(57)【要約】  本発明は、ベルガモット果実（ダイダイ変種ベルガミア）の水性アルコール抽出物および少なくとも１種のリン脂質を含む粉末状固体組成物に関する。本発明は、また、前記組成物の製造方法に関する。本発明の組成物は、代謝異常症候群、脂質異常症および２型糖尿病の予防および／または治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む粉末状固体組成物を調製するための製造方法：
ａ）ベルガモット果実の水性アルコール抽出物を少なくとも１種の極性有機溶媒中に分散させ、そして、溶液または分散液が得られるまで混合し続ける；加熱を任意に適用する；該抽出物は、フラボノイドネオエリオシトリン、ナリンギンおよびネオヘスペリジンを含有する；
ｂ）次いで、少なくとも１種のリン脂質を、ベルガモット果実抽出物の溶液／分散液に添加し、その混合物を混合し続ける；少なくとも１種のリン脂質と、該抽出物のフラボノイドとの間の重量比は、６〜３０の範囲である；加熱を任意に適用する；
ｃ）次いで、該有機溶媒を除去して、粉末状固体組成物を得る。
【請求項２】
前記重量比が、６〜２０、好ましくは６〜１２の範囲である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のリン脂質が、ダイズ、ヒマワリまたは卵からのレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、同一または異なるアシル基は、大部分が、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のリン脂質が、レシチンである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
レシチン以外の、１２以上のＨＬＢ値を有する追加の界面活性剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記追加の界面活性剤が、スクロースエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンステアレート、Ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールサクシネート、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記追加の界面活性剤が、スクロースエステルおよびＤ−α−トコフェリルポリエチレングリコールサクシネートから選択される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記極性有機溶媒が、極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
前記極性プロトン性溶媒が、直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ８アルキルアルコールである、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記極性非プロトン性溶媒が、直鎖または分岐鎖のＣ１〜Ｃ８アルキルエステルまたはＣ１〜Ｃ８ジアルキルケトンから選択される、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記極性有機溶媒が、エチルアルコール、酢酸エチル、アセトン、イソブチルアルコール、イソプロピルアルコール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記有機溶媒が、エチルアルコールおよび酢酸エチルから選択される、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製造方法により得られる粉末状固体組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の粉末状固体組成物と、少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤および／または担体とを含む医薬製剤、栄養補助製剤ならびに化粧用製剤。
【請求項１５】
メタボリックシンドローム、脂質異常症および２型糖尿病の予防および／または治療に使用するための、請求項１３に記載の粉末状固体組成物または請求項１４に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、ベルガモット抽出物およびリン脂質を含む粉末状固体組成物に関する。
【０００２】
本発明は、また、粉末固体の形態での前記組成物の製造方法に関する。さらに、本発明は、前記組成物を含む医薬製剤、栄養補助製剤および化粧用製剤、ならびに前記組成物および製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
フラボノイドは、果物や野菜に天然に存在するポリフェノール系化合物の重要なファミリーである。
【０００４】
メタボリックシンドロームの予防および改善、ならびに心血管疾患、高脂血症および２型糖尿病のような関連する病状の治療における、フラボノイドの好ましい効果は、いくつかの研究（Galleano M.ら、「Flavonoids and metabolic syndrome」、Ann．NY Acad．Sci．（2012）、1259：87-94）によって確認されている。
【０００５】
柑橘類は、フラボノイドの重要な供給源である。柑橘類の最も重要なフラボノイドには、ジオスメチン、ジオスミン、ヘスペリジン、ナリンギン、ネオヘスペリジン、ノビレチン、ケルセチン、ルチンおよびフラボンタンゲレチンが含まれる。代謝異常症候群の治療、脂質異常症の正常化、および２型糖尿病の管理における、柑橘類フラボノイドの潜在的な有益な効果は、十分に文書化されている（Ashraful Alam M.ら、「Effect of Citrus Flavonoids, Naringin and Naringenin on Metabolic Syndrome and Their Mechanisms of Action」、 Adv. Nutr. (2014)、vol.5：404-417；Assiniら、「Citrus flavonoids in lipid metabolism」、Curr. Opin. Lipidol. (2013)、vol.24(1): 34-40; Un Ju Jungら、「Effect of citrus flavonoids on lipid metabolism and glucose-regulating enzyme mRNA levels in type-2 diabetic mice」、Int. J. Biochem. Cell. Biol. (2006)、vol.38(7)、1134-145）。
【０００６】
柑橘類の中で、ベルガモットは、他のどの柑橘類においても見つけることができない、ナリンギン、ネオヘスペリジン、ブルテリジン(brutelidin)およびメリチジン(melitidin)等の特定のフラバノン−７−Ｏ−グリコシドの重要な供給源であり、臨床試験で潜在的な健康上の利益があることが証明されている（Mollace V.ら、「Hypolipemic and hypoglycaemic activity of bergamot polyphenols: From animal models to human studies」、Fitoterapia (2011)、3: 309-316）。
【０００７】
最近、Ｌｏｍｂａｒｄｏら（US 8,741,362 B2）によって、コレステロール、血糖の減少およびメタボリックシンドロームの治療に有効であることが証明されている特定のポリフェノール組成物を用いて、ベルガモット果実の水性アルコール抽出物が開発された。
【０００８】
他のすべてのフラボノイドに関しては、ベルガモット果実抽出物のフラバノン−７−Ｏ−グリコシドは、経口バイオアベイラビリティーが乏しいという特徴がある。その結果、著しい健康上の利益を得るためには、高経口用量のベルガモット果実抽出物が必要とされる。
【０００９】
従って、改善された経口バイオアベイラビリティーを有する代替のベルガモット果実抽出物誘導体を見出す必要性が依然としてある。
【００１０】
本発明の概要
本発明は、以下の工程を含む粉末状固体組成物の製造方法に関する：
ａ）ベルガモット果実の水性アルコール抽出物を少なくとも１種の有機溶媒中に分散させ、溶液または分散液が得られるまで混合し続ける；加熱を任意に適用する；
ｂ）次いで、少なくとも１種のリン脂質を、前記抽出物の溶液または分散液に添加し、その混合物を混合し続ける；加熱を任意に適用する；
ｃ）次いで、前記有機溶媒を除去して、粉末組成物を得る。
【００１１】
本発明は、また、本発明の方法によって得られる少なくとも１種のリン脂質とベルガモット果実（ダイダイ変種ベルガミア（Citrus aurantium var. bergamia））の水性アルコール抽出物とを含む粉末状固体組成物に関し、さらに、本発明は、また、前記組成物を含む、医薬製剤、栄養補助製剤および化粧用製剤に関する。
【００１２】
本発明に係る粉末組成物および前記組成物を含有する製剤は、メタボリックシンドローム、脂質異常症および２型糖尿病の予防および／または治療に有用である。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の方法によって得られる少なくとも１種のリン脂質とベルガモット果実（ダイダイ変種ベルガミア）の水性アルコール抽出物とを含む粉末状固体組成物に関する。
【００１４】
ベルガモット果実の水性アルコール抽出物は、３種の主要なフラバノン−７−Ｏ−グリコシド、即ち、前記抽出物の生物学的活性の主要な原因である、ネオエリオシトリン、ナリンギンおよびネオヘスペリジンの存在によって特徴付けられる。
【００１５】
驚くべきことに、本発明に係る組成物は、ベルガモット果実抽出物の活性成分（フラボノイド）、特に、フラバノン−７−Ｏ−グリコシド、特にナリンギン及びネオヘスペリジンの改善された経口バイオアベイラビリティーによって特徴付けられることが発見され、それらは、ラットでの薬物動態研究の血漿サンプルにおいて、分析された。
【００１６】
リン脂質は、大豆、ヒマワリまたは卵からのレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンを含む群から選択することができ、ここで同一または異なるアシル基は、大部分が、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、またはそれらの組み合わせに由来する。好ましくは、リン脂質はレシチンである。
【００１７】
少なくとも１種のリン脂質対ベルガモット果実抽出物フラバノン−７−Ｏ−グリコシド（ネオエリオシトリン、ナリンギンおよびネオヘスペリジン）の重量比は、６〜３０、好ましくは６〜２０、より好ましくは６〜１２の範囲内である。
【００１８】
この比率のおかげで、ベルガモット果実抽出物の活性成分（フラボノイド）の改善された経口バイオアベイラビリティーが達成される。
【００１９】
粉末状固体組成物は、また、レシチン以外の、１２以上のＨＬＢ値を有する、追加の界面活性剤を含んでいても良い。この追加の界面活性剤は、製造工程中のベルガモット果実抽出物の有機溶媒における可溶化を高め、抽出物とリン脂質との相互作用を最大にする。さらに、追加の界面活性剤は、腸液中の粉末状固体分散体の濡れ性および速い分散性を高め、そしてより速くより高い吸収を促進し、それ故に、ベルガモット果実抽出物の活性成分のより高いバイオアベイラビリティーを促進する。
【００２０】
追加の界面活性剤は、スクロースエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンステアレート、Ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールサクシネート、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。スクロースエステルおよびＤ−α−トコフェリルポリエチレングリコールサクシネートが好ましいものである。
【００２１】
その物理的および技術的特性を改善する目的で、追加の成分をまた、粉末状固体分散体に添加して、錠剤およびカプセル剤などの従来の剤形へのより容易な組み込みを可能にすることもできる。
【００２２】
これらの追加の成分としては、例えば、セルロース粉末、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、マンニトール、マルトデキストリン、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、イソマルト、イヌリンなどの可溶性および不溶性充填剤；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天然ゴムなどの結合剤； 二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤および潤滑油を挙げることができる。
【００２３】
本発明は、また、水性アルコール性ベルガモット果実抽出物および少なくとも１種のリン脂質を含む粉末状固体組成物の調製のための製造方法に関する。
【００２４】
本発明に係る粉末状固体組成物を調製するための製造方法は、以下の工程を含む：
ａ）ベルガモット果実の水性アルコール抽出物を、少なくとも１種の適切な有機溶媒に分散させ、溶液または分散液が得られるまで混合し続ける；必要に応じて、加熱を任意に適用する；
ｂ）次いで、少なくとも１種のリン脂質を、ベルガモット果実抽出物の溶液／分散液に添加し、その混合物を混合し続ける；加熱を任意に適用する；
ｃ）次いで、前記有機溶媒を除去し、粉末固体の形態での組成物を得る。
【００２５】
適切な有機溶媒は、極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒などの、抽出物の全体的または少なくとも実質的な可溶化をもたらす極性有機溶媒である。
【００２６】
好ましくは、極性プロトン性溶媒は、直鎖または分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルアルコールであり、極性非プロトン性溶媒は、直鎖または分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルエステルまたはＣ１−Ｃ８ジアルキルケトンである。
【００２７】
選択された有機溶媒中のリン脂質の全体的なまたはイベント(event)部分的な可溶化もまた望ましい。
【００２８】
有機溶媒は、エチルアルコール、酢酸エチル、アセトン、イソブチルアルコール、イソプロピルアルコール、およびそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。エチルアルコールおよび酢酸エチルが好ましい。
【００２９】
活性成分のいかなる分解も引き起こさずに可溶化を促進するために、加熱を任意に適用する。
【００３０】
工程ｂ）の後、追加の界面活性剤および／または追加の成分を、得られた溶液（または分散液）に添加してもよく、異なる成分の相互作用を促進するために、適切な時間、これを混合し続ける。
【００３１】
溶媒は真空下で除去することができる。噴霧乾燥および凍結乾燥などの代替の乾燥方法もまた、有機溶媒を除去するために使用することができる。
【００３２】
次いで、得られた粉末組成物は、通常、キャリブレーションされ、そして最終的に粉砕されて、所望の粒径分布が得られる。
【００３３】
本発明は、また、本発明の組成物と少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤および／または担体とを含む、医薬製剤、栄養補助製剤および化粧用製剤に関する。
【００３４】
好ましくは、製剤は、経口投与用または局所投与用である。
【００３５】
生理学的に許容される賦形剤および／または担体は、例えば、崩壊剤、潤滑油、結合剤、コーティング剤、着色剤、吸収促進剤、可溶化剤、安定剤、香料、甘味剤、消毒剤、防腐剤、酸化防止剤などを挙げることができる。
【００３６】
本発明の製剤の剤形の例は、例えば、錠剤、チュアブル錠、硬ゼラチンカプセル剤、再構成用粉末剤、即席（extemporary）または即使用可能懸濁液剤を挙げることができる。
【００３７】
本発明の粉末状固体組成物およびその製剤は、代謝異常症候群、脂質異常症および２型糖尿病の予防および／または治療のために、単独でまたは他の植物抽出物と組み合わせて使用することができる。
【００３８】
ベルガモット果実の水性アルコール抽出物の有効成分（フラボノイド）のバイオアベイラビリティーの改善は、ベルガモット果実抽出物の薬理学的性能の改善および１日の投与量の大幅な削減を可能にする。
【００３９】
粉末状固形組成物を、水性アルコール性ベルガモット果実抽出物と比較して、ラットにおけるインビボ薬物動態研究において試験を行った。その例に報告されている研究の結果は、本発明の組成物として投与されたときのベルガモット果実抽出物の活性成分のバイオアベイラビリティーの増加を明らかに示している。
【００４０】
志願者に関する予備的な臨床試験もまた行われ、水性アルコール性ベルガモット果実抽出物と比較した本発明の組成物のコレステロール低下効果を評価した。
【００４１】
以下の例は、本発明をさらに説明する。
【００４２】
例
例１−ベルガモット果実の水性アルコール抽出物のレシチン系（lecithin based）粉末状固体組成物の調製。
【００４３】
３５０ｇのベルガモット果実の水性アルコール抽出物、４２０ｇのヒマワリレシチンおよび７０ｇのマルトデキストリンを、反応器中で８５００ｍＬのエチルアルコール中に懸濁させる。懸濁液を混合しながら７０℃で２時間加熱する。
【００４４】
次いで、柔らかい塊が得られるまで、溶媒を、真空（約２００ｍＢａｒ）下、７０℃で除去する。
【００４５】
乾燥塊（dry mass）が得られるまで、乾燥を、オーブン中で、真空下、５０℃で約１２時間完了する。
【００４６】
乾燥塊を、２ｍｍのふるいを通してキャリブレーションし、そして２％の二酸化ケイ素と混合して、自由流動性粉末を得る。
【００４７】
例２−追加の界面活性剤を含有するベルガモット果実の水性アルコール抽出物のレシチン系粉末状固形組成物の調製。
【００４８】
５００ｇのベルガモット果実の水性アルコール抽出物、７００ｇのヒマワリレシチンおよび５０ｇのスクロースモノパルミテートを、反応器中で約１０Ｌｔの酢酸エチル中に可溶化する。
【００４９】
得られた溶液に、微結晶セルロース１００ｇを加え、懸濁液を混合しながら７０℃で２時間加熱する。
【００５０】
次いで、柔らかい塊が得られるまで、溶媒を、真空（約２００ｍＢａｒ）下、７０℃で除去する。
【００５１】
乾燥塊が得られるまで、乾燥を、オーブン中で、真空下、５０℃で約１２時間完了する。
【００５２】
乾燥塊を、２ｍｍのふるいを通してキャリブレーションし、そして２％の二酸化ケイ素および１％のタルクと混合して、自由流動性粉末を得る。
【００５３】
例３−ラットの薬物動態学的研究
ナリンギンおよびネオヘスペリジンの血漿濃度を、例１で得られた組成物の単回投与量の経口投与後のラットにおいて測定し、そしてベルガモット果実の水性アルコール抽出物を投与して得られる血漿濃度と比較した。体重約３００ｇの雄のスプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラットを薬物動態実験に使用した。ベルガモット果実の水性アルコール抽出物の単回投与量５００ｍｇ／Ｋｇ、およびベルガモット果実の水性アルコール抽出物の約２００ｍｇ／Ｋｇに相当する、例１で得られた組成物の単回投与量５００ｍｇ／Ｋｇを、胃内強制栄養法により水懸濁液として投与した。投与から１および２時間後に、血液試料を採取した。血漿は、ＥＤＴＡの存在下、４℃で１０分間、２．０００ｒｐｍで遠心分離することによって血液試料から得た。適切な抽出手順の後、試料をナリンギンおよびネオヘスペリジン濃度について蛍光検出器を備えたＨＰＬＣにより分析した。
【００５４】
分析結果を以下の表１にまとめる：
【００５５】
【表１】
2020500895.tif 000002
【００５６】
例４−例１で得られた組成物を含有する製剤（錠剤）
例１で得られた組成物                        ５００．０ｍｇ
微結晶セルロース                            １５０．０ｍｇ
無水リン酸二カルシウム                      １０４．０ｍｇ
クロスカルメロースナトリウム                  ３０．０ｍｇ
二酸化ケイ素                                    ８．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                        ８．０ｍｇ
【００５７】
例１で得られた組成物１．０Ｋｇ、微結晶セルロース（直接圧縮グレード）０．３Ｋｇ、無水リン酸二カルシウム（直接圧縮グレード）０．２０８Ｋｇおよびクロスカルメロースナトリウム０．０６Ｋｇを、１０分間Ｖミキサーで混合した。１６ｇの二酸化ケイ素および１６ｇのステアリン酸マグネシウムを粉末混合物に添加し、そしてさらに２分間混合した。得られた混合物を、直径１１ｍｍの円形の凹型パンチを備えたシングルパンチ打錠機で圧縮した。
【００５８】
例５−例２で得られた組成物を含有する製剤（サイズ０の硬ゼラチンカプセル剤）
例２で得られた組成物                      ３５０．０ｍｇ
二酸化ケイ素                                  ５．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ５．０ｍｇ
【００５９】
例２で得られた組成物２．０Ｋｇを、二酸化ケイ素２８．５ｇおよびステアリン酸マグネシウム２８．５ｇと、２分間Ｖミキサーで混合した。その混合物を、サイズ０の硬ゼラチンカプセル剤に充填した。
【００６０】
例６−臨床試験
本発明の組成物のコレステロール低下効果を評価するために、志願者に関する予備的臨床試験をまた行った。
１０人の患者を、５００ｍｇの２つの硬ゼラチンカプセル剤、朝に１つ、夕方に１つ（毎日、合計１０００ｍｇ）で、３０日間連続して治療した。この研究の主目的は、３０日間の治療前後の、総コレステロール（ｔＣｈｏｌ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トリグリセリド（ＴＧ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）および血糖の変調を測定することにより、高血糖症に関連するまたは関連しない脂質異常症の患者における心血管リスクの軽減に関する臨床活動の評価でした。安全性もまた評価されました。
【００６１】
包含基準は次の通りであった：署名されたインフォームドコンセント；３０〜９０歳；ＩＩ型糖尿病の診断；空腹時血糖≧１１０ｍｇ／ｄｌ；高トリグリセリド血症（＞１７５ｍｇ／ｄｌ）の有無にかかわらず、単独の高コレステロール血症（低密度リポタンパク質ｃＬＤＬに結合したコレステロール≧１３０ｍｇ／ｄｌ）；「臨床診療における心血管疾患予防に関する欧州ガイドライン」（２０１２年）によって測定された中程度の心血管リスク。全ての併用治療は、試験開始の少なくとも３か月前に開始し、試験の全期間中、一定の治療計画において維持されなければならない。
【００６２】
除外基準は次の通りであった：明白な肝疾患、重度の胃腸障害、慢性腎不全、高カルシウム血症、ミオパチー、制御されていない糖尿病、心筋虚血、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩＩおよびＩＶの存在、アルコール乱用、精神障害および大鬱病の病歴、ＨＩＶまたは重篤な感染症または腫瘍、４ヵ月までに安定したスタチン療法、を伴う患者。
【００６３】
試験の間、患者は７日ごとに訪問され、そして、コンプライアンスが監視された。起こりうる副作用を監視するために、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、クレアチンを測定した。
【００６４】
１日１０００ｍｇで３０日間連続して治療すると、大多数の被験者において、総コレステロール、ＬＤＬ、ＴＧ、空腹時血糖が大幅に減少し、ＨＤＬが有意に増加した。その結果を表２に報告する。
【００６５】
２７７ｍｇ／ｄｌ  ｔＣｈｏｌ、１８４ｍｇ／ｄｌ  ＬＤＬ、および２５５ｍｇ／ｄｌ  ＴＧの初期平均値が、治療後、それぞれ１９５、１１３および１６４ｍｇ／ｄｌに減少した。
【００６６】
さらに、空腹時血糖の低下もまた観察された。
【００６７】
【表２】
2020500895.tif 000003
【国際調査報告】
2020500895.tif 000004