(57)【要約】開示されるのは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝的変異によって引き起こされる聴覚損失の治療および／または予防に有用な組成物および方法である。本願に開示される組成物および方法は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子それぞれの活性を回復させるために、有毛細胞の生存を促進するために、および聴覚損失に罹患する患者の聴力を回復させるために、内耳へのＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１のアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター遺伝子伝達を使用する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現ベクターであって、
配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：１の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、配列ＩＤ  ＮＯ：３、又は配列ＩＤ  ＮＯ：３の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列；および
前記核酸配列に作動可能に連結されるプロモーター、
を含む、発現ベクター。
【請求項２】
前記発現ベクターは、アデノ−関連ウイルスベクターである、
請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記アデノ−関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡｎｃ８０からなる群から選択される、
請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記プロモーターは、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、又はＰｏｕ４ｆ３プロモーター、からなる群から選択される、
請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
聴覚損失の治療または予防のための方法において使用のための医薬組成物であって、
配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：１の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、配列ＩＤ  ＮＯ：３、又は配列ＩＤ  ＮＯ：３の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列；および前記核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターを含む、
医薬組成物。
【請求項６】
前記発現ベクターは、アデノ−関連ウイルスベクターである、
請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アデノ−関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡｎｃ８０からなる群から選択される、
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記プロモーターは、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、又はＰｏｕ４ｆ３プロモーター、からなる群から選択される、
請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：１の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、配列ＩＤ  ＮＯ：３、又は配列ＩＤ  ＮＯ：３の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列；および前記核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターを用いてトランスフェクションされた細胞。
【請求項１０】
前記発現ベクターは、アデノ−関連ウイルスベクターである、
請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記アデノ−関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡｎｃ８０からなる群から選択される、
請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記プロモーターは、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、又はＰｏｕ４ｆ３プロモーター、からなる群から選択される、
請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、幹細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１４】
前記幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
聴覚損失の治療または予防のための方法であって、
配列ＩＤ  ＮＯ：１、配列ＩＤ  ＮＯ：１の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、配列ＩＤ  ＮＯ：３、又は配列ＩＤ  ＮＯ：３の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列；および前記核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターの有効量を必要な被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターは、アデノ−関連ウイルスベクターである、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アデノ−関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡｎｃ８０からなる群から選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロモーターは、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、又はＰｏｕ４ｆ３プロモーター、からなる群から選択される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現ベクターは、被検体の内耳に注射によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記注射方法は、蝸牛開口術、蝸牛窓膜、内リンパ嚢、中央階、半規管開口術（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）、内リンパ嚢経由の中央階、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被検体は、聴覚損失に関連する一つ以上の遺伝的危険因子を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝的危険因子の一つは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異又はＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体は、聴覚損失の任意の臨床指標を示さない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異又はヒトＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異からなる群から選択される聴覚損失を引き起こす変異を含む、遺伝子導入マウス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年３月１７日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６２／４７２，７９０、および２０１７年７月１２日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６２／５３１，５２２に基づく利益を主張し、それらの各内容は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
［本開示の分野］
開示されるのは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝的変異によって引き起こされる聴覚損失および難聴の治療および／または予防に有用な組成物および方法である。
［本開示の背景］
聴覚損失は、ヒトにおいて最も一般的な感覚障害である。世界保健機関（ＷＨＯ）によって公開された障害をもたらす聴覚損失の程度における２０１２年の推定によると、障害をもたらす聴覚損失を持って生きている人口は世界中で３億６千万人（３億２千８００万人の成人、および３千２００万人の子供）であり、それらの人口の８９％（または３億２千２００万人）は、低所得国に住む（聴覚損失の有病率におけるＷＨＯ全体の推定；Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｄｅａｆｎｅｓｓ，ＷＨＯ２０１２）。
【０００２】
現在、聴覚損失または難聴を予防または治療するための未承認の治療薬がある。障害をもたらす聴覚損失を有する人々のための現在の治療選択は、人工内耳移植である。人工内耳移植は、関連する医療費が大きく、患者につき１，０００，０００ドルを超える生涯コストを伴なう常法である（Ｍｏｈｒ  ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．米国における深刻な聴覚損失に対する重大な社会的費用（Ｔｈｅ  ｓｏｃｉｅｔａｌ  ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｏ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）；Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｓｓｅｓｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ；１６（４）：１１２０−３５）。
【０００３】
人工内耳移植に対する現在の需要は、供給を超えている。生産される人工内耳ユニットの生産率は、毎年５０，０００ユニットである。現在の出生率、並びに新生児における障害をもたらす聴覚損失の発生率および有病率に基づいて、１３４，０００個の人工内耳が、患っている子供それぞれに１個の人工内耳を提供するために毎年必要とされる。両側の（２個の）人工内耳を必要とする患者を含む場合、この数は増加する。
【０００４】
人工内耳の生涯コストは、多くの人々にとって、および特に障害をもたらす聴覚損失を有する多数の人々が住んでいる先進国以外で生きている人々にとって、高額である。治療選択は、人工内耳移植に替わる費用効率の高い代替品を提供するために、特に先進国以外で生きている人々にとって必要とされる。
【０００５】
言語修得前難聴の５０％超は、遺伝性、すなわち、先天的（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ）である（アメリカ疾病予防管理センター−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ）。先天的聴覚損失および難聴は、伝音性、感音性、またはそれらの両方の組み合わせ；症候性（外耳または他の器官の先天性異常と関連する、または他の器官システムが関与する医学的問題と関連する）または非症候性（外耳の関連する目に見える異常がない、または任意の関連する医学的問題がない）；および言語習得前（言語発達前）または言語習得後（言語発達後）であってもよい（Ｒｉｃｈａｒｄ  ＪＨ  Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，Ａ  Ｅｌｉｏｔ  Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，ＰｈＤ，ａｎｄ  Ｇｕｙ  Ｖａｎ  Ｃａｍｐ，ＰｈＤ，難聴および先天的聴力損失概説（Ｄｅａｆｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ），ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ  最初の掲載：１９９９年２月１４日；最後の修正：２０１４年１月９日。先天的聴力損失の７０％超は、非症候性である。非症候性難聴の種々の遺伝子座は、ＤＦＮと指定される（ＤｅａＦＮｅｓｓのために）。遺伝子座は、遺伝的形質の様式：ＤＦＮＡ（常染色体優性）、ＤＦＮＢ（常染色体劣性）、およびＤＦＮＸ（Ｘ連鎖性）に基づいて名付けられる。上記名称に続く数は、遺伝子地図および／または遺伝子発見の順番を反映する。一般集団において、聴覚損失の有病率は、年齢と共に増加する。この変化は、遺伝的特徴の影響および環境の影響、並びに環境要因と個々の遺伝性素因との間の相互作用を反映する。
【０００６】
感音性聴覚損失（ＳＮＨＬ）は、ヒトにおいて最も一般的な神経変性疾患であり、現在、承認されている薬理学的介入はない。ＳＮＨＬは、遺伝性疾患によって引き起こされ、並びに音感覚心的外傷および中毒性難聴のような損傷を介して得られる。遺伝子診断は、非症候性ＳＮＨＬを引き起こす少なくとも１００個の遺伝子があることを証明している。遺伝学的および遺伝子治療技術の最近の進歩は、多くの劣性型の難聴の救出は、遺伝子治療を通して可能であることを示している（Ａｋｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ａｓｋｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。内耳への長期間にわたる遺伝子伝達は、アデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いて達成されている（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。数年前に記述されている最初のこれらの観察にかかわらず、ヒト臨床試験への移行は未だ起こっていない。この分野における移行研究のための理想的な疾患標的は、内耳の細胞の定義された群に影響を与え、生後、発話の発達後に起こる劣性型遺伝性聴覚損失である。
【０００７】
本願に記述されるように、聴覚損失の一般的な劣性原因の発生率および遺伝子サイズを考慮することの両方を注意深く評価することによって、使用可能な公平な一般的患者集団を有する遺伝子治療プログラムを発展させることが可能である。例えば、他の変異ほど一般的でないけれども、ＴＭＰＲＳＳ３は、人工内耳移植を保証するほど重症である聴覚損失におけるかなり一般的な原因である。加えて、ＴＭＰＲＳＳ３に変異を有する患者は、他の変異を有する患者と同様に人工内耳移植に応答し得ない（Ｓｈｅａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。このことは、この疾患の移植結果を改善するために、独立型の治療薬として、または他の治療薬および／または人工内耳移植と組み合わせて、ＴＭＰＲＳＳ３、またはＬＯＸＨＤ１のような他の遺伝子を標的とする機会を示す。表１（出典Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｎｉｓｈｉｏ，＆Ｕｓａｍｉ，２０１６）は、ＴＭＰＲＳＳ３の変異が、遺伝子のサイズによって蝸牛にかなり限られた分布を有する言語習得後劣性聴覚損失の最も一般的な原因となり得、存在するＡＡＶベクターに組み込まれ得る、ということを証明する。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
ヒト膜貫通プロテアーゼ、セリン３（ＴＭＰＲＳＳ３；ＤＦＮＢ１０、ＤＦＮＢ８、ＥＣＨＯＳ１、ＴＡＤＧ１２；Ａｃｃ：ＨＧＮＣ：１１８７７とも称される）は、生まれつきの（出生時に見られる）および子供時代の両方で発病する常染色体劣性難聴との関連によって特定された。ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異は、常染色体劣性非症候性聴覚障害型ＤＦＮＢ８および１０と関連する。ＴＭＰＲＳＳ３は１６４６塩基対遺伝子であり、セリンプロテアーゼをコードし、ＤＦＮＡ８／１０と関連し、人工内耳移植を受ける聴覚損失患者の１〜５％を示し得る（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１)。この遺伝子の機能の損失は、変異の部位に依存して幅広い聴力表現型をもたらすように見える。生まれつき、および成人の両方で発症する進行性聴覚損失は、この遺伝子の損失と関連している。
【００１０】
ＤＦＮＢ８聴覚損失の発症は、言語習得後（１０〜１２年齢）であり、一方、ＤＦＮＢ１０聴覚損失の発症は、言語習得前（生まれつき）である。この表現型の違いは、遺伝子型の違いを反映する。ＤＦＮＢ８原因変異は、スプライス部位の変異であり、非効率的なスプライシングは、言語習得前難聴を防ぐのには十分であるが、最終的な聴力損失を予防するのには十分でない減少した正常タンパク質の量と関連する（Ｒｉｃｈａｒｄ  ＪＨ  Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）参照。常染色体劣性非症候性聴覚障害の原因となる公知の遺伝子：難聴および遺伝性聴力損失修正（Ｇｅｎｅｓ  Ｋｎｏｗｎ  ｔｏ  Ｃａｕｓｅ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：Ｄｅａｆｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ）；ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ）。
【００１１】
聴覚損失の原因となる公知の２１番目の染色体におけるＴＭＰＲＳＳ３変異を、表２に記述する。
【００１２】
【表２−１】
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【００１３】
【表２−２】
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【００１４】
【表２−３】
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【００１５】
【表２−４】
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【００１６】
【表２−５】
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【００１７】
【表２−６】
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【００１８】
【表２−７】
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【００１９】
【表２−８】
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【００２０】
リポキシゲナーゼホモロジードメイン１遺伝子（ＬＯＸＨＤ１：ＬＨ２Ｄ１、ＤＦＮＢ７７、ＦＬＪ３２６７０；ＯＭＩＭ：６１３０７２；Ａｃｃ：ＨＧＮＣ：２６５２１とも呼ばれる）は、ＰＬＡＴ（ポリシスチン／リポキシゲナーゼ／アルファ−トキシン）ドメインだけからなる高く保存されたタンパク質をコードし、細胞膜に対する標的タンパク質に関与すると考えられる。マウスにおける研究は、この遺伝子が内耳の機械感覚性有毛細胞に発現され、この遺伝子の変異は聴覚欠損につながり、この遺伝子が正常な有毛細胞機能に必須である、ということを示す。ヒトファミリー分離難聴のスクリーニングは、ＤＦＮＢ７７、進行型の常染色体劣性非症候性聴覚損失（ＡＲＮＳＨＬ）の原因となるこの遺伝子の変異を特定した。種々のイソ型をコードする選択的スプライスによる転写物変異体は、この遺伝子で知られている。
ＬＯＸＨＤ１の臨床的特徴：
・常染色体劣性
・聴覚損失、感覚神経的、両側性（低周波数での軽度聴覚損失）
・アシュケナージ系ユダヤ人ファミリーにおいて７歳〜１０歳で人工内耳移植につながる先天性発症
・血縁のイラン人ファミリーにおいて７歳〜８歳で発症し、成人期に中間周波数および高周波数における中程度〜重度の損失に進行する
常染色体劣性聴覚損失−７７（ＤＦＮＢ７７）は、染色体１８ｑ２１におけるＬＯＸＨＤ１遺伝子（６１３０７２）のホモ接合変異によって引き起こされるという証拠。
【００２１】
原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成において、任意の他の組織ではなく、胚性の１３．５日および１６日の成長中マウスの内耳においてＬｏｘｈｄ１発現を検出した。出産後４日で、発現は、蝸牛および前庭の有毛細胞において、その核内で最も高い濃度で検出された。Ｌｏｘｈｄ１は、細胞質に進行的に局在化され、成人において、Ｌｏｘｈｄ１は、不動毛の長さに沿って有毛細胞に発現された。
【００２２】
Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）突然変異誘発スクリーニングを用いて、Ｇｒｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）は、３週齢で聴覚障害になる、および８週齢で聴覚障害になる「サンバ（ｓａｍｂａ）」マウス系列を成長させた。ホモ接合性サンバマウスは、他の神経学的または前庭の異常は示さず、ヘテロ接合性サンバマウスは、完全に正常を示した。不動毛の発展には、ホモ接合性サンバマウスにおいて影響を与えなかったが、有毛細胞機能は混乱し、有毛細胞は最終的に変性した。
【００２３】
Ｇｒｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）は、サンバにはＰＬＡＴドメイン１０のベータ−サンドイッチ構造を不安定にするマウスＬｏｘｈｄ１遺伝子の変異があることを明らかにした。変異は、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の安定性、または不動毛に沿ってＬｏｘｈｄ１タンパク質の局在化を変えなかった。しかしながら、出産後２１日で、いくつかの有毛細胞は、融合した不動毛および頂端細胞表面での細胞膜の波打ち現象を伴う形態的異常を示した。有毛細胞の損失および螺旋神経節ニューロンの減少を含む深刻な変性変化を、出産後９０日で観察した。Ｇｒｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）は、螺旋神経節ニューロンの変性が、有毛細胞の機能および維持の混乱に続発するようであるということを仮定した。
【００２４】
聴覚損失の原因となる染色体１８番目におけるＬＯＸＨＤ１変異を、表３に記述する。
【００２５】
【表３−１】
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【００２６】
【表３−２】
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【００２７】
【表３−３】
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【００２８】
【表３−４】
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【００２９】
【表３−５】
2020509786.tif 000016
【００３０】
【表３−６】
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【００３１】
米国出願公開Ｎｏ．２０１３／００９５０７１は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれ、アポトーシスタンパク質のＸ連鎖性阻害剤（ＸＩＡＰ）を内耳の蝸牛窓膜へ伝達するために変異されたチロシンアデノ−関連ウイルスベクターを用いて、加齢に関連した聴覚損失を回復させるための遺伝子治療方法を記述する。しかしながら、米国出願公開Ｎｏ．２０１３／００９５０７１は、本願に開示されるような、ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝的変異が原因となる聴覚損失または難聴の発症を防ぐ、もしくは遅らせる、または聴覚損失または難聴を回復させるために、機能的ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１をコードする核酸配列の伝達については熟慮していない。
【００３２】
加えて、聴覚障害のための臨床的遺伝子療法を発展させるために、現在の最先端において重要な落とし穴は、ヒトの聴覚損失を正確に映し出す動物モデルの欠損である。ヒトの成人発症を伴なう遺伝的聴覚損失のためのいくつかの利用可能なマウスモデルは、伝達研究を複雑にする生まれつきの聴覚損失を示す。聴覚の発達後の遺伝的聴覚損失の発症モデルは少ない。新生児マウスにおけるベクター伝達は、成人マウスにおける伝達より種々のトランスフェクションパターンをもたらす（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。種々のベクターシステムおよび遺伝子標的を用いて聴覚の救出を評価するために使用されることができる新規な動物モデルが必要である。
【００３３】
現在、聴覚損失または難聴を予防する、または治療するための承認されている治療方法はなく、当該治療を試験するために有用な臨床前動物モデルを欠いている。本発明は、変異したＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の活性を回復させ、有毛細胞の生存を促進し、聴覚損失または難聴で苦しむ患者の聴覚を回復させるために、内耳にＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１のウイルスベクター遺伝子を伝達する組成物および方法、並びに当該組成物および方法を試験するための細胞に基づくモデル、および動物に基づくモデルを記述する。
【発明の概要】
【００３４】
［簡潔な要約］
本願に開示されるのは、配列ＩＤ  Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸配列を含む、または配列ＩＤ  ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターであり、ここで、核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。さらに本願に開示されるのは、聴覚損失の治療または予防のための方法に使用するための医薬組成物であり、配列ＩＤ  Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸配列を有する、または配列ＩＤ  ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する発現ベクターを含み、ここで、核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列ＩＤ  ＮＯ：１または配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、アデノ−関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０から選択されるアデノ−関連ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、アデノ−関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２またはＡｎｃ８０である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、任意の有毛細胞プロモーターから選択され、発達初期に作動可能に連結される核酸の発現を誘導し、例えば、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーター等の発現を生涯にわたって維持する。
【００３５】
本願に開示されるのは、配列ＩＤ  Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸配列を含む、または配列ＩＤ  ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターを有する細胞であり、ここで、核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列ＩＤ  ＮＯ：１または配列ＩＤ  ＮＯ：２の核酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
【００３６】
本願に開示されるのは、配列ＩＤ  Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸配列を含む、または配列ＩＤ  ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ  Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターの有効量を必要な被検体に投与することを含む、聴覚損失を治療する、または予防する方法であり、ここで、核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列ＩＤ  ＮＯ：１または配列ＩＤ  ＮＯ：２の核酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、アデノ−関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０から選択されるアデノ−関連ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、アデノ−関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２またはＡｎｃ８０である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、任意の有毛細胞プロモーターから選択され、発達初期に作動可能に連結される核酸の発現を誘導し、例えば、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーター等の発現を生涯にわたって維持する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、被検体の内耳に、例えば、注射によって投与される。いくつかの実施形態において、伝達方法は、蝸牛開口術、蝸牛窓膜、半規管開口術（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される（Ｅｒｉｎ  Ｅ．Ｌｅａｒｙ  Ｓｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）聴覚適用のための内耳薬物伝達（Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  Ａｕｄｉｔｏｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６０（１５）：１５８３−１５９９）。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、内リンパ嚢を介して中央階に伝達される（Ｃｏｌｌｅｔｔｉ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ヒト内耳における内リンパ嚢から内リンパ部分へのガドリニウム分布の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｓａｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｎｅｒ  ｅａｒ）．Ａｕｄｉｏｌ  Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ．１５（６）：３５３−６３；Ｍａｒｃｏ  Ｍａｎｄａｌａ，ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）メニエール病における内リンパ嚢から蝸牛への誘導された内リンパ流入（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｆｌｏｗ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｓａｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｃｈｌｅａ  ｉｎ  Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．１４３，６７３−６７９；Ｙａｍａｓｏｂａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）内リンパ嚢でのアデノウイルスベクター接種後の内耳導入遺伝子発現（Ｉｎｎｅｒ  ｅａｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｓａｃ）．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０（５）：７６９−７４）。いくつかの実施形態において、被検体は、聴覚損失と関連する一つ以上の遺伝的危険因子を有する。いくつかの実施形態において、遺伝的危険因子の一つは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異である。いくつかの実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異は、聴覚損失の原因となる公知の任意の一つ以上のＴＭＰＲＳＳ３変異から選択される（例えば、表２参照）。いくつかの実施形態において、遺伝的危険因子の一つは、ＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異である。いくつかの実施形態において、ＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異は、聴覚損失の原因となる公知の任意の一つ以上のＬＯＸＨＤ１変異から選択される（例えば、表３参照）。いくつかの実施形態において、被検体は、聴覚損失の任意の臨床指標を示さない。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本願に記述される発現ベクターは、他の核酸配列を含む一つ以上の発現ベクターと、および／または聴覚損失を治療するための一つ以上の他の活性薬剤との組み合わせ療法として投与される。例えば、組み合わせ療法は、配列ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列を有する第一の発現ベクター、および配列ＩＤ  ＮＯ：２の核酸配列を有する第二の発現ベクターを含んでもよく、ここで両方の発現ベクターは、聴覚損失を治療するための組み合わせ療法の一部として被検体に投与される。
【００３８】
本願に記述されるのは、聴覚損失の原因となる公知の任意の一つ以上のＴＭＰＲＳＳ３変異から選択される変異を有するヒトＴＭＰＲＳＳ３遺伝子を有する遺伝子導入マウスである（例えば、表２参照）。本願に記述されるのは、聴覚損失の原因となる公知の任意の一つ以上のＬＯＸＨＤ１変異から選択される変異を有するヒトＬＯＸＨＤ１遺伝子を有する遺伝子導入マウスである（例えば、表３参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、野生型ヒトＴＭＰＲＳＳ３（ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｎｏ．ＢＣ０７４８４７．２）をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【図２】図２は、図１におけるｃＤＮＡによってコードされる野生型ヒトＴＭＰＲＳＳ３アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、野生型ヒトＬＯＸＨＤ１（ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｎｏ．ＡＫ０５７２３２．１）をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
【図４】図４は、図３におけるｃＤＮＡによってコードされる野生型ヒトＬＯＸＨＤ１アミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、成人マウス蝸牛におけるＴｍｐｒｓｓ３免疫組織化学を示す（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ，Ｌ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｈ．Ｓ．，Ｌｅｎｏｉｒ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｒｅｂｉｌｌａｒｄ，Ｇ．，Ｇａｂｏｙａｒｄ，Ｓ．，．．．Ｄｅｌｐｒａｔ，Ｂ．（２０１１））．ヒトＤＦＮＢ８/１０難聴における、Ｔｍｐｒｓｓ３、膜貫通セリンプロテアーゼ欠損は聴覚の発症における蝸牛有毛細胞の生存に重要である。（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８６（１９），１７３８３−１７３９７）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
［詳細な説明］
本発明として考えられる主題は、明細書の結論における特許請求の範囲に特に指摘され、明確にクレームされる。本発明における前述のおよび他の目的、特徴、並びに利点は、添付図面と併用されて続く詳細な説明から明らかになるだろう。
【００４１】
本願に使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、臨床転帰において所望の変化を目的としている様々な活動を包含する。例えば、本願に使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」は、本願に記述されるような、聴覚損失の一つ以上の臨床指標または徴候において検出可能な改善を達成すること、または本当に達成するということを目的としている任意の活動を包含する。
【００４２】
ＴＭＰＲＳＳ３変異またはＬＯＸＨＤ１変異に起因する聴覚損失は、一般的に２つの集団：（ｉ）聴覚損失を持って生まれる被検体である生まれつきの集団、および（ｉｉ）出生時の測定可能な聴覚損失は有さないが、ある期間にわたって進行性の聴覚損失を示す進行性の集団を示す。したがって、いくつかの例において、被検体は（例えば、遺伝子診断試験で検出されるように）ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子、またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異を有してもよいが、聴覚損失の臨床指標または徴候を未だ示さないので、治療的介入を開始することができる期間を提供する。結果的に、いくつかの実施形態において、本発明は、聴覚が徐々に退行する期間に治療的介入をするための方法を提供する。本発明の方法を、当該期間より前に開始することができる。本発明によって提供される聴覚損失を治療する方法は、制限されないが、聴覚損失の発症または聴覚損失の臨床指標もしくは徴候の進行を予防する、または遅らせる方法を含む。
【００４３】
本願に使用される用語「聴覚損失」は、音を聞くための能力の減少を記述するために使用され、難聴および音を聞くための能力がないことを含む。
本願に使用される用語「有効量」または「治療的有効量」は、本願に記述されるような活性剤の量に関し、上記の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」の説明において記述されるような、一つ以上の所望の臨床成績を達成するために、または達成する方向に貢献するために十分である量に関する。任意の個々の場合において適切な「有効」量は、用量漸増試験のような当該技術分野において公知の標準技術を用いて決定されてもよい。
【００４４】
本願に使用される用語「活性剤」は、本願に記述される組成物および方法において使用されることを目的とする、および例えば聴覚損失を治療する目的のために生物学的に活性化することを目的とする分子（例えば、本願に記述されるＡＡＶベクター）に関する。
【００４５】
本願に使用される用語「医薬組成物」は、本願に記述される少なくとも一つの活性剤または二つ以上の活性剤の組み合わせ、または、例えば担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤などのような薬物伝達において使用のために適している一つ以上の成分、を含む組成物に関する。
【００４６】
本願において同じ意味で使用される用語「被検体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、ヒト、非−ヒト患者、齧歯動物（ラット、マウスおよびモルモットのような）などを含む哺乳類を包含するが限定されない。本発明のいくつかの実施形態において、被検体はヒトである。
【００４７】
本発明における活性剤の用量は、活性剤の有効性および／または有効量を決定するために行われるヒトまたは他の哺乳類における試験に基づいて算出されてもよい。投与量、および投与頻度または投与時期は、当該技術分野において公知の方法によって決定されてもよく、活性剤の医薬品形態、投与経路、単一の活性剤が使用されるのか複数の活性剤が使用されるのか（例えば、必要とされる第一の活性剤の用量は、当該活性剤が第二の活性剤と組み合わせて使用される場合より低くなってもよい）、および年齢、体重または薬物代謝に影響を及ぼす任意の医学的状態の存在を含む患者の特徴、などのような要因に依存してもよい。
【００４８】
一実施形態において、単回投与で投与されてもよい。他の実施形態において、複数回投与は、ある期間にわたって、例えば１日４回、１日２回、１日１回、週に１回、月に１回などのような特定の間隔で、投与されてもよい。
［聴覚損失における臨床的特徴］遺伝性聴覚損失および難聴は、伝音性、感音性、またはその両方の組み合わせ；症候性（外耳または他の器官の先天性異常と、または他の器官システムを含む医学的問題と関連する）または非症候性（外耳の関連する可視できる異常、または任意の関連する医学的問題はない）；および言語習得前（言語が発達する前）または言語習得後（言語が発達する後）、であってもよい（Ｒｉｃｈａｒｄ  ＪＨ  Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．（２１０４）難聴および遺伝性聴覚損失修正（Ｄｅａｆｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ）．（ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ)。
［診断／試験］聴覚損失の遺伝型は、聴覚損失の後天的（非−遺伝性）原因とは区別されなければならない。聴覚損失の遺伝型は、耳鼻科的、聴覚的、および身体検査、家族歴、付随的試験（例えば、側頭骨におけるＣＴ検査）、および分子遺伝学的試験によって診断される。分子遺伝学的試験は、様々な型の症候性および非症候性難聴で可能であり、診断および遺伝相談に大きな役割を果たす。
【００４９】
聴覚損失を測定するために使用される選択試験：
［１．歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）］歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）は、蝸牛が比率１．１〜１．３の２つの純粋な音質周波数によって同時に刺激される場合に発生される応答である。ＤＰＯＡＥの発生メカニズムにおける最近の研究は、ＤＰＯＡＥ応答において２つの重要な要素が存在すること、一つは、相互変調「ひずみ」によって発生される、一つは「反射」によって発生される、ことを明確に示している。
【００５０】
ＤＰＯＡＥの有病率は、正常な成人の耳で１００％である。左耳および右耳からの応答は、非常に相関性がある（すなわち、左耳および右耳からの応答は非常に類似している）。正常な被検体では、女性がより高い振幅ＤＰＯＡＥを有する。老化過程は、ＤＰＯＡＥ振幅を低くする、およびＤＰＯＡＥ応答スペクトルを狭くすることによってＤＰＯＡＥ応答へ影響を与える（すなわち、より高い周波数での応答が徐々に減少する）。ＤＰＯＡＥを、臨床研究において使用される他の動物種、例えば、トカゲ、マウス、ラット、モルモット、チンチラ、チキン、犬および猿のような動物種からも記録することができる。（耳音響放射ウェブサイト）。
［２．聴性脳幹反応（ＡＢＲ）］聴性脳幹反応（ＡＢＲ）試験は、聴覚のための内耳（蝸牛）および脳経路についての情報を与える。この試験は、時々、聴性誘発反応（ＡＥＰ）とも称される。試験は、子供や聴覚スクリーニングにおける従来の行動論的方法では難しい他の患者で使用されることができる。ＡＢＲは、脳または脳経路における聴覚損失の型を示す兆候、症状、病気を有する人々に適応される。試験は、ヒトおよび動物の両方に使用される。ＡＢＲは、頭に電極（心電図が動作される場合に心臓周囲に置かれる電極に類似する）を貼り付け、および音に応答して脳波活性を記録することによって行われる。試験される人は、試験が行われる間、静かに休んでいる、または眠っている。応答は必須ではない。ＡＢＲを、新生児の聴覚スクリーニングプログラムにおけるスクリーニング試験としても使用することができる。スクリーニング試験として使用される場合、強さのレベル、または大きさのレベルの一つが検査され、乳児は検査に合格するか不合格であるかである。（アメリカ言語聴覚協会ウェブサイト）。
［聴覚損失の臨床症状］聴覚損失は、次の型および発症によって記述される：
［型］
・伝音性聴覚損失は、外耳および／または中耳の耳小骨の異常に起因する。
・感音性聴覚損失は、内耳構造（すなわち、蝸牛）の機能異常に起因する。
・混合聴覚損失は、伝音性および感音性聴覚損失の組み合わせである。
・中枢聴覚機能障害は、第８脳神経、聴性脳幹、または大脳皮質レベルでの損傷または機能障害に起因する。
［発症］
・言語習得前聴覚損失は、発話の発達前に存在する。全ての生まれつきの（出生時の）聴覚損失は、言語習得前であるが、全ての言語習得前聴覚損失は生まれつきではない。
・言語習得後聴覚損失は、正常な発話の発達後に起こる。
（Ｒｉｃｈａｒｄ  ＪＨ  Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．；難聴および遺伝性聴覚損失概説（Ｄｅａｆｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ）；ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ；最初の掲載：１９９９年２月１４日；最後の修正：２０１４年１月９日)
［聴覚損失の重症度］聴覚は、デシベル（ｄＢ）で測定される。各周波数のための閾値または０ｄＢマークは、正常な若い成人が、ある時間におけるトーンバースト５０％を認識するレベルに関する。聴覚は、個々の閾値が正常な閾値の１５ｄＢ以内である場合に正常と考えられる。聴覚損失の重症度は、表４に示されるように等級付けられる。
【００５１】
【表４】
2020509786.tif 000018
【００５２】
［聴覚障害率］聴覚障害率を算出するために、２５ｄＢを、５００Ｈｚ、１０００Ｈｚ、２０００Ｈｚ、３０００Ｈｚの純粋な音質平均から減算する。結果に、耳特異的レベルを得るために１．５乗じる。障害は、良い耳に５倍悪い耳を重みづけすることによって決定される（表５参照）。会話音声は、約５０〜６０ｄＢ  ＨＬ（聴覚レベル）であるので、純粋な音質平均に基づく機能障害の算出は、誤解を招く恐れがある。例えば、４５ｄＢ聴覚損失は、３０％が示すより機能的にはるかに重大である。異なる評定尺度は、若い子供には適切であり、若い子供にとって一定の制限された聴覚損失は、言語の発達において重大な影響を及ぼし得る［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ＆Ｄｏｗｎｓ  ２００２］。
【００５３】
【表５】
2020509786.tif 000019
【００５４】
［聴覚損失の周波数］聴覚損失の周波数は、下記のように指定される：
・低い（＜５００Ｈｚ）
・中間（５０１〜２０００Ｈｚ）
・高い（＞２０００Ｈｚ）
［遺伝子治療］遺伝子治療は、ＤＮＡが遺伝病を治療するために患者に導入される場合である。新しいＤＮＡは、通常、既存遺伝子において疾患原因変異の影響を修正するための機能性遺伝子を含む。遺伝子導入は、実験的目的または治療的目的のいずれかのために、遺伝情報を標的細胞に動かすベクターまたはベクターシステムに依存する。ベクターまたはベクターシステムは、遺伝子導入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学、および寿命における重要な決定因と考えられる。最近、遺伝子導入を達成するための最も効率的かつ効果的方法は、複製−欠損を作成しているウイルスに基づかれるベクターまたはベクターシステムの使用を介する（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２０１５／０５４６５３；祖先ウイルス配列を予測する方法およびその使用（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ａｎｃｅｓｔｒａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ））。
［ベクター］今まで、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルパー依存的アデノウイルス、およびレンチウイルスは、蝸牛遺伝子伝達のために全て試験されている。もちろん、最も潜在性を示しているものは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）であり、アデノ関連ウイルスは、複製せず、内耳に導入遺伝子を効率的に伝達することができ、中毒性難聴の原因とならない。特に、ＡＡＶは、内耳有毛細胞に効果的に伝達することができ、このことは、有毛細胞特異的変異のために遺伝子異常を修正することを望む場合に重要な特徴である。今まで、多くの異なるＡＡＶサブタイプが、コルチ器官への任意の損傷をほとんど示すことなく、蝸牛遺伝子伝達のために用いられて成功してきた。ＡＡＶ血清型１、２、５、６、および８を研究する最近の報告では、有毛細胞、支持細胞、聴覚神経、および螺旋靭帯での成功した遺伝子発現を証明し、最も効果的に遺伝子導入されるのは有毛細胞であることを証明した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｒ．Ｌｕｓｔｉｇ，ＭＤ  ａｎｄ  Ｏｍａｒ  Ａｋｉｌ，ＰｈＤ（２０１２）蝸牛遺伝子治療（Ｃｏｃｈｌｅａｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２５（１）：５７−６０）。内耳に投与可能なＡＡＶベクターの例は、米国特許出願Ｎ０．２０１３／００９５０７１にさらに記述されており、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【００５５】
修正されることができる標的遺伝子のサイズは、ＡＡＶの伝達能力に基づいて制限される（Ｗｕ，Ｙａｎｇ，＆Ｃｏｌｏｓｉ，２０１０）。翻訳の目的のために、このことは、劣性聴覚損失を引き起こす比較的小さい遺伝子（＜４．６ｋＢ）が原因となるこれらの遺伝性疾患に対する潜在的標的を制限する。遺伝子治療薬を発展させるための初期治療として、標的遺伝子変異は比較的よく起こるべきであり、聴覚損失は言語の発達後に起こるべきである。これらの特徴に適合する進行性の聴覚損失を有する患者を特定することは、聴覚損失の進行に介入する、および中断する、またはもしかすると聴覚損失の進行を逆転する機会を提供する。内耳遺伝子治療試験は、後天性難聴のヒトにおいて開始されているので、多くの安全性問題および伝達問題が取り組まれている（臨床試験識別番号ＮＣＴ０２１３２１３０）。遺伝子試験の利用可能性および正確性の向上は、これらの型の治療介入から利益を得ることができる患者の同定をもたらすだろう（Ｐｒｅｃｉａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
［遺伝子治療のマウスモデル］：劣性型遺伝的難聴の様々な異なるマウスモデルは、遺伝子治療を介して救出されている。例えば、聴覚損失を誘導するＶＧＬＵＴ３変異、ＴＬＣ１変異、フィルリン（ｗｈｉｒｌｉｎ）変異、クラリン（ｃｌａｒｉｎ）１変異の修正を含む（Ａｋｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ａｓｋｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｉｓｇｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。全てのこれらのモデルは、聴覚の成熟前および内耳有毛細胞の変性前に、新生児のマウス内耳へのベクターの伝達を必要とする。このことは、遺伝子治療戦略を用いて聴覚の救出に作用するために、標的疾患が、聴覚の損失および標的細胞の変性より前に遺伝子治療における伝達を可能にするように、少なくとも人において緩徐進行性であるべきである、ということを示す。
［ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子変異は聴覚損失を誘導する］：ＴＭＰＲＳＳ３（ＤＦＮＡ８/１０）の変異に関連する聴覚損失は、様々な異なる表現型で存在することができる。生まれつき深刻な聴覚損失、および成人で発症する進行性聴覚損失が記述されている（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。現在のところ、Ｔｍｐｒｓｓ３機能障害によるメカニズムは知られていない。出生時の聴覚損失マウス、および少し遅い時期であるがまだ聴覚の成熟前に聴覚損失を発症するマウス、の２つのマウスモデルが、今まで発展されている。Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｔｍｐｒｓｓ３におけるタンパク質ー短縮型ナンセンス変異を有するエチル−ニトロソウレア−誘導変異マウスを生成した。これは、出生後１２日、聴覚の成熟の前後における有毛細胞の損失および聴覚の悪化を示した。加えて、嚢状の有毛細胞に影響を及ぼし、螺旋神経節の遅延型変性が観察された（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。螺旋神経節の変性が、コルチ器官の変性に関連するのか、螺旋神経節におけるＴｍｐｒｓｓ３の機能障害に起因するのかはマウスモデルから明確でない。多くの研究では、マウス内耳におけるＴｍｐｒｓｓ３の分布を評価しており、有毛細胞および螺旋神経節細胞におけるＴｍｐｒｓｓ３の存在を証明している（Ｆａｎ，Ｚｈｕ，Ｌｉ，Ｊｉ，＆Ｗａｎｇ，２０１４；Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１)。マウスＴｍｐｒｓｓ３の発現を、抗体抗−ＴＭＰＲＳＳ３を用いて１月齢のＣ５７Ｂ１５マウスで評価した（１：１００，ａｂ１６７１６０，アブカム社（Ａｂｃａｍ），ケンブリッジ、マサチューセッツ）。標識は、内有毛細胞および外有毛細胞、血管条、並びに螺旋神経節細胞の約５０％において観察された（図５）。このことは、蝸牛内電位の変化がないことがＦａｓｑｕｅｌｌｅマウスモデルにおいて観察されたけれども（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、Ｔｍｐｒｓｓ３機能の損失は、さらに、ｓｔｒｉａｌ機能の損失をもたらす恐れがあることを示す。
【００５６】
Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝型−表現型研究は、生まれつき〜成人に発症する深刻な進行性聴覚損失に至るまでの聴覚損失における広範な異なる型を証明する（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。研究では、Ｔｍｐｒｓｓ３変異に起因する聴覚損失は、成人の人工内耳移植を受けている患者の２％〜５％を構成し得ることを示す（Ｊｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｎｉｓｈｉｏ，＆Ｕｓａｍｉ，２０１６；Ｓｌｏａｎ−Ｈｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。これらの変異を有する多くの患者は、かなりの量の残聴を有する。このことは、治療可能な細胞の基質があることになるので、可能性のある救援治療のために魅力的な標的になるだろう。この変異を有する患者の人工内耳移植の成功についてのいくつかの異なる研究がある。Ｔｍｐｒｓｓ３の損失によって誘導される少なくともいくつかの聴覚損失の形態は、遺伝的難聴の他の形態より、人工内耳移植を伴なう聴覚損失を有する形態と同様に研究できない（Ｓｈｅａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。このことは、Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子が有毛細胞および最大５０％のらせん神経節細胞の両方に発現されるという事実に潜在的に関する（図５参照）。これらの相違は、伝達のためのベクターシステムを選択する場合に考慮される必要がある。ベクターは、強い有毛細胞指向性、並びに有毛細胞と、らせん神経節との組み合わされた指向性を用いて試験されるだろう。ベクター指向性における相違は、新生児の内耳伝達および成人の内耳伝達を比較する場合にも見られている（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６ａ）。標的の臨床集団は成熟した聴覚システムを有するヒトであるので、本願に開示されるのは、聴覚の成熟後に聴覚損失の発症を有するマウスモデルであり、病気の進行（実施例１参照）および成人の蝸牛への救援治療のモデル伝達（実施例２参照）の両方のためのモデルとして使用されることができる。
［内耳への伝達のためのＡＡＶ血清型］：広範囲の異なるＡＡＶ血清型は、内耳組織へトランスフェクションするのに有用であることが証明されている（Ｇｙｏｒｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６ｂ；Ｘｉａ，Ｙｉｎ，＆Ｗａｎｇ，２０１２）。新生児の、および成人の動物においてベクター伝達導入遺伝子の分布に明らかな違いがあり、さらに、有毛細胞へのトランスフェクションを評価する場合、内リンパ、対、内リンパへの伝達に違いがある（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。マウスモデルにおいて、内リンパへのベクター伝達は、有毛細胞における向上したトランスフェクションをもたらすが、残聴の損失をもたらし、このことは、進行性聴覚損失のモデルを作ることを難しくする。潜在的に多くの動物またはヒトにおいて、ベクターは、聴覚損失を引き起こすことなく内リンパ嚢へ伝達することが可能であるので、トランスフェクション効率を上昇させることが可能である（Ｃｏｌｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。プラスミド研究の目的のために、外リンパへの伝達は、マウスの聴覚を評価することを可能にするだろう。ＡＡＶ２は、成人動物における有毛細胞、および螺旋神経節への伝達を示している（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＡＡＶ２の付加的利点は、ヒト遺伝子治療臨床試験において、すでに広範囲の実績および安全性データを有していることである（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，２０１６）。最近、様々な研究は、合成ＡＡＶ（ＡＡＶ２/Ａｎｃ８０）が有毛細胞への伝達を向上させるが、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＡＡＶ２と同等の螺旋神経節への伝達を提供しないことを示している（Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｘｉａｏ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，＆Ｌｉｂｅｒｍａｎ，２０１７）。本発明は、聴覚損失を成人で発症し、およびＡＡＶ２またはＡＡＶ２/Ａｎｃ８０  Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子治療が聴覚および螺旋神経節機能におけるより良い救出をもたらすかどうかを比較するためのマウスモデルを提供する。
［人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）］。人工多能性幹細胞（ＩＰＳまたはＩＰＳＣｓ）は、皮膚、肝臓、胃または他の成熟細胞のような成人細胞から遺伝子の導入を介して作成されている幹細胞であり、細胞を再プログラム化し、細胞を胚性幹細胞の全ての特徴を有する細胞に転換する幹細胞である。多能性という用語は、体の器官、神経システム、皮膚、筋肉、および骨格を形成する全ての３つの胚性系統を含む複数の細胞型を生じさせる細胞の能力を含意する。
［ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  遺伝子編集］。本願に記述される方法は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子変異、またはＬＯＸＨＤ１遺伝子変異を編集することによって聴覚を救うためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集の使用も熟慮する。この技術は、２つの遺伝性聴覚損失マウスモデル（Ｔｍｃ１  ａｎｄ  Ｐｍｃａ２）において聴覚をうまく救出するために使用されている（Ａｓｋｅｗ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）。Ｔｍｃ遺伝治療は、聴覚障害のあるマウスにおいて聴覚機能を回復させる（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．７（２９５）：２９５ｒａ１０８）。技術は、顕性聴覚損失を標的にするために主に使用されている一方、Ｔｍｐｒｓｓ３ノックーインマウスモデル、および最終的にＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子における変異によって引き起こされる聴覚損失を有するヒトにおいて、劣性聴覚損失を標的にし、聴覚を回復させるために発展されることができる。欠陥遺伝子配列を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の使用は、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２０１６／０６９９１０、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２０１５／０４８５７７、および米国出願公開Ｎｏ．２０１５／０２９１９６６にさらに記述されており、それらの全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【実施例】
【００５７】
［実施例１−患者に見られる出生後に発症する進行性聴覚損失を正確に映し出すＴＭＰＲＳＳ３変異のマウスモデル］
［マウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを有するヒトＴＭＰＲＳＳ３変異［ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）］の標的化変異］：存在するマウスモデルは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の完全なノックアウトを有し、生まれつきの聴覚損失、または出生後１２日で聴覚の発症時の有毛細胞の変性をもたらす（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。この例は、ヒトＴＭＰＲＳＳ３変異を有するノックインマウスの発展を記述する。ＴＭＰＲＳＳ３におけるｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）は、最も一般的な変異であり、中国、ドイツ、オランド、および韓国からの１０以上の様々な民族の聴覚障害のある患者で同定されており、この変異がＤＦＮＢ８/ＤＦＮＢ１０表現型の主な原因になることを示す（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｅｌｂｒａｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ヒト変異を有するマウスモデルは、Ｈａｒｍｓ  ｅｔ  ａｌ．の以前の研究において詳細に記述されるようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて生成されるだろう（Ｈａｒｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。簡潔に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）設計ツールは、遺伝子および対象の変異のための適切なｇＲＮＡを選択するために使用され；最小限の予測されたオフ−ターゲットゲノム部位編集を有するｇＲＮＡが選択され、対象のゲノム遺伝子座および他の予測されたオフ−ターゲットゲノム部位を増幅するためのプライマーと共に、サービスプロバイダーによって合成されるだろう。
【００５８】
一旦設定されると、マウスは遺伝子型が同定され、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥを用いて２週齢、４週齢、および１２週齢での聴覚損失を評価されるだろう。遅れて発症する聴覚損失において、ＡＢＲ試験およびＤＰＯＡＥ試験の比較は、Ｔｍｐｒｓｓ３機能の減少が有毛細胞機能または螺旋神経節機能に非対称に影響を与えるかどうかを証明し得る。このことは、Ｓｈｅａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の観察で与えられた臨床発展のためのベクターの選択に影響を及ぼすだろう（Ｓｈｅａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ヒトにおける顕著な表現型はないけれども、マウス変異は、嚢状有毛細胞のわずかな変性を示している。前庭系の組織学的評価およびロータロッド試験は、平衡機能障害を検査するために使用されるだろう。蝸牛における変異Ｔｍｐｒｓｓ３の発現は、定量的ＲＴ  ＰＣＲによって決定されるだろう。結果は、野生型マウスおよびホモ接合体Ｔｍｐｒｓｓ３ｃ．９１６Ｇ＞Ａのために分析されるだろう。出生後３日齢、並びに２週齢、４週齢および１２週齢の蝸牛における組織学的および免疫組織化学的分析は、有毛細胞損失のパターンを特定するために行われるだろう。組織化学的データに基づいて、選択された時点は、有毛細胞生存における基礎頂端勾配があるかどうか決定するための有毛細胞生存における全載分析のために選択されるだろう。示された試料は、不動毛束形態を評価するために走査型電子顕微鏡法によって評価されてもよい。統計学的分析は、反復測定のためにＡＮＯＶＡを用いてグラフバッド（Ｇｒａｐｈｐａｄ）  プリズム（Ｐｒｉｓｍ）第７版によって行われるだろう。推定された動物は、変異体では時点につきｎ＝１０を使用し、対照では時点につきｎ＝３を使用する。
【００５９】
［ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）］によって誘導される聴覚損失の経時変化の確立は、救出研究を行うための時点を設定するだろう。うまくいく場合には、側音（ｌａｔｅｒａｌ）臨床前安全性研究の経時変化を定義することにもなるだろう。
【００６０】
標的変異が、マウスにおいて完全な生まれつきの聴覚損失をもたらす場合、誘導型ノックアウトマウスが設計されてもよい。ヒトは非常に様々な表現型を示すので、このことはマウスにおいて観察されてもよく、統計学的分析を難しくする。このことは、救出実験のために対照として反対側未処理耳を用いることによって対処されることが可能である。交互に、Ｔｍｐｒｓｓ３の役割を、ヒトｉＰＳＣモデルにおいて評価してもよい（実施例４に記述されるように）。聴覚損失の進行は、実験的観察が６月齢にまで拡大される場合に遅延されるかもしれない。
［実施例２−マウスモデルにおける聴覚損失は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子治療によって阻害される、または回復されることができるかどうかの評価］
様々なベクターが内耳へ遺伝子を伝達するために提案されている。より小さい遺伝子の長期伝達のために、ＡＡＶベクターは広範囲に研究されており、安全であり、広範囲の細胞への伝達を提供する。しかしながら、外有毛細胞へのＡＡＶ伝達は、より高力価のベクターでさえ不完全であることが示されている。最近、合成アデノ関連ウイルスベクターＡＡＶ２/Ａｎｃ８０が開発されており、内有毛細胞および外有毛細胞への優れた伝達を提供する。２つの異なるベクターシステムが試験され、Ｔｍｐｒｓｓ３機能が螺旋神経節の救出にも必要とされ得るという潜在性に基づかれるものである。聴覚の救出は、これらの２つのベクターシステムを用いるマウスモデルで比較されるだろう。潜在性結果は、ＡＡＶ２/Ａｎｃ８０の場合においてより悪いＡＢＲを伴なうＤＰＯＡＥの救出を含み、このことは有毛細胞に加えて螺旋神経節を治療することの必要性を示すだろう。簡潔にベクターは、実施例１の結果に基づいて聴覚損失の発症を確認される前の１〜２週間で後半規管に半規管開口術で伝達されるだろう。対数倍異なる３つの濃度のベクターはマイクロポンプを用いて注入されるだろう。動物の聴覚は、実施例１で決定された時点で一連のＡＢＲおよびＤＰＯＥＡを用いて評価されるだろう。３〜６月齢の動物において、蝸牛における組織学的、免疫組織化学的および全載評価によって有毛細胞生存が評価されるだろう。対照は、ベクター（ＡＡＶ２．ｈＣＭＶ．ＧＦＰ、またはＡＡＶ２/Ａｎｃ８０．ｈＣＭＶ．ＧＦＰ）を発現するＧＦＰのみで処理された動物からなる。マウスは、任意の前庭システムをさらに示す場合、前庭システム組織学およびロータロッド試験によって評価もされるだろう。加えて、Ｔｍｐｒｓｓ３治療の毒性は、Ｔｍｐｒｓｓ３発現する両ベクターを用いてトランスフェクションする野生型マウスによって評価されるだろう。統計学的分析は、反復測定のためにＡＮＯＶＡを用いてグラフバッド（Ｇｒａｐｈｐａｄ）プリズム（Ｐｒｉｓｍ）第７版によって行われるだろう。結果は、ベクター力価当たりの聴覚に基づいて評価されるだろう。推測される動物は、変異体では時点当たりｎ＝６０（２つのベクター、３つの濃度のベクター、組織学的および全載評価）を使用し、対照では時点当たりｎ＝３を使用する。過剰発現研究は、２つのベクターを用いてｎ＝５を使用するだろう。
【００６１】
Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子治療は、聴覚損失の進行を防ぐことを予期される。Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子治療では、量的効果と同じように聴覚を救出するための種々のベクターで違いがあってもよい。
【００６２】
聴覚の救出が不完全であることが明らかにされる場合、異なるベクターを設計してもよい。潜在的にＴｍｐｒｓｓ３の発現は、異なる長さのプロモーターを使用することによって、またはＴｍｐｒｓｓ３の調節領域を含むことによって最適化される必要があるかもしれない。潜在的にＴｍｐｒｓｓ３遺伝子治療は、非常に速い時点で内耳に提供されなければならないかもしれない。
［ＡＡＶ２ＴＭＰＲＳＳ３伝達システムの評価］：ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターによって引き起こされるヒトＴＭＰＲＳＳ３（ＢＣ０７４８４７）は、ＡＡＶ２ベクターシステムにおいてクローン化された。ベクターは、塩化セシウム勾配で精製された。力価はｐＰＣＲによって決定された（１．１×１０１３ＧＣ／ｍｌ）。合成および精製後、ベクターを２０μｌ体積にアリコートし、５％グリセロールを有するＰＢＳ中に８０℃で保存した。
［ＴＭＰＲＳＳ３伝達のためのアッセイシステムの発展］：ベクター機能の効率性を評価するために、我々はＴＭＰＳＳ３産生を分析するためのシステムを発展させたかった。これは、異なるプロモーターを用いるベクター設計を後に評価するために、およびベクター安全性を評価するためにも役立つだろう。細胞系列は、異なるＡＡＶ血清型を用いるトランスフェクション効率について様々である（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。様々な細胞系列は、ＡＡＶ２を用いてトランスフェクションされる能力の検査を受けた。残念ながら、ＡＡＶ２を用いてトランスフェクションすることができるいくつかの一般的に使用される細胞系列は、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＴＭＰＲＳＳ３を発現する。様々なヒト癌細胞系列が検査され、TMPRSS３を発現することがないＲＮＡｓｅｑが確認されている。原発性若年性鼻咽頭血管線維種（ＪＮＡ）細胞は、ＡＡＶ２ｈｃｍｖ．ｇｆｐを用いてトランスフェクションすることが明らかになった。細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア）を補充されたＴ−７５フラスコに、３７℃で５％ＣＯ２を維持しながらプレートに置いた。培地交換は４８時間ごとに行った。細胞がＰ４に達し９０〜１００％密集になった時、３ｍｌの０．０５％トリプシンを洗浄のために加え、吸引し、その後、細胞を除去するために３ｍｌのトリプシンを加えた。インキュベーションを３７度で３〜５分間行った。トリプシンを１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いて中和した。細胞溶液を１５ｍｌの円すい状の瓶に集め、１２００ｒｐｍで５分間、４度で回転した。細胞を、その後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで懸濁し、プレートに置き、２４時間付着させた。ＡＡＶ２−ＴＭＰＲＳＳ３の導入は、細胞を４ウェルチャンバーミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）ＥＺ  スライド（ＰＥＺＧＳ０４１６、ミリポアシグマ社、バーリントン、マサチューセッツ）に置き、５００μＬの培地に２μｌ／ｍｌ濃度のＡＡＶ２．ｈｃｍｖ．ＴＭＰＲＳＳ３を有する培地に細胞を播種することによって行った。細胞培地を２４時間後に交換し、その後、トランスフェクション後４８時間ごとに細胞が分析されるまで交換した。
［ＡＡＶ２−ＴＭＰＲＳＳ３トランスフェクション細胞の免疫細胞化学］：トランスフェクションされたＪＮＡ細胞を、ＰＢＳを用いて最初に洗浄し、その後ＰＢＳ中に４％パラホルムアルデヒドを有する溶液を用いて室温で１０分間固定化した。細胞を、１％トリトン−Ｘ１００／１％ウシ胎児血清／１０％正常血清を用いて、１時間室温でブロッキングし透過処理した。一次抗体（１：１００、ａｂ１６７１６０、アブカム社（Ａｂｃａｍ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ／１：５０、ＧＴＸ８１６４４、ジェーンテックス（ＧｅｎｅＴｅｘ）社、アーバイン、カリフォルニア）を、４℃で一晩インキュベーションした。次の日、細胞を、ＰＢＳを用いてリンスし、その後、アレクサ（Ａｌｅｘａ）フルオロ（Ｆｌｕｏｒ）４８８（１：５００、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスバッド、カリフォルニア）を用いて標識化した。これらの細胞を、ＰＢＳを用いてさらに洗浄し、その後、プロロング（ＰｒｏＬｏｎｇ）ゴールド（Ｇｏｌｄ）退色防止封入培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスバッド、カリフォルニア）を用いて０．２μｇ／ｍｌ  ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールと共に染色した。
【００６３】
［ＡＡＶ／Ａｎｃ８０−ＴＭＰＲＳＳ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの構築］我々は、ヒトＴＭＰＲＳＳ３全長ｃＤＮＡをＡＡＶ／Ａｎｃ８０ベクターにｅＧＦＰマーカーと共にクローン化するだろう。このため、ウイルス感染した細胞をＧＦＰ発現によって確認することができる。我々は証明された配列を有するヒトＴＭＰＲＳＳ３全長ｃＤＮＡを得る。我々は、クローン化するためにＡＡＶ／Ａｎｃ８０ベクターを使用するだろう。以前に、ヒトＩＳＬ１遺伝子を同じベクターにクローン化し、新生児のマイスの内耳および成人のマウスの内耳に、蝸牛開口術および半規管開口術それぞれによって、ＡＡＶ／Ａｎｃ８０−ＩＳＬ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを注入した。ＡＡＶ／Ａｎｃ８０は、有毛細胞損傷または聴覚損失を引き起こすことなく、新生児の有毛細胞および成人の有毛細胞に効率的に遺伝子伝達を仲介する。導入遺伝子の更なる発現は経時的に維持され、このことは、遺伝子発現を修復するために、および聴覚を回復させるために、Ｔｍｐｒｓｓ３−／−有毛細胞におけるＴＭＰＲＳＳ３遺伝子を発現するという我々の目標に理想的である（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【００６４】
ＴＭＰＲＳＳ３をＡＡＶ／Ａｎｃ８０−ＴＭＰＲＳＳ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターにクローン化後、ベクターは１０１２のウイルス価を達成する目的で増幅され、パッケージ化されるだろう。我々は、感染ヒト細胞によってＡＡＶ／Ａｎｃ８０−ＴＭＰＲＳＳ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを最初に試験するだろう。我々は、ＴＭＰＲＳＳ３およびＧＦＰが同じ細胞に発現したかどうか試験するために、抗−ＴＭＰＲＳＳ抗体と共に免疫標識を行い、ＧＦＰと共局在化するだろう。インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）研究のために、我々は、蝸牛開口術によって野生型新生児内耳に、半規管開口術によって成人の内耳にそれぞれ、注入することによってベクターを試験するだろう。注入後２週間、ＧＦＰ信号が有毛細胞に限定されるかどうか試験するために、マウスの蝸牛を採取するだろう。我々の以前の研究において、我々は１００％の内有毛細胞で強いＧＦＰ発現、および９５％を超える外有毛細胞で減速した発現を観察した。したがって、我々はTMPRSS３遺伝子と同様の発現パターンを観察することを期待する。
【００６５】
ＡＡＶ／Ａｎｃ８０−ＴＭＰＲＳＳ３−ＧＦＰを、続いて、聴覚研究された１月後に蝸牛開口術によってＴｍｐｒｓｓ３−／−蝸牛に注入するだろう。我々は、注入されていない対照内耳と比較して注入された内耳がより良い聴覚を観察することを期待する。このことは、特にＴｍｐｒｓｓ３−／−マウスが深刻な早期に発症する聴覚損失を患う場合に明白になるだろう。Ｔｍｐｒｓｓ３−／−における聴覚損失が、遅発型の進行性である場合に、我々は、例えば２月齢および３月齢などの後の段階で聴覚救出を観察し始めるかもしれない。聴覚研究はＡＢＲおよびＤＰＯＡＥによって行われるだろう。ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値が、注入された耳において任意の周波数で重大に低い場合に、Ｔｍｐｒｓｓ３−／−マウスにおけるＡＡＶ−介在聴覚救出の兆候である。我々は、聴覚回復が維持されるかどうか決定するために、６月間、聴覚救出の進行を観察するだろう。
【００６６】
Ｔｍｐｒｓｓ３−／−マウスにおいて、有毛細胞は最終的に死亡するだろう。ＡＡＶ−介在遺伝子伝達を用いて、有毛細胞機能の回復は、経時的に有毛細胞生存につながるようであり、経時的に有毛細胞を蝸牛の長さに沿って数えることによって確認されるだろう。我々は、注入されていない対照の蝸牛と比較して、注入された蝸牛において著しく有毛細胞を観察することを期待する。聴覚結果と細胞生存との比較は、救出治療のために最適なベクターおよびベクター量を決定するだろう。
［実施例３−ＴＭＰＲＳＳ３］
［ＴＭＰＲＳＳ３−変異マウスモデルの発展］ヒトの状態とできる限り近く似ているマウスモデルの発展は、更なる治療への鍵となる。ノックアウトＴｍｐｒｓｓ３マウスモデルは、商業業者から入手でき、これらの実施例に記述される実験において使用されてもよい。しかしながら、上述されるような聴覚損失を引き起こす公知のヒト変異体を心にとどめることは、マウスモデルを発展させることに、より関連性があるだろう。モデルは、ヒト変異がヒトと同様にマウスにおいても聴覚損失を引き起こすことを示すことを期待され、このことは、そのモデルを治療のために研究されるのに役立つものにする。遺伝子導入マウス系列を産生する方法は、当該技術分野において日常的に使用され、当業者に公知であるだろう。重要なことに、マウスモデルを生成する時間は、わずか数年前では平均２年であり近頃ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いると数か月になり著しく短くなっている。したがって、マウスモデルを産生するのにかかる時間は、もはや速度制限因子ではない。我々は、我々の研究のためにヒト変異を有するＴＭＰＲＳＳ３マウスモデルを作成することを提案している。ＴＭＰＲＳＳ３ノックアウトマウスにおいて、有毛細胞は死に、マウスは深刻な聴覚損失を示す。Ｔｍｐｒｓｓ３ノックインマウスモデルの作成後、我々はＡＢＲおよびＤＰＯＡＥによって有毛細胞の生存および聴覚損失を研究するだろう。マウスモデルが有毛細胞の損失における進行性聴覚損失を示す場合、そのことは我々がヒトＤＦＮＢ８のためのＴｍｐｒｓｓ３マウスモデルを生成しているという証明である。
［遺伝子治療用のＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３を産生するために］我々は、Ｔｍｐｒｓｓ３変異マウスを治療するためにＡＡＶ−介在遺伝子治療を使用するだろう。我々は、研究用に２つのＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２）を同定しているが、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、もしくはＡＡＶ８のような他のアデノ関連ウイルスベクターのような、他の発現ベクターを試験してもよい。Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２は共に、正常な聴覚に副作用を及ぼすことなく哺乳類の新生児有毛細胞に遺伝子を高効率的に伝達する。さらに最近、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２は共に、正常な聴覚に影響を及ぼすことなく成人のマウス有毛細胞に遺伝子を伝達するために使用されることができることを示す（Ｚｉｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ウイルス進化系統におけるインシリコ再構築は、潜在的な遺伝子治療ベクターを生成する（Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｙｉｅｌｄｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｅｃｔｏｒ），Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１５  Ａｕｇ  １１；１２（６）：１０５６−６８；およびＡｓｋｅｗ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｍｃ遺伝子治療は、聴覚障害マウスにおける聴覚機能を回復させる（Ｔｍｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅａｆ  ｍｉｃｅ），Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌ  ８；７（２９５）：２９５ｒａ１０８）。我々は、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３ウイルスを産生するためにヒトＴＭＰＲＳＳ３ｃＤＮＡをベクターにクローン化するだろう。我々は、ＴＭＰＲＳＳ３がインビトロ（ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ）培養システムにおいて使用するために産生されるということを示すために研究を行うだろう。その確認に続いて、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３が、内耳の細胞分析によって、および聴覚研究（ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ）によって示されるように副作用を有さないことを示すために、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３を新生児の野生型マウス内耳に注入するだろう。
［聴覚の回復におけるＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３の研究］我々は、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３を新生児のＴｍｐｒｓｓ３ノックイン変異マウス内耳に注入するだろう。分析は、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３注入マウスおよびＡＡＶ−ＧＦＰを注入された対照マウスで行われ、分析には聴覚試験、細胞分子生物学研究、および長期効果を含むだろう。細胞レベルにおいて、我々は、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３が１月齢で有毛細胞生存を促進するかどうか決定するだろう。ＡＡＶ−ＧＦＰを注入された対照変異耳において、我々はこの時点における有毛細胞の損失を観察することを期待する。対照的に、我々はＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３を注入されると有毛細胞の生存が観察されることを期待する。我々は、注入工程（蝸牛開口術、蝸牛窓膜、半規管開口術）および聴覚回復をより良くするための用量を最適化するだろう。重要なことに、我々は、成人（１月〜６月齢）マウスに注入を行い、聴覚回復を評価するだろう。成人への注入結果は、新生児への注入結果と比較され、そのことは、介入が未だ効果的である時間窓について我々に情報を与えるだろう。
［実施例４−患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞から生成された有毛細胞の研究］
本研究の一つの重要な態様は、ヒト有毛細胞を用いて我々の作業戦略を証明することである。ヒトの側頭骨は本研究で利用することはできないので、我々は、代わりに患者の線維芽細胞、および対照の家族線維芽細胞を用いて患者のｉＰＳ細胞系列を設立するだろう。線維芽細胞は最も頻度の高い変異を有する患者から採取され、ｉＰＳ細胞系列を設立するだろう。ｉＰＳ細胞系列は、有毛細胞を含む内耳細胞に分化するだろう。培養システムと共に、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３をｉＰＳ誘導有毛細胞に感染するために使用するだろう。感染された有毛細胞は、パッチクランピング（ｐａｔｃｈｙ  ｃｌａｍｐｉｎｇ）によって生存および有毛細胞形質導入を研究されるだろう。我々は、未感染および未処理の対照有毛細胞と比較して、有毛細胞生存および有毛細胞機能の向上を観察することを期待する。本研究は、ヒト有毛細胞におけるＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３インフェクションおよびＴＭＰＲＳＳ３遺伝子発現の効率を評価するための機会を提供するだろう。当該成果は、正常に機能しないヒト有毛細胞がＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３で治療されることができることを証明し、そのことは、ＡＡＶ−ＴＭＰＲＳＳ３を未来の臨床研究に向かう主な一歩とする。
［実施例５−ＬＯＸＨＤ１］
［ＬＯＸＨＤ１−変異マウスモデルの発展］ヒトの状態とできる限り近く似ているマウスモデルの発展は、更なる治療への鍵となる。ノックアウトＬＯＸＨＤ１マウスモデルは、上述されるような聴覚損失を引き起こす公知のヒト変異体を心に抱くモデルを発展させることに関連があるだろう。モデルは、ヒト変異がヒトと同様にマウスにおいても聴覚損失を引き起こすことを示すことを期待され、このことは、そのモデルを治療のために研究されるのに役立つものにする。遺伝子導入マウス系列を産生する方法は、当該技術分野において日常的に使用され、当業者に公知であるだろう。重要なことに、マウスモデルを生成する時間は、わずか数年前では平均２年であり近頃ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いると数か月になり著しく短くなっている。したがって、マウスモデルを産生するためにかかる時間は、もはや速度制限因子ではない。我々は、我々の研究のためにヒト変異を有するＬＯＸＨＤ１マウスモデルを作成することを提案している。ＬＯＸＨＤ１ノックアウトマウスにおいて、有毛細胞は死に、マウスは深刻な聴覚損失を示す。ＬＯＸＨＤ１ノックインマウスモデルの作成後、我々はＡＢＲおよびＤＰＯＡＥによって有毛細胞の生存および聴覚損失を研究するだろう。マウスモデルが有毛細胞の損失における進行性聴覚損失を示す場合、そのことは我々がヒトＤＦＮＢ７７のためのＬＯＸＨＤ１マウスモデルを生成しているという証明である。
［遺伝子治療用のＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１を産生するために］我々は、ＬＯＸＨＤ１変異マウスを治療するためにＡＡＶ−介在遺伝子治療を使用するだろう。我々は、研究用に２つのＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２）を同定しているが、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、もしくはＡＡＶ８のような他のアデノ関連ウイルスベクター、のような他の発現ベクターを試験してもよい。Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２は共に、正常な聴覚に副作用を及ぼすことなく哺乳類の新生児有毛細胞に遺伝子を高効率的に伝達する。さらに、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２は共に、正常な聴覚に影響を及ぼすことなく成人のマウス有毛細胞に遺伝子を伝達するために使用されることができる（Ｚｉｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ウイルス進化系統におけるインシリコ再構築は、潜在的な遺伝子治療ベクターを生成する（Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｙｉｅｌｄｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｅｃｔｏｒ），Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１１；１２（６）：１０５６−６８；およびＡｓｋｅｗ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｍｃ遺伝子治療は、聴覚障害マウスにおける聴覚機能を回復させる（Ｔｍｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅａｆ  ｍｉｃｅ），Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．７（２９５）：２９５ｒａ１０８）。我々は、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１ウイルスを産生するためにヒトＬＯＸＨＤ１ｃＤＮＡをベクターにクローン化するだろう。我々は、ＬＯＸＨＤ１がインビトロ（ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ）培養システムにおいて使用するために産生されるということを示すために研究を行うだろう。その確認に続いて、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１が、内耳の細胞分析によって、および聴覚研究（ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ）によって副作用を有さないことを示すために、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１を新生児の野生型マウス内耳に注入するだろう。
［聴覚の回復におけるＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１の研究］我々は、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１を新生児のＬＯＸＨＤ１ノックイン変異マウス内耳に注入するだろう。分析は、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１注入マウスおよびＡＡＶ−ＧＦＰを注入された対照マウスで行われ、分析には聴覚試験、細胞分子生物学研究、および長期効果を含むだろう。細胞レベルにおいて、我々は、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１が１月齢で有毛細胞生存を促進するかどうか決定するだろう。ＡＡＶ−ＧＦＰを注入された対照変異耳において、我々はこの時点における有毛細胞の損失を観察することを期待する。対照的に、我々はＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１を注入されると有毛細胞の生存が観察されることを期待する。我々は、注入工程（蝸牛開口術、蝸牛窓膜、半規管開口術）および聴覚回復をより良くするための用量を最適化するだろう。重要なことに、我々は、成人（１月〜６月齢）マウスに注入を行い、聴覚回復を評価するだろう。成人への注入結果は、新生児への注入結果と比較され、そのことは、介入が未だ効果的である時間窓についての情報を我々に与えるだろう。
［患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞から生成された有毛細胞の研究］
本研究の一つの重要な態様は、ヒト有毛細胞を用いて我々の作業戦略を証明することである。ヒトの側頭骨は本研究で利用することはできないので、我々は、代わりに患者の線維芽細胞、および対照の家族線維芽細胞を用いて患者のｉＰＳ細胞系列を設立するだろう。線維芽細胞は最も頻度の高い変異を有する患者から採取され、ｉＰＳ細胞系列を設立するだろう。ｉＰＳ細胞系列は、有毛細胞を含む内耳細胞に分化するだろう。培養システムと共に、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１をｉＰＳ誘導有毛細胞に感染するために使用するだろう。感染された有毛細胞は、パッチクランピング（ｐａｔｃｈｙ  ｃｌａｍｐｉｎｇ）によって生存および有毛細胞形質導入を研究されるだろう。我々は、未感染および未処理の対照有毛細胞と比較して、有毛細胞生存および有毛細胞機能の向上を観察することを期待する。本研究は、ヒト有毛細胞におけるＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１インフェクションおよびＬＯＸＨＤ１遺伝子発現の効率を評価するための機会を提供するだろう。当該成果は、正常に機能しないヒト有毛細胞がＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１で治療されることができることを証明し、そのことは、ＡＡＶ−ＬＯＸＨＤ１を未来の臨床研究に向かう主な一歩とする。
［実施例６−実験方法］
［ＡＢＲ測定］：ＡＢＲ閾値を知的聴覚システムスマートＥＰプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｍａｒｔ  ＥＰ  ｐｒｏｇｒａｍ）（ＩＨＳ社，マイアミ，フロリダ，米国）を用いて記録した。動物は上述されるように麻酔され、温熱パッドで保温した（３７℃）。針電極を、頂点（＋）、左耳の後ろ（−）、反対の耳の後ろ（グランド）に置いた。トーンバーストを、高周波数変換器を用いて５００μｓの期間で、４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ、および３２ｋＨｚにおいて示した。記録は、１００Ｋと等しい総ゲインを用いて、高周波および低周波通過フィルターのための１００Ｈｚ設定および１５ｋＨｚ設定を用いて行われた。最小の１２８スイープを９０ｄＢ  ＳＰＬで示した。ＳＰＬは１０ｄＢステップで減少した。閾値レベルに近い、最大１０２４プレゼンテーションまで用いて５ｄＢ  ＳＰＬステップを各周波数で行った。閾値は、少なくとも一つの波が２以上の反復記録で同定されることが可能であるＳＰＬとして定義された。術前閾値は最初の操作前に測定され、最後の術後閾値は動物を犠牲にする前に測定された。我々は、各ベクター伝達前および最後のベクター伝達後３日にマウスを試験した。
［ＤＰＯＡＥ測定］：ＯＨＣにおける機能的損傷を評価するために、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）および入／出力関数（Ｉ／Ｏ関数）を上述のＩＨＳプログラムを用いて両側で記録した。歪成分を、ＩＨＳ高周波数変換器を用いて２ｋＨｚ〜３２ｋＨｚの純音のために測定した。エティモティック（Ｅｔｙｍｏｔｉｃ）１０Ｂ＋プローブを外耳管に挿入した。Ｌ１レベルを６５ｄＢに設定し、Ｌ２レベルを５５ｄＢに設定した。周波数は、１６スイープを用いてＦ２−Ｆ１比が１．２２と得られた。Ｉ／Ｏ関数は、１６ｋＨｚの周波数で得られた。６５ｄＢ  ＳＰＬ〜３１ｄＢ  ＳＰＬの範囲の９つの刺激レベルを５ｄＢステップで使用した。マウスは、各ベクター伝達前および最後のベクター伝達後３日に試験された。
［内耳へのＴＭＰＲＳＳ３発現ＡＡＶの伝達］全ての手順は、適切な動物実験委員会によって検査され承認された。成人マウスを、０．９％塩化ナトリウム液中にケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）、キシロカイン（６ｍｇ／ｋｇ）、およびアセプロマジン（２ｍｇ／ｋｇ）の混合物を有する溶液のｉ．ｐ．注射で麻酔した。ベクターは、後部半規管にいずれも伝達された。背面耳介後部切開を行って、後部または外側半規管を露出した。マイクロドリルを用いて、蝸牛開口術によって、外リンパ空間を作成し露出した。続いて、０．５μｌのベクターを、０．１μｌ目盛りを有するハミルトンマイクロシリンジ、および３６ゲージ針を用いて注射した。蝸牛開口術は、骨ろうを用いて密封され、動物を回復させることができた。
［マウスのロータロッド（ＲＲ）訓練および試験のためのプロトコル］：訓練のために、マウスをＲＲロータロッド（ＥＮＶ−５７５Ｍ、メド  アソシエイティッド  インク．（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｉｎｃ．）、ジョージア、米国）に置き、一度に一匹ずつ、プログラムを４〜４０ｒｐｍの速度に初期化した。マウスは落ちる／ジャンプする／止まる、および最初のスロットで回転すると、マウスは捕らえられ、プログラムを停止することなく連続的なスロットに置かれる。処置後、マウスをＲＲに置き、各スロットに一匹のマウスでプログラムを開始する。マウスが落ちると、マウスは捕らえら、他のマウスがプログラムを終えるのを待つために動物小屋に置かれる。
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Ｇｅｎｇ，Ｒ．，Ｏｍａｒ，Ａ．，Ｇｏｐａｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｈ．−Ｃ．，Ｓｔｅｐａｎｙａｎ，Ｒ．，Ｂａｓｃｈ，Ｍ．Ｌ．，．．．Ａｌａｇｒａｍａｍ，Ｋ．Ｎ．（２０１７）．アッシャー症候群ＩＩＩにおける進行性聴覚損失のモデリングおよび防止（Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ  ｉｎ  Ｕｓｈｅｒ  ＳｙｎｄｒｏｍｅＩＩＩ）．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７（１），１３４８０．
Ｇｙｏｒｇｙ，Ｂ．，Ｓａｇｅ，Ｃ．，Ｉｎｄｚｈｙｋｕｌｉａｎ，Ａ．Ａ．，Ｓｃｈｅｆｆｅｒ，Ｄ．Ｉ．，Ｂｒｉｓｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｔａｎ，Ｓ．，．．．Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｃ．Ａ．（２０１７）．エキソーム関連ＡＡＶを用いて内耳有毛細胞への遺伝子伝達による聴覚の救出（Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  Ｈｅａｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｉｎｎｅｒ−Ｅａｒ  Ｈａｉｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＡＡＶ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２５（２），３７９−３９１．
Ｈａｒｍｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｅｒｕｇｇｉａ，Ｄ．，Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｇ．，Ｍｏｎｔｏｌｉｕ，Ｌ．，．．．Ｇｕｒｕｍｕｒｔｈｙ，Ｃ．Ｂ．（２０１４）．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてのマウスゲノム編集（Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｐ．１５．７．１−１５．７．２７）．Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
Ｉｓｇｒｉｇ，Ｋ．，Ｓｈｔｅａｍｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｅｌｙａｎｔｓｅｖａ，Ｉ．Ａ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｔ．Ｓ．，Ｖｉｊａｙａｋｕｍａｒ，Ｓ．，．．．Ｃｈｉｅｎ，Ｗ．Ｗ．（２０１７）．遺伝子治療は、アッシャー症候群のマウスモデルにおける平衡機能および聴覚機能を回復させる（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｕｄｉｔｏｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｕｓｈｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２５（３），７８０−７９１．
Ｊｏｌｌｙ，Ｃ．，Ｍｉｓｔｒｉｋ，Ｐ．，Ｒａｊａｎ，Ｇ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｋ．，Ｓｔａｅｃｋｅｒ，Ｈ．，Ｈｅｌｂｉｇ，Ｓ．，＆Ｕｓａｍｉ，Ｓ．−Ｉ．（２０１２）．人工内耳の新しい傾向、並びに深い挿入電極および聴覚保護によって証明された無外傷性（Ｎｅｗ  ｔｒｅｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｔｒａｕｍａｔｉｃｉｔｙ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｅｐ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）．Ｐｒａｃｔｉｃａ  Ｏｔｏ−Ｒｈｉｎｏ−Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｃａ，（ＳＵＰＰＬ．１３２）．
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，Ｌ．Ａ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．Ｍ．，＆Ｌａｎｇ，Ｈ．（２０１１）．正常および聴覚障害のある成人のマウスの耳における中央階へのアデノ関連ウイルス介在遺伝子伝達（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｃａｌａ  ｍｅｄｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｅａｆｅｎｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｅａｒ）．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１８（６），５６９−５７８．
Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ，Ｌ．Ｄ．，Ｐａｎ，Ｂ．，Ａｓｋｅｗ，Ｃ．，Ｗａｓｓｍｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｇｌｕｃｋ，Ｓ．Ｄ．，Ｇａｌｖｉｎ，Ａ．，．．．Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．（２０１７）．合成ＡＡＶベクターは、哺乳類内耳への安全および効率的な遺伝子伝達を可能にする（Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｉｎｎｅｒ  ｅａｒ）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５（３），２８０−２８４．
Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｏ，Ｓ．−Ｙ．，＆Ｕｓａｍｉ，Ｓ．−Ｉ．（２０１６）．遺伝疫学を特に重視することを伴なう人工内耳移植を受けている患者の病因における包括的研究（Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  Ｃｏｃｈｌｅａｒ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）．Ｏｔｏｌｏｇｙ＆Ｎｅｕｒｏｔｏｌｏｇｙ，３７（２），ｅ１２６−ｅ１３４．
Ｐｒｅｃｉａｄｏ，Ｄ．ａ，Ｌａｗｓｏｎ，Ｌ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｃ．，Ｍｙｅｒ，Ｄ．，Ｎｇｏ，Ｃ．，Ｂｒａｄｓｈａｗ，Ｊ．Ｋ．，．．．Ｇｒｅｉｎｗａｌｄ，Ｊ．Ｈ．（２００５）．特発性小児感音性聴覚損失における一連の診断的パラダイムを有する向上した診断有効性（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ）．Ｏｔｏｌｏｇｙ＆Ｎｅｕｒｏｔｏｌｏｇｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎｅｕｒｏｔｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ［ａｎｄ］Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｏｌｏｇｙ，２６（４），６１０−５．
Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ，Ｊ．Ｌ．，＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．（２０１６）．癌遺伝子治療におけるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．
Ｓｈｅａｒｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｅｐｐｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．，Ｆｒｅｅｓ，Ｋ．，Ｔｅｊａｎｉ，Ｖ．，Ｓｌｏａｎ−Ｈｅｇｇｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．，．．．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｊ．Ｈ．（２０１７）．末梢の聴覚システムにおける遺伝的変異体は、成人の人工内耳性能に重大に影響を及ぼす（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ａｄｕｌｔ  ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）．Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４８，１３８−１４２．
Ｓｈｕ，Ｙ．，Ｔａｏ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｓｈｅｎ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，＆Ｃｈｅｎ，Ｚ．−Ｙ．（２０１６）．アデノウイルスベクターは、インビボにおいて哺乳類内耳の様々な細胞サブタイプを標的にする（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ）．Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ，２０１６，１−８．
Ｓｈｕ，Ｙ．，Ｔａｏ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｔａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｄａｉ，Ｐ．，．．．Ｃｈｅｎ，Ｚ．−Ｙ．（２０１６ａ）．新生児および成人の哺乳類内耳細胞サブタイプを標的にするアデノ関連ウイルスベクターの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２７（９），６８７−６９９．
Ｓｈｕ，Ｙ．，Ｔａｏ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｔａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｄａｉ，Ｐ．，．．．Ｃｈｅｎ，Ｚ．−Ｙ．（２０１６ｂ）．新生児および成人の哺乳類内耳細胞サブタイプを標的にするアデノ関連ウイルスベクターの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２７（９），６８７−６９９．
Ｓｌｏａｎ−Ｈｅｇｇｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｅｒｅｒ，Ａ．Ｏ．，Ｓｈｅａｒｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｋｏｌｂｅ，Ｄ．Ｌ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｃ．Ｊ．，Ｆｒｅｅｓ，Ｋ．Ｌ．，．．．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｊ．Ｈ．（２０１６）．聴覚損失を有する１１１９人の患者の臨床評価における包括的な遺伝的試験（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  １１１９  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３５（４），４４１−４５０．
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｘｉａｏ，Ｒ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．，＆Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｃ．（２０１７）．成人マウスにおける祖先ＡＡＶを用いての蝸牛遺伝子治療：蝸牛機能障害を起こさない内耳有毛細胞における完全な形質導入（Ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ＡＡＶ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎｅｒ  ｈａｉｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，４５５２４．
Ｔａｏ，Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｍ．，Ｓｈｕ，Ｙ．，Ｒｕｐｒｅｃｈｔ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｔａｎｇ，Ｙ．，．．．Ｃｈｅｎ，Ｚ．−Ｙ．（２０１７）．聴覚機能障害を起こさない成人哺乳類内耳細胞サブタイプにおけるアデノ関連ウイルスベクターの伝達（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｕｄｉｔｏｒｙ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｈｕｍ．２０１７．１２０．
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｃｈａｎｇ，Ｑ．，Ａｈｍａｄ，Ｓ．，Ｚｈｏｕ，Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｙ．，．．．Ｌｉｎ，Ｘ．（２０１３）．出生後早期の中央階へのウイルス接種は、内耳において外因性の緑色蛍光タンパク質の過剰発現を達成し、聴覚脳幹応答閾値を保護した（Ｅａｒｌｙ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｃａｌａ  ｍｅｄｉａ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｅａｒ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｂｒａｉｎｓｔｅｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ）．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５（３−４），１２３−１３３．
Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ，Ｎ．Ｊ．Ｄ．，Ｓｃｈｒａｄｅｒｓ，Ｍ．，Ｏｏｓｔｒｉｋ，Ｊ．，Ｈｕｙｇｅｎ，Ｐ．Ｌ．Ｍ．，Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒａｎｎｅｍａｎ，Ｓ．，．．．Ｋｕｎｓｔ，Ｈ．Ｐ．Ｍ．（２０１１）．ＴＭＰＲＳＳ３変異を有するＤＦＮＢ８／１０ファミリーの遺伝型−表現型相関（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＦＮＢ８／１０  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＴＭＰＲＳＳ３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）．ＪＡＲＯ−Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，１２（６），７５３−７６６．
Ｗｕ，Ｚ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，＆Ｃｏｌｏｓｉ，Ｐ．（２０１０）．ＡＡＶベクターパッケージングにおける遺伝子サイズの影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（１），８０−６．
Ｘｉａ，Ｌ．，Ｙｉｎ，Ｓ．，＆Ｗａｎｇ，Ｊ．（２０１２）．アデノ関連ウイルスベクターを用いて新生児マウスにおける内耳遺伝子トランスフェクション：２つの方法の比較（Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｍｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７（８），ｅ４３２１８．
本発明の一つ以上の実施形態を記述している。それにもかかわらず、様々な修飾が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われてもよい。したがって、他の実施形態は次の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2020509786.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020509786.tif 000023
【図５】
2020509786.tif 000024
【配列表】
2020509786000001.app
【国際調査報告】
2020509786.tif 000025