(57)【要約】本発明は活性物質を標的に特異的に伝達するエクソソームを製造する方法及びそれによって製造されたエクソソーム、エクソソームを使って活性物質を標的組職に伝達する方法、エクソソームを活性成分として含む活性物質の伝達のための医薬組成物、及び標的ペプチドが膜貫通タンパク質の細胞外部分に挿入される発現ベクターを含むエクソソームを製造するための組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）標的ペプチドを膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入して発現ベクターを製造する段階、及び
ｂ）段階ａ）の発現ベクターをエクソソーム生成細胞に導入する段階を含む、活性物質を標的特異的に伝達するためのエクソソームの製造方法。
【請求項２】
前記膜貫通タンパク質が、テトラスパニン、インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、アネキシン又はＲａｂである、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項３】
前記テトラスパニンが、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ８２からなる群から選択される１種以上である、請求項２に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項４】
前記標的ペプチドは特異組職に移動することができるペプチドである、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項５】
前記特異組職が、血液脳関門、炎症のある血管、横紋筋、肝又は癌組職を含む群から選択される、請求項４に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項６】
前記標的ペプチドが、アンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）内在性配列ペプチド複合体（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、横紋筋標的ペプチド、ペプチド−２２、ＴＨＲ、ＴＨＲレトロエナンチオ、ＣＴＲ、レプチン２０、ＲＶＧ（Ｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）２９、ＣＤＸ、アパミン、ＭｉｎｉＡｐ−４、ＧＳＨ、Ｇ２３、ｇ７、ＴＧＮ、ＴＡＴ（４５−５７）、ＳｙｎＢ１、ジケトピペラジン及びＰｈＰｒｏからなる群から選択される、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項７】
膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインへの標的ペプチド挿入が膜貫通の発現又は機能に影響を及ぼさない、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項８】
活性物質が、タンパク質薬物、酵素、核酸及び化学物質からなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項９】
前記エクソソーム生成細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、巨大核細胞、マクロファージ、幹細胞及び腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によって製造された活性物質を標的特異的に伝達するためのエクソソーム。
【請求項１１】
活性成分として請求項１に記載の方法によって製造されたエクソソームを含む活性物質を伝達するための医薬組成物。
【請求項１２】
エクソソームの量が組成物の総重量の約１０〜９５％である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的有効量が約０．００１〜１０ｇ／Ｋｇ、約０．０１〜８ｇ／Ｋｇ又は約０．１〜５ｇ／Ｋｇである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって製造されたエクソソームを使って活性物質を伝達する方法。
【請求項１５】
膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入された標的ペプチドを含む活性物質の標的特異的伝達のために請求項１０に記載のエクソソームを生成するための発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する参考文献  
本出願は２０１７年８月１７日に出願された韓国特許出願第１０−２０１７−０１０４１７１号及び２０１８年４月１９日に出願されたアメリカ仮出願第６２／６５９，８１６号を優先権として主張する出願であり、これらのそれぞれの内容は参照することにより本願に含まれる。
発明の分野
本発明は標的特異的な方法で物質を伝達するエクソソームの製造方法及びその方法で製造されたエクソソームに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人体はおよそ２００余種類の１００兆個の細胞からなっており、細胞内で多様なタンパク質の作用によって生理活性が調節されて生命を維持する。
【０００３】
細胞はリン脂質から構成された二重膜構造の細胞膜で取り囲まれており、細胞膜は異物が細胞内に流入することを防ぐ。今まで開発されたタンパク質治療剤は大部分が細胞膜を通過して細胞内に入ることができずに、細胞の外部で作用するか又は細胞膜にある受容体に作用して細胞内に信号を伝達することによって生理作用を現す。
【０００４】
サイトゾルに存在する多くのタンパク質は互いに作用して生理活性を調節する。したがって、タンパク質治療剤を細胞内、すなわちサイトゾル内に伝達することができるなら細胞の活性をもっと効果的に制御することができるであろう。
【０００５】
最近、標的タンパク質を細胞膜を通して細胞内に直接伝達する方法が多く研究されている。細胞膜を通過するペプチドであるタンパク質導入ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ、ＰＴＤｓ）と標的タンパク質の組み換えタンパク質を作って投与するとき、前記組み換えタンパク質が細胞膜を通過してサイトゾル内に入る。ＰＴＤの例としては、ＨＩＶ−１  ＴＡＴ、ＨＳＶ  ＶＰ２２、Ａｎｔｐ、ｄｆＴＡＴ、Ｈｐｈ−１がある。ＰＴＤｓと標的タンパク質を結合して製造された融合タンパク質は組み換えタンパク質として生成され、この際に分離工程が必要である。しかし、前記方法はタンパク質のリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）が正常にできなく、活性が落ち、タンパク質が非特異的に伝達され、生体内で免疫反応を引き起こす危険が高く、費用が高くかかり、収率が低いという問題点がある。
【０００６】
一方、Ｇｏｌｄ  ＮＰ（ｎａｎｏ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ＮＰ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ＮＰ、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ＮＰなどの多様なナノ粒子と結合された標的タンパク質はエンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞膜を通過して細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）に入ることができる。しかし、ナノ粒子と標的タンパク質の複合体は大部分が細胞内リソゾームで分解される。標的タンパク質がリソゾームの内部で分解されれば、タンパク質の活性を失うことになる。また、細胞質で標的タンパク質とナノ粒子が分離されにくく、ナノ粒子の毒性が問題になることができる。
【０００７】
エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、細胞間信号伝逹のために、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを捕集したままで細胞外に分泌される５０〜２００ｎｍ大きさの膜構造の小さな小疱である。
【０００８】
エクソソームは、赤血球が成熟する最後の段階で細胞内タンパク質を除去することによって赤血球内にヘモグロビンのみ残す過程で最初に発見された。このようなエクソソームは電子顕微鏡による研究で原形質膜から直接分離されるものではなく、多胞体（Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｙ、ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内特定区画から放出されるということが確認された。すなわち、多胞体と原形質膜の融合が起きれば、このような小疱は細胞の外に放出され、これをエクソソームと呼ぶ。
【０００９】
このようなエクソソームがどの分子機序によって作られるかが確かに明かされたことがない。しかし、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、 巨大核細胞（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）、マクロファージなどを含む多様な種類の免疫細胞、幹細胞及び腫瘍細胞なども生きている状態でエクソソームを生成して分泌すると知られている。
【００１０】
エクソソームには細胞内の多様なタンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。このようにエクソソームに含まれて細胞の外に分泌される物質は融合又はエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって他の細胞内に再び流入して細胞間の通信者としての役割もする。
【００１１】
所望のタンパク質が内部に含まれたエクソソームは生体内で多様な疾患の治療に使われることができる。このためには、標的タンパク質を含むエクソソームを効率的に作らなければならない。韓国特許登録第１０−０５１９３８４号には次の段階を含む方法、及び前記で生成されたエクソソームをワクチンとして使用する方法が開示されている：
１）特異抗原に対する遺伝子を細胞株内に導入する段階、
２）導入された遺伝子から生成されたタンパク質が細胞株内で安定に発現する段階、及び
３）エクソソームを通して前記タンパク質を細胞の外に放出させる段階。
【００１２】
しかし、前記エクソソームは細胞内で自然的に形成されるから、標的タンパク質をコーディングする遺伝子を生成細胞に導入しても標的タンパク質を含むエクソソームが製造される可能性が非常に低い。エクソソームが標的組職に伝達される効率が低いという問題点がある。
【００１３】
テトラスパニンファミリー（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ  ｆａｍｉｌｙ）は４個の膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｎｉｓ）、細胞内Ｎ末端とＣ末端を有しており、２個の細胞外ループが第１膜貫通ドメインと第２膜貫通ドメインとの間、及び第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインとの間に突出している。
【００１４】
ＣＤ９はテトラスパニン系に属する約２４〜２７ｋＤ大きさの細胞表面糖タンパク質受容体であり、細胞発達、活性、成長及び運動性を調節するのに重要な信号伝逹作用を調節する。また、細胞付着及び細胞移動を調節することができ、血小板誘発内皮細胞の増殖に関与する血小板活性化を誘導する。また、筋肉細胞融合を促進し、根管維持に寄与する。
【００１５】
本発明は、標的ペプチドをエクソソームの膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入して発現ベクターを製造する段階、及びエクソソーム膜に位置する標的ペプチドを含むエクソソームを生成する段階を含む、標的特異的伝達のためのエクソソームの製造方法を提供する。また、本発明は、挿入された標的ペプチドがＨＥＫ２９３Ｔ細胞でよく発現し、エクソソームに捕集された活性物質が標的組職によく伝達されるということを示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、活性物質を標的組職に特異的に伝達するエクソソームを製造する方法及びそれによって生成されたエクソソームを提供する。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、エクソソームを用いて標的組職に活性物質を伝達する方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の実施形態は、活性成分としてエクソソームを含む活性物質の伝達のための医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の実施形態は、標的ペプチドが膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入される発現ベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、ＣＩＢＮ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、及び標的ペプチド挿入ＣＤ９遺伝子複合体を含むｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−ＳｂｆＩベクターの模式図である。図１Ｂは、ＣＤ９タンパク質構造で標的ペプチドの挿入部位を示した模式図である。
【図２】アンジオペプチン−２ペプチド複合体を含むエクソソームで処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でアンジオペプチン−２ペプチド複合体の発現を示す写真である。
【図３】アポＢペプチド複合体を含むエクソソームで処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でアポＢペプチド複合体の発現を示す写真である。
【図４】アポＥペプチド複合体を含むエクソソームで処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でアポＥペプチド複合体の発現を示す写真である。
【図５】ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体を含むエクソソームで処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体の発現を示す写真である。
【図６】Ｃｒｅリコンビナーゼ−ＣＲＹ２遺伝子、ＣＩＢＮ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、及び標的ペプチド挿入ＣＤ９遺伝子複合体を含むｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−ＳｂｆＩベクターの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、活性物質を標的組職に特異的に伝達するエクソソームを製造する方法及びそれによって生成されたエクソソームを提供する。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、エクソソームを用いて標的組職に活性物質を伝達する方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらに他の実施形態は、活性成分としてエクソソームを含む活性物質の伝達のための医薬組成物を提供する。
【００２４】
本発明のさらに他の実施形態は、標的ペプチドが膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入される発現ベクターを提供する。
【００２５】
本発明は、１）標的ペプチドをエクソソームの膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入して発現ベクターを製造する方法、及び２）前記発現ベクターをエクソソーム生成細胞に導入することにより活性物質の標的特異的伝達のためのエクソソームを生成する方法に関するものである。
【００２６】
本明細書で使用された用語“膜貫通タンパク質”は細胞の脂質二重層を位置させ、これに付着されたタンパク質である。前記膜貫通タンパク質は極性アミノ酸の分率が高い疎水性領域を有する。特定の疎水性領域は二重層の内部に位置する反面、より高い親水性領域は水性細胞内及び細胞外環境と接触する。本発明の一実施形態で、膜貫通タンパク質はテトラスパニン、インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、アネキシン及びＲａｂのような群から選択されるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用された用語“テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）”は４個の膜貫通ドメインを有し、細胞膜上に存在しながら細胞間の情報を受け、細胞増殖などを調節する膜タンパク質である。前記テトラスパニンは、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ８２からなる群から選択される１種以上のタンパク質である。本発明の一実施形態で、前記テトラスパニンはＣＤ９である。
【００２８】
本明細書で使用された用語“標的ペプチド”は生体内で特異的部位に物質を伝達することができるペプチドであり、エクソソームの表面で発現し、エクソソームが特異的組職に移動することができるようにする。本発明によって、特異的組職に移動することができる任意のペプチドは標的ペプチドとして使われることができる。本発明の一実施形態で、前記標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列又は横紋筋（ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ）標的ペプチド、ペプチド−２２、ＴＨＲ、ＴＨＲレトロエナンチオ、ＣＴＲ、レプチン２０、ＲＶＧ２９、ＣＤＸ；アパミン、ＭｉｎｉＡｐ−４、ＧＳＨ、Ｇ２３、ｇ７、ＴＧＮ、ＴＡＴ（４５−５７）、ＳｙｎＢ１、ジケトピペラジン及びＰｈＰｒｏから選択されるが、これらに限定されない。前記標的ペプチドは膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入され、挿入は膜貫通の発現又は機能に影響を及ぼさない。例えば、標的ペプチドはＣＤ９のＮ末端からアミノ酸位置１７０−１７１の間に挿入される（配列番号３）。
【００２９】
本明細書で使用された“特異的部位”は標的ペプチドが移動する特異的組職である。本発明の一実施形態で、特異的部位は血液脳関門、炎症のある血管、横紋筋、肝及び癌組職から選択されるが、これらに限定されない。
【００３０】
“発現ベクター”は所望の宿主細胞から所望のペプチドを発現することができる組み換えベクターを意味し、遺伝子挿入を発現するように作動可能に連結された必須調節要素を含む。前記発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、プローモーター、オペレーターなどの発現調節要素を含む。前記開始コドン及び終止コドンは一般的にヌクレオチド配列として見なされ、ポリペプチドをコーディングするためにコーディング配列とともにフレーム内にいなければならない。ベクターのプローモーターは構成性又は誘導性であり得る。
【００３１】
本発明の用語“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”は一般的な機能を果たすように核酸発現配列と所望のタンパク質又はＲＮＡをコーディングする核酸配列間の機能的連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）を意味する。例えば、プローモーターとタンパク質又はＲＮＡコーディング核酸配列が作動可能に連結されてコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる。発現ベクターとの作動可能な連結は当該技術分野でよく知られた遺伝子組み換え技術を用いてなすことができ、部位特異的ＤＮＡ開裂及び連結は当該技術分野で一般的に知られた酵素を使ってなすことができる。
【００３２】
また、前記発現ベクターは“選択マーカー”をさらに含むことができる。選択マーカーは形質転換微生物又は組み換えベクターの選別のためのマーカーであり、薬物耐性、栄養所要量、細胞毒性薬に対する耐性又は表面タンパク質の発現のように選択可能な表現型を付与するために使われる。選択マーカーを含むベクターを使えば、選択剤が処理された環境で選択マーカーを発現する細胞のみ生存するので、形質転換された細胞を選別することができる。選択マーカーとしては抗生剤耐性遺伝子、例えばカナマイシン、アンピシリン及びピューロマイシンから選択されるが、これらに限定されない。
【００３３】
“エクソソーム生成細胞”はＢリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、 巨大核細胞、マクロファージ、幹細胞及び腫瘍細胞からなる群から選択される１種以上である。本発明の一実施形態で、前記エクソソーム生成細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００３４】
本明細書で使用された用語“活性物質”は生体機能を増進させるか抑制させる物質であり、異常な状態を示す人体の機能を調節する物質の分泌を制御する物質を意味する。活性物質はタンパク質薬物、酵素、核酸、化学物質及びこれらの混合物から選択されるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の一実施形態は、ＣＩＢＮ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、及び標的ペプチド複合体が挿入されたＣＤ９コーディング遺伝子を含むｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−Ｓｂｆｌベクターを提供し、ここで標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、横紋筋標的ペプチド、ペプチド−２２、ＴＨＲ、ＴＨＲレトロエナンチオ、ＣＴＲ、レプチン２０、ＲＶＧ２９、ＣＤＸ、アパミン、ＭｉｎｉＡｐ−４、ＧＳＨ、Ｇ２３、ｇ７、ＴＧＮ、ＴＡＴ（４５−５７）、ＳｙｎＢｌ、ジケトピペラジン及びＰｈＰｒｏから選択されるが、これらに限定されない。前記ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞のようなエクソソーム生成細胞に導入して膜タンパク質に標識された標的ペプチドを有するエクソソームを収得する（図１）。図２及び図５はエクソソーム膜タンパク質で標的ペプチドの発現を示す。
【００３６】
また、本発明は、１）標的ペプチドを膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入して発現ベクターを製造する段階、及び２）前記段階１）の発現ベクターをエクソソーム生成細胞に導入する段階を含む、活性物質の標的特異的伝達のためのエクソソームを生成する方法を提供する。
【００３７】
膜貫通タンパク質はテトラスパニン、インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、アネキシン及びＲａｂのような群から選択されるが、これらに限定されない。テトラスパニンはＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ８２からなる群から選択される。本発明の一実施形態で、前記テトラスパニンはＣＤ９である。
【００３８】
前記標的ペプチドは特異組職に移動することができる任意のペプチドである。本発明の一実施形態で、前記標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、横紋筋標的ペプチド、ペプチド−２２、ＴＨＲ、ＴＨＲレトロエナンチオ、ＣＴＲ、レプチン２０、ＲＶＧ２９、ＣＤＸ、アパミン、ＭｉｎｉＡｐ−４、ＧＳＨ、Ｇ２３、ｇ７、ＴＧＮ、ＴＡＴ（４５−５７）、ＳｙｎＢｌ、ジケトピペラジン及びＰｈＰｒｏから選択されるが、これらに限定されない。
【００３９】
前記エクソソーム生成細胞はＢリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、 巨大核細胞、マクロファージ、幹細胞又は腫瘍細胞を含む群から選択される１種以上である。本発明の一実施形態で、前記エクソソーム生成細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００４０】
本発明の具体的な実施形態はＣＩＢＮ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、及び標的ペプチド複合体が挿入されたＣＤ９コーディング遺伝子を含むｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−Ｓｂｆｌベクターを提供し、ここで標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、及び横紋筋標的ペプチドから選択されるが、これらに限定されない。前記ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞のようなエクソソーム生成細胞に導入して、膜タンパク質に標識された標的ペプチドを有するエクソソームを収得する（図１Ｂ）。図２及び図５はエクソソーム膜タンパク質で標的ペプチドの発現を示す。
【００４１】
また、本発明は、本発明の方法によって製造されたエクソソームを使って活性物質を標的組職に伝達するための方法を提供する。
【００４２】
本発明の方法は、１）標的ペプチドを膜貫通タンパク質の細胞外膜ドメインに挿入して発現ベクターを製造する段階、及び２）前記段階１）の発現ベクターをエクソソーム生成細胞に導入する段階を含む。
【００４３】
前記膜貫通タンパク質はテトラスパニン、インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣ−１、ＭＨＣ−ＩＩ、アネキシン及びＲａｂのような群から選択されるが、これらに限定されない。テトラスパニンはＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１又はＣＤ８２を含む群から選択される。本発明の一実施形態で、テトラスパニンはＣＤ９である。
【００４４】
前記標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、横紋筋標的ペプチド、ペプチド−２２、ＴＨＲ、ＴＨＲレトロエナンチオ、ＣＴＲ、レプチン２０、ＲＶＧ２９、ＣＤＸ、アパミン、ＭｉｎｉＡｐ−４、ＧＳＨ、Ｇ２３、ｇ７、ＴＧＮ、ＴＡＴ（４５−５７）、ＳｙｎＢｌ、ジケトピペラジン及びＰｈＰｒｏから選択されるが、これらに限定されない。
【００４５】
前記エクソソーム生成細胞はＢリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、 巨大核細胞、マクロファージ、幹細胞及び腫瘍細胞を含む群から選択される１種以上である。本発明の一実施形態で、前記エクソソーム生成細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００４６】
本発明の具体的な実施形態はＣＩＢＮ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、及び標的ペプチド複合体が挿入されたＣＤ９コーディング遺伝子を含むｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−Ｓｂｆｌベクターを提供し、ここで標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、横紋筋標的ペプチドから選択されるが、これらに限定されない。前記ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞のようなエクソソーム生成細胞に導入して、膜タンパク質に標識された標的ペプチドを有するエクソソームを収得する（図１Ｂ）。図２及び図５はエクソソーム膜タンパク質で標的ペプチドの発現を示す。
【００４７】
また、本発明は、エクソソームを活性成分として含む活性物質の伝達のための医薬組成物を提供し、ここでエクソソームの量は組成物の総重量の約１０〜約９５％である。
【００４８】
本発明の医薬組成物は前記活性成分と同一又は類似の機能を示す１種以上の活性成分をさらに含む。
【００４９】
また、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤及びこれらの混合物を含む。薬学的に許容される担体は、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ  ｅｄ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  ＣｏＩｎｃ．に記載された化学物質、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの混合物から選択されるが、これらに限定されない。前記医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝液、及び静菌剤のようなその他の通常の添加剤をさらに含む。
【００５０】
前記医薬組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、及び界面活性剤のような希釈剤又は賦形剤をさらに含む。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、経口製剤又は非経口製剤に剤形化される。
【００５２】
経口投与のための固形製剤は、錠剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などを含む。経口投与のための固形製剤は１種以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチンなどを含む。前記固形製剤は、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような滑剤をさらに含む。
【００５３】
経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、溶液剤、乳剤又はシロップ剤などがある。前記液体製剤は、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、防腐剤などを含む。
【００５４】
非経口投与剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤などの注射剤を含む。非水性溶剤及び懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを含む群から選択される。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、所望の方法によって経口投与されるか非経口投与される。非経口投与は皮膚外用及び腹腔内注射から選択され、腹腔内注射は直腸内注射、皮下注射、静脈注射、及び筋肉内注射から選択されるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明による医薬組成物は薬学的に有効な量で投与される。薬学的に有効な量は疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使われる薬物などによって変わることができる。本発明の医薬組成物は単独で又は他の治療剤と併用して投与されることができる。他の治療剤との併用投与の際、投与は順次又は同時に行われることができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、薬学的有効量が０．００１〜１０ｇ／Ｋｇ、０．０１〜８ｇ／Ｋｇ又は０．１〜５ｇ／Ｋｇの活性成分を含む。投与は一日に１回又は数回であり得る。
【００５８】
また、本発明は、標的ペプチドが膜貫通タンパク質の細胞外ドメインに挿入される発現ベクターを提供する。
【００５９】
前記膜貫通タンパク質はテトラスパニン、インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＭＨＣ−１、ＭＨＣ−ＩＩ、アネキシン及びＲａｂのような群から選択されるが、これらに限定されない。テトラスパニンはＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１又はＣＤ８２を含む群から選択された１種以上のタンパク質である。本発明の一実施形態で、テトラスパニンはＣＤ９である。
【００６０】
前記標的ペプチドは、アンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、横紋筋標的ペプチド、ペプチド−２２、ＴＨＲ、ＴＨＲレトロエナンチオ、ＣＴＲ、レプチン２０、ＲＶＧ２９、ＣＤＸ、アパミン、ＭｉｎｉＡｐ−４、ＧＳＨ、Ｇ２３、ｇ７、ＴＧＮ、ＴＡＴ（４５−５７）、ＳｙｎＢｌ、ジケトピペラジン及びＰｈＰｒｏから選択されるが、これらに限定されない。
【００６１】
前記発現ベクターは所望の宿主細胞から所望のペプチドを発現することができる組み換えベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須調節要素を含む。前記発現細胞は選択マーカーをさらに含む。選択マーカーは、抗生剤耐性遺伝子、言わばカナマイシン、アンピシリン又はピューロマイシンから選択されることができるが、これらに限定されない。当該技術分野で公知となったどの選択マーカーも使われることができる。
【００６２】
前記医薬組成物は、発現ベクターの導入、エクソソーム生成用形質転換細胞の培養、又は前記形質転換細胞から生成されたエクソソームを分離及び精製するのに適した１種以上の他の構成成分組成物、溶液又は装置をさらに含むことができる。例えば、前記組成物は、前記発現ベクターの導入に適切な緩衝液、前記エクソソーム生産用形質転換細胞の培養に必要な培地及び容器などをさらに含む。
【００６３】
本発明の一実施形態は、ＣＩＢＮ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、及び標的ペプチド複合体が挿入されたＣＤ９コーディング遺伝子を含むｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−Ｓｂｆｌベクターを提供し、ここで標的ペプチドはアンジオペプチン−２、アポＢ、アポＥ、ＶＣＡＭ−１内在性配列、及び横紋筋標的ペプチドから選択されるが、これらに限定されない。前記ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞のようなエクソソーム生成細胞に導入して、膜タンパク質に標識された標的ペプチドを有するエクソソームを収得する（図１）。図２及び図５はエクソソーム膜タンパク質で標的ペプチドの発現を示す。
【００６４】
実施例
以下、本発明を下記実施例に基づいて詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を例示するものであるだけ、本発明の内容がこれらに限定されるものではない。
【００６５】
実施例１
（アンジオペプチン−２ペプチド複合体がエクソソームの膜タンパク質に標識されたエクソソームの製造）
アンジオペプチン−２は血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）を標的とするタンパク質である。アンジオペプチン−２ペプチドが膜タンパク質に標識されたエクソソームを下記のような方法で製造した。
【００６６】
まず、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−ＳｂｆＩベクター（＃ＯＧ４１１，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＵＫ）のマルチクローニング部位をＮｄｅＩ制限酵素で分解してＤＮＡを線形化した。その後、ＣＩＢＮ遺伝子（配列番号１）、ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号２）、Ｎ末端から１−１７０アミノ酸をコーディングするＣＤ９の遺伝子断片、１７１−２２８アミノ酸をコーディングするＣＤ９の遺伝子断片、及びアンジオペプチン−２ペプチド複合体（配列番号４）をコーディングする遺伝子断片をＰＣＲによって製造した。その後、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣＭＶ−ＳｂｆｌベクターのＮｄｅｌ部分はギブソンアセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）によって順次連結されることにより、３断片の２末端が２０〜２４ｂｐだけ互いに重畳してＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９の配列（１−１７０）−アンジオペプチン−２ペプチド複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）の配列を有するベクターを収得した。アンジオペプチン−２ペプチド複合体は３回繰り返されたアンジオペプチン−２アミノ酸配列（配列番号５）から構成されて、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号６）によって記載されたリンカーはアンジオペプチン−２アミノ酸配列の間に位置し、そしてＰＰＶＡＴのアミノ酸配列（配列番号７）に記載されたリンカーはアンジオペプチン−２配列の両末端に挿入される。
【００６７】
ＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９（１−１７０）−アンジオペプチン２複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）をコーディングするベクターをエクソソーム生成細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。２４時間培養した後、牛胎児血清が含まれていない培地で４８時間培養した。培養液を１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、空隙の大きさが０．２μｍであるポリエテールスルホン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ）膜を用いて濾過した。４℃で接線流動濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって濾過液を１次濃縮した。その後、４℃でセファロースビード（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄ）からなるサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて濃縮液を精製した。リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）３００〜５００ｍｌを添加して溶液を希釈した後、４℃で接線流動濾過によって２次濃縮を遂行することにより、アンジオペプチン−２ペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームを収得した。
【００６８】
実施例２
（アポＢペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームの製造）
アポＢは血液脳関門を標的とするタンパク質であり、アポＢペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームを下記のような方法で製造した。
アポＢペプチド複合体（配列番号８）のみ挿入したことを除き、実施例１に記載されたものと同一の段階を行ってエクソソーム膜でアポＢペプチド複合体で標識されたエクソソームを収得した。アポＢペプチド複合体は３回繰り返されたアポＢアミノ酸配列（配列番号９）から構成され、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号６）によって記載されたリンカーはアポＢアミノ酸配列の間に位置し、そしてＰＰＶＡＴのアミノ酸配列（配列番号７）に記載されたリンカーはアポＢ配列の両末端に挿入される。
【００６９】
実施例３
（アポＥペプチド複合体が膜タンパク質に標識されたエクソソームの製造）
アポＥは血液脳関門を標的とするタンパク質であり、アポＥペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームを下記のような方法で製造した。
アポＥペプチド複合体（配列番号１０）のみ挿入したことを除き、実施例１に記載されたものと同一の段階を行って、エクソソーム膜でアポＥペプチド複合体で標識されたエクソソームを収得した。アポＥペプチド複合体は３回繰り返されたアポＥアミノ酸配列（配列番号１１）から構成され、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号６）によって記載されたリンカーはアポＥアミノ酸配列の間に位置し、そしてＰＰＶＡＴのアミノ酸配列（配列番号７）に記載されたリンカーはアポＥ配列の両末端に挿入される。
【００７０】
実施例４
（ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体が膜タンパク質に標識されたエクソソームの製造）
ＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）は血管炎症部位を標的とするタンパク質であり、ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームを下記のような方法で製造した。
【００７１】
ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体（配列番号１２）のみ挿入したことを除き、実施例１に記載されたものと同一の段階を行って、エクソソーム膜でＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体で標識されたエクソソームを収得した。ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体は３回繰り返されたＶＣＡＭ−１内在性配列（配列番号１３）から構成され、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号６）によって記載されたリンカーはＶＣＡＭ−１内在性配列の間に位置し、そしてＰＰＶＡＴのアミノ酸配列（配列番号７）に記載されたリンカーはＶＣＡＭ−１内在性配列の両末端に挿入される。
【００７２】
実施例５
（横紋筋標的ペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームの製造）
横紋筋標的ペプチドは横紋筋を標的とするペプチドであり、横紋筋標的ペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームを下記のような方法で製造した。
【００７３】
横紋筋標的ペプチド複合体（配列番号１４−１６）のみ挿入したことを除き、実施例１に記載されたものと同一の段階を行って、エクソソーム膜で横紋筋標的ペプチド複合体で標識されたエクソソームを収得した。横紋筋標的ペプチド複合体は３回繰り返されたアミノ酸配列、ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号１７）、ＴＡＲＧＥＨＫＥＥＥＬＩ（配列番号１８）又はＳＫＴＦＮＴＨＰＱＳＴＰ（配列番号１９）から構成され、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号６）によって記載されたリンカーは配列の間に位置し、そしてＰＰＶＡＴのアミノ酸配列（配列番号７）に記載されたリンカーは配列の両末端に挿入される。
【００７４】
実施例６
（エンジオプロテイン−２ペプチド複合体の発現）
実施例１のエクソソームをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。エクソソーム膜でアンジオプロテイン−２ペプチド複合体の発現は２４時間後に蛍光顕微鏡によって確認された。図２はエクソソーム膜でアンジオプロテイン−２ペプチド複合体の発現を示す。
【００７５】
実施例７
（アポＢペプチド複合体の発現）
実施例２のエクソソームをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。エクソソーム膜でアポＢペプチド複合体の発現は２４時間後に蛍光顕微鏡によって確認された。図３はエクソソーム膜でアポＢペプチド複合体の発現を示す。
【００７６】
実施例８
（アポＥペプチド複合体の発現）
実施例３のエクソソームをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。エクソソーム膜でアポＥペプチド複合体の発現は２４時間後に蛍光顕微鏡によって確認された。図４はエクソソーム膜でアポＥペプチド複合体の発現を示す。
【００７７】
実施例９
（ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体の発現）
実施例４のエクソソームをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。エクソソーム膜でＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体の発現は２４時間後に蛍光顕微鏡によって確認された。図５はエクソソーム膜でＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体の発現を示す。
【００７８】
実施例１０
（横紋筋標的ペプチド複合体の発現）
実施例５のエクソソームをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。エクソソーム膜で横紋筋標的ペプチド複合体の発現は２４時間後に蛍光顕微鏡によって確認された。エクソソーム膜で横紋筋標的ペプチド複合体の発現が確認された。
【００７９】
実施例１１
（アンジオペプチン−２標的ペプチド複合体がエクソソーム膜に標識されたエクソソームの標的特異的伝達）
ＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９（１−１７０）−アンジオペプチン−２ペプチド複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）をコーディングするベクターは追加のＣｒｅリコンビナーゼ−ＣＲＹ２遺伝子が１００μＷの強度で４６０ｎｍ波長の光を放出するＬＥＤ光の下でさらに挿入されたことを除き、実施例１に記載されたものと同一の段階によって収得した。ベクターをエクソソーム生成細胞としてのＨＥＫ２９３Ｔに導入した。２４時間培養した後、ＬＥＤ光の下で牛胎児血清のない培地で４８時間培養した。培養培地を接線流動濾過及びサイズ排除クロマトグラフィーによって分離して、エクソソーム膜にアンジオペプチン−２ペプチド複合体で標識されたエクソソームを収得した。アンジオペプチン−２ペプチド複合体がエクソソーム膜上に標識されていないエクソソームを対照群として使った。１×１０９粒子／５０μｌの濃度に生成されたエクソソームをＣ５７ＢＬ／６  ｌｏｘＰ−ｅＮｐｈｒ３．０−ｌｏｘＰ−ｅＹＦＰ  ＴＧマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）の血管に静脈内又は腹腔内注射し、注射４８時間後又は７２時間後に臓器を摘出して組職病理学的検査を行った。マウスでｅＹＦＰの分布を分析して、生体内で特異標的ペプチドで標識されたエクソソームの機能及び分布を決定した。
【００８０】
その結果、アンジオペプチン−２ペプチド複合体が標識されたエクソソームは血液脳関門に特異的に伝達された。
【００８１】
実施例１２
（エクソソーム膜にアポＢペプチド複合体が標識されたエクソソームの標的特異的伝達効果）
ＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９（１−１７０）−アポＢペプチド複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）をコーディングするベクターは追加のＣｒｅリコンビナーゼ−ＣＲＹ２遺伝子が１００μＷの強度で４６０ｎｍ波長の光を放出するＬＥＤ光の下でさらに挿入されたことを除き、実施例２に記載されたものと同一の段階によって収得した。生体内で特異標的ペプチドで標識されたエクソソームの機能及び分布を決定するために実施例１１に記載されたものと同一の段階を遂行した。
【００８２】
その結果、アポＢペプチド複合体が標識されたエクソソームは血液脳関門に特異的に伝達された。
【００８３】
実施例１３
（エクソソーム膜にアポＥペプチド複合体が標識されたエクソソームの標的特異的伝達効果）
ＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９（１−１７０）−アポＥペプチド複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）をコーディングするベクターは追加のＣｒｅリコンビナーゼ−ＣＲＹ２遺伝子が１００μＷの強度で４６０ｎｍ波長の光を放出するＬＥＤ光の下でさらに挿入されたことを除き、実施例３に記載されたものと同一の段階によって収得した。生体内で特異標的ペプチドで標識されたエクソソームの機能及び分布を決定するために実施例１１に記載されたものと同一の段階を遂行した。
【００８４】
その結果、アポＥペプチド複合体が標識されたエクソソームは血液脳関門に特異的に伝達された。
【００８５】
実施例１４
（エクソソーム膜にＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体が標識されたエクソソームの標的特異的伝達効果）
ＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９（１−１７０）−ＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）をコーディングするベクターは追加のＣｒｅリコンビナーゼ−ＣＲＹ２遺伝子が１００μＷの強度で４６０ｎｍ波長の光を放出するＬＥＤ光の下でさらに挿入されたことを除き、実施例４に記載されたものと同一の段階によって収得した。生体内で特異標的ペプチドで標識されたエクソソームの機能及び分布を決定するために実施例１１に記載されたものと同一の段階を遂行した。
【００８６】
その結果、膜タンパク質にＶＣＡＭ−１内在性配列ペプチド複合体が標識されたエクソソームは血管炎症部位に特異的に伝達されたことを確認した。
【００８７】
実施例１５
（エクソソーム膜に横紋筋標的ペプチド複合体が標識されたエクソソームの標的特異的伝達効果）
ＣＩＢＮ−ＥＧＦＰ−ＣＤ９（１−１７０）−横紋筋標的ペプチド複合体−ＣＤ９（１７１−２２８）をコーディングするベクターは追加のＣｒｅリコンビナーゼ−ＣＲＹ２遺伝子が１００μＷの強度で４６０ｎｍ波長の光を放出するＬＥＤ光の下でさらに挿入されたことを除き、実施例５に記載されたものと同一の段階によって収得した。生体内で特異標的ペプチドで標識されたエクソソームの機能及び分布を決定するために実施例１１に記載されたものと同一の段階を遂行した。
【００８８】
その結果、膜タンパク質に横紋筋標的ペプチド複合体が標識されたエクソソームは横紋筋に特異的に伝達されたことを確認した。
【図１】
2020534864.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2020534864000001.app
【国際調査報告】
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