(57)【要約】本発明は、プログラム細胞死リガンド2(PD-L2)を過剰発現する細胞、特に損傷および／または老化細胞を検出する方法、ならびにその同定に関する。本発明はまた、多くの病理および老化に関与し、また毒性物質への曝露の結果として産生される、損傷および／または老化細胞を排除するための、プログラム細胞死リガンド2(PD-L2)およびプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)相互作用のアンタゴニスト、またはPD-1またはPD-L2発現阻害剤の使用にも及ぶ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイ試料における損傷および／または老化細胞の存在の検出方法であって、
PD-L2遺伝子の産物（mRNAまたはタンパク質）あるいはPD-L2プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の産物のレベルを測定し、当該レベルが基準値よりも高い場合に損傷および／または老化細胞の存在を認める、方法。
【請求項２】
mRNAのレベルがqRT-PCRによって決定される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
PD-L2  mRNAまたはタンパク質のレベルが、
PD-L2タンパク質またはPD-L2  mRNAに結合する分子に前記試料を接触させること、PD-L2またはPD-L2  mRNAへの前記分子の結合を検出すること、および、PD-L2またはPD-L2  mRNAへの前記分子の結合を検出することができる細胞、または結合した前記分子のレベルが基準値より高い細胞を損傷または老化細胞として同定すること、によって決定される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
試料中の損傷および／または老化細胞の同定方法であって、
PD-L2タンパク質またはPD-L2  mRNAに結合する分子を投与する工程、
PD-L2またはPD-L2  mRNAへの前記分子の結合を検出する工程、および
PD-L2またはPD-L2  mRNAへの前記分子の結合を検出することができる細胞、または結合した前記分子の濃度が基準値より高い細胞を損傷または老化細胞として同定する工程を含む、方法。
【請求項５】
前記試料が、被験体から取り出された生物学的試料、細胞培養物、または、前記生物学的試料もしくは前記細胞培養物から分離された細胞群である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾患または状態の予後における使用のための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の損傷および／または老化細胞の検出方法。
【請求項７】
損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾病または状態を予測または診断するための方法であって、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によって、アッセイ試料中の損傷および／または老化細胞の存在を検出する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記アッセイ試料が、被験体から得られたかまたは取り出された生物学的試料である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを被験体に投与する工程を含む、被験体の皮膚からのほくろの除去を含む皮膚の美容向上方法。
【請求項１０】
PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを被験体に投与する工程を含む、被験体の寿命を延ばし、かつ／または、被験体の生物学的老化の非病理学的効果を改善または除去するための方法。
【請求項１１】
損傷および／または老化細胞を除去する方法であって、
前記細胞をPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと接触させる工程を含む、方法。
【請求項１２】
損傷および／または老化細胞を除去する方法であって、
治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
損傷および／または老化細胞の存在を特徴とする疾病または状態を治療、改善または予防する方法であって、
前記治療を必要とする被験体に、治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを投与する工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記疾患または状態が、変性疾患；２型糖尿病；サルコペニア；白内障、放射線誘発性口腔粘膜炎；脳動脈瘤および心臓動脈瘤；緑内障；アルツハイマー病、パーキンソン病；嚢胞性線維症、腸管疾患、変形性関節症および椎間板変性；全身性硬化症、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、心臓線維症、口腔粘液線維症、膵臓線維症アテローム性動脈硬化症、脳グリア性瘢痕、ならびに、母斑および創傷治癒後の瘢痕などの良性病変を含む線維性疾患;新生児早老症のヴィーデマン・ローテンシュトラウク症候群、成人早老症のウェルナー症候群、ハチンソン・ギルフォード症候群、ロトムント・トンプソン症候群、マルビル・スミス症候群、コケイン症候群、先天性角化異常症；がん、再生不良性貧血、肺気腫、軟骨変性、肥満、黄斑変性、緑内障、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、腎移植；化学療法、抗レトロウイルス薬、コルチコイド、PPARガンマアゴニストおよび／または医療用放射線もしくは非医療用放射線への曝露の老化または老化誘発効果から選択される、請求項6、7または13に記載の方法。
【請求項１５】
前記PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストが、PD-L2に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
老化抑制剤としてのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストの使用。
【請求項１７】
被験体における損傷／老化細胞の除去に使用するための、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項１８】
損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾病または状態の治療、改善または予防に使用するための、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項１９】
前記疾患または状態が、変性疾患；２型糖尿病；サルコペニア；白内障、放射線誘発性口腔粘膜炎；脳動脈瘤および心臓動脈瘤；緑内障；アルツハイマー病、パーキンソン病；嚢胞性線維症、腸管疾患、変形性関節症および椎間板変性；全身性硬化症、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、心臓線維症、口腔粘液線維症、膵臓線維症アテローム性動脈硬化症、脳グリア性瘢痕、ならびに、母斑および創傷治癒後の瘢痕などの良性病変を含む線維性疾患;新生児早老症のヴィーデマン・ローテンシュトラウク症候群、成人早老症のウェルナー症候群、ハチンソン・ギルフォード症候群、ロトムント・トンプソン症候群、マルビル・スミス症候群、コケイン症候群、先天性角化異常症；がん、再生不良性貧血、肺気腫、軟骨変性、肥満、黄斑変性、緑内障、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、腎移植；化学療法、抗レトロウイルス薬、コルチコイド、PPARガンマアゴニストおよび／または医療用放射線もしくは非医療用放射線への曝露の老化または老化誘発効果から選択される、請求項１８に記載の使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項２０】
前記アンタゴニストが、タンパク質、ペプチド、抗体、化合物、遺伝物質、小分子、薬剤またはRNAi試薬を含む、請求項16、17、18または19のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２１】
前記抗体が、PD-L2および／またはPD-1に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項20に記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２２】
前記抗体が、抗PD-L2抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項21に記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２３】
前記アンタゴニストが、PD-L2および／またはPD-1に特異的に結合し、かつ、PD-L2のPD-1との相互作用能または結合能を遮断する分子である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法、請求項１６に記載の使用、または、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項２４】
前記アンタゴニストが、PD-L2に特異的に結合する抗体、または、PD-L2のPD-1との相互作用能または結合能を遮断する、その抗原結合フラグメント分子である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法、請求項１６に記載の使用、または、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項２５】
前記アンタゴニストが、PD-1および／またはPD-L2の発現を阻害、減少または抑制することができる分子である、請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法、請求項16に記載の使用、または請求項17〜22に記載の使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項２６】
前記使用が、化学療法、抗レトロウイルス薬、コルチコイド、PPARガンマアゴニストおよび／または医療用放射線または非医療用放射線への曝露と併用される、請求項17または18に記載の使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項２７】
化学療法または放射線療法の治療効果を増大させるに使用するための、請求項26に記載の使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト。
【請求項２８】
PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む、損傷および／または老化細胞の治療組成物。
【請求項２９】
治療上許容される量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクルとを接触させる工程を含む、請求項28に記載の損傷および／または老化細胞の治療組成物の製造方法。
【請求項３０】
PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストである、モノクローナル抗体。
【請求項３１】
損傷および／または老化細胞の同定に使用するための、PD-L2またはPD-L2  mRNAに結合する分子。
【請求項３２】
前記分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、化合物、遺伝物質、小分子、薬剤またはRNAi試薬を含む、請求項31に記載の分子、または請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、PD-L2に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項32に記載の分子または方法。
【請求項３４】
前記分子またはアンタゴニストが、磁気共鳴イメージング(MRI)、コンピュータ断層撮影(CT)および／または光学イメージング(OI)を使用して可視である造影材料を含む、請求項31〜33のいずれかに記載の分子、または請求項9〜14、31および32のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
アッセイ試料における、損傷および／または老化細胞の存在を検出するか、または損傷および／または老化細胞のレベルを決定するための、qRT-PCRプライマーとしてのPD-L2特異的オリゴヌクレオチドのペアの使用。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドのペアが、配列番号９および配列番号１０のペアと、配列番号１９および配列番号２０のペアとの間で選択される、請求項35に記載の使用。
【請求項３７】
請求項2に記載の方法が使用される、請求項35または36に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷および／または老化細胞、ならびにそれらを検出および／または排除する方法に関する。より具体的には、本発明は、損傷および／または老化細胞を検出および／または同定する新規な方法、ならびにそのような細胞を排除する方法、ならびにそれを通して、かかる細胞が関与する病理、さらには毒性物質への曝露の試験結果として生じるいくつかの老化効果を治療または改善する方法に関する。本発明はPD-L2を発現する細胞、特に、限定的ではないが、損傷および／または老化細胞を検出する方法に及ぶ。また、本発明は、プログラム細胞死リガンド2(PD-L2)およびプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)相互作用のアンタゴニストに関する。本発明はまた、損傷および／または老化細胞を排除するためのこれらのアンタゴニストの使用にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
修復を受けることができない損傷細胞は、アポトーシスまたは老化という２つの細胞プログラムを活性化する。細胞老化は、(1)さらなる細胞増殖を妨げるエピジェネティックな再編成;(2)炎症細胞を動員するサイトカインを含む強力な分泌プログラムまたは細胞老化関連分泌現象(SASP);および、(3)リソソーム関連β-ガラクトシダーゼ活性(SA-β-gal)およびリソソーム関連α-フルクトース(SA-α-fuc)活性のアップレギュレーションという3つの特性によって特徴付けられる。これらの特性は、必ずしもリンクされていない。例えば、p53の非存在下では損傷細胞は停止することはできないが、分泌現象を実行することができる(Coppe et al., 2008)。一方、最も一般的に使用されている細胞老化のバイオマーカーであるSA-βgalは、DNA損傷などの細胞増殖が制限された特定の条件下で存在することが多い。したがって、細胞損傷と細胞老化との間の境界は明確に定義されていない。
【０００３】
さらに、細胞損傷および細胞老化は、密接に関連する概念であり、損傷した細胞が多くの場合老化細胞になる。逆に、細胞老化(必ずしも細胞損傷を意味しない手段によって開始される)は細胞に自己損傷を与える高いレベルの活性酸素種(Reactive Oxygen Species; ROS)をもたらす異常なミトコンドリア機能によって特徴付けられるため、老化細胞は、確実に、それ自体が実際に損傷した細胞である (Ziegler et al., 2015)。
【０００４】
損傷および／または老化した細胞は多くのヒト病理に存在し(Munoz-Espin and Serrano, 2014)、これには、限定されないが、肺線維症、２型糖尿病、サルコペニア、白内障、放射線誘発口腔粘膜炎、脳動脈瘤、心臓動脈瘤、緑内障、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、腸疾患維症、腸管疾患、変形性関節症、および椎間板変性が含まれる(Munigoz-Espin and Serrano, 2014)。損傷および／または老化細胞に関連する疾患のリストは、着実に増え続けており、老化が更なる病理に関係していると仮定することは不合理ではない。したがって、損傷および／または老化細胞を同定するための信頼できる方法の開発は、これらの病理に対する予後的価値があり得る。
【０００５】
老化はまた、治療誘発性の遺伝毒性ストレスに反応して誘発され得る。例えば、放射線／化学療法で治療した場合、腫瘍細胞は重度に損傷を受け、その後、これらの細胞の一部がアポトーシスによって死滅するが、他の細胞は老化する(Ewald et al., 2010; Sanoff et al., 2014; Wood et al., 2016)。生存する損傷および／または老化細胞の存在は転移を促進する可能性があり(Ruland et al., 2016)、また、当該腫瘍の完全退行に悪影響を及ぼす可能性があるため(Sun et al., 2012; Zacarias-Fluck et al., 2015)、腫瘍再発を促進する。さらに、化学療法を受けた癌生存者は、治療後数年で、化学療法を受けていない者と比較して、慢性疾患の発症頻度が上昇し死亡率が増加することが知られている(Ness et al., 2015)。これは、化学療法剤への全身曝露の結果、損傷および／または老化細胞が全身に残留することにより引き起こされると考えられている(Ewald et al., 2010)。同様に、関連する態様において、環境毒物への曝露はまた、マウスにおいて損傷／老化細胞が集積することが見出されている(Sorrentino et al., 2014)。
【０００６】
近年、CDK4キナーゼおよびCDK6キナーゼの選択的阻害剤が開発された。ある癌では、これらの阻害剤は大部分の腫瘍細胞において老化応答を誘導する結果、癌治療に非常に有望視されている。これらの阻害剤の1つであるパルボシクリブ (PD-0332991)は、ER陽性およびHER2陰性乳癌の治療のために、レトロゾールと併用した臨床使用が承認されている。しかしながら、上述した老化細胞の発生や、これらの細胞に関連する副作用の存在は、老化を誘導するこれらの療法の懸念の原因であり、また、癌患者の治療におけるこれらの薬物の効力を低下させ得る。
【０００７】
老化細胞はまた、老化した生物に蓄積し、寿命に悪影響を及ぼす。実際、トランスジェニック早老マウスおよび自然老化マウスから老化細胞を選択的に排除すると、腫瘍形成を遅延させ、老化関連障害に対してより大きな抵抗性をもたらすことが示されている(Baker et al., 2011、2016; Childs et al., 2016; Zhu et al., 2015)。
【０００８】
その結果、損傷および／または老化細胞の負荷を軽減する介入は、慢性疾患および加齢に関連する障害を潜在的に改善し得る(Zhu et al., 2015)。そのため、損傷および／または老化細胞を選択的に殺すことができる、老化抑制剤(senolytics)として知られる薬物の同定には大きな関心が寄せられている。
【０００９】
老化抑制活性(senolytic activity)を有するいくつかの薬物が同定されており、マウスモデルにおいて寿命延長および年齢関連障害の軽減における有効性が研究されている。
【００１０】
これらの老化抑制薬の例には、慢性白血病の治療のためにブリストル・マイヤーズスクイブ(Bristol-Myers Squibb)によって開発されたチロシンキナーゼ阻害剤であるダサチニブ、および、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)阻害活性を有するフラボノールであるクエルセチンが含まれる。これらの薬剤は、併用すると、経年加齢マウス、早老マウス、および放射線暴露マウスにおいて、損傷細および／または老化細胞の数を減少させ、心臓および血管機能の改善、老化関連症状の遅延、寿命延長をもたらした(Zhu et al, 2015; Roos et al., 2016)。また、老化細胞によりアップレギュレートされる抗アポトーシスタンパク質BCL-WおよびBCL-XLの阻害剤であるABT-737は、老化細胞を選択的に排除し、その結果、放射線照射または自然加齢マウスにおいて血液幹細胞を若返らせることが示されている(Yosef et al., 2016)。また、Bcl-2ファミリーの他の阻害剤であるナビトクラックス(ABT-263)もまた、インビトロおよびインビボにおいて効率的に老化細胞を除去することが示されている(Chang et al., 2016; Zhu et al., 2016)。老化細胞の薬理学的排除はまた、マウスにおいてアテローム性動脈硬化症状を軽減すること(Childs et al., 2016; Roos et al., 2016)、および椎間板変性を軽減すること(Chen et al., 2016)が示されている。
【００１１】
上記の治療は損傷および／または老化細胞に関して動物モデルにおいて有効であることが実証されているものの、ヒトにおいて同じ有効性を有するかどうかを評価するために試験されたことはない。むしろ、それらは、現在、抗癌療法としてヒト臨床試験において評価されているにすぎない。この理由は、上述した治療は、全て、腫瘍細胞および／または損傷および／または老化細胞だけでなく、健康な細胞においてアポトーシス応答も誘導することである。健康な細胞におけるこのアポトーシス応答は、一般的に、多くの抗癌療法と関連し、また、標準的な化学療法と日常的に関連する副作用（多くの場合消耗性である）の原因である。そのため、慢性疾患を治療するために、または予防的介入として、これらの治療を使用する際に得られる全体的な利益は、注意深く評価されるべきである。
【００１２】
したがって、上述した治療に関連する細胞傷害性副作用を伴わずに、損傷および／または老化細胞を排除することができる方法が必要とされている。好ましくは、このような方法は、老化細胞の存在に関連する病理または疾患の予防および／または治療に適用可能であるべきである。
【００１３】
さらに、van Deursenのグループのレビュー(Childs et al., 2015)など、この問題に関連するいくつかの参考文献に記載されているように、老化細胞を同定し、それらの機能的重要性をインビボで決定するための証拠について、普遍的に受け入れられている標準は現在ないことに言及しなければならない。生物学的試料における老化細胞の存在を検出するために現在使用されている方法(例えば、上記のvan Deursenのグループのレビューのボックス1に記載されているように、レポーター遺伝子が対応する遺伝子のプロモーターに連結されているものを含む、p16またはp21タンパク質のアップレギュレーションに基づく方法)は老化細胞に特異的ではないか、またはリソソーム関連β-ガラクトシダーゼ活性(SA-β gal)のアップレギュレーションに基づく方法で起こるように、それらは、当該方法を適用する前に細胞または組織を固定することを必要とする。これは、その適用性を妨げ、インビボでの検出方法のためのそれらの使用をほぼ不可能にする。この最後の欠点はヒトに適用される方法にはあまり関連しないが、老化の過程、特定の病理へのその関与、およびそれらの治療のための考えられる手段または標的についての知識を増加させるために使用される動物モデルにおける研究手段として検出が想定される場合に、より重大になる。したがって、特異性が向上した、そして好ましくは、インビボでのその適用を可能にする遺伝子の活性または発現の変化に基づいた、１つの老化細胞の検出する方法を持つことも推奨される。また、損傷および／または老化細胞の検出のためのこのような方法は、当該検出方法が被験体から採取される1つ以上の生物学的試料に対して実施される場合であっても、該細胞の存在に関連する1つ以上の病理、特にヒトについて予後的価値があり得ることもまた好ましい。
【００１４】
本発明者らは、前記問題を克服する方法を見出した。
【００１５】
提案する解決策を適切に説明するために、T細胞の活性化は、以下の少なくとも2つのシグナルを必要とすることを思い出されたい。免疫反応に特異性を付与する第1のシグナルは、主要組織適合性複合体(MHC)によって提示される外来抗原の認識後にT細胞受容体(TCR)を介して形質導入される。共刺激と呼ばれる第2のシグナルは、T細胞を増殖させ、機能的になるように誘導する。T細胞の同時刺激は抗原特異的でもMHC制限的でもなく、代わりに、抗原提示細胞(APC)によって発現される異なる細胞表面分子によって引き起こされる。さらに、阻害受容体もまた、T細胞上で同定されている。これらの阻害受容体の1つは、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)である。PD-1がその2つのリガンド:プログラム細胞死リガンド1および2(PD-L1およびPD-L2、それぞれCD274またはB7-H1、CD273またはB7-DCとしても知られている)のいずれかと相互作用すると、サイトカイン産生が減少し、また、T細胞生存が減少するため、自己免疫が減少し、自己寛容が促進される(Fagarasan and Honjo, 2000)。したがって、T細胞共刺激／阻害経路の操作は、ヒトおよび動物における免疫応答を刺激または抑制する大きな可能性を提供する。また、PD-1受容体はナチュラルキラー細胞(NK)によって発現され、このタンパク質に対する特異的抗体によるその遮断はナチュラルキラー細胞の増殖を誘導し、細胞傷害活性を増強する(Guo et al, 2016)。
【００１６】
T細胞およびNK細胞と同様に、多くの腫瘍細胞はPD-L1を発現し、癌免疫回避におけるPD-1の役割は十分に確立されている。PD-1およびPD-L1に対する抗体およびペプチドは癌治療のために開発されており(Ohaegbulam et., 2015; Pardoll、2012; Sharma and Allison、2015)、ある種の癌に対して非常に有効であることが証明されている。治療用抗PD-1抗体の例はニボルマブ(Bristol-Myers Squibb)、ペンブロリズマブ(Merck)、およびピジリズマブ(Medivation)であり、これらは、それぞれ、転移性黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、および、びまん性大細胞リンパ腫(DLBCL)の治療のために臨床的に承認されている。
【００１７】
腫瘍微小環境における免疫寛容の誘導におけるPD-L2の潜在的な役割はあまり注目されてない。おそらく、構成的・基礎的発現量が低く、また発現が制限されているためである。これは、当初、マクロファージおよび樹状細胞(DC)のような抗原提示細胞に限定されると考えられていたが、いくつかのグループはその後、PD-L1発現が微小環境刺激（Th2サイトカインが特に重要であると思われる）に依存して、より広範囲の他の免疫細胞および非免疫細胞において誘導され得ることを報告した。Rozaliらがレビュー論文(Rozali et., 2012)で結論付けたように、癌におけるPD-L2の標的化は有用な治療アプローチであり得ることを示すデータがあるが、ほとんどのPD-L2遮断研究はPD-L1の標的化と組み合わせて実施されている(Panekh et., 2009; He et., 2004)。他の免疫反応へのその関与でさえも明らかではないが、特異的siRNAでのその発現を阻害する効果についてのいくつかの報告を見出すことが可能である(例えば、Hobo et., 2010を参照のこと)。
【００１８】
しかしながら、本発明者らは、上述の問題に対する解決策を提供するのに役立つPD-L2に関する予想外の証拠を見出した。
【発明の概要】
【００１９】
本発明者らは、老化腫瘍細胞および非アポトーシス損傷細胞が、PDCD1LG2遺伝子(PD-L2リガンドの遺伝子)の転写レベル、およびそれにコードされるタンパク質であるPD-L2のレベルを高度に増大させることを初めて見出した。本発明者らは、DNA損傷および／または老化をもたらすインビボ手順がまた、PD-L2タンパク質およびその関連mRNAレベルのアップレギュレーションをもたらすことを観察した。本発明者らはまた、老化におけるPD-L2のアップレギュレーションを観察した。本発明者らは、損傷および／または老化細胞が、PD-L2のアップレギュレーションを介して、免疫抑制環境を誘導し、PD-1介在シグナル伝達の阻害を介して免疫系の検出を回避すると結論付ける。
【００２０】
本発明者らは、このような知見を利用して、損傷および／または老化細胞を検出および／または同定し、さらにはそれらを排除して、上記で言及した現在の治療に関連する細胞傷害性副作用を回避することを提案する。PD-L2／PD-1シグナル伝達の抑制を通して、これらの損傷および／または老化細胞によって生じる免疫寛容を破ることによって、この所望の利点を達成することが可能であるはずである。特に、PD-L2／PD-1シグナル伝達の低下または抑制に基づく方法は免疫細胞の再活性化、ならびに免疫系による損傷および／または老化細胞のクリアランスをもたらし、これは、損傷および／または老化細胞が関与する病理の改善につながるはずである。損傷および／または老化細胞の検出はまた、当該細胞の存在に関連する病理の予後／診断において有用であり得る。
【００２１】
現在まで、損傷および／または老化細胞をインビトロまたはインビボで検出するために利用可能な特定の方法はないと考えられる。損傷および／または老化細胞がPD-L2の発現をアップレギュレートするという本発明者らの観察の試験結果として、PD-L2に結合する分子を使用しPD-L2への当該分子の結合を検出することによって、PD-L2のmRNAレベルまたはPD-L2タンパク質レベルを分析することにより、または正常な状態における大部分の細胞におけるPD-L2の低レベルの発現を利用することによって、インビトロまたはインビボで上記細胞を同定することが初めて可能となった。そして、このような細胞の集積から生じる、例えば上述した慢性疾患および状態の診断を容易にする。
【００２２】
その結果、本発明者らは、a)損傷および／または老化細胞におけるPD-L2のアップレギュレーションがこれらの細胞の検出および／または同定を可能にすること;b)損傷および／または老化細胞の存在の検出は、これらの細胞の存在に関連する病理に予後的価値があり得ること;c)PD-L2／PD-1シグナル伝達の抑制は免疫を増強し、損傷細胞および老化細胞の免疫クリアランス／排除に寄与し得ること;および d)PD-L2／PD-1シグナル伝達経路の抑制を介した損傷細胞のクリアランス／排除は、損傷および／または老化細胞の存在に関連する病理に対して治療効果を有するはずであること、を提言する。
【００２３】
したがって、本発明の第1の態様において、PD-L2遺伝子の産物(mRNAまたはタンパク質)の量が決定され、そしてその量が基準よりも高い場合に損傷および／または老化細胞の存在が認められる、試料における損傷および／または老化細胞の存在の検出方法が提供される。
【００２４】
第2の態様において、損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾患の予後／診断のための方法であって、損傷および／または老化細胞の存在が本発明の第1の態様の方法によって決定される方法が提供される。
【００２５】
第3の態様において、損傷および／または老化細胞を除去する方法であって、当該細胞をPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと接触させる工程を包含する方法が提供される。
【００２６】
第4の態様において、本発明は、損傷および／または老化細胞の排除に使用するためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストに関する。
【００２７】
前記態様と強く関連するため、あり得る実施形態と考えられ得る第5の態様において、本発明は、損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾病の治療、改善または予防における使用のためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストに関する。
【００２８】
さらなる態様では、損傷および／または老化細胞の存在を特徴とする疾病を治療、改善または予防する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト／阻害剤を投与する工程を含む方法が提供される。
【００２９】
さらなる態様は、被験体の皮膚からのほくろの除去を含む、皮膚の美容向上方法であって、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを被験体に投与することを含む方法が提供される。
【００３０】
また、さらなる態様は、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを被験体に投与する工程を含む、被験体の寿命を延ばし、かつ／または、被験体の生物学的老化の非病理学的効果を改善または除去するための方法が提供される。
【００３１】
さらに別の態様において、損傷および／または老化細胞を同定する方法であって、PD-L2タンパク質またはPD-L2  mRNAに結合する分子を投与する工程；前記分子のPD-L2またはPD-L2 mRNAへの結合を検出する工程；および、前記分子のPD-L2またはPD-L2  mRNAへの結合を検出することができる細胞、または結合した前記分子のレベルが対照値より高い細胞を損傷または老化細胞として同定する工程を含む、方法が提供される。
【００３２】
別の態様において、損傷および／または老化細胞の治療に有利に使用され得る組成物であって、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストおよび薬学的に許容可能なビヒクルを含む組成物が提供される。
【００３３】
また、別の態様において、第4の態様に係る損傷および／または老化細胞の治療組成物を製造する方法であって、治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと、薬学的に許容されるビヒクルとを接触させる工程を含む方法が提供される。
【００３４】
本発明の他の一態様によれば、PD-12／PD-1相互作用のアンタゴニストであるモノクローナル抗体が提供される。
【００３５】
好ましくは、抗体はPD-L2および／またはPD-1に特異的に結合し、これら2つのタンパク質間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合フラグメントである。より好ましくは、抗体はPD-L2に特異的に結合し、その受容体PD-1へのその結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００３６】
したがって、本発明の他の一態様においては、損傷および／または老化細胞の同定に使用するための、PD-L2またはPD-L2  mRNAに結合する分子が提供される。
【００３７】
さらに、アッセイ試料中の損傷および／または老化細胞の有無を検出するためにPD-L2特異的なオリゴヌクレオチドのペアをqRT-PCRプライマーとして使用することも本発明の一態様であり、望ましくは、オリゴヌクレオチドのペアは配列番号9および配列番号10のペア、または配列番号19および配列番号20のペアである場合である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1は、PD-L2  mRNAが老化頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)細胞においてアップレギュレートされることを示す。(A)CDK4／CDK6特異的阻害剤であるパルボシクリブで7日間処置したヒトHNSCC細胞株UT-SCC-38およびUT-SCC-42BのSA-βガラクトシダーゼ活性を示す代表的な画像。パルボシクリブ処置は、劇的に増加した細胞サイズおよび増加したSA-βガラクトシダーゼ活性の結果として青色を示した核周囲顆粒の集積を示した(矢印)。スケールバー、100μm。(B)PD-L1およびPD-L2  mRNAレベルを定量的RT-PCRによって評価し、ハウスキーピング遺伝子βアクチンのmRNAレベルに対して標準化した。データは5つの独立した実験の平均+／-SDに対応し、未処置細胞と比較したPD-L1  mRNA量およびPD-L2  mRNA量の倍率変化（fold change）を示す。有意性(*P-0.05; ***P-0.001)を算出するために統計的t検定分析を行った。
【図２】図2は、PD-L2 mRNAが老化黒色腫細胞においてアップレギュレートされることを示す。(A)CDK4／CDK6阻害剤パルボシクリブ、遺伝毒性薬ブレオマイシンまたはMdm2阻害剤ヌトリンのいずれかで7日間処置したヒト黒色腫SK-Mel-103細胞のSA-βガラクトシダーゼ活性を示す代表的な画像。老化細胞は、劇的に増加した細胞サイズおよび増加したSA-βガラクトシダーゼ活性の結果として青色を示した核周囲顆粒の集積を示した(矢印)。スケールバー、100μm。(B)(A)の細胞を抗53BP1抗体で免疫染色し、代表的な画像を共焦点顕微鏡で撮影した。ブレオマイシン治療細胞のみが、DNA二重鎖破断(矢印)の存在を明らかにする核内53-BP1小構造体(nuclear 53-BP1 foci)を示した。スケールバー、50μm。(C)PD-L1およびPD-L2  mRNAレベルを定量的RT-PCRによって評価し、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンのmRNAレベルに対して標準化した。データは2〜5回の独立した実験+／-SDの平均に相当し、パルボシクリブ(パルボシクリブ)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびヌトリンで処置した細胞におけるPD-L1およびPD-L2  mRNAレベルの、未処置細胞に対する倍率変化(fold-change)を示す。
【図３】図3は、DNA損傷がPD-L2発現の強力な誘導因子であることを示す。マウス筋芽細胞系C2C12(A)およびマウス黒色腫細胞系HcMel3(B)およびHcMel12(C)を、指示された濃度で遺伝毒性薬物であるブレオマイシンおよびドキソルビシンで処置した。48時間後、定量的RT-PCRによりPD-L1とPD-L2  mRNAレベルを解析した。データは、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンのmRNAレベルに対して標準化した。このグラフは、未処置細胞に対するPD-L1およびPD-L2  mRNAレベルの倍率変化(fold change)を示す。3つのグループのそれぞれにおいて、左のバーは対照に対応し、中央のバーはブレオマイシンに対応し、右のバーはドキソルビシンに対応する。この実験は一度行った。
【図４】図4は、PD-L2発現が腎線維症においてアップレギュレートされることを示す。線維症は、片側尿管閉塞(UUO)によってC57BL6マウス腎臓で誘導した。(A)老化細胞の存在を、最適切断温度(OCT)化合物含浸組織切片のSA-βガラクトシダーゼ汚染によって評価した。さらに、細胞核をNuclear Red Fast(NRF)で染色した。老化細胞は、増加したSA-βガラクトシダーゼ活性の結果として青色を示した(矢印)。処置後12〜13日目に、(B)老化関連遺伝子p21およびIL‐6のmRNAレベル、ならびに(C)免疫リガンドPD‐L1およびPD‐L2のmRNAレベルを定量的RT‐PCRにより分析した。データは、ハウスキーピング対照遺伝子β-アクチンのmRNAレベルに対して標準化した。データは、4つの腎臓の平均+／-SDに対応する。有意性(** P-0.01; ***P-0.001; ****P-0.0001)を計算するために統計的t検定分析を行った。
【図５】図5は、PD-L2が肺線維症においてアップレギュレートされることを示す。(A)線維症は、単回用量のブレオマイシンの気管内送達によってC57BL6マウス肺において誘導した。損傷の14日後、SA-βガラクトシダーゼ活性を全臓器で分析した。老化肺(右側画像)は増加したSA-βガラクトシダーゼ活性を示すブルー染色を呈した。(B)PD-L1およびPD-L2のmRNAレベルを肺組織試料における定量的RT-PCRによって評価し、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のmRNAレベルに対して標準化した。データは、3〜5個の肺の平均+／-SDに対応する。統計的t検定分析を行って有意性(*P-0.05)を計算した。
【図６】図6は、SK-Mel-103マウス異種移植片が成長を停止させ、ビヒクルまたはパルボシクリブで処置すると老化することを示す。(A)ヒト黒色腫SK‐Mel‐103細胞を免疫不全nu／nuマウスに皮下接種した。腫瘍の体積が約200mm3である場合、マウスを強制経口投与によりパルボシクリブで処置し、腫瘍進行をカリパス測定により分析した。データは、9-11個の対照(実線)および10-14個のパルボシクリブ処置(破線)独立異種移植片の平均+／-SEMを表す。(B)全腫瘍においてSA-βガラクトシダーゼ活性を分析した。老化腫瘍(右)は、増加したSA-βガラクトシダーゼ活性を示すブルー染色を呈した。(C)SA-βガラクトシダーゼ活性を腫瘍切片上で分析した(上部画像)。増殖マーカーKi67の発現を、免疫組織化学法によって同じ腫瘍について評価した(下の画像)。パルボシクリブ処置マウスからの異種移植片は、増加したSA-βガラクトシダーゼ活性を示すブルー染色を呈し、老化細胞の存在が明らかとなった(右上の画像)。
【図７】図7は、老化SK-Mel-103マウス異種移植片がPD-L2をアップレギュレートすることを示す。(A)PD-L1およびPD-L2  mRNAレベルを、ビヒクルまたはパルボシクリブのいずれかで処置した免疫不全nu／nuマウスに皮下接種したヒト黒色腫SK-Mel-103細胞の定量的RT-PCRによって評価した。値はハウスキーピング遺伝子TATAボックス結合タンパク質(TBP)に対して正規化し、ビヒクル処置腫瘍に対して表した。グラフは、6〜7個の独立した異種移植片の平均+／-SDを示す。統計的t検定分析を行って有意性(***P-0.001)を計算した。(B)PD-L2レベルを、ビヒクルおよびパルボシクリブ処置腫瘍において、ウエスタンブロット法によって分析した。染色体抗構造維持(抗SMC1)タンパク質レベルをローディング・コントロールとして使用した。
【図８】図8は、高齢個体におけるPD-L2アップレギュレーションを示す。PD-L2(左)とPD-L1(右)mRNAレベルを若齢マウス(10週年齢)(灰色系棒)および高齢マウス(75週年齢)(白い棒)由来の肝臓における定量的RT-PCRにより評価した。値をハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対して正規化した。グラフは、4匹のマウスの平均+／-SDを表す。統計的t検定分析を行って有意性(*P-0.05)を計算した。
【図９】図9は、PD-L2およびPD-L1の転写調節における酵素阻害剤およびTLRアゴニストの効果を示す。(A)老化／SASP／DNA損傷応答に関与することが知られている酵素に対する市販の阻害剤:IKK阻害剤(50μM)、PIM阻害剤(1μM)、ロテノン(1μM)、JAK阻害剤(3μM)、ラパマイシン(50nM)およびメトホルミン(5mM)の存在下または非存在下で、500nMドキソルビシンで48時間治療した、またはピルベート枯渇培地中で培養したC2C12細胞におけるPD-L2  mRNAレベルを定量的RT-PCRによって評価した。(B)PD-L1  mRNAレベル(黒色バー)およびPD-L2mRNAレベル(黒色バー)を、以下のTLRアゴニスト:TLR1／2アゴニスト(Pam3CSK4、300ng／ml)、TLR2アゴニスト(HKLM、10OBcells／ml)、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)HMWおよびLMW、10μg／ml)、TLR4アゴニスト(LPS-EK、10μg／ml)、TRL5アゴニスト(FLA-ST、1μg／ml)、TRL6／2アゴニスト(FSL-1、100ng／ml)、TRL7アゴニスト(ssRNA40、5μg／ml)およびTLR9アゴニスト(ODN1826、5μM)の存在下または非存在下で6時間インキュベートしたC2C12細胞における定量的RT-PCRによって評価した。データをハウスキーピング遺伝子β-アクチンのmRNAレベルに対して正規化し、(A)ドキソルビシン処置細胞に対して、または(B)未処置細胞に対して表した。これらの実験は、1回または2回のいずれかで行った。第2の場合において、データは、2つの独立した実験の平均+／-SDを表す。
【図１０】図10は、(A)プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)のDNA配列、および(B)タンパク質配列を示す。
【図１１】図11は、(A)プログラム細胞死リガンド2(PD-L2)のDNA配列、および(B)タンパク質配列(B)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
上記で定義したように、本発明は、PD-L2遺伝子の産物(mRNAおよびタンパク質の両方)の発現が損傷および／または老化細胞においてアップレギュレートされるという予想外の発見に基づく。PD-L2アップレギュレーションはその公知の受容体PD-1によって媒介されるシグナル伝達の増加をもたらすと思われ、その結果、損傷および／または老化細胞は、当該細胞が免疫系によって排除されない有利な免疫抑制環境を誘導する。これは多くの方法および／または使用に対する適用性を有する非常に重要な知見であり、その多くは本発明の態様として本明細書に記載される。
【００４０】
第1の適用は、PD-L2アップレギュレーションが損傷および／または老化細胞を同定するために、および／または試料における損傷および／または老化細胞の存在を検出するために使用できることである。上述したとおり、損傷および／または老化細胞の同定のための確立された方法は現在のところ存在せず、特異性の欠如は主要な問題の1つである。基底／正常状態でのPD-L2発現は通常低く、限定されたタイプの細胞に限定されるので、細胞または試料におけるPD-L2アップレギュレーションを観察または決定することは、かかる目的のための前例のない方法を意味し、p16やp21などのタンパク質のアップレギュレーションに依存する方法よりも特異性が増大することを暗示する。
【００４１】
損傷および／または老化細胞を同定する方法、ならびに試料中の損傷および／または老化細胞の存在を検出する方法は、両方とも同じ原理に基づく。すなわち、PD-L2遺伝子(通常PDCD1LG2と命名される)の産物の発現を検出し、基準値に対する前記産物の濃度の上昇を観察することに基づく。したがって、原則として、上記損傷および／または老化細胞を同定するための方法は、試料中の損傷および／または老化細胞の存在を検出するための方法の特定の実施形態、つまり、試料の細胞は方法の実施を通して完全性を維持し、同じ試料中に存在する他の細胞に対して（例えば、細胞培養物、組織試料、または例えばメンブレンやポリマー支持体のような任意の種類の支持体に固定された細胞の分析の場合のように、試料中の位置により）同定可能な個々の実体として観察または処置することができるという、特定の実施形態として考えることができる。しかし、損傷および／または老化細胞の同定方法の最も頻繁な実施形態の1つは、1つの個体から採取された生物学的試料への適用であり、対照細胞に関して本発明者らによって観察された損傷および／または老化細胞におけるPD-L2のレベルの高度な増加であり、特定の事象が起こった場合の生物学的試料の特定の細胞の同定は通常、同じ試料にも存在する他の細胞にも存在しないマーカ(比色信号または蛍光信号など)の存在の検出によって視覚的に行われ、その結果、基準値は周囲の細胞における信号の不在とみなすことができることを考慮すると、いくつかの特徴は両方の方法に共通であるが、両方の方法を異なる方法として記載することがより明確であると考えられる。
【００４２】
試料における損傷および／または老化細胞の存在をPD-L2  mRNAレベルから検出することは、本願の実施例のいくつかのアッセイと同様、qRT-PCRによって行うことができる。かかる場合、基準値(reference value)は、本願のアッセイと同様にアッセイ試料と同じステップに付される損傷／老化細胞を含まないと考えられる対照試料において検出されるPD-L2  mRNAレベルとすることができる。対照試料は、好ましくは、損傷／老化細胞の存在以外は他のアッセイ試料とできるだけ多くの特徴を共有するように選択されるべきであり、例えば、同じ年齢または性別の被験体から抽出された同じ組織や、損傷／老化細胞を既に除いた組織または臓器の一部から抽出された、同じ個体から採取された試料である。しかしながら、基準値は、以前に得られた値でもよい。例えば、基準値は、多数の対照試料を分析した、以前の試料の研究の平均値として得てもよい。この後者の選択肢は、臨床において特に有用であり得る。損傷および／または老化細胞がアッセイ試料中に存在するという結論をより確実にするためには、少なくとも2倍、最も好ましくは少なくとも6倍以上の増大が好ましい。
【００４３】
より高いPD-L2発現レベルと損傷細胞および／または老化細胞の存在との間の関連が本願において開示されることを考慮すると、アッセイ試料において損傷および／または老化細胞のレベルを検出するためのqRT-PCRプライマーとしてのPD-L2特異的オリゴヌクレオチドペアの使用もまた、特に(好ましくは)配列番号9および配列番号10のオリゴヌクレオチドペア、または配列番号19および配列番号20のオリゴヌクレオチドペアが使用される場合に、本発明の一態様である。
【００４４】
PD-L2タンパク質の発現を測定する場合、PD-L2タンパク質の発現の基礎レベルが低いことを考慮すると、ウエスタンブロットおよび対応バンドの視覚同定が、損傷／老化細胞がアッセイ試料中に存在することを決定するのに十分であると思われる。好ましくは、対照試料が同じアッセイに含まれており、アッセイ試料に対応するシグナルが対照試料に対応するシグナルよりも高い場合(対照試料におけるシグナルは検出されるのに十分に高くないかもしれないので、その強度は0としてもよい)、損傷／老化細胞がアッセイ試料中に存在すると結論される。したがって、例えば、アッセイ試料として、生物学的試料(例えば、腎臓または肺の試料)、またはこのような臓器の細胞の培養物中のPD-L2タンパク質のレベルを検出すること；PD-L2タンパク質のレベルを対照試料のレベルと比較すること；およびアッセイ試料においてPD-L2が過剰発現されること、を決定することは、損傷した細胞および／または老化細胞の存在がアッセイ試料において認められる場合、本発明の損傷および／または老化細胞の検出法をどのように実施するかの考えられる例であり得る。
【００４５】
ウエスタンブロットによる判定は、上記方法の特定の実施形態と考えることができ、PD-L2  mRNAまたはタンパク質に結合する分子がアッセイ試料に添加され、損傷／老化細胞がアッセイ試料中に存在するかどうかを判定するために、かつ／または細胞を損傷／老化細胞として同定するために、前記分子の結合が判定される。
【００４６】
PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質に結合する分子は標識されていること、すなわち、分子の一部として、その存在を容易に検出および定量できる化学基、残基または部分（moiety）を含むことが好ましい。このような分子の典型的な例は、可視光の周波数の範囲で検出可能な着色信号によって可視化され得る部分を有するものや、蛍光体(fluorophore)で起こるように、異なる周波数の光で励起された後に周波数の信号を放出するものである。別の可能性としては、標識されるか、または検出が容易な分子が出現または消失する反応を生じ得る第２の分子の添加によってその存在が判定可能なように分子を選択することである。その意味で、一次抗体が使用され、その結合が、蛍光体などの標識や、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの着色分子を生じ得る酵素に結合する二次抗体によって明らかにされるイムノアッセイは当業者に周知であり、免疫組織化学アッセイ、ELISAの両方に容易に適合される。
【００４７】
PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質に結合する分子は、好ましくは被験体の種を考慮して、検出対象であるPD-L2遺伝子の産物に応じて選択される。分子がPD-L2  mRNAに結合することが意図される場合、添加する分子は当該mRNAに相補的な分子であり得、好ましくは結合が特異的であるように注意深く選択される。例えば、添加された分子は、前記mRNAのフラグメントに相補的であり、それに結合することができるオリゴヌクレオチドであってもよく、例えば、結合を増加させるために、または細胞への侵入を容易にするために化学的に修飾された天然siRNAおよびその類似体(アナログ)である。当業者は公的データベースにおいて利用可能なcDNA配列からこのようなオリゴヌクレオチドおよびその類似体を容易に設計できる。cDNA配列は、例えば、Homo sapiensおよびMus musculus PD-L2  cDNAにそれぞれ対応する、以下に記載される参照配列NM_025239.3(配列番号3)およびNM_021396.2(配列番号25)である。
【００４８】
原則として、損傷および／または老化細胞の存在を決定する方法、ならびに損傷細胞／老化細胞を同定する方法の両方は、被験体から採取された生物学的試料(例えば、生検試料(biopsy)または血、尿、唾液または脳脊髄液などの生物学的流体の試料)のみならず、生きものを含む全生物も含む、「アッセイ試料(assayed sample)」の概念の広義の意味に適合する。これは、β-galシグナルの判定の1つのような方法に関して有利である。しかしながら、全生存動物における損傷および／または老化細胞の存在の判定を行うことは、好ましくは、PD-L2の存在／レベルに関連するシグナルを容易に検出し(例えば、画像化すること)、このような画像から損傷細胞／老化細胞のあり得る存在を判定する手段を提供することを示唆する。これは、通常、PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質に結合することができる少なくとも1つの分子を生体に投与することを含み、この分子は判定のために使用され得る画像において容易に変換されるシグナルを放出し、または、小動物においては容易に可視化され得るシグナルを放出する。したがって、好ましくは、ヒトおよび他の哺乳動物について、とりわけ臨床または獣医学的診断目的のために、「試料」の概念は、以前に得られた被験体(ヒトまたは他の哺乳動物)の身体から採取または抽出された試料、例えば、生検試料または生理学的流体(例えば、血液、唾液、尿、涙液分泌物、脳脊髄液など)の試料、該試料から得られた細胞、該細胞の培養物、確立された細胞株の培養物、または該試料のいずれかから個別化された細胞、に限定される。研究目的のために使用される動物モデルの場合、動物全体における損傷／老化細胞の存在の検出(または該細胞の同定)は特に、動物が死んだ後に有用であり得、その結果、特にその死後に、動物全体モデルにおいて実施される損傷および／または老化細胞の存在を決定する本発明の方法の変形例は、本発明の実施形態と考えられ得る。
【００４９】
損傷および／または老化細胞を同定できるようにするために、PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質に結合する分子は、医療用イメージング(medical imaging)中に体内の構造または流体のコントラストを増強するために使用され得る従来の造影材料(contrast material)を含み得る。このような物質は、磁気共鳴イメージング(MRI)、コンピュータ断層撮影(CT)および／または光学イメージング(OI)を使用して見ることができる。
【００５０】
造影材料に使用される材料を注意深く選択することにより、損傷および／または老化細胞の存在に関連する様々な疾患および状態の診断および／または治療のいずれかにおいて上記分子を使用することが可能になる。
【００５１】
MRI、CTまたはOIを用いて可視である造影材料は、金属または非金属材料を含んでもよい。造影材料は、磁性材料または非磁性材料を含むことができる。
【００５２】
造影材料が磁性である実施形態では、造影材料はMRI造影材料を含んでもよい。造影材料は、常磁性または超常磁性材料を含むことができる。例えば、造影剤は、鉄、ニッケル、コバルト、またはジスプロシウム、またはこれらの元素の1つ以上を含有する酸化物または合金などの化合物を含んでもよい。好ましくは、造影剤はマグネタイト(Fe3O4)を含む。
【００５３】
造影剤が非磁性である実施形態では、造影剤がMRI、CTまたはOI造影剤を含んでもよい。例えば、造影材料は、ガドリニウム、金、ヨウ素または硫酸ホウ素を含んでもよい。これらの材料の各々は、MRI、CTまたはOI造影剤のいずれかとして使用され得る。好ましくは、造影材料はガドリニウムを含む。
【００５４】
PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質に結合する分子は、生体分子(すなわち、生物内で天然に見出され得る分子)またはその類似体であり得、これは、その生物学的活性を部分的または完全に維持しつつ、天然分子に関して1つ以上の人工的になされた改変を含む。分子、その類似体の生体分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、化合物、遺伝物質、小分子、薬剤またはRNAi試薬を含むことができる。好ましくは、生体分子はPD-L2タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、この抗体またはそのフラグメントは、上記で定義されるような、その検出を容易にする任意の種類の標識(例えば、上記で言及されるような造影剤)を含む。いくつかの市販の抗PD-L2抗体、特に、例えば、抗ヒト抗体PD-L2(D7U8CTMXP)(カタログ番号82723、Cell Signal Technologies社)、MABC969抗PD-L2抗体、クローン24F.10C12(カタログ番号MABC969、Merck Millipore社、スペイン)、および精製された抗ヒトCD273(B7-DC、PD-L2)抗体クローンMIH18(Biolegend社、日本)、または抗マウスPD-L2(クローンTY25)(カタログ番号BE0112、Bio X Cell社、米国)などの、ウエスタンブロットまたは他の免疫検出もしくは免疫組織化学技術で既に使用されているものなど、その目的に適合させることができる抗PD-L2抗体が利用可能である。
【００５５】
標識部分の代わりに、またはそれに加えて、分子は、第２の添加分子に結合するため（磁性ビーズの場合のような第２の添加分子の性質のため）、例えば、アフィニティークロマトグラフィによってその単離を容易にする部分を含むことができる。
【００５６】
好ましくは、造影材料は生体分子に共有結合される。
【００５７】
さらに、それは、p16に基づく判定の2016年にvan Duersenのグループによって記述されたアプローチ(上記文献を参照)に類似のもの（すなわち、そのレベルが判定される分子は直接PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質ではなく、PD-L2プロモーターに作動可能に連結された遺伝子から発現されるmRNAまたはタンパク質である）に従い、損傷および／または老化細胞の存在の判定方法、ならびに該細胞の同定方法の両方と適合する。この構築物は、通常、発現ベクターの一部であるか、または研究のための動物モデルの場合、ゲノムに組み込まれ得る。発現ベクターは、目的の特定の臓器に直接的に投与され得るか、または特定の組織に優先的に投与されるように設計され得る。かかるアプローチは、遺伝子から発現されるタンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)などのような、励起時の発光のようにその検出を容易にする特徴を有するレポータータンパク質である場合に特に有用である。このようなアプローチにより、融合タンパク質の発現も可能になり。この場合、タンパク質の追加部分には、テイルを有するタグ付きタンパク質のように、追加のアッセイまたはその精製を容易にする異なる特徴がある。
【００５８】
損傷および／または老化細胞を検出するための方法(または損傷および／または老化細胞を識別する方法)は、損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾患または状態の予後（prognosis）において有用であり得る。損傷および／または老化細胞の検出は、上記で説明したように行われ。すなわち、本発明の方法によって行われ、その結果、該方法は、損傷および／または老化細胞に関連する疾患の予後／診断のための方法として記載され得、ここで、損傷および／または老化細胞の存在は、本発明の前記細胞の検出方法または同定方法によって決定される。好ましくは、上記のように、上記予後または診断法が実施される試料は、疾病が診断または予後される被験体の身体から以前に得られ、採取され、または抽出された試料、例えば、生検試料または生理学的流体(例えば、血、唾液、尿、涙液分泌物、脳脊髄液など)の試料、または前記試料から得られた細胞、または被験体から最初に採取された試料から得られた加工試料に限定される。被験体は、好ましくはヒトまたは別の哺乳動物である。
【００５９】
損傷および／または老化細胞の検出方法(または損傷および／または老化細胞の同定方法)は、損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる特定の疾患または状態を直接的に予測または診断することを可能にしないが、アッセイ試料が由来する被験体はそのような疾患または状態のうちの1つを発症する危険性の被験体であること(その明白な例は、放射線／化学療法後の損傷および／または老化細胞の存在に関連する腫瘍退縮または転移促進のリスクがあること)、または損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾患におそらく罹患している被験体であることを示し、この疾患は適切な処置を提供するために、好ましくは続いて同定または確認されるべきである。そのため、損傷および／または老化細胞の存在を検出することは、一定の予後的または診断的価値を有すると考えられる。例えば、PD-L2過剰発現が腎臓または肺の試料において検出されたために損傷および／または老化細胞が存在することを決定することは被験体が線維性腎臓または線維性肺(アッセイ試料に依存する)を患っているか、または将来患うことの指標であり得、これは確認されなければならないが、同時に、好ましくは抗体のようなPD-L2アンタゴニストが損傷および／または老化細胞を排除するために治療の一部として有利に添加され得ることの指標でもある。同様に、PD-L2過剰発現の評価により、損傷および／または老化細胞が、癌を患っているか、または癌を患ったことがあり、化学療法または放射線療法を受けた被験体から採取された試料中に存在するという判定をすることは、被験体が転移を発症する危険性があること、または腫瘍退縮を示すことの指標、および、より注意深いフォローアップおよび頻繁なモニタリングが実施されなければならないことの指標であると考えられ得る。
【００６０】
したがって、本発明の別の態様として、損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾病または状態を予測または診断するための方法であって、アッセイ試料における損傷および／または老化細胞の存在の検出のための本発明の方法が実施される方法、すなわち、PD-L2遺伝子の産物(mRNAまたはタンパク質)またはPD-L2プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の産物のレベルが決定され、そして該レベルが基準より高い場合に損傷および／または老化細胞の存在が認められる方法が考えられる。基準値は上述または後述するように0とすることができる。好ましくは、アッセイ試料は被験体から得られたかまたは取り出された生物学的試料(例えば、血、尿、生検試料)である。
【００６１】
上述のように、PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質に結合する分子(例えば抗体)を、PD-L2  mRNAまたはPD-L2タンパク質の検出を視覚的に可能にするか、または適用された技術によって分子を可視化する際に可能にするメーカーに連結することにより、アッセイ試料の画像を撮ることができ、また、当該画像を単純に観察することにより（例えば、単にマーカーのシグナルが存在するか否かを観察することにより）、損傷および／または老化細胞の存在の有無を確認することができるようになる。その結果、損傷および／または老化細胞の存在の有無の決定を、直接的に試料を観察する必要なしに、または決定を下す瞬間に存在させる必要なしに、さらには技術的知識を有する必要なしに、画像の観察から下すことができる。
【００６２】
先の段落で論じた検出および予後判定方法に加えて、本願で開示される知見は、同じ発明概念に基づく、同じ発明の追加の態様として提案された他の異なる態様にも適用可能である。
【００６３】
PD-L2およびPD-1の相互作用は、T細胞および他の免疫細胞に対して決定的に重要な負の共刺激シグナルを提供することが見出された。したがって、損傷および／または老化細胞を排除するためにPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを投与する方法が本明細書に提供される。PD-L2とPD-1の間の相互作用のアンタゴニストは、PD-L2および／またはPD-1と特異的に結合し、PD-L2のPD-1と相互作用または結合する能力を阻害／遮断／抑制する生体分子(例えば、抗体またはペプチド)でありうる。PD-1または好ましくはPD-L2の発現の低下として、PD-1／PD-L2相互作用およびPD-L2の生物学的活性の量も低下させ、本明細書中で使用されるアンタゴニストの規定内に包含されるのは、PD-1および／またはPD-L2発現を低下させることができる化合物、例えば、化合物、薬剤、低分子、およびRNA妨害試薬（マイクロRNAまたはsiRNAなど）、および、それらのアナログ、さらには遺伝物質である。
【００６４】
結果として、本発明のアンタゴニストは、損傷および／または老化細胞に対する免疫応答を増加させる。本明細書に記載されるように、本発明者らはT細胞媒介免疫反応を抑制し、自己免疫を制御するのに通常役立つ免疫経路の破壊が、損傷および／または老化細胞が宿主の免疫反応を回避することができる機構を提供すると結論付ける。したがって、本発明者らは、そのような機構を妨害することが、損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾患を治療、改善または予防するために有用であることを提案する。したがって、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを投与する方法は、考えられる実施形態として、治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストがそれを必要とする被験体に投与される、損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾病を治療、改善または予防するための方法を有すると言える。また、本発明は、損傷および／または老化細胞の存在に関連する疾病を治療、改善または予防するためのPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを提供する、とも言える。
【００６５】
アゴニストは受容体に結合することによって単一の細胞応答をオンにし、細胞内での変化のための生化学的メカニズムを開始する。アンタゴニストは、受容体とアゴニストとの相互作用を阻害／遮断／抑制することによって当該応答をオフにする。より広い意味では、リガンドまたは受容体の発現の阻害剤もアンタゴニストと考えることができる。それらは受容体とアゴニストとして作用するリガンドとの相互作用を阻害／抑制するからである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストはPD-L2および／またはPD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００６７】
上記のように、PD-1に対する承認された抗体は、癌の治療のために既に臨床的に使用されている。本発明者らは、本発明の可能な実施形態として、これらの抗PD-1抗体を、老化を含む、損傷および／または老化細胞に関連する他の疾患および状態を治療するという別の目的に使用することを提案する。
【００６８】
「阻害」、「遮断（ブロック）」および「抑制」との用語は、本明細書では、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性の任意の統計的に有意な減少を指すために互換的に使用される。例えば、「阻害」は、生物学的活性の少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または約100%の減少を指すことができる。
【００６９】
したがって、「阻害」、「遮断（ブロック）」または「抑制」との用語が、例えば、T細胞活性化および／またはT細胞媒介性の直接的または間接的な細胞溶解活性に対するPD-L2および／またはPD-1活性に対する効果を記載するために適用される場合、この用語は例えば、アンタゴニスト(例えば、抗PD-L2抗体および／または抗PD-1抗体)が、アンタゴニストが結合する抗原の活性を統計的に有意に低下させる能力をいう。例えば、「阻害」、「遮断（ブロック）」または「抑制」との用語は、抗PD-L2抗体および／または抗PD-1抗体がPD-L2またはPD-1の活性を減少させる能力、および／または、該抗体が、未処置細胞集団(すなわち、対照)における発現および／またはT細胞媒介細胞溶解活性と比較して、インビトロまたはインビボでT細胞媒介細胞溶解活性を増加させる能力を指すために使用することができる。「阻害」、「遮断（ブロック）」または「抑制」との用語はまた、本明細書において、アンタゴニスト(例えば、抗PD-L2または抗PD-1抗体、あるいはその抗原結合フラグメント)の、PD-L2がPD-1と相互作用する(すなわち、PD-1に結合する)能力を減少させる能力を指すために使用される。
【００７０】
ブロッキング抗体（アンタゴニストまたは遮断剤）は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または減少させるもの、例えば、PD-L2がPD-1と相互作用するかまたはPD-1に結合する能力を阻害または減少させるものである。特定の実施形態において、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。望ましくは、生物学的活性は少なくとも10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、または約100%低下する。
【００７１】
本文脈において使用される用語「抗体」は免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはこれらの組合せなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において使用される用語「抗体」はインタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、Fab、Fab'、F(ab;)2、およびFvフラグメントなどの抗体フラグメント、一本鎖突然変異体、少なくとも2つのインタクトな抗体から生成される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部を含む融合タンパク質、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。したがって、一実施形態では、抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要クラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそれらのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる公知のサブユニット構造および三次元立体配置を有する。本発明において使用される抗体は、ネイキッドであるか、または毒素や放射性同位体のような他の分子にコンジュゲートされて、抗体薬物結合体(ADC)を形成し得る。
【００７２】
「抗体」または「免疫グロブリン」との用語は、本明細書中で交換可能に使用され、抗体全体および任意の抗原結合フラグメントまたはその単鎖を含む。典型的な全抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの光(L)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書中ではVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、CH1、CH2およびCH3の3つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLを含む。VHおよびVL領域は、相補決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得、より保存された領域(フレームワーク領域(FW)と呼ばれる)が点在する。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFWから構成され、FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4の順序アミノ末端からカルボキシ末端に配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む宿主組織および因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。本発明の例示的な抗体には、典型的な抗体、scFv、およびそれらの組み合わせが含まれ、ここで、例えば、scFvは典型的な抗体の重鎖および／または軽鎖のいずれかのN末端に(例えば、ペプチド結合を介して、または化学リンカーを介して)共有結合しているか、または典型的な抗体の重鎖および／または軽鎖に挿入されている。本明細書中のさらなる例示的な抗体は、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の改変された免疫グロブリン分子を含む。本開示の目的のために、用語「抗体」はまた、標的化される目的の細胞上の発現ペプチド(例えば、PD-L2)に結合する、免疫グロブリン由来の天然および／または合成アミノ酸配列(例えば、ペプチボディ)を含むFc融合タンパク質を包含する。
【００７３】
「抗原結合フラグメント」との語句は、インタクトな抗体の一部分を指し、および／またはインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって実施することができることが知られている。抗体フラグメントの例としてはFab、Fab'、F(ab')2およびFvフラグメント、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ(diabody)、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
特定の実施形態において、本開示の方法に従って使用される抗体は、減少したエフェクター機能を有する。いくつかの実施形態では、抗体がエフェクター機能を担うFc領域に突然変異を含む。
【００７５】
好ましくは、アンタゴニストは抗PD-L2抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００７６】
PD-L1と比較して、PD-L2の構成的基礎発現(constitutive basal expression)は低く、マクロファージおよび樹状細胞のようなプロフェッショナルAPCに限定されると最初は考えられていたが、近年、PD-L2はケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞および乏突起膠細胞を含む種々の非プロフェッショナルAPCにおいても発現されることが見出されている(Rozali et al., 2012)。その結果、抗PD-L2抗体の治療的使用は、今まで記載されていない。
【００７７】
興味深いことに、PD-1に対するPD-L2の相対親和性は、PD-1に対するPD-L1よりも2〜6倍高いと計算された(Youngnak et al., 2003)。
【００７８】
さらに、上記に示唆されるように、PD-L1と比較して、PD-L2の構成的基礎発現は低く、より少ない細胞型に限定されるという事実のために(Rozal et al., 2012)、本発明者らは、PD-L2を標的にする方がPD-L1またはPD-1を標的にするよりもより有効であり、かつ、副作用がはるかに少ないと予想する。
【００７９】
したがって、本発明は、損傷および／または老化細胞を排除するための前例のない非細胞傷害性の解決策を提供し、また、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニスト、特に抗PD-L2抗体の治療的指標（すなわち、複数のヒト疾患における免疫系による老化および／または損傷細胞の排除を防止する免疫寛容を破壊すること）を提供する。
【００８０】
PD-L2／PD-1相互作用の他のアンタゴニストは当該分野で公知の技術を使用して容易に同定および調製され得、次いで、損傷および／または老化細胞を除去するために使用され得る。本発明者らは、このような細胞がPD-L2の発現をアップレギュレートすることを示した。
【００８１】
本発明で使用され得る他のアンタゴニストとしては、タンパク質、ペプチド、化合物、遺伝物質、小分子、薬剤、またはRNAi試薬が挙げられ、すべて、リガンド／受容体相互作用を破壊または予防することができる。
【００８２】
アンタゴニストがPD-L2およびPD-1の相互作用を阻害できることを確認する方法も知られている。
【００８３】
アンタゴニストが抗体である場合、PD-L2およびPD-1の相互作用を阻害することが事前に確認されれば、以前から知られている、PD-1、好ましくはPD-L2に対する既知の抗体、特には市販されている抗体を使用することができる。例えば、市販の抗体である抗ヒトPD-L2(クローン化TY25)(カタログ番号BE0112、Bio X Cell社、米国)または抗ヒト抗体であるMABC969-PD-L2抗体、クローン24F.10C12(カタログ番号 MABC969、メルク・ミリポア社、スペイン)、および精製抗ヒトCD273(B7-DC、PD-L2)抗体クローンMIH18(バイオレジェンド社、日本)が、かかる目的のために使用することができる。好ましくは、新たに得られた抗体が使用される。
【００８４】
一般的な抗体、特にモノクローナル抗体を得るための方法は、当業者に周知である。PD-1または好ましくはPD-L2に対する抗体は、治療効果を求める哺乳動物とは異なる宿主動物にPD-1またはPD-L2全タンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープを投与することによって、「Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition」（E.A. Greenfield編、2014年）などの古典的な実験マニュアルに記載されているような公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は特に、最初にKohlerおよびMilstein(1975)により説明されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Cote et al., 1983)、またはEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985)のような、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術によって調製および単離され得る。あるいは上述したように、Fabおよび／またはscFv発現ライブラリーを構築して、PD-1受容体またはPD-L2リガンドに対して所望の特異性を有するフラグメントを迅速に同定できるようにしてもよい。
【００８５】
特定の特異性を有する抗体の設計のためには、例えば、抗体を生成する前に標的化されるべき抗原の特定のドメインまたは領域の免疫原としての選択を容易にする、タンパク質の注釈付き配列またはDNAコーディング配列をリソースとすることが有利である。NCBI Reference Sequence (NC_000007.14, Homo sapiens annotation release: 107(2015年9月29日の現在のリリース))またはUniProtKB P16671(所望される場合、抗体を生成する前に標的化または変異されるべき抗体の特定のドメインまたは領域を免疫原として選択するため)。
【００８６】
ヒトプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)のmRNAに対応するDNA配列(2115塩基対)(GenBank受託番号NM 005018、バージョンNM_005018.1)を、配列番号1および図10Aに示す。
【００８７】
ヒトプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)のタンパク質配列(288アミノ酸)を、配列番号2および図10Bに示す。また、NCBI受託番号NP 005009, version NP_005009.1を用いて見出すこともできる。
【００８８】
ヒトプログラム細胞死リガンド2(PD-L2)(GenBank受託番号NM_025239、バージョンNM_025239.2)のDNA配列(2418塩基類対)は、配列番号3および図11Aに示されている。
【００８９】
ヒトプログラム細胞死リガンド2(PD-L2)またはヒトプログラム細胞死1リガンド2(PDCD1LG2)のタンパク質配列(288アミノ酸)を配列番号4および図11Bに示す。また、NCBI受託番号NP 0079515、バージョンNP_079515.2を用いて見出すこともできる。
【００９０】
ヒトでの使用を意図した抗体はマウスなどの非ヒト免疫系で作製することができるが、有害反応を回避するために、ヒトへの投与を可能にするにはヒト化が必要であり得る。ヒト化抗体は、最初に非ヒト種において生成され、そのタンパク質配列がヒトにおいて天然に産生される抗体改変体との類似性を増加させるように改変されており、その結果、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列が残存する、抗体(通常、モノクローナル抗体)である。ヒト化後でさえ、ヒト化抗体のアミノ酸配列は、ヒトにおいて天然に存在する抗体とは部分的に異なる。例えば、AlmagroおよびFransson(2008)によって概説されているように、抗体ヒト化のための当業者にはいくつかのプロセスが公知であり、例えば、以下が挙げられる：マウス-ヒト(ヒトFcにスプライシングされたマウスFab)キメラの産生を介するヒト化(このキメラは、Fab部分のアミノ酸配列の選択的改変によってさらにヒト化され得る);「ドナー」(非ヒト抗体)の1つ以上のCDRセグメントの挿入;ヒト抗体の対応するセグメントを置換することによる「ドナー」(非ヒト抗体)の1つ以上のCDRセグメントの挿入(これは哺乳動物細胞培養において発現し得る構築物を作製するための組換えDNA技術を使用して行われ得る)、または微生物もしくはウイルス(ファージディスプレイにおけるように)または無細胞抽出物(リボソームディスプレイにおけるように)によってディスプレイされるヒトRNAから通常誘導される抗体遺伝子ライブラリーを作製することによって非ヒト哺乳動物の使用を回避することさえも可能);適切な中間産物(通常、FabまたはscFvのような抗体フラグメント)の選択;および完全な抗体を得ること(再度、組換えDNA技術)。ヒト化方法としてはいくつかの特許文献に専門的に記載されており、例えば、Genentechに譲渡された米国特許第6054297号明細書、米国特許第5225539号明細書、および米国特許第4816397号明細書などの特許文献も有用な参考文献である。
【００９１】
いったん得られると、または分子が以前に知られており、そして上記の抗PD-L2抗体として商業的に入手可能でさえある場合、以前の臨床試験に対する治療的使用のための候補としてそれらを確認するための方法もまた、当業者に公知である。例えば、腎線維症の場合、腎線維症の動物モデルは、１）処置前のPD-L2過剰発現の確認、および、２）その後の、抗体のようなPD-L2アンタゴニストの投与が損傷および／または老化細胞の低下を含む疾患の症状を改善することを検証するための両方に使用され得る。癌に関しては、動物モデル(マウス、ラット等)へ異種移植片(例えば、黒色腫移植片)を注入し、化学療法剤(例えば、ドキソルビシン等)とPD-L2アンタゴニスト、例えば、抗PD-L2抗体(既に知られているもの、市販されているもの、または新しく開発されたものでもよい)とを組み合わせて投与し、そして、老化細胞の排除を含む腫瘍体積の減少が観察されることは、当該アンタゴニストが、臨床試験（癌の治療におけるその治療効果、特に化学療法剤との併用における治療効果が最終的に確認される）の候補であると考えられることを良好に支持するものである。
【００９２】
このようなアンタゴニストは、損傷および／または老化細胞の排除が望まれる任意の状態、または、損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾患を治療、改善または予防するのに使用する際に適切であり得る。このような疾患には、例えば、変性疾患、２型糖尿病、サルコペニア、白内障、放射線誘発口腔粘膜炎、脳動脈瘤、心臓動脈瘤、緑内障、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、腸管疾患、変形性関節症、および椎間板変性(inverted disc degeneration)が含まれる。
【００９３】
本発明によって(特に、上述したように、予後または診断の後に)治療、改善または予防され得る、上記に列挙された疾患および状態以外の他の疾患および状態としては、以下のものが挙げられる：
新生児早老症のヴィーデマン・ローテンシュトラウク症候群、成人早老症のウェルナー症候群、ハチンソン・ギルフォード症候群、ロトムント・トンプソン症候群、マルビル・スミス症候群、コケイン症候群、先天性角化異常症(Dyskeratosis Congenita)、特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis)、肝線維症、腎線維症、口腔粘膜線維症、心臓線維症、膵臓線維症、癌、再生不良性貧血(aplastic anaemia)、肺気腫、軟骨変性、肥満、黄斑変性、緑内障、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、腎移植。線維性疾患は、その下にある臓器または組織のアーキテクチャおよび機能を消失させる、細胞外マトリックスタンパク質（最も顕著にはコラーゲン）の異常な沈着を特徴とする変性疾患の一例である。これらの疾患は多数の人々に影響を及ぼすが、現在のところ、それらの進行を予防するのに有効であることが証明されている治療はない。
【００９４】
線維症(fibrosis)は、典型的には炎症または損傷の結果として、体内の多くの組織で起こり得る。線維性疾患の例は、全身性硬化症、肺線維症、腎線維症、心線維症および肝線維症、脳グリア瘢痕およびアテローム性動脈硬化症である。老化細胞の集積は、線維性病理において一般的な事象である。老化細胞は、それらの分泌因子(SASP)の媒介によって、これらの病理の症状および進行の主な原因である慢性炎症を引き起こす。その結果、老化細胞を標的とすることは、線維性疾患に対する有望な治療アプローチの可能性を提供する。
【００９５】
損傷および／または老化細胞はまた、母斑および創傷治癒後の皮膚瘢痕などの良性病変にも存在する。本発明はまた、老化を受けたメラニン形成母斑を含む表皮の美容改善、例えば、ほくろの除去に関する。したがって、本発明のさらなる態様は被験体の皮膚からのほくろの除去を含む、皮膚の美容向上方法であり、この方法は、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを被験体に投与する工程を含む。
【００９６】
損傷および／または老化細胞はまた、老化した生物に蓄積し、寿命に悪影響を及ぼす。したがって、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストの使用(および、結果として、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと、生物の損傷および／または老化細胞を接触させる工程を含む、生物の損傷および／または老化細胞を排除する方法)は、老化に関して以下の二重の効果を奏し得る。すなわち、主に老化に密接に関連する疾患、障害または状態(例えば、変性疾患)に関する治療効果と；寿命の延長、生物学的老化の減少、および／または老化効果(例えば、病理学的量に達しない美容効果または可動性)の改善または排除に関連する非治療効果である。この二重の効果はまた、本明細書の老化抑制剤の定義に従って、老化抑制剤としての化合物の使用に内在する。したがって、本発明の一態様はまた、被験体における生物学的老化の寿命を延ばし、および／または非病理学的効果を改善または除去するための方法であって、特に被験体が成人(ヒト被験者の場合は18歳を超える)または高齢成人(その種において一般に健康であり、慢性疾患を有さない生命の期間よりも歳をとっている個体、ヒトの場合は通常少なくとも25歳を超え、より頻繁には少なくとも40歳を超えることを意味する)である場合に、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを被験体に投与する方法を含む方法である。したがって、本発明はまた、化学療法または放射線療法の副作用、および／または、化学療法または放射線療法による治療によって引き起こされる老化の加速の軽減のために使用され得る。化学療法または放射線療法による治療は、非癌性の健康な組織に損傷を与え、これらの組織における細胞老化を促進し、これらは副作用の病理学的役割を果たす。本発明はまた、PD-L2／PD-1アンタゴニストを、細胞の損傷または老化を促進することが知られている他の化合物、治療または薬剤と組み合わせて使用することを包含し、これらには、任意の種類の放射線、すなわち、非医療用放射線と、医療目的（例えば、X線などの診断目的、または、がんや一部の皮膚障害に適用される放射線療法などの治療目的）で照射される「医療用放射線」の両方が含まれる。したがって、化学療法、放射線療法、および／または抗レトロウイルス薬、コルチコイド、PPARガンマアゴニストなどの損傷および／または老化細胞を促進する任意の他の薬物、治療または薬剤、および／またはがん治療を目的としない放射線への曝露と併用するための、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストもまた、本発明の一態様である。本明細書において、「併用（組み合わせ）」は、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと一緒に薬物、治療または薬剤を同時に投与（適用）することを含むが、後にPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを投与することも含む。
【００９７】
損傷および／または老化細胞はまた、例えば、癌を治療するために使用されるスタンダードな放射線療法および化学療法によって生じる癌療法誘発性遺伝毒性ストレスに応答して産生され、腫瘍退縮に負の影響を及ぼし、癌生存者の健康に有害な影響を及ぼすことが示されている。CDK4キナーゼおよびCDK6キナーゼに対する選択的阻害剤であるパルボシクリブ、リボシクリブおよびアベマシクリブなどの化学療法薬は、ほとんどの腫瘍細胞において老化応答を誘導する。さらに、さらなる老化誘導化学療法が将来開発される可能性が高い。したがって、本発明はまた、癌の治療、特に、以前の化学療法処置を生き残った残存癌細胞の選択的排除のために使用され得る。以前の化学療法処置を生き残った残存癌細胞では、細胞老化プログラムを誘発するDNA損傷の結果として、β-ガラクトシダーゼおよび／またはα-フコシダーゼ活性が上昇し得る。
【００９８】
したがって、本発明は、上記の疾患および状態に関連して使用され得、そしてそれらの治療効力を増加させるために化学療法と組み合わせて使用され得る。
【００９９】
本発明はまた、皮下脂肪分解、代謝機能不全、および老化の促進を引き起こし得る抗レトロウイルス薬剤での治療後の老化細胞の除去のために使用され得る。これらの抗レトロウイルス薬剤の例には、アバカビル、アザシチジン、アジドチミジン(AZT)、ジデオキシシチジン、エファビレンツ、インビラーゼ、イキサベピロン、ラミブジン(3TC)、ロピナビル、ネビラピン、リトナビル、ステイブジン、テノホビル、チプラナビル、チオテパが含まれる。
【０１００】
本発明はまた、コルチゾール、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、およびアルドステロンを含むコルチコイドでの治療後の老化細胞の除去にも使用することができる。これらのコルチコイドでの治療は、例えば、デキサメタゾン投与後の腱における細胞老化および組織変性、および、肥満、インスリン抵抗性などの代謝機能不全をもたらし得る。
【０１０１】
本発明は、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、およびトログリタゾンなどのチアゾリジンジオンを含むPPARガンマアゴニストの長期使用後の老化細胞の除去にも使用することができる。老化細胞の除去はSASPの誘導を妨げ、これは心臓有害事象の増加、および癌のリスクの増加に関連し得る。
【０１０２】
本発明は、心臓肥大を含む細胞肥大の治療にも使用することができる。老化細胞は増殖因子シグナル伝達を保持するが、分裂を受けることができず、拡大し続け、肥大する。老化細胞はしばしば、ラパマイシン(mTOR)複合体活性化の構成的哺乳動物標的を受ける。
【０１０３】
本発明は、老化細胞からSASPの一部として放出されるサイトカインによって引き起こされる慢性炎症の治療にも使用することができる。
【０１０４】
本発明はまた、DNA損傷および細胞老化を引き起こし、続いてSASPサイトカインを放出する放射線(医療用放射線および非医療用放射線の両方)への曝露によって引き起こされる加速老化の副作用を減少させることに関する。老化は、アルファ放射線、ベータ放射線、ガンマ放射線を含む様々な形態の放射線によって引き起こされ得る。例としては、医療用Ｘ線、PETスキャン、CTスキャンへの暴露や、核降下物または原子力事故による核放射線、太陽への露出または他のUV源からのUV放射線、高い高度での長時間にわたる宇宙放射線(例えば、パイロットや飛行機の添乗員、頻繁に飛行機を利用する旅行者、宇宙飛行士が受けるもの)、および医療用放射線療法が挙げられる。
【０１０５】
したがって、本発明の一態様では、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストの治療有効量を被験体に投与する工程を含む、損傷および／または老化細胞を除去する方法が提供されるとも言える。
【０１０６】
また、本発明の別の態様において、損傷および／または老化細胞の存在を特徴とする疾病または状態を治療、改善または予防する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストを投与する工程を含む方法が提供される。
【０１０７】
本発明に係るアンタゴニストは、損傷および／または老化細胞を排除するために、または損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾患を治療、改善または予防するために使用され得る薬剤（medicament）（これは、単剤療法、すなわち、そのアンタゴニストまたは薬剤の単独使用であり得る）において使用され得ることが理解される。あるいは、本発明によるアンタゴニストは、損傷および／または老化細胞を排除するための、または損傷および／または老化細胞の存在を特徴とする疾患を治療、改善または予防するための、公知の治療の補助剤として、またはそれと組み合わせて使用され得る。例えば、アンタゴニストは肺線維症を治療するための公知の薬剤(例えば、コルチコステロイド)と組み合わせて使用され得る。同様に、本発明のアンタゴニストは、癌を治療するための周知技術(例えば、化学療法および／または放射線療法)と組み合わせて使用され得る。
【０１０８】
本明細書中に記載されるようなアンタゴニストが、どの患者に投与されるべきかについての制限はない。むしろ、本明細書中に記載される任意のアンタゴニストは、本明細書中に記載される任意の患者に投与され得ることが意図される。実際、アンタゴニストおよび示された患者群のそれぞれおよびすべての組み合わせが本発明に包含されることが、本発明者らによって明確に意図される。したがって、本発明は、アンタゴニストおよび指示された患者群のそれぞれおよびすべての可能な組み合わせを含む。
【０１０９】
本発明に係るアンタゴニストは特に、組成物が使用されるべき様式に依存して、多数の異なる形態を有する組成物中で組み合わされ得る。従って、例えば、該組成物は、紛体、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与され得る任意の他の好適であり得る。薬剤のビヒクルは、それが与えられる被験体によって十分に許容されるものでなければならないことが理解されるのであろう。
【０１１０】
本発明に係るアンタゴニストを含む薬剤は、多くの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされ得、そのケースでは、アンタゴニストが例えば、錠剤、カプセル剤または液剤の形態で経口摂取され得る組成物内に含まれ得る。本発明のアンタゴニストを含む組成物は吸入によって投与され得る(例えば、鼻腔内投与)。組成物はまた、局所使用のために製剤化され得る。例えば、クリームまたは軟膏を、例えば、治療部位に隣接して皮膚に適用してもよい。
【０１１１】
本発明に係るアンタゴニストはまた、徐放または遅延放出デバイス内に組み込まれ得る。このようなデバイスは例えば、表皮上または表皮下に挿入され得、そして薬剤は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。このようなデバイスは本発明に従って使用されるアンタゴニストでの長期間の治療が必要とされ、そして通常、頻繁な投与(例えば、少なくとも毎日の注射)を必要とする場合に、特に有利であり得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、アンタゴニストおよび組成物は、血流への注射によって、または治療を必要とする部位への直接的な注射によって、被験体に投与され得る。注射は、静脈内(ボーラスまたは点滴)または皮下(ボーラスまたは点滴)、または皮内(ボーラスまたは点滴)であり得る。
【０１１３】
必要とされるアンタゴニストの量はその生物学的活性およびバイオアベイラビリティーによって決定され、これは、次に、投与の様式、アンタゴニストの生理化学的特性、ならびにそれが単剤療法として使用されているか、または併用療法において使用されているかに依存することが理解される。投与の頻度はまた、処置される被験体内のアンタゴニストの半減期に影響される。投与される最適な投薬量は、当業者によって決定され得、そして使用される特定のアンタゴニスト、医薬組成物の強度、投与の様式、および治療される疾病または状態の進行によって変化する。処置される特定の被験体に依存するさらなる因子は、被験体の年齢、体重、性別、食事および投与期間を含み、それにより投薬量を調節する必要性を生じる。
【０１１４】
一般に、どのアンタゴニストが使用されるかに依存して、本発明によるアンタゴニストは、損傷および／または老化細胞を排除するために、または損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる疾患を治療、改善または予防するために、0.001μg／kg体重〜10mg／kg体重の1日用量で使用され得る。より好ましくは、1日用量は0.01μg／kg体重〜1mg／kg体重、より好ましくは0.1μg／kg〜100μg／kg体重、最も好ましくは約0.1μg／kg〜10μg／kg体重である。
【０１１５】
アンタゴニストは、損傷および／または老化細胞の存在を特徴とする状態または疾患の発症前、発症中または発症後に投与することができる。1日用量は単回投与(例えば、1日1回の注射)として与えられ得る。あるいは、アンタゴニストは1日の間に2回以上の投与を必要とし得る。一例として、アンタゴニストは、毎日の投与量として、0.07μg〜700mg(すなわち、体重70kgと仮定)を2回(または治療するバクテリア感染の重症度に依存して、それ以上)投与され得る。治療を受けている患者は起床時に第1の投薬を摂取し、その後、夕方に第2の投薬を摂取することができる（2回投与レジメンである場合)か、またはその後、3時間隔または4時間隔で摂取することができる。あるいは、徐放デバイスを使用して、投与を反復する必要なしに、患者に本発明のアンタゴニストの最適用量を提供し得る。
【０１１６】
公知の手順、例えば、製薬業界で慣用的に使用される手順(例えば、インビボ実験、臨床試験など)は、本発明のアンタゴニストを含む特定の製剤および正確な治療レジメン(例えば、アンタゴニストの日用量および投与頻度)を得るために使用され得る。本発明者らは、本発明のアンタゴニストの使用に基づいて損傷および／または老化細胞の存在を特徴とする疾患を治療するための組成物を記載するのは、自分たちが初めてであると考える。
【０１１７】
したがって、別の態様において、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストおよび薬学的に許容可能なビヒクルを含む、損傷および／または老化細胞の治療組成物が提供される。
【０１１８】
語句「損傷および／または老化細胞の治療組成物」は、被験体における損傷および／または老化細胞の存在によって特徴付けられる任意の疾病または状態の治療的改善、予防または治療において使用される医薬製剤(pharmaceutical formulation)を意味し得る。
【０１１９】
さらなる態様において、第4の態様に係る損傷および／または老化細胞の治療組成物を製造するための方法（プロセス）も提供され、該方法は、治療有効量のPD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストと薬学的に許容可能なビヒクルとを接触させる工程を含む。
【０１２０】
本発明のアンタゴニストの「治療有効量」は、被験体に投与されたときに、損傷および／または老化細胞を排除するか、または所望の効果を生じるために必要とされる抗体の量である任意の量である。
【０１２１】
例えば、使用されるアンタゴニストの治療有効量は、約0.001mg〜約1000mg、好ましくは約0.01mg〜約500mgであり得る。薬剤の量は、約0.1mg〜約100mg、最も好ましくは約0.5mg〜約50mgの量であることが好ましい。指針として、本明細書に記載される実施例において使用される抗体の投与量は、40mg／kgであった。
【０１２２】
本明細書中で言及される「薬学的に許容可能なビヒクル」は、医薬組成物を製剤化する際に有益であることが当業者に知られている、任意の公知の化合物または公知の化合物の組合せである。
【０１２３】
「被験体(subject)」は、本明細書中で使用される場合、脊椎動物、哺乳動物または家畜であり得る。したがって、本発明による組成物および薬剤は任意の哺乳動物、例えば家畜(例えば、ウシ)、ペットを治療するために使用されてもよく、または他の獣医学的適用において使用されてもよい。しかし、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【０１２４】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固形であってもよく、組成物は散剤(powder)または錠剤(tablet)の形態であってもよい。固形の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性バインダー、甘味料、防腐剤、色素、コーティング剤または錠剤崩壊剤としても作用し得る1つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、カプセル化物質であってもよい。散剤では、ビヒクルは、細かく分割された本発明に係る活性剤と混合された細かく分割された固形物である。錠剤では、活性剤は適当な割合で所要の圧縮特性を有するビヒクルと混合し、所望の形状および大きさに圧縮することができる。散剤および錠剤は、好ましくは99%までの活性剤を含有する。好適な固形ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス類、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、医薬ビヒクル物はゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【０１２５】
しかしながら、医薬ビヒクルは液状であってもよく、医薬組成物は液状である。液状ビヒクルは、溶液剤、懸濁液、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤および加圧組成物を調製する際に使用される。活性剤は、水、有機溶媒、両者の混合物、または薬学的に許容される油脂などの薬学的に許容される液状ビヒクルに溶解または懸濁させることができる。液状ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、香料、懸濁剤、増粘剤、色剤、粘性調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の好適な医薬添加剤物を含有することができる。経口および非経口投与のための液状ビヒクルの好適な例としては、水(上記のように添加剤を部分的に含む、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム液)、アルコール(一価アルコールおよび多価アルコール、例えば、エチレングリコールを含む)およびそれらの誘導体、ならびに油(例えば、分別ヤシ油および落花生油)が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態組成物において有効である。加圧組成物のための液状ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進剤であり得る。
【０１２６】
無菌の溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、腹腔内注射、静脈注射、そして特に皮下注射によって利用することができる。アンタゴニストは、滅菌水、生理食塩水または他の適切な滅菌注射可能媒体を使用して投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【０１２７】
本発明のアンタゴニストおよび組成物は、他の溶質または懸濁剤(例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース)、胆汁塩類、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノレエート、ポリソルベート80(ソルビトールおよび酸化エチレンと共重合したその無水物のオレイン酸エステル)などを含む滅菌溶液または懸濁液の形成で経口投与され得る。本発明に従って使用されるアンタゴニストはまた、液体または固体組成物形成のいずれかで経口投与され得る。経口投与に適した組成物には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および散剤などの固形形態、ならびに溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁液剤などの液状形態が含まれる。非経口投与に有効な形態には、滅菌した溶液剤、乳剤および懸濁液が含まれる。
【０１２８】
本発明は、機能的変異体(functional variant)またはその機能的フラグメントを含む、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸配列または核酸配列を実質的に含む、任意の核酸またはペプチドまたはその変異体、誘導体または類似体に及ぶことが理解されるのであろう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能的変異体」、および「機能的フラグメント」との用語は、本明細書中で言及される配列のいずれか1つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも40%の配列同一性、例えば本明細書中で言及される配列と40%の同一性を有する配列であり得る。
【０１２９】
本明細書中で言及される配列のいずれかに対して、50%を超える、より好ましくは65%、70%、75%を超える、さらにより好ましくは80%を超える配列同一性を有するアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列もまた、想定される。好ましくは、アミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列は、本明細書中で言及される配列のいずれかと少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【０１３０】
当業者は、2つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算する方法を理解するのであろう。2つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列間の同一性パーセンテージを算出するために、最初に2つの配列のアラインメントを準備し、続いて配列同一性値を算出しなければならない。2つのシーク配列の同一性の割合は、下記(i) および(ii)に応じて異なる値をとることがある。すなわち、(i)配列のアラインに使用される方法、例えば、ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(異なるプログラムで実行される)、または3D比較からの構造アラインメントと、(ii)アラインメント法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカルアラインメント対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス(例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnetなど)、およびギャップペナルティ、例えば、機能形態および定数である。
【０１３１】
アラインメントを行った後に、2つの配列間の同一性パーセンテージを計算する多くの異なる方法が存在する。例えば、アイデンティティの数を、(i)最短配列の長さ;(ii)アラインメントの長さ;(iii)配列の平均長さ;(iv)非ギャップ位置の数;または(iv)オーバーハングを除く等価位置の数で割ることができる。さらに、同一性パーセンテージはまた、長さに強く依存することが理解される。したがって、配列のペアが短いほど、偶然で起こることが予想される配列同一性は高くなる。
【０１３２】
よって、アミノ酸配列または核酸配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることが理解される。一般的な多重アラインメントプログラムClustalW(Thompson et al, 1994)は、本発明に係るタンパク質またはDNAの多重アラインメントを生成するための好ましい方法である。ClustalWの適切なパラメータは、DNAアラインメントの場合、Gap Open Penalty = 15.0、Gap Extension Penalty = 6.66、Matrix = Identityである。タンパク質アラインメントについては、Gap Open Penalty = 10.0、Gap Extension Penalty = 0.2、Matrix = Gonnetである。DNAおよびタンパク質アラインメントの場合、ENDGAP = -1、GAPDIST = 4である。当業者は最適な配列アラインメントのために、これらのパラメータおよび他のパラメータを変化させることが必要であり得ることを認識する。
【０１３３】
好ましくは、2つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列間の同一性パーセンテージの算出は、(N／T)*100のようなアラインメントから算出され得、ここで、Nは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Tはギャップを含むが、オーバーハングを除く、比較される位置の総数である。よって、2つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、(i)例えば、上記に記載されるように、適切なパラメータのセットを使用して、ClustalWプログラムを使用して配列アラインメントを準備すること、および、(ii)NおよびTの値を式：配列同一性=(N／T)*100に代入すること、を含む。
【０１３４】
類似の配列を同定するための代替的な方法は、当業者に知られている。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、第1の態様に係るペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントもしくは機能的変形例、あるいは、それらの相補体にハイブリダイズする配列である。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドを約45oCで3倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中のフィルタ結合DNAまたはRNAにハイブリダイズさせ、続いて、約20〜65oCで0.2倍SSC／0.1% SDS中で少なくとも1回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似のペプチドは、示される配列と、少なくとも1つ、しかしながら、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個未満のアミノ酸だけ異なっていてもよい。
【０１３５】
遺伝子コードは縮重しているため、本明細書に記載される任意の核酸配列が、それによってコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく変化または改変されて、その機能的変異体が提供され得ることは明白である。適切なヌクレオチド変異体は配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変された配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生じる。他の好適な変形例は相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化を生じるために、置換されるアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする種々のコドンの置換によって改変される、配列の全てまたは一部を含む変異体である。例えば、小さな無極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな無極性疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した(塩基性)アミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換され得るかが理解され、そして当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知る。
【０１３６】
発明の一態様によれば、PD-l2／PD-1相互作用のアンタゴニストであるモノクローナル抗体が提供される。
【０１３７】
好ましくは、抗体は、PD-L2および／またはPD-1に特異的に結合し、これら2つのタンパク質間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合フラグメントである。より好ましくは、抗体は、PD-L2に特異的に結合し、その受容体PD-1への結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１３８】
現在まで、損傷および／または老化細胞をインビトロまたはインビボで検出するために利用可能な方法はなかった。損傷および／または老化細胞がPD-L2の発現をアップレギュレートするという本発明者らの観察の結果として、今般、PD-L2に結合する生体分子を使用して、および／またはmRNAレベルを分析することによって、上記細胞をインビトロまたはインビボで同定することが初めて可能となった。そして、これにより、このような細胞の集積から生じる慢性疾患および状態(例えば、上記に言及されるもの)の診断が容易になる。
【０１３９】
このように、発明の別の態様において、損傷および／または老化細胞の同定に使用するための、PD-L2またはPD-L2  mRNAに結合する生体分子が提供される。本発明のさらに別の態様において、損傷および／または老化細胞を同定する方法であって、PD-L2またはPD-L2  mRNAに結合する生体分子を投与する工程、および、該薬剤がPD-L2またはPD-L2  mRNAに結合したかどうかを検出する工程を含む方法が提供される。
【０１４０】
本明細書に記載される全ての特徴(添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む)、および／または、本明細書で開示される全ての方法またはプロセスの全ての工程は、特徴および／または工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１４１】
本発明をより良く理解し、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、以下、例示として、以下に記載される実施例および添付の概略図を参照する。
【実施例】
【０１４２】
本発明は以下の実施例においてのみ、例示として記載される。
【０１４３】
実施例に記載されるように、本発明者らは、種々の初代細胞株および腫瘍細胞株ならびに老化のインビボモデルにおいて見出される損傷および／または老化細胞におけるPD-L2のアップレギュレーションを一貫して観察した。これらの観察は、PD-L2  mRNAまたはタンパク質レベルが損傷および／または老化細胞の同定のためのバイオマーカーとして使用され得ることを暗示する。さらに、これらの観察は、損傷および／または老化細胞がPD-L2の発現を誘導し得、それによりPD-1受容体を介する免疫細胞活性化を阻害することによって、免疫系を回避し得ることを強く示唆する。その結果、発明者らは、PD-L2／PD-1相互作用のアンタゴニストが損傷および／または老化細胞を排除することができ、かかる細胞の存在を特徴とする疾病を治療、改善または予防するために使用することができる方法を有利に開発することができた。
【０１４４】
実施例に記載した研究に用いた材料および方法は特に断らない限り、以下のとおりであった。
【０１４５】
材料
細胞株
SK-Mel103(ヒト黒色腫)細胞およびC2C12(マウス筋芽細胞)細胞は、American Type Culture Collectionから入手した。
(Landsberg et al., 2012)に記載されているHcMel3およびHcMel12(B57BL6マウス由来のマウス黒色腫転移細胞)は、Thomas Tueting博士(ボン大学、ドイツ)によって提供された。
UT-SCC-38およびUT-SCC42-B細胞株(初発病巣由来のHNSCC細胞)は、Reidar Grenman博士(トゥルク大学、フィンランド)から供与され、以前より記載されている(Grenman et al., 1991; Pekkola-Heino et al., 1994, 1995)。
HcMel3細胞およびHcMel12細胞をRPMI(Gibco社)中で維持した。残りの細胞系をDMEM(Gibco社)中で維持した。全ての培地に、抗真菌薬-抗生物質(Gibco社)を含む10%ウシ胎仔血清(Gibco社)を添加し、20%O2および5%CO2中、37oCでインキュベートした。
【０１４６】
抗体
抗53BP1抗体はAbcam社(ab172580)から、抗PD-L2(D7U8CTM)抗体はCell Signaling社(カタログ番号82723)から、抗SMC1抗体はBethyl laboratories社(A300-056A)から、Ki67抗体はMaster Diagnostica社(0003110QD)から、それぞれ入手した。
【０１４７】
化学薬品
パルボシクリブ(PD 0332991)はSelleckchem社(#S1116)から、ヌトリンはSigma社(NG287)から、ドキソルビシンをPharmacia & Upjohn社から、それぞれ入手した。また、ブレオマイシンはSigma(B8416)から、ラパマイシン、ロテノンおよびメトホルミンはSigma社から(それぞれ53123-88-9、83-79-4および1115-70-4)、IKK阻害剤(BAY 11-7082)はSelleck Chemicals社(カタログ番号S2913)から、JAK2阻害剤(NVP-BSK805)はApexBio社(カタログ番号A3675)から、それぞれ入手し、PIM阻害剤(ETP-47995)はCNIOで合成した。マウスTLRアゴニストは、InvivoGen社(マウスTLR1-9アゴニストキット)から購入した。
【０１４８】
SA-β  galアッセイ細胞株、腫瘍切片、異種移植片および全肺におけるSA-β  gal活性は、Cell Signaling社のβ-ガラクトシダーゼ染色キット(#9860)を用いて評価した。
【０１４９】
定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)
全RNAをTRI試薬(Sigma-Aldrich社)で単離した。cDNA合成は、BIO-RAD社の「iScript Advanced cDNA Synthesis kit」(#1725037)を用いて行った。定量リアルタイムPCR反応は、「MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate with barcode」(Thermo Fisher社、#4346906)および「MicroAmp Optical Adhesive Film」(Thermo Fisher社、#4311971)を使用し、7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems社)中で「GoTaq qPCR Master Mix」（Promega社、#A6002）を用いて行った。
【０１５０】
プライマー配列を以下に示す:
ヒトqRT-PCRプライマー:
β‐アクチン  フォワード(配列番号5): 5'-CAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3
β‐アクチン  リバース(配列番号6): 5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC-3'
PD-L1  フォワード(配列番号7): 5'-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3'
PD-L1  リバース(配列番号8): 5'-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT-3'
PD-L2  フォワード(配列番号9): 5'-ATTGCAGCTTCACAGATAGC-3'
PD-L2  リバース(配列番号10): 5'-AAAGTTGCATTCCAGGGTCAC-3'
TBP  フォワード(配列番号11): 5'-ATCAGTGCCGTGGTTCGT-3
TBP  リバース(配列番号12): 5'-TTCGGAGAGTTCTGGGATTG-3'
マウスqRT-PCRプライマー:
アクチン  フォワード(配列番号13): 5'-GGCACCACACCTTCTTACAATG-3
アクチン  リバース(配列番号14): 5'-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3'
GAPDH  フォワード(配列番号15): 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3
GAPDH  フォワード(配列番号16): 5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3'
PD-L1  フォワード(配列番号17): 5'AGTCAATGCCCCATACCGC-3'
PD-L1  リバース(配列番号18): 5'TTCTGGATAACCCTCGGCCT-3'
PD-L2  フォワード(配列番号19): 5'CAAGCCTCAGCCTAGCAGAA-3'
PD-L2  リバース(配列番号20): 5'TCCATCCGACTCAGAGGGTC-3
IL-6  フォワード(配列番号21): 5'-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3'
IL-6  リバース(配列番号22): 5'-GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA-3'
p21  フォワード(配列番号23): 5'GTGGGTCTGACTCCAGCCC-3
p21  リバース(配列番号24): 5'CCTTCTCGTGAGACGCTTAC-3
【０１５１】
方法
SA-β  galアッセイ
細胞株(図1Aおよび図2A)
SK-Mel-103、UT-SCC-38細胞株およびUT-SCC-42B細胞株を、抗真菌剤‐抗生物質(Gibco社)を含む10%ウシ胎仔血清(Gibco社)を添加したDMEM(Gibco社)中に維持し、20%O2、5%CO2中、37℃でインキュベートした。SK-Mel-103細胞およびUT-SCC-42B細胞は3〜4日毎に1:10に分割した。UT-SCC-38細胞は3〜4日毎に1:3に分割した。
アッセイの8日前に、20.000 SK-Mel-103細胞、40.000 UT-SCC-38細胞およびUT-SCC-42B細胞を6ウェル組織培養プレート(Falcon社)に播種した。翌日、細胞を2μMパルボシクリブで処置した。SK-Mel-103細胞もまた、10nMドキソルビシン、1μMヌトリンまたは6x10-3units／mlブレオマイシンで処置した。全ての細胞を、培地を交換することなく、老化誘導剤の存在下で少なくとも7日間インキュベートした。対照細胞を、SA-βgalアッセイの24〜48時間前に6ウェルプレートに播種した。
Cell Signaling社(#9860)のβ-ガラクトシダーゼ染色キットを用いて、SA-βガラクトシダーゼ活性を、製造者を指示書に従って（「染色溶液」(緩衝液A、緩衝液B、X-galを添加)を注意深くpH 6に調節する変更を唯一行った）評価した。
【０１５２】
組織切片(図4Aおよび図6B)
線維性腎臓および対照腎臓のSA-βガラクトシダーゼ活性を評価するために(図4A)、腎臓を最適切断温度(OCT)化合物(ライカバイオシステムズ社)に包埋し、続いて凍結切片に使用した。「Senescence β-Galactosidase Staining Kit」(Cell Signaling社、#9860)を製造者の指示に従って使用して、SA-βガラクトシダーゼ染色を行った。簡単に説明すると、切片を、2%ホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含有するPBS溶液で10分間固定し、PBSで3回洗浄し、次いで、X-gal溶液(pH 6.0に調節)と共に37℃で4時間インキュベートした。続いて、スライドをnuclear fast redで染色した。
対照腫瘍およびパルボシクリブ処置腫瘍の包埋凍結切片(図6B)を「Senescence β-Galactosidase Staining Kit」(Cell Signaling社、#9860)を用いて染色した。腫瘍を、2%ホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含有するPBS溶液で10分間固定した。次いで、試料をPBSで3回洗浄し、X-gal染色液(pH 6.0に調整)で一晩(16時間)染色した。
【０１５３】
全臓器／異種移植片(図5Aおよび図6B)
SA-βガラクトシダーゼ活性を、「Senescence β-Galactosidase Staining Kit」(Cell Signaling社、#9860)を用いて、全マウント肺(図5A)および異種移植片(図6B)において評価した。肺を、2%ホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含有するPBS溶液で45分間固定し、PBSで3回洗浄した。その後、固定した組織をX-gal染色溶液(pH 6.0に調節)で一晩(16時間)染色した。
【０１５４】
定量的リアルタイムPCR
細胞抽出物(図1B、図2C、図3および図9)
SK-Mel-103、UT-SCC-38およびUT-SCC-42B(図1Bおよび図2C)を、10cmのシャーレに播種し、以下の濃度で、示された老化誘導剤と共にインキュベートした：2μMパルボシクリブ、10nMドキソルビシン、1μMヌトリンおよび6x10-3units／mlブレオマイシン。処置した細胞はさらに分割せず、処置の間、培地は変更しなかった。対照細胞は、先に記載したように3〜4日毎に分割した。
処置の1週間後、全RNAを対照から単離し、製造者の指示書に従ってTRI試薬(Sigma-Aldrich #T9424)で処置した。
C2C12、HcMell3およびHcMell2(図3)を、12x10-3units／mlブレオマイシンまたはドキソルビシン500nM(C2C12)もしくは167nM(HcMel3およびHcMel12)で48時間処置した。全RNAを、TRI試薬(Sigma-Aldrich社、#T9424)を用いて、製造者の説明書に従って単離した。
C2C12細胞(図9)を、以下の阻害剤の存在下または非存在下で、指示された濃度で500 nMドキソルビシンで48時間処置するか、またはピルベート枯渇培地中で培養した(図9A)：IKK阻害剤(50μM)、PIM阻害剤(1μM)、ロテノン(1μM)、JAK阻害剤(3μM)、ラパマイシン(50nM)およびメトホルミン(5mM)。さらに、C2C12細胞を、下記TLRアゴニスト(Mouse LR1-9 Agonist Kit、InvivoGen社)の存在下または非存在下で6時間インキュベートした：TLR1／2アゴニスト(Pam3CSK4、300ng／ml)、TLR2アゴニスト(HKLM、108 cells／ml)、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)HMWおよびポリ(I:C)LMW、10μg／ml)、TLR4アゴニスト(LPS-EK、10μg／ml)、TRL5アゴニスト(FLA-ST、1μg／ml)、TRL6／2アゴニスト(FSL-1、100ng／ml)、TRL7アゴニスト(ssRNA40、5μg／ml)およびTLR9アゴニスト(ODN1826、5μM)。全RNAを、TRI試薬(Sigma-Aldrich社、#T9424)を用いて、製造者の説明書に従って単離した。
単離したRNAを、ナノドロップマシンNanoVue(GE Healthcare社)を用いて定量した。BIO-RAD社(#1725037)の「iScript Advanced cDNA Synthesis kit」を用いて、2〜7μgの全RNAについてcDNA合成を実施した。希釈cDNA(1:10)および「GoTa qPCR Master Mix」(Promega社、A6002)を用いて定量的リアルタイムPCRを実施した。反応は、以下の15μl容量の反応混合物中で、トリプリケートで行った：7.5μlの2X GoTaq PCR Master Mix；0.6μlのプレ混合プライマー(10μMのフォワードプライマー、10μMのリバースプライマー)；1.9μlのヌクレアーゼフリー水、および5μlのテンプレートcDNA(予め1:10に希釈)。
qRT-PCR反応は、「MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate with barcode」(Thermo Fisher社 #4346906)および「MicroAmp Optical adhesive film」(Thermo Fisher社 #4311971)を用いて、7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems社)にて行った。この反応は、2つの保持段階(50oCで2:00分間、95oCで10:00分間)および40回の増幅反応(95oCで00:15分間／60oCで01:00分間／72oCで00:30分間)と、それに続く融曲線段階とからなった。
目的の遺伝子のCt値を平均し、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対して正規化した。各細胞株および条件について、少なくとも2つの独立した実験を行った。
【０１５５】
腎臓(図4Bおよび図4C)
全RNAを単離するために(図4B)、腎生検体（kidney biopsy）を、製造者の説明書に従って、TRI試薬(Sigma-Aldrich社、#T9424)に溶解した。2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。cDNA合成およびRT-qPCRは、以前から記載されているように行った。目的の遺伝子のCt値を平均し、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対して正規化した。
【０１５６】
肺(図5B)
遺伝子発現分析のために、肺を単離し、最適切断温度(OCT)化合物(ライカバイオシステムズ社)に包埋した。OCT包埋組織試料の全RNAを得るために、10μm厚の10個のクライオスタット切片を切断し、余分なOCTを除去した。凍結切片をTRI試薬(Sigma-Aldrich社、# T9424)に溶解した後、プールし、製造者の指示書に従って処理した。2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。cDNA合成およびRT-qPCRは、以前から記載されているように行った。目的の遺伝子のCt値を平均し、ハウスキーピング遺伝子Gapdhに対して正規化した。
【０１５７】
異種移植片(図7A)
腫瘍を単離し、最適切断温度(OCT)化合物(ライカバイオシステムズ社)に包埋した。全RNAを得るために、10μmの厚さの10個の凍結切片を切断し、余剰OCTを除去した。次いで、凍結切片をプールし、そしてTRI試薬(Sigma-Aldrich社、#T9424)に溶解して全RNAを得て、製造者の指示書に従って処理した。前述のとおり、2μgの全RNAを用いてcDNAを合成し、RT-qPCRを行った。PD-L1およびPD-L2に対するヒト特異的プライマーを使用した。目的の遺伝子のCt値を平均し、ハウスキーピング遺伝子TPBに対して正規化した。
【０１５８】
高齢動物(図8)
若齢マウス(10週齢)および高齢マウス(75週齢)からの肝臓試料を収集し、最適切断温度(OCT)化合物(ライカバイオシステムズ社)に包埋した。OCT包埋組織試料の全RNAを得るために、10μm厚の10個のクライオスタット切片を切断し、余剰OCTを除去した。凍結切片をTRI試薬(Sigma-Aldrich社 # T9424)に溶解した後、プールし、製造者の指示書に従って処置した。2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。cDNA合成およびRT-qPCRは、以前から記載されているように行った。目的の遺伝子のCt値を平均し、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対して正規化した。
【０１５９】
ウエスタンブロット(図7B)
腫瘍を単離し、最適切断温度(OCT)化合物(ライカバイオシステムズ社)に包埋した。タンパク質抽出物を得るために、厚さ10μmの10個の凍結切片を切断し、余剰OCTを除去した。次に、凍結切片をプールし、タンパク質溶解物に対するプロテアーゼ阻害剤を含むRIPA溶解緩衝液(150mM塩化ナトリウム、1.0%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、50mMトリス、pH8.0)に溶解した。試料を5分間超音波処置し(30秒オン／オフ)、試料緩衝液に再懸濁し、95℃で5分間変性させた。等量のタンパク質溶解物を、4〜12%NuPAGEゲル(インビトロジェン社)上で分離した。タンパク質をニトロセルロースメンブレン(GEヘルスケア社)に移し、メンブレンを抗PD-L2(1:1000)(D7U8CTM;Cell Signaling社、カタログ番号82723)または抗SMC1(1:1000)(Bethyl laboratories社、A300-056A)と共にインキュベートした。
そして、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(1:1000)(Rockland社)で検出した。結合したタンパク質をECL(GE Healthcare社)で可視化し、Molecular Imager Gel Dox XR System(Bio-Rad社)で化学発光を検出した。
【０１６０】
免疫蛍光(図2B)
SK-Mel-103細胞を、24ウェルプレート内に予め置いた直径12mmの丸いカバースリップ(Marienfeld社、#0111520)上に50%コンフルエンシーで播種した。翌日、細胞を老化誘導剤:2μMパルボシクリブ、10nM、1μMヌトリン、および6x10-3units／mlブレオマイシンで処置した。処置した細胞は更に分割せず、培地は処置期間中(7日間)変えなかった。対照細胞を、手順開始の24〜48時間前に、処置細胞と同様に播種した。老化誘導剤の添加の7日後、対照細胞および処置細胞を1×PBSで洗浄し、2%パラホルムアルデヒド-PBSで10分間固定した。その後、細胞を5分間0.25%のTriton-PBSで浸透させ、1xPBSで2回洗浄し、30分間5%BSA-PBSでブロックした。次に、細胞を、予めブロッキング緩衝液(5% BSA-PBS)で1:100に希釈した抗53BP1抗体(Abcam社、#ab172580)と共に30分間インキュベートし、1×PBSで10分間3回洗浄し、暗所でさらに30分間、ブロッキング緩衝液で1:400に希釈した二次抗体:ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 546(ThermoFisher社、#A-11010)と共にインキュベートした。最後に、細胞を再び1×PBSで10分間3回洗浄し、1×PBS中300nMのDAPI(Sigma社、# D9542)と共に10分間インキュベートした。全てのインキュベーションおよび洗浄は、24ウェルプレートにおいて室温で行った。免疫染色の終了後、カバーガラスを24ウェルプレートから注意深く取り出し、一滴のProLong Gold抗退色試薬(インビトロジェン社、# P36930)を載せたスライドガラス(Menzel-Glaser社、#0111520)上に置いた。スライドグラスを暗所で、室温で少なくとも24時間保存して退色防止剤を乾燥させ、続いて免疫染色した核の画像をSP5-MP共焦点マイクロスコープ(ライカ社)で取得した。
【０１６１】
免疫組織化学(図6B)
免疫組織化学分析のために、腫瘍をホルマリンで固定し、パラフィンブロックに包埋した。次いで、切片を、標準的な手順に従ってKi67で染色した。
【０１６２】
動物実験
片側尿管閉塞(UUO)(図4)
腎線維症を、C57BL6マウス(ENVIGO)において、左尿管の外科的閉塞(UUO)によって誘発した。簡単に説明すると、マウスを麻酔し、腹腔にアクセスするために外科的切開を行った。その後、腎門の近くで6／0絹(LA BOUVET社)を用いて左尿管の2か所を結紮した。次に、腹膜を3／0絹(B. Braun Aesculap社)で縫合し、表皮を外科用ステープルで縫合した。非手術(対照)マウスと、腎臓を結紮したマウス(線維症)を、結紮後10日目(図4A)または12〜13日目(図4B)に屠殺して、SA-βガラクトシダーゼ活性および遺伝子発現をそれぞれ分析した。
【０１６３】
肺線維症(図5)
ブレオマイシン(1.5U／kg)またはビヒクル(PBS)を気管内に一回送達することにより、C57BL6マウス(ENVIGO)において肺線維症を誘発した。気管内注射の14日後、ビヒクル(対照)またはブレオマイシン処置(線維症)マウスの肺試料を収集し、SA-βgal活性および遺伝子発現を分析した。
【０１６４】
異種移植片(図6および図7)
SK‐Mel‐103細胞(1×106)を免疫不全nu／nuマウス(ENVIGO社)に皮下接種した。腫瘍が200mm3の平均サイズになったときに、マウスを、ビヒクル(50mM乳酸ナトリウム、pH4.0)またはパルボシクリブ100mg／kgで、平日に最大10日間経口強制経口投与で処置した。腫瘍の進行をキャリパー測定によってモニターした。腫瘍体積は、式：体積=(幅)２×長さ／2を用いて計算した。マウスを屠殺し、対照個体がヒトエンドポイント(図6A)に到達したとき、またはパルボシクリブ処置の5日後(図6B)に試料を収集して、同等サイズの腫瘍(図6B)を得、これを続いて遺伝子発現解析(図7A)およびタンパク質発現解析(図7B)に使用した。
これらの実験で使用した動物はすべて、別に指定しない限り、10〜16週齢の雄マウスであった。CNIOでの動物実験は、CNIO-ISCIII Ethics Committee for Research and Animal Welfare(CEIyBA)によって承認されたプロトコルに従って行った。
【０１６５】
結果
実施例1:  PD-L2が損傷および／または老化細胞において高度かつ優先的に発現されるという、培養細胞における証拠
本発明者らは、Pfizer社によって開発されたCDK4／CDK6特異的阻害剤であるパルボシクリブによる腫瘍細胞株の長期処置が、黒色腫SK-Mel-103および頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)SCC38およびSCC42B細胞株などの様々なヒト腫瘍細胞において老化反応(サイズの増大、扁平状の形態（morphology）、細胞周期停止、SA-β-gal活性の増大)と一致する表現型変化を誘導することを観察した(図1Aおよび図2A)。これらの条件下で、老化細胞はPD-L2  mRNAレベルのアップレギュレーションを示したが、PD-L1  mRNAレベルのアップレギュレーションは示さなかった(図1Bおよび図2C)。パルボシクリブに加えて、遺伝毒性薬剤ブレオマイシンおよびMdm2阻害剤ナットリンは、SK-Mel-103細胞において老化を誘導し(図2A)、PD-L2  mRNAレベルに対して同様の効果を有した(図2C)。クロマチン中に53BP1小構造体（foci）が存在しないことからわかるように(図2B)、パルボシクリブもヌトリンもこれらの細胞においてDNA損傷を引き起こさなかったので、本発明者らは、この場合も同様に、PD-L2誘導がDNA損傷応答よりもむしろ老化応答に関連すると結論付けることができた。
【０１６６】
次に、本発明者らは、観察をマウス細胞株に拡張した。本発明者らは、マウス黒色腫細胞株B16F1およびB16F10をパルボシクリブまたはブレオマイシンで処置すると、PD-L2  mRNAがアップレギュレートすることを観察した(データ不図示)。さらに、本発明者らは、遺伝毒性薬剤ブレオマイシンまたはドキソルビシンでの短時間(48時間)処置は、マウス筋芽細胞系C2C12(図3A)およびマウス黒色腫細胞系HcMel3およびHcMel13(図3Bおよび図3C)においてPD-L2  mRNAの劇的な増加をもたらすことを見出した。老化に関連する表現型変化の発現は進行するのにより長い期間を必要とするので、この観察は、PD-L2が老化応答に加えてDNA損傷応答の実施に応答して誘導され得ることを示唆する。しかしながら、上記のように、細胞老化は持続的DNA損傷を引き起こし、老化関連マーカーは細胞周期停止の不在下でさえDNA損傷を引き起こし得るので、この区別は無益であり得る。PD-L2誘導が早期老化応答と関連しているか、それとも、DNA損傷によって引き起こされる2つの異なる細胞プログラムの実施によって引き起こされるかどうかは、さらなる解明を必要とするのであろう。
【０１６７】
実施例2:  PD-L2が損傷および／または老化細胞において高度かつ優先的に発現されるという、肺線維症および腎線維症の前臨床モデルにおける証拠
肺線維症および腎線維症を含む線維症病理は、近年、老化の発生と関連付けられている。本発明者らは、これらの疾患のマウスモデルを使用して、PD-L2の調節をインビボで検討した。単回用量のブレオマイシンの気管内送達によって、マウスにおいて肺線維症を誘発した。腎線維症は、尿管の外科的閉塞によって引き起こされた。肺線維症および腎線維症は、両方とも、線維性腎臓由来の組織試料(図4A)および線維性肺全体(図5A)におけるSA-βガラクトシダーゼ陽性染色の検出によって明らかにされるように、老化細胞の集積をもたらした。腎線維症モデルにおいて、これは、線維性臓器における２つの十分に特徴付けられた老化マーカー（p21およびIL-6）の転写アップレギュレーションによって強化された(図4B)。本発明者らの以前の観察と一致して、本発明者らは線維性臓器において、PD-L2  mRNAの有意かつ特異的なアップレギュレーションを見出したが、PD-L1  mRNAのアップレギュレーションは見出さず、それによって、PD-L2が細胞老化と関連して誘導されることを確認した(図4Cおよび図5B)。
【０１６８】
実施例3:  PD-L2が損傷および／または老化細胞において高度かつ優先的に発現されるという、化学療法の前臨床モデルにおける証拠
経口胃管栄養法によって送達されたパルボシクリブによるインビボ処置は、ヒト黒色腫細胞株SK-Mel-103のマウス異種移植片の成長を停止させることが示された(図6A)。このCDK4／CDK6阻害剤は、全腫瘍および腫瘍切片の強い染色によって証明されるように、強い老化応答を誘導した(図6B)。増加したSA-βガラクトシダーゼ活性は、Ki67ポジティブ増殖細胞の不在と強く相関した(図6B)。SK-Mel-103異種移植片をPD-L1発現およびPD-L2発現について分析すると、PD-L2  mRNAがパルボシクリブ処置マウス由来の異種移植片において選択的にアップレギュレートされることが観察された(図7A)。したがって、PD-L2タンパク質レベルも老化腫瘍において増加する(図7B)。
【０１６９】
実施例4:  PD-L2が高齢個体においてアップレギュレートされるという、動物モデルにおける証拠
本発明者らは、高齢マウス(75週齢)由来の組織(肝臓を含む)が若齢マウス(10週齢)由来のものと比較して、統計的に有意に高いレベルのPD-L2  mRNAを有することを観察した(図8)。これは、生理学的環境において、PD-L2レベルが、老化の特徴である老化細胞の集積に関連することを実証する。
総合すると、これらの観察は、PD-L2がDNA損傷および老化誘導刺激に応答して誘導されることを実証する。
【０１７０】
実施例5:  損傷／老化細胞におけるPD-L2アップレギュレーションの原因となる分子メカニズムの証拠
本発明者らは、老化／DNA損傷応答に関与することが知られている酵素に対する市販の阻害剤(例えば、ラパマイシン、ロテノン、メトホルミン、JAK阻害剤、およびNFkB阻害剤)を使用して、インビトロでのPD-L2誘導を防止した(図9A)。本発明者らはまた、NFkBを活性化し、SASPの自己分泌およびパラクリン効果を媒介し得るTLRのアゴニストを使用した(図9B)。この実験的アプローチは、本発明者らに、PD-L2の転写誘導の原因となるメカニズムについての初めての洞察を与えた。PD-L2アップレギュレーションをシグナル伝達する細胞経路をさらにキャラクタライズするために、本発明者らは、適宜ノックダウン／活性化戦略を実施する。
【０１７１】
実施例6:  損傷および／または老化細胞によるPD-L2リガンドの発現が、インビトロでのT細胞活性化を妨害する証拠
本発明者らは、対照／老化ヒト腫瘍細胞の存在下でのヒトT細胞(Jurkat)の活性化を観察する。Jurkat細胞は、酵素プロテインキナーゼCを活性化する12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート(TPA)と、免疫細胞の表面上のグリコシル化タンパク質に結合するレクチンであるフィトヘマグルチニン(PHA)との組み合わせによって、インビトロで活性化することができる。活性化されたT細胞はIL-2を強く誘導する。したがって、IL-2  mRNAレベルを分析することによって、またはELISAによる分泌されたIL-2の免疫検出によって、本発明者らは、Tリンパ球活性化における共培養対照細胞および老化細胞の効果を推測することができる。本発明者らは、PD-L2アップレギュレーションがT細胞活性化を妨害し、したがってIL2誘導を減少させることを観察する。さらに、本発明者らは、老化細胞の阻害効果がブロッキング抗PD-1抗体または抗PD-L2抗体の存在によって逆転されるが、抗PD-L1抗体の存在によっては逆転されないことを観察する。最後に、本発明者らは、レンチウイルスshRNAプラスミドを用いたノックダウンPD-L2から、PD-L2がT細胞活性化の抑制に直接関与することを観察する。
【０１７２】
実施例7:  PD-L2／PD-1相互作用の妨害がT細胞活性化を増加させ、インビボで損傷／老化細胞の免疫クリアランスを促進する証拠
本発明者らは、ブレオマイシン誘発肺線維症(図4)、片側尿管閉塞(UUO)誘発腎線維症(図5)および生物老化(図8)という老化の3つのインビボモデルにおけるPD-L2のアップレギュレーションを証明した。この効果の機能的意味を実証するために、線維症マウスを、ブロッキング抗PD-1および抗PD-L2抗体で処置し、そしてこれらの疾患の進行を分析する。PD-1／PD-L2相互作用を防止することにより、これらの抗体はT細胞免疫を増強し、免疫系による老化細胞のクリアランスを改善し、線維性領域の退縮を促進する。さらに、浸潤Tリンパ球に対するPD-1／PD-L2相互作用の遮断の影響を老化臓器において分析する。フローサイトメトリーを用いて、浸潤T細胞の数および活性化状態を分析し、キャラクタライズする。
【０１７３】
本発明者らは、マウス細胞株において、DNA損傷がPD-L2の強力な誘導因子であることを見出した(図3)。この場合、PD-L2の劇的なアップレギュレーションが老化の開始前に起こる。この効果は、マウス黒色腫細胞株HcMel3およびHcMel12を用いて異種移植片を作製することによって、インビボで認証される。これらの細胞株は同質遺伝子(isogenic)であり、そしてコンピテントな免疫系を有するマウスにおいて腫瘍を誘導し得る。PD-L2アップレギュレーションは遺伝毒性薬物であるドキソルビシンまたは照射によるこれらの異種移植片の処置に続き、次いで、ブロッキング抗PD-1抗体または抗PD-L2抗体の存在下での腫瘍進行を分析する。これらの治療用抗体は、腫瘍退縮を促進することが示されている。PD-L2の直接的な関与を試験するために、本発明者らは、HcMel3細胞株およびHcMel12細胞株においてPD-L2をノックダウンする。これは、遺伝毒性損傷によるPD-L2アップレギュレーションを防ぎ、抗PD-1および／またはPD-L2抗体の効果を打ち消す。
【０１７４】
結論
結論として、本発明者らは、PD-L2が抗原存在細胞および他の免疫細胞のみならず、損傷および／または老化細胞においても発現されることを初めて示した。この発見は非常に重要である。損傷および／または老化細胞の存在に関連する状態について予後的価値があり得る、損傷および／または老化細胞の同定のための方法を提供し、さらにより重要なことには、損傷および／または老化細胞に関連する疾患および状態の排除および治療のための治療戦略を提供するからである。
【０１７５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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