(57)【要約】  本発明は、高いアミド分解水準を有するアベルマブ抗体組成物、ならびにＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の有害な相互作用にもとづく疾患などを治療するためのその組成物の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アベルマブを含み、アベルマブ分子の一部分がアミド分解している組成物。
【請求項２】
アミド分解したアベルマブ変異体の比率は、６％超、好ましくは８％超である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アミド分解したアベルマブ変異体の比率は、６〜３０％の範囲内、好ましくは８〜２５％の範囲内である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、アミド分解した変異体の量が前記範囲を外れるアベルマブを含む組成物よりも、細胞表面での高いＰＤ−Ｌ１結合活性、高いＡＤＣＣ、および／または高い治療効果のうちのいずれか１つまたは組合わせを示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満のＬＭＷ種を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の比率は、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
アミド分解したアベルマブ変異体の比率は、８〜２５％の範囲内であり、
前記組成物は、０．１〜１０％の範囲内のＬＭＷ種を含有し、および
重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の比率は、０．１〜１０％の範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは７．５％未満のアベルマブ分子は、アフコシル化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは３％未満のアベルマブ分子は、５個以上のマンノース残基を持つ高マンノースＮ−グリカンを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
薬剤として使用する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の有害な相互作用にもとづく疾患の治療に使用する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
癌の治療に使用する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項１４】
前記癌は、非小細胞肺癌、尿路上皮癌、膀胱癌、中皮腫、メルケル細胞癌、胃または胃食道接合部癌、卵巣癌、乳癌、胸腺腫、胃腺癌、副腎皮質癌、頭頸部扁平上皮癌、腎細胞癌、黒色腫、および／または古典的ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用する組成物、または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物および使用説明書を含むキット。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物、請求項１５に記載の医薬組成物、または請求項１６に記載のキットは、製造後に患者への投与まで、１２℃未満、好ましくは１０℃未満、より好ましくは８℃未満に保存される保存方法。
【請求項１８】
輸送用のアベルマブ組成物を調製する方法であって、
（ａ）アベルマブを含む複数の組成物を製造する工程、
（ｂ）アベルマブを含む組成物を試験して、６％超、好ましくは８％超のアベルマブがアミド分解されている組成物を特定する工程、および
（ｃ）６％超、好ましくは８％超のアミド分解したアベルマブを有すると特定された組成物を輸送用の無菌容器に導入する工程を含む、方法。
【請求項１９】
輸送用のアベルマブ組成物を調製する方法であって、
（ａ）アベルマブを含む複数の組成物を製造する工程、
（ｂ）アベルマブを含む組成物を試験して、６〜３０％、好ましくは８〜２５％のアベルマブがアミド分解されている組成物を特定する工程、および
（ｃ）６〜３０％、好ましくは８〜２５％のアミド分解したアベルマブを有すると特定された組成物を輸送用の無菌容器に導入する工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記無菌容器が、バイアル、シリンジ、アンプル、およびバッグからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
重鎖配列として配列番号２および軽鎖配列として配列番号１を含み、配列番号１のＡｓｎ３３および／またはＡｓｎ５５はアミド分解されている、抗体。
【請求項２２】
重鎖配列として配列番号２および軽鎖配列として配列番号１からなり、配列番号１のＡｓｎ３３および／またはＡｓｎ５５はアミド分解されている、請求項２１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
導入
本発明は、アミド分解水準の高いアベルマブ抗体組成物に関し、ならびに例えばＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の有害な相互作用にもとづく疾患などを治療するためのその組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療用タンパク質の大規模生産では、目的タンパク質とは異種の集合体が生成される。生成されたタンパク質は、個々の修飾の性質にも依るが、生物学的機能やその安定性に影響を及ぼす種々の修飾を受けている可能性がある。
【０００３】
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）残基のアミド分解は、組換えＤＮＡ技術を使用して産生される治療用タンパク質で発生する最も一般的な翻訳後修飾の１種である。この反応では、Ａｓｎ残基は、コハク酸イミド中間体（Ａｓｕ）を経て、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐまたはｉｓｏＤ）あるいはアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）に約３：１の比率で転化する（図１）。
【０００４】
Ａｓｎ残基のアミド分解の速度は、隣接するアミノ酸、溶媒の誘電率および溶媒の粘度、温度、溶液ｐＨ、およびタンパク質のより高次の構造を含む種々の因子に依存している（Wakankar and Borchardt, J Pharm Sci. 2006 Nov;95(11):2321-36）。
【０００５】
抗体の結合親和性に悪影響を与えるＡｓｎのアミド分解については、様々な報告がなされている。
【０００６】
Harrisらは、ｍＡｂハーセプチンの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１中でのＡｓｎ３０のアミド分解が、この抗体の結合効力を７０％にまで低下させることを提示した（J Chromatogr B Biomed Sci Appl。2001 Mar 10; 752(2)：233-45）。
【０００７】
ＩｇＧ１  ｍＡｂの軽鎖（Ａｓｎ３３）のＣＤＲ１ループ中のＡｓｎ残基のアミド分解は、抗原結合を４０〜６０％まで低下させることが示された（Vlasak et al., Anal Biochem. 2009 Sep 15;392(2):145-54）。
【０００８】
ヒト化組換えＩｇＧ１  ｍＡｂの別の例において、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ２のＡｓｎ５５は、イソＡｓｐおよびＡｓｐへのアミド分解を起こしやすく、それにより結合活性が１４分の１にまで低下することが見出された。（Huang et al., Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5): 1432-9）
【０００９】
ＩｇＧ１  ｍＡｂの重鎖ＣＤＲ２のＡｓｎ５５でのコハク酸イミドの形成が、７０％の効力の低下をもたらす例も報告されている。（Yan et al., J Pharm Sci. 2009 Oct; 98(10):3509-21）
【００１０】
Yuangらは、ＩｇＧ２抗体の軽鎖中のＡｓｎ３３のアミド分解は、効力の喪失と相関し、抗体を４０℃で１か月間培養した後に、効力がほぼ完全に喪失することを報告した。（MAbs. 2013 Sep-Oct; 5(5):787-94）
【００１１】
治療用タンパク質の結合親和性に及ぼすアミド分解による潜在的な悪影響を考慮して、この翻訳後修飾を最小限に抑える要望があり、製造中および製造後の両者でタンパク質をアミド分解から保護する方法が研究されてきた（Gervais, J Chem Technol Biotechnol 2016; 91：569-575）。
【００１２】
例えばKanekoらは、採取日がｍＡｂのアミド分解種の量に影響することを説明している（J Biosci Bioeng. 2010 Mar; 109(3)：281-7）。この研究では、採取日によってｍＡｂの変異体が異なることがイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーによって解明された。ｍＡｂのアミド分解形態に対応するピークは、４日目の採取での１．０６％から、１０日目の採取では７．７１％まで増加していた。
【００１３】
このデータは、例えばｐＨや温度が、検討したｍＡｂのアミド分解の程度に影響を及ぼすことをさらに示唆するDenglらによる提示データと一致している（Pharm Res. 2013 May;30(5):1380-99）。
【００１４】
また、哺乳類細胞の培養培地へ種々の添加物を補給すると、アミド分解したタンパク質の蓄積が著しく低くなることを報告している（Hossler et al., Biotechnol Prog. 2015 Jul-Aug; 31(4):1039-52;Bruhlmannet et al., Biotechnol Prog. 2015 May-Jun; 31(3):615-29）。
【００１５】
製造後に、適切な製剤の選択を含む厳選された貯蔵条件によって、アミド分解を最小限に抑えることができる。Clelandらは、ヒトＥＧＦＲ−２（ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２）に対するヒト化ｍＡｂの凍結乾燥製剤でのアミド分解を、糖：タンパク質のモル比として３６０：１を選択することで４０℃で３ヶ月間の保存中は抑制できることを説明している（J Pharm Sci. 2001 Mar;90(3):310-21）。
【００１６】
現在臨床開発中である１種の治療用タンパク質は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブである（ＷＯ２０１３／０７９１７４Ａ１号）。
【００１７】
プログラム死１（ＰＤ−１）受容体ならびにＰＤ−１配位子１および２（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）は、免疫調節において一体化して役割を果たす。活性化Ｔ細胞に発現するＰＤ−１は、間質細胞、腫瘍細胞、またはその両方により発現するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２によって活性化され、Ｔ細胞死および局所免疫抑制を開始し、潜在的に腫瘍発生および成長に対して免疫寛容な環境を提供する（Dong et al., Nat Med. 1999 Dec;5(12):1365-9; Freeman et al., J Exp Med. 2000 Oct 2;192(7):1027-34; Dong et al., Nat Med. 2002 Aug;8(8):793-800; Topalian et al., Curr Opin Immunol. 2012 Apr;24(2):207-12）。逆に言えば、この相互作用を阻害すると、非臨床動物モデルでは、局所Ｔ細胞応答を増強しかつ抗腫瘍活性をもたらすことができる（Dong et al., Nat Med. 2002 Aug;8(8): 793-800; Iwai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Sep 17; 99(19): 12293-7）。臨床現場において、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１間の相互作用を阻害する抗体による治療は、進行性または転移性の固形腫瘍の患者において、寛容性のある安全特性とともに７〜３８％の奏効率を生み出したことが報告されている（Hamid et al., N Engl J Med. 2013 Jul 11;369(2) :134-44; Brahmer et al., N Engl J Med. 2012 Jun 28;366(26):2455-65; Topalian et al., N Engl J Med. 2012 Jun 28;366(26):2443-54; Herbst et al., Nature. 2014 Nov 27; 515(7528):563-7）。注目すべきことに、大多数の患者において1年以上にわたってこの効果が継続したように見受けられた。
【００１８】
アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても公知）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１型の完全なヒトモノクローナル抗体である。アベルマブはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を競合的に阻害する。
【００１９】
Ｔ細胞を標的とする抗ＰＤ−１抗体に対比して、アベルマブは腫瘍細胞を標的とする。それゆえにアベルマブでは、ＰＤ−Ｌ１の阻害がＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１間の経路でもそのまま残り末梢での自己免疫寛容を促進するので、自己免疫関連の安全性問題のリスクが低くなるなど、副作用の低減が期待される（Latchman et al., Nat Immunol. 2001 Mar;2(3) :261-8）。
【００２０】
アベルマブは、現在、非小細胞肺癌、尿路上皮癌、中皮腫、メルケル細胞癌、胃癌または胃食道接合部癌、卵巣癌、および乳癌を含む多種の癌で臨床試験されている。
【００２１】
アベルマブのさらなる医学的使用は、ＷＯ２０１６／１３７９８５号、ＷＯ２０１６／１８１３４８号、ＷＯ２０１６／２０５２７７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３９３９(出願番号)、米国特許出願６２／４２３，３５８号に記載されている。
【００２２】
またＷＯ２０１３／０７９１７４号では、第２．４節にアベルマブのアミノ酸配列を持つ抗体のヒト水性製剤を記載している。この製剤は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体、抗酸化剤としてのメチオニンを含み、そのｐＨは５．５である。抗酸化剤を含まないアベルマブ製剤は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／００２０４０（出願番号）に記載されている。
【発明の概要】
【００２３】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、アベルマブ組成物のアミド分解水準とその細胞結合活性との間には負の相関関係がないことを見出した。
【００２４】
したがって一側面において、本発明はアベルマブを含む組成物を提供し、そのアベルマブ分子の一部分はアミド分解している。
【００２５】
さらなる側面において、本発明は、アミド分解したアベルマブ変異体の比率が２％超、４％超、６％超、８％超、１０％超、または１２％超であるアベルマブを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる側面において、本発明は、アミド分解したアベルマブ変異体の比率が２〜５０％、４〜４０％、６〜３０％、８〜３０％、１０〜２５％、１２〜２０％、または１２〜１６％の範囲内であるアベルマブを含む組成物を提供する。
【００２７】
アミド分解したアベルマブ変異体を含む本発明の組成物は、好ましくは、１５％未満、１０％未満、８％未満、６％未満、または４％未満の低分子量（ＬＭＷ）種を含有する。いくつかの態様において、ＬＭＷ種の含有量は０．１〜１０％、２〜６％、または３〜５％の範囲内である。
【００２８】
さらに、アミド分解したアベルマブ変異体を含む本発明の組成物は、１５％未満、１０％未満、８％未満、または６％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体を有することが好ましい。いくつかの態様において、重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の含有量は、０．１〜１０％、１〜８％、または３〜６％の範囲内である。
【００２９】
いくつかの態様において、アベルマブ組成物は、８〜２５％のアミド分解した変異体、０．１〜１０％の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および０．１〜１０％のＬＭＷ種を有する。他の態様において、アベルマブ組成物は、１２〜２０％のアミド分解した変異体、１〜８％の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および２〜６％のＬＭＷ種を有する。さらに他の態様において、アベルマブ組成物は、１２〜１６％のアミド分解した変異体、３〜６％の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および３〜５％のＬＭＷ種を有する。
【００３０】
いくつかの態様において、アベルマブ組成物は、８〜２５％のアミド分解した変異体、１０％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および１０％未満のＬＭＷ種を有する。他の態様において、アベルマブ組成物は、８〜２５％のアミド分解した変異体、６％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および６％未満のＬＭＷ種を有する。他の態様において、アベルマブ組成物は、１２〜２０％のアミド分解した変異体、８％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および６％未満のＬＭＷ種を有する。さらに他の態様において、アベルマブ組成物は、１２〜１６％のアミド分解した変異体、６％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および５％未満のＬＭＷ種を有する。
【００３１】
いくつかの態様において、アベルマブ組成物は、６％超のアミド分解した変異体、１０％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および１０％未満のＬＭＷ種を有する。他の態様において、アベルマブ組成物は、８％超のアミド分解した変異体、８％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および６％未満のＬＭＷ種を有する。さらに他の態様において、アベルマブ組成物は、１０％超のアミド分解した変異体、６％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および５％未満のＬＭＷ種を有する。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明のアベルマブ組成物は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または７．５％未満のアフコシル化されたアベルマブ分子を有する。
【００３３】
いくつかの態様において、本発明のアベルマブ組成物中の２０％未満、１０％未満、５％未満、または３％未満のアベルマブ分子は、５個以上のマンノース残基を備える高マンノースＮ−グリカンを有する。
【００３４】
本発明の任意の個々の側面に関連して説明する任意で適切なかつ好ましい特徴項目を含むいずれかの特徴項目は、本発明のその他の側面に関連して説明する任意で適切なかつ好ましい特徴項目を含む特徴項目であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本発明をより深く理解するために、かつ本発明の態様が如何に実施されるかを示すために、例として以下の図表を参照とする。
【００３６】
【図１】図１は、（Chelius et al., Anal Chem. 2005 Sep 15;77(18):6004-11からの）Ａｓｎのアミド分解の分解経路を示す。
【図２】図２は、アベルマブの軽鎖タンパク質配列（図２Ａ）および重鎖タンパク質配列（図２Ｂ）を示す。
【図３】図３は、カルボキシペプチダーゼＢで処理したブランク試料の典型的なＩＥＸ結果を示す。
【図４】図４は、カルボキシペプチダーゼＢで処理したブランク試料に重ねて、カルボキシペプチダーゼＢで処理したアベルマブ試料の典型的なＩＥＸ結果を示す。
【図５】図５は、カルボキシペプチダーゼＢで処理したブランク試料に重ねて、５０℃で４週間培養して人工的にアミド分解し、かつカルボキシペプチダーゼＢで処理したアベルマブ試料の典型的なＩＥＸ結果を示す。
【図６】図６は、アミド分解の水準とアベルマブの細胞結合活性との相関関係を示す。
【図７】図７は、アミド分解の水準とアベルマブの細胞結合活性との相関関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
アベルマブは、そのＣＤＲ領域に２個所の潜在的なアミド分解部位を持つ。Ａｓｎ３３は、軽鎖ＣＤＲ１配列：ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（配列番号３）内に見られ、Ａｓｎ５５は、軽鎖ＣＤＲ２配列：ＤＶＳＮＲＰＳ（配列番号４）内に見られる。本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１発現細胞の細胞表面へのアベルマブの結合におけるアミド分解の影響を評価した。驚くべきことに、多くの先行する技術報告では、結合効力に対してＣＤＲ領域中のアミド分解は負の影響を持つことを明らかにしているのに、本発明者らは、アベルマブの全体的なＡｓｎのアミド分解水準にはその細胞結合活性と負の相関関係が無いことを見出した。
【００３８】
これらの結果にしたがって、１０〜２５％のアミド分解した変異体を有するアベルマブ組成物は高い治療効果を示すことが、臨床研究において解明された。
【００３９】
定義
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される以下の用語は、以下に示す意味を持つ。
【００４０】
本明細書で使用される際に、「アベルマブ」という用語は、完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１  ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても公知）を指し、かつＷＯ２０１３／０７９１７４Ａ１号では抗体Ａ０９−２４６−２として記載されている。本明細書で使用されるアベルマブは、その翻訳後修飾に関しては限定はなく、その分子のバイオ後続品形態を含む。
【００４１】
最も好ましくは、アベルマブは、配列番号１の軽鎖配列および配列番号２の重鎖配列を含み、好ましくはその翻訳後変異体を含む。その翻訳後変異体として、例えばアミド分解した変異体および切断された重鎖のＣ末端リジンを持つ変異体が挙げられる。
【００４２】
「バイオ後続品」（後発生物製剤としても公知）という用語は、当技術分野で周知であり、当業者にとって、薬品物質がアベルマブのバイオ後続品と思われる際には容易に識別できるものである。バイオ後続品は、既に使用が許可されている別のバイオ医薬品（基準薬品としても公知）に類似したバイオ医薬品である。バイオ後続品が承認されるには、その医薬品が基準薬品に類似し、かつ品質、安全性、または効力の点で基準薬品と有意な差異が無いことを示す必要がある。生物製剤は、分子構造が高度に複雑であり、また（例えば、異なる細胞株がその生産に使用される場合には）一般に製造工程の変更に影響を受けやすく、かつ後続の生産者は、通常、創始者の分子クローン、細胞保管所、発酵および精製工程に関するノウハウ、または有効な薬品物質それ自体には接触できないので（創始者の商品化された医薬品のみには接近可能）、いかなる「バイオ後続品」も創始者の医薬品と全く同一とは考えられない。
【００４３】
本明細書において、「アミド分解した変異体」という用語は、少なくとも１個の位置でアミド分解したアベルマブの変異体を意味する。アミド分解反応では、ＡｓｎまたはＧｌｎの側鎖残基からアミド基が消失する。アミド分解した残基の電荷が中性から負側に変化するので、アミド分解反応の最終生成物での等電点（ｐＩ）は低くなる。Ａｓｎ残基のアミド分解は、Ｇｌｎ残基のアミド分解よりもはるかに一般的である。アベルマブ中の残基のアミド分解により、アベルマブの非修飾形態と比較して、この変異体ではこの特定の残基における配列が異なることになる。アミド分解した変異体の比率は、元の分子全体に対する、すなわち例えばＬＭＷ種を含まない上記のアベルマブに対する変異体の比率に関連する。
【００４４】
本明細書において、「酸化された変異体」という用語は、重鎖メチオニン２５５で酸化されたアベルマブの変異体を指す。アベルマブ分子の各々は２本の重鎖を持ち、その重鎖は酸化されなくてもよく、あるいはその重鎖の１本または２本が酸化されてもよい。酸化された変異体の比率は、すべての重鎖Ｍｅｔ２５５残基に対する酸化された重鎖Ｍｅｔ２５５残基の比率を指す。
【００４５】
本明細書において、「低分子量種」という用語は、元の分子よりも低い分子量で検出されるすべてのアベルマブ種を指す。
【００４６】
本明細書において、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、活性成分の生体活性の有効性を妨害せず、かつ典型的な量で投与された場合に患者に毒性をもたらさない１種以上の材料を指す。その担体は、患者への活性成分の投与を促進するように添加される。
【００４７】
当然なことであるが、「治療すること」または「治療」という表現には、病気の既定の症状の予防ならびに緩和が含まれる。したがって、症状、疾患、または病気を「治療すること」またはそれらの「治療」には、（１）病状、疾患、または病気に苦しみ、またはそれらに罹患し易いか、または病状、疾患、または病気の臨床症状または潜在臨床症状をまだ発現していないか示していないヒトで、発症する病状、疾患、または病気の臨床症状の出現を防止または遅延させること、（２）病状、疾患、または病気を阻止すること、すなわち、疾患の発症または（維持療法での）その再発、またはその臨床症状もしくは潜在臨床症状のうちの少なくとも１つを停止、低減または遅延させること、または（３）疾患を軽減もしくは減弱させること、すなわち病状、疾患、または病気、あるいはその臨床症状もしくは潜在臨床症状のうちの少なくとも１つを退縮させることが挙げられる。
【００４８】
高いアミド分解水準を持つ組成物
本発明は、アベルマブ分子の一部分がアミド分解しているアベルマブ組成物を提供する。すなわち、本発明のアベルマブ組成物中のアベルマブ分子の一部分は、１個以上の位置で、好ましくは少なくとも軽鎖Ａｓｎ３３および／または軽鎖Ａｓｎ５５でアミド分解される。アミド分解した変異体の量を増加させるアベルマブ組成物は、細胞表面へのＰＤ−Ｌ１の結合の増大と関連することが判明している。
【００４９】
いくつかの態様において、アベルマブ組成物は、２％超、４％超、６％超、８％超、１０％超、または１２％超のアミド分解した変異体を有する。
【００５０】
約１０〜２５％の範囲のアミド分解した変異体を有するアベルマブのバッチでは、（Biacore分析でＰＤ−Ｌへの高い結合親和性により確定される）高い細胞結合活性だけでなく、高いＡＤＣＣ活性も示すことが見出され、これらはアベルマブのなお一層の作用機構を示している。このアミド分解の範囲内の複数のバッチが臨床試験で試され、それを用いた治療は、安全かつ有効であることが判明した。これに従って、本発明のアベルマブ組成物のアミド分解した変異体の範囲を、２〜５０％、４〜４０％、６〜３０％、８〜３０％、１０〜２５％、または１２〜２０％に設定できる。
【００５１】
臨床試験で試されたアベルマブのバッチでは、ＬＭＷ種の含有量は１０％未満であった。したがって、本発明の組成物は、好ましくは、１５％未満、１０％未満、８％未満、６％未満、または５％未満のＬＭＷ種を含有する。いくつかの態様において、ＬＭＷ種の含有量は、０．１〜１０％、２〜６％、または３〜５％の範囲内にある。試験したバッチにおける、酸化された重鎖メチオニン（Ｍｅｔ）２５５を有するアベルマブの変異体の含有量は、１０％未満であった。したがって、本発明の組成物は、好ましくは１５％未満、１０％未満、８％未満、または６％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブの変異体を有する。いくつかの態様において、重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の含有量は、０．１〜１０％、１〜８％または３〜６％の範囲内にある。
【００５２】
いくつかの態様において、アベルマブ組成物は、８〜２５％のアミド分解した変異体、１０％未満の重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化された変異体、および１０％未満のＬＭＷ種を有する。その組成物は、高いＡＤＣＣ水準、ならびに高い細胞結合活性を有することが判明した。
【００５３】
いくつかの態様において、本発明のアベルマブ組成物は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または７．５％未満のアフコシル化されたアベルマブ分子を有する。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明のアベルマブ組成物中の２０％未満、１０％未満、５％未満、または３％未満のアベルマブ分子は、５個以上のマンノース残基を持つ高マンノースＮ−グリカンを有する。
【００５５】
本発明の組成物は、その製造後に患者に投与されるまで、好ましくは、１２℃未満、１０℃未満、または８℃未満に保存される。いくつかの態様において、本発明の組成物は、その投与まで２〜８℃に保存される。
【００５６】
重鎖Ｍｅｔ２５５の酸化水準を測定する適切な方法は、当業者に周知である（Bertolotti-Ciarlet et al., Mol Immunol. 2009 May;46(8-9):1878-82; Liu et al., Biochemistry. 2008 May 6;47(18):5088-100）。同様に当業者は、例えば、Agilent Technogies社製のProtein 230 KITによる2100 Bioanalyzer Systemなどの自動化ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用するＬＭＷ種の量を測定する方法、ならびにその制御方法についても周知している。抗体のグリコシル化形態の測定も、２ＡＢグリカンをマッピングするＵＰＬＣ／ＨＰＬＣなど、同様に標準的な作業となる。
【００５７】
アミド分解水準を制御する方法は一般的に公知である。例えば、製造中に、治療用タンパク質のアミド分解水準は、細胞の採取日（Kaneko et al., J Biosci Bioeng. 2010 Mar;109(3):281-7）、細胞培養の生産段階中のｐＨと温度（Dengl et al., Pharm Res. 2013 May; 30(5)：1380-99）、および細胞培養培地の調整（Hossler et al., Biotechnol Prog. 2015 Jul-Aug;31(4):1039-52; Bruhlmann et al., Biotechnol Prog. 2015 May-Jun;31(3):615-29）に基づいて制御できる。適切な温度設定および抗体調剤の選択を含む適切な保存条件を選択することで、アミド分解を製造後に制御できる（Cleland et al., J Pharm Sci. 2001 Mar;90(3):310-21）。
【００５８】
アミド分解した変異体の部分を検出し定量する方法も当業者には周知である（Gervais, J Chem Technol Biotechnol 2016;91:569-575; Vlasak and Ionescu, Curr Pharm Biotechnol. 2008 Dec;9(6):468-81）。
【００５９】
アミド分解などの電荷に関連する修飾は、一般に、イオン交換（ＩＥＸ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または等電点電気泳動（ＩＥＦ）を使用して検出されるが、当業者に公知のその他のクロマトグラフ法および電気泳動法を使用して検出されてもよい。ＩＥＸ−ＨＰＬＣおよびＩＥＦを、ＭＳ一体型液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）およびタンデム型ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのように質量分析（ＭＳ）法とさらに一体化させて、ＩＥＸ−ＨＰＬＣおよびＩＥＦを使用して特定された酸性変異体が、目的のタンパク質のアミド分解した変異体に真に対応するかを検証してもよい。
【００６０】
好ましいイオン交換クロマトグラフィーは、Dionex ProPac WCX-10（ＷＣＸ−１０とも略される）などの弱陽イオン交換（ＷＣＸ）クロマトグラフィーである。ＷＣＸ−１０カラムは、非多孔質で相溶性のエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン共重合体の１０ｍｍ径ビーズからなる、親水性の中性ポリマーに囲まれた固定相を備える。ビーズの表面には、カルボン酸基がグラフトされている。
【００６１】
本発明によれば、アミド分解した変異体の比率は、以下の弱陽イオン交換クロマトグラフィーにより測定されてもよい。
【００６２】
まず試料を、移動相Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨは５±０．１）を使用して５ｍｇ／ｍＬのアベルマブ抗体濃度まで希釈する。希釈した試料を５％（ｖ／ｖ）のカルボキシペプチダーゼＢで前処理する。得られた溶液を自動測定機構に移し、５±３°Ｃで最大７２時間まで冷蔵保存してもよい。次に、この試料をＷＣＸ−ＨＰＬＣに供試する。例えば、次の表１の条件を適用する。
【００６３】
【表１】
2020509063.tif 000002
【００６４】
この方法で得た典型的なクロマトグラムを図３〜５に示す。
【００６５】
酸性ピークは、主ピークの前に溶出する。ペプチドマッピング／ＭＳにより確認されるように、Ｒｔ＝６．０分からＲｔ＝２２．０〜２３．０分までの範囲の酸性ピークは、主にアベルマブのアミド分解した変異体に関連する。これらピーク下の面積の全ピーク下の総面積に対する比率は、アミド分解したアベルマブ変異体の比率に相当する。当業者なら容易に分かるように、全ピーク下の総面積には、ブランク試料を測定した際に見られるタンパク質の関連しないピークは除外される（クロマトグラムで、これらのピークはＲｔ＝約１．０分からＲｔ＝約４．０分までに溶出する）。
【００６６】
上記に従って、本発明はさらに以下の項目の態様についても述べる。
１．  アベルマブを含む組成物であって、酸性種のピークは、組成物のＷＣＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムで、約６．０分の保持時間から２２．０〜２３．０分の保持時間までに溶出し、
クロマトグラム試料は、カルボキシペプチダーゼＢで前処理され、
ＷＣＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含みｐＨが５±０．１の第１移動相、および２０ｍＭのＴｒｉｓと６０ｍＭのＮａＣｌを含みｐＨが１０．１±０．１の第２移動相を用いて生成され、および
ＷＣＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、２３０ｎｍでの検出を用いて生成される、組成物。
２．  前記酸性種ピークの曲線下の面積は、前記クロマトグラムの曲線下の総面積の２％超、４％超、６％超、８％超、１０％超、または１２％超である、前記項目１に記載の組成物。
３．  前記酸性種ピークの曲線下の面積は、前記クロマトグラムの曲線下の総面積の２〜５０％、４〜４０％、６〜３０％、８〜３０％、１０〜２５％、または１２〜２０％である、前記項目１に記載の組成物。
４．  クロマトグラフィーは、表１に詳述された条件で実行される、前記項目１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
５．  前記クロマトグラムの曲線下の総面積は、約６．０分の保持時間から約４１．０〜４２．０分の保持時間までに溶出するピークに相当する、前記項目１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
６．  ＷＣＸカラムの固定相は、親水性の中性ポリマーに囲まれた非多孔質で相溶性のエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン共重合体の１０ｍｍ径ビーズからなり、その表面はカルボン酸基によりグラフトされている、前記項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
７．  前記ＷＣＸカラムは、ＷＣＸ−１０カラムである、前記項目６に記載の組成物。
８．  前記組成物は、前記酸性種のピーク量が前記範囲を外れるアベルマブ含む組成物よりも、細胞表面での高いＰＤ−Ｌ１結合活性、高いＡＤＣＣ、および／または高い治療効果のうちのいずれか１つまたは組合わせを示す、前記項目１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
９．  前記組成物は、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満のＬＭＷ種を含有する、前記項目１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
１０．  重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の比率は、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満である、前記項目１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
１１．  前記酸性種ピークの曲線下の面積は、クロマトグラムの曲線下の総面積の８〜２５％であり、
前記組成物は、０．１〜１０％の範囲内のＬＭＷ種を含有し、および
重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の比率は、０．１〜１０％の範囲内である、前記項目１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
１２．  ２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは７．５％未満のアベルマブ分子は、アフコシル化されている、前記項目１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
１３．  ２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは３％未満のアベルマブ分子は、５個以上のマンノース残基を持つ高マンノースＮ−グリカンを有する、前記項目１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
１４．  前記項目１〜１３のいずれか１項に記載の組成物は、製造後に患者への投与まで、１２℃未満、好ましくは１０℃未満、より好ましくは８℃未満で保存される、保存方法。
【００６７】
特定の部位でのアミド分解の量を定量的に測定し、それにより組成物中のアミド分解した変異体の最小比率を決定することも可能である。単一残基のアミド分解は、例えば、ペプチドマッピング／ＭＳによって定量化できる。特にアミド分解し易いアスパラギン部位として、軽鎖Ａｓｎ３３、軽鎖Ａｓｎ１７３／１７４、重鎖Ａｓｎ３１８、および重鎖Ａｓｎ３８７／３９２／３９３が挙げられる。
【００６８】
ペプチドマッピング／ＭＳに基づいて、ＣＤＲ領域の軽鎖Ａｓｎ３３および可能性として軽鎖Ａｓｎ５５がアミド分解され易いことが判明した。従って、その２つの残基は、全体的なアミド分解水準と細胞結合活性との間に観察される相互関係の要因となることがある。従って、本発明は以下の態様についても述べる。
１．  アベルマブを含み、アベルマブ分子の一部分は、軽鎖Ａｓｎ３３でアミド分解されている組成物。
２．  軽鎖Ａｓｎ３３でアミド分解したアベルマブ変異体の比率は、０．５％超、１％超、２％超、３％超、または４％超である、前記項目１に記載の組成物。
３．  軽鎖Ａｓｎ３３でアミド分解したアベルマブ変異体の比率は、０．１〜２０％の範囲内、０．５〜１５％の範囲内、１〜１０％の範囲内、２〜８％の範囲内、または３〜７％の範囲内である、前記項目１または２に記載の組成物。
４．  アベルマブを含み、アベルマブ分子の一部分は、軽鎖Ａｓｎ５５でアミド分解されている組成物。
５．  軽鎖Ａｓｎ５５でアミド分解したアベルマブ変異体の比率は、０．０１％超、０．０５％超、または０．０７５％超である、前記項目４に記載の組成物。
６．  軽鎖Ａｓｎ５５でアミド分解したアベルマブ変異体の比率は、０．０１〜２％の範囲内、０．０５〜１％の範囲内、または０．０７５〜０．５％の範囲内である、前記項目４または５に記載の組成物。
７．  アベルマブ分子の一部分は、軽鎖Ａｓｎ３３でアミド分解され、アベルマブ分子の一部分は、軽鎖Ａｓｎ５５でアミド分解されている、前記項目１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
８．  前記組成物は、軽鎖Ａｓｎ３３でアミド分解したアベルマブ変異体の量が前記範囲を外れるアベルマブを含む組成物よりも、細胞表面での高いＰＤ−Ｌ１結合活性、高いＡＤＣＣ、および／または高い治療効果のうちのいずれか１つまたは組合わせを示す、前記項目１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
９．  前記組成物は、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満のＬＭＷ種を含有する、前記項目１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
１０．  重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の比率は、１０％未満、好ましくは８％未満、より好ましくは６％未満である、前記項目１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
１１．  軽鎖Ａｓｎ３３でアミド分解したアベルマブ変異体の比率は、１〜１０％の範囲内であり、
前記組成物は、０．１〜１０％の範囲内のＬＭＷ種を含有し、および
重鎖Ｍｅｔ２５５で酸化されたアベルマブ変異体の比率は、０．１〜１０％の範囲内である、前記項目１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
１２．  ２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは７．５％未満のアベルマブ分子は、アフコシル化されている、前記項目１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
１３．  ２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは３％未満のアベルマブ分子は、５個以上のマンノース残基を持つ高マンノースＮ−グリカンを有する、前記項目１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
１４．  重鎖配列として配列番号２、および軽鎖配列として配列番号１を含み、配列番号１のＡｓｎ３３および／またはＡｓｎ５５はアミド分解されている、抗体。
１５．  配列番号１のＡｓｎ３３および／またはＡｓｎ５５は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に転化されている、前記項目１４に記載の抗体。
１６．  前記項目１〜１３のいずれか１項に記載の組成物、あるいは前記項目１４または１５の抗体を含む組成物は、製造後に患者への投与まで、１２℃未満、好ましくは１０℃未満、より好ましくは８℃未満で保存される、保存方法。
【００６９】
アミド分解した組成物の使用および治療方法
本発明のアベルマブ組成物は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の有害な相互作用にもとづく疾患の治療に適している。
【００７０】
いくつかの態様において、本発明は、上述のアベルマブ組成物を患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００７１】
一態様において、治療される癌は、非小細胞肺癌、尿路上皮癌、膀胱癌、中皮腫、メルケル細胞癌、胃または胃食道接合部癌、卵巣癌、乳癌、胸腺腫、胃腺癌、副腎皮質癌、頭頸部扁平上皮癌、腎細胞癌、黒色腫、および/または古典的ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
【００７２】
本発明はまた、以下の工程を含む輸送用のアベルマブ組成物の調製方法に関する。
（ａ）アベルマブを含む複数の組成物を製造する工程、
（ｂ）アベルマブを含む組成物を試験して、本発明の組成物に対応する組成物を特定する工程、および
（ｃ）本発明の組成物を輸送用の無菌容器内に導入する工程。
【００７３】
輸送用の無菌容器は、バイアル、シリンジ、アンプル、およびバッグからなる群から選択される任意の容器であってもよい。
【００７４】
本発明はまた保存方法に関し、本発明の組成物は、製造後に患者への投与まで、１２℃未満、好ましくは１０℃未満、より好ましくは８℃未満で保存される。
【００７５】
アミド分解組成物を含む医薬製剤
本発明はまた、前記アミド分解したアベルマブ組成物を含む医薬製剤を提供する。その製剤はまた、好ましくは薬学的に許容可能な担体を含む。
【００７６】
医薬製剤は、好適には、液体製剤または再生した液体製剤である。他の態様において、医薬製剤は凍結乾燥製品として存在する。
【００７７】
医薬製剤中のアベルマブ抗体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、２０ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上、または１００ｍｇ／ｍL以上であってもよい。いくつかの態様において、アベルマブ抗体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、または１５ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬである。好ましくは、アベルマブ抗体の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬである。
【００７８】
一態様において、本発明のアミド分解組成物は、５１ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール、０．６ｍｇ／ｍＬの氷酢酸（１００％）、０．３ｍｇ／ｍＬの水酸化ナトリウム、および０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート中に処方された２０ｍｇ／ｍＬのアベルマブ抗体を含む。
【００７９】
医薬製剤は、バイアルなどの容器中に包装して提供されてもよい。
【００８０】
アミド分解した組成物を含むキット
本発明はさらに、好ましくはアミド分解したアベルマブ組成物の製剤で充填された容器内に、アミド分解したアベルマブ組成物を含むキットを提供する。
【００８１】
そのキットは、好適には、アミド分解したアベルマブ組成物の使用説明書を含む。さらにキットは、他の抗体または小分子抗癌剤などの追加の治療薬を含んでもよい。例えば、アミド分解したアベルマブ組成物は、シクロホスファミド、ゲムシタビン、スチムバックス、またはＦＯＬＦＯＸ化学療法のコア成分を含むキットで提供されてもよい。
【実施例】
【００８２】
実施例１：アベルマブ組成物中のアミド分解した変異体を定量する方法
５０μＬのアベルマブ試料（２０ｍｇ／ｍＬのアベルマブ抗体の水性製剤、５１ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール、０．６ｍｇ／ｍＬの氷酢酸、０．３ｍｇ／ｍＬのＮａＯＨ、０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０）を１５０μＬの移動相Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨは５±０．１）により希釈した。１０μＬのカルボキシペプチダーゼＢ（ｎｐカルボキシペプチダーゼＢ、注文コード２５００、ASA Spezialenzyme GmbH）を加えて、冷却した自動測定機構（５℃±３℃）に移した。
【００８３】
上記の表１に示した条件で、５０μＬの前処理試料をＩＥＸ−ＨＰＬＣに注入した。
【００８４】
アミド分解したアベルマブ変異体の比率を、全ピーク下の総面積に対比して、アミド分解した変異体に対応するピークの（Ｒｔ＝６．０分からＲｔ＝２２．０〜２３．０分までの）ピーク下面積に基づいて計算した。
【００８５】
実施例２：アベルマブの細胞結合活性を定量する方法
アベルマブの生体活性を、組換えＨＥＫ−２９３（ｈＰＤ−Ｌ１）細胞株に過剰発現させたヒトＰＤ−Ｌ１受容体に結合する能力を測定可能な細胞ベース分析法により評価した。この目的に向けて、試験するアベルマブ組成物中のアベルマブ抗体を、室温で３０分間、旋回中のタンパク質Ａを付着した９６個ウェルのプレートに結合させた。次に、５０，０００個のＨＥＫ−２９３（ｈＰＤ−Ｌ１）細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を付着したプレートのウェル毎に添加し、３７℃、５％ＣＯ２中、１時間で抗ＰＤ−Ｌ１抗体と結合させた。未結合の細胞を洗い流し、結合した細胞の存在をATPlite 1step（Perkin Elmer社製）により各ウェルで確認した。次に、１秒あたりの計数値を、対数変換した抗ＰＤ−Ｌ１抗体の濃度に対してプロットし、４ＰＬ（Ｓ字型用量反応曲線）に適合させた。各データ組について、ＰＤ−Ｌ１の結合可能な最大能力の５０％で結合可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体の濃度（ＥＣ５０）を計算した。試料の生体活性は、参照材料に対する活性度（％）として表され、効力の比（すなわち、標準製剤と未知製剤の等効性用量でのＥＣ５０の比率）を百分率で示す。この効力は、３個の個別の分析からの平均結果として得られる。
【００８６】
実施例３：人工的にアミド分解したアベルマブ試料の生体活性
種々のアミド分解水準を有するアベルマブ試料の生体活性を試験した。試料をストレス条件（５０℃での培養）または促進条件（２５℃での培養）で処理して、人工的にアミド分解した。未処理の試料を参照材料として使用した。
【００８７】
次に、実施例１に概説した方法に従ってアミド分解したアベルマブ変異体の比率を決定し、実施例２に概説した方法に従って生体活性の水準を測定した。
【００８８】
結果は以下の通りであった。
【００８９】
【表２】
2020509063.tif 000003
【００９０】
アミド分解した変異体の比率を細胞結合活性に対してプロットし、両者間に０．００１４のＰ値とともに有意な相関が見られた（図６）。
【００９１】
実施例４：人工的にアミド分解したアベルマブ試料の生体活性
種々のアミド分解水準を有するアベルマブ試料の生体活性をまた、別の一連の実験で試験した。試料を促進条件（２５℃での培養）で処理して、人工的にアミド分解した。未処理の試料を参照材料として使用した。
【００９２】
次に、実施例１に概説した方法に従ってアミド分解したアベルマブ変異体の比率を決定し、実施例２に概説した方法に従って生体活性の水準を測定した。
【００９３】
結果は以下の通りであった。
【００９４】
【表３】
2020509063.tif 000004
【００９５】
アミド分解した変異体の比率を細胞結合活性に対してプロットし、両者間に０．０２２０のＰ値とともに有意な相関が見られた（図７）。
【００９６】
実施例５：人工的にアミド分解したアベルマブ試料の生体活性
アベルマブ試料を、緩衝液をｐＨ９の重炭酸アンモニウム溶液に置き換えた後に、室温で４日間保存して人工的にアミド分解した。未処理試料を参照材料として使用した。
【００９７】
次に、実施例１に概説した方法に従ってアミド分解したアベルマブ変異体の比率を決定し、実施例２に概説した方法に従って生体活性の水準を測定した。
【００９８】
結果は以下の通りであった。
【００９９】
【表４】
2020509063.tif 000005
【０１００】
実施例６：アベルマブのアミド分解した変異体の生体活性
アベルマブ軽鎖の位置３３または５５のアスパラギンを、それぞれの部位でのアミド分解を模倣するようにアスパラギン酸に変異させた。発現したタンパク質の生体活性は、実施例２に概説した方法で測定した。変異のないアベルマブを参照材料として使用した。
結果は次のとおりであった。
【０１０１】
【表５】
2020509063.tif 000006
【図１】
2020509063.tif 000007
【図２Ａ】
2020509063.tif 000008
【図２Ｂ−１】
2020509063.tif 000009
【図２Ｂ−２】
2020509063.tif 000010
【図３】
2020509063.tif 000011
【図４】
2020509063.tif 000012
【図５】
2020509063.tif 000013
【図６】
2020509063.tif 000014
【図７】
2020509063.tif 000015
【配列表】
2020509063000001.app
【国際調査報告】
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2020509063.tif 000017
2020509063.tif 000018
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