(57)【要約】組織状態を検出するための方法およびシステムが本明細書で提供される。いくつかの局面において、疾患または状態の１種またはこれより多くのマーカーおよび１種またはこれより多くの組織特異的な無細胞のポリヌクレオチドのレベルが定量され、レベルが参照と比較され、上記組織が、上記比較に基づいて上記疾患または状態によって損傷を受けているか否かが決定される。本明細書で記載される方法を実施するためのシステムがまた、提供される。
2020534036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）被験体から血液サンプルを得る工程；
ｂ）細胞枯渇サンプルを得るために、該血液サンプルから細胞を除去する工程；
ｃ）微粒子枯渇サンプルを得るために、該血液サンプルから細胞外微粒子を除去する工程；
ｄ）該微粒子枯渇サンプル中の遺伝子に相当する無細胞のＲＮＡの量を定量する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記細胞外微粒子を除去する工程は、前記細胞枯渇サンプルと、該細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合部分とを接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合部分は、抗体または抗原結合抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合抗体断片は、血球によって発現されることが公知の細胞表面マーカーと相互作用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は、抗ＣＤ４５抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体は、抗ＣＤ６６ｂ抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞枯渇サンプルと、第１の細胞上の第１のタンパク質と相互作用する第１の抗体および第２の細胞上の第２のタンパク質と相互作用する第２の抗体とを接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のタンパク質は、前記第２の細胞上で発現されず、前記第２のタンパク質は、前記第１の細胞上で発現されない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外微粒子は、エクソソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記エクソソームは、血球に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血球は血小板であり、前記細胞外微粒子を除去する工程は、前記細胞枯渇サンプルと、抗ＧｙｐＡ抗体またはそのＧｙｐＡ抗原結合断片とを接触させることを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血球は赤血球であり、前記細胞外微粒子を除去する工程は、前記細胞枯渇サンプルと、抗ＣＤ２３５ａ抗体またはその抗ＣＤ２３５ａ抗原結合断片とを接触させることをさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記血球は顆粒球であり、前記細胞外微粒子を除去する工程は、前記細胞枯渇サンプルと、抗ＣＤ６６ｂ抗体またはそのＣＤ６６ｂ抗原結合断片とを接触させる工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記血球はリンパ球であり、前記細胞外微粒子を除去する工程は、前記細胞枯渇サンプルと、ＣＤ４５、ＣＤ１９またはＣＤ３に結合する抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞枯渇サンプルは、６０℃において１時間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞枯渇サンプルが、カオトロピック塩、界面活性剤、プロテイナーゼＫ、２−メルカプトエタノール、またはこれらの組み合わせの存在下でインキュベートされることを包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、Ｔｒｉｓとともにインキュベートされることを包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
脂質構造およびタンパク質構造を乱すことを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞枯渇サンプルとシリカカラムとを接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記シリカカラムへのＲＮＡの結合を増強するために、前記細胞枯渇サンプルを、カオトロピック塩および１００％  イソプロパノールとともにインキュベートすることを包含する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条に従って２０１７年９月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５６０，９３６号（本明細書に完全に示されるかのように参考として援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
種々のマーカーが、種々の状態を検出するために利用可能である。しかし、これらの状態のうちの多くは、異なる組織に影響を及ぼし得るものである。循環において（例えば、血液サンプルにおいて）これらの状態のマーカーを検出しても、どの組織が影響を及ぼされているかを識別するにあたって常に有益であるわけではない。例えば、炎症に関する遺伝子マーカーは、身体のどこかでの炎症応答を示し得るが、肝臓、腎臓、肺または関節のようなどの組織がその応答を被っているかは、わらない可能性がある。組織特異的検査（例えば、生検）は、しばしば侵襲性であり、感染リスクがあり、代表的には、器官または組織全体を網羅するわけではない。画像化技術（例えば、ＭＲＩおよびＣＴスキャン）は、組織の健康状態を評価するために使用され得るが、概して、明白な特徴および変化を検出し得るに過ぎない。従って、これらの画像化技術は概して、状態の早期開始または状態のかなり新しい発生をとらえるために十分感度が高いわけではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
いくつかの局面において、被験体から血液サンプルを得る工程；細胞枯渇サンプルを得るために、上記血液サンプルから細胞を除去する工程；微粒子枯渇サンプルを得るために、上記血液サンプルから細胞外微粒子を除去する工程；上記微粒子枯渇サンプル中の遺伝子に相当する無細胞のＲＮＡの量を定量する工程を包含する方法が、本明細書で開示される。場合によっては、上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、上記細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合部分とを接触させることを包含する。場合によっては、上記結合部分は、抗体または抗原結合抗体断片である。場合によっては、上記抗体または抗原結合抗体断片は、血球によって発現されることが公知の細胞表面マーカーと相互作用する。場合によっては、上記抗体は、抗ＣＤ４５抗体を含む。場合によっては、上記抗体は、抗ＣＤ６６ｂ抗体を含む。場合によっては、方法は、上記細胞枯渇サンプルと、第１の細胞上の第１のタンパク質と相互作用する第１の抗体および第２の細胞上の第２のタンパク質と相互作用する第２の抗体とを接触させることを包含する。場合によっては、上記第１のタンパク質は、上記第２の細胞上で発現されず、上記第２のタンパク質は、上記第１の細胞上で発現されない、場合によっては、上記細胞外微粒子は、エクソソームである。場合によっては、上記エクソソームは、血球に由来する。場合によっては、上記血球は血小板であり、上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、抗ＧｙｐＡ抗体またはそのＧｙｐＡ抗原結合断片とを接触させることを包含する。場合によっては、上記血球は赤血球であり、上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、ＣＤ２３５ａ抗体またはその抗ＣＤ２３５ａ抗原結合断片とを接触させることを包含する。場合によっては、上記血球は顆粒球であり、上記細胞外微粒子を除去する工程は、細胞枯渇サンプルと、抗ＣＤ６６ｂ抗体またはそのＣＤ６６ｂ抗原結合断片とを接触させることを包含する。場合によっては、上記血球はリンパ球であり、上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、ＣＤ４５、ＣＤ１９またはＣＤ３に結合する抗体またはその抗原結合断片とを接触させることを包含する。場合によっては、上記細胞枯渇サンプルは、６０℃において１時間インキュベートされる。場合によっては、方法は、上記細胞枯渇サンプルが、カオトロピック塩、界面活性剤、プロテイナーゼＫ、２−メルカプトエタノール、またはこれらの組み合わせの存在下でインキュベートされることを包含する。場合によっては、方法は、上記サンプルが、Ｔｒｉｓとともにインキュベートされることを包含する。場合によっては、方法は、脂質構造およびタンパク質構造を乱すことを包含する。場合によっては、方法は、上記細胞枯渇サンプルとシリカカラムとを接触させることを包含する。場合によっては、方法は、上記シリカカラムへとＲＮＡの結合を増強するために、上記細胞枯渇サンプルが、カオトロピック塩および１００％  イソプロパノールとともにインキュベートされることを包含する。
【０００４】
援用の表示
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、および特許出願が、参考として援用されることを示される具体的にかつ個々に示されるのと同程度に、本明細書に参考として援用される。
【０００５】
本発明の新規な特徴は、特に添付の請求項に示される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例証的な実施形態において示される以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、最小量の血球夾雑を有し、無細胞のＲＮＡ研究に最適である新鮮に濾過されたサンプルを示す。
【０００７】
【図２】図２は、非血球転写物（肝臓ＲＮＡ）のシグナルが、血液サンプルの濾過後に２倍高くなっていることを示す。
【０００８】
【図３】図３は、本明細書で開示される方法を使用して増大した無細胞のＲＮＡ収量を示す。
【０００９】
【図４Ａ】図４Ａは、疾患感度（ＮＡＦＬＤ＝非アルコール性脂肪肝疾患，  ＮＡＳＨ＝非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ｓｔｅａｔｏｔｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ））での多形核（ＰＭＮ）白血球転写物追跡を示す。
【００１０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＭＮによって占められるトランスクリプトームの程度を示す。
【００１１】
【図５】図５は、肝組織ＲＮＡの滴定から計算されたｑＰＣＲプライイマー効率を示す。
【００１２】
【図６】図６は、本明細書で記載される方法に従って処理されたサンプルでの非血球転写物のｑＰＣＲ定量の優れた再現性を示す。
【００１３】
【図７】図７は、再現性が投入量の関数として改善していることを示す。
【００１４】
【図８】図８は、６５名の患者のＮＡＦＬＤコホートを使用する、シーケンシングとｑＰＣＲパネルとの間の相関を示す。各点は、各患者のシーケンシング（ｌｏｇ２  ＴＰＭ）およびｑＰＣＲ（ネガティブＣｔ）検出によってプロットした９６遺伝子のｑＰＣＲパネルにおける遺伝子のうちの１つを表す。各サンプルに関して、抽出したＲＮＡのうちの半分をｑＰＣＲに使用し、他方の半分をシーケンシングにおいて使用した。
【００１５】
【図９】図９は、より多くの全ＲＮＡを有するサンプルでの、ｑＰＣＲとシーケンシングとの間の改善された相関を示す。
【００１６】
【図１０】図１０Ａは、９６遺伝子パネルからのｑＰＣＲデータを使用する、初期分類子、ＮＡＳＨ  対  コントロールを示す。図１０Ｂは、９６遺伝子パネルからのｑＰＣＲデータを使用する、初期分類子、ＮＡＦＬＤ  対  ＮＡＳＨを示す。
【００１７】
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｄは、ＣＤ４５結合部分が多数のタイプの血球およびそれらの細胞外微粒子を捕捉し得ることを示す。
【図１１−２】図１１Ａ〜Ｄは、ＣＤ４５結合部分が多数のタイプの血球およびそれらの細胞外微粒子を捕捉し得ることを示す。
【００１８】
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、シーケンシングアッセイ感度改善を示す。図１２Ａは、改善前の感度を示し、図１２Ｂは、改善後の感度を示す。
【００１９】
【図１３】図１３Ａは、診断での肝臓特異的遺伝子シーケンシング追跡の数を示し、図１３Ｂは、線維症スコアでの肝臓特異的遺伝子検出追跡を示す。
【００２０】
【図１４】図１４Ａは、診断でのアルブミン転写物シーケンシング追跡を示し、図１４Ｂは、線維症スコアでのアルブミン転写物検出追跡を示す。
【００２１】
【図１５】図１５は、全遺伝子からのシーケンシングデータを使用する、初期分類子：ＮＡＳＨ  対  コントロールを示す。
【００２２】
【図１６】図１６は、本明細書で開示される方法、システムおよびキットが、目的の約２５０遺伝子の検出を可能にすることを示す。
【００２３】
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、シーケンシングアッセイの改善が、ＮＡＳＨ  対  Ｃｏｎｔｒｏｌのより良好な分類子を生じることを示し、図１７Ａは改善前を、図１７Ｂは改善後を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
非血球に由来する血液中のＲＮＡを分析することを目的とする者は、多くの整列されないＲＮＡおよび有益なｍＲＮＡがほとんどないことに遭遇する。これは、血液からの抽出効率および量を改善することによって改善され得る。これは、富化によって、すなわち、シーケンシングする前に市販の捕捉ベースのキットを使用することによって、さらに改善され得る。このプロセスの最後に、有益なＲＮＡ（例えば、肝臓からの有用な組織特異的ｍＲＮＡ）は、代表的には、約０．３％未満である。これは問題である。なぜならシーケンシングのうちの９９．７％超が有益でない読み取りに浪費されているからである。このようになる理由は、血球によってコードされるｍＲＮＡが、血液中の無細胞のＲＮＡの大部分を構成することである。代表的な不十分に処理された血液サンプル（例えば、細胞を除くために低速遠心分離を使用）において、その得られる血漿のうちの８５％超が、血小板転写物である。これは、低減され得るが、高速遠心分離（例えば、１６，０００×ｇ）によってまたは濾過して大きな血小板および他の細胞断片を除去することによっては、排除されない。次に最も一般的な夾雑物は、顆粒球転写物であり、次に、単核細胞およびＲＢＣの転写物である。不運なことに、これら夾雑物は、単純に遠心分離によって除去することはできず、それら細胞によって生成されるエクソソームによっておそらく与えられる。高速遠心分離によってこれらを除去しようとする試みは、大部分のエクソソームをおそらく除去し、器官特異的シグナルを大いに低下させる。
【００２５】
代替手段は、目的でない細胞によって与えられるエクソソームを選択的に免疫枯渇させることである。これは、起源細胞に対して特異的である抗体を使用することによって達成され得る。しかし、そのエクソソームは、免疫枯渇を可能にするためにこれらの抗原の十分に高いレベルを発現しなければならない。例えば、リンパ球に由来するエクソソーム上のＣＤ４５のレベルは、十分に高いが、顆粒球上のレベルは、血漿シーケンシングによって決定される場合に、明らかに十分に高くない。目的は、免疫枯渇を可能にする適切な抗体を識別することである。ＣＤ４１（血小板）、ＣＤ６６ｂ（顆粒球）、ＣＤ２３５（ＲＢＣ）、ＣＤ４５（リンパ球）抗体の組み合わせは、これらの夾雑するエクソソームを除去するために使用され得る。これによって、血漿の遙かに大きなサンプルが処理されることが可能になり、組織特異的ＲＮＡを抽出することが遙かにより効率的になるはずである。
【００２６】
どの組織またはどの細胞タイプを本発明者らが研究したいのか（例えば、肝細胞のみ）を本発明者らが正確に知る代替手段は、枯渇よりむしろ直接免疫富化を行うことである。この場合、本発明者らは、組織特異的Ａｂ（例えば、肝細胞についてはＡＳＧＲ１）を使用して、肝臓特異的であるエクソソームを免疫富化することである。
【００２７】
本明細書で記載される方法、システムおよびキットは、おそらく障害およびおそらく拘束下にある組織（ｔｉｓｓｕｅ  ｕｎｄｅｒ  ｄｕｒｅｓｓ）の両方を同時に決定するために、マーカータイプの組み合わせを使用する、障害の迅速な、非侵襲性の検出に関する。本明細書中の開示の実施を通じて、組織または影響が及ぼされていると疑われる組織のいかなる侵襲性の調査を要することなく、疾患が何であるか、および１またはこれより多くの組織に対するその影響の程度に関する確信のある予測が行われ得る。
【００２８】
専らではないがしばしば、マーカーのうちの１種は、起源組織に容易に相関され得る循環しているＲＮＡであり、その結果、その器官に由来するＲＮＡの相対的寄与の増大が、その器官における拘束またはその起源に対して特異的であることを示す。単一のマーカーおよび器官に由来する凝集ＲＮＡは、ともに、組織状態のインジケーターとして種々の実施形態において企図される。代わりにまたは組み合わせにおいて、循環しているＤＮＡ（例えば、組織特異的様式で差次的にメチル化されるＤＮＡ）は、組織特異的マーカーのうちの一部または全てとして含まれる。
【００２９】
同時に、障害のタイプを示すマーカーがまた、測定される。障害のタイプを示すと企図されるマーカーの範囲は広い（タンパク質、ステロイド、脂質、コレステロール、または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられる）。疾患または障害に関係するタンパク質をコードする特定の転写物のようなＲＮＡは、疾患状態を示すメチル化パターンを有するＤＮＡのように、特に有用である。常にではないがしばしば、その疾患マーカーはまた、例えば、採血から容易に得られる、循環しているマーカーである。しかし、Ｘ線、ＭＲＩまたは他のデータのような代替手段が、いくつかの疾患についてのマーカーとして企図される。
【００３０】
これらのマーカーのレベルまたはこれらのマーカーが何であるかと、参照値またはデータセットとを比較することによって、患者または患者のサンプルを、特定の組織または器官として位置づけられる、その患者における特定の疾患を示すものとして分類し得る。その参照値またはデータセットは、その疾患および組織に応じて変動し、１もしくはこれより多くの健康な個体、障害もしくは組織拘束の種々の程度を被っている１またはこれより多くの個体からのデータ、中間の個体からのデータ、およびモデルから予測されるデータを種々に含む。サンプルは、その値が個々にもしくはまとめて閾値を上回るかもしくは下回る場合に、またはその値がその障害もしくは状態と相関する参照データセットから有意に異ならない場合に、またはその値がその疾患もしくは障害の非存在と相関する参照データセットから有意に異なる場合に、障害または状態を示すものとして分類され得る。
【００３１】
例えば、本明細書で記載される方法、システムおよびキットは、多数の器官において、日常的にリスクのある集団において、ある状態または多数の状態の発生または進行をスクリーニングするために使用され得る。これは、１またはこれより多くの組織が、傷害、損傷または機能不全のリスクにある慢性的な状態（例えば、メタボリックシンドローム、肥満症、糖尿病、神経変性障害およびがん）を有する被験体において特に有用であり得る。
【００３２】
メタボリックシンドロームおよび肥満症は、全世界の集団の大きくかつ増え続けるパーセンテージに影響を及ぼしている。この集団は、生命を脅かす合併症（例えば、心臓発作、脳卒中、肝硬変、膵臓の消耗、および腎不全）を発生させる一定のかつ比較的ハイリスクにある。従って、この集団は、一連の器官および組織において合併症を発生させる一定のリスクにある。同様に、多くのがんは、変異し、異なる組織および器官に転移する一定のリスクにある。さらに、がんの処置はしばしば、成功するか半信半疑で投与され、これらの処置が有効であるか否かまたは毒性であるか否かを迅速に決定することは望ましい。これらの例示的な場合に、旧来の方法（例えば、画像化技術および生検）を使用して慣用的に被験体を評価することは実際的ではない。しかし、本明細書で記載されるもののような方法、システムおよびキットは、被験体の１またはこれより多くの器官において損傷、増大したリスクおよび治療効果を迅速に検出することを提供し、それによって、急性の合併症、疾患の進行、および治療効果に関して、慢性的状態を有する被験体をモニターする手段を提供する。
【００３３】
以下の方法、キット、およびシステムは、拘束下にあるか、損傷を受けているか、または状態もしくは疾患によって影響を及ぼされている被験体における組織または器官を迅速にかつ非侵襲的に検出することが意図される。場合によっては、以下の方法、キット、およびシステムはまた、どの疾患もしくは状態が、拘束下にある組織に影響を及ぼしているか、またはその疾患もしくは状態がその組織にどの程度影響を及ぼしているかを決定する。サンプル（例えば、血漿、唾液、または尿）は、その被験体から集められ、その被験体において疾患および疾患位置を示し得るマーカーおよび無細胞のポリヌクレオチドに関して分析される。これらの方法、キットおよびシステムは概して、その拘束下にある組織もしくは器官から生物学的流体（例えば、血漿または尿サンプル中の無細胞のＲＮＡ）へと放出または分泌される、循環している無細胞の核酸に依拠する。ある種の組織において特異的に発現されるかまたは優勢に発現される遺伝子に焦点を当てることによって、その組織から全ての循環しているＲＮＡへの相対的なＲＮＡの寄与に基づいて、推論または結論がその組織の健康状態について引き出され得る。相対的寄与を定量することによって、有利なことには、侵襲性の生検またはマクロスケールに制限される画像化技術なしに、状態によって影響を及ぼされる組織が位置決めされ得る。組織特異的核酸は、治療を選択する、治療の効果をモニターする、および疾患または状態の進行をモニターするために、種々の状態に関するマーカーと組み合わせて使用される。
【００３４】
疾患および拘束下にある組織を識別することは、試験被験体のサンプル中の組織特異的ポリヌクレオチドおよびマーカーのレベルを、コントロール被験体の少なくとも１つのサンプルのものと比較することを要し得る。その組織特異的ポリヌクレオチドおよびマーカーは、本明細書中でパネルといわれ得る。場合によっては、試験被験体から得られるサンプル中のマーカーおよび組織特異的ポリヌクレオチドのレベルは、コントロール被験体のものと比較される。場合によっては、試験被験体から得られるサンプル中のマーカーおよび組織特異的ポリヌクレオチドのレベルは、多数のコントロール被験体における相当するレベルの平均と比較される。そのコントロール被験体は、目的の状態を有し得るか、またはそのコントロール被験体は、その状態なしの被験体であり得る。
【００３５】
方法、システムおよびキットは、組織特異的ポリヌクレオチドおよび／またはマーカーのパネルを検出または定量することを提供する。遺伝子発現が、被験体の集団内で、および被験体の集団間で（例えば、異なる人種群の間で）は非常に変動し得、そしてこのような場合に、組織特異的ポリヌクレオチドおよび／またはマーカーのパネルが、特に有用であり得ることは、認識される。例えば、その方法は、そのパネルを、少なくとも１つのコントロールパネルに対して比較する工程を包含し得る。各組織特異的ポリヌクレオチドおよびマーカーの発現レベルが類似ではなくてもよい一方で、そのパネルがコントロールパネルに十分類似であるかまたは十分異なっている場合に、その被験体の状態または組織についての結論または推論がなお、なされ得る。このようにして、パネルは、疾患の単一のマーカーまたは単一の組織特異的ポリヌクレオチドを使用することを超える利点を提供し得る。場合によっては、その方法は、第１の時点でのその被験体のパネルと、第２の時点でのその被験体のパネルとを比較する工程を包含する。従って、単一の被験体の天然の遺伝的バリエーションおよび遺伝子発現の変動は、制御され、パネル間の差異は、影響を及ぼされる状態または組織における変化に起因する可能性がより高い。場合によっては、そのパネルは、非ポリヌクレオチド分子を含み得る。そのパネルは、ポリヌクレオチドおよび他の生物学的分子（例えば、ペプチド、脂質、病原体断片など）を含み得る。
【００３６】
本明細書で記載される方法、キット、およびシステムは、その被験体がその疾患もしくは状態を発生させる確率もしくはリスク、その疾患もしくは状態の進行もしくは重篤度、またはその疾患もしくは状態に対する治療もしくは処置の効果を決定するために使用され得る。本明細書で開示されるキット、システムおよび方法は、状態のリスク、状態の進行した状態、または処置による状態の改善の間を区別するために、マーカーまたは組織特異的ポリヌクレオチドの第１のレベルと、そのマーカーまたは組織特異的核酸の第２のレベルとを比較するために十分に高感度かつ正確である。場合によっては、そのマーカーまたは組織特異的核酸の第１のレベルは、第１の時点での被験体に由来するサンプルに相当し、そのマーカーまたは組織特異的核酸の第２のレベルは、第２の時点での被験体に由来する第２のサンプルに相当する。
【００３７】
多数の疾患および組織が、本明細書で開示されるキット、システムおよび方法を使用して同時に評価され得る。このようにして、本明細書で開示されるキット、システムおよび方法は、少なくとも１つの状態の存在または非存在を評価し、影響を及ぼされる組織および影響を及ぼされない組織の両方を識別するために使用され得る。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書で開示される方法、システムまたはキットによって生じた結果に基づいて医療行為を選択または推奨する工程を包含する。いくつかの実施形態において、個別化された医療行為が、その決定に基づいて、推奨され、必要に応じて採用される。場合によっては、個別化された医療行為は、拘束下にある組織を、例えば、放射線療法またはその組織の注射で直接的に処置する工程を包含する。医療行為の非限定的な例としては、さらなる検査（例えば、生検、画像化、手術）を行うこと、その疾患または状態についてその被験体を処置すること、およびその被験体の処置を改変すること（例えば、薬学的組成物の用量を変化させること、薬学的組成物の投与を中止すること、異なるまたはさらなる薬学的組成物を投与すること）が挙げられる。
【００３８】
本明細書で開示されるシステム、方法およびキットは、複数の組織において状態または疾患を検出することを提供し得る。場合によっては、被験体は、その状態の程度または重篤度に依存して、１またはこれより多くの組織に影響を及ぼすことが公知の状態を有する。本明細書で開示されるもののようなシステム、方法およびキットは、有利なことには、拘束下にある多数の組織の識別および標的化された処置を可能にする。例えば、本明細書で開示されるシステムは、被験体において炎症を検出し、肝臓および心臓が、循環している肝臓特異的ＲＮＡおよび心臓特異的ＲＮＡのレベルに起因する炎症によって影響を及ぼされていることを決定するためのマーカーを提供し得る。また、例示によれば、その方法は、がんと関連する変異（例えば、がんの原因または転帰として起こる変異）を有するか、またはがんを示すレベルで存在する、血漿サンプル中の無細胞のＲＮＡを検出する工程を包含し得る。がんの存在が一旦検出されると、その方法は、種々の組織に由来する無細胞のＲＮＡの組織特異的な相対的寄与を定量して、どの組織が腫瘍を、またはその始まりを有している可能性があるかを決定する工程を包含し得る。
【００３９】
損傷を受けている組織を検出することに加えて、その方法はさらに、組織損傷を引き起こしつつある状態を識別するか、またはその状態間を区別することを提供する。非限定的な例示によれば、方法は、被験体において肝損傷を検出すること、その肝損傷を引き起こす状態を識別すること、その被験体を処置するために治療を選択すること、およびその治療の有効性をモニターすることに関して、本明細書で開示される。ヒト肝臓において優勢に発現される遺伝子に相当する無細胞のＲＮＡは、被験体の血漿サンプル中で定量される。その血漿サンプル中でのこのようなＲＮＡの上昇したレベルは、肝損傷があることを示す。本明細書で記載されるように、疾患を識別し、疾患を区別することは、一般に、組織特異的ＲＮＡを単に検出するのではなく定量すること、および疾患のマーカーを定量することに依存する。例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）およびより進行しかつ重篤な疾患である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、類似の肝臓特異的ＲＮＡおよびマーカーによって識別され得るが、これらの分子のレベルは、ＮＡＦＬＤの症例にあるより、ＮＡＳＨの症例にある方が高い可能性がある。なぜならＮＡＦＬＤよりＮＡＳＨにおいてより多くの肝損傷が起こっているからである。肝臓のより多くの損傷が大部分の症例においてＮＡＦＬＤよりＮＡＳＨにおいて起こっていることから、より多くの肝臓特異的ＲＮＡが、ＮＡＦＬＤの症例よりＮＡＳＨの症例において肝臓から放出される。
【００４０】
被験体における疾患の存在および位置は、疾患の早期ステージにおいて決定され得る。なぜなら本明細書で記載されるシステムおよび方法は、迅速な結果を提供し、非侵襲性かつ安価であるからである。従って、その被験体は有利には、早期ステージと比較して、制御または処置することが比較的より困難である進行したステージへと疾患が進行する前に処置され得る。例えば、本明細書で開示されるシステムおよび方法は、画像化技術（例えば、ＣＴまたはＰＥＴスキャン）で可視化されるほど十分腫瘍が大きくなる前に、どの組織または器官ががん細胞を有するかを決定することを可能にし得る。このようにして、本明細書で開示される方法およびシステムは、疾患の早期ステージにおいて、焦点を絞った分析および標的化した治療（例えば、局所注射および標的化した放射線療法）を提供する。
【００４１】
有利なことには、その方法およびシステムは、組織損傷の程度に適したまたは最適な治療での処置を提供する。場合によっては、その方法は、そのマーカーおよび／または組織特異的ポリヌクレオチドを検出／定量して、治療の有効性または毒性を評価する工程を包含する。場合によっては、その治療は継続される。他の場合には、その治療は中止されるおよび／または別の治療で置き換えられる。にも拘わらず、その方法およびシステムの迅速かつ非侵襲性の性質に起因して、治療効果は、従来の処置最適化と比較してより頻繁に評価および最適化され得る。
【００４２】
非限定的な例示によれば、従来の実務によれば、がんに関して処置されている患者は、化学療法が投与され、ＭＲＩは、腫瘍サイズが低減しているか否かを決定するために３ヶ月後に行われる。腫瘍サイズの増大が観察される場合、その医師は、異なる治療を処方するが、その腫瘍は既に転移している。対照的に、本明細書で記載される方法を使用すると、その患者は、腫瘍を有する組織に相当する組織特異的核酸および処置有効性のマーカーのレベルを評価するために処置の開始後１〜２週間で検査される。組織特異的核酸およびマーカーのレベルが、その治療が無効であることを示す場合、その医師は、同様の方法によって、有効であると迅速に決定される異なる治療を処方する。後者の場合に、腫瘍は、画像化技術を利用する従来の方法と比較して増殖するまでの時間がより短く、転移せず、それによって、その患者がより良好な予後を有することを提供する。
【００４３】
いくつかの局面において、本開示は、本明細書で開示されるシステム、サンプル、マーカー、および組織特異的ポリヌクレオチドの使用を提供する。場合によっては、拘束下にある被験体における組織または器官、および拘束の原因である疾患または状態を非侵襲的に検出するためのインビトロサンプルの使用が、本明細書で開示される。場合によっては、拘束下にある被験体における組織または器官、および拘束の原因である疾患または状態を非侵襲的に検出するためのエキソビボサンプルの使用が、本明細書で開示される。概して、本明細書で開示される使用は、サンプル（エキソビボサンプルおよびインビトロサンプルが挙げられる）においてマーカーおよび組織特異的ポリヌクレオチドを定量することを包含する。本明細書で開示されるいくつかの使用は、第１のサンプルにおけるマーカーの量および組織特異的ポリヌクレオチドの量を比較すること、ならびにその量と第２のサンプルにおけるそれぞれの量とを比較することを含む。場合によっては、その第１のサンプルは第１の被験体に由来し、その第２のサンプルはコントロール被験体（例えば、健康な被験体またはある状態を有する被験体）に由来する。場合によっては、その第１のサンプルは第１の時点における被験体に由来し、その第２のサンプルは第２の時点における同じ被験体に由来する。その第１の時点は、その被験体に治療を投与する前に得られ得、その第２の時点は、その治療後に得られ得る。従って、同様に、被験体の状態、被験体の組織の健康状態、または治療剤の効果をモニターまたは評価するために、本明細書で開示されるサンプル、マーカー、組織特異的ポリヌクレオチド、キットおよびシステムの使用が、本明細書で提供される。
【００４４】
ある種の用語法
以下の説明は、本明細書で開示される方法、システムおよびキットの理解を助けるために提供される。本明細書で使用される用語の以下の説明は、これらの用語の定義の限定であるとは意図されない。これらの用語は、本出願全体を通じてさらに記載されかつ例示される。
【００４５】
本明細書で記載される方法、システムおよびキットは概して、無細胞の核酸を検出および定量する。この理由から、本明細書で記載される生物学的サンプルは、概して無細胞の生物学的流体である。被験体に由来するサンプルは、非限定的例によれば、細胞が除去されている血液、血漿、血清、尿、または脊髄液であり得る。例えば、その生物学的分子は、被験体の血流中に循環している可能性があるので、その検出試薬は、その被験体に由来する血液または血清サンプル中でそのマーカーを検出または定量するために使用され得る。用語「血漿（ｐｌａｓｍａ）」および「血清（ｓｅｒｕｍ）」は、別段注記されなければ、本明細書で交換可能に使用される。しかし、いくらかの場合には、それらは、説明または請求項によって両方が網羅されることを示すために、サンプル種の１つのリストの中に含まれる。
【００４６】
用語「組織特異的ポリヌクレオチド（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、例えば、「組織特異的ＲＮＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ）」とは、本明細書で使用される場合、一般に、特定の組織において優勢に発現されるポリヌクレオチドをいう。しばしば、本明細書で開示される方法、システムおよびキットは、無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドを利用する。本明細書で記載される無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドは、それらが発現される組織または器官の損傷に際して、生物学的流体中で定量され得るレベルで発現されるポリヌクレオチドである。いくらかの場合には、生物学的流体中の本明細書で開示される無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、その組織または器官の損傷に際した無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの放出に起因し、その無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの発現における変化に起因しない。本明細書で開示される無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの上昇したレベルは、その相当する組織または器官に対する損傷を示す。場合によっては、本明細書で開示される無細胞のポリヌクレオチドは、いくつかの組織において発現／生成されるが、それら組織のうちの少なくとも１つにおいて組織特異的に発現／生成される。これらの場合に、その無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの絶対量または相対量は、特定の組織もしくは器官に対する損傷、または組織もしくは器官の集まりを示す。代わりにまたはさらに、組織特異的ポリヌクレオチドは、組織特異的改変を有する核酸である。非限定的な例によれば、本明細書で開示される組織特異的ポリヌクレオチドまたはマーカーとしては、組織特異的メチル化パターンを有するＤＮＡ分子（例えば、遺伝子または非コード領域の一部）が挙げられる。言い換えると、そのポリヌクレオチドおよびマーカーは、多くの組織において同様に発現され得るか、または被験体全体にさらに遍在して発現され得るが、その改変は組織特異的である。概して、本明細書で開示される組織特異的ポリヌクレオチドまたはそのレベルは、疾患に対して特異的ではない。概して、本明細書で開示される組織特異的ポリヌクレオチドは、疾患機構に関わるタンパク質をコードしない。
【００４７】
用語「マーカー（ｍａｒｋｅｒ）」とは、本明細書で使用される場合、広く種々の生物学的分子を包含する。マーカーはまた、疾患マーカーまたは疾患のマーカーとして本明細書で言及され得る。場合によっては、そのマーカーは、複数の疾患と関連する状態に関するものである。例えば、そのマーカーは、炎症に関するものであり得、これは、心血管疾患、肝炎およびがんと関連し得る。マーカーとしては、非限定的な例によれば、ペプチド、ホルモン、脂質、ビタミン、病原体、細胞断片、代謝物質および核酸が挙げられる。場合によっては、マーカーは無細胞の核酸である。概して、本明細書で開示されるマーカーは、組織特異的ではない。しかし、希な場合には、そのマーカーは組織特異的である。本明細書で開示されるマーカーは、疾患生体マーカーともいわれ得る。その疾患生体マーカーは、疾患の結果として存在するかもしくは生成されるか、疾患の結果として異常調節されている、疾患に機構的に関わっているか、疾患状態において変異もしくは改変されているか、またはこれらの任意の組み合わせである生体分子である。マーカーは、その被験体によって生成され得る。マーカーはまた、他の種によって生成され得る。例えば、そのマーカーは、肝炎ウイルスまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌によって作られる核酸またはタンパク質であり得る。このようなマーカーを識別する方法は、組織特異的ポリヌクレオチドを検出／定量して、どの組織にこれらの病原体が感染しているかまたはどの組織がこれらの病原体によって影響を及ぼされているかを、および必要に応じて、その組織が損傷を受けている程度を決定する工程をさらに包含し得る。本明細書で開示される疾患のマーカーは概して、その疾患によって影響を及ぼされなかった個体では循環していない。
【００４８】
一般に、用語「無細胞のポリヌクレオチド（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」および「無細胞の核酸（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、本明細書で交換可能に使用され、そのポリヌクレオチドを細胞から抽出することなしに、サンプルから単離され得るポリヌクレオチドに言及する。本明細書で開示される無細胞のポリヌクレオチドは、代表的には、損傷を受けた組織または損傷を受けた器官から放出または分泌されているポリヌクレオチドである。例えば、その組織または器官に対する損傷は、細胞溶解を生じ、その損傷を受けた組織の細胞から循環へと無細胞のポリヌクレオチドを放出する、疾患、傷害または他の状態に起因し得る。場合によっては、本明細書で開示される無細胞のポリヌクレオチドは組織特異的である。他の場合には、無細胞のポリヌクレオチドは組織特異的ではない。場合によっては、無細胞のポリヌクレオチドは、細胞に存在するかまたは細胞と接触した状態にある。場合によっては、無細胞のポリヌクレオチドは、オルガネラ、小胞またはエクソソームと接触した状態にある。場合によっては、無細胞のポリヌクレオチドは無細胞であり、これは、その無細胞のポリヌクレオチドが細胞と接触した状態にないことを意味する。本明細書で記載される無細胞のポリヌクレオチドは、別段特定されなければ、自由に循環している。場合によっては、無細胞のポリヌクレオチドは、自由に循環している。すなわち、その無細胞のポリヌクレオチドは、いかなる小胞、オルガネラ、細胞とも接触した状態にない。場合によっては、無細胞のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質（トランスフェラーゼ、リボソームタンパク質など）と会合しているが、任意の他の分子とは会合していない。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「約、およその（ａｂｏｕｔ）」数字とは、その数字±その数字の１０％をいう。用語「約、およその」範囲とは、その最低値のマイナス１０％およびその最高値の＋１０％の範囲に言及する。
【００５０】
本明細書および請求項において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「この、その、上記（ｔｈｅ）」とは、状況が別段明らかに規定しなければ、複数形への言及を含む。例えば、用語「１つのサンプル（ａ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、複数のサンプル（これらの混合物を含む）を含む。
【００５１】
用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」および「分析する（ａｎａｌｙｚｉｎｇ）」とは、測定の形態をいうために本明細書でしばしば交換可能に使用され、１つの要素が存在するかしないかを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的、定性的または定量的、および定性的な決定を包含し得る。評価する（ａｓｓａｙｉｎｇ）は、代わりに、相対的または絶対的である。「の存在を検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ）」とは、存在する何かの量を決定すること、ならびにそれが存在するか否かを決定することを含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、レシピエントにおいて有益なまたは望ましい結果を得るための薬学的または他の介入レジメンに言及して使用される。有益なまたは望ましい結果としては、治療利益および／または予防利益が挙げられるが、これらに限定されない。治療利益は、根底にある処置されている障害の根絶またはその症状の改善をいい得る。また、治療利益は、その根底にある障害と関連する生理学的症状のうちの１またはこれより多くの根絶または改善で達成され得、その結果、改善は、その被験体がその根底にある障害になお罹患している可能性があるにも関わらず、その被験体において観察される。予防効果としては、疾患もしくは状態の出現を遅らせる、防止する、または排除すること、疾患もしくは状態の症状の開始を遅らせるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅くすること、停止すること、もしくは改善する（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）こと、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。予防利益に関しては、特定の疾患を発生させるリスクにある被験体、または疾患の生理学的症状のうちの１またはこれより多くを報告している被験体が、この疾患の診断がなされない可能性があるとしても、処置を受け得る。
【００５３】
方法
前述および以下の説明において考察されるように、本明細書で開示される方法は、拘束下にある被験体における組織または器官を非侵襲的に検出すること、およびどの疾患または状態が、拘束下にある組織または器官に影響を及ぼしているかを決定することが意図される。本明細書で開示されるいくつかの方法は、被験体における疾患または状態のステージまたは進行を決定する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、被験体における疾患または状態を処置するために使用される治療に対する応答を決定する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、被験体における特定の組織または器官が、損傷を受けているか、傷害を受けているか、または感染しているかを決定する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、被験体における特定の組織または器官が、疾患または状態によって影響を及ぼされているか否かを決定する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、本明細書で開示される生物学的分子を検出または定量する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、本明細書で開示されるマーカーおよび／または組織特異的ポリヌクレオチドを検出または定量する工程を包含する。
【００５４】
本明細書で開示されるいくつかの方法は、その被験体のサンプル中の少なくとも１種の核酸を検出する、定量するおよび／または分析する工程を包含する。その方法は、生物学的サンプル中の少なくとも１種の核酸を検出する、定量するおよび／または分析する工程を包含し得る。場合によっては、その生物学的サンプルは凍結されている。場合によっては、その生物学的サンプルは一度も凍結されていない。その組織特異的ポリヌクレオチドは、組織特異的な無細胞のポリヌクレオチドであり得る。その方法は、そのマーカーおよび／またはその組織特異的な無細胞のポリヌクレオチドの量と、そのマーカーの参照レベルおよびその組織特異的ポリヌクレオチドの参照レベルとを、それぞれ比較する工程をさらに包含する。場合によっては、参照レベルとの比較は、必要とされない。例えば、そのマーカーおよび／または組織特異的な無細胞のポリヌクレオチドの存在は、その疾患もしくは状態を検出するか、またはその特定の組織が、その疾患もしくは状態によって、損傷を受けているか、傷害を受けているか、または感染しているかを決定するために十分であり得る。いくつかの局面において、その方法は、その疾患もしくは状態の診断もしくは予後を、またはその進行の評価を提供する。
【００５５】
いくつかの局面において、本開示は、血液サンプル中の循環している非血液ＲＮＡを富化する方法を提供し、その方法は、その血液サンプルから血球を枯渇させる工程；およびその血液サンプルからエクソソームを枯渇させる工程を包含する。いくつかの局面において、本開示は、血液サンプル中の循環している非血液ＲＮＡを富化する方法を提供し、その方法は、その血液サンプルから血球を枯渇させて、細胞枯渇血液サンプルを生成する工程；およびその細胞枯渇血液サンプルと血球表面結合部分とを接触させる工程を包含する。
【００５６】
いくつかの局面において、本開示は、（ａ）被験体から血液サンプルを得る工程；（ｂ）細胞をその血液サンプルから除去して、細胞枯渇サンプルを得る工程；（ｃ）その血液サンプルから細胞外微粒子を除去して、微粒子枯渇サンプルを得る工程；および（ｄ）その微粒子枯渇サンプル中の遺伝子に相当するＲＮＡの量を定量する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、その方法は、（ａ）被験体から血液サンプルを得る工程；（ｂ）その血液サンプルを遠心分離または濾過して、血漿サンプルを得る工程；（ｃ）その血漿サンプルを濾過して、血小板をその血漿サンプルから除去し、それによって、細胞枯渇サンプルを生成する工程；（ｄ）その細胞枯渇サンプルと細胞表面タンパク質結合部分とを接触させる工程であって、ここでその細胞表面タンパク質結合部分は、その細胞枯渇サンプル中の血球エクソソーム上の細胞表面タンパク質に結合し得る工程；（ｅ）その細胞表面タンパク質結合部分をその細胞枯渇サンプルから除去し、それによって、その血球エクソソームをその細胞枯渇サンプルから除去する工程；ならびに（ｆ）その細胞枯渇サンプル中の循環している無細胞のＲＮＡを定量する工程であって、ここでその無細胞のＲＮＡは、目的の組織によって発現される工程を包含する。
【００５７】
細胞の除去
いくつかの局面において、本開示は、本明細書で開示されるサンプル（例えば、生物学的流体、血液、血漿サンプル、細胞枯渇サンプル）から細胞を除去する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、その細胞を除去する工程は、そのサンプルを遠心分離する工程を包含する。場合によっては、その細胞を除去する工程は、そのサンプル１回より多く遠心分離する工程を包含する。場合によっては、その細胞を除去する工程は、そのサンプルを２回遠心分離する工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルを約５，０００ｇ〜約２５，０００ｇで遠心分離する工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルを約８，０００ｇ〜約２０，０００ｇで遠心分離する工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルを約１２，０００ｇ〜約１８，０００ｇで遠心分離する工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルを約１４，０００ｇ〜約１８，０００ｇで遠心分離する工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルを約１６，０００ｇで遠心分離する工程を包含する。場合によっては、その細胞を除去する工程は、そのサンプルを濾過する工程を包含する。そのサンプルを濾過する工程は、そのサンプルと、約２００ミクロン〜約１０００ミクロンの孔径を有するフィルタとを接触させる工程を包含し得る。そのサンプルを濾過する工程は、そのサンプルと８００ミクロンフィルタとを接触させる工程を包含し得る。
【００５８】
いくつかの局面において、本開示は、本明細書で開示されるサンプルから細胞を除去して、本明細書で記載されるとおりの細胞枯渇サンプルを生成する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、実質的に細胞を含まない。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約１０個未満の細胞を含む。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約５０個未満の細胞を含む。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約１００個未満の細胞を含む。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約１５０個未満の細胞を含む。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約２００個未満の細胞を含む。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約５００個未満の細胞を含む。場合によっては、その細胞枯渇サンプルは、約１０００個未満の細胞を含む。
【００５９】
場合によっては、その細胞は血球である。場合によっては、その細胞は白血球である。場合によっては、その細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、幹細胞前駆体、マクロファージ、単球、顆粒球、血小板、赤血球、循環している内皮細胞、または循環している上皮細胞から選択される。場合によっては、その細胞は血小板である。場合によっては、その細胞は顆粒球である。
【００６０】
本明細書で開示されるいくつかの方法は、その血液サンプル中に本来存在していた細胞のうちの少なくとも約９０％を除去する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、その血液サンプル中に本来存在していた細胞のうちの少なくとも約９５％を除去する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、その血液サンプル中に本来存在していた細胞のうちの少なくとも約７５％〜少なくとも約９５％を除去する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、その血液サンプル中に本来存在していた細胞のうちの少なくとも約７５％〜少なくとも約９９％を除去する工程を包含する。場合によっては、その細胞は、そのサンプル中の細胞断片を含む。このようなサンプルは、本明細書で「細胞枯渇サンプル（ｃｅｌｌ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ）」といわれ得る。
【００６１】
細胞外微粒子の除去
いくつかの局面において、本開示は、本明細書で開示されるサンプル（例えば、生物学的流体、血液、血漿サンプル、細胞枯渇サンプル）から細胞外微粒子を除去する工程を包含する方法を提供する。いくつかの局面において、本開示は、サンプルから少なくとも１種の細胞外微粒子を除去する工程を包含する方法を提供する。いくつかの局面において、本開示は、サンプルから複数の細胞外微粒子を除去する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、その細胞外微粒子は、エクソソーム、小胞、微小小胞、エクソソーム様小胞、または微粒子として特徴づけられるかまたは言及される。場合によっては、その細胞外微粒子はエクソソームである。場合によっては、その細胞外粒子は白血球に由来する。場合によっては、その細胞外粒子は血球に由来する。場合によっては、その細胞外粒子は循環している細胞に由来する。血漿または血清中のエクソソームのうちの９０％超は、血球に由来する。本明細書で開示される方法は、このような細胞外微粒子を除去し、それによって、循環している無細胞の核酸の定量の精度および感度を改善する。
【００６２】
いくつかの方法は、そのサンプルと、その細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、そのサンプルは細胞枯渇サンプルである。場合によっては、その結合部分は、循環している細胞によって発現されることが公知の細胞表面マーカーと相互作用する。場合によっては、その循環している細胞は骨髄由来細胞である。場合によっては、その循環している細胞は血球である。場合によっては、その循環している細胞は白血球である。場合によっては、その循環している細胞はＴ細胞である。場合によっては、その循環している細胞はＢ細胞である。場合によっては、その循環している細胞は樹状細胞である。場合によっては、その循環している細胞はナチュラルキラー細胞である。場合によっては、その循環している細胞は幹細胞前駆体である。場合によっては、その循環している細胞はマクロファージである。場合によっては、その循環している細胞は単球である。場合によっては、その循環している細胞は顆粒球である。場合によっては、その循環している細胞は血小板である。場合によっては、その循環している細胞は赤血球である。場合によっては、その循環している細胞は、循環している内皮細胞である。場合によっては、その循環している細胞は、循環している上皮細胞である。
【００６３】
いくつかの方法は、そのサンプルと、その細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、その結合部分は、その細胞外微粒子の表面上のタンパク質に対するレセプターまたはリガンドである。場合によっては、その結合部分は結合タンパク質である。場合によっては、その結合部分は低分子である。場合によっては、その結合部分は、アプタマーまたは核酸である。場合によっては、その結合部分は、脂質、脂肪酸、ステロールまたは他の生体ポリマーである。場合によっては、その結合部分は抗体である。場合によっては、その結合部分は抗原結合抗体断片である。場合によっては、その抗体またはその抗原結合断片は、ＧｙｐＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６またはＣＤ３２６から選択される細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、その細胞外微粒子は白血球に由来し、その細胞表面マーカーはＣＤ４５である。場合によっては、その細胞外微粒子は顆粒球に由来し、その細胞表面マーカーはＣＤ６６ｂである。
【００６４】
いくつかの方法は、そのサンプルと、その細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、その結合部分は、固体支持体に付着される。場合によっては、その結合部分は、固体支持体に接続される。場合によっては、その結合部分は、固体支持体に結合体化される。場合によっては、その結合部分は、固体支持体と相互作用する。固体支持体の非限定的な例は、ビーズ、カラム、プレート、またはアレイである。場合によっては、その結合部分は、そのサンプルと非混和性である溶液に対して親和性を有し、その結果、その溶液が、そのサンプルとその結合部分とを接触させた後にそのサンプルに添加される場合、その結合部分は、その溶液の中へと分離し、それによって、その細胞外粒子をそのサンプルから除去する。
【００６５】
いくつかの方法は、そのサンプルと、複数の細胞外微粒子の表面上の複数のタンパク質と相互作用する複数の結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルと、少なくとも２種の結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルと、少なくとも３種の結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルと、少なくとも４種の結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、方法は、そのサンプルと、約２種の結合部分〜約５種の結合部分とを接触させる工程を包含する。いくつかの方法は、そのサンプルと、第１の結合部分および第２の結合部分とを接触させる工程を包含する。場合によっては、その第１の結合部分は、第１の細胞上の第１のタンパク質と相互作用し、第２の抗体は、第２の細胞上の第２のタンパク質と相互作用する。場合によっては、その第１の結合部分およびその第２の結合部分は異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は同じである。例えば、いくつかの場合には、その第１の結合部分およびその第２の結合部分は、同じタンパク質を標的とするが、両方が使用される。なぜならどの結合部分がその被験体のサンプルにおいて最もよく機能するかについては不確実性があるからである。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約１０アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約１００アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約２００アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約４００アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、異なる遺伝子から発現される。場合によっては、その第１のタンパク質は、第２の細胞で発現されず、その第２のタンパク質は、第１の細胞で発現されない。場合によっては、その第１の細胞およびその第２の細胞は、２種の異なるタイプの白血球である。場合によっては、方法は、本明細書で開示されるように、細胞外微粒子を除去する工程に類似の様式で細胞断片を除去する工程を包含する。
【００６６】
本明細書で開示されるいくつかの方法は、本明細書で開示されるサンプルから細胞外微粒子を除去する工程を包含する。場合によっては、その方法は、その血液サンプルから、その血液サンプルに本来存在していた細胞外微粒子のうちの少なくとも９０％を枯渇させる。場合によっては、その方法は、その血液サンプルから、その血液サンプルに本来存在していた細胞外微粒子のうちの少なくとも９９％を枯渇させる。
【００６７】
本明細書で開示されるいくつかの方法は、細胞、細胞断片、および細胞外微粒子の範囲を超えて、そのサンプルのさらなる構成要素を除去する工程を包含する。さらなる構成要素の非限定的な例は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、およびｔＲＮＡなどである。
【００６８】
細胞外微粒子の捕捉
いくつかの局面において、本開示は、サンプルとタンパク質結合部分とを接触させる工程であって、ここでそのタンパク質結合部分は、その血漿サンプル中の細胞外微粒子上の表面タンパク質に結合し得、その細胞外微粒子は、その被験体の組織に由来する工程；その細胞枯渇サンプルからそのタンパク質結合部分を除去し、それによって、そのサンプルからその細胞外微粒子を除去する工程；およびその細胞外微粒子中の核酸を定量する工程であって、ここでその核酸は、その組織によって発現される工程を包含する方法を提供する。場合によっては、その目的の組織は血液ではない。場合によっては、その目的の組織は固形器官である。場合によっては、その目的の組織は肝臓であり、そのタンパク質結合部分は、ＳＬＣ７Ａ１０または脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）と相互作用する。場合によっては、その目的の組織は脂肪であり、そのタンパク質結合部分は、アシアロ糖タンパク質レセプター１（ＡＳＧＲ１）、またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）と相互作用する。場合によっては、その目的の組織は神経学的組織であり、そのタンパク質結合部分は、グルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）と相互作用する。場合によっては、その目的の組織は腎臓であり、そのタンパク質結合部分はγ−グルタミルトランスペプチダーゼと相互作用する。場合によっては、その細胞表面タンパク質結合部分は、抗体またはその抗原結合断片である。場合によっては、その細胞外微粒子はエクソソームである。組織または腫瘍に由来するエクソソームの非限定的例としては、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ）、エピジジモソーム（ｅｐｉｄｉｄｉｍｏｓｏｍｅ）、デクソソーム（ｄｅｘｏｓｏｍｅ）、テクソソーム（ｔｅｘｏｓｏｍｅ）、およびオンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅ）が挙げられる。
【００６９】
核酸の定量
いくつかの局面において、本開示は、被験体のサンプル中のＲＮＡを定量する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、そのサンプルは、本明細書で記載されるように質変化または処理される。場合によっては、そのＲＮＡは無細胞のＲＮＡであり、これは、循環している無細胞のＲＮＡともいわれ得る。場合によっては、そのＲＮＡは、細胞、細胞断片、細胞外微粒子（例えば、エクソソーム）、またはこれらの断片に付着されない。場合によっては、そのＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。場合によっては、そのＲＮＡは、ｍＲＮＡから本質的になる。場合によっては、そのＲＮＡはｍＲＮＡである。場合によっては、そのＲＮＡは、約７５ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチドの長さを有する。場合によっては、そのＲＮＡは、約１００ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドの長さを有する。場合によっては、そのＲＮＡは、約１２５ヌクレオチド〜約２２５ヌクレオチドの長さを有する。場合によっては、そのＲＮＡは、約３００ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチドの長さを有する。
【００７０】
いくつかの方法は、そのサンプルへのそのＲＮＡの相対的寄与を定量する工程を包含する。いくつかの方法は、そのサンプルの全ＲＮＡ中のそのＲＮＡの画分を定量する工程を包含する。本明細書で開示されるいくつかの方法は、そのＲＮＡをシーケンシングする工程を包含する。場合によっては、定量する工程は、Ｑ−ＰＣＲを包含する。場合によっては、定量する工程は、マルチプレックスＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＰＣＲ）を包含する。場合によっては、定量する工程は、アレイ検出法（例えば、マイクロアレイ）を包含する。場合によっては、定量する工程は、プライミングおよびテンプレートスイッチングプロセスによって、アダプターの同時添加でのランダムプライミングを包含する。
【００７１】
いくつかの局面において、本開示は、被験体のサンプル中のＲＮＡを定量する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、そのＲＮＡは組織に由来する。場合によっては、その組織は流体組織（例えば、血液）ではない。場合によっては、その組織は固形組織である。場合によっては、その組織は器官である。場合によっては、その組織は、機能と関連する。例えば、その組織は、神経学的組織であり得る。神経学的組織は、脳、脊髄、末梢神経、またはこれらの組み合わせであり得る。組織の非限定的な例としては、肝臓、脂肪、腎臓が挙げられる。場合によっては、そのＲＮＡは組織特異的細胞タイプに由来する。場合によっては、その組織特異的細胞タイプは非血球である。場合によっては、その組織特異的細胞タイプは、神経学的細胞タイプである。神経学的細胞タイプの非限定的な例は、星状細胞および乏突起膠細胞である。場合によっては、その組織特異的細胞タイプは、肝細胞タイプである。肝細胞タイプの非限定的な例は、肝細胞、クッパー細胞、および肝星細胞である。場合によっては、その組織特異的細胞タイプは腎細胞タイプである。腎細胞タイプの非限定的な例は、腎尿細管細胞である。
【００７２】
いくつかの局面において、本開示は、被験体のサンプル中のＲＮＡを定量する工程を包含する方法を提供する。場合によっては、そのＲＮＡは、血液中で発現されるより、目的の組織においてより高度に発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、血球で発現されるより、目的の組織においてより高度に発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、血球によって発現されない。場合によっては、そのＲＮＡは、血液中よりもその組織において少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、血液中よりもその組織において少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、血液中よりもその組織において少なくとも２０倍高く発現される。
【００７３】
場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりもその組織において少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりもその組織において少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりもその組織において少なくとも２０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりも２種以下の組織において少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりも２種以下の組織において少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりも２種以下の組織において少なくとも２０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりも３種以下の組織において少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりも３種以下の組織において少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の組織よりも３種以下の組織において少なくとも２０倍高く発現される。
【００７４】
場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより１種の細胞タイプにおいて少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプよりその細胞タイプにおいて少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプよりその細胞タイプにおいて少なくとも２０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより２種以下の細胞タイプにおいて少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより２種以下の細胞タイプにおいて少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより２種以下の細胞タイプにおいて少なくとも２０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより３種以下の細胞タイプにおいて少なくとも５倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより３種以下の細胞タイプにおいて少なくとも１０倍高く発現される。場合によっては、そのＲＮＡは、任意の他の細胞タイプより３種以下の細胞タイプにおいて少なくとも２０倍高く発現される。
【００７５】
いくつかの局面において、本開示は、被験体のサンプル中のＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡを定量する工程を包含する方法を提供する。その方法は、定量する前に、そのＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡを増幅する工程を包含する。その方法は、定量すると同時に、ＲＮＡを増幅する工程を包含する。場合によっては、増幅する工程は、そのＲＮＡまたはｃＤＮＡをランダムヘキサマーとハイブリダイズする工程を包含する。場合によっては、増幅する工程は、そのＲＮＡまたはｃＤＮＡを配列特異的プライマーとハイブリダイズする工程を包含する。場合によっては、増幅する工程は、サーモサイクリング反応を包含する。場合によっては、増幅する工程は、等温反応を包含する。場合によっては、増幅する工程は、鎖置換増幅を包含する。
【００７６】
システム
いくつかの局面において、本開示は、生物学的流体中の核酸の検出または定量を改善するために、その生物学的流体サンプルから細胞、細胞断片、および細胞外微粒子を枯渇させるシステムを提供する。いくつかのシステムは、その生物学的流体のさらなる構成要素（例えば、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、細菌ＲＮＡ）を除去し得る。細菌ＲＮＡは、腸に由来し得る。場合によっては、その核酸はＲＮＡを含む。場合によっては、その核酸はＲＮＡから本質的になる。場合によっては、そのＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。
【００７７】
いくつかの局面において、本開示は、非血液組織（固形組織または固形器官が挙げられる）に由来する生物学的流体サンプル中の細胞外微粒子を捕捉するシステムを提供する。いくつかの局面において、本開示は、循環している細胞でない細胞に由来する細胞外微粒子を捕捉することを提供する。いくつかの局面において、本開示は、血球でない細胞に由来する細胞外微粒子を捕捉することを提供する。
【００７８】
いくつかの局面において、本開示は、被験体のサンプル中の細胞外微粒子に結合し得る結合部分の混合物を含むシステムを提供する。場合によっては、その結合部分は、細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する。場合によっては、その結合部分は、その細胞外微粒子の表面上のタンパク質に対するレセプターまたはリガンドである。場合によっては、その結合部分は、その細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合タンパク質である。場合によっては、その結合部分は低分子である。場合によっては、その結合部分はアプタマーまたは核酸である。場合によっては、その結合部分は、脂質、脂肪酸、ステロールまたは他の生体ポリマーである。場合によっては、その結合部分は抗体である。場合によっては、その結合部分は抗原結合抗体断片である。
【００７９】
場合によっては、その細胞外微粒子は血球に由来する。場合によっては、その結合部分は、血球上の細胞表面マーカーであるその細胞外微粒子上のタンパク質と相互作用するかまたは結合する。血球の非限定的な例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、幹細胞前駆体、マクロファージ、単球、顆粒球、血小板、赤血球、循環している細胞、および循環している上皮細胞である。場合によっては、その細胞は血小板である。場合によっては、その細胞は顆粒球である。血球上の細胞表面マーカーの非限定的な例としては、ＧｙｐＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６またはＣＤ３２６が挙げられる。
【００８０】
場合によっては、その結合部分は、非血球上の細胞表面マーカーであるその細胞外微粒子上のタンパク質と相互作用するかまたは結合する。非血球タイプの非限定的な例は、星状細胞、肝細胞、および脂肪細胞である。その非血球は、固形組織または固形器官に由来し得る。固形組織の非限定的例としては、肝臓、脂肪、腎臓、膵臓、心臓、筋、骨髄、皮膚、前立腺、精巣、乳房、卵巣、子宮、結腸、肺、および神経学的組織が挙げられる。肝細胞上の細胞表面マーカーの非限定的な例としては、ＡＳＧＲ１およびＧＦＡＰが挙げられる。脂肪細胞上の細胞表面マーカーの非限定的な例は、ＳＬＣ７Ａ１０およびＦＡＢＰ４である。星状細胞上の細胞表面マーカーの非限定的な例としては、ＧＬＡＳＴが挙げられる。腎細胞（例えば、腎尿細管細胞）上の細胞表面マーカーの非限定的な例としては、γ−グルタミルトランスペプチダーゼが挙げられる。
【００８１】
いくつかのシステムは、複数の細胞外微粒子の表面上の複数のタンパク質と相互作用する複数の結合部分を含む。場合によっては、システムは、少なくとも２種の結合部分を含む。場合によっては、システムは、少なくとも３種の結合部分を含む。場合によっては、システムは、少なくとも４種の結合部分を含む。場合によっては、システムは、約２種の結合部分〜約５種の結合部分を含む。いくつかのシステムは、第１の結合部分および第２の結合部分を含む。場合によっては、その第１の結合部分は、第１の細胞上の第１のタンパク質と相互作用し、第２の抗体は、第２の細胞上の第２のタンパク質と相互作用する。場合によっては、その第１の結合部分およびその第２の結合部分は異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は同じである。例えば、いくつかの場合には、その第１の結合部分およびその第２の結合部分は、同じタンパク質を標的とするが、両方が使用される。なぜならどの結合部分がその被験体のサンプルにおいて最良に機能するかについては不確実性があるからである。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約１０アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約１００アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約２００アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、少なくとも約４００アミノ酸が異なる。場合によっては、その第１のタンパク質およびその第２のタンパク質は、異なる遺伝子から発現される。場合によっては、その第１のタンパク質は、その第２の細胞で発現されず、その第２のタンパク質は、その第１の細胞で発現されない。場合によっては、その第１の細胞およびその第２の細胞は、２種の異なるタイプの白血球である。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも２種の異なる細胞タイプに由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。
【００８２】
いくつかのシステムは、複数の細胞外微粒子の表面上の複数のタンパク質と相互作用する複数の結合部分を含む。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも２種の異なる細胞タイプに由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも３種の異なる細胞タイプに由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも４種の異なる細胞タイプに由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも５種の異なる細胞タイプに由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも２種の異なるタイプの循環している細胞または血球に由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも３種の異なるタイプの循環している細胞または血球に由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも４種の異なるタイプの循環している細胞または血球に由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。場合によっては、その複数の結合部分は、少なくとも５種の異なるタイプの循環している細胞または血球に由来する細胞外微粒子に結合し得るかまたは相互作用し得る。循環している細胞または血球のタイプの非限定的な例としては、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、幹細胞前駆体、マクロファージ、単球、顆粒球、血小板、赤血球、循環している細胞、および循環している上皮細胞が挙げられる。
【００８３】
本明細書で開示されるいくつかのシステムは、固体支持体を含み、ここで少なくとも１種の結合部分は、その固体支持体に付着される。場合によっては、その結合部分は、その固体支持体に接続される。場合によっては、その結合部分は、その固体支持体に結合体化される。場合によっては、その結合部分は、その固体支持体と相互作用する。固体支持体の非限定的な例は、ビーズ、カラム、プレート、またはアレイである。場合によっては、その結合部分は、そのサンプルと非混和性の溶液に対して親和性を有し、その結果、そのサンプルとその結合部分とを接触させた後にその溶液がそのサンプルに添加される場合、その結合部分はその溶液の中へと分離し、それによって、その細胞外粒子をそのサンプルから除去する。場合によっては、そのシステムは、その溶液を含む。
【００８４】
場合によっては、本明細書で開示されるシステムは、被験体のサンプルのための容器を含む。その容器は、ＥＤＴＡを含み得る。その容器は、ＥＤＴＡを含まなくてもよい。そのサンプルは細胞を含み得る。いくつかのシステムは、その被験体のサンプルからその細胞を分離するための細胞分離構成要素を含む。場合によっては、その細胞分離構成要素は、その容器を回転させて、その容器に遠心力を適用する機械であり、それによって、その血液サンプルから細胞のうちの少なくとも一部を除去する。代わりに、またはさらに、システムは、その細胞を除去するためのフィルタを含む。場合によっては、そのフィルタは、細胞断片、細胞外微粒子、またはそのサンプルの他の構成要素を除去する。一般に、そのフィルタは、これらの構成要素を、そのサンプル中の循環している無細胞のメッセンジャーＲＮＡから分離するために適している。場合によっては、そのフィルタは、約２００ミクロン〜約８００ミクロンの孔径を有する。場合によっては、そのフィルタは、約８００ミクロン〜約２０００ミクロンの孔径を有する。場合によっては、そのフィルタは、約４００ミクロン〜約１２００ミクロンの孔径を有する。場合によっては、そのフィルタは、約６００ミクロン〜約１０００ミクロンの孔径を有する。場合によっては、そのフィルタは、約８００ミクロンの孔径を有する。
【００８５】
本明細書で開示されるいくつかのシステムは、被験体に由来するサンプルに存在する核酸を定量するために少なくとも１種の試薬を含む。場合によっては、その核酸はＲＮＡである。場合によっては、そのＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。場合によっては、その核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。場合によっては、その試薬は、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドである。場合によっては、その試薬は、逆転写酵素であり、そのシステムは、そのＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写するために使用される。場合によっては、その試薬は、そのｃＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドである。場合によっては、そのシステムは、そのＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅し得る２種のオリゴヌクレオチドを含む。場合によっては、その試薬は、その核酸を増幅する酵素である。場合によっては、そのシステムは、Ｑ−ＰＣＲまたはシーケンシングリードアウトを生成および／または読み取るために必要な機械または試薬を含む。このような機械および試薬は、当該分野で周知である。
【００８６】
場合によっては、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、相対的エントロピー最大化によるデコンボリューションの使用：複雑な混合物から、その混合物の遺伝子発現測定に基づいて、特定の目的の細胞タイプ／組織／器官（例えば、無細胞のＲＮＡ）の相対的量を定量する方法を含む。
【００８７】
異なる組織に由来するＲＮＡの混合物が与えられると、その方法は、その混合物を構成する組織の割合のベクトルｐを、その混合物の遺伝子発現値およびその組織の各々における遺伝子発現値を使用して解く。この方法の目的は、１）混合物において観察される発現プロフィールと、ｐによって重み付けされた組織発現プロフィールの線形組み合わせとの間の相対的エントロピー、および２）値ｐが合計して１でなければならないという制約の下でのＬ２ノルムペナルティー関数との合計を最小にする値ｐを見出すことである。
【００８８】
その目的は組織寄与を超える確率分布を予測することであるので、最適化は、全ての組織を網羅する確率が合計して１でなければならないという制約の下で行われなければならない。現行の実行では、ｎ種の組織を網羅する確率が合計して１であるというこの制約は、演繹的に参照組織を選択することによって満たされ、次いで、ｎ−１個の自由パラメーター（ｆｒｅｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を予測し、その参照組織に対する特定の組織の寄与のｌｏｇ比を表す。次いで、ｌｏｇ比は、パラメーター予測が完了した後に、確率へと変換され得る。参照組織は、予測されたｌｏｇ比が数字の上で安定しているように、その混合物中で高度に表される可能性が高い組織であるように選択される。他のアプローチ（例えば、制約つき最適化法の使用）がまた可能であるが、それらは、数値的に困難である傾向が高い可能性がある。
【００８９】
特徴選択工程は、デコンボリューションの前に行われる。特徴マトリクスは、組織遺伝子発現プロフィールから構築される。遺伝子であり得るか、または遺伝子の重み付けされた線形組み合わせであり得る特徴は、組織特異的であるように選択される。高度に相関した遺伝子は、ノイズを低減しかつ多重共線性を低減する新たな特徴を作り出すために一緒に組み合わされ得る。
【００９０】
そのフィットのＰ値は、ｌｏｇ比検定（ｌｏｇ  ｒａｔｉｏ  ｔｅｓｔ）を使用して計算され得る。
【００９１】
より正確には、ｎ×ｆの特徴マトリクスＦが与えられる場合（ここでｎは、組織の総数であり、ｆは特徴の総数であり、観察される発現プロフィールＯのｆという長さのベクトル）、本発明者らは、以下を最小にする値Ｐを見出す：
【数１】
2020534036.tif 000003
ここでＱは、現在の値Ｐから予測された発現プロフィールのＦという長さのベクトルであり、
【数２】
2020534036.tif 000004
【００９２】
番号付けした実施形態
本開示は、本明細書で記載される番号付けした実施形態の検討を通じてさらに理解される。  １．被験体から血液サンプルを得る工程；上記血液サンプルを遠心分離または濾過して、血漿サンプルを得る工程；上記血漿サンプルを濾過して、上記血漿サンプルから血小板を除去し、それによって、細胞枯渇サンプルを生成する工程；上記細胞枯渇サンプルと細胞表面タンパク質結合部分とを接触させる工程であって、ここで上記細胞表面タンパク質結合部分は、上記細胞枯渇サンプル中の血球エクソソーム上の細胞表面タンパク質に結合し得る工程；上記細胞枯渇サンプルから上記細胞表面タンパク質結合部分を除去し、それによって、上記細胞枯渇サンプルから血球エクソソームを除去する工程；および上記細胞枯渇サンプル中の循環している無細胞のＲＮＡを定量する工程であって、ここで上記無細胞のＲＮＡは、目的の組織によって発現される工程を包含する方法。  ２．被験体から血液サンプルを得る工程；上記血液サンプルから細胞を除去して、細胞枯渇サンプルを得る工程；上記血液サンプルから細胞外微粒子を除去して、微粒子枯渇サンプルを得る工程；上記微粒子枯渇サンプル中の遺伝子に相当するＲＮＡの量を定量する工程を包含する方法。  ３．上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、上記細胞外微粒子の表面上のタンパク質と相互作用する結合部分とを接触させる工程を包含する、実施形態１または２に記載の方法。  ４．上記結合部分は、抗体または抗原結合抗体断片である、実施形態１または２に記載の方法。  ５．上記抗体または抗原結合抗体断片は、支持体に付着される、実施形態４に記載の方法。  ６．上記抗体は、血球によって発現されることが公知の細胞表面マーカーと相互作用する、実施形態４に記載の方法。  ７．上記血球は白血球である、実施形態６に記載の方法。  ８．上記抗体は、抗ＣＤ４５抗体を含む、実施形態７に記載の方法。  ９．上記血球は顆粒球である、実施形態６に記載の方法。  １０．上記抗体は、抗ＣＤ６６ｂ抗体を含む、実施形態９に記載の方法。  １１．上記細胞枯渇サンプルと、第１の細胞上の第１のタンパク質と相互作用する第１の抗体および第２の細胞上の第２のタンパク質と相互作用する第２の抗体とを接触させる工程を包含する実施形態４に記載の方法。  １２．上記第１のタンパク質および上記第２のタンパク質は、少なくとも１０アミノ酸が異なる、実施形態１１に記載の方法。  １３．上記第１のタンパク質および上記第２のタンパク質は、異なる遺伝子から発現される、実施形態１１に記載の方法。  １４．上記第１のタンパク質は、上記第２の細胞で発現されず、上記第２のタンパク質は、上記第１の細胞で発現されない、実施形態１１に記載の方法。  １５．上記第１の細胞および上記第２の細胞は、２種の異なるタイプの白血球である、実施形態１１に記載の方法。  １６．定量する工程は、上記微粒子枯渇サンプルに対する上記ＲＮＡの相対的寄与を定量する工程を包含する、実施形態１または２に記載の方法。  １７．定量する工程は、上記ＲＮＡをシーケンシングする工程を包含する、実施形態１または２に記載の方法。  １８．上記ＲＮＡは、上記被験体の任意の他の組織より、目的の組織においてより高度に発現される、実施形態１または２に記載の方法。  １９．上記目的の組織は、神経学的組織である、実施形態１８に記載の方法。  ２０．上記目的の組織は、肝臓、脂肪、腎臓、または神経学的組織である、実施形態１８に記載の方法。  ２１．細胞を除去する工程は、血液を遠心分離または濾過する工程を包含する、実施形態１または２に記載の方法。  ２２．細胞を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルを濾過して、血小板を除去する工程を包含する、実施形態２に記載の方法。  ２３．上記ＲＮＡまたはそのｃＤＮＡを増幅して、増幅した核酸を生成する工程を包含する、実施形態１または２に記載の方法。  ２４．上記増幅する工程は、上記ＲＮＡまたはｃＤＮＡを、ランダムヘキサマーとハイブリダイズする工程を包含する、実施形態２３に記載の方法。  ２５．上記ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡを含む、実施形態１または２に記載の方法。  ２６．定量する工程は、上記ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは増幅した核酸をシーケンシングする工程を包含する、実施形態１、２または２３に記載の方法。  ２７．上記ＲＮＡは、血液において発現されるより、目的の組織においてより高度に発現される、実施形態１または２に記載の方法。  ２８．上記細胞外微粒子はエクソソームである、実施形態１または２に記載の方法。  ２９．上記エクソソームは血球に由来する、実施形態２８に記載の方法。  ３０．上記血球は血小板である、実施形態２９に記載の方法。  ３１．上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、抗ＧｙｐＡ抗体またはそのＧｙｐＡ抗原結合断片とを接触させる工程を包含する、実施形態３０に記載の方法。  ３２．上記血球は赤血球である、実施形態２９に記載の方法。  ３３．上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、抗ＣＤ２３５ａ抗体またはその抗ＣＤ２３５ａ抗原結合断片とを接触させる工程を包含する、実施形態３２に記載の方法。  ３４．上記血球は顆粒球である、実施形態２９に記載の方法。  ３５．上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、抗ＣＤ６６ｂ抗体またはそのＣＤ６６ｂ抗原結合断片とを接触させる工程を包含する、実施形態３４に記載の方法。  ３６．上記血球はリンパ球である、実施形態２９に記載の方法。  ３７．上記細胞外微粒子を除去する工程は、上記細胞枯渇サンプルと、ＣＤ４５、ＣＤ１９もしくはＣＤ３に結合する抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程を包含する、実施形態３６に記載の方法。  ３８．上記ＲＮＡは、細胞、エクソソーム、またはその断片に付着されない、実施形態１または２に記載の方法。  ３９．上記細胞枯渇サンプルは、上記血液サンプル中の細胞のうちの少なくとも９０％が枯渇されている、実施形態１または２に記載の方法。  ４０．上記細胞枯渇サンプルは、血漿または血清を含む、実施形態１または２に記載の方法。  ４１．上記細胞枯渇サンプルは、血漿または血清から本質的になる、実施形態１または２に記載の方法。  ４２．上記ＲＮＡを、上記血漿または血清から精製する工程を包含する、実施形態４１に記載の方法。  ４３．上記血漿または血清は、６０℃において１時間インキュベートされる、実施形態４２に記載の方法。  ４４．カオトロピック塩、界面��性剤、プロテイナーゼＫ、２−メルカプトエタノール、またはこれらの組み合わせの存在下でインキュベートする工程を包含する、実施形態４３に記載の方法。  ４５．上記サンプルをＴｒｉｓとともにインキュベートする工程を包含する、実施形態４３または４４に記載の方法。  ４６．脂質構造およびタンパク質構造を乱す工程を包含する、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の方法。  ４７．上記血漿または血清と、シリカカラムとを接触させる工程を包含する、実施形態４２に記載の方法。  ４８．上記サンプルを、カオトロピック塩および１００％  イソプロパノールとともにインキュベートして、シリカカラムへとＲＮＡの結合を増強する工程を包含する、実施形態４７に記載の方法。  ４９．バキュームマニホールドを使用して、上記サンプルを上記シリカカラムに通す工程を包含する、実施形態４８に記載の方法。  ５０．上記サンプルを、低濃度カオトロピック塩およびエタノールで洗浄する工程を包含する、実施形態４９に記載の方法。  ５１．上記サンプルを１００％  エタノール洗浄液で洗浄して、上記サンプル中の不純物およびインヒビターを除去する工程を包含する、実施形態５０に記載の方法。  ５２．上記シリカカラムから、低イオン緩衝液または水でＲＮＡを溶離する工程を包含する、実施形態４８に記載の方法。  ５３．上記溶離したＲＮＡを、非常に高い触媒効率を有する高純度のインヒビター耐性組換えＤＮａｓｅとともに２０分間インキュベートして、いかなるＤＮＡをも排除する工程を包含する、実施形態５２に記載の方法。  ５４．上記ＲＮＡを、夾雑物およびインヒビターを排除するインヒビター除去カラムに通す工程を包含する、実施形態５３に記載の方法。  ５５．カオトロピック塩および６６％  エタノールを使用して、シリカ膜に上記ＲＮＡを結合させる工程、上記ＲＮＡを洗浄し、溶離する工程を包含する、実施形態５３に記載の方法。  ５６．水で溶離する工程を包含する、実施形態５５に記載の方法。  ５７．血液サンプル中の循環している非血液ＲＮＡを富化する方法であって、上記方法は、上記血液サンプルから血球を枯渇させる工程；および上記血液サンプルからエクソソームを枯渇させる工程を包含する方法。  ５８．血液サンプル中の循環している非血液ＲＮＡを富化する方法であって、上記方法は、上記血液サンプルから血球を枯渇させて、細胞枯渇血液サンプルを生成する工程；および上記細胞枯渇血液サンプルと血球表面結合部分とを接触させる工程を包含する方法。  ５９．枯渇させる工程は、上記血液サンプルを濾過して、上記血球を除去する工程を包含する、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６０．上記血球は血小板を含む、実施形態５９に記載の方法。  ６１．枯渇させる工程は、上記血液サンプルを遠心分離する工程を包含する、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６２．上記方法は、上記血液サンプルから、上記血液サンプル中に本来存在していた細胞のうちの少なくとも９０％を枯渇させる、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６３．上記方法は、上記血液サンプルから、上記血液サンプル中に本来存在していた細胞のうちの少なくとも９９％を枯渇させる、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６４．上記方法は���上記血液サンプルから、上記血液サンプル中に本来存在していた細胞外微粒子のうちの少なくとも９０％を枯渇させる、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６５．上記方法は、上記血液サンプルから、上記血液サンプル中に本来存在していた細胞外微粒子のうちの少なくとも９９％を枯渇させる、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６６．上記非血液ＲＮＡは固形器官に由来する、実施形態５７または５８に記載の方法。  ６７．上記固形器官は、肝臓、脂肪、腎臓または脳である、実施形態６６に記載の方法。  ６８．上記固形器官は、脳または脊髄にある、実施形態６７に記載の方法。  ６９．上記非血液ＲＮＡは非血球タイプに由来する、実施形態５７または５８に記載の方法。  ７０．上記非血球タイプは、乏突起膠細胞である、実施形態６９に記載の方法。  ７１．上記非血液ＲＮＡを定量する工程を包含する。実施形態５７または５８に記載の方法。  ７２．定量する工程は、定量的ＰＣＲおよびシーケンシングから選択される少なくとも１つの方法を含む、実施形態７１に記載の方法。  ７３．被験体の血液サンプルのための容器；容器を回転させて、上記容器に遠心力を適用し、それによって、上記血液サンプルから細胞のうちの少なくとも一部を除去する機械；上記血液サンプルから血小板を除去するためのフィルタ；および細胞外微粒子上のタンパク質と相互作用する抗体を含む、システム。  ７４．複数の抗体を含む、実施形態７３に記載のシステム。  ７５．上記複数の抗体は、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｂ、ＧｙｐＡ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１９、およびＣＤ３のうちの少なくとも１つを含む、実施形態７３に記載のシステム。  ７６．上記抗体は、上記血液サンプルと接触しかつ上記血液サンプルから除去され得る支持体に付着され、それによって、上記血液サンプルから上記細胞外微粒子を除去する、実施形態７３に記載のシステム。  ７７．上記血液サンプル中に存在するＲＮＡを定量するための少なくとも１種の試薬を含む、実施形態７３に記載のシステム。  ７８．被験体から血液サンプルを得る工程；上記血液サンプルを遠心分離または濾過して、血漿サンプルを得る工程；上記血漿サンプルと細胞表面タンパク質結合部分とを接触させる工程であって、ここで上記細胞表面タンパク質結合部分は、上記血漿サンプル中の細胞外微粒子上の細胞表面タンパク質に結合し得、上記細胞
外微粒子は、上記被験体の組織に由来する工程；上記細胞枯渇サンプルから上記細胞表面タンパク質結合部分を除去し、それによって、上記細胞枯渇サンプルから上記細胞外微粒子を除去する工程；および上記細胞外微粒子中のＲＮＡを定量する工程であって、ここで上記ＲＮＡは、上記目的の組織によって発現される工程を包含する方法。  ７９．上記組織は固形器官である、実施形態７８に記載の方法。  ８０．上記細胞表面タンパク質結合部分は、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態７８に記載の方法。  ８１．上記組織は肝臓である、実施形態７８に記載の方法。  ８２．上記細胞表面タンパク質は、アシアロ糖タンパク質レセプター１（ＡＳＧＲ１）またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）である、実施形態８０に記載の方法。  ８３．上記組織は脂肪である、実施形態７８に記載の方法。  ８４．上記細胞表面タンパク質は、ＳＬＣ７Ａ１０または脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）である、実施形態８３に記載の方法。  ８５．上記組織は神経学的組織である、実施形態７８に記載の方法。  ８６．上記細胞表面タンパク質は、グルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）である、実施形態８５に記載の方法。  ８７．上記組織は腎臓である、実施形態７８に記載の方法。  ８８．上記細胞表面タンパク質は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼである、実施形態８７に記載の方法。
【実施例】
【００９３】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例証する目的で示され、いかなる様式でも本発明を限定するとは意味されない。本実施例は、本明細書で記載される方法とともに、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として意図されない。その中での変更および請求項の範囲によって規定されるとおりの本発明の趣旨内に包含される他の使用は、当業者に想起される。
【００９４】
実施例１：無細胞のＲＮＡの単離
Ｖ２抽出法：  血液サンプルを、ＥＤＴＡチューブの中に集め、１９００ｇで１０分間、遠心分離した。血漿を新しいチューブの中に分離した（図３における血小板富化血漿）。血小板を除去するために、その後血漿を１６０００ｇで遠心分離し、０．８μｍフィルタに通した。いくつかの場合には、その血漿を凍結し、３７℃で融解した。血漿から核酸を精製するために、サンプルを、Ｔｒｉｓバックグラウンドにおいて高濃度のカオトロピック塩、界面活性剤、プロテイナーゼＫおよび２−メルカプトエタノールの存在下で、６０℃で１時間インキュベートして、脂質構造およびタンパク質構造を乱した。その溶解後、さらなるカオトロピック塩およびイソプロパノール  １００％をそのサンプルに添加して、シリカカラムへの核酸の結合を増強した。バキュームマニホールドを使用して、サンプルをシリカ膜に通した。サンプルを、低濃度のカオトロピック塩およびエタノールで十分に洗浄し、さらに１００％  エタノールで洗浄して、不純物およびインヒビター（ポリサッカリド、生物塩（ｂｉｏｓａｌｔ）、タンパク質）を除去した。核酸を、低イオン緩衝液または水で溶離した。その後、サンプルを、２０分間、非常に高い触媒効率を有する高純度のインヒビター耐性組換えＤＮａｓｅとともにインキュベートして、いかなるＤＮＡをも排除した。下流の適用において逆転写酵素反応の阻害を防止するために、ｃｆＲＮＡを、夾雑物およびインヒビター（ポリフェノール、フミン酸）を排除するインヒビター除去カラムに通した。残っている酵素および不純物を除去し、そのｃｆＲＮＡを濃縮するために、カオトロピック塩および６６％  エタノールを使用して、そのサンプルをシリカ膜に結合させ、洗浄し、１５μｌの水に溶離した。ｃｆＲＮＡの量、サイズおよび完全性を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を使用して、そのサンプル１μｌをＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ｃｈｉｐにおいて実行することによって予測した。
【００９５】
この方法を、以前から公知の方法（本明細書で旧来の抽出法といわれる）と比較し得る（図３を参照のこと）。以前から公知の方法の例は、以下のとおりである。１ｍｌの血漿を室温において融解し、３０分間、５５℃において、２Ｍ  ＧＴＣ、１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２−メルカプトエタノールおよび２００μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。その溶解後、カオトロピック塩およびエタノールを添加し、そのサンプルをシリカベースのマトリクスを通してスピンダウンした。２．５Ｍ  ＧＴＣ、５０ｍＭ  シトレート、および３７．７％  エタノールでの洗浄後、核酸を水に溶離した。その後、サンプルを、ＤＮａｓｅＩエンドヌクレアーゼで３０分間、３７℃において処理した。最後に、３３％  エタノールおよびカオトロピック塩を使用して、サンプルをシリカマトリクスに結合させ、洗浄し、１５μｌの水に溶離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを使用するｑＰＣＲによって、ｍＲＮＡの量を予測した。ヒト１８Ｓ転写物を、ＲＮＡ濃度を予測するための代理物として使用した（１８Ｓ＿Ｆ：  ５’−ＧＧＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＣ；  １８Ｓ−逆方向：  ５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＴ；  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＷＣＯ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）。ヒト脳組織全ＲＮＡを使用して、較正曲線を作成した（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）。リアルタイム定量ＰＣＲを、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で行った。
【００９６】
実施例２．  無細胞の核酸の免疫枯渇および富化
血漿サンプルを、被験体から得た。その血漿は、多数のタイプの血球に由来するエクソソームを含んだ。血漿を、ＣＤ４５抗体とともにインキュベートした。ＣＤ４５抗体を標的とする磁性粒子を、その血漿サンプルに添加した。磁石を使用して、その磁性粒子および結合した構造を除去し、結合しなかったエクソソームを残した。その得られたサンプルは、エクソソームの除去後の単核細胞に由来するいくらかの転写物を含み、ＲＮＡシーケンシングによって測定されるように、表１に示されるとおりのこの細胞タイプからの転写物の１０倍枯渇を示した。
【００９７】
そのサンプルをシーケンシングによって分析した。以下の表は、特定の細胞タイプによって表されるリードの％を示す。例えば、単核細胞（リンパ球および単球）は、枯渇前には細胞のうちの８．８３１％を、および枯渇後には０．８９３％を占めた。
【表１】
2020534036.tif 000005
【００９８】
実施例３．無細胞のＲＮＡの定量に関するＱ−ＰＣＲ効率の評価
肝臓ｍＲＮＡのｑＰＣＲから生成した各アンプリコンを、肝臓組織ｍＲＮＡの滴定に対して比較して、ｑＰＣＲ反応の効率を決定した。１００％であると予測される理想的ＰＣＲ反応に関して予測される１サイクルあたりの倍加と比較した収率のパーセンテージとして効率を計算する。結果を図５に示す。ｘ軸は線維症ステージである。問い合わせたＲＮＡは、以下の遺伝子に相当する。
【００９９】
実施例４．同量のＲＮＡから出発する２つのＰＣＲ複製物の間の再現性
ＲＮＡを、コントロールドナー血漿のプールから得た。１ｍｌの血漿からのＲＮＡが、１５マイクロリットルの抽出物中に含まれる。結果については図７を参照のこと。Ｘ軸およびＹ軸には、ＰＣＲのＣｔカウントが示される。
【０１００】
実施例５：多数の血球エクソソームを除去するための抗体カクテルの使用
血漿サンプルを、被験体から得る。その血漿は、多数のタイプの血球に由来するエクソソームを含む。その多数のタイプの血球に対応する細胞表面マーカーに結合する抗体を有する磁性ビーズを、その血漿サンプルに添加し、インキュベートする。代わりにまたはさらに、多くの血球タイプで発現される細胞表面マーカーに結合する単一の抗体を使用する。そのサンプルを磁石に供し、望ましくないエクソソームを血漿サンプルから除去し、目的のエクソソームを残す。その得られたサンプルは、エクソソームの除去後に血球に由来する遙かにより少ない転写物を含み、組織特異的転写物の検出感度を増大させる。
【０１０１】
その残っているサンプル中の目的の核酸を、以下の工程に従って分析する。
・収集：  ＥＤＴＡ−  ２回スピン、続いて濾過  →  血小板の減少  １回の低速スピン、続いて、高速スピン（１６ｋ）が好ましい。上清を凍結する。
・抽出：  サンプルを融解し、続いて、濾過し、Ｑｉａｇｅｎ  ＣＮＡキット  →  血小板が少ない血漿からの収量が１０×増大、より長い転写物に加えてより小さなｃｆＲＮＡ種（１００塩基）
・クリーンアップ：  ポリフェノールインヒビター除去カラム、カラム外組換えＤＮＡｓｅ（ｏｆｆ−ｃｏｌｕｍｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡｓｅ）、クリーンアップカラム
・ＲＴ：  高濃度ランダムヘキサマーでのＳＳ  ＩＶ  ２工程
・ＲＱ−ＰＣＲ：  全プライマーを含む増幅前工程において異なるプライマーでのネスト化デザイン、続いて、エキソヌクレアーゼ１処理して、１本鎖プライマーを除去し、続いて、最終ＰＣＲ検出反応のための１対のネスト化プライマーを使用して別個のマイクロチャンバの中で最終増幅。残っている血球および他の器官（目的のもの以外）に由来する核酸は、正規化のために含まれる。
・Ｓｗｉｆｔ  １Ｓを使用して、そのサンプル中の核酸のシーケンシングライブラリーを調製し、続いて、標的富化を行う。
・データ処理：  アラインメントの前に部分的アセンブリ、エントロピーに基づく血球割り当て。
【０１０２】
図１６：右パネルは、以前に考察した改善のうちの全てを含む：１）「Ｍｏｌｓｔｒａｃｔ」から新たな抽出（ＣＮＡ）キットへの切り替え、２）ポリフェノールインヒビター除去カラムの追加、３）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳｍａｒｔｅｒからＳｗｉｆｔ  １ｓライブラリー調製への切り替え、４）一重捕捉富化から多重（１６サンプル）捕捉富化への切り替え。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書で示されかつ記載されてきたが、このような実施形態が例示によって提供されるに過ぎないことは、当業者に明らかである。多くのバリエーション、変更および置換は今や、本発明から逸脱することなく、当業者に想起される。本明細書で記載される発明の実施形態に対する種々の質変化が、本発明を実施するにあたって使用され得ることは、理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物が請求項によって網羅されることが意図される。
【図１】
2020534036.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020534036.tif 000016
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020534036.tif 000025