(57)【要約】  本発明は、栄養価、特にＰＤＣＡＡＳが改良されたエンドウマメタンパク質組成物、並びにそれを製造するための方法及び食品又は医薬組成物におけるこの組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グロブリン及びアルブミンを含むエンドウマメタンパク質組成物であって、前記組成物の固体抽出物が、
−  前記固体抽出物の重量に対して、少なくとも８０重量％、好ましくは、８０〜９９重量％、より優先的に、８５〜９８重量％、９０〜９７重量％、９２〜９５重量％のタンパク質を含み；
−  ６５／３５〜８５／１５、好ましくは、７０／３０〜８２／１８、より優先的に、７５／２５〜８０／２０の、グロブリン対アルブミンの質量比を有することを特徴とするエンドウマメタンパク質組成物。
【請求項２】
前記組成物の前記固体抽出物が、６〜１０ＴＩＵ／ｍｇの抗トリプシン因子の含量を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１に等しいＰＤＣＡＡＳを有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
エンドウマメタンパク質組成物を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ）タンパク質画分を得るために、エンドウマメからグロブリン及びアルブミンを抽出する工程と；
ｂ）グロブリン富化画分及びアルブミン富化画分を得るために、前記アルブミンから前記グロブリンを分離する工程と；
ｃ）処理されたアルブミン富化画分を得るために、前記アルブミン富化画分中の抗トリプシン因子の含量を減少させる工程と；
ｄ）前記混合物の前記固体抽出物が、６５／３５〜８５／１５、好ましくは、７０／３０〜８２／１８、より優先的に、７５／２５〜８０／２０の、グロブリン対アルブミンの質量比を有するように、前記グロブリン富化画分及び前記処理されたアルブミン富化画分を混合する工程と
を含む、方法。
【請求項５】
工程ａ）において、前記グロブリン及び前記アルブミンが、以下の工程：
ａ−ｉ）前記エンドウマメを粉砕する工程と；
ａ−ｉｉ）液相Ｂ中で懸濁された固相Ａを得るために、前記粉砕されたエンドウマメを水溶液中に導入する工程と；
ａ−ｉｉｉ）前記タンパク質画分に相当する前記液相Ｂを、前記固相Ａから分離する工程と
を含むプロセスによりエンドウマメから抽出されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）において、前記グロブリンが、以下の工程：
ｂ−ｉ）液相Ｄ中で懸濁された固相Ｃを得るために、前記タンパク質画分のグロブリンを凝集する工程と；
ｂ−ｉｉ）前記グロブリンを含有する前記固相Ｃから、前記アルブミンを含有する前記液相Ｄを分離する工程と
を含むプロセスにより前記アルブミンから分離されることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）において、前記処理されたアルブミン富化画分が、２０〜８０ＴＩＵ／ｍｇ、好ましくは、３０〜５０ＴＩＵ／ｍｇの、前記固体抽出物中の抗トリプシン因子の含量を有することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）において、前記グロブリン富化画分及び前記処理されたアルブミン富化画分が、湿潤環境中で混合され、次に、前記混合物が乾燥されることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
食品又は医薬組成物における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエンドウマメタンパク質組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、栄養価、特にＰＤＣＡＡＳが改良されたエンドウマメタンパク質組成物、それを製造するための方法及び食品又は医薬組成物におけるこの組成物の使用である。
【背景技術】
【０００２】
一日のタンパク質必要量は、食品摂取量の１２％〜２０％である。これらのタンパク質は、動物由来の製品（肉、魚、卵、乳製品）及び植物性食品（穀物、マメ科植物、海藻類）の両方によって供給される。
【０００３】
しかしながら、先進工業国において、タンパク質摂取は、主に、動物由来のタンパク質の形態である。しかしながら、多くの研究は、植物性タンパク質をおろそかにした動物由来のタンパク質の過剰な摂取が、癌及び心血管疾患の増加の原因の１つであることを実証している。
【０００４】
さらに、動物性タンパク質は、特に、牛乳又は卵に由来するタンパク質に関するそれらのアレルギー誘発性の点、及び集約農業の破壊的な影響に関する環境上の点の両方で、多くの欠点を示す。
【０００５】
したがって、有利な栄養及び機能特性を有しつつ、動物由来の化合物の欠点を示さない、植物由来のタンパク質に対する、製造業者からの高まるニーズがある。
【０００６】
１９７０年代以来、エンドウマメは、特に、動物飼料のためのタンパク質資源としてだけでなく、人による摂取のための食品として、ヨーロッパ、主にフランスで、最も広く発展してきたマメ科の種子植物であった。エンドウマメは、約２７重量％のタンパク質を含有する。「エンドウマメ」という用語は、本明細書において、その最も広い意味で考えられ、特に、「滑らかなエンドウマメ（ｓｍｏｏｔｈ  ｐｅａ）」の全ての野生型品種並びに「滑らかなエンドウマメ」及び「しわのあるエンドウマメ（ｗｒｉｎｋｌｅｄ  ｐｅａ）」の全ての突然変異体品種を、前記品種が一般に意図される使用（人による摂取のための食品、動物飼料及び／又は他の使用）にかかわらず含む。
【０００７】
それらの明白な品質にもかかわらず、エンドウマメタンパク質は、動物性タンパク質及びダイズタンパク質より栄養能が低い。実際に、いくつかの研究は、エンドウマメタンパク質のＰＤＣＡＡＳが１未満であることを示している（例えば、“Ａｌｉｍｅｎｔｓ  ａ
ｂａｓｅ  ｄｅ  ｓｏｊａ−ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｅｓ  ｄｅ  ｈａｕｔｅ  ｑｕａｌｉｔｅ［Ｓｏｙ−ｂａｓｅｄ  ｆｏｏｄｓ−ｈｉｇｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ］”，ＥＮＳＡ，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１５を参照）。ＰＤＣＡＡＳ、又はタンパク質消化率補正アミノ酸スコアは、２つの基準：人の必須アミノ酸必要量及びタンパク質消化率にしたがって、タンパク質の品質を評価するのに使用される。１９８９年以来、ＷＨＯ及びＦＡＯは、タンパク質品質を決定するためにこの方法の使用を推奨している。栄養的に完全なタンパク質は、この方法において１（又は結果の表現に応じて１００％）のスコアを取得しなければならないことが認められている。
【０００８】
多くの研究及び調査が、エンドウマメタンパク質が抱えているこの欠陥を克服しようとしてきた。１未満のＰＤＣＡＡＳは、少なくとも部分的に、エンドウマメタンパク質と同時抽出される抗栄養因子の存在に起因する。例えば、消化性トリプシンを阻害することによってタンパク質の消化を妨げる抗トリプシン因子が挙げられ得る。したがって、本出願
人は、主にグロブリンを含み、且つ抗栄養因子の低い含量を有するエンドウマメタンパク質組成物を製造するための方法を開発した（国際公開第２００７／０１７５７２号パンフレットを参照）。この組成物のＰＤＣＡＡＳは、９３％（又は０．９３）の値に達することによって明らかに改善されている（“Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａ  ｗｉｎｎｅｒ？”，Ｃ．Ｌｅｆｒａｎｃ−Ｍｉｌｌｏｔ，２０１４を参照）。１のＰＤＣＡＡＳ値に達するために、周知の解決法は、この組成物に、コムギから抽出されたタンパク質の混合物を加えることにある（“Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａ  ｗｉｎｎｅｒ？”，Ｃ．Ｌｅｆｒａｎｃ−Ｍｉｌｌｏｔ，２０１４をさらに参照）。この見事な解決法は、それでもなお、所望のタンパク質を得るためにいくつかの工程を結びつける必要性、及び微量のグルテンを含有し得るコムギタンパク質の使用などのいくつかの欠点を有する。
【０００９】
したがって、栄養価が動物性タンパク質の栄養価と同等である、エンドウマメのみから抽出されたタンパク質に対する満たされていないニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これらのニーズを満たすために研究を行い、本発明を開発したことは、本出願人にとって名誉なことである。特に、本出願人は、国際公開第２００７／０１７５７２号パンフレットに記載のタンパク質組成物を、アルブミン富化エンドウマメ抽出物と混合することによって、エンドウマメから抽出されたタンパク質のみを含む、１のＰＤＣＡＡＳを有する組成物を開発した。この解決法は、アルブミン富化エンドウマメ抽出物が抗トリプシン因子の高い含量も有するため、当業者によって想定されていなかった。抗トリプシン因子は、８〜１０ｋＤａの低分子量アルブミンであり、これは、トリプシンの活性部位に不可逆的に結合することが可能である。したがって、それらは、プロテアーゼ摂取されたタンパク質の胃腸内加水分解を防ぐため、タンパク質の消化率及びそれらのＰＤＣＡＡＳを低下させる。アルブミン富化エンドウマメ抽出物中の抗トリプシン因子の含量を低下させることに成功し、それらをグロブリン富化エンドウマメ抽出物と組み合わせることによって、本出願人は、優れた栄養価を有するエンドウマメタンパク質組成物を得ることができた。
【００１１】
本発明の第１の主題は、グロブリン及びアルブミンを含むエンドウマメタンパク質組成物であって、組成物の固体抽出物が、
−  固体抽出物の重量に対して、少なくとも８０重量％、好ましくは、８０〜９９重量％、より優先的に、８５〜９８重量％、９０〜９７重量％、９２〜９５重量％のタンパク質を含み；
−  ６５／３５〜８５／１５、好ましくは、７０／３０〜８２／１８、より優先的に、７５／２５〜８０／２０の、グロブリン対アルブミンの質量比を有することを特徴とする、エンドウマメタンパク質組成物である。
【００１２】
本発明の第２の主題は、エンドウマメタンパク質組成物を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ）タンパク質画分を得るために、エンドウマメからグロブリン及びアルブミンを抽出する工程と；
ｂ）グロブリン富化画分及びアルブミン富化画分を得るために、アルブミンからグロブリンを分離する工程と；
ｃ）処理されたアルブミン富化画分を得るために、アルブミン富化画分中の抗トリプシン因子の含量を減少させる工程と；
ｄ）混合物の固体抽出物が、６５／３５〜８５／１５、好ましくは、７０／３０〜８２／１８、より優先的に、７５／２５〜８０／２０の、グロブリン対アルブミンの質量比を有するように、グロブリン富化画分及び処理されたアルブミン富化画分を混合する工程。
【００１３】
本発明の第３の主題は、食品又は医薬組成物における本発明に係るエンドウマメタンパク質組成物の使用である。
【００１４】
「エンドウマメ」という用語は、本特許出願において、「滑らかなエンドウマメ」の全ての野生品種並びに「滑らかなエンドウマメ」及び「しわのあるエンドウマメ」の全ての突然変異体品種を意味するものと理解されるべきである。
【００１５】
「タンパク質」という用語は、本特許出願において、ペプチド結合によって一緒に結合されるアミノ酸残基の配列からなる１つ以上のポリペプチド鎖で形成された高分子を意味するものと理解されるべきである。エンドウマメタンパク質の具体的な文脈において、本発明は、より具体的には、グロブリン（エンドウマメタンパク質の約５０〜６０重量％）及びアルブミン（エンドウマメタンパク質の２０〜２５重量％）に関する。エンドウマメグロブリンは、主に、３つのサブファミリー：レグミン、ビシリン及びコンビシリンに分類される。エンドウマメアルブミンは、主に、ＰＡ１及びＰＡ２と呼ばれる２つのファミリーに分類される。
【００１６】
「抗トリプシン因子」という用語は、本出願において、消化性プロテアーゼ、特にトリプシンを阻害する活性を有する化合物の全てを意味するものと理解されるべきである。本発明に係る組成物中の抗トリプシン因子の含量を計算するための方法は、本出願の実施例において詳述されている。
【００１７】
「ＰＤＣＡＡＳ」という用語は、本発明において、タンパク質消化率補正アミノ酸スコアを意味するものと理解されるべきである。この方法は、人による摂取を意図された食品のタンパク質品質を推定するために現在最も一般的に使用されているものである。ＰＤＣＡＡＳは、２つの基準：ＦＡＯの推奨による人の必須アミノ酸必要量及びタンパク質の消化率にしたがってタンパク質の品質を評価する。１９８９年以来、ＷＨＯ及びＦＡＯは、タンパク質品質を決定するために、この方法の使用を推奨している。栄養的に完全なタンパク質は、この方法において、１（又は結果の表現に応じて１００％）のスコアを取得しなければならないことが認められている。本発明に係る組成物のＰＤＣＡＡＳを計算するための方法は、本出願の実施例において詳述されている。
【００１８】
本発明の様々な主題が、以下に続く本発明の詳細な説明においてさらによく理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の主題である組成物は、グロブリン及びアルブミンを含むエンドウマメタンパク質組成物である。
【００２０】
以下に続く全文において、「タンパク質」、「グロブリン」及び「アルブミン」という用語はそれぞれ、エンドウマメのみから抽出された、タンパク質、グロブリン及びアルブミンを示す。したがって、エンドウマメ以外の植物源又は動物源から抽出された、タンパク質、グロブリン及びアルブミンは、これらの用語に含まれない。グロブリンは、当業者に周知の様々な方法によって、特に、それらの水への溶解性によって、アルブミンと区別され得、アルブミンは純水に可溶性であるが、グロブリンは、塩水のみに可溶性である。電気泳動又はクロマトグラフィーによって、混合物中に存在するアルブミン及びグロブリンを同定することも可能である。
【００２１】
本発明に係る組成物の固体抽出物は、固体抽出物の重量に対して、少なくとも８０重量％、好ましくは、８０〜９９重量％、より優先的に、８５〜９８重量％、９０〜９７重量
％、９２〜９５重量％のタンパク質を含む。当業者に周知の、タンパク質レベルを定量化するための任意の参照アッセイ方法が使用され得る。好ましくは、総窒素がアッセイされ（％／粗製物）、その結果に係数６．２５が乗算される。植物性タンパク質の分野におけるこの周知の方法は、タンパク質が平均で１６％の窒素を含有するという観察に基づいている。当業者に周知の、乾燥物質をアッセイする任意の方法も使用され得る。
【００２２】
さらに、本発明に係る組成物の固体抽出物は、６５／３５〜８５／１５、好ましくは、７０／３０〜８２／１８、より優先的に、７５／２５〜８０／２０の、グロブリン対アルブミンの質量比を有する。
【００２３】
特定の一実施形態によれば、本発明に係る組成物に含まれるアルブミンは、ＰＡ１及びＰＡ２型のアルブミン及びレクチンから本質的になる。したがって、本発明に係る組成物のタンパク質の重量に対する抗トリプシン因子の重量パーセンテージは、自然状態におけるエンドウマメ中のタンパク質の重量に対する抗トリプシン因子の重量パーセンテージ未満である。好ましくは、本発明に係る組成物の固体抽出物は、６〜１０ＴＩＵ／ｍｇの抗トリプシン因子の含量を有する。抗トリプシン因子の含量は、特に、後述される方法にしたがって測定され得る。
【００２４】
特定の一実施形態によれば、本発明に係る組成物は、１（又は結果の表現に応じて１００％）に等しいＰＤＣＡＡＳを有する。実際に、本発明に係る組成物中の抗トリプシン因子の低い含量が、組成物に良好な消化率を与える。本発明に係る組成物中のグロブリン対アルブミンの質量比はまた、良好なアミノ酸バランスに寄与する。アルブミンの存在は、特に、含硫アミノ酸で組成物を富化することを可能にする。したがって、本発明に係る組成物は、優れた栄養価を有する。
【００２５】
本発明に係る組成物は、特に、後述されるエンドウマメタンパク質組成物を製造するための方法によって得ることができる。
【００２６】
本発明の主題である、エンドウマメタンパク質組成物を製造するための方法は、タンパク質画分を得るために、グロブリン及びアルブミンがエンドウマメから抽出される工程ａ）を含む。
【００２７】
好ましい一実施形態によれば、工程ａ）において、グロブリン及びアルブミンは、以下の工程：
ａ−ｉ）エンドウマメを粉砕する工程と；
ａ−ｉｉ）液相Ｂ中で懸濁された固相Ａを得るために、粉砕されたエンドウマメを水溶液中に導入する工程と；
ａ−ｉｉｉ）タンパク質画分に相当する液相Ｂを、固相Ａから分離する工程と
を含むプロセスによりエンドウマメから抽出される。
【００２８】
このような方法は、特に、欧州特許出願ＥＰ１４００５３７号明細書に記載されている。
【００２９】
工程ａ−ｉ）において使用されるエンドウマメは、特に、清浄化（石、虫の死骸、土壌残留物などの好ましくない粒子の除去）或いは「脱ぷ」と呼ばれる周知の工程によるエンドウマメの外部繊維（セルロース外殻）の除去などの、当業者に周知の工程を予め経ていてもよい。
【００３０】
工程ａ−ｉ）において、エンドウマメは、水の非存在下で粉砕され得る（「乾式粉砕」として知られているプロセス）。別の実施形態によれば、エンドウマメは、水の存在下で
粉砕され得る（「湿式粉砕」として知られているプロセス）。この場合、固相Ａが、湿式粉砕工程の最後に、液相Ｂ中で、懸濁状態で直接得られるため、工程ａ−ｉｉ）は実施されない。
【００３１】
工程ａ−ｉｉ）において、水溶液のｐＨは、特に、６．２〜７であり得、水溶液の温度は、特に、５〜２０℃であり得る。
【００３２】
工程ａ−ｉｉｉ）は、固相Ａから液相Ｂを分離することを可能にする。液相Ｂは、タンパク質画分に相当し、「可溶性画分」とも呼ばれる。それは、タンパク質、特に、グロブリン及びアルブミン、及びさらに水性相に可溶性の他の化合物、特に、塩、アミノ酸及び炭水化物を含有する。固相Ａとしては、エンドウマメ繊維及びデンプンを含有する。
【００３３】
好ましくは、液相Ｂ及び固相Ａは、分別によって分離される。分別による分離は、特に、遠心分離デカンタ又はハイドロサイクロンによって行われ得る。
【００３４】
本発明に係る方法は、グロブリン富化画分及びアルブミン富化画分を得るために、グロブリン及びアルブミンが分離される工程ｂ）を含む。
【００３５】
「グロブリン富化画分」及び「アルブミン富化画分」という用語は、前記画分中のタンパク質の重量に対するグロブリンの、又はアルブミンの重量パーセンテージが、その自然状態におけるエンドウマメ中のタンパク質の重量に対するグロブリンの、又はアルブミンの重量パーセンテージより多い画分を意味することが意図される。したがって、富化は、その自然状態におけるエンドウマメと富化画分との間の、グロブリンの、又はアルブミンの割合の増加パーセンテージに相当する。特に、富化画分の富化は、その自然状態におけるエンドウマメと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％である。富化は、特に、グロブリン及びアルブミンに関して、対象とするタンパク質画分の精製及び／又は濃縮によって得ることができる。これらの画分は、加えられるプロセスに応じて、水和形態又は乾燥形態であり得る。
【００３６】
工程ｂ）は、特に、タンパク質の等電ｐＨにおけるタンパク質の沈殿又は膜分離、例えば限外ろ過によって行われ得る。
【００３７】
好ましい一実施形態によれば、工程ｂ）において、グロブリンは、以下の工程：
ｂ−ｉ）液相Ｄ中で懸濁された固相Ｃを得るために、タンパク質画分のグロブリンを凝集する工程と；
ｂ−ｉｉ）グロブリンを含有する固相Ｃから、アルブミンを含有する液相Ｄを分離する工程と
を含むプロセスによりアルブミンから分離される。
【００３８】
好ましくは、工程ｂ−ｉ）において、グロブリンの凝集は、タンパク質画分のｐＨを、グロブリンの等電ｐＨにすることによって行われる。より優先的に、タンパク質画分のｐＨは、４．５に調整される。タンパク質の凝集は、特に、５〜３０分間、より具体的には、１０〜３０分間にわたって、３０〜７０℃でタンパク質画分を加熱することによって特に行われ得る。
【００３９】
工程ｂ−ｉｉ）において、固相Ｃ（「ｆｌｏｃ」とも呼ばれる）は、好ましくは、遠心分離によって液相Ｄから分離される。固相Ｃは、グロブリン富化画分に相当し、グロブリンを含む。液相Ｄは、アルブミン富化画分に相当し、アルブミン、及びさらに水性相に可溶性の他の化合物、特に、塩、アミノ酸及び炭水化物を含む。
【００４０】
本発明に係る方法は、処理されたアルブミン富化画分を得るために、アルブミン富化画分中の抗トリプシン因子の含量が減少される工程ｃ）を含む。
【００４１】
好ましい一実施形態によれば、工程ｃ）において、処理されたアルブミン富化画分は、２０〜８０ＴＩＵ／ｍｇ、好ましくは、３０〜５０ＴＩＵ／ｍｇの、固体抽出物中の抗トリプシン因子の含量を有する。
【００４２】
好ましくは、工程ｃ）において、アルブミン富化画分中の抗トリプシン因子の含量は、以下の工程：
ｃ−ｉ）精密ろ過透過液又は遠心分離上清を得るために、アルブミン富化画分の精密ろ過又は遠心分離を行う工程と；
ｃ−ｉｉ）処理されたアルブミン富化画分に相当する限外ろ過保持液を得るために、前記精密ろ過透過液又は前記遠心分離上清の限外ろ過を行う工程と
を含むプロセスにより減少される。
【００４３】
工程ｃ−ｉ）の精密ろ過は、精密ろ過透過液及び精密ろ過保持液をもたらす。その後の限外ろ過工程ｃ−ｉｉ）において後に処理されるのは透過液である。工程ｃ−ｉ）の遠心分離は、同様に、遠心分離上清及び遠心分離堆積物をもたらす。その後の限外ろ過工程ｃ−ｉｉ）において後に処理されるのは上清である。
【００４４】
工程ｃ−ｉ）が精密ろ過である場合、それは、優先的に、タンジェンシャル膜精密ろ過である。より具体的には、タンジェンシャル精密ろ過は、優先的に、０．０１μｍ〜１μｍ、優先的に、０．０５μｍ〜０．５μｍの気孔を有するセラミック膜を用いて行われる。
【００４５】
限外ろ過工程ｃ−ｉｉ）は、精密ろ過透過液又は遠心分離上清において行われる。それは、一方で、アルブミン富化限外ろ過保持液を、他方で、塩、アミノ酸及び炭水化物に富んだ透過液を得ることを可能にする。より具体的には、膜透過圧を４バール未満に保ちながら、０．１〜０．５μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いた限外ろ過を行うことが推奨されている。
【００４６】
本発明に係る方法は、混合物の固体抽出物が、６５／３５〜８５／１５、好ましくは、７０／３０〜８２／１８、より優先的に、７５／２５〜８０／２０の、グロブリン対アルブミンの質量比を有するように、グロブリン富化画分及び処理されたアルブミン富化画分が混合される工程ｄ）を含む。
【００４７】
特定の一実施形態によれば、工程ｄ）において、グロブリン富化画分及び処理されたアルブミン富化画分は、湿潤環境中で混合され、次に、前記混合物は乾燥される。湿潤環境中での混合は、特に、好ましくは、羽根又はタービンを備えた可動シャフトなどの適切な撹拌システムを備えた、この目的に好適な任意の容器中で行われ得る。均質な混合物を得た後、後者は、噴霧乾燥、或いは凍結乾燥などの、当業者に周知の技術を用いて乾燥される。
【００４８】
本発明に係る方法は、工程ａ）ｂ）ｃ）、若しくはｄ）の前及び／又は後に１つ以上の任意選択の工程も含み得る。特定の一実施形態によれば、本発明に係る方法は、工程ｃ）と工程ｄ）との間に、グロブリン富化タンパク質画分及び／又は処理されたアルブミン富化タンパク質画分の酵素加水分解の工程を含んでいてもよい。酵素加水分解反応において使用される酵素のタイプは、好ましくは、プロテアーゼグループの酵素である。
【００４９】
本発明の主題はまた、食品又は医薬組成物における本発明に係るエンドウマメタンパク
質組成物の使用である。
【００５０】
実際に、その優れた栄養価及び低いアレルギー誘発性のため、このようなエンドウマメタンパク質組成物は、多くの工業用途において、特に、食品加工又は医薬品産業において、及び動物飼料において、明らかに興味を集めている。
【００５１】
用語「食品組成物」は、人又は動物の摂取を意図された組成物を意味するものと理解される。「食品組成物」という用語は、食料品及び栄養補助食品を包含する。用語「医薬組成物」は、治療上の使用を意図された組成物を意味するものと理解される。
【００５２】
以下に続く実施例は、本出願をより十分に例示することを可能にするが、本出願の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１：エンドウマメ粉並びにエンドウマメグロブリン及びエンドウマメアルブミンのそれぞれが富化された画分の製造
１００μｍのグリッドを備えたＡｌｐｉｎｅハンマーミルで殻付きの飼料用エンドウマメを粉砕することによって、エンドウマメ粉をまず調製する。この粉は、「エンドウマメ粉」と呼ばれる。
【００５４】
次に、８７重量％の乾燥物質を含有する３００ｋｇのエンドウマメ粉を、６．５のｐＨで、２５重量％の乾燥物質（ＤＭ）の最終濃度で、水に浸漬する。次に、２５重量％のＤＭ（したがって、２６１ｋｇの乾燥粉）を含有する１０４４ｋｇの粉懸濁液を、５００ｋｇの水とともに、１４段で構成されるハイドロサイクロンバッテリー（ｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｎｅ  ｂａｔｔｅｒｙ）中に導入する。ハイドロサイクロンバッテリーには、第５段において粉懸濁液が供給される。この分離により、第１段の出口に相当する軽質相が得られる。軽質相は、タンパク質、繊維及び可溶性物質の混合物からなる。ハイドロサイクロン出口におけるこの軽質相は、混合物（合計で１４２ｋｇのＤＭとして）：繊維（約１４．８重量％、すなわち２１ｋｇのＤＭ）、タンパク質（約４２．８重量％、すなわち、６０．８ｋｇのＤＭ）及び可溶性物質（約４２．４重量％、すなわち、６０．２ｋｇのＤＭ）を含有する。この画分は、１１．４重量％のＤＭ含量を有する。繊維を、工業用ジャガイモデンプン加工ユニットにおいて使用されるＷｅｓｔｆａｌｉａタイプの遠心分離デカンタにおいて分離する。遠心分離デカンタの出口における軽質相は、タンパク質及び可溶性物質の混合物を含有する一方、重質相は、エンドウマメ繊維を含有する。重質相は、２０重量％のＤＭで１０５ｋｇの繊維を含有する。繊維の実質的に全てが、実際にこの画分中に見られることが留意される。タンパク質及び可溶性物質画分に関しては、それは、可溶性物質及びタンパク質（６重量％のＤＭを含有する画分）の溶液中の１１４２ｋｇの混合物を含有する。遠心分離デカンタの出口における軽質相を、４．５のｐＨに調整し、５０℃で加熱することによって、タンパク質をそれらの等電点で凝集させる。このように凝集されたタンパク質を、熟成タンク中で１０分間置く。タンパク質の沈殿の後、遠心分離デカントを行い、それにより、２０重量％のＤＭを含有する５６ｋｇのタンパク質（乾量基準で８６％のＮｘ６．２５）を含有する堆積物、及び特に、アルブミンを含有するタンパク質画分を含有する上清を回収することが可能である。堆積物は、グロブリンが富化されたタンパク質画分に相当し、それは、「グロブリン富化画分」と呼ばれる。上清は、アルブミンが富化されたタンパク質画分に相当し、それは、「アルブミン富化画分」と呼ばれる。
【００５５】
次に、アルブミン富化画分を精製する。そのｐＨを、５０％の水酸化ナトリウムを加えることによって７．０に調整する。このように得られた懸濁液の温度を、７０℃にした。溶液を、０．１４μｍのカットオフ閾値（４．５ｍｍの１９のチャネル）を有するＩｎｓ
ｉｄｅ  Ｃｅｒａｍ（登録商標）タイプのセラミック膜を装着した精密ろ過ユニットに通して注入する。ろ過の間中、温度を６０℃に調節し、膜透過圧を０．４〜０．６バールの値に維持する。７０７リットルの精密ろ過透過液及び１７６８リットルの精密ろ過保持液をこのように回収する。５５０リットルの透過液を、限外ろ過ユニットに通して注入する。限外ろ過ユニットには、Ｎｏｖａｓｅｐ社によって販売されている、１５ＫＤａのカットオフ閾値（６ｍｍの７つのチャネル）を有するＫｅｒａｓｅｐ（登録商標）ＢＸタイプのセラミック膜が装着されている。ろ過の間中、温度を６０℃に調節し、膜透過圧を、１〜３バールの値に維持する。４６７リットルの限外ろ過透過液、及び７．２重量％のＤＭで７５重量％のタンパク質を含有する３３リットルの保持液を、このように回収する。この限外ろ過保持液は、アルブミンが富化された、処理されたタンパク質画分に相当し、「処理されたアルブミン富化画分」と呼ばれる。
【００５６】
実施例２：本発明に係るエンドウマメタンパク質組成物の製造
電動式撹拌機を装着したステンレス鋼タンクを使用する。１．８９ｋｇの「グロブリン富化画分」及び２ｋｇの「処理されたアルブミン富化画分」を、このタンク中に導入する。この混合物は、７５／２５の、「グロブリン富化画分」と「処理されたアルブミン富化画分」との間の乾燥物質の相対パーセンテージとして表される比率を得ることを可能にする。次に、電動式撹拌機を起動し、生成物を、１５〜３０分間にわたって均質化する。次に、混合物を、単段噴霧乾燥塔に送り、乾燥させる。９５重量％のＤＭを含有する粉末を、このように回収する。生成物は、「７５／２５エンドウマメタンパク質組成物」と呼ばれる。
【００５７】
電動式撹拌機を装着した上記のステンレス鋼タンクを再度使用する。２．５ｋｇの「グロブリン富化画分」及び２ｋｇの「処理されたアルブミン富化画分」を、このタンク中に導入する。この混合物は、８０／２０の、「グロブリン富化画分」と「処理されたアルブミン富化画分」との間の乾燥物質の相対パーセンテージとして表される比率を得ることを可能にする。次に、電動式撹拌機を起動し、生成物を１５〜３０分間にわたって均質化する。次に、混合物を、単段噴霧乾燥塔に送り、乾燥させる。９６重量％のＤＭを含有する粉末を、このように回収する。生成物は、「８０／２０エンドウマメタンパク質組成物」と呼ばれる。
【００５８】
上述される混合物を、水の存在なしで、乾式混合のみによる以外は同様に製造する。Ｍｉｓｓｅｎａｒｄ−Ｑｕｉｎｔオービタルシェーカーを、このために使用するが、粉末混合用の機器の他の部品が好適であり得る。生成物は、「乾燥８０／２０エンドウマメタンパク質組成物」及び「乾燥７５／２５エンドウマメタンパク質組成物」と呼ばれる。
【００５９】
実施例３：消化率及びＰＤＣＡＡＳを計算するための方法
ラットにおけるタンパク質消化率の測定が、以下のＦＡＯ論文：“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｊｏｉｎｔ  ＦＡＯ／ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ．Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ”に記載されている。
【００６０】
このために、実験用飼料は、１０重量％の、試験されるタンパク質、１重量％のＡＩＮ９３ビタミン混合物、３．５重量％のＡＩＮ９３鉱物混合物、０．２重量％の重酒石酸コリン、５重量％のセルロース、１０重量％のトウモロコシ油から構成される。飼料は、コーンスターチを用いて１００％になるように構成される。
【００６１】
タンパク質を含有しないこの同じ飼料を、試験の対照として使用する。このために、タンパク質を、コーンスターチで置き換える。
【００６２】
成長中のスプラーグドーリーラット（試験の開始時に５０〜７０ｇの重量）を、１８〜２４℃の温度及び４０〜７０％の湿度で、代謝ケージ中で個別に飼育する。ラットに、少なくとも２日間にわたって標準飼料を与えてから、試験を開始する。次に、ラットに、最小で９日間にわたって実験食を与えるが、この９日間は、４日間の食餌に順化する第１の期間と、それに続く、便を採取する５日間の期間からなる。試験の期間にわたって、水を自由に与える。このように採取した便を毎日計量し、２４時間凍結乾燥させ、粉砕する。飼料及び便に含まれる窒素の測定により、タンパク質消化率を計算することが可能になる。使用される測定方法は、ケルダール法である。
【００６３】
摂取された窒素及び排泄された窒素が、飼料摂取又は便の重量に、それぞれの窒素レベルを乗算することによって得られる。基底窒素レベルは、タンパク質を含有しない食餌を与えられた動物の便中窒素を測定することによって得られる。
【００６４】
タンパク質消化率は、以下の方法で得られる：
消化率＝［摂取された窒素−（便中窒素−基底窒素）］／摂取された窒素×１００
【００６５】
アミノグラム又は総アミノ酸プロファイルは、ＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ１３９０３：２００５公定法を用いて確立される。
【００６６】
アミノ酸スコアは、成体において決定される参照プロファイルに対して限定的な必須アミノ酸であるものと決定される。それを得るために、以下の比率が計算されなければならない：［１ｇの試験タンパク質に含まれるアミノ酸のｍｇ］／［参照プロファイルのアミノ酸のｍｇ］。最小値は、アミノ酸スコアを表す。
【００６７】
ＰＤＣＡＡＳ（タンパク質消化率補正アミノ酸スコア）は、この限定的なアミノ酸スコアに、ラットにおいて決定されるタンパク質消化率を乗算することによって得られる。
【００６８】
成体における参照プロファイルは、ＦＡＯによってその論文中に記載されている：“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｊｏｉｎｔ  ＷＨＯ／ＦＡＯ／ＵＮＵ  ｅｘｐｅｒｔ  ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．２００７。
【００６９】
【表１】
2020535835.tif 000002
【００７０】
実施例４：抗トリプシン因子の含量を測定するための方法
抗トリプシン因子の含量を測定するための方法は、トリプシン阻害剤を水酸化ナトリウムで抽出することにある。増加する体積の希釈された試料を、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニンｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）（これは、次に、４１０ｎｍで吸収する化合物であるｐ−ニトロアニリンの形態で加水分解される）の存在下で過剰なトリプシンと接触させる。酢酸との反応のブロックの後、着色の増加が、４１０ｎｍにおいて分光光度計で測定される。次に、阻害剤含量を、着色の減少率から計算する。トリプシンの１単位は、ＡＯＣＳ  Ｂａ  １２−７５方法の条件下で１０ｍｌの反応混合物当たり４１０ｎｍにおける吸光度の０．０１単位の増加を生じるのに必要とされる酵素の量として任意に定義される。抗トリプシン因子含量は、試験される試料のｍｇ当たりのトリプシン阻害単位（ＴＩＵ／ｍｇ）で表される。
【００７１】
実施例５：様々な画分の比較
【００７２】
【表２】
2020535835.tif 000003
【００７３】
これらの実施例は、アルブミン富化画分中の抗トリプシン因子の濃度を明らかに実証し、これは、ひいてはこれらの低分子量及び水溶性画分に抗トリプシン因子が豊富にあることを示す、当該技術分野における一般的な教示を裏付けるものである。したがって、当業者は、グロブリン富化画分のＰＤＣＡＡＳを改善することを意図して、アルブミン富化画分を再利用することを断念してきた。当業者は、その代わりに、先行技術において教示されるようにコムギタンパク質などの補完的供給源を使用することを選択してきた。本出願人は、この教示の上を行き、エンドウマメに由来するタンパク質画分のみに基づいてＰＤＣＡＡＳが１に等しいタンパク質を得ることを可能にする解決法を開発した。
【００７４】
実施例６：再構成される飲料又は「粉末混合物」のためのレシピにおける様々な製品の官能的比較：
以下を含む再構成される飲料又は「粉末混合物」のためのレシピを用いて官能条件の相違を評価することが提案される。
−「乾燥８０／２０エンドウマメタンパク質組成物」及び「乾燥７５／２５エンドウマメタンパク質組成物」
−「８０／２０エンドウマメタンパク質組成物」及び「７５／２５エンドウマメタンパク質組成物」。
【００７５】
これは、粉末の乾式混合と比較した、水への溶解及び噴霧乾燥によって本発明に係るエンドウマメタンパク質組成物を製造することの潜在的な利点を実証することを可能にするはずである。
【００７６】
レシピは以下のとおりである。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
様々な粉末化成分を計量し、オービタルシェーカーを用いて、乾式混合後に一緒に導入する。様々な混合物を、方法が後述されるテイスティングパネルによって比較する。
【００７９】
パネルは、配合された製品をテイスティングする資格がある者である。パネルに、製品を区別する能力についての性能レベルを確認するために指示及び訓練を与えた−コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）、記述子の適切な使用（ｃｏｒｒｅｃｔ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ）−再現性（Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ）、複製を見分ける能力（ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｓｐｏｔ  ａ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）。パネルは、液体の利用について特別に訓練された個人で構成される。
【００８０】
３種の飲料を、テイスティングの時点で２５ｇの粉末を、Ｅｖｉａｎ水中で混合することによって再構成した。次に、飲料を、周囲温度でパネリストに提供する。
【００８１】
テイスティング条件：個別のテイスティングボックス、白色の壁、静かな雰囲気（集中を促すため）−赤色光（製品の色によって影響されないように）−午前又は午後の最後に（最大感覚能力であるように）−３桁のコードによる匿名の製品（コードが製品の評価に
影響を与えないように）−順不同で提示される製品（順序及び持続性の影響を回避するために）
【００８２】
製品を比較するのに使用される方法は、３点試験法であった。３つの試料を、試飲者に同時に示し；３つの試料のうちの２つが同一である。訓練は、どの試料が他の２つと異なるかを特定することにある。バイアスを避けるために、試験を、均衡させたブロック中で行った（異なる試料は、試料Ａ又は試料Ｂのいずれかであり；それは、ランダムに第１、第２又は第３の位置にある−ＡＡＢ、ＡＢＡ、ＡＢＢ、ＢＡＡ、ＢＡＢ、ＢＢＡ）。
【００８３】
データ処理：「どの試料が異なるものですか？」という質問にランダムに答えることによって、正解を見つける確率は３分の１である。その結果、Ｎ人のパネリストが偶然正解を得る確率ＢＲは、二項分布ＢＲ〜Ｂ（Ｎ，１／３）に従う。通常の信頼度閾値は、０．０５である。
【００８４】
結果：１８人の個人がパネルに参加し、１０の正解が、このレベルの参加で有意差がある（α＝０．０５）と結論付けるのに必要とされる。１３人のパネリストが、正しい異なる試料を見つけたため、混合物間に有意差があることを結論付けることができる。異なる試料を見つけたパネリストによってなされたコメントが、以下の表にまとめられている。
【００８５】
【表４】
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【００８６】
したがって、アルブミン及びグロブリン画分を水中で混合し、次に、このように得られた溶液を噴霧乾燥することによって、乾式混合によって得られた場合よりはるかに良好な官能態様を有する、本発明に係るタンパク質組成物が得られることが証明される。
【国際調査報告】
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