(57)【要約】腫瘍細胞の増殖を低減する、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞の移動を減少させるための方法が開示される。これらの方法は、上記腫瘍細胞と有効量の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の可溶化ＥＣＭまたは可溶性画分とを接触させ、それによって、腫瘍細胞の増殖を低減する、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞の移動を減少させる工程を包含する。腫瘍を有する被験体を処置するための方法がまた、開示される。上記方法は、治療上有効な量の、ＥＣＭの可溶性画分および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を上記被験体に投与し、それによって、上記被験体における腫瘍を処置する工程を包含する。具体的な非限定的例では、上記腫瘍は神経膠腫である、および／または上記ＥＣＭヒドロゲルは膀胱ＥＣＭヒドロゲルである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖を低減する、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞の移動を減少させるための方法であって、前記方法は、
前記腫瘍細胞と有効量の可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルまたはその可溶性画分とを接触させ、それによって、前記腫瘍細胞の増殖を低減する、前記腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または前記腫瘍細胞の移動を減少させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記可溶性画分は、
ａ．組織に由来する脱細胞化細胞外マトリクスを部分的にまたは完全に消化して、消化したＥＣＭ材料を生成する工程；
ｂ．前記消化したＥＣＭ材料をｐＨ７．２〜約７．４へと中和して、中和した消化ＥＣＭ材料を生成する工程；
ｃ．前記中和した消化ＥＣＭ材料を、その下限臨界溶液温度を上回る温度でゲル化する工程；  
ｄ．前記ゲル化したＥＣＭ材料を遠心分離して、ペレットおよび上清を生成する工程；ならびに
ｅ．前記上清および前記ペレットを単離して、前記ＥＣＭ材料の前記可溶性画分を生成する工程、
によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織から調製された前記脱細胞化ＥＣＭ材料は、酸性プロテアーゼでの前記部分的な消化または前記完全な消化の前に透析されない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞はインビボのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍細胞はインビトロのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞は、神経膠腫細胞、乳がん細胞または肺がん細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭは膀胱ＥＣＭである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外マトリクスは食道ＥＣＭであり、前記腫瘍細胞は食道腺癌細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍を有する被験体を処置するための方法であって、前記方法は、
前記腫瘍を有する被験体を選択する工程；および
前記被験体に、治療上有効な量の、可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルまたはその可溶性画分および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を投与する工程、
それによって、前記被験体における前記腫瘍を処置する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記可溶性画分は、
ａ．組織に由来する脱細胞化細胞外マトリクスを部分的にまたは完全に消化して、消化したＥＣＭ材料を生成する工程；
ｂ．前記消化したＥＣＭ材料をｐＨ７．２〜約７．４へと中和して、中和した消化ＥＣＭ材料を生成する工程；
ｃ．前記中和した消化ＥＣＭ材料を、その下限臨界溶液温度を上回る温度でゲル化する工程；
ｄ．前記ゲル化したＥＣＭ材料を遠心分離して、ペレットおよび上清を生成する工程；ならびに
ｅ．前記上清および前記ペレットを単離して、前記ＥＣＭ材料の前記可溶性画分を生成する工程、
によって生成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織から調製された前記脱細胞化ＥＣＭ材料は、酸性プロテアーゼでの前記部分的な消化または前記完全な消化の前に透析されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍は固形腫瘍である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記固形腫瘍は、神経膠腫、肺がんまたは乳がんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍は神経膠腫であり、前記神経膠腫は、上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、または混合性神経膠腫である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＣＭは膀胱ＥＣＭである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＣＭは食道ＥＣＭであり、前記固形腫瘍は食道腺癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルまたはその可溶性画分は、前記腫瘍に局所投与される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍を処置する工程は、腫瘍容積を減少させること；転移の数もしくはサイズを減少させること；または前記腫瘍の症状を軽減することを含む、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍を外科的に切除する工程をさらに包含する、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体に、治療上有効な量の追加の化学療法剤を投与する工程をさらに包含する、請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
被験体において神経膠腫、乳がんまたは肺がんを処置するための、膀胱細胞外マトリクスヒドロゲルの可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルまたはその可溶性画分の使用。
【請求項２２】
被験体において食道腺癌を処置するための、食道膀胱細胞外マトリクスヒドロゲルの可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルまたはその可溶性画分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
これは、２０１７年３月２日に出願された米国仮出願第６２／４６５，９８８号（これは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
分野
これは、がんの分野、具体的には、がん（例えば、神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない）の処置のための可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルおよびその可溶性画分の使用に関する。
【０００３】
政府の支援についての承認
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金第ＣＡ２１０６９４号および第ＴＲ００１８５８号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
がんは、米国では、冠疾患に次いで、ヒトの死亡原因第２位である。世界的には、数百万人もの人々が、毎年がんで死亡している。米国のみでは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって報告されるように、がんは、１年に５０万人を遙かに超える人々の死亡を引き起こし、年間１２０万人を超える新たな症例が診断されている。がんによる死亡は増大しつつある；がんは、米国ではまもなく死亡原因第１位になると推測される。
【０００５】
神経膠腫は、高度に侵襲性かつ神経学的に破壊的な腫瘍であり、小児および成人の両方において脳腫瘍の死亡原因第１位である。悪性神経膠腫は希に、中枢神経系の外へと転移するが、それらは罹患した患者の脳にびまん性に侵襲する。脳神経膠腫の処置は、その位置、細胞タイプ、および悪性度に依存する。通常は、処置は、外科的切除、全身的化学療法および放射線療法の併用を包含する。しかし、神経膠腫の高度に浸潤性の性質、およびそれらの本質的化学療法抵抗性に起因して、腫瘍のうちの８０％は再発する。従って、処置をしても、多形膠芽腫を有する患者のメジアン生存期間は、１８ヶ月未満である。従って、がん（例えば、神経膠腫）を処置するための治療剤が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルの可溶性画分が腫瘍細胞の増殖、アポトーシスおよび移動に影響を及ぼすが、非新生物細胞には影響を及ぼさないことを、本明細書で開示される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、方法は、腫瘍細胞の増殖を低減する、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞の移動を減少させるためのものである。上記方法は、上記腫瘍細胞と有効量の、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルの可溶性画分とを接触させ、それによって、上記腫瘍細胞の増殖を低減する、上記腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または上記腫瘍細胞の移動を減少させる工程を包含する。
【０００８】
さらなる実施形態において、腫瘍を有する被験体を処置するための方法が開示される。上記方法は、上記被験体に、治療上有効な量の、ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を投与し、それによって、上記被験体において腫瘍を処置する工程を包含する。
【０００９】
具体的な非限定的例では、上記腫瘍は神経膠腫である。他の具体的な非限定的例では、上記ＥＣＭヒドロゲルは膀胱ＥＣＭヒドロゲルである。
【００１０】
さらなる非限定的な例では、上記腫瘍は食道腺癌である。他の具体的な非限定的例では、上記ＥＣＭヒドロゲルは食道ＥＣＭヒドロゲルである。
【００１１】
なお他の実施形態において、方法は、腫瘍細胞の増殖を低減する、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞の移動を減少させるためのものである。上記方法は、上記腫瘍細胞と有効量の可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルと接触させ、それによって、上記腫瘍細胞の増殖を低減する、上記腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または上記腫瘍細胞の移動を減少させる工程を包含する。具体的な非限定的例では、上記腫瘍は神経膠腫である。他の具体的な非限定的例では、上記ＥＣＭヒドロゲルは、膀胱ＥＣＭヒドロゲル、または小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）ヒドロゲルである。
【００１２】
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明からより明らかになり、添付の図面を参照しながら進められる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂ：可溶化ＥＣＭ生体足場は、神経膠腫細胞増殖を阻害する。（Ａ）高グレード初代ヒト神経膠腫細胞を、ペプシン可溶化ＥＣＭ足場で４８時間にわたって処置した。処置なしおよびペプシンコントロール群と比較して、ＳＩＳおよびＵＢＭ処置は、細胞生存性において著しい低減を生じた。可溶化ＥＣＭの効果は、組織特異的である。なぜなら真皮も精巣ＥＣＭも細胞生存性に影響を及ぼさなかったからである。（Ｂ）初代ヒト神経膠腫細胞を、ＳＩＳおよびＵＢＭに由来する可溶性画分で２４時間処置した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂ：可溶化ＥＣＭ生体足場は、神経膠腫細胞増殖を阻害する。（Ａ）高グレード初代ヒト神経膠腫細胞を、ペプシン可溶化ＥＣＭ足場で４８時間にわたって処置した。処置なしおよびペプシンコントロール群と比較して、ＳＩＳおよびＵＢＭ処置は、細胞生存性において著しい低減を生じた。可溶化ＥＣＭの効果は、組織特異的である。なぜなら真皮も精巣ＥＣＭも細胞生存性に影響を及ぼさなかったからである。（Ｂ）初代ヒト神経膠腫細胞を、ＳＩＳおよびＵＢＭに由来する可溶性画分で２４時間処置した。
【００１４】
【図２】図２：ＥＣＭヒドロゲルは、がん細胞表現型を調節する。可溶化ＥＣＭヒドロゲル、具体的には、膀胱マトリクス（ＵＢＭ）ヒドロゲルは、がん細胞を誘導して、「細胞ブリッジ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｒｉｄｇｅ）」、陰性コントロールペプシンおよび培地とは別個の表現型を形成する。その表現型はまた、ＴＧＦβ陽性コントロール（がん細胞移動の公知の誘導因子）とは別個である。
【００１５】
【図３】図３Ａ〜３Ｄ：可溶化ＥＣＭヒドロゲルは、食道腺癌増殖を減少させる。ＢｒｄＵ増殖アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）は、ペプシン−可溶化ＥＣＭヒドロゲル、具体的には、膀胱マトリクス（ＵＢＭ）ヒドロゲルおよび食道ＥＣＭ（ｅＥＣＭ）の両方が、陰性コントロールペプシンと比較して、食道上皮細胞のがん細胞増殖（ＯＥ３３，  Ｓｉｇｍａ）（Ｃ）を減少させることを示す。ｅＥＣＭは、ペプシンコントロール（Ａ）と比較して、別の食道がん細胞（ＳＫ−ＧＴ−４，  Ｓｉｇｍａ）（Ｄ）、がん前駆バレット食道細胞株（ＣＰ−Ａ，  Ｓｉｇｍａ）（Ｂ）、および正常細胞株（Ｈｅｔ−１Ａ，  ＡＴＣＣ）を減少させる。ＵＢＭは、ペプシンコントロールと比較して、ＳＫ−ＧＴ−４、ＣＰ−Ａ、またはＨｅｔ−１Ａ細胞増殖（Ａ、Ｂ、Ｄ）を減少させない。細胞を飢餓状態にし、２４時間処理し、ＢｒｄＵを２４時間パルスした（ｐｕｌｓｅｄ）。吸光度値は、複製のＳ期の間にＢｒｄＵが組み込まれたことを表し、より高い吸光度値は、増大した増殖に相当する。実験は、ｎ＝３で、技術的に四連で示される。
【００１６】
【図４】図４Ａ〜４Ｄ：可溶化ＥＣＭヒドロゲルは、がん前駆バレット食道細胞アポトーシスを増大させる。アポトーシスに対する可溶化ＥＣＭの効果を、フローサイトメトリー、ならびにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシンＶの二重染色を使用して決定した。ペプシンと比較して、ＵＢＭまたはｅＥＣＭ処理での早期および後期アポトーシス細胞の倍数変化を、Ｈｅｔ−１Ａ（Ａ）、ＣＰ−Ａ（Ｂ）、ＯＥ３３（Ｃ）、およびＳＫ−ＧＴ−４（Ｄ）に関して示す。ＣＰ−Ａ細胞については、ＵＢＭヒドロゲル処理は、ペプシンコントロールと比較して、後期アポトーシスを増大させ（ｐ＝０．００９５）、ｅＥＣＭヒドロゲル処理は、ペプシンコントロールと比較して、後期アポトーシスの増大に向かう傾向があった（ｐ＝０．０７５６）。ＵＢＭおよびｅＥＣＭヒドロゲルは、ペプシンコントロールと比較して、Ｈｅｔ−１Ａ、ＯＥ３３、またはＳＫ−ＧＴ−４細胞において、早期または後期アポトーシスに関して差異を示さなかった。
【００１７】
【図５】図５：ＥＣＭ生体足場に由来する可溶性画分および構造画分の調製のための方法論を図示する模式図。
【００１８】
【図６】図６：可溶性ＥＣＭ生体足場は、非新生物細胞の成長に影響を及ぼさない。ヒト胎児ミクログリアを、ＵＢＭ可溶性画分の漸増濃度で２４時間処理した。
【００１９】
【図７】図７：ＥＣＭ可溶性画分での処理後の細胞成長の定量。
【００２０】
【図８】図８：ＥＣＭ生体足場の可溶性画分は、神経膠腫細胞の移動を阻害する。スクラッチアッセイ。低グレード初代ヒト神経膠腫細胞（１１１９）を、ＵＢＭに由来する可溶性画分で処理した。処理の２４時間後、細胞は、処理なしコントロールと比較して、移動する能力の低減を示した。
【００２１】
【図９】図９：ＥＣＭ生体足場の可溶性画分およびＥＣＭ生体足場に由来するＭＢＶは、食道がん細胞生存性を阻害する。生存性に対するＥＣＭ生体足場の可溶性画分およびＭＢＶの効果を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。ＯＥ３３およびＯＥ１９細胞は、コントロールと比較して、ＵＢＭ  ＳＦＦ、コラゲナーゼＭＢＶ（ｃＭＢＶ）およびエラスターゼＭＢＶ（ｅＭＢＶ）で生存性の減少を示した。
【００２２】
【図１０】図１０。膀胱ＥＣＭの可溶性画分（ＵＢＭ−ＳＦ）は、神経膠腫細胞生存性を顕著に減少させた。ＵＢＭ−ＳＦは、小腸粘膜下組織の可溶性画分（ＳＩＳ−ＳＦ）または真皮ＥＣＭの可溶性画分（真皮−ＳＦ）より強力であった。
【００２３】
【図１１】図１１。種々の供給源ＥＣＭは、別個の可溶性画分を提供する。
【００２４】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃ。軟寒天コロニー形成アッセイ、１６時間（Ａ）、５６時間（Ｂ）、および１１９時間（Ｃ）。コロニー形成は、インビトロで、用量依存性様式で抑止される。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃ。軟寒天コロニー形成アッセイ、１６時間（Ａ）、５６時間（Ｂ）、および１１９時間（Ｃ）。コロニー形成は、インビトロで、用量依存性様式で抑止される。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃ。軟寒天コロニー形成アッセイ、１６時間（Ａ）、５６時間（Ｂ）、および１１９時間（Ｃ）。コロニー形成は、インビトロで、用量依存性様式で抑止される。
【００２５】
【図１３】図１３。３×ＵＢＭ−ＳＦ処理の２４時間後の０３１９細胞におけるＥｒｋ１／２およびｐＥｒｋ１／２に関する免疫細胞化学。ＵＢＭ−ＳＦは、０３１９神経膠腫細胞においてリン酸化ＥＲＫシグナル伝達を増大させる。ＵＢＭ−ＳＦは、ＭＰＡＫ／ＥＲＫ経路を通じて神経膠腫細胞増殖を減少させ得る。
【００２６】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄ。スクラッチアッセイ、０時間（Ａ）、２４時間（Ｂ）、４８時間（Ｃ）、および９６時間（Ｄ）。ＵＢＭ−ＳＦは、神経膠腫細胞移動を抑制する。ＵＢＭ−ＳＦはまた、神経膠腫細胞によって致死的である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄ。スクラッチアッセイ、０時間（Ａ）、２４時間（Ｂ）、４８時間（Ｃ）、および９６時間（Ｄ）。ＵＢＭ−ＳＦは、神経膠腫細胞移動を抑制する。ＵＢＭ−ＳＦはまた、神経膠腫細胞によって致死的である。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄ。スクラッチアッセイ、０時間（Ａ）、２４時間（Ｂ）、４８時間（Ｃ）、および９６時間（Ｄ）。ＵＢＭ−ＳＦは、神経膠腫細胞移動を抑制する。ＵＢＭ−ＳＦはまた、神経膠腫細胞によって致死的である。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄ。スクラッチアッセイ、０時間（Ａ）、２４時間（Ｂ）、４８時間（Ｃ）、および９６時間（Ｄ）。ＵＢＭ−ＳＦは、神経膠腫細胞移動を抑制する。ＵＢＭ−ＳＦはまた、神経膠腫細胞によって致死的である。
【００２７】
【図１５】図１５。Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓアッセイ、Ｎ＝４。栄養素の非存在下で、神経膠腫細胞は、ＵＢＭ−ＳＦに向かって移動する。神経膠腫細胞移動は、ＵＢＭ−ＳＦにいったん曝されると、劇的に減少される（ほぼ存在しない）。
【００２８】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄ。可溶化ＥＣＭヒドロゲルは、食道がん細胞生存性を阻害する。正常細胞、バレット細胞、およびＥＡＣ細胞の代謝活性に対する可溶化ＥＣＭの効果を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、ペプシン陰性コントロールと比較して、正常Ｈｅｔ−１ａ細胞株（Ａ）またはＣＰ−Ａ細胞株（Ｂ）の代謝活性に対して効果を有しなかった。ＵＢＭは、ペプシン陰性コントロールと比較して、ＯＥ３３（Ｃ）およびＳＫ−ＧＴ−４（Ｄ）の食道上皮がん細胞株の代謝活性を減少させた。
【００２９】
【図１７】図１７。ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、食道がん細胞シグナル伝達経路をダウンレギュレートする−全トランスクリプトームアッセイを２４時間にわたって、ペプシン陰性コントロールと比較して、ＵＢＭまたはｅＥＣＭで処理したＨｅｔ−１Ａ正常細胞およびＯＥ３３食道上皮がん細胞の遺伝子シグナチャーを同定するために使用した。差次的に発現された（２倍より大きなまたは小さな変化、一元配置ＡＮＯＶＡによる有意性ｐ＜０．０５として定義される）遺伝子を、上位のシグナル伝達経路を同定するために、偏りのない経路シグナル伝達分析を使用して分析した。注記すべきことに、ペプシン陰性コントロールと比較して、ＵＢＭおよびｅＥＣＭ処理によって調節されたその上位の差次的に発現された経路は、がん進行に関連する。ｅＥＣＭは、接着斑（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ、細胞周期、およびＤＮＡ複製をダウンレギュレートし、全トランスクリプトーム分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって示されるように、食道がん細胞表現型をダウンレギュレートする正味の効果とともに、オートファジー（制御されたがん細胞死）をアップレギュレートした。
【００３０】
【図１８】図１８。全トランスクリプトームアッセイのｑＰＣＲ確認。図１７に示される結果を、ｑＰＣＲを使用して確認した。
【００３１】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂ。ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、ＯＥ３３  ＡＫＴリン酸化をダウンレギュレートし、Ｈｅｔ−１Ａ  ＡＫＴリン酸化を増大させる。ウェスタンブロットを、ｐＡＫＴ（がん細胞増殖の陽性レギュレーター）、細胞代謝、および細胞生存に関して、ペプシン、ＵＢＭ、およびｅＥＣＭで０時間、６時間または２４時間で処理したＯＥ３３およびＨｅｔ−１Ａ細胞に対して行った。ＯＥ３３細胞およびＨｅｔ−１Ａ細胞は、ペプシンコントロールにおいてｐＡＫＴの変化を全く示さなかった。ＯＥ３３細胞は、２４時間のＵＢＭ−ＥＣＭ処理でｐＡＫＴ発現におけるダウンレギュレーション、ならびに６時間および２４時間のｅＥＣＭ処理でのｐＡＫＴ発現におけるダウンレギュレーションを示す（図２６Ａ）。対照的に、Ｈｅｔ−１Ａ細胞は、６時間および２４時間のＵＢＭ−ＥＣＭおよびｅＥＣＭ処理でのｐＡＫＴ発現におけるダウンレギュレーションを示した（図２６Ｂ）。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲは、ＢＥからＥＡＣへの進行を含め、多くのがんにおいてアップレギュレートされることが示された。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔは、ＥＡＣシグナル伝達経路であるが、その活性化はまた、非悪性細胞の創傷治癒プロセスにおいて極めて重要であることが示される。同じＥＣＭヒドロゲル刺激に応答して、Ｈｅｔ−１ＡおよびＯＥ３３細胞におけるリン酸化ＡＫＴの逆のレギュレーションが、以前のがんの設定において組織再構成を促進する治療に都合がよい。
【００３２】
【図２０】図２０。ＵＢＭ可溶性画分は、初代神経膠腫細胞においてカスパーゼ−３媒介性アポトーシスを誘導する。正常な初代ヒト包皮線維芽細胞または初代ヒト神経膠腫細胞（０３１９）を、３ｍｇ／ｍｌ  ＵＢＭ可溶性画分（ＵＢＭ−ＳＦ）で１２時間にわたって処理した。位相差顕微鏡法は、正常ヒト線維芽細胞とは対照的に、初代ヒト神経膠腫細胞がＵＢＭ−ＳＦでの処理後に迅速なアポトーシスを受けることを示す。１２時間（ｈｒ）でのＮｕｃｖｉｅｗカスパーゼ−３基質を使用する細胞培養物の評価は、カスパーゼ−３がＵＢＭ−ＳＦのアポトーシス効果を媒介していることを示す。
【００３３】
【図２１】図２１。ＵＢＭ可溶性画分は、正常初代ヒト星状細胞の増殖速度を増大する。初代ヒト星状細胞、初代ヒト神経膠腫細胞（０３１９）、または不死化神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）を、３ｍｇ／ｍｌ  ＵＢＭ可溶性画分（ＵＢＭ−ＳＦ）ありまたはなしで２４時間処理した。そのデータは、ＵＢＭ−ＳＦが正常ヒト初代星状細胞の増殖を増大させたが、神経膠腫細胞の数を有意に減少させたことを示す。
【００３４】
【図２２】図２２。ＵＢＭ可溶性画分は、初代神経膠腫細胞に対して毒性であるが、初代ヒト星状細胞に対しては毒性ではない。初代ヒト星状細胞、初代ヒト神経膠腫細胞（０３１９）、または不死化神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）は、３ｍｇ／ｍｌ  ＵＢＭ可溶性画分（ＵＢＭ−ＳＦ）ありまたはなしで２４時間にわたって処理した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙからの結果は、ＵＢＭ−ＳＦが正常ヒト初代星状細胞の生存性に影響を及ぼさなかったが、神経膠腫細胞の生存性を有意に減少させたことを示す。
【００３５】
【図２３】図２３。ＵＢＭ可溶性画分は、種々の新生物細胞における細胞成長を阻害する。細胞を、示された試験物品で２４時間処理した。細胞生存性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
【００３６】
【図２４】図２４。テモゾロミドとＵＢＭ−ＳＦとの比較。テモゾロミド（ＴＭＺ）は、多形膠芽腫（ＧＢＭ）および星状細胞腫を処置するために使用される経口アルキル化剤である。ヒトミクログリア細胞（ＣＨＭＥ５）、初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、および２種の初代ヒト神経膠腫細胞株（１０１５および１１１９）を、漸増濃度のＴＭＺまたはＵＢＭ−ＳＦで２４時間処理して、各試験基質の治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を比較した。ＴＭＸは、正常細胞株および新生物細胞株の両方に対して毒性であった。これは、ＴＭＺが治療濃度域を有さないか、またはせいぜいで、非常に狭い治療濃度域を有することを示唆する。対照的には、ＵＢＭ−ＳＦは、その基質が正常細胞生存性に影響を及ぼすことなく、新生物細胞を優先的に殺滅する大きな治療濃度域を有した。
【００３７】
【図２５】図２５。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＵＢＭ−ＳＦの分画。ＵＢＭ−ＳＦを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ樹脂を使用するＳＥＣによって分解した（右パネル）。その画分を、示されるようにプールし、ヒトミクログリア細胞（ＣＨＭＥ５）、初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、および２種の初代ヒト神経膠腫細胞株（０３１９および１１１９）を処理するために使用した。そのデータは、画分９〜２２は、神経膠腫細胞を優先的に殺滅することを示す（左パネル）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
可溶化ＥＣＭ、またはＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分が、腫瘍細胞（例えば、悪性腫瘍細胞）の増殖を減少させる、アポトーシスを増大させる、および／または移動を減少させるために使用され得ることが、本明細書で開示される。ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分は、正常細胞に対して細胞傷害性ではなく、周りの実質組織に対して有害効果を誘発しない。従って、可溶化ＥＣＭ、および／またはＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分は、被験体において腫瘍を処置するために有用である。具体的な非限定的例では、その腫瘍は神経膠腫である、および／またはその可溶性ＥＣＭヒドロゲルは、膀胱ＥＣＭに由来する。
【００３９】
腫瘍細胞の増殖を低減する、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞の移動を減少させるための方法がまた、本明細書で開示される。その方法は、その腫瘍細胞と有効量の可溶化ＥＣＭまたはＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分とを接触させ、それによって、その腫瘍細胞の増殖を低減する、その腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる、および／またはその腫瘍細胞の移動を減少させる工程を包含する。具体的な非限定的例では、その腫瘍は神経膠腫である。他の具体的な非限定的例では、そのＥＣＭヒドロゲルは、膀胱ＥＣＭヒドロゲルまたは小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）ヒドロゲルである。これらの方法はまた、被験体の処置に有用である。
【００４０】
用語
別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、発行Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、発行Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，発行ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．，  １９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出され得る。
【００４１】
本開示の種々の実施形態の検討を容易にするために、具体的用語の以下の説明が提供される：
【００４２】
酸性プロテアーゼ：ペプチド結合を切断する酵素であって、その酵素は、酸性ｐＨにおいてペプチド結合を切断する活性の増大を有するもの。例えば、および限定なしに、酸性プロテアーゼは、ペプシンおよびトリプシンを含み得る。
【００４３】
腺癌：身体のいくつかの部分で起こり得る悪性腫瘍のタイプ。それは、腺起源、腺の特徴、または両方を有する上皮組織の新生物である。
【００４４】
アポトーシス：多細胞生物において起こるプログラムされた細胞死のプロセス。アポトーシスは、特徴的な細胞の変化（形態）または死滅を含む。これらの変化としては、ブレブ形成、細胞収縮、核フラグメント化、クロマチン凝縮、染色体ＤＮＡフラグメント化、および全体的なｍＲＮＡ分解（ｇｌｏｂａｌ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ）が挙げられる。
【００４５】
塩基：７より大きいｐＨを有する化合物または化合物の溶液。例えば、および限定なしに、その塩基は、アルカリ水酸化物またはアルカリ水酸化物の水性溶液である。ある種の実施形態において、その塩基は、ＮａＯＨ、またはＰＢＳ中のＮａＯＨである。
【００４６】
がん：分化の喪失を伴う特徴的退形成を受け、成長の速度を増大させ、周りの組織に侵襲し、そして転移の能力がある良性または悪性の腫瘍。例えば、甲状腺がんは、甲状腺組織の中またはその組織から生じる腫瘍であり、食道がんは、食道組織の中またはその組織から生じる腫瘍である。残存がんは、そのがんを低減または根絶するために被験体に与えられる処置のうちのいずれかの形態の後に、その被験体に残るがんである。転移性がんとは、転移性のがんが由来するその元の（原発の）がんの起源の部位以外の身体中の１またはこれより多くの部位における腫瘍である。がんとしては、固形腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
遠心分離：遠心力が混合物に適用され、その混合物のより密度の大きな構成要素が、混合物中の他の密度のより小さな構成要素に対して遠心分離機の軸から離れて移動するプロセス。その混合物に適用される力は、遠心分離ローターの速度、および回転の半径の関数である。大部分の適用において、回転力は、沈殿物（ペレット）を生じて、遠心チューブの底に集まり、ここでその残りの溶液は、適切には、「上清（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）」または「上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）」といわれる。他の類似の適用では、密度ベースの分離または「勾配遠心分離（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）」技術は、特定の種を、その所望の構成要素より密度の大きなまたはより密度の小さな両方の構成要素を含む混合物から単離するために使用される。
【００４８】
遠心分離ローターの円運動の間に、適用される力は、回転の半径および角速度の積であり、ここでその力は、旧来から、地球表面での重力に起因する標準加速度「ｇ」に対する加速度として表現される。その適用される遠心力は、「相対遠心力（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｏｒｃｅ）」（ＲＣＦ）といわれ、「ｇ」の倍数で表される。
【００４９】
化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）；化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）：本明細書で使用される場合、異常な細胞成長によって特徴づけられる疾患の処置において治療上の有用性を有する任意の化学的薬剤。このような疾患としては、腫瘍、新生物、およびがん、ならびに過形成的成長によって特徴づけられる疾患（例えば、乾癬）が挙げられる。一実施形態において、化学療法剤は、固形腫瘍のような新生物を処置するにあたって有用な薬剤である。一実施形態において、化学療法剤は、放射性分子である。当業者は、有用な化学療法剤を容易に同定し得る（例えば、Ｓｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  第１４版のＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  第８６章；  Ｐｅｒｒｙら，Ａｂｅｌｏｆｆ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  第２版，  （Ｃ）  ２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  ＩｎｃのＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  第１７章；  Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ．，  Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ．  （編）：  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  第２版．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  １９９５；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＤＳ，  Ｋｎｏｂｆ  ＭＦ，  Ｄｕｒｉｖａｇｅ  ＨＪ  （編）：  Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  第４版．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  １９９３）を参照のこと）。化学療法剤としては、当業者によって公知のもの（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、アザチオプリン、シクロホスファミド、代謝拮抗物質（例えば、フルダラビン）、抗新生物剤（例えば、エトポシド、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンクリスチン）、カルボプラチン、シスプラチナおよびタキサン（例えば、タキソール）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。ラパマイシンは、化学療法剤としても使用されている。
【００５０】
粉砕する（ｃｏｍｍｉｎｕｔｅ）（粉砕（ｃｏｍｍｉｎｕｔｉｏｎ）および粉砕する（ｃｏｍｍｉｎｕｔｉｎｇ））：すり潰す（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、ブレンドする（ｂｌｅｎｄｉｎｇ）、切り刻む（ｓｈｒｅｄｄｉｎｇ）、スライスする（ｓｌｉｃｉｎｇ）、製粉する（ｍｉｌｌｉｎｇ）、切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）、切り刻む（が挙げられるが、これらに限定されない）ことによって、より大きな粒子をより小さな粒子へと縮小させるプロセス。ＥＣＭは、任意の形態（湿潤化した（ｈｙｄｒａｔｅｄ）形態、凍結形態、風乾形態、凍結乾燥形態、粉末化形態、シート形態が挙げられるが、これらに限定されない）にある間に粉砕され得る。
【００５１】
接触する：直接的な物理的会合にある配置。固体形態および液体形態の両方の状態を含む。
【００５２】
サイトカイン：用語「サイトカイン」とは、ナノモル濃度からピコモル濃度の液性調節因子として作用し、正常のまたは病的な条件のいずれか下で、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する可溶性タンパク質およびペプチドの多様な群に対する包括的な名称として使用される。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接的に媒介し、細胞外環境において起こるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、トランスフォーミング増殖因子、およびインターフェロン−γが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
診断：疾患を、その徴候、症状および種々の検査の結果によって同定するプロセス。そのプロセスを通じて達した結論も、診断といわれる。一般に行われる検査の形態としては、血液検査、医用画像化、および生検が挙げられる。
【００５４】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）：細胞成長のための天然のまたは人工の足場。天然のＥＣＭ（多細胞生物（例えば、哺乳動物およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない）において見出されるＥＣＭ）は、構造生体分子および非構造生体分子（コラーゲン、エラスチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、抗菌物質、化学誘因物質、サイトカイン、および増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない）の複雑な混合物である。哺乳動物において、ＥＣＭはしばしば、約９０％のコラーゲンを、その種々の形態において含む。ＥＣＭの組成および構造は、その組織の供給源に依存して変動する。例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、膀胱マトリクス（ＵＢＭ）、食道（Ｅ）および肝臓間質ＥＣＭは各々、各組織に必要とされる特有の細胞ニッチに起因して、それらの全体的な構造および組成において異なる。無傷の「細胞外マトリクス」および「無傷のＥＣＭ」とは、その構造生体分子および非構造生体分子（コラーゲン、エラスチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、抗菌物質、化学誘因物質、サイトカイン、および増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない）の活性を保持する細胞外マトリクスである。
【００５５】
そのＥＣＭ内の生体分子の構造および／または活性は、化学的にまたは機械的に、例えば、そのＥＣＭを架橋することによっておよび／または透析することによって、変更され得るか、または除去され得る。無傷のＥＣＭは本質的に、そのＥＣＭが消化、透析および／もしくは架橋プロセスに、または可溶化の前に、ＥＣＭの貯蔵および取り扱いの間に自然に起こるプロセス以外の条件に供されていないことを意味して、酵素により消化されていない、架橋されていないおよび／または透析されていない。従って、実質的に架橋されるおよび／または透析される（本明細書で記載されるその使用においてＥＣＭのゲル化および機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない些細な様式以外のもので）ＥＣＭは、「無傷」であると見做されない。「無細胞」ＥＣＭは、ＥＣＭが維持されるように、その細胞を除去するように処理されている供給源組織を表す。
【００５６】
ゲル化：ゾルからのゲルの形成。
【００５７】
神経膠腫：グリア細胞から生じる腫瘍。神経膠腫としては、上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、および混合性神経膠腫が挙げられる。神経膠腫は、グレードによって特徴づけられ得る。世界保健機関（ＷＨＯ）は、神経膠腫をグレードＩ〜ＩＶとして分類する。低グレード神経膠腫（ＷＨＯグレードＩＩ）は、十分に分化され（退形成性でない）、良性の傾向を示し、一般にはより良好な予後を有する。しかし、それらは再発し得、時間を経てグレードが増大するので、それらは悪性として分類される。高グレード（ＷＨＯグレードＩＩＩ〜ＩＶ）神経膠腫は、未分化または退形成性である。高グレード神経膠腫は悪性であり、不十分な予後を有する。神経膠腫は、テント上（小脳のテントの上、および大部分は成人において見出される）、テント内（小脳のテントの下、および大部分は、小児において見出される）、または橋（脳幹の橋に位置する）にある。神経膠腫の症状は、腫瘍が中枢神経系内で位置する場所に依存し、影響を及ぼされる。脳の神経膠腫の症状は、頭痛、嘔吐、発作、および脳神経障害である。視神経膠腫の症状は、視力喪失である。脊髄神経膠腫の症状は、疼痛、虚弱、または四肢の痺れである。一般に神経膠腫は、脳脊髄液を介して拡がり、脊髄への「直接転移（ｄｒｏｐ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）」を引き起こし得る。
【００５８】
ヒドロゲル：親水性であり、ときおり、水が分散媒であるコロイド性ゲルとして見出されるポリマー鎖のネットワーク。ヒドロゲルは、高度に吸収性の天然または合成のポリマーネットワークである。ヒドロゲルはまた、天然の組織に類似する程度の柔軟性を有する。
【００５９】
炎症：組織への傷害によって誘発される局所的な防御的応答。炎症は、正常な（健康的な）環境下で組織のこのような領域内で見出される白血球の数を超える数の任意のクラスの白血球の任意の組織空間、ユニット、または領域における外観またはそれらへの移動によって特徴づけられる。炎症は、有害な刺激（例えば、病原体、損傷した細胞、または刺激物）に対する血管組織の複雑な生物学的応答によって組織化される。
【００６０】
単離される：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質）は、その構成要素が天然に起こるマトリクス、細胞または生物中の他の生物学的構成要素（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離されているか、離れて生成されているか、または離れて精製されている。そのようにして「単離されて」いる核酸、ペプチドおよびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞での組換え発現によって調製される核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学合成された核酸を包含する。単離されたＥＣＭは、そのＥＣＭを生成する細胞から分離されている。
【００６１】
等張性緩衝化溶液：７．２〜７．８の間のｐＨに緩衝化されかつ等張性の環境を促進するために塩の平衡化濃度を有する溶液。
【００６２】
哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」とは、ヒトおよび脊椎動物被験体の両方を含む。
【００６３】
転移：身体において１つの場所からもう１つの場所へのがんの拡がり。これは、そのがん細胞が元の腫瘍部位を離れて血流、リンパ系、脳脊髄液を介して、または拡大によって移動する複雑な一連の工程である。
【００６４】
疾患を防止または処置する：疾患を「防止する」とは、例えば、疾患（例えば、がん）に対する素因を有することが既知である人物において、疾患の部分的または完全な発生を阻害することをいう。既知の素因を有する人物の例は、家族に乳がんの病歴がある者、または被験体をある状態（例えば、黒色腫）に罹りやすくする因子に曝されている者である。「処置」とは、疾患または病的状態が発生し始めた後に、その徴候または症状を改善する治療的介入をいう。いくつかの実施形態において、処置とは、腫瘍のサイズの縮小、転移の数および／もしくはサイズの減少、またはその腫瘍の症状の減少をいう。
【００６５】
増殖：細胞の数が増大するような細胞の分裂。細胞分裂のプロセスは、有糸分裂といわれる。
【００６６】
治療剤：包括的な意味で使用される場合、それは、処置剤、予防剤、および補充剤（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）を含む。「処置」または「処置する」とは、ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分のような物質を、測定可能に任意の疾患症状を低減する、疾患の進行を遅らせる、または例えば、腫瘍の疾患退縮を引き起こすために十分な量において、患者に提供することを意味する。ある種の実施形態において、その疾患の処置は、その患者がその疾患（例えば、腫瘍）の症状を呈する前に開始され得る。
【００６７】
治療上有効な量：組成物（例えば、ＥＣＭヒドロゲル）の「治療上有効な量」とは、患者に投与される場合に、治療上の利益（例えば、症状の改善）を提供する、進行を低減する、または疾患退縮を引き起こすために有効な量を意味する。ＥＣＭヒドロゲルの特定された可溶性画分の量は、処置されている被験体において望ましい効果を達成するために十分である。治療上有効な量は、全身的にまたは局所的に（例えば、脳に）投与され得る。さらに、有効量の、ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分は、単一用量において、または時間を経ていくつかの用量において、投与され得る。しかし、その有効量は、適用される調製物、処置されている被験体、その病気（ａｆｆｌｉｃｔｉｏｎ）の重篤度およびタイプ、ならびにその化合物の投与様式に依存する。本明細書で開示される方法において有用なＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分は、医療的および獣医学的設定において等しい適用を有する。従って、一般的用語「被験体」または「患者」は、全ての動物（ヒトまたは獣医学的被験体（例えば、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ）が挙げられるが、これらに限定されない）を含むことが理解される。
【００６８】
腫瘍：細胞の異常な成長（これは、良性または悪性であり得る）。悪性疾患としばしば関連する他の特徴としては、転移、隣接する細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルでのサイトカインもしくは他の分泌産物の放出、および炎症もしくは免疫学的応答の抑制もしくは増悪、周りのもしくは遠隔の組織もしくは器官（例えば、リンパ節など）の侵襲が挙げられる。「転移性疾患」とは、元の腫瘍部位に残っており、身体の他の部分へと、例えば、血流またはリンパ系を介して移動するがん細胞をいう。
【００６９】
個体における腫瘍の量は、その腫瘍の数、容積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）である。周りの組織に侵襲するおよび／または転移し得る腫瘍は、「悪性」といわれる。血液腫瘍の例としては、白血病（急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、および慢性リンパ性白血病）が挙げられる）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行性および高グレード形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および骨髄異形成が挙げられる。
【００７０】
固形腫瘍（例えば、肉腫および癌腫）の例としては、以下が挙げられる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ系悪性疾患、膵臓がん、乳がん（基底乳癌（ｂａｓａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺管癌および小葉乳癌（ｌｏｂｕｌａｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が挙げられる）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）。１つの非限定的な例では、腫瘍は神経膠腫である。
【００７１】
超音波処理：１５ｋＨｚより高くかつ４００ｋＨｚより低い周波数での超音波に曝すプロセス。
【００７２】
別段説明されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が別段明示的に示さなければ、複数形の言及も含む。同様に、文言「または（ｏｒ）」とは、状況が別段明示的に示さなければ、「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値が近似値であり、説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。本明細書で記載されるものに類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）とは、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）を意味する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合には、本明細書（用語の説明を含む）が優先する。さらに、その材料、方法および例は、例証に過ぎず、限定であることを意図しない。
【００７３】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ヒドロゲルおよびその可溶性画分
ＥＣＭヒドロゲルを調製するための方法は、例えば、米国特許第８，３６１，５０３号に開示される。任意のタイプの細胞外マトリクス組織が、本明細書で開示されるとおりの方法において使用され得るヒドロゲルを生成するために使用され得る（ＥＣＭに関連する米国特許第４，９０２，５０８号；同第４，９５６，１７８号；同第５，２８１，４２２号；同第５，３５２，４６３号；同第５，３７２，８２１号；同第５，５５４，３８９号；同第５，５７３，７８４号；同第５，６４５，８６０号；同第５，７７１，９６９号；同第５，７５３，２６７号；同第５，７６２，９６６号；同第５，８６６，４１４号；同第６，０９９，５６７号；同第６，４８５，７２３号；同第６，５７６，２６５号；同第６，５７９，５３８号；同第６，６９６，２７０号；同第６，７８３，７７６号；同第６，７９３，９３９号；同第６，８４９，２７３号；同第６，８５２，３３９号；同第６，８６１，０７４号；同第６，８８７，４９５号；同第６，８９０，５６２号；同第６，８９０，５６３号；同第６，８９０，５６４号；および同第６，８９３，６６６号を参照のこと）。ある種の実施形態において、そのＥＣＭは、脊椎動物から、例えば、および限定なしに、温血の哺乳類の脊椎動物（ヒト、サル、ウマ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられるが、これらに限定されない）から単離される。具体的な非限定的例では、そのＥＣＭは、ブタまたはヒトのものである。
【００７４】
そのＥＣＭは、任意の器官または組織（膀胱、腸、肝臓、食道および真皮が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。そのＥＣＭは、細胞培養物から得られ得る。一実施形態において、そのＥＣＭは、膀胱から単離される。別の実施形態において、そのＥＣＭは食道に由来する。そのＥＣＭは、そのＥＣＭの基底膜部分を含んでいてもよいし、そうでなくてもよい。ある種の実施形態において、そのＥＣＭは、少なくとも基底膜の一部を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、米国特許第８，３６１，５０３号（本明細書に参考として援用される）のように、膀胱ＥＣＭ（例えば、ブタ膀胱ＥＣＭ）は、膀胱組織を擦過して、スカルペルハンドルおよび湿らせたガーゼとともに長手方向の拭き取り動作を使用して、漿膜および筋層の両方を含むその外側の層を除去することによって調製される。その組織セグメントの外反後に、その粘膜の内腔部分は、その同じ拭き取り動作を使用して下にある組織から剥離される。いくつかの実施形態において、粘膜下組織の穿孔が防止される。これらの組織を除去した後、その得られたＥＣＭは、主に粘膜下組織からなる。脱細胞化真皮ＥＣＭからのヒドロゲルの生成は、Ｗｏｌｆら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３３：７０２８−７０３８，２０１２（本明細書に参考として援用される）に開示される。食道組織からのＥＣＭの生成は、例えば、Ｂａｄｙｌａｋら  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ．３５（７）：１０９７−１０３，２０００およびＢａｄｙｌａｋら，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．２００５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１２８（１）：８７−９７，２００５（ともに本明細書に参考として援用される）で開示される。米国特許第６，８９３，６６６号（本明細書に参考として援用される）は、膀胱、皮膚、食道および小腸からのＥＣＭの生成を開示する。
【００７６】
市販のＥＣＭ調製物は、本明細書で記載される方法、デバイスおよび組成物においても使用され得る。一実施形態において、そのＥＣＭは、小腸粘膜下組織またはＳＩＳに由来する。市販の調製物としては、ＳＵＲＧＩＳＩＳＴＭ、ＳＵＲＧＩＳＩＳ−ＥＳＴＭ、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳＴＭ、およびＳＴＲＡＴＡＳＩＳ−ＥＳＴＭ（Ｃｏｏｋ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄ．）ならびにＧＲＡＦＴＰＡＴＣＨＴＭ（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．；  Ｃａｎｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、そのＥＣＭは、真皮に由来する。市販の調製物としては、ＰＥＬＶＩＣＯＬＴＭ（欧州ではＰＥＲＭＡＣＯＬＴＭとして販売；  Ｂａｒｄ，  Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，  Ｇａ．）、ＲＥＰＬＩＦＯＲＭＴＭ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ；  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．）およびＡＬＬＯＤＥＲＭＴＭ（ＬｉｆｅＣｅｌｌ；  Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，  Ｎ．Ｊ．）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、そのＥＣＭは、膀胱に由来する。市販の調製物としては、ＵＢＭ（Ａｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；  Ｊｅｓｓｕｐ，  Ｍｄ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
ＥＣＭの調製のための組織は、多くの種々の方法で採取され得、一旦採取されると、その採取された組織の種々の部分が使用され得る。ＥＣＭはまた、食道および小腸から調製されており、ヒドロゲルは、このＥＣＭから調製されている（例えば、Ｋｅａｎｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ，  ２１（１７−１８）：  ２２９３−２３００，  ２０１５（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。食道ＥＣＭは、外筋層（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｅｘｔｅｒｎａ）から粘膜および粘膜下組織を機械的に分離し、トリプシンを含む緩衝液中でその粘膜層を消化し、続いて、スクロース、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ１００（登録商標）、デオキシコール酸、過酢酸およびＤＮＡｓｅに曝すことによって調製され得る。小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）は、無傷の小腸から、その粘膜下組織、粘膜筋板、および基底緻密層（ｂａｓｉｌａｒ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）を無傷のまま残して、粘膜、漿膜、および外筋層（ｔｕｎｉｃａ  ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｅｘｔｅｒｎａ）の表面層を機械的に除去することによって、調製され得る。次いで、ＳＩＳは、過酢酸で処理される。例示的なプロトコルは、Ｋｅａｎｅらにおいて提供される。真皮ヒドロゲルは、例えば、Ｗｏｌｆら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．  ２０１３．  ３５（２５）：６８３８-４９．  ＰＭＩＤ：  ２３８７３８４６．  ＰＭＣＩＤ：  ３８０８５０５（本明細書に参考として援用される）に開示されるように、生成され得る。
【００７８】
一実施形態において、そのＥＣＭは、膀胱マトリクス（ＵＢＭ）を調製するために、採取したブタ膀胱から単離される。過剰な結合組織および残尿を、その膀胱から除去する。その漿膜、外筋層、粘膜下組織および粘膜筋板の大部分を、機械的剥脱によって、または酵素処理、湿潤化、および剥脱の組み合わせによって、除去され得る。これらの組織の機械的除去は、長手方向の拭き取り動作を使用して剥脱して、その外側の層（特に、反管腔側の平滑筋層）およびさらには粘膜の管腔部分（上皮層）を除去することによって達成され得る。これらの組織の機械的除去は、例えば、Ａｄｓｏｎ−Ｂｒｏｗｎピンセットおよびメッツェンバウム剪刀で腸間膜組織を除去し、湿らせたガーゼを巻き付けたスカルペルハンドルまたは他の剛性の物体での長手方向の拭き取り動作を使用して筋層および粘膜下組織を拭い去ることによって達成される。その粘膜の上皮細胞はまた、脱上皮化溶液（例えば、および限定なしに、高張性塩類溶液）中に組織を浸漬することによって解離され得る。その得られたＵＢＭは、その粘膜の基底膜および隣接する固有層を含み、これは、過酢酸でさらに処理され、凍結乾燥および粉末化される（米国特許第８，３６１，５０３号（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【００７９】
真皮部分は、ＥＣＭヒドロゲルの調製のために使用され得る（ＰＣＴ出願番号２０１５／１５１６４７２８（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。具体的な非限定的例では、その真皮は、３００  ＲＰＭで、室温において以下の溶液中、ボルテックスシェイカーで０．２５％  トリプシン／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（すなわち、ＳＤＳなし）とともに脱細胞化され得る：  ０．２５％  トリプシンで６時間、１×；  脱イオン水で１５分間、３×；  ７０％  エタノールで１０〜１２時間、ｌ×；  ３％  Ｈ２Ｏ２で１５分間、１×、脱イオン水で１５分間、２×；  ０．２６％  ＥＤＴＡ／０．６９％  Ｔｒｉｓ中の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で６時間、１×および次いで一晩、１×；  脱イオン水で１５分間、３×；  ０．１％  過酢酸／４％  エタノールで２時間、１×；  ＰＢＳで１５分間、２×；および最後に脱イオン水で１５分間、２×。次いで、真皮シートを凍結乾燥し、その後、粒状形態へとワーリングブレンダーおよび＃２０メッシュスクリーンを有するＷｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用して縮小される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、その上皮細胞は最初に、その組織を脱上皮化溶液（例えば、高張性塩類溶液（例えば、および限定なしに、１．０Ｎ  塩類溶液））中に１０分間〜４時間の範囲の期間にわたって先ず浸漬することによって剥離され得る。高張性塩類溶液への曝露は、上皮細胞をその下にある基底膜から効果的に除去する。最初の剥離手順後に残っている組織は、上皮基底膜およびその上皮基底膜に対して反管腔側の組織層を含む。この組織は、次に、反管腔側組織の大部分を除去するが、上皮基底膜を除去しないさらなる処理に供される。その外側の漿膜、外膜、平滑筋組織、粘膜下組織および粘膜筋板の大部分は、機械的剥脱によって、または酵素処理、湿潤化、および剥脱の組み合わせによって、その残りの脱上皮化組織から除去される。
【００８１】
ＥＣＭは、任意の数の標準的技術（過酢酸への曝露、低線量のγ線照射、ガスプラズマ滅菌、エチレンオキシド処理または電子線処理が挙げられるが、これらに限定されない）によって滅菌され得る。より代表的には、ＥＣＭの滅菌は、０．１％（ｖ／ｖ）  過酢酸、４％（ｖ／ｖ）  エタノール、および９５．９％（ｖ／ｖ）  滅菌水中に２時間浸漬することによって得られる。その過酢酸残渣は、１５分間、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で２回、および１５分間滅菌水で２回洗浄することによって除去される。ＥＣＭ材料は、プロピレンオキシドまたはエチレンオキシド処理、γ線照射処理（０．０５〜４ｍＲａｄ）、ガスプラズマ滅菌、過酢酸滅菌、または電子線処理によって滅菌され得る。そのＥＣＭは、グルタルアルデヒド（これは、タンパク質材料の架橋を引き起こす）での処理によっても滅菌され得るが、この処理は、ゆっくりと再吸収されるか、または全く再吸収されず、構築的リモデリングではなくむしろ瘢痕組織形成または被包により似ている宿主リモデリングの異なるタイプを促すように、その材料を実質的に変更させる。タンパク質材料の架橋はまた、カルボジイミドまたは脱水熱処理法（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）または光酸化法で誘導され得る。米国特許第８，３６１，５０３号で開示されるように、ＥＣＭは、０．１％（ｖ／ｖ）  過酢酸（ａ）、４％（ｖ／ｖ）  エタノール、および９６％（ｖ／ｖ）  滅菌水中に２時間浸すことによって消毒される。次いで、そのＥＣＭ材料は、１５分間、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で２回、および１５分間、脱イオン水で２回、洗浄される。
【００８２】
目的の組織の単離の後に、脱細胞化を、種々の方法（例えば、および限定なしに、高張性塩類溶液、過酢酸、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ（登録商標）または他の界面活性剤への曝露）によって行う。滅菌および脱細胞化は、同時であり得る。例えば、および限定なしに、過酢酸での滅菌（上記）はまた、そのＥＣＭを脱細胞化するように働き得る。脱細胞化ＥＣＭは、次いで、乾燥されるか、凍結乾燥（フリーズドライ）されるかまたは風乾され得るかのいずれかである。乾燥したＥＣＭは、引き裂く、製粉する、切断する、すり潰す、および剪断する、が挙げられるが、これらに限定されない方法によって粉砕され得る。その粉砕したＥＣＭはまた、例えば、および限定なしに、凍結または凍結乾燥した状態ですり潰すかまたは製粉するような方法によって、粉末化形態へとさらに加工され得る。可溶化ＥＣＭ組織を調製するために、粉砕したＥＣＭは、消化溶液を形成するために酸性溶液中の酸性プロテアーゼで消化される。
【００８３】
一実施形態において、その脱細胞化ＥＣＭ材料は、その酸性プロテアーゼによって部分的に消化される。一例では、その脱細胞化ＥＣＭ材料は、１ｍｇ／ｍＬ  凍結乾燥した粉末化ＥＣＭ材料を、０．０１Ｍ  ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬ  ペプシンで４８時間消化するよりは、あまり完全には消化されない。別の例では、その脱細胞化ＥＣＭ材料は、１０ｍｇ／ｍＬ  凍結乾燥した粉末化ＥＣＭ材料を０．０１Ｍ  ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬ  ペプシンで４８時間消化するよりは、あまり完全には消化されない。１つのさらなる実施形態において、そのＥＣＭ材料中のヒアルロン酸は、非消化ＥＣＭ材料と比較して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満または１０％未満消化される（ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ２０１５／１６４７２８（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【００８４】
ＥＣＭの消化溶液は、代表的には、室温においてある種の量の時間にわたって一定に撹拌して維持される。そのＥＣＭ消化物は、直ぐに使用され得るか、または−２０℃で貯蔵されるか、または例えば、および限定なしに、−２０℃もしくは−８０℃で凍結され得る。従って、そのＥＣＭ消化物は、可溶化形態で維持され得る。ヒドロゲルを可溶化形態で維持するための方法は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／５２２６１（２０１６年９月１０日出願、本明細書に参考として援用される）に開示される。このＰＣＴ出願に開示されるこれらの方法のうちのいずれかは、腫瘍を処置する可溶化ヒドロゲルまたはその可溶性画分を生成するために有用である。
【００８５】
そのＥＣＭが一旦可溶化（代表的には、実質的に完全に）されると、その溶液のｐＨは、７．２〜７．８の間に、および一実施形態によればｐＨ７．４に上昇される。塩基（例えば、ヒドロキシルイオンを含む塩基（ＮａＯＨが挙げられる））は、その溶液のｐＨを上昇させるために使用され得る。同様の緩衝液（例えば、等張性緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられるが、これらに限定されない））は、その溶液を目標ｐＨにするために、またはそのゲルのｐＨおよび等張性の強度を目標レベル（例えば、生理学的ｐＨおよびイオン条件）に維持することを助けるために、使用され得る。これは、可溶化ＥＣＭヒドロゲルである「プレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）」溶液を形成する。その中和した消化物溶液（プレゲル、可溶化ＥＣＭヒドロゲル）は、下限臨界溶液温度でゲル化され得る（ＰＣＴ公開番号２０１５／１６４７２８（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【００８６】
そのＥＣＭヒドロゲルは、温度を上昇した際にゲルを形成する（ゾルからゲルへの転移）。リバースゲル（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｌ）におけるその下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は、リバースゲル化ポリマーがその溶媒（例えば、水または水性溶媒）中で可溶性であるより低い温度である。温度がリバースゲルにおけるＬＣＳＴより高く上昇するとき、ヒドロゲルが形成される。ポリマーのリバースゲル化およびそのＬＣＳＴに対する関係の一般的概念は、化学分野で広く公知である。本明細書で記載されるＥＣＭゲルは、例えば、脱細胞化した無傷のＥＣＭから、以下で記載されるように、ＥＣＭ材料を酸性プロテアーゼで消化し、その材料を中和してプレゲルを形成し、そのプレゲルの温度をそのプレゲルのＬＣＳＴを上回って上昇させてそのプレゲルがゲル化する（例えば、ヒドロゲルを形成する）ことを引き起こすことによって、調製される。酸性プロテアーゼ消化したものの溶液からゲルへの転移温度は、代表的には、１０℃〜４０℃の範囲内およびその間の任意の増分または範囲内（例えば、２０℃〜３５℃）である。例えば、そのプレゲルは、ヒドロゲルを形成するために３７℃へと加温され得る。次いで、そのヒドロゲルは遠心分離され、その可溶性画分が集められる。その得られたヒドロゲルの可溶性構成要素からその構造構成要素を分離するために、そのヒドロゲルは、そのヒドロゲルの溶液および構造構成要素を分離するために十分なｇ力において十分な時間にわたって遠心分離される。この分離法の状況における溶液によって、それは、その得られた水性溶液および溶解されるかまたはさもなければ約１０，０００ｇ（１０，０００×重力）〜約１００，０００ｇ（例えば、約１０，０００ｇ、１５，０００ｇ、２０，０００ｇ、２５，０００ｇ、３０，０００ｇ、３５，０００ｇ、４０，０００ｇ、４５，０００ｇ、５０，０００ｇ、５５，０００ｇ、６０，０００ｇ、６５，０００ｇ、７０，０００ｇ、７５，０００ｇ、８０，０００ｇ、８５，０００ｇ、９０，０００ｇ、９５，０００ｇ、または１００，０００ｇ）での遠心分離後にその水性溶液中に残っている成分に言及される。１つの具体的な非限定的例では、遠心分離は、約２５，０００ｇで約３０分間行われる。いくつかの実施形態において、遠心分離は、約１０，０００ｇで、約１時間〜約２４時間（例えば、約１時間〜約２０時間、約１時間〜約１０時間、または約１時間〜約５時間、例えば、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、または２４時間）である。遠心分離は、例えば、約１２時間〜約２４時間、または約１８〜約２４時間にわたって行われ得る。他の実施形態において、遠心分離は、約１００，０００ｇ、約１〜約２０分間（例えば、約５〜約１０分間、例えば、約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間または２０分間）である。非限定的な例では、遠心分離は、１００，��００ｇで約１０分間にわたって行われる。その方法は、代表的には、ゲル化前の透析工程を含まず、代表的には３７℃において特定の速度でゲル化する、より完全なＥＣＭ様マトリクスを生じる（以下を参照のこと）。
【００８７】
従って、そのＥＣＭは、代表的には、哺乳動物組織に由来し得る（例えば、膀胱、食道、または小腸のうちの１つに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない）。１つの具体的な非限定的例では、そのＥＣＭは、膀胱に由来する。一実施形態によれば、その組織から調製される脱細胞化ＥＣＭ材料は、酸性プロテアーゼでの部分的もしくは完全な消化前に透析されない、および／または酸性プロテアーゼでの消化後かつ中和された消化ＥＣＭ材料のゲル化前に透析されない。
【００８８】
１つの非限定的実施形態において、そのＥＣＭは、凍結乾燥および粉砕される。次いで、そのＥＣＭは、消化したＥＣＭ（例えば、膀胱ＥＣＭ）を生成するために、酸性溶液中の酸性プロテアーゼで可溶化される。その酸性プロテアーゼは、ペプシンもしくはトリプシン、またはこれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。次いで、そのＥＣＭは、プロテアーゼに適したまたは最適な酸性ｐＨ（例えば、約ｐＨ２より高い、または〜４の間のｐＨ）において、例えば、０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液中で可溶化され得る。その溶液は、代表的に、約１２〜約４８時間にわたって、組織タイプ（例えば、以下の例を参照のこと）に依存して、混合する（撹拌、かき混ぜる、混ぜる、ブレンドする、回転させる、傾けるなど）しながら、可溶化される。ＥＣＭヒドロゲルは、（ｉ）細胞外マトリクスを粉砕する、（ｉｉ）無傷の透析していないまたは架橋していない細胞外マトリクスを酸性溶液中の酸性プロテアーゼで消化することによって可溶化して、消化溶液を生成する、（ｉｉｉ）その消化溶液のｐＨを７．２〜７．８の間のｐＨへと上昇させて、中和した消化溶液（プレゲル溶液）を生成する、および（ｉｖ）その溶液をゲル化する、ことによって調製される。次いで、そのＥＣＭヒドロゲルは遠心分離され、その可溶性画分は集められる。
【００８９】
ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分は、例えば、ＥＣＭ（例えば、脱細胞化ＥＣＭ）を酸性プロテアーゼで部分的にまたは完全に消化し、その消化したＥＣＭ材料を７．０〜８．０（例えば、７．２〜７．８または７．４）のｐＨへと中和し、その中和した消化ＥＣＭ材料をその下限臨界溶液温度を上回る温度でゲル化し、そのゲル化したＥＣＭ材料を遠心分離して、ペレットおよび上清を生成することによって生成され得る。次いで、その上清は集められ、本明細書で開示される方法において利用される。
【００９０】
ＥＣＭヒドロゲルの分画のための例示的方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１５／１６４７２８（本明細書に参考として援用される）に開示される。このＰＣＴ公開に開示される方法は、酸性プロテアーゼ（例えば、ペプシン）で、組織から調製された脱細胞化ＥＣＭ材料を部分的にまたは完全に消化する工程；その消化したＥＣＭ材料を、７．０〜８．０、７．２〜７．８または７．４のｐＨへと中和する工程；その中和した消化ＥＣＭ材料を、その下限臨界溶液温度を上回る温度でゲル化する工程；そのゲル化したＥＣＭ材料を遠心分離して、ペレットおよび上清を生成する工程；ならびにその上清およびペレットを分離し、それによって、そのＥＣＭ材料の構造画分および可溶性画分を分離する工程を包含する。
【００９１】
そのＥＣＭヒドロゲルは、その下限臨界溶液温度を上回る温度（例えば、約３７℃の温度）に曝される場合にゲルを形成する。その「プレゲル」形態にあるＥＣＭヒドロゲル（可溶化ＥＣＭヒドロゲル）は、凍結され得、例えば、および限定なしに、−２０℃または−８０℃で貯蔵され得る。その「プレゲル」形態にあるＥＣＭヒドロゲルは、室温（例えば、約２５℃）で貯蔵され得る。いくつかの非限定的な例では、そのＥＣＭヒドロゲルは、３７℃未満で（例えば、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５，  １４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃で）プレゲル形態にある。そのＥＣＭヒドロゲルは、貯蔵のために凍結され得、そして従って、０℃未満で貯蔵され得る。本明細書で使用される場合、用語「プレゲル形態」または「プレゲル」とは、ｐＨが増大されるが、ゲル化されていないＥＣＭヒドロゲルをいう。例えば、および限定なしに、そのプレゲル形態にあるＥＣＭヒドロゲルは、７．２〜７．８の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、その可溶化ＥＣＭヒドロゲルは、本明細書で開示される方法において使用される。ヒドロゲルを可溶化形態で維持するための方法は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／５２２６１（２０１６年９月１０日出願、本明細書に参考として援用される）で開示される。このＰＣＴ出願で開示されるこれらの方法のうちのいずれも、腫瘍を処置する可溶化ヒドロゲルまたはその可溶性画分を生成するために有用である。
【００９２】
その可溶性画分を生成することが目的である場合、そのＥＣＭヒドロゲルの温度は、その下限臨界溶液温度を上回って上昇される。次いで、そのＥＣＭヒドロゲルは、遠心分離され、その可溶性画分が集められる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、その可溶性画分は、本明細書で開示される方法で利用される。その可溶性画分は、直接適用され得るか、または薬学的組成物中にさらなる成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリアが挙げられるが、これらに限定されない）とともに含められ得る。その可溶性画分、およびその可溶性画分を含む薬学的組成物は、種々の方法で、乾燥、例えば、凍結乾燥粉末、液剤、ゲルなどのいずれかとして適用または投与され得る。その組成物は、それ自体で、またはデバイスとともに投与され得る。
【００９４】
別の実施形態において、その上清／可溶性画分は、残っている構造構成要素をその上清から沈殿させることによって、例えば、それらの構造構成要素を塩析することによって（例えば、その上清中の塩濃度を増大させることによって）、さらに精製される。その可溶性画分は、例えば、凍結乾燥によって必要に応じて乾燥され、次いで、適切な水性溶液（例えば、水、塩類溶液、等張性緩衝液、ＰＢＳ、または無血清培地）を使用して再湿潤化され得る。一実施形態によれば、その上清は、濃縮される。すなわち、その凍結乾燥した上清は、凍結乾燥前のその上清の容積よりも小さな容積へと再湿潤化され、必要に応じてその凍結乾燥した上清は、凍結乾燥前の上清容積のうちの＜１０％、１０％、２０％、２５％または５０％の容積へと再湿潤化され、それによって、可溶性ＥＣＭ構成要素の濃縮溶液を生成する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される任意の方法によって調製されるＥＣＭ組成物の生物学的に活性な可溶性画分は、生体適合性基材に吸収されるか、その基材上に吸着されるか、またはその基材上もしくは基材中に別の方法で分散される。生体適合性基材の非限定的な例としては、以下が挙げられる：メッシュ、不織脱細胞化組織、ポリマー組成物、ポリマー構造、細胞成長足場、移植物（ｉｍｐｌａｎｔ）、整形外科的移植物、および眼内レンズ、縫合糸、血管内移植物、ステント、および移植片（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。本明細書で記載される組成物は、任意の適切な方法によって、不織材料、例えば、包帯、縫合糸、移植物、例えば、セラミック、金属、またはポリマー移植物、例えば、補綴物、人工血管または別の方法で改変された血管、弁、眼内レンズ、または組織移植物に適用され得るか、またはその中に組み込まれ得る。本明細書で使用される場合、用語「被覆（ｃｏａｔ）」、ならびに関連する同種のもの（例えば、「被覆された（ｃｏａｔｅｄ）および「被覆すること（ｃｏａｔｉｎｇ）」とは、部分的にまたは全体に、無機構造物を本明細書で記載される組成物で覆うことから構成しているプロセスをいう。例えば、および限定なしに、可溶化画分で無機構造物を被覆することは、注ぐ、埋め込む、層化する、浸す、スプレーする、のような方法を含み得る。超音波処理は、無機構造物の被覆を助けるために使用され得る。
【００９６】
別の実施形態において、ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分を含む組成物は、生体適合性の構造材料（例えば、金属）、無機カルシウム化合物（例えば、水酸化カルシウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウム）、またはセラミック組成物上に被覆され得る。適切な金属の非限定的な例は、コバルト−クロム合金、ステンレス鋼合金、チタン合金、タンタル合金、チタン−タンタル合金であり、これらは、非金属および金属両方の構成要素（例えば、モリブデン、タンタル、ニオブ、ジルコニウム、鉄、マンガン、クロム、コバルト、ニッケル、アルミニウムおよびランタン（種々のグレードのＣＰ  Ｔｉ（市販の純チタン）またはＴｉ  ６Ａｌ  ４Ｖ（９０重量％  Ｔｉ、６重量％  Ａｌおよび４重量％  Ｖ）、ステンレス鋼３１６、ニチノール（ニッケル−チタン合金）、ヒドロキシアパタイトで被覆されたチタン合金が挙げられるが、これらに限定されない））を含み得る。金属は、高強度、可撓性、および生体適合性に起因して有用である。金属はまた、複雑な形状へと形成され得、多くは、生物学的環境における腐食に耐え得、摩損を低減し得、そして組織への損傷を引き起こし得ない。他の組成物（セラミック、カルシウム化合物（例えば、霰石が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる）。金属、セラミックおよび／または他の材料の組み合わせはまた、有用であり得る。
【００９７】
任意の有用な薬剤は、本明細書で記載されるとおりの任意の組成物の中に混合され得るか、その組成物と共送達され得るか、共適用され得るか、または別の方法で組み合わされ得る。例えば、および限定なしに、有用な薬剤としては、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、モノカイン、ホルモン、血管新生因子、化学療法剤および抗生物質が挙げられる。
【００９８】
使用方法
腫瘍細胞の増殖を、インビボまたはインビトロのいずれかで低減するための方法が、本明細書で開示される。腫瘍細胞のアポトーシスを、インビボまたはインビトロのいずれかで増大させるための方法がまた本明細書で開示される。さらに、腫瘍細胞の移動を、インビボまたはインビトロのいずれかで減少させるための方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、その方法は、その腫瘍細胞と有効量の可溶化ＥＣＭヒドロゲルとを接触させる工程を包含する。他の実施形態において、その方法は、その腫瘍細胞と有効量の、細胞外マトリクスヒドロゲルの可溶性画分とを接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、その腫瘍細胞は神経膠腫細胞である。他の実施形態において、そのＥＣＭは膀胱ＥＣＭである。さらなる実施形態において、その腫瘍細胞は神経膠腫細胞であり、そのＥＣＭは膀胱ＥＣＭまたはＳＩＳ  ＥＣＭである。さらなる実施形態において、その腫瘍細胞は食道腺癌細胞である。他の実施形態において、その細胞外マトリクスは食道ＥＣＭである。さらなる実施形態において、その腫瘍細胞は食道腺癌であり、そのＥＣＭは食道ＥＣＭである。
【００９９】
本明細書で開示される方法の全ては、神経膠腫または神経膠腫細胞のうちのいずれかのタイプのために使用され得る。その神経膠腫は、上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、または混合性神経膠腫であり得る。その神経膠腫は、ＷＨＯグレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶであり得る。その神経膠腫は、低グレード神経膠腫または高グレード（ＷＨＯグレードＩＩＩ〜ＩＶ）神経膠腫であり得る。その神経膠腫は、テント上、テント内、または橋にあり得る。
【０１００】
被験体において腫瘍を処置するための方法がまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、被験体において既存の腫瘍を処置する工程を包含する。さらなる実施形態において、良性から悪性への病変の変換を防止する、または被験体において転移を防止するための方法が、本明細書で開示される。いくつかの非限定的例では、その方法は、その被験体において腫瘍の症状を低減する。さらなる非限定的例では、その腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、その腫瘍細胞は神経膠腫細胞である。他の実施形態において、そのＥＣＭは膀胱ＥＣＭである。さらなる実施形態において、その腫瘍細胞は神経膠腫細胞であり、そのＥＣＭは膀胱ＥＣＭである。さらなる実施形態において、その腫瘍細胞は食道腺癌細胞である。他の実施形態において、その細胞外マトリクスは食道ＥＣＭである。さらなる実施形態において、その腫瘍細胞は食道腺癌であり、そのＥＣＭは食道ＥＣＭである。
【０１０１】
一般に、その方法は、腫瘍（例えば、良性または悪性の腫瘍）を有する被験体を選択する工程、およびその被験体に、治療上有効な量の可溶化ＥＣＭヒドロゲルおよび／またはＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、処置の必要性のある被験体（例えば、神経膠腫を有する被験体）を選択する工程、およびその被験体に、治療上有効な量の、ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分を投与する工程を包含する。さらなる薬剤（例えば、化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない）はまた、その目的の被験体に投与され得る。さらなる処置（例えば、腫瘍の外科的切除が挙げられるが、これらに限定されない）はまた、その被験体に投与され得る。
【０１０２】
その腫瘍は、良性または悪性であり得る。その腫瘍は、固形腫瘍またはリンパ増殖性腫瘍であり得る。その腫瘍は、目的の任意の腫瘍（神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。他の実施形態において、その腫瘍は、リンパ腫、乳がん、肺がんおよび結腸がんである。さらなる例は、皮膚腫瘍、乳房腫瘍、脳腫瘍、子宮頚癌、精巣癌、頭頚部腫瘍、消化管腫瘍、泌尿生殖器系腫瘍、婦人科系腫瘍、乳房、内分泌系腫瘍、皮膚腫瘍、軟部組織および骨の肉腫、中皮腫、黒色腫、中枢神経系の新生物、または白血病である。いくつかの実施形態において、その腫瘍は、頭頚部腫瘍（例えば、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺の腫瘍および傍神経節腫）である。他の実施形態において、その腫瘍は、肺腫瘍（例えば、非小細胞肺がんまたは小細胞肺がん）である。さらなる実施形態において、その腫瘍は、消化管の腫瘍（例えば、食道、胃、膵臓、肝臓、胆道（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒｅｅ）、小腸、結腸、直腸および肛門領域のがん）であり得る。なお他の実施形態において、その腫瘍は、泌尿生殖器系の腫瘍（例えば、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎および精巣のがん）であり得る。いくつかの実施形態において、その腫瘍は、婦人科系腫瘍（例えば、子宮頸部、膣、外陰部、子宮体のがん、妊娠性絨毛疾患、卵巣、卵管、腹腔、または乳房のがん）である。他の実施形態において、その腫瘍は、内分泌系腫瘍、例えば、甲状腺腫瘍、上皮小体腫瘍、副腎皮質腫瘍、膵臓内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍およびカルチノイド症候群である。その腫瘍は、軟部組織および骨の肉腫、中皮腫、皮膚のがん、黒色腫（皮膚黒色腫および眼内黒色腫を含む）、中枢神経系の新生物、小児のがん（網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、神経線維腫症、神経芽腫、腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、横紋筋肉腫を含む）であり得る。その腫瘍は、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、およびホジキン病を含む）であり得る。その腫瘍は、白血病（例えば、急性白血病、慢性骨髄性白血病およびリンパ性白血病）であり得る。その腫瘍は、形質細胞腫瘍、原発部位不明がん（ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｉｔｅ）、腹膜播種（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓｔｏｓｉｓ）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連原発性中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連ホジキン病およびＡＩＤＳ関連肛門性器がん、肝臓への転移性がん、骨への転移性がん、悪性胸水および心内膜液浸出、ならびに悪性腹水であり得る。具体的な非限定的例では、その腫瘍は、黒色腫または結腸がんである。
【０１０３】
その腫瘍の処置は一般に、その腫瘍の診断後に、または前駆状態（例えば、異形成または良性腫瘍の発生）の開始後に、開始される。処置は、がんの早期ステージにおいて開始され得る、例えば、被験体がある状態の症状を表す前に（例えば、ステージＩの診断の間にまたは異形成の診断時に）開始され得る。しかし、処置は、その疾患の任意のステージ（例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶのがんが挙げられるが、これらに限定されない）の間に開始され得る。いくつかの例では、処置は、悪性腫瘍またはさらには転移性の腫瘍へと変換し得る良性腫瘍を有するこれらの被験体に投与される。
【０１０４】
腫瘍の存在は、当該分野で公知の方法によって決定され得、代表的には、細胞学的および形態学的評価を含む。その腫瘍は、確立された腫瘍であり得る。
【０１０５】
悪性のがんのような状態の発生後に開始された処置は、その状態のうちの１つの症状の重篤度の減少、またはその症状の完全な除去、または転移、腫瘍容積もしくは腫瘍の数の低減を生じ得る。いくつかの例では、その腫瘍は、処置後に検出不能になる。開示の一局面において、腫瘍の形成（例えば、転移）は、遅らされるか、防止されるか、または減少される。別の局面において、その原発性腫瘍のサイズは減少される。さらなる局面において、その腫瘍の症状は減少される。なお別の局面では、腫瘍容積は減少される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、腫瘍を有する被験体の処置のための方法が開示される。いくつかの非限定的例では、ＥＣＭヒドロゲルの可溶化画分（本明細書で開示されるとおり）のうちのいずれかの治療上有効な量が利用される。他の非限定的例では、ＥＣＭヒドロゲルの可溶化形態（本明細書で開示されるとおり）のうちのいずれかの治療上有効な量が利用される。
【０１０７】
具体的な非限定的例では、そのＥＣＭヒドロゲルは膀胱ＥＣＭヒドロゲルである。他の非限定的例では、そのＥＣＭヒドロゲルは、ＳＩＳ  ＥＣＭヒドロゲルである。いくつかの実施形態において、その投与は、腫瘍細胞増殖を低減する、腫瘍細胞アポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞移動を減少させる。その投与は、腫瘍に対して直接であり得る。具体的な非限定的例では、その腫瘍は神経膠腫である。
【０１０８】
その状態の発生前の処置（例えば、異形成または早期（良性）前駆状態を検出した際の処置）は、その状態を発生させる「リスクにある」被験体の処置と本明細書でいわれる。いくつかの実施形態において、組成物（例えば、ＥＣＭヒドロゲルの可溶化画分）またはその可溶性画分を含む薬学的組成物の投与は、本明細書で記載される状態の発生の間またはその後に行われ得る。いくつかの実施形態において、その被験体はバレット食道を有しない。他の実施形態において、その被験体はバレット食道を有する。いくつかの例では、その被験体は、例えば、子宮頸部、膣もしくは肛門上皮の上皮異形成、または口腔もしくは洞（ｓｉｎｕｓ）における上皮異形成を有する。いくつかの例では、その上皮異形成は、発がん性のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）での感染が原因で発生したか、または発生するリスクにある。
【０１０９】
薬学的組成物は、そのＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分、および／またはその可溶化ＥＣＭヒドロゲル、ならびに必要に応じて１またはこれより多くの追加の化学療法剤を含み得る。これらの組成物は、腫瘍を処置するために有用である。これらの組成物は、腫瘍中の細胞の増殖に影響を及ぼすために、または任意の目的の腫瘍の発生を遅らせる、防止する、そのリスクを低減する、またはその腫瘍を処置する、またはその転移の発生率を低減するために、被験体への投与のための種々の方法で製剤化され得る。本明細書で記載される組成物はまた、それらが最初の病変の転移を防止するような適用のために製剤化され得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、局所投与（例えば、腫瘍内投与）のために製剤化される。薬学的組成物は、従って、局所的な使用および全身的な使用の両方のために提供され、ヒトまたは獣医学的な医療における使用のために製剤化される。局所投与は、腫瘍に、または腫瘍切除の部位に、直接であり得る。
【０１１０】
開示される方法および組成物は、代表的には、ヒト被験体を処置するために使用されるが、それらは、他の脊椎動物（例えば、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ）における類似または同一の疾患を処置するためにも使用され得る。適切な投与形式が、最良には、各被験体の医師によって個々に決定され得る。種々の薬学的に受容可能なキャリアおよびそれらの製剤化が、標準的な製剤化の専門書の中に記載される（例えば、Ｅ．  Ｗ．  ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０，  補遺４２：  ２Ｓ，  １９８８もまた参照のこと。その薬学的組成物の投与形態は、選択された投与様式によって決定される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、罹患領域または目的の組織における細胞（例えば、腫瘍）へと局所投与される場合、開示される組成物は、腫瘍細胞増殖を低減する、腫瘍細胞アポトーシスを増大させる、および／または腫瘍細胞移動を低減する。局所投与はまた、その腫瘍への直接注射によるか、または腫瘍もしくは腫瘍切除の部位へのスプレー、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の適用によるものであり得る。いくつかの実施形態において、送達ビヒクル（例えば、コラーゲン）が利用される。生体適合性の支持体（例えば、メッシュ）がまた使用され得、ここでその支持体は、ヒドロゲルで被覆される。その可溶化ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分、またはその可溶化ＥＣＭヒドロゲルは、任意の経路（非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、もしくは関節内の注射もしくは注入）が挙げられる）によって、または舌下、経口、局所、鼻内、もしくは経粘膜投与によって、または肺吸入によって投与され得る。その適切な投与経路は、腫瘍の提示に基づいて、医師によって選択され得る。
【０１１２】
その可溶化ＥＣＭヒドロゲルの可溶性画分が、非経口組成物として、例えば、注射もしくは注入のために提供される場合、それらは一般に、水性キャリア中に、例えば、等張性緩衝溶液中に、約３．０〜約８．０のｐＨで、好ましくは約３．５〜約７．４（例えば、約７．２〜約７．４）のｐＨで、懸濁される。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液、およびリン酸ナトリウム−リン酸緩衝液、および酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液が挙げられる。
【０１１３】
貯蔵物（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）もしくは「デポー（ｄｅｐｏｔ）」遅延放出調製物の形態は、治療上有効な量のその調製物が、注射または送達後に長時間または数日にわたって血流へと送達されるように使用され得る。徐放性組成物の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形物品（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態にある半透性ポリマーマトリクスのような）、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油でのエマルジョンのような）またはイオン交換樹脂、ならびに僅かに可溶性の誘導体（例えば、僅かに可溶性の塩のような）が挙げられる。徐放性製剤は、その腫瘍の位置に依存して、経口的に、直腸に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、局所に（散剤、軟膏剤、ゲル、滴剤もしくは経皮パッチによって）、口内に、または経口もしくは鼻スプレーとして投与され得る。その薬学的組成物は、生体分解性ポリマーおよび／またはゼリー化するポリサッカリドおよび／または生体接着性ポリマー、両親媒性ポリマー、粒子の界面特性を改変する薬剤および薬理学的に活性な物質を含む粒子の形態にあり得る。これらの組成物は、活性物質の制御された放出を可能にするある種の生体適合性特徴を示す。米国特許第５，７００，４８６号を参照のこと。
【０１１４】
開示される方法において有用な、その薬学的に受容可能なキャリアおよび賦形剤は、従来のものである。例えば、非経口製剤は通常、薬学的にかつ生理学的に受容可能な流体ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、他の平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）である注射可能な流体を含む。含まれ得る賦形剤は、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）である。望ましい場合、投与されるべきその薬学的組成物はまた、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムもしくはソルビタンモノラウレート））を含み得る。このような投与形態を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかである。
【０１１５】
投与される活性化合物の量は、処置されている被験体、その病気の重篤度、および投与様式に依存し、最良には、処方する医師の判断に委ねられる。これらの限度内では、投与されるべき製剤は、その処置されている被験体において望ましい効果を達成するために有効な量において活性構成要素のある量を含む。複数の処置が想定される（例えば、規定の時間間隔（例えば、毎日、１週間に２回、１週間に１回、１ヶ月間に２回または１ヶ月に１回）にわたって）。その結果、長期投与が達成される。投与は、疾患の抑制または防止が望ましい場合にはいつでも、例えば、被験体のある種の年齢において、または環境曝露の前に始まり得る。
【０１１６】
正確な用量は、特定の画分の有効性、被験体の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づいて、当業者によって容易に決定される。
【０１１７】
さらなる薬剤が投与され得る（例えば、サイトカイン、ケモカイン、または化学療法剤）。これらは、開示される薬学的組成物中に含まれ得る。サイトカインが投与され得る（例えば、インターロイキン（ＩＬ）またはインターフェロン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）、例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γ））。一例では、腫瘍の防止および処置のために、外科的処置がその被験体に施され得る。一例では、この投与は、逐次的である。他の例では、この投与は同時である。
【０１１８】
化学療法剤の例は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然生成物、またはホルモンおよびそれらのアンタゴニストである。アルキル化剤の例としては、以下が挙げられる：ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン）。代謝拮抗物質の例としては、以下が挙げられる：葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５−ＦＵまたはシタラビン）、およびプリンアナログ（例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニン）。天然生成物の例としては、以下が挙げられる：ビンカ・アルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣ）、および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）。種々雑多な薬剤の例としては、以下が挙げられる：白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩ）、置換されたウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質機能抑制剤（ａｄｒｅｎｏｃｒｏｔｉｃａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）。ホルモンおよびアンタゴニストの例としては、以下が挙げられる：副腎皮質コルチコイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロンアセテート、およびメゲストロールアセテート）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、およびアンドロゲン（例えば、テストステロンプロピオネート（ｔｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）およびフルオキシメステロン）。最も一般に使用される化学療法薬の例としては、以下が挙げられる：アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン（例えば、ドセタキセル））、Ｖｅｌｂａｎ、ビンクリスチン、ＶＰ−１６。一方で、いくつかのより新たな薬物としては、以下が挙げられる：ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサン、ＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼバリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）およびカルシトリオール。使用され得る免疫モジュレーターの非限定的な��としては、以下が挙げられる：ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、γインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，  Ｌａ．のＩｍｒｅｇ製）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。
この開示は、以下の非限定的な例によって例証される：
【実施例】
【０１１９】
実施例１
可溶性画分の生成
膀胱マトリクス調製：ブタ膀胱を、慣用的な商業的生産の副生成物として、市場に出せる体重のブタ（ｍａｒｋｅｔ  ｗｅｉｇｈｔ  ｐｉｇ）（１１０〜１３０ｋｇ）から獲得した。ＵＢＭといわれる、この組織に由来する細胞外マトリクスを、以前に記載されるとおりに調製した（Ｆｒｅｙｔｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  ２００６；７８：３２７−３３）。簡潔には、漿膜、外筋層、粘膜下組織、および粘膜筋板の大部分を機械的に除去し、その粘膜の管腔尿路上皮細胞を、滅菌水中ですすぐことによって解離した。残りの組織は、それらの層の中の基底膜、下にある粘膜固有層および任意の存在する細胞からなった。そのマトリクスは、４％  エタノールを有する０．１％  過酢酸中で２時間、高速で撹拌することによって脱細胞化し、続いて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）および滅菌水で徹底的にすすいだ。脱細胞化を、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）核染色および残余ＤＮＡの定量を使用して検証した（Ｃｒａｐｏら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１；３２：３２３３−４３）。次いで、そのＵＢＭを、乾燥シートへと凍結乾燥し、＃６０メッシュスクリーン付きのＷｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用して粒状物へと製粉した（Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５；２６：１４３１−５）か、または乾燥シートとして残しておいた。
【０１２０】
食道ＥＣＭ調製：ブタ食道を、慣用的な商業的生産の副生成物として、市場に出せる体重のブタ（１１０〜１３０ｋｇ）から獲得した。ｅＥＣＭといわれる、この組織に由来する細胞外マトリクスを、以前に記載されるとおりに調製した（Ｋｅａｎｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２０１５；２１（１７−１８）：２２９３−３０）。ブタ食道を、−２０℃で貯蔵し、一晩、４℃で解凍した。ｅＥＣＭを、粘膜および粘膜下組織層をその下にある外筋層から機械的に分離することによって調製した。その粘膜および粘膜下組織を、ｅＥＣＭを作製するために、以下の工程で脱細胞化した：３７℃において、揺動プレート上で、１％  トリプシン（Ａｍｒｅｓｃｏ）／０．０５％  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）、１時間、タイプ１水で１５分間、１Ｍ  スクロース（Ｓｉｇｍａ）で３０分間、タイプ１水で３０分間、３．０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で４８時間、タイプ１水で１５分間、ＰＢＳで１５分間、１０％  デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で４時間、タイプ１水で３０分間、４％  エタノール中０．１％  過酢酸（ＰＡＡ）（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｉｄｌａｎｄ）で４時間、揺動プレート上で１００  Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２時間ならびにＰＢＳ、タイプ１水、ＰＢＳ、およびタイプ１水の１５分間の洗浄。全ての脱細胞化工程を、シェイカープレート上で、３００ｒｐｍで室温において行った。
【０１２１】
小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）ＥＣＭ調製物：ブタ小腸は、慣用的な商業的生産の副生成物として、市場に出せる体重のブタ（１１０〜１３０ｋｇ）から獲得した。ＳＩＳを、粘膜、漿膜、および外筋層の表面層を、無傷の小腸から機械的に除去し、以前に確立された脱細胞化プロトコルに従って、粘膜下組織、粘膜筋板、および基底緻密層を無傷のまま残すことによって調製した（Ｂａｄｙｌａｋら  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９９；  ２０：２２５７）。次いで、ＳＩＳを、３００ｒｐｍにおいてシェイカープレート上で撹拌しながら４．０％  エタノール中の０．１％  過酢酸に４時間、室温において供した。
【０１２２】
真皮ＥＣＭ調製：  ブタの側背の側腹部からの全層皮膚を、安楽死の直後に採取した。真皮といわれる、この組織に由来する細胞外マトリクスを、以前に記載されるとおりに調製した（Ｒｅｉｎｇら  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１０；３１（３３）：８６２６-３３）。全層皮膚シートを、６ｃｍ×１０ｃｍの矩形へと切断し、その後、真皮の網状層および乳頭層を残して皮下脂肪、結合組織および重なっている表皮を除去するように、分割した。トリプシン、過酸化水素、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＥＤＴＡで連続洗浄し、過酢酸での脱細胞化を達成した。
【０１２３】
精巣ＥＣＭ調製：ブタ精巣を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，  Ｉｎｄｉａｎａ）から購入し、−２０℃で貯蔵した。凍結された精巣を生ぬるい流水中で解凍し、４ｍｍにスライスし、タイプＩ水中ですすぎ、タイプＩ水を、水が無色であるうちに２０〜６０分ごとに交換し、被膜剥離し、０．０２％および０．０５％のＥＧＴＡ溶液中、３７℃において２．５時間時間撹拌した。次いで、組織を、室温において、０．０７５％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、２４時間にわたって撹拌した；ＳＤＳ溶液を、１２時間で新鮮な溶液と交換した。組織を、タイプ１水で２０分間、続いて、ＰＢＳで２０分間、タイプ１水で２０分間、およびＰＢＳで２０分間すすいだ。次いで、組織を、室温で２時間、１％  ＴＸ−１００中で撹拌し、水／ＰＢＳ／水／ＰＢＳで各々２０分間再びすすいだ。次いで、材料を、０．１％  ＰＡＡおよび４％  ＥｔＯＨ中で２時間洗浄し、上記で記載されるように水／ＰＢＳですすいだ。
【０１２４】
ペプシン可溶化ＥＣＭの調製：ＥＣＭを、０．０１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ２．０）中で凍結乾燥した粉末化ＵＢＭまたはｅＥＣＭ（１０ｍｇ／ｍＬ）およびペプシン（１ｍｇ／ｍＬ）を混合することによって、以前に記載されるように（Ｆｒｅｙｔｅｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８；２９：  １６３０−７）ペプシンで酵素消化した。この溶液を、室温で４８時間撹拌した。撹拌後、そのＵＢＭスラリーを、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ホスフェート、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）中で、ｐＨ７．４へと中和して、ペプシンを不活性化し、細胞培養アッセイのための材料を調製した。０．０１Ｍ  ＨＣｌ中のペプシン（１ｍｇ／ｍＬ）の溶液（ＵＢＭサンプルと同じ様式で処理）を、全ての実験のコントロール条件として供した。全ての材料を、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１２５】
ペプシン可溶化ＥＣＭの分画：中和したＥＣＭ消化物を、３７℃でインキュベートして、ゲル化を誘導した。次いで、そのＥＣＭヒドロゲルゲルを、２５，０００×ｇにおいて３０分間遠心分離して、清澄な上清をペレットの上に残して、その足場の不溶性の構造構成要素をペレットへと圧縮した。その構造構成要素を含むゲルペレットを集め、その出発容積へと１×ＰＢＳ中で再懸濁した。そのゲルペレットの不溶性に起因して、そのゲルペレット懸濁物を、１０μｌのピペットチップを通じて激しくピペッティングして、その材料をできるだけ均質化した。その均質化した懸濁物を、使用するまで−８０℃で貯蔵した。その可溶性構成要素を含む清澄な上清を取り出し、乾燥するまで凍結乾燥した。その乾燥した上清を、滅菌水でその元の容積の１０％で再湿潤化して、１×から１０×までのＰＢＳ濃度にした。その再湿潤化した可溶性構成要素を２０，０００×ｇで遠心分離して、その溶液を清澄にした。この最終遠沈からの上清を取り出し、その出発容積へと希釈し、−８０℃で使用するまで貯蔵した。両方の分画した構成要素の出発容積への希釈は、その画分の生物学的活性を、全ての材料に関して同じ希釈率を使用して直接比較することを可能にした。
【０１２６】
塩抽出によるＥＣＭ可溶性画分の調製：１０ｍｇのＵＢＭを、オービタルロッカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｒｏｃｋｅｒ）上で、円錐型容器中の１０ｍｌの、０．１５４モル濃度のＮａＣｌ中、２２℃において２４時間でインキュベートした。インキュベーション後、そのサンプルを、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清を新しいチューブに移した。その上清を、０．２２ミクロンフィルタを通して濾過し、凍結乾燥した。その凍結乾燥した塩類溶液可溶性画分を１０ｍｌ  超純水中で再懸濁し、１０ｋＤａ分子量カットオフカラムを使用して、５，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって脱塩した。その溶離液を廃棄し、脱塩した可溶性画分の容積を、超純水を使用して１ｍｌへと調節し、１０×濃度と称されるＵＢＭ塩類溶液可溶性画分（ＵＢＭ−ＳＦ）溶液を得た。
【０１２７】
実施例２
結果
ペプシン−可溶化ＥＣＭの可溶性画分は、初代ヒト神経膠腫細胞表現型を調節した。初代ヒト神経膠腫細胞を、種々の供給源組織に由来するペプシン可溶化ＥＣＭに、２４時間以内で反応させた。これらの効果は、培地コントロールに合わせたペプシンコントロールによって示されるように、ペプシンの存在のせいにはできない。ＳＩＳおよびＵＢＭ処理は、生きている神経膠腫細胞における劇的な低減を引き起こす。これは、これらのＥＣＭ環境が神経膠腫細胞の増殖速度を減少させるか、それらに細胞死を受けさせるか、またはその両方を行うことを示唆する（図１）。
【０１２８】
ＥＣＭヒドロゲルは食道がん細胞表現型を調節した。ＯＥ３３食道がん細胞は、ペプシンコントロールまたは培地コントロールに存在しない「細胞ブリッジ」（矢印で示される）の出現とともに、ペプシン可溶化ＵＢＭでの２４時間の処理後の著しい表現型変化を示した。その表現型はまた、ＴＧＦβ−１陽性コントロール（がん細胞移動の公知の誘導因子）とは異なる（図２）。
【０１２９】
ＥＣＭヒドロゲルは、食道腺癌増殖を減少させた。Ｈｅｔ−１Ａ、ＣＰ−Ａ、およびＥＡＣ（ＯＥ３３、ＳＫ−ＧＴ−４）細胞増殖に対する可溶化ＵＢＭまたはｅＥＣＭの効果を、ＢｒｄＵ増殖アッセイを使用して評価した。生物学的複製物（ｎ＝３）の代表的グラフを示す（図３Ａ〜Ｄ）。ＵＢＭ−ＥＣＭは、ペプシンコントロールと比較して、ＯＥ３３がん細胞の増殖を減少させた（ｐ＝０．０００８、図３Ｃ）が、Ｈｅｔ−１Ａ（図３Ａ）、ＣＰ−Ａ細胞（図３Ｂ）、またはＳＫ−ＧＴ−４細胞（図３Ｄ）に関しては、ペプシンコントロールと比較して、増殖の変化を示さなかった。ｅＥＣＭは、ペプシンコントロールと比較して、全ての細胞タイプの増殖を減少させた：Ｈｅｔ−１Ａ（ｐ＜０．０００１）、ＣＰ−Ａ（ｐ＜０．０００１）、ＯＥ３３（０．０００３）、およびＳＫ−ＧＴ−４（ｐ＜０．０００１）（図３Ａ〜３Ｄ）。
【０１３０】
ＥＣＭ組織タイプを比較すると、ｅＥＣＭは、Ｈｅｔ−１Ａ（ｐ＜０．０００１、図３Ａ）、ＣＰ−Ａ（ｐ＜０．０００１、図３Ｂ）、およびＳＫ−ＧＴ−４（ｐ＜０．０００１、図３Ｄ）に関してＵＢＭ−ＥＣＭと比較して、全ての細胞タイプの増殖を有意に減少させた。ＯＥ３３細胞増殖を減少させるためにｅＥＣＭとＵＢＭ−ＥＣＭとの間に差異はなかった（図３Ｃ）。従って、食道ＥＣＭは、食道がんを処置するために特に有用であった。
【０１３１】
ペプシン可溶化ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、化生細胞アポトーシスを増大させた（図４Ａ〜４Ｄ）。アポトーシスに対する可溶化ＥＣＭの効果を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシンＶの二重染色を使用して決定した。ペプシンと比較したペプシン可溶化ＵＢＭまたはｅＥＣＭ処理に伴う早期および後期アポトーシス細胞の倍数変化を、Ｈｅｔ−１Ａ（図４Ａ）、ＣＰ−Ａ（図４Ｂ）、ＯＥ３３（図４Ｃ）、およびＳＫ−ＧＴ−４（図４Ｄ）に関して示す。ＣＰ−Ａ細胞に関して、ＵＢＭ−ＥＣＭ処理は、ペプシンコントロールと比較して後期アポトーシスを増大させ（ｐ＝０．００９５）、ｅＥＣＭ処理は、ペプシンコントロールと比較して後期アポトーシスの増大に向かう傾向があった（ｐ＝０．０７５６）。ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、ペプシンコントロールと比較して、Ｈｅｔ−１Ａ、ＯＥ３３、またはＳＫ−ＧＴ−４細胞において早期または後期アポトーシスの差異を示さなかった。その結果は、ＵＢＭが食道がん前駆細胞のアポトーシスを増大させることを示した。
【０１３２】
ＥＣＭヒドロゲルは、構成要素部分へと分離され得る。具体的な非限定的例では、この図は、ＵＢＭヒドロゲルを、遠心分離を通じて、構造構成要素および可溶性構成要素へと、または高密度および低密度の構成要素へと分ける１つの方法を示す（図５）。中和したＥＣＭ消化物は、３７℃でインキュベートして、ゲル化を誘導した。次いで、そのＥＣＭヒドロゲルを、２５，０００×ｇで３０分間遠心分離して、清澄な上清をペレットの上に残して、足場の不溶性の構造構成要素をペレットへと圧縮した。構造構成要素を含むゲルペレットを集め、１×ＰＢＳ中でその出発容積へと再懸濁した。ゲルペレットの不溶性に起因して、ゲルペレット懸濁物を、１０μｌのピペットチップを通じて激しくピペッティングして、材料をできるだけ均質化した。均質化した懸濁物を、使用するまで−８０℃で貯蔵した。その可溶性構成要素を含む清澄な上清を取り出し、乾燥するまで凍結乾燥した。その乾燥した上清を、滅菌水でその元の容積の１０％で再湿潤化して、１×から１０×までのＰＢＳ濃度にした。その再湿潤化した可溶性構成要素を２０，０００×ｇで遠心分離して、その溶液を清澄にした。この最終遠沈からの上清を取り出し、その出発容積へと希釈し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。両方の分画した構成要素の出発容積への希釈は、その画分の生物学的活性を、全ての材料に関して同じ希釈率を使用して直接比較することを可能にした。
【０１３３】
非新生物ミクログリア細胞株は、ＵＢＭ−ＳＦによって影響を及ぼされなかった。ＵＢＭ−ＳＦの漸増濃度で処理したＣＨＭＥ５細胞は、正常に成長するようであった。従って、非新生物細胞タイプは、培養培地に添加した非新生物ＥＣＭの存在によって害されなかった（そしてしばしば利益を与えた）（図６）。
【０１３４】
ＵＢＭ塩類溶液可溶性画分（ＵＢＭＳＦ）は、ミクログリア細胞を支持しながら、用量依存性様式で神経膠腫細胞数を減少させた。細胞数データは、ＵＢＭ−ＳＦの漸増濃度が高グレード（１０１５）および低グレード（１１１９）の両方の初代ヒト神経膠腫細胞の総細胞数を減少させた一方で、ミクログリア細胞株（ＣＨＭＥ５）が、影響が及ぼされずに成長することを示した。これは、汎細胞毒性（ｐａｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）活性と比較した場合、ＵＢＭ−ＳＦが腫瘍溶解活性を有することを示唆する（図７）。図１０、図２０、図２１および図２３〜２５もまた参照のこと。
【０１３５】
ＵＢＭ−ＳＦは、神経膠腫細胞移動を減少させた。古典的スクラッチアッセイ（Ｌｉａｎｇら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  ２００７；  ２：３２９-３３３）では、ＵＢＭ−ＳＦに曝露した神経膠腫細胞は、培地コントロールと比較して、２４時間以内に減少した移動を示す（図８）。スクラッチアッセイを示す図１４Ａ〜１４Ｄもまた参照のこと。
【０１３６】
ＥＣＭ生体足場の塩類溶液可溶性画分およびＥＣＭ生体足場に由来する膜結合小胞（ＭＢＶ）は、食道がん細胞生存性を阻害した。生存性に対するＥＣＭ生体足場の塩類溶液可溶性画分およびＭＢＶの効果は、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。ＯＥ３３およびＯＥ１９細胞は、コントロールと比較して、ＵＢＭ  ＳＦＦ、コラゲナーゼＭＢＶ（ｃＭＢＶ）およびエラスターゼＭＢＶ（ｅＭＢＶ）での生存性における減少を示した（図９）。
【０１３７】
ＥＣＭ生体足場の塩類溶液可溶性画分は、神経膠腫を減少させたが、非新生物細胞生存性を減少させなかった。神経膠腫細胞生存性は、有効性の増大する順序で、真皮ＥＣＭ、ＳＩＳ、およびＵＢＭの可溶性画分によって減少した。これらの同じＥＣＭ構成要素は、ミクログリア細胞（ＣＨＭＥ５）または神経芽細胞（Ｎ１Ｅ−１１５）の生存性を減少させなかった。これは、ＵＢＭ−ＳＦが、汎細胞毒性活性と比較した場合に、優先的な腫瘍溶解活性を有することを示唆する（図１０）。さらなる結果を、図７、図２０、図２１、および図２３〜２５に示す。
【０１３８】
ＥＣＭ環境のタンパク質組成は、複雑でありかつ供給源組織によって変動する。細胞に対する供給源組織ＥＣＭの差次的効果は、少なくとも部分的に、それらの供給源組織の差次的タンパク質組成によって説明され得る。図１１に示されるように、そのタンパク質シグナチャーは複雑である。
【０１３９】
神経膠腫コロニー形成は、用量依存性様式でＵＢＭ−ＳＦによって抑止された。軟寒天（０．５％）中でのコロニー形成は、化学療法薬のインビトロスクリーニングに関して、当該分野で受け入れられているアッセイである。結果を、２つの高グレード（０３１９，  １０１５）および１つの低グレード（１１１９）初代ヒト神経膠腫細胞をＮ＝２で、図１２Ａ〜１２Ｃに示す。大きなコロニーの形成が、寒天での１６時間以内の細胞の平板培養で起こることは明らかであった。しかし、これは、ＵＢＭ−ＳＦの存在下で妨害された（図１２Ａ）。より後の時点で、このコロニー破壊効果は、存在するＵＢＭ−ＳＦの濃度に依存し、この傾向は、試験した各神経膠腫細胞タイプに当てはまった（図１２Ｂおよび図１２Ｃ）。
【０１４０】
ｐＥＲＫ１／２は、ＵＢＭ−ＳＦで処理した神経膠腫細胞においてアップレギュレートされた。ＵＢＭ−ＳＦによって示された腫瘍溶解性／腫瘍増殖抑制性（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｃ）の特性は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の調節によって説明され得る。図１３に示されるように、ＵＢＭ−ＳＦでの処理後には、神経膠腫細胞にｐＥＲＫ１／２の増大が存在する。ｐＥＲＫのアップレギュレーションは、神経膠腫細胞増殖を減少させることが観察されている（Ｃｈｅｎら  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ２０１４；９（１）：ｅ８７２８１）。
【０１４１】
ＵＢＭ−ＳＦは、より早期の時点で神経膠腫細胞移動を減少させ、より後期の時点で細胞死を引き起こす。２種の高グレード（０３１０、１０１５）および１種の低グレード（１１１９）の神経膠腫細胞タイプを、古典的スクラッチアッセイにおいて試験した（図１４Ａ〜１４Ｄ）。細胞を、３×ＵＢＭ−ＳＦありまたはなしの無血清培地で予め処理し、スクラッチを導入し、次いで、処置群を導入した（各列の上の第１の記号、右むきの矢印「→」、および第２の記号に相当）。０％は、無血清培地を示し、３×は、分光光度計によって測定されるように、３ｍｇ／ｍＬの濃度でのＵＢＭ−ＳＦを示す。スクラッチ直後の時間０では、全ての条件は、本質的に同一であることが観察された（図１４Ａ）。２４時間（２４ｈ）後に、無血清培地を与えられた細胞が、ＵＢＭ−ＳＦに曝された細胞より遙かに迅速に、そのスクラッチを満たすように移動していることは明らかであった（図１４Ｂ）。４８時間では、ＵＢＭ−ＳＦを与えたある種の群は、明らかに死滅した；培地コントロールの細胞は、移動してスクラッチを満たし続ける。ＵＢＭ−ＳＦを与えた細胞は死滅せず、移動が停止した（図１４Ｃ）。処理後９６時間では、ＵＢＭ−ＳＦを与えた全ての神経膠腫細胞は死滅する（図１４Ｄ）。
【０１４２】
神経膠腫細胞の移動は、ＵＢＭ−ＳＦによって軽減した。ＵＢＭ−ＳＦの存在下での神経膠腫細胞の移動を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイによって測定した。高グレードの１０１５細胞は、早期の時点でＵＢＭ−ＳＦによって殺滅されることが示されたので、移動は観察されなかった。低グレードの１１１９細胞は、０％  ＦＢＳで予め処理した場合に、ＵＢＭ−ＳＦの存在下で１０％  ＦＢＳに向かう移動が少ないことが示された。同様に、０％  ＦＢＳ培地中のＵＢＭ−ＳＦで予め処理された１１１９細胞は、おそらく細胞死に起因して、１０％  ＦＢＳに向かって全く移動しなかった（図１５）。
【０１４３】
ペプシン可溶化ＥＣＭは、食道腺癌細胞代謝を低下させた。正常細胞、バレット細胞、およびＥＡＣ細胞の代謝活性に対する可溶化ＥＣＭの効果を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。その生物学的複製物（ｎ＝３）の代表的グラフを示す（図１６Ａ〜Ｄ）。ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、ペプシンコントロールと比較して、Ｈｅｔ−１Ａ細胞（図１６Ａ）またはＣＰ−Ａ細胞（図１６Ｂ）の代謝活性に影響を及ぼさなかった。ＵＢＭは、ペプシンコントロールと比較して、ＯＥ３３細胞（ｐ＝０．０００１、図１６Ｃ）およびＳＫ−ＧＴ−４細胞（ｐ＝０．００３５、図２３Ｄ）の代謝活性を低下させた。ＵＢＭはまた、ｅＥＣＭと比較して、ＯＥ３３細胞（ｐ＜０．０００１、図１６Ｃ）およびＳＫ−ＧＴ−４細胞（ｐ＝０．００２４、図１６Ｄ）の代謝活性を低下させた。
【０１４４】
ペプシン可溶化ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、食道がん細胞シグナル伝達経路をダウンレギュレートした。全トランスクリプトーム分析を使用して、２４時間にわたって、ペプシン陰性コントロールと比較して、ＵＢＭまたはｅＥＣＭで処理したＨｅｔ−１Ａ正常細胞およびＯＥ３３食道上皮がん細胞の遺伝子シグナチャーを同定した。差次的に発現された（一元配置ＡＮＯＶＡによる有意性ｐ＜０．０５とともに、２倍より大きなまたは小さな変化として規定される）遺伝子を、不偏経路シグナル伝達分析を使用して分析して、上位のシグナル伝達経路を同定した。注記すべきことに、ペプシン陰性コントロールと比較して、ＵＢＭおよびｅＥＣＭ処理によって調節されるその上位の差次的に発現された経路は、がん進行に関連する。ｅＥＣＭは、接着斑−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ、細胞周期、およびＤＮＡ複製をダウンレギュレートし、食道がん細胞表現型をダウンレギュレートするという正味の効果とともに、オートファジー（制御されたがん細胞死）をアップレギュレートした（図１７）。
【０１４５】
全トランスクリプトーム分析のｑＰＣＲ確認。図１７に示される効果を、ｑＰＣＲを使用して確認した（図１８）。ＯＥ３３細胞における接着斑−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル伝達に関して、ｅＥＣＭ処理は、３種の負の調節因子（ＵＬＫ１、ＴＳＣ２、ＰＩＫ３ＩＰ１）をアップレギュレートし、１種の正の調節因子（ＨＲＡＳ）をダウンレギュレートした。ＵＢＭ−ＥＣＭは、１種の負の調節因子（ＤＤＩＴ４）および１種の正の調節因子（ＳＬＣ２Ａ３）をダウンレギュレートした。Ｈｅｔ１−Ａ細胞における接着斑−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル伝達に関して、ｅＥＣＭ処理は、４種の負の調節因子（ＤＤＩＴ４、ＵＬＫ１、ＦＯＸＯ３Ａ、ＴＳＣ２）を増大させ、２種の正の調節因子（ＲＩＣＴＯＲ、ＳＬＣ２Ａ３）を増大させた。
【０１４６】
ＯＥ３３細胞におけるオートファジーシグナル伝達に関して、ｅＥＣＭは、２種の正の調節因子（ＵＬＫ１、ＭＡＰＩＬＣ３Ｂ）をアップレギュレートし、４種の負の調節因子／遺伝子（ＨＲＡＳ、Ｅ２Ｆ１、ＣＤＫ２、ＰＣＮＡ）をダウンレギュレートした。Ｈｅｔ−１Ａ細胞におけるオートファジーシグナル伝達に関して、ｅＥＣＭは、腫瘍抑制因子ＵＬＫ１、増殖マーカーＰＣＮＡおよびＥ２Ｆ１、ならびにオートファジー関連遺伝子ＭＡＰＩＬＣ３ＢおよびＧＡＢＡＲＡＰＬ２を増大させた。
【０１４７】
細胞周期およびＤＮＡ複製経路に関しては、多くの遺伝子が重複した。細胞周期シグナル伝達に関しては、ｅＥＣＭは、ＯＥ３３細胞において９種の正の調節因子（ＣＤＣ６、ＣＤＫ２、ＭＣＭ４、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ２、ＣＤＣ４５、ＣＤＫ１、ＭＣＭ６）をダウンレギュレートし、Ｈｅｔ−１Ａ細胞において５種の正の調節因子（ＣＤＣ６、ＭＣＭ４、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、ＭＣＭ６）をアップレギュレートした。ＯＥ３３細胞におけるＤＮＡ複製シグナル伝達に関しては、ｅＥＣＭは、８種の正の調節因子（ＲＰＡ２、ＣＤＣ６、ＰＲＩＭ１、ＣＤＫ２、ＭＣＭ４、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、ＭＣＭ６）をダウンレギュレートし、Ｈｅｔ−１Ａ細胞において７種の正の調節因子（ＲＰＡ２、ＣＤＣ６、ＰＲＩＭ１、ＭＣＭ４、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、ＭＣＭ６）をアップレギュレートした。
【０１４８】
ペプシン可溶化ＵＢＭおよびｅＥＣＭは、ＯＥ３３細胞においてリン酸化ＡＫＴタンパク質発現を減少させ、Ｈｅｔ−１Ａ細胞においてリン酸化ＡＫＴを増大させた。ウェスタンイムノブロットを、ｐＡＫＴ（増殖、細胞周期、および代謝の重要な上流の調節因子）に関して、ＯＥ３３溶解物およびＨｅｔ−１Ａ溶解物で行った。ＯＥ３３細胞およびＨｅｔ−１Ａ細胞は、ペプシンコントロールにおいてｐＡＫＴに変化を示さなかった。ＯＥ３３細胞は、２４時間においてＵＢＭ処理でのｐＡＫＴ発現のダウンレギュレーションを、ならびに６時間および２４時間においてｅＥＣＭ処理でのｐＡＫＴ発現のダウンレギュレーションを示した（図１９Ａ）。対照的に、Ｈｅｔ−１Ａ細胞は、６時間および２４時間においてＵＢＭおよびｅＥＣＭ処理でのｐＡＫＴ発現のアップレギュレーションを示した（図１９Ｂ）。
【０１４９】
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲは、多くのがんにおいてアップレギュレートされる（ＢＥからＥＡＣへの進行を含む）ことを示した。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔは、ＥＡＣシグナル伝達経路であるが、その活性化はまた、非悪性細胞の創傷治癒プロセスにおいて極めて重要であることが示される。同じＥＣＭヒドロゲル刺激に応じたＨｅｔ−１Ａ細胞およびＯＥ３３細胞におけるリン酸化ＡＫＴの反対の調節は、以前のがんの状況において組織再構成を促進する治療にとって好都合な転帰である。
【０１５０】
ＵＢＭ−ＳＦは、カスパーゼ−３媒介性アポトーシスを通じて神経膠腫細胞死を引き起こした。コマ撮り動画を、１２時間にわたって２０分ごとに細胞を画像化することによって獲得した。ＵＢＭ−ＳＦを与えた神経膠腫細胞（０３１９）は、細胞死を受けた一方で、ヒト包皮線維芽細胞は、成長および分裂し続けた。ウェルへのＮＵＣＶＩＥＷＴＭ試薬（カスパーゼ−３によって特異的に切断される）の添加は、神経膠腫細胞がカスパーゼ−３媒介性アポトーシスを受けたのに対して、線維芽細胞ではアポトーシスが観察されないことを明らかにした（図２０）。
【０１５１】
ＵＢＭ−ＳＦは、初代星状細胞成長を支持しながら、初代ヒト神経膠腫および樹立された神経膠腫細胞株を死滅させた。細胞生存性を、生存／死滅蛍光アッセイによって測定し、次いで、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用して定量した。初代星状細胞は、生存したままであった一方で、初代ヒト神経膠腫細胞タイプ（０３１９）および樹立された神経膠腫細胞株（Ｕ−８７ＭＧ）は、ＵＢＭ−ＳＦで処理した場合に細胞死を受けた（図２２Ａ）。この観察を、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒによって定量したところ、ＵＢＭ−ＳＦで処理した初代星状細胞は、２４時間において培地コントロールより有意に増殖したのに対して、神経膠腫細胞の集団は、有意に減少した（図２２Ｂ）。
【０１５２】
ＵＢＭ−ＳＦは、肺がん細胞および乳がん細胞の生存性を減少させ、正常乳房上皮細胞を支持する。肺がん細胞およびＨｅＬａ細胞は、ＵＢＭ−ＳＦで処理した場合に用量依存性の減少した生存性を示した一方で、正常乳房上皮細胞は、ほぼ変化しなかった。従って、哺乳動物ＥＣＭ（具体的には、凍結乾燥ＵＢＭの塩類溶液抽出画分）は、多くのがん細胞タイプにわたって腫瘍溶解特性を有した（図２３）。
【０１５３】
ＵＢＭ−ＳＦは、テモゾロミド（ＴＭＺ）とは異なり、神経膠腫細胞を標的化するための治療濃度域を示した。非新生物のウェルおよび神経膠腫のウェルを、アルキル化剤ＴＭＺ（グレードＩＶ神経膠腫を有する患者の現在の治療至適基準）で処理した場合、全ての細胞は、用量依存性様式で類似の速度で死滅することが認められた。しかし、これらの同じ細胞を漸増濃度のＵＢＭ−ＳＦで処理した場合、非新生物細胞は常に、神経膠腫細胞より数多く生存し、それによって、ＵＢＭ−ＳＦの治療濃度域の存在を示した（図２４）。
【０１５４】
ＵＢＭ−ＳＦの多数の副画分（ｓｕｂ−ｆｒａｃｔｉｏｎ）は抗神経膠腫特性を保持した。ＵＢＭ−ＳＦを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって副画分へとさらに分けた。画分をプールし、ミクログリア細胞（ＣＨＭＥ５）、初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、１種の高グレード神経膠腫細胞タイプ（０３１９）および１種の低グレード神経膠腫細胞タイプ（１１１９）を処理するために使用した。多数のプールした画分は、非新生物細胞も支持しながら、親の溶液に由来する抗神経膠腫特性を保持した（図２５）。
【０１５５】
開示される発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態に鑑みて、その例証される実施形態が本発明の単に好ましい例であり、本発明の範囲を限定すると理解されるべきではないことは、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。本発明者らは、従って、本発明者らの発明として、これらの特許請求の範囲および趣旨の範囲内に入る全てを特許請求する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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