(57)【要約】  本開示は、炎症、ならびに炎症性疾患、障害、および状態を処置するために、加えて、自己免疫疾患、細菌感染により引き起こされる疾患もしくは障害、または癌を処置するために、アルファ−キナーゼ１（ＡＬＰＫ１）を阻害することに関連した方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の処置を必要としている対象において炎症を処置するための方法であって、アルファ−キナーゼ１（ＡＬＰＫ１）阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
炎症性疾患、障害、または状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要としている対象にアルファ−キナーゼ１（ＡＬＰＫ１）阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項３】
炎症性疾患または障害が、炎症促進性サイトカインの過剰産生による、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、放射線誘発性炎症、乾癬、Ｔ細胞媒介性過敏性疾患、アレルギー性疾患、アトピー性皮膚炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（グレーブス病）、多発性硬化症、強直性脊椎炎、および水疱症から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
炎症性疾患または障害が、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、および放射線誘発性炎症から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
炎症性腸疾患がクローン病および潰瘍性大腸炎から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＡＬＰＫ１阻害剤がキナーゼ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キナーゼ阻害剤が、１−ベンジル−３−ヘキサデシル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム  ヨウ素化塩または他のそのハロゲン塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＬＰＫ１阻害剤が、ＡＬＰＫ１に方向付けられた抗体または抗ＡＬＰＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＡＬＰＫ１阻害剤がＡＬＰＫ１アンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＬＰＫ１阻害剤が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群から選択されるＡＬＰＫ１に方向付けられた干渉ＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７に記載のキナーゼ阻害剤、および担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
炎症の処置を必要としている対象において炎症を処置する方法における使用のためのＡＬＰＫ１の阻害剤。
【請求項１３】
炎症促進性サイトカインの過剰産生による、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、放射線誘発性炎症、乾癬、Ｔ細胞媒介性過敏性疾患、アレルギー性疾患、およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される炎症性疾患、障害、または状態を処置する方法における使用のためのＡＬＰＫ１の阻害剤。
【請求項１４】
炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、または放射線誘発性炎症を処置するための方法における請求項１２に記載のＡＬＰＫ１の阻害剤。
【請求項１５】
クローン病または潰瘍性大腸炎を処置するための方法における請求項１３に記載のＡＬＰＫ１の阻害剤。
【請求項１６】
炎症促進性サイトカインの過剰産生による、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、放射線誘発性炎症、乾癬、Ｔ細胞媒介性過敏性疾患、アレルギー性疾患、およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される炎症性疾患、障害、または状態を処置する方法における使用のための請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
クローン病または潰瘍性大腸炎を処置する方法における使用のための請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
処置を必要としている対象において、自己免疫疾患、細菌感染により引き起こされる疾患もしくは障害、または癌を処置するための方法であって、アルファ−キナーゼ１（ＡＬＰＫ１）阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
癌を処置する方法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌が、軟部組織肉腫、乳癌、頭頚部癌、メラノーマ、子宮頚癌、膀胱癌、血液悪性腫瘍、神経膠芽腫、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、腎癌、肺癌、メルケル細胞癌、小腸癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、胃癌、胃腸間質性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、脳癌、および多発性骨髄腫から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
癌が乳癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
自己免疫疾患を処置するための方法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
自己免疫疾患が、全身性血管炎、糸球体腎炎（連鎖球菌感染後糸球体腎炎）、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、痛風、痛風性関節炎、反応性関節炎、敗血症性ショック、グレーブス病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性筋炎、悪性貧血、セリアック病、湿疹、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性心筋炎、セリアック病、若年性特発性関節炎、グレーブス眼症、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性ぶどう膜炎（uveoitis）、円形脱毛症、ウェゲナー、白斑、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、ギラン・バレー症候群、抗リン脂質抗体症候群、サルコイドーシス疼痛、円形脱毛症、ランバート・イートン筋無力症症候群、自己免疫性溶血性貧血、寒冷凝集素症、温式自己免疫性溶血性貧血、多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症（チャーグ・シュトラウス症候群）、およびベーチェット病から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細菌感染により引き起こされる疾患または障害を処置するための方法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
疾患または障害が、慢性感染症、敗血症、およびサイトカインストームから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
疾患または障害が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、およびＢｒｕｃｅｌｌａから選択される細菌により引き起こされる、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[01]本発明は、アルファ−プロテインキナーゼ１（ＡＬＰＫ１）を阻害することにより炎症ならびに関連した疾患および障害を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[02]炎症応答の機構に関する研究は、必須のシグナル伝達コンポーネントとして働く様々なプロテインキナーゼを同定している。プロテインキナーゼの欠陥は、ヒト炎症性疾患、癌、および糖尿病の原因と関連している場合が多い。
【０００３】
[03]アルファ−キナーゼは、通常のプロテインキナーゼとほとんど配列類似性を示さない、新規のプロテインキナーゼスーパーファミリーを代表する。アルファ−プロテインキナーゼ１（ＡＬＰＫ１）、ＡＬＰＫ２、ＡＬＰＫ３、伸長因子２キナーゼ（ｅＥＦ２Ｋ）、および一過性受容器電位カチオンチャネルＭ６およびＭ７（ＴＲＰＭ６およびＴＲＰＭ７）を含む合計６つのアルファ−キナーゼメンバーが同定されている。Ｒｙａｚａｎｏｖ  ＡＧら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９９、９（２）：Ｒ４３〜４５；Ｒｙａｚａｎｏｖ  ＡＧら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７、９４（１０）：４８８４〜４８８９。
【０００４】
[04]ＡＬＰＫ１は、上皮細胞においてラフト含有スクロースイソメラーゼ（ＳＩ）小胞の新しいコンポーネントとして同定された。Ｈｅｉｎｅｔ  Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０（２７）：２５６３７〜２５６４３。ＡＬＰＫ１はミオシン１をリン酸化し、頂端部細胞膜への開口放出輸送において重要な役割を果たすことが示された。マウスにおけるＡＬＰＫ１のトランスポゾン挿入によるホモ接合性不活化変異は、完全長ＡＬＰＫ１を過剰発現することにより救出され得る運動協調性欠陥を生じた。Ｃｈｅｎ  Ｍら、（２０１１）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：１。
【０００５】
[05]いくつかの遺伝的関連研究は、ＡＬＰＫ１を痛風のリスクに関連付けたが、同定された多型の全部が全ての集団で複製するとは限らなかった。Ｗａｎｇ  ＳＪら、（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８９：１２４１〜１２５１；Ｋｏ  ＡＭら、（２０１３）Ｊ．Ｉｎｔｌ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．４２：４６６〜４７４；Ｃｈｉｂａ  Ｔら、（２０１５）Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ２８：１〜４。他の遺伝的関連研究は、ＡＬＰＫ１を、慢性腎臓疾患、心筋梗塞、および糖尿病のリスク因子として結びつけた。Ｙａｍａｄａ  Ｙら、（２０１３）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ５０：４１０〜４１８；Ｆｕｊｉｍａｋｉ  Ｔら、（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔ．  ２：１２７〜１３１；Ｓｈｉｍｏｔａｋａ  Ｓら、（２０１３）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔ．  １：９４０〜９４４；Ｙａｍａｄａ  Ｙら、（２０１５）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐｏｒｔ  ＤＯＩ：１０．３８９２／ｂｒ．２０１５．４３９。
【０００６】
[06]追加の機能研究は、ＡＬＰＫ１を、免疫応答に関与するものとして関連付けている。例えば、ＡＬＰＫ１は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓの感染に対する応答において、それのＴＩＦＡオリゴマー化およびＩＬ−８発現の促進を通しての細菌に対する自然免疫の制御因子であることが示唆された。Ｍｉｌｉｖｏｊｅｖｉｃ  Ｍら、（２０１７）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １３（２）：ｅ１００６２２４。マウスにおけるＡＬＰＫ１の過剰発現は、テストステロンのレベルの低下、ならびに炎症促進性サイトカインＩＬ−１βおよびＴＧＦ−βの産生の増加を生じ、ＡＬＰＫ１とテストステロンのバランスが、炎症促進性サイトカインのテストステロン媒介性阻害において役割を果たし得ることを示唆した。Ｋｕｏ  ＴＭら、（２０１５）Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１５）１５４：１５０〜１５８。最近、ミオシンＩＩＡが、痛風紅斑においてＡＬＰＫ１調節性ＴＮＦ輸送と相互作用することが示された。Ｌｅｅ  ＣＰら、（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔ  ６：２５７４０。
【０００７】
[07]ＡＬＰＫ１発現および変異はまた、肺癌、結腸直腸癌、および乳癌を含むある特定の癌に見いだされている。Ｌｉａｏ  ＨＦら、（２０１６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ６：２７３５０；Ｓｔｒｉｅｔｚ  Ｊら、（２０１６）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  １−１６。
【０００８】
[08]高血糖症のマウスモデルにおいて、ＡＬＰＫ１の過剰発現が、複数の初期腎障害を加速した。Ｋｕｏ  ＴＭら、（２０１６）Ｂｉｏｃｈｉｍｋａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｋａ  Ａｃｔａ  １８６２：２０３４〜２０４２。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[09]臨床症状が過剰性および／または慢性炎症に起因する多くの疾患、障害、および状態がある。そのような疾患、障害、および状態を処置するために標的組織において炎症を阻害し、および／または低下させるための新しい方法の必要性がある。本開示は、この必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[10]本発明は、一部には、ＡＬＰＫ１の阻害が、炎症のいくつかの異なる動物モデルにおいて炎症およびそれの臨床効果を低下させ、加えて、多様なヒトおよびマウス細胞株において炎症促進性サイトカインの産生を低下させるのに有効であるという発見に基づいている。したがって、本開示は、そのような処置を必要としている対象において炎症を処置する方法であって、前記対象にＡＬＰＫ１阻害剤を投与するステップを含む、方法を提供する。本開示はまた、炎症性疾患、障害、または状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要としている対象にＡＬＰＫ１阻害剤を投与するステップを含む、方法を提供する。実施形態において、炎症性疾患、障害、または状態は、慢性または過剰性炎症により特徴付けられる。
【００１１】
[11]実施形態において、炎症性疾患または障害は、炎症促進性サイトカインの過剰産生による、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、痛風、放射線誘発性炎症、乾癬、心血管疾患、糖尿病、肺、結腸、および乳房の癌を含む上皮癌、Ｔ細胞媒介性過敏性疾患、アレルギー性疾患、アトピー性皮膚炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（グレーブス病）、多発性硬化症、強直性脊椎炎、および水疱症から選択される。
【００１２】
[12]実施形態において、炎症性腸疾患または障害は、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、および放射線誘発性炎症から選択される。実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎から選択される。
【００１３】
[13]実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、キナーゼ阻害剤である。実施形態において、キナーゼ阻害剤は、１−ベンジル−３−ヘキサデシル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム  ヨウ素化塩または他のそのハロゲン塩である。
【００１４】
[14]実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、ＡＬＰＫ１に方向付けられた抗体、または抗ＡＬＰＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である。
[15]実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、ＡＬＰＫ１アンチセンスポリヌクレオチドである。実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群から選択されるＡＬＰＫ１に方向付けられた干渉ＲＮＡである。
【００１５】
[16]実施形態において、本開示はまた、本明細書に記載された方法における使用のための、ＡＬＰＫ１阻害剤および担体または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、キナーゼ阻害剤である。実施形態において、キナーゼ阻害剤は、１−ベンジル−３−ヘキサデシル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム  ヨウ素化塩または他のそのハロゲン塩である。実施形態において、薬学的組成物は、経口または直腸経路による送達のために製剤化される。実施形態において、薬学的組成物は、錠剤またはカプセルの形をとった経口剤形として製剤化される。実施形態において、薬学的組成物は、軟膏、坐剤、または浣腸の形をとった直腸剤形として製剤化される。実施形態において、薬学的組成物は、非経口剤形として製剤化される。実施形態において、非経口剤形は、例えば水性液体の注射による、静脈内、動脈内、または筋肉内経路による投与に適している。
【００１６】
[17]本開示はまた、自己免疫疾患、細菌感染により引き起こされる疾患もしくは障害、または癌を、そのような処置を必要としている対象において処置するための方法であって、前記対象にアルファ−キナーゼ１（ＡＬＰＫ１）阻害剤を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１７】
[18]方法が癌を処置する方法である実施形態において、癌は、肺癌、結腸直腸癌、および乳癌から選択され得る。
[19]方法が自己免疫疾患を処置するための方法である実施形態において、自己免疫疾患は、全身性血管炎、糸球体腎炎（連鎖球菌感染後糸球体腎炎）、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、痛風、痛風性関節炎、反応性関節炎、敗血症性ショック、グレーブス病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性筋炎、悪性貧血、セリアック病、湿疹、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性心筋炎、セリアック病、若年性特発性関節炎、グレーブス眼症、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性ぶどう膜炎（uveoitis）、円形脱毛症、ウェゲナー、白斑、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、ギラン・バレー症候群、抗リン脂質抗体症候群、サルコイドーシス疼痛、円形脱毛症、ランバート・イートン筋無力症症候群、自己免疫性溶血性貧血、寒冷凝集素症、温式自己免疫性溶血性貧血、多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症（チャーグ・シュトラウス症候群）、およびベーチェット病から選択され得る。
【００１８】
[20]方法が、細菌感染により引き起こされる疾患または障害を処置するための方法である実施形態において、疾患または障害は、慢性感染症、敗血症、およびサイトカインストームから選択され得る。実施形態において、疾患または障害は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、およびＢｒｕｃｅｌｌａから選択される細菌により引き起こされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[21]不活化ＡＬＰＫ１変異がＤＳＳ誘導性大腸炎に対する抵抗性を与えることを示す図である。体重パーセンテージ変化（％）、三角形、野生型（ＷＴ）；菱形、ヘテロ接合性変異体（ＨＥ）；四角形、ホモ接合性変異体（ＨＯ）。
【図２】[22]図２Ａは、不活化ＡＬＰＫ１変異が放射線誘発性体重減少に対する抵抗性を与えることを示す図である。ｙ軸は、パーセンテージ体重変化を示す。図２Ｂは、不活化ＡＬＰＫ１変異が放射線誘発性体重減少に対する抵抗性を与えることを示す図である。ｙ軸は、生存率を示す。
【図３】[23]不活化ＡＬＰＫ１変異が高脂肪食誘導性肥満に対する抵抗性を与えることを示す図である。「ＨＦＤ」は、「高脂肪食処理」を指し、ｙ軸はパーセンテージ体重変化を示す。
【図４】[24]図４Ａは、不活化ＡＬＰＫ１変異がコラーゲン誘導性関節炎に対する抵抗性を与えることを示す図である。ＡＬＰＫ１変異体雄  足蹠ＲＡスコア。図４Ｂは、不活化ＡＬＰＫ１変異がコラーゲン誘導性関節炎に対する抵抗性を与えることを示す図である。ＡＬＰＫ１変異体雄  左と右の、後ろ足蹠厚さの差。
【図５】[25]ＡＬＰＫ１のｓｉＲＮＡによるノックダウンがＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてサイトカイン発現の減少をもたらすことを示す図である。
【図６】[26]図６Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＬＰＫ１のノックダウンが、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物誘導ならびにヒトおよびマウスＡＬＰＫ１の過剰発現によるサイトカイン発現の減少をもたらすことを示す図である。図６Ｂは、ＩＬ８が測定されて、Ｆｌａｇ−ＡＬＰＫ１、マウスＡＬＰＫ１、６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１−３＊Ｆｌａｇ、６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１による効率的なＩＬ８発現が示されているが、６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１−Ｅ変異体によっては示されなかった。ＡＬＰＫ１は、サイトカイン発現障害を救出することができるが、キナーゼ死滅変異体については救出できない。
【図７】[27]図７Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＬＰＫ１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトが、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物誘導によるサイトカイン発現および分泌の減少をもたらすことを示す図である。野生型ＨＥＫ２９３Ｔ対照に対して標準化された相対的発現。図７Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＬＰＫ１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトが、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物誘導によるサイトカイン発現および分泌の減少をもたらすことを示す図である。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物誘導から４時間後のＨＥＫ２９３Ｔの条件培地におけるＩＬ８濃度。
【図８】[28]ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＬＰＫ１のノックダウンが、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞可溶化物誘導によるサイトカイン発現の減少をもたらすことを示す図である。
【図９】[29]図９Ａは、ＴＨＰ−１マクロファージ細胞における低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるＡＬＰＫ１ノックダウンが、ＬＰＳ誘導が有る場合、炎症促進性サイトカインの発現の低下をもたらすことを示す図である。図９Ｂは、ＴＨＰ−１マクロファージ細胞における低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるＡＬＰＫ１ノックダウンが、ＬＰＳ誘導が無い場合、炎症促進性サイトカインの発現の低下をもたらすことを示す図である。
【図１０】[30]図１０Ａは、ＴＨＰ−１マクロファージ細胞におけるＡＬＰＫ１のｓｈＲＮＡによるノックダウンが、ＴＮＦαの分泌の阻害を生じることを示す図である。図１０Ｂは、ＴＨＰ−１マクロファージ細胞におけるＡＬＰＫ１のｓｈＲＮＡによるノックダウンが、ＩＬ１βの分泌の阻害を生じることを示す図である。
【図１１】[31]ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞株マクロファージにおけるｓｉＲＮＡによるＡＬＰＫ１ノックダウンがＴＮＦα、ＩＬ１β、およびＩＬ８の発現の減少を生じたことを示す図である。
【図１２】[32]図１２Ａは、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ様細胞株におけるｓｈＲＮＡによるＡＬＰＫ１ノックダウンが、ＬＰＳの存在下で、サイトカイン発現の減少をもたらすことを示す図である。図１２Ｂは、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ様細胞株におけるｓｈＲＮＡによるＡＬＰＫ１ノックダウンが、ＬＰＳの非存在下で、サイトカイン発現の減少をもたらすことを示す図である。
【図１３】[33]不活化ＡＬＰＫ１変異を有するマウスから単離された骨髄由来マクロファージ細胞において、炎症促進性サイトカイン発現が減少したことを示す図である。
【図１４】[34]ＡＬＰＫ１阻害剤ＭＩ６Ｃが、ＤＳＳ誘導性大腸炎モデルにおいて回復を向上させることを示す図である。マウスを、３％ＤＳＳで０日目から５日目まで処理し、その後、飲料水に変え、ＤＭＳＯに溶解したＭＩ６Ｃ（１ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）かまたはＤＭＳＯ単独（ｎ＝５）のいずれかを毎日、ＩＰ注射した。Ｙ軸は、０日目に対する体重の変化を示し、Ｘ軸は時間（日）を示す。
【図１５Ａ】[35]図１５Ａは、ＡＬＰＫ１変異が、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ乳癌モデルにおいて腫瘍増殖および転移を低下させることを示す図である。各パネルにおいて、ＡＬＰＫ１変異を有するマウスは、暗色のバーにより示されており、ニセのトランスジェニック対照は明色のバーにより示されている。Ａ、乳房腫瘍出現週齢；Ｂ、乳房腫瘍出現から１０週間後における乳房腫瘍量；Ｃ、乳房腫瘍出現から１０週間後における肺腫瘍量（乳房腫瘍からの転移）；Ｄ、乳房腫瘍発症から１０週間後における肺重量（乳房腫瘍からの転移）。
【図１５Ｂ】[35]図１５Ｂは、ＡＬＰＫ１変異が、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ乳癌モデルにおいて腫瘍増殖および転移を低下させることを示す図である。各パネルにおいて、ＡＬＰＫ１変異を有するマウスは、暗色のバーにより示されており、ニセのトランスジェニック対照は明色のバーにより示されている。Ａ、乳房腫瘍出現週齢；Ｂ、乳房腫瘍出現から１０週間後における乳房腫瘍量；Ｃ、乳房腫瘍出現から１０週間後における肺腫瘍量（乳房腫瘍からの転移）；Ｄ、乳房腫瘍発症から１０週間後における肺重量（乳房腫瘍からの転移）。
【図１５Ｃ】[35]図１５Ｃは、ＡＬＰＫ１変異が、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ乳癌モデルにおいて腫瘍増殖および転移を低下させることを示す図である。各パネルにおいて、ＡＬＰＫ１変異を有するマウスは、暗色のバーにより示されており、ニセのトランスジェニック対照は明色のバーにより示されている。Ａ、乳房腫瘍出現週齢；Ｂ、乳房腫瘍出現から１０週間後における乳房腫瘍量；Ｃ、乳房腫瘍出現から１０週間後における肺腫瘍量（乳房腫瘍からの転移）；Ｄ、乳房腫瘍発症から１０週間後における肺重量（乳房腫瘍からの転移）。
【図１５Ｄ】[35]図１５Ｄは、ＡＬＰＫ１変異が、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴ乳癌モデルにおいて腫瘍増殖および転移を低下させることを示す図である。各パネルにおいて、ＡＬＰＫ１変異を有するマウスは、暗色のバーにより示されており、ニセのトランスジェニック対照は明色のバーにより示されている。Ａ、乳房腫瘍出現週齢；Ｂ、乳房腫瘍出現から１０週間後における乳房腫瘍量；Ｃ、乳房腫瘍出現から１０週間後における肺腫瘍量（乳房腫瘍からの転移）；Ｄ、乳房腫瘍発症から１０週間後における肺重量（乳房腫瘍からの転移）。
【図１６】[36]ヒトＡＬＰＫ１アイソフォーム１のアミノ酸配列を示す図である。アイソフォーム２の配列は、以下のように、アイソフォーム１と異なる：１〜９２：ＭＮＮＱＫＶＶＡＶＬ．．．ＶＩＧＡＧＬＱＱＬＬ  →  ＭＣＲＫＲＴＲＡＲＴＳＡＡＥ
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[37]本発明は、一部には、ＡＬＰＫ１が、炎症の多様な細胞および動物モデルにおいて炎症応答の強力な誘導因子であり、それゆえに、それの阻害が、炎症を阻害し、かつそれの有害効果を改善するのに有効であるという発見に基づいている。したがって、本開示は、炎症を処置するため、ならびに過剰性および／または慢性炎症により特徴付けられた疾患、障害、および状態を処置するための、加えて、自己免疫疾患、細菌感染により引き起こされた疾患および障害、ならびに癌を処置するための、そのような処置を必要としている対象にＡＬＰＫ１阻害剤を投与することにより、または前記対象においてＡＬＰＫ１を、例えば遺伝子治療アプローチおよび関連組成物を用いて阻害することによる、方法を提供する。
【００２１】
[38]用語「ＡＬＰＫ１」は、本文が明確に特定のアイソフォームを指すことがない限り、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにより同定されたヒト配列  −  Ｑ９６ＱＰ１（ＡＬＰＫ１＿ＨＵＭＡＮ）のアイソフォーム１（Ｑ９６ＱＰ１−１）またはそのオルタナティブスプライスバリアントアイソフォーム２（Ｑ９６ＱＰ１−２）を交換可能に指すように本明細書で用いられる。図１６および配列番号１を参照されたい。アイソフォーム２は、以下のように、アイソフォーム１と異なる：
１〜９２：ＭＮＮＱＫＶＶＡＶＬ．．．ＶＩＧＡＧＬＱＱＬＬ  →  ＭＣＲＫＲＴＲＡＲＴＳＡＡＥ
[39]実施形態において、炎症性疾患または障害は、炎症促進性サイトカインの過剰産生による、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、痛風、放射線誘発性炎症、乾癬、心血管疾患、糖尿病、肺、結腸、および乳房の癌を含む上皮癌、Ｔ細胞媒介性過敏性疾患、アレルギー性疾患、ならびにアトピー性皮膚炎から選択される。
【００２２】
[40]実施形態において、炎症性疾患または障害は、炎症性腸疾患、関節炎、肥満症、および放射線誘発性炎症から選択される。実施形態において、炎症性腸疾患または障害は、クローン病および潰瘍性大腸炎から選択される。
【００２３】
[41]実施形態において、自己免疫疾患は、全身性血管炎、糸球体腎炎（連鎖球菌感染後糸球体腎炎）、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、痛風、痛風性関節炎、反応性関節炎、敗血症性ショック、グレーブス病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性筋炎、悪性貧血、セリアック病、湿疹、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性心筋炎、セリアック病、若年性特発性関節炎、グレーブス眼症、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性ぶどう膜炎（uveoitis）、円形脱毛症、ウェゲナー、白斑、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、ギラン・バレー症候群、抗リン脂質抗体症候群、サルコイドーシス疼痛、円形脱毛症、ランバート・イートン筋無力症症候群、自己免疫性溶血性貧血、寒冷凝集素症、温式自己免疫性溶血性貧血、多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症（チャーグ・シュトラウス症候群）、およびベーチェット病から選択される。
【００２４】
[42]実施形態において、細菌感染により引き起こされる疾患または障害は、慢性感染症、敗血症、およびサイトカインストームから選択される。実施形態において、疾患または障害は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、およびＢｒｕｃｅｌｌａから選択される細菌により引き起こされる。
【００２５】
[43]実施形態において、癌は、軟部組織肉腫、乳癌、頭頚部癌、メラノーマ、子宮頚癌、膀胱癌、血液悪性腫瘍、神経膠芽腫、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、腎癌、肺癌、メルケル細胞癌、小腸癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、胃癌、胃腸間質性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、脳癌、および多発性骨髄腫から選択される。
【００２６】
[44]実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤はキナーゼ阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、１−ベンジル−３−ヘキサデシル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム（ＮＨ−１２５、ＣＡＳ  ２７８６０３−０８−０としても知られており、それは、本明細書においてＭＩ６またはＭＩ６Ｃと呼ばれる場合がある）：
【００２７】
【化１】
2020525554.tif 000002
【００２８】
実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、１−ベンジル−３−ヘキサデシル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムのハロゲン塩である。実施形態において、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、およびアスタチンから選択される。実施形態において、ハロゲンはヨウ素である。
【００２９】
[45]実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、ＡＬＰＫ１に方向付けられた抗体または抗ＡＬＰＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である。実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、または前述のいずれかの抗原結合断片である。「抗体」という総称的な用語は、免疫グロブリン分子、およびそれらの抗原結合活性断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。そのような断片は、別の免疫グロブリンドメインと融合していてもしていなくてもよく、その別の免疫グロブリンドメインには、Ｆｃ領域またはその断片が挙げられるが、それらに限定されない。抗原結合断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片が挙げられる。これらの断片は、無傷抗体の重鎖定常断片（Ｆｃ）を欠損し、それらが、無傷抗体より、循環からより迅速にクリアランスされかつ非特異的結合をあまり生じない傾向にあるため、好まれる場合がある。そのような断片は、当技術分野において知られた方法を用いて、例えば、（Ｆａｂ断片を作製するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）ペプシンなどの酵素でのタンパク質切断により、無傷抗体から作製される。好ましくは、抗原結合断片は、重鎖の二量体（ラクダ科抗体）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）断片である。他の融合産物が作製され得ることを当業者は認識しているだろうし、その融合産物には、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）−Ｆｃ融合体、およびｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体が挙げられるが、それらに限定されない。免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹを含む任意の型、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を含む任意のクラス、または任意のサブクラスであり得る。
【００３０】
[46]好ましくは、本明細書に記載された方法における治療用の抗体は、モノクローナル抗体、好ましくはＩｇＧ抗体である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に特異的な抗体の実質的に均一な集団に由来し、その集団は、実質的に類似したエピトープ結合部位を含有する。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびその任意のサブクラスであり得る。モノクローナル抗体産生のための方法は、当技術分野において知られており、例えば、ハイブリドーマテクノロジーである。実施形態において、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、もしくはヒト化抗体、またはその抗原結合断片、好ましくは、対象、好ましくはヒト対象に投与された時、低毒性を示す抗原結合断片である。
【００３１】
[47]実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤はＡＬＰＫ１アンチセンスポリヌクレオチドである。実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群から選択されるＡＬＰＫ１に方向付けられた干渉ＲＮＡである。
【００３２】
[48]実施形態において、遺伝子治療アプローチは、ＡＬＰＫ１を阻害するために用いられ得る。実施形態において、遺伝子治療アプローチは、遺伝子編集技術を用いてＡＬＰＫ１に不活化変異を導入するステップを含み得る。実施形態において、遺伝子編集技術には、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９に基づいた技術が挙げられ得る。
【００３３】
[49]本明細書に記載された方法の関連において、用語「処置すること」は、処置されることになっている疾患、障害、または状態に関連した１つまたは複数の症状の改善または安定化を指し得る。用語「処置すること」はまた、疾患、障害、または状態の管理を包含し得、対象が治療から得る有益な効果であるが、根本的な疾患、障害、または状態の治癒を生じない効果も指す。本開示の関連において、用語「防止」は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状の再発、発生、進行、または発症を防止することを指す。
【００３４】
[50]治療有効量の組成物が対象に投与される実施形態において、治療有効量は、所望の治療結果、例えば、処置されることになっている疾患、障害、もしくは状態の１つもしくは複数の症状の改善もしくは安定化を達成するのに十分な量、または防止の関連においては、疾患、障害、もしくは状態の１つもしくは複数の症状の再発、発生、進行、もしくは発症の防止を達成するのに十分な量である。
【００３５】
[51]実施形態において、治療有効量は、標準治療と比較して少なくとも等価の治療効果を達成するのに必要とされる量である。標準治療の例は、同じ疾患、障害、または状態を処置するのに適応されるＦＤＡ認可薬物である。
【００３６】
[52]本明細書に記載された方法のいずれかの関連において、対象は、好ましくは、ヒトであるが、非ヒト哺乳動物、好ましくは、非ヒト霊長類であり得る。他の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、例えば、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ）、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、または任意の他の非ヒト哺乳動物であり得る。
【００３７】
[53]実施形態において、ヒト対象は、成人ヒト、小児ヒト、または老人ヒトから選択され、それらの用語は、医師により理解されており、例えば、米国食品医薬品局により定義されている通りである。
【００３８】
[54]実施形態において、本開示は、有機小分子（例えば、１−ベンジル−３−ヘキサデシル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム  ヨウ素化塩または他のそのハロゲン塩）の形をとった、またはタンパク質（例えば、ＡＬＰＫ１に方向付けられた抗体またはそのＦｃ断片）もしくは核酸（例えば、ＡＬＰＫ１に方向付けられたアンチセンスポリヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの干渉ＲＮＡ）などの大きな生体分子の形をとった、ＡＬＰＫ１阻害剤を提供する。本開示の関連において、総称的な用語「化合物」は、有機小分子と大きな生体分子の両方を包含するものとする。
【００３９】
[55]実施形態において、本開示は、ＡＬＰＫ１阻害剤、および１つまたは複数の賦形剤または担体、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物を提供する。本明細書で用いられる場合、句「薬学的に許容される」は、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合って、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしに、妥当な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触しての使用に適している、化合物、材料、組成物、担体、および／または剤形を指す。薬学的組成物を調製するための賦形剤は、一般的に、ヒトまたは動物身体に投与された時、安全かつ無毒性であることが知られているものである。薬学的に許容される賦形剤の例には、非限定的に、無菌液体、水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、油、界面活性剤、懸濁化剤、炭水化物（例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、またはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、および前述のいずれかの適切な混合物が挙げられる。組成物に利用される特定の賦形剤は、製剤化されることになっている化合物の化学的安定性および溶解性、ならびに意図された投与経路を含む様々な因子に依存する。
【００４０】
[56]薬学的組成物は、バルクまたは単位剤形で提供され得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために単位剤形で薬学的組成物を製剤化することは特に有利である。用語「単位剤形」は、処置されるべき対象についての単位の投薬量として適した物理的に別々の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。単位剤形は、アンプル、バイアル、坐剤、糖衣錠、錠剤、カプセル、ＩＶバッグ、またはエアロゾル吸入器における単一ポンプであり得る。
【００４１】
[57]治療適用において、用量は、活性化合物の化学的および物理的性質、加えて、例えば、年齢、体重、および併存疾患を含む、対象の臨床的特徴に依存して異なり得る。一般的に、用量は、治療有効量であるべきである。薬学的組成物の有効量は、医師または他の資格要件を満たしたオブザーバーによって認められるような客観的に識別できる向上を提供する量である。例えば、障害、疾患、または状態の症状を軽減すること。
【００４２】
[58]薬学的組成物は、任意の望ましい経路（例えば、肺、吸入、鼻腔内、経口、頬側、舌下、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、髄腔内、経皮、経粘膜、直腸など）による投与のための任意の適切な形（例えば、液体、エアロゾル、溶液、吸入剤、ミスト、スプレー剤；または固体、粉末、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、パッチなど）をとり得る。実施形態において、薬学的組成物は、経口的に受け入れられる剤形、例えば、非限定的に、カプセル、錠剤、バッカル錠、トローチ、ロゼンジ、および乳濁液、水性懸濁液、分散液、または溶液の形をとる経口液体の形をとる。カプセルは、不活性な増量剤および／または希釈剤などの賦形剤、例えば、デンプン（例えば、トウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカのデンプン）、糖、人工甘味剤、結晶性および微結晶性セルロースなどの粉末セルロース、小麦粉、ゼラチン、ガムなどを含有し得る。経口用の錠剤の場合、一般的に用いられる担体には、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤もまた加えられ得る。
【００４３】
[59]実施形態において、薬学的組成物は、錠剤の形をとる。錠剤は、糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、スクロース、ソルビトール、またはマンニトールなどの不活性な希釈剤または担体と共に本明細書に記載された化合物の単位用量を含み得る。錠剤はさらに、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの非糖由来希釈剤、またはセルロースもしくはその誘導体、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびトウモロコシデンプンなどのデンプンを含み得る。錠剤はさらに、ポリビニルピロリドンなどの結合剤および造粒剤、崩壊剤（例えば、架橋カルボキシメチルセルロースなどの膨潤性架橋ポリマー）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸塩）、保存剤（例えば、パラベン）、抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）、緩衝剤（例えば、リン酸またはクエン酸バッファー）、ならびにクエン酸／重炭酸混合物などの発泡剤を含み得る。錠剤は被覆錠剤であり得る。被覆は、保護フィルム被覆（例えば、ワックスまたはワニス）、または活性化合物の放出を調節する、例えば、遅延放出（摂取から所定のラグタイム後の活性物質の放出）もしくは胃腸管における特定の位置での放出のために設計された被覆であり得る。後者は、例えば、ブランド名Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）で販売されたものなどの腸溶フィルム被覆剤を用いて達成することができる。
【００４４】
[60]錠剤製剤は、通常の圧縮法、湿式造粒法、または乾式造粒法により作製され得、薬学的に許容される希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、表面改質剤（界面活性剤を含む）、懸濁化剤、または安定化剤を利用し得、それらには、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギン酸、アカシアゴム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、スクロース、ソルビトール、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、タルク、乾燥デンプンおよび粉糖が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい表面改質剤には、非イオン性および陰イオン性表面改質剤が挙げられる。表面改質剤の代表例には、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、およびトリエタノールアミンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４５】
[61]実施形態において、薬学的組成物は、硬いまたは柔らかいゼラチンカプセルの形をとる。この製剤化に従って、本発明の化合物は、固体、半固体、または液体の形をとり得る。
【００４６】
[62]実施形態において、薬学的組成物は、非経口投与に適した無菌の水溶液または水分散液の形をとる。本明細書で用いられる場合、非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技術を含む。
【００４７】
[63]実施形態において、薬学的組成物は、直接的注射によるかまたは静脈内注入のための無菌注入液への添加によるかのいずれかによる投与に適した無菌の水溶液または水分散液の形をとり、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、その適切な混合物、または１つもしくは複数の植物油を含有する溶媒または分散媒を含む。溶液または懸濁液は、共溶媒または界面活性剤の助けを借りて水中に調製することができる。適切な界面活性剤の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂肪酸およびＰＥＧ−脂肪酸モノエステルおよびジエステル、ＰＥＧグリセロールエステル、アルコール−油エステル交換生成物、ポリグリセリル脂肪酸、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ステロールおよびステロール誘導体、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、糖およびそれの誘導体、ポリエチレングリコールアルキルフェノール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン（ＰＯＥ−ＰＯＰ）ブロックコポリマー、ソルビタン脂肪酸エステル、イオン性界面活性剤、脂溶性ビタミンおよびそれらの塩、水溶性ビタミンおよびそれらの両親媒性誘導体、アミノ酸およびそれらの塩、ならびに有機酸およびそれらのエステルおよび無水物が挙げられる。分散液もまた、例えば、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中のそれらの混合物中に調製することができる。
【００４８】
[64]実施形態において、本明細書に記載された化合物または組成物は、単独療法または補助的療法として投与され得る。実施形態において、本明細書に記載された化合物または組成物は、例えば、食事および運動の側面などを含む治療レジメンの一部として、単独で、または１つもしくは複数の追加の治療剤（すなわち、追加のＡＰＩ）もしくは治療と組み合わせて、投与され得る。実施形態において、本明細書に記載された方法は、一次療法としてＡＬＰＫ１阻害剤の投与を含む。他の実施形態において、ＡＬＰＫ１阻害剤の投与は補助的療法である。どちらの場合でも、本発明の方法は、本明細書に記載されているような疾患、障害、または状態の処置または防止のための、１つまたは複数の追加の治療剤および／または治療と組み合わせての、ＡＬＰＫ１阻害剤の投与を企図する。用語「治療」は、疾患、障害、または状態、１つもしくは複数のそれらの症状の防止、処置、管理、または改善に用いることができる任意の方法、プロトコール、および／または作用物質を指す。
【００４９】
[65]本開示はまた、本明細書に記載された方法における使用のための薬学的組成物をパッケージングすること、およびそれらを含むキットを提供する。キットは、ボトル、バイアル、アンプル、ブリスター包装、およびシリンジからなる群から選択される１つまたは複数の容器を含み得る。キットはさらに、１つもしくは複数の使用説明書、１つもしくは複数のシリンジ、１つもしくは複数のアプリケーター、または本明細書に記載された化合物もしくは組成物を再構成するのに適した無菌溶液を含み得る。
【００５０】
[66]本明細書に用いられた全てのパーセンテージおよび比は、他に指示がない限り、重量による。
[67]本発明はさらに、以下の非限定的実施例により記載および例示される。
【実施例】
【００５１】
[68]以下の実施例は、ＡＬＰＫ１を阻害することが、炎症を直接的または間接的に処置するのに有効であることを実証する。
実施例１
不活化ＡＬＰＫ１変異は、ＤＳＳ誘導性大腸炎に対する抵抗性を与える
[69]デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎のマウスモデルを用いて、ＡＬＰＫ１の不活化変異による阻害（エクソン１３の前の１個およびエクソン１３の後の１個である、イントロンにおける２個の部位をターゲットするＣＲＩＳＰＲベクターを、マウス受精胚へ注射して、エクソン１３が欠失したＡＬＰＫ１マウス変異体を作製した。ＡＬＰＫ１のキナーゼドメインの一部分をコードするエクソン１３の欠失は、ＡＬＰＫのキナーゼ活性を殺す）が、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患を改善することができるかどうかを評価した。ＤＳＳ処理は、結腸上皮細胞の破壊を引き起こし、大腸炎を誘導し、それは、次に、体重減少を引き起こす。体重減少を、疾患進行の指標として用いた。このモデル系は、以前に、例えば、Ｏｋａｙａｓｕ  Ｈら、１９９０に記載されている。簡単に述べれば、８〜９週齢の雌マウスを、オートクレーブされた飲料水中に溶解された２％ＤＳＳ（ＭＷ  ４０Ｋ〜５０Ｋ、ＭＰ  ＢＩＯＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ）で、７日間、処理した。マウスの体重を毎日および試験期間の終わりに、計量した。全データを、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。実験群は、ＡＬＰＫ１野生型（ＷＴ）（ｎ＝３）；ヘテロ接合性（ＨＥ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝２）；およびホモ接合性（ＨＯ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝３）であった。
【００５２】
[70]結果：不活化ＡＬＰＫ１変異は、ＤＳＳ誘導性大腸炎モデルにおける疾患進行／重症度、体重減少の全ての３つの測定値において保護効果を示した（図１）。
実施例２
不活化ＡＬＰＫ１変異は、放射線誘発性炎症に対する抵抗性を与える
[71]放射線誘発性炎症のマウスモデルを用いて、ＡＬＰＫ１の不活化変異による阻害が放射線誘発性炎症を改善することができるかどうかを評価した。放射線は、免疫系を刺激して、炎症応答を活性化する。このモデル系は、以前に、例えば、Ｂｉｊｕ  Ｇら、２０１２に記載されている。簡単に述べれば、８〜９週齢雌マウスに、１日目に１回、マウスあたり９グレイ（Ｇｙ）全身照射（Ｃｏ６０からのガンマ線）を照射した。動物生存率および体重を毎日測定した。放射線は、胃腸系および造血系の損傷を引き起こした。免疫系不全と組み合わされた腸管内菌叢の移行は、敗血症および死をもたらし得る。
【００５３】
[72]実験群は、ＡＬＰＫ１野生型（ＷＴ）（ｎ＝４）；ヘテロ接合性（ＨＥ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝６）；およびホモ接合性（ＨＯ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝５）であった。この研究において、ヘテロ接合性変異だけが、放射線誘発性体重減少（図２Ａ）および致死性（図２Ｂ）に対する保護効果を示した。
【００５４】
実施例３
不活化ＡＬＰＫ１変異は、高脂肪食誘導性肥満に対する抵抗性を与える
[73]高脂肪食誘導性肥満のマウスモデルを用いて、ＡＬＰＫ１の不活性化変異による阻害が、このモデル系において炎症を改善することができるかどうかを評価した。肥満は、代謝性疾患の発生の原因となる炎症性成分の存在を多くの慢性疾患と共有する。この炎症状態は、炎症促進性タンパク質の循環レベルの増加に反映される。高脂肪食（ＨＦＤ）摂食は、ヒトメタボリックシンドロームに似ている、げっ歯類における肥満および代謝障害を誘導し得る。このモデル系は、以前に、例えば、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  Ａら、１９８３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｉら、１９９９に記載されている。簡単に述べれば、８〜９週齢雄マウスを、０日目からＨＦＤ（６０％脂肪、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）で処理した。体重を、ＨＦＤ後１日目から８４日目まで毎週、測定した。パーセンテージ体重増加（％ｇ）を、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表した。
【００５５】
[74]実験群は、ＡＬＰＫ１野生型（ＷＴ）（ｎ＝６）；ヘテロ接合性（ＨＥ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝５）；およびホモ接合性（ＨＯ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝４）であった。この研究において、ＡＬＰＫ１におけるヘテロ接合性不活化変異とホモ接合性不活性化変異の両方が、ＨＦＤ誘導性体重増加に対する保護を与えた（図３）。
【００５６】
実施例４
不活化ＡＬＰＫ１変異は、コラーゲン誘導性関節炎に対する抵抗性を与える
[75]コラーゲン誘導性関節炎のマウスモデルを用いて、ＡＬＰＫ１の不活性化変異による阻害が、このモデル系において炎症を改善することができるかどうかを評価した。関節リウマチは、身体の過敏な免疫系が、関節内層および軟骨などの身体自体の組織を攻撃する、炎症性免疫過程として認識されている。炎症は、関節リウマチによく見られる疼痛および腫脹を引き起こし得る。このモデル系は、以前に、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｈら、２０００に記載されている。簡単に述べれば、８週齢雄マウスを、１つの後足の足蹠上での皮下注射による、２０μｌウシＩＩ型コラーゲン（免疫化グレード  ウシＩＩ型コラーゲン、溶液（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、カタログ番号２００２２）および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、４ｍｇ／ｍｌにおける不活性化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、カタログ番号７００１））（両方について１ｍｇ／ｍｌ最終濃度）で処理し、その他の足に、対照の２０μｌ  ＰＢＳを注射した。ウシＩＩ型コラーゲンは、炎症による足腫脹を誘導する。マウスを、関節リウマチスコアについて評価し、足腫脹についての足厚さを、コラーゲン注射から２５日後まで１日おきに測定した。関節リウマチ（ＲＡ）スコアは、０〜１６のスケール上での全ての４つの足スコアの合計であり、各足は、以下のようにスコアリングされる：
スコア０  −  正常な足；
スコア１  −  １つの爪先が炎症かつ腫大している；
スコア２  −  １つより多い爪先が、足全体ではないが、炎症かつ腫大している、または足全体の軽度の腫脹；
スコア３  −  足全体が炎症かつ腫大している；および
スコア４  −  非常に炎症かつ腫大した、または強直した（硬直した、または運動不能の）足。
【００５７】
[76]データは、示されているような実験群の数の平均値±標準偏差として表されている。実験群は、ＡＬＰＫ１野生型（ＷＴ）（ｎ＝８）；ヘテロ接合性（ＨＥ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝７）；およびホモ接合性（ＨＯ）不活化ＡＬＰＫ１変異（ｎ＝７）であった。この研究において、足蹠ＲＡスコア（図４Ａ）および足蹠厚さの差（図４Ｂ）である、炎症の両方の指標は、ＡＬＰＫ１におけるヘテロ接合性またはホモ接合性不活化変異を有するマウスにおいて、より低かった。
【００５８】
実施例５
ＡＬＰＫ１ノックダウンは、様々なヒトおよびマウス細胞において炎症促進性サイトカインの発現を阻害する
[77]結果は、表1に要約されており、下記でより詳細に記載されている。
【００５９】
【表１】
2020525554.tif 000003
【００６０】
５Ａ．ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞におけるｓｉＲＮＡによるＡＬＰＫ１ノックダウンは、サイトカイン発現の減少を生じる
[78]Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｓｉＲＮＡ（ＡＬＰＫ１−ｓｉＲＮＡ−１、ＡＬＰＫ１−ｓｉＲＮＡ−２、スクランブルｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションした。トランスフェクション後４２時間目において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、ＲＮＡ抽出のために収集した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、＃ＲＲ０３７Ａ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）においてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ試薬を用いてｑＰＣＲにより測定した。ＡＬＰＫ１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αのそれぞれの遺伝子発現を、ＧＡＰＤＨに対して標準化した。これらの炎症促進性サイトカインの全ての５つの発現は、ＡＬＰＫ１ノックダウンにより減少した（図５）。
【００６１】
５Ｂ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＬＰＫ１のノックダウンは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物誘導によるサイトカイン発現の減少をもたらし、ヒトおよびマウスＡＬＰＫ１の過剰発現は、そのサイトカイン発現障害を救出することができるが、キナーゼ死滅変異体については救出することができない。
【００６２】
[79]Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＡＬＰＫ１−ｓｉＲＮＡ−２またはスクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。２日後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ３０００（ＬＩＦＥ）を用いて、細胞に、ｃＤＮＡを含有しない（空）または以下を含有する過剰発現構築物（ｐＣＤＮＡ３．１−）をトランスフェクションした：
・Ｎ末端において１＊Ｆｌａｇでタグ付けされたＡＬＰＫ１（Ｆｌａｇ−ＡＬＰＫ１）
・マウスＣ末端ＨＡ−タグ付けＡＬＰＫ１（マウスＡＬＰＫ１）
・Ｎ末端において６＊Ｈｉｓタグで、およびＣ末端において３＊Ｆｌａｇでタグ付けされたＡＬＰＫ１（６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１−３＊Ｆｌａｇ）
・Ｎ末端において６＊Ｈｉｓタグでタグ付けされたＡＬＰＫ１（６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１）
・６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１のＥ１１９０Ａ変異体（６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１−Ｅ変異体）。
【００６３】
[80]ｓｉＲＮＡによるＡＬＰＫ１の効率的なノックダウンおよび過剰発現ベクターによるＡＬＰＫ１過剰発現の両方を確認するために、ＡＬＰＫ１の遺伝子発現を測定した（図６Ａ）。ＩＬ８発現を測定して（図６Ｂ）、Ｆｌａｇ−ＡＬＰＫ１、マウスＡＬＰＫ１、６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１−３＊Ｆｌａｇ、６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１により効率的なＩＬ８発現が示されたが、６＊Ｈｉｓ−ＡＬＰＫ１−Ｅ変異体によっては示されず、ＡＬＰＫ１のキナーゼ活性が、ＡＬＰＫ１誘導性ＩＬ８発現に必要とされることを示唆した。
【００６４】
５Ｃ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＬＰＫ１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物誘導によるサイトカイン発現および分泌の減少をもたらす
[81]ＣＲＩＳＰＲ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＡＬＰＫ１のエクソン３へのターゲティング配列およびＡＬＰＫ１のエクソン１４へのターゲティング配列を含有するＣＲＩＳＰＲｖ１．０のトランスフェクションにより作製した。トランスフェクションから１日後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２．５μｇ／ｍｌピューロマイシン上で３日間、選択した。単一コロニーを増殖して、安定発現株を作製した。ＮＦ−κβシグナル伝達を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物での処理により活性化した。１％Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物の４時間の処理後、２９３Ｔ細胞を、ｍＲＮＡ発現の分析のために、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＬＩＦＥ）を用いて、収集した。ＡＬＰＫ１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化した（図７Ａ）。上清ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物におけるＩＬ−８分泌を、ヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した（図７Ｂ）。
【００６５】
５Ｄ．ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＬＰＫ１のノックダウンは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞可溶化物誘導によるサイトカイン発現の減少をもたらす
[82]Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細胞可溶化物（ＳＦＬ）およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞可溶化物（ＳＴＬ）は、ＨＥＫ２９３細胞において、炎症促進性サイトカインＩＬ６、ＩＬ８、およびＴＮＦαの発現を誘導し得る。ＡＬＰＫ１のｓｉＲＮＡによるノックダウンは、これらのサイトカインの全ての３つの発現を減少させる（図８）。ｓｉＲＮＡは、上記の５Ａにおいて記載されている通りであった。
【００６６】
５Ｅ．ＴＨＰ−１マクロファージ細胞におけるＡＬＰＫ１のｓｈＲＮＡによるノックダウンは、ＬＰＳ誘導の有り無しに関わらず、サイトカインの発現の低下をもたらす
[83]ＴＨＰ−１細胞を、ＡＬＰＫ１に方向付けられたｓｈＲＮＡ−１１９０、ＡＬＰＫ１に方向付けられたｓｈＲＮＡ−２０２７、またはヌルベクター（Ｎｅｇ）を有するレンチウイルスに５日間、感染させ、ピューロマイシンを用いることにより選択した。ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えて、マクロファージ分化を２日間、誘導し、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えて、ＮＦκβ経路を誘導した。ＬＰＳで刺激された細胞（図９Ａ）と刺激されていない細胞（図９Ｂ）のどちらにおいても、ＩＬ１β、ＩＬ−８、およびＴＮＦαの発現は、ＡＬＰＫ１のｓｈＲＮＡノックダウンにより低下した。アクチン（ａｃｔｂ）およびＧＡＤＰＨ（ｇａｄｐｈ）の発現もまた、示されている。
【００６７】
５Ｆ．ＴＨＰ−１マクロファージ細胞におけるＡＬＰＫ１のｓｈＲＮＡによるノックダウンは、ＴＮＦαおよびＩＬ１βの分泌の阻害を生じる
[84]ＴＨＰ−１細胞を、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）により２〜６日間、分化型マクロファージへ誘導した時、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＡＬＰＫ１のｓｈＲＮＡによるノックダウンは、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）誘導によるＴＮＦα（図１０Ａ）およびＩＬ１β（図１０Ｂ）の分泌の阻害をもたらす。
【００６８】
５Ｇ．ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＡＬＰＫ１ノックダウンは、サイトカイン発現の減少を生じる
[85]乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８におけるｓｉＲＮＡによるＡＬＰＫ１ノックダウンは、ＩＬ１β、ＩＬ８、およびＴＮＦαの発現の減少を生じた（図１１）。
【００６９】
５Ｈ．ＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるＡＬＰＫ１ノックダウンは、サイトカイン発現の減少を生じる
[86]マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７におけるｓｈＲＮＡによるＡＬＰＫ１ノックダウンは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）刺激の有り（図１２Ａ）無し（図１２Ｂ）に関わらず、サイトカイン発現の減少をもたらす。
【００７０】
５Ｉ．不活化ＡＬＰＫ１変異を有するマウス由来の一次マウスマクロファージ細胞
[87]マウス骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）を、上記の実施例1に記載された野生型（ＷＴ）マウスならびにホモ接合性（ＨＯ）およびヘテロ接合性（ＨＥ）ＡＬＰＫ１マウスから採取した。成熟ＢＭＤＭを、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで処理して、サイトカイン発現を誘導した。サイトカインＩＬ１β、ＴＮＦα、ＴＧＦβ１、ＩＬ６、ＩＦＮα、ＩＬ１５、ＩＬ１０、およびＴＮＦβのｍＲＮＡ発現は、ホモ接合性（ＨＯ）ＡＬＰＫ１ノックアウトマウスとヘテロ接合性（ＨＥ）ＡＬＰＫ１ノックアウトマウスの両方由来の細胞において低下した（図１３）。
【００７１】
実施例６
低分子キナーゼ阻害剤、ＭＩ６は、ＤＳＳ大腸炎モデルにおいて回復を向上させる
[88]小分子のライブラリーをＡＬＰＫ１に対する阻害活性についてスクリーニングすることにより、ＡＬＰＫ１阻害剤を同定した。そのライブラリーをスクリーニングするために、結合アッセイ、キナーゼアッセイ、およびサイトカイン分泌についての細胞に基づいたアッセイを含む様々なアッセイを用いた。結合アッセイおよびキナーゼアッセイ、加えて少なくとも２つの細胞に基づいたアッセイにおけるそれのパフォーマンスに基づいて、ＭＩ６をＡＬＰＫ１阻害剤として同定した。
【００７２】
[89]ＤＳＳ誘導性大腸炎モデルにおいて炎症を改善するＭＩ６の能力を、以下のように評価した。８週齢雌野生型ＦＶＣマウスを、３％ＤＳＳ（ナトリウム塩、ＭＷ  ４０Ｋ〜５０Ｋ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製）で０日目から５日目まで処理した。その後、マウスには飲料水に変えた。マウスに、ＤＭＳＯ中に溶解したＭＩ６（１ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）かまたはＤＭＳＯ単独（ｎ＝５）のいずれかを腹腔内（ＩＰ）に毎日、注射した。動物の体重を毎日、計量した。ＭＩ６での処理の３日間以内に、処理された動物は、未処理の動物と比較して、体重増加の向上を示し始めた（図１４）。
【００７３】
実施例７
ＡＬＰＫ１変異は、乳癌モデルにおいて腫瘍増殖および転移を低下させる
[90]ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニック腫瘍モデルにおいて、ポリオーマウイルスミドルＴ抗原（ＰｙＶＴ）は、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター下で発現し、そのプロモーターは、ＰｙＶＴの乳腺組織特異的発現を作動させる。ＰｙＶＴは、ｓｒｃおよびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼを含む複数の発癌経路を活性化し、侵襲性腫瘍表現型を生じる、癌遺伝子である。その導入遺伝子を有する未交尾の雌は、１０〜１２週齢までに、多巣性で、低分化で、高浸潤性腺管癌を発生し、その原発性乳腺腫瘍に由来した肺転移の高い発生率を有する。５週齢において、雌は、以下の４つの群へ分類される非侵襲性局所的病変を発生する：単純、固形、嚢胞性、および混合型（固形および嚢胞性）。固形病変は、結節性シートにおける異型細胞の高密度腫瘤を有する大きな病巣からなる。嚢胞性病変は、サイズおよび複雑度が様々であり、著しい量の透明液を含む多層上皮により裏打ちされている。
【００７４】
[91]原発性腫瘍の遠位部位への転移は、依然として、多くの癌型において死亡の大きな原因であり、転移モデルの重要性を浮き彫りにしている。自発的乳腺発癌のＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニック腫瘍モデルは、腫瘍進行に関連した機構を研究することおよび新規な化学療法の開発のための強力なツールである。
【００７５】
[92]本発明者らは、ＭＭＴＶ−ＰｙＶＴモデルにおいてＡＬＰＫ１不活化変異の保護効果を調べた。図１５Ａ〜Ｄに示されているように、乳腺組織における腫瘍量（図１５Ｂ）と転移性肺腫瘍量（図１５Ｄ）の両方が、ＡＬＰＫ１変異を含まないニセのＭＭＴＶ−ＰｙＶＴトランスジェニックマウスと比較して、統計的に有意に低く、この変異の保護効果を示している。
【００７６】
等価物
[93]当業者は、本明細書に記載されているような本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または単なる日常的な実験を用いて、確かめることができるだろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図される。
【００７７】
[94]本明細書に引用された全ての参考文献は、あたかも各個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、全ての目的のために全体として参照により組み入れられていることを具体的かつ個々に示されているかのように、同じ程度で、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００７８】
[95]本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態により範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な改変が、前述の記載および添付の図から当業者に明らかになるだろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図される。
【図１】
2020525554.tif 000004
【図２】
2020525554.tif 000005
【図３】
2020525554.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020525554.tif 000016
【図１４】
2020525554.tif 000017
【図１５Ａ】
2020525554.tif 000018
【図１５Ｂ】
2020525554.tif 000019
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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