(57)【要約】レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示されている。レンチウイルスベクター系は、治療用ベクターを含む。レンチウイルスベクター系は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患した被験体の細胞中でのＰＡＨ発現を上方制御するためのレンチウイルス粒子を産生する。一局面において、治療用カーゴ部分を含むウイルスベクターが提供され、上記治療用カーゴ部分が、ＰＡＨ配列またはその改変体と；プロモーターと；肝臓特異的エンハンサーと、を含み、上記ＰＡＨ配列またはその改変体が、上記プロモーターおよび上記肝臓特異的エンハンサーの両方によって作動的に調節される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用カーゴ部分を含むウイルスベクターであって、前記治療用カーゴ部分が、
ＰＡＨ配列またはその改変体と；
プロモーターと；
肝臓特異的エンハンサーと、
を含み、
前記ＰＡＨ配列またはその改変体が、前記プロモーターおよび前記肝臓特異的エンハンサーの両方によって作動的に調節される、
ウイルスベクター。
【請求項２】
前記肝臓特異的エンハンサーがプロトロンビンエンハンサーを含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターを含む、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記肝臓特異的プロモーターがｈＡＡＴプロモーターを含む、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記ＰＡＨ配列またはその改変体が末端切断されている、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記ＰＡＨ配列またはその改変体の末端切断された部分が、前記ＰＡＨ配列またはその改変体の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）である、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記治療用カーゴ部分がβグロビンイントロンをさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
前記治療用カーゴ部分が、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位が、前記プロトロンビンエンハンサーの上流に配置されている、請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位が、前記プロトロンビンエンハンサーの下流に配置されている、請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記ＰＡＨ配列またはその改変体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記ＰＡＨ配列またはその改変体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記プロトロンビンエンハンサーが、配列番号５と少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
前記プロトロンビンエンハンサーの配列が配列番号５を含む、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
前記ｈＡＡＴプロモーターの配列が配列番号６を含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
βグロビンイントロンの配列が配列番号７または８を含む、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項１７】
肝細胞核因子結合部位の配列が、配列番号９〜１２のいずれか１つを含む、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
前記治療用カーゴ部分が、少なくとも１つの所定の相補的ｍＲＮＡ配列に結合することが可能な少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列が、完全長ＵＴＲを含有する相補的ｍＲＮＡ配列を標的とする、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの所定の相補的ｍＲＮＡ配列がＰＡＨｍＲＮＡ配列である、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列がｓｈＲＮＡを含む、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列が第一のプロモーターの調節下にあり、かつ前記ＰＡＨ配列またはその改変体が第二のプロモーターの調節下にある、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２３】
前記第一のプロモーターがＨ１プロモーターを含む、請求項２０に記載のウイルスベクター。
【請求項２４】
前記第二のプロモーターが肝臓特異的プロモーターを含む、請求項２０に記載のウイルスベクター。
【請求項２５】
前記肝臓特異的プロモーターがｈＡＡＴプロモーターを含む、請求項２４に記載のウイルスベクター。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列が、配列番号１３または配列番号１４と少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列が配列番号１３または配列番号１４を含む、請求項２１に記載のウイルスベクター。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２９】
標的細胞に感染することが可能なレンチウイルス粒子であって、前記レンチウイルス粒子が、
前記標的細胞に感染することに関して最適化されたエンベロープタンパク質と；
請求項１に記載のウイルスベクターと；
を含む、レンチウイルス粒子。
【請求項３０】
前記標的細胞が、肝細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、神経内分泌細胞、内分泌細胞、リンパ球、骨髄系細胞、実質臓器内に存在する細胞または造血系統の細胞、造血幹細胞もしくは前駆造血幹細胞である、請求項２９に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項３１】
被験体中のＰＫＵを処置する方法であって、治療的有効量の請求項２９または３０に記載のレンチウイルス粒子を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
被験体中のＰＫＵを予防する方法であって、治療的有効量の請求項２９または３０に記載のレンチウイルス粒子を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
ＰＫＵ表現型と相関する、前記被験体においてＰＫＵ遺伝子型を診断することをさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体が子宮内に存在する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記診断することが、前記被験体の出生前スクリーニングの間に行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記診断することがインビトロで行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療的有効量の前記レンチウイルス粒子が、複数の単回用量の前記レンチウイルス粒子を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療的有効量の前記レンチウイルス粒子が、単回用量の前記レンチウイルス粒子を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「ＶＥＣＴＯＲＳ  ＷＩＴＨ  ＰＲＯＭＯＴＥＲ  ＡＮＤ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ  ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＰＨＥＮＹＬＫＥＴＯＮＵＲＩＡ」という名称の２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，９７９号の優先権を主張し、その開示内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示の態様は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置するための遺伝子医薬に関する。より具体的には、本開示の態様は、様々なプロモーターとエンハンサーの組み合わせによってその発現が調節される、ＰＡＨ含有レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、処置せずに放置すれば、知的障害、発作、行動上の問題ならびに成長および発達の障害を罹患した小児に引き起こし得る障害の異質な群を表す。高フェニルアラニン血症が知的障害をもたらす機序は、高用量フェニルアラニンの驚くべき毒性を反映し、神経系組織のミエリン形成不全または脱髄を伴う。ＰＫＵは、北アメリカでは、１２，０００人に１人の平均発生率が報告されており、男女等しく罹患する。この障害は、ヨーロッパまたはアメリカ原住民系の人々において最も一般的であり、東部地中海地域でずっと高いレベルに達する。
【０００４】
ＰＫＵを有する患者における神経学的変化は、生後１ヶ月以内に示され、成人のＰＫＵ患者での磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、脳内に白質の病変を示した。これらの病変の大きさと数は、血中フェニルアラニン濃度と直接関連する。対照被験体と比較した、ＰＫＵを有する青年および成人の認知プロファイルには、著しく低下した知能指数、処理速度、運動調節および抑制能力、ならびに注意力の試験での低下した成績が含まれ得る。
【０００５】
ＰＫＵの大半は、肝臓のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の欠乏によって引き起こされる。ＰＡＨは、分子状酸素および触媒量の、ＰＡＨの非タンパク質補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の存在下で、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のチロシン（Ｔｙｒ）へのヒドロキシル化を触媒する多量体の肝臓の酵素である。ＰＡＨの十分な発現の不存在下では、血中のフェニルアラニンレベルが増加し、ＰＫＵ患者に高フェニルアラニン血症および有害な副作用をもたらす。ＰＡＨ活性の減少または不存在は、チロシンのならびにメラニン、ｌ−チロキシンおよびドーパミンなどのカテコールアミン神経伝達物質などのその下流の生成物の欠乏を引き起こし得る。
【０００６】
ＰＫＵは、ＰＡＨ中の変異および／またはＰＡＨ補因子（すなわち、ＢＨ４）の合成または再生の欠陥によって引き起こされ得る。注目すべきことに、いくつかのＰＡＨ変異は、小胞体中でのタンパク質の折り畳みに影響を与えることが示されており、酵素触媒活性を減弱させまたは大きく消失させる、タンパク質構造中のミスセンス変異（６３％）および小さな欠失（１３％）に起因する加速された分解および／または凝集をもたらす。
【０００７】
一般に、血液の血漿Ｐｈｅレベル、食事でのＰｈｅに対する耐性および治療に対する潜在的な応答性に基づいて、ＰＫＵを分類するために、３つの主要な表現型の群が使用されている。これらの群には、古典的ＰＫＵ（Ｐｈｅ＞１２００μＭ）、非定型または軽症型ＰＫＵ（Ｐｈｅは、６００〜１２００μＭ）および恒常的軽症型高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ、Ｐｈｅ１２０〜６００μＭ）が含まれる。
【０００８】
ＰＫＵの検出は、普遍的新生児スクリーニング（ＮＢＳ）に依存する。かかとの穿刺から収集された一滴の血液が、米国の全５０州において義務付けられているスクリーニングにおいて、フェニルアラニンレベルについて試験される。
【０００９】
現在のところ、生涯にわたるＰｈｅの食事制限およびＢＨ４の補給が、ＰＫＵに対して利用可能なただ２つの処置の選択肢であり、罹患した乳児で最適な臨床転帰を確保するために、早期の治療的介入が決定的に重要である。しかしながら、費用がかかる薬物適用および特殊な低タンパク質食品は、患者に対して大きな負担を課し、特にこれらの製品が民間の健康保険の適用を完全に受けていない場合には、低栄養、心理社会的または神経認知的合併症をもたらし得る。さらに、ＢＨ４治療は、ＢＨ４生合成における欠陥と関連する軽症型高フェニルアラニン血症の処置に主に有効であるのに対して、軽症型または古典的ＰＫＵを有する患者の２０〜３０％が応答するに過ぎない。このため、負担がかかるＰｈｅ制限食の代替として、ＰＫＵに対する新たな処置様式に対する切迫した要望が存在する。このため、フェニルケトン尿症の処置のための代替的方法を開発することが望ましいであろう。
【００１０】
遺伝子医薬は、ＰＫＵを有効に処置する潜在性を有する。遺伝子医薬は、疾患の治療または予防を目的とする遺伝子構築物の送達および発現を伴い得る。遺伝子構築物の発現は、様々なプロモーター、エンハンサーおよび／またはこれらの組み合わせによって調節され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示の一態様において、ウイルスベクターは治療用カーゴ部分を含み、治療用カーゴ部分は、ＰＡＨ配列またはその改変体と、プロモーターと、肝臓特異的エンハンサーとを含み、ＰＡＨ配列またはその改変体は、プロモーターおよび肝臓特異的エンハンサーの両方によって作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）調節される。
【００１２】
実施形態において、肝臓特異的エンハンサーはプロトロンビンエンハンサーを含む。実施形態において、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。実施形態において、肝臓特異的プロモーターはｈＡＡＴプロモーターを含む。実施形態において、治療用カーゴ部分はβグロビンイントロンをさらに含む。実施形態において、治療用カーゴ部分は、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位をさらに含む。実施形態において、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位は、プロトロンビンエンハンサーの上流に配置されている。実施形態において、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位は、プロトロンビンエンハンサーの下流に配置されている。
【００１３】
実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は末端切断されている。実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体の末端切断された部分は、ＰＡＨ配列またはその改変体の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。
【００１４】
実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は、以下：
【化１】
2020535828.tif 000003
【化２】
2020535828.tif 000004
【化３】
2020535828.tif 000005
と少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む。
【００１５】
実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は、配列番号１；配列番号２；配列番号３；または配列番号４を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、プロトロンビンエンハンサーは、以下：
【化４】
2020535828.tif 000006
と少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む。
【００１７】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーの配列は配列番号５を含む。
【００１８】
実施形態において、ｈＡＡＴプロモーターの配列は配列番号６を含む。実施形態において、βグロビンイントロンの配列は配列番号７または８の１つを含む。実施形態において、肝細胞核因子結合部位の配列は、配列番号９〜１２のいずれか１つを含む。
【００１９】
実施形態において、治療用カーゴ部分は、少なくとも１つの所定の相補的ｍＲＮＡ配列に結合することが可能な少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列をさらに含む。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、完全長ＵＴＲを含有する相補的ｍＲＮＡ配列を標的とする。実施形態において、少なくとも１つの所定の相補的ｍＲＮＡ配列はＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列である。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、内在性ＰＡＨの産生を阻害する。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列はｓｈＲＮＡを含む。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は第一のプロモーターの調節下にあり、およびＰＡＨ配列またはその改変体は第二のプロモーターの調節下にある。実施形態において、第一のプロモーターはＨ１プロモーターを含む。実施形態において、第二のプロモーターは肝臓特異的プロモーターを含む。実施形態において、肝臓特異的プロモーターはｈＡＡＴプロモーターを含む。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、以下：
【化５】
2020535828.tif 000007
と少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む。
【００２０】
実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、配列番号１３または配列番号１４を含む。
【００２１】
実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
【００２２】
本開示の一態様において、標的細胞に感染することが可能なレンチウイルス粒子は、標的細胞に感染することに関して最適化されたエンベロープタンパク質と、本開示の実施形態のいずれかによるウイルスベクターとを含む。実施形態において、標的細胞は、肝細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、神経内分泌細胞、内分泌細胞、リンパ球、骨髄系細胞、実質臓器内に存在する細胞または造血系統の細胞、造血幹細胞もしくは前駆造血幹細胞である。
【００２３】
本開示の態様において、被験体中のＰＫＵを処置する方法が開示されている。該方法は、治療的有効量の本明細書に記載されたレンチウイルス粒子を被験体に投与することを含む。本開示の態様において、被験体中のＰＫＵを予防する方法は、治療的有効量の本明細書に記載されたレンチウイルス粒子を被験体に投与することを含む。実施形態において、該方法は、ＰＫＵ表現型と相関する、被験体においてＰＫＵ遺伝子型を診断することをさらに含む。実施形態において、被験体は子宮内に存在する。実施形態において、診断は被験体の出生前スクリーニングの間に行われる。実施形態において、診断はインビトロで行われる。実施形態において、治療的有効量のレンチウイルス粒子は、複数の単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態において、治療的有効量のレンチウイルス粒子は、単回用量のレンチウイルス粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、環状化形態の例示的な３ベクターレンチウイルスベクター系を図示する。
【００２５】
【図２】図２は、環状化形態の例示的な４ベクターレンチウイルスベクター系を図示する。
【００２６】
【図３】図３は、ＰＡＨの発現を制御するためにプロトロンビンエンハンサーとｈＡＡＴプロモーターの変形を含有する８つの例示的レンチウイルスベクターの線形マップを図示する。
【００２７】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、（図４Ａ）Ｈｅｐａ１−６および（図４Ｂ）２９３Ｔ細胞中での、異なるエンハンサー要素ありおよび３’ＵＴＲありまたはなしでのＰＡＨのレベルを比較するイムノブロットデータを図示する。
【００２８】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、（図５Ａ）ウサギβグロビンイントロン、（図５Ｂ）コドン最適化されたＰＡＨ配列および（図５Ｃ）上流または下流のいずれかにＨＮＦ１またはＨＮＦ１／４結合部位を有するプロトロンビンエンハンサーありまたはなしでの、Ｈｅｐａ１−６細胞中でのＰＡＨのレベルを比較するイムノブロットデータを図示する。
【００２９】
【図６】図６は、プロトロンビンエンハンサー中の変形を介してＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターで形質導入されたＨｅｐａ１−６細胞中でのＰＡＨ  ＲＮＡ発現を図示する。
【００３０】
【図７】図７は、Ｈｅｐａ１−６細胞中での、アンチα１トリプシン（ｈＡＡＴ）またはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターのいずれかによる、ＰＡＨ発現のレベルを比較するイムノブロットデータを図示する。
【００３１】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、Ｈｅｐａ１−６細胞（図８Ａ）またはＨｅｐ３Ｂ細胞（図８Ｂ）中での、ウサギまたはヒトβグロビンイントロンありまたはなしでのＰＡＨのレベルを比較するイムノブロットデータを図示する。
【００３２】
【図９】図９は、ＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターを用いたヒト初代肝細胞中でのＰＡＨ発現のイムノブロットデータを図示する。
【００３３】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターで形質導入され、ＢＨ４補因子前駆体であるセピアプテリンで処置されたＨｅｐａ１−６細胞の（図１０Ａおよび１０Ｃ）細胞培地または（図１０Ｂ）ライセート中でのフェニルアラニンレベルの検出によるＰＡＨ活性を図示する。
【００３４】
【図１１】図１１は、ＰＡＨを含有するレンチウイルスベクターでの処置後における、Ｐａｈｅｎｕ２マウスの血中Ｐｈｅの減少したレベルを図示する。
【００３５】
【図１２】図１２は、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨによる血中のフェニルアラニン抑制を図示する。
【００３６】
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、様々なＤＪまたはＡＡＶ／２血清型ベクターを用いた２９３細胞中でのＡＡＶによって送達されるＰＡＨの発現後における、ＰＡＨタンパク質発現（図１３Ａ）およびＰＡＨ  ＲＮＡ発現（図１３Ｄ）を示す；ＡＡＶ／ＤＪベクター（図１３Ｂ）およびＡＡＶ／２ベクター（図１３Ｃ）の送達後に、ＰＡＨタンパク質発現の倍数変化も分析された。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｄは、様々なＤＪまたはＡＡＶ／２血清型ベクターを用いた２９３細胞中でのＡＡＶによって送達されるＰＡＨの発現後における、ＰＡＨタンパク質発現（図１３Ａ）およびＰＡＨ  ＲＮＡ発現（図１３Ｄ）を示す；ＡＡＶ／ＤＪベクター（図１３Ｂ）およびＡＡＶ／２ベクター（図１３Ｃ）の送達後に、ＰＡＨタンパク質発現の倍数変化も分析された。
【００３７】
【図１４】図１４は、ＰＫＵのためのＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨレンチウイルスベクター治療で処置された新生仔ｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス中でのＰｈｅの減少したレベルを図示する。
【００３８】
【図１５】図１５は、それぞれが、内在性Ｐａｈ遺伝子によって発現されたｍＲＮＡの３’ＵＴＲを標的とし、ＰＡＨタンパク質の発現を阻害する、プロトロンビンーｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１３）またはプロトロンビンーｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号１４）をコードするレンチウイルスベクターでの処置後においてＰＡＨ発現を示すＨｅｐ３Ｂ細胞から得たデータを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示の概要
本開示は、治療用ベクターおよび細胞への治療用ベクターの送達に関する。実施形態において、治療用ベクターは、ＰＡＨ配列またはその改変体および肝臓特異的エンハンサーを含む。実施形態において、治療用ベクターは、宿主（すなわち、内在性）ＰＡＨタンパク質発現を制御する低分子ＲＮＡも含む。
【００４０】
定義および解釈
本明細書中に別段の定義が為されていなければ、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段の要求がされていなければ、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般的に、本明細書に記載されている、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法およびこれらの技術は、周知のものであり、一般的に本分野において使用されているものである。別段の記載がなければ、本開示の方法および技術は、一般に、本分野において周知の慣用的な方法に従って、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。あらゆる酵素的反応または精製技術は、製造業者の仕様に従って、本分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されているように行われる。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および医化学および薬化学に関連して使用される命名法ならびにこれらの研究室手技および技術は、本分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲中に使用されている場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、互換的に使用され、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数形も含むことが意図され、それぞれの意味に含まれる。また、本明細書において使用される場合、「および／または」は、列記された項目の１つまたはそれより多くのあらゆるすべての可能な組み合わせのみならず、選択的に（「ｏｒ」）解釈される場合には、組み合わせの欠如も表し、これらを包含する。
【００４２】
範囲を含む全ての数的表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、０．１の増分によって（＋）または（−）に変動される近似値である。常に明示的に述べられているわけではないが、全ての数的表記には、「約」という用語が前置されていることが理解されるべきである。「約」という用語は、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ−０．１」など、「Ｘ」のわずかな増分に加えて、正確な値「Ｘ」も含む。常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載されている試薬は単に例示であること、およびこのようなものと同等な試薬が本分野において知られていることも理解されるべきである。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じて、ある程度、変動し得る。本用語が使用されている文脈が与えられた当業者にとって明確でない本用語の使用が存在する場合、「約」は、当該用語の最大プラスまたはマイナス１０％を意味するであろう。
【００４４】
活性作用物質「の投与」または「を投与する」という用語は、治療的に有用な形態および治療的有効量で、その個体の身体中に導入することができる形態で、処置を必要とする被験体に活性作用物質を与えることを意味するものと理解されるべきである。
【００４５】
本明細書において使用される「含む」という用語は、組成物および方法が表記された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」とは、その組成物または方法にとってなんらかの本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。「からなる」とは、特許請求される組成物および実質的な方法工程に対して、微量を超えるその他の成分を除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲に属する。したがって、方法および組成物は、さらなる工程および要素を含むことができ（含む）、または重要でない工程および組成物を含み（から本質的になる）、または記載された方法工程もしくは組成物のみを意図する（からなる）ことが意図される。
【００４６】
本明細書において使用される「発現」、「発現された」または「コードする」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を表す。発現には、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングまたはその他の形態の転写後修飾もしくは翻訳後修飾が含まれ得る。
【００４７】
本明細書において使用される「アデノ随伴ウイルスベクター」という用語は、そのアデノ随伴ウイルスの担体または輸送体を表す。本明細書において、「アデノ随伴ウイルスベクター」という用語は、「ＡＡＶベクター」とも称され得る。
【００４８】
本明細書において使用される「アデノ随伴ウイルス」という用語は、軽度の免疫応答を生成し、宿主細胞ゲノム中に組み込むことが可能であり、病原性でない小型ウイルスを表す。
【００４９】
本明細書において使用される「ＡＡＶ／ＤＪ」（本明細書において、「ＡＡＶ−ＤＪ」とも表される）という用語は、野生型ＡＡＶ血清型より高い形質導入および感染率を媒介する、異なるＡＡＶ血清型から作出されたＡＡＶベクターの血清型である。
【００５０】
本明細書において使用される「ＡＡＶ２」（本明細書において、「ＡＡＶ／２」または「ＡＡＶ−２」とも表される）という用語は、天然に存在するＡＡＶ血清型である。
【００５１】
本明細書において使用される「ＡＡＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ」という用語は、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含むＡＡＶベクターを表す。
【００５２】
本明細書において使用される略号「ＡｐｏＥエンハンサー」は、アポリポタンパク質Ｅエンハンサーを表す。
【００５３】
本明細書において使用される「遺伝子医薬」または「複数の遺伝子医薬」という用語は、臨床的疾患または症状発現を処置するために遺伝子標的を焦点とする治療薬および治療戦略を一般的に表す。「遺伝子医薬」という用語は、遺伝子治療などを包含する。
【００５４】
本明細書において使用される略号「ｈＡＡＴ」は、ｈＡＡＴプロモーターを表す。
【００５５】
本明細書において使用される「ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９」という用語は、本明細書において、Ｕ２８９ともいわれ得、または導入遺伝子により発現される末端切断されたｈＰＡＨ３’ＵＴＲと一般的に、または末端切断された３’ＵＴＲと一般的にいわれ得る。
【００５６】
本明細書において使用される「肝細胞核因子」という用語は、主に肝臓内で発現される転写因子を表す。肝細胞核因子の種類には、肝細胞核因子１、肝細胞核因子２、肝細胞核因子３および肝細胞核因子４が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書において使用される略号「ＨＮＦ」は、肝細胞核因子を表す。したがって、ＨＮＦ１は肝細胞核因子１を表し、ＨＮＦ２は肝細胞核因子２を表し、ＨＮＦ３は肝細胞核因子３を表し、およびＨＮＦ４は肝細胞核因子４を表す。
【００５８】
本明細書において使用される「ＨＮＦ結合部位」という語句は、ＨＮＦ転写因子が結合することができるＤＮＡの領域を表す。したがって、ＨＮＦ１結合部位は、ＨＮＦ１が結合することができるＤＮＡの領域であり、ＨＮＦ４結合部位は、ＨＮＦ４が結合することができるＤＮＡの領域である。
【００５９】
本明細書において使用される「個体」、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、あらゆる個々の哺乳動物被験体、例えば、マウス、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類またはヒト霊長類を表す。
【００６０】
本明細書において使用される「ウサギβグロビンイントロン」という語句は、ＲＮＡ成熟の間に、スプライシングによって除去され、タンパク質をコードしないウサギβグロビン遺伝子内の核酸セグメントを表す。
【００６１】
本明細書において使用される「ヒトβグロビンイントロン」という語句は、ＲＮＡ成熟の間に、スプライシングによって除去され、タンパク質をコードしないヒトβグロビン遺伝子内の核酸セグメントを表す。
【００６２】
本明細書において使用される「ＬＶ」という用語は、「レンチウイルス」を一般的に表す。非限定的な例として、「ＬＶ−ＰＡＨ」への言及は、ＰＡＨ配列を含有し、かつＰＡＨを発現するレンチウイルスへの言及である。
【００６３】
本明細書において使用される「ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ」という用語は、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスを表す。ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨベクターは、ＡＧＴ３２３ベクターとも表される。
【００６４】
本明細書において使用される「ＬＶ−ＨＮＦ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ」という用語は、ＨＮＦ結合部位と、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスを表す。
【００６５】
本明細書において使用される「ＬＶ−Ｐｒｏ−イントロン−ＰＡＨ」という用語は、プロトロンビンエンハンサーと、イントロンと、ＰＡＨ配列とを含み、イントロンがヒトβグロビンイントロンであるレンチウイルスを表す。
【００６６】
本明細書において使用される「ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ」という用語は、プロトロンビンエンハンサーとｈＡＡＴプロモーターとを含むレンチウイルスを表す。
【００６７】
本明細書において使用される「ＬＶ−Ｐｒｏ−ＴＢＧ−ＰＡＨ」という用語は、プロトロンビンエンハンサーと、チロキシン結合グロブリンと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスを表す。
【００６８】
本明細書において使用される「ＬＶ−ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＵＴＲ」という用語は、アポリポタンパク質Ｅエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列と、遺伝子の非翻訳領域とを含み、非翻訳領域がＰＡＨ遺伝子の３’ＵＴＲであるレンチウイルスを表す。
【００６９】
本明細書において使用される「ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨーｓｈＰＡＨ」という用語は、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列と、ｓｈＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスを表す。
【００７０】
本明細書において使用される「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現するために使用することができるあらゆる細胞株を表す。
【００７１】
本明細書において使用される、２つまたはそれを超える核酸またはポリペプチド配列という文脈における「パーセント同一性」という用語は、最大の一致のために比較されおよび整列されたときに、以下に記載されている配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を用いてまたは目視検査によって測定された場合、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定された百分率を有する２つまたはそれを超える配列またはサブ配列を表す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在することができ、または、あるいは、比較されるべき２つの配列の全長にわたって存在することができる。配列比較のために、通例、１つの配列が参照配列として機能し、試験配列がこれと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験および参照配列がコンピュータ中に入力され、必要であれば、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列に対するパーセント配列同一性を計算する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容され得る」は、合理的な便益／リスク比に相応して過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答またはその他の問題もしくは合併症なしに、健全な医学的判断の範疇内で、ヒトおよび動物の組織、臓器および／または体液（ｂｏｄｉｌｙ  ｆｌｕｉｄ）と接触させて使用するのに適している、化合物、物質、組成物および／または剤形を表す。
【００７３】
本明細書において使用される「薬学的に許容され得る担体」は、生理的に適合され得る、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤などを表し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容され得る塩、例えば、酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）または塩基付加塩（ｂａｓｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）を含むことができる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
【００７４】
「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」という用語は、本明細書においてＰＡＨとも表され得る。フェニルアラニンヒドロキシラーゼという用語は、ヌクレオチドおよびペプチド配列の両方を含む、全ての野生型および改変体ＰＡＨ配列を含む。限定するものではなく、フェニルアラニンヒドロキシラーゼという用語は、配列番号１〜４への言及を含み、これらと少なくとも約８０％の同一性を有する改変体をさらに含む。ヒトＰＡＨは、本明細書においてｈＰＡＨとも表され得る。ヒトＰＡＨは、本明細書においてｈＰＡＨとも表され得る。
【００７５】
本明細書において使用される「野生型ｈＰＡＨ」という用語は、本明細書において、内在性ＰＡＨまたは「完全長ＰＡＨ」とも表され得る。
【００７６】
本明細書において「ＰＫＵ」とも表される、本明細書において使用される「フェニルケトン尿症」という用語は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの慢性的欠乏症ならびに軽症および古典的形態の疾患を含む、これに関連するすべての症状を表す。「フェニルケトン尿症」の処置は、したがって、ＰＫＵと関連する症状の全てまたはいくつかに対する処置に関係し得る。
【００７７】
本明細書において使用される「プロトロンビンエンハンサー」という用語は、タンパク質によって結合されることができ、これがプロトロンビン遺伝子の転写をもたらすプロトロンビン遺伝子上の領域である。
【００７８】
本明細書において使用される略号「Ｐｒｏ」は、プロトロンビンエンハンサーを表す。
【００７９】
本明細書において使用される「低分子ＲＮＡ」は、長さが一般に約２００ヌクレオチドまたはそれ未満であり、サイレンシングまたは干渉機能を有する非コードＲＮＡを表す。他の実施形態において、低分子ＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１００ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約７５ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。このようなＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本開示の「低分子ＲＮＡ」は、一般的には、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊をもたらす経路を通じて、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害しまたはノックダウンすることが可能であるべきである。
【００８０】
本明細書において使用される「ｓｈＰＡＨ」という用語は、ＰＡＨを標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡを表す。
【００８１】
本明細書において使用される略号「ｌｎｃＲＮＡ」は、長い非コードＲＮＡを表す。
【００８２】
本明細書において使用される「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」という用語は、「配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ  Ｎｏ．）」という用語と同義である。
【００８３】
本明細書において使用される「チロキシン結合グロブリン」という用語は、血流中で甲状腺ホルモンを運ぶ役割を担う輸送タンパク質である。本明細書において使用される略号「ＴＢＧ」は、チロキシン結合グロブリンを表す。
【００８４】
本明細書において使用される「治療的有効量」という用語は、所定の病気、損傷、疾患または状態に罹患している患者に見られる合併症の症状、進行または開始を処置または予防するための、適切な組成物中のおよび適切な剤形中の本開示の活性作用物質の十分な量を表す。治療的有効量は、患者の状態またはその重篤度の状況および処置されるべき被験体の年齢、体重などに応じて変動するであろう。治療的有効量は、例えば、投与の経路、被験体の状態のほか、当業者によって理解されるその他の要因を含む、多数の要因のいずれにも応じて変動することができる。
【００８５】
本明細書において使用される「治療用ベクター」という用語は、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターへの言及を含むが、これらに限定されない。さらに、レンチウイルスベクター系に関して本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、「プラスミド」という用語と同義である。例えば、２−ベクターおよび３−ベクターパッケージング系を含む３ベクターおよび４−ベクター系は、３−プラスミドおよび４−プラスミド系とも表すことができる。
【００８６】
本明細書において使用される「処置」または「処置する」という用語は、処置されている被験体の自然経過を変更することを試みての介入を一般的に表し、予防のためまたは臨床病理の経過の間のいずれでも実施することができる。望ましい効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症状を緩和すること、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理的帰結を抑制し、低減しまたは阻害すること、病状を好転させるまたは軽減すること、および寛解または改善された予後を引き起こすことが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
「処置」は、病状を標的とし、病状と闘う、すなわち、病状を好転させるまたは予防することが意図される。このため、具体的な処置は、標的とされるべき病状ならびに薬物治療および治療的アプローチの現在または将来の状況に依存するであろう。処置は、随伴する毒性を有することがあり得る。
【００８８】
本明細書において使用される「末端切断された」という用語は、本明細書において、「短縮された」または「なしの（ｗｉｔｈｏｕｔ）」とも表され得る。
【００８９】
本明細書において使用される「ＵＴＲ」という用語は、遺伝子のコード領域の５’または３’のいずれかにある遺伝子の領域を表す。
【００９０】
本明細書において使用される「３’ＵＴＲ」という用語は、遺伝子のコード領域の３’にある「ＵＴＲ」である。
【００９１】
本明細書において使用される「改変体」という用語は、本明細書において、類似体または変形とも表され得る。改変体は、ヌクレオチド配列に対するあらゆる置換、欠失または付加を表す。
【００９２】
本明細書において考慮される場合、比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視による検査によって実施することができる（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記参照）。
【００９３】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）中に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公に入手可能である。
【００９４】
本開示の核酸およびタンパク質配列は、さらに、例えば関連する配列を同定するために、公的データベースに対する検索を実行するための「問い合わせ配列」として使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示に提供されている核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較目的でギャップを加えた整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているとおりに、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００９５】
本開示の態様および実施形態の説明
本開示の一態様において、ウイルスベクターは治療用カーゴ部分を含み、治療用カーゴ部分は、ＰＡＨ配列またはその改変体と、プロモーターと、肝臓特異的エンハンサーとを含み、ＰＡＨ配列またはその改変体は、プロモーターおよび肝臓特異的エンハンサーの両方によって作動的に調節される。
【００９６】
実施形態において、肝臓特異的エンハンサーはプロトロンビンエンハンサーを含む。実施形態において、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。実施形態において、肝臓特異的プロモーターはｈＡＡＴプロモーターを含む。実施形態において、治療用カーゴ部分はβグロビンイントロンをさらに含む。実施形態において、治療用カーゴ部分は、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位をさらに含む。実施形態において、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位は、プロトロンビンエンハンサーの上流に配置されている。実施形態において、少なくとも１つの肝細胞核因子結合部位は、プロトロンビンエンハンサーの下流に配置されている。
【００９７】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、ＨＮＦ結合部位と、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＨＮＦ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、ＨＮＦ結合部位は、ＨＮＦ１またはＨＮＦ１／４結合部位である。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、イントロンと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−Ｐｒｏ−イントロン−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、イントロンはウサギグロビンイントロンである。実施形態において、イントロンはヒトグロビンイントロンである。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーとｈＡＡＴプロモーターとを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ）が提供される。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、チロキシン結合グロブリンと、ＰＡＨ配列とを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−Ｐｒｏ−ＴＢＧ−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、ＡｐｏＥエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列と、ＰＡＨの３’ＵＴＲとを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＵＴＲ）が提供される。
【００９８】
実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は末端切断されている。実施形態において、末端切断されたＰＡＨ配列またはその改変体の部分は、ＰＡＨ配列またはその改変体の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。
【００９９】
実施形態において、３’ＵＴＲにおけるＰＡＨ末端切断は、３’ＵＴＲへのある種の制御性ＲＮＡの結合を妨げる。実施形態において、制御性ＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡは、１９から２５ヌクレオチドの長さのｓｉＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡは、配列番号１３または１４と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれを超えるパーセント同一性を有する配列を含む低分子ＲＮＡ配列である。
【０１００】
実施形態において、ＰＡＨ配列は配列番号１を含む。実施形態において、ＰＡＨ配列は、コドン最適化されたＰＡＨ配列（配列番号２）を含む。実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は、末端切断された３’ＵＴＲ（２８９ヌクレオチド）（配列番号４）を含む。実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は、５’ＵＴＲ（８９７ヌクレオチド）（配列番号３）を含む。
【０１０１】
実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれを超えるパーセント同一性を有する配列を含む。
【０１０２】
実施形態において、改変体は、上記配列のいずれに対しても作製することができる。実施形態において、ＰＡＨ配列またはその改変体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む。
【０１０３】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーは、配列番号５と、少なくとも８０％、または少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれを超えるパーセント同一性を有する配列を含む。
【０１０４】
実施形態において、改変体は、上記配列に対して作製することができる。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーの配列は配列番号５を含む。
【０１０５】
実施形態において、ｈＡＡＴプロモーターの配列は配列番号６を含む。実施形態において、βグロビンイントロンの配列は配列番号７または８の１つを含む。実施形態において、肝細胞核因子結合部位の配列は、配列番号９〜１２のいずれか１つを含む。
【０１０６】
実施形態において、治療用カーゴ部分は、少なくとも１つの所定の相補的ｍＲＮＡ配列に結合することが可能な少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列をさらに含む。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、完全長ＵＴＲを含有する相補的ｍＲＮＡ配列を標的とする。実施形態において、少なくとも１つの所定の相補的ｍＲＮＡ配列はＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列である。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列はｓｈＲＮＡを含む。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は第一のプロモーターの調節下にあり、およびＰＡＨ配列またはその改変体は第二のプロモーターの調節下にある。実施形態において、第一のプロモーターはＨ１プロモーターを含む。実施形態において、第二のプロモーターは肝臓特異的プロモーターを含む。実施形態において、肝臓特異的プロモーターはｈＡＡＴプロモーターを含む。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、配列番号１３または配列番号１４と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれを超えるパーセント同一性を有する配列を含む。
【０１０７】
実施形態において、改変体は、上記配列のいずれに対しても作製することができる。実施形態において、少なくとも１つの低分子ＲＮＡ配列は、配列番号１３または配列番号１４を含む。
【０１０８】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列と、内在性ＰＡＨを標的とするｓｈＲＮＡとを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ｓｈＰＡＨ）が提供される。実施形態において、ｓｈＲＮＡは、内在性ＰＡＨの３’ＵＴＲを標的とする。実施形態において、ｓｈＰＡＨは配列番号１３を含む。実施形態において、ｓｈＰＡＨは配列番号１４を含む。
【０１０９】
本開示の一態様において、標的細胞に感染することが可能なレンチウイルス粒子は、標的細胞に感染することに関して最適化されたエンベロープタンパク質と、本明細書に開示されているウイルスベクターのいずれかとを含む。実施形態において、標的細胞は、肝細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、神経内分泌細胞、内分泌細胞、リンパ球、骨髄系細胞、実質臓器内に存在する細胞または造血系統の細胞、造血幹細胞もしくは前駆造血幹細胞である。
【０１１０】
本開示の態様において、被験体中のＰＫＵを処置する方法は、治療的有効量の本明細書に開示されたレンチウイルス粒子のいずれかを被験体に投与することを含む。本開示の態様において、被験体中のＰＫＵを予防する方法は、治療的有効量の本明細書に開示されたレンチウイルス粒子のいずれかを被験体に投与することを含む。本開示の別の態様において、被験体中のＰＫＵを処置するための、治療的有効量の本明細書に開示されたレンチウイルス粒子のいずれかの使用が開示されている。実施形態において、該方法は、ＰＫＵ表現型と相関する、被験体においてＰＫＵ遺伝子型を診断することをさらに含む。実施形態において、被験体は子宮内に存在する。実施形態において、診断は被験体の出生前スクリーニングの間にまたは親の遺伝子スクリーニングの後に行われる。実施形態において、診断はインビトロで行われる。実施形態において、治療的有効量のレンチウイルス粒子は、複数の単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態において、治療的有効量のレンチウイルス粒子は、単回用量のレンチウイルス粒子を含む。
【０１１１】
本開示の別の態様において、被験体中のＰＫＵを処置する方法であって、治療的有効量の、外来性ＰＡＨを含むレンチウイルスベクターで、ＰＡＨの変異体形態を有する被験体を処置することを含む方法が提供される。実施形態において、被験体は哺乳動物である。実施形態において、哺乳動物はヒトである。実施形態において、哺乳動物はげっ歯類である。実施形態において、げっ歯類はマウスまたはラットである。実施形態において、哺乳動物はブタである。
【０１１２】
実施形態において、被験体はレンチウイルスベクターで処置される。実施形態において、レンチウイルスベクターはＰＡＨ配列またはその改変体を含む。実施形態において、ＰＡＨ配列は、本明細書に記載されているＰＡＨ配列または改変体のいずれかである。
【０１１３】
実施形態において、レンチウイルスベクターは、本明細書に記載されているＰＡＨまたは改変体を含むレンチウイルスベクターのいずれかである。実施形態において、ＰＡＨを含むレンチウイルスベクターは、図１および２に図示されている、ＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターである。実施形態において、ＰＡＨを含むレンチウイルスベクターは、図３に図示されている、ＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターである。
【０１１４】
実施形態において、ウイルスベクターは、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含む（本明細書において、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨまたはＡＧＴ３２３とも称される）。実施形態において、プロトロンビンエンハンサー配列は、本明細書に記載されているプロトロンビン配列または改変体のいずれかである。実施形態において、ｈＡＡＴプロモーターは、本明細書に記載されているｈＡＡＴプロモーター配列または改変体のいずれかである。実施形態において、ＰＡＨ配列は、本明細書に記載されているＰＡＨ配列または改変体のいずれかである。
【０１１５】
実施形態において、レンチウイルスベクターは、組み込まれたレンチウイルスベクターから構成される。実施形態において、組み込まれたレンチウイルスベクターはレンチウイルスベクター系に由来する。実施形態において、レンチウイルスベクター系は、ｒｅｖ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子をコードする別個のプラスミドを含む。実施形態において、組み込まれたレンチウイルスベクターは３−ベクターレンチウイルス系に由来する。実施形態において、３−ベクターレンチウイルス系は図１に例示されている。実施形態において、組み込まれたレンチウイルスベクターは４−ベクターレンチウイルス系に由来する。実施形態において、４−ベクターレンチウイルスベクター系は図２に例示されている。
【０１１６】
実施形態において、被験体はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで処置される。実施形態において、ＡＡＶベクターは、本明細書に開示されているＡＡＶベクターのいずれかを含む。実施形態において、ＡＡＶベクターはＰＡＨ配列またはその改変体を含む。実施形態において、ＰＡＨ配列は、本明細書に記載されているＰＡＨ配列または改変体のいずれかである。
【０１１７】
実施形態において、注射は皮内注射である。実施形態において、注射は筋肉内注射である。実施形態において、注射は皮下注射である。実施形態において、注射は静脈内注射である。
【０１１８】
実施形態において、本明細書に記載されている方法は、レンチウイルス粒子で被験体を処置する前に、特定の力価の組み込まれたレンチウイルスベクターを作製することをさらに含む。特定の力価は、細胞標的およびインビトロでのレンチウイルスベクター形質導入を使用し、続いて、形質導入された細胞の頻度および細胞当たりの組み込まれたベクターコピー数の数を測定するための、形質導入された細胞からの染色体ＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析を使用する試験系において決定される。力価は、適切な数の細胞中へのレンチウイルスベクターの適切な列（ｃｏｌｕｍｎ）での形質導入から生じたであろう組み込まれたコピー数の数として表される。実施形態において、力価は、１×１０５〜１×１０１５の組み込まれたベクターコピー、例えば、１×１０７〜１×１０１３の組み込まれたベクターコピーまたは１×１０９〜１×１０１１の組み込まれたベクターコピーである。実施形態において、力価は１×１０１０の組み込まれたベクターコピーである。
【０１１９】
実施形態において、特定の力価の組み込まれたレンチウイルスベクターを作製することは、１またはそれを超える細胞にベクター系を加えることを含む。実施形態において、１またはそれを超える細胞は細胞株である。実施形態において、細胞株は２９３Ｔ細胞株である。実施形態において、細胞株はＨｅＬａ細胞株である。実施形態において、細胞株はＣＨＯ細胞株である。実施形態において、細胞株はＨｅｐ３Ｂ細胞株である。当業者は、他の実施形態において、細胞株は本分野において既知のいずれの適切な細胞株でもあり得ることも理解するであろう。
【０１２０】
実施形態において、方法は、ＰＡＨを含むレンチウイルスベクターの注射後に血液中のＰｈｅのレベルを測定することをさらに含む。
【０１２１】
本開示の態様において、ヒトＰＡＨは、ＡＡＶによって送達される発現系を用いて、細胞中で発現される。実施形態において、ＡＡＶ−２血清型が使用される。実施形態において、ＡＡＶ−ＤＪ血清型が使用される。実施形態において、ＡＡＶベクターはＧＦＰを含有する。実施形態において、ＡＡＶベクターはいずれの血清型をも提示し得、またはヒト肝細胞の形質導入を改善するように設計された、組換えＤＮＡもしくはその他の合成的アプローチによって生成され得る。
【０１２２】
実施形態において、ヒトＰＡＨがＡＡＶベクター中に導入される。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーがＡＡＶベクター中に導入される。実施形態において、ｈＡＡＴプロモーターがＡＡＶベクター中に導入される。実施形態において、ウサギグロビンイントロンがＡＡＶベクター中に導入される。実施形態において、ヒトＰＡＨ、プロトロンビンエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギグロビンイントロンのいずれか１つまたはそれより多くが、ＡＡＶベクター中に導入される。実施形態において、ウイルスベクターは、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列とを含む（ＡＡＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ；ＡＧＴ３２３）。
【０１２３】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサー配列は、本明細書に開示されているプロトロンビン配列または改変体のいずれかである。実施形態において、ＰＡＨ配列は、本明細書に記載されているＰＡＨ配列または改変体のいずれかである。実施形態において、ｈＡＡＴ配列は、本明細書に開示されているｈＡＡＴ配列または改変体のいずれかである。実施形態において、イントロン配列は、本明細書に開示されているイントロン配列または改変体のいずれかである。
【０１２４】
本開示の態様において、レンチウイルスベクター治療は、変異体ＰＡＨ遺伝子を有する被験体の処置において使用される。実施形態において、被験体はヒトである。他の実施形態において、本明細書において実験的に示されているように、被験体は、Ｐａｈ変異体マウス系統に由来する新生仔マウスである。実施形態において、変異体マウス系統はＰａｈｅｎｕ１である。実施形態において、変異体マウス系統はＰａｈｅｎｕ２である。実施形態において、変異体マウス系統はＰａｈｅｎｕ３である。
【０１２５】
実施形態において、レンチウイルスベクター中のＰＡＨ配列は、本明細書に記載されており、ｗｗｗ．ｂｉｏｐｋｕ．ｏｒｇ．に見出されるＰＡＨｖｄｂ、ＢＩＯＤＥＦ、ＢＩＯＰＫＵ、ＪＡＫＥまたはＰＮＤｄｂデータベース中に列記されているものを含む、ＰＡＨ配列または改変体のいずれかである。
【０１２６】
実施形態において、レンチウイルスベクターは、組み込まれたレンチウイルスベクターから構成される。実施形態において、組み込まれたレンチウイルスベクターはレンチウイルスベクター系に由来する。実施形態において、レンチウイルスベクター系は、ｒｅｖ遺伝子およびエンベロープ遺伝子をコードする別個のプラスミドを含む。実施形態において、組み込まれたレンチウイルスベクターは３−ベクターレンチウイルス系に由来する。実施形態において、３−ベクターレンチウイルス系は図１に例示されている。実施形態において、組み込まれたレンチウイルスベクターは４−ベクターレンチウイルス系に由来する。実施形態において、４−ベクターレンチウイルスベクター系は図２に例示されている。
【０１２７】
本開示の態様において、ｓｈＲＮＡおよびＰＡＨを含有する細胞中でのレンチウイルスの発現は、内在性ＰＡＨの発現を抑制するが、レンチウイルスベクターから発現される外来性ＰＡＨの発現を抑制しない。
【０１２８】
実施形態において、ｓｈＲＮＡおよびＰＡＨを含有するレンチウイルスは、本明細書に記載されているとおりに、インビボで被験体中において発現される。実施形態において、被験体は哺乳動物である。実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１２９】
実施形態において、ｓｈＲＮＡおよびＰＡＨを含有するレンチウイルスは、インビトロまたはエクスビボで発現される。実施形態において、レンチウイルスは、インビトロで、例えば細胞株中で発現される。実施形態において、細胞株は、本明細書に記載されている細胞株または当業者に既知の細胞株のいずれかである。実施形態において、細胞株はＨｅｐ３Ｂ細胞株である。
【０１３０】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、ｈＡＡＴプロモーターと、ＰＡＨ配列と、内在性ＰＡＨを標的とするｓｈＲＮＡとを含むレンチウイルスベクターが提供される（本明細書において、必要に応じて、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ｓｈＰＡＨと称される）。実施形態において、ｓｈＲＮＡは、内在性ＰＡＨの３’ＵＴＲを標的とする。
【０１３１】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサー配列は、本明細書に開示されているプロトロンビン配列または改変体のいずれをも含む。実施形態において、ｈＡＡＴプロモーターは、本明細書に開示されているｈＡＡＴプロモーター配列または改変体のいずれをも含む。実施形態において、ＰＡＨ配列は、本明細書に記載されているＰＡＨ配列または改変体のいずれをも含む。実施形態において、レンチウイルスベクター中のｓｈＲＮＡ配列は、配列番号１３を含む。実施形態において、レンチウイルスベクター中のｓｈＲＮＡ配列は配列番号１４を含む。
【０１３２】
本明細書に記載されている本発明のその他の態様および利点は、添付の図面と併せて、本発明の態様を例示する以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【０１３３】
フェニルケトン尿症
ＰＫＵは、ＰＡＨの変異および／またはＰＡＨ補因子（すなわち、ＢＨ４）の合成または再生の欠陥によって引き起こされると考えられている。注目すべきことに、いくつかのＰＡＨ変異は、小胞体中でのタンパク質の折り畳みに影響を与えることが示されており、酵素触媒活性を減弱させまたは大きく消失させる、タンパク質構造中のミスセンス変異（６３％）および小さな欠失（１３％）に起因する加速された分解および／または凝集をもたらす。ＰＡＨの機能性に影響を及ぼすことができる多数の変異が存在するので、ＰＫＵを処置するための有効な治療的アプローチは、異常なＰＡＨおよび代替ＰＡＨが投与され得る様式に対処することが必要であろう。
【０１３４】
一般に、診断で測定されたＰｈｅレベル、食事でのＰｈｅに対する耐性および治療に対する潜在的な応答性に基づいて、ＰＫＵでは、３つの主要な表現型の群が分類される。これらの群には、古典的ＰＫＵ（Ｐｈｅ＞１２００μＭ）、非定型または軽症型ＰＫＵ（Ｐｈｅは、６００〜１２００μＭ）および恒常的軽症型高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ、Ｐｈｅ１２０〜６００μＭ）が含まれる。
【０１３５】
ＰＫＵの検出は、普遍的新生児スクリーニング（ＮＢＳ）に依存する。米国の全５０州において義務付けられ、多くの先進国で日常的に使用されているスクリーニングにおいて、かかとの穿刺から収集された一滴の血液がフェニルアラニンレベルについて試験される。
【０１３６】
遺伝子医薬
遺伝子医薬は、疾患の治療または予防を目的として、遺伝子構築物を宿主細胞に送達するために使用されるウイルスベクターへの言及を含む。
【０１３７】
遺伝子構築物には、既存の欠陥を修正または補完する機能的遺伝子または遺伝子の一部、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンス、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、低分子相同性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡまたはその他を含む制御性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、ならびに病状を変化させるために、重大な細胞因子について競合するように設計されたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。遺伝子医薬は、特定の疾患の処置または緩和を与えるために、これらの治療的遺伝子構築物を標的細胞へ送達することを含む。
【０１３８】
機能的なＰＡＨ遺伝子をインビボで肝臓に送達することによって、ＰＡＨ活性は再構成されるはずであり、血液中のＰｈｅの正常なクリアランスがもたらされ、したがって、食事制限または頻繁な酵素置換治療の必要性がなくなる。この治療的アプローチの効果は、内在性ＰＡＨに対するｓｈＲＮＡのターゲティングによって改善されるはずである。本開示の態様において、胎児がＰＫＵ遺伝子型のリスクがあると同定された場合、機能的ＰＡＨ遺伝子またはその改変体は、子宮内に送達することもできる。実施形態において、診断工程は、胎児はＰＫＵ表現型に対するリスクがあるかどうかを決定するために実施することができる。診断工程が、胎児がＰＫＵ表現型に対するリスクがあることを決定すれば、次いで、本明細書に詳述されている遺伝子医薬で胎児を処置することができる。処置は、子宮内でまたはインビトロで行われ得る。
【０１３９】
治療用ベクター
本明細書の様々な態様および実施形態にしたがうレンチウイルスのビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。様々な実施形態において、レンチウイルスのＰｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する１つのベクターは、プロモーターに作動可能に連結されて、逆転写および組み込みのために提供される。別の実施形態において、Ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。他の実施形態において、プロモーターに作動可能に連結された、ウイルスカプシドを形成するためのレンチウイルスのＧａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが提供される。実施形態において、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列の少なくともいくつかとは別個のベクター上にある。
【０１４０】
本明細書中のベクターに対しては、多数の改変を施すことができ、野生型復帰変異体を得る機会をさらに最少化するための粒子を作製するために使用される。これらには、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔ欠失およびマトリックス（ＭＡ）欠失が含まれるが、これらに限定されない。実施形態において、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と称される、レンチウイルスＲＮＡをパッケージするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
【０１４１】
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現する、レンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結された、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別個のベクターが使用される。このｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列も含有しない。一実施形態において、ｅｎｖ核酸配列はレンチウイルスのエンベロープタンパク質をコードする。
【０１４２】
別の実施形態において、エンベロープタンパク質はレンチウイルス由来ではなく、異なるウイルス由来である。得られる粒子は、偽型粒子と称される。エンベロープタンパク質の適切な選択によって、実質的にあらゆる細胞を感染させることができる。例えば、インフルエンザウイルスのエンベロープタンパク質、ヒトおよび非ヒトラブドウイルス分離株、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎または麻疹）ならびにオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）由来のＶＳＶ−Ｇまたは類似のエンベロープタンパク質など、細胞内区画を標的とするエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。好ましく使用することができる他のエンベロープタンパク質には、ネコ白血病ウイルスおよびネコ内在性レトロウイルス、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａなどのモロニー白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルスＧＡＬＶおよびヒヒ内在性レトロウイルスからのエンベロープタンパク質が含まれる。これらの後者のエンベロープタンパク質は、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。所望される宿主細胞に応じて、他のエンベロープタンパク質を選択することができる。
【０１４３】
本明細書において提供されるレンチウイルスベクター系は、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｒｅｖ遺伝子の少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子の各々は、個別のプラスミド上に提供され得、または１もしくはそれを超える遺伝子は、同じプラスミド上に一緒に提供され得る。一実施形態において、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミド上に提供される（例えば、図１）。別の実施形態において、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、第一のプラスミド上に提供され、ｒｅｖ遺伝子は、第二のプラスミド上に提供される（例えば、図２）。したがって、本明細書に記載されているとおりにレンチウイルスを産生するために、３−ベクターおよび４−ベクター系の両方を使用することができる。実施形態において、治療用ベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞、例えば、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定例は、２９３Ｔ／１７ＨＥＫ細胞株である。治療用ベクター、エンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子が最終的に産生される。
【０１４４】
別の態様において、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示されている。この系は、本明細書に記載されているとおりのレンチウイルスベクター；細胞を感染させることに関して最適化されたエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって産生され、レンチウイルス粒子は、ＰＡＨを産生することを阻害し、および／または内在性ＰＡＨの発現を阻害することができる。
【０１４５】
別の態様において、本明細書において治療用ベクターとも称されるレンチウイルスベクターは、以下の要素：ハイブリッド５’末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号１５〜１６）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号１７）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）（配列番号１８）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ））（配列番号１９）、アンチαトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号６）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）（配列番号１〜４、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）（配列番号２０）およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号２１）を含む。実施形態において、本明細書において治療用ベクターとも称されるレンチウイルスベクターは、以下の要素：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号１５〜１６）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号１７）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）（配列番号１８）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号１９）、Ｈ１プロモーター（配列番号２２）、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ（配列番号１〜４）、アンチαトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号６）、ＰＡＨｓｈＲＮＡ（配列番号１〜４）、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）（配列番号２０）およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号２１）を含む。実施形態において、本明細書に引用された配列を修飾するために、置換、欠失、付加または変異による配列変形を使用することができる。
【０１４６】
別の態様において、ヘルパープラスミドは、以下の要素：ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチンエンハンサー（配列番号２３）；ＨＩＶ構成要素ｇａｇ（配列番号２４）；ＨＩＶ構成要素ｐｏｌ（配列番号２５）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２６）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２７）；およびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２８）を含む。別の態様において、ヘルパープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現するための第一のヘルパープラスミドと、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現するための第二のかつ別個のプラスミドとを含むように修飾され得る。実施形態において、本明細書に引用された配列を修飾するために、置換、欠失、付加または変異による配列変形を使用することができる。
【０１４７】
別の態様において、エンベローププラスミドは、以下の要素：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号２９）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号３０）を含む。実施形態において、本明細書に引用された配列を修飾するために、置換、欠失、付加または変異による配列変形を使用することができる。
【０１４８】
様々な態様において、レンチウイルスのパッケージングのために使用されるプラスミドは、ベクター機能の喪失なしに、様々な要素の置換、付加、除去または変異によって修飾される。例えば、限定されることなく、以下の要素は、パッケージング系を構成するプラスミド中の類似の要素を置き換えることができる。伸長因子−１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターを置き換えることができる。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギβグロビンポリＡを置き換えることができる。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株または系統群から構築することができる。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ＨＥＲＶ−Ｗを含むヒト内在性レトロウイルス、ヒヒ内在性レトロウイルスＢａＥＶ、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、インフルエンザＡトリペストウイルス（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）由来の膜糖タンパク質で置換することができる。
【０１４９】
様々なレンチウイルスのパッケージング系は、商業的に（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤからのＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキット）得ることができ、本明細書に記載されているとおりに設計することもできる。さらに、レンチウイルス粒子の産生効率を含む、あらゆる数の関連する要因を改善するために、レンチウイルスのパッケージング系の態様を置換または修飾することは、当業者の技能の範疇に属する。
【０１５０】
別の態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも使用することができる。実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＤＪ血清型である。実施形態において、ＡＡＶベクターは、血清型１〜１１のいずれかである。実施形態において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ−２である。実施形態において、ＡＡＶベクターは、ヒト肝細胞の最適な形質導入のために作出された非天然の種類である。
【０１５１】
ＡＡＶベクター構築  本開示の態様において、ＰＡＨコード配列（配列番号１〜４）およびｈＡＡＴプロモーター（配列番号６）と一緒のプロトロンビンエンハンサー（配列番号５）は、ｐＡＡＶプラスミド（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に挿入される。隣接するＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限部位を有するＰＡＨコード配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成される。ｐＡＡＶプラスミドおよびＰＡＨ配列は、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ酵素を用いて消化され、一緒に連結される。ＰＡＨ配列の挿入は、配列決定によって確認される。次に、プロトロンビンエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターは、隣接するＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位とともに、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成される。ＰＡＨコード配列およびプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーター配列を含有するｐＡＡＶプラスミドは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素を用いて消化され、一緒に連結される。プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターの挿入は、配列決定によって確認される。
【０１５２】
さらに、ＰＡＨを発現するための代表的なＡＡＶプラスミド系は、ＡＡＶヘルパープラスミド、ＡＡＶプラスミドおよびＡＡＶ  Ｒｅｖ／Ｃａｐプラスミドを含み得る。ＡＡＶヘルパープラスミドは、左側ＩＴＲ（配列番号３１）、プロトロンビンエンハンサー（配列番号５）、ヒトアンチαトリプシンプロモーター（配列番号６）、ＰＡＨ要素（配列番号１〜４）、ポリＡ要素（配列番号３２）および右側ＩＴＲ（配列番号３３）を含有し得る。ＡＡＶプラスミドは、適切なプロモーター要素（配列番号２３または配列番号２９）、Ｅ２Ａ要素（配列番号３４）、Ｅ４要素（配列番号３５）、ＶＡ  ＲＮＡ要素（配列番号３６）およびポリＡ要素（配列番号３２）を含有し得る。ＡＡＶ  Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、適切なプロモーター要素、Ｒｅｐ要素（配列番号３７）、Ｃａｐ要素（配列番号３８）およびポリＡ要素（配列番号３２）を含有し得る。
【０１５３】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーおよびＰＡＨ配列を含むＡＡＶ／ＤＪプラスミド（ＡＡＶ／ＤＪ−Ｐｒｏ−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、イントロンと、ＰＡＨ配列とを含むＡＡＶ／ＤＪプラスミド（ＡＡＶ／ＤＪ−Ｐｒｏ−イントロン−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、イントロンはヒトβグロビンイントロンである。実施形態において、イントロンはウサギβグロビンイントロンである。実施形態において、ＧＦＰを含むＡＡＶ／ＤＪプラスミド（ＡＡＶ／ＤＪーＧＦＰ）が提供される。
【０１５４】
実施形態において、プロトロンビンエンハンサーおよびＰＡＨ配列を含むＡＡＶ２プラスミド（ＡＡＶ２−Ｐｒｏ−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、プロトロンビンエンハンサーと、イントロンと、ＰＡＨ配列とを含むＡＡＶ２プラスミド（ＡＡＶ２−Ｐｒｏ−イントロン−ＰＡＨ）が提供される。実施形態において、イントロンはヒトβグロビンイントロンである。実施形態において、イントロンはウサギβグロビンイントロンである。実施形態において、ＧＦＰを含むＡＡＶ２（ＡＡＶ２−ＧＦＰ）が提供される。
【０１５５】
実施形態において、本明細書に開示されているＡＡＶベクターのいずれもが、制御性ＲＮＡを発現する配列を含有し得る。実施形態において、制御性ＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態において、制御性ＲＮＡは、配列番号１３または１４と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれを超えるパーセント同一性を有する配列を含む低分子ＲＮＡ配列である。
【０１５６】
ＡＡＶ粒子の作製。ＡＡＶ−ＰＡＨプラスミドを、プラスミドｐＡＡＶ−ＲＣ２（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と組み合わせる。ｐＡＡＶ−ＲＣ２プラスミドは、ＲｅｐおよびＡＡＶ−２キャプシド遺伝子を含有し、ｐＨｅｌｐｅｒはアデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子を含有する。ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ−８（配列番号３９）またはＡＡＶ−ＤＪ（配列番号４０）配列からもなり得る。ＡＡＶ粒子を作製するために、これらのプラスミドを、比率１：１：１（ｐＡＡＶ−ＰＡＨ：ｐＡＡＶ−ＲＣ２：ｐＨｅｌｐｅｒ）で、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトする。１５０ｍｍディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中での細胞のトランスフェクションのために、１０μｇの各プラスミドを１ｍＬのＤＭＥＭ中に一緒に添加する。別の管中で、６０μＬのトランスフェクション試薬ＰＥＩ（１μｇ／ｍＬ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍＬのＤＭＥＭに添加する。２つの管を一緒に混合し、１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、３日後に、細胞を収集する。ドライアイス／イソプロパノール中で、凍結／融解溶解によって、細胞を溶解する。３７℃で３０分間、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を細胞ライセートに添加する。次いで、４℃で１５分間、１２，０００ｒｐｍでの遠心によって、細胞残屑をペレットにする。上清を集め、次いで、標的細胞に添加する。
【０１５７】
投与量および剤形
開示されているベクター組成物は、目的の遺伝子または配列の短期、中期または長期発現および開示されたベクターのエピソームとしての維持を可能にする。したがって、投薬レジメンは、処置されている状態および投与の方法に基づいて変動し得る。
【０１５８】
実施形態において、ベクター組成物は、変動する用量で、必要とする被験体に投与され得る。具体的には、被験体は、約１０６感染量以上（１つの標的細胞を形質導入するために、平均して、１用量が必要とされる）を投与される。より具体的には、被験体は、ｋｇ体重当たり約１０７感染量以上、約１０８感染量以上、約１０９感染量以上、約１０１０感染量以上、約１０１１感染量以上もしくは約１０１２感染量以上またはこれらの値の間にある任意の数の用量を投与される。投薬の上限は、各疾患の徴候に対して決定され、各個別の製品または製品ロットに対する毒性／安全性プロファイルに依存するであろう。
【０１５９】
さらに、本開示のベクター組成物は、１日に１回もしくは２回など定期的にまたは他のあらゆる適切な期間、投与され得る。例えば、ベクター組成物は、必要とする被験体に、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１年に１回、１８ヶ月に１回、２年に１回、３０ヶ月に１回または３年に１回投与され得る。
【０１６０】
実施形態において、開示されたベクター組成物は、薬学的組成物として投与される。実施形態において、薬学的組成物は、臨床適用のための、鼻、肺、経口、局所または非経口剤形を含むがこれらに限定されない、様々な剤形で調合することができる。剤形の各々は、様々な、可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤などの希釈剤またはその他の薬学的に許容され得る賦形剤を含むことができる。薬学的組成物は、注射、ガス注入、注入または皮内曝露のために調合することもできる。例えば、注射可能な製剤は、適切なｐＨおよび張度で水性または非水性溶液中に開示されたベクターを含み得る。
【０１６１】
開示されたベクター組成物は、ガイド下注射を用いた肝臓中への直接的注射を介して被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、動脈または静脈循環を介して全身的に投与することができる。いくつかの実施形態において、ベクター組成物は、脾臓または膵臓を含む、肝臓を直接取り囲む組織へのガイド下カニューレ挿入を介して投与することができる。いくつかの実施形態において、ベクター組成物は、門脈または門脈洞（ｐｏｒｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）中への注射によって送達され得、臍静脈中への注射によって送達され得る。
【０１６２】
開示されたベクター組成物は、鼻内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）、肺、膣内、局所投与（ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）、乱刺後の局所投与、粘膜投与、エアロゾルを介した、アガロースもしくはゼラチンなどの半固体媒体中で、または頬側もしくは鼻スプレー製剤を介したなどの、あらゆる薬学的に許容され得る方法を用いて投与することができる。
【０１６３】
さらに、開示されたベクター組成物は、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カプセル、液体分散物、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、溶液、エマルジョンおよび懸濁物などの、あらゆる薬学的に許容され得る剤形に調合することができる。さらに、薬学的組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤またはこれらのあらゆる組み合わせであり得る。さらに、薬学的組成物は、経皮送達系であり得る。
【０１６４】
実施形態において、薬学的組成物は、経口投与のための固体剤形で調合することができ、固体剤形は粉末、顆粒、カプセル、錠剤または丸剤であり得る。実施形態において、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶セルロースまたはゼラチンなどの１またはそれを超える賦形剤を含むことができる。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、経口剤形は、即時放出または放出調節形態（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍ）であり得る。放出調節剤形には、制御放出または持続放出、腸内放出（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ）などが含まれる。放出調節剤形中で使用される賦形剤は、当業者に一般的に知られている。
【０１６５】
実施形態において、薬学的組成物は、舌下または頬側剤形として調合することができる。このような剤形は、舌下で投与される舌下錠剤または溶液組成物および頬と歯肉間に配置されるバッカル錠を含む。
【０１６６】
実施形態において、薬学的組成物は、鼻剤形として調合することができる。本開示のこのような剤形は、鼻送達用の溶液、懸濁物およびゲル組成物を含む。
【０１６７】
実施形態において、薬学的組成物は、懸濁物、エマルジョンまたはシロップなどの経口投与用液体剤形で調合することができる。実施形態において、液体剤形は、水および流動パラフィンなどの一般的に使用される単純な希釈剤に加えて、保湿剤、甘味剤、芳香剤（ａｒｏｍａｔｉｃｓ）または防腐剤などの様々な賦形剤を含むことができる。実施形態において、組成物は、小児患者に投与するのに適するように調合することができる。
【０１６８】
実施形態において、薬学的組成物は、無菌水溶液、懸濁物、エマルジョン、非水性溶液または坐剤など、非経口投与用剤形中に調合することができる。実施形態において、溶液または懸濁物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油またはオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルを含むことができる。
【０１６９】
薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与時間および様式、排泄速度ならびに疾患の重篤度に応じて変動し得る。
【０１７０】
実施形態において、ＰＫＵの処置は、針または血管内カニューレ挿入を用いた、開示されたベクター構築物の肝臓中へのガイド下での直接的注射によって達成される。実施形態において、ベクター組成物は、静脈もしくは動脈カニューレ挿入もしくは注射、皮内送達、筋肉内送達または肝臓近くの排出臓器（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｏｒｇａｎ）中への注射によって、脳脊髄液、血液またはリンパ循環中に投与される。
【０１７１】
以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供されている。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載されている具体的な条件または詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書中に引用されている全ての刊行物は、参照により、明確に組み込まれる。
【実施例】
【０１７２】
［実施例１］レンチウイルスベクター系の開発
【０１７３】
図１に要約されているように、レンチウイルスベクター系を開発した（環状化形態）。治療用ベクター、エンベローププラスミドおよびヘルパープラスミドでのトランスフェクション後に、（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州から購入された）２９３Ｔ／１７ＨＥＫ細胞中で、レンチウイルス粒子を作製した。機能的なウイルス粒子を産生した２９３Ｔ／１７ＨＥＫ細胞のトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡ取り込みの効率を増加させるために、試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を利用した。まず、無血清培養培地中に、プラスミドとＤＮＡを３：１（ＰＥＩのＤＮＡに対する質量比）の比で別々に添加した  ２〜３日後に、細胞培地を収集し、高速遠心および／またはろ過に続く陰イオン交換クロマトグラフィーによってレンチウイルス粒子を精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）を単位として表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶｐ２４レベル（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子中に組み込まれる）を測定し、定量的ＰＣＲによって、形質導入された細胞当たりのウイルスＤＮＡコピーの数を測定することによって、または細胞を感染させ、（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光性タンパク質マーカーをコードする場合）光を使用することによって達成された。
【０１７４】
上述されているように、レンチウイルス粒子の産生のために、３−ベクター系（すなわち、２−ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む）を設計した。３−ベクター系の模式図が、図１に示されている。簡潔には、図１を参照すると、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、本事例では、Ｒｅｖを含む。図１の中央に登場するベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書に記載されているように、治療用ベクターである。
【０１７５】
図１を参照すると、ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドは、ニワトリβアクチンプロモーターを伴うＣＭＶエンハンサー（配列番号２３）；ニワトリβアクチンイントロン（配列番号４１）；ＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号２４）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２５）；ＨＩＶインテグラーゼ（配列番号２６）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２７）；ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２８）；およびウサギβグロビンポリＡ（配列番号４２）を含む。
【０１７６】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２９）；βグロビンイントロン（配列番号７または８）；ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質（配列番号３０）；およびウサギβグロビンポリＡ（配列番号４２）を含む。
【０１７７】
ヘルパー（＋Ｒｅｖ）およびエンベローププラスミドからなる２−ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む３−ベクター系の合成が開示されている。
【０１７８】
材料および方法：
【０１７９】
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４−３ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  Ａｉｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）からのＤＮＡ断片の最初のＰＣＲ増幅によって、ヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に挿入するために使用することができるＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するために、プライマーを設計した。フォワードプライマーは（５’−ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号４３）であり、リバースプライマーは（５’−ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号４４）であった。
【０１８０】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片に対する配列は、以下のとおりであった。
【０１８１】
【化６】
2020535828.tif 000008
【化７】
2020535828.tif 000009
【化８】
2020535828.tif 000010
【０１８２】
次に、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって、ＲＲＥと、Ｒｅｖと、ウサギβグロビンポリＡ配列とを含有し、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位を有するＤＮＡ断片が合成された。次いで、このＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてプラスミド中に挿入した。ＤＮＡ配列は、以下のとおりであった。
【０１８３】
【化９】
2020535828.tif 000011
【化１０】
2020535828.tif 000012
【０１８４】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターをＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーターに加えて、ニワトリβアクチンイントロン配列）で置き換えた。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位を有する、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、このＤＮＡ断片を、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてプラスミド中に挿入した。ＤＮＡ配列は、以下のとおりであった。
【０１８５】
【化１１】
2020535828.tif 000013
【化１２】
2020535828.tif 000014
【０１８６】
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
【０１８７】
水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列は、隣接するＥｃｏＲＩ制限部位とともに、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、このＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ制限部位において、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを用いて配列決定することによって、正しい配向性を決定した。
【０１８８】
ＤＮＡ配列は、以下のとおりであった。
【０１８９】
【化１３】
2020535828.tif 000015
【化１４】
2020535828.tif 000016
【０１９０】
３−ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む４−ベクター系も設計し、本明細書に記載された方法および材料を用いて作製した。４−ベクター系の模式図が、図２に示されている。簡潔には、図２を参照すると、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、本事例では、Ｒｅｖを含まない。第二のベクターは、別個のＲｅｖプラスミドである。第三のベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書に記載されているとおりの治療用ベクターである。
【０１９１】
図２を参照すると、ヘルパープラスミドは、ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーター（配列番号２３）；ニワトリβアクチンイントロン（配列番号４１）；ＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号２４）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２５）；ＨＩＶインテグラーゼ（配列番号２６）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２７）；およびウサギβグロビンポリＡ（配列番号４２）を含む。
【０１９２】
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４８）；およびウサギβグロビンポリＡ（配列番号４２）を含む。
【０１９３】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２９）；βグロビンイントロン（配列番号７または８）；ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質（配列番号３０）；およびウサギβグロビンポリＡ（配列番号４２）を含む。
【０１９４】
一態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＡに示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＢ中に示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＣ中に示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＤ中に示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＥ中に示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＦ中に示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＧ中に示されている要素の全てを含む。別の態様において、ＰＡＨを発現する治療用レンチウイルスベクターは、図３のベクターＨ中に示されている要素の全てを含む。
【０１９５】
ヘルパー、Ｒｅｖおよびエンベローププラスミドからなる３−ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む４−ベクター系の合成が開示されている。
【０１９６】
材料および方法：
【０１９７】
Ｒｅｖなしのヘルパープラスミドの構築：
【０１９８】
ＲＲＥとウサギβグロビンポリＡ配列とを含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｒｅｖなしのヘルパープラスミドを構築した。この配列は、隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位とともに、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＲＲＥ／ウサギポリＡβグロビン配列を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてヘルパープラスミド中に挿入した。
【０１９９】
ＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【０２００】
【化１５】
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【０２０１】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
【０２０２】
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列は、隣接するＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位とともに、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって、単一のＤＮＡ断片として合成された。次いで、このＤＮＡ断片を、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターで置き換えられているｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位において挿入した。ＤＮＡ配列は、以下のとおりであった。
【０２０３】
【化１６】
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【０２０４】
パッケージング系中で使用されるプラスミドは、類似の要素を用いて修飾することができ、イントロン配列は、ベクター機能の喪失なしに、潜在的に除去され得る。例えば、以下の要素は、パッケージング系中の類似の要素を置き換えることができる。
【０２０５】
プロモーター：伸長因子−１（ＥＦ−１）（配列番号４９）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号５０）およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号５１）は、ＣＭＶ（配列番号２９）またはＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（配列番号２３）を置き換えることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２０６】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号５２）およびｂＧＨポリＡ（配列番号５３）は、ウサギβグロビンポリＡ（配列番号４２）を置き換えることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２０７】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株または系統群から構築することができる。例えば、Ｂａｌ株からのＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号２４）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２５）；およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２６）は、本明細書に概説されているとおりのヘルパー／ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミド中に含有されているｇａｇ、ｐｏｌおよびｉｎｔ配列と入れ替えることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２０８】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号５４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号５５）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号５６）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号５７）、インフルエンザＡトリペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号５８）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号５９）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号６０）またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号６１）由来の膜糖タンパク質で置換することができる。これらのエンベロープに対する配列は、本明細書中の配列部分において特定されている。さらに、これらの配列は、付加、置換、欠失または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２０９】
要約すると、３−ベクターと４−ベクター系は、以下のように比較対照することができる。３−ベクターレンチウイルスベクター系は、以下のものを含有する。１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、ＲＲＥおよびＲｅｖ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇエンベロープ；および３．治療用ベクター：ＲＳＶ、５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、プロトロンビンエンハンサー、α１アンチトリプシンプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ＷＰＲＥおよび３’ΔＬＴＲ。４−ベクターレンチウイルスベクター系は、以下のものを含有する。１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼおよびＲＲＥ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇエンベロープ；および４．治療用ベクター：ＲＳＶ、５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、プロトロンビンエンハンサー、α１アンチトリプシンプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ＷＰＲＥおよび３’ΔＬＴＲ。上記要素と一致する配列は、本明細書中の配列表部分において特定されている。
【０２１０】
［実施例２］治療用ベクター
【０２１１】
例えば、図３に示されているように、例示的な治療用ベクターを設計および開発した。
【０２１２】
まず、左から右へ、図３のベクターＡを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１３】
次に、左から右へ、図３のベクターＢを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサーの上流にあるＨＮＦ１（肝細胞核因子）結合部位、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１４】
次に、左から右へ、図３のベクターＣを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサーの上流にあるＨＮＦ１／４（肝細胞核因子）結合部位、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１５】
次に、左から右へ、図３のベクターＤを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサー、ＨＮＦ１（肝細胞核因子）、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１６】
次に、左から右へ、図３のベクターＥを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサー、ＨＮＦ１／４（肝細胞核因子）、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１７】
次に、左から右へ、図３のベクターＦを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサーの上流にある５つのＨＮＦ１（肝細胞核因子）結合部位、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１８】
次に、左から右へ、図３のベクターＧを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサーの上流にある３つのＨＮＦ１／ＨＮＦ４（肝細胞核因子）結合部位、ｈＡＡＴプロモーター、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２１９】
まず、左から右へ、図３のベクターＨを参照すると、主要な遺伝要素は、以下のとおりである：本明細書に詳述されているとおりの、ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、プロトロンビンエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーター、ウサギβグロビンイントロン、ＰＡＨ配列およびその改変体を含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）ならびにＵ３領域中に欠失を有するＬＴＲ。
【０２２０】
図３に一般的に概説されているベクターを作製するために、本明細書に記載されている方法および材料ならびに当業者によって理解されるその他を使用した。
【０２２１】
阻害性ＲＮＡの設計：ヒト細胞中のＰＡＨレベルをノックダウンするための潜在的なｓｈＲＮＡ候補を検索するために、ホモ・サピエンスフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）（ＮＭ＿０００２７７．１）ｍＲＮＡの配列を使用した。潜在的なＲＮＡｓｈＲＮＡ配列は、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって主催されるＧＰＰ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）などのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって選択された候補から選択された。ｓｈＲＮＡ発現を制御するために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＨ１（配列番号２２）のすぐ３’に、選択された個々のｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクター中に挿入した。細胞を形質導入し、特異的なｍＲＮＡレベルの変化を測定するために、これらのレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用した。
【０２２２】
ベクター構築：ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡのために、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温まで冷却する間にアニーリングした。１時間、３７℃で、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、レンチウイルスベクターを消化した。アガロースゲル電気泳動によって、消化されたレンチウイルスベクターを精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得たＤＮＡゲル抽出キットを用いて、ゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を測定し、ベクター対オリゴ（３：１の比）を混合し、アニーリングさせ、連結した。３０分間、室温で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行った。２５μＬのＳＴＢＬ３形質転換受容性細菌細胞に、２．５μＬの連結混合物を添加した。４２℃での熱ショック後に、形質転換が達成された。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、ＬＢブロス中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＮＡミニプレップキットを用いて、採集された細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。ｓｈＲＮＡ発現を制御するために使用されたプロモーターに対する特異的プライマーを用いるＤＮＡ配列決定によって、レンチウイルスベクター中でのｓｈＲＮＡ配列の挿入を確認した。以下の標的配列を用いて、ＰＡＨをノックダウンするために、例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した。
【０２２３】
ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１：
ＴＣＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧＣＧＡＴＴＴＴＴ（配列番号１３）
【０２２４】
ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２：
ＡＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号１４）
【０２２５】
［実施例３］肝臓特異的プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーター
【０２２６】
肝臓特異的プロトロンビンエンハンサー（配列番号５）およびヒトα−１アンチトリプシンプロモーター（配列番号６）を含有するレンチウイルスベクターで、Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーム細胞を形質導入した。得られたＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【化１７】
2020535828.tif 000019
これらの感染に対する結果は、本明細書中のさらなる実施例に詳述されている。
【０２２７】
［実施例４］プロトロンビンエンハンサーを伴うｈＡＡＴプロモーターおよび肝細胞核因子（ＨＦＮ）結合部位
【０２２８】
肝臓特異的プロトロンビンエンハンサー（配列番号５）、ヒトα−１アンチトリプシンプロモーター（配列番号６）および１またはそれを超える肝細胞核因子（ＨＮＦ）結合部位を含有するレンチウイルスベクターで、Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーム細胞を形質導入した。５つのＨＮＦ１結合部位（下線が付されたフォントで表記されている）を含む得られたＤＮＡ配列は以下のとおりであった。
【化１８】
2020535828.tif 000020
３つのＨＮＦ１／ＨＮＦ４結合部位（ＨＮＦ１は下線が付されたフォントで表記され、ＨＮＦ４は太字のフォントで表記されている）を含む得られたＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【化１９】
2020535828.tif 000021
これらのベクターからのＰＡＨの発現は、本明細書中のさらなる実施例に詳述されている。
【０２２９】
［実施例５］ＰＡＨのための材料および方法
【０２３０】
ホモサピエンスフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）ｍＲＮＡ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ：ＮＭ＿０００２７７．１）の配列は、この遺伝子の遠位および近位末端に位置するＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位とともに、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって化学的に合成された。ＡｐｏＥ（ＮＭ＿０００００１．１１、Ｕ３５１１４．１）またはプロトロンビン（ＡＦ４７８６９６．１）およびｈＡＡＴ（ＨＧ９８３８５．１）遺伝子座調節領域の一部を含むハイブリッドプロモーターの調節下において、ｐＣＤＨレンチウイルスプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中に、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素で処理されたｈＰＡＨを連結した。さらに、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の２８９ヌクレオチドを含めるために、ヒトＰＡＨを合成した。
【０２３１】
２時間、３７℃で、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて、レンチウイルスベクターおよびｈＰＡＨ配列を消化した。アガロースゲル電気泳動によって、消化されたレンチウイルスベクターを精製し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から得たＤＮＡゲル抽出キットを用いて、ゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を測定し、次いで、３：１の挿入物対ベクター比を用いて、ＰＡＨ配列（ｈＰＡＨ）と混合した。３０分間、室温で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて混合物を連結した。２５μＬのＳＴＢＬ３形質転換受容性細菌細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に、２．５μＬの連結混合物を添加した。４２℃での熱ショックによって、形質転換を実施した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を画線し、次いで、コロニーをＬＢブロス中で増殖させた。ＰＡＨ配列の挿入を確認するために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＤＮＡミニプレップキットを用いて、採集された細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター（ＬＶ）中のＰＡＨ配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次に、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有する、ＡｐｏＥエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターまたはプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーター配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。ＰＡＨコード配列およびハイブリッドプロモーターを含有するレンチウイルスベクターをＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で消化し、一緒に連結した。ＤＮＡ配列決定によって、ハイブリッドプロモーターを含有するプラスミドを確認した。次いで、レンチウイルス粒子をパッケージして形質導入された細胞中でＰＡＨを発現するその能力に関して試験するために、ｈＰＡＨおよびハイブリッドプロモーター配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。哺乳動物細胞をレンチウイルス粒子で形質導入した。３日後に細胞を収集し、ＰＡＨ発現に対するイムノブロットによって、タンパク質を分析した。
【０２３２】
ｈＰＡＨ配列の修飾：
【０２３３】
ＡｐｏＥエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによって制御される細胞発現レベルを改善するために、ｈＰＡＨ配列のいくつかの修飾を取り込んだ。まず、ＰＡＨコード領域の後およびｍＲＮＡ末端の前に、ｈＰＡＨ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の２８９ヌクレオチドを挿入した。これによって、ＬＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−ＵＴＲを作製した。
【０２３４】
次に、肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサーを肝臓特異的プロトロンビンエンハンサーと交換した。ｈＰＡＨコード配列およびＵＴＲの２８９ヌクレオチドを有するＡｐｏＥまたはプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターの組み合わせのいずれかを用いて、ＰＡＨの発現を分析した。次に、ＵＴＲ領域を有しない、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびｈＰＡＨコード配列を用いて、ＰＡＨの発現を評価した。プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターの組み合わせは、ＡｐｏＥエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターの組み合わせで必要とされるようなＵＴＲ領域の必要性をなくした。したがって、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターの組み合わせは、ＵＴＲ領域の必要性なしに、肝臓特異的な様式で、高いレベルのＰＡＨ発現を制御することができる。ｈＰＡＨ遺伝子を制御するための肝臓特異的制御要素を理解する上でのこの重要な進歩は、ｈＰＡＨの高レベルの産生をなお達成しながら、肝臓組織中での特異的発現のための構築物の生成を可能にする。導入遺伝子発現を肝細胞に限定することは、フェニルケトン尿症用の遺伝子医薬におけるベクターの安全性と標的特異性のための重要な考慮事項である。
【０２３５】
［実施例６］プロトロンビンエンハンサーの変形を有するおよび３’ＵＴＲを有するまたは有しないｈＰＡＨの、Ｈｅｐａ１−６細胞および２９３Ｔ細胞中でのレンチウイルスによって送達された発現
【０２３６】
本実施例は、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示されているように、プロトロンビンエンハンサーと組み合わせてｈＡＡＴプロモーターを含有するレンチウイルスベクターを用いることにより、ＡｐｏＥエンハンサーと比較して、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞および２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞中で、ヒトＰＡＨの発現が増加されることを説明する。プロトロンビンエンハンサーがｈＡＡＴプロモーターと組み合わされると、３’ＵＴＲはｈＰＡＨ発現のために必要とされない。３’ＵＴＲは、それぞれ、図４Ａおよび４Ｂに示されているように、プロトロンビンを含有するベクターにおけるＰＡＨ発現を実際には減少させる。本実施例は、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示されているように、プロトロンビンエンハンサーと組み合わされた肝細胞核因子１および４（ＨＮＦ１／４）結合部位を発現するレンチウイルスベクターが、Ｈｅｐａ１−６細胞および２９３Ｔ細胞中のＰＡＨタンパク質のレベルを増加させることも説明する。
【０２３７】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンおよびＡｐｏＥエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、レンチウイルスベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞または２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、その３’ＵＴＲを有するまたは有しないヒトＰＡＨ遺伝子を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、肝臓特異的プロトロンビンまたはＡｐｏＥエンハンサーのいずれかを含有するｈＡＡＴプロモーターによって駆動された。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、３日後に、ｈＰＡＨ発現に対するイムノブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対的発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用するイムノブロットによって検出され、ローディング対照のために抗βアクチン抗体（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた。
【０２３８】
図４Ａおよび４Ｂに示されているように、以下の６つの群が比較される：Ｈｅｐａ１−６細胞または２９３Ｔ細胞のみを含む対照（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、プロトロンビンエンハンサーの上流に５×ＨＮＦ１結合部位を含有するプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン３）、プロトロンビンエンハンサーの上流に３×ＨＮＦ１および３×ＨＮＦ４結合部位を含有するプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン４）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによって、３’ＵＴＲを有するｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン５）、およびＡｐｏＥエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによって、３’ＵＴＲを有するｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン６）。図４Ａおよび４Ｂは、ＡｐｏＥエンハンサーと比較した場合、プロトロンビンエンハンサーがｈＡＡＴプロモーターと組み合わされると、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞および２９３Ｔ細胞の両方において、ＰＡＨの発現が増加されることを実証する。さらに、プロトロンビンエンハンサーがベクター中に含められると、ｈＰＡＨ発現のために、ＰＡＨ３’ＵＴＲは必要とされない。
【０２３９】
［実施例７］イントロン配列、コドン最適化されたＰＡＨ配列およびＨＮＦ−１またはＨＮＦ１／４結合部位を含有するプロトロンビンエンハンサーを有するｈＰＡＨの、Ｈｅｐａ１−６細胞中での、レンチウイルスによって送達された発現
【０２４０】
本実施例は、図５Ａに示されているように、プロトロンビンエンハンサーおよびウサギβグロビンイントロン配列と組み合わせたｈＡＡＴプロモーターを含有するレンチウイルスベクターによって、ヒトＰＡＨの発現が、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞中で増加されることを説明する。イントロン配列が逆方向で挿入されると、ｈＰＡＨは発現されない。図５Ｂでは、これは、ｈＰＡＨコード配列のコドン最適化されたバージョンが、最適化されていないｈＰＡＨコード領域配列より発現が少ないことを示す。本実施例は、図５Ｃに示されているように、プロトロンビンエンハンサーと組み合わされた肝細胞核因子−１および−４（ＨＮＦ１およびＨＮＦ１／４）結合部位を発現するレンチウイルスベクターは、Ｈｅｐａ１−６細胞中のｈＰＡＨタンパク質のレベルを増加させることも説明する。
【０２４１】
ヒトＰＡＨ（最適化されているおよび最適化されていない）、プロトロンビンエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビン配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、レンチウイルスベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、ウサギβグロビンイントロンを有するまたは有しないヒトＰＡＨ遺伝子を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、プロトロンビンエンハンサーの上流または下流のいずれかに、ＨＮＦ１またはＨＮＦ１／４結合部位を有する肝臓特異的プロトロンビンエンハンサーを含有するｈＡＡＴプロモーターによって駆動された。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、３日後に、ＰＡＨ発現に対するイムノブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対的発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用するイムノブロットによって検出され、ローディング対照のために抗βアクチン抗体（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた。
【０２４２】
図５Ａに示されているように、以下の４つの群が比較される：Ｈｅｐａ１−６細胞のみを含む対照（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現し、順方向にウサギβグロビンイントロンを含有するレンチウイルスベクター（レーン３）およびプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現し、逆方向にウサギβグロビンイントロンを含有するレンチウイルスベクター（レーン４）。図５Ｂに示されているように、３つの群が比較される：Ｈｅｐａ１−６細胞のみを含む対照（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域のみを発現するレンチウイルスベクター（レーン２および３）およびプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコドン最適化された配列を発現するレンチウイルスベクター（レーン４）。図５Ｃに示されているように、以下の６つの群が比較される：Ｈｅｐａ１−６細胞のみを含む対照（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域のみを発現するレンチウイルスベクター（レーン２および３）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現し、ウサギβグロビンイントロンを含有するレンチウイルスベクター（レーン４）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの上流にあるＨＮＦ１結合部位によってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン５）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの下流にあるＨＮＦ１結合部位によってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン６）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの上流にあるＨＮＦ１／４結合部位によってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン７）、ならびにプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの下流にあるＨＮＦ１／４結合部位によってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン８）。図５Ａ〜５Ｃは、ウサギβグロビンイントロン配列がｈＰＡＨコード配列の上流に追加されると、ｈＰＡＨの発現がＨｅｐａ１−６癌腫細胞中で増加されることを実証する。さらに、コドン最適化されたｈＰＡＨコード配列は、最適化されていない配列よりも発現が少ない。最後に、プロトロンビンエンハンサーの上流へのＨＮＦ１またはＨＮＦ１／４結合部位の追加は、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターのみを含有するレンチウイルスベクターと比較して、ｈＰＡＨの発現を増加させるが、下流への追加は増加させない。
【０２４３】
［実施例８］ｈＡＡＴプロモーターならびにＨＮＦ−１およびＨＮＦ−１／４結合部位を含有するプロトロンビンエンハンサーを有するｈＰＡＨ  ＲＮＡの、Ｈｅｐａ１−６細胞中でのレンチウイルスによって送達された発現
【０２４４】
図６に示されているように、本実施例は、１および５の感染効率（ＭＯＩ）で、プロトロンビンエンハンサーならびにＨＮＦ１およびＨＮＦ１／４に対する結合部位と組み合わされたｈＡＡＴプロモーターを含有するレンチウイルスベクターが形質導入されたＨｅｐａ１−６癌腫細胞中で、ヒトＰＡＨ  ＲＮＡの発現が増加されることを説明する。
【０２４５】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、レンチウイルスベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、ヒトＰＡＨ遺伝子を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、上流のＨＮＦ１またはＨＮＦ１／４結合部位を有する肝臓特異的プロトロンビンエンハンサーを含有するｈＡＡＴプロモーターによって駆動された。レンチウイルス粒子で細胞を形質導入し、３日後に、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＴＣＧＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣ−３’）（配列番号６６）ならびにｈＰＡＨに対するプライマーセットフォワード：５’−ＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＧＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＧ−３’（配列番号６７）およびリバース：５’−ＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴ−３’（配列番号６８）を用いたｑＰＣＲ分析によって分析した。アクチンプローブ（５’−ＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣ−３’）（配列番号６９）およびプライマーセット（フォワード：５’−ＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号７０）およびリバース：５’−ＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴ−３’）（配列番号７１）を用いて、全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を正規化した。
【０２４６】
図６に示されているように、以下の４つの群が比較される：Ｈｅｐａ１−６細胞のみを含む対照（バー１）、１ＭＯＩ（バー２）および５ＭＯＩ（バー５）でプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター、１ＭＯＩ（バー３）および５ＭＯＩ（バー６）で、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの上流にあるＨＮＦ１結合部位によって、ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターならびに１ＭＯＩ（バー４）および５ＭＯＩ（バー７）で、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの上流にあるＨＮＦ１／４結合部位によって、ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター。図６は、ＰＡＨ  ＲＮＡの発現は、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するベクターを用いると、１から４．７ｐｇ（１〜５ＭＯＩ）に増加することを実証する。ＨＮＦ１結合部位がプロトロンビンエンハンサーの上流に含められると、２．３から１０．７ｐｇ（１〜５ＭＯＩ）まで増加し、ＨＮＦ１／４結合部位がプロトロンビンエンハンサーの上流に挿入されると、３から１７．８ｐｇ（１〜５ＭＯＩ）まで増加する。
【０２４７】
［実施例９］プロトロンビンエンハンサーおよびｈＡＡＴまたはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターのいずれかを有するｈＰＡＨの、Ｈｅｐａ１−６細胞中での、レンチウイルスによって送達された発現
【０２４８】
本実施例は、図７に示されているように、ｈＡＡＴプロモーターと組み合わされたプロトロンビンエンハンサーを含有するレンチウイルスベクターによって、ＴＢＧプロモーター（配列番号６２）と比較して、ヒトＰＡＨの発現が、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞中で増加されることを説明する。
【０２４９】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンエンハンサーならびにｈＡＡＴおよびＴＢＧプロモーターは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、レンチウイルスベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、ヒトＰＡＨ遺伝子を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、肝臓特異的ｈＡＡＴまたはＴＢＧプロモーターのいずれかによって駆動された。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、３日後に、ＰＡＨ発現に対するイムノブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対的発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用するイムノブロットによって検出され、ローディング対照のために抗βアクチン抗体（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた。
【０２５０】
図７に示されているように、以下の４つの群が比較される：プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現し、ウサギβグロビンイントロンを含有するレンチウイルスベクター（レーン２）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターのみを含有するレンチウイルスベクターを用いた対照（レーン３）、およびプロトロンビンエンハンサー／ＴＢＧプロモーターによってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン４）。図７は、プロトロンビンエンハンサーがｈＡＡＴプロモーターと組み合わされると、ＴＢＧプロモーターと比較して、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞中で、ＰＡＨの発現が大幅に増加することを実証する。
【０２５１】
［実施例１０］ＰＡＨ遺伝子の上流にあるウサギまたはヒトのいずれかのβグロビンイントロン配列を有するｈＰＡＨの、Ｈｅｐａ１−６細胞またはＨｅｐ３Ｂ細胞中でのレンチウイルスによって送達された発現
【０２５２】
本実施例は、図８Ａおよび８Ｂに示されているように、ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギまたはヒトのいずれかのβグロビンイントロンと組み合わされたプロトロンビンエンハンサーを含有するレンチウイルスベクターを用いたＨｅｐａ１−６およびＨｅｐ３Ｂ癌腫細胞中でのヒトＰＡＨの発現が、ヒトβグロビンイントロンによって増加されないことを説明する。
【０２５３】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギまたはヒトβグロビンイントロンは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、レンチウイルスベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞またはＨｅｐ３Ｂヒト肝細胞癌腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、ヒトＰＡＨ遺伝子を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギまたはヒトβグロビンイントロンのいずれかによって駆動された。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、３日後に、ＰＡＨ発現に対するイムノブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対的発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用するイムノブロットによって検出され、ローディング対照のために抗βアクチン抗体（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた。
【０２５４】
図８Ａおよび８Ｂに示されているように、以下の４つの群が比較される：レンチウイルスなし（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビンイントロン配列によってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン３）、ならびにプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびヒトβグロビンイントロンによってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン４）。図８Ａおよび８Ｂは、プロトロンビンエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターを有するＨｅｐａ１−６およびＨｅｐ３Ｂ癌腫細胞中で、ＰＡＨの発現が増加されることを実証する。ウサギβグロビンイントロンの添加は、Ｈｅｐａ１−６細胞中での発現を改善するが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中では改善しない。ヒトβグロビンイントロンは、Ｈｅｐａ１−６またはＨｅｐ３Ｂ細胞のいずれにおいても、発現を改善しない。
【０２５５】
［実施例１１］プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターを有するｈＰＡＨの、初代ヒト肝細胞中でのレンチウイルスによって送達された発現
【０２５６】
本実施例は、図９に示されているように、ｈＡＡＴプロモーターと組み合わされたプロトロンビンエンハンサーを含有するレンチウイルスベクターを用いた、初代ヒト肝細胞中で、ヒトＰＡＨの発現が大幅に増加されることを説明する。
【０２５７】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンおよびＡｐｏＥエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、レンチウイルスベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、初代ヒト肝細胞（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、ヒトＰＡＨのコード配列またはコード配列および３’ＵＴＲを取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、肝臓特異的プロトロンビンまたはＡｐｏＥエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターによって駆動された。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、４日後に、ＰＡＨ発現に対するイムノブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対的発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用するイムノブロットによって検出され、ローディング対照のために抗βアクチン抗体（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた。
【０２５８】
図９に示されているように、以下の５つの群が比較される：プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターのみを含有するレンチウイルスベクターを用いた対照（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの上流にある５×ＨＮＦ１結合部位によってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン３）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現し、ウサギβグロビンイントロンを含有するレンチウイルスベクター（レーン４）、ならびに３’ＵＴＲを有し、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン５）。図９は、プロトロンビンエンハンサーがｈＡＡＴプロモーターと組み合わされると、ＡｐｏＥエンハンサーと比較して、初代ヒト肝細胞中で、ＰＡＨの発現が増加されることを実証する。また、ｈＰＡＨコード配列の上流にウサギβグロビンイントロン配列を含めることは、ｈＰＡＨ発現を増強する。
【０２５９】
［実施例１２］Ｈｅｐａ１−６細胞中での、レンチウイルスによって送達されたｈＰＡＨの酵素活性
【０２６０】
本実施例は、それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｃおよび１０Ｂに示されているように、ｈＰＡＨがＨｅｐａ１−６細胞中で発現されると、細胞培地および細胞ライセート中のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの減少によって示されるとおり、レンチウイルスによって送達されるヒトＰＡＨは酵素的に活性であることを説明する。補因子ＢＨ４の前駆体、セピアプテリンは、Ｈｅｐａ１−６細胞中のＰＡＨ活性のために必要であった。
【０２６１】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンエンハンサーおよびＡｐｏＥエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビンイントロンを合成し、レンチウイルスベクター中に挿入した。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用した。レンチウイルスベクターは、ヒトＰＡＨのコード配列を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、肝臓特異的プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによって駆動され、ウサギβグロビンイントロン配列を含んだ。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、４日後に、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｓｓａｙキット（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、細胞培地または細胞ライセートのいずれかからのフェニルアラニンレベルを測定した。
【０２６２】
図１０Ａおよび１０Ｂに示されているように、図１０Ａ中の細胞培地からまたは図１０Ｂ中の細胞ライセートから、４つの群が比較されている。セピアプテリンなし（バー１）またはセピアプテリンあり（バー３）の、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターのみを含有するレンチウイルスベクターを用いる対照、セピアプテリンなし（バー２）またはセピアプテリンあり（バー４）の、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現し、ウサギβグロビンイントロン配列を含有するレンチウイルスベクター。図１０Ｃに示されているように、１０の群が細胞培地から比較されている。セピアプテリンなし（バー１）またはセピアプテリンあり（バー６）の、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターのみを含有するレンチウイルスベクターを用いる対照、セピアプテリンなし（バー２）またはセピアプテリンあり（バー７）の、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター、セピアプテリンなし（バー３）またはセピアプテリンあり（バー８）の、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびプロトロンビンエンハンサーの上流にある５×ＨＮＦ１結合部位によってｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター、セピアプテリンなし（バー４）またはセピアプテリンあり（バー９）の、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨのコード領域を発現し、ウサギβグロビンイントロン配列を含有するレンチウイルスベクター、セピアプテリンなし（バー５）またはセピアプテリンあり（バー１０）の、ＡｐｏＥエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによって、３’ＵＴＲを含むｈＰＡＨのコード領域を発現するレンチウイルスベクター。図１０Ａおよび１０Ｂは、セピアプテリンの存在下で、ｈＰＡＨがＨｅｐａ１−６細胞中において酵素的に活性であることを示す。図１０Ａに示されているとおり、ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターで形質導入されたＨｅｐａ１−６細胞中において、細胞培地フェニルアラニンレベルの３８％の減少が存在した。細胞ライセートでは、図１０Ｂに示されているとおり、ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターで形質導入されたＨｅｐａ１−６細胞において、フェニルアラニンレベルの８８％の減少が存在した。図１０Ｃは、異なる肝臓特異的プロモーター要素を含有するベクター中で、ｈＰＡＨは酵素的に活性であることを示す。プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびｈＰＡＨを含有するベクターによるＰｈｅレベルの４１％の減少、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターの上流にある５×ＨＮＦ１結合部位およびｈＰＡＨを含有するベクターによるＰｈｅレベルの４３％の減少、ウサギβグロビンイントロンを含むプロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターとｈＰＡＨとを含有するベクターによるＰｈｅレベルの４８％の減少、ならびにＡｐｏＥエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターと３’ＵＴＲを含むｈＰＡＨとを含有するベクターによるＰｈｅレベルの３６％の減少が存在した。
【０２６３】
［実施例１３］レンチウイルスによって送達されるＰＡＨは、ＰＡＨ変異体マウスの血液中で血中フェニルアラニンレベルを減少させる。
【０２６４】
本実施例は、レンチウイルスによって送達されるＰＡＨが、Ｐａｈｅｎｕ２変異体マウスの血液中のフェニルアラニンレベルを減少させることを説明する。Ｐａｈｅｎｕ２変異体マウスは、Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙら（Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４：１２０５−１２１０（Ａｕｇｕｓｔ、１９９３））に記載され、特徴付けられており、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。Ｐａｈｅｎｕ２変異体マウス（ｎ＝４）に、尾静脈を介して、１５０μＬ容量のＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ（ＡＧＴ３２３）ベクターを注射した。処置された対照動物には、尾静脈を介して、レンチウイルスベクターを含有しない生理食塩水を注射した。形質導入された２９３Ｔ細胞中の組み込まれたベクターコピーのｑＰＣＲ検出によって測定すると、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ（ＡＧＴ３２３）の力価は１×１０１０であった。注射の時点で、マウスは６〜８週齢であった。ベクター注射の前（Ｔ＝０）、注射の１および２週後に血液を収集した。
【０２６５】
フェニルアラニンレベルの測定のために、顔面静脈を介して血液を収集した。ランセットを使用して頬を穿刺し、血清管中に４００μＬの全血を収集した。血液を１時間静置し、次いで、管を遠心した。血漿／血清が上部層上に分離され、収集された。次いで、臨床用アミノ酸分析機器上で分析されるまで、血漿を凍結させた。
【０２６６】
ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ（ＡＧＴ３２３）ベクターの導入は、注射後１週および２週の両方で、血中フェニルアラニンレベルの低下を引き起こした。表１および図１１に示されているように、１週および２週の時点での平均μＭレベルの血中フェニルアラニンは、それぞれ、１６７４．７および１８９０であった。これは、約２４００〜約２５００の間の対照処置されたマウスの平均μＭ血中フェニルアラニンレベルと比較されている（表１および図１１）。
【０２６７】
さらに、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ（ＡＧＴ３２３）ベクターの導入は、肝細胞の遺伝的改変をもたらした。剖検の間に集められた肝臓に対するベクターコピー数の研究は、レンチウイルスベクターコピー数が、これらの研究において約０．２／細胞であることを示した。図１２に示されているように、肝臓中の増加するベクターコピー数とフェニルアラニンの減少するレベルとの間には、概ね、線形の関係性が存在する（ピアソン積相関係数＝−０．３２６）。
【０２６８】
２０％以上の血中フェニルアラニンレベルの減少は、フェニルケトン尿症疾患を有するヒト患者に対して治療上の利益を与え、患者の診断を古典的ＰＫＵから軽症型フェニルケトン尿症へ移行させる可能性がある。
【表１】
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【０２６９】
［実施例１４］ＤＪまたはＡＡＶ２血清型のいずれかを用いたｈＰＡＨの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのＡＡＶによって送達された発現
【０２７０】
本実施例は、ウサギβグロビンイントロンありまたはなしで、ｈＡＡＴプロモーターと組み合わされたプロトロンビンエンハンサーを含有するＡＡＶベクターを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で、ヒトＰＡＨが発現されることを説明する。
【０２７１】
ヒトＰＡＨ、プロトロンビンエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビンイントロンは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルイビル、ケンタッキー州）によって合成され、ＡＡＶベクター中に挿入された。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を形質導入するために、確認されたｈＰＡＨ配列を含有するＡＡＶベクターを使用した。ＡＡＶベクターは、本明細書に開示されているとおりにヒトＰＡＨ遺伝子を取り込んだ。さらに、これらの構築物中でのｈＰＡＨ発現は、肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビンイントロンによって駆動された。細胞をＡＡＶ粒子で形質導入し、３日後に、ＰＡＨ発現に対するイムノブロットまたはｑＰＣＲによってタンパク質またはＲＮＡを分析した。ヒトＰＡＨタンパク質の発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用するイムノブロットによって検出され、ローディング対照のために抗βアクチン抗体（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いた。ＴａｑＭａｎ  Ｆａｍ標識されたプローブ（配列番号６６）およびＰＡＨプライマー（フォワード：配列番号６７；リバース：配列番号６８）を用いるｑＰＣＲによって、ＰＡＨ  ＲＮＡ発現を検出した。
【０２７２】
図１３Ａは、以下の６つの群の比較を示す：ＡＡＶ／ＤＪ−ＧＦＰベクター（レーン１）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するＡＡＶ／ＤＪベクター（レーン２）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビンイントロン配列によってｈＰＡＨを発現するＡＡＶ／ＤＪベクター（レーン３）、ＡＡＶ２−ＧＦＰベクター（レーン４）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターによってｈＰＡＨを発現するＡＡＶ２ベクター（レーン５）、プロトロンビンエンハンサー／ｈＡＡＴプロモーターおよびウサギβグロビンイントロン配列によってｈＰＡＨを発現するＡＡＶ２ベクター（レーン６）。
【０２７３】
図１３Ｂおよび１３Ｃは、図１３Ａ中のＰＡＨバンドの増加した曝露後におけるブロットを示す。定量的画像化によって分析される範囲にバンド密度が入るように、曝露を増加させた。元のバンド強度は、ＡＡＶ／ＤＪ血清型ベクターでの処置を示すブロットと比べて、ＡＡＶ／２血清型ベクターでの処置を示すブロット上ではずっと低かった。その結果、ＰＡＨタンパク質の定量的測定を行うために、ＡＡＶ／ＤＪ血清型ブロットと比較して、ＡＡＶ／２血清型ブロット上では、より長い曝露時間が必要とされた。
【０２７４】
定量的画像化の結果は、ウサギβグロビンイントロンを含むＡＡＶ／ＤＪベクターまたはウサギβグロビンイントロンを欠くＡＡＶ／ＤＪベクターのいずれかを用いると、ＰＡＨタンパク質発現が２倍増加したことを示した（図１３Ｂ；バンドの下の数字は、相対的倍数増加を示す）。ウサギβグロビンイントロンを有するＡＡＶ／２ベクターの使用はＰＡＨの発現を抑制したのに対して、ウサギβグロビンイントロンを有しないＡＡＶ２ベクターの使用は、ＰＡＨの５０倍増加をもたらした（図１３Ｃ；バンドの下の数字は、相対的倍数増加を示す）。ＡＡＶ血清型間でのＰＡＨ発現の比較は、ＡＡＶ／ＤＪ  ＰＡＨベクターの使用は、ＡＡＶ２  ＰＡＨベクターの使用と比較して、ＰＡＨタンパク質のより高い発現をもたらすことを明らかにした。
【０２７５】
図１３Ｄは、ＰＡＨ  ＲＮＡ発現が、ＡＡＶ２  ＰＡＨベクターと比較して、ＡＡＶ／ＤＪ  ＰＡＨベクターでより高く、ウサギβグロビンイントロンありおよびなしで、類似の発現が存在することを実証する。
【０２７６】
［実施例１５］新生仔ｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス中のＰＫＵに対するレンチウイルスベクター治療
【０２７７】
肝臓中への直接注射を介して、１０μＬのベクターストックＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨで新生仔ｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス（生後３日）を処置した。処置されない動物は、ベクターなしの生理食塩水を受けた（シャム対照）。約５×１０６形質導入単位／マウス（約１０９形質導入単位／ｋｇ）の最終用量のために、ベクターストックは、無菌生理食塩水中において（ＨＥＫ２９３細胞中で測定された）約５×１０８形質導入単位／ｍＬであった。
【０２７８】
表２および図１４に示されているように、血中フェニルアラニンレベルのμＭ濃度は、処置されていないｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス（２０６３＋／−１８５）と比較して、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ処置されたｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス（１３９０＋／−１２７）中で著しく低下した。
【表２】
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【０２７９】
［実施例１６］ＰＡＨ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とするｓｈＰＡＨの発現は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中でのＬＶ−Ｈ１−ｓｈＰＡＨ−プロトロンビン−ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨによるＰＡＨ発現を抑制しない
【０２８０】
本実施例は、ｓｈＰＡＨが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中でのレンチウイルスベクター、ＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ｓｈＰＡＨ配列＃１（配列番号１３）からの、またはレンチウイルスベクターＬＶ−Ｐｒｏ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ｓｈＰＡＨ配列＃２（配列番号１４）からのＰＡＨ発現を抑制しないことを説明する。
【０２８１】
本明細書に開示されているヒトＰＡＨを合成し、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１３）またはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号１４）のいずれかを含有するレンチウイルスベクター中に挿入した。これらの配列の挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。次いで、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州から購入した）を形質導入するために、ＰＡＨ単独またはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列番号＃１（配列番号１３）もしくはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列番号＃２（配列番号１４）のいずれかとの組み合わせのいずれかを含有するレンチウイルスベクターを使用した。細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、３日後に、ＰＡＨ発現に対するウェスタンブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対的発現は、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）およびローディング対照β−アクチンを使用するイムノブロットによって検出された。ｈＰＡＨ発現は、プロトロンビンエンハンサーおよびｈＡＡＴプロモーターによって駆動された。レンチウイルスベクターは、様々な事例において、ヒトＰＡＨ遺伝子とＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１３）またはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号１４）とを取り込んだ。ｓｈＰＡＨ−２発現を制御するために使用されたプロモーターに対して相補的なプライマーを用いたＤＮＡ配列決定によって、レンチウイルスベクター（ＬＶ）中でのｓｈＲＮＡ配列の挿入を確認した。この事例では、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ発現を制御するためにＨ１プロモーターを使用した。ｓｈＰＡＨに対する標的配列−（ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１３）またはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号１４））は、ＬＶ−ＰＡＨベクター中には存在しないＰＡＨ  ３’ＵＴＲ中にある。
【０２８２】
図１５に示されているように、レンチウイルス由来のＰＡＨの発現は、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１３）またはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号１４）のいずれによっても抑制されない。
【０２８３】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
2020535828.tif 000034
【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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