(57)【要約】  ＤＮＡメチル化を評価するための方法およびキットである。より詳細には、完全にまたは部分的にメチル化されたＤＮＡのシトシンメチル化を、感度を改善して定性的または定量的のいずれかで評価する方法である。本方法およびキットは、シトシンメチル化の変化によって特徴付けされる状態の診断または表現型の発達のモニタリングを含むが、これらに限定されない様々な用途に有用である。【選択図】図５
2020534820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、前記試料が、前記目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を、
ａ）前記目的のＤＮＡ領域の修飾された前記標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）前記目的のＤＮＡ領域の修飾された前記反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の前記プライマーがメチル化特異的である場合に任意で、前記標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）の前記プライマーがメチル化特異的でない場合に、前記標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、前記プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）の前記プローブのうちの１つ以上が使用される場合に、前記遺伝子に沿った前記プライマーの伸長が、ハイブリダイズした前記プローブの前記検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法。
【請求項２】
患者の状態を診断またはモニタリングする方法であって、前記状態が目的のＤＮＡ領域のメチル化の調節によって特徴付けられ、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、前記試料が、前記目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記ＤＮＡ試料を、
ａ）前記目的のＤＮＡ領域の修飾された前記標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）前記目的のＤＮＡ領域の修飾された前記反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の前記プライマーがメチル化特異的である場合に任意で、前記標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）の前記プライマーがメチル化特異的でない場合に、前記標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）の前記プローブのうちの１つ以上が使用される場合に、前記遺伝子に沿った前記プライマーの伸長が、ハイブリダイズした前記プローブの前記検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ試料が、前記目的のＤＮＡ領域の低コピー数を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的のＤＮＡ領域内の１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化が分析される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記状態が、腫瘍性状態である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記目的の核酸標的が、ＤＮＡ遺伝子または遺伝子領域である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子領域が、プロモーター領域である、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が、大腸腫瘍マーカーなどの腫瘍マーカー、特に腺腫または腺がんのマーカーである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記大腸腫瘍マーカーが、
【表１４７】
2020534820.tif 000150
の遺伝子のうちの１つ以上であり、前記遺伝子が、転写開始部位の５ｋｂ上流を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記大腸腫瘍マーカーが、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、もしくはＣＡＨＭ遺伝子のうちの１つ以上、または転写開始部位の５ｋｂ上流である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記大腸腫瘍マーカーが、（ｉ）ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１、（ｉｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＩＲＦ４、（ｉｉｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＧＲＡＳＰ、（ｉｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＣＡＨＭ、（ｉｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、およびＧＲＡＳＰ、（ｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、およびＣＡＨＭ、もしくは（ｖｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、およびＣＡＨＭ、またはこれらの遺伝子の転写開始部位の５ｋｂ上流から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、非メチル化シトシン残基をウラシルに修飾する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、亜硫酸水素塩である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記亜硫酸水素塩が、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ亜硫酸水素ナトリウムである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、メチル化特異的プライマーを使用するがプローブは使用しない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プローブを使用する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、メチル化特異的プライマーおよびメチル化特異的プローブを使用する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、非メチル化特異的プライマーおよびメチル化特異的プローブを使用する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブが、加水分解プローブである、請求項１〜１６および１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブが、前記目的のＤＮＡ領域での完全な、および部分的なメチル化パターンの全てに集合的にハイブリダイズする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１４８】
2020534820.tif 000151
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１４９】
2020534820.tif 000152
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１５０】
2020534820.tif 000153
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１５１】
2020534820.tif 000154
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１５２】
2020534820.tif 000155
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１５３】
2020534820.tif 000156
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１５４】
2020534820.tif 000157
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１５５】
2020534820.tif 000158
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１５６】
2020534820.tif 000159
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１５７】
2020534820.tif 000160
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１５８】
2020534820.tif 000161
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１５９】
2020534820.tif 000162
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子がＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１６０】
2020534820.tif 000163
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１６１】
2020534820.tif 000164
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１６２】
2020534820.tif 000165
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１６３】
2020534820.tif 000166
の配列または実質的に同様な配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子がＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１６４】
2020534820.tif 000167
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１６５】
2020534820.tif 000168
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１６６】
2020534820.tif 000169
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１６７】
2020534820.tif 000170
の配列または実質的に同様な配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子がＩＲＦ４であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１６８】
2020534820.tif 000171
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１６９】
2020534820.tif 000172
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１７０】
2020534820.tif 000173
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１７１】
2020534820.tif 000174
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子がＩＲＦ４であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１７２】
2020534820.tif 000175
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１７３】
2020534820.tif 000176
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１７４】
2020534820.tif 000177
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１７５】
2020534820.tif 000178
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子がＩＲＦ４であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１７６】
2020534820.tif 000179
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１７７】
2020534820.tif 000180
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１７８】
2020534820.tif 000181
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１７９】
2020534820.tif 000182
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
２つ以上の遺伝子領域のメチル化が分析される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ試料が、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿から単離される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ試料が、循環セルフリーＤＮＡまたは循環腫瘍ＤＮＡである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅が、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、等温増幅、またはシグナル増幅である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記状態が、腫瘍性状態である、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍性状態が、悪性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記状態が、腺腫または腺がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記腺がんが、結腸直腸の腺がんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記低コピー数が、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である、請求項３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記低コピー数が、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である、請求項３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記低コピー数が、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である、請求項３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記増幅が定量的ＰＣＲであり、前記低コピー数がＬＯＤである、請求項３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ステップ（ｉｖ）の結果が、偽陰性結果の低減された発生を示す、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡが、ヒトＤＮＡである、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
複数のＤＮＡ領域がスクリーニングの対象であるが、目的のＤＮＡ領域の標的鎖のみを増幅する方法を使用して、少なくとも１つの前記ＤＮＡ領域がスクリーニングされる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングするためのキットであって、
ａ）前記目的のＤＮＡ領域の標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセットであって、プライマーが、非メチル化シトシンの薬剤による修飾を受けている前記目的のＤＮＡ領域の形態にハイブリダイズするように設計されている、第１のセットと、
ｂ）前記目的のＤＮＡ領域の修飾された前記反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセットと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の前記プライマーがメチル化特異的である場合に任意で、前記標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）の前記プライマーがメチル化特異的でない場合に、前記標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、を含む、キット。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ領域が、
【表１８０】
2020534820.tif 000183
の遺伝子のうちの１つ以上であり、前記遺伝子が、転写開始部位の５ｋｂ上流を含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記遺伝子が、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、もしくはＣＡＨＭ遺伝子のうちの１つ以上、または転写開始部位の５ｋｂ上流である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記遺伝子が、（ｉ）ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１、（ｉｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＩＲＦ４、（ｉｉｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＧＲＡＳＰ、（ｉｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＣＡＨＭ、（ｉｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、およびＧＲＡＳＰ、（ｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、およびＣＡＨＭ、もしくは（ｖｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、およびＣＡＨＭ、またはこれらの遺伝子の転写開始部位の５ｋｂ上流から選択される、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記薬剤が、非メチル化シトシン残基をウラシルに修飾し、かつ前記薬剤が、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩であり得る、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
前記キットが、メチル化特異的プライマーを含むがプローブを含まない、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
前記キットが、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プローブを含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記キットが、メチル化特異的プライマーおよびメチル化特異的プローブを含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記キットが、非メチル化特異的プライマーおよびメチル化特異的プローブを含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記プローブが、加水分解プローブである、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記プローブが、前記目的のＤＮＡ領域での完全な、および部分的なメチル化パターンの全てに集合的にハイブリダイズする、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１８１】
2020534820.tif 000184
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１８２】
2020534820.tif 000185
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１８３】
2020534820.tif 000186
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１８４】
2020534820.tif 000187
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５８】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１８５】
2020534820.tif 000188
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１８６】
2020534820.tif 000189
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１８７】
2020534820.tif 000190
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１８８】
2020534820.tif 000191
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５９】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１８９】
2020534820.tif 000192
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１９０】
2020534820.tif 000193
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１９１】
2020534820.tif 000194
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１９２】
2020534820.tif 000195
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項６０】
前記遺伝子がＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１９３】
2020534820.tif 000196
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１９４】
2020534820.tif 000197
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１９５】
2020534820.tif 000198
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１９６】
2020534820.tif 000199
の配列または実質的に同様な配列を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項６１】
前記遺伝子がＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表１９７】
2020534820.tif 000200
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表１９８】
2020534820.tif 000201
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表１９９】
2020534820.tif 000202
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２００】
2020534820.tif 000203
の配列または実質的に同様な配列を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項６２】
前記遺伝子がＩＲＦ４であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表２０１】
2020534820.tif 000204
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２０２】
2020534820.tif 000205
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表２０３】
2020534820.tif 000206
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２０４】
2020534820.tif 000207
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項６３】
前記遺伝子がＩＲＦ４であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表２０５】
2020534820.tif 000208
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２０６】
2020534820.tif 000209
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが
【表２０７】
2020534820.tif 000210
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２０８】
2020534820.tif 000211
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項６４】
前記遺伝子がＩＲＦ４であり、
（ｉ）前記プライマーの第１のセットが、
【表２０９】
2020534820.tif 000212
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２１０】
2020534820.tif 000213
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）前記プライマーの第２のセットが、
【表２１１】
2020534820.tif 000214
の配列または実質的に同様な配列を含み、前記プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブが、
【表２１２】
2020534820.tif 000215
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ＤＮＡメチル化を評価するための方法に関する。より詳細には、本発明は、完全にまたは部分的にメチル化されたＤＮＡのシトシンメチル化を、感度を改善して定性的または定量的のいずれかで評価する方法に関する。本発明の方法は、シトシンメチル化の変化によって特徴付けされる状態の診断または表現型の発達のモニタリングを含むが、これらに限定されない様々な用途に有用である。
【背景技術】
【０００２】
任意の先行出版物（またはそれに由来する情報）または既知の任意の事項に対する本明細書内での参照は、その先行刊行物（またはそれに由来する情報）または既知の事項が、本明細書が関係する努力傾注分野における共通で一般的な知識の一部を形成することへの承認、または自認、または何らかの形態の提案として受け取らない、かつ受け取るべきでない。
【０００３】
本明細書において著者が参照した出版物の書誌の詳細は、記載の最後にアルファベット順にまとめられている。
【０００４】
ＤＮＡメチル化は、哺乳動物において最も熱心に研究されているエピジェネティック修飾の１つであり、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）ヌクレオチドへのメチル（ＣＨ３）基の付加を指す。このメチル基は、シトシン塩基の５番目の炭素原子、またはアデニン塩基の６番目の窒素原子に付加される。
【０００５】
ＤＮＡメチル化は、動物細胞の遺伝子制御において役割を果たす。活発な遺伝子転写と低メチル化との間に相関があるだけでなく、トランスフェクションの実験では、メチル部分の存在が生体内での遺伝子発現を阻害することも示されている。さらに、遺伝子の活性化は、強力な脱メチル化剤である５−アザシチジンで細胞を処理することによって誘導できる。メチル化は、ＤＮＡとクロマチンタンパク質および特定の転写因子の両方との相互作用に影響を与えることによって、遺伝子発現に影響するものと思われる。メチル化パターンは体細胞において非常に安定であるが、初期胚はＤＮＡメチル化の大きな改変によって特徴付けられる。
【０００６】
したがって、ＤＮＡメチル化は健全な成長および発達に不可欠であり、ゲノム刷り込み、発がん、反復要素の抑制などの様々プロセスに関連している。さらに、宿主に侵入して損傷を与え得る他の潜在的に危険なＤＮＡ配列と共に、レトロウイルス遺伝子の発現の抑制も可能にする。加えて、ＤＮＡメチル化は、がんの発達に重要な役割を果たしており、遺伝子転写の重要な調節因子である。研究により、高集結の５−メチルシトシンを含むプロモーター領域を有する遺伝子は、転写的にサイレントであることが示されている。
【０００７】
哺乳動物では、全てのＣｐＧの６０％〜９０％がメチル化されている。メチル化されたシトシン残基は、自発的に脱アミノ化して、時間経過と共にＴ残基を形成し、したがって、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドは、着実に脱アミノ化して、ＴｐＧジヌクレオチドになり、これは、ヒトゲノム内のＣｐＧジヌクレオチドの過少表示によって示される（それらは予想される頻度のわずか２１％で発生する）。ＣｐＧアイランドは、多くの遺伝子の開始点に通常存在するＣｐＧ部位の高い頻度を伴う領域である。
【０００８】
ＤＮＡメチル化レベルをモニタリングする診断的有用性の証拠の増加に伴い、ＤＮＡメチル化を信頼性があり、かつ正確に評価する手段が益々重要になっている。現在、メチル化特異的ＰＣＲは、亜硫酸水素により変換されるＤＮＡのメチル化されたＣｐＧ部位を検出するために一般的に使用されている方法である。この方法において、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、シトシン−ホスホジエステル−グアニジン［ＣｐＧ］部位におけるメチル化されたシトシン残基を調査する。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ  ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲの変形物であり、メチル化特異的プライマーに加えて、メチル化されたＣｐＧ部位の調査に対して５’−３’加水分解プローブをさらに使用し、それにより定量化を可能する。
【０００９】
組織生検は、診断、予後、残存疾患の検出、および治療法の選択を支持する病理学的検査の生物学的物質の供給源として長い間役立ってきた。大多数の種類のがんがＤＮＡを血液中に放出し（循環腫瘍ＤＮＡ−ｃｔＤＮＡ）、ｃｔＤＮＡの検出が罹患率および死亡率に相当な影響力を有し得る証拠が増えている。ｃｔＤＮＡは一般に非常に低レベルで存在し、ｃｔＤＮＡ放出の主な原因であるアポトーシスおよびネクローシスに一部起因して、非常に断片化されている（Ｓ．Ｊａｈｒ，２００１ｅｔ  ａｌ．；Ｋ．Ｃ．Ａ．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｆ．Ｍｏｕｌｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｆ．Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐ．Ｏ．Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｉ．Ｂ．Ｒｏｎｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ｃｔＤＮＡは一般に、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ遺伝子などの腫瘍特異的な体細胞ゲノムの改変を標的化することによって検出され、適合される正常細胞から採取されたＤＮＡ、および健常者の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ−主な供給源は白血球）には含まれない。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＣＧＣ）などの大規模なシーケンスプロジェクトにより、５〜１０％を超える特定の組織種の腫瘍で体細胞変異がほとんど観察されず（Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、腫瘍の不均一性のため、遺伝子の変異パターンが非常に多様である（Ｍ．Ｓ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ことが明らかになっている。変異の多様性は、適切な感度の検査を提供するために大部分のゲノムを調査する必要があるため、ＤＮＡ配列の変化に基づいたがん診断検査の開発に課題をもたらす。異常なＤＮＡメチル化は、大多数の種類の固形がんの特徴であり、一般的な過剰メチル化事象は大多数の変異よりも頻繁に発生する。変異標的とは異なり、ＤＮＡメチル化パターンは、初期から後期ステージまでのがんの進化を通じて比較的安定している。したがって、メチル化ベースの試験は、高度に個別化されたアッセイを開発する必要なく、ｃｔＤＮＡダイナミクスをモニタリングするための明確な理論的利点を有する（Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓ．Ｇａｒｒｉｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｐ．Ｐｏｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｋ．Ｗａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかしながら、ｃｔＤＮＡは、ｃｃｆＤＮＡの１つのサブタイプのみを表示する。非腫瘍ｃｃｆＤＮＡは、診断、予後、またはモニタリングの目的に対するメチル化分析の潜在的な標的でもある。ｃｔＤＮＡのように、ｃｃｆＤＮＡも同様に、非常に低いコピー数に関連した、したがって偽陰性の結果である可能性がある欠点がある。
【００１０】
しかしながら、ｃｃｆＤＮＡ（および特にｃｔＤＮＡなどの疾患固有のｃｃｆＤＮＡ）などの低コピー数のメチル化ＤＮＡの検出に関しては、特定の複雑さが存在する。非常に低いコピー数のＤＮＡ分子の検出および増幅に関連する固有の困難は別として、非メチル化シトシンを脱アミノ化してＤＮＡにウラシルを生成する亜硫酸水素溶液を用いてＤＮＡを前処理することは、メチル化の変化を検出するための一般的な方法であり、次いで、その後のＰＣＲ増幅中にチミンに変換される。亜硫酸水素処理は、メチル化されたシトシンに影響を与えないため、容易に検出できる。その結果、全てのシトシンがメチル化されるわけではないため、天然の二本鎖分子の２つの相補鎖は、亜硫酸水素変換後に２つの非相補的な一本鎖になる。したがって、フォワードおよびリバースプライマーが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の２つのそれぞれの鎖の相補配列にアニールするであろう、非亜硫酸水素処理された二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅とは異なり、亜硫酸水素変換されたＤＮＡの開始コピーの数は、標的化された領域の２つの鎖の相補性が失われるため、すぐに効果的に二等分されている。さらに、亜硫酸水素処理されたＤＮＡの精製中の物質の損失および／または亜硫酸水素処理が、高ｐＨ、高亜硫酸水素濃度、および亜硫酸塩変換プロセスを促進するために必要な高温によるＤＮＡの著しい損傷をもたらすという事実による開始物質の固有の損失がさらに存在する。損傷は、脱プリンが無作為な鎖の切断をもたらすために発生する。したがって、所望されるアンプリコンが長いほど、無傷の鋳型分子の数はより制限されるであろう。これは、ＰＣＲ増幅の失敗、または鋳型分子のサンプリングの制限に起因するメチル化レベルに関する定量的に正確な情報の損失につながる可能性がある。最終的には、亜硫酸水素処理は、一本鎖ＤＮＡ分子の無作為なニッキング（すなわち、リン酸骨格の破壊）をさらに引き起こす。かかる「ニッキング」が標的化アンプリコン領域で発生すると、これは増幅不可能なＤＮＡにつながり、標的の検出性がさらに損なわれる。さらに、目的の遺伝子（複数可）についての調査のエリアに応じて、ＤＮＡは、亜硫酸水素変換プロセスのために高度にＡＴリッチであるか、または領域がＣｐＧアイランドで発生する場合は高度にＣＧリッチであり得、プロセスはゲノムの複雑さを軽減するが、好適なＰＣＲアッセイの設計の困難につながる。標的アンプリコン領域でこの損傷またはニッキングが発生する場合、開始鋳型のさらなる損失が発生する。分析の焦点が既に非常に低いレベルで存在しているｃｔＤＮＡである場合、標的特異的検出を可能にするのに十分な長さのＤＮＡの断片を信頼性を有して増幅できないため、この要因の組み合わせは、正確な結果を得るのに致命的であることを示し得る。
【００１１】
したがって、ＤＮＡメチル化の正確かつ高感度な検出を可能にする改善された方法を開発し、それにより、診断、予後、または疾患のモニタリングなどのＤＮＡメチル化分析の適用の感度を改善する必要がある。本発明に至るまでの研究において、増幅反応が、プライマーおよび／またはプローブの異なるセットを利用するように設計され、これらが、目的の亜硫酸水素変換されたＤＮＡ領域の標的鎖および非相補的な反対鎖の両方を同時に増幅できるようにそれ自体が設計されている場合、ＤＮＡメチル化分析、特に定量分析の感度が大幅に改善されることが判定されている。多くの生物学的試料のＤＮＡメチル化分析の状況下において相補的ＤＮＡの両方の鎖を標的とすることが、検出されたコピー数の増加を示さないことを考慮すると、この発見は全く予想外である。しかしながら、本発明者らは、非常に低い（検出限界［ＬＯＤ］以下など）標的インプット集団を特異的に増幅する場合、感度が改善されるだけでなく、得られるコピー数が、同じインプット標的集団の１００％が標的鎖のみから増幅された場合に、理論的に得られるコピー数の２倍に相当することを判定した。しかしながら、メチル化分析に固有の亜硫酸水素変換ステップは、インプットＤＮＡ集団の損傷および／または無作為なニッキングを引き起こし、それによって増幅可能なＤＮＡの開始量を大幅に低減することが知られている。したがって、論理的には、標的鎖および反対鎖の両方を増幅する増幅反応を設計すると、１本の鎖のみを標的とする場合に比べてアウトプットが２倍になると予想されるかもしれないが、この「倍増」は、亜硫酸水素変換ステップ後に存在する増幅可能なＤＮＡの量に対して計算されることになり、これは、以前に発生すると考えられていたよりもかなり多くのＤＮＡを損傷および／またはニッキングすることが判定された。しかしながら、本発明の状況下では、非常に予想外なことに、発生することが観察されているコピー数の「倍増」は、実際には亜硫酸水素前処理されたＤＮＡのレベルの倍増であることが見出された。これは、亜硫酸水素変換によって誘導されることが知られている著しいニッキングおよび損傷の以前に存在するレベルである。この結果は完全に直感に反するが非常に重要であり、初めて、試料中のメチル化されたＤＮＡの希少なコピー数の存在がルーチン的にかつ信頼性を有して検出可能になった。以前の従来技術の方法はそのようなＤＮＡを検出するのに十分な感度がなかった。なおさらに、当然のことながら、亜硫酸水素の損傷およびニッキングの作用の結果、当業者は、亜硫酸水素の損傷が、既に希少であったコピー数のＤＮＡレベルを大幅に低減していたため、アウトプットを改善するための手段として両方の鎖を増幅する試みを考慮しなかったことになり、これにより、増幅系手段に基づくメチル化分析のレンタリングが無駄になった。本発明者らによって、本発明の方法が実際には、理論的に可能と考えられていたものよりも少なくとも５０％より多い倍増アウトプットを生成し、アッセイの開発を可能としたことを判定し、これは低コピー数ＤＮＡのメチル化を高感度かつ信頼性を有して検出することができる。偽陽性率は増加されないが、偽陰性率が大幅に減少することを考慮すると、後者の発見はさらに予想外である。ニッキングによる低コピー数の開始鋳型レベルの減少が、以前に容認されていたおよそ５０％ではなく、実際には最大９０％であることが、現在さらに予想外に判定されているという事実に照らしてこれらの発見を考慮すると、この方法の有効性の改善はさらに驚くべきことである。本発明の開発前は、低コピー数ＤＮＡから臨床的に有用な結果を得ることは、増幅産物が産生されなかったか、または望ましくない少なさといういずれかの事実のために達成されておらず、得られた結果は、以前に考えられていたよりもはるかに高いレベルの偽陰性結果を反映しており、その結果、これらの結果に依存している患者にとって非常に有害な臨床結果につながる可能性がある。なおさらに、ニッキングの発生の認識により（問題の程度ではないが）、以前はこの問題を軽減するための多大な努力がもたらされていた。しかしながら、そのような従来技術の努力の全てが、方法の亜硫酸水素変換ステップの最適化に焦点を合わせていた。しかしながら、亜硫酸水素変換効率を高める技術は、本質的にＤＮＡ損傷を高めるため、これらの努力は成功していない。重要なことに、その時点では、増幅ステップ自体を最適化して、従来技術の亜硫酸水素変換の最適化の努力よりも著しく優れた効率を達成できるという認識はなかった。したがって、本発明の方法により、現在、低コピー数のＤＮＡ分子のメチル化分析に基づいて増幅を実行する、信頼性のある正確な方法の開発が可能になっている。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「なる」などの変形物は、述べられた完全体、またはステップ、または完全体もしくはステップの群の包含を意味するが、他の完全体、またはステップ、または完全体もしくはステップの群の除外を意味しないことが理解されるであろう。
【００１３】
本明細書で使用する「由来」という用語は、特定の完全体または完全体の群が明示された種から起源を有しているが、必ずしも明示された源から直接的に取得されていないことを示すものとする。さらに、本明細書で使用される「１つの（ａ）」、「および（ａｎｄ）」、および「１つの（ｔｈｅ）」のような単数形は、文脈から別の方法が明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００１４】
特に他の方法が定義されない限り、本明細書で使用される全て技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書は、本明細書の後方に参考文献として提示されるＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５のプログラムを使用して調製されたヌクレオチド配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数字標識＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって配列リストで識別される。各配列に対する長さ、配列の種類（ＤＮＡなど）、および起源の生物は、それぞれ数字標識フィールド＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞で提供される情報によって示される。本明細書で言及されるヌクレオチド配列は、配列番号標識とそれに続く配列識別子によって識別される（例えば、配列番号１、配列番号２など）。本明細書で言及される配列識別子は、配列リストの数字標識フィールド＜４００＞で提供される情報に相関し、その後に配列識別子が続く（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２など）。すなわち、本明細書で詳述される配列番号１は、配列表で＜４００＞１として示される配列に相関する。
【００１６】
本発明の一態様は、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析し、偽陰性結果の低減された発生を示す結果を取得することと、を含む、方法に関する。
より詳細には、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする改善された方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的のＤＮＡ領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、遺伝子またはその領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該標的遺伝子の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的のＤＮＡ領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）標的遺伝子の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）標的遺伝子の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００１８】
さらに別の態様において、該遺伝子または遺伝子領域は、哺乳動物の遺伝子または遺伝子領域である。
【００１９】
さらに別の態様において、該遺伝子は、大腸腫瘍マーカーであり、より詳細には、以下のうちの１つ以上である。
【表１】
2020534820.tif 000003
【００２０】
さらなる態様において、遺伝子またはその領域のメチル化をスクリーニングする方法が提供され、その標的遺伝子は本質的に以下からなるリストから選択され、
【表２】
2020534820.tif 000004
該方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該遺伝子またはその領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）標的遺伝子の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）標的遺伝子の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む。
【００２１】
別の態様において、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００２２】
さらに別の態様において、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたメチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたメチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）任意で、検出手段を組み込む１つ以上のプローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該ＤＮＡに沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、非メチル化シトシン残基を修飾する該薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムである。
【００２４】
一実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、標的遺伝子である。
【００２５】
別の実施形態において、該標的遺伝子は、本質的に以下からなるリストから選択される。
【表３】
2020534820.tif 000005
【００２６】
さらに別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、またはＣＡＨＭのうちの１つ以上、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【００２７】
さらに別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿である。
【００２８】
さらなる実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【００２９】
さらに別の実施形態において、該プローブは、非メチル化特異的プローブである。
【００３０】
なおさらに別の実施形態において、該プローブは、メチル化特異的プローブである。
【００３１】
さらに別の態様において、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計された非メチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計された非メチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該ＤＮＡに沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００３２】
さらに別の実施形態において、非メチル化シトシン残基を修飾する該薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムである。一実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、標的遺伝子である。
【００３３】
別の実施形態において、該標的遺伝子は、本質的に以下からなるリストから選択される。
【表４】
2020534820.tif 000006
【００３４】
さらに別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、またはＣＡＨＭのうちの１つ以上、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【００３５】
さらに別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿である。
【００３６】
またさらなる実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【００３７】
別のさらなる実施形態において、該プローブは、加水分解プローブである。
【００３８】
さらに別の態様において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満である。別の実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。より詳細には、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である。さらなる実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、より詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。
【００３９】
さらに別の態様において、該増幅は定量的ＰＣＲであり、該低コピー数はＬＯＤである。
【００４０】
さらに別のさらなる実施形態において、該プローブは、部分的シトシンメチル化の領域に向けられた１つ以上の加水分解プローブであり、該１つ以上のプローブは、該領域で少なくとも２つの異なるメチル化パターンに集合的にハイブリダイズする。
【００４１】
さらに別の態様において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表５】
2020534820.tif 000007
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表６】
2020534820.tif 000008
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表７】
2020534820.tif 000009
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表８】
2020534820.tif 000010
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【００４２】
さらに別の態様において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表９】
2020534820.tif 000011
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１０】
2020534820.tif 000012
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１１】
2020534820.tif 000013
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１２】
2020534820.tif 000014
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【００４３】
別のさらなる態様において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１３】
2020534820.tif 000015
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１４】
2020534820.tif 000016
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１５】
2020534820.tif 000017
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１６】
2020534820.tif 000018
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【００４４】
さらなる態様において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１７】
2020534820.tif 000019
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１８】
2020534820.tif 000020
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１９】
2020534820.tif 000021
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表２０】
2020534820.tif 000022
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【００４５】
さらなる態様において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表２１】
2020534820.tif 000023
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表２２】
2020534820.tif 000024
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表２３】
2020534820.tif 000025
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表２４】
2020534820.tif 000026
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【００４６】
別の態様において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表２５】
2020534820.tif 000027
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表２６】
2020534820.tif 000028
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表２７】
2020534820.tif 000029
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表２８】
2020534820.tif 000030
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【００４７】
さらに別の態様において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表２９】
2020534820.tif 000031
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表３０】
2020534820.tif 000032
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表３１】
2020534820.tif 000033
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表３２】
2020534820.tif 000034
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【００４８】
さらに別の態様において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表３３】
2020534820.tif 000035
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表３４】
2020534820.tif 000036
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表３５】
2020534820.tif 000037
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表３６】
2020534820.tif 000038
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【００４９】
本発明の別の態様は、患者の状態を診断またはモニタリングする方法であって、状態が目的のＤＮＡ領域のメチル化の調節によって特徴付けられ、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法に関する。
【００５０】
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法に従って１つ以上の腫瘍性マーカーを検出するための１つ以上のプライマーおよび／またはプローブと、該プライマーおよび／またはプローブによる検出を容易するために有用な試薬と、を含む生物学的試料をアッセイするキットに関する。例えば、生物学的試料を受領するためのさらなる手段も含まれ得る。
【００５１】
さらなる態様において、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングするためのキットであって、
ａ）目的のＤＮＡ領域の標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセットであって、プライマーが、非メチル化シトシンの薬剤による修飾を受けている目的のＤＮＡ領域の形態にハイブリダイズするように設計されている、第１のセットと、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセットと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】亜硫酸水素処理がどのようにして非相補的な一本鎖ＤＮＡをもたらすかを示す概略図である。Ａ）ＤＮＡを亜硫酸水素溶液で処理すると、非メチル化シトシン（Ｃ）残基がウラシル（Ｕ）残基に変換される一方で、メチル化されたシトシン（ｍＣ）残基は影響を受けない。その結果として、もたらされる亜硫酸水素処理されたＤＮＡ鎖は、もはや相補的ではない。後続のＰＣＲ増幅中に、ウラシルはＤＮＡ類似体チミン（Ｔ）に置き換えられる。これにより、メチル化されたシトシンと非メチル化シトシンとを区別できる。Ｂ）上部および下部鎖に相補的なオリゴヌクレオチド（フォワード、リバース）を使用した野生型ＤＮＡのＰＣＲ増幅により、１サイクル後に２倍のＤＮＡ物質をもたらす。Ｃ）２つのオリゴヌクレオチドプライマーセット（亜硫酸水素変換された、ならびにメチル化および／または非メチル化特異的）が無い限り、元の野生型ＤＮＡの標的鎖のみが増幅されるであろう。
【図２】ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１のそれぞれの標的領域（灰色）、または２０００ｐｇの完全にメチル化され、かつ亜硫酸水素変換されたＤＮＡの標的領域と、反対側の標的領域（赤）との両方を検出する、亜硫酸水素およびメチル化された特異的オリゴヌクレオチド（プライマー／プローブ）を使用した、Ａ）ＢＣＡＴ１およびＢ）ＩＫＺＦ１における標的メチル化領域に対するリアルタイムＰＣＲ増幅曲線のグラフ表示である。１のΔＣｔ値は、鋳型の２倍の量が増幅されていることを示す。
【図３】Ａ）標的領域またはＢ）２０００ｐｇの亜硫酸水素で処理された完全にメチル化されたＤＮＡ（およそ６０６ゲノムコピーに相当）の標的および反対側の標的領域とアニーリングするオリゴヌクレオチド（プライマー／プローブを使用した、ＡＣＴＢ、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の標的メチル化領域のデジタルドロップレットＰＣＲ系定量化のグラフ表示である。ＡＣＴＢ、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１’およびＩＫＺＦ１’と表記される、Ｂ）内のＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１に対する反対側の標的鎖の蛍光集団を示す。括弧内の数字は、標的（複数可）の判定されたコピー、コピー／ウェルを指す。
【図４】様々な量の完全にメチル化されたＤＮＡ（０〜３００ｐｇ／ｍＬの範囲）を添加したプールされたヒト血漿のグラフ表示である。続いて、循環セルフリーＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素変換した。得られたＤＮＡの５〜１３の試料複製物を、図３で記載したアッセイを使用して三重で分析した。三重のＰＣＲ複製物のいずれかがＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１に対して陽性である場合に、試料は陽性とみなされた。検出限界（ＬＯＤ）は、プロビット分析を使用して計算した。
【図５】様々な量の完全にメチル化されたＤＮＡ（０〜５００ｐｇ／ｍＬの範囲）を添加したプールされたヒト血漿で、陽性と測定されたＰＣＲ複製物のグラフ表示である。続いて、循環セルフリーＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素変換した。ＩＫＺＦ１およびＢＣＡＴ１のそれぞれの標的領域（赤いバー；配列番号１１〜２１、６４〜６６）、または標的領域および反対側の標的領域の両方（黒いバー；配列番号１１〜２１、７７〜９５、６２〜６３、９６、６５〜６６、９７）を検出する亜硫酸水素およびメチル化特異的オリゴヌクレオチド（プライマー／プローブ）を使用して、得られたＤＮＡを分析した。三重のＰＣＲ複製物のいずれかがＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１に対して陽性である場合に、試料は陽性とみなされた。
【図６】図５で記載したアッセイを使用した、標的領域（赤）、または標的領域および反対側の標的領域（黒）でのＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１におけるメチル化領域のｑＰＣＲに基づく陽性のグラフ表示である。各事例において、３ｐｇ（およそ１ゲノムコピーに相当）の試料ごとに超音波処理され、亜硫酸水素処理され、完全メチル化されたＤＮＡを含む多数の複製物（ｎ≧２７０）が増幅され、全ての試料にわたる陽性レベルを特定した。三重のＰＣＲ複製物のいずれかがＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１に対して陽性である場合に、試料は陽性とみなされた。
【図７】ＩＲＦ４の標的領域（黒；配列番号１０８〜１１０）、および２０００ｐｇの完全にメチル化され、亜硫酸水素変換されたＤＮＡの標的および反対側の標的領域の両方（赤；配列番号１０８〜１１０および１１１〜１１３）をそれぞれ検出する、亜硫酸水素およびメチル化特異的オリゴヌクレオチド（プライマー／プローブ）を使用したＩＲＦ４における標的メチル化領域に対するリアルタイムＰＣＲ増幅曲線のグラフ表示である。１のΔＣｔ値は、鋳型の２倍の量が増幅されていることを示す。
【図８】実施例において使用されるＩＫＺＦ１、ＢＣＡＴ１、ＩＲＦ４、およびＡＣＴＢ配列の詳細である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、増幅反応が少なくとも２セットのプライマー（および定量分析を実行する場合にはプローブ）を使用するように設計されている場合に、ＤＮＡのＰＣＲに基づくメチル化分析の信頼性および感度を大幅に改善できるという判定を部分的に前提としており、少なくとも１つのプライマーセットは、目的の亜硫酸水素変換されたＤＮＡ領域の標的鎖とハイブリダイズし、かつこれを増幅するように設計されており、もう一方のプライマーセットは、目的の亜硫酸水素変換されたＤＮＡ領域の反対側の鎖とハイブリダイズし、かつこれを増幅するように設計されている。この方法の開発は、循環セルフリーＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）、例えば疾患特異的なｃｃｆＤＮＡ、特に循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）のメチル化マーカーなどの低コピー数のＤＮＡメチル化標的に向けられた増幅に基づく分析の信頼性の欠如の真の程度および感度の欠如の解明のために必要とされている。詳細には、目的の二本鎖ＤＮＡ領域の亜硫酸水素変換が２つの非相補鎖の生成につながる。したがって、亜硫酸水素変換されたＤＮＡ鎖の１つに基づいて設計されたフォワードおよびリバースプライマーセットによって両方を増幅することはできない（ＰＣＲ反応が未処理のＤＮＡに対して進行する通常の方法で）という事実に加えて、亜硫酸水素変換ステップ自体が、変換プロセスを駆動するために必要な高いｐＨおよび温度のためにＤＮＡ損傷を引き起こす。しかしながら、亜硫酸水素処理は、ＤＮＡ分子の両方の鎖の無作為なニッキング（ＤＮＡリン酸骨格の破壊）を引き起こす可能性があることもさらに判定されている。そのようなニッキングが標的アンプリコン領域で発生する場合、ＤＮＡは増幅不能となる。
【００５４】
したがって、亜硫酸水素変換に基づくＤＮＡメチル化分析を定量的または定性的に実施する従来技術の方法を使用して１本の鎖のみを増幅できるという事実、および亜硫酸水素変換プロセスの過酷な条件によって誘発されるさらなる全体的なＤＮＡ損傷は、初期増幅に対して利用可能な全体的なＤＮＡコピー数を大幅に低減し、それによって、潜在的に目的の試料の遺伝子過剰メチル化を正確に検出できない点まで、感度の大幅な低減につながる。しかしながら、無作為なニッキングの発生は、利用可能な開始物質の濃度を潜在的にさらに低下させるだけでなく、最も重要なことに、許容できないレベルの偽陰性結果によって特徴付けされる信頼性の低い偏った結果に今もなおつながり、これは疾患の診断およびスクリーニングの状況下では非常に望ましくない。偽陽性の結果も望ましくないが、そのような患者は少なくともさらなる検査を受ける可能性が高い。しかしながら、偽陰性の結果は、患者が疾患を患っていないと誤って分類される可能性があり、潜在的に致命的な結果を招き得る。
【００５５】
亜硫酸水素変換されたＤＮＡの無作為なニッキングの影響の深刻度の程度を、その後得られる低コピー数ＤＮＡにおいてもたらされる増幅の精度で判定することは予想できず、新しい増幅方法論の再設計および開発を必要としており、得られる増幅結果の精度を大幅に改善することに加えて、スクリーニング検査の全体的な感度も改善する。従来技術の方法は、亜硫酸水素変換ステップの最適化の効率を改善するための努力に焦点が合わせられており、これは、開始ＤＮＡ集団のさらに高いレベルの損傷をもたらし、目的のＤＮＡが非常に低い開始コピー数しか存在せず、特に問題である。しかしながら、本発明者らは、存在量が低い標的インプット集団を増幅する場合、感度が改善されるだけでなく、得られるコピー数が、同じインプット標的集団の１００％が標的鎖のみから増幅された場合に、理論的に得られるコピー数の２倍を示すことになる方法を設計した。これは、目的のメチル化ＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方の増幅を可能にするように設計された少なくとも２つの異なるプライマーおよびプローブのセットの使用を組み込む増幅アッセイを設計することによって達成されている。しかしながら、この「倍増」は、発生すると以前考えられていたよりもＤＮＡを著しく損傷および／またはニッキングすることが今では判定されている亜硫酸水素変換ステップ後に存在する増幅可能なＤＮＡの量に対して相対的に計算されることになると論理的に予想されるが、本発明の状況では、予想に大きく反して、観察されるコピー数の「倍増」は、実際には亜硫酸水素処理前のＤＮＡのレベル、すなわち亜硫酸水素変換によって導入されることが知られている著しいニッキングおよび損傷の前に存在するレベルの倍増であることが見出された。したがって、本発明の方法の開発により、メチル化特異的増幅アッセイのルーチン的な適用が可能になっており、これは以前に達成可能であったよりも著しく高い感度および精度を示す。がん診断の状況下において、偽陰性の結果は、患者にとって非常に深刻な結果をもたらす可能性がある。したがって、本発明の方法は、ＤＮＡメチル化を評価する際に高レベルの感度を確保する、単純であるが強固な手段を提供する。
【００５６】
したがって、本発明の一態様は、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析し、偽陰性結果の低減された発生を示す結果を取得することと、を含む、方法に関する。
【００５７】
より詳細には、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする改善された方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的のＤＮＡ領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００５８】
一実施形態において、ステップ（ｉｖ）から得られる結果は、偽陰性結果の低減された発生を示す。
【００５９】
「目的のＤＮＡ領域」への言及は、メチル化状態の分析が求められている１つ以上のＣｐＧ部位（「アイランド」）を含むＤＮＡの任意の領域または形態への言及として理解されるべきである。これは、例えば、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子間領域、またはプロモーターであり得る。この目的のために、「遺伝子」への言及は、それが完全長タンパク質であろうと、またはタンパク質断片であろうと、タンパク質産物をコードするＤＮＡ分子への言及として理解されるべきである。しかし当然のことながら、タンパク質産物を必然的に生産することが知られていない、かつＲＮＡにのみ転写され得る、特定されているいくつかの遺伝子がある。したがって、本明細書における「遺伝子」への言及は、両方のタイプの遺伝子への言及を含むと理解されるべきである。ゲノムＤＮＡまたはそれから転写されたＲＮＡに関して、遺伝子は一般にイントロン領域およびエキソン領域の両方を含むと予期されるであろう。目的の対象核酸領域は、任意の特定の遺伝子に関連することが知られていないゲノムＤＮＡの一部であり得る（一般に「ジャンク」ＤＮＡ領域と称される）。目的の核酸標的は、ゲノムＤＮＡの２つの領域間の、またはゲノムＤＮＡの１つの領域と、ウイルスもしくは導入される配列などの外来ＤＮＡの領域との間のいずれかの組換えによって生成されるゲノムＤＮＡの任意の領域であってもよい。分析の対象となるＤＮＡは必ずしもゲノムＤＮＡである必要はないが、ｃＤＮＡなどの組換え的に発現されるＤＮＡはしばしばメチル化されていないことが一般に理解されている。それにもかかわらず、本発明は、メチル化され得るＤＮＡのあらゆる源または形態の分析にまで及ぶと理解されるべきである。
【００６０】
いかなる方法であっても本発明を限定することなく、ＤＮＡメチル化は細菌、植物、および動物において普遍的である。ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡの化学修飾の一種であり、細胞分裂の巡にわたって安定であるが、生物の基礎となるＤＮＡ配列の変化を伴わない。クロマチンおよびＤＮＡの修飾はエピジェネティクスの２つの重要な機能であり、細胞分化のプロセスで役割を果たし、同じゲノム物質を含むにもかかわらず、細胞の異なる特徴を安定的に維持することが可能である。真核生物のＤＮＡメチル化は、シトシンのピリミジン環の５位炭素でのみ発生する。哺乳動物では、ＤＮＡメチル化は、ほとんどがＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの５位炭素で発生する。ＣｐＧジヌクレオチドは、ヒトゲノムのおよそ１％を構成している。
【００６１】
哺乳動物では、全てのＣｐＧの７０〜８０％がメチル化されている。ＣｐＧは、多くの遺伝子の調節領域の５’末端に通常存在する「ＣｐＧアイランド」と称されるクラスターにグループ化され得る。がんなどの多くの疾患プロセスでは、遺伝子プロモーターおよび／またはＣｐＧアイランドは異常なメチル化を獲得する。低メチル化は、がん関連遺伝子でしばしば見られるが、異常なＤＮＡ過剰メチル化は、しばしば腫瘍抑制遺伝子の遺伝的転写サイレンシングと関連する。ＤＮＡメチル化は、２つの方法で遺伝子の転写に影響を与え得る。第１に、ＤＮＡのメチル化自体が転写因子の遺伝子との結合を物理的に妨げ、それ故に転写を遮断し得る。第２に、メチル化されたＤＮＡは、メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質（ＭＢＤ）として知られるタンパク質によって結合され得る。次に、ＭＢＤタンパク質は、ヒストン脱アセチル化酵素、およびヒストンを修飾できる他のクロマチンリモデリングタンパク質など、追加のタンパク質を遺伝子座に補充し、それにより、サイレントクロマチンと称される小型で不活性なクロマチンが形成される。ＤＮＡのメチル化およびクロマチン構造間のこの関連は非常に重要である。特に、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の損失はレット症候群に関与するとされており、メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）はがんの過剰メチル化された遺伝子の転写サイレンシングを仲介する。
【００６２】
ヒトでは、ＤＮＡメチル化のプロセスは３つの酵素、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ、および３ｂ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ）によって実行される。ＤＮＭＴ３ａおよびＤＮＭＴ３ｂは、開発の初期にＤＮＡメチル化パターンを設定する新規メチルトランスフェラーゼであると考えられている。ＤＮＭＴ１は、ＤＮＡ複製中にＤＮＡメチル化パターンを娘鎖にコピーするための、提唱されている維持メチルトランスフェラーゼである。ＤＮＭＴ３Ｌは、他のＤＮＭＴ３と相同のタンパク質であるが、触媒活性を有しない。代わりに、ＤＮＭＴ３Ｌは、ＤＮＡと結合するその能力を増強し、その活性を刺激することにより、新規メチルトランスフェラーゼを支援する。最後に、ＤＮＭＴ２は、全てのＤＮＡメチルトランスフェラーゼに共通する１０の配列モチーフ全てを含む「謎の」ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ相同体として同定されており、しかしながら、ＤＮＭＴ２はＤＮＡをメチル化し得ないが、代わりに小型ＲＮＡをメチル化することが示されている。
【００６３】
したがって、「メチル化」という用語は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用により、核酸の領域、例えばゲノムＤＮＡのシトシンまたはアデノシン塩基に付加されるメチル基の存在を意味すると理解されるべきである。これに関して、完全にまたは部分的にメチル化された形態のＤＮＡを検出することへの全般的な言及は、ヘミメチル化されたＤＮＡの検出を含むと理解されるべきである。
【００６４】
一実施形態において、該目的の核酸標的は、ＤＮＡ遺伝子またはプロモーター領域などの遺伝子領域である。したがって、「標的遺伝子」への言及は、調査されるメチル化に関連する遺伝子または遺伝子の領域への言及として理解されるべきである。当業者によって理解されるように、「遺伝子」への言及は、遺伝子のプロモーター領域を含む。
【００６５】
「遺伝子の領域」または「遺伝子領域」への言及は、遺伝子全体ではなく遺伝子の一部に対応するＤＮＡの任意の区間への言及として理解されるべきである。例えば、本発明の方法により分析されるＤＮＡは、例えばＤＮＡｓｅの作用により生体内循環中に、その単離中に断片化され得、または、本発明の方法による分析以前の予備ステップとして切断されている場合がある。
【００６６】
この実施形態によれば、遺伝子またはその領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該標的遺伝子の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）標的遺伝子の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）標的遺伝子の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００６７】
別の実施形態において、該遺伝子または遺伝子領域は、哺乳動物の遺伝子または遺伝子領域である。
【００６８】
さらなる実施形態において、該遺伝子は、大腸腫瘍マーカーであり、より詳細には、以下のうちの１つ以上である。
【表３７】
2020534820.tif 000039
【００６９】
本明細書では、これらの遺伝子は、遺伝子名およびヒト染色体座標のセットの両方を参照することにより特定される。遺伝子名および染色体座標の両方は、当業者に周知であり、理解されるであろう。一般に、遺伝子は、その名前を参照することによってルーチン的に識別でき、それを介してその配列および染色体座の両方をルーチン的に取得できるか、またはその染色体座標を参照することによって、それを介して遺伝子名およびその配列の両方をルーチン的に取得することもできる。
【００７０】
「遺伝子」への言及は、これらの分子の全ての形態およびその断片、またはそのバリアントへの言及として理解されるべきである。当業者によって理解されるように、いくつかの遺伝子は、個体間で対立遺伝子バリエーションまたは一塩基多型を示すことが知られている。かかるバリエーションには、様々なサイズのＳＮＰの挿入および欠損、ならびにジヌクレオチドおよびトリヌクレオチドの繰り返しなどの単純な配列の繰り返しが含まれる。バリアントには、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％以上の配列同一性を共有する同じ領域からの核酸配列、すなわち、本明細書に記載される遺伝子に対して１つ以上の欠損、付加、置換、逆配列などが含まれる。したがって、本発明は、かかるバリアントまで及ぶと理解されるべきであり、現在の診断用途に関しては、実際の核酸配列間にわずかな遺伝的バリエーションが個体間で存在し得るという事実にもかかわらず、同じ結果を達成する。したがって、本発明は、任意の他の変異、多型または対立遺伝子バリエーションから生じるＤＮＡの全ての形態に及ぶと理解されるべきである。
【００７１】
上述される遺伝子に対応するＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８染色体座標は以下のとおりである。
【表３８−１】
2020534820.tif 000040
【表３８−２】
2020534820.tif 000041
【００７２】
これらの遺伝子への言及は、これらの遺伝子の各々の転写開始部位、特に遺伝子のプロモーター領域の５ｋｂ上流を含むと理解されるべきである。本発明をいずれか１つの理論または作用の様式に限定することなく、ＩＫＺＦ１は一般にｃｈｒ７：５０３０４７８２〜５０４０５１００（アセンブリＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に及ぶと理解される。これは、転写開始部位からポリアデニル化部位まで続く。しかしながら、ＩＫＺＦ１遺伝子は５’転写開始部位をさらに有し、この開始部位を含む座標はＣｈｒ７：５０３０４０８３〜５０４０５１０１である。上流のＣｐＧアイランドも含まれている場合、座標は５０３０３３００〜５０４０５１０１である。２ｋｂ上流の配列が含まれている場合、座標は５００３０２０８３〜５０４０５１０１である。
【００７３】
以下でより詳細に論ずるように、本発明の方法は、１つの遺伝子のメチル化をスクリーニングするために適用することができるか、または、起源の生物学的試料からのＤＮＡの別々の一定量の増幅を介すか、もしくは多重化増幅法を使用して増幅される単一の一定分量の状況下のいずれかで２つ以上の遺伝子のメチル化について所与の生物学的試料をスクリーニングするために適合することができる。
【００７４】
本発明の方法による増幅方法論の適用は、さらにより予想外に、開始ＤＮＡ試料の亜硫酸水素処理後に残る非損傷／ニッキングの目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方の増幅の長所により理論的に達成することを期待される、最良で、２倍の改善よりも著しく大きい感度の改善を達成する。この結果は、増幅前に亜硫酸水素処理された開始ＤＮＡの最大９０％が損傷されているか、またはニック化されているかのいずれかであることを考慮すると、予想外であり直感に反する。したがって、本方法により、ｃｃｆＤＮＡ、例えば疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどの非常に低い開始コピー数で存在する標的遺伝子の非常に正確なメチル化分析のルーチン的な実施が可能となった。これに関して、「低コピー数」への言及は、信頼できかつ再現可能な増幅結果を達成するために必要なレベルを下回る試料中のＤＮＡの量への言及として理解されるべきである。本発明をいずれかの理論または作用の様式に限定することなく、開始試料中の低レベルの標的ＤＮＡは、増幅産物の検出可能なレベルを生成するために必要な多数の増幅サイクルのために、定量的および定性的増幅方法に関して不正確な結果の確率を高めるとしてよく理解されている問題である。これに関して、所与の試料源が低コピー数試料に対応するかどうかの判定は、当業者によってルーチン的に決定可能である。ｃｃｆＤＮＡマーカー、ｃｔＤＮＡマーカー、最小残存疾患マーカー、腫瘍性クローン進化マーカーなどを評価するために採取される特定の試料の種類は、従来技術の増幅に基づくメチル化分析を使用して信頼できかつ正確な結果を達成するには低すぎる目的の標的ＤＮＡの開始レベルを示すことが周知である。しかしながら、標的ＤＮＡの量が不明である他の試料源がある場合がある。これらの状況では、当業者はルーチン的な方法論を適用して、開始標的ＤＮＡの量が本明細書で定義される「低コピー数」の範囲内であるか、および従来技術の増幅方法では信頼性の高い分析ができないかどうかを判定することができる。定量的ＰＣＲに関しては、該「低コピー数」は検出限界（ＬＯＤ）としても知られている。ＬＯＤは、目的のアッセイまたは試料に関連して当業者によって判定可能な十分に理解された測定基準である。さらに、本発明をいずれかの理論または作用の様式に限定することなく、ｑＰＣＲアッセイでは、蛍光シグナルの蓄積により陽性反応が検出される。Ｃｔ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値をわたる（つまり、バックグラウンドレベルを超える）ために必要なサイクル数として定義される。Ｃｔレベルは、試料中の標的核酸の量に反比例である（すなわち、Ｃｔレベルが低いほど、試料中の標的核酸の量が多くなる）。Ｃｔ＜２９は一般に、試料中の豊富な標的核酸を示す強い陽性反応と見なされる。３０〜３７のＣｔは通常中程度の量の標的核酸を示す陽性反応であり、３８〜４０のＣｔは最小量の標的核酸を示す弱い反応と見なされる。結果を達成するために必要なＣｔサイクルの数が増えると、そこから取得される結果の不正確さの可能性も増加する。前述のように、ｑＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）に関して、本発明の方法により、標的ＤＮＡメチル化の正確かつ再現可能な分析が可能となり、その標的ＤＮＡは、従来技術のｑＰＣＲ法のＬＯＤを下回る量で存在する。
【００７５】
一実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満である。別の実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。最も詳細には、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である。さらなる実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、最も詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。
【００７６】
別の実施形態において、該増幅は定量的ＰＣＲであり、該低コピー数はＬＯＤである。
【００７７】
したがって、遺伝子またはその領域のメチル化をスクリーニングする方法が提供され、その標的遺伝子は本質的に以下からなるリストから選択され、
【表３９】
2020534820.tif 000042
該方法は、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該遺伝子またはその領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）標的遺伝子の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）標的遺伝子の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む。
【００７８】
別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、目的のＤＮＡ領域の低コピー数を含むＤＮＡ試料である。
【００７９】
さらに別の実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【００８０】
別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰおよび／またはＣＡＨＭ、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【００８１】
本発明の方法に従って試験されるＤＮＡは、生物学的試料から単離され得る。「生物学的試料」への言及は、動物、植物、細菌などの任意の源に由来する、細胞物質、生体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、腹水、精液）、糞便（便）、組織生検標本、外科標本、または体内に導入された後に除去された液体（例えば、腸洗浄液から回収した溶液など）を含むがこれらに限定されない生物学的物質の任意の試料への言及として理解されるべきである。本発明の方法に従って試験される生物学的試料は、直接的に試験されてもよく、または試験の前に何らかの形態の処理を必要とする場合がある。例えば、生検または外科的試料では、試験の前に均質化が必要である場合がある。代替的に、細胞試料は、試験の以前に透過処理が必要である場合がある。さらに、生物学的試料が液体形態ではない範囲において（試験にそのような形態が必要な場合）、試料を可動化するために、緩衝液などの試薬の添加が必要である場合がある。
【００８２】
目的のＤＮＡ領域が生物学的試料に存在する範囲で、生物学的試料は直接的に試験されてもよく、または生物学的試料内に存在するＤＮＡの全てもしくは一部が試験の前に単離されてもよい。さらに別の例において、試料は、分析の以前に部分的に精製されてもよく、そうでなければ濃縮されてもよい。例えば、生物学的試料が非常に多様な細胞集団を含む範囲で、特に目的の亜集団を濃縮することが所望される場合がある。標的生体試料またはそれに由来する分子を、試験の前に処理、例えば、生ウイルスを不活性化することは、本発明の範囲内である。これも当然のことながら、生物学的試料は、新鮮な採取物であってもよく、または試験の前は保存されていてもよく（凍結など）、もしくはそれ以外の場合は試験の前に処理されてもよい（培養などによって）。
【００８３】
本明細書に開示される方法による試験に最も好適な試料の種類の選択は、状況の性質に依存することになる。大腸腫瘍の発症または発症の素因についてスクリーニングする範囲で、例えば、該試料は、好ましくは糞便（便）試料、腸洗浄、外科的切除、組織生検、または尿、唾液、腹水、血液試料（全血、血清、血漿など）などの生体液である。
【００８４】
より好ましくは、該生物学的試料は、血液試料、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、尿、生検試料、または便試料である。
【００８５】
本発明の試料は、目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含む。当業者によって理解されるように、染色体ＤＮＡは、一緒にハイブリダイズして分子を形成するＤＮＡの２つの相補鎖を含む。目的の対象であるＤＮＡ領域は、本発明の状況下において、「標的鎖」として定義され、一方で相補鎖は「反対鎖」として称される。当業者は、ＤＮＡ二重螺旋の２本鎖が「センス」鎖、「コード」鎖、「ポジティブ（＋）」鎖、「上部（ｔｏｐ）」鎖、または「上部（ｕｐｐｅｒ）」鎖ともしばしば称されることを認識するであろう。後者の３つの用語は、目的のＤＮＡ領域がタンパク質発現産物を産生しない場合に、より一般的に利用される。対応する相補鎖は、「アンチセンス」鎖、「非コーディング」鎖、「ネガティブ（−）」鎖、「下部（ｌｏｗｅｒ）」鎖または「下部（ｂｏｔｔｏｍ）」鎖としばしば称される。これは、染色体遺伝子座の状況下において、上部（ｔｏｐ）／＋／上部（ｕｐｐｅｒ）鎖に相補的であり、その自然の状態では、上部鎖とハイブリダイズして特徴的な二重螺旋構造を形成する鎖を意味すると理解されるべきである。当業者によって理解されるように、タンパク質をコードしない多くの遺伝子領域が存在するとことが決定されているため（したがって、センスまたはコーディング鎖で見出されたとして正しく記載されていない）、この命名法は次第に明確さが低下してきており、さらに、その遺伝子は、当業者がこれらの鎖をどのように定義するかに応じて、＋／上部鎖または−／下部鎖のいずれかに基づき得る。タンパク質をコードする遺伝子でさえ、従来は−／下部／アンチセンス鎖と見なされていたことに基づくことが知られている。したがって、この用語のみを参照して、特定の染色体位置を参照せずに、または注釈付きのヒトゲノムデータベースで使用される特定の＋／−鎖命名法を参照して、鎖を特定および定義することは不正確であり得る。これに関して、本発明の状況下において、「標的鎖」への言及は、目的の領域を含むＤＮＡ鎖への言及であり、２本の鎖のうちのいずれかであり、一方で、「反対側の鎖」は相補鎖への言及である。したがって、標的鎖は、遺伝子が染色体二重螺旋のどこに位置するかに応じて、＋／−（上部／下部）鎖のいずれかに対応する。
【００８６】
当然のことながら、本発明の方法のステップ（ｉ）の生物学的試料の標的および反対鎖は、該ＤＮＡの非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触する以前に、ハイブリダイズした二本鎖形態またはハイブリダイズしていない一本鎖形態のいずれかであり得る。対象ＤＮＡが二本鎖または一本鎖の形態であるかどうかは、本発明の方法による試験の開始以前に試料がどんな処理を受けたか（受けたとすれば）に依存する可能性が高い。なおさらに、非メチル化シトシン修飾をもたらすために選択される薬剤に応じて、当業者は、二本鎖または一本鎖形態の形成を促進するために試料のＤＮＡを操作することを選択し得る。
【００８７】
上記で詳述したように、本発明の方法は、増幅に基づく方法論を介してＤＮＡ標的のメチル化特性を正確に定性的または定量的に分析する手段を提供する。本発明の方法を適用することにより、亜硫酸水素処理プロセス中の糖リン酸ＤＮＡ骨格のニッキングの結果としての、結果の歪みが大幅に低減された。この方法の適用に関して、二本鎖ＤＮＡ配列のメチル化を調査するように設計された既存の増幅方法のいずれかを、増幅およびプロービングの組み合わせを介して、本発明の方法に従って適合できることが、当業者によって認識されるべきである。例えば、メチル化特異的プライマーまたは非メチル化特異的プライマーのいずれかを使用する増幅法（ＰＣＲなど）を設計できる。例示される実施形態によれば、メチル化特異的プライマーが使用される（例えば、メチル化特異的ＰＣＲ）。しかしながら、非メチル化特異的プライマーも使用できるが、この場合、これらのプライマーはメチル化されているかに関係なく標的ＤＮＡを増幅するため、メチル化の調査はメチル化特異的プローブの使用から得られた結果のみに依存するであろう。同様に、使用されるプローブに関して、例示される実施形態は加水分解プローブを使用し、これによりリアルタイムＰＣＲ定量化を達成することが可能となる。しかしながら、このようなプローブを使用する場合でも、得られた読み取り値を定性的に分析すれば十分であり得る。代替的に、定性的な読み取りのみを提供し、定量分析を可能にしないプローブを使用することを選択し得る。
【００８８】
第１のステップでは、分析の対象である核酸試料を薬剤と接触させて、非メチル化シトシン残基を修飾する。本明細書で使用する「修飾する」という用語は、薬剤による非メチル化シトシンの別のヌクレオチドへの変換を意味し、該変換は起源の核酸試料中の非メチル化シトシンとメチル化シトシンを識別する。任意の好適な薬剤が使用され得る。一実施形態において、薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムなどの非メチル化シトシンをウラシルに変換する薬剤である。しかしながら、メチル化されたシトシンではなく、非メチル化シトシンを選択的に修飾する他の同等の修飾剤を本発明の方法に使用できる。例えば、亜硫酸水素アンモニウムなどの亜硫酸水素塩の他の好適な形態のいずれも使用できる。亜硫酸水素ナトリウムは、シトシンの５、６−二重結合と容易に反応するが、メチル化されたシトシンとは反応せず、アルカリまたは高温条件下で脱アミノ化されてウラシルを生成するスルホン化されたシトシン中間体を生成する。Ｔａｑポリメラーゼはウラシルをチミン、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）をシトシンとして認識するため、亜硫酸水素ナトリウム処理およびＰＣＲ増幅の連続的な組み合わせにより、最終的に非メチル化シトシン残基のチミンへの変換（Ｃ→Ｕ→Ｔ）、およびメチル化されたシトシン残基（「ｍＣ」）からシトシン（ｍＣ→ｍＣ→Ｃ）への変換がもたらされる。したがって、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理は、非メチル化シトシンをウラシルに変換することにより、メチル化に依存する配列の違いを創造する。当然のことながら、ステップ（ｉ）の核酸へのプライマーのハイブリダイズに関して、プライマーは、修飾された（例えば、亜硫酸水素変換された）ＤＮＡ、またはそこから増幅されたＤＮＡにハイブリダイズするように設計される。これに関して、プライマーは、方法の設計に応じて、メチル化特異的プライマーまたは非メチル化特異的プライマーとして機能するように設計され得る。
【００８９】
この実施形態によれば、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【００９０】
一実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、標的遺伝子である。
【００９１】
別の実施形態において、該標的遺伝子は以下のうちの１つ以上である。
【表４０】
2020534820.tif 000043
【００９２】
さらに別の実施形態において、該標的遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、またはＣＡＨＭのうちの１つ以上、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【００９３】
さらに別の実施形態において、ステップ（ｉｖ）の結果は、偽陰性結果の低減された発生を示す。
【００９４】
さらに別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿である。
【００９５】
なおさらなる実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【００９６】
一実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満である。別の実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。最も詳細には、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である。さらなる実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、最も詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。
【００９７】
別の実施形態において、増幅は定量的ＰＣＲであり、該低コピー数はＬＯＤである。非メチル化シトシン残基の変換がもたらされると、試料は増幅のための準備が整う。上記で詳述したように、本発明は、増幅に基づくメチル化分析のアウトプットを予想外に著しく増加することができる、偽陰性結果の発生が著しく減少するという判定に基づいており、増幅反応は、修飾された標的鎖にハイブリダイズするように設計された少なくとも１セットのプライマーおよびプローブと、目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖にハイブリダイズするように設計されたプライマーおよびプローブのさらなるセットと、を使用するように設計されており、これらの鎖は、亜硫酸水素処理後に相補的ではなくなり、それにより標的および反対鎖の両方のメチル化分析を独立して進めることが可能である。疾患のマーカーとして低コピー数の標的遺伝子を検出することに向けられた臨床診断用途の状況下において、本発明の方法は、増幅産物の生成、そしてしたがって既に非常に低いレベルの開始ＤＮＡ標的物質のレベルを低減させる、一般的なＤＮＡ損傷事象により以前はこれが妨げられた場合がある結果だけでなく、さらにより重要なことに、プライマーまたはプローブのハイブリダイゼーション部位内でニックが発生した場合などに偽陰性の結果に生成につながる可能性がある、標的鎖の無作為なニッキングの作用による影響が大幅に少ない結果を生成することも可能にする。
【００９８】
これに関して、「プライマー」への言及は、ヌクレオチドの配列、またはその機能的誘導体もしくは類似体を含む任意の分子への言及として理解されるべきであり、その機能には、目的のメチル化領域に隣接する相補的ＤＮＡ配列へのアニーリングと、アニーリング領域の下流のＤＮＡ配列の増幅との両方が含まれる。当然のことながら、プライマーは、非核酸成分を含み得ることを理解すべきである。例えば、プライマーは、蛍光もしくは酵素タグなどの非核酸タグ、または分子の使用もしくは検出を促進する他の非核酸成分をさらに含み得る。別の例において、プライマーは、核酸側鎖を示すペプチド骨格を含むタンパク質の核酸であり得る。好ましくは、該プライマーは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００９９】
本発明での使用に好適なプライマーの設計および合成は、当業者に周知であろう。一実施形態において、対象のプライマーは、４〜６０ヌクレオチドの長さ、別の実施形態においては、１０〜５０ヌクレオチドの長さ、さらに別の実施形態においては、１５〜４５ヌクレオチドの長さ、さらに別の実施形態においては、２０〜４０ヌクレオチドの長さである。
【０１００】
本発明の方法で使用されるプライマーの数に関して、これは当業者により決定することができる。プライマーの総数に関して、考慮が必要な可変性は、増幅される核酸領域のサイズおよび数、ならびにプライマーがハイブリダイズする配列間の距離である。ネステッドＰＣＲ反応が実行される範囲で、当然のことながら、標的鎖または反対鎖のいずれかに向けられたプライマーの「セット」への言及は、最も外側のフォワードプライマーおよびリバースプライマーだけでなく、これらの鎖の１つに対する既定のネステッド反応に使用される全てのプライマーへの言及である。これも当然のことながら、例えば、ネステッド反応の設計の状況下で、所与のＤＮＡ鎖を増幅するセットの一部として使用するために選択され得るプライマーの数に関係なく、第１のセットの少なくともいくつかの配列は、前者が標的鎖を選択的に増幅するように設計され、後者が反対鎖を選択的に増幅するように設計されているという点で、第２のセットのプライマーの少なくともいくつかの配列とは異なることになる。しかしながら、内部ネステッドライマーを使用するように選択した場合、鋳型鎖の配列の性質次第であり、これらが両方の鎖に対して同じになり得ることは考えられない。
【０１０１】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の相補鎖との配列特異的ハイブリダイゼーションが可能な直鎖状の一本鎖オリゴマーデオキシリボ核酸またはリボ核酸分子である。プライマーは好ましくはＤＮＡである。本発明のプライマーは、増幅プロセス中に重合の特異的かつ効率的な開始（プライマー伸長）を提供するのに十分な長さである。厳密な長さは、温度（増幅時）、緩衝液、およびヌクレオチド組成を含む複数の要因次第であろう。好ましくは、プライマーは一本鎖であるが、鎖が最初に分離される場合は二本鎖プライマーを使用し得る。プライマーは、当技術分野で一般的に知られている従来のホスホトリエステルおよびホスホジエステル法または自動化方法などの任意の好適な方法を使用して調製され得る。
【０１０２】
上記で詳述したように、本発明の方法で利用されるプライマーは、目的の標的核酸を増幅する任意の好適なプライマーであり得る。例えば、プライマーは、メチル化特異的プライマーまたは非メチル化特異的プライマーであり得る。「メチル化特異的」プライマーとは、亜硫酸水素変換された、メチル化されたＤＮＡに対して非メチル化ＤＮＡのように、メチル化されたＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを識別できるプライマーを意味する。そのようなメチル化特異的プライマーは、例えば、非変換５−メチルシトシンのみとハイブリダイズするか（すなわち、プライマーは亜硫酸水素変換された、メチル化されたＤＮＡにハイブリダイズする）、または逆に、非メチル化シトシンから変換されるチミンとハイブリダイズする（すなわち、プライマーは、亜硫酸水素変換された非メチル化ＤＮＡにハイブリダイズする）ことにより、メチル化されたＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを識別するように設計できる。それにより、メチル化は、増幅を達成する特定のプライマーの能力によって決定される。当業者に理解されるように、メチル化特異的識別を達成するためのプライマーは、好ましくはＤＮＡメチル化の潜在的部位（ＣｐＧジヌクレオチド）と重複し、修飾された非メチル化ＤＮＡをメチル化されたＤＮＡから特異的に識別するように設計される。例えば、プライマーは、１〜数個のＣｐＧ配列、好ましくは１〜５個のＣｐＧ配列または１〜４個のＣｐＧ配列と重複するように設計され得る。
【０１０３】
非メチル化特異的プライマーが使用される場合、利用されるプローブのパネルは、メチル化されたおよび非メチル化ＤＮＡを識別することが不可能なプローブを含まないことが必要であることは理解されよう。これに関して、当然のことながら、非メチル化特異的プライマーが使用される場合、亜硫酸水素変換された標的鎖の非メチル化特異的領域を標的とするという事実は、反対鎖の対応する領域が亜硫酸水素変換後にまだ相補的であることを意味するため、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットは同じであり得る。本発明に従って、目的の核酸領域の２つ以上のメチル化パターンを検出するが、非メチル化ＤＮＡを検出しないプローブセットを設計することは、十分に当業者の技術の範囲内である。使用されるプライマーがメチル化特異的である場合、プローブセットが目的の核酸標的の非メチル化形態に向けられたプローブを含むかの問題はそれほど重要でない。
【０１０４】
目的のＤＮＡ領域の「１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計された」プライマーへの言及は、プライマーが対象領域の全てまたは一部のメチル化された形態の増幅を可能にすることを意味すると理解されるべきであり、その後、これらのアンプリコンはプローブによって調査される。プライマーが非メチル化特異的である場合、メチル化のいかなる程度の有無に関係なく、対象領域の全ての形態を増幅する。例えば、プライマーは、部分的シトシンメチル化の領域の一部を形成するＣｐＧの上流および下流に位置する非メチル化ＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され得る。この状況では、プライマーは、メチル化されていないがシトシンのメチル化領域の近位に位置するＤＮＡ部位にハイブリダイズするように設計されているため、試料に存在する全ての核酸分子のこの領域を増幅することになる。この場合、この方法のメチル化特異性はプローブによってのみ提供され、プローブのプールに、標的領域の完全にメチル化されていない形態に向けられたプローブが含まれないようにすることが重要であろう。別の実施形態において、１つ以上のプライマーはメチル化特異的であり、完全にメチル化された、および部分的にメチル化された領域の上流および／または下流にある１つ以上のシトシン残基にハイブリダイズするように設計され得る。メチル化特異的プライマーを設計することにより、メチル化特異的増幅を達成できる。さらに別の例では、プライマーの一方または両方は、部分的にメチル化された残基自体に向けられ得る。この状況では、良好な感度を達成するために、乱交雑にハイブリダイズするプライマー、またはプライマーのプールを設計することが望ましく、可能な限り多くの異なる部分的にメチル化された形態のＤＮＡ標的とハイブリダイズして、増幅することを可能にし、それにより特異性を改善する。これは、例えば、多重化アッセイの適用の状況下で達成され得る。好適な乱交雑プライマーまたはプライマーのプールの設計に関して、プローブ配列設計に関して以下に提供される記載は、これらのプライマーの設計にも適用可能であり、両方の分子は、標的ＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドである。かかるプライマーおよびプローブの設計は、国際特許公開公報第２０１５／１８４４９８号で詳細に論じられている。
【０１０５】
一実施形態において、該プライマーは、メチル化特異的である。
【０１０６】
この実施形態によれば、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的のＤＮＡ領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたメチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたメチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）任意で、検出手段を組み込む１つ以上のプローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該ＤＮＡに沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【０１０７】
別の実施形態において、非メチル化シトシン残基を修飾する該薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムである。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、標的遺伝子またはその領域である。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、該標的遺伝子は、本質的に以下からなるリストから選択される。
【表４１】
2020534820.tif 000044
【０１１０】
さらに別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、またはＣＡＨＭのうちの１つ以上、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、ステップ（ｉｖ）の結果は、偽陰性結果の低減された発生を示す。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿である。
【０１１３】
さらなる実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【０１１４】
さらなる実施形態において、該プローブは、非メチル化特異的プローブである。
【０１１５】
一実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満である。別の実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。最も詳細には、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である。さらなる実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、最も詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。
【０１１６】
別の実施形態において、増幅は定量的ＰＣＲであり、低コピー数はＬＯＤである。
【０１１７】
さらに別の実施形態において、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的の遺伝子領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計された非メチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計された非メチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該ＤＮＡに沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【０１１８】
さらに別の実施形態において、非メチル化シトシン残基を修飾する該薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムである。
【０１１９】
一実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、標的遺伝子である。
【０１２０】
別の実施形態において、該標的遺伝子は、本質的に以下からなるリストから選択される。
【表４２】
2020534820.tif 000045
【０１２１】
さらに別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、またはＣＡＨＭのうちの１つ以上、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【０１２２】
さらに別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿である。
【０１２３】
さらに別の実施形態において、ステップ（ｉｖ）の結果は、偽陰性結果の低減された発生を示す。
【０１２４】
さらなる実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【０１２５】
一実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満である。別の実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。最も詳細には、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である。さらなる実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、最も詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。
【０１２６】
別の実施形態において、該増幅は定量的ＰＣＲであり、該低コピー数はＬＯＤである。
【０１２７】
本発明の方法により増幅されるＤＮＡ領域のサイズは、当業者により決定され得、プローブが結合しなければならない領域のサイズ、およびプライマーが向けられているＣｐＧジヌクレオチドクラスターのＤＮＡ標的配列に沿った分布などの要因に依存するであろう。この目的のために、本発明の増幅方法は、プローブがプライマー間のＤＮＡ配列領域（すなわち、プライマー間配列）、またはプライマー領域と重複する領域に向けられ、したがって増幅の結果として生成されるアンプリコンに選択的にハイブリダイズするように設計される。
【０１２８】
当然のことながら、目的の標的に「向けられる」フォワードおよびリバースプライマーへの言及は、プライマーが問題の標的の全てまたは一部のいずれかをハイブリダイズおよび増幅することを意味すると理解されるべきである。例えば、目的の標的が標的遺伝子である場合、プライマーは、プロモーター領域の全部または一部など、遺伝子のより小さな区分のサブ領域にハイブリダイズして増幅するように設計され得る。当業者によって理解されるように、一般に、大きなアンプリコンよりも小さなサイズのアンプリコンを生成および分析することが望ましい。
【０１２９】
上記で詳述したように、本発明の方法は、メチル化されたＤＮＡ標的、特に少ない初期コピー数の存在を定量的または定性的にスクリーニングする、信頼性があり、非常に感度がより高く、正確な手段を提供する。定量分析の実行が求められる範囲で、増幅ステップによって生成される目的のアンプリコンにハイブリダイズするように設計された検出可能なプローブを組み込むために、メチル化分析アッセイが必要である。したがって、「プローブ」への言及は、ヌクレオチドの配列、またはその機能的誘導体もしくは類似体を含む任意の分子への言及として理解されるべきであり、その機能には、該ヌクレオチド配列の少なくとも１つの領域の標的核酸分子とのハイブリダイゼーションが含まれる。上記で詳述したように、本発明の方法は、部分的メチル化が存在する場合でも、メチル化されたＤＮＡ標的の定量的（または定性的）スクリーニングの信頼性のある正確な手段を提供する。これは、所与の目的の領域に対する全ての潜在的で部分的なメチル化パターンを検出するように設計された、プローブまたはプローブのプールの設計および適用によって可能となる。この種類のプローブの異種プールの使用は、スクリーニングされるＤＮＡ試料に存在するＤＮＡの部分的にメチル化された形態の全範囲に効果的にハイブリダイズし、検出を可能とすることがさらに特定されている。
【０１３０】
したがって、別の実施形態において、該プローブは、部分的シトシンメチル化の領域に向けられた１つ以上の加水分解プローブであり、該１つ以上のプローブは、該領域で少なくとも２つの異なるメチル化パターンに集合的にハイブリダイズする。
【０１３１】
核酸プローブは、非核酸成分を含み得る。詳細には、核酸プローブは、蛍光タグ、または分子の検出もしくは固定化などの分子の機能を促進するいずれかの他の成分などの検出手段も含む。「検出手段」への言及は、プローブの検出を可能にする任意の手段の組み込みへの言及として理解されるべきである。検出手段は、定性的または定量的検出のいずれかを促進し得るが、定量性は特に有用である。検出手段は、フルオロフォアまたは放射性同位体などの検出可能な部分または媒介物の形態を取り得る。代替的に、検出手段は、磁気ビーズまたはビオチン−ストレプトアビジン系などを介した分析のために、反応混合物からのプローブの物理的単離を可能にし得る。
【０１３２】
本発明を限定することなく、個々のプローブ成分は、全て同じ検出剤（例えば、フルオロフォア）で標識するか、または各プローブ成分を異なる薬剤（例えば、異なる発光波長のフルオロフォア）で標識できる。例えば、プローブ混合物は、混合物に２つ以上のプローブ特異性が存在する場合でも、全てのプローブ成分が同じフルオロフォアで標識されるように設計され得、したがって、結合する任意の１つ以上のプローブは、リアルタイムＰＣＲで陽性シグナルを示すことになる。代替的なアプローチとしては、異なるプローブと異なるフルオロフォアを付着させ、ハイブリダイズするプローブ特異性を識別することである。例えば、目的の遺伝子の、複数の異なる部分的にメチル化された形態を識別するように設計された異種プローブ混合物は、検出された波長（複数可）に基づいてメチル化された（またはされない）塩基を識別する。例えば、部分的メチル化が初期ステージのがんの特徴であり、完全なメチル化が後期ステージのがんの特徴である場合、このアプローチは、がんのステージ分けに有益であり得る。現在のリアルタイムＰＣＲ機器は、最大６つの異なる蛍光団を検出できるが、１つの試料の複数の機能を調査するための他の技術が利用可能である（例えば、ビーズに基づく蛍光選別）。そのような場合、各プローブをビーズに付着させて、個別に選別でき得る。
【０１３３】
例えば、本発明は、この実施形態を実施するための、例えば、ＴａｑＭａｎ（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，７２７６−７２８０，１９９１；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１，３７６１−３７６６，１９９３）などのリアルタイム定量的形態のＰＣＲの使用を包含する。例えば、Ｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：Ｅ３２，２０００のＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法では、改変されたＴａｑＭａｎ加水分解プローブアッセイを使用して、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化を検出する。本質的に、この方法は、核酸試料を亜硫酸水素で処理し、例えばＰＣＲなどの増幅反応を使用して、対照試料ではなく腫瘍細胞でメチル化される１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸を増幅することを含む。増幅反応は、目的の領域に隣接するフォワードおよびリバースプライマー、ならびに２つのプライマー間で１つ以上のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの部位にハイブリダイズするプローブの、３つのオリゴヌクレオチドの存在下で実行される。プローブは、５’蛍光レポーターおよび３’クエンチャー（またはその逆も同様）で二重標識されている。プローブが無傷の場合、クエンチャー色素はレポーターが近接しているため、レポーターの蛍光を吸収する。ＰＣＲ産物へのアニーリングに続いて、プローブは、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により切断される。この切断により、レポーターがクエンチャーから放出され、それによって蛍光シグナルが増加し、これを使用して初期鋳型のメチル化レベルを推定できる。非変異核酸（すなわち、メチル化された核酸）に選択的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーを使用することにより、メチル化のレベルが、例えば標準曲線を使用して決定される。
【０１３４】
代替的に、切断を必要とする標識プローブを使用するのではなく、例えば分子ビーコンなどのプローブが使用される（例えば、Ｍｈｌａｎｇａ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４６３−４７１，２００１を参照されたい）。分子ビーコンは、ステムループ構造を有する一本鎖核酸分子である。ループ構造は、腫瘍試料ではメチル化され、対照試料ではメチル化されていない、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを囲む領域に相補的である。ステム構造は、プローブ（ループ）の両側にある互いに相補的な２つの「アーム」をアニールすることによって形成される。蛍光部分は一方のアームと結合し、分子ビーコンが標的配列と結合していないときに検出可能な蛍光を抑制するクエンチング部分は他方のアームと結合する。ループ領域がその標的核酸と結合すると、アームが分離され、蛍光が検出可能となる。しかしながら、一塩基のミスマッチでも、試料で検出される蛍光のレベルが大幅に変化する。したがって、特定の塩基の有無は、検出される蛍光のレベルによって決定される。そのようなアッセイは、核酸中の１つ以上の非変異部位（すなわち、メチル化されたヌクレオチド）の検出を容易にする。
【０１３５】
蛍光標識された架橋型核酸（ＬＮＡ）分子または蛍光標識されたタンパク質−核酸（ＰＮＡ）分子は、ヌクレオチドの違いの検出に有用である（例えば、Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１７）：１−５，２００２に記載される）。ＬＮＡおよびＰＮＡ分子は、核酸、特にＤＮＡと高い親和性で結合する。ＬＮＡまたはＰＮＡプローブと複合したフルオロフォア（特に、ロドミンまたはヘキサクロロフルオレセイン）は、プローブが標的核酸とハイブリダイゼーションすると、かなり高いレベルで蛍光を発する。しかしながら、単一のヌクレオチドのミスマッチでさえも発生した場合には、蛍光の増加レベルは同じレベルには増強されない。したがって、試料で検出される蛍光の程度は、ＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化されたシトシンの存在下などで、ＬＮＡまたはＰＮＡプローブと標的核酸との間のミスマッチの存在を示す。好ましくは、蛍光標識されたＬＮＡまたはＰＮＡ技術を使用して、例えば当技術分野で既知のおよび／または本明細書に記載の増幅方法を使用して以前に増幅されている核酸の少なくとも一塩基変化を検出する。
【０１３６】
当業者には明らかなように、Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８９８−１９０５，１９９９に記載されているような、ＬＮＡまたはＰＮＡ検出技術は、ＬＮＡまたはＰＮＡプローブを固体支持体に固定化することにより、１つ以上のマーカーのハイスループット検出に適している。
【０１３７】
好ましくは、メチル化依存配列の違いは、蛍光系定量的ＰＣＲに基づく方法によって検出される（リアルタイム定量的ＰＣＲ、Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４，１９９６；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９９５−１００１，１９９６）（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」および「Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）」技術）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）およびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）技術の場合、配列識別を、（１）増幅ステップ、または（２）蛍光検出ステップの２つのステップのいずれか、または両方で生じさせることができる。ＦＲＥＴハイブリダイゼーションの場合、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）でのプローブ様式、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのいずれか、または両方を使用して、配列の違いを識別できる。最も好ましくは、本明細書の全ての発明の実施形態で使用される増幅プロセスは、蛍光系リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４，１９９６）であり、二重標識された蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを使用した、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ）を利用する。
【０１３８】
一実施形態において、検出手段は、蛍光レポーター分子、より好ましくは、加水分解プローブである。「加水分解プローブ」への言及は、二重標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドへの言及として理解されるべきである。本発明をいずれか１つの理論または作用の様式に限定することなく、オリゴヌクレオチドの５’末端は蛍光レポーター分子で標識され、３’末端はクエンチャー分子で標識される。プローブの配列は、増幅された標的分子内の目的の領域と特異的である。加水分解プローブは、配列の長さが、蛍光を抑制するために５’フルオロフォアおよび３’クエンチャーを十分に近接して配置されるように設計されている。
【０１３９】
加水分解プローブは、ＰＣＲ増幅プライマーの結合部位間の目的の領域と結合するように設計されている。ＰＣＲサイクルの伸長段階で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲプライマーの下流の相補鎖を合成する。伸長が結合した加水分解プローブに達すると、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解プローブが分解される。プローブの切断により、蛍光レポーター分子がプローブの残りの部分（したがってクエンチャー）から分離され、レポーター分子が蛍光を発する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、残りの新生鎖の合成を継続するため、したがって、プローブのハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ反応を阻害しない。その後のＰＣＲサイクルでは、放出される蛍光レポートの量、つまり蛍光が累積的に増加する。好適なレポーターおよびクエンチャー分子の例は、５’蛍光レポーター色素６ＦＡＭ（「ＦＡＭ」；２，７ジメトキシ−４，５−ジクロロ−５−カルボキシ−フルオレセイン）、ＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＴＥＸ６１５、Ｃｙ５、およびＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）；および３’クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、Ｄａｂｅｃｙｌ、Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ−１）、ＢＨＱ−２、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、およびＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱである（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：３５７−３６２，１９９５；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９９５−１００１，１９９６；Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４，１９９６）。さらに、ＺＥＮクエンチャーなどの内部クエンチャーを含めることにより、プローブを二重消光し得、さらに大きいクエンチングを提供し、バックグラウンド蛍光をさらに低減する。
【０１４０】
一実施形態において、該プローブは、加水分解プローブである。
【０１４１】
別の実施形態において、該プローブは、部分的シトシンメチル化の領域に向けられた１つ以上の加水分解プローブであり、該１つ以上のプローブは、該領域で少なくとも２つの異なるメチル化パターンに集合的にハイブリダイズする。
【０１４２】
当業者は、２つ以上の遺伝子マーカーをスクリーニングする範囲で、本発明の方法を使用して、一つには全てではないがいくつかの遺伝子マーカーがスクリーニングされるように、方法を設計する選択をし得ることを理解し、一方で、他では標準的な従来技術のメチル化分析法を使用してスクリーニングされる。例えば、２つの遺伝子が分析の対象である場合に、一方の遺伝子は、標的鎖、および亜硫酸水素（または同等の）変換されたＤＮＡの非相補的反対鎖の両方の増幅に基づいて分析され得（すなわち、本発明の方法により）、一方で、他方の遺伝子は、標的鎖のみの標準的なメチル化特異的増幅を受け得る。これは、一方のマーカーが、他のマーカーと同じレベルの感度での分析を必要とせず、したがって本発明の方法の適用を必ずしも必要としない場合に適切であり得る。このような分析設計の例を、実施例１１に提供する。
【０１４３】
本発明の方法が部分的にメチル化されたＤＮＡを検出するように設計される範囲で、本発明のプローブは、単一の反応内で、少なくとも２つの異なるメチル化パターンを示すＤＮＡ配列とハイブリダイズできるように設計される。例えば、プローブは、完全にメチル化された配列、および１つ以上の部分的にメチル化された配列とハイブリダイズし得る。別の例において、プローブは、ＤＮＡ配列の少なくとも２つの異なる部分的なメチル化された形態を検出し得る。本発明の方法が、完全におよび部分的にメチル化された形態の両方を示すＤＮＡ標的のメチル化を検出する、正確かつ再現可能な手段を提供することに向けられている範囲で、この検出方法が、部分的にメチル化された形態を示す、または示すと考えられるＤＮＡ配列の１つの別個の領域にプローブの焦点を合わせるように設計されていることが理解されるべきである。しかしながら、当業者は、ＤＮＡ標的が、プローブによって標的とされる領域以外のＤＮＡ配列の領域で部分的なメチル化パターンを示し得ることを理解するであろう。したがって、当然のことながら、本方法のこの実施形態は、プローブが向けられるＤＮＡ領域での部分的なメチル化の検出および評価に限定されるが、ＤＮＡ標的の任意の他の領域には限定されない。したがって、特定の遺伝子標的をスクリーニングする範囲で、本発明の方法は、プローブが向けられた部位で部分的なメチル化を示す、その遺伝子の部分的なメチル化された形態の全てを検出するように設計されている。しかしながら、対象遺伝子が、その配列に沿った他の部位でも部分的なメチル化を示し得る範囲で、プローブがこれらのメチル化部位に向けられていない場合に、これらの部分的なメチル化された形態は検出されない。しかしながら、当業者は、潜在的に部分的なメチル化の２つ以上の領域が目的の領域である範囲で、これらの領域が増幅プライマーペアの間に位置されているとすると、このような領域の複数に向けられたプローブの使用を含むように方法を適合できることを理解するであろう。
【０１４４】
本明細書における少なくとも２つの「該領域での異なるメチル化パターン」とハイブリダイズする対象の１つのプローブまたは複数のプローブへの言及は、本発明の方法で使用されるプローブが、同じＤＮＡ配列領域とハイブリダイズするように全てが設計されることを意味すると理解されるべきである。しかしながら、メチル化されたこのＤＮＡ配列領域は、完全なメチル化または一部のメチル化された形態の範囲を示し得、これは「異なるメチル化パターン」または「差次的メチル化」と称される。この領域に存在するメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの数が増加すると、潜在的に異なる部分的なメチル化パターンの数が増加する。例えば、Ｃｈｒ７：５０３０４３２３−５０３０４３４９でのＩＫＺＦ１の完全にメチル化された形態に加えて、６つの部分的なメチル化された形態、および完全な非メチル化形態を含む増幅プライマー間に７つの異なるメチル化パターンが存在する。状態の状況に応じて、特定のＤＮＡ標的の全てではなく、一部のメチル化形態のいくつかのスクリーニングのみを求める場合もあるが、目的のＤＮＡ標的の全ての差次的なメチル化された形態を検出することを選択し得る。例えば、２つの主要な、部分的なメチル化された形態が存在することが既知である場合に、これら２つのみのスクリーニングを選択し得る。この評価を行い、プローブセットを適切に設計することは、十分に当業者の技術の範囲内であろう。
【０１４５】
したがって、この実施形態によれば、目的の遺伝子またはその遺伝子領域のメチル化をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換するために、亜硫酸水素剤と接触させることであって、該試料が、該目的の遺伝子領域の標的鎖および反対鎖の両方を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的の遺伝子領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたメチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたメチル化特異的フォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）検出手段を組み込む１つ以上のメチル化特異的プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法を提供する。
【０１４６】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表４３】
2020534820.tif 000046
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表４４】
2020534820.tif 000047
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表４５】
2020534820.tif 000048
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表４６】
2020534820.tif 000049
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１４７】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表４７】
2020534820.tif 000050
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表４８】
2020534820.tif 000051
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表４９】
2020534820.tif 000052
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表５０】
2020534820.tif 000053
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１４８】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表５１】
2020534820.tif 000054
の配列または実質的に同様な配列を含み、該第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表５２】
2020534820.tif 000055
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表５３】
2020534820.tif 000056
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表５４】
2020534820.tif 000057
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１４９】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表５５】
2020534820.tif 000058
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表５６】
2020534820.tif 000059
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表５７】
2020534820.tif 000060
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表５８】
2020534820.tif 000061
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【０１５０】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表５９】
2020534820.tif 000062
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表６０】
2020534820.tif 000063
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表６１】
2020534820.tif 000064
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表６２】
2020534820.tif 000065
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【０１５１】
さらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表６３】
2020534820.tif 000066
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表６４】
2020534820.tif 000067
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表６５】
2020534820.tif 000068
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表６６】
2020534820.tif 000069
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１５２】
別のさらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表６７】
2020534820.tif 000070
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表６８】
2020534820.tif 000071
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表６９】
2020534820.tif 000072
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表７０】
2020534820.tif 000073
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１５３】
さらに別のさらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表７１】
2020534820.tif 000074
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表７２】
2020534820.tif 000075
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表７３】
2020534820.tif 000076
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表７４】
2020534820.tif 000077
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１５４】
本発明の方法が標的および／または反対の増幅産物に向けられた２つ以上のプローブを利用する範囲で、当然のことながら、対象プライマーは上記に開示された配列に対応する場合があり、または実質的に類似する場合がある。代替的に、これらの配列または実質的に類似の配列は、より大きなプライマー分子内のサブ領域を表し得る。「実質的に類似の配列」への言及は、配列に若干の差異を示す可能性があるが、それでも実質的に類似する配列と同じＤＮＡ標的を増幅するように機能する配列への言及として理解されるべきである。
【０１５５】
本発明のプローブは、検出されることが求められる部分的および完全にメチル化された配列の範囲に「集合的に」結合する。「集合的に」とは、使用のために選択されたプローブのコホートが、個別に、または個々のプローブのハイブリダイゼーションの乱交雑によって可能になることを意味し、検出が求められるＤＮＡ標的の部分的にメチル化された形態の範囲に結合する。本発明をいずれかの理論または作用様式に限定することなく、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの位置がそうであるように、プローブによって調査されるＤＮＡ領域の配列は当業者に既知である。この配列情報に基づいて、およびＩＫＺＦ１に関連して前述したように、標的鎖および反対鎖の両方で考えられる完全および部分的なメチル化パターンの全範囲を予測できる。その後、それぞれ個別に一意のメチル化パターンに結合するか、乱交雑を示し、２つ以上のメチル化パターンと結合できるプローブを設計できる。完全にメチル化された配列に向けられたプローブは、完全にメチル化された配列および部分的にメチル化された配列の違いが１つのシトシン残基のメチル化の欠損と同じくらい小さい場合でも、部分的にメチル化された配列と結合しない。メチル化特異的プローブの異種プール、またはメチル化されたおよび非メチル化シトシンの両方を乱交雑に結合するように設計されたプローブのいずれかが増幅アッセイで使用されるかどうかも判定されていて、目的の標的のメチル化に関して正確な結果を得ることができる。
【０１５６】
ある特定の完全にまたは部分的にメチル化された配列パターンとハイブリダイズするように設計されたプローブを、当業者に周知の方法により生成できる。２つ以上のメチル化パターンと結合できるという点で、乱交雑を示すプローブに関して、この設計は、当業者に周知であるいくつかの方法によって達成することもできる。例えば、プローブ（５’−加水分解プローブなど）の１つ以上の塩基位置は一意ではないが、２つの塩基、つまりシトシンまたはチミジンの混合物である。１つのＣｐＧ部位のみがメチル化について調査される（または調査されない）場合に、そのような縮重オリゴヌクレオチドは、２つの異なるオリゴヌクレオチド配列の混合物、例えば−ａｔＣＧａｔ−−および−−ａｔＴＧａｔ−−となる。２つのＣｐＧ部位を調査する場合に、縮退オリゴヌクレオチドカクテルは４つの異なる配列の混合物となることになる。
【０１５７】
前述したように、プローブは、ＴａｑＭａｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ、Ｂｅａｃｏｎｓなどの検出プローブの任意の変形物にすることができる。プローブ混合物は、
（ｉ）１合成で８重の重複として（合成中にＣおよびＴをブレンドすることにより）；
（ｉｉ）３つの異なる２重の重複プローブとし、かつ混合され；
（ｉｉｉ）１つの２重および１つの４重の重複プローブとし、かつ混合され；または
（ｉｖ）８つの異なる一意プローブとし、混合されるように合成され得る（ＩＫＺＦ１の例の標的鎖の状況下で）。
【０１５８】
プローブは、各調査されるＣ／Ｔ塩基における脱塩基性スペーサ（例えば、５−ニトロ−インドールまたは３−ニトロ−ピロール）、または各調査されるＣ／Ｔ塩基におけるイノシンを含む単一配列でもあり得る。１つ以上の脱塩基スペーサ（複数可）を含む単一配列の「乱交雑」プローブは、１つのみのアニーリング温度を有するが、脱塩基スペーサ（複数可）を含むプローブの融解温度は、全ての調査されるＣｐＧ部位でメチル化を検出するプローブよりも大幅に低いことになる。したがって、脱塩基スペーサ（複数可）を有する乱交雑プローブは、メチル化されたＣｐＧ部位のみを標的とするプローブよりも大幅に長くする必要があることになる。イノシンは、任意の塩基との塩基対合を可能にしすることになるが、Ｃ＞Ａ＞Ｇ＞Ｔの順に優先される。この配列は、プローブと反対側の鎖にあるため、この場合、プローブは、Ａ（＝Ｔ、非メチル化）またはＧ（＝Ｃ、メチル化）とアニーリングすることになる。これらのオプションのどちらも、乱交雑プローブほど特異的ではない。３位置で４塩基のうちのいずれかと対合が可能なため、実際には６４重の縮重（８重に対して）しており、それ故プライマーのメチル化特異性により大きく依存している。脱塩基スペーサまたはイノシン含有プローブは、８つのオリゴヌクレオチド成分の混合物ではなく、単一オリゴヌクレオチド成分であるという利点を有する。
【０１５９】
プローブは、各潜在的に部分的にメチル化されたＣ位置で、ピリミジン（ＣまたはＴ）類似体も有することもできる。例えば、アナログ、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オンは、ＧおよびＡの両方と塩基対を形成することになる単一の「塩基」である（反対鎖の２つの選択肢である）。ある研究から、それはＡ（＝Ｔ＝非メチル化）に対する６０％の優先度と、Ｇ（＝Ｃ＝メチル化された）の４０％の優先度を有する。（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，９５：４２５８−４２６３，１９９８）。ここでの利点は、このプローブが８つの可能なメチル化の組み合わせ全てをほぼ等しい親和性で結合する単一のオリゴヌクレオチドであることである。個々のプローブ配列のいくつかはシトシン塩基の代わりにチミジンを含むため、アニーリング温度を下げ、プローブ配列（複数可）のいくつかは、より低いアニーリング温度を補償するために長さを延長する必要があり得ることが理解される。代わりのアプローチは、アニーリング温度を上げる化学修飾（主要な溝結合塩基など）を含めることになる。これも当然のことながら、プローブの縮重位置での各塩基の割合は、必ずしも５０／５０である必要はない。例えば、特定のＣ残基が真のがんの８０％でメチル化されているが、真のがんの２０％でメチル化されていないことが特定された場合に、この位置で８０％のＣおよび２０％のＴのプローブを作製して、メチル化の発生と適合させることができる。
【０１６０】
上記で詳述したように、プローブ配列は、反対鎖にもハイブリダイズするように設計されている。反対鎖上のこれらのプローブ配列設計は、部分的なメチル化を調査するために、縮重位置にＧまたはＡ（または上記のようにイノシンまたは脱塩基スペーサ）を有する。上述のピリミジン類似体は、ここでＴおよびＣの両方と結合するであろうプリン類似体、Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンに変化することなる。
【０１６１】
任意の遺伝子の増幅プローブを設計するためにこれらの原理を使用できることを理解されたい。
【０１６２】
本発明のプローブおよび／またはプライマーは、それらが自己刺激またはプライマーダイマーを形成しないことを決定するためにも評価される（例えば、検出アッセイで使用される別のプローブまたはプライマーと）。さらに、プローブまたはプライマー（またはその配列）は、多くの場合に標的核酸から変性する温度（すなわち、プローブまたはプライマーの融解温度、またはＴｍ）を決定するために評価される。Ｔｍを推定する方法は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５，１９９５、またはＢｒｅｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０，１９８６に記載される。
【０１６３】
本発明のプローブまたはプライマーを生成／合成する方法は、当該分野で既知である。例えば、オリゴヌクレオチド合成は、Ｇａｉｔ（Ｅｄ）（Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）に記載される。例えば、プローブまたはプライマーは、生物学的合成（例えば、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の消化）または化学合成により得られ得る。短い配列（最大約１００ヌクレオチド）の場合に、化学合成が好ましい。
【０１６４】
より長い配列については、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１０１，２０−７８，１９８３に記載されるように、一本鎖ＤＮＡに対してＭ１３を使用するなど、分子生物学で利用される標準的な複製方法が有用である。オリゴヌクレオチド合成の他の方法には、例えば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：９０，１９７９）、および支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２，１９８１）、ならびにホスホルアミデート技術、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．２８７−３１４（１９８８）、および“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，”Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，ｅｄｉｔｏｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７、およびそこに引用されている参考文献に記載される。架橋型核酸（ＬＮＡ）を含むプローブは、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：３４２３，１９９７；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４７，１９９８に記載されるように合成される。一方、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブは、例えば、Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５，１９９２；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６，１９９３；およびＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：５３３２，１９９３に記載されるように合成される。
【０１６５】
本発明のＤＮＡ試料は、目的のメチル化領域に隣接するプライマーを使用して増幅される。上記で詳述したように、この「領域」は、遺伝子の長さの短い部分または大幅な部分を包含するように選択され得る。後者の場合、生成されるアンプリコンは非常に長くなる。しかしながら、特定の実施形態において、領域は、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドがクラスター化されている遺伝子の非常に短い区間に対応し得る。この場合、生成されるアンプリコンは非常に短くなることになる。
【０１６６】
プライマーおよびプローブと、標的ＤＮＡとの相互作用を促進することは、任意の好適な方法によって実行され得る。それらの方法は、当業者に既知であろう。この目的のために、当然のことながら、プライマーおよびプローブを、任意の好適な時点で反応チューブの中へと組み込むことができる。組み込みは一般に初期の増幅サイクルの開始前であるが、１つ以上の追加のプライマーの組み込みは初期の増幅サイクルに続いて実行される。プライマーの組み込みの様式は、当業者がどのように増幅反応を実行しようとしているかに依存するが、一般的に、使いやすさと汚染の回避のために、通常、反応全体を単一のチューブで実行できることが望ましい。それにもかかわらず、本発明のステップを達成する任意の他の方法を使用できる。したがって、試料をプライマーまたはプローブオリゴヌクレオチドと「接触させる」という言及は、相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）を生じさせることができるように、プライマーまたはプローブと、試料との混合を促進することへの言及として理解すべきである。この目的を達成する手段は、当業者に周知であろう。
【０１６７】
複数のメチル化されたＤＮＡ領域を増幅する場合、当業者は多重化増幅反応を設計し得る。この多重化は、１つのチューブ内の標的および反対鎖の両方を増幅するか、あるいは単一チューブ内の標的または反対鎖の複数の領域を増幅するレベルで設計され得る。例えば、２つ以上の別個の遺伝子またはメチル化領域を標的として向けられた、２つ以上のペアのフォワード／リバースプライマーが使用される場合、これら全てのプライマーを単一の試料に導入し、多重化増幅技術を使用して試料を増幅し得る。代替的に、試料を複数のアリコートに分割することを選択してもよく、各アリコートは別個のプライマー対を使用して増幅される。これも当然のことながら、当業者は、１つのメチル化領域のみを増幅するが、複数のプライマーがネステッドＰＣＲ反応の適用を反映するように向けられた複数セットのプライマーを使用するように、この方法を適応することを選択し得る。代替的に、各々が１つの一意なプライマーペアを使用するいくつかの個々の増幅反応が実行され得る。これらの方法は、２つ以上の別個のメチル化領域を増幅する場合、２つ以上の遺伝子のメチル化を分析する場合、または標的および反対鎖の増幅反応を分離しようとする場合に関連するようになる。この場合、２つの遺伝子（ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１など）を分析する必要がある場合に、例えば、亜硫酸水素ナトリウムの変換後、試料を２つのアリコートに分割してもよく、次いで各アリコートは、その遺伝子の関連するメチル化配列領域に向けられた１つ以上のフォワードおよびリバースプライマーのセットを使用して増幅される。代替的に、単一試料で多重化反応を実行でき、１つの遺伝子の選択されたメチル化配列領域に向けられたプライマーペアおよび加水分解プローブセットの使用、ならびに別の遺伝子の選択されたメチル化配列領域に向けられた別のプライマーセットおよび加水分解プローブセットの使用に関して反応が多重化される。当業者に周知であるように、多重化反応は、２つ以上のメチル化配列領域および／または２つ以上の遺伝子、または標的および反対鎖の両方の状況下で、２つ、３つ、またはそれ以上のプライマーおよび加水分解プローブで実行するように設計できる。当然のことながら、多重化またはネステッド増幅反応を適切に設計することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【０１６８】
本発明の増幅ステップは、目的のＤＮＡ標的に沿ったハイブリダイズしたプライマーの伸長をもたらす。上記で詳述したように、ハイブリダイズした二重標識された加水分解プローブの検出をもたらすのはプライマー伸長分子の生成である。これを行うことができる手段は、アンプリコンの生成時に生成される検出手段のアウトプットを定性的または定量的に分析できるという事実として当業者に周知であり、後者が特に好ましい手段である。この目的のために、当然のことながら、プローブの検出は、プローブがハイブリダイズするＤＮＡ配列に沿ってプライマーが伸長し、置換、切断、またはプローブの修飾をもたらす場合にのみもたらされ、これにより、その検出手段が機能するようになり（例えば、活性化または曝露される）、それによって定性的または定量的手段のいずれかによって検出可能である。
【０１６９】
この方法の好ましい用途は、疾患の発症（腫瘍の発達またはその素因など）を診断する目的でメチル化レベルを評価することであるが、該メチル化のレベルにおける逆の変化の検出は、特定の状況下で、例えば、腺腫または腺がんの発達などの腫瘍性状態の調節に向けられた治療または予防治療の有効性をモニタリングするために所望され得る。例えば、メチル化のレベルが上昇している場合に、個体が腺腫または腺がんの発達を特徴とする状態を、発達していること示し、治療的処置レジメンの開始後のメチル化のレベルの低減についてのスクリーニングを利用して、腫瘍細胞の順調な排除を示し得る。別の例において、腫瘍の縁が完全に除去されているかを判断するために、この方法を使用して腫瘍切除の縁で組織を試験する。
【０１７０】
したがって、本方法は、診断、予後、分類、疾患リスクの予測、疾患の再発の検出、多くの種類の腫瘍の治療の選択、および腫瘍のモニタリングに使用できる。原発性がん、転移性がん、再発性がんなど、進行の任意のステージのがんを検出できる。さらに、この方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡメチル化の分析が必要な他の状況下での用途を有する。
【０１７１】
非限定的な例として腫瘍発達を使用して、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）が腫瘍を有するかを判定する、哺乳動物から採取した生体試料に腫瘍細胞または腫瘍細胞由来のＤＮＡが含まれているかを判定する、哺乳類が腫瘍を発症するリスクまたは可能性を推定する、抗がん治療の有効性をモニタリングする、またはがんを有する哺乳動物における適切な抗がん治療を選択する方法を提供する。そのような方法は、多くの腫瘍細胞が正常細胞とは異なるメチル化状態を有することの判定に基づく。
【０１７２】
本発明の方法は、腫瘍を有することが既知であるか、もしくは疑われる個体を評価するために、またはルーチン的な臨床試験として、すなわち、必ずしも腫瘍を有すると疑われるわけではない個体において使用できる。個体における腫瘍の状態を確認するために、さらなる診断アッセイを実行できる。
【０１７３】
さらに、本方法は、一連の治療の有効性を評価するために使用され得る。例えば、抗がん治療の有効性は、がんを有する哺乳動物におけるＤＮＡメチル化を経時的にモニタリングすることで評価できる。例えば、治療前または治療初期の哺乳動物から採取した試料のレベルと比較した、治療後に哺乳動物から採取された生物学的試料の関連する診断配列のいずれかにおけるメチル化の減少または欠如は、効果的な治療を示す。
【０１７４】
したがって、本発明の方法は、一度の試験として、または疾患発達のリスクがあると考えられる個体の継続的なモニタリングとして、または治療的または予防的治療レジメンの有効性のモニタリングとして有用である。これらの状況において、生体試料の任意の１つ以上の分類におけるメチル化レベルの調節を位置付けすることは、個体の状況、または現在使用されている治療法もしくは予防法の有効性の有用な指標である。したがって、本発明の方法は、個体におけるメチル化レベルの増加または減少をモニタリングすることであって、それらの正常レベルと比較した、または該個体の生物学的試料から決定された１つ以上のより初期のメチル化レベルと比較した、モニタリングすることにまで及ぶと理解されるべきである。
【０１７５】
本発明の別の態様は、患者の状態を診断またはモニタリングする方法であって、状態が目的のＤＮＡ領域のメチル化の調節によって特徴付けられ、
（ｉ）ＤＮＡ試料を、非メチル化シトシン残基を修飾する薬剤と接触させることであって、該試料が、該目的のＤＮＡ領域の標的鎖および反対鎖の両方を含み、ＤＮＡ試料が、低コピー数の該目的のＤＮＡ領域を含む、接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を、
ａ）目的のＤＮＡ領域の修飾された標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセット、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセット、ならびに
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、接触させることと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅することであって、ステップ（ｉｉ）（ｃ）のプローブのうちの１つ以上が使用される場合に、該遺伝子に沿った該プライマーの伸長が、ハイブリダイズした該プローブの検出をもたらす、増幅することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出のアウトプットを定性的または定量的に分析することと、を含む、方法に関する。
【０１７６】
一実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、標的遺伝子またはその領域である。
【０１７７】
別の実施形態において、該遺伝子標的は、以下のうちのいずれか１つ以上の疾患特異的ｃｃｆＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【表７５】
2020534820.tif 000078
【０１７８】
なおさらに別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、またはＣＡＨＭのうちの１つ以上、特にＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１である。
【０１７９】
さらに別の実施形態において、ステップ（ｉｖ）の結果は、偽陰性結果の低減された発生を示す。
【０１８０】
さらに別の実施形態において、該ＤＮＡ試料は、血液、血漿、血清、唾液、糞便、腹水、または尿である。
【０１８１】
なおさらなる実施形態において、該目的のＤＮＡ領域は、疾患特異的ｃｃｆＤＮＡ、特にｃｔＤＮＡなどのｃｃｆＤＮＡである。
【０１８２】
さらに別の実施形態において、該プライマーおよびプローブは、メチル化特異的である。
【０１８３】
なおさらに別の実施形態において、該プライマーは、メチル化特異的ではないが、該プローブは、メチル化特異的である。
【０１８４】
なおさらなる実施形態において、該プローブは、部分的シトシンメチル化の領域に向けられた１つ以上の加水分解プローブであり、該１つ以上のプローブは、該領域で少なくとも２つの異なるメチル化パターンに集合的にハイブリダイズする。
【０１８５】
一実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１００コピー未満である。別の実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の９５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の９０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の８０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の７０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の６０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１５コピー未満、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、または試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。最も詳細には、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の５０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の４０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の３０コピー未満、さらにより詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の２０コピー未満である。さらなる実施形態において、該低コピー数は、試験される標的ＤＮＡ／試料の１０コピー未満、最も詳細には、試験される標的ＤＮＡ／試料の５コピー未満である。
【０１８６】
別の実施形態において、該増幅は定量的ＰＣＲであり、該低コピー数はＬＯＤである。
【０１８７】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表７６】
2020534820.tif 000079
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表７７】
2020534820.tif 000080
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表７８】
2020534820.tif 000081
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表７９】
2020534820.tif 000082
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１８８】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表８０】
2020534820.tif 000083
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表８１】
2020534820.tif 000084
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表８２】
2020534820.tif 000085
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表８３】
2020534820.tif 000086
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１８９】
なおさらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表８４】
2020534820.tif 000087
の配列または実質的に同様な配列を含み、該第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表８５】
2020534820.tif 000088
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表８６】
2020534820.tif 000089
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表８７】
2020534820.tif 000090
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１９０】
なおさらに別の実施形態において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表８８】
2020534820.tif 000091
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表８９】
2020534820.tif 000092
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表９０】
2020534820.tif 000093
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表９１】
2020534820.tif 000094
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【０１９１】
なおさらに別の実施形態において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表９２】
2020534820.tif 000095
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表９３】
2020534820.tif 000096
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表９４】
2020534820.tif 000097
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表９５】
2020534820.tif 000098
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【０１９２】
さらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表９６】
2020534820.tif 000099
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表９７】
2020534820.tif 000100
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表９８】
2020534820.tif 000101
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表９９】
2020534820.tif 000102
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１９３】
別のさらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１００】
2020534820.tif 000103
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１０１】
2020534820.tif 000104
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１０２】
2020534820.tif 000105
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１０３】
2020534820.tif 000106
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１９４】
さらに別のさらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１０４】
2020534820.tif 000107
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１０５】
2020534820.tif 000108
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１０６】
2020534820.tif 000109
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１０７】
2020534820.tif 000110
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０１９５】
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法に従って１つ以上の腫瘍性マーカーを検出するための１つ以上のプライマーおよび／またはプローブと、該プライマーおよび／またはプローブによる検出を促進するのに有用な試薬と、を含む生物学的試料をアッセイするためのキットに関する。例えば、生物学的試料を受領するためのさらなる手段も含まれ得る。
【０１９６】
したがって、別の態様において、目的のＤＮＡ領域のメチル化をスクリーニングするためのキットであって、
ａ）目的のＤＮＡ領域の標的鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第１のセットであって、プライマーが、非メチル化シトシンの薬剤による修飾を受けている目的のＤＮＡ領域の形態にハイブリダイズするように設計されている、第１のセットと、
ｂ）目的のＤＮＡ領域の修飾された反対鎖の１つ以上の完全にまたは部分的にメチル化された形態を増幅するように設計されたフォワードおよびリバースプライマーの第２のセットと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的である場合に任意で、標的および反対鎖の各々に向けられた１つ以上のプローブ、またはステップ（ａ）および（ｂ）のプライマーがメチル化特異的でない場合に、標的および反対鎖に向けられた１つ以上のメチル化特異的プローブであって、検出手段を組み込む、プローブと、を含む、キットを提供する。
【０１９７】
別の実施形態において、該ＤＮＡ領域は、
【表１０８】
2020534820.tif 000111
の遺伝子のうちの１つ以上であり、該遺伝子は、転写開始部位の５ｋｂ上流を含む。
【０１９８】
さらに別の実施形態において、該遺伝子は、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、もしくはＣＡＨＭ遺伝子のうちの１つ以上、または転写開始部位の５ｋｂ上流である。
【０１９９】
さらに別の実施形態において、該遺伝子は、（ｉ）ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１、（ｉｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＩＲＦ４、（ｉｉｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＧＲＡＳＰ、（ｉｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、およびＣＡＨＭ、（ｉｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、およびＧＲＡＳＰ、（ｖ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、およびＣＡＨＭ、もしくは（ｖｉ）ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、およびＣＡＨＭ、またはこれらの遺伝子の転写開始部位の５ｋｂ上流から選択される。
【０２００】
さらに別の実施形態において、該薬剤は、非メチル化シトシン残基をウラシルに修飾し、かつ該薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩であり得る。
【０２０１】
なおさらに別の実施形態において、該キットは、メチル化特異的プライマーを含むがプローブを含まない。
【０２０２】
さらなる実施形態において、該キットは、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プローブを含む。
【０２０３】
なおさらに別の実施形態において、該キットは、メチル化特異的プライマーおよびメチル化特異的プローブを含む。
【０２０４】
なおさらなる実施形態において、該キットは、非メチル化特異的プライマーおよびメチル化特異的プローブを含む。
【０２０５】
またなおさらなる実施形態において、該プローブは、加水分解プローブである。
【０２０６】
なおまたさらなる実施形態において、該プローブは、該目的のＤＮＡ領域での完全な、および部分的なメチル化パターンの全てに集合的にハイブリダイズする。
【０２０７】
別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１０９】
2020534820.tif 000112
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１１０】
2020534820.tif 000113
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１１１】
2020534820.tif 000114
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１１２】
2020534820.tif 000115
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０２０８】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１１３】
2020534820.tif 000116
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１１４】
2020534820.tif 000117
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１１５】
2020534820.tif 000118
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１１６】
2020534820.tif 000119
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０２０９】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＩＫＺＦ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１１７】
2020534820.tif 000120
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１１８】
2020534820.tif 000121
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１１９】
2020534820.tif 000122
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１２０】
2020534820.tif 000123
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０２１０】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１２１】
2020534820.tif 000124
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１２２】
2020534820.tif 000125
配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１２３】
2020534820.tif 000126
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１２４】
2020534820.tif 000127
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【０２１１】
さらに別の実施形態において、該遺伝子はＢＣＡＴ１であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１２５】
2020534820.tif 000128
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１２６】
2020534820.tif 000129
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１２７】
2020534820.tif 000130
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１２８】
2020534820.tif 000131
の配列または実質的に同様な配列を含む。
【０２１２】
さらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１２９】
2020534820.tif 000132
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１３０】
2020534820.tif 000133
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１３１】
2020534820.tif 000134
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１３２】
2020534820.tif 000135
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０２１３】
別のさらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１３３】
2020534820.tif 000136
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１３４】
2020534820.tif 000137
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１３５】
2020534820.tif 000138
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１３６】
2020534820.tif 000139
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０２１４】
さらに別のさらなる実施形態において、該遺伝子はＩＲＦ４であり、
（ｉ）該プライマーの第１のセットは、
【表１３７】
2020534820.tif 000140
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第１のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１３８】
2020534820.tif 000141
の配列または実質的に同様な配列を含み、
（ｉｉ）該プライマーの第２のセットは、
【表１３９】
2020534820.tif 000142
の配列または実質的に同様な配列を含み、該プライマーの第２のセットの増幅産物に向けられたプローブは、
【表１４０】
2020534820.tif 000143
から選択される配列または実質的に同様な配列のうちの１つ以上を含む。
【０２１５】
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらに説明する。
【０２１６】
実施例１
ＰＣＲ増幅可能なＤＮＡに関する亜硫酸水素処理の有害作用。
亜硫酸水素処理がＰＣＲ増幅に及ぼす影響を判定するために、亜硫酸水素処理前後のアンプリコンの定量化を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して比較した。
【０２１７】
完全にメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の濃度を、標準的な慣行に従って２６０ｎｍの吸光度を測定することにより推定した。予想されるＤＮＡコピーの等価数を計算し、ＤＮＡの一部を亜硫酸水素ナトリウムで処理した。亜硫酸水素処理の前後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡコピーの実際の量を、ＡＣＴＢアッセイを使用したｄｄＰＣＲによって判定した。亜硫酸水素処理前のＤＮＡコピーを推定するために使用されるｄｄＰＣＲ  ＡＣＴＢアッセイは、標的領域［配列番号６７〜７１］の相補鎖の両方を検出および増幅するが、一方で、亜硫酸水素処理後のＤＮＡコピーを推定するアッセイでは、図１に示すように、ＤＮＡ［配列番号７２〜７６］の１本の鎖のみが検出および増幅される。したがって、亜硫酸水素処理されたＤＮＡと比較して、野生型ＤＮＡのコピー数はそれぞれ２倍のコピーの定量化が予測される。しかしながら、実際に観察された損失は予想よりも１０〜４０％高くなった（表１）。
【０２１８】
加えて、鋳型インプットとしての亜硫酸水素変換されたＤＮＡでのＢＣＡＴ１［配列番号５７〜５８および６４〜６６］またはＩＫＺＦ１［配列番号３、４、１１〜１３］についての標的鎖特異的アッセイを評価して、ＤＮＡの損失および／または損傷が配列特異的かを判定した。表１は、概してＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１が同様の量で定量化されることを示しているが、これらは亜硫酸水素処理されたＤＮＡにおけるＡＣＴＢよりも増幅量が少ない。これは、ＤＮＡニッキング／損傷が配列特異的であり得、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１において標的化されたアンプリコン領域がメチル化されているという事実を反映し得ることを示しており、一方で、標的となるＡＣＴＢアンプリコン領域は、メチル化されていることが既知である領域からではない。
【表１４１】
2020534820.tif 000144
【０２１９】
実施例２
亜硫酸水素変換されたＤＮＡの両鎖の標的化
完全にメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（２０００ｐｇ／ウェル；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を鋳型として使用し、ＱＩＡｃｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）にカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して亜硫酸水素を変換した。ｑＰＣＲアッセイは、ＢＣＡＴ１［配列番号６４〜６６および６１〜６３］、ならびにＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１および２２〜３２］の一方または両方のいずれかの鎖上の領域を標的化するように設計した。ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡ（１６６．７ｐｇ／μＬ）で構成し、以下のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。
【０２２０】
図２は、Ａ）ＢＣＡＴ１およびＢ）ＩＫＺＦ１の増幅結果を示す。一本鎖を標的とするプライマーの使用と比較して、ＤＮＡの両鎖を標的とするプライマーを使用すると、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の両方で生成されるアンプリコンの量がおよそ２倍になることが確認され、したがって、この技術が期待どおりに機能することを確認した。
【０２２１】
実施例３
亜硫酸水素変換されたＤＮＡの一本または二本鎖増幅のｄｄＰＣＲの定量化
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、ＤＮＡを、およそ２０，０００の個別の液滴に分配することにより絶対定量を提供し、その後これらはエンドポイントＰＣＲ増幅の個々の反応小胞として機能する。ＰＣＲ増幅に続いて、その特定の液滴が少なくともその中に開始する１つのＤＮＡ分子を有することを示す指標として、液滴の蛍光を評価する。蛍光が陽性の液滴の数をカウントし、元の試料のＤＮＡのコピー数を、ポアソン分布を使用して計算し、各液滴が１つ以上のＤＮＡ分子を含む可能性をモデル化する。ＰＣＲ増幅はエンドポイントであるため、反応の効率は重要ではなく、この技術によって提供される定量はより正確な判定である。
【０２２２】
実施例２で観察された現象がＰＣＲ増幅効率と無関係であるかを確認するために、ｄｄＰＣＲを使用して上記の実験を繰り返した。完全にメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（２０００ｐｇ／ウェル；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を鋳型として使用し、ＱＩＡｃｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）にカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して亜硫酸水素を変換した。ｄｄＰＣＲアッセイは、ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］についての標的鎖と、ＢＣＡＴ１［配列番号６４〜６６および６１〜６３］、ならびにＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１および２２〜３２］についての標的鎖または標的鎖および反対鎖の両方とに対する領域を標的とするように設計した。ＰＣＲ反応物を、１０μＬの２ｘ  ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし；ＢｉｏＲａｄ）、４５０ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリーの水を用いて最大２μＬで作製した５０〜２００ｎＭの各プローブ、ならびに８μＬの鋳型ＤＮＡ（２５０ｐｇ／μＬ）で構成した。ＩＫＺＦ１アンプリコンをＦＡＭ標識されたプローブを使用して検出し、ＡＣＴＢをＨＥＸプローブを使用して検出し、ＢＣＡＴ１の標的鎖をＦＡＭプローブで検出し、標的反対鎖をＨＥＸプローブで検出した。液滴を、ＱＸ２００  ｍａｎｕａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して生成し、続いて次のようにサイクルした：Ｃ１０００（ＢｉｏＲａｄ）で９５℃、１０分；［９４℃、３０秒；５８℃、１分］ｘ４５；９８℃、１０分。液滴を、ＱＸ２００  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で読み取り、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して結果を分析し、陽性の液滴の数を比較した。
【０２２３】
図３は、Ａ）標的鎖特異的増幅およびＢ）二本鎖増幅に対する定量結果を示す。両方のアッセイについてＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＡＣＴＢの標的鎖の蛍光集団を示し、標的および反対鎖の両方を同時に検出するアッセイで、反対鎖のＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１アンプリコンについて追加集団を観察した。括弧内の値は、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェアによって決定された、ウェルごとの各増幅された遺伝子のコピー数を指し、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１について、標的特異的鎖アッセイのみと比較して、標的および反対鎖アッセイで増幅されるコピーの数はおよそ２倍であることが観察される（それぞれ１７９対３８０コピー／ウェル、２１２％、および２３７対４２８コピー／ウェル、１８０％）。ＡＣＴＢは、両方のアッセイで標的特異的鎖でのみ増幅され、２つのＰＣＲではほぼ同じ量で、２９８対２６５コピー／ウェルで存在する。亜硫酸水素処理により、ＰＣＲ増幅可能な物質が３０〜５７％減少し、これは以前の結果と一致しているが、亜硫酸水素処理中のニッキングの無作為な性質を示す。
【０２２４】
これらの結果は、亜硫酸水素により誘導される損傷およびニッキングによる開始鋳型の大幅な損失にもかかわらず、亜硫酸水素変換後の非相補的ＤＮＡの両鎖を標的にすると、予想外に増幅されるＤＮＡの量が２倍になることを裏付けている。
【０２２５】
実施例４
低ＤＮＡインプットでのメチル化特異的ＰＣＲの感度の改善
少量の血漿中のメチル化された循環腫瘍ＤＮＡを探す場合のように、ＤＮＡインプット量が非常に低い場合の検出の感度は、当技術分野における重大な問題である。これ試験するために、過剰な非メチル化ＤＮＡの背景において試料に非常に低濃度のメチル化されたＤＮＡを添加し、標的鎖、または標的および反対鎖を検出したアッセイでの検出の比較を行った。
【０２２６】
完全にメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および白血球の非メチル化ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を、ＱＩＡｃｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）にカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して亜硫酸水素変換し、１：１６６７の比率で混合した。このＤＮＡ混合物の４５の試料を、ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１［配列番号６４〜６６および６１〜６３］およびＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１および２２〜３２］の一方または両鎖の領域を標的とするように設計されたｑＰＣＲアッセイで３回分析した。ＰＣＲが機能することを確認するために、ＡＣＴＢ増幅を対照として使用した。ＰＣＲ反応物を、１ウェルあたり、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、３ｐｇのメチル化されたＤＮＡおよび５ｎｇの非メチル化ＤＮＡを含む１２μＬの鋳型ＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡの１コピーおよび非メチル化ＤＮＡの１５１５コピーに相当）で構成した。対照試料は、５ｎｇの亜硫酸水素変換された非メチル化ＤＮＡのみを含む。これらを次のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。１つ以上の複製がＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１のいずれかに対して陽性である場合、試料を陽性とみなした。
【０２２７】
試料の合計７３％が標的鎖特異的ＰＣＲを使用して検出されたが、試料の９３％は両鎖が標的とされた際に検出された（表２）。５ｎｇの非メチル化ＤＮＡのみを含む試料においてアッセイの陽性は存在しなかった。この検出における増加は、フィッシャーの正確両側検定（ｐ＝０．０２）で判定されたように統計的に有意であり、非相補的ＤＮＡの両鎖を標的にすると、非常に少量のメチル化ＤＮＡ（試料あたり約１コピー）を検出する能力で感度が大幅に向上することを示す。
【表１４２】
2020534820.tif 000145
【０２２８】
実施例５
血漿における改善された検出
プールされた血漿は、３０歳未満の推定陰性白人対象からであり、完全にメチル化されたＤＮＡ（添加範囲：２．３〜３００ｐｇ／ｍＬ、Ｐ０−Ｐ３００）を添加し、実際の臨床試料をシミュレートした。製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＤＳＰ  ｖｉｒｕｓ／ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔを使用して、ＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙ自動プラットフォームで４．５ｍＬの試料（濃度ごとに１６複製）からＤＮＡを抽出した。次に、溶出したＤＮＡを、ＱＩＡｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）でカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、亜硫酸水素変換した。ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１［配列番号６４〜６６および６１〜６３］、ならびにＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１および２２〜３２］の一方または両鎖を増幅するように設計されたｑＰＣＲアッセイを使用して、得られた亜硫酸水素変換されたＤＮＡを３回（濃度ごとに８試料の複製）分析した。ＡＣＴＢ増幅を対照として使用し、抽出、亜硫酸水素変換、およびＰＣＲが機能することを確認した。ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡで構成し、以下のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。複製がＤＮＡ鎖のいずれかでＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１に対して陽性である場合に、試料を陽性とみなした。それぞれのアッセイの検出限界（ＬＯＤ）は、プロビット分析を使用して計算した。
【０２２９】
図４は、プロビット分析のグラフ表示であり、一本鎖ＰＣＲについてのＬＯＤは５１．８３ｐｇ／ｍＬ（血漿）（約１５．７コピー／ｍＬ）であり、標的特異的鎖および反対鎖の両方を検出するＰＣＲアッセイについては２６．９８ｐｇ／ｍＬ（〜８．２コピー／ｍＬ）であることを示す。シミュレートした臨床試料のＬＯＤは、両鎖を標的とするアッセイにおいて、標的鎖のみを対象としたアッセイと比較してほぼ半分（５２％）であり、ここでも低濃度のメチル化されたＤＮＡを含む試料での本発明の有用性を示す。
【０２３０】
実施例６
臨床試料の検出の改善
結腸内視鏡検査で確認された結腸直腸がんを伴う症例を有する患者、または疾患の証拠がない患者から採取した血漿を試験して、本発明の臨床的有用性を判定した。
【０２３１】
４４人の結腸内視鏡検査で確認されたＣＲＣ、および疾患の証拠のない４４人の患者（ＮＥＤ）からの血漿の９ｍＬ（２×４．５ｍＬ）を、製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙでＤＳＰ  ｖｉｒｕｓ／ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔを使用して抽出した。次に、溶出したＤＮＡを、ＱＩＡｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）でカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、亜硫酸水素変換した。得られた亜硫酸水素変換された各試料のＤＮＡを、６つの等しいアリコートに分割した。ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１［配列番号６４〜６６および６１〜６３］およびＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１および２２〜３２］の一方または両鎖を増幅するように設計されたｑＰＣＲアッセイを使用して、試料を３回分析した。ＡＣＴＢ増幅を対照として使用し、抽出、亜硫酸水素変換、およびＰＣＲが機能することを確認した。ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡで構成し、以下のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。複製がＤＮＡ鎖のいずれかでＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１に対して陽性である場合に、試料を陽性とみなした。
【０２３２】
表３は結果をまとめたものであり、全体のアッセイの陽性、ならびに個々のまたは合計のＢＣＡＴ１またはＩＫＺＦ１複製の陽性に関して、一本鎖および二本鎖アッセイの間のいずれかの違いを、両側ＭｃＮｅｍａｒ  χ２検定を使用して評価した。標的鎖特異的ＰＣＲ（以下「一本鎖アッセイ」と称される）は２３／４４（５２％）のがん試料を検出したが、亜硫酸水素されたＤＮＡの両鎖を標的とするアッセイ（以下「二本鎖アッセイ」と称される）は３０／４４（６８％、ｐ＝０．０７）を検出した。アッセイの陽性の全体的な増加に加えて、二本鎖アッセイでは、一本鎖アッセイと比較して、ＢＣＡＴ１（ｐ＝０．０００２）、ＩＫＺＦ１（ｐ＝０．００１８）、および複合（ｐ＝０．０００）の全体的な複製の陽性が、統計的に有意に増加した。がんのステージを見ると、二本鎖アッセイにおけるＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の両方の陽性は、一本鎖アッセイよりも高く、いくつかのステージでは統計的にそうである。４４人のＮＥＤ試料のうち、一本鎖アッセイでは何も検出しなかったが、二本鎖アッセイでは２／４４（４．５％）を検出し、単一のＢＣＡＴ１を有する両試料は、４０．４８および４３．９７の後期Ｃｔで陽性を複製する。この差は統計的に有意ではなかった。
【０２３３】
これらの結果は、疾患の証拠のない患者からの非特異的検出の有意な増加なしに、臨床疾患を有する患者からの血漿中のセルフリー腫瘍ＤＮＡの検出の増加を示すことにより、現在の方法の臨床的有用性を確認する。
【０２３４】
表３．アッセイの陽性およびメチル化されたＢＣＡＴおよび／またはＩＫＺＦ１は、結腸内視鏡検査で確認されたがん患者、または疾患の証拠がない患者由来の血漿試料から抽出されたＤＮＡにおいて陽性を複製し、標的鎖に向けられた一本鎖アッセイ、または亜硫酸水素されたＤＮＡ鎖の両鎖を標的とするアッセイを使用して増幅する。
【表１４３】
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【０２３５】
実施例７
血漿における改善された検出
プールされた血漿は、３０歳未満の推定健康ドナーからであり、完全にメチル化されたＤＮＡ（添加範囲：０〜５００ｐｇ／ｍＬ）を添加し、実際の臨床試料をシミュレートした。ＱＳ  ＤＳＰ  ｖｉｒｕｓ／ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｍｉｄｉまたはＱＳ  ＤＳＰ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して、ＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙ自動プラットフォーム上で４．５ｍＬの試料からＤＮＡを抽出した。次に、溶出したＤＮＡを、ＱＩＡｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）でカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、亜硫酸水素変換した。ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１［配列番号６２〜６３、９６、６５〜６６、９７］、ならびにＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１、７７〜９５］の一方または両鎖を増幅するように設計されたｑＰＣＲアッセイを使用して、得られた亜硫酸水素変換されたＤＮＡを３回（濃度ごとに１２〜２４試料の複製）分析した。ＡＣＴＢ増幅を対照として使用し、抽出、亜硫酸水素変換、およびＰＣＲが機能することを確認した［配列番号７４〜７６］。ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡで構成し、以下のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。メチル化されたＤＮＡ濃度および試験の陽性の関係は、プロビット回帰モデリングによって評価し、ＬＯＤは、各方法について陽性結果を判定する９５％の確率をもたらす濃度として推定した。試料を、リアルタイムＰＣＲを介して３回試験し、メチル化されたＢＣＡＴ１またはＩＫＺＦ１の各々について３つの複製のいずれかで検出された場合（合計６つの複製）に、試料を陽性とみなした。標的領域のみを検出するのではなく、標的領域および反対側の標的領域の両方を同時に検出すると、検出限界の２倍の改善を観察した（１０．７ｐｇ／ｍＬ対２１．４ｐｇ／ｍＬ）。改善された感度は、ＰＣＲ複製の陽性の増加にも反映された。表４および図５を参照されたい。
【表１４４】
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【０２３６】
実施例８
低ＤＮＡインプットでのメチル化特異的ＰＣＲの感度の改善
汎用のメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｄ５０１１）を、血漿中に見られる循環セルフリーＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）を反映するために、超音波処理を介して断片化した（約１００〜５００ｂｐの断片）。断片化したＤＮＡを亜硫酸水素変換し、ｄｄＰＣＲ［配列番号１１〜２１、６４〜６６、７４〜７６］を使用して定量化し、試料あたり（４５μＬ）１２５０コピーの亜硫酸水素変換された非メチル化ＤＮＡの背景においてメチル化されたＤＮＡの約１ゲノムコピーに希釈した。４５の試料を、ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１［配列番号６２〜６３、９６、６５〜６６、９７］、ならびにＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１、７７〜９５］の一方または両鎖の領域を標的とするように設計されたｑＰＣＲアッセイで３回分析した。
【０２３７】
ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡで構成した。対照試料は、１２５０コピーの亜硫酸水素変換された非メチル化ＤＮＡのみを含む。これらを次のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。１つ以上の複製がＢＣＡＴ１および／またはＩＫＺＦ１のいずれかに対して陽性である場合、試料を陽性とみなした。
【０２３８】
試料の合計３７％が標的鎖特異的ＰＣＲを使用して検出されたが、試料の６７％は両鎖が標的とされた際に検出された（フィッシャーの正確両側検定でｐ値＝＜０．００１；図６）。異なるロットのＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘおよびオリゴヌクレオチドミックスを使用して、ＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の両鎖を標的とするアッセイで複数の実行を実施し、図６のＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の１つの鎖のみを標的としたアッセイと比較して、該アッセイの一貫して改善された陽性を生成した。これは、非相補的ＤＮＡの両鎖を標的にすると、非常に少量のメチル化ＤＮＡ（試料あたり約１コピー）を検出する能力の感度が大幅に向上することを示す。
【０２３９】
実施例９
改善された感度の臨床的な実証
結腸内視鏡検査で確認された結腸直腸がんを伴う症例、または疾患の証拠がない患者から採取した血漿を試験して、本発明の臨床的有用性を判定した（２×４．５ｍＬ）。研究コホートには、１，５３６人の結腸内視鏡検査で確認された対照、および４０人の推定健康ドナー（３０歳未満）で構成される１，５７６人の対象が含まれた。実施例７に記載されるように、循環ＤＮＡを単離し、亜硫酸水素変換し、ＰＣＲアッセイした。
【０２４０】
表５は結果をまとめたものであり、全体のアッセイの陽性、ならびに個々のまたは合計のＢＣＡＴ１またはＩＫＺＦ１複製の陽性に関して、一本鎖アッセイと二本鎖アッセイとの間の違いを、両側ＭｃＮｅｍａｒ  χ２検定を使用して評価した。標的鎖特異的ＰＣＲ（以下「一本鎖アッセイ」と称される）は１０６／１７７（５９．９％）のがん試料を検出したが、亜硫酸水素されたＤＮＡの両鎖を標的とするアッセイ（以下「二本鎖アッセイ」と称される）は１２７／１７７（７０．１％、ｐ＝０．００６７）を検出した。アッセイの陽性の全体的な増加に加えて、二本鎖アッセイでは、一本鎖アッセイと比較して、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１の陽性が、有意に増加した。がんのステージを見ると、二本鎖アッセイにおけるＢＣＡＴ１およびＩＫＺＦ１の両方の陽性は、一本鎖アッセイよりも高い。腫瘍のない対象からの１０７２試料のうち、一本鎖アッセイでは７８（７．３％）を検出したのに対し、１６３（１５．２％）を二本鎖アッセイによって検出した（ｐ＝０．００１９）。
【０２４１】
これらの結果は、臨床疾患を有する患者からの血漿中のセルフリー腫瘍ＤＮＡの検出の増加を実証することにより、本発明の臨床的有用性を確認する。
【表１４５】
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【０２４２】
実施例１０
亜硫酸水素変換されたＤＮＡの両鎖の標的化
完全にメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（２０００ｐｇ／ウェル；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を鋳型として使用し、ＱＩＡｃｕｂｅ  ＨＴ（Ｑｉａｇｅｎ）でカスタマイズされたＥｐｉｔｅｃｔ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して亜硫酸水素を変換した。ｑＰＣＲアッセイは、ＩＲＦ４［配列番号１０８〜１１０および１１１〜１１３］の一方または両方のいずれかの鎖上の領域を標的化するように設計した。ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡ（１６６．７ｐｇ／μＬ）で構成し、以下のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。
【０２４３】
図７は、ＩＲＦ４の増幅結果を示す。一本鎖を標的とするプライマーの使用と比較して、ＤＮＡの両鎖を標的とするプライマーを使用すると、ＩＲＦ４で生成されるアンプリコンの量がおよそ２倍になることが確認され、したがって、この技術が別の遺伝子上で期待どおりに機能することを確認した。
【０２４４】
実施例１１
低ＤＮＡインプットでのメチル化特異的ＰＣＲの感度の改善
汎用なメチル化されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｓ７８２１）を、血漿中に見られる循環セルフリーＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）を反映するために、超音波処理を介して断片化した（約１００〜５００ｂｐの断片）。断片化したＤＮＡを亜硫酸水素変換し、ｄｄＰＣＲ［配列番号１１〜２１、６４〜６６、７４〜７６］を使用して定量化し、試料あたり（４５μＬ）１２５０コピーの亜硫酸水素変換された非メチル化ＤＮＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号７８２２）の背景においてメチル化されたＤＮＡの約１ゲノムコピーに希釈した。４５の試料を、ＡＣＴＢ［配列番号７４〜７６］、ＩＫＺＦ１［配列番号１１〜２１］、ならびにＩＲＦ４［配列番号１０８〜１１０］の標的鎖、ならびにＢＣＡＴ１［配列番号６２〜６３、９６、６５〜６６、９７］一方または両鎖の領域を標的とするように設計されたｑＰＣＲアッセイで３回分析した。
【０２４５】
ＰＣＲ反応物を、１５μＬの２ｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２００ｎＭの各フォワードおよびリバースプライマー、ヌクレアーゼフリー水を用いて３μＬとなるように作製した１００ｎＭの各プローブ、１２μＬの鋳型ＤＮＡで構成した。対照試料は、１２５０コピーの亜硫酸水素変換された非メチル化ＤＮＡのみを含む。これらを次のようにサイクルした：Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）で９５℃、１５分［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒］ｘ５０；４０℃、１０秒。ＩＫＺＦ１およびＩＲＦ４の両方をＦＡＭチャネルで検出し、一方でＢＣＡＴ１の両鎖をＨＥＸチャネルで検出した。１つ以上の複製がＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１および／またはＩＲＦ４のいずれかに対して陽性である場合、試料を陽性とみなした。
【０２４６】
２３．７％（ＩＫＺＦ１）および２２．２％（ＢＣＡＴ１）の複製の合計、ならびに７７．８％の試料を、単一の標的鎖特異的ＰＣＲを使用して検出し、一方で、３５．６％（ＩＫＺＦ１とＩＲＦ４の一本鎖）、および４５．２％（二本鎖ＢＣＡＴ１）の複製、ならびに９３．３％の試料を、両鎖を標的とした際に検出した（それぞれｐ値＝０．０１６９、０．０００１、０．０６９、フィッシャーの正確両側検定；表６）。これは、非相補的ＤＮＡの両鎖を標的にするか、または標的鎖に追加のマーカーを追加すると、非常に少量のメチル化ＤＮＡ（試料あたり約１コピー）を検出する能力の感度が大幅に向上することを示す。
【表１４６】
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【０２４７】
当業者は、本明細書に記載された本発明は、詳細に記載されたもの以外の変形および修正が可能であることを理解するであろう。本発明はそのようなすべての変形および修正を含むことを理解されたい。本発明は、個々にまたは集合的に本明細書で言及または示される全てのステップ、特徴、組成物、および化合物、ならびに任意の２つ以上の先述のステップ、または特徴のあらゆる組み合わせもさらに含む。
【０２４８】
参考文献
Ａ．Ｒ．Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ｆ．Ｍｏｕｌｉｅｒｅ，Ｓ．Ｅｌ  Ｍｅｓｓａｏｕｄｉ，Ｃ．Ｍｏｌｌｅｖｉ，Ｅ．Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ，Ｆ．Ｒｏｌｅｔ，Ｂ．Ｇｉｌｌｅｔ，Ｃ．Ｇｏｎｇｏｒａ，Ｐ．Ｄｅｃｈｅｌｏｔｔｅ，Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｍ．Ｄｅｌ  Ｒｉｏ，Ｐ．−Ｊ．Ｌａｍｙ，Ｆ．Ｂｉｂｅａｕ，Ｍ．Ｎｏｕａｉｌｌｅ，Ｖ．Ｌｏｒｉｏｔ，Ａ．−Ｓ．Ｊａｒｒｏｕｓｓｅ，Ｆ．Ｍｏｌｉｎａ，Ｍ．Ｍａｔｈｏｎｎｅｔ，Ｄ．Ｐｅｚｅｔ，ａｎｄ  Ｍ．Ｙｃｈｏｕ，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＫＲＡＳ  ａｎｄ  ＢＲＡＦ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ．，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．４，ｐｐ．４３０−４３５，Ａｐｒ．２０１４．
【０２４９】
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【０２５０】
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【０２５１】
Ｆ．Ｄｉｅｈｌ，Ｍ．Ｌｉ，Ｄ．Ｄｒｅｓｓｍａｎ，Ｙ．Ｈｅ，Ｄ．Ｓｈｅｎ，Ｓ．Ｓｚａｂｏ，Ｌ．Ａ．Ｄｉａｚ，Ｓ．Ｎ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｋ．Ａ．Ｄａｖｉｄ，Ｈ．Ｊｕｈｌ，Ｋ．Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ，ａｎｄ  Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．４５，ｐｐ．１６３６８−１６３７３，Ｎｏｖ．２００５．
【０２５２】
Ｆ．Ｍｏｕｌｉｅｒｅ，Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｅ．Ａｒｎａｕ  Ｐｅｙｒｏｔｔｅ，Ｍ．Ｄｅｌ  Ｒｉｏ，Ｍ．Ｙｃｈｏｕ，Ｆ．Ｍｏｌｉｎａ，Ｃ．Ｇｏｎｇｏｒａ，ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｔｈｉｅｒｒｙ，“Ｈｉｇｈ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ  ｔｕｍｏｕｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ．，”ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，ｖｏｌ．６，ｎｏ．９，ｐ．ｅ２３４１８，２０１１．
【０２５３】
Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ｓ．Ｂ．Ｈｏｏｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｐａｎｔｅｌ，“Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．，”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１１，ｎｏ．６，ｐｐ．４２６−４３７，Ｊｕｎ．２０１１．
【０２５４】
Ｉ．Ｂ．Ｒｏｎｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｖ．Ｂｒｏｕｄｅ，ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｃｈａｎｇ，“Ｉｆ  ｎｏｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｔｈｅｎ  ｗｈａｔ？Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．，“Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．，ｖｏｌ．４，ｎｏ．５，ｐｐ．３０３−３１３，Ｏｃｔ．２００１．
【０２５５】
Ｋ．Ｃ．Ａ．Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ａ．Ｂ．Ｙ．Ｈｕｉ，Ｎ．Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．Ｌａｕ，Ｔ．Ｎ．Ｌｅｕｎｇ，Ｋ．−Ｗ．Ｌｏ，Ｄ．Ｗ．Ｓ．Ｈｕａｎｇ，ａｎｄ  Ｙ．Ｍ．Ｄ．Ｌｏ，“Ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．，”Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．５０，ｎｏ．１，ｐｐ．８８−９２，Ｊａｎ．２００４．
【０２５６】
Ｋ．Ｗａｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｓａｍｉｍｉ，“Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．，”Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ，ｖｏｌ．２，ｐ．１３，２０１５．
【０２５７】
Ｍ．Ｓ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｐ．Ｓｔｏｊａｎｏｖ，Ｐ．Ｐｏｌａｋ，Ｇ．Ｖ．Ｋｒｙｕｋｏｖ，Ｋ．Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ａ．Ｓｉｖａｃｈｅｎｋｏ，Ｓ．Ｌ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｃ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｈ．Ｍｅｒｍｅｌ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｋｉｅｚｕｎ，Ｐ．Ｓ．Ｈａｍｍｅｒｍａｎ，Ａ．ＭｃＫｅｎｎａ，Ｙ．Ｄｒｉｅｒ，Ｌ．Ｚｏｕ，Ａ．Ｈ．Ｒａｍｏｓ，Ｔ．Ｊ．Ｐｕｇｈ，Ｎ．Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｅ．Ｈｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｓｏｕｇｎｅｚ，Ｌ．Ａｍｂｒｏｇｉｏ，Ｅ．Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｓｈｅｆｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｃｏｒｔｅｓ，Ｄ．Ａｕｃｌａｉｒ，Ｇ．Ｓａｋｓｅｎａ，Ｄ．Ｖｏｅｔ，Ｍ．Ｎｏｂｌｅ，Ｄ．ＤｉＣａｒａ，Ｐ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．Ｈｅｉｍａｎ，Ｔ．Ｆｅｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｉｍｉｅｌｉｎｓｋｉ，Ｂ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．Ｈｏｄｉｓ，Ｓ．Ｂａｃａ，Ａ．Ｍ．Ｄｕｌａｋ，Ｊ．Ｌｏｈｒ，Ｄ．−Ａ．Ｌａｎｄａｕ，Ｃ．Ｊ．Ｗｕ，Ｊ．Ｍｅｌｅｎｄｅｚ−Ｚａｊｇｌａ，Ａ．Ｈｉｄａｌｇｏ−Ｍｉｒａｎｄａ，Ａ．Ｋｏｒｅｎ，Ｓ．Ａ．ＭｃＣａｒｒｏｌｌ，Ｊ．Ｍｏｒａ，Ｒ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｒ．Ｏｎｏｆｒｉｏ，Ｍ．Ｐａｒｋｉｎ，Ｗ．Ｗｉｎｃｋｌｅｒ，Ｋ．Ａｒｄｌｉｅ，Ｓ．Ｂ．Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｃ．Ｗ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ａ．Ｂｉｅｇｅｌ，Ｋ．Ｓｔｅｇｍａｉｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｂａｓｓ，Ｌ．Ａ．Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｍ．Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｇｏｌｕｂ，Ｄ．Ａ．Ｇｏｒｄｅｎｉｎ，Ｓ．Ｓｕｎｙａｅｖ，Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ，ａｎｄ  Ｇ．Ｇｅｔｚ，“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９９，ｎｏ．７４５７，ｐｐ．２１４−２１８，Ｊｕｌ．２０１３．
【０２５８】
Ｐ．Ｂｏｒｄｉ，Ｍ．Ｄｅｌ  Ｒｅ，Ｒ．Ｄａｎｅｓｉ，ａｎｄ  Ｍ．Ｔｉｓｅｏ，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ＥＧＦＲ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．，”Ｔｒａｎｓｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．４，ｎｏ．５，ｐｐ．５８４−５９７，Ｏｃｔ．２０１５．
【０２５９】
Ｐ．Ｏ．Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｂ．Ｃ．Ａ．Ａｌｖｅｓ，Ｆ．ｄｅ  Ｓ．Ｇｅｈｒｋｅ，Ｒ．Ｋ．Ｋｕｎｉｙｏｓｈｉ，Ｍ．Ｌ．Ｗｒｏｃｌａｖｓｋｉ，Ａ．Ｄｅｌ  Ｇｉｇｌｉｏ，ａｎｄ  Ｆ．Ｌ．Ａ．Ｆｏｎｓｅｃａ，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．，”Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３４，ｎｏ．２，ｐｐ．９８３−９８６，Ａｐｒ．２０１３．
【０２６０】
Ｐ．Ｐｏｌａｋ，Ｒ．Ｋａｒｌｉｃ，Ａ．Ｋｏｒｅｎ，Ｒ．Ｔｈｕｒｍａｎ，Ｒ．Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ，Ｍ．Ｓ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｅ．Ｒｙｎｅｓ，Ｋ．Ｖｌａｈｏｖｉｃｅｋ，Ｊ．Ａ．Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｒ．Ｓｕｎｙａｅｖ，“Ｃｅｌｌ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｈａｐｅｓ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５１８，ｎｏ．７５３９，ｐｐ．３６０−３６４，Ｆｅｂ．２０１５．
【０２６１】
Ｓ．Ｅｌ  Ｍｅｓｓａｏｕｄｉ，Ｆ．Ｍｏｕｌｉｅｒｅ，Ｓ．Ｄｕ  Ｍａｎｏｉｒ，Ｃ．Ｂａｓｃｏｕｌ−Ｍｏｌｌｅｖｉ，Ｂ．Ｇｉｌｌｅｔ，Ｍ．Ｎｏｕａｉｌｌｅ，Ｃ．Ｆｉｅｓｓ，Ｅ．Ｃｒａｐｅｚ，Ｆ．Ｂｉｂｅａｕ，Ｃ．Ｔｈｅｉｌｌｅｔ，Ｔ．Ｍａｚａｒｄ，Ｄ．Ｐｅｚｅｔ，Ｍ．Ｍａｔｈｏｎｎｅｔ，Ｍ．Ｙｃｈｏｕ，ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｔｈｉｅｒｒｙ，“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｍｕｌｔｉｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｃａｒｅ．，”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．２２，ｎｏ．１２，ｐｐ．３０６７−３０７７，Ｊｕｎ．２０１６．
【０２６２】
Ｓ．Ｇａｒｒｉｇｏｕ，Ｇ．Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｆ．Ｇａｒｌａｎ，Ｃ．Ｎｏｒｍａｎｄ，Ａ．Ｄｉｄｅｌｏｔ，Ｄ．Ｌｅ  Ｃｏｒｒｅ，Ｓ．Ｐｅｙｖａｎｄｉ，Ｃ．Ｍｕｌｏｔ，Ｒ．Ｎｉａｒｒａ，Ｐ．Ａｕｃｏｕｔｕｒｉｅｒ，Ｇ．Ｃｈａｔｅｌｌｉｅｒ，Ｐ．Ｎｉｚａｒｄ，Ｋ．Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｒａｌｌａ，Ｅ．Ｚｏｎｔａ，Ｃ．Ｃｈａｒｐｙ，Ａ．Ｐｕｊａｌｓ，Ｃ．Ｂａｒａｕ，Ｏ．Ｂｏｕｃｈｅ，Ｊ．−Ｆ．Ｅｍｉｌｅ，Ｄ．Ｐｅｚｅｔ，Ｆ．Ｂｉｂｅａｕ，Ｊ．Ｂ．Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｚａａｎａｎ，Ｐ．Ｌａｕｒｅｎｔ−Ｐｕｉｇ，Ｉ．Ｓｏｂｈａｎｉ，ａｎｄ  Ｖ．Ｔａｌｙ，“Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．，”Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．６２，ｎｏ．８，ｐｐ．１１２９−１１３９，Ａｕｇ．２０１６．
【０２６３】
Ｓ．Ｊａｈｒ，Ｈ．Ｈｅｎｔｚｅ，Ｓ．Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ｄ．Ｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｏ．Ｆａｃｋｅｌｍａｙｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｈｅｓｃｈ，ａｎｄ  Ｒ．Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，“ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｏｒｉｇｉｎ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．６１，ｎｏ．４，ｐｐ．１６５９−１６６５，Ｆｅｂ．２００１．
【０２６４】
Ｙ．Ｌｉ，Ｘ．−Ｈ．Ｆｕ，Ｊ．−Ｑ．Ｙｕａｎ，Ｚ．−Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｍａｏ，Ｘ．−Ｍ．Ｄｏｎｇ，Ｊ．−Ｌ．Ｔａｎｇ，ａｎｄ  Ｓ．−Ｙ．Ｗａｎｇ，“Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ｕｓｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｋ−ｒａｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，ｖｏｌ．１５，ｎｏ．６，ｐｐ．７１５−７２５，Ｊｕｎ．２０１５．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【図８−Ｃ】
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【図８−Ｄ】
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【図８−Ｅ】
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【図８−Ｆ】
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【図８−Ｇ】
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【図８−Ｈ】
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【図８−Ｉ】
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【図８−Ｊ】
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【図８−Ｋ】
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【図８−Ｌ】
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【図８−Ｍ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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