(57)【要約】  体液を薬物の細胞特異的効力の判定に用いる方法が提供される。複数の種類の担体を含み、各担体が、単一細胞致死量の治療剤と、その薬剤を確認する固有のバーコードとを含む組成物であって、等しい数の各種類の担体と、等しい濃度の薬剤と、等しい濃度の各バーコードとを含む、組成物も提供される。さらに、特に限定されないが腫瘍を含めた細胞微小環境内での１つまたは複数の薬物の治療プロファイルを試験するのに有用な方法が提供される。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患のある対象の少なくとも１つの治療剤に対する奏効を予測する方法であって、
（ａ）複数の種類の担体を含み、各種類の担体が独立に、少なくとも単一細胞致死量の少なくとも１つの治療剤と、前記少なくとも１つの治療剤を固有に確認する１つまたは複数のバーコードとを含む組成物を前記対象に投与する段階と、
（ｂ）前記対象から体液試料を採取する段階と、
（ｃ）前記体液中で、前記固有のバーコードの存在によって前記少なくとも１つの治療剤の効果を確認する段階と、
を含み、それにより疾患のある対象の治療剤に対する奏効を予測する、方法。
【請求項２】
前記組成物が、実質的に等しい数の各種類の担体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各種類の担体が、バーコード濃度が実質的に等しい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各種類の担体が、有効治療量（ＥＴＤ）の前記少なくとも１つの治療剤と比較して実質的に等しい濃度の前記少なくとも１つの治療剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの治療剤が、前記疾患の細胞に対して細胞毒性を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が癌であり、前記少なくとも１つの治療剤が癌細胞に対して細胞毒性を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各種類の担体が、異なる少なくとも１つの治療剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が静脈内注射であり、前記組成物が、前記対象の単一疾患細胞当たり１〜２００の各種類の担体を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が腫瘍内注射であり、前記組成物が、前記対象の単一疾患細胞当たり１〜２０の各種類の担体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物の投与後４８〜１９２時間の時間枠内で前記採取を実施する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バーコードが核酸分子であり、前記確認が、前記核酸分子のシーケンシングを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記バーコードが核酸分子であり、前記確認が、前記核酸分子の増幅を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記体液が、血液、血漿、血清、唾液、尿、リンパ液、腫瘍液、母乳、脳脊髄液および精液からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液が血液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ａ）の前に、前記対象から体液試料を採取し、前記試料中の腫瘍ＤＮＡの割合を確認することをさらに含み、前記固有のバーコードによる前記少なくとも１つの治療剤の効果の前記確認が、投与前の前記腫瘍ＤＮＡの割合との比較を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｃ）の前に前記体液試料からインタクトな細胞を除去することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｃ）の前に前記体液試料からインタクトな担体を除去することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの担体がタグをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固有のバーコードが、前記疾患の細胞に特異的なヌクレアーゼに特異的な切断部位を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記固有のバーコードが、前記疾患の細胞内での細胞質内局在が増大したヌクレアーゼに特異的な切断部位を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記単一細胞致死量が、ＥＴＤの０．１％〜３％である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１７年７月６日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  ＰＲＥＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＩＮ  ＢＯＤＩＬＹ  ＦＬＵＩＤＳ」と題する米国仮特許出願第６２／５２９，０２３号の利益を主張するものであり、上記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、治療剤の個々に患者に対する治療効力および活性を予測するのに有用なアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
患者によって投薬に対する奏効が異なるため、治療の成功は各患者にふさわしい薬物の選択にかかっている。「個別化医療」は、各患者に固有の病状に対処することを目的とするものである。個別化医療を必要とする疾患および障害としては、悪性疾患、炎症性疾患および神経変性疾患が挙げられる。
【０００４】
非限定的な例として、癌は診療所での薬物療法に対する実際の奏効率が低い。例えば、乳癌、食道癌、結腸癌または胃癌の患者のうち治療が奏効するのは６０％未満であり、肺癌、メラノーマ、膵癌、肝癌または再発性卵巣癌の患者では、統計値は３０％未満に減少する。したがって、各患者に固有の病状に対処できる適切な治療剤を選択すれば治療転帰を大幅に改善することができる。
【０００５】
これまで、遺伝情報および患者特異的バイオマーカーによって個別化医療の進歩をみた。しかし、患者の約５０％には未だミスマッチがみられ、効果的な治療法がないことから、非奏効者に分類されている。
【０００６】
個別化治療に現在用いられている方法はいずれも、患者から組織を抽出することを必要とするものである。生検の形で実施されることが多いこのような抽出は、患者に対して侵襲性であり、医療実施者にとって高額なものであり、疾患部位によっては不可能なこともある。さらに、細胞抽出には、疾患の一部の細胞を採取するにとどまり、それ以外の細胞を見逃すというリスクが伴う。これは、腫瘍転移、腫瘍の不均一性または疾患の散在性に起因するものと思われる。細胞抽出を実施せずに、薬物について患者に特異的な効果をスクリーニングする代替法が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、生検も組織抽出も必要とせずに、疾患のある対象の治療剤または治療剤の組合せに対する奏効を予測および判定するのに有用な方法を提供する。
【０００８】
本発明は、体液を抽出するだけで、生検を実施せずに、複数の治療剤に関して患者に特異的な効力を同時にスクリーニングすることを可能にする個別化法を初めて提供するものである。それにより、本明細書に開示される方法は、生検の不快感もコストもなく１人の患者に合わせて薬物を選択する新たな方法を医師にもたらす。
【０００９】
第一の態様では、疾患のある対象の少なくとも１つの治療剤に対する奏効を予測する方法であって、
（ａ）複数の種類の担体を含み、各種類の担体が独立に、少なくとも単一細胞致死量の少なくとも１つの治療剤と、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する１つまたは複数のバーコードとを含む組成物を対象に投与する段階；
（ｂ）対象から体液試料を採取する段階；および
（ｃ）体液中で、固有のバーコードの存在によって少なくとも１つの治療剤の効果を確認する段階
を含み、それにより疾患のある対象の治療剤に対する奏効を予測する、方法が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に等しい数の各種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、バーコード濃度が実質的に等しい。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、有効治療量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療剤と比較して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療剤を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤は、疾患の細胞に対して細胞毒性を示す。いくつかの実施形態では、疾患は癌であり、少なくとも１つの治療剤は癌細胞に対して細胞毒性を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態では、各種類の担体は、異なる少なくとも１つの治療剤を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、投与は静脈内注射であり、組成物は、対象の単一疾患細胞当たり１〜２００の各種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、投与は腫瘍内注射であり、組成物は、対象の単一疾患細胞当たり１〜２０の各種類の担体を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物の投与後４８〜１９２時間の時間枠内で採取を実施する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、バーコードは核酸分子であり、確認は核酸分子のシーケンシングを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは核酸分子であり、確認は核酸分子の増幅を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、体液は、血液、血漿、血清、唾液、尿、リンパ液、腫瘍液、母乳、脳脊髄液および精液からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、体液は血液である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、段階（ａ）の前に、対象から体液試料を採取し、試料中の腫瘍ＤＮＡの割合を確認することをさらに含み、固有のバーコードによる少なくとも１つの治療剤の効果の確認は、投与前の腫瘍ＤＮＡの割合との比較を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、段階（ｃ）の前に体液試料からインタクトな細胞を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、段階（ｃ）の前に体液試料からインタクトな担体を除去することをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体はタグをさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、固有のバーコードは、疾患の細胞に特異的なヌクレアーゼに特異的な切断部位を含む。いくつかの実施形態では、固有のバーコードは、疾患の細胞内での細胞質内局在が増大したヌクレアーゼに特異的な切断部位を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、単一細胞致死量は、ＥＴＤの０．１％〜３％である。
【００２２】
以下に記載する詳細な説明から、本発明のさらなる実施形態および全範囲の適用性が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から、本発明の趣旨と範囲に含まれる様々な変更および修正が当業者に明らかになることから、この詳細な説明および具体例が、本発明の好ましい実施形態を示すものであると同時に、単に説明を目的として記載されるものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ−図１Ｃ。相対薬物濃度が等しいリポソーム混合物からのバーコードの検出。ゲムシタビン、シスプラチンおよびドキソルビシンを有効治療量（ＥＴＤ）の（１Ａ）５％、（１Ｂ）１％および（１Ｃ）０．１％で投与したときのトリプル陰性乳癌腫瘍に対する上記薬物の効力を示す棒グラフである。薬物の効力は、死細胞中のバーコードの量と生細胞中のバーコードの量との比と定義した。
【図２】図２Ａ−図２Ｄ。血漿でのバーコード検出レベル。注射後の様々な時点での（２Ａ）ドキソルビシン、（２Ｂ）ゲムシタビンおよび（２Ｃ）シスプラチンを含有するリポソームに対応するバーコード２、３、４の血漿中のコピー数を示す図である。（２Ｄ）共通の軸を用いて２Ａ〜２Ｃの図を合わせたもの。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、腫瘍生検を必要とせず、むしろ液体生検から実施することができ、疾患に対する治療剤または治療剤の組合せの治療効力を予測および判定するのに有用な方法を提供する。本明細書に開示される方法は、患者から組織を抽出することを必要とせずに、各患者に固有の病状に対処する治療を調整することを可能にするものである。
【００２５】
本発明は、セラノスティクス解析に有用な組成物であって、担体数、有効治療量（ＥＴＤ）に対する薬物濃度およびバーコード濃度がいずれも実質的に等しい、組成物も提供する。このような組成物は、治療剤の組合せの治療効力を予測および判定する方法、例えば、特に限定されないが本明細書に記載される方法などを実施するうえで有利なものである。
【００２６】
本明細書でのちに示すように、担体（例えば、ナノ粒子）が、治療サイクルを開始する前に患者体内での薬物または薬物の組合せの治療効力を検討する際の評価基準としての役割を果たす。
【００２７】
第一の態様では、複数の種類の担体を含み、各種類の担体が独立に、少なくとも単一細胞致死量の少なくとも１つの治療剤と、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する少なくとも１つのバーコードとを含む組成物であって、実質的に等しい数の各種類の担体を含む、組成物が提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、投与する組成物は、国際公開第２０１６０２４２８１号に記載されている組成物であり、組成物は、実質的に等しい数の各種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、国際公開第２０１６０２４２８１号に記載されているセラノスティクス法／診断法に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載されるセラノスティクス法／診断法に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、疾患のある対象の少なくとも１つの治療剤に対する奏効の予測に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、疾患のある対象の複数の治療剤に対する奏効の予測に使用するためのものである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、担体は、治療剤および対応するバーコードと、任意選択でタグとを含む。いくつかの実施形態では、各担体は極めて低用量の薬物を含有する。いくつかの実施形態では、各担体は、１個の細胞だけを治療するのに十分であり、全身の治療閾値をはるかに下回る、極めて低用量の薬物を含有する。いくつかの実施形態では、各担体は、実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療剤を含む。いくつかの実施形態では、各担体は、有効治療量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療剤と比較して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療剤を含む。いくつかの実施形態では、各担体は、少なくとも１つの治療剤のＭＴＤの１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満または０．１％未満を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、各担体は、少なくとも１つの治療剤のＭＴＤの０．１〜１０％、０．１〜７％、０．１〜５％、０．１〜３％、０．１〜２％、０．１〜１％、０．５〜１０％、０．５〜７％、０．５〜５％、０．５〜３％、０．５〜２％、０．５〜１％、１〜１０％、１〜７％、１〜５％、１〜３％または１〜２％を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００３０】
本明細書で使用される「ＥＴＤ」は、所望の効果が得られることが医学的に認められている、薬物または薬物の組合せの用量を指す。様々な薬物のこのような用量は当業者に周知であり、多数の入手源、例えばほんの数例を挙げれば、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍおよびｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍなどから入手可能である。いくつかの実施形態では、ＥＴＤは最小有効治療量（ＭＥＴＤ）である。ＭＥＴＤとは、所望の効果を得ることが可能な最低の用量のことである。当業者であれば、このような有効量は対象全体を治療するためのものであることが理解されよう。本発明の診断上／セラノスティクス上の目的には、病態全体の治療は必要とされず、むしろ数個の細胞の治療のみが必要とされる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの担体を含み、少なくとも１つの担体は、治療有効量の少なくとも１つの治療剤；少なくとも１つの治療剤を固有に確認する核酸分子；および任意選択でタグ（すなわち、トレーサー）を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤および核酸分子が少なくとも１つの担体の中に封入されている。担体がタグをさらに含むいくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤、核酸分子およびタグが少なくとも１つの担体の中に封入されている。担体がタグをさらに含むいくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤および核酸分子が少なくとも１つの担体の中に封入されており、タグが担体上に固定されている。担体がタグをさらに含むいくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤および核酸分子が少なくとも１つの担体の中に封入されており、タグが少なくとも１つの担体の中に封入されているか、少なくとも１つの担体上に固定されている。いくつかの実施形態では、タグが担体の膜上に固定されている。
【００３３】
別の実施形態では、組成物は複数の担体を含み、各担体は独立に、少なくとも１つの治療剤と、前記少なくとも１つの治療剤を固有に確認する核酸分子とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤またはその組合せを独立に含む、１〜５種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤またはその組合せを独立に含む、１〜１０種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤またはその組合せを独立に含む、１〜１００種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤またはその組合せを独立に含む、１〜２００種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤またはその組合せを独立に含む、１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜６００、１〜７００、１〜７５０、１〜８００、１〜９００、１〜１０００、１〜１２００、１〜１４００、１〜１５００、１〜１６００、１〜１７５０、１〜１８００または１〜２０００の担体を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤またはその組合せを独立に含む、２〜５００種類の担体を含む。したがって、本発明の方法により、単一の細胞分析で複数の治療剤またはその組合せを同時にスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法により、単一の細胞分析で癌治療剤またはその組合せを同時にスクリーニングすることができる。
【００３４】
本明細書で使用される「〜種類の担体」は、異なる治療剤または治療剤の組合せを含む担体を指す。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも２種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも３種類の担体を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、複数の種類の担体はいずれも、治療剤または治療剤の組合せが異なる同じ担体である。いくつかの実施形態では、担体はリポソームである。いくつかの実施形態では、各種類の担体は同じ種類のリポソームである。いくつかの実施形態では、各種類のリポソームは、脂質組成が同じである。いくつかの実施形態では、各種類のリポソームは、大きさ、体積または直径が等しい、または実質的に等しい。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、各種類のリポソームは、脂質濃度が同じである。いくつかの実施形態では、各種類のリポソームは、脂質濃度が実質的に等しい。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、バーコード濃度が実質的に等しい。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、バーコード濃度が等しい。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療剤を含む。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、少なくとも１つの治療剤のＭＥＤまたはＭＴＤと比較して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療剤を含む。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、実質的に等しい相対用量の少なくとも１つの治療剤を含む。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、少なくとも１つの治療剤のＭＥＤまたはＭＴＤと比較して等しい濃度の少なくとも１つの治療剤を含む。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、等しい相対用量の少なくとも１つの治療剤を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、実質的に等しいとは等しいことである。いくつかの実施形態では、実質的に等しいとは、パラメータを測定することが可能な範囲内で等しいことである。いくつかの実施形態では、実質的に等しいとは、担体を作製することが可能な状態で等しいことである。いくつかの実施形態では、実質的に等しいとは、最大でも１％、２％、３％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％の変動があることである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、実質的に等しいとは、最大でも１０％の変動があることである。いくつかの実施形態では、各種類の担体数は、等しいか、可能な限り等しい。いくつかの実施形態では、担体数が等しく、バーコード濃度および相対治療剤濃度は、担体数を等しく維持しながら可能な限り等しくなっている。いくつかの実施形態では、各種類の担体数が等しく、バーコード濃度および／または治療剤の相対濃度が実質的に等しい。
【００３７】
本明細書でのちに詳述するように、各種類の担体の担体数は、１種類の担体（およびそれにより１種類の治療剤）に偏りが生じないよう等しくするべきである。担体が、大きさが等しく脂質含有量が同じ（各脂質成分の割合が同じ）リポソームである場合、総脂質濃度は担体数に比例する。したがって、各種類のリポソームの脂質濃度を測定すると同時に、異なる種類の担体をその担体総数が同じになるよう混ぜること。各種類の担体に搭載する薬物の量は、等しい数の担体を混ぜたとき、各治療剤の（ＭＥＤに基づく）相対用量が最終的にほぼ等しくなるよう修正することができる。いくつかの実施形態では、実質的に等しい脂質濃度は、最大でも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％または２０％の変動を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、実質的に等しい脂質濃度は最大でも１％の変動を含む。いくつかの実施形態では、リポソームの脂質濃度は、２０〜５５ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、２０〜４５ｍＭ、２０〜４０ｍＭ、２５〜５５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、２５〜４５ｍＭ、２５〜４０ｍＭ、３０〜５５ｍＭ、３０〜５０ｍＭ、３０〜４５ｍＭまたは３０〜４０ｍＭである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リポソームの脂質濃度は３０〜４５ｍＭである。いくつかの実施形態では、リポソームの脂質濃度は３０〜５５ｍＭである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも２種類の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも３種類の担体を含む。
【００３９】
治療剤
いくつかの実施形態では、治療剤は、対象が罹患している疾患または病態を治療するものである。いくつかの実施形態では、治療剤は特定の細胞を標的とするものである。いくつかの実施形態では、治療剤は、その標的細胞に対して細胞毒性を示すものである。いくつかの実施形態では、治療剤はその標的細胞を死滅させるものである。いくつかの実施形態では、治療剤は、その標的細胞に細胞死を誘導するものである。いくつかの実施形態では、治療剤は、その標的細胞にアポトーシスを誘導するものである。いくつかの実施形態では、治療剤は、その標的細胞に壊死を誘導するものである。いくつかの実施形態では、治療剤は、その標的細胞にアポトーシスまたは壊死を誘導するものである。いくつかの実施形態では、治療剤は癌を治療するものである。いくつかの実施形態では、治療剤は癌細胞を死滅させるものである。いくつかの実施形態では、治療剤は、癌細胞を死滅させると思われるものである。当業者には、本発明の組成物および方法が、個別化治療の試験に使用するためのものであることが理解されよう。したがって、治療剤は、患者を治療することが可能であると思われる任意の薬物または薬物の組合せであり得る。理論または仮説に基づく治療剤であっても、本発明のアッセイまたは本発明の組成物の使用によってその薬剤が効果的であるかどうかが当業者にはわかるため、それを使用してもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、治療有効量は、実質的に単一細胞治療有効量である。いくつかの実施形態では、単一細胞治療有効量は単一細胞致死量である。
【００４１】
本明細書で使用される「単一細胞致死量」は、単一細胞を死滅させるのに必要な用量および時間で効果を示す量を指す。治療剤の致死量は、障害または病態、標的とする細胞および具体的な薬剤の性状に左右され、当業者に公知の標準的な臨床技術によって求めることができる。いくつかの実施形態では、「単一細胞致死量」は、単一細胞を死滅させるのに十分な最小有効量を指す。その量は、細胞の種類、薬物の種類および／または治療期間によって異なり得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、治療剤の単一細胞致死量は、その治療剤の有効治療量（ＥＴＤ）よりも大幅に低い薬剤用量である。いくつかの実施形態では、単一細胞致死量は、最大でも治療剤の有効治療量（ＥＴＤ）の１０％、７％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％または０．０００１％である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、単一細胞致死量は、ＭＥＤの１０％〜０．００１％、５％〜０．００１％、３％〜０．００１％、２％〜０．００１％、１％〜０．００１％、０．５％〜０．００１％、０．１％〜０．００１％、１０％〜０．０１％、５％〜０．０１％、３％〜０．０１％、２％〜０．０１％、１％〜０．０１％、０．５％〜０．０１％、０．１％〜０．０１％、１０％〜０．１％、５％〜０．１％、３％〜０．１％、２％〜０．１％、１％〜０．１％、０．５％〜０．１％、１０％〜０．５％、５％〜０．５％、３％〜０．５％、２％〜０．５％、１％〜０．５％、１０％〜１％、５％〜１％、３％〜１％または２％〜１％である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、単一細胞致死量はＭＥＤの０．１％〜３％である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、各種類の担体中の治療剤の濃度は、単一細胞致死量を上回り、各種類の担体中の治療剤の濃度は、実質的に等しくなくてよい。いくつかの実施形態では、各種類の担体中の治療剤の濃度は、単一細胞致死量を上回り、各種類の担体中の治療剤の濃度の差は、１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、７％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下または１００％以下である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。本明細書でのちに示すように、濃度がほぼ単一細胞致死量である限り、担体数が等しいことの方が薬剤の相対濃度が等しいことよりも重要である。いくつかの実施形態では、各種類の担体中の治療剤の濃度の差は、１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、７％以下、１０  １５％以下または２０％以下である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、各種類の担体中の治療剤の濃度の差は１０％以下である。いくつかの実施形態では、各種類の担体中の治療剤の濃度の差は、１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、７％以下、１０  １５％以下もしくは２０％以下またはＭＥＤ以下である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、各種類の担体中の治療剤の濃度の差はＭＥＤの１％以下である。
【００４４】
治療剤が組成物の他の成分と反応し得る別の実施形態では、単一細胞ごとに致死量の薬剤になるように、過剰な量の薬剤を用いる。非限定的な例では、シスプラチンがバーコードＤＮＡと反応し得ることから、細胞に致死量のシスプラチンを投与するため、過剰な量を封入し得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、わずかな量の治療剤を用い得る。非限定的な例として、単一細胞を死滅させるのに単一コピーのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素で十分である。
【００４６】
別の実施形態では、単一細胞致死量は、実質的に単一細胞を死滅させるのに十分なものである。別の実施形態では、治療有効量は、単一細胞を死滅させるのに十分な量の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００４７】
本明細書で使用される「致死」または「致死性」という用語は、細胞内部から細胞外部へのＤＮＡの放出を含む任意の種類の細胞死を指す。いくつかの実施形態では、致死量は、細胞にアポトーシスまたは壊死を誘導するものである。いくつかの実施形態では、致死量は、細胞にアポトーシスを誘導するものである。いくつかの実施形態では、致死量は、細胞に壊死を誘導するものである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤は、細胞の膜を横断することができないものである。このような実施形態では、致死量は、例えば単一細胞を死滅させる濃度よりも高い濃度であり得る。細胞膜を横断することができない治療剤の例としては、特に限定されないが、ＲＮＡおよび親水性の薬物が挙げられる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、単一細胞致死量は、リポソームの薬物濃度が１０ｍｇ／ｍｌ未満、７ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、３ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．５ｍｇ／ｍｌ未満、０．１ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５ｍｇ／ｍｌ未満または０．０１ｍｇ／ｍｌ未満である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、単一細胞致死量は、リポソームの薬物濃度が２ｍｇ／ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、単一細胞致死量は、リポソームの薬物濃度が１０〜０．１、１０〜０．０５、１０〜０．０１、７〜０．１、７〜０．０５、７〜０．０１、５〜０．１、５〜０．０５、５〜０．０１、３〜０．１、３〜０．０５、３〜０．０１、２〜０．１、２〜０．０５、２〜０．０１、１〜０．１、１〜０．０５または１〜０．０１である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００５０】
バーコード
一実施形態では、バーコードは１つまたは複数の核酸分子である。ＤＮＡ鎖などの核酸分子であれば、バーコーディングの選択肢の数に制限がない。本発明全体を通じて使用される「バーコード」および「ＤＮＡバーコード」は、互いに互換性があり、同じ意味を有する。ＤＮＡバーコードとしての役割を果たす核酸分子は、デオキシ核酸もしくはリボ核酸またはその両方のポリマーであり、任意選択で合成の、非天然の、または改変したヌクレオチド塩基が含まれる、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子を例えば、ビオチン、放射標識または蛍光標識で標識する。
【００５１】
当業者に理解されるように、治療剤の担体に固有のＤＮＡバーコードを組み込むこと（封入）により、特に限定されないが、マイクロアレイシステム、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション（「ブロッティング」を含む）またはハイスループットシーケンシングを含めたアッセイを用いて、個々の治療剤を確認することが可能になる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、担体の中にＤＮＡバーコードを封入することによって、負荷電ＤＮＡバーコードに細胞の負荷電脂質二重層を通過させることを可能にする。
【００５３】
いくつかの実施形態では、核酸分子の配列は、環境中に天然に存在する、または特に本発明の方法が標的とする細胞中に天然に存在する材料／物質／粒子に関連する配列、パターン、シグネチャーまたは任意の他の核酸配列を含まない。さらなる実施形態では、核酸分子の配列は、天然に存在するヌクレオチド配列と結合し得る１０塩基超のヌクレオチド配列、特にエクソンを含まない。別の実施形態では、核酸分子は、（核酸分子と細胞の遺伝物質、特に細胞のエクソンのハイブリダイゼーションを防止し、かつ／または偽陽性増幅の結果が出ないようにするため）細胞の遺伝物質と実質的に同一でも相補的でもない配列を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、核酸配列はさらに、分子ビーコンとしての役割を果たし得る。核酸配列は通常、ヘアピンなどの一本鎖分子であり得る。核酸分子は、細胞中の相補的な遺伝子の検出、例えば細胞内の遺伝子変異の検出などに使用し得る。いくつかの実施形態では、核酸は、変異を有する配列に相補的な配列を有する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、所定の固有の配列を含むか、これよりなるものである。本明細書で使用される「固有の配列」または「固有に確認する」という用語は、単射関数（１対１関数とも呼ばれる）に基づき、他のものとの違いを保持している配列を指す。
【００５６】
固有のバーコード（例えば、固有の配列を有する核酸）は、本発明の方法の実施後に、担体内でそれに対応する少なくとも１つの治療剤を確認するのに適したものである。核酸配列の存在を検出する方法および核酸配列を確認する方法は当業者に公知であり、複数のバーコードの存在を増強することができるシーケンシングおよびアレイ（例えば、マイクロアレイ）システム（例えば、Ｉｌｕｍｉｎａ社が販売しているもの）がこれに含まれる。
【００５７】
いくつかの実施形態、例えば精度を増大させるのが望ましい実施形態などでは、核酸分子は、シークエンシングおよび／または増幅アッセイ（例えば、ＰＣＲ）に適した長さである。別の実施形態では、核酸分子は、好ましくはナノスケールで、本発明の担体内に搭載するのに適した長さである。核酸分子の長さは、本発明の組成物および方法に使用する担体の種類および大きさに左右される（例えば、短い配列はナノ粒子に使用するのに適しているのに対し、長い配列は微粒子に使用され得る）ことを理解するべきである。
【００５８】
別の実施形態では、核酸分子は、長さが最大でも１０００塩基、最大でも９００塩基、最大でも８００塩基、最大でも７００塩基、最大でも６００塩基、最大でも５００塩基、最大でも４５０塩基、最大でも４００塩基、最大でも３５０塩基、最大でも３００塩基、最大でも２５０塩基、最大でも２００塩基、最大でも１９０塩基、最大でも１８０塩基、最大でも１７０塩基、最大でも１６０塩基、最大でも１５０塩基、最大でも１４０塩基、最大でも１３０塩基または最大でも１２０塩基であり、それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。別の実施形態では、核酸分子は、長さが少なくとも５塩基、少なくとも６塩基、少なくとも７塩基、少なくとも８塩基、少なくとも９塩基、少なくとも１０塩基、少なくとも１１塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１３塩基、少なくとも１４塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも１６塩基、少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基または少なくとも２０塩基、少なくとも２１塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２３塩基、少なくとも２４塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも２６塩基、少なくとも２７塩基、少なくとも２８塩基、少なくとも２９または少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも６０塩基、少なくとも７０塩基、少なくとも８０塩基、少なくとも９０塩基、少なくとも１００塩基または少なくとも２００塩基、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基または少なくとも５００塩基であり、それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００５９】
核酸の長さの非限定的な例としては、特に限定されないが、５〜５０塩基、５〜４０塩基、５〜３０塩基、５〜２５塩基、５〜２４塩基、５〜２３塩基、５〜２２塩基、５〜２１塩基、５〜２０塩基、５〜１９塩基、５〜１８塩基、５〜１７塩基、５〜１６塩基または５〜１５塩基、１５〜５０塩基、１５〜６０塩基、１５〜７０塩基、１５〜８０塩基、１５〜９０塩基、１５〜１００塩基、１５〜２００塩基、１５〜２５０塩基または１５〜５００塩基が挙げられる。
【００６０】
別の実施形態では、各担体の中にある核酸分子は、担体当たりまたは標的細胞当たり１つまたは複数の鎖の濃度を有する。核酸分子の量の決定は、当業者の能力の範囲内に十分に含まれるものである。別の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子は１〜１００００個の核酸分子である。別の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子は１〜１０００個の核酸分子である。別の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子は１〜５０００個の核酸分子である。別の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子は１〜５００個の核酸分子である。別の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子は５〜５００個の核酸分子である。当業者には、各粒子内の核酸分子の量を、実施する具体的なアッセイ、例えば、シークエンシングおよび／または増幅アッセイに適するよう予め決定し得ることが理解されよう。
【００６１】
いくつかの実施形態では、各粒子が固有のバーコードを含む。当業者には、各粒子（すなわち、担体）を固有のバーコードでバーコーディングすることにより、単一細胞内に入った粒子の数がわかることが理解されよう。いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を治療するための治療用量を求める方法であって、対象に複数の種類の担体を含む組成物を投与することを含み、各種類の担体が、１つまたは複数の治療剤を含み、各種類の担体の１つまたは複数の治療剤の用量が異なっている、方法を提供する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、各種類の粒子（すなわち、担体）が、担体の種類を確認する固有のバーコード（例えば、核酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、各粒子（すなわち、担体）が、担体の種類を確認する固有のバーコード（例えば、核酸配列）を含む。
【００６３】
別の実施形態では、バーコードは、希土類元素、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、磁性粒子、色素および放射性同位元素からなる群より選択される。
【００６４】
別の実施形態では、バーコードは希土類元素である。別の実施形態では、希土類元素はランタニドである。いくつかの実施形態では、ランタニドは、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）およびイットリウム（Ｙ）から選択される。いくつかの実施形態では、ランタニドは、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、ＹｂおよびＬｕから選択される。
【００６５】
希土類元素（例えば、ランタニド）は、発光標識と錯体を形成したとき有用であり得、一般に、検出可能な光学的応答が得られるよう選択した条件下でランタニド錯体と目的の試料とを組み合わせることによって用いる。光学的応答を誘発するよう選択した波長で試料を照射し得る。
【００６６】
別の実施形態では、組成物中の担体は、核酸分子を細胞内でバーコードとして操作可能に用いるための追加の薬剤（例えば、化学的または生物学的薬剤）をさらに含む。薬剤の非限定的な例としては、例えばＤＮＡバーコードまたはＲＮＡバーコードの内因性または外因性酵素による分解をそれぞれ防ぐ、ＤＮアーゼ阻害剤またはＲＮアーゼ阻害剤が挙げられる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、組成物を形成する溶液中のバーコード濃度は、０．００１〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００５〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０１〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０５〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、０．１〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、０．５〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、１〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、２〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、５〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、１０〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、１５〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、２０〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、２５〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、３０〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００１〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００５〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０１〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０５〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．１〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．５〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、１〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、２〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、５〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、１０〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、１５〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、２０〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、２５〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、３０〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００１〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００５〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０１〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０５〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．１〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．５〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、１〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、２〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、５〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、１０〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、１５〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、２０〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、２５〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、３０〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００１〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．００５〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０１〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．０５〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．１〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、０．５〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、１〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、２〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、５〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、１０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、１５〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、２０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）、２５〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）または３０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で変化し得る。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、２〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）の間で変化し得る。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、１０〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で変化し得る。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、２０〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で変化し得る。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、３０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で変化し得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、各種類の担体は、バーコード濃度が実質的に等しい。いくつかの実施形態では、各種類の担体は、バーコード濃度が等しい。いくつかの実施形態では、複数の種類のバーコードのバーコード濃度は、０．１％以下、０．５％以下、１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、７％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下または２５％以下だけ異なる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００６９】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物は、データの統計的有意性が確保されるように、分析する細胞の量に対して少ない数のナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、疾患細胞当たりのバーコード化ナノ粒子の数は、５個未満であるのが好ましい。本発明は、部分的には、静脈内に注射する用量の６〜７％が腫瘍部位に蓄積し、実際に腫瘍部位に到達するナノ粒子の５％が細胞によって取り込まれ、残りは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に閉じ込められることを考慮に入れることによって、疾患細胞当たり最大５種類のバーコードを存在させるために注射するべき粒子の数を算出し得るという観察結果に基づくものである。
【００７０】
一実施形態では、疾患細胞当たり１〜５種類の担体（すなわち、バーコード化ナノ粒子）が存在する。別の実施形態では、疾患細胞当たり１〜５種類の担体が存在すれば、体液を分析する際に十分なデータと高いシグナル／ノイズ比（ＳＮＲ）が得られる。本明細書で使用される「体液（ｆｌｕｉｄ）」と「体液（ｂｏｄｉｌｙ  ｆｌｕｉｄ）」は互換的なものである。
【００７１】
一実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜２００個、静脈内注射により投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜３００個、静脈内注射により投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜４００個、静脈内注射により投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜５００個、静脈内注射により投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜１０００個、静脈内注射により投与する。
【００７２】
別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜２０個、腫瘍内に投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜１０個、腫瘍内に投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜５０個、腫瘍内に投与する。別の実施形態では、粒子または各種類の粒子を腫瘍細胞当たり１〜１００個、腫瘍内に投与する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、少なくとも１バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも５バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも１０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも２０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも３０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも４０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも５０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも６０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも７０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも８０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも９０バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも１００バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも５００バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも１０００バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも５０００バーコード分子／粒子、あるいは少なくとも１００００バーコード分子／粒子である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、最大でも５バーコード分子／粒子、あるいは最大でも１０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも２０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも３０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも４０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも５０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも６０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも７０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも８０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも９０バーコード分子／粒子、あるいは最大でも１００バーコード分子／粒子、あるいは最大でも５００バーコード分子／粒子、あるいは最大でも１０００バーコード分子／粒子、あるいは最大でも５０００バーコード分子／粒子である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、５〜１００バーコード分子／粒子の範囲内にある。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、１０〜９０バーコード分子／粒子の範囲内にある。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、２０〜８０バーコード分子／粒子の範囲内にある。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、１〜１０００バーコード分子／粒子の範囲内にある。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、１〜１００００バーコード分子／粒子の範囲内にある。
【００７４】
切断部位
いくつかの実施形態では、固有のバーコードは少なくとも１つの切断部位を含む。いくつかの実施形態では、固有のバーコードは複数の切断部位を含む。本明細書で使用される切断部位は、配列特異的ヌクレアーゼまたは構造特異的ヌクレアーゼによって切断され得るヌクレオチド配列を指す。配列特異的ヌクレアーゼまたは構造特異的ヌクレアーゼの切断部位を有するＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の設計は、当業者には日常的なものであり、一本鎖である、二本鎖である、切れ目がある、ミスマッチである、または任意の他の点で固有のヌクレオチド構造またはヌクレオチド配列をこの目的に用い得ることが理解されよう。いくつかの実施形態では、切断部位は、疾患細胞に特異的なヌクレアーゼによって特異的に切断される。このようなヌクレアーゼは、例えば、腫瘍特異的ヌクレアーゼまたは幹細胞特異的ヌクレアーゼであり得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、切断部位は、疾患細胞の細胞質に誤って局在化したヌクレアーゼによって特異的に切断される。いくつかの実施形態では、切断部位は、疾患細胞での細胞質内局在が増大したヌクレアーゼに特異的なものである。健常細胞では、多くのヌクレアーゼがもっぱら、またはほぼもっぱら核染色を示す。バーコードに核局在も核内移行シグナルもみられない実施形態では、切断部位を有するバーコードは、細胞質内のバーコードと核内のヌクレアーゼとの間の相互作用が制限され得る健常細胞では切断されないか、切断されてもわずかであるものと思われる。ヌクレアーゼが細胞質に誤って局在化しているか、細胞質内で過剰発現している疾患細胞では、バーコードとヌクレアーゼが自由に相互作用して切断が起こるものと思われる。
【００７６】
非限定的な例として、ＤＮＡ２などのヌクレアーゼは、乳癌および膵癌を含めた多数の癌に過剰発現することが知られており、過剰発現によって細胞質漏出が起こり得る。疾患細胞の細胞質に誤って局在化するヌクレアーゼの非限定的な例としては、乳癌、直腸癌、卵巣癌、甲状腺癌および非小細胞肺癌に細胞質内局在することがわかっているヒトアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼであるＡＰＥ１ならびに色素性乾皮症の細胞に細胞質内局在することがわかっているＸＰＦ−ＥＲＣＣ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、固有のバーコードはＡＰＥ１切断部位を含む。
【００７７】
当業者には、対象由来の試料中の切断バーコードと未切断バーコードとを比較して測定すれば、疾患細胞での治療剤の効果を特異的に測定することが可能であることが理解されよう。切断ヌクレオチド配列と未切断ヌクレオチド配列の判別は、本明細書で上に記載したアッセイなどの日常的なヌクレオチド検出／同定により遂行することができる。
【００７８】
タグ
別の実施形態では、本発明の１つまたは複数の担体は、少なくとも１つのタグまたは検出可能部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、全担体に同じタグを使用する。他の実施形態では、担体のサブセットに固有のタグを使用する。
【００７９】
本発明の組成物および方法に使用し得るタグとしては、特に限定されないが、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、放射性マーカー、金属、希土類、磁性粒子または色素が挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、タグまたは検出可能部分は、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ビーズ、チップまたはプレートをベースとするマルチプレックスイムノアッセイなどの免疫アッセイ、質量分析、電気泳動、免疫比ろう法、免疫比濁法、酵素アッセイ、例えば測光および蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）をベースとする解析によって、またはその他の臨床的に確立されたアッセイによって評価が可能な比色定量アッセイまたは蛍光定量アッセイを含めたアッセイに有用なタグである。これらの方法はいずれも、当業者に周知であり、文献に記載されている。
【００８１】
タグの量は通常、実施するアッセイによって決まり、当業者が決定することができ、当業者の能力の範囲内にあるものである。いくつかの実施形態では、担体は、前記タグの１つの分子またはそれ以上の分子を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、タグは担体内に封入されている。いくつかの実施形態では、タグは担体の外側に固定されている。いくつかの実施形態では、タグは担体の膜内に固定されている。いくつかの実施形態では、タグは、リンカーを介して担体に固定されているか、担体内に固定されている。このようなリンカーは、特に限定されないが、アミノ酸、脂質、炭水化物またはその組合せであり得る。
【００８３】
担体
いくつかの実施形態では、治療剤（１つまたは複数）、前記治療剤（１つまたは複数）のＤＮＡバーコーディングに有用な核酸配列および任意選択でタグの担体が提供される。本発明の方法を実施するのに使用する前記担体は、生体分子、例えば、細胞表面ポリペプチド、例えば異常増殖細胞、癌細胞、免疫細胞および変性細胞上のポリペプチドを含めたポリペプチドなどを含めた特定の分子を標的とし得る。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、（本発明の方法を実施するのに使用する化合物を含むことに加えて）異常増殖する、疾患のある、感染した、機能不全の、および／または細胞の受容体を選択的に標的とする分子、例えば、ペプチドまたは抗体を含む、ナノ粒子形態およびリポソーム膜形態の担体を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は、運搬する材料（治療剤、核酸分子および任意選択でタグ）が内部コアの中にある小胞などの小胞の形態である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は脂質ベースの粒子である。別の実施形態では、前記脂質ベースの粒子はリポソームである。別の実施形態では、前記少なくとも１つの担体はミセルである。
【００８６】
いくつかの実施形態では、溶液は、指定された細胞に対して不活性であり、影響を及ぼさないものである。いくつかの実施形態では、組成物の治療剤以外の全成分が、指定された細胞に対して不活性であり、影響を及ぼさないものである。いくつかの実施形態では、溶液は水溶液である。別の実施形態では、本発明の組成物は、（カチオン性界面活性剤が細胞に影響を及ぼし、かつ／または治療剤に影響を及ぼして、治療剤の効果の正確な解析を妨げ得るため）カチオン性界面活性剤を含まない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は、運搬する材料（治療剤、核酸分子および任意選択でタグ）が、ポリマー／タンパク質／塩などの別の物質の有無を問わず、運搬する材料と複合体／微粒子を形成する小胞などの小胞の形態である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は、諸成分がポリマー主鎖とコンジュゲートしている、またはファンデルワールス相互作用もしくは疎水性相互作用により複合体を形成している、デンドリマー様構造を形成する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体はポリマーナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体はナノゲルである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は金属ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子または酸化鉄ナノ粒子）である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は炭素ナノチューブである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は多層粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体はゾル−ゲルセラミック粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は、タンパク質と薬物の複合体である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの担体は、諸成分がポリマー主鎖とコンジュゲートしている、またはファンデルワールス相互作用もしくは疎水性相互作用により複合体を形成している、デンドリマー様構造を形成する。
【００９０】
一実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、それが細胞外マトリックスを通って細胞内に入るのを容易にするため、直径が５００ｎｍ未満である。一実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、それが細胞外マトリックスを通って細胞内に入るのを用にするため、直径が４００ｎｍ未満である。
【００９１】
一実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、直径３００ｎｍ未満、直径２５０ｎｍ未満，直径２００ｎｍ未満、直径１５０ｎｍ未満、直径１００ｎｍ未満、直径５０ｎｍ未満、直径２０ｎｍ未満、直径１０ｎｍ未満または直径５ｎｍ未満である。別の実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、少なくとも直径１ｎｍ、少なくとも直径５ｎｍ、少なくとも直径１０ｎｍ、少なくとも直径２０ｎｍ、少なくとも直径３０ｎｍ、少なくとも直径４０ｎｍ、少なくとも直径５０ｎｍ、少なくとも直径６０ｎｍ、少なくとも直径７０ｎｍ、少なくとも直径８０ｎｍ、少なくとも直径９０ｎｍ、少なくとも直径１００ｎｍ、少なくとも直径１５０ｎｍ、少なくとも直径２００ｎｍ、少なくとも直径２５０ｎｍまたは少なくとも直径３００ｎｍである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００９２】
別の実施形態では、担体は直径１〜３００ｎｍである。別の実施形態では、担体は直径１０〜２５０ｎｍである。別の実施形態では、担体は直径５〜２５０ｎｍである。別の実施形態では、リポソームは直径２０〜１５０ｎｍである。別の実施形態では、リポソームは直径５〜１５０ｎｍである。別の実施形態では、リポソームは直径２０〜１５０ｎｍである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、静脈内投与用の担体は直径５〜２５０ｎｍである。静脈内投与用の担体がリポソームであるいくつかの実施形態では、担体は直径４０〜２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍内投与用の担体は直径５〜３００ｎｍである。腫瘍内投与用の担体がリポソームであるいくつかの実施形態では、担体は直径４０〜３００ｎｍである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、担体の形態は、球形または実質的に球形、非球形（例えば、楕円形、チューブ形など）、不定形などであり得る。
【００９５】
標的細胞への治療剤および核酸の送達を容易にするのにリポソーム運搬媒体を使用することが本発明により企図される。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は一般に、研究、産業および医療の様々な用途で、特にｉｎ  ｖｉｖｏで診断用化合物または治療用化合物の運搬媒体として使用するのに有用であり（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８；Ｄｒｕｍｍｏｎｄら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３，１９９９）、通常、１つまたは複数の二重層からなる膜によって外部の媒体から隔離された内部水空間を有する微視的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は通常、空間的に分離された親水性ドメインと疎水性ドメインとを含む合成または天然由来の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，同上）。リポソームの二重層膜を両親媒性ポリマーおよび界面活性剤によって形成することもできる（例えば、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソームなど）。
【００９６】
一実施形態では、標的細胞への治療剤および核酸分子（ＤＮＡバーコード）の送達が最適化されるよう担体を選択および／または調製し得る。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、運搬媒体が効率的に標的細胞まで送達されるよう、そのような運搬媒体の特性（例えば、大きさ、電荷および／またはｐＨ）を最適化し得る。あるいは、（例えば、神経変性疾患の治療法を断定するため）標的細胞が中枢神経系である場合、運搬媒体の選択および調製には、血液脳関門の通過と血液脳関門内での保持および／またはそのような運搬媒体を上記のような標的細胞に直接送達する代替手段の使用を考慮に入れなければならない。
【００９７】
所望の実体をリポソームに組み込む工程は、「搭載」と呼ばれることが多い（Ｌａｓｉｃら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２）。リポソームに組み込まれた治療剤、核酸および／またはタグは、全部または一部がリポソームの二重層膜内にあるリポソームの内部空間内に位置し得る。リポソームへの薬剤の組込みは、本明細書では「封入」とも呼ばれ、ここでは、薬剤はリポソームの内部空間内に完全に含まれている。担体（例えば、リポソーム）内に薬剤を封入するには通常、薬剤と担体との間の共有結合などの化学結合を必要としない。薬剤をリポソームなどの運搬媒体に組み込む目的は多くの場合、その薬剤（例えば、核酸）を分解する酵素もしくは化学物質を含み得る環境および／または薬剤をその迅速に排出させる系もしくは受容体から薬剤を保護することである。したがって、本発明の好ましい実施形態では、選択する運搬媒体は、治療剤および核酸分子ならびに任意選択でそこに含まれるタグの安定性を増強することが可能なものである。リポソームにより、封入された薬剤を標的細胞まで到達させることができ、かつ／あるいは封入された薬剤を優先的に標的細胞まで到達させ得る、またはその代わりに、薬剤が他の望ましくない標的部位もしくは細胞まで送達されるのを制限し得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、担体は、封入された治療有効量の少なくとも１つの治療剤、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する核酸分子および任意選択のタグの細胞への浸透を容易にする。いくつかの実施形態では、担体内に封入することによって、治療有効量の少なくとも１つの治療剤、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する核酸分子および任意選択のタグの細胞への浸透が可能になる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の所望の薬剤を封入するようリポソーム運搬媒体を調製して、組成物が高いトランスフェクション効率および安定性の増強を示すようにする。多数の細胞系で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも、リポソームによって標的細胞内への核酸の導入を容易にすることができ、ポリカチオン（例えば、ポリＬ−リジンおよびプロタミン）をコポリマーとして添加することによって、数種類のカチオン性リポソームのトランスフェクション効率を高め、場合によっては、著明に２〜２８倍増大させることができる。（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３；Ｓ．Ｌｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照されたい）。
【０１００】
別の実施形態では、前記少なくとも１つの担体は、ナノリポソームまたは脂質ナノ粒子である。ナノリポソームは、生物活性剤の溶解性およびバイオアベイラビリティ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの安定性を改善するとともに、生物活性剤と他の分子との望ましくない相互作用が起こらないようにすることによって、生物活性剤の性能を増強することができる。ナノリポソームのまた別の利点として、細胞を特異的に標的とする点があり、このことは、標的細胞には最適な致死性に必要な薬物濃度をもたらすと同時に、健常な細胞および組織に対しては有害作用を最小限に抑えるための必要条件である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体はリポソームである。
【０１０１】
本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」という語句は、１つまたは複数の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質およびＰＥＧ修飾脂質）を含む運搬媒体を指す。脂質ナノ粒子は、１つまたは複数の標的細胞に１つまたは複数の薬剤を送達するよう製剤化するのが好ましい。適切な脂質の例としては、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）が挙げられる。また、単独で使用するか他の運搬媒体と併用するかを問わず、ポリマーを運搬媒体として使用することも企図される。適切なポリマーとしては、例えば、ポリアクリラート、ポリアルキシアノアクリラート（ｐｏｌｙａｌｋｙｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマーおよびポリエチレンイミンが挙げられる。一実施形態では、標的細胞への核酸のトランスフェクションを容易にする能力に基づいて運搬媒体を選択する。
【０１０２】
本発明は、カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を運搬媒体に使用して、封入し、かつ／または標的細胞内への核酸の送達を促進することを企図する。本明細書で使用される「カチオン性脂質」という語句は、選択するｐＨ、例えば生理的ｐＨなどで正味の正電荷を有する多数の脂質種のうちのいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つまたは複数のカチオン性脂質、非カチオン性脂質およびＰＥＧ修飾脂質を用い、多成分脂質混合物を様々な比で含ませることによって調製し得る。これまでに複数のカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くが市販されている。
【０１０３】
本発明の組成物および方法に使用するのに適したカチオン性脂質としては、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０５３５７２号に記載されているものが挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、イオン化可能なカチオン性脂質を含む、脂質ナノ粒子を用いる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」を用いる。（米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化するか、中性脂質のジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」またはその他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム運搬媒体または脂質ナノ粒子にすることができ、このようなリポソームを用いて、標的細胞内への核酸の送達を促進することができる。その他の適切なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。企図されるカチオン性脂質としてはこのほか、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス、シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル１−１−（シス、シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンもしくは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンもしくは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジ−メチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照されたい）またはその混合物が挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．ら，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ  Ｖ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；国際公開第２００５／１２１３４８Ａ１号）。
【０１０４】
コレステロール系カチオン性脂質の使用も本発明によって企図される。このようなコレステロール系カチオン性脂質は、単独で、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせて使用することができる。適切なコレステロール系カチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキシアミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）またはＩＣＥが挙げられる。
【０１０５】
さらに、トランスフェクションの効果を増強する試薬が複数市販されている。適切な例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、ＦＵＧＥＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（ＤＯＧＳ）およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥが挙げられる。
【０１０６】
また、ジアルキルアミノ系脂質、イミダゾール系脂質およびグアニジニウム系脂質などのカチオン性脂質も企図される。例えば、特定の実施形態は、１つまたは複数のイミダゾール系カチオン性脂質を含む組成物に関するものである。
【０１０７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導体化脂質、例えばＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などを単独で、または好ましくは運搬媒体（例えば、脂質ナノ粒子）を含む他の脂質と組み合わせて使用することも本発明によって企図される。このような成分の添加は、複合体の凝集を防ぎ、脂質−核酸組成物の循環血中での寿命を延ばし、標的細胞への脂質−核酸組成物の送達を増大させる手段となり得る（Ｋｌｉｂａｎｏｖら（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）か、あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏで製剤から迅速に交換するようそれらを選択し得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）。特に有用な交換可能な脂質には、短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドがある。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、モル比がリポソーム運搬媒体中に存在する脂質全体の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％または約２％であり得る。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０８】
本発明は、非カチオン性脂質の使用も企図する。本明細書で使用される「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される「アニオン性脂質」という語句は、選択するｐＨ、例えば生理的ｐＨなどで正味の負電荷を有する多数の脂質種のうちのいずれかを指す。非カチオン性脂質としては、特に限定されないが、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＳＯＰＥ）、コレステロールまたはその混合物が挙げられる。このような非カチオン性脂質は、単独で使用してもよいが、他の添加剤、例えばカチオン性脂質と組み合わせて使用するのが好ましい。カチオン性脂質と組み合わせて使用する場合、非カチオン性脂質は、モル比が運搬媒体中に存在する脂質全体の５％〜約９０％、または好ましくは約１０％〜約７０％であり得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、複数の脂質および／またはポリマー成分を組み合わせることによって運搬媒体（例えば、脂質ナノ粒子）を調製する。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質および／またはＰＥＧ修飾脂質ならびにこのような脂質の相互の相対モル比の選択は、選択する脂質（１つまたは複数）の特性、目的とする標的細胞の性状および送達するべき薬剤の特性に基づくものである。さらなる考慮事項としては、例えば、選択する脂質（１つまたは複数）のアルキル鎖の飽和度ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性および毒性が挙げられる。
【０１１０】
本発明の組成物に使用するリポソーム運搬媒体は、現在当該技術分野で公知の様々な技術によって調製することができる。従来の技術によって、例えば、特に限定されないが、選択した脂質を適切な溶媒に溶かした後、溶媒を蒸発させて容器の内側に薄い膜を残すことによって、または噴霧乾燥によって、脂質を適切な容器または器の内壁に堆積させることにより多層小胞（ＭＬＶ）を調製し得る。次いで、ボルテックスしながら水相を容器に加え、それによりＭＬＶが形成され得る。次いで、多層小胞のホモジナイゼーション、超音波処理または押出によって単層小胞（ＵＬＶ）を形成することができる。さらに、界面活性剤除去法によって単層小胞を形成することができる。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物にｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途でもｉｎ  ｖｉｖｏ用途でも検出可能な診断用の放射性核種、蛍光物質またはその他の物質を搭載し得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、粒子のハイスループット合成および標識ができるよう適合させたインラインのマイクロ流体機構を用いて、本発明のナノ粒子担体を脂質で作製する。このような作製方法は当該技術分野、例えば、Ｊａｈｎら，２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，６２８９−６２９３で知られている。通常、治療ペイロードを収容するのに適した大きさの粒子を作製する。
【０１１３】
例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，４０１９−４０２５によって示されているように、安定なＨＳＰＣ粒子内に化学薬剤を搭載し得る。「タンパク質産生ナノ粒子」の内部で生物学的治療剤（タンパク質／ＲＮＡ）を合成させてもよい。いくつかの実施形態では、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．ら，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２，２６８５−２６８９，（２０１２）に示されるように、標的部位で合成ナノ粒子に制御可能にタンパク質およびＲＮＡを合成させる。このナノ粒子は、光解離性保護基でケージされたアミノ酸、リボソームおよびＤＮＡを含めた転写および翻訳を担う分子機構で満たされた脂質小胞からなる。この粒子は、ＲＮＡ／タンパク質を産生することが可能なナノ工場としての役割を果たす。タンパク質／ＲＮＡ合成はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、空間的および時間的に制御可能なものであり得、ミクロンスケールの組織領域をミリ秒の時間スケールで照射することによって開始させることが可能である。したがって、このプラットフォームを用いて、ＲＮＡ（Ｐｎｇら，２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，１９０−１９４）およびタンパク質の活性、例えば抗癌活性をスクリーニングし得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、リポソーム形成脂質がナノ粒子の４０〜１００％ｍｏｌを構成する、ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、コレステロールを０〜５０％％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を１〜８％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的化部分を有する脂質）を０〜１０％ｍｏｌ含む。
【０１１５】
本明細書および当該技術分野で使用されるモルパーセント（％ｍｏｌ）は、ナノ粒子を構成する成分または化合物の総モル数に基づく特定の成分または化合物のパーセントを指す。例えば、ナノ粒子が化合物Ａを３ｍｏｌ、化合物Ｂを１ｍｏｌ含有する場合、化合物Ａは混合物の７５ｍｏｌ％を占め、化合物Ｂは２５ｍｏｌ％を占めることになる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、リポソーム形成脂質を４０〜７０％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、コレステロールを２０〜５０％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を４〜８％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的化部分を有する脂質）を０〜３％ｍｏｌ含む。特定の実施形態では、リポソーム形成脂質を４０〜７０％ｍｏｌ、コレステロールを２０〜５０％ｍｏｌ、ＰＥＧ脂質を４〜８％ｍｏｌ、機能性脂質を０〜３％ｍｏｌ含むナノ粒子が静脈内投与に適している。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、リポソーム形成脂質を５０〜８０％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、コレステロールを０〜５０％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を０〜３％ｍｏｌ含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的化部分を有する脂質）を４〜８％ｍｏｌ含む。特定の実施形態では、リポソーム形成脂質を５０〜８０％ｍｏｌ、コレステロールを０〜５０％ｍｏｌ、ＰＥＧ脂質を０〜３％ｍｏｌ、機能性脂質を４〜８％ｍｏｌ含むナノ粒子が腫瘍内投与に適している。
【０１１８】
セラノスティクスへの使用
一態様では、本発明は、疾患のある対象の少なくとも１つの治療剤に対する奏効を予測する方法であって、
（ａ）複数の種類の担体を含み、各種類の担体が独立に、少なくとも単一細胞治療有効量の少なくとも１つの治療剤と、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する１つまたは複数のバーコードとを含む組成物を対象に投与する段階；
（ｂ）対象から体液試料を採取する段階；および
（ｃ）体液中で、固有のバーコードの存在によって少なくとも１つの治療剤の効果を確認する段階
を含み、それにより疾患のある対象の治療剤に対する奏効を予測する、方法を提供する。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、疾患のある対象の少なくとも１つの治療剤に対する奏効を予測する方法であって、
（ａ）複数の種類の担体を含み、各種類の担体が独立に、少なくとも単一細胞治療有効量の少なくとも１つの治療剤と、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する１つまたは複数のバーコードとを含む組成物を対象に投与する段階；
（ｂ）対象から体液試料を採取する段階；および
（ｃ）体液中に固有のバーコードが存在するかどうかを判定し、固有のバーコードの存在が、対象に治療剤が奏効することを示す段階；
を含み、それにより疾患のある対象の治療剤に対する奏効を予測する、方法を提供する。
【０１２０】
別の実施形態では、この方法は、核酸分子のシーケンシングを実施する段階をさらに含む。別の実施形態では、この方法は、核酸分子を増幅する段階をさらに含む。本明細書で使用される「確認」および「判定」という用語は、互換的に使用され、体液中にバーコードが存在するかどうかを確認することを指す。いくつかの実施形態では、確認は、核酸分子のシーケンシングおよび／または増幅を含む。核酸の増幅およびシーケンシングの方法は当業者に周知である。
【０１２１】
別の実施形態では、この方法は、段階（ｃ）の前に体液試料からインタクトな細胞を除去することをさらに含む。インタクトな細胞の除去については当業者に周知であり、特に限定されないが、分画遠心法、ろ過、免疫選択ビーズまたは分取が挙げられる。いくつかの実施形態では、この方法は、インタクトな細胞のカウントをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、インタクトな細胞中に少なくとも１つのバーコードを検出することをさらに含む。インタクトな細胞由来のバーコードを検出する実施形態では、固有のバーコードによって少なくとも１つの治療剤の効果を確認することは、インタクトな細胞中のバーコードレベルの比較を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤の効果を確認することは、体液中に細胞外バーコードを検出することを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、この方法は、段階（ｃ）の前に体液からインタクトな担体を除去することをさらに含む。別の実施形態では、少なくとも１つの担体はリポソームであり、この方法は、段階（ｃ）の前に体液試料からインタクトなリポソームまたはナノリポソームを除去することをさらに含む。インタクトなリポソームを除去する方法の非限定的な例として、分画遠心法がある。いくつかの実施形態では、この方法は、インタクトなリポソームの数をカウントすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、インタクトなリポソーム中に少なくとも１つのバーコードを検出することをさらに含む。インタクトなリポソーム由来のバーコードを検出する実施形態では、固有のバーコードによって少なくとも１つの治療剤の効果を確認することは、インタクトなリポソーム中のバーコードレベルの比較を含む。いくつかの実施形態では、リポソームはナノリポソームである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療剤の効果を確認することは、体液中にリポソーム外または担体外のバーコードを検出することを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、投与する組成物は本発明の組成物である。いくつかの実施形態では、投与する組成物は、各種類の担体の数が実質的に等しい組成物である。
【０１２４】
別の実施形態では、この方法は、段階（ａ）の前に、対象から体液試料を採取し、試料中の循環血中腫瘍ＤＮＡの割合を確認することをさらに含む。循環血中腫瘍ＤＮＡは当該技術分野で周知であり、それを確認する方法についても同様である。いくつかの実施形態では、ドライバー変異または少数のヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の存在によって腫瘍ＤＮＡを確認する。ドライバー変異は、本明細書で上に記載したヌクレオチド検出方法を用いて、具体的には、特に限定されないが、Ｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で検出することができる。試料中の腫瘍ＤＮＡの割合を確認する実施形態では、固有のバーコードによって少なくとも１つの治療剤の効果を確認することは、投与前の腫瘍ＤＮＡの割合との比較を含む。いくつかの実施形態では、この比較により、試料中のバーコードが健常細胞の死滅によるものであるか、疾患細胞の死滅によるものであるかを判別することが可能である。いくつかの実施形態では、この方法は、段階（ｃ）の一部として、体液中の腫瘍ＤＮＡの割合を確認することをさらに含む。
【０１２５】
別の実施形態では、この方法は、薬剤を標的細胞とインキュベートした後に、洗浄およびＤＮアーゼ処理の段階をさらに含む。
【０１２６】
本明細書で使用される「体液（ｆｌｕｉｄ）」および「体液（ｂｏｄｉｌｙ  ｆｌｕｉｄ）」という用語は、互換的に使用され、対象の身体によって産生される任意の液体を指す。いくつかの実施形態では、体液は、血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、腫瘍液、母乳、脳脊髄液および精液からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、体液は血液である。体液の採取は当業者には日常的なものであろう。採取する体液は、疾患による必要に応じて選択され、例えば、考え得る体液と疾患をいくつか挙げると、脳腫瘍では脳脊髄液を採取し、転移性癌ではリンパ液を採取し、乳腺腫瘍では母乳を採取し、または前立腺癌では精液を採取し得る。当業者であれば、採取するべき適切な体液を決定することが可能であるが、ほとんどの疾患では血液採取を用い得る。固形腫瘍、例えば嚢胞液の採取がルーチンとなっている悪性嚢胞などでは、本明細書で「腫瘍液」と呼ばれる腫瘍周辺または腫瘍付近の体液を採取してもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、採取する体液の量は、統計的に有意なデータを得るのに十分なバーコードを抽出するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、採取する体液の量は、バーコードのディープシーケンシングを実施するのに十分なものである。いくつかの実施形態では、採取する体液の量は、ＰＣＲまたはその他の形態のヌクレオチド増幅に十分なものである。いくつかの実施形態では、採取する体液の量は、少なくとも１ミリリットル（ｍＬ）、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１１ｍＬ、１２ｍＬ、１３ｍＬ、１４ｍＬまたは１５ｍＬである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、１〜５ｍＬ、１〜１０ｍＬ、１〜１５ｍＬ、５〜１０ｍＬまたは５〜１５ｍＬ採取する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、バーコードの確認の前に体液から核酸を単離する。いくつかの実施形態では、変化させていない体液で確認を実施する。いくつかの実施形態では、核酸を単離する前または確認を実施する前に体液を処理する。いくつかの実施形態では、体液の処理は、インタクトな細胞および／または担体の除去を含む。いくつかの実施形態では、処理は、体液から諸成分を分離することを含む。いくつかの実施形態では、体液は血液であり、処理はプラスミドの分離を含む。いくつかの実施形態では、バーコードの確認の前にＤＮＡおよびＲＮＡを分離する。核酸単離および確認は当該技術分野で周知であり、例えば、分画遠心法、沈降または選択的酵素消化を用い得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、治療剤が細胞を死滅させるのに十分な時間を与えることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、遊離しているインタクトな担体を実質的に体液から消失するのに十分な時間を与えることを含む。インタクトな担体が消失するのに必要な時間は、導入した担体の最初の数に左右される。投与後、いくつか間隔をおいて血液を検査することによって実験的に十分な時間を求め得る。体液を採取する前の十分な時間は、障害または病態の性状および具体的な薬剤に左右され、当業者に公知の標準的な臨床技術によって求めることができる。非限定的な例として、十分な時間としては、約２４時間、約３０時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約１４４時間、約１６８時間、約１９２時間またはそれ以上が挙げられる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、体液内でバーコードが分解されるのを避けるため、持続時間を１４４時間未満とする。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、３〜２４０時間、１２〜２４０時間、２４〜２４０時間、４８〜２４０時間、７２〜２４０時間、９６〜２４０時間、３〜１９２時間、１２〜１９２時間、２４〜１９２時間、４８〜１９２時間、７２〜１９２時間、９６〜１９２時間、３〜１４４時間、１２〜１４４時間、２４〜１４４時間、４８〜１４４時間、７２〜１４４時間または９６〜１４４時間の時間枠内で採取を実施する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、１４４時間後、１６８時間後、１９２時間後、２１６時間後または２４０時間後に採取を実施する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、２４〜７２時間の範囲内にある。いくつかの実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、２４〜９６時間の範囲内にある。他の実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、２４〜１２０時間の範囲内にある。他の実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、２４〜１４４時間の範囲内にある。他の実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、２４〜１９２時間の範囲内にある。いくつかの実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、４８〜７２時間の範囲内にある。いくつかの実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、４８〜９６時間の範囲内にある。他の実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、４８〜１２０時間の範囲内にある。他の実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、４８〜１４４時間の範囲内にある。他の実施形態では、標的細胞を採取する前の持続時間は、４８〜１９２時間の範囲内にある。他の実施形態では、組成物の投与の少なくとも２４時間後に試料を採取する。他の実施形態では、少なくとも組成物の投与の４８時間後に試料を採取する。他の実施形態では、少なくとも組成物の投与の７２時間後に試料を採取する。他の実施形態では、少なくとも組成物の投与の９６時間後に試料を採取する。他の実施形態では、少なくとも組成物の投与の１４４時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の４８時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の７２時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の９６時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の１２０時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の１４４時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の１９２時間後に試料を採取する。他の実施形態では、最大でも組成物の投与の２４０時間後に試料を採取する。他の実施形態では、組成物の投与の２４〜１９２時間後に試料を採取する。他の実施形態では、組成物の投与の４８〜１９２時間後に試料を採取する。他の実施形態では、組成物の投与の２４〜２４０時間後に試料を採取する。他の実施形態では、組成物の投与の４８〜２４０時間後に試料を採取する。標的細胞を採取する正確な時間枠は、使用するバーコードの種類と量および検討する治療剤を含めた複数の因子によって決定し得る。非限定的な例として、核酸分子は通常、投与（特に全身投与）後の４８時間に分解を受けやすいのに対し、希土類元素は、これより長い時間にわたって検出することができる。他の実施形態では、治療剤によって標的細胞に作用する時間が異なる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、治療剤（例えば、シスプラチン）は固有のバーコードを含む。当業者には、このような実施形態では、前記担体が治療剤（例えば、シスプラチン）を含み得るものであり、さらにバーコードを加える必要はないことが理解されよう。
【０１３３】
別の実施形態では、前記組成物を全身投与用に製剤化する。別の実施形態では、前記全身投与は静脈内注射である。別の実施形態では、前記投与は、組織内への注射、例えば腫瘍内注射などである。
【０１３４】
本明細書で使用される「投与すること」、「投与」という用語およびこれに類似した用語は、妥当な医療行為において、治療効果または診断効果が得られる方法で対象に活性薬剤を含有する組成物を送達する任意の方法を指す。本発明の主題の一態様は、静脈内投与を提供する。その他の適切な投与経路としては、非経口、皮下、経口、筋肉内、腫瘍内または腹腔内が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は静脈内注射であり、組成物は、対象の腫瘍の単一細胞当たり１〜２００の担体を含む。いくつかの実施形態では、投与は腫瘍内注射であり、組成物は、対象の腫瘍の単一細胞当たり１〜２０の担体を含む。
【０１３５】
投与量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、もしあれば、現在受けている治療の種類、治療頻度ならびに所望の効果の性質に左右される。
【０１３６】
本発明の方法を用いて、多数の標的細胞型を優先的に標的とし得る。例えば、企図される標的細胞としては、特に限定されないが，肝細胞、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球および腫瘍細胞が挙げられる。本明細書で使用される「腫瘍細胞」には、原発性癌細胞および転移細胞が含まれる。
【０１３７】
本明細書で使用される「対象」という用語は、本発明の組成物および方法を実施する、特に限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含めた任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。いくつかの実施形態では、「対象」および「患者」という用語は、本明細書でヒト対象を指すのに互換的に使用される。他の実施形態では、「対象」および「患者」という用語は、本明細書で非ヒト対象を指すのに互換的に使用される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、悪性疾患のある対象の治療剤に対する奏効を判定または予測するのに有用である。いくつかの実施形態では、前記悪性疾患は、癌、癌転移および前悪性病変である。いくつかの実施形態では、対象に癌がある。いくつかの実施形態では、疾患は炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は神経疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、特定の細胞または細胞型の死滅または減少から便益が得られる疾患である。
【０１３９】
癌治療剤の例としては、例えば、特に限定されないが、４−ヒドロキシシクロホスファミド、５−ＦＵ、アビラテロン、アシトレチン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アミホスチン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、ヒ素、アスパラギナーゼ、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）アスパラギナーゼ、アキシチニブ、アザシチチジン（ａｚａＣＩＴＩｔｉｄｉｎｅ）、ＢＣＧ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブ、ブロモクリプチン、ブセレリン、ブスルファン、カバジタキセル、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デガレリクス、デノスマブ、デキサメタゾン、デキスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ペグ化リポソーム化ドキソルビシン、エンザルタミド、エピルビシン、エリブリン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イニパリブ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、ランブロリズマブ、ランレオチド、ラパチニブ、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルナノ粒子、アルブミン結合（ｎａｂ）、パミドロン酸、パニツムマブ、パゾパニブペメトレキセド、ペルツズマブ、ポルフィマー、プロカルバジン、キナゴリド、ラルチトレキセド、レオウイルス血清型３−Ｄｅａｒｉｎｇ株、リツキシマブ、ロミデプシン、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、サイロトロピンアルファ、トシリズマブ、トポテカン、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トラスツズマブ、エムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、トレオスルファン、トレチノイン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンが挙げられる。
【０１４０】
治療剤として使用される化学療法剤の例としては、例えば、特に限定されないが、例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アジリジン、エポキシド、スルホン酸アルキル）、シスプラチンおよびその類似体（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、５‐フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン）、トポシオメラーゼ（ｔｏｐｏｓｉｏｍｅｒａｓｅ）相互作用剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビンなど；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルなど）、インターフェロン、インターロイキン２、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、モノクローナル抗体、エストロゲンモジュレーター（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン）、メゲストロール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、オクトレオチド）、オクトレオチド、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、カソデックス）、キナーゼおよびチロシン阻害剤（例えば、イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはグリベック（Ｇｌｅｅｖａｃ））；ゲフィチニブ（イレッサ）；ならびにエルロチニブ（タルセバ）などが挙げられる。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第７版，Ｄｅｖｉｔａら，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５，第１５章，１６章，１７章および６３章を参照されたい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、炎症性疾患または炎症性障害のある対象の治療剤に対する奏効を判定または予測するのに有用である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、変性疾患または変性障害のある対象の治療剤に対する奏効を判定または予測するのに有用である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、神経疾患または神経障害のある対象の治療剤に対する奏効を判定または予測するのに有用である。
【０１４４】
別の態様では、インタクトな細胞が実質的に除去された体液を含み、インタクトな細胞が実質的に除去された体液が、少なくとも１つの治療剤を固有に確認する少なくとも１つのバーコードを含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、体液は、いかなるインタクトな細胞も除去されている。いくつかの実施形態では、体液は複数のバーコードを含む。いくつかの実施形態では、体液は、インタクトな担体が実質的に除去されている。いくつかの実施形態では、体液は、インタクトなリポソームが実質的に除去されている。いくつかの実施形態では、体液はｃｆｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、バーコードはｃｆｔＤＮＡである。いくつかの実施形態では、組成物は、疾患のある対象の治療剤に対する奏効を予測するのに使用するものである。
【０１４５】
本明細書においてある値とともに使用される「約」という用語は、記載される値の±１０％を指す。例えば、長さ約１０００ナノメートル（ｎｍ）は長さ１０００ｎｍ±１００ｎｍを指す。
【０１４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数形の指示対象を含むことが留意される。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」と言う場合、これには複数のこのようなポリヌクレオチドが含まれ、「ポリヌクレオチド（ｔｈｅ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」と言う場合、これには１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に公知のその等価物などへの言及が含まれる。さらに、請求項は任意の任意選択の要素が除外されるよう起草され得ることが留意される。したがって、この記述は、請求項要素の列挙に関連して「単に〜」、「〜のみ」などの排他的用語を使用する、または「否定的な」限定を使用するのに先立つ原則としての役割を果たすものとする。
【０１４７】
「Ａ、ＢおよびＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似する慣用的表現を使用する場合は一般に、当業者であればそのような慣例的表現を理解するであろうという意味でこのような構文を意図する（例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」であれば、特に限定されないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣおよび／またはＡとＢとＣなどを有するが含まれることになる）。当業者にはさらに、説明、請求項または図面を問わず、２つ以上の択一的用語を表す離接語および／または離接語句は実質的にいずれも、その用語のうちの１つ、その用語のうちのいずれか、または両用語が含まれる可能性を企図するものであると解釈するべきであることが理解されよう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句には、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性が含まれることが理解されよう。
【０１４８】
明確にするため別個の実施形態において記載されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせても得られることが理解される。これとは逆に、簡潔にするため単一の実施形態において記載されている本発明の様々な特徴は、別個にも、または任意の適切なサブコンビネーションでも得られる。本発明に属する諸実施形態の組合せはいずれも、本発明に明確に包含され、ありとあらゆる組合せが個別にかつ明確に開示された場合と同じように本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のサブコンビネーションについても、そのいずれも本発明によって明確に包含され、ありとあらゆるサブコンビネーションが個別にかつ明確に本明細書に開示された場合と同じように本明細書に開示される。
【０１４９】
下の実施例を検討すれば、本発明のほかの目的、利点および新規な特徴が当業者に明らかになるが、これらの実施形態は限定することを意図するものではない。さらに、本明細書で既に説明し、のちの特許請求の範囲の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれ、下の実施例で実験的裏付けが得られるものである。
【０１５０】
本明細書で既に説明し、のちの特許請求の範囲の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、下の実施例で実験的裏付けが得られるものである。
【０１５１】
（実施例）
本明細書で使用される命名法および本明細書で用いられる実験法には一般に、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡに関する技術が含まれる。このような技術については文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，第１〜４巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載されている方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編），「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編），「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（上記の文献はいずれも参照により組み込まれる）を参照されたい。その他の一般的な参考文献については、本明細書全体を通して記載されている。
【０１５２】
実施例１：効果の正確な評価には相対薬物濃度の等しい同数のリポソームが必要とされる
セラノスティクスに使用するためリポソーム混合物に含めるのに理想的な各薬物の用量を検討する実験を実施した。既存のプロトコル（全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６０２４２８１号を参照されたい）に従い、ドキソルビシン（バーコード２）、ゲムシタビン（バーコード３）またはシスプラチン（バーコード４）を搭載したリポソームが作製していた。リポソームの各バッチについて、脂質濃度、封入薬物濃度、サイズ分布およびゼータ電位を測定した。その結果を表１にまとめる。異なるバッチはいずれも、脂質組成（ＨＳＰＣ  ５５モル％、コレステロール４０モル％およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ５モル％）およびサイズ（約１００ｎｍ）が同じリポソームのものであることから、脂質濃度（スチュワートアッセイによって評価した）およびそれから導かれる脂質量（モル数）は各バッチのリポソームの総数に比例するものと考えられた。
【０１５３】
【表１】
2020525051.tif 000003
【０１５４】
薬物にはそれぞれ固有の有効治療量（ＭＴＤ）があり、効果を検討するためには、各リポソーム混合物（一緒に注射するべき全３種類のリポソームの混合物）について各薬物の相対量を同じにするのが妥当である。つまり、理想的な用量を明らかにするため、薬物が３種類とも有効治療量の５％、１％または０．１％の濃度で存在する混合リポソームのバッチを作製した。それぞれの総用量を得るため混合物に加えた各リポソームバッチの量（ｕｌ）を表２に記載する。
【０１５５】
【表２】
2020525051.tif 000004
【０１５６】
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの脂肪体にトリプル陰性乳癌腫瘍の細胞を移植し、マウスの中で腫瘍を形成するまで増殖させた。マウスを３つのグループに分け、次いで、各グループに５％、１％または０．１％のリポソーム混合物を注射した。注射から４８時間後、腫瘍を切り取り、ＦＡＣＳによって生細胞／死細胞の解析を実施し、次いで、生細胞と死細胞について別個にバーコード解析を実施した。ゲムシタビンは、使用濃度とは関係なく最も効果的な治療剤であることがわかったが、それが他の２つの薬物より１０倍以上効果的であることがわかったのは予想外のことであった（図１Ａ〜１Ｃ）。同じ腫瘍細胞を用いたこれまでの実験に基づけば、ゲムシタビンがこれほど極端に優れているとは予想されるものではなく、実際、解析に関する何らかのアーティファクトであるものと思われた。
【０１５７】
ゲムシタビンは、有効治療量がドキソルビシンまたはシスプラチンの２０倍超であるが、両薬剤よりもはるかに高い濃度でリポソームに組み込んだわけではない。さらに、ゲムシタビンを含むリポソームおよびシスプラチンを含むリポソームをドキソルビシンを含むリポソームよりもはるかに多数作製した（表１を参照されたい）。このため、相対用量が等しくなるように、ゲムシタビン含有リポソームを他の２つの薬物よりもはるかに多数注射し、事実上、ドキソルビシン含有リポソームよりもはるかに多数のシスプラチン含有リポソームを注射した。混合物に加えた各リポソームバッチの体積に各バッチの脂質濃度を乗じることにより、ゲムシタビン、シスプラチンおよびドキソルビシンの間のリポソームの相対濃度が９１：３３：１であることがわかる。つまり、ドキソルビシンを含有するリポソーム１個に対して、シスプラチンを含有するリポソームが３３個、ゲムシタビンを含有するリポソームが９１個存在したことになる。これにより結果の偏りが説明されるものと思われる。
【０１５８】
上記の薬物は、０．１％という極めて低い用量でも効果的であった（死細胞からバーコードを検出することができた）ことから、用量が等しいことは、リポソーム数が等しいことほど重要ではないことが明らかになった。確かに、用量がリポソームのバッチによって大幅に異なるべきではなく、例えばＭＴＤの１％以下であるが、のちのいずれの実験でも、各種類のリポソームの混合物への搭載量を脂質濃度によって決めることにした。薬物濃度が等しいことは依然として重要ではあったが、リポソーム数が等しいことが最も重要であり、したがって、薬物濃度はできる限り等しくするようにした。
【０１５９】
実施例２：液体生検でのセラノスティクス検出
より正確な結果が得られるリポソーム混合物の作製方法があるため、腫瘍生検試料だけでなく、血流中を循環する無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｆｔＤＮＡ）でもバーコード解析を実施することができるのではないかと考えた。マウス４Ｔ１乳腺腫瘍モデルを用いて、リポソームバーコードを血液のセラノティクスに使用することが可能であるかを検討した。４Ｔ１乳癌細胞を標準的な組織培養条件で増殖させた。６×１０６個／ｍｌの４Ｔ１細胞５０μｌ（３×１０５個／マウス）を８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの左前の乳頭に皮下注射した。注射から２〜３日毎に、マウスの体重および腫瘍サイズ（長さおよび幅）ならびに健康状態を記録した。腫瘍体積をノギスで測定し、長さ／２×（幅）２として計算した。
【０１６０】
３種類のリポソーム、すなわち、ドキソルビシン含有リポソーム（バーコード２）、ゲムシタビン含有リポソーム（バーコード３）およびシスプラチン含有リポソーム（バーコード４）を１つの混合物で同時に検討した（表３を参照されたい）。４Ｔ１細胞はシスプラチンに対する感受性が高いが、ドキソルビシンに対してはそれより低く、ゲムシタビンに対してはさらに低い。さらに、この細胞は、ドキソルビシンに対して抵抗性を示すようになることが明らかにされているとともに、ゲムシタビンによって治療の最初の数日間は腫瘍成長が遅くなるが、それより後の時点では効果がみられないことがわかっている（Ｋｉｅｗら，２０１２，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙ−Ｌ‐ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ−Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．７３：１２０−１２９）。
【０１６１】
リポソームは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）５５モル％、ポリエチレングリコールジステアロイル−ホスホエタノールアミン（ｍ２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）５モル％およびコレステロール４０モル％で構成されるものとした。脂質の最初の搭載濃度を５０ｍＭとした。リポソームを形成するため、脂質を無水エタノールに溶かし、６５℃まで加温し、適切なバーコード化溶液１ｍｌに注入した。Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒの８００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、８０ｎｍ、次いで、８０ｎｍ、５０ｎｍ、５０ｎｍの細孔径ポリカルボナート膜を用いて段階的押出を連続して２回実施することにより、リポソームを小さくした。押出後、動的光散乱法を用いてサイズを測定した。多分散指数は０．０５〜０．０９、粒子径は９０±１０ｎｍであった。全リポソームがほぼ同じ粒子径および同じ脂質組成になったため、脂質濃度が再びリポソームの総数を測定する効果的な方法になった。押出および様々な治療剤の搭載の過程で一部のリポソームが失われることから、各リポソームの数が等しい最終混合物が確実に得られるように、搭載後に脂質濃度を測定した（表４を参照されたい）。
【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
ドキソルビシン−ＨＣｌは硫酸アンモニウム（１２０ｍＭ）勾配により能動的にリポソーム内に搭載したのに対し、ゲムシタビンおよびシスプラチンは、それぞれ硫酸アンモニウム（１２０ｍＭ）および０．９％ＮａＣｌで受動的に搭載した。封入されなかったバーコードおよび薬物については、それぞれ１０００ｋＤａおよび１２〜１４ｋＤａのＭＷカットオフ膜を用いて透析により除去した。最終的な薬物含有リポソームを０．２μｍでろ過し、冷蔵条件（２℃〜８℃）で遮光して保管した。
【０１６４】
各種のリポソームは総リポソーム量がほぼ等しく（３１：３３：３７）、さらに、ゲムシタビンがドキソルビシンの１４倍、シスプラチンの７倍搭載されていた。表４に記載する通り、全３種類のリポソームの数が等しいリポソーム混合物（ＬＰＭ）を作製した。ドキソルビシン含有バッチは脂質濃度が最も低かったため、この種類のリポソームをさらに混合物に加えた（ゲムシタビン１８．７８ｕｌおよびシスプラチン１６．６７ｕｌに対して２０ｕｌ）。加えたリポソームの体積に薬物濃度を乗じることにより、ＭＴＤのパーセントを算出することができた。０．１％ＭＴＤが効果的であることがわかっていたが、このＬＰＭはＭＴＤのほぼ１％になるよう設計した。リポソーム数が等しくなるよう考慮して混合物を設計したため、用量は完全には均一にならなかったが、いずれの薬物もＭＴＤの１％に近く、いずれも０．１％の閾値を超えていたため、効果を示すはずである。リポソームの担体にはスクロース−ヒスチジン緩衝液（ｐＨ＝６．５）を使用し、腫瘍体積が約１００〜３００ｍｍ３に達したとき、最終体積１５０ｕｌを各マウスの側面尾静脈に注射した。
【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
ＬＰＭ注射後０時間、３時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および２４０時間の時点で、マウスを屠殺し、大静脈から血液を採取した。選択したグループから腫瘍を切り分け、のちに記載する解析のためＭＡＣＳ保存液に入れて保管した。用いた計２３匹のマウスを以下のグループに従って屠殺した：
【表５】
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【０１６７】
屠殺後、各個体から血液０．５〜０．７ｍｌを採取し、腫瘍を取り出したとき、これを処理するか、処理まで４℃のＭＡＣＳ組織保存液３ｍｌ中、遮光して保管した。血液試料を１０００×ｇで１５分間、２回遠心分離して、乏血小板血漿を得た。血漿試料をのちの処理のために凍結させた。ＤＮＡ抽出には、試料を室温で融解し、１００μｌを確保し、残りの血漿を再び凍結させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｖｉｒｕｓキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ社）を製造業者の指示通りに用いてバーコードを単離した（詳細については下を参照されたい）。溶出した試料を直ちにリアルタイムＰＣＲ解析に供するか、凍結させた。
【０１６８】
腫瘍組織を分離して単細胞懸濁液にした後、細胞をカウントし、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）溶液またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて染色した。ＣＦＳＥ希釈標準溶液（２．５μｇ／μｌ）を１：１０００に希釈した（単細胞懸濁液１ｍｌ中にＣＦＳＥが１μｌ希釈されている状態）。細胞をＣＦＳＥと３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＲＰＭＩで洗浄した（×３）後、分取した。分取の１０〜１５分前、ＰＩストック（ＳＩＧＭＡ社）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１：２００に希釈した（単細胞懸濁液１ｍｌ中にストックＰＩが５μｌ含まれている状態）。フロー活性化細胞分取器（ＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いて細胞を分取し、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって解析し、生死に従って分離した。このようにして純粋な生細胞集団を得た。未染色細胞を陰性対照として用いた。
【０１６９】
リアルタイムＰＣＲ解析の前にリポソーム、血液および生細胞の試料からの核酸抽出を実施した。リポソームからの抽出は、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｖｉｒｕｓキットを製造業者の指示通り（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）に用いて実施した。生きた腫瘍細胞については、ＦＡＣＳ分取後に得られた細胞ペレットにＰＢＳを２００μｌ加えた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｖｉｒｕｓキットで以下の通りに核酸（バーコードおよびゲノムＤＮＡ）を抽出した。試料を溶解させ、結合条件を調整した後、カラムにかける前に、標準的プロトコルに遠心分離段階を加え（１３，０００ｇで１分間）て試料から固形残屑をすべて除去した。これによりカラムの目詰まりが回避される。予め温めた無ヌクレアーゼ水４０μｌで試料を溶出させた。最終的な試料体積を記録した。２回の連続する溶出（３０μｌ、次いで１０μｌ）によって溶出を実施し、最終溶出体積は３２μｌであった。
【０１７０】
バーコードの定量化にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて異なるバーコードを解析した。ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、プライマー（ＩＤＴ社）および５’末端を蛍光ＦＡＭ色素で標識し、３’末端をＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と結合した非蛍光クエンチャーで標識した特異的プローブを用いてアッセイを実施した。バーコードコピー数の定量化には、バーコードストック（１００μＭ）から始まる各バーコードの標準曲線を作成した。希釈液をすべて調製した後、リアルタイムＰＣＲを用いて標準曲線を検証した。いずれのバーコードについても以下の成分および設定で反応を実施した：
【表６】
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【表７】
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【０１７１】
ＰＣＲの定量結果を（標準曲線を用いて）バーコードコピー数に変換し、各種のバーコードの結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。注射直後の血液中のバーコード濃度は極めて高く、その後４日間にわたって徐々に低下し、４日間後の時点でベースラインレベルに達した。全３種類のバーコードの結果を一緒にプロットしたものを図２Ｄに示す。シスプラチンはＤＮＡと結合し、ＰＣＲによる検出を部分的に阻害することがある。このことにより、注射からちょうど３時間後のバーコード４のレベルが有意に低いことが説明されるものと思われる。それでも、３種類のリポソームのいずれにも循環血中バーコードのレベルが減少するという同じ傾向がみられる。１９２時間後、バーコード４にバーコードコピー数のわずかな増加がみられたが、他の２種類にはみられなかったのは重要なことである（図２Ｄ）。マウスにバーコード供給源を新たに投与したわけではないことから、バーコード数の増加は重要である。この増加はむしろ、シスプラチンに対して感受性を示すアポトーシス細胞が死滅して、バーコード４をｃｆｔＤＮＡとして循環血中に放出し、次いでそれが液体生検試料中に検出されたことによるものである可能性が高い。このことは、液体生検が対象における薬物の効果をセラノティクスで監視するのに効果的な方法であることを示している。
【０１７２】
ここまで、本発明をその特定の実施形態とともに説明してきたが、当業者には多数の代替形態、修正形態および変形形態が明らかになることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲に含まれるこのような代替形態、修正形態および変形形態がすべて包含されるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際調査報告】
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