(57)【要約】  対象におけるケロイドを治療する方法であって、対象におけるケロイド又はケロイドを形成するリスクのある領域に医薬組成物を適用することを含み、組成物が、有効量のヒアルロナン及び有効量のコラーゲンを含み、ヒアルロナン対コラーゲンの単位体積あたりの重量比が１より大きい、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるケロイドを治療する方法であって、
対象におけるケロイド又はケロイドを形成するリスクのある領域に医薬組成物を適用することを含み、前記医薬組成物が、有効量のヒアルロナンと有効量のコラーゲンの有効量とを含み、単位体積あたりの前記ヒアルロナン対前記コラーゲンの重量比が１より大きい、方法。
【請求項２】
前記ヒアルロナン対前記コラーゲンの重量比が２以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロナン対前記コラーゲンの重量比が３以上である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記医薬組成物が、
ヒアルロナンと、ｐＨ７±２の０．００１Ｍ〜０．１Ｍリン酸緩衝液と、０．１％〜０．９％ＮａＣｌ溶液とを混合して、ヒアルロナン溶液を作製することと、
コラーゲン溶液を提供することと、
前記ヒアルロナン溶液と前記コラーゲン溶液を４℃より低い温度で混合して、混合物中のヒアルロナン対コラーゲンの単位体積あたりの重量比が１を超えるように混合物を得ることと、
前記混合物のｐＨを７±１に調整することと、
を含む手順によって製造される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒアルロナン溶液のｐＨが６未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記コラーゲン溶液のｐＨが６未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ケロイドを形成するリスクのある領域が、ケロイド瘢痕が外科的に除去された領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記医薬組成物が、栄養素、生物活性剤、抗菌剤、細胞、細胞外マトリックス成分及び賦形剤から成る群から選択される添加物を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒアルロナンの分子量が４〜５０００ｋＤａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、ケロイド線維芽細胞において、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−１）、セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＢ（卵白アルブミン）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−２）、１型コラーゲン、フィブロネクチン、アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）又は結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の遺伝子発現を低下させることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物活性剤が、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮‐単球活性化ポリペプチド、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＢＲＡＫ、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）及び腫瘍壊死因子から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、テネイシン、ラミニン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラチン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、寒天、セルロース、グリコーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、凝固酵素、ポリグルタミン酸及び合成ポリマー又はその誘導体から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗菌剤が、抗生物質、抗菌タンパク質又は抗菌ペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、幹細胞、衛星細胞、前駆細胞又は組織細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記賦形剤が、ワセリン、グリセリン又はレシチンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記栄養素が、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、脂質、ビタミン又はミネラルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
対象におけるケロイドを治療又は予防するための医薬組成物であって、有効量のヒアルロナンと有効量のコラーゲンとを含み、前記ヒアルロナン対前記コラーゲンの重量比が１を超える、医薬組成物。
【請求項１８】
前記ヒアルロナン対前記コラーゲンの重量比が２以上である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ヒアルロナン対前記コラーゲンの重量比が３以上である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ヒアルロナンと、ｐＨ７±２の０．００１Ｍ〜０．１Ｍリン酸緩衝液と、０．１％〜０．９％ＮａＣｌ溶液とを混合して、ヒアルロナン溶液を作製することと、
コラーゲン溶液を提供することと、
前記ヒアルロナン溶液と前記コラーゲン溶液を４℃より低い温度で混合して、混合物中のヒアルロナン対コラーゲンの単位体積あたりの重量比が１を超えるように混合物を得ることと、
前記混合物のｐＨを７±１に調整することと、
を含む手順によって製造される、請求項１７〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ヒアルロナン溶液のｐＨが６未満である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記コラーゲン溶液のｐＨが６未満である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
栄養素、生物活性剤、抗菌剤、細胞、細胞外マトリックス成分及び賦形剤から成る群から選択される添加物を更に含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ヒアルロナンの分子量が４〜５０００ｋＤａである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ケロイド線維芽細胞において、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−１）、セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＢ（卵白アルブミン）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−２）、１型コラーゲン、フィブロネクチン、アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）又は結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の遺伝子発現を低下させることができる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記生物活性剤が、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮‐単球活性化ポリペプチド、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＢＲＡＫ、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）及び腫瘍壊死因子から成る群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、テネイシン、ラミニン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラチン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、寒天、セルロース、グリコーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、凝固酵素、ポリグルタミン酸及び合成ポリマー又はその誘導体から成る群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記抗菌剤が、抗生物質、抗菌タンパク質又は抗菌ペプチドである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記細胞が、幹細胞、衛星細胞、前駆細胞又は組織細胞である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記賦形剤が、ワセリン、グリセリン又はレシチンである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記栄養素が、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、脂質、ビタミン又はミネラルである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１７年９月１日に提出された米国特許仮出願第６２／５５３，２６７号に対する優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ケロイドは、皮膚線維症の異常な過形成に起因する瘢痕の一種である。主な原因は、細胞外マトリックスの過剰な蓄積であり、大きな瘢痕の形成につながる。瘢痕は、外観が目立つだけでなく、過剰な炎症反応、かゆみ及び痛みも引き起こし、周辺組織の機能障害にまでつながる。
【０００３】
ケロイドは、前胸部、恥骨上部、上腕等、人体の高張力位置で発生する。瘢痕の形状は、ほとんどがカニ型又はダンベル型である。その構造、柔軟性及び強度も、正常組織とは異なる。ケロイド瘢痕は臨床手術で除去することができるが、患者の再発率は依然として６０％を上回る。
【０００４】
研究によれば、ケロイドの病因は、家族の遺伝的要因に加えて、ほとんどがケロイド線維芽細胞に関連していることが示されている。通常の創傷組織から分離された線維芽細胞と比較すると、ケロイド線維芽細胞は、細胞外マトリックス成分、特にコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン及びプロテオグリカン、並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子及び結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を含む一部の増殖因子（ＰＤＧＦ）を、過剰に分泌する。ケロイド患者の創傷における線維組織の過形成により、肉芽組織は創傷の元の領域を超えて更に大きくなり、ケロイド瘢痕を形成する。更に、ケロイド線維芽細胞におけるコネキシン及びアポトーシス遺伝子の発現が正常よりも低いので、アポトーシスの程度が比較的低い。また、ケロイドの瘢痕組織では、コラーゲン及びグリコサミノグリカンの成分が増加することにより、コラーゲンの束が厚くなり、渦巻き状の配置が形成される。更に、創傷組織の代謝活性は正常組織よりも高く、その結果、創傷組織において低酸素状態が生じるので、このような高い酸素消費と低酸素の拡大のもとでは、ケロイドが形成されやすくなる。
【０００５】
現在のケロイドの治療は、主にケロイド瘢痕を対象とする。圧迫包帯、ステロイドの局所注射、レーザーによる若返り、薬物の外用等、多くの治療法がある。治療は瘢痕の程度に応じて選択されるので、ケロイドの再発を防止することができず、結果として再発率が高くなる。更に、現在、全てのタイプのケロイド患者に対する単一の治療法はなく、一部の治療法は、副作用さえ引き起こし得る。したがって、大部分のケロイド患者に適し、安全かつ有効であり、再発率を低下させることのできる医薬組成物及び治療方法を開発することが重要である。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、対象におけるケロイドを治療する方法が、本明細書に記載される。本方法は、対象におけるケロイド又はケロイドを形成するリスクのある領域に医薬組成物を適用することを含み、組成物は、有効量のヒアルロナンと有効量のコラーゲンとを含み、単位体積あたりのヒアルロナン対コラーゲンの重量比は１よりも大きい（例えば、１．５〜１０００、１．５〜３．５、２〜５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００）。一部の実施形態では、ケロイドを形成するリスクのある領域は、ケロイド瘢痕が外科的に除去された領域である。
【０００７】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒアルロナンと、ｐＨ７±２の０．００１Ｍ〜０．１Ｍリン酸緩衝液と、０．１％〜０．９％ＮａＣｌ溶液とを混合して、ヒアルロナン溶液を作製することと、コラーゲン溶液を提供することと、混合物における単位体積あたりのヒアルロナン対コラーゲンの重量比が１よりも大きくなるように、ヒアルロナン溶液とコラーゲン溶液を４℃以下で混合して、混合物を得ることと、混合物のｐＨを７±１に調整することと、を含む手順によって、製造される。ヒアルロナン溶液のｐＨは、６未満であり得る。一部の実施形態では、コラーゲン溶液のｐＨは、６未満である。
【０００８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、栄養素、生物活性剤、抗菌剤、細胞、細胞外マトリックス成分及び賦形剤から成る群から選択される添加物を更に含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ヒアルロナンの分子量は、４〜５０００ｋＤａである（例えば、４〜２０ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａ、１００〜５００ｋＤａ、５００〜１０００ｋＤａ、１０００〜２０００ｋＤａ、２０００〜２５００ｋＤａ、２５００〜５０００ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、１０００ｋＤａ、１５００ｋＤａ、１８００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、２５００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、３５００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、４５００ｋＤａ又は５０００ｋＤａ）。
【００１０】
一部の実施形態では、ヒアルロナン溶液の濃度は、３〜１０００ｍｇ／ｍｌ（例えば３〜２００ｍｇ／ｍｌ）であり得る。一部の実施形態では、コラーゲン溶液の濃度は、０．０３〜５００ｍｇ／ｍｌ（例えば１〜１００ｍｇ／ｍｌ）であり得る。
【００１１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ケロイド線維芽細胞において、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−１）、セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＢ（卵白アルブミン）、２型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−２）、１型コラーゲン、フィブロネクチン、アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）又は結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の遺伝子発現を低下させることができる。
【００１２】
一部の実施形態では、生物活性剤は、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮‐単球活性化ポリペプチド、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＢＲＡＫ、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）及び腫瘍壊死因子から成る群から選択される。
【００１３】
一部の実施形態では、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ヒアルロナン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、テネイシン、ラミニン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラチン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、寒天、セルロース、グリコーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、凝固酵素、ポリグルタミン酸及び合成ポリマー又はその誘導体から成る群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、抗菌剤は、抗生物質、抗菌タンパク質又は抗菌ペプチドである。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、衛星細胞、前駆細胞又は組織細胞である。一部の実施形態では、賦形剤は、ワセリン、グリセリン又はレシチンである。一部の実施形態では、栄養素は、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、脂質、ビタミン又はミネラルである。
【００１５】
別の態様では、対象におけるケロイドを治療又は予防するための医薬組成物が、本明細書に記載される。組成物は、有効量のヒアルロナンと有効量のコラーゲンとを含み、単位体積あたりのヒアルロナン対コラーゲンの重量比は、１よりも大きい。
【００１６】
１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。実施形態の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、及び特許請求の範囲から、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞の形態を示す一連の画像である。
【図２】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞の遊走を示す棒グラフである。＊Ｐ＜０．０５．
【図３】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞の収縮力の割合を示す棒グラフである。＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５．
【図４Ａ】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞の１型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−１）の遺伝子発現を示す棒グラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１．
【図４Ｂ】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞の２型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ−２）の遺伝子発現を示す棒グラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１．
【図４Ｃ】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞のＩ型コラーゲンの遺伝子発現を示す棒グラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１．
【図４Ｄ】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞のフィブロネクチンの遺伝子発現を示す棒グラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１．
【図４Ｅ】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞のアルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の遺伝子発現を示す棒グラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１．
【図４Ｆ】様々な医薬組成物における正常線維芽細胞及びケロイド線維芽細胞の結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の遺伝子発現を示す棒グラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１．
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ヒアルロナン及びコラーゲンを含む様々な組成物が、ケロイド線維芽細胞の形態、遊走、収縮性及びケロイド関連遺伝子の発現を正常レベル又は正常レベルに近いレベルまで回復することが、予想外に発見された。したがって、当該組成物を用いて、ケロイドを治療することができ、又は、ケロイドのリスクを低減することができる。
【００１９】
医薬組成物
したがって、ケロイドを治療するための医薬組成物が、本明細書に記載される。組成物は、有効量のヒアルロナンと有効量のコラーゲンとを含み、単位体積あたりのヒアルロナン対コラーゲンの重量比は、１よりも大きい（例えば、１．５〜１０００、１．５〜３．５、２〜５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００）。
【００２０】
組成物は、栄養素、生物活性剤、抗菌剤、細胞、細胞外マトリックス成分及び賦形剤を含む1つ以上の成分を更に含み得る。
【００２１】
天然に存在するコラーゲン又はその機能的変異体のいずれも、医薬組成物の調製に用いることができる。コラーゲンは、ヒト及び動物の皮膚、腱、靭帯、骨等、コラーゲンの豊富な組織から分離及び精製することができる。コラーゲンを単離及び精製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，５１２，２９１号；米国特許公開第２００４０１３８６９５号；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第８２巻、３３〜６４頁、１９８２年；Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｏｎｅｓｏｎ，Ｉ．他、Ａｍ．Ｌｅａｔｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ａｓｓｏｃ．、第ＬＸＶ巻、４４０〜４５０頁、１９７０年；米国特許第６，０９０，９９６号を参照されたい。また、コラーゲンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ラホーヤ、カリフォルニア州）が説明するような組換え技術によって調製することもでき、又は様々なベンダー（例えばＦｉｂｒｏｇｅｎ；サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）から購入することもできる。「コラーゲン」という用語は、上記の分子、分解／水和された分子（ゼラチンとも呼ばれる）及びそれらの誘導体を指す。コラーゲン溶液を作るには、コラーゲンを酢酸（例えば０．１Ｍ〜０．５Ｍ）、ＨＣｌ（例えば０．００１〜０．０５Ｎ）又は水に溶解することができる。
【００２２】
「ヒアルロナン」という用語は、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の反復二糖単位を含む、天然に存在するアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカン、及びその誘導体を指す。天然に存在するヒアルロナン（「ヒアルロン酸」又は“ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ”としても知られる）は、従来の方法により、その自然源、例えば連鎖球菌のカプセル、雄鶏のとさか、軟骨、滑膜関節液、臍帯、皮膚組織及び目の硝子体液から分離することができる。例えば、Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ  Ｌａｇｏ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６２（４）：３２１−３２６、２００５年；及びＩｃｈｉｋａ  Ａｍａｇａｉ他、Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５（３）：８０５−８１０、２００９年を参照されたい。或いは、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＬＬＣ、Ｈｙａｌｕｒｏｎ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ等の商業ベンダーから購入することもできる。天然に存在するヒアルロナンの誘導体としては、ヒアルロナンエステル、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロナン、ヒアルロナンアミド生成物、架橋ヒアルロン酸、コハク酸のヘミエステル又はその重金属塩、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の部分エステル又は全エステル、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、及びアミン又はジアミン修飾ヒアルロン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。それらは、その官能基（例えばカルボン酸基、ヒドロキシル基、還元末端基、Ｎ−アセチル基）の１つ以上を化学的に修飾することによって得ることができる。カルボキシル基は、エステル化、又はカルボジイミド及びビスヒドラジド（ｂｉｓｈｙｄｒａｚｉｄｅ）によって媒介される反応を介して、修飾することができる。ヒドロキシル基の修飾としては、硫酸化、エステル化、イソ尿素カップリング、臭化シアン活性化、過ヨウ素酸酸化等が挙げられるが、これらに限定されない。還元末端基は、還元的アミノ化によって修飾することができる。還元末端基はまた、リン脂質、色素（例えばフルオロフォア又は発色団）又は親和性マトリックスの調製に適した薬剤に連結させることができる。天然に存在するヒアルロナンの誘導体は、架橋剤（例えば、ビスエポキシド、ジビニルスルホン、ビスカルボジイミド、低分子ホモ二官能性リンカー、ホルムアルデヒド、シクロヘキシルイソシアニド及びリジンエチルエステル、金属カチオン、ヒドラジド、又はそれらの混合物）を用いた架橋結合により、又は内部エステル化、光架橋若しくは表面プラズマ処理を介して、得ることもできる。ヒアルロナンの分子量は、４ｋＤａ〜５０００ｋＤａの範囲（例えば４〜２０ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａ、１００〜５００ｋＤａ、５００〜１０００ｋＤａ、１０００〜２０００ｋＤａ、２０００〜２５００ｋＤａ、２５００〜５０００ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、１０００ｋＤａ、１５００ｋＤａ、１８００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、２５００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、３５００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、４５００ｋＤａ又は５０００ｋＤａ）であり得る。ヒアルロナン溶���を作るために、ＮａＣｌ（例えば０．１〜０．９％）とともに、ヒアルロナンをリン酸緩衝液（例えばｐＨ７±２で０．００１〜０．１Ｍ）に溶解することができる。ヒアルロナンの濃度は、３〜１０００ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。ヒアルロナンの好ましい範囲は、３〜２００ｍｇ／ｍＬである。
【００２３】
「栄養素」という用語は、細胞の増殖に不可欠な栄養源を指す。栄養素は、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、炭素源（例えばグルコース）、脂肪酸又はそれらの混合物であり得る。一例では、医薬組成物の栄養素は、細胞増殖培地、例えば最小必須培地、イーグル基礎培地、ダルベッコ改変イーグル培地、ハム栄養混合培地Ｆ−１０又はＦ−１２、１９９培地、ＲＰＭＩ培地、エームス培地、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ改変）、クリック培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、グラスゴー最小必須培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｌ−１５培地、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、Ｓｗｉｍ’ｓ  Ｓ−７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地又はＷｉｌｌｉａｍ培地Ｅである。
【００２４】
生物活性剤は、細胞生存率を改善し、細胞増殖を促進し、又は細胞分化を誘導する任意の薬剤（例えばペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖又は小分子）である。一例では、生物活性剤は、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、結合組織増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、コロニー刺激因子、幹細胞因子、セロトニン、及びフォン・ヴィレブランド因子、トランスフォーミング増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、内皮‐単球活性化ポリペプチド、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子等の増殖因子である。別の例では、生物活性剤は、ＩＬ−２、乳房発現ケモカイン（例えばＢＲＡＫ）、腎臓発現ケモカイン（例えばＣＸＣＬ１４）を含むがこれらに限定されないサイトカイン又はケモカインである。生物活性剤はまた、デキサメタゾン、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸、レチノイン酸、プロリン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、及びウシ血清アルブミン等の細胞分化因子、並びにＴＧＦ−β３であり得る。好ましい例では、分化因子は、間葉系幹細胞の軟骨形成（米国特許第５，９０８，７８４号に開示されているものを参照）、骨形成（例えばデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロールリン酸）、脂肪生成（例えばインスリン、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシン）、心筋分化（例えばアクチビンＡ、ＢＭＰ−４）、内皮細胞分化（例えばＥＢＭ−２、デキサメタゾン及びＶＥＧＦ）、平滑筋細胞分化（例えばＰＤＧＦ−ＢＢ）、神経誘導（例えばｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢ２７サプリメント、ＤＭＳＯ、ブチル化ヒドロキシアニソール、フォルスコリン、バルプロ酸、ＫＣｌ、Ｋ２５２ａ及びＮ２サプリメント）及び内胚葉系列分化（例えばデキサメタゾン、ＨＧＦ及びＦＧＦ−４）を促進する化合物である。生物活性剤はまた、漢方薬又はその有効成分でもあり得る。
【００２５】
細胞外マトリックス成分としては、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブロネクチン、エラスチン、テナシン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリペプチド、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、寒天、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、グリコーゲン及びそれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。更に、細胞外マトリックス成分は、フィブリン、フィブリノゲン、トロンビン、ポリグルタミン酸、合成ポリマー（例えばアクリレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリ（乳酸−コ−グリコール酸）又は架橋剤（例えばゲニピン、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド又はエポキシド）であり得る。
【００２６】
潤滑及び防湿を提供するために、医薬組成物には１つ以上の賦形剤が含まれ得る。賦形剤の存在は、創傷の治癒のために上皮層を結合し滑らかにするクリームとしても機能することができる。レシチン、ワセリン、グリセロール、グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）及びグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）は、細胞組織ゲルに含めることのできる例示的な賦形剤である。当技術分野では、他の賦形剤も知られており、利用可能である。
【００２７】
医薬組成物には、幹細胞、衛星細胞、前駆細胞又は任意の組織細胞等の細胞が含まれ得る。
【００２８】
医薬組成物はまた、１つ以上の抗菌剤、例えば抗生物質、抗菌タンパク質又は抗菌ペプチドを含み得る。
【００２９】
医薬組成物は、液体、クリーム、ゲル、ゼリー、ペースト、軟膏、スプレー、コロイド、フォーム、スポンジ、マトリックス、包帯材、パッド、顆粒、懸濁液又は粉末の形態であり得る。
【００３０】
医薬組成物を作るには、ヒアルロナン溶液とコラーゲン溶液を４℃より低い温度で混合して、ヒアルロナンとコラーゲンを単位体積あたりの望ましい重量比で含む混合物を製造する。ヒアルロナン対コラーゲンの好ましい重量比は、１．５〜１０００の範囲である。混合物には、１つ以上の他の成分（例えば栄養素、生物活性剤、抗菌剤、細胞、細胞外マトリックス成分及び賦形剤）を追加することができる。次いで、最終混合物のｐＨを中性又は中性付近（例えば７±１）に調整して、ゼラチン状の粘度を有する医薬組成物を作製する。ヒアルロナン溶液の濃度は、３〜１０００ｍｇ／ｍｌ（例えば３〜１００ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、１５〜３５ｍｇ／ｍｌ、２５〜５０ｍｇ／ｍｌ、３５〜６５ｍｇ／ｍｌ、５０〜７５ｍｇ／ｍｌ、６５〜８５ｍｇ／ｍｌ、７５〜９５ｍｇ／ｍｌ、８５〜１０５ｍｇ／ｍｌ、１００〜４００ｍｇ／ｍｌ、２５０〜５５０ｍｇ／ｍｌ、４００〜７００ｍｇ／ｍｌ、５５０〜８５０ｍｇ／ｍｌ、７００〜１０００ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、６００ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ、８００ｍｇ／ｍｌ、９００ｍｇ／ｍｌ又は１０００ｍｇ／ｍｌ）であり得る。ヒアルロナンの好ましい範囲は、３〜２００ｍｇ／ｍｌである。コラーゲン溶液の濃度は、０．０３〜５００ｍｇ／ｍｌ（例えば０．０３〜１ｍｇ／ｍｌ、１〜２．５ｍｇ／ｍｌ、２．５〜５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、１５〜３５ｍｇ／ｍｌ、２５〜５０ｍｇ／ｍｌ、３５〜６５ｍｇ／ｍｌ、５０〜７５ｍｇ／ｍｌ、６５〜８５ｍｇ／ｍｌ、７５〜９５ｍｇ／ｍｌ、８５〜１０５ｍｇ／ｍｌ、１００〜２００ｍｇ／ｍｌ、１５０〜２５０ｍｇ／ｍｌ、２００〜３００ｍｇ／ｍｌ、２５０〜３５０ｍｇ／ｍｌ、３００〜４００ｍｇ／ｍｌ、３５０〜４５０ｍｇ／ｍｌ、４００〜５００ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ又は５００ｍｇ／ｍｌ）であり得る。コラーゲンの好ましい範囲は、１〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００３１】
治療方法
ケロイドを治療、予防又は再発を抑制するために、医薬組成物を患者に投与することができる。組成物は、ケロイド又はケロイドを発症するリスクのある領域に、注射することができ、又は局所的に適用することができる。特に、ケロイドが外科的に除去された領域に組成物を投与して、創傷治癒を助け、同じ領域でケロイドが形成されるリスクを減らすことができる。
【００３２】
組成物は、適切な治療期間、例えば１〜４週間、１２ヶ月、又は１〜３年間にわたり、必要な頻度で、例えば１日１〜５回、週１〜５回、月１〜５回、対象に適用することができる。
【００３３】
「治療」とは、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、又は障害になりやすい傾向を治療し、緩和し、軽減し、治し、発症を遅らせ、予防し、又は改善することを目的とした、障害を患っている対象又は障害を発症するリスクのある対象への組成物の投与を指す。「有効量」とは、治療対象において医学的に望ましい結果をもたらすことのできる組成物の量を指す。治療法は、単独で実施することができ、又は、他の薬物又は療法と併用して実施することができる。
【００３４】
以下の具体的な例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる形であれ、本開示の残りの部分を限定するものではない。更なる労力を要することなく、当業者であれば、本明細書の説明に基づいて、本開示を最大限に利用できると考えられる。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
実施例１：医薬組成物の調製
ヒアルロナン、リン酸緩衝液（０．００１〜０．１Ｍ、ｐＨ７±２）及びＮａＣｌ溶液（０．１〜０．９％）を混合して、ヒアルロナン溶液を調製した。表１、２及び３に示す重量比で、各遠心分離管でコラーゲン溶液をヒアルロナン溶液と混合した。各管に、ウシ胎仔血清及び細胞培養培地を含む混合物を、各管の最終体積が同じになるように加えた。続いて、各管のｐＨをｐＨ酸塩基試験紙で測定し、ＨＣｌ及びＮａＯＨでｐＨを中性（ｐＨ７．０）に調整した。混合ステップは、４℃より低い温度で実施された。
【００３６】
【表１】
2020536849.tif 000003
【表２】
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【表３】
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【００３７】
実施例２：形態学
以前の研究では、ケロイド線維芽細胞が通常の培養条件下で紡錘状の付着を示すことが示唆された。ヒアルロナン及びコラーゲンを含む様々な組成物がケロイド線維芽細胞の形態に与える効果を理解するために、正常線維芽細胞（ＮＦ）及びケロイド線維芽細胞（ＫＦ）を、表１〜３の対照群と実験群で、培養培地（１０ｍＬ  ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）において培養した。線維芽細胞を、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、電子顕微鏡で観察した。
【００３８】
図１に示すように、培養培地（平面培養群）では、正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞の外観に有意な差異はなく、両者が紡錘状に付着した。両者とも同様の配置で増殖したが、培養後のケロイド線維芽細胞の密度は、正常線維芽細胞の密度よりも有意に大きかった。コラーゲンのみの組成物（対照群）では、正常線維芽細胞は平面培養群よりも有意に多い糸状仮足を示し、外側に向かって成長した。細胞間の突起は互いにつながって、インターレース網を形成した。正常線維芽細胞と同様に、ケロイド線維芽細胞も糸状仮足を示し、インターレース網を形成した。一方、実験群１では、ケロイド線維芽細胞は核の近くでより肥大性であり、正常線維芽細胞よりも突出した。しかしながら、実験群２及び実験群３では、正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞の両方の隆起が減少した。それらの全体的な形態及び成長は、実験群２、３、５〜１０及び１２〜１８で類似した。データから、ヒアルロナン及びコラーゲンを含む組成物で培養されたケロイド線維芽細胞は、正常な形態に戻ることができることが示された。
【００３９】
実施例３：遊走試験
以前の研究では、ケロイド線維芽細胞は正常線維芽細胞よりも高い遊走能力を有することが示されている。ヒアルロナン及びコラーゲンを含む様々な組成物のケロイド線維芽細胞の遊走に対する効果を理解するために、試験を行った。各群の組成物１００μＬを培養皿のコーティングに適用し、培養皿の中央にＯリング（内径４ｍｍ、外径６ｍｍ）を配置した。コーティングされた皿の各々のＯリングの内側に、それぞれ正常線維芽細胞又はケロイド線維芽細胞を置いた。細胞が付着した後、Ｏリングを取り除き、細胞を４日間培養し続けた。その後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、観察した。細胞遊走面積を計算した。
【００４０】
図２に示すように、コラーゲンのみの群（対照群）では、ケロイド線維芽細胞の遊走面積は、正常線維芽細胞の遊走面積よりも有意に大きかった。しかしながら、実験群２及び３では、ケロイド線維芽細胞の遊走面積と正常線維芽細胞の遊走面積との間に、有意な差はなかった。実験群５〜１０及び１２〜１８でも、同様の結果が観察された。この結果から、重量比が１を超えるヒアルロナン及びコラーゲンを含む組成物は、ケロイド線維芽細胞の遊走能力を正常レベルに回復させる能力があることが示唆される。
【００４１】
実施例４：収縮試験
以前の研究では、ケロイド線維芽細胞は正常線維芽細胞よりも収縮力が強いことが示されている。ヒアルロナン及びコラーゲンを含む様々な組成物のケロイド線維芽細胞の収縮力に対する効果を理解するために、試験を行った。
【００４２】
ヒアルロナン及びコラーゲンを含む様々な組成物に、正常線維芽細胞又はケロイド線維芽細胞をそれぞれ加えた。均一に混合した後、各々の５０μＬを培養皿の中央に半球状に落とし、３７℃のインキュベーターに２時間放置した。２時間のゲル化後、半球の面積（Ａ０）を記録した。培地８００μＬを加えた後、線維芽細胞が組成物を収縮させ始め、半球が縮んだ。４８時間後、半球の面積（Ａ）を記録した。次の式Ｘ＝［（Ａ０−Ａ）／Ａ０］×１００％を用いて、細胞収縮力の割合を計算した。縮み率が高いほど、収縮力が強いことを示す。
【００４３】
図３に示すように、ケロイド線維芽細胞の収縮力の割合は、対照群及び実験群１の正常線維芽細胞の収縮力の割合よりも有意に高かった。しかしながら、実験群２及実験群３のケロイド線維芽細胞と正常線維芽細胞の収縮力の割合に、有意差はなかった。実験群５〜１０及び１２〜１８でも、同様の結果が観察された。この結果から、重量比が１を超えるヒアルロナン及びコラーゲンを含む組成物は、ケロイド線維芽細胞の収縮能力を正常レベルまで低下させる能力があることが示唆される。
【００４４】
実施例５：遺伝子発現解析
以前の研究では、張力因子（ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、α−ＳＭＡ等）、増殖因子ＣＴＧＦ及び細胞外マトリックス成分（コラーゲンＩ及びフィブロネクチン）がケロイドの形成に関連していることが実証されている。ヒアルロナン及びコラーゲンを含む様々な組成物のケロイド線維芽細胞に対する効果を分子レベルで理解するために、試験を行った。
【００４５】
表１に記載の平面培養群、対照群及び実験群において、正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞を別々に培養した。４日間の培養後、線維芽細胞から全ＲＮＡを抽出した。次に、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって解析した。平面培養群では、標準的な培養皿の表面で細胞を培養した。
【００４６】
図４Ａ〜図４Ｆに示すように、平面培養群、対照群及び実験群１では、ケロイド線維芽細胞におけるＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、コラーゲンＩ、フィブロネクチン、α−ＳＭＡ及びＣＴＧＦの発現レベルが、正常線維芽細胞よりも高かった。一方、実験群２及び実験群３では、ケロイド線維芽細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルは低下し、正常線維芽細胞と有意差はなかった。この結果から、重量比が１を超えるヒアルロナン及びコラーゲンを含む組成物は、ケロイド形成に関連する遺伝子の発現レベルを低下させることができることが示唆される。
【００４７】
要約すると、重量比が１を超えるヒアルロナン及びコラーゲンを含む組成物は、ケロイド線維芽細胞の形態、遊走及び収縮性を正常レベルまで改善することが示された。ケロイド関連遺伝子の発現レベルも、組成物により、正常線維芽細胞の発現レベル近くまで調節された。したがって、組成物は、皮膚が異常な突起のない正常な皮膚に近付くことができるように、ケロイド患者における治癒中の創傷組織の過形成を低下させることができる。更に、組成物は、治癒中の組織の過形成を防止するために、ケロイド瘢痕の外科的除去後の患者の治療に用いることができる。
【００４８】
他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴を、任意の組合せで組み合せてもよい。本明細書に開示される各特徴を、同じ、均等な又は同様の目的を果たす代替の特徴に置換してよい。よって、別段に明記しない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の均等な又は類似の特徴の単なる一例である。
【００４９】
上記の説明から、当業者であれば、記載された実施形態の必須特性を容易に確認することができ、その主旨及び範囲から逸脱することなく、実施形態の様々な変更及び修正を行って、様々な用途及び条件に適合させることができる。よって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2020536849.tif 000013
【図４Ｆ】
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【国際調査報告】
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