(57)【要約】治療の前後にがん患者から得られた生体サンプルにおいて前記治療に対する応答における該がん患者により産生された因子／バイオマーカーのレベル変化を決定することにより、免疫チェックポイント阻害薬による治療に対する該がん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する方法およびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）による治療に対するがん患者の応答の予測方法であって、前記方法は：前記免疫チェックポイント阻害薬による治療セッション後に期間において前記がん患者から得られた生体サンプルにおいて、前記治療に対する応答における、前記がん患者により産生された複数の因子（以下「バイオマーカー」とも呼ぶ）のレベルを決定することを含み、前記複数の因子の１つ以上は前記治療に対する前記患者の応答性または非応答性を促進し、参照レベルと比較したとき、前記複数の因子の２つ以上の各々のレベル変化は前記免疫チェックポイント阻害薬による前記治療に対する前記がん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する、方法。
【請求項２】
前記生体サンプルは血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルは全血、血清または末梢血単核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療セッションは複数の治療セッションの１つであり、前記生体サンプル、好ましくは血漿を前記複数の治療セッションの１つの後の約２４時間以上において前記がん患者から得る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体サンプル、好ましくは血漿を前記複数の治療セッションの１つの後の１週間以下を含む約３０、３６、４０、４８、５０、６０、７２時間以上において前記がん患者から得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記各因子の参照レベルは、前記同じがん患者から事前に得られた生体サンプル、好ましくは血漿、以後「参照／ベースライン生体サンプル」、において決定された前記同じ因子の濃度のベースラインレベルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の治療セッションの１つは前記ＩＣＩによる第一治療セッションである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記参照／ベースライン生体サンプルを、前記ＩＣＩによる前記第一治療セッション前の時点において前記がん患者から得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記時点は、前記第一治療セッション前、約６０、５０、４８、４０、３６、３０、または２４時間を含む約７２時間以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の治療セッションの１つは前記ＩＣＩによる前記第一治療セッションではなく、このセッションのための前記参照／ベースライン生体サンプルは前記第一セッションでない前記セッションを先行した治療セッション後の時点における前記がん患者から得られた同じ生体サンプルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記時点は、前記第一治療セッションでない前記セッションに先行した前記治療セッション後約３０、３６、４０、４８、５０、６０、７２時間以上を含む２４時間以上、１週間以下である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＣＩによる治療後の前記がん患者の前記生体サンプル、好ましくは血漿中に循環している前記因子／バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、酵素または可溶性受容体などの分子因子を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記因子は、腫瘍誘発性または転移誘発性因子であり、前記腫瘍誘発性因子は血管新生
誘発性、炎症誘発性／走化性または増殖性成長因子であってよい、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照／ベースラインレベルと比較した、前記ＩＣＩによる治療後の前記がん患者から得られた前記生体サンプルにおいて同定された前記因子／バイオマーカーの１つ以上のレベル変化は各々の因子についての倍率変化により規定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記因子の前記レベル変化は、前記ＩＣＩによる治療に対する応答における前記がん患者により産生された前記因子の１つ以上の各々のレベルの少なくとも１．５倍の増加（上方制御）または少なくとも０．５倍の減少（下方制御）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子の上方制御を示す≧１．５の倍率変化または前記因子の下方制御を示す≦０．５の倍率変化を有意とみなし、前記ＩＣＩによる治療に対する前記がん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＣＩによる治療に対する前記がん患者の好ましいまたは好ましくない応答の前記予測は、前記循環因子の１つ以上、必要に応じて２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５以上の有意な倍率変化に基づく、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍誘発性因子／バイオマーカーの１つ以上のレベルにおいて少なくとも約１．５倍の増加（上方制御）があり、前記予測は前記治療に対する前記がん患者の好ましくない応答である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍誘発性因子／バイオマーカーの１つ以上のレベルにおいて少なくとも約０．５倍の減少（下方制御）があり、前記予測は前記治療に対する前記がん患者の好ましい応答である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ−４から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＡＭＰ−２２４、ＭＥＤＩ０６８０、またはＰＤＲ００１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫チェックポイント阻害薬は、ＢＭＳ−９８６０１６、ＬＡＧ５２５またはＲＥＧＮ３７６７などの抗ＬＡＧ−３；ＴＳＲ０２２またはＭＢＧ４５３などの抗ＴＩＭ−３；およびＪＮＪ６１６１０５８８などの抗ＶＩＳＴＡ；およびリリルマブなどの抗ＫＩＲから選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫チェックポイント阻害薬は、２つの免疫チェックポイント阻害薬の組み合わせである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み合わせは：（ｉ）抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４、例えば、ニボルマブおよびイピリムマブ；（ｉｉ）抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１、例えば、ニボルマブおよびアテゾリズマブ；抗４−ＩＢＢ／抗ＰＤ−１、例えば、ウレルマブおよびニボルマブから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫チェックポイント阻害薬は、免疫療法、免疫調節薬、プロテアソーム阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬、武装化腫瘍溶解性ウイルス、化学療法、メトロノミック化学療法、標的療法、光線力学療法、血管標的光線力学療法、および放射線療法などの別のがん治療との組み合わせである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、例えば、ＭＥＤＩ−５７０、ＢＭＳ−９８６２２６；抗ＯＸ４０／ＣＤ１３４、例えば、ＭＯＸＲ０９１６、ＫＨＫ４０８３、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９；ＣＤ４０および抗４−ＩＢＢ／ＣＤ１３７、例えば、ウレルマブまたはウトミルマブなどのＴ細胞共刺激分子に対するアゴニストモノクローナル抗体との組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＣＩに対する宿主応答を示す因子／バイオマーカーは、これに限定されないが、ＡＤＡＭＴＳ１、アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＥＧＦ；エオタキシン−２；ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＨＧＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＴＡＣＩ；Ｍ−ＣＳＦ；ＭＭＰ−９；ＰＤＧＦ−ＢＢ；プロＭＭＰ９；ＳＣＦを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
抗ＰＤ−１治療に対する応答において上方制御された前記因子は、Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；およびＰＤＧＦ−ＢＢを含む血管新生誘発性因子；ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；およびＭ−ＣＳＦを含む炎症誘発性および／または走化性因子；ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；およびＨＧＦを含む増殖性成長因子；ならびに転移誘発性因子ＭＭＰ−９から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗ＰＤ−Ｌ１治療に対する応答において上方制御された前記因子は、Ｇ−ＣＳＦ；およびＳＣＦを含む血管新生誘発性因子；エオタキシン−２；Ｇ−ＣＳＦ；ＩＬ−１ｒａ；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＳＣＦ；およびＴＡＣＩを含む炎症誘発性および／または走化性因子；アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＥＧＦ；およびＨＧＦを含む増殖性成長因子；ならびにＡＤＡＭＴＳ１およびプロＭＭＰ９を含む転移誘発性因子から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
複数の抗体、および使用説明書を含むキットであって、前記複数の抗体の各々の抗体は、免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の応答性または非応答性を促進する複数の因子の各々と選択的に結合する、キット。
【請求項３３】
前記キットはサンドイッチまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記キットは複数のヒトモノクローナル抗体を含み、前記抗体の各々は血管新生誘発性
、炎症誘発性／走化性、増殖性および／または転移誘発性活性を有する腫瘍誘発性因子と特異的に結合し、これらの腫瘍誘発性および転移誘発性因子の少なくともいくつかは、前記免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する、請求項１に記載の方法により事前に同定された因子である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体のうち少なくとも３０は各々次の３０因子：ＡＤＡＭＴＳ１、アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＥＧＦ；エオタキシン−２；ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＨＧＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＴＡＣＩ；Ｍ−ＣＳＦ；ＭＭＰ−９；ＰＤＧＦ−ＢＢ；プロＭＭＰ９；およびＳＣＦから選択される因子と特異的に結合する、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
請求項１〜３１に記載の方法において使用するための、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学の分野であり、詳細には、免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の個別化応答の予測方法、およびそのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床腫瘍学における主要な障害の１つは、治療に対する初期腫瘍応答が観察される場合でさえ、腫瘍はしばしば治療に対して耐性を生じることである。多くの研究は、薬物耐性を促進する腫瘍細胞における変異および遺伝子異常の寄与に重点的に取り組み、腫瘍再増殖を説明することができる。しかしながら、研究結果は、がん治療に応じて宿主は次々に腫瘍再増殖の一因となる腫瘍誘発性および転移誘発性効果を生じ、したがって、薬物の抗腫瘍作用を無効にすることを示した（概要については、Ｋａｔｚ  ａｎｄ  Ｓｈａｋｅｄ，２０１５；Ｓｈａｋｅｄ，２０１６参照）。
【０００３】
抗がん治療モダリティに対する宿主媒介応答は、分子および／または細胞応答であり得る。化学療法薬を用いた治療時、宿主骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）は骨髄コンパートメントから集められ、治療された腫瘍をコロニー形成し、腫瘍血管新生およびがん再増殖に寄与し、それにより治療耐性を促進する（Ｓｈａｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，２００８）。がん治療は、マクロファージおよび抗原提示細胞などの様々な免疫細胞の腫瘍誘発性活性化も誘発する（Ｂｅｙａｒ−Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｄｅ  Ｐａｌｍａ
ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，２０１３；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。全体的に見て、これら前述の研究は、異なる抗がん治療に対する宿主媒介分子および細胞応答は、免疫細胞の活性化または教育ならびに様々な腫瘍誘発性因子の分泌を含むことを示している。これらの複合効果は、腫瘍再増殖および治療耐性の一因となる。この比較的新しい現象は、がん進行および治療耐性の理解においてパラダイムシフトをもたらした。
【０００４】
近年、新規治療モダリティ、免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）を用いた免疫療法はがん治療に革命をもたらしている。このような免疫調節薬は、メラノーマ、前立腺がん、非小細胞肺がん、腎細胞がん、さらにいくつかの血液悪性腫瘍などの進行性悪性腫瘍（ステージＩＶを含む）の治療に関して注目すべき成功を示した（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ヒト免疫系は、がん性細胞を認識し、がん性細胞に対する応答を開始することができるが、この応答は免疫寛容をもたらす腫瘍由来の阻害によってしばしば無効にされる。これに関して、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、腫瘍内微小環境をコロニー形成することが分かった（Ｇａｊｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、腫瘍部位において、これらは、腫瘍細胞に対して作用する能力を完全に欠いている（Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｈａ，２００９）。これは、がん細胞、間質細胞または骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの他の抑制免疫細胞によって分泌された因子の直接阻害効果のせいである（Ｍａｋｋｏｕｋ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２０１５）。例えば、ＩＬ−１０は様々な種類のがんにおいて頻繁に上方制御され、免疫系を抑制することが分かった（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。したがって、腫瘍細胞に対する免疫系を負に調節する分子の同定は、腫瘍に対する免疫細胞の活性化を支援する免疫調節薬の開発をもたらすだろう。
【０００５】
ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１などの免疫チェックポイントタンパク質は特に興味深い。これらのチェックポイントタンパク質は、腫瘍細胞または他の
免疫細胞によって発現され、ＣＴＬ消耗の一因となる（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。特に、これらは、チェックにおいて免疫応答を維持し、腫瘍細胞に対するＴ細胞致死効果を阻害する。このようなことから、チェックポイント阻害薬は免疫抑制効果を阻害するために開発された。現在、免疫チェックポイント、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１またはそのリガンドＰＤ−Ｌ１を阻止する抗体が開発されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２）。現在、これらのＩＣＩは、いくらか有望で顕著な成功を収めた様々な悪性腫瘍の治療のために臨床において使用されている（Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｒｏ，２０１５）。しかしながら、ＩＣＩは、がん患者の限られた一部にしか（約１０〜２０％）治療効果を示さなかった。例えば、イピリムマブ、ＣＴＬＡ−４阻止抗体の臨床研究からプールされたデータは、臨床応答期間はおよそ３年であり、１０年まで持続することができることを示した。しかしながら、この劇的な治療効果は、患者の小集団（約２０％）においてしか観察されない。したがって、大部分の患者は、このような治療に対して内因性耐性機序を示す。さらに、ＩＣＩに応答する患者の亜集団を規定する分子の測面は、完全にクリアではない。腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌ１発現などのマーカー、変異負荷、およびリンパ球浸潤は、免疫療法に応答するがん患者を予測する可能性があることが示唆された。しかしながら、これら前述のバイオマーカーは、免疫療法に対する腫瘍応答性またはＩＣＩに対する患者の耐性と必ずしも相関するとは限らない。したがって、更なる可能性ある機序はいまだに知られていない。
【０００６】
有望なＩＣＩ治療モダリティを含むがん治療の全てのモダリティに対する腫瘍耐性の一因となる宿主媒介細胞および分子機序を解明することが非常に望まれている。これは、このような望ましくない宿主効果を阻止するストラテジーの開発を可能とし治療成果を改善してがん治療耐性を遅らせるだろう。
【発明の概要】
【０００７】
１つの態様では、本発明は、前記治療で治療されたがん患者の生体サンプルにおいて１つ以上の免疫チェックポイント阻害薬（以後「ＩＣＩ」と呼ぶ）によるがん免疫療法に対する宿主由来耐性因子のセットの同定方法に関する。これらの因子は、特異的宿主由来耐性因子、すなわち、これらは、ＩＣＩを用いる前記がん治療に対する応答において、がん細胞の内因性耐性により産生されないが、宿主、すなわち、がん患者に由来し、前記患者に適用されたＩＣＩによる治療の有効性を限定または無効にし得る。これらの因子の決定は、ＩＣＩによる治療に対する患者の好ましいまたは好ましくない応答を個別化された形態で予測を可能とする。本明細書中、「因子」または「バイオマーカー」と互換的に表されるこれらの因子は、患者が治療されるＩＣＩによるがん治療に対する応答において、種々の臓器または腫瘍内微小環境のいずれかにおける、因子、主にサイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、酵素および宿主細胞により産生される他の分子である。
【０００８】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の応答の予測方法であって、前記方法は：少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害薬による治療セッション後に期間においてがん患者から得られた生体サンプルにおいて、前記治療に対する応答の、がん患者により産生された複数の因子のレベルを決定することを含み、複数の因子の１つ以上は治療に対する患者の応答性または非応答性を促進し、複数の因子の２つ以上のレベル変化は参照レベルと比較して前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する、方法に関する。
【０００９】
特定の実施形態では、生体サンプルは血漿である。特定の実施形態では、がん患者の生体サンプルは全血サンプルである。特定の実施形態では、生体サンプルは血清である。特定の実施形態では、生体サンプルは末梢血単核細胞である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、複数の抗体、および使用説明書を含むキットであって、前記複数の抗体の各々の抗体は、免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の応答性または非応答性を促進する複数の因子の各々と選択的に結合する、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、抗ＰＤ−１治療ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血漿および骨髄細胞は、腫瘍細胞の転移性を促進することを示している。ナイーブ（腫瘍を有さない）８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１週間、抗ＰＤ−１またはコントロール抗体で治療した（ｎ＝３マウス／群）。（Ａ）ＥＭＴ６細胞の浸潤および転移性を、コントロールおよび抗ＰＤ−１治療マウスから抽出された血漿の存在下、ボイデンチャンバーアッセイで評価した。浸潤および転移細胞の代表的画像を示す。（Ｂ）細胞被覆率を、画像から定量化して、細胞被覆率の増加倍率を算出した。３回の生物学的反復の平均を示す。（Ｃ〜Ｄ）コントロールまたは抗ＰＤ−１治療マウスの大腿骨から回収した骨髄細胞を、２４時間、血清非含有ＤＭＥＭ中で培養した（１×１０６細胞／ｍｌ）。条件培地を集め、ＭＭＰ活性を評価するためにザイモグラフィにより評価した。代表的ザイモグラフィブロットを（Ｃ）に示し、ＭＭＰ９の定量を（Ｄ）に示す。３回の生物学的反復で実験を行った。スチューデントｔ検定を用いて、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、インビトロで腫瘍細胞の転移性に対する抗ＰＤ−１治療ナイーブＳＣＩＤマウス由来血漿の効果を示す。ナイーブ（腫瘍を有さない）８〜１０週齢ＳＣＩＤマウスを、１週間、抗ＰＤ−１またはコントロール抗体で治療した（ｎ＝３マウス／群）。（Ａ）ＥＭＴ６細胞の浸潤性を、コントロールおよび抗ＰＤ−１治療マウスから抽出された血漿の存在下、ボイデンチャンバーアッセイで評価した。浸潤細胞の代表的画像を示す。（Ｂ）細胞被覆率のパーセンテージを画像から定量化した。３回の生物学的反復の平均を示す。スチューデントｔ検定を用いて、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｄは、腫瘍細胞の転移性に対する抗ＰＤ−１治療ナイーブＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス由来の血漿および骨髄細胞の効果を示す。ナイーブ（腫瘍を有さない）８〜１０週齢ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、１週間、抗ＰＤ−１またはコントロール抗体で治療した（ｎ＝３マウス／群）。（Ａ）ＥＭＴ６細胞の浸潤および転移性を、コントロールおよび抗ＰＤ−１治療マウスから抽出された血漿の存在下、ボイデンチャンバーアッセイで評価した。浸潤および転移細胞の代表的画像を示す。（Ｂ）細胞被覆率のパーセンテージを画像から定量化した。３回の生物学的反復の平均を示す。（Ｃ〜Ｄ）コントロールまたは抗ＰＤ−１治療マウスの大腿骨から回収した骨髄細胞を、２４時間、血清非含有ＤＭＥＭ中で培養した（１×１０６細胞／ｍｌ）。条件培地を集め、ＭＭＰ活性を評価するためにザイモグラフィにより評価した。代表的ザイモグラフィブロットを（Ｃ）に示し、ＭＭＰ９の定量を（Ｄ）に示す。３回の生物学的反復で実験を行った。スチューデントｔ検定を用いて、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、抗ＰＤ−１治療ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血漿で前培養されたＥＭＴ６細胞は、実験的肺転移アッセイにおいて死亡率を増大させることを示す。（Ａ〜Ｂ）ＥＭＴ６マウス乳がん細胞をコントロールまたは抗ＰＤ−１治療ＢＡＬＢ／ｃマウス由来血漿の存在下４時間前培養した。細胞を洗浄し、ナイーブ８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈により静脈内注射し（２．５×１０４細胞／マウス）、実験的肺転移アッセイを行った。生存率を経時評価した。カプランマイヤー生存曲線を、それぞれ、ｎ＝５およびｎ＝７〜８マウス／群を使用した第一（Ａ）および第二（Ｂ）実験について示す。（Ａ）ｐ＜０．０５および（Ｂ）ｐ＝０．０５５。
【図４Ｂ】同上。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、抗ＰＤ−１治療マウスから得られた血漿を含むマトリゲル中での種々の宿主細胞型のコロニー化を示す。コントロールまたは抗ＰＤ−１治療マウスから得られた血漿を１：１０の比でマトリゲルと混合した。マトリゲルプラグをナイーブ８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に移植した（ｎ＝４マウス／群）。（Ａ）１０日後、マトリゲルプラグを取り出し、薄片にした後、Ｈ＆Ｅ（左顕微鏡写真）またはＣＤ３１内皮細胞マーカー（赤、右顕微鏡写真）で染色した。（Ｂ）並列実験において、マトリゲルプラグを単一細胞懸濁液で調製した。細胞懸濁液を、フローサイトメトリーを用いて指定免疫細胞型について評価した。スチューデントｔ検定によって評価したとき、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明によれば、方法は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の応答の予測することであって、前記予測することは：少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）による治療セッション後に期間においてがん患者から得られた生体サンプルにおいて、前記治療に対する応答においてがん患者により産生された複数の因子のレベルを決定することを含み、複数の因子の１つ以上は治療に対する患者の応答性または非応答性を促進し、複数の因子の２つ以上のレベル変化は参照レベルと比較して前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測することを提供する。
【００１３】
生体サンプルは、全血サンプル、血漿、血清、または末梢血単核細胞であってよい。特定の実施形態では、生体サンプルは血漿である。
【００１４】
がん治療では、治療サイクルは、時間（例えば、１日または２日にわたっての注射）の１つの時点において患者に薬物を投与してから、治療をしないいくらかの時間（例えば、１、２または３週間）がある。治療および休止時間は１つの治療サイクルを構成する。患者がサイクルを終える場合、次のサイクルが再び始まる。一連の治療サイクルはコースと呼ぶ。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、「治療セッション」は、治療サイクルの開始時にＩＣＩを患者に投与する場合に「時間における１つの時点」を表す。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）」は、単一ＩＣＩ、ＩＣＩの組み合わせおよびＩＣＩと別のがん治療との組み合わせを表す。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」は、「ＩＣＩによる治療」を表す。
【００１８】
特定の実施形態では、治療セッションは複数の治療セッションの１つであり、生体サンプル、好ましくは血漿を複数の治療セッションの１つの後２４時間以上においてがん患者から得る。特定の実施形態では、前記複数の治療セッションの１つの後、１週間以下を含む約３０、３６、４０、４８、５０、６０、７２時間以上においてサンプルを得る。
【００１９】
免疫チェックポイント阻害薬による治療に対する応答における宿主／がん患者により産生された複数の因子レベルを、生体サンプル、好ましくは血漿において決定する。それから、各因子について得られた値（因子濃度ｐｇ／ｍＬ）を、同じがん患者から事前に得られた生体サンプル、好ましくは血漿（以後「参照／ベースラインサンプル」）において決
定された同じ因子濃度のベースラインレベルである参照レベルと比較する。
【００２０】
本発明の特定の実施形態では、薬物による治療を開始した場合、ＩＣＩを用いたがん患者の複数の治療セッションの１つは治療の第一セッションである。この場合、参照／ベースラインサンプルを治療開始前の時点においてがん患者から得てから、ＩＣＩを用いた第一治療後にがん患者から得られた生体サンプル、好ましくは血漿中の決定された因子およびＩＣＩを用いた第一治療前の時点においてがん患者から得られた参照／ベースライン生体サンプル、好ましくは血漿中で見られた同じ因子の濃度レベル間で比較を行う。特定の実施形態では、この時点は、第一治療セッション前、約６０、５０、４８、４０、３６、３０、または２４時間を含む約７２時間以下である。
【００２１】
本発明の特定の他の実施形態では、ＩＣＩを用いたがん患者の治療セッションは、第一治療セッションでない複数の治療セッションの１つである。この場合、参照／ベースラインサンプルを、第一セッションでない前記セッションに先行した治療セッション後の時点においてがん患者から得る。この場合、参照／ベースラインサンプルは、第一治療セッションでない複数のセッションの前記セッション後約３０、３６、４０、４８、５０、６０、７２時間以上、１週間以下を含む約２４時間以上においてがん患者から得られた同じ生体サンプルである。
【００２２】
ＩＣＩによる治療後のがん患者の生体サンプル、好ましくは血漿中に循環している因子／バイオマーカーとしては、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、酵素または可溶性受容体などの分子因子が挙げられる。
【００２３】
因子は、腫瘍誘発性または転移誘発性因子であってよい。腫瘍誘発性因子は、血管新生誘発性、炎症誘発性／走化性または増殖性成長因子であってよい。
【００２４】
本発明によれば、参照／ベースラインレベルと比較した、ＩＣＩによる治療後にがん患者から得られた生体サンプル中で同定された因子／バイオマーカーの１つ以上のレベル変化は、各因子についての倍率変化により規定される。各因子についての倍率変化を、因子について、治療：参照／ベースライン値の比を算出することにより決定する。
【００２５】
特定の実施形態では、因子のレベル変化は、ＩＣＩによる治療に対する応答におけるがん患者により産生された因子の１つ以上の各々のレベルの少なくとも１．５倍の増加（上方制御）または少なくとも０．５倍の減少（下方制御）である。因子の上方制御を示す≧１．５の倍率変化または因子の下方制御を示す≦０．５の倍率変化を本発明により有意とみなし、ＩＣＩによる治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する。
【００２６】
参照／ベースラインレベルと比較した、ＩＣＩによる治療後にがん患者から得られた生体サンプルにおいて同定された因子／バイオマーカーの１つ以上のレベル変化は、有意である場合、前記がん治療に対する前記がん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する。倍率変化は、少なくとも約１．５倍以上高い、すなわち、≧１．５（上方制御）である場合、または少なくとも約０．５倍以下、すなわち、≦０．５（下方制御）である場合に有意とみなす。本明細書中使用されるとき、ＩＣＩによる治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する場合、倍率変化は「有意とみなされる」。
【００２７】
患者の生体サンプル中の全ての循環因子について倍率変化を決定する。治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答の予測は、循環因子の１つ以上、必要に応じて２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５以上の有意な倍率変化
に基づく。
【００２８】
特定の実施形態では、該変化は、１つ以上のバイオマーカーのレベルの少なくとも約１．５倍の増加（上方制御）である。増加が腫瘍誘発性であるバイオマーカーのレベルである場合、これは、治療に対するがん患者の好ましくない応答を示す。
【００２９】
特定の実施形態では、該変化は、１つ以上のバイオマーカーのレベルの少なくとも約０．５倍の減少（下方制御）である。減少が腫瘍誘発性であるバイオマーカーのレベルである場合、これは、治療に対するがん患者の好ましい応答を示す。
【００３０】
特定の実施形態では、治療セッションは、治療を開始する場合、がん患者の複数の治療セッションの第一セッションである。この場合、比較は、ＩＣＩによる治療の第一開始後にがん患者から得られた生体サンプル、好ましくは血漿において決定された因子、およびＩＣＩによる治療開始前にがん患者から得られた参照／ベースライン生体サンプル、好ましくは血漿において見られた同じ因子間である。結果は、患者を治療する腫瘍内科医が、がん患者の治療を継続するかどうか、またはどのように継続するかを決定する支援をし得る。
【００３１】
特定の実施形態では、ＩＣＩにより治療しているがん患者における治療応答をモニターするために本発明の方法を行う。この場合、治療セッションは、いくつかの治療セッションのうちの１つのセッションであるが、第一セッションではない。これらの結果は、治療を継続するかどうか、どのように継続するかの決定において腫瘍内科医を支援するだろう。
【００３２】
特定の実施形態では、腫瘍誘発性因子について決定された倍率変化はがん治療に対する患者の好ましい応答を予測し、スケジュール通り同じＩＣＩによる治療を継続する決定をしてよい。
【００３３】
特定の実施形態では、腫瘍誘発性因子について決定された倍率変化はＩＣＩに対する患者の好ましくない応答を予測する。この場合、腫瘍誘発性因子の特異的生物活性に応じて、例えば、該因子が炎症誘発性である場合に抗炎症薬を治療に加えることにより、または該因子が血管新生誘発性である場合に抗血管新生薬を治療に加えることにより、同じＩＣＩだが、腫瘍原性因子の生物活性を遮断する薬物を添加する治療を継続することを決定してよい。
【００３４】
特定の実施形態では、腫瘍誘発性因子に対して決定された倍率変化は、使用されるＩＣＩに対する患者の好ましくない応答を予測し、腫瘍内科医の決定は、異なるＩＣＩを用いた治療に変更することであってもよく、または２つのＩＣＩの組み合わせもしくはＩＣＩとがん治療において使用される別の薬物との組み合わせであってよい。
【００３５】
免疫チェックポイントは、免疫活性化の制御因子である。これらは、免疫ホメオスタシスの維持および自己免疫を阻止する重要な役割を果たす。がんでは、免疫チェックポイント機序は、しばしば、新生抗腫瘍免疫応答を抑制するように活性化される。免疫チェックポイント分子はがん免疫療法にとって良好な標的とみなされる。免疫チェックポイント分子の遮断を引き起こす免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）は、多発性がんで使用できる可能性を有するがん免疫療法のための薬物開発の良好な候補と考えられているものであり、現在既に使用されているか開発中である。
【００３６】
免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）開発の目標としての候補である免疫チェックポイントの例としては、２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有するＰＤ−１（プ
ログラム死−１）；ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）；ＡＤＯＲＡ２Ａとしても知られるＡ２ＡＲ（アデノシンＡ２Ａ受容体）；ＣＤ２７６とも呼ばれるＢＴ−Ｈ３；ＶＴＣＮ１とも呼ばれるＢＴ−Ｈ４；ＣＤ２７２とも呼ばれるＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）；ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）；ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）；ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）；ＴＤＯ（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）；ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン  ムチンドメイン３）；ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー）が挙げられる。
【００３７】
本発明の特定の実施形態では、ＩＣＩは、ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはＰＤ−１経路を中和／遮断するＰＤ−Ｌ１である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１  ｍＡｂは、進行性または切除不能なメラノーマ、転移性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）および頭頚部再発性有棘細胞がん（ＳＣＣＨ）の治療用に承認または試験されたペムブロリズマブ（キイトルーダ；旧ランブロリズマブ）である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１  ｍＡｂは、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、メラノーマおよび結腸直腸がん（ＣＲＣ）用に承認または試験されたニボルマブ（オプジーボ）である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１  ｍＡｂは、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、および急性骨髄性白血病用に承認または試験されたピディリズマブ（ＣＴ００１１）である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１  ｍＡｂは、ＲＥＧＮ２８１０、ＡＭＰ−２２４、ＭＥＤＩ０６８０、またはＰＤＲ００１である。
【００３８】
本発明の特定の他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害薬は、ＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、多発性がん用に承認された、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンチオ）、またはデュルバルマブ（イミフィンジ）である。アテゾリズマブは、多発性がん用であり、ベバシズマブ、ゲムシタビン、シスプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンフルニン、エンチノスタット、ダラツムマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、カルボプラチン、Ｎａｂ−パクリタキセル、ラジウム２２３二塩化物、オビヌツズマブなどの１つまたは２つの他のがん薬物と組み合わせて試験されている。
【００３９】
本発明の特定の他の実施形態では、ＩＣＩは、ＣＴＬＡ−４に対するｍＡｂ抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４は、進行性／転移性メラノーマおよび去勢抵抗性前立腺がん用に承認または試験されたイピリムマブ（ヤーボイ）である。特定の他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂは、トレメリムマブ（旧チシリムマブ）である。
【００４０】
特定の実施形態では、ＩＣＩは、（ｉ）ＭＧＡ２７１などの抗Ｂ７−Ｈ３；（ｉｉ）エパカドスタットなどの抗ＩＤＯ；（ｉｉｉ）リリルマブなどの抗ＫＩＲ；（ｉｖ）ＢＭＳ−９８６０１６、ＬＡＧ５２５、ＲＥＧＮ３７６７などの抗ＬＡＧ−３；（ｖ）ＴＳＲ０２２またはＭＢＧ４５３などの抗ＴＩＭ−３；ならびに（ｖｉ）ＪＮＪ６１６１０５８８などの抗ＶＩＳＴＡを含むｍＡｂである。
【００４１】
特定の実施形態では、２つのＩＣＩの組み合わせを本発明により使用する。特定の実施形態では、組み合わせは、抗ＰＤ−１およびニボルマブ−イピリムマブまたはＲＥＧＮ２８１０およびイピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４を含む。特定の実施形態では、組み合わせは、抗ＰＤ−Ｌ１およびデュルバルマブ−トレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４を含む。特定の実施形態では、組み合わせは、抗ＰＤ−１およびニボルマブ−アテゾリズマブなどの抗ＰＤ−Ｌ１を含む。特定の実施形態では、組み合わせは、ＢＭＳ−９８６０１６−ニボルマブまたはＲＥＧＮ３７６７−ＲＥＧＮ２８１０などの抗ＬＡＧ−３および抗ＰＤ−１を含む。特定の実施形態では、組み合わせは、抗ＰＤ−１ペムブロリズマブ＋ＩＤＯ阻害薬エパカドスタットを含む。
【００４２】
免疫チェックポイント阻害薬および別のがん治療による別の免疫療法を含む組み合わせ療法は、該組み合わせ療法に対するがん患者の応答性または非応答性を予測するために本発明により調査することができる可能性のある治療でもある。
【００４３】
したがって、特定の実施形態では、ＩＣＩ療法を、別のがん治療と組み合わせて使用する。特定の実施形態では、併用は、放射線療法との併用である。特定の実施形態では、組み合わせは、単独または化学療法薬の組み合わせであってよい化学療法、またはメトロノミック化学療法との組み合わせである。
【００４４】
特定の実施形態では、ＩＣＩ治療を、「分子標的療法」と時々呼ばれる標的がん治療と組み合わせて使用する。特定の実施形態では、標的治療薬は、ボルテゾミブ（ベルケイド）、スニチニブ（スーテント）などの小分子である。特定の実施形態では、標的治療薬は、ベバシズマブ（アバスチン）、パニツムマブ（ベクティビックス）、ダラツムマブ（ダラザレックス）などのモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１を、ＲＣＣ治療用に試験されたスニチニブ（スーテント）もしくはパゾパニブ（ヴォトリエント）と併用して、または抗ＣＴＬＡ−４イピリムマブとＢＲＡＦ阻害薬ダブラフェニブ（タフィンラー）との組み合わせと組み合わせて使用する。
特定の実施形態では、ＩＣＩ治療を、抗血管新生療法、例えば、ＶＥＧＦを標的とするｍＡｂと組み合わせて使用する。したがって、併用は、イピリムマブおよびベバシズマブの併用であってよい。
【００４５】
特定の実施形態では、ＩＣＩ治療を、がんワクチン、免疫調節薬、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）、腫瘍溶解性ウイルスなどの他の免疫療法と組み合わせて使用する。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４イピリムマブまたは抗ＰＤ−１ペムブロリズマブを、腫瘍溶解性ウイルス、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）と組み合わせて使用する。
【００４６】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦＲ（ＧＩＴＲ；ＣＤ３５７）、およびＣＤ４０などの共刺激分子は、活性化Ｔ細胞、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｒｅｇ、および他の免疫細胞によって発現される。アゴニスト抗体による免疫性チェックポイントＰＤ−１の阻害および共刺激分子の刺激は、免疫応答を増強する相補的戦略であり、したがって、組み合わせで使用する強い理論的根拠を提供する。したがって、特定の実施形態では、抗ＰＤ−１を、抗ＣＤ１３７などの共刺激分子と組み合わせて使用する。
【００４７】
本発明によれば、がん治療は、病気の全ステージにおいて、原発性または転移性、全てのタイプのがんと関連する。がんは、肉腫、がん腫、骨髄腫、リンパ腫および白血病から選択され得る。特定の実施形態では、がんは、肉腫のタイプ、例えば、軟部組織肉腫、骨肉腫である。特定の実施形態では、がんは、これに限定されないが、メラノーマ、脳がん、頚部がん、頭部がん、骨がん、鼻咽頭がん、肝がん、胃腸がん、胆道がん、胆管がん、食道がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、子宮頚がん、前立腺がん、腎臓がん、陰茎がん、精巣がん、皮膚がん、肺がん、胸部がん、膵がん、胸腺がん、甲状腺がん、または膀胱がんを含むがん腫である。
【００４８】
特定の実施形態では、がんは、リンパ腫、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫であり得るリンパ系のがんである。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫であり得る。
【００４９】
特定の実施形態では、がんは、白血病、骨髄およびリンパ系を含む体の血液形成組織のがんである。特定の実施形態では、白血病は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択される。特定の実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。
【００５０】
特定の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。特定の実施形態では、がんは、進行性（ステージＩＩＩもしくはＩＶ）または転移性ＮＳＣＬＣである。
【００５１】
特定の実施形態では、がんは、転移性メラノーマ、腎細胞がん（ＲＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、膀胱がん、メルケル細胞がん、頭頸部がん、またはミスマッチ修復欠損固形腫瘍である。
【００５２】
がん患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与後、本発明の方法によって同定された宿主由来因子／バイオマーカーは：（ｉ）がん患者；および（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害薬に対して特異的である。これは、がん患者に関する固有情報を提供し、個別化された形態での予測を可能とし、診断、計画治療、治療が如何によく効くかを見出すこと、または予後診断する手助けとなる「宿主応答」である。
【００５３】
治療が１つの単一ＩＣＩである場合、宿主／患者によって産生された因子はこの特定のＩＣＩに対して特異的である。治療を２つのＩＣＩの組み合わせで行う場合、宿主／患者によって産生された因子はこのＩＣＩの組み合わせに対して特異的である。治療が別のがん治療との組み合わせのＩＣＩである場合、別のがん患者によって産生された因子はこの組み合わせに対して特異的である。
【００５４】
特定の実施形態では、バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、酵素または可溶性受容体などの分子因子である。これらの因子のいくつかは、腫瘍に影響を与え、腫瘍血管新生およびがん再増殖に寄与する細胞を誘導し、これにより使用された治療に対する耐性を促進する。このような細胞の例としては、Ｇ−ＣＳＦおよびＳＤＦ−１αなどのサイトカインおよび成長因子による骨髄コンパートメントから結集された後、治療された腫瘍をコロニー形成してがん治療耐性、限定されないが、特に化学療法耐性を促進する、骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）が挙げられる。他の細胞は、マクロファージおよび抗原提示細胞などの免疫細胞、または腫瘍進行において中心的役割を果たす腫瘍内微小環境内の間質細胞である。
【００５５】
がん治療に対する腫瘍耐性に寄与する宿主媒介細胞および分子機序は、特定のがん治療により宿主において産生された因子および／または細胞の生体機能に基づく。各因子は、１つ以上の生体機能または活性を示し得る。
【００５６】
特定の実施形態では、因子は腫瘍原性であり、腫瘍増殖に寄与する。特定の実施形態では、腫瘍原性因子は血管新生誘発性である。他の実施形態では、腫瘍原性因子は炎症誘発性／走化性である。さらに他の実施形態では、腫瘍原性因子は増殖性成長因子である。
【００５７】
特定の実施形態では、血管新生誘発性因子としては、ＡＮＧ（アンジオゲニン）；アンジオポエチン−１；アンジオポエチン−２；ｂＮＧＦ（塩基性神経成長因子）；カテプシンＳ；ガレクチン−７；ＧＣＰ−２（顆粒球走化性タンパク質、ＣＸＣＬ６）；Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）；ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子２、ＣＳＦ２としても知られる）；ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化因子阻害薬−１）；ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢから選択されるＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）；ＰｌＧＦ（またはＰＬＧＦ、胎盤成長因子）；ＰｌＧＦ−２；ＳＣＦ（幹細胞因子）；ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２、ストロマ細胞由来因子１
）；Ｔｉｅ２（またはＴＩＥ−２、内皮受容体チロシンキナーゼ）；ＶＥＧＦ  Ａ、ＶＥＧＦ  ＣおよびＶＥＧＦ  Ｄから選択されるＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）；ＶＥＧＦ  Ｒ１；ＶＥＧＦ  Ｒ２；ＶＥＧＦ  Ｒ３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
特定の実施形態では、炎症誘発性および／または走化性因子としては、６Ｃｋｉｎｅ（ＣＣＬ２１、エキソドス２（Ｅｘｏｄｕｓ−２））；アンジオポエチン−１；アンジオポエチン−２；ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３、Ｂリンパ球化学誘引物質またはＢ細胞誘引性ケモカイン１（ＢＣＡ−１）；ＢＲＡＫ（ＣＸＣＬ１４）；ＣＤ１８６（ＣＸＣＲ６）；ＥＮＡ−７８（ＣＸＣＬ５、上皮細胞由来好中球活性化ペプチド７８）；エオタキシン１（ＣＣＬ１１）；エオタキシン２（ＣＣＬ２４）；エオタキシン３（ＣＣＬ２６）；ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）；ＧＤＦ−１５（増殖分化因子１５、マクロファージ阻害性サイトカイン１、ＭＩＣ−１としても知られる）；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＲＯ（増殖調節がん遺伝子）；ＨＣＣ−４（ＣＣＬ１６、ヒトＣＣサイトカイン４）；Ｉ−３０９（ＣＣＬ１）；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−１Ｒ４（ＳＴ２）；ＩＬ−２；ＩＬ−２Ｒ；ＩＬ−３；ＩＬ−３Ｒα；ＩＬ−５；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−７；ＩＬ−８；ＩＬ−８  ＲＢ  （ＣＸＣＲ２、インターロイキン８受容体、β）；ＩＬ−１１；ＩＬ−１２；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１２ｐ７０；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３  Ｒ１；ＩＬ−１３Ｒ２；ＩＬ−１５；ＩＬ−１５Ｒα；ＩＬ−１６；ＩＬ−１７；ＩＬ−１７Ｃ；ＩＬ−１７Ｅ；ＩＬ−１７Ｆ；ＩＬ−１７Ｒ；ＩＬ−１８；ＩＬ−１８ＢＰａ；ＩＬ−１８  Ｒα；ＩＬ−２０；ＩＬ−２３；ＩＬ−２７；ＩＬ−２８；ＩＬ−３１；ＩＬ−３３；ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０、インターフェロンγ誘発性タンパク質１０）；Ｉ−ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１、インターフェロン誘発性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質）；ＬＩＦ（白血病抑制因子）；ＬＩＸ（ＣＸＣＬ５、リポ多糖誘発性ＣＸＣケモカイン）；ＬＲＰ６（低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６）；ＭａｄＣＡＭ−１（粘膜アドレッシン細胞接着分子１）；ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２、単球走化性タンパク質１）；ＭＣＰ−２（ＣＣＬ８）；ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）；ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）；Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）としても知られている）；ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）；ＭＩＧ（ＸＣＬ９、γインターフェロンにより誘発されたモノカイン）；ＭＩＰ−１γ（ＣＣＬ９、マクロファージ炎症性タンパク質１γ）；ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）；ＭＩＰ−１β；ＭＩＰ−１δ（ＣＣＬ１５）；ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）；ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ１９）；ＭＰＩＦ−１（ＣＣＬ２３、骨髄前駆体阻害因子１）；ＰＡＲＣ（ＣＣＬ１８、肺および活性化調節ケモカイン）；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４、血小板因子４）；ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５、活性化時調節、正常Ｔ細胞発現および分泌）；レジスチン；ＳＣＦ；ＳＣＹＢ１６（ＣＸＣＬ１６、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂ１６）；ＴＡＣＩ（ＣＡＭＬタンパク質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ＣＡＭＬ  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ））；ＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７、ＣＣ胸腺および活性関連ケモカイン）；ＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子）；ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）；ＴＮＦ  Ｒ１；ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体４）；ＴＲＥＭ−１（骨髄細胞に発現する誘発性受容体１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
特定の実施形態では、増殖因子としては、アクチビンＡ；アンフィレグリン；Ａｘｌ（ＡＸＬ、受容体型チロシンキナーゼ）；ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）；ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）；カテプシンＳ；ＥＧＦ（上皮成長因子）；ＦＧＦ−１（線維芽細胞成長因子１）；ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ、塩基性ＦＧＦとしても知られている）；ＦＧＦ−７；ＦＧＦ−２１；フォリスタチン（ＦＳＴ）；ガレクチン７；Ｇａｓ６（増殖停止時に特異的に発現される遺伝子６）；ＧＤＦ−１５；ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）；ＨＧＦ；ＩＧＦＢＰ−１（インスリン様成長因子結合タンパク質１）；ＩＧＦＢＰ−３；ＬＡＰ（潜在関連ペプチド）；ＮＧＦ  Ｒ（神経成長因子受容体）；ＮｒＣＡＭ（神経細胞接着分子）；ＮＴ−３（ニューロトロフィン３）；ＮＴ−４；ＰＡＩ−１；ＴＧＦ−α
（トランスフォーミング成長因子α）；ＴＧＦ−β；およびＴＧＦ−β３；ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
特定の実施形態では、転移誘発性因子としては、ＡＤＡＭＴＳ１（Ａディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼとトロンボスポンジンモチーフ１）；カテプシンＳ；ＦＧＦ−２；フォリスタチン（ＦＳＴ）；ガレクチン７；ＧＣＰ−２；ＧＤＦ−１５；ＩＧＦＢＰ−６；ＬＩＦ；ＭＭＰ−９（マトリックスメタロペプチダーゼ９、９２ｋＤａゼラチナーゼまたはゼラチナーゼＢ（ＧＥＬＢ）としても知られている）；プロＭＭＰ９；ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）；ＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子、ＣＸＣＬ１２としても知られている）およびその受容体ＣＸＣＲ４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
因子は、抗腫瘍性因子、例えば、抗血管新生、抗炎症性および／または抗増殖性成長因子であってもよい。
【００６２】
特定の実施形態では、ＩＣＩに対する宿主応答を示す循環因子としては、ＡＤＡＭＴＳ１、アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＥＧＦ；エオタキシン−２；ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＨＧＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＴＡＣＩ；Ｍ−ＣＳＦ；ＭＭＰ−９；ＰＤＧＦ−ＢＢ；プロＭＭＰ９；ＳＣＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明によれば、抗ＰＤ−１治療に対する応答において上方制御された因子の多くは、血管新生、炎症、走化性および増殖などの腫瘍誘発性および転移誘発性過程におけるキープレーヤーである。上方制御された血管新生誘発性因子としては：Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；およびＰＤＧＦ−ＢＢが挙げられる。上方制御された炎症誘発性および／または走化性因子としては：ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；およびＭ−ＣＳＦが挙げられる。上方制御された増殖性成長因子としては：ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；およびＨＧＦが挙げられる。上方制御された転移誘発性因子としては：ＭＭＰ−９が挙げられる。
【００６４】
本発明によれば、抗ＰＤ−Ｌ１治療に対する応答において上方制御された因子の多くは、炎症、走化性および増殖などの腫瘍誘発性および転移誘発性過程におけるキープレーヤーである。上方制御された血管新生誘発性因子としては：Ｇ−ＣＳＦ；およびＳＣＦが挙げられる。上方制御された炎症誘発性および／または走化性因子としては：エオタキシン−２；Ｇ−ＣＳＦ；ＩＬ−１ｒａ；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＳＣＦ；およびＴＡＣＩが挙げられる。上方制御された増殖性成長因子としては：アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＥＧＦ；およびＨＧＦが挙げられる。上方制御された転移誘発性因子としては：ＡＤＡＭＴＳ１およびプロＭＭＰ９が挙げられる。
【００６５】
別の態様では、本発明は、複数の抗体、および使用説明書を含むキットであって、前記複数の抗体の各々の抗体は、免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の応答性または非応答性を促進する複数の因子の各々と選択的に結合する、キットを提供する。
【００６６】
特定の実施形態では、キットは、タンパク質レベルを検出する抗体アレイのいずれかのタイプである。特定の実施形態では、キットは、物質、通常、液体サンプルまたは湿式サ
ンプル中の抗原の存在を検出するための固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を使用する、サンドイッチまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。本発明によれば、この液体サンプルは、ＩＣＩによる治療を行っているがん患者から得られた生体サンプルである。
【００６７】
特定の実施形態では、キットは、各々が血管新生誘発性、炎症誘発性／走化性、増殖性および／または転移誘発性活性を有する腫瘍誘発性因子と特異的に結合する、複数のヒトモノクローナル抗体を含み、これらの腫瘍誘発性因子の少なくとも一部は免疫チェックポイント阻害薬による治療に対するがん患者の好ましいまたは好ましくない応答を予測する、本発明によって事前に同定された因子である。もちろん、キットは、可能性のある候補となる腫瘍誘発性因子と結合する追加の抗体を含むだろう。キット中のモノクローナル抗体の数は、製造者の判断によって決まるだろう。
【００６８】
したがって、特定の実施形態では、本発明のキットは、モノクローナル抗体アレイを含み、前記モノクローナル抗体のうち少なくとも３０は各々次の３０因子から選択される因子と特異的に結合する：ＡＤＡＭＴＳ１、アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＥＧＦ；エオタキシン−２；ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＨＧＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＴＡＣＩ；Ｍ−ＣＳＦ；ＭＭＰ−９；ＰＤＧＦ−ＢＢ；プロＭＭＰ９；およびＳＣＦ。
【００６９】
特定の好ましい実施形態では、キットは本発明による使用のためである。
【００７０】
本発明を、次の非限定的実施例により例証する。
【実施例】
【００７１】
イントロダクション
最近の臨床研究は、患者がＩＣＩに対する耐性を生じる場合もあれば、ＩＣＩ治療に対して応答しない場合もあることを報告している（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。本発明者らは、宿主がＩＣＩ治療に対する応答において腫瘍誘発性因子を産生し、次に、これが腫瘍再増殖、進行および治療に対する耐性の一因となる。この機序に寄与する因子を同定するために、本発明者らは、腫瘍を有さないおよび腫瘍を有する免疫適格性マウスの両方においてインビボ実験を行う。このアプローチは、本発明者らが、ＩＣＩの治療抗腫瘍活性および宿主細胞に対するこれらの薬物の効果を識別することを可能とする。本発明者らは、抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬ−４モノクローナル抗体を含む、臨床で広く使用されるＩＣＩに焦点を当て、特定のＩＣＩに対する応答性または耐性があることが知られているマウス腫瘍モデルを使用する。例えば、ＣＴ２６結腸およびＥＭＴ−６乳がんセルラインは、それぞれ、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−Ｌ１に対して応答するが（Ｄｕｒａｉｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；Ｓｗａｒｔ  ｅｔ  ａ．，２０１３）、本発明者らの実験室でも試験したように（示さず）、ＭＣ３８結腸および４Ｔ１乳がんセルラインは、いくつかのＩＣＩ（抗ＰＤ−１を含む）に対して耐性があるかまたは中程度しか応答しない（Ｄｅ  Ｈｅｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｋｏｄｕｍｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【００７２】
材料および方法
（ｉ）腫瘍細胞培養：マウスＥＭＴ６乳がん細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国ＡＴＣＣ社）から購入した。信頼あるストックから解凍後４ヶ月以下の間培養液中で細胞を継代して、定期的に試験してマイコプラズマ感染していないことを確認した（ＥＺ−ＰＣＲマイコプラズマ試験キット、Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン、ストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を培養した。５％ＣＯ２下３７℃において細胞を培養した。
【００７３】
（ｉｉ）動物治療プロトコールおよび腫瘍モデル：ナイーブ８〜１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＣＩＤまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（Ｈａｒｌａｎ社、イスラエル国）に抗ＰＤ−１または不適切なＩｇＧラット抗マウス抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を腹腔内注射した。他の実験では、ナイーブ８〜１０週齢雌および雄ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ｂｌ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ社、イスラエル国）に抗ＰＤ−Ｌ１または不適切なＩｇＧラット抗マウス抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を腹腔内注射した。全ての場合に、１週間にわたって隔日毎に（合計３回注射）、２００μｇ／マウス２０ｇの用量で抗体を投与した。ＥＭＴ６マウス乳がん細胞（５×１０５）を、８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に移植した。式  幅２×長さ×０．５を用いて、バーニアノギスで定期的に腫瘍サイズを評価した。いくつかの実験では、ＥＭＴ６細胞（２５×１０３）を尾静脈によりマウスに注射して実験的肺転移を形成した。マウス生存期間を毎日モニターし、呼吸困難に直面または体重が１５％超減少した場合、これらのマウスを安楽死させた。マウスをエンドポイントにおいて犠牲にして、腫瘍を下記の通りに処理した。
【００７４】
（ｉｉｉ）血漿サンプルおよび条件培地調製：コントロールＩｇＧ治療、抗ＰＤ−１治療または抗ＰＤ−Ｌ１治療マウスから血液を心穿刺によってＥＤＴＡ被覆チューブ中へ採取した。その後、１０００ｇ、４℃、２０分間で全血を遠心分離することにより血漿を単離した。さらに使用するまで、−８０℃においてアリコートで血漿を貯蔵した。骨髄由来細胞をＩｇＧまたは抗ＰＤ−１治療マウスの大腿骨から回収した。骨髄細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を２４時間血清フリーＤＭＥＭ中で培養し、条件培地（ＣＭ）を作製した。
【００７５】
（ｉｖ）修正ボイデンチャンバーアッセイ：血清不足（ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ）ＥＭＴ６細胞（０．２×１０５細胞）を、浸潤アッセイについては５０μｌマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）または遊走アッセイについては１００μｌフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかで被覆されたボイデンチェンバの上側コンパートメントで培養した。下側コンパートメントは、ＩｇＧ治療または抗ＰＤ−１治療ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＣＩＤまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから得られた５％血漿を含有するＤＭＥＭ培地で満たした。４時間（遊走について）またはオーバーナイト（浸潤について）のインキュベーション後、底フィルターに遊走した細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。ＬＥＩＣＡ  ＤＭＩ  ６０００Ｂ蛍光倒立顕微鏡を用いて１００倍対物レンズ視野下に画像をキャプチャーした（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、独国）。群当たり、少なくとも１０視野を評価した。視野内の全ピクセルにわたって底膜コンパートメントを覆っているポジティブピクセル（細胞を示す）のパーセンテージを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＳＣ２  Ｖ９．０（米国カリフォルニア州サンノゼ）を用いて算出した。実験を３回反復して行い、少なくとも２回独立して行った。
【００７６】
（ｖ）マトリゲルプラグアッセイ：マトリゲル（０．５ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を、ＩｇＧ治療または抗ＰＤ−１治療マウスから得られた血漿と混合した（１０：１の比、マトリゲル：血漿、体積基準）。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス、７〜８週齢の側腹部に、マトリゲルを皮下注射した。１０日後にプラグを取り出し、その後、フローサイトメトリー分析のために単一細胞懸濁液として調製または下記組織学的分析のために処理した。
【００７７】
（ｖｉ）フローサイトメトリー分析：マトリゲルプラグ、腫瘍または脾臓をマウスから回収し、単一細胞懸濁液として調製した。骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）を大腿骨から回収した。血液を後眼窩洞出血より採血した。全ての場合において、細胞を抗体混合物で免疫染色し、次のマーカーによって異なる細胞型を同定した：骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ−１＋／Ｌｙ６Ｇ＋／Ｌｙ６Ｃ＋；Ｍ１マクロファージ、ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ２０６−／Ｆ４／８０＋；Ｍ２マクロファージ、ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ２０６＋／Ｆ４／８０＋；細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋；ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋；および制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸｐ３＋。全てのモノクローナル抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、またはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、製造元取扱説明書に従って使用した。少なくとも１００，０００イベントをＣｙａｎ  ＡＤＰフローサイトメーターを用いて得て、Ｓｕｍｍｉｔ  ｖ４．３ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて解析した。
【００７８】
（ｖｉｉ）免疫組織化学：マトリゲルプラグを−８０℃において最適切断温度（ＯＣＴ）で貯蔵し、凍結切片にした（１０μｍ）。マトリゲルプラグ薄片をＨ＆Ｅ（Ｅｍｍｏｎｙａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ブルガリア）で染色し、宿主細胞のコロニー化を評価した。マトリゲル薄片の内皮細胞を、ＣＤ３１抗体（１：１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびＣｙ３結合二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて免疫染色によって検出した。Ｌｅｉｃａ  ＣＴＲ６０００システムを用いて画像をキャプチャーした。
【００７９】
（ｖｉｉｉ）抗体アレイ：３つのタンパク質プロファイリング実験を行った。第一実験では、ＩｇＧ治療または抗ＰＤ−１治療雌ＢＡＬＢ／ｃマウスから抽出された血漿サンプルを治療群毎にプールした（群当たりｎ＝５）。全部で１１１因子をスクリーニングするために製造元取扱説明書に従って膜型プロテオームプロファイルマウスＸＬサイトカインアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；カタログ番号：ＡＲＹ０２８）にサンプルを適用した。第二実験では、ＩｇＧ治療または抗ＰＤ−Ｌ１治療雌または雄ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ｂｌ／６マウスから抽出された血漿サンプルを群毎にプールした（群当たりｎ＝７）。全部で２００因子をスクリーニングするために、製造元取扱説明書に従ってガラススライド型Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙマウスサイトカインアレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社；カタログ番号：ＱＡＭ−ＣＡＡ−４０００）にサンプルを適用した。第三実験では、ＩｇＧ治療または抗ＰＤ−１治療雌ＢＡＬＢ／ｃまたはＳＣＩＤマウスから抽出された血漿サンプルを群毎にプールした（群当たりｎ＝７）。全部で２００因子をスクリーニングするために、製造元取扱説明書に従ってガラススライド型Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙマウスサイトカインアレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社；カタログ番号：ＱＡＭ−ＣＡＡ−４０００）にサンプルを適用した。膜型アレイのため、現像したＸ線フィルム上のピクセル密度を、透過式濃度計および画像解析ソフトウェアを用いて解析した。ガラススライド型アレイのため、レーザー蛍光スキャナーによって蛍光出力を検出した。全ての場合において、データを正規化し、アレイの各因子の倍率変化を、治療：コントロール値の比の算出によって決定した。
【００８０】
（ｉｘ）統計解析：データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。差の統計的有意性を１元配置ＡＮＯＶＡにより評価した後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（米国カリフォルニア州ラホーヤ）を用いてテューキーアドホック統計検定を行った。２つの群のみを比較する場合、いくつかの実験では、スチューデントｔ検定を使用した。全群間の差を互いに比較し、０．０５未満のｐ値のとき有意とみなした。
【００８１】
実施例１．抗ＰＤ−１治療に対する応答における腫瘍細胞攻撃性のインビトロ評価
【００８２】
抗ＰＤ−１治療が宿主における応答を誘発して、次に、腫瘍細胞攻撃性に対する直接的効果を有するかどうかを試験するため、抗ＰＤ−１またはＩｇＧコントロール抗体で治療された健康なナイーブマウスから抽出された血漿の存在下でインビトロ遊走および浸潤アッセイを行った。ナイーブマウスの使用は、本発明者らが腫瘍の存在に関係なく宿主媒介効果を評価することを可能とした。この目的を達成するために、腫瘍を有さないＢａｌｂ／ｃマウスに１週間の期間にわたって（合計３回注射）抗ＰＤ−１またはＩｇＧコントロール抗体を腹腔内注射した。マウスを犠牲にして、血液を採血し、血漿を精製した。ＥＭＴ６腫瘍細胞の浸潤性および遊走性に対する血漿サンプルの効果を、修正ボイデンチャンバーアッセイを用いてインビトロで評価した。図１Ａ〜Ｂは、抗ＰＤ−１治療マウスから得た血漿は、ＩｇＧ治療コントロールマウスから得た血漿と比較して、ＥＭＴ６細胞の浸潤性および遊走性を有意に増強することを示している。これらの発見は、抗ＰＤ−１治療マウスの血漿中の宿主由来因子が腫瘍細胞攻撃性を増強することを示唆している。メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍細胞浸潤および遊走を支援することが分かっているので、本発明者らは、抗ＰＤ−１またはＩｇＧコントロール抗体で治療されたマウスから得られた骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）の条件培地（ＣＭ）中のＭＭＰの発現レベルを次に評価した。本発明者らは、コントロールと比較して抗ＰＤ−１抗体で治療されたマウスから得られたＢＭＤＣのＣＭ中でＭＭＰ９が非常に上昇したことを見出した（図１Ｃ〜Ｄ）。まとめると、これらの結果は、抗ＰＤ−１治療に対する応答において、宿主細胞は、循環中に腫瘍細胞攻撃性を支援する因子を分泌することを示唆している。
【００８３】
実施例２．適応免疫系の細胞は、抗ＰＤ−１治療に対する応答において腫瘍支持性因子を分泌する。
【００８４】
抗ＰＤ−１治療に対する応答において腫瘍支持性因子を分泌する宿主細胞型を同定するために、実施例１に記載のものと同様な実験を行った。しかしながら、この場合、適応免疫細胞を欠くＳＣＩＤ  ＣＢ１７マウス、および適応免疫細胞型に欠けており自然免疫細胞型に機能を果たさないＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使用した。腫瘍を有さないＳＣＩＤまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに１週間の期間にわたって（合計３回注射）抗ＰＤ−１またはＩｇＧコントロール抗体を腹腔内注射した。マウスを犠牲にして、血液を採血し、血漿を精製した。ＥＭＴ６腫瘍細胞の浸潤性および遊走性に対する血漿サンプルの効果を、修正ボイデンチャンバーアッセイを用いてインビトロで評価した。本発明者らの結果は、抗ＰＤ−１治療ＳＣＩＤマウスから得られた血漿がＥＭＴ６細胞の浸潤性を阻害したが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから得られた血漿は浸潤に対する効果を有さず、コントロールと比較してＥＭＴ６細胞の遊走を阻害したことを示している（図２、図３Ａ〜Ｂ）。本発明者らは、抗ＰＤ−１またはＩｇＧコントロール抗体で治療されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから得られた骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）の条件培地（ＣＭ）中のＭＭＰ９の発現レベルを次に評価した。図３Ｃ〜Ｄに示されたように、ＭＭＰ９のレベルは、抗ＰＤ−１およびコントロールマウスから抽出された骨髄細胞からのＣＭ中同様であった。これらの結果全体は、実施例１に記載および図１に示されたものと明らかに対照的である。これらは、腫瘍細胞浸潤および遊走を促進する因子は、抗ＰＤ−１治療に対する応答において適応免疫系の細胞によって主に分泌されることを示唆している。
【００８５】
実施例３．抗ＰＤ−１治療に対する応答における腫瘍進行のインビボ評価
【００８６】
抗ＰＤ−１治療に対する宿主の応答が如何に腫瘍の運命に影響を与えるかを評価するため、本発明者らは、抗ＰＤ−１治療ナイーブ（腫瘍を有さない）マウス由来の血漿で前治療された腫瘍細胞のインビボ転移性を調査した。この目的を達成するために、ＥＭＴ６細胞を抗ＰＤ−１抗体またはコントロールＩｇＧで治療されたナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスから抽出された１０％血漿を含む血清フリー培地中４時間前培養した。細胞を洗浄し、その後、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に静脈内注射して、実験的肺転移モデルを作
製した。図４における結果は、抗ＰＤ−１治療マウスから得られた血漿に前暴露されたＥＭＴ６細胞を注射されたマウスは、ＩｇＧ治療マウスから得られた血漿で前治療されたＥＭＴ６細胞を注射されたコントロールマウスと比較して死亡率増加を示すことを示している。全マウスから肺を取り出し、転移を評価した。肺の転移性病変数において有意差は観察されなかった。
【００８７】
実施例４．抗ＰＤ−１治療は、マトリゲルプラグにおける腫瘍支持性宿主細胞のコロニー化を促進する。
【００８８】
腫瘍内微小環境における宿主細胞組成に対する抗ＰＤ−１治療の効果の特徴を決定するため、マトリゲルプラグアッセイを使用した。マトリゲルは、腫瘍内微小環境において見られる腫瘍細胞外マトリックスからなる物質である。マトリゲルを、抗ＰＤ−１治療またはＩｇＧ治療マウスから得られた血漿と１０：１で混合した。その後、マトリゲル−血漿混合物を、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に移植して、プラグを形成した。１０日後、プラグを取り出し、薄片にして、内皮細胞を免疫染色した。図５Ａに示されたように、血管は、コントロールと比較して抗ＰＤ−１治療マウスから得られた血漿を含むマトリゲルプラグにおいてより豊富であった。これは、宿主由来抗ＰＤ−１誘発性循環因子は血管新生を促進することを示唆している。並列実験では、単一細胞懸濁液としてマトリゲルプラグを調製し、フローサイトメトリーによって分析して様々な免疫細胞型を同定した。図５Ｂおよび表１に示されたように、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および活性化ヘルパーＴ細胞のレベルは、免疫療法の治療効果と合致して、コントロールと比較して抗ＰＤ−１治療マウスから得られた血漿を含むマトリゲルプラグにおいて増加した。しかしながら、Ｍ２様マクロファージおよびＭＤＳＣを含む腫瘍誘発性作用に関連する他の細胞型のレベルも増加した。これらの発見は、抗ＰＤ−１治療が腫瘍支持性免疫細胞を含む宿主応答を誘発することを示唆している。
【００８９】
マトリゲルアッセイの結果は、本発明者らが、抗ＰＤ−１治療に対する応答における腫瘍および異なる器官中の免疫細胞組成変化を特徴付けることを促した。この目的を達成するために、腫瘍を有さないＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＥＭＴ６腫瘍（その腫瘍は５００ｍｍ３の大きさに達した）を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに１週間の期間にわたって（合計３回）、抗ＰＤ−１またはＩｇＧ抗体を腹腔内注射した。マウスを犠牲にし、血液、脾臓、ＢＭＤＣおよび腫瘍を抽出し、フローサイトメトリーによって分析して種々の免疫細胞型を同定した。表１中に示されたデータは、腫瘍内において、予想通りに、免疫療法の治療効果と合致して、ＣＴＬは非常に上昇し活性化した。しかしながら、ヘルパーＴおよびＣＴＬを含む適応免疫細胞のレベルは、コントロールと比較して、血液および腫瘍を有さないおよび腫瘍を有する抗ＰＤ−１治療マウスの両方のＢＭＤＣ中で減少した。加えて、腫瘍を有さないまたは腫瘍を有するマウスの造血器官（例えば、脾臓およびＢＭＤＣ）において、Ｍ１およびＭ２マクロファージならびにＭＤＳＣを含む自然免疫細胞のレベルは変動し、時々増加した。これらの結果は、腫瘍中、予想通りに、ＣＴＬは活性であり抗腫瘍作用を促進するが、他の評価した器官においては、Ｍ２マクロファージおよびＭＤＳＣを含む腫瘍支持性免疫細胞は抗ＰＤ−１治療に対する応答において上昇し、したがって、ＣＴＬの抗腫瘍作用を相殺し得る。
【００９０】
実施例５．循環宿主由来因子に対する免疫チェックポイント阻害薬療法の効果−マウスにおけるタンパク質プロファイリングアプローチ
【００９１】
図１〜５に示されたデータは、抗ＰＤ−１治療が腫瘍細胞攻撃性を最終的に促進する循環中の因子の上方制御を誘発することを示唆している。このような効果は、免疫チェックポイント阻害薬治療の他のタイプに対する応答において起こり得る。そのレベルが抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１治療に対する応答において変化する宿主由来循環因子を同定する
ため、本発明者らは、ナイーブ（腫瘍を有さない）マウスを用いて３タンパク質アレイ型スクリーニングを行った。ナイーブマウスの使用は、腫瘍に関係なく、治療に対する応答における宿主により特異的に産生された因子を同定することを可能とする。
【００９２】
第一スクリーニングにおいて、ナイーブ８〜１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）に、１週間の期間にわたって隔日毎に２００μｇ／マウス２０ｇの用量で、抗ＰＤ−１ラット抗マウス抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を腹腔内注射した（全部で３回注射した）。コントロールマウス（ｎ＝３）に、同用量でラット抗マウスＩｇＧ抗体を同様に注射した。第一注射後１週間目、マウスを犠牲にし、心穿刺によってＥＤＴＡ被覆チューブ中へ血液を採取した。室温において１０分間、１３００ｇにおいて全血の遠心分離によって血漿を単離した。上澄み（血漿サンプルである）を集め、群毎にプールした。さらに使用するまで、アリコートを−８０℃において貯蔵した。血漿サンプルを、全部で１１１因子をスクリーニングするために膜型プロテオームプロファイルマウスＸＬサイトカインアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；カタログ番号：ＡＲＹ０２８）に適用した。アレイによって検出されたサイトカイン、酵素および成長因子の全リストを、表２に示している。現像したＸ線フィルムのピクセル密度を透過式濃度計および画像解析ソフトウェアを用いて解析した。正規化データを解析して抗ＰＤ−１治療に対する応答においてその循環レベルが変化した因子を同定した。詳細には、治療：コントロール値の比の算出によって各因子について倍率変化を決定した。１．５超または０．５未満の倍率変化を示す因子を、抗ＰＤ−１治療に対する応答において、それぞれ、上方制御または下方制御されたと定義した。これらの因子、およびこれらのそれぞれの倍率変化を、表３中に一覧にしている。抗ＰＤ−１治療に対する応答において上方制御された因子の多くは、血管新生、炎症、走化性および増殖などの腫瘍誘発性および転移誘発性過程におけるキープレーヤーである。上方制御された血管新生誘発性因子としては：Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；およびＰＤＧＦ−ＢＢが挙げられる。上方制御された炎症誘発性および／または走化性因子としては：ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ；ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１Ｒα；ＩＬ−２；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−１０；ＩＬ−１２ｐ４０；ＩＬ−１３；ＩＬ−３３；およびＭ−ＣＳＦが挙げられる。上方制御された増殖性成長因子としては：ＦＧＦ−２１；Ｇａｓ６；およびＨＧＦが挙げられる。上方制御された転移誘発性因子としては：ＭＭＰ−９が挙げられる。
【００９３】
第二スクリーニングでは、ナイーブ８〜１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ、雄ＢＡＬＢ／ｃ、雌Ｃ５７Ｂｌ／６または雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７マウス／群）に、１回の注射毎に２００μｇ／マウス２０ｇの用量で、１週間の期間にわたって隔日毎に抗ＰＤ−Ｌ１またはコントロールＩｇＧ抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を腹腔内に注射した（全部で３回注射した）。最後の投与後２４時間目、マウスを犠牲にし、血液を採取して血漿を調整した。各群から得られた血漿サンプルをプールし、全部で２００因子をスクリーニングするために、製造元取扱説明書に従ってガラススライド型Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙマウスサイトカインアレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社；カタログ番号：ＱＡＭ−ＣＡＡ−４０００）に適用した。アレイによって検出されたサイトカイン、酵素および成長因子の全リストを、表４に示している。治療：コントロール値の比の算出によってタンパク質アレイで各因子について倍率変化を決定した。１．５超または０．５未満の倍率変化を示す因子を、抗ＰＤ−Ｌ１治療に対する応答において、それぞれ、上方制御または下方制御されたと定義した。これらの因子、およびこれらのそれぞれの倍率変化を、表５中に一覧にしている。データは、異なるマウス系統間を比較または同系統の雄および雌間を比較する場合に、上方制御および下方制御された因子のプロファイルが完全に重なるわけではないことを示している。これは、抗ＰＤ−Ｌ１治療に対する応答は遺伝子型依存性であることを示唆している。これは、がん患者の中で存在することが分かっている差を反映し、したがって、個別化された形態で患者における宿主の応答を試験する理論的根拠を提供する。抗ＰＤ−Ｌ１治療に対する応答において上方制御された因子
の多くは、炎症、走化性および増殖などの腫瘍誘発性および転移誘発性過程におけるキープレーヤーである。上方制御された血管新生誘発性因子としては：Ｇ−ＣＳＦ；およびＳＣＦが挙げられる。上方制御された炎症誘発性および／または走化性因子としては：エオタキシン−２；Ｇ−ＣＳＦ；ＩＬ−１ｒａ；ＩＬ−６；ＩＬ−７；ＩＬ−３３；Ｉ−ＴＡＣ；ＭａｄＣＡＭ−１；ＭＣＰ−５；ＳＣＦ；およびＴＡＣＩが挙げられる。上方制御された増殖性成長因子としては：アンフィレグリン；Ａｘｌ；ＥＧＦ；およびＨＧＦが挙げられる。上方制御された転移誘発性因子としては：ＡＤＡＭＴＳ１およびプロＭＭＰ９が挙げられる。
【００９４】
宿主細胞タイプがこれらの腫瘍誘発性因子を分泌する洞察を得るために、本発明者らは、抗ＰＤ−１またはコントロールＩｇＧ抗体で治療したＢＡＬＢ／ｃおよびＳＣＩＤマウス間を比較して同様なスクリーニングを行った。ＳＣＩＤマウスは、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）変異を有し、したがって、機能的適応免疫細胞タイプ（Ｂ細胞およびＴ細胞）を欠く。ナイーブ８〜１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃまたはＳＣＩＤマウス（群当たりｎ＝７マウス）に、１回の注射毎に２００μｇ／マウス２０ｇの用量で、１週間の期間にわたって隔日毎に（全部で３回注射した）、抗ＰＤ−１またはコントロールＩｇＧ抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を腹腔内に注射した。最後の投与後２４時間目、マウスを犠牲にし、血液を採取して血漿を調整した。各群から得られた血漿サンプルをプールし、全部で２００因子をスクリーニングするために、製造元取扱説明書に従ってガラススライド型Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙマウスサイトカインアレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社；カタログ番号：ＱＡＭ−ＣＡＡ−４０００）に適用した。アレイによって検出されたサイトカイン、酵素および成長因子の全リストを、表４に示している。コントロール値の比の算出によってタンパク質アレイで各因子について倍率変化を決定した。１．５超または０．５未満の倍率変化を示す因子を、抗ＰＤ−１治療に対する応答において、それぞれ、上方制御または下方制御されたと定義した。これらの因子、およびこれらのそれぞれの倍率変化を、表６中に一覧にしている。いくつかの因子は抗ＰＤ−１治療に対する応答において上方制御されることが分かったが、この一部は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して特異的であったが、ＳＣＩＤマウスに対して特異的でなく、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１；アンフィレグリン、Ｉ−ＴＡＣおよびＳＣＦであった。これらの結果は、これらの特異的因子が抗ＰＤ−１治療に対する応答において適応免疫系の細胞によって分泌されることを示唆している。
【００９５】
まとめると、これらの結果は、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１治療は、腫瘍進行を支持する宿主における応答を誘発し、免疫チェックポイント阻害薬治療の所望の治療効果を相殺することを示している。
【００９６】
付表
【００９７】
【表１】
2020525758.tif 000002
【００９８】
【表２】
2020525758.tif 000003
【００９９】
【表３−１】
2020525758.tif 000004
【表３−２】
2020525758.tif 000005
【０１００】
【表４−１】
2020525758.tif 000006
【表４−２】
2020525758.tif 000007
【０１０１】
【表５】
2020525758.tif 000008
【０１０２】
【表６】
2020525758.tif 000009
【０１０３】
参考文献
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【図１Ａ】
2020525758.tif 000010
【図１Ｂ】
2020525758.tif 000011
【図１Ｃ】
2020525758.tif 000012
【図１Ｄ】
2020525758.tif 000013
【図２Ａ】
2020525758.tif 000014
【図２Ｂ】
2020525758.tif 000015
【図３Ａ】
2020525758.tif 000016
【図３Ｂ】
2020525758.tif 000017
【図３Ｃ】
2020525758.tif 000018
【図３Ｄ】
2020525758.tif 000019
【図４Ａ】
2020525758.tif 000020
【図４Ｂ】
2020525758.tif 000021
【図５Ａ】
2020525758.tif 000022
【図５Ｂ】
2020525758.tif 000023
【国際調査報告】
2020525758.tif 000024
2020525758.tif 000025
2020525758.tif 000026
2020525758.tif 000027