(57)【要約】  効率的で、高立体選択的なＲ−３−アミノ酪酸の製造方法である。当該方法は、大腸菌由来の、立体異性化触媒活性を有するアスパルターゼを利用し、クロトン酸を効率的にＲ−３−アミノ酪酸に転換させ、反応のわずか２４ｈ後の転換率が≧９８％と高く、ｅｅ値が≧９９．９％で、大幅に転換効率を向上させ、反応時間を短縮させ、生産コストを削減する。前記方法は、収率が高く、転換率が高く、コストが低く、生産周期が短く、プロセスが簡単で、拡大しやすい、大規模生産に適するといった多くの利点がある。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法であって、
（１）反応系において、クロトン酸を基質とし、アスパルターゼによる触媒下で、反応式Ｉで表される立体異性化触媒反応を行うことにより、Ｒ−３−アミノ酪酸を形成する工程、
【化９】
2020534848.tif 000013
（２）任意に前記工程(1)の反応後の反応系からＲ−３−アミノ酪酸を分離する工程を含み、
ここで、前記アスパルターゼは大腸菌由来のものであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アスパルターゼは野生型または突然変異体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｒ−３−アミノ酪酸のｅｅ値が≧９９．５％で、および／または前記反応の転換率が≧９０％であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記突然変異体は、野生型アスパルターゼに相応するアミノ酸配列に、２０４番目のスレニオン（Ｔ）、３３８番目のメチオニン（Ｍ）、３４１番目のリシン（Ｋ）、３４３番目のアスパラギン（Ｎ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるアミノ酸の突然変異が存在することを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記突然変異体における突然変異は、Ｔ２０４Ｃ、Ｍ３３８Ｉ、Ｋ３４１Ｍ、Ｎ３４３Ｃ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
アスパルターゼの使用であって、以下の立体異性化触媒反応の触媒に使用される製剤の製造に使用され、
【化１０】
2020534848.tif 000014
ここで、前記アスパルターゼは大腸菌由来のものであることを特徴とする使用。
【請求項７】
Ｒ−３−アミノ酪酸生産菌株であって、外来の大腸菌由来のアスパルターゼであるポリペプチドを発現し、かつ以下の立体異性化触媒反応の触媒に使用されることを特徴とする菌株。
【化１１】
2020534848.tif 000015
【請求項８】
Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法であって、
１）  生産条件で請求項7に記載の生産菌株を培養することにより、Ｒ−３−アミノ酪酸を得る工程、
２）  任意に、１）の培養系からＲ−３−アミノ酪酸を分離する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
立体異性化触媒活性を有するアスパルターゼであって、アミノ酸配列が配列番号３で示されることを特徴とするアスパルターゼ。
【請求項１０】
請求項９に記載のアスパルターゼをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に属し、具体的に、酵素法によってＲ−３−アミノ酪酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドルテグラビル（Ｄｏｌｕｔｅｇｒａｖｉｒ）は、グラクソ・スミスクライン社の抗ＨＩＶ新薬で、２０１３年にＦＤＡによって市販が許可され、この薬物の画期性が認められた。Ｒ−３−アミノ酪酸はドルテグラビルの生産における重要な中間体で、現在、既存の製造方法は主に化学合成法および酵素触媒法がある。
【０００３】
化学合成法は、たとえばＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １８  （２００７）  １５５４−１５６６では、ホルムアルデヒドを原料とし、ホーナー・ワズワース・エモンズ（Ｈｏｒｎｅｒ-Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ-Ｅｍｍｏｎｓ）反応を経て２−クロトン酸ｔ−ブチルを得、さらに付加し、触媒水素化を行い、Ｒ−３−アミノ酪酸ｔ−ブチルを得、最後に加水分解してＲ−３−アミノ酪酸を得ることができると報告された。しかし、この反応は−７８℃の低温環境が必要で、反応条件が厳しく、操作が困難である。
【０００４】
【化１】
2020534848.tif 000002
【０００５】
また、たとえば中国特許出願公報ＣＮ１０４３７０７５５では、アセト酢酸エチルを原料とし、アセトアミドと縮合し、不斉水素化し、さらに加水分解を経てＲ−３−アミノ酪酸を得る方法が公開されたが、この方法は高価な不斉水素化触媒が必要で、生産コストが高く、重金属汚染があり、産業化大規模生産に不利である。
【０００６】
【化２】
2020534848.tif 000003
【０００７】
酵素触媒法は、たとえばＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ  ２０１６，  ８，  １２２６−１２３２では、ラセミ体の３−アミノ酪酸ｔ−ブチルを原料とし、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＡ（ＣＬＡ−Ａ）による立体選択的触媒を経てＲ型３−ブチリルアミノ酪酸ｔ−ブチルを得、さらにＣＡＬ−Ａの触媒によって加水分解してＲ−３−アミノ酪酸を得ることが報告された。しかし、この方法は転換率が低く、未反応の原料が無駄になる。
【０００８】
【化３】
2020534848.tif 000004
【０００９】
さらに、ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ，２０１４，６，９６５−９６８では、バチルス菌ＹＭ５５−１由来のアスパルターゼの突然変異体ＢＳＡＳＰ−Ｃ６の触媒によってクロトン酸からＲ−３−アミノ酪酸を製造する方法が報告されたが、この方法では、１００時間の反応の転換率がわずか６０％で、反応時間が長く、転換率が低く、かつ反応時間の増加につれ、産物のｅｅ値が低下する。
【００１０】
そのため、本分野では、環境にやさしく、効率的で、高立体選択的なＲ−３−アミノ酪酸の製造方法の開発が切望されている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、Ｒ−３−アミノ酪酸のｅｅ値、転換率を顕著に向上させ、反応時間を短縮させることができる、効率的で、高立体選択的なＲ−３−アミノ酪酸の製造方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の第一の側面は、Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法であって、
（１）反応系において、クロトン酸を基質とし、アスパルターゼによる触媒下で、反応式Ｉで表される立体異性化触媒反応を行うことにより、Ｒ−３−アミノ酪酸を形成する工程を有することを特徴とする。
【００１３】
【化４】
2020534848.tif 000005
【００１４】
（２）任意に前記工程（１）の反応後の反応系からＲ−３−アミノ酪酸を分離する工程を含み、
ここで、前記アスパルターゼは大腸菌由来のものである方法を提供する。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは野生型または突然変異体である。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記Ｒ−３−アミノ酪酸のｅｅ値は≧９９．５％、好ましくは≧９９．７％、より好ましくは≧９９．８％、最も好ましくは≧９９．９％である。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記反応の転換率は≧９０％、好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９８％、さらに好ましくは≧９９％、最も好ましくは１００％である。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記突然変異体は、野生型アスパルターゼに相応するアミノ酸配列に、２０４番目のスレニオン（Ｔ）、３３８番目のメチオニン（Ｍ）、３４１番目のリシン（Ｋ）、３４３番目のアスパラギン（Ｎ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるアミノ酸の突然変異が存在する。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記突然変異体における突然変異は、Ｔ２０４Ｃ、Ｍ３３８Ｉ、Ｋ３４１Ｍ、Ｎ３４３Ｃ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記野生型アスパルターゼのアミノ酸配列は配列番号５で示される。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは、
（ａ）  アミノ酸配列が配列番号５で示されるポリペプチド、
（ｂ）  アミノ酸配列が配列番号３で示されるポリペプチド、あるいは
（ｃ）  配列番号５または配列番号３で示されるアミノ酸配列が１個または複数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、またさらに好ましくは１〜８個、一層さらに好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなるもので、（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドの機能を有する、配列番号５または配列番号３で示されるアミノ酸配列のポリペプチドから誘導されたポリペプチドからなる群から選ばれる。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼのアミノ酸配列は配列番号５または配列番号３で示される配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは、静止細胞、菌体、粗製酵素液、精製酵素、粗製酵素粉、固定化酵素、遊離酵素、醗酵液、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる形態である。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記反応系では、前記アスパルターゼの濃度は０．５〜５Ｕ／ｍＬである。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記反応系では、前記クロトン酸の濃度は１００ｍＭ〜１０００ｍＭである。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記反応系では、さらにアンモニウム源が存在する。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記アンモニウム源は、アンモニア水、ＮＨ４＋塩（たとえばＮＨ４Ｃｌ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記アンモニウム源とクロトン酸のモル比は、１：１〜１：３である。
【００２９】
もう一つの好適な例において、工程（ａ）では、反応系のｐＨは、７．０〜９．５、好ましくは７．５〜９．０、より好ましくは８．０〜８．５である。
【００３０】
もう一つの好適な例において、工程（ａ）では、反応温度は、２０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃、より好ましくは３５〜４５℃である。
【００３１】
もう一つの好適な例において、工程（ｉ）では、反応時間は、０．５ｈ〜７２ｈ、好ましくは２ｈ〜４８ｈ、より好ましくは４ｈ〜２４ｈである。
【００３２】
本発明の第二の側面は、アスパルターゼの使用であって、以下の立体異性化触媒反応の触媒に使用される製剤の製造に使用され、
【化５】
2020534848.tif 000006
ここで、前記アスパルターゼは大腸菌由来のものの使用を提供する。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは野生型または突然変異体である。
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは、本発明の第一の側面で定義された通りである。
【００３５】
本発明の第三の側面は、Ｒ−３−アミノ酪酸生産菌株であって、外来の大腸菌由来のアスパルターゼであるポリペプチドを発現し、かつ以下の立体異性化触媒反応の触媒に使用される菌株を提供する。
【００３６】
【化６】
2020534848.tif 000007
【００３７】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは野生型または突然変異体である。
【００３８】
もう一つの好適な例において、前記突然変異体は、野生型アスパルターゼに相応するアミノ酸配列に、２０４番目のスレニオン（Ｔ）、３３８番目のメチオニン（Ｍ）、３４１番目のリシン（Ｋ）、３４３番目のアスパラギン（Ｎ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるアミノ酸の突然変異が存在する。
【００３９】
もう一つの好適な例において、前記の突然変異は、Ｔ２０４Ｃ、Ｍ３３８Ｉ、Ｋ３４１Ｍ、Ｎ３４３Ｃ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００４０】
もう一つの好適な例において、前記生産菌株は細菌である。好ましくは、前記生産菌株は大腸菌である。より好ましくは、前記生産菌株はＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００４１】
本発明の第四の側面は、Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法であって、
１）  生産条件で本発明の第三の側面に記載の生産菌株を培養することにより、Ｒ−３−アミノ酪酸を得る工程、
２）  任意に、１）の培養系からＲ−３−アミノ酪酸を分離する工程を含む方法を提供する。
【００４２】
本発明の第五の側面は、立体異性化触媒活性を有するアスパルターゼであって、アミノ酸配列が配列番号３で示されるアスパルターゼを提供する。
【００４３】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは、菌体、粗製酵素液、精製酵素、粗製酵素粉、固定化酵素、遊離酵素、醗酵液、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる形態である。
【００４４】
本発明の第六の側面は、本発明の第五の側面に記載のアスパルターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４５】
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは、
（ａ）  配列番号３で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）  配列が配列番号４で示されるポリヌクレオチド、
（ｃ）  ヌクレオチド配列の配列番号４で示される配列との相同性が≧９５％（好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％）で、かつ配列番号３で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドからなる群から選ばれる。
【００４６】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせて、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明者は幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、意外にも、効率的で、高立体選択的なＲ−３−アミノ酪酸の製造方法を見出した。当該方法は、大腸菌由来の、立体異性化触媒活性を有するアスパルターゼを利用し、効率的に、高立体選択的にクロトン酸をＲ−３−アミノ酪酸に転換させる。特に、本発明の突然変異型アスパルターゼは非常に優れた高立体選択性および高転換率を有するため、大幅に転換効率を向上させ、反応時間を短縮させ、生産コストを削減する。実験では、反応のわずか２４ｈ後の転換率が≧９８％と高く、ｅｅ値が≧９９．９％であることが示された。本発明の方法は、収率が高く、転換率が高く、コストが低く、生産周期が短く、プロセスが簡単で、拡大しやすく、大規模生産に適するといった多くの利点がある。これに基づき、本発明を完成させた。
【００４８】
用語
ｅｅ値
本明細書で用いられるように、「ｅｅ値」または「エナンチオマー過剰度」は、キラル分子において一つのエナンチオマーのもう一つのエナンチオマーに対する過剰度を特徴付けるためのもので、通常、百分率で表示される。
【００４９】
アスパルターゼ
本明細書で用いられる用語「酵素」、「ポリペプチド」、「アスパルターゼ」、「本発明のポリペプチド」、「本発明のアスパルターゼ」または「ＡｓｐＡ」は同様の意味を有し、本明細書で入れ替えて使用することができ、いずれも大腸菌由来の、クロトン酸の立体異性化を触媒してＲ−３−アミノ酪酸を生成する活性を有するタンパク質を指す。好ましくは、前記の本発明のポリペプチドは、本発明の第一の側面で限定された酵素である。
【００５０】
アスパルターゼは、脱アミノ酵素の一つで、可逆的にＬ−アスパラギン酸が脱アミノ化してフマル酸を生成する反応を触媒する分解酵素で、ＥＣ  ４．  ３．  １．  １で、細菌、酵母に幅広く存在し、高等植物（たとえば豆類の芽や葉など）にも低濃度のアスパルターゼが含まれ、高等動物にはこの酵素は存在しない。
【００５１】
本発明において、大腸菌由来のアスパルターゼを、ＡｓｐＡと定義する。
【００５２】
本発明において、バチルス菌におけるアスパルターゼをＡｓｐＢと定義し、突然変異体をＢＳＡＳＰ−Ｃ６とする。
【００５３】
既存技術の知識に基づき、当業者に周知のように、ポリペプチドの一部の領域、たとえば重要でない領域で少数のアミノ酸残基を変えても生物活性が変わらず、たとえば、適切にあるアミノ酸を置換した配列ではその活性が影響されない（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第四版，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．  Ｐ２２４を参照する）。そのため、当業者は、得られた分子が必要な生物活性を維持することを保証しながら、このような置換を行うことができる。
【００５４】
具体的な実施形態において、本発明のアスパルターゼは野生型または突然変異体である。
【００５５】
好適な実施形態において、前記突然変異体は、野生型アスパルターゼに相応するアミノ酸配列に、２０４番目のスレニオン（Ｔ）、３３８番目のメチオニン（Ｍ）、３４１番目のリシン（Ｋ）、３４３番目のアスパラギン（Ｎ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるアミノ酸の突然変異が存在する。
【００５６】
もう一つの好適な例において、前記の突然変異は、Ｔ２０４Ｃ、Ｍ３３８Ｉ、Ｋ３４１Ｍ、Ｎ３４３Ｃ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００５７】
もう一つの好適な例において、前記野生型アスパルターゼのアミノ酸配列は配列番号５で示される。
【００５８】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは、
（ａ）  アミノ酸配列が配列番号５で示されるポリペプチド、
（ｂ）  アミノ酸配列が配列番号３で示されるポリペプチド、あるいは
（ｃ）  配列番号５または配列番号３で示されるアミノ酸配列が１個または複数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、またさらに好ましくは１〜８個、一層さらに好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなるもので、（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドの機能を有する、配列番号５または配列番号３で示されるアミノ酸配列のポリペプチドから誘導されたポリペプチドからなる群から選ばれる。
【００５９】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼのアミノ酸配列は配列番号５または配列番号３で示される配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
【００６０】
もう一つの好適な例において、前記アスパルターゼは、菌体、粗製酵素液、精製酵素、粗製酵素粉、固定化酵素、遊離酵素、醗酵液、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる形態である。
【００６１】
具体的な実施形態において、前記アスパルターゼは、アミノ酸配列が配列番号３で示され、当該ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号４で示される。
【００６２】
具体的な実施形態において、前記アスパルターゼは、アミノ酸配列が配列番号５で示され、当該ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号６で示される。
【００６３】
本発明において、前記アスパルターゼは、アミノ酸配列が配列番号５または３で示されるポリペプチドと比較すると、２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、さらに好ましくは３個以下、またさらに好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸に置換されてなる変異体を含む。これらの保存的突然変異体は、たとえば下記表に示されるようにアミノ酸の置換を行って生成することができる。
【００６４】
【表Ａ】
2020534848.tif 000008
【００６５】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび/または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
【００６６】
そのため、本発明書で用いられる「含有する」、「有する」または「含む」は、「含める」、「主に…で構成される」、「基本的に…で構成される」および「…で構成される」を含む。「主に…で構成される」、「基本的に…で構成される」および「…で構成される」は、「含有する」、「有する」または「含む」の下位概念に該当する。
【００６７】
具体的な実施形態において、前記相同性または配列同一性は、８０％以上でもよいが、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％〜９８％、最も好ましくは９９％以上である。
【００６８】
本分野の一般技術者に周知の配列の相同性または同一性の測定方法は、分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集，オックスフォード大学出版社，ニューヨーク，１９８８、バイオコンピューティング：情報科学および ゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ），Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集，アカデミック・プレス，ニューヨーク，１９９３、配列データのコンピューター分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ），第Ｉ部，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー，１９９４、分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミック・プレス，１９８７および配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ），Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９１およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）を含むが、これらに限定されない。同一性測定の好適な方法は、測定される配列の間で最大のマッチングを得るものである。同一性の測定方法は、公衆に得られるコンピュータープログラムに組み込まれている。２つの配列の間の同一性の測定に好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧプログラムパック （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮやＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ．ら，１９９０）を含むが、これらに限定されない。公衆は、ＮＣＢＩやほかのリソースからＢＬＡＳＴＸプログラム（ＢＬＡＳＴマニュアル，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，１９９０）を得ることができる。よく知られるＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法も同一性の測定に使用することができる。
【００６９】
Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法
本発明は、効率的で、高立体選択的なＲ−３−アミノ酪酸の製造方法を提供する。本発明の方法は、本発明の第一の側面に記載のように、大腸菌由来の、立体異性化触媒活性を有するアスパルターゼを利用し、効率的に、高立体選択的にクロトン酸をＲ−３−アミノ酪酸に転換させ、大幅に転換効率を向上させ、反応時間を短縮させ、生産コストを削減する。
【００７０】
好適な実施態様において、前記Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法は、
（１）反応系において、クロトン酸を基質とし、アスパルターゼによる触媒下で、反応式Ｉで表される立体異性化触媒反応を行うことにより、Ｒ−３−アミノ酪酸を形成する工程、
【化７】
2020534848.tif 000009
（２）任意に前記工程(1)の反応後の反応系からＲ−３−アミノ酪酸を分離する工程を含み、
ここで、前記アスパルターゼは大腸菌由来のものである。
【００７１】
もう一つの好適な例において、前記Ｒ−３−アミノ酪酸のｅｅ値は≧９９．５％、好ましくは≧９９．７％、より好ましくは≧９９．８％、最も好ましくは≧９９．９％である。
【００７２】
もう一つの好適な例において、前記反応の転換率は≧９０％、好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９８％、さらに好ましくは≧９９％、最も好ましくは１００％である。
【００７３】
もう一つの好適な実施態様において、前記Ｒ−３−アミノ酪酸を生産する方法は、
１）  生産条件で本発明のＲ−３−アミノ酪酸生産菌株を培養することにより、Ｒ−３−アミノ酪酸を得る工程、
２）  任意に、１）の培養系からＲ−３−アミノ酪酸を分離する工程を含む。
【００７４】
アスパルターゼの用途
本発明者は、思いがけず、本発明のアスパルターゼは以下の立体異性化触媒反応の触媒に使用される製剤の製造に有用であることを見出した。
【００７５】
【化８】
2020534848.tif 000010
【００７６】
Ｒ−３−アミノ酪酸生産菌株
また、本発明者は、本発明のアスパルターゼを発現する工学的菌株（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｔｒａｉｎ）を提供し、前記工学的菌株（またはそれに発現される本発明のアスパルターゼ、またはその固定化酵素）は効率的に、高立体選択的にクロトン酸をＲ−３−アミノ酪酸に転換させることができ、その転換率が≧９８％で、Ｒ−３−アミノ酪酸のキラルｅｅ値が≧９９．９％である。
【００７７】
もう一つの好適な例において、前記生産菌株は細菌である。好ましくは、前記生産菌株は大腸菌である。より好ましくは、前記生産菌株はＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００７８】
本発明の主な利点は以下の通りである。
【００７９】
本発明は、効率的に、高立体選択的にクロトン酸をＲ−３−アミノ酪酸に転換させることができ、反応のわずか２４ｈ後の転換率が≧９８％と高く、ｅｅ値が≧９９．９％で、大幅に転換効率を向上させ、反応時間を短縮させ、生産コストを削減する。
【００８０】
本発明の方法は、転換率が高く、コストが低く、収率が高く、生産周期が短く、プロセスが簡単で、拡大しやすく、大規模生産に適し、得られるＲ−３−アミノ酪酸のｅｅ値が非常に高い。Ｒ−３−アミノ酪酸およびＲ−３−アミノ酪酸を前駆体とする下流産物の生産において応用の将来性が大いにある。
【００８１】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、「％」と「部」は、重量で計算された。
【００８２】
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学用語はいずれも本発明が属する分野の普通の技術者が通常理解する意味と同様である。本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料で本発明を実施または検証することができるが、本明細書に記載の方法と材料が好ましい。
【実施例１】
【００８３】
ＡｓｐＡ野生型の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成および検出
１．１  Ａｓｐａ野生型酵素液の調製
ＡｓｐＡ野生型のアミノ酸配列(配列番号５)に従い、ＡｓｐＡ野生型酵素をコードするデオキシリボ核酸配列(配列番号６)を合成し、酵素をｐＥＴ２８ａに連結し、酵素切断部位はＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで、酵素が連結されたベクターで、宿主である大腸菌ＢＬ２１感受性細胞を形質転換する。シード菌をＴＢ培地に接種し、３７℃で、２００ｒｐｍシェーカーにおいてＯＤ６００値が４．０になるまで培養し、ＩＰＴＧを濃度が０．１ｍＭになるように入れて誘導し、温度を２８℃にして続けて１２時間培養し、４℃で遠心して菌体を収集し、リン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で細胞を再懸濁させ、均質化して破砕させ、ＡｓｐＡ野生型酵素液を得た。
【００８４】
ＡｓｐＡ野生型のアミノ酸配列：
CLKQIIGSLKKKVHMSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ（配列番号５）
【００８５】
ＡｓｐＡ野生型の核酸コード配列：
TGCCTGAAACAGATCATCGGTTCTCTGAAAAAAAAAGTTCACATGTCTAACAACATCCGTATCGAAGAAGACCTGCTGGGTACCCGTGAAGTTCCGGCTGACGCTTACTACGGTGTTCACACCCTGCGTGCTATCGAAAACTTCTACATCTCTAACAACAAAATCTCTGACATCCCGGAATTCGTTCGTGGTATGGTTATGGTTAAAAAAGCTGCTGCTATGGCTAACAAAGAACTGCAGACCATCCCGAAATCTGTTGCTAACGCTATCATCGCTGCTTGCGACGAAGTTCTGAACAACGGTAAATGCATGGACCAGTTCCCGGTTGACGTTTACCAGGGTGGTGCTGGTACCTCTGTTAACATGAACACCAACGAAGTTCTGGCTAACATCGGTCTGGAACTGATGGGTCACCAGAAAGGTGAATACCAGTACCTGAACCCGAACGACCACGTTAACAAATGCCAGTCTACCAACGACGCTTACCCGACCGGTTTCCGTATCGCTGTTTACTCTTCTCTGATCAAACTGGTTGACGCTATCAACCAGCTGCGTGAAGGTTTCGAACGTAAAGCTGTTGAATTCCAGGACATCCTGAAAATGGGTCGTACCCAGCTGCAGGACGCTGTTCCGATGACCCTGGGTCAGGAATTCCGTGCTTTCTCTATCCTGCTGAAAGAAGAAGTTAAAAACATCCAGCGTACCGCTGAACTGCTGCTGGAAGTTAACCTGGGTGCTACCGCTATCGGTACCGGTCTGAACACCCCGAAAGAATACTCTCCGCTGGCTGTTAAAAAACTGGCTGAAGTTACCGGTTTCCCGTGCGTTCCGGCTGAAGACCTGATCGAAGCTACCTCTGACTGCGGTGCTTACGTTATGGTTCACGGTGCTCTGAAACGTCTGGCTGTTAAAATGTCTAAAATCTGCAACGACCTGCGTCTGCTGTCTTCTGGTCCGCGTGCTGGTCTGAACGAAATCAACCTGCCGGAACTGCAGGCTGGTTCTTCTATCATGCCGGCTAAAGTTAACCCGGTTGTTCCGGAAGTTGTTAACCAGGTTTGCTTCAAAGTTATCGGTAACGACACCACCGTTACCATGGCTGCTGAAGCTGGTCAGCTGCAGCTGAACGTTATGGAACCGGTTATCGGTCAGGCTATGTTCGAATCTGTTCACATCCTGACCAACGCTTGCTACAACCTGCTGGAAAAATGCATCAACGGTATCACCGCTAACAAAGAAGTTTGCGAAGGTTACGTTTACAACTCTATCGGTATCGTTACCTACCTGAACCCGTTCATCGGTCACCACAACGGTGACATCGTTGGTAAAATCTGCGCTGAAACCGGTAAATCTGTTCGTGAAGTTGTTCTGGAACGTGGTCTGCTGACCGAAGCTGAACTGGACGACATCTTCTCTGTTCAGAACCTGATGCACCCGGCTTACAAAGCTAAACGTTACACCGACGAATCTGAACAG（配列番号６）
【００８６】
１．２  ＡｓｐＡ野生型の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成
１００ｍＬの反応系において、３７℃で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液をｐＨ  ８．０になるように、ＭｇＣｌ２を最終濃度が２ｍＭになるように、３００ｍＭになるようにクロトン酸を、３００ｍＭになるようにＮＨ４Ｃｌを、ＡｓｐＡ野生型酵素液を２０ｍＬ入れた。
【００８７】
ＨＰＬＣによって反応の進展を検出し、反応を２４ｈで停止させ、転換率が＜５％であった。
【００８８】
転換率の計算：転換率は、物質転換率とも呼ばれ、数値上は発酵過程において消耗されたクロトン酸と発酵開始時のクロトン酸の合計量との比で、通常、百分率で表示され、モル比（ｍｏｌ％）でも、重量比（ｗｔ％）でもよい。
【実施例２】
【００８９】
ＡｓｐＡ突然変異体1の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成および検出
２．１  ＡｓｐＡ突然変異体１酵素液の調製
ＡｓｐＡ突然変異体１の４つの突然変異部位のアミノ酸はいずれも突然変異した（表１および表２を参照する）。ＡｓｐＡ突然変異体１のアミノ酸配列(配列番号３)に従い、ＡｓｐＡ突然変異体１酵素をコードするデオキシリボ核酸配列(配列番号４)を合成し、酵素をｐＥＴ２８ａに連結し、酵素切断部位はＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで、酵素が連結されたベクターで、宿主である大腸菌ＢＬ２１感受性細胞を形質転換する。シード菌をＴＢ培地に接種し、３７℃で、２００ｒｐｍシェーカーにおいてＯＤ６００値が４．０になるまで培養し、ＩＰＴＧを濃度が０．１ｍＭになるように入れて誘導し、温度を２８℃にして続けて１２時間培養し、４℃で遠心して菌体を収集し、リン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で細胞を再懸濁させ、均質化して破砕させ、ＡｓｐＡ突然変異体１酵素液を得た。
【００９０】
ＡｓｐＡ突然変異体１のアミノ酸配列：
CLKQIIGSLKKKVHMSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRCQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIIPAMVCPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ（配列番号３）
【００９１】
ＡｓｐＡ突然変異体１の核酸コード配列：
TGCCTGAAACAAATCATTGGTAGCCTGAAGAAAAAAGTGCACATGAGCAATAACATTCGCATCGAAGAGGATCTGCTGGGTACACGTGAAGTGCCGGCAGATGCCTACTACGGTGTGCATACACTGCGCGCCATCGAAAATTTTTACATCAGCAATAATAAAATCAGCGATATCCCGGAATTCGTGCGCGGCATGGTTATGGTGAAAAAAGCCGCCGCAATGGCCAACAAGGAACTGCAGACCATTCCGAAGAGTGTGGCAAACGCCATTATCGCCGCCTGTGATGAAGTGCTGAACAATGGTAAATGCATGGATCAGTTTCCGGTGGACGTGTATCAAGGCGGCGCCGGTACCAGCGTGAACATGAACACCAATGAGGTGCTGGCCAACATTGGTCTGGAGCTGATGGGTCACCAGAAAGGCGAATACCAGTACCTGAACCCGAACGATCACGTGAACAAGTGTCAGAGCACAAATGACGCATACCCGACAGGCTTTCGTATTGCCGTGTACAGTAGCCTGATCAAGCTGGTGGATGCCATCAATCAGCTGCGTGAAGGCTTCGAGCGTAAGGCCGTTGAATTTCAGGACATCCTGAAAATGGGTCGTTGTCAGCTGCAGGATGCAGTGCCGATGACCCTGGGTCAGGAATTTCGCGCATTCAGCATCCTGTTAAAAGAGGAAGTGAAAAACATCCAGCGTACCGCCGAACTGCTGCTGGAAGTTAACCTGGGTGCCACCGCCATCGGCACAGGCCTGAATACCCCGAAAGAGTATAGCCCGCTGGCCGTTAAAAAACTGGCAGAGGTGACCGGTTTCCCGTGTGTGCCGGCAGAGGATCTGATCGAAGCAACCAGCGATTGCGGTGCTTATGTTATGGTGCATGGTGCCCTGAAACGCCTGGCCGTTAAGATGAGTAAAATCTGTAATGACCTGCGTCTGCTGAGCAGCGGTCCTCGTGCAGGCCTGAACGAGATCAACCTGCCGGAACTGCAGGCCGGCAGTAGCATCATCCCGGCCATGGTTTGCCCTGTGGTGCCGGAGGTGGTGAATCAGGTGTGCTTCAAGGTGATCGGCAATGACACCACCGTGACAATGGCCGCAGAGGCAGGCCAGCTGCAACTGAACGTGATGGAGCCGGTGATTGGCCAGGCCATGTTTGAAAGCGTGCACATCTTAACCAACGCCTGCTACAACCTGCTGGAGAAATGCATCAATGGTATTACCGCCAACAAAGAAGTTTGCGAGGGTTACGTGTACAACAGCATTGGCATCGTGACCTATCTGAATCCGTTTATTGGCCATCACAACGGCGACATTGTGGGCAAGATTTGCGCAGAGACCGGCAAAAGTGTTCGCGAAGTGGTTCTGGAGCGCGGTTTACTGACCGAGGCCGAACTGGATGACATTTTCAGCGTTCAAAATCTGATGCACCCGGCCTACAAAGCCAAACGCTACACAGACGAAAGCGAGCAA（配列番号４）
【００９２】
酵素活性を測定したところ、５．１  Ｕ／ｍＬであった。ＡｓｐＡ突然変異体１酵素の酵素活性Ｕは、１分間につきクロトン酸から触媒によって１マイクロモルの産物であるＲ−３−アミノ酪酸を生成させる酵素の量は１酵素活性単位、すなわち、１Ｕであるように定義されている。
【００９３】
測定方法：１００ｍＬ三角フラスコに、１６ｍＬの反応液（ｐＨ８．０）を入れ、反応液に３００ｍｍｏｌ／Ｌクロトン酸、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化アンモニウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液が含まれ、密閉し、反応液および酵素液をそれぞれ４２度のシェーカーに置いて５〜１０ｍｉｎインキュベートした。反応液にＡｓｐＡ突然変異体酵素液を４ｍＬ入れ、すぐに４２℃、回転数２００ｒｐｍのシェーカーにおいて反応を開始した。３０ｍｉｎ後、サンプルを１ｍＬ採取し、１ｍＬのアセトニトリルを入れて反応を停止させ、遠心でタンパク質を除去し、上清液を２，４−ジニトロフルオロベンゼンで誘導し、ＨＰＬＣによって分析した(ピーク面積から酵素活性を計算した)。
【００９４】
２．２  ＡｓｐＡ突然変異体１の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成
１００ｍＬの反応系において、３７℃で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液をｐＨ８．０になるように、ＭｇＣｌ２を最終濃度が２ｍＭになるように、３００ｍＭになるようにクロトン酸を、３００ｍＭになるようにＮＨ４Ｃｌを、ＡｓｐＡ突然変異体１酵素液を２０ｍＬ入れた。
【００９５】
ＨＰＬＣによって反応の進展を検出し、反応を２４ｈで停止させ、転換率が≧９８％で、ｅｅ値が９９．９％であった。
【実施例３】
【００９６】
ＡｓｐＡ突然変異体２〜１２の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成および検出
３．１  ＡｓｐＡ突然変異体２〜１２酵素液の調製
ＡｓｐＡ突然変異体２〜１２の具体的な突然変異の状況は表１および表２に示すように、ここで、ＡｓｐＡ突然変異体２〜５は単アミノ酸突然変異で、ＡｓｐＡ突然変異体６〜８は２つの突然変異部位のアミノ酸突然変異で、ＡｓｐＡ突然変異体９〜１２は３つの突然変異部位のアミノ酸突然変異である。
【００９７】
ＡｓｐＡ突然変異体２〜１２のアミノ酸配列に従い、それぞれＡｓｐＡ突然変異体酵素をコードするデオキシリボ核酸配列を合成し、酵素液の調製方法は実施例２．１と同様である。
【００９８】
【表１】
2020534848.tif 000011
【００９９】
【表２】
2020534848.tif 000012
【０１００】
３．２  ＡｓｐＡ突然変異体２〜１２の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成
実験方法は実施例２．２と同様で、ＡｓｐＡ突然変異体１酵素液の代わりにそれぞれＡｓｐＡ突然変異体２〜１２酵素液を使用した。
【０１０１】
結果は表２に示す。実験結果から、２４ｈの反応後、ＡｓｐＡ野生型(実施例１)および突然変異体１(実施例２)および突然変異体２〜１２(実施例３)はいずれもある程度の立体選択性を有し（選択的にＲ−３−アミノ酪酸の形成を触媒することができる）、かつ反応時間がいずれも顕著に短縮したことがわかる。また、転換率および反応速度について、突然変異体１(４部位の突然変異体)は顕著に３部位の突然変異体(たとえば突然変異体９〜１２)、そして２部位の突然変異体(たとえば突然変異体６−８)、単部位の突然変異体(たとえば突然変異体２〜５)および野生型よりも優れたことがわかる。
【０１０２】
比較例１．  バチルス菌由来のＡｓｐＢ突然変異体の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成および検出
１．１  バチルス菌ＡｓｐＢ突然変異体酵素液の調製
ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ，２０１４，６，９６５−９６８における方法を参照してＡｓｐＢ突然変異体酵素液を調製し、ＡｓｐＢ突然変異体のアミノ酸配列は配列番号１で示され、核酸コード配列は配列番号２で示される。
【０１０３】
ＡｓｐＢ突然変異体のアミノ酸配列：
NTDVRIEKDFLGEKEIPKDAYYGVQTIRATENFPITGYRIHPELIKSLGIVKKSAALANMEVGLLDKEVGQYIVKAADEVIEGKWNDQFIVDPIQGGAGTSINMNANEVIANRALELMGEEKGNYSKISPNSHVNMSQSTNDAFPTATHIAVLSLLNQLIETTKYMQQEFMKKADEFAGVIKMGRCHLQDAVPILLGQEFEAYARVIARDIERIANTRNNLYDINMGATAVGTGLNADPEYISIVTEHLAKFSGHPLRSAQHLVDATQNTDCYTEVSSALKVCMINMSKIANDLRLMASGPRAGLSEIVLPARQPGSSIIPGMVCPVMPEVMNQVAFQVFGNDLTITSASEAGQFELNVMEPVLFFNLIQSISIMTNVFKSFTENCLKGIKANEERMKEYVEKSIGIITAINPHVGYETAAKLAREAYLTGESIRELCIKYGVLTEEQLNEILNPYEMIHPGIAGRK（配列番号１）
【０１０４】
ＡｓｐＢ突然変異体の核酸コード配列：
AACACCGATGTGCGCATTGAGAAGGACTTCCTGGGTGAAAAGGAAATCCCGAAGGATGCCTATTACGGCGTGCAGACCATCCGTGCCACAGAGAACTTTCCTATCACCGGCTACCGCATCCATCCGGAACTGATTAAGAGCCTGGGCATTGTGAAGAAAAGCGCCGCACTGGCAAACATGGAGGTGGGTCTGCTGGATAAGGAAGTGGGTCAGTACATCGTGAAGGCCGCCGACGAAGTTATTGAAGGTAAGTGGAACGATCAGTTTATCGTGGACCCGATTCAGGGCGGCGCAGGTACAAGCATTAATATGAACGCCAACGAAGTGATCGCAAACCGCGCCCTGGAACTGATGGGTGAGGAAAAGGGCAACTATAGCAAGATCAGCCCGAACAGCCACGTTAACATGAGCCAGAGCACCAATGATGCATTTCCGACCGCAACCCATATTGCCGTGCTGAGTCTGCTGAATCAGCTGATCGAGACCACCAAGTACATGCAGCAGGAGTTTATGAAGAAGGCCGACGAATTCGCCGGCGTTATTAAAATGGGCCGCTGCCATCTGCAAGACGCCGTTCCGATTCTGCTGGGTCAGGAGTTTGAGGCTTATGCTCGTGTGATCGCACGTGACATTGAGCGCATCGCCAATACCCGTAACAACCTGTATGATATCAACATGGGCGCAACCGCCGTTGGCACAGGCCTGAATGCAGACCCGGAGTACATTAGCATCGTTACCGAGCACCTGGCCAAATTTAGCGGTCATCCGCTGCGTAGTGCCCAGCATCTGGTTGATGCCACCCAGAATACAGATTGCTACACCGAGGTGAGCAGTGCCCTGAAAGTGTGCATGATCAATATGAGTAAGATTGCCAACGACCTGCGCTTAATGGCAAGTGGCCCGCGCGCAGGCCTGAGCGAAATTGTTCTGCCTGCACGCCAACCGGGCAGCAGCATCATCCCTGGTATGGTGTGTCCGGTGATGCCGGAAGTGATGAACCAGGTTGCCTTCCAGGTGTTCGGTAACGACCTGACCATCACAAGCGCAAGCGAAGCAGGCCAGTTCGAGTTAAACGTGATGGAACCTGTGCTGTTTTTTAACTTAATTCAGAGCATCAGTATTATGACAAATGTTTTTAAGTCTTTTACCGAAAACTGTCTGAAAGGTATCAAGGCCAACGAGGAACGCATGAAAGAGTATGTGGAAAAAAGCATTGGCATCATCACCGCCATCAACCCGCATGTGGGCTATGAGACAGCCGCCAAACTGGCCCGCGAAGCCTATTTAACCGGCGAGAGTATTCGCGAGCTGTGTATCAAGTACGGCGTGCTGACCGAAGAGCAGCTGAACGAGATCCTGAATCCGTACGAGATGATCCATCCTGGCATTGCAGGTCGCAAA（配列番号２）
【０１０５】
酵素活性を測定したところ、３．８Ｕ／ｍＬであった。ＡｓｐＢ突然変異体酵素の酵素活性Ｕは、１分間につきクロトン酸から触媒によって1マイクロモルの産物であるＲ−３−アミノ酪酸を生成させる酵素の量は１酵素活性単位、すなわち、１Ｕであるように定義されている。
【０１０６】
測定方法：１００ｍＬ三角フラスコに、１６ｍＬの反応液（ｐＨ８．５）を入れ、反応液に３００ｍｍｏｌ／Ｌクロトン酸、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化アンモニウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液が含まれ、密閉し、反応液および酵素液をそれぞれ４２度のシェーカーに置いて５〜１０ｍｉｎインキュベートした。反応液に酵素液を４ｍＬ入れ、すぐに４２℃で、回転数２００ｒｐｍのシェーカーにおいて反応を開始した。３０ｍｉｎ後、サンプルを１ｍＬ採取し、１ｍＬのアセトニトリルを入れて反応を停止させ、遠心でタンパク質を除去し、上清液を２，４−ジニトロフルオロベンゼンで誘導し、ＨＰＬＣによって分析した(ピーク面積から酵素活性を計算した)。
【０１０７】
１．２  ＡｓｐＢ突然変異体の触媒によるＲ−３−アミノ酪酸の合成
１００ｍＬの反応系において、３７℃で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液をｐＨ８．０になるように、ＭｇＣｌ２を最終濃度が２ｍＭになるように、３００ｍＭになるようにクロトン酸を、３００ｍＭになるようにＮＨ４Ｃｌを、ＡｓｐＢ突然変異体酵素液を２０ｍＬ入れた。
【０１０８】
ＨＰＬＣによって反応の進展を検出し、反応２４ｈの時点で、転換率が４２％で、ｅｅ値が９９．９％で、反応１００ｈの時点で、転換率が６０％で、ｅｅ値が９９．７％であった。
【０１０９】
結果から、比較例における方法と比べ、本発明の方法は、大腸菌由来の、立体異性化触媒活性を有するアスパルターゼを利用し、効率的に、高立体選択的にクロトン酸をＲ−３−アミノ酪酸に転換させ、大幅に転換効率を向上させ、反応時間を短縮させ、生産コストを削減することが示された。本発明の方法は、収率が高く、転換率が高く、コストが低く、生産周期が短く、プロセスが簡単で、拡大しやすく、大規模生産に適するといった多くの利点がある。これに基づき、本発明を完成させた。
【０１１０】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【国際調査報告】
2020534848.tif 000016
2020534848.tif 000017
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