(57)【要約】  本発明は、ホウレンソウ植物中に存在する場合にＣＭＶに対する抵抗性を付与するアルファ−ＣＭＶと命名される対立遺伝子であって、ここで前記対立遺伝子によりコードされるタンパク質が、ＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質であり、そのアミノ酸配列において：ａ）そのＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」；およびｂ）モチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」；およびｃ）優先度の高い順に配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するＬＲＲドメインを含む、対立遺伝子に関する。前記対立遺伝子は、優先度の高い順に配列番号１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノムヌクレオチド配列を有する。本発明は、前記対立遺伝子を含む植物および前記対立遺伝子を含む様々な方法にさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウレンソウ植物中に存在する場合にＣＭＶに対する抵抗性を付与するアルファ−ＣＭＶと命名される対立遺伝子であって、前記対立遺伝子によりコードされるタンパク質が、ＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質であり、そのアミノ酸配列において：ａ）そのＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」；ｂ）モチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」；およびｃ）優先度の高い順に配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するＬＲＲドメインを含む、対立遺伝子。
【請求項２】
対立遺伝子が、優先度の高い順に配列番号１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の対立遺伝子。
【請求項３】
対立遺伝子が、優先度の高い順に配列番号２に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するコーディング配列を有する、請求項１に記載の対立遺伝子。
【請求項４】
対立遺伝子が、優先度の高い順に配列番号３に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するコーディング配列を有する、請求項１に記載の対立遺伝子。
【請求項５】
前記対立遺伝子が優先度の高い順に配列番号４に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の対立遺伝子。
【請求項６】
対立遺伝子が、優先度の高い順に配列番号５に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の対立遺伝子。
【請求項７】
そのアミノ酸配列において：ａ）そのＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」；ｂ）モチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」；およびｃ）優先度の高い順に配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するＬＲＲドメインを含むＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
優先度の高い順に配列番号１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項１−６のいずれか一項に記載のアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を含み、かつ任意にベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子をさらに含む、ホウレンソウ植物。
【請求項１０】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に配列番号１３に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するベータ−ＷＯＬＦ３であり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、およびＰｆｓ：１６に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号１４に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ６であり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、Ｐｆｓ：１５、およびＰｆｓ：１６に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１２】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号１５に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ６ｂであり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、Ｐｆｓ：１５、Ｐｆｓ：１６および単離ＵＳ１５０８に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１３】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号１６に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ８であり、かつ前記植物が少なくともＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：１５への抵抗性、およびＰｆｓ：１６への中間的な抵抗性を示す、請求項９に記載の植物。
【請求項１４】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号１７に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ９であり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１０、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、およびＰｆｓ：１３に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１５】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号１８に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ１１であり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１３、Ｐｆｓ：１５、Ｐｆｓ：１６および単離ＵＳ１５０８に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１６】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号１９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ１２であり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１０、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２および単離Ｐｆｓ：１３に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１７】
ベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子が、優先度の高い順に、配列番号２０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ１５であり、かつ前記植物が、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１３、Ｐｆｓ：１４、およびＰｆｓ：１５に少なくとも抵抗性である、請求項９に記載の植物。
【請求項１８】
前記植物がＦ１ハイブリッド品種である、請求項９−１７のいずれかに記載の植物。
【請求項１９】
第一親ホウレンソウ植物を第二親ホウレンソウ植物と交雑させること、および得られたハイブリッドホウレンソウ種子を収穫することを含む、ハイブリッドホウレンソウ種子の製造方法であって、第一および／または第二親ホウレンソウ植物が請求項１−６のいずれかに記載の対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を含む、方法。
【請求項２０】
第一および／または第二親が近交系の植物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９または請求項２０に記載の方法により生産される種子から成長したハイブリッドホウレンソウ植物。
【請求項２２】
請求項１−６のいずれかに記載の対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を保有するホウレンソウ植物を同定する、または選択するための方法であって、植物のゲノムにおけるゲノムヌクレオチド配列またはその一部の存在を決定することを含み、ここで、前記配列が、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する、方法。
【請求項２３】
請求項１−３および５のいずれかに記載の対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を保有するホウレンソウ植物を同定する、または選択するための方法であって、植物のゲノムにおけるコーディング配列またはその一部の存在を決定することを含み、ここで、前記配列が、配列番号２に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する、方法。
【請求項２４】
請求項１−２、４および６のいずれかに記載の対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を保有するホウレンソウ植物を同定する、または選択するための方法であって、植物のゲノムにおけるコーディング配列またはその一部の存在を決定することを含み、ここで、前記配列が、優先度の高い順に配列番号３に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する、方法。
【請求項２５】
請求項１で規定されるＬＲＲドメインの存在を決定することを含む、請求項２２−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＬＲＲドメインがＬＲＲドメインを増幅するプライマー対を使用することにより決定され、ここでフォワードプライマーが配列番号６の配列を含む核酸分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＲＲドメインがＬＲＲドメインを増幅するプライマー対を使用することにより決定され、ここでリバースプライマーが配列番号７の配列を含む核酸分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号６の配列を含む核酸分子であるフォワードプライマーおよび配列番号７の配列を含む核酸分子であるリバースプライマーを含むプライマー対。
【請求項２９】
（ａ）請求項１−６のいずれか一項に記載の対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を含む植物を別の植物と交雑すること；（ｂ）任意に１回以上の自殖および／または交雑を実施すること；（ｃ）１回以上の自殖および／または交雑のあとに請求項１−６のいずれかに記載の前記対立遺伝子または請求項７もしくは８に記載の核酸を含む植物を選択すること：を含む、ＣＭＶへの抵抗性を示すホウレンソウ植物の製造方法。
【請求項３０】
対立遺伝子を含む植物の選択が、請求項２２−２７のいずれか一項に記載の方法による対立遺伝子の存在を決定することを含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）に対するホウレンソウ植物における抵抗性を付与できる対立遺伝子に関する。本発明はまた、前記対立遺伝子を保持するホウレンソウ植物、前記ホウレンソウ植物の繁殖材料（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、前記ホウレンソウ植物の細胞、および前記ホウレンソウ植物の種子に関する。本発明はさらに、対立遺伝子を保持するホウレンソウ植物を生産する方法、およびＣＭＶ抵抗性を付与するための育種における対立遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）は野菜として栽培されるヒユ科の顕花植物である。ホウレンソウの消費可能な部分は栄養成長期の葉および葉柄である。ホウレンソウは、バラ売り、束売り、袋詰め、缶詰、冷凍で販売される。ホウレンソウには３つの基本的な種類：工業用、生鮮用、アジア向けのホウレンソウがある。これらの種類の中には、サボイ、セミサボイ、スムースの３つの異なる葉が認識され得る。サボイはシワがあり（ｃｒｉｎｋｌｙ）かつカールした（ｃｕｒｌｙ）葉を有する。平らなまたは滑らかな（スムース）葉のホウレンソウは、広く、滑らかな葉を持っている。セミサボイは、葉が少ししわになっている品種である。ホウレンソウの主な市場はベビーリーフである。ベビーのホウレンソウの葉は、多くの場合、平らな葉の品種であり、通常、収穫される葉は約８センチメートル以下である。これらの柔らかくて甘い葉は、束ではなくばら売りされる。サラダによく使用されるが、軽く調理することもできる。
【０００３】
ホウレンソウの生産を脅かす病害の１つは、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）である。キュウリモザイクウイルスは、ブロモウイルス科およびククモウイルス属に属する一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。前記ウイルスは世界中に分布しており、既知の植物ウイルスの中で最も広い宿主範囲を持っていると考えられている。１００以上の植物科で１２００以上の植物種に感染することができると報告されている。
【０００４】
前記ウイルスは、多くのさまざまな方法で、例えば、機械的には、アブラムシなどの昆虫媒介生物によって、種子上で、さらには寄生雑草によっても伝染され得る。ＣＭＶ感染の症状および重症度は、植物の種および年齢に依存する。ＣＭＶの典型的な症状は、斑点、黄変、リングスポットの形成、葉、果実、および花の発育不良および歪みである。
【０００５】
ホウレンソウにおけるＣＭＶはホウレンソウ胴枯病としても知られる。感染したホウレンソウ植物で観察される症状は、一般に葉の萎黄病の斑点、葉の狭小化、しわ、内転、ならびに葉脈の歪みである。
【０００６】
ホウレンソウ栽培品種の一部にはＣＭＶ抵抗性が観察されるが、それらの栽培品種における抵抗性の遺伝学的基礎は、これまで分子レベルで特徴付けられておらず、すなわち、これまでの原因遺伝子とその配列は不明であった。さらに、ホウレンソウにおけるＣＭＶ抵抗性を同定することができる当技術分野で既知の密接に関連する分子マーカーも、当技術分野で既知の遺伝子自体の分子特性も存在しない。したがって、ホウレンソウ植物におけるＣＭＶ抵抗性の同定は、現在表現型アッセイに基づいており、病害試験で病害症状の非存在に基づいて抵抗性について多くの系統がスクリーニングされる。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ホウレンソウにおけるＣＭＶに抵抗性を付与する新しい抵抗性対立遺伝子を提供し、この抵抗性対立遺伝子を同定するための分子ツールを提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明に至る研究において、驚くべきことに、いくつかのＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ抵抗性を付与する対立遺伝子が観察されたのと同じ遺伝子座にＣＭＶ抵抗性を付与する対立遺伝子も位置することが見出された。
【０００９】
この遺伝子座には、１または２のいわゆるＷＯＬＦ遺伝子が位置する。「アルファ−ＷＯＬＦ」タイプまたは「ベータ−ＷＯＬＦ」タイプ遺伝子のいずれかである（まとめて「ＷＯＬＦ遺伝子またはアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子」と呼ばれる）これらの１または２の遺伝子は、それぞれＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲ（コイルドコイル−ヌクレオチド結合部位−ロイシンリッチリピート（Ｃｏｉｌｅｄ  Ｃｏｉｌ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ））ファミリーに属するタンパク質をコードする。ホウレンソウ植物に存在する対立遺伝子バリアント（または複数の対立遺伝子バリアント）に応じて、前記植物はベト病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ）の病原種に対する特定の抵抗性プロファイルを付与するＷＯＬＦタンパク質のバリアントを産生するだろう。本発明に至る研究は、アルファ−ＷＯＬＦ型の１つの対立遺伝子バリアントがベト病への抵抗性を提供せず、代わりにＣＭＶへの抵抗性を与えることを解明した。
【００１０】
本発明の文脈において、用語「対立遺伝子」または「対立遺伝子バリアント」は、特定の表現型、すなわち抵抗性、より具体的にはＣＭＶ抵抗性に関連する遺伝子のバージョンを示すために使用される。ホウレンソウ植物は、１または２のＷＯＬＦ遺伝子を保有し得ることがわかった。これらの２つのＷＯＬＦ遺伝子のそれぞれに対して、複数の対立遺伝子が存在する。本発明のＷＯＬＦ遺伝子対立遺伝子は、ＣＭＶへの抵抗性を付与する。本発明の文脈において、対立遺伝子または対立遺伝子バリアントは核酸である。
【００１１】
ホウレンソウ品種ビロフレー（Ｖｉｒｏｆｌａｙ）のベータ−ＷＯＬＦ遺伝子は、スキャフォールド１２７３５（配列：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＱ１４３３３９．１）、２１３５７３−２２１８８４位に位置する。ホウレンソウ植物がアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子を保有するまたはアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子のみ保有する場合にも、アルファ−ＷＯＬＦ遺伝子は、ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子がビロフレーゲノムアセンブリーにおけるスキャフォールド１２７３５に位置するのとほとんど同じ場所に位置する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ＣＭＶに感受性であるホウレンソウ品種ビロフレーについてのゲノムアセンブリーが公開されている（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ＳｙｎＶｉｒｏｆｌａｙ，  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔ；  Ｂｉｏｐｒｏｊｅｃｔ：ＰＲＪＮＡ４１４９７；  ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹＺＶ００００００００．２；  ＢｉｏＳａｍｐｌｅ：ＳＡＭＮ０２１８２５７２；  ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹＺＶ００００００００．２；  ＢｉｏＳａｍｐｌｅ：ＳＡＭＮ０２１８２５７２、Ｄｏｈｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４，  Ｎａｔｕｒｅ  ５０５：５４６−５４９）。ビロフレーのこのゲノムアセンブリーでは、ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子はスキャフォールド１２７３５（配列：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＱ１４３３３９．１）、２１３５７３−２２１８８４に位置する。この間隔でカバーされる配列は、ビロフレーのベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の全ゲノム配列と、前記遺伝子の上流の２０００塩基対配列と、遺伝子の下流配列に加えて、ＷＯＬＦ遺伝子の下流にある隣接遺伝子の遺伝子座までを含む。ホウレンソウ品種ビロフレーは単一のＷＯＬＦ遺伝子、すなわちベータ−ＷＯＬＦ遺伝子を有するのみであるが、多くのほかのホウレンソウ系統は、ゲノムにおける同じ位置で単一のアルファ型ＷＯＬＦ遺伝子を有する。他のホウレンソウ系統はゲノムにおけるほぼ同じ位置で２つのＷＯＬＦ遺伝子を有する。かかる場合に、２つのＷＯＬＦ遺伝子は互いに隣接して位置する。２つのＷＯＬＦ遺伝子を有するほとんどのホウレンソウ系統では、ＷＯＬＦ遺伝子の１つはアルファ型に属し、かつ他方のＷＯＬＦ遺伝子は、ベータ型に属する。本発明に至る研究では、ＷＯＬＦ遺伝子座におけるこの対立遺伝子変異がＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅの病原種に対する抵抗性における差異の原因であることが観察されたが、驚くべきことに、対立遺伝子バリアントの１つがベト病の代わりにＣＭＶに対する抵抗性を付与する。
【００１３】
アルファ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子およびベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子の差異は、コードされたタンパク質配列の特定の保存されたアミノ酸モチーフの存在にある。上述の通り、すべてのＷＯＬＦタンパク質はＮ末端からＣ末端に当技術分野で一般的に知られている以下のドメインを有する：コイルドコイルドメイン（ＲＸ−ＣＣ−様、ｃｄ１４７９８）、ＮＢＳドメイン（「ＮＢ−ＡＲＣドメイン」とも呼ばれる、ｐｆａｍ００９３１；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｉｅｚｅｎ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，  １９９８，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８：Ｒ２２６−Ｒ２２８）、およびＬＲＲドメインを構成するロイシンリッチリピート（ＩＰＲ０３２６７５）。さらに、すべてのＷＯＬＦタンパク質は、それらのアミノ酸配列中にＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」を含む。これに加えて、すべてのアルファ−ＷＯＬＦタンパク質は、それらのアミノ酸配列中にモチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」を含むのに対して、すべてのベータ−ＷＯＬＦタンパク質は、それらのアミノ酸配列中にモチーフ「ＨＶＧＣＶＶＤＲ」を含む。
【００１４】
本発明は、アルファ−ＣＭＶと命名されるアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子の新たなＣＭＶ抵抗性を付与する対立遺伝子に関する。
【００１５】
具体的には、本発明は、ＣＭＶ抵抗性を付与するアルファ−ＣＭＶと命名される対立遺伝子に関し、ここで、前記対立遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質であり、そのアミノ酸配列において以下を含む：ａ）そのＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」；ｂ）モチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」；およびｃ）優先度の高い順に配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するＬＲＲドメイン。任意に、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子は、そのアミノ酸配列においてさらなるモチーフ、すなわち「ＤＱＥＤＥＧＥＤＮ」をさらに含む。
【００１６】
本発明の目的のために、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子によりコードされるタンパク質のＬＲＲドメインは、優先度の高い順に、配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列として同定される。本発明のＬＲＲドメインはモチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」で始まる。
【００１７】
当業者は配列類似性の計算方法に精通している。適切には、配列類似性はＥＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスおよび「類似性スコア」を使用して、ＥＭＢＯＳＳストレッチャー６．６．０（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）を使用して計算される。
【００１８】
一実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子によりコードされるタンパク質のＬＲＲドメインは優先度の高い順に配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列として規定される。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、そのアミノ酸配列において以下を含むＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質をコードする核酸に関する：ａ）そのＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」；ｂ）モチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」；およびｃ）優先度の高い順に配列番号１０に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するＬＲＲドメイン。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、優先度の高い順に配列番号１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノムヌクレオチド配列を有する核酸に関する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、優先度の高い順に配列番号２または配列番号３に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するコーディング配列を有する核酸に関する。
【００２２】
本明細書中で規定されるアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のＬＲＲドメインは、特定のプライマーを使用してＬＲＲドメインのアミノ酸配列をコードするゲノムＤＮＡを増幅および配列決定し、続いてＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、それにより正しいリーディングフレームを選択する際に常識を適用することにより、決定してもよい。当業者はｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／で見つけることができるような無料で利用できるオンラインバイオインフォマティクスツールを使用してこれを行うことができる。
【００２３】
アルファ−ＣＭＶなどのアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインのゲノム配列は、配列番号６の配列を有する核酸分子であるフォワードプライマーおよび配列番号７の配列を有する核酸分子であるリバースプライマー、を有するプライマー対を使用して増幅されてもよい。
【００２４】
配列番号６および配列番号７を有するプライマーを使用してアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子などのアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインコード領域を増幅するための、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲ条件は、以下のとおりである：９５℃で３分（初期の変性ステップ）；４０増幅サイクルであって、各サイクルは以下からなる：９５℃で３０秒変性、６０℃で３０秒アニーリング、および７２℃で３０秒伸長；７２℃で２分（最終伸長ステップ）。
【００２５】
ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子、例えば変種ビロフレーに存在するようなヌル（ｎｕｌｌ）対立遺伝子のＬＲＲドメインは、配列番号８の配列を有する核酸分子であるフォワードプライマーおよび配列番号７の配列を有する核酸分子であるリバースプライマーを使用して増幅されてもよい。
【００２６】
配列番号８および配列番号７を有するプライマーを使用するベータ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインコード領域を増幅するための、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃で３分（初期の変性ステップ）；４０増幅サイクルであって、各サイクルは以下からなる：９５℃で３０秒変性、５８℃で５０秒アニーリングおよび７２℃で５０秒伸長；７２℃で２分（最終伸長ステップ）。
【００２７】
したがって、本発明はまた、アルファ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインを増幅するための、より具体的にはアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のＬＲＲドメインを増幅するための、プライマー対に関し、ここで、フォワードプライマーが配列番号６の配列を含む核酸分子であり、かつリバースプライマーは配列番号７の配列を含む核酸分子である。本明細書で開示されるプライマーは、上述の条件を使用してＷＯＬＦ遺伝子の一部を選択的に増幅するために具体的に設計されており、他のＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質コード遺伝子を増幅するためのものではない。
【００２８】
本発明は、ホウレンソウ植物中に存在する場合にＣＭＶに対する抵抗性を付与するアルファ−ＣＭＶに関し、ここで、前記対立遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質であり、そのアミノ酸配列において以下を含む：ａ）そのＮ末端でモチーフ「ＭＡＥＩＧＹＳＶＣ」；およびｂ）モチーフ「ＫＷＭＣＬＲ」；およびここで前記対立遺伝子が、優先度の高い順に配列番号１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノムヌクレオチド配列を有する。
【００２９】
本発明は、優先度の高い順に配列番号１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子に関する。
【００３０】
表２で提供される配列番号２１は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のゲノム配列およびベータ−ＣＭＶ対立遺伝子のゲノム配列を表す。配列番号２１は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）の上流の２キロベース領域をさらに含む。配列番号２により表されるアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のコーディング配列を使用することにより、当業者は配列番号１により表される開始コドン（ＡＴＧ）の上流の２キロベース領域を有するアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のゲノム配列を同定できる。
【００３１】
本発明は、２つの異なるスプライスバリアントに関する。一実施形態では、本発明は、優先度の高い順に配列番号２に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するコーディング配列を有するアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子に関する。これはアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子の第一スプライスバリアントである。別の実施形態では、本発明は、優先度の高い順に配列番号３に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するコーディング配列を有するアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子に関する。これは、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子の第二スプライスバリアントである。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子は、優先度の高い順に、配列番号４に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００３３】
別の実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子は、優先度の高い順に配列番号５に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００３４】
アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子はホウレンソウ植物中に存在する場合にＣＭＶへの抵抗性、好ましくはＣＭＶへの完全な抵抗性を付与する。ホウレンソウ植物におけるＣＭＶに対する抵抗性は、植物が２または３の本葉を有する場合に、２つの単離株（ＮＬ１６およびＳＰ４３）の混合物であるＣＭＶウイルスを植物に機械的に播種することにより試験されてもよい。試験される植物は昼間温度２０℃、夜間温度１８℃の状態で栽培され、少なくとも１６時間光を受ける。播種は植物のすべての本葉にカーボランダム（ｃａｒｂｏｒｕｎｄｒｕｍ）粉末をまぶし、その後播種物を浸したスポンジでそれらをこすることにより行われる。播種物は水で希釈された等量の両方の分離株の混合物であり、好ましくは１：１０希釈である。接種後、植物は水でわずかにすすがれる。症状は播種後７−９日観察されてもよい。抵抗性植物、すなわち本発明の対立遺伝子を含む植物は症状を示さないのに対して、感受性植物は典型的には矮性成長および植物の中心にモザイク症状を示す。
【００３５】
本明細書に記載されている試験の詳細な例は、ホウレンソウの識別性、均一性、安定性に関するＣＰＶＯプロトコルで見つけることができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｐｖｏ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＴＰ／ｖｅｇｅｔａｌｅｓ／ＴＰ＿０５５−５Ｒｅｖ＿Ｓｐｉｎａｃｉａ＿ｏｌｅｒａｃｅａ．ｐｄｆ。
【００３６】
本発明の別の態様は、本発明のアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物に関し、種子の代表的なサンプルはＮＣＩＭＢ受託番号４２６５１でＮＣＩＭＢに寄託された。
【００３７】
さらなる実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む本発明の植物は、農学的にエリートなホウレンソウ植物である。
【００３８】
本発明の文脈において、農学的にエリートなホウレンソウ植物は、人間の介入の結果である、識別可能で望ましい農学的形質の蓄積をもたらす遺伝子型を有する非自然発生の植物であり、例えば、交雑と選択、変異誘発、形質転換、またはそうでなければかかる形質を導入することによって達成される。農学的にエリートなホウレンソウ植物は、繁殖系統（例えば戻し交配（ｂａｃｋｃｒｓｓ）系統、近交系（ｉｎｂｒｅｒｄ））、栽培品種（ｃｕｌｔｉｖａｒｓ）および品種（ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）（開放受粉した、またはハイブリッド）などの種類にかかわらず任意の栽培されるＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物を含む。野生で発生するＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａの植物（すなわち栽培されていないホウレンソウ）またはＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａおよびＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａなどのＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａの近縁野生種は、この定義に包含されない。
【００３９】
好ましくは、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む農学的にエリートなホウレンソウ植物は、近交系またはハイブリッドの植物である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、近交系の植物は、３回以上の自殖または戻し交配の結果である植物集団の植物；または倍加半数体である。近交系は、例えば、商用ハイブリッドの生産に使用される親系統であってもよい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、ハイブリッド植物は、様々な遺伝子型を有する２つの異なる植物間の交雑の結果である植物である。より具体的には、ハイブリッド植物は、２つの異なる近交系の植物間の交雑の結果である。かかるハイブリッド植物はＦ１ハイブリッド品種の植物であってもよい。
【００４２】
ヘテロ接合型でアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有する植物は、例えば品種ビロフレーに存在するようなベータ−ＷＯＬＦ０対立遺伝子をさらに含んでもよく、ここで、ベータ−ＷＯＬＦ０対立遺伝子はＣＭＶまたはベト病への抵抗性を付与しない。あるいは、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子についてヘテロ接合の植物は、ベト病への抵抗性を提供するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子をさらに含んでもよい。好ましくは、かかる対立遺伝子は１種以上のベト病への少なくとも中間的な抵抗性を提供するであろう。より好ましくは、かかる対立遺伝子は少なくとも１０種のベト病への少なくとも中間的な抵抗性を提供するだろう。最も好ましくは、植物がＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１−Ｐｆｓ：１６に完全に抵抗性であるように、アルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子は、ベト病に対する抵抗性を付与する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子は、配列番号１３に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するベータ−ＷＯＬＦ３であり、かつここで前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、およびＰｆｓ：１６に少なくとも抵抗性である。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子が、配列番号１４に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ６であり、かつ、ここで、前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、Ｐｆｓ：１５、およびＰｆｓ：１６に少なくとも抵抗性である。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子は、配列番号１５に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ６ｂであり、かつ前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、Ｐｆｓ：１５、Ｐｆｓ：１６および単離ＵＳ１５０８に少なくとも抵抗性である。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子が、配列番号１６に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ８であり、かつ、ここで、前記植物は少なくとも、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：１５への抵抗性、およびＰｆｓ：１６への中間的な抵抗性を示す。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子が、配列番号１７に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ９であり、かつ、ここで、前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１０、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、およびＰｆｓ：１３に少なくとも抵抗性である。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子が、配列番号１８に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ１１であり、かつ、ここで前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１３、Ｐｆｓ：１５、Ｐｆｓ：１６および単離ＵＳ１５０８に少なくとも抵抗性である。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子が、配列番号１９に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ１２であり、かつ、ここで前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１０、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２および単離Ｐｆｓ：１３に少なくとも抵抗性である。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベト病抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物に関し、ここで、ベト病抵抗性を付与する対立遺伝子が、配列番号２０に優先度の高い順に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するゲノム配列を有するアルファ−ＷＯＬＦ１５であり、かつ、ここで前記植物は、ＣＭＶおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１３、Ｐｆｓ：１４、およびＰｆｓ：１５に少なくとも抵抗性である。
【００５１】
一実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子および１以上のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種への抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の対立遺伝子を含む植物は、農学的にエリートな植物、好ましくはハイブリッド植物である。
【００５２】
本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む繁殖材料にさらに関する。一実施形態では、繁殖材料は有性生殖に適している。かかる繁殖材料は、例えば小胞子、花粉、子房、胚珠、胚嚢および卵細胞を含む。別の実施形態では、繁殖材料は、栄養生殖に適している。かかる繁殖材料は、例えば挿し木（ｃｕｔｔｉｎｇ）、根、茎、細胞、プロトプラスト、および再生可能な細胞の組織培養物（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を含む。組織培養物を調製するのに適している植物の一部は、特に、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、成長点の細胞、根端、葯、花、種子および茎である。
【００５３】
本発明は、ＣＭＶへの抵抗性を示すホウレンソウ植物の生産のためのアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む組織培養物の使用にさらに関する。
【００５４】
本発明はまた、繁殖材料の供給源としてのアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物の使用に関する。
【００５５】
本発明はまた、種子の供給源としてのアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物の使用に関する。
【００５６】
さらに、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物の細胞に関する。かかる細胞は、単離された形態であってもよく、または完全な植物またはその部分の一部であってもよく、そして、かかる細胞はＣＭＶへの抵抗性を付与するアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を有するため本発明の細胞を構成する。本発明の植物の各細胞はＣＭＶへの抵抗性を付与する遺伝情報を有する。本発明のかかる細胞はまた、本発明の対立遺伝子を含む新たな植物を再生産するために使用されてもよい再生可能な細胞であってもよい。
【００５７】
一態様では、本発明は、ＣＭＶへの抵抗性を示すホウレンソウ植物の生産のためのアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む細胞の使用に関する。
【００５８】
本発明のさらに別の態様は、第一親ホウレンソウ植物を第二親ホウレンソウ植物と交雑させること、および得られたハイブリッドホウレンソウ種子を収穫することを含む、ハイブリッドホウレンソウ種子を作製するための方法に関し、ここで第一および／または第二親ホウレンソウ植物は、ＣＭＶ対立遺伝子を含む。特定の実施形態では、第一および／または第二親植物は本明細書中で規定される近交系の植物である。
【００５９】
本発明は、第一親ホウレンソウ植物を第二親ホウレンソウ植物と交雑させること、および得られたハイブリッドホウレンソウ種子を収穫することにより生産された種子から成長したハイブリッドホウレンソウ植物にさらに関し、ここで第一および／または第二親ホウレンソウ植物は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む。
【００６０】
本発明の別の態様は、ゲノムヌクレオチド配列またはその部分の存在（または非存在）について植物を決定すること、または検出すること、または測定すること、または定量的にもしくは定性的に確認すること、またはアッセイすることを含む、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物を同定する、または検出する、または遺伝子型決定する、または選択する方法に関し、ここで、前記配列は、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。したがって、本発明は、ゲノムヌクレオチド配列またはその部分の存在（または非存在）について植物を決定すること、または検出すること、または測定すること、または定量的にもしくは定性的に確認すること、またはアッセイすることを含む、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するかまたは保有しないとしてホウレンソウ植物を特性解析することを包含および含み、ここで、前記配列は、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有し；前記方法は、植物のＤＮＡまたはＲＮＡを抽出または取得すること、およびヌクレオチド配列またはその部分のその存在または非存在に関するそれらの解析を含んでもよく、ここで、前記配列は、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。配列情報および本明細書中に記載の方法を使用することにより、当業者は配列番号２１を使用することによりアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物を同定する、または検出する、または遺伝子型決定する、または選択することができ、ここで、前記配列は、配列番号２１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。コーディング配列もしくはタンパク質またはその部分などのホウレンソウ植物の発現産物を解析して、前記産物がどこから発現したのかを確認し、植物が、ゲノムヌクレオチド配列またはその部分を有する（または有しない）かどうかを決定できることが本発明の範囲内でさらに理解され得もし、ここで、前記配列は、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。かかるコーディング配列は、配列番号２および／または配列番号３に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するだろうが、タンパク質は、配列番号４および／または配列番号５に優先度の高い順に９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６１】
一実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物を同定または選択する方法は、植物のゲノムにおけるゲノムヌクレオチド配列またはその一部の存在を決定することを含み、ここで、前記配列は、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。
【００６２】
一実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物を同定または選択する方法は、植物のゲノムにおけるゲノムヌクレオチド配列またはその一部の存在を決定することを含み、ここで、前記配列は、配列番号２１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。
【００６３】
本発明は、植物のゲノムにおけるコーディング配列またはその一部の存在を決定することを含むアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物を同定または選択する方法にさらに関し、ここで、前記配列は、配列番号２に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。
【００６４】
本発明は、植物のゲノムにおけるコーディング配列またはその一部の存在を決定することを含むアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物を同定または選択する方法にさらに関し、ここで、前記配列は、配列番号３に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する。
【００６５】
ホウレンソウ植物のゲノムにおけるアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子が属するＷＯＬＦ遺伝子の少なくとも一部のゲノムＤＮＡまたはコーディングＤＮＡ配列を決定することは、当技術分野で公知の任意の適切な分子生物学的方法を使用して実施されてもよく、（ゲノム）ＰＣＲ増幅、続いてサンガーシーケンス、全ゲノムシーケンス、トランスクリプトームシーケンス、配列特異的ターゲットキャプチャー、続いて次世代シーケンス（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｘＧｅｎ（登録商標）ターゲットキャプチャーシステムを使用）、ＬＲＲドメインを含む遺伝子配列の特異的な増幅（たとえば、Ｊｕｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ７６：５３０−５４４に記載のＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲｅｎＳｅｑ）手法を使用）続いてシーケンシングなどを含むがこれらに限定されない。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中で規定されるＬＲＲドメインをコードするＤＮＡ配列を決定することを含むアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有する植物を同定または選択する方法に関する。
【００６７】
前記方法のさらなる実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のＬＲＲドメインはＬＲＲドメインのゲノムＤＮＡ領域を増幅するプライマー対を使用することにより決定される。フォワードプライマーは好ましくは配列番号６の配列を含む核酸分子であり、かつリバースプライマーは好ましくは配列番号７の配列を含む核酸分子である。
【００６８】
本発明の別の態様は、（ａ）アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物を別の植物と交雑すること；（ｂ）任意に１回以上の自殖および／または交雑を実施すること；（ｃ）任意に各回の自殖または交雑のあとにアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物を選択すること、を含むＣＭＶへの抵抗性を含むホウレンソウ植物の製造方法に関する。
【００６９】
アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物を選択することは、配列番号１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する対立遺伝子のゲノムＤＮＡ配列の存在を決定することにより遺伝子型的に行われてもよい。
【００７０】
アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物を選択することは、配列番号２１に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する対立遺伝子のゲノムＤＮＡ配列の存在を決定することにより遺伝子型的に行われてもよい。
【００７１】
別の実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物を選択することは、配列番号２に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する対立遺伝子のコーディング配列の存在を決定することにより遺伝子型的に行われてもよい。
【００７２】
別の実施形態では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物を選択することは、配列番号３に優先度の高い順に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％配列類似性を有する対立遺伝子のコーディング配列の存在を決定することにより遺伝子型的に行われてもよい。
【００７３】
あるいは、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子の存在は、病害試験、例えば本明細書に記載される試験で植物をアッセイすること、および本明細書に記載される症状の非存在に基づいてアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有する植物を同定すること、または選択することにより表現型的に決定されてもよい。
【００７４】
本発明は、ＣＭＶに対する抵抗性を付与するための育種におけるアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物の使用にさらに関する。
【００７５】
本発明はまた、本発明のアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するホウレンソウ植物の開発のための育種方法であって、前記対立遺伝子を含む生殖質が使用される方法に関する。本発明の対立遺伝子を含む植物に成長でき、かつ生殖質を代表できる種子は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２６５１でＮＣＩＭＢに寄託された。
【００７６】
別の態様では、本発明は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物の製造方法に関し、前記方法は、以下を含む：（ａ）対立遺伝子を含む植物を別の植物と交雑すること；（ｂ）任意にＦ１において前記対立遺伝子を含む植物を選択すること；（ｃ）任意に得られたＦ１を好ましい親と戻し交配することおよびＢＣ１Ｆ１において前記対立遺伝子を有する植物を選択すること；（ｄ）任意に１以上のさらなる回の自殖、交雑、および／または戻し交配を実施し、その後、前記対立遺伝子を含むか、または前記対立遺伝子により付与されるＣＭＶへの抵抗性を示す植物を選択すること。本発明はまた、この方法により生産されるホウレンソウ植物を包含する。
【００７７】
本発明はまた、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物の生産における、代表的な種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２６５１でＮＣＩＭＢに寄託されたホウレンソウ植物の使用に関する。
【００７８】
本発明はまた、天然または加工形態のいずれかで、本発明のホウレンソウ植物の収穫した葉および本発明のホウレンソウ植物の収穫した葉を含む食品に関する。
【００７９】
本発明は、消費のためのアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むホウレンソウ植物の使用にさらに関する。
【００８０】
ホウレンソウの葉は通常、包装された形で販売され、事前に包装されたホウレンソウの葉、または前記葉を含むサラダで加工されたものを含むが、これらに限定されない。かかるパッケージの言及は例えば米国特許第５，５２３，１３６でなされており、これは、葉物（ｌｅａｆｙ  ｐｒｏｄｕｃｅ）を含有するかかるパッケージを含む包装フィルムおよびかかる包装フィルムのパッケージならびに本発明のホウレンソウの葉と共に使用に適しているかかる包装フィルムおよびパッケージの作製および使用方法を提供する。したがって、本発明は、本発明のホウレンソウ植物の葉、ならびに本発明のホウレンソウ植物に由来する葉の使用ならびに作製および使用する方法を包含する。
【００８１】
本発明は、家庭環境において、植物からの葉を収穫するための生育基質中に、本発明の１以上の植物、または本発明の植物に由来する１以上のホウレンソウ植物を含む容器にさらに関する。この方法で、消費者は、植物が収穫可能な状態にあるときに、サラダに使用するために非常に新鮮な葉を選ぶことができてもよい。
【００８２】
寄託情報
そのゲノムにおいてヘテロ接合に本発明のアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物の種子は、受託番号４２６５１で２０１６年９月９日にＵＫ、ＡＢ２１  ９ＹＡ、アベルディーン、ブックスバーン、クライブストーン  エステート、フェルグソンビルディングＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄに寄託された。前記寄託はブダペスト条約の条件に従って行われた。特許が発行されると、寄託に関するすべての制限が削除され、寄託は３７ＣＦＲセクション１．８０１−１．８０９の要件を満たすことを目的とする。特許の発行時に前記寄託は撤回できず、一般への公開に制限または条件はない。寄託は、３０年間、または最新の要望の後５年に、または特許の有効期間内のいずれか長い方で保管所で維持され、そしてその期間内に必要に応じて代替される。
【００８３】
配列情報
表２．配列情報．
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【００８４】
本発明は、以下の実施例においてさらに明確にされ、それは例示の目的のためだけに与えられ、決して本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８５】
実施例１
ホウレンソウ植物におけるＣＭＶへの抵抗性についての試験
ＣＭＶ感染への抵抗性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｐｖｏ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＴＰ／ｖｅｇｅｔａｌｅｓ／ＴＰ＿０５５−５Ｒｅｖ＿Ｓｐｉｎａｃｉａ＿ｏｌｅｒａｃｅａ．ｐｄｆで入手可能なホウレンソウの識別性、均一性、安定性に関する試験のＣＰＶＯプロトコルでに記載されているようにアッセイした。本発明のホウレンソウの種子は、品種ビロフレーおよびＰｏｌｋａの種子とともに、５ｘ５ｃｍの土壌ブロックに、２０℃の昼間温度および１８℃の夜間温度で少なくとも１６時間光を受ける栽培体制の下で播種した。植物が３つの本葉を発達させたとき、それらにＣＭＶを接種した。播種はカーボランダム（ｃａｒｂｏｒｕｎｄｒｕｍ）粉末を植物の葉にまぶし、その後播種物に浸したスポンジで葉をこすることにより行った。播種物は水で単離株ＮＬ１６およびＳＰ４３を希釈したものであった（１：１０）。播種後、植物を水で軽くすすいだ。
【００８６】
播種後７−９日で症状が観察されてもよい。抵抗性植物、すなわち本発明の対立遺伝子を含む植物は症状を示さないが、感受性植物は典型的には矮性成長および植物の中心にモザイク症状を示す。
【００８７】
この特定の試験の植物は、症状の発生に基づいて抵抗性または感受性であると評価された。症状を示さない植物は、この特定の試験では抵抗性と見なした。感染の症状を示した植物は、このテストでは感受性と評価した。
【００８８】
品種ビロフレーおよびＰｏｌｋａのすべての植物は、それらが矮性成長および植物の中心にモザイク症状などの症状を示したため感受性であると評価されたが、本発明の植物は症状を示さず、抵抗性と評価された。
【００８９】
実施例２
品種ビロフレーの植物へのＣＭＶ抵抗性の移入
寄託ＮＣＩＭＢ４２６５１の種子では、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子がヘテロ接合的に存在する。この寄託物の種子を成熟したホウレンソウ植物に成長させ、個別に自殖しＦ２集団を生成した。
【００９０】
Ｆ２種子５０個を使用して実施例１に記載される病害試験のための植物を育成した。病害試験で抵抗性であると評価されたＦ２植物ををさらに成熟するまで育て、再び個別に自殖し、各植物についてＦ３集団を得た。各Ｆ３集団を再び実施例１に記載される病害試験に供した。ＣＭＶ病害試験において完全に抵抗性であると評価されたＦ３集団の植物はホモ接合でアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含むと考えることができる。
【００９１】
アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子がホモ接合である植物の１つを使用して、ＣＭＶに感受性である品種ビロフレーの植物と交雑し、Ｆ１種子を得、その後Ｆ１種子から栽培されたＦ１植物を得た。Ｆ１植物を自殖してＦ２集団の種子および植物を得た。この集団を再度実施例１に記載される病害試験に供した。病害試験はＣＭＶ抵抗性の分離パターンが３：１であることを示し、これは、優性遺伝の分離パターンと一致する。
【００９２】
実施例３
ＬＲＲドメインコード領域の増幅
アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を保有するＣＭＶ抵抗性ホウレンソウ植物の同定および選択は、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子の存在についてＤＮＡをスクリーニングすることによって効率的に行われ得る。例えば以下に記載するように、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のＬＲＲドメインの配列を増幅すること、および任意に決定することにより行われ得る。
【００９３】
実施例２で得られたＦ２集団からのホウレンソウ植物の単離ゲノムＤＮＡを、フォワードプライマーＡＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＴＡＧＧ（配列番号６）およびリバースプライマーＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧ（配列番号７）を使用して増幅した。プライマー対はアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子が属するアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインコード領域を増幅し、アルファ−ＷＯＬＦ遺伝子の一部を選択的に増幅するよう設計されており、他のＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質コード遺伝子を増幅するためのものではない。
【００９４】
配列番号６および配列番号７を有するプライマーを使用するアルファ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインコード領域を増幅するためのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲ条件は以下のとおりである：
−９５℃で３分（初期の変性ステップ）
−４０増幅サイクルであって、各サイクルは以下からなる：９５℃で３０秒変性、６０℃で３０秒アニーリング、および７２℃で３０秒伸長、
−７２℃で２分（最終伸長ステップ）。
【００９５】
実施例２で得られたＦ２集団からのホウレンソウ植物の単離ゲノムＤＮＡをフォワードプライマーＴＣＡＣＧＴＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＴ（配列番号８）およびリバースプライマーＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧ（配列番号７）を使用して並行して増幅した。このプライマー対はビロフレーのベータ−ＷＯＬＦ０対立遺伝子が属するベータ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインコード領域を増幅し、ベータ−ＷＯＬＦ遺伝子の一部を選択的に増幅するために設計されており、他のＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質コード遺伝子を増幅するためのものではない。
【００９６】
配列番号７および配列番号８を有するプライマーを使用するベータ−ＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインコード領域を増幅するためのＴａｑ酵素を使用するＰＣＲ条件は以下のとおりである：
−９５℃で３分（初期の変性ステップ）
−４０増幅サイクルであって、各サイクルは以下からなる：９５℃で３０秒変性、５８℃で５０秒アニーリングおよび７２℃で５０秒伸長、
−７２℃で２分（最終伸長ステップ）。
【００９７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で可視化し（示さず）、ＤＮＡをＰＣＲ反応から精製した。続いて、ＰＣＲ産物の配列を、当技術分野で周知の方法を使用して決定した。
【００９８】
配列番号６および配列番号７を有するプライマーにより増幅されるアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のＬＲＲドメインの配列は配列番号９の下で表２で提供される。
【００９９】
配列番号７および配列番号８を有するプライマーにより増幅されるベータ−ＷＯＬＦ０対立遺伝子のＬＲＲドメインの配列は配列番号１１の下で表２で提供される。
【０１００】
ＰＣＲ産物をアガロースゲルで可視化し（示さず）、これは、植物の約２５％がアルファ−ＷＯＬＦ断片のみを含有し、約５０％にアルファ−およびベータ−ＷＯＬＦ断片の両方を含有することが実証され、かつ残りの約２５％の植物がベータ−ＷＯＬＦ断片のみを含有していたことを実証した。アルファ−ＷＯＬＦ断片を含有する植物はＣＭＶについて抵抗性であると評価された植物と完全に相関した。ベータ−ＷＯＬＦ断片のみを含む植物は、ＣＭＶについて感受性であると評価された植物と完全に相関した。
【０１０１】
ＰＣＲ反応からＤＮＡを精製し、その後ＰＣＲ産物の配列を決定した。アルファ−ＷＯＬＦ  ＰＣＲは、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子のＬＲＲドメインのゲノム配列である、配列番号９の配列に対応する配列を与えた。ベータ−ＷＯＬＦ  ＰＣＲ産物は、ベータ−ＷＯＬＦ０対立遺伝子のＬＲＲドメインのゲノム配列である、配列番号１１の配列に対応する配列を与えた。
【０１０２】
最終的に、得られた配列をアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子およびベータ−ＷＯＬＦ０について、それぞれ配列番号１０および配列番号１２を有するＬＲＲドメインの対応するアミノ酸配列に翻訳した（表２も参照）。
【０１０３】
実施例４
ＣＭＶ抵抗性のハイブリッドおよび親系統の作製
Ｒａｃｏｏｎ（５１−３１７ＲＺ）に存在するＷＯＬＦ対立遺伝子の１つは配列番号１３を有するベータ−ＷＯＬＦ３であり、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ種Ｐｆｓ：１、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１４、およびＰｆｓ：１６に対する抵抗性を付与する。これらの種に対する完全な抵抗性に続いて、ベータ−ＷＯＬＦ３はＰｆｓ：８に対する中間的な抵抗性を提供する。本実験の目的は、ベータ−ＷＯＬＦ３対立遺伝子を本発明のアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子と組み合わせた安定なハイブリッドを作製することであった。
【０１０４】
ホモ接合でアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を含む植物、例えば実施例２で得られた植物をハイブリッドＲａｃｏｏｎの雄親系統の植物と交雑した。Ｆ１植物を実施例１に記載されるＣＭＶ病害試験に供し、かつ抵抗性植物を選択した。選択した植物を再度ハイブリッドＲａｃｏｏｎの雄親系統の植物と交雑してＢＣ１集団を得た。ＢＣ１集団を実施例１に記載されるＣＭＶ病害試験に供し、再度ＣＭＶ抵抗性植物を選択した。これをＢＣ４集団が得られるまで３回以上繰り返した。
【０１０５】
再度、抵抗性植物をＣＭＶ病害試験から選択し、この植物を自殖した。得られたＳ１ＢＣ４集団から、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子についてホモ接合である植物を実施例３で言及したＷＯＬＦ遺伝子のＬＲＲドメインの配列を決定することにより選択した。
【０１０６】
選択したホモ接合の植物をさらに交配してＲａｃｏｏｎについて代替的なＣＭＶ抵抗性親系統として機能し得る集団を得た。
【０１０７】
このＣＭＶ抵抗性親系統からの植物をハイブリッドＲａｃｏｏｎの雌親系統と交雑し、ベータ−ＷＯＬＦ３対立遺伝子により付与されるベト病抵抗性と組み合わせて、本発明のアルファ−ＣＭＶ対立遺伝子により付与されるＣＭＶ抵抗性である新しいハイブリッド品種についての種子を生産した。
【０１０８】
同様の方法で、アルファ−ＣＭＶ対立遺伝子を１以上のベト病種に対する抵抗性を付与するアルファ−／ベータ−ＷＯＬＦ対立遺伝子と組み合わせてハイブリッドを作製できる。
【配列表】
2020534844000001.app
【国際調査報告】
2020534844.tif 000045
2020534844.tif 000046
2020534844.tif 000047