(57)【要約】バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルを用いて、潜在的な毒性剤による腸の損傷を逆転、軽減または予防する候補治療剤の能力を評価する方法が開示される。剤が腸の機能に及ぼす影響を評価する方法も開示され、この方法は、剤をバイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルと接触させる段階を含む。2020500018.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルであって、人工の三次元生体腸組織モデルを形成するための
（ｉ）筋線維芽細胞を含む腸間質組織の層と、
（ｉｉ）該腸間質組織の層上の腸上皮細胞の層と
を含む、モデル。
【請求項２】
前記腸間質組織の層の少なくとも１つが、筋線維芽細胞を含み、前記腸上皮細胞の層が、少なくとも１つのタイプの免疫細胞をさらに含む、請求項１に記載の腸組織モデル。
【請求項３】
前記免疫細胞が、骨髄細胞である、請求項２に記載の腸組織モデル。
【請求項４】
前記骨髄細胞が、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞または巨核球である、請求項３に記載の腸組織モデル。
【請求項５】
前記免疫細胞が、（ａ）間質層、（ｂ）上皮細胞層、（ｃ）間質層と上皮細胞層との間、（ｄ）上皮細胞層の上、および（ｅ）間質細胞層の下、のうちの少なくとも１つに存在する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項６】
前記腸上皮細胞の層が、健康なドナー由来の初代上皮細胞を含む、請求項１または２に記載の腸組織モデル。
【請求項７】
前記腸上皮細胞の層が、罹患したドナー由来の初代上皮細胞を含む、請求項１または２に記載の腸組織モデル。
【請求項８】
前記罹患したドナーが、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核、憩室炎、炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、内分泌障害、代謝障害、肥満、糖尿病、脂質異常症、腸癌または結腸直腸癌を有する、請求項７に記載の腸組織モデル。
【請求項９】
前記腸上皮細胞の層が、少なくとも１つの幹細胞集団をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの幹細胞集団が、分化することが可能である、請求項９に記載の腸組織モデル。
【請求項１１】
前記腸組織モデルが、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞が、結腸直腸の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞が、腸組織モデル内の層または区画に存在する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腸上皮細胞の層および間質組織の層が、健康なドナー由来の初代上皮細胞を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）頂端部のビリン染色、
（ｂ）タイトジャンクション、
（ｃ）頂端部の刷子縁、
（ｄ）上皮表面上の絨毛様構造、
（ｅ）間質組織の層と上皮細胞の層との間の基底層、
（ｆ）粘液を分泌する、
（ｇ）ＣＹＰ３Ａ４を発現する、
（ｈ）ｐ−糖タンパク質を発現する、
（ｉ）グルカゴン様ペプチド−１を発現する、
（ｊ）ＢＣＲＰを発現する、
（ｋ）腸内分泌細胞を含む、および
（ｌ）杯細胞を含む
のうちの少なくとも１つを示す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項１６】
完全に成熟した灌流可能な脈管構造を含まない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項１７】
赤血球を含まない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項１８】
中枢神経系によって神経支配されていない、請求項１〜１７のいずれか一項記載の組織モデル。
【請求項１９】
筋線維芽細胞を含む腸間質組織の層および／または腸上皮細胞の層が、実質的に単層である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項２０】
腸組織層と接触している生体適合性膜をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項２１】
少なくとも２細胞層の厚さである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項２２】
複数の腸組織モデルが、アレイを形成するように構成されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項２３】
前記アレイがマイクロタイタープレートのウェル内に存在する、請求項２２に記載の腸組織モデル。
【請求項２４】
静置培養条件に供される培養下にある、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の腸組織モデル。
【請求項２５】
非静置培養条件に供される培養下にある、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の腸組織モデル。
【請求項２６】
腸間質組織の正常な層および腸上皮細胞の正常な層を含む少なくとも１つの第１の領域と、腸間質組織の層および腸上皮細胞の層を含む少なくとも１つの第２の領域とを含み、ここで、該第２の領域の層の少なくとも１つが、罹患したドナー由来の細胞を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の腸組織モデル。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の腸組織モデルを中に埋め込まれた非ヒト動物を含む、腸の障害または損傷の非ヒト動物モデル。
【請求項２８】
非ヒト動物が免疫不全げっ歯類である、請求項２７に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項２９】
候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載の腸組織モデルまたは非ヒト動物モデルを候補治療剤と接触させる段階であって、該腸組織モデルが腸の障害または損傷の表現型を有する、段階；
（ｂ）腸組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
（ｃ）候補治療剤と接触していない対照腸組織モデルと比較した、決定された腸組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する段階。
【請求項３０】
前記腸の障害または損傷の表現型が、該表現型を生じさせる処置、化合物、または感染性因子と腸組織モデルとを接触させることによって誘導される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記腸の障害または損傷の表現型が、前記腸組織モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力が、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の浸潤または転移の低減である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘導または予防する能力を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載の腸組織モデルまたは非ヒト動物モデルを、前記候補治療剤と接触させる段階；
（ｂ）腸組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
（ｃ）候補治療剤と接触していない対照腸組織モデルと比較した、決定された腸組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する段階。
【請求項３４】
前記腸組織モデルの上皮細胞および／または筋線維芽細胞が、罹患したドナーから得られる、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記罹患したドナーが、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核、憩室炎、炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、内分泌障害、代謝障害、肥満、糖尿病、脂質異常症、腸癌または結腸直腸癌を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記腸の障害または損傷が炎症である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記腸の障害または損傷が、物理的損傷であり、前記腸組織モデルが、候補治療剤と接触する前に物理的破損を受ける、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記腸障害または損傷が線維性障害である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記腸の障害または損傷が感染性疾患である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記腸の障害または損傷が癌である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記腸組織モデルが、候補治療剤と接触する前に潜在的な毒性剤と接触する、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記潜在的な毒性剤が、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、微生物（たとえば、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌）、または環境作用物質である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記潜在的な毒性剤が、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記潜在的な毒性剤が、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記潜在的な毒性剤が、化学療法剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記潜在的な毒性剤が、イブプロフェン、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンＢ、およびアミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記潜在的な毒性剤が放射線である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記潜在的な毒性剤が免疫活性化剤または調節剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、代謝活性の指標を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記代謝活性の指標が、対照と比較した、前記腸組織モデルにおけるレサズリン減少、テトラゾリウム塩減少、カスパーゼ、またはＡＴＰレベルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記腸組織モデルの生存能力または機能性が、対照と比較したバリア機能である、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記腸組織モデルの生存能力または機能性が、対照と比較した薬物流出である、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記腸組織モデルの生存能力または機能性が、対照と比較したシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性である、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記腸組織モデルの生存能力または機能性が、対照と比較したＲＮＡまたはタンパク質発現である、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記腸組織モデルの生存能力または機能性が、対照と比較したペプチド分泌である、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドがサイトカインである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記腸組織モデルの生存能力または機能性が、対照と比較した組織学によって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腸組織細胞の再生を同定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した粘液分泌を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較したトランスポーター活性を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した酵素活性を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較したトリグリセリド合成を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較したカイロミクロン分泌活性を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記腸組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較したコラーゲン産生を測定することによって決定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記腸組織上皮細胞の生存能力または機能性が、経時的に測定される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
毒性剤による損傷を逆転または軽減するための方法であり、前記腸組織モデルを、最初に毒性剤と接触させ、次に候補治療剤と接触させる、請求項２９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
毒性剤による損傷を軽減または予防するための方法であり、前記腸組織モデルを、最初に候補治療剤と接触させ、次に毒性剤と接触させる、請求項２９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記腸組織モデルが、候補治療薬および毒性剤と接触させる前に、細胞培養培地中で培養されている、請求項２９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記腸組織モデルが細胞培養培地中で少なくとも３日間培養されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
腸の機能への潜在的な毒性剤の効果を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載のバイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルに該剤を接触させる段階；および
（ｂ）該腸組織モデル細胞の生存能力または機能性に対する該剤の効果を測定する段階。
【請求項７２】
毒性剤による損傷を逆転または軽減するための方法であり、前記腸組織モデルを、最初に毒性剤と接触させ、次に該潜在的な毒性剤を除去する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
剤の腸管吸収の動態を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載のバイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルに該剤を接触させる段階；および
（ｂ）該腸組織モデルによる吸収の動態を測定する段階。
【請求項７４】
候補治療剤の有効な投与濃度および投与スケジュールを予測する方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載のバイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルに、種々の濃度または量の該剤を接触させる段階；
（ｂ）該腸組織モデル細胞の生存能力または機能性に対する該剤の効果を経時的に測定する段階；および
（ｃ）効能をもたらす最短の用量間タイミングを決定するために、経時的に該腸組織モデル細胞の回復を測定する段階。
【請求項７５】
（ｄ）前記剤を除去する段階；および
（ｅ）該剤の欠如が腸組織モデルの生存能力または機能性の改善をもたらすか否かを評価する段階
をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の腸組織モデルを作成する方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）腸筋線維芽細胞を含む層を、生体適合性表面上に付着させる段階；および
（ｂ）腸筋線維芽細胞の層上に腸上皮細胞の層を付着させる段階。
【請求項７７】
前記腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つがバイオプリンティングによって付着される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つがインクジェットプリンティングによって付着される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つが押出しによって付着される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つがマイクロバルブまたはマイクロソレノイドバルブプリンティング（ＭＳＶ）によって付着される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つがバイオインクの一部として付着される、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記バイオインクがヒドロゲルを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ヒドロゲルがコラーゲンである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
免疫細胞を付着させる段階をさらに含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球、肥満細胞または好酸球である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記免疫細胞が、少なくとも１つの前記腸組織層の一部として付着される、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記免疫細胞が、（ａ）間質層、（ｂ）上皮細胞層、（ｃ）間質層と上皮細胞層との間、（ｄ）上皮細胞層の上、および（ｅ）間質細胞層の下、のうちの少なくとも１つに付着される、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記免疫細胞が腸組織モデル内の層または区画として付着される、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記腸組織モデルがマイクロタイタープレートのウェル内に配置される、請求項８４〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
細胞培養培地中で腸組織モデルを培養する段階をさらに含む、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記腸組織モデルが細胞培養培地中で少なくとも３日間培養される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記生体適合性表面がマイクロタイタープレートのウェル内にある、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腸組織モデルおよびアッセイにおけるそれらの使用の分野にある。バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルを用いて、潜在的な毒性剤による腸損傷を逆転、軽減または予防する候補治療剤の能力を評価する方法が開示される。剤が腸機能に与える効果を評価する方法も開示され、この方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルを剤と接触させる段階を含む。
【背景技術】
【０００２】
腸の粘膜は、吸収、初回通過代謝、クリアランス、薬物間相互作用の調節において重要な役割を果たしており、薬物誘発毒性の部位となり得る。薬品開発に利用される現在のインビトロのシステムおよび前臨床モデルは、ネイティブのヒト腸組織の複雑さを十分に再現していないため、安全性および有効性の予測可能性を低下させ、薬品開発を損なっている。
【０００３】
現在の前臨床モデルは、ヒトの腸組織の複雑さおよび機能を捉えるそれらの能力に限界がある［１−５］。全身性アベイラビリティー、有効性の低下、および標的外効果は、候補薬物の予測を成功させるための課題であり続けており、薬物開発を減退させている。インビトロでの腸機能の複雑さをモデル化するための前臨床的ツールの欠如に起因して、多くの困難が予測され得る［１−３］。経口送達は薬物投与のための最も一般的な方法である。腸は経口投与された薬物の吸収および初回通過代謝の程度において決定的な役割を果たす。腸はまた、ＮＳＡＩＤＳ［４］や化学療法剤［５］などの化合物の標的外毒性の重要な部位としても機能し、薬物間相互作用の部位としても機能する［２，６］。標準的な２Ｄシステムは、低い生物学的利用能などの結果を正確にモデル化するための複雑さを欠いており、それば、低い透過性と、腸上皮における取り込みおよび排出トランスポーターとの代謝酵素の相互作用と、の組み合わせの結果である［３］。腸の生物学的利用能および毒性を研究するために使用される主なインビトロモデルは、腸ミクロソームおよび２Ｄ単層を含む。ミクロソームは代謝の初期評価のために便利なツールであるが、細胞レベルの結果をモデル化することはできない。
【０００４】
２Ｄ細胞単層モデルは、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用のネイティブの状況を欠如していて、表現型が限定されており、一方で、動物モデルの遺伝的不一致は、ヒトの結果との高い相関を提供し得ない［１６］。現在のインビトロの腸管モデルには、結腸直腸および十二指腸の腫瘍に由来する細胞株の２Ｄ細胞単層モデル（たとえば、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＨＴ２９−１８Ｎ２およびＨｕＴｕ８０）が含まれる。しかしながら、正常組織と比較した腫瘍細胞における代謝の変化はこれらのモデルの主な欠点である。そして、これらの腫瘍モデルはネイティブの腸上皮の特徴を表現しない。Ｃａｃｏ−２細胞株は受動輸送を模倣し、腸管吸収を予測するために用いられる最も確立された細胞モデルである。Ｃａｃｏ−２モデルの制限は、Ｐ−４５０代謝酵素の発現および活性の欠如、頑強な腸トランスポーターの発現および機能の欠如、継代数での変動、ならびにその系内のクローン間の不一致を含む。他の２Ｄモデルには腸上皮細胞が含まれるが、他の特殊化した上皮細胞型（たとえば、杯細胞、パネート細胞）、ならびに腸壁に存在する他の支持細胞からの単離に部分的に起因して、他の細胞株と共に、限定された腸上皮機能を有し得る。
【０００５】
一般的に使用される細胞系の制限は、初代ヒト腸細胞を用いるための方法の開発を促進した。初代腸上皮細胞の単培養物は、インビボ組織とより密接に似ているが、部分的に腸壁に存在する他の支持細胞型からのそれらの単離に対して限られた腸上皮機能を有し得る。さらに、単離された上皮単培養物における試験は、ネイティブ組織に存在する間質細胞および免疫細胞に対する効果を見る能力を妨げる。
【０００６】
より複雑な３Ｄ構造としては、全組織またはバイオプシーに由来する腸管セグメントおよび腸オルガノイドが挙げられる。初代ヒト腸細胞を増殖させる［９，１０］または多能性幹細胞を分化させる［１１］オルガノイドの発見は、腸をインビトロでモデル化するための別の経路を明らかにした。オルガノイドは、腸管の全ての領域由来であり得［１２］、器官の発達、疾患のモデル化、および再生医療を含む多くの腸研究の領域に適用されている［１３，１４］。これらの構造は、（ヒトからの）利用可能性の低さ、インビトロでの生存寿命の制限を受け、そしてインビボでの器官生理学を欠如し得る。注目すべきことに、腸内オルガノイドにおける閉鎖内腔および上皮の内向き配向は、それらがインビボで通常経験するであろう直接的な刺激に対して頂端面を比較的アクセスしにくくし、オルガノイドを大部分の標準的なＡＤＭＥ ／Ｔｏｘアッセイと不適合にするであろう。
【０００７】
ヒト組織由来の腸切片は、ネイティブ組織の正確な細胞構造および複雑さ、ならびに代謝活性のレベルを提供することができる。しかしながら、腸切片はエクスビボでの生存能力が限られており、約２４時間しか機能しない。さらに、これらの組織は凍結保存と適合性がないため、短期間の研究の用途に限定される［１５］。
【０００８】
動物モデルは、化合物のバイオアベイラビリティーを推定するために頻繁に用いられるが、遺伝的な差異は、ヒトと比較して代謝酵素およびトランスポーターの発現において不一致をもたらし得、これは予測不良をもたらし得る［２，３，１６］。
【０００９】
現在のインビトロシステムの既存の制限を克服するために、自動化されたバイオプリンティングプラットフォームが、ネイティブの腸粘膜の構造の重要な観点を再現するために再現性のある高度な細胞の３Ｄ初代ヒト組織モデルを開発するのに利用された。標準的な２Ｄ単層培養と比較して、バイオプリントされた３Ｄ腸組織モデルは、より生理学的に関連のある環境を作り出し、細胞がネイティブ組織に見られる細胞−細胞相互作用および細胞−マトリックス相互作用を確立することを可能にする。間質組織層によって支持された極性化腸上皮を組み込んだモデルは、組織学的および標準的な生化学的ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ読み取りの両方と適合し得る。
【００１０】
バイオプリントされた３Ｄ腸組織は、極性化した上皮形態および培養中２週間を超えて維持された生理学的バリア機能を含む、ネイティブ様の層状構造を示す。バイオプリントされた３Ｄ腸組織は、ネイティブの腸と比較して類似の内因性レベルで重要なＰ４５０代謝酵素およびトランスポーターを発現し、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４酵素ならびにＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰ排出トランスポーターの両方の機能的活性を実証する。さらに、バイオプリントされた腸組織は、バリア機能の低下、細胞傷害性の上昇、ならびに遺伝子発現および細胞形態の変化を伴い、既知の毒物であるインドメタシンおよびＴＮＦαに応答する。バイオプリンティングプラットフォームの再現性および標準的なアッセイアプローチとの適合性と組み合わされた完全なヒト初代細胞由来組織は、このシステムを薬品開発におけるＡＤＭＥ／Ｔｏｘアプリケーションのための新規かつ実用的なインビトロツールにする。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、筋線維芽細胞、ならびに、任意で骨髄性免疫細胞、平滑筋細胞、内皮細胞およびニューロンのような他の重要な細胞型を含む腸間質組織の層の上に、腸上皮細胞層を提供することによって、既存のインビトロのアッセイシステムを超える利点を提供する、腸組織モデルを提供する。これらの腸組織モデルは、より包括的なシステムにおいて治療の影響を見ることを可能にする。また、腸組織モデルは、培養において長期間にわたって上皮の形態および機能を支持し、これにより、長期にわたる治療の研究を可能にする。それらの多細胞性および構造のため、腸組織構築物は、分泌、輸送、細胞−細胞相互作用、ならびに炎症および癌を含む病原性過程を含む、多面的過程を研究するための独自のシステムを提供する。
【００１２】
腸組織モデルは、薬品開発のリード最適化段階におけるＡＤＭＥ−ＴＯＸ適用、および創薬の全段階にわたる疾患モデル化のための製薬業界における動物モデルに対する価値ある代替物である。一実施形態では、本明細書に記載の腸組織モデルは、腸粘膜に近似させるために上皮および固有層の両方を組み込む。別の実施形態では、組織構築物は、間質区画内の初代ヒト筋線維芽細胞によって支持される上皮区画内の初代ヒト腸上皮細胞を含む。モデルの複雑さは、内分泌機能をモデル化するために追加の特殊化細胞型、たとえば腸内分泌細胞を上皮層に組み込むことによって任意選択的に増大され、一方、杯細胞はモデル粘膜バリア機能に追加され得る。免疫細胞、または内皮細胞および平滑筋細胞を含む粘膜下区画の添加によって、さらなる複雑さが達成される。開示される腸組織構築物の利点は、それらが二次元環境を有する組織構築物と比較してより生理学的に関連性があることである。組織の多細胞性および構造は、分泌、輸送、細胞間相互作用および病原性過程を含む三次元コンフォメーションにおける細胞の複雑な多面的過程を研究するためのユニークな機会を提供する。これらの相互作用を通して、三次元組織は、二次元単層で培養された細胞とは異なる様式で分化し、新しいシグナル伝達経路および細胞外マトリックス相互作用を活性化する。
【００１３】
本明細書に記載の腸組織モデルは、化合物がどのように腸組織に影響を及ぼすかを正確に研究する機会、および腸内の病原性プロセスをモデル化する機会を提供する。本明細書に開示される腸組織モデルは、薬物開発プロセスの早い段階で医薬化合物の毒性を予測するのに有用である。罹患細胞区画（たとえば、炎症組織または腫瘍組織）および正常細胞区画の両方を同じ組織に組み込むことによって、健康組織と罹患組織の両方に対する治療剤の影響を同じ組織系で評価することができる。初代細胞を含む腸組織構築物は、個別化医療に特に有用である。
【００１４】
予期せぬことに、腸上皮細胞の層中の初代上皮細胞のみを用いて作製された本明細書に記載の腸組織モデルは、クロモグラニンＡを発現し、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および粘液を分泌し、杯細胞の形成、ならびにネイティブ腸組織に特徴的な二次構造、培養における組織の肥厚、およびＣＹＰ３Ａ４活性を示す。これは、機能的な腸内分泌細胞が産生されたことを示す。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルを提供する。それは、人工の三次元生体腸組織モデルを形成するための
（ｉ）筋線維芽細胞を含む腸間質組織の層、および
（ｉｉ）腸間質組織の層上の腸上皮細胞の層
を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、腸間質組織層の少なくとも１つは筋線維芽細胞を含み、腸上皮細胞層は少なくとも１つのタイプの免疫細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は骨髄性細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄性細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞または巨核球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ系細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、（ａ）間質層、（ｂ）上皮細胞層、（ｃ）間質層と上皮細胞層との間、（ｄ）上皮細胞層の上、および（ｅ）間質細胞層の下、の少なくとも１つに存在する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、腸上皮細胞の層は健康なドナー由来の初代上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、腸上皮細胞の層は罹患ドナー由来の初代上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、罹患ドナーは、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核、憩室炎、炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、内分泌障害、代謝障害、肥満、糖尿病、脂質異常症、腸または結腸直腸癌を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、腸上皮細胞の層は少なくとも１つの幹細胞集団をさらに含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも１つの幹細胞集団は分化することができる。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞は、結腸直腸の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞は、腸組織モデル内の層または区画に存在する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、腸上皮細胞の層および間質組織の層は、健康なドナー由来の初代上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、腸上皮細胞の層および間質組織の層は、罹患ドナー由来の初代上皮細胞を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、腸組織モデルは、以下のうちの少なくとも１つを示す：
（ａ）頂端部のビリン染色；
（ｂ）タイトジャンクション；
（ｃ）頂端部の刷子縁；
（ｄ）上皮表面上の絨毛様構造；
（ｅ）間質組織の層と上皮細胞の層との間の基底層；
（ｆ）粘液を分泌する；
（ｇ）ＣＹＰ３Ａ４を発現する；
（ｈ）ｐ−糖タンパク質を発現する；
（ｉ）グルカゴン様ペプチド−１を発現する；
（ｊ）ＢＣＲＰを発現する；
（ｋ）腸内分泌細胞を含む；および
（ｌ）杯細胞を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組織モデルは、完全に成熟した灌流可能な血管系を含まない。いくつかの実施形態では、組織モデルは赤血球を含まない。いくつかの実施形態では、組織モデルは、たとえば中枢神経系によって、神経支配されていない。
【００２２】
いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む腸間質組織の層および／または腸上皮細胞の層は、実質的に単層である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、腸組織層と接触する生体適合性膜をさらに含む。いくつかの態様において、モデルは、少なくとも２細胞層の厚さである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、アレイを形成するように構成された複数の腸組織モデルを含む。いくつかの態様において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。いくつかの実施形態では、腸モデルは、静置培養条件に供される培養中にある。いくつかの実施形態では、腸モデルは、非静的培養条件に供される培養中にある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、腸間質組織および腸上皮細胞の正常な層を含む少なくとも１つの第１の領域、ならびに腸間質組織および腸上皮細胞の層を含む少なくとも１つの第２の領域を含み、ここで、その第二の領域の層の少なくとも１つは、罹患ドナー由来の細胞を含む。
【００２５】
腸組織モデルを中に埋め込まれた非ヒト動物を含む、腸の障害または損傷の非ヒト動物モデルも提供される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は免疫不全げっ歯類動物である。
【００２６】
候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する方法も提供され、その方法は、
（ａ）腸組織モデルまたは非ヒト動物モデルを、候補治療剤と接触させる段階であって、該腸組織モデルは、腸の障害または損傷の表現型を有する、段階；
（ｂ）腸組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
（ｃ）候補治療剤と接触させていない対照腸組織モデルと比較した、決定された腸組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する段階
を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷の表現型は、腸組織モデルを、表現型を引き起こす処置、化合物、または感染性因子と接触させることによって誘発される。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷の表現型は、腸組織モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である。いくつかの実施形態では、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力は、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の浸潤または転移の減少である。
【００２８】
候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する方法も提供され、この方法は、
（ａ）腸組織モデルまたは非ヒト動物モデルを、候補治療剤と接触させる段階；
（ｂ）腸組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
（ｃ）候補治療剤と接触させていない対照腸組織モデルと比較した、決定された腸組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する段階
を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、腸組織モデルの上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、罹患ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、罹患ドナーは、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核、憩室炎、炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、内分泌障害、代謝性障害、肥満、糖尿病、脂質異常症、腸または結腸直腸癌を有する。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷は炎症である。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷は物理的損傷であり、腸組織モデルは、候補治療剤と接触する前に物理的破損を受ける。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷は線維性障害である。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷は感染性疾患である。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷は癌である。いくつかの実施形態において、癌は結腸直腸癌である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルを、候補治療剤と接触させる前に潜在的な毒性剤と接触させる。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、微生物（たとえば、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌）、または環境作用物質である。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、イブプロフェン、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンＢ、およびアミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は放射線である。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は免疫活性化剤または調節剤である。
【００３１】
特定の実施形態では、腸組織細胞の生存能力または機能性は、代謝活性の指標を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、代謝活性の指標は、対照と比較した腸組織モデルにおけるレサズリンの減少、テトラゾリウム塩の減少またはＡＴＰレベルである。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの生存能力または機能性は、対照と比較したバリア機能である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの生存能力または機能性は、対照と比較した薬物流出である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの生存能力または機能性は、対照と比較したチトクロームＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの生存能力または機能性は、対照と比較したＲＮＡまたはタンパク質の発現である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの生存能力または機能性は、対照と比較したペプチド分泌である。いくつかの実施形態では、ペプチドはサイトカインである。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの生存能力または機能性は、対照と比較した組織学によって決定される。いくつかの実施形態において、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腸組織細胞の再生を同定することによって決定される。いくつかの実施形態では、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した粘液分泌を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したトランスポーター活性を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した酵素活性を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したトリグリセリド合成を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したカイロミクロン分泌活性を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、腸組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したコラーゲン産生を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、腸組織上皮細胞の生存能力または機能性は、経時的に測定される。いくつかの実施形態では、毒性剤による損傷を逆転または軽減する方法を提供し、腸組織モデルを、最初に毒性剤と、次に候補治療剤と接触させる。いくつかの実施形態では、毒性剤による損傷を軽減または防止する方法が提供され、腸組織モデルを、最初に候補治療剤と、次に毒性剤と接触させる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、候補治療剤および毒性剤と接触させる前に細胞培養培地中で培養されている。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは細胞培養培地中で少なくとも３日間培養されている。
【００３３】
腸機能に対する潜在的な毒性剤の影響を評価する方法も提供する。その方法は、
（ａ）剤を、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルと接触させる段階；および
（ｂ）腸組織モデル細胞の生存能力または機能性に対する剤の効果を測定する段階
を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、毒性剤による損傷を逆転または軽減する方法が提供され、腸組織モデルを、最初に毒性剤と接触させ、次いで潜在的な毒性剤が除去される。
【００３５】
剤の腸管吸収の動態を評価する方法も提供され、その方法は、
（ａ）剤を、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルと接触させる段階；および
（ｂ）腸組織モデルによる吸収の動態を測定する段階
を含む。
【００３６】
候補治療剤の有効投与濃度および投与スケジュールを予測する方法も提供され、その方法は、
（ａ）種々の濃度または量の剤を、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルと接触させる段階；
（ｂ）腸組織モデル細胞の生存能力または機能性に対する剤の効果を経時的に測定する段階；および
（ｃ）効能をもたらす最短の用量間タイミングを決定するために、経時的に腸組織モデル細胞の回復を測定する段階
を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、その方法は、
（ｄ）剤を除去する段階；および
（ｅ）剤の不在が腸組織モデルの生存能力または機能性の改善をもたらすか否かを評価する段階
をさらに含む。
【００３８】
腸組織モデルを作製する方法も提供され、この方法は、
（ａ）腸筋線維芽細胞を含む層を生体適合性表面上に付着させる段階；および
（ｂ）腸筋線維芽細胞の層上に腸上皮細胞の層を付着させる段階
を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つは、バイオプリンティングによって付着される。いくつかの実施形態において、腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つは、インクジェットプリンティングによって付着される。いくつかの実施形態では、腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つは、押出しによって付着される。いくつかの実施形態において、腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つは、マイクロバルブプリンティング（ＭＳＶ）によって付着される。いくつかの実施形態において、腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つは、インクジェットプリンティングによって付着される。いくつかの実施形態において、腸筋線維芽細胞および腸上皮細胞のうちの少なくとも１つはバイオインクの一部として付着される。いくつかの実施形態では、バイオインクはヒドロゲルを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルはコラーゲンである。いくつかの態様において、その方法は免疫細胞を付着させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球、肥満細胞または好酸球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は少なくとも１つの腸組織層の一部として付着する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、（ａ）間質層、（ｂ）上皮細胞層、（ｃ）間質層と上皮細胞層との間、（ｄ）上皮細胞層の上、および（ｅ）間質細胞層の下、の少なくとも１つに付着される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は層または区画として付着される。いくつかの実施形態では、腸組織モデルはマイクロタイタープレートのウェル内に付着される。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞培養培地中で腸組織モデルを培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは細胞培養培地中で少なくとも３日間培養される。いくつかの実施形態では、生体適合性表面はマイクロタイタープレートのウェル内にある。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、７日目（全培養時間１１日）における、筋線維芽細胞（ＩＭＦ）組織単独、２Ｄ  Ｃａｃｏ−２／ＳＴＣ−１単層、および両方の層から構成される３Ｄ組織（ＩＭＦ＋Ｃａｃｏ−２／ＳＴＣ−１）でのバイオプリントされた腸組織構築物のＨ＆Ｅ染色（図１Ａ）およびトリクローム染色（図１Ｂ）による組織学的比較を示す。単独で播種すると、ＩＭＦおよび上皮細胞（Ｃａｃｏ−２／ＳＴＣ−１）の両方が、１１日間にわたって培養物中で単層を形成する。一緒にバイオプリントすると、上皮細胞は二次構造を形成し、ＩＭＦはトリクローム染色で見られるようにより多くのコラーゲンを生成する（青）。
【図２】図２Ａ〜図２Ｆは、Ｃａｃｏ−２を用いた３Ｄプリント組織を示す顕微鏡写真であり、Ｃａｃｏ−２バイオプリント３Ｄ腸組織の重要な構造的および組織特異的特徴を実証する。図２Ａは、Ｈ＆Ｅ染色による二層構造を示す。図２Ｂは、３Ｄバイオプリント組織のトリクローム染色を示す。図２Ｃは、ＣＫ１９（上皮）およびビメンチン（線維芽細胞）の共染色を示す。図２Ｄは、ＣＫ１９およびコラーゲンＩＶの共染色を示す。図２Ｅは、刷子縁を同定するビリン染色を示す。図２Ｆは、上皮細胞上のＥ−カドヘリン染色を示し、タイトジャンクションを示す。基底層は、図２Ｂ（矢印）のトリクローム染色および図２ＤのコラーゲンＩＶ染色において見ることができる。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、培養中に経時的に厚くなり、重要な構造的特徴を維持する、バイオプリントされた３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織を示すグラフである。図３Ａは、Ｃａｃｏ−２／ＳＴＣ−１上皮細胞を支持するＩＭＦ間質を有する３Ｄバイオプリント組織の組織学的経時変化を示す。図３Ｂは、ＰＣＮＡおよびＣＫ１９の共染色を示す。ＰＣＮＡ染色は細胞が増殖していることを示し、３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織が培養中で高度に生存可能であることを示す。図３Ｃは、それぞれアルシアンブルー／ＰＡＳ染色およびムチン２／ＣＫ１９共染色によるムチン産生の欠如を示す。
【図４】図４は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）によって測定された２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織のバリア機能比較を示す棒グラフである。ＴＥＥＲを用いて、２Ｄ共培養物およびＣａｃｏ−２／ＳＴＣ−１を含む３Ｄ組織における腸の上皮バリアの質を評価した。１４日間の培養期間にわたり時間経過としてバリア機能を追跡した。データは、バリア機能が３Ｄ組織において時間とともに増加することを示す。３Ｄ組織におけるバリア機能の値は生理学的範囲内に入るが、２Ｄ単層の値は人為的に高くなり得る。通常の小腸のＴＥＥＲ値は５０〜１００Ω・ｃｍ２である（Srinivasan B., Kolli A.R., Esch M.B., Abaci H.E., Shuler M.L., Hickman J.J. (2015), TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.  J Lab Autom 20(2), 107-126）。
【図５】図５は、ルシファーイエローによって測定された２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織の透過性比較を示す棒グラフである。ルシファーイエローは、培養中の複数の時点でバリアの完全性を実証するために用いた。透過性は３Ｄプリント組織上で測定し、Ｃａｃｏ−２／ＳＴＣ−１細胞の２Ｄ上皮単層および間質単独と比較した。バイオプリントされた３Ｄ構築物および２Ｄ単層の両方が許容可能な範囲内で低い透過性を示す（培養の後期段階として＜３％）。データは、３Ｄ組織が輸送アッセイに十分低い受動的透過性を有することを示唆する。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、複数の実験に関して平均したＴＥＥＲ（図６Ａ）および透過率（図６Ｂ）データを示すグラフである。
【図７】図７は、バイオプリントされたＣａｃｏ−２組織からの腸内分泌細胞ＧＬＰ−１分泌の機能アッセイ検証を示す棒グラフである。
【図８】図８は、２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織の遺伝子発現比較の経時変化を示す棒グラフである。持続的な遺伝子発現は、３Ｄ組織対２Ｄ培養物においてトランスポーター／酵素のパネルについて観察される。ＣＹＰ３Ａ４発現はトランスポーターと比較して低い。微量（０．０００００４）が３Ｄ組織において１４日目に検出される。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織のＰ−ｇｐ発現比較を示す棒グラフおよび顕微鏡写真である。Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、腸上皮の頂端面上の排出トランスポーターである。Ｐ−ｇｐ遺伝子発現は、７日目の２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織において類似するが（図９Ａ）、３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織における免疫組織化学染色によって、Ｐ−ｇｐタンパク質発現の改善が観察され、培養の後期段階における発現の増強を伴う（図９Ｂ）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織のＰ−ｇｐ発現比較を示す棒グラフおよび顕微鏡写真である。Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、腸上皮の頂端面上の排出トランスポーターである。Ｐ−ｇｐ遺伝子発現は、７日目の２Ｄ単層および３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織において類似するが（図９Ａ）、３ＤバイオプリントＣａｃｏ−２組織における免疫組織化学染色によって、Ｐ−ｇｐタンパク質発現の改善が観察され、培養の後期段階における発現の増強を伴う（図９Ｂ）。
【図１０】図１０は、コラーゲン中の初代腸筋線維芽細胞の層、および初代ヒト腸上皮細胞の最上層を示す概略図である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｄは、バイオプリントされた３Ｄ初代腸上皮細胞（ＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す組織学的グラフである。９、１０、および１７日目の組織学パネルは、３Ｄ初代ヒト腸管上皮細胞（ｈＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す。組織は正しい構造を示し、上皮細胞はタイトジャンクションを形成し、ネイティブの組織に類似する発現パターンで極性化している。図１１Ａは、正しい構造を有する３Ｄ二層組織が初代ｈＩＥＣを用いて達成されたことを示す。培養９日目の像は、二次構造形成を伴う異なる上皮層を明らかにする。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｄは、バイオプリントされた３Ｄ初代腸上皮細胞（ＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す組織学的グラフである。９、１０、および１７日目の組織学パネルは、３Ｄ初代ヒト腸管上皮細胞（ｈＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す。組織は正しい構造を示し、上皮細胞はタイトジャンクションを形成し、ネイティブの組織に類似する発現パターンで極性化している。図１１Ｂは、３Ｄ二層組織中の上皮細胞が、タイトジャンクションを形成し、ネイティブ組織と同様の発現パターン形成で極性化していることを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｄは、バイオプリントされた３Ｄ初代腸上皮細胞（ＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す組織学的グラフである。９、１０、および１７日目の組織学パネルは、３Ｄ初代ヒト腸管上皮細胞（ｈＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す。組織は正しい構造を示し、上皮細胞はタイトジャンクションを形成し、ネイティブの組織に類似する発現パターンで極性化している。図１１Ｃは、上皮中に初代ｈＩＥＣを有するバイオプリントされた腸組織が正しい構造を示すことを示す。 ＩＭＦおよびｈＩＥＣマーカーの正しい発現パターンを有する二層組織は、１７日間の培養期間にわたって維持された。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｄは、バイオプリントされた３Ｄ初代腸上皮細胞（ＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す組織学的グラフである。９、１０、および１７日目の組織学パネルは、３Ｄ初代ヒト腸管上皮細胞（ｈＩＥＣ）組織がネイティブ組織の重要な特徴を発現することを示す。組織は正しい構造を示し、上皮細胞はタイトジャンクションを形成し、ネイティブの組織に類似する発現パターンで極性化している。図１１Ｄは、バイオプリントされた腸組織が持続的な生存性を有し、ネイティブの腸に似ていることを示す。
【図１２】図１２は、バイオプリントされた３Ｄ初代ＩＥＣ組織が粘液を産生することを示す組織学的グラフのパネルである。ムチン−２染色は、初代腸上皮細胞を有する組織には見ることができるが、３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織に見ることはできない。染色は、尖端刷子縁形成、杯細胞、および粘液産生を伴う極性化した上皮を示す。Ｃａｃｏ−２組織は杯細胞を含まず、粘液を生成しない。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、バイオプリントした３Ｄ初代ＩＥＣ組織が重要なトランスポーターおよび酵素を発現することを示す棒グラフである。このパネルで分析された全ての遺伝子の発現値は、組織が成熟するにつれて誘導される。図１３Ａは、９日間培養した初代ヒト腸上皮細胞を有する３Ｄ組織において、分析した全てのトランスポーターおよび酵素が、３Ｄ組織が成熟するにつれて初代ＩＥＣより高いレベルに誘導されることを示す。Ｐ−ｇｐは、初代ＩＥＣにおいて最も高いベースライン発現を示し、一方Ｐ−ｇｐおよびＣＹＰ３Ａ４は、９日目に３Ｄ組織において最も高度に発現される遺伝子である。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、バイオプリントした３Ｄ初代ＩＥＣ組織が重要なトランスポーターおよび酵素を発現することを示す棒グラフである。このパネルで分析された全ての遺伝子の発現値は、組織が成熟するにつれて誘導される。図１３Ｂは、総細胞数におけるいずれの差も除去するために、ＣＫ１９発現に対する比率としての遺伝子発現を示す棒グラフである（たとえば、２−（ΔΔＣｔ）ＰＧＰ／２−（ΔΔＣｔ）ＣＫ１９）。９日目から０日目までの発現を比較する相対倍率変化は、３Ｄ組織が成熟するにつれて全ての遺伝子における誘導を示す。バイオプリンティングアプローチは、時点ごとに低い構築物変動性（ｎ＝３）で再現可能な組織を作り出す。
【図１４】図１４は、初代ＩＥＣを有する３Ｄ組織におけるトランスポーターおよび代謝遺伝子の発現が、３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織と比較して高いことを示す棒グラフである。３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織の遺伝子発現は、９日目に複数の時点で初代組織と比較される。初代ＩＥＣ組織における全体的なトランスポーター遺伝子発現は、ＭＲＰ３を除いて３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織よりかなり高い。代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の発現は初代組織では極めて高く、３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織では見られない。
【図１５】図１５は、腸上皮が経時的に分化することを示す棒グラフのパネルである。初代腸上皮細胞を用いて作製された組織は、ネイティブ腸に見出される重要な特殊化細胞型を発現する。腸内分泌細胞マーカーはＣＨＧＡ、杯細胞マーカーはＭＵＣ２である。ＣＨＧＡおよびＭＵＣ２の増加ならびにＬＧＲ５の減少が観察され、これは上皮細胞が分化していることを示唆する。値は、組織中の上皮細胞集団に特異的な変化を視覚化するためにＣＫ１９に対する比として表される。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、３Ｄ組織が上皮層に１００％ＳＴＣ−１細胞を用いて印刷され、初代腸上皮細胞が存在しないことを示す顕微鏡写真である。組織は二層構造を示す。マウスＳＴＣ−１細胞は上皮タイトジャンクションを欠如し、周囲の上皮を破損しバリア機能の多様性を増大させ得る侵襲性凝集体を形成する。ＳＶ４０は、この細胞株の由来であるトランスジェニックマウス系統に基づくＳＴＣ−１細胞に対するマーカーとして使用される。図１６Ａは、マウスＳＴＣ−１細胞株のバイオプリントされた３Ｄ腸組織への組み込みを介する腸内分泌機能のモデリングを示す。腸ホルモンＣＣＫ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＩＰ、およびＰＹＹを分泌するマウス腸細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびポリオーマウイルススモールＴ抗原に対するダブルトランスジェニックマウスの腫瘍に由来する。腸内分泌機能をモデル化するために、マウスＳＴＣ−１細胞株が３Ｄ組織上皮に添加される。ＳＴＣ−１細胞は上皮細胞のようにはふるまわない。ＳＴＣ−１細胞は単独で厚い層を形成し、上皮マーカーおよびタイトジャンクション形成を欠如している。図１６Ｂは、初代腸細胞と共に取り込まれると、ＳＴＣ−１細胞が侵襲性凝集物を形成することを示す。ＳＴＣ−１細胞は周囲の上皮を破損し得る。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ＳＴＣ−１細胞と初代腸上皮細胞を組織上皮に組み込む組織を示す組織学的顕微鏡写真である。組織は正しい二層構造を形成し、ネイティブ組織と同様に見え、粘液を生成する。図１７Ａは、異常な挙動にもかかわらず、ＳＴＣ−１細胞を有する組織が正しい構造および発現パターン形成を維持することを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ＳＴＣ−１細胞と初代腸上皮細胞を組織上皮に組み込む組織を示す組織学的顕微鏡写真である。組織は正しい二層構造を形成し、ネイティブ組織と同様に見え、粘液を生成する。図１７Ｂは、ＳＴＣ−１細胞を有する組織も粘膜のバリアを発達させることを示す。矢印は、尖端の刷子縁を示し、アスタリスク（＊）は杯状細胞および粘液を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、初代腸上皮細胞を用いて作製した３Ｄバイオプリント組織におけるＧＬＰ−１分泌を示す棒グラフである。組織は２時間の飢餓後の基礎ＧＬＰ−１分泌について測定される。タンパク質含有量は、ＧＬＰ−１レベルを正規化するために測定される（図１８Ａ）。ベースラインＧＬＰ−１分泌は、マウス腸内分泌細胞株ＳＴＣ−１の取り込みによって増強され、飢餓後の５０ｍＭ  フォルスコリン＋１０μＭ  ＩＢＭＸ＋１０ｍＭグルコースの混合物による刺激によってさらに増強される（図１８Ｂ）。ＧＬＰ−１はＳＴＣ−１細胞なしで組織中で検出および誘導され得、これは腸内分泌細胞がｈＩＥＣ単離物中に存在し機能的であることを示唆する。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、初代腸上皮細胞を用いて作成された３Ｄ組織におけるバリア機能を示す棒グラフである。ＴＥＥＲおよびルシファーイエローの透過性は、上皮播種の１０日後に測定される。バリア機能は、初代腸上皮細胞（ｈＩＥＣ）を必要とする。筋線維芽細胞（ＩＭＦ）およびＳＴＣ−１細胞のみを有する組織はバリア機能を示さない。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｅは、Ｔａｑｍａｎアレイカード分析を示すグラフである。図２０Ａ〜２０Ｂは、重要なトランスポーターが存在し、組織が成熟するにつれて培養中に経時的に誘導されることを示す。薬物動態を調節するトランスポーター（Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰ）および重要な胆汁酸トランスポーターＡＳＢＴが高度に発現され、時間とともに増加する。データは、ゴールドスタンダードのＣａｃｏ−２を有する組織に対する３Ｄ  ｈＩＥＣ組織の明確な利点を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｅは、Ｔａｑｍａｎアレイカード分析を示すグラフである。図２０Ａ〜２０Ｂは、重要なトランスポーターが存在し、組織が成熟するにつれて培養中に経時的に誘導されることを示す。薬物動態を調節するトランスポーター（Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰ）および重要な胆汁酸トランスポーターＡＳＢＴが高度に発現される。頂端排出トランスポーターＢＣＲＰおよび取り込みトランスポーターＰＥＰＴ１は経時的に高度に上方制御される。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｅは、Ｔａｑｍａｎアレイカード分析を示すグラフである。図２０Ｃは、重要な代謝酵素が経時的に誘導されることを示す。高度に発現されたＣＥＳ２は腸内の主要な酵素であり、種々の生体異物の代謝に関与している。メジャーフェーズＩチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ３Ａ４は経時的に持続的な発現を伴って高度に誘導される（１５０倍）。初代ＩＥＣにおけるＣＹＰ３Ａ４発現は、Ｃａｃｏ−２細胞よりも優れている（Ｃａｃｏ−２細胞はＣＹＰ３Ａ４を発現しない）。メジャーフェーズＩＩ酵素ＵＧＴ１Ａ１もまた高度に発現され、経時的に誘導される。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｅは、Ｔａｑｍａｎアレイカード分析を示すグラフである。図２０Ｄは脂質生物学の遺伝子発現を示す。脂肪酸およびコレステロールのトランスポーターは、遊離コレステロールの取り込みに関与するＮＰＣ１Ｌ１を除いて低レベルで発現される。脂肪処理に関与する酵素は高度に発現され、０日目から増加し、次いで１７日目まで維持される。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜２０Ｅは、Ｔａｑｍａｎアレイカード分析を示すグラフである。図２０Ｅは、重要な内分泌マーカーが存在し、組織が成熟するにつれて誘導されることを示す。重要な分泌ペプチドＣＣＫ、ＧＣＧ、ＧＩＰ、ＰＹＹ、およびＳＳＴが発現され、時間とともに増加する。これらのマーカーはＳＴＣ−１細胞を欠如している組織にも存在し、腸内分泌細胞がｈＩＥＣ組織に存在することを示唆する。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、３Ｄ腸組織が薬物によって調節され得る持続性のＣＹＰ３Ａ４機能を有することを示す。 ＣＹＰ３Ａ４活性は初代腸上皮細胞に特異的である。構築物は培養中２週間を超えて機能的なＣＹＰ３Ａ４活性を維持する（図２１Ａ）。有意なＣＹＰ３Ａ４活性は、予測されるように、リファンピシンで誘導され、ケトコナゾールで阻害され得る（図２１Ｂ）。
【図２２−１】図２２Ａ〜図２２Ｉは、３Ｄバイオプリント腸組織の構造を示す。図２２Ａは、成人のヒト腸筋線維芽細胞（ＩＭＦ）、続いて成人のヒト腸上皮細胞（ｈＩＥＣ）を含む間質層をバイオプリンティングすることによって二層構造が達成されることを示す。図２２Ｂ〜２２Ｃは、ビメンチンを発現する間質細胞およびＣＫ１９を発現する上皮区画が、培養中１７日間にわたって分離したままであることを示す。図２２Ｄ〜２２Ｅは、タイトジャンクションＥ−カドヘリン（図２２Ｄ）および頂端部ビリン（図２２Ｅ）について染色された上皮細胞を示す。図２２Ｆ〜２２Ｇは、杯細胞からの粘液産生が培養を通して観察されることを示す。
【図２２−２】図２２Ａ〜図２２Ｉは、３Ｄバイオプリント腸組織の構造を示す。図２２Ｆ〜２２Ｇは、杯細胞からの粘液産生が培養を通して観察されることを示す。図２２Ｈ〜２２Ｉは、リゾチーム染色されたパネート細胞（図２２Ｈ）およびクロモグラニン発現腸内分泌細胞（図２２Ｉ）も存在することを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ネイティブ腸、３Ｄバイオプリント腸組織、およびＣａｃｏ−２単層の遺伝子発現比較を示す。図２３Ａは、腸上皮細胞系（ＬＧＲ５、ＣＤＸ２）についての一般的な腸マーカーを示し、タイトジャンクションは３つの群の間で類似している。上皮サブタイプマーカーは、ネイティブおよび３Ｄバイオプリント腸組織で最も高い。薬物誘導性転写因子ＶＤＲ、ＮＲ１Ｉ２（ＰＸＲ）、およびＮＲ１Ｉ３（ＣＡＲ）は、正常な腸組織機能および３Ｄ腸組織について類似している。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ネイティブ腸、３Ｄバイオプリント腸組織、およびＣａｃｏ−２単層の遺伝子発現比較を示す。図２３Ｂは、フェーズＩシトクロムＰ４５０を含む、分析された全ての代謝酵素をネイティブおよび３Ｄバイオプリント腸組織が発現していることを示し、その大部分はＣａｃｏ−２細胞を欠いている。脂肪酸代謝を調節する遺伝子ＤＧＡＴ１、ＭＯＧＡＴ１、およびＭＴＴＰは、正常な腸組織機能および３Ｄバイオプリント腸組織でほぼ同等である。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ネイティブ腸、３Ｄバイオプリント腸組織、およびＣａｃｏ−２単層の遺伝子発現比較を示す。図２３Ｃは、トランスポーターが３つのグループ全てによって、レベルの変動を伴って発現されることを示す。排出トランスポーターについて、３Ｄバイオプリント腸組織は正常な腸組織機能と最も類似しているが、Ｃａｃｏ−２はＡＢＣＢ１（Ｐ−ｇｐ）およびＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ）を過少発現し、ＡＢＣＣ２（ＭＲＰ２）およびＡＢＣＣ３（ＭＲＰ３）を過剰発現する。取り込みトランスポーターＳＬＣ１５Ａ１（ＰＥＰＴ１）およびＳＬＣＯ２Ｂ１（ＯＡＴＰ２Ｂ１）は、Ｃａｃｏ−２単層ではなく、ネイティブおよび３Ｄバイオプリント腸組織によって同様に発現される。胆汁酸トランスポーターは３つのグループ全てで異なる。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、３Ｄバイオプリント腸組織のバリア機能を示す。図２４Ａは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が６日目から２１日目までの３Ｄバイオプリント腸組織について測定されたことを示し、これは、培養初期における増加を示し、バリア機能の維持は１０日後に生理学的レベル内にある（点線）（ｎ＝２４）。２１日目のＣａｃｏ−２単層は生理学的値を超えるＴＥＥＲを有する。図２４Ｂは、試験化合物の透過性が頂端から基底方向に測定されたことを示し、低（ルシファーイエロー、ミトキサントロン）、中（ジゴキシン）、および高（プロプラノロール）透過性の化合物の間の区別を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰトランスポーター機能を示す。図２５Ａ〜２５Ｂは、Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰが、正常な腸組織機能と同様に、３Ｄバイオプリント腸組織において頂端に局在化していることを示す。頂端面でのパッチ状のＣａｃｏ−２単層における発現。有意性のレベル：二元分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰトランスポーター機能を示す。図２５Ａ〜２５Ｂは、Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰが、正常な腸組織機能と同様に、３Ｄバイオプリント腸組織において頂端に局在化していることを示す。頂端面でのパッチ状のＣａｃｏ−２単層における発現。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜２５Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰトランスポーター機能を示す。図２５Ｃは、Ｐ−ｇｐ基質ジゴキシンが２．１の流出比でＢｔｏＡ方向により大きな透過性を有したことを示す。Ｐ−ｇｐ阻害剤ゾスキダル（Ｚｏｓｕｑｕｉｄａｒ）の存在下では、ジゴキシンの流出比は１．２に低下した。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜２５Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰトランスポーター機能を示す。図２５Ｄは、コントロール条件下でＢＣＲＰ／Ｐ−ｇｐ基質トポテカンが８．８の流出比を有したことを示す。Ｋｏ１４３によるＢＣＲＰ阻害はＢｔｏＡ輸送を減少させ、流出比は３．６に減少した。Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰの二重阻害は、１．４の流出比で輸送の消失をもたらした。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｅは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるチトクロームＰ４５０代謝を示す。図２６Ａは、ＣＹＰ２Ｃ９基礎活性がルシフェリン活性アッセイによって確認され、阻害剤スルファフェナゾールによって減少したことを示す。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｅは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるチトクロームＰ４５０代謝を示す。図２６Ｂ〜２６Ｃは、ＣＹＰ３Ａ４活性がルシフェリン活性アッセイ（図２６Ｂ）およびミダゾラム水酸化（図２６Ｃ）によって示されたことを示し、これらは両方ともケトコナゾールによって阻害された。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｅは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるチトクロームＰ４５０代謝を示す。図２６Ｂ〜２６Ｃは、ＣＹＰ３Ａ４活性がルシフェリン活性アッセイ（図２６Ｂ）およびミダゾラム水酸化（図２６Ｃ）によって示されたことを示し、これらは両方ともケトコナゾールによって阻害された。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜２６Ｅは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるチトクロームＰ４５０代謝を示す。図２６Ｄは、リファンピシン処理によるＣＹＰ３Ａ４誘導がミダゾラム代謝の増加によって検出されたことを示す。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｅ】図２６Ａ〜２６Ｅは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるチトクロームＰ４５０代謝を示す。図２６Ｅは、リファンピシン処理が、ＰＸＲ制御されたＣＹＰ、ＡＢＣＢ１（Ｐ−ｇｐ）、およびＵＧＴ１Ａ１の遺伝子発現を増加させたが、対照遺伝子ＣＫ１９およびＥＣＡＤではそうでなかったことを示す。有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるインドメタシン毒性を示す。図２７Ａは、ビヒクルまたは様々な用量のインドメタシン（Ｉｎｄｏ）との２４時間のインキュベーション後の組織のＴＥＥＲ測定値を示し、増加するインドメタシンに伴うＴＥＥＲの用量反応の減少を示す。有意性のレベル：一元分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるインドメタシン毒性を示す。図２７Ｂは、インドメタシン用量の増加と共にＬＤＨ活性が増加したことを示し、これは細胞毒性の増加を示唆する。有意性のレベル：一元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜２７Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるインドメタシン毒性を示す。図２７Ｃは、試験した全てのインドメタシン用量についてプロスタグランジンＥ２合成が同様のレベルに減少したことを示し、薬物活性を確認する。有意性のレベル：一元分散分析による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２７Ｄ】図２７Ａ〜２７Ｄは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるインドメタシン毒性を示す。図２７Ｄは、インドメタシン処理した組織の組織学が、バリア機能のマーカーであるＥ−カドヘリンの減少を伴う、より高い用量のインドメタシンでの上皮の崩壊および歪んだ核の染色を示すことを示す。有意性のレベル：一元分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｃは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＴＮＦα誘導毒性を示す。図２８Ａは、２４時間ＴＮＦαで処理した３Ｄバイオプリント組織が、対照と比較して増大した上皮組織崩壊を示したことを示す。有意性のレベル：ｂにおけるｔ検定で＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｃにおける二元分散分析により＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜２８Ｃは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＴＮＦα誘導毒性を示す。図２８Ｂは、ＴＮＦα処理後の細胞形態の変化と相関するＬＤＨ活性の増加を示す。有意性のレベル：ｂにおけるｔ検定で＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｃにおける二元分散分析により＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２８Ｃ】図２８Ａ〜２８Ｃは、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＴＮＦα誘導毒性を示す。図２８Ｃは、炎症に関連する遺伝子のサブセット、ＣＯＸ２、ＩＬ８、およびＴＮＦαがＴＮＦα処置に応答して上方制御されたことを示す。有意性のレベル：ｂにおけるｔ検定で＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｃにおける二元分散分析により＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２９】図２９は、Ｃａｃｏ−２組織学を示す。２１日目のＣａｃｏ−２細胞の単層を、一般的なおよび特殊化された細胞サブタイプの上皮マーカーについて染色した。Ｃａｃｏ−２は、単層を横切ってＣＫ１９、Ｅ−カドヘリン、およびビリンを発現する。クロモグラニン、リゾチーム、またはムチン−２については染色は観察されなかった。
【図３０】図３０は、ミトキサントロンのＢＣＲＰ排出を示す。ＢＣＲＰ基質であるミトキサントロンの低い透過性ＡｔｏＢ（ＡからＢ）が、ＢｔｏＡ（ＢからＡ）方向においてかなりより高い透過性、流出比＝ １９０で観察された。ＢＣＲＰ阻害剤Ｋｏ１４３の存在下では、ミトキサントロン透過性ＢｔｏＡが減少し、流出比が１４５に減少した。注：ＡｔｏＢのサンプルは検出の限界に近いか、または検出の限界より下であった。（ｎ＝  ４）有意性のレベル：二元分散分析による＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３１】図３１は、ＭＲＰ２およびＭＲＰ３トランスポーター発現を示す。ネイティブ腸、３Ｄバイオプリント腸組織、およびＣａｃｏ−２単層を、ＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）およびＭＲＰ３（ＡＢＣＣ３）の発現について比較した。同様のレベルのＭＲＰ染色が、正常な腸組織と３Ｄバイオプリント腸組織との間で観察され、Ｃａｃｏ−２単層においてより高いレベルが見られた。
【図３２】図３２は、３Ｄバイオプリント腸組織のミダゾラム代謝における個体間変動性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
特定の定義
他に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのいかなる言及も、特に明記しない限り「および／または」を包含することを意図している。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「約」は、列挙された値の±１０％を意味する。たとえば、約１０には９〜１１が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「アレイ」は、１つの試料に対して複数の試験を実施すること、複数の試料に対して１またはそれ以上の試験を実施することを可能にするように空間的に配置された複数の要素の関連を含む科学的ツールを意味する。いくつかの実施形態では、複数の腸組織モデルは、アレイを形成するように構成される。いくつかの実施形態では、アレイは、中または高スループットスクリーニングに関連するものを含む、スクリーニング方法および装置に適合しているか、またはそれと適合性がある。さらなる実施形態では、アレイは、複数の試験を同時に実施することを可能にする。さらなる実施形態では、アレイは、複数の試料を同時に試験することを可能にする。いくつかの態様において、アレイは細胞マイクロアレイである。さらなる実施形態では、細胞マイクロアレイは、固体支持体の表面上の生細胞の多重調査を可能にするラボラトリーツールである。他の実施形態では、アレイは組織マイクロアレイである。さらなる実施形態では、組織マイクロアレイは、複数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的分析の実行を可能にするためにアレイへと組み立てられた複数の別個の組織または組織サンプルを含む。いくつかの態様において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。マイクロタイタープレースはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈおよび他の供給元から市販されており、長方形マトリックスに配置された６、１２、２４、４８、９６、３８４および１５４６サンプルウェルフォーマットで利用できるが、より多数のウェルも可能である。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「アッセイ」とは、有機または生物学的試料（たとえば、細胞凝集体、組織、器官、生物など）中で物質（たとえば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ペプチド、ホルモン、または薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「基底層」とは、腸間質組織層と上皮細胞層との間のコラーゲンを含む層を意味する。腸組織モデルには他の層も存在し得る。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「生体適合性膜」は、組織に対して毒性ではない膜を意味する。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「バイオインク」は、バイオプリンティングに使用するための液体、半固体、または固体の組成物を意味する。いくつかの実施形態では、バイオインクは細胞溶液、細胞凝集体、細胞含有ゲル、多細胞体、または組織を含む。いくつかの実施形態において、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生体力学的特性を提供する非細胞性材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは押出しコンパウンドを含む。特定の場合、押出しコンパウンドはバイオプリンティングプロセスの後に除去されるように設計される。他の実施形態では、押出しコンパウンドの少なくとも特定の部分はプリント後に細胞に同伴されたままであり、除去されない。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「バイオプリンティング」は、自動または半自動の、コンピュータ支援の、三次元のプロトタイピング装置（たとえば、バイオプリンター）と適合可能である方法を介する、細胞（たとえば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃度、多細胞凝集体、多細胞体など）の三次元の正確な付着を利用することを意味する。適切なバイオプリンターとしては、Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）からのＮｏｖｏｇｅｎ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（登録商標）、および、米国特許第９，１４９，９５２号および米国公開出願第２０１５／００９３９３２、２０１５／０００４２７３、および２０１５／００３７４４５号に記載されるものが挙げられる。
【００４９】
バイオプリンティングは、インクジェットプリンティング（米国特許第７，０５１，６５４号参照）および／または押出しプリンティング（米国特許第９，１４９，９５２、８，９３１，８８０、９，２２７，３３９、８，１４３，０５５、８，７２８，８０７、および９，３１５，０４３号、ならびに米国公開出願第２０１３／０１９０２１０、２０１３／０１６４３３９、２０１５／０２８２８８５、２０１６／００４０１３２、２０１６／００９７０３９、および２０１６／０１２２７２３号参照）によって実行することができる。別の実施形態では、バイオプリンティングは、たとえばマイクロバルブを含むマイクロ流体装置を用いたマイクロバルブプリンティングによって実施することができる。たとえば、Beebe, D. J., Moore, J. S., Bauer, J. M., Yu, Q., Liu, R. H., Devadoss, C., Jo, B., 2000, "Functional hydrogel structures for autonomous flow control inside microfluidic channels", Nature 404, 588-590、および米国特許第６，６６３，８２１号を参照。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「層」は、１つまたは複数の細胞厚さである、Ｘ平面およびＹ平面における細胞の関連を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の腸組織モデルは少なくとも２つの層を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の腸組織モデルは、２つの層を複数含む。様々な実施形態において、層は、連続的、実質的に連続的、または非連続的な細胞のシートを形成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の腸組織モデルの各層は、Ｘ、Ｙ、およびＺ軸に複数の細胞を含む。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「極性化した」は、空間的に非対称性であることを意味する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「足場」は、合成足場、たとえば、ポリマー足場および多孔性ヒドロゲル、非合成足場、たとえば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞化組織、ならびに人工組織の物理的構造に不可欠であり、該組織の損傷／破損なしに組織から除去することができない、任意の他の種類の予め形成された足場を指す。さらなる実施形態では、脱細胞化組織足場は、任意の様式で培養細胞によって生成された脱細胞化ネイティブ組織または脱細胞化細胞材料、たとえば、死ぬことが許容されるかまたは脱細胞化され、生きている間にそれらが生成した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を残す細胞層を含む。したがって、用語「足場なし」は、予め形成された足場が、使用時に人工組織の不可欠な部分ではなく、人工組織の不活性成分として除去されているか、または残ったままであることを意味することを意図する。「足場なし」は、「足場フリー」および「予め形成された足場なし」と交換可能に使用される。
【００５３】
本明細書で使用される「対象」は、ヒト、霊長類、類人猿、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマなどを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物種の生物である。対象は生きているか死んでいる任意の哺乳動物種であり得る。対象は最近死亡した対象または生きている対象から採取された生検サンプルを含む。
【００５４】
「非ヒト動物」は、ヒト以外の任意の種であり得る。一実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物である。別の実施形態では、非ヒト動物は脊椎動物である。別の実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタおよび非ヒト霊長類からなる群から選択される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「治療物質」とは、疾患を治療することが承認されているか、疾患を治療するための調査中であるか、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変化などの生物学的応答を誘導する、任意の分子、生物製剤、化合物または組成物を意味する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「組織」は細胞の凝集体を意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「生存可能」とは、細胞の少なくとも５０％が生存していることを意味する。他の実施形態では、生存細胞は、少なくとも１つの生存能力試験によって決定した場合に、バイオインクまたは組織層中の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、またはそれを超える細胞である。 生存能力についての試験は当技術分野において公知であり、製造元のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に従って行われるａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）アッセイを含む。
【００５８】
腸組織モデルの組成
いくつかの実施形態では、組織モデル内の細胞は、腸組織の層状構造を再現するように空間的に組織化されており、極性化した上皮は、腸筋線維芽細胞を含む間質組織の層の上に存在する。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは上皮細胞上に刷子縁をさらに含む。
【００５９】
特に、非限定的な実施形態において、本明細書に記載の人工腸組織は、２つの主要な部分：１）筋線維芽細胞を含む間質層；および２）上皮細胞を含む極性化した上皮層、含む。これらの層は、インクスプレー、押出し、マイクロバルブプリンティング（ＭＳＶ）、レーザーベースのバイオプリンティング、および細胞の手動配置によるものを含む、バイオプリンティングの任意の既知の方法で付着させることができる。一実施形態では、上皮層が筋線維芽細胞層の先端になるように、Ｎｏｖｏｇｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒを用いて細胞が付着される。別の実施形態では、経時的に分解する熱応答性ヒドロゲル（Ｎｏｖｏｇｅｌ（登録商標）２．０）と混合した細胞の空間的に制御された付着および／または圧縮ガス推進によるエアロゾル化細胞材料の付着（インクジェットスプレー）によって構造体が作製される。この実施形態において、２つの層は一緒になって腸組織の壁をモデル化する。この構成は、インビボ組織をモデル化し、ネイティブの組織応答を予測するために重大である。上皮層の応答は、薬物、化学物質、栄養素または生物学的剤に対するネイティブの組織応答を予測し、毒性、有効性、吸収、炎症、または恒常性に関する情報を提供し得る。
【００６０】
特定の実施形態において、筋線維芽細胞層は、連続付着技術を使用してバイオプリントされる。この実施形態において、上皮層は、筋線維芽細胞層上へのインクジェット、マイクロバルブ、または押出し付着技術を用いてバイオプリントされる。実質的に隣接する上皮の層はインビボ組織と一致しており、生理学的に関連のある構造を再現するのに重要である。インクジェットおよびマイクロバルブ付着技術は、筋線維芽細胞層の潜在的に不規則な表面上に上皮細胞の１つまたは複数の薄層を付着させる能力を提供する。そのような実施形態では、上皮層のインクジェットまたはマイクロバルブ付着は、筋線維芽細胞層のバイオプリンティング直後または筋線維芽細胞層を成熟させた後に任意に行われる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、細胞はバイオプリントされる。さらなる実施形態では、バイオプリントされた細胞は、凝集されて人工腸組織モデルを形成する。なおさらなる実施形態において、人工腸組織モデルは、製造時または使用時に、予め形成された足場を含まないか、または実質的に含まない。場合によっては、バイオプリンティングは、ネイティブ組織の適切な細胞性を模倣する組織の製造を可能にする。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の三次元の人工の腸組織モデルは、それらが三次元であり、予め形成された足場がなく、本質的に細胞からなり、および／または高い細胞密度（たとえば、３０％超の細胞密度、４０％超の細胞密度、５０％超の細胞密度、６０％超の細胞密度、７０％超の細胞密度、８０％超の細胞密度、９０％超の細胞密度、または９５％超の細胞密度）を有する、という事実により、先行技術によって製造された組織と区別される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三次元の人工の腸組織モデルは、それらが神経支配されていない（たとえば、実質的に神経組織を含まない）、成熟血管系を実質的に含まない、および／または血液成分を実質的に含まない、という事実により、ネイティブの（たとえば、非人工の）組織と区別される。たとえば、様々な実施形態において、三次元の人工の腸組織モデルは、血漿、赤血球、血小板など、および／または内因的に生成された血漿、赤血球、血小板などを含まない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、モデルは、自然に発生する腸組織のように管状の形状ではないが、平面状またはシート状であり、これはインビトロアッセイおよび分析を有利に可能にする。いくつかの実施形態では、上皮細胞はヒト起源のものではない。特定の実施形態では、人工腸組織モデルは未分化細胞を欠如している。特定の実施形態では、人工腸組織モデルは未分化腸細胞を欠如している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三次元人工腸組織モデルは、それらが実質的に平面であるという点でネイティブの腸組織と区別される。特定の実施形態では、本明細書に記載の三次元人工腸組織モデルは、ネイティブの腸組織を超える機能的改善を有し、一例は、培養中で１４日間またはそれを超える長い培養期間の後の高い生存能力である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルに用いる細胞は形質転換または不死化されている。いくつかの実施形態では、腸組織モデルで使用される細胞はトランスジェニックであり、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）のような、蛍光タンパク質とのタンパク質融合を含む。いくつかの実施形態において、腸組織モデルにおいて使用される細胞はトランスジェニックであり、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＧＦＰのような蛍光タンパク質、またはホタルもしくはウミシイタケルシフェラーゼのような発光タンパク質とのレポーター構築物を含む。特定の実施形態では、任意の細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える遺伝子の欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、３Ｄ腸組織モデルはキメラであり、ここでは、少なくとも１つの細胞が、３Ｄ腸組織モデルの他のどの細胞とも異なる哺乳動物種に由来する。いくつかの実施形態では、３Ｄ腸組織モデルはキメラであり、ここでは、少なくとも１つの細胞が、３Ｄ腸組織モデルの他の細胞とも異なるヒトドナーを形成する。別の実施形態では、腸組織モデルは、腫瘍に由来する細胞および／または人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）および／または胚性幹細胞に由来する細胞を含む。腸組織モデルに存在し得る腫瘍細胞の例には結腸直腸腫瘍細胞が含まれる。
【００６５】
本腸組織モデルと現在のインビトロモデルとの間には重要な違いがある。Ｃａｃｏ−２細胞株は受動輸送を模倣し腸管吸収を予測するために使用される最も確立された細胞モデルであり、インビトロで腸バリアをモデル化するためのゴールドスタンダードと考えられている。Ｃａｃｏ−２モデルの限界には、（主要な腸代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４を含む）Ｐ−４５０代謝酵素活性の欠如、粘液産生の欠如が含まれ、これにより、粘膜バリアの正確なモデリングの妨げ、継代数の変動、および細胞系のクローン間の不一致が含まれる（表１）。他の２Ｄモデルは初代腸上皮細胞を含み得るが、他の特殊化された上皮細胞型または腸壁に存在する他の支持細胞型のいずれかからのそれらの単離に部分的に起因して、細胞株と共に、限られた腸上皮機能を有し得る。さらに、単離された上皮単培養物における試験は、ネイティブ組織に存在する間質細胞および免疫細胞に対する効果を見る能力を妨げる。
【００６６】
（表１）従来の２Ｄ  Ｃａｃｏ−２単層モデルと比較した３Ｄ組織モデルの優位性を示す主な違い
2020500018.tif 000003
【００６７】
全組織または生検材料に由来する腸セグメントおよび腸オルガノイドを含む、より複雑な３Ｄ構造は、ヒト組織に由来する場合は利用可能性が限られており、インビトロでの生存寿命が限られており、インビボ器官生理学を欠如し得る。特に、これらの組織は構造的に層状ではなく、腸オルガノイドにおける上皮の内向きの方向は直接的な刺激または吸収の評価のために頂部表面を比較的接近し難くする。３Ｄバイオプリント腸組織は、筋線維芽細胞および任意に免疫細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、またはニューロンを含む腸間質組織の層の上に腸上皮細胞層を含む複数の細胞型を組み込むことによって既存のインビトロアッセイシステムを超える利点を提供する。さらに、このモデルは組織様の３Ｄアーキテクチャおよび機能性を長期間の培養で実証しているため、臨床的に関連のあるエンドポイントを用いたより長期にわたる研究を可能にする。ヒト初代細胞を含めることによって、腸組織モデルは、重要な補助物として機能し、または場合によっては、機能の種差が解釈を妨げる動物実験の代替として機能し得る。
【００６８】
組織構築物とネイティブ組織との間には重要な違いがある。バイオプリント組織構築物は、中枢神経支配された神経組織および血管組織を含むネイティブの腸とは異なる。足場の使用は組織様密度および３Ｄディメンションの達成を妨げ、それらのシステムは限られた空間構成を有するので、バイオプリント組織構築物は足場を使用することができる他の３Ｄ工学的方法とは異なる。バイオプリント組織構築物は、血液、成熟灌流可能血管成分、および付属物の取り込みに関して、エクスビボで培養された組織外植片／スライス／腸管セグメントと異なる。組織外植片は、粘膜、粘膜下層、筋、および漿膜の全ての常在細胞型ならびに付属肢を含むという利点を有するが、宿主遺伝学の実験的操作について限られた選択肢しかなく、そのような組織サンプルの利用可能性に制限がある。さらに、エクスビボでの組織切片は培養下で１４日未満しか生存できず、バイオプリント組織構築物は１４日を超えて維持することができる。
【００６９】
（表２）２Ｄ、３Ｄバイオプリント、およびインビボ組織の比較 
2020500018.tif 000004
【００７０】
細胞のインプット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工組織、アレイ、および方法は、複数の細胞型を含む。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、筋線維芽細胞を含む哺乳動物間質組織の層と哺乳動物上皮細胞の層とを含む。様々な実施形態において、適切な上皮細胞は、ヒト腸に由来する（たとえば、PLoS ONE 6.11:e26890 (2011), PMC. Web 28 Sept. 2016, or Sato et al., Nature 459:262-5 (2009)を参照）か、または、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もしくはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の定方向分化に由来する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞は腸組織筋線維芽細胞である。様々な実施形態において、腸組織筋線維芽細胞は、ヒト腸から単離された初代細胞に由来する。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞は皮膚起源または血管起源である。いくつかの実施形態において、細胞成分のうちの１つまたは複数は非ヒト哺乳動物に由来する。他の実施形態では、細胞成分のうちの１つまたは複数はヒトに由来する。他の実施形態では、筋線維芽細胞は正常組織、罹患組織または腫瘍組織（たとえば、結腸直腸腫瘍組織）に由来する。
【００７２】
腸上皮細胞は、特定の腸の領域の機能をより正確に模倣するために、十二指腸、空腸、回腸、および結腸を含む腸の様々な領域から単離することができる。さらなる機能的特徴を提供するために、さらなる細胞型を腸の構築物に組み込むことができる。細胞型は、代替のヒト腸細胞系（たとえば、ＨＴ−２９、ＨＴ２９−１８Ｎ２、および／またはＨｕＴｕ８０細胞系）を含み得る。そのような細胞株は、９６ウェルプラットフォームを含むハイスループット適用について考慮され得る。一実施形態では、これらの細胞株は、初代腸上皮細胞の代わりにまたはそれと組み合わせて上皮層として添加される。
【００７３】
一実施形態において、免疫成分は、初代骨髄細胞（たとえば、単球、マクロファージ、および／または樹状細胞）および／またはリンパ球系細胞／白血球（たとえば、ＰＢＭＣ、好中球、Ｔ細胞、および／またはＢ細胞など）を添加することによって腸組織モデルに組み込まれる。このような腸管組織モデルは、疾患の表現型（ＩＢＤ、大腸炎、クローン病）および炎症、ならびに免疫−腫瘍学モデルをモデル化するのに用いることができる。免疫細胞は、筋線維芽細胞バイオインクと直接混合することにより、単層としてプリント表面に添加し、続いて間質組織をその上部にプリントすることにより、間質層に隣接してまたはその中に埋め込んだプリント層または区画として添加することにより、筋線維芽細胞間質層に組み込むことができるか、および／または、上皮内の混合物として添加することができる。一実施形態では、リンパ系細胞は、パイエル板のネイティブの腸の生理学を模倣するために、上皮層の直下の区画化された凝集体としてバイオプリントされる。別の実施形態では、特殊化された腸上皮細胞（たとえば腸内分泌細胞、杯細胞、Ｍ細胞、および／またはパネート細胞）は、特定の腸機能をモデル化するために上皮に組み込まれる。別の実施形態では、内分泌機能（たとえば、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、ＣＣＫ、および／またはＳＳＴペプチド分泌）をモデル化するために、腸内分泌細胞が幹細胞から追加または生成される。別の実施形態では、杯細胞は、吸収、分布、代謝および排出（ＡＤＭＥ）および／または毒物学試験および／またはミクロビオーム相互作用の研究のために粘膜のバリア機能をモデル化するために添加される。別の実施形態では、Ｍ細胞およびパネート細胞が免疫機能を調節するために添加される。別の実施形態では、初代ヒト内皮細胞（たとえば、ＨＵＶＥＣ）が、腸の微小血管系をモデル化するために添加され、間質層に組み込まれるか、または追加の粘膜下層として組み込まれる。別の実施形態では、腸組織モデルは、間質組織および上皮細胞の一方もしくは両方の層に、または１つまたは複数の別々の層として、リンパ内皮細胞および／または平滑筋細胞などの追加の細胞を含む。別の実施形態では、神経細胞は、腸神経系をモデル化するために粘膜下層に組み込まれる。特殊化された細胞は、初代分離株内の幹細胞集団の指向的分化、またはｉＰＳ細胞に由来し得る。さらに、初代細胞またはｉＰＳ細胞は、腸疾患をモデル化するために罹患ドナーに由来し得る（たとえば、ＩＢＤ、大腸炎、およびクローン病の遺伝的根拠に対処する）。
【００７４】
別の実施形態では、腸組織モデルには、ｘ−ｙ軸を横切る複数の区画を含めることができ、たとえば、１つの区画は正常な組織を含み、隣接する区画は疾患細胞を有する組織、たとえば腸疾患または障害を有する個体から得られた細胞を含む。そのような多区画腸組織構築物は、単一の組織ウェル中に存在し得る同じ構築物中の正常組織および罹患組織に対する候補治療的処置の試験を可能にする。
【００７５】
別の実施形態では、腸組織モデルは層状であるが、絨毛および／または陰窩を模倣する二次構造を含む。他の実施形態において、腸組織モデルは、組織を含まないが細胞培養培地を含み得るルーメン様構造または管を含む。
【００７６】
別の実施形態では、腸組織モデルは、腸組織モデルの１つまたは複数の層または区画内に、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞または不死化細胞を含み得る。そのような組織構築物は、腫瘍または細胞に対する候補治療処置の試験、ならびに腫瘍細胞浸潤および転移の研究を可能にする。腫瘍および腫瘍細胞の例には、腸腺癌細胞、腸肉腫細胞、消化管間質細胞、カルチノイド癌細胞、および腸リンパ腫細胞が含まれる。いくつかの態様において、腫瘍および腫瘍細胞は、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＨＴ２９−１８Ｎ２、ＨｕＴｕ８０およびＳＴＣ−１細胞を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
別の実施形態において、腫瘍細胞を含む腸組織モデルは、癌のインビボモデルとして非ヒト動物に移植され得る罹患組織モデルとして使用され得る。一実施形態では、腫瘍細胞は結腸直腸細胞である。別の実施形態では、非ヒト動物は、これらに限定されないが、ネズミ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタおよび任意の非ヒト霊長類動物を含む任意の種からなる群から選択され、それらであり得る。特定の実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類動物である。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は免疫不全げっ歯類動物である。より具体的な実施形態では、動物はＮＯＤ  ＳＣＩＤガンママウスである。腸組織モデルは、非ヒト動物の任意の部分に埋め込むことができる。一実施形態では、腸組織モデルは、非ヒト動物の腹膜に埋め込まれる。
【００７８】
特別な細胞型に関連するマーカーの発現は、これらに限定されないが、骨髄細胞マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ２０６）、リンパ系細胞マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１５）、腸内分泌マーカー（ＣＨＧＡ、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、ＣＣＫ）、杯細胞マーカー（ＭＵＣ２）、血管マーカー（ＣＤ３１）、および初代単離株中の幹細胞マーカー（ＬＧＲ５）を含み得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は実質的に単層である。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、その表面積の９５％を超えて単層を含む。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、その表面積の９０％を超えて単層を含む。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、その表面積の８０％を超えて単層を含む。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、１細胞厚を超える。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２細胞厚を超える。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、３細胞厚を超える。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、４細胞厚を超える。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は５細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は１０細胞厚を超える。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は２０細胞を超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は５０細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は１００細胞を超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２〜１００細胞厚である。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、３０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、４０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、５０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は１００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、５００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、６００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、１０００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２０μｍ〜１０００μｍの厚さである。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、３０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、４０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、５０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、１００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、２００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、５００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、６００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、筋線維芽細胞を含む間質組織の層は、１０００μｍ未満の厚さである。
【００８０】
いくつかの実施形態において、腸組織モデルは、哺乳動物上皮細胞を含む上皮組織の層を含む。さらなる実施形態では、上皮細胞は腸組織上皮細胞（たとえば、ヒト腸上皮細胞）である。なおさらなる実施形態において、適切な腸組織上皮細胞は、初代単離物または幹細胞の指向性分化に由来する細胞（たとえば、ｉＰＳＣ由来および／またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）由来）である。いくつかの実施形態では、腸組織上皮細胞は不死化ヒト細胞である。不死化腸上皮細胞を生成する方法は、たとえば、Paul EC, Hochman J, Quaroni A（1993）, Conditionally immortalized intestinal epithelial cells: novel approach for study of differentiated enterocytes. Am J Physiol. 265(1 Pt 1):C266-78 および Whitehead RH, VanEeden PE, Noble MD, Ataliotis P, Jat PS (1993), Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 90(2):587-91に記載される。他の実施形態では、腸組織上皮細胞は、Ｃａ  ＳｋｉまたはＨＴ−２９細胞などの不死化細胞である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、上皮細胞は、たとえば、ラット、マウス、ブタ、または霊長類動物などの非ヒト哺乳動物に由来する。他の実施形態では、上皮細胞はヒトに由来する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、上皮組織の層は本質的に腸組織上皮細胞からなる。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は本質的に初代腸組織上皮細胞からなる。いくつかの実施形態において、上皮組織の層は、本質的に腸組織上皮細胞からなる。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は本質的に初代腸組織上皮細胞からなる。いくつかの実施形態では、腸組織の層は実質的に単層である。いくつかの実施形態において、腸組織上皮細胞は、腸上皮組織の層に存在する唯一の細胞である。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は、腸癌腫、肉腫、リンパ腫および／または腺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は、その表面積の９５％を超えて単層を含む。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は、その表面積の９０％を超えて単層を含む。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は、その表面積の８０％を超えて単層を含む。いくつかの実施形態において、上皮組織の層は１細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は３細胞厚を超える。いくつかの実施形態において、上皮組織の層は、４細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は５細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は１０細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２０細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は５０細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は１００細胞厚を超える。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２〜１００細胞厚である。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は３０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は４０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は５０μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は１００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は５００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、間質組織層は６００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は１０００μｍを超える厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２０〜１０００μｍの厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は１０００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、間質組織の層は、６００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、上皮組織の層は、５００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は１００μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は５０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態において、上皮組織の層は４０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は３０μｍ未満の厚さである。いくつかの実施形態では、上皮組織の層は２０μｍ未満の厚さである。
【００８３】
任意で、腸組織モデルは他の細胞型（たとえば、ＧＰＬ−１産生細胞、免疫細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞など）を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は樹状細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はマクロファージ細胞である。
【００８４】
広範囲の細胞比が適切である。いくつかの実施形態において、上皮層は、腸組織上皮細胞を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞は筋線維芽細胞間質組織の層に存在する唯一の細胞である。いくつかの実施形態において、筋線維芽細胞および上皮細胞は、特定の比率で腸モデルに存在する。筋線維芽細胞の適切な割合は、非限定的な例として、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および９５％の筋線維芽細胞を含み、その中の増分を含む。上皮細胞の適切な比率は、非限定的な例として、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および９５％の上皮細胞を含み、その中の増分を含む。特定の実施形態では、筋線維芽細胞の上皮細胞に対する比率は、少なくとも５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：６５、  ５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、または９５：５であり、その中の増分を含む。特定の実施形態では、筋線維芽細胞の上皮細胞に対する比率は５：９５〜９５：５である。特定の実施形態では、筋線維芽細胞の上皮細胞に対する比率は、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：６５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、または９５：５であり、増分を含む。特定の実施形態では、筋線維芽細胞の上皮細胞に対する比率は約５０：５０である。特定の実施形態では、筋線維芽細胞の上皮細胞に対する比率は約６０：４０〜約４０：６０である。
【００８５】
広範囲の細胞濃度がバイオインクに適している。バイオインクは、非限定的な例として、バイオインク１ミリリットル当たり、約１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、１０００万、２０００万、３０００万、４０００万、５０００万、６０００万、７０００万、８０００万、９０００万、１億、１．１億、１．２億、１．３億、１．４億、１．５億、１．６億、１．７億、１．８億、１．９億、２億、２．２５億、２．５億、２．７５億、３億、またはそれ超の細胞を含む、細胞の濃度を用いた連続付着バイオプリンティング技術のために適切に調製される。特定の実施形態では、連続付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは、約１億〜２億細胞／ｍＬを含む。バイオインクは、非限定的な例として、バイオインク１ミリリットル当たり、約２５万、５０万、１００万、２００万、３００万、５００万、１０００万、１５００万、またはそれ超の細胞を含む、細胞の濃度を用いたインクジェット付着バイオプリンティングのために適切に調製される。特定の実施形態では、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは、約１〜５００万細胞／ｍＬを含む。特定の実施形態では、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは、約１〜４００万細胞／ｍＬを含む。特定の実施形態では、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは、約１〜３００万細胞／ｍＬを含む。特定の実施形態では、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは、約１〜２００万細胞／ｍＬを含む。
【００８６】
特定の実施形態において、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜１０億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜９億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜８億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜７億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜６億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜５億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜４億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜３億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり５，０００万〜２億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、１ミリリットル当たり７５００万〜６億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、１ミリリットル当たり１億〜６億個の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり１億〜５億個の細胞を含む。特定の実施形態において、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり１億〜４億の細胞を含む。特定の実施形態では、腸組織バイオインクは、１ミリリットル当たり１億〜３億個の細胞を含む。特定の実施形態において、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり１億〜２億の細胞を含む。特定の実施形態において、腸組織バイオインクは、ミリリットル当たり１億〜１億５千万個の細胞を含む。
【００８７】
特定の実施形態では、バイオインクは粘性の液体である。特定の実施形態では、バイオインクは半固体である。特定の実施形態では、バイオインクは固体である。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は１００センチポアズより大きい。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は２００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は５００センチポアズより大きい。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は１，０００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は、２０００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は、５，０００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は１０，０００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は、２０，０００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は、５０，０００センチポアズより大きい。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は１００，０００センチポアズより大きい。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は１００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は２００センチポアズ未満である。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は５００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は１，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は２，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は５，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は１０，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は２０，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態において、バイオインクの粘度は、５０，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は１００，０００センチポアズ未満である。特定の実施形態では、バイオインクの粘度は１００〜１００，０００センチポアズである。
【００８８】
腸組織モデルの構造上の特徴
本開示の腸モデルは、多くの構成で構造的に配置することができる。特定の実施形態では、上皮組織、および筋線維芽細胞を含む間質組織は、直接接触しているか、またはその中の増分を含めて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０μｍまたはそれを超えて離れている別個の構造的に異なる層である。特定の実施形態では、分離は、本開示の目的のために接触とみなされる、基底層を形成するための２つの層の間のコラーゲンの分泌および付着に起因する。通常の生理学的組織では、細胞および細胞層は、頂部（内腔に面する）表面、および他の細胞または組織マトリックスに面する側底表面を有するように極性化されている。本明細書に開示される腸組織モデルの目的のために、側底表面とは、別の細胞、細胞外マトリックス、または生体適合性膜もしくは培養容器の表面に面する表面をいう。本明細書に開示される腸組織モデルの目的のために、頂部表面は、生体適合性膜または培養容器の表面から離れた方に面する表面をいう。いくつかの実施形態において、腸組織上皮細胞は極性化している。いくつかの実施形態において、腸組織の層は、頂端側および側底側の表面を有する。
【００８９】
一実施形態では、１つまたは複数のバイオインクは、特定の割合の腸筋線維芽細胞、腸上皮細胞、Ｃａｃｏ−２上皮細胞、およびＳＴＣ−１腸内分泌細胞の細胞混合物を含み得、生体材料支持体を含み得る。別の実施形態では、Ｎｏｖｏｇｅｌ（登録商標）中の初代腸筋線維芽細胞を含むバイオインクがプリントされ、粘膜間質層を模倣する組織を形成する。別の実施形態では、コラーゲン中に初代腸筋線維芽細胞を含むバイオインクがプリントされて、粘膜間質層を模倣する組織を形成する。別の実施形態では、初代腸上皮細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＳＴＣ−１細胞、またはこれらの細胞型の混合物を含む細胞懸濁液が添加され、上皮を模倣するための組織を形成する。一実施形態では、プリントされた粘膜間質組織の上に細胞懸濁液が手動で加えられて、層状構造を作り出す。別の実施形態では、細胞懸濁液の手動での添加は自動化され、（たとえば、インクジェット付着（米国特許第７，０５１，６５４号を参照）またはマイクロソレノイド（ＭＳＶ）によって）スプレーとしてバイオプリントされるか、またはプリント組織上に押し出される。上皮層は単一細胞懸濁物として、または細胞凝集物として、付着させることができる。上皮層は、増殖培地中で、またはマトリックス材料を含むバイオインク中で、付着させることができる。一実施形態では、細胞は、表皮層と間質層との接触を改善するために、コラーゲン４、ラミニン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む基底膜成分と混合される。別の実施形態では、上皮層は、基底膜成分の層の付着に続いて、増殖培地中またはマトリックス材料を含むバイオインク中に付着させることができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルは生体適合性膜をさらに含む。特定の実施形態において、筋線維芽細胞を含む間質組織の側底表面は、生体適合性膜または培養容器に付着した表面であり、筋線維芽細胞を含む間質組織を含む間質組織の頂端面は、生体適合性膜または培養容器に付着していない表面である。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面上に付着されて層を形成し、それによって２つの構造的に区別できる層を形成する。特定の実施形態では、上皮組織および筋線維芽細胞を含む間質組織は連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９９％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９５％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９０％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の５０〜９９％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の８０％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の７０％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の６０％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の５０％〜１００％が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９９％未満が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９８％未満が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９７％未満が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９５％未満が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の９０％未満が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態では、上皮組織層の８０％未満が、筋線維芽細胞を含む間質組織と連続的に接触している。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面を完全に覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の９９％〜１００％を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の９５％〜１００％を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の９０％〜１００％を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の８０％〜１００％を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の７０％〜１００％を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の６０％〜１００％を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の５０％〜１００％を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の９９％未満を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の９８％未満を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の９７％未満を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の９５％未満を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の９０％未満を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の８０％未満を覆っている。特定の実施形態では、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の頂端面の７０％未満を覆っている。特定の実施形態において、上皮組織層は、筋線維芽細胞を含む間質組織の先端表面の５０〜９９％を覆っている。
【００９１】
本明細書に記載されるように製造された腸組織構築物は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
・筋線維芽細胞を含む腸粘膜間質の支持層の上に腸上皮細胞の層を含む二層構造を含み、一方または両方の層は、免疫細胞を含む１つまたは複数の他の細胞を任意でさらに含む。
・腸上皮細胞マーカーＣＫ８、ＣＫ１８およびＣＫ１９のうちの１つまたは複数を含む。ＣＫ８、ＣＫ１８およびＣＫ１９マーカーを検出するための方法は、Notohara K, Hamazaki S, Tsukayama C, Nakamoto S, Kawabata K, Mizobuchi K, Sakamoto K, Okada S (2000) Solid-pseudopapillary tumor of the pancreas: immunohistochemical localization of neuroendocrine markers and CD10. Am J Surg Pathol. 24(10):1361-71により開示される。
・腸の筋線維芽細胞マーカーであるビメンチンおよびα−ｓｍａのうちの１つまたは複数を含む。ビメンチンおよびα−ｓｍａマーカーを検出するための方法は、Essawy M, Soylemezoglu O, Muchaneta-Kubara EC, Shortland J, Brown CB, el Nahas AM (1997). Myofibroblasts and the progression of diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant. 12(1):43-50により開示される。
・細胞内タイトジャンクションの形成を伴う腸上皮細胞の極性化を示す。タイトジャンクションは、Ｅ−カドヘリンおよび／またはＺＯ−１を検出することによって同定される。カドヘリンおよびＺＯ−１を検出するための方法は、Radhakrishna K. RAO, Shyamali BASUROY, Vijay U. RAO, Karl J. KARNAKY, Jr and Akshay GUPTA (2002) Tyrosine phosphorylation and dissociation of occludin-ZO-1 and E-cadherin-β-catenin complexes from the cytoskeleton by oxidative stress. Biochem. J. 368:471-481により開示される。
・上皮細胞上に側底側マーカーを示す。側底側マーカーを検出するための方法は、Parton RG, Prydz K, Bomsel M, Simons K, Griffiths G. (1989) Meeting of the apical and basolateral endocytic pathways of the Madin-Darby canine kidney cell in late endosomes. J Cell Biol. 109(6 Pt 2):3259-72により開示される。
・刷子縁の形成（ビリン）を示す。刷子縁の形成を検出するための方法は、Chantret I, Barbat A, Dussaulx E, Brattain MG, Zweibaum A. (1988) Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: a survey of twenty cell lines. Cancer Res. 1988 48(7):1936-42により開示される。
・粘膜バリアの形成を示す。粘膜バリア形成を検出するための方法は、Dorofeyev AE1,Vasilenko IV, Rassokhina OA, Kondratiuk RB (2013) Mucosal barrier in ulcerative colitis and Crohn's disease. Gastroenterol Res Pract. Epub 2013 May 7により開示される。
・トランスポーター／酵素Ｐ−ｇｐ／ＭＤＲ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＢＣＲＰ、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＰＥＰＴ１、ＯＡＴＰＢ１、ＡＳＢＴ、ＭＤＴ１、ＯＣＴＮ２、ＯＳＴａｌｐｈａ、ＯＳＴｂｅｔａ、ＣＥＳ２、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＧＳＴＰ１、ＵＧＴ１Ａ１のうちの１つまたは複数を発現する。Ｐ−ｇｐ／ＭＤＲ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＢＣＲＰ、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＰＥＰＴ１、およびＯＡＴＰＢ１を検出するための方法は、Taipalensuu J, Tornblom H, Lindberg G, Einarsson C, Sjoqvist F, Melhus H, Garberg P, Sjostrom B, Lundgren B, Artursson P (2001) Correlation of gene expression of ten drug efflux proteins of the ATP-binding cassette transporter family in normal human jejunum and in human intestinal epithelial Caco-2 cell monolayers. J Pharmacol Exp Ther. 299(1):164-70; Sticova E, Lodererova A, van de Steeg E, Frankova S, Kollar M, Lanska V, Kotalova R, Dedic T, Schinkel AH, Jirsa M (2015) Down-regulation of OATP1B proteins correlates with hyperbilirubinemia in advanced cholestasis. Int J Clin Exp Pathol. 8(5):5252-5262; および Kudo M, Katayoshi T, Kobayashi-Nakamura K, Akagawa M, Tsuji-Naito K (2016) H+/peptide transporter (PEPT2) is expressed in human epidermal keratinocytes and is involved in skin oligopeptide transport. Biochem Biophys Res Commun. 475(4):335-341により開示される。
・ＩＶ型コラーゲン染色によって証明されるように、上皮細胞層と間質層との間に基底層を示す。ＩＶ型コラーゲンを染色する方法は、Sanes JR, Engvall E, Butkowski R, Hunter DD (1990) Molecular heterogeneity of basal laminae: isoforms of laminin and collagen IV at the neuromuscular junction and elsewhere. J Cell Biol. 111(4):1685-99により開示される。
・透過性／吸収特性を有するバリアを示す。透過性／吸収特性は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値またはルシファー透過性を決定することによって同定され得る。ＴＥＥＲ値およびルシファー透過性を決定するための方法は、Akbari P, Braber S, Alizadeh A, Verheijden KA, Schoterman MH, Kraneveld AD, Garssen J, Fink-Gremmels J (2015) Galacto-oligosaccharides Protect the Intestinal Barrier by Maintaining the Tight Junction Network and Modulating the Inflammatory Responses after a Challenge with the Mycotoxin Deoxynivalenol in Human Caco-2 Cell Monolayers and B6C3F1 Mice. J Nutr. 145(7):1604-1613 および Venugopal R, Galam L, Cox R, Fukumoto J, Cho Y, Parthasarathy PT, Lockey RF, Kolliputi N (2015) Inflammasome Inhibition Suppresses Alveolar Cell Permeability Through Retention of Neuregulin-1 (NRG-1). Cell Physiol Biochem. 36(5):2012-24により開示される。
・腸トランスポーターおよび代謝酵素を介する能動輸送を示す。腸トランスポーターの例には、ＨＰＴ１、ＰＥＰＴ１、ＢＣＲＰ、ＭＲＰ２、ＭＤＲ１、ＯＡＴＰ１Ａ３、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＳＶＣＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ５、およびＳＧＬＴ１が含まれる。腸トランスポーターの活性を検出するための方法は、たとえば、Hilgendorf C, Ahlin G, Seithel A, Artursson P, Ungell AL, Karlsson J (2007) Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metab Dispos. 35(8):1333-40により開示される。
・骨髄性免疫細胞を含む場合、骨髄性活性化を示す。一実施形態では、骨髄活性化は、ＬＰＳおよび／またはインターフェロン−ガンマでの処置によって誘導される。骨髄活性化を誘導するための方法は、Greifenberg V, Ribechini E, Rossner S, Lutz MB (2009) Myeloid-derived suppressor cell activation by combined LPS and IFN-gamma treatment impairs DC development. Eur J Immunol. 39(10):2865-76により開示される。
・発現したマーカーに対応する遺伝子発現を示す。そのような遺伝子の例には、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＫ１９、ＣＨＧＡ、およびＭＵＣ２が含まれる。そのような遺伝子発現を検出するための方法は、Taipalensuu J, Tornblom H, Lindberg G, Einarsson C, Sjoqvist F, Melhus H, Garberg P, Sjostrom B, Lundgren B, Artursson P (2001) Correlation of gene expression of ten drug efflux proteins of the ATP-binding cassette transporter family in normal human jejunum and in human intestinal epithelial Caco-2 cell monolayers. J Pharmacol Exp Ther. 299(1):164-70; Chang SK, Dohrman AF, Basbaum CB, Ho SB, Tsuda T, Toribara NW, Gum JR, Kim YS (1994) Localization of mucin (MUC2 and MUC3) messenger RNA and peptide expression in human normal intestine and colon cancer. Gastroenterology. 107(1):28-36; および Kelly OG, Chan MY, Martinson LA, Kadoya K, Ostertag TM, Ross KG, Richardson M, Carpenter MK, D'Amour KA, Kroon E, Moorman M, Baetge EE, Bang AG (2011) Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29(8):750-6により開示される。
・栄養素刺激に反応して腸内分泌機能および腸ペプチドの産生を示す。腸内分泌機能および／または腸ペプチドの産生は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＰＹＹおよび／またはコレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、および胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）のレベルの変化を検出することによって決定され得る。ＧＬＰ−１、ＰＹＹおよびＣＣＫのレベルを検出するための方法は、Egerod KL, Engelstoft MS, Grunddal KV, Nohr MK, Secher A, Sakata I, Pedersen J, Windelov JA, Fuchtbauer EM, Olsen J, Sundler F, Christensen JP, Wierup N, Olsen JV, Holst JJ, Zigman JM, Poulsen SS, Schwartz TW (2012) A major lineage of enteroendocrine cells coexpress CCK, secretin, GIP, GLP-1, PYY, and neurotensin but not somatostatin. Endocrinology. 153(12):5782-95により開示される。
・リンパ球（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１５）、腸内分泌マーカー（ＣＨＧＡ、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、ＣＣＫ）、杯細胞マーカー（ＭＵＣ２）、血管マーカー（ＣＤ３１）、および幹細胞マーカー（ＬＧＲ５）を含む、追加の任意の細胞型に関連する追加のマーカーの発現を示す。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１５、ＣＨＧＡ、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、ＣＣＫ、ＭＵＣ２、ＣＤ３１、およびＬＧＲ５を検出するための方法は、Reading CL, Estey EH, Huh YO, Claxton DF, Sanchez G, Terstappen LW, O'Brien MC, Baron S, Deisseroth AB (1993) Expression of unusual immunophenotype combinations in acute myelogenous leukemia. Blood. 81(11):3083-90; Zhao X, Zhao Q, Luo Z, Yu Y, Xiao N, Sun X, Cheng L (2015) Spontaneous immortalization of mouse liver sinusoidal endothelial cells.  Int J Mol Med. 35(3):617-24; Fan XS, Wu HY, Yu HP, Zhou Q, Zhang YF, Huang Q (2010) Expression of Lgr5 in human colorectal carcinogenesis and its potential correlation with beta-catenin. Int J Colorectal Dis. 25(5):583-90; および上述の参照文献により開示される。
・粘液分泌／粘膜バリアの形成を示す。粘液分泌／粘膜バリアの形成は、ムチン２（ＭＵＣ２）を検出することによって決定され得る。ムチン２を検出するための方法は、Chang SK, Dohrman AF, Basbaum CB, Ho SB, Tsuda T, Toribara NW, Gum JR, Kim YS (1994) Localization of mucin (MUC2 and MUC3) messenger RNA and peptide expression in human normal intestine and colon cancer. Gastroenterology. 107(1):28-36により開示される。
・脂質代謝／輸送を示す。脂質代謝／輸送を検出するための方法は、たとえば、Welti R, Wang X (2004) Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Curr Opin Plant Biol. 7(3):337-44 および Pfeffer PE, Douds Jr DD, Becard G, Shachar-Hill Y. Carbon uptake and the metabolism and transport of lipids in an arbuscular mycorrhiza. Plant Physiol. 1999 Jun;120(2):587-98により開示される。
・炎症および免疫反応を示す。組織の炎症および免疫応答ならびに検出するための方法は、たとえば、Pantenburg B, Dann SM, Wang HC, Robinson P, Castellanos-Gonzalez A, Lewis DE, White AC Jr (2008) Intestinal immune response to human Cryptosporidium sp. infection. Infect Immun. 76(1):23-9 および Trine H. Mogensen (2009) Pathogen Recognition and Inflammatory Signaling in Innate Immune Defenses. Clin Microbiol Rev. 22(2): 240-273により概説されている。この実施形態では、組織構築物は、腸の損傷（急性、亜慢性および／または慢性）および回復をモデル化するのに用いることができる。別の実施形態において、組織構築物は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの腸疾患をモデル化するために用いることができる。別の実施形態では、組織構築物は、正常または罹患腸組織のいずれかに対する免疫調節の影響を評価するのに用いることができる。
・損傷を受けると、組織構築物は線維症および線維性瘢痕形成を示す。線維症は慢性組織炎症によって引き起こされ、コラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰な付着によって特徴付けられる。腸線維症のメカニズムは、Silvia Speca, Ilaria Giusti, Florian Rieder, and Giovanni Latella (2012) Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World J Gastroenterol. 18(28): 3635-3661において議論される。
【００９２】
骨髄性免疫細胞が存在する場合、骨髄性細胞マーカーＣＤ１４、ＣＤ２０６およびＣＤ６８のうちの１つまたは複数を含む。ＣＤ１４、ＣＤ２０６およびＣＤ６８マーカーを検出するための方法は、Catherine E. Angel, Chun-Jen J. Chen, Oliver C. Horlacher, Sintia Winkler, Thomas John, Judy Browning, Duncan MacGregor, Jonathan Cebon and P. Rod Dunbar (2009) Distinctive localization of antigen-presenting cells in human lymph nodes. Blood 2009(113):1257-1267により開示される。Ｂ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、およびＣＤ２０の細胞表面発現によって検出することができる。活性化Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２５、およびＣＤ３０の細胞表面発現によって検出することができる。エフェクターＢ細胞は、ＣＤ１３８の細胞表面発現によって検出することができる。 Ｔ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３８、およびＣＤ５４などの細胞表面発現によって検出することができる。活性化Ｔ細胞は、ＣＤ２５、ｓＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）の細胞表面発現によって検出することができる。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の細胞表面発現によって検出することができる。ヒトにおいて、主要樹状細胞（ＤＣ）サブセットは、表面マーカー、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の発現において、および活性化後に産生されるサイトカインにおいて異なる慣用的なＤＣ（ｃＤＣ）および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む。ｃＤＣはＣＤ１１ｃに対して陽性であり、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１）またはＣＤ１４１（ＢＤＣＡ３）のいずれかを保有する。ＣＤ１ｃ＋ｃＤＣはＴＬＲ８およびＴＬＲ１０を介してＴＬＲ１を発現し、ＣＤ１ｃ−ＣＤ１４１＋ｃＤＣはＴＬＲ１、２、３、６、８、および１０を発現する。ｐＤＣはＴＬＲ１、６、および１０を発現する。検出はフローサイトメトリー免疫表現型検査によって行うことができる。免疫表現型検査は、不均一な細胞集団において、または細胞ごとに（単一細胞分析）行うことができる。リンパ球特異的細胞表面マーカーの検出に適した抗体は、たとえば、Abcam and R&D Systems, Incから市販されている。リンパ球細胞表面マーカーおよび検出のための方法は、Andrade MC, Ferreira SB, Goncalves LC, De-Paula AM, de Faria ES, Teixeira-Carvalho A, Martins-Filho OA (2013) Cell surface markers for T and B lymphocytes activation and adhesion as putative prognostic biomarkers for head and neck squamous cell carcinoma. Hum Immunol. 74(12):1563-74; Kragh M, Larsen JM, Thysen AH, Rasmussen MA, Wolsk HM, Bisgaard H, Brix S (2016) Divergent response profile in activated cord blood T cells from first-born child implies birth-order-associated in utero immune programming. Allergy. 71(3):323-32; Oboshi W, Aki K, Tada T, Watanabe T, Yukimasa N, Ueno I, Saito K, Hosoi E (2016) Flow Cytometric Evaluation of Surface CD56 Expression on Activated Natural Killer Cells as Functional Marker. J Med Invest. 63(3-4):199-203; Meixlsperger S, Leung CS, Ramer PC, Pack M, Vanoaica LD, Breton G, Pascolo S, Salazar AM, Dzionek A, Schmitz J, Steinman RM, Munz C (2013) CD141+ dendritic cells produce prominent amounts of IFN-α after dsRNA recognition and can be targeted via DEC-205 in humanized mice. Blood.121(25):5034-44に提供される。
【００９３】
特定の実施形態では、腸上皮層の腸上皮細胞の少なくとも５０％が、他の腸上皮細胞とタイトジャンクションを形成する。 特定の実施形態では、腸上皮層の腸上皮細胞の少なくとも７０％が、他の腸上皮細胞とタイトジャンクションを形成する。 特定の実施形態では、腸上皮層の腸上皮細胞の少なくとも９０％が、他の上皮細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、腸上皮層の腸上皮細胞の５０〜９０％が、他の腸上皮細胞とタイトジャンクションを形成する。
【００９４】
上皮組織層の構造
通常、上皮組織細胞は隣接する細胞とタイトジャンクションを形成する。タイトジャンクションは、カドヘリンと呼ばれる膜貫通タンパク質ファミリーによって特徴付けられる。これらのうちの１つであるＥ−カドヘリンは、腸組織のタイトジャンクションにおいて特に顕著であり、それらの形成を特徴付ける。特定の実施形態において、上皮組織層は、タイトジャンクションを形成する細胞のみを含む（すなわち、「からなる」）。特定の実施形態において、上皮組織層中の実質的に全ての細胞は、少なくとも１つの隣接する細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の９９％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の９５％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の９０％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の８０％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の７０％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の６０％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態では、上皮組織層中の５０％〜１００％の細胞が、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。特定の実施形態において、上皮組織層中の５０〜９９％の細胞は、少なくとも１つの他の細胞とタイトジャンクションを形成する。
【００９５】
別の実施形態では、上皮組織層は、ネイティブの腸組織に存在するような微絨毛を特徴とする刷子縁を示す。刷子縁はビリンの頂端染色によって検出することができる。
【００９６】
細胞層の生存能力および密度
本開示の方法によりバイオプリントする利点は、細胞を高密度および高い生存能力でプリントすることができることである。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は１ｍＬ当たり１×１０６細胞を超える。特定の実施形態において、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１０×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも２０×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５０×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１００×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも２００×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５００×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり約１００×１０６細胞〜１ｍＬ当たり約９００×１０６細胞の間である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり約１００×１０６細胞〜１ｍＬ当たり約７００×１０６細胞の間である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり約１００×１０６細胞〜１ｍＬ当たり約６００×１０６細胞の間である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり約１００×１０６細胞〜１ｍＬ当たり約５００×１０６細胞の間である。特定の実施形態では、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり約１００×１０６細胞〜１ｍＬ当たり約３００×１０６細胞の間である。特定の実施形態において、上皮／間質細胞層の密度は、１ｍＬ当たり約１００×１０６細胞〜１ｍＬ当たり約２００×１０６細胞の間である。特定の実施形態では、上皮／間質組織の層または上皮組織の層は、体積で７０％〜１００％が生細胞である。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で９９％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で９５％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で９０％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で８０％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で７０％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で６０％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で５０％を超える。特定の実施形態では、上皮／間質組織層の生存能力は、生細胞が体積で５０〜９９％である。特定の実施形態では、この生存能力は、プリント後少なくとも８、１２、２４、４８、７２、９６、またはそれを超える時間にわたって維持される。特定の実施形態では、この生存能力は、プリント後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、またはそれを超える日数にわたって維持される。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも０．１×１０５細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１×１０５細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０５細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１０×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも２０×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５０×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１００×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも２００×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり少なくとも５００×１０６細胞である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり１×１０５細胞未満である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり２×１０５細胞未満である。特定の実施形態では、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり５×１０５細胞未満である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり１×１０６細胞未満である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり５×１０６細胞未満である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり１０×１０６細胞未満である。特定の実施形態において、上皮細胞層の密度は、１ｍＬ当たり１０×１０６細胞である。特定の実施形態では、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で９９％を超える。特定の実施形態では、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で９５％を超える。特定の実施形態では、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で９０％を超える。特定の実施形態において、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で８０％を超える。特定の実施形態では、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で７０％を超える。特定の実施形態では、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で６０％を超える。特定の実施形態では、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で５０％を超える。特定の実施形態において、上皮組織層の生存能力は、生細胞が体積で５０〜９９％である。特定の実施形態において、この生存能力は、プリント後少なくとも８、１２、２４、４８、７２、または９６時間にわたって維持される。特定の実施形態において、この生存能力は、プリント後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間、維持される。
【００９７】
バイオインクおよび細胞層の非細胞成分
バイオプリントされる細胞またはバイオインクは、往々にして、バイオプリンティングに対するそれらの適合性を改善する賦形剤または押出し化合物を含む。押出し化合物の例には、これらに限らないが、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性剤ポリオール類（たとえば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロネート、アルギネート、細胞外マトリックス成分（およびその誘導体）、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然または合成ポリマー、ナノファイバー、および自己集合性ナノファイバーが含まれる。いくつかの実施形態では、押出し化合物は合成ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、押出し化合物は、通常は哺乳動物組織と関連していない非合成ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、押出し化合物はバイオプリンティング後に物理的、化学的、または酵素的手段によって除去される。いくつかの実施形態において、本開示のバイオインクは、１重量％またはそれを超える押出し化合物を含む。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１重量％を超える押出し化合物を含有する。いくつかの実施形態において、本開示のバイオインクは、５重量％未満の押出し化合物を含有する。いくつかの実施形態において、本開示のバイオインクは、０重量％〜２重量％の間の押出し化合物を含む。いくつかの実施形態では、本開示のバイオインクは、１重量％未満の押出し化合物を含有する。いくつかの実施形態において、本開示の腸組織モデルは、０重量％〜５重量％の押出し化合物を含む。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、２重量％未満の押出し化合物を含有する。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１重量％未満の押出し化合物を含有する。いくつかの実施形態では、上皮バイオインクはヒドロゲルを含まない。いくつかの実施形態では、上皮バイオインクは押出し化合物を含まない。いくつかの実施形態では、上皮バイオインクは、賦形剤または押出し化合物として使用される合成ポリマーを含まない。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、賦形剤または押出し化合物として使用される合成ポリマーを含まない。いくつかの実施形態では、上皮細胞層は、賦形剤または押出し化合物として使用される合成ポリマーを含まない。いくつかの実施形態では、間質細胞層は、賦形剤または押出し化合物として使用される合成ポリマーを含まない。
【００９８】
プリント表面
生体適合性表面に付着された腸組織モデルが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、間質組織層は生体適合性表面上にプリントされる。特定の実施形態において、生体適合性表面は、０．４μｍ〜１０μｍの孔径を有する膜である。特定の実施形態において、生体適合性表面は、約１μｍの孔径を有する。一実施形態では、生体適合性表面は、大きさが３μｍの孔を有するポリテトラフルオロエチレン膜を含む。
【００９９】
特定の実施形態では、生体適合性表面は、細胞接着または生存能力を改善するために組成物でコーティングされる。特定の実施形態において、腸組織モジュールは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５４６ウェルプレートにプリントされる。特定の実施形態において、腸組織モジュールは、６０、１００もしくは１５０ｍｍ、またはそれを超える直径を有する組織培養プレートにプリントされる。そのような実施形態では、腸組織モデルの表面領域は、組織培養場所のウェルの直径と同じ大きさであり得る。特定の実施形態では、腸組織モジュールは組織培養フラスコまたはマイクロ流体チップにプリントされる。特定の実施形態において、腸組織モデルはＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートの中／上にプリントされる。
【０１００】
特定の実施形態では、腸組織モデルは、静的条件下の培養培地中で、たとえば組織培養場所のウェル内で、培養される。別の実施形態において、腸組織モデルは、非静的、たとえば流動条件下で培養される。
【０１０１】
特定の実施形態では、腸組織モデルは平面を有する。他の実施形態では、腸組織モデルの表面は非平面である。他の実施形態では、腸組織モデルの表面はヒドロゲルまたは足場材料である。他の実施形態では、腸組織モデルの表面は、バイオプリントされた組織を含む。他の実施形態において、腸組織モデルの表面は細胞単層である。
【０１０２】
腸組織モデルの生成のためのプロセス
本開示は、腸組織モデルを製造するための方法およびプロセスを提供する。特定の実施形態では、人工の三次元生体腸組織モデルの生成物は、バイオプリンティングのプロセスによって製造される。特定の実施形態では、人工の三次元生体腸組織モデルの生成物の少なくとも１つの構成物が、バイオプリンティングのプロセスによって製造される。特定の実施形態では、人工の三次元生体腸組織モデルを作製するプロセスは、筋線維芽細胞を含む腸間質バイオインクを調製する段階；腸上皮バイオインクを調製する段階；腸上皮バイオインクが腸間質筋線維芽細胞バイオインクの層の少なくとも１つの表面上に層を形成するように、腸間質筋線維芽細胞バイオインクおよび腸上皮バイオインクを付着する段階；ならびに、細胞が凝集して人工の三次元生体腸組織モデルを形成し得るために、付着したバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる段階、を含む。特定の実施形態では、腸間質筋線維芽細胞組織バイオインクは、頂端面および側底面を有する組織層を形成する。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは、腸間質筋線維芽細胞組織層の頂端面と接触して付着される。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは本質的に腸管上皮細胞からなる。
【０１０３】
一実施形態では、粘膜および／または上皮を模倣する単層または多層を製造するために連続的付着が利用される。粘膜下組織、筋層、および漿膜をモデル化するために、追加の層を連続付着によってプリントすることができる。バイオプリンティングの方法は、インクジェット付着、押出し、マイクロソレノイド付着（ＭＳＶ）を含み、生物分散（ｂｉｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）アプローチも、１細胞層のように薄い、より微細な分解能で、層、細胞、および／またはマトリックスを追加するのに用いることができる。スプレーアプローチも、細胞材料をプリント表面、組織、またはマトリックス材料に埋め込むために、他のアプローチと組み合わせて用いることができる。バイオプリンティングは、細胞を正確なジオメトリー内に配置することを可能にし、これらに限定されないが、Ｎｏｖｏｇｅｌ  ２．０、３．０およびコラーゲンを含む複数のバイオインク配合物の使用を可能にする点で、現在のインビトロ腸モデルに対して利点を提供する。連続付着は、マトリックスの製造および分化を促進するために、様々な生体材料をＮｏｖｏｇｅｌ配合物および様々なプリント表面に組み込むことができる。プリント方法は、コラーゲンのようなマトリックス支持材料で被覆することができる様々な孔径を有する様々なプリント表面を利用する。たとえば、連続付着は、コラーゲン被覆プリント表面上に層状組織をプリントするのに用いることができる。ヒドロゲルはまた、生体材料を支持するため、または細胞が存在しないスペースを確保するための領域を構成するために添加することができる。
【０１０４】
特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは、初代腸上皮細胞から本質的になる。特定の実施形態において、初代腸上皮細胞は、罹患していない組織から単離される。特定の実施形態では、腸組織構築物を作製するために用いられる細胞（たとえば、初代腸上皮細胞、筋線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞など）は、腸機能に影響を及ぼす疾患、たとえばセリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核、憩室炎、炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、内分泌障害、代謝障害、肥満、糖尿病、脂質異常症、結腸直腸癌などを有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、セリアック病を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、クローン病を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、潰瘍性大腸炎を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、過敏性腸症候群の対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、痔核を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、憩室炎を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、炎症性腸疾患を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、顕微鏡的大腸炎を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、リンパ球性大腸炎を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、コラーゲン性大腸炎を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、内分泌障害を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、代謝障害を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は肥満を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、糖尿病を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、脂質異常症を有する対象から単離される。特定の実施形態において、初代腸組織上皮細胞および／または筋線維芽細胞は、結腸直腸癌を有する対象から単離される。
【０１０５】
特定の実施形態において、腸上皮細胞株は、ＡＴＣＣ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏａｒｒａｙ、およびＬｏｎｚａなどの商業的供給源から得られ、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＨＴ２９−１８Ｎ２、およびＨｕＴｕ８０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ、ＨＩＥＣ−６（ｎｏｒｍａｌ）、ＦＨｓ  ７４  Ｉｎｔ（ｎｏｒｍａｌ）、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｌｏｎｚａ’ｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）、ならびに  Ｈｕｍａｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ｆｒｏｍ  Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏａｒｒａｙ）を含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、腸筋線維芽細胞株は、ＡＴＣＣ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏａｒｒａｙおよびＬｏｎｚａなどの商業的供給源から得られる。
【０１０７】
特定の実施形態では、バイオインクは免疫細胞をさらに含む。特定の実施形態において、バイオインクは、リンパ球、白血球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、好中球、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む。免疫細胞は、患者の生検または細胞株由来の初代免疫細胞であり得る。特定の実施形態では、免疫細胞株は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏａｒｒａｙ、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＦｏｒＭｅｄｉｃｉｎｅ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、およびＬｏｎｚａなどの商業的供給源から得られる。
【０１０８】
特定の実施形態では、バイオインクは、腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、パネート細胞、マイクロホールド（ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ）細胞、カップ（ｃｕｐ）細胞および／またはタフト（ｔｕｆｔ）細胞などの特殊な腸上皮細胞をさらに含む。特定の実施形態では、特殊な腸上皮細胞株は、当技術分野において公知の方法に従って得られる。他の実施形態では、特殊な細胞は、そのような細胞を契約ベースで単離する会社から得られる。
【０１０９】
特定の実施形態では、バイオインクのうちの１つまたは複数は腸癌細胞を含む。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは腸肉腫細胞を含む。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは腸リンパ腫細胞を含む。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは腸腺癌細胞を含む。細胞は、患者の生検または細胞株由来の初代細胞であり得る。特定の実施形態において、癌腫、肉腫、リンパ腫、および腺癌細胞株は、ＡＴＣＣなどの商業的供給源から得られる。
【０１１０】
特定の実施形態において、一方または両方のバイオインクは、神経細胞などの特殊化された細胞をさらに含み得る。特定の実施形態では、神経細胞株は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏａｒｒａｙなどの商業的供給源から得られる。
【０１１１】
特定の実施形態では、一方または両方のバイオインクは、内皮細胞などの特殊化された細胞をさらに含み得る。特定の実施形態では、神経細胞株は、ＡＴＣＣ（登録商標）などの商業的供給源から得られる。
【０１１２】
特定の実施形態において、一方または両方のバイオインクは、平滑筋細胞などの特殊化された細胞をさらに含み得る。特定の実施形態では、神経細胞株は、ＡＴＣＣ（登録商標）などの商業的供給源から得られる。
【０１１３】
特定の実施形態では、一方または両方のバイオインクは、幹細胞集団の指向性（定方向）分化によって得ることができる特殊化細胞をさらに含み得る。幹細胞集団は、初代単離物またはたとえばＡＴＣＣから市販されているものであり得る。一実施形態では、幹細胞は、Ｌｏｎｚａ、ＳｔｅｍＧｅｎｔおよびｉＸＣｅｌｌｓから市販されているｉＰＳ細胞である。
【０１１４】
特定の実施形態において、上皮細胞は、罹患ドナー、たとえば、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、痔核または憩室炎を有する対象からの初代細胞である。罹患ドナー由来の細胞を有する腸組織構築物は、それぞれの疾患のモデルにおいて用いることができる。これらの疾患モデルは、それぞれの疾患の治療における有効性について候補の治療的処置を試験するために用いることができる。
【０１１５】
特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは単層で付着される。特定の実施形態では、間質筋線維芽細胞組織バイオインクは単層で付着される。特定の実施形態では、バイオインクは押出し化合物をさらに含む。特定の実施形態では、腸上皮組織の層は、腸間質筋線維芽細胞組織の層と連続的に接触して付着される。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは、腸間質筋線維芽細胞組織の層の頂端面の５０％〜１００％を覆う層を形成する。特定の実施形態において、腸上皮バイオインクは、腸間質筋線維芽細胞組織の層の頂端面の７０％〜１００％を覆う層を形成する。特定の実施形態では、上皮バイオインクは、腸間質筋線維芽細胞組織の層の頂端面の９０％〜１００％を覆う層を形成する。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは、腸間質筋線維芽細胞組織の層の頂端面の５０〜９０％を覆う層を形成する。
【０１１６】
特定の実施形態では、腸組織モデルは５０〜５００μｍの厚さである。特定の実施形態では、腸組織モデルは約１００μｍの厚さである。特定の実施形態では、腸上皮バイオインクは押出し化合物をさらに含む。特定の実施形態において、筋線維芽細胞および上皮細胞は、上皮細胞に対して約９５：５〜約５：９５の筋線維芽細胞の比率でバイオインク中に存在する。特定の実施形態において、筋線維芽細胞および上皮細胞は、上皮細胞に対して約７５：２５〜約２５：７５の筋線維芽細胞の比率でバイオインク中に存在する。特定の実施形態では、筋線維芽細胞および上皮細胞は、上皮細胞に対して約６０：４０〜約４０：６０の筋線維芽細胞の比率でバイオインク中に存在する。特定の実施形態において、筋線維芽細胞および上皮細胞は、上皮細胞に対して約５０：５０の筋線維芽細胞の比率でバイオインク中に存在する。特定の実施形態では、バイオインクはさらに分泌細胞を含む。
【０１１７】
特定の実施形態では、モデルは予め形成された足場を実質的に含まずに製造される。特定の実施形態では、筋線維芽細胞および上皮細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、筋線維芽細胞バイオインクまたは上皮バイオインクのいずれかが、付着後に平面層を形成する。特定の実施形態では、腸組織モデルは一様な厚さのものである。特定の実施形態では、筋線維芽細胞バイオインクは生体適合性膜上に付着される。特定の実施形態において、筋線維芽細胞バイオインクは、０．４μｍを超える孔径を有する生体適合性膜上に付着される。特定の実施形態において、筋線維芽細胞バイオインクは、約１μｍの孔径を有する生体適合性膜上に付着される。特定の実施形態において、人工の三次元生体腸組織モデルはアレイを形成するために付着される。
【０１１８】
特定の実施形態では、筋線維芽細胞バイオインクは、体積で生細胞が３０％〜１００％である。特定の実施形態では、筋線維芽細胞バイオインクは、体積で生細胞が７０％〜１００％である。特定の実施形態では、筋線維芽細胞バイオインクは、体積で生細胞が９０％〜１００％である。特定の実施形態では、筋線維芽細胞バイオインクは押出しバイオプリンティングによって付着される。特定の実施形態において、上皮バイオインクは、インクジェットバイオプリンティングによって付着される。特定の実施形態において、筋線維芽細胞バイオインクは、インクジェットバイオプリンティングによって付着されない。特定の実施形態では、腸組織モデルの任意の層は、３日後の培養においてインビトロ培養において生存可能である。特定の実施形態では、腸組織モデルの任意の層は１０日後にインビトロ培養で生存可能である。
【０１１９】
特定の実施形態では、本明細書に開示される３Ｄ腸組織モデルは、積層造形法（ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）によって製造される。本明細書における３Ｄ腸組織モデルのための積層造形法は、インビトロ目的のための３Ｄ腸組織モデルのカスタマイズされた製造を可能にする。これは、組織がユーザ指定の設計により製造されるという点で重要である。特定の実施形態では、３Ｄ腸組織モデルはユーザが指定した細胞のみを含む。特定の実施形態では、３Ｄ腸組織モデルは、ユーザが指定した細胞型のみを含む。特定の実施形態では、３Ｄ腸組織モデルは、ユーザが指定した細胞の数または細胞の濃度のみを含む。特定の実施形態では、３Ｄ腸組織モデルは、製造前または製造中に小分子、治療用分子、または治療用物質で処理されている細胞を含む。治療用分子または物質は、疾患を治療する、または生物学的応答を引き出すことを目的とした任意の分子である。特定の実施形態では、３Ｄ腸組織モデルは、生体適合性または組織培養プラスチック、生体適合性合成ポリマー、架橋性ゲル、可逆的架橋ゲルおよび他の非細胞成分を含む。
【０１２０】
腸組織モデルの成熟
特定の実施形態では、本開示の腸組織モデルはバイオプリンティング後に特定の期間、成熟される。特定の実施形態では、モデルは使用前に１〜２４時間、たとえば使用前少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、１８、２４時間またはそれより多くの時間、成熟される。特定の実施形態では、モデルは使用前に１〜３０日間、たとえば使用前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間またはそれより多くの日数、成熟される。いくつかの実施形態では、組織の出荷または移送は使用である。特定の実施形態では、本開示の腸組織モデルの間質筋線維芽細胞層は、上皮層を添加する前のバイオプリンティング後に特定期間、成熟される。特定の実施形態では、間質筋線維芽細胞層は、使用前に１〜２４時間、たとえば使用前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、１８、２４時間またはそれより多くの時間、成熟される。特定の実施形態では、間質筋線維芽細胞層は使用前に１〜３０日間、たとえば使用前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間またはそれより多くの日数、成熟される。いくつかの実施形態では、組織の出荷または移送は使用である。いくつかの実施形態では、上皮層は、間質筋線維芽細胞層のバイオプリンティングの直後に、または、たとえば、間質筋線維芽細胞層のバイオプリンティングの後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、１８、２４時間後に、間質筋線維芽細胞層上にバイオプリンティングされる。いくつかの実施形態では、組織の出荷または移送は使用である。いくつかの実施形態では、上皮層は、間質筋線維芽細胞層のバイオプリンティング後１〜３０日以内に、たとえば、間質筋線維芽細胞層のバイオプリンティング後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日以内に、間質筋線維芽細胞層上にバイオプリンティングされる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、規定されたスケジュールで細胞培養培地を交換してまたは交換せずに、静的条件下で細胞培養培地中で成熟させる。他の実施形態では、腸組織モデルは、非静的条件下で細胞培養培地中で成熟される。非静的条件は、腸組織モデルの頂端面および／または側底面を横切る細胞培養培地の流れを含む。
【０１２２】
腸組織モデルを培養するために、任意の哺乳動物組織培養培地を用いることができる。例としては、ＢＧＪｂ、ＢＭＥ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ  ＢＭＯＣ−３、ＣＭＲＬ、ＣＯ２−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ  Ｍｅｄｉａ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  Ｍｅｄｉａ、Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｇｌａｓｇｏｗ  （Ｇ−ＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ（ＩＭＤＭ）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、ＭＣＤＢ  １３１、Ｍｅｄｉａ  １９９、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ  （ＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＭＥＭ）、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＭ  Ｒｅｇａ−３、ＮＣＴＣ−１３５  Ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ  ７５２／１、およびＷｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉａ  Ｅ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）がある。
【０１２３】
組織構築物の使用
本明細書に記載の腸組織構築物は複数の用途に利用することができる。一実施形態では、組織バリアは毒物学およびＡＤＭＥ用途に利用することができる。一実施形態では、組織構築物の機能的特徴は、バリアの確立および（ＴＥＥＲおよびルシファーイエロー透過性によって証明される）透過性／吸収の実証を含む。これらの特徴は、透過速度論（Ｐａｐｐ）および取り込み／排出（ａｂ、ｂａ）研究を可能にする。別の実施形態では、重要なトランスポーターおよび代謝酵素をそれぞれ介する能動輸送および代謝の調査は、ウェルベースのアッセイを介して、または質量分析による基質およびそれらの代謝産物の検出を介して行うことができる。これらの同じ技術を用いて、様々な薬物および適用化合物の能動輸送および代謝のメカニズムを評価することができる。試験物質の輸送速度論、流出速度および透過係数は、それゆえ、ＦＤＡ推奨の参照薬との相関のために利用することができよう。バリア機能および透過速度論を通じて、組織構築物は、経口的に送達された化合物の吸収を予測するため、またはネイティブ組織と同様に腸トランスポーターを介して化合物の能動輸送が存在するか否かを予測するため、腸バリアを破損するか、および／または腸の炎症を誘発する化合物の能力を予測するため、および／または炎症を調節するための化合物の有効性を予測するために、用いることができる。別の実施形態では、粘膜バリアの発達およびバリア機能に対する適用された化合物の効果も、（ＭＵＣ２を検出することによって）粘液分泌によって評価することができる。別の実施形態では、脂質代謝、吸収、および輸送は、エンドポイントとして（たとえば、ａｐｏＢ−４８  ＥＬＩＳＡを介して）カイロミクロン分泌、およびトリグリセリド合成（１３Ｃオレエート、Ｄ２０）を検出することによってモデル化することができる。別の実施形態では、腸内分泌機能は、栄養刺激（たとえば、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、ＣＣＫ、および／またはＳＳＴ）に応答して腸ペプチド分泌を検出することによって評価することができる。蠕動運動などの運動または運動に対する反応は、流動成分の追加、流動または細胞ベースの移動、および／または平滑筋細胞およびニューロンのような他の細胞型の追加によってモデル化することができる。
【０１２４】
免疫細胞を含む本明細書に開示される組織構築物の主要な適用は、炎症および炎症性疾患のモデル化、ならびに癌に対する免疫調節の影響のモデル化である。一実施形態では、免疫細胞は骨髄性細胞またはリンパ性細胞である。別の実施形態では、疾患モデルは、正常な組織モデル、たとえば免疫細胞を欠如している腸組織モデル、免疫細胞を含むが免疫細胞を活性化するように刺激されていない（静止）モデル、または免疫細胞を欠如して免疫応答を模倣するためにサイトカインで刺激されたモデル、と並べて比較される。この実施形態において、組織構築物は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、およびクローン病などの疾患に対する炎症および免疫応答の評価のために有用である。免疫細胞を含む組織構築物はまた、急性反応、たとえば腸炎、または炎症性腸疾患などの慢性反応を研究するために用いることができる。免疫細胞を含む組織構築物はまた、候補医薬化合物または療法の急性、亜慢性、または慢性投与を含む、損傷および回復をモデル化するために用いることができる。別の実施形態では、免疫細胞を含む組織構築物は創傷治癒および線維症を評価するために用いることができる。線維性瘢痕形成は、たとえば、ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎およびクローン病の一般的な合併症であるが、クローン病ではかなりより一般的である。さらに、免疫細胞を含む組織構築物は、微生物／ミクロビオーム相互作用（クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）または共生細菌などの病原菌）または腸感染症（細菌またはウイルス）のモデル化に用いることができる。組織構築物の三次元の性質は、病原体の侵襲性および転位の観察の向上を可能にする。免疫細胞を含む組織構築物は、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−１７）、細菌構成物または生成物、創傷を形成するための化学的破損（たとえば、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎）、腸損傷をモデル化する物理的破損（たとえば、スクラッピング）、または化学的破損（たとえば、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘発ＩＢＤ）によって刺激することが得きる。一実施形態では、組織は、続いて、候補の薬学的剤または炎症効果を逆転もしくは制御するための処置で処置される。一実施形態では、抗ＴＮＦアルファなどのアンタゴニストの影響が、損傷した表現型の修正のために追跡される。検出することができる炎症シグナルは、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−８、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−４、ＩＬ−１９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、および／またはＩＦＮ−ガンマ）の放出、抗菌ペプチド（たとえば、ベータデフェンシン、リゾチーム、および／またはｓＩｇＡ）、ソマトスタチンなどの内分泌物質、炎症経路の活性化（たとえば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、および／またはＮＦｋＢ）、炎症に反応したバリア破損の評価（組織学、ＴＥＥＲ、ルシファーイエロー、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー、および／または他のウェルベースのアッセイ）、粘液分泌または遺伝子調節の評価または杯細胞の喪失、恒常性上皮調節への影響の評価、イオン、栄養素および水分輸送、胆汁再吸収、増殖、細胞毒性、組織損傷、および／またはアポトーシスの測定、（カスパーゼ８またはＴｕｎｅｌ）または自食作用または創傷領域の���上皮化、および刺激に応答して上方制御された重要なマーカーおよび受容体の発現（ＴＬＲｓ、Ｍｙｄ９９、ＨＮＦ４ａｌｐｈａ、ＭＬＣＫ、Ｍｕｃ２、ＴＦＦ３）を含む。記載される表現型のいずれについても、３Ｄ腸モデルを用いて、動態および発症の程度ならびに摂動からの回復を実証することができる。たとえば、治療薬を組織に投与し、組織損傷の発症の動態と並行して吸収の動態を測定し、次いで試験剤を除去し、そして組織中の分子のクリアランスおよび損傷からの回復の動態を測定することができる。これらのパラメータの分析は、クリニックに入れる化合物についての適切な投薬レベルおよび投薬スケジュールの予測を可能にし得る。
【０１２５】
腸組織モデルは、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する方法に用いることもでき、その方法は、
（ａ）腸組織モデルまたは非ヒト動物モデルを候補治療剤と接触させる段階であって、該腸組織モデルは、腸の障害または損傷の表現型を有する、段階；
（ｂ）腸組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
（ｃ）候補治療剤と接触させていない対照腸組織モデルと比較して、決定された腸組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減または予防する能力を評価する段階
を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷の表現型は、腸組織モデルを、表現型を引き起こす処置、化合物、または感染性因子と接触させることによって誘発される。いくつかの実施形態では、腸の障害または損傷の表現型は、腸組織モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である。いくつかの実施形態では、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力は、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の浸潤または転移の減少である。
【０１２７】
腸組織モデルは、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する方法にも用いることができ、その方法は、
（ａ）腸組織モデルまたは非ヒト動物モデルを候補治療剤と接触させる段階；
（ｂ）腸組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
（ｃ）候補治療剤と接触させていない対照腸組織モデルと比較して、決定された腸組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腸の障害または損傷を逆転、軽減または予防する能力を評価する段階
を含む。
【０１２８】
一実施形態では、腸の障害または損傷の表現型は、腸組織モデルを、表現型を引き起こす処置、化合物、または感染性因子と接触させることによって誘発される。そのような処置の例には、放射線処置および物理的損傷が含まれる。化合物の例には、ＮＳＡＩＤを含む腸組織に有害であることが知られているいずれかの化合物、たとえば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンナトリウム、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビローフェン（ｆｌｕｒｂｉｒｏｆｅｎ）、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン（ｎａｂｕｍｅｔｏｎｅ）、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダクおよびトルメチンが含まれる。感染性因子の例には、サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、セレウス菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、カンピロバクター（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ）、ランブル鞭毛虫（ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、腸内寄生虫、およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が含まれる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、候補化学療法剤または免疫調節剤の影響を調査することができる。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは腫瘍細胞を含み、腫瘍の治療のための候補治療薬または免疫調節剤は腸組織モデルと接触させられる。
【０１３０】
他の実施形態において、腸組織モデルは、腸組織モデルを腸ミクロバイオームの生物と接触させ、生物と接触させていない対照腸組織モデルと比較した腸組織細胞の生存能力または機能性を決定することによって、腸のミクロバイオームを研究するための方法において用いることができる。一実施形態では、腸組織モデルは罹患腸組織細胞を含む。他の実施形態では、腸組織モデルは正常な腸組織細胞を含む。さらなる実施形態では、腸組織モデルは、治療剤または処置の腸内ミクロビオームへの影響を評価するために、候補治療剤または処置と接触させられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される腸組織モデルおよびアレイは、インビトロアッセイにおける使用のためのものである。いくつかの実施形態において、「アッセイ」は、有機的または生物学的サンプル（たとえば、細胞凝集体、組織、器官、生物など）中の物質（たとえば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる実施形態において、アッセイは、定性的アッセイおよび定量的アッセイを含む。なおさらなる実施形態において、定量的アッセイは、サンプル中の化学物質または生体分子などの物質の量を測定する。
【０１３２】
様々な実施形態において、腸組織モデルおよびアレイは、非限定的な例として、画像ベースのアッセイ、分泌タンパク質の測定、マーカーの発現、ならびにタンパク質またはｍＲＮＡの産生において使用するためのものである。様々なさらなる実施形態において、腸組織モデルおよびアレイは、分子結合（放射性リガンド結合を含む）、分子取り込み、活性（たとえば、酵素活性および受容体活性、代謝産物産生など）、遺伝子発現、タンパク質発現、タンパク質修飾（非限定的な例には、リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、グリコシル化、脂質化などが含まれる）、受容体アゴニズム、受容体アンタゴニズム、細胞シグナル伝達、アポトーシス、化学感受性、トランスフェクション、細胞マイグレーション、走化性、細胞生存率、細胞増殖、安全性、有効性、代謝、毒性、感染力、免疫活性化、免疫調節、および乱用傾向、のうちの１つまたは複数を検出または測定するためのアッセイにおける使用のためである。様々な実施形態において、腸組織モデルは毒物学、薬学的または毒性試験のためである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルおよびアレイは、イムノアッセイに使用するためのものである。イムノアッセイは、たとえば、フローサイトメトリー、ハイスループットまたはロースループット画像分析、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ホモジニアスアッセイ、たとえばＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）、および時間分解蛍光または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連する技術を含む。さらなる実施形態において、イムノアッセイは競合イムノアッセイまたは非競合イムノアッセイである。競合イムノアッセイでは、たとえば、試料中の抗原が抗体と結合するために標識抗原と競合し、次いで抗体部位に結合した標識抗原の量が測定される。非競合的イムノアッセイ（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）では、たとえば、試料中の抗原は抗体部位に結合し、続いて、標識抗体を抗原に結合させ、次いでその部位上の標識抗体の量が測定される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルおよびアレイはＥＬＩＳＡで使用するためのものである。さらなる態様において、ＥＬＩＳＡは、試料中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学的技術である。ＥＬＩＳＡでは、たとえば、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの抗体が利用される。さらなる例として、未知の量の抗原を有する試料が、（表面への吸着を介して）非特異的に、または（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕獲を介して）特異的に、固体支持体（たとえば、ポリスチレンマイクロタイタープレート）に固定化される。なおさらなる例として、抗原が固定化された後、検出抗体が添加され、抗原と複合体を形成する。検出抗体は、たとえば、酵素と共有結合しているか、またはバイオコンジュゲーションによって酵素と結合している二次抗体によってそれ自体が検出される。
【０１３５】
他の実施形態では、腸組織モデルは、腸組織モデルの構成物を決定するために質量分析に供される。そのような構成物は、候補の治療的処置の代謝産物、タンパク質、サイトカイン、ＲＮＡ、ＤＮＡなどを含む。
【０１３６】
たとえば、いくつかの実施形態では、細胞、多細胞凝集体、または組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは薬物発見のために用いられる。さらなる実施形態において、組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは薬物発見のためのキットの一部として使用される。いくつかの実施形態では、各腸組織モデルは生体適合性マルチウェル容器のウェル内に存在し、ここでは、この容器は１つまたは複数の自動化薬物スクリーニング手順および／または装置と適合性がある。さらなる実施形態では、自動化薬物スクリーニング手順および／または装置は、コンピュータまたはロボット支援による任意の適切な手順または装置を含む。
【０１３７】
さらなる実施形態において、薬物スクリーニングアッセイまたは薬物発見アッセイのためのアレイは、任意の治療分野において潜在的に有用な薬物を研究または開発するために使用される。なおさらなる実施形態において、適切な治療分野は、非限定的な例として、感染性疾患、血液学、腫瘍学、小児科、胃腸病学、疼痛管理、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、遺伝子治療、毒性学、毒性、および免疫学を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルおよびアレイは細胞ベースのスクリーニングに使用するためのものである。さらなる実施形態では、細胞ベースのスクリーニングは、ウイルス感染、真菌感染、細菌感染または寄生虫感染などの１つまたは複数の感染性疾患に対するものである。さらなる実施形態において、細胞ベースのスクリーニングは結腸癌に対するものである。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、その構築物またはそのアレイは、抗体、哺乳動物細胞、細菌、生物学的に活性なタンパク質、ホルモン、ペプチド、小分子などを含む生物製剤の性能を評価するのに使用するためのものである。他の実施形態において、腸組織モデルまたはそのアレイは、その構築物含む哺乳動物の腸組織モデルと、これらに限らないが、病原体保有細胞、生きている病原性細胞、癌細胞、免疫細胞、血液細胞、幹細胞／前駆細胞、または遺伝子操作された細胞を含む、１つまたは複数の追加の細胞型と、の間の細胞−細胞間および細胞−組織相互作用の研究に有用である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、アレイは腸組織モデルおよび追加の組織構築物を含む。さらなる実施形態において、腸組織構築物は、１つまたは複数の表面上のさらなる組織構築物と直接接触している。なおさらなる実施形態において、腸組織モデルは、流体路または共通の流体リザーバを介して１つまたは複数のさらなる組織構築物または細胞に接続される。なおさらなる実施形態では、人工の腸組織構築物と接触する液体媒体は、免疫細胞、血液由来細胞、または腫瘍由来細胞などの生きている哺乳動物細胞を含む。他の実施形態では、腸組織と接触する液体媒体は、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、または他の病原体などの感染性因子を含む。
【０１４１】
特定の実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルは、腸間質筋線維芽細胞の層および腸上皮組織の層を含む。他の実施形態では、腸間質筋線維芽細胞の層および腸上皮組織の層のうちの少なくとも１つは、骨髄細胞、リンパ球／白血球、腸内分泌細胞、杯細胞、パネート細胞、Ｍ細胞、神経細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、ｉＰＳ細胞および／または罹患ドナーからの初代細胞またはｉＰＳ細胞の指向性分化に由来する（たとえば、ＩＢＤ、大腸炎またはクローン病を有する対象由来）特殊化細胞などのさらなる細胞型を含む。
【０１４２】
一実施形態では、腸組織構築物は、腸線維症および線維性瘢痕形成を治療するための候補薬を試験するために用いることができる。腸線維症および瘢痕形成を検出するための方法は、たとえば、Florian Rieder, Sean Kessler, Miquel Sans, and Claudio Fiocchicorresponding (2012) Animal models of intestinal fibrosis: new tools for the understanding of pathogenesis and therapy of human disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303(7): G786-G801により概説されている。
【０１４３】
腸組織構築物はまた、腸創傷治癒のための候補治療薬を試験する方法に用いることができる。この実施形態では、腸組織構築物は損傷を受け（たとえば、切断され、二分され、穿孔され、穿刺され、擦り取られ、掻き取られ、損傷を引き起こす化学薬品に曝される、など）、その損傷された組織構築物は候補治療剤で処理され、そして、治癒の証拠が、候補治療剤と接触させていない対照構築物のそれと比較して検出される。別の実施形態では、損傷剤自体が単純に除去され、動力学および治癒の程度が、以前に損傷を受けていない対照構築物のそれと比較される。
【０１４４】
腸組織構築物はまた、微生物／ミクロビオーム相互作用（病原性または共生細菌）および腸感染症（細菌またはウイルス）をモデル化するために用いることもできる。
【０１４５】
腸組織構築物はまた、流動成分の添加および／または平滑筋細胞およびニューロンの包含により蠕動運動をモデル化するために用いることもできる。この実施形態では、腸組織構築物はバイオリアクター内の培地の流れに供される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルは少なくとも２細胞層の厚さである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは２細胞層またはそれを超える厚さである。いくつかの実施形態では、腸上皮細胞が腸間質組織を完全には覆わない場合、その覆われていない間質組織は、覆われていない領域において１細胞層程度に少ない厚さであり得る。同様に、間質組織層がプリント表面を完全に覆っていない場合、覆っている腸上皮細胞層は、腸間質組織なしで、プリント表面上で１細胞層程度に少ない厚さであり得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも２０μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも１００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも２００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも３００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも４００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも５００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも６００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも７００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも８００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも９００μｍである。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは少なくとも１０００μｍである。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、５０μｍ〜３０００μｍの間である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、７５μｍ〜１０００μｍの間である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは１００μｍ〜１０００μｍの間である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは２００μｍ〜１０００μｍの間である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは、５００μｍ〜１０００μｍの間である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、５０μｍ〜５００μｍの間である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、５０μｍ〜３００μｍの間である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、５０μｍ〜２００μｍの間である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、５０μｍ〜１５０μｍの間である。いくつかの実施形態において、腸組織モデルの平均の厚さは、５０μｍ〜１２５μｍの間である。いくつかの実施形態では、腸組織モデルの平均の厚さは、７５μｍ〜１００μｍの間である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、プリント表面領域は、０．０１ｃｍ２〜１００ｃｍ２である。プリント面は、マイクロタイタープレートのウェルであり得、それは、６〜３８４ウェルまたはそれを超える範囲であり得る。いくつかの実施形態において、プリント表面領域は、２４ウェルプレートについて２ｃｍ２である。
【０１４９】
潜在的な毒性剤は、腸組織の構造または機能に影響を及ぼし得るものであれば何でもよい。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、微生物（たとえば、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌）、または環境作用物質である。他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。
【０１５０】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである。
【０１５１】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、またはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に使用される化合物、Ｆｌｔ−３阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソウレア、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的化／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／減少させる化合物、または抗血管新生化合物、である化学療法剤である。他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ａｒａ−Ｃ、ＶＰ−１６、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ＰＫＣ４１２、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、ＳＯＭ２３０、ＦＴＹ７２０、６−チオグアニン、クラドリビン、６−メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、２−ヒドロキシ−１Ｈ−イソインドール−１，３−ジオン誘導体、１−（４−クロロアニリノ）−４−（４−ピリジルメチル）フタラジン、１−（４−クロロアニリノ）−４−（４−ピリジルメチル）フタラジンスクシネート、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ＺＤ４１９０、ＺＤ６４７４、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ、ｒｈｕＦａｂ、マクゴン（ｍａｃｕｇｏｎ）、ＦＬＴ−４阻害剤、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦＲ−２  ＩｇＧＩ抗体、ＲＰＩ４６１０、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、１１−α−エピヒドロコチゾン、コルテキソロン、１７ａ−ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／またはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの薬学的に許容される塩、である化学療法剤である。
【０１５２】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、イブプロフェン、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンＢ、およびアミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は放射線である。いくつかの実施形態では、放射線は、Ｘ線、ガンマ線、ＵＶなどを含み得る。いくつかの実施形態では、放射線は単独で、または他の１つまたは複数の毒性剤と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、放射線は、光子放射線療法、粒子線放射線療法、他の種類の放射線療法、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、毒性剤は生体適合性溶媒に溶解される。潜在的な毒性剤が水不溶性である場合、潜在的な毒性剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような極性の非プロトン性有機溶媒に溶解し、次いで、蒸留水、水性Ｔｗｅｅｎ、培養培地、または他の生体適合性溶媒中で、９ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（塩類溶液）のような水溶液で希釈される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、毒性剤は免疫系のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、免疫調節剤は、ＬＰＳもしくはイミキモドのようなトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ステロイド、または抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１もしくは抗ＣＴＬＡ４のようなチェックポイント阻害剤を含み得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、腸上皮細胞の生存能力または機能性は、代謝活性の指標を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、代謝活性は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｃａｒｓｌｂａｄ，  ＣＡ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性アッセイ、または別のアッセイによって測定することができる。いくつかの実施形態では、代謝活性の指標は、対照と比較した腸組織モデルにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である。いくつかの実施形態において、レサズリンの減少は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（Rampersad, S.N., (2012), Multiple applications of alamar blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors 12(9): 12347-12360）を用いて測定される。いくつかの実施形態において、テトラゾリウム塩は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）、ナトリウム３'−［１−フェニルアミノ）−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロベンゼン）スルホン酸水和物（ＸＴＴ）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）等（Ｒａｍｐｅｒｓａｄ，  ２０１２）を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、腸上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性、プロテアーゼ活性、ＡＴＰ利用、ＡＴＰレベルおよびそれらの変化、グルコース取り込み活性、ナトリウム−グルコース共輸送体−１（ＳＧＬＴ１）活性、任意の腸特異的タンパク質もしくはペプチドの分泌、またはＲＮＡ発現を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、腸上皮細胞の生存能力または機能性は、アルカリホスファターゼ活性またはカスパーゼ活性を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ活性は、合成ペプチド基質を用いてカスパーゼ活性を測定することによって測定される（Kumar (2004) Chapter 2: Measurement of caspase activity in cells undergoing apoptosis. Methods in Molecular Biology, vol. 228. Totowa, NJ: Humana Press Inc.）。いくつかの実施形態において、細胞内ＡＴＰは、ＡＴＰアッセイキット（Weng, Z., Patel, A.B., Panagiotidou, S., and Theoharides, T.C. (2015). The novel flavone tetramethoxyluteolin is a potent inhibitor of human mast cells. J Allergy Clin Immunol 135(4), 1044-1052）を用いて測定される。ＡＴＰレベルを測定するための市販のキットの１つは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）である。
【０１５８】
他の実施形態では、腸上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したモデル中の輸送分子活性を測定することによって決定される。他の実施形態では、輸送分子の活性は、少なくとも１つの高分子の排出および／または取り込みである。他の実施形態では、高分子はコラーゲンである。
【０１５９】
他の実施形態では、上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した上皮細胞の再生を同定することによって決定される。一実施形態では、再生は、上皮細胞を視覚的に検査し、生存細胞の数の増加を同定することによって同定される。
【０１６０】
他の実施形態では、上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腸組織モデルの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）または受動的透過性を測定することによって決定される。
【０１６１】
他の実施形態において、腸上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、イオン交換に対する変化、ｐＨに対する変化、酸／塩基バランスに対する変化、バリア機能に対する変化、または生理学における変化、病理学における変化、分子の輸送に対する変化、ナトリウム−グルコース共輸送体−１（ＳＧＬＴ１）活性に対する変化、間質線維組織の量、または腸組織モデルの再生、を測定することによって決定される。
【０１６２】
他の実施形態では、腸上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腸線維組織の量を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、腸線維性組織は、ＴｒｉｃｈｒｏｍｅまたはＡｌｉｃｉａｎ  ｂｌｕｅ／ＰＡＳ線維症測定、コラーゲンＩＩＩ免疫組織化学、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色、または他のタイプのアッセイを用いて測定される（Farris A.B., Adams C.D., Brousaides N., Della Pelle P.A., Collins A.B., Moradi E., Smith R.N., Grimm P.C., and Colvin R.B. (2011) Morphometric and visual evaluation of fibrosis in renal biopsies. J Am Soc Nephrol 22(1), 176-86）。いくつかの実施形態において、腸上皮細胞の生存能力または機能性は経時的に測定される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、腸組織モデルを、最初に潜在的な毒性剤と接触させ、次に候補治療剤と接触させる。他の実施形態では、腸組織モデルを、最初に候補治療剤と接触させ、次いで潜在的な毒性剤と接触させる。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは、候補治療剤および潜在的な毒性剤と接触させる前に細胞培養培地で培養されている。いくつかの実施形態では、腸組織モデルは細胞培養培地中で少なくとも３日間培養されている。
【０１６４】
剤の腸機能に対する効果を評価する方法も提供され、その方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルに剤を接触させ、そして、腸上皮細胞の生存能力または機能性により剤の腸機能に対する効果を測定することを含む。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルは、筋線維芽細胞組織の層と、上皮組織の層であって、該上皮組織が腸上皮細胞を含む層と、を含み、ただし、筋線維芽細胞組織はバイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、そして人工の三次元生体腸組織モデルを形成する。
【０１６５】
腸機能に対する潜在的な毒性剤の効果を評価する方法も提供され、その方法は、
（ａ）バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルに剤を接触させる段階；および
（ｂ）腸組織モデル細胞の生存能力または機能性に対する剤の効果を測定する段階
を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、毒性剤による損傷を逆転または軽減するための方法が提供され、腸組織モデルを、最初に毒性剤と接触させ、次いで潜在的な毒性剤が除去される。
【０１６７】
剤の腸吸収の動態を評価する方法も提供され、その方法は、
（ａ）バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルに剤を接触させる段階；および
（ｂ）腸組織モデルによる吸収の動態を測定する段階
を含む。
【０１６８】
候補治療剤の有効投与濃度および投与スケジュールを予測する方法も提供され、その方法は、
（ａ）様々な濃度または量の剤を、バイオプリントされた人工の三次元生体腸組織モデルと接触させる段階；
（ｂ）腸組織モデル細胞の生存能力または機能性に対する剤の効果を経時的に測定する段階；および
（ｃ）効能をもたらす最短の用量間タイミングを決定するために、経時的に腸組織モデル細胞の回復を測定する段階
を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、その方法は、
（ｄ）剤を除去する段階；および
（ｅ）剤の欠如が腸組織モデルの生存能力または機能性の改善をもたらすか否かを評価する段階
を含む。
【０１７０】
本明細書の開示はビジネス方法を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される技術および方法のスピードおよびスケーラビリティは、インビトロアッセイ等の研究および開発のための細胞ベースのツールにおいて使用するための腸組織モデルの生産のための工業施設および／または商業施設を設計、構築および運営するために利用される。さらなる実施形態において、腸組織モデルおよびそのアレイは、たとえば、細胞アレイ（たとえば、マイクロアレイまたはチップ）、組織アレイ（たとえば、マイクロアレイまたはチップ）、ならびに生物学的アッセイおよびハイスループット薬物スクリーニングのためのキットとして、製造、保存、流通、販売、宣伝、および販売される。他の実施形態では、人工の腸組織モデルおよびそのアレイは、サービスとして生物学的アッセイおよび／または薬物スクリーニングを実施するために生成され利用される。
【０１７１】
検証
理想的な人工の腸組織モデルは、完全ヒトかつ多細胞性であり、腸上皮細胞および腸筋線維芽細胞、ならびに場合によっては骨髄細胞などのさらなる細胞を含む。さらに、人工の腸組織は、以下の特徴のうちの１つまたは複数以上を示す。
・二層構造を示すＨ＆Ｅ染色によって証明されるような正確な組織構造。
・上皮細胞マーカー（ＣＫ１９）、筋線維芽細胞マーカー（ビメンチン）、および骨髄性細胞マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ６８、およびＣＤ２０６）、ならびに、リンパ系免疫細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９等）、内皮細胞（ＣＤ３１）またはニューロンなどの組織に組み込まれたいずれかの他の特殊化細胞型のマーカーについての免疫組織化学。
・ウェルベースのＴＥＥＲ研究および／またはルシファーイエローによる透過性/吸着によって証明されるようなバリア機能。
・サイトカイン産生（たとえば、ＥＬＩＳＡによって測定された、たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦα）。
・上皮タイトジャンクション形成（たとえば、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１）、刷子縁形成（ビリン）、重要なトランスポーター発現（たとえば、Ｐ−ｇｐ／ＭＤＲ１、ＢＣＲＰ）、および基底膜形成（たとえば、コラーゲンＩＶ）。
・トランスポーター／代謝酵素活性（たとえば、Ｐ−ｇｐおよびＣＹＰ３Ａ４）。
・刺激後の誘導性サイトカイン産生（たとえばＬＰＳによる）。
・培養における持続可能性および生存性（たとえば、組織学、ＭＴＴまたはＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）。
・粘液産生（たとえばＭＵＣ２、たとえばＥＬＩＳＡによる）、杯細胞の存在。
・内分泌ペプチド分泌（たとえば、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、ＣＣＫ）、腸内分泌細胞の存在。
・脂質吸収／輸送（たとえば、カイロミクロン分泌、ａｐｏＢ−４８、たとえばＥＬＩＳＡによる）、トリグリセリド合成（たとえば１３Ｃオレエート、Ｄ２Ｏ）。
・分化およびマイグレーションに加えて、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって同定された化学的損傷剤で二分する／切断する／打ち抜く／処置することによる線維性瘢痕形成（たとえばＣＫ１９、ビメンチン）。
・ＴＧＦ−ベータまたは他の線維形成性化合物のような線維化促進刺激物質に応答した誘導性コラーゲンまたは他の線維性ＥＣＭ産生（たとえば、組織学および遺伝子発現）。
・急性（たとえば、腸炎）または慢性（たとえば、ＩＢＤ）の炎症の誘発。炎症性刺激は、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−１７）、細菌成分または生成物、創傷を生じるための化学的破損（たとえば、デキストラン硫酸ナトリウム）、物理的破損（たとえば、切断、二分、擦過、削り取り、穿孔）、ＴＬＲアゴニスト（たとえば、ＬＰＳ、ＲＮＡ、イミキモド）または化学的（たとえば、ＩＢＤのモデルを誘導するための２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸の使用）を含み得る。
・サイトカイン（たとえば、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ）、抗菌ペプチド（たとえば、βデフィンシン、リゾチーム、ｓｌｇＡ）、および内分泌物質（たとえば、ソマトスタチン）の放出。
・炎症経路の活性化（たとえば、JAK/STAT、NFκB）。
・炎症への応答におけるバリア破損（たとえば、組織学、ＴＥＥＲ、ルシファーイエローによる）
・炎症性刺激への応答における粘液分泌の変化／遺伝子制御／杯細胞の喪失。
・増殖／アポトーシス（たとえば、カスパーゼ８を検出することによる、またはＤＮＡ断片化を検出する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング（Ｔｕｎｅｌ）による）。
・刺激への応答におけるマーカーおよび受容体の上方制御（ＴＬＲ、Ｍｙｄ９９、ＨＮＦ４アルファ、ＭＬＣＫ、Ｍｕｃ２またはＴＦＦ３）。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本開示の腸モデルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間、または１、２、３、もしくは４週間よりも長く培養中で維持されている２Ｄ共培養または組織外植片と比較して増大した特異的機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間、または１、２、３、もしくは４週間よりも長く培養中に維持されている２Ｄ共培養物または組織外植片と比較して２倍増加した特異的機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間、または１、２、３、もしくは４週間よりも長く培養中で維持されている２Ｄ共培養または組織外植片と比較して５倍またはそれ超、増加した特異的機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１４日またはそれより多い日数の培養中に維持されている２Ｄ共培養または組織外植片と比較して２倍またはそれ超の増加した特異的機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１４日を超えて培養物中に維持されている２Ｄ共培養物または組織外植片と比較して５倍またはそれ超の増加した特異的機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１４日またはそれより多い日数、培養中に維持されている２Ｄ共培養または組織外植片と比較して２倍またはそれ超の増加した特異的機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の腸組織モデルは、１４日またはそれ超の日数、培養物中に維持されている２Ｄ共培養物または組織外植片と比較して５倍またはそれ超の増加した特異的機能を示す。
【実施例】
【０１７３】
以下の例示的な例は、本明細書に記載のソフトウェアアプリケーション、システム、および方法の実施形態の代表例であり、決して限定することを意味するものではない。
【０１７４】
実施例１
手動で作成した三次元腸組織モデル
ゼラチンを含有する間質バイオインクを用いる連続的付着および上皮懸濁液の手動での付着によって、ヒト初代腸細胞および腸細胞株でヒト腸組織を製造した。
【０１７５】
バイオインクは、ミリリットル当たり２０００万細胞の濃度の８％ゼラチン中の１００％初代成人ヒト腸筋線維芽細胞（ＩＭＦ）の細胞混合物により生成した。Ｎｏｖｏｇｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（登録商標）を用いた連続付着によって三次元バイオインク構築物をプリントした。２４ウェルプレートにＴｒａｎｓｗｅｌｌごとに１つの組織をプリントした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプリンティング表面は、３μｍの大きさの孔を有するＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン（ウシ）の等モル混合物で被覆されたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を含んだ。プリント後、増殖培地中、加湿インキュベーター中で組織を４日間、成熟させた。組織を１００％ＩＭＦ培地で培養し、培地を毎日交換した。インキュベーション後、間質組織構築物をインキュベーターから取り出し、ＢＳＣフードに入れた。上皮細胞を適用する直前に培地を吸引した。上皮細胞を、７５％Ｃａｃｏ−２細胞および２５％ＳＴＣ−１細胞の細胞懸濁混合物として添加した。Ｃａｃｏ−２細胞はヒト結腸直腸腺癌上皮細胞株である。ＳＴＣ−１細胞はマウス腸内分泌腸細胞株である。いくつかのウェルでは、プリントされたＩＭＦ層に上皮細胞を添加せず、これらのウェルを比較研究のための対照として用いた。いくつかのウェルでは、追加の２Ｄ対照として、上皮細胞を、ＩＭＦ層を含まない空のＴｒａｎｓｗｅｌｌに添加した。付着後、培地をＴｒａｎｓｗｅｌｌバスケットの外側領域に加えた。培地は最大１８日間毎日変更した。全培養期間は、４日間のＩＭＦ間質組織インキュベーションと、上皮細胞の添加後４、７、または１４日であった。したがって、実験は４、７、および１４日目とラベル付けされ、それらはそれぞれ８、１１、および１８日の全培養時間に対応する。
【０１７６】
実験の経時的研究は、上皮細胞の添加後４、７、および１４日に行った。上清中へのＧＬＰ−１分泌について組織を測定した。組織はまた、ＴＥＥＲまたはルシファーイエロー（非溶解アッセイ）によって複数の時点でバリア機能について測定した。インキュベーション後、組織学のために組織をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定するか、またはＲＮＡ抽出のために溶解した。
【０１７７】
結果
バイオプリントされた腸組織構築物は、静的培地条件でのインキュベーション後に凝集構造を維持し、二層構造を達成した。間質層および上皮層を示すために、組織をＴｒａｎｓｗｅｌｌの平面に対して垂直に断面で切断した。予想外の発見は、Ｃａｃｏ−２上皮層が培養中に３Ｄ組織において経時的にその厚さを増加させたことであり、これは試験期間内にＣａｃｏ−２上皮細胞の２Ｄ単層培養では観察されなかった。データは、プリントされた間質筋線維芽細胞層と組織上皮の分化および二次構造形成を指示する上皮層との間のクロストークを示唆した。このデータは、プリントされた間質層が組織の肥厚化および二次構造形成に必要であることを示唆する。さらに、データは、流動条件も機械的刺激も適切な二次構造形成に必要とされないことを示唆する（図１Ａ〜１Ｂ）。
【０１７８】
組織は正常なネイティブ腸組織のマーカーを発現した。Ｈ＆Ｅは、経時的に上皮層の肥厚を示したが、ビメンチン＋筋線維芽細胞およびＣＫ１９＋上皮細胞の二層構造は維持された（図２Ａ）。各層は正しいマーカーを発現し、基底層はＩＭＦ層中のＩＶ型コラーゲンおよび上皮層中のＥ−カドヘリンにより染色され、タイトジャンクションの存在を示していた。タイトジャンクションの存在は、バリアが上皮内に形成されていることを示す重要な発見である。頂端部のビリン染色によって示される上皮細胞の正しい極性化は、組織が経時的に厚くなるにつれていくらかの組織崩壊を伴いながら培養の初期に見られた。極性化上皮もまた、組織が成熟するにつれて細胞が空間的に組織化していることを意味する重要な発見である（図２Ｂ〜２Ｆ）。ＰＣＮＡ染色は、組織が高度に生存可能であり培養物中で増殖していることを実証する。これらの組織はＭＵＣ２およびアルシアンブルー／ＰＡＳについて染色され、それらがムチンを発現しないことを示した。これは、Ｃａｃｏ−２細胞が粘液を産生しないことが知られているので予想されたことである（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１７９】
ＳＶ４０Ｔ抗原は、ＳＴＣ−１細胞を同定するために用い、早期の時点でＣａｃｏ−２細胞からの凝集および分離、その後のより遅い時点での間質への浸潤を示した。３ＤシステムはＳＴＣ−１細胞の挙動を視覚化することを可能にし、これは２Ｄ共培養では不可能であり、ＳＴＣ−１細胞はそれらがもともと単離された腫瘍組織と同様の表現型をとることを示唆した。これは、モデルシステムが、腫瘍増殖および浸潤／転移に対する効果の評価を含む、腫瘍細胞と健康な組織微小環境との相互作用を研究するために使用され得ることを示唆する。両方の細胞株がネイティブの組織または初代上皮細胞と比較して人工的に高い増殖速度を有し得る一方で、Ｃａｃｏ−２細胞は培養中に経時的に上皮層を支配することが観察された（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１８０】
ＴＥＥＲおよびルシファーイエローによって測定されるように、バイオプリント組織はバリアを発達させた。Ｃａｃｏ−２細胞に関する従来の文献から予想されるように、バリア形成はＣａｃｏ−２／ＳＴＣ−１  ２Ｄ単層培養において人為的に高かった。重要な発見は、バリア機能は３Ｄ組織における生理学的範囲内であるということであり、これは、３Ｄ環境が２Ｄ単層よりも生理学的に関連性があり、よりネイティブ様の組織を生成し得ることを示唆する。また、ＴＥＥＲおよび透過性データは、バイオプリントアプローチの再現性を強調する複数の実験にわたって再現可能であることに留意されたい（図４、５、および６Ａ〜６Ｂ）。
【０１８１】
バイオプリントされた組織は、上皮層の添加の７日後にＧＬＰ−１を産生する。Ｃａｃｏ−２細胞単独ではＧＬＰ−１を産生することができないことが知られているので、これは、ＳＴＣ−１細胞が組織中に存在し機能的であることを示した。３Ｄ組織は、同じ時点で２Ｄ単層より多くのＧＬＰ−１を産生する。この発見は予想外のことであり、これもまた細胞挙動に対する３Ｄ環境の有益な効果を支持し得る。それはまた、培養中に成熟するにつれて、３Ｄ組織の厚さの増加および３Ｄ上皮中に存在する細胞の潜在的な数の増加を反映し得る（図７）。
【０１８２】
３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織は、ｑＰＣＲによる２Ｄ単層と同様のパターンで重要なトランスポーターを発現する。パターンは、研究された異なる時点で異なり得るが、集合的にデータは２Ｄおよび３Ｄ組織の両方が類似の範囲内で同じマーカーを発現することを示す。組織学は、Ｐ−ｇｐが３Ｄ組織においてより上方制御され得ることを示し、これは予想外の発見である。また、Ｐ−ｇｐ染色は上皮の頂端側にあり、これもまた、上皮細胞の適切な極性化およびネイティブ組織と同様の頂端排出トランスポーターの適切な配置を支持する（図８および図９Ａ〜９Ｂ）。
【０１８３】
実施例２
バイオプリントされた三次元腸組織モデル
ヒト腸組織構築物は、コラーゲンを含有する間質バイオインクを用いる連続的付着とそれに続く上皮懸濁物の付着によって、１００％ヒト成人初代腸管細胞を用いてバイオプリンティングすることによって製造した。
【０１８４】
バイオインクは、１００％ウシＩ型コラーゲン中の１００％初代成人ヒト腸筋線維芽細胞（ＩＭＦ）の１ミリリットル当たり２０００万細胞の濃度の細胞混合物により生成された。Ｎｏｖｏｇｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（登録商標）を用いた連続的な付着によって三次元バイオインク構築物を基層にプリントして、間質構造を作製した。 ２４ウェルプレートにＴｒａｎｓｗｅｌｌごとに１つの組織をプリントした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプリント表面は、大きさが３μｍの孔を有するタイプＩおよびＩＩＩのコラーゲン（ウシ）の等モル混合物で被覆されたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を含んでいた。プリント後、組織を１００％ＩＭＦ培地中３７℃の加湿インキュベーター中で４日間、成熟させ、培地を毎日交換した。インキュベーション後、間質組織構築物をインキュベーターから取り出し、ＢＳＣフードに入れた。上皮細胞を適用する直前に培地を吸引した。上皮細胞を、１００％初代成人ヒト腸上皮細胞の細胞懸濁液として、プリントされた間質層上に分配した。用いた培地は１００％の初代腸上皮細胞増殖培地を含んでいた。いくつかのウェルでは、プリントされたＩＭＦ層に上皮細胞を添加せず、これらのウェルを比較研究のための対照として使用した。付着後、培地をＴｒａｎｓｗｅｌｌバスケットの外側領域に加えた。培地は最大２１日間２４〜２８時間ごとに交換した。完全培養期間は、４日間のＩＭＦ間質組織インキュベーションと、上皮細胞の添加後９、１０、または１７日である。したがって、実験は９、１０、および１７日目としてラベル付けされ、それぞれ１３、１４および２１日の全培養時間に対応する。
【０１８５】
実験の経時的研究は、上皮細胞の添加後０、９、１０、および１７日目に行った。組織を、１０日目および１７日目に上清へのＧＬＰ−１分泌について測定した。また、組織を、ＴＥＥＲまたはルシファーイエロー（非溶解アッセイ）によって複数の時点でバリア機能について測定した。インキュベーション後、組織学のために組織をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定するか、またはＲＮＡ抽出のために溶解した。
【０１８６】
結果
バイオプリントされた腸組織は、培地中インキュベーション後に凝集構造を維持し、二層構造を達成した。間質層および上皮層を示すために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの平面に垂直な断面で組織を切断した（図１０）。重要な発見は、間質および上皮の両方において初代腸細胞で排他的にプリントされた組織が、ネイティブの組織と同様の正しい構造および発現パターン形成を示すことである。タイトジャンクションは、上皮細胞がバリアを形成したことを示す。上皮細胞層は組織化され、極性化されており、頂端部の明確なビリン染色は刷子縁が形成されたことを示唆する。重要な知見は、３Ｄ組織は１７日間の培養期間を通して生存可能である（ＰＣＮＡ染色）ことである。組織はまた、正しい先端発現パターンでＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰ排出トランスポーターを発現する。この層状構造は、中心に向かって内向きの上皮細胞を有する円形の凝集体（腸オルガノイド）を生成する、インビトロで初代腸上皮細胞を培養する代替の非バイオプリント法とは対照的であることを指摘することも重要である。円形のコンホメーションでは、頂端面は露出されず、化合物の直接の刺激に利用することができず、また吸収／透過性評価に必要な腸壁の頂端側および側底側の両方からのサンプルの収集もできない（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。
【０１８７】
組織の明視野イメージングは、上皮表面上の二次絨毛様構造の形成を示す。これは、バイオプリントした組織の全体的な形態がネイティブの組織に似ていることを裏付けるので重要である。これはまた、培養９日目にも見られ、バイオプリンティングによってもたらされる３Ｄ環境が組織分化を増強し得ることを示している（図１１Ａおよび図１１Ｃ）。
【０１８８】
組織は、腸内分泌細胞のマーカーであるクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞の存在を示す。この発見は、ネイティブ組織内に通常見られる特殊な上皮細胞型の存在が初代腸上皮細胞を有するバイオプリント組織にも見られ得ることを実証するので重要である。幹細胞集団が初代上皮細胞内に存在し得ること、およびこの集団が３Ｄ組織環境内で分化することが可能であることが示唆されるので、これは重要な発見である。Ｃａｃｏ−２細胞単独では内分泌機能やＣＨＧＡ陽性細胞を有さないため、これも重要な発見である（図１１Ａおよび図１１Ｃ）。
【０１８９】
初代腸上皮細胞を用いて作製された３Ｄ組織は、粘液および頂端刷子縁を生成する。この発見は、バイオプリントされた腸管組織がネイティブの組織と同様の様式で組織化および機能するという事実を強調している。ゴールドスタンダードのＣａｃｏ−２組織は粘液を生成せず、それゆえ粘膜バリアのモデルとしては使用できないため、これは重要な発見である。杯細胞が存在する。Ｃａｃｏ−２細胞には杯細胞、または杯様細胞がないため、これは重要である。幹細胞集団が初代上皮細胞内に存在し得ること、およびこの集団が分化することが可能であることもまた示唆する。さらに、プリントの方法および培養条件を変更することによってこの分化を方向付けることが可能であり得る（図１２）。
【０１９０】
バイオプリントされた組織は重要なトランスポーターおよび代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４を発現する。遺伝子発現分析は、試験した全てのマーカーが９日間の培養期間中に組織が成熟するにつれて上方制御されたことを示し、これもまた組織が培養において生存可能であることを裏付けている。上皮特異的マーカーＣＫ１９に対する発現値の正規化は、発現の上方制御がネイティブ組織と同様に上皮細胞に特異的であることを示した。生物学的複製の分離（ｎ＝３）もまた、バイオプリントされた組織間の再現性を強調している（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。
【０１９１】
初代腸上皮細胞におけるトランスポーターおよび代謝酵素の発現は、３Ｄ  Ｃａｃｏ−２組織よりかなり高く、したがってそれよりも優れていた。初代腸上皮細胞を用いて作製された組織の極めて重要な差別化要因は、主要なＰ４５０代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４発現が初代ＩＥＣで極めて高く、Ｃａｃｏ−２組織では完全に欠如していることであった。ＣＹＰ３Ａ４活性は薬物代謝を研究するために使用される重要な代謝酵素である。Ｃａｃｏ−２細胞は、それらがＣＹＰ３Ａ４発現を欠いているためにＣＹＰ３Ａ４活性を研究するためのインビトロモデルとして使用することができないことが広く知られている。このデータは、慣用的なインビトロモデルを超えるバイオプリント腸組織構築物の重要な利点を強調する（図１４）。
【０１９２】
腸幹細胞マーカーＬＧＲ５は０日目（上皮細胞が添加されたとき）に発現され、これは初代腸上皮細胞集団が幹細胞のサブ集団を含むことを示唆する。幹細胞マーカーＬＧＲ５の発現は培養中に経時的に減少するが、腸内分泌細胞（ＣＨＧＡ）および杯細胞（ＭＵＣ２）を含む特殊化上皮細胞に対するマーカーは増加する。これは、幹細胞が上皮内に存在し、正常に分化している一方で、組織は培養中に成熟して特殊化した細胞型を産生することを示唆している。初代腸内分泌細胞および初代杯細胞は市販されていない。それは我々がネイティブの細胞型を含む３Ｄ組織を作り出すことができ、特定の表現型を達成するために特定の細胞型への組織の分化を潜在的に推進することもできることを我々に教示する点で重要な発見である。また、データは、慣用的なインビトロモデルを超えるバイオプリント腸組織の重要な利点を強調する（図１５）。
【０１９３】
実施例３
腸内分泌細胞を含むバイオプリントされた三次元腸組織モデル
ヒト腸組織構築物を、ヒト成人初代腸細胞およびマウス腸内分泌細胞株ＳＴＣ−１を用いて、コラーゲンを含有する間質バイオインクを用いる連続付着および上皮懸濁物の手動付着によって作製した。
【０１９４】
間質層は、実施例２と同じ方法で生成した。バイオインクは、ウシＩ型コラーゲン中の１００％初代成人腸管筋線維芽細胞（ＩＭＦ）の細胞混合物により、ミリリットル当たり２０００万細胞の濃度で生成した。Ｎｏｖｏｇｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（登録商標）を用いた連続的な付着によって三次元バイオインク構築物を基層にプリントして間質構造を作製した。２４ウェルプレートにＴｒａｎｓｗｅｌｌごとに１つの組織をプリントした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプリント表面は、大きさが３μｍの孔を有するタイプＩおよびＩＩＩのコラーゲン（ウシ）の等モル混合物で被覆されたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を含んでいた。プリント後、加湿した３７℃のインキュベーター中で組織を４日間成熟させた。組織を１００％ＩＭＦ培地で培養し、培地を毎日交換した。インキュベーション後、間質組織構築物をインキュベーターから取り出し、そしてＢＳＣフードに入れた。上皮細胞を適用する直前に培地を吸引した。上皮細胞を、９９％の初代成人ヒト腸上皮細胞および１％のマウスＳＴＣ−１細胞の細胞懸濁混合物として、プリントされた間質層上に手動で分注した。いくつかのウェルでは、プリントされたＩＭＦ層に上皮細胞を添加せず、これらのウェルを比較研究のための対照として使用した。他の対照ウェルでは、１００％ＳＴＣ−１細胞を上皮に添加し、初代腸上皮細胞を添加しなかった。付着後、培地をＴｒａｎｓｗｅｌｌバスケットの外側領域に加えた。培地は２４〜４８時間ごとに、または２１日まで交換した。完全培養期間は、４日間のＩＭＦ間質組織インキュベーションと、上皮細胞の添加後９、１０、または１７日である。したがって、実験は９、１０、および１７日目としてラベル付けされ、それぞれ１３、１４および２１日の全培養時間に対応する。
【０１９５】
実験の経時的研究は、上皮細胞の添加後０、９、１０、および１７日目に行った。組織を、１０日目および１７日目に上清へのＧＬＰ−１分泌について測定した。また、組織を、ＴＥＥＲまたはルシファーイエロー（非溶解アッセイ）によって複数の時点でバリア機能について測定した。インキュベーション後、組織学のために組織をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定するか、またはＲＮＡ抽出のために溶解した。
【０１９６】
結果
初代上皮細胞の非存在下でバイオプリント筋線維芽細胞間質層の上部に加えた場合、ＳＴＣ−１細胞単独で厚い層を形成し、これは、３Ｄ環境がそれらに凝集の合図を与え得ることを示唆する。ＳＴＣ−１細胞は、上皮マーカーＣＫ１９を発現せず、タイトジャンクションを形成しないので、上皮表現型を有さない。初代腸上皮細胞と組み合わせると、それらは上皮に均一に取り込まれず、その代わりに間質層に侵入する凝集体を形成する。３Ｄシステムの利点は、このＳＴＣ−１細胞機能を観察できるということである。さらに、これは、モデルシステムが、腫瘍増殖および浸潤／転移に対する効果を評価することを含めて、腫瘍細胞と健康な組織微小環境との相互作用を研究するために使用され得ることを示唆する。凝集体形成および浸潤は、２Ｄ単層共培養において視覚化することはできない（図１６Ａ〜図１６Ｂ）。
【０１９７】
上皮中に１％のＳＴＣ−１および９９％の初代腸上皮細胞を用いて作製されたバイオプリント腸組織は、組織学的パネルにおいて、１００％の初代腸上皮細胞をプリントした組織と同様に見える。ＳＴＣ−１細胞の異常な挙動にもかかわらず、同様の二層構造、発現パターン形成、生存率、および粘膜バリア染色を見ることができる。実施例２と比較した実施例３のデータの類似性は、３Ｄバイオプリント腸組織構築物表現型の再現性およびモデルの頑健性を強調する（図１６Ａ〜図１６Ｂおよび図１７Ａ〜図１７Ｂ）。
【０１９８】
ＧＬＰ−１分泌は、３Ｄプリント組織において基底レベルで検出された。予想通り、ＧＬＰ−１分泌はＳＴＣ−１細胞の存在によって増強された。予想通り、グルコース、フォルスコリン、およびＩＢＭＸを含む、既知のＧＬＰ−１刺激剤のカクテルによる刺激によって分泌はさらに増強された。予想外のことは、初代腸上皮細胞単独でＧＬＰ−１を産生することができるということであった。これは、腸内分泌細胞が存在するだけでなく機能的であることを示し、組織上皮においてＣＨＧＡ陽性細胞を示す組織学的染色を支持する。また、予想外のことは、初代細胞からのＧＬＰ−１分泌がＳＴＣ−１細胞の非存在下でも刺激され得ることであった。これは、腸内分泌細胞が初代腸上皮細胞を有する組織に存在し、それらが機能的であり、その機能が誘導可能であることを示す（図１８Ａ〜図１８Ｂ）。
【０１９９】
バリア機能は、初代腸上皮細胞を用いて作製された組織においても実証された。バリア機能は、ＴＥＥＲおよびルシファーイエロー透過性の両方によって測定された。このモデルにおけるバリア形成はサイトケラチン１８に対して陽性に染色されるであろう初代腸上皮細胞の存在を必要とすることに注目することが重要である。データは、間質層（ＩＭＦ）単独ではバリアを形成しないこと、およびＳＴＣ−１細胞はバリアを形成しないことを示す。初代細胞上皮への１％ＳＴＣ−１細胞の取り込みはバリアを破損しないが、組織の変動性を増加させ得る。このデータは組織学的に示されたＥ−カドヘリン染色と一致した。  Ｅ−カドヘリンはタイトジャンクションマーカーであり、バリア形成に必要であり、初代腸上皮細胞を含む組織にのみ存在する（図１９Ａ〜図１９Ｃ）。
【０２００】
Ｔａｑｍａｎアレイカード中の遺伝子発現パネルは、重要な遺伝子が存在しており、培養中に組織が成熟し分化するにつれて、１７日の時間経過にわたって誘導されたことを示す。遺伝子発現パターンは、組織が高度に再現性があることを示す生物学的複製によってヒートマップにまとめられている（１群当たりｎ＝３の生物学的複製）。２つの別個の実験を比較する：１つは初代腸上皮細胞のみでのもので、１つは初代腸上皮細胞および１％ＳＴＣ−１細胞でのものであり、類似の傾向を示した。これは、実験結果が実験間で再現性があることを示しており、これもまたバイオプリント腸組織の再現性を裏付ける。
【０２０１】
Ｔａｑｍａｎアレイは、重要なトランスポーター、フェーズＩおよびフェーズ２代謝酵素、脂質生物学マーカー、ならびに腸内分泌マーカーが存在し、上方制御されることを示した。ここでもまた、重要なトランスポーターおよび代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の発現は、初代細胞で作製した組織においてＣａｃｏ−２細胞で作製した組織よりも優れていることに留意することが重要である。それらは高度に発現され、組織が培養中に成熟するにつれて増加する。重要な内分泌遺伝子がＳＴＣ−１細胞を欠如している組織内に存在し、培養中に時間とともに増加することに注意することも重要である。内分泌遺伝子もまた、初代腸上皮細胞における腸内分泌細胞の存在、およびこれらの細胞が以前に示されたＧＬＰ−１分泌に加えてＣＣＫ、ＰＹＹ、およびＳＳＴ分泌を含む複数の機能が可能であり得ることを支持する（図２０Ａ〜図２０Ｅ）。
【０２０２】
代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４は発現されただけでなく、少なくとも１７日間、酵素的に機能的であった。この機能的活性は、組織が２週間を超えて代謝的に適格であることを示すだけでなく、現在のゴールドスタンダードＣａｃｏ−２モデル（Ｃａｃｏ−２組織はＣＹＰ３Ａ４を欠く）で達成できないエンドポイントを強調するので、重要かつ予想外の発見であった。さらに、ネイティブの腸においてＣＹＰ３Ａ４活性を刺激する（リファンピシン）、および阻害する（ケトコナゾール）ことが知られている十分に確立された薬物もまた、３Ｄバイオプリント腸組織モデルにおいて同様に機能した。Ｃａｃｏ−２細胞は薬物誘導ＣＹＰ３Ａ４活性を示すことができない。さらに、このＣＹＰ３Ａ４機能は、流体の流れまたは機械的刺激の存在なしで１４日を超えて予想外に見られ、このことは、どちらも腸組織における生理学的機能の再現の必要条件ではないことを示唆する。ＭＤＣＫ細胞系は、薬物代謝研究のためのインビトロでの代用物としてしばしば使用されるが、これらはイヌおよび腎臓細胞であり、それゆえ完全に異なる系である（図２１Ａ〜図２１Ｂ）。
【０２０３】
実施例４
バイオプリントされた三次元腸管組織モデル
ヒト腸組織構築物は、コラーゲンを含有する間質バイオインクを用いる連続的付着とそれに続く上皮懸濁物の付着により、１００％ヒト成人初代腸細胞を用いてバイオプリンティングすることにより製造した。
【０２０４】
バイオインクは、１００％ウシＩ型コラーゲン中の１００％初代成人ヒト腸筋線維芽細胞（ＩＭＦ）の１ミリリットル当たり２０００万細胞（２０Ｍ／ｍＬ）の濃度の細胞混合物により生成した。Ｎｏｖｏｇｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（登録商標）を用いた連続的な付着によって三次元バイオインク構築物を基層にプリントして、間質構造を作製した。２４ウェルプレートにおいてＴｒａｎｓｗｅｌｌごとに１つの組織をプリントした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプリント表面は、大きさが３μｍの孔を有するタイプＩおよびＩＩＩのコラーゲン（ウシ）の等モル混合物で被覆されたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を含んでいた。プリント後、１００％ＩＭＦ培地中３７℃の加湿インキュベーター中で４日間組織を成熟させ、培地を毎日交換した。インキュベーション後、間質組織構築物をインキュベーターから取り出し、ＢＳＣフードに入れた。上皮細胞を適用する直前に培地を吸引した。上皮細胞を、１００％初代成人ヒト腸上皮細胞の細胞懸濁物として、プリントされた間質層上に分配した。使用した培地は１００％の初代腸上皮細胞増殖培地を含んでいた。いくつかのウェルでは、プリントされたＩＭＦ層に上皮細胞を添加せず、これらのウェルを比較研究のための対照として用いた。付着後、次いで組織を、補足物を含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から構成される３Ｄ腸培地中で培養した。培地は最大２１日間毎日交換した。
【０２０５】
Ｃａｃｏ−２単層に対するバイオプリントされた三次元腸組織モデルの技術的進歩を示すために、Ｃａｃｏ−２単層研究も行った。手短に言えば、細胞を標準的な２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）透過性支持体上にウェル当たり３０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、４８時間ごとに培地を交換しながら、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を含むＤＭＥＭ中で気液界面で培養した。単層を２１日間成長させ、次いでＴＥＥＲによる使用に適格とした（７８５±５６Ω＊ｃｍ２）。
【０２０６】
実施例４の３Ｄバイオプリントヒト腸組織の組織学的特徴付け
組織学的特徴付けは、頂端部のビリン発現、タイトジャンクション形成、ならびに杯細胞、パネート細胞、および腸内分泌細胞を含む特殊化された上皮細胞型の存在を伴う極性化した上皮を示した。実施例４の３Ｄバイオプリント腸組織は、ヒト腸上皮細胞（ｈＩＥＣ）を含む上皮層を支持するヒト腸筋線維芽細胞（ＩＭＦ）からなる二層構造で設計された。直接的な化合物試験のために頂端面と側底面の両方へのアクセスを可能にするために３Ｄバイオプリント腸組織をＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート上に層状構造で作製し（図２２Ａ）、１７日間の培養期間にわたって組織学的に分析した。１７日目に、組織は、極性化した円柱上皮形態および二次構造形成を示した（図２２Ｂ）。上皮および間質組織区画は、上皮層に限定された上皮細胞特異的マーカーＣＫ１９および間質に限定された筋線維芽細胞マーカービメンチンの正確な発現を伴って、区別できるままであった（図２２Ｃ）。バリア機能に関与する重要なタンパク質であるタイトジャンクションマーカーＥ−カドヘリンは、ｈＩＥＣ層の上皮細胞間で均一に発現された（図２２Ｄ）。ｈＩＥＣの正しい極性化および刷子縁形成は、尖端表面での刷子縁タンパク質ビリンについての陽性染色によって見られた（図２２Ｅ）。過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）／アルシアンブルー染色により、尖端の刷子縁が確認され、杯細胞のサブ集団の存在および粘液の排出が示唆された（図２２Ｆ）。ムチン−２についての免疫組織化学により、正常な腸機能を示す特徴である、杯細胞の存在および粘液分泌が確認された。粘液捕捉細胞は、培養中の経時的な正常な細胞代謝回転の間に上皮から剥がれ落ち、組織学的に細胞破片が観察された（図２２Ｇ）。杯細胞に加えて、リゾチーム陽性パネート細胞やクロモグラニン発現腸内分泌細胞を含む、様々な生物学的刺激に対する多くの反応に重要な腸上皮の他の特殊な細胞型が、３Ｄバイオプリント腸組織モデルの上皮層内に存在した（図２２Ｈ〜２２Ｉ）。組織構造および重要な細胞マーカーの発現は、培養中２週間を超えて維持され、分析された１０日目および１７日目の時点で一貫した発現パターン形成が見られ、このことは、モデルが長期化合物研究に好適であり得ることを示唆する。
【０２０７】
３Ｄバイオプリント腸組織は、Ｃａｃｏ−２単層培養物と比較してより厚く、単層には存在しない上皮中に二次構造形成を含んでいた。Ｃａｃｏ−２細胞は３Ｄバイオプリント腸組織の上皮よりも円柱状ではないように見えたものの、Ｅ−カドヘリンおよびビリンを発現し、タイトジャンクション形成および極性化上皮表現型が確認された。しかしながら、３Ｄバイオプリント腸組織とは対照的に、Ｃａｃｏ−２単層では、特殊化細胞のサブ集団および粘液産生の証拠は見られなかった（図２９）。
【０２０８】
実施例４の３Ｄバイオプリントヒト腸組織の遺伝子発現の特徴付け
遺伝子発現分析を利用して、１７日間の培養期間にわたって３Ｄバイオプリント腸組織における重要な腸上皮組織マーカー、代謝酵素、およびトランスポーターの発現をさらに評価し、ネイティブドナー腸組織および標準Ｃａｃｏ−２単層の両方と比較した（図２３）。上皮における示差的発現を具体的に研究するため、および全細胞数のいかなる変動も除去するために、上皮特異的マーカーＣＫ１９の発現と比較して遺伝子を分析した。タイトジャンクションマーカーＥ−カドヘリン（ＣＤＨ１）は、全てのサンプルにおいて高度に発現された。レベルは３Ｄ腸組織およびネイティブ組織で同程度であったが、Ｃａｃｏ−２単層におけるＥ−カドヘリン発現は人為的に高かった。組織学的所見の裏付けとして、パネート細胞（ＬＹＺ）および腸内分泌細胞（ＣＨＧＡ）を含む特殊化された細胞サブ集団のマーカーは、３Ｄバイオプリント腸組織に存在し、ネイティブドナー組織に匹敵したが、Ｃａｃｏ−２単層はそれらの発現を欠如した。ムチン−２細胞は、免疫組織化学的アプローチ（図２２Ｇ）によって３Ｄバイオプリンティング腸組織において同定されたが、遺伝子発現はネイティブの腸と比較して減少した。バイオプリント組織における遺伝子発現値の大部分は、ドナー腸組織の２倍以内であった。ＶＤＲ、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２）、およびＣＸＲ（ＮＲ１Ｉ３）を含む薬物代謝および体内動態に関与する重要な生体異物活性化核内受容体もまた、３Ｄバイオプリント腸組織において、そしてネイティブの腸に匹敵するレベルで発現された。対照的に、Ｃａｃｏ−２は異常に高いＶＤＲの発現および低いＮＲ１Ｉ２の発現を示した（図２３Ａ）。
【０２０９】
ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ２Ｊ２を含む主要な腸のフェーズＩ  Ｐ４５０代謝酵素は、３Ｄバイオプリント腸組織において検出された。臨床的に重要なＣＹＰ３Ａ４は、ネイティブ組織と同様のレベルで３Ｄバイオプリント腸モデルにおいて高度に発現されたが、Ｃａｃｏ−２単層においては発現は見られなかった。加水分解に関与する主要な生体内変換酵素であるＣＥＳ２もまた、ネイティブの腸組織および３Ｄ腸組織の両方において高度に発現されたが、Ｃａｃｏ−２単層においてははるかに低いレベルであった。重要な腸フェーズＩＩ代謝酵素ＧＳＴＰ１およびＵＧＴ１Ａ１も、３Ｄバイオプリント腸組織において、ＤＧＡＴ１、ＭＯＧＡＴ２、およびＭＴＴＰを含む脂肪酸代謝の転写物として発現された（図２３Ｂ）。腸の排出および取り込みトランスポーターは、薬物−薬物相互作用の部位および薬物吸収の制限要因の両方であり得る。主要排出トランスポーターＰ−ｇｐ（ＡＢＣＢ１、ＭＤＲ１）およびＢＣＲＰ（ＡＢＣＧ２）ならびに重要な取り込みトランスポーターＰＥＰＴ１（ＳＬＣ１５Ａ１）およびＯＡＴＰ２Ｂ１（ＳＬＣＯ２Ｂ１）は、ネイティブの腸に匹敵するレベルで３Ｄバイオプリント腸組織において発現される（図２３Ｃ）。腸胆汁酸関連トランスポーターＡＳＢＴ（ＳＬＣ１０Ａ２）、ＯＳＴａ（ＳＬＣ５１Ａ）、およびＯＳＴｂ（ＳＬＣ５１Ｂ）も検出された。興味深いことに、Ｃａｃｏ−２単層において、分析された多くの重要な代謝酵素およびトランスポーターは、減少され、過剰発現され、または不在であり、このことは、バイオプリントモデルがＣａｃｏ−２単層よりも正常組織機能により密接に似ていることを示唆する。
【０２１０】
実施例４の３Ｄバイオプリントヒト腸組織のバリア機能の特徴付け
実施例４の３Ｄバイオプリント腸組織は生理学的バリア機能を発達させ、高透過性化合物と低透過性化合物とを正確に区別した。腸は選択的透過性のバリアであり、栄養素と生体異物の両方の吸収を調節する。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を用いて、２１日間の培養期間にわたって３Ｄバイオプリント腸組織におけるバリア機能を測定した。測定は、組織が培養の１０〜２１日の間にバリア機能を発達させ、維持し、正常なヒト腸機能に匹敵する生理学的範囲（５０〜１００Ω＊ｃｍ２）内の値を示すことを実証した［２０］（図２４Ａ）。対照的に、Ｃａｃｏ−２単層は、極めて大きいＴＥＥＲ測定値（７８５±５６Ω＊ｃｍ２）を示し、これは正常なヒト組織機能よりも有意に高い値である。
【０２１１】
高透過性および低透過性の代表的な化合物を用いて、３Ｄバイオプリント腸組織バリア機能をさらに検証した（図２４Ｂ）。傍細胞輸送マーカールシファーイエローは低い透過性を正しく示し、これは、薬物輸送に対する完全な物理的バリアの存在を示唆する。３Ｄバイオプリント腸組織は、低透過性のミトキサントロン（ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ）排出トランスポーターのプロトタイプ的基質）と高透過性のプロプラノロール（受動的な経細胞輸送参照化合物）を正確に区別した。
【０２１２】
実施例４の３Ｄバイオプリント腸組織モデルにおけるトランスポーター局在化および機能
頂端表面での重要な排出トランスポーターＰ−ｇｐ（ＡＢＣＢ１、ＭＤＲ１）およびＢＣＲＰ（ＡＢＣＧ２）の正確な極性化した発現パターン形成を確認するため、免疫組織化学的染色を用いた。染色は、発現がネイティブ組織と同様に頂端表面にわたって連続的であることを実証したが、Ｃａｃｏ−２細胞における頂端発現はその単層にわたってパッチ状に現れた（図２  ２５Ａ〜２５Ｂ）。組織学的染色はまた、ネイティブの腸と同様の３Ｄバイオプリント腸組織における正しい頂端ＭＲＰ２および基底外側（側底）ＭＲＰ３発現パターン形成が確認された。対照的に、Ｃａｃｏ−２単層は、遺伝子発現データと一致してＭＲＰ２およびＭＲＰ３トランスポーターを過剰発現しているように見えた（図３１）。
【０２１３】
双方向輸送の評価は、化合物が能動的流出を受けるか否かの予測を可能にする。Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰ機能を、阻害あり、およびなしで、双方向輸送を測定することによって、３Ｄバイオプリント腸組織モデルにおいて試験した（図２５Ｃ）。対照条件下で、Ｐ−ｇｐ基質ジゴキシンの非対称な透過性が、２を超える流出比で観察された。ゾスキダル（Ｚｏｓｕｑｕｉｄａｒ）によるＰ−ｇｐの阻害は、ＢｔｏＡ輸送の速度を減少させ、流出比を１．２へ減少させ、３Ｄバイオプリント腸組織におけるＰ−ｇｐの活性が確認された。ＢＣＲＰ機能は、トポテカン（図２５Ｄ）およびミトキサントロン（図３０）の流出により確認された。ＢＣＲＰ／Ｐ−ｇｐ基質トポテカンおよびＢＣＲＰ基質ミトキサントロンは、それぞれ８．８および１２９の流出比でＢｔｏＡ方向に優先的に輸送された。さらに、ＢＣＲＰ阻害剤Ｋｏ１４３によるトポテカン輸送のその後の阻害は、流出比を３．６に低下させ、Ｋｏ１４３およびゾスキダルによる二重阻害はさらに流出比を１．４に低下させた。まとめると、これらの結果は、３Ｄバイオプリント腸組織モデルが、適切な局在および機能で、臨床的に関連性のあるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰトランスポーターを発現することを実証する。
【０２１４】
実施例４の３Ｄバイオプリント腸組織モデルにおけるチトクロームＰ４５０代謝機能の証明
遺伝子発現分析により、３Ｄバイオプリント腸組織における重要な腸チトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９の発現を同定した（図２３Ｂ）。機能的アッセイを、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９について行い、それらの活性および特異性を確認した（図２６）。ＣＹＰ２Ｃ９活性は、発光原性（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）Ｐ４５０基質変換によって３Ｄバイオプリント腸組織において容易に検出され、スルファフェナゾールによって有意に阻害することができた（図２６Ａ）。ＣＹＰ３Ａ４活性およびケトコナゾールによる特異的阻害は、発光原性Ｐ４５０基質変換（図２６Ｂ）およびミダゾラム代謝物形成（図２６）の両方によって確認された。リファンピシン処置は、処置した組織におけるミダゾラムの有意に高い代謝回転、ならびにＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、Ｐ−ｇｐ、およびＵＧＴ１Ａ１を含むＰＸＲ誘導性遺伝子の遺伝子発現における有意な上方制御と関連しており、他方、上皮マーカー遺伝子ＣＫ１９およびＥＣＡＤは安定性を維持した（図２６Ｄ〜２６Ｅ）。３人の別々のドナーから製造された３つの別々のセットの３Ｄバイオプリント腸組織に対するＣＹＰ３Ａ４活性の比較は、基礎ＣＹＰ３Ａ４活性における予想される個体間変動にもかかわらず、ドナー間のケトコナゾール阻害およびリファンピシン誘導の一致を示した（図３２）。
【０２１５】
胃腸毒性のモデルとしての３Ｄバイオプリント腸組織（実施例４）の特徴付け
化合物毒性適用のための３Ｄバイオプリント腸モデルの有用性は、ＮＳＡＩＤインドメタシン、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）オキシゲナーゼ阻害剤、および腸細胞アポトーシスおよび壊死を通して腸上皮バリア機能の低下をもたらす既知のＧＩ毒物によって評価した。３Ｄバイオプリント腸組織は、２４時間の処置に応答してＴＥＥＲによって測定して、バリア機能の用量依存的な減少を示した（図２７Ａ）。腸細胞への傷害は、ＬＤＨ放出によって検出され、０．２５ｍＭを超えるインドメタシン用量の存在下で有意に増加した（図２７Ｂ）。インドメタシンの存在下でのプロスタグランジンＥ２合成の阻害の実証は、既知の活性のメカニズムを支持した（図２７Ｃ）。３Ｄバイオプリント腸組織モデルの利点である組織学的分析の利用により、上皮層の破損の増加およびＥ−カドヘリンの発現の減少が、インドメタシン投与量の増加と相関し、バリア機能の喪失と一致することが確認された（図２７Ｄ）。
【０２１６】
一般的にＧＩ毒性ならびに慢性疾患状態に関連する、炎症に対する３Ｄバイオプリント腸モデル応答を特徴付けるために、組織を高用量の炎症誘発性サイトカインＴＮＦαで２４時間、処理し、形態の変化、ＬＤＨ放出および遺伝子発現について評価した（図２８）。 ＴＮＦαによる処理は上皮形態を変化させ、間質層からの細胞の解離をもたらした。これは、３Ｄバイオプリント腸組織からのＬＤＨ放出の有意な増加を伴い、このことは、細胞傷害性応答および腸細胞死を示唆する。ＣＯＸ−２、ＩＬ−８、およびＴＮＦαの遺伝子発現も上方制御され、このことは、炎症経路の活性化を示す。データは、まとめて、３Ｄバイオプリント腸組織が、バリア破損および炎症を含む、インビトロでのGI毒性の組織学的および生化学的側面を検出および定量化するために用いることができることを実証する。
【０２１７】
３Ｄバイオプリント腸組織モデルの利点
現在の前臨床モデルは、ヒト腸組織の複雑さおよび機能を捉えるそれらの能力において制限されている［１−５］。細胞単層は、細胞−細胞相互作用および細胞−マトリックス相互作用のネイティブの前後関係を欠如し、表現型が限定される一方、動物モデルの遺伝的不一致は、ヒトでの結果との高い相関をもたらすことができない［１６］。完全ヒトバイオプリントヒト３Ｄ腸組織モデルは、初代ヒト細胞を用いて設計され、ギャップを埋めるためおよび薬物開発における乏しい予測性に関連するトランスレーショナルな課題に取り組むために、腸の生物学および機能の複数の側面を再現することができた。バイオプリントプラットフォームは、従来の２Ｄモデルと比較してネイティブ組織の構造および機能をよりよく模倣するために、空間的に制御された細胞の付着によって多細胞３Ｄバイオプリント組織を再現可能に生成できる自動化アプローチを可能にする［１８、１９］。３Ｄの複雑さは、標準的な生化学的アプローチおよび組織学的エンドポイントによる組織の両方の調査を可能にする。３Ｄバイオプリント腸組織は、頂端および基底区画へのアクセスを可能にするために層状構造を持つ高度に細胞的な構造である。
【０２１８】
３Ｄ微小環境は、初代ヒト筋線維芽細胞と初代ヒト上皮細胞との間のクロストークを促進して、１７日間の培養期間にわたって極性化上皮の発達および維持を支持する。組織学的分析は、円柱上皮形態、タイトジャンクション、および頂端刷子縁形成を伴う上皮の正しい極性化を確認した。組織学および遺伝子発現分析はまた、標準的なＣａｃｏ−２単層には顕著に見られなかった特殊な細胞亜集団の存在および粘液産生の証拠を３Ｄバイオプリント腸組織において示した。ムチン−２陽性杯細胞の同定およびパネート細胞の存在を伴うムチン染色は、これらの組織が、粘膜バリア機能および抗菌またはミクロバイオーム機能を含む腸生物学のさらなる局面を特徴付けるために用いることができることを示唆する。ムチン−２遺伝子の発現はネイティブの腸と比較して減少しているが、これは部分的には転写レベルでの一時的な制御の違い、または培養条件を変えることで調節できる表現型の違いによるものであり得る［１１］。クロモグラニン陽性細胞は、３Ｄ腸組織がＧＬＰ−１シグナル伝達を含む腸内の腸内分泌機能を研究するのにも用いることができることを示唆する。このデータは、分離物内の幹細胞集団が、オルガノイド細胞培養によって達成される組成物に類似する培養で成熟するにつれて３Ｄ腸組織内で分化することができ［９、１０、２１］、培養条件の変更により指向性分化を受け得る［１１］ことを示す。本研究では成体初代細胞を組織の作製に利用したが、ｉＰＳＣはより特殊化された表現型の達成を容易にするための潜在的な代替の細胞源とみなすこともできる。しかしながら、ｉＰＳ由来の腸上皮細胞の成熟度は、胎児期の表現型によりよく似ている［１４］。
【０２１９】
オルガノイドシステムを超える３Ｄバイオプリント組織の層状構造の利点は、バリア機能および標準的な方法論を用いた指向性輸送評価との適合性である。オルガノイド研究者らはオルガノイド内腔を露出させるためにアプローチを利用してきたが、努力は複雑なバイオリアクターのセットアップを必要とし［２２］、非生理学的ＴＥＥＲを有する単層をもたらし得る［２３、２４］。ＴＥＥＲによる生理学的バリア機能は、１０日目までに３Ｄ腸組織においてうまく実証され、２１日の培養期間を通して維持された。３Ｄ腸組織は成人の腸上皮細胞の報告されている単層培養と一致するＴＥＥＲ値を有するが［２５］、初代ヒト腸上皮単層膜は、ネイティブの腸と比較して低いＣＹＰ発現を有し得る［２６］。これは、部分的には、上皮を支持して機能を維持するための腸筋線維芽細胞のような他の関連細胞型が存在しないことに起因し得る。３Ｄバイオプリント腸組織は、培養中２週間を超えてバリア機能を維持する。さらに、組織は、傍細胞マーカールシファーイエローおよび経細胞マーカープロプラノロールなどの低透過性基質と高透過性基質とをうまく区別することができた。培養中の長期間にわたる機能性および化合物間を区別する能力は、臨床的に関連するエンドポイントを用いた急性および慢性試験の両方を可能にし得る。３週間の成熟期間を必要とするＣａｃｏ−２単層プロトコルは、人工的に高いＴＥＥＲ値を示したが、これは部分的には、観察されたＥ−カドヘリン発現の上昇によるものであり得る［２０］。生理学的ＴＥＥＲ値の利点を用いて、ヒト腸上皮細胞を用いたモデルは、Ｃａｃｏ−２単層よりもインビボ透過性とのより良い相関をもたらし得る［２５］。
【０２２０】
腸の排出および取り込みトランスポーターは吸収の重要な媒介物質である。遺伝子発現分析および免疫組織化学により、３Ｄバイオプリント腸組織における腸トランスポーターの存在が確認され、ネイティブドナー組織の発現レベルと同様の発現レベルが実証された。臨床的に関連性のあるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰ、吸収された化合物の正味の割合に有意に影響を及ぼし得る排出トランスポーター［２、６］は、頂端上皮において正しく発現され、それぞれ既知の基質ジゴキシンおよびトポテカンに応答して機能的であった。機能的トランスポーターの発現は、このシステムが薬物動態に対する排出トランスポーターの相対的な寄与を評価するために適用され得るか、またはＰＥＰＴ１およびＯＡＴＰ２Ｂ１のような取り込みトランスポーターを標的とすることによる吸収増加の潜在的なモデルとして使用され得ることを示唆する。
【０２２１】
３Ｄバイオプリント腸組織の発現をネイティブの腸およびＣａｃｏ−２細胞と比較するために、広範囲の遺伝子パネルを用いた。３Ｄバイオプリント腸組織はネイティブ腸の酵素およびトランスポーター発現とよく一致したが、以前の報告［７、２６］と一致して、Ｃａｃｏ−２単層はより不一致であった。この不一致は、部分的には、Ｃａｃｏ−２細胞の癌起源または比較した群の起源の組織領域に起因し得る。重要な代謝酵素およびトランスポーターの発現は、胃腸管内の位置によって異なることが知られている［２、２７］。Ｃａｃｏ−２細胞は結腸に由来するのに対し、ネイティブ腸組織および３Ｄバイオプリント腸モデルは両方とも回腸に由来する。３Ｄバイオプリント腸組織は、腸内の代謝に必要なシトクロムＰ４５０およびフェーズＩＩ酵素の発現と並んで、重要な生体異物核内受容体ＶＤＲ、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２）、およびＣＡＲ（ＮＲ１Ｉ３）を含む遺伝子の発現を示した。ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４についての活性アッセイは、酵素が機能的であることを確認した。３Ｄバイオプリント腸組織は、ＰＸＲ活性化と一致して、ＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現および活性の両方の増加を伴ってリファンピシン処置に応答した。ＣＹＰ３Ａ４およびＰＸＲの両方ともＣａｃｏ−２単層中では機能的でないか、または存在しないことに留意することが重要である［８］。さらに、３Ｄモデルの堅牢性は、複数のドナーから製造された組織におけるミダゾラム代謝によって実証された。ドナーの比較は、予想通りの個体間変動を示し［２７］、腸スライスについて示されたものと同様の値であり［２８］、２Ｄシステムについて報告されたものよりかなり高い［８、２６］ことを示した。これらのデータは、以前の成人、胎児、またはＣａｃｏ−２単層では達成できない薬物誘発代謝およびトランスポーター研究に対するこのモデルの適合性を示唆する［８、２６］。３Ｄバイオプリント腸組織モデルにおけるトランスポーターおよび酵素の二重の存在は、Ｐ−ｇｐ／ＣＹＰ３Ａ４基質が重複している場合に見られるような複雑な相互作用を明らかにするために用いることができることを示唆する［２９］。
【０２２２】
胃腸毒性は、下痢の高い罹患率、現在のインビトロモデルまたはインビボモデルでは正確に予測または特徴付けることができない結果にしばしば関連する薬物開発における一般的な臨床的有害事象である［４、５、３０］。ＮＳＡＩＤインドメタシンを用いて、３Ｄバイオプリント腸組織の毒性反応の検証に成功した。組織は、インビトロで報告された結果［３１］およびインビボでの結果［４］と同様のバリア機能の減少と相関して、ＴＥＥＲの減少および細胞破損の増加と共に用量依存的に反応した。３Ｄバイオプリント腸組織はまた、以前の２Ｄモデルと一致する、バリア機能の低下および炎症性遺伝子の上方制御を伴い［３２］、臨床標的である毒性の炎症性刺激ＴＮＦαに応答した［３０］。これらのデータは、３Ｄバイオプリント腸モデルが、腸内で標的外毒性を持ち長期生存能力と組み合わされる、化学療法剤などの他の既知のクラスの化合物のスクリーニングに適用できることを示唆し［５］、このモデルが投与および回復の研究に受け容れられることを示す。さらに、炎症マーカーの上方制御は、将来の応用が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎などの慢性疾患のモデリングを含み得ることを示唆する［４、５、３０］。免疫細胞を取り込むことおよび／または罹患ドナーによって単離された腸細胞を用いることによって、さらなる複雑さを達成することができる［１３、２４］。
【０２２３】
要約すると、標準的なモデルと比較して、複雑さおよび機能が増大した新規のインビトロの３Ｄバイオプリント腸組織モデルが提供される。完全なヒト３Ｄバイオプリント腸モデルは、生理学的バリア機能ならびに重要な機能的トランスポーターおよび代謝酵素の発現を伴い、腸粘膜を再現する。３Ｄバイオプリント腸組織は、バリア機能、透過性、代謝、輸送、および毒性のためのアッセイと適合可能な柔軟なプラットフォームを提供する。
【０２２４】
３Ｄバイオプリント腸組織モデルのさらなる適用は、炎症、感染性疾患、および内分泌生物学を含む複数の適用のための治療標的を特徴付けるための疾患モデルとしての利用を含む。３Ｄバイオプリント腸組織において脂肪酸代謝に関与する酵素の高発現は、肥満と戦うためにこれらの酵素を標的とする化合物を評価するための潜在的な適用を示す［３３］。さらに、３Ｄバイオプリント腸モデルの間質は、２Ｄでは適切にモデル化できない疾患表現型、創傷治癒などの損傷および再生を含む線維形成を特徴付けるためのプラットフォームを提供する。ネイティブの微小環境をよりよく模倣するために、追加の用途は、十二指腸、結腸および直腸などの回腸との比較のためにＧＩ管の異なるセグメントからの細胞を利用することができ、層状の流れを統合することができよう。３Ｄバイオプリント腸モデルは、たとえば、血管系をモデル化するための内皮細胞、粘膜下組織および胃腸運動性をより正確にモデル化するための平滑筋細胞、疾患状態をモデル化するための免疫細胞を組み込むことによって複雑さを増すため、様々な細胞インプットの追加によって特化させることができよう。癌細胞はまた、３Ｄ環境における腫瘍の挙動をモデル化するために追加することができる。ネイティブ組織のような多細胞性および構造のために、バイオプリントされた３Ｄ腸組織は、分泌、輸送、細胞−細胞相互作用、および制御されたシステムにおける複数の適用にわたる病原性プロセスを含む複雑な多面的なプロセスを研究するためのユニークな機会を提供する。
【０２２５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を思い付くであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。
【０２２６】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０２２７】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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