(57)【要約】肺炎連鎖球菌に対するワクチン組成物及び方法を提供する。前記組成物はリポソームを含み、このリポソームは、１つ又は複数の血清型に由来する多糖類を有し、且つ、その表面に非共有結合的に付着し、外側に露出したタンパク質を有する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームを含むワクチン組成物であって、組成物中のリポソームの少なくともいくつかは、肺炎連鎖球菌の１つ又は複数の血清型に由来する莢膜多糖を封入しており、且つ、非共有結合性の付着を介してその表面に付着された１つ又は複数のタンパク質を有しており、そのタンパク質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に提示されている、ワクチン組成物。
【請求項２】
複数セットのリポソームを含むワクチン組成物であって、あるセット内の各リポソームは同じ血清型(他のセットの血清型とは異なる血清型)を封入し、組成物中のリポソームの少なくともいくつかは、非共有結合性の付着を介してその表面に付着された１つ又は複数のタンパク質を有しており、そのタンパク質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に提示されている、ワクチン組成物。
【請求項３】
血清型が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆからなる群より選択される、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
血清型が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、及び２３Ｆからなる群より選択される、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
少なくとも複数のリポソームが、第一の種類の莢膜多糖を封入し、少なくとも複数のリポソームが、第二の種類の莢膜多糖を封入する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
タンパク質がＰｎｃＯである、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ＰｎｃＯが、リポソームに非共有結合的に付着している唯一のタンパク質である、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ＰｎｃＯが、ストレプトアビジン-ビオチン連結を介してリポソームに付着している、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
タンパク質が、ポリヒスチジンタグを含み、及び、タンパク質が、リポソーム二重層中に存在する金属を介してリポソームに非共有結合的に付着している、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
個体を肺炎連鎖球菌に対して免疫化する方法であって、請求項１に記載のワクチン組成物を、個体に投与することを含む方法。
【請求項１２】
ワクチン組成物が複数セットのリポソームを含み、リポソームの各セットが、同じ種類の血清型(別のセットのリポソームに封入されている血清型とは異なる血清型)を封入し、組成物中のリポソームの少なくともいくつかは、非共有結合性の付着を介してその表面に付着された１つ又は複数のタンパク質を有しており、そのタンパク質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に提示されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、少なくとも２０セットのリポソームを含み、２０セットのリポソームが、合わせて以下の血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、及び２３Ｆを封入する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、少なくとも２４セットのリポソームを含み、２４セットのリポソームが、合わせて以下の血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆを封入する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質がＰｎｃＯである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＰｎｃＯが、ストレプトアビジン-ビオチン連結を介してリポソームに非共有結合的に付着している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複数セットのリポソームを別々に調製すること(各セットのリポソームは、独自の莢膜多糖を封入している)、次いで、複数セットのリポソームを混合して、ワクチン組成物を得ることを含み、さらに、リポソームの少なくとも一部の表面にタンパク質を非共有結合的に付着させて、タンパク質の少なくとも一部をリポソームの外側に露出させることを含む、請求項２に記載のワクチン組成物を製造する方法。
【請求項１９】
リポソームのセットの少なくともいくつかが、肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆからなる群より選択される莢膜多糖を封入している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質がＣＲＭ１９７又はＰｎｃＯである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2017年10月13日に出願された、米国仮出願第62/572,081号、及び2018年5月11日に出願された米国仮出願第62/670,419号に基づく優先権を主張し、それらの開示は、参照により本明細書に包含される。
【技術分野】
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所によって付与された助成AI088485及びAI117309の下で、政府の支援を受けて完成された。政府は、本発明に所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
共生微生物は一般に、生息宿主と共生関係を果たす。しかし、ある状況下では、病原性への移行が、通常では良性の共生生物からの疾患を促すことがある。このことは、治療が最初のコロニー形成を予防し、それによって将来の疾患の可能性を排除するが、共生関係の確立によってもたらされる何らかの利益(直接的又は間接的)も排除するかどうか、又は病原性移行の過程を標的としながら、治療がコロニー形成(及び関連する利益)を保持すべきかどうかという問題を提起する。このジレンマは、肺炎球菌性疾患に対処するための継続的なワクチン接種の努力によく表れている。
【０００４】
肺炎球菌性疾患は、世界中で数百万人が罹患している(特に若年者、高齢者、及び資源が限られた国)主要でグローバルな感染症脅威である。疾患の転帰には、肺炎、菌血症、髄膜炎、中耳炎(中耳感染症)などがある。一般的に前述したように、この疾患の治療は、感染の範囲及び疾患進行のステップのために困難である。
【０００５】
より具体的には、肺炎球菌性疾患の原因となる肺炎連鎖球菌によるヒトのコロニー形成は、ほぼ普遍的である(Bogaert et al., Lancet Infect Dis 4, 144-154 (2004))。例えば、コロニー形成は生後最初の数年以内に子供の95％を超えて生じる(Gray, et al., J Infect Dis 142, 923-933 (1980); Huebner et al., The Pediatric Infectious Disease Journal 19, 1017-1020 (2000))。コロニー形成の構成は、細菌細胞を覆う多糖の内容によって細分化される肺炎連鎖球菌の90を超える異なる血清型によって複雑化される(Daniels et al., J Pediatr Pharmacol Ther 21, 27-35 (2016))。現在のワクチンは、侵襲性感染に関連する肺炎連鎖球菌血清型の表面莢膜多糖(CPS：capsular polysaccharide)を収集し、精製し、組み合わせる(Feldman et al., The Journal of Infection, (2014))。このアプローチは初期のコロニー形成を最小限に抑え、集団免疫を可能にし、疾患を減少させるのに有効であった(Loo et al., The Pediatric Infectious Disease Journal 33 Suppl 2, S140-151 (2014))。
【０００６】
しかし、肺炎球菌性疾患の進行には、コロニー形成より多くのことが必要である。獲得すると、肺炎連鎖球菌は、無症候性バイオフィルムとして鼻咽頭に滞留する(Bakaletz, Paediatr Respir Rev 13, 154-159 (2012); Munoz-Elias et al., Infection and Immunity 76, 5049-5061 (2008))。言い換えれば、肺炎連鎖球菌は、上気道共生菌である。疾患はバイオフィルム散在時に発生し、一部の細菌が病原性になるよう刺激する破壊的事象(ウイルス感染など)によって、しばしば促される(図５)(Marks et al., mBio 4, (2013))。推移すると、これらの細菌はバイオフィルムから抜け出し；肺、血液、中耳、及び他の位置に広がり；そして上記の疾患型を引き起こす(Marks et al., Infect Immun 80, 2744-2760 (2012))。この観点から見ると、現在のワクチンオプションを介してコロニー形成を予防することは、その後の疾患進行を排除する上流ルートとして役立つ。
【０００７】
しかし、コロニー形成を制限することは、現在のワクチンによってカバーされる13〜23の血清型についてのみ可能であり、これは、これまでに同定された90を超える血清型にはほど遠い(Tin Tin Htar et al., BMC Infect Dis 15, 419 (2015))。従って、コロニー形成を排除することは、疾患を予防するが、残りの血清型に対して鼻咽頭にニッチを提供して居住を確立し、病原性に進行するという意図しない結果も提示する(Richter et al., Emerg Infect Dis 19、1074-1083 (2013); Weinberger et al., Lancet 378、1962-1973 (2011))。現在の戦略によれば、普遍的なカバレージを提供することができる唯一の仮説的なワクチンは、肺炎連鎖球菌のあらゆる既知の血清型由来の多糖表面抗原を取り込むであろう。このような方針は、製造の観点から法外に高価であり、且つ、未だ検出されていない肺炎連鎖球菌血清型又は全く異なる上気道共生生物及び病原体によるニッチ置換の危険性を排除しない(Weinberger et al., Lancet 378、1962-1973 (2011); Hausdorff et al., Expert Review of Vaccines 14、413-428 (2015); Madhi et al., Journal of Infectious Diseases 196, 1662-1666 (2007); Keller et al., Emergence and Pathogenesis. mBio 7, e01792 (2016); Spijkerman et al., PloS One 7、e39730 (2012))。そのため、新たな血清型の問題に対処できるワクチン戦略、又はコロニー形成と病原性移行の両方に対して複合的アプローチを提供するワクチン戦略は、未だ利用可能ではない。
【発明の概要】
【０００８】
本開示において、コロニー形成に対する抗原、及び病原性移行に対する抗原を含む組成物及び方法が提供される。例えば、最も攻撃的な肺炎連鎖球菌血清型のコロニー形成を防止するためのものと、病原性移行を制限するためのものとの２つのクラスの相補的抗原の非共有結合性・共局在化は、動物被験体において完全なワクチンの有効性と、現在までに報告されている疾患の最も包括的なカバレージを提供する。その結果、本ワクチン製剤は、世界中で数1000万人から数億人を苦しめる疾患を効果的に管理する見込みのある、普遍的な肺炎球菌性疾患の予防を提供する。このアプローチは、より一般的には、複雑な共生生物-宿主動態に応答して、バランスのとれた予防的治療戦略を提示する。
【０００９】
本開示において、二重機能性リポソーム製剤は、相補的抗原型(それぞれが共生生物疾患の進行における別の状態と関連する)の共局在化を可能にした。製造の観点から、リポソーム設計は、現在のワクチンオプションの製造とは全く対照的に、コスト効率が良く、スケーラブルな製剤を可能にする。効力の観点からは、リポソーム製剤のキャパシティ、及び封入抗原の広範かつ相殺的な性質は、肺炎球菌性疾患の市販ワクチンオプションにおける現在の標準であるプレベナー(Prevnar)及びニューモバックス(Pneumovax)対照に対して測定されるように、現在までに報告されている最も強固かつ包括的な免疫応答を可能にする。
【００１０】
本開示の組成物及び方法は、細菌多糖類のリポソーム封入(本明細書ではLEPS[liposomal encapsulation of polysaccharides]と呼ばれる)に関する。一態様では、本開示は、リポソームを含むワクチン組成物を提供する。組成物中のリポソームは、単一の種類の細菌多糖類又は複数の種類の細菌多糖類(例えば、莢膜多糖類)を封入(カプセル化)してもよい。リポソームの少なくともいくつかは、タンパク質の少なくとも一部がリポソームの外側に露出されるように、表面に非共有結合的に付着されたタンパク質を有する。例えば、リポソームは、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型由来の１つ以上の莢膜多糖を封入してもよく、そして非共有結合を介して表面に付着した１つ以上のタンパク質を有してもよく、その結果、タンパク質の少なくともいくらかの部分が、リポソーム外側への表面(外側表面)上に提示される。
【００１１】
ワクチン組成物は、複数の種類のリポソームを有してもよく、各種類は、異なる種類の単一の血清型又は血清型の組み合わせ(すなわち、莢膜多糖)を封入する。例えば、複数のリポソームが、第１の血清型を封入してもよく、複数のリポソームが第２の血清型を封入してもよく、複数のリポソームが第３の血清型を封入してもよい、などの例が挙げられ、その結果、組成物は、合計で、1〜約100の既知の血清型を封入するリポソームを有してもよい。さらなる血清型が同定されると、組成物は、新たに同定された血清型を封入するリポソームを添加することによって改変されてもよい。同様に、なおさらに、例えば、複数のリポソームが血清型の第１の組合せを封入してもよく、複数のリポソームが血清型の第２の組合せを封入してもよい。いくつかのリポソームの全ては、タンパク質の少なくとも一部がリポソーム外側への表面上に提示されるように、非共有結合的に付着されたタンパク質を有してもよい。一実施形態において、２０価(２０血清型)ワクチン組成物が提供され、ここで、リポソームは、リポソーム中に封入された単一又は複数の血清型を有し、及びリポソームは、非共有結合的に付着したCRM197、PncO又はGlpO、又はそれらの組合せをさらに有する。一実施形態において、２０の血清型は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F、及び23Fである。一実施形態において、前記ワクチンは２４価(２４血清型)のワクチン組成物であり、ここで、リポソームは、リポソーム中に封入された単一又は複数の血清型を有し、前記２４の血清型は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fである。
【００１２】
一例では、ワクチン組成物はリポソームを含み、リポソームは単一の血清型を有し、組成物中のすべてのリポソームの血清型内容物は同じであっても異なっていてもよい。従って、例えば、組成物はリポソームの複数のセットを有してもよく、ここで、リポソームの各セットは複数のリポソームを含み、各々は単一の血清型を封入する。血清型は、図１６に列挙される血清型から選択されてもよい。他の単一の血清型を含むリポソームのさらなるセットが調製されてもよく、そしてこの組成物に添加されてもよい。
【００１３】
組成物は、以下の１つ以上を有し得る：血清型１を封入する複数のリポソーム、血清型２を封入する複数のリポソーム、血清型３を封入する複数のリポソーム、血清型４を封入する複数のリポソーム、血清型５を封入する複数のリポソーム、血清型６Ａを封入する複数のリポソーム、血清型６Ｂを封入する複数のリポソーム、血清型７Ｆを封入する複数のリポソーム、血清型８を封入する複数のリポソーム、血清型９Ｎを封入する複数のリポソーム、血清型９Ｖを封入する複数のリポソーム、血清型１０Ａを封入する複数のリポソーム、血清型１１Ａを封入する複数のリポソーム、血清型１２Ｆを封入する複数のリポソーム、血清型１４を封入する複数のリポソーム、血清型１５Ｂを封入する複数のリポソーム、血清型１７Ｆを封入する複数のリポソーム、血清型１８Ｃを封入する複数のリポソーム、血清型１９Ａを封入する複数のリポソーム、血清型１９Ｆを封入する複数のリポソーム、血清型２０を封入する複数のリポソーム、血清型２２Ｆを封入する複数のリポソーム、血清型２３Ｆを封入する複数のリポソーム、血清型３３Ｆを封入する複数のリポソーム。
【００１４】
リポソームに非共有結合的に付着され得るタンパク質の例としては、ジフテリアトキソイド変異体CRM197、又はPncO及びGlpOなどの細菌由来のタンパク質の表面露出タンパク質又は表面露出部分が挙げられる。多糖免疫原の産生に有用な免疫原性キャリアの他の例としては、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、及びツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)が挙げられる。
【００１５】
１つの局面において、本開示は、保護されるべき個体に、１つ以上の血清型がその中に封入されており、表面に非共有結合的に付着されて外側に露出された１つ以上のタンパク質を有するリポソームを含む組成物を投与する工程を含む、細菌感染(例えば、肺炎連鎖球菌感染)に対して個体を免疫するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
［図１］
市販の標準と比較したLEPSワクチンの有効性。マウスに、１）肺炎連鎖球菌血清型19F由来の莢膜多糖(CPS)を含有するLEPS、２）プレベナー13(PCV13)、３）ニューモバックス23(PPSV23)、４）PBS(偽：Sham)、及び５）種々の対照(CPS単独、CPS＋CRM197、及び空のLEPS[EL]＋CRM197)を0日目及び14日目にワクチン接種した。14日目と28日目に血清を採取した。（Ａ）LEPS、PCV13、PPSV23の抗体クラスシフトと（Ｂ）総IgG力価。（Ｃ）マウス敗血症モデルにおける血清型19Fの致死的攻撃に対する防御。（Ｄ）オプソニン食作用活性(OPA)アッセイを用いた選択的ワクチン接種戦略の機能的抗体活性評価。（Ｅ）コロニー形成後5日目に測定した未免疫マウス又は免疫マウスで評価した鼻咽頭細菌負荷量。（Ｆ）CD4+T細胞枯渇が無い(白)又は有る(黒)マウス血清において28日目(Post 2)に測定した19F CPS抗体価。N.S.：有意差なし
【００１７】
［図２］
PncO及びGlpOタンパク質抗原の免疫応答評価。（Ａ）アラム(alum)アジュバント又は空LEPSのいずれかによる初回(Post 1；左側の棒)及び追加免疫(Post 2；右側の棒)ワクチン接種後のマウス血清中の抗PncO及び抗GlpO抗体価。（Ｂ）追加ワクチン接種後のマウス血清におけるIgG1(Th2対応；左側の棒)及びIgG2a(Th1対応；右側の棒)の力価；IgG1/IgG2a比を棒の上に示す。（Ｃ）CD4+T細胞枯渇の無い(左側の棒)又は有る(右側の棒)マウス血清における抗PncO抗体価及び抗GlpO抗体価。（Ｄ）CD4+細胞枯渇有り又は無しでの、PspA(一般的に使用される肺炎球菌タンパク質抗原)(Li et al., Sci Adv 2, e1600264 (2016))又はPncO＋GlpOによるワクチン接種後のマウスの攻撃(チャレンジ)-防御敗血症モデル；肺炎連鎖球菌血清型19Fは負荷株(チャレンジ株)であり、１製剤当たり４匹のマウスを使用した。（Ｅ）PncO＋GlpOワクチン接種後のマウス血清中のIFN-γ(Th1対応)及びIL-17A(Th17対応)の力価。（Ｆ）初回及び追加ワクチン接種後のウサギ血清中の抗PncO抗体価及び抗GlpO抗体価。
【００１８】
［図３］
20の血清型にわたるCPS封入、及びGlpO及びPncOの表面局在化を特徴とする完全なLEPSプラットフォームの評価。（Ａ）ワクチン接種後のマウス血清における示された肺炎連鎖球菌血清型由来のPncO(左から１番目の棒)、GlpO(左から２番目の棒)、及び封入されたCPS(残りの棒)に対するIgG価。（Ｂ）プレベナー13(PCV13)、ニューモバックス23(PPSV23)、完全LEPSシステム(LEPS20:Pnco&GlpO)間のマウスの攻撃-防御データ比較であって、コロニー形成モデルとインフルエンザA投与によるインビボ撹乱を用いて、肺炎発症を促す。表示の血清型(プレベナー13(19F)及びニューモバックス(19F及び11A)で部分的にカバーされ、LEPS20:PncO&GlpOで完全にカバーされる)を負荷した場合のワクチン接種オプションに関する生存率が示される。（Ｃ）11A(左)及び35C(右)血清型を負荷した場合の、IAV投与1日後及び5日後の鼻咽頭表面(NP)、鼻咽頭洗浄液(洗浄)、肺、血液からの細菌数。
【００１９】
［図４］
1998年から2040年までの小児(5歳未満；Ａ)及び高齢者(65歳以上；Ｂ)における侵襲性肺炎球菌性疾患(IPD)発生率。IPDの総発生率は、PCV7(プレベナー7)、PCV13(プレベナー13)、PPSV23(ニューモバックス)、及び非ワクチン型(NVT)血清型によって引き起こされる疾患に分けられた。NVT血清型は、PCV13(Ａ)又はPPSV23(Ｂ)ワクチン内に含まれないものと定義される。1998〜2007年のPCV7血清型の発生率は、Pilispviliら(J Infect Dis 201, 32-41 (2010))が発表した研究から得た。PCV13血清型の総発生率及び発生率は、肺炎連鎖球菌についてのCDCの活性細菌コア(ABC：Active Bacterial Core)サーベイランスプログラムから得た(https://www.cdc.gov/abcs/reports-findings/survreports/spneu-types.html)。2007年以降(PCV7血清型)及び2015年以降(PCV13血清型)の発生率は、過去数年間に観察された傾向から予測した。PCV15(プレベナー15)導入後の総IPDの減少は、血清型侵襲性(Brueggemann et al., J Infect Dis 190、1203-1211 (2004); Sleeman et al., J Infect Dis 194、682-688 (2006))及びPCV7及びPCV13についての以前の傾向に基づいて予測された(その率はワクチン導入後4年で安定した)。LEPS導入を伴う(点線)又は伴わない(実線)IPDの予測は、2030年を超えて行われた。LEPSの導入後の4年間(Ａ)にわたるIPDの80％の減少又は10年間(Ｂ)にわたるIPDの90％の減少は、GlpO及びPncOタンパク質抗原(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A 113, 6898-6903 (2016))の98％配列カバレッジ、及び70の肺炎連鎖球菌血清型に対して実証された活性に基づいた(図６)。
【００２０】
［図５］
肺炎球菌性疾患を特徴とする共存疾患進行モデル。（Ａ）肺炎連鎖球菌のコロニー形成、バイオフィルムの確立、病原性への環境刺激、及びバイオフィルム放出と疾患症状。（Ｂ）現在のワクチンオプション(プレベナー及びニューモバックス；特定の血清型の莢膜多糖類[CPS]標的)及びLEPSプラットフォーム(現在カバーされているワクチン血清型のコロニー形成及び非ワクチンタイプ[NVT]血清型のバイオフィルム放出の両方に対処する)に及ぶ免疫標的。
【００２１】
［図６］
LEPSプラットフォーム。（Ａ）複合糖質ワクチン(例えば、プレベナー・ファミリー)とLEPSとの概略比較。（Ｂ）LEPS粒子を生成するための処方手順の概略図。
【００２２】
［図７］
LEPSの特性評価。：初期濃度に対する、多糖(PS)封入効率(Ａ；黒四角)又はタンパク質表面結合効率(Ｂ；黒円)（Ｃ）粒子表面電荷評価及び（Ｄ）粒度分布。（Ｅ）透過型電子顕微鏡によるLEPS粒子画像；１：LEPS表面；２：PS封入リポソーム；３：LEPS。
【００２３】
［図８］
現在のプレベナー7(PCV7)及び13(PCV13)治療オプションに及ぶ血清型を負荷した場合のLEPS免役化の防御能。20種の多糖類を含有するLEPS製剤(すなわち、LEPS20)で免疫したマウスを、敗血症モデルで評価し、負荷株(x軸)を、それぞれの複合糖質ワクチン中の含有に基づいてカテゴリーに分類した。具体的には「PCV7」表示にはプレベナー7及びプレベナー13の両方がカバーする細菌血清型が含まれるのに対し、「PCV13-ユニーク」グループには、プレベナー13がカバーする６つの追加血清型が示され、「非ワクチンタイプ」表示は、市販の複合糖質ワクチンに含まれていない血清型に相当する。
【００２４】
［図９］
ウサギにおけるLEPSワクチン戦略。ニュージーランド白ウサギを、肺炎連鎖球菌血清型19F CPSを含むLEPS粒子で免疫し(0日目)、追加免役し(14日目)、（Ａ）14日目(Post 1；左側の棒)と28日目(Post 2；右側の棒)の総IgG価について、及び、（Ｂ）OPAアッセイにより血清型19Fに対する機能的抗体活性(Post 2のサンプル)について、抹消血サンプルを分析した。
【００２５】
［図１０］
特定の肺炎連鎖球菌細胞型に対するGlpO及びPncOのOPAアッセイ。（Ａ）プレベナー13(PCV13)、Alumアジュバントを伴うGlpO＋PncO、空のLEPSを伴うGlpO＋PncOで免疫したマウス由来の血清によって媒介される浮遊性(左)及びバイオフィルム放出性(BFR)(右)血清型19F細菌に対するOPA。（Ｂ）浮遊性細菌、BFR細菌、及びCPSを除去するためにLL-37で処理した浮遊性細菌についてのペレット(左)及び上清(右)中の莢膜多糖(CPS)含量；「カプセル％」値は、各サブ図面中の浮遊性サンプルに対するものである。
【００２６】
［図１１］
プレベナー7(PCV7)と併用で(同時投与)又はプレベナー7を追加(add-on)投与したGlpO及びPncOの免疫原性の評価。（Ａ）色分けしたワクチン接種サンプルからもたらされた、PncO、GlpO、及び特定の血清型に対するIgG価。（Ｂ）プレベナー7と併用又はプレベナー7を追加免疫した場合のGlpO及びPncO(PG)投与時のマウス保護(左；敗血症誘発モデル)と細菌負荷(右；コロニー形成後5日目に測定)。マウスは血清型19F(プレベナー7及びプレベナー13[PCV13]でカバーされる)又は1(プレベナー7でカバーされないが、プレベナー13でカバーされる)を負荷された。
【００２７】
［図１２］
血清型19FによるマウスIAV誘発肺炎モデルを用いた場合のLEPS20:PncO&GlpOの追加評価。IAV投与の1日後及び5日後の鼻咽頭表面(NP)、鼻咽頭洗浄液(洗浄)、肺、ならびに血液からの細菌数。プレベナー13(PCV13)； ニューモバック23(PPSV23)
【００２８】
［図１３］
LEPS20:PncO&GlpOの追加的マウス疾患モデル評価。（Ａ）敗血症及び（Ｂ）肺炎疾患モデルを用いた、プレベナー13(PCV13)、ニューモバックス23(PPSV23)、及び完全なLEPSシステム間の、マウスの攻撃-防御データ比較。表示された血清型で負荷された場合の、ワクチン接種オプションにわたる生存率(ボックス内の動物の数)が示される。これらの血清型は、プレベナー13(19F)及びニューモバックス(19F及び11A)で部分的にカバーされ、LEPS20:PncO&GlpOで完全にカバーされる。
【００２９】
［図１４］
代替的なLEPS処方手順及びマウスの攻撃-防御アッセイにおける比較。肺炎連鎖球菌血清型4、6B、9V、及び14由来の多糖を混合し、リポソーム調製の間に同時処方するか、又はリポソーム粒子内に個々に処方し、次いでマウスワクチン接種の前に合わせた。次に、敗血症疾患モデルを用いて、マウス被験体に個々の血清型(x軸)を負荷した。
【００３０】
［図１５］
表Ｓ１：プレベナー13(PCV13)、ニューモバックス23(PPSV23)、及び20種の多糖類(すなわち、20価[20V])を含有するLEPS製剤間のOPA比較。値は、OPAアッセイにおいて50％の細胞死が生じた血清希釈度を表す。破線は非ワクチン血清型を示す；より高いOPA読み取り値は、特定の多糖に対するより強い抗体応答(すなわち、より高い力価)に起因する。
【００３１】
［図１６］
表Ｓ２：プレベナー13(PCV13)、ニューモバックス23(PPSV23)、及びPncO＋GlpOタンパク質抗原(Alumアジュバントとともに投与)間のOPA比較。値は、OPAアッセイにおいて50％の細胞死が生じた血清希釈度を表す。破線は非ワクチン血清型を示す；より高いOPA読み取り値は、その特定の多糖に対するより強い抗体応答(すなわち、より高い力価)に起因する。OPAアッセイで利用される血清型-特異的肺炎連鎖球菌株には、初期のコロニー形成(浮遊性)及び疾患(すなわち、バイオフィルム放出[BFR])に関連する細胞表現型が含まれる。
【００３２】
［図１７］
表Ｓ３：GlpO及びPncOの概要
【００３３】
［図１８］
GlpOによるワクチン接種は、潜在的なオフターゲット免疫原性のリスクを示す。Ａ）それぞれの細菌種についての、偽ワクチン接種に対して正規化された蛍光強度(例えば、偽ワクチン接種読み取り値は、それぞれの細菌についての異なる絶対蛍光読み取り値を表す)；ボックス内の数字は、GlpOの予測されるタンパク質エピトープとの相同性を表す。Ｂ）BFR EF3030、ストレプトコッカス・アガラクチア、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチラス・プランタルム、及びペディオコッカス・アシディラクチシのOPAアッセイ結果。破線は、細菌の50％死滅を表す。エラーバーは、4つの技術的再現の標準偏差を表す。
【００３４】
［図１９］
BFR肺炎誘発モデルにおける死に至るまでの時間。試験した血清型は、6C(Ａ)、35B(Ｂ)、15C(Ｃ)、16F(Ｄ)、23A(Ｅ)、及び9N(Ｆ)を含んだ。４匹のCD-1マウスに、偽対照、PCV13、PPSV23、及び、CRM197、GlpO、PncO、又はGlpO＋PncOを伴うLEPS(20V)のいずれかをワクチン接種した。用量は、各タンパク質のマイクログラム(34、68、又は136μg)で表される。
【００３５】
［図２０］
LEPS(20V):PncO用量漸増試験における、タンパク質(黒色)及びCPS(青色)抗原の相対抗体価。CD-1マウスに、LEPS(20V):PncO を、34(Ａ)、68(Ｂ)、及び136μg(Ｃ)のPncOで皮下接種した。エラーバーは、４つの生物学的再現の標準偏差を表す。
【００３６】
［図２１］
PncOの用量を増加した場合のIAV肺炎誘発。Ａ）様々な生理学的位置(鼻咽頭、鼻咽頭洗浄、肺、血液)における細菌負荷。Ｂ）各生理学的位置において17μg用量と比較した、細菌負荷に対するワクチン接種効果。PncO用量は、17(赤色)、34(青色)、68(緑色)、及び136μg(オレンジ色)、ならびに偽対照(黒色)とした。
【００３７】
［図２２］
10A、11A、15B、33FのCPSを含むためのLEPSワクチンの拡張。Ａ）投与後１(Post 1：左棒)及び投与後２(Post 2：右棒)の各CPSに対する相対抗体価。Ｂ）ワクチン接種後、IgG、IgM、IgA、及びIgEによってセグメント化されたCPS抗体プールの組成。Ｃ）偽、PCV13、PPSV23、LEPS(24V):PncO、及びLEPS(24V):CRM197から得られた、LEPS(24V)製剤に含まれる24のCPSすべてに対する相対抗体価。エラーバーは、４つの生物学的再現の標準偏差を表す。
【００３８】
［図２３］
代替的なタンパク質-リポソーム付着戦略の特性評価。Ａ）Co-PoP、Ni-NTA、Co-NTA、BSB及びBSリポソームを用いてEMSAアッセイで測定した、リポソームに結合するタンパク質の分画。インキュベーションは、10、20、30、又は60分間行った。エラーバーは、３つの技術的再現の標準偏差を表す。Ｂ）ワクチン接種後、IgG、IgM、IgA、及びIgEによってセグメント化されたCPS抗体プールの組成。Ｃ）1回目(左カラム)及び2回目(右カラム)の投与後の、PCV13及びPPSV23と比較した、代替のタンパク質-リポソーム付着製剤の相対抗体価。エラーバーは、４つの生物学的再現の標準偏差を表す。Ｄ）代替のタンパク質-リポソーム付着製剤を使用するOPAアッセイ；破線は、細菌の50％死滅を表す。ワクチン接種には、Ni-NTA、Co-NTA、BSB及びBSリポソームとともに、偽、PCV13、PPSV23が含まれる。エラーバーは、４つの技術的再現の標準偏差を表す。
【００３９】
［図２４］
免疫蛍光アッセイの結果とGlpOとの細菌相同性との相関。破線は95％信頼区間を表す。
【００４０】
［図２５］
GlpO用量増加抗体価。34(Ａ)、68(Ｂ)、又は136(Ｃ)μgのタンパク質を含むLEPS(20V):GlpO製剤をワクチン接種したマウスにおける、タンパク質(黒色)及びCPS(青色)抗体の濃度。
【００４１】
［図２６］
GlpO＋PncO用量増加抗体価。34(Ａ)、68(Ｂ)、136(Ｃ)、又は272(Ｄ)μgの総タンパク質を含むLEPS(20V):GlpO＋PncO製剤をワクチン接種したマウスにおける、タンパク質(黒色)及びCPS(青色)抗体の濃度。
【００４２】
［図２７］
表Ｓ４：交差反応性について試験したものを含む、種々のタンパク質領域の相同性パーセントを備えたGlpO相同体を有する細菌。
【００４３】
［図２８］
表Ｓ５：CD-1マウスの血液中の代謝産物の濃度
【００４４】
［図２９］
表Ｓ６：CD-1マウスにおける白血球の血液学的評価
【００４５】
［図３０］
表Ｓ７：LEPS(20V):PncO用量増加に関する50％死滅希釈の変化率
【００４６】
［図３１］
表Ｓ８：LEPS(20V):PncO用量増加に関する抗体価の変化率
【００４７】
［図３２］
表Ｓ９：LEPS(20V):PncO用量増加に関する完全なOPAデータ
【００４８】
［図３３］
表Ｓ１０：LEPS(20V):GlpO＋PnCO用量増加についての完全なOPAデータ
【００４９】
［図３４］
表Ｓ１１：LEPS(24V):PncO CPS OPA力価
【００５０】
［図３５］
表Ｓ１２：NVT血清型に対するラウンド１試験のCPS OPAデータ
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書中で使用される用語「免疫応答」とは、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、及び他のもの(侵入病原体、病原体に感染した細胞又は組織に対する選択的損傷、破壊、又は動物体からの排除をもたらすもの)の１つ又は複数を含む、免疫系の細胞の協調的作用を指す。
【００５２】
本明細書で使用する「免疫原」という用語は、哺乳動物において体液性抗体及び/又は細胞性免疫応答を刺激又は誘導することができる物質を指す。この用語は、本明細書で「抗原」と互換的に使用することができる。
【００５３】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、その天然の状態ではポリペプチドと通常は会合している他の巨大分子から実質的に分離されているポリペプチドを意味する。単離されたポリペプチドは、その天然の状態でポリペプチドと通常は会合する他の巨大分子を完全に含まなくてもよい。例えば、ポリペプチドは、少なくとも50、60、70、80、90、95、又は99％純粋であり得る。単離されたポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドを正常に発現する細胞から精製され得るか、合成され得るか、又は組換えDNA法を使用して産生され得る。
【００５４】
多糖類は、典型的には特定の血清型に由来する。表Ｓ１及びＳ２(それぞれ図１５及び１６)に示す血清型を含む多くの血清型は、特性決定され、当該分野で公知である。多糖類は、特定の細菌由来の莢膜多糖類である。製剤を調製するために使用される多糖類は、単離された莢膜多糖類であってもよい。
【００５５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含むポリマーを意味するために、互換的に使用され得る。短鎖は一般に、ペプチド(約30アミノ酸以下)、中鎖はポリペプチド(30〜1,000アミノ酸)、及び長鎖はタンパク質と呼ばれる。ポリペプチドは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドには、翻訳後プロセシングのような天然プロセスによって、又は当技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。
【００５６】
共有結合性の多糖-タンパク質カップリングとは対照的に、本開示はリポソーム技術を利用して、所望の細菌血清型(多糖)含量を封入し、次いで、所望のタンパク質を非共有結合的に付着させ、そして表面ディスプレイする。したがって、本開示は、リポソームによる、１つ又は複数の種類の細菌多糖類のリポソーム封入(LEPS)を提供し、これはさらに、非共有結合的に付着し表面提示された１つ又は複数の種類のタンパク質、例えば細菌タンパク質、例えば細菌表面に露出しているタンパク質を含む。細菌多糖類の例は、肺炎連鎖球菌由来の多糖類などの肺炎球菌多糖類である。プレベナー製剤とは対照的に、本発明のLEPS製剤は、多糖類及びタンパク質(例えば、CRM197)の非共有結合性-共局在化によって、複合糖質ワクチンの有効性を達成する。プレベナー及びニューモバックス製剤とは対照的に、本LEPS製剤は、多糖類及びタンパク質の両方を含み、コロニー形成ならびに病原性移行に対する戦略を提供する。LEPS製剤において、標的抗原(例えば、表面提示肺炎連鎖球菌タンパク質)は分離しており、プレベナー製剤に含まれる多糖類標的に加えて存在する。さらに、タンパク質抗原は、共生疾患移行の異なる側面を表しており、結果として生じる免疫応答の効力と幅に新たな側面を加えている。本製剤中のタンパク質抗原が選択されるのは、それらが免疫応答にアクセス可能であるように細菌(肺炎連鎖球菌など)に表面配置されるからである。
【００５７】
１つの局面において、本開示は、１又は複数種の細菌多糖類を封入するリポソームを含む組成物であって、そしてさらに、リポソームの表面に非共有結合的に付着され、提示される１又は複数種の細菌タンパク質を含む組成物を提供する。
【００５８】
タンパク質又は多糖に関する「種類(タイプ)」という用語は、任意の特定のタンパク質又は多糖分子を意味する。したがって、１つの「種類」のタンパク質又は多糖のみが存在する場合、それは、特定のタンパク質又は多糖の１つ以上の分子が存在し得ることを意味する。２種類以上のタンパク質又は多糖類が存在すると言われる場合、これは、複数種のタンパク質又は多糖類が存在することを意味する。
【００５９】
本開示のリポソームは、１つの種類の多糖(血清型)のみを封入しても、又は２つ以上の種類の多糖を封入してもよい。例えば、リポソームは、１種のみの細菌莢膜多糖をその中に封入しても、又は複数種の細菌莢膜多糖(例えば、肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖)をその中に封入してもよい。
【００６０】
血清型及び詳細は、種々の周知のソースから入手可能である。例えば、肺炎球菌の様々な血清型に関する情報は、CDCの世界肺炎球菌株バンク(Global Pneumococcal Strain Bank)や世界保健機関(WHO)から入手できる(who.int/biologicals/publications/meetings/areas/vaccines/pneumococcal/Pneumo%20Meeting%20Report%20FINAL%20IK%2024_Dec_08.pdf?ua=1)。肺炎球菌の莢膜多糖の例には、本開示の表Ｓ１(図１５)及びＳ２(図１６)に提供される血清型が含まれる。一実施形態において、血清型は、以下の１つ又は複数を含む：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A。一実施形態において、血清型は、4、6B、9V、14、18C、19F、23Fである。一実施形態において、血清型は、4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、及び19Aである。一実施形態において、血清型は、4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7Fである。一実施形態において、血清型は、1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fである。一実施形態において、血清型は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fである。一実施形態において、血清型は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fである。
【００６１】
多糖類は、表面多糖類であってもよく、例えば、チフス菌に対するVi多糖抗原、髄膜炎菌多糖類(A型、C型、W135型及びY型、ならびにB群髄膜炎菌の多糖類及び修飾多糖類を含む)、黄色ブドウ球菌由来の多糖類、ストレプトコッカス・アガラクチア由来の多糖類、肺炎連鎖球菌由来の多糖類、マイコバクテリウム、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス由来の多糖類(例えば、マンノホスホイノシチド トレハロース、ミコール酸、マンノースキャップ・アラビノマンナン、それからの莢膜及びアラビノガラクタンなど)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス由来の多糖類、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザのリポ多糖類、ヘモフィルス・インフルエンザb菌由来の莢膜多糖類、モラクセラ・カタラーリスのリポ多糖類、シゲラ・ソネイのリポ多糖類、クルーズ・トリパノソーマのリポペプチドホスホグリカン(LPPG)、癌関連ガングリオシドGD3、GD2、腫瘍関連ムチン、特にT-F抗原及びシアリルT-F抗原、及びT-F抗原に構造的に関連するHIV関連多糖類、髄膜炎菌多糖類−特に血清型A、B、C W-135及びYに由来のもの、ヘモフィルス・インフルエンザb菌(PRP)の莢膜多糖類など。
【００６２】
１つの局面において、本開示は、１種又は複数種の細菌性多糖(例えば、細菌性莢膜多糖)を封入するリポソームを含む組成物を提供する。一実施形態では、本開示は、肺炎連鎖球菌由来の細菌性莢膜多糖の１種又は複数種を封入するリポソームを含む組成物を提供する。本開示の組成物は、複数のリポソームを含んでもよく、リポソームの少なくともいくつかはそれぞれ、単一の種類の細菌(例えば、肺炎連鎖球菌)莢膜多糖を封入する。他のリポソームは、複数種の細菌性莢膜多糖を封入してもよい。いくつかのリポソームは、多糖類を封入しなくてもよい。一実施形態では、組成物は、i）単一の種類の多糖を含むリポソーム(この多糖は、異なるリポソームにおいて同じであっても異なっていてもよい)、及び/又はii）複数種の多糖を含むリポソーム(この複数種は異なるリポソームにおいて異なっていてもよい)を含む。さらに、任意に、いくつかのリポソームは、多糖類を封入しなくてもよい(本明細書では空と呼ばれる)。一実施形態では、組成物はリポソームを含み、前記リポソームは２種類以上の多糖を含む。一実施形態において、組成物はリポソームを含み、いくつかのリポソームは単一の種類の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入し、この単一の種類の肺炎連鎖球菌莢膜多糖は異なるリポソームにおいて異なっていてもよく、及び/又はいくつかのリポソームは２種以上の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入し、この２種以上の莢膜多糖は、異なるリポソームにおいて異なっていてもよく、そして任意で、いくつかのリポソームは空であってもよい。
【００６３】
組成物中の少なくともいくつかのリポソームは、タンパク質が外側表面上に提示されるように、表面に非共有結合的に付着されたタンパク質分子を有する。表面に提示されるタンパク質分子は、多糖類が存在するリポソームの水性区画に存在する必要はない。一実施形態では、表面提示タンパク質分子は、水性区画中に存在しない、すなわち、リポソームはタンパク質分子を封入しない。むしろ、タンパク質分子は、表面に非共有結合的にのみ付着され、リポソームの外側に提示される。タンパク質分子は、表面露出細菌タンパク質などの細菌タンパク質であってもよい。表面露出細菌タンパク質及び多糖は、同じ種類の細菌又は異なる種類の細菌に由来してもよく、又は非細菌タンパク質であってもよい。一例において、それらはストレプトコッカス・ニューモニアエ(肺炎連鎖球菌)由来である。
【００６４】
一実施形態では、組成物は、以下のものを含む：
ａ）１種(単一の種類)の細菌多糖を封入するリポソーム、及び/又は
ｂ）複数種の細菌多糖を封入するリポソーム；
ここで、リポソームの１つ又は複数は、その表面上に非共有結合的に付着しており、リポソームの外側に提示されるタンパク質分子を有する。
【００６５】
一実施形態では、組成物は、以下のものを含む：
ａ）１種の細菌多糖を封入するリポソーム、及び/又は
ｂ）複数種の細菌多糖を封入するリポソーム；
ここで、ａ）及び/又はｂ）のリポソームの１つ又は複数は、その表面上に非共有結合的に付着しており、リポソームの外側に提示されるタンパク質分子を有する。
【００６６】
一実施形態では、組成物は、以下のものを含む：
ａ）１種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入するリポソーム、及び/又は
ｂ）複数種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入するリポソーム；
ここで、少なくともいくつかのリポソームは、タンパク質分子の少なくとも一部がリポソームの外側に提示されるように、その表面に非共有結合的に付着したタンパク質分子を有する。一実施形態では、タンパク質分子は、表面露出肺炎連鎖球菌タンパク質である。
【００６７】
一実施形態では、組成物は、以下のものを含む：
ａ）１種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入するリポソームであって、前記莢膜多糖は、表Ｓ１及びＳ２(それぞれ図１５及び１６)に示す血清型からなる血清型の群より選択される、リポソーム、及び/又は
ｂ）複数種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入するリポソームであって、前記莢膜多糖は、表Ｓ１及びＳ２(それぞれ図１５及び１６)に示す血清型からなる群より選択される、リポソーム；
【００６８】
そしてここで、少なくともいくつかのリポソームは、タンパク質分子の少なくとも一部がリポソームの外側に提示されるように、その表面に非共有結合的に付着したタンパク質分子を有する。一実施形態では、タンパク質分子は、表面露出肺炎連鎖球菌タンパク質である。
【００６９】
一実施形態において、組成物は複数のリポソームセットを含み、ここで、リポソームの各セットは、組成物中のリポソームの他のセットに封入された１種の莢膜多糖とは異なる１種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入し、そしていくつかのリポソームは、いかなる莢膜多糖も封入していなくてもよく、そしてここで、リポソームの少なくともいくつかは、タンパク質分子の少なくとも一部がリポソームの外側に提示されるように、その表面上に非共有結合的に付着されたタンパク質分子を有する。一実施形態では、タンパク質分子は、表面露出肺炎連鎖球菌タンパク質である。前記１種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖は、表Ｓ１及びＳ２(それぞれ図１５及び１６)から選択され得る。
【００７０】
一実施形態では、組成物は、以下のものを含む：
ａ）１種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入するリポソーム、ここで、前記莢膜多糖は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fからなる血清型の群より選択される、及び/又は
ｂ）複数種の肺炎連鎖球菌莢膜多糖を封入するリポソーム、ここで、前記莢膜多糖は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fからなる群より選択される；
ここで、少なくともいくつかのリポソームは、タンパク質分子の少なくとも一部がリポソームの外側に提示されるように、その表面上に非共有結合的に付着したタンパク質分子を有する。一実施形態では、タンパク質分子は、表面露出肺炎連鎖球菌タンパク質である。
【００７１】
一実施形態では、組成物は、以下のものを含む：
ａ）１種の肺炎連鎖球菌多糖を封入するリポソーム、ここで、前記多糖は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fからなる血清型の群より選択される、及び/又は
ｂ）複数種の肺炎連鎖球菌多糖を封入するリポソーム、ここで、前記多糖は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fからなる血清型の群より選択される；
ここで、リポソームは、タンパク質分子の少なくとも一部がリポソームの外側に提示されるように、その表面上に非共有結合的に付着したタンパク質分子を有し、前記タンパク質分子は、CRM197、ジフテリアトキソイド(DT又はCRM197変異体)、破傷風トキソイド(TT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、精製ツベルクリンタンパク質(PPD)、表面露出タンパク質又は細菌由来のタンパク質の一部(PncO、GlpOなど)、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、選択されるものを含む。
【００７２】
一実施形態において、組成物は、リポソームを含んでもよく、各リポソームは、単一の血清型多糖を封入する。しかしながら、組成物内の異なるリポソームは、同一の又は異なった単一の血清型多糖を有してもよい。リポソームの表面に非共有結合的に付着したタンパク質分子は、異なるリポソーム上で同じであっても異なっていてもよい。リポソームは、表面上に提示される１種類のタンパク質分子、又は表面上に提示される複数種のタンパク質分子を有していてもよい。さらに、組成物中のいくつかのリポソームは、多糖類を封入していなくてもよく、組成物中のいくつかのリポソームは、表面上に付着し、提示されるタンパク質を有していなくてもよい。いくつかのリポソームは、多糖類を封入しているだけで、表面に付着したタンパク質を有していなくてもよく、いくつかのリポソームは、表面に付着したタンパク質のみを有し、封入された多糖類を有していなくてもよい。
【００７３】
リポソームが複数の細菌多糖類の種類(血清型)を封入する場合、その種類の数は2〜100であり得る。例えば、その数は、5〜50、5〜25、5〜20、又は2〜100のうちの任意の数であり得る。一実施形態では、リポソームは、100を超える多糖類の種類を封入することができる。特定の実施形態において、血清型は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又はより多い数(最大で100)であり得る。
【００７４】
リポソーム二重層は、当該技術分野で知られている１種又は複数種のリン脂質を含むことができる。多糖類を封入し、非共有結合によって表面上にタンパク質分子を提示する脂質構造は、単層であってもよい。一例では、組成物は、二重層、単層、又は他の脂質構造の混合物を含んでもよい。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「リン脂質」は、疎水性の脂質尾部に、グリセロール骨格を介して連結された親水性の頭部(リン酸基を有する)を有する脂質である。リン脂質は、炭素数6〜22個(これには、全ての整数個の炭素及びその間の範囲が含まれる)のアシル側鎖を含む。アシル鎖は飽和であっても不飽和であってもよい。リン脂質の例には、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールなどが含まれる。例として、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)が挙げられる。
【００７６】
一実施形態では、例えば、リン脂質は飽和又は不飽和の任意のリン脂質であってもよい。リン脂質中のアシル鎖は、6〜22個の炭素を含有することができる。リポソームは、コレステロール及び/又は他のステロールを含んでもよく、リン脂質はPEG化されてもよい。
【００７７】
一実施形態では、リポソーム二重層は、ポルフィリン・コンジュゲートを含むことができる。一例では、ポルフィリン・コンジュゲート内のリン脂質は、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである。ポルフィリン・コンジュゲートのリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及び/又はホスファチジルイノシトールを含んでもよく、又は本質的にそれ(それら)からなっていてもよい。一例では、ポルフィリンは、炭素数1〜20個(それらの間の全ての整数個の炭素を含む)の炭素鎖リンカーによって、リン脂質上のグリセロール基にコンジュゲートされる。
【００７８】
種々の実施形態において、リポソームの二重層は、ポルフィリン・コンジュゲートに加えて、他のリン脂質も含む。これらのリン脂質の脂肪酸鎖は、二重層を形成するために適切な数の炭素原子を含み得る。例えば、脂肪酸鎖は、12、14、16、18、20又は22個の炭素原子を含み得る。異なる実施形態では、二重層は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及び/又はホスファチジルイノシトールを含む。
【００７９】
例えば、リポソーム二重層は、ポルフィリン・リン脂質コンジュゲート、ポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質、任意にコレステロール、及び任意にPEG-リン脂質を含むことができる。PEGは、任意の便利なサイズであり得る。例えば、PEG部分の平均分子量は、500〜5000ダルトン(ならびにその間の全ての整数値及び範囲)であってもよい。他のPEGサイズが使用されてもよい。PEG-脂質は、0〜20モル％(小数第１０位までの、それらの間の全ての％値を含む)の量で存在することができる。PEG脂質の例として、DSPE-PEG(例えば、DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG-5000又は他のサイズのDSPE-PEG)が挙げられる。
【００８０】
本発明の二重層及び単層はまた、ステロールを含んでもよい。ステロールは、動物性ステロール又は植物性ステロールであってもよい。ステロールの例には、コレステロール、シトステロール、スチグマステロール、及びコレステロールが含まれる。ある実施形態において、コレステロールは、0モル％〜50モル％、又は0.1〜50モル％存在してもよい。他の実施形態では、コレステロールは、1〜50モル％、5〜45モル％、又は10〜30モル％存在し得る。
【００８１】
タンパク質又はペプチドは、それらが表面に提示されるようにリポソーム二重層に非共有結合的に付着している。一実施形態では、ヒスチジンで標識された(HIS-タグ)タンパク質が、タンパク質が表面に提示されるように、リポソームに非共有結合的に付着されていてもよい。例えば、リポソームは、二重層内に１つ又は複数の基/部分を含み得る(例えば、ポルフィリン、大環状分子、アミノ酸、又は金属イオンキレート脂質)。例えば、金属(例えば、Co2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、及びFe3+)を使用する場合、金属は二重層の中又は内に存在するように二重層中の成分にキレート化されてもよく、タンパク質が、タンパク質の一部(例えば、金属に結合する基又は部分、例えば、ヒスチジンタグなど)と前記金属との間の相互作用(例えば、配位)によって、前記金属に非共有結合的に付着されてもよく、タンパク質の少なくとも一部は二重層内に存在し、タンパク質の残りは構造の外側に提示される。例えば、二重層構造は、コバルト金属が二重層及びポルフィリン大環状分子の内部にあるようにコバルトがキレート化しているポルフィリンを含んでもよく、さらに、それに非共有結合的に付着したヒスチジンタグを有するタンパク質分子を有してもよく、Hisタグの少なくとも一部は二重層の内部にあり、コバルト金属コアに配位している。Hisタグを含む分子の残りは、リポソームの外側に提示される。別の例では、ニトリロ三酢酸(NTA)-ニッケルと多重ヒスチジンとの間で起こるような、金属キレート化-配位子相互作用は、ヒスチジン標識タンパク質のリポソームへの非共有結合を提供することができる。したがって、Ni-NTAは二重層に存在することができ、ヒスチジンタグはそれに非共有結合的に付着されることができ、その結果、タンパク質のHisタグの少なくとも一部は二重層内にあり、Niに配位されることになる。タンパク質分子の残りは、リポソームの外側に提示される。
【００８２】
一実施形態では、金属キレート化学の代わりに、他の親和性ベースのアプローチ(ストレプトアビジン-ビオチンに基づく化学など)を使用して、タンパク質をリポソームに非共有結合的に付着させることができる。リポソームは、その二重層内にストレプトアビジンを取り込むことができ、次いでビオチン化タンパク質をリポソーム二重層に非共有結合的に付着させることができる。例えば、ストレプトアビジンは、リポソームに共有結合的又は非共有結合的に付着され得る。別の例では、リポソームは、ビオチン化脂質を取り込むことができる(例えば、DSPE-PEG-ビオチン)。ビオチン化リポソームを、ストレプトアビジン結合タンパク質とインキュベートして、ビオチン-ストレプトアビジン・リンケージ(BS結合)を形成することができる。一実施形態では、ビオチン含有リポソームを、ストレプトアビジン及びビオチン化タンパク質に付着させて、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン・リンケージ(BSB結合)を作り出すことができる。
【００８３】
リポソームに非共有結合的にコンジュゲート可能なタンパク質の例は、CRM197である。多糖免疫原の産生に有用な免疫原性キャリアの他の例としては、ジフテリアトキソイド(DT又はCRM197変異体)、破傷風トキソイド(TT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、及び精製ツベルクリンタンパク質(PPD)が挙げられる。さらに、追加的又は代替的に、表面露出タンパク質又は細菌由来のタンパク質の一部(例えば、PncO又はGlpOなど)もまた、使用され得る。一実施形態では、PncO及びGlpOの両方を使用することができる。一実施形態では、GlpOのみ又はPncOのみを使用することができる。
【００８４】
例えば、連鎖球菌(例えば、肺炎連鎖球菌など)に対して防御的な免疫応答を誘発するPncO又はそのフラグメントが使用され得る。PncOは、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュータンス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ロドコッカスspに由来するものを含む、連鎖球菌種によって産生されるもののいずれか１つであってもよい。
【００８５】
PncOは、肺炎連鎖球菌由来のPncOのアミノ酸配列と同一である必要はない。その免疫原性、及びそれに対して産生される抗体の防御能力を変化させることなく、タンパク質配列に対して修飾を行うことができる。例えば、保存的置換が、以下のアミノ酸のグループ内で行われてもよい：１）アラニン(A)、グリシン(G)；２）アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；３）アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；４）アルギニン(R)、リジン(K)；５）イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；６）フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；７）セリン(S)、スレオニン(T)；及び８）システイン(C)、メチオニン(M)。例えば、抗原は、本明細書中で提供されるPncOの配列と90〜99％同一であってもよく、ここで、このタンパク質は連鎖球菌(例えば、肺炎連鎖球菌など)に対する防御抗体を誘発し得る。
【００８６】
PncOの配列は、肺炎連鎖球菌D39由来のPncO(blpY)が、GenBank受託番号ABJ54598.1として利用可能である。配列を以下に示す。PncO配列中の表面アクセス可能領域は、太字で示されている。
2020536968.tif 000002
【００８７】
一実施形態では、表面提示タンパク質の配列は、既知の配列と80〜99％同一であってもよい。従って、リポソーム表面に非共有結合的に付着したタンパク質は、既知の配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％又は少なくとも95％同一であってもよく、ここで、このタンパク質は連鎖球菌(例えば、肺炎連鎖球菌など)に対する防御抗体を生成し得る。一実施形態では、PncOは、配列番号１のPncOと少なくとも70％、好ましくは80又は85％、例えば少なくとも90％又は少なくとも95、98又は99％の同一性を有する。
【００８８】
GlpOの配列は、肺炎連鎖球菌D39に由来するものが、GenBank受託番号EC 1.1.3.21として利用可能である。配列を以下に示す。
2020536968.tif 000003
【００８９】
GlpO配列中の表面アクセス可能領域は、上記で太字で示されている。表面タンパク質は、本明細書中で提供されるGlpOの配列と80〜99％同一であってもよく、ここで、抗原は連鎖球菌(例えば、肺炎連鎖球菌など)に対する防御抗体を生成し得る。一実施形態において、表面タンパク質は、本明細書中で提供されるGlpO配列に対して、少なくとも70％の同一性、好ましくは80又は85％、例えば少なくとも90％の同一性又は少なくとも95、98又は99％の同一性を有する。
【００９０】
表面タンパク質は、本明細書中に記載されるタンパク質の組み合わせ、又は細菌の他の表面露出タンパク質、又はそれらの免疫原性変異体であってもよい。例えば、タンパク質はstkP又はPspAであってもよい。
【００９１】
リポソーム中のタンパク質及び多糖の量は、例えば、保護に望ましい量の応答を誘発するために、変化してもよい。一例として、製剤の用量あたりのリポソームに取り込まれるタンパク質の量は、1μg/用量から1mg/用量まで(その間の全ての0.1μg/用量の値及び範囲を含む：例えば、30〜650μg/用量)であってもよく、及び/又は、リポソーム中の多糖の量は10μg/用量から2.0mg/用量まで(その間の全ての0.1μg/用量の値及び範囲を含む：例えば、80〜1,100μg/用量)であってもよく、及び/又は、リポソーム脂質の量は500μg/用量から15mg/用量まで(その間の全ての0.1μg/用量の値及び範囲を含む：例えば、900μg/用量〜10mg/用量)である。製剤中に、例えば、キャリア又は賦形剤の形態の他のタンパク質があってもよく、なくてもよい。
【００９２】
複数の実施形態において、一用量あたりのリポソームに内包されるタンパク質は、10〜800μg/用量であってもよく(その間にある小数点第１０位及び範囲に至る、その間のすべての数値と範囲を含む)、及び/又は、一用量あたりのリポソームに含まれる多糖類は、10μg/用量〜1.5mg/用量又は50μg/用量〜1mg/用量であってもよく(その間にある小数点第１０位及び範囲に至る、その間のすべての数値と範囲を含む)、及び/又は、一用量あたりのリポソームに含まれるリポソーム脂質は、750μg/用量〜10mg/用量であってもよい(その間にある小数点第１０位及び範囲に至る、その間のすべての数値と範囲を含む)。
【００９３】
一例では、それぞれの多糖の量は2〜44μg/用量であり、タンパク質の量は15〜350μg/用量であり、リポソームの量は500〜5000μg/用量である。例えば、LEPS20V製剤は、一用量あたり約80〜900μgの多糖を有してもよく(表面積に正規化すると0.15〜1.25 mg/kg)、一用量あたり約30〜650μgのタンパク質(0.09〜0.9 mg/kg)を有してもよく、及び一用量あたり950〜9500μgのリポソーム(約1.4〜13.5 mg/kg)を有してもよく、前記製剤は、約0.14〜27μg/μgの多糖−タンパク質比(意図される用量では1.36)、1.1〜110μg/μgのリポソ−ム−多糖比(例えば、10.82)、及び1.5〜300μg/μg (例えば、14.71)のリポソーム−タンパク質比(例えば、14.71)を有する。別の例では、LEPS24V製剤は、一用量あたり約105〜1050μgの多糖(表面積に正規化すると0.15〜1.25 mg/kg)、一用量あたり約32〜650μgのタンパク質(0.09〜0.9 mg/kg)、及び一用量あたり950〜9500μgのリポソーム(1.36〜13.55 mg/kg)を有し、前記製剤は、0.16〜32μg/μgの多糖−タンパク質比(意図される用量では1.6)、0.9〜90μg/μgのリポソ−ム−多糖比(例えば、9)、及び1.5〜300μg/μgのリポソーム−タンパク質比(例えば、15)を有する。
【００９４】
種々の例において、リポソーム中の多糖−タンパク質の比は、0.1〜50w/w(多糖及びタンパク質の総重量に基づいて)であってもよく、前記値はそれらの間の全ての0.1値及び範囲を含む。種々の例において、リポソーム中の多糖−タンパク質の比は、0.1〜40w/w(多糖及びタンパク質の総重量に基づいて)であってもよい。種々の例において、リポソーム脂質−多糖比として表されるリポソームの多糖負荷は、0.5〜200w/w(リポソーム脂質及び多糖の総重量に基づいて)であってもよい。一例において、リポソーム脂質−タンパク質比として表されるリポソームのタンパク質負荷は、1〜500w/w(リポソーム脂質及びタンパク質の総重量に基づいて)であってもよい。
【００９５】
一例では、リポソーム(例えば、組成物中(例えば、一用量)のリポソーム)は、0.6〜0.7の多糖−タンパク質比(例えば、0.68)、及び/又は、10〜11のリポソーム脂質−多糖比(例えば、約10.8)、及び/又は、7〜8のリポソーム脂質―タンパク質比(例えば、約7.35)を有する。別の例において、組成物(例えば、一用量)は、0.75〜0.85(例えば、約0.8)の多糖−タンパク質比、及び/又は、約8.5〜9.5(例えば、約9.1)のリポソーム脂質−多糖比、及び/又は、7〜8(例えば、約7.35)のリポソーム脂質−タンパク質比を有する。
【００９６】
LEPS製剤内にさらなる多糖類をスケーラブルに封入するオプションは、現在の複合糖質ワクチンオプション(これは、CRM197への新しい血清型CPSの各共有結合を伴う、連続的な努力及び製造コストを必要とし、これは広範なワクチン適用範囲及びグローバルなアクセスの両方を制限する)との相違点をさらに強調する。LEPS製剤内に追加の多糖類をスケーラブルに封入することは、新しい１種以上の多糖類のみを封入するリポソームの追加、又は既存の及び新しい多糖類を封入するリポソームの調製の形で行うことができる。同様に、既存の製剤にリポソームを追加することによって(ここで、追加されたリポソームは、表面提示された新しいタンパク質を有する)、又は既存のタンパク質群及び新しいタンパク質を有するリポソームを調製することによって、新しい表面提示タンパク質がLEPS製剤に追加されてもよい。
【００９７】
製剤は、キャリア又は賦形剤を含むことができる。製剤は、免疫反応の程度又は性質を増強するためのアジュバントを含むことができる。免疫原性抗原及び/又はアジュバントの量の決定は、医薬又は獣医学の分野における標準的な技術に従うことができる。
【００９８】
一実施形態において、本組成物は、アジュバントを有さない。アジュバントは本発明の組成物では必須ではないが、所望であれば、アジュバントを使用してもよい。例えば、アジュバントは、リン酸緩衝生理食塩水中の0.001〜50重量％溶液として使用することができ、抗原は約0.0001〜約5重量％、例えば、約0.0001〜約1重量％、例えば、約0.0001〜約0.05重量％などのマイクログラム〜ミリグラムのオーダーで存在する。抗原は、マイクログラム〜ミリグラムのオーダー、又は約0.001〜約20重量％、例えば約0.01〜約10重量％、又は約0.05〜約5重量％の量で存在することができる。アジュバントは、免疫原性組成物中の別個の成分として投与されてもよく、又はリポソーム中に組み込まれてもよい。
【００９９】
ワクチンの調製において有用に使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられる：オイルアジュバント(例えば、フロイント完全アジュバント及び不完全アジュバント)、ミネラル塩、アラム(alum)、シリカ、カオリン、及び炭素、ポリヌクレオチド、ならびに微生物起源の特定の天然物質。アジュバントの例は、アルファ-ラクトアルブミンと脂肪酸との非共有結合複合体である。複合体を作製するのに有用な脂肪酸には、不飽和シスC14〜C20脂肪酸が含まれる(WO 2014/008465を参照)。
【０１００】
本発明のワクチン組成物では、キャリア及び/又は非キャリア-アジュバントを使用することができる。例としては、アルミニウムベースのアジュバント(アラム、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなど)、モノホスホリル脂質A(MPL)、及び3-O-脱アシル化モノホスホリル脂質A(又は3-De-O-アシル化モノホスホリル脂質A又は3-O-デスアシル-4'モノホスホリル脂質A)(3D-MPL)が挙げられる。
【０１０１】
医薬製剤は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はキャリアなどの添加剤を含むことができる。このような添加剤は、水及び油、生理食塩水などの液体、グルコースなど、ならびに助剤、安定化剤、増粘剤又は潤滑剤、湿潤剤又は乳化剤、又はpH緩衝剤、ゲル化剤又は粘度増強添加剤、洗浄剤及び可溶化剤(例えば、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)80、ポリソルベート20又は80とも呼ばれる)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、防腐剤(例えば、チメルソール、ベンジルアルコール)、増量物質(例えば、ラクトース、マンニトール)、香味剤、着色剤などであってもよく、投与経路及び所望する製剤に依存する。「Remington's Pharmaceutical Science」、第17版、1985年を参照。プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えば、オリーブ油及びコーン油)、ゼラチン、ならびに注射可能な有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)のような非水性溶媒又はビヒクルが使用され得る。製剤は凍結乾燥され、使用直前に再溶解又は再懸濁することができる。製剤は例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、組成物中に滅菌剤を組み込むことによって、組成物を照射することによって、又は組成物を加熱することによって、滅菌されてもよい。
【０１０２】
本技術の重要な特徴は、多糖類のタンパク質へのコンジュゲーションを必要としないことである。コンジュゲーション工程は単純ではなく、コンジュゲーションタイプのワクチン製剤では、含まれ得る多糖類(血清型)の数は、タンパク質のサイズによって制限される。対照的に、本技術は多糖類のタンパク質へのコンジュゲーションを必要としないので、いくつの血清型が製剤中に表され得るかが、限定されない。したがって、本製剤は、特定された新しい血清型を包含させるのに適応可能である。例えば、新しい血清型多糖を封入するリポソームを、既存の製剤に添加することができる。
【０１０３】
本発明の組成物は、液体製剤、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、徐放性製剤、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、又は肺炎連鎖球菌又は他の連鎖球菌に対して防御的な免疫応答を生じさせるために組成物を、被験体に導入するのに適した任意の他の形態として提供することができる。組成物は、ヒト又は非ヒト動物に投与することができる。
【０１０４】
組成物は、一般に集団に投与することができ、又は肺炎連鎖球菌のような連鎖球菌感染症を発症する危険性がある個体を標的とすることができる。例えば、それは、感染した個体と濃厚接触している任意の個体に投与され得る。
【０１０５】
組成物は、任意の適切な投与経路(非経口、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、粘膜(例えば、鼻腔内)、局所、皮内、及び経口投与を含むが、これらに限定されない)を使用して、被験体に導入されることができる。
【０１０６】
免疫化は単一用量によって行うことができ、又は間隔を空けた複数用量(例えば、1、2、3、4、又は5用量)によって行うことができる。例えば、初回投与用量及びその後の追加免疫用量を使用することができる。この組成物は単独で投与されてもよく、又は他の予防的組成物(例えば、他の免疫原性組成物など)又は治療的組成物(例えば、抗生物質など)と同時投与されても、又は連続的に投与されてもよい。
【０１０７】
一態様では、本開示は、肺炎連鎖球菌に対するワクチン組成物などのワクチン組成物を調製する方法であって、１つ又は複数のセットのリポソーム(１セット中のすべてのリポソームは、単一の同じ種類の莢膜多糖(血清型)を封入する)を調製する工程と、セットを混合して、所望の血清型を封入するリポソームを含む組成物を得る工程とを含む方法を提供する。従って、例えば、図１５及び１６の血清型の１つ又は複数を封入(被包)するリポソームを、ワクチン組成物形成のために使用できる。一例では、血清型は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fからなる群より選択される。さらなる血清型が所望される場合、これらのさらなる血清型を封入するリポソームが調製されてもよく、そして既存の組成物に添加されてもよく、又は以前の血清型と新しい血清型とを含む新しい組成物が調製されてもよい。
【０１０８】
１つの局面において、本開示は、個体における肺炎を予防する方法であって、本明細書中に記載される組成物の有効量を個体に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、集団における肺炎の全体的な発生率を減少させる方法を提供し、この方法は、集団中の複数の個体に、本明細書中に記載される有効量の組成物を投与することを含み、それによって、免疫原性組成物の投与が、集団中の個体の少なくともいくらかにおいて肺炎の発生を予防し、その結果、集団中の肺炎の全体的な発生率が減少する。
【０１０９】
連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせるリポソーム組成物について特定の言及がなされているが、本明細書に記載される戦略、組成物及び方法は任意の細菌に適用可能である。例えば、LEPS製剤は、黄色ブドウ球菌、ヘモフィルス・インフルエンザ、モラクセラ・カタラーリス、大腸菌、クロストリジウム・ディフィシルのワクチン組成物として使用することができる。他の細菌(それに対して本発明の組成物が処方され、使用される)には、ストレプトコッカス・アガラクチア、マイコバクテリウム、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・インフルエンザb菌、シゲラ・ソネイ、クルーズ・トリパノソーマ、ナイセリア・メニンギティディスなどが含まれる。
【０１１０】
以下の実施例は、例示的な実施例として提供され、いかなる方法による限定も意図しない。
【実施例１】
【０１１１】
最も優れたワクチン接種の比較
【０１１２】
現在の研究の最初の実験において、本発明者らは、特定の血清型由来の肺炎連鎖球菌多糖類を、免疫原性CRM197タンパク質(結合多糖成分の免疫反応性を増幅する能力があるジフテリア毒素の不活化突然変異体)に共有結合的に付着させることに依拠する、プレベナーワクチンファミリーの代替物を確立することを追求し、いわゆる複合糖質ワクチンを得た(例えば、プレベナー13は、CRM197に共有結合的に付着した13の異なる血清型多糖類を特徴とする)。共有結合性多糖−タンパク質カップリングとは対照的に、本発明者らはリポソーム技術を利用して、必要な多糖内容物を封入し、CRM197タンパク質を非共有結合的に付着させ、表面提示した(図６及び７;多糖類のリポソーム封入(LEPS)と呼ばれる)。そうすることにより、プレベナー13に匹敵する、IgMからIgGへのインビボ抗体シフトパターンと総抗体価の有効性、肺炎連鎖球菌の細菌攻撃に対する防御を達成した(図１Ａ〜Ｃ)。これらの比較において、ニューモバックス23ワクチン(23種の血清型由来の精製CPSを含む)も試験され、プレベナー13及びLEPS製剤と比較して、減少した有効性(抗体クラスシフト及び力価ならびに細菌攻撃防御)を示した。重要なことに、LEPSは、多糖とCRM197の非共有結合性・共局在化を介して複合糖質ワクチンの有効性を達成する。LEPS製剤内に追加の多糖類をスケーラブルに封入する選択肢は、現在の複合糖質ワクチンの選択肢(この選択肢は、CRM197への新しい血清型CPSの各共有結合による付着を伴う、連続的な努力及び製造コストを必要とし、したがって、広範なワクチン適用範囲及びグローバルなアクセスの両方を制限する)との相違点をさらに強調する(Gregorio, Nat Rev Immunol 14, 505-514 (2014))。
【０１１３】
さらなるアッセイは、LEPSプラットフォームによって与えられる免疫応答に対する洞察を提供した。すなわち、図１Ｄは、オプソニン食作用活性(OPA)アッセイからのデータを提示し、このアッセイでは、HL-60ヒト食細胞との共培養に先立って、免疫化マウス由来の血清を19F肺炎連鎖球菌血清型(現行のプレベナー製剤及びニューモバックス製剤により認識される)に添加する。細菌死滅は、３つ全てのワクチン製剤について容易に観察され、LEPSは再び、現在の標準に匹敵するレベルの性能を有する。表Ｓ１(図１５)は、３つのワクチン系に対するOPAアッセイによって評価された血清型のより完全な比較を示す。同様に、図８は、LEPS製剤に含まれる７つの非ワクチン血清型に加えて、プレベナー7及び13がカバーする血清型に対する防御の有効性を強調している。鼻腔洗浄実験では、19F肺炎連鎖球菌血清型が、このケースで比較されている３種類のワクチン系に含まれる対応する多糖類が原因で、マウス鼻咽頭内での居住を確立していないことが示される(図１Ｅ)。抗CD4+ T細胞枯渇アッセイ(抗体価が有意に低下された)によって、免疫応答機構の洞察が得られ、胸腺依存性経路を介した抗原プロセシングが示された(図１Ｆ)。最後に、ウサギ被験体内の抗体価及びOPA活性は、マウス被験体で観察されたものと一致したインビボでの傾向を示した(図９)。
【０１１４】
拡張性のタンパク質抗原血清型評価と普遍的適用範囲の見通し
【０１１５】
代替的な肺炎球菌疾患ワクチンを可能にしたのと同じリポソーム技術は、共生生物に基づく疾患進行の相補的側面に対処する興味深い可能性を持っている。すなわち、この製剤は、肺炎球菌の病原性移行を選択的に標的化する、タンパク質抗原(GlpO及びPncO；抗原発見及び検証モデル(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A 113, 6898-6903 (2016))を通じて同定される)のリポソーム表面局在化に加えて、現在のワクチンの基礎として役立つ多糖類(コロニー形成免疫標的)の同時封入を提供する(図５)。この可能性を検証する前に、OPAアッセイは、将来の免疫実験のための防御の相関として、GlpO及びPncOタンパク質抗原のより注意深い評価を可能にした。しかしながら、この場合、OPAアッセイは、対応する多糖又はタンパク質抗原成分に応答する、共生疾患進行のコロニー形成(表面CPSを含む浮遊細胞)局面及び分散(表面タンパク質抗原標的を提示するバイオフィルム放出細胞)局面の両方を評価した。その結果得られる洞察は、浮遊性CPS細胞標的のみを評価する従来のOPAアッセイ(それゆえ、コロニー形成予防に対する先天的バイアスを有する)とは対照的である。表Ｓ２(図１６)及び図１０に示すように、プレベナー13、ニューモバックス23、及びGlpO/Pncoタンパク質抗原は、それぞれの細胞標的に対して特異的活性を示す。注目すべきは、GlpO/PncOタンデムは、肺炎連鎖球菌の７０を超えるバイオフィルム放出血清型に対して活性であることである。これは肺炎球菌性疾患に対する進行性抗原の最大かつ最も包括的な評価であり、肺炎連鎖球菌血清型全体にわたるglpO/pncO遺伝子の高い配列保存性(Li et al., Sci Adv 2, e1600264 (2016))とともに、あらゆる病原性移行肺炎連鎖球菌細胞に対する普遍的な防御能を強調している。また、タンパク質抗原について、免疫応答機構(LEPS製剤内で又はLEPS製剤とは別で)についてより徹底的に検査したところ、マウスではTh1及びTh17活性に寄与する優勢なTh2応答(図２Ａ〜Ｅ)が、ウサギでは対応する体液性応答(図２Ｆ)が示された。抗原型の相補的な側面を支持して、PncO及びGlpOタンパク質を、プレベナー7との同時投与及び追加投与形式の両方で試験し、共生コロニー形成、病原性移行、又はその両方に対処することによる防御能力を実証した(図１１)。
【０１１６】
LEPS技術による包括的ワクチンプラットフォーム
【０１１７】
次に、PncO及びGlpOタンパク質抗原を、多糖類を封じ込めたリポソームにカップリングさせると、完全なLEPSビヒクル(LEPS20:PncO&GlpO;図３)が得られ、したがって、共生疾患進行ワクチン接種パラダイムの最終評価が可能になった。図１及び２のデータから、完全なLEPSビヒクルは、理想的な免疫応答特性(クラススイッチング、記憶、広範なT細胞活性化)を有することが期待された。肺炎球菌疾患移行のin vivoインフルエンザAウイルス(IAV)誘発性肺炎モデルで試験した場合、包括的かつ指向性の防御に加えて、完成したビヒクル内の抗原型(図３Ａ)の各々について液性応答がもたらされた。各戦略的血清型(19F[図１２]、11A、及び35C)についてのチャレンジアッセイは、プレベナー13及びニューモバックス23の防御限界を確認し、完全なLEPS系の完全な防御能力を強調する(図３Ｂ)。抗原相補性を強調すると、LEPS20:Pnco&GlpO製剤は、11A及び35C血清型によるコロニー形成を防ぐために必要とされる必要なCPSがなくても、完全な防御を提供する。関連する解剖学的プロファイリングにより、さらに、最終的なLEPS製剤が、非ワクチン血清型の疾患分散を阻害する能力が確認される。同様の結果は、肺炎及び敗血症疾患モデルでも見られる(図１３)。
【０１１８】
LEPSワクチンの有効性は重要な結果であったが、より広範な意義は、現在のワクチン製剤でカバーされていないニッチ置換血清型の病原性移行を防御すると同時に、肺炎連鎖球菌における最も侵襲性の高い血清型のコロニー形成を排除する二重の可能性である。これは、肺炎連鎖球菌株にわたる配列保存及び複数の抗原にわたる抗原連続変異の最小化によって補助される、GlpO及びPncO抗原の普遍的な保護能力(表Ｓ２(図１６))のために可能である。図４は、非ワクチン血清型の不応性と、このような懸念に対処するLEPS製剤の可能性を強調した、侵襲性肺炎球菌性疾患症例の現在の予測されるタイムラインを示している。注目すべきことに、LEPSプラットフォームはまた、現在の複合糖質ワクチン製品に付随する多糖類−タンパク質カップリング化学では経済的に実行不可能な選択肢で、(GlpO及びPncOタンパク質抗原を表面提示することに加えて)全ての既知の肺炎連鎖球菌血清型多糖類を封入する見通しを通じて、普遍性に関して技術的に実行可能なビジョンを提供する。そのため、LEPSプラットフォームは、共生性疾患進行の基本的な教義を予想しながら、現行ワクチンの最良の側面を組み合わせる。
【０１１９】
この開示は、２つの相補的抗原の共局在化により、肺炎球菌性疾患のための次世代ワクチンを提供する。現在のワクチン設計の有効性を損なうことなく、疾患に対するワクチン応答の普遍性を可能にする改変を導入する。こうして得られたLEPSプラットフォームは、侵襲的な血清型のコロニー形成を最小限に抑えると同時に、すべてのコロニー形成血清型に対する病原性移行を防御する。結果として、この完全な疾患進行経路は、肺炎球菌性疾患に取り組むという困難な側面に対する包括的な答えを提供するワクチンの開発を導いた。より広くは、本研究で概説される概念は、宿主に対する最大の利益に応じて、居住を排除又は保持するように調整可能なアプローチを用いて、微生物片利共生に対する利益及び欠点のバランスをとることを目的とする。
【０１２０】
材料及び方法
【０１２１】
実験計画
共生生物に基づく疾患進行の理解及び分析に由来する相補的抗原を、肺炎球菌性疾患ワクチン接種との関連において、リポソームキャリア-プラットフォームを用いて共局在化した。評価の様式には、リポソームベクターの特性評価；組織特異的疾患進行；抗体、サイトカイン、及びT細胞枯渇アッセイ；エンドポイント及び時間経過の攻撃防御アッセイ；包括的オプソニン食作用活性アッセイ；ならびにマウス及びウサギモデルで実施された試験が含まれた。データは、肺炎球菌性疾患の症例に普遍的に適用できる可能性のある、共生生物に基づく疾患のステージにわたって免疫応答を指令することができる強力なワクチン接種戦略を一様に支持している。
【０１２２】
倫理声明
本研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用のためのガイドの勧告に厳格に準拠して実施された。プロトコルは、バッファローにある大学の動物実験委員会の承認を受けた。全ての細菌接種及び処置は、動物のいかなる潜在的な苦痛をも最小限にするように設計された条件下で行われた。
【０１２３】
試薬
細菌及び細胞培養培地(化学的に定義された細菌増殖培地(CDM)を含む)及び試薬は、Fisher Chemical及びSigma-Aldrichから購入した。ヒツジ血液は、Hemostat Laboratoriesから購入した。脂質DOPG-Na及びDSPE-PEG2000は、NOFから入手し、DOGS-NTA-NiはAvanti Polar Lipidsから購入し、DOPC、コレステロール及びアラム(リン酸アルミニウムとして)、多糖類はSigma-Aldrichから購入した。LL-37はInvivoGenから購入した。Pfizer及びMerckから、それぞれプレベナー7及び13、ニューモバックス23ワクチンを入手した。
【０１２４】
抗原の調製
すべてのタンパク質(CRM197、緑色蛍光タンパク質[GFP]、PspA、GlpO、及びPncO)を、大腸菌を介してポリヒスチジンタグを用いて組換え生産した。GFP、CRM197、及びPspAに関する遺伝子を含むプラスミドは、協同的交換によって得られた(Li et al., Sci Adv 2, e1600264 (2016); Stefan et al., J Biotechnol 156, 245-252 (2011))。残りの遺伝子を、肺炎連鎖球菌ゲノムDNAからPCR増幅し、そしてPCRプライマーによって増幅産物に導入された制限部位SacI/XhoI(glpO)及びNdeI/XhoI(pncO)を使用して、別個のpET21cベクターにクローニングした(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A 113, 6898-6903 (2016))。プラスミドを制限消化及びコロニーPCRによって確認した後、最終構築物を、大腸菌BL21(DE3)に化学的に形質転換して、SDS-PAGEによる分析の前に、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG； 1mM)を使用して、0.4〜0.6のOD600nm値で3mLの溶原性ブロス(LB)培養物の導入を介して個々の発現を確認した。フレンチプレスを用いて細胞を破壊し、細胞溶解物を高速タンパク質液体クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare HisTrap HP、1×1mL)に通すことにより、確認された発現は、発現及びタンパク質精製のための1L規模の培養を促進した。最終タンパク質産物を、PiercTM Micro BCATMタンパク質アッセイを用いて定量した。
【０１２５】
LEPSの調製及び特性評価
タンパク質及び多糖成分を、リポソーム送達系を介して共局在化した。LEPSリポソームキャリアは、DOPC：DOPG：DOGS-NTA-Ni：コレステロール：DSPE-PEG2000からなり、そのモル比は総脂質量500μgに対して3：3：1：4：0.1であった。脂質をクロロホルムに溶解した後、溶液を、Branson 450D Sonifierを使用して1分間超音波処理し(テーパー付きチップを使用して20％振幅で)、次いで、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させてフィルムを形成した。次いで、脂質を、多糖抗原を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再水和してリポソームを形成し、次いで、200nmの孔径を有する手動押出機(Avanti Polar Lipids)に10〜12回通した。氷上で、バックグラウンドリポソーム溶液を50nm孔径フィルターに2回通し、毎回PBSで置換した。次に、タンパク質を、4℃で30分間、リポソームと共にインキュベートし、ポリヒスチジンタグ−Niキレート化を介して媒介される表面結合を形成した。CRM197は、図１；図８；図９；図１４；及び表Ｓ１(図１５)で使用したLEPS製剤に含まれた；CRM197は、図２；図３；図１０；図１２；及び図１３で使用したLEPS製剤には含まれなかった(GlpO/PncOに置き換えられた)。この段階で、未結合のタンパク質及び多糖を、4℃での一晩の透析(100kDa MWCO)によって、最終LEPS構築物から分離した。研究全体を通して、ワクチン接種で使用される最終製剤は、個別の多糖を含有するLEPS粒子の混合物から構成された。例えば、最終的な20価のCPS LEPS製剤は、20個の個別に調製されたサンプルを混合することから得られた。あるいは、同時製剤化アプローチもまた試験され(限られた数の血清型多糖を用いて)、上記の混合アプローチと比較され、最終ワクチン保護に差はなかった(図１４)。全ての最終LEPS製剤は、プレベナー及びニューモバックス製剤内で利用される同量の多糖内容物(及び必要に応じてCRM197タンパク質)を送達するように調製され、免疫化の前にPBS中で1：10に希釈された。
【０１２６】
LEPS粒子の特性評価は、多糖封入及び表面タンパク質結合効率を分析することによって開始した。多糖(19Fを使用)又はタンパク質(GFPを使用)―脂質比の範囲にわたって定量を完了させて、効率の交点を同定した(図７)。多糖類の評価のために、濃硫酸(150μL)及び30μLのフェノール(5％ w/v)を、50μLのリポソーム溶液に添加し、続いて80℃で30分間及び22℃で30分間インキュベートした後、495nmでの比色分析を行った。タンパク質含量を、359nmの励起波長及び508nmの発光波長での蛍光分析によって測定した。両方の分析を、Synergy 4 Multi-Mode Microplate Reader(BioTek Instruments、Inc.)を用いて行い、測定値を標準と比較し(グルコース又はGFPのいずれかを使用)、LEPS産生プロセスに導入された多糖及びタンパク質の初期量に対する比率を求めた。Zetasizer nano-ZS90(Malvern、Inc.)上の動的光散乱(DLS)を使用して、25℃でのリポソームの粒子直径及びゼータ電位を評価した。すべての実験は、4mW 633nm HeNeレーザーを光源として、入射レーザービームに対して90°の固定測定角で行った。LEPS粒子の画像はJEOL JSM-CXIIの100 kVにおける透過型電子顕微鏡分析により得られ、200メッシュFormvarと炭素被覆グリッド(FCF-200-Cu-TB、Electron Microsopy Sciences)をディップコーティングして調製したサンプルを使用し、その後、酢酸ウラニル1％溶液を用いてネガティブ染色を行った。
【０１２７】
ワクチンの予防接種
非近交系の6週齢の雌CD-1マウス(Harlan Laboratories)を免疫化実験に使用した。マウスを皮下注射(200μL)によって免疫化した；製剤のバックグラウンド溶液はPBSとした(「偽」陰性対照は、抗原成分なしで投与したバックグラウンド溶液とした)。最終タンパク質抗原レベルは、ネイキッド製剤又はリポソーム製剤(GlpO、PncO、CRM197、及びPspA)において12.5μgであった。組み合わせる場合、PncO及びGlpOは、それぞれ6.25μgで投与した。別段の指示がない限り、アラムアジュバントを、製造業者の指示に従ってタンパク質サンプルに添加した。14日後、マウスを同じ製剤で追加免疫した；抗体及びOPAアッセイのために、血清サンプルを後眼窩出血によって、14日目及び28日目に収集した。4ヶ月齢のニュージーランド白ウサギ(Cocalico Biologicals)を、0日目及び14日目に、500μLの各サンプルの筋肉内投与によって免疫化し；末梢血サンプルを、抗体及びOPAアッセイのために14日目及び28日目に収集した。
【０１２８】
細菌の調製及びバイオフィルム放出
本研究で用いた細菌株を初めに、0.5％の酵母エキスと5％のヒツジ血液を補足したTodd-Hewittアガープレートで増殖させ、37℃で一晩インキュベートした。単体コロニーを、0.5％酵母エキスを含む5mLのTodd-Hewittブロスに接種し、OD600が0.6になるまで、37℃でインキュベートした。この時点で、細菌を遠心分離によって収集し、PBSで1回洗浄し、PBSに再懸濁し、浮遊細胞を必要とする実験のために、OD600測定によって定量した。浮遊細胞をin vitroバイオフィルムモデルに導入し、すべてのOPAアッセイ(特に他の指定がない限り)、マウスコロニー形成分析、及びin vivoインフルエンザ誘発肺炎モデル内で利用した。
【０１２９】
バイオフィルム状態を確立するために、NCI-H292上皮細胞(CRL-1849；ATCC)を、37℃及び5％CO2で、T75フラスコ中で、ウシ胎仔血清を加えたRPMI-1640培地中で最初に培養した。100％培養密度に達した後、H292細胞を4％緩衝化パラホルムアルデヒド中で34℃にて48時間前固定し、続いてPBSで3回洗浄した。次いで、CDM増殖肺炎球菌を、固定したH292細胞上に播種し、培地の交換を12時間毎に行った。形成されたバイオフィルムを4時間、熱(38.5℃)に暴露し、次いで、放出された細胞を遠心分離によって収集し、PBSで1回洗浄し、PBSに再懸濁し、OD600測定によって定量した。バイオフィルム放出細胞を利用した実験には、in vivo敗血症及び肺炎モデルが含まれた。
【０１３０】
誘発モデル
肺炎球菌株の1×104(敗血症モデル)又は1×106(肺炎モデル)コロニー形成単位(CFU)を、それぞれ腹腔内又は鼻腔内(イソフルラン使用)投与することによって、マウスをチャレンジした。コロニー形成を誘導するために、マウスに、イソフルランなしで1×106CFU細菌を鼻腔内投与した。インフルエンザ誘発性肺炎を促すために、肺炎球菌のコロニー形成に続いて、IAVの40プラーク形成単位(A/PR/8/34株[H1N1；ATCC VR-95];プラークアッセイにより測定した力価)を鼻腔内接種した。罹患の徴候(うずくまる、波打った被毛、嗜眠、及び腹部表面温度)についてマウスを4時間ごとにモニタリングした。瀕死状態であることが判明したマウスを、CO2窒息及び頸椎脱臼により安楽死させた。
【０１３１】
抗体分析
抗原抗体価分析は、関連する血清型由来の20種の多糖、ならびにGlpO及びPncOタンパク質抗原を含むように拡張された方法を用いて、従前に記載されたように行った(Li et al., Sci Adv 2, e1600264 (2016))。従って、分析は、研究内で利用される全ての抗原に拡張された。サイトカイン測定値は、IFN-γとIL-17A ELISAキット(R&D Systems)を用いて行った。
【０１３２】
組織細菌数
コロニー形成後5日目に、図１Ｅ及びS7B&Cに示すようにサンプルを分析した。インフルエンザ誘発性肺炎に続いて、マウスを、示されているように、IAV投与後1日目及び5日目に、又は瀕死状態となったときに分析し、鼻咽頭組織、鼻咽腔洗浄液、肺、及び血液サンプルの組合せを採取し、既報(Tyx et al., J Bacteriol 193, 3512-3524 (2011))のように細菌負荷量を測定した。手短に説明すると、組織及び器官ホモジネート、洗浄液、及び血液をホモジナイズして、細菌凝集体の解離を確実にし、次いで、計数の前に、トリプチックソイ及び5％血液寒天プレート上で連続的に希釈した。
【０１３３】
CD4+の枯渇
インビボCD4+T細胞枯渇のために、0.5mgの抗CD4+モノクローナル抗体(Invitrogen)をマウスに連続3日間腹腔内注射した。6日後、95％以上のT細胞枯渇がフローサイトメトリーを用いて確認され、次いで、これらのマウス被験体を、示された実験において利用した。
【０１３４】
OPAアッセイ
従前のプロトコル(Romero-Steiner et al., Clinical and Vaccine Immunology: CVI 13, 165-169 (2006))に拡張して、ヒトHL-60細胞をジメチルホルムアミドで分化させて、抗体媒介性オプソニン化貪食作用及び肺炎連鎖球菌の死滅(免疫化マウス被験体から収集した血清の希釈物に暴露)を定量し、50％死滅エンドポイント(CFU数によって定量化)を特定した。HL60と肺炎球菌を75分間インキュベートした。
【０１３５】
統計解析
GraphPad Prismソフトウェア(バージョン6.0h.283；GraphPad Software Inc., La Jolla、CA)を用いて、不対データについて両側スチューデントt検定を用いて、統計的有意性について比較分析した。全てのデータは、4〜12の被験体を用いた動物実験で、最低３つのサンプルから得られた。
【実施例２】
【０１３６】
この実施例では、潜在的な安全性の懸念に対処し、望ましい肺炎球菌ワクチンを確立するLEPS製剤の別の実施形態を開発した。安全性の懸念は、GlpOに関連する潜在的なオフターゲット免疫原性を評価し、hisタグ化タンパク質への依存性を排除する(及び新生抗原の潜在的な導入を排除する)ための代替的なタンパク質−リポソーム付着戦略を評価することによって対処した。その際、本発明者らは、PncOの用量漸増によるバイオフィルム破綻病原性標的化を保持しながら、製剤からGlpOを除去し、ワクチンを24種のCPSを含むように拡張した。次に、単回用量漸増試験を用いて包括的なLEPSデザインを評価した。これらの研究は、普遍的な肺炎球菌ワクチンの開発における重要なステップである。
【０１３７】
結果
【０１３８】
GlpOに関連するオフターゲット免疫原性のリスク評価
【０１３９】
肺炎連鎖球菌GlpO及びPncOタンパク質抗原は、天然の細菌叢内の相同標的に対する免疫反応性を危険にさらす。初回免疫試験では負の毒性学的スコアリングは観察されなかったが、50％BLAST相同性スクリーニングを用いてヒト共生細菌における標的に対するGlpO及びPncOタンパク質の配列相同性検索を行った。PncOについてヒットは同定されなかったが、かなりの数の細菌叢タンパク質標的が、GlpOに対して50％を超える相同性を有することが見出された(表Ｓ４(図２７))。同定された細菌のサブセットから、多様な相同性及び生理学的位置を示す10種を、さらなる分析のために選択した(図１８)。
【０１４０】
次に、肺炎連鎖球菌GlpOに対する抗体が、オフターゲット細菌結合を示したかどうかを調べるために、免疫蛍光アッセイでGlpOワクチン接種マウスの血清を検査した。試験した細菌種に対する強力な抗体結合が、偽ワクチン接種と比較して観察された(図１８Ａ)。さらに、いくつかの種の免疫蛍光は、GlpOワクチンの直接標的である肺炎連鎖球菌EF3030(19F)株について得られたものと同等であった。免疫蛍光をタンパク質相同性の文脈で評価した場合(図２４)、有意な正の相関(R2＝0.858)が観察され、観察された結合強度が配列相同性に関連することを示した。観察されたオフターゲット抗体結合を考慮して、OPAアッセイを、４つの代表的な種を使用して行い、得られた抗体結合が中和活性を有するかどうかを決定した。図１８Ｂに示すように、BFR EF3030と比較して、各細菌種について有意な殺傷活性が観察された。まとめると、これらの結果は、GlpOによるワクチン接種が、ヒトのマイクロバイオームに影響を及ぼす可能性があることを示唆している。
【０１４１】
LEPS(20V)製剤におけるタンパク質抗原量の漸増
【０１４２】
用量限界を確立し、タンパク質抗原に対する個々の有効性を評価するために、様々な用量(34、68、又は136μg)のGlpO及びPncOを用いた20価のLEPS(LEPS(20V))ワクチン製剤の免疫原性及びOPA評価を行った。ワクチンの有効性は、６種類のワクチン及びNVT血清型(6C、35B、15C、16F、23A、9N)に及ぶBFR肺炎誘発モデルを用いて判定した。図１９に示すように、GlpO、PncO、及びGlpO＋PncOを伴うワクチン接種は、プレベナー13(登録商標)(PCV13)及びニューモバックス23(登録商標)(PPSV23)と比較して、試験したすべての血清型について実質的に生存率を改善した。さらに、LEPS(20V)におけるGlpO及び/又はPncOのワクチン接種は、CRM197を用いて製剤化されたLEPS(20V)と比較して、すべての血清型で生存率を改善した。これは、NVT細菌(すなわち、そのCPSはLEPSに含まれていない)に対する防御が、肺炎球菌の破綻病原性タンパク質が含まれているために生じることを示している。6C、15C、16F及び23A血清型のGlpO又はPncOに対して、初回用量34μgでは不完全な防御が観察されたが、用量を増加させると、タンパク質を組み合わせたワクチン製剤に匹敵する100％の防御を回復できることが観察された。
免疫原性を評価するために、ワクチン接種から生じる抗体の産生及び中和活性を測定した。GlpO(図２５)、PncO(図３Ａ〜Ｃ)、及びGlpO＋PncO(図２６)の用量にわたる抗体価を定量すると、すべてのCPS及びタンパク質抗原にわたる抗体の有意な産生が観察された。興味深いことに、タンパク質用量が34から68μgに増加するにつれて、CPSを標的とする相対抗体価が増加することが見出された(図２０)。しかしながら、用量を68から136μgに増加させた場合、CPS抗体の有意な減少があった(図２０)。次いで、OPAアッセイによるこれらの抗体の中和活性を、浮遊又はBFR細菌のいずれかを使用して測定した(表５、６(それぞれ、図２８及び２９))。抗体価についての観察と一致して、浮遊性細菌についての50％死滅希釈は、タンパク質用量を136μgに増加させた場合に減少した。逆に、BFR細菌の50％死滅希釈は一般に、タンパク質用量と共に増加した。総合すると、これらの研究は、単離GlpO又はPncOのいずれかの用量増加が、同時処方物の代替物として役立ち得ることを示す。
【０１４３】
IAV肺炎誘発モデルにおけるPncOの用量増加
【０１４４】
GlpOのオフターゲット免疫原性に関する懸念から、インフルエンザAウイルス(IAV)肺炎誘発モデル(病原性肺炎球菌のin vivoバイオフィルム放出を模倣する)を用いて、独立したタンパク質としてのPncOの有効性の追加確認を求めた。コンディショニングしたEF3030(19F)肺炎連鎖球菌を感染させたマウスに、IAVを接種し、鼻咽頭バイオフィルムから血液及び肺への細菌転移を促した。図２１に示すように、PncOの用量を増加させると、各位置における細菌負荷が減少した。興味深いことに、PncOのワクチン接種により、IAV感染後の鼻咽頭のコロニー形成が減少した。これは、コロニー形成を増強するための細菌の最初のコンディショニングによって引き起こされるPncOのアップレギュレーションによる可能性が高い。それにもかかわらず、本研究はさらに、我々の初回用量34μgを超えてPncOの用量を増加させると、肺炎連鎖球菌の増殖及び転移が有意に抑制されることを実証している。
【０１４５】
24価LEPSワクチンの構築
【０１４６】
LEPSワクチンプラットフォームの一般化可能性を実証するために、20価製剤に導入した4種類の新しい血清型CPSの免疫原性とOPAレベルを評価した。特に、10A、11A、15B、33F血清型は、現在使用されているワクチンに含まれる全ての血清型を包含するように選択された。免疫原性を、最初に、図２１に示すように、各CPSについて別々に評価した。潜在的抗体産生及びIgMからIgGへのクラスシフトが、各CPSで達成された(図２２Ａ及びＢ)。これらの結果は、LEPS封入プロセスが、任意の肺炎球菌CPSに一般化可能であることをさらに支持する。
【０１４７】
新たなCPS抗原を個々に評価する最初の研究に続いて、新たな24価ワクチン(LEPS(24V))を創製するために、我々のLEPS20Vワクチンと４つのすべての新しい処方物を組み合わせた。さらに、追加のCPSの組み込みに起因する免疫原性の潜在的損失を評価するために、全24血清型にわたる相対抗体価を評価した。図２２Ｃに示されるように、PncO又はCRM197のいずれかと製剤化されたLEPS(24V)は、すべての血清型について有意な力価のCPS抗体を産生した。さらに、測定された抗体価は一般に、市販のワクチンについて得られるものに匹敵した。さらに、OPAアッセイを用いて、LEPS(24V)製剤をワクチン接種したマウスから得られた血清の中和活性を測定した。表Ｓ７(図３０)に示すように、CRM197及びPncO製剤の両方は、すべての共有及び非共有血清型にわたって、PCV13に匹敵するOPA力価を得ることができた。まとめると、これらの結果は、LEPS製剤戦略が、肺炎連鎖球菌に対するCPSベースのワクチンを構築するための一般化可能でスケーラブルなプロセスであることを示している。
【０１４８】
代替的なタンパク質−リポソーム付着戦略の開発
【０１４９】
LEPSプラットフォームの特徴は、タンパク質の非共有結合的な表面局在化である。例として、ニッケル-NTAを含有するヒスタグ化タンパク質及び脂質を使用した。ニッケル及びヒスタグ化キレート化成分の使用に関連する潜在的な毒性及び/又は有害な免疫原性の懸念に対処するために、今日まで免疫化研究中にいかなる有害反応も観察していないが、しかしながら、我々は、キャリア又は抗原タンパク質のための代替的な非共有結合性付着方法を評価した。最初の変化には、キレート化金属(ニッケル[Ni2+]-対-コバルト[Co2+])又は金属スキャフォールド(NTA-対-ポルフィリン)の変化が含まれた。さらに、２つのビオチン-ストレプトアビジン系を評価した(どちらもリポソームに組込まれたビオチン化脂質(DSPE-PEG-ビオチン)を特徴とする)。「BSB」と示される１つの系では、ビオチン含有リポソームをストレプトアビジン及びビオチン化CRM197とインキュベートして、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン結合を作製した。別の系では、ビオチン化リポソームをストレプトアビジン結合PspAとインキュベートして、ビオチン-ストレプトアビジン結合(BS)を形成した。
【０１５０】
最初に、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を利用して、リポソームの表面に結合したタンパク質の画分を決定することによって結合効率を測定した。図２３Ａに示されるように、すべてのリポソーム変形例は、経時的に少なくとも50％のタンパク質結合を備え、BS及びBSBの両方の戦略は、すべてのインキュベーション時間にわたって、金属キレート化オプションと比較して、同等又は増強された結合を実証する。興味深いことに、これらの製剤を用いて19F CPSを送達した場合、結合効率は、免疫原性の一般的な代理として役立った。マウスの免疫化後、CPS抗体クラスシフトの程度(図２３Ｂ)及び力価(図２３Ｃ)は、各製剤についてのタンパク質結合効率と相関した。具体的には、BS製剤は、抗体価、抗体クラスシフトの両方においてCo-NTAを大きく上回った。さらに、これらの傾向は、OPAアッセイによって測定される中和活性について観察された(図２３Ｄ)。最後に、全ての製剤を動的光散乱を用いて特性決定し、リポソームサイズ分布及び表面電荷を決定した。表Ｓ８(図３１)に示すように、リポソーム製剤にわたる特性は同様であった。しかしながら、タンパク質及び多糖類の包含は、リポソームサイズを増加させ、タンパク質の包含はリポソーム表面の負電荷の増加をもたらした。総合すると、これらの結果は、臨床への橋渡し及び有用性を促進するように設計された製剤バリエーションにわたる効力を保持するためのLEPSプラットフォームの柔軟性を強調する。
【０１５１】
LEPS急性毒性の単一用量評価
【０１５２】
LEPSワクチンの毒性を評価するために、CD-1マウスにおける単回用量漸増試験を実施し、急性毒性を評価し、最大耐量(MTD)を特定した。これらの研究では、動物に、我々の治療用量(34μgのタンパク質及び2.2μgの各CPS)ならびに5倍用量及び10倍用量にて、ワクチンを接種した。表１に示すように、雄マウス及び雌マウスの両方が、LEPS中のタンパク質及びCPSの治療用量の10倍まで耐性であった。また、ワクチン接種に伴う血液学的影響については、血液中の代謝物及び白血球濃度を測定することにより評価された(表９、１０(それぞれ図３２及び３３))。
【０１５３】
表９(図３２)に示すように、血液中の種々の化学物質のレベルは、全ての用量にわたってほぼ同様であった。ナトリウムの濃度は異なるグループ間で統計的に異なっていたが、その濃度に識別可能なパターンはなかった。同様に、異なる白血球の濃度は、全てのグループにわたって同様であることが観察された(表Ｓ１０(図３３))。これらの研究では、ワクチン用量の増加に関連したリンパ球のわずかな増加が観察され、潜在的な免疫応答が示唆された；しかしながら、その相違点は統計的には異ならなかった。ワクチン接種時に軽度の反応性が生じたが、長期の苦痛を引き起こさない初期の痛みと刺激に限られていた。まとめると、これらの結果は、LEPSワクチンが動物において明白な急性毒性を示さないことを実証する。
【０１５４】
考察
【０１５５】
肺炎連鎖球菌に対する強力なワクチンが開発されているが、血清型の適用範囲が不完全であり、破綻的な疾患の可能性があるため、世界的な医療負担はかなり大きくなる。この実施例は、適用範囲を24血清型に拡大し、１つの表面付着タンパク質抗原(PncO)に統一し、用量当たりの適切な量のタンパク質(例えば、68μg)を特定し、そして代替の付着戦略を特定することによって、さらなる血清型の課題を満たすための本LEPSシステムの使用を実証する。総合すると、これらの結果は、臨床開発計画を明確にし、製造を簡素化し、安全性の懸念に対処することにより、LEPSシステムの臨床準備を進展させるのに役立つ。
【０１５６】
例えば、この実施例では、GlpOを含まないワクチン製剤を使用し、PncO用量を増加させた。さらに、我々は、LEPSワクチンが代替の非共有結合タンパク質表面付着アプローチによって機能的に構築され得ることを実証する。
【０１５７】
興味深いことに、ワクチン接種におけるタンパク質濃度の増加及び代替のタンパク質−リポソーム付着戦略の結合親和性の両方に関連する独特の効果が観察された。具体的には、PncO用量を34μgから68μgに増加させると、20のCPSすべてについて相対抗体価が改善され(表１１(図３４))、14/20の血清型についてOPAアッセイ結果が改善されることが観察された(表Ｓ１２(図３５))。これは、CPS含有量が一定のままであるという事実にもかかわらず観察された。しかし、PncO含有量を136μgにさらに倍加すると、相対抗体価及びOPAアッセイ性能の両方が低下した(表Ｓ１１、Ｓ１２(それぞれ図３４及び３５))。中間のタンパク質濃度は、表面におけるタンパク質の濃度を効果的に増加させ、免疫応答の効果的な誘発を提供し得る。
【０１５８】
材料及び方法
【０１５９】
本研究で使用する細菌株及び細胞株(すべてを含む)
この研究における肺炎連鎖球菌株は、OPA及び免疫蛍光検査における対照として、７０を超える血清型及び肺炎連鎖球菌EF3030(血清型19F)を含んでいた。補足表１に列挙した細菌種を、OPA及び免疫蛍光アッセイを含む細菌叢研究に使用した。NCI-H292上皮細胞(CRL1849、American Type Culture Collection(ATCC))を利用して、バイオフィルム増殖をサポートした。ヒトHL60細胞を、標準及び改変OPA研究で使用するために分化させた。
【０１６０】
相同性検索に関する記述
【０１６１】
BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov)で入手可能な共生細菌アミノ酸配列におけるギャップ及びミスマッチを考慮することにより、共生細菌種におけるglpO相同体の保存(補足表１)を計算した。表面への接近しやすさを、InterProデータベース(ebi.ac.uk/interpro)を用いて確立し、エピトープ領域を、IEDB Analysis Resource(tools.immuneepitope.org/bcell)を用いたBepiPred線形エピトープ予測法で予測した。この研究のために使用された参照glpO配列は、肺炎連鎖球菌D39(受入番号：CP000410.1)であった。
【０１６２】
細菌の増殖と播種
本研究で使用した肺炎連鎖球菌株を、最初に、0.5％酵母エキス及び5％(vol vol-1)ヒツジ血を補充したTodd-Hewitt寒天プレート上で増殖させ、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを、0.5％酵母エキスを含む5mLのTodd-Hewittブロスに移植し、37℃で、OD600が0.6になるまでインキュベートした。次いで、細菌を、合成培地(CDM)中で1:10に希釈し、約0.5mLのOD600とし、次いでこれを、固定されたH292細胞の層を含む24ウェルプレートの各ウェルに添加した。あるいは、培養した浮遊性肺炎連鎖球菌を遠心分離によって収集し、PBSで１回洗浄し、PBSに再懸濁し、浮遊性細胞を必要とする実験のためにOD600測定によって定量した。
【０１６３】
H292細胞の増殖と固定
【０１６４】
NCI-H292上皮細胞を、最初に、T75フラスコ中で、ウシ胎仔血清(FBS)を加えたRPMI 1640中で、37℃及び5％CO2にて培養した。100％培養密度に達すると、培地を除去し、細胞層が分散するまで、トリプシン-EDTA溶液で細胞をインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によって収集し、FBSを含むRPMI 1640中で1：8に希釈し、24ウェルプレートに移し、100％培養密度に達するまで上記のように増殖させた。100％培養密度に達した後、H292細胞をPBSで３回洗浄し、4％緩衝化パラホルムアルデヒド中で34℃で48時間前固定し、PBSで３回洗浄した。
【０１６５】
バイオフィルムの増殖と放出
【０１６６】
CDM-増殖肺炎球菌を、上記のように固定したH292細胞上に播種し、特に明記しない限り、37℃で48時間インキュベートした。バイオフィルム増殖期を通して、培地を12時間毎に交換した。肺炎球菌のバイオフィルム放出を促進するために、特に明記しない限り、バイオフィルムを4時間熱(38.5℃)に曝した。全ての放出は、変動性を減少させるために同時に行った。次いで、放出された細胞を遠心分離によって収集し、PBSで１回洗浄し、PBSに再懸濁し、OD600測定によって定量した。次いで、これらのバイオフィルム放出細胞を、肺炎球菌性疾患肺炎及び敗血症モデルで使用した。
【０１６７】
タンパク質の産生と精製
【０１６８】
大腸菌(BL21(DE3))を用いて、すべてのタンパク質[CRM197、GlpO、PncO、PspA]を、ポリヒスチジン又はストレプトアビジンタグを用いて組換え生産した。細菌株を、最初に溶原性ブロス3mLに接種し、一晩増殖させた。次いで、細菌を1Lの溶原性ブロスに移し、0.4〜0.6のOD600に達するまで増殖させた。続いて、1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いてタンパク質産生を誘導し、培養物を22℃で一晩インキュベートした。タンパク質精製はフレンチプレスを用いて細胞を破壊し、細胞溶解物を高速タンパク質液体クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare HisTrap HP、1×1ml及びXXXX)に通すことによって行った。最終タンパク質産物を、Pierce Micro BCAタンパク質アッセイキットを使用して定量した。
【０１６９】
LEPSの製剤化と構築
【０１７０】
LEPSベクターを以下のように製剤化した。500μgの総脂質量を有するLEPSキャリアは、特に明記しない限り、3：3：1：4：0.1のモル比の、DOPC/DOPG/DOGS-NTA-Ni/コレステロール/DSPE-PEG2000から構成された。脂質をクロロホルムに溶解し、1分間超音波処理し、次いでロータリーエバポレーターを用いて蒸発させてフィルムを形成した。このフィルムを、単一の莢膜多糖抗原を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて再水和して、リポソームキャリアを形成した。次いで、これらの粒子を、200nmの孔径を有する手動押出機に通した(10〜12回)。各々が異なるCPSを含有する、個々に調製された20種(又は24種)のLEPSサンプルを、ポリヒスチジン又はストレプ-タグを含むタンパク質抗原(CRM197、GlpO、PncO、又はPspA)と共に4℃で30分間インキュベートして、ポリヒスチジンタグ-Niキレート化による表面結合を促進した。結合していないタンパク質又は封入されていないCPを、PBS中での一晩の透析(4℃)によって除去した。次いで、全てのサンプルを合わせて、最終的な20価又は24価のLEPS変形例を形成した。20価の製剤は、20価；1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、17F、18C、19A、19F、20、22F、及び23Fを含んでいた。24価の製剤は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、及び33Fを含んでいた。
【０１７１】
代わりに、ビオチン-ストレプトアビジン連結を容易にするために調製されたリポソームは、モル比3：3：1：1：4：0.1の、DOPC/DOPG/DOGS-NTA-Ni/コレステロール/DSPE-PEG-ビオチンで構成された。リポソーム粒子を、ストレプトアビジン及びビオチン化タンパク質又はストレプトアビジン-結合タンパク質のいずれかを使用して、上記のように構築した。これらのインキュベーションを、種々の期間実施し、結合したタンパク質の画分の結合を、EMSAアッセイを使用して決定した。代替リポソームを用いたその後の研究のために、30分間のインキュベーションを用いて構築した粒子を使用した。
【０１７２】
電気泳動移動度シフト解析
【０１７３】
EMSA実験は、2.5μgのタンパク質を50μgのリポソームと共にインキュベートし、続いて0.75％アガロースゲル中で電気泳動し(50Vを90分間適用)、そして表記の励起及び発光フィルターを用いたIVIS Lumina IIシステムにより、画像化して行われた。EMSA血清安定性試験のために、3μgのタンパク質を、40μLのPBS中の60μgのリポソームと、プレインキュベートした。24時間のインキュベーション後、40μLのウシ胎仔血清(FBS、VWR #82013-602)を加え、さらに8時間インキュベートした。イミダゾール置換実験のために、1μgのレポータータンパク質を、PBS中で20μgのリポソームに結合させた。次いで、イミダゾールを滴定し、蛍光を用いて結合を評価した。血清安定性のために、1μgのレポータータンパク質を、100μLのPBS中で20μgのリポソームに結合させ、次いで等容量のFBSを添加し、結合を蛍光でモニターした。20μgのリポソームと共に500ngのペプチドをインキュベートした後、ペプチド結合を、RGD-His FAMフルオロフォア消光で評価した。
【０１７４】
動物の免疫化と血清の採取
【０１７５】
非近交系6週齢の雄及び雌CD-1マウスを免疫実験に用いた。マウスを皮下注射(200μL)により免疫した。しかしながら、毒性学的評価の間は、マウスを筋肉内で免疫化した。製剤に使用したバックグラウンド溶液はPBSであった(「偽」陰性対照は、抗原成分なしで投与したバックグラウンド溶液であった)。最終タンパク質抗原濃度を、以下の濃度で漸増させた：34、68、及び136μg。組み合わせの場合、GlpO及びPncOは、68、136、及び272μgの濃度で投与した。陽性対照として、以前に記載されているように(REF)、PCV13又はPPSV23でマウスを免疫した。免疫後14日目に、マウスを同じ製剤で追加免疫した。免疫後14日目及び28日目に、抗体及びOPAアッセイのために後眼窩出血を介してマウスから血清サンプルを採取した。
【０１７６】
抗体価及び抗体クラスの測定
【０１７７】
抗原抗体価分析は従前に記載されるように行われ(Li, Y. et al. Science Advances 2, doi:10.1126/sciadv.1600264 (2016))、この方法は、関連する血清型由来の20種の多糖ならびにGlpO及びPncOタンパク質抗原を含むように拡張された。従って、分析は、研究で使用された全ての抗原に拡張された。
【０１７８】
標準的なOPAアッセイ
【０１７９】
従前のプロトコル(Romero-Steiner, S. et al. Clinical and Vaccine Immunology 13, 165-169, doi:10.1128/CVI.13.2.165-169.2006)に拡張して、ヒトHL60細胞をジメチルホルムアミドで分化させて、抗体媒介性オプソニン化貪食作用及び肺炎連鎖球菌の死滅(免疫化マウス被験体から収集した血清の希釈物に曝露)を定量し、50％死滅エンドポイント(CFU数により定量化)を特定した。HL60細胞及び肺炎球菌を75分間インキュベートした。
【０１８０】
BFR改変OPAアッセイ
【０１８１】
標準的なOPAアッセイを改変して、抗体媒介性オプソニン化貪食作用及びBFR肺炎連鎖球菌の死滅を定量した。これは、浮遊性肺炎連鎖球菌をBFR細菌で置き換えることによって行われ、次いで、BFR細菌は、免疫化されたマウス被験体から収集された血清の希釈物に曝露され、50％死滅エンドポイント(CFU数によって定量化)を特定した。HL60細胞及び肺炎球菌は75分間インキュベートされた。
【０１８２】
細菌叢細菌を用いたOPAアッセイ
【０１８３】
上記の標準的なOPAアッセイを使用して、GlpOで免疫化したマウス被験体から収集した血清の希釈物に曝露した場合の、抗体媒介性オプソニン化貪食作用、及び共生細菌(図１８Ａに示す)又は肺炎連鎖球菌EF303(陽性対照)の死滅を測定し、50％死滅エンドポイント(CFU数によって定量化)を特定した。HL60細胞及び細菌細胞は、75分間インキュベートされた。
【０１８４】
肺炎球菌負荷モデル(BFR肺炎、IAV肺炎)
【０１８５】
BFR肺炎：マウスに、鼻腔内(イソフルラン使用)投与により、肺炎球菌株の1×106(肺炎モデル)CFUを負荷した。罹患の徴候(うずくまる、波打った被毛、嗜眠、及び腹部表面温度)についてマウスを4時間ごとにモニタリングした。瀕死状態であることが判明したマウスを、CO2窒息及び頸椎脱臼により安楽死させた。
【０１８６】
IAV肺炎：コロニー形成を誘発するために、マウスに、イソフルランなしで、1×106 CFUのマウス継代肺炎連鎖球菌EF3030を鼻腔内に投与した。インフルエンザ誘発性肺炎を模倣するため、肺炎球菌のコロニー形成の後、40プラーク形成単位のIAVを鼻腔内接種した。マウス適応IAV株A/PR/8/34(H1N1)(ATCC VR-95)を用い、プラークアッセイにより力価を測定した。罹患の徴候(うずくまる、波打った被毛、嗜眠、及び腹部表面温度)についてマウスを4時間ごとにモニタリングした。瀕死状態であることが判明したマウスを、CO2窒息及び頸椎脱臼により安楽死させた。
【０１８７】
細菌負荷評価
【０１８８】
事前に定めた時点(腹腔内及び鼻腔内負荷感染についてはそれぞれ感染後24時間及び48時間)又は瀕死状態になった時点で、マウスを安楽死させ(既述の通り)、鼻咽頭組織、鼻咽腔洗浄液、肺、肝臓、脾臓、及び血液サンプルの組合せを採取し、細菌負荷量について評価した。組織及び器官サンプル、洗浄液、及び血液をホモジナイズし(30秒間又は完全にホモジナイズされるまで10の設定で；Tissue-Tearor, BioSpec Products Inc.)、細菌凝集体の解離を確実にし、次いで計数前にトリプチックソイ及び5％血液寒天プレート上で連続希釈した。
【０１８９】
免疫蛍光アッセイ
【０１９０】
GlpOワクチン接種マウスからの血清を、1：10、1：100、及び1：1000の比で希釈し、オフターゲットGlpO効果を定量するために研究に利用した細菌株を含む96ウェルプレート中で(表Ｓ４(図２７))、１ウェルあたり105の細菌細胞とともに、25℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、25℃で1時間、3％ウシ血清アルブミンでブロックした。結合後、未結合抗体をPBSで洗浄することによって除去し、次いで、細胞を、アルカリホスファターゼと結合した二次抗体(抗マウスIgG)と共に25℃で1時間インキュベートした。結合していない抗体をPBS洗浄により除去し、p-ニトロフェニルホスフェートを添加してシグナルを発生させ、0.75 MのNaOHを用いて反応を停止させた。405nmの吸光度で、プレートリーダー分光光度計を用いてシグナルを検出した。
【０１９１】
毒性試験のデザインと実施
【０１９２】
非近交系6週齢の雄及び雌CD-1マウスをCharles Riverから入手した。マウスに、LEPS(20V):CRM197又はアラム:PncOを筋肉内注射し、ここでCRM及びPncOはどちらも最初の用量(34μg)の1、5、及び10倍で処方した。投与前と投与2日後の両方で、血液学的評価のために血液サンプルを採取した。免疫後2週間、マウスの体重及び行動の変化をモニタリングした。マウスを、免疫化の14日後にCO2窒息によって屠殺し、続いて頸椎脱臼し、そして生命維持に必要な臓器を採取し、秤量した。
【０１９３】
血液化学及び細胞の血液学的評価
【０１９４】
非近交系6週齢の雄及び雌のCD-1マウスをCharles Riverから入手した。マウスにLEPS(20V):CRM197又はアラム:PncOを注射し、ここでCRM197及びPncOはどちらも、初期用量(12.5μg)の1、5、及び10倍で投与した。免疫の約6時間前と2日後に、後眼窩出血を介して血液サンプルを採取した。血液サンプルを、製造業者のプロトコルに従ってMASCOT血液学プロファイリング(Drew Scientific)に供した。
【０１９５】
本開示を様々な実施形態を通して説明してきたが、当業者には日常的な修正が明らかであり、そのような修正は本開示の範囲内であることが意図される。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ＡＢ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３ＡＢ】
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【図２３ＣＤ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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