(57)【要約】  本開示は、特に肝細胞においてＬＤＨＡ発現を低減するために有用なオリゴヌクレオチド、組成物及び方法に関する。【選択図】図３
2020536587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）として示される配列を有するアンチセンス鎖と、ＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）として示される配列を有するセンス鎖とを含むことを特徴とする、ＬＤＨＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、修飾されている、請求項１又は請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記修飾されたヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記２’修飾が、２’−フルオロ又は２’−Ｏ−メチルである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
下記の位置：前記センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８〜２６位、又は３１〜３６位、及び／又は、前記アンチセンス鎖の１位、６位、８位、１１〜１３位、１５位、１７位、又は１９〜２２位のうち１以上が、２’−Ｏ−メチルで修飾されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８〜２６位、及び３１〜３６位、及び前記アンチセンス鎖の１位、６位、８位、１１〜１３位、１５位、１７位、及び１９〜２２位の全てが、２’−Ｏ−メチルで修飾されている、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
下記の位置：前記センス鎖の３位、５位、８〜１１位、１３位、１５位、又は１７位、及び／又は、前記アンチセンス鎖の２〜５位、７位、９位、１０位、１４位、１６位、又は１８位のうち１以上が、２’−フルオロで修飾されている、請求項２〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記センス鎖の３位、５位、８〜１１位、１３位、１５位、又は１７位、及び前記アンチセンス鎖の２〜５位、７位、９位、１０位、１４位、１６位、及び１８位の全てが、２’−フルオロで修飾されている、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１個の修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１個の修飾されたヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記センス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の２位と３位、前記アンチセンス鎖の３位と４位、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位のうち１以上の間に、ホスホロチオエート結合を有する、請求項１０又は請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記センス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の２位と３位、前記アンチセンス鎖の３位と４位、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間に、ホスホロチオエート結合を有する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アンチセンス鎖の第１の位置ウリジンが、リン酸類似体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記アンチセンス鎖の１位に、下記の構造
2020536587.tif 000018
を含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記センス鎖の−ＧＡＡＡ−配列のヌクレオチドのうち１以上が、一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記センス鎖の−ＧＡＡＡ−配列のヌクレオチドのそれぞれが、一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記−ＧＡＡＡ−モチーフが、構造：
2020536587.tif 000019
を含み、ここで、
Ｌは、結合、クリックケミストリーハンドル、又は置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、並びにこれらの組合せからなる群から選択される、両端を含んで１〜２０個の長さの連続する共有結合原子のリンカーを表し、且つ
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮである、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
Ｌが、アセタールリンカーである、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｘが、Ｏである、請求項１８又は請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記−ＧＡＡＡ−配列が、構造：
2020536587.tif 000020
を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、Ｎａ+対イオンとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
図３に示されるような化学構造を有する組成物。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドを、対象に送達する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物又はオリゴヌクレオチドを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記対象が、ＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３、及び／又は特発性高シュウ酸尿症に罹患しているか又は罹患するリスクがあり、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを前記対象に投与することにより、前記対象の肝細胞におけるＬＤＨＡタンパク質の発現を低減することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
原発性高シュウ酸尿症に罹患しているか、又は罹患するリスクがある対象の治療のための請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物の使用であって、前記処置が、前記オリゴヌクレオチド又は組成物を前記対象に投与することを含む、使用。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチド又は組成物が、前記対象に静脈内又は皮下投与される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２８】
ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）で示される配列を有するアンチセンス鎖と、ＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）で示される配列を有するセンス鎖とを含み、
前記センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８〜２６位、及び３１〜３６位、及び、前記アンチセンス鎖の１位、６位、８位、１１〜１３位、１５位、１７位、及び１９〜２２位の全てが、２’−Ｏ−メチルで修飾され、且つ、前記センス鎖の３位、５位、８〜１１位、１３位、１５位、又は１７位、及び、前記アンチセンス鎖の２〜５位、７位、９位、１０位、１４位、１６位、及び１８位の全てが、２’−フルオロで修飾され、
前記センス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の１位と２位、前記アンチセンス鎖の２位と３位、前記アンチセンス鎖の３位と４位、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間に、ホスホロチオエート結合を有し、
前記アンチセンス鎖の１位に、下記の構造：
2020536587.tif 000021
を含み、
前記センス鎖の−ＧＡＡＡ−配列のヌクレオチドのそれぞれが、構造：
2020536587.tif 000022
を含む一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされている、
ＬＤＨＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３０】
Ｎａ+対イオンを更に含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドを、対象に送達する方法であって、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項２９若しくは請求項３０に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記対象が、ＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３、及び／又は特発性高シュウ酸尿症に罹患しているか、又は罹患するリスクがあり、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項２９若しくは請求項３０に記載の組成物を、前記対象に投与することにより、前記対象の肝細胞におけるＬＤＨＡタンパク質の発現を低減することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
原発性高シュウ酸尿症に罹患しているか、又は罹患するリスクがある対象の治療のための、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項２９若しくは請求項３０に記載の組成物の使用であって、前記治療が、前記オリゴヌクレオチド又は組成物を、前記対象に投与することを含む、使用。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチド又は組成物が、前記対象に静脈内又は皮下投与される、請求項３０若しくは請求項３１に記載の方法、又は請求項３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）の下、「ＬＤＨＡの発現を阻害するための方法及び組成物」という名称の２０１８年９月４日出願の米国仮出願第６２／７２６９５０号、「ＬＤＨＡの発現を阻害するための方法及び組成物」という名称の２０１７年１０月１３日出願の米国仮出願第６２／５７２４０３号、及び「ＬＤＨＡの発現を阻害するための方法及び組成物」という名称の２０１７年１０月１３日出願の米国仮出願第６２／５７２３９８号に対する利益を主張するものであり、それらの全内容は本明細書の一部として援用される。
【０００２】
本発明は、遺伝子発現及び／又は活性を低減するためのオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）は、シュウ酸塩の過剰産生により引き起こされる常染色体劣性障害であり、腎臓におけるシュウ酸カルシウムの沈澱及び最終的には末期腎疾患をもたらす。１型ＰＨ（ＰＨ１）、２型ＰＨ（ＰＨ２）及び３型ＰＨ（ＰＨ３）と呼ばれる３つの形態のＰＨ並びに特発性高シュウ酸尿症がある。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、肝臓におけるシュウ酸代謝の最終段階であるグリオキシル酸からシュウ酸への変換を担う重要な酵素であることから、肝臓のシュウ酸産生を低減するための標的として同定されている。ＬＤＨサブユニットをコードする遺伝子を標的とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、少なくとも１つには、恒久的なＲＮＡｉに基づくＬＤＨタンパク質のノックダウンを作りだし、それにより、ＬＤＨ酵素活性を低減する有力なオリゴヌクレオチドの同定に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、他の特徴の中でも、従前のオリゴヌクレオチドに比べて改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、改善された肝臓標的指向性、及び／又は遺伝子ノックダウンに対する改善された持続的効果を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝細胞にオリゴヌクレオチドを特異的に送達するためにＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分がコンジュゲートされた、ニックの入ったテトラループ構造を含み、それにより筋肉、皮膚、又は子宮などの他の組織における潜在的な望ましくない影響を回避又は最小化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対象、例えば、原発性高シュウ酸尿症に罹患している患者において肝臓のシュウ酸産生を低減するために有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、尿シュウ酸レベルを低減するために有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＰＨ１、ＰＨ２及び／又はＰＨ３を含む原発性高シュウ酸尿症、並びに特発性高シュウ酸尿症を治療するために有用である。
【０００５】
本開示のいくつかの態様は、ＬＤＨＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは、ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）として示される配列を有するアンチセンス鎖とＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）として示される配列を有するセンス鎖とを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、この２’修飾は、２’−フルオロ又は２’−Ｏ−メチルである。いくつかの実施形態では、下記の位置：センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８〜２６位、若しくは３１〜３６位及び／又はアンチセンス鎖の１位、６位、８位、１１〜１３位、１５位、１７位、若しくは１９〜２２位のうち１以上が２’−Ｏ−メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８〜２６位、及び３１〜３６位並びにアンチセンス鎖の１位、６位、８位、１１〜１３位、１５位、１７位、及び１９〜２２位の全てが２’−Ｏ−メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、下記の位置：センス鎖の３位、５位、８〜１１位、１３位、１５位、若しくは１７位及び／又はアンチセンス鎖の２〜５位、７位、９位、１０位、１４位、１６位、若しくは１８位の１以上が２’−フルオロで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、５位、８〜１１位、１３位、１５位、又は１７位及びアンチセンス鎖の２〜５位、７位、９位、１０位、１４位、１６位、及び１８位の全てが２’−フルオロで修飾されている。
【０００７】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のうち１以上の間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の第１の位置のウリジンは、リン酸類似体を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に下記の構造を含む。
【００１０】
2020536587.tif 000003
【００１１】
いくつかの実施形態では、センス鎖の−ＧＡＡＡ−配列のヌクレオチドのうち１以上が一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、センス鎖の−ＧＡＡＡ−配列のヌクレオチドのそれぞれが一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、−ＧＡＡＡ−モチーフは、構造：
【００１２】
2020536587.tif 000004
【００１３】
を含み、ここで、
Ｌは、結合、クリックケミストリーハンドル、又は置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、並びにこれらの組合せからなる群から選択される、両端を含んで１〜２０個の長さの連続する共有結合原子のリンカーを表し、且つ
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アセタールリンカーである。いくつかの実施形態では、ＸはＯである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、−ＧＡＡＡ−配列は、下記の構造を含む。
【００１６】
2020536587.tif 000005
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＬＤＨＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）として示される配列を有するアンチセンス鎖とＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）として示される配列を有するセンス鎖とを含み、
センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８〜２６位、及び３１〜３６位並びにアンチセンス鎖の１位、６位、８位、１１〜１３位、１５位、１７位、及び１９〜２２位の全てが２’−Ｏ−メチルで修飾され、且つ、センス鎖の３位、５位、８〜１１位、１３位、１５位、又は１７位及びアンチセンス鎖の２〜５位、７位、９位、１０位、１４位、１６位、及び１８位の全てが２’−フルオロで修飾され、
このオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有し、
このオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に下記の構造：
【００１８】
2020536587.tif 000006
【００１９】
を含み、
センス鎖の−ＧＡＡＡ−配列のヌクレオチドのそれぞれは、構造：
【００２０】
2020536587.tif 000007
【００２１】
を含む、一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされている。
【００２２】
本開示の他の態様は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかとＮａ+対イオンとを含む組成物を提供する。
【００２３】
図３に示されるような化学構造を有する組成物もまた提供される。
【００２４】
本開示の他の態様は、オリゴヌクレオチドを対象に送達する方法を提供し、その方法は、本明細書に記載の組成物又はオリゴヌクレオチドのいずれかを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３、及び／又は特発性高シュウ酸尿症に罹患しているか、又は罹患するリスクがあり、その方法は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを対象に投与することにより、対象の肝細胞においてＬＤＨＡタンパク質の発現を低減することを含む。
【００２５】
本開示の他の態様は、原発性高シュウ酸尿症に罹患しているか、又は罹患するリスクがある対象の治療のための本明細書に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物の使用を提供し、この治療は、オリゴヌクレオチド又は組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は組成物は、対象に静脈内又は皮下投与される。
【００２６】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付図面は、特定の実施形態を示し、明細書書面とともに、本明細書に開示される組成物及び方法の特定の態様の限定されない例を示すのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａは、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡとの相補領域を有するガイド（アンチセンス）鎖を有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの限定されない例を示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示されるパッセンジャー（センス）鎖の２７〜３０位に存在するループ配列の例の化学構造の非限定的な提示である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａに示されるガイド（アンチセンス）鎖の１位に示される修飾ウリジンの化学構造の非限定的な提示である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＬＤＨＡ  ＡＡＶマウスモデルを用い、図１Ａに示される特定のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のためのタイムラインを示す概略図である。ＡＡＶ注射は第−１週に行い、単回用量のオリゴヌクレオチドを示されたように０．５、１、３、又は６ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。１、２、４、６、８、及び１０週目に４ｍｍの生検パンチを採取し、ブロック中及びｍＲＮＡノックダウン分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ中で急速冷凍した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１に記載される試験の結果のサブセットを示すグラフである。残留するｈＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのパーセンテージを、１、３、又は６ｍｇ／ｋｇ用量の投与後週数で示す。これらの結果は、時間を合わせたＰＢＳに対して正規化した。ヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの用量依存的低減は、投与後４週間持続した。
【図３−１】図３は、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡとの相補領域を有するガイド（アンチセンス）鎖とニックが入ったテトラループ構造を有するパッセンジャー（センス）鎖を有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの非限定的化学構造である。
【図３−２】図３は、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡとの相補領域を有するガイド（アンチセンス）鎖とニックが入ったテトラループ構造を有するパッセンジャー（センス）鎖を有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの非限定的化学構造である。
【図３−３】図３は、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡとの相補領域を有するガイド（アンチセンス）鎖とニックが入ったテトラループ構造を有するパッセンジャー（センス）鎖を有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの非限定的化学構造である。
【図４】図４は、初回投与後２８日目及び５６日目のカニクイザル（幼若及び若成体）における、図３に示されるようなオリゴヌクレオチドの２回投与後のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ（上のパネル）、ＬＤＨタンパク質（中央のパネル）、及びＬＤＨ活性（残留率％、下のパネル）の低減を示すグラフである。
【図５】図５は、カニクイザルにおける図３に示されるようなオリゴヌクレオチドの２回投与後のＬＤＨタンパク質レベル（ウエスタンブロットにより検出）の低減を示すグラフである。
【図６】図６は、カニクイザルにおける図３に示されるようなオリゴヌクレオチドの１０回投与後のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現（残留率％）の低減を示すグラフである。
【図７】図７は、カニクイザルにおける図３に示されるようなオリゴヌクレオチドの１０回投与後のＡｇｏ２／ＲＩＳＣに組み込まれたオリゴヌクレオチドの濃度を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、非盲検多施設共同試験でのＰＨ患者における種々の用量（１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は６ｍｇ／ｋｇ）の図３に示されるようなオリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。図８Ａは、試験過程のこれらの患者における尿中シュウ酸（ＵＯＸ）含量の絶対値の変化を示す。１．５ｍｇ／ｋｇ用量群では、５７日後にｎ＝２。３ｍｇ／ｋｇ用量群では、５７日後にｎ＝２。６ｍｇ／ｋｇ用量群では、１日後にｎ＝２及びｎ＝１。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、非盲検多施設共同試験でのＰＨ患者における種々の用量（１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は６ｍｇ／ｋｇ）の図３に示されるようなオリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。図８Ｂは、試験過程の１．５ｍｇ／ｋｇ用量群及び３ｍｇ／ｋｇ用量群における患者のベースラインからの尿中シュウ酸（ＵＯＸ）％の２４時間変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
いくつかの態様によれば、本開示は、ＬＤＨ酵素活性を低減するために有効なＬＤＨＡ  ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、これらのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、例えば、肝臓細胞（例えば、肝細胞）におけるＬＤＨＡの低減に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを用いる肝臓ＬＤＨ活性の抑制は、ＰＨ１、ＰＨ２及び／又はＰＨ３を含む原発性高シュウ酸尿症、並びに特発性高シュウ酸尿症を治療するための治療アプローチを提供する。
【００２９】
定義される用語の説明を含む本開示のさらなる態様を以下に示す。
【００３０】
Ｉ．定義
およそ：本明細書で使用する場合、用語「およそ」又は「約」は、対象とする１以上の値に適用される場合に、示された参照値に類似の値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、そうではないことが述べられない限り又はそうでなければ文脈から明白でない限り（そのような値がとり得る値の１００％を超える場合を除き）、示された参照値のいずれの方向でも（より大きい又はより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満内に入る範囲の値を指す。
【００３１】
投与すること：本明細書で使用する場合、用語「投与すること」又は「投与」は、薬理学的に有用な様式で（例えば、対象において病態を治療するために）対象にある物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を提供することを意味する。
【００３２】
アシアロ糖タンパク質受容体(Asialoglycoprotein receptor)（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用する場合、用語「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」は、４８ｋＤａの大サブユニット（ＡＳＧＰＲ−１）及び４０ｋＤａの小サブユニット（ＡＳＧＰＲ−２）により形成される、２つに分かれるＣ型レクチンを指す。ＡＳＧＰＲは、主として肝細胞の類洞側表面で発現され、結合、内部移行、及び続いての末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）のクリアランスに主要な役割を持つ。
【００３３】
減弱する：本明細書で使用する場合、用語「減弱する」は、低減する又は効果的に停止させることを意味する。限定されない例として、本明細書に提供される治療の１以上は、対象においてシュウ酸蓄積を低減し得る又は効果的に停止させ得る。このような減弱は、例えば、シュウ酸蓄積の１以上の側面（例えば、症状、組織の特徴、及び細胞など）若しくはそのような蓄積から生じる症状の軽減、シュウ酸蓄積の１以上の側面若しくはそのような蓄積から生じる症状の検出可能な進行（増悪）がないこと、又は対象においてそうではない場合に予想される検出可能なシュウ酸蓄積若しくはそのような蓄積から生じる症状がないことにより例示される。
【００３４】
相補的：本明細書で使用する場合、用語「相補的」は、２つのヌクレオチド間（例えば、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能とする、２つの反対の核酸又は単一の核酸鎖の反対の領域について）の構造的関係を指す。例えば、一方の核酸のプリンヌクレオチドは、反対の核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的であり、互いに水素結合を形成することによって一緒に塩基対を形成し得る。いくつかの実施形態では、相補的ヌクレオチドは、ワトソン−クリック様式又は安定な二重鎖の形成を可能とする他のいずれかの様式で塩基対を形成し得る。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載されるように相補性の領域を形成するように、互いに相補的な複数のヌクレオチドの領域を有し得る。
【００３５】
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドに比べて、その五炭糖の２’位にヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、リン酸基若しくは塩基における又は糖、リン酸基若しくは塩基の修飾若しくは置換を含む、２’位以外での原子の１以上の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
【００３６】
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態のオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に分離された(covalently separate)核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に連結された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、折り畳まれた（例えば、ヘアピンを介して）単一の核酸鎖から形成され、一緒に塩基対を形成したヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供する。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖を形成した２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば一端又は両端にオーバーハングを有する、部分的に二重鎖を形成した、２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的なヌクレオチドの逆平行配列を含み、従って、１以上のミスマッチを有することがあり、これらは内部ミスマッチ又は末端ミスマッチを含み得る。
【００３７】
二重鎖：本明細書で使用する場合、用語「二重鎖」は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合を介して形成された構造を指す。
【００３８】
賦形剤：本明細書で使用する場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の稠度又は安定化効果を提供するか、又はそれに寄与するために組成物に含まれ得る非治療薬を指す。
【００３９】
肝細胞：本明細書で使用する場合、用語「肝細胞」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。これらの細胞は、肝臓の質量のおよそ７０〜８５％を構成し、血清アルブミン、フィブリノゲン、及びプロトロンビン群の凝固因子（第３因子及び第４因子を除く）を産生する。肝細胞系譜細胞のマーカーとしては、限定されるものではないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンセターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝細胞核因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝細胞核因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を含み得る。成熟肝細胞のマーカーとしては、限定されるものではないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６リン酸（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２−２Ｆ８を含み得る。例えば、Ｈｕｃｈら（２０１３），Ｎａｔｕｒｅ，４９４（７４３６）：２４７−２５０を参照、肝細胞マーカーに関する内容は本明細書の一部として援用される。
【００４０】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）：本明細書で使用する場合、用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」又は「ＬＤＨ」は、乳酸／ピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸／グリセリン酸、及びグリオキシル酸／シュウ酸代謝のホメオスタシスを調節する酵素を指す。機能的ＬＤＨは、４つの単量体ポリペプチド鎖から構成され、四量体を形成する。筋肉（Ｍ）型又は心臓（Ｈ）型ＬＤＨとして知られる最も多いサブユニットは、それぞれＬＤＨＡ遺伝子及びＬＤＨＢ遺伝子によりコードされている。サブユニット組成物に基づいて５つの異なるアイソザイムが同定されており（４Ｈ、３Ｈ１Ｍ、２Ｈ２Ｍ、１Ｈ３Ｍ、４Ｍ）、これらは類似の酵素活性を示すが動態挙動及び組織分布が異なる。肝臓及び骨格筋の主要なアイソザイムＬＤＨ５は、４Ｍサブユニットを有する。
【００４１】
乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）：本明細書で使用する場合、用語「乳酸デヒドロゲナーゼＡ」又は「ＬＤＨＡ」は、ＬＤＨＡ遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：３９３９）によりコードされているＬＤＨ酵素の単量体を指し、これには、異なるアイソフォームをコードする少なくとも５つのｍＲＮＡ転写変異体（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５５６６．３、ＮＭ＿００１１３５２３９．１、ＮＭ＿００１１６５４１４．１、ＮＭ＿００１１６５４１５．１、及びＮＭ＿００１１６５４１６．１）が存在する。
【００４２】
乳酸デヒドロゲナーゼＢ（ＬＤＨＢ）：本明細書で使用する場合、用語「乳酸デヒドロゲナーゼＢ」又は「ＬＤＨＢ」は、ＬＤＨＢ遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：３９４５）によりコードされているＬＤＨ酵素のモノマーを指し、これには、異なるアイソフォームをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡ転写変異体（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１７４０９７．２及びＮＭ＿００１３１５５３７．１）が存在する。
【００４３】
ループ：本明細書で使用する場合、用語「ループ」は、互いに十分相補的である核酸の２つの逆平行領域により挟み込まれた核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対合領域を指し、従って、適当なハイブリダイゼーション条件下（例えば、リン酸バッファー中、細胞内）で、不対合領域に挟み込まれたこれらの２つの逆平行領域はハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成する。
【００４４】
修飾ヌクレオチド間結合：本明細書で使用する場合、用語「修飾ヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較して１以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しない結合である。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、その修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１以上の望ましい特性を付与する。
【００４５】
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して１以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基及び／又はリン酸基に１以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた１以上の化学部分を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ヌクレオチドは、温度安定性の改善、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などに寄与し得る。
【００４６】
ニックが入ったテトラループ構造：「ニックが入ったテトラループ構造」は、分離したセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖の存在を特徴とし、センス鎖は、アンチセンス鎖と相補的な領域を有し、且つ、これらの鎖のうち少なくとも一方、一般にはセンス鎖がその少なくとも一方の鎖内で形成された隣接するステム領域を安定化するように構成されたテトラループを有する、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造である。
【００４７】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば１００未満のヌクレオチド長の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有しても有さなくてもよい。一連の限定されない例として、オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
【００４８】
オーバーハング：本明細書で使用する場合、用語「オーバーハング」は、一鎖又は一領域がそれとともに二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて延伸する一鎖又は一領域を生じる末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から延伸する１以上の不対合のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖上の３’又は５’オーバーハングである。
【００４９】
リン酸類似体：本明細書で使用する場合、用語「リン酸類似体」は、リン酸基の静電気特性及び／又は立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドの糖の４’−炭素位にリン酸類似体（「４’−リン酸類似体」と呼ばれる）を有する。４’−リン酸類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’−炭素で）に結合されているオキシメチルホスホン酸又はその類似体である。
【００５０】
発現の低減：本明細書で使用する場合、用語遺伝子の「発現の低減」は、適当な参照細胞又は対象と比べた場合の、ある細胞又は対象におけるその遺伝子によりコードされているＲＮＡ転写産物若しくはタンパク質の量の低減及び／又はその遺伝子の活性量の低減を指す。例えば、細胞を二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で処理する行為は、その二本鎖オリゴヌクレオチドで処理されない細胞に比べて、ｍＲＮＡ転写産物、タンパク質及び／又は酵素活性（例えば、ＬＤＨＡ遺伝子によりコード）の量に低減をもたらし得る。同様に、「発現を低減する」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子（例えば、ＬＤＨＡ）の発現の低減をもたらす行為を指す。
【００５１】
相補性領域：本明細書で使用する場合、用語「相補性領域」は、適当なハイブリダイゼーション条件下、例えば、リン酸バッファー中、細胞内などで、２つのヌクレオチド配列間でハイブリダイゼーションを可能とするのに十分に逆平行ヌクレオチド配列と相補的である核酸（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）のヌクレオチド配列を指す。
【００５２】
リボヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「リボヌクレオチド」は、２’位にヒドロキシル基を含有するリボースを五炭糖として有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、２’位以外の原子の１以上の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドであり、リボース、リン酸基又は塩基の修飾又は置換が含まれる。
【００５３】
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有し、そのアンチセンス鎖若しくはアンチセンス鎖の一部が、標的ｍＲＮＡの切断においてアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより用いられる二本鎖オリゴヌクレオチド又は（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有し、そのアンチセンス鎖（若しくはそのアンチセンス鎖の一部）が標的ｍＲＮＡの切断においてＡｇｏ２エンドヌクレアーゼにより用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
【００５４】
鎖：本明細書で使用する場合、用語「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合）を介して相互に連結された単一の連続するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は、２つの遊離末端、例えば、５’末端及び３’末端を有する。
【００５５】
対象：本明細書で使用する場合、用語「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は、「対象」と互換的に使用され得る。
【００５６】
合成：本明細書で使用する場合、用語「合成」は、人工的に合成された（例えば、機械（例えば、固相核酸合成装置）を用いて）又はそうでなければその分子を通常産生する天然源（例えば、細胞又は生物）に由来しない核酸又は他の分子を指す。
【００５７】
標的化リガンド：本明細書で使用する場合、用語「標的化リガンド」は、対象とする組織又は細胞の同族分子（例えば、受容体）に選択的に結合し、且つ、対象とする組織又は細胞に他の物質を標的化する目的で別の物質にコンジュゲートさせることができる分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド又は脂質）を指す。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ＧａｌＮａｃ部分を含む。
【００５８】
テトラループ：本明細書で使用する場合、用語「テトラループ」は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションにより形成された隣接二重鎖の安定性を増すループを指す。安定性の増大は、隣接するステム二重鎖の融解温度（Ｔm）の上昇が、無作為に選択されたヌクレオチド配列からなる同等の長さの一セットのループから平均で予想される隣接するステム二重鎖のＴmよりも高いこととして検出可能である。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基長の二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4中で少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃又は少なくとも７５℃の融解温度を付与し得る。いくつかの実施形態では、テトラループは、相互作用を積み上げることによって隣接するステム二重鎖の塩基対を安定化させ得る。加えて、テトラループ内のヌクレオチド間の相互作用としては、限定されるものではないが、非ワトソン−クリック塩基対合、相互作用の積み上げ、水素結合、及び接触相互作用が含まれる（Ｃｈｅｏｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９０  Ａｕｇ．  １６；  ３４６（６２８５）：６８０−２；  Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｊｕｌ．  １２；  ２５３（５０１６）：１９１−４）。いくつかの実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドを含むか又はからなり、一般には４〜５個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、テトラループは、修飾されていてもされていなくてもよい（例えば、標的化部分とコンジュゲートされていてもされていなくてもよい）３個、４個、５個、又は６個のヌクレオチドを含むか又はからなる。一実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドからなる。標準的なＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ記号は、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ  （１９８５）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：  ３０２１−３０３０に記載されるようなテトラループヌクレオチドを指して使用され得る。例えば、文字「Ｎ」は、いずれの塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用され、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）はその位置にあり得ることを示すために使用され、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）はその位置にあり得ることを示すために使用され得る。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧ  テトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９０  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；  ８７（２１）：８４６７−７１；  Ａｎｔａｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９１  Ｎｏｖ．  １１；  １９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば。ｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。例えば、関連開示に関して本明細書の一部として援用される���ａｋａｎｏら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１  （４８），１４２８１−１４２９２、２００２．  ＳＨＩＮＪＩら  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．  ７８ｔｈ；  ＮＯ．  ２；  ＰＡＧＥ．  ７３１  （２０００）参照。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックが入ったテトラループ構造内に含まれる。
【００５９】
治療：本明細書で使用する場合、用語「治療」は、既存の病態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康及び／若しくは福利を改善する目的で、又は病態の発生を防ぐ若しくはその可能性を低減するために、それを必要とする対象に、例えば対象への治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド）の投与を介して医療を提供する行為を指す。いくつかの実施形態では、治療は、対象が罹患している病態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状又は寄与因子の頻度若しくは重篤度を低減することを含む。
【００６０】
ＩＩ．ＬＤＨＡ発現のオリゴヌクレオチドに基づく阻害剤
ｉ．オリゴヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）を有するガイド（アンチセンス）鎖を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖と二重鎖を形成するセンス鎖が提供される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、その３’末端にステム−ループを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、（例えば、その３’末端に）Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループセットを含み、ここで、Ｓ1はＳ2と相補的であり、且つ、ＬはＳ1とＳ2の間に２〜６ヌクレオチド長の範囲のループを形成する。いくつかの実施形態では、Ｓ1とＳ2の間に形成される二重鎖は４、５、６、７、又は８塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）は、テトラループ（例えば、ニックが入ったテトラループ構造内）である。テトラループは、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及び／又はこれらの組合せを含有し得る。一般に、テトラループは、４〜５個のヌクレオチドを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドを含むか、又はからなり、一般に、４個のヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、テトラループは、３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含むか、又はからなる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列ＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）のセンス鎖を有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）のアンチセンス鎖と配列ＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）のセンス鎖を含む。
【００６２】
ｉｉ．オリゴヌクレオチド修飾
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１以上の好適な修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はリン酸基に修飾を有する。本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾されている。特定の実施形態では、それらのヌクレオチドの半数を超えるものが修飾されている。特定の実施形態では、それらのヌクレオチドの半数未満が修飾されている。
【００６３】
ａ．糖修飾
いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）には、修飾デオキシリボース又はリボース部分が含まれる。いくつかの実施形態では、糖のヌクレオチド修飾は、２’修飾を含む。２’修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、又は２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸であり得る。一般に、修飾は、２’−フルオロ又は２’−Ｏ−メチルである。いくつかの実施形態では、糖の修飾は糖環の修飾を含み、これには糖環の１以上の炭素の修飾を含み得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、下記の位置の１以上が２’−Ｏ−メチルで修飾されている：センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８〜２６、又は３１〜３６位及び／又はアンチセンス鎖の１、６、８、１１〜１３、１５、１７、又は１９〜２２位。特定の実施形態では、センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８〜２６、及び３１〜３６位の全て及び／又はアンチセンス鎖の１、６、８、１１〜１３、１５、１７、及び１９〜２２位の全てが２’−Ｏ−メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、下記の位置の１以上が２’−フルオロで修飾されている：センス鎖の３、５、８〜１１、１３、１５、又は１７及び／又はアンチセンス鎖の２〜５、７、９、１０、１４、１６、又は１８位。特定の実施形態では、センス鎖の３、５、８〜１１、１３、１５、及び１７位の全て及び／又はアンチセンス鎖の２〜５、７、９、１０、１４、１６、及び１８位の全てが２’−フルオロで修飾されている。
【００６５】
いくつかの実施形態では、末端３’末端基（例えば、３’−ヒドロキシル）はリン酸基又は他の基であり、これは、例えば、リンカー、アダプター又は標識を付加するために使用することができる。
【００６６】
ｂ．５’末端リン酸基
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、アルゴノート２との相互作用を増強する。しかしながら、５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素による分解に感受性があり得、これはそれらのｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティを限定することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、このような分解に耐性のある５’リン酸基の類似体を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’−炭素位にリン酸類似体（「４’−リン酸類似体」と呼ばれる）を有する。例えば、２０１７年９月１日出願の「４’−リン酸類似体及びそれを含むオリゴヌクレオチド」という名称の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号参照（そのリン酸類似体に関する内容は本明細書の一部として援用される）。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’−リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分に（例えば、その４’−炭素で）結合されたオキシメチルホスホン酸又はその類似体である。他の実施形態では、４’−リン酸類似体は、チオメチル基の硫黄原子若しくはアミノメチル基の窒素原子が糖部分の４’−炭素に結合されたチオメチルホスホン酸若しくはアミノメチルホスホン酸又はその類似体である。特定の実施形態では、４’−リン酸類似体は、オキシメチルホスホン酸である。
【００６９】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドに結合されたリン酸類似体は、メトキシホスホン酸（ＭＯＰ）である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドに結合されたリン酸類似体は、５’モノメチル保護ＭＯＰである。いくつかの実施形態では、下記のリン酸類似体を含むウリジンヌクレオチドは、例えばガイド（アンチセンス）鎖の第１の位置に使用され得る。
【００７０】
2020536587.tif 000008
【００７１】
式中、修飾ヌクレオチドは、［Ｍｅホスホン酸−４Ｏ−ｍＵ］又は５’−メトキシ、ホスホン酸−４’オキシ−２’−Ｏ−メチルウリジンと呼ばれる。
【００７２】
ｃ．修飾ヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態では、リン酸修飾又は置換は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は少なくとも５つ）の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを生じ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のうち１以上の間にホスホロチオエート結合を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する。
【００７４】
ｉｉｉ．標的化リガンド
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞又は器官の標的化を容易にするため、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするために修飾される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするために修飾され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１以上の標的化リガンドとコンジュゲートされているヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的化リガンドは、１以上のＧａｌＮＡｃ部分である。ＧａｌＮＡｃは、主として肝細胞の類洞側表面で発現され、結合、内部移行、及び続いての末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）のクリアランスに主要な役割を持つアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する高親和性リガンドである。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分の本開示のオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションは、これらのオリゴヌクレオチドをこれらの肝細胞上で発現されるＡＳＧＰＲへ標的化するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価のＧａｌＮａｃ部分に直接又は間接的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１以上の二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされている。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、以下に示されるように、［ａｄｅｍＧ−ＧａｌＮＡｃ］又は２’−アミノジエトキシメタノール−グアニジン−ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、グアニジンヌクレオチドに結合された一価ＧａｌＮａｃを含む。
【００７７】
2020536587.tif 000009
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、以下に示されるように、［ａｄｅｍＡ−ＧａｌＮＡｃ］又は２’−アミノジエトキシメタノール−アデニン−ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドに結合された一価ＧａｌＮａｃを含む。
【００７９】
2020536587.tif 000010
【００８０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２〜４個のヌクレオチドがＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）の２〜４個のヌクレオチドがそれぞれ別のＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端にステム−ループを含んでよく、このループの４個のヌクレオチド全てが個々に一価のＧａｌＮａｃ部分とコンジュゲートされてよい。このようなコンジュゲーションの一例を、５’から３’方向にヌクレオチド配列ＧＡＡＡ（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）に示し、ステム結合点を含むループは下記に示される。このようなループは、例えば、図１Ａに示される分子の２７〜３０位に存在し得る。化学式で、
2020536587.tif 000011
は、オリゴヌクレオチド鎖との結合点である。
【００８１】
2020536587.tif 000012
【００８２】
適当な方法又は化学（例えば、クリックケミストリー）を用いて標的化リガンドをヌクレオチドと連結することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーはより安定である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを用いてヌクレオチドとコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドとコンジュゲートするためにアセタールに基づくリンカーが使用される。アセタールに基づくリンカーは、例えば、２０１６年６月２３日に公開されている国際特許出願公開第ＷＯ２０１６１００４０１  Ａ１号に開示されており、このようなリンカーに関するその内容は本明細書の一部として援用される。
【００８３】
一例を５’から３’方向にヌクレオチドＧＡＡＡを含むループに関して下記に示し、ここで、ＧａｌＮａｃ部分はアセタールリンカーを用いてこのループのヌクレオチドに結合されている。このようなループは、例えば、図１Ａに示される分子の２７〜３０位に存在し得る。化学式で、
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は、オリゴヌクレオチド鎖との結合点である。
【００８４】
2020536587.tif 000014
【００８５】
ＩＩＩ．製剤
本明細書では、オリゴヌクレオチドの使用を容易にするために製剤が提供される。例えば、本明細書では、ＬＤＨＡの発現の低減において使用するためのオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。このような組成物は、対象の標的細胞の周囲環境に又は全身に投与された際にＬＤＨＡ発現を低減するのに十分な量のオリゴヌクレオチドが細胞に入るように適宜調剤することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド製剤は、本明細書に開示されるようにＬＤＨＡの低減のためにオリゴヌクレオチドを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような製剤は、賦形剤を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように調剤される。投与経路の例としては、限定されるものではないが、皮下投与、皮内投与、経粘膜投与、静脈内投与、及び直腸投与が挙げられる。
【００８７】
ＩＶ．使用方法
ｉ．細胞におけるＬＤＨＡ発現の低減
いくつかの実施形態では、細胞においてＬＤＨＡの発現を低減するために有効な量の本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つを細胞に送達するための方法が提供される。本明細書に提供される方法は、いずれの適当な細胞種にも有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＬＤＨＡを発現する任意の細胞である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞はｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにある（すなわち、培養細胞に又は細胞が存在する生物に送達することができる）。特定の実施形態では、肝細胞においてＬＤＨＡの発現を低減するために有効な量の本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つを細胞に送達するための方法が提供される。
【００８８】
阻害の結果は、細胞又は対象の１以上の特性を評価するための適当なアッセイにより、又はＬＤＨＡ発現の指標となる分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質、酵素活性、代謝産物レベル、シュウ酸レベルなど）を評価するための生化学技術により確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドがＬＤＨＡの発現レベルを低減する程度は、発現レベルを（例えば、ＬＤＨＡのｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）を適当な対照（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されなかった又は陰性対照が送達された細胞又は細胞集団におけるＬＤＨＡ発現のレベルと）比較することにより評価される。いくつかの実施形態では、ＬＤＨＡ発現の適当な対照レベルは所定のレベル又は値であってよく、従って、対照レベルは毎回測定する必要はない。所定のレベル又は値は、多様な形態をとることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均値などの単一のカットオフ値であり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドの投与は、細胞におけるＬＤＨＡ発現のレベルに低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ＬＤＨＡ発現のレベルの低減は、ＬＤＨＡの適当な対照レベルに比べて１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、又は９０％以下への低減であり得る。適当な対照レベルは、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドと接触させた細胞又は細胞集団におけるＬＤＨＡ発現のレベルであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従った細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の効果が、ある有限期間の後に評価される。例えば、ＬＤＨＡのレベルは、細胞へのオリゴヌクレオチドの導入の少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間；又は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日後又はそれを超える日数の後に細胞において分析され得る。
【００９０】
ｉｉ．処置方法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対象、例えば、原発性高シュウ酸尿症に罹患している患者において肝臓のシュウ酸産生を低減するために有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、尿のシュウ酸レベルを低減するために有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＰＨ１、ＰＨ２及び／又はＰＨ３を含む原発性高シュウ酸尿症、並びに特発性高シュウ酸尿症を治療するために有用である。よって、本開示の態様は、シュウ酸蓄積の処置のためにＬＤＨＡ発現を低減するための方法に関する。いくつかの態様では、ＰＨ１、ＰＨ２及び／又はＰＨ３を含む原発性高シュウ酸尿症、並びに特発性高シュウ酸尿症を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、これらの方法は、それを必要とする対象に有効量の本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つを投与することを含み得る。このような治療は、例えば、シュウ酸蓄積を減弱する又は停止させるために使用することができる。本開示は、シュウ酸蓄積に関連する疾患又は障害のリスクのある(又はその疾患若しくは障害に感受性のある)対象を処置する予防方法及び治療方法の両方を提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、処置される対象は、例えば肝臓におけるシュウ酸の蓄積の低減から治療上利益を受ける対象である。いくつかの実施形態では、処置される対象は、シュウ酸蓄積、腎疾患、又はＰＨ１、ＰＨ２及び／又はＰＨ３を含む原発性高シュウ酸尿症、並びに特発性高シュウ酸尿症をもたらす病態を有する又は有する疑いのある対象である。
【００９２】
本明細書に記載の方法は一般に、対象に有効量、すなわち、望ましい治療結果をもたらし得る量のオリゴヌクレオチドを投与することを含む。治療上許容される量は、疾患又は障害を治療することができる量であり得る。いずれかの対象に適当な用量は、対象の大きさ、体表面積、齢、投与される特定の組成物、組成物中の有効成分、投与時間及び投与経路、健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む特定の要因によって異なる。一般に、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、静脈内又は皮下投与される。
【００９３】
一連の非限定例としては、本開示のオリゴヌクレオチドは一般に、年に４回（３か月毎に１回）、隔月（２か月毎に１回）、毎月、又は毎週投与される。例えば、オリゴヌクレオチドは、１週間毎、２週間毎、又は３週間毎に投与され得る。オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、毎月投与され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、処置される対象はヒトである。いくつかの実施形態では、処置される対象は、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象（例えば、マウス又はラット）である。いくつかの実施形態では、処置される対象は、ヒトＬＤＨＡ転写産物を発現する（例えば、ＡＡＶ送達発現ベクターから）ように操作された非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象である。
【実施例】
【００９５】
実施例１：  ＬＤＨＡの特異的ノックダウンに有用な特定のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド
配列ＵＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＧＧ（配列番号１）のアンチセンス鎖と配列ＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ（配列番号２）のセンス鎖を有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現をノックダウンするその能力に関して評価した。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドにおいて、下記の位置が２’−Ｏ−メチルで修飾されている（２’−ＯＭｅとして示される）：センス鎖の１、２、４、６、７、１２、１４、１６、１８〜２６、及び３１〜３６位及びアンチセンス鎖の１、６、８、１１〜１３、１５、１７、及び１９〜２２位。下記の位置が２’−フルオロで修飾されている（２’−Ｆとして示される）：センス鎖の３、５、８〜１１、１３、１５、又は１７位及びアンチセンス鎖の２〜５、７、９、１０、１４、１６、及び１８位。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を有する。図１Ｂは、図１Ａに示されるパッセンジャー（センス）鎖の２７〜３０位の化学構造の提示であり、図１Ｃは、同じ分子におけるガイド（アンチセンス）鎖の１位に示される修飾ウリジンの化学構造の提示である。図１Ｃは、図１Ａに示されるガイド（アンチセンス）鎖の１位に示される修飾ウリジンの化学構造の非限定的な提示である。化学式
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は、それに直接結合している部分の立体化学が特定されない一重結合である。
図３は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの化学構造である。この化学構造のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＬＤＨＡ−１とも呼ばれてきた。ＧａｌＮＡｃ糖は、センス鎖上の２７〜３０位を含むヌクレオチドにコンジュゲートされている。健常な雌マウスの肝臓におけるＬＤＨＡ−１によるＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのノックダウンの用量反応性及び持続期間を、ヒトＬＤＨＡ  ＡＡＶマウスモデルを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。ヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡは、ＡＡＶ９ウイルス形質導入を介した甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターの制御下で発現された。マウスモデルを確立するために、４〜６週齢の雌ＣＤ−１マウスに、安定なヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現を生じさせるために、制御された力価のＡＡＶ９ウイルスを静脈内（ＩＶ）投与した。図２Ａは、この評価のタイムラインを示す概略図である。このＡＡＶ注射（１００μＬ中７．５×１０11ゲノムコピーの用量で）を１週間前に行い、単回用量のＬＤＨＡ−１を、１週間後に、示されたように、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０個体のマウス）、１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３０個体のマウス）、３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３０個体のマウス）、又は６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３０個体のマウス）で皮下注射した。１、２、４、６、８、及び１０週間目に、４ｍｍの肝臓生検パンチを採取し、ブロック中、及びｍＲＮＡノックダウン分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で急速凍結させた。
【００９６】
図２Ｂは、図２Ａに記載される試験の結果のサブセットを示すグラフである。残留するｈＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのパーセンテージを、１、３、又は６ｍｇ／ｋｇ用量の投与後週数で示す。これらの結果は、時間を合わせたＰＢＳに対して正規化した（ｎ＝４０個体のマウス）。これらの結果は、ヒトＬＤＨＡを発現する健常なマウスにおいて用量１、３、又は６ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１の単回ＳＣ投与後に、異所的に発現されたＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの急速且つ持続的ノックダウンが達成されたことを示す。
【００９７】
６ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１の単回ＳＣ投与は、投与後１週目にＰＢＳ対照に比べて肝臓におけるヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの発現を９０％低減した（ｐ≦０．０５）。ヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの用量依存的低減は、単回投与後４週間持続した。ＬＤＨＡの発現は、単回投与後６週目に回復した。
【００９８】
３ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１の単回ＳＣ投与は、投与後１週目にＰＢＳ対照に比べて肝臓におけるヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの発現を６３％低減した。このヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのノックダウンの程度は、単回投与後４週間一定を維持し、単回投与後６週目にベースラインのＬＤＨＡ発現が回復した。
【００９９】
１ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１の単回ＳＣ投与は、投与後１週目にＰＢＳ対照に比べて肝臓におけるヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの発現を５０％低減した。このヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡのノックダウンの程度は、投与後４週間４５％ノックダウンで持続した。ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの発現は、単回投与後６週間までにベースラインに戻った。
【０１００】
実施例１の材料及び方法
動物：  雌ＣＤ−１マウス、（出生日２０１６年８月９日、受領日２０１６年９月１３日）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（キングストン、ＮＹ、系統コード０２２）から購入した。マウスは投与開始前に少なくとも３日間馴化させた。マウスは特定病原体感染防止飼育条件下で維持し、実験動物用飼料と水を自由摂取させた。
【０１０１】
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドＬＤＨＡ−１：  無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、ＧａｌＮＡｃ官能基を有する二本鎖の二重鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。これらのオリゴヌクレオチドを−２０℃で保存した。使用前に、これらのオリゴヌクレオチドを解凍し、十分に混合し（穏やかにボルテックスにかけ）、次いで、少なくとも３０分間室温となるように平衡化した。
【０１０２】
ＲＴ−ｑＰＣＲによるＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの測定：  およそ５０ｍｇのサンプルをＴｉｕｓｓｕｅｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を用い、０．７５ｍＬのフェノール／グアニジン系ＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）中でホモジナイズした。このホモジネートを１−ブロモ−３−クロロプロパン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）で抽出した。製造者の説明書に従ってＭａｇＭａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）を用い、０．２ｍｌの水相からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの分光測定を用いて定量した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、ＩＡ）からのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ並びにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、ＭＡ）及びＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ハーキュリーズ、ＣＡ）からの試薬を用いてＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルを測定し、ＡＡ  Ｖ９プラスミドレベルに対して正規化した。ＬＤＨＡ−１処置群のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの低減の程度は、同日のＰＢＳ対照群の平均発現レベルに対する発現のパーセント（ＤＮＡのｑＰＣＲにより決定されたＡＡＶ９プラスミドコピー数に対して正規化）として計算し、ここで、ＰＢＳ対照群のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現を１００％とした。グラフをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを解析した。ＬＤＨＡ−１処置群のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベル（ＡＡＶ９コピー数に対して正規化）を同時点でのＰＢＳ対照群と比較するために、ダネットの多重比較検定を用いる一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。
【０１０３】
実施例２：  幼若及び若成体カニクイザルにおけるＬＤＨＡ−１標的化ＬＤＨＡの毒性及びトキシコキネティクス
５週間反復皮下投与毒性及びトキシコキネティクス試験を、３０、１００、又は３００ｍｇ／ｋｇの実施例１に記載のＬＤＨＡ−１の皮下投与を２回施した幼若及び若成体カニクイザルにおけるＬＤＨＡ標的化オリゴヌクレオチドの効果を示すように設計した（図３も参照）。雄及び雌の幼若及び若成体カニクイザルに、１日目及び２９日目に０（１日目に無菌注射用水、ＳＷＦＩ、２９日目に無菌生理食塩水）、３０、１００、又は３００ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１の皮下（ＳＣ）注射を施した。計画屠殺(terminal sacrifice) （３１日目）及び回復後屠殺（recovery sacrifice)（５７日目）時に、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルの分析、ウエスタン分析によるＬＤＨタンパク質レベルの分析、及び酵素アッセイによるＬＤＨ活性の分析のために肝組織を採取した。
【０１０４】
研究計画を表１に示す。肝組織を計画屠殺（３１日目）及び回復後屠殺（５７日目）時にカニクイザルから採取し、ウエスタンブロット及びＬＤＨ活性アッセイのために液体窒素中で急速凍結するか、又はＲＴ−ｑＰＣＲ分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ中でインキュベートし、凍結させた。
【０１０５】
３０、１００、又は３００ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１を２回投与した後に、サルのＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現、ＬＤＨタンパク質濃度、及びＬＤＨ活性は全て、明らかな用量反応性は認められず全ての用量レベルで３１日目の計画屠殺時に有意に低減していた（ｐ≦０．０００１）。同様の所見が５７日目の回復後屠殺時にも見られ（示されたようにｐ＜０．０００１、ｐ≦０．００１、ｐ≦０．０１、統計的有意性は対応のないｔ検定を用いて計算）；ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ、ＬＤＨ  タンパク質、及びＬＤＨ活性のノックダウンの回復は見られなかった（図４）。ウエスタンブロットにより測定した場合の肝臓ＬＤＨタンパク質レベルに対する用量の効果を図５に示す。ＬＤＨタンパク質レベルは、計画屠殺時（３１日目）及び回復後屠殺時（５７日目）の両方で、全ての用量レベルで顕著に低減していた。
【０１０６】
この結果は、３１日目に、ＬＤＨＡ−１は、明らかな用量反応性なく、全ての用量レベルで、対照に比べてサルのＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現、ＬＤＨタンパク質濃度、及びＬＤＨ活性の低減に強力な活性を示すことを示した。この低減は、標的ノックダウンの回復の兆候なく５７日目まで持続した。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
加えて、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルの低減を評価するため、及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(RNA-induced silencing complex)（ＲＩＳＣ）に組み込まれたＬＤＨＡ−１の濃度を定量するために、ＬＤＨＡ標的化オリゴヌクレオチドの３９週間反復皮下投与毒性及びトキシコキネティクス試験を、３０、１００、又は３００ｍｇ／ｋｇの実施例１に記載のＬＤＨＡ−１のＳＣ投与を１０回施した幼若及び若成体カニクイザルで実施した。試験１日目、２９日目、５７日目、８５日目、１１３日目、１４１日目、１６９日目、１９７日目、２２５日目、及び２５３日目に、幼若なサルには、０（生理食塩水）、３０、１００、又は３００ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１の皮下（ＳＣ）注射を施し、若成体のサルには、０（生理食塩水）又は３００ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−１のＳＣ注射を施した。ＲＴ−ｑＰＣＲによるＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルの分析のために、計画屠殺時（２５５日目、最終投与の２日後）及び回復後屠殺（３０９日目、最終投与の８週間後）に肝組織を採取した。また、２５５日目に採取した肝臓サンプルを用い、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、アルゴノートタンパク質２（Ａｇｏ２）免疫沈降とその後のステム−ループ（ＳＬ）−ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定されるＬＤＨＡ−１の濃度を定量した。
【０１０９】
投与期間の終了時（２５５日目）に、ＬＤＨＡ−１の強力な薬力学的活性が明らかであった。サルのＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現は、全ての用量レベルで低減された（９１．４％から８６．１％への低減、Ｐ≦０．０００１）。ＲＩＳＣ複合体に積載されたＬＤＨＡ−１の濃度には用量依存性があり、３０ｍｇ／ｋｇ（２．１ｎｇ／ｇ）に比べて３００ｍｇ／ｋｇ（５．６ｎｇ／ｇ）の用量レベルで有意に高い濃度であった（Ｐ≦０．０５）。ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現の有意な低減（９２．０％から８６．２％へ）により示されるＬＤＨＡ−１の薬力学的効果は、回復が見られることなく投与後少なくとも８週間持続した（図６）。３０９日目のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ低減の判定は、薬力学的回復の評価としては十分であると思われ、よって、３０９日目にＲＩＳＣ複合体に積載されたＬＤＨＡ−１の濃度は評価しなかった。
【０１１０】
試験２５５日目にＲＩＳＣに組み込まれたＬＤＨＡ−１の定量を図７に報告する。各用量群の平均値±ＳＤのグラフ。２５５日目に、肝臓においてＲＩＳＣに組み込まれたＬＤＨＡ−１濃度は、用量が増すとともに増加した。ＬＤＨＡ−１濃度は、３０ｍｇ／ｋｇ用量に比べて３００ｍｇ／ｋｇ用量で有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。ＲＩＳＣ複合体に組み込まれたＬＤＨＡ−１の濃度は、３００ｍｇ／ｋｇを投与した幼若なサルと若成体のサルの間で同等であった。
【０１１１】
投与期間の終了時（２５５日目）に、ＬＤＨＡ−１の強力な薬力学的活性が明らかであった。サルのＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現は、全ての用量レベルで対照に比べて低減していた。これに対して、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれたＬＤＨＡ−１の濃度には用量依存性があり、３０ｍｇ／ｋｇに比べて３００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで有意に高い濃度であった。ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの低減により測定されるＬＤＨＡ−１の薬力学的効果は、回復の兆候なく３０９日目（投与後８週間）まで持続した。
【０１１２】
実施例２の材料及び方法
ＲＴ−ｑＰＣＲによるＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの測定：  およそ５０ｍｇの各サンプルをＴｉｕｓｓｕｅｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を用い、０．７５ｍＬのフェノール／グアニジン系ＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）中でホモジナイズした。このホモジネートを１−ブロモ−３−クロロプロパン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）で抽出した。製造者の説明書に従ってＭａｇＭａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）を用い、０．２ｍｌの水相からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの分光測定を用いて定量した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、ＭＡ）からのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ及び試薬を用いてＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルを測定し、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。ＬＤＨＡ−１処置群のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの低減の程度は、同日の対照群の平均発現レベルに対する発現のパーセント（ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化）として計算し、ここで、対照群のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ発現を１００％とした。
【０１１３】
ＬＤＨのウエスタンブロット：  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）をＴ−ＰＥＲ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）とともに用いて組織ライゼートを調製した。総タンパク質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）によって測定し、等しいタンパク質濃度をＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）によって分離した。電気泳動タンパク質を、ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）を用いてニトロセルロース膜に転写し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ）でブロッキングした。次に、膜をウサギ抗ＬＤＨＡ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバース、ＭＡ）及びマウス抗グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ抗体（Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）とともにインキュベートした。抗ウサギＩＲＤｙｅ  ６８０及び抗マウスＩＲＤｙｅ  ８００二次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ）を検出に使用し、シグナル強度を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ）を用いて測定した。積分強度（シグナルの大きさとそれが分布する領域の尺度）を各バンドについて測定した。「平均値又は中央値バックグラウンド」法を用いてノイズシグナルを補正した。ＬＤＨＡ−１処置群のＬＤＨタンパク質の低減の程度は、同日の対照群の平均発現レベルに対する発現のパーセント（ＧＡＰＤＨタンパク質レベルに対して正規化）として計算し、ここで、対照群のＬＤＨＡタンパク質発現を１００％とした。
【０１１４】
ＬＤＨ活性アッセイ：  第６．２．２節のＬＤＨウエスタンブロットに関して調製された組織抽出物の正規化タンパク質濃度を、製造者の説明書に従ってＬａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｂｅａｍ、Ｉｎｃ．、ケンブリッジ、ＭＡ）を用いてＬＤＨ活性に関して評価した。簡単に述べれば、組織抽出物をＴ−ＰＥＲ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いで、１０μＬのサンプルを４０μＬのＬＤＨアッセイバッファー中に加えることにより、９６ウェルプレート中に二反復の５倍希釈を行った。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及びＬＤＨ陽性対照の一連の標準溶液を製造者の説明書に従って調製した。このプレートを混合し、遮光し、３０分間室温でインキュベートした。反応混合物を添加した時点及び３０分後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＭＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、ＣＡ）を用いて４５０ナノメーターでの吸光度を測定した。ＬＤＨＡ−１処置群のＬＤＨ活性の低減の程度は、同日の対照群の平均活性レベルに対する活性のパーセントとして計算し、ここで、対照群のＬＤＨ活性を１００％とした。
【０１１５】
Ｓｌ−ＲＴ−ｑＰＣＲを用いたＡｇｏ２会合オリゴヌクレオチドの測定：  急速凍結サル肝臓サンプルからのＡｇｏ２タンパク質の免疫沈降を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを用いて行った。サンプル中のＡｇｏ２タンパク質を単離した後、研究に基づくＳＬ−ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いて、Ａｇｏ２複合体と会合したＬＤＨＡ−１の濃度を定量した。免疫沈降におけるサンプル間の変動を制御するために、Ａｇｏ２複合体に積載されている内因性のマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１６を正規化因子として使用した。手順の詳細はＡｐｐｅｎｄｉｘ  １０．２に示されている。ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの低減が飽和している高用量でのＲＩＳＣ積載ＬＤＨＡ−１の用量比例性に関する情報を得るために、２５５日目のサンプルのみ分析した。薬力学的回復の評価のためには、３０９日目のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの低減の判定で十分であると思われた。
【０１１６】
データ解析：  グラフをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを解析した。ＬＤＨＡ−１処置群のＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベル（ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化）、ＬＤＨタンパク質レベル（ＧＡＰＤＨタンパク質レベルに対して正規化）、及びＬＤＨ活性レベルを同時点でのＰＢＳ対照群と比較するために、ダネットの多重比較検定を用いる一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。ＲＩＳＣに組み込まれたＬＤＨＡ−１の濃度をα＝０．０５で比較するために、多重比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。ｍｉＲ−１６正規化ＬＤＨＡ−に関する個々の動物データについてＲＯＵＴ外れ値分析を行い、１つの外れ値を特定し、全ての分析から除外した。
【０１１７】
実施例３：  ヒト試験における原発性高シュウ酸尿症の治療におけるＲＮＡｉオリゴヌクレオチド標的化ＬＤＨＡに関する概念実証
本試験の目的は、実施例１のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドＬＤＨＡ−１の単回投与漸増試験のヒトにおける安全性、忍容性、薬物動態学、及び薬力学を評価することであった。副次評価項目には、スクリーニング中２回の２４時間採取物の平均値として定義される２４時間尿中シュウ酸排泄のベースラインからの変化を評価することを含んだ。本試験は２群に分かれた。
【０１１８】
Ａ群は、英国の単一施設において登録された２５名の健常ボランティア（ＮＨＶ）におけるプラセボ対照一重盲検第１相試験として計画された。Ｂ群は、１．５、３、及び６ｍｇ／ｋｇの投与を受けた３コホートのＰＨ１患者、並びにフレキシブルな投与を受けた第４のＰＨ２のみのコホートを含む、１６名のＰＨ患者における、フレキシブルな用量での、実施例１に記載のＬＤＨＡ−１オリゴヌクレオチドの非盲検多施設共同試験として計画された。Ｂ群の患者は欧州連合（ＥＵ）の５施設及び米国の１施設で登録されていた。
【０１１９】
第１のＢ群コホート（１．５ｍｇ／ｋｇ）では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの単回投与後の初期の結果は、４名の成人患者のうち３名が４３〜５７日目に既に尿中シュウ酸が正常付近の濃度（≦６０ｍｍｏｌ／２４時間）に達していたことを示した。ベースラインの尿中シュウ酸レベルが２．２８ｍｍｏｌ／２４時間であった４人目の成人は実質的低減を示し、７１日以降の観察ではその患者にとって有意な低減を示した（尿中シュウ酸（ＵＯＸ）＜１．０ｍｍｏｌ／２４時間）。これらの結果を図８Ａ及び８Ｂにまとめる。
【０１２０】
第２のＢ群コホート（３ｍｇ／ｋｇ）では、４名の成人患者のうち２名が２９〜４３日目に既に正常な尿中シュウ酸濃度（≦０．４６ｍｍｏｌ／２４時間）に達していた。他の患者も両人とも実質的なシュウ酸低減を示した。この群の１名の患者は血漿シュウ酸レベルの上昇を示した。しかしながらやはり、ＬＤＨＡ−１による処置中に、血漿シュウ酸は正常レベルにまで低減した。これらの結果を図８Ａ及び８Ｂにまとめる。
【０１２１】
第４のＢ群コホートの１名の成人ＰＨ２患者も、サンプル採取日の少なくとも１日目（５７日目）に２４時間尿中シュウ酸排泄の実質的（３５％を超える）低減を受けていた。
【０１２２】
更に、軽度〜中等度の注射部位反応が３件のみ見られた。全て一過性のもので（＜７２時間）、介入なく消散した。
【０１２３】
要約すると、ＬＤＨＡ−１の投与は、評価された８名の１型及び２型原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１及びＰＨ２）患者の大多数で、尿中シュウ酸レベルを正常範囲（２４時間排泄≦０．４６ｍｍｏｌと定義）又は正常付近範囲（２４時間排泄≦０．６ｍｍｏｌと定義）とした。評価された患者は全員、尿中シュウ酸に実質的及び臨床上有意な低減（ベースラインに比べて＞３０％の低減と定義）を受けていた。評価される患者は、６週目又は４３日目までデータが入手可能な患者である。評価される全ての患者は成人であり、７名のＰＨ１患者と１名のＰＨ２患者を含む。
【０１２４】
これらの上記データは、ヒトにおける実施例１のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドＬＤＨＡ−１の臨床概念実証をなし、ＬＤＨＡ−１が安全であり且つ十分に忍容されることも示す。これらの結果は、単回用量の投与後の効力及び作用の持続を実証し、対象への３か月毎の投与と一致し、それを裏づけるものである。
【０１２５】
作用持続期間と合わせて、この尿中シュウ酸の低減の大きさにより、肝臓のシュウ酸産生の最終段階に関与する乳酸デヒドロゲナーゼの治療的標的化の有効性が確認される。この作用機序に基づけば、ＬＤＨＡ−１は、全てのタイプの原発性高シュウ酸尿症の治療に使用することができる。尿中シュウ酸の実質的低減により、このプラットフォームはヒトにおいて標的遺伝子発現を有効に低減することができること、及び複数の形態の原発性高シュウ酸尿症を治療するためのこのようなＲＮＡｉ治療薬の使用が確立される。
【０１２６】
実施例３の材料及び方法
ＬＤＨＡ−１の分子構造（実施例１、図１Ａ及び図３も参照）
【０１２７】
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【０１２８】
医薬開発
薬剤製品は、ＳＣ投与用のＷＦＩ（注射用水）中の溶液としての、ＬＤＨＡ−１からなる無菌液体薬剤製品であった。使用製剤（ｐＨ６．２〜８．２のＷＦＩ中１７０ｍｇ／ｍｌ濃度のＬＤＨＡ−１）は、ｐＨ、モル浸透圧濃度（２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）、粘度、及び投与経路との適合性に基づいて選択された。
【０１２９】
診断及び選択／除外基準
Ａ群の選択基準：
１．被験者は、潜在リスク及び副作用を含むその試験のあらゆる性質及び目的を理解していなければならず、全ての試験手順及び制限に応じる意志と能力がある。
２．１８〜５５歳（両端値を含む）の男性又は女性被験者。
３．被験者は体格指数（ＢＭＩ）１９．０〜３２Ｋｇ／ｍ２（両端値を含む）でなければならなかった。
４．非喫煙者、少なくとも１か月禁煙、及びＥＯＳ中は禁煙を続ける意志がある。また、被験者はニコチン含有製品（例えば、ニコチンパッチ）を断っていなければならない。
５．被験者はそれ以外の点では健康でなければならなかった。健康な状態は、詳細な医療歴及び手術歴、バイタルサイン、１２誘導ＥＣＧ、血液学、血液検査、血清学、及び検尿を含む全身の身体検査の後に、ＰＩの見解に基づいて、臨床上有意な、活動性の、又は慢性の疾患のエビデンスがないことにより定義された。
６．被験者は、治験責任医師又は適格な被指名人により異常性が臨床上有意でない(Not Clinically Significant)（ＮＣＳ）と分類されない限り、正常範囲内の血液学及び臨床化学検査及び尿分析を有さなければならなかった。肝パネル検査（ＡＬＴ及びＡＳＴ）は正常でなければならなかった。肝パネルの結果に関しては再検査を１回行うことができた。
７．子供を持つ可能性のある女性及び男性並びに男性被験者の女性パートナーは、インフォームドコンセント日からＩＭＰの最終投与後１２週まで有効性が高く且つ承認された避妊法を使用する意志がなければならなかった。有効性の高い避妊法は、下記のうち少なくとも１つを満たすと定義された：
ａ．厳格な節制：これが患者の好ましい及び通常のライフスタイルに即していた場合。［周期的禁欲（例えば、カレンダー法、排卵法、徴候体温法、胚卵後法）及び離脱は許容される避妊法ではなかった］。
ｂ．外科的避妊（下記の外科術のうち１つを受けていること：子宮摘出、両側卵管結紮、両側卵巣摘出、又は両側卵管切除）且つ避妊後少なくとも６週間。
ｃ．スクリーニング来院前少なくとも１か月間、安定用量での併用ホルモン経口避妊薬（エストロゲン及びプロゲステロン）、インプラント、又は注射避妊薬とバリア法。併用ホルモン避妊は、排卵抑制に関連している場合に限り、有効性の高い避妊法と見なされた。排卵抑制に関連したものである場合、プロゲステロン単独ホルモン避妊法も、有効性の高い避妊法と見なされる。
ｄ．子宮内避妊具とコンドーム。スクリーニング来院の少なくとも１か月前に挿入されたホルモン子宮内避妊具（ＩＵＤ）。
ｅ．二重バリア法［例えば、殺精子フォーム／ゲル／フィルム／クリーム／坐剤付きのコンドーム及び閉塞キャップ（ダイアフラム又は子宮頸管キャップ／膣円蓋キャップ）］。注、女性用コンドームと男性用コンドーム、又は２つの男性用コンドームは、その２者間の摩擦がどちらかの製品の不具合を生じ得るので、一緒に用いてはならなかった。
ｆ．スクリーニング来院前にパートナーが精管切除（術後少なくとも６か月）。
８．閉経後の女性：スクリーニング前１２か月無月経、且つスクリーニング来院時に血清ＦＳＨ＞２６ＩＵ／Ｌと定義。
９．女性：スクリーニング時及び０日目の来院時に妊娠検査が陰性。
【０１３０】
Ｂ群−ＰＨ患者選択基準
ＰＨ患者は、本試験への参加が適格となるためには下記の基準を全て満たさなければならなかった。
１．患者及び／又は患者が未成年（＜１８歳未満の患者、又は地域条例に従って成年年齢に満たないと定義）である場合には患者の親又は保護者が、
ａ．潜在リスク及び副作用を含むその試験のあらゆる性質及び目的を理解していなければならなかった。
ｂ．２４時間尿サンプルの採取を含む全ての試験手順に応じる意志と能力がなければならなかった。
ｃ．インフォームドコンセントを提出しなければならなかった。青年（１２〜１８歳未満、又は１２歳を超え、地方条例に成年年齢未満）は、参加の同意書を提出することができなければならなかった。１２歳未満の小児については、同意は地域条例に基づいた。
２．インフォームドコンセントを得る時点で少なくとも６歳の男性又は女性。
３．患者は最低２５Ｋｇの体重を持たなければならなかった。
４．遺伝子型判定（履歴として入手可能な遺伝子型情報は試験の適格性に許容される）により確認されたＰＨ１又はＰＨ２の確定診断。
５．スクリーニング期間に行った２回の評価の少なくとも１回で、２４時間尿シュウ酸排泄が、１８歳以上の患者では≧０．７ｍｍｏｌ、又は１８歳未満の患者では１．７３ｍ２体表面積（ＢＳＡ）当たり≧０．７ｍｍｏｌ、なお、両方のシュウ酸測定値間の変動が３０％未満。
６．成人（年齢≧１８歳）ではＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＤＲＤ）式、又は６〜１８歳未満の患者ではシュワルツの式を用いて計算し、１．７３ｍ２  ＢＳＡに対して正規化した場合にｅＧＦＲ≧３０ｍＬ／分。
７．子供を持つ可能性のある男性、女性患者、及び子供を持つ可能性のある男性患者の女性パートナーは、インフォームドコンセント日からＩＭＰの最終投与後１２週まで有効性が高く且つ承認された避妊法を使用する意志がなければならなかった。有効性の高い避妊法は、下記のうち少なくとも１つを満たすと定義された：
ａ．厳格な節制：これが患者の好ましい及び通常のライフスタイルに即していた場合。［周期的禁欲（例えば、カレンダー法、排卵法、徴候体温法、胚卵後法）及び離脱は許容される避妊法ではなかった］。
ｂ．外科的避妊（下記の外科術のうち１つを受けていること：子宮摘出、両側卵管結紮、両側卵巣摘出、又は両側卵管切除）且つ避妊後少なくとも６週間。
ｃ．スクリーニング来院前少なくとも１か月間、安定な用量での併用ホルモン経口避妊薬（エストロゲン及びプロゲステロン）、移植、又は注射避妊薬とバリア法。併用ホルモン避妊は、排卵抑制に関連している場合に限り、有効性の高い避妊法と見なされた。排卵抑制に関連したものである場合、プロゲステロン単独ホルモンの避妊も、有効性の高い避妊法と見なされた。
ｄ．子宮内避妊具とコンドーム。ホルモン子宮内避妊具（ＩＵＤ）はスクリーニング来院の少なくとも１か月前に挿入。
ｅ．二重バリア法［例えば、殺精子フォーム／ゲル／フィルム／クリーム／坐剤付きのコンドーム及び閉塞キャップ（ダイアフラム又は子宮頸管キャップ／膣円蓋キャップ）］。注、女性用コンドームと男性用コンドーム、又は２つの男性用コンドームは、その２者間の摩擦どちらかの製品の不具合を生じ得るので、一緒に用いてはならなかった。
ｆ．スクリーニング来院前にパートナーが精管切除（術後少なくとも６か月）。
８．閉経後の女性：スクリーニング前１２か月無月経、且つスクリーニング時に血清ＦＳＨ＞２６ＩＵ／Ｌと定義。
９．ＷＯＣＰについては、スクリーニング時及び０日目に妊娠検査が陰性。
１０．試験登録の少なくとも４週間前に安定用量でピリドキシンを受容しているＰＨ１患者は、試験中、同じ安定用量を維持する意志がなければならなかった。万一、ＰＨ２患者がピリドキシンを受容していた場合には、試験登録の少なくとも４週間前にこれを中断しなければならなかった。
【０１３１】
Ａ群−ＮＨＶ除外基準
下記の基準のいずれかを満たす健常ボランティアは本試験から除外した：
１．試験のコンプライアンス若しくはデータの解釈に干渉する又は限定されるものではないが下記を含む被験者の安全性に影響を及ぼす可能性のある医学的状態又は共存症の存在：
ａ．重篤な介在疾患
ｂ．投与前３０日以内からＥＯＳ来院までに定期予防接種
ｃ．既知の原因の活動性肝疾患／傷害又はトランスアミナーゼの上昇（例えば、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患／脂肪性肝炎（ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ））
ｄ．過度のアルコール摂取に関する医師の懸念
ｅ．１日３グラムを超えるパラセタモールの定期使用又は慢性使用。
２．腎臓結石の病歴
３．本試験中又はＩＭＰの最終投与後９０日以内に、妊娠していた、授乳していた、又は妊娠を試みようとしていた女性。
４．本試験中又はＩＭＰの最終投与後９０日以内に妊娠を試みようとしていた女性パートナーがいる男性。
５．試験投薬の初回投与前９０日以内のいずれかの治験薬の使用。被験者が過去にｓｉＲＮＡ又は抗体試験に参加していた場合には、本試験で初回用量が投与される前に少なくとも６か月の休薬期間が必要とされた。
６．用量投与前４８時間（２日）以内からＥＯＳ来院又は２９日目までの激しい活動、日光浴、及び接触スポーツ。
７．臨床研究センターで投与前９０日以内に４５０ｍＬを超える献血歴又はＩＭＰ受容後３０日未満に献血の予定。
８．投与７日以内及び全試験を通じて血漿又は血小板の提供。
９．治験責任医師により決定された場合、週に男性で２１単位、女性で１４単位を超えるアルコール摂取の履歴。アルコール摂取は臨床施設への入院の４８時間前から試験の終了まで禁止された。
１０．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体、又は抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１及び２抗体に関するスクリーニング検査が陽性。被験者が過去３か月以内に検査されている場合には、履歴データが使用可能であった。
１１．オリゴヌクレオチドに基づく療法に対する下記反応のうち１以上の履歴。
ａ．重度の血小板減少症
ｂ．肝毒性
ｃ．療法の中断に至る重度の風邪様症状
ｄ．療法の中断に至る注射からの局部的皮膚反応（グレード３以上）
ｅ．血液凝固障害／臨床上重要な凝固時間の延長
【０１３２】
他の制限：
全ての定期的な非局所的投薬及び非定期的投薬（ＯＴＣ（ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｃｏｕｎｔｅｒ）投薬、健康補助食品、及びセントジョーンズワート抽出物などの植物薬の慢性投与）は、臨床研究センターへの入院の少なくとも１４日前からＥＯＳ来院（含む）にかけて停止されなければならなかった。パラセタモール（アセトアミノフェン）は例外とされ、これは臨床研究センターへの入院まで許容された。しかしながら、イブプロフェン、アスピリン、ナプロキセンなどのＮＳＡＩＤは、臨床研究センターへの入院の少なくとも１４日前に停止されなければならなかった。被験者は試験参加中（すなわち、スクリーニングからＥＯＳ来院まで）、激しい運動を行ってはならなかった。試験中、被験者は、シュウ酸が多く含まれる食品を避け、国の食事指針を超えない適量のタンパク質及びカルシウムを摂取する必要があった。プロテインシェークは避けなければならなかった。
【０１３３】
Ｂ群−ＰＨ患者除外基準
下記の基準のいずれかを満たすＰＨ患者は本試験から除外した：
１．過去の腎移植及び／又は肝移植。
２．その時、透析を受けている。
３．全身シュウ酸症の臨床像の確定エビデンス。
４．登録前４か月以内にいずれかの臨床試験に参加し、そこで治験医薬品を受容した。Ｕｏｘ及び／又は血漿シュウ酸を低減する可能性を有するＩＭＰでは、これらの濃度が履歴ベースラインレベルに戻らなければならなかった。
ａ．患者が本試験の以前のコホートに参加していた場合には、再登録前に最低８週間経過しなければならず、尿中シュウ酸排泄がベースラインの≧８０％まで戻らなければならなかった。
５．試験のコンプライアンス若しくはデータの解釈に干渉する又は限定されるものではないが下記を含む患者の安全性に影響を及ぼす可能性のある医学的状態又は共存症の存在：
ａ．重篤な介在疾患
ｂ．投与前３０日以内からＥＯＳ来院までに定期予防接種
ｃ．既知の原因の活動性肝疾患／傷害又はトランスアミナーゼの上昇（例えば、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患／脂肪性肝炎（ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ））
ｄ．過度のアルコール摂取に関する医師の懸念
ｅ．１日３グラムを超えるアセトアミノフェンの定期使用又は慢性使用。
６．治験責任医師により決定された場合、週に男性で２１単位、女性で１４単位を超えるアルコール摂取の履歴。
７．本試験中又はＩＭＰの最終投与後９０日以内に、妊娠している、授乳している、又は妊娠を試みようとする女性。
８．肝機能検査（ＬＦＴ）の異常：ＡＬＴ及び／又はＡＳＴが年齢及び性別ごとのＵＬＮの１．５倍を超える。
９．オリゴヌクレオチドに基づく療法に対する下記反応のうち１以上の履歴。
ａ．重度の血小板減少症
ｂ．肝毒性
ｃ．療法の中断に至る重度の風邪様症状
ｄ．療法の中断に至る注射からの局部的皮膚反応（グレード３以上）
ｅ．血液凝固障害／臨床上重要な凝固時間の延長
【０１３４】
他の制限：
患者はまた、２４時間尿検体採取前２４時間及び採取中並びにＰＤ血液採取前２４時間、ビタミンＣ摂取を避けなければならなかった。患者は試験参加中（すなわち、スクリーニングからＥＯＳ来院まで）、激しい運動を行ってはならなかった。試験中、患者は、シュウ酸が多く含まれる食品を避け、国の食事指針を超えない適量のタンパク質及びカルシウムを摂取する必要があった。プロテインシェークは避けなければならなかった。
【０１３５】
尿中シュウ酸（ＵＯＸ）レベルの測定
２４時間尿サンプルを患者から取得し、アリコートを、シュウ酸の溶解度を高めるために酸性化した。一般に、シュウ酸は不溶性であり、酸性条件下で可溶化され得る結晶を形成する。次に、可溶化されたＵＯＸに対して、そのレベルを決定するためにＨＰＬＣ分析を行った。
【０１３６】
本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書には具体的に開示されない１又は複数の要素、１又は複数の制限の不在下で適宜実施することができる。よって、例えば、本明細書で各場合において、「を含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、示され記載される特徴又はその一部のいずれの等価物も排除する意図はなく、本特許請求される本発明の範囲内で種々の修飾が可能であることが認識される。よって、本発明を好ましい実施形態、任意選択の特徴により具体的に開示してきたが、本明細書に開示される概念の修飾及び変形は当業者により再分類することができ、このような修飾及び変形は、本明細書及び添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられると理解されるべきである。
【０１３７】
加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群又は選択肢の他の分類に関して記載される場合、当業者は、本発明がそれによりマーカッシュ群又は他の群の個々の要素又は要素のサブグループによっても記載されることを認識するであろう。
【０１３８】
本発明を記載する文脈において（特に下記の特許請求の範囲に関して）、用語「１つの(a)」及び「１つの(an)」及び「その(the)」及び類似の指示対象の使用は、本明細書で特に断りのない限り又は文脈によりそうではないことが明示されない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「を含む(comprising)」、「を有する(having)」、「を含む(including)」及び「を含有する(containing)」は、そうではないことが述べられない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「限定されるものではないが、含む」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書において値の範囲の列挙は、単に、本明細書で特に断りのない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に示す省略法として用いることが意図されるにすぎず、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されている場合と同じく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で特に断りのない限り又は文脈によりそうではないことが明示されない限り、好適ないずれの順序で実施することもできる。本明細書に示されるいずれかの、又は全ての例、又は例示の文言（例えば、「など」）は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図するにすぎず、別段の主張がない限り、本発明の範囲に限定を示すものではない。本明細書中の文言に、本発明の実施に不可欠として特許請求されない要素を示すと解釈されるべきものはない。
【０１３９】
本発明の実施形態は、本発明を実施するために本発明者らに既知の最良の実施態様を含めて本明細書に記載される。それらの実施形態の変形も、以上の記載を読めば当業者には明らかとなり得る。
【０１４０】
本発明者らは、当業者がこのような変形形態を必要に応じて使用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施されることを意図する。よって、本発明は、適用法が許す限り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題のあらゆる修飾及び等価物を含む。更に、そのあらゆる可能性のある変形形態での上記要素のいずれの組合せも、本明細書で特に断りのない限り又は文脈によりそうではないことが明示されない限り、本発明により包含される。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、又は慣例の実験だけを用いて確認することができる。このような等価物は下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020536587.tif 000024
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020536587.tif 000027
【図３−１】
2020536587.tif 000028
【図３−２】
2020536587.tif 000029
【図３−３】
2020536587.tif 000030
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020536587.tif 000038
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