(57)【要約】  本発明は、ＶＨドメインを含む重鎖、ならびにマスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）およびＶＬドメインを含む軽鎖を含む、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体を提供する。かかる活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、腫瘍微小環境においてＣＴＬＡ−４結合活性を有するが（ここで、マスキング部分は、腫瘍特定のプロテアーゼによる切断可能部分のタンパク質分解的切断によって除去される）、腫瘍外では顕著に低減されたＣＴＬＡ−４への結合を示す。このようにして、本発明の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、抗腫瘍活性を保持しながら、腫瘍外の抗ＣＴＬＡ−４活性に関連する副作用を低減する。
2020500016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤＲＨ１：ＳＹＴＭＨ（配列番号５５７）；ＣＤＲＨ２：ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５５８）；および、ＣＤＲＨ３：ＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号５５９）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）（ａ）ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ（配列番号５６０）；ＣＤＲＬ２：ＧＡＦＳＲＡＴ（配列番号５６１）；および、ＣＤＲＬ３：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号５６２）を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）；および、（ｃ）マスキング部分（ＭＭ）を含む、軽鎖（ここで、軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＭＭ−ＣＭ−ＶＬのような構造的配置を有する）
を含む、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項２】
ＭＭが、ＹＶ０１、ＹＶ０２、ＹＶ０３、ＹＶ０４、ＹＶ０９、ＹＶ２３、ＹＶ２４、ＹＶ３５、ＹＶ３９、ＹＶ５１、ＹＶ６１、ＹＶ６２、ＹＶ６３、ＹＶ６４、ＹＶ６５およびＹＶ６６からなる群より選択される、請求項１に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項３】
ＣＭが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１７、レグマイン、マトリプターゼおよびｕＰＡからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である、請求項２に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項４】
ＣＭが、２００１、２００３、２００５、２００６、２００７、２００８、２００９、２０１１、２０１２、３００１、３００６、３００７、３００８、３００９、３０１１および３０１２からなる群より選択される、請求項３に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項５】
ＭＭが、ＹＶ０４、ＹＶ２３、ＹＶ２４、ＹＶ３９、ＹＶ６１、ＹＶ６２、ＹＶ６３またはＹＶ６４である、請求項４に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項６】
ＭＭがＹＶ３９である、請求項５に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項７】
ＣＭが、２００１、２０１１または２０１２である、請求項６に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項８】
ＣＭが２０１１である、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項９】
（ｉ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含む重鎖；および、
（ｉｉ）配列番号５６３、５６４および５６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１０】
（ｉ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含む重鎖；および、
（ｉｉ）配列番号５６４のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項９に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１１】
（ｉ）重鎖が、配列番号３５０のヒトＩｇＧ１定常ドメイン配列をさらに含み；および、
（ｉｉ）軽鎖が、配列番号３４６のヒト軽鎖κ定常ドメイン配列をさらに含む、
請求項１０に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１２】
本明細書に記載の第二のリンカーペプチド（ＬＰ２）をさらに含み、ここで、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、Ｎ末端からＣ末端へ、ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＶＬまたはＭＭ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＶＬの構造的配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１３】
ＬＰ１およびＬＰ２が互いに同じではない、請求項１２に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１４】
スペーサーをさらに含み、Ｎ末端からＣ末端へ、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＶＬの構造的配置を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１５】
毒性剤をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１６】
毒性剤が、切断可能なリンカーを介して活性化可能な抗体にコンジュゲートされている、請求項１５に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１７】
検出可能部分をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１８】
検出可能部分が診断剤である、請求項１７に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体および担体を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
さらなる治療剤を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項２３】
（ｉ）請求項２２に記載のベクターを含む細胞を活性化可能な抗体の発現をもたらす条件下で培養すること；および、
（ｉｉ）活性化可能な抗体を回収すること
を含む、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体を製造する方法。
【請求項２４】
有効量の請求項１９または２０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＣＴＬＡ−４活性を低下させる方法。
【請求項２５】
治療的有効量の請求項１９または２０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において癌を処置する、癌の症状を軽減する、または癌の進行を遅延させる方法。
【請求項２６】
癌が、膀胱癌、骨の癌、乳癌、カルチノイド、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿生殖器癌または尿路上皮癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
癌が黒色腫である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月３日出願の米国仮特許出願第６２／４１７，２１２号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体を引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢにより電子送信された配列表の参照
電子的に提出された配列表（名称：3338_059PC02_SeqListing.txt；サイズ：５２７，９６８バイト；作成日：２０１７年１０月２７日）の内容は、その全体が引用により本明細書中に包含される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫系は、腫瘍発生を制御し、腫瘍退縮に介在することができる。これには、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の産生と活性化が必要である。複数のＴ細胞共刺激受容体およびＴ細胞の負の調節因子、または共抑制性受容体が協調作用し、Ｔ細胞活性化、増殖およびエフェクター機能の獲得または喪失を制御する。最初に最もよく特徴付けられたＴ細胞共刺激性分子および共抑制性分子としては、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４が挙げられる（Rudd et al. (2009) Immunol. Rev. 229: 12）。ＣＤ２８は、抗原提示細胞上のＢ７−１およびＢ７−２リガンドに結合することによりＴ細胞受容体結合に共刺激性シグナルを提供する一方、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞増殖および機能を下方制御する負のシグナルを提供する。Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）リガンドにも結合するが、ＣＤ２８よりも高い親和性を有する、ＣＴＬＡ−４は、細胞自律的な（または内因性の）経路および非細胞自律的な（または外因性の）経路の両方を介してＴ細胞機能の負の調節因子として作用する。ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）機能の内因性調節には、Ｔ細胞活性化の結果としてのＣＴＬＡ−４の誘導性表面発現、および対立する細胞でのＢ７リガンドの多価結合によるＴ細胞増殖およびサイトカイン増殖の阻害が介在する（Peggs et al. (2008) Immunol. Rev. 224:141）。
【０００４】
抗ＣＴＬＡ−４抗体は、架橋すると、インビトロでＴ細胞機能を抑制する（Krummel ＆ Allison (1995) J. Exp. Med. 182:459; Walunas et al. (1994) Immunity 1:405）。ＣＴＬＡ−４を構成的に発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、非細胞自律的にエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）機能を制御する。ＣＴＬＡ−４を欠くＴｒｅｇは、抑制能を損ない（Wing et al. (2008) Science 322:271）、ＣＴＬＡ−４とＢ７との相互作用を阻止する抗体は、Ｔｒｅｇ機能を阻害し得る（Read et al. (2000) J. Exp. Med. 192:295; Quezada et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:1935）。近年、Ｔｅｆｆは、外因性経路を介してＴ細胞機能を制御することが示されている（Corse ＆ Allison (2012) J. Immunol. 189:1123; Wang et al. (2012) J. Immunol. 189:1118）。ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆによるＴ細胞機能の外因性調節は、抗原提示細胞上のＢ７リガンドを除去するＣＴＬＡ−４陽性細胞の能力を介して起こり、それによって、それらの共刺激能を制限する（Qureshi et al. (2011) Science 332: 600; Onishi et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:10113）。ＣＴＬＡ−４／Ｂ７相互作用の抗体遮断は、ＣＴＬＡ−４の結合によって伝達される負のシグナルを妨害することによってＴｅｆｆ活性化を促進すると考えられている；Ｔ細胞活性化および増殖のこの内因性調節は、ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ増殖の両方を促進することができる（Krummel ＆ Allison (1995) J. Exp. Med. 182:459; Quezada et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:1935）。動物モデルを用いた初期の研究では、ＣＴＬＡ−４の抗体遮断は、自己免疫を悪化させることが示された（Perrin et al. (1996) J. Immunol. 157:1333; Hurwitz et al. (1997) J. Neuroimmunol. 73:57）。腫瘍免疫の長期化により、確立された腫瘍の後退を引き起こす抗ＣＴＬＡ−４の能力は、ＣＴＬＡ−４遮断の治療的可能性のドラマティックな一例を提供した（Leach et al. (1996) Science 271:1734）。
【０００５】
ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト抗体であるイピリムマブおよびトレメリムマブは、ＣＴＬＡ−４−Ｂ７相互作用を阻害するために選択され（Keler et al. (2003) J. Immunol. 171:6251; Ribas et al. (2007) Oncologist 12:873）、多発性悪性腫瘍について種々の臨床治験で試験されている（Hoos et al. (2010) Semin. Oncol. 37:533; Ascierto et al. (2011) J. Transl. Med. 9:196）。腫瘍の退縮および疾患の安定化が頻繁に観察され、これらの抗体による処置は、種々の臓器システムに影響を及ぼし得る炎症性浸潤物による有害事象を伴っていた。２０１１年に、ＩｇＧ１定常領域を有するイピリムマブが、進行性黒色腫を有する以前に処置された患者の第ＩＩＩ相治験における全生存率の改善に基づき、切除不能または転移性黒色腫の治療として米国および欧州で承認された（Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711）。
【０００６】
しかしながら、イピリムマブによる処置は、大腸炎などの用量限定的毒性によって妨げられていた（Di Giacomo et al. (2010) Seminars in Oncology 37:499）。従って、毒性が低減されているが同等の抗腫瘍効力を有する、改良型のイピリムマブなどの、改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体が必要とされている。そのような改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、現在の抗体よりも有効な抗腫瘍剤であり得る。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む重鎖ならびにマスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）および軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む軽鎖を含む、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体を提供する。かかる活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、腫瘍微小環境においてＣＴＬＡ−４結合活性を有するが（ここで、マスキング部分は、腫瘍特異的プロテアーゼによる切断可能部分のタンパク質分解的切断によって除去される）、腫瘍外では顕著に低減したＣＴＬＡ−４への結合を示す。このようにして、本発明の活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、抗腫瘍活性を保持しながら、腫瘍外の抗ＣＴＬＡ−４活性に関連する副作用を軽減する。
【０００８】
本発明は、改良型イピリムマブなどの改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体、特に活性化されると細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）に結合する活性化可能な抗体を提供する。ある態様において、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、
（ｉ）ＣＤＲＨ１：ＳＹＴＭＨ（配列番号５５７）；ＣＤＲＨ２：ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５５８）；および、ＣＤＲＨ３：ＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号５５９）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）（ａ）ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ（配列番号５６０）；ＣＤＲＬ２：ＧＡＦＳＲＡＴ（配列番号５６１）；および、ＣＤＲＬ３：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号５６２）を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）；および、（ｃ）マスキング部分（ＭＭ）を含む、軽鎖（ここで、軽鎖は、ＭＭ−ＣＭ−ＶＬのようにＮ末端からＣ末端への構造的配置を有する）
を含む。
【０００９】
ある態様において、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、
（ｉ）ＣＤＲＨ１：ＳＹＴＭＨ（配列番号５５７）；ＣＤＲＨ２：ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５５８）；および、ＣＤＲＨ３：ＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号５５９）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、重鎖；ならびに
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）マスキング部分（ＭＭ）；（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）；および、（ｃ）ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ（配列番号５６０）；ＣＤＲＬ２：ＧＡＦＳＲＡＴ（配列番号５６１）；および、ＣＤＲＬ３：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号５６２）を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、軽鎖
を含む。
【００１０】
ある態様において、活性化可能な抗体は、重鎖、およびＮ末端からＣ末端へＭＭ−ＣＭ−ＶＬの構造的配置を有するような軽鎖を含む。本明細書で用いる、ＶＬドメインに結合しているＮ末端フラグメントは、プロドメインと呼ばれ、ＭＭおよびＣＭを含む。
【００１１】
ある態様において、活性化可能な抗体は、完全抗体、すなわち、２本の成熟全長重鎖および２本の成熟全長軽鎖を含む抗体を含む。ある態様において、活性化可能な抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖまたはｓｃＡｂを含む。ある態様において、活性化可能な抗体はモノクローナル抗体を含む。
【００１２】
ある態様において、ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能する。ある態様において、ＣＭは、表３のＣＭ群から選択される。ある態様において、ＣＭは、２００１（配列番号２９７）、２００３（配列番号２９８）、２００５（配列番号２９９）、２００６（配列番号３００）、２００７（配列番号３０１）、２００８（配列番号３０２）、２００９（配列番号３０３）、２０１１（配列番号３０４）、２０１２（配列番号３０５）、３００１（配列番号３０６）、３００６（配列番号３０７）、３００７（配列番号３０８）、３００８（配列番号３０９）、３００９（配列番号３１０）、３０１１（配列番号３１１）および３０１２（配列番号３１２）からなる群より選択される。ある態様において、ＣＭは２００１（配列番号２９７）である。ある態様において、ＣＭは２０１１（配列番号３０４）である。ある態様において、ＣＭは２０１２（配列番号３０５）である。
【００１３】
ある態様において、ＭＭは、表４−６のＭＭからなる群より選択される。ある態様において、ＭＭは、ＹＶ０１（配列番号１）、ＹＶ０２（配列番号２）、ＹＶ０３、（配列番号３）、ＹＶ０４（配列番号４）、ＹＶ０９、（配列番号９）、ＹＶ２３（配列番号２３）、ＹＶ２４（配列番号２４）、ＹＶ３５（配列番号３５）、ＹＶ３９（配列番号３９）、ＹＶ５１（配列番号５１）、ＹＶ６１（配列番号６０）、ＹＶ６２（配列番号６１）、ＹＶ６３（配列番号６２）、ＹＶ６４（配列番号６３）、ＹＶ６５（配列番号６４）およびＹＶ６６（配列番号６５）からなる群より選択され、そしてＣＭは、２００１、２００６、２００７、２００８、２００９、２０１１および２０１２からなる群より選択される。ある態様において、ＭＭはＹＶ３９であり、ＣＭは２０１１である。ある態様において、ＭＭはＹＶ３９であり、ＣＭは２０１２である。ある態様において、ＭＭはＹＶ３９であり、ＣＭは２００１である。
【００１４】
ある態様において、活性化可能な抗体は、配列番号３５３のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５６から５２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号３５６から５２９のプロドメインおよびＶＬに対応するプロドメインおよびＶＬを有する軽鎖を含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号５６４、５６５または５６３のプロドメインおよびＶＬを有する軽鎖を含む。一態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号５６４のプロドメインおよびＶＬを有する軽鎖を含む。
【００１５】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号３４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号５６４、５６５および５６３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の軽鎖可変ドメインアミノ酸を含む。
【００１６】
ある態様において、活性化可能な抗体は、配列番号３５３の重鎖配列および配列番号４４９、４７３または３８３の軽鎖配列の組合せを含む。ある態様において、活性化可能な抗体は、配列番号３４９の重鎖配列および配列番号４４８、４７２または３８２の軽鎖配列の組合せを含む。
【００１７】
本発明は、活性化されるとヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合して、活性化された活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体と呼ばれる、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を提供する。ある態様において、活性化された活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブと同じ結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合する。また、本発明は、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体が、重鎖、ならびにプロドメインがイピリムマブのＣＴＬＡ−４への結合能を低下させるようにイピリムマブ軽鎖に連結させたＭＭおよびＣＭを含むプロドメインを含む軽鎖を含むため、イピリムマブほど効率よくＣＴＬＡ−４に結合しない、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体も提供する。
【００１８】
ある態様において、活性化可能な抗体は、フローサイトメトリーによって測定したとき、１μｇ／ｍＬ以上のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ−４に結合する。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上、または４０μｇ／ｍＬ以上のＥＣ５０でＣＴＬＡ−４に結合する。
【００１９】
ある態様において、ＭＭは、最大４０アミノ酸長のポリペプチドである。ある態様において、ＭＭは、抗体の天然結合パートナーと最大５０％同一であるポリペプチドである。ある態様において、ＭＭは、ＣＴＬＡ−４に対して２５％を超えるアミノ酸配列同一性を有しない。ある態様において、ＭＭは、ＣＴＬＡ−４に対して１０％を超えるアミノ酸配列同一性を有しない。
【００２０】
本発明の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、切断可能部分がプロテアーゼにより切断されるとき活性化される。ある態様において、プロテアーゼは、ＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞に近接している腫瘍によって産生される。ある態様において、プロテアーゼは、ＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞と共局在化している腫瘍によって産生される。ある態様において、プロテアーゼは、以下の表１に示されるプロテアーゼの群から選択される。ある態様において、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、レグマイン、およびセリンプロテアーゼ、例えばマトリプターゼまたはウロキナーゼ（ｕＰＡ）からなる群から選択される。ある態様において、プロテアーゼは、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１７、レグマイン、マトリプターゼおよびｕＰＡ、またはかかるプロテアーゼの１以上の組合せからなる群より選択される。ある態様において、ＣＭは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼによって切断される。ある態様において、ＣＭは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、セリンプロテアーゼおよびレグマインによって切断される。
【００２１】
【表１】
2020500016.tif 000003
【表２】
2020500016.tif 000004
【００２２】
本発明は、１以上のリンカーペプチドをさらに含む、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を提供する。ある態様において、リンカーペプチドは、ＭＭとＣＭの間にある。ある態様において、リンカーペプチドは、ＣＭとＶＬの間にある。ある態様において、活性化可能な抗体は、第一のリンカーペプチド（ＬＰ１）および第二のリンカーペプチド（ＬＰ２）を含む。ある態様において、活性化可能な抗体は、軽鎖が、そのＮ末端からＣ末端へ、ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＶＬの構造的配置を有するように、重鎖および軽鎖を含む。ある態様において、ＬＰ１およびＬＰ２は互いに同一ではない。ある態様において、ＬＰ１およびＬＰ２は互いに同一である。ある態様において、プロドメインは、ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２を含む。
【００２３】
ある態様において、ＬＰ１および／またはＬＰ２は、グリシン−セリンポリマーを含む。ある態様において、ＬＰ１および／またはＬＰ２は、（ＧＳ）ｎ（配列番号５３２）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号５３３）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号５３４）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５３５）（ここで、ｎは、１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号５４２）を含む。ある態様において、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＧＧＳ（配列番号５４３）を含む。
【００２４】
本発明は、スペーサーも含む活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を提供する。ある態様において、スペーサーは、ＭＭに直接結合し、Ｎ末端からＣ末端へ、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＶＬの構造的配置を有する。ある態様において、スペーサーは、ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号５４４）、ＧＱＳＧＱＧ（配列番号５４５）、ＱＧＱＳＧＳ（配列番号５４６）、ＱＧＱＳＧＱ（配列番号５４７）、ＱＳＧＱＧ（配列番号５４８）、ＧＱＳＧＳ（配列番号配列番号５４９）、ＱＧＱＳＧ（配列番号５５０）、ＳＧＱＧ（配列番号５５１）、ＱＳＧＳ（配列番号５５２）、ＱＧＱＳ（配列番号５５３）、ＧＱＧ、ＳＧＳ、ＱＧＱ、ＱＧ、ＧＳ、Ｇ、ＳおよびＱからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、スペーサーおよびＭＭは、アミノ酸配列ＱＧＱＳＧＳＣＲＴＱＬＹＧＹＮＬＣＰＹ（配列番号５５６）を含む。
【００２５】
本発明はまた、ドラスタチン、オーリスタチン、オーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メイタンシノイド、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、またはそれらの誘導体などの毒性剤を含む、活性化可能な抗体も提供する。ある態様において、毒性剤は、リンカーを介して活性化可能な抗体に連結される。ある態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。ある態様において、リンカーは切断不可能なリンカーである。
【００２６】
本発明は、検出可能部分を含む活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を提供する。ある態様において、検出可能な部分は、診断剤である。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む医薬組成物を提供する。ある態様において、医薬組成物は追加の治療剤を含む。
【００２８】
本発明は、本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする単離された核酸分子、該単離された核酸分子の１以上を含むベクター、ならびに活性化可能な抗体の発現をもたらす条件下で１つまたは複数のベクターを含む細胞を培養することにより該活性化可能な抗体を製造する方法も提供される。
【００２９】
本発明は、（ａ）本明細書に記載の活性化可能な抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を、活性化可能な抗体の発現をもたらす条件下で培養すること、および（ｂ）活性化可能な抗体を回収すること
を含む、活性化可能な抗体を製造する方法を提供する。
【００３０】
本発明は、有効量の本明細書に記載の活性化可能な抗体または本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＣＴＬＡ−４活性を低下させる方法を提供する。
【００３１】
本発明は、有効量の本明細書に記載の活性化可能な抗体または本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、天然リガンドのＣＴＬＡ−４への結合を遮断する方法を提供する。
【００３２】
本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の活性化可能な抗体または本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＣＴＬＡ−４関連障害を処置する、その症状を軽減する、またはその進行を遅延させる方法を提供する。ある態様において、ＣＴＬＡ−４関連障害とは癌である。ある態様において、癌は、切除不能または転移性の黒色腫のような黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、肉腫、または皮膚癌である。ある態様において、ＣＴＬＡ−４関連障害は、イピリムマブで処置可能であることが知られている障害である。
【００３３】
本発明のある面または態様がマーカッシュグループとしてまたは選択肢が他のグループ化によって記載されている場合、本発明は、全体としてリストされたグループのすべてを含む場合だけでなく、グループの各メンバーを個々に包含し、またメイングループのすべての可能なサブグループを包含し、またメイングループにおいて１つまたは複数のグループメンバーが欠けている場合も包含する。本発明はまた、特許請求の範囲に記載された発明における任意のグループのメンバーのうち１つまたは複数の明示的な除外も想定している。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａから１Ｃは、（ｉ）非血縁（unrelated)のマウスＩｇＧ２ａ抗体（図１Ａ）、（ｉｉ）マウス抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）ＩｇＧ２ａ抗体（図２Ｂ）、または（ｉｉｉ）活性化可能な９Ｄ９抗体（図１Ｃ）で処理したマウス（ｎ＝１０）における、腫瘍移植後の日数の関数としての腫瘍体積を示す。全ての抗体および活性化可能な抗体を、２５μｇ／マウスの用量で投与した。活性化可能な９Ｄ９抗体は、マスキング部分としてＭＹ１１（配列番号２９４）および切断可能部分として２００１（配列番号２９７）を含む。“ＴＦ”は、各試験の終了時に無腫瘍のマウスの数を示す。非血縁のＩｇＧ２ａ抗体およびマウス抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）ＩｇＧ２ａ抗体を対照として用いた。
【図２】図２Ａから２Ｃは、異なる活性化可能なマウス抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）ＩｇＧ２ａ抗体で処理したマウスの、腫瘍中の制御性Ｔ細胞の頻度（図２Ａ）ならびに脾臓中の制御性Ｔ細胞の増殖および活性化（図２Ｂおよび２Ｃ）を示す。異なる活性化可能な９Ｄ９抗体は、（ｉ）マスキング部分として、ＭＹ０３（配列番号２９３）またはＭＹ１１（配列番号２９４）のいずれか、および（ｉｉ）切断可能部分として、０００３（配列番号３２０）、１００４（配列番号３２３）または２００１（配列番号２９７）を含む。非血縁のマウスＩｇＧ２ａ抗体（“ＤＴ １Ｄ１２ ｍｇ２ａ”）およびマウス抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）ＩｇＧ２ａ抗体（“９Ｄ９ ｍｇ２ａ”）を対照として用いた。図２Ａにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、腫瘍においてＦｏｘｐ３＋である全ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図２Ｂおよび２Ｃは、それぞれ、脾臓におけるＦｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の割合（％）として、増殖中（Ｋｉ−６７＋）および活性化（ＩＣＯＳ＋）制御性Ｔ細胞の頻度を示す。
【図３】図３Ａから３Ｅは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いてインビトロで測定した場合の、異なる抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）のヒトＣＴＬＡ−４への結合能を示す。イピリムマブ（“ＹＶ１”）を全ての試験において対照として用いた。図３Ａにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ０４（配列番号４）、ＹＶ０６（配列番号６）、ＹＶ０９（配列番号９）またはＹＶ２３（配列番号２３）をマスキング部分として含む。図３Ｂにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ２７（配列番号２７）、ＹＶ２９（配列番号２９）、ＹＶ３２（配列番号３２）またはＹＶ３３（配列番号３３）をマスキング部分として含む。図３Ｃにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ３５（配列番号３５）またはＹＶ４１（配列番号４１）をマスキング部分として含む。図３Ｄにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ２４（配列番号２４）、ＹＶ３９（配列番号３９）、ＹＶ５１（配列番号５１）、ＹＶ５２（配列番号５２）またはＹＶ５３（配列番号５３）をマスキング部分として含む。図３Ｅにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ５４（配列番号５４）、ＹＶ５５（配列番号５５）、ＹＶ５６（配列番号５６）、ＹＶ５７（配列番号５７）またはＹＶ５８（配列番号５８）をマスキング部分として含む。図３Ａから３Ｅにおいて、全ての抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、２００１（配列番号２９７）を切断可能部分としてを含む。
【００３５】
【図４】図４Ａから４Ｄは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いてインビトロで測定した場合の、さらなる抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）のヒトＣＴＬＡ−４への結合能を示す。イピリムマブ（“ＹＶ１”）を全ての試験において対照として用いた。図４Ａにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ０４、ＹＶ０６、ＹＶ０９、ＹＶ２３、ＹＶ２７またはＹＶ２９をマスキング部分として含む。図４Ｂにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ３２、ＹＶ３３、ＹＶ３５またはＹＶ４１をマスキング部分として含む。図４Ｃにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ２４、ＹＶ３９、ＹＶ５１、ＹＶ５２またはＹＶ５３をマスキング部分として含む。図４Ｄにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ５４、ＹＶ５５、ＹＶ５６、ＹＶ５７またはＹＶ５８をマスキング部分として含む。図４Ａから４Ｄにおいて、全ての抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、切断可能部分として３００１を含む。
【図５】図５Ａから５Ｆは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いてインビトロで測定した場合の、いくつかの抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）のヒトＣＴＬＡ−４への結合能を示す。イピリムマブ（“ＹＶ１”）を対照として用いた。図５Ａにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ０４をマスキング部分として含み、かつ２００１（配列番号２９７）、２００６（配列番号３００）、２００７（配列番号３０１）、２００８（配列番号３０２）または２００９（配列番号３０３）を切断可能部分として含む。図５Ｂにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ０４またはＹＶ２３をマスキング部分として含み、かつ２００１、２００６、２００７、２００８または２００９を切断可能部分として含む。図５Ｃにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ３９をマスキング部分として含み、かつ２００１、２００６、２００８または２００９を切断可能部分として含む。図５Ｄにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ６１（配列番号６０）、ＹＶ６２（配列番号６１）、ＹＶ６３（配列番号６２）、ＹＶ６４（配列番号６３）またはＹＶ３９（配列番号３９）をマスキング部分として含み、かつ２００１または２０１２を切断可能部分として含む。図５Ｅにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ６５（配列番号６４）、ＹＶ６６（配列番号６５）、ＹＶ０１（配列番号１）、ＹＶ０２（配列番号２）またはＹＶ３９（配列番号３９）をマスキング部分として含み、かつ２００１または２０１２を切断可能部分として含む。図５Ｆにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ３９またはＹＶ０３（配列番号３）をマスキング部分として含み、かつ２００１または２０１２を切断可能部分として含む。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いてインビトロで測定したとき、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ（図６Ａ）またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ（図６Ｂ）のいずれかを有する抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体のヒトＣＴＬＡ−４への結合能を比較する。イピリムマブ（“ＹＶ１”）を対照として用いた。図６Ａおよび６Ｂの両方において、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ３９をマスキング部分として含み、かつ２００１、２００８、２０１１または２０１２を切断可能部分として含む。本明細書に記載の改変抗体（ＹＶ３９−ＮＳＵＢ）において、切断可能部分は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５７０）を含むプロテアーゼ耐性リンカー（“ＮＳＵＢ”）で置き換えられた。
【図７】図７Ａから７Ｄは、フローサイトメトリーを介して測定したときの、異なる抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体のヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現している５８個のα−β−細胞への結合能を示す。結合は、添加した抗ＣＴＬＡ−４抗体の濃度の関数として、任意の蛍光単位（平均蛍光強度、ＭＦＩまたは幾何平均蛍光強度、ｇＭＦＩ）として示される。図７Ａにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ０４、ＹＶ２３、ＹＶ２４またはＹＶ３９をマスキング部分として含み、かつ２００１を切断可能部分として含む。図７Ｂにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ６１、ＹＶ６２、ＹＶ６４またはＹＶ３９をマスキング部分として含み、かつ２００１または２０１１を切断可能部分として含む。図７Ｃにおいて、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、ＹＶ３９をマスキング部分として含み、切断可能部分については、２０１１（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）またはＩｐｉ ＹＶ３９ ２０１１の３つの変異体：（ｉ）１か所で切断されている（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ＭＭＰモノクリップド”）、（ｉｉ）ＭＭＰによって完全に切断されている（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ＭＭＰ”）または（ｉｉｉ）ｕＰＡによって完全に切断されている（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１ ｕＰＡ”）が含まれる。図７Ｄは、図７Ｃに示す異なる活性化可能な抗体についてのＥＣ５０値を提供する。イピリムマブを図７Ａから７Ｄについて対照として用いた。
【００３６】
【図８】図８は、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）アッセイを用いてインビトロで測定したとき、マスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２０１１を異なる濃度で含む抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）（□）の活性を示す。抗体活性は、ＳＥＢ刺激後のヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を介して示される。非血縁のヒトＩｇＧ１アイソタイプ（△）、イピリムマブ（○）およびＳＥＢのみの刺激（×マーク）を対照として用いた。
【図９】図９Ａから９Ｆは、１０ｍｇ／ｋｇの用量を１回投与された、異なる抗ヒトＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）で処理されたヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝１０）における腫瘍移植後の日数の関数としての腫瘍体積を示す。非血縁のマウスＩｇＧ２ａ抗体（図９Ａ）およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを含むイピリムマブ（図９Ｂ）を、対照として用いた。図９Ｃから９Ｆにおいて、活性化可能な抗体は、マスキング部分としてそれぞれＹＶ０４、ＹＶ２３、ＹＶ２４およびＹＶ３９を含み、かつ切断可能部分として２００１を含む。
【図１０】図１０Ａから１０Ｆは、異なる抗ヒトＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）で処理したヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝１０）における腫瘍移植後日数の関数としての腫瘍体積を示す。抗体を移植後７日目に２００μｇ／マウスの用量で１回投与した。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体（図１０Ａ）およびイピリムマブとヒトＩｇＧ１アイソタイプ（図１０Ｂ）を対照として用いた。図１０Ｃから１０Ｆにおいて、活性化可能な抗体は、マスキング部分としてＹＶ３９を含み、かつ切断可能部分として２００１、２０１２、２０１１または２００８を含む。切断可能部分である２０１２、２０１１および２００８は、２００１の脱アミド化部位の影響を受けないように修飾されている。
【図１１】図１１Ａから１１Ｇは、異なる用量のマスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２０１１を含む抗ＣＴＬＡ活性化可能な抗体（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）で処理したヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝１６）における腫瘍移植後日数の関数としての腫瘍体積を示す（図１１Ｅから１１Ｇ）。抗体を、腫瘍移植後７日目に、１０ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｅ）、３ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｆ）または１ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｇ）の用量で１回投与した。対照動物をイピリムマブ（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ；それぞれ図１１Ｂから１１Ｄ）または非血縁のヒトＩｇＧ１抗体（図１１Ａ）で処理した。
【図１２】図１２Ａから１２Ｄは、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを含む異なる抗ヒトＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体で処理した、ヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝１０）における腫瘍中（図１２Ａおよび１２Ｂ）または脾臓中（図１２Ｃおよび１２Ｄ）の制御性Ｔ細胞の頻度を示す。全ての抗体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した。活性化可能な抗体は、ＹＶ０４、ＹＶ２３、ＹＶ２４またはＹＶ３９をマスキング部分として含み、２００１を切断可能部分として含む。図１２Ｃおよび１２Ｄの横軸のラベルはそれぞれ図１２Ａおよび１２Ｂにも適用される。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを含むイピリムマブを対照として用いた。図１２Ａおよび１２Ｃにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、Ｆｏｘｐ３＋である全ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図１２Ｂおよび１２Ｄにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、Ｆｏｘｐ３＋である全ＣＤ４５＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図１２Ｅおよび１２Ｆは、活性化（ＩＣＯＳ＋）細胞および増殖中の（Ｋｉ−６７＋）細胞の頻度を脾臓中の制御性Ｔ細胞の割合（％）として示す。
【図１３】図１３Ａから１３Ｃは、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体で処理したヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウスにおける、腫瘍（図１３Ａおよび１３Ｂ）または脾臓（図１３Ｃ）中の制御性Ｔ細胞の頻度を示す。用いる活性化可能な抗体は、マスキング部分としてＹＶ３９を含み、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプまたはヒトＩｇＧ１アイソタイプのいずれかであった。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体およびマウスＩｇＧ１アイソタイプを含むイピリムマブを対照として用いた。図１３Ａおよび１３Ｃにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、Ｆｏｘｐ３＋である全ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図１３Ｂにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、Ｆｏｘｐ３＋である全ＣＤ４５＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図３Ｄおよび１３Ｅは、脾臓中の制御性Ｔ細胞の割合（％）として、増殖中（Ｋｉ−６７＋）および活性化（ＩＣＯＳ＋）細胞の頻度を示す。
【００３７】
【図１４】図１４Ａから１４Ｃは、異なる抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体で処理したマウスの腫瘍における、制御性Ｔ細胞（図１４Ａおよび１４Ｂ）またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（図１４Ｃ）の頻度を示す。図１４Ｄおよび１４Ｅは、脾臓における制御性Ｔ細胞を示す。抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、マスキング部分としてＹＶ３９を含み、切断可能部分として２０１２、２０１１、２００８または２００１を含む。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体およびヒトＩｇＧ１アイソタイプを含むイピリムマブを対照として用いた。図１４Ａおよび１４Ｄにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、Ｆｏｘｐ３＋である全ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図１４Ｂおよび１４Ｅにおいて、制御性Ｔ細胞の頻度は、Ｆｏｘｐ３＋である全ＣＤ４５＋ Ｔ細胞の割合（％）として示される。図１４Ｃは、腫瘍中の全ＣＤ４５＋ Ｔ細胞の割合（％）としてのＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の頻度を示す。図１４Ｆおよび１４Ｇは、脾臓における増殖中（Ｋｉ−６７＋）および活性化（ＩＣＯＳ＋）制御性Ｔ細胞の割合（％）を示す。
【図１５】図１５は、異なる用量のイピリムマブまたはマスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２０１１を含む抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）のいずれかで処理した、ヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝８）の腫瘍における制御性Ｔ細胞の頻度を示す。抗体を、腫瘍移植後７日目に１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体を対照として用いた。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、異なる用量のイピリムマブまたはマスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２０１１を含む抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）で処理した、ヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝８）の脾臓における活性化（ＩＣＯＳ＋）および増殖中（Ｋｉ−６７＋）制御性Ｔ細胞の割合（％）を示す。抗体を、腫瘍移植後７日目に１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体を対照として用いた。
【図１７】図１７Ａから１７Ｄは、異なる用量のイピリムマブ（“Ｉｐｉ”）（図１７Ｂ）、イピリムマブの非フコシル化バージョン（“Ｉｐｉ ＮＦ”）（図１７Ｃ）、またはマスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２０１１を含む抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体の非フコシル化バージョン（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１ ＮＦ”）（図１７Ｄ）で処理した、ヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝１０）における腫瘍移植後日数の関数としての腫瘍体積を示す。抗体を、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した（それぞれ、図１７Ｂ〜１７Ｄの左パネル、中パネルおよび右パネル）。対照動物は非血縁のヒトＩｇＧ１抗体を投与された（図１７Ａ）。
【図１８】図１８は、イピリムマブの非フコシル化バージョン（“Ｉｐｉ ＮＦ”）またはマスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部位としての２０１１を含む抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体の非フコシル化バージョン（“ＮＦ Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）のいずれかで処理したヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウス（ｎ＝５）の腫瘍における制御性Ｔ細胞の頻度を示す。抗体を、腫瘍移植後７日目に２００μｇ／マウスの用量で１回投与した。非血縁のヒトＩｇＧ１抗体を対照として用いた。
【図１９】図１９は、イピリムマブ（“Ｉｐｉ”）およびイピリムマブの非フコシル化バージョン（“Ｉｐｉ ＮＦ”）の両方の、種々のヒト、カニクイザルおよびマウスＦｃ受容体に対する結合親和性（Ｋｄ）を示す。
【図２０】図２０は、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体で処理した後のカニクイザルの血液中のＫｉ６７＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の中央値パーセンテージを示す。抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、マスキング部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２００１を含む。ビークルおよびイピリムマブを対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明をより容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義を詳細な説明中に記載している。
【００３９】
用語“１つの（“ａ”または“ａｎ”）”の物体（entity）は、その物体の１つまたは複数を意味することに留意されたい。例えば、“１つの（“ａ”）ヌクレオチド配列”は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すと理解される。そのように、用語“ａ”（または、“ａｎ”）、“１つまたは複数”および“少なくとも１つ”は、本明細書中、互換的に用いられ得る。
【００４０】
さらに、“および／または”は、本明細書で用いる場合、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの、他の有無にかかわらず、具体的な開示として解釈されるべきである。従って、本明細書中、“Ａおよび／またはＢ”などの語句で用いられる用語“および／または”は、“ＡおよびＢ”、“ＡまたはＢ”、“Ａ”（単独）および“Ｂ”（単独）を含むことを意図する。同様に、“Ａ、Ｂおよび／またはＣ”などの語句で用いられる用語“および／または”は、以下の側面のそれぞれを包含することを意図している：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００４１】
“〜を含む”という表現で本明細書中ある側面が記載されている場合は、“からなる”および／または“から本質的になる”という用語で記載されている類似の側面も提供されることを理解されたい。
【００４２】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；および、the Oxford Dictionary Of Biochemistry および Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本明細書で用いられる多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【００４３】
単位、接頭辞および記号は、それらのＳｙｓｔｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）承認形式で示される。数値範囲はその範囲を定義する数を包含する。他に特記しない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’方向に左から右へ記載される。アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端方向へ左から右へ記載される。本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な側面を限定するものではなく、それは本明細書全体を参照することによって得られる。従って、すぐ下に定義されている用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義されている。
【００４４】
本明細書で用いる用語“細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４”または“ＣＴＬＡ−４”は、活性化Ｔ細胞によって発現され、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである受容体を意味する。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８と相同であり、そして両分子は抗原提示細胞上でそれぞれＢ７−１およびＢ７−２とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は制御性Ｔ細胞にも見いだされ、その抑制機能に寄与している。ＣＴＬＡ−４はまた、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、ＣＤ１５２、インスリン依存性真性糖尿病１２（ＩＤＤＭ１２）、セリアック病３（ＣＥＬＩＡＣ３）、ＧＲＤ４およびＧＳＥとも呼ばれる。用語“ＣＴＬＡ−４”は、細胞によって天然に発現されるＣＴＬＡ−４の任意の変異体またはアイソフォームを含む。
【００４５】
本明細書で用いる用語“Ｔ細胞”は、様々な細胞性免疫反応に関与する胸腺由来リンパ球として定義される。本明細書で用いる用語“制御性Ｔ細胞”は、抑制特性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞を意味する。“Ｔｒｅｇ”は、制御性Ｔ細胞について本明細書中で用いられる略語である。
【００４６】
本明細書で用いる用語“ヘルパーＴ細胞”は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を意味する。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原を認識する。異なるサイトカインを産生する少なくとも２種類のヘルパーＴ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２がある。ヘルパーＴ細胞は、活性化されると、ＣＤ２５＋になるが、一時的にＦｏｘＰ３＋になる。
【００４７】
本明細書で用いる用語“細胞傷害性Ｔ細胞”は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を意味する。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原を認識する。
【００４８】
用語“抗体”は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。“特異的に結合する”または“〜と免疫反応する”または“〜に免疫特異的に結合する”とは、抗体が所望の抗原の１以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないかまたははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ドメイン抗体、一本鎖、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖならびにＦａｂ発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は１本の“軽”鎖（約２５ｋＤａ）および一本の“重”鎖を有する（約５０−７０ｋＤａ）。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。一般的に、ヒトから得られた抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なるクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラスもある。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
【００５０】
本明細書で用いる用語“活性化可能な抗体”とは、マスキング部分（ＭＭ）および切断可能部分（ＣＭ）も含む抗体を意味し、ここで、ＭＭは、プロテアーゼによって切断可能であるＣＭを介して抗体のＶＬに連結される。本明細書で用いる“プロドメイン”は、抗ヒトＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体のＶＬドメインに結合しているＮ末端フラグメントを含み、そしてそれ自体がＭＭおよびＣＭを含む。ある態様において、活性化可能な抗体の軽鎖は、以下のようにＮ末端からＣ末端までの構造配置を有する：ＭＭ−ＣＭ−ＶＬ。ある態様において、プロドメインは、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のＶＨドメインに結合している。活性化可能な抗体は、全て癌ではないにしてもほとんどの癌に存在する上方制御されたタンパク質分解活性によって切断されるように設計されている。そのようなタンパク質分解的切断または活性化は、プロドメインを除去し、活性な抗体、すなわち活性化された活性化可能な抗体を放出する。正常組織における活性化可能な抗体のプロテアーゼ活性化は、正常組織におけるタンパク質分解活性の厳密な制御のために著しく減少する。このように、活性化可能な抗体は、循環系および正常組織において大部分不活性のままである。
【００５１】
活性化可能な抗体は、そのプロドメインが抗原結合ドメインをマスキングし、それにより抗原結合ドメインがその標的に結合する能力を阻害するという点で、活性化された活性化可能な抗体よりも標的への結合に対してより低い親和性を有し、ここで、ＭＭはＣＭのタンパク質分解的切断によって除去されており、それにより活性抗体を放出する。そのようにして放出された抗体は、その標的への結合に対してより高い親和性を示す。ある態様において、ＭＭはイピリムマブの抗原結合ドメインと特異的に相互作用して、抗体がその標的に結合する能力を低下させる。ＭＭが活性化可能な抗体のタンパク質分解的切断によって除去されるとき、放出された抗体は、親イピリムマブと同程度の親和性でその標的に結合する。
【００５２】
本発明の活性化可能な抗体の概略図、例えばＭＭ−ＣＭ−ＶＬは、排他的であることを意図しない。リンカー配列、スペーサー配列およびシグナル配列などの他の配列要素は、そのような概略図において列挙された配列要素の前、後または間に存在し得る。重鎖がＭＭ−ＣＭ−ＶＨのようにＮ末端からＣ末端への構造配置を有するように、ＭＭおよびＣＭを含むプロドメインを抗体のＶＬではなく抗体のＶＨに結合することができることも理解されるべきである。
【００５３】
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”（ｍＡｂ）または“モノクローナル抗体組成物”は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子の集団を意味する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子において同一である。ｍＡｂは、それに対する固有の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる、抗原結合部位またはドメインを含む。モノクローナル抗体分子は、典型的には、２本の重鎖および２本の軽鎖を含み得る。
【００５４】
用語“抗原結合ドメイン”は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を意味する。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）鎖および軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域のアミノ酸残基によって形成される。“超可変領域”と呼ばれる、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多様なストレッチは、“フレームワーク領域”または“ＦＲ”として知られるより保存された隣接ストレッチ間に挿入される。従って、用語“ＦＲ”は、免疫グロブリン中の超可変領域の間に、およびそれに隣接して、天然に見出されるアミノ酸配列を意味する。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するために三次元空間において互いに関連して配置されている。抗原結合表面は結合抗原の三次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、「免疫学上重要なタンパク質のKabat配列」（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991))、または Chothia ＆ Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)による定義に従っている。
【００５５】
本明細書で用いる用語“エピトープ”は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を含む。用語“エピトープ”は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ、好ましくは、≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭであるとき、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００５６】
本明細書で用いる用語“特異的結合特性”、“免疫学的結合特性”および“免疫学的結合特性”とは、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有相互作用を意味する。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）として表すことができ、ここで、より小さいＫｄはより高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量化することができる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを含み、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターによって変わる。従って、“結合速度定数（on rate constant）”（ｋｏｎ）および“解離速度定数（off rate constant）”（ｋｏｆｆ）は両方とも、濃度ならびに実際の結合速度および解離速度の計算によって決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)参照）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメーターの相殺を可能にし、そして解離定数Ｋｄに等しい（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に知られている同様のアッセイなどのアッセイによって測定した場合、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭであるとき、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合すると言われる。
【００５７】
本明細書で用いる用語“単離されたポリヌクレオチド”とは、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源のポリヌクレオチドあるいはそれらの組合せを意味し、その起源によって、“単離されたポリヌクレオチド”は、（１）“単離されたポリヌクレオチド”が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない、（２）天然には連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、または（３）より大きな配列の一部として天然には生じない。本発明のポリヌクレオチドには、本明細書に示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、および本明細書に示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子が含まれる。
【００５８】
本明細書で言及される用語“単離されたタンパク質”は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡまたは合成起源のタンパク質あるいはそれらの何らかの組合せを意味し、その起源または由来によって、“単離されたタンパク質”は、（１）天然に見出されるタンパク質と結合しない、（２）同じ起源の他のタンパク質を含まない、例えばマウスタンパク質を含まない、（３）異なる種の細胞によって発現される、または（４）天然に存在しない。
【００５９】
用語“ポリペプチド”は、本明細書中、ポリペプチド配列の天然タンパク質、フラグメントまたは類縁体を意味する総称として用いられる。従って、天然タンパク質フラグメントおよび類縁体は、ポリペプチド属の種である。本発明によるポリペプチドは、本明細書に示す重鎖免疫グロブリン分子および本明細書に示す軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子とカッパ軽鎖免疫グロブリンなどの軽鎖免疫グロブリン分子との組み合わせ、およびそれらの逆、ならびにそのフラグメントおよび類縁体によって形成される抗体分子を含む。
【００６０】
本明細書で用いる用語“天然に存在する（天然）”は、対象に適用されるとき、該対象が天然に見出され得るという事実を意味する。例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に改変されていないか、またはそうでなければ天然に存在する、生物（ウイルスを含む）に存在するものである。
【００６１】
本明細書で用いる用語“作動可能に連結された”は、そのように記載された構成要素の位置がそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に“作動可能に連結された”調節配列は、コード配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるように連結されている。
【００６２】
本明細書で用いる用語“調節配列”は、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセシングをもたらすために必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような調節配列の性質は、原核生物における宿主生物に応じて異なり、そのような調節配列には、一般的に、真核生物におけるプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれ、概してそのような調節配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語“調節配列”は、少なくとも、その存在が発現およびプロセシングに必須であるすべての成分を含むことを意図しており、またその存在が有利であるさらなる成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。本明細書で言及される用語“ポリヌクレオチド”は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかである長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【００６３】
本明細書で言及される用語“オリゴヌクレオチド”は、天然および非天然のオリゴヌクレオチド結合によって共に連結された天然に存在する、および修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０から６０塩基長であり、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブの場合、一本鎖であるが、例えば、遺伝子変異体の構築における使用のために、二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。
【００６４】
本明細書で言及される用語“天然ヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及される用語“修飾ヌクレオチド”は、修飾または置換糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及される用語“オリゴヌクレオチド結合”は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレロエート（phosphoroselerloate）、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニレート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stecらの、米国特許第５，１５１，５１０号； Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、要すれば、検出のための標識を含み得る。
【００６５】
本明細書で用いる、２０個の従来のアミノ酸およびその略語は、常套の用法に従う。Immunology−A Synthesis （2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991))を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−, α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型のアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの適当な構成要素であり得る。非従来型のアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で用いられるポリペプチド表記法では、標準的な用法および慣例に従って、左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方向である。
【００６６】
ポリペプチドに適用される場合、用語“実質的に同一”は、２つのペプチド配列が、例えば、初期設定のギャップの重みを使用するプログラムＧＡＰまたはプログラムＢＥＳＴＦＩＴによって、最適に整列された場合に、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【００６７】
本明細書中で考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における軽微なバリエーションは、本発明に包含されることが企図されるが、但しそのアミノ酸配列におけるバリエーションは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を維持する。特に、保存的アミノ酸の置換が企図される。保存的置換は、アミノ酸の側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起きる置換である。遺伝子的にコードされるアミノ酸は、一般に、ファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。アミノ酸の他のファミリーとしては、（ｉ）セリンおよびスレオニン（これらは、脂肪族−ヒドロキシファミリーである）；（ｉｉ）アスパラギンおよびグルタミン（これらは、アミド含有ファミリーである）；（ｉｉｉ）アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン（これらは、脂肪族ファミリーである）；ならびに（ｉｖ）フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン（これらは、芳香族ファミリーである）が挙げられる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの独立した置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の独立した置換、セリンによるスレオニンの独立した置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の同様の置換が、特にそれらの置換がＣＤＲまたはフレームワーク領域内のアミノ酸に関与しない場合に、生じる分子の結合または特性に対して大きく影響しないと予想することは、妥当である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。アッセイは、本明細書中に詳細に記載される。抗体もしくは免疫グロブリン分子のフラグメントまたは類縁体は、当業者によって容易に調製され得る。フラグメントまたは類縁体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造的ドメインおよび機能的ドメインは、ヌクレオチド配列データおよび／またはアミノ酸配列データと、公的または私的な配列データベースとの比較によって同定され得る。好ましくは、コンピューターによる比較方法は、公知の構造および／または機能からなる他のタンパク質に存在する、配列モチーフまたは予想されるタンパク質立体配置ドメインを同定するために使用される。公知の３次元構造へと折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Bowie et al. Science 253:164 (1991)。従って、上記の例は、当業者が、本発明に従う構造的ドメインおよび機能的ドメインを規定するために使用され得る配列モチーフおよび構造的立体配置を認識し得ることを示す。
【００６８】
好ましいアミノ酸置換は、（１）ＣＭを含む切断可能なリンカー以外の活性化可能な抗体の領域におけるタンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、（２）酸化に対する感受性を低下させる置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる置換、（４）結合親和性を変化させる置換、および（４）このような類縁体の他の物理化学的または機能的特性を付与するか、または改変する置換である。類縁体は、天然に存在するペプチド配列以外の、配列の種々の突然変異タンパク質を含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（好ましくは、分子間の接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分）において行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊する傾向がないか、または親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊しないはずである）。当該分野において認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))； Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；および、Thornton et al. Nature 354:105 (1991)に記載されている。
【００６９】
本明細書で用いる用語“ポリペプチドフラグメント”は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または１つもしくは複数の内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列において対応する位置と同一である、ポリペプチドを意味する。フラグメントは、一般的に、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり、通常は少なくとも５０アミノ酸長であり、そしてよりさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で用いる用語“類縁体”とは、推定されるアミノ酸配列の一部に対する実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントから構成され、かつ適当な結合条件下でＣＴＬＡ−４に対する特異的な結合を有するポリペプチドを意味する。一般的に、ポリペプチド類縁体は、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類縁体は、一般的に、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上であり、そして天然に存在する完全長ポリペプチドと同じ長さであることが多い。
【００７０】
用語“薬物（agent）”は、本明細書中、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から得られた抽出物を表すために用いらる。
【００７１】
本明細書で用いる用語“標識”または“標識される”は、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込みまたは標識アビジン（例えば、光学的方法または熱量測定の方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドに対する結合による、検出可能なマーカーの組み込みを意味する。特定の状況において、標識またはマーカーはまた、治療的であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野において公知である。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。ある態様において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーアームによって結合されている。
【００７２】
本明細書中の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms （Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)）によって例示されるように、当技術分野における従来の使用法に従って用いられる。
【００７３】
本明細書で用いる“実質的に純粋な”とは、対象の化学種が、存在する優勢な化学種である（すなわち、モル濃度に基づいて、その化学種が、その組成におけるあらゆる他の個別の化学種より豊富である）ことを意味し、そして好ましくは、実質的に精製された画分は、対象の化学種が、存在する全ての高分子化学種のうちの少なくとも約５０％（モル濃度に基づく）を構成する組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に存在する全ての高分子化学種の、約８０％より多くを構成し、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％および９９％より多くを構成し得る。最も好ましくは、対象の化学種は、本質的に均一（不純物化学種が、従来の検出方法によって、その組成物において検出される可能性がない）になるまで精製され、その組成物は、本質的に、単一の高分子化学種からなる。
【００７４】
本明細書で用いる“処置”は、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。有益なまたは望ましい臨床結果には、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の低下、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の蔓延（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の発症または再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延（delay or slowing）、疾患状態の改善、ならびに寛解（部分的であろうと全体的であろうと）、の１以上が含まれ得るが、これらに限定されない。また、“処置”には、癌などの増殖性疾患の病理学的影響の軽減も含まれる。本発明の方法は、処置のこれらの側面のうち何れか１以上を企図する。
【００７５】
本明細書で用いる用語“有効量”は、単独でまたは第２の療法と組み合わせて用いられるとき、寛解、緩和、軽減および／またはその症状の１以上の遅延などの特定の障害、病状または疾患を処置するのに十分な化合物または組成物の量を意味する。癌または他の不要な細胞増殖に関して、有効量とは、腫瘍を縮小させるおよび／または腫瘍の増殖速度を低下させる（腫瘍増殖を抑制するためなど）、または他の不要な細胞増殖を予防もしくは遅延させるのに十分な量を含む。有効量は１回以上の投与で投与され得る。
【００７６】
本明細書で用いる、“併用療法”とは、第一の薬物が他の薬物と共に投与されることを意味する。“〜と組み合わせて”とは、ある治療法に加えて別の治療法を投与することを意味する。従って、“〜と組み合わせて”とは、ある治療法の個体への送達前、送達中または送達後の別の治療法の投与を意味する。
【００７７】
本明細書で用いる用語“医薬品または薬物”とは、対象に対して適切に投与されたときに所望の治療効果を誘導し得る化合物または組成物を意味する。
【００７８】
本明細書で用いる“薬学的に許容される”または“薬理学的に許容される”とは、生物学的にまたは他の点で望ましくないことはない物質を意味し、例えば、この物質は、何らかの重大な望ましくない生物学的効果を引き起こさない、またはそれが含まれる組成物の他の任意の成分との有害な相互作用を起こさないで、個体または対照に投与される医薬組成物に組み込むことができる。薬学的に許容される担体または賦形剤は、毒性試験および製造試験の要求される基準を満たしており、および／または米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドに含まれている。
【００７９】
用語“癌”、“癌性”または“悪性”は、典型的には無制御の細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理的状態を意味するかまたは説明する。癌の例としては、例えば、切除不能または転移性黒色腫などの黒色腫、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、癌腫および肉腫が挙げられる。そのような癌のより具体的な例には、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ ＡＬＬ）、扁平細胞癌腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、多形神経膠芽腫、頚部癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌腫、および頭頸部癌、胃癌、胚細胞腫、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ならびに慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）が含まれる。
【００８０】
“白血病”とは、造血臓器の進行性の悪性疾患を意味し、一般に、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の無制御の増殖および発達を特徴とする。白血病は一般的に以下の基準に基づいて臨床的に分類されている：（１）疾患の期間および特徴−急性または慢性；（２）関与する細胞の種類−骨髄性（骨髄系）、リンパ性（リンパ系）または単球性；および、（３）血中の異常細胞数の増加または非増加−白血病性または非白血病性（亜白血性）。白血病には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血病性白血病、白血球血症性白血病（leukocythemic leukemia）、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリーセル白血病、血芽球性白血病（hemoblastic leukemia）、血芽球細胞性白血病（hemocytoblastic leukemia）、組織球性白血病（histiocytic leukemia）、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（lymphatic leukemia)、リンパ芽球性白血病、リンパ細胞性白血病（lymphocytic leukemia）、リンパ行性白血病（lymphogenous leukemia）、リンパ性白血病（lymphoid leukemia）、リンパ肉腫細胞性白血病（lymphosarcoma cell leukemia）、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病（myeloid granulocytic leukemia）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Naegeli leukemia）、形質細胞性白血病、形質細胞白血病（plasmacytic leukemia）、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病（Schilling’s leukemia）、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病が含まれる。ある側面において、本発明は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、および／またはフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ ＡＬＬ）の治療方法を提供する。
【００８１】
Ｉ．抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体
本発明は、従来の抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、イピリムマブ）と同程度に有効であるが、より大きい、すなわち改善された安全性プロファイルを有する、改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体を提供する。具体的には、改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、活性化されるとヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する活性化可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。本明細書において活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体またはＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体とも呼ばれるこれらの改善された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、異常なＣＴＬＡ−４の発現および／または活性に関連する疾患または障害を含むがこれらに限定されない疾患または障害の症状を処置、予防、その進行の遅延、緩和および／または軽減する方法において使用される。例えば、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、癌または他の新生物状態の症状を処置、予防、その進行の遅延、緩和および／または軽減する方法において使用される。活性化可能な抗体は、例えば、米国特許第８，５１３，３９０号、同第８，５１８，４０４号；同第９，１２０，８５３号；同第９，１２７，０５３号、および国際公開ＷＯ２０１６／１４９２０１に記載されている。
【００８２】
ある態様において、本明細書に提供される活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、（ｉ）イピリムマブまたはその抗原結合ドメイン（ＡＢ）、例えばイピリムマブ可変軽鎖（ＶＬ）、（ｉｉ）切断可能部分（ＣＭ）、および（ｉｉｉ）マスキング部分（ＭＭ）を含む。ある態様において、ＶＬは、ＭＭのカップリングがイピリムマブのＣＴＬＡ−４への結合能を低下させるように、ＭＭにカップリング（結合）される。ある態様において、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば腫瘍微小環境で過剰発現されるプロテアーゼの基質を含む切断可能部分（ＣＭ）（基質リンカーとしても知られる）を介してＶＬにカプリングされる。
【００８３】
抗体またはその抗原結合フラグメント
ある態様において、抗体またはその抗原結合ドメイン（ＡＢ）は、米国特許第６，９８４，７２０号および同第７，６０５，２３８号（引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）にて１０Ｄ１として識別される抗ＣＴＬＡ−４抗体 イピリムマブの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。イピリムマブ（以前は、ＭＤＸ−０１０およびＢＭＳ−７３４０１６としても公知）は、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として市販されており、転移性黒色腫の治療用に承認され、他の癌で臨床治験中である。Hoos et al. (2010) Semin. Oncol. 37:533; Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711; Pardoll (2012) Nat. Immunol. 13(12): 1129を参照のこと。
【００８４】
イピリムマブは、ほとんどのヒトＦｃ受容体に最もよく結合するヒトＩｇＧ１アイソタイプを有し（Bruhns et al. (2009) Blood 113: 3716）、それが結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に関してマウスＩｇＧ２ａと同等であると考えられる。ＩｇＧ１はヒトＮＫ細胞および単球によって発現される活性化受容体ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合するので、イピリムマブは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を仲介することができる。ＩｇＧ１−アイソタイプのイピリムマブは、元はハイブリドーマから直接単離されたが、その後クローニングされ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現された。免疫応答を上方制御しようとするＴ細胞上の受容体を標的とする抗体においてＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に介在するアイソタイプは望ましくない可能性があるという考察にもかかわらず、抗体のＩｇＧ１アイソタイプは、カニクイザルではワクチン応答を増強し、機能的と考えられていたため、部分的に保持された。イピリムマブは、例えば処置後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の表面上のＨＬＡ−ＤＲの発現の有意な増加ならびに絶対的リンパ球数の増加によって証明されるように、血中の活性化Ｔ細胞の数を増加させることが示されており（Ku et al. (2010) Cancer 116:1767; Attia et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:6043; Maker et al. (2005) J. Immunol. 175:7746; Berman et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl):15s.3020; Hamid et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl): 15s.9008）、Ｔ細胞の枯渇はヒトの末梢では起こらないことを示している。イピリムマブは、エフェクター細胞としてＩＬ−２活性化ＰＢＭＣを用いて、活性化Ｔ細胞の中程度のＡＤＣＣのみを示した；しかしながら、標的としてのＴｒｅｇｓの使用は試験していない。イピリムマブで処置された患者の血中の末梢Ｔｒｅｇの頻度のわずかな変化が観察されているが（Maker et al. (2005) J. Immunol. 175:7746）、腫瘍内Ｔｒｅｇｓに対するイピリムマブの効果に関する情報はほとんど得られていない。しかしながら、イピリムマブで処置された患者からの転移性黒色腫病巣からの生検における高いＣＤ８＋対Ｔｒｅｇ比と腫瘍壊死との間の正の相関が報告されている（Hodi et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:3005）。さらに、イピリムマブで処置した膀胱癌患者からの腫瘍組織は、未処置膀胱癌患者からの腫瘍よりも低いＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の割合（％）を有した（Liakou et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:14987）。
【００８５】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、可変重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ１、本明細書中ＣＤＲＨ１とも称される）、ＣＤＲ２（ＶＨ ＣＤＲ２、本明細書中ＣＤＲＨ２とも称される）およびＣＤＲ３（ＶＨ ＣＤＲ３、本明細書中ＣＤＲＨ３とも称される）、ならびに可変軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ ＣＤＲ１、本明細書中ＣＤＲＬ１とも称される）、ＣＤＲ２（ＶＬ ＣＤＲ２、本明細書中ＣＤＲＬ２とも称される）およびＣＤＲ３（ＶＬ ＣＤＲ３、本明細書中ＣＤＲＬ３とも称される）の組合せを含む。これらのＣＤＲ配列は表２に提供されている。
【００８６】
【表３】
2020500016.tif 000005
【００８７】
イピリムマブ−ＶＬ鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK （配列番号３４４)
イピリムマブ−ＶＨ鎖
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS （配列番号３４５)
【００８８】
以下に示される他の種々の配列が提供される。
ヒトκ定常ＬＣ
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号３４６)
マウスκ定常軽鎖
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKD眼RHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC （配列番号３４７)
イピリムマブ−ヒトκＬＣ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号３４８)
イピリムマブ−マウスκＬＣ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKD眼RHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC （配列番号３４９）
ヒトＩｇＧ１定常ＨＣ
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （配列番号３５０)
マウスＩｇＧ１定常ＨＣ
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （配列番号３５１)
マウスＩｇＧ２ａ定常ＨＣ
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK （配列番号３５２)
イピリムマブ−ＶＨ−ヒトＩｇＧ１定常ＨＣ
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （配列番号３５３)
イピリムマブ−ＶＨ−マウスＩｇＧ１定常ＨＣ
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （配列番号３５４)
イピリムマブ−ＶＨ−マウスＩｇＧ２ａ定常ＨＣ
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK （配列番号３５５)
【００８９】
ある態様において、抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含み、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列が、表２に示すＣＤＲ配列と比較して、保存的アミノ酸の相違を含む、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸配列の相違を含む。
【００９０】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号３４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である重鎖可変ドメインを含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、抗体の活性化可能な形態の作製において添加されるＭＭ、ＣＭ、リンカー、スペーサーまたは他の配列を含まない、配列番号５６３〜５６５からなる群と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００９１】
ある態様において、活性化可能な抗体中のＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、特に、抗体またはその抗原結合フラグメントのＦｃ領域に修飾を含み得る。例えば、抗体とＦｃγＲとの相互作用は、Ｎ２９７残基で各Ｆｃフラグメントに結合したグリカン部分を修飾することにより増強することができる。特に、コアフコース残基が存在しないことは、抗原結合またはＣＤＣを変化させることなく、活性化ＦｃγＲＩＩＩＡに対するＩｇＧの改善された結合によってＡＤＣＣを大幅に増強する（Natsume et al. (2009) Drug Des. Devel. Ther. 3:7）。低フコシル化された（afucosylated）腫瘍特異的抗体がマウスモデルにおいてインビボで治療活性の増強につながるという有力な証拠がある（Nimmerjahn ＆ Ravetch (2005) Science 310:1510; Mossner et al. (2010) Blood 115:4393）。
【００９２】
抗体のグリコシル化の修飾は、例えば、グリコシル化機構を変えて宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構を改変された細胞は、当技術分野において発表されており、本発明の組換え抗体を発現させて、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生するための宿主細胞として用い得る。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、これらの細胞株で発現される抗体がそれらの炭水化物上にフコシルを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α−（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いている（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号；Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87: 614）。別の例として、ＥＰ１１７６１９５はまた、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株、ならびに抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する活性をほとんどまたは全く有さない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）も記載している。ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に付着させる能力が低下した、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化もまた結果としてもたらす、変異型ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ１３を記載している。また、Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733も参照のこと。ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／０８９２３１に記載されているように、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体も鶏卵中で産生させることができる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、ウキクサのような植物細胞中で産生され得る。例えば、米国特許公開公報２０１２／０２７６０８６を参照のこと。ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすバイセクト糖鎖（bisecting GlcNAc）構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載する。また、Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176も参照のこと。あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断することができる。例えば、酵素アルファ−L−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する。Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516。コアフコシル化はまた、ＥＰ２２８２７７３Ｂ１に記載されているものなどの小分子フコース類縁体の存在下で、またはＷＯ０８／０５２０３０に記載されているようにカスタノスペルミンの存在下で、抗体産生細胞を培養することによって低減され得る。
【００９３】
切断可能な部分（ＣＭ）
ある態様において、ＣＭはプロテアーゼに特異的であり、これは、処置および／または診断の部位における標的化された活性化可能な抗体の活性化のために腫瘍細胞における無調節なプロテアーゼ活性を活用するのに有用である。多数の研究が、固形腫瘍における異常なプロテアーゼレベル、例えばｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の相関を証明している（例えば、Murthy R V, et al. “Legumain expression in relation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer.” Clin Cancer Res. 11 (2005): 2293-2299; Nielsen B S, et al. “Urokinase plasminogen activator is localized in stromal cells in ductal breast cancer.” Lab Invest 81 (2001): 1485-1501; Look O R, et al. “In situ localization of gelatinolytic activity in the extracellular matrix of metastases of colon cancer in rat liver using quenched fluorogenic DQ-gelatin.” J Histochem Cytochem. 51 (2003): 821-829）。
【００９４】
この方法の一般的な概説は、米国特許第７，６６６，８１７号、同第８，５１３，３９０号および同第９，１２０，８５３号ならびに国際公開ＷＯ２０１６／１１８６２９およびＷＯ２０１６／１４９２０１に論じられており、それらの内容全体は引用により本明細書に包含される。切断可能部分の選択プロセスは、多数の望ましい特徴を有する切断可能部分を同定するために使用される。例えば、選択された切断可能部分は、全身的に安定であり（すなわち、対象の全身循環中で安定であり）、一般にプラスミン、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）またはＫＬＫ−５および／もしくはＫＬＫ−７などのカリクレイン（ＫＬＫ）のような循環プロテアーゼによる切断を受けにくく、無毒であり、一般にＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７ならびに／またはＫＬＫ−５およびＫＬＫ−７などのカリクレインのようなプロテアーゼにより皮膚のような潜在的な毒性部位での切断を受けにくく、そして意図される処置および／または診断の部位で活性である。ある態様において、同定された切断可能部分は、意図する治療および／または診断部位で過剰発現されるが、通常、正常、健康またはその他の非罹患もしくは非損傷組織では発現されないプロテアーゼについて選択され、次いで、選択された基質を、正常組織、例えば非罹患組織において発現されるプロテアーゼに対して対抗スクリーニングする。例示的なプロテアーゼおよび／または酵素は、上記の表１に示されている。
【００９５】
ある態様において、切断可能部分は、２００１および３００１ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される。ある態様において、切断可能部分は、２００１（配列番号２９７）、２００６（配列番号３００）、２００７（配列番号３０１）、２００８（配列番号３０２）、２００９（配列番号３０３）、２０１２（配列番号３０５）、２０１１（配列番号３０４）、２００３（配列番号２９８）、３００１（配列番号３０６）、３００６（配列番号３１３）、３００７（配列番号３０８）、３００８（配列番号３０９）、３００９（配列番号３１０）、３０１２（配列番号３１２）、３０１１（配列番号３１１）および２００５（配列番号２９９）からなる群より選択される。表３は、本明細書に記載される活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体と共に用いられ得るさらなる切断可能部分を提供する。
【００９６】
【表４】
2020500016.tif 000006
【表５】
2020500016.tif 000007
【００９７】
マスキング部分（ＭＭ）
本発明の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、マスキング部分（ＭＭ）を含む。ある態様において、ＭＭは、抗ＣＴＬＡ−４抗体にカップリングされるか、そうでなければ結合されるアミノ酸配列であって、ＭＭが、抗ＣＴＬＡ−４抗体のＣＴＬＡ−４への特異的結合能を低下させるように、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体構築物内に位置する。ある態様において、ＭＭは、抗原結合ドメインに特異的に結合する。好適なＭＭは、様々な既知の技術のいずれかを用いて同定される。例えば、ペプチドＭＭは、Daughertyらの米国特許出願公開第２００９／００６２１４２号およびDaughertyらの同第２０１２／０２４４１５４号（これらの内容は、その全体が引用により本明細書に包含される）に記載されている方法を用いて同定される。
【００９８】
ある態様において、ＭＭは、ＹＶ０１〜ＹＶ６６からなる群より選択され、以下の表４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【表６】
2020500016.tif 000008
【表７】
2020500016.tif 000009
【表８】
2020500016.tif 000010
【表９】
2020500016.tif 000011
【００９９】
ある態様において、標的に対する本明細書に開示のＭＭを含む活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体のＫｄは、標的に対するＭＭで修飾されていないＡＢまたは親ＡＢのＫｄの、少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００倍以上であるか、または５−１０、１０−１００、１０−２００、１０−５００、１０−１，０００倍以上である。
【０１００】
ある態様において、ＭＭは、活性化可能な抗体の天然の結合パートナーではない。ある態様において、ＭＭは、活性化可能な抗体のいかなる天然結合パートナーに対しても全くまたは実質的に相同性を含まない。ある態様において、ＭＭは、活性化可能な抗体の天然結合パートナーに対して、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％の同一性を有する。ある態様において、ＭＭは、活性化可能な抗体の天然結合パートナーに対して最大５０％、２５％、２０％または１０％の同一性を有する。ある態様において、ＭＭは、ヒトＣＴＬＡ−４に対して最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％の同一性を有する。ある態様において、ＭＭは、ヒトＣＴＬＡ−４に対して、最大５０％、２５％、２０％または１０％の同一性を有する。
【０１０１】
例示的な活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体
本明細書に記載の特定の抗体は、表２から６に記載の、マスキング部分、切断可能部分、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（または、対応するＣＤＲ）、および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（または、対応するＣＤＲ）の任意の組合せを含む活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体である。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、マスキング部分としてＹＶ０１（配列番号１）、切断可能部分としてＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３１３）、およびイピリムマブの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（配列番号３４４）を含む軽鎖を含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、マスキング部分としてＹＶ０１（配列番号１）、切断可能部分としてＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（２００１）（配列番号２９７）、およびイピリムマブの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲ（それぞれ、配列番号５６０、５６１および５６２）を含む軽鎖を含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（配列番号３４５）またはちょうど対応するＣＤＲ（配列番号５５７、５５８および５５９）を含む。
【０１０２】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４は、マスキング部分としてＹＶ３９（配列番号３９）、切断可能部分としてＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（“２０１１”）（配列番号３０４）、およびイピリムマブの重鎖および軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号３４５および３４４）を含み、ここで、ＭＭおよびＣＭは、配列ＭＭ−ＣＭ−ＶＬにおいてＶＬに連結している。
【０１０３】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、スペーサーによって活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体に連結され得る。ある態様において、スペーサーは、シグナルペプチドの不存在下で活性化可能な抗体に結合される。ある態様において、スペーサーは、活性化可能な抗体のＭＭに直接結合している。ある態様において、スペーサーはアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＳ（配列番号５４６）を有する。ある態様において、活性化可能な抗体は、“スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＶＬ”または“スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ”のＮ末端からＣ末端までの構造配置において、ＭＭ配列ＣＲＴＱＬＹＧＹＮＬＣＰＹ（ＹＶ３９）（配列番号３９）に直接結合した配列ＱＧＱＳＧＳ（配列番号５４６）のスペーサーを含む。
【０１０４】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＭＭとＣＭとの間にリンカーペプチド（ＬＰ）を含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＭと抗体またはその抗原結合ドメイン（ＡＢ）との間にリンカーペプチドを含む。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、第一のリンカーペプチド（ＬＰ１）および第二のリンカーペプチド（ＬＰ２）を含み、ここで、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、以下のＮ末端からＣ末端までの構造配置を有する：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ。ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖は、以下のＮ末端からＣ末端までの構造配置を有する：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＶＬ。ある態様において、２つのリンカーペプチドは、互いに同一である必要はない。活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体と共に使用され得るリンカーペプチドの例は、米国特許公開第２０１６／０１９３３３２号および国際公開ＷＯ２０１６／１４９２０１（同上）に提供されている。
【０１０５】
本発明はまた、非プロテアーゼ切断可能リンカーを介して抗体の軽鎖に連結されているＭＭを含む改変型抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む。ある態様において、非プロテアーゼ切断可能リンカーは、配列番号５７０に示されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、そのような改変型抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＹＶ３９および非プロテアーゼ切断可能リンカーを含む軽鎖を有する。ある態様において、改変型抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖は以下のアミノ酸配列を含む：
QGQSGSCRTQLYGYNLCPYGGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号５３０) または
CRTQLYGYNLCPYGGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号５３１)。
【０１０６】
本明細書に記載の組成物での使用に適するリンカーは、一般的に、活性化可能な抗体の標的への結合の阻害を促進するために、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体のフレキシビリティーを提供するものである。そのようなリンカーは、一般に、フレキシブルリンカーと呼ばれる（本明細書中、リンカーペプチドとも呼ばれる）。好適なリンカーは、容易に選択することができ、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸、３アミノ酸から１２アミノ酸、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸、または７アミノ酸から８アミノ酸などの異なる長さのものであり得て、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。
【０１０７】
フレキシブルリンカーの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＧＳＧＧＳは配列番号５３４）および（ＧＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＳは配列番号５３５）、ここで、ｎは、１以上の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で知られている他のフレキシブルリンカーが挙げられる。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、それ故に、構成要素間の中性テザー（neutral tether）として用いられ得る。グリシンは、アラニンよりも有意に多くのｐｈｉ−ｐｓｉ空間にアクセスし、そしてより長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)を参照）。フレキシブルリンカーの例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号５３６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５３７）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号５３８）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５３９）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号５４０）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号５４１）などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、活性化可能な抗体の設計が全てまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得て、その結果リンカーがフレキシブルリンカーならびに所望の活性化可能な抗体構造を提供するために可撓性の低い構造を与える１以上の部分を含み得ることを認識し得る。
【０１０８】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブのＶＬおよびＶＨ（または対応するＣＤＲ）ならびに以下の表５に提供されるＭＭおよびＣＭの組み合わせを含む。カラム２のＭＭは、カラム４のＣＭと組み合わせることができる。
【０１０９】
【表１０】
2020500016.tif 000012
【表１１】
2020500016.tif 000013
【０１１０】
ある態様において、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、以下の表６に示すＭＭおよびＣＭの特定の組合せを含む。
【表１２】
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【表１３】
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【０１１１】
ある態様において、本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体にはまた、活性化可能な抗体に複合体化した薬物が含まれる。ある態様において、コンジュゲート剤は、抗癌剤などの治療剤である。ある態様において、薬物は、活性化可能な抗体の炭水化物部分にコンジュゲートされ、好ましくはこの炭水化物部分は、抗体の抗原結合領域または活性化可能な抗体中の抗原結合フラグメントの外側に位置する。ある態様において、薬物は、抗体のスルフヒドリル基または活性化可能な抗体中の抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。ある態様において、薬物は、抗体のアミノ基または活性化可能な抗体の抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。ある態様において、薬物は、抗体のカルボン酸基または活性化可能な抗体の抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。
【０１１２】
ある態様において、薬物は、毒素などの細胞毒性物質（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
【０１１３】
ある態様において、複合体化活性化可能な抗体は、活性化可能な抗体配列に挿入されるか、そうでなければ包含される修飾アミノ酸配列を介して部位特異的コンジュゲーションのために修飾され得る。これらの修飾アミノ酸配列は、複合体化された活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体と複合体化された薬物の制御された配置および／または投与量を可能にするように設計されている。例えば、活性化可能な抗体は、反応性チオール基を提供し、タンパク質の折り畳みおよび集合（アセンブリ）に悪影響を及ぼさず、抗原結合を変化させない、軽鎖および重鎖上の位置にシステイン置換を含むように操作することができる。ある態様において、活性化可能な抗体は、活性化可能な抗体内に１以上の非天然アミノ酸残基を含むか、そうでなければ導入して、コンジュゲーションに適した部位を提供するように操作され得る。ある態様において、活性化可能な抗体は、活性化可能な抗体配列内に酵素的に活性化可能なペプチド配列を含むか、そうでなければ導入するように操作することができる。
【０１１４】
ある態様において、薬物は、検出可能部分、例えば標識または他のマーカーなどである。例えば、薬物は、放射標識されたアミノ酸、標識アビジンによって検出され得る１以上のビオチニル部分（例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジン、または光学的もしくは比色法によって検出することができる酵素活性）、１以上の放射性同位元素または放射性核種、１以上の蛍光標識、１以上の酵素標識、および／または１以上の化学発光剤であるか、またはそれらを含む。ある態様において、検出可能部分はリンカー分子によって結合されている。
【０１１５】
抗体と細胞毒性物質の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジピン酸ジメチル ＨＣＬなど）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン ２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質−カップリング剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987) に記載されているように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６参照）。
【０１１６】
当業者は、多種多様な可能性のある部分が本発明の得られた抗体に結合され得ることを認識し得る（例えば、“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）。
【０１１７】
ＩＩ．抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体の使用
活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む本発明の治療用製剤は、異常なＣＴＬＡ−４発現および／または活性と関連する疾患または障害を含むが、これらに限定されない、疾患または障害の予防、処置またはそうでなければ緩和のために用いられる。例えば、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む本発明の治療法製剤は、癌免疫療法として、例えば癌に罹患している対象における内因性免疫応答を増強し、それによって対象を処置するために用いられ、その方法は、本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかを治療的有効量で対象に投与することを含む。
【０１１８】
本明細書に記載の免疫療法を用いて処置することができる癌の例には、骨腫瘍、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、切除不能または転移性黒色腫、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、大腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、血液悪性腫瘍、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、脳下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発される癌を含む環境誘発癌、転移性癌、およびこれらの癌の任意の組み合わせが含まれる。ある態様において、癌は、ＭＥＬ、ＲＣＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、ＣＲＰＣ、頭頸部の扁平上皮癌、ならびに食道癌、卵巣癌、胃腸管癌および乳癌から選択される。本発明の方法はまた、転移性癌の処置にも適用可能である。
【０１１９】
他の癌には、例えば、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫／原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、および前駆Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ならびにこれらの癌の任意の組み合わせを含む血液悪性腫瘍が含まれる。
【０１２０】
増加したタンパク質分解は癌の特徴であることが知られている（例えば、Affara N I, et al. “Delineating protease functions during cancer development.” Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32を参照のこと）。腫瘍の進行、浸潤および転移は、プロテアーゼが関与しているいくつかの相互依存的な過程から生じる。このプロセスは、その内容全体が本明細書に包含されている米国特許出願公開第２０１６／０１９３３３２ Ａ１号に概説されている。
【０１２１】
癌対象を処置するためのこれらの方法のいくつかの態様において、本発明の活性化可能な抗体、例えば活性化可能なイピリムマブは、単剤療法として対象に投与される。ある態様において、免疫調節標的の刺激または遮断は、化学療法レジメン、放射線療法、外科手術、ホルモン遮断療法および血管新生阻害剤を含む標準的な癌治療と効果的に組み合わせることができる。活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、（免疫複合体としての）抗腫瘍剤に結合させることができるか、またはその薬物とは別に投与することができる。後者（別個の投与）の場合、抗体は、薬物の前、後またはそれと同時に投与することができるか、または他の既知の治療薬と同時投与することができる。化学療法薬にはとりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））、シスプラチン、カルボプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル（ロイケラン（登録商標））、シクロホスファミド（サイトキサン（Cytoxan、登録商標）；ネオザール、（Neosar、登録商標））、レナリドマイド（レブラミド（登録商標））、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））、デキサメサゾン、ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン、ベンダムスチン（トレアンダ（登録商標））、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、イホスファミド、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、フルダラビン（フルダラ（登録商標））、サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、オファツムマ（アーゼラ（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（登録商標）、ＺＯＲＴＲＥＳＳ（登録商標））、およびカルフィルゾミブ（ＫＹＰＲＯＬＩＳ（商標））が含まれる。異なるメカニズムで作用する抗癌剤の併用投与は、薬物耐性の出現や腫瘍細胞の抗原性の変化を克服するのに役立ち得る。
【０１２２】
活性化可能イピリムマブなどの本発明の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗はまた、他の免疫調節受容体またはそれらのリガンドに対する抗体などの他の免疫調節剤と組み合わせて用いることもできる。Ｔ細胞応答を調節するいくつかの他の共刺激受容体および阻害受容体ならびにリガンドが同定されている。刺激性受容体の例には、誘導性Ｔ細胞共刺激性（ＩＣＯＳ）受容体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２７、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）受容体、およびヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）が含まれ、阻害性受容体の例には、プログラムされた細胞死−１（ＰＤ−１）受容体、プログラムされた細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）受容体、ＢおよびＴリンパ球抑制性（ＢＴＬＡ）受容体、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ−１）、ナチュラル−キラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ１６０、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に対する受容体が含まれる（Mellman et al. (2011) Nature 480:480; Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12: 252; Baitsch et al. (2012) PloS One 7:e30852）。
【０１２３】
抗ＰＤ−１抗体オプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）およびキイトルーダ（登録商標）（ペムブロリズマブ）、ならびに抗ＰＤ−Ｌ１抗体テセントリク（登録商標）（アテゾリズマブ）は、癌の処置に用いることが承認されており、本発明の活性化可能な抗ＣＬＴＡ−４抗体、例えば活性化可能なイピリムマブと併用することができる。これらの受容体およびそのリガンドは、免疫応答を刺激するかまたはその抑制を予防し、それにより腫瘍細胞を攻撃するように設計された治療薬のための標的を提供する（Weber (2010) Semin. Oncol. 37:430; Flies et al. (2011) Yale J. Biol. Med. 84:409; Mellman et al. (2011) Nature 480:480; Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252）。刺激性受容体または受容体リガンドは、アゴニスト剤によって標的化され、一方、阻害性受容体または受容体リガンドは、遮断剤によって標的化される。免疫療法的抗腫瘍活性を増強するための最も有望なアプローチの中には、いわゆる“免疫チェックポイント”の遮断があり、それは、免疫系を調節し、かつ自己寛容を維持しそして側副組織の損傷を最小限に抑えるための、末梢組織における生理学的免疫応答の時間および振幅を調節するために極めて重要である、過剰な阻害シグナル伝達経路を意味する。例えば Weber (2010) Semin. Oncol. 37:430; Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252を参照のこと。免疫チェックポイントの多くはリガンド−受容体相互作用によって開始されるため、それらは抗体によって容易に遮断されるか、または組換え型のリガンドもしくは受容体によって調節され得る。
【０１２４】
本発明に有用な抗ＰＤ−１抗体
当技術分野において知られている抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載の方法において用いられ得る。特に、高い親和性でＰＤ−１に特異的に結合する様々なヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号に記載されている。米国特許第８，００８，４４９号に記載されている抗ＰＤ−１ ヒト化抗体はそれぞれ、以下の特徴のうちの１以上を示すことが実証されている：（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを用いた表面プラズモン共鳴によって決定するとき、１ｘ１０−７Ｍ未満のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する；（ｂ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない；（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を増加させる；（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γを増加させる；（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させる；（ｆ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する；（ｇ）ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を阻害する；（ｈ）抗原特異的メモリー応答を刺激する；（ｉ）抗体応答を刺激する；および、（ｊ）インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する。本発明において使用可能な抗ＰＤ−１抗体には、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、そして少なくとも１つの、ある態様において、少なくとも５つの上記の特徴を示す、モノクローナル抗体が含まれる。
【０１２５】
他の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第６，８０８，７１０号、同第７，４８８，８０２号、同第８，１６８，７５７号および同第８，３５４，５０９号、米国特許出願公開第２０１６／０２７２７０８号、ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２００８／１５６７１２、ＷＯ２０１５／１１２９００、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１４／２０６１０７、ＷＯ２０１５／３５６０６、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１７／０２０２９１、ＷＯ２０１７／０２０８５８、ＷＯ２０１６／１９７３６７、ＷＯ２０１７／０２４５１５、ＷＯ２０１７／０２５０５１、ＷＯ２０１７／１２３５５７、ＷＯ２０１６／１０６１５９、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１７／０４０７９０、ＷＯ２０１７／１３３５４０、ＷＯ２０１７／１３２８２７、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１０６０６１（これらの各々は、その内容全体が引用により本明細書に包含される）に記載されている。
【０１２６】
ある態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（“オプジーボ（登録商標）”としても公知；以前は、５Ｃ４、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６またはＯＮＯ−４５３８と記載）、ペンブロリズマブ（Merck、“キイトルーダ（登録商標）” 、ランブロリズマブおよびＭＫ−３４７５としても公知、ＷＯ２００８１５６７１２Ａ１参照）、ＰＤＲ００１（Novartis；ＷＯ２０１５／１１２９００参照）、ＭＥＤＩ−０６８０（AstraZeneca；ＡＭＰ−５１４；ＷＯ２０１２／１４５４９３参照）、ＲＥＧＮ−２８１０（Regeneron；ＷＯ２０１５／１１２８００参照）、ＪＳ００１（TAIZHOU JUNSHI PHARMA；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)）、ＢＧＢ−Ａ３１７（Beigene；ＷＯ２０１５／３５６０６およびＵＳ ２０１５／００７９１０９）、ＩＮＣＳＨＲ１２１０（ＳＨＲ−１２１０；Jiangsu Hengrui Medicine；ＷＯ２０１５／０８５８４７参照；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)）、ＴＳＲ−０４２（ANB011；Tesaro Biopharmaceuticals；ＷＯ２０１４／１７９６６４参照）、ＧＬＳ−０１０（WBP3055；Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)参照）、ＡＭ−０００１（Armo）、ＳＴＩ−１１１０（Sorrento Therapeutics；ＷＯ２０１４／１９４３０２参照）、ＡＧＥＮ２０３４（Agenus；ＷＯ２０１７／０４０７９０参照）、およびＭＧＤ０１３（Macrogenics）からなる群より選択される。
【０１２７】
一態様において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブである。ニボルマブは、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）との相互作用を選択的に阻止し、それにより抗腫瘍Ｔ細胞機能の下方制御を阻止する、完全ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害抗体である（米国特許第８，００８，４４９号；Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56）。
【０１２８】
別の態様において、抗ＰＤ−１抗体はペムブロリズマブである。ペムブロリズマブは、ヒト細胞表面受容体ＰＤ−１（プログラムされた死−１またはプログラムされた細胞死−１）に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体である。ペムブロリズマブは、例えば、米国特許第８，３５４，５０９号および同第８，９００，５８７に記載されている。また、www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789 （最終アクセス：２０１４年１２月１４日）も参照のこと。ペンブロリズマブは、再発性または難治性黒色腫の治療薬としてＦＤＡにより承認されている。
【０１２９】
本発明の方法に使用可能な抗ＰＤ−１抗体にはまた、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、そしてヒトＰＤ−１への結合について本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブと交差競合する、単離された抗体が含まれる（例えば、米国特許第８，００８，４４９号および同第８，７７９，１０５号；ＷＯ２０１３／１７３２２３参照）。ある態様において、抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体のいずれか、例えばニボルマブと同じエピトープに結合する。抗原への結合について交差競合する抗体の能力は、これらのモノクローナル抗体が抗原の同じエピトープ領域に結合し、そしてその特定のエピトープ領域への他の交差競合抗体の結合を立体構造的に妨げることを示す。これらの交差競合抗体は、ＰＤ−１の同じエピトープ領域へのそれらの結合のために、対照抗体、例えばニボルマブのそれと顕著に類似した機能的性質を有すると予期される。交差競合抗体は、Biacore分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーなどの標準的なＰＤ−１結合アッセイにおいて、ニボルマブと交差競合するそれらの能力に基づいて容易に同定することができる（例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３参照）。
【０１３０】
ある態様において、ヒトＰＤ−１への結合についてヒトＰＤ−１抗体ニボルマブと交差競合するか、またはヒトＰＤ−１抗体ニボルマブの同じエピトープ領域に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト対象への投与について、これらの交差競合抗体はキメラ抗体、遺伝子操作された抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体である。かかるキメラ抗体、遺伝子操作された抗体、ヒト化もしくはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製および単離することができる。
【０１３１】
本明細書に記載の方法において使用可能な抗ＰＤ−１抗体はまた、上記の抗体の抗原結合部分も含む。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが十分に実証されている。
【０１３２】
本明細書に記載の方法または組成物における使用に適する抗ＰＤ−１抗体は、高い特異性および親和性でＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２の結合を遮断し、そしてＰＤ−１シグナル伝達経路の免疫抑制効果を阻害する抗体である。本明細書に記載の組成物または方法のいずれにおいても、抗ＰＤ−１“抗体”は、ＰＤ−１受容体に結合し、リガンド結合の阻害および免疫系の上方制御において全長抗体の機能特性と同様の機能特性を示す抗原結合部分またはフラグメントを含む。特定の態様において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＰＤ−１への結合についてニボルマブと交差競合する。
【０１３３】
本発明に有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体
全ての抗ＰＤ−Ｌ１抗体を本明細書に記載の方法において用いることができる。本明細書に記載の方法において有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例としては、米国特許第９，５８０，５０７号に記載の抗体が挙げられる。米国特許第９，５８０，５０７号に記載の各抗ＰＤ−Ｌ１ヒトモノクローナル抗体は、以下の特徴の１以上を示すことが実証されている：（ａ）Biacoreバイオセンサーシステムを用いた表面プラズモン共鳴によって決定するとき、１ｘ１０−７Ｍ未満のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する；（ｂ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を増加させる；（ｃ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させる；（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させる；（ｅ）抗体応答を刺激する；および、（ｆ）Ｔ細胞エフェクター細胞および／または樹状細胞に対する制御性Ｔ細胞（T regulatory cell）の効果を逆転させる。本発明において使用可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、そして少なくとも１つの、ある態様において、少なくとも５つの、上記の特徴を示す、モノクローナル抗体が含まれる。
【０１３４】
特定の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（以前の１２Ａ４またはＭＤＸ−１１０５；例えば、米国特許第７，９４３，７４３号およびＷＯ２０１３／１７３２２３参照）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６、アテゾリズマブおよびＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）としても公知；米国特許第８，２１７，１４９号；また、Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000も参照のこと）、デュルバルマブ（イミフィンジ（商標）；ＭＥＤＩ−４７３６；AstraZeneca；ＷＯ２０１１／０６６３８９参照）、アベルマブ（Pfizer；ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ；バベンチオ（登録商標）；ＷＯ２０１３／０７９１７４参照）、ＳＴＩ−１０１４（Sorrento；ＷＯ２０１３／１８１６３４参照）、ＣＸ−０７２（CytomX；ＷＯ２０１６／１４９２０１参照）、ＫＮ０３５（3D Med/Alphamab；Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)参照）、ＬＹ３３０００５４（Eli Lilly Co.；例えば、ＷＯ２０１７／０３４９１６参照）、およびＣＫ−３０１（Checkpoint Therapeutics；Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)参照）からなる群より選択される。
【０１３５】
特定の態様において、ＰＤ−Ｌ１抗体はアテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））である。アテゾリズマブは、完全ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０１３６】
特定の態様において、ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（イミフィンジ（商標））である。デュルバルマブは、ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０１３７】
特定の態様において、ＰＤ−Ｌ１抗体はアベルマブ（バベンチオ（登録商標））である。アベルマブは、ヒトＩｇＧ１λモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０１３８】
他の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、２８−８、２８−１、２８−１２、２９−８、５Ｈ１、およびそれらの何れかの組合せからなる群より選択される。
【０１３９】
本明細書に記載の方法において使用可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体にはまた、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合について本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、アテゾリズマブおよび／またはアベルマブと交差競合する単離された抗体も含まれる。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えばアテゾリズマブおよび／またはアベルマブと同じエピトープに結合する。抗原への結合について交差競合する抗体の能力は、これらの抗体が抗原の同じエピトープ領域に結合し、そしてその特定のエピトープ領域への他の交差競合抗体の結合を立体構造的に妨げることを示す。これらの交差競合抗体は、それらがＰＤ−Ｌ１の同じエピトープ領域に結合することにより、対照抗体、例えばアテゾリズマブおよび／またはアベルマブと顕著に類似した機能的性質を有すると予期される。交差競合抗体は、Biacore分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーなどの標準的なＰＤ−Ｌ１結合アッセイにおいて、アテゾリズマブおよび／またはアベルマブと交差競合するそれらの能力に基づいて容易に同定することができる（例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３参照）。
【０１４０】
特定の態様において、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合についてアテゾリズマブおよび／またはアベルマブと交差競合するか、またはアテゾリズマブおよび／またはアベルマブと同じヒトＰＤ−Ｌ１抗体のエピトープ領域に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト対象への投与に関して、これらの交差競合抗体は、キメラ抗体、遺伝子操作された抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体である。そのようなキメラモノクローナル抗体、遺伝子操作されたモノクローナル抗体、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製および単離することができる。
【０１４１】
本明細書に記載の本発明の方法に使用可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、上記抗体の抗原結合部分を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより実行され得ることが十分に実証されている。
【０１４２】
本明細書に記載の方法または組成物における使用に適する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、高い特異性および親和性でＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１の結合を遮断し、そしてＰＤ−１シグナル伝達経路の免疫抑制効果を阻害する抗体である。本明細書に記載の組成物または方法のいずれにおいても、抗ＰＤ−Ｌ１“抗体”は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、受容体結合の阻害および免疫系の上方制御において全長抗体と類似の機能特性を示す、抗原結合部分またはフラグメントを含む。特定の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合についてアテゾリズマブおよび／またはアベルマブと交差競合する。
【０１４３】
予防、改善または処置の有効性は、異常なＣＴＬＡ−４発現および／または活性に関連する疾患または障害を含むが、これらに限定されない疾患または障害を診断または処置するための公知の方法に関連して決定される。対象の生存期間を延ばすこと、そうでなければ対象における異常なＣＴＬＡ−４発現および／もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を含むがこれらに限定されない疾患もしくは障害の進行を遅延させることは、活性化可能な抗体が臨床効果をもたらすことを示唆する。
【０１４４】
本発明の治療物質は、改善された移行、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる好適な担体、賦形剤および他の薬物と共に投与され得ることが理解される。多くの好適な製剤は、すべての製薬化学者に知られている処方に見出すことができる：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975))、特に、その中のBlaug、Seymourによる第８７章。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞（例えば、リポフェクチン（商標））を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸水性ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョン・カーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含む半固体混合物が含まれる。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理学的に適合性であり、かつ投与経路に許容性であるという条件で、上記混合物のいずれも本発明による処置および治療に適当であり得る。製薬化学者によく知られている製剤、賦形剤および担体に関する追加の情報について、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)、Charman W N “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000)、Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)およびそれらの文献が引用する文献も参照のこと。
【０１４５】
活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、医薬組成物の形態で投与することができる。そのような組成物の調製に関する原理および考察、ならびに構成成分の選択における手引きは、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；および、 Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０１４６】
製剤はまた、処置される特定の適応症に必要な場合には、２以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物を含み得る。あるいは、または加えて、組成物は、その機能を増強する薬物、例えば細胞毒性物質、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤を含み得る。そのような分子は、意図する目的に対して有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０１４７】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中にある、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルで調製されたマイクロカプセルに封入され得る。
【０１４８】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１４９】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、加工品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間の間、タンパク質を放出する。
【０１５０】
ある態様において、活性化可能な抗体は検出可能な標識を含む。無傷の抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ）２）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して、用語“標識した”とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識されている別の反応材との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識が含まれる。用語“生物学的サンプル”は、対象から単離された組織、細胞および体液、ならびに対象体内に存在する組織、細胞および体液を含むことを意図している。従って、用語“生物学的サンプル”の用法に包含されるのは、血液、および血清、血漿またはリンパ液を含む血液の一部または成分である。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を標準的な画像化技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０１５１】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体（本明細書中、“活性化合物”とも言う）、ならびにその誘導体、フラグメント、類縁体および相同体は、投与に適する医薬組成物に包含され得る。そのような組成物は、一般的に、活性化可能な抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる用語“薬学的に許容される担体”は、医薬投与に適合する、あらゆる全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。好適な担体は、この分野の標準的な参考書であるRemingtonのPharmaceutical Sciencesの最新版に記載されており、それは引用により本明細書中に包含される。そのような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液および５%ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビークルも用いることができる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬物の使用は、当技術分野においてよく知られている。任意の常套の媒体または薬物が活性化合物と適合しない場合を除き、組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的活性化合物もまた、組成物に包含させ得る。
【０１５２】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤される。投与経路の例には、非経腸、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経腸、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張化剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経腸製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１５３】
注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理的食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF、Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、かつ容易な注射筒充填可能性が得られる程度に流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによって可能となる。
【０１５４】
無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に含ませ、次いで濾過滅菌することによって、調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒体および上記に列挙した成分のうち必要な他の成分を含有する滅菌ビークルに含ませることによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、その前に無菌濾過した溶液から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分を加えた粉末が得られる。
【０１５５】
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１５６】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与のためには、浸透させるべき障壁に適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、軟膏、膏薬（salve）、ゲルまたはクリームに製剤される。
【０１５７】
本発明の活性化可能な抗体はまた、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）のようなヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの単一部位での多量の注射を容易にするための薬物（皮下薬物分散剤）とともに皮下に投与され得る。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開公報第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一側面において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１または複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０１５８】
化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの常套の坐剤基剤を含む）または直腸送達用の停留浣腸剤の形態で調製することもできる。
【０１５９】
ある態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの、身体からの急速な排出に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Incから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用可能である。これらは、当業者に知られている方法に従って、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように製造することができる。
【０１６０】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口または非経腸組成物を単位投与量形態に製剤することが特に有利である。本明細書で用いる単位投与量形態とは、処置されるべき対象のための単位投与量(unitary dosage)として適した物理的に分けられた単位を意味する。各単位は、必要な薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位投与量形態の仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物を調合する技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接的に依存する。
【０１６１】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサーに包含され得る。
【０１６２】
本明細書に記載の態様は、本明細書に記載の特定の抗体の調製および本明細書に記載の抗体の使用方法を詳細に記載する以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに定義することができる。本発明の範囲から逸脱することなく、材料および方法の両方に対して多くの改変が実施され得ることが当業者には明らかである。
【０１６３】
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載され得る。
【実施例】
【０１６４】
実施例
実施例１：
活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体についてのマスキング部分の同定
抗ＣＴＬＡ−４抗体のそれらの標的タンパク質への結合を減少させるマスキング部分（ＭＭ）を同定するために、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／０２５８４６、ＷＯ２０１０／０８１１７３およびＷＯ２０１６／１４９２０１（それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）に記載の方法と同様の方法を用いて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（すなわち、イピリムマブ）を用いて、ペプチドライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングは、２回の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）精製と、その後の３回の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）からなる。
【０１６５】
最初のＭＡＣＳ精製は、プロテインＡ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Invitrogen）および１００ｎＭの濃度の抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いて行った。およそ１０１１個の細胞を結合についてスクリーニングし、６ｘ１０６個の細胞を回収した。２回目のＭＡＣＳ精製を、ストレプトアビジン ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）および１００ｎＭの濃度のビオチニル化抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いて行った。最初のＭＡＣＳ精製からの溶出液から細胞増殖させて、約１０１１個の細胞を結合についてスクリーニングし、約１０７個の細胞を回収した。上記のＭＡＣＳ精製の結果物を、Alexa Fluor（登録商標）488（Thermo Fisher Scientific）で標識した漸減濃度の抗ＣＴＬＡ−４を用いた一連のＦＡＣＳ選別にかけた。標識した抗ＣＴＬＡ４抗体を、第１、第２および第３の選別それぞれに、１０ｎＭ、１ｎＭおよび２００ｐＭの濃度で用いた。第３の選別からの個々のペプチドクローンを、配列分析によって同定し、その後、抗ＣＴＬＡ４抗体に結合する能力について確かめた。２つのペプチドコンセンサス配列を、親和性成熟について選択した：ＸＸＣＸＸＸＭＹＧＹＮＬＣＰＹ（配列番号５５４）およびＸＸＸＣＸＨＳＭＹＮＶＣＬＤＰ（配列番号５５５）。
【０１６６】
親和性成熟ライブラリーを、表７に記載のように、これらのコンセンサス配列上に構築した。１列目および３列目はコンセンサス配列を表し、２列目および４列目は、同ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１０／０８１１７３（同上）に記載されている方法と同様の方法を用いて、ディスプレイシステムに挿入されたペプチドライブラリーをコードするヌクレオチド配列を表す。
【表１４】
2020500016.tif 000016
【０１６７】
成熟ライブラリーを、上記の天然ライブラリーについて記載したのと同様の方法でスクリーニングした。スクリーニングは、１回のＭＡＣＳと、それに続く数回のＦＡＣＳ選別からなる。ＭＡＣＳは、プロテインＡ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）および１００ｎＭの濃度の抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いて行った。ＭＡＣＳについて、１０１１個の細胞を結合についてスクリーニングし、約１０８個の細胞を選択した。ＭＡＣＳからの溶出液から細胞増殖させて、約１０１１個の細胞を、漸減濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗ＣＴＬＡ４抗体を用いた数回のＦＡＣＳソーティングにかけた。標識した抗ＣＴＬＡ４抗体を、第１、第２、第３、第４および第５の選別それぞれに、１００ｎＭ、２０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭおよび１ｎＭの濃度で用いた。第４および第５の選別からの個々のペプチドクローンを、配列分析によって同定し、その後、抗ＣＴＬＡ４抗体に結合するそれらの能力について確かめた。上記の方法により同定された抗ＣＴＬＡ−４マスキング部分の配列を、表４および５に記載する。４つのコンセンサス配列を、表４および５に記載のマスク配列から誘導することができる：
コンセンサス１． C(L/M/V/T)Y(S/V/I)(F/L/M/A)(Y/F)N(V/I)CLDP （配列番号５６６)
コンセンサス２． CAQMYGYSMC(P/A)(H/R/A)T （配列番号５６７）
コンセンサス３． CX(M/I/Y/L/N/F)(Y/W/F/Q/T)(M/Y)YG(Y/V/F)(N/D)LCP(Y/F) （配列番号５６８)
コンセンサス４． (N/T)(S/T/M/A)CP(N/Y)HP(M/L)C(H/F/Y)D(Y/F/W) （配列番号５６９）。
【０１６８】
実施例２：
活性化可能な抗ｍｕＣＴＬＡ−４抗体の構築および特性化
活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体が腫瘍を処置するために用いられ得るという概念実証を示すために、６つの活性化可能な抗マウスＣＴＬＡ−４抗体（クローン９Ｄ９に基づく）を、本明細書の実施例１および３に記載の方法と同様の技術を用いて構築した。これらの抗体は、マスキング部分としてのＭＹ１１またはＭＹ０３のいずれか、および切断可能部分としての、アミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３２０）を有する“０００３”、アミノ酸配列ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号３２３）を有する“１００４”、またはアミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９７）を有する“２００１”を含む。抗体は全てマウスＩｇＧ２ａアイソタイプであった。対照として、抗マウスＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（９Ｄ９）（“９Ｄ９ ｍｇ２ａ”）およびｍＩｇＧ２ａアイソタイプ（“ｍｇ２ａ”）を有するヒト抗ジフテリア毒素抗体を用いた。
【０１６９】
０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１ｘ１０６ ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射した。種々の抗体の投与は腫瘍移植後７日目に始めた。投与前に、腫瘍サイズを測定し、マウスを、同程度の平均腫瘍体積（例えば、３９〜４４ｍｍ３）を有するように異なる処置群に無作為に分けた。腫瘍をキャリパーを用いて二次元的に測定し、腫瘍体積を、Ｌ×（Ｗ２/２）、Ｌ＝長さ（２つの測定のうち長い方）、Ｗ＝幅として、計算した。次いで、マウスを、指定の抗体（例えば、２５μｇ／用量）で腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。腫瘍体積を週に２回測定した。腫瘍移植後１２日目に、各群からの数匹のマウスを屠殺し、そしてＴ細胞集団に対する抗体の効果を調べるために、腫瘍および脾臓を免疫モニタリングのために採取した。種々の群からの残りのマウスのうちのいくつかまたは全てを、その後の薬物動態（ＰＫ）分析および／または薬力学（ＰＤ）分析に用いた。
【０１７０】
図１Ａに示すように、非血縁のマウスＩｇＧ２ａ抗体（すなわち、ヒト抗ジフテリア毒素抗体）を投与されたマウスは、腫瘍を制御することができなかった。対照的に、図１Ｃに示すように、活性化可能な抗マウスＣＴＬＡ−４抗体（マスキング部分としてＭＹ１１および切断可能部分として２００１を含む）を投与されたマウスは、抗マウスＣＴＬＡ−４ ｍＡｂ（９Ｄ９）を投与されたマウスとほぼ同程度に、腫瘍サイズを制御した（図１Ｂ）。これらのデータは、腫瘍特異的プロテアーゼが切断可能部分を切断し、その結果マスキング部分の除去および放出された抗体のその標的タンパク質への結合をもたらし得ることを実証する。
【０１７１】
活性化可能な抗マウスＣＴＬＡ−４抗体が末梢において活性であるか否かを決定するために、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増殖および活性を脾臓において決定し、比較のために、下記実施例５に記載されているように、腫瘍サンプルにおいて制御性Ｔ細胞の存在量を決定した。図１Ｂおよび１Ｃのデータと一致して、全ての活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、腫瘍における抗マウスＣＴＬＡ−４ ｍＡｂ（９Ｄ９）と同様の挙動を示した（図２Ａ）。対照的に、活性化可能な抗体は、脾臓中の非血縁のマウスＩｇＧ２ａ抗体に類似していた（図２Ｂおよび２Ｃ）。かかるデータは、活性化可能な抗マウスＣＴＬＡ−４抗体のマスキング部分含有プロドメインが無傷のまま、脾臓内で抗体に結合して該抗体の活性を阻害した状態で残り、一方、プロドメインは、腫瘍特異的プロテアーゼによって切断されて、腫瘍において完全に活性な抗ＣＴＬＡ−４抗体を生成することを示唆する。
【０１７２】
実施例３：
活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の構築
本明細書に記載の、抗ＣＴＬＡ４マスキング部分、切断可能部分および抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）を含む活性化可能な抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００９/０２５８４６（同上）およびＷＯ２０１０/０８１１７３（同上）、およびＷＯ２０１６/１１８６２９（同上）に記載の方法と同様の方法により産生された。活性化可能な抗ＣＴＬＡ４抗体を、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞（Thermo Fisher Scientific）中で発現させ、そして製造業者のプロトコールに従ってプロテインＡクロマトグラフィー（MabSelect SuRe、GE Healthcare）により精製した。得られた活性化可能な抗体の品質管理は、大部分が少なくとも９５％のモノマーを含むことを示した。
【０１７３】
本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体をヒトの設定に用いることの実現可能性を評価するために、該抗体を、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）重鎖（Ｈｃ）およびヒトκ（ｈＫ）軽鎖（Ｌｃ）形態として作製した。活性化可能な抗体は全て、イピリムマブの抗体またはその抗原結合ドメインを含む。切断可能部分は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９７）を含む本明細書中“２００１”と称される切断可能部分およびその誘導体ならびに配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０６）を含む本明細書中“３００１”と称される切断可能部分およびその誘導体からなる群より選択された。ある態様において、切断可能部分は、本明細書中“２００１”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９７）；本明細書中“２００６”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３００）；本明細書中“２００７”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３０１）；本明細書中“２００８”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３０２）；本明細書中“２００９”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３０３）；本明細書中“２０１２”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３０５）；本明細書中“２０１１”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３０４）；本明細書中“２００３”とも称されるＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号２９８）；本明細書中“３００１”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０６）；本明細書中“３００６”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３０７）；本明細書中“３００７”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３０８）；本明細書中“３００８”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３０９）；本明細書中“３００９”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３１０）；本明細書中“３０１２”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３１２）；本明細書中“３０１１”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３１１）；および、本明細書中“２００５”とも称されるＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号２９９）からなる群より選択された。マスキング部分は、表４および５に提供されるマスキング部分の群から選択された。ある態様において、マスキング部分は、本明細書中ＹＶ３９と称されるＣＲＴＱＬＹＧＹＮＬＣＰＹ（配列番号３９）であった。活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体のいくつかは、スペーサー配列および／またはリンカーペプチドも含んでいた。
【０１７４】
実施例４：
活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のインビトロ特性化
プロテアーゼ活性の不存在下における活性化可能な抗体のＣＴＬＡ−４への結合能を評価するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、結合親和性を測定した。簡単に説明すると、Nunc MaxiSorp（登録商標）プレートを、１μｇ／ｍＬのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質（Sino Biological）のＰＢＳ溶液（ｐＨ ７．４）を１００μＬ／ウェルで用いて、４０℃にて一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、ウェルを、室温で２時間、ＰＢＳＴ中、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を２００μＬ／ウェル用いてブロッキングした。その後、プレートをＰＢＳＴでさらに３回洗浄した。その後、活性化可能な抗体を、下記の表８に示すように、段階希釈した。
【表１５】
2020500016.tif 000017
【０１７５】
本実施例において、親抗体および活性化可能な抗体に用いた最高濃度は、それぞれ１０ｎＭおよび１００ｎＭであった。しかしながら、この濃度は、より強いまたはより弱いマスキングを有する活性化可能抗体についての完全飽和結合曲線を得るために増減することができる。
【０１７６】
希釈した抗体をプレートに添加し、室温にて１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的、Sigma カタログ番号Ａ０２９３；ＰＢＳＴ中、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで１：４，０００に希釈）を各ウェルに添加し、プレートを室温にてさらに１時間インキュベートした。次いで、プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および１Ｎ ＨＣｌを用いて発色させた。次いで、４５０ｎｍで吸光度を測定し、光学密度（ＯＤ ４５０ｎｍ）として報告した。
【０１７７】
図３Ａから３Ｅに示すように、抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体は、一般的に、イピリムマブ（“ＹＶ１”）と比較して、ＣＴＬＡ−４への結合が減少した。図４Ａから４Ｄ、図５Ａから５Ｆおよび図６Ａから６Ｂも参照のこと。かかるデータは、マスキング部分が抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体上の抗原結合ドメインを効果的に隠すことを実証している。
【０１７８】
結合能をさらに評価するために、活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体を段階希釈し（例えば、６０μｇ／ｍＬから０．０００３μｇ／ｍＬ）、ヒトＣＴＬＡ−４を安定的に発現する５８個のα−β− ＣＴＬＡ−４/ＣＤ３ζ細胞に添加した。４℃で３０分間インキュベーション後、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識した抗ヒト二次抗体を添加し、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のヒトＣＴＬＡ−４への結合を、Ｃａｎｔｏフローサイトメーターを用いて評価した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）解析ソフトウェアを用いて決定した。イピリムマブを対照として用いた。図７Ａおよび７Ｂに示すように、活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブほど効果的にはヒトＣＴＬＡ−４に結合しなかった。これらのデータは、特定のプロテアーゼの不存在下では、活性化可能な抗体のマスキング部分がそのような活性化可能な抗体のヒトＣＴＬＡ−４への結合を阻害することをさらに実証している。
【０１７９】
活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体で観察された減少した結合がマスキング部分によるものであることを確認するために、マスキング部分としてＹＶ３９および切断可能部分として２０１１を含む活性化可能な抗体のモノクリップ形態、ＭＭＰ完全クリップ形態およびｕＰＡ完全クリップ形態について試験を行った。抗体のモノクリップ形態は、１つの無傷の軽鎖（マスキング部分を含む）およびＭＭＰ１４によって切断された場合と同じ位置で切断された第二の軽鎖を産生する構築物を発現させることにより産生された。ＭＭＰまたはｕＰＡ完全クリップ形態は、それぞれＭＭＰまたは得るｕＰＡによって切断されたかのように、両軽鎖が切断された構築物から発現された。図７Ｃおよび７Ｄに示すように、モノクリップ型の活性化可能な抗体は、非クリップ型の活性化可能な抗体（ＥＣ５０＝２２ｎＭ）およびイピリムマブ（ＥＣ５０＝０．５４ｎＭ）と比較して、中間の結合（ＥＣ５０＝２．８ｎＭ）を有した。対照的に、ＭＭＰまたはｕＰＡ完全クリップ型の活性化可能な抗体は、イピリムマブと同様に挙動した（ＭＭＰクリップ型：ＥＣ５０＝０．６５ｎＭ；ｕＰＡクリップ型：ＥＣ５０＝０．７６）。そのようなデータは、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体で観察された結合の減少がマスキング部分によるものであることを裏付けている。
【０１８０】
次に、観察されたＣＴＬＡ−４への結合の減少が活性の低下と相関するかどうかを決定するために、部分としてのＹＶ３９および切断可能部分としての２０１１を含む活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）の活性を、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いたインビトロ機能的アッセイにおいて特徴付けた。ＳＥＢは、Ｔ細胞を強力に活性化し、そしてサイトカイン分泌を刺激する、スーパー抗原である。標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離法を用いて、健康なヒトドナーから全新鮮末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。抗体の連続希釈（例えば、４０μｇ／ｍＬから０．０１μｇ／ｍＬ）を行い、９６ウェル平底組織培養プレートに三連で播種した。用いた抗体には、（ｉ）Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１、（ｉｉ）イピリムマブ、および（ｉｉｉ）非血縁のアイソタイプ対称が含まれた。次に、単離したＰＢＭＣを、Ｔ細胞アッセイ培地（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩ−ＦＢＳ）＋１％ ＨＥＰＥＳ緩衝液＋１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸＋１％ピルビン酸Ｎａ）に再懸濁し、１ｘ１０５細胞／ウェルでプレートに添加した。細胞を、最適以下の濃度（例えば、８５ｎｇ／ｍＬ−ＳＥＢを滴定し、そしてＴ細胞増殖に対する刺激を観察することにより決定された）のＳＥＢで刺激した。細胞を３７℃にて３日間インキュベートした。その後、上清中のＩＬ−２濃度を、均一系時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）により測定した。ＨＴＲＦデータをＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏを用いて分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてグラフ化した。
【０１８１】
図８に示すように、イピリムマブは、用量依存的にＰＢＭＣによるＳＥＢ介在ＩＬ−２産生を増強した。対照的に、Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１なる活性化可能な抗体は、アイソタイプ対照の活性と同程度の活性を有し、マスキング部分（ＹＶ３９）がイピリムマブの機能的活性を阻止するのに有効であることが示唆される。これらのデータは、上記の結合データと一致しており、そして特定のプロテアーゼの不存在下では、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は低下した活性を示すことを実証している。
【０１８２】
実施例５：
活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のインビボ特徴付け(characterization)
インビボで本明細書に記載の抗体を特徴付けするために、４つの活性化可能なヒト抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブに基づく）を、マウスＩｇＧ２ａを用いて調製した。該抗体は、マスキング部分としてＹＶ０４、ＹＶ２３、ＹＶ２４またはＹＶ３９、および切断可能部分として２００１を含んだ（それぞれ、“Ｉｐｉ ＹＶ０４ ２００１”、“Ｉｐｉ ＹＶ２３ ２００１”、“Ｉｐｉ ＹＶ２４ ２００１”および“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２００１”）。対照として、イピリムマブ（“Ｉｐｉ ｍｇ２ａ”）および非血縁のヒト抗ジフテリア毒素（“対照ｍｇ２ａ”）を用いた。これらの活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体の活性を、以下に記載のようにＭＣ３８腫瘍モデルを用いて評価した。
【０１８３】
すなわち、０日目に、ヒトＣＴＬＡ−４ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスに、２ｘ１０６個のＭＣ３８結腸腺癌細胞をそれらの左下腹部の４分の１に皮下注射した。腫瘍をキャリパーで二次元的に測定し、腫瘍体積をＬ×（Ｗ２/２）、式中Ｌ＝長さ（２つの測定値のうち長いほう）、Ｗ＝幅として計算した。次いで、マウスを、同様の平均腫瘍体積（例えば、３７ｍｍ３）を有するように、種々の群に無作為化した。抗体の投与を腫瘍移植の７日後に開始し、マウスは、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により単回用量（例えば、２００μｇ／マウス）の関連抗体を投与された。腫瘍移植後１２日目に、各群のマウスのうち数匹を屠殺し、腫瘍および脾臓を採取して、Ｔ細胞集団に対する抗体の効果を調べるために免疫モニタリングした。種々の群からの残りのマウスのうちの数匹または全てを、その後の薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）分析に用いた。
【０１８４】
Ｔ細胞集団の免疫モニタリング
採取した腫瘍および脾臓を、gentleMACS Octo Dissociator（商標）（Miltenyi, San Diego, CA）で処理した。単一細胞懸濁液を以下のＴ細胞マーカーで染色した：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＩＣＯＳ、ＣＤ４５、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ３、Ｋｉ−６７、ＰＤ−１、グランザイムＢおよびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）。
【０１８５】
ＰＫ／ＰＤ分析
マウスを、体位、グルーミングおよび呼吸の変化、ならびに嗜眠について毎日チェックした。腫瘍および群の体重を、死亡、安楽死または試験期間の終了まで週２回記録した。処置に対する応答を腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の関数として測定し、これは以下のように計算された：％ ＴＧＩ＝｛１−［（Ｔｔ−Ｔｏ）／（Ｃｔ−Ｃｏ）］｝×１００、Ｔｔ＝所定の日における処置群の腫瘍体積、Ｔｏ＝初期の腫瘍体積、Ｃｔ＝所定の日における対照群の腫瘍体積、Ｃｏ＝対照群の初期の腫瘍体積。腫瘍が約２５００ｍｍ３を超える体積に達した場合、または潰瘍化したように見えた場合は、動物を安楽死させた。
【０１８６】
統計分析
マイクロソフトエクセルを用いて、腫瘍体積および体重の、平均値、標準偏差（ＳＤ）および中央値を計算した。試験動物の１００％および少なくとも６０％がそれぞれ各処置群に残ったときに、平均値および中央値を計算した。GraphPad Prism（登録商標）v.4ソフトウェアを用いてデータをプロットした。
【０１８７】
予期した通り、非血縁の対照抗体を投与されたマウスは、腫瘍増殖を制御することができなかった（図９Ａ）が、イピリムマブを投与されたマウスは全て、腫瘍増殖を効果的に制御した（図９Ｂ）。異なる活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与されたマウスは、イピリムマブと同程度に腫瘍増殖を制御した（図９Ｃから９Ｆ）。活性化可能な抗体のうち、Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２００１は、腫瘍増殖の制御においてイピリムマブの有効性に最もよく似ていた（図９Ｆ）。
【０１８８】
活性化可能な抗マウスＣＴＬＡ−４抗体を用いて観察されたように（実施例２参照）、処置マウスの腫瘍および脾臓における制御性Ｔ細胞の頻度に関しては、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）は、腫瘍においてイピリムマブと同様に挙動したが（図１２Ａおよび１２Ｂ）、脾臓においては、活性化可能な抗体は、非血縁の対照抗体とより同等の挙動を示した（図１２Ｃから１２Ｆ）。
【０１８９】
本明細書に示されるデータをまとめると、本明細書に記載の活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体が、望ましくない副作用の危険性を低減しながら、伝統的なイピリムマブのように腫瘍を効果的に抑制できることが実証される。
【０１９０】
実施例６：
修飾された切断可能部分を含む活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のインビボ特徴付け
特定の切断可能部分配列における可能性のある脱アミド化部位を試験するために（実施例１０参照）、ヒトＩｇＧ１および種々のＣＭ配列を用いて活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体を調製した。活性化可能な抗体は、マスキング部分としてＹＶ３９および切断可能部分として２００１のいくつか変異体のうち１つ：ＷＴ（２００１）、ＡＮＰ（２０１２）、ＤＮＰ（２０１１）またはＱ（２００８）を含む（それぞれ、“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２００１”、“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１２”、“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”および“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２００８”）。イピリムマブおよび非血縁のヒト抗ジフテリア毒素もまた対照として用いた。
【０１９１】
活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体の活性を測定するために、ＭＣ３８腫瘍モデルを実施例５に記載のように用いた。用量滴定試験（図１１Ａから１１Ｆ）のために、マウスを、イピリムマブまたはマスキング部分としてＹＶ３９および活性可能部分として２０１１を含む活性化可能な抗体（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１”）を、２００μｇ／用量、６０μｇ／用量および２０μｇ／用量の用量で用いた処置した。
【０１９２】
図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、対照抗体で処置したマウスは腫瘍を制御できなかったが、イピリムマブで処置した１０匹のマウスのうち６匹は、試験終了時に腫瘍がなくなった。種々の活性化可能な抗体で処置したマウスは、伝統的なイピリムマブで観察されたように腫瘍を制御することができた（図１０Ｃから１０Ｆ）。図１１Ｂ−１１Ｇも参照のこと。
【０１９３】
処置マウスの腫瘍および脾臓における制御性Ｔ細胞の頻度に関して、先に観察された通り、腫瘍特異的プロテアーゼが２００１の切断可能部分変異体を切断するために必要とされた。腫瘍において、これらの活性化可能な抗体は、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の頻度を減少させることにおいてイピリムマブのように挙動した（図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａおよび１４Ｂ）。また図１５も参照のこと。脾臓において、抗体は、非血縁の対照抗体とより密接に類似し（図１３Ｃから１３Ｅ、１４Ｄから１４Ｇおよび１６Ａから１６Ｂ）、このことは、特定の腫瘍関連プロテアーゼの不存在下で、マスキング部分が活性化可能な抗体に結合したままであることを実証した。
【０１９４】
実施例７：
活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の非フコシル化バージョンのインビボ特徴付け
上記のように、コアフコース残基が存在しないことは、抗原結合またはＣＤＣを変化させることなく、ＩｇＧの活性化ＦｃγＲＩＩＩＡへの改善された結合を介してＡＤＣＣを強く増強することができる（Natsume et al. (2009) Drug Des. Devel. Ther. 3:7）。イピリムマブの非フコシル化形態（“Ｉｐｉ ＮＦ”）およびｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１の非フコシル化形態（“Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１ ＮＦ”）を調製した。種々のマウス、ヒトおよびカニクイザルのＦｃ受容体について、ＩｐｉおよびＩｐｉ ＮＦの結合を決定した。結果を図１９に示す。予期した通り、Ｉｐｉ ＮＦは、活性化受容体ヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、カニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびマウスＦｃγＲＩＶに対して顕著に増強された親和性（すなわち、より低いＫｄ）を示した。
【０１９５】
実施例５に記載のＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１ ＮＦおよびＩｐｉ−ＮＦを種々の用量で試験した。イピリムマブおよび非血縁のｈＩｇＧ１を対照として用いた。結果を図１７Ａ−Ｄに示す。Ｉｐｉ ＮＦは、イピリムマブよりも腫瘍増殖の制限または予防においていくらか有効であり（図１７Ｂおよび１７Ｃを比較）、Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１ ＮＦは、Ｉｐｉ ＮＦと同等であった（図１７Ｃおよび１７Ｄを比較）。加えて、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞もまた、Ｉｐｉ ＮＦおよびＩｐｉ ＹＶ３９ ２０１１抗体で処置したマウスの腫瘍において同様に枯渇した（図１８参照）。両試験において、Ｉｐｉ ＹＶ３９ ２０１１ ＮＦは、腫瘍において完全に活性化されることが示されている。
【０１９６】
これらの結果は、本発明の方法が、例えばＹＶ３９ ２０１１ ＮＦなどの非フコシル化活性化型ＣＴＬＡ−４抗体を含む、非フコシル化形態のイピリムマブに等しく適用可能であることを裏付けている。
【０１９７】
実施例８：
カニクイザルにおける、活性化可能な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体のインビボ特徴付け
霊長動物において抗ＣＴＬＡ−４抗体を評価するために、マスキング部分としてＹＶ３９を含み、切断可能部分として２００１を含む活性化可能な抗体をカニクイザルに投与した。ビークルおよびイピリムマブを対照として用いた。各サルに１０ｍｇの抗体または抗ＣＴＬＡ−４活性化可能な抗体を投与し、抗体投与後０日目、４日目、８日目、１５日目、２２日目、３６日目および４３日目に採血した。図２０に示すように、イピリムマブを投与されたサルにおいて、抗体投与後およそ８から１５日目にＫｉ６７染色によって測定されるように、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖の急上昇があった。対照的に、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ビークル対照と同様に挙動し、そしてサルにおいてＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を誘導しなかった。これらのデータは、霊長動物においてさえも、活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、活性化を示したとしてもわずかしか示さず、特異的プロテアーゼが存在しないことを実証している。
【０１９８】
まとめると、図１から２０に示したデータは、本明細書に記載の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体が、イピリムマブを上回る改善を提供することを実証する。活性化可能な抗体は、イピリムマブ処置でしばしば観察される重篤な有害事象のリスクを低減しながら、イピリムマブと同じくらい効果的に腫瘍増殖を制御する。
【０１９９】
実施例９：
活性化可能なＣＴＬＡ−４抗体のＫａｐｐ値およびＭＥ値
表９は、ヒトＩｇＧ１フォーマットにおける種々のマスキング部分および切断可能部分を含む、本明細書に記載の活性化可能な抗体についてのＫａｐｐ値およびマスキング効率（ＭＥ）値を提供する。この表に提供された値は、図に示されたデータから計算された。Ｋａｐｐは、測定条件下での活性化可能な抗体の結合親和性を表し、この実施例ではＥＬＩＳＡによる結合を表す。しかしながら、結合親和性は、初代細胞またはトランスフェクト細胞上で発現されるＣＴＬＡ−４への結合によって、または限定されないが、表面プラズモン共鳴もしくは平衡透析などの他の物理的方法によっても測定できることを理解されたい。マスキング効率（ＭＥ）は、活性化可能な抗体のＫａｐｐを、同じ条件下で測定したイピリムマブのＫＤで割ることによって計算される。
【０２００】
【表１６】
2020500016.tif 000018
【０２０１】
表１０は、ＹＶ１マウスＩｇ２ａフォーマットの種々のマスキング部分および切断可能部分を含む、本明細書に記載の活性化可能な抗体についてのＫａｐｐ値およびＭＥ値を提供する。提供された値は、図に示されたデータから計算された。
【表１７】
2020500016.tif 000019
【０２０２】
より高いＭＥ値を有するマスキング部分およびＹＶ１マウスＩｇＧ２ａフォーマットにおける２０１２切断可能部分を含む活性化可能な抗体についてのＫａｐｐ値およびＭＥ値を提供する。提供された値は、図に示されたデータから計算された。
【表１８】
2020500016.tif 000020
【０２０３】
実施例１０：
活性化型ＣＴＬＡ−４抗体の脱アミド化、異性化および安定化評価
実施例６に示唆されるように、特定の活性化可能なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体中の特定の切断可能部分（ＣＭ）配列における可能性のある脱アミド化部位を試験するために、そのような活性化可能な抗体を種々のＣＭ配列を用いて調製した(すなわち、２００１、２０１１、２０１２および２００８）。切断可能部分２０１１、２０１２および２００８において、２００１切断可能部分に見られるＤＮＨ配列は、それぞれＤＮＰ、ＡＮＰおよびＤＱＨに置き換えられた。
【０２０４】
これらの活性化可能なＣＴＬＡ−４抗体は、ＨＥＫ２９３細胞における関連構築物の一過性トランスフェクションにより産生され、そして可能性のある分解産物を検出するためにペプチドマッピング液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を行った。本発明の活性化可能な抗ＣＴＬＡ−４抗体に用いるために最初に選択された２００１（ＤＮＨ）切断可能部位は、４℃にてＰＢＳ中、７日後にアスパラギン（Ｎ）残基（６．４％）の脱アミド化を示した。過酷安定性試験では、２５℃で４週間貯蔵した場合には脱アミド化が１８．５％から３２．８％に増加し、４０℃で１週間および４週間貯蔵した場合にはそれぞれ３６．５％および６６．６％に増加した。
【０２０５】
切断可能部分２００８、２０１１および２０１２は、これらの活性化可能なＣＴＬＡ−４抗体における２００１での脱アミド化の問題を克服することを試みるために選択された。これらは全て、２００１の６．４％の脱アミド化と比較して、ＰＢＳ中４０℃にて１週間貯蔵した場合、０．１％以下の脱アミド化を示した。しかしながら、さらなる安定性分析（ＬＣ−ＭＳによるものも)は、２００８（ＤＱＨ）切断可能部分を含むこれらの活性化可能なＣＴＬＡ−４抗体は最小の脱アミド化を示したが、それは種々の条件下でアスパラギン酸残基で有意なアスパラギン酸異性化を示したことを示した（表１２参照）。対称的に、２０１１（ＤＮＰ）は、最小のアスパラギン酸異性化を示した。アスパラギン酸異性化は、アスパラギン酸残基がアラニンで置き換えられている２０１２（ＡＮＰ）には関係なかった。
【表１９】
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【０２０６】
しかしながら、マウス、ラットおよびカニクイザル血清におけるインビトロ安定性試験は、これらの活性化可能なＣＴＬＡ−４抗体において、２０１２（ＡＮＰ）についてアスパラギン残基とプロリン残基との間の実質的なクリッピングを示した（表１３参照）。２０１１（ＤＮＰ）は、許容される低レベルの脱アミド化、アスパラギン酸異性化、および軽鎖クリッピングを伴う切断可能部分として残った。
【表２０】
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【０２０７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトおよび受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の両方を含む）は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたは受託番号／データベース配列が、引用により包含されることが具体的かつ個別に示されたのと同じ程度にあらゆる目的でその内容全体が引用により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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