(57)【要約】Ｆｃ領域を含有する条件的に活性化された結合タンパク質の組成物、及びそのような条件的に活性化された結合タンパク質を共発現し、精製するための方法が、本明細書に提供される。条件的に活性化された結合タンパク質を患者に投与することによってがんを治療する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）と、
ｉｉ）ドメインリンカーと、
ｉｉｉ）
１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、
２）ＣＮＣＬ、ならびに
３）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、を含む、第１の拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）ドメインリンカーと、
ｖ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｖｉ）第１の開裂性リンカーと、
ｖｉｉ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）
１）偽可変軽ドメイン、
２）非開裂性リンカー、及び
３）偽可変重ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、
ｉｉ）第２の開裂性リンカーと、
ｉｉｉ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、ヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項２】
ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）ドメインリンカーと、
ｉｉｉ）
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、
２）拘束非開裂性リンカー、ならびに
３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第１の開裂性リンカーと、
ｖ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）
１）偽可変重ドメイン、
２）非開裂性リンカー、及び
３）偽可変軽ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｉｉ）第２の開裂性リンカーと、
ｉｉｉ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、ヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項３】
ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第１のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）
１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、
２）第１の開裂性リンカー、及び
３）偽可変重ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第２のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、
２）第２の開裂性リンカー、ならびに
３）偽可変軽ドメイン、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第１のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、前記第１の偽Ｆｖドメインの前記可変軽ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの前記可変重ドメインが、前記開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項４】
ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第１のＦｃドメインと、
ｉｉｉ）第１の開裂性リンカーと、
ｉｖ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｖ）第１のドメインリンカーと、
ｖｉ）
１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、
２）第２の開裂性リンカー、
３）偽可変重ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、を含む、第１のモノマーと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第３のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第２のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、
２）第２の開裂性リンカー、ならびに
３）偽可変軽ドメイン、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、前記第１の偽Ｆｖドメインの前記可変軽ドメイン及び前記第２の偽Ｆｖドメインの前記可変重ドメインが、前記開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項５】
ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）ドメインリンカーと、
ｉｉｉ）
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、
２）第１の開裂性リンカー、ならびに
３）偽可変軽ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第２のＦｃドメインと、
ｖ）第２の開裂性リンカーと、
ｖｉ）第３のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｖｉｉ）
１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、
２）第３の開裂性リンカー、ならびに
３）偽可変重ドメイン、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、前記第１の偽Ｆｖドメインの前記可変重ドメイン及び前記第２の偽Ｆｖドメインの前記可変軽ドメインが、前記開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項６】
前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインに対するＮ末端であり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインに対するＮ末端である、請求項１または２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７】
前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインに対するＮ末端であり、前記偽重可変ドメインが、前記偽軽可変ドメインに対するＮ末端である、請求項１または２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８】
可変重鎖が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記可変軽ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項９】
前記偽重ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記偽軽ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１０】
前記ＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｈ７Ｂ３、及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１１】
前記第１及び第２のｓｄＡＢＤが、同じＴＴＡに結合する、請求項１及び３〜１０のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１２】
前記第１及び第２のｓｄＡＢＤが、異なるＴＴＡに結合する、請求項１及び３〜１０のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１３】
前記ｓｄＡＢＤ（複数可）が、配列番号１４、１５、２１、２２、２３、２５、１５５、１５９、１６３、及び１６７からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１４】
前記第１及び第２のＦｃドメインの一方が、配列番号１９９を有し、もう一方が、配列番号２００を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１５】
前記第１及び／または第２の開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択される、ヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項〜１１のいずれかに記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
【請求項１６】
核酸組成物であって、
ａ）請求項１〜１５のいずれかに記載の第１のモノマーをコードする第１の核酸と、
ｂ）それぞれ、請求項１〜１５のいずれかに記載の第２のモノマーをコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の第１及び第２の核酸を含む、発現ベクター組成物。
【請求項１８】
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項１６に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項１６に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項２０】
ヘテロ二量体タンパク質を作製する方法であって、前記ヘテロ二量体タンパク質を発現する条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロ二量体タンパク質を回収することと、を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を投与することを含む、がんを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５５，９９９号、及び２０１７年９月８日出願の同第６２／５５５，９４３号の利益を主張し、これらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞または特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床環境において望ましい場合が多い。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しながら、健康な細胞及び組織を可能な限り無傷及び非損傷の状態で残すことが、がん療法の主要目的である。１つのそのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘発して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによる。
【０００３】
腫瘍関連抗原に優れた結合特異性及び親和性を提供する無傷モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、がん治療及び診断の分野でうまく適用されてきた。しかしながら、無傷ＭＡｂの大きいサイズ、それらの不十分な生体内分布及び血液プール中の長い持続性は、無傷ＭＡｂの臨床用途を制限してきた。例えば、無傷抗体は、腫瘍範囲内の特定の蓄積を示し得る。生体内分布研究において、周辺領域内の一次蓄積を伴う不均質な抗体分布は、腫瘍を精密に調査するときに顕著である。腫瘍壊死、不均質な抗体分布、及び間質組織圧力の増大により、無傷抗体構築物で腫瘍の中心部分に到達することは不可能である。対照的に、より小さい抗体フラグメントは、迅速な腫瘍局在を示し、腫瘍内へとより深く浸透し、また血流から比較的迅速に除去される。
【０００４】
親ＭＡｂの小結合ドメインに由来する単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）は、臨床用途のために無傷ＭＡｂよりも良好な生体内分布をもたらし、腫瘍細胞をより効率的に標的とし得る。単鎖フラグメントは、細菌から効率的に操作され得るが、大部分の操作されたｓｃＦｖは、一価構造を有し、二価化合物が経験する結合力の欠如に起因する、それらの親ＭＡｂと比較して減少した腫瘍蓄積、例えば、腫瘍細胞上の短い滞留時間、及び特異性を示す。
【０００５】
ｓｃＦｖの好ましい特性にもかかわらず、ある特定の特徴は、がん化学療法におけるそれらの完全な臨床展開を妨げる。特筆すべきは、罹患組織及び健康組織の両方に共通する細胞表面受容体へのこれらの薬剤の標的化に起因する、罹患組織と健康な組織との間のそれらの相互反応性である。改善された治療指数を有するＳｃＦｖは、これらの薬剤の臨床的有用性において重要な進歩をもたらす。本発明は、そのような改善されたｓｃＦｖ、及びそれを製造し、使用する方法を提供する。本発明の改善されたｓｃＦｖは、二量体化合物を形成することによって、単一ユニットにより実証された結合力の欠如を克服するという予想外の利益を有する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）拘束非開裂性リンカー、ならびに（３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、（ｉｖ）第１の開裂性リンカーと、（ｖ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）（１）偽可変重ドメイン、（２）非開裂性リンカー、及び（３）偽可変軽ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、（ｉｉ）第２の開裂性リンカーと、（ｉｉｉ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、拘束Ｆｖドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、第１の開裂性リンカーのＮ末端において第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメインをさらに含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。
【０００９】
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは同じである。ある特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは異なる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
【００１３】
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ２１７及びＰｒｏ２１８、Ｐｒｏ２１９及びＰｒｏ２１８、配列番号９及び１０、または配列番号１０及び１１のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
別の態様では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）第１のドメインリンカーと、（ｉｉｉ）（１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、（２）第１の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変重ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、（ｉｖ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）第２のドメインリンカーと、（ｉｉｉ）（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）第２の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変軽ドメイン、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、（ｉｖ）第１のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、第１の偽Ｆｖドメインの可変軽ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの可変重ドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーをさらに含む。様々な実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーを含み、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは同じである。ある特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは異なる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ３６及びＰｒｏ３７、Ｐｒｏ３６及びＰｒｏ３８、Ｐｒｏ６７及びＰｒｏ６８、配列番号１及び２、配列番号１及び３、または配列番号４及び５のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明のさらに別の態様では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のモノマーと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）第１の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変軽ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、（ｉｖ）第２のＦｃドメインと、（ｖ）第２の開裂性リンカーと、（ｖｉ）第３の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第３の抗原結合ドメインと、（ｖｉｉ）（１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、（２）第３の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変重ドメイン、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、第１の偽Ｆｖドメインの可変重ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの可変軽ドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
【００２４】
ある特定の実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーをさらに含む。様々な実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーを含み、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーを含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。様々な例では、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは同じである。ある特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは異なる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡ、第２のＴＴＡ、及び／または第３のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。場合によっては、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲである。他の場合では、第１のＴＴＡは、ＥｐＣＡＭである。場合によっては、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲである。他の場合では、第２のＴＴＡは、ＥｐＣＡＭである。ある特定の場合では、第３のＴＴＡは、ＥＧＦＲである。他の場合では、第３のＴＴＡは、ＥｐＣＡＭである。
【００３１】
ある特定の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第２のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ、第２のＴＴＡ、及び第３のＴＴＡは同じである。特定の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第２のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ、第２のＴＴＡ、及び第３のＴＴＡは異なる。
【００３２】
様々な実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、第３の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。他の実施形態では、第１、第２、及び／または第３の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ６９及びＰｒｏ７０、または配列６及び７のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
別の態様では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）第１のＦｃドメインと、（ｉｉｉ）第１の開裂性リンカーと、（ｉｖ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｖ）第１のドメインリンカーと、（ｖｉ）（１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、（２）第２の開裂性リンカー、（３）偽可変重ドメイン、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、を含む、第１のモノマーと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）第２のドメインリンカーと、（ｉｉｉ）（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）第３の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変軽ドメイン、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、（ｉｖ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のモノマーと、を含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブ・イン・ホール修飾を含み、第１の偽Ｆｖドメインの可変軽ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの可変重ドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下でヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーをさらに含む。様々な実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーを含み、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。様々な例では、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される。特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは同じである。ある特定の場合では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは異なる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４、１５、及び２１〜２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ６７及びＰｒｏ７１、または配列４及び８のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つの第１のモノマーをコードする核酸が、本明細書に提供される。本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つの第２のモノマーをコードする核酸もまた、本明細書に提供される。加えて、第１のモノマーをコードする核酸を含む発現ベクター、第２のモノマーをコードする核酸を含む発現ベクター、または第１のモノマーをコードする核酸及び第２のモノマーをコードする核酸を含む発現ベクターが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発現ベクターのうちのいずれか１つを含む宿主細胞が、本明細書に提供される。
【００４５】
本発明の一態様では、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法が提供される。この方法は、ヘテロ二量体タンパク質を発現する条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養することと、ヘテロ二量体タンパク質を回収することと、を含む。
【００４６】
本発明の一態様では、本発明のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つを患者に投与することを含む、がんを治療する方法が提供される。
【００４７】
本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物は、同族プロテアーゼによる開裂の非存在下でプロドラッグ組成物と称され得る。
【００４８】
別の態様では、本明細書に記載の任意のプロドラッグ組成物を投与することを含む、それを必要とするヒト対象におけるがんを治療する方法が、本明細書に提供される。
【００４９】
本出願は、２０１７年３月８日出願の国際公開特許出願第ＷＯ２０１７／１５６１７８号、２０１６年３月８日出願の米国仮特許出願第６２／３０５，０９２号、２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５５，９４３号、２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５５，９９９号、２０１７年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６２／５８３，３２７号、及び２０１７年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／５８７，３１８号を参照し、図面、レジェンド、及び定義、ならびに全ての列挙される実施形態を含むこれらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物１」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。本明細書に記載されるような他の開裂部位が使用され得るが、Ｐｒｏ３７＋Ｐｒｏ３６プロドラッグ構築物の概略、及びエンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂後に得られる二重特異性ポリペプチドが示される。二重特異性ポリペプチドは、ＥＧＦＲに結合するｓｄＡＢＤ及びＣＤ３に結合するＦｖドメインを含む。限定されないが、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、及びＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図１は、ＦｃドメインのＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図２】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物２」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。多くの実施形態は他の開裂部位を利用するが、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を再び使用して、Ｐｒｏ３８＋Ｐｒｏ３６プロドラッグ構築物の概略が示される。限定されないが、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、及びＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図２は、ＦｃドメインのＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図３】本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、低い条件付けまたは条件付けの欠如を示したことを示す。図３Ａにおいて、Ｐｒｏ３６＋３７（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ３６＋３７（四角）は、前処理された。図３Ｂにおいて、Ｐｒｏ３６＋３８（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ３６＋３８（四角）は、前処理された。Ｐｒｏ２１４は、完全長の負の対照（白抜きの四角）であり、Ｐｒｏ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない正の対照である。
【図４】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物３」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。多くの実施形態は他の開裂部位を利用するが、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を再び使用して、Ｐｒｏ６８＋Ｐｒｏ６７プロドラッグ構築物の概略、及びエンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂後に得られる二重特異性ポリペプチドが示される。二重特異性ポリペプチドは、ＥＧＦＲに結合するｓｄＡＢＤ及びＣＤ３に結合するＦｖドメインを含む。限定されないが、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、及びＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図２は、ＦｃドメインのＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図５】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物４」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。多くの実施形態は他の開裂部位を利用するが、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を再び使用して、Ｐｒｏ６９＋Ｐｒｏ７０プロドラッグ構築物の概略が示される。限定されないが、ＦＯＬＲ１、Ｈ７Ｂ３、及びＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図５は、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図６】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物５」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。多くの実施形態は他の開裂部位を利用するが、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を再び使用して、Ｐｒｏ７１＋Ｐｒｏ６７プロドラッグ構築物の概略が示される。限定されないが、ＦＯＬＲ１、Ｈ７Ｂ３、及びＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図２は、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図７Ａ】本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付けを示したが、高い活性が欠如していたことを示す。図７Ａにおいて、Ｐｒｏ６７＋６８（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ６７＋６８（四角）は、前処理された。
【図７Ｂ】本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付けを示したが、高い活性が欠如していたことを示す。図７Ｂにおいて、Ｐｒｏ６９＋７０（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ６９＋７０（四角）は、前処理された。
【図７Ｃ】本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付けを示したが、高い活性が欠如していたことを示す。図７Ｃにおいて、Ｐｒｏ６７＋７１（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ６７＋７１（四角）は、前処理された。Ｐｒｏ２１４は、完全長の負の対照（白抜きの四角）であり、Ｐｒｏ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない正の対照である。
【図８】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物６」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。本明細書に記載される他の開裂部位も同様に使用され得るが、ＭＭＰ９プロテアーゼ開裂部位を使用して、Ｐｒｏ２１９＋Ｐｒｏ２１８プロドラッグ構築物の概略が示される。限定されないが、ＦＯＬＲ１、Ｈ７Ｂ３、及びＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図８は、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図９】Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物７」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。本明細書に記載される他の開裂部位も同様に使用され得るが、ＭＭＰ９プロテアーゼ開裂部位を使用して、Ｐｒｏ２１７＋Ｐｒｏ２１８プロドラッグ構築物の概略が示される。限定されないが、ＥｐＣＡＭなどの他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態において使用され得ることに留意されたい。加えて、図９は、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「ｔａｇ」の使用を示し、これらを使用して、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進したが、当業者によって理解されるように、これらを除去することができる。
【図１０】本明細書に記載の例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付け及び高い効力を示したことを示す。図１０Ａにおいて、Ｐｒｏ２１７＋２１８（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ２１７＋２１８（四角）は、前処理された。Ｐｒｏ２１４は、完全長の負の対照（白抜きの四角）であり、Ｐｒｏ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない正の対照である。図１０Ｂにおいて、Ｐｒｏ２１８＋２１９（丸）は、ＥＫプロテアーゼで前処理されなかったが、開裂されたＰｒｏ２１８＋２１９（四角）は、前処理された。Ｐｒｏ２１４は、完全長の負の対照（白抜きの四角）であり、Ｐｒｏ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない正の対照である。
【図１１Ａ】いくつかの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図１１Ｂ】いくつかの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図１１Ｃ】いくつかの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図１２】多くの好適なｓｃＦｖリンカーまたはドメインリンカーを示す。
【図１３Ａ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１３Ｂ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１３Ｃ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１３Ｄ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１３Ｅ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１３Ｆ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１３Ｇ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。
【図１４Ａ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１４Ｂ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１４Ｃ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１４Ｄ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１４Ｅ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１４Ｆ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１４Ｇ】本発明の配列を示す。リンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれている。ＣＤＲは太字で下線が引かれている。斜線（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意である。したがって、Ｃ末端タグを除く図１４の配列が、本明細書の記載内に含まれる。
【図１５Ａ】追加のＰｒｏ２１９構築物（図１５Ａ）及び追加のＰｒｏ２１７構築物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）を示す。
【図１５Ｂ】追加のＰｒｏ２１９構築物（図１５Ａ）及び追加のＰｒｏ２１７構築物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）を示す。
【図１５Ｃ】追加のＰｒｏ２１９構築物（図１５Ａ）及び追加のＰｒｏ２１７構築物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）を示す。
【図１６Ａ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【図１６Ｂ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【図１６Ｃ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【図１６Ｄ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【図１６Ｅ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【図１６Ｆ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【図１６Ｇ】本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交差部を示し、ドメインリンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは下線が引かれ、斜体である。構築物の多くは、ヒスチジンタグを含むが、その使用に応じて任意である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
Ｉ．導入
本発明は、ＣＤ３及び腫瘍抗原などの重要な生理学的標的に結合する二重特異性抗体（抗体様機能タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低減する方法に関する。抗体などの多くの抗原結合タンパク質は、有意な「オン標的／オフ腫瘍」副作用を有する可能性があり、したがって、罹患組織の近くの治療用分子の結合能力のみを活性化して、オフ標的相互作用を回避する必要性がある。したがって、本発明は、多くの機能タンパク質ドメインを有する多価の条件的に有効な（「ＭＣＥ」）タンパク質に関する。一般に、これらのドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。別のドメインは、ある特定の条件下、例えば、ＡＢＤの部分がＡＢＤの相補部分の付近にあるときに、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に結合して、抗ＣＤ３  Ｆｖ結合ドメインを形成するＡＢＤである。つまり、治療用分子は、ＣＤ３結合ドメインが腫瘍環境に曝露されるまで不活性である「プロドラッグ」様形式で作製される。この条件付けを達成するために、本発明は、本明細書に記載され、図面に示されるように、その形式に応じていくつかの異なる方法で「偽」または「不活性」または「非活性」可変ドメインを利用する。これらは、本明細書において「ｉＶＨ」及び「ｉＶＬ」ドメインと称される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメイン（「ＣＤ３  Ｆｖ」）は、拘束された形式であり、従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーは、２つのドメインが互いに結合できるようにするには短すぎる。いくつかの実施形態では、プロドラッグ（例えば、未開裂）形式において、プロドラッグポリペプチドはまた、「偽Ｆｖドメイン」も含む。偽Ｆｖドメインは、標準的なフレームワーク領域であるが、「非活性」もしくは「ダミー」ＣＤＲを有する可変重ドメイン（不活性可変重ドメイン）、標準的なフレームワーク領域であるが、「非活性」もしくは「ダミー」ＣＤＲを有する可変軽ドメイン（不活性可変軽ドメイン）のいずれか、または両方を含み得る。したがって、拘束されたＦｖドメインは、各々のフレームワーク領域の親和性により、偽Ｆｖドメインに結合する。しかしながら、偽ドメインの「非活性」ＣＤＲにより、得られるＡＢＤは、ＣＤ３に結合せず、したがってオフ標的毒性を防止する。しかしながら、腫瘍内またはその近くにあるプロテアーゼの存在下で、プロドラッグ構築物は、「真の」可変重ドメイン及び可変軽ドメインが会合できるような方法で開裂され、したがって活性ＣＤ３結合及び得られる腫瘍有効性を引き起こす。
【００５３】
他の実施形態では、プロドラッグ形式において、プロドラッグポリペプチドは、２つの偽Ｆｖドメイン及び各偽Ｆｖドメインに連結されたＦｃドメインを含む。第１の偽Ｆｖドメインは、不活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含み得、第２の偽Ｆｖドメインは、活性可変重ドメイン及び不活性可変軽ドメインを含み得る。プロドラッグ形式のＡＢＤは、タンパク質分解的に不活性な組織においてＣＤ３に結合しない。しかし腫瘍内またはその近くで、プロテアーゼは、プロドラッグ構築物を開裂することができ、それにより活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインは会合し、ＣＤ３に結合することができ、それによって標的腫瘍細胞の細胞毒性を誘導する。
【００５４】
したがって、本明細書に提供されるプロドラッグ構築物は、「ノブ・イン・ホール」（「ＫＩＨ」）立体配座を形成するヘテロ二量体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。ノブ・イン・ホール概念の詳細な説明は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及び同第７，１８６，０７６号、ならびにＲｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１９９６，９（７）：６１７−６２１、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９７，２７０（１）：２６−３５、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６：６７７−６８１、及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２４（１−２）：７−１５において見出すことができる。手短に言えば、ノブは、より小さいアミノ酸側鎖をより大きいもの（例えば、Ｔ３６６Ｗ）と置き換えることによって、第１のＩｇＧ  Ｆｃ鎖のＣＨ３ドメイン界面において作成され得、ホールは、より大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、Ｙ４０７Ｖ）と置き換えることによって、第２のＩｇＧ  Ｆｃ鎖のＣＨ３界面におい並列位置で作成され得る。好適なＫＩＨ変異体は、以下に記載される。したがって、本明細書において「ノブ置換（複数可）」を有するＣＨ３ドメインは、「ＣＨ３−ノブ」と称され、「ホール置換（複数可）」を有するＣＨ３ドメインは、本明細書において「ＣＨ３−ホール」と称され、当業者によって理解されるように、Ｆｃ二量体のどちら「側」が「ホール変異体」を含有し、どちらが「ノブ変異体」を含有するかは確定的でなく、変化し得るため、その汎称は「ＣＨ３−ＫＩＨ」であり、両方を網羅する。
【００５５】
本明細書で考察されるように、本発明において使用される様々な立体配座及び形式が存在する。プロドラッグ構築物の立体配座は、プロドラッグ活性化がいくつかの一般的な方法で起こり得るように多種多様な構成を取り得、図１では「構築物１」として、図２では「構築物２」として、図４では「構築物３」として、図５では「構築物４」として、図６では「構築物５」として、図８では「構築物６」として、及び図９では「構築物７」として示される。これらの構築物は、一般にヘテロ二量体Ｆｃ構造を形成するＦｃドメインに依存して、非活性結合ドメインの適切な開裂前会合を可能にする。
【００５６】
「構築物１」の実施形態では、プロドラッグ構築物は、ＣＨ２−ＣＨ３−ホールポリペプチド、第１の偽Ｆｖドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、第１のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２−ＣＨ３−ノブポリペプチド、第２の偽Ｆｖドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。偽Ｆｖドメインは、腫瘍環境に曝露されるまで不活性であるＣＤ３結合ドメイン（Ｆｖ）を指す。この実施形態では、偽Ｆｖドメインは、活性可変重ドメイン（活性ＶＨ）及び不活性可変軽ドメイン（不活性ＶＬ）を含む。他の実施形態では、偽Ｆｖドメインは、活性可変軽ドメイン（活性ＶＬ）及び不活性可変重ドメイン（不活性ＶＨ）を含む。さらに、当業者によって理解されるように、「構築物１」の偽Ｆｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端的に、いずれかの配向でＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る（例えば、図１／「構築物１」において、偽Ｆｖドメインは、ＶＨ−リンカー−ＶＬとして示されるが、これは切り替えられ得る）。
【００５７】
「構築物１」のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに連結された第２の抗原結合ドメインに連結された不活性ＶＨドメインに開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＬドメインにドメインリンカーを介して連結された第１のＴＴＡの抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに連結された不活性ＶＬドメインに開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＨドメインにドメインリンカーを介して連結された第２のＴＴＡの抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。腫瘍部位またはその近くで第１のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーを開裂し、第２のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーを開裂すると、第１のＦｃポリペプチドの活性ＶＬ及び第２のＦｃポリペプチドの活性ＶＨは会合し、活性ＣＤ３結合を引き起こし得る。活性ＶＨ及びＶＬドメインの固有の自己集合に加えて、各ドメインは、腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインに連結される。そのようなものとして、プロテアーゼ開裂産生物は、腫瘍細胞に結合し、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じ腫瘍抗原である。他の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる腫瘍抗原である。
【００５８】
場合によっては、「構築物１」のプロドラッグ構築物は、２つの開裂部位を有し、１つは第１のＦｃポリペプチドの活性可変軽鎖と不活性可変重鎖との間にあり、２つ目は第２のＦｃポリペプチドの活性可変重鎖と不活性可変軽鎖との間にある。いくつかの実施形態では、２つの開裂部位が認識され、同じプロテアーゼによって開裂される。そのようなものとして、２つの開裂部位は、同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有し得る。他の実施形態では、２つの開裂部位が認識され、異なるプロテアーゼによって開裂される。したがって、２つの開裂部位は、異なるアミノ酸配列を有し得る。
【００５９】
「構築物２」のいくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド、活性可変軽鎖（活性ＶＬ）及び不活性可変重鎖（不活性ＶＨ）を含む第１の偽Ｆｖドメイン、ならびに標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、第１のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド、活性可変重鎖（活性ＶＨ）及び不活性可変軽鎖（不活性ＶＬ）を含む第２の偽Ｆｖドメイン、ならびに標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。
【００６０】
「構築物２」のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドにドメインリンカーを介して連結された不活性ＶＨドメインに開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＬドメインにドメインリンカーを介して連結された第１のＴＴＡの抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドにドメインリンカーを介して連結された不活性ＶＬドメインに開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＨドメインにドメインリンカーを介して連結された第２のＴＴＡの抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。腫瘍部位またはその近くで第１のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーを開裂し、第２のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーを開裂すると、第１のＦｃポリペプチドの活性ＶＬ及び第２のＦｃポリペプチドの活性ＶＨは会合し、活性ＣＤ３結合を引き起こし得る。活性ＶＨ及びＶＬドメインの固有の自己集合に加えて、各ドメインは、腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインに連結される。そのようなものとして、プロテアーゼ開裂産生物は、腫瘍細胞に結合し、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じ腫瘍抗原である。他の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる腫瘍抗原である。
【００６１】
「構築物３」のプロドラッグは、「構築物２」と同様であるが、第１のＦｃポリペプチドの不活性ＶＨドメインとＣＨ３−ホールポリペプチドとの間のドメインリンカー、及び第２のＦｃポリペプチドの不活性ＶＬドメインとＣＨ３−ノブポリペプチドとの間のドメインリンカーが欠如している。
【００６２】
ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびにＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド、第１の偽Ｆｖドメイン、第２の偽Ｆｖドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る第２の抗原結合ドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る第３の抗原結合ドメインを含む第２のＦｃポリペプチドと含むプロドラッグ構築物（例えば、「構築物４」）もまた、本明細書に提供される。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。他の実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原である。第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。第１及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。第１及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。第２及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。
【００６３】
「構築物４」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに連結されたＴＴＡの第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、不活性ＶＨドメインに開裂性リンカーを介して連結された活性ＶＬドメインにドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡの第３の抗原結合ドメインに開裂性リンカーを介して連結されたＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに連結された不活性ＶＬドメインに開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＨドメインにドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡの第２の抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。
【００６４】
「構築物５」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、不活性ＶＨドメインに開裂性リンカーを介して連結された活性ＶＬドメインにドメインリンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインに開裂性リンカーを介して連結されたＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに連結されたＴＴＡの第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに連結された不活性ＶＬドメインに開裂性リンカーを介して連結された活性ＶＨドメインにドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡの第３の抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。他の実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原である。第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。第１及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。第１及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。第２及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。
【００６５】
ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド、ならびに標準的なフレームワーク領域及び「非活性」または「ダミー」ＣＤＲを有する可変重ドメイン及び可変軽ドメインを含む、第１の偽Ｆｃポリペプチド、を含む第１のＦｃペプチドと、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、及び拘束された形式のＣＤ３結合ドメイン、を含む、第２のＦｃポリペプチドと、を含むプロドラッグ構築物（例えば、「構築物６」）が、本明細書に提供され、従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーは、２つのドメインが互いに結合できるようにするには短すぎる。いくつかの実施形態では、拘束された活性Ｆｖドメインは、開裂性リンカーを介してＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに共有結合され、第１の偽Ｆｖドメインは、開裂性リンカーを介してＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに共有結合される。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、同じプロテアーゼによって認識され得る。他の実施形態では、開裂性リンカーは、異なるプロテアーゼによって認識され得る。
【００６６】
「構築物６」の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーを介して連結された拘束された活性Ｆｖドメイン（例えば、拘束された非開裂性リンカーを介して活性可変軽鎖に連結された活性可変重鎖、または拘束された非開裂性リンカーを介して活性可変重鎖に連結された活性可変軽鎖）にドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡの第１の抗原結合ドメインを含み、第１のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーまたは非開裂性リンカーを介して連結された偽Ｆｖドメイン（例えば、非開裂性リンカーを介して不活性可変重ドメインに連結された不活性可変軽ドメイン、または非開裂性リンカーを介して不活性可変軽ドメインに連結された不活性可変重ドメイン）を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。
【００６７】
「構築物６」と同様の別のプロドラッグ構築物（例えば、「構築物７」）が、本明細書に提供される。構築物７の例示的な実施形態は、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し得る第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、及び拘束された形式のＣＤ３結合ドメインを含む、第２のＦｃポリペプチドと（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーは、２つのドメインが互いに結合できるようにするには短すぎる）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチド及び第１の偽Ｆｖドメインを含む、第１のＦｃポリペプチドと、を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。場合によっては、第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合し得る。他の場合では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合し得る。
【００６８】
「構築物７」の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインにドメインリンカーを介して連結された拘束された活性Ｆｖドメイン（例えば、拘束された非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束された非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）にドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡの第１の抗原結合ドメインを含み、第１のＦｃポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２−ＣＨ３−ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーまたは非開裂性リンカーを介して連結された偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３−ノブを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２−ＣＨ３−ノブポリペプチドに隣接した開裂性リンカーは、ＣＨ２−ＣＨ３−ホールポリペプチドに隣接した同じ開裂性リンカーである。他の実施形態では、開裂性リンカーは異なる。
【００６９】
ＩＩ．定義
本出願がより完全に理解され得るために、いくつかの定義が以下に記載される。そのような定義は、文法的等価物を包含するよう意図される。
【００７０】
「ＣＯＢＲＡ（商標）」及び「条件付き二重特異性再方向付け活性化」という用語は、多くの機能タンパク質ドメインを有する二重特異性の条件的に有効なタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、機能ドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。ある特定の実施形態では、別のドメインは、ある特定の条件下でＴ細胞抗原に結合するＡＢＤである。Ｔ細胞抗原としては、ＣＤ３が挙げられるが、これに限定されない。「半ＣＯＢＲＡ（商標）」という用語は、標的発現細胞の表面上に集中したときの固有の自己集合により、半ＣＯＢＲＡの可変重鎖が別の半ＣＯＢＲＡ（商標）（相補的半ＣＯＢＲＡ（商標））の可変軽鎖に会合することができる場合に、Ｔ細胞抗原に結合することができる、条件的に有効なタンパク質を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、特定の定義された位置に存在し得る２０個の天然に存在するアミノ酸または任意の非天然類似体のうちの１つを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」は、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。本明細書の「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。
【００７２】
本明細書の「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失、あるいはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に付着した、改変した炭水化物またはＰＥＧ構造であり得る。明確にするために、特に断りのない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対してである。本明細書の好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
【００７３】
本明細書の「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の、異なるアミノ酸配列による置き換えを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置において天然に存在しない、その生物内または任意の生物内のいずれかに天然に存在しないアミノ酸に対してである。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（なおもアルギニンをコードする）に交換して宿主生物発現レベルを増大させる）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、つまり、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の生成にもかかわらず、タンパク質が、それが出発した特定の位置における同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の付加を意味する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の除去を意味する。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、本明細書で概説されるように、ＣＤ３に特異的に結合し、標的細胞受容体などの標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）を標的とする。特定の抗原またはエピトープへの「特異的結合」またはそれ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」であるとは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定され得る。
【００７７】
特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤは、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比較して、対照分子に対して２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上であるＫＤを有する。
【００７８】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上の抗原またはエピトープのＫＡまたはＫａを有する抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は概して、当該技術分野において既知であるようなＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔを使用して測定される。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃ親または前駆体を含む）とは、後に修飾されて変異体を生成するポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書で使用される場合、「親Ｆｃポリペプチド」とは、修飾されて変異体を生成する未修飾Ｆｃポリペプチド、一般に本明細書で定義されるヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、修飾されて変異体抗体を生成する未修飾抗体を意味する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立された形式、例えば、抗体ナンバリングのためのＥＵインデックスに従って番号付けされ得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。幅広い好適な例示的標的抗原が、本明細書に記載される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、標的抗原を発現させる細胞を意味する。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」または「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」とは、概して抗体からの抗原結合ドメインのＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖドメインは通常、それらが活性ＶＨ及びＶＬドメインを含有する場合、本明細書で考察されるような「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」を形成する（場合によっては、下記で考察されるような拘束リンカーを含有するＦｖ、Ｆｖドメインが本発明において多くの方法で組織化され得、例えばｓｃＦｖ形式、拘束されたＦｖ形式、偽Ｆｖ形式などで「活性」または「不活性」であり得るが）。本発明において、場合によっては、Ｆｖドメインが、図８及び図９に示されるように、単一のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインで構成されるが、分子内ＡＢＤを形成することができないように拘束リンカーを有することが理解されるべきである。これらの実施形態では、２つの活性ＡＢＤが形成されるのは開裂後である。場合によっては、Ｆｖドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインで構成され、それらのうちの１つは非活性であり、それにより、開裂後にのみ分子間ＡＢＤが形成される。
【００８４】
本明細書の「可変ドメイン」とは、それぞれカッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶκ、Ｖλ、及び／またはＶＨ遺伝子のうちのいずれかによって実質的にコードされた１つ以上のＩｇドメインを含む、免疫グロブリンの領域を意味する。各ＶＨ及びＶＬは、次の順序、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つの「フレームワーク領域」または「ＦＲ」からなる。したがって、ＶＨドメインは、構造ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を有し、ＶＬドメインは、構造ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。本明細書においてより十分に記載されるように、ｖｈＦＲ領域及びｖｌＦＲ領域は自己集合して、Ｆｖドメインを形成する。一般に、本発明のプロドラッグ形式では、ＶＨ及びＶＬドメインが自己会合することができない「拘束Ｆｖドメイン」、ならびにＣＤＲが自己会合したときに機能的（活性）抗原結合ドメインを形成しない「偽Ｆｖドメイン」が存在する。
【００８５】
超可変領域は、抗原結合特異性を与え、概して、軽鎖可変領域内のおよそアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内のおよそ３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を示す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、及び／または軽鎖可変領域内の超可変ループ（例えば、残基２６−３２（ＬＣＤＲ１）、５０−５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１−９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５３−５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を形成する残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）のアミノ酸残基を包含する。本発明の特定のＣＤＲは、以下に記載される。
【００８６】
当業者によって理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付け及び配置は、異なるナンバリングシステムによって異なり得る。しかしながら、可変重配列及び／または可変軽配列の開示が、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。
【００８７】
ＣＤＲナンバリングの有用な比較は、以下の通りであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。
表１
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【００８８】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは概して、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）を指すときに使用され、Ｆｃ領域に対してはＥＵナンバリングシステムが使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記（１９９１））。
【００８９】
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽ＣＤＲ及び３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む。当業者によって理解されるように、ＣＤＲの各セット、ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲは、両方が個々に、かつセットとして抗原に結合することができる。例えば、拘束Ｆｖドメインにおいて、ｖｈＣＤＲは、例えばＣＤ３に結合することができ、ｖｌＣＤＲは、ＣＤ３に結合することができるが、拘束された形式では、それらはＣＤ３に結合することができない。
【００９０】
これらのＣＤＲは、より大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインそれぞれの一部であり得る。加えて、本明細書においてより十分に概説されるように、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【００９１】
ＣＤＲは、抗原結合部位、またはより具体的には、エピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして既知の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特定の構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。単一の抗原が２つ以上のエピトープを有し得る。
【００９２】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成成分とも呼ばれる）、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基を含んでもよく、換言すれば、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
【００９３】
エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。立体配座及び非立体配座エピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で区別され得る。
【００９４】
エピトープは典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３、通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫測定法、例えば「ビニング」で検証され得る。以下で概説されるように、本発明は、本明細書の列挙される抗原結合ドメイン及び抗体だけではなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されたエピトープとの結合を競合するものも含む。
【００９５】
本発明の可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、「活性」または「不活性」であり得る。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「不活性ＶＨ」（「ｉＶＨ」）及び「不活性ＶＬ」（「ｉＶＬ」）は、それらの同種ＶＬまたはＶＨパートナーとそれぞれが対になったときに、「不活性」ではない類似ＶＬまたはＶＨに結合すれば、「活性」ＶＨまたは「活性」ＶＬが結合するであろう抗原に特異的に結合しない、得られるＶＨ／ＶＬ対を形成する、偽Ｆｖドメインの構成成分を指す。例示的な「不活性ＶＨ」及び「不活性ＶＬ」ドメインは、野生型ＶＨまたはＶＬ配列の突然変異によって形成される。例示的な突然変異は、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３内である。例示的な突然変異は、ＣＤＲ２内にドメインリンカーを配置し、それにより「不活性ＶＨ」または「不活性ＶＬ」ドメインを形成することを含む。対照的に、「活性ＶＨ」（ａＶＨ）また「活性ＶＬ」（ａＶＬ）は、その「活性」同種パートナー、すなわちＶＬまたはＶＨとそれぞれ対になると、その標的抗原に特異的に結合することが可能であるものである。
【００９７】
対照的に、本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合することが可能であるＣＤ３結合ドメインを指す。この用語は、２つの文脈、（ａ）その同種パートナーと対になり、ＣＤ３に特異的に結合することが可能である配列のものである、Ｆｖ結合対の単一メンバー（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）を指す場合、及び（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することが可能な配列の同種の対（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）で使用される。例示的な「活性」ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ／ＶＬ対は、野生型または親配列である。
【００９８】
「ＣＤ−ｘ」は、分化クラスター（ＣＤ）タンパク質を指す。例示的な実施形態では、ＣＤ−ｘは、本発明のポリペプチド構築物が投与された対象におけるＴ細胞の動員または活性化に関与するＣＤタンパク質から選択される。例示的な実施形態では、ＣＤ−ｘは、ＣＤ３である。
【００９９】
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、例えばＥＧＦＲ及びＣＤ３にそれぞれ（特異的に）結合する／それと相互作用する／それを認識するドメインを特徴付ける。標的抗原結合ドメイン（ＥＧＦＲを認識する）の構造及び機能、また好ましくはＣＤ３結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能は、抗体、例えば、ｓｄＡＢＤを含む完全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明によると、標的抗原結合ドメインは概して、標的腫瘍抗原に結合する３つのＣＤＲの存在によって特徴付けられる（概して、当該技術分野において可変重ドメインと称されるが、対応する軽鎖ＣＤＲは存在しない）。あるいは、ＴＴＡに対するＡＢＤは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含むことができる。ＣＤ３結合ドメインは好ましくは、標的結合を可能にする抗体の少なくとも最小の構造要件も含む。より好ましくは、ＣＤ３結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。例示的な実施形態では、標的抗原及び／またはＣＤ３結合ドメインが、ファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング方法によって産生されるか、または取得可能であることが想定される。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「ドメイン」とは、本明細書で概説されるように、機能を有するタンパク質配列を意味する。本発明のドメインは、腫瘍標的抗原結合ドメイン（ＴＴＡドメイン）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、リンカードメイン、及び半減期延長ドメインを含む。
【０１０１】
本明細書の「ドメインリンカー」とは、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合するアミノ酸配列を意味する。ドメインリンカーは、開裂性リンカー、拘束開裂性リンカー、非開裂性リンカー、拘束非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなどであり得る。
【０１０２】
本明細書の「ヒンジリンカー」とは、本明細書で概説されるようなドメインをＦｃドメインのヒンジ領域に結合するアミノ酸配列を意味する。ヒンジリンカーは、開裂性リンカー、拘束開裂性リンカー、非開裂性リンカー、拘束非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなどであり得る。
【０１０３】
本明細書の「開裂性リンカー」（「ＣＬ」）とは、本明細書で概説されるように、プロテアーゼ、好ましくは罹患組織におけるヒトプロテアーゼによって開裂され得るアミノ酸配列を意味する。開裂性リンカーは概して、少なくとも３アミノ酸長であり、必要な柔軟性に応じて、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のアミノ酸が本発明で使用される。
【０１０４】
本明細書の「非開裂性リンカー」（「ＮＣＬ」）とは、正常な生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって開裂することができないアミノ酸配列を意味する。
【０１０５】
本明細書の「開裂性拘束リンカー」または「拘束開裂性リンカー」（「ＣＣＬ」）とは、２つのドメインが、それらが異なるポリペプチド鎖上に存在するまで、例えば、開裂後まで互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合するプロテアーゼ開裂部位（本明細書で定義されるような）を含有する、短いポリペプチドを意味する。ＣＣＬが本明細書で定義されるようなＶＨ及びＶＬドメインと結合する場合、ＶＨ及びＶＬは、分子内での立体障害により、開裂前に自己集合して機能的Ｆｖを形成することができない。関連するプロテアーゼによって開裂すると、ＶＨ及びＶＬは集合して、分子間で活性抗原結合ドメインを形成することができる。一般に、ＣＣＬは、１０アミノ酸長未満であり、９、８、７、６、５、及び４個のアミノ酸が本発明で使用される。一般に、プロテアーゼ開裂部位は概して、図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃに示されるように、十分な特異性を与えるために少なくとも４＋アミノ酸長である。
【０１０６】
本明細書の「非開裂性拘束リンカー」（「ＮＣＣＬ」）または「拘束非開裂性リンカー」（「ＣＮＣＬ」）とは、２つのドメインが互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合し、生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって有意に開裂されない、短いポリペプチドを意味する。
【０１０７】
本明細書の「拘束Ｆｖドメイン」とは、活性重可変ドメイン及び軽可変ドメインが分子内で相互作用して、ＣＤ３などの抗原に結合する活性Ｆｖを形成することができない方法で、本明細書で概説されるような拘束リンカーと共有結合した、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含むＦｖドメインを意味する。したがって、拘束Ｆｖドメインは、ｓｃＦｖと同様であるが、拘束リンカーの存在により抗原に結合することが可能ではないものである。
【０１０８】
本明細書の「偽Ｆｖドメイン」とは、ドメインリンカー（開裂性、拘束、非開裂性、非拘束などであり得る）を使用して連結された、（ｉ）偽もしくは不活性可変重ドメイン及び偽もしくは不活性可変軽ドメイン、（ｉｉ）偽もしくは不活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメイン、または（ｉｉｉ）活性可変重ドメイン及び偽もしくは不活性可変軽ドメインを含むドメインを意味する。偽ＦｖドメインのＶＨｉ及びＶＬｉドメインは、互いと会合したとき（ＶＨｉ／ＶＬｉ）、または活性ＶＨもしくはＶＬと会合したときのいずれかにおいてヒト抗原に結合せず、したがって、ＶＨｉ／ＶＬｉ、ＶＨｉ／ＶＬ、及びＶＬｉ／ＶＨ  Ｆｖドメインは、ヒトタンパク質にはっきりと結合せず、それにより、これらのドメインは、ヒト体内で非活性である。
【０１０９】
本明細書の「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、概して本明細書で考察されるようなｓｃＦｖを使用して可変軽（ＶＬ）ドメインに共有結合されて、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重（ＶＨ）ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端のいずれかの配向であり得る（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）。
【０１１０】
本明細書の「単一ドメインＦｖ」、「ｓｄＦｖ」、「単一ドメイン抗体」、または「ｓｄＡＢＤ」とは、概してラクダ抗体技術に基づき、３つのＣＤＲのみを有する抗原結合ドメインを意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：１１２９−３５（１９９４）、Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ７４：２７７−３０２（２００１）、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５−９７（２０１３）を参照されたい。
【０１１１】
「プロテアーゼ開裂部位」とは、プロテアーゼによって認識され、開裂されるアミノ酸配列を指す。好適なプロテアーゼ開裂部位は、以下で概説される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ開裂ドメイン」は、「プロテアーゼ開裂部位」、ならびに個々のプロテアーゼ開裂部位間、及びプロテアーゼ開裂部位（複数可）と本発明の構築物の他の機能的構成成分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨｉ、ＶＬｉ、標的抗原結合ドメイン（複数可）、半減期延長ドメインなど）との間の任意のリンカーを組み込むペプチド配列を指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（ＣＨ２及びＣＨ３）、ならびに任意にＣγ１（ＣＨ１）とＣγ２（ＣＨ２）との間のヒンジ領域の全てまたは一部を含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵナンバリングにおいて、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２３１〜４４７を含み、ヒンジは、２１６〜２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義は、アミノ酸２３１〜４４７（ＣＨ２−ＣＨ３）または２１６〜４４７（ヒンジドメイン−ＣＨ２−ＣＨ３）の両方を含む。
【０１１４】
ＩＩＩ．本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、様々な方法で一緒に連結された、本明細書において概してドメインと称される多くの異なる構成成分を有する。ドメインのうちのいくつかは、各々が標的抗原（例えば、ＴＴＡまたは例えば、ＣＤ３）に結合する結合ドメインである。それらは、２つ以上の抗原に結合するため、本明細書において「多重特異性」と称され、例えば、本発明のプロドラッグ構築物は、ＴＴＡ及びＣＤ３に結合し得、したがって、図１に示されるように「二重特異性」である。本発明のタンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第１の抗原結合ドメインがＥＧＦＲに結合し、第２の抗原結合ドメインがＥｐＣＡＭに結合し、抗ＣＤ３結合ドメインが存在する場合、これは「三重特異性」分子である。
【０１１５】
本発明のタンパク質は、腫瘍標的抗原結合ドメイン、半減期延長ドメイン、リンカーなど、本明細書で概説されるような様々な方法で配置されたＣＤ３抗原結合ドメインを含むことができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質は、第１の腫瘍標的抗原結合ドメインを含み、第２のタンパク質は、第２の腫瘍標的抗原結合ドメインを含み、それにより、第１の腫瘍標的抗原結合ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原結合ドメインは、同じ腫瘍標的抗原に結合する。ある特定の場合では、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインは、同じ腫瘍標的抗原の異なるエピトープ、領域、または部分に結合する。場合によっては、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインは、異なる腫瘍標的抗原に結合する。
【０１１７】
本発明のタンパク質を、細胞における共発現及び共精製によって産生して、ＣＤ３及び腫瘍標的抗原に結合し得る相補対のタンパク質を得ることができる。いくつかの実施形態では、相補対のタンパク質の各々は、別々に精製される。いくつかの実施形態では、相補対のタンパク質の各々は、同時にまたは付随して精製される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、相補対のタンパク質の一方のタンパク質をコードする核酸配列、及び相補対のタンパク質のもう一方のタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、そのような発現ベクターを含む。場合によっては、そのような宿主細胞を好適な条件下、培養培地中で培養して、タンパク質を産生することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞を好適な条件下で培養して、本明細書に記載のタンパク質を培養培地中に分泌することができる。ある特定の実施形態では、本発明の分泌タンパク質を含む培養培地を精製して、相補対のタンパク質のタンパク質を得る。有用な精製の方法としては、タンパク質Ａクロマトグラフィー、タンパク質Ｇクロマトグラフィー、ヘパリン結合、逆相クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＣＨＴクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
Ａ．ＣＤ３抗原結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合遺伝子複合体、ＭＨＣの文脈において提示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含む、タンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）及びβ（ベータ）鎖ならびにＣＤ−ζ（ゼータ）の全てと会合して、Ｔ細胞受容体複合体を含む。ＣＤ３に結合するＦｖドメインなどによるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化をもたらす。
【０１２０】
しかしながら、当該技術分野において既知であるように、ＣＤ３活性化は、多くの毒性副作用を引き起こす可能性があり、したがって、本発明は、後に本発明のプロドラッグポリペプチドを開裂して活性ＣＤ３結合ドメインを提供する特定のプロテアーゼが見つかる、腫瘍細胞の存在下でのみ、本発明のポリペプチドの活性ＣＤ３結合を提供することに関する。したがって、本発明において、抗ＣＤ３  ＦｖドメインのＣＤ３への結合は、高いレベルのプロテアーゼを有する罹患細胞または組織の微小環境においてのみ、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍微小環境において、ＣＤ３  ＦｖドメインのＣＤ３への結合を制限するプロテアーゼ開裂ドメインによって調節される。
【０１２１】
したがって、本発明は、ＶＨ及びＶＬドメインの２つのセット、活性セット（ＶＨ及びＶＬ）、ならびに不活性セット（ＶＨｉ及びＶＬｉ）を提供し、４つ全てが、プロドラッグ構築物（複数可）中に存在する。構築物は、ＶＨ及びＶＬセットが自己会合することができず、むしろ不活性パートナー、例えば、本明細書に示されるようなＶＨｉ及びＶＬならびにＶＬｉ及びＶＨと会合するように形式設定される。
【０１２２】
本発明で使用される、当該技術分野において既知である多くの好適な活性ＣＤＲセット、及び／またはＶＨ及びＶＬドメインが存在する。例えば、ＣＤＲ及び／またはＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ−６６またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、及びＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する活性Ｆｖドメインを形成するＶＨ及びＶＬ配列は、図１３Ａにおいて構築物Ｉ−３（配列番号１６）及び構築物Ｉ−４（配列番号１７）として示される。
【０１２４】
不活性ＶＨｉ及びＶＬｉドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域（ＦＲ）を含有し、それにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、ＣＤ３に結合できないようにする。一実施形態では、不活性ドメインの一方または両方が相補的構築物対に存在する場合、不活性Ｆｖドメインを形成するＶＨｉ及びＶＬｉ。一実施形態では、不活性ドメインの一方または両方が存在する場合に不活性Ｆｖドメインを形成するＶＨｉ及びＶＬｉは、図１３Ａに構築物Ｉ−５（配列番号１８）及び構築物Ｉ−６（配列番号１９）として示される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、不活性ＶＬｉドメインのアミノ酸配列は、図１４ＡにＰｒｏ３６（配列番号１）として、図１４ＢにＰｒｏ６７（配列番号４）として、図１４ＤにＰｒｏ７０（配列番号７）として、及び図１４ＥにＰｒｏ２１８（配列番号１０）として示される。いくつかの実施形態では、不活性ＶＨｉドメインのアミノ酸配列は、図１４ＡにＰｒｏ３７（配列番号２）として、図１４ＢにＰｒｏ３８（配列番号３）として、図１４ＣにＰｒｏ６８（配列番号５）として、図１４ＤにＰｒｏ７０（配列番号７）として、図１４ＤにＰｒｏ７１（配列番号８）として、及び図１４ＥにＰｒｏ２１８（配列番号１０）として示される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、不活性ＶＨｉドメインは、活性ＶＬドメインと対になったときに、対になったＶＨｉ−ＶＬドメインを標的抗原に結合できないようにする、１つ以上の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸挿入、欠失、または置換）を含む。他の実施形態では、不活性ＶＬｉドメインは、活性ＶＨドメインと対になったときに、対になったＶＨ−ＶＬｉを標的抗原に結合できないようにする、１つ以上の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸挿入、欠失、または置換）を含む。
【０１２７】
当業者によって理解されるように、本発明で使用される多くの「不活性」可変ドメインが存在する。基本的に、どんなアミノ酸が可変領域内のＣＤＲ位置にあろうと、別の可変ドメインとの自己集合を可能にするヒトフレームワーク領域を有する任意の可変ドメインが使用され得る。明確にするために、不活性ドメインは、ＣＤＲを含むと言われているが、技術的に、不活性可変ドメインは結合能力を与えない。
【０１２８】
場合によっては、不活性ドメインは、プロドラッグ形式で選択的結合を促進して、開裂前の分子内ＶＨｉ−ＶＬ及びＶＨ−ＶＬｉドメインの形成を（例えば、分子間対形成よりも）促すように操作され得る。例えば、参照によりその全体が、特に界面残基アミノ酸置換に関して本明細書に明示的に組み込まれるＩｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３（８）：６６７−６７７（２０１０）を参照されたい。
【０１２９】
一態様では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されたときに、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。一態様では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されたときに、ヒトＣＤ３に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されたときに、ＣＤ３εに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されたときに、ＣＤ３εに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂部位は、第１のモノマー上の抗ＣＤ３活性ＶＨドメインと不活性ＶＬドメインとの間にあり、それらが折り畳み、Ｔ細胞上でＣＤ３に結合するのを防ぐ。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂部位は、第２のモノマー上の抗ＣＤ３不活性ＶＨドメインと活性ＶＬドメインとの間にあり、それらが折り畳み、Ｔ細胞上でＣＤ３に結合するのを防ぐ。プロテアーゼ開裂部位が、標的細胞に存在するプロテアーゼによって開裂されると、第１のモノマーの抗ＣＤ３活性ＶＨドメイン及び第２のモノマーの抗ＣＤ３活性ＶＬドメインは、Ｔ細胞上でＣＤ３に結合することができる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との強力なＣＤ３結合親和性を示すだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。場合によっては、ポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。ある特定の場合では、ＣＤ３に対するヒト：カニクイザＫＤ比率は、５〜０．２である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが挙げられるが、これらに限定されないＣＤ３に結合する任意のドメインであり得る。場合によっては、ＣＤ３結合ドメインが、抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて使用するために、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０１３３】
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化またはヒト結合ドメインを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、及び／または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、例えば、１つ以上の、例えば３つ全てのＬＣ  ＣＤＲ及び１つ以上の、例えば３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含むヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。ある特定の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、λ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、κ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、ヒト化または完全ヒトである。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルＣＤ３との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
【０１３７】
一実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むＦｖである。実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３つの修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）であるが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域、及び／または本明細書に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３つの修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）であるが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向、軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域のいずれかであり得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して親和性を有し、ＫＤは１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３εに対する親和性を有し、ＫＤは１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下である。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性、すなわち約１００ｎＭ以上を有する。
【０１３９】
ＣＤ３への結合親和性は、例えば、当該技術分野において既知であるように、概してＢｉａｃｏｒｅまたはＯｃｔｅｔアッセイを使用して、抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３合ドメインがアッセイプレート上でコーティングされた、微生物細胞表面上に提示された、溶液中などのＣＤ３に結合する能力によって決定され得る。ＣＤ３に対する本開示の抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインの結合活性は、リガンド（例えば、ＣＤ３）または抗原結合タンパク質自体もしくはそのＣＤ３結合ドメインをビーズ、基質、細胞などに固定化することによってアッセイされ得る。薬剤は、適切な緩衝液に添加され得、結合パートナーが所与の温度である期間にわたってインキュベートされ得る。未結合材料を除去するための洗浄後、結合タンパク質は、例えば、高いｐＨのＳＤＳ緩衝液などで放出され、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析され得る。
【０１４０】
Ｂ．腫瘍標的抗原に対する抗原結合ドメイン
記載されるＣＤ３及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、１つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する少なくとも１つ、または少なくとも２つ、またはそれ以上のドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりＣＤ３結合ドメインをＴ細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、ＴＴＡ結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、Ｔ細胞係合子として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも１つの標的抗原が、疾患、障害、または状態に関与及び／または関連している。例示的な標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病に関連したものを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体に関連している。少なくとも１つの標的抗原はまた、健康な組織に向けられ得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質、またはポリサッカライドなどの細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性組織細胞上にある。本明細書において、２つ以上の標的抗原に結合すると、２つの不活性ＣＤ３結合ドメインは共局在し、標的細胞の表面上に活性ＣＤ３結合ドメインを形成することが企図される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質中の不活性ＣＤ３結合ドメインを活性化するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合強度を強化するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合強度を強化するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、同じ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、異なる抗原結合ドメインを含む。例えば、罹患細胞または組織、例えば腫瘍またはがん細胞中で二重に発現されることが知られている２つの異なる抗原結合ドメインは、標的のための抗原結合タンパク質の結合または選択性を強化し得る。
【０１４２】
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの標的抗原に結合する。標的抗原は、場合によっては、罹患細胞または組織、例えば腫瘍またはがん細胞の表面上で発現される。標的抗原としては、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ−３）、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、３を含有するＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン（ＬＹＰＤ３）、及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本明細書に開示されるポリペプチド構築物はまた、罹患細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質を含む。例示的な抗原結合ドメイン対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ、及びＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
本明細書に記載のポリペプチド構築物の設計は、１つ以上の標的抗原に対する結合ドメインが、標的抗原に対する結合ドメインが、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む任意の種類の結合ドメインであり得ることにおいて柔軟であることを可能にする。いくつかの実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち抗体模倣体、例えばアンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディである。さらなる実施形態では、１つ以上の標的抗原に対する結合ドメインは、１つ以上の抗原に結合するか、または関連する受容体ドメイン、レクチン、またはペプチドである。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは独立して、標的抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、またはリガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＬｙＰＤ３、ＣＥＡ、及びＦｏＩＲのうちの少なくとも１つから選択される抗原に特異的かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、２つの異なる抗原に特異的かつ独立して結合し、これらの抗原のうちの少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、ＬｙＰＤ３、Ｂ７Ｈ３、及びＦＯＬＲ１のうちの１つから選択される。
【０１４６】
多くの実施形態では、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に対する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、ラクダ単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢＤ）に基づく単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）である。ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、従来抗体のようなフレームワーク領域、ならびに３つのＣＤＲを有するが、いかなる重鎖定常ドメインを有しない。ＣＤ３に結合しない不活性Ｆｖの形成をもたらす分子内折り畳みが、あまり複雑でなく、より少ないＶＨ及びＶＬドメインを有するため、これらのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは概して、ＴＴＡに結合するｓｃＦｖよりも好ましい。これらのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、それらが結合する標的によって標識され得る。例えば、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲは、ヒトＥＧＦＲなどに結合するｓｄＡＢＤである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号１４に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−１として示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号１４に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−１として示されるアミノ酸配列のヒト化バージョンを有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号１４に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−１として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
【０１４８】
他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２１に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−８として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２１に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−８として示されるアミノ酸配列のヒト化バージョンを有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２１に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−８として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２２に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−１１として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２２に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−１１として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２３に記載されるか、または図１３Ｂにおいて構築物Ｉ−１２として示されるアミノ酸配列を有する。様々な実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号２３に記載されるか、または図１３Ｂに構築物Ｉ−１２として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１５に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−２として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１５に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−２として示されるアミノ酸配列のヒト化バージョンを有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１５に記載されるか、または図１３Ａに構築物Ｉ−２として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂前のタンパク質は、約１００ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂後のタンパク質は、約２５〜約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を超えるサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織浸透を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織分布を有する。
【０１５２】
Ｃ．半減期延長
本発明のタンパク質は、任意に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当該技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
【０１５３】
１．Ｆｃ領域
本発明のタンパク質は、抗体のＦｃ領域を本明細書に概説される追加の構成成分と組み合わせるＦｃドメイン融合タンパク質を含み、ＡＢＤ〜ＴＴＡ及びＦｖドメイン、概して本明細書に概説される偽ドメインを含む。
【０１５４】
本明細書に記載されるヘテロ二量体Ｆｃタンパク質のノブ・イン・ホール形式は、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を好む「立体影響」をもたらすアミノ酸置換（複数可）を指す。場合によっては、ノブ・イン・ホール形式は、電荷アミノ酸置換のジスルフィド結合または対と組み合わされて、ヘテロ二量体形式をさらに好み得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質は、Ｆｃ領域にノブまたはホールのいずれかを含むＦｃアームを含む。換言すれば、第１のモノマーＦｃアームは、ノブを含み、第２のモノマーＦｃアームは、ホールを含む。「構築物６」または「構築物７」の実施形態では、活性Ｆｖドメイン（例えば、抗ＣＤ３可変重鎖及び可変軽鎖）を含有するモノマーＦｃアームは、ＣＨ３−ノブを含み、偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重鎖及び不活性可変軽鎖）を含有するモノマーＦｃアームは、ＣＨ３−ホールを含むが、これは逆も同様であり得る。他の実施形態では、活性Ｆｖドメインを含有するモノマーＦｃアームは、ＣＨ３−ホールを含み、偽Ｆｖドメインを含有するモノマーＦｃアームは、ＣＨ３−ノブを含む。
【０１５６】
ノブの形成のためのアミノ酸残基は、概して、天然に存在するアミノ酸残基であり、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、アミノ酸残基は、トリプトファン及びチロシンである。一実施形態では、ノブの形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなどの小さい側鎖体積を有する。ノブを形成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、限定されないが、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、またはＦ４０５Ｗ置換が挙げられる。
【０１５７】
ホールの形成のためのアミノ酸残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ホールの形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きい側鎖体積を有する。ホールを生成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、限定されないが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｔ、及びＹ４０７Ｖ置換が挙げられる。ある特定の実施形態では、ノブは、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、ホールは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換を含む。
【０１５８】
一般に、本明細書で使用するための好ましいＦｃドメインは、ヒトＩｇＧドメイン、一般にＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかである。場合によっては、例えば、エフェクター機能が望ましくない場合、ＩｇＧ４が使用され、場合によっては、これがアーム交換を防ぐため、ヒンジドメインにおいてＳ２２８Ｐ変異体を含有する。
【０１５９】
ヘテロ二量体化を促進する当該技術分野において既知のＦｃ領域に対する他の修飾もまた企図され、本出願によって包含されることが理解される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される形式のＦｃ領域は、限定されないが、ＦｃのＣ末端にヒスチジンタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６））、ストレプトアビジンタグ（例えば、ｓｔｒｅｐタグまたはＳｔｒｅｐタグＩＩ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグなどのタグを含む。
【０１６１】
さらに、Ｆｃドメインは、追加のアミノ酸修飾を含有して、当該技術分野において既知であるように、エフェクター機能または半減期を改変する。
【０１６２】
２．ヒト血清アルブミン結合ドメイン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子質量約６７ｋＤａ）は、約５０ｍｇ／ｍＬ（６００μＭ）で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約２０日間の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役割を果たす。
【０１６３】
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命タンパク質の消失半減期を延長する。例えば、Ｆａｂフラグメントへのアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、Ｆａｂフラグメント単独の投与と比較して、マウス及びウサギのそれぞれに静脈内投与されたときに、２５〜５８倍の低減されたインビボクリアランス及び２６〜３７倍の半減期延長をもたらした。別の例では、インスリンが脂肪酸でアシル化されてアルブミンとの会合を促進する場合、ウサギまたはブタに皮下注射されたときに持続的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続性作用との間のつながりを実証した。
【０１６４】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが挙げられるが、これらに限定されないＨＳＡに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）、例えばＨＳＡに特異的なラクダ由来ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び可変ドメイン（ＶＨＨ）である。ある特定の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢＤ）に由来し、単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）を含み、つまり、ｓｄＡＢＤは、従来抗体のＦｖにおける標準的な６つのＣＤＲではなく、３つのＣＤＲを含有する単一可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、ペプチドである。さらなる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、小分子である。抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインが、かなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。ある特定の場合では、ＨＳＡ結合ドメインは、それがペプチドまたは小分子である場合、５ｋＤ以下である。
【０１６５】
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、抗原結合タンパク質自体の改変した薬力学及び薬物動態を提供する。上記の通り、半減期延長ドメインは、消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはまた、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の改変を含む、薬理学的特性を改変させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインなしのタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散、及び増強した有効性を提供する。一実施形態では、治療法は、低減した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の低減などの副作用の低減をもたらす。
【０１６６】
さらに、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡ結合ドメインの特徴は、ＨＳＡに対するＨＳＡ結合ドメインの結合親和性を含む。ＨＳＡ結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特定の消失半減期を標的とするように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、高い結合親和性を有する。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（中）、及び１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度を含む。上記の通り、ＨＳＡへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
【０１６７】
Ｄ．プロテアーゼ開裂部位
本発明のポリペプチド（例えば、タンパク質）組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
【０１６８】
本明細書に記載されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、少なくとも１つのプロテアーゼによって開裂されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロテアーゼ開裂部位を含む。場合によっては、本明細書に記載のタンパク質は、少なくとも１つのプロテアーゼによって開裂される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。本明細書でより十分に考察されるように、２つ以上のプロテアーゼ開裂部位がプロドラッグ構築で使用される場合、それらは同じであっても（例えば、単一プロテアーゼによって開裂される複数の部位）、異なっていてもよい（２つ以上の開裂部位が少なくとも２つの異なるプロテアーゼによって開裂される）。当業者によって理解されるように、３つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する構築物は、１、２、３個などを利用することができ、例えば、いくつかの構築物は、２つの異なるプロテアーゼに対して３つの部位などを利用することができる。
【０１６９】
プロテアーゼ開裂部位のアミノ酸配列は、標的とされるプロテアーゼに依存する。当該技術分野において既知であるように、体内で見つかり、疾患状態に関連し得る多くのヒトプロテアーゼが存在する。
【０１７０】
プロテアーゼは、いくつかの罹患細胞及び組織、例えば腫瘍またはがん細胞によって分泌され、プロテアーゼが豊富である微小環境またはプロテアーゼに富んだ微小環境を作り出すことが既知である。場合によっては、対象の血液は、プロテアーゼが豊富である。場合によっては、腫瘍を包囲する細胞が、プロテアーゼを腫瘍微小環境中に分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を包囲する細胞としては、腫瘍間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、間葉系幹細胞、多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、プロテアーゼ、例えば、微生物ペプチドで見られるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは、対象の血液中に存在する。この特徴は、標的細胞または組織のプロテアーゼに富んだ微小環境を除いて、Ｔ細胞が抗原結合タンパク質によって結合されないため、抗原結合タンパク質などの標的化治療薬がさらなる特異性を有することを可能にする。
【０１７１】
プロテアーゼは、場合によっては、配列特異的な方法でタンパク質を開裂するタンパク質である。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ（例えば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｃ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｅ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＳ）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ＫＬＫ７、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニジン、ブロメライン、カルパイン、Ｃａｓｐａｓｅ（例えば、Ｃａｓｐａｓｅ−３）、Ｍｉｒ１−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、メプリン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン−１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ−α）、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
いくつかの好適なプロテアーゼ及びプロテアーゼ開裂配列は、配列番号２１〜２８及び２９〜８８として記載され、図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１３Ｂ、及び１４Ａ〜１４Ｆに示される。
【０１７３】
Ｅ．リンカー
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは同様に柔軟性または非柔軟性（例えば、立体障害）を含む機能性、ならびに原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
【０１７４】
本発明は、２つ以上のドメインを結合するために使用される「ドメインリンカー」を提供する（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨまたはＶＬに対する標的腫瘍抗原結合ドメイン（ＴＴＡＢＤ、本明細書において「αＴＴＡ」（「抗ＴＴＡ」に対して）と称されるときもある）、別の構成成分に対する半減期延長ドメインなど）。ドメインリンカーは、例えば、非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、開裂性リンカー（「ＣＬ」）、開裂性及び拘束リンカー（ＣＣＬ）、ならびに非開裂性及び拘束リンカー（ＮＣＣＬ）であり得る。いくつかの実施形態では、拘束リンカーは、２つのドメインが互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合し、生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって有意に開裂されない１０アミノ酸未満（例えば、９、８、７、６、５、または４アミノ酸）の短いポリペプチドである。一般に、プロテアーゼ開裂部位は概して、図１１Ａ〜１１Ｃに示されるように、十分な特異性を与えるために少なくとも４＋アミノ酸長である。
【０１７５】
１．非開裂性リンカー
一実施形態では、ドメインリンカーは、非開裂性リンカー（ＮＣＬ）である。この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインを通して、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチドにおいてドメインを結合するために好適な内部非開裂性リンカーの例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号２８）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号２９）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０）（ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎ、「拘束非開裂性リンカー」または「ＣＮＣＬ」である。例えば、Ｐｒｏ２１９及びＰｒｏ２１７において、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＶＨ及びＶＬが活性抗原結合ドメインに分子内で自己集合することを可能にしない８アミノ酸（「８ｍｅｒ」）によって分離され、代わりに、腫瘍プロテアーゼによる開裂まで、Ｐｒｏ２１８との分子間アセンブリが代わりに起こる。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２）である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
【０１７７】
２．開裂性リンカー
本明細書のプロドラッグ構築物の全ては、少なくとも１つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性（ＣＬ）であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」（「ＰＣＤ」）と称されるときもある。この実施形態では、ＣＬは、本明細書で概説されるように、かつ図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃに示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、ＣＬは、プロテアーゼ開裂部位のみを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、ＣＬのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方にさらに数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に１、２、３、４、または５〜８つのアミノ酸が存在し得る。
【０１７８】
ＩＶ．発現方法
本発明は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の２つのモノマーをコードする核酸、ならびに発現ベクター及び宿主細胞を提供する。当業者によって理解されるように、１つまたは２つの発現ベクターが作製され得る。つまり、第１のモノマーをコードする第１の核酸及び第２のモノマーをコードする第２の核酸は、単一発現ベクターまたは２つの発現ベクターに入れられ得る。次いで、発現ベクター（複数可）は、２つのモノマーが発現されるように増殖される宿主細胞に入れられる。場合によっては、これは一般に好まれないが、各モノマーを別々の宿主細胞中で産生することができ、次いで発現産生物を組み合わせて、本発明のヘテロ二量体プロドラッグタンパク質を形成する。
【０１７９】
しかしながら、ほとんどの実施形態は、２つのモノマーの共発現の使用に依存する。つまり、細胞（例えば、宿主細胞）中の共発現及び共精製によって本発明のタンパク質を産生して、第１のモノマーＦｃポリペプチド及び第２のモノマーＦｃポリペプチドを得るための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、相補対のタンパク質（例えば、第１のモノマーＦｃポリペプチド及び第２のモノマーＦｃポリペプチド）は、ほぼ等モル比（例えば、ほぼ１：１比）で産生される。他の実施形態では、相補対のタンパク質（例えば、第１のモノマーＦｃポリペプチド及び第２のモノマーＦｃポリペプチド）は、等モルでない比（例えば、ほぼ１：１比でない）で産生される。換言すれば、本明細書に記載の方法を使用して、例えば、限定されないが、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１  １０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００などの第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの比を得ることができる。
【０１８０】
特定量のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または発現ベクター）を細胞中で発現させて、所望の量のポリペプチドを産生することができる。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量及び細胞に導入される（例えば、トランスフェクトされる、電気穿孔される、形質導入されるなど）第２のモノマーＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は同じである。例えば、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、ほぼ１：１の比で細胞に導入され得る。他の実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量及び細胞に導入される第２のモノマーＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は異なる。例えば、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、例えば限定されないが、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１  １０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０などの比で細胞に導入され得る。
【０１８１】
ポリペプチドの発現ベクターは、細胞による所望の比でのポリペプチドの産生を可能にする１つ以上の構成成分（例えば、プロモーター、調節要素、エンハンサーなど）を含み得る。場合によっては、第１のモノマーＦｃポリペプチドの第１の発現ベクターは、第２のポリペプチドの第２の発現ベクターの発現レベルと比較して、ベクターの発現レベルを増加させる構成成分を含む。他の場合では、第２のモノマーＦｃポリペプチドの第２の発現ベクターは、第１のモノマーＦｃポリペプチドの第１の発現ベクターの発現レベルと比較して、ベクターの発現レベルを増加させる構成成分を含む。ある特定の場合では、第１のモノマーＦｃポリペプチドの第１の発現ベクターは、ベクターの発現レベルが、第２のモノマーＦｃポリペプチドの第２の発現ベクターの発現レベルと同じであるような構成成分を含む。
【０１８２】
場合によっては、本明細書に記載の核酸は、例えば、哺乳類細胞における本開示の二重特異性の条件的に有効なタンパク質の産生を提供する。本開示の第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどに操作可能に連結され得る。
【０１８３】
好適なプロモーター及びエンハンサー要素は、当該技術分野において既知である。細菌細胞における発現の場合、好適なプロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ、及びｔｒｃが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞における発現の場合、好適なプロモーターとしては、軽鎖及び／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素；サイトメガロウイルス最初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルスからの末端反復配列に存在するプロモーター；ＥＦ−１ａ、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；及び様々な当該技術分野において既知の組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
タンパク質をコードする核酸またはヌクレオチド配列、例えば、本明細書に記載のプロドラッグ構築物は、発現ベクター及び／またはクローニングベクターに存在し得る。タンパク質、例えば、プロドラッグ構築物が２つの別々のポリペプチドを含む場合、２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別々のベクターにおいてクローン化され得る。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製の起源、ならびにベクターの複製及び／または維持をもたらす他の特徴を含み得る。好適な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
【０１８５】
発現ベクターは概して、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において機能する選択可能なマーカーが存在し得る。好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｉｎ  ＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びレトロウイルス由来のベクター、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルス）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本開示は、タンパク質、例えば、本開示のプロドラッグ構築物を産生するように修飾される哺乳類細胞を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、当業者に既知の任意の方法、例えば、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔、ウイルス感染などを使用して哺乳類細胞に導入され得る。
【０１８７】
好適な哺乳類細胞は、一次細胞及び不死化細胞株を含む。好適な哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。好適な哺乳類細胞株としては、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＥＫ２９３細胞、ｅｘｐｉ２９３細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ−７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ−６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。標的タンパク質コードベクターのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。
【０１８８】
細菌におけるポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体フラグメントの発現について記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４，も参照されたい）。発現後、Ｆｃ融合タンパク質は、可溶性分画中の細菌性細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製され得る。
【０１８９】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、好適なクローニングまたは発現宿主であり、それらのグリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす菌類及び酵母菌株を含む。例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００４，２２：１４０９−１４１４及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００６，２４：２１０−２１５を参照されたい。
【０１９０】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用され得る。米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号を参照されたい。
【０１９１】
グリコシル化タンパク質の発現のための好適な宿主細胞もまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が特定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞または安定な宿主細胞株は、細胞によって産生され、分泌されたポリペプチドの量に従って選択される。宿主細胞または安定な宿主細胞株は、本明細書に記載のプロドラッグ組成物を産生し、分泌し得る。場合によっては、好適な細胞は、等モル比（例えば、ほぼ１：１比）の本明細書に記載の第１のポリペプチドのうちのいずれか１つ及び第２のポリペプチドのうちのいずれか１つを産生し得る。他の実施形態では、好適な細胞は、非等モル比（例えば、１：１とは異なる比）の第１のモノマーＦｃポリペプチドのうちのいずれか１つ及び第２のモノマーＦｃポリペプチドのうちのいずれか１つを産生する。
【０１９３】
Ｖ．本発明の例示的な形式
当業者によって理解されるように、プロドラッグ組成物を形成する２つのモノマーを含むヘテロ二量体タンパク質組成物は、多種多様な形式を取り得る。重要なことは、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインが各々、開裂後にｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと会合したことである。つまり、概して１つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、非開裂性ドメインリンカーを介して活性可変重ドメインに連結され、１つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、非開裂性ドメインリンカーを介して活性可変軽ドメインに連結される。これは、活性ＣＤ３  ＡＢＤが、腫瘍細胞表面上に形成し得ることを保証する。開裂が起こり、不活性ＶＨ及びＶＬが解離すると、ａＶＨ及びａＶＬは分子間で会合して、１つ以上の活性ＣＤ３  ＡＢＤを形成する。
【０１９４】
本明細書に提供される構築物及び形式の全てについて、多くの異なる構成成分、例えばｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ、開裂部位、ａＶＨ及びａＶＬドメイン、ｉＶＨ及びｉＶＬドメイン、ならびにＦｃドメイン、例えば図１３に示される全てが、各形式で「混合され、一致され」得る。
【０１９５】
（Ｎ末端からＣ末端に）ＧＦＰ−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃホールに対するＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−抗原結合ドメインに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図１を参照）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＧＦＰ−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃホールに対するＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−抗原結合ドメインに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含むが、これは一般に、患者に投与される実際のプロドラッグ分子に使用されない。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ホール形式でＣＨ２−ＣＨ３を含むｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ）−ＮＣＬ−活性ＶＬ−ＣＬ−ＶＨｉ−ｓｄＡＢＤ−ＮＣＬ−Ｆｃ領域を含む第１のモノマーＦｃと、ノブ形式でＣＨ２−ＣＨ３を含むｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ）−ＮＣＬ−活性ＶＨ−ＣＬ−ＶＬｉ−ＮＣＬ−Ｆｃ領域を含む第２のモノマーＦｃと、を含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１に示されるように、Ｐｒｏ３７及びＰｒｏ３６を含む。Ｐｒｏ３７のアミノ酸配列は、図１４Ａに示される。Ｐｒｏ３７のアミノ酸配列は、図１４Ａに示される。
【０１９６】
また、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図２を参照）が、本明細書に提供され、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃホールに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃホールに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−ドメインリンカー（ヒンジリンカー）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図２に示されるように、Ｐｒｏ３８及びＰｒｏ３６を含む。Ｐｒｏ３６のアミノ酸配列は、図１４Ａに示される。Ｐｒｏ３８のアミノ酸配列は、図１４Ｂに示される。
【０１９７】
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−Ｆｃホールに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図４を参照）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−Ｆｃホールに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図４に示されるように、Ｐｒｏ６８及びＰｒｏ６７を含む。Ｐｒｏ６８は、Ｐｒｏ３７に似ているが、ＧＦＰに結合するｓｄＡＢＤまたはＣＨ２ドメインに付着したドメインリンカーを含まない。Ｐｒｏ６７は、Ｐｒｏ３６に似ているが、ＣＨ２ドメインに付着したドメインリンカーを含まない。Ｐｒｏ６８のアミノ酸配列は、図１４Ｃに示される。Ｐｒｏ６７のアミノ酸配列は、図１４Ｂに示される。
【０１９８】
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−Ｆｃホールに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）に対するＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−Ｆｃノブ−開裂性リンカー−ＡＢＤに対するＡＢＤを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図５を参照）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−Ｆｃホールに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）に対するＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−Ｆｃノブ−開裂性リンカー−ＡＢＤに対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図５に示されるように、Ｐｒｏ６９及びＰｒｏ７０を含む。Ｐｒｏ７０は、Ｐｒｏ６７に似ており、Ｐｒｏ９構築物がＣ末端に付着している。Ｐｒｏ６９のアミノ酸配列は、図１４Ｃに示される。Ｐｒｏ７０のアミノ酸配列は、図１４Ｄに示される。
【０１９９】
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）に対するＴＴＡ−Ｆｃホール−開裂性リンカー−ＡＢＤに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図６を参照）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）に対するＴＴＡ−Ｆｃホール−開裂性リンカー−ＡＢＤに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図６に示されるように、Ｐｒｏ７１及びＰｒｏ６７を含む。Ｐｒｏ７１は、Ｐｒｏ６９に似ており、Ｐｒｏ９構築物がＣ末端に付着している。Ｐｒｏ６７は、Ｐｒｏ３６に似ているが、ＣＨ２ドメインに付着したドメインリンカーがない。Ｐｒｏ７１のアミノ酸配列は、図１４Ｄに示される。Ｐｒｏ６７のアミノ酸配列は、図１４Ｂに示される。
【０２００】
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−拘束抗ＣＤ３Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）−活性ＶＬドメイン）−開裂性リンカー−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン−非開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−開裂性リンカー−Ｆｃホールを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図８を参照）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−ドメインリンカー−拘束抗ＣＤ３Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）−活性ＶＨドメイン）−開裂性リンカー−Ｆｃノブに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン−非開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−開裂性リンカー−Ｆｃホールを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図８に示されるように、Ｐｒｏ２１９及びＰｒｏ２１８を含む。Ｐｒｏ２１８のアミノ酸配列は、図１４Ｅに示される。Ｐｒｏ２１９のアミノ酸配列は、図１４Ｅに示される。
【０２０１】
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−開裂性リンカー−Ｆｃノブに対するＴＴＡ−ドメインリンカー−拘束抗ＣＤ３Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン−非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）−活性ＶＬドメイン）−ＡＢＤに対するＡＢＤを含む、第１のモノマーＦｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン−非開裂性リンカー−不活性ＶＨドメイン）−開裂性リンカー−Ｆｃホールを含む、第２のモノマーＦｃポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図９を参照）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡ−開裂性リンカー−Ｆｃノブに対するＴＴＡ−ドメインリンカー−拘束抗ＣＤ３Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン−非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）−活性ＶＨドメイン）−ＡＢＤに対するＡＢＤを含み、第２のモノマーＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン−非開裂性リンカー−不活性ＶＬドメイン）−開裂性リンカー−Ｆｃホールを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃポリペプチドのＣ末端は、限定されないが、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグなどのタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図９に示されるように、Ｐｒｏ２１７及びＰｒｏ２１８を含む。Ｐｒｏ２１８のアミノ酸配列は、図１４Ｅに示される。Ｐｒｏ２１７のアミノ酸配列は、図１４Ｅに示される。
【０２０２】
ヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物のＴＴＡに対するＡＢＤは、ＴＴＡに結合する単一ドメイン抗体であり得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢＤ）は、ＥＧＦＲに対するｓｄＡＢＤ、ＥｐＣＡＭに対するｓｄＡＢＤ、別の標的腫瘍抗原に対するｓｄＡＢＤである。ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤは、同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。他の実施形態では、第１のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤは、異なるＴＴＡに結合する。他の場合では、第１のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２のモノマーＦｃのｓｄＡＢＤは、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ＣＤＲ及び／または配列番号１４に記載される可変ドメインまたは図１３Ａの構築物Ｉ−１を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ＣＤＲ及び／または配列番号１５に記載される可変ドメインまたは図１３Ａの構築物Ｉ−２を有する。
【０２０３】
ＣＤ３結合ドメインのいくつかの実施形態では、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、図１３Ａの構築物Ｉ−３及びＩ−４の配列を有し、ＶＨｉ及びＶＬｉは、構築物Ｉ−６及びＩ−５の配列を有する。場合によっては、第１のモノマーＦｃタンパク質の偽Ｆｖドメインは、開裂性リンカー、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＬ−リンカー−ＶＨｉまたはＶＨｉ−リンカー−ＶＬのいずれかを使用して連結されたＶＬ及びＶＨｉを含み得る。いくつかの実施形態では、偽Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＣＬ−ｖｈｉＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈｉＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈｉＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈｉＦＲ４の構造を有する。他の場合では、偽Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈｉＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈｉＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈｉＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈｉＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を有する。いくつかの実施形態では、第２のモノマーＦｃタンパク質の偽Ｆｖドメインは、開裂性リンカー、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬｉまたはＶＬｉ−リンカー−ＶＨを使用して連結されたＶＨ及びＶＬｉを含み得る。場合によっては、偽Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌｉＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌｉＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌｉＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌｉＦＲ４の構造を有する。他の場合では、偽Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｌｉＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌｉＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌｉＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌｉＦＲ４−ＣＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を有する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明は、拘束リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る）を使用して共有結合された活性ＶＨドメイン及び活性ＶＬドメインを含む、拘束Ｆｖドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でＶＨとＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束Ｆｖドメインは、可変ドメイン内に含有された６つのＣＤＲのセットを含み、ＶＨのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合し、ＶＬのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合するが、プロドラッグ形式（例えば、未開裂）では、ＶＨ及びＶＬは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができない。
【０２０５】
拘束Ｆｖドメインは、活性ＶＨ及び活性ＶＬ（ＶＨａ及びＶＬａ）または不活性ＶＨ及びＶＬ（ＶＨｉ及びＶＬｉ）を含み得る。当業者によって理解されるように、拘束活性Ｆｖドメイン中のＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。本明細書で概説されるように、拘束活性Ｆｖドメインは、図８及び図１４ＥにおいてＰｒｏ２１９として、または図９及び図１４ＥにおいてＰｒｏ２１７として示されるものなどの場合、非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬを含むことができる。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。この実施形態では、ＣＤＲ及び／または可変ドメインは、図１３Ａの構築物Ｉ−３及びＩ−４のものである。
【実施例】
【０２０６】
Ａ．実施例１：プロ構築物の構築及び精製
トランスフェクション
各構築物の対を、別々の発現ベクター（ｐｃｄｎａ３．４誘導体）から発現させた。半ＣＯＢＲＡの対をコードした等量のプラスミドＤＮＡを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ×２５′）及び濾過（０．２ｕＭフィルター）によって、トランスフェクションの５日後に採取した。タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。構築物を精製し、最終緩衝液組成物は、２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース、ｐＨ７であった。最終調製物を−８０℃で保存した。
【０２０７】
プロテアーゼ開裂
ＥＫ
組み換えヒトエンテロキナーゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１５８５−ＳＥ−０１０）を使用して、本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグタンパク質を開裂した。組み換えプロテアーゼを製造業者の手順に従って活性化し、約１００ｍＭのストック濃度で調製した。
【０２０８】
試験試料（Ｐｒｏ３６＋３７、Ｐｒｏ３６＋３８、Ｐｒｏ６７＋６８、Ｐｒｏ６９＋７０、Ｐｒｏ６７＋７１、Ｐｒｏ２１７＋２１８、及びＰｒｏ２１８＋２１９）を緩衝化し、塩化カルシウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）に交換し、室温で一晩、１０ｎＭの最終濃度の適切なプロテアーゼでインキュベートした。開裂をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２０９】
ＭＭＰ−９
ＭＭＰ９の活性化：組み換えヒトＭＭＰ９を以下のプロトコルに従って活性化した。組み換えヒトＭＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ  ＃９１１−ＭＰ−０１０）は、０．４４ｍｇ／ｍＬ（４．７ｕＭ）である。酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＢｒｉｊ−３５であった。
【０２１０】
−ｒｈＭＭＰ９をアッセイ緩衝液で約１００ｕｇ／ｍｌに希釈する（２５ｕｌのｈＭＭＰ９＋７５ｕＬのアッセイ緩衝液）
【０２１１】
−ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックからの酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を、１ｍＭの最終濃度になるように添加する（１ｕＬ〜１００ｕＬ）
【０２１２】
−３７℃で２４時間インキュベートする
【０２１３】
−ＭＭＰ９を１０ｎｇ／ｕｌに希釈する（９００ｕｌのアッセイ緩衝液を１００ｕｌの活性化溶液に添加する）
【０２１４】
活性化ｒｈＭＭＰ９の濃度は、約１００ｎＭである。
【０２１５】
ＴＤＣＣアッセイのための構築物の開裂
構築物を開裂するために、製剤緩衝液（２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ−アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース）中１ｍｇ／ｍＬの濃度（１０．５ｕＭ）の１００ｕｌのタンパク質試料に、最大１０ｍＭのＣａＣｌ２を供給した。活性化ｒｈＭＭＰ９を２０〜３５ｎＭの濃度になるまで添加した。試料を室温で一晩（１６〜２０時間）インキュベートした。開裂の完全性を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１０〜２０％  ＴＧ、ＴＧ泳動用緩衝液、２００ｖ、１時間）を使用して検証した。試料は、典型的には９８％開裂した。
【０２１６】
Ｂ．実施例２：活性化ヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグタンパク質の効力を試験するためのＴ細胞依存性細胞傷害作用（ＴＤＣＣ）アッセイ
ホタルルシフェラーゼ形質導入ＨＴ−２９細胞を、およそ８０％密集度まで成長させ、Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇ中０．４８ｍＭのＥＤＴＡ）で分離した。細胞を遠心分離し、ＴＤＣＣ培地（ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ  １６４０中の５％熱失活ＦＢＳ）中に再懸濁した。精製したヒトＰａｎ−Ｔ細胞を解凍、遠心分離し、ＴＤＣＣ培地中に再懸濁した。
【０２１７】
ＨＴ−２９＿Ｌｕｃ細胞及びＴ細胞の共培養物を３８４ウェル細胞培養プレートに添加した。次いで、連続希釈したＣＯＢＲＡを共培養物に添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、等量のＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、２０分間インキュベートした。プレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ上で０．１ｓ／ウェルの曝露時間で読み取った。全発光を記録し、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７上で分析した。
【０２１８】
活性化（開裂）ヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグタンパク質がＴ細胞と係合し、上記のアッセイを使用して標的の陽性腫瘍細胞の方向に細胞溶解を向けるときに誘導された特定の細胞毒性のパーセンテージを試験した。
【０２１９】
図３Ａ及び図３Ｂは、Ｐｒｏ３６＋３７及びＰｒｏ３６＋３８などのいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付けの欠如を提示したことを示す。
【０２２０】
図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃは、Ｐｒｏ６７＋６８及びＰｒｏ６９＋７０などのいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付けを提示したが、高い活性が欠如していたことを示す。
【０２２１】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、Ｐｒｏ２１７＋２１８及びＰｒｏ２１８＋２１９などの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同族プロテアーゼにより開裂されたときに、条件付け及び高い効力を提示したことを示す。
【０２２２】
融合タンパク質と比較可能な方法でのプロテアーゼ開裂時にがん細胞の殺傷を誘導したＥＧＦＲに対する単一ドメイン抗体を含有する本明細書に記載のプロドラッグ構築物は、ＥＧＦＲに対する単一ドメイン抗体及び抗ＣＤ３  Ｆｖドメインを含む。
【０２２３】
全ての引用される参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の特定の実施形態は、例証の目的で上述されてきたが、詳細の多くの変形が、添付の特許請求の範囲に記載されるように本発明から逸脱することなく行われ得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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