(57)【要約】  末梢血リンパ球及び骨髄浸潤リンパ球を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び／又は骨髄から拡大培養する方法並びにそのような拡大培養されたＴＩＬの、癌及び血液悪性腫瘍などの疾患の処置における使用が本明細書に開示される。
2020519600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
（ａ）任意選択により、イブルチニブを含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）液性腫瘍を入手するステップ；
（ｃ）任意選択により、前記腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ前記腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）前記第１の細胞培養培地中で前記ＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、前記ＴＩＬの第２の集団は、数において前記ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記初期拡大培養は、２１日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中で前記ＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、前記ＴＩＬの第３の集団は、前記第２の拡大培養の開始から７日後、数において前記ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも１０倍多く、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、前記第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）前記ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）前記ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、前記癌を有する患者に投与するステップ
を含み、前記癌は、血液悪性腫瘍である、方法。
【請求項２】
ＩＴＫ阻害剤の添加を更に含み、前記ＩＴＫ阻害剤は、任意選択により、ＩＴＫに共有結合するＩＴＫ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＴＫ阻害剤は、ステップ（ｄ）中に前記第１の細胞培養培地に添加されるか、ステップ（ｅ）中に前記第２の細胞培養培地に添加されるか、又はステップ（ｄ）中に前記第１の細胞培養培地に添加されることと、ステップ（ｅ）中に前記第２の細胞培養培地に添加されることとの両方である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９（（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミド）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５μＭの濃度で添加される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記初期拡大培養は、３日間〜１１日間の期間にわたって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の拡大培養は、３日間〜１１日間の期間にわたって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＬ−２は、前記第１の細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の細胞培養培地中において、前記ＩＬ−２は、１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及び前記ＯＫＴ−３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記初期拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＩＬの第３の集団を前記患者に投与する前に前記患者を非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンで処置するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、２日間にわたって６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でシクロホスファミドを投与し、続いて５日間にわたって２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でフルダラビンを投与するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者への前記ＴＩＬの第３の集団の投与の翌日に開始する高用量ＩＬ−２レジメンで前記患者を処置するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記高用量ＩＬ−２レジメンは、許容量まで８時間ごとに１５分のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
患者集団は、イブルチニブで前処置された患者集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を調製するプロセスであって、
（ａ）前記腫瘍を断片化するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で前記ＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、前記ＴＩＬの第２の集団は、数において前記ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記初期拡大培養は、２１日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で前記ＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、前記ＴＩＬの第３の集団は、前記第２の拡大培養の開始から７日後、数において前記ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、前記第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；及び
（ｄ）前記ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ
を含み、前記腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、プロセス。
【請求項２３】
前記ＴＩＬの第１の集団は、腫瘍又はその一部から入手される、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記腫瘍又はその一部は、患者から切除されたものである、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記初期拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記初期拡大培養は、１１日間以下の期間にわたって行われる、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記第２の拡大培養は、１１日間以下の期間にわたって行われる、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２８】
血液悪性腫瘍の処置のためのＴＩＬの集団の製造における液性腫瘍の使用。
【請求項２９】
骨髄又は末梢血から入手されたＴＩＬを拡大培養する方法であって、
（ａ）骨髄又は末梢血のサンプルからＴＩＬの第１の集団を特定すること；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で前記ＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手することであって、前記ＴＩＬの第２の集団は、数において前記ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記初期拡大培養は、２１日間以下の期間にわたって行われる、入手すること；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で前記ＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手することであって、前記ＴＩＬの第３の集団は、前記第２の拡大培養の開始から７日後、数において前記ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、前記第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、入手すること；
（ｄ）前記ＴＩＬの第３の集団を回収すること；及び
（ｅ）前記ＴＩＬの第３の集団を前記患者に提供すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記初期拡大培養は、１１日間以下の期間にわたって行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の拡大培養は、１１日間以下の期間にわたって行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩＬ−２は、前記第１の細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の細胞培養培地中において、前記ＩＬ−２は、１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及び前記ＯＫＴ−３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記初期拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法であって、
ａ．末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬをガス透過性容器内において約２〜約６日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に約２〜約６日間の期間にわたってステップ（ｄ）からの前記ＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）からの培養物から前記抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｅ）で分離された前記ＰＢＬから前記抗体を取り出すこと；及び
ｈ．前記ＰＢＬを回収すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記第１の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｄ）後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記第１の細胞培養培地は、第２の細胞培養培地と交換される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｅ）後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び第２の培養培地は、第３の細胞培養培地と交換される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記第３の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、異なる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、同一である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＰＢＬとの比は、約０．１：１〜約１０：１（Ｂ細胞：ＰＢＬ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＰＢＬとの比は、０．１：１、１：１及び１０：１（Ｂ細胞：ＰＢＬ）からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約１×１０５〜約１０×１０５個のＰＢＬがある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２．５×１０５〜１０×１０５個のＰＢＬがある、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＰＢＬがある、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びＰＢＬ：ビーズ比は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおいて約１：１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５４】
ＩＴＫ阻害剤の添加を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５５】
ＩＴＫ阻害剤は、ステップ（ｃ）、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）の少なくとも１つ中に添加される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９（（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミド）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
閉鎖滅菌系で行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項６０】
末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法であって、
ａ．患者の末梢血からＰＢＭＣのサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存され、及び前記患者は、任意選択により、ＩＴＫで前処置される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離し、且つ任意選択により、０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤で前記ＰＢＬを前処理すること；
ｃ．前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と２〜５日間の期間にわたって共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中のガス透過性容器に約２．５×１０５〜約５×１０５個の細胞を添加し、且つ３〜６日間の期間にわたり、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体並びに任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤で前記ＰＢＬを刺激すること；
ｅ．前記第１の細胞培養培地を第２の細胞培養培地及び約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度の追加のＩＬ−２並びに任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤に交換すること；
ｆ．ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体並びに任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤と共に３〜６日間の追加の期間にわたってステップ（ｅ）からの前記ＰＢＬを培養すること；
ｇ．前記第２の細胞培養培地を第３の細胞培養培地に交換し、且つ３０００ＩＵ／ｍＬの濃度の追加のＩＬ−２及び任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤を添加し、且つ２〜５日間の追加の期間にわたって前記細胞を培養すること；
ｈ．ステップ（ｇ）の培養物から前記抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｉ．ステップ（ｈ）で分離された前記ＰＢＬから前記抗体を取り出すこと；及び
ｊ．前記ＰＢＬを回収すること
を含み、前記ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに共有結合するＩＴＫ阻害剤である、方法。
【請求項６１】
血液悪性腫瘍を処置する方法であって、
ａ．血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血からＰＢＭＣのサンプルを入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬをガス透過性容器内において約２〜約６日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に約２〜約６日間の期間にわたってステップ（ｄ）からの前記ＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）の培養物から前記抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｆ）で分離された前記ＰＢＬから前記抗体を取り出すこと；及び
ｈ．前記ＰＢＬを回収すること；及び
ｉ．前記血液悪性腫瘍を処置するために前記ＰＢＬを治療有効量で前記患者に投与すること
を含む方法。
【請求項６２】
前記患者は、ＰＢＭＣサンプルを入手する前にＩＴＫ阻害剤で前処置される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９（（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミド）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記患者は、イブルチニブレジメンの少なくとも３つのラウンドで前処置される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記血液悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】
ステップ（ｄ）後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記細胞培養培地は、第２の細胞培養培地と交換される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７１】
ステップ（ｅ）後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記第２の細胞培養培地は、第３の細胞培養培地と交換される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記第３の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、異なる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、同一である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＰＢＬとの比は、約０．１：１〜約１０：１（Ｂ細胞：ＰＢＬ）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７７】
ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＰＢＬとの比は、０．１：１、１：１及び１０：１（Ｂ細胞：ＰＢＬ）からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約１×１０５〜約１０×１０５個のＰＢＬがある、請求項６１に記載の方法。
【請求項７９】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２．５×１０５〜１０×１０５個のＰＢＬがある、請求項６１に記載の方法。
【請求項８０】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＰＢＬがある、請求項６１に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｄ）及び（ｅ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する、請求項６１に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びＰＢＬ：ビーズ比は、ステップ（ｄ）及び（ｅ）のそれぞれにおいて約１：１である、請求項６１に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＰＢＬは、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬの量で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項８５】
骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法であって、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋及び非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．任意選択により、前記ＡＭＬ芽細胞画分を破砕すること；
ｄ．前記任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分をＭＩＬ細胞画分に約０．１：１〜約１０：１の細胞数比で添加すること；
ｅ．ＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地においてガス透過性容器内で１つ又は両方の細胞画分を培養すること；
ｆ．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＭＩＬを刺激してＭＩＬの拡大培養を入手すること；
ｇ．約２〜約６日間の追加の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＭＩＬを再刺激すること；
ｈ．約１〜約３日間の追加の期間にわたって追加のＩＬ−２と共に前記ＭＩＬを培養すること；及び
ｉ．前記ＭＩＬを回収すること
を含む方法。
【請求項８６】
前記第１の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ステップ（ｅ）が開始された後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記第１の細胞培養培地は、第２の細胞培養培地と交換される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、異なる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、同一である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
ステップ（ｅ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２×１０４〜約５×１０５個のＭＩＬがある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
ステップ（ｅ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２．８×１０４〜３．４×１０５個のＭＩＬがある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
ステップ（ｅ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＭＩＬがある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｄ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＩＬ−２は、約６０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｆ）において約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
ステップ（ｄ）における前記培養は、約３日間の期間にわたって行われる、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
ステップ（ｅ）における前記刺激は、約４日間の期間にわたって行われる、請求項８５に記載の方法。
【請求項９９】
ステップ（ｆ）における前記刺激は、約７日間の期間にわたって行われる、請求項８５に記載の方法。
【請求項１００】
ステップ（ｇ）における前記追加のＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びＭＩＬ：ビーズ比は、ステップ（ｅ）及び（ｆ）のそれぞれにおいて約１：１である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０２】
前記任意選択により破砕された細胞画分は、超音波処理、ボルテックス、振動及び溶解からなる群から選択される方法を使用して破砕される、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＡＭＬ芽細胞画分と前記ＭＩＬ画分との細胞数比は、約１：１である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０４】
閉鎖滅菌系で行われる、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０５】
骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法であって、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋及び非ＣＤ１４＋細胞画分を選別すること；
ｃ．前記ＡＭＬ芽細胞画分を破砕し、且つ前記破砕されたＡＭＬ芽細胞画分を約１：１の細胞数比で前記ＭＩＬ細胞画分に添加すること；
ｄ．約６０００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地においてガス透過性容器内で前記ＡＭＬ芽細胞画分及び前記ＭＩＬ細胞画分を約３日間の期間にわたって培養すること；
ｅ．ビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を約１：１（ＭＩＬ：ビーズ）の比率で細胞培養物に添加し、且つ約１日間の期間にわたって前記ＭＩＬ及び抗体を培養すること；
ｆ．前記第１の細胞培養培地を、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度の追加のＩＬ−２を含む第２の細胞培養培地に交換すること；
ｇ．約３日間の追加の期間にわたって前記抗体ビーズ及びＭＩＬを培養すること；
ｈ．少なくとも約４日間の追加の期間にわたり、ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＭＩＬを再刺激すること；
ｉ．少なくとも約３日間の追加の期間にわたり、前記第２の細胞培養培地を、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度の追加のＩＬ−２を含む第３の細胞培養培地に交換すること；及び
ｊ．前記ＭＩＬを回収すること
を含む方法。
【請求項１０６】
血液悪性腫瘍を処置する方法であって、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋及び非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．任意選択により、前記ＡＭＬ芽細胞画分を破砕すること；
ｄ．前記任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分を前記ＭＩＬ細胞画分に約０．１：１〜約１０：１の細胞数比で添加すること；
ｅ．ＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地においてガス透過性容器内で１つ又は両方の細胞画分を培養すること；
ｆ．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＭＩＬを刺激してＭＩＬの拡大培養を入手すること；
ｇ．約２〜約６日間の追加の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＭＩＬを再刺激すること；
ｈ．約１〜約３日間の追加の期間にわたって追加のＩＬ−２と共に前記ＭＩＬを培養すること；
ｉ．前記ＭＩＬを回収すること；及び
ｊ．前記血液悪性腫瘍を処置するために前記ＭＩＬを治療有効量で患者に投与すること
を含む方法。
【請求項１０７】
前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
ステップ（ｅ）が行われた後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記第１の細胞培養培地は、第２の細胞培養培地と交換される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、異なる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、同一である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
ステップ（ｅ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２×１０４〜約５×１０５個のＭＩＬがある、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１５】
ステップ（ｅ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２．８×１０４〜３．４×１０５個のＭＩＬがある、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１６】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＭＩＬがある、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｄ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＩＬ−２は、約６０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｆ）において約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２０】
ステップ（ｅ）における前記培養は、約３日間の期間にわたって行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２１】
ステップ（ｆ）における前記刺激は、約４日間の期間にわたって行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２２】
ステップ（ｇ）における前記刺激は、約７日間の期間にわたって行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２３】
ステップ（ｆ）後に行われる追加のＩＬ−２補充ステップを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２４】
前記追加のＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びビーズ：ＭＩＬ比は、ステップ（ｆ）及び（ｇ）のそれぞれにおいて約１：１である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＭＩＬは、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの量で投与される、請求項１０６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１７年５月１０日に提出された米国仮特許出願第６２／５０４，３３７号；２０１７年７月１０日に提出された米国仮特許出願第６２／５３０，６８１号；２０１７年８月２５日に提出された米国仮特許出願第６２／５５０，３９８号；２０１７年１１月２２日に提出された米国仮特許出願第６２／５９０，０３４号；２０１８年１月２４日に提出された米国仮特許出願第６２／６２１，４６２号；２０１８年１月２５日に提出された米国仮特許出願第６２／６２１，７９８号；及び２０１８年３月２３日に提出された米国仮特許出願第６２／６４７，３６７号に対する優先権を主張し、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
[0002]  リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び／又は骨髄に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法並びにそれから入手されるＴＩＬの集団を含む組成物が本明細書に開示される。更に、そのような血液悪性腫瘍の処置を含む、液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液又は骨髄から拡大培養されたＴＩＬの治療的使用が本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
[0003]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子自己移植を用いた、かさ高い難治性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al, Nat.Rev. Immunol.2006, 6, 383-393。ＴＩＬは、Ｔ細胞が優勢であり、ＩＬ−２に基づくＴＩＬ拡大培養とそれに続く「急速拡大培養プロセス」（ＲＥＰ）は、そのスピード及び効率のためにＴＩＬ拡大培養のための好ましい方法となっている。Dudley, et al, Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-57；Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39；Riddell, et al, Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al, J. Immunother.2003, 26, 332-42。黒色腫におけるＴＩＬ療法に対する応答を改善し、ＴＩＬ療法を他の種類の腫瘍に拡大培養するためのいくつかのアプローチが探求されているが、成功が限られており、この分野は、依然として課題となっている。Goff, et al., J. Clin.Oncol.2016, 34, 2389-97；Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39；Rosenberg, et al, Clin.Cancer Res.2011, 17, 4550-57。Ｂ細胞リンパ腫からのＴＩＬの拡大培養への以前のアプローチは、ＴＩＬ増殖の１２の試みの２つのみが腫瘍に対する潜在的な活性を提供するという不十分な結果を得た。Schwartzentruber, et al, Blood 1993, 82, 1204-1211。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む多くの血液悪性腫瘍により効果的な治療を提供する緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]  本発明は、ＴＩＬ拡大培養プロセスが、リンパ腫又は白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍から入手される有効なＴＩＬ集団をもたらし得るという驚くべき発見を提供する。
【０００５】
発明の概要
[0005]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法であって、
（ａ）任意選択により、少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、初期拡大培養は、２１日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０００６】
[0006]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法であって、
（ａ）任意選択により、少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、初期拡大培養は、２１日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０００７】
[0007]  本発明の一実施形態において、方法は、ＩＴＫ阻害剤の添加を更に含む。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ステップ（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つ中に細胞培養培地に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にＩＴＫに結合する共有結合ＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに結合するアロステリックＩＴＫ阻害剤である。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９（（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミド）及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミドである。前述のＩＴＫ阻害剤は、Tocris Bioscience, Inc.（Minneapolis, MN, USA）、Selleckchem, Inc.（Houston, TX, USA）及びAK Scientific, Inc.（Union City, CA, USA）を含むさまざまな供給元から市販されている。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５μＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５μＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．５ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約１ｎＭ〜約１０ｎＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ及び５０μＭの濃度で添加される。
【０００８】
[0008]  本発明の一実施形態において、末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬをガス透過性容器内において約２日間〜約６日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に約２日間〜約６日間の期間にわたってステップ（ｄ）からのＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）からの培養物から抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｅ）で分離されたＰＢＬから抗体を取り出すこと；及び
ｈ．ＰＢＬを回収すること
を含む。
【０００９】
[0009]  本発明の一実施形態において、方法は、ステップ（ｄ）後にＩＬ−２を添加することと、第１の培地を第２の細胞培地に交換することとを更に含む。別の実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）後にＩＬ−２を添加することと、第２の培地を第３の細胞培地に交換することとを更に含む。一実施形態において、第１の細胞培養培地、第２の細胞培養培地又は第３の培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、同一である。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、異なる。本発明の一実施形態において、第１、第２及び第３の細胞培養培地の１つ以上は、同一ある。別の実施形態において、第１、第２及び第３の細胞培養培地は、全て異なる。
【００１０】
[0010]  一実施形態において、前記ＰＢＬと前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞との任意選択による共培養は、１時間〜３日間の期間にわたって行われる。
【００１１】
[0011]  本発明の一実施形態において、ステップ（ｃ）におけるＴ細胞とＢ細胞との比は、約０．１：１〜約１０：１である（Ｂ細胞：Ｔ細胞）。別の実施形態において、ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＴ細胞との比は、０．１：１、１：１及び１０：１（Ｂ細胞：Ｔ細胞）からなる群から選択される。
【００１２】
[0012]  本発明の一実施形態において、ステップ（ｄ）の開始時のＰＢＬの開始細胞数は、少なくとも約１×１０５〜約１０×１０５個のＰＢＬである。別の実施形態において、ステップ（ｄ）の開始時のＰＢＬの開始細胞数は、少なくとも約２．５×１０５〜１０×１０５個のＰＢＬである。別の実施形態において、ステップ（ｄ）の開始時のＰＢＬの開始細胞数は、少なくとも５×１０５個のＰＢＬである。
【００１３】
[0013]  本発明の一実施形態において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおけるＩＬ−２は、約１０００ＩＵ／ｍＬ〜約６０００ＩＵ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおけるＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍＬの濃度で使用される。
【００１４】
[0014]  本発明の一実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされる。本発明の一実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、DynaBeads（登録商標）である。一実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおいて約１：１のビーズ：ＰＢＬ比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体ビーズをＰＢＬと共培養することを含む。
【００１５】
[0015]  本発明の一実施形態において、方法は、ＩＴＫ阻害剤を添加することを含む。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つ中に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである。
【００１６】
[0016]  本発明の実施形態において、ＰＢＬを調製するための前述の方法のいずれかは、閉鎖滅菌系で行われる。
【００１７】
[0017]  本発明の一実施形態において、末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．末梢血からＰＢＭＣのサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と４日間の期間にわたって共培養すること；
ｄ．ＣＭ−２細胞培養培地中のガス透過性容器に約２．５×１０５〜約５×１０５個の細胞を添加し、且つ約４日間の期間にわたり、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＰＢＬを刺激すること；
ｅ．ＣＭ−２をＡＩＭ−Ｖ細胞培養培地及び約３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２と交換すること；
ｆ．ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に約３日間の追加の期間にわたってステップ（ｅ）からのＰＢＬを培養すること；
ｇ．ステップ（ｆ）の培養物から抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｈ．ステップ（ｇ）で分離されたＰＢＬから抗体を取り出すこと；及び
ｉ．ＰＢＬを回収すること
を含む。
【００１８】
[0018]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍を処置する方法は、
ａ．血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血からＰＢＭＣのサンプルを入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬをガス透過性容器内において少なくとも約４日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に３日間の期間にわたってステップ（ｄ）からのＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）の培養物から抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｅ）で分離されたＰＢＬから抗体を取り出すこと；及び
ｈ．ＰＢＬを回収すること；及び
ｉ．前記血液悪性腫瘍を処置するためにＰＢＬを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
【００１９】
[0019]  本発明の一実施形態において、方法は、ＩＴＫ阻害剤で前処置された患者からＰＢＭＣサンプルを入手することを更に含む。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである。別の実施形態において、患者は、イブルチニブレジメンの少なくとも３つのラウンドで前処置される。
【００２０】
[0020]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬの量で投与される。
【００２１】
[0021]  本発明の一実施形態において、骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．任意選択により、ＡＭＬ芽細胞画分を破砕すること；
ｄ．任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分をＭＩＬ画分に約０．１：１〜約１０：１の細胞数比で添加すること；
ｅ．ＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地においてガス透過性容器内で１つ又は両方の細胞画分を培養すること；
ｆ．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを刺激してＭＩＬの拡大培養を入手すること；
ｇ．約２〜約６日間の追加の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを再刺激すること；
ｈ．約１〜約３日間の追加の期間にわたって追加のＩＬ−２と共にＭＩＬを培養すること；及び
ｉ．前記ＭＩＬを回収すること
を含む。
【００２２】
[0022]  本発明の一実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）後にＩＬ−２を添加することと、培地を第２の細胞培地に交換することとを更に含む。一実施形態において、第１の細胞培養培地及び第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、同一である。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、異なる。
【００２３】
[0023]  一実施形態において、ステップ（ｅ）の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも約２×１０４〜約５×１０５個のＭＩＬがある。別の実施形態において、ステップ（ｅ）の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも約２．８×１０４〜３．４×１０５個のＭＩＬがある。別の実施形態において、ステップ（ｅ）の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＭＩＬがある。
【００２４】
[0024]  本発明の一実施形態において、ＩＬ−２は、ステップ（ｅ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態において、ＩＬ−２は、約６０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態において、ＩＬ−２は、ステップ（ｇ）において約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態において、ＩＬ−２は、ステップ（ｈ）において約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【００２５】
[0025]  一実施形態において、ステップ（ｅ）における培養は、約３日間の期間にわたって行われる。一実施形態において、ステップ（ｆ）における刺激は、約４日間の期間にわたって行われる。一実施形態において、ステップ（ｇ）における刺激は、約７日間の期間にわたって行われる。
【００２６】
[0026]  本発明の一実施形態において、任意選択により破砕された細胞画分は、超音波処理、均質化、ボルテックス、振動及び溶解からなる群から選択される方法を使用して破砕される。本発明の一実施形態において、非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽球画分）は、高温溶解、化学溶解（有機アルコールなど）、酵素溶解及び当技術分野で公知の他の細胞溶解方法を含む適切な溶解方法を使用して溶解される。
【００２７】
[0027]  本発明の一実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びＭＩＬ：ビーズ比は、ステップ（ｆ）及び（ｇ）のそれぞれにおいて約１：１である。
【００２８】
[0028]  本発明の一実施形態において、方法は、閉鎖滅菌系で行われる。
【００２９】
[0029]  本発明の一実施形態において、骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ細胞画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．ＡＭＬ芽細胞画分を破砕し、且つ破砕されたＡＭＬ芽細胞画分を約１：１の細胞数比でＭＩＬ細胞画分に添加すること；
ｄ．約６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地を有するガス透過性容器内で細胞画分を約３日間の期間にわたって培養すること；
ｅ．ビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を約１：１（ＭＩＬ：ビーズ）の比率で細胞培養物に添加し、且つ約１日間の期間にわたってＭＩＬ及び抗体を培養すること；
ｆ．第１の細胞培養培地を、約３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を含む第２の細胞培養培地に交換すること；
ｇ．約３日間の追加の期間にわたって抗体及びＭＩＬを培養すること；
ｈ．少なくとも約４日間の追加の期間にわたり、ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを再刺激すること；
ｉ．少なくとも約３日間の追加の期間にわたり、第２の細胞培養培地を、約３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を含む第３の細胞培養培地に交換すること；
ｊ．前記ＭＩＬを回収すること
を含む。
【００３０】
[0030]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍を処置する方法は、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．任意選択により、ＡＭＬ芽細胞画分を破壊すること；
ｄ．任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分をＭＩＬ画分に約０．１：１〜約１０：１の細胞数比で添加すること；
ｅ．ＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地においてガス透過性容器内で１つ又は両方の細胞画分を培養すること；
ｆ．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記サンプルを刺激すること；
ｇ．少なくとも約４日間の追加の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを再刺激すること；
ｈ．少なくとも約３日間の追加の期間にわたって追加のＩＬ−２と共にＭＩＬを培養すること；
ｉ．前記ＭＩＬを回収すること；及び
ｊ．血液悪性腫瘍を処置するために前記ＭＩＬを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
【００３１】
[0031]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの量で投与される。
【００３２】
図面の簡単な説明
[0032]  前述の概要及び以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】[0033]リンパ腫腫瘍の病理情報を示す。
【図２】[0034]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬのエフェクターメモリー（ＥＭ）サブセットが黒色腫ＴＩＬのＥＭサブセットよりも有意に高いことを示す。
【図３】[0035]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬのＣＤ２８＋ＣＤ４＋サブセットが黒色腫ＴＩＬのこれらのサブセットよりも有意に高いことを示す。
【図４】[0036]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、分化マーカーを示す。グラフの赤線は、中央値を表す。ＣＭは、セントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭは、エフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡは、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。
【図５】[0037]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、分化マーカーを示す。グラフの赤線は、中央値を表す。ＣＭは、セントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭは、エフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡは、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。
【図６】[0038]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、枯渇マーカーを示す。グラフの赤線は、中央値を表す。ＬＡＧ３は、リンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１は、プログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。
【図７】[0039]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、枯渇マーカーを示す。グラフの赤線は、中央値を表す。ＬＡＧ３は、リンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１は、プログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。
【図８】[0040]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。ＮＫは、ナチュラルキラー細胞を指し、ＴＣＲａｂは、アルファ及びベータ鎖を有するＴ細胞受容体を発現する細胞を指す。
【図９】[0041]生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。
【図１０】[0042]リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。
【図１１】[0043]リンパ腫ＴＩＬの酵素結合免疫スポット（ELIspot）アッセイの結果を示す。
【図１２】[0044]黒色腫ＴＩＬのELIspotアッセイの結果を示す。
【図１３】[0045]NANOSTRING NCOUNTER分析の結果を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較してより高いレベルのＲＯＲＣ  ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示す。各遺伝子は、ヒートマップの赤枠で強調表示される。
【図１４】[0046]ＴＩＬ拡大培養及び処置プロセスを図示する。ステップ１は、１０個のG-Rex 10フラスコへの４つの腫瘍断片の添加を指す。ステップ２では、およそ４０×１０６ＴＩＬ以上が入手される。ステップ３では、ＲＥＰのために３６個のG-Rex 100フラスコへの分割が生じる。ステップ４では、ＴＩＬを遠心分離によって回収する。新鮮ＴＩＬ生成物は、およそ４３日の合計プロセス時間後にステップ５で入手され、その時点でＴＩＬが患者に注入され得る。
【図１５】[0047]本開示のリンパ腫から入手したＴＩＬを伴う使用のための処置プロトコルを示す。手術（及び腫瘍切除）は、開始時に行われ、リンパ球枯渇化学療法は、本明細書の他の箇所に記載されているように、化学療法を伴う骨髄非破壊的リンパ球枯渇を指す。
【図１６Ａ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。ナイーブＴ細胞サブセットのＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｂ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。セントラルメモリーＴ細胞サブセット（ＣＭ）のＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｃ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（ＥＭ）のＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｄ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットのＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１７Ａ】[0049]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ１を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ１を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ９Ｔ細胞の異なるＣＤ２７＋サブ集団を表し、これは、リンパ腫ＴＩＬにおける共刺激分子ＣＤ２８発現ＣＤ４  Ｔ細胞の割合が高いことを示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。
【図１７Ｂ】[0049]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ１を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ１を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ９Ｔ細胞の異なるＣＤ２８＋サブ集団を表し、これは、リンパ腫ＴＩＬにおける共刺激分子ＣＤ２８発現ＣＤ４  Ｔ細胞の割合が高いことを示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。
【図１８Ａ】[0050]以下の実施例４に従って実施されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す。ELIspotを使用した結果を示す。ELIspotデータは、１０６個のＴＩＬあたりのＩＦＮ−γ産生細胞として表される。
【図１８Ｂ】[0050]以下の実施例４に従って実施されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す。ＥＬＩＳＡを使用した結果を示す。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ（対数目盛により測定される５×１０５ＴＩＬ／ウェルのＴＩＬ培養物の上清におけるＩＦＮ−γレベルとして表される。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。
【図１９Ａ】[0051]ＴＩＬの溶解能力を示す。共培養（ＴＩＬエフェクター細胞とＧＦＰ＋Ｐ８１５標的細胞）における４時間で１０６ＴＩＬに正規化された標的細胞のＬＵ５０を示す。
【図１９Ｂ】[0051]ＴＩＬの溶解能力を示す。共培養（ＴＩＬエフェクター細胞とＧＦＰ＋Ｐ８１５標的細胞）における２４時間で１０６ＴＩＬに正規化された標的細胞のＬＵ５０を示す。
【図２０Ａ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。同種異系の５２６の標的細胞に対する黒色腫ＴＩＬの細胞溶解活性を示す。図２０Ａのデータは、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が５０：１である共培養における死細胞パーセントとして示されている。
【図２０Ｂ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。７−ＡＡＤ取り込みにより決定された自己腫瘍細胞に対するリンパ腫ＴＩＬの細胞溶解活性を示す。図２０Ｂのデータは、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が５０：１である共培養における死細胞パーセントとして示されている。
【図２０Ｃ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。黒色腫ＴＩＬによって誘発された標的細胞の殺傷パーセントを表す。
【図２０Ｄ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。異なるＥ：Ｔ比でのリンパ腫ＴＩＬによって誘発された標的細胞の殺傷パーセントを表す。
【図２１】[0053]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの遺伝子発現プロファイルを示すヒートマップである。発現プロファイルは、NanoStringの５７９プレックスnCounter GX Human Immunology V2 CSOパネルによって決定された。ヒートマップは、黒色腫ＴＩＬと比較したリンパ腫ＴＩＬの特定の遺伝子セットの発現における倍数変化を示し、リンパ腫由来ＴＩＬからのＩＬ−１７Ａ及びＲＯＲＣのより高い発現を示唆している。この図に示される癌は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びマントル細胞リンパ腫を含む。
【図２２】[0054]ＴＩＬの調製、回収及び出荷スケジュールの２Ａプロセスを示す概略図である。
【図２３】[0055]ＴＩＬを調製するための２Ａプロセスを示すフローチャートである。
【図２４Ａ−Ｂ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を実証するフローチャートである。
【図２４Ｃ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を実証するフローチャートである。
【図２５Ａ−Ｂ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２５Ｃ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２６】[0058]新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び凍結保存されたＰＢＭＣから分離されたＰＢＬの拡大倍数のグラフを表す。凍結保存されたＰＢＭＣは、イブルチニブレジメンで処置されていない（プレＲｘ  ＰＢＬ）又は処置された（ポストＲｘ  ＰＢＬ）、ＣＬＬを有する患者に由来する。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２７】[0059]新鮮なＰＢＭＣ及び凍結保存されたＰＢＭＣから分離されたＰＢＬのＩＦＮ−γ産生細胞のグラフを表す。凍結保存されたＰＢＭＣ内でプレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬも表される。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２８】[0060]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの割合を表す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ａ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ｂ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ｃ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ｄ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ａ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ｂ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの及びＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ｃ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ｄ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３１Ａ】[0062]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットのＣＤ２７サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３１Ｂ】[0062]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットのＣＤ２７サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３２Ａ】[0063]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットのＣＤ２８サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３２Ｂ】[0063]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットのＣＤ２８サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３３Ａ】[0064]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ４集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３３Ｂ】[0064]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ８集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３４Ａ】[0065]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ４集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３４Ｂ】[0065]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ８集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。赤点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；緑点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３５Ａ】[0066]自己腫瘍殺傷アッセイを使用して測定されたプレＲｘ  ＰＢＬの細胞溶解活性の結果を示す。細胞傷害性は、ＬＵ５０（標的細胞の５０％を殺傷するのに必要なＰＢＬの数）として測定される。
【図３５Ｂ】[0066]自己腫瘍殺傷アッセイを使用して測定されたポストＲｘ  ＰＢＬの細胞溶解活性の結果を示す。細胞傷害性は、ＬＵ５０（標的細胞の５０％を殺傷するのに必要なＰＢＬの数）として測定される。
【図３６Ａ】[0067]ＡＭＬ患者の骨髄（ＭＩＬ）又は末梢血（ＰＢＬ）のいずれかから分離されたＭＩＬの拡大倍数のグラフを表す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。全てのＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１．３の開始細胞数は、１３８，０００個の細胞であり、ＭＩＬ２の開始細胞数は、６２，０００個、ＭＩＬ３の開始細胞数は、２８，０００個の細胞であった。ＰＢＬ２の開始細胞数は、３３８，０００であり、ＰＢＬ３の開始細胞数は、３３６，０００であった。
【図３６Ｂ】[0067]ＡＭＬ患者の骨髄（ＭＩＬ）又は末梢血（ＰＢＬ）のいずれかから分離されたＰＢＬの拡大倍数のグラフを表す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。全てのＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１．３の開始細胞数は、１３８，０００個の細胞であり、ＭＩＬ２の開始細胞数は、６２，０００個、ＭＩＬ３の開始細胞数は、２８，０００個の細胞であった。ＰＢＬ２の開始細胞数は、３３８，０００であり、ＰＢＬ３の開始細胞数は、３３６，０００であった。
【図３７Ａ】[0068]ＭＩＬのＩＦＮ−γ産生細胞を示す。
【図３７Ｂ】[0068]ＰＢＬのＩＦＮ−γ産生細胞を示す。
【図３８Ａ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＴＣＲαβ＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｂ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ４＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｃ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ８サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｄ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＴＣＲαβ＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｅ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ４＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｆ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ８サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３９Ａ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図３９Ｂ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３９Ｃ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３９Ｄ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４０Ａ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４０Ｂ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４０Ｃ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４０Ｄ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４１Ａ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４１Ｂ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４１Ｃ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４１Ｄ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４２Ａ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４２Ｂ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４２Ｃ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４２Ｄ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４３Ａ】[0074]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２７サブセットを示すグラフを表す。
【図４３Ｂ】[0074]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２７サブセットを示すグラフを表す。
【図４４Ａ】[0075]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２８サブセットを示すグラフを表す。
【図４４Ｂ】[0075]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２８サブセットを示すグラフを表す。
【図４５Ａ】[0076]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＰＤ１＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４５Ｂ】[0076]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＰＤ１＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４６Ａ】[0077]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＬＡＧ３＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４６Ｂ】[0077]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＬＡＧ３＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４７】[0078]ＰＢＬ方法１及びＰＢＬ方法３の例示的な実施形態を示すタイムラインである。この図において、ＩＬ−２の添加は、プロセス中の任意の時点において、例示的な実施形態では括弧で囲まれた領域上で発生し得る。
【図４８】[0079]ＭＩＬ方法３の例示的な実施形態を示すタイムラインである。この図において、ＩＬ−２の添加は、プロセス中の任意の時点において、例示的な実施形態では括弧で囲まれた領域上で発生し得る。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
配列表の簡単な説明
[0080]  配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[0081]  配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[0082]  配列番号３は、組換えヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列である。
[0083]  配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[0084]  配列番号５は、組換えヒトＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列である。
[0085]  配列番号６は、組換えヒトＩＬ−７タンパク質のアミノ酸配列である。
[0086]  配列番号７は、組換えヒトＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[0087]  配列番号８は、組換えヒトＩＬ−２１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３５】
発明の詳細な説明
[0088]  他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
定義
[0089]  本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「〜と組み合わせて投与される」、「〜と組み合わせて投与すること」、「同時（simultaneous）」及び「同時（concurrent）」という用語は、両方の活性医薬成分及び／又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、対象への２つ以上の活性医薬成分の投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
【００３７】
[0090]  「インビボ」という用語は、哺乳動物対象の体内で起こる事象を指す。
【００３８】
[0091]  「エクスビボ」という用語は、人工環境において哺乳動物対象の体の外側で起こる事象を指す。
【００３９】
[0092]  「インビトロ」という用語は、試験系で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生存細胞又は死細胞が使用され得る細胞ベースのアッセイを包含し、無傷細胞が使用されない無細胞アッセイも包含し得る。
【００４０】
[0093]  「急速拡大培養」という用語は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍若しくは９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍）又は最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。いくつかの急速拡大培養プロトコルが本明細書に記載されている。
【００４１】
[0094]  腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
【００４２】
[0095]  「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む、円形核を有する末梢血細胞を指す。任意選択により、末梢血単核細胞は、照射同種異系末梢血単核細胞である。抗原提示細胞である。「ＰＢＬ」という用語は、末梢血リンパ球を指し、末梢血から拡大培養したＴ細胞である。ＰＢＬ及びＴＩＬという用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００４３】
[0096]  「抗ＣＤ３抗体」という用語は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３及びＵＣＨＴ−１が含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
【００４４】
[0097]  「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むモノクローナル抗体又はそのバイオシミラー若しくは変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
【００４５】
【表１】
2020519600.tif 000003
【００４６】
[0098]  「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）という用語は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、その保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含む全ての形態のＩＬ−２を含む。ＩＬ−２は、例えば、Nelson, J. Immunol.2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu.Rev. Immunol.2008, 26, 453-79に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ−２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、１単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２０９−ｂ）から市販で供給される組換えＩＬ−２の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物などのＩＬ−２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、およそ１５ｋＤａの分子量の非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ−２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ−２という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ−２１４を含む、ペグ化形態のＩＬ−２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ−２１４及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６Ａ１号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ−２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４，９０２，５０２号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したＩＬ−２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
【表２】
2020519600.tif 000004
【００４８】
[0099]  「ＩＬ−４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）という用語は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２  Ｔ細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２  Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir.Res.2001, 2, 66-70。ＩＬ−４によって活性化されると、Ｔｈ２  Ｔ細胞は、続いて、ポジティブフィードバックループにおいて更なるＩＬ−４を産生する。ＩＬ−４はまた、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ  ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−４組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ  ＣＴＰ００４３）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
【００４９】
[00100]  「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）という用語は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは、間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手され得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７は、Ｔ細胞の発現を刺激することができる。ＩＬ−７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ−７受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ−７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−７組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ  ＰＨＣ００７１）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
【００５０】
[00101]  「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）という用語は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、その保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含む全ての形態のＩＬ−１５を含む。ＩＬ−１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有する。組換えヒトＩＬ−１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２３０−ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号３４−８１５９−８２）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
【００５１】
[00102]  「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）という用語は、インターロイキン−２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、その保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含む全ての形態のＩＬ−２１を含む。ＩＬ−２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat.Rev. Drug.Disc.2014, 13, 379-95に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、１５．４ｋＤａの分子量の、１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−４０８−ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号１４−８２１９−８０）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
【００５２】
[00103]  「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むことを意図している。活性医薬成分のためのそのような薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
【００５３】
[00104]  １つ及び複数の「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）又はそれらの単鎖を指す。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を更に指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と称され、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）に分散することができる、超可変性を有する領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、１つ又は複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００５４】
[00105]  「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質を指す。一部の実施形態において、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合、抗体又はＴＣＲによって結合され得る分子である。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原は、免疫系によって更に認識され得る。一部の実施形態において、抗原は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘導することができる。一部の場合、これは、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有するか又はそれに結合していることを要し得る。抗原は、１つ以上のエピトープ（例えば、Ｂエピトープ及びＴエピトープ）も有し得る。一部の実施形態において、抗原は、好ましくは、典型的には高度に特異的且つ選択的な態様でその対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体又はＴＣＲと反応しない。
【００５５】
[00106]  「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」という用語又はそれらの複数形は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。特定の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、試験対象に適切な抗原を注射し、次いで所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離するという当技術分野における知識及び技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に分離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。ＤＮＡは、分離されると発現ベクター中に入れられ得、次いで、これを、大腸菌（E. coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を入手する。抗体の組換え産生は、以下により詳細に記載される。
【００５６】
[00107]  本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（又は単に「抗体部分」若しくは「断片」）という用語は、特異的に抗原に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなり得るドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward, et al, Nature, 1989, 341, 544-546）、及び（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域ペアが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る；例えば、Bird, et al., Science 1988, 242, 423-426；及びHuston, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988, 85, 5879-5883を参照されたい）。そのようなｓｃＦｖ抗体は、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語内に包含されることも意図している。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して入手され、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００５７】
[00108]  本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発によって又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００５８】
[00109]  「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから入手され、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００５９】
[00110]  本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくはトランス染色体である動物（マウスなど）又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下で更に説明する）から分離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから分離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、生成又は分離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、生成又は分離された全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又はヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それらに関係している一方、インビボでのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
【００６０】
[00111]  本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【００６１】
[00112]  「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００６２】
[00113]  「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の活性医薬成分又は抗体とのコンジュゲートを含む、ヒト抗体の任意の変異形態を指す。「コンジュゲート」、「抗体−薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」又は「イムノコンジュゲート」という用語は、別の治療部分にコンジュゲートされた抗体又はその断片を指し、これは、当技術分野で利用可能な方法を使用して本明細書に記載の抗体にコンジュゲートすることができる。
【００６３】
[00114]  １つの「ヒト化抗体」、複数の「ヒト化抗体」及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図する。ヒトフレームワーク配列内で更なるフレームワーク領域の改変がなされ得る。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の１５個の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能を更に改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。更なる詳細については、Jones, et al, Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann, et al, Nature 1988, 332, 323-329；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol 1992, 2, 593-596を参照されたい。本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能及び／又はＦｃＲ結合に改善（例えば、減少）を付与することも知られている、任意のＦｃ変異体を使用するように改変され得る。Ｆｃ変異体は、例えば、国際公開第１９８８／０７０８９Ａ１号、同第１９９６／１４３３９Ａ１号、同第１９９８／０５７８７Ａ１号、同第１９９８／２３２８９Ａ１号、同第１９９９／５１６４２Ａ１号、同第９９／５８５７２Ａ１号、同第２０００／０９５６０Ａ２号、同第２０００／３２７６７Ａ１号、同第２０００／４２０７２Ａ２号、同第２００２／４４２１５Ａ２号、同第２００２／０６０９１９Ａ２号、同第２００３／０７４５６９Ａ２号、同第２００４／０１６７５０Ａ２号、同第２００４／０２９２０７Ａ２号、同第２００４／０３５７５２Ａ２号、同第２００４／０６３３５１Ａ２号、同第２００４／０７４４５５Ａ２号、同第２００４／０９９２４９Ａ２号、同第２００５／０４０２１７Ａ２号、同第２００５／０７０９６３Ａ１号、同第２００５／０７７９８１Ａ２号、同第２００５／０９２９２５Ａ２号、同第２００５／１２３７８０Ａ２号、同第２００６／０１９４４７Ａ１号、同第２００６／０４７３５０Ａ２号及び同第２００６／０８５９６７Ａ２号；及び米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，７３９，２７７号；同第５，８３４，２５０号；同第５，８６９，０４６号；同第６，０９６，８７１号；同第６，１２１，０２２号；同第６，１９４，５５１号；同第６，２４２，１９５号；同第６，２７７，３７５号；同第６，５２８，６２４号；同第６，５３８，１２４号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，９９８，２５３号；及び同第７，０８３，７８４号に開示されるアミノ酸置換のいずれか１つを含み得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
[00115]  「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体など、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すことを意図する。
【００６５】
[00116]  「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することにより、そのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を生成することを強いられる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号；及びBolliger, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90, 6444-6448に更に十分に記載されている。
【００６６】
[00117]  「グリコシル化」という用語は、抗体の改変誘導体を指す。アグリコシル化抗体は、グリコシル化を欠く。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために改変することができる。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変えることによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を除去する、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されているように、アグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。追加的又は代替的に、減少したフコシル残基の量を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティング（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体など、グリコシル化の種類が変更された抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体の能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変えて宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が改変された細胞は、当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体は、それらの炭水化物上でフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子を標的とした破壊によって生成された（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号又はYamane-Ohnuki, et al, Biotechnol.Bioeng., 2004, 87, 614-622）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号には、そのような細胞株で発現される抗体が、アルファ１，６結合関連酵素を減少させるか又は排除することにより低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載され、また抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性が低いか又は酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）も記載される。国際公開第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）が連結した炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、またその宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞が記載される（Shields, et al, J. Biol Chem.2002, 277, 26733-26740も参照されたい。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株で発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを発現するよう操作された細胞株（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセ���ルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））が記載される（Umana, et al., Nat.Biotech.1999, 77, 176-180も参照されたい）。代わりに、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断し得る。例えば、フコシダーゼであるアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、Tarentino, et al., Biochem.1975, 14, 5516-5523に記載されるように、抗体由来のフコシル残基を除去する。
【００６７】
[00118]  「ペグ化」とは、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合するようになる条件下において、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応する修飾抗体又はその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれも包含することを意図する。ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体であり得る。ペグ化の方法は、当技術分野において公知であり、例えば欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号並びに米国特許第５，８２４，７７８号に記載されているように、本発明の抗体に適用することができ、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
[00119]  「融合タンパク質」又は「融合ポリペプチド」という用語は、２つ以上の個々のタンパク質の特性を組み合わせたタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、直接又はアミノ酸リンカーを介して共有結合した少なくとも２つの異種ポリペプチドを有する。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的にはＣ末端からＮ末端に連結しているが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結することもできる。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得、構成ポリペプチドのいずれか２つ以上又は両方を含み得る。この用語は、融合タンパク質を構成する抗原の、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、種間同族体及び免疫原性断片を包含する。本開示の融合タンパク質は、成分抗原又はその免疫原性断片の更なるコピーも含み得る。融合タンパク質は、互いに結合し、ＩｇＧ  ＦｃドメインなどのＦｃドメインに更に結合した１つ以上の結合ドメインを含み得る。融合タンパク質は、モノクローナル抗体を模倣し、６つ以上の結合ドメインを提供するために共に更に連結され得る。融合タンパク質は、当技術分野において公知であるように、組換え法によって産生され得る。融合タンパク質の調製は、当技術分野で公知であり、例えば国際公開第１９９５／０２７７３５Ａ１号、同第２００５／１０３０７７Ａ１号、同第２００８／０２５５１６Ａ１号、同第２００９／００７１２０Ａ１号、同第２０１０／００３７６６Ａ１号、同第２０１０／０１００５１Ａ１号、同第２０１０／０７８９６６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１２５４１９Ａ１号及び同第２０１６／０２７２６９５Ａ１号並びに米国特許第８，９２１，５１９号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
[00120]  核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然に互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然に互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００７０】
[00121]  「保存的アミノ酸置換」という用語は、抗体又は融合タンパク質の抗原への結合を無効にしないアミノ酸配列改変を意味する。保存的アミノ酸置換には、あるクラスのアミノ酸の同じクラスのアミノ酸での置換が含まれ、ここで、クラスは、例えば、標準Dayhoff頻度交換行列又はBLOSUM行列によって決定されるように、一般的な物理化学的アミノ酸側鎖特性及び天然に見られる相同タンパク質における高い置換頻度によって定義される。６つの一般的なクラスのアミノ酸側鎖が分類されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕなど、別のクラスＩＩＩ残基へのＡｓｐの置換は、保存的置換である。従って、抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスからの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187；Kobayashi, et al., Protein Eng.1999, 12, 879-884 (1999)；及びBurks, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94, 412-417を参照されたい。
【００７１】
[00122]  ２つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」（又はそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合（必要に応じてギャップを導入する）、同じであるか、又は同じヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【００７２】
[00123]  本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失及び／又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
【００７３】
[00124]  核酸配列は、明示的に示される配列と同様に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列も非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。Batzer, et al, Nucleic Acid Res.1991, 79, 5081；Ohtsuka, et al, J. Biol.Chem.1985, 260, 2605-2608；Rossolini, et al., Mol.Cell.Probes 1994, 8, 91-98。核酸という用語は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００７４】
[00125]  「バイオシミラー」という用語は、モノクローナル抗体又はタンパク質を含む生物学的産物を意味し、これは、臨床的に不活性な成分におけるわずかな違いにかかわらず、米国の認可された参照生物学的製品と高度に類似しており、製品の安全性、純度及び効力の点で生物学的製品と参照製品との間に臨床的に有意義な違いはない。更に、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。生物学的製剤又は生物学的医薬品は、細菌又は酵母などの生物学的供給源によって作製されるか又はそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリン又はエリスロポエチンなどの比較的小さい分子又はモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照ＩＬ−２タンパク質がアルデスロイキン（PROLEUKIN）である場合、アルデスロイキンに関して医薬品規制当局によって承認されたタンパク質は、アルデスロイキン「に対するバイオシミラー」又はアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。ヨーロッパにおける同様の生物学的用途の関連法的根拠は、改正された規則（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）であり、従って、ヨーロッパでは、バイオシミラーは、規則（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条の下で認可され得、認可が承認され得るか又は認可申請の対象であり得る。ヨーロッパでは、すでに認可されている元の生物学的医薬品は、「参照医薬品」と呼ばれることがある。バイオシミラーと見なされる製品の要件のいくつかは、類似生物学的医薬品におけるＣＨＭＰガイドラインに概説されている。更に、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、ＥＭＡによって製品ごとに提供され、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び／又は有効性として参照医薬品と類似し得る。更に、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を処置するために使用されるか又は使用を意図され得る。従って、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した品質特性を有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した生物学的活性を有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した安全性プロファイルを有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した有効性を有すると見なし得る。本明細書に記載されるように、ヨーロッパにおけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可されている参照医薬品と比較される。しかしながら、一部の場合、バイオシミラーは、特定の研究において欧州経済地域外で認可されている生物学的医薬品（ＥＥＡ非認可の「コンパレータ」）と比較され得る。そのような試験には、例えば、特定の臨床試験及びインビボ非臨床試験が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、非ＥＥＡ認可コンパレータと比較された又は比較され得る生物学的医薬品にも関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意に影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな改変（例えば、アミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、相違が医薬品の安全性及び／又は有効性において変化をもたらさないことを条件として、参照医薬品の翻訳後改変と異なる１つ以上の翻訳後改変、例えば、限定されるものではないが、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び／又は切断を含み得る。バイオシミラーは、参照医薬品と同一又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。排他的ではないが、特に相違が参照医薬品に関する安全性の懸念に対処するか又は対処することを意図している場合、バイオシミラーは、異なるグリコシル化パターンを有し得る。更に、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれない場合、例えばその強度、医薬形態、製剤、賦形剤及び／又は提示において参照医薬品から逸脱し得る。バイオシミラーは、例えば、参照医薬品と比較した場合の薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）プロファイルにおける相違を含み得るが、依然として承認されるか又は承認に適していると見なされるために、参照医薬品と十分に類似していると認められる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特性を示し、ここで、異なる結合特性は、ＥＭＡなどの規制当局により、類似の生物学的製品としての認可に対する障壁ではないと見なされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。
【００７５】
[00126]  「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」の形成をもたらし得る。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
【００７６】
[00127]  「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。骨髄内に存在する液性腫瘍を含む、液性腫瘍から入手したＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。末梢血中を循環する液性腫瘍を含む液性腫瘍から入手したＴＩＬは、本明細書ではＰＢＬとも称され得る。ＭＩＬ、ＴＩＬ及びＰＢＬという用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞が由来する組織タイプによってのみ異なる。
【００７７】
[00128]  「生検」という用語は、骨髄生検を含む、癌細胞を入手するために使用されるあらゆる医療処置を指す。
【００７８】
[00129]  「急性骨髄性（myeloid）白血病」又は「ＡＭＬ」という用語は、当技術分野で急性骨髄性（myelogenous）白血病及び急性非リンパ性白血病としても知られている骨髄性血液細胞株の癌を指す。ＡＭＬは、液性腫瘍であるが、緑色腫などの髄外所見を含むＡＭＬの一部の所見は、固形腫瘍の特性を示すが、本明細書では液性腫瘍として分類される。
【００７９】
[00130]  本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形又は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のために希少である。
【００８０】
[00131]  「有効量」又は「治療有効量」という用語は、疾患処置を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分である、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
【００８１】
[00132]  「治療効果」は、その用語が本明細書で使用される場合、治療上の利益及び／又は予防上の利益を包含する。予防効果は、疾患若しくは状態の出現を遅らせるか若しくは排除すること、疾患若しくは状態の症状の発症を遅らせるか若しくは排除すること、疾患若しくは状態の進行を遅らせること、停止させること若しくは逆行させること又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【００８２】
[00133]  「治療」、「治療している」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得。「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有すると診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「治療」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「治療」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がないなかで免疫応答を誘発するか又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
【００８３】
[00134]  「ＱＤ」、「ｑｄ」又は「ｑ．ｄ．」という用語は、１日に１回、１日１回又は毎日１回を意味する。「ＢＩＤ」、「ｂｉｄ」又は「ｂ．ｉ．ｄ．」という用語は、１日に２回、１日２回又は毎日２回を意味する。「ＴＩＤ」、「ｔｉｄ」又は「ｔ．ｉ．ｄ．」という用語は、１日に３回、１日３回又は毎日３回を意味する。「ＱＩＤ」、「ｑｉｄ」又は「ｑ．ｉ．ｄ．」という用語は、１日に４回、１日４回又は毎日４回を意味する。
【００８４】
[00135]  本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に遊走した、白血球として元来入手される細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定されないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから入手されるものであり（「新鮮に採取された」と称されることもある）及び「二次ＴＩＬ」は、限定されないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察する通りの「ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は増殖された任意のＴＩＬ細胞集団である。
【００８５】
[00136]  ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般的に、次のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１及びＣＤ２５の１つ以上を発現することによって分類することができる。追加的及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられ得る  −  例えば、ＴＩＬは、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。
【００８６】
[00137]  本明細書において「凍結保存されたＴＩＬ」（又は凍結保存されたＭＩＬ若しくはＰＢＬ）とは、初代、バルク又は拡大培養（ＲＥＰ  ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処置及び保存されることを意味する。凍結保存のための一般的な方法も、実施例を含む本明細書の他の箇所に記載されている。明確性のために、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として使用され得る凍結組織サンプルと区別可能である。
【００８７】
[00138]  本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」（又は解凍したＭＩＬ若しくはＰＢＬ）とは、以前に凍結保存され、次いで細胞培養温度又はＴＩＬが患者に投与され得る温度を含むが、これらに限定されない室温以上に戻るように処置されたＴＩＬの集団を意味する。
【００８８】
[00139]  本明細書における「細胞の集団」（ＴＩＬを含む）とは、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般的に、集団は、一般に１×１０６〜１×１０１０の数の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は、異なる数を含む。例えば、ＩＬ−２の存在下での初代ＴＩＬの初期増殖は、およそ１×１０８細胞のバルクＴＩＬの集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、一般的に、注入のために１．５×１０９〜１．５×１０１０個の細胞の集団を提供するために行われる。
【００８９】
[00140]  一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【００９０】
[00141]  一般に、採取された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【００９１】
[00142]  一般に、本明細書で考察する通り、ＴＩＬは、最初に、本明細書で考察する通り患者から切除された腫瘍から初代ＴＩＬ集団を入手することにより調製される（「初代細胞集団」又は「第１の細胞集団」）。これに続き、細胞をＩＬ−２と培養することを利用した初期バルク拡大培養が行われ、第２の細胞集団が形成される（本明細書において「バルクＴＩＬ集団」又は「第２の集団」と称されることもある）。
【００９２】
[00143]  「細胞傷害性リンパ球」という用語には、細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球及びＣＤ４＋Ｔ−ヘルパーリンパ球を含む）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。細胞傷害性リンパ球には、例えば、末梢血由来αβＴＣＲ陽性Ｔ細胞又は腫瘍関連抗原によって活性化され、及び／又は腫瘍特異的キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体で形質導入されたγδＴＣＲ陽性Ｔ細胞並びに腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が含まれ得る。
【００９３】
[00144]  「セントラルメモリーＴ細胞」という用語は、ヒトではＣＤ４５ＲＯ＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含む。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子は、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２及びＢＭＩ１を含む。セントラルメモリーＴ細胞は、ＴＣＲトリガー後にエフェクター分子として主にＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
【００９４】
[00145]  「エフェクターメモリーＴ細胞」という用語は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含む。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子は、ＢＬＩＭＰ１を含む。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後、インターフェロン−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、大量のパーフォリンを保有する。「閉鎖系」という用語は、外部環境に対して閉鎖された系を指す。細胞培養方法に適した任意の閉鎖系を本発明の方法と共に使用することができる。閉鎖系としては、例えば、密閉Ｇ容器が挙げられるが、これに限定されるものではない。腫瘍セグメントが閉鎖系に添加されると、ＴＩＬが患者に投与される準備ができるまで、系は、外部環境に対して開放されない。
【００９５】
[00146]  一部の実施形態において、本開示の方法は、腫瘍組織又は腫瘍組織からの細胞を標準的な実験用培地（限定なしにＲＰＭＩを含む）で成長させて、照射フィーダー細胞及び抗ＣＤ３抗体などの試薬で処理することにより、ＴＩＬ数の増加及び／又は所望の細胞表面マーカー又は他の構造的、生化学的若しくは機能的特徴を含む細胞に関する集団のエンリッチメントなど、所望の効果を実現する「プレＲＥＰ」段階を更に含む。プレＲＥＰ段階は、ＴＩＬ産生を改善するための代替戦略を取り入れ易くなるように、実験グレードの試薬を（実験グレードの試薬が後のＲＥＰ段階中に希釈されるという仮定の下に）利用し得る。従って、一部の実施形態において、プレＲＥＰ段階中、開示されるＴＬＲアゴニスト及び／又はペプチド又はペプチドミメティクスが培養培地中に含まれ得る。プレＲＥＰ培養は、一部の実施形態においてＩＬ−２を含み得る。本発明は、好ましい態様において、新鮮に採取したＴＩＬ又は再刺激ＴＩＬ（本明細書において「ｒｅＴＩＬ」と称されることもある）のための解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき、意外にもメモリーエフェクターＴ細胞サブセットを含めたメモリーＴ細胞サブセットの拡大につながり、及び／又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激急速拡大培養プロトコル」又は「ｒｅＲＥＰ」とも称される、１つ以上の追加的な再刺激プロトコルでＲＥＰを増強する新規方法に関する。即ち、凍結保存ＴＩＬに対してｒｅＲＥＰ手順を用いることにより、患者は、高度に代謝的に活性で健康なＴＩＬを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。
【００９６】
[00147]  「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」又は「治療量」が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者（対象）の状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。一般的に、本明細書に記載される遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む医薬組成物は、１０４〜１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６、１０５〜１０１０、１０５〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０９〜１０１１又は１０９〜１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると言うことができる。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球組成物は、これらの投薬量でも複数回投与され得る。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng.J.of Med.319: 1676, 1988を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【００９７】
[00148]  疑義を回避するために、本明細書では、本発明の特定の態様、実施形態又は例と併せて記載された特定の特徴（例えば、整数、特性、値、使用、疾患、式、化合物又は基）は、不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は例にも適用可能であると理解されるべきであることを意図する。従って、そのような特徴は、必要に応じて、本明細書で定義された定義、特許請求の範囲又は実施形態のいずれかと共に使用することができる。本明細書に開示されている全ての特徴（添付の請求項、要約及び図面を含む）及び／又はそのように開示されている任意の方法若しくはプロセスの全てのステップは、少なくとも一部の特徴及び／又はステップが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本発明は、開示された実施形態のいかなる詳細にも限定されるものではない。本発明は、本明細書に開示されている特徴（添付の請求項、要約及び図面を含む）の任意の新規なもの若しくは新規な組み合わせ又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスのステップの任意の新規なもの若しくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。
【００９８】
[00149]  「約」及び「およそ」という用語は、統計的に有意義な値の範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更に好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。「約」又は「およそ」という用語によって包含される許容される変動は、研究下の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。更に、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状並びに他の量及び特性が正確でなく且つ正確である必要がないが、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて、近似及び／又はより大きいか若しくはより小さくてもよいことを意味する。一般的に、寸法、サイズ、処方、パラメータ、形状又は他の量若しくは特徴は、そうであると明示的に述べられているかどうかにかかわらず、「約」又は「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された機構を採用し得ることに留意されたい。
【００９９】
[00150]  元の形式及び修正された形式において、添付の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行的な用語は、記載されていない特許請求の範囲の更なる要素又はステップが存在する場合、特許請求の範囲の対象から除外されるものに関し、特許請求の範囲の対象を定義する。「含む」という用語は、包含的であるか又はオープンエンドであることが意図されており、いかなる追加の列挙されていない要素、方法、ステップ又は材料も排除するものではない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲に明記されたもの及び材料の場合には明記された材料に関連する通常の不純物以外のいかなる要素、ステップ又は材料も排除する。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲を、特定の要素、ステップ又は材料並びに特許請求の範囲に記載された発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載された全ての組成物、方法及びキットは、代替性の実施形態において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行的な用語のいずれかにより、より具体的に定義することができる。
【０１００】
末梢血（ＰＢＬ）及び／又は骨髄（ＭＩＬ）を含む治療用Ｔ細胞を拡大培養する方法の実施形態
末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法
[00151]  ＰＢＬ方法１．本発明の一実施形態において、本明細書で説明するプロセスを使用してＰＢＬを拡大培養する。本発明の一実施形態において、方法は、全血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含む。一実施形態において、方法は、非ＣＤ１９＋画分のネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を分離することにより、Ｔ細胞を濃縮することを含む。０日目に、純粋Ｔ細胞を１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１比（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＰＢＬを回収し、ビーズを取り出し、ＰＢＬをカウントし、フェノタイピングする。一実施形態において、方法は、非ＣＤ１９＋画分の磁気ビーズに基づくネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を分離することにより、Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【０１０１】
[00152]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣがカウントされる。Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して分離される。分離したＴ細胞をカウントし、GRex 24ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種し、１ウェルあたり合計８ｍｌのＣＭ２培地中、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と１：１の比率で、DynaBeads（登録商標）（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）と共培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＣＭ２から、３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖに交換する。７日目に、拡大培養した細胞を回収し、カウントし、次いで３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（ビーズ：細胞）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計１００ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、GRex 10Mフラスコにおいて１フラスコあたり１５×１０６個の細胞で培養する。１１日目に、培地を新鮮なＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで補充したＣＭ−４培地に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞がカウントされる。
【０１０２】
[00153]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣがカウントされる。Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して分離される。分離したＴ細胞をカウントし、GRex 24ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種し、１ウェルあたり合計８ｍｌのＣＭ２培地中、３０００ＩＵのＩＬ−２と１：１の比率でDynaBeads（登録商標）（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）と共培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＣＭ２から、３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖに交換する。７日目に、ＰＢＬを回収し、カウントし、次いで３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（ビーズ：細胞）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、GRex 24ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０６個の細胞で再播種する。１１日目に、培地を新鮮なＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで補充したＣＭ−４培地に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞がカウントされる。
【０１０３】
[00154]  ＰＢＬ方法２．本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、全血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含むＰＢＬ方法２を使用して拡大培養される。ＰＢＭＣからのＴ細胞は、ＰＢＭＣを３７℃で少なくとも３時間インキュベートし、次いで非接着細胞を分離することにより、濃縮される。非接着細胞は、ＰＢＬ方法１と同様に拡大培養し、即ち０日目に、非接着細胞を１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１比（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＰＢＬを回収し、ビーズを取り出し、ＰＢＬをカウントし、フェノタイピングする。
【０１０４】
[00155]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存したＰＭＢＣサンプルを解凍し、ＰＢＭＣ細胞をＣＭ−２培地中の６ウェルプレートに１ウェルあたり６００万細胞で播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、カウントする。ＰＢＬは、１ウェルあたり１×１０６細胞、１：１のビーズ：細胞比の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８DynaBeads（登録商標）及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に、GRex 24ウェルプレートの各ウェル中、合計７ｍｌのＣＭ−２培地で培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＡＩＭ−Ｖ培地及び３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２と交換する。７日目に、拡大培養した細胞を回収し、カウントし、次いで３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（Ｔ細胞：ビーズ）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計１００ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、GRex 10Mフラスコにおいて１フラスコあたり１５×１０６個の細胞で培養する。１１日目に、培地をＣＭ−４培地に交換し、新鮮なＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）を補充する。１４日目に、DynaMag（商標）Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞がカウントされる。
【０１０５】
[00156]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存したＰＭＢＣサンプルを解凍し、ＰＢＭＣ細胞をＣＭ−２培地中の６ウェルプレートに１ウェルあたり６００万細胞で播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、カウントする。ＰＢＬは、１ウェルあたり１×１０６細胞、１：１のビーズ：細胞比の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８DynaBeads（登録商標）及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に、GRex 24ウェルプレートの各ウェル中、合計７ｍｌのＣＭ−２培地で培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＡＩＭ−Ｖ培地及び３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２と交換する。７日目に、拡大培養した細胞を回収し、カウントし、次いで３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（Ｔ細胞：ビーズ）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、GRex 24ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０６個の細胞で培養する。１１日目に、培地をＣＭ−４培地に交換し、新鮮なＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）を補充する。１４日目に、DynaMag（商標）Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞がカウントされる。
【０１０６】
[00157]  ＰＢＬ方法３．本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、末梢血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含むＰＢＬ方法３を使用して拡大培養される。Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋選択を使用して分離され、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣサンプルの非ＣＤ１９＋画分のネガティブ選択を使用して選択される。０日目に、Ｔ細胞及びＢ細胞を、１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１比（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＰＢＬを回収し、ビーズを取り出し、ＰＢＬをカウントし、フェノタイピングする。
【０１０７】
[00158]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、末梢血に由来する凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、カウントする。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、CD19 Multisort Kit, Human（Miltenyi Biotec）を使用して選別される。非ＣＤ１９＋細胞画分のうち、Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して精製される。Ｔ細胞（ＰＢＬ）及びＢ細胞は、約３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で約８ｍｌのＣＭ２培地中、Grex 24ウェルプレートで異なる比率で共培養される。Ｂ細胞：Ｔ細胞の比率は、０．１：１、１：１及び１０：１である。Ｔ細胞／Ｂ細胞共培養は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））により１：１の比率（ビーズ：細胞）で刺激される。４日目に、培地をＣＭ２からＡＩＭ−Ｖ培地に交換し、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、細胞を回収し、カウントし、ＡＩＭ−Ｖ培地の新しいGrex 24ウェルプレートに、１ウェルあたり約１．５×１０５〜約４×１０５個の細胞の細胞範囲で再播種し、３０００ＩＵ／ｍＬの追加のＩＬ−２と共に、１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））により刺激する。１４日目に、DynaMag（商標）Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞がカウントされる。
【０１０８】
[00159]  一実施形態において、ＰＢＭＣは、全血サンプルから分離される。一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、ＰＢＬを拡大培養するための出発材料として使用される。一実施形態において、サンプルは、拡大培養プロセス前に凍結保存される。別の実施形態において、新鮮なサンプルは、ＰＢＬを拡大培養するための出発材料として使用される。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、当技術分野で公知の方法を使用してＰＢＭＣから分離される。一実施形態において、Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラムを使用して分離される。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、当技術分野で公知の抗体選択方法、例えばＣＤ１９ネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから分離される。
【０１０９】
[00160]  本発明の実施形態において、プロセスは、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間又は約１４日間にわたって実施される。別の実施形態において、プロセスは、約７日間にわたって実施される。別の実施形態において、プロセスは、約１４日間にわたって実施される。
【０１１０】
[00161]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に培養される。一実施形態において、任意の利用可能な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８製品が本発明において有用である。本発明の一実施形態において、使用される市販の製品は、DynaBeads（登録商標）である。一実施形態において、DynaBeads（登録商標）は、１：１の比（ビーズ：細胞）のＰＢＭＣと共に培養される。別の実施形態において、抗体は、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１又は５：１の比率（ビーズ：細胞）でＰＢＭＣと共に培養されたDynaBeads（登録商標）である。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップ及び／又は抗体で細胞を再刺激するステップは、約２〜約６日間、約３〜約５日間又は約４日間の期間にわたって実施される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップは、約２日間、３日間、４日間、５日間又は６日間の期間にわたって実施される。
【０１１１】
[00162]  一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、ＩＬ−２と共に培養される。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣからのＰＢＬの拡大培養に使用される細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，５００ＩＵ／ｍＬ、約１，６００ＩＵ／ｍＬ、約１，７００ＩＵ／ｍＬ、約１，８００ＩＵ／ｍＬ、約１，９００ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ＩＵ／ｍＬ、約２，１００ＩＵ／ｍＬ、約２，２００ＩＵ／ｍＬ、約２，３００ＩＵ／ｍＬ、約２，４００ＩＵ／ｍＬ、約２，５００ＩＵ／ｍＬ、約２，６００ＩＵ／ｍＬ、約２，７００ＩＵ／ｍＬ、約２，８００ＩＵ／ｍＬ、約２，９００ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ＩＵ／ｍＬ、約３，１００ＩＵ／ｍＬ、約３，２００ＩＵ／ｍＬ、約３，３００ＩＵ／ｍＬ、約３，４００ＩＵ／ｍＬ、約３，５００ＩＵ／ｍＬ、約３，６００ＩＵ／ｍＬ、約３，７００ＩＵ／ｍＬ、約３，８００ＩＵ／ｍＬ、約３，９００ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ＩＵ／ｍＬ、約４，１００ＩＵ／ｍＬ、約４，２００ＩＵ／ｍＬ、約４，３００ＩＵ／ｍＬ、約４，４００ＩＵ／ｍＬ、約４，５００ＩＵ／ｍＬ、約４，６００ＩＵ／ｍＬ、約４，７００ＩＵ／ｍＬ、約４，８００ＩＵ／ｍＬ、約４，９００ＩＵ／ｍＬ、約５，０００ＩＵ／ｍＬ、約５，１００ＩＵ／ｍＬ、約５，２００ＩＵ／ｍＬ、約５，３００ＩＵ／ｍＬ、約５，４００ＩＵ／ｍＬ、約５，５００ＩＵ／ｍＬ、約５，６００ＩＵ／ｍＬ、約５，７００ＩＵ／ｍＬ、約５，８００ＩＵ／ｍＬ、約５，９００ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ＩＵ／ｍＬ、約６，５００ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ＩＵ／ｍＬ、約７，５００ＩＵ／ｍＬ、約８，０００ＩＵ／ｍＬ、約８，５００ＩＵ／ｍＬ、約９，０００ＩＵ／ｍＬ、約９，５００ＩＵ／ｍＬ及び約１０，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む。
【０１１２】
[00163]  本発明の一実施形態において、拡大培養プロセスのためのＰＢＭＣの開始細胞数は、約２５，０００〜約１，０００，０００、約３０，０００〜約９００，０００、約３５，０００〜約８５０，０００、約４０，０００〜約８００，０００、約４５，０００〜約８００，０００、約５０，０００〜約７５０，０００、約５５，０００〜約７００，０００、約６０，０００〜約６５０，０００、約６５，０００〜約６００，０００、約７０，０００〜約５５０，０００、好ましくは約７５，０００〜約５００，０００、約８０，０００〜約４５０，０００、約８５，０００〜約４００，０００、約９０，０００〜約３５０，０００、約９５，０００〜約３００，０００、約１００，０００〜約２５０，０００、約１０５，０００〜約２００，０００又は約１１０，０００〜約１５０，０００である。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約１３８，０００、１４０，０００、１４５，０００又はそれを超える数である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約２８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約６２，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３６，０００である。
【０１１３】
[00164]  本発明の一実施形態において、細胞は、GRex 24ウェルプレートで増殖される。本発明の一実施形態において、同等のウェルプレートが使用される。一実施形態において、拡大培養のための出発材料は、１ウェルあたり約５×１０５個のＴ細胞である。本発明の一実施形態において、１ウェルあたり１×１０６個の細胞が存在する。本発明の実施形態において、１ウェルあたりの細胞数は、ウェルに播種し、Ｔ細胞を拡大培養するのに十分な数である。
【０１１４】
[00165]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬの拡大倍数は、約２０％〜約１００％、２５％〜約９５％、３０％〜約９０％、３５％〜約８５％、４０％〜約８０％、４５％〜約７５％、５０％〜約１００％又は２５％〜約７５％である。本発明の一実施形態において、拡大倍数は、約２５％である。本発明の別の実施形態において、拡大倍数は、約５０％である。別の実施形態において、拡大倍数は、約７５％である。
【０１１５】
[00166]  本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、プロセス全体を通して１日以上培養物に添加され得る。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、４日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、７日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、１１日目に追加される。他の実施形態において、追加のＩＬ−２は、４日目、７日目及び／又は１１日目に追加される。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養プロセスを通して１日以上で交換され得る。一実施形態において、細胞培養培地は、プロセスの４日目、７日目及び／又は１１日目に交換される。本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、追加のＩＬ−２と共に、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間培養される。本発明の実施形態において、ＰＢＬは、ＩＬ−２の各添加後３日間の期間にわたって培養される。
【０１１６】
[00167]  一実施形態において、細胞培養培地は、方法中に少なくとも一度交換される。一実施形態において、細胞培養培地は、追加のＩＬ−２が加えられるのと同時に交換される。別の実施形態において、細胞培養培地は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目又は１４日目の少なくとも１日で交換される。本発明の一実施形態において、方法全体で使用される細胞培養培地は、同じであるか又は異なり得る。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４又はＡＩＭ−Ｖである。
【０１１７】
[00168]  本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、１４日間の拡大培養プロセスを通して１日以上、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で再刺激され得る。一実施形態において、Ｔ細胞は、７日目に再刺激される。一実施形態において、GRex 10Mフラスコが再刺激ステップに使用される。本発明の一実施形態において、同等のフラスコが使用される。
【０１１８】
[00169]  本発明の一実施形態において、DynaMag（商標）Magnetを使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞がカウントされ、細胞は、以下の実施例で更に説明する表現型及び機能分析を使用して分析される。本発明の一実施形態において、抗体は、当技術分野で公知の方法を使用してＰＢＬ又はＭＩＬから分離される。前述の実施形態のいずれにおいても、ＴＩＬ、ＰＢＬ又はＭＩＬの磁気ビーズベースの選択が使用される。
【０１１９】
[00170]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、非接着細胞を識別するのに有効な所望の温度で一定期間インキュベートされる。本発明の一実施形態において、インキュベーション時間は、約３時間である。本発明の一実施形態において、温度は、摂氏約３７度である。次いで、非接着細胞は、上記のプロセスを使用して拡大培養される。
【０１２０】
[00171]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、イブルチニブ又は本明細書の他の箇所に記載のＩＴＫ及びキナーゼ阻害剤などの別のＩＴＫ若しくはキナーゼ阻害剤で処置された患者から入手される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にＩＴＫに結合する共有結合ＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに結合するアロステリックＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２又はＰＢＬ方法３を含む前述の方法のいずれかで使用するＰＢＭＣサンプルを入手する前に、イブルチニブ又は本明細書の他の箇所に記載のＩＴＫ阻害剤を含む他のＩＴＫ阻害剤で処置された患者から入手される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤処置は、少なくとも１回、少なくとも２回又は少なくとも３回又はそれを超えて投与されている。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたＰＢＬは、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養された細胞より少ないＬＡＧ３＋、ＰＤ−１＋細胞を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたＰＢＬは、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養された細胞より増加したレベルのＩＦＮγ産生を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたＰＢＬは、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養された細胞より低いエフェクター：標的細胞比で増加した溶解活性を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者は、未処置の患者と比較してより高い拡大倍数を有する。
【０１２１】
[00172]  本発明の一実施形態において、方法は、細胞培養にＩＴＫ阻害剤を添加するステップを含む。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、プロセスの０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目又は１４日目の１日以上で添加される。一実施形態において、細胞培養培地が交換される方法中の日にＩＴＫ阻害剤が添加される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、０日目及び細胞培養培地が交換されるときに添加される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＬ−２が添加される方法中に添加される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、方法の０日目、４日目、７日目及び任意選択により１１日目に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、方法の０日目及び７日目に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、当技術分野で公知のものである。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は本明細書の他の部分に記載されているものである。
【０１２２】
[00173]  本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５ｕＭの濃度で本方法に使用される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｕＭ、２ｕＭ、３ｕＭ、４ｕＭ又は５ｕＭの濃度で本方法に使用される。
【０１２３】
[00174]  本発明の一実施形態において、方法は、ＰＢＭＣが、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤処置への以前の曝露を有しない患者に由来する場合、ＩＴＫ阻害剤を添加するステップを含む。
【０１２４】
[00175]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで任意選択により前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置され、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月又は１年又はそれを超えて処置を受けた対象又は患者からのものである。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤レジメンを現在受けている患者に由来する。
【０１２５】
[00176]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されており、キナーゼ阻害剤又はイブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤での処置に抵抗性である対象又は患者からのものである。
【０１２６】
[00177]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤での処置をもはや受けていない対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤での処置をもはや受けておらず、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月若しくは少なくとも１年又はそれを超えて処置を受けていない対象又は患者からのものである。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、ＩＴＫ阻害剤への以前の曝露を有するが、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月又は少なくとも１年処置されていない患者に由来する。
【０１２７】
[00178]  本発明の実施形態において、０日目に、ＣＤ１９＋について細胞が選択され、適宜選別される。本発明の一実施形態において、選択は、抗体結合ビーズを使用して行われる。本発明の一実施形態において、純粋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから０日目に分離される。本発明の一実施形態において、０日目に、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及び純粋Ｔ細胞を最低４日間にわたって抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共培養する。本発明の一実施形態において、４日目に、培養物にＩＬ−２が添加される。本発明の一実施形態において、７日目に、培養物は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体及び追加のＩＬ−２で再刺激される。本発明の一実施形態において、１４日目にＰＢＬが回収される。
【０１２８】
[00179]  本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されていない患者について、１０〜１５ｍｌのバフィーコートは、約５×１０９個のＰＢＭＣを生成し、これは、約５．５×１０７個の出発細胞材料及び拡大培養プロセスの終了時に約１．１×１０９個のＰＢＬを生成する。本発明の一実施形態において、約５４×１０６個のＰＢＭＣは、約６×１０５個の出発材料及び約１．２×１０８個のＭＩＬ（約２０５倍の拡大倍数）を生成する。
【０１２９】
[00180]  本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者について、拡大培養プロセスは、約２０×１０９個のＰＢＬを生成する。本発明の一実施形態において、４０．３×１０６個のＰＢＭＣは、約４．７×１０５個の出発細胞材料及び約１．６×１０８個のＰＢＬ（約３３８倍の拡大倍数）を生成する。
【０１３０】
[00181]  本発明の一実施形態において、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者に対する本発明において有用なＰＢＬの臨床用量は、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬ、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬ、約０．１２×１０９〜約１２×１０９個のＰＢＬ、約０．１５×１０９〜約１１×１０９個のＰＢＬ、約０．２×１０９〜約１０×１０９個のＰＢＬ、約０．３×１０９〜約９×１０９個のＰＢＬ、約０．４×１０９〜約８×１０９個のＰＢＬ、約０．５×１０９〜約７×１０９個のＰＢＬ、約０．６×１０９〜約６×１０９個のＰＢＬ、約０．７×１０９〜約５×１０９個のＰＢＬ、約０．８×１０９〜約４×１０９個のＰＢＬ、約０．９×１０９〜約３×１０９個のＰＢＬ又は約１×１０９〜約２×１０９個のＰＢＬである。
【０１３１】
[00182]  前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血サンプルから、アフェレーシスにより、バフィーコートから、又はＰＢＭＣを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
【０１３２】
骨髄由来のＰＢＭＣから骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法
[00183]  ＭＩＬ方法１．本発明の一実施形態において、骨髄由来のＰＢＭＣからＭＩＬを拡大培養する方法が記載される。本発明の一実施形態において、方法は、１４日間にわたって実施される。一実施形態において、方法は、骨髄ＰＢＭＣを入手し、且つＰＢＭＣを凍結保存することを含む。０日目に、ＰＢＭＣを１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１比（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬをカウントし、フェノタイピングする。
【０１３３】
[00184]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、骨髄由来の凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣがカウントされる。ＰＢＭＣは、GRex 24ウェルプレートで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＣＭ−２細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ヒトＡＢ血清、１−グルタミン、２−メルカプトエタノール、硫酸ゲンタマイシン、ＡＩＭ−Ｖ培地から構成される）中、１ウェルあたり５×１０５個の細胞で１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共培養される。４日目に、細胞培養培地を、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖと交換する。７日目に、拡大培養したＭＩＬをカウントする。１ウェルあたり１×１０６個の細胞を新しいGRex 24ウェルプレートに移し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共に培養する。１１日目に、細胞培養培地をＡＩＭ−ＶからＣＭ−４（ＡＩＭ−Ｖ培地、２ｍＭのGlutamax及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２から構成される）に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、ＭＩＬがカウントされる。
【０１３４】
[00185]  ＭＩＬ方法２．本発明の一実施形態において、方法は、７日間にわたって実施される。一実施形態において、この方法は、骨髄に由来するＰＭＢＣを入手し、且つＰＢＭＣを凍結保存することを含む。０日目に、ＰＢＭＣを３：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。７日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬをカウントし、フェノタイピングする。
【０１３５】
[00186]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣがカウントされる。ＰＢＭＣは、GRex 24ウェルプレートで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＣＭ−２細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ヒトＡＢ血清、１−グルタミン、２−メルカプトエタノール、硫酸ゲンタマイシン、ＡＩＭ−Ｖ培地から構成される）中、１ウェルあたり５×１０５個の細胞で１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共培養される。７日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、ＭＩＬがカウントされる。
【０１３６】
[00187]  ＭＩＬ方法３．本発明の一実施形態において、方法は、骨髄からＰＢＭＣを入手することを含む。０日目に、ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋についてＰＢＭＣが選択され、選別され、非ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋細胞画分が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻して添加される。ＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養物に添加する。３日目に、ＰＢＭＣを１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１比（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１１日目に、ＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。１４日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬをカウントし、フェノタイピングする。
【０１３７】
[00188]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣのサンプルが解凍され、ＰＢＭＣがカウントされる。細胞をＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０及びＣＤ１４抗体で染色し、Ｓ３ｅ細胞選別（Bio-Rad）を使用して選別する。細胞は、免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）と、ＡＭＬ芽細胞画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）との２つの画分に選別される。Grex 24ウェルプレートに播種される免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）からの細胞数とほぼ等しいＡＭＬ芽細胞画分からの細胞数を１００ｕｌの培地に懸濁し、超音波処理する。この例では、ＡＭＬ芽細胞画分から約２．８×１０４〜約３．３８×１０５個の細胞を取り、１００ｕｌのＣＭ２培地に懸濁し、３０秒間超音波処理する。超音波処理したＡＭＬ芽細胞画分の１００ｕｌをGrex２４ウェルプレートの免疫細胞画分に添加する。免疫細胞は、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＣＭ−２細胞培養培地中に１ウェルあたり約２．８×１０４〜約３．３８×１０５個の細胞の量で存在し、ＡＭＬ芽細胞画分の一部と共に約３日間培養される。３日目に、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））を各ウェルに加え、約１日間培養する。４日目に、細胞培養培地を、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖと交換する。７日目に、拡大培養したＭＩＬをカウントする。１ウェルあたり約１．５×１０５〜４×１０５個の細胞を新しいGRex 24ウェルプレートに移し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共に培養する。１１日目に、細胞培養培地をＡＩＭ−ＶからＣＭ−４（３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補充）に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、任意選択によりＭＩＬがカウントされる。
【０１３８】
[00189]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、骨髄から入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣは、アフェレーシス、吸引、針生検又は当技術分野で公知の他の同様の手段を通じて骨髄から入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣは、新鮮である。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、凍結保存されている。
【０１３９】
[00190]  本発明の一実施形態において、方法は、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間又は約１４日間にわたって実施される。別の実施形態において、方法は、約７日間にわたって実施される。別の実施形態において、方法は、約１４日間にわたって実施される。
【０１４０】
[00191]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に培養される。一実施形態において、任意の利用可能な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８製品が本発明において有用である。本発明の一実施形態において、使用される市販の製品は、DynaBeads（登録商標）である。一実施形態において、DynaBeads（登録商標）は、１：１の比（ビーズ：細胞）のＰＢＭＣと共に培養される。別の実施形態において、抗体は、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１又は５：１の比率（ビーズ：細胞）でＰＢＭＣと共に培養されたDynaBeads（登録商標）である。前述の実施形態のいずれにおいても、免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）又はＡＭＬ芽細胞画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）の磁気ビーズベースの選択が使用される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップ及び／又は抗体で細胞を再刺激するステップは、約２〜約６日間、約３〜約５日間又は約４日間の期間にわたって実施される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップは、約２日間、３日間、４日間、５日間又は６日間の期間にわたって実施される。
【０１４１】
[00192]  本発明の一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分にからの細胞数と免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）からの細胞数との比は、約０．１：１〜約１０：１である。別の実施形態において、比率は、約０．１：１〜約５：１、約０．１：１〜約２：１又は約１：１である。本発明の一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分は、細胞凝集を破壊するために任意選択により破砕される。一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分は、超音波処理、均質化、細胞溶解、ボルテックス又は振動を使用して破砕される。別の実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分は、超音波処理を使用して破砕される。本発明の一実施形態において、非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽球画分）は、高温溶解、化学溶解（有機アルコールなど）、酵素溶解及び当技術分野で公知の他の細胞溶解方法を含む適切な溶解方法を使用して溶解される。
【０１４２】
[00193]  本発明の一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分からの細胞は、１００ｕＬあたり約０．２×１０５〜約２×１０５個の細胞の濃度で懸濁され、免疫細胞画分と共に細胞培養物に添加される。別の実施形態において、濃度は、１００ｕＬあたり約０．５×１０５〜約２×１０５個の細胞、１００ｕＬあたり約０．７×１０５〜約２×１０５個の細胞、１００ｕＬあたり約１×１０５〜約２×１０５個の細胞又は１００ｕＬあたり約１．５×１０５〜約２×１０５個の細胞である。
【０１４３】
[00194]  一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、ＩＬ−２と共に培養される。本発明の一実施形態において、ＭＩＬの拡大培養に使用される細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，５００ＩＵ／ｍＬ、約１，６００ＩＵ／ｍＬ、約１，７００ＩＵ／ｍＬ、約１，８００ＩＵ／ｍＬ、約１，９００ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ＩＵ／ｍＬ、約２，１００ＩＵ／ｍＬ、約２，２００ＩＵ／ｍＬ、約２，３００ＩＵ／ｍＬ、約２，４００ＩＵ／ｍＬ、約２，５００ＩＵ／ｍＬ、約２，６００ＩＵ／ｍＬ、約２，７００ＩＵ／ｍＬ、約２，８００ＩＵ／ｍＬ、約２，９００ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ＩＵ／ｍＬ、約３，１００ＩＵ／ｍＬ、約３，２００ＩＵ／ｍＬ、約３，３００ＩＵ／ｍＬ、約３，４００ＩＵ／ｍＬ、約３，５００ＩＵ／ｍＬ、約３，６００ＩＵ／ｍＬ、約３，７００ＩＵ／ｍＬ、約３，８００ＩＵ／ｍＬ、約３，９００ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ＩＵ／ｍＬ、約４，１００ＩＵ／ｍＬ、約４，２００ＩＵ／ｍＬ、約４，３００ＩＵ／ｍＬ、約４，４００ＩＵ／ｍＬ、約４，５００ＩＵ／ｍＬ、約４，６００ＩＵ／ｍＬ、約４，７００ＩＵ／ｍＬ、約４，８００ＩＵ／ｍＬ、約４，９００ＩＵ／ｍＬ、約５，０００ＩＵ／ｍＬ、約５，１００ＩＵ／ｍＬ、約５，２００ＩＵ／ｍＬ、約５，３００ＩＵ／ｍＬ、約５，４００ＩＵ／ｍＬ、約５，５００ＩＵ／ｍＬ、約５，６００ＩＵ／ｍＬ、約５，７００ＩＵ／ｍＬ、約５，８００ＩＵ／ｍＬ、約５，９００ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ＩＵ／ｍＬ、約６，５００ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ＩＵ／ｍＬ、約７，５００ＩＵ／ｍＬ、約８，０００ＩＵ／ｍＬ、約８，５００ＩＵ／ｍＬ、約９，０００ＩＵ／ｍＬ、約９，５００ＩＵ／ｍＬ及び約１０，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む。
【０１４４】
[00195]  本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、方法全体を通して１日以上培養物に添加され得る。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、４日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、７日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、１１日目に追加される。別の実施形態において、追加のＩＬ−２は、４日目、７日目及び／又は１１日目に追加される。本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、追加のＩＬ−２と共に、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間の期間、培養される。本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、ＩＬ−２の各添加後３日間の期間にわたって培養される。
【０１４５】
[00196]  一実施形態において、細胞培養培地は、方法中に少なくとも一度交換される。一実施形態において、細胞培養培地は、追加のＩＬ−２が加えられるのと同時に交換される。別の実施形態において、細胞培養培地は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目又は１４日目の少なくとも１日で交換される。本発明の一実施形態において、方法全体で使用される細胞培養培地は、同じであるか又は異なり得る。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４又はＡＩＭ−Ｖである。本発明の一実施形態において、１１日目の細胞培養培地交換ステップは、任意選択による。本発明の一実施形態において、拡大培養プロセスのためのＰＢＭＣの開始細胞数は、約２５，０００〜約１，０００，０００、約３０，０００〜約９００，０００、約３５，０００〜約８５０，０００、約４０，０００〜約８００，０００、約４５，０００〜約８００，０００、約５０，０００〜約７５０，０００、約５５，０００〜約７００，０００、約６０，０００〜約６５０，０００、約６５，０００〜約６００，０００、約７０，０００〜約５５０，０００、好ましくは約７５，０００〜約５００，０００、約８０，０００〜約４５０，０００、約８５，０００〜約４００，０００、約９０，０００〜約３５０，０００、約９５，０００〜約３００，０００、約１００，０００〜約２５０，０００、約１０５，０００〜約２００，０００又は約１１０，０００〜約１５０，０００である。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約１３８，０００、１４０，０００、１４５，０００又はそれを超える数である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約２８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約６２，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３６，０００である。
【０１４６】
[00197]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬの拡大倍数は、約２０％〜約１００％、２５％〜約９５％、３０％〜約９０％、３５％〜約８５％、４０％〜約８０％、４５％〜約７５％、５０％〜約１００％又は２５％〜約７５％である。本発明の一実施形態において、拡大倍数は、約２５％である。本発明の別の実施形態において、拡大倍数は、約５０％である。別の実施形態において、拡大倍数は、約７５％である。
【０１４７】
[00198]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、１０〜５０ｍｌの骨髄吸引液から拡大培養される。本発明の一実施形態において、１０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、２０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、３０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、４０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、５０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。
【０１４８】
[00199]  本発明の一実施形態において、約１０〜５０ｍｌの骨髄吸引液から得られるＰＢＭＣの数は、約５×１０７〜約１０×１０７個のＰＢＭＣである。別の実施形態において、得られるＰＭＢＣの数は、約７×１０７個のＰＢＭＣである。
【０１４９】
[00200]  本発明の一実施形態において、約５×１０７〜約１０×１０７個のＰＢＭＣから約０．５×１０６〜約１．５×１０６個の拡大培養開始細胞材料が得られる。本発明の一実施形態において、約１×１０６個の拡大培養開始細胞材料が得られる。
【０１５０】
[00201]  本発明の一実施形態において、拡大培養期間の終わりに回収されるＭＩＬの総数は、約０．０１×１０９個〜約１×１０９個、約０．０５×１０９個〜約０．９×１０９個、約０．１×１０９個〜約０．８５×１０９個、約０．１５×１０９個〜約０．７×１０９個、約０．２×１０９個〜約０．６５×１０９個、約０．２５×１０９個〜約０．６×１０９個、約０．３×１０９個〜約０．５５×１０９個、約０．３５×１０９個〜約０．５×１０９個又は約０．４×１０９個〜約０．４５×１０９個である。
【０１５１】
[00202]  本発明の一実施形態において、骨髄吸引液に由来する１２×１０６個のＰＢＭＣは、およそ１．４×１０５個の出発細胞材料を生成し、これは、拡大培養プロセスの終わりに約１．１×１０７個のＭＩＬを生成する。
【０１５２】
[00203]  本発明の一実施形態において、上記のＭＩＬ方法３を使用して骨髄ＰＢＭＣから拡大培養されたＭＩＬは、ＭＩＬ方法１又はＭＩＬ方法２を使用して拡大培養されたＭＩＬと比較して高い割合のＣＤ８＋細胞並びにより少ない数のＬＡＧ３＋及びＰＤ１＋細胞を含む。本発明の一実施形態において、上記のＭＩＬ方法３を使用して血液ＰＢＭＣから拡大培養されたＰＢＬは、ＭＩＬ方法１又はＭＩＬ方法２を使用して拡大培養されたＰＢＬと比較して高い割合のＣＤ８＋細胞及び増加したレベルのＩＦＮγ産生を含む。
【０１５３】
[00204]  本発明の一実施形態において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者に有用なＭＩＬの臨床用量は、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、９．５×１０８個のＭＩＬである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、４．１×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、２．２×１０９である。
【０１５４】
[00205]  前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血サンプルから、骨髄から、アフェレーシスにより、バフィーコートから、又はＰＢＭＣを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
【０１５５】
「２Ａプロセス」を使用したＴＩＬの拡大培養方法
[00206]  本発明の一実施形態において、本発明は、骨髄及び／又は末梢血に由来するＴ細胞を拡大培養するための装置及び方法を提供する。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、ポリクローナルであるが、高度に腫瘍特異的な様式で、骨髄微小環境からの高められた腫瘍特異性を有する。一実施形態において、骨髄微小環境は、Ｔ細胞を維持及び拡大培養するために使用される。本発明の一実施形態において、７日間又は１４日間の拡大培養プロセスでＴＩＬのおよそ２５〜１００倍の拡大培養がある。一実施形態において、ＴＩＬの拡大倍数は、約３０〜９０倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約３５〜８５倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約４０〜８０倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約４５〜７５倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約４０〜７０倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約４５〜６５倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍及び５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍又は約１００倍の拡大倍数である。
【０１５６】
[00207]  本発明の一実施形態において、Ｔ細胞製造プロセスは、腫瘍特異性を選択するための介入を必要としない。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞製造プロセスは、Ｔ細胞拡大培養時に骨髄及び／又は末梢血中に腫瘍が存在することを必要としない。一実施形態において、Ｔ細胞は、ほぼ完全な骨髄の存在下で拡大培養される。
【０１５７】
[00208]  一実施形態において、本発明は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０６２７４２号に記載の実施例、特に実施例２１に記載の骨髄及び／又は末梢血からＴ細胞を抽出する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるNoonan, et al., 2005, Cancer Res.65:2026-2034に記載されるように、骨髄及び／又は末梢血からＴ細胞を抽出する方法を提供する。
【０１５８】
[00209]  一実施形態において、当業者に知られている骨髄及び／又は末梢血を入手するための方法は、本発明において有用である。本発明の一実施形態において、骨髄及び／又は末梢血は、針吸引を使用して入手される。本発明の一実施形態において、患者からの骨髄がヘパリン含有シリンジに吸引され、室温で一晩保存される。本発明の一実施形態において、保存後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞（ＭＮＣ）が濃縮されている。勾配内の細胞は、赤血球まで収集され、ＨＢＳＳを使用して洗浄される。ＭＮＣは、２％ＨＳＡ及び５％ＤＭＳＯが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにＭＮＣの一部が確保されている。ＱＣバイアルを解凍して、ＭＮＣ製品のＣＤ３＋及びＣＤ３８＋／１３８＋の細胞含有量を測定する。骨髄の収集が本発明を限定するものではないことに留意することが重要である。
【０１５９】
[00210]  本発明の一実施形態において、骨髄を吸引及びリンパ球分離培地密度勾配で分画し、細胞をほぼ赤血球ペレットのレベルまで収集する。一実施形態において、この分画法は、赤血球及び好中球を実質的に除去し、ほぼ完全な骨髄を提供する。一実施形態において、結果として生じる分画された材料は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞である。本発明の一実施形態において、方法は、Ｔ細胞特異的分離ステップなしで且つ腫瘍細胞分離ステップなしで、例えば、抗体又は他の細胞タイプ特異的検出可能標識でＴ細胞を標識することなしで且つ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した選別なしで実施され得る。
【０１６０】
[00211]  本発明の一実施形態において、入手した骨髄がフィコールされるか、又は末梢血が２００ｕＬ／ウェルのＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６個／ｍＬの細胞で無血清条件において懸濁される。
【０１６１】
[00212]  本発明の一実施形態において、骨髄は、完全寛解にない対象から収集される。本発明の一実施形態において、骨髄は、完全寛解にある対象から収集される。
【０１６２】
[00213]  本発明の一実施形態において、骨髄を入手し、凍結し得る。一実施形態において、骨髄を入手し、直ちに使用してＴ細胞を抽出し得る。
【０１６３】
[00214]  更なる実施形態において且つ上記のいずれかに従って、本発明は、ＴＩＬを拡大培養する方法であって、液性腫瘍から入手した少なくとも１つのＴＩＬを含むＴＩＬの集団を接触させることを含む方法を提供する。本明細書におけるＴＩＬの拡大培養に関する全ての議論は、骨髄、末梢血及び／又は液性腫瘍を含む血液悪性腫瘍から入手したＴＩＬの拡大培養に適用可能である。
【０１６４】
[00215]  一実施形態において、本発明は、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を調製するためのプロセスであって、
（ａ）断片化した腫瘍を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養（プレＲＥＰ）を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｄ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、プロセスを提供する。
【０１６５】
[00216]  一実施形態において、本発明は、第１のプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）プロセス、次いで第２の拡大培養プロセス（急速拡大培養プロセス−ＲＥＰであり得る）を含む、ＴＩＬの集団を拡大培養させるためのプロセスであって、拡大培養に使用される細胞培養培地は、１００ＩＵ／ｍＬ〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ〜４，８００ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ〜４，６００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ〜４，４００ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ〜４，２００ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ〜４，０００ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ〜３，８００ＩＵ／ｍＬ、９００ＩＵ／ｍＬ〜３，６００ＩＵ／ｍＬ、１，０００ＩＵ／ｍＬ〜３，４００ＩＵ／ｍＬ、１，１００ＩＵ／ｍＬ〜３，２００ＩＵ／ｍＬ、１，２００ＩＵ／ｍＬ〜３，０００ＩＵ／ｍＬ、１，３００ＩＵ／ｍＬ〜２，８００ＩＵ／ｍＬ、１，４００ＩＵ／ｍＬ〜２，６００ＩＵ／ｍＬ、１，５００ＩＵ／ｍＬ〜２，４００ＩＵ／ｍＬ、１，６００ＩＵ／ｍＬ〜２，２００ＩＵ／ｍＬ、１，７００ＩＵ／ｍＬ〜２，０００ＩＵ／ｍＬ、５，５００ＩＵ／ｍＬ〜９，５００ＩＵ／ｍＬ、６，０００ＩＵ／ｍＬ〜９，０００ＩＵ／ｍＬ、６５００ＩＵ／ｍＬ〜８，５００ＩＵ／ｍＬ、７，０００ＩＵ／ｍＬ〜８，０００ＩＵ／ｍＬ及び７，５００ＩＵ／ｍＬ〜８，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む、プロセスを提供する。
【０１６６】
[00217]  一実施形態において、本発明は、プレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）プロセス及び急速拡大培養プロセス（ＲＥＰ）を含む、ＴＩＬの集団を拡大培養させるためのプロセスであって、拡大培養に使用される細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，５００ＩＵ／ｍＬ、約１，６００ＩＵ／ｍＬ、約１，７００ＩＵ／ｍＬ、約１，８００ＩＵ／ｍＬ、約１，９００ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ＩＵ／ｍＬ、約２，１００ＩＵ／ｍＬ、約２，２００ＩＵ／ｍＬ、約２，３００ＩＵ／ｍＬ、約２，４００ＩＵ／ｍＬ、約２，５００ＩＵ／ｍＬ、約２，６００ＩＵ／ｍＬ、約２，７００ＩＵ／ｍＬ、約２，８００ＩＵ／ｍＬ、約２，９００ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ＩＵ／ｍＬ、約３，１００ＩＵ／ｍＬ、約３，２００ＩＵ／ｍＬ、約３，３００ＩＵ／ｍＬ、約３，４００ＩＵ／ｍＬ、約３，５００ＩＵ／ｍＬ、約３，６００ＩＵ／ｍＬ、約３，７００ＩＵ／ｍＬ、約３，８００ＩＵ／ｍＬ、約３，９００ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ＩＵ／ｍＬ、約４，１００ＩＵ／ｍＬ、約４，２００ＩＵ／ｍＬ、約４，３００ＩＵ／ｍＬ、約４，４００ＩＵ／ｍＬ、約４，５００ＩＵ／ｍＬ、約４，６００ＩＵ／ｍＬ、約４，７００ＩＵ／ｍＬ、約４，８００ＩＵ／ｍＬ、約４，９００ＩＵ／ｍＬ、約５，０００ＩＵ／ｍＬ、約５，１００ＩＵ／ｍＬ、約５，２００ＩＵ／ｍＬ、約５，３００ＩＵ／ｍＬ、約５，４００ＩＵ／ｍＬ、約５，５００ＩＵ／ｍＬ、約５，６００ＩＵ／ｍＬ、約５，７００ＩＵ／ｍＬ、約５，８００ＩＵ／ｍＬ、約５，９００ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ＩＵ／ｍＬ、約６，５００ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ＩＵ／ｍＬ、約７，５００ＩＵ／ｍＬ、約８，０００ＩＵ／ｍＬ、約８，５００ＩＵ／ｍＬ、約９，０００ＩＵ／ｍＬ、約９，５００ＩＵ／ｍＬ及び約１０，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む、プロセスを提供する。
【０１６７】
[00218]  一実施形態において、本発明は、プレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）プロセスを含む、ＴＩＬの集団を拡大培養させるためのプロセスを提供する。一実施形態において、本発明は、ＴＩＬの集団を拡大培養させるプレＲＥＰプロセスであって、液性腫瘍から入手したＴＩＬの集団を細胞培養培地と接触させるステップを含み、細胞培養培地は、初期濃度１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を更に含む、プレＲＥＰプロセスを提供する。
【０１６８】
[00219]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬの集団を拡大培養するためのプレＲＥＰプロセスであって、液性腫瘍から入手したＴＩＬの集団を細胞培養培地と接触させるステップを含み、細胞培養培地は、初期濃度約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を更に含む、プレＲＥＰプロセスを提供する。
【０１６９】
[00220]  一実施形態において、ＲＥＰは、任意の適切な方法によって本開示による液性腫瘍から入手したＴＩＬを使用して、ガス透過性容器中で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下での非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３、モノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販）を含み得る。ＴＩＬは、任意選択により３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又はＩＬ−１５などのＴ細胞成長因子の存在下において、任意選択によりヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μＭ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）などのベクターから発現させることができる、癌のエピトープなどのその抗原部分を含む１つ以上の抗原を用いてインビトロでＴＩＬを更に刺激することによって急速に拡大培養させることができる。他の適切な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２及びＶＥＧＦＲ２又はそれらの抗原部分が挙げられ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば、例として照射自己リンパ球により、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２により更に再刺激することができる。
【０１７０】
[00221]  一実施形態において、ＴＩＬを拡大培養させるための方法は、約５０００ｍＬ〜約２５０００ｍＬの細胞培養培地、約５０００ｍＬ〜約１００００ｍＬの細胞培養培地又は約５８００ｍＬ〜約８７００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬを拡大培養させるための方法は、約１０００ｍＬ〜約２０００ｍＬの細胞培地、約２０００ｍＬ〜約３０００ｍＬの細胞培養培地、約３０００ｍＬ〜約４０００ｍＬの細胞培養培地、約４０００ｍＬ〜約５０００ｍＬの細胞培養培地、約５０００ｍＬ〜約６０００ｍＬの細胞培養培地、約６０００ｍＬ〜約７０００ｍＬの細胞培養培地、約７０００ｍＬ〜約８０００ｍＬの細胞培養培地、約８０００ｍＬ〜約９０００ｍＬの細胞培養培地、約９０００ｍＬ〜約１００００ｍＬの細胞培養培地、約１００００ｍＬ〜約１５０００ｍＬの細胞培養培地、約１５０００ｍＬ〜約２００００ｍＬの細胞培養培地又は約２００００ｍＬ〜約２５０００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大するには、１種類以下の細胞培養培地を使用する。任意の適切な細胞培養培地、例えばＡＩＭ−Ｖ細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen, Carlsbad CA）が使用され得る。これに関して、本発明の方法は、ＴＩＬの数を拡大するために必要とされる培地の量及び培地の種類の数を有利に減少させる。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大することは、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を拡大するのに必要な手順を単純化する。
【０１７１】
[00222]  一実施形態において、第２の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる。そのような実施形態は、細胞集団が約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養は、フィードなしで発生する。一実施形態において、この拡大培養は、培地がガス透過性フラスコ内で約１０ｃｍの高さにある限り、フィードなしで発生する。一実施形態において、これは、フィードなしであるが、１つ以上のサイトカインの添加を伴う。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。そのような容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、ＴＩＬの拡大培養に使用されており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０号、国際公開第２０１１／０７２０８８Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０号、国際公開第２０１３／１７３８３５Ａ１号及び米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６Ａ１号に記載されているものを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなプロセスは、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292にも記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
[00223]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 10フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１０ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、４０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に１億〜３億個のＴＩＬを提供する。
【０１７３】
[00224]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、４５０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に１０億〜３０億個のＴＩＬを提供する。
【０１７４】
[00225]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100Mフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、１０００ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、培地交換なしで１０億〜３０億個のＴＩＬを提供する。
【０１７５】
[00226]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100Lフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２０００ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、培地交換なしで１０億〜３０億個のＴＩＬを提供する。
【０１７６】
[00227]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 24ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、２ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、８ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に１ウェルあたり２０００万〜６０００万個の細胞を提供する。
【０１７７】
[00228]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 6ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、１０ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、４０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に１ウェルあたり１億〜３億個の細胞を提供する。
【０１７８】
[00229]  一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
【０１７９】
[00230]  一実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること；腫瘍組織サンプルからＴＩＬを入手すること；細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む、本方法の所要期間である。
【０１８０】
[00231]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０１８１】
[00232]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。
【０１８２】
[00233]  一実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性容器内で拡大培養する。米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載されているものを含む、当技術分野で公知の方法、組成物及び装置を使用して、ＰＢＭＣを使用してＴＩＬを拡大培養するためにガス透過性容器が使用されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性バッグ内で拡大培養する。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１１Ｌ、約１２Ｌ、約１３Ｌ、約１４Ｌ、約１５Ｌ、約１６Ｌ、約１７Ｌ、約１８Ｌ、約１９Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ及び約３０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、５０〜１５０ｍＬ、１５０〜２５０ｍＬ、２５０〜３５０ｍＬ、３５０〜４５０ｍＬ、４５０〜５５０ｍＬ、５５０〜６５０ｍＬ、６５０〜７５０ｍＬ、７５０〜８５０ｍＬ、８５０〜９５０ｍＬ及び９５０〜１０５０ｍＬからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、１Ｌ〜２Ｌ、２Ｌ〜３Ｌ、３Ｌ〜４Ｌ、４Ｌ〜５Ｌ、５Ｌ〜６Ｌ、６Ｌ〜７Ｌ、７Ｌ〜８Ｌ、８Ｌ〜９Ｌ、９Ｌ〜１０Ｌ、１０Ｌ〜１１Ｌ、１１Ｌ〜１２Ｌ、１２Ｌ〜１３Ｌ、１３Ｌ〜１４Ｌ、１４Ｌ〜１５Ｌ、１５Ｌ〜１６Ｌ、１６Ｌ〜１７Ｌ、１７Ｌ〜１８Ｌ、１８Ｌ〜１９Ｌ及び１９Ｌ〜２０Ｌからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、０．５Ｌ〜５Ｌ、５Ｌ〜１０Ｌ、１０Ｌ〜１５Ｌ、１５Ｌ〜２０Ｌ、２０Ｌ〜２５Ｌ及び２５Ｌ〜３０Ｌからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日及び約２８日の揺動時間を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、３０分〜１時間、１時間〜１２時間、１２時間〜１日、１日〜７日、７日〜１４日、１４日〜２１日及び２１日〜２８日の揺動時間を用いる。一実施形態において、細胞拡大培���システムは、約２揺動／分、約５揺動／分、約１０揺動／分、約２０揺動／分、約３０揺動／分及び約４０揺動／分の揺動速度を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、２揺動／分〜５揺動／分、５揺動／分〜１０揺動／分、１０揺動／分〜２０揺動／分、２０揺動／分〜３０揺動／分及び３０揺動／分〜４０揺動／分の揺動速度を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約２°、約３°、約４°、約５°、約６°、約７°、約８°、約９°、約１０°、約１１°及び約１２°の揺動角を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、２°〜３°、３°〜４°、４°〜５°、５°〜６°、６°〜７°、７°〜８°、８°〜９°、９°〜１０°、１０°〜１１°及び１１°〜１２°の揺動角を用いる。
【０１８３】
[00234]  一実施形態において、液性腫瘍から入手したＴＩＬを拡大培養する方法は、ＴＩＬが優れた腫瘍反応性について選択されるステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられ得る。
【０１８４】
[00235]  一実施形態において、本発明は、液性腫瘍からＴＩＬの集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292に記載されているようなステップを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、腫瘍又はその一部を酵素培地に入れ、およそ１分間機械的に分離させ得る。次いで、混合物を５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートし、次いでおよそ１分間再び機械的に破砕し得る。５％ＣＯ２中、３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍又はその一部を３回目におよそ１分間機械的に破砕し得る。３回目の機械的破砕後、大きい組織片が存在する場合、５％ＣＯ２中、３７℃で更に３０分のインキュベーションを伴って又は伴わず、１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用し得る。最終インキュベーションの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにフィコールを用いた密度勾配分離を行うことができる。ＴＩＬ培養は、２４ウェルプレート（Costar２４ウェル細胞培養クラスター、平底；Corning Incorporated, Corning, NY）で開始され、各ウェルに、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp., Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化細胞又はおよそ１〜８ｍｍ３のサイズの１つの腫瘍断片が播種され得る。ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Hepes及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加した、GlutaMAXを含むRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液を含む。培養は、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有するガス透過性フラスコ（G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton内で開始され得、各フラスコに、ＩＬ−２を含む１０〜４０ｍＬのＣＭ中、１０〜４０×１０６個の生存可能な腫瘍消化細胞又は５〜３０個の腫瘍断片が充填され得る。G-Rex 10及び24ウェルプレートは、５％ＣＯ２中３７℃において加湿インキュベーター内でインキュベートされ得、培養開始の５日後、培地の半分は、取り出され、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２と交換され得、５日後、培地の半分は、２〜３日ごとに交換され得る。本開示の液性腫瘍から入手したＴＩＬを使用して、本明細書の他の箇所に記載されるように、T-175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して、ＴＩＬの第２の拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）が行われ得る。T-175フラスコ中のＲＥＰでは、１×１０６個のＴＩＬが各フラスコ中の１５０ｍＬの培地に懸濁され得る。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を添加したＣＭ及びＡＩＭ−Ｖ培地（５０／５０培地）の１対１の混合物で培養され得る。T-175フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ−Ｖ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加し得る。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日でカウントし得、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。１００ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量のフラスコ（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing）中のＲＥＰでは、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を添加した、４００ｍＬの５０／５０培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心分離ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心分離し得る。入手したＴＩＬペレットを３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮な５０／５０培地に再懸濁し、G-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。ＴＩＬをG-Rex 100フラスコ中で連続的に拡大培養する場合、７日目に各G-Rex 100中のＴＩＬは各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁され、細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコに接種するために使用され得る３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次いで、５％ヒトＡＢ血清を含む約１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を各フラスコに添加し得る。次いで、G-Rex 100フラスコを５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、４日後に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を有する１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各G-Rex 100フラスコに加え得る。この後、培養１４日目に細胞を回収することによってＲＥＰが完了され得る。
【０１８５】
[00236]  一実施形態において、癌を拡大培養又は処置する方法は、ＴＩＬが患者の腫瘍サンプルから入手されるステップを含む。患者の腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を使用して入手され得る。例えば、ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物及び鋭的切開による腫瘍断片（サイズ約１〜約８ｍｍ３）から培養され得る。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
【０１８６】
[00237]  一実施形態において、前述のように、T-175フラスコ及びガス透過性バッグを使用して（Tran, et al, J. Immunother.2008, 31, 742-51；Dudley, et al, J. Immunother.2003, 26, 332-42）又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）を使用して、ＴＩＬの第２の／ＲＥＰ拡大培養プロセスが実施され得る。T-175フラスコ中のＴＩＬ拡大培養では、１５０ｍＬの培地中に懸濁した１×１０６個のＴＩＬが各T-175フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、ＩＬ−２の１ｍＬあたり３０００ＩＵ（国際単位）及び抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ−３）の１ｍＬあたり３０ｎｇを添加したＣＭ及びＡＩＭ−Ｖ培地の１対１の混合物で培養され得る。T-175フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ−Ｖ及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加した。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日でカウントし、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
【０１８７】
[00238]  一実施形態において、１００ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）中の第２の／ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養では、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２及び１ｍＬあたり３０ｎｇの抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）を添加した、４００ｍＬの５０／５０培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心分離ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（毎分回転数；４９１×ｇ）で１０分間遠心分離し得る。ＴＩＬペレットを、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地で再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。ＴＩＬをG-Rex 100フラスコ中で連続的に拡大培養する場合、７日目に各G-Rex 100フラスコ中のＴＩＬは各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁され得、細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコに播種するために使用され得る３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコを５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、４日後に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を有する１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各G-Rex 100フラスコに加え得る。細胞は、培養１４日目に回収され得る。
【０１８８】
[00239]  一実施形態において、ＴＩＬは、以下のように調製され得る。２ｍｍ３の腫瘍断片を、２ｍＭグルタミン（Mediatech, Inc.Manassas, VA）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen Life Technologies）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies）、５％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical, Inc.Winchester, VA）及び６００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２（Chiron, Emeryville, CA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を含む完全培地（ＣＭ）中で培養する。液性腫瘍の酵素的消化のために、腫瘍標本をさいの目に切りRPMI-1640へ入れ、洗浄し、１５〜２２℃で５分間、８００ｒｐｍで遠心分離し、酵素的消化緩衝液（RPMI-1640中０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ及び３０単位／ｍｌのＤＮａｓｅ）に再懸濁し、続いて室温で一晩回転させる。断片から作製されたＴＩＬをＣＭ中で３〜４週間増殖させ、新鮮に拡大培養させるか、又は１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む熱不活性化ＨＡＢ血清中で凍結保存し、研究時まで−１８０℃で保存し得る。腹水採取から入手した腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）をＣＭ中２４ウェルプレートの３×１０６細胞／ウェルで播種した。低倍率倒立顕微鏡を使用して、ＴＩＬの増殖を隔日で検査した。
【０１８９】
ＴＩＬ製造プロセス（「２Ａプロセス」）の例示的な実施形態
[00169]  プロセス２Ａとして知られる例示的なＴＩＬ製造／拡大培養プロセスは、図２２に概略的に示されている。特定の態様において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができるＴＩＬを産生し、従って成熟ＴＩＬ（即ち対象／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004；173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらの全ては、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
[00170]  本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、従って相対的健康を増加させ、且つ前記代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、ＴＩＬは、一般的に患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、任意選択により、以下に考察する通り遺伝的に操作され得る。
【０１９１】
[00171]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
【０１９２】
[00172]  一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセスを含む）は、従来の拡大培養法と比較して７〜１４日に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセスを含む）は、７〜１４日間に短縮される。
【０１９３】
[00173]  図２３は、例示的な２Ａプロセスを示す。図２３で示すように且つ以下で更に詳細に説明されるように、一部の実施形態において、第１の拡大培養（ステップＢ）は、１１日間に短縮され、第２の拡大培養（ステップＤ）は、１１日間に短縮される。一部の実施形態において、本明細書で詳細に考察されるように、第１及び第２の拡大培養（ステップＢ及びステップＤ）の組み合わせは、２２日間に短縮される。理解されるように、図２３に示され且つ以下に説明されるプロセスは、例示的なものであり、本明細書で説明する方法は、説明したステップへの変更及び追加並びに任意の組み合わせを包含する。このプロセスの例示的な実施形態は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されており、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
Ａ．ステップＡ：患者腫瘍サンプルの入手
[00174]  一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【０１９５】
[00175]  患者腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を用いて、一般的に、外科的切除、針生検、アフェレーシス又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含むサンプルを入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定されないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定されないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。一部の実施形態において、腫瘍は、約１．５ｃｍより大きく、約４ｃｍより小さい。一部の実施形態において、腫瘍は、４ｃｍより小さい。
【０１９６】
[00176]  入手後、腫瘍サンプルは、一般的に鋭的剥離を用いて１〜約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２〜３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
【０１９７】
[00177]  一般に、採取された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【０１９８】
[00178]  一実施形態において、ＴＩＬは、最初に、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
【０１９９】
[00179]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は、鋭的剥離で入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３〜８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約８〜２７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１０〜２５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１５〜２５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約８〜２０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１５〜２０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約８〜１５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約８〜１０ｍｍ３である。
【０２００】
[00180]  一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約４０個〜約５０個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約４０個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約５０個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片サイズは、約８〜２７ｍｍ３であり、約５０未満の腫瘍断片が存在する。
【０２０１】
[00181]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定されないが、ＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭ  GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的分離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に、溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
【０２０２】
Ｂ．ステップＢ：第１の拡大培養
[00182]  ステップＡにおける腫瘍断片の剥離又消化後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、一般的に３〜１４日間の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７〜１４日間の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０〜１４日間の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日間の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日間の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約２００×１０６個以下のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
【０２０３】
[00183]  好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図２３に示されるステップＢ）、その後の、以下でステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、高速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択の凍結保存及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
【０２０４】
[00184]  実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。
【０２０５】
[00185]  一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％のヒトＡＢ血清、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ  １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降では２〜３日毎に培地の半分を交換した。
【０２０６】
[00186]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０２０７】
[00187]  一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセスを含む；ステップＢ）プロセスは３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察するように、ステップＢの第１の拡大培養は、１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察するように、ステップＢの第１の拡大培養は、１１日間に短縮される。
【０２０８】
[00188]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップＢプロセス中に含められ得る。
【０２０９】
[00189]  一部の実施形態において、ステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。
【０２１０】
Ｃ．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00190]  一部の実施形態において、ステップＢからのバルクＴＩＬ集団は、当技術分野で公知であり且つ本明細書に記載される方法を使用して直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、第２の拡大培養（ＲＥＰ）に供し、次に凍結保存することができる。
【０２１１】
[00191]  一部の実施形態において、ステップＢのＴＩＬは、貯蔵されず、ステップＢのＴＩＬは、ステップＤに直接進む。一部の実施形態において、本明細書に更に記載される通り、移行は、閉鎖系で行われる。
【０２１２】
Ｄ．ステップＤ：第２の拡大培養
[00192]  一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、採取及び初期バルク処理後（即ちステップＡ及びステップＢ後）に数が拡大される。これは、本明細書において一般的に第２の拡大培養と称され、当技術分野では一般的に急速拡大培養プロセス（ＲＥＰ）と称される拡大培養プロセスを含み得る。第２の拡大培養は、一般的に、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、いくつもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、第２の拡大培養で入手されるＴＩＬの数を増加させるためにスケールアップすることを含み得る。
【０２１３】
[00193]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、本開示の方法を使用してガス透過性容器中で行うことができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択により、３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２又はＩＬ−１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μＭ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択によりベクターから発現させることのできる、エピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原によるインビトロでのＴＩＬの更なる刺激により、急速に拡大培養することができる。他の適切な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２及びＶＥＧＦＲ２又はそれらの抗原部分が挙げられ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば、照射自己リンパ球により、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２により更に再刺激することができる。
【０２１４】
[00194]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０２１５】
[00195]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ３抗体を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
【０２１６】
[00196]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップＤプロセスにおける第２の拡大培養中に含められ得る。
【０２１７】
[00197]  一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示フィーダー細胞を含む添加細胞培養培地で実施され得る。
【０２１８】
[00198]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０〜１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００〜１：２００である。
【０２１９】
[00199]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０２２０】
[00200]  一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスとも称される）は、実施例及び図で考察されるように、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、１１日間に短縮される。
【０２２１】
[00201]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）T-175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施され得る。T-175フラスコ中のＴＩＬ急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養では、１５０ｍＬの培地中に懸濁した１×１０６個のＴＩＬが各T-175フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、ＩＬ−２の１ｍＬあたり３０００ＩＵ及び抗ＣＤ３の１ｍＬあたり３０ｎｇを添加したＣＭ及びＡＩＭ−Ｖ培地の１対１の混合物で培養され得る。T-175フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ−Ｖ及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加した。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日でカウントし、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
【０２２２】
[00202]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、１００ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）中で実施され得、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬは、５％人ＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２及び１ｍＬあたり３０ｎｇの抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）を添加した、４００ｍＬの５０／５０培地中でＰＢＭＣと共に培養され得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。ＴＩＬペレットを、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地で再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するとき、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割し得、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ得、４日後、各G-Rex 100フラスコに１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを加え得る。細胞は、培養１４日目に回収され得る。
【０２２３】
[00203]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０２２４】
[00204]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養が実施され、これは、優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられ得る。
【０２２５】
[00205]  ＴＩＬのＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、先述の通りT-175フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、フラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、ＲＥＰは、ガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。T-175フラスコにおけるＴＩＬ  ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養について、約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各T-175フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとＡＩＭ−Ｖ培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。T-175フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地の半分は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのＡＩＭ−Ｖを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントし得、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５〜約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
【０２２６】
[00206]  １００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100, Wilson Wolf）中でのＴＩＬ  ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養について、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中において、約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。ＴＩＬがG-Rex 100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、７日目に各G-Rex 100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用される。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex 100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを加える。細胞は培養１４日目に回収される。
【０２２７】
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00207]  一実施形態において、本明細書に記載される第２の拡大培養手順（ステップＤ、ＲＥＰを含む）には、ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
【０２２８】
[00208]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、実施例、特に同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例１４に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
【０２２９】
[00209]  一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
【０２３０】
[00210]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０２３１】
[00211]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５〜６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００〜６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０〜４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５〜３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００〜３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０２３２】
[00212]  一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせてＲＥＰ段階で使用される。
【０２３３】
２．サイトカイン
[00213]  本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
【０２３４】
[00214]  代わりに、ＴＩＬの急速拡大培養又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の２つ以上の組み合わせについて、一般的に米国特許出願公開第２０１７／０１０７４９０Ａ１号、国際公開第２０１５／１８９３５６号、米国特許出願公開第２０１７／０１０７４９０Ａ１号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（それぞれ本明細書に全体として参照により明示的に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
【０２３５】
３．抗ＣＤ３抗体
[00215]  一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（ＲＥＰを含む）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ−２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般的に好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（本明細書によって全体として参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０２３６】
[00216]  当業者が理解するであろう通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定されないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、いくつも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。
【０２３７】
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬの回収
[00217]  第２の拡大培養ステップ後、細胞は、回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１、２、３、４回又はそれを超える第２の拡大培養ステップ後に回収される。
【０２３８】
[00218]  ＴＩＬは、例えば、遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は、当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、自動化系を使用して回収する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、半自動化系を使用して回収する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、半自動化系を使用して回収される。一部の実施形態において、第２の拡大培養からのＴＩＬは、半自動化装置を使用して回収される。一部の実施形態において、ＬＯＶＯシステムが使用される（例えば、Benchmark Electronicsから市販）。一部の実施形態において、回収ステップは、ＴＩＬを洗浄すること、ＴＩＬを配合すること及び／又はＴＩＬを分取することを含む。一部の実施形態において、細胞は、任意選択により、回収後又は回収の一部として凍結される。
【０２３９】
Ｆ．ステップＦ：最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動
[00219]  ステップＡ〜Ｅが完了した後、細胞は、患者への投与における使用のために容器に移される。
【０２４０】
[00220]  一実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
【０２４１】
Ｇ．追加の拡大培養ステップ
[00221]  理解されるように、上記のステップＡ〜Ｆのいずれも、何度でも繰り返すことができ、更に上記と異なる順序で実施され得る。
【０２４２】
[00222]  一部の実施形態において、１つ以上の拡大培養ステップを最終製剤ステップＦ前に繰り返し得る。そのような追加の拡大培養ステップは、上記の第１及び／又は第２の拡大培養ステップの要素を含み得る（例えば、細胞培養培地に記載の成分を含む）。追加の拡大培養ステップは、追加の拡大培養ステップ前及び／又は中に細胞培養培地に補充される細胞培養培地中の追加の成分を含む追加の要素を更に含み得る。
【０２４３】
[00223]  更なる実施形態において、図２３及び上記の段落に記載されたいずれかの拡大培養ステップに、拡大培養ステップ中に生成された細胞が、製造／拡大培養プロセスの残りのステップに必要になるまで、保存のために当技術分野で公知の方法を使用して保存される、凍結保存ステップが先行又は後続し得る。
【０２４４】
ＴＩＬ、ＭＩＬ及びＰＢＬの医薬組成物、投与量及び投与レジメン
[00240]  一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養させたＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示の方法を使用して拡大培養されたＴＩＬは、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、ＴＩＬは、単一の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０〜６０分続く。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
【０２４５】
[00241]  任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。特に癌が血液悪性腫瘍である場合、好ましくは平均が約７．８×１０１０ＴＩＬである約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０ＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。
【０２４６】
[00242]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約４×１０８〜約２．５×１０９の範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、９．５×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、４．１×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、２．２×１０９である。
【０２４７】
[00243]  本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの数は、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＴＩＬ、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＴＩＬ、約０．１２×１０９〜約１２×１０９個のＴＩＬ、約０．１５×１０９〜約１１×１０９個のＴＩＬ、約０．２×１０９〜約１０×１０９個のＴＩＬ、約０．３×１０９〜約９×１０９個のＴＩＬ、約０．４×１０９〜約８×１０９個のＴＩＬ、約０．５×１０９〜約７×１０９個のＴＩＬ、約０．６×１０９〜約６×１０９個のＴＩＬ、約０．７×１０９〜約５×１０９個のＴＩＬ、約０．８×１０９〜約４×１０９個のＴＩＬ、約０．９×１０９〜約３×１０９個のＴＩＬ又は約１×１０９〜約２×１０９個のＴＩＬの範囲である。
【０２４８】
[00244]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
【０２４９】
[00245]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより高い。
【０２５０】
[00246]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
【０２５１】
[00247]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
【０２５２】
[00248]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
【０２５３】
[00249]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
【０２５４】
[00250]  本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量も適切な場合に使用され得る。ＴＩＬの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
【０２５５】
[00251]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは、複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続し得る。
【０２５６】
[00252]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。
【０２５７】
[00253]  本発明の一実施形態において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者に有用なＭＩＬの臨床用量は、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、９．５×１０８ＭＩＬである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、４．１×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、２．２×１０９である。
【０２５８】
[00254]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０２５９】
[00255]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲内である。
【０２６０】
[00256]  有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植若しくは腫瘍への直接注射又は吸入を含む、同様の有用性を有する薬剤の許容される投与様式のいずれかにより、単回投与又は複数回投与のいずれかで投与され得る。
【０２６１】
癌を処置する方法
[00257]  上記のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ（及びそれらの集団）の組成物及び組み合わせは、過剰増殖性障害を処置するための方法において使用することができる。好ましい一実施形態において、それらは、癌の処置に使用するためのものである。好ましい実施形態において、本発明は、癌が液性腫瘍などの血液悪性腫瘍である、癌の処置方法を提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である。
【０２６２】
[00258]  一実施形態において、本発明は、癌の処置方法であって、癌は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アベルマブ又はアテゾリズマブを含むＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１阻害剤による治療に応答する血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０２６３】
[00259]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法であって、
（ａ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｃ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｄ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０２６４】
[00260]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法であって、
（ａ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｃ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｄ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０２６５】
[00261]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法であって、
（ａ）キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０２６６】
[00262]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法であって、
（ａ）キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第３の集団は、第２の拡大培養の開始から７日後、数においてＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０２６７】
[00263]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、本発明に従って患者に投与される。
【０２６８】
[00264]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２６９】
[00265]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２７０】
[00266]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法１、ＭＩＬ方法２又はＭＩＬ方法３を使用して拡大培養されたＴＩＬは、ＡＭＬを処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２７１】
[00267]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＰＢＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２７２】
[00268]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＰＢＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２７３】
[00269]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＰＢＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２７４】
[00270]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２又はＰＢＬ方法３を使用して拡大培養されたＴＩＬは、ＣＬＬを処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０２７５】
[00271]  本発明の前述の実施形態のいずれかにおいて、キナーゼ阻害剤による前処理が記載されている。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ、イブルチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤からなる群から選択される。一実施形態において、キナーゼ阻害剤による前処置レジメンは、当技術分野で知られている通り及び／又は医師によって指示されている通りである。
【０２７６】
[00272]  本発明の前述の実施形態のいずれかにおいて、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤（ＩＴＫ）による前処理が記載されている。インターロイキン−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）は、Ｔ細胞で発現する非受容体チロシンキナーゼであり、さまざまな経路を調節する。当技術分野で公知の任意のＩＴＫ阻害剤が、本発明の実施形態で使用され得る（例えば、Lo, et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents, 20:459-469 (2010)；Vargas, et al, Scandinavian Journal of Immunology, 78(2):130-139 (2013)；国際公開第２０１５１１２８４７号；国際公開第２０１６１１８９５１号；国際公開第２００７１３６７９０号、米国特許出願公開第２０１２００５８９８４Ａ１号及び米国特許第９，５３１，６８９号及び同第９，６９５，２００号；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にＩＴＫに結合する共有結合ＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに結合するアロステリックＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、５−アミノメチルベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、（４又は５−アリール）ピラゾリル−インドール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリジン系ＩＴＫ阻害剤、ジアゾロジアジン系ＩＴＫ阻害剤、トリアゾール系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルインダゾール系ＩＴＫ阻害剤、インドール系ＩＴＫ阻害剤、アザインドール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリルインドール系阻害剤、チエノピラゾール系ＩＴＫ阻害剤、複素環ＩＴＫ阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤（イブルチニブなど）、アザベンゾイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンゾチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、インドール系ＩＴＫ阻害剤、ピリドン系ＩＴＫ阻害剤、スルホキシミン置換ピリミジンＩＴＫ阻害剤、アリールピリジノン系ＩＴＫ阻害剤及び当技術分野で公知の任意の他のＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤による前処置レジメンは、当技術分野で知られている通り及び／又は医師によって指示されている通りである。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、
【化１】
2020519600.tif 000005
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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及びその組み合わせからなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、スプリセル［Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（６−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキサミド）、イブルチニブ（（１−｛（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］ピペリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン）、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］シンノリン−３−オール、ＣＴＡ０５６（７−ベンジル−１−（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル）−２−（４−（ピリジン−４−イル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−６（５Ｈ）−オン）、化合物１０（Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008)）、化合物１９（Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008)）、化合物２７（Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008)）、化合物２６（Boehringer Ingelheim from Winters, et al, Bioorg Med Chem Lett., 18:5541-4 (2008)）、化合物３７（Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物４１（Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物４８（Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物５１（Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物１０ｎ（Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009)）、化合物１０ｏ（Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009)）、化合物７ｖ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物７ｗ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物７ｘ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物７ｙ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物４４（Bayer Schering Pharma from vonBonin, et al., Exp Dermatol., 20:41-7 (2011)）、化合物１３（Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010)）、化合物２４（Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010)）、化合物３４（Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010)）、化合物１０ｏ（Nycomed from Herdemann, et al., Bioorg Med Chem Lett., 21:1852-6 (2011)）、化合物３（Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012)）、化合物７（Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012)）及び／又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０２７７】
[00273]  前述の実施形態のいずれかにおいて、イブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡとして市販され、化学名１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン）を有する）を含む前処置レジメンは、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月又は６ヶ月の期間にわたり、１４０ｍｇカプセル１つを１日４回（ｑ．ｄ．）経口投与すること、１４０ｍｇカプセル２つを１日４回経口投与すること、１４０ｍｇカプセル３つを１日４回経口投与すること又は１４０ｍｇカプセル４つを１日４回経口投与することを含む。前述の実施形態において、イブルチニブを含む前処置レジメンは、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ及び５００ｍｇからなる群から選択されるイブルチニブ用量を経口投与することも含み得、ここで、投与は、１日１回、１日２回、１日３回又は１日４回行われ、投与期間は、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月及び６ヶ月からなる群から選択される。
【０２７８】
[00274]  任意の前述の実施形態において、処置される癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である。
【０２７９】
[00275]  示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における、本明細書に記載の方法及び組成物の有効性は、当技術分野において公知の様々な動物モデルを使用して試験することができる。
【０２８０】
化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇
[00276]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を提供し、ここで、患者は、本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、１つ以上の化学療法剤である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７〜２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容量まで８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０２８１】
[00277]  実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者においてリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制調整」とも称される）を利用する。
【０２８２】
[00278]  一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせの投与を使用して達成される。そのような方法は、Gassner, et al, Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85、Muranski, et al, Nat.Clin.Pract.Oncol, 2006, 3, 668-681、Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al, J. Clin.Oncol. 2005, 23, 2346-2357に記載されており、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
[00279]  一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日若しくは７日又はそれを超えて実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間実施される。
【０２８４】
[00280]  一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により１μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日若しくは７日又はそれを超えて実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、静脈内（即ちｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４〜５日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４日間実施される。
【０２８５】
[00281]  一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、４日間にわたり、フルダラビンは、２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
【０２８６】
[00224]  一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与することにより行われる。骨髄又は末梢血から入手したＴＩＬを拡大培養するいくつかの方法が本明細書に記載される。本発明の一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与することにより行われる。骨髄又は末梢血から入手したＴＩＬを拡大培養するいくつかの方法が本明細書に記載される。
【実施例】
【０２８７】
実施例
[00224]  本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
【０２８８】
実施例１  −  非ホジキンリンパ腫からのＴＩＬの拡大培養
[00282]  ＴＩＬは、図１に示される病態を有する５つの非ホジキンリンパ腫腫瘍（１つのマントル細胞リンパ腫腫瘍、３つの濾胞性リンパ腫腫瘍及び１つのＡＢＣ型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫腫瘍）からプレＲＥＰ段階でＩＬ−２を１１〜１４日間使用して拡大培養し、続いてＩＬ−２、マイトジェン抗ＣＤ３抗体及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）フィーダーを使用して１４日間ＲＥＰを行った。ＴＩＬは、５つのリンパ腫腫瘍全てから成功して生成され、最大拡大培養指数は、６８０倍であり、これは、他の方法を使用して以前に観察されたものよりも有意に高かった。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。更に、平均ＣＤ３＋Ｔ細胞集団は、９５％であった（Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211の方法を使用した７５％に対して）。
【０２８９】
[00283]  細胞選別及びフローサイトメトリーは、Becton, Dickinson & Co.（BD）FACS CANTO IIシステムを使用して実施した。フローサイトメトリー分析により、黒色腫ＴＩＬのものと同等のエフェクターメモリー細胞の著しい相対的増加が観察された（図２）。黒色腫ＴＩＬ培養物と比較して、リンパ腫においてエフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋（ＴＥＭＲＡ）細胞（ｐ＝０．００１３；ＣＤ４、ＣＤ８）及びＣＤ２８＋ＣＤ４＋（ｐ＝０．００８）サブセットの有意な増加が観察された（図３）。
【０２９０】
[00284]  ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞分化の表現型マーカーの比較が図４及び図５にそれぞれ示されている。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞枯渇の表現型マーカーの比較が図６及び図７にそれぞれ示されている。
【０２９１】
[00285]  図８は、非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。黒色腫ＴＩＬと比較したリンパ腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加傾向が示されている。
【０２９２】
[00286]  図９は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。黒色腫ＴＩＬ（１１〜７５ＬＵ５０、４時間）と比較して、リンパ腫ＴＩＬにおいて、ＬＵ５０／１０６としてＢＲＬＡで測定したＴＩＬの最小細胞溶解活性は、４時間で１未満〜６ＬＵ５０及び２４時間で１〜３９ＬＵ５０の範囲であった。
【０２９３】
[00287]  図１０は、リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。比較可能な結果を示す。リンパ腫ＴＩＬのELIspotアッセイの結果を図１１に示し、図１２の黒色腫ＴＩＬの同じアッセイの結果と比較する。ELIspotアッセイでは、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート／イオノマイシン、抗ＣＤ３抗体又はＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢビーズで刺激すると、リンパ腫ＴＩＬによる広範なＩＦＮ−γ産生が観察され、これらの条件下で一部のリンパ腫ＴＩＬによって産生されるＩＦＮ−γは、黒色腫ＴＩＬによって産生されるＩＦＮ−γと同等であり、一部の場合、リンパ腫ＴＩＬにおけるＩＦＮ−γ産生がはるかに高かった。
【０２９４】
[00288]  図１３は、NANOSTRING NCOUNTER分析（Nanostring Technologies, Inc., Seattle, WA）の結果を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較してより高いレベルのＲＯＲＣ  ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示す。この発見は、リンパ腫反応性Ｔ細胞が主にＴＨ２及びＴＨ１７であるという観察と一致している。
【０２９５】
[00289]  全体として、結果は、ＴＩＬ細胞療法がリンパ腫患者の処置に使用され得るという証拠を提供する。
【０２９６】
実施例２  −  ＡＭＬ患者の骨髄から増殖した骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）及びＡＭＬ患者の末梢血から増殖した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の表現型及び機能的特徴付け
[00290]  骨髄のサンプル及び入手可能な関連血液サンプルが、イブルチニブ（１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン）を含むレジメンの少なくとも３ラウンドで前処置された患者を含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者から、患者の年齢、性別、ステージ、腫瘍タイプ、癌の部位、処置歴、匿名化した病理報告及び実施された分子検査（例えば、ＭＳＩ発現及びＲａｆ／Ｒａｓ発現）に関する情報を伴って入手される。ＭＩＬ及びＰＢＬは、ＭＩＬ方法１、ＭＩＬ方法２若しくはＭＩＬ方法３又はＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２若しくはＰＢＬ方法３の１つを使用して拡大培養され、ＭＩＬ及びＰＢＬの表現型及び機能が特徴付けられた。
【０２９７】
[00291]  図３６Ａ及び３６Ｂは、ＭＩＬ及びＰＢＬの拡大倍数を示す。図３６Ａは、３人の患者（ＭＩＬ１、ＭＩＬ２、ＭＩＬ３）の拡大倍数を示し、図３６Ｂは、患者２及び３（ＰＢＬ２、ＰＢＬ３）の一致したＰＢＬの拡大倍数を示す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養され、ＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１の拡大倍数は、ＭＩＬ１内の各サンプルで２５（ＭＩＬ１．１）、５０（ＭＩＬ１．２）及び７５（ＭＩＬ１．３）倍の増加を示す。これは、ＭＩＬ方法３が好ましい拡大培養方法であり得ることを予備的に示す。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３の拡大倍数データは、不十分なようである。これは、開始細胞数が少ないためである可能性がある。比較のため、患者ＭＩＬ１（ＭＩＬ１．３）のサンプル３の開始細胞数は、１３８，０００細胞であったのに対し、ＭＩＬ２及びＭＩＬ３の開始細胞数は、それぞれ６２，０００及び２８，０００であった。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３について図３６Ｂに示されるＰＢＬの拡大倍数は、それぞれ約１０倍及び４０倍であり、同様の開始細胞数（ＰＢＬ２について３３８，０００、ＰＢＬ３について３３６，０００）であった。
【０２９８】
[00292]  図３７Ａ及び３７Ｂは、ＭＩＬ（図３７Ａ）及び適合ＰＢＬ（図３７Ｂ）のＩＦＮ−γ産生細胞の数を示す。ＭＩＬ１．３、ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＩＦＮ−γ分泌の有意な増加を示し、ＭＩＬ方法３が好ましい拡大培養方法であることを示す。ＰＢＬのデータは、不確定である。
【０２９９】
[00293]  図３８Ａ〜３８Ｆは、ＭＩＬ及びＰＢＬのＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットを示す。図３８Ａ及び３８Ｄは、３つ全ての方法（ＭＩＬ１．１、ＭＩＬ１．２、ＭＩＬ１．３）を使用して拡大培養されたＭＩＬ（図３８Ａ）及びＰＢＬ方法３を使用して拡大培養されたＰＢＬ（図３８Ｄ）のＴＣＲａｂ＋サブセットを示す。データは、ＴＣＲαβ＋サブセットが全てのＭＩＬ及びＰＢＬでほぼ１００％であることを示し、これは、ほぼ全てのＴ細胞の拡大培養において拡大培養プロセスが成功したことを示す。図３８Ｂ及び３８Ｅは、ＭＩＬ方法３によって拡大培養されたＭＩＬについてＣＤ４サブセットが減少することを示す（これは、図３８ＣにおけるＣＤ８サブセットの増加に相関する）。図３８Ｅ及び３８ＦのＰＢＬデータは、ＭＩＬ１．３データと一致しているようである。
【０３００】
[00294]  図３９Ａ〜Ｄ及び４０Ａ〜Ｄは、ＭＩＬ（図３９）及びＰＢＬ（図４０）のＣＤ４サブセットのデータを示す。図３９Ａ及び４０Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図３９Ｂ及び４０Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３９Ｃ及び４０Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３９Ｄ及び４０Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。ＭＩＬ方法３（ＭＩＬ１．３）及びＰＢＬ方法３（ＰＢＬ２及びＰＢＬ３）を使用して拡大培養された全てのサンプルは、コンパレータである黒色腫ＴＩＬのＣＤ４サブセットと一致している。
【０３０１】
[00295]  図４１Ａ〜Ｄ及び４２Ａ〜Ｄは、ＭＩＬ（図４１）及びＰＢＬ（図４２）のＣＤ８サブセットのデータを示す。図４１Ａ及び４２Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図４１Ｂ及び４２Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図４１Ｃ及び４２Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図４１Ｄ及び４２Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。ＭＩＬ方法３（ＭＩＬ１．３）を使用して拡大培養されたサンプルは、コンパレータである黒色腫ＴＩＬのＣＤ４サブセットと一致している。ＰＢＬ２及びＰＢＬ３のデータを対照として使用した。
【０３０２】
[00296]  図４３Ａ及び４３Ｂは、ＭＩＬ（図４３Ａ）及びＰＢＬ（図４３Ｂ）のＣＤ４ＣＤ２７及びＣＤ８ＣＤ２７サブセットのデータを示す。図４４Ａ及び４４Ｂは、ＭＩＬ（図４４Ａ）及びＰＢＬ（図４４Ｂ）のＣＤ４ＣＤ２８及びＣＤ８ＣＤ２８サブセットのデータを示す。ＰＢＬのデータは、黒色腫ＴＩＬと比較して各サンプルの拡大培養プロセスの０日目及び１４日目に示されている。ＭＩＬのデータは、黒色腫ＴＩＬと比較してＭＩＬ１．３のみについて０日目及び１４日目に示されている。ＭＩＬ及びＰＢＬのＣＤ２８サブセットは、黒色腫ＴＩＬに類似している。
【０３０３】
[00297]  図４５Ａ及び４５Ｂは、ＭＩＬ（図４５Ａ）及びＰＢＬ（図４５Ｂ）のＣＤ４及びＣＤ８サブセットのそれぞれの内のＰＤ１＋細胞の比較を表す。図４６Ａ及び４６Ｂは、ＭＩＬ（図４６Ａ）及びＰＢＬ（図４６Ｂ）のＣＤ４及びＣＤ８サブセットのそれぞれの内のＬＡＧ３＋細胞の比較を表す。ＰＤ１＋及びＬＡＧ３＋の両方のデータは、０日目の測定値に対するＭＩＬ１．３サンプルの大幅な減少を示す一方、ＭＩＬ１．１及びＭＩＬ１．２は、０日目に対するＰＤ１及びＬＡＧ３の両方が増加傾向にあるようであった。ＰＢＬデータを対照として使用した。
【０３０４】
[00298]  この実施例の実験は、ＭＩＬ方法３で拡大培養されたＭＩＬがより高い拡大倍数を有し、機能性が高く、より高いＣＤ８サブセットの割合を有し、より少ないＬＡＧ３＋及びＰＤ１＋Ｔ細胞サブセットを有していたことを示す。データは、メモリーサブセットが黒色腫ＴＩＬに類似していることも示した。データは、凍結保存されたサンプルが、新鮮なサンプルと比較してより高い拡大倍数を有するようであることも示した。ＰＢＬサンプルのデータの多くは、小さいサンプルサイズに基づいているようであり、不確定なもののようである。
【０３０５】
実施例３  −  ＴＩＬを拡大培養し、拡大培養したＴＩＬを用いて癌を処置する方法
[00299]  骨髄は、針吸引を使用して入手される。骨髄サンプルをヘパリン含有シリンジに吸引し、室温で一晩保存する。貯蔵後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞（ＭＮＣ）が濃縮されている。勾配内の細胞は、赤血球まで収集され、ＨＢＳＳを使用して洗浄される。ＭＮＣは、２％ＨＳＡ及び５％ＤＭＳＯが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにＭＮＣの一部が確保されている。ＱＣバイアルを解凍して、ＭＮＣ製品のＣＤ３＋及びＣＤ３８＋／１３８＋の細胞含有量を測定する。
【０３０６】
[00300]  骨髄を吸引及びリンパ球分離培地密度勾配で分画し、細胞をほぼ赤血球ペレットのレベルまで収集する。この分画法は、赤血球及び好中球を実質的に除去し、ほぼ完全な骨髄を提供する。結果として生じる分画された材料は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞である。骨髄は、フィコール処理され（Ficolled）、ＴＩＬは、当技術分野において公知の方法及び本明細書に記載の任意の方法を用いて拡大培養される。例えば、ＴＩＬを拡大培養させるための例示的な方法が図１４に示される。ＴＩＬを拡大培養するための及び拡大培養したＴＩＬで癌患者を処置するための例示的な方法を図１５に示す。
【０３０７】
実施例４  −  非ホジキンリンパ腫腫瘍から増殖した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の表現型及び機能的特徴付け
[00301]  この実施例で説明する実験の目標には、治療的有効性を有するＴＩＬをＮＨＬ腫瘍から分離及び培養できるかどうかを決定し、ＮＨＬ由来ＴＩＬの特性を黒色腫由来ＴＩＬと比較することが含まれる。
【０３０８】
[00302]  患者からのＴＩＬの抽出及び拡大培養のための材料及び方法は、本明細書に記載されている通りである。患者のＴＩＬは、病変、この場合にはリンパ組織の外科的切除を介して抑制性腫瘍微小環境から抽出された。本明細書に開示される拡大培養プロセスを使用してＴＩＬを拡大培養し、１０９〜１０１１個のＴＩＬを得た。
【０３０９】
[00303]  ＮＨＬ由来のＴＩＬ（１つのマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、３つの濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、３つのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））を、フローサイトメトリーを使用して黒色腫由来のＴＩＬに対する分化のマーカーについて分析した。抗ＣＤ５６、抗ＴＣＲａｂ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２７及び抗ＣＤ２８抗体についてＴＩＬを分析した。これらの抗体は、分化パネル１（ＤＦ１）として使用された。抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ９、抗ＣＤ３８、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＣＲ７及び抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を分化パネル２（ＤＦ２）として使用した。ＤＦ２を使用して、次のＴ細胞サブセットを特定した。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）；セントラルメモリーＴ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）；エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）；及び最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）。
【０３１０】
[00304]  図１６は、異なる癌タイプでの異なる細胞サブ集団におけるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を示す。黒色腫（黒）、マントル細胞（赤）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（青）及び濾胞性リンパ腫（紫）の癌タイプを試験した。図１６Ａ〜１６Ｄは、黒色腫ＴＩＬと比較してリンパ腫ＴＩＬがより増殖性が高く、従ってより高い抗腫瘍活性を有する傾向を一般的に示す。同様に、図１７Ｂは、ＣＤ４／ＣＤ２８発現リンパ腫Ｔ細胞がＣＤ４／ＣＤ２８発現黒色腫Ｔ細胞よりも高い増殖能力を有することを示す。
【０３１１】
[00305]  ＴＩＬによるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生は、ｍＡＢコーティングされたDynabeads（商標）（ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）でＴＩＬを刺激し、ELIspot（商標）（Immunospot CTL）を使用することによって測定し、Immunospot（商標）S6エントリーアナライザーを使用して、またDuoSet（商標）ＥＬＩＳＡキット（製造者の指示に従うＲ＆Ｄシステムを使用したＥＬＩＳＡによって列挙した。
【０３１２】
[00306]  図１８Ａ及び１８Ｂは、ＮＨＬ  ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬによるＩＦＮγ産生が類似していることを示し、２つのＴＩＬタイプ間で同様の細胞傷害性機能を示す。
【０３１３】
[00307]  ＴＩＬの溶解能力は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）を使用して決定した。ｅＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＰ８１５細胞を標的細胞として使用した。ＴＩＬ及び標的細胞をＯＫＴ３の存在下で４時間／２４時間共培養した。次いで、ルシフェリンを添加し、細胞を５分間インキュベートした。生物発光は、ルミノメーターを使用して測定された。パーセント生存率及びパーセント細胞傷害性は次のように計算された。
％生存率＝（実験的生存率−最小）／（最大シグナル−最小シグナル）×１００
％細胞傷害性＝１００−（％生存率）
【０３１４】
[00308]  ＴＩＬの溶解能力は、エフェクター細胞によって誘導される標的細胞の５０パーセント細胞傷害性を表す溶解単位ＬＵ５０として表された。
【０３１５】
[00309]  自己腫瘍及び同種異系腫瘍の両方に対する腫瘍殺傷能力を測定するためにＴＩＬをアッセイした。ＴＩＬは、異なるエフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）（１０：１、２０：１、５０：１又は１００：１のいずれか）で自己リンパ腫細胞又は同種異系黒色腫細胞株（５２６黒色腫細胞株）と混合された。共培養前にCellTrace Violet色素（ThermoFisher）で腫瘍細胞を標識した。２４時間後、細胞を７−ＡＡＤで染色して細胞死を判定した。ＴＩＬによって殺傷された腫瘍細胞の割合は、リンパ腫細胞ではＣＤ１９に対してCellTrace Violet色素、黒色腫細胞ではＭＣＳＰに対してCellTrace Violetでゲートされた７−ＡＡＤ陽性腫瘍細胞として表された。
【０３１６】
[00310]  図１９は、ＮＨＬ  ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬが４時間（図１９Ａ）及び２４時間（図１９Ｂ）で同種異系腫瘍及び自己腫瘍の両方に対して同様の細胞傷害性機能を有することを示す。
【０３１７】
[00311]  遺伝子発現解析は、nCounter GX Human Immunology V2パネル（NanoString, Seattle）を使用してＴＩＬでも実行された。製造者の指示に従って、１００ｎｇの総ＲＮＡをアッセイした。データは、各サンプルの組み込みコントロール遺伝子プローブの幾何平均でスケーリングすることにより正規化された。データは、黒色腫遺伝子発現に対してマッピングされ、比較された。
【０３１８】
[00312]  図２１は、遺伝子発現解析の結果を示す。ヒートマップは、黒色腫ＴＩＬにわたる遺伝子発現の倍数変化を示す。リンパ腫由来のＴＩＬからのＩＬ１７Ａ及びＲＯＲＣの発現は、黒色腫由来のＴＩＬと比較してより高い発現を示した。
【０３１９】
[00313]  全体として、この実験の結果は、リンパ腫由来のＴＩＬの機能的特徴が黒色腫由来のＴＩＬと類似していることを実証し、リンパ腫由来のＴＩＬの使用がリンパ腫癌の処置に成功するであろうことを示す。
【０３２０】
実施例５  −  慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者の末梢血から増殖した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の表現型及び機能的特徴付け。
[00314]  ＰＢＭＣは、３ラウンドのイブルチニブによる処置前及び処置後のＣＬＬを有する患者から収集された。
【０３２１】
[00315]  図２４及び本明細書の他の箇所で説明するように、３つの異なる方法、ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２及びＰＢＬ方法３を使用してＴ細胞を拡大培養した。特定のサンプルは、新鮮なＰＢＭＣから得られ、特定のサンプルは、凍結保存されたＰＢＭＣから得られた。細胞が拡大培養及び回収されると、上記の実施例４及び本明細書の他の箇所に記載された方法を使用して、フェノタイピングし、機能的に特徴付けた。この実施例の目標は、ＰＢＬの最適な拡大培養プロセスを決定し、イブルチニブ処置サンプルから拡大培養したＰＢＬが未処置サンプルから拡大培養したＰＢＬよりも強力かどうかを決定することであった。
【０３２２】
[00316]  ＰＢＬの拡大倍数を図２６に示す。ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２及びＰＢＬ方法３を使用して拡大培養されたＰＢＬの結果が示される。未処理のＰＢＬ（プレＲｘ  ＰＢＬ）は、平均１７９倍の拡大倍数を示し、イブルチニブ処理ＰＢＬ（ポストＲｘ  ＰＢＬ）は、平均３０６倍の拡大倍数を示した。新鮮なＰＢＭＣに由来するＰＢＬ（ＰＢＬ）は、平均８２倍の拡大倍数のみを示した。ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間ではｐ＝０．００６。ＰＢＬとプレＲｘ  ＰＢＬとの間ではｐ＝０．３及びプレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間ではｐ＝０．１。全体として、ＰＢＬ及びプレＲｘ  ＰＢＬの両方の全てのグループと比較して全てのポストＲｘ  ＰＢＬグループで平均拡大倍数の増加が見られる。
【０３２３】
[00317]  図２７は、ＰＢＬ、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生細胞を示す。ＰＢＬについて、ＩＦＮ−γ産生細胞の平均数は、約１８６４であった。プレＲｘ  ＰＢＬについて、ＩＦＮ−γ産生細胞の平均数は、約７５３０であり、ポストＲｘ  ＰＢＬについて、ＩＦＮ−γ産生細胞の平均数は、約１１９８４であった。ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間ではｐ＝０．００６。ＰＢＬとプレＲｘ  ＰＢＬとの間ではｐ＝０．００６及びプレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間ではｐ＝０．０１。全体として、ＰＢＬ及びプレＲｘ  ＰＢＬの両方の全てのグループと比較して全てのポストＲｘ  ＰＢＬグループでＩＦＮ−γ産生細胞の平均数の有意な増加が見られる。
【０３２４】
[00318]  各サンプルで表現型の特徴付けを実施した。図２８は、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの割合を表し、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用する。ここで、データは、ＣＤ４サブセット（左に示す）が、いずれの方法が細胞の拡大培養に使用されたかに関係なく、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方間で同等であることを示す。プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットは、黒色腫ＴＩＬよりも高いことが示された（それぞれｐ＝０．０００６）。ＣＤ８サブセット（右に示す）は、細胞の拡大培養に使用されるプロセスに関係なく、プレＲＸ  ＰＢＬ及びポストＲＸ  ＰＢＬの両方で低かった。プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットは、黒色腫ＴＩＬよりも低いことが示された（それぞれｐ＝０．０００６）。より低いＣＤ８サブセットは、単に癌のタイプの派生物であると仮定される（即ち、ＣＬＬでは、ＣＤ４サブセットは、典型的には拡大培養される）。
【０３２５】
[00319]  図２９Ａ〜２９Ｄは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。図２９Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図２９Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図２９Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図２９Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。図２９は、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットが、黒色腫ＴＩＬで見られるものと同等であることを示す。
【０３２６】
[00320]  図３０Ａ〜３０Ｄは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。図３０Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図３０Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３０Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３０Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。図３０は、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットが、黒色腫ＴＩＬで見られるものと同等であることを示す。
【０３２７】
[00321]  図３１Ａ及び３１Ｂは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、ＣＤ４細胞（図３１Ａ）及びＣＤ８細胞（図３１Ｂ）のＣＤ２７サブセットの比較を表す。ＣＤ４ＣＤ２７細胞サブセットは、黒色腫ＴＩＬと比較してプレＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．０３）及びポストＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．０２）の両方で有意に高かった。ＣＤ８ＣＤ２７細胞サブセットは、黒色腫ＴＩＬと比較してプレＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．００２）及びポストＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．００１）の両方で有意に高かった。
【０３２８】
[00322]  図３２Ａ及び３２Ｂは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、ＣＤ４細胞（図３０Ａ）及びＣＤ８細胞（図３０Ｂ）のＣＤ２８サブセットの比較を表す。ＣＤ４ＣＤ２８細胞サブセット及びＣＤ８ＣＤ２８細胞サブセットは、黒色腫ＴＩＬと比較してプレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方で同等であることが示された。
【０３２９】
[00323]  図３３Ａ及び３３Ｂは、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋（図３３Ａ）及びＣＤ８＋（図３３Ｂ）集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。データは、ポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋（ｐ＝０．０６）及びＣＤ８＋（ｐ＝０．０１）集団の両方でＬＡＧ３＋サブセットの有意な平均減少を示す。
【０３３０】
[00324]  図３４Ａ及び３４Ｂは、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋（図３４Ａ）及びＣＤ８＋（図３４Ｂ）集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。データは、ポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団の両方でＰＤ１＋サブセットの平均減少を示すが、減少は有意でなかった。
【０３３１】
[00325]  図３５Ａ及び３５Ｂは、生物発光再溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）を使用して測定されたプレＲｘ  ＰＢＬ（図３５Ａ）及びポストＲｘ  ＰＢＬ（図３５Ｂ）の細胞溶解活性の結果を示す。CelllTrace（商標）Violet Cell Proliferation Kit（Invitrogen）を使用して、以下のようにアッセイを実施した。ＰＢＬであるエフェクター細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識された。標的細胞（自己ＣＤ１９＋腫瘍細胞）をミトシインＣとインキュベートし、CellTrace Vioet Cell Proliferation Kitの指示に従ってCellTrace（商標）Violet（ＣＴＶ）で標識した。エフェクター細胞及び標的細胞を２：１、５：１、２０：１の比率で２４時間インキュベートした（Ｅ：Ｔ細胞）。カウントブライト（countbright）ビーズを加え、細胞をアネキシンＶ−ＰＩで染色し、ＣＴＶ＋／アネキシン−Ｖ  ＰＩ＋細胞（死細胞の数を提供する）を分析した。ポストＲｘ  ＰＢＬは、標的腫瘍細胞の５０％を殺傷するのに必要な細胞がより少ないため（即ち、ＬＵ５０は、ポストＲｘ  ＰＢＬの方がプレＲｘ  ＰＢＬよりも低い）、より強力であると思われる。
【０３３２】
[00326]  この実施例で実施された実験は、次の結果を示した：新鮮なＣＬＬ  ＰＢＭＣから拡大培養されたＰＢＬは、凍結保存されたＰＢＭＣ（プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬ）から拡大培養されたＰＢＬと比較してより低い拡大倍数及び有意により低いＩＦＮ−γ産生を示し；ポストＲｘ  ＰＢＬは、プレＲｘ  ＰＢＬと比較して一貫してより高い拡大倍数及びＩＦＮ−γ産生の有意な増加を示し；プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方は、自己（ＣＤ１９＋）腫瘍細胞に対して溶解活性を示したが、ポストＲｘ  ＰＢＬは、プレＲｘ  ＰＢＬよりも低いＬＵ５０を有していた。
【０３３３】
[00327]  上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのように作成及び使用し得るかについて当業者に完全な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図されない。当業者に明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。
【０３３４】
[00328]  全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために、且つあくまでも参考として使用され、決して限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従って適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【０３３５】
[00329]  本明細書に引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物、又は特許、又は特許出願があらゆる目的から全体として参照により組み込まれると具体的且つ個別的に指示されたものと見なすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的から参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３６】
[00330]  当業者に明らかであろう通り、本願の多くの改良形態及び変形形態がその趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は、単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【図１】
2020519600.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
2020519600000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月24日(2020.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【図１】[0033]リンパ腫腫瘍の病理情報を示す。
【図２】[0034]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬのエフェクターメモリー（ＥＭ）サブセットが黒色腫ＴＩＬのＥＭサブセットよりも有意に高いことを示す。
【図３】[0035]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬのＣＤ２８＋ＣＤ４＋サブセットが黒色腫ＴＩＬのこれらのサブセットよりも有意に高いことを示す。
【図４】[0036]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、分化マーカーを示す。グラフの白色の棒は、中央値を表す。ＣＭは、セントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭは、エフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡは、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。
【図５】[0037]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、分化マーカーを示す。グラフの白色の棒は、中央値を表す。ＣＭは、セントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭは、エフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡは、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。
【図６】[0038]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、枯渇マーカーを示す。グラフの白色の棒は、中央値を表す。ＬＡＧ３は、リンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１は、プログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。
【図７】[0039]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、枯渇マーカーを示す。グラフの白色の棒は、中央値を表す。ＬＡＧ３は、リンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１は、プログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。
【図８】[0040]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。ＮＫは、ナチュラルキラー細胞を指し、ＴＣＲａｂは、アルファ及びベータ鎖を有するＴ細胞受容体を発現する細胞を指す。
【図９】[0041]生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。
【図１０】[0042]リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。
【図１１】[0043]リンパ腫ＴＩＬの酵素結合免疫スポット（ELIspot）アッセイの結果を示す。
【図１２】[0044]黒色腫ＴＩＬのELIspotアッセイの結果を示す。
【図１３】[0045]NANOSTRING NCOUNTER分析の結果を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較してより高いレベルのＲＯＲＣ  ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示す。各遺伝子は、ヒートマップの白枠で強調表示される。
【図１４】[0046]ＴＩＬ拡大培養及び処置プロセスを図示する。ステップ１は、１０個のG-Rex 10フラスコへの４つの腫瘍断片の添加を指す。ステップ２では、およそ４０×１０６ＴＩＬ以上が入手される。ステップ３では、ＲＥＰのために３６個のG-Rex 100フラスコへの分割が生じる。ステップ４では、ＴＩＬを遠心分離によって回収する。新鮮ＴＩＬ生成物は、およそ４３日の合計プロセス時間後にステップ５で入手され、その時点でＴＩＬが患者に注入され得る。
【図１５】[0047]本開示のリンパ腫から入手したＴＩＬを伴う使用のための処置プロトコルを示す。手術（及び腫瘍切除）は、開始時に行われ、リンパ球枯渇化学療法は、本明細書の他の箇所に記載されているように、化学療法を伴う骨髄非破壊的リンパ球枯渇を指す。
【図１６Ａ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。ナイーブＴ細胞サブセットのＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｂ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。セントラルメモリーＴ細胞サブセット（ＣＭ）のＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｃ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（ＥＭ）のＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｄ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットのＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１７Ａ】[0049]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ１を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ１を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ９Ｔ細胞の異なるＣＤ２７＋サブ集団を表し、これは、リンパ腫ＴＩＬにおける共刺激分子ＣＤ２８発現ＣＤ４  Ｔ細胞の割合が高いことを示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。
【図１７Ｂ】[0049]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ１を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ１を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ９Ｔ細胞の異なるＣＤ２８＋サブ集団を表し、これは、リンパ腫ＴＩＬにおける共刺激分子ＣＤ２８発現ＣＤ４  Ｔ細胞の割合が高いことを示す。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。
【図１８Ａ】[0050]以下の実施例４に従って実施されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す。ELIspotを使用した結果を示す。ELIspotデータは、１０６個のＴＩＬあたりのＩＦＮ−γ産生細胞として表される。
【図１８Ｂ】[0050]以下の実施例４に従って実施されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す。ＥＬＩＳＡを使用した結果を示す。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ（対数目盛により測定される５×１０５ＴＩＬ／ウェルのＴＩＬ培養物の上清におけるＩＦＮ−γレベルとして表される。Ｐ値は、両側マン−ホイットニー検定（不対）を使用して計算された。
【図１９Ａ】[0051]ＴＩＬの溶解能力を示す。共培養（ＴＩＬエフェクター細胞とＧＦＰ＋Ｐ８１５標的細胞）における４時間で１０６ＴＩＬに正規化された標的細胞のＬＵ５０を示す。
【図１９Ｂ】[0051]ＴＩＬの溶解能力を示す。共培養（ＴＩＬエフェクター細胞とＧＦＰ＋Ｐ８１５標的細胞）における２４時間で１０６ＴＩＬに正規化された標的細胞のＬＵ５０を示す。
【図２０Ａ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。同種異系の５２６の標的細胞に対する黒色腫ＴＩＬの細胞溶解活性を示す。図２０Ａのデータは、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が５０：１である共培養における死細胞パーセントとして示されている。
【図２０Ｂ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。７−ＡＡＤ取り込みにより決定された自己腫瘍細胞に対するリンパ腫ＴＩＬの細胞溶解活性を示す。図２０Ｂのデータは、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が５０：１である共培養における死細胞パーセントとして示されている。
【図２０Ｃ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。黒色腫ＴＩＬによって誘発された標的細胞の殺傷パーセントを表す。
【図２０Ｄ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。異なるＥ：Ｔ比でのリンパ腫ＴＩＬによって誘発された標的細胞の殺傷パーセントを表す。
【図２１】[0053]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの遺伝子発現プロファイルを示すヒートマップである。発現プロファイルは、NanoStringの５７９プレックスnCounter GX Human Immunology V2 CSOパネルによって決定された。ヒートマップは、黒色腫ＴＩＬと比較したリンパ腫ＴＩＬの特定の遺伝子セットの発現における倍数変化を示し、リンパ腫由来ＴＩＬからのＩＬ−１７Ａ及びＲＯＲＣのより高い発現を示唆している。この図に示される癌は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びマントル細胞リンパ腫を含む。
【図２２】[0054]ＴＩＬの調製、回収及び出荷スケジュールの２Ａプロセスを示す概略図である。
【図２３】[0055]ＴＩＬを調製するための２Ａプロセスを示すフローチャートである。
【図２４Ａ−Ｂ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を実証するフローチャートである。
【図２４Ｃ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を実証するフローチャートである。
【図２５Ａ−Ｂ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２５Ｃ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２６】[0058]新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び凍結保存されたＰＢＭＣから分離されたＰＢＬの拡大倍数のグラフを表す。凍結保存されたＰＢＭＣは、イブルチニブレジメンで処置されていない（プレＲｘ  ＰＢＬ）又は処置された（ポストＲｘ  ＰＢＬ）、ＣＬＬを有する患者に由来する。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２７】[0059]新鮮なＰＢＭＣ及び凍結保存されたＰＢＭＣから分離されたＰＢＬのＩＦＮ−γ産生細胞のグラフを表す。凍結保存されたＰＢＭＣ内でプレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬも表される。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２８】[0060]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの割合を表す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ａ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ｂ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ｃ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２９Ｄ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ａ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ｂ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの及びＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ｃ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３０Ｄ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３１Ａ】[0062]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットのＣＤ２７サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３１Ｂ】[0062]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットのＣＤ２７サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３２Ａ】[0063]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットのＣＤ２８サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３２Ｂ】[0063]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットのＣＤ２８サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３３Ａ】[0064]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ４集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３３Ｂ】[0064]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ８集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３４Ａ】[0065]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ４集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３４Ｂ】[0065]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ８集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。各点は、１人の患者である。灰色点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；白点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図３５Ａ】[0066]自己腫瘍殺傷アッセイを使用して測定されたプレＲｘ  ＰＢＬの細胞溶解活性の結果を示す。細胞傷害性は、ＬＵ５０（標的細胞の５０％を殺傷するのに必要なＰＢＬの数）として測定される。
【図３５Ｂ】[0066]自己腫瘍殺傷アッセイを使用して測定されたポストＲｘ  ＰＢＬの細胞溶解活性の結果を示す。細胞傷害性は、ＬＵ５０（標的細胞の５０％を殺傷するのに必要なＰＢＬの数）として測定される。
【図３６Ａ】[0067]ＡＭＬ患者の骨髄（ＭＩＬ）又は末梢血（ＰＢＬ）のいずれかから分離されたＭＩＬの拡大倍数のグラフを表す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。全てのＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１．３の開始細胞数は、１３８，０００個の細胞であり、ＭＩＬ２の開始細胞数は、６２，０００個、ＭＩＬ３の開始細胞数は、２８，０００個の細胞であった。ＰＢＬ２の開始細胞数は、３３８，０００であり、ＰＢＬ３の開始細胞数は、３３６，０００であった。
【図３６Ｂ】[0067]ＡＭＬ患者の骨髄（ＭＩＬ）又は末梢血（ＰＢＬ）のいずれかから分離されたＰＢＬの拡大倍数のグラフを表す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。全てのＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１．３の開始細胞数は、１３８，０００個の細胞であり、ＭＩＬ２の開始細胞数は、６２，０００個、ＭＩＬ３の開始細胞数は、２８，０００個の細胞であった。ＰＢＬ２の開始細胞数は、３３８，０００であり、ＰＢＬ３の開始細胞数は、３３６，０００であった。
【図３７Ａ】[0068]ＭＩＬのＩＦＮ−γ産生細胞を示す。
【図３７Ｂ】[0068]ＰＢＬのＩＦＮ−γ産生細胞を示す。
【図３８Ａ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＴＣＲαβ＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｂ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ４＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｃ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ８サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｄ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＴＣＲαβ＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｅ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ４＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｆ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞サブセットを示すグラフを表す。ＣＤ８サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３９Ａ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図３９Ｂ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３９Ｃ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３９Ｄ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４０Ａ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４０Ｂ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４０Ｃ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４０Ｄ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４１Ａ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４１Ｂ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４１Ｃ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４１Ｄ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４２Ａ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４２Ｂ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４２Ｃ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４２Ｄ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４３Ａ】[0074]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２７サブセットを示すグラフを表す。
【図４３Ｂ】[0074]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２７サブセットを示すグラフを表す。
【図４４Ａ】[0075]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２８サブセットを示すグラフを表す。
【図４４Ｂ】[0075]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２８サブセットを示すグラフを表す。
【図４５Ａ】[0076]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＰＤ１＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４５Ｂ】[0076]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＰＤ１＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４６Ａ】[0077]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＬＡＧ３＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４６Ｂ】[0077]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＬＡＧ３＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４７】[0078]ＰＢＬ方法１及びＰＢＬ方法３の例示的な実施形態を示すタイムラインである。この図において、ＩＬ−２の添加は、プロセス中の任意の時点において、例示的な実施形態では括弧で囲まれた領域上で発生し得る。
【図４８】[0079]ＭＩＬ方法３の例示的な実施形態を示すタイムラインである。この図において、ＩＬ−２の添加は、プロセス中の任意の時点において、例示的な実施形態では括弧で囲まれた領域上で発生し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１０】
[00304]  図１６は、異なる癌タイプでの異なる細胞サブ集団におけるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を示す。黒色腫、マントル細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫の癌タイプを試験した。図１６Ａ〜１６Ｄは、黒色腫ＴＩＬと比較してリンパ腫ＴＩＬがより増殖性が高く、従ってより高い抗腫瘍活性を有する傾向を一般的に示す。同様に、図１７Ｂは、ＣＤ４／ＣＤ２８発現リンパ腫Ｔ細胞がＣＤ４／ＣＤ２８発現黒色腫Ｔ細胞よりも高い増殖能力を有することを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2020519600.tif 000108
【図２】
2020519600.tif 000109
【図３】
2020519600.tif 000110
【図４】
2020519600.tif 000111
【図５】
2020519600.tif 000112
【図６】
2020519600.tif 000113
【図７】
2020519600.tif 000114
【図８】
2020519600.tif 000115
【図９】
2020519600.tif 000116
【図１０】
2020519600.tif 000117
【図１１】
2020519600.tif 000118
【図１２】
2020519600.tif 000119
【図１３】
2020519600.tif 000120
【図１４】
2020519600.tif 000121
【図１５】
2020519600.tif 000122
【図１６Ａ】
2020519600.tif 000123
【図１６Ｂ】
2020519600.tif 000124
【図１６Ｃ】
2020519600.tif 000125
【図１６Ｄ】
2020519600.tif 000126
【図１７Ａ】
2020519600.tif 000127
【図１７Ｂ】
2020519600.tif 000128
【図１８Ａ】
2020519600.tif 000129
【図１８Ｂ】
2020519600.tif 000130
【図１９Ａ】
2020519600.tif 000131
【図１９Ｂ】
2020519600.tif 000132
【図２０Ａ】
2020519600.tif 000133
【図２０Ｂ】
2020519600.tif 000134
【図２０Ｃ】
2020519600.tif 000135
【図２０Ｄ】
2020519600.tif 000136
【図２１】
2020519600.tif 000137
【図２２】
2020519600.tif 000138
【図２３】
2020519600.tif 000139
【図２４Ａ】
2020519600.tif 000140
【図２４Ｂ】
2020519600.tif 000141
【図２４Ｃ】
2020519600.tif 000142
【図２５Ａ】
2020519600.tif 000143
【図２５Ｂ】
2020519600.tif 000144
【図２５Ｃ】
2020519600.tif 000145
【図２６】
2020519600.tif 000146
【図２７】
2020519600.tif 000147
【図２８】
2020519600.tif 000148
【図２９Ａ】
2020519600.tif 000149
【図２９Ｂ】
2020519600.tif 000150
【図２９Ｃ】
2020519600.tif 000151
【図２９Ｄ】
2020519600.tif 000152
【図３０Ａ】
2020519600.tif 000153
【図３０Ｂ】
2020519600.tif 000154
【図３０Ｃ】
2020519600.tif 000155
【図３０Ｄ】
2020519600.tif 000156
【図３１Ａ】
2020519600.tif 000157
【図３１Ｂ】
2020519600.tif 000158
【図３２Ａ】
2020519600.tif 000159
【図３２Ｂ】
2020519600.tif 000160
【図３３Ａ】
2020519600.tif 000161
【図３３Ｂ】
2020519600.tif 000162
【図３４Ａ】
2020519600.tif 000163
【図３４Ｂ】
2020519600.tif 000164
【図３５Ａ】
2020519600.tif 000165
【図３５Ｂ】
2020519600.tif 000166
【図３６Ａ】
2020519600.tif 000167
【図３６Ｂ】
2020519600.tif 000168
【図３７Ａ】
2020519600.tif 000169
【図３７Ｂ】
2020519600.tif 000170
【図３８Ａ】
2020519600.tif 000171
【図３８Ｂ】
2020519600.tif 000172
【図３８Ｃ】
2020519600.tif 000173
【図３８Ｄ】
2020519600.tif 000174
【図３８Ｅ】
2020519600.tif 000175
【図３８Ｆ】
2020519600.tif 000176
【図３９Ａ】
2020519600.tif 000177
【図３９Ｂ】
2020519600.tif 000178
【図３９Ｃ】
2020519600.tif 000179
【図３９Ｄ】
2020519600.tif 000180
【図４０Ａ】
2020519600.tif 000181
【図４０Ｂ】
2020519600.tif 000182
【図４０Ｃ】
2020519600.tif 000183
【図４０Ｄ】
2020519600.tif 000184
【図４１Ａ】
2020519600.tif 000185
【図４１Ｂ】
2020519600.tif 000186
【図４１Ｃ】
2020519600.tif 000187
【図４１Ｄ】
2020519600.tif 000188
【図４２Ａ】
2020519600.tif 000189
【図４２Ｂ】
2020519600.tif 000190
【図４２Ｃ】
2020519600.tif 000191
【図４２Ｄ】
2020519600.tif 000192
【図４３Ａ】
2020519600.tif 000193
【図４３Ｂ】
2020519600.tif 000194
【図４４Ａ】
2020519600.tif 000195
【図４４Ｂ】
2020519600.tif 000196
【図４５Ａ】
2020519600.tif 000197
【図４５Ｂ】
2020519600.tif 000198
【図４６Ａ】
2020519600.tif 000199
【図４６Ｂ】
2020519600.tif 000200
【図４７】
2020519600.tif 000201
【図４８】
2020519600.tif 000202
【国際調査報告】
2020519600.tif 000203
2020519600.tif 000204
2020519600.tif 000205