(57)【要約】本開示は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を調節するために血液脳関門に浸透することが可能な化合物に関する。本開示はさらに、膠芽腫及び他のＥＧＦＲ媒介がんを治療する方法に関する。本開示はさらに、阻害剤の存在下でグルコース代謝を変化させたと決定された膠芽腫及び他のＥＧＦＲ媒介がんを治療する方法に関する。本開示はまた、対象にグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与する方法を提供する。【選択図】図２６Ａ
2020536855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ−ａまたは式Ｉ−ｂの化合物：
【化１】
2020536855.tif 000101
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体（式中：
Ｚは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、水素、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ７、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ８、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり；またはＲ１及びＲ２は、一緒になって炭素環式または複素環式環を完成し；
Ｒ３は、水素、アルキル、またはアシルであり；
Ｒ４は、アルコキシであり；
Ｒ５は、アルキルであり；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、アルキル、例えばアルコキシアルキル、アラルキル、またはアリールアシルから選択される）。
【請求項２】
Ｒ７及びＲ８がアルコキシアルキルであり、Ｒ３が水素である場合、そのときはＺは、３−エチニルフェニルではない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｚは、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールから選択されるＲ６で任意に置換されている、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アラルキル、またはアリールアシルから選択され；
Ｒ６の各存在は、独立して、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択され；または
Ｒ１及びＲ２は、一緒になって炭素環式または複素環式環を完成する
のいずれかである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ７及びＲ８が組み合わさって複素環式環を形成し、Ｒ３が水素である場合、そのときはＺは、２−フルオロ、４−ブロモフェニル、３−ブロモフェニル、３−メチルフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、または３−クロロ、４−フルオロフェニルではない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物は、式（ＩＩ−ａ）または式（ＩＩ−ｂ）：
【化２】
2020536855.tif 000102
の化合物である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１は、水素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１は、ＯＲ７である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ７は、水素である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ７は、アルキルである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ７は、アルコキシアルキルである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ７は、アリールアシルである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２は、フラニルなどのヘテロアリールである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ヘテロアリールは、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、
【化３】
2020536855.tif 000103
で置換されている、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２は、ＯＲ８である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ８は、水素である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ８は、アルコキシアルキルである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ８は、
【化４】
2020536855.tif 000104
で置換されたアルキルである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ８は、アシルである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ８は、アリールアシルである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１及びＲ２は、組み合わさって炭素環式または複素環式環、例えば、５員、６員、または７員炭素環式または複素環式環を形成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記炭素環式または複素環式環は、ヒドロキシル、アルキル（例えば、メチル）、またはアルケニル（例えば、ビニル）で置換されている、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物は、
【化５】
2020536855.tif 000105
である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記炭素環式または複素環式環は、アルキル（例えば、メチル）で置換されており、前記アルキル部分は、互いに対してトランスである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物は、
【化６】
2020536855.tif 000106
である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
前記炭素環式または複素環式環は、アルキル（例えば、メチル）で置換されており、前記アルキル部分は、互いに対してシスである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２７】
前記化合物は、
【化７】
2020536855.tif 000107
である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記化合物は、式（ＩＩＩ−ａ）、（ＩＩＩ−ｂ）、（ＩＩＩ−ｃ）、（ＩＩＩ−ｄ）、（ＩＩＩ−ｅ）、または（ＩＩＩ−ｆ）：
【化８】
2020536855.tif 000108
である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ３は、水素である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ３は、アシルである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ３は、アルキルアシルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ３は、アルキルオキシアシルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ３は、アシルオキシアシルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ３は、
【化９】
2020536855.tif 000109
であり；
Ｒ９は、アルキルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｚは、１つ以上のＲ６で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ６の各存在は、独立して、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アルキニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｚは、１、２、３、４、または５個のＲ６で置換されたフェニルである、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
各Ｒ６は、独立して、ハロ、アルキル、アルキニル、またはアリールアルコキシから選択される、請求項３５または３６に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｚは、２−フルオロ−３−クロロフェニル、２−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、２，４，６−トリフルオロフェニル、ペンタフルオロフェニル、２−フルオロ−３−ブロモフェニル、２−フルオロ−３−エチニルフェニル、及び２−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｚは、３−エチニルフェニルである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｚは、３−クロロ−４−（（３−フルオロベンジル）オキシ）ベンゼンである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｚは、３−クロロ−２−（トリフルオロメチル）フェニルである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｚは、２−フルオロ−３−ブロモフェニルである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｚは、２−フルオロ，５−ブロモフェニルである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｚは、２，６−ジフルオロ，５−ブロモフェニルである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｚは、
【化１０】
2020536855.tif 000110
から選択される１つのＲ６で置換されており；
Ｒ９及びＲ１０は、独立して、アルキルから選択される、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
前記化合物は、式（ＩＶ−ａ）の化合物：
【化１１】
2020536855.tif 000111
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４７】
前記化合物は、式（ＩＶ−ｂ）の化合物：
【化１２】
2020536855.tif 000112
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４８】
前記化合物は、式（ＩＶ−ｃ）の化合物：
【化１３】
2020536855.tif 000113
であり；
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４９】
前記化合物は、式（ＩＶ−ａ）の化合物：
【化１４】
2020536855.tif 000114
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５０】
前記化合物は、式（Ｖ−ｂ）の化合物：
【化１５】
2020536855.tif 000115
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５１】
前記化合物は、式（Ｖ−ｃ）の化合物：
【化１６】
2020536855.tif 000116
であり；
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５２】
前記化合物は：
【化１７】
2020536855.tif 000117
2020536855.tif 000118
2020536855.tif 000119
2020536855.tif 000120
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５３】
先行請求項のいずれか１項に記載の化合物及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項５４】
ＥＧＦＲまたはそのバリアント、例えば、ΔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ細胞外変異体、ＥＧＦＲ  Ａ２８９、ＥＧＦＲ  Ｔ２６３、及び／またはＥＧＦＲ活性化変異体、例えば、ｅｘ１９欠失を阻害する方法であって、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の化合物または組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５５】
がんを治療する方法であって、がんの治療を必要とする対象に請求項１〜５２のいずれか１項に記載の化合物または組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
前記がんは、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、心臓癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、線維肉腫、胃癌、消化器癌、頭部、脊椎及び頸部癌、カポジ肉腫、腎臓癌、白血病、肝臓癌、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、膵臓癌、陰茎癌、精巣生殖細胞癌、胸腺腫癌、胸腺癌、肺癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記がんは、神経膠腫、星細胞腫または膠芽腫である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
神経膠腫またはＧＢＭと診断された対象を分類する方法であって：
ａ．前記対象から生物学的試料を得ること；
ｂ．前記生物学的試料をグルコース代謝阻害剤で処置すること；
ｃ．グルコース代謝が前記グルコース代謝阻害剤によって減弱されるかどうかを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項５９】
前記生物学的試料は、ＧＢＭ腫瘍からのものである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記方法はさらに、グルコース減弱のレベルを対照と比較することを含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記対照は、非がん性試料、異なる表現型を有するがん性試料、野生型ＥＧＦＲ発現レベルを有するがん試料または前記生物学的試料がグルコース代謝阻害剤に供される前に前記生物学的試料から採取されたがん性試料を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記方法はさらに、グルコース代謝が前記生物学的試料において前記グルコース代謝阻害剤によって減弱された場合に前記対象を代謝応答体として分類することを含む、請求項５８〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記方法はさらに、代謝応答体として分類された前記対象をグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤で治療することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６４】
対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象にグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項６５】
前記がんは、神経膠腫、星細胞腫または膠芽腫である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
対象における膠芽腫を治療する方法であって、前記対象がＥＧＦＲ阻害剤によって低減したグルコース代謝に対して感受性であると決定した後に前記対象に所定量のグルコース取り込み阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項６７】
対象における膠芽腫を治療する方法であって、前記対象がＥＧＦＲ阻害剤によって低減したグルコース代謝に対して感受性であると決定した後に前記対象に治療的有効量のグルコース取り込み阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項６８】
対象における膠芽腫増殖を低減する方法であって、前記対象に所定量のＥＧＦＲ阻害剤及びＭＤＭ２阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項６９】
対象における膠芽腫増殖を低減する方法であって、前記対象から採取された試料中のグルコース代謝が、ＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性であると決定した後に、有効量のＥＧＦＲ阻害剤及びＭＤＭ２阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７０】
対象におけるがんを治療するまたはがん細胞増殖を低減するための方法であって、前記対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７１】
グルコース代謝阻害剤に対して応答性であるがんを有すると決定された対象におけるがんを治療するまたはがん細胞増殖を低減するための方法であって、治療的有効量のグルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７２】
前記がんは、多形性膠芽腫、神経膠腫、低悪性度星細胞腫、混合乏突起星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、多形性黄色星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、未分化星細胞腫、ＣＮＳ癌、非ＣＮＳ癌、もしくはＣＮＳ転移または肺癌である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
対象における悪性神経膠腫または膠芽腫を治療する方法であって、前記対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７４】
対象における悪性神経膠腫または膠芽腫を治療する方法であって、前記対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定された後に前記対象に所定量の前記グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７５】
前記対象は、
ａ．前記対象から腫瘍生検を得ること；
ｂ．前記グルコース代謝阻害剤の存在下で前記腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定すること；
ｃ．工程ｂで得られた前記腫瘍細胞によるグルコース取り込みの前記レベルを対照によるグルコース取り込みのレベルと比較すること；及び
ｄ．前記腫瘍細胞によるグルコース取り込みの前記レベルが前記対照と比較して減弱された場合、前記対象が前記グルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定すること
を含む方法によって前記グルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている、請求項５８〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
グルコース取り込みは、放射性標識されたグルコース２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）の取り込みによって測定される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記１８Ｆ−ＦＤＧを陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によって検出することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象は、
ａ．前記対象から第１の血液試料を得ること；
ｂ．前記対象をケトン食療法に付すこと；
ｃ．所定期間ケトン食療法に付された後に前記対象から第２の血液試料を得ること；
ｄ．前記第１及び前記第２の血液試料中のグルコースレベルを測定すること；
ｅ．前記第２の血液試料中の前記グルコースレベルを前記第１の血液試料中の前記グルコースレベルと比較すること；及び
ｆ．前記第２の血液試料中の前記グルコースレベルが前記第１の血液試料中のグルコースレベルと比較して低減する場合、前記対象が感受性であると決定すること
を含む方法によって前記グルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている、請求項５８〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記第２の血液試料と前記対照血液試料との間の前記グルコースレベルの低減は、約０．１５ｍＭまたはそれを超える、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２の血液試料と前記対照血液試料との間の前記グルコースレベルの低減は、約０．２０ｍＭまたはそれを超える、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２の血液試料と前記対照血液試料との間の前記グルコースレベルの低減は、約０．１５ｍＭ〜２．０ｍＭの範囲内である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２の血液試料と前記対照血液試料との間の前記グルコースレベルの低減は、約０．２５ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲内である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤での治療に対するがん細胞または腫瘍の感受性を評価する方法であって、前記がん細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定または検出すること及びグルコース取り込みの前記レベルを対照と比較することを含む、前記方法。
【請求項８４】
前記グルコースは、放射性標識されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記放射性標識されたグルコースは、２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
放射性標識されたグルコース取り込みを測定及び検出することは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によって定量化される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記対照は、非がん性試料、異なる表現型を有するがん性試料、野生型ＥＧＦＲ発現レベルを有するがん試料を含む、請求項８３〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記グルコース代謝阻害剤は、グルコース取り込み阻害剤、グルコーストランスポーター阻害剤、解糖阻害剤、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤を含む、請求項５８〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、またはオシメルチニブである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＥＧＦＲ阻害剤は、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の化合物である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記グルコース代謝阻害剤は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ピクチリシブ、ダクトリシブ、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、イデラリシブ、デュベリシブ、ブパルリシブ、ＩＰＩ−５４９、ＳＰ２５２３、ＧＤＣ−０３２６、ＴＧＲ−１２０２、ＶＰＳ３４阻害剤１、ＧＳＫ２２６９５５７、ＧＤＣ−００８４、ＳＡＲ４０５、ＡＺＤ８８３５、ＬＹ３０２３４１４、ＰＩ−１０３、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＩＣ−８７１１４、ウォルトマニン、ＸＬ１４７類似体、ＺＳＴＫ４７４、アルペリシブ、ＰＩＫ−７５ＨＣｌ、Ａ６６、ＡＳ−６０５２４０、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）、ＰＩＫ−９３、ＰＩＫ−９０、ＡＺＤ６４８２２、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＧＳＫ１０５９６１５、デュベリシブ、ゲダトリシブ、ＴＧ１００−１１５、ＡＳ−２５２４２４、ＢＧＴ２２６、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＳ−６０４８５０、ＰＩＫ−２９４、ＧＳＫ２６３６７７１、コパンリシブ、ＹＭ２０１６３６、ＣＨ５１３２７９９、ＣＡＹ１０５０５、ＰＩＫ−２９３、ＰＫＩ−４０２、ＴＧ１００７１３、ＶＳ−５５８４、タセリシブ、ＣＺＣ２４８３２、ＡＭＧ３１９、ＧＳＫ２２９２７６７、ＨＳ−１７３、クエルセチン、ボクスタリシブ、ＰＩＫ−９３、オミパリシブ、ＰＩＫ−９０、ＧＮＥ−３１７、ピララリシブ、ＰＦ−４９８９２１６、ＡＺＤ８１８６、７４０Ｙ−Ｐ、Ｖｐｓ３４−ＩＮ１、ＰＩＫ−ＩＩＩ、ＰＩ−３０６５またはそれらの類似体である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記グルコース代謝阻害剤は、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）またはサイトカラシンＢである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞質ｐ５３安定化剤は、ＭＤＭ２阻害剤である、請求項６３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリンである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン−３またはイダサヌトリンである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＭＤＭ２阻害剤は、ＲＯ５０４５３３７、ＲＯ５５０３７８１、ＲＯ６８３９９２１、ＳＡＲ４０５８３８、ＤＳ−３０３２、ＤＳ−３０３２ｂ、またはＡＭＧ−２３２である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞質ｐ５３安定化剤は、ＢＣＬ−２阻害剤である、請求項６３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＢＣＬ−２阻害剤は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＧ３１３９、ｍＲＮＡアンタゴニストＳＰＣ２９９６、ベネトクラクス（ＡＢＴ−１９９）、ＧＤＣ−０１９９、オバトクラクス、パクリタキセル、ナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）、ＡＢＴ−７３７、ＮＵ−０１２９、Ｓ０５５７４６、またはＡＰＧ−１２５２である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞質ｐ５３安定化剤は、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤である、請求項６３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ＷＥＨＩ５３９、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−７３７、サブトクラクス、ＡＴ１０１、ＴＷ−３７、ＡＰＧ−１２５２、またはガンボギン酸である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記細胞質ｐ５３安定化剤は、同じ組成物で投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、併用して投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、互いに２４時間以内に投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、互いに６時間以内に投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、互いに２時間以内に投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、互いに１時間以内に投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、互いに３０分以内に投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記グルコース代謝阻害剤及び前記ｐ５３安定化剤は、前記対象に同時に投与される、請求項６３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記対象には、１ｍｇ〜２５０ｍｇのエルロチニブが投与される、請求項５７〜８９及び９４〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記対象には、２５ｍｇのエルロチニブが投与される、請求項５７〜８９及び９４〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記対象には、１００ｍｇのエルロチニブが投与される、請求項５７〜８９及び９４〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対象には、１５０ｍｇのエルロチニブが投与される、請求項５７〜８９及び９４〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記対象には、５０ｍｇ〜１６００ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象には、１００ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象には、１５０ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対象には、３００ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象には、４００ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対象には、６００ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記対象には、１６００ｍｇのイダサヌトリンが投与される、請求項５７〜９６及び１０２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記対象は、多形性膠芽腫と診断されている、請求項５４〜１２０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
前記対象は、膠芽腫に対して先行治療で先に治療されている、請求項５４〜１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
前記対象は、前記先行治療に対して耐性であると決定されている、請求項５４〜１２２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２４】
前記方法はさらに、追加的療法の適用を含む、請求項５４〜１２３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２５】
グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を含む薬学的組成物。
【請求項１２６】
前記グルコース代謝阻害剤は、グルコース取り込み阻害剤、グルコーストランスポーター阻害剤、解糖阻害剤、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤を含む、請求項１２５に記載の薬学的組成物。
【請求項１２７】
前記ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、またはオシメルチニブである、請求項１２５または１２６に記載の薬学的組成物。
【請求項１２８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤は、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の化合物である、請求項１２５または１２６に記載の薬学的組成物。
【請求項１２９】
前記グルコース代謝阻害剤は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項１２５または１２６に記載の薬学的組成物。
【請求項１３０】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ピクチリシブ、ダクトリシブ、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、イデラリシブ、デュベリシブ、ブパルリシブ、ＩＰＩ−５４９、ＳＰ２５２３、ＧＤＣ−０３２６、ＴＧＲ−１２０２、ＶＰＳ３４阻害剤１、ＧＳＫ２２６９５５７、ＧＤＣ−００８４、ＳＡＲ４０５、ＡＺＤ８８３５、ＬＹ３０２３４１４、ＰＩ−１０３、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＩＣ−８７１１４、ウォルトマニン、ＸＬ１４７類似体、ＺＳＴＫ４７４、アルペリシブ、ＰＩＫ−７５ＨＣｌ、Ａ６６、ＡＳ−６０５２４０、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）、ＰＩＫ−９３、ＰＩＫ−９０、ＡＺＤ６４８２２、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＧＳＫ１０５９６１５、デュベリシブ、ゲダトリシブ、ＴＧ１００−１１５、ＡＳ−２５２４２４、ＢＧＴ２２６、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＳ−６０４８５０、ＰＩＫ−２９４、ＧＳＫ２６３６７７１、コパンリシブ、ＹＭ２０１６３６、ＣＨ５１３２７９９、ＣＡＹ１０５０５、ＰＩＫ−２９３、ＰＫＩ−４０２、ＴＧ１００７１３、ＶＳ−５５８４、タセリシブ、ＣＺＣ２４８３２、ＡＭＧ３１９、ＧＳＫ２２９２７６７、ＨＳ−１７３、クエルセチン、ボクスタリシブ、ＰＩＫ−９３、オミパリシブ、ＰＩＫ−９０、ＧＮＥ−３１７、ピララリシブ、ＰＦ−４９８９２１６、ＡＺＤ８１８６、７４０Ｙ−Ｐ、Ｖｐｓ３４−ＩＮ１、ＰＩＫ−ＩＩＩ、ＰＩ−３０６５またはそれらの類似体である、請求項１２９に記載の薬学的組成物。
【請求項１３１】
前記グルコース代謝阻害剤は、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）またはサイトカラシンＢである、請求項１２５または１２６に記載の薬学的組成物。
【請求項１３２】
前記細胞質ｐ５３安定化剤は、ＭＤＭ２阻害剤またはアンタゴニストである、請求項１２５〜１３１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３３】
前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリンである、請求項１３２に記載の薬学的組成物。
【請求項１３４】
前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン−３またはイダサヌトリンである、請求項１３２に記載の薬学的組成物。
【請求項１３５】
前記ＭＤＭ２阻害剤は、ＲＯ５０４５３３７、ＲＯ５５０３７８１、ＲＯ６８３９９２１、ＳＡＲ４０５８３８、ＤＳ−３０３２、ＤＳ−３０３２ｂ、またはＡＭＧ−２３２である、請求項１３２に記載の薬学的組成物。
【請求項１３６】
前記細胞質ｐ５３安定化剤は、ＢＣＬ−２阻害剤である、請求項１２５〜１３１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３７】
前記ＢＣＬ−２阻害剤は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＧ３１３９、ｍＲＮＡアンタゴニストＳＰＣ２９９６、ベネトクラクス（ＡＢＴ−１９９）、ＧＤＣ−０１９９、オバトクラクス、パクリタキセル、ナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）、ＡＢＴ−７３７、ＮＵ−０１２９、Ｓ０５５７４６、またはＡＰＧ−１２５２である、請求項１３６に記載の薬学的組成物。
【請求項１３８】
前記細胞質ｐ５３安定化剤は、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤である、請求項１２５〜１３１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３９】
前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ＷＥＨＩ５３９、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−７３７、サブトクラクス、ＡＴ１０１、ＴＷ−３７、ＡＰＧ−１２５２、またはガンボギン酸である、請求項１３８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５８９，９７２号、及び２０１７年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／５６３，３７３号の利益を主張する。これらの出願の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された許可番号ＣＡ１５１８１９、ＣＡ２１１０１５、及びＣＡ２１３１３３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
膠芽腫（多形性膠芽腫；ＧＢＭ）は、成人における原発性悪性脳腫瘍の大部分を占める。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の増幅及び変異は、ＧＢＭで見られる特徴的な遺伝子異常である（Ｓｕｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８６０２−８６０６；Ｅｋｓｔｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：４３０９−４３１３）。チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、モノクローナル抗体、ワクチン、及びＲＮＡ系薬剤を含む、ＥＧＦＲまたはその変異構成的活性型であるΔＥＧＦＲを標的とする様々な潜在的療法が現在、ＧＢＭの治療のために開発中または臨床試験中である。しかしながら、診療所におけるこれまでのそれらの有効性は、元々の薬物耐性及び獲得された薬物耐性によって今のところ制限されている（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１２：１９７−２０９）。主要な制限は、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ及びアファチニブなどの現行の療法が不十分な脳浸透性であることである（Ｒａｚｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１２：９５−１０３；Ｒｅａｒｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１７：４３０−４３９；Ｔｈｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：３５３−３６１）。
【０００４】
分子標的療法は、がん治療に革命を起こし、現代の精密医療への道を開いてきた。しかしながら、十分に定義された作用可能な遺伝子変化にもかかわらず、膠芽腫（ＧＢＭ）患者では標的薬は成功していない。これは、大部分は、ほとんどの標的薬剤が腫瘍を殺傷するのに必要なレベルまでＣＮＳに十分に浸透していないことに起因し；治療耐性を駆動するために強力な適応メカニズムを潜在的に引き起こす。原発病変及び代償性シグナル伝達経路（複数可）の両方を阻害する薬物併用は魅力的であるが、これらの併用療法戦略は、各薬物の閾値下投薬につながる毒性の増強によって妨げられてきた。
【０００５】
代替的な治療アプローチは、発がん性ドライバーを標的として腫瘍の生存に重要な機能特性を改変し、直交的な第２の攻撃に対して細胞を脆弱ものとしている６。この「合成致死」戦略は、がん遺伝子制御機能ネットワーク（複数可）が腫瘍細胞死の経路と交差する場合に特に魅力的であり得る。所定の例では、発がん性シグナル伝達は、グルコース代謝を駆動して内因性アポトーシスを抑制し、生存を促進する。標的療法を用いた発がん性ドライバーの阻害は、グルコース消費の減弱の直接的な結果として内因性アポトーシス機構を誘発し得る。これらの腫瘍形成経路の絡み合った性質は、合理的な併用治療のための治療機会を提供し得るが、これはまだ研究されていない。
【発明の概要】
【０００６】
前述の観点から、膠芽腫及び他のがんの治療のための脳浸透性化学療法剤の臨床的ニーズが依然として存在する。
【０００７】
本開示は、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物：
【化１】
2020536855.tif 000003
またはその薬学的に許容可能な塩（式中：
Ｚは、アリールまたはヘテロアリールであり、１つ以上のＲ６で任意に置換されており；
Ｒ１は、水素、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ７、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ８、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり；またはＲ１及びＲ２は、炭素環式または複素環式環を完成し；
Ｒ３は、水素、アルキル、またはアシルであり；
Ｒ４は、アルコキシであり；
Ｒ５は、アルキルであり；
Ｒ６の各存在は、独立して、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アルキニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択され；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、アルキル、例えばアルコキシアルキル、アラルキル、またはアリールアシルから選択される）を提供する。
【０００８】
所定の態様では、本開示は、ＥＧＦＲまたはΔＥＧＦＲを阻害する方法であって、対象に有効量の式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【０００９】
所定の態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、がんの治療を必要とする対象に有効量の式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫である。
【００１０】
所定の態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、対象にグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫である。いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物である。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示の目的でのみ提供されるが、その理由は、本発明の精神及び範囲内での様々な変化及び改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるからであることが理解されるべきである。
【００１２】
本明細書に記載の任意の方法または組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実行され得ること及び異なる実施形態が組み合わされ得ることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】１０ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ００５の経口薬物動態及び２５ｍｇ／ｋｇでのエルロチニブのそれを示している。ＪＧＫ００５は、エルロチニブと比較して良好なＣＮＳ浸透性を有する。
【図２】それぞれ、ＥＧＦＲ変異膠芽腫ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９に対するエルロチニブ（左欄）及びＪＧＫ００５（右欄）の活性を示している。ＪＧＫ００５は、両方の場合でエルロチニブによりも低い活性を示す。
【図３】エルロチニブ及びＪＧＫ０１０の無細胞ＥＧＦＲキナーゼ活性を示している。両方の化合物が、およそ８ｎｍのＩＣ５０を有する。
【図４】ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９細胞に対するエルロチニブ（左欄）、ＪＧＫ００５（中央欄）、及びＪＧＫ０１０（右欄）の効能を示している。
【図５】１０ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ００５及び１０ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ０１０の経口薬物動態を示している。
【図６】複数の原発性膠芽腫細胞株におけるＥＧＦＲ阻害剤の比較を示している。欄１〜４：ＧＢＭ３９（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、５〜８：ＧＳ１００ＥＧＦＲｗｔ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、９〜１２：ＧＳ０１７（Ａ２８９Ｔ）、１３〜１６：ＧＳ０２４（ＥＧＦＲ多染色体性）。
【図７Ａ】ＥＧＦＲ変化肺癌におけるＪＧＫ０１０の活性を示している。
【図７Ｂ】ＥＧＦＲ  Ａｍｐ扁平上皮癌におけるＪＧＫ０１０の活性を示している。
【図８Ａ】６ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ０１０の経口薬物動態を示している。
【図８Ｂ】１０ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ０１０の経口薬物動態を示している。
【図８Ｃ】６ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ０１０のＩＶ薬物動態を示している。
【図８Ｄ】６ｍｇ／ｋｇでのＪＧＫ０１０のＩＰ薬物動態を示している。
【図９】ＥＧＦＲ  Ａｍｐ  ＷＴ＋ｖＩＩＩ  ＨＫ３０１に対するエルロチニブ及び本開示の例示的な化合物の活性を示している。
【図１０】ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ  Ａｍｐ  ＧＢＭ３９に対するエルロチニブ及び本開示の例示的な化合物の活性を示している。
【図１１】ＨＫ３０１細胞に対するエルロチニブ及び本開示の例示的な化合物の活性を示している。
【図１２】ＧＢＭ３９細胞に対するエルロチニブ及び本開示の例示的な化合物の活性を示している。
【図１３Ａ】エルロチニブ及び本開示の例示的な化合物のホスホル−ＥＧＦＲｖＩＩＩ阻害を示している。
【図１３Ｂ】エルロチニブ及び本開示の例示的な化合物のホスホル−ＥＧＦＲｖＩＩＩ阻害を示している。
【図１４Ａ】ＪＧＫ００５の薬物動態を示している。
【図１４Ｂ】ＪＧＫ００５の薬物動態を示している。
【図１５Ａ】ＪＧＫ０３８の薬物動態を示している。
【図１５Ｂ】ＪＧＫ０３８の薬物動態を示している。
【図１６Ａ】ＪＧＫ０１０の薬物動態を示している。
【図１６Ｂ】ＪＧＫ０１０の薬物動態を示している。
【図１７Ａ】ＪＧＫ０３７の薬物動態を示している。
【図１７Ｂ】ＪＧＫ０３７の薬物動態を示している。
【図１８Ａ】エルロチニブとＪＧＫ０３７との間のマウスの脳／血液薬物動態の比較を示している。
【図１８Ｂ】エルロチニブとＪＧＫ０３７との間のマウスの脳／血液薬物動態の比較を示している。
【図１９】エルロチニブ及び本開示の例示的な化合物の脳浸透を示している。
【図２０】ＲＬＵ変化に対するビヒクルまたはＪＧＫ０３７のいずれかでの処置の効果を示している。
【図２１Ａ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、ＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを示している。１９種の患者由来ＧＢＭグリオーマスフェアにおける４時間のエルロチニブ処置後の１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みのビヒクルに対する変化率を示している。「代謝応答体」（青）は、ビヒクルに対する１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの有意な減少を示す試料である一方で、「非応答体」（赤）は、有意な減少を示さない。
【図２１Ｂ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、ＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを示している。１２時間のエルロチニブ処置でのグルコース消費及びラクテート産生のビヒクルに対する変化率を示している。測定は、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌの生物プロファイル分析器を使用して行われる。
【図２１Ｃ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、ＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを示している。エルロチニブで７２時間処置した後の代謝応答体（青、ｎ＝１０）または非応答体（赤、ｎ＝９）のアネキシンＶ染色を示している。
【図２１Ｄ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、ＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを示している。エルロチニブで２４時間処置した代謝応答体または非応答体における各ＢＨ３ペプチド（ＢＩＭ、ＢＩＤ、またはＰＵＭＡ）への曝露後のシトクロムｃ放出により決定されるプライミングにおけるビヒクル対照に対する変化率を示している。
【図２１Ｅ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、ＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを示している。左：ＧＦＰ対照またはＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ３（ＧＬＵＴ１／３）を過剰発現するＨＫ３０１細胞の全細胞溶解物の免疫ブロット、右：１２時間のエルロチニブ処置後のＨＫ３０１−ＧＦＰまたはＨＫ３０１−ＧＬＵＴ１／３のグルコース消費またはラクテート産生の変化を示している。値は、ビヒクル対照に対するものである。
【図２１Ｆ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、ＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを示している。ＨＫ３０１−ＧＦＰまたはＨＫ３０１−ＧＬＵＴ１／３細胞の使用を示している。すべての実験についてエルロチニブ濃度は、１μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２２Ａ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。対照ガイドＲＮＡ（ｓｇＣｔｒｌ）またはｐ５３ガイドＲＮＡ（ｐ５３ＫＯ）でＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９タンパク質を発現する２つの応答体（ＨＫ３０１及びＨＫ３３６）における示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図２２Ｂ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。エルロチニブで２４時間処置されたｓｇＣｔｒｌ及びｐ５３ＫＯ細胞におけるＢＩＭペプチドへの曝露後のシトクロムｃ放出によって決定されるプライミングのビヒクル対照に対する変化率を示している。
【図２２Ｃ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおける示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図２２Ｄ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおけるタンパク質局在化を明らかにするためにＤＡＰＩ染色と組み合わされたｐ５３タンパク質のその免疫蛍光を示している（スケールバー＝２０μｍ）。グリオーマスフェアをまず単一細胞に解離し、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して製造者の指示に従って９６ウェルプレートに付着させた。次いで付着した細胞を氷冷メタノールで１０分間固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。次いで細胞をＰＢＳ中１０％のＦＢＳ及び３％のＢＳＡを含有するブロッキング溶液を用いて１時間インキュベートし、その後ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＳＣ−１２６，１：５０の希釈）抗体と４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、希釈１：２０００）と１時間インキュベートし、１０分間ＤＡＰＩ染色し、次いでＣａｓｃａｄｅ  ＩＩ蛍光カメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えるＮｉｋｏｎ  ＴＩ  Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡を使用して画像化した。細胞を４６１ｎＭ及び６４７ｎＭの発光で画像化し、次いでＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ分析ソフトウェアを使用して処理した。
【図２２Ｅ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおける２４時間の１００ｎＭのドキソルビシン処置後の示されたｍＲＮＡレベルの変化を示している。レベルは、それぞれのＤＭＳＯ処置細胞に対して正規化された。
【図２２Ｆ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおけるものであること以外は２２Ｂと類似するデータを示している。
【図２２Ｇ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ２７３Ｈ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ＮＥＳにおけるものであること以外は２２Ｅと類似するデータを示している。
【図２２Ｈ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲを内因性アポトーシスに関連づけることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ２７３Ｈ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ＮＥＳにおけるものであること以外は２２Ｂ及び２２Ｆと類似するデータを示している。すべての実験についてエルロチニブ濃度は、１μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２３Ａ】Ｂｃｌ−ｘＬがＥＧＦＲｉ代謝応答体において細胞質ｐ５３に結合し、それを隔離することによってＧＢＭ細胞死を妨害することを示している。２４時間のエルロチニブ処置の後、２つの代謝応答体（ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９）におけるｐ５３の免疫沈降を示している。免疫沈降は、示された抗体でプローブした。下はそれぞれの事前免疫沈降溶解物（インプット）である。
【図２３Ｂ】Ｂｃｌ−ｘＬがＥＧＦＲｉ代謝応答体において細胞質ｐ５３に結合し、それを隔離することによってＧＢＭ細胞死を妨害することを示している。２つの非応答体（ＨＫ３９３及びＨＫ２５４）におけるものであること以外は２３Ａと類似するデータを示している。
【図２３Ｃ】Ｂｃｌ−ｘＬがＥＧＦＲｉ代謝応答体において細胞質ｐ５３に結合し、それを隔離することによってＧＢＭ細胞死を妨害することを示している。ＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１−ＧＬＵＴ１／３におけるものであること以外は２３Ａ及び２３Ｂと類似するデータを示している。右側は、示されたインプットについての免疫ブロットである。
【図２３Ｄ】Ｂｃｌ−ｘＬがＥＧＦＲｉ代謝応答体において細胞質ｐ５３に結合し、それを隔離することによってＧＢＭ細胞死を妨害することを示している。ＨＫ３０１をエルロチニブ、ＷＥＨＩ−５３９、またはその両方で２４時間処置し、免疫沈降及び免疫ブロットを先に記載したように実施したことを示している。
【図２３Ｅ】Ｂｃｌ−ｘＬがＥＧＦＲｉ代謝応答体において細胞質ｐ５３に結合し、それを隔離することによってＧＢＭ細胞死を妨害することを示している。エルロチニブ、ＷＥＨＩ−５３９、またはその両方で７２時間処置した後の２つの応答体（ＧＢＭ３９及びＨＫ３０１）及び１つの非応答体（ＨＫ３９３）のアネキシンＶ染色を示している。
【図２３Ｆ】Ｂｃｌ−ｘＬがＥＧＦＲｉ代謝応答体において細胞質ｐ５３に結合し、それを隔離することによってＧＢＭ細胞死を妨害することを示している。エルロチニブ、ｗｅｈｉ−５３９、またはその両方で７２時間処置した後のＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１−ＧＬＵＴ１／３のアネキシンＶ染色を示している。すべての実験についてエルロチニブ及びＷＥＨＩ−５３９の濃度はそれぞれ１μＭ及び５μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２４Ａ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。２７３種のＧＢＭ試料にわたるＥＧＦＲ及びｐ５３制御に関与する遺伝子の変化の概要を示している。ＥＧＦＲにおける遺伝子変化（増幅／変異）は、ｐ５３におけるものと相互排他的である。示されているように、ＥＧＦＲの変化は表の左側にある一方で、ｐ５３におけるほとんどの変化は右側にある。
【図２４Ｂ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。ＥＧＦＲとｐ５３経路に関与する遺伝子の変化の間の有意な関連性を示す表を示している。
【図２４Ｃ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。用量漸増マトリックスとして表される種々の濃度のエルロチニブ、ヌトリン、及びその組み合わせで処置された代謝応答体（左：ＨＫ３０１）及び非応答体（右：ＧＳ０１７）のアネキシンＶ染色を示している。
【図２４Ｄ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。２４Ｃに記載されたようにエルロチニブ及びヌトリンの用量漸増を１０種の代謝応答体及び６種の非応答体にわたって行い、相乗効果スコアを計算した（材料及び方法を参照）ことを示している。
【図２４Ｅ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。エルロチニブ、ヌトリン、またはその両方で７２時間処置した後のＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１のＧＬＵＴ１／３のアネキシンＶ染色を示している。
【図２４Ｆ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。ＨＫ３０１−ｓｇＣｔｒｌ及びＨＫ３０１−ｐ５３ＫＯにおけるものであること以外は２４Ｅと同同一を示している。
【図２４Ｇ】ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化の相乗的致死性を示している。エルロチニブ、ヌトリン、またはその組み合わせで２４時間処置したＨＫ３０１を示している。免疫沈降は、免疫グロブリンＧ対照抗体または抗ｐ５３抗体で実施し、免疫沈降は、示された抗体でプローブした。下はそれぞれの事前免疫沈降溶解物（インプット）である。すべてのデータは、少なくともｎ＝３の独立した実験の代表、すなわち、平均±ＳＥＭである。示されない限り、すべての実験についてエルロチニブ及びヌトリンの濃度はそれぞれ１μＭ及び２．５μＭであった。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２５Ａ】グルコース代謝の調節がＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングすることを示している。ＨＫ３９３及びＨＫ２５４においてエルロチニブ、２ＤＧ、またはピクチリシブで４時間処置した後の１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みのビヒクルに対する変化率を示している。
【図２５Ｂ】グルコース代謝の調節がＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングすることを示している。２４時間のエルロチニブ、２ＤＧ、またはピクチリシブの後にＨＫ３９３及びＨＫ２５４においてＢＩＭペプチドに曝露した後のシトクロムｃ放出によって決定されるプライミングのビヒクル対照に対する変化率を示している。
【図２５Ｃ】グルコース代謝の調節がＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングすることを示している。ＨＫ３９３のｓｇＣｔｒｌ及びｐ５３ＫＯにおけるものであること以外は２５Ｂと類似するデータを示している。
【図２５Ｄ】グルコース代謝の調節がＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングすることを示している。２４時間の２ＤＧまたはピクチリシブ処置の後のＨＫ３９３及びＨＫ２５４におけるｐ５３の免疫沈降を示している。免疫沈降は、示された抗体でプローブした。下はそれぞれの事前免疫沈降溶解物（インプット）である。
【図２５Ｅ】グルコース代謝の調節がＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングすることを示している。ＨＫ３９３及びＨＫ２５４におけるヌトリンと組み合わされた様々な薬物（エルロチニブ、２ＤＧ、及びピクチリシブ）の相乗効果スコアを示している。
【図２５Ｆ】グルコース代謝の調節がＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングすることを示している。２ＤＧ、ピクチリシブ、２ＤＧ＋ヌトリン、またはピクチリシブ＋ヌトリンで７２時間処置した後のＨＫ３９３のｓｇＣｔｒｌ及びＨＫ３９３  ｐ５３ＫＯのアネキシンＶ染色を示している。示されない限り、すべての実験についてエルロチニブ、２ＤＧ、ピクチリシブ、及びヌトリンの濃度はそれぞれ１μＭ、１ｍＭ、１μＭ及び２．５μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２６Ａ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。１５時間のエルロチニブ処置（７５ｍｇ／ｋｇ）の前及び後のＧＢＭ３９の頭蓋内異種移植片の１８Ｆ−ＦＤＧのＰＥＴ／ＣＴ画像化を示している。
【図２６Ｂ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。ビヒクル（ｎ＝５）、７５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブ（ｎ＝７）、５０ｍｇ／ｋｇのイダサヌトリン（ｎ＝５）、またはその組み合わせ（ｎ＝１２）で毎日処置されたＧＢＭ３９頭蓋内異種移植片を示しており、腫瘍負荷は、示された日に分泌ガウシアルシフェラーゼを使用して評価した（材料及び方法を参照）。
【図２６Ｃ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。ＨＫ３９３の頭蓋内異種移植片におけるものであること以外は２６Ａと類似するデータを示している。
【図２６Ｄ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。ＨＫ３９３の頭蓋内異種移植片におけるものであること以外は２６Ｂと類似するデータを示している（すべての群についてｎ＝７）。
【図２６Ｅ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。２６Ｂの生存率を示している。
【図２６Ｆ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。２６Ｃの生存率を示している。
【図２６Ｇ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。２５日間の示された処置及びそれに次ぐ薬物から解放後の代謝応答体ＨＫ３３６の生存率を示している（すべての群についてｎ＝７）。
【図２６Ｈ】ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込み及びｐ５３の組み合わされた標的化がインビボで腫瘍成長を抑制することを示している。２５日間の示された処置及びそれに次ぐ薬物から解放後の非応答体ＧＳ０２５の生存率を示している（すべての群についてｎ＝９）。２６Ｂ及び２６Ｄについての比較は、最後の測定からのデータセットを使用し、両側不対ｔ検定を使用して行われた。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２７Ａ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。２つの代謝応答体（ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９）におけるエルロチニブの示された時間での１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みのビヒクルに対する変化率を示している。
【図２７Ｂ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。ｓｉＲＮＡでのＥＧＦＲの遺伝子ノックダウン後の代謝応答体（ＨＫ３０１）及び非応答体（ＨＫ２１７）の示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図２７Ｃ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。ＥＧＦＲの遺伝子ノックダウン後のＨＫ３０１及びＨＫ２１７における１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの変化率を示している。
【図２７Ｄ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。３つの代謝応答体（ＨＫ３０１、ＧＢＭ３９、ＨＫ３９０）及び３つの非応答体（ＨＫ３９３、ＨＫ２１７、ＨＫ２５４）における１２時間のエルロチニブ処置でのグルコース消費の変化を示している。測定は、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌの生物プロファイル分析器を使用して行われる。
【図２７Ｅ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。３つの代謝応答体（ＨＫ３０１、ＧＢＭ３９、ＨＫ３９０）及び３つの非応答体（ＨＫ３９３、ＨＫ２１７、ＨＫ２５４）における１２時間のエルロチニブ処置でのラクテート産生の変化を示している。測定は、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌの生物プロファイル分析器を使用して行われる。
【図２７Ｆ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。１２時間のエルロチニブ処置後の２つの応答体（ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９（青））及び２つの非応答体（ＨＫ２１７及びＨＫ３９３（赤））の基底ＥＣＡＲ測定結果を示している。
【図２７Ｇ】ＥＧＦＲ阻害後のＧＢＭ細胞株の特性化を示している。Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌの生物プロファイル分析器によって測定される、１２時間のエルロチニブ処置後のグルタミン消費の変化を示している。すべての実験についてエルロチニブ濃度は１μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２８Ａ】ＥＧＦＲ阻害後の下流のシグナル伝達における変化が代謝応答と相関することを示している。代謝応答体における４時間のエルロチニブ処置後の示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図２８Ｂ】ＥＧＦＲ阻害後の下流のシグナル伝達における変化が代謝応答と相関することを示している。代謝非応答体における４時間のエルロチニブ処置後の示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図２９Ａ】患者由来ＧＢＭ細胞株の遺伝子特性化を示している。ＧＢＭ株のパネルにわたる遺伝子背景を示している。
【図２９Ｂ】患者由来ＧＢＭ細胞株の遺伝子特性化を示している。ＥＧＦＲの多染色体性を示すＨＫ３９０、ＨＫ３３６、ＨＫ２５４、及びＨＫ３９３の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示している。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、商用利用可能な蛍光標識された二重色ＥＧＦＲ（赤）／ＣＥＰ７（緑）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して実施した。ＦＩＳＨハイブリダイゼーション及び分析は、製造者が示唆したプロトコルに従って細胞株で実施した。細胞をＤＡＰＩでカウンター染色し、蛍光プローブシグナルを二重及び三重色フィルターを備えるＺｅｉｓｓ（Ａｘｉｏｆｏｔ）蛍光顕微鏡下で画像化した。
【図３０Ａ】ＥＧＦＲ阻害が代謝応答体におけるアポトーシスバランスをシフトさせることを示している。代謝応答体（ＧＢＭ３９、ＨＫ３０１、及びＨＫ３３６）及び非応答体（ＨＫ２１７、ＨＫ３９３、及びＨＫ２５４）における２４時間のエルロチニブ処置後の示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図３０Ｂ】ＥＧＦＲ阻害が代謝応答体におけるアポトーシスバランスをシフトさせることを示している。代謝応答体（ＨＫ３０１）における動的ＢＨ３プロファイリング分析の例を示している。左：シトクロムｃ放出率は、示された濃度での様々なペプチドへの曝露後に測定される。右：ビヒクル処置細胞とエルロチニブ処置細胞との間のシトクロムｃ放出の差を計算してプライミング率を得る。すべての実験についてエルロチニブ濃度は１μＭであった。
【図３１Ａ】ＧＬＵＴ１／３の過剰発現がＥＧＦＲ阻害によって引き起こされる減弱したグルコース代謝を救済することを示している。ＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１のＧＬＵＴ１／３における１２時間のエルロチニブ処置でのグルコース消費及びラクテート産生の変化を示している。測定は、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌの生物プロファイル分析器を使用して行われる。
【図３１Ｂ】ＧＬＵＴ１／３の過剰発現がＥＧＦＲ阻害によって引き起こされる減弱したグルコース代謝を救済することを示している。左：ＧＦＰ対照またはＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ３（ＧＬＵＴ１／３）を過剰発現するＧＢＭ３９細胞の全細胞溶解物の免疫ブロット、右：１２時間のエルロチニブ処置後のＧＢＭ３９−ＧＦＰまたはＧＢＭ３９−ＧＬＵＴ１／３のグルコース消費またはラクテート産生の変化を示している。値は、ビヒクル対照に対するものである。
【図３１Ｃ】ＧＬＵＴ１／３の過剰発現がＥＧＦＲ阻害によって引き起こされる減弱したグルコース代謝を救済することを示している。ＧＢＭ３９−ＧＦＰ及びＧＢＭ３９−ＧＬＵＴ１／３におけるものであること以外は３５Ａと類似するデータを示している。すべての実験についてエルロチニブ濃度は１μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３２Ａ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ及びｐ５３ＫＯ細胞における４時間のエルロチニブ処置後の１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの変化率を示している（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。
【図３２Ｂ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＨＫ３０１（代謝応答体）における２４時間の１μＭのエルロチニブ処置または１００ｎＭのドキソルビシン処置後のｐ５３制御遺伝子の相対的なｍＲＮＡレベルを示している。
【図３２Ｃ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ｐ５３ルシフェラーゼレポーター系に感染したＨＫ３０１細胞を示しており、ｐ５３活性を２４時間の１μＭのエルロチニブ処置後に測定した（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。結果は、２つの独立した実験の代表である。
【図３２Ｄ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＨＫ３３６のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおける示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図３２Ｅ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＨＫ３３６のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおけるタンパク質局在化を明らかにするためにＤＡＰＩ染色と組み合わされたｐ５３タンパク質の免疫蛍光を示している（スケールバー＝２０μｍ）。免疫蛍光は、先に記載されているように実施した。
【図３２Ｆ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＨＫ３３６のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおける２４時間の１００ｎＭのドキソルビシン処置後の示されたｍＲＮＡレベルの変化を示している（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。レベルは、それぞれのＤＭＳＯ処置細胞に対して正規化された。
【図３２Ｇ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。エルロチニブで２４時間処置されたＨＫ３３６のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔ細胞におけるアポトーシスプライミング（ＢＩＭペプチドへの曝露後のシトクロムｃ放出によって決定される）のビヒクル対照に対する変化率を示している。（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝２）。結果は、２つの独立した実験の代表である。
【図３２Ｈ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ２７３Ｈ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ＮＥＳにおける示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図３２Ｉ】細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングに必要とされることを示している。ＰＦＴμ事前処置（２時間で１０μＭ）を伴ってまたは伴わずに２４時間のエルロチニブ処置後のＨＫ３０１におけるプライミングの変化率を示している（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝２）。結果は、２つの独立した実験の代表である。
【図３３Ａ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、細胞質ｐ５３の機能を介してＢｃｌ−ｘＬ依存性を誘導することを示している。エルロチニブで処置された代謝応答体（ＨＫ３０１及びＨＫ３３６）または非応答体（ＨＫ２２９）におけるＢＡＤ及びＨＲＫペプチドへの曝露後のシトクロムｃ放出によって決定されるプライミングのビヒクル対照に対する変化率を示している。
【図３３Ｂ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、細胞質ｐ５３の機能を介してＢｃｌ−ｘＬ依存性を誘導することを示している。左：２４時間のエルロチニブ処置後のＧＢＭ３９−ＧＦＰ及びＧＢＭ３９−ＧＬＵＴ１／３におけるｐ５３の免疫沈降を示している。免疫沈降は、示された抗体でプローブした。右：それぞれの事前免疫沈降溶解物（インプット）。
【図３３Ｃ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、細胞質ｐ５３の機能を介してＢｃｌ−ｘＬ依存性を誘導することを示している。７２時間のエルロチニブ、ＷＥＨＩ−５３９、またはその組み合わせでの処置後のＨＫ３０１（左）及びＨＫ３３６（右）のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔのアネキシンＶ染色を示している。
【図３３Ｄ】ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝の阻害が、細胞質ｐ５３の機能を介してＢｃｌ−ｘＬ依存性を誘導することを示している。ＧＢＭ３９−ＧＦＰ及びＧＢＭ３９−ＧＬＵＴ１／３におけるものであること以外は３３Ｃと類似するデータを示している。すべての実験についてエルロチニブ及びＷＥＨＩ−５３９濃度は１μＭであった。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３４Ａ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。２つの代謝応答体（ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９）における２４時間のエルロチニブ、ヌトリンまたはその組み合わせの後の示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図３４Ｂ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。ＥＧＦＲの遺伝子ノックダウン及びその後の７２時間のヌトリン処置の後のＨＫ３０１及びＨＫ２１７におけるアネキシンＶ染色を示している。
【図３４Ｃ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。ＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１−ＧＬＵＴ１／ＧＬＵＴ３におけるＢＡＸオリゴマー化の検出を示している。２４時間の示された処置の後、細胞を採取し、タンパク質の架橋を促進するために１ｍＭのＢＭＨ中でインキュベートし、示された抗体で免疫ブロットした。下のＢＡＸは、細胞分別後の細胞質シトクロムｃについての免疫ブロットである。
【図３４Ｄ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。上：ＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１−ＨＡ−ＢｃｌｘＬにおける示されたタンパク質の免疫ブロット、下：エルロチニブ、ヌトリン、またはその組み合わせで７２時間処置した後のＨＫ３０１−ＧＦＰ及びＨＫ３０１−ＨＡ−ＢｃｌｘＬにおけるアネキシンＶ染色を示している。
【図３４Ｅ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。７２時間のエルロチニブ、ヌトリンまたはその組み合わせ＋／−ＰＦＴμ事前処置（２時間で１０μＭ）の後のＨＫ３０１のアネキシンＶ染色を示している。
【図３４Ｆ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。エルロチニブ、ヌトリン、またはその組み合わせで７２時間処置した後のＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３Ｒ２７３Ｈ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ＮＥＳのアネキシンＶ染色を示している。
【図３４Ｇ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。ＨＫ３０１のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおけるものであること以外は３４Ｆと類似するデータを示している。すべての実験について薬物濃度は次のとおりである：エルロチニブ（１μＭ）、ヌトリン（２．５μＭ）。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３４Ｈ】ＥＧＦＲ制御グルコース代謝及びｐ５３活性化の阻害がＧＢＭにおける内因性アポトーシスを促進することを示している。ＨＫ３３６のｓｇＣｔｒｌ、ｐ５３ＫＯ、ｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｃｙｔｏ、及びｐ５３ＫＯ＋ｐ５３ｗｔにおけるものであること以外は３４Ｇと類似するデータを示している。すべての実験について薬物濃度は次のとおりである：エルロチニブ（１μＭ）、ヌトリン（２．５μＭ）。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３５Ａ】代謝応答体及び非応答体におけるグルコース代謝の阻害が内因性アポトーシスを促進することを示している。２４時間のエルロチニブまたは２ＤＧ処置後の代謝応答体ＨＫ３０１におけるＢＩＭペプチドへの曝露後のシトクロムｃ放出によって決定されるプライミングのビヒクル対照に対する変化率を示している。
【図３５Ｂ】代謝応答体及び非応答体におけるグルコース代謝の阻害が内因性アポトーシスを促進することを示している。左：２４時間の２ＤＧ処置後のＨＫ３０１におけるｐ５３の免疫沈降を示している。免疫沈降は、示された抗体でプローブした。右：それぞれの事前免疫沈降溶解物（インプット）。
【図３５Ｃ】代謝応答体及び非応答体におけるグルコース代謝の阻害が内因性アポトーシスを促進することを示している。オリゴマイシン及びロテノンへの曝露後のＨＫ３０１細胞のＯＣＲ及びＥＣＡＲ測定結果を示している。
【図３５Ｄ】代謝応答体及び非応答体におけるグルコース代謝の阻害が内因性アポトーシスを促進することを示している。ヌトリン、エルロチニブ、２ＤＧ、オリゴマイシン、ロテノンを個々の薬剤としてまたはヌトリンと組み合わせて７２時間処置した後のＨＫ３０１におけるアネキシンＶ染色を示している。
【図３５Ｅ】代謝応答体及び非応答体におけるグルコース代謝の阻害が内因性アポトーシスを促進することを示している。２つの非応答体（ＨＫ２５４及びＨＫ３９３）における４時間のエルロチニブまたはピクチリシブ処置後の示されたタンパク質の免疫ブロットを示している。
【図３５Ｆ】代謝応答体及び非応答体におけるグルコース代謝の阻害が内因性アポトーシスを促進することを示している。２４時間のピクチリシブまたは２ＤＧ処置後のＨＫ２５４におけるｐ５３の免疫沈降を示している。免疫沈降は、示された抗体でプローブした。下はそれぞれの事前免疫沈降溶解物（インプット）である。すべての実験について薬物濃度は次のとおりである：エルロチニブ（１μＭ）、ヌトリン（２．５μＭ）、２ＤＧ（ＨＫ３０１の場合３ｍＭ及びＨＫ２５４の場合１ｍＭ）、オリゴマイシン（１μＭ）、ロテノン（１μＭ）、及びピクチリシブ（１μＭ）。比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３６Ａ】ＥＧＦＲ阻害及びｐ５３活性化のインビボ有効性を示している。非腫瘍保持マウスにおける示された時点でのイダサヌトリンの脳及び血漿濃度を示している（ｎ＝２マウス／時点）。
【図３６Ｂ】ＥＧＦＲ阻害及びｐ５３活性化のインビボ有効性を示している。３６時間のイダサヌトリン（５０ｍｇ／ｋｇ）処置後の頭蓋内腫瘍保持異種移植片におけるｐ５３発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示している。
【図３６Ｃ】ＥＧＦＲ阻害及びｐ５３活性化のインビボ有効性を示している。ＧＢＭ３９（ｎ＝３）及びＨＫ３９３（ｎ＝５）頭蓋内異種移植片における１５時間のエルロチニブ処置後の１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの変化率を示している。
【図３６Ｄ】ＥＧＦＲ阻害及びｐ５３活性化のインビボ有効性を示している。エルロチニブ（７５ｍｇ／ｋｇ）またはエルロチニブ（７５ｍｇ／ｋｇ）とイダサヌトリン（５０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせで毎日処置した後のマウスの体重の変化を示している。すべての処置は、経口で行われた。データは、３つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。＊ｐ＜０．０５。
【図３７Ａ】２ＤＧ（ヘキソキナーゼ阻害剤）またはサイトカラシンＢ（グルコーストランスポーター阻害剤）での解糖の直接的阻害が、ｐ５３活性化（ヌトリンでの）と予想外の相乗効果を示すことを示している。
【図３７Ｂ】低グルコース（０．２５ｍＭ）がナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）でのＢＣＬ−ｘＬ阻害と相乗的細胞死をもたらすことを示している。
【図３７Ｃ】低グルコース（０．２５ｍＭ）がヌトリンでのＢＣＬ−ｘＬ阻害と相乗的細胞死をもたらすことを示している。
【図３８】ＥＧＦＲｉ阻害剤であるエルロチニブに対する代謝応答体と代謝非応答体との間の比較を示している。エルロチニブ及びヌトリンの組み合わせは、代謝応答体では予想外の相乗的な合成致死性をもたらすが、非応答体ではそうではない。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
神経膠腫は、脳腫瘍の中で最も一般的に発生する形態であり、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は最も悪性の形態であり、すべてのがん関連死の３〜４％を引き起こしている（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１４：９７−１０９．）。世界保健機関は、ＧＢＭを悪性で、有糸分裂的に活性であり、壊死を起こしやすいものとして特性化された悪性度ＩＶがんと定義している。ＧＢＭは、４〜５％の５年生存率で非常に予後が悪く、ＧＢＭの生存率の中央値は１２．６ヶ月である（ＭｃＬｅｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ．９８：１７４５−１７４８．）。これは、高い平均発症年齢、腫瘍の位置、及び腫瘍の病態生理の現在の理解不足などの独自の治療制限に起因し得る（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１４：９７−１０９）。ＧＢＭに対する標準的な現在の治療法の標準は、放射線療法及び化学療法を併用した腫瘍切除を含み、近年では、生存率を上昇させる顕著な改善はほとんどない（Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｌａｎｃｅｔ．３５９：１０１１−１０１８．）。
【００１５】
ＧＢＭ化学療法の標準は、テモゾロミド（ＴＭＺ）であり、これはＤＮＡ中のプリン（ＡまたはＧ）をメチル化し、アポトーシスを誘導する脳浸透アルキル化剤である（Ｓｔｕｐｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：９８７−９９６）。しかしながら、ＴＭＺの使用は、健康な細胞におけるＤＮＡ損傷から重大なリスクが生じるという欠点及びＧＢＭ細胞が薬物に対する耐性を急速に発現し得るという欠点を有する（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：１３５９−１３７０）。このように、追加的な化学療法の選択肢が緊急で必要とされている。
【００１６】
ＥＧＦＲは、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４とともに受容体チロシンキナーゼのＨＥＲスーパーファミリーのメンバーである。ＧＢＭ進行の一般的なドライバーは、ＥＧＦＲ増幅であり、これは全ＧＢＭ症例の約４０％で見られる（Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．５：３４１−３５４；Ｈａｔａｎｐａａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．１２：６７５−６８４）。また、ＥＧＦＲ増幅は、ＥＧＦＲタンパク質バリアントの存在と関連している：ＥＧＦＲ変異体の６８％において；アミノ酸６と２７３の間のＮ末端リガンド結合領域に欠失がある。ＥＧＦＲのリガンド結合ドメインにおけるこれらの欠失は、ＥＧＦＲのリガンド非依存的活性化をもたらし得る（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１：７７３−７７９．）。
【００１７】
低分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、ＥＧＦＲ標的療法の中で最も臨床的に進んでおり、可逆性及び非可逆性の両方の阻害剤が臨床試験中である。可逆性阻害剤及び非可逆性阻害剤の例には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ＰＫＩ１６６、カネルチニブ及びペリチニブが含まれる（Ｍｉｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１３：５２−６１）。メカニズム的には、これらのＴＫＩは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインに結合するためにＡＴＰと競合するが、これらのＥＧＦＲ特異的チロシンキナーゼ阻害剤は、神経膠腫に対しては比較的無効であり、エルロチニブの場合で応答率は２５％ほどの高さに達するにすぎない（Ｍｉｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１３：５２−６１；Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：７４８−５４）。ＴＫＩは、忍容性が高く、ＧＢＭ患者ではある程度の抗腫瘍活性を示すが、受容体阻害に対する耐性の問題の再発がそれらの有効性を制限している（Ｌｅａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．１０：３２１６−３２２４；Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．３：４３０−４４６）。また、最近の研究では、治療後のゲフィチニブ及びエルロチニブの脳血漿濃度が開始用量の６〜１１％にすぎなかったことが示されており、これらの化合物は、表１に示されるように、血液脳関門を通過できない場合があることを示唆している（Ｋａｒｐｅｌ−Ｍａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：１０００−１０１２）。それ故、標的への不十分な送達は、残念な臨床結果の別の原因であり得る。
【００１８】
【表１】
2020536855.tif 000004
【００１９】
この証拠の観点から、血液脳関門を通過し、ＥＧＦＲ及びそのアイソフォームを阻害する能力を有する強力なチロシンキナーゼ阻害剤に対する満たされていない臨床的必要性が依然として存在する。
【００２０】
さらに、発がん性シグナル伝達及び代謝経路の間の絡み合いが、ＧＢＭにおける新規な併用療法の機会を創出することが本発明者によって示されている。より具体的には、本発明者は、ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込みの急性阻害が、最小限の細胞死を誘導するが、患者由来のＧＢＭ細胞におけるアポトーシス閾値を低下させ、アポトーシスのために細胞を「プライミング」することを発見した。予想外にも、本発明者によるメカニズムの研究により、Ｂｃｌ−ｘＬは、細胞質ｐ５３が内因性アポトーシスを誘発するのを妨げ、腫瘍の生存につながることが明らかとなった。ｐ５３の薬理学的安定化（例えば、脳浸透性小分子であるイダサヌトリンなどでの）は、ｐ５３を内因性アポトーシス機構に関与させることを可能にし、ＧＢＭ異種移植片におけるＥＧＦＲ駆動グルコース取り込みを標的とした相乗的致死性を促進する。注目すべきことに、本発明者はまた、例えば、非侵襲的陽電子放出断層撮影を使用して、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）の取り込みの急速な変化が、インビボでのその組み合わせに対する感受性を予測することができることを発見した。
【００２１】
本発明者は、とりわけ、がん遺伝子のシグナル伝達、グルコース代謝、及び細胞質ｐ５３の間の重要な関連性を同定し、これは、ＧＢＭ及び他の悪性腫瘍における併用療法のために利用され得る。
【００２２】
本開示の化合物
本開示は、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物：
【化２】
2020536855.tif 000005
またはその薬学的に許容可能な塩（式中：
Ｚは、アリールまたはヘテロアリールであり、１つ以上のＲ６で任意に置換されており；
Ｒ１は、水素、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ７、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ８、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり；またはＲ１及びＲ２は、炭素環式または複素環式環を完成し；
Ｒ３は、水素、アルキル、またはアシルであり；
Ｒ４は、アルコキシであり；
Ｒ５は、アルキルであり；
Ｒ６の各存在は、独立して、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アルキニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択され；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、アルキル、例えばアルコキシアルキル、アラルキル、またはアリールアシルから選択される）を提供する。
【００２３】
式Ｉ−ａまたは式Ｉ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ７及びＲ８がアルコキシアルキルであり、Ｒ３が水素である場合、そのときはＺは、３−エチニルフェニルではない。
【００２４】
式Ｉ−ａまたは式Ｉ−ｂの所定の実施形態では、Ｚは、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールから選択されるＲ６で任意に置換されている。
【００２５】
式Ｉ−ａまたは式Ｉ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、アラルキル、またはアリールアシルから選択され；Ｒ６の各存在は、独立して、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択され；またはＲ１及びＲ２は、一緒になって炭素環式または複素環式環を完成する。
【００２６】
式Ｉ−ａまたは式Ｉ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ７及びＲ８が組み合わさって複素環式環を形成し、Ｒ３が水素である場合、そのときはＺは、２−フルオロ、４−ブロモフェニル、３−ブロモフェニル、３−メチルフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、または３−クロロ、４−フルオロフェニルではない。
【００２７】
式Ｉ−ａまたは式Ｉ−ｂの所定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ−ａ）または式（ＩＩ−ｂ）の化合物である：
【化３】
2020536855.tif 000006
【００２８】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、または式ＩＩ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ１は、水素である。他の実施形態では、Ｒ１は、ＯＲ７である。
【００２９】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、または式ＩＩ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ７は、水素である。所定の実施形態では、Ｒ７は、アルキルである。所定の実施形態では、Ｒ７は、アルコキシアルキルである。所定の実施形態では、Ｒ７は、アリールアシルである。
【００３０】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、または式ＩＩ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ２は、ヘテロアリール、例えばフラニルである。所定の実施形態では、Ｒ２のヘテロアリールは、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、
【化４】
2020536855.tif 000007
で置換されている。他の実施形態では、Ｒ２は、ＯＲ８である。
【００３１】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、または式ＩＩ−ｂの所定の実施形態では、Ｒ８は、水素である。所定の実施形態では、Ｒ８は、アルコキシアルキルである。所定の実施形態では、Ｒ８は、
【化５】
2020536855.tif 000008
で置換されたアルキルである。所定の実施形態では、Ｒ８は、アシルである。所定の実施形態では、Ｒ８は、アリールアシルである。
【００３２】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、または式ＩＩ−ｂの所定の好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、組み合わさって炭素環式または複素環式環、例えば５員、６員、もしくは７員炭素環式または複素環式環を形成する。所定の実施形態では、炭素環式または複素環式環は、ヒドロキシル、アルキル（例えば、メチル）、またはアルケニル（例えば、ビニル）で置換されている。所定の実施形態では、化合物は、化合物は、
【化６】
2020536855.tif 000009
である。所定の実施形態では、炭素環式または複素環式環は、アルキル（例えば、メチル）で置換されており、アルキル部分は、互いに対してトランスである。所定の実施形態では、化合物は、化合物は、
【化７】
2020536855.tif 000010
である。所定の実施形態では、炭素環式または複素環式環は、アルキル（例えば、メチル）で置換されており、アルキル部分は、互いに対してシスである。所定の実施形態では、化合物は、化合物は、
【化８】
2020536855.tif 000011
である。
【００３３】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、または式ＩＩ−ｂのさらにより好ましい実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩ−ａ）、（ＩＩＩ−ｂ）、（ＩＩＩ−ｃ）、（ＩＩＩ−ｄ）、（ＩＩＩ−ｅ）、または（ＩＩＩ−ｆ）の化合物である：
【化９】
2020536855.tif 000012
【００３４】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、または式ＩＩＩ−ｆの所定の実施形態では、Ｒ３は、水素である。所定の実施形態では、Ｒ３は、アシルである。所定の実施形態では、Ｒ３は、アルキルアシルである。所定の実施形態では、Ｒ３は、アルキルオキシアシルである。所定の実施形態では、Ｒ３は、アシルオキシアシルである。所定の実施形態では、Ｒ３は、
【化１０】
2020536855.tif 000013
であり；Ｒ９は、アルキルである。
【００３５】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、または式ＩＩＩ−ｆの所定の実施形態では、Ｚは、１つ以上のＲ６で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールであり；Ｒ６の各存在は、独立して、アルキル、アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロ、アルケニル、アルキニル、アラルキルオキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択される。所定の好ましい実施形態では、Ｚは、１、２、３、４、または５個のＲ６で置換されたフェニルである。所定の実施形態では、各Ｒ６  は、独立して、ハロ、アルキル、アルキニル、またはアリールアルコキシから選択される。さらにより好ましい実施形態では、Ｚは、２−フルオロ−３−クロロフェニル、２−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、２，４，６−トリフルオロフェニル、ペンタフルオロフェニル、２−フルオロ−３−ブロモフェニル、２−フルオロ−３−エチニルフェニル、及び２−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルである。他のさらにより好ましい実施形態では、Ｚは、３−エチニルフェニルである。さらに他のさらにより好ましい実施形態では、Ｚは、３−クロロ−４−（（３−フルオロベンジル）オキシ）ベンゼンである。さらに他のさらにより好ましい実施形態では、Ｚは、３−クロロ−２−（トリフルオロメチル）フェニルである。さらに他のさらにより好ましい実施形態では、Ｚは、３−ブロモフェニルである。さらに他のさらにより好ましい実施形態では、Ｚは、２−フルオロ、５−ブロモフェニルである。さらに他のさらにより好ましい実施形態では、Ｚは、２，６−ジフルオロ、５−ブロモフェニルである。所定の実施形態では、Ｚは、
【化１１】
2020536855.tif 000014
から選択される１つのＲ６で置換されており；Ｒ９及びＲ１０は、独立して、アルキルから選択される。
【００３６】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、または式ＩＩＩ−ｆの所定の実施形態では、化合物は、式（ＩＶ−ａ）の化合物：
【化１２】
2020536855.tif 000015
であり；各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される。
【００３７】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、または式ＩＩＩ−ｆの所定の実施形態では、化合物は、式（ＩＶ−ｂ）の化合物：
【化１３】
2020536855.tif 000016
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される。
【００３８】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、または式ＩＩＩ−ｆの所定の実施形態では、化合物は、式（ＩＶ−ｃ）の化合物：
【化１４】
2020536855.tif 000017
であり；
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される。
【００３９】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、式ＩＩＩ−ｆ、式ＩＶ−ａ、式ＩＶ−ｂ、または式ＩＶ−ｃの所定の実施形態では、化合物は、式（Ｖ−ａ）の化合物：
【化１５】
2020536855.tif 000018
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される。
【００４０】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、式ＩＩＩ−ｆ、式ＩＶ−ａ、式ＩＶ−ｂ、または式ＩＶ−ｃの所定の実施形態では、化合物は、式（Ｖ−ｂ）の化合物：
【化１６】
2020536855.tif 000019
であり、
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される。
【００４１】
式Ｉ−ａ、式Ｉ−ｂ、式ＩＩ−ａ、式ＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ａ、式ＩＩＩ−ｂ、式ＩＩＩ−ｃ、式ＩＩＩ−ｄ、式ＩＩＩ−ｅ、式ＩＩＩ−ｆ、式ＩＶ−ａ、式ＩＶ−ｂ、または式ＩＶ−ｃの所定の実施形態では、化合物は、式（Ｖ−ｂ）の化合物：
【化１７】
2020536855.tif 000020
であり；
各Ｒ６は、独立して、フルオロ、クロロ、またはブロモから選択される。
【００４２】
所定の実施形態では、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物は、表２中の化合物から選択される。
【００４３】
【表２】
2020536855.tif 000021
2020536855.tif 000022
2020536855.tif 000023
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2020536855.tif 000029
【００４４】
治療方法
所定の態様では、本開示は、ＥＧＦＲまたはΔＥＧＦＲを阻害する方法であって、対象に有効量の式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００４５】
所定の態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、がんの治療を必要とする対象に有効量の式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫である。
【００４６】
所定の態様では、本開示は、対象における膠芽腫を治療する方法であって、対象に所定量のグルコース取り込み阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００４７】
所定の態様では、本開示は、対象における膠芽腫増殖を低減する方法であって、対象に所定量のＥＧＦＲ阻害剤及びＭＤＭ２阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００４８】
所定の態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するまたはがん細胞増殖を低減する方法であって、対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００４９】
所定の態様では、本開示は、対象における悪性神経膠腫または膠芽腫を治療する方法であって、対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００５０】
所定の態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するまたはがん細胞増殖を低減する方法であって、対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００５１】
所定の態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、がんの治療を必要とする対象に有効量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫である。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍は、グルコース代謝阻害剤に対して感受性であることが決定されている。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、そのような治療に対して適格性を有すると先に決定された対象にグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することによってＧＢＭ成長または増殖を抑制するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、グルコース代謝の阻害及び細胞質ｐ５３の安定かは、同時または順次であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭを治療する方法、対象におけるＧＢＭを低減または阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭ細胞の成長を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤でＧＢＭ患者を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＭＢ患者の予後を改善するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭのリスクを低減するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭを有する患者を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療に対する患者の反応を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭ腫瘍細胞をアポトーシスに対してプライミングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭ患者を治療に対してコンディショニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、無効な療法のリスクを低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭの症状を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍生存の機会を低減するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、療法に対する腫瘍細胞の脆弱性を増大させるための方法を提供する。本開示で論述される工程及び実施形態は、これらの方法のいずれかの一部として企図される。その上、これらの方法のいずれかにおいて使用するための組成物も企図される。
【００５４】
所定の態様では、本開示は、対象における悪性神経膠腫またはＧＢＭを治療する方法であって、対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定された後に対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、対象から腫瘍生検を得ること、任意のグルコース代謝阻害剤の存在下で腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定すること、得られた腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを対照によるグルコース取り込みのレベルと比較すること；及び腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルが対照と比較して減弱している場合、対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定することを含む方法によって対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている。いくつかの実施形態では、グルコース取り込みは、放射性標識されたグルコース２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）の取り込みによって測定される。さらなる実施形態では、１８Ｆ−ＦＤＧの検出は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）による。いくつかの実施形態では、生検は、ＧＢＭ腫瘍から採取される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、対象から第１の血液試料を得ること、対象をケトン食療法に所定期間付すこと、ケトン食療法に付された後に対象から第２の血液試料を得ること、第１及び第２の血液試料中のグルコースレベルを測定すること；第２の血液試料中のグルコースレベルを第１の血液試料中のグルコースレベルと比較すること、及び第２の血液試料中のグルコースレベルが第１の血液試料中のグルコースレベルと比較して低減した場合、対象が感受性であると決定することを含む方法によって対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている。いくつかの実施形態では、グルコースレベルの低減は、第２の血液試料と対照血液試料との間であり、約０．１５ｍＭもしくはそれを超え、約０．２０ｍＭもしくはそれを超え、０．１５ｍＭ〜２．０ｍＭの範囲内であり、または０．２５ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲内である。いくつかの実施形態では、グルコースレベルの低減は、約、少なくとも約、または多くとも約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍＭ（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）である。
【００５７】
所定の態様では、本開示は、神経膠腫またはＧＢＭと診断された対象を分類する方法であって、対象から生物学的試料を得ること、生物学的試料をグルコース代謝阻害剤（複数可）で処置すること、及びグルコース代謝がグルコース代謝阻害剤によって減弱しているかどうかを決定することを含む、方法を提供する。グルコース代謝の減弱を決定することは、グルコースレベルの変化、及び／または解糖速度の変化、及び／またはグルコース取り込みの変化、及び／または細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の変化を決定すること、及び／またはグルコース代謝阻害剤の投与の前及び後のヘキソキナーゼ、またはホスホフルクトキナーゼ、またはピルビン酸キナーゼの活性を測定することを含む。いくつかの実施形態では、解糖の変化を決定することは、ピルベート及び／またはラクテートの直接的測定を含む。所定の実施形態では、生物学的試料は、ＧＢＭ腫瘍からのがん細胞を含む。他の実施形態では、方法はさらに、グルコース減弱のレベルを対照と比較することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、グルコース代謝が生物学的試料においてグルコース代謝阻害剤によって減弱された場合、対象を代謝応答体として分類することを含む。さらなる実施形態では、方法はさらに、代謝応答体として分類された対象をグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を含む組成物で治療することを含む。
【００５８】
所定の態様では、本開示は、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤での治療に対するがん細胞または腫瘍の感受性を評価する方法であって、がん細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定または検出すること及びグルコース取り込みのレベルを対照と比較することを含む、方法を提供する。グルコースは、放射性標識され得、例えば、２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）などである。いくつかの実施形態では、放射性標識されたグルコース取り込みの測定及び検出は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によって行われる。
【００５９】
所定の態様では、本開示は、対象における膠芽腫を治療する方法であって、対象がＥＧＦＲ阻害剤によって低減したグルコース代謝に対して感受性であると決定した後に、治療的有効量のグルコース取り込み阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００６０】
所定の態様では、本開示は、対象における膠芽腫増殖を低減する方法であって、対象がＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性であると決定した後に、有効量のＥＧＦＲ阻害剤及びＭＤＭ２阻害剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤は、同じ組成物で投与される。他の実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３は、別々の組成物で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤は、互いに２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間以内もしくは３０分以内またはそれらの間の時間もしくは分の任意の部分以内に投与される。またさらなる実施形態では、グルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤は、同時に対象に投与される。
【００６２】
本方法の所定の実施形態では、対象からの試料中のグルコースのレベル（またはグルコースの変化もしくはグルコース減弱）を対照試料と比較することなどの対照の使用が企図される。対照は、非がん性試料、異なる表現型を有するがん性試料、野生型ＥＧＦＲ発現レベルを有するがん試料または患者の非がん性細胞から採取されたまたは患者から採取されていない任意の他の対照試料を含み得る。所定の実施形態では、対照は、試料がグルコース代謝阻害剤に供される前に患者から採取された試料からのものである。
【００６３】
所定の態様では、本開示は、グルコース代謝阻害剤に対して応答性であるがんを有すると決定された対象におけるがんを治療するまたはがん細胞増殖を低減するための方法であって、有効量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤をがん患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、例えば、ＣＮＳ転移である。いくつかの実施形態では、がんは、非ＣＮＳ癌である。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫、神経膠腫、低悪性度星細胞腫、混合乏突起星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、多形性黄色星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、未分化星細胞腫、肺癌などである。
【００６４】
本明細書における方法の実施形態では、対象は、多形性膠芽腫と診断されている。いくつかの実施形態では、対象は、先行する治療で膠芽腫に対して先に治療されている。さらにいくつかの実施形態では、対象は、先行する治療に対して耐性であると決定されている。
【００６５】
本方法の所定の実施形態では、方法はさらに、追加の療法の適用を含む。いくつかの実施形態では、追加の療法は、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、手術である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、本明細書に記載の１つ以上の療法を含む。
【００６６】
悪性神経膠腫及び膠芽腫
神経膠腫の種類及び段階
原発性悪性脳腫瘍は、脳または脊椎で始まる腫瘍であり、神経膠腫として集合的に知られている。神経膠腫は、特定のがんの種類ではないが、グリア細胞に由来する腫瘍を記述するために使用される用語である。原発性悪性脳腫瘍の例には、星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、多形性黄色星細胞腫、びまん性星細胞腫、未分化星細胞腫、ＧＢＭ、神経節膠腫、乏突起膠腫、上衣腫が含まれる。ＷＨＯの脳腫瘍の分類によれば、星細胞腫は、基礎となる病理学によって決定される４つの悪性度にカテゴリー化されている。神経膠腫を分類するために使用される特徴には、有糸分裂、細胞または核の異型、ならびに血管増殖及び偽柵状配列特徴を有する壊死が含まれる。悪性（または高悪性度）神経膠腫には、未分化神経膠腫（ＷＨＯ悪性度ＩＩＩ）及び多形性膠芽腫（ＧＢＭ；ＷＨＯ悪性度ＩＶ）が含まれる。これらは、予後が最も悪い最も侵攻性の脳腫瘍である。
【００６７】
ＧＢＭは、脳癌の中で最も一般的で、複雑で、治療耐性があり、死亡率が最も高い種類であり、すべての脳癌の４５％を占めており、毎年約１１，０００人の男性、女性、子供が診断されている。ＧＢＭ（悪性度４の星細胞腫及び多形性膠芽腫としても知られている）は、悪性（がん性）原発性脳腫瘍の中で最も一般的な種類である。それらは、多数の理由から非常に侵攻性である。まず、膠芽腫細胞は、豊富な血液供給を刺激する物質を分泌するため、急速に増殖する。それらはまた、正常な細胞と並んで腫瘍の微細な巻回体を送り込むことによって正常な脳内に長距離で侵入し、浸潤する能力を有している。２種類の膠芽腫が知られている。原発性ＧＢＭは、最も一般的な形態である；それらは、急速に成長し、しばしば早期に症状を引き起こす。二次性膠芽腫はあまり一般的ではなく、全ＧＢＭの約１０パーセントを占める。それらは、低悪性度のびまん性星細胞腫または未分化星細胞腫から進行し、若年患者においてよりしばしば見られる。二次性ＧＢＭは、前頭葉に好んで位置し、予後がより良好である。
【００６８】
ＧＢＭは通常、腫瘍の外科的除去、放射線及び化学療法を含む組み合わされた多様式の治療計画によって治療される。まず、手術中に可能な限り多くの腫瘍が除去される。脳内の腫瘍の位置はしばしば、そのどのくらいが安全に除去され得るかを決定する。手術後、放射線及び化学療法は、残存する腫瘍細胞の成長を遅延させる。経口化学療法薬であるテモゾロミドは、６週間使用されることが最も多く、次いでその後に毎月使用される。別の薬物であるベバシズマブ（アバスチン（登録商標）として知られている）も治療中に使用される。この薬物は、血液供給を動員する腫瘍の能力を攻撃し、しばしば腫瘍の成長を遅延させるか、または停止さえもする。
【００６９】
新しい調査的治療も使用され、これらは、標準療法に治療を加えることまたは標準療法の一部をより良好に作用し得る異なる治療に置き換えることを含み得る。これらの治療のいくつかには、ワクチン免疫療法などの免疫療法、または腫瘍が存在する脳の領域への低量の電気パルス及びＮＵ−０１２９などの球状核酸（ＳＮＡ）が関与するナノ療法が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、上記の療法の１つ以上と組み合わせて使用される。
【００７０】
本明細書で論述される方法及び組成物の実施形態はまた、肺癌、非ＣＮＳ癌、ＣＮＳ癌、及びＣＮＳ転移、例えば脳転移、軟髄膜転移、脈絡膜転移、脊髄転移を含むがこれらに限定されない他の種類のがんに適用可能であることが企図される。
【００７１】
グルコース代謝阻害剤
所定の態様では、本開示の方法及び組成物は、グルコース代謝阻害剤（複数可）を含む。阻害剤は、グルコース取り込み阻害剤、グルコーストランスポーター阻害剤、解糖阻害剤、ヘキソキナーゼ阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、細胞内グルコース欠乏の任意の誘導剤またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００７２】
ＥＧＦＲ阻害剤
いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤である。ＥＧＦＲシグナル伝達経路は、神経膠腫及びＧＢＭを含むいくつかのがんにおいて活性化される。活性化は、ＥＧＦＲタンパク質における変異の活性化、または典型的にはＥＧＦＲ遺伝子コピー数の増加によるＥＧＦＲの過剰発現を含む複数のメカニズムによって生じ得る。ＥＧＦＲ遺伝子の増幅及び過剰発現は、腫瘍のおよそ４０％で観察される膠芽腫（ＧＢＭ）の特に顕著な特徴である。ＥＧＦＲ阻害剤は、小分子チロシンキナーゼ阻害剤または抗体であり得る。例えば、モノクローナル抗体である。
【００７３】
小分子阻害剤
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブであり、これは、ＥＧＦＲ受容体のＡＴＰ結合部位に可逆的様式で結合し、これによりＥＧＦＲホモ二量体上にホスホチロシン残基を形成する受容体の能力を遮断し、シグナルカスケードの伝達を妨害して他の細胞生化学プロセスを活性化する小分子標的療法である。本開示はまた、他のＥＧＦＲ阻害剤がまた、例えば、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、またはオシメルチニブなどの本明細書に記載の方法及び組成物と共に使用され得ることを企図している。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つ以上のＥＧＦＲ阻害剤を除外する。所定の好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物である。
【００７４】
抗体
所定の実施形態では、方法及び組成物は、抗体であるＥＧＦＲ阻害剤を含む。臨床使用におけるＥＧＦＲ抗体には、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ．商標）及びパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ．商標）が含まれるがこれらに限定されない。細胞外受容体ドメインはリガンド結合部位を含み、これらの抗体は、リガンド結合を遮断し、ＥＧＦＲシグナル伝達を妨げると考えられる。多くの研究は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに特異的な抗体（または他の結合分子）の生成に焦点を当ててきた（例えば、米国特許第５，４５９，０６１号、第５，５５８，８６４号、第５，８９１，９９６号、第６，２１７，８６６号、第６，２３５，８８３号、第６，６９９，４７３号、及び第７，０６０，８０８号；欧州特許第ＥＰ０３５９２８２号及び第ＥＰ０６６７１６５号を参照、これらのすべてはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナる抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖである。一実施形態では、抗体は、キメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒトまたはヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／または定常ドメイン配列）にグラフトされた非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。一実施形態では、非ヒトドナーは、マウスである。一実施形態では、抗原結合配列は、合成であり、例えば、変位誘発（例えば、ファージディスプレイスクリーニングなど）によって得られる。一実施形態では、キメラ抗体は、マウスＶ領域及びヒトＣ領域を有する。一実施形態では、マウス軽鎖Ｖ領域は、ヒトカッパ軽鎖またはヒ6トＩｇＧ１のＣ領域に融合される。
【００７６】
抗体断片の例には、限定されないが：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結したＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）（ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインを関連させて結合ドメインを形成するペプチドリンカーによって連結されている）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号参照）ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多特異的断片であるダイアボディ（米国特許公開２００５／０２１４８６０）が含まれる。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結させるジスルフィド橋の組み込みによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに接続されるｓｃＦｖを含むミニボディがまた製造され得る（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。
【００７７】
モノクローナル抗体は、すべての抗体産生細胞が単一のＢリンパ球細胞株に由来するので、すべての抗体分子が同じエピトープを認識する単一種の抗体である。ハイブリドーマ技術は、抗原で先に免疫されたマウスからの単一のＢリンパ球と不死の骨髄腫細胞（通常はマウス骨髄腫）との融合を含む。この技術は、同じ抗原またはエピトープ特異性を有する構造的に同一の抗体（モノクローナル抗体）が無制限に産生され得るように、単一の抗体産生細胞を無限に多くの世代にわたって増殖させるための方法を提供する。しかしながら、治療的適用において、ハイブリドーマ技術の目標は、非ヒト（例えば、マウス）ハイブリドーマ細胞株によって生成されたモノクローナル抗体の投与に起因し得るヒトの免疫反応を低減することである。
【００７８】
モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインを、外来の抗体の可変領域をそのまま残しつつ、ヒト由来の類似ドメインに置き換えるための方法が開発されてきた。代替的には、「完全ヒト」モノクローナル抗体がヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスにおいて産生される。げっ歯類及びヒトのアミノ酸配列の両方を有する抗体可変ドメインを組換えにより構築することによってモノクローナル抗体の可変領域をよりヒト型に変換するための方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、高度可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワーク領域はヒトのアミノ酸配列に由来する。げっ歯類に特徴的な抗体中のアミノ酸配列を、ヒト抗体の対応する位置に見られるアミノ酸配列に置き換えることは、治療使用中の有害な免疫反応の可能性を低減すると考えられる。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞はまた、ハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を変化させる場合があるまたは変化させない場合がある遺伝子変異または他の変化に供され得る。
【００７９】
元の抗体の抗原またはエピトープ特異性を保持する（すなわち、分子が結合ドメインを有する）他の抗体またはキメラ分子を産生するために、モノクローナル及び他の抗体ならびに組換えＤＮＡ技術を使用して、改変抗体を作製することが可能である。そのような技術は、異なる抗体のフレームワーク領域、定常領域、または定常領域とフレームワーク領域のための遺伝子材料に、免疫グロブリン可変領域または抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡを導入することを含み得る。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、及び第６，８８１，５５７号（この参考文献によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８０】
本明細書に記載のような既知の手段により、本明細書に記載のタンパク質、そのそれぞれのエピトープの１つ以上、または前述のいずれかの複合体に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、結合断片及び結合ドメインならびにＣＤＲ（前述のいずれかの改変形態を含む）は、そのような抗原またはエピトープが天然源から単離されているか、または天然化合物の合成誘導体またはバリアントであるかにかかわらず、作製され得る。
【００８１】
抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物源から産生され得る。特に、抗体は、ヒツジ、ネズミ科動物（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリであり得る。また、より新しい技術は、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリからのヒト抗体の開発及びそのスクリーニングを可能とする。例えば、米国特許第６，９４６，５４６号（この参考文献によって本明細書に組み込まれる）に記載されているように、バクテリオファージ抗体発現技術は、動物免疫化の非存在下で特異的な抗体を産生することを可能にする。これらの技術はさらに、Ｍａｒｋｓ（１９９２）；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；及びＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）に記載されている。
【００８２】
様々な動物種におけるポリクローナル抗体を産生するための方法、及びヒト化、キメラ、及び完全ヒトを含む様々な種類のモノクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野でよく知られている。これらの抗体を産生するための方法もよく知られている。例えば、以下の米国特許及び特許公開は、そのような方法を可能にする記述を提供しており、参照により本明細書に組み込まれる：米国特許公開第２００４／０１２６８２８及び第２００２／０１７２６７７号；ならびに米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，１９６，２６５号；第４，２７５，１４９号；第４，２７７，４３７号；第４，３６６，２４１号；第４，４６９，７９７号；第４，４７２，５０９号；第４，６０６，８５５号；第４，７０３，００３号；第４，７４２，１５９号；第４，７６７，７２０号；第４，８１６，５６７号；第４，８６７，９７３号；第４，９３８，９４８号；第４，９４６，７７８号；第５，０２１，２３６号；第５，１６４，２９６号；第５，１９６，０６６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，４２０，２５３号；第５，５６５，３３２号；第５，５７１，６９８号；第５，６２７，０５２号；第５，６５６，４３４号；第５，７７０，３７６号；第５，７８９，２０８号；第５，８２１，３３７号；第５，８４４，０９１号；第５，８５８，６５７号；第５，８６１，１５５号；第５，８７１，９０７号；第５，９６９，１０８号；第６，０５４，２９７号；第６，１６５，４６４号；第６，３６５，１５７号；第６，４０６，８６７号；第６，７０９，６５９号；第６，７０９，８７３号；第６，７５３，４０７号；第６，８１４，９６５号；第６，８４９，２５９号；第６，８６１，５７２号；第６，８７５，４３４；及び第６，８９１，０２４号。本明細書及びそれらで引用されるすべての特許、特許公開、及び他の刊行物は、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ＥＧＦＲに対する抗体は、動物種、モノクローナル細胞株または抗体の他の供給源にかかわらず、タンパク質の効果を中和または打ち消す能力を有することが十分に予想される。所定の動物種は、抗体の「Ｆｃ」部分を介した補体系の活性化のため、アレルギー反応を引き起こす可能性がより高い場合があるので、治療用抗体を生成するためにはあまり好ましくない場合がある。しかしながら、抗体全体は、酵素的に消化されて「Ｆｃ」（補体結合）断片、及び結合ドメインまたはＣＤＲを有する結合断片になり得る。Ｆｃ部分の除去は、抗原結合断片が望ましくない免疫学的応答を誘発する可能性を低減し、それ故、Ｆｃを有しない抗体は、予防的または療法的治療に特に有用であり得る。上述したように、抗体はまた、他の種で生成された、または他の種からの配列を有する抗体を動物に投与することから生じる有害な免疫学的結果を低減または排除するために、キメラ、部分的または完全ヒトとなるように構築され得る。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、アンタゴニスト抗体である。
【００８４】
ＰＩ３Ｋ阻害剤
所定の実施形態では、方法及び組成物は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼＰＩ３Ｋ阻害剤であるグルコース代謝阻害剤を含む。ミトゲン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路を介したシグナル伝達は、細胞外刺激によって誘発され、増殖、分化及び細胞死などの様々な生物学的プロセスを制御する。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、そのような細胞外刺激に応答した細胞内シグナル伝達の重要なコーディネーターである。それらは、プレックストリン−ホモロジー、ＦＹＶＥ、Ｐｈｏｘ及び他のリン脂質結合ドメインを含むタンパク質を様々なシグナル伝達複合体にしばしば細胞膜においてドッキングさせることによってシグナル伝達カスケードにおけるセカンドメッセンジャーとして後に作用するホスホイノシトール−３−ホスフェート（ＰＩＰ）、ホスホイノシトール−３，４−ジホスフェート（ＰＩＰ２）及びホスホイノシトール−３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）を生成するためにイノシトール脂質のＤ−３’位置へのホスフェートの転移を触媒する脂質キナーゼのファミリーを含む（Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０：５３５（２００１）；Ｋａｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７：６１５（２００１））。本方法及び組成物はまた、異なるＰＩ３Ｋアイソフォーム（各々が細胞シグナル伝達及びがんにおいて相違する役割を果たす）に対するアイソフォーム選択的阻害剤の使用を企図している。個々のアイソフォームを標的とする阻害剤は、より高い治療有効性を達成することができる可能性がある。
【００８５】
例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤には、ピクチリシブ、ダクトリシブ、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、イデラリシブ（ＣＡＬ−１０１、ＧＳ−１１０１）、デュベリシブ、ブパルリシブ、ＩＰＩ−５４９、ＳＰ２５２３、ＧＤＣ−０３２６、ＴＧＲ−１２０２、ＶＰＳ３４阻害剤１、ＧＳＫ２２６９５５７（ネミラリシブ）、ＧＤＣ−００８４、ＳＡＲ４０５、ＡＺＤ８８３５、ＬＹ３０２３４１４、ＰＩ−１０３、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１（ＫＵ−５７７８８）、ＩＣ−８７１１４、ウォルトマニン、ＸＬ１４７類似体、ＺＳＴＫ４７４、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＰＩＫ−７５ＨＣｌ、Ａ６６、ＡＳ−６０５２４０、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）、ＰＩＫ−９３、ＰＩＫ−９０、ＡＺＤ６４８２２、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＧＳＫ１０５９６１５、デュベリシブ（ＩＰＩ−１４５、ＩＮＫ１１９７）、ゲダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＴＧ１００−１１５、ＡＳ−２５２４２４、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＳ−６０４８５０、ＰＩＫ−２９４、ＧＳＫ２６３６７７１、コパンリシブ（ＢＡＹ８０−６９４６）、ＹＭ２０１６３６、ＣＨ５１３２７９９、ＣＡＹ１０５０５、ＰＩＫ−２９３、ＰＫＩ−４０２、ＴＧ１００７１３、ＶＳ−５５８４（ＳＢ２３４３）、タセリシブ（ＧＤＣ００３２）、ＣＺＣ２４８３２、ＡＭＧ３１９、ＧＳＫ２２９２７６７、ＨＳ−１７３、クエルセチン、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＰＩＫ−９３、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＰＩＫ−９０、ＧＮＥ−３１７、ピララリシブ（ＸＬ１４７）、ＰＦ−４９８９２１６、ＡＺＤ８１８６、７４０Ｙ−Ｐ、Ｖｐｓ３４−ＩＮ１、ＰＩＫ−ＩＩＩ、ＰＩ−３０６５もしくは任意の他のＰＩ３Ｋ阻害剤またはそれらの類似体が含まれる。
【００８６】
グルコース取り込み阻害剤／ヘキソキナーゼ阻害剤
いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、グルコース取り込みまたは解糖阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ヘキソキナーゼ阻害剤である。例示的なヘキソキナーゼ阻害剤には、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）、ブロモピルビン酸、ロニダミンミトクロンドリアルヘキソキナーゼ阻害剤及びＰＫＭ２調節剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
グルコーストランスポーター阻害剤
いくつかの実施形態では、ＧＢＭまたはがんを治療する方法は、対象に有効量のグルコーストランスポーター阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む。分子のグルコーストランスポーターファミリーの例示的な阻害剤には、フラボノイドファミリーのいくつかのメンバーが含まれる。例えば、フォルスコリン、フロレチン（フラボノイド様化合物）及びサイトカラシンＢは、ＧＬＵＴ１を阻害することが知られている。フラボノールであるクエルセチンは、ＧＬＵＴ２媒介グルコース輸送を阻害することが示されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５２５２−１５２６０，２００２）。エストラジオール及びイソフラボン植物性エストロゲンゲニステインはまた、ＧＬＵＴ１媒介グルコース輸送の阻害剤である（Ａｆｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３６５：７０７−７１９，２００２）。グルコーストランスポーター阻害剤であるフォルスコリン、ジピリダモール及びイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４の両方に結合する（Ｈｅｌｌｗｉｇ  ＆  Ｊｏｏｓｔ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３８３−３８９，１９９１）。サイトカラシンＢもＧＬＵＴ４に結合する（Ｗａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２８４：５６−６２，１９９６）。したがって、本方法及び組成物のいくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、フォルスコリン、クエルセチン、ゲニステイン、エストラジオール、ジピリダモール、イソブチルメチルキサンチンまたはサイトカラシンＢである。
【００８８】
これらの既知の阻害剤に加えて、当業者は、グルコーストランスポーターの阻害剤を同定することが知られている多数のアッセイがあることを理解する。例えば、グルコーストランスポーターに対する阻害剤の効果は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの卵母細胞またはＣＨＯなどの細胞中の対象となるＧＬＵＴ、好ましくはグルコーストランスポーター８を発現すること、阻害剤の存在下または非存在下でグルコース取り込みを測定すること、及び阻害剤が競合的かまたは非競合的かを決定することによって評価され得る。所与のＧＬＵＴアイソフォームの配列が分かると、多数の分子に対するその感受性が薬物候補を同定するために容易に試験され得る。
【００８９】
細胞質ｐ５３安定化剤
本発明者は、例えば、ＣＮＳ浸透小分子などでの薬理学的ｐ５３安定化が、患者由来の原発性ＧＢＭモデルにおいてＥＧＦＲ駆動グルコース取り込みの阻害と相乗的致死性であったことを実証した。本発明者は、ｐ５３の非転写機能が、代謝応答体における内因性アポトーシスを刺激する上で重要な役割を有し得ることを初めて実証した。したがって、本明細書に記載の治療方法は、グルコース代謝阻害剤と組み合わせた細胞質ｐ５３安定化剤（複数可）の投与を含む。細胞質ｐ５３安定化剤（複数可）及びグルコース代謝阻害剤は、同じまたは異なる組成物で、同時にまたは順次に投与され得る。いくつかの実施形態では、単一のｐ５３安定化剤が使用され、他の実施形態では、複数のｐ５３安定化剤が使用される。例えば、ヌトリンとＡＢＴ７３７（ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬを結合させる）との組み合わせは、ミトコンドリアレベルでアポトーシス促進性及び抗アポトーシスタンパク質のバランスを相乗的に標的化し、それによって細胞死を促進することが報告されている。（Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｖｏｌ．１３．ｐｐ．２１７）。本明細書で意図されるように、細胞質ｐ５３安定化剤は、直接的または間接的にｐ５３を薬理学的に安定化または活性化し得る任意の小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの誘導体である。細胞質ｐ５３の安定化は、がん細胞などの細胞をアポトーシスのためにプライミングすることをもたらす。
【００９０】
ＭＤＭ２アンタゴニスト
細胞内のｐ５３のタンパク質レベルは、その負の調節因子であるＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＭＤＭ２によって厳密に制御され、低く維持される。本開示の方法または組成物の実施形態では、細胞質ｐ５３の安定化剤は、ＭＤＭ２アンタゴニスト／阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２アンタゴニストは、ヌトリンである。さらなる実施形態では、ヌトリンは、ヌトリン−３またはイダサヌトリンである。他の実施形態では、ＭＤＭ２アンタゴニストは、ＲＯ５０４５３３７（ＲＧ７１１２としても知られている）、ＲＯ５５０３７８１、ＲＯ６８３９９２１、ＳＡＲ４０５８３８（ＭＩ−７７３としても知られている）、ＤＳ−３０３２、ＤＳ−３０３２ｂ、もしくはＡＭＧ−２３２または任意の他のＭＤＭ２阻害剤である。
【００９１】
ＭＤＭ−２に結合することが知られている本方法の範囲内の他の化合物には、Ｒｏ−２４４３、ＭＩ−２１９、ＭＩ−７１３、ＭＩ−８８８、ＤＳ−３０３２ｂ、ベンゾジアゼピンジオン類（例えば、ＴＤＰ５２１２５２）、スルホンアミド類（例えば、ＮＳＣ２７９２８７）、クロメノトリアゾロピリミジン、モルホリノン及びピペリジノン類（ＡＭ−８５５３）、テルフェニル類、カルコン類、ピラゾール類、イミダゾール類、イミダゾール−インドール類、ピロリジノン（例えば、ＰＸＮ８２２）、ピリアキソン、ピペリジン類、天然に誘導されたプレニル化キサントン類、ＳＡＨ−８（ステープルペプチド）ｓＭＴｉｄｅ−０２、ｓＭＴｉｄｅ−０２ａ（ステープルペプチド）、ＡＴＳＰ−７０４１（ステープルペプチド）、スピロリゴマー（α−ヘリックス模倣体）が含まれる。ＭＤＭ２のタンパク質折り畳みを引き起こすことが知られている化合物には、ＰＲＩＭＡ−１ＭＥＴ（ＡＰＲ−２４６としても知られている）Ａｐｒｅａ１０２−１０５、ＰＫ０８３、ＰＫ５１７４、ＰＫ５１９６、ＰＫ７０８８、ベンゾチアゾール類、スチクチン（ｓｔｉｃｔｉｃ）酸及びＮＳＣ３１９７２６が含まれる。
【００９２】
ＢＣＬ−２阻害剤
本方法または組成物のさらなる実施形態では、細胞質ｐ５３安定化剤は、ＢＣＬ−２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤は、例えば、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＧ３１３９、ｍＲＮＡアンタゴニストＳＰＣ２９９６、ベネトクラクス（ＡＢＴ−１９９）、ＧＤＣ−０１９９、オバトクラクス、パクリタキセル、ナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）、ＡＢＴ−７３７、ＮＵ−０１２９、Ｓ０５５７４６、ＡＰＧ−１２５２または任意の他のＢＣＬ−２阻害剤である。
【００９３】
Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤
本方法または組成物のまたさらなる実施形態では、細胞質ｐ５３安定化剤は、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、例えば、ＷＥＨＩ５３９、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−７３７、サブトクラクス、ＡＴ１０１、ＴＷ−３７、ＡＰＧ−１２５２、ガンボギン酸または任意の他のＢｃｌ−ｘＬ阻害剤である。
【００９４】
追加の方法
所定の態様では、本開示は、ＥＧＦＲまたはΔＥＧＦＲを阻害する方法であって、対象に有効量の式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００９５】
所定の態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、がんの治療を必要とする対象に有効量の式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫である。
【００９６】
所定の態様では、本開示は、がんを治療する方法であって、がんの治療を必要とする対象に有効量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫である。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍は、グルコース代謝阻害剤に対して感受性であることが決定されている。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、そのような治療に対して適格性を有すると先に決定された対象にグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することによってＧＢＭ成長または増殖を抑制するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、グルコース代謝の阻害及び細胞質ｐ５３の安定かは、同時または順次であり得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭを治療する方法、対象におけるＧＢＭを低減または阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭ細胞の成長を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤でＧＢＭ患者を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＭＢ患者の予後を改善するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭのリスクを低減するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭを有する患者を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療に対する患者の応答を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭ腫瘍細胞をアポトーシスに対してプライミングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭ患者を治療に対してコンディショニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、無効な療法のリスクを低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＢＭの症状を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍生存の機会を低減するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、療法に対する腫瘍細胞の脆弱性を増大させるための方法を提供する。本開示で論述された工程及び実施形態は、これらの方法のいずれかの一部として企図される。その上、これらの方法のいずれかにおいて使用するための組成物も企図される。
【００９９】
所定の態様では、本開示は、対象における悪性神経膠腫またはＧＢＭを治療する方法であって、対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定された後に対象に所定量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を投与することを含む、方法を提供する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、対象から腫瘍生検を得ること、任意のグルコース代謝阻害剤の存在下で腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定すること、得られた腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを対照によるグルコース取り込みのレベルと比較すること；及び腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルが対照と比較して減弱している場合、対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定することを含む方法によって対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている。いくつかの実施形態では、グルコース取り込みは、放射性標識されたグルコース２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）の取り込みによって測定される。さらなる実施形態では、１８Ｆ−ＦＤＧの検出は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）による。いくつかの実施形態では、生検は、ＧＢＭ腫瘍から採取される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、対象から第１の血液試料を得ること、対象をケトン食療法に所定期間付すこと、ケトン食療法に付された後に対象から第２の血液試料を得ること、第１及び第２の血液試料中のグルコースレベルを測定すること；第２の血液試料中のグルコースレベルを第１の血液試料中のグルコースレベルと比較すること、及び第２の血液試料中のグルコースレベルが第１の血液試料中のグルコースレベルと比較して低減する場合、対象が感受性であると決定することを含む方法によって対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている。いくつかの実施形態では、グルコースレベルの低減は、第２の血液試料と対照血液試料との間であり、約０．１５ｍＭもしくはそれを超え、約０．２０ｍＭもしくはそれを超え、０．１５ｍＭ〜２．０ｍＭの範囲内であり、または０．２５ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲内である。いくつかの実施形態では、グルコースレベルの低減は、約、少なくとも約、または多くとも約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍＭ（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）である。
【０１０２】
所定の態様では、本開示は、神経膠腫またはＧＢＭと診断された対象を分類する方法であって、対象から生物学的試料を得ること、生物学的試料をグルコース代謝阻害剤（複数可）で処置すること、及びグルコース代謝がグルコース代謝阻害剤によって減弱しているかどうかを決定することを含む、方法を提供する。グルコース代謝の減弱を決定することは、グルコースレベルの変化、及び／または解糖速度の変化、及び／またはグルコース取り込みの変化、及び／または細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の変化を決定すること、及び／またはグルコース代謝阻害剤の投与の前及び後のヘキソキナーゼ、またはホスホフルクトキナーゼ、またはピルビン酸キナーゼの活性を測定することを含む。いくつかの実施形態では、解糖の変化を決定することは、ピルベート及び／またはラクテートの直接的測定を含む。所定の実施形態では、生物学的試料は、ＧＢＭ腫瘍からのがん細胞を含む。他の実施形態では、方法はさらに、グルコース減弱のレベルを対照と比較することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、グルコース代謝が生物学的試料においてグルコース代謝阻害剤によって減弱された場合、対象を代謝応答体として分類することを含む。さらなる実施形態では、方法はさらに、代謝応答体として分類された対象をグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を含む組成物で治療することを含む。
【０１０３】
所定の態様では、本開示は、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤での治療に対するがん細胞または腫瘍の感受性を評価する方法であって、がん細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定または検出すること及びグルコース取り込みのレベルを対照と比較することを含む、方法を提供する。グルコースは、放射性標識され得、例えば、２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）などである。いくつかの実施形態では、放射性標識されたグルコース取り込みの測定及び検出は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によって行われる。
【０１０４】
所定の実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、グルコース取り込み阻害剤、グルコーストランスポーター阻害剤、解糖阻害剤、ヘキソキナーゼ阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、細胞内グルコース欠乏の任意の誘導剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、またはオシメルチニブである。さらなる実施形態では、グルコース阻害剤は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼＰＩ３Ｋ阻害剤である。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ピクチリシブ、ダクトリシブ、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、イデラリシブ、デュベリシブ、ブパルリシブ、ＩＰＩ−５４９、ＳＰ２５２３、ＧＤＣ−０３２６、ＴＧＲ−１２０２、ＶＰＳ３４阻害剤１、ＧＳＫ２２６９５５７、ＧＤＣ−００８４、ＳＡＲ４０５、ＡＺＤ８８３５、ＬＹ３０２３４１４、ＰＩ−１０３、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＩＣ−８７１１４、ウォルトマニン、ＸＬ１４７類似体、ＺＳＴＫ４７４、アルペリシブ、ＰＩＫ−７５ＨＣｌ、Ａ６６、ＡＳ−６０５２４０、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）、ＰＩＫ−９３、ＰＩＫ−９０、ＡＺＤ６４８２２、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＧＳＫ１０５９６１５、デュベリシブ、ゲダトリシブ、ＴＧ１００−１１５、ＡＳ−２５２４２４、ＢＧＴ２２６、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＳ−６０４８５０、ＰＩＫ−２９４、ＧＳＫ２６３６７７１、コパンリシブ、ＹＭ２０１６３６、ＣＨ５１３２７９９、ＣＡＹ１０５０５、ＰＩＫ−２９３、ＰＫＩ−４０２、ＴＧ１００７１３、ＶＳ−５５８４、タセリシブ、ＣＺＣ２４８３２、ＡＭＧ３１９、ＧＳＫ２２９２７６７、ＨＳ−１７３、クエルセチン、ボクスタリシブ、ＰＩＫ−９３、オミパリシブ、ＰＩＫ−９０、ＧＮＥ−３１７、ピララリシブ、ＰＦ−４９８９２１６、ＡＺＤ８１８６、７４０Ｙ−Ｐ、Ｖｐｓ３４−ＩＮ１、ＰＩＫ−ＩＩＩ、ＰＩ−３０６５またはそれらの類似体であり得る。いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）またはサイトカラシンＢである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、細胞質ｐ５３安定化剤は、ＭＤＭ２アンタゴニスト／阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２アンタゴニストは、ヌトリンである。さらなる実施形態では、ヌトリンは、ヌトリン−３またはイダサヌトリンである。他の実施形態では、ＭＤＭ２アンタゴニストは、ＲＯ５０４５３３７、ＲＯ５５０３７８１、ＲＯ６８３９９２１、ＳＡＲ４０５８３８、ＤＳ−３０３２、ＤＳ−３０３２ｂ、もしくはＡＭＧ−２３２または任意の他のＭＤＭ２阻害剤である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、細胞質ｐ５３安定化剤は、ＢＣＬ−２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤は、例えば、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＧ３１３９、ｍＲＮＡアンタゴニストＳＰＣ２９９６、ベネトクラクス（ＡＢＴ−１９９）、ＧＤＣ−０１９９、オバトクラクス、パクリタキセル、ナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）、ＡＢＴ−７３７、ＮＵ−０１２９、Ｓ０５５７４６、ＡＰＧ−１２５２または任意の他のＢＣＬ−２阻害剤である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、細胞質ｐ５３安定化剤は、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、例えば、ＷＥＨＩ５３９、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−７３７、サブトクラクス、ＡＴ１０１、ＴＷ−３７、ＡＰＧ−１２５２、ガンボギン酸または任意の他のＢｃｌ−ｘＬ阻害剤である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、エルロチニブであり、細胞質ｐ５３安定化剤は、イダサヌトリンである。いくつかの実施形態では、対象には、約１ｍｇ〜２５０ｍｇのエルロチニブの任意の用量が投与される。いくつかの実施形態では、対象には、１、５、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、２１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１６０、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、及び２５０ｍｇのエルロチニブまたはそれらの間の誘導可能な任意の用量が投与される。いくつかの実施形態では、対象には、５０ｍｇ〜１６００ｍｇのイダサヌトリンの任意の用量が投与される。いくつかの実施形態では、対象には、１００、１５０、３００、４００、４５０、または６００ｍｇのイダサヌトリンが投与される。いくつかの実施形態では、対象には、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５及び１６５０ｍｇまたはそれらで誘導可能な任意の用量が投与される。
【０１０９】
他の実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物である。いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤は、式Ｉ−ａまたはＩ−ｂの化合物であり、細胞質ｐ５３安定化剤は、イダサヌトリンである。
【０１１０】
所定の態様では、本開示は、対象における膠芽腫を治療する方法であって、対象がＥＧＦＲ阻害剤によって低減したグルコース代謝に対して感受性であると決定した後に、治療的有効量のグルコース取り込み阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１１１】
所定の態様では、本開示は、対象における膠芽腫増殖を低減する方法であって、対象がＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性であると決定した後に、有効量のＥＧＦＲ阻害剤及びＭＤＭ２阻害剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤は、同じ組成物で投与される。他の実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３は、別々の組成物で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤は、互いに２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間以内もしくは３０分以内またはそれらの間の時間もしくは分の任意の部分以内に投与される。またさらなる実施形態では、グルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤は、同時に対象に投与される。
【０１１３】
本方法の所定の実施形態では、対象からの試料中のグルコースのレベル（またはグルコースの変化もしくはグルコース減弱）を対照試料と比較することなどの対照の使用が企図される。対照は、非がん性試料、異なる表現型を有するがん性試料、野生型ＥＧＦＲ発現レベルを有するがん試料または患者の非がん性細胞から採取されたまたは患者から採取されていない任意の他の対照試料を含み得る。所定の実施形態では、対照は、試料がグルコース代謝阻害剤に供される前に患者から採取された試料からのものである。
【０１１４】
所定の態様では、本開示は、グルコース代謝阻害剤に対して反応性であるがんを有すると決定された対象におけるがんを治療するまたはがん細胞増殖を低減するための方法であって、有効量のグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤をがん患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、例えば、ＣＮＳ転移である。いくつかの実施形態では、がんは、非ＣＮＳ癌である。いくつかの実施形態では、がんは、多形性膠芽腫、神経膠腫、低悪性度星細胞腫、混合乏突起星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、多形性黄色星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、未分化星細胞腫、肺癌などである。
【０１１５】
本明細書における方法の実施形態では、対象は、多形性膠芽腫と診断されている。いくつかの実施形態では、対象は、先行する治療で膠芽腫に対して先に治療されている。さらにいくつかの実施形態では、対象は、先行する治療に対して耐性であると決定されている。
【０１１６】
本方法の所定の実施形態では、方法はさらに、追加の療法の適用を含む。いくつかの実施形態では、追加の療法は、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、手術である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、本明細書に記載の１つ以上の療法を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び／または方法は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、もしくはオシメルチニブ、ピクチリシブ、ダクトリシブ、ＬＹ２９４００２、デュベリシブ、もしくはブパルリシブ、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）、サイトカラシンＢ、ＡＰＲ−２４６、ＲＯ５０４５３３７、ＲＯ５５０３７８１、ＲＯ６８３９９２１、ＳＡＲ４０５８３８、ＤＳ−３０３２、ＤＳ−３０３２ｂ、もしくはＡＭＧ−２３２、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドＧ３１３９、ｍＲＮＡアンタゴニストＳＰＣ２９９６、ベネトクラクス（ＡＢＴ−１９９）、ＧＤＣ−０１９９、オバトクラクス、パクリタキセル、ナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）、ＡＢＴ−７３７、ＮＵ−０１２９、Ｓ０５５７４６、もしくはＡＰＧ−１２５２、サブトクラクス、ＡＴ１０１、ＴＷ−３７、ＡＰＧ−１２５２、またはガンボギン酸のうちの１つ以上を除外する。いくつかの実施形態では、組成物及び／または方法は、ピクチリシブ、ダクトリシブ、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、イデラリシブ、デュベリシブ、ブパルリシブ、ＩＰＩ−５４９、ＳＰ２５２３、ＧＤＣ−０３２６、ＴＧＲ−１２０２、ＶＰＳ３４阻害剤１、ＧＳＫ２２６９５５７、ＧＤＣ−００８４、ＳＡＲ４０５、ＡＺＤ８８３５、ＬＹ３０２３４１４、ＰＩ−１０３、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＩＣ−８７１１４、ウォルトマニン、ＸＬ１４７類似体、ＺＳＴＫ４７４、アルペリシブ、ＰＩＫ−７５ＨＣｌ、Ａ６６、ＡＳ−６０５２４０、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）、ＰＩＫ−９３、ＰＩＫ−９０、ＡＺＤ６４８２２、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＧＳＫ１０５９６１５、デュベリシブ、ゲダトリシブ、ＴＧ１００−１１５、ＡＳ−２５２４２４、ＢＧＴ２２６、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＳ−６０４８５０、ＰＩＫ−２９４、ＧＳＫ２６３６７７１、コパンリシブ、ＹＭ２０１６３６、ＣＨ５１３２７９９、ＣＡＹ１０５０５、ＰＩＫ−２９３、ＰＫＩ−４０２、ＴＧ１００７１３、ＶＳ−５５８４、タセリシブ、ＣＺＣ２４８３２、ＡＭＧ３１９、ＧＳＫ２２９２７６７、ＨＳ−１７３、クエルセチン、ボクスタリシブ、ＰＩＫ−９３、オミパリシブ、ＰＩＫ−９０、ＧＮＥ−３１７、ピララリシブ、ＰＦ−４９８９２１６、ＡＺＤ８１８６、７４０Ｙ−Ｐ、Ｖｐｓ３４−ＩＮ１、ＰＩＫ−ＩＩＩ、ＰＩ−３０６５またはそれらの類似体を除外する。
【０１１８】
１つ以上の組成物の使用は、本明細書に記載の方法に基づいて用いられ得る。１つ以上の組成物の使用は、本明細書に記載の方法に従って治療のための薬剤の調製において用いられ得る。他の実施形態は、本出願を通して論述される。本開示の１つの態様に関連して論述される任意の実施形態は、本開示の他の態様に同様に及び反対に適用される。実施例の項における実施形態は、本明細書に記載の技術のすべての態様に適用可能な実施形態であると理解される。
【０１１９】
評価の方法
グルコース取り込み試験
本開示の方法及び組成物の実施形態では、ＧＢＭまたはがんを有する対象は、「代謝応答体」または「代謝非応答体」のいずれかとして分類される、すなわち、グルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定される。所定の実施形態では、対象の分類は、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を含む治療剤を対象に投与することに先行する。したがって、本開示は、がんを評価し、対象を分類し、グルコース代謝、解糖またはグルコース取り込みの分析を含む、対象の治療に対する感受性を決定するための方法を提供する。対象を代謝応答体として分類するための方法は、実施例１に詳細に記載されている。解糖及びグルコース取り込みをモニターする技術は、Ｔ．ＴｅＳｌａａ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｔｅｉｔｅｌｌ．２０１４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５４２，ｐｐ．９２−１１４で提供されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
解糖は、２分子のＡＴＰの同時生成を伴う１分子のグルコースの２分子のピルベートへの細胞内生化学的変換である。ピルベートは、ＮＡＤＨ及びＦＡＤＨ２を産生するためにミトコンドリア内のトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルへの侵入を含む、いくつかの潜在的な宿命を有する代謝中間体である。代替的には、ピルベートは、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への同時再生を伴って乳酸脱水素酵素によってサイトゾル内でラクテートに変換され得る。解糖を介するフラックスの増加は、例えば、ヌクレオチド、脂質、及びタンパク質の生合成のためのグルコース由来の代謝中間体と同様に、ＡＴＰの形態で追加のエネルギーを提供することによってがん細胞の増殖を支援する。Ｗａｒｂｕｒｇ（Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ．１９５６；９（２）：７５−８３）は、増殖する腫瘍細胞が、主に酸素が利用可能なときに呼吸する非悪性細胞とは対照的に、酸素の存在下でグルコースをラクテートに変換する好気性解糖を増大させることを最初に観察した。Ｗａｒｂｕｒｇ効果と呼ばれるこのミトコンドリアバイパスは、がん細胞、活性化リンパ球、及び多能性幹細胞を含む急速に増殖する細胞で発生する。Ｗａｒｂｕｒｇ効果は、１８Ｆ−デオキシグルコースなどのフッ素化グルコース類似体の細胞内取り込みの増加を識別するために陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを使用する臨床診断検査のために利用されてきた。
【０１２１】
それ故、解糖は、治療及び診断方法のための標的を表す。本方法の文脈では、悪性細胞によるグルコース取り込み及びラクテート排泄の測定は、グルコース異化及び／またはグルコース代謝阻害剤に対する感受性のシフトを検出するのに有用であり得る。そのようなシフトを検出することは、ＧＢＭを治療する方法、無効な療法のリスクを低減する方法、腫瘍の生存の機会を低減する方法にとって重要である。本開示の目的のため、１８Ｆ−デオキシグルコースＰＥＴは、所定の実施形態では、ｐ５３活性化に対する感受性を予測するための急速な非侵襲的機能バイオマーカーとして機能する。この非侵襲的分析は、薬物動態／薬力学的評価が非常に困難で非実用的である悪性脳腫瘍にとって特に価値があり得る。いくつかの場合では、遅延画像化プロトコル（４１）及びＭＲＩ融合でのパラメトリック応答マップ（ＰＲＭ）は、腫瘍の１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの変化を定量化するのに有用であり得る（４２）。
【０１２２】
所定の態様では、方法は、グルコース取り込み及びラクテート産生を測定することに関連し得る。培養中の細胞の場合、グルコース取り込み及びラクテート排泄を測定することによって解糖フラックスが定量化され得る。細胞内へのグルコース取り込みは、グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１−Ｇｌｕｔ４）を介する一方で、ラクテート排泄は、細胞膜でのモノカルボン酸トランスポーター（ＭＣＴ１−ＭＣＴ４）を介する。
【０１２３】
細胞外グルコース及びラクテート
グルコース取り込み及びラクテート排泄を検出するための方法には、例えば、細胞外グルコースもしくはラクテートキット、細胞外バイオアナライザー、ＥＣＡＲ測定、［３Ｈ］−２−ＤＧもしくは［１４Ｃ］−２−ＤＧ取り込み、１８ＦＤＧ取り込みまたは２−ＮＢＤＧ取り込みが含まれる。
【０１２４】
細胞培養培地中のグルコース及びラクテートレベルを定量化するための商用利用可能なキット及び機器が利用可能である。キットの検出方法は通常、比色分析または蛍光分析であり、分光光度計などの標準的な実験装置と適合性がある。生物プロファイル分析器（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌなど）または生化学分析器（例えば、ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓなど）は、細胞培養培地中のグルコース及びラクテートの両方のレベルを測定し得る。ＧｌｕｃＣｅｌｌ（Ｃｅｓｃｏ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）は、細胞培養培地中のグルコースレベルのみを測定し得る。各々の商用の方法は、異なる検出プロトコルを有するが、分析のための培養培地の収集は同じである。
【０１２５】
細胞外酸性化速度
解糖はまた、ピルベートからのその変換後の単位時間当たりの乳酸の排泄に主に由来する周囲培地の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の測定を介して決定され得る。Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックス（ＸＦ）分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、同じ細胞内で解糖及び酸化的リン酸化（酸素消費を介する）を同時に測定するためのツールである。
【０１２６】
グルコース類似体の取り込み
本開示の方法の所定の実施形態は、グルコース類似体の使用を含む。当業者によく知られているであろうが、細胞によるグルコース取り込み率を決定するために、グルコースの標識されたアイソフォームが細胞培養培地に添加され、次いで所与の期間後に細胞内で測定され得る。これらの研究のためのグルコース類似体の例示的な種類には、放射性グルコース類似体、例えば、２−デオキシ−Ｄ−［１，２−３Ｈ］−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−［１−１４Ｃ］−グルコース、または２−デオキシ−２−（１８Ｆ）−フルオロ−Ｄ−グルコース（１８ＦＤＧ）、または蛍光性グルコース類似体、例えば、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアキソール−４−イル）アミノ］−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ）が含まれるがこれらに限定されない。放射性グルコース類似体の取り込みの測定は、シンチレーションカウンターを必要とする一方で、２−ＮＢＤＧの取り込みは通常、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によって測定される。いくつかの実施形態では、グルコース取り込みは、放射性標識されたグルコース２−デオキシ−２−［フッ素−１８］フルオロ−Ｄ−グルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）の取り込みによって測定される。さらなる実施形態では、１８Ｆ−ＦＤＧを検出することは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）による。いくつかの実施形態では、生検は、ＧＢＭ腫瘍から採取される。１８Ｆ−ＦＤＧを測定する例の詳細な説明は、以下の実施例に提供されている。
【０１２７】
所定の態様では、方法は、腫瘍試料などの生物学的試料のグルコース取り込みを対照と比較することに関連し得る。倍増加または減少は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００もしくはそれ以上、またはそれらで誘導可能な任意の範囲であるか、少なくともこれらであるか、または多くともこれらである。代替的には、試料と参照との間の発現の差は、少なくともまたは多くとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％の差、またはそれらで誘導可能な任意の範囲などの減少または増加率として表され得る。
【０１２８】
相対的な発現レベルを表すための他の方法は、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、またはそれらで誘導可能な任意の範囲などの正規化されたまたは相対的な数を用いる。いくつかの実施形態では、レベルは、対照に対するものであり得る。
【０１２９】
バイオマーカーレベルの評価を容易にするために、加重投票プログラムなどのアルゴリズムが使用され得る。また、誤った評価のリスクを低減するために、他の臨床的証拠がバイオマーカーベースの試験と組み合わされ得る。他の細胞遺伝学的評価がいくつかの実施形態で考慮され得る。
【０１３０】
生物学的試料の調製
所定の態様では、方法は、対象から試料を得ることを含む。がん細胞を含有する患者からの任意の生物学的試料は、本明細書で論述されるグルコース取り込みを評価するために使用され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍からの生物学的試料が使用される。他の実施形態では、生物学的試料は、血液または血漿である。試料の評価は、がん細胞のパンニング（濃縮）、細胞株のインビトロ成長、またはがん細胞の単離を含み得るが、含む必要はない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、対象から腫瘍生検を得ること、任意のグルコース代謝阻害剤の存在下で腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを測定すること、得られた腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルを対照によるグルコース取り込みのレベルと比較すること；及び腫瘍細胞によるグルコース取り込みのレベルが対照と比較して減弱している場合、対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定することを含む方法によって対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定されている。
【０１３２】
腫瘍生検はＧＢＭに限られてもよいが、ＧＢＭに限られない。本明細書で提供される得る方法は、針吸引などの生検、切開生検、切除生検、パンチ生検の方法を含み得る。針吸引の方法はさらに、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、または大型コア生検を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の試料は、十分な量の生物学的材料を確保するために本明細書の方法によって得られ得る。いくつかの場合では、細針吸引試料取得手順は、超音波、Ｘ線、または他の撮像装置の使用によって案内され得る。
【０１３３】
他の実施形態では、試料は、非がん性またはがん性組織を含むがこれらに限定されない組織のいずれかから得られ得る。生物学的試料を得るための一般的方法は、当該技術分野で知られている。Ｒａｍｚｙ，Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｐｓｙ  ２００１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの刊行物は、生検及び細胞学的方法のための一般的方法を記載している。
【０１３４】
他の実施形態では、対象から第１の血液試料を得ること、対象をケトン食療法に所定期間付すこと、ケトン食療法に付された後に対象から第２の血液試料を得ること、第１及び第２の血液試料中のグルコースレベルを測定すること、第２の血液試料中のグルコースレベルを第１の血液試料中のグルコースレベルと比較すること、及び第２の血液試料中のグルコースレベルが第１の血液試料中のグルコースレベルと比較して低減した場合、対象が感受性であると決定することを含む方法によって対象がグルコース代謝阻害剤に対して感受性であると決定される。いくつかの実施形態では、グルコースレベルの低減は、第２の血液試料と対照血液試料との間であり、約０．１５ｍＭもしくはそれを超え、約０．２０ｍＭもしくはそれを超え、０．１５ｍＭ〜２．０ｍＭの範囲内であり、または０．２５ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲内である。
【０１３５】
生物学的試料は、血液または血漿であり得るか、細胞の不均質または均質な集団であり得る。生物学的試料は、本明細書に記載の分析方法に好適な試料を提供し得る当該技術分野で知られている任意の方法を使用して得られ得る。
【０１３６】
試料は、当該技術分野で知られている方法によって得られ得る。試料は、本方法のキットの構成要素を使用して得られ、貯蔵され、または輸送され得る。いくつかの場合では、複数のがん性試料などの複数の試料は、本明細書に記載の方法によって診断のために得られ得る。他の場合では、１つの組織タイプからの１つ以上の試料及び別の組織からの１つ以上の試料などの複数の試料が、本方法によって診断のために得られ得る。試料は、異なる時間で得られ得、異なる方法によって貯蔵及び／または分析される。
【０１３７】
薬学的組成物
所定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるグルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０１３８】
所定の態様では、治療剤または阻害剤などの、本明細書に記載の方法で使用するための組成物または薬剤は好適には、薬学的に許容可能な担体中に含有される。担体は、非毒性、生体適合性であり、薬剤の生物学的活性に有害な影響を及ぼさないように選択される。本開示のいくつかの態様における薬剤は、経口、非経口または外科的投与を可能にする錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、保管剤、吸入剤及び注射剤などの固体、半固体、ゲル、液体または気体の形態で、局所送達（すなわち、骨格筋または他の組織などの身体の特定の位置への）または全身送達のための調製物に製剤化され得る。本開示の所定の態様はまた、医療デバイスのコーティング、局所投与などによる組成物の局所投与が企図される。
【０１３９】
本発明の組成物及び方法は、治療を必要とする個体を治療するために利用され得る。所定の実施形態では、個体は、ヒトなど哺乳動物、または非ヒト哺乳動物である。ヒトなどの動物に投与される場合、組成物または化合物は好ましくは、例えば、本発明の化合物及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物として投与される。薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野でよく知られており、例えば、水もしくは生理学的に緩衝された生理食塩水などの水溶液、またはグリコール、グリセロール、オリーブ油などの油、もしくは注射用有機エステルなどの他の溶媒もしくはビヒクルを含む。好ましい実施形態では、そのような薬学的組成物がヒト投与のため、特に侵襲性投与経路（すなわち、上皮障壁を介した輸送または拡散を回避する注射または埋め込みなどの経路）のためのものである場合、水溶液はパイロジェンを含まないか、または実質的にパイロジェンを含まない。賦形剤は、例えば、薬剤の遅延放出を達成するため、または１つ以上の細胞、組織または臓器を選択的に標的とするために選択され得る。薬学的組成物は、錠剤、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、顆粒、再構成用の凍結乾燥物、粉末、溶液、シロップ、坐剤、注射剤などの投薬単位形態であり得る。組成物はまた、経皮送達系、例えば、皮膚パッチ中に存在し得る。組成物はまた、ローション、クリーム、または軟膏などの局所投与に好適な溶液中に存在し得る。
【０１４０】
薬学的に許容可能な担体は、例えば、本発明の化合物などの化合物を安定化するため、その溶解性を増大させるため、またはその吸収を増大させるために作用する生理学的に許容可能な薬剤を含有し得る。そのような生理学的に許容可能な薬剤には、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる。生理学的に許容可能な薬剤を含む薬学的に許容可能な担体の選択は、例えば、組成物の投与経路に依存する。調製物または薬学的組成物は、自己乳化性薬物送達系または自己微小乳化性薬物送達系であり得る。薬学的組成物（調製物）はまた、リポソームまたは他のポリマーマトリックスであり得、それには、例えば、本発明の化合物が組み込まれていてよい。リポソーム、例えば、リン脂質または他の脂質を含むリポソームは、製造及び投与が比較的簡易である非毒性の生理学的に許容可能な代謝可能な担体である。
【０１４１】
語句「薬学的に許容可能な」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適なそれらの化合物、材料、組成物、及び／または投薬形態を指すために本明細書で用いられる。
【０１４２】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分との適合し、患者に害を与えないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として機能し得る材料の例には：（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース、及びその誘導体；（４）粉末のトラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロゲン非含有水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；ならびに（２１）薬学的製剤に用いられる他の非毒性適合性物質が含まれる。
【０１４３】
薬学的組成物（調製物）は、例えば、経口（例えば、水性もしくは非水性の溶液または懸濁液中のようなドレンチ、錠剤、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト）；口腔粘膜を介した吸収（例えば、舌下）；皮下；経皮（例えば、皮膚に適用されるパッチとして）；ならびに局所（例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏または噴霧剤として）を含む多数の投与経路のいずれかによって対象に投与され得る。化合物はまた、吸入用に製剤化され得る。所定の実施形態では、化合物は簡易に、滅菌水に溶解または懸濁され得る。適切な投与経路及びそれに好適な組成物の詳細は、例えば、米国特許第６，１１０，９７３号、第５，７６３，４９３号、第５，７３１，０００号、第５，５４１，２３１号、第５，４２７，７９８号、第５，３５８，９７０号及び第４，１７２，８９６号、ならびにそれに引用される特許で見ることができる。
【０１４４】
製剤は好都合には、単位投薬形態中に存在し得、薬学の技術分野でよく知られている任意の方法によって調製され得る。単一の投薬形態を製造するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変わる。単一の投薬形態を製造するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は一般に、治療効果をもたらす化合物のその量となる。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【０１４５】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明の化合物などの活性化合物を、担体及び、任意に、１つ以上の付属成分と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、本発明の化合物を液体担体、もしくは細分化された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に関連させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
【０１４６】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、カシェット、丸剤、錠剤、ロゼンジ（香味ベース、通常はスクロース及びアカシアまたはトラガカントを使用する）、凍結乾燥物、粉末、顆粒の形態、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルションとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、またはトローチ（不活性ベース、例えば、ゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシアを使用する）として、及び／または口腔洗浄剤などとしてであり得、各々は、活性成分として既定量の本発明の化合物を含有する。組成物または化合物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与され得る。
【０１４７】
経口投与のための固体投薬形態（カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）を調製するために、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つ以上の薬学的に許容可能な担体、及び／または以下のいずれかと混合される：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／またはアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、所定のシリケート、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収加速剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレー；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物；（１０）錯化剤、例えば、変性及び非変性シクロデキストリン；ならびに（１１）着色剤。カプセル剤（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、錠剤及び丸剤の場合、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含み得る。類似する種類の固体組成物も、ラクトースまたは乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する軟質及び硬質充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いられ得る。
【０１４８】
錠剤は、任意に１つ以上の付属成分を用いて、圧縮または成形によって製造され得る。圧縮された錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性または分散剤を使用して調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で加湿された粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することによって製造され得る。
【０１４９】
錠剤、及び薬学的組成物の他の固体投薬形態、例えば、糖衣錠、カプセル（スプリンクルカプセル及びゼラチンカプセルを含む）、丸剤及び顆粒は任意に、薬学的製剤化技術においてよく知られている腸溶コーティング及び他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて印付けまたは調製され得る。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために種々の割合でヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／またはマイクロスフェアを使用して、それの中の活性成分の遅延または制御放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって、または使用直前に滅菌水、またはいくつかの他の滅菌注射用媒体に溶解され得る滅菌固体組成物の形態に滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。これらの組成物はまた、不透明化剤を任意に含有し得、それらが消化管の所定部分でのみ、または優先的に、任意に遅延した様式で活性成分（複数可）を放出する組成物のものであり得る。使用され得る埋め込み組成物の例には、高分子物質及びワックスが含まれる。活性成分はまた、適切な場合には上述した賦形剤の１つ以上を用いて、マイクロカプセル化された形態であり得る。
【０１５０】
経口投与に有用な液体投薬形態には、薬学的に許容可能なエマルション、再構成のための凍結乾燥物、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加えて、液体投薬形態は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、シクロデキストリン及びその誘導体、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有し得る。
【０１５１】
経口組成物はまた、不活性希釈剤の他に、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤ならびに防腐剤などのアジュバントを含み得る。
【０１５２】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁剤を含有し得る。
【０１５３】
局所または経皮投与のための投薬形態には、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容可能な担体、及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝液、または推進剤と混合され得る。
【０１５４】
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、活性化合物に加えて、賦形剤、例えば動物性及び植物性の脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含有し得る。
【０１５５】
粉末及び噴霧剤は、活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。噴霧剤は、慣用の推進剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素及び揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタン及びプロパンを追加的に含有し得る。
【０１５６】
経皮パッチは、本発明の化合物の身体への制御された送達を提供するという付加的な利点を有する。そのような投薬形態は、活性化合物を適切な媒体に溶解または分散させることによって製造され得る。吸収増強剤はまた、皮膚を横断する化合物の流動を増加させるために使用され得る。そのような流動の速度は、速度制御膜を提供することによって、またはポリマーマトリックスまたはゲル中に化合物を分散させることによって制御され得る。
【０１５７】
本明細書で使用される語句「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内及び胸骨下の注射及び注入を含む。非経口投与に好適な薬学的組成物は、１つ以上の活性化合物を、１つ以上の薬学的に許容可能な滅菌等張性水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末（酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図された受領者の血液と等張にする溶質または懸濁もしくは増粘剤を含有し得る）と組み合わせて含む。
【０１５８】
本発明の薬学的組成物に用いられ得る好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散体の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【０１５９】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗細菌及び抗真菌剤の包含によって確保され得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。また、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によって注射用薬学的形態の吸収を延長がもたらされ得る。
【０１６０】
いくつかの場合では、薬物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、不十分な水溶解性を有する結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは今度は、結晶サイズ及び結晶形態に依存し得る。代替的には、非経口的に投与される薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成される。
【０１６１】
注射用デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に対象化合物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって製造される。ポリマーに対する薬物の比、及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポ注射用製剤はまた、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を封入することによって調製される。
【０１６２】
本発明の方法で使用するため、活性化合物は、それ自体でまたは、例えば、０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する薬学的組成物として与えられ得る。
【０１６３】
導入方法はまた、再装填可能なまたは生分解性のデバイスによって提供され得る。様々な遅延放出ポリマーデバイスが、近年、タンパク質性バイオ医薬品を含む薬物の制御放出のために開発され、インビボで試験されてきた。生分解性及び非分解性ポリマーの両方を含む様々な生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）は、特定の標的部位での化合物の持続放出のための埋め込み物を形成するために使用され得る。
【０１６４】
薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性にならないように、特定の患者、組成物、及び投与様式にとって所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように変化し得る。
【０１６５】
投薬量
選択される投薬量レベルは、用いられる特定の化合物もしくは化合物の組み合わせ、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物（複数可）の排泄速度、治療期間、用いられる特定の化合物（複数可）と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態及び先行病歴、ならびに医学分野でよく知られている類似の要因を含む様々な要因に依存する。
【０１６６】
所定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも０．１％の治療剤または診断剤などの活性剤を含み得る。他の実施形態では、活性剤は、単位の重量の約２％〜約７５％、または、例えば、約２５％〜約６０％、及びそれらで誘導可能な任意の範囲を構成し得る。実施形態では、組成物は、経口投与される。実施形態では、組成物は、舌下投与される。他の非限定的な例では、用量はまた、投与当たり約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、及びそれらで誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書で列挙された数値からの誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が投与され得る。
【０１６７】
当該技術分野で通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の治療的有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルで薬学的組成物または化合物の投薬を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることができるであろう。「治療的有効量」とは、所望の治療効果を誘発するのに十分な化合物の濃度を意味する。化合物の有効量は、対象の体重、性別、年齢、病歴に応じて変化することが一般的に理解される。有効量に影響を与える他の要因には、患者の病態の重症度、治療される障害、化合物の安定性、及び所望の場合には、本発明の化合物と共に投与される別の種類の治療剤が含まれるがこれらに限定されない。より多い総用量が、薬剤の複数回の投与によって送達され得る。有効性及び投薬量を決定するための方法は、当業者に知られている（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３  ｅｄ．，１８１４−１８８２、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６８】
一般に、本発明の組成物及び方法において使用される活性化合物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最小用量である化合物の量である。そのような有効用量は一般に、上述した要因に依存する。
【０１６９】
所望の場合、活性化合物の有効１日用量は、１日を通して適切な間隔で別々に投与される１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の副次用量として、任意に、単位投薬形態で投与され得る。本発明の所定の実施形態では、活性化合物は、１日２回または３回投与され得る。好ましい実施形態では、活性化合物は、１日１回投与される。
【０１７０】
この治療を受ける患者は、霊長類、特にヒト；及び他の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、及びイヌ；家禽；及び一般的なペットを含む、必要としている任意の動物である。
【０１７１】
薬学的組成物及び製剤の投薬量は、製剤の種類に依存し、対象のサイズ及び健康状態に応じて変化する。様々な組み合わせ及び投薬量が企図され、本発明の範囲内であり、「有効用量」、「治療的有効用量」、「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」組成物の範囲内であり、例えば、例として、エルロチニブでは１〜２５０ｍｇ及びイダサヌトリンでは５０〜４５０ｍｇの任意の投薬量である。いくつかの実施形態では、対象には、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５ｍｇのエルロチニブが投与される。いくつかの実施形態では、対象には、５０ｍｇ〜４５０ｍｇの任意の用量のイダサヌトリンが投与される。いくつかの実施形態では、対象には、１００または１５０ｍｇのイダサヌトリンが投与される。本明細書に記載の方法及び組成物に従った他の治療剤の投薬量は、医学界で知られている。語句「有効用量」、「治療的有効用量」、「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」は、動物、またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー性、または他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
【０１７２】
所定の実施形態では、ヒト成人（体重およそ７０キログラム）の場合、約０．１ｍｇ〜約３０００ｍｇ（すべての値及びその間の範囲を含む）、または約５ｍｇ〜約１０００ｍｇ（すべての値及びその間の範囲を含む）、または約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ（すべての値及びその間の範囲を含む）の化合物が投与される。これらの投薬量の範囲は例示に過ぎないこと、及び当業者に知られている要因に応じて投与が調整され得ることが理解される。
【０１７３】
製剤化では、溶液は、投薬製剤と適合する手法で、治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、上述した舌下、バッカル、及び経皮製剤などの様々な投薬形態で容易に投与される。治療用組成物または予防用組成物の有効量は、意図された目的に基づいて決定される。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象における使用に好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路及びレジメンに関連して上記で論述した所望の反応をもたらすように計算された組成物の既定量を含有する。投与される量は、処置の数及び単位用量の両方に応じて、所望とされる結果及び／または保護に依存する。組成物の正確な量も実行者の判断に依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす要因には、対象の身体的及び臨床的状態、投与経路、意図された治療の目的（症状の緩和対治癒）、ならびに特定の組成物の効力、安定性、及び毒性が含まれる。
【０１７４】
所定の実施形態では、対象には、エルロチニブが約、少なくとも約、または多くとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５２５、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５７５、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６２５、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７２５、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７７５、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８２５、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８７５、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９２５、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９７５、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００ミリグラム（ｍｇ）またはマイクログラム（ｍｃｇ）またはμｇ／ｋｇまたはマイクログラム／ｋｇ／分またはｍｇ／ｋｇ／分またはマイクログラム／ｋｇ／時またはｍｇ／ｋｇ／時、またはそれらで誘導可能な任意の範囲の量で投与される。
【０１７５】
用量は、必要な場合にまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、もしくは２４時間（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）毎にまたは１日当たり１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９回（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）投与され得る。用量は、病態の徴候の前または後に最初に投与され得る。いくつかの実施形態では、患者には、第１の用量のレジメンが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）毎または患者が病態の徴候または症状を経験するかまたは示してから１、２、３、４、もしくは５日後（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）に投与される。患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上の日数（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）または病態の症状が消失もしくは低減するまでまたは症状が消失もしくは低減してから６、１２、１８、もしくは２４時間後もしくは１、２，３、４もしくは５時間後まで治療され得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、対象の治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、及び５週間毎または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月毎に繰り返され得る。
【０１７７】
患者には、本明細書に記載の単一の化合物または化合物の組み合わせが約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｍｇ／ｋｇ（またはそれらで誘導可能な任意の範囲）、少なくともこれら、または多くともこれらの量で投与され得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤は、同じ組成物で投与される。他の実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３は、別々の組成物で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及び細胞質ｐ５３安定化剤は、互いに２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間以内もしくは３０分以内またはそれらの間の時間または分の任意の部分以内で投与される。またさらなる実施形態では、グルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤は、同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、グルコース代謝阻害剤及びｐ５３安定化剤は、併用して投与される。
【０１７９】
併用療法
所定の実施形態では、本発明の化合物は、単独で使用され得るか、または別の種類の治療剤と併用して投与され得る。
【０１８０】
所定の実施形態では、本開示の方法は、化学療法、治療剤、がん性細胞の外科的除去、放射線療法、及びそれらの組み合わせなどの追加の療法と組み合わせて使用される。いくつかの態様では、治療レジメンは、化学療法、治療剤、がん性細胞の外科的除去及び／または放射線療法のうちの１つ以上を除外する。同時に投与される場合、併用がん療法は、単一の製剤でまたは別々の製剤で投与され得、別々の場合、次いで任意に、異なる投与様式による。
【０１８１】
さらなる実施形態では、療法的治療剤の組み合わせががん細胞に投与される。治療剤は、順次（互いに数分、数時間、または数日以内に）または並行して投与され得る；それらはまた、事前混合された単一の組成物で患者に投与され得る。
【０１８２】
複数の抗がん手段、薬剤または化合物（またはそのような薬剤及び／または化合物の組み合わせ）の様々な組み合わせが用いられ得、例えば、第１の抗がん手段、薬剤または化合物が「Ａ」であり、抗がん療法レジームの一部として与えられる第２の抗がん手段、薬剤または化合物（またはそのような手段、薬剤及び／または化合物の組み合わせ）が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１８３】
治療的化合物または薬剤の患者への投与は、もし存在する場合には、療法の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的プロトコルに従う。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されるであろうことが予想される。また、様々な標準的な治療、及び外科的介入が、記載される療法と組み合わせて適用され得ることが企図される。
【０１８４】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されてきた放射線療法には、γ線、Ｘ線として一般的に知られているもの、及び／または腫瘍細胞への放射性同位体の直接的送達が含まれる。マイクロ波及びＵＶ照射などのＤＮＡ損傷因子の他の形態も企図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製及び修復に対して、ならびに染色体の集合及び維持に対して広い範囲の損傷をもたらす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）で５０〜２００レントゲンの１日線量〜２０００〜６０００レントゲンの単回線量の範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１８５】
代替的ながん療法には、免疫療法、標的療法、遺伝子療法、またはそれらの組み合わせなどの、手術、化学療法及び放射線療法以外の任意のがん療法が含まれる。本方法を使用して予後不良と確認された対象は、従来の治療（複数可）単独では良好な応答を有しない場合があり、１つ以上の代替的ながん療法がそれ自体でまたは１つの以上の従来の治療と組み合わせて処方または適用され得る。
【０１８６】
薬学的に許容可能な塩
本開示は、本発明の組成物及び方法において、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩の使用を含む。所定の実施形態では、本発明の企図される塩には、アルキル、ジアルキル、トリアルキルまたはテトラアルキルアンモニウム塩が含まれるがこれらに限定されない。所定の実施形態では、本発明の企図される塩には、Ｌ−アルギニン、ベネンタミン、ベンザチン、ベタイン、水酸化カルシウム、コリン、デアノール、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、２−（ジエチルアミノ）エタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、ヒドラバミン、１Ｈ−イミダゾール、リチウム、Ｌ−リシン、マグネシウム、４−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン、ピペラジン、カリウム、１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジン、ナトリウム、トリエタノールアミン、トロメタミン、及び亜鉛塩が含まれるがこれらに限定されない。所定の実施形態では、本発明の企図される塩には、Ｎａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｚｎまたは他の金属塩が含まれるがこれらに限定されない。所定の実施形態では、本発明の企図される塩には、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、２，２−ジクロロ酢酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−オキソグルタル酸、４−アセトアミド安息香酸、４−アミノサリチル酸、酢酸、アジピン酸、ｌ−アスコルビン酸、ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、（＋）−カンファー酸、（＋）−カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸（デカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、カルボン酸、桂皮酸、クエン酸、シクラム酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、ｄ−グルコヘプトン酸、ｄ−グルコン酸、ｄ−グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、ヒプール酸、臭化水素酸、塩酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、ｌ−リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、及びウンデシレン酸塩が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８７】
薬学的に許容可能な酸付加塩はまた、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミドなどとの様々な溶媒和物として存在し得る。そのような溶媒和物の混合物も調製され得る。そのような溶媒和物源は、調製もしくは結晶化の溶媒に固有であるか、またはそのような溶媒に偶発的である結晶化の溶媒に由来し得る。
【０１８８】
湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味、香味及び芳香剤、防腐剤ならびに酸化防止剤も組成物中に存在し得る。
【０１８９】
薬学的に許容可能な酸化防止剤の例には：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。
【０１９０】
定義
本明細書で別段定義されない限り、本出願で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される化学、細胞及び組織培養、分子生物学、細胞及びがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬理学、遺伝学ならびにタンパク質及び核酸化学に関連して使用される命名法、及びそれらの技術は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。
【０１９１】
本開示の方法及び技術は一般に、別段示されない限り、当該技術分野でよく知られている従来の方法に従って、及び本明細書を通して引用及び論述される様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，“Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，７ｔｈ  ｅｄ．”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；及びＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．”，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）を参照されたい。
【０１９２】
本明細書で使用される化学用語は、別段定義されない限り、“Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ”，Ｐａｒｋｅｒ  Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ．Ａ．（１９８５）に例示されているように、当該技術分野における従来の使用法に従って使用される。
【０１９３】
上記のものすべて、ならびに本出願で言及される任意の他の刊行物、特許及び公開された特許出願は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。矛盾する場合は、その特定の定義を含む本明細書が優先する。
【０１９４】
用語「薬剤」は、化学的化合物（有機または無機化合物、化学的化合物の混合物など）、生体高分子（核酸、抗体（その部分ならびにヒト化、キメラ及びヒト抗体及びモノクローナル抗体を含む）、タンパク質またはその一部、例えば、ペプチド、脂質、炭水化物など）、または細菌、植物、真菌、もしくは動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製された抽出物を意味するために本明細書で使用される。薬剤には、例えば、構造が知られている薬剤、及び構造が知られていないものが含まれる。
【０１９５】
「患者」、「対象」、または「個体」は、互換的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、哺乳動物、例えばヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタなどを含む）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。
【０１９６】
病態または患者を「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るための工程を行うことを指す。本明細書で使用される場合、また、当該技術分野でよく理解されるように、「治療」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床結果には、１つ以上の症状または病態の緩和または改善、疾患の範囲の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の広がりの防止、疾患の進行の遅延または遅化、疾患の状態の改善または軽減、ならびに検出可能または検出不可能にかかわらない寛解（部分的または全体的にかかわらない）が含まれ得るがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを意味し得る。
【０１９７】
用語「予防すること」は、当該技術分野で認識されており、局所再発などの病態（例えば、疼痛）、がんなどの疾患、心不全などの症候群合併症または任意の他の医学的病態などの病態に関連して使用される場合、当該技術分野でよく理解されており、組成物が投与されてない対象と比較して、対象における医学的病態の症状の頻度を低減するか、またはその発症を遅延させる組成物の投与を含む。それ故、がんの予防には、例えば、未治療の対照集団と比較して、予防的治療を受けている患者の集団における検出可能ながん性成長の数を低減すること、及び／または未治療の対照集団に対して、治療された集団における検出可能ながん性成長の出現を、例えば、統計的及び／または臨床的に有意な量だけ遅延させることが含まれる。
【０１９８】
物質、化合物または薬剤を対象に「投与すること」または「投与」は、当業者に知られている様々な方法のうちの１つを使用して行われ得る。例えば、化合物または薬剤は、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼内、舌下、経口（摂取による）、経鼻（吸入による）、脊髄内、脳内、及び経皮（例えば、皮膚管を介する吸収による）で投与され得る。化合物または薬剤はまた、再装填可能なまたは生分解性のポリマーデバイスもしくは他のデバイス、例えば、パッチ及びポンプ、または化合物もしくは薬剤の放出の延長、遅延もしくは制御を提供する製剤によって適切に導入され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回、及び／または１回以上の延長された期間にわたって実施され得る。
【０１９９】
物質、化合物または薬剤を対象に投与する適切な方法はまた、例えば、対象の年齢及び／または身体状態、ならびに化合物もしくは薬剤の化学的及び生物学的特性（例えば、溶解性、消化吸収性、生物学的利用能、安定性及び毒性）に依存する。いくつかの実施形態では、化合物または薬剤は、例えば、対象への摂取によって経口投与される。いくつかの実施形態では、経口投与される化合物または薬剤は、延長放出もしくは遅延放出製剤中にあるか、またはそのような遅延もしくは延長放出のためのデバイスを使用して投与される。
【０２００】
本明細書で使用される場合、語句「併用投与」は、先に投与された治療薬剤がまだ身体内で有効である間に第２の薬剤が投与されるような２つ以上の異なる治療薬剤の投与の任意の形態を指す（例えば、２つの薬剤が患者において同時に有効であり、これは２つの薬剤の相乗効果を含み得る）。例えば、異なる治療化合物は、同じ製剤または別々の製剤のいずれかで、同時または順次のいずれかで投与され得る。それ故、そのような治療を受ける個体は、異なる治療薬剤の組み合わされた効果から利益を受け得る。
【０２０１】
薬物または薬剤の「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、対象に投与された場合に、意図された治療効果を有する薬物または薬剤の量である。完全な治療効果は、必ずしも１回の用量の投与によって生じるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。それ故、治療的有効量は、１回以上の投与で投与され得る。対象に必要とされる正確な有効量は、例えば、対象のサイズ、健康状態及び年齢、ならびにがんまたはＭＤＳなどの治療される病態の性質及び程度に依存する。当業者は、日常的な実験によって所与の状況のための有効量を容易に決定し得る。
【０２０２】
用語「アシル」は、当該技術分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）−、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）−によって表される基を指す。
【０２０３】
用語「アシルアミノ」は、当該技術分野で認識されており、アシル基で置換されたアミノ基を指し、例えば、式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）ＮＨ−によって表され得る。
【０２０４】
用語「アシルオキシ」は、当該技術分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）Ｏ−、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）Ｏ−によって表される基を指す。
【０２０５】
用語「アルコキシ」は、アルキル基に結合した酸素を有するそのアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。
【０２０６】
用語「アルコキシアシル」は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を指し、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表され得る。
【０２０７】
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を指す。好ましい実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に３０個以下、より好ましくは２０個以下の炭素原子（例えば、直鎖の場合はＣ１−３０、分岐鎖の場合はＣ３−３０）を有する。
【０２０８】
その上、本明細書、実施例、及び特許請求の範囲を通して使用される用語「アルキル」は、非置換及び置換アルキル基の両方を含むことが意図されており、その後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素原子上で水素を置き換える置換基を有するアルキル部分を指し、それには、トリフルオロメチル及び２，２，２−トリフルオロエチルなどのハロアルキル基が含まれる。
【０２０９】
用語「Ｃｘ−ｙ」または「Ｃｘ−Ｃｙ」は、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシなどの化学的部分と併せて使用される場合、鎖内にｘ〜ｙ個の炭素を含有する基を含むことを意味する。Ｃ０アルキルは、基が末端位置にある場合は水素、内部の場合は結合を示す。Ｃ１−６アルキル基は、例えば、鎖内に１〜６個の炭素原子を含有する。
【０２１０】
用語「アルキルアミノ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１個のアルキル基で置換されたアミノ基を指す。
【０２１１】
用語「アルキルチオ」は、本明細書で使用される場合、アルキル基で置換されたチオール基を指し、一般式アルキルＳ−によって表され得る。
【０２１２】
用語「アミド」は、本明細書で使用される場合、基
【化１８】
2020536855.tif 000030
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表すか、またはＲ９及びＲ１０は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、環構造に４個〜８個の原子を有する複素環を完成させる）を指す。
【０２１３】
用語「アミン」及び「アミノ」は、当該技術分野で認識されており、非置換及び置換の両方のアミンならびにその塩、例えば、
【化１９】
2020536855.tif 000031
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１０’は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表すか、またはＲ９及びＲ１０は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、環構造に４個〜８個の原子を有する複素環を完成させる）によって表され得る部分を指す。
【０２１４】
用語「アミノアルキル」は、本明細書で使用される場合、アミノ基で置換されたアルキル基を指す。
【０２１５】
用語「アラルキル」は、本明細書で使用される場合、アリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２１６】
用語「アリール」は、本明細書で使用される場合、置換または非置換単環芳香族基であって、環の各原子が炭素であるものを指す。好ましくは、環は、５〜７員環、より好ましくは６員環である。用語「アリール」にはまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通している２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、環の少なくとも１つが芳香族であり、例えば、他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得るものが含まれる。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。
【０２１７】
用語「カルバメート」は、当該技術分野で認識されており、基
【化２０】
2020536855.tif 000032
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素またはヒドロカルビル基を表す）を指す。
【０２１８】
用語「カルボシクリルアルキル」は、本明細書で使用される場合、炭素環基で置換されたアルキル基を指す。
【０２１９】
用語「炭素環」、「カルボシクリル」、及び「炭素環式」は、本明細書で使用される場合、非芳香族飽和または不飽和環であって、環の各原子が炭素であるものを指す。好ましくは、炭素環式環は、３〜１０個の原子、より好ましくは５〜７個の原子を含有する。
【０２２０】
用語「カルボシクリルアルキル」は、本明細書で使用される場合、炭素環基で置換されたアルキル基を指す。
【０２２１】
用語「カルボネート」は、当該技術分野で認識されており、基−ＯＣＯ２−によって表される基を指す。
【０２２２】
用語「カルボキシ」は、本明細書で使用される場合、式−ＣＯ２Ｈによって表される基を指す。
【０２２３】
用語「エステル」は、本明細書で使用される場合、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９（式中、Ｒ９は、ヒドロカルビル基を表す）を指す。
【０２２４】
用語「エーテル」は、本明細書で使用される場合、酸素を介して別のヒドロカルビル基に連結したヒドロカルビル基を指す。したがって、ヒドロカルビル基のエーテル置換基は、ヒドロカルビル−Ｏ−であり得る。エーテルは、対称または非対称のいずれかであり得る。エーテルの例には、複素環−Ｏ−複素環及びアリール−Ｏ−複素環が含まれるがこれらに限定されない。エーテルには、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表され得る「アルコキシアルキル」基が含まれる。
【０２２５】
用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含む。
【０２２６】
用語「ヘタラルキル」及び「ヘテロアラルキル」は、本明細書で使用される場合、ヘタリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２２７】
用語「ヘテロアリール」及び「ヘタリール」には、置換または非置換芳香族単環構造、好ましくは５〜７員環、より好ましくは５〜６員環であって、その環構造が、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、より好ましくは１または２個のヘテロ原子を含むものが含まれる。用語「ヘテロアリール」及び「ヘタリール」にはまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通している２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、環の少なくとも１つがヘテロ芳香族であり、例えば、他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得るものが含まれる。ヘテロアリール基には、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、及びピリミジンなどが含まれる。
【０２２８】
用語「ヘテロ原子」は、本明細書で使用される場合、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄である。
【０２２９】
用語「ヘテロシクリルアルキル」は、本明細書で使用される場合、複素環基で置換されたアルキル基を指す。
【０２３０】
用語「ヘテロシクリル」、「複素環」、及び「複素環式」は、置換または非置換非芳香族環構造、好ましくは３〜１０員環、より好ましくは３〜７員環であって、その環構造が、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、より好ましくは１または２個のヘテロ原子を含むものを指す。用語「ヘテロシクリル」及び「複素環式」にはまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通している２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、環の少なくとも１つが複素環式であり、例えば、他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得るものが含まれる。ヘテロシクリル基には、例えば、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタムなどが含まれる。
【０２３１】
用語「ヒドロカルビル」は、本明細書で使用される場合、＝Ｏまたは＝Ｓ置換基を有さず、典型的には少なくとも１つの炭素−水素結合及び主に炭素の骨格を有するが、任意にヘテロ原子を含み得る炭素原子を介して結合した基を指す。それ故、メチル、エトキシエチル、２−ピリジル、及びさらにはトリフルオロメチルなどの基は、本出願の目的のためにヒドロカルビルであると考えられるが、アセチル（連結炭素上に＝Ｏ置換基を有する）及びエトキシ（炭素ではなく酸素を介して連結されている）などの置換基はそうではない。ヒドロカルビル基には、アリール、ヘテロアリール、炭素環、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【０２３２】
用語「ヒドロキシアルキル」は、本明細書で使用される場合、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基を指す。
【０２３３】
用語「低級」は、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシなどの化学的部分と組み合わせて使用される場合、置換基中の原子が１０個以下、好ましくは６個以下である基を含むことを意味する。「低級アルキル」は、例えば、１０個以下、好ましくは６個以下の炭素原子を含有するアルキル基を指す。所定の実施形態では、本明細書で定義されるアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシ置換基は、それらが単独で現れるかまたはヒドロキシアルキル及びアラルキル（この場合、例えば、アリール基内の原子は、アルキル置換基内の炭素原子をカウントする場合にカウントされない）という記述のように他の置換基と組み合わせて現れるかにかかわらず、それぞれ低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、または低級アルコキシである。
【０２３４】
用語「ポリシクリル」、「多環」、及び「多環式」は、２つ以上の原子が２つの隣接する環に共通である２つ以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリル）を指し、例えば、環は「融合環」である。多環の環の各々は、置換または非置換であり得る。所定の実施形態では、多環の各環は、環に３〜１０個、好ましくは５〜７個の原子を含有する。
【０２３５】
用語「スルフェート」は、当該技術分野で認識されており、基−ＯＳＯ３Ｈ、またはその薬学的に許容可能な塩を指す。
【０２３６】
用語「スルホンアミド」は、当該技術分野で認識されており、一般式
【化２１】
2020536855.tif 000033
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素またはヒドロカルビルを表す）によって表される基を指す。
【０２３７】
用語「スルホキシド」は、当該技術分野で認識されており、基−Ｓ（Ｏ）−を指す。
【０２３８】
用語「スルホネート」は、当該技術分野で認識されており、基ＳＯ３Ｈ、またはその薬学的に許容可能な塩を指す。
【０２３９】
用語「スルホン」は、当該技術分野で認識されており、基−Ｓ（Ｏ）２−を指す。
【０２４０】
用語「置換された」は、骨格の１つ以上の炭素上の水素に置き換わる置換基を有する部分を指す。「置換」または「で置換された」は、そのような置換が、置換された原子及び置換基の許容される価数に従い、置換が安定な化合物、例えば、例として再配列、環化、脱離などによる転換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の条件を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが企図される。広い態様では、許容される置換基には、有機化合物の非環状及び環状、分岐及び非分岐、炭素環式及び複素環式、芳香族及び非芳香族の置換基が含まれる。許容可能な置換基は、１つ以上であり得、適切な有機化合物にとって同じであり得るかまたは異なり得る。本発明の目的のため、窒素などのヘテロ原子は、水素置換及び／またはヘテロ原子の原子価を満足する本明細書に記載の有機化合物の任意の許容可能な置換基を有し得る。置換基には、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアナシルなど）、チオカルボニル（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートなど）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切な場合には、それら自体が置換され得ることは当業者によって理解される。
【０２４１】
用語「チオアルキル」は、本明細書で使用される場合、チオール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２４２】
用語「チオエステル」は、本明細書で使用される場合、基−Ｃ（Ｏ）ＳＲ９または−ＳＣ（Ｏ）Ｒ９
（式中、Ｒ９は、ヒドロカルビルを表す）を指す。
【０２４３】
用語「チオエーテル」は、本明細書で使用される場合、酸素が硫黄で置き換えられたエーテルに相当する。
【０２４４】
用語「ウレア」は、当該技術分野で認識されており、一般式
【化２２】
2020536855.tif 000034
（式中、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素またはヒドロカルビルを表す）によって表され得る。
【０２４５】
本明細書で使用される用語「調節する」は、機能または活性（細胞増殖など）の阻害または抑制及び機能または活性の増強を含む。
【０２４６】
語句「薬学的に許容可能な」は、当該技術分野で認識されている。所定の実施形態では、その用語には、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な組成物、賦形剤、アジュバント、ポリマー及び他の材料及び／または投薬形態が含まれる。
【０２４７】
「薬学的に許容可能な塩」は、患者の治療に好適であるかまたは適合する酸付加塩または塩基付加塩を指すために本明細書で使用される。
【０２４８】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な酸付加塩」は、式Ｉによって表される任意の塩基化合物の任意の非毒性の有機または無機塩を意味する。好適な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウム及び硫酸水素カリウムなどの金属塩が含まれる。好適な塩を形成する例示的な有機酸には、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸及びサリチル酸などのモノ、ジ、及びトリカルボン酸、ならびにｐ−トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸などのスルホン酸が含まれる。モノまたはジ酸塩のいずれかが形成され得、そのような塩は、水和、溶媒和または実質的に無水形態のいずれかで存在し得る。一般に、式Ｉの化合物の酸付加塩は、水及び様々な親水性有機溶媒により可溶であり、一般に、それらの遊離塩基形態と比較してより高い融点を示す。適切な塩の選択は当業者に知られる。他の薬学的に許容可能ではない塩、例えば、オキサレートは、例えば、実験室での使用のための式Ｉの化合物の単離において、またはその後の薬学的に許容可能な酸付加塩への変換のために使用され得る。
【０２４９】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な塩基付加塩」は、式Ｉによって表される任意の酸化合物またはそれらの中間体のいずれかの任意の非毒性の有機または無機の塩基付加塩を意味する。好適な塩を形成する例示的な無機塩基には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、または水酸化バリウムが含まれる。好適な塩を形成する例示的な有機塩基には、メチルアミン、トリメチルアミン及びピコリンなどの脂肪族、脂環式、もしくは芳香族有機アミンまたはアンモニアが含まれる。適切な塩の選択は、当業者に知られる。
【０２５０】
本開示の方法及び組成物において有用な化合物の多くは、それらの構造中に少なくとも１つの立体中心を有する。この立体中心は、ＲまたはＳ構成で存在し得、前記Ｒ及びＳ表記は、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），４５，１１−３０に記載の規則に従って使用される。本開示は、化合物のエナンチオ及びジアステレオ異性体の形態、その塩、プロドラッグまたは混合物などのすべての立体異性体の形態（すべてのあり得る立体異性体の混合物を含む）を企図している。例えば、ＷＯ０１／０６２７２６を参照されたい。
【０２５１】
さらに、アルケニル基を含有する所定の化合物は、Ｚ（ツザンメン（ｚｕｓａｍｍｅｎ））またはＥ（エントゲーゲン（ｅｎｔｇｅｇｅｎ））異性体として存在し得る。各場合において、本開示は、混合物及び別々の個々の異性体の両方を含む。
【０２５２】
化合物の一部はまた、互変異性形態で存在し得る。そのような形態は、本明細書に記載の式で明示的に示されていないが、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。
【０２５３】
「プロドラッグ」または「薬学的に許容可能なプロドラッグ」は、本開示の化合物（例えば、式Ｉの化合物）を形成するために投与後に宿主において代謝される、例えば、加水分解または酸化される化合物を指す。プロドラッグの典型的な例には、活性化合物の機能性部分上に生物学的に不安定なまたは開裂可能な（保護）基を有する化合物が含まれる。プロドラッグには、活性化合物を生成するために、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、脱水酸化、加水分解、脱加水分解、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、または脱リン酸化され得る化合物が含まれる。生物学的に不安定なまたは開裂可能な（保護）基としてエステルまたはホスホロアミデートを使用するプロドラッグの例は、米国特許第６，８７５，７５１号、第７，５８５，８５１号、及び第７，９６４，５８０号に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のプロドラッグは、代謝されて式Ｉの化合物を生成する。本開示は、その範囲内に、本明細書に記載の化合物のプロドラッグを含む。好適なプロドラッグの選択及び調製のための従来の手順は、例えば、“Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載されている。
【０２５４】
本明細書で使用される語句「薬学的に許容可能な担体」は、医薬的または治療的使用のための薬物を製剤化するのに有用な液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。
【０２５５】
本明細書で使用される用語「溶解性のＬｏｇ」、「ＬｏｇＳ」または「ｌｏｇＳ」は、化合物の水溶解性を定量化するために当該技術分野で使用される。化合物の水溶解性は、その吸収及び分布特徴に有意に影響を及ぼす。低い溶解性はしばしば、不十分な吸収となる。ＬｏｇＳ値は、ｍｏｌ／リットルで測定される溶解性の単位のない対数（底１０）である。
【０２５６】
本明細書に記載の化合物には、本発明の化合物のすべての好適な同位体変動を含む。本発明の化合物の同位体変動は、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有するが、自然界に通常または優勢的に見られる原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって置き換えられているものとして定義される。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素の同位体、例えば、それぞれ、２Ｈ（重水素）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、３３Ｓ、３４Ｓ、３５Ｓ、３６Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２９Ｉ及び１３１Ｉが含まれる。したがって、「水素」または「Ｈ」の記述は、別段特定されない限り、１Ｈ（プロチウム）、２Ｈ（重水素）、及び３Ｈ（トリチウム）を包含することが理解されるべきである。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、「発現の増加」、「発現のレベルの増加」、「発現の上昇」、「発現の減少」、または「発現のレベルの減少」は、参照レベルまたは対照と比較した、対象の試料中のグルコース取り込みなどのバイオマーカーの発現レベルを指す。所定の態様では、参照レベルは、同じ対象からの非がん性組織からの発現の参照レベルであり得る。代替的には、参照レベルは、異なる対象または対象の群からの発現の参照レベルであり得る。例えば、発現の参照レベルは、がんを有さない対象もしくは対象の群の試料（例えば、組織、体液または細胞試料）から得られる発現レベル、またはがんを有する対象もしくは対象の群の非がん性組織から得られる発現レベルであり得る。参照レベルは、単一の値であり得るか、または値の範囲であり得る。発現の参照レベルは、当業者に知られている任意の方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、参照レベルは、がんを有するまたはがんを有さない対象のコホートから決定される発現の平均レベルである。参照レベルはまた、グラフ上の領域としてグラフで示され得る。所定の実施形態では、参照レベルは、正規化されたレベルである。
【０２５８】
「約」及び「およそ」は一般に、測定の性質または精度を考慮して測定された量の許容可能な誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所要の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。代替的には、及び特に生物学的システムにおいて、用語「約」及び「およそ」は、一桁以内、好ましくは所与の値の５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で論述される数値は、用語「約」または「およそ」を用いて使用され得る。
【０２５９】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、所定の実施形態では、遺伝子産物または機能性タンパク質を指す場合に、本明細書で互換的に使用される。しかしながら、これらの用語は、その使用法に限定されず、所定の実施形態では、当該技術分野においてそれらの許容される意味を伝える。
【０２６０】
用語「減弱すること」、「改善すること」、「阻害すること」、もしくはは「低減すること」またはこれらの用語の任意の変化形は、特許請求の範囲及び／または明細書で使用される場合、所望の結果を達成するための任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【０２６１】
用語「阻害剤」は、タンパク質、プロセス（例えば、代謝プロセス）、または生化学的経路の活性または発現を間接的または直接的に阻害する治療薬剤を指す。
【０２６２】
当業者は、試験対象からの発現レベルが、参照レベルと比較して、上昇した発現のレベル、類似する発現のレベルまたは低下した発現のレベルを有すると決定され得ることを理解する。
【０２６３】
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するが、受容体の活性型によって開始される細胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害し得る部位を表す。
【０２６４】
用語「阻害剤」は、タンパク質、プロセス（例えば、代謝プロセス）、または生化学的経路の発現の活性を間接的または直接的に阻害する治療薬剤を指す。
【０２６５】
本明細書で使用される場合、所定の実施形態では、「治療すること」、「治療」または「療法」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。これには：症状の緩和、炎症の減少、がん細胞成長の阻害、及び／または腫瘍サイズの減少が含まれる。いくつかの実施形態では、用語「治療」は、がんを有する対象におけるがん細胞増殖の阻害または低減を指す。さらに、これらの用語は、病態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒及び改善することを包含することが意図されている。例えば、がんの場合、治療に対する反応には、悪液質の低減、生存時間の増加、腫瘍進行までの時間の延長、腫瘍質量の低減、腫瘍負荷の低減及び／または腫瘍転移までの時間、腫瘍再発、腫瘍反応、完全反応、部分反応、安定疾患、進行疾患、進行のない生存、全生存までの時間の延長が含まれ、それぞれ、新薬の承認のために国立がん研究所及び米国食品医薬品局によって設定された標準によって測定される。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１（７）：１４０４−１４１１を参照されたい。
【０２６６】
所定の実施形態では、用語「薬学的製剤」または「薬学的組成物」は、本明細書に記載の化合物の塩、溶媒和物、及び水和物を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの活性成分を含む組成物または組成物の混合物を意味することが意図されている。
【０２６７】
特許請求の範囲及び／または明細書で用語「含む」と併せて使用される場合の単語  「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、それは「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは１つを超える」の意味にも一致する。
【０２６８】
本出願を通して、所定の実施形態では、用語「約」は、値が、値を決定するために用いられる装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【０２６９】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されないか、または代替物が相互に排他的でない限り、「及び／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物及び「及び／または」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも２番目またはそれ以上のものを意味し得る。
【実施例】
【０２７０】
本発明は、現在一般的に説明されており、本発明の所定の態様及び実施形態を例示する目的のためだけに含まれており、本発明を限定することを意図していない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【０２７１】
実施例１：ＪＧＫシリーズの例示的な化合物の調製
一般手順：すべての反応は、アルゴンの不活性雰囲気下で日常的に行った。別段記述されない限り、材料は商業供給者から入手し、精製せずに使用した。すべての溶媒は、使用直前に標準的技術によって精製し、乾燥させた。ＴＨＦ及びＥｔ２Ｏは、ナトリウム及びベンゾフェノンから新たに蒸留した。塩化メチレン、トルエン、及びベンゼンは、ＣａＨ２で還流することによって精製した。反応は、薄層クロマトグラフィ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ）によって確認した。スポットは、ＵＶライト下で観察することによって、及びｐ−アニスアルデヒド溶液またはホスホモリブデン酸溶液に浸漬した後、焦がして着色することによって検出した。水性後処理では、すべての有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、水ポンプ圧での回転蒸発前に濾過した。粗化合物は、シリカゲル（ＳｉｌｉｃａＦｌａｓｈ  Ｐ６０、２３０−４００メッシュ、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ  Ｉｎｃ）でのカラムクロマトグラフィによって精製した。プロトン（１Ｈ）及び炭素（１３Ｃ）のＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ４００（４００／１００ＭＨｚ）またはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ５００（５００／１２５  ＭＨｚ）分光計で得た。化学シフトは、内部標準としてＭｅ４ＳｉまたはＣＨＣｌ３を用いてｐｐｍ単位で報告される。分裂パターンは、ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｍ、多重項；ｂ、ブロードによって示されている。高分解能質量分析データは、ＩｏｎＳｅｎｓｅ  ＩＤ−ＣＵＢＥ  ＤＡＲＴ源を有するＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓを使用して得た。
【０２７２】
ＪＧＫ００１、ＪＧＫ００３の調製
【化２３】
2020536855.tif 000035
［ＪＧＫ００１］無水メタノール（５．０ｍＬ）中のエルロチニブ（１３４ｍｇ、０．３４０６ｍｍｏｌ）の溶液にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（２２８ｍｇ、１．７０２９ｍｍｏｌ）を室温で一度に添加した。同じ温度で４８時間  撹拌した後、真空中で濃縮した。反応混合物をＨ２Ｏ（３０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１）によって精製してＪＧＫ００１（１５６ｍｇ、７３％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．８６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２０−７．２３ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．１６ （ｔｄ， Ｊ ＝ １．２， ７．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．１６−４．２５ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．８０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．７７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．４５ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４４ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４４ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．０３ （ｓ， １ Ｈ）， １．５５ （ｓ， ９ Ｈ）， １．１１ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １５２．１， １５１．５， １４９．２， １４８．８， １４５．７， １４２．７， １３０．６， １２８．９， １２７．４， １２５．３， １２２．６， １２１．５， １１４．７， １１１．４， １０８．０， ９０．７， ８３．７， ８３．３， ８２．９， ７６．８， ７０．９， ７０．７， ６８．８， ６８．７， ５９．２， ５９．１， ５５．０， ２８．２， ２７．３；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値６２６．３０６１［Ｃ３３Ｈ４３Ｎ３Ｏ９についての計算値６２５．２９９３］。
【０２７３】
［ＪＧＫ００３］無水エタノール（２．６ｍＬ）中のエルロチニブ（１０１ｍｇ、０．２５６７ｍｍｏｌ）の溶液にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１７２ｍｇ、１．２８３６ｍｍｏｌ）を室温で一度に添加した。同じ温度で４８時間撹拌した後、真空中で濃縮した。反応混合物をＨ２Ｏ（３０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１）によって精製してＪＧＫ００３（１１７ｍｇ、７１％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．８６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２１−７．２４ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．１７−４．２５ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．６１−３．８２ （ｍ， ６ Ｈ）， ３．４６ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４５ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．０２ （ｓ， １ Ｈ）， １．５５ （ｓ， ９ Ｈ）， １．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３ Ｈ）， １．１２ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １５２．０， １５１．４， １４９．２， １４８．９， １４５．５， １４３．０， １３０．８， １２８．８， １２７．３， １２５．３， １２２．５， １２１．７， １１４．７， １１１．３， １０７．９， ８９．３， ８３．７， ８３．２， ８２．８， ７６．７， ７０．９， ７０．７， ６８．８， ６８．６， ６３．０， ５９．２， ５９．１， ２８．２， ２７．４， １４．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値６４０．３２１１［Ｃ３４Ｈ４５Ｎ３Ｏ９についての計算値６３９．３１５０］。
【０２７４】
ＪＧＫ００２の調製
【化２４】
2020536855.tif 000036
エルロチニブ（１６５ｍｇ、０．４１９４ｍｍｏｌ）の固体に無水酢酸（５．０ｍＬ）を添加した。撹拌しながら９０ｏＣ（浴温度）で３日間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で中和し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／１〜１／３）によって精製してＪＧＫ００２（１６１ｍｇ、８８％の単離収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．０６ （ｓ， １ Ｈ，）， ７．４５ （ｔ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， １ Ｈ，）， ７．３７−７．３９ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．３６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３０−７．３４ （ｍ， １ Ｈ）， ７．１５ （ｓ， １ Ｈ）， ４．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ４．１６ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．７９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．４６ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４５ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．０６ （ｓ， １ Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７０．５， １５８．８， １５６．１， １５３．５， １５１．１， １５０．８， １４１．０， １３０．９， １３０．３， １２９．３， １２７．５， １２３．４， １１７．２， １０７．９， １０３．１， ８２．４， ７８．４， ７０．６， ７０．３， ６８．９， ６８．７， ５９．３， ５９．３， ２３．７；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値４３６．１８１１［Ｃ２４Ｈ２５Ｎ３Ｏ５についての計算値４３５．１７８８］。
【０２７５】
ＪＧＫ０１０、ＪＧＫ０３２の調製−アニリン類似体での置換のための一般手順
【化２５】
2020536855.tif 000037
［環化］ＤＭＦ（１３．５ｍＬ、０．２Ｍ）中のジオール２（５３０ｍｇ、２．６９５９ｍｍｏｌ）の溶液に炭酸カリウム（１４９０ｍｇ）を一度に添加し、続いて１−ブロモ−２−クロロエタン（１．３ｍＬ）をＡｒ下で室温で連続して少しずつ添加した。撹拌しながら６０ｏＣ（浴温度）で２４時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）でクエンチした。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６／１〜３／１）によって精製して縮合−クロロキナゾリン３（４０４ｍｇ、６７％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．８４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４７ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４３−４．４５ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３９−４．４２ （ｍ， ２ Ｈ）。［既知化合物；Ｃｈｉｌｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，１８６２−１８６６］
【０２７６】
［ＪＧＫ０１０］ＤＭＦ（２．６ｍＬ）中の縮合−クロロキナゾリン３（１１４ｍｇ、０．５１２０ｍｍｏｌ）の溶液に３−クロロ−２−フルオロアニリン（０．１０ｍＬ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら６０ｏＣ（浴温度）で２４時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、Ｅｔ２Ｏ（３０．０ｍＬ）で希釈して白色の懸濁液を得た。得られた白色の固体をＥｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で連続して洗浄し、収集してＪＧＫ０１０（１４０ｍｇ、８２％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．６８ （ｓ， １ Ｈ）， ８．５９ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ３．２， ６．８， ６．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．１０−７．１８ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３８−４．４３ （ｍ， ４ Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．７８ （ｓ， １ Ｈ）， ８．７９ （ｓ， １ Ｈ）， ８．４５ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３４ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．４６−４．５３ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４０−４．５２ （ｍ， ２ Ｈ） ；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １５９．８， １５４．０， １５２．２， １４９．９， １４５．７， １３５．２， １２９．９， １２８．１， １２６．４， １２５．８， １２０．９， １１１．３， １０８．１， １０５．８， ６５．５， ６４．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３３２．０５５１［Ｃ１６Ｈ１１ＣｌＦＮ３Ｏ２についての計算値３３１．０５１８］。
【０２７７】
ＪＧＫ００５の調製
【化２６】
2020536855.tif 000038
ＣＨ３ＣＮ（２．０ｍＬ）中の縮合−クロロキナゾリン３（１４ｍｇ、０．０６２８ｍｍｏｌ）の溶液に３−エチニルアニリン（０．０５ｍＬ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら８０ｏＣ（浴温度）で１２時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１）によって精製してＪＧＫ００５（１０ｍｇ、５２％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ９．４５ （ｓ， １ Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０４−８．０５ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．８７−７．９０ （ｍ， １ Ｈ）， ７．３４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．１４−７．１６ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３５−４．３９ （ｍ， ４ Ｈ）， ４．１４ （ｓ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １５６．８， １５３．３， １４９．５， １４６．５， １４４．１， １４０．２， １２９．３， １２６．７， １２４．９， １２２．７， １２２．１， １１３．０， １１０．４， １０８．８， ８４．０， ８０．９， ６４．９， ６４．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３０４．１０７９［Ｃ１８Ｈ１３Ｎ３Ｏ２についての計算値３０３．１００２］。
【０２７８】
ＪＧＫ０２５
【化２７】
2020536855.tif 000039
ＪＧＫ０２５の調製は一般手順に従った；ＪＧＫ０２５（２５％）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．３０ （ｓ， １ Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １ Ｈ）， ８．２８ （ｓ， １ Ｈ）， ７．５１−７．５８ （ｍ， １ Ｈ）， ７．４１−７．４８ （ｍ， １ Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １ Ｈ）， ７．１７−７．２３ （ｍ， １ Ｈ）， ４．４４−４．５０ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３９−４．４４ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ １６１．６ （Ｊ ＝ ２４５．９ Ｈｚ）， １６０．０， １５７．６ （Ｊ ＝ ２４９．６ Ｈｚ）， １５２．１， １５０．１， １４５．６， １３５．４， １３０．４， １２１．４， １１２．４， １１０．９， １０８．１， １０８．１， １０５．４， ６５．５， ６４．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３１６．０８９０［Ｃ１６Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ２についての計算値３１５．０８１３］。
【０２７９】
ＪＧＫ０２６
【化２８】
2020536855.tif 000040
ＪＧＫ０２６の調製は一般手順に従った；ＪＧＫ０２６（２２％）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．０９ （ｓ， １ Ｈ）， ８．７４ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３９−７．５１ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２３−７．２９ （ｍ， １ Ｈ）， ４．４５−４．４９ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４０−４．４４ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ １５９．８， １５８．１ （Ｊ ＝ ２３９．６ Ｈｚ）， １５３．７ （Ｊ ＝ ２４３．２ Ｈｚ）， １５２．１， １５０．１， １４５．７， １３５．７， １２６．０， １１７．９， １１７．８， １１６．０， １１０．９， １０８．２， １０６．２， ６５．５， ６４．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３１６．０８９３［Ｃ１６Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ２についての計算値３１５．０８１３］。
【０２８０】
ＪＧＫ０２７
【化２９】
2020536855.tif 000041
ＪＧＫ０２７の調製は一般手順に従った；ＪＧＫ０２７（６％）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．２３ （ｂｓ， １ Ｈ）， ８．７５ （ｓ， １ Ｈ）， ８．２９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４６−７．５５ （ｍ， １ Ｈ）， ７．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ４．４６−４．５０ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４０−４．４６ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ １６３．６， １６０．７， １６０．４， １５８．４， １５２．５， １５１．５， １４６．２， １３０．６， １１５．６， １１３．５， １１３．４， １１１．９， １０９．３， １０８．２， ６６．２， ６５．３；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３１６．０８８９［Ｃ１６Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ２についての計算値３１５．０８１３］。
【０２８１】
ＪＧＫ０２８
【化３０】
2020536855.tif 000042
ＪＧＫ０２８の調製は一般手順に従った；ＪＧＫ０２８（４１％）；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ８．６４ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０３ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３１−７．３８ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．２４−７．３１ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．５０−４．５５ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４４−４．５０ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ １６０．１， １５２．８， １５０．９ （Ｊ ＝ ２４５．６ Ｈｚ）， １４９．０， １４６．２， １４５．９ （Ｊ ＝ ２４９．７ Ｈｚ）， １３４．６， １２６．０， １２４．０， １２３．１， １１６．２， １０９．８， １０７．８， １０５．０， ６５．２， ６４．２；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３１６．０８８４［Ｃ１６Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ２についての計算値３１５．０８１３］。
【０２８２】
ＪＧＫ０２９
【化３１】
2020536855.tif 000043
ＪＧＫ０２９の調製は一般手順に従った；ＪＧＫ０２９（５２％）；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ８．６０ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．０７−７．１３ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．５０−４．５３ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４４−４．４８ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １６１．７， １６０．３， １５８．６， １５８．１， １５３．２， １５０．３， １４４．４， １４３．７， １１７．２， １１３．８， １１３．０， １１２．３， １０９．５， １０１．５， ６５．３， ６４．５；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３３４．０７９４［Ｃ１６Ｈ１０Ｆ３Ｎ３Ｏ２についての計算値３３３．０７１９］。
【０２８３】
ＪＧＫ０１７
【化３２】
2020536855.tif 000044
ＪＧＫ０１７の調製は一般手順に従った；ＪＧＫ０１７（５％）；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．５９ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．４９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．２１ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４１−４．４２ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３８−４．４０ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １５６．４， １５３．２， １４９．７， １４６．７， １４４．５， １３８．４， １３３．５， １３２．２， １２８．２， １２５．４， １１９．９， １１９．７， １１４．３， １１０．４， １０５．７， ６４．５， ６４．３。
【０２８４】
ＪＧＫ００４の調製
【化３３】
2020536855.tif 000045
［ベンゾイル化］無水ＣＨ２Ｃｌ２（５．２ｍＬ、０．２Ｍ）中のジオール２（２０５ｍｇ、１．０４２８ｍｍｏｌ）の冷却した（０ｏＣ）溶液にピリジン（０．５ｍＬ）及び塩化ベンゾイル（０．７ｍＬ）をＡｒ下で連続して少しずつ添加した。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１０／１）によって精製してベンゾイルクロロキナゾリン２−（２）（２２０ｍｇ、５２％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．０７ （ｓ， １ Ｈ）， ８．３１ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１６ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０４−８．０７ （ｍ， ４ Ｈ）， ７．５３−７．５８ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．３４−７．３９ （ｍ， ４ Ｈ）。
【０２８５】
［ＪＧＫ００４］ＣＨ３ＣＮ（３．０ｍＬ）中のベンゾイルクロロキナゾリン２−（２）（１８０ｍｇ、０．４４４ｍｍｏｌ）の溶液に３−クロロ−２−フルオロアニリン（０．０６ｍＬ、０．５３３ｍｍｏｌ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら８０ｏＣ（浴温度）で１５時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１）によって精製してＪＧＫ００４（１０９ｍｇ、４８％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．８５ （ｓ， １ Ｈ）， ８．４８−８．５３ （ｍ， １ Ｈ）， ８．０８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ４ Ｈ）， ７．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．５１−７．５９ （ｍ， ３ Ｈ）， ７．３９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， １６．０ Ｈｚ， ４ Ｈ）， ７．１６−７．２１ （ｍ， ２ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １６４．２， １６３．７， １５６．６， １５５．１， １５０．６， １４９．１， １４８．６， １４７．５， １４２．１， １３４．１， １３４．１， １３０．３， １３０．２， １２８．６， １２８．６， １２８．１， １２８．０， １２７．９， １２７．８， １２５．３， １２４．６， １２４．５， １２２．９， １２１．６， １２１．０， １２０．９， １１４．４， １１３．３；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値５１４．０９６３［Ｃ２８Ｈ１７ＣｌＦＮ３Ｏ４についての計算値５１３．０８８６］。
【０２８６】
ＪＧＫ００６の調製
【化３４】
2020536855.tif 000046
ＣＨ３ＣＮ（３．０ｍＬ）中のベンゾイルクロロキナゾリン２−（２）（１００ｍｇ、０．２４７ｍｍｏｌ）の溶液に３−エチニルアニリン（０．０５ｍＬ、０．４３０ｍｍｏｌ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら５０ｏＣ（浴温度）で２４時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、４／１）によって精製してＪＧＫ００６（４８ｍｇ、４０％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．７１ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．９６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９０−７．９５ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６２−７．７５ （ｍ， ３ Ｈ）， ７．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２２−７．３１ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．０４ （ｓ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １６４．８， １６３．９， １５６．７， １５５．３， １４８．９， １４６．９， １４１．３， １３８．１， １３４．１， １３４．０， １３０．３， １３０．１， １２８．９， １２８．６， １２８．５， １２８．１， １２８．０， １２７．９， １２４．８， １２２．７， １２２．４， １２２．１， １１５．１， １１３．１， ８３．３；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値４８６．１４４３［Ｃ３０Ｈ１９Ｎ３Ｏ４についての計算値４８５．１３７０］。
【０２８７】
ＪＧＫ０３２の調製
【化３５】
2020536855.tif 000047
１．０Ｍの塩酸溶液を塩酸溶液（０．１ｍＬ、ジオキサン中４．０Ｍ、０．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．３ｍＬ）に室温で添加することによって生成した。ＭｅＯＨ中のＪＧＫ０１０（６．１ｍｇ、０．０１８３９ｍｍｏｌ）の溶液に上記で生成した塩酸溶液（０．０３０ｍＬ、０．０３０ｍｍｏｌ）を室温で少しずつ添加した。同じ温度で１０秒間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮してＪＧＫ０３２（６．７ｍｇ、９９％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．６３ （ｓ， １ Ｈ）， ８．８１ （ｓ， １ Ｈ）， ８．３６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １．６， ６．９， ８．３ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３５ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １．１， ８．１， １６．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．４９−４．５１ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４３−４．４５ （ｍ， ２ Ｈ）。
【０２８８】
ＪＧＫ０１２の調製
【化３６】
2020536855.tif 000048
ＪＧＫ０１０（３９ｍｇ、０．１１７６ｍｍｏｌ）の固体に無水酢酸（５．０ｍＬ）を添加した。８０ｏＣ（浴温度）で撹拌しながら１２時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で中和し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、２／１〜１／１）によって精製してＪＧＫ０１２（３７ｍｇ、８４％の単離収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．０１ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３１−７．４１ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．０９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．４１−４．４３ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３７−４．４０ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７０．２， １５９．２， １５３．３， １５１．３， １４９．７， １４５．８， １３０．６， １２９．８， １２９．７， １２４．７， １２２．５， １２２．４， １１７．７， １１３．６， １０９．２， ６４．５， ６４．２， ２２．９；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３７４．０７０１［Ｃ１８Ｈ１３ＣｌＦＮ３Ｏ３についての計算値３７３．０６２３］。
【０２８９】
ＪＧＫ０１５の調製
【化３７】
2020536855.tif 000049
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中のＬ−アミノ酸類似体Ａ（２２７ｍｇ、０．７７１２ｍｍｏｌ）の溶液に縮合−クロロキナゾリン３（１１７ｍｇ、０．５９３２ｍｍｏｌ）を室温で一度に添加した。撹拌しながら３５ｏＣ（浴温度）で１２時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、飽和ブライン（３０．０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（３０．０ｍＬ）で希釈して黄色の懸濁液を得た。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４０／１〜１０／１）によって精製してＪＧＫ０１５（２６１ｍｇ、９２％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．５７ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．３７ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２７ （ｓ， １ Ｈ）， ７．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ５．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．５４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．０， １３．５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．３１−４．３３ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．２７−４．２９ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．６８ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．０６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．６， １４．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．００ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．１， １３．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， １．３９ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７２．４， １５６．５， １５５．２， １５３．６， １４９．１， １４６．３， １４３．８， １３７．６， １３１．６， １２９．７， １２１．７， １１３．８， １１０．３， １０６．６， ８０．０， ６４．４， ６４．２， ５４．４， ５２．２， ３７．６， ２８．３；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値４８１．２０８２［Ｃ２５Ｈ２８Ｎ４Ｏ６についての計算値４８０．２００３］。
【０２９０】
ＪＧＫ０１６、ＪＧＫ０２３の調製
【化３８】
2020536855.tif 000050
［ＪＧＫ０１６（Ｂｏｃ脱保護）］無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ、０．０５Ｍ）中のＪＧＫ０１５（１２１ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）の溶液にトリフルオロ酢酸（１．０ｍＬ）を室温で少しずつ添加した。同じ温度で５時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、２０／１）によって精製してＪＧＫ０１６（７４ｍｇ、７７％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １０．５ （ｓ， １ Ｈ）， ８．６８ （ｓ， １ Ｈ）， ８．４３ （ｓ， ２ Ｈ）， ８．２０ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４４−４．４６ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３９−４．４１ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．６８ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．０３−３．１３ （ｍ， ２ Ｈ）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ８．２６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．７３ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．０８ （ｓ， １ Ｈ）， ４．３１−４．３５ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．７２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．６８ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．２７−３．２９ （ｍ， １ Ｈ）， ３．０１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．９， １３．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ２．８９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．０， １３．５ Ｈｚ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ １７４．４， １５７．４， １５２．６， １４９．７， １４５．０， １４４．２， １３７．５， １３２．８， １２９．２， １２２．８， １２２．３， １１１．５， １１０．１， １０７．９， ６４．５， ６４．１， ５５．２， ５１．０， ３９．５；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３８１．１５５３［Ｃ２０Ｈ２０Ｎ４Ｏ４についての計算値３８０．１４７９］。
【０２９１】
［ＪＧＫ０２３（加水分解）］ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３：１、合計４．０ｍＬ）中のＪＧＫ０１６（４２ｍｇ、０．１１０４ｍｍｏｌ）の冷却（０ｏＣ）溶液に水酸化リチウム（１４ｍｇ）を一度に添加した。室温で２時間撹拌した後、反応混合物を１ＮのＨＣｌで中和し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、３０／１〜１５／１）によって精製してＪＧＫ０２３（２５ｍｇ、６２％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．６２ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４８−４．５０ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４２−４．４４ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．３２−３．３７ （ｍ， １ Ｈ）， ３．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １６９．７， １５９．１， １５２．４， １４８．８， １４６．０， １３６．１， １３４．１， １３３．１， １２９．７， １２９．７， １２４．８， １２４．８， １１０．０， １０８．１， １０４．９， ６５．２， ６４．２， ５３．６， ３５．４；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３６７．１３３４［Ｃ１９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４についての計算値３６６．１３２２］。
【０２９２】
ＪＧＫ０２０の調製
【化３９】
2020536855.tif 000051
イソプロピルアルコール（５．３ｍＬ）中のクロロキナゾリン２（１０４ｍｇ、０．５２９４ｍｍｏｌ）の溶液にアミノ酸（１８７ｍｇ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら５０ｏＣ（浴温度）で１２時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５／１〜３／１）によって精製してＪＧＫ０２０（１２８ｍｇ、５３％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １０．６８ （ｓ， １ Ｈ）， １０．２２ （ｂｒ， １ Ｈ）， ８．６４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １ Ｈ）， ７．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２６−７．３１ （ｍ， ４ Ｈ）， ４．１２−４．１８ （ｍ， １ Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．９８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．２， １４．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ２．８４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．０， １３．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， １．３０ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １７３．０， １５８．２， １５５．９， １５５．６， １４８．７， １４８．４， １３６．１， １３５．８， １２９．７， １２４．７， １０７．６， １０７．３， １０３．３， ７８．８， ５５．７， ５２．３， ３６．３， ２８．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値４５５．１９２０［Ｃ２３Ｈ２６Ｎ４Ｏ６についての計算値４５４．１８４６］。
【０２９３】
ＪＧＫ０１４
【化４０】
2020536855.tif 000052
ＪＧＫ０１４（２６％）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．６２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １ Ｈ）， ７．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ４．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．５６−４．６２ （ｍ， １ Ｈ）， ４．３６−４．４２ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．７３ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．０３−３．１５ （ｍ， ２ Ｈ）， １．４３ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７２．４， １５６．５， １５５．２， １５３．６， １４９．１， １４６．３， １４３．８， １３７．６， １３１．６， １２９．７， １２１．７， １１３．８， １１０．３， １０６．６， ８０．０， ６４．４， ６４．２， ５４．４， ５２．２， ３７．６， ２８．３；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値４８１．２０８０［Ｃ２５Ｈ２８Ｎ４Ｏ６についての計算値４８０．２００３］。
【０２９４】
ＪＧＫ０２１
【化４１】
2020536855.tif 000053
ＪＧＫ０２１の調製に続いてＪＧＫ０２３の合成手順を行った；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．６２ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４８−４．５０ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．４２−４．４４ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．３２−３．３７ （ｍ， １ Ｈ）， ３．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １６９．７， １５９．１， １５２．４， １４８．８， １４６．０， １３６．１， １３４．１， １３３．１， １２９．７， １２９．７， １２４．８， １２４．８， １１０．０， １０８．１， １０４．９， ６５．２， ６４．２， ５３．６， ３５．４；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３６７．１３４７［Ｃ１９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４についての計算値３６６．１３２２］。
【０２９５】
ＪＧＫ０２２の調製
【化４２】
2020536855.tif 000054
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中のジオールＸ（１２１ｍｇ、０．６１５５ｍｍｏｌ）の溶液に３−クロロ−２−フルオロアニリン（０．１４ｍＬ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら６０ｏＣ（浴温度）で３日間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、Ｅｔ２Ｏ（３０．０ｍＬ）で希釈して白色の懸濁液を得た。得られた白色の固体をＥｔ２Ｏ（３×５０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で連続して洗浄し、収集してＪＧＫ０２２（１３２ｍｇ、７０％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．１６ （ｂｒ， １ Ｈ）， １０．４３ （ｂｒ， １ Ｈ）， ８．６８ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １ Ｈ）， ７．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．４０ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １５９．１， １５６．４， １５４．１， １５２．１， １４９．１， １４８．３， １３５．１， １２９．７， １２８．１， １２６．８， １２５．７， １２０．８， １０７．４， １０６．９， １０２．９；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値３０６．０４３７［Ｃ１４Ｈ９ＣｌＦＮ３Ｏ２についての計算値３０５．０３６１］。
【０２９６】
ＪＧＫ０１８の調製
【化４３】
2020536855.tif 000055
［塩素化］塩化チオニル（７．５ｍＬ、０．２８Ｍ）中の１１（５００ｍｇ、２．１３４ｍｍｏｌ）の溶液にジメチルホルムアミド（０．１５ｍＬ）を少しずつ添加した。撹拌しながら８０ｏＣ（浴温度）で２時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、真空中で濃縮した。残渣をＥｔ２Ｏ（２００ｍＬ）で連続して洗浄し、次の工程に即座に使用した。
【０２９７】
［置換］無水ＤＭＦ（１１ｍＬ、０．２Ｍ）中の上記で生成したクロロキナゾリン１２の溶液に３−クロロ−２−フルオロアニリン（０．５０ｍＬ、４．５４８ｍｍｏｌ）を室温でＡｒ下で少しずつ添加した。同じ温度で１時間撹拌した後、反応混合物をＥｔ２Ｏ（１００．０ｍＬ）で希釈して白色の懸濁液を得た。得られた白色の固体をＥｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で連続して洗浄し、収集してＪＧＫ０１８（５２５ｍｇ、６８％）を得た；分光データをＺｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，８２００−８２１５と適合させた。
【０２９８】
１３の調製
【化４４】
2020536855.tif 000056
［アセチル脱保護］ＪＧＫ０１８（５５０ｍｇ、１．５２０ｍｍｏｌ）にアンモニア溶液（８．０ｍＬ、メタノール中７Ｎ）を少しずつ添加した。密封チューブ内で撹拌しながら５０ｏＣ（浴温度）で２時間加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、真空中で濃縮した。得られた白色の固体をＥｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で連続して洗浄し、収集して１３（３９４ｍｇ、８１％）を得た；得られた分光データをＺｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，８２００−８２１５のものと適合させた。
【０２９９】
１４の調製
【化４５】
2020536855.tif 000057
無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の１３（１１３ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）の冷却（０ｏＣ）溶液にトリエチルアミン（０．２５ｍＬ、１．７６７ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、続いて無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（６２ｍｇ、０．４５９ｍｍｏｌ）をＡｒ下で少しずつ添加した。室温で３日間撹拌した後、反応混合物を飽和水性Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５／１〜３／１）によって精製して１４（４２ｍｇ、２８％の単離収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．６９ （ｓ， １ Ｈ）， ８．３９−８．４５ （ｍ， １ Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．１１−７．１６ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．９０ （ｓ， ３ Ｈ）， １．５９ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １５６．２ （Ｊ ＝ ３９．５ Ｈｚ）， １５４．９， １５１．３， １５０．３， １４９．５ （Ｊ ＝ ２２４．１ Ｈｚ）， １４０．４， １２８．１ （Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ）， １２４．８， １２４．４ （Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ）， １２１．５， １２０．８ （Ｊ ＝ ５１．２ Ｈｚ）， １１３．５， １０９．０， １０８．８， ８４．６， ５６．２， ２７．６；
【０３００】
Ｃの調製
【化４６】
2020536855.tif 000058
無水ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中のＡ１（５６ｍｇ、０．１９０４ｍｍｏｌ）の溶液にトリエチルアミン（０．０８ｍＬ、０．５７１２ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、続いて塩化クロロアセチル（０．０５ｍＬ、０．６２８６ｍｍｏｌ）を室温でＡｒ下で添加した。同じ温度で１時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物をさらなる精製をせずに次の工程に使用した。
【０３０１】
ＪＧＫ０３１の調製
【化４７】
2020536855.tif 000059
［アルキル化］ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の１４（４４ｍｇ、０．１０５８ｍｍｏｌ）の冷却（０ｏＣ）溶液に炭酸カリウム（７３ｍｇ、０．５２８ｍｍｏｌ）を一度に添加し、続いてＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の上記で生成したＣ（０．１９０４ｍｍｏｌ）を室温で少しずつ添加した。撹拌しながら４０ｏＣ（浴温度）で３日間加熱した後、反応混合物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１００／１〜３０／１）によって精製してアルキル化生成物１４−（２）（４３ｍｇ、５５％の単離収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．１６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．４４ （ｓ， １ Ｈ）， ６．９８−７．１３ （ｍ， ５ Ｈ）， ６．３４ （ｍ， １ Ｈ）， ４．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．４８ （ｓ， ２ Ｈ）， ３．６９ （ｓ， ６ Ｈ）， ２．９５−３．１３ （ｍ， ２ Ｈ）， １．５３ （ｓ， ９ Ｈ）， １．４０ （ｓ， ９ Ｈ）。
【０３０２】
［脱保護］無水ＭｅＯＨ（５．０ｍＬ）中のアルキル化生成物１４−（２）（２６ｍｇ、０．０３４８ｍｍｏｌ）の溶液に０．５Ｎの塩酸塩溶液（０．５ｍＬ）を少しずつ添加した。同じ温度で２４時間撹拌し、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（逆相シリカゲル、ＭｅＯＨまたはＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、１０／１）によって精製してＪＧＫ０３１（１２ｍｇ、６１％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ８．２０ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６７ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．２４−７．３０ （ｍ， １ Ｈ）， ７．１１−７．２１ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．８３−３．０１ （ｍ， ２ Ｈ）；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値５５４．１６３１［Ｃ２７Ｈ２５ＣｌＦＮ５Ｏ５についての計算値５５３．１５２２］。
【０３０３】
ＪＧＫ０３３の調製
【化４８】
2020536855.tif 000060
無水ＴＨＦ（６ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２ｍＬ）中のＪＧＫ０３１（５ｍｇ、０．００９０２６ｍｍｏｌ）の溶液に水酸化リチウム・Ｈ２Ｏ（３ｍｇ）を一度に添加した。室温で２時間撹拌し、反応混合物を１Ｎの塩酸塩溶液で中和し、真空中で濃縮した。残渣を逆カラムクロマトグラフィ（逆相シリカゲル、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、５／１）によって精製してＪＧＫ０３３（４．４ｍｇ、９０％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ７．１６ （ｓ， １ Ｈ）， ６．３２ （ｓ， １ Ｈ）， ６．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ５．８９−５．９８ （ｍ， ２ Ｈ）， ５．５９−５．７９ （ｍ， ４ Ｈ）， ４．００ （ｓ， ２ Ｈ）， ２．５１ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ １６３．９， １５９．４， １５７．２， １５４．３， １５２．１， １４９．５， １３７．１， １３５．４， １２９．７， １２６．９， １２４．６， １２１．５， １２０．３， １０８．０， １０６．９， ９７．８， ５６．６， ５３．５， ３５．６；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値５４０．１４３５［Ｃ２６Ｈ２３ＣｌＦＮ５Ｏ５についての計算値５３９．１３６６］。
【０３０４】
ＪＧＫ００８の調製
【化４９】
2020536855.tif 000061
無水ＭｅＯＨ（５．６ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（５．６ｍＬ）中のラパチニブ（３２６ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）の溶液にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（３７８ｍｇ、２．８１９ｍｍｏｌ）をＡｒ下で一度に滴下した。室温で２日間撹拌した後、反応混合物を飽和水性Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（５×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＨ２Ｏ及び飽和ブラインで連続して洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１〜１／１）によって精製してＪＧＫ００８（１１９ｍｇ、３１％の単離収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．７１ （ｂｓ， １ Ｈ）， ８．６４ （ｓ， １ Ｈ）， ８．４４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．８５−７．９５ （ｍ， ３ Ｈ）， ７．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３２−７．３７ （ｍ， １ Ｈ）， ７．２１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， １０．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ６．９８−７．０３ （ｍ， １ Ｈ）， ６．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， １ Ｈ）， ６．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ４７．１ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．１３ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ３２．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ６６．１ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ２．８９ （ｓ， ３ Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １６３．９， １６２．０， １５８．０， １５４．２， １５２．７， １５１．７， １５１．０， １３９．１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， １３２．４， １３０．１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ）， １２９．１， １２８．６， １２８．２， １２５．１， １２３．１， １２２．４， １２２．３， １１５．４， １１４．９ （ｄ， Ｊ ＝ ２１．０ Ｈｚ）， １１４．１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．９ Ｈｚ）， １１３．９， １１１．５， １１０．９， １０７．７， ８１．３， ７０．９， ４５．０， ４３．６， ４２．３， ４１．４， ４１．２， ２８．４；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値６８１．１９４６［Ｃ３４Ｈ３４ＣｌＦＮ４Ｏ６Ｓについての計算値６８０．１８６６］。
【０３０５】
ＪＧＫ０１１の調製
【化５０】
2020536855.tif 000062
ラパチニブ（６８ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）の固体に無水酢酸（５．０ｍＬ）をＡｒ下で添加した。室温で２日間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３／１〜１／３）によって精製してＪＧＫ００２（４８ｍｇ、６２％の単離収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．１８ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１０−８．１７ （ｍ， ３ Ｈ）， ７．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．２７−７．３６ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．１８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １３．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ６．９７−７．０３ （ｍ， ２ Ｈ）， ６．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， １ Ｈ）， ６．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．１４ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．６６ （ｓ， ２ Ｈ）， ３．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ２．９５ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．３３ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．２３ （ｓ， ３ Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７１．４， １７１．２， １６３．９， １６２．２， １６２．０， １５４．０， １５３．７， １５２．５， １５１．０， １３８．５ （Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， １３４．２， １３０．８， １３０．３， １３０．２， １２９．９， １２９．１， １２７．４， １２３．９， １２２．４ （Ｊ ＝ ２．９ Ｈｚ）， １２１．８， １１８．０， １１５．１， １１５．０， １１４．０ （Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ）， １１３．８， １１１．１， １０８．９， ７０．１ （Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ）， ５２．３， ４７．０， ４１．４， ４０．７， ２３．７， ２１．８；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ［Ｍ＋Ｈ］＋実測値６６５．１６２８［Ｃ３３Ｈ３０ＣｌＦＮ４Ｏ６Ｓについての計算値６６４．１５５３］。
【０３０６】
実施例２：ＪＧＫシリーズのさらなる例示的な化合物の調製
一般的化学情報
すべての化学物質、試薬、及び溶媒は、入手可能な場合には商用源から購入し、受領したまま使用した。必要に応じて、試薬及び溶媒は、標準的方法によって精製し、乾燥させた。空気及び水分に敏感な反応は、オーブン乾燥ガラス器内でアルゴンの不活性雰囲気下で行った。マイクロ波照射反応は、単一モード反応器ＣＥＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波合成器内で行った。室温反応は、周囲温度（およそ２３℃）で行った。すべての反応は、紫外線（λ＝２５４、３６５ｎｍ）によってまたはアルカリ性ＫＭｎＯ４溶液を使用することによって可視化されたスポットを有する事前被覆されたＭｅｒｃｋ  ６０  Ｆ２５４シリカゲルプレートでの薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によってモニターした。フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＦＣ）は、ＳｉＯ２６０（粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。減圧下（真空中）での濃縮は、２５〜５０℃で回転蒸発によって実施した。精製された化合物は、高真空下またはデシケーターにおいてさらに乾燥させた。収率は、精製された化合物に対応し、さらに最適化されなかった。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ分光計（３００、４００、または５００ＭＨｚで動作）で記録した。炭素ＮＭＲ（１３Ｃ  ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ分光計で（４００または５００ＭＨｚのいずれかで）記録した。ＮＭＲの化学シフト（δｐｐｍ）は、残留溶媒シグナルを参照した。１Ｈ  ＮＭＲデータは、次のように報告される：化学シフト（ｐｐｍ）；多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｑｕｉｎｔ＝五重項、ｍ＝多重項／複合パターン、ｔｄ＝二重項の三重項、ｄｄｄ＝二重項の二重項の二重項、ｂｒ＝ブロードシグナル）；結合定数（Ｊ）（Ｈｚ）、積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのデータは、化学シフト、及び該当する場合は結合定数の観点から報告される。高分解能質量（ＨＲＭＳ）スペクトルは、ＩｏｎＳｅｎｓｅ  ＩＤ−ＣＵＢＥ  ＤＡＲＴ源質量分析計を有するＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓで記録した。化合物４−クロロ−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン（１）、４−クロロキナゾリン−６，７−ジオール（２）、及びＪＧＫ０１０は、先に報告されたように調製した。
【０３０７】
４−アニリノキナゾリン化合物ＪＧＫ０３５−ＪＧＫ０４１、及びＪＫＧ０４３の合成のための一般手順Ａ。
【０３０８】
ｉＰｒＯＨ（０．１〜０．３Ｍ）中の４−クロロキナゾリン（１当量）の混合物をアニリン（１当量）で処理し、混合物をマイクロ波照射（６０Ｗ）下で８０℃で１５〜２０分間加熱した。混合物を２３℃に冷却し、追加のアニリン（１当量）で処理し、マイクロ波照射（８０℃、６０Ｗ、１５〜２０分）に再度供した。混合物を減圧下で濃縮するか、または沈殿した４−アニリノキナゾリン塩酸塩を濾過（低温ｉＰｒＯＨで洗浄）して単離した。残渣を飽和水性ＮａＨＣＯ３に懸濁し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃまたはヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配で溶出）による精製により、典型的には白色からオフホワイト色、または淡黄色の固体として所望の生成物が得られた。
【０３０９】
Ｎ−（２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０３５）．
【化５１】
2020536855.tif 000063
一般手順Ａに従って、化合物ＪＧＫ０３５をｉＰｒＯＨ（１．５ｍＬ）中の４−クロロキナゾリン１（５１ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及び２−フルオロアニリン（４０μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）から調製した。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １０：１→１０：４）によりＪＧＫ０３５（５６ｍｇ、８２％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．６４ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３６ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ８．３， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０ − ７．０５ （ｍ， １Ｈ）， ４．４４ − ４．３７ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １５６．０８， １５３．６０， １５３．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．７ Ｈｚ）， １４９．５２， １４６．６５， １４４．３４， １２７．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．５ Ｈｚ）， １２４．６６ （ｄ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， １２３．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ）， １２２．８９， １１５．０６ （ｄ， Ｊ ＝ １９．３ Ｈｚ）， １１４．４６， １１０．６２， １０６．１０， ６４．６９， ６４．５１ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−Ｃ１６Ｈ１１ＦＮ３Ｏ２−についての計算値、２９６．０８４１；実測値、２９６．０８４１。
【０３１０】
４−クロロ（７，７，８，８−２Ｈ４）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン（３）．
【化５２】
2020536855.tif 000064
乾燥ＤＭＦ（４．８ｍＬ）中の化合物２（１９３ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の溶液をＣｓ２ＣＯ３（７８８ｍｇ、２．４２ｍｍｏｌ）で処理し、５分間撹拌し、１−ブロモ−２−クロロ（２Ｈ４）エタン（２７０μＬ、３．１６ｍｍｏｌ）で少しずつ処理した。混合物を２３℃で１時間撹拌し、次いで７０℃で１８時間撹拌した。混合物を２３℃に冷却した後、すべての揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）に溶解し、水（２×１３ｍＬ）、ブライン（１３ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １：０→１０：１．５）による精製により標記化合物３（１０９ｍｇ、４９％）が白色のふわふわした固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７ ｐｐｍ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １６０．１９， １５２．５２， １５１．５４， １４７．９３， １４６．０６， １２０．１０， １１３．７２， １１０．８３ｐｐｍ（観察されない２つの高磁場炭素）。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１０Ｈ４Ｄ４ＣｌＮ２Ｏ２＋についての計算値、２２７．０５２０；実測値、２２７．０５１６。
【０３１１】
Ｎ−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）（７，７，８，８−２Ｈ４）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０３６）．
【化５３】
2020536855.tif 000065
一般手順Ａに従って、化合物ＪＧＫ０３６をｉＰｒＯＨ（１．２ｍＬ）中の４−クロロキナゾリン３（５５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及び３−クロロ−２−フルオロアニリン（５２μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）から調製した。ＪＧＫ０３６・ＨＣｌを粗反応混合物から濾過によって単離し、塩基性化後、抽出により純粋なＪＧＫ０３６（６７ｍｇ、８２％）が淡黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ９．６２ （ｓ， １Ｈ）， ８．３４ （ｓ， １Ｈ）， ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３ − ７．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１９ ｐｐｍ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １５７．１７， １５３．１０， １５２．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ２４９．２ Ｈｚ）， １４９．２８， １４６．０４， １４３．６８， １２８．２１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ）， １２７．２７， １２７．０３， １２４．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２０．１１ （ｄ， Ｊ ＝ １６．７ Ｈｚ）， １１２．４８， １０９．６４， １０８．３５， ６３．５０ （ｍ， ２Ｃ’ｓ）。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ８Ｄ４ＣｌＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、３３６．０８４８；実測値、３３６．０８４１。
【０３１２】
Ｎ−（３−ブロモ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０３７）．
【化５４】
2020536855.tif 000066
一般手順Ａに従って、化合物ＪＧＫ０３７をｉＰｒＯＨ（１．５ｍＬ）中の４−クロロキナゾリン１（１００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及び３−ブロモ−２−フルオロアニリン（１００μＬ、０．８９ｍｍｏｌ）から調製した。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １０：０→１０：３）によりＪＧＫ０３７（１５０ｍｇ、８９％）が淡黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．６５ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ７．４， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２９ − ７．２４ （ｍ， １Ｈ）， ７．１１ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４４ − ４．３８ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １５５．８９， １５３．３７， １５０．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．２ Ｈｚ）， １４９．７０， １４６．７５， １４４．５３， １２８．６５ （ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ）， １２７．２４， １２５．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２１．７９， １１４．５３， １１０．５９， １０８．５９ （ｄ， Ｊ ＝ １９．４ Ｈｚ）， １０５．９３， ６４．７０， ６４．５１ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−Ｃ１６Ｈ１０ＢｒＦＮ３Ｏ２−についての計算値、３７３．９９４６；実測値、３７３．９９４６。
【０３１３】
Ｎ−｛２−フルオロ−３−［（トリエチルシリル）エチニル］フェニル｝−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（４）．
【化５５】
2020536855.tif 000067
１ドラムのバイアルにＪＧＫ０１０（７５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、ＸＰｈｏｓ（１９．７ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１９５ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、［ＰｄＣｌ２・（ＭｅＣＮ）２］（３．６ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を装填した。バイアルを排気し、アルゴンを再充填した（少なくとも２回繰り返した）。乾燥アセトニトリル（１ｍＬ）を添加し、橙色の懸濁液を２３℃で２５分間撹拌し、次いでエチニルトリエチルシラン（１５０μＬ、０．８４ｍｍｏｌ）を注入した。チューブを密封し、反応混合物を予熱した油浴内で９５℃で３．５時間撹拌した。懸濁液を２３℃とし、ＥｔＯＡｃで希釈し、ＳｉＯ２のプラグを通して濾過し（ＥｔＯＡｃで洗浄）、蒸発させた。ＦＣ（ＳｉＯ２；ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ８：２→４：６）による精製により標記化合物４（４８ｍｇ、４９％）が黄色の泡状固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．６８１ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， １．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．６７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８２ （ｓ， １Ｈ）， ７．３７６ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２１ − ７．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４４ − ４．３８ （ｍ， ４Ｈ）， １．０７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， ９Ｈ）， ０．７１ ｐｐｍ （ｑ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， ６Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １５５．９５， １５３．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ２４８．０ Ｈｚ）， １５３．４４， １４９．６２， １４６．６６， １４４．４７， １２７．６８， １２７．６０， １２４．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ）， １２２．７９， １１４．４９， １１１．７７ （ｄ， Ｊ ＝ １４．６ Ｈｚ）， １１０．６１， １０５．９７， ９８．６５， ９８．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ６４．７０， ６４．５１， ７．６３， ４．５０ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２４Ｈ２７Ｎ３Ｏ２Ｓｉ＋についての計算値、４３６．１８５１；実測値、４３６．１８３１。
【０３１４】
Ｎ−（３−エチニル−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０３８）．
【化５６】
2020536855.tif 000068
湿潤ＴＨＦ（０．９ｍＬ）中の化合物４（４０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の混合物をＴＨＦ（４５０μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）中のＴＢＡＦの１Ｍの溶液で少しずつ処理し、混合物を２３℃で１８時間撹拌した。水（１０ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。ＦＣ（ＳｉＯ２；ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ７：３→３：７）、続いて第２のＦＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １：０→６：４）による精製によりＪＧＫ０３８（１９ｍｇ、６４％）がオフホワイト色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．６９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．６７ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３６ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ − ７．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４３ − ４．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３４ ｐｐｍ （ｓ， １Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １５５．９４， １５４．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ２４８．８ Ｈｚ）， １５３．３９， １４９．６５， １４６．７０， １４４．４７， １２７．８１， １２７．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ）， １２４．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２３．４７， １１４．４９， １１０．５８， １１０．５０ （ｄ， Ｊ ＝ １４．３ Ｈｚ）， １０５．９９， ８２．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ）， ７６．７０ （ｄ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ）， ６４．６９， ６４．５０ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ１３ＦＮ３Ｏ２＋）についての計算値、３２２．０９８６；実測値、３２２．０９８１。
【０３１５】
Ｎ−［２−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０３９）．
【化５７】
2020536855.tif 000069
一般手順Ａに従って、化合物ＪＧＫ０３９をｉＰｒＯＨ（１．５ｍＬ）中の４−クロロキナゾリン１（３７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び２−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリン（４２μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）から調製した。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １：０→１０：３）によりＪＧＫ０３９（３５ｍｇ、５８％）がオフホワイト色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ９．００ − ８．９２ （ｍ， １Ｈ）， ８．７０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４２ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．４０ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ − ７．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４６ − ４．３８ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １５５．７７， １５３．２４， １５０．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ２５２．０ Ｈｚ）， １４９．８１， １４６．８０， １４４．６６， １２８．６２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， １２６．３４， １２４．４４， １２４．４０， １２２．６６ （ｑ， Ｊ ＝ ２７２．４ Ｈｚ）， １２０．４１ （ｑ， Ｊ ＝ ４．６ Ｈｚ）， １１４．５８， １１０．５５， １０５．８６， ６４．７０， ６４．５１ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−Ｃ１７Ｈ１０Ｆ４Ｎ３Ｏ２−についての計算値、３６４．０７１５；実測値、３６４．０７１２。
【０３１６】
４−クロロ−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−［１，４］ジオキセピノ［２，３−ｇ］キナゾリン（５）．
【化５８】
2020536855.tif 000070
乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物２（１００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液をＣｓ２ＣＯ３（４６０ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）で処理し、１５分間撹拌し、１，３−ジブロモプロパン（１３５μＬ、１．３３ｍｍｏｌ）で少しずつ処理した。混合物を２３℃で１時間撹拌し、次いで６５℃で１８時間撹拌した。２３℃に冷却後、すべての揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に懸濁し、水（２×５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。ＦＣ（ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２  １：１０→０：１→ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １０：１．５）、続いて第２のＦＣ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １０：１→１０：３）による精製により標記化合物５（４１ｍｇ、３４％）が白色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｓ， １Ｈ）， ７．５５ （ｓ， １Ｈ）， ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３４ ｐｐｍ （ｑｕｉｎｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １６０．５７， １５８．８６， １５３．１０， １５３．０３， １４８．８８， １２０．８３， １１８．１９， １１５．６４， ７０．５１， ７０．３３， ３０．５１ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１１Ｈ１０ＣｌＮ２Ｏ２＋についての計算値、２３７．０４２５；実測値、２３７．０４１６。
【０３１７】
Ｎ−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−［１，４］ジオキセピノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０４０）．
【化５９】
2020536855.tif 000071
一般手順Ａに従って、化合物ＪＧＫ０４０をｉＰｒＯＨ（１．５ｍＬ）中の４−クロロキナゾリン５（３３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及び３−クロロ−２−フルオロアニリン（３２μＬ、０．２９ｍｍｏｌ）から調製した。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １：０→１０：３．５）によりＪＧＫ０４０（３４ｍｇ、７０％）が白色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ９．７２ （ｓ， １Ｈ）， ８．３９ （ｓ， １Ｈ）， ８．０８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３ − ７．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２７ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ ｐｐｍ （ｑｕｉｎｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １５７．４３， １５６．６７， １５３．８５， １５２．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ２４９．３ Ｈｚ）， １５０．７４， １４７．２９， １２８．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ）， １２７．４１， １２７．０４， １２４．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２０．１３ （ｄ， Ｊ ＝ １６．５ Ｈｚ）， １１７．５２， １１３．８１， １１０．７７， ７０．７５， ７０．６２， ３０．８０ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１７Ｈ１４ＣｌＦＮ３Ｏ２＋）についての計算値、３４６．０７５３；実測値、３４６．０７４０。
【０３１８】
８−クロロ−２Ｈ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キナゾリン（６）．
【化６０】
2020536855.tif 000072
乾燥ＤＭＦ（３．４ｍＬ）中の化合物２（１００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液をＣｓ２ＣＯ３（３３５ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）で処理し、２３℃で１５分間撹拌した。混合物をクロロヨードメタン（１３０μＬ、１．７９ｍｍｏｌ）で少しずつ処理し、１時間撹拌し、次いで７０℃で１７時間撹拌した。混合物を２３℃に冷却した後、すべての揮発性物質を真空中で除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に懸濁し、水（２×７ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。ＦＣ（ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２  ３：１０→０：１→ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ１０：２）による精製により標記化合物６（３８ｍｇ、３６％）が白色のふわふわした固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．３２ （ｓ， １Ｈ）， ６．２１ ｐｐｍ （ｓ， ２Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １５９．８２， １５４．８９， １５２．７９， １５０．９４， １４９．７８， １２１．２３， １０５．２３， １０２．８９， １０１．１２ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ９Ｈ６ＣｌＮ２Ｏ２＋についての計算値、２０９．０１１２；実測値、２０９．０１０４。
【０３１９】
Ｎ−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−２Ｈ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キナゾリン−８−アミン（ＪＧＫ０４１）．
【化６１】
2020536855.tif 000073
一般手順Ａに従って、化合物ＪＧＫ０４１をｉＰｒＯＨ（１．５ｍＬ）中の４−クロロキナゾリン６（３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び３−クロロ−２−フルオロアニリン（３８μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）から調製した。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １：０→１：１）によりＪＧＫ０４１（３５ｍｇ、６６％）が淡黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ９．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．３７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３ − ７．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ６．２５ ｐｐｍ （ｓ， ２Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １５７．３７， １５３．１０， １５２．６０， １５２．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ２４８．９ Ｈｚ）， １４８．５６， １４７．２８， １２８．３０ （ｄ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ）， １２７．１７， １２６．９０， １２４．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ）， １２０．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １６．４ Ｈｚ）， １０９．８２， １０４．５９， １０２．３８， ９８．７７ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１５Ｈ１０ＣｌＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、３１８．０４４０；実測値、３１８．０４３５。
【０３２０】
［（３−クロロ−２−フルオロフェニル）（７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−イル）アミノ］メチルアセテート（ＪＧＫ０４３）．
【化６２】
2020536855.tif 000074
乾燥ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のＪＧＫ０１０（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の混合物をＴＨＦ（１５０μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）中のＬｉＨＭＤＳの１Ｍの溶液で０℃で少しずつ処理した。その温度で１５分間撹拌した後、混合物を乾燥ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のクロロメチルアセテート（５５μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に少しずつ添加した。最初にＪＧＫ０１０の溶液を含有していたフラスコを０．５ｍＬの乾燥ＴＨＦですすぎ、反応混合物に添加した。０℃で２時間撹拌した後、撹拌を２３℃で２２時間継続した。飽和水性ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で蒸発させた。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  １：０−＞１：１）による精製により標記化合物ＪＧＫ０４３（３０ｍｇ、４９％）が淡黄色の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．０８ − ６．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９４ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．２， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８２ （ｓ， １Ｈ）， ５．７３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４０ − ４．２９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１２ ｐｐｍ （ｓ， ３Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ １７０．３３， １５２．９６， １５０．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ２４５．６ Ｈｚ）， １４９．３７， １４８．０５， １４３．２４， １４０．１７ （ｄ， Ｊ ＝ １３．１ Ｈｚ）， １３１．８９， １２４．１７， １２４．１２ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ）， １２２．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ）， １２１．３３ （ｄ， Ｊ ＝ １７．１ Ｈｚ）， １１５．４１， １１４．３１， １０２．２４， ７１．１９， ６５．０７， ６４．２３， ２０．８５ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１９Ｈ１６ＣｌＦＮ３Ｏ４＋についての計算値、４０４．０８０８；実測値、４０４．０７９２。
【０３２１】
例３：ＪＧＫシリーズのさらなる例示的な化合物の調製
一般手順：すべての化学物質、試薬、及び溶媒は、入手可能な場合には商用源から購入し、受領したまま使用した。必要に応じて、試薬及び溶媒は、標準的方法によって精製し、乾燥させた。空気及び水分に敏感な反応は、オーブン乾燥ガラス器内でアルゴンの不活性雰囲気下で行った。マイクロ波照射反応は、単一モード反応器ＣＥＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波合成器内で行った。室温（ＲＴ）反応は、周囲温度（およそ２３℃）で行った。すべての反応は、紫外線（λ＝２５４、３６５ｎｍ）によってまたはアルカリ性ＫＭｎＯ４溶液を使用することによって可視化されたスポットを有する事前被覆されたＭｅｒｃｋ  ６０  Ｆ２５４シリカゲルプレートでの薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によってモニターした。フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＦＣ）は、ＳｉＯ２６０（粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。減圧下（真空中）での濃縮は、２５〜５０℃で回転蒸発によって実施した。精製された化合物は、高真空下またはデシケーターにおいてさらに乾燥させた。収率は、精製された化合物に対応し、さらに最適化されなかった。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ分光計（３００、４００、または５００ＭＨｚで動作）で記録した。炭素ＮＭＲ（１３Ｃ  ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ分光計で（４００または５００ＭＨｚのいずれかで）記録した。ＮＭＲ化学シフト（δｐｐｍ）は、残留溶媒シグナルを参照した。１Ｈ  ＮＭＲデータは、次のように報告される：化学シフト（ｐｐｍ）；多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｑｕｉｎｔ＝五重項、ｍ＝多重項／複合パターン、ｔｄ＝二重項の三重項、ｄｄｄ＝二重項の二重項の二重項、ｂｒ＝ブロードシグナル）；結合定数（Ｊ）（Ｈｚ）、積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのデータは、化学シフト、及び該当する場合は結合定数の観点から報告される。高分解能質量（ＨＲＭＳ）スペクトルは、ＩｏｎＳｅｎｓｅ  ＩＤ−ＣＵＢＥ  ＤＡＲＴ源質量分析計を有するＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ、またはオートサンプラーを有するＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣを有するＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計で記録した。
【０３２２】
３−［（７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−イル）アミノ］−２−フルオロベンゾニトリル（ＪＧＫ０４４）．
【化６３】
2020536855.tif 000075
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ９．０６ − ８．９８ （ｍ， １Ｈ）， ８．６９ （ｓ， １Ｈ）， ７．４１ （ｓ， １Ｈ）， ７．３９ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．３５ − ７．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３７ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．６３， １５３．６３ （ｄ， Ｊ ＝ ２５４．６ Ｈｚ）， １５３．０４， １４９．９４， １４６．８０， １４４．７６， １２８．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ）， １２７．４８， １２６．５８， １２５．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ）， １１４．５６， １１３．８０， １１０．４５， １０５．８３， １０１．３０ （ｄ， Ｊ ＝ １３．９ Ｈｚ）， ６４．７０， ６４．５１ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１７Ｈ１２ＦＮ４Ｏ２＋についての計算値、３２３．０９３９；実測値、３２３．０９２７。
【０３２３】
３−［（７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−イル）アミノ］ベンゾニトリル（ＪＧＫ０４５）．
【化６４】
2020536855.tif 000076
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ ９．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ８．４６ （ｔ， Ｊ ＝ １．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１８ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， ２．３， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．６， １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ４．４９ − ４．３６ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １５６．２４， １５２．６９， １４９．３１， １４６．１５， １４３．８０， １４０．５２， １２９．８７， １２６．３５， １２５．９６， １２４．１５， １１８．９３， １１２．６６， １１１．２３， １０９．９６， １０８．３０， ６４．５２， ６４．１９ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１７Ｈ１３Ｎ４Ｏ２＋についての計算値、３０５．１０３３；実測値、３０５．１０１８。
【０３２４】
エチル（３−クロロ−２−フルオロフェニル）７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−イルカルバメート（ＪＧＫ０４７）．
【化６５】
2020536855.tif 000077
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．９６ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．３７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．１， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０８ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ４．２７ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２２ ｐｐｍ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １５８．９８， １５４．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ２５０．７ Ｈｚ）， １５３．９０， １５３．４１， １５１．１７， １４９．６８， １４５．６１， １３０．１２， １２９．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ）， １２８．２０， １２４．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ）， １２２．２２ （ｄ， Ｊ ＝ １６．８ Ｈｚ）， １１７．９６， １１３．５１， １０９．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ）， ６４．７３， ６４．３６， ６３．４４， １４．４３．ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１９Ｈ１６ＣｌＦＮ３Ｏ４＋についての計算値、４０４．０８０８；実測値、４０４．０８００。
【０３２５】
（±）−４−（３−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−７−オール（（±）−ＪＧＫ０５０）．
【化６６】
2020536855.tif 000078
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ ９．６１ （ｓ， １Ｈ）， ８．３４ （ｓ， １Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ （ｄ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１９ （ｓ， １Ｈ）， ５．７０ − ５．５９ （ｍ， １Ｈ）， ４．２７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１７ ｐｐｍ （ｄ， Ｊ ＝ １０．６ Ｈｚ， １Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １５７．１８， １５３．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ２４７．４ Ｈｚ）， １５３．１３， １４８．７８， １４６．１４， １４１．９２， １３０．１２， １２８．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ）， １２７．７８， １２５．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ）， １１１．９５， １０９．８７， １０８．７１， １０８．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．３ Ｈｚ）， ８８．６３， ６７．２３ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１２ＢｒＦＮ３Ｏ３＋についての計算値、３９２．００４１；実測値、３９２．００３０。
【０３２６】
（±）−シス−及び（±）−トランス−Ｎ−（３−ブロモ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジメチル−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミンのジアステレオ異性体混合物（（±）−シス／トランス−ＪＧＫ０５１）．
【化６７】
2020536855.tif 000079
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３；（±）−シス／トランス ２：１）： δ ＝ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．６８ − ８．６３ （ｍ， １Ｈ）， ７．３７ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２８ − ７．２４ （ｍ， １Ｈ）， ７．１０ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５２ − ４．３９ （ｍ， １．３Ｈ）， ４．０９ − ３．９８ （ｍ， ０．７Ｈ）， １．４５３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， １．１Ｈ）， １．４５１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， １．１Ｈ）， １．３６９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １．９Ｈ）， １．３６８ ｐｐｍ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １．９Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３；（±）−シス／トランス ２：１）： δ ＝ １５５．８７， １５５．８４， １５３．１９， １５０．１２ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．５ Ｈｚ）， １５０．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．２ Ｈｚ）， １４９．８７， １４８．８９， １４６．７７， １４４．６４， １４３．６３， １２８．７３ （ｄ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ）， １２７．１５， １２７．１２， １２５．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２１．７１， １２１．７０， １１４．３０， １１３．９３， １１０．５４， １１０．４７， １０８．５７ （ｄ， Ｊ ＝ １９．４ Ｈｚ）， １０５．６６， １０５．２８ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ１６ＢｒＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４０４．０４０４；実測値、４０４．０３９３。
【０３２７】
（±）−シス−Ｎ−（３−ブロモ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジメチル−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（（±）−ＪＧＫ０５２）．
【化６８】
2020536855.tif 000080
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．６６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ７．４， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３０ − ７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ７．１０ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ − ４．４１ （ｍ， ２Ｈ）， １．３６９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３６８ ｐｐｍ （ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ３Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．８５， １５３．１９， １５０．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．１ Ｈｚ）， １４８．８９， １４６．７７， １４３．６３， １２８．７３ （ｄ， Ｊ ＝ １０．２ Ｈｚ）， １２７．１４， １２５．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２１．７１， １１４．３０， １１０．５４， １０８．５７ （ｄ， Ｊ ＝ １９．５ Ｈｚ）， １０５．６５， ７２．８５， ７２．５８， １４．７１， １４．５５ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ１６ＢｒＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４０４．０４０４；実測値、４０４．０４１６。
【０３２８】
Ｎ−（３−ブロモ−４−クロロ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０５３）．
【化６９】
2020536855.tif 000081
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ ９．７０ （ｓ， １Ｈ）， ８．３５ （ｓ， １Ｈ）， ７．９４ （ｓ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８， ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４７ − ４．３５ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １５７．０３， １５４．１４ （ｄ， Ｊ ＝ ２４９．５ Ｈｚ）， １５３．０１， １４９．３６， １４６．０８， １４３．７４， １３０．７５， １２７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．９ Ｈｚ）， １２６．８０ （ｄ， Ｊ ＝ １３．４ Ｈｚ）， １２５．３７ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ）， １１２．５０， １１０．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ２２．５ Ｈｚ）， １０９．６６， １０８．３９， ６４．５１， ６４．１４ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１ＢｒＣｌＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４０９．９７０２；実測値、４０９．９６９７。
【０３２９】
Ｎ−（３，４−ジブロモ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０５４）．
【化７０】
2020536855.tif 000082
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ ９．６５ （ｓ， １Ｈ）， ８．３４ （ｓ， １Ｈ）， ７．９２ （ｓ， １Ｈ）， ７．６７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３５ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １５６．９５， １５３．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ２４９．１ Ｈｚ）， １５２．９９， １４９．３５， １４６．０９， １４３．７４， １２８．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， １２８．１４， １２７．２１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．７ Ｈｚ）， １２０．９６， １１２．５１， １１２．３３， １０９．６８， １０８．３６， ６４．５１， ６４．１４ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１Ｂｒ２ＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４５３．９１９７；実測値、４５３．９１９１。
【０３３０】
Ｎ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０５５）．
【化７１】
2020536855.tif 000083
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．９９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．３， ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．７２ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３６ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．１６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ４．６， ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．９， ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４４ − ４．３６ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．５９， １５３．３５， １５２．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ２４３．１ Ｈｚ）， １４９．６９， １４６．６７， １４４．５２， １２８．７５ （ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ）， １２６．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， １２５．０６， １１７．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ）， １１６．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．９ Ｈｚ）， １１４．５２， １１０．４８， １０５．８５， ６４．６８， ６４．５０ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１２ＢｒＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、３７６．００９１；実測値、３７６．００７７。
【０３３１】
Ｎ−（３−ブロモ−２，６−ジフルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０５６）．
【化７２】
2020536855.tif 000084
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ ９．６０ （ｓ， １Ｈ）， ８．３２ （ｓ， １Ｈ）， ７．９４ （ｓ， １Ｈ）， ７．７４ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２１ （ｓ， １Ｈ）， ４．４４ − ４．３８ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １５７．７８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２４８．８， ３．３ Ｈｚ）， １５７．３７， １５５．０１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２４７．９， ４．９ Ｈｚ）， １５３．０８， １４９．４７， １４６．０４， １４３．８６， １３０．７６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ）， １１７．３０ （ｔ， Ｊ ＝ １７．５ Ｈｚ）， １１３．３０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２１．８， ３．０ Ｈｚ）， １１２．５６， １０９．４５， １０８．２８， １０３．５５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２０．４， ３．６ Ｈｚ）， ６４．５２， ６４．１４ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１ＢｒＦ２Ｎ３Ｏ２＋についての計算値、３９３．９９９７；実測値、３９４．０００８。
【０３３２】
Ｎ−（３−ブロモ−２，４−ジフルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０５７）．
【化７３】
2020536855.tif 000085
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．５１ （ｔｄ， Ｊ ＝ ９．０， ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ７．８， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３７ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５６．１０， １５５．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２４６．６， ３．５ Ｈｚ）， １５３．２８， １５１．２５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２４５．１， ４．０ Ｈｚ）， １４９．７４， １４６．５６， １４４．５３， １２４．３９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．８， ３．４ Ｈｚ）， １２２．７２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， １．８ Ｈｚ）， １１４．４２， １１１．４９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２２．５， ３．９ Ｈｚ）， １１０．３４， １０５．９８， ９７．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２５．７， ２２．９ Ｈｚ）， ６４．６９， ６４．５０ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１ＢｒＦ２Ｎ３Ｏ２＋についての計算値、３９３．９９９７；実測値、３９４．００１３。
【０３３３】
Ｎ−（３−ブロモ−５−クロロ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０５８）．
【化７４】
2020536855.tif 000086
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．６， ２．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １Ｈ）， ７．４１ （ｓ， １Ｈ）， ７．３７ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２６ （ｓ， １Ｈ）， ７．２８ − ７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ４．４４ − ４．３９ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．４５， １５３．１３， １４９．８８， １４８．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ２４１．７ Ｈｚ）， １４６．７６， １４４．７２， １３０．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ）， １２９．２６ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ）， １２６．０８， １２１．２１， １１４．６０， １１０．４９， １０８．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．９ Ｈｚ）， １０５．７１， ６４．７０， ６４．５２ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１ＢｒＣｌＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４０９．９７０２；実測値、４０９．９７１３。
【０３３４】
（±）−トランス−Ｎ−（３−ブロモ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジメチル−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（（±）−ＪＧＫ０５９）．
【化７５】
2020536855.tif 000087
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．６６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ７．３， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．３７５ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２８ − ７．２４ （ｍ， １Ｈ）， ７．１０ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０８ − ３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， １．４５１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．４４８ ｐｐｍ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ３Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．９０， １５３．１２， １５０．１２ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．５ Ｈｚ）， １４９．９０， １４６．５９， １４４．６５， １２８．７０ （ｄ， Ｊ ＝ １０．２ Ｈｚ）， １２７．１８， １２５．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ）， １２１．７４， １１３．８４， １１０．４３， １０８．５７ （ｄ， Ｊ ＝ １９．２ Ｈｚ）， １０５．３１， ７５．３１， ７５．０５， １７．２３， １７．２０ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ１６ＢｒＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４０４．０４０４；実測値、４０４．０４０５。
【０３３５】
Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０６０）．
【化７６】
2020536855.tif 000088
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．６７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４０ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．３３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．１， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３８ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．８４， １５３．０８， １４９．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ２４６．３ Ｈｚ）， １４９．８８， １４６．４２， １４４．６７， １２７．５５， １２７．１９ （ｄ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ）， １２５．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．１ Ｈｚ）， １２１．０５， １２０．４７ （ｄ， Ｊ ＝ １８．２ Ｈｚ）， １１４．３６， １１０．４３， １０５．９７， ６４．７１， ６４．５１ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１Ｃｌ２ＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、３６６．０２０７；実測値、３６６．０２０７。
【０３３６】
Ｎ−（３−ブロモ−２，５−ジフルオロフェニル）−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（ＪＧＫ０６１）．
【化７７】
2020536855.tif 000089
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ ９．６５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４０ （ｓ， １Ｈ）， ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．６３ − ７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２１ （ｓ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３７ ｐｐｍ （ｍ， ４Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １５７．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ２４３．５ Ｈｚ）， １５６．８４， １５２．９３， １４９．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．９ Ｈｚ）， １４９．４３， １４６．１６， １４３．８１， １２９．２２ − １２８．４４ （ｍ）， １１６．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ２６．７ Ｈｚ）， １１３．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ２５．７ Ｈｚ）， １１２．５３， １０９．７３， １０８．７６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２２．５， １２．５ Ｈｚ）， １０８．３３， ６４．５２， ６４．１５ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ１１ＢｒＦ２Ｎ３Ｏ２＋についての計算値、３９３．９９９７；実測値、３９３．９９８８。
【０３３７】
（±）−Ｎ−（３−ブロモ−２−フルオロフェニル）−７−エテニル−７，８−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キナゾリン−４−アミン（（±）−ＪＧＫ０６２）．
【化７８】
2020536855.tif 000090
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．６５ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．２， ７．３， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４０ （ｓ， １Ｈ）， ７．３７ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １Ｈ）， ７．２７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ６．４， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．２， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．９５ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １７．３， １０．７， ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．６０ （ｄｔ， Ｊ ＝ １７．３， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．４８ （ｄｔ， Ｊ ＝ １０．７， １．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８２ − ４．７４ （ｍ， １Ｈ）， ４．４２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．５， ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９ ｐｐｍ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．６， ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ＝ １５５．９０， １５３．３８， １５０．１４ （ｄ， Ｊ ＝ ２４２．４ Ｈｚ）， １４９．１２， １４６．７０， １４４．１２， １３１．４８， １２８．６４ （ｄ， Ｊ ＝ １０．３ Ｈｚ）， １２７．２４， １２５．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ）， １２１．７６， １２０．４３， １１４．２９， １１０．６９， １０８．５８ （ｄ， Ｊ ＝ １９．３ Ｈｚ）， １０６．０６， ７４．０３， ６７．８４ ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＤＡＲＴ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ１４ＢｒＦＮ３Ｏ２＋についての計算値、４０２．０２４８；実測値、４０２．０２３３。
【０３３８】
実施例４：例示的な化合物の生物活性及びアッセイプロトコル
無細胞ＥＧＦＲキナーゼアッセイをＥＧＦＲキナーゼ系（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｖ３８３１）を使用して実施した。２５０ｎＭ〜０．０３０５２ｎＭの２倍希釈での１３種の濃度、無薬物対照、及び無酵素対照を反応当たり２５ｎｇのＥＧＦＲ酵素に対して２連で使用した。ＡＤＰ−Ｇｌｏキナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｖ６９３０）を使用して阻害剤の存在下でＥＧＦＲ活性を測定した。
【０３３９】
患者由来の膠芽腫細胞を使用してＧＩ５０アッセイを実施した。４０，０００ｎＭ〜９．７７ｎＭ（ＧＢＭ株の場合）または４，０００ｎＭ〜０．９７７ｎＭ（肺癌株（ＨＫ０３１）の場合）の２倍希釈での１３種の濃度を３８４ウェルプレートにウェル当たり１５００細胞で４連で播種した。細胞を３日間インキュベートし、次いで増殖をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７０）によって評価した。参照として、エルロチニブは、６４２ｎＭ（ＨＫ３０１）及び２７８８ｎＭ（ＧＢＭ３９）のＧＩ５０を示した。
【０３４０】
薬物動態学的研究は、８〜１０週齢のオスのＣＤ−１マウスで実施した。示されたように２連でマウスに投薬した。その時点で、全血を後眼窩出血によって得、脳組織を採取した。血液試料を遠心分離して血漿を得、脳組織を洗浄してホモジナイズした。試料をアセトニトリルで抽出し、上清をスピードバックを使用して乾燥させた。乾燥した試料を５０：５０：０．１のアセトニトリル：水：ギ酸で可溶化し、Ａｇｉｌｅｎｔ６４００シリーズのトリプル四重極ＬＣ／ＭＳで定量した。
【０３４１】
【表３】
2020536855.tif 000091
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【０３４２】
実施例５：エルロチニブ及び本開示の例示的な化合物のタンパク質結合
エルロチニブ及び本開示のいくつかの例示的な化合物のタンパク質結合が以下の表４に示されている。Ｆｕは「未結合画分」を指す。
【表４】
2020536855.tif 000100
【０３４３】
実施例６：ＥＧＦＲｉ代謝応答体及び非応答体の分類
１９種の患者由来ＧＢＭ細胞株にわたる急性ＥＧＦＲ阻害でのグルコース消費の変化を特性化した。血清ベースの培養条件とは対照的に、患者の腫瘍の分子的特徴の多くを保存するグリオーマスフェアとして補充された無血清培地で細胞を培養した。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲｉ）であるエルロチニブでの処置は、放射性標識グルコース取り込み（１８Ｆ−ＦＤＧ）がＥＧＦＲ阻害で有意に減弱したＧＢＭのサブセットを同定した；以下「代謝応答体」と称する（図２１Ａ及び図２７Ａ）。ｓｉＲＮＡを使用してＥＧＦＲをサイレンシングすることにより、グルコース取り込みの低減が、エルロチニブのオフターゲット効果によるものではないことが確認された（図２７Ｂ、２７Ｃ）。ＥＧＦＲｉ処置細胞における１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの低減は、ラクテート産生、グルコース消費、及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の低下と関連していたが、グルタミンレベルは未変化のままであった（図２１Ｂ、図２７Ｄ〜Ｇ）。最後に、グルコース利用の低下は、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲのシグナル伝達（各々がＧＢＭ及び他のがんにおけるグルコース代謝を制御し得る）の変動と相関していた（図２８Ａ）。
【０３４４】
対照的に、すべての「非応答体」ＧＢＭ（すなわち、ＥＧＦＲｉまたはｓｉＲＮＡでの１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの変化なし）（図２１Ａ及び図２７Ｂ、２７Ｃ）では、ＥＧＦＲの強固な阻害にもかかわらず、グルコース消費、ラクテート産生、及びＥＣＡＲの変化は観察されなかった（図２１Ｂ、図２７Ｄ〜Ｇ、及び図２８Ｂ）。その上、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲのシグナル伝達は、これらの細胞では大きく影響を受けなかった（図２８Ｂ）。注目すべきことに、すべての代謝応答体は、ＥＧＦＲの変化（コピー数増加、変異）を有していたが、代謝応答を有しない６種のＧＢＭ株もＥＧＦＲの変異及び／またはコピー数増加を有していた（図２９Ａ、２９Ｂ）。まとめると、これらのデータは、２つの重要なポイントを示している。第一に、ＥＧＦＲの急性阻害は、初代ＧＢＭ細胞のサブセットにおけるグルコース利用を急速に減弱させること、第二に、ＥＧＦＲの遺伝子的変化だけでは、どのＧＢＭがＥＧＦＲｉに対して代謝応答を有するかを予測することはできなかったことである。
【０３４５】
実施例７：ＥＧＦＲｉ代謝応答体はアポトーシスのためにプライミングされる
グルコース代謝の変動は、アポトーシス促進因子の発現を誘導し、内因性アポトーシスを刺激し得、このことは、ＥＧＦＲｉに応答したグルコース取り込みの低減が、内因性アポトーシス経路を刺激するであろうことを示唆している。実際、急性エルロチニブ処置は、代謝応答体の培養物においてのみ、アポトーシス促進性ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢＩＭ及びＰＵＭＡの発現を促進した（図３０Ａ）。しかしながら、アネキシンＶ染色により、代謝応答体は、７２時間のエルロチニブ曝露後に、少しではあったが（約１７％）、非応答体（約３％）と比較して有意に高いアポトーシスを有することが明らかとなった（図２１Ｃ）。
【０３４６】
アポトーシス促進因子の明白な誘導にもかかわらず、アポトーシスのレベルが低いことにより、本発明者は、ＥＧＦＲｉでのグルコース取り込みの変動が、アポトーシスのためにＧＢＭ細胞を「プライミング」し；それ故、有意な細胞死を誘導せずにアポトーシスの傾向を増大させるかどうかという疑問を抱くに至った。これを試験するために、本発明者は、代謝応答体及び非応答体の両方をエルロチニブで２４時間処置し、アポトーシスプライミングの変化を定量化するために動的ＢＨ３プロファイリングを実施した（図３０Ｂ）。複数のＢＨ３ペプチド（例えば、ＢＩＭ、ＢＩＤ及びＰＵＭＡ）を使用して、我々は、エルロチニブ処置された代謝応答体においてアポトーシスプライミング（ビヒクルに対するシトクロムｃ放出の変化によって決定される）の有意な増加を観察した（図２１Ｄ−暗灰色の棒）。重要なことに、代謝応答体におけるプライミングは、非応答体におけるプライミングよりも有意に高く（図２１Ｄ−薄灰色の棒）、ＥＧＦＲｉで減弱したグルコース取り込みがＧＢＭにおいてアポトーシスプライミングを誘発する根拠を示唆している。
【０３４７】
本発明者は、グルコース取り込みの低減が、ＥＧＦＲｉでのアポトーシスプライミングに必要かどうかを、グルコース消費を救済することがこれらの効果を減少させるかどうかを確認することによって試験した。これを試験するために、グルコーストランスポーター１（ＧＬＵＴ１）及び３（ＧＬＵＴ３）を２つの代謝応答体（ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９）で異所的に発現させた。ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ３（ＧＬＵＴ１／３）の強制発現は、両方の細胞株におけるグルコース取り込み及びラクテート産生のＥＧＦＲｉ媒介減弱を救済し（図２１Ｅ及び図３１Ａ〜Ｃ）を救済し、重要なことに、ＥＧＦＲｉに応答したアポトーシスプライミングを著しく抑制した（図２１Ｆ）。まとめると、これらのデータは、グルコース消費のＥＧＦＲｉ媒介阻害が、有意な細胞死を誘導するには不十分ではあるものの、アポトーシスの閾値を低下させ、このプライミングされた状態を利用する薬剤に対してＧＢＭ細胞を潜在的に脆弱にすることを実証している。
【０３４８】
実施例８：ＥＧＦＲｉでのアポトーシスプライミングには、細胞質ｐ５３が必要である
ＧＢＭがＥＧＦＲｉでアポトーシスのためにプライミングされるメカニズムを調査した。がん遺伝子駆動グルコース代謝の阻害により、ＧＢＭ細胞は、細胞質ｐ５３依存的アポトーシスに対して相乗的に感受性なものとなる。発がん性遺伝子シグナル伝達を標的とすることによる（例えば、ＥＧＦＲｉ）、ＧＢＭにおけるグルコース代謝フラックスの減弱は、内因性アポトーシス経路に関与する細胞質ｐ５３をもたらす（「プライミング」）。しかしながら、Ｂｃｌ−ｘＬは、細胞質ｐ５３媒介細胞死を妨げる。薬理学的なｐ５３の安定化は、このアポトーシス妨害を克服し、ＧＢＭにおけるがん遺伝子駆動グルコース代謝の組み合わされた標的化と相乗的致死性をもたらす。
【０３４９】
プライミングされた状態の細胞では、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）は、大部分がアポトーシス促進性ＢＨ３タンパク質（例えば、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＨＲＫ）で負荷されており；結果として、細胞は、生存のためにこれらの相互作用に依存する。腫瘍抑制タンパク質であるｐ５３は、細胞死を妨害するための抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質と後に結合する必要があるアポトーシス促進性タンパク質を上方制御することが知られている。ＥＧＦＲｉ誘導プライミングにｐ５３が必要かどうかを調べるために、我々は２つの代謝応答体（ＨＫ３０１及びＨＫ３３６、図２２Ａ）においてＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ−９でｐ５３をサイレンシングした（以下、ｐ５３ＫＯと称される）。ＥＧＦＲｉでのグルコース消費の変化は、ｐ５３ＫＯ細胞では影響を受けなかったが（図３２Ａ）、ＢＨ３プロファイリングにより、ｐ５３ＫＯがＨＫ３０１細胞及びＨＫ３３６細胞の両方においてエルロチニブ誘導アポトーシスプライミングをほぼ消失させたことが明らかとなった（図２２Ｂ）。
【０３５０】
ｐ５３転写活性は、グルコース制限下で増強されることが示されたので、ｐ５３媒介転写がＥＧＦＲｉによって誘導されたかどうかを決定するために我々は調査した。しかしながら、エルロチニブは、ｐ５３制御遺伝子（例えば、ｐ２１、ＭＤＭ２、ＰＩＧ３、ＴＩＧＡＲ）の発現を増加させず（図３２Ｂ）、ＨＫ３０１代謝応答体細胞においてｐ５３ルシフェラーゼレポーター活性も誘導しなかった（図３２Ｃ）。これらのデータは、ｐ５３がＥＧＦＲｉでのプライミングに必要であるが、その転写活性は必要ではない可能性があることを示している。
【０３５１】
ｐ５３のよく記載されている核機能に加えて、ｐ５３は、細胞質に局在し得、そこで内因性アポトーシス経路に直接関与し得る。細胞質ｐ５３がＥＧＦＲｉでのアポトーシスプライミングに重要であるかどうかを評価するために、我々は、核局在化シグナルを欠損したｐ５３変異体（ｐ５３ｃｙｔｏ）をＨＫ３０１及びＨＫ３３６のｐ５３ＫＯグリオーマスフェアに安定的に導入した。予想されたとおり、ｐ５３ｃｙｔｏは発現し（図２２Ｃ及び図３２Ｄ）、細胞質に限定され（図２２Ｄ及び図３２Ｅ）、転写活性を有さなかった（図２２Ｅ及び図３２Ｆ）。逆に、ＨＫ３０１及びＨＫ３３６のｐ５３ＫＯ細胞における野生型ｐ５３（ｐ５３ｗｔ）の再構成は、親細胞に類似する局在性を示し、ｐ５３制御遺伝子の転写を救済した（図２２Ｃ〜Ｅ及び図３２Ｅ〜Ｇ）。意外なことに、ｐ５３ｃｙｔｏの安定的な導入は、ＨＫ３０１及びＨＫ３３６の両方のｐ５３ＫＯ細胞においてエルロチニブでのプライミングをｐ５３ｗｔに匹敵するレベルまで有意に回復させ（図２２Ｆ及び図３２Ｇ）、ｐ５３の細胞質機能がＥＧＦＲｉ媒介プライミングに必要とされることを示している。この裏付けとして、転写活性がありながら（図２６２２Ｇ）核内に閉じ込められたｐ５３変異体（ｐ５３ＮＥＳ）をＨＫ３０１のｐ５３ＫＯ細胞に導入したところ、ＥＧＦＲｉ媒介アポトーシスプライミングを誘導することができなかった（図２２Ｇ、２２Ｈ及び図３２Ｈ）。最後に、ピフィトリン−μ（ＰＦＴμ）での細胞質ｐ５３活性の薬理学的阻害は、エルロチニブでのプライミングを著しく低減した（図３２Ｉ）。まとめると、これらの結果は、細胞質ｐ５３がＧＢＭにおいてＥＧＦＲｉを受けて内因性アポトーシス機構に関与することを示している。
【０３５２】
先行研究は、ヒト腫瘍由来のｐ５３変異体（特にＤＮＡ結合ドメインにおけるもの）が、トランス活性化欠損に加えて低下した細胞質機能を有することを実証した。それ故、本発明者は、ＨＫ３０１のｐ５３ＫＯにおけるこれらの「ホットスポット」ｐ５３変異体のうちの２つ、すなわち、Ｒ１７５ＨまたはＲ２７３Ｈの安定的な発現が、低減したＥＧＦＲｉ媒介プライミングを有するかどうか試験した（図３２Ｈ）。予想されたように、両方の変異体は、転写能力を欠いており（図２２Ｇ）、低減した細胞質活性と一致しており、ＥＧＦＲｉでのアポトーシスプライミングが不可能でった（図２２Ｈ）。そのため、先の知見と一致して、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインにおける発がん性変異は「二重攻撃」をもたらし、これによりトランス活性化及び細胞質機能の両方が無効とされる（後者はＥＧＦＲｉでのアポトーシスプライミングに関連を有する）。
【０３５３】
実施例９：ＥＧＦＲ駆動グルコース取り込みの阻害は、利用可能なＢｃｌ−ｘＬ依存性を創出する
Ｂｃｌ−ｘＬは、細胞質ｐ５３を隔離し、ｐ５３媒介アポトーシスを妨害し得る；それ故、プライミングされたアポトーシス状態及び生存のためのＢｃｌ−ｘＬへの依存性を創出する。実際、ＢＨ３プロファイリングは、ＥＧＦＲｉ代謝応答体における細胞生存のためのＢｃｌ−ｘＬへの依存性を明らかにした（図３３Ａ）。そのため、我々は、ＥＧＦＲｉでのグルコース消費の減弱は、Ｂｃｌ−ｘＬによる細胞質ｐ５３の隔離をもたらし得ると仮定した。これを調べるために、我々は、共免疫沈降を実施して応答体（ｎ＝２）及び非応答体（ｎ＝２）の両方においてＥＧＦＲｉに応答するｐ５３−Ｂｃｌ−ｘＬ相互作用の動態を調べた。重要なことに、我々は、代謝応答体ではエルロチニブ処置後にＢｃｌ−ｘＬとｐ５３の相互作用が顕著に増大したが（図２３Ａ）、非応答体ではそうではなかった（図２３Ｂ）ことを観察した。このことは、ＥＧＦＲ依存性グルコース消費の阻害が、Ｂｃｌ−ｘＬによるｐ５３の隔離をもたらすことを示唆している。この解釈と一致して、グルコース取り込み及びアポトーシスプライミングのＥＧＦＲｉ媒介低減を救済するＧＬＵＴ１／３の異所性発現は、ｐ５３とＢｃｌ−ｘＬとの関連を妨害した（図２３Ｃ及び図３３Ｂ）。これらの知見は、グルコース取り込みのＥＧＦＲｉ媒介阻害が、細胞質ｐ５３とＢｃｌ−ｘＬとの間の相互作用を促進することによってＧＢＭ細胞をアポトーシスのためにプライミングすることを強く示唆している。
【０３５４】
Ｂｃｌ−ｘＬからのｐ５３の遊離により、ｐ５３はＢＡＸを直接活性化し、シトクロムｃ放出及び細胞死をもたらすことが可能になる。我々は、ＥＧＦＲｉに応答する代謝応答体におけるＢｃｌ−ｘＬとｐ５３との間の結合の増加を認識すると、我々は、Ｂｃｌ−ｘＬからのｐ５３の移動がアポトーシスを誘発するかどうか疑問を抱いた。これを試験するため、我々は、代謝応答体（ＨＫ３０１）をエルロチニブ及び特異的Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤であるＷＥＨＩ−５３９で処置した。ＷＥＨＩ−５３９の添加は、エルロチニブ処置下でＢｃｌ−ｘＬとｐ５３との関連を破壊し（図２３Ｄ）、ＨＫ３０１及びＧＢＭ３９細胞（代謝応答体）において相乗的致死性をもたらした（図２３Ｅ）。注目すべきことに、細胞質ｐ５３は、ＥＧＦＲｉ代謝応答体の細胞における組み合わせの効果に十分であった（図３３Ｃ）。しかしながら、ＷＥＨＩ−５３９は、エルロチニブで処置された非応答体（ＨＫ３９３）においてアポトーシスを増強せず、このことは、ＥＧＦＲｉでのグルコース取り込みの減弱、及びその後のｐ５３とＢｃｌ−ｘＬとの関連が、生存のためのＢｃｌ−ｘＬへの依存性を生成するために必要であることを示唆している（図３３Ｅ）。この裏付けとして、ＧＬＵＴ１／３の強制発現は、その薬物の組み合わせで細胞死を有意に減少させた（図２３Ｆ及び図３３Ｄ）。まとめると、これらの観察は、Ｂｃｌ−ｘＬが、細胞質ｐ５３を隔離することによってグルコース取り込みのＥＧＦＲｉ媒介阻害に応答してＧＢＭ細胞死を減弱することを示している（図３２Ｇ）。
【０３５５】
実施例１０：ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化は、ＥＧＦＲｉ代謝応答体において相乗的である
メカニズム研究により、機能的ｐ５３に依存するＥＧＦＲ駆動ＧＢＭにおける潜在的治療機会が明らかとなった。ｐ５３シグナル伝達軸は、ＧＢＭにおいて変化する３つの主要な経路の１つであるが、ＴＣＧＡのＧＢＭデータセットの分析は、ｐ５３変異がＥＧＦＲの変化と相互排他的であることを実証した（図２８Ａ及び２８Ｂ）。逆に、ＥＧＦＲ変異または増加を有する患者において、ｐ５３経路は、ＭＤＭ２の増幅及び／またはＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座におけるＭＤＭ２の負の制御因子であるｐ１４ＡＲＦの欠失により抑制され得る。これらの関係性、及びＥＧＦＲｉで減弱したグルコース取り込み下でのプライミングのためのｐ５３の要件を考慮すると、我々は、ＭＤＭ２阻害を介したｐ５３の安定化が、Ｂｃｌ−ｘＬ拮抗に類似する治療効果を有し得ると仮定した。ヌトリン（ＭＤＭ２の広く特性化された阻害剤）を使用して、我々は、代謝応答体のグリオーマスフェアにおいてエルロチニブと対になった場合の顕著な相乗的致死性を発見した。ＨＫ３０１細胞の９０％超が、エルロチニブとヌトリンの組み合わせでアポトーシスを受けた（図２４Ｃ）。注目すべきことに、我々は、代謝非応答体ではこれらの薬物間の相乗効果が観察できなかった（ＧＳ０１７、図２４Ｃ）。次いで我々は、この組み合わせを初代ＧＢＭ細胞（すべてｐ５３野生型）の我々のパネルを通して試験し、ＥＧＦＲｉに対する代謝応答を有するＧＢＭのみで相乗的致死性を見出した（図２４Ｄ及び図３４Ａ）。ＥＧＦＲの遺伝子ノックダウンは、代謝応答体においてのみ相乗効果を確認した（図３４Ｂ）。重要なことに、ＧＬＵＴ１／３の強制発現は、エルロチニブとヌトリンの組み合わせでＢＡＸオリゴマー化、シトクロムｃ放出、及びアポトーシスを有意に低減し（図２４Ｅ及び図３４Ｃ）、エルロチニブとヌトリンの組み合わせの相乗効果には、ＥＧＦＲｉでのグルコース代謝の阻害が必要となるという考えを支持している。
【０３５６】
次いでエルロチニブ及びヌトリンの組み合わせに対する細胞死の誘発におけるｐ５３の役割を調査した。予想通り、２つのＥＧＦＲｉ代謝応答体（ＨＫ３０１及びＨＫ３３６）におけるｐ５３のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ−９標的化は、その薬物の組み合わせに対する感受性を完全に減少させた（図２４Ｆ）。同様に、Ｂｃｌ−ｘＬの異所性発現は、併用処置で細胞死を著しく抑制し、ｐ５３媒介アポトーシスに拮抗する際のＢｃｌ−ｘＬの重要な機能と一致した（図３４Ｄ）。その上、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害（例えば、ＷＥＨＩ−５３９）での結果と類似して、ヌトリンの添加は、エルロチニブ処置下でＢｃｌ−ｘＬからｐ５３を遊離した（図２４Ｇ）。これらのデータは、ｐ５３の安定化が細胞質ｐ５３媒介アポトーシスを刺激し得るという先行観察と一致している。細胞質ｐ５３活性が代謝応答体におけるＥＧＦＲｉ及びヌトリン誘導アポトーシスに必要であるという示唆の裏付けとして、ＰＦＴμでの細胞質ｐ５３活性の妨害は、その組み合わせの相乗効果を有意に低減したが（図３４Ｅ）、核内に閉じ込められたｐ５３変異体であるｐ５３ＮＥＳを含有するＨＫ３０１細胞は、エルロチニブ及びヌトリンでアポトーシスを増強することができなかった（図３４Ｆ）。最後に、がんの「ホットスポット」変異体であるＲ１７５Ｈ及びＲ２７３Ｈは、トランス活性化及び細胞質欠損の両方を有するが、その薬物の組み合わせに対して完全に非感受性であった（図３４Ｆ）。
【０３５７】
細胞質ｐ５３は、その薬物の組み合わせで細胞死を促進することが所望とされるが、我々は、ヌトリンとの相乗的アポトーシスの最適な実行のためには、ｐ５３の転写依存的及び非依存的機能の両方が必要であることをいくつかの例で観察した（図３４Ｆ）。これらの結果は、ｐ５３の転写非依存的機能が単独で内因性アポトーシスを実行し得る一方で、他の文脈では、細胞質ｐ５３媒介細胞死を刺激するためにその転写依存的機能を必要とし得るという報告と一致する。まとめると、本明細書に記載の結果は、ＥＧＦＲ駆動グルコース代謝及びｐ５３の組み合わされた標的化が、原発性ＧＢＭにおいて顕著な相乗的細胞死を誘導し得；これはｐ５３の細胞質機能に依存することを示している。
【０３５８】
実施例１１：グルコース代謝の調節は、ＥＧＦＲｉ非応答体をｐ５３媒介細胞死のためにプライミングする
前述のデータから、本発明者は、グルコース代謝のＥＧＦＲｉ媒介減弱がアポトーシス機構をプライミングし、ｐ５３活性化などのアポトーシス促進刺激と相乗効果をもたらすモデルを提案することに至った。相乗効果は、ＥＧＦＲ阻害剤による細胞ストレスの誘導、グルコース取り込みの低減及びアポトーシスのための細胞のプライミングならびにＢＣＬ−２のアンタゴニストによるｐ５３の安定化の間にある。ＥＧＦＲ阻害は、細胞ストレスにおける解糖を急速に減弱させ得る。これは、１）ｐ５３の活性化（例えば、ヌトリン、類似体または本明細書に記載の他のものを介する）及び２）ＢＣＬ−２の阻害（例えば、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラクス）などの本明細書に記載のようないくつかの薬剤のいずれかによる）によって内因性アポトーシスが有意に増強され得る腫瘍特異的脆弱性を創出する。
【０３５９】
このモデルの論理的予測は、グルコース代謝の直接的阻害がＥＧＦＲｉの効果を表現型模写すべきであるということである。これと一致して、グルコース代謝阻害剤である２−デオキシグルコース（２ＤＧ）の添加は、ＨＫ３０１細胞（ＥＧＦＲｉ代謝応答体）においてアポトーシスプライミング、ｐ５３のＢｃｌ−ｘＬへの結合、及びヌトリンとの相乗効果を刺激した（図４０Ａ、４０Ｂ、及び４０Ｄ）。興味深いことに、オリゴマイシン（複合Ｖ／ＡＴＰ合成酵素）またはロテノン（複合体Ｉ）での酸化的リン酸化の阻害は、ＨＫ３０１グリオーマスフェアにおいてヌトリン処置と相乗効果を示さなかった（図３５Ｃ及び３５Ｄ）。それ故、酸化的代謝ではなく、グルコース代謝フラックスの低減のみが、ｐ５３活性化に対する相乗的感受性に十分であるようである。
【０３６０】
このことは、本発明者が、ＥＧＦＲｉ非応答体におけるグルコース消費の調節が類似するｐ５３依存的脆弱性をもたらすかどうかを検討することを促した。これを調査するために、彼らは、２ＤＧでの、またはＰＩ３Ｋ（グルコース代謝のよく特性化されたドライバー）の標的化を介するグルコース取り込みの直接的阻害が、２つのＥＧＦＲｉ代謝非応答体においてアポトーシスプライミングを誘発するかどうかを試験した（図２５Ａ）。エルロチニブ処置とは対照的に、ピクチリシブでのＰＩ３Ｋの急性阻害は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲシグナル伝達を無効にし（図３５Ｅ）、ＨＫ３９３及びＨＫ２５４細胞における１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みを有意に低減した（図２５Ｂ）。ピクチリシブでのグルコース消費の減少は、有意により高いアポトーシスプライミングと関連しており、予想されたように、２ＤＧはこれらの効果と完全に酷似していた（図２５Ｂ及びＣ）。そのため、ＥＧＦＲｉ代謝非応答体は、グルコース取り込みの阻害後にアポトーシスのためにプライミングされ得る。重要なことに、ＨＫ３９３におけるｐ５３のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ−９標的化は、２ＤＧまたはピクチリシブによって媒介されるプライミングを有意に抑制した。（図２５Ｄ）。その上、ｐ５３依存的プライミングは、Ｂｃｌ−ｘＬ及びｐ５３の結合の増大と関連しており、アポトーシスを妨げるためのＢｃｌ−ｘＬによるｐ５３の隔離を示している（図２５Ｅ及び図３５Ｆ）。この解釈と一致して、２ＤＧまたはピクチリシブとヌトリンとの組み合わせは、ＥＧＦＲｉ非応答体の細胞において有意なｐ５３依存的相乗的致死性を引き起こした（図２５Ｆ及び２５Ｇ）。まとめると、これらのデータは、グルコース代謝の急性阻害が、直接的にまたは標的療法と共にのいずれかで、ＧＢＭにおいてｐ５３依存的アポトーシスプライミングを促進し；これは、増強された細胞死のための標的化可能な脆弱性を創出することを実証している。
【０３６１】
実施例１２：インビボでのＧＢＭを標的とするための組み合わせ療法の戦略及び非侵襲的バイオマーカー
細胞培養で得られた結果は、がん遺伝子駆動グルコース代謝及びｐ５３の組み合わされた標的化が、原発性ＧＢＭにおいて相乗的活性を有することを示している。このことにより、我々は、このアプローチが同所性ＧＢＭ異種移植片モデルにおいて有効であり得るどうかを調査するに至った。これらの研究のため、我々は、現在多くの悪性腫瘍のために臨床試験中である強力なＭＤＭ２阻害剤であるイダサヌトリンを用いた。イダサヌトリンについてのＣＮＳ浸透の不確実性を考慮して、我々はまず、イダサヌトリンが無傷の血液脳関門を有するマウスの脳内に蓄積し（脳：血漿、０．３５）、同所性腫瘍保持マウスにおいてｐ５３を安定化させ得ることを実証した（図４１Ａ、４１Ｂ）。
【０３６２】
次に、がん遺伝子阻害でのグルコース代謝の変動は、ｐ５３の活性化に対する相乗的な感受性に必要であることから、我々は、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴで測定されるＥＧＦＲｉ投与後のインビボでのグルコース取り込みの急速な減弱が、エルロチニブ＋イダサヌトリンの組み合わせた処置の治療効力のための非侵襲的な予測バイオマーカーとして機能し得ると推論した（図２６Ａ）。我々は、ＥＧＦＲ代謝応答体のグリオーマスフェア（ＧＢＭ３９）の同所性異種移植片において、急性エルロチニブ処置（７５ｍｇ／ｋｇ）が、１８Ｆ−ＦＤＧ取り込み（エルロチニブ投与から１５時間後）を急速に低減したことを観察した（図２６Ｂ及び図３６Ｃ）。マウスの別々の群では、彼らは、個々の薬物及び毎日のエルロチニブ（７５ｍｇ／ｋｇ）処置とイダサヌトリン（５０ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせを試験した。単一薬剤対照と比較して、我々は、最小限の毒性で、ＧＢＭ３９頭蓋内腫瘍保持マウスにおいて、相乗的な成長阻害（分泌ガウシアルシフェラーゼによって決定される）を観察した（図２６Ｂ及び図３６Ｄ）。対照的に、非代謝応答体（ＨＫ３９３）の同所性異種移植片は、急性ＥＧＦＲｉでの１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの変化を示さず（図２６Ｄ及び図３６Ｃ）、エルロチニブとイダサヌトリンの組み合わせでの相乗的活性も示さなかった（図２６Ｅ）。それ故、ＥＧＦＲｉでのグルコース取り込みの急速な変化を測定するために使用される非侵襲的１８Ｆ−ＦＤＧのＰＥＴは、エルロチニブとイダサヌトリンの組み合わせに対するその後の相乗的感受性を予測するのに有効であった。
【０３６３】
最後に、我々は、２つのＥＧＦＲｉ代謝応答体（ＧＢＭ３９及びＨＫ３３６）または２つの非応答体（ＨＫ３９３及びＧＳ０２５）のいずれかの同所性異種移植片における全生存期間に対するその薬物の組み合わせの効果を評価した。すべての腫瘍はｐ５３野生型であった（図２９Ａ）。腫瘍成長の証拠（ガウシアルシフェラーゼによって決定される）に続いて、マウスをビヒクル、エルロチニブ、イダサヌトリン、またはその組み合わせで最大２５日間処置した。その薬物の組み合わせは、ＥＧＦＲｉ代謝応答体のＧＢＭ腫瘍においてのみ生存期間の顕著な増加をもたらした（図３０Ｆ〜Ｉ）。まとめると、これらのデータは、ＥＧＦＲ及びｐ５３の組み合わされた標的化が、相乗的に成長を阻害し、ｐ５３野生型ＧＢＭ同所性異種移植片のサブセットにおいて生存期間を延長することを示している。重要なことに、１８Ｆ−ＦＤＧのＰＥＴは、この新しい併用療法戦略に対する感受性の非侵襲的な予測バイオマーカーとして価値があった。
【０３６４】
実施例１３：２ＤＧまたはサイトカラシンＢでの解糖の直接的阻害
我々は、ヘキソキナーゼ阻害剤（２ＤＧ）及びグルコーストランスポーター阻害剤（サイトカラシンＢ）での解糖の直接的阻害が、ヌトリンによるｐ５３活性化にどのように影響を及ぼすかを試験した。図３７に示される結果は、低グルコース（０．２５ｍＭ）が、ナビトクラクスまたはヌトリンでのＢＣＬ−ｘＬ阻害との相乗的な細胞死をもたらすことを実証している。細胞死は、単一薬剤としてまたはｐ５３活性化剤であるヌトリンとの組み合わせで解糖阻害剤である２ＤＧまたはサイトカラシンＢで７２時間処置されたグリオーマスフェア試料においてアネキシンＶ染色を使用して測定した。同じ効果は、低グルコース条件（０．２５ｍＭ）でグリオーマスフェアを培養し、ヌトリンまたはナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３）で７２時間それらを処置することによって繰り返された。
【０３６５】
実施例１４：実験手順
マウス
６〜８週齢のメスのＮＯＤｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）をＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ（ＵＣＬＡ）医療センター動物飼育施設から購入した。６〜８週齢のオスのＣＤ−１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。ＵＣＬＡの実験動物部門（ＤＬＡＭ）のＡＡＡＬＡＣ承認の動物施設において定義された細菌叢の病原体のない条件下ですべてのマウスを飼育した。すべての動物実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＯｖｅｒｓｉｇｈｔのＵＣＬＡオフィス（ＯＡＲＯ）の承認を得て実施した。
【０３６６】
患者由来のＧＢＭ細胞
ＧＢＭ細胞培養を誘導するためのすべての患者組織は、ＵＣＬＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）のプロトコル：１０−０００６５を使用して明示的なインフォームドコンセントにより入手した。先に記載されているように１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ヘパリン（５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、及びＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で補充されている）からなるグリオーマスフェア条件で初代ＧＢＭ細胞を確立し、維持した。すべての細胞を３７℃、２０％のＯ２、及び５％のＣＯ２で成長させ、商用利用可能なキット（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ，Ｌｏｎｚａ）を使用してマイコプラズマの存在について日常的にモニターし、陰性であることを試験した。実験時には、使用されたほとんどのＨＫ株は２０〜３０継代であったが（ＨＫ３８５ｐ８、ＨＫ３３６ｐ１５を除く）、ＧＳ及びＧＢＭ３９株は１０継代未満であった。すべての細胞は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析によって認証された。
【０３６７】
試薬及び抗体
以下の供給源からの化学阻害剤をインビトロ試験のためにＤＭＳＯに溶解した：エルロチニブ（Ｃｈｅｍｉｅｔｅｋ）、ヌトリン−３Ａ（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＷＥＨＩ−５３９（ＡＰＥｘＢＩＯ）、ピクチリシブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、オリゴマイシン（Ｓｉｇｍａ）、ロテノン（Ｓｉｇｍａ）、２ＤＧ（Ｓｉｇｍａ）を使用前に新たに媒体に溶解した。免疫ブロットに使用された抗体は列挙した供給源から入手した：β−アクチン（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３７００）、チューブリン（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３８７３）、ｐ−ＥＧＦＲ  Ｙ１０８６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３６−９７００）、ｔ−ＥＧＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０６−８４７）、ｔ−ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４６８５）、ｐ−ＡＫＴ  Ｔ３０８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１３０３８）、ｐ−ＡＫＴ  Ｓ４７３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４０６０）、ｔ−ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４６９５）、ｐ−ＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４３７０）、ｔ−Ｓ６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２２１７）、ｐ−Ｓ６  Ｓ２３５／２３６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４８５８）、ｔ−４ＥＢＰ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９６４４）、ｐ−４ＥＢＰ１  Ｓ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９４５１）、Ｇｌｕｔ３（Ａｂｃａｍ，ａｂ１５３１１）、Ｇｌｕｔ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０７−１４０１）、ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳＣ−１２６）、ＢＡＸ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，５０２３）、ＢＩＭ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２９３３）、Ｂｃｌ−２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２８７０）、Ｂｃｌ−ｘＬ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２７６４）、Ｍｃｌ−１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，５４５３）、シトクロムｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４２７２）、及び開裂カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９６６１）。免疫沈降に使用された抗体は列挙された供給源から入手した：ｐ５３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１２４５０）及びＢｃｌ−ｘＬ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２７６４）。二次抗体は列挙された供給減から入手した：抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ−結合（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，７０７４）及び抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ−結合（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，７０７６）。すべての免疫ブロット抗体は、１：１０，０００で使用したβ−アクチン及びチューブリンを除き、１：１０００の希釈で使用した。免疫沈降抗体は、製造者の指示に従って希釈した（ｐ５３の場合は１：２００及びＢｃｌ−ｘＬ５３の場合は１：１００）。二次抗体は、１：５０００の希釈で使用した。
【０３６８】
１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）取り込みアッセイ．
細胞を５×１０４細胞／ｍｌで播種し、示された時点で指定された薬物で処置した。適切な処置後、細胞を収集し、１８Ｆ−ＦＤＧ（放射能１μＣｉ／ｍＬ）を含有するグルコース非含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に再懸濁した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次いで氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで各試料の放射能をガンマカウンターを使用して測定した。
【０３６９】
グルコース、グルタミン、及びラクテートの測定
Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ生物プロファイルベーシック分析器を使用して細胞のグルコース消費及びラクテート産生を測定した。簡潔には、細胞を２ｍＬのグリオーマスフェア条件及び適切な薬物条件（ｎ＝５）で１×１０５細胞／ｍｌで播種した。薬物処置の１２時間後、１ｍｌの培地を各試料から除去し、Ｎｏｖａの生物プロファイル分析器で分析した。測定結果を細胞数に対して正規化した。
【０３７０】
アネキシンＶアポトーシスアッセイ
細胞を収集し、製造者のプロトコル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってアネキシンＶ及びＰＩ染色について分析した。簡潔には、細胞を５×１０４細胞／ｍｌで播種し、適切な薬物で処置した。示された時点の後、細胞を収集し、トリプシン化し、ＰＢＳで洗浄し、アネキシンＶ及びＰＩで１５分間染色した。次いで試料をＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。
【０３７１】
免疫ブロット
細胞を収集し、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）に溶解した。溶解物を１４，０００ｘｇで４℃で１５分間遠心分離した。次いでタンパク質試料をＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で煮沸させ、１２％のビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離し、ニトロセルロースメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。免疫ブロットは、抗体の製造者の仕様に従って、また先に記述されているように実施した。メンブレンはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して開発した。
【０３７２】
免疫沈降
細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＩＰ溶解緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、５％のグリセロール）中で４℃で１５分間インキュベートした。次いで３００〜５００μｇの各試料をタンパク質Ａ／Ｇプラスアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１時間プレクリアした。プレクリアの後、次いで試料を製造者の仕様に従って、また先に記述されているように抗体−ビーズ複合体と一晩インキュベートした。次いで試料を１０００ｇで１分間遠心分離し、ビーズを５００μＬのＩＰ溶解緩衝液で５回洗浄した。タンパク質を２ｘＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で９５℃で５分間煮沸することによってビーズから溶出した。試料を先に記載されたように免疫ブロットによって分析した。免疫沈降抗体を製造者の指示に従って希釈した（ｐ５３の場合は１：２００及びＢｃｌ−ｘＬの場合は１：１００）。
【０３７３】
動的ＢＨ３プロファイリング
ＧＢＭグリオーマスフェアをまずＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）で単一細胞懸濁液に解離し、ＭＥＢ緩衝液（１５０ｍＭのマンニトール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０２ｍＭのＥＧＴＡ、０．０２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、５ｍＭのスクシネート）に再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液（３×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートにおいて０．００２％のジギトニン及び示されたペプチドを含有する５０μｌのＭＥＢ緩衝液を保持するウェルに播種した。次いでプレートを２５℃で５０分間インキュベートした。次いで細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、続いてＮ２緩衝液（１．７Ｍのトリス、１．２５Ｍのグリシン、ｐＨ９．１）で５分間中和した。試料をＤＡＰＩ及び抗シトクロムｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する２０μＬの染色溶液（ＰＢＳ中１０％のＢＳＡ、２％のＴｗｅｅｎ２０）で一晩染色した。翌日、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用してシトクロムｃ放出を定量した。測定結果をシトクロムｃ放出を促進しない適切な対照（ＤＭＳＯ及び不活性ＰＵＭＡ２Ａペプチド）に対して正規化した。デルタプライミングは、ビヒクル処置細胞と薬物処置細胞との間のシトクロムｃ放出量の差を指す。
【０３７４】
ＢＡＸオリゴマー化
７．５×１０５細胞を示された薬物で処置した。２４時間の処置後、細胞を収集し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中１ｍＭのビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）に３０分間再懸濁した。次いで細胞を上述したように免疫ブロットのためにペレット化及び溶解した。
【０３７５】
シトクロムｃ検出
５百万個の細胞を１×１０５細胞／ｍＬの濃度で播種し、示された薬物で処置した。２４時間の処置後、細胞を収集し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。次いでミトコンドリア単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，８９８７４）を使用して細胞内分別を実施した。細胞質及びミトコンドリア画分の両方を免疫ブロットに供し、シトクロムｃを１：１０００の希釈でシトクロムｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４２７２）を使用して検出した。
【０３７６】
マウス異種移植片試験
頭蓋内実験のため、ＧＢＭ３９、ＨＫ３３６、ＨＫ３９３、ＧＳ０２５細胞をメスのＮＳＧマウス（６〜８週齢）の脳の右線条体に注射した（１回の注射当たり４×１０５細胞）。注射座標は、前頂の側方２ｍｍ、後方１ｍｍで、深さは２ｍｍであった。腫瘍負荷を分泌ガウシアルシフェラーゼによってモニターし、３回連続した成長測定の後、マウスを、適切なビヒクル、７５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブ、５０ｍｇ／ｋｇのイダサヌトリン、または両方の薬物の組み合わせからなる４つの処置群に無作化した。ビヒクルは、エルロチニブを溶解するために使用される水中０．５％のメチルセルロース、及びイダサヌトリンを溶解するために使用されるＲｏｃｈｅから入手した独自の製剤からなっていた。腫瘍負荷は、分泌ガウシアルシフェラーゼによって週に２回評価した。可能な場合、マウスを２５日間処置し、処置を中止し、生存をモニターした。薬物は経口強制摂取で投与した。試料サイズは、パイロット実験からの推定及び先の文献１２からの結果に基づいて選択した。調査者は、群割り当てまたは成果の評価が盲検化されなかった。すべての研究は、ＵＣＬＡ  ＯＡＲＯプロトコルガイドラインに従った。
【０３７７】
頭蓋内遅延ＰＥＴ／ＣＴマウスの画像化
マウスを示された用量及び時間のエルロチニブで処置し、次いで事前に温め、２％のイソフルランで麻酔し、７０μＣｉの１８Ｆ−ＦＤＧを静脈注射した。１時間の無意識の取り込みの後、マウスを麻酔から離脱させたが、さらに５時間の取り込みのために温め続けた。１８Ｆ−ＦＤＧの最初の投与から６時間後、マウスをＧ８  ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｓｏｆｉｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化した。上記に従って、定量化は、ＡＭＩＤＥソフトウェアを使用して３Ｄの対象領域（ＲＯＩ）を描画することによって実施した。
【０３７８】
免疫組織化学
ＦＦＰＥ（ホルマリン固定、パラフィン包埋）ブロックから切断された４μｍの切片について免疫組織化学を実施した。次いで切片をキシレンで脱パラフィン化し、等級化エタノールで再水和した。Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ圧力調理器において９５℃で４０分間ｐＨ９．５のＮｕｃｌｅａｒ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で抗原回復を達成した。次いで組織切片を３％過酸化水素（ＬＯＴ１６１５０９；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理して非特異的バックグラウンド染色を低減した。ｐ５３に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２５２７）を１：１５０希釈で８０分間適用し、続いてＭＡＣＨ３ウサギＨＲＰ−ポリマー検出キット（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で検出した。クロモゲンとしてベクターＮｏｖａＲＥＤ（ＳＫ−４８００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して可視化を達成した。最後に切片をＴａｃｈａの自動化ヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）でカウンター染色した。
【０３７９】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
Ｐｕｒｅｌｉｎｋ  ＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全細胞からＲＮＡを抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて製造者の指示に従ってｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０で定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。相対的な発現値は、対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化される  。プライマー配列は列挙されているとおりである（５’から３’）：Ｐ２１（フォワード  ＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＣＧＡＧＡＣＡＣＣ、リバース  ＧＡＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣ）、ＰＵＭＡ（フォワード  ＡＣＧＡＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＴＡＣＧ、リバース  ＧＴＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧ）、ＧＡＰＤＨ（フォワード  ＴＧＣＣＡＴＧＴＡＧＡＣＣＣＣＴＴＧＡＡＧ、リバース  ＡＴＧＧＴＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＴＧＣＧＧ）、ＭＤＭ２（フォワード  ＣＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＴＧＧ、リバース  ＡＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＡＡＧＣ）、ＴＩＧＡＲ（フォワード  ＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＴＴＡＣ、リバース  ＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧ）、ＰＩＧ３（フォワード  ＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＡ、リバース  ＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＡＴ）。
【０３８０】
Ｐ５３レポーター活性
ｐ５３応答性配列：ＴＡＣＡＧＡＡＣＡＴＧＴＣＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＧの制御下でルシフェラーゼをコードするｐ５３レポータープラスミドから合成されたレンチウイルスに細胞をまず感染させた。次いで感染した細胞を５，０００細胞／５０μＬで９６ウェルプレートに播種し、示された薬物で２４時間処置し、次いで１ｍＭのＤ−ルシフェリンと２時間インキュベートした。生物発光をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【０３８１】
遺伝子操作
一般に、遺伝子操作に使用されるレンチウイルスは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２９３−ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）をトランスフェクションすることによって作製した。トランスフェクションの４８時間後にウイルスを収集した。レンチウイルスｓｇｐ５３ベクター及びｓｇ対照ベクターはそれぞれ以下のガイドＲＮＡを含有していた：ＣＣＧＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＧＣ及びＧＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＧＧ。ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ−ｖ２をバックボーンとして使用した。Ｇｌｕｔ１及びＧｌｕｔ３のｃＤＮＡを商用利用可能なベクターからクローニングし、ＣＭＶプロモーターを含有するｐＬｅｎｔｉ−ＧＬｕｃ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレンチウイルスバックボーンに組み込んだ（Ｇｌｕｔ１はＷｏｌｆ  Ｆｒｏｍｍｅｒからの贈り物（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１８０８５４４）であり、Ｇｌｕｔ３はＯｒｉＧｅｎｅ＃ＳＣ１１５７９１から入手し、レンチウイルスバックボーンはＴａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＧＬ−ＧＦＰから入手した）。ｐＭＩＧ  Ｂｃｌ−ｘＬは、Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒからの贈り物（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８７９０４５）であり、上記のレンチウイルスバックボーン（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にクローニングした。細胞質（Ｋ３０５Ａ及びＲ３０６Ａ）及び野生型ｐ５３のコンストラクトは、Ｒ．Ａｇａｍｉ及びＧ．Ｌａｈａｖから親切な贈り物であった。対象となる遺伝子をＰＧＫプロモーターを含有するレンチウイルスベクターにクローニングした。ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン変異体（Ｒ１７５Ｈ）及び（Ｒ２７３Ｈ）ならびに核変異体（Ｌ３４８Ａ及びＬ３５０Ａ）のためのコンストラクトは、野生型ｐ５３コンストラクトに対して部位特異的変異誘発（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｅ０５５４Ｓ）を使用して生成した。
【０３８２】
ＥＧＦＲノックダウン実験の場合、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用してＥＧＦＲに対するｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｓ５６３）を細胞にトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、示された実験のために使用した。
【０３８３】
免疫蛍光
免疫蛍光のために、グリオーマスフェアをまず単一細胞に解離し、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して製造者の指示に従って９６ウェルプレートに付着させた。次いで付着した細胞を氷冷メタノールで１０分間固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。次いで細胞をＰＢＳ中１０％のＦＢＳ及び３％のＢＳＡを含有するブロッキング溶液と１時間インキュベートし、その後ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＳＣ−１２６，１：５０の希釈）抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、希釈１：２０００）と１時間インキュベートし、１０分間ＤＡＰＩ染色し、次いでＣａｓｃａｄｅ  ＩＩ蛍光カメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えるＮｉｋｏｎ  ＴＩ  Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡を使用して画像化した。細胞を４６１ｎＭ及び６４７ｎＭの発光で画像化し、次いでＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ分析ソフトウェアを使用して処理した。
【０３８４】
酸素消費率（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）測定
ＯＣＲ及びＥＣＡＲを含む代謝測定のために、示された薬物で処置されたグリオーマスフェアをまず単一細胞の懸濁液に解離し、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して製造者の指示に従ってＸＦ２４プレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に付着させた。アッセイに先行して、細胞を非緩衝化ＤＭＥＭで補充し、ＯＣＲ及びＥＣＡＲ測定を開始する前に３７℃で３０分間インキュベートした。対照及びエルロチニブで処置された細胞間の基底ＥＣＡＲ測定を示す。
【０３８５】
質量分析試料の調製
オスのＣＤ−１マウス（６〜８週齢）を経口強制摂取により５０ｍｇ／ｋｇのイダサヌトリンを２連で処置した。投与から０．５、１、２、４、６、８、１２、及び２４時間後に、マウスを屠殺し、後眼窩出血によって血液を採取し、脳組織を収集した。マウスの全血を遠心分離して血漿を単離した。イダサヌトリンを液−液抽出によって血漿から単離した：５０μＬの血漿を２μＬの内部標準及び１００μＬのアセトニトリルに添加した。マウスの脳組織を２ｍＬの低温ＰＢＳで洗浄し、新鮮な２ｍＬの低温ＰＢＳで組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。次いでイダサヌトリンを液−液抽出によって類似の手法で単離し、再構成した：１００μＬの脳ホモジネートを２μＬの内部標準及び２００μＬのアセトニトリルに添加した。ボルテックス混合後、試料を遠心分離した。上清を除去し、ロータリーエバポレーターによって蒸発させ、１００μＬの５０：５０の水：アセトニトリルで再構成した。
【０３８６】
質量分析によるイダサヌトリンの検出
クロマトグラフィ分離は、１００×２．１ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ）で１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。移動相は、溶媒Ａ：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中０．１％のギ酸、溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．１％のギ酸から構成されていた。分析物を５％のＢ（０〜４分）、５〜９９％のＢ（４〜３２分）、９９％のＢ（３２〜３６分）の勾配で溶出し、次いで５％のＢに１２分間戻して注入間で再平衡化した。クロマトグラフシステムへの２０μＬの注入は、０．１０ｍＬ／分の溶媒流速で使用した。質量分析は、６４６０トリプル四重極ＬＣ／ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施した。正モードでエレクトロスプレーを使用してイオン化を達成し、データ取得は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで行った。イダサヌトリンの検出に使用されたＭＲＭ遷移は、１１４Ｖのフラグメント電圧、及び２０ｅＶの衝突エネルギーでｍ／ｚ６１６．２→４２１．２であった。分析物シグナルを内部標準に対して正規化し、較正曲線（０．５、５、５０、２５０、５００、２０００ｎＭ）と比較の比較によって濃度を決定した。イダサヌトリンの脳濃度は、脳血管系内の残留血液についてマウス脳重量の１．４％で調整した。
【０３８７】
分泌ガウシアルシフェラーゼ測定
分泌ガウシアルシフェラーゼ（ｓＧｌｕｃ）レポーター遺伝子を含有するレンチウイルスベクター（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＧＬ−ＧＦＰ）に細胞を感染させ、マウスの右線条体内に頭蓋内に埋め込んだ（４×１０５細胞／マウス）。分泌ガウシアルシフェラーゼ（ｓＧｌｕｃ）のレベルを測定するために、マウスの尾静脈から６μＬの血液を収集し、直ちに５０ｍＭのＥＤＴＡと混合して凝固を防止した。Ｇｌｕｃ活性は、９６ウェルプレートに１００μＭのセレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）１００μＬを注入した後、化学発光を測定することによって得た。
【０３８８】
相乗効果スコアの計算
１．０×１０５のＧＢＭ細胞を３連で播種し、エルロチニブ、ヌトリン、またはその組み合わせで複数の濃度で各薬物を６種の濃度（０〜１０μＭ）で細胞に添加するマトリックスを使用して処置した。アネキシンＶ染色は、７２時間の処置後に測定した。Ｃｈａｌｉｃｅソフトウェアを使用して、その組み合わせの反応をその単一薬剤と比較した。組み合わせの効果は、相乗効果スコアを使用して計算した。
【０３８９】
ＤＮＡシーケンシング
標的とするシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑを使用して次の遺伝子ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＭＳＨ６、ＮＦ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３について試料ＨＫ２０６、ＨＫ２１７、ＨＫ２５０、ＨＫ２９６について実施した。１試料当たり１００万〜２００万のリードがあり、１遺伝子当たり２３０の平均カバー率であった。これらの試料について全ゲノムＳＮＰアレイを使用してコピー数バリアントを決定した。ＧＢＭ３９の遺伝子プロファイルは、文献で先に報告されている。
【０３９０】
全エクソームシーケンシングは、試料ＨＫ１５７、ＨＫ２２９、ＨＫ２４８、ＨＫ２５０、ＨＫ２５４、ＨＫ２９６、ＨＫ３０１、ＨＫ３３６、ＨＫ３５０、ＨＫ３９０、ＨＫ３９３について実施し、ＳｅｑＷｒｉｇｈｔで行った。試料を別々のキャプチャー反応で２つのプールにグループ化した。Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｒａｐｉｄキャプチャー及びライブラリ調製を使用し、ＨｉＳｅｑ  ２５００、１００ｘのオンターゲットカバー率を有する２ｘ１００ｂｐ、２回の完全急速実行（各々が１つの正常な２倍体対照を有する）でシーケンシングを実施した。これらの試料についてのコピー数分析は、ＥＸＣＡＶＡＴＯＲソフトウェアを使用して行った。
【０３９１】
ＴＣＧＡ試料のアノテーション
ＴＣＧＡからの２７３種のＧＢＭ試料をＥＧＦＲ、ｐ５３及びｐ５３制御経路の遺伝子変化について分析した。変異の同時発生を調査し、有意な相互作用のみが表示されている。データを先に記載されているようにｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用して分析した。
【０３９２】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、商用利用可能な蛍光標識された二重色ＥＧＦＲ（赤）／ＣＥＰ７（緑）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して実施した。ＦＩＳＨハイブリダイゼーション及び分析は、製造者が示唆したプロトコルに従って細胞株で実施した。細胞をＤＡＰＩでカウンター染色し、蛍光プローブシグナルを二重及び三重色フィルターを備えるＺｅｉｓｓ（Ａｘｉｏｐｈｏｔ）蛍光顕微鏡下で画像化した。
【０３９３】
統計分析
比較は、両側不対スチューデントのｔ検定を使用して行い、ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。複数の独立した実験からのすべてのデータは、正規分散のものであると想定した。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．値を表している。すべての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して計算した。すべてのインビトロ及びインビボ実験について、試料サイズを事前決定するために統計的方法を使用せず、試料を除外しなかった。インビボ腫瘍測定については、最後のデータセットを群間の比較に使用した。上記で記載されているように、すべてのマウスを試験前に無作為化した。
【０３９４】
参照による組み込み
本明細書で記述されたすべての刊行物及び特許は、各々の個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが明確かつ個別に示されているかのようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先する。
【０３９５】
均等物
本発明の特定の実施形態が論述されてきたが、上記の明細書は例示的であり、制限的ではない。本発明の多くの変更は、本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討すると当業者に明らかになる。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの均等物の完全な範囲、ならびに明細書及びそのような変更を参照して決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３２Ｉ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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