(57)【要約】  本発明は、第一のマイクロ流体チャネルシステムにおいて、粒子を整列させる、選別する、および／または、集める方法に関し、当該方法は、ｉ）少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネルを提供するステップ、ｉｉ）前記の第一の入口を通してチャネル内に第一の流体を注入するステップ、ｉｉｉ）前記の第二の入口を通してチャネル内に第二の流体を注入するステップを含み、ここで、第一の流体の粘性は、第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れ、２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む。本発明はまた、ｉ）少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネル、ｉｉ）第一の流体、ｉｉｉ）第二の流体、を備えるマイクロ流体チャネルシステムにも関し、ここで、第一の流体の粘性は、第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れることができ、２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のマイクロ流体チャネルシステムにおいて、粒子を整列させる、選別する、および／または、集める方法であって、
前記方法は、以下のステップ：
ｉ．少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネルを提供するステップ、
ｉｉ．前記の第一の入口を通して前記チャネル内へ第一の流体を注入するステップ、
ｉｉｉ．前記の第二の入口を通して前記のチャネル内へ第二の流体を注入するステップ、
ここで、前記の第一の流体の粘性は、前記の第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は、混合されずに並んで層状に流れ、前記の２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記粒子は、好ましくは前記の第二の流体内に含まれ、前記の第一の流体の粘性は、前記の第二の流体内の前記粒子が、前記の第一の流体によって、前記の第二の流体により占領される空間に制限されるように選択される、
方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記の第一のマイクロ流体チャネルの高さは、２μｍ〜６０μｍ、５μｍ〜５０μｍ、１０μｍ〜４５μｍ、１５μｍ〜４０μｍ、２５μｍ〜３５μｍの群から選択される、
方法。
【請求項４】
請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、
前記の第二の入口に対する前記の第一の入口の角度は、１８０度以下である、
方法。
【請求項５】
請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、
第一のマイクロ流体チャネル、すなわち整列チャネルは、実質的に一直線であり、１ｍｍ〜４０ｍｍ、２ｍｍ〜３５ｍｍ、５ｍｍ〜２５ｍｍ、８ｍｍ〜２０ｍｍ、１０ｍｍ〜２０ｍｍ、〜１２ｍｍ〜１８ｍｍの群から選択される長さを有する、
方法。
【請求項６】
請求項１から６のいずれかの方法であって、
前記の第一および前記の第二の流体は水性の流体であって、前記の第一の流体の粘性は１００ｃＰ〜２０００ｃＰであり、前記の第二の流体の粘性は０．００１ｃＰ〜１００ｃＰである、または、前記の第一および前記の第二の流体は水性の流体であって、前記の第一および第二の流体の粘性は０．００１ｃＰ〜１００ｃＰである、
方法。
【請求項７】
請求項１から７のいずれかの方法であって、
前記の水性の第一の流体は、有機高分子、天然高分子、セルロース、グルコース、フルクトースまたは任意の他の糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ビス−アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジン−アクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミド、アガロース、アルギン酸、またはそれらの混合物を含む群から選択される物質を含む、
方法。
【請求項８】
請求項１から８のいずれかの方法であって、
前記の第一の出口は、エマルション出口であり、少なくとも１つの粒子は、前記の第一の出口を離れるときに液滴内に封入される、
方法。
【請求項９】
請求項１から９のいずれかの方法であって、
前記マイクロ流体システムは、第三の入口を備える、
方法。
【請求項１０】
請求項１から１０のいずれかの方法であって、
第三の流体が前記の第三の入口内に注入されて、３つの流体の粘性は、第一の流体が前記の第二の流体を前記の第三の流体から分離させて、全ての３つの流体が実質的に混合されずに少なくとも前記の整列チャネルの長さを層状に流れるように選択される、
方法。
【請求項１１】
請求項１から１１のいずれかの方法であって、
粒子は、単一細胞または細胞凝集体、真核生物細胞、原核生物細胞、ビーズ、抗体またはそのフラグメント、抗原、およびヒドロゲルビーズを含む群から選択されてよい、
方法。
【請求項１２】
粒子を整列させる、選別する、および／または、集める方法であって、
請求項１から１２のいずれかに記載の第一のマイクロ流体チャネルシステムは、請求項１から１２のいずれかに記載のさらなるマイクロ流体チャネルシステムと組み合わされて、両方のシステムの出口は、１つの共通のチャネルにおいて接続される、
方法。
【請求項１３】
マイクロ流体チャネルシステムであって、
ｉ．少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネル、
ｉｉ．第一の流体、
ｉｉｉ．第二の流体、
を含み、
ここで、前記の第一の流体の粘性は、前記の第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れることができ、前記の２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む、
システム。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の方法または請求項１４に記載のシステムの使用であって、
１つの液滴内に異なる粒子を選別するための、
使用。
【請求項１５】
１つの接続点において集合している２以上のマイクロ流体チャネルを備えるシステムであって、
前記の２以上のチャネルの少なくとも２つは、平行に流れる２つの流体がローディングされて、その一方は、他方よりも高い粘性を有する、
システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物株の開発、抗体作製、抗体分析の分野であり、全て、マイクロ流体デバイスを用いる。本出願は、マイクロ流体デバイスおよびシステムにおける、および、マイクロ流体デバイスおよびシステムを通した、細胞培養および細胞分析の分野である。本出願はまた、マイクロ流体の分野でもあり、特に、マイクロ流体分析およびデバイス、ならびに、細胞の選別、細胞の整列（ｏｒｄｅｒｉｎｇ）および／または収集（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）の開発の分野である。移動する流体内に懸濁された粒子を、１つまたは複数の局所化された流れのラインに集めるための、様々なシステム、方法およびデバイスが提供される。
【背景技術】
【０００２】
粒子分離および濾過は、産業、医学および研究において、非常に多くの技術的解決手段に適用されている。これらの適用を対処するために、様々なマクロスケール技術が粒子分離に関して開発されている。マイクロスケール技術は、スケールダウンによって独特な流体力学的効果の使用を可能にして、電磁分離力を強めるという点で利点を提供する。誘電泳動力は、サイズまたはいくつかの誘電性のタグに基づいて粒子を識別するために用いられている。連続的な分離のための他の技術は、壁に並べられた様々なサイズの粒子に関する層流プロファイルおよび流れの異なる交差した横断面に依存する。さらにマイクロスケール技術は、サイズに基づいて粒子の方向において分岐を作る、精密に設計されたフィルターまたはポストアレイを伴う。これらの技術は、粒子のサイズまたは誘電特性に応じて、非常に正確な分離を生じさせることができる。例えば、非対称的に並べられた障害物による決定論的置換に関して、直径１μｍの粒子について２０ｎｍ未満の解像度が報告されている。さらに、これらのシステムでは複雑性が低くなり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現行のマイクロスケール分離システムの不利な点は、スケーリングが、通常、これらの技術の処理能力を制限することである。粒子間相互作用が性能に大幅な影響を及ぼし得るので、ほとんどの場合において、粒子の体積分率は、１％よりも十分低く維持される。さらに、小さな体積流量は、マイクロチャネルにおいて大きな平均流体速度をもたらし得て、分離力が粒子に作用するのに不十分な時間をもたらす。これらのシステムに関する１〜５０μＬ／分の範囲の典型的な流量は、多くの調製適用に不十分である（例えば、大量の血液中の特殊細胞の濃縮、超音波造影剤の濾過または大量のコロイド／エマルションの調製）。マイクロ流体システムにおいて限定された空間として微小液滴または液滴（エマルション）を用いることの根本的な問題の一つは、液滴の大部分を所望の試料で満たすことである。例えば、ｉ）２つの異なる細胞を１つの液滴内に、ｉｉ）１つの細胞および１つのプローブを１つの液滴内に、ｉｉｉ）抗原および抗体を１つの液滴内に、ｉｖ）抗原およびＢまたはＴ細胞を１つの液滴内に、または、ｖ）化学物質および細菌細胞などを１つの液滴内に入れたいと考えるであろう。しかしながら、ポアソン分布によれば、液滴の大部分は、所望の組み合わせを含まない。マイクロ流体チャネルを通って移動している流体内に懸濁された粒子の自己整列を生じさせてそれを用いる、多くのシステム、デバイス、器具および方法を有することが有用である。このことは、移動している流体内に懸濁された粒子を１つまたは複数の局所化された流れのラインに集めるのに有用である。そのようなシステムにおいて、基板と、細胞を集めるための入口と出口を有する基板上に提供された少なくとも１つのチャネルとを有することが有用である。懸濁された粒子を有する層流でのチャネルおよび流体の層流を押し流すポンプエレメントを有し、それにより、細胞がその中で１つまたは複数の流れのラインに選別されることも有利である。さらに、マイクロ流体チャネル内の粒子の分布および／または局在の評価のための決定論的手法を提供する方法を有することが有用である。本発明者らは、これらの問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、第一のマイクロ流体チャネルシステムにおいて、粒子を整列させる、選別する、および／または、集める方法に関し、当該方法は、ｉ）少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネルを提供するステップ、ｉｉ）前記の第一の入口を通してチャネル内に第一の流体を注入するステップ、ｉｉｉ）前記の第二の入口を通してチャネル内に第二の流体を注入するステップを含み、ここで、第一の流体の粘性は第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れ、２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む。
【０００５】
本発明はまた、ｉ）少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネル、ｉｉ）第一の流体、ｉｉｉ）第二の流体、を備えるマイクロ流体チャネルシステムにも関し、ここで、第一の流体の粘性は第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れることができ、２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明に係るデバイスを用いた液滴内の共封入粒子の一般的なマスクデザインを示す。
【図２Ａ−Ｃ】本発明に係る液滴デバイス内の共封入粒子の特定のマスクデザインを示す。
【図３】共封入前の、それぞれのチャネル内の細胞ＡおよびＢのセットの異なる分布を示す。両方のチャネルにおいて、細胞は、図２に示されるように、流れ粘性媒体（ｓｔｒｅａｍ  ｖｉｓｃｏｕｓ  ｍｅｄｉａ）によって制限される。
【図４】２つの流体の層流を示す。
【図５】図１または２に示されるマイクロ流体デバイスにおける、ポアソン分布と比較した粒子のより高い濃縮を示す。
【図６】ポアソン統計または実験的データに従った単一粒子／細胞封入の確率質量関数を示す。３００μｓの期間の液滴生産に関してλ０，５６に対応する細胞濃度、および、３００μｓの期間の液滴生産に関してλ０，８５に対応する細胞濃度を示す。
【図７】本発明に係る方法の粒子／細胞共封入の確率を示し、細胞濃度は、３００μｓの期間の液滴生産に関してλ０，５６および３００μｓの期間の液滴生産に関してλ０，８５に対応する。
【図８】本発明に係るマイクロ流体チャネル内の細胞の分布を示す。
【図９】マイクロ流体デバイス内の粒子／細胞の整列を示し、ここで、整列させるための粘性媒体は、フッ素油内に存在する。
【図１０】マイクロチャネルにおける細胞の時間的な位置を分析する方法を示す。
【図１１】図１０に説明される方法に基づく、チャネルの所定の長さの後に流れている細胞間の間隔の分析を示す。
【図１２】図６および７に説明されるポアソン統計と比較した液滴内の粒子のより良好の共封入を達成する、本発明に係るデバイスを用いた液滴内の共封入粒子／細胞のための特定のマスクデザインを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、第一のマイクロ流体チャネルシステムにおいて、粒子を整列させる、選別する、および／または、集める方法に関し、当該方法は、ｉ）少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネルを提供するステップ、ｉｉ）前記の第一の入口を通してチャネル内に第一の流体を注入するステップ、ｉｉｉ）前記の第二の入口を通してチャネル内に第二の流体を注入するステップを含み、ここで、第一の流体の粘性は第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れ、２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、異なる粘性の流体を「混合」することによって、チャネル内で粒子の流れを安定して編成することが可能であることを見いだした。混合はもちろん、一般的な意味での混合を意味しないが、ここではそれに反して、互いと混合せずに出来るだけ長く平行して層状に流れるように、例えば異なる粘性の２つの流体を集めることを意味する。２つの流体のこの平行の流れの効果は、２つの流れの一方における粒子が、正確にその流れに制限されることである。そのような流れまたは流体の流れのラインを用いて、粒子を所望の空間また位置に運ぶことができる。本発明の好ましい態様では、そのような流れは、２つの異なる粒子または細胞を特異的に１つの液滴内に運ぶために用いられる。
【０００９】
チャネルは、水力直径および約０．０７以上である水力直径に注目した粒子のサイズの比を有してよい。水力直径に対する粒子サイズの比は、約０．５以下であってよい。
【００１０】
１つまたは複数の集められた流れのラインは、集められた粒子のサイズの約５倍、４倍、３倍、２倍、および／または１．５倍以下である幅を有してよい。システムの実施態様は、溶液内の粒子の濃度を増加させてよい。
【００１１】
チャネル内の粒子の局所化された流れで移動している粒子を数え上げるために検出器が適用されてよい。方法は、検出器によって検出することのできるタグを用いて選択された粒子をタグ化するためのシステムをさらに備えてよく、検出器はそれにより、選択された粒子を検出して数え上げる。
【００１２】
当技術分野で知られている他の方法と異なり、第一および第二の流体によって構成される流体システム内の粒子（単数または複数）の局在は、本質的に、粘弾性または粘性の力またはそれらの組み合わせによって制御される。したがって、一実施態様では、本明細書に開示の流体システムを特徴付けるレイノルズ数は１未満である。
【００１３】
任意および全ての態様において、方法は、収集がもっぱら粘弾性または粘性の力によって生じ得るシステムを備えてよい。他の方法の実施態様は、収集が粘弾性または粘性および他の力に起因し得るシステムを備えてよい。任意の態様において、実施態様は器具を備えてよく、チャネルの横断面の形状および面積は、入口から出口まで一貫していてよい。他の実施態様では、チャネルの横断面の形状および面積は、入口から出口まで変化してよい。１つまたは複数の局所化された流れのラインは、所定の粒子サイズの約５倍、４倍、３倍、２倍、および／または１．５倍以下である幅を有してよい。所定のサイズの粒子を有する流体懸濁液を入口から出口まで移動させることは、４つの局所化された流れ、２つの局所化された流れ、および／または、単一の局所化された流れに所定のサイズの粒子を集める。
【００１４】
列挙された態様において、または、任意のそれらの実施態様において、標的粒子を粒子の集団から分離する方法が提供され得て、ここで、分類（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）は受動的に行われる。標的粒子は、集団内の他の粒子と異なるサイズを有してよく、標的粒子は、チャネル内の所定の位置において局所化された流動を形成し得る。一部の実施態様では、第一のアウトプット分岐への入り口は、標的粒子の局所化された流れのチャネル内の所定の位置を取り囲むように配置されてよい。方法の実施態様は、チャネルに作動可能に接続された分類システムによって用いられるタグを用いて選択的に粒子をタグ化するステップを含んでもよい。タグは、選択的にタグ化される粒子のサイズを増大させてよく、タグは磁性タグであってよい。
【００１５】
本発明では、粒子は好ましくは第二の流体内に含まれて、第一の流体の粘性は、第二の流体内の粒子が、第一の流体によって、第二の流体により占領される空間に制限されるように選択される。図４に見ることができるように、２つの入口は、入口の接続点で集合する２つの流体を提供する。流体が集合した時点で、異なる粘性に起因して２つの流体は別々に移動する。結果として、それぞれの流体内の粒子は、流体がチャネル内に有する空間に制限される。粒子はしたがって、互いの後に整列した状態で移動する。このことは、この整列が他の適用に関して再度用いられ得ることを意味する。
【００１６】
本発明において、好ましくは第一のマイクロ流体チャネルの高さは、２μｍ〜６０μｍ、５μｍ〜５０μｍ、１０μｍ〜４５μｍ、１５μｍ〜４０μｍ、２５μｍ〜３５μｍの群から選択される。
【００１７】
本発明において、好ましくは第一のマイクロ流体チャネルの幅は、２μｍ〜１５０μｍ、５μｍ〜１２５μｍ、２５μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜８５μｍ、５０μｍ〜７０μｍの群から選択される。より好ましくは、第一のマイクロ流体チャネルの幅は、約６０μｍである。
【００１８】
別の実施態様では、第一および／または第二のマイクロ流体チャネルの幅は、輸送されている流体の粘性に反比例する。
【００１９】
別の実施態様では、第一および／または第二のマイクロ流体チャネルの幅は、粒子のサイズに反比例する。
【００２０】
理想的には、第一の入口および第二の入口は、Ｙ字状に、実質的に同一の位置においてマイクロ流体チャネル内に入る。この形状は、２つの流体がすぐに混合しないが平行して移動するのを可能にする。したがって、理想的には、第一の入口と第二の入口の間の角度は１８０度以下である。
【００２１】
好ましくは、本発明に係る方法では、整列チャネルは実質的に一直線であり、１ｍｍ〜４０ｍｍ、２ｍｍ〜３５ｍｍ、５ｍｍ〜２５ｍｍ、８ｍｍ〜２０ｍｍ、１０ｍｍ〜２０ｍｍ、および１２ｍｍ〜１８ｍｍの群から選択される長さを有する。
【００２２】
好ましくは、第一および第二の流体は水性の流体であり、第一の流体の粘性は１００ｃＰ〜２０００ｃＰであり、第二の流体の粘性は０．００１ｃＰ〜２ｃＰである。
【００２３】
より好ましくは、第一の流体の粘性は、１００ｃＰ〜２０００ｃＰ、２００ｃＰ〜１５００ｃＰ、３００ｃＰ〜１２００ｃＰ、および５００ｃＰ〜１０００ｃＰの群から選択される。
【００２４】
より好ましくは、第二の流体の粘性は、０．００１ｃＰ〜１００ｃＰ、０．０１０ｃＰ〜５０ｃＰ、０．２５０ｃＰ〜１０．０ｃＰ、および０．５ｃＰ〜１．０ｃＰの群から選択される。
【００２５】
さらなる実施態様では、第一および第二の流体は水性の流体であり、第一および第二の流体の粘性は０．００１ｃＰ〜１００ｃＰである。
【００２６】
別の実施態様では、第二の流体は約１ｃＰの粘性を有する。さらなる実施態様では、第一の流体は第二の流体の２倍の粘性を有する。
【００２７】
一実施態様では、本明細書に開示の流体システムの滞留時間は、第一および第二の流体の間の粘性勾配を確保にするのに十分である。滞留時間は、第一および第二の流体の組成、流量およびチャネルの長さのような異なるパラメーターによって決定される測定値である。
【００２８】
水性の第一の流体は、有機高分子、天然高分子、セルロース、グルコース、フルクトースまたは任意の他の糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ビス−アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジン−アクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミド、アガロース、アルギン酸、またはそれらの混合物の群から選択される物質を含むことが好ましい。本明細書において用いられる用語「有機高分子」は、化学合成によって得られる高分子を指し、主に炭素および水素元素を含む単量体であって任意のさらなる元素；制限されないが、酸素、窒素および硫黄と組み合わされてよい単量体から構成される。本発明の関連において、有機高分子の例は、合成ペプチドまたはタンパク質であってよい。本明細書において用いられる用語「天然高分子」は、天然に生じる高分子を指し、主に炭素および水素元素を含む単量体であって、任意のさらなる元素；制限されないが、酸素、窒素および硫黄と組み合わされてよい単量体から構成される。本発明の関連において、天然高分子の例はヒアルロン酸であってよい。天然または合成高分子は、油類およびそれらの誘導体を包含してもよい。
【００２９】
一実施態様では、粘性の水性の第一の流体は、非高分子の油類およびそれらの誘導体、例えば、フッ素油類を含む群から選択される物質を含む（例えば、図９を参照）。
【００３０】
一実施態様では、第一の出口はエマルション出口であり、少なくとも１つの粒子は、第一の出口を離れるときに液滴内に封入される。
【００３１】
一実施態様では、マイクロ流体システムは、第三の入口を備える。この実施態様では、より低い粘性の流体を分離するために、より高い粘性の流体が用いられてよい；例えば図１を参照。
【００３２】
この実施態様では、第三の流体は第三の入口内に注入されて、３つの流体の粘性は、第一の流体が第二の流体を第三の流体から分離させて、全ての３つの流体が少なくとも整列チャネルの長さを実質的に混合されずに層状に流れるように選択される。
【００３３】
粒子は、細胞、真核生物細胞、原核生物細胞、ビーズ、抗体またはそのフラグメント、抗原などを含む群から選択されてよい。上記に概説されるように、２つの異なる細胞型が存在する場合、それらは１つの液滴内に、整えられた様式（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で集められることが好ましい。
【００３４】
好ましくは、そのような方法では、２つの細胞を含む液滴の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％よりも多くが、２つの所望の細胞を有する。
【００３５】
本発明はまた、粒子を整列させる、選別する、および／または、集める方法にも関し、ここで、本発明に係る第一のマイクロ流体チャネルシステムは、本発明に係るさらなるマイクロ流体チャネルシステムと組み合わされて、両方のシステムの出口は、１つの共通のチャネルにおいて接続される。この実施態様は図２に示される。したがって、本発明は、接続点において集合している２以上のマイクロ流体チャネルのシステムにも関し、ここで、２以上のチャネルの少なくとも２つは、平行に流れる２つの流体がローディングされて、その一方は他方よりも高い粘性を有する。
【００３６】
また、ｉ）少なくとも第一および第二の入口および第一の出口を備える第一のマイクロ流体チャネル、ｉｉ）第一の流体、ｉｉｉ）第二の流体を備えるマイクロ流体チャネルシステムも特許請求の範囲に記載されていて、ここで、第一の流体の粘性は、第二の流体の粘性よりも高く、それにより、２つの流体は混合されずに並んで層状に流れることができ、２つの流体の一方は、整列される、選別される、および／または、集められるべき粒子を含む。
【００３７】
本発明はまた、１つの液滴内に異なる粒子を選別するための、本発明に係る方法または本発明に係るシステムの使用にも関する。本明細書において用いられる用語「異なる粒子」は、複数の同一または別の粒子を指してよい。
【００３８】
当技術分野で知られている他の方法と異なり、本明細書に開示の方法およびシステムのさらなる利点は、異なる粘性の２つの流体を混合することによって、液滴内の封入前にマイクロ流体システムにおける粒子の位置を制御することができる点である。流体内の粒子の、この優れた制御は、封入ステップに悪影響を及ぼす高い流量を用いずに、単一の液滴内への少なくとも１つの粒子の正確な封入を可能にする。
【００３９】
したがって、別の実施態様では、本発明に係る方法および／またはシステムは、液滴あたり少なくとも１つの粒子の封入を可能にする。より好ましくは、本発明に係る方法および／またはシステムは、液滴あたり１つのみの粒子の封入を可能にする
【００４０】
本発明は、１つの接続点において集合している２以上のマイクロ流体チャネルを備えるシステムにも関し、ここで、２以上のチャネルの少なくとも２つは、平行に流れる２つの流体がローディングされて、その一方は他方よりも高い粘性を有する。ここで、一方のチャネルは粒子を輸送してよく（粒子が何であり得るかは上記の定義を参照）、他方は異なる粒子を輸送してよい。それらが集合する接続点において液滴が形成される。これが繰り返されて、第三またはさらなる粒子を取り込み得る。
【実施例】
【００４１】
マイクロ流体チップデバイスの設計、製造および調製
全てのマイクロ流体デバイスは、２Ｄコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）ソフトウェア（ＡｕｔｏＣＡＤ  ２０，Ａｕｔｏｄｅｓｋ）を用いて設計された。ＳＵ−８をコーティングする前に、４’’シリコンウエハを２００℃で少なくとも５分間、ホットプレート上で乾燥させた。
【００４２】
ＳＵ−８層は、最終速度として２０００〜４０００ＲＰＭで３０秒間、スピンコーティングＳＵ−８樹脂（ＳＵ−８−２０２５またはＳＵ−２０３５，ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）によってウエハ上に適用されて、そのあとに、最初に６５℃で１〜３分間、それから９５℃で３〜１０分間プリベークを続けて、ＵＶ露光前に室温まで冷却させた。ＳＵ−８コーティングウエハは、マスクアライナー（ＭＪＢ４接触マスクアライナー、ＳＵＳＳ  ＭｉｃｒｏＴｅｃ）を用いて高解像度の透明マスク（ＪＤ  Ｐｈｏｔｏ  Ｔｏｏｌｓ，ＵＫ）を通して３６５ｎｍのＵＶ露光がされて、マイクロチャネルを構築した。マスクアライナーをＷＥＣ接触モードで用いて、典型的に１０〜４０秒間、１０〜１６ｍＷ／ｃｍ２の線量で樹脂を露光した。露光されたＳＵ−８コーティングウエハを、最初に６５℃で１〜３分間、それから９５℃で１〜１０分間ポストベークして、現像前に室温まで冷却させた。ポストベークしたＳＵ−８ウエハを、ＰＧＭＥＡ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ，Ｙ０２０１００）を用いて１〜１０分間、１００ＲＰＭにて環状シェイカー上のガラスコンテナー内で現像して、引き続き、ウエハを窒素で乾燥させて、２００℃で少なくとも５分間ハードベークした。ＳＵ−８型上のマイクロチャネルの高さを、接触スタイラスプロフィロメータ（Ｄｅｋｔａｋ  ６Ｍ，Ｖｅｅｃｏ）または白色干渉法（ＮＴ９１００，Ｖｅｅｃｏ）を用いて測定した。ディッシュ内でポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４，ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）を１：１０（硬化剤：基剤）の比で混合して、ＳＵ−８型の上に注いだ。続いて、減圧デシケーター内でＰＤＭＳを数分間脱気して、型から気泡を除去した。７０℃にてオーブン（ＶＷＲ，Ｆｒａｎｃｅ）内で２時間、ＰＤＭＳを硬化した。硬化したＰＤＭＳを型から剥がして、入口および出口ポートのための穴を、０．７５ｍｍバイオプシーパンチ（Ｈａｒｒｉｓ，ＵＳＡ）を用いてあけた。穴があけられたＰＤＭＳスラブを、スコッチテープを用いて粒子および埃から浄化して、その後に、イソプロパノールおよび脱イオン水でリンスした。浄化されたＰＤＭＳスラブを、加圧窒素を用いて乾燥させた。ＰＤＭＳスラブ上のマイクロ流体チャネルのネットワークを、ＰＤＭＳスラブおよびガラスを酸素プラズマ（Ｐｉｃｏ，Ｄｉｅｎｅｒ  Ｐｌａｓｍａ）に１分間露光して、露光後にそれらを接触させることによって、ガラススライド（５０ｍｍ×７５ｍｍ，Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接着させた。最後のステップとして、ＨＦＥ−７５００（Ｎｏｖｅｃ，３Ｍ）溶液中１％（ｖ／ｖ）シラン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｌ１６５８４）でネットワークを洗い流すことによってフルオロ親和性コーティングをマイクロ流体チャネルの壁に適用して、その後にＨＦＥ−７５００でチャネルをリンスして、残ったＨＦＥ−７５００を加圧窒素ガスでパージした。
【００４３】
器具のセットアップ
液滴生産および再注入のために、４８８ｎｍ、５６１ｎｍおよび６３８ｎｍのレーザー（Ｏｍｉｃｒｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および対応する帯域フィルター（ＰＭＴ１：４４０／４０，ＰＭＴ２：５２５／４０，ＰＭＴ３：５９３／４６，ＰＭＴ４：７０８／７５，ＰＭＴ５：８０９／８１，Ｓｅｍｒｏｃｋ）を備える４つの光電子増倍管（ＰＭＴ）（Ｈ１０７２３，Ｈａｍａｍａｔｓｕ）と接続されて改造されている、倒立落射蛍光顕微鏡（ＴｉＥ，Ｎｉｋｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で実験を行なった。ＰＭＴからのシグナルをＦＰＧＡカード（ＮＩ−ＵＳＢ７８５６Ｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）へ送り込んで、プロプライエタリ・ソフトウェア・ルーチン（ｕＤｒｏｐ  ３．５−３．９，ＨｉＦｉＢｉＯ）を用いて液滴データを記録した。
【００４４】
高速カメラ（Ｐｈａｎｔｏｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を顕微鏡の左側ポートに取り付けて、液滴生産および細胞封入を監視した。５チャネルシリンジポンプ（Ｎｅｍｅｓｙｓ，Ｃｅｔｏｎｉ）を用いて全ての流体をマイクロ流体チップ内に押し流した。
【００４５】
静的液滴アレイに関して、励起光をＬＥＤ源（ＳＯＬＡ  ｌｉｇｈｔ  ｅｎｇｉｎｅ，Ｌｕｍｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）によって提供した。特定のチャネルに関する蛍光シグナルを、室温（２５℃）および周囲酸素濃度で、適切な帯域フィルター（ＧＦＰおよびＴＲＩＴＣフィルターセット，Ｎｉｋｏｎ、および、Ｃｙ５フィルターセット，Ｓｅｍｒｏｃｋ）およびカメラセッティング（Ｏｒｃａ  Ｒ２，Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて記録した。１０×対物を用いて画像を得た（ＮＡ  ０．４５）。
【００４６】
細胞培養および細胞標識化
ＣＨＯ−Ｓ（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）細胞株を、標準的な細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中、１２５ｒｐｍにて環状シェイカー上で滅菌Ｅｒｌｅｎｍａｙｅｒフラスコ中で培養した。ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５％プルロニックＦ−６８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、およびＬ−グルタミンで補充されたＣＨＯ−Ｓ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中で細胞を培養した。
【００４７】
細胞懸濁液は典型的に、製造元から提供される標準的なプロトコルに従って、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  ＲｅｄまたはＮｕｃＲｅｄ（全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて標識された。
【００４８】
調製セルロース
Ｅｒｌｅｎｍａｙｅｒフラスコ中で室温にて、マグネチックスターラーおよびスターラーバー（５００ＲＰＭ〜２０００ＲＰＭ）を用いた攪拌下で２％（ｗ／ｗ）メチル−セルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＤ．Ｉ．水中に溶解させた。
【００４９】
細胞封入手順および監視
細胞を採取して、１５ｕｍ、１０ｕｍフィルターを通して濾過した。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってカウントして、細胞濃度を１０ｍ〜８０ｍ細胞／ｍＬに調整した。それから、マイクロ流体デバイスと適合するカスタムメイドのリザーバー内へ細胞を吸引した。連続相は、Ｎｏｖｅｃ  ＨＦＥ７５００フッ素油中２％（ｗ／ｗ）００８−フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から構成された。水相をオンチップ（ｏｎ−ｃｈｉｐ）で共に流した。流量（油について約１０００〜６０００μｌ／ｈ、および、それぞれの水溶液について約１００〜８００μｌ／ｈ）を、８０〜４００ｐｌの典型的に単分散の液滴を生産するように調整して、ローディングの効果を測定した。液滴形成中、ホームメイドのアクセサリを用いて細胞懸濁液を約５℃に冷却して、抗体分泌を遅らせて細胞の生存能力を保存した。レーザー／ＰＭＴシステムを用いて、または、毎秒１０’０００〜１００’０００フレームの速度で高速イメージングを用いて、データを回収した。レーザー／ＰＭＴシステムを測定に用いた場合は、データ処理および分析はｕＤｒｏｐによって行われた。静的液滴アレイを用いて液滴をイメージングした場合は、エマルションを２Ｄチャンバーシステム中に直接注入し、または、氷上（細胞実験）または室温（無細胞実験）で０．１％（ｗ／ｗ）００８−フッ素系界面活性剤を有するフッ素油を含む１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中に回収した。チューブ内に回収した場合は、カスタムメイドのＰＤＭＳバルブを用いて観察チャンバー内に導入する前に、０．１％（ｗ／ｗ）００８−フッ素系界面活性剤を含むフッ素油を用いて１：１に液滴を希釈した。７５０μｌ／ｈの流量を用いてチャンバー内に液滴を再注入した。チャンバーを満たし終えた後に、チャンバーを穏やかに閉めて蛍光顕微鏡（Ｔｉ  Ｅｃｌｉｐｓｅ，Ｎｉｋｏｎ）上に載せた。
【００５０】
画像解析
高速画像を専売ＩｍａｇｅＪおよびＭａｔｌａｂルーチンを用いて処理した。ＩｍａｇｅＪを用いて、目的領域の平均グレーレベルを経時的に抽出して、グレーレベル曲線を得た。Ｍａｔｌａｂでは、バックグラウンド（曲線全体の平均グレーレベル）の除去によってさらなる画像処理を行ない、シグナルの反転は細胞を表わすピークを有する曲線を生じさせた。
【００５１】
ルーチンは、組み込み関数を用いてピーク間の間隔を決定し、それから、データをヒストグラムに集計した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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