの実施形態では、患者は併用療法を受け、第2の薬剤による単剤療法のそれを超える治療効果が観察される。
【０１２８】
個体における転移の減少は、Makelaら、Sci Rep. 7:42109, 2017の記載に従って決定することができ、標準的な方法に従って集団で観察することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、対象から得られたTNBC腫瘍組織におけるEpCAMmed/highおよびCD10-/lowの発現プロファイルを有する癌細胞の存在または量を使用して、CDK19遺伝子またはその対応するタンパク質を標的とする治療に対する対象の治療応答性を予測または評価することができる。本明細書に記載および実証されるように、発現プロファイルEpCAMmed/high/CD10-/lowを有する細胞は、高い腫瘍開始能を有し、CDK19にも富んでいる。いくつかの実施形態では、高いパーセンテージのEpCAMmed/highおよびCD10-/lowのTNBC細胞を有する対象は、特に応答性であり得る。
【０１３０】
1つのアプローチでは、TNBCを有する対象のCDK19標的剤に対する治療応答しやすさは、（a）対象から得られた腫瘍試料中のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞を定量し、（b）（a）のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の量を、CDK19標的療法に応答する腫瘍に特徴的な参照値と比較し、ついでEpCAMmed/high/CD10-/low細胞が参照値に等しいか参照値を超える場合にCDK19発現または活性の阻害剤で患者を治療することによって決定される。参照値は、健常集団およびTNBC集団のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞を定量し、健常組織および腫瘍組織に特徴的な統計的に有意な範囲を計算することによって決定できる。別のアプローチでは、同じ対象からの腫瘍組織および健常な組織を試験することができ、健常組織と比較して腫瘍内のEpCAMmed/high/CD10-/low細胞が高い対象を、CDK19標的療法に応答しやすいと同定できる。
【０１３１】
３．３：薬剤の送達
本明細書に記載の方法で使用される医薬組成物は、当業者に知られている方法により製剤化することができる、有効成分および1つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体または賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療上有効な量で、CDK19遺伝子の発現レベルを低下させるDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療有効量のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチド、CDK19の活性を阻害する小分子を含む、本発明の医薬組成物を包含する。医薬組成物中の有効成分の治療有効量は、疾患の症状を予防、緩和、または改善するのに、または治療されている対象の生存を延長するのに十分である。治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【０１３２】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物はデポ製剤として製剤化される。一般に、デポ製剤は通常、非デポ製剤よりも長く作用する。いくつかの実施形態では、そのような調製物は、埋め込み（例えば、皮下）によって、または筋肉内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、デポ製剤は、適切なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂を使用して、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として調製される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は送達システムを含み得る。送達システムの例には、エキソソーム、リポソーム、およびエマルジョンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、活性成分は、治療される細胞型、組織、または器官を特異的に標的とするエキソソームにロードまたはパッケージされ得る。エキソソームは、多胞体が原形質膜に融合した後に細胞外環境に放出される、エンドサイトーシス起源の小さな膜結合小胞である。エキソソームの産生は、B細胞、T細胞、樹状細胞を含む多くの免疫細胞で報告されている。治療用化合物をエキソソームにロードするために使用される技術は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許公開第US20132013426号および第US20140348904号、ならびに国際特許公開WO2015002956（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、治療化合物は、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション試薬（すなわち、カチオン性リポソーム）の使用により、エキソソームにロードされ得る。いくつかの実施形態では、エキソソームを産生するようにエキソソーム産生細胞を操作することができ、それに治療化合物をロードすることができる。例えば、エキソソームは、エキソソームが宿主細胞によって産生されたときに、活性成分（すなわち、DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド）がエキソソームに取り込まれるように、活性成分を発現する遺伝子構築物でエキソソーム産生宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることによりロードできる。エキソソームが選択された細胞型、組織、または器官を標的とすることができるように、さまざまな標的化部分をエキソソームに導入することができる。標的化部分は、標的化された細胞型、組織、または器官に特異的な細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質またはペプチドに結合し得る。いくつかの実施形態では、エキソソームは標的化部分が表面上に発現されている。いくつかの実施形態では、エキソソームの表面上に発現される標的化部分は、エキソソーム膜貫通タンパク質に融合される。標的化部分をエキソソームに導入する技術は当技術分野で知られており、例えば、米国特許公開第US20130053426号および同第US20140348904号、および国際特許公開第WO2015002956号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【実施例】
【０１３４】
４．実施例
４．１：実施例１-材料および実験方法
化学試薬：
以下は、この研究で使用した化合物の化学名である。CCT152921は、4-[（2-フェニルエチル）アミノ]-6-キナゾリンカルボニトリル（NIH NCAT）である。この化合物をビヒクル（PBS+0.5％Methocel(w/v)+0.25％Tween 20(v/v)）に3mg/mLの濃度に再懸濁し、マウスに30mg/kgを投与した。CCT251921またはビヒクルは、毎日強制経口投与した。
【０１３５】
shRNA発現レンチウイルスプラスミド：
センス標的配列、15-merループ配列（5'-GTTAATATTCATAGC-3'：配列番号19）、およびセンス配列の逆相補体を含む相補的ssDNAオリゴヌクレオチドのペアを合成した（Elim Biopharmaceuticals）。オリゴヌクレオチドを、50μMアニーリング緩衝液（10mM Tris-HCl pH8.0、50mM NaCl、1mM EDTA）でアニーリングした。その後、二本鎖DNAオリゴテンプレートを、構成的に活性なshRNAベクター構築物のためのBbsIで消化したpRSI12-U6-(sh)-HTS4-UbiC-TagRFP-2A-Puro shRNA発現ベクター（Cellecta）および誘導可能なshRNAベクター構築物のためのBbsIで消化したpRSITUR-U6Tet-(sh)-UbiC-TetRep-2A-TagRFPにクローニングした。この研究で使用したshRNAベクターのセンス鎖は、5'-GCG AGA ATT GAA GTA CCT TAA-3'（shCDK19-1（配列番号1））、5'-ACC AGC AAA TAT CCT AGT AAT-3'（shCDK19-2（配列番号2））、および5'-GCA GGG TAA TAA CCA CAT TAA-3'（shCDK8-2（配列番号3））であった。未修飾の上記のpRSI12-U6-(sh)-HTS4-UbiC-TagRFP-2A-Puro shRNA発現ベクターは「空の」対照shRNAとして使用した。pHIV-ZsGreen発現ベクター（Addgene）を使用してGFP陽性腫瘍細胞を作製した。RNAiスクリーニングに使用されるDECIPHER 27K Pooled shRNAレンチウイルスライブラリー-Human Module 1 (Cellecta)には、同じpRSI12 shRNA発現ベクター内に5,043のヒト遺伝子を標的とする27,500の固有のshRNA構築物（遺伝子当たり約5または6の冗長shRNA）が含まれている。
【０１３６】
細胞株：
MDA-MB231、MDA-MB468、HS578T、および293T細胞をATCCから入手した。HMEC細胞はThermoFisher Scientificから入手した。これらの細胞は、マイコプラズマを含まないことが供給業者から認定されている。使用した細胞株はいずれも、ICLACが管理している一般的に誤認されている細胞株のデータベースにリストされていない。使用したすべての細胞株は、供給業者からの元の細胞が解凍されてから10回未満継代した。MDA-MB231、MDA-MB468、293T、およびHS578T細胞はすべて、PSA（Life Technologies）、10％FBS（Hyclone）、Glutamax（ThermoFisher Scientific）、およびピルビン酸ナトリウム（Life Technologies）を補充したDMEM（Invitrogen）で増殖させた。HMEC細胞はHuMEC Ready Medium（ThermoFisher Scientific）で増殖させた。
【０１３７】
マウス：
Nod scidガンマ（NSG）マウス（NOD.Cg-PrkdcscidIL2Rgtm1Wjl/SzJ）をJackson Laboratoryから購入した。PDX実験に使用したマウスは、8〜10週齢の成体雌マウスであった。この研究で使用されたすべてのマウスは、スタンフォード大学APLAC委員会によって承認されたプロトコルに従って、スタンフォード動物施設で維持された。マウスは無菌の滅菌条件下、社内で維持した。マウスにオートクレーブした食物と水を投与した。ドキシサイクリン誘導性構築物を利用するPDX実験のため、マウスに通常の齧歯類の餌の代わりに625mgのドキシサイクリンヒクレート/kg餌（Envigo）を含む齧歯類の餌を与えた。
【０１３８】
PDX腫瘍およびその病理学的および臨床的特徴：
ヒトの試料については、スタンフォード大学の機関審査委員会およびシティー・オブ・ホープによるプロトコルの承認後に、インフォームドコンセントが得られた。この研究で使用されたすべてのPDX腫瘍の完全な説明については、図１５を参照。
【０１３９】
PDX腫瘍細胞の単一細胞懸濁液：
異種移植片をかみそりの刃で機械的に約1mmに細断し、37℃で3〜4時間、120μg/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、0.25μg/mLのアンフォテリシンB（PSA）（Life Technologies）を含むAdvanced DMEM/F12（Invitrogen）中、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ（Stem Cell Technologies）とともにインキュベートした。次に、細胞をACK溶解緩衝液（Gibco）で処理して赤血球を溶解し、その後、予熱したディスパーゼ（Stem Cell Technologies）とDNAseI（Sigma）で5分間処理し、40μmナイロンメッシュフィルターでろ過した。最後に、細胞をフローサイトメトリー緩衝液（HBBS、2％FCS、PSA）で洗浄した。
【０１４０】
PDX腫瘍細胞のエンリッチメント：
PDX腫瘍が単一の細胞に解離した後、生細胞の数をトリパンブルー染色で決定し、血球計算盤で手動にてカウントした。細胞をフローサイトメトリー緩衝液で106生細胞/mLの濃度に再懸濁し、ビオチン抗ヒトCD326（EpCAM）抗体（Biolegend）と1:50（v/v）にて4℃で20分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、80μLに再懸濁し、20μLの抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）と4℃で20分間インキュベートした。次に、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、500μLの緩衝液に再懸濁した。製造業者のプロトコルに従い、細胞を磁化したLSカラム（Miltenyi Biotec）に適用し、洗浄し、磁石から溶出させた。
【０１４１】
レンチウイルスの製造：
レンチウイルスは、パッケージングプラスミドミックス（Cellecta）を用いて製造し、293T細胞でLipofectamine 2000（Thermofisher Scientific）を使用し、製造業者の指示に従ってpRSI12shRNA発現プラスミドにサブクローニングした。上清を48時間後と72時間後に収集し、0.45μmフィルターでろ過し、製造業者の指示に従ってレンチウイルス沈殿溶液（Alstem LLC）で沈殿させた。ウイルスを元の量の1/100に再懸濁した。ウイルス力価は、濃縮ウイルスの連続希釈液に感染した293T細胞のフローサイトメトリー分析によって決定した。
【０１４２】
レンチウイルス感染：
インビトロ細胞株実験では、播種時に濃縮レンチウイルス上清（MOIが3になるように）を細胞と混合した。細胞は、蛍光顕微鏡下でRFPを視覚化することによりモニターした。すべてのフローサイトメトリー分析は、感染から少なくとも72時間後に行った。
【０１４３】
インビボPDX腫瘍増殖およびオルガノイドコロニー形成実験では、濃縮レンチウイルス上清（MOIが10になるように）を、4μg/mLのポリブレン（Sigma-Aldrich）を含むオルガノイド培地でPDX腫瘍細胞の単一細胞懸濁液と混合した。オルガノイド培地は以下から構成されている：Advanced DMEM/F12（Invitrogen）、10％FBS（Hyclone）、2.5％成長因子減少マトリゲル（BD）、10ng/mLのマウスEGF（R＆D）、100ng/mLのNoggin（R＆D）、250ng/mLのRSPO-I（R＆D）、1XB27（Invitrogen）、1XN2（Invitrogen）、およびPSA（Life Technologies）。 その後、細胞を1200xgで2時間、15℃で遠心分離することによりスピノキュレーションを行った。細胞をピペッティングによって再懸濁し、48ウエルの超低接着細胞培養プレート（Corning）に一晩放置した。
【０１４４】
オルガノイドコロニー形成アッセイでは、細胞を翌日マトリゲルに移した。インビボPDXアッセイでは、PDX腫瘍生着のセクションで説明したように、約75％の細胞をNSGマウスに注入した。残りの25％の細胞をマトリゲルに播種し、細胞がRFP陽性になるまで72時間オルガノイド培地で培養した。その時点で培地を除去し、ディスパーゼと交換し、マトリゲルが溶解するまで2〜3時間インキュベートした。解離した細胞をフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析して、マウスに注入された細胞の「ベースライン」RFPパーセンテージを決定した。
【０１４５】
オルガノイドコロニー形成アッセイ：
照射されたL1-Wnt3aフィーダー細胞（Dr. Roel Nusseからの気前の良い贈与品）を成長因子減少マトリゲル（BD Biosciences）と混合し、37℃で固化した。PDX腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、固化したマトリゲル/フィーダー細胞混合基質に移し、オルガノイド培地で増殖させた。細胞を、5％CO2を含む37℃のインキュベーターで約2週間培養した。培地の50％を3〜4日ごとに新しい培地と交換した。コロニーを蛍光顕微鏡下でカウントした。RFP陽性コロニー（形質導入細胞を表す）のみをカウントした。CDK19 shRNAの発現を誘導する実験では、ドキシサイクリンヒクレートを100ng/mLの最終濃度で培地に添加した。
【０１４６】
細胞生存アッセイ：
化学物質で処理したまたはレンチウイルスに感染した細胞株について、製造業者の指示に従い、WST-1細胞増殖試薬（Roche）を各ウエルに1:10（v/v）の最終希釈で加えた。その後、細胞を37℃、5％CO2でインキュベートした。試薬添加後1〜4時間の間に、プレートをSpectraMax M3バイオアナライザー（Molecular Devices）で分析した。各ウエルの吸光度を450nm（シグナル波長）および650nm（参照波長）で測定した。したがって、各実験試料のシグナルは、吸光度experimental（A450nm-A650nm）であった。培地の影響を補正するために、ブランクウエルの吸光度を測定することにより、吸光度background（A450nm-A650nm）を得た。したがって、各試料のバックグラウンド補正シグナルAcorrectedは吸光度experimental-吸光度backgroundであった。ノックダウンのすべての補正値を対照試料の補正値に正規化し、「相対生存率」を得た。
【０１４７】
定量的PCR RNA発現分析：
細胞をTrizol（Life Technologies）で溶解し、製造業者の指示に従ってRNAを抽出した。次にRNAをDNAseIで処理して、混入しているゲノムDNAを除去した。製造業者の指示に従い、SuperScript III First Strand Synthesis Kit（Life Technologies）を使用してRNAをcDNAに逆転写した。製造業者の指示に従い、TaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems）および次のTaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems）を使用した：ACTB,Hs00357333_g1;CDK19,Hs01039931_m1;CDK8,Hs00993274_m1。データは7900HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）で収集され、データはSDS2.4ソフトウェア（Applied Biosystems）で分析された。各試料の遺伝子発現データは、ベータアクチンの発現に対して正規化した。
【０１４８】
PDX腫瘍細胞の生着および限界希釈アッセイ：
PDX細胞の単一細胞懸濁液を、通常のマトリゲル（BD Biosciences）とフローサイトメトリー緩衝液の50％（v/v）混合物に再懸濁し、総量を50〜100μLにした。インスリン注射器を用い、細胞を4番目の腹部脂肪体でメスのNSGマウスの乳頭に皮下注射した。限界希釈アッセイのため、マウスに注入された特定の数の細胞をフローサイトメトリーにより、および第二に血球計算盤で手動にてカウントして決定した。
【０１４９】
PDX腫瘍の増殖および総体重：
PDX腫瘍は触診により検出された。腫瘍容積は、長さ（l）と幅（w）を測定し、楕円体の計算式1/6x1xw2xπを使用して容積を計算することによって決定した。腫瘍の容積およびマウスの体重は週に2回測定した。
【０１５０】
マウスPDX腫瘍および肺の解剖：
マウスを安楽死させた後、異種移植腫瘍およびマウス肺を外科的に切除した。各腫瘍から3〜4mmの切片を切り取り、画像化のため氷冷PBSに保存した。マウスの肺および腫瘍をM205FA蛍光実体顕微鏡（Leica）で画像化し、画像はDFC310FXカメラ（Leica）で記録した。
【０１５１】
RFPパーセンテージを決定するフローサイトメトリー：
フローサイトメトリーは、100μmノズルで、フローサイトメトリーAria II（BD Biosciences）とDivaソフトウェア（BD Biosciences）を使用して行った。データ分析は、Flowjoソフトウェア（Flowjo）を用いて行った。すべての実験で、側方散乱プロファイルおよび前方散乱プロファイル（面積および幅）を用いて、残屑および細胞ダブレット（debris and cell doublets）を排除した。死んだ細胞は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）陽性細胞（分子プローブ）を除外することにより排除した。PDX腫瘍細胞については、GFP陽性、次にRFP陽性にゲートした（gated）。RFPパーセンテージは、RFP陽性でもあるGFP陽性細胞のパーセンテージである。各試料について、腫瘍のRFP％をベースラインRFP％で除したものであるRFP画分を取得する（「レンチウイルス感染」のセクションを参照）。次に、各試料のRFP画分を、100％に設定されたshRNA対照試料のRFP画分に正規化して、「正規化された％RFP」を取得する。
【０１５２】
分析およびセルソーティングのためにEpCAM、CD10、およびCD49f細胞表面マーカーを使用するフローサイトメトリー：
分析およびセルソーティングのためのフローサイトメトリーは、以前の記載に従って行った。使用したヒト抗体には以下が含まれていた：EpCAM-Alexa Fluor 488（クローン9C4、Biolegend）；1μgmL-1、CD49f-APC（クローンGoH3、Biolegend）；CD10 PeCy7/Apc-Cy7（クローンH110a、Biolegend）；1μgmL-1およびH-2Kdビオチン/パシフィックブルー（クローンSF1-1.1、Biolegend）；1μgmL-1。
【０１５３】
RNAiドロップアウト生存スクリーニング：
NSGマウスで増殖したGFP陽性PDX-T1腫瘍を切開し、単一細胞に加工し、前述のようにEpCAMで濃縮した。この時点での細胞の分析は、それらが約98％-100％のGFP陽性であることを示した。
【０１５４】
インビトロRNAiドロップアウト生存スクリーニングのため、6千万個の解離したPDX-T1細胞に、ポリブレンの存在下でMOIが1のDECIPHER 27KプールshRNAレンチウイルスライブラリー-ヒトモジュール1（Cellecta）を形質導入し、その後前述のように2時間スピノキュレーションした。翌日、細胞の半分を遠心分離し、インビトロベースライン参照試料として凍結した。少数の細胞をオルガノイドコロニー形成条件で別途プレーティングして、72時間後にレンチウイルス感染率を決定した（細胞は約80％RFP陽性であることがわかった）。残りの細胞を、250,000細胞/mLマトリゲルの照射されたL1-Wnt3aフィーダー細胞を含む12ｍLのマトリゲルで調製した12の150 mmディッシュにプレーティングした。3〜4日ごとに新鮮な培地と交換しながら、細胞を19日間増殖させた。最終日に、マトリゲルを溶解し、細胞を回収するために、すべての培地をディスパーゼと交換した。すべてのプレートからの細胞をプールし、洗浄し、インビトロオルガノイド増殖実験試料として凍結した。
【０１５５】
インビボRNAiドロップアウト生存スクリーニングのため、3千万個の解離したPDX-T1細胞に、ポリブレンの存在下でMOIが1.25のDECIPHER 27KプールshRNAレンチウイルスライブラリー-ヒトモジュール1（Cellecta）を形質導入し、その後前述のように2時間スピノキュレーションした。翌日、細胞の半分を遠心分離し、インビボベースライン参照試料として凍結した。少数の細胞をオルガノイドコロニー形成条件で別途プレーティングして、72時間後にレンチウイルス感染率を決定した（細胞は約70％RFP陽性であることがわかった）。残りの細胞を、通常のマトリゲル（BD Biosciences）とフローサイトメトリー緩衝液の50％（v/v）混合物に総量1.8mLで再懸濁した。これらの細胞を17匹のNSGマウスの左右の乳房脂肪体に均等に注入した。腫瘍の直径が約10mmに達したらマウスを安楽死させ、前述のように腫瘍を切開した。次に、これらの腫瘍を単一細胞に処理し、プールし、洗浄し、インビボ増殖実験試料として凍結した。
【０１５６】
2組の試料、インビトロベースライン参照試料とインビトロオルガノイド増殖実験試料、インビボベースライン参照試料とインビボ増殖実験試料を、ゲノムDNA抽出、バーコード増幅、ハイスループット配列決定およびデコンボリューションのためにCellecta、Inc.に提出した。各試料で2千万バーコードの読み取りが実行された。
【０１５７】
インビボおよびインビトロRNAiドロップアウト生存スクリーニングからの「ヒット」選択アルゴリズム：
概要について図５Ｃの模式図を参照。本発明者らは、アルゴリズムを適用して、検証のためにヒットをより扱いやすい数に絞り込んだ。1）個々のshRNAについて、「ドロップアウト比」を決定した。これは、増殖実験試料のshRNAバーコード数をベースライン参照試料のshRNAバーコード数で除したものであった。各スクリーニングにおいて、これらを最低から最高にランク付けした。2）本発明者らは、各実験で最も低いドロップアウト率の上位5％を調べ、>2shRNAによりターゲットした遺伝子を同定した。3）本発明者らは、2つの実験間で重複した遺伝子を同定するために、インビボスクリーニングのshRNA遺伝子標的（208遺伝子）をインビトロスクリーニングのshRNA遺伝子標的（150遺伝子）と相互参照した。これらの46個の重複する「ヒット」遺伝子を図５Ａに示す。
【０１５８】
PDX腫瘍の免疫蛍光：
PDX腫瘍の切片をホルマリンで一晩固定し、70％エタノールに移した。次に試料をパラフィンに包埋し、組織学用に切片を作成した。ホルマリン固定パラフィン包埋切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノール勾配で再水和した。電子レンジで20分間加熱することにより、抗原検索をTris-EDTA緩衝液で行った。一次抗体であるポリクローナルウサギ抗CDK19抗体（Sigma）とポリクローナルニワトリ抗CDK8抗体（Novus Biologicals）を、試料に一晩適用する前に、TBS+1％BSAでそれぞれ1:50と1:100に希釈した。一晩のインキュベーション後、二次抗体であるCy3ロバ抗ウサギ抗体（Jackson ImmunoResearch）およびAlexa488ヤギ抗ニワトリ抗体（Life Technologies）をTBS+1％BSAで1:500に希釈し、試料と室温でインキュベートした。DAPI染色後、ProLongRGold退色防止剤（antifade）（Cell Signaling）で切片をマウントした。Zeiss LSM710共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を使用して、免疫蛍光画像を撮影した。出版用の画像はFijiソフトウェアで処理した。
【０１５９】
マイクロアレイ実験：
EpCAM濃縮PDX-T1細胞をshCDK19-2、shCDK8-2または対照shRNAに感染させ、オルガノイド培養条件で72時間培養した。その後、細胞をディスパーゼでマトリゲルから回収し、フローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーでソーティングしてGFPとRFPの両方が陽性の細胞を得た。製造業者の指示に従ってRNeasy plus micro kit（Qiagen）によってこれらの細胞からRNAを抽出し、Agilent 2100バイオアナライザーで定量化した。各試料からの50ngの全RNAを使用した。インビトロ転写、断片化、標識、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、およびスキャニングは、スタンフォードタンパク質および核酸施設（PAN施設）によって行った。試料はPrimeView Human Gene Expression Arrays（Affymetrix）でハイブリダイズした。遺伝子レベルの差異的発現分析は、Transcriptome Analysis Console（Affymetrix）で行った。ダウンレギュレーションされた遺伝子はlog2（試料/対照）<-1.5の遺伝子として、アップレギュレーションされた遺伝子はlog2（試料/対照）>1.5の遺伝子として定義した。
【０１６０】
H3K27Acクロマチン免疫沈降：
ChIPアッセイは、例えば、Zarnegarら、Nucleic Acids Research, gkx648, July, 2017の記載に従って行った。ChIP当たり約250,000〜500,000個のMDA-MB231細胞を使用した。ChIP当たり1μgの抗H3K27ac（Active Motif＃39133）を使用した。
【０１６１】
ライブラリー構築：
ChIP濃縮DNAは、Qubit3.0およびdsDNA HSアッセイを使用して定量化した。転位ベースのNEXTERA XTを使用し（製造業者のプロトコルに従い、インデックス作成のために〜14PCRサイクルを使用）、最大1ngのDNAをライブラリー構築に使用した。インデックス付きの試料をプールし、NextSeq500でのシーケンシングのために送り、読み取り深度が〜6千万リードの75bpシングルエンドリードを取得した。
【０１６２】
配列分析：
生の配列読み取りをGalaxy（usegalaxy.org）にアップロードし、Bowtie2（-very-fast-local）を使用してヒトゲノム（hg19）にアラインメントした。一意にマッピングされた読み取りのみをさらなる分析のために保持した。データを視覚化するため、アライメントファイルを使用してDeepToolsでシグナルトラックを生成し（100bpの瓶に200bpの読み取り拡張子およびRPKM正規化）、BigWigファイルをBroadの統合ゲノムブラウザーにロードした。MACS2を使用して、各複製のピーク（-nomodel、p=0.01、-broad、cuttoff0.1、duplicates=auto、extension200）を呼び出した。Bedtoolsを使用して、すべての複製で生じるピークのみを含むコンセンサスピークリストを生成した。本発明者らは、DiffBindを使用してコンセンサスピーク全体の差異的ピーク分析を行った。UCSCからのヒトRefSeq表の最も近い重複しない特徴をフェッチすることにより、DiffBind出力ピークリストに注釈が付けられた。さまざまなピークセットにわたるChIPシグナルの集約プロットのデータは、DeepToolsのcomputeMatrix（スケール領域：1000；50bp瓶）およびplotProfileを使用して生成された。次に、GraphPad Prismソフトウェアを使用してデータをプロットした。
【０１６３】
GSEA解析：
遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）は、javaGSEAデスクトップアプリケーション（GSEA 3.0）を使用して実行され、ランキングメトリックとしてのCDK19ノックダウン対対照のlog2倍数変化値、およびエンリッチメントのために試験された遺伝子セットとしてのHallmarks、CDK19KD-EnhancerUpおよびCDK19KD-EnhancerDOWNを使用した。
【０１６４】
Metascape分析：
CDK19KD-EnhancerUPの「コア」遺伝子とCDK19KD-EnhancerDOWNの「コア」遺伝子を使用した特徴遺伝子セットのMetascapeカスタムエンリッチメント分析（次のパラメーターを使用：入力種としてのH. Sapiens、0.01のp値カットオフ、および最小エンリッチメント1.5）をオンライン（www.metascape.org）で行った。
【０１６５】
統計解析：
結果を平均値±標準偏差として示す。統計計算は、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc）を使用して行った。分散は、F検定を使用して分析した。P値を決定するため、t検定を同分散集団で行い、ウェルチ補正付きのt検定を異なる分散のサンプルに適用した。動物実験では、サンプルサイズは事前に指定された効果サイズを検出するのに十分な検出力を確保するために事前に決定されず、分析から除外された動物はなく、実験は無作為化されておらず、研究者は実験中のグループ割り当てを知らされていなかった。
【０１６６】
４．２：実施例２-TNBCの増殖に不可欠な遺伝子の同定
TNBCの増殖に不可欠な遺伝子を同定するため、TNBC PDXであるPDX-T1の5000遺伝子をターゲットとする27,500shRNAライブラリーを使用して、2つのプールされたRNAiドロップアウト生存スクリーニングを行った（図１５）。スクリーニングは、インビトロでのオルガノイド培養として、およびインビボでのnod scidガンマ（NSG）マウスにおけるPDXとしての2つの異なるフォーマットで行われた（図１Ａ）。各実験試料およびベースライン参照試料における個々のshRNAの存在量は、shRNAバーコードのハイスループットシーケンスによって決定された。目標は、shRNAによるノックダウンがさまざまな実験条件でPDX腫瘍細胞の増殖を阻害する遺伝子を特定することであった。他の腫瘍におけるスクリーニングと一致して、インビボスクリーニングは、インビトロスクリーニング（図５Ｂ）と比較して、より有意なshRNAドロップアウト率を有した（図５Ａ）。図５Ａおよび５Ｂは、ベースライン試料におけるshRNA数に対するインビボ増殖実験試料（図５Ａ）およびインビトロ増殖実験試料（図５Ｂ）におけるshRNA数を示すグラフである。ルシフェラーゼを標的とする対照shRNA（薄い灰色のドット）とCDK19を標的とするshRNA（暗い灰色のドット）を強調表示してある。他のshRNAはすべて黒いドットで示してある（各実験は1回行った）。最終的な候補リストは、2つ以上のshRNAによってターゲットにされ、インビトロとインビボの両方で同定された、各スクリーニングで最低5％のshRNA比を持つ遺伝子に限定した（図５Ｃ）。これにより、46個の候補遺伝子が同定された（図５Ｄ）。
【０１６７】
癌ゲノムアトラス（TCGA）からのデータが他の乳癌サブタイプからの試料と比較してTNBC患者の試料でCDK19コピー数の増幅とmRNAのアップレギュレーションがより一般的である（23％）ことを示したため、CDK19を選択した（例えば、Cancer Genome Atlas Research, N.ら、The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nat Genet 45:1113-1120, 2013;FIG.6Aを参照）。さらに、高いCDK19発現は乳癌患者の再発のない生存率の低さと相関することが報告されている（例えば、Broudeら、Current cancer drug targets 15, 739-749, 2015およびPorterら、Proc Natl Acad Sci USA 109:13799-13804,2012を参照）。CDK19は、細胞周期の進行よりもRNAポリメラーゼII（RNAPII）転写の調節に関連すると言われているCDKファミリーのサブセットに属している。CDK19とそのパラログであるCDK8は、他の3つのタンパク質：MED12、MED13、およびサイクリンCと結合することにより、どちらもCDKモジュール（CKM）を形成できる。PDX細胞におけるCDK19の存在と核局在は、免疫蛍光法によって確認された（図６Ｂ）。図６Ａおよび６Ｂにおいて、パーセンテージは、トリプルネガティブ、HER2ポジティブ、エストロゲン受容体ポジティブ、およびすべての乳癌における、CDK19コピー数増幅またはCDK19 mRNAアップレギュレーションを伴う試料のパーセンテージを示す。分数は、各グループの陽性試料と合計試料の数を示す。データはcBioPortalから得た（例えば、Gaoら、Sci Signal 6, pl1, 2013を参照）。
【０１６８】
４．３：実施例３-CDK19ノックダウンの増殖阻害効果
CDK19ノックダウンの増殖阻害効果を検証するために、3つの一般的に使用されるTNBC細胞株：MDA-MB231、MDA-MB468、およびHS578Tを使用した。独立してCDK19を標的とする2つの異なるshRNA（shCDK19-1（配列番号1）およびshCDK19-2（配列番号2））を使用して、CDK19のノックダウンを確認した（図７Ａおよび７Ｂ）。図７Ａおよび７Ｂの両方の図について、CDK19ノックダウン細胞におけるCDK19の相対発現は、対照shRNAを形質導入した細胞におけるCDK19の平均発現に対して正規化される。各条件での遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてのベータアクチンに正規化される（**P<0.01;****P<0.0001、平均±標準偏差、（図７Ａおよび７Ｂ）n=3（図７Ｃ）n=2、実験は2回行った）。CDK19のノックダウンはまた、3つのすべてのTNBC細胞株において増殖の低下を引き起こすことも示した（図１Ｂ〜１Ｄ）。図１Ｂ〜１Ｄは、CDK19ノックダウンがTNBC細胞の生存を大幅に減少させたことを示している（MDA-MB231細胞の生存率、****P<0.0001（図１Ｂ）、MDA-MB468細胞、***P<0.001;****P<0.0001（図１Ｃ）、またはHS578T細胞、*P<0.05;****P<0.0001（図１Ｄ）；対照shRNAまたはCDK19標的shRNA（shCDK19-1、shCDK19-2）での形質導入の4日後に評価）。図１Ｂ〜１Ｄのすべての値は、対照shRNA試料に正規化された（平均±標準偏差、n=3、実験は2回行われ、P値は対応のないt検定によって決定された）。
【０１６９】
最初のドロップアウトスクリーニング（PDX-T1）で使用したのと同じTNBC PDXにおいて、CDK19ノックダウン（図７Ｃ）はまたオルガノイドコロニーの形成を阻害した（図１Ｅ）。図１Ｅにおいて、対照shRNAまたはCDK19標的shRNA（shCDK19-1、shCDK19-2）のいずれかによる形質導入の2週間後にコロニーをカウントした、***P<0.001（対応のないt検定）（平均±標準偏差、n=6、実験は2回行った）。非形質転換乳腺細胞におけるCDK19ノックダウンの効果を決定するため、ヒト乳腺上皮細胞（HMEC）にCDK19を標的とするshRNAを感染させた。HMECでは、2つのCDK19ノックダウンのどちらも細胞の生存率に影響を与えなかった（図１Ｆ）。図１Ｆにおいて、HMEC細胞の生存率を、対照shRNAまたはCDK19を標的とするshRNA（shCDK19-1、shCDK19-2）による形質導入の4日後に評価した。すべての値は対照shRNA試料に正規化され、nsはP>0.05である（平均±標準偏差、n=6、実験は2回行い、対応のないt検定によってP値を決定した）。まとめると、本研究は、インビトロでCDK19ノックダウンにより複数のTNBC細胞株の増殖とPDXオルガノイドコロニーの形成が阻害されるが、非形質転換乳腺上皮細胞の増殖には悪影響がないことを示す。
【０１７０】
本発明者らは、NSGマウスで増殖させた3つの異なるTNBC PDXでCDK19をノックダウンすることにより、より生理学的に適切なインビボシステムに研究を拡張した。これらのPDX：PDX-T1、PDX-T2、およびPDX-T3は、化学療法を受けていない患者から得られた（図１５）。これらの研究では、すべてのPDX腫瘍細胞を最初に緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識し、その後CDK19 shRNAまたは対照shRNAのいずれかに感染した細胞を赤色蛍光タンパク質（RFP）でさらに標識した。RFP陽性でもあるGFP標識腫瘍細胞の割合を測定することで、shRNAがPDX腫瘍細胞に及ぼす影響を判断できた。試験した2つのCDK19 shRNAのそれぞれで、CDK19ノックダウンにより、3つすべてのTNBC PDXからの腫瘍のRFP陽性細胞のパーセンテージが大幅に減少した（図１Ｇ〜１Ｉおよび図１Ｍ）。腫瘍の増殖をモニターし、腫瘍が17mmを超えたときに腫瘍を分析した。PDX-T1におけるRFP陽性細胞の割合***P<0.001;****P<0.0001（図１Ｇ）、PDX-T2における割合、****P<0.0001（図１Ｈ）、PDX-T3における割合、**P<0.01（図１Ｉ）、またはPDX-T4における割合、**P<0.01（図１Ｊ）はフローサイトメトリーによって決定され、100％に設定された対照shRNA試料の平均RFPパーセンテージに正規化された。各データポイントは1匹のマウスを表す。図１Ｈおよび１Ｈについては、平均±標準偏差、n=9、実験は3回行った。図１Ｉおよび１Ｊについては、平均±標準偏差、n=3、実験は1回行った。すべてについて、P値は対応のないt検定によって決定した）。
【０１７１】
図１Ｍは、対照shRNA（上段）、shCDK19-1（中段）、またはshCDK19-2（下段）で形質導入されたPDX-T1腫瘍の代表的な画像を示す。明視野画像（左の列）は肉眼的腫瘍の形態を示し、FITC画像（中央の列）はGFPで標識された腫瘍細胞を示し、Texas-Red画像（右の列）はRFPで標識されたshRNA形質導入細胞を示す。
【０１７２】
これらの結果は、CDK19がインビボでの腫瘍増殖に重要であることを確認した。CDK19ノックダウンは、形質導入された（RFP陽性）TNBC細胞がマウスにおいて肺に転移するのを防いだ。PDX-T1（図１Ｋ）またはPDX-T4（図１Ｌ）腫瘍異種移植片を有するマウスからのRFP陽性肺転移を有するマウスのパーセンテージを示す。RFP陽性の肺転移を有するマウスの数および各治療群のマウスの総数は、各状態の割合として示されている。PDX腫瘍細胞を、対照shRNAまたはCDK19を標的とするshRNA（shCDK19-1、shCDK19-2）のいずれかで形質導入した（図１Ｋについては、n=9、実験は3回行った；図１Ｉについては、n=3、実験は1回行った）。さらに、通常は肺に転移するPDX-T1では、CDK19ノックダウンにより、これら細胞による肺転移の検出が排除された（図１Ｋおよび図１Ｎ）。図１Ｎにおいて、明視野画像（左の列）は全体的な肺の形態を示し、FITC画像（中央の列）はGFPで標識された転移性腫瘍細胞を識別し、Texas-Red画像（右の列）はRFPで標識されたshRNA形質導入転移細胞を示す。本発明者らはまた、化学療法抵抗性の炎症性乳癌患者の脳転移から得られる悪性のPDXであるPDX-T4に対するCDK19ノックダウンの効果も試験した。炎症性乳癌は悪性であり、治療が困難であり、予後が極めて悪いことが知られているため、CDK19ノックダウンがこれらのマウスにおいてPDXの増殖（図１Ｊ）と肺転移の両方を阻害したことは注目に値する（図１Ｌおよび図７Ｄ）。これらのデータは、インビボでCDK19ノックダウンが原発腫瘍の増殖に影響を与えただけでなく、腫瘍転移も阻害したことを示している。
【０１７３】
４．４：実施例４-TNBC PDX内の腫瘍開始細胞（TIC）の同定
CDK19ノックダウンが、発癌性を評価するために一般的に使用される2つの独立したアッセイ（インビボでのPDX増殖とインビトロでのオルガノイドコロニー形成）で増殖を阻害し、腫瘍の開始に重要な遺伝子がしばしば癌のサブセットで増幅または過剰発現されるとすると、腫瘍開始細胞（TIC）はCDK19阻害に感受性があると仮定される。それゆえ、本発明者らは、TNBC PDX内のTICを同定しようとした。以前は、正常な乳房組織内および乳癌内の細胞亜集団を分離するのにEpCAMとCD49fが使用された。しかしながら、多くのTNBC PDXでは、EpCAMおよびCD49fはしばしば細胞を明確に別個の亜集団に分離することができない（図２Ａ、左）。したがって、本発明者らは、基底細胞マーカーであるCD10とEpCAMを併用して、乳癌PDXをFACSでソートした。本発明者らは、CD10およびEpCAMがPDX細胞を3つの異なる亜集団、EpCAMmed/high/CD10-/low、EPCAMlow/med/CD10low/+、およびEpCAM-/CD10-に分離できることを発見した（図２Ａ、右）。図２Ａにおいて、EpCAMとCD49fを使用して見られる大きな分離できない細胞集団（左）は、EpCAMとCD10を使用して3つの異なる亜集団になる（右）：EpCAMmed/high/CD10-/low（ゲート（1））、EPCAMlow/med/CD10low/+（ゲート（2））およびEpCAM-/CD10-（ゲート（3））。EpCAMおよびCD49fを使用したこれらの3つの亜集団の重複も示す（図８Ａ）。
【０１７４】
EpCAM/CD10で分離された3つの亜集団の腫瘍開始能力を試験するため、本発明者らは、インビトロでオルガノイドコロニー形成アッセイを行い、インビボで移植限界希釈アッセイ（LDA）を行った。オルガノイドコロニー形成アッセイでは、EpCAMmed/high/CD10-/low細胞は、EpCAMlow/medCD10low/+細胞よりも有意に多くのオルガノイドコロニーを形成した（図２Ｂ）。図２Ｂにおいて、EpCAMmed/high/CD10-/low細胞は、EPCAMlow/med/CD10low/+細胞よりも有意に多くのオルガノイドコロニーを形成した、*P<0.05（対応のないt検定）（平均±標準偏差、n=3、実験は2回行った）。NSGマウスで行われた移植アッセイでは、6つのすべてのPDXからのEpCAMmed/high/CD10-/low細胞の注入により、時にはわずか100細胞（PDX-T1およびPDX-T2）の移植で、一貫して腫瘍が形成された（図２Ｃ）。対照的に、EPCAMlow/med/CD10low/+細胞の移植は、2つのPDX（PDX-T1およびPDX-T2）でのみ、および多数の細胞（すなわち2500細胞）を移植した場合にのみ、腫瘍を形成した（図２Ｃ）。さらに、あらゆるPDXからのEpCAM-/CD10-細胞の移植からは腫瘍は形成されなかった。したがって、TICは、本発明者らが調査したすべてのPDX乳房腫瘍のEpCAMmed/high/CD10-/low亜集団で富んでいる。
【０１７５】
これらの異なる亜集団を同定したら、次に、本発明者らは、CDK19の発現が腫瘍形成性の低いEPCAMlow/med/CD10low/+細胞と比較して腫瘍形成性の高いEpCAMmed/high/CD10-/low細胞で濃縮されるかどうかを調べた。調べた4つのPDXのうち3つにおいて、CDK19の発現は、腫瘍形成性の低いEPCAMlow/med/CD10low/+細胞と比較して、腫瘍形成性の高いEpCAMmed/high/CD10-/low細胞で高かった（図２Ｄ〜２Ｇ）。図２Ｄ〜２Ｇのデータを生成するため、EPCAMlow/med/CD10low/+細胞およびEpCAMmed/high/CD10-/low細胞でのCDK19の相対発現をRT-qPCRで測定した。各条件での遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてのベータアクチンに正規化されている。CDK19の相対発現は、EPCAMlow/med/CD10low/+細胞におけるCDK19の平均発現に正規化される。*P<0.05（対応のないt検定）（PDX-T1：平均+標準偏差、n=2；PDX-T2：平均+標準偏差、n=6（EpCAMlow/med/CD10low/+）およびn=3（EpCAMmed/high/CD10-/low）；PDX-T3：平均+標準偏差、n=6（EpCAMlow/med/CD10low/+）およびn=3（EpCAMmed/high/CD10-/low）；PDX-T8：平均+標準偏差、n=3。すべての実験は少なくとも2回行った）。したがって、CDK19は本発明者らが調べたすべてのPDX腫瘍で発現されたが、本発明者らが調べた4つの腫瘍のうち3つにおいて、より腫瘍形成性の高いEpCAMmed/high/CD10-/low亜集団で高レベルで発現された。
【０１７６】
CDK19ノックダウンの設定における腫瘍開始頻度を決定するため、本発明者らは、ドキシサイクリン誘導性CDK19ノックダウン構築物で形質導入したPDX-T1細胞を使用してLDAを行い、CDK19発現を制御できるinducCDK19KD-PDX-T1細胞を生成した（図８Ｂ）。図８Ｂにおいて、ドキシサイクリン処理されたinducCDK19KD-PDX-T1細胞におけるCDK19の相対発現は、対照inducCDK19KD-PDX-T1細胞におけるCDK19の平均発現に対して正規化される。各条件での遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてのベータアクチンに正規化される（*P<0.05、平均±標準偏差、n=2、実験は2回行った）。ドキシサイクリン（+Dox）の存在下でのinducCDK19KD-PDX-T1細胞のインビボ移植を、ドキシサイクリンなし（No Dox）のinducCDK19KD-PDX-T1細胞と比較することにより、本発明者らは、CDK19ノックダウンにより、調べたすべての細胞移植条件で腫瘍形成が排除されることを見出した（図８Ｃ）。inducCDK19KD-PDX-T1細胞をNSGマウスの乳房脂肪体に50、250、1250細胞で注入した。ドキシサイクリン群のマウスには、CDK19 shRNAを誘導するためのドキシサイクリン含有の齧歯類餌を与え、一方、対照群のマウスには通常の齧歯類餌を与えた。腫瘍は、腫瘍の触診により検出した。形成された腫瘍の数および実施された注射の数を各集団について示す。腫瘍が形成された集団および注射は、図８Ｃにおいて太字で示してある（n=5/群）。ELDAを使用して、本発明者らは、腫瘍開始頻度が対照（No Dox）群における342細胞に1つ（95％CI：828に1つから142に1つ）からCDK19ノックダウン（+Dox）群における∞細胞に1つ（95％CI：∞に1つから2587に1つ）に有意に減少することを見出した（図８Ｄ）。CDK19ノックダウンによって引き起こされる腫瘍開始頻度の有意な減少と、TIC亜集団におけるCDK19のより高い発現との両方は、TIC阻害が、CDK19ノックダウンで観察される腫瘍増殖の障害の原因である可能性が高いことを示唆している。
【０１７７】
４．５：実施例５-CDK19によって制御される遺伝子および経路の同定
CDK19とそのよく説明されているパラログであるCDK8との間には84％のアミノ酸配列相同性がある（図９）。CDK8は、結腸癌、急性骨髄性白血病、および黒色腫などのさまざまな悪性腫瘍に役割を果たすことが示されている。CDK8の高発現は、結腸癌の予後不良と関連している（Firesteinら、Nature 455:547-551, 2008）。胚性幹細胞におけるCDK8ノックアウトは、多能性幹細胞の表現型におけるその本質的な役割により、胚発生を防止することが示された（Porterら、Proc Natl Acad Sci USA, 109:13799-13804, 2012）。CDK8の既知の癌関連の活性には、Wnt/β-カテニン経路の正の調節、成長因子誘導転写、およびTGFPシグナル伝達が含まれる。状況に応じて、CDK8は転写を負または正に制御することも示されている。しかしながら、最近の証拠は、CDK19がCDK8とは異なって機能することが示唆されている。CDK19とCDK8とが他のCKM成員への結合に相互に排他的に関与することをインビトロ研究が示したのに対し、子宮頸癌および結腸癌の細胞株での遺伝子ノックダウン研究は、CDK19とCDK8とが異なる遺伝子を制御することを示した。本発明者らの目標は、TNBCにおいて、CDK19またはCDK8の標的ノックダウンから生じる包括的な遺伝子発現の変化を調べることにより、CDK19およびCDK8が異なる生物学的機能を持っているかどうかを調べることであった。
【０１７８】
TNBCにおいてCDK19の分子標的がCDK8とは異なるかどうかを理解するため、本発明者らは、MDA-MB231の各遺伝子をノックダウンし、対照に対する各遺伝子発現の変化を調べた。全体として、CDK19ノックダウンは3909遺伝子に影響を与え、CDK8ノックダウンは4233遺伝子に影響を与えた（図３Ａ）。しかしながら、CDK19ノックダウン実験では、アップレギュレーションされた遺伝子の12％とダウンレギュレーションされた遺伝子の5％のみが、CDK8ノックダウンの影響も受けた。このことは、CDK19およびCDK8が異なる遺伝子を主に制御していることを示唆した（図３Ａ）。
【０１７９】
CDK19およびCDK8ノックダウン遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）により、最もアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた遺伝子の中で濃縮された特徴遺伝子セットを同定することができた（図３Ｂおよび図１０）。図１０において、CDK19またはCDK8のノックダウンで独自に濃縮された特徴遺伝子セットは黒で示され、CDK19とCDK8の両方のノックダウンで濃縮されたものは「*」でマークされ、CDK19とCDK8のノックダウン間で反対方向に発現する遺伝子によって濃縮されたものは「**」でマークされている。正規化されたエンリッチメントスコアおよびFDRq値は、GSEAソフトウェアによって決定される。<0.25のFDRカットオフを使用して、重要な特徴を選択した。これらの特徴遺伝子セットは、特定の生物学的状態または経路に特に関与する遺伝子で構成されている。有糸分裂（E2F標的、G2Mチェックポイント、有糸分裂紡錘体）、PI3K-AKT-MTORシグナル伝達、MYC経路（Myc標的v1）、解糖、アポトーシス、および酸化的リン酸化などの既知の乳癌関連の特徴に関連する遺伝子が、CDK19およびCDK8ノックダウンによって同じ方向に変化し（図３Ｂ、中央重複領域）、CDK19とCDK8との間の共制御関係を示す。さらに、早期のエストロゲン応答、上皮から間葉への移行（EMT）、コレステロールのホメオスタシス、MYC経路（Myc標的v2）、インターフェロンα応答、および脂肪酸代謝に関連する遺伝子は、CDK19によるノックダウンに応答して、CDK8と比べて反対方向に変化したが（図３Ｂ、囲み）、これはCDK19とCDK8との間に逆制御関係が存在することを示唆している。CDK8ノックダウンと比較してCDK19ノックダウンにより反対方向に遺伝子発現によって濃縮された特徴遺伝子セットは、囲んである。多くの特徴遺伝子セットは、CDK19ノックダウンのために独自に変化した遺伝子のみが濃縮されていた（図３Ｂ、左側の領域）。これらの遺伝子セットによって反映される特徴には、P53シグナル伝達、KRASシグナル伝達、アンドロゲン応答、NOTCHシグナル伝達、TGFベータシグナル伝達、およびIL6-JAK-STAT3シグナル伝達が含まれ、これらはTNBCの標的療法の潜在的な生物学的経路である。これらの生物学的経路はすべて、TNBCの標的療法の評価における臨床調査の活発な分野を表している。本発明者らの知見と一致して、コレステロールのホメオスタシス、P53シグナル伝達、有糸分裂、NFκB経路など、本発明者らのCDK19ノックダウン実験で富んでいると見出された多くの経路は、以前に他の細胞型でもCDK19によって制御されることが示されている。
【０１８０】
要約すると、これらの分析は、CDK19とCDK8とが特定の経路を共制御する一方で、他の経路を逆制御する可能性があることを示した。さらに、CDK19は、CDK8と同様、生物学的経路を正または負に制御することができる。CDK19によって規制される臨床的に関連のあるTNBC経路が多数あることは、CDK19をターゲットにすると、同時に複数の経路を調節する機会を提供でき、それと同時にCDK19の有利な限定された組織分布のために潜在的な毒性を回避できることを示唆している。このアプローチは、TNBCで一般的に見られる単剤療法への抵抗を克服し、P53やMYCが関与するような「ドラッグできない（undruggable）」プロセスのターゲティングを可能にするであろう。
【０１８１】
４．６：実施例６-CDK19およびCDK8がエピジェネティックな変更に及ぼす影響
最近の研究では、ヒストン3リジン27アセチル化（H3K27Ac）でマークされる、エンハンサー（「スーパーエンハンサー」とも呼ばれる）の大きなクラスターで作用することにより重要な発癌性遺伝子の転写を調節する上で、CDK19とCDK8、およびその他の転写CDK（CDK7、CDK12/CDK13）の役割が強調されている。この遺伝子調節の正確なメカニズムは不明であるが、一部は、RNAPII-メディエーター相互作用を調節するメディエーターとのCKMの相互作用を介して、および一部は、RNAPIIのC末端ドメインのセリン残基をリン酸化することによって生じると考えられている。エンハンサーで機能する転写CDKの傾向を考慮して、本発明者らは、CDK19およびCDK8が、遺伝子発現を制御するメカニズムとしてエンハンサー部位でのエピジェネティックな修飾を調節できるかどうかを調べたいと考えた。他のシグナル伝達経路を介したエンハンサー修飾は同定されているが、この遺伝子制御のメカニズムはCDKについては未だ報告されていない。
【０１８２】
エピジェネティック制御におけるCDK19の役割を調べるため、H3K27Ac修飾に対するクロマチン免疫沈降およびシーケンシング（CHIP-Seq）を3つの異なる条件下でMDA-MB231細胞に対して行った：対照（空のベクター形質導入）、CDK19ノックダウン、およびCDK8ノックダウン。すべてのH3K27Ac修飾領域のゲノム全体の分析は、CDK19ノックダウンとCDK8ノックダウンの両方が、対照と比較して同様の全体的なH3K27Acレベルを持つことを示した（図１１）。図１１において、識別されたすべてのH3K27Acピーク領域にわたるH3K27Ac CHIP-Seqシグナルは1-Kbに正規化され、それらの領域の中央に集中している。隣接する2Kb領域のシグナルも示してある。相対的なシグナルの変化を比較するため、各領域の中心の周りにある各50ベースのウィンドウ1-Kbのシグナルを合計することにより、各生物学的複製の合計シグナルを決定した。各試料の合計CHIP-Seqシグナル間のP値は、対応のないt検定によって決定した。対照と比較したCDK19ノックダウンにおけるH3K27Acレベルの比較分析により、本発明者らは、H3K27Acシグナルが増加した3034のピーク領域（All-H3K27UP）とH3K27Acシグナルが減少した502のピーク領域（All-H3K27DOWN）を同定した。対照と比較してCDK8ノックダウンでも異なるピーク領域を除外することにより、本発明者らは、CDK19ノックダウンに固有の、H3K27Acシグナルが増加した2309のピーク領域（CDK19KD-H3K27UP）とH3K27Acシグナルが減少した432の領域（CDK19KD-H3K27DOWN）を同定した。CDK19に対するこれらの領域の特異性は、CDK19ノックダウン、CDK8ノックダウン、および対照におけるこれらの領域でのH3K27Acレベルを比較することによって調べた。対照と比較して、CDK19KD-H3K27UP領域全体のH3K27Acレベルのエンリッチメント（図３Ｃ）およびCDK19KD-H3K27DOWN領域全体のH3K27Acレベルの減少（図３Ｄ）は、CDK19ノックダウンでのみ有意であり、CDK8ノックダウンでは有意ではなかった。図３Ｃおよび３Ｄにおいて、***P<0.001；nsはP>0.05である（すべての試料n=3、実験は3回行った）。CDK19KD-H3K27AcUPまたはCDK19KD-H3K27AcDOWN領域のH3K27Ac CHIP-Seqシグナルは、1-Kbに正規化され、これらの領域の中央に集中している。隣接する2Kb領域のシグナルも示してある。相対的なシグナルの変化を比較するため、各領域の中心の周りにある各50ベースのウィンドウ1-Kbのシグナルを合計することにより、各生物学的複製の合計シグナルを決定した。各試料の合計CHIP-Seqシグナル間のP値は、対応のないt検定によって決定した。したがって、CDK19KD-H3K27UPおよびCDK19KD-H3K27DOWNは、H3K27AcシグナルがCDK8のノックダウンと比較してCDK19のノックダウンに対してより特異的で最も感受性のピーク領域を定める。
【０１８３】
本発明者らは、次に、CDK19ノックダウンの結果としてのH3K27Acレベルの増加または減少が遺伝子出力の変化に対応するかどうかを評価した。このため、以前に定義されたAll-H3K27UPおよびAll-H3K27DOWNピーク領域に、最も近い遺伝子への近接性によって注釈を付け、さらなる分析のため2つの遺伝子セット：CDK19KD-EnhancerUP（1593遺伝子）およびCDK19KD-EnhancerDOWN（341遺伝子）を確立した（表1および表2）。これらの遺伝子セットと本発明者らのCDK19ノックダウン遺伝子発現データのGSEAは、CDK19ノックダウンによって最もアップレギュレーションされた遺伝子は、CDK19KD-EnhancerUP遺伝子（NES1.68、FDR q値=0.000）（図３Ｅ）に富んでいるのに対し、CDK19ノックダウンによって最もダウンレギュレーションされた遺伝子は、CDK19KD-EnhancerDOWN遺伝子（NES-1.84、FDR q値=0.000）に富んでいる（図３Ｆ）ことを示した。したがって、CDK19ノックダウンの結果として、遺伝子の推定エンハンサー要素でのH3K27Acシグナルへの摂動は、遺伝子発現の変化とよく相関し、予想される方向にあった。
【０１８４】
表１：
2020534354.tif 000003
【０１８５】
2020534354.tif 000004
【０１８６】
表２：
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
2020534354.tif 000009
【０１９１】
2020534354.tif 000010
【０１９２】
前記GSEAにより、各エンリッチメントに最も貢献する最先端の「コア」遺伝子を同定することもできた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。これらの「コア」遺伝子では、CDK19ノックダウンによるH3K27Acエンハンサーシグナルの違い（図１３Ａ〜１３Ｄ）により、遺伝子発現において対応する大きな変化となる（図１３Ｅ）。ELF3（図１３Ａ）およびETV7（図１３Ｂ）遺伝子座での遺伝子トラックは、CDK19ノックダウン試料におけるH3K27Acシグナルのエンリッチメントを示し、一方、CHI3L2（図１３Ｃ）およびCRTAM（図１３Ｄ）遺伝子座での遺伝子トラックは、対照試料におけるH3K27Acシグナルのエンリッチメントを示す。上のトラックは対照試料を示し、下のトラックはCDK19ノックダウン試料を示す。灰色のバーは、対照試料とCDK19ノックダウン試料の間で異なる（FDR<0.05）ことがDiffBindによって識別された領域を示す。次にMetascape分析を使用して、CDK19KD-EnhancerUPの「コア」遺伝子とCDK19KD-EnhancerDOWNの「コア」遺伝子内に富んでいる特徴遺伝子セットを評価した。CDK19KD-EnhancerUPの「コア」遺伝子内では、早期のエストロゲン応答（p値=8.72e-5）および上皮間葉細胞分化転換（p値=1.08e-3）が富んでいると識別された特徴であった（図３Ｇ、暗い灰色のバー）。同様に、CDK19KD-EnhancerDOWNの「コア」遺伝子内では、アンドロゲン応答（p値=1.89e-3）が富んでいることがわかった（図３Ｇ、薄い灰色のバー）。したがって、早期のエストロゲン応答、上皮間葉細胞分化転換、およびアンドロゲン応答の遺伝子セット内の遺伝子のサブセット（図３Ｇ）は、H3K27Acエンハンサーシグナルに変化があり、遺伝子発現において対応する強い変化がある。これらの遺伝子は、各特徴遺伝子セット中の全遺伝子のごく一部（5-10％）を構成するが、CDK19が遺伝子転写をエピジェネティックに調節できるこれらの生物学的プロセス内の主要な遺伝子を強調している。
【０１９３】
４．７：実施例７-事前に確立されたオルガノイドの増殖に対するCDK19ノックダウンの影響
本発明者らは、CDK19ノックダウンが事前に確立されたオルガノイドのインビトロでの増殖と事前に確立されたPDX腫瘍にインビボで及ぼす影響を調べた。これは、患者の既存の腫瘍の治療をモデル化することを目的としていた。インビトロでは、（CDK19 shRNAを誘導するために）ドキシサイクリンを処理群に加えると、対照（ドキシサイクリンなし）と比較して、事前に確立されたオルガノイドの数が有意に減少した（図４Ａおよび４Ｂ）。図４Ａおよび４Ｂにおいて、ドキシサイクリン処理を開始した後の0日目（図４Ａ）および16日目（図４Ｂ）でのオルガノイドコロニーの数を示す、****P<0.0001；nsはP>0.05（平均±標準偏差、n=6、実験は2回行った、P値は対応のないt検定によって決定した）。インビボでは、事前に確立されたinducCDK19KD-PDX-T1またはinducCDK19KD-PDX-T3（ドキシサイクリン誘導性CDK19ノックダウン構築物で形質導入されたPDX-T3細胞）腫瘍を有するマウスにドキシサイクリンを給餌すると、これらの腫瘍の増殖に有意な影響を与えた（図４Ｃおよび４Ｄ）。図４Ｃおよび４Ｄにおいて、ドキシサイクリン給餌NSGマウスおよび対照NSGマウスにおける事前に確立された腫瘍の増殖を示す：inducCDK19KD-PDX-T1、****P<0.0001；***P<0.001（平均±標準偏差、n=5、実験は2回行った、P値は対応のないt検定によって決定した）（図４Ｃ）およびinducCDK19KD-PDX-T3、****P<0.0001；***P<0.001（平均±標準偏差、n=5、実験は1回行った、P値は対応のないt検定によって決定した）（図４Ｄ）。CDK19 shRNA誘導腫瘍は、対照腫瘍と比較した場合、inducCDK19KD-PDX-T1腫瘍では最終的に82％小さく、inducCDK19KD-PDX-T3腫瘍では38％小さかった（図４Ｃおよび４Ｄ）。inducCDK19KD-PDX-T1実験およびinducCDK19KD-PDX-T3実験の両方において、マウスの総体重は、処理群と対照群との間で有意差はなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。最後に、生存研究は、PDX-T1腫瘍が対照shRNAで形質導入されたマウスと比較してPDX-T1腫瘍がCDK19 shRNAで形質導入されたマウスにおいて全生存が有意に長かったことを示した（図４Ｅ）。図４Ｅに示すのは、対照shRNA（黒線）、shCDK19-1（実線灰色）またはshCDK19-2（破線灰色）で形質導入されたPDX-T1異種移植片を移植されたマウスのカプランマイヤー生存曲線である。マウスを腫瘍の直径を毎週測定して追跡した。腫瘍の最長径が17mmを超えたときにマウスを屠殺した。shCDK19-2群の2匹のマウスはPDX腫瘍を発症せず、実験の終わりに屠殺した。これらのマウスは、shCDK19-2群の生存曲線を作成するときに打ち切られた、***P<0.001（n=9、実験は3回行った、ログランク（Mantel-Cox）検定を用いてP値を決定した）。要約すると、これらの実験は、事前に確立された腫瘍であっても、CDK19の特異的なノックダウンは腫瘍の増殖を有意に減少させること、およびCDK19ノックダウンはマウスの生存を延長できることを示した。
【０１９４】
４．８：実施例８-事前に確立されたPDX腫瘍に対するCCT251921の影響
CDK19標的療法の使用を臨床的にモデル化するため、本発明者らは、CDK19および密接に関連するパラログCDK8の両方の経口で生物学的に利用可能な阻害剤であるCCT251921（図４Ｆ）で、事前に確立されたPDX腫瘍を有するマウスを処置した。PCT-T1腫瘍は、CCT251921またはビヒクルの毎日の経口投与（30mg/kg）を開始する前に、マウスで事前に確立された。CCT251921による処置は、14日目までに腫瘍増殖の有意な減少をもたらした（図４Ｇ）。CCT251921で処置されたマウスにおける腫瘍の最終的な容積は、ビヒクルで処置されたマウスの腫瘍よりも30％以上小さかった（図４Ｇ）。事前に確立されたPDX-T1異種移植腫瘍を有するNSGマウスを、CCT251921またはビヒクルの毎日の強制経口投与で処置した。マウスを週に2回、腫瘍容積を測定して追跡した、****P<0.0001；***P<0.001（平均±標準偏差、n=5、実験は1回行った、P値は対応のないt検定で決定した）。CCT251921コホートおよびビヒクルコホートの両方のマウスは全体的な体重減少を被ったが、これは2群間で有意差はなく、おそらくそれらの摂食習慣に対する毎日の強制経口投与の影響によるものであった（図１４Ｃ）。遺伝子のノックダウンと化学的阻害とで異なる生物学的結果が生じる可能性があることはよく知られている。本発明者らは、本実施例において、CDK19キナーゼ活性の化学的阻害が、ノックダウン研究で示されたCDK19の総損失の影響を再現できることを、事前に確立された腫瘍で示す。
【０１９５】
本発明者らのデータから、本発明者らは、CDK19が複数の癌関連経路を調節すること、およびCDK19がTICの潜在的な治療標的であることを結論付ける。したがって、CDK19阻害は、CDK8、CDK9、およびBRD4などの転写補因子を標的とする治療戦略と、TICおよびその自己複製経路、例えば、Hedgehog、Wnt/β-カテニン、およびNotchなどを標的とする治療戦略との両方に有用である。しかしながら、一部の治療アプローチは、正常な細胞に対する毒性によって制限される場合がある。これは、正常な組織における転写補因子の遍在的な発現、および正常な幹細胞における自己複製経路の重要性に起因する。例えば、BRD4阻害は、マウスの複数の臓器における組織ホメオスタシスの破壊をもたらした。同様に、狭い治療指数の課題により、これまでのところ、Hedgehog、Notch、およびWnt経路阻害剤の臨床的成功は限られている。CDK19の生物学は、治療標的としての潜在的な利点を示している。CDK19は、そのパラログCDK8、CDK9、およびBRD4などの他の遍在する転写補因子と比較して、組織分布がより限定されており（例えば、Tsutsuiら、Genes to cells:devoted to molecular & cellular mechanisms 16:1208-1218, 2011参照）、CDK19阻害による毒性が限られる可能性があるが、CDK8、CDK9、およびBRD4のノックアウトは致命的である（例えば、Brownら、Mamm Genome 23:632-640, 2012;Westerling, Molecular and Cellular Biology 27:6177-6182, 2007;およびHouzelsteinら、Molecular and Cellular Biology 22, 3794-3802, 2002参照）。さらに、組織におけるCDK19の限られた発現は、治療ウィンドウを広げ、NOTCHなどの幹細胞経路の本来なら毒性の阻害を可能にするか、G2/Mチェックポイントなどの重要なプロセスを可能にする。CDK19の小分子阻害が障害されたPDX増殖を示す本発明者らの研究は、TNBCにおいてCDK19を治療的に標的とする可能性を確認している。
【０１９６】
５．参考文献
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【０１９７】
前記発明は、明確化および理解の目的である程度詳細に記載したが、当業者は、この開示に精通すると、添付の特許請求の範囲における本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細の様々な変更を加えることができることを理解するであろう。したがって、本発明は、上記の方法論または構成の正確な要素または詳細に限定されるものではない。プロセス自体に必要なまたは固有の範囲を除いて、図を含む本開示に記載される方法またはプロセスの工程または段階に対する特定の順序は、意図または暗示されない。多くの場合、プロセスの工程の順序は、記載されている方法の目的、効果、または取込みを変更することなく変えてよい。
【０１９８】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許文献は、そのような各刊行物または文献が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献（特許、公開された特許出願、および未公開の特許出願）の引用は、そのような文献が関連する先行技術であることの承認として意図されておらず、その内容または日付に関する承認を構成するものでもない。
【０１９９】
CDK19転写変異体1（NM_015076.4）（配列番号12）：
1 tgtggccgcc gaggagtccc ttgctgaagg cggaccgcgg agcggcgggc ggcgggcggc
61 gcgcgcgcgc gcgcgagagg cggctgttgg agaagtggag cggcggtcgc ggggggagga
121 ggaggaggga ctgagcggcg gcggcccccg cgtcccgtgc ctctatgggg gaagcagaca
181 atggattatg atttcaaggc gaagctggcg gcggagcggg agcgggtgga ggatttgttt
241 gagtacgaag ggtgcaaagt gggacgcggc acctacggtc acgtctacaa ggcgaggcgg
301 aaagatggaa aagatgaaaa ggaatatgca ttgaagcaaa ttgaaggcac aggaatatcc
361 atgtcggctt gtagagagat tgcacttttg cgagaattga agcaccctaa tgtgattgca
421 ttgcagaagg tgttcctttc tcacagtgac aggaaggtat ggctgctgtt tgattatgca
481 gagcatgact tgtggcatat tattaagttt caccgtgcat caaaagcaaa taaaaagccc
541 atgcagttgc caagatctat ggttaaatcc ttactttacc agattcttga tggtatccat
601 tacctccatg caaattgggt gcttcacaga gacttgaaac cagcaaatat cctagtaatg
661 ggagaaggtc ctgagagggg gagagtcaaa atagctgaca tgggttttgc cagattattc
721 aattctcctc taaagccact agcagatttg gatccagtag ttgtgacatt ttggtatcgg
781 gctccagaac ttttgcttgg tgcaaggcat tatacaaagg ccattgatat atgggcaata
841 ggttgtatat ttgctgaatt gttgacttcg gaacctattt ttcactgtcg tcaggaagat
901 ataaaaacaa gcaatccctt tcatcatgat caactggatc ggatatttag tgtcatgggg
961 tttcctgcag ataaagactg ggaagatatt agaaagatgc cagaatatcc cacacttcaa
1021 aaagacttta gaagaacaac gtatgccaac agtagcctca taaagtacat ggagaaacac
1081 aaggtcaagc ctgacagcaa agtgttcctc ttgcttcaga aactcctgac catggatcca
1141 accaagagaa ttacctcgga gcaagctctg caggatccct attttcagga ggaccctttg
1201 ccaacattag atgtatttgc cggctgccag attccatacc ccaaacgaga attccttaat
1261 gaagatgatc ctgaagaaaa aggtgacaag aatcagcaac agcagcagaa ccagcatcag
1321 cagcccacag cccctccaca gcaggcagca gcccctccac aggcgccccc accacagcag
1381 aacagcaccc agaccaacgg gaccgcaggt ggggctgggg ccggggtcgg gggcaccgga
1441 gcagggttgc agcacagcca ggactccagc ctgaaccagg tgcctccaaa caagaagcca
1501 cggctagggc cttcaggcgc aaactcaggt ggacctgtga tgccctcgga ttatcagcac
1561 tccagttctc gcctgaatta ccaaagcagc gttcagggat cctctcagtc ccagagcaca
1621 cttggctact cttcctcgtc tcagcagagc tcacagtacc acccatctca ccaggcccac
1681 cggtactgac cagctcccgt tgggccaggc cagcccagcc cagagcacag gctccagcaa
1741 tatgtctgca ttgaaaagaa ccaaaaaaat gcaaactatg atgccattta aaactcatac
1801 acatgggagg aaaaccttat atactgagca ttgtgcagga ctgatagctc ttctttattg
1861 acttaaagaa gattcttgtg aagtttcccc agcacccctt ccctgcatgt gttccattgt
1921 gacttctctg ataaagcgtc tgatctaatc ccagcacttc tgtaaccttc agcatttctt
1981 tgaaggattt cctggtgcac ctttctcatg ctgtagcaat cactatggtt tatcttttca
2041 aagctctttt aataggattt taatgtttta gaaacaggat tccagtggtg tatagtttta
2101 tacttcatga actgatttag caacacaggt aaaaatgcac cttttaaagc actacgtttt
2161 cacagacaat aactgttctg ctcatggaag tcttaaacag aaactgttac tgtcccaaag
2221 tactttacta ttacgttcgt atttatctag tttcagggaa ggtctaataa aaagacaagc
2281 ggtgggacag agggaaccta caaccaaaaa ctgcctagat ctttgcagtt atgtgcttta
2341 tgccacgaag aactgaagta tgtggtaatt tttatagaat cattcatatg gaactgagtt
2401 cccagcatca tcttattctg aatagcattc agtaattaag aattacaatt ttaaccttca
2461 tgtagctaag tctaccttaa aaagggtttc aagagctttg tacagtctcg atggcccaca
2521 ccaaaacgct gaagagagta acaactgcac taggatttct gtaaggagta attttgatca
2581 aaagacgtgt tacttccctt tgaaggaaaa gtttttagtg tgtattgtac ataaagtcgg
2641 cttctctaaa gaaccattgg tttcttcaca tctgggtctg cgtgagtaac tttcttgcat
2701 aatcaaggtt actcaagtag aagcctgaaa attaatctgc ttttaaaata aagagcagtg
2761 ttctccattc gtatttgtat tagatataga gtgactattt ttaaagcatg ttaaaaattt
2821 aggttttatt catgtttaaa gtatgtatta tgtatgcata attttgctgt tgttactgaa
2881 acttaattct atcaagaatc tttttcattg cactgaatga tttcttttgc ccctaggaga
2941 aaacttaata attgtgccta aaaactatgg gcggatagta taagactata ctagacaaag
3001 tgaatatttg catttccatt atctatgaat tagtggctga gttctttctt agctgcttta
3061 aggagcccct cactccccag agtcaaaagg aaatgtaaaa acttagagct cccattgtaa
3121 tgtaaggggc aagaaatttg tgttcttctg aatgctacta gcagcaccag ccttgtttta
3181 aatgttttct tgagctagaa gaaatagctg attattgtat atgcaaatta catgcatttt
3241 taaaaactat tctttctgaa cttatctacc tggttatgat actgtgggtc catacacaag
3301 taaaataaga ttagacagaa gccagtatac attttgcact attgatgtga tactgtagcc
3361 agccaggacc ttactgatct cagcataata atgctcacta ataatgaagt ctgcatagtg
3421 acactcatca agactgaaga tgaagcaggt tacgtgctcc attggaagga gtttctgata
3481 gtctcctgct gttttacccc ttccattttt taaaataaga aattagcagc cctctgcata
3541 atgtagctgc ctatatgcag ttttatcctg tgccctaaag cctcactgtc cagagctgtt
3601 ggtcatcaga tgcttattgc accctcacca tgtgcctggt gccctgctgg gtagagaaca
3661 cagaggacag ggcatacttc ttgtccttaa ggagcttgtg atctgtgaca gtaagccctc
3721 ctgggatgtc tgtgccatgt gattgactta caagtgaaac tgtcttataa tatgaaggtc
3781 tttttgttta cttctaaacc cacttgggta gttactatcc ccaaatctgt tctgtaaata
3841 atattatgga agggtttcta tgtcagtcta ccttagagaa agccagtgat tcaatatcac
3901 aaaaggcatt gacgtatctt tgaaatgttc acagcagcct tttaacaaca actgggtggt
3961 ccttgtaggc agaacatact ctcctaagtg gttgtaggaa attgcaagga aaatagaagg
4021 tctgttcttg ctctcaagga ggttaccttt aataaaagaa gacaaaccca gatagatatg
4081 taaaccaaaa tactatgccc cttaatactt tataagcagc attgttaaat agttcttacg
4141 cttatacatt cacagaacta ccctgttttc cttgtatata atgacttttg ctggcagaac
4201 tgaaatataa actgtaaggg gatttcgtca gttgctccca gtatacaata tcctccagga
4261 catagccaga aatctccatt ccacacatga ctgagttcct atccctgcac tggtactggc
4321 tcttttctcc tctttccttg cctcagggtt cgtgctaccc actgattccc tttaccctta
4381 gtaataattt tggatcattt tctttccttt aaaggggaac aaagcctttt ttttttttga
4441 gacggagtgt tgctctgtca cccaagctgg agtgcagtgg cacgatcttg gctcactcca
4501 acctccacct tccaggttca agtgattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta
4561 cgggcacgca ccaccacgtc tggctaattt ttgtattttt agtagagatg gggtttcacc
4621 ctattggtca ggctggtctt gaattcctca cctcaggtca tccgcctgtc tcggcctccc
4681 gaagtgctgg gattataggt gtgagccacc gcacccagtt gggaacaaag cctttttaac
4741 acacgtaagg gccctcaaac cgtgggacct ctaaggagac ctttgaagct ttttgagggc
4801 aaactttacc tttgtggtcc ccaaatgatg gcatttctct ttgaaattta ttagatactg
4861 ttatgtcccc caagggtaca ggaggggcat ccctcagcct atgggaacac ccaaactagg
4921 aggggttatt gacaggaagg aatgaatcca agtgaaggct ttctgctctt cgtgttacaa
4981 accagtttca gagttagctt tctggggagg tgtgtgtttg tgaaaggaat tcaagtgttg
5041 caggacagat gagctcaagg taaggtagct ttggcagcag ggctgatact atgaggctga
5101 aacaatcctt gtgatgaagt agatcatgca gtgacataca aagaccaagg attatgtata
5161 tttttatatc tctgtggttt tgaaacttta gtacttagaa ttttggcctt ctgcactact
5221 cttttgctct tacgaacata atggactctt aagaatggaa agggatgaca tttacctatg
5281 tgtgctgcct cattcctggt gaagcaactg ctacttgttc tctatgcctc taaaatgatg
5341 ctgttttctc tgctaaaggt aaaagaaaag aaaaaaatag ttggaaaata agacatgcaa
5401 cttgatgtgc ttttgagtaa atttatgcag cagaaactat acaatgaagg aagaattcta
5461 tggaaattac aaatccaaaa ctctatgatg atgtcttcct agggagtaga gaaaggcagt
5521 gaaatggcag ttagaccaac agaggcttga aggattcaag tacaagtaat attttgtata
5581 aaacatagca gtttaggtcc ccataatcct caaaaatagt cacaaatata acaaagttca
5641 ttgttttagg gtttttaaaa aacgtgttgt acctaaggcc atacttactc ttctatgcta
5701 tcactgcaaa ggggtgatat gtatgtatta tataaaaaaa aaaaccctta atgcactgtt
5761 atctcctaaa tatttagtaa attaatacta tttaattttt ttaaagattt gtctgtgtag
5821 acactaaaag tattacacaa aatctggact gaaggtgtcc tttttaacaa caatttaaag
5881 tactttttat atatgttatg tagtatatcc tttctaaact gcctagtttg tatattccta
5941 taattcctat ttgtgaagtg tacctgttct tgtctctttt ttcagtcatt ttctgcacgc
6001 atcccccttt atatggttat agagatgact gtagcttttc gtgctccact gcgaggtttg
6061 tgctcagagc cgctgcaccc cagcgaggcc tgctccatgg agtgcaggac gagctactgc
6121 tttggagcga gggtttcctg cttttgagtt gacctgactt ccttcttgaa atgactgtta
6181 aaactaaaat aaattacatt gcatttattt tatattcttg gttgaaataa aatttaattg
6241 actttg
【０２００】
CDK19転写変異体2（NM_001300960.1）（配列番号13）：
1 tgtggccgcc gaggagtccc ttgctgaagg cggaccgcgg agcggcgggc ggcgggcggc
61 gcgcgcgcgc gcgcgagagg cggctgttgg agaagtggag cggcggtcgc ggggggagga
121 ggaggaggga ctgagcggcg gcggcccccg cgtcccgtgc ctctatgggg gaagcagaca
181 atggattatg atttcaaggc gaagctggcg gcggagcggg agcgggtgga ggatttgttt
241 gagtacgaag ggtgcaaagt gggacgcggc acctacggtc acgtctacaa ggcgaggcgg
301 aaagatggaa aagatgaaaa ggaatatgca ttgaagcaaa ttgaaggcac aggaatatcc
361 atgtcggctt gtagagagat tgcacttttg cgagaattga agcaccctaa tgtgattgca
421 ttgcagaagg tgttcctttc tcacagtgac aggaaggtat ggctgctgtt tgattatgca
481 gagcatgact tgtggcatat tattaagttt caccgtgcat caaaagcaaa taaaaagccc
541 atgcagttgc caagatctat ggttaaatcc ttactttacc agattcttga tggtatccat
601 tacctccatg caaattgggt gcttcacaga gacttgaaac cagcaaatat cctagtaatg
661 ggagaaggtc ctgagagggg gagagtcaaa atagatatat gggcaatagg ttgtatattt
721 gctgaattgt tgacttcgga acctattttt cactgtcgtc aggaagatat aaaaacaagc
781 aatccctttc atcatgatca actggatcgg atatttagtg tcatggggtt tcctgcagat
841 aaagactggg aagatattag aaagatgcca gaatatccca cacttcaaaa agactttaga
901 agaacaacgt atgccaacag tagcctcata aagtacatgg agaaacacaa ggtcaagcct
961 gacagcaaag tgttcctctt gcttcagaaa ctcctgacca tggatccaac caagagaatt
1021 acctcggagc aagctctgca ggatccctat tttcaggagg accctttgcc aacattagat
1081 gtatttgccg gctgccagat tccatacccc aaacgagaat tccttaatga agatgatcct
1141 gaagaaaaag gtgacaagaa tcagcaacag cagcagaacc agcatcagca gcccacagcc
1201 cctccacagc aggcagcagc ccctccacag gcgcccccac cacagcagaa cagcacccag
1261 accaacggga ccgcaggtgg ggctggggcc ggggtcgggg gcaccggagc agggttgcag
1321 cacagccagg actccagcct gaaccaggtg cctccaaaca agaagccacg gctagggcct
1381 tcaggcgcaa actcaggtgg acctgtgatg ccctcggatt atcagcactc cagttctcgc
1441 ctgaattacc aaagcagcgt tcagggatcc tctcagtccc agagcacact tggctactct
1501 tcctcgtctc agcagagctc acagtaccac ccatctcacc aggcccaccg gtactgacca
1561 gctcccgttg ggccaggcca gcccagccca gagcacaggc tccagcaata tgtctgcatt
1621 gaaaagaacc aaaaaaatgc aaactatgat gccatttaaa actcatacac atgggaggaa
1681 aaccttatat actgagcatt gtgcaggact gatagctctt ctttattgac ttaaagaaga
1741 ttcttgtgaa gtttccccag caccccttcc ctgcatgtgt tccattgtga cttctctgat
1801 aaagcgtctg atctaatccc agcacttctg taaccttcag catttctttg aaggatttcc
1861 tggtgcacct ttctcatgct gtagcaatca ctatggttta tcttttcaaa gctcttttaa
1921 taggatttta atgttttaga aacaggattc cagtggtgta tagttttata cttcatgaac
1981 tgatttagca acacaggtaa aaatgcacct tttaaagcac tacgttttca cagacaataa
2041 ctgttctgct catggaagtc ttaaacagaa actgttactg tcccaaagta ctttactatt
2101 acgttcgtat ttatctagtt tcagggaagg tctaataaaa agacaagcgg tgggacagag
2161 ggaacctaca accaaaaact gcctagatct ttgcagttat gtgctttatg ccacgaagaa
2221 ctgaagtatg tggtaatttt tatagaatca ttcatatgga actgagttcc cagcatcatc
2281 ttattctgaa tagcattcag taattaagaa ttacaatttt aaccttcatg tagctaagtc
2341 taccttaaaa agggtttcaa gagctttgta cagtctcgat ggcccacacc aaaacgctga
2401 agagagtaac aactgcacta ggatttctgt aaggagtaat tttgatcaaa agacgtgtta
2461 cttccctttg aaggaaaagt ttttagtgtg tattgtacat aaagtcggct tctctaaaga
2521 accattggtt tcttcacatc tgggtctgcg tgagtaactt tcttgcataa tcaaggttac
2581 tcaagtagaa gcctgaaaat taatctgctt ttaaaataaa gagcagtgtt ctccattcgt
2641 atttgtatta gatatagagt gactattttt aaagcatgtt aaaaatttag gttttattca
2701 tgtttaaagt atgtattatg tatgcataat tttgctgttg ttactgaaac ttaattctat
2761 caagaatctt tttcattgca ctgaatgatt tcttttgccc ctaggagaaa acttaataat
2821 tgtgcctaaa aactatgggc ggatagtata agactatact agacaaagtg aatatttgca
2881 tttccattat ctatgaatta gtggctgagt tctttcttag ctgctttaag gagcccctca
2941 ctccccagag tcaaaaggaa atgtaaaaac ttagagctcc cattgtaatg taaggggcaa
3001 gaaatttgtg ttcttctgaa tgctactagc agcaccagcc ttgttttaaa tgttttcttg
3061 agctagaaga aatagctgat tattgtatat gcaaattaca tgcattttta aaaactattc
3121 tttctgaact tatctacctg gttatgatac tgtgggtcca tacacaagta aaataagatt
3181 agacagaagc cagtatacat tttgcactat tgatgtgata ctgtagccag ccaggacctt
3241 actgatctca gcataataat gctcactaat aatgaagtct gcatagtgac actcatcaag
3301 actgaagatg aagcaggtta cgtgctccat tggaaggagt ttctgatagt ctcctgctgt
3361 tttacccctt ccatttttta aaataagaaa ttagcagccc tctgcataat gtagctgcct
3421 atatgcagtt ttatcctgtg ccctaaagcc tcactgtcca gagctgttgg tcatcagatg
3481 cttattgcac cctcaccatg tgcctggtgc cctgctgggt agagaacaca gaggacaggg
3541 catacttctt gtccttaagg agcttgtgat ctgtgacagt aagccctcct gggatgtctg
3601 tgccatgtga ttgacttaca agtgaaactg tcttataata tgaaggtctt tttgtttact
3661 tctaaaccca cttgggtagt tactatcccc aaatctgttc tgtaaataat attatggaag
3721 ggtttctatg tcagtctacc ttagagaaag ccagtgattc aatatcacaa aaggcattga
3781 cgtatctttg aaatgttcac agcagccttt taacaacaac tgggtggtcc ttgtaggcag
3841 aacatactct cctaagtggt tgtaggaaat tgcaaggaaa atagaaggtc tgttcttgct
3901 ctcaaggagg ttacctttaa taaaagaaga caaacccaga tagatatgta aaccaaaata
3961 ctatgcccct taatacttta taagcagcat tgttaaatag ttcttacgct tatacattca
4021 cagaactacc ctgttttcct tgtatataat gacttttgct ggcagaactg aaatataaac
4081 tgtaagggga tttcgtcagt tgctcccagt atacaatatc ctccaggaca tagccagaaa
4141 tctccattcc acacatgact gagttcctat ccctgcactg gtactggctc ttttctcctc
4201 tttccttgcc tcagggttcg tgctacccac tgattccctt tacccttagt aataattttg
4261 gatcattttc tttcctttaa aggggaacaa agcctttttt ttttttgaga cggagtgttg
4321 ctctgtcacc caagctggag tgcagtggca cgatcttggc tcactccaac ctccaccttc
4381 caggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggactacg ggcacgcacc
4441 accacgtctg gctaattttt gtatttttag tagagatggg gtttcaccct attggtcagg
4501 ctggtcttga attcctcacc tcaggtcatc cgcctgtctc ggcctcccga agtgctggga
4561 ttataggtgt gagccaccgc acccagttgg gaacaaagcc tttttaacac acgtaagggc
4621 cctcaaaccg tgggacctct aaggagacct ttgaagcttt ttgagggcaa actttacctt
4681 tgtggtcccc aaatgatggc atttctcttt gaaatttatt agatactgtt atgtccccca
4741 agggtacagg aggggcatcc ctcagcctat gggaacaccc aaactaggag gggttattga
4801 caggaaggaa tgaatccaag tgaaggcttt ctgctcttcg tgttacaaac cagtttcaga
4861 gttagctttc tggggaggtg tgtgtttgtg aaaggaattc aagtgttgca ggacagatga
4921 gctcaaggta aggtagcttt ggcagcaggg ctgatactat gaggctgaaa caatccttgt
4981 gatgaagtag atcatgcagt gacatacaaa gaccaaggat tatgtatatt tttatatctc
5041 tgtggttttg aaactttagt acttagaatt ttggccttct gcactactct tttgctctta
5101 cgaacataat ggactcttaa gaatggaaag ggatgacatt tacctatgtg tgctgcctca
5161 ttcctggtga agcaactgct acttgttctc tatgcctcta aaatgatgct gttttctctg
5221 ctaaaggtaa aagaaaagaa aaaaatagtt ggaaaataag acatgcaact tgatgtgctt
5281 ttgagtaaat ttatgcagca gaaactatac aatgaaggaa gaattctatg gaaattacaa
5341 atccaaaact ctatgatgat gtcttcctag ggagtagaga aaggcagtga aatggcagtt
5401 agaccaacag aggcttgaag gattcaagta caagtaatat tttgtataaa acatagcagt
5461 ttaggtcccc ataatcctca aaaatagtca caaatataac aaagttcatt gttttagggt
5521 ttttaaaaaa cgtgttgtac ctaaggccat acttactctt ctatgctatc actgcaaagg
5581 ggtgatatgt atgtattata taaaaaaaaa aacccttaat gcactgttat ctcctaaata
5641 tttagtaaat taatactatt taattttttt aaagatttgt ctgtgtagac actaaaagta
5701 ttacacaaaa tctggactga aggtgtcctt tttaacaaca atttaaagta ctttttatat
5761 atgttatgta gtatatcctt tctaaactgc ctagtttgta tattcctata attcctattt
5821 gtgaagtgta cctgttcttg tctctttttt cagtcatttt ctgcacgcat ccccctttat
5881 atggttatag agatgactgt agcttttcgt gctccactgc gaggtttgtg ctcagagccg
5941 ctgcacccca gcgaggcctg ctccatggag tgcaggacga gctactgctt tggagcgagg
6001 gtttcctgct tttgagttga cctgacttcc ttcttgaaat gactgttaaa actaaaataa
6061 attacattgc atttatttta tattcttggt tgaaataaaa tttaattgac tttg
【０２０１】
CDK19転写変異体3（NM_001300963.1）（配列番号14）：
1 gaggggcggc cctggtacgc aggcgcgcat gctttgtggg ggcgaggctg tggtggcccg
61 agattccagg agggcttcgt gtatggacct caagcgttgg aggtagcaga cttttcagca
121 gaagaaaaga tgaaaaggaa tatgcattga agcaaattga aggcacagga atatccatgt
181 cggcttgtag agagattgca cttttgcgag aattgaagca ccctaatgtg attgcattgc
241 agaaggtgtt cctttctcac agtgacagga aggtatggct gctgtttgat tatgcagagc
301 atgacttgtg gcatattatt aagtttcacc gtgcatcaaa agcaaataaa aagcccatgc
361 agttgccaag atctatggtt aaatccttac tttaccagat tcttgatggt atccattacc
421 tccatgcaaa ttgggtgctt cacagagact tgaaaccagc aaatatccta gtaatgggag
481 aaggtcctga gagggggaga gtcaaaatag ctgacatggg ttttgccaga ttattcaatt
541 ctcctctaaa gccactagca gatttggatc cagtagttgt gacattttgg tatcgggctc
601 cagaactttt gcttggtgca aggcattata caaaggccat tgatatatgg gcaataggtt
661 gtatatttgc tgaattgttg acttcggaac ctatttttca ctgtcgtcag gaagatataa
721 aaacaagcaa tccctttcat catgatcaac tggatcggat atttagtgtc atggggtttc
781 ctgcagataa agactgggaa gatattagaa agatgccaga atatcccaca cttcaaaaag
841 actttagaag aacaacgtat gccaacagta gcctcataaa gtacatggag aaacacaagg
901 tcaagcctga cagcaaagtg ttcctcttgc ttcagaaact cctgaccatg gatccaacca
961 agagaattac ctcggagcaa gctctgcagg atccctattt tcaggaggac cctttgccaa
1021 cattagatgt atttgccggc tgccagattc cataccccaa acgagaattc cttaatgaag
1081 atgatcctga agaaaaaggt gacaagaatc agcaacagca gcagaaccag catcagcagc
1141 ccacagcccc tccacagcag gcagcagccc ctccacaggc gcccccacca cagcagaaca
1201 gcacccagac caacgggacc gcaggtgggg ctggggccgg ggtcgggggc accggagcag
1261 ggttgcagca cagccaggac tccagcctga accaggtgcc tccaaacaag aagccacggc
1321 tagggccttc aggcgcaaac tcaggtggac ctgtgatgcc ctcggattat cagcactcca
1381 gttctcgcct gaattaccaa agcagcgttc agggatcctc tcagtcccag agcacacttg
1441 gctactcttc ctcgtctcag cagagctcac agtaccaccc atctcaccag gcccaccggt
1501 actgaccagc tcccgttggg ccaggccagc ccagcccaga gcacaggctc cagcaatatg
1561 tctgcattga aaagaaccaa aaaaatgcaa actatgatgc catttaaaac tcatacacat
1621 gggaggaaaa ccttatatac tgagcattgt gcaggactga tagctcttct ttattgactt
1681 aaagaagatt cttgtgaagt ttccccagca ccccttccct gcatgtgttc cattgtgact
1741 tctctgataa agcgtctgat ctaatcccag cacttctgta accttcagca tttctttgaa
1801 ggatttcctg gtgcaccttt ctcatgctgt agcaatcact atggtttatc ttttcaaagc
1861 tcttttaata ggattttaat gttttagaaa caggattcca gtggtgtata gttttatact
1921 tcatgaactg atttagcaac acaggtaaaa atgcaccttt taaagcacta cgttttcaca
1981 gacaataact gttctgctca tggaagtctt aaacagaaac tgttactgtc ccaaagtact
2041 ttactattac gttcgtattt atctagtttc agggaaggtc taataaaaag acaagcggtg
2101 ggacagaggg aacctacaac caaaaactgc ctagatcttt gcagttatgt gctttatgcc
2161 acgaagaact gaagtatgtg gtaattttta tagaatcatt catatggaac tgagttccca
2221 gcatcatctt attctgaata gcattcagta attaagaatt acaattttaa ccttcatgta
2281 gctaagtcta ccttaaaaag ggtttcaaga gctttgtaca gtctcgatgg cccacaccaa
2341 aacgctgaag agagtaacaa ctgcactagg atttctgtaa ggagtaattt tgatcaaaag
2401 acgtgttact tccctttgaa ggaaaagttt ttagtgtgta ttgtacataa agtcggcttc
2461 tctaaagaac cattggtttc ttcacatctg ggtctgcgtg agtaactttc ttgcataatc
2521 aaggttactc aagtagaagc ctgaaaatta atctgctttt aaaataaaga gcagtgttct
2581 ccattcgtat ttgtattaga tatagagtga ctatttttaa agcatgttaa aaatttaggt
2641 tttattcatg tttaaagtat gtattatgta tgcataattt tgctgttgtt actgaaactt
2701 aattctatca agaatctttt tcattgcact gaatgatttc ttttgcccct aggagaaaac
2761 ttaataattg tgcctaaaaa ctatgggcgg atagtataag actatactag acaaagtgaa
2821 tatttgcatt tccattatct atgaattagt ggctgagttc tttcttagct gctttaagga
2881 gcccctcact ccccagagtc aaaaggaaat gtaaaaactt agagctccca ttgtaatgta
2941 aggggcaaga aatttgtgtt cttctgaatg ctactagcag caccagcctt gttttaaatg
3001 ttttcttgag ctagaagaaa tagctgatta ttgtatatgc aaattacatg catttttaaa
3061 aactattctt tctgaactta tctacctggt tatgatactg tgggtccata cacaagtaaa
3121 ataagattag acagaagcca gtatacattt tgcactattg atgtgatact gtagccagcc
3181 aggaccttac tgatctcagc ataataatgc tcactaataa tgaagtctgc atagtgacac
3241 tcatcaagac tgaagatgaa gcaggttacg tgctccattg gaaggagttt ctgatagtct
3301 cctgctgttt taccccttcc attttttaaa ataagaaatt agcagccctc tgcataatgt
3361 agctgcctat atgcagtttt atcctgtgcc ctaaagcctc actgtccaga gctgttggtc
3421 atcagatgct tattgcaccc tcaccatgtg cctggtgccc tgctgggtag agaacacaga
3481 ggacagggca tacttcttgt ccttaaggag cttgtgatct gtgacagtaa gccctcctgg
3541 gatgtctgtg ccatgtgatt gacttacaag tgaaactgtc ttataatatg aaggtctttt
3601 tgtttacttc taaacccact tgggtagtta ctatccccaa atctgttctg taaataatat
3661 tatggaaggg tttctatgtc agtctacctt agagaaagcc agtgattcaa tatcacaaaa
3721 ggcattgacg tatctttgaa atgttcacag cagcctttta acaacaactg ggtggtcctt
3781 gtaggcagaa catactctcc taagtggttg taggaaattg caaggaaaat agaaggtctg
3841 ttcttgctct caaggaggtt acctttaata aaagaagaca aacccagata gatatgtaaa
3901 ccaaaatact atgcccctta atactttata agcagcattg ttaaatagtt cttacgctta
3961 tacattcaca gaactaccct gttttccttg tatataatga cttttgctgg cagaactgaa
4021 atataaactg taaggggatt tcgtcagttg ctcccagtat acaatatcct ccaggacata
4081 gccagaaatc tccattccac acatgactga gttcctatcc ctgcactggt actggctctt
4141 ttctcctctt tccttgcctc agggttcgtg ctacccactg attcccttta cccttagtaa
4201 taattttgga tcattttctt tcctttaaag gggaacaaag cctttttttt ttttgagacg
4261 gagtgttgct ctgtcaccca agctggagtg cagtggcacg atcttggctc actccaacct
4321 ccaccttcca ggttcaagtg attctcctgc ctcagcctcc cgagtagctg ggactacggg
4381 cacgcaccac cacgtctggc taatttttgt atttttagta gagatggggt ttcaccctat
4441 tggtcaggct ggtcttgaat tcctcacctc aggtcatccg cctgtctcgg cctcccgaag
4501 tgctgggatt ataggtgtga gccaccgcac ccagttggga acaaagcctt tttaacacac
4561 gtaagggccc tcaaaccgtg ggacctctaa ggagaccttt gaagcttttt gagggcaaac
4621 tttacctttg tggtccccaa atgatggcat ttctctttga aatttattag atactgttat
4681 gtcccccaag ggtacaggag gggcatccct cagcctatgg gaacacccaa actaggaggg
4741 gttattgaca ggaaggaatg aatccaagtg aaggctttct gctcttcgtg ttacaaacca
4801 gtttcagagt tagctttctg gggaggtgtg tgtttgtgaa aggaattcaa gtgttgcagg
4861 acagatgagc tcaaggtaag gtagctttgg cagcagggct gatactatga ggctgaaaca
4921 atccttgtga tgaagtagat catgcagtga catacaaaga ccaaggatta tgtatatttt
4981 tatatctctg tggttttgaa actttagtac ttagaatttt ggccttctgc actactcttt
5041 tgctcttacg aacataatgg actcttaaga atggaaaggg atgacattta cctatgtgtg
5101 ctgcctcatt cctggtgaag caactgctac ttgttctcta tgcctctaaa atgatgctgt
5161 tttctctgct aaaggtaaaa gaaaagaaaa aaatagttgg aaaataagac atgcaacttg
5221 atgtgctttt gagtaaattt atgcagcaga aactatacaa tgaaggaaga attctatgga
5281 aattacaaat ccaaaactct atgatgatgt cttcctaggg agtagagaaa ggcagtgaaa
5341 tggcagttag accaacagag gcttgaagga ttcaagtaca agtaatattt tgtataaaac
5401 atagcagttt aggtccccat aatcctcaaa aatagtcaca aatataacaa agttcattgt
5461 tttagggttt ttaaaaaacg tgttgtacct aaggccatac ttactcttct atgctatcac
5521 tgcaaagggg tgatatgtat gtattatata aaaaaaaaaa cccttaatgc actgttatct
5581 cctaaatatt tagtaaatta atactattta atttttttaa agatttgtct gtgtagacac
5641 taaaagtatt acacaaaatc tggactgaag gtgtcctttt taacaacaat ttaaagtact
5701 ttttatatat gttatgtagt atatcctttc taaactgcct agtttgtata ttcctataat
5761 tcctatttgt gaagtgtacc tgttcttgtc tcttttttca gtcattttct gcacgcatcc
5821 ccctttatat ggttatagag atgactgtag cttttcgtgc tccactgcga ggtttgtgct
5881 cagagccgct gcaccccagc gaggcctgct ccatggagtg caggacgagc tactgctttg
5941 gagcgagggt ttcctgcttt tgagttgacc tgacttcctt cttgaaatga ctgttaaaac
6001 taaaataaat tacattgcat ttattttata ttcttggttg aaataaaatt taattgactt
6061 tg
【０２０２】
CDK19転写変異体4（NM_001300964.1）（配列番号15）：
1 agaaaagaaa caagctgcgg tacaactgtc ctcaccagcc ctcgcctccc gagtcactgc
61 agccaaccct tcagcaagaa aagatgaaaa ggaatatgca ttgaagcaaa ttgaaggcac
121 aggaatatcc atgtcggctt gtagagagat tgcacttttg cgagaattga agcaccctaa
181 tgtgattgca ttgcagaagg tgttcctttc tcacagtgac aggaaggtat ggctgctgtt
241 tgattatgca gagcatgact tgtggcatat tattaagttt caccgtgcat caaaagcaaa
301 taaaaagccc atgcagttgc caagatctat ggttaaatcc ttactttacc agattcttga
361 tggtatccat tacctccatg caaattgggt gcttcacaga gacttgaaac cagcaaatat
421 cctagtaatg ggagaaggtc ctgagagggg gagagtcaaa atagctgaca tgggttttgc
481 cagattattc aattctcctc taaagccact agcagatttg gatccagtag ttgtgacatt
541 ttggtatcgg gctccagaac ttttgcttgg tgcaaggcat tatacaaagg ccattgatat
601 atgggcaata ggttgtatat ttgctgaatt gttgacttcg gaacctattt ttcactgtcg
661 tcaggaagat ataaaaacaa gcaatccctt tcatcatgat caactggatc ggatatttag
721 tgtcatgggg tttcctgcag ataaagactg ggaagatatt agaaagatgc cagaatatcc
781 cacacttcaa aaagacttta gaagaacaac gtatgccaac agtagcctca taaagtacat
841 ggagaaacac aaggtcaagc ctgacagcaa agtgttcctc ttgcttcaga aactcctgac
901 catggatcca accaagagaa ttacctcgga gcaagctctg caggatccct attttcagga
961 ggaccctttg ccaacattag atgtatttgc cggctgccag attccatacc ccaaacgaga
1021 attccttaat gaagatgatc ctgaagaaaa aggtgacaag aatcagcaac agcagcagaa
1081 ccagcatcag cagcccacag cccctccaca gcaggcagca gcccctccac aggcgccccc
1141 accacagcag aacagcaccc agaccaacgg gaccgcaggt ggggctgggg ccggggtcgg
1201 gggcaccgga gcagggttgc agcacagcca ggactccagc ctgaaccagg tgcctccaaa
1261 caagaagcca cggctagggc cttcaggcgc aaactcaggt ggacctgtga tgccctcgga
1321 ttatcagcac tccagttctc gcctgaatta ccaaagcagc gttcagggat cctctcagtc
1381 ccagagcaca cttggctact cttcctcgtc tcagcagagc tcacagtacc acccatctca
1441 ccaggcccac cggtactgac cagctcccgt tgggccaggc cagcccagcc cagagcacag
1501 gctccagcaa tatgtctgca ttgaaaagaa ccaaaaaaat gcaaactatg atgccattta
1561 aaactcatac acatgggagg aaaaccttat atactgagca ttgtgcagga ctgatagctc
1621 ttctttattg acttaaagaa gattcttgtg aagtttcccc agcacccctt ccctgcatgt
1681 gttccattgt gacttctctg ataaagcgtc tgatctaatc ccagcacttc tgtaaccttc
1741 agcatttctt tgaaggattt cctggtgcac ctttctcatg ctgtagcaat cactatggtt
1801 tatcttttca aagctctttt aataggattt taatgtttta gaaacaggat tccagtggtg
1861 tatagtttta tacttcatga actgatttag caacacaggt aaaaatgcac cttttaaagc
1921 actacgtttt cacagacaat aactgttctg ctcatggaag tcttaaacag aaactgttac
1981 tgtcccaaag tactttacta ttacgttcgt atttatctag tttcagggaa ggtctaataa
2041 aaagacaagc ggtgggacag agggaaccta caaccaaaaa ctgcctagat ctttgcagtt
2101 atgtgcttta tgccacgaag aactgaagta tgtggtaatt tttatagaat cattcatatg
2161 gaactgagtt cccagcatca tcttattctg aatagcattc agtaattaag aattacaatt
2221 ttaaccttca tgtagctaag tctaccttaa aaagggtttc aagagctttg tacagtctcg
2281 atggcccaca ccaaaacgct gaagagagta acaactgcac taggatttct gtaaggagta
2341 attttgatca aaagacgtgt tacttccctt tgaaggaaaa gtttttagtg tgtattgtac
2401 ataaagtcgg cttctctaaa gaaccattgg tttcttcaca tctgggtctg cgtgagtaac
2461 tttcttgcat aatcaaggtt actcaagtag aagcctgaaa attaatctgc ttttaaaata
2521 aagagcagtg ttctccattc gtatttgtat tagatataga gtgactattt ttaaagcatg
2581 ttaaaaattt aggttttatt catgtttaaa gtatgtatta tgtatgcata attttgctgt
2641 tgttactgaa acttaattct atcaagaatc tttttcattg cactgaatga tttcttttgc
2701 ccctaggaga aaacttaata attgtgccta aaaactatgg gcggatagta taagactata
2761 ctagacaaag tgaatatttg catttccatt atctatgaat tagtggctga gttctttctt
2821 agctgcttta aggagcccct cactccccag agtcaaaagg aaatgtaaaa acttagagct
2881 cccattgtaa tgtaaggggc aagaaatttg tgttcttctg aatgctacta gcagcaccag
2941 ccttgtttta aatgttttct tgagctagaa gaaatagctg attattgtat atgcaaatta
3001 catgcatttt taaaaactat tctttctgaa cttatctacc tggttatgat actgtgggtc
3061 catacacaag taaaataaga ttagacagaa gccagtatac attttgcact attgatgtga
3121 tactgtagcc agccaggacc ttactgatct cagcataata atgctcacta ataatgaagt
3181 ctgcatagtg acactcatca agactgaaga tgaagcaggt tacgtgctcc attggaagga
3241 gtttctgata gtctcctgct gttttacccc ttccattttt taaaataaga aattagcagc
3301 cctctgcata atgtagctgc ctatatgcag ttttatcctg tgccctaaag cctcactgtc
3361 cagagctgtt ggtcatcaga tgcttattgc accctcacca tgtgcctggt gccctgctgg
3421 gtagagaaca cagaggacag ggcatacttc ttgtccttaa ggagcttgtg atctgtgaca
3481 gtaagccctc ctgggatgtc tgtgccatgt gattgactta caagtgaaac tgtcttataa
3541 tatgaaggtc tttttgttta cttctaaacc cacttgggta gttactatcc ccaaatctgt
3601 tctgtaaata atattatgga agggtttcta tgtcagtcta ccttagagaa agccagtgat
3661 tcaatatcac aaaaggcatt gacgtatctt tgaaatgttc acagcagcct tttaacaaca
3721 actgggtggt ccttgtaggc agaacatact ctcctaagtg gttgtaggaa attgcaagga
3781 aaatagaagg tctgttcttg ctctcaagga ggttaccttt aataaaagaa gacaaaccca
3841 gatagatatg taaaccaaaa tactatgccc cttaatactt tataagcagc attgttaaat
3901 agttcttacg cttatacatt cacagaacta ccctgttttc cttgtatata atgacttttg
3961 ctggcagaac tgaaatataa actgtaaggg gatttcgtca gttgctccca gtatacaata
4021 tcctccagga catagccaga aatctccatt ccacacatga ctgagttcct atccctgcac
4081 tggtactggc tcttttctcc tctttccttg cctcagggtt cgtgctaccc actgattccc
4141 tttaccctta gtaataattt tggatcattt tctttccttt aaaggggaac aaagcctttt
4201 ttttttttga gacggagtgt tgctctgtca cccaagctgg agtgcagtgg cacgatcttg
4261 gctcactcca acctccacct tccaggttca agtgattctc ctgcctcagc ctcccgagta
4321 gctgggacta cgggcacgca ccaccacgtc tggctaattt ttgtattttt agtagagatg
4381 gggtttcacc ctattggtca ggctggtctt gaattcctca cctcaggtca tccgcctgtc
4441 tcggcctccc gaagtgctgg gattataggt gtgagccacc gcacccagtt gggaacaaag
4501 cctttttaac acacgtaagg gccctcaaac cgtgggacct ctaaggagac ctttgaagct
4561 ttttgagggc aaactttacc tttgtggtcc ccaaatgatg gcatttctct ttgaaattta
4621 ttagatactg ttatgtcccc caagggtaca ggaggggcat ccctcagcct atgggaacac
4681 ccaaactagg aggggttatt gacaggaagg aatgaatcca agtgaaggct ttctgctctt
4741 cgtgttacaa accagtttca gagttagctt tctggggagg tgtgtgtttg tgaaaggaat
4801 tcaagtgttg caggacagat gagctcaagg taaggtagct ttggcagcag ggctgatact
4861 atgaggctga aacaatcctt gtgatgaagt agatcatgca gtgacataca aagaccaagg
4921 attatgtata tttttatatc tctgtggttt tgaaacttta gtacttagaa ttttggcctt
4981 ctgcactact cttttgctct tacgaacata atggactctt aagaatggaa agggatgaca
5041 tttacctatg tgtgctgcct cattcctggt gaagcaactg ctacttgttc tctatgcctc
5101 taaaatgatg ctgttttctc tgctaaaggt aaaagaaaag aaaaaaatag ttggaaaata
5161 agacatgcaa cttgatgtgc ttttgagtaa atttatgcag cagaaactat acaatgaagg
5221 aagaattcta tggaaattac aaatccaaaa ctctatgatg atgtcttcct agggagtaga
5281 gaaaggcagt gaaatggcag ttagaccaac agaggcttga aggattcaag tacaagtaat
5341 attttgtata aaacatagca gtttaggtcc ccataatcct caaaaatagt cacaaatata
5401 acaaagttca ttgttttagg gtttttaaaa aacgtgttgt acctaaggcc atacttactc
5461 ttctatgcta tcactgcaaa ggggtgatat gtatgtatta tataaaaaaa aaaaccctta
5521 atgcactgtt atctcctaaa tatttagtaa attaatacta tttaattttt ttaaagattt
5581 gtctgtgtag acactaaaag tattacacaa aatctggact gaaggtgtcc tttttaacaa
5641 caatttaaag tactttttat atatgttatg tagtatatcc tttctaaact gcctagtttg
5701 tatattccta taattcctat ttgtgaagtg tacctgttct tgtctctttt ttcagtcatt
5761 ttctgcacgc atcccccttt atatggttat agagatgact gtagcttttc gtgctccact
5821 gcgaggtttg tgctcagagc cgctgcaccc cagcgaggcc tgctccatgg agtgcaggac
5881 gagctactgc tttggagcga gggtttcctg cttttgagtt gacctgactt ccttcttgaa
5941 atgactgtta aaactaaaat aaattacatt gcatttattt tatattcttg gttgaaataa
6001 aatttaattg actttg
【０２０３】
サイクリン依存性キナーゼ8（CDK8）、転写変異体1（NM_001260.2）（配列番号16）：
1 gagtgccctc cctcctcctc tctttgagga ggtaccggct gttgtgcggc tctgcccttc
61 tgtttgagtg tatgggagag tgagtgagtg agtgagtgtg agcgtgtgtg tgagagcgtg
121 aggcgtgagt gcgcgtgtga gaggacgaga gcccgcctgg ccgccccgcc gctcccgccg
181 cagcaggagc agaacgcgcg gccggagaga gcggcggagc cggcgcccag ggagcccgcg
241 gggacaaggg cagagacacc gctccccacc cccagccctc gtccctcggc tctccttcgc
301 cgggggatcc tccccgttcc tccacccccg gccggcctct gccccgccgt ccccctggat
361 gtccctggcg ctttcgcggg gcctcctcct gctcttgccg catcagtcgg gctggtgctg
421 cggccggcgg gcgtagagcg ggcgggttcc cgggggctgc ggctgcccgt gcttccccgg
481 tccccacccc tgccccccgg ccccccgacc cagctctccg gcctcagagg ctgtgacaat
541 ggactatgac tttaaagtga agctgagcag cgagcgggag cgggtcgagg acctgtttga
601 atacgagggc tgcaaagttg gccgaggcac ttatggtcac gtctacaaag ccaagaggaa
661 agatgggaag gatgataaag actatgcttt aaaacaaata gaaggaactg ggatctctat
721 gtcggcatgt agagaaatag cattacttcg agagcttaag catccaaacg tcatttctct
781 tcaaaaggtg tttctgtctc atgctgatag gaaggtgtgg cttctgtttg actatgctga
841 acatgacctc tggcatataa tcaagtttca cagagcttct aaagcaaaca agaagccagt
901 tcagttacct cggggaatgg tgaagtcact attatatcag atcctagatg gtattcacta
961 cctgcatgct aactgggtgt tgcacagaga tttgaaacct gctaatattt tagttatggg
1021 tgaaggtcct gagcgaggaa gagtaaaaat tgctgacatg ggctttgccc gattatttaa
1081 ttcacctttg aagcctttag cagatttgga tccagtggtt gttacattct ggtaccgagc
1141 ccctgaacta cttcttggag caaggcatta taccaaagct attgatattt gggctatagg
1201 gtgtatattt gcagaactac taacgtcaga accaatattt cactgtcgac aagaggacat
1261 caaaactagt aatccttatc accatgacca gctggacaga atattcaatg taatgggatt
1321 tcctgcagat aaagattggg aagatataaa aaagatgcct gaacattcaa cattaatgaa
1381 agatttcaga agaaatacgt ataccaactg cagccttatc aagtatatgg aaaaacataa
1441 agttaaacca gatagtaaag cattccactt gcttcagaag ctgcttacca tggacccaat
1501 aaagcgaatt acctcagaac aggctatgca ggacccctat ttcttagaag acccacttcc
1561 tacatcagac gtttttgccg gttgtcaaat cccttaccca aaacgagaat ttttaacgga
1621 agaagaacct gatgacaaag gagacaaaaa gaaccagcag cagcagcagg gcaataacca
1681 cactaatgga actggccacc cagggaatca agacagcagt cacacacagg gacccccgtt
1741 gaagaaagtg agagttgttc ctcctaccac tacctcaggt ggacttatca tgacctcaga
1801 ctatcagcgt tccaatccac atgctgccta tcccaaccct ggaccaagca catcacagcc
1861 gcagagcagc atgggatact cagctacctc ccagcagcct ccacagtact cacatcagac
1921 acatcggtac tgagctgcat cggaatcttg tccatgcact gttgcgaatg ctgcagggct
1981 gactgtgcag ctctctgcgg gaacctggta tgggccatga gaatgtactg tacaaccaca
2041 tcttcaaaat gtccagtagc caagttccac cacttttcac agattggggt agtggcttcc
2101 aagttgtacc tattttggag ttagacttga aaagaaagtg ctagcacagt ttgtgttgtg
2161 gatttgctac ttccatagtt tacttgacat ggttcagact gaccaatgca tttttttcag
2221 tgacagtctg tagcagttga agctgtgaat gtgctagggg caagcatttg tctttgtatg
2281 tggtgaattt tttcagtgta acaacattat ctgaccaata gtacacacac agacacaaag
2341 tttaactggt acttgaaaca tacagtatat gttaacgaaa taaccaagac tcgaaatgag
2401 attattttgg tacacctttc tttttagtgt cttatcagtg ggctgattca ttttctacat
2461 taatcagtgt tttctgacca agaatattgc ttggattttt ttgaaagtac aaaaagccac
2521 atagtttttc cagaaaggtt tcaaaactcc caaagattaa cttccaactt ataagtttgt
2581 ttttattttc aatctatgac ttgactggta ttaaagctgc tatttgatag taattaaata
2641 tgttgtcatt gatataaacc tgtttggttc agcaaacaaa ctaaaatgat tgtcatagac
2701 agtgttttat ttttcctgtt ggtgttgctg atttgtgagc atgctttaag atgaaaaaag
2761 catgaatgat aacttcctta aaaaggtgcg gcatccaatt caaatatttt cgtcctgatt
2821 ttaaagctgg ttggtgtagt gctattaaaa tttcgttcag ttaattttcc ttttgaaaac
2881 ttgttcgcac gttgtttagg gtgcccttac ttcagcaaag gagaaggagt aggagagcct
2941 tagaattttt gaggaaaaaa aaacctataa catacaatgt actgtatcaa actattttac
3001 atgaatgaca caagtattct gaataaaaaa taattgaaca ttgttaaaaa caaggtgtta
3061 tgtaataaat ttatttttca taaatcaaaa aaaaaaaaaa a
【０２０４】
サイクリン依存性キナーゼ8（CDK8）、転写変異体2（NM_001318368.1）（配列番号17）：
1 gagtgccctc cctcctcctc tctttgagga ggtaccggct gttgtgcggc tctgcccttc
61 tgtttgagtg tatgggagag tgagtgagtg agtgagtgtg agcgtgtgtg tgagagcgtg
121 aggcgtgagt gcgcgtgtga gaggacgaga gcccgcctgg ccgccccgcc gctcccgccg
181 cagcaggagc agaacgcgcg gccggagaga gcggcggagc cggcgcccag ggagcccgcg
241 gggacaaggg cagagacacc gctccccacc cccagccctc gtccctcggc tctccttcgc
301 cgggggatcc tccccgttcc tccacccccg gccggcctct gccccgccgt ccccctggat
361 gtccctggcg ctttcgcggg gcctcctcct gctcttgccg catcagtcgg gctggtgctg
421 cggccggcgg gcgtagagcg ggcgggttcc cgggggctgc ggctgcccgt gcttccccgg
481 tccccacccc tgccccccgg ccccccgacc cagctctccg gcctcagagg ctgtgacaat
541 ggactatgac tttaaagtga agctgagcag cgagcgggag cgggtcgagg acctgtttga
601 atacgagggc tgcaaagttg gccgaggcac ttatggtcac gtctacaaag ccaagaggaa
661 agatgggaag gatgataaag actatgcttt aaaacaaata gaaggaactg ggatctctat
721 gtcggcatgt agagaaatag cattacttcg agagcttaag catccaaacg tcatttctct
781 tcaaaaggtg tttctgtctc atgctgatag gaaggtgtgg cttctgtttg actatgctga
841 acatgacctc tggcatataa tcaagtttca cagagcttct aaagcaaaca agaagccagt
901 tcagttacct cggggaatgg tgaagtcact attatatcag atcctagatg gtattcacta
961 cctgcatgct aactgggtgt tgcacagaga tttgaaacct gctaatattt tagttatggg
1021 tgaaggtcct gagcgaggaa gagtaaaaat tgctgacatg ggctttgccc gattatttaa
1081 ttcacctttg aagcctttag cagatttgga tccagtggtt gttacattct ggtaccgagc
1141 ccctgaacta cttcttggag caaggcatta taccaaagct attgatattt gggctatagg
1201 gtgtatattt gcagaactac taacgtcaga accaatattt cactgtcgac aagaggacat
1261 caaaactagt aatccttatc accatgacca gctggacaga atattcaatg taatgggatt
1321 tcctgcagat aaagattggg aagatataaa aaagatgcct gaacattcaa cattaatgaa
1381 agatttcaga agaaatacgt ataccaactg cagccttatc aagtatatgg aaaaacataa
1441 agttaaacca gatagtaaag cattccactt gcttcagaag ctgcttacca tggacccaat
1501 aaagcgaatt acctcagaac aggctatgca ggacccctat ttcttagaag acccacttcc
1561 tacatcagac gtttttgccg gttgtcaaat cccttaccca aaacgagaat ttttaacgga
1621 agaagaacct gatgacaaag gagacaaaaa ccagcagcag cagcagggca ataaccacac
1681 taatggaact ggccacccag ggaatcaaga cagcagtcac acacagggac ccccgttgaa
1741 gaaagtgaga gttgttcctc ctaccactac ctcaggtgga cttatcatga cctcagacta
1801 tcagcgttcc aatccacatg ctgcctatcc caaccctgga ccaagcacat cacagccgca
1861 gagcagcatg ggatactcag ctacctccca gcagcctcca cagtactcac atcagacaca
1921 tcggtactga gctgcatcgg aatcttgtcc atgcactgtt gcgaatgctg cagggctgac
1981 tgtgcagctc tctgcgggaa cctggtatgg gccatgagaa tgtactgtac aaccacatct
2041 tcaaaatgtc cagtagccaa gttccaccac ttttcacaga ttggggtagt ggcttccaag
2101 ttgtacctat tttggagtta gacttgaaaa gaaagtgcta gcacagtttg tgttgtggat
2161 ttgctacttc catagtttac ttgacatggt tcagactgac caatgcattt ttttcagtga
2221 cagtctgtag cagttgaagc tgtgaatgtg ctaggggcaa gcatttgtct ttgtatgtgg
2281 tgaatttttt cagtgtaaca acattatctg accaatagta cacacacaga cacaaagttt
2341 aactggtact tgaaacatac agtatatgtt aacgaaataa ccaagactcg aaatgagatt
2401 attttggtac acctttcttt ttagtgtctt atcagtgggc tgattcattt tctacattaa
2461 tcagtgtttt ctgaccaaga atattgcttg gatttttttg aaagtacaaa aagccacata
2521 gtttttccag aaaggtttca aaactcccaa agattaactt ccaacttata agtttgtttt
2581 tattttcaat ctatgacttg actggtatta aagctgctat ttgatagtaa ttaaatatgt
2641 tgtcattgat ataaacctgt ttggttcagc aaacaaacta aaatgattgt catagacagt
2701 gttttatttt tcctgttggt gttgctgatt tgtgagcatg ctttaagatg aaaaaagcat
2761 gaatgataac ttccttaaaa aggtgcggca tccaattcaa atattttcgt cctgatttta
2821 aagctggttg gtgtagtgct attaaaattt cgttcagtta attttccttt tgaaaacttg
2881 ttcgcacgtt gtttagggtg cccttacttc agcaaaggag aaggagtagg agagccttag
2941 aatttttgag gaaaaaaaaa cctataacat acaatgtact gtatcaaact attttacatg
3001 aatgacacaa gtattctgaa taaaaaataa ttgaacattg ttaaaaacaa ggtgttatgt
3061 aataaattta tttttcataa atcaaaaaaa aaaaaaaa
【０２０５】
サイクリン依存性キナーゼ8（CDK8）、転写変異体3（NM_001346501.1）（配列番号18）：
1 gagtgccctc cctcctcctc tctttgagga ggtaccggct gttgtgcggc tctgcccttc
61 tgtttgagtg tatgggagag tgagtgagtg agtgagtgtg agcgtgtgtg tgagagcgtg
121 aggcgtgagt gcgcgtgtga gaggacgaga gcccgcctgg ccgccccgcc gctcccgccg
181 cagcaggagc agaacgcgcg gccggagaga gcggcggagc cggcgcccag ggagcccgcg
241 gggacaaggg cagagacacc gctccccacc cccagccctc gtccctcggc tctccttcgc
301 cgggggatcc tccccgttcc tccacccccg gccggcctct gccccgccgt ccccctggat
361 gtccctggcg ctttcgcggg gcctcctcct gctcttgccg catcagtcgg gctggtgctg
421 cggccggcgg gcgtagagcg ggcgggttcc cgggggctgc ggctgcccgt gcttccccgg
481 tccccacccc tgccccccgg ccccccgacc cagctctccg gcctcagagg ctgtgacaat
541 ggactatgac tttaaagtga agctgagcag cgagcgggag cgggtcgagg acctgtttga
601 atacgagggc tgcaaagttg gccgaggcac ttatggtcac gtctacaaag ccaagaggaa
661 agatgggaag gatgataaag actatgcttt aaaacaaata gaaggaactg ggatctctat
721 gtcggcatgt agagaaatag cattacttcg agagcttaag catccaaacg tcatttctct
781 tcaaaaggtg tttctgtctc atgctgatag gaaggtgtgg cttctgtttg actatgctga
841 acatgacctc tggcatataa tcaagtttca cagagcttct aaagcaaaca agaagccagt
901 tcagttacct cggggaatgg tgaagtcact attatatcag atcctagatg gtattcacta
961 cctgcatgct aactgggtgt tgcacagaga tttgctgaca tgggctttgc ccgattattt
1021 aattcacctt tgaagccttt agcagatttg gatccagtgg ttgttacatt ctggtaccga
1081 gcccctgaac tacttcttgg agcaaggcat tataccaaag ctattgatat ttgggctata
1141 gggtgtatat ttgcagaact actaacgtca gaaccaatat ttcactgtcg acaagaggac
1201 atcaaaacta gtaatcctta tcaccatgac cagctggaca gaatattcaa tgtaatggga
1261 tttcctgcag ataaagattg ggaagatata aaaaagatgc ctgaacattc aacattaatg
1321 aaagatttca gaagaaatac gtataccaac tgcagcctta tcaagtatat ggaaaaacat
1381 aaagttaaac cagatagtaa agcattccac ttgcttcaga agctgcttac catggaccca
1441 ataaagcgaa ttacctcaga acaggctatg caggacccct atttcttaga agacccactt
1501 cctacatcag acgtttttgc cggttgtcaa atcccttacc caaaacgaga atttttaacg
1561 gaagaagaac ctgatgacaa aggagacaaa aagaaccagc agcagcagca gggcaataac
1621 cacactaatg gaactggcca cccagggaat caagacagca gtcacacaca gggacccccg
1681 ttgaagaaag tgagagttgt tcctcctacc actacctcag gtggacttat catgacctca
1741 gactatcagc gttccaatcc acatgctgcc tatcccaacc ctggaccaag cacatcacag
1801 ccgcagagca gcatgggata ctcagctacc tcccagcagc ctccacagta ctcacatcag
1861 acacatcggt actgagctgc atcggaatct tgtccatgca ctgttgcgaa tgctgcaggg
1921 ctgactgtgc agctctctgc gggaacctgg tatgggccat gagaatgtac tgtacaacca
1981 catcttcaaa atgtccagta gccaagttcc accacttttc acagattggg gtagtggctt
2041 ccaagttgta cctattttgg agttagactt gaaaagaaag tgctagcaca gtttgtgttg
2101 tggatttgct acttccatag tttacttgac atggttcaga ctgaccaatg catttttttc
2161 agtgacagtc tgtagcagtt gaagctgtga atgtgctagg ggcaagcatt tgtctttgta
2221 tgtggtgaat tttttcagtg taacaacatt atctgaccaa tagtacacac acagacacaa
2281 agtttaactg gtacttgaaa catacagtat atgttaacga aataaccaag actcgaaatg
2341 agattatttt ggtacacctt tctttttagt gtcttatcag tgggctgatt cattttctac
2401 attaatcagt gttttctgac caagaatatt gcttggattt ttttgaaagt acaaaaagcc
2461 acatagtttt tccagaaagg tttcaaaact cccaaagatt aacttccaac ttataagttt
2521 gtttttattt tcaatctatg acttgactgg tattaaagct gctatttgat agtaattaaa
2581 tatgttgtca ttgatataaa cctgtttggt tcagcaaaca aactaaaatg attgtcatag
2641 acagtgtttt atttttcctg ttggtgttgc tgatttgtga gcatgcttta agatgaaaaa
2701 agcatgaatg ataacttcct taaaaaggtg cggcatccaa ttcaaatatt ttcgtcctga
2761 ttttaaagct ggttggtgta gtgctattaa aatttcgttc agttaatttt ccttttgaaa
2821 acttgttcgc acgttgttta gggtgccctt acttcagcaa aggagaagga gtaggagagc
2881 cttagaattt ttgaggaaaa aaaaacctat aacatacaat gtactgtatc aaactatttt
2941 acatgaatga cacaagtatt ctgaataaaa aataattgaa cattgttaaa aacaaggtgt
3001 tatgtaataa atttattttt cataaatcaa aaaaaaaaaa aaa
【図１−１】
2020534354.tif 000011
【図１−２】
2020534354.tif 000012
【図１−３】
2020534354.tif 000013
【図１−４】
2020534354.tif 000014
【図１−５】
2020534354.tif 000015
【図１−６】
2020534354.tif 000016
【図１−７】
2020534354.tif 000017
【図１−８】
2020534354.tif 000018
【図１−９】
2020534354.tif 000019
【図１−１０】
2020534354.tif 000020
【図１−１１】
2020534354.tif 000021
【図１−１２】
2020534354.tif 000022
【図１−１３】
2020534354.tif 000023
【図１−１４】
2020534354.tif 000024
【図２−１】
2020534354.tif 000025
【図２−２】
2020534354.tif 000026
【図２−３】
2020534354.tif 000027
【図２−４】
2020534354.tif 000028
【図３−１】
2020534354.tif 000029
【図３−２】
2020534354.tif 000030
【図３−３】
2020534354.tif 000031
【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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