(57)【要約】本開示は、結合オリゴヌクレオチド及び機能的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの任意の天然または合成類似体）の両方を迅速に選択するための組成物及び方法を説明する。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、フローチャンバー内に複数の固定されたアプタマークラスター（例えば、本明細書に記載のアプタマーライブラリーから）及び必要に応じて、１つ以上の標的細胞（例えば、がん細胞、免疫細胞など）及び／または細胞機能の検出可能な指標（例えば、アポトーシス、細胞増殖、遺伝子またはタンパク質発現などの蛍光指標）を含むフローセル（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定装置のフローセル）である。特定の実施形態において、本明細書に提供されるのは、そのようなアプタマークラスター含有フローセルを使用して、アプタマーライブラリーから機能的アプタマーを特定する方法である（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置などの配列決定装置において）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローチャンバーを含むフローセルであって、複数のアプタマークラスターが前記フローチャンバー内の固体表面に固定されている前記フローセル。
【請求項２】
少なくとも約１０６個の別個のアプタマークラスターを含む、請求項１に記載のフローセル。
【請求項３】
１０６〜１０９個のアプタマークラスターを含む、請求項２に記載のフローセル。
【請求項４】
各々のアプタマークラスターが、少なくとも約１０４個のアプタマーのコピーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフローセル。
【請求項５】
各々のアプタマークラスターが１０４〜１０６個のアプタマーのコピーを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフローセル。
【請求項６】
前記フローセル内に標的セルをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のフローセル。
【請求項７】
前記標的細胞が原核細胞である、請求項６に記載のフローセル。
【請求項８】
前記標的細胞が真核細胞である、請求項６に記載のフローセル。
【請求項９】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項８に記載のフローセル。
【請求項１０】
前記ヒト細胞ががん細胞である、請求項９に記載のフローセル。
【請求項１１】
前記ヒト細胞が免疫細胞である、請求項９に記載のフローセル。
【請求項１２】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好酸球、ＮＫ細胞または樹状細胞である、請求項１１に記載のフローセル。
【請求項１３】
前記フローセル内の細胞機能のレポーターをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のフローセル。
【請求項１４】
前記細胞機能のレポーターが、前記細胞が細胞機能を受けるときに蛍光を発する色素である、請求項１３に記載のフローセル。
【請求項１５】
前記細胞機能がアポトーシスである、請求項１４に記載のフローセル。
【請求項１６】
前記色素がカスパーゼ−３／７活性の検出器である、請求項１４に記載のフローセル。
【請求項１７】
前記細胞機能が増殖である、請求項１４に記載のフローセル。
【請求項１８】
前記細胞機能が遺伝子発現である、請求項１４に記載のフローセル。
【請求項１９】
前記細胞機能がサイトカイン発現である、請求項１４に記載のフローセル。
【請求項２０】
前記アプタマークラスターがアプタマークラスターライブラリー由来である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のフローセル。
【請求項２１】
標的に特異的に結合する１つ以上のアプタマーを特定する方法であって、以下：（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターと前記標的とを接触させること；及び（ｉｉ）前記標的に特異的に結合する固定されたアプタマークラスターを特定すること、を包含する前記方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、さらに以下のステップ：
（ａ）表面上のアプタマーライブラリーから複数のアプタマーを固定するステップ；及び
（ｂ）前記フローセル表面上の複数の局所的に固定されたアプタマーを増幅して、複数の固定されたアプタマークラスターを形成するステップ、を包含する、前記方法。
【請求項２３】
前記増幅が、ブリッジＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅を介して実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固定されたアプタマークラスターから相補鎖を除去して、一本鎖の固定されたアプタマークラスターを提供することをさらに包含する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固定されたアプタマークラスターが、ステップ（ｉ）の前に配列決定される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記配列決定が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定を介して行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アプタマーライブラリーから前記表面にアプタマーをプリントすることにより、前記複数の固定されたアプタマークラスターを生成することをさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１０８個の別個のアプタマーが前記表面に固定されている、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
各々のアプタマークラスターが少なくとも５０個の同一のアプタマーを含む、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記表面がフローセル表面である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法は、フローセルから未結合の標的を除去するために、ステップ（ｉ）の後に洗浄ステップを実行することをさらに包含する、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記固定されたアプタマーの各々が、式ＩＩまたは式ＩＩＩによる配列：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｐ２（ＩＩ）、または
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｐ２（ＩＩＩ）、
を有する、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで：
Ｐ１は５’プライマー部位配列であり；
Ｐ２は３’プライマー部位配列であり；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基のステム領域配列であり；
Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；
Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；そして
Ｌ１及びＬ２は各々独立して、少なくとも１つの塩基のループ領域配列である、前記方法。
【請求項３３】
前記標的が細胞である、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が原核細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的が細菌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が真核細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記標的がウイルスである、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的がタンパク質である、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的が検出可能に標識されている、請求項２１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
細胞の特性を調節する１つ以上のアプタマーを特定する方法であって、以下：（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターを前記細胞と接触させること；及び（ｉｉ）前記細胞の特性を調節する前記固定されたアプタマークラスターを特定すること、を包含する、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、さらに以下のステップ：
（ａ）表面上にアプタマーライブラリー由来の複数のアプタマーを固定するステップ；及び
（ｂ）フローセル表面上の前記複数の局所的に固定されたアプタマーを増幅して、前記複数の固定されたアプタマークラスターを形成するステップ、をさらに包含する、前記方法。
【請求項４３】
前記増幅が、ブリッジＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅を介して実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記固定されたアプタマークラスターから前記相補鎖を除去して、一本鎖固定されたアプタマークラスターを提供することをさらに包含する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記固定されたアプタマークラスターが、ステップ（ｉ）の前に配列決定される、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記配列決定がＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定を介して行われる、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
アプタマーライブラリー由来のアプタマーを前記表面にプリントすることにより、前記複数の固定されたアプタマークラスターを生成することをさらに包含する、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１０８個の別個のアプタマーが前記表面に固定されている、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
各々のアプタマークラスターが少なくとも５０個の同一のアプタマーを含む、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記表面がフローセル表面である、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記固定されたアプタマーの各々が、式ＩＩまたは式ＩＩＩによる配列：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｐ２（ＩＩ）、または
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｐ２（ＩＩＩ）、
を有する、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで：
Ｐ１は５’プライマー部位配列であり；
Ｐ２は３’プライマー部位配列であり；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基のステム領域配列であり；
Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；
Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；かつ
Ｌ１及びＬ２は各々独立して、少なくとも１つの塩基のループ領域配列である、前記方法。
【請求項５２】
前記細胞が原核細胞である、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記原核細胞が細菌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が真核細胞である、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記アプタマーと前記標的とを接触させる前に、前記細胞が検出可能な標識で標識されている、請求項４１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記検出可能な標識が蛍光色素である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記蛍光色素が、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記検出可能な標識が、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が、蛍光標識抗体またはその抗原結合フラグメント、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで標識されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、前記細胞へのアプタマーの曝露後に検出可能に標識される、請求項４１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記調節される細胞の特性が、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、細胞形態学、細胞活性化、リン酸化、カルシウム動員、脱顆粒または細胞移動、細胞分化である、請求項４１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記アプタマーライブラリーを合成することをさらに包含する、請求項２１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項２１〜６３のいずれか１項に記載の方法に従って特定されたアプタマー。
【請求項６５】
複数のアプタマークラスター、標的、及び蛍光レポーターを含む組成物。
【請求項６６】
少なくとも約１０６個のアプタマークラスターを含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
１０６〜１０９個のアプタマークラスターを含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
各々のアプタマークラスターが少なくとも約１０４個のアプタマーのコピーを含む、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
各々のアプタマークラスターが１０４〜１０６個のアプタマーのコピーを含む、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記標的が標的細胞である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記細胞が原核細胞である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記細胞が真核細胞である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ヒト細胞ががん細胞である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記標的が標的ウイルスである、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記標的が標的タンパク質である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記蛍光レポーターが細胞死レポーターである、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記蛍光レポーターが酸化還元電位レポーターである、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記蛍光レポーターが膜完全性レポーターである、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記蛍光レポーターがキャプシド完全性レポーターである、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記蛍光レポーターがタンパク質完全性レポーターである、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記蛍光レポーターがタンパク質変性レポーターである、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記アプタマークラスターが蛍光マーカーで標識されている、請求項６５〜８２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記アプタマークラスターが、光学顕微鏡下での可視性を可能にするための要素で標識されている、請求項６５〜８３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記要素がナノ粒子である、請求項に８４記載の組成物。
【請求項８６】
前記アプタマークラスターがアンチセンス鎖で標識されている、請求項６５〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記アンチセンス鎖が、標的の結合時に置換または除去される、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
酵素をさらに包含する、請求項６５〜８７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記酵素がリガーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、編集酵素、及び／または制限酵素である、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記アプタマークラスターが固体支持体上に固定されている、請求項６５〜８９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記固体支持体がフローセルである、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記フローセルが、プラスチック、ガラス、ポリマー、または金属でできている、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
前記フローセルがプレート、トレイ、またはチップである、請求項９１または９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記フローセルが床及び天井を備え、前記床及び前記天井がその間に充填可能な空間を備える、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記充填可能な空間が、空気、水、水性緩衝液、培養培地、血清、患者由来の試料、基質、ポリマー、またはタンパク質で満たされている、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記患者由来の試料が血液、血清、及び／または尿である、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記基質がゲルである、請求項９５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４７８，９９３号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
アプタマーは、特定の標的分子に結合し得る短い一本鎖核酸オリゴマーである。アプタマーは通常、反復プロセスでオリゴヌクレオチドの大きなランダムプールから選択される。つい最近では、細胞内、インビボ、及びインビトロでアプタマーが首尾よく選択されている。
【０００３】
アプタマーの選択、それらの構造と機能の関係、及びそれらの作用機序は、全て十分に理解されていない。１００を超えるアプタマー構造が解明及び報告されているが、繰り返し起こる構造モチーフはほとんど確認されていない。
【０００４】
特定の標的に結合できるアプタマーを特定するためのさまざまな異なるアプタマー選択プロセスが記載されている。しかし、目的の標的に対する望ましい機能的効果を媒介し得るアプタマーを迅速かつ便利に特定する能力は、アプタマー治療に顕著な影響を有するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要約
本明細書で提供されるのは、標的（例えば、標的細胞または標的分子）に結合するか、及び／またはその機能的効果を媒介するアプタマーの特定に関する組成物及び方法である。例えば、特定の実施形態では、本明細書では、そのフローチャンバー内に複数の固定されたアプタマークラスター（例えば、本明細書に記載のアプタマーライブラリー由来）を含むフローセル（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定装置のフローセル）、及び、必要に応じて、１つ以上の標的細胞（例えば、がん細胞、免疫細胞など）及び／または細胞機能の検出可能な指標（例えば、アポトーシス、細胞増殖、遺伝子またはタンパク質発現などの蛍光指標）が提供される。特定の実施形態において、本明細書に提供されるのは、そのようなアプタマークラスター含有フローセルを使用して、アプタマーライブラリーから機能的アプタマーを（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置などの配列決定装置において）特定する方法である。
【０００６】
特定の態様において、標的（例えば、標的細胞、標的ウイルス、標的タンパク質、細胞上のトポグラフィー的特徴）に特異的に結合する１つ以上のアプタマーを特定する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）表面（例えば、フローセル表面）に固定された複数のアプタマークラスターと標的とを接触させること；及び（ｉｉ）標的に結合する固定されたアプタマークラスターを特定することを包含する。特定の実施形態において、この方法は、ステップ（ｉ）の後に洗浄ステップを実施して、表面（例えば、フローセル表面）から結合していない標的を除去することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、この標的は検出可能に標識される（例えば、蛍光標識される）。
【０００７】
いくつかの態様では、細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）の特性を調節する１つ以上のアプタマーを特定するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターと細胞とを接触させること；及び（ｉｉ）細胞の特性（例えば、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、細胞形態など）を調節する固定されたアプタマークラスターを特定することを包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、表面（例えば、フローセル表面）から結合していない標的を除去するために、ステップ（ｉ）の後に洗浄ステップを実施することをさらに包含する。いくつかの実施形態では、細胞は、検出可能な標識（例えば、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素などの蛍光色素）を含む。いくつかの実施形態において、細胞の特性の変化は、細胞の特性を調節する固定されたアプタマークラスターを特定するために、検出される検出可能な標識の特性の変化を引き起こす。
【０００８】
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、標的（例えば、標的タンパク質などの標的分子）を調節する機能的特性（例えば、酵素特性）を保有する１つ以上のアプタマーを特定する方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターと標的とを接触させること；及び（ｉｉ）標的を調節する（例えば、標的を切断する、標的の化学的または構造的変化を誘発するなど）固定されたアプタマークラスターを特定することを包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、フローセルから未結合の標的を除去するために、ステップ（ｉ）の後に洗浄ステップを実行することをさらに包含する。
【０００９】
特定の実施形態では、この方法は、固定されたアプタマークラスターの生成をさらに包含する。いくつかの実施形態において、この固定されたアプタマークラスターは、以下によって生成される：（ａ）複数のアプタマー（例えば、アプタマーライブラリーから）を表面に固定すること；及び（ｂ）フローセル表面上の複数の局所的に固定されたアプタマーを増幅し（例えば、ブリッジＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅を介して）、複数の固定されたアプタマークラスターを形成することによって、生成される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、固定されたアプタマークラスターから相補鎖を除去して、一本鎖の固定されたアプタマークラスターを提供することをさらに包含する。特定の実施形態において、固定されたアプタマークラスターは、ステップ（ｂ）に続いて配列決定される（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定を使用する）。いくつかの実施形態において、この固定されたアプタマークラスターは、表面上にアプタマークラスター（例えば、アプタマーライブラリーから）を直接プリントすることにより生成される。いくつかの実施形態において、この方法は、アプタマーライブラリーの生成を含む（例えば、化学的核酸合成による）。
【００１０】
特定の態様において、本明細書に提供されるのは、アプタマークラスター（例えば、クラスター化アプタマーライブラリー）を含む組成物である。特定の実施形態において、アプタマークラスターは、固体支持体（例えば、フローセル）上に固定される。特定の実施形態では、組成物は、標的（例えば、標的細胞、標的分子、標的タンパク質）をさらに含む。特定の実施形態では、この組成物はさらに、検出可能な標識（例えば、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素などの蛍光色素）を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、１０４〜１０９個のアプタマークラスター（例えば、少なくとも約１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、または１０８個のアプタマークラスター）を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリー内の各クラスターは１０３〜１０６個のアプタマー（例えば、１クラスターあたり少なくとも約１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５個のアプタマー）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本明細書に記載される特定の実施形態による、アプタマーライブラリー合成、配列決定、及び標的特定ワークフローの概略図である。
【図２】図２は、アプタマーライブラリー（Ｌｉｂ）、ランダム配列の短いまたは長いアプタマー、特定の標的細胞サイクル６及び７（それぞれＣｙｃ６及びＣｙｃ７）のＳＥＬＥＸ選択プロセスのアプタマー出力、ＳＥＬＥＸ選択プロセスからの特定のアプタマー配列（Ａｐｔ１及びＡｐｔ２）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘフローセル上の空のレーン（空）への標的細胞（Ｈａｎａ細胞）の結合を示す棒グラフである。細胞をフローセルレーンに流し、結合細胞をカウントした（結合対非結合、分数として表され、１＝１００％の細胞）。
【図３】図３は、フローセル上のアプタマーに結合した細胞の画像である。この画像は、経時的な、表面に対する細胞の動きを示す。その画像によって、細胞が表面自体に付着するのではなく、固定されたアプタマークラスターによって保持されており、したがって、自由に移動できるが、その場所に限定されていることが示される。画像化は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘで実行した。
【図４】図４は、本明細書で提供される特定の例示的な実施形態による特定のアプタマー構造の概略図である。
【図５】図５は、３つのパネルを含み、本明細書に開示される特定の実施形態による例示的なアプタマー特定方法を示す。パネルＡは、フローセルベースのアプタマー検出法の概略図である。最初のアプタマーライブラリーを配列決定し、ライブラリー由来のアプタマーが固有の座標でクラスター化されるフローセルが生成される。陽性標的（例えば、腫瘍生検細胞）及び陰性標的（例えば、末梢血）を、１つ以上の生物学的効果（例えば、アポトーシス）の蛍光指標で標識し、アプタマークラスターが固定されているフローセルの異なるレーンに導入する。インキュベーション後、蛍光が検出され、アプタマークラスターが固定されているフローセル上の位置に関連付けられる。アプタマーを、有効性の有／無（効果あり／効果なし）及び選択性の有／無（選択的／非選択的）に基づいてスコア付けする。最高スコアのオリゴ（Ｅ＋Ｓ）を合成し、検証する。パネルＢは、スクリーニング蛍光顕微鏡用の特注アダプター内に保持された、配列決定後のフローセルの写真を示す。パネルＣは、アポトーシス細胞が陽性シグナルを生成する、インキュベーション後の標的細胞を示す、特許請求される方法の実施形態の実施中に得られた蛍光顕微鏡画像のスクリーンショットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
全般
本明細書で提供されるのは、標的（例えば、標的細胞または標的分子）に対して結合、及び／またはその機能的効果を媒介するアプタマーの特定に関する方法及び組成物である。特定の実施形態では、この方法は、表面に固定された複数のアプタマークラスターに標的を接触させることを包含する。したがって、いくつかの実施形態では、この方法は、アプタマーのクラスターが固定されているフローセルの表面全体にまたがって標的を含む溶液を流すこと、及びどのアプタマークラスターが標的に結合するか、それと相互作用するか、及び／またはその機能的効果を媒介するかを検出することを包含する。
【００１３】
特定の実施形態において、各々の固定されたアプタマークラスターの配列は、例えば、アプタマークラスターを配列決定することにより、または既知配列のアプタマーを表面の所定の位置にプリントすることにより、既知となるか及び／または決定される。したがって、標的がアプタマークラスターに結合するか、それと相互作用するか、及び／または調節される表面上の位置を決定することにより、関連する効果をその位置のアプタマー配列に関連付けることができる。
【００１４】
例えば、いくつかの実施形態において、標的に結合するアプタマーは、既知の配列のアプタマークラスターが既知の位置に固定されている表面を横切って検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含む標的を含む組成物を流すことにより特定される。標的が保持される表面上の位置が決定され（例えば、蛍光顕微鏡を使用して）、それらの位置に固定されたアプタマーが標的に結合することが示される。
【００１５】
特定の実施形態では、標的を機能的に調節するアプタマーは、既知の配列のアプタマークラスターが既知の位置に固定されている表面にまたがって、調節される機能を示す検出可能な標識（例えば、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素などの蛍光色素）を含む標的を含む組成物を流すことにより特定される。標的が調節されることを検出可能な標識が示す表面上の位置が決定され（例えば、蛍光顕微鏡を使用して）、それらの位置に固定されたアプタマーが標的を調節可能であることが示される。
【００１６】
特定の態様において、表面上に固定されたアプタマークラスターの生成に関連する方法及び組成物も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、アプタマー（例えば、本明細書に開示されるアプタマーライブラリー由来）は、フローセル表面などの表面上に固定される。いくつかの実施形態では、次いで、ブリッジ増幅またはローリングサークル増幅などの局所的増幅プロセスを実行して、アプタマークラスターが生成される。次いで、各々のアプタマークラスターの配列を表面上の位置と関連付けるために、アプタマークラスターを配列決定してもよい（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定により）。相補鎖を除去して、一本鎖アプタマークラスターを生成してもよい。次いで、表面（例えば、フローセル）を、本明細書で提供されるアプタマー特定方法で使用する準備を行う。
【００１７】
好都合なことに、特定の実施形態では、本明細書で提供される方法の全てのステップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘ機器などのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置で実行され得る。
【００１８】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、アプタマークラスター（例えば、本明細書で提供される方法の実施中に生成されるクラスター化アプタマーライブラリー）を含む組成物である。特定の実施形態において、アプタマークラスターは、固体支持体（例えば、フローセル）上に固定される。特定の実施形態では、この組成物は、標的（例えば、標的細胞、標的分子、標的タンパク質）をさらに含む。特定の実施形態では、この組成物は、検出可能な標識（例えば、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素などの蛍光色素）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、１０４〜１０９個のアプタマークラスター（例えば、少なくとも約１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、または１０８個のアプタマークラスター）を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリー内の各々のクラスターは１０３〜１０６個のアプタマー（例えば、１クラスターあたり少なくとも約１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５個のアプタマー）を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、標的は、任意のタイプの細胞（例えば、細菌などの原核細胞、または哺乳動物細胞などの真核細胞）、ウイルス、タンパク質、及び／または粒子であり得る。いくつかの実施形態では、粒子は標的に付着されている。
【００２０】
いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、機能の蛍光レポーターである。いくつかの実施形態では、機能の蛍光レポーターは、細胞死レポーター、酸化還元電位レポーター、膜完全性レポーターである。いくつかの実施形態では、機能の蛍光レポーターは、キャプシド完全性レポーター（例えば、ウイルスのキャプシド完全性及びまたは機能を測定するためのレポーター）などのウイルスレポーターである。いくつかの実施形態において、機能の蛍光レポーターは、タンパク質完全性レポーター（すなわち、タンパク質の構造的完全性及び安定性を測定するためのレポーター）またはタンパク質変性レポーター（すなわち、タンパク質変性を検出するレポーター）などのタンパク質レポーターである。
【００２１】
細胞死レポーターの例は、７−ＡＡＤ、及びアネキシンＶフルオロフォアである。特定の実施形態では、標的は、標的に対する生物学的または化学的効果の検出を可能にする検出可能な標識に連結するか、結合するか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光色素である。蛍光色素の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、及び酸化還元電位色素が挙げられる。一実施形態では、標的は、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素で標識される。
【００２２】
特定の実施形態では、標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、または標識に対するアプタマーの曝露前のイオン濃度のマーカーで標識されている。
【００２３】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素で標識される。特定の実施形態では、標的細胞は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、標的細胞は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで、細胞に対するアプタマーの曝露前に標識されている。いくつかの実施形態において、標的細胞は、標的へのアプタマーの曝露後に標識される。一実施形態では、標的細胞は、蛍光標識抗体またはその抗原結合断片、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで標識される。一実施形態において、標的細胞は、蛍光標識抗体またはその抗原結合断片、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで、細胞へのアプタマーの曝露後に標識される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、アプタマークラスターはフローセルに固定される（例えば、フローセルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器フローセル及び／またはＰｏｌｏｎａｔｏｒシーケンサーフローセルなどの画像ベースのＤＮＡ配列決定に使用される）。特定の実施形態において、フローセルは、任意の材料から作製され得る。いくつかの実施形態では、フローセルは、プラスチック、ガラス、ポリマー、または金属でできている。いくつかの実施形態では、フローセルはプレート、トレイ、またはチップである。いくつかの実施形態において、フローセルは、その床と天井との間に、以下：空気、水、水性緩衝液、培養培地、血清、患者由来試料（例えば、血液、血漿、血清、尿）、基質（例えば、ゲル）、ポリマー、及び／またはタンパク質（例えば、コラーゲン、または患者由来の細胞外基質）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、フローセルは標的（例えば、標的細胞）を含む。いくつかの実施形態において、フローセル（例えば、その床及び／またはその天井）は、ポリマー、タンパク質、オリゴ、脂質、及び／または化学基などのブロッカーでコーティングされている。いくつかの実施形態では、フローセルは、クラスターに近接して標的を結合するための任意の長さのアンカーを含む。いくつかの実施形態では、アンカーはポリマー、タンパク質、オリゴ、脂質、及び／または化学基である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、アプタマークラスターはフローセル内にランダムに配置される。他の実施形態において、アプタマークラスターは、フローセル内の特定のパターンに従って配置される。いくつかの実施形態では、フローセルは任意の段階で固定される。いくつかの実施形態では、組成物は固定剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、フローセルは、オリゴ選択の反復プロセスに使用される。他の実施形態では、フローセルは、オリゴ選択の非反復プロセスで使用される。
【００２６】
特定の実施形態では、この標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、この標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで、標的へのアプタマーの曝露前に標識されている。
【００２７】
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
【００２８】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、タンパク質もしくはペプチド標的または標的細胞に対するトポグラフィー的特徴に特異的に結合し得る短い（例えば、２００塩基未満）一本鎖核酸分子（ｓｓＤＮＡ及び／またはｓｓＲＮＡ）を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合「アプタマークラスター」という用語は、同一配列の局所的に固定されたアプタマー（例えば、少なくとも１０個）の集合を指す。
【００３１】
「結合」または「相互作用する」という用語は、会合であって、例えば、生理学的条件下での、静電、疎水性、イオン及び／または水素による結合の相互作用に起因して、例えばアプタマーと標的との間の２つの分子間の安定した結合であり得る会合を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、２つの核酸配列は、それらが各位置で互いに塩基対を形成する場合、互いに「相補性」であるか、または「相補的」である。
【００３３】
本明細書で使用する場合、２つの核酸配列は、両方が同じ核酸配列に相補的である場合、互いに「対応する」。
【００３４】
「調節」という用語は、機能的特性または生物学的な活性もしくはプロセス（例えば、酵素活性または受容体結合）に関して使用される場合、上方制御する（例えば、活性化または刺激する）、下方制御する（例えば、阻害または抑制する）か、そうでなければこのような特性、活性、もしくはプロセスの品質を変更する能力を指す。特定の例では、そのような調節は、シグナル伝達経路の活性化などの特定の事象の発生を条件とする場合があるか、及び／または特定の細胞タイプでのみ顕在化する場合がある。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、所定の標的に結合するアプタマーの能力を指す。典型的には、アプタマーは、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下というＫＤに対応する親和性でその標的に特異的に結合し、その非特異的で無関係な標的（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、またはＨＥＫ２９３細胞もしくはＥ．ｃｏｌｉ細胞などの無関係な細胞）への結合に対するその親和性よりも顕著に少ない（例えば、少なくとも２倍少ない、少なくとも５倍小さい、少なくとも１０倍小さい、少なくとも５０倍小さい、少なくとも１００倍小さい、少なくとも５００倍小さい、または少なくとも１０００倍小さい）ＫＤで標的に結合する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、２つのオリゴヌクレオチドのＴｍまたは融解温度とは、オリゴヌクレオチド／標的の５０％が結合し、オリゴヌクレオチド標的分子の５０％が結合しない温度である。２つのオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、オリゴヌクレオチド濃度に依存し、反応混合物中の一価、二価カチオンの濃度に影響される。Ｔｍは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ，Ｊ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：１４６０−１４６５（１９９８）に記載されているように、経験的に決定されてもよいし、最近傍式を使用して計算されてもよい。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有する場合があり、既知または未知の任意の機能を実行する場合がある。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコーディングまたは非コーディング領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前に付与されても、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される場合がある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによりさらに修飾され得る。
【００３８】
アプタマーライブラリー
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、アプタマーライブラリーに存在するアプタマーのうちで所望の特性を有するアプタマーの特定に関する。本明細書で使用される場合、アプタマーライブラリーは、別個の配列（例えば、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７の別個の配列）を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）の集合であり、少なくとも核酸分子のサブセットは、標的タンパク質、ペプチド、または細胞の組織分布的特徴に特異的に結合し得るように構造化されている。いくつかの実施形態では、潜在的なアプタマーの任意のライブラリーが、本明細書で提供される方法及び組成物で使用され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｒ−Ｐ２（Ｉ）
による配列を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含む、からなるか、及び／または本質的にからなり
ここで、Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；及びＲは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下のランダムに配置された塩基を含む配列である。
【００４０】
一実施形態では、Ｒは、約２５％のＡを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＴを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＧを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＣを含む配列である。さらに別の実施形態では、Ｒは、約２５％のＡ、約２５％のＴ、約２５％のＧ、及び約２５％のＣを含む配列である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｒ”−Ｐ２（Ｉ）
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むかか、からなるか、及び／または本質的にからなり、
ここで、Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；及びＲ”は、バイアスのかかった混合物からのランダムに配置された塩基、またはランダムな文字列と反復またはバイアスされた文字列の任意の組み合わせを含む、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、または５０塩基長以下の配列である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式ＩＩ：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｐ２（ＩＩ）
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な模式図は、図４Ａに示される）、
ここで、
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基長）のステム領域配列であり；Ｓ１＊は、Ｓ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長）のループ領域配列であり；及びＳ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊は、合計で少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式ＩＩＩ：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｐ２（ＩＩＩ）、
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な模式図を、図４Ｂに示す）、
ここで、
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基長）のステム領域配列であり；Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０塩基長のループ領域配列である）であり；そして
Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊は、合計で少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式ＩＶ：
Ｐ１−Ｌｉｂ−Ｍ１／Ｍ２−Ｄ−Ｍ１／Ｍ２＊−Ｌｉｂ−Ｐ２（ＩＶ）
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な概略図を図４Ｃに提供する）、
ここで、
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列である；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；
Ｌｉｂは：（ｉ）Ｒ；（ｉｉ）Ｒ”；（ｉｉｉ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊；及び（ｉｖ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊から選択される式を有する配列であり；
Ｒは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下のランダムに配置された塩基を含む配列であり；
Ｒ”は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下の配列であり、バイアスされた混合物からのランダムに配置された塩基、またはランダムな文字列と繰り返しもしくはバイアスされた文字列との任意の組み合わせを含む；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長）のステム領域配列であり；Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長）のループ領域配列であり；
ここで、Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊は、合計で少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下であり；
Ｄは、少なくとも１つの塩基（例えば、約１〜２０塩基長、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基長）を含むスペーサー配列であり；
Ｍ１は、約１０〜１８塩基長または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８塩基長の多量体形成ドメイン配列であり、配列の鎖が相補的なドメインを含む別の鎖と相互作用し得；そして
Ｍ２は、Ｍ１配列の鎖と相互作用する鎖を含むＭ１の相補的ドメインである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式Ｖ：
Ｐ１−Ｌｉｂ−Ｔ＊−Ｌｉｂ−Ｐ２（Ｖ）による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な概略図を図４Ｄに示す）、
ここで：
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；
Ｌｉｂは、以下から選択される式を有する配列である：（ｉ）Ｒ；（ｉｉ）Ｒ”；（ｉｉｉ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊；及び（ｉｖ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊；
Ｒは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下のランダムに配置された塩基を含む配列であり；
Ｒ”は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下の配列であり、バイアスされた混合物からのランダムに配置された塩基、またはランダムな文字列と繰り返しもしくはバイアスされた文字列との任意の組み合わせを含み；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長）のステム領域配列であり；
Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長）のループ領域配列であり；
ここで、Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊は、合計で少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下であり；
Ｔは、Ｌｉｂ配列またはＴ＊の任意の部分にワトソン／クリックまたはフーグスティーンの塩基対によって結合される２番目の鎖であり、ここでこの鎖は、必要に応じてその５’及び３’末端に不対ドメインを含む（例えば、アプタマーへの機能的部分の付着を促進するため）；そして
Ｔ＊は専用ドメイン配列である（例えば、約４〜４０塩基長、または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長）。
【００４６】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｒは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下という任意のランダム混合物（例えば、基準塩基の場合、２５％Ａ、２５％Ｔ、２５％Ｇ、２５％Ｃ）からランダムに配置された塩基である。
【００４７】
上記式の一実施形態では、Ｒは約２５％のＡを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＴを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＧを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＣを含む配列である。さらに別の実施形態では、Ｒは約２５％のＡ、約２５％のＴ、約２５％のＧ、及び約２５％のＣを含む配列である。
【００４８】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｒ”は、バイアスされた混合物からランダムに配置された塩基を含む配列である（例えば、基準塩基については、１塩基あたり２５％から逸脱する任意の混合物）。いくつかの実施形態では、Ｒ”は約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＡを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＴを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＣを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％のＧを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”はランダムな文字列（文字列は、単一の塩基を含む任意の配列）と繰り返し文字列またはバイアス文字列との任意の組み合わせを含む配列である。
【００４９】
上記の式のいくつかの実施形態において、Ｒ”は、バイアスされた混合物からランダムに配置された塩基（例えば、基準塩基の場合、１塩基あたり２５％から逸脱する任意の混合物）；またはランダムな文字列（文字列は単一の塩基を含む任意の配列）と、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下の繰り返しまたはバイアスされた文字列との任意の組み合わせである。
【００５０】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｓ１は少なくとも１塩基以上のステム領域配列である。他の実施形態では、Ｓ１は、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長のステム領域配列である。
【００５１】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｓ２は少なくとも１塩基以上のステム領域配列である。他の実施形態では、Ｓ２は、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長の間のステム領域配列である。
【００５２】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｌ１は少なくとも１つの塩基のループ領域配列である。他の実施形態では、Ｌ１は、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長のループ領域配列である。
【００５３】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｌ２は少なくとも１つの塩基のループ領域配列である。他の実施形態では、Ｌ２は、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長のループ領域配列である。
【００５４】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｔはその５’及び３’末端に不対ドメインを含んでもよく、またはパドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）テール（例えば、ライブラリーと対になった２つのドメイン間のループ）であってもよい。
【００５５】
本開示のアプタマーは、任意の数のステム及びループ、ならびにステム及びループからなる他の構造（例えば、ヘアピン、バルジなど）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アプタマーのループは、主ライブラリー軸に直交するステムを形成する安定したループ−ループＷＣペアリングを形成するために埋め込まれた塩基を含む。他の実施形態では、アプタマー内の２つのループが一緒になって直交ステムを形成する。さらに他の実施形態では、アプタマーのループは、主ライブラリー軸に沿って既存のステムと安定したフーグスティーンペアリングを形成するために埋め込まれた塩基を含む。他の実施形態では、アプタマーのループは、アプタマーの任意のステムとフーグスティーンペアリングを形成し得る。
【００５６】
上記の式のいくつかの実施形態では、アプタマー配列は、１つ以上の多量体形成ドメインをさらに含む。
【００５７】
上記の式のいくつかの実施形態では、アプタマー配列は、１つ以上（例えば、約１〜２０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基長）のスペーサーをさらに含む。
【００５８】
本開示のアプタマーは、様々な方法で調製され得る。一実施形態では、アプタマーは化学合成により調製される。別の実施形態では、アプタマーは酵素合成により調製される。一実施形態では、酵素合成は、鋳型を使用してまたは使用せずに、ヌクレオチドを付加してプライマーを伸長し得る任意の酵素を使用して実行され得る。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ｋマー（例えば、ｋ≧２塩基）を一緒にアセンブルすることにより調製される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本開示のアプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにそれらの天然及び／または合成類似体の任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、アプタマーはＤＮＡを含む。一実施形態では、アプタマーはＲＮＡを含む。
【００６０】
他の実施形態において、本開示のアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部に任意の改変を含んでもよい。アプタマーの修飾としては、限定するものではないが、スペーサー、リン酸化、リンカー、結合化学、フルオロフォア、クエンチャー、光反応性、及び修飾塩基（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、ＰＳ、メチル化、２−Ｏ−メチル、ハロゲン化、超強塩基、ｉｓｏ−ｄＮ、逆塩基、Ｌ−リボース、骨格としての他の糖など）が挙げられる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示のアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部的に、外部の非核酸分子に結合され得る。非核酸分子の非限定的な例としては、限定するものではないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、低分子薬、単糖類及び多糖類、脂質、抗体及び抗体断片、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６２】
本開示のアプタマーは、生物学的機能を有する任意のドメインを含んでもよい。本明細書に記載のアプタマーの生物学的機能の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＲＮＡ転写の鋳型としての機能、タンパク質への結合、認識、及び／または活性の調節、転写因子への結合、特殊化された核酸構造（例えば、Ｚ−ＤＮＡ、Ｈ−ＤＮＡ、Ｇ−ｑｕａｄなど）、制限酵素の酵素基質としての作用、特定のエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、組換え部位、編集部位、またはｓｉＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を調節する。別の実施形態では、アプタマーは少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、アプタマーは少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。
【００６３】
他の実施形態では、本開示のアプタマーは、いくつかの公知の方法のいずれか１つによって構築された核酸ナノ構造に組み込むための任意のドメインを含んでもよい（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６１８−６２１（２００４）；Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：２９７−３０２（２００６）；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７４−７７（２００９）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：７２５−７３０（２００９）；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８５：６２３−６２６（２０１２）；Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：１１７７−１１８３（２０１２）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態では、本開示のアプタマーは、分子論理及び計算の機能を果たす任意のドメインを含んでもよい（Ｓｅｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５８５−１５８８（２００６）；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ６：２５９８−２６０３（２００６）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：３６８−３７２（２０１１）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）；Ａｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：３５３−３５７（２０１４）、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示のアプタマーは、標的（例えば、真核生物または原核生物の細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の負の選択サイクルを受ける。他の実施形態では、本開示のアプタマーは、標的（例えば、真核細胞または原核細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の正の選択サイクルを受ける。
【００６５】
本開示のアプタマーは、溶液中にあってもよいし、固相（例えば、表面、粒子、樹脂、基質など）に付着してもよい。いくつかの実施形態では、アプタマーは表面に付着している。一実施形態では、表面はフローセル表面である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示のアプタマーは、アプタマーライブラリーで合成される。本開示のアプタマーライブラリーは、様々な方法で調製され得る。一実施形態では、アプタマーライブラリーは化学合成により調製される。別の実施形態では、アプタマーライブラリーは、酵素合成により調製される。一実施形態では、この酵素合成は、鋳型を使用してまたは使用せずに、ヌクレオチドを付加してプライマーを伸長し得る任意の酵素を使用して行われ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの天然及び／または合成類似体の任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、ＤＮＡを含む。一実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーはＲＮＡを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、アプタマーライブラリーで合成されるアプタマーは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然または合成塩基、塩基類似体、またはそれらの組み合わせ）１０Ｋ種（Ｋ≧２）のコレクションであり、１種あたりＺコピー（１≦Ｚ≦Ｋ−１）がある。
【００６９】
他の実施形態において、本開示のアプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部に、任意の改変を含んでもよい。アプタマーの修飾としては、限定するものではないが、スペーサー、リン酸化、リンカー、結合化学、フルオロフォア、クエンチャー、光反応性修飾、及び修飾塩基（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、ＰＳ、メチル化、２−Ｏ−メチル、ハロゲン化、超強塩基、ｉｓｏ−ｄＮ、逆塩基、Ｌ−リボース、骨格としての他の糖）が挙げられる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部で外部の非核酸分子に結合されてもよい。非核酸分子の非限定的な例としては、限定するものではないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、低分子薬、単糖類及び多糖類、脂質、抗体及び抗体断片、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７１】
アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、生物学的機能を有する任意のドメインを含んでもよい。本明細書に記載のアプタマーの生物学的機能の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＲＮＡ転写の鋳型としての機能、タンパク質への結合、認識、及び／またはタンパク質の活性調節、転写因子への結合、特殊化された核酸構造（例えば、Ｚ−ＤＮＡ、Ｈ−ＤＮＡ、Ｇ−ｑｕａｄなど）、制限酵素の酵素基質としての作用、特定のエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、組換え部位、編集部位、またはｓｉＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を調節する。別の実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。
【００７２】
他の実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、いくつかの公知の方法の１つによって構築された核酸ナノ構造への組み込みのための任意のドメインを含んでもよい（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６１８−６２１（２００４）；Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：２９７−３０２（２００６）；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７４−７７（２００９）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：７２５−７３０（２００９）；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８５：６２３−６２６（２０１２）；Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：１１７７−１１８３（２０１２）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態では、本開示のアプタマーは、分子論理及び計算の機能を果たす任意のドメインを含んでもよい（Ｓｅｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５８５−１５８８（２００６）；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ６：２５９８−２６０３（２００６）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：３６８−３７２（２０１１）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）；Ａｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：３５３−３５７（２０１４）、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、標的（例えば、真核細胞または原核細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の負の選択サイクルを受ける。他の実施形態では、本開示のアプタマーは、標的（例えば、真核細胞または原核細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の正の選択サイクルを受ける。
アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、溶液中にあっても、固相（例えば、表面、粒子、樹脂、基質など）に付着していてもよい。いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは表面に付着している。一実施形態では、表面はフローセル表面である。
【００７４】
固定されたアプタマークラスター
特定の態様では、表面に固定された複数のアプタマークラスター（例えば、本明細書で提供されるアプタマーライブラリー由来のアプタマーのクラスター）にまたがって標的を含む試料を流すことにより、標的に結合するか及び／または調節するアプタマーを特定する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、表面は任意の固体支持体であってもよい。いくつかの実施形態では、表面はフローセルの表面である。いくつかの実施形態において、表面はスライドまたはチップである（例えば、遺伝子チップの表面）。いくつかの実施形態では、表面はビーズ（例えば、常磁性ビーズ）である。
【００７５】
特定の実施形態では、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、表面上に固定されたアプタマークラスターを生成し得る。いくつかの実施形態では、アプタマークラスターは表面に直接プリントされる。例えば、いくつかの実施形態において、アプタマークラスターは、ガラススライド上に細いピンでプリントされるか、フォトリソグラフィーを使用してプリントされるか、インクジェットプリントを使用してプリントされるか、または微小電極アレイ上の電気化学によってプリントされる。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７個の別個のアプタマークラスターが表面にプリントされる。いくつかの実施形態では、各々のアプタマークラスターは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００個の同一のアプタマー分子を含む。有利なことに、マイクロアレイの直接プリントにより、既知の配列のアプタマーを表面の所定の位置に特異的に固定可能になり、その後の配列決定が不要になる場合がある。
【００７６】
特定の実施形態では、表面に固定されたアプタマークラスターは、最初にアプタマー（例えば、本明細書に開示されたアプタマーライブラリーから）を表面に固定すること（例えば、各々のアプタマーが固定される位置はランダムである）により生成される。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０個の別個のアプタマーが表面上に固定される。アプタマーの固定化に続いて、局所増幅プロセス（例えば、ブリッジ増幅またはローリングサークル増幅）を実行して、それによって、元の固定されたアプタマーの固定化部位の近くに配置された各々の固定されたアプタマーのコピーのクラスターを生成する。特定の実施形態（例えば、ローリングサークル増幅が実施される実施形態）では、アプタマークラスターは、表面に直接固定されるのではなく、表面のナノピットまたは細孔に収容される。いくつかの態様において、増幅は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００個の同一のアプタマー分子を含む各々のアプタマークラスターをもたらす。特定の実施形態では、次いで、各々のアプタマークラスターの配列を表面上のその位置に関連付けるために、アプタマークラスターを配列決定する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定により）。存在する場合、一本鎖アプタマーのクラスターを生成するために、鎖のハイブリダイゼーションの影響を受けにくい（例えば、塩濃度及び／または温度による）条件下で、表面を洗浄することにより、相補鎖をアプタマークラスターから除去してもよい。次いで、表面（例えば、フローセル）は、本明細書で提供されるアプタマー特定方法で使用する準備が行われる。いくつかの実施形態において、固定されたアプタマークラスターは、１つの機器上で調製及び／または配列決定され、次いで、アプタマー特定のために別個の機器に移される。他の実施形態において、アプタマークラスターは、アプタマー特定に使用されるのと同じ機器で調製及び／または配列決定される。
【００７７】
上記の方法のいくつかの実施形態において、アプタマーまたはアプタマークラスター（例えば、アプタマーライブラリー由来）は、アプタマーを表面の高さにするアダプターを含む（例えば、細孔を備えるフローセルのように表面が平坦でない場合）。一実施形態において、アプタマーまたはアプタマークラスターは、フローセル表面上の細孔の内側に固定され、アダプターを使用して、アプタマーを表面に結合させて、アプタマーを表面の高さにする。いくつかの実施形態において、アダプターは核酸アダプター（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００塩基長の配列）である。いくつかの実施形態において、アダプター配列に相補的な配列は、アプタマースクリーニングの前にアダプターにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、アダプターは化学アダプター（例えば、アプタマーを表面に接続するポリマー）である。
【００７８】
アプタマーライブラリースクリーニング
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、標的に特異的に結合するか、及び／または調節する１つ以上のアプタマーを特定する方法であり、この方法は、一般的に以下を含む：（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターと標的とを接触させること；及び（ｉｉ）標的に特異的に結合するか、及び／または調節する固定されたアプタマークラスターを特定すること。各々のアプタマークラスターの配列は表面上の特定の位置（例えば、本明細書で提供される方法に従って決定される）に関連付けられているため、その結合／変調に関与するアプタマーの配列が特定され、標的が結合するか、及び／または位置される位置が決定され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、標的は検出可能な標識で標識されるか、及び／または検出可能な標識を含む。この標的は、検出可能に直接（例えば、直接化学リンカーを介して）または間接的に（例えば、検出可能に標識された標的特異的抗体を使用して）標識され得る。標的が細胞である実施形態では、検出可能な標識が細胞によって内在化されるような条件下で、標的細胞を検出可能な標識とインキュベートすることにより、この標的細胞が標識され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマースクリーニング方法を実施する前に、標的を検出可能に標識する。いくつかの実施形態において、標的は、本明細書で提供されるアプタマースクリーニング方法の実施中に標識される。いくつかの実施形態において、この標的は、アプタマークラスターに結合した後に標識される（例えば、結合した標的を検出可能に標識された抗体と接触させることにより）。いくつかの実施形態では、任意の検出可能な標識が使用され得る。検出可能な標識の例としては、限定するものではないが、蛍光部分、放射性部分、常磁性部分、発光部分及び／または比色部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的は、蛍光部分に連結されるか、それを含むか、及び／またはそれによって結合される。蛍光部分の例としては、限定するものではないが、アロフィコシアニン、フルオレセイン、フィコエリトリン、ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０、ＥＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ＥＹＦＰ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＣｙＰｅｔが挙げられる。
【００８０】
標的は、非分子標的であっても、または超分子標的であってもよい。本開示のアプタマーが結合及び／または調節し得る標的の非限定的な例としては、限定するものではないが、細胞、細菌、真菌、古細菌、原生動物、ウイルス、ビリオン粒子、合成及び自然発生の顕微鏡的粒子、及びリポソームが挙げられる。いくつかの実施形態では、フローセルに導入される標的は、生／天然である。他の実施形態において、フローセルに導入される標的は、任意の溶液に固定されている。
【００８１】
いくつかの実施形態では、標的は細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞である。細菌の非限定的な例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ及びＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅが挙げられる。例示的な種としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ．  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ニワ���リ、ネコ、イヌ、フェレットまたは霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などの非ヒト動物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、寄生虫細胞（例えば、マラリア細胞、リーシュマニア細胞、クリプトスポリジウム細胞またはアメーバ細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなどの真菌細胞である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、細胞はがん細胞（例えば、ヒトがん細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、任意のがん性または前がん性腫瘍由来である。がん細胞の非限定的な例としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮由来のがん細胞が挙げられる。さらに、がんは具体的には以下の組織型のものであってもよいが、これらに限定されない：新生物、悪性、癌腫、がん、未分化、巨細胞及び紡錘細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、毛母癌、移行細胞癌、乳頭移行細胞癌、腺癌、ガストリノーマ、悪性、胆管癌、肝細胞癌、肝細胞癌と胆管癌の組み合わせ、小柱腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープの腺癌、腺癌、家族性大腸ポリポーシス、固形癌、カルチノイド腫瘍、悪性、分枝肺胞腺癌、乳頭腺癌、嫌色素性癌、好酸性癌、好酸性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞性腺癌、乳頭及び濾胞性腺癌、非被包性硬化癌、副腎皮質癌、子宮内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳垢腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭嚢胞腺癌、乳頭漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢細胞癌、ムチン性腺癌、印環細胞癌、浸潤管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、ページェット病、乳腺、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生随伴腺癌、胸腺腫、悪性、卵巣間質腫瘍、悪性、莢膜腫、悪性、顆粒膜細胞腫瘍、悪性および芽球腫、悪性、セルトリ細胞癌、ライディッヒ細胞腫瘍、悪性、脂質細胞腫瘍、悪性、傍神経節腫、悪性、乳腺外傍神経節腫、悪性、褐色細胞腫、グロマン肉腫、悪性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒色腫巨大色素性母斑、類上皮細胞黒色腫、青母斑、悪性、肉腫、線維肉腫、線維性組織球腫、悪性、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胚性横紋筋肉腫、肺胞性横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、間質肉腫、混合腫瘍、悪性、ミュラー混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、間葉腫、悪性、ブレンナー腫瘍、悪性、葉状腫瘍、悪性、滑膜肉腫、中皮腫、悪性、発芽細胞腫、胎児性癌、奇形腫、悪性、卵巣甲状腺腫、悪性、絨毛腫、中腎腫、悪性、血管肉腫、血管内皮腫、悪性、カポジ肉腫、血管周囲細胞腫、悪性、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍皮質骨肉腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、悪性、間葉性軟骨肉腫、骨の巨大細胞腫瘍、ユーイング肉腫、歯原性腫瘍、悪性、エナメル上皮歯牙肉腫、エナメル上皮腫、悪性、エナメル芽細胞性線維肉腫、松果体腫、悪性、脊索腫、神経膠腫、悪性、上衣細胞腫、星状細胞腫、原形質星細胞腫、線維性星状細胞腫、星状芽細胞腫、グリア芽細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起膠腫、原始神経外胚葉、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽腫、網膜芽腫、嗅神経原性腫瘍、髄膜腫、悪性、神経線維肉腫、神経鞘腫、悪性、顆粒細胞腫瘍、悪性、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、傍肉芽腫、悪性リンパ腫、小リンパ球、悪性リンパ腫、大細胞、びまん性、悪性リンパ腫、濾胞、菌状息肉腫、その他の特定の非ホジキンリンパ腫、悪性組織球症、多発性骨髄腫、肥満細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、骨髄肉腫、及びヘアリー細胞白血病。
【００８３】
いくつかの実施形態では、標的はウイルスである。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＨＡＶ−６、ＶＺＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、またはエボラウイルスである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。特定の実施形態では、タンパク質標的がスクリーニングされるとき、それらはビーズ（例えば、検出可能に標識されたビーズ）上に固定される。いくつかの実施形態では、タンパク質標的は、検出可能な部分に連結されている。標的タンパク質の非限定的な例としては、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦα受容体、ＣＤ５２、ＩＬ−２Ｒα、Ｂ細胞活性化因子、ＶＥＧＦ、ＣＤ３０、ＩＬ−１β、上皮成長因子受容体、ＣＤ３８、ＲＡＮＫリガンド、補体タンパク質Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ３、アルファ−４インテグリン、ＩｇＥ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＩＬ−６Ｒ、ＥｒｂＢ２、ＩＬ−１２、及びＩＬ−２３が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、がん関連抗原である。がん関連抗原の例としては、限定するものではないが、アジポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、α−アクチニン−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＬＫ、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、ベータカテニン、ＢＩＮＧ−４、ＢＩＲＣ７、ＣＡ−１２５、ＣＡ９、ＣＡＬＣＡ、がん胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＬＲ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２７４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリンＡ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、上皮腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＣＲＬ３、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＦＯＬＲ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２  ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸内カルウボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＩＴ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＣＣＤＣ１１０としても公知のＫＭＨＮ１、ＫＲＡＳ、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、ＬＧＲ５、ＬＭＰ２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍ��ｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、Ｍｉｄｋｉｎｅ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ１６、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ネオ−ＰＡＰ（ｎｅｏ−ＰＡＰ）、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ＯＸ４０、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ＰＬＡＣ１、ＰＭＥＬ、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、多型上皮ムチン（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＲＬＲ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＯＲ１、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、セセルニン１、ＳＩＲＴ２、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＮＲＰＤ１  ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、スルビビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１または−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＥＲＴ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トンプソン−ヌーヴェル（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−ｎｏｕｖｅｌｌｅ）抗原、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＵＰＫ３Ａ、ＶＥＧＦ、ＶＴＣＮ１  ＷＴ１、及びＸＡＧＥ−１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はネオ抗原（ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、調節される細胞の特性は、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、細胞形態、細胞活性化、リン酸化、カルシウム動員、脱顆粒、細胞移動、及び／または細胞分化である。特定の実施形態では、標的は、標的に対する生物学的または化学的効果の検出を可能にする検出可能な標識に連結されるか、結合されるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識とは蛍光色素である。蛍光色素の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、及び酸化還元電位色素が挙げられる。一実施形態では、標的は、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素で標識される。
【００８６】
特定の実施形態では、標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで、標的へのアプタマーの曝露前に標識されている。
【００８７】
いくつかの実施形態において、標的は、標的へのアプタマーの曝露後に標識される。一実施形態では、標的は、蛍光標識抗体、アネキシンＶ、抗体断片、及び人工抗体ベースの構築物、融合タンパク質、糖、またはレクチンで標識されている。別の実施形態では、標的は、蛍光標識抗体、アネキシンＶ、抗体断片及び人工抗体ベースの構築物、融合タンパク質、糖、またはレクチンで、標的へのアプタマーの曝露の後に、標識される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、標的細胞は蛍光色素で標識されている。蛍光色素の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、及び酸化還元電位色素が挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素で標識されている。特定の実施形態では、標的細胞は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、標的細胞は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで、細胞へのアプタマーの曝露前に標識されている。いくつかの実施形態において、標的細胞は、標的へのアプタマーの曝露後に標識される。一実施形態では、標的細胞は、蛍光標識抗体またはその抗原結合断片、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで標識される。一実施形態において、標的細胞は、蛍光標識抗体またはその抗原結合断片、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで、細胞へのアプタマーの曝露後に標識される。
【００９０】
表面上の検出可能なマーカーの位置は、例えば蛍光顕微鏡法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定され得る。
【００９１】
図１は、本明細書で提供される方法の特定の実施形態を示す例示的なワークフローを提供する。このワークフローは、あたかもＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のように選択及び準備された最初のアプタマーライブラリー（例えば、本明細書で提供されるアプタマーライブラリー）から始まる。このライブラリーは、例えば、新しく合成されてもよく、または以前の選択プロセスの出力であってもよい。このプロセスには、１つ以上の正の選択サイクル、１つ以上の負の選択サイクル、または両方を、組み合わせ及び配列のいずれかで含み得る。
【００９２】
準備されたライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルのアダプターにマウントされる。ブリッジＰＣＲ増幅は、初期ライブラリーの各単一配列を、同じ配列の約１００，０００コピーのクラスターに変換する。次いで、このライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定される。このプロセスにより、ライブラリーの各配列をフローセル表面の特定の座標セットにリンクするマップが作成される。
【００９３】
合成による配列決定のプロセスで追加された、ライブラリー由来の鎖に相補的な鎖は、多数の方法のうちいずれか１つ（例えば、界面活性剤、変性剤など）によって除去される。次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアダプター、及びＰＣＲプライマーに相補的なオリゴヌクレオチド鎖をフローセルにポンピングし、アプタマー領域のみを一本鎖にする。ＲＮＡアプタマーがライブラリーの一部として合成される場合、転写は多くの方法（例えば、Ｔｅｒ結合Ｔｕｓタンパク質、ビオチン結合ストレプトアビジンタンパク質）のいずれか１つによって開始及び停止される。
【００９４】
表面上の全てのオリゴヌクレオチドが折り畳みプロトコールに従って折り畳まれて適切な３Ｄ構造をとることができるように、フローセルの温度を上げた後、冷却する。この状態では、オリゴライブラリーは折りたたまれており、標的と係合する準備ができている。
【００９５】
標的を含む溶液を、機器のハードウェアを使用してフローセルに流す。標的に対する生物学的または化学的効果を報告する目的で、フローセル／機器に導入する前に蛍光色素で標的を標識してもよい。標的を一定時間インキュベートして、効果を発生させる。次に、生物学的または化学的効果（例えば、細胞の活性化、アポトーシスなど）を報告するための蛍光色素またはマーカーをフローセルにポンピングしてもよい（図１を参照）。
【００９６】
影響を受ける標的（ヒット）を画像分析によって認識して、対応する配列を分析する。抽出された配列を、結合及び機能について個別に合成及び試験する。
【実施例】
【００９７】
実施例１−アプタマーライブラリーの準備
アプタマーライブラリーは、フローセルの表面に既に付着している鎖を補完するためにサンプル配列の側面にアダプターＤＮＡ配列の添付を含んだ、Ｉｌｌｕｍｉｎａのハイスループット配列決定プラットフォーム試料調製キットを使用して調製した。調製したライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルの表面のアダプターにマウントした。
【００９８】
アプタマーライブラリーの調製には、アダプターを取り付けるために２ステップの「テール」ＰＣＲプロセスを使用した。ＰＣＲ反応ミックスには、表１に示す以下の成分を含んでいた。
【表１】
2020515271.tif 000002
【００９９】
プライマーは、アダプターがサンプル配列に対して特定の方向を持つように設定した。これは、クラスター内のフォワードアプタマー配列を、１回の読み取りで保持するように行った。
【０１００】
１回目のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの配列：
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ７側スタブフォワードプライマー
ＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＡ  ［配列番号１］；及び
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ５側スタブリバースプライマー
ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＴＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡ  ［配列番号２］
最初の反応に使用されたＰＣＲプログラムは、以下の表２に示されている。
【表２】
2020515271.tif 000003
【０１０１】
最初のＰＣＲ反応の生成物（ＰＣＲ  １）は、２回目のＰＣＲ反応の入力である。
【０１０２】
２回目のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの配列：
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ７側開始
ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧ  ［配列番号３］；及び
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ５側開始
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧ  ［配列番号４］。
【０１０３】
２番目の反応に使用されるＰＣＲプログラムは、以下の表３に示されている：
【表３】
2020515271.tif 000004
【０１０４】
完成したライブラリーには、濃度のｑｂｉｔチェックならびにライブラリーのサイズ及び副産物をチェックするためのタップステーション／フラグメントアナライザー（断片分析器）を含む品質管理を行った。クラスターの生成及び配列決定は、シーケンシングプラットフォーム及びＩｌｌｕｍｉｎａのプロトコールに従って実行した。配列決定プロセスの後、変性によりクラスターが一本鎖型で提供される。その後、アダプター及びプライマーがブロックされ、アプタマーは、それらの折り畳み緩衝液中で、その３Ｄの高次構造に折り畳まれる。
【０１０５】
クラスターの生成及び配列決定
ブリッジＰＣＲ増幅を使用して、初期ライブラリーの由来の各単一配列を、同じ配列の約１００，０００コピーのクラスターに変換した。その後、クラスタライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定した。このプロセスにより、ライブラリー由来の各配列をフローセル表面の特定の座標セットにリンクするマップが作成された。
【０１０６】
合成による配列決定のプロセスで追加されたライブラリーからの相補鎖を除去し、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及びＰＣＲプライマーに相補的なオリゴヌクレオチド鎖を、フローセルにポンピングし、アプタマー領域のみを一本鎖にした。ＲＮＡアプタマーの場合、転写は多数の方法（Ｔｅｒ結合Ｔｕｓタンパク質、またはビオチン結合ストレプトアビジンタンパク質など）のうちのいずれか１つによって開始及び停止された。
【０１０７】
フローセルの温度を上げてから冷却し、フローセルの表面上の全てのオリゴヌクレオチドが適切な折りたたみ緩衝液中で適切な３Ｄ高次構造をとるようにさせた。例えば、使用された１つの折りたたみ緩衝液レシピ（セルセレックス紙）には、１リットルのＰＢＳ、５ｍｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、及び４．５ｇのグルコースを含んでいた。
【０１０８】
標的導入
標的（例えば、細胞、細菌、粒子、ウイルス、タンパク質など）は、機械のハードウェアを使用して、使用される環境（例えば、ヒト血清、ＰＢＳ、ｌｂ）に応じて、所望の結合緩衝液でシステムに導入した。一般的な結合緩衝液レシピのオプションの１つは（セルセレックス紙）：１リットルのＰＢＳ、５ｍｌの１ＭのＭｇＣｌ２、４．５ｇのグルコース、１００ｍｇのｔＲＮＡ、及び１ｇのＢＳＡである。標的は、フローセル／機械への導入の前または後に標識され、特定の時間インキュベートされて効果が生じた。
【０１０９】
プラットフォームの励起源と発光フィルターに適合する種々のフルオロフォアを使用して、標的を標識してもよい。標識化は、標的で利用可能な任意の可能なドッキング部位を通じて行ってもよい。標識剤の例としては、限定するものではないが、ＤｉＩ、抗ＨＬＡ＋二次Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０、抗ＨＬＡ  ＰＥ−Ｃｙ５、及びＤｙｌｉｇｈｔ  ６５０が挙げられる。
【０１１０】
機能的アプタマーのスクリーニングでは、蛍光レポーターを使用して効果が視覚化され得る。例えば、フローセルへの７ＡＡＤの導入を使用して、標的を標識して細胞死をスクリーニングしてもよく、また、アネキシンＶフルオロフォアコンジュゲートを使用して、アポトーシスをスクリーニングするために標的を標識してもよい。レポーター剤、その濃度、インキュベーション時間、及び特定のレシピプロトコールは、特定のスクリーニング効果に従って調整する必要がある。
【０１１１】
初期ライブラリーを配列決定した後、標的細胞を導入し、機能性オリゴヌクレオチドクラスターを取得する代表的な方法
８０μｌの「取り込みミックス緩衝液（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ）」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次に、温度を５５℃に設定する。６０μｌの「取り込みミックス（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）」を、２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、８０秒後に１０μｌの「取り込みミックス」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにフローセルにポンピングする。２１１秒後、温度を２２℃に設定し、６０μｌの「取り込みミックス緩衝液」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次に、７５μｌの「スキャンミックス（Ｓｃａｎ  Ｍｉｘ）」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。
【０１１２】
次に、この方法は、クラスターの平面に焦点を合わせ、顕微鏡とフローセルの平面を位置合わせするように調整する。１００μｌの「取り込みミックス緩衝液」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。上記の組み込みステップを９９回反復する。
【０１１３】
温度制御をオフにして、１２５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ」を、２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次に、温度を５５℃に設定し、７５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｉｘ」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。８０秒後、２５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｉｘ」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。
さらに８０秒後、２５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｉｘ」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。８０秒後、温度を２２℃に設定する。次いで、温度制御をオフにして、６０μｌの「取り込みミックス緩衝液」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次いで、各々の水チューブに残っている容積をチェックして、適切な送達を確認する。
【０１１４】
その後、変性が起こり、キャッピングが続く。変性ステップの場合、温度は１２０秒間２０℃に設定する。７５μｌの「洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）」をフローセルに６０μｌ／分の速度でポンピングし、続いて７５μｌの「Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を６０μｌ／分の速度で、７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でポンピングする。
【０１１５】
キャッピングステップでは、７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でフローセルにフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。次に、８０μｌの「５’キャップ」を８０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を、１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を６０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を９０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を、１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１５０秒間８５℃に設定する。
【０１１６】
１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１８０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２１０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２４０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２７０秒間８５℃に設定する。７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。
【０１１７】
３’キャップの場合、８０μｌの「３’キャップ」を８０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を６０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を９０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１５０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を、１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１８０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２１０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２４０秒間８５℃に設定する。
【０１１８】
１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２７０秒間８５℃に設定する。７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を０℃に設定する。２００μｌの「折り畳み緩衝液（Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（冷却）」を２５０μｌ／分の速度で、続いて１６０μｌの折り畳み緩衝液（冷却）」を４０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を６００秒間０℃に設定する。
【０１１９】
その温度を１２０秒間３７℃に上げる。これに結合ステップが続く。
【０１２０】
結合ステップでは、８０μｌの「結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３７℃に設定する。８０μｌの「標的＃１」を１００μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３００秒間３７℃に設定する。１０μｌの「標的＃１」を、再び１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３００秒間３７℃に設定する。最後に、１０μｌの「標的＃１」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２７００秒間３７℃に設定する。
【０１２１】
その後、３つの連続した取り込みステップ及び洗浄ステップを続けて、未結合の標的を除去し、これは、取り込み、８０μｌの「結合緩衝液」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングすること、取り込み、８０μｌの「結合緩衝液」を８０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングすること、取り込み、８０μｌの「結合緩衝液」を２００μｌ／分の速度でフローセルにポンピングすること、及び取り込みからなる。
【０１２２】
上記の変性、キャッピング、結合、取り込み、洗浄の各ステップは、配列決定と標的の導入が完了するまで繰り返される。次いで、種々の標的を追加して、アプタマーへの結合及び／または活性を評価する。
【０１２３】
図３は、フローセルに結合されたハナ（Ｈａｎａ）セルの動きの低速度撮影の画像を示している。その結果、セルは実際には表面自体ではなく表面自体に結合された配列によって結合されているため、自由に移動するが、その場所に限定されていることが示されている。
【０１２４】
実施例２−機能アプタマーの特定
本明細書で提供される方法の実施形態を使用して、新たに単離された（１２時間）ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞においてアポトーシスを誘導するアプタマーを特定した。
【０１２５】
本明細書に記載のアプタマーライブラリーをフローセル上に固定化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器でブリッジＰＣＲを実施して、クラスター化ライブラリーを生成した。増幅プロセスの間、クラスター化ライブラリーは、フローセルが配列決定後に破壊されないように配列決定プロセスの最後にＰＢＳを漂白試薬の代わりに使用したことを除いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａのプロトコールに従って配列決定した。公知のプローブはライブラリーの０．１〜１％を占めていたため、得られた配列決定マップを、後で生成される蛍光顕微鏡画像に合わせることができた。
【０１２６】
最終的なＰＢＳ洗浄後、フローセルを、温度制御機能を備えた蛍光顕微鏡にロードし、位相でクラスターを画像化してクラスターを見て、緑色の蛍光チャンネルで画像化してアポトーシス指標を見た。公知のプローブ配列の座標を使用して、顕微鏡で生成された画像を、シーケンサーによる配列決定プロセス中に生成された配列クラスターマップと整列させた。
【０１２７】
骨髄吸引液から新たに単離されたヒト乳癌細胞を、１０６細胞／ｍＬの濃度で調製し、１％アルブミン及び１ｍＭのＭｇ２＋を含むＰＢＳ中のフローセルチャンバー床で１００ミクロン２あたり平均細胞密度が約１になるようにした。製造業者の指示に従って、標的細胞に緑色蛍光カスパーゼ３／７活性レポーター色素をロードして、洗浄した。シリンジポンプを使用して、細胞をフローセルにポンピングした。
【０１２８】
フローセルは、Ｐｈａｓｅ及びＧｒｅｅｎチャネルのｔ＝０で画像化し、次いで３７度でインキュベートして、３０分間隔で再度画像化した。標的細胞が機能的アプタマーに係合している場合、アプタマー誘発アポトーシスを、緑色蛍光によって検出した。漸増するポンプ圧力下で細胞を同じ緩衝液で洗浄し、さらに画像化して、標的細胞に対してより高い親和性を有する機能的アプタマーを特定した。
【０１２９】
クラスター化されたアプタマーライブラリー分析は、標的特異的なアプタマー配列を特定するために同じ配列決定されたライブラリーを使用して、フローセルの異なるレーンのカウンター標的として末梢血単核細胞を使用して繰り返した。計算解析を実行して、標的またはカウンター標的細胞がアプタマークラスターに結合し、アポトーシスを受けた座標を変換して、標的細胞対カウンター標的細胞のアポトーシス機能を優先的に媒介するアプタマー配列を特定した。特定のドナーからの腫瘍細胞に対する標的選択的アポトーシスを特異的に媒介し得る１，０００を超えるアプタマーが、ライブラリーから首尾よく特定された。
【０１３０】
実施例３−Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーでの機能アプタマーの特定
本明細書で提供される方法の実施形態を使用して、新たに単離された（１２時間）ヒト腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するアプタマーを特定する。
【０１３１】
本明細書に記載のアプタマーライブラリーを、フローセル上に固定し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器でブリッジＰＣＲを実施して、クラスター化ライブラリーを生成した。増幅プロセス中、配列決定後にフローセルが破壊されないように、配列決定プロセスの最後にＰＢＳを漂白試薬の代わりに使用したことを除いて、クラスター化されたライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａのプロトコールに従って配列決定する。
【０１３２】
最終的なＰＢＳ洗浄後、クラスターを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの緑色蛍光チャンネルで画像化して、アポトーシス指標を見る。骨髄吸引液から新たに単離されたヒト乳癌細胞を、１０６細胞／ｍＬの濃度で調製し、１％アルブミン及び１ｍＭのＭｇ２＋を含むＰＢＳのフローセルチャンバー床で１００ミクロン２あたり平均細胞密度が約１になるようにする。製造業者の指示に従って、標的細胞に緑色蛍光カスパーゼ３／７活性レポーター色素をロードして、洗浄する。セルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器を使用してフローセルにポンピングされる。
【０１３３】
フローセルの画像化中に、追加の配列決定サイクルを実行する。フローセル内の標的細胞の位置は、細胞特異的な蛍光シグナルの存在に基づいて決定される。アプタマー誘導アポトーシスは、１つ以上のアプタマークラスターに関連付けられたフローセル座標での蛍光シグナルの出現によって検出される。セルはいくつかのクラスターの「スポット」としてシーケンサーに表示される。アポトーシスを起こしている標的細胞は、活性レポーター色素の蛍光発光に基づいて特定される。
【０１３４】
クラスター化されたアプタマーライブラリー分析は、同じ配列決定されたライブラリーを使用してフローセルの異なるレーンでカウンター標的として非腫瘍細胞を使用して繰り返し、標的特異的なアプタマー配列を特定する。計算解析を実行して、標的またはカウンター標的細胞がアプタマークラスターに結合し、アポトーシスを受けた座標を変換して、標的細胞対カウンター標的細胞のアポトーシス機能を優先的に媒介するアプタマー配列を特定する。特定のドナーからの腫瘍細胞に対する標的選択的アポトーシスを特異的に媒介し得るアプタマーを、ライブラリーから特定する。
【０１３５】
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は、各々の個々の出版物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が支配する。
【０１３６】
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または慣用的な実験以下を使用して確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１】
2020515271.tif 000005
【図２】
2020515271.tif 000006
【図３】
2020515271.tif 000007
【図４】
2020515271.tif 000008
【図５】
2020515271.tif 000009
【国際調査報告】
2020515271.tif 000010
2020515271.tif 000011
2020515271.tif 000012
2020515271.tif 000013
2020515271.tif 000014
2020515271.tif 000015
2020515271.tif 000016
2020515271.tif 000017
2020515271.tif 000018