(57)【要約】  本発明は、ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２３８７５による天然に存在しない樹状様骨髄性白血病細胞、ならびにそのような細胞を利用する方法およびキットを提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２３８７５による天然に存在しない樹状様骨髄性白血病細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞集団を含む、細胞培養物。
【請求項３】
哺乳動物において感作および／またはアレルゲン性を誘発することができる薬剤を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
（ｂ）表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのうちの１つ以上で定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を前記細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記細胞内での前記発現が、前記試験薬剤の前記感作および／またはアレルゲン効果の指標である、インビトロ方法。
【請求項４】
哺乳動物の皮膚の感作を誘発することができる薬剤を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
（ｂ）表Ａで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を前記細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記細胞内での前記発現が、前記試験薬剤の皮膚感作効果の指標である、インビトロ方法。
【請求項５】
哺乳動物において呼吸器感作を誘発することができる薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
（ｂ）表ＢまたはＣで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を前記細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記細胞内での前記発現が、前記試験薬剤の呼吸器感作効果の指標である、方法。
【請求項６】
薬剤の皮膚感作効力を決定するための方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の集団を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で提供された前記細胞を試験薬剤にさらす工程と、
（ｃ）表Ｄで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｂ）の前記細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｃ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現が、工程（ｂ）の前記試験薬剤の前記皮膚感作効力の指標である、方法。
【請求項７】
哺乳動物においてアレルゲン性のタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の集団を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で提供された前記細胞を試験タンパク質にさらす工程と、
（ｃ）表Ｅで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｂ）の前記細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｃ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現が、工程（ｂ）の前記試験タンパク質の前記アレルゲン性の指標である、方法。
【請求項８】
（ｄ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において感作および／またはアレルゲン性を誘発しない１つ以上のネガティブコントロール薬剤をさらすことと、
（ｅ）工程（ｂ）または（ｃ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現を工程（ｄ）の前記細胞内で測定することと、をさらに含み、
前記試験薬剤が、工程（ｅ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現が工程（ｂ）または（ｃ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現とは異なる事象において、感作剤および／またはアレルゲン性として同定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ｆ）請求項１または２に記載の樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において感作を誘発する、および／またはアレルゲン性である１つ以上のポジティブコントロール薬剤にさらすことと、
（ｇ）工程（ｂ）または（ｃ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現を工程（ｆ）の前記細胞内で測定することと、をさらに含み、
前記試験薬剤が、工程（ｇ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現が工程（ｂ）または（ｃ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記発現に対応する事象において、感作剤および／またはアレルゲン性として同定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）が、前記バイオマーカーのうちの１つ以上の核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）において前記バイオマーカーのうちの１つ以上の発現を測定することが、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、およびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して行われる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）において前記バイオマーカーのうちの１つ以上の発現を測定することが、ＤＮＡマイクロアレイを使用して決定される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）において前記バイオマーカーのうちの１つ以上の発現を測定することが、表Ａ〜Ｅのうちの１つ以上において同定された前記バイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子にそれぞれ選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を使用して行われる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、核酸分子を含むか、または核酸分子からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＰＭＯを含むか、またはそれらからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、ＤＮＡを含むか、またはＤＮＡからなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の結合部分が、５〜１００ヌクレオチド長である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の結合部分が、１５〜３５ヌクレオチド長である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、または酵素部分からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記放射性部分が、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびイットリウム−９０からなる群から選択される放射性原子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合部分の前記検出可能な部分が、蛍光部分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）が、前記バイオマーカーのうちの１つ以上の前記タンパク質の発現を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）において前記バイオマーカーのうちの１つ以上の発現を測定することが、表Ａ〜Ｅのうちの１つ以上で同定される前記バイオマーカーのうちの１つにそれぞれ選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を使用して行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の結合部分が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれらからなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分および酵素部分からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）が、アレイを使用して行われる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記アレイが、ビーズ系アレイである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アレイが、表面系アレイである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）が、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥのうちのいずれか１つに列挙された前記バイオマーカーのうちの全ての発現を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
試験薬剤の感作効果および／またはアレルゲン性を決定するための、請求項１または２に記載の樹状様細胞の集団の使用。
【請求項３６】
分析キットであって、
（ｉ）１つ以上の結合部分を含むアレイと、
（ｉｉ）請求項１または２で定義される１つ以上の細胞または細胞培養物と、
（ｉｉｉ）（場合により）１つ以上のコントロール薬剤と、
（ｉｖ）（場合により）使用説明書と、を含む、分析キット。
【請求項３７】
請求項３〜３４のいずれか一項に記載の方法で使用するための分析キットであって、
（ｉ）請求項１５〜２４のいずれか一項で定義される１つ以上の結合部分を含むアレイと、
（ｉｉ）請求項１または２で定義される１つ以上の細胞または細胞培養物と、
（ｉｉｉ）（場合により）１つ以上のコントロール薬剤と、
（ｉｖ）  （場合により）請求項３〜３４のいずれか一項で定義される方法を行うための説明書と、を含む、分析キット。
【請求項３８】
実質的に本明細書に記載されている通りの細胞、細胞培養物、方法、またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然に存在しない樹状様細胞株ならびにそのような細胞を利用する方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、自然免疫と適応免疫との間の重要な接続を架橋することによって、免疫反応において重要な役割を果たしている。それらは、引き起こされると、炎症部位での他の細胞の移動および活性化に影響を与える、大量のメディエーターを迅速に生成し、抗原提示を通じて細胞反応を微調整することにより、様々な病原体および環境要因に選択的に反応する。このように、感作剤による刺激の間にＤＣによってなされる免疫学的決定の探求および利用−は、感作を予測するための強力な試験戦略としての役割を果たし得る。
【０００３】
しかしながら、異なるＤＣ亜集団の多面的な表現型および特殊な機能、ならびにそれらの広範で希少な分布は、複雑な要因であり、試験プラットフォームとしての一次ＤＣの利用を妨げている。したがって、樹状様モデル細胞株を利用するなどして、一次ＤＣの変動および一次ＤＣを得る際の難易度に関連する問題も回避する、正確で信頼性の高いインビトロアッセイを構築することが実際に必要である。
【０００４】
ゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）は、化学的感作剤およびタンパク質感作剤ならびにアレルゲンの評価のために開発されたインビトロアッセイである。これは、試験薬剤の感作またはアレルゲン性の可能性を予測するために、樹状細胞様細胞株からの転写プロファイルを使用する（９）。転写プロファイルは、感作剤を非感作剤から区別する上で最大の予測性能を有すると同定された遺伝子から構成されている。具体的には、ＧＡＲＤは、皮膚感作剤（ＷＯ  ２０１２／０５６２３６、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ａ  ｂｌｉｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ｓｔｕｄｙ．ＡＬＴＥＸ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｆｉｒｓｔ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １７，２０１７、Ｆｏｒｒｅｒｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｔｏ  ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｒｅａｄｏｕｔ−Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｗｉｔｈ  ＧＡＲＤ．Ｔｏｘｉｃｏｌｇｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘ  Ｓｃｉ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１）、呼吸器感作剤（ＷＯ  ２０１３／１６０８８２、ＷＯ  ２０１６／０８３６０４、Ｆｏｒｒｅｒｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ＧＡＲＤ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０（３））、皮膚感作剤の効力（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６８７８、Ｚｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．ＡＬＴＥＸ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｐｒｉｌ  １２，２０１７，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１４５７３／ａｌｔｅｘ．１７０１１０１）、およびタンパク質のアレルゲン性を同定するために開発された。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、これより、ＧＡＲＤアッセイでの使用に適した好ましい樹状細胞様細胞株として、「ＳｅｎｚａＣｅｌｌ」と呼ばれる天然に存在しない樹状様骨髄性白血病細胞株（ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２３８７５）を提供する。ＳｅｎｚａＣｅｌｌは、ＧＡＲＤアッセイにおいても使用され得るＭＵＴＺ−３細胞株と比較されており、ＭＵＴＺ−３細胞は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ；ＤＳＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ  ２９５）から入手可能な樹状様細胞である。しかしながら、ＭＵＴＺ−３細胞は、それらの使用を複雑にするフィーダー細胞株による培養を必要とするようにプロトコル化されている。したがって、ＧＡＲＤアッセイなどの方法で使用するためのＭＵＴＺ−３の代替品が依然として必要である。
【０００６】
ＳｅｎｚａＣｅｌｌとＭＵＴＺ−３との間の比較には、バイオマーカーパネルの発現を比較する表現型分析、細胞株の転写レベルを比較する転写分析、それらのＤＮＡ配列の比較、および機能分析が含まれ、これらは、表現型および転写プロファイルにおける多くの定量化可能な違いを明らかにし、さらに、ＧＡＲＤアッセイにおいて共有機能を示した。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様において、ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２３８７５による天然に存在しない樹状様骨髄性白血病細胞を提供する。
【０００８】
この細胞は、本明細書で「ＳｅｎｚａＣｅｌｌ」とも呼ばれる。ＳｅｎｚａＣｅｌｌ（ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２３８７５）は、２０１７年３月９日にＳｅｎｚａＧｅｎ  ＡＢにより、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０，ＵＳＡに寄託された。
【０００９】
「天然に存在しない」とは、細胞が自然界で見られるものとは異なり、改変されており、かつ／またはそれらの変異であることを意味し、言い換えれば、それらは、通常天然に存在する細胞ではない。例えば、天然に存在するヒト骨髄性白血病細胞または天然に存在する樹状細胞とは異なり、改変されており、かつ／またはそれらの変異である。
【００１０】
本発明の第２の態様において、第１の態様による細胞集団を含む細胞培養物を提供する。
【００１１】
一実施形態において、細胞または細胞集団は、不死細胞または不死化細胞を含むか、またはそれらからなる。「不死」とは、別様に、ＤＮＡの損傷またはテロメアの短縮が原因である可能性のある、分裂を続けることができないポイントによって制限されない細胞を意味する。さらなる実施形態または代替の実施形態において、細胞または細胞集団は、未分化細胞を含むか、またはそれらからなる。
【００１２】
本発明の第３の態様において、哺乳動物において感作および／またはアレルゲン性を誘発することができる薬剤を同定するためのインビトロ方法であって、
ａ）第１または第２の態様による樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
ｂ）表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥのうちの１つ以上で定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの細胞内での発現が、試験薬剤の感作および／またはアレルゲン効果の指標である、インビトロ方法を提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様において、哺乳動物の皮膚の感作を誘発することができる薬剤を同定するためのインビトロ方法であって、
ａ）第１または第２の態様による樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
ｂ）表Ａで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの細胞内での発現が、試験薬剤の皮膚感作効果の指標である、インビトロ方法を提供する。
【００１４】
本発明による樹状様細胞を使用し得る哺乳動物の皮膚の感作を誘発することができる薬剤を同定するための方法は、実施例１の機能分析の項に記載されている。ＷＯ２０１２／０５６２３６、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ａ  ｂｌｉｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ｓｔｕｄｙ．ＡＬＴＥＸ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｆｉｒｓｔ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １７，２０１７、Ｆｏｒｒｅｒｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｔｏ  ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｒｅａｄｏｕｔ  −Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｗｉｔｈ  ＧＡＲＤ．Ｔｏｘｉｃｏｌｇｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘ  Ｓｃｉ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１に記載されている方法（これらは全てが参照により本明細書に組み込まれる）も使用することができる。
【００１５】
一実施形態において、この方法は、ヒトの皮膚に過敏反応を誘発することができる薬剤を同定するためのものである。好ましくは、過敏反応は、細胞媒介性過敏反応、例えば、ＩＶ型の過敏反応である。好ましくは、過敏反応は、哺乳動物におけるＩＶ型の遅延型過敏反応である。好ましくは、ＩＶ型の遅延型過敏反応は、ＤＣ媒介性である。好ましくは、この方法は、アレルゲン性接触皮膚炎（ＡＣＤ）を誘発することができる薬剤を同定するためのものである（すなわち、過敏反応は、ＡＣＤである）。
【００１６】
一実施形態において、「哺乳動物の皮膚の感作を誘発することができる薬剤」は、哺乳動物における表皮接触部位でＩＶ型の遅延型過敏反応を誘発し、引き起こすことができる薬剤である。
【００１７】
本発明の第５の態様において、哺乳動物において呼吸器感作を誘発することができる薬剤を同定するための方法であって、
ａ）第１または第２の態様による樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
ｂ）表Ｂで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの細胞内での発現が、試験薬剤の呼吸器感作効果の指標である、方法を提供する。
【００１８】
本発明の第６の態様において、哺乳動物において呼吸器感作を誘発することができる薬剤を同定するための方法であって、
ａ）第１または第２の態様による樹状様細胞の集団を試験薬剤にさらす工程と、
ｂ）表Ｃで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの細胞内での発現が、試験薬剤の呼吸器感作効果の指標である、方法を提供する。
【００１９】
第５および第６の態様の方法は、工程（ｂ）が表Ｂおよび／またはＣで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を細胞内で測定することを含むように組み合わせることができる。
【００２０】
本発明による樹状様細胞を使用し得る哺乳動物において呼吸器感作を誘発することができる薬剤を同定するための方法が、実施例２で議論されている。ＷＯ２０１３／１６０８８２、ＷＯ２０１６／０８３６０４、およびＦｏｒｒｅｒｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ＧＡＲＤ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０（３）に記載されている方法（これらは全てが参照により本明細書に組み込まれる）も使用することができる。
【００２１】
「呼吸器感作を誘発するできる薬剤」とは、哺乳動物の気道におけるＩ型の即時型過敏反応を誘発し、引き起こすことができる任意の薬剤を意味する。好ましくは、Ｉ型の即時型過敏反応は、ＤＣ媒介性であり、かつ／またはＴ細胞のＴｈ２細胞への分化を伴う。好ましくは、Ｉ型の即時型過敏反応は、体液性免疫および／または呼吸器アレルギーを引き起こす。
【００２２】
一実施形態において、「哺乳動物の皮膚の感作を誘発することができる薬剤」は、哺乳動物における肺上皮の部位でＩ型の即時型過敏反応を誘発し、引き起こすことができる薬剤である。好ましくは、肺上皮の部位は、肺の呼吸帯内にあるが、代替的にまたは追加的に、肺の伝導帯内にあってもよい。
【００２３】
本発明の第７の態様において、薬剤の皮膚感作効力を決定するための方法であって、
（ａ）第１または第２の態様による樹状様細胞の集団を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で提供された細胞を試験薬剤にさらす工程と、
（ｃ）表Ｄで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｂ）の細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現が、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、方法が提供される。
【００２４】
本発明による樹状様細胞を使用し得る薬剤の皮膚感作効力を決定するための方法は、実施例３で議論されている。Ｚｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７），Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．ＡＬＴＥＸ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｐｒｉｌ  １２，２０１７，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１４５７３／ａｌｔｅｘ．１７０１１０１、およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６８７８に記載されている方法（参照により本明細書に組み込まれる）も使用することができる。
【００２５】
本発明の第８の態様において、哺乳動物においてアレルゲン性であるタンパク質を同定するための方法であって、
（ａ）第１または第２の態様による樹状様細胞の集団を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で提供された細胞を試験薬剤にさらす工程と、
（ｃ）表Ｅで定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｂ）の細胞内で測定する工程と、を含むか、またはそれらの工程からなり、
工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現が、工程（ｂ）の試験薬剤のアレルゲン性の指標である、方法を提供する。
【００２６】
本発明による樹状様細胞を使用し得る哺乳動物においてアレルゲン性のタンパク質を同定するための方法が、実施例４で詳細に議論されている。
【００２７】
一実施形態において、本発明の任意の態様による方法は、
ｄ）第１または第２の態様による樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において感作および／またはアレルゲン性を誘発しない１つ以上のネガティブコントロール薬剤にさらすことと、
ｅ）工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｄ）の細胞内で測定することと、をさらに含み、
試験薬剤は、工程（ｅ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現が工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現とは異なる事象において、感作および／またはアレルゲン性として同定される。
【００２８】
ネガティブコントロール薬剤として、ビヒクルコントロールを使用してもよい。ビヒクルコントロールは、ＤＭＳＯおよび／または蒸留水を含み得る。
【００２９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、ネガティブコントロールとして、非刺激細胞を使用してもよい。「非刺激細胞」とは、特定の試験薬剤にさらされていない細胞を含むか、または意味する。
【００３０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上のネガティブコントロール薬剤は、１−ブタノール、２−アミノフェノール、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ニトロ−１，４−フェニレンジアミン、４−アミノ安息香酸、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミド、エチルバニリン、ホルムアルデヒド、ゲラニオール、ヘキシルケイ皮アルデヒド、イソプロパノール、Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ＊、サリチル酸メチル、ペニシリンＧ、プロピレングリコール、重クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０、および硫酸亜鉛からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含み得るか、またはそれらからなり得る。
【００３１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現は、試験薬剤にさらさられる前および後に工程（ａ）で提供された細胞内で測定され、試験薬剤にさらさられる前および後の１つ以上のバイオマーカー間の発現の差は、試験薬剤のアレルゲン性および／または感作効果の指標である。したがって、工程（ａ）において提供される細胞は、ネガティブコントロールおよび試験結果の両方を提供し得る。
【００３２】
「工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現とは異なる」および「発現の差」とは、第１のサンプル（例えば、試験薬剤サンプル）における存在および／または量が、第２のサンプル（例えば、コントロール薬剤サンプル）の存在および／または量とは異なることを含む。
【００３３】
例えば、試験サンプルにおける存在および／または量は、統計的に有意な様式で１つ以上のネガティブコントロールサンプルの存在および／または量とは異なり得る。好ましくは、試験薬剤にさらされた細胞集団における１つ以上のバイオマーカーの発現は、
ネガティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現の８０％以下、例えば、ネガティブコントロールまたはネガティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現のわずか７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％であるか、あるいは
ネガティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現の少なくとも１２０％、例えば、ネガティブコントロールまたはネガティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現の少なくとも１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または少なくとも５００％である。
【００３４】
「工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現とは異なる」は、代替的にまたは追加的に、試験サンプルが、１つ以上のネガティブコントロールサンプルとして、異なる群に属するものとして分類されることを含む。例えば、ＳＶＭを使用する場合、試験サンプルは、１つ以上のネガティブコントロールサンプルとして決定値閾値の反対側にある（例えば、１つ以上の試験（またはその複製）が≦０のＳＶＭ決定値を有する場合に試験薬剤がタンパク質アレルゲンとして分類される場合、１つ以上のポジティブコントロールサンプル（またはそれらの大部分）がまた、≦０のＳＶＭ決定値を有するべきである）。
【００３５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、本発明の任意の態様による方法は、
ｆ）第１または第２の態様による樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において感作を誘発する、および／またはアレルゲン性である１つ以上のポジティブコントロール薬剤にさらすことと、
ｇ）工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｆ）の細胞内で測定することと、をさらに含み、
試験薬剤は、工程（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現が工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現に対応する事象において、感作剤および／またはアレルゲン性として同定される。
【００３６】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｆ）で提供された１つ以上のポジティブコントロール薬剤は、Ｄｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ７からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含むか、またはそれらからなる。
【００３７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上のポジティブコントロール薬剤は、ヘキサクロロ白金酸アンモニウム、過硫酸アンモニウム、エチレンジアミン、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、無水マレイン酸、メチレンジフェノールジイソシアネート、無水フタル酸、トルエンジイソシアネート、および無水トリメリット酸からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含み得るか、またはそれらからなり得る。
【００３８】
「工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現に対応する」とは、試験薬剤にさらされた細胞集団における１つ以上のバイオマーカーの発現が、１つ以上のポジティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現と同一であるか、または有意に異ならないことを意味する。好ましくは、試験薬剤にさらされた細胞集団における１つ以上のバイオマーカーの発現は、１つ以上のポジティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現の８１％〜１１９％、例えば、１つ以上のポジティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現の８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上、および１つ以上のポジティブコントロール薬剤にさらされた細胞集団の発現の１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、または１１９％以下である。
【００３９】
「工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現に対応する」は、代替的にまたは追加的に、試験サンプルが１つ以上のポジティブコントロールサンプルと同じ群に属するとして分類されることを含む。例えば、ＳＶＭを使用する場合、試験サンプルは、１つ以上のポジティブコントロールサンプルと同じ決定値閾値の側にある（例えば、１つ以上の試験（またはその複製）が＞０のＳＶＭ決定値を有する場合に試験薬剤がアレルゲン性として分類される場合、１つ以上のポジティブコントロールサンプル（またはそれらの大部分）がまた、＞０のＳＶＭ決定値を有するべきである）。
【００４０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、試験される薬剤のアレルゲン性および／または感作効力の指標である。例えば、この方法を使用して、ポジティブコントロールおよび／または１つ以上の追加の試験薬剤と比較した、試験薬剤の相対的アレルゲン性および／または感作効力を予測することができる。
【００４１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｈ）試験薬剤のアレルゲン性および／または感作効果を同定するさらなる工程を含む。
【００４２】
例えば、工程（ｈ）は、試験薬剤をアレルゲンもしくは非アレルゲンとして、かつ／または感作剤もしくは非感作剤として同定することができる。代替的にまたは追加的に、工程（ｈ）は、ポジティブコントロールおよび／または１つ以上の追加の試験薬剤と比較した、試験薬剤の相対的アレルゲン性またはアレルゲン効力および／または感作効果または感作効力を同定し得る。
【００４３】
同定は、当該技術分野で既知の任意の適切な統計学的方法または機械学習アルゴリズム、例えば、ランダムフォレスト（ＲＦ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、主成分分析（ＰＣＡ）、通常最小二乗法（ＯＬＳ）、部分的最小二乗回帰（ＰＬＳ）、直交部分的最小二乗回帰（Ｏ−ＰＬＳ）および他の多変量統計分析（例えば、後方段階的ロジスティック回帰モデル）を用いて行われてもよい。多変量統計分析の総説については、例えば、Ｓｃｈｅｒｖｉｓｈ，Ｍａｒｋ  Ｊ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８７）．“Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２（４）：３９６−４１３（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。好ましくは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）が使用されている。
【００４４】
典型的には、アレルゲン性または感作薬剤は、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（例えば、ｅ１０７１  １．５−２４）から入手可能なものなど、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して同定される。しかしながら、任意の他の好適な手段も使用され得る。ＳＶＭを使用して、本明細書で定義される１つ以上のバイオマーカーを含むか、またはそれらからなるバイオマーカーシグネチャーのＲＯＣ  ＡＵＣを決定することもできる。
【００４５】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰のために使用される関連した教師あり学習法のセットである。２つのカテゴリのうちの１つに属するものとして各々がマークされた訓練例のセットを所与として、ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、新しい例がどちらの分類に入るかを予測するモデルを構築する。直感的に、ＳＶＭモデルは、別々の分類の例が可能な限り広い明確なギャップによって分割されるようにマッピングされた、空間の点としての例の表現である。次いで、新しい例は、同じ空間にマッピングされ、例がギャップのどちらの側に入るかに基づき、分類に属すると予測される。
【００４６】
より形式的に、サポートベクターマシンは、分類、回帰、または他のタスクのために使用され得る、高次元または無限次元の空間中に超平面または超平面のセットを構築する。直感的に、良好な分離は、一般にマージンが大きいほど分類子の汎化誤差が小さくなるため、任意のクラスの最も近い訓練データポイントに対して最大の距離（いわゆる関数マージン）を有する超平面によって達成される。ＳＶＭに関するさらなる情報については、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ，１９９８，Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：１２１−１６７．を参照されたい。
【００４７】
本発明の一実施形態において、ＳＶＭは、既知の薬剤（すなわち、既知のアレルゲン性／感作剤または非アレルゲン性／非感作薬剤）のバイオマーカープロファイルを使用して本発明の方法を行う前に「訓練」される。そのような訓練サンプルを実行することによって、ＳＶＭは、何のバイオマーカープロファイルがアレルギーおよび／または感作を誘発することができる薬剤と関連するのかを学習することができる。いったん訓練プロセスが完了すると、次いで、ＳＶＭは、試験されたバイオマーカーサンプルがアレルゲン性または非アレルゲン性／感作または非感作剤からのものであるどうかを予測することができる。
【００４８】
個々のＳＶＭの決定値は、ケースバイケースで、当業者によって決定され得る。一実施形態において、試験薬剤は、１つ以上の試験（またはその複製）が＞０のＳＶＭ決定値を有する場合、アレルゲン性および／または感作剤として分類される。一実施形態において、試験薬剤は、１つ以上の試験（またはその複製）が≦０のＳＶＭ決定値を有する場合、非アレルゲン性および／または非感作剤として分類される。これにより、試験薬をアレルゲン性または非アレルゲン性／感作または非感作として分類することができる。
【００４９】
しかしながら、この訓練手順は、ＳＶＭに必要な訓練パラメータを予めプログラミングすることによって回避され得る。例えば、アレルゲン性および／または感作薬剤は、表Ａ〜Ｅのうちの１つ以上に列挙された全てのバイオマーカーの測定に基づいて、ＷＯ２０１２／０５６２３６、ＷＯ２０１３／１６０８８２、またはＷＯ２０１６／０８３６０４に記載されているＳＶＭアルゴリズムを使用して、既知のＳＶＭパラメーターにより同定され得る。
【００５０】
好適なＳＶＭパラメータが、適切なデータの選択（すなわち、既知のアレルゲン性および／もしくは非アレルゲン性薬剤または感作および／もしくは非感作薬剤にさらされた細胞からのバイオマーカー測定）を使用してＳＶＭマシンを訓練することによって、表Ａ〜Ｅに列挙されたバイオマーカーの任意の組み合わせについて決定され得ることは、当業者によって理解されるであろう。代替的に、表Ａ〜Ｅのバイオマーカーを使用して、当該技術分野で既知の任意の他の好適な統計的方法により、アレルゲン性タンパク質および／または感作薬剤を同定することができる。
【００５１】
代替的に、表Ａ〜Ｅのデータを使用して、当該技術分野で既知の任意の他の好適な統計的方法（例えば、ＡＮＯＶＡ、ＡＮＣＯＶＡ、ＭＡＮＯＶＡ、ＭＡＮＣＯＶＡ、多変量回帰分析、主成分分析（ＰＣＡ）、因子分析、正準相関分析、正準相関分析、冗長性分析対応分析（ＣＡ、相反平均）、多次元スケーリング、判別分析、線形判別分析（ＬＤＡ）、クラスタリングシステム、再帰的分割、および人工ニューラルネットワーク）により、アレルギーおよび／または感作を誘発することができる薬剤を同定することができる。
【００５２】
好ましくは、本発明の方法は、インビトロで行われる。
【００５３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、本発明の方法の工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）は、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥに列挙された２つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ、Ｂ，Ｃ，Ｄ、またはＥに列挙されたバイオマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、または３９１個の発現を測定することを含むか、またはそれからなる。例えば、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、および／または（ｇ）は、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥに列挙されたバイオマーカーのうちの全ての発現を測定することを含み得るか、またはそれらからなり得る。
【００５４】
「発現」とは、バイオマーカーの存在、レベルおよび／または量を意味する。
【００５５】
「バイオマーカー」は、任意の生体分子またはその構成要素もしくはフラグメントであって、それらの測定によって、感作効果および／または試験薬剤のアレルゲン性を決定するのに有用な情報を与えることができる、任意の生体分子またはその構成要素もしくはフラグメントを含む。したがって、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの文脈において、バイオマーカーは、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡなどの核酸分子であってもよい。または、バイオマーカーは、核酸分子または炭水化物部分によってコードされるタンパク質、またはその抗原成分またはフラグメントであってもよい。
【００５６】
第７の態様の方法のさらなる実施形態または代替の実施形態において、試験薬剤は、皮膚の感作を誘発することができることが既に知られているか、またはその可能性がある。例えば、試験薬剤は、当該技術分野で既に知られている方法、例えば、ＷＯ２０１２／０５６２３６および／またはｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用することによって、皮膚の感作を誘発することができることが既に知られている場合がある。代替の実施形態またはさらなる実施形態において、当該方法は、試験薬剤の皮膚感作効力および皮膚感作剤／非感作剤の状態を同定するためのものである（すなわち、試験物質が感作剤であるか否かを同定し、皮膚感作剤としてのその効力を同定する）。代替の実施形態またはさらなる実施形態において、当該方法は、ＷＯ  ２０１２／０５６２３６および／またはＪｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈらに記載の方法を用いて試験薬剤が感作剤であるかどうかを同定することを含む。
【００５７】
「皮膚感作効力」とは、薬剤の皮膚感作効力の強さを含み、または意味する。例えば、薬剤の感作能力の相対的な効力または強さから、最も効力が高いものから最も効力の低いものまでの試験薬剤群、またはその逆の試験薬剤群の順序を導き、および／または１つ以上の既知の規制またはシステムに従った分類を導く。「感作状態」とは、化学物質（または化学物質の混合物）が感作剤（例えば、皮膚感作剤および／または呼吸器感作剤）であるか否かを含むか、または意味する。
【００５８】
「皮膚感作」とは、哺乳動物においてＩＶ型の遅延型過敏反応を誘発し、引き起こすことができる任意の薬剤を意味する。好ましくは、ＩＶ型の遅延型過敏反応は、ＤＣ媒介性である。
【００５９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法によって決定された皮膚感作効力は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ（ＣＬＰ）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）１２７２／２００８（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｈａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｃｌｐ−２０１５）に従って分類される。このシステムは、国連のＧｌｏｂａｌｌｙ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＨＳ）に基づいており、これは、２０１５年の６月から、物質および混合物の両方の分類およびラベリングに適用する唯一の規制である。これらを市場に出す前に、製品を適切に分類し、ラベリングし、包装する企業が必要である。１Ａ（強）、１Ｂ（弱）、またはカテゴリーなし（非感作剤）のカテゴリーを与える。
【００６０】
例えば、この方法は、
（ｉ）効力カテゴリー１Ａのうちの１つ以上の薬剤、
（ｉｉ）効力カテゴリー１Ｂのうちの１つ以上の薬剤、および／または
（ｉｉｉ）効力カテゴリーのカテゴリーがないもののうちの１つ以上の薬剤、を提供し得る。
【００６１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法によって決定された皮膚感作効力は、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，‘Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ，’Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，２５（１）：１１−２１，ｉ．ｅ．ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  １（ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ），２，３，４，５，ｏｒ  ６  （ｔｒｕｅ  ｎｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）（例えば、表４、図４）に記載されているシステムにより分類される。
【００６２】
例えば、この方法は、
（ｉ）効力カテゴリー１のうちの１つ以上の薬剤、
（ｉ）効力カテゴリー２のうちの１つ以上の薬剤、
（ｉｉｉ）効力カテゴリー３のうちの１つ以上の薬剤、
（ｉｖ）効力カテゴリー４のうちの１つ以上の薬剤、
（ｖ）効力カテゴリー５のうちの１つ以上の薬剤、および／または
（ｖｉ）効力カテゴリー６のうちの１つ以上の薬剤、を提供してもよい（例えば、本明細書の表８および／またはＢａｓｋｅｔｔｅｒら、２０１４（前出）を参照）。
【００６３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、皮膚感作効力は、局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）分類、モルモット最大化試験（ＧＰＭＴ）または無有害作用量（ＮＯＥＬ）に従って分類される。
【００６４】
ＬＬＮＡの詳細な説明については、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｃｏｎｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００２．４０（５）：ｐ．５９３−８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。モルモット最大化試験の詳細な説明については、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｂ．ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９６９．５２（３）：ｐ．２６８−７６（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。皮膚感作効力に関連する無有害作用量（ＮＯＥＬ）試験の詳細な説明については、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，‘Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ’Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，５２（１）：３９−４３、およびＧｒｉｅｍ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，‘Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｄａｔａ．’Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３８：２６９−２９０（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＮＯＥＬレベルと効力レベルとの間の相関については、ＷＨＯ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃａｔａｌｏｇｕｉｎｇ−ｉｎ−Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ．Ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．（ＩＰＣＳ  ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ：ｎｏ．５），ＩＳＢＮ  ９７８  ９２  ４  １５６３６０  ４（特に、２６〜２８ページの表１）（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。ＣＬＰの詳細な説明については本明細書に参考として組み込まれる（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｈａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｃｌｐ−２０１５）を参照のこと。
【００６５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現は、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす前および後に、工程（ａ）で提供される細胞において測定され、試験薬剤にさらす前とさらした後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差が、工程（ｂ）の皮膚感作剤の効力の指標である。
【００６６】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現は、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす前および後に、工程（ａ）で提供される細胞において測定され、工程（ｃ）の前と後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差が、工程（ｂ）の皮膚感作剤の効力の指標である。
【００６７】
「発現の差」は、第１のサンプル（例えば、試験薬剤サンプル）における存在および／または量が、第２のサンプル（例えば、コントロール薬剤サンプル）の存在および／または量と異なることを含む。好ましくは、存在および／または量は、比較サンプルの４０％以下、例えば、３９％以下、３８％以下、３７％以下、３６％以下、３５％以下、３４％以下、３３％以下、３２％以下、３１％以下、３０％以下、２９％以下、２８％以下、２７％以下、２６％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下または０％である。
【００６８】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、試験薬剤にさらさられる前と後に工程（ａ）で提供される細胞において測定され、試験薬剤にさらさられる前と後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差は、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。したがって、工程（ａ）において提供される細胞は、ネガティブコントロールおよび試験結果の両方を提供し得る。
【００６９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、試験薬剤にさらさられる前と後に工程（ａ）で提供される細胞において測定され、工程（ｃ）の前と後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差は、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。したがって、工程（ａ）において提供される細胞は、ネガティブコントロールおよび試験結果の両方を提供し得る。
【００７０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｉ）第１または第２の態様による樹状様細胞のさらなる集団を提供する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）で提供された細胞を、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす工程と、
（ｋ）工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現を工程（ｊ）の細胞内で測定する工程と、を含み、
工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーと工程（ｋ）で測定された１つ以上のバイオマーカーとの間の発現における相似は、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
【００７１】
「発現における相似」とは、第１のサンプル（例えば、試験薬剤サンプル）における存在および／または量が、第２のサンプル（例えばコントロールサンプル）における存在および／または量と類似しているか、または同一であることを含む。好ましくは、存在および／または量は、コントロールサンプルの少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％である。
【００７２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｌ）試験薬剤の皮膚感作効力を同定する工程を含む。
【００７３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、所定の効力を有する皮膚感作剤は、１−ブタノール、４−アミノ安息香酸、ベンズアルデヒド、クロロベンゼン、フタル酸ジエチル、ジメチルホルムアミド、エチルバニリン、グリセロール、イソプロパノール、乳酸、サリチル酸メチル、オクタン酸、プロピレングリコール、フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、過マンガン酸カリウム、サリチル酸、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０、硫酸亜鉛、２，４−ジニトロクロロベンゼン、オキサゾロン、二クロム酸カリウム、Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（ＭＣ／ＭＣＩ）、ホルムアルデヒド、２−アミノフェノール、２−ニトロ−１，４−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ヘキシルシンナムアルデヒド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−メルカプトベンゾチアゾール、グリオキサール、シンナムアルデヒド、イソオイゲノール、エチレンジアミン、レゾルシノール、シンナミルアルコール、オイゲノール、ペニシリンＧ、ゲラニオール、およびＤＭＳＯからなる群から選択される薬剤を含むか、またはそれらの薬剤からなる。
【００７４】
本発明の任意の態様の方法の好ましい実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）は、バイオマーカーのうちの１つ以上の核酸分子の発現を測定することを含むか、またはそれからなる。核酸分子は、ＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子であってもよい。好ましくは、核酸分子は、ｍＲＮＡ分子である。しかし、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子であってもよい。
【００７５】
一実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）のバイオマーカーのうちの１つ以上の発現の測定は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、およびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して行われる。好ましくは、１つ以上のバイオマーカーの発現は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定される。
【００７６】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）で測定された１つ以上のバイオマーカーは、アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ）を使用して測定される。さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）で測定された１つ以上のバイオマーカーは、全ゲノムアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴアレイ）を使用して測定される。さらなる実施形態または代替の実施形態において、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムが使用される（例えば、全ゲノムアレイからの選択に基づくカスタムＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒコードセット（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴアレイ）。
【００７７】
この方法は、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのうちの１つ以上で同定されたバイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子に選択的にそれぞれ結合することができる１つ以上の結合部分を使用して、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）における１つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含み得る。好ましくは、この方法は、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのうちの１つ以上で同定されたバイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子にそれぞれ選択的に結合することができる２つ以上の結合部分を使用して、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）における２つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含む。例えば、上記に記載のバイオマーカーの任意の特定の組み合わせの発現は、これらのバイオマーカーのうちのそれぞれに選択的に結合することができる結合部分の同等の組み合わせを使用して測定することができる。
【００７８】
一実施形態において、１つ以上の結合部分はそれぞれ、核酸分子を含むか、または核酸分子からなる。さらなる実施形態において、１つ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＰＭＯを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、１つ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡを含むか、またはＤＮＡからなる。一実施形態において、１つ以上の結合部分は、５〜１００ヌクレオチド長である。しかし、代替の実施形態において、１つ以上の結合部分は、１５〜３５ヌクレオチド長である。
【００７９】
１つ以上の結合部分は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来の１つ以上のプローブを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。プローブ識別番号は、本明細書の表Ａ〜Ｅに提供されている。
【００８０】
適切な結合剤（結合分子または結合部分とも呼ばれる）は、後述するように、所与の核酸、タンパク質またはアミノ酸モチーフに結合する能力に基づいて、ライブラリーから選択されてもよく、またはスクリーニングされてもよい。
【００８１】
好ましい実施形態において、結合部分は、検出可能な部分を含む。
【００８２】
「検出可能な部分」とは、その存在および／または相対的な量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）を直接的または間接的に決定することが可能な部分を含む。
【００８３】
適切な検出可能な部分は、当該技術分野において周知である。
【００８４】
例えば、検出可能な部分は、特定の条件にさらされたときに検出され得る蛍光部分および／または発光部分および／または化学発光部分であってもよい。このような蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために特定の波長および強度で放射線（すなわち、光）にさらされる必要があり、それによって、検出可能な特定の波長で検出可能な蛍光を発することができる。
【００８５】
または、検出可能な部分は、基質（好ましくは検出不可能なもの）を、可視化および／または検出することができる検出可能な生成物に変換することができる酵素であってもよい。適切な酵素の例は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに関連して以下により詳細に議論される。
【００８６】
検出可能な部分は、放射性部分であり得、放射性原子を含むか、またはこれからなる。放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびイットリウム−９０からなる群から選択され得る。
【００８７】
したがって、検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分；放射性部分（例えば、放射性原子）；または酵素部分からなる群から選択されてもよい。
【００８８】
明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載の試験サンプル中および／またはコントロールサンプル中の１つ以上のバイオマーカー、および／または選択されたタンパク質を検出する際に使用するための抗体分子）は、検出可能な部分を容易に検出可能にするために、十分な適切な同位体原子を含んでいなければならない。
【００８９】
代替の好ましい実施形態において、結合部分の検出可能な部分は、蛍光部分である。
【００９０】
放射性標識または他の標識は、本発明の方法のサンプルおよび／または本発明の結合部分に既知の方法で存在するバイオマーカーに組み込まれてもよい。例えば、結合剤がポリペプチドである場合、結合剤は、生合成されてもよく、または、例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いた化学的なアミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、および１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、結合部分のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０，４９−５７）を使用して、１２３  Ｉを組み込むことができる。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｊ−Ｆ  Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。他の検出可能な部分（例えば、酵素、蛍光、発光、化学発光または放射性部分）をタンパク質に接合させる方法は、当該技術分野で周知である。
【００９１】
試験されるサンプル中のバイオマーカーは、上述のタンパク質の存在、量および／または位置の決定を間接的に補助する部分で標識されてもよいことは、当業者には理解されるであろう。したがって、この部分は、多成分検出可能な部分の１つの成分を構成していてもよい。例えば、試験されるサンプル中のバイオマーカーは、ビオチンで標識されていてもよく、これにより、検出可能な標識に融合または他の方法で結合されたストレプトアビジンを用いたその後の検出を可能にする。
【００９２】
本発明の第１の態様で提供されている方法は、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）において、表Ａ〜Ｅのうちの１つ以上で定義される１つ以上のバイオマーカーのタンパク質の発現を決定することを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。この方法は、表Ａ〜Ｅのうちの１つ以上で同定されたバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を使用して、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）における１つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含み得る。１つ以上の結合部分は、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、モノクローナル抗体またはそのフラグメント）を含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。
【００９３】
「抗体」との用語は、任意の合成抗体、組換え抗体または抗体ハイブリッドを含み、例えば、限定されないが、免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖の可変領域および／または定常領域のファージディスプレイによって作られる単鎖抗体分子、または当業者に既知のイムノアッセイ形式で抗原に結合することができる他の免疫相互作用分子を含む。アフィボディーやアプタマーなどの抗体様結合剤の使用も含まれる。
【００９４】
１つ以上のタンパク質結合部分は、検出可能な部分を含んでいてもよい。検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分および酵素部分からなる群から選択されてもよい。
【００９５】
本発明の方法のさらなる実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）は、１つ以上のタンパク質に結合することができる第２の結合剤を含むアッセイを使用して行われてもよく、第２の結合剤も、検出可能な部分を含んでいる。好適な第２の結合剤は、第１の結合剤に関連して上に詳細に記載されている。
【００９６】
したがって、試験されるサンプル中の目的のタンパク質は、まず、第１の結合剤を用いて単離および／または固定化された後、第２の結合剤を用い、バイオマーカーの存在および／または相対量を決定することができる。
【００９７】
一実施形態において、第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、典型的には、組換え抗体またはそのフラグメントである。簡便には、抗体またはそのフラグメントは、ｓｃＦｖ；Ｆａｂ；免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される。または、第２の結合剤は、抗体様結合剤（例えば、アフィボディーまたはアプタマー）であってもよい。
【００９８】
代替的に、試験されるサンプル中のタンパク質上の検出可能な部分が、特定の結合対（例えば、ビオチン）のメンバーを含むか、またはこのメンバーからなる場合、第２の結合剤は、特定の結合対（例えば、ストレプトアビジン）の相補的なメンバーを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。
【００９９】
検出アッセイが使用される場合、検出可能な部分は、蛍光部分；発光部分；化学発光部分；放射性部分；酵素部分からなる群から選択される。本発明の方法における使用に適切な検出可能な部分の例は、上に記載されている。
【０１００】
血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫ラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む）が挙げられる。例示的なサンドイッチアッセイは、参照により本明細に組み込まれる、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号に記載されている。スライド上での細胞の抗体染色は、当業者によく知られているように、細胞研究室の診断試験で周知の方法で使用することができる。
【０１０１】
したがって、一実施形態において、アッセイは、典型的には、通常は固相アッセイにおいて有色反応生成物を与える酵素の使用を含むＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が広く使用されている。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ＮＡＤＰを基質として使用し、第２の酵素系の補酵素として作用するＮＡＤを生成することである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のピロホスファターゼは、酵素が組織中に存在せず、安定であり、良好な反応色をもたらすため、良好な共役を提供する。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光システムも使用することができる。
【０１０２】
ビタミンであるビオチンとのコンジュゲート化は、酵素によって結合したアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出することができ、大きな特異性およびアフィニティで結合するので、頻繁に使用される。
【０１０３】
別の実施形態において、タンパク質検出に使用されるアッセイは、簡便には、蛍光定量アッセイである。したがって、第２の結合剤の検出可能な部分は、Ａｌｅｘａフルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ−６４７）などの蛍光部分であってもよい。
【０１０４】
好ましくは、この方法の工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）は、アレイを使用して行われる。アレイは、ビーズ系アレイまたは表面系アレイであってもよい。アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択されてもよい。
【０１０５】
アレイそれ自体は、当該技術分野において周知である。典型的には、アレイは、固体支持体の表面上に形成された、各々が有限範囲を有する離間した（すなわち、分離した）領域（「スポット」）を有する線形または二次元構造から形成される。アレイは、ビーズ構造であってもよく、各ビーズは、分子コードまたはカラーコードによって同定され得るか、または連続フローで同定され得る。分析は、サンプルが溶液からその分子群をそれぞれ吸着する一連のスポットの上を通過する場合に、順次実行することもできる。固体支持体は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、特にプラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマーピン、もしくは複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチド、および他の適切な分子を固定化し、かつ／もしくはイムノアッセイを実施するのに好適な任意の他の表面の形態であってもよい。結合プロセスは当該技術分野において周知であり、一般にタンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを固体支持体に共有結合または物理吸着によって架橋することからなる。代替的に、アフィニティタグまたは類似の構築物を介したプローブのアフィニティカップリングを使用してもよい。接触印刷または非接触印刷、マスキングまたはフォトリソグラフィのような周知の技術を使用することによって、各スポットの位置を定義することができる。概説については、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２，１３−２９）、およびＬａｌ  ｅｔ  ａｌ  （２００２，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １５；７（１８  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３−９）を参照されたい。
【０１０６】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」とは、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の離間した領域の密度を有する領域のアレイの意味を含む。マイクロアレイ内の領域は、約１０〜２５０μｍの範囲の典型的な寸法、例えば直径を有し、アレイ内の他の領域からほぼ同じ距離だけ離れている。代替的に、アレイは、マクロアレイまたはナノアレイであってもよい。
【０１０７】
適切な結合分子（上述）が同定され、単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を用いてアレイを製造することができる。
【０１０８】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）で測定された１つ以上のバイオマーカーは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡなど）である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、および／または（ｋ）で測定された１つ以上のバイオマーカーは、タンパク質またはポリペプチドである。
【０１０９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはインシリコで行われる。好ましくは、この方法は、インビトロで行われる。
【０１１０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、
（ｉ）第１または第２の態様による樹状様細胞を培養する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の細胞を、好ましくは定常状態の成長期にある１つ以上のウェル、例えば１つ以上のマルチウェルアッセイプレートのウェルに播種する工程と、
（ｉｉｉ）試験される薬剤を（ｉｉ）の１つ以上のウェルに加える工程と、
（ｉｖ）ポジティブコントロールを（ｉｉ）の１つ以上の別個のウェルに加える工程と、
（ｖ）ネガティブコントロールを、（ｉｉ）の１つ以上の別個のウェルに加え、かつ／または（ｉｉ）の１つ以上の別個のウェルを培地コントロールを得るために刺激されない状態にしておく工程と、
（ｖｉ）（ｉｉｉ）〜（ｖ）のウェルにおいて、好ましくは約２４時間、細胞をインキュベートし、場合により、（ｉｉｉ）〜（ｖ）のウェルから細胞を採取し、さらに場合により、上清を除去し、ＴＲＩｚｏｌ試薬で保存する工程と、
（ｖｉｉ）（ｖｉ）の細胞から精製された全ＲＮＡを単離し、場合により、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程と、
（ｖｉｉｉ）例えば、Ａｖｉｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイなどのアレイを使用して、（ｖｉｉ）からの個々のｍＲＮＡ転写の発現レベルを定量化する工程と、
（ｉｘ）例えば、適切なアルゴリズムを使用して、（ｖｉｉｉ）からのデータをエクスポートおよび正規化する工程と、
（ｘ）表Ａ〜Ｅ）のうちの１つ以上のバイオマーカーに由来する（ｉｘ）からのデータを分離する工程と、
（ｘｉ）予測モデルを、（ｘ）のデータ、例えば、以前に構築され、履歴データ上で訓練された凍結ＳＶＭモデルに適用して、試験された薬剤およびネガティブ／ポジティブコントロールのアレルゲン性または感作剤の状態を予測する（例えば、アレルゲン／非アレルゲンおよび／または感作剤／非感作剤として分類）工程と、のうちの１つ以上の工程を含む。
【０１１１】
「試験タンパク質」は、アレルゲン性または感作の状態を決定するべき任意のタンパク質またはタンパク質性物質（またはタンパク質またはタンパク質性物質の混合物）を含む。
【０１１２】
「アレルゲン性」は、哺乳動物においてアレルゲンである、および／またはアレルゲン性反応を誘発することができる、タンパク質（またはタンパク質の混合物）を含むか、または意味する。
【０１１３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、アレルゲン性は、過敏反応（例えば、細胞媒介性過敏反応）を含む。さらなる実施形態または代替の実施形態において、過敏反応は、ＩＶ型の過敏反応である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、過敏反応は、呼吸器アレルギーである。
【０１１４】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、第８の態様の方法は、哺乳動物におけるタンパク質の感作状態を同定するためのものである。例えば、工程（ｂ）または（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現は、試験タンパク質の感作状態の指標であり得る。「感作状態」とは、試験タンパク質（または試験タンパク質の混合物）が感作剤（例えば、皮膚感作剤および／または呼吸器感作剤）であるか否か、を含むか、または意味する。さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、哺乳動物において呼吸器感作を誘発することができるタンパク質を同定するためのものである。例えば、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現は、試験タンパク質の呼吸器感作効果の指標であり得る。一実施形態において、この方法は、呼吸器過敏反応を誘発することができるタンパク質を同定するためのものである。好ましくは、過敏反応は、体液性過敏反応、例えば、Ｉ型の過敏反応である。一実施形態において、この方法は、呼吸器アレルギーを誘発することができる薬剤を同定するためのものである。
【０１１５】
「試験タンパク質の呼吸器感作効果を示す」は、試験タンパク質が呼吸器感作剤であるか否かを決定することと、および／または試験タンパク質の呼吸器感作剤としての効力を決定することと、を含む。「呼吸器感作を誘発することができる」タンパク質は、哺乳動物の気道におけるＩ型の即時型過敏反応を誘発し、引き起こすことができる任意のタンパク質を意味する。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。好ましくは、Ｉ型の即時型過敏反応は、ＤＣ媒介性であり、かつ／またはＴ細胞のＴｈ２細胞への分化を伴う。好ましくは、Ｉ型の即時型過敏反応は、体液性免疫および／または呼吸器アレルギーを引き起こす。
【０１１６】
哺乳動物の肺の伝導帯には、気管、気管支、細気管支、および終末細気管支が含まれる。呼吸帯には、呼吸細気管支、肺胞管、および肺胞が含まれる。伝導帯は、気道で構成され、血液とのガス交換がなく、気道を開いた状態に保つために軟骨で補強されている。伝導帯は、吸入した空気を加湿し、３７℃（９９°Ｆ）に温める。また、全ての通路の壁に位置する繊毛を介して粒子を除去することによって、空気を浄化する。呼吸帯は、血液とのガス交換の部位である。
【０１１７】
一実施形態において、「呼吸器感作を誘発することができる」タンパク質は、哺乳動物における肺上皮の部位でＩ型の即時型過敏反応を誘発し、引き起こすことができるタンパク質である。好ましくは、肺上皮の部位は、肺の呼吸帯内にあるが、代替的にまたは追加的に、肺の伝導帯内にあってもよい。
【０１１８】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、哺乳動物においてアレルゲン性である食物タンパク質を同定するためのものである。例えば、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現は、食物タンパク質のアレルゲン性の指標であり得る。好ましくは、食物タンパク質のアレルゲン性は、１型の過敏反応が原因である。
【０１１９】
哺乳動物は、家畜または農場動物であってもよい。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１２０】
本発明のさらなる態様において、試験薬剤の感作効果および／またはアレルゲン性を決定するための、第１または第２の態様による樹状様細胞の集団の使用を提供する。
【０１２１】
本発明のさらなる態様において、分析キットであって、
ｉ．１つ以上の結合部分を含むアレイと、
ｉｉ．第１または第２の態様で定義される１つ以上の細胞または細胞培養物と、
ｉｉｉ．（場合により）１つ以上のコントロール薬剤と、
ｉｖ．（場合により）使用説明書と、を含む、分析キットを提供する。
【０１２２】
本発明のさらなる態様において、本発明の方法において使用するための分析キットであって、
ｉ．本明細書で定義される１つ以上の結合部分を含むアレイと、
ｉｉ．第１または第２の態様で定義される１つ以上の細胞または細胞培養物と、
ｉｉｉ．（場合により）１つ以上のコントロール薬剤と、
ｉｖ．（場合により）本発明の方法を行うための説明書と、を含む、分析キットを提供する。
【０１２３】
当業者であれば、矛盾しない全ての実施形態を組み合わせて使用することができることを理解するであろう。したがって、本発明の一態様の実施形態は、本発明の別の態様にも等しく適用され得る。
【０１２４】
本明細書における明らかに以前に公開された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先行技術の一部であるか、または共通の一般的な知識であると認識されるべきではない。
【０１２５】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】異なる表面マーカーについての発現レベルを階層的クラスタリングで使用して、細胞株を比較した。ラベルの数字は、実験を表す。クラスタリングは、細胞を２つの別個のクラスターにグループ化する。
【図２】ＳｅｎｚａＣｅｌｌ、固有の変異による高いまたは中程度の影響で影響を受けると予測される遺伝子に関連した生物学的プロセスの分布。
【図３】ＭＵＴＺ−３、同定された変異による高いまたは中程度の影響で影響を受けると予測される遺伝子に関連した生物学的プロセスの分布。
【図４】Ａ）ＲＮＡ配列データの階層的クラスタリングは、実験３で得られたサンプルについての別個のクラスターを示す。実験１および２からの細胞は、細胞株について別個のクラスターを形成する。Ｂ）サンプルのＰＣＡプロットは、変異の最大の原因が細胞株間の違いによって説明され得ることを示す。また、実験３で準備したサンプルが残りのサンプルから逸脱することも明らかである。
【図５】円グラフは、発見された差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）がＰＡＮＴＨＥＲを使用してマッピングされた分子機能の分布を表す。
【図６】試験化学物質ＤＮＣＢおよび２−ヒドロキシエチルアクリレートで刺激された後、ＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌから得られた発現値を使用した場合のＳＶＭ皮膚感作剤の予測。全ての予測は、真のクラスに正しく対応している。
【０１２７】
実施例１
背景技術
アレルゲン性接触皮膚炎（ＡＣＤ）は、人口のかなりの割合が罹患する炎症性皮膚疾患である。これは、皮膚感作剤に繰り返しさらされることによって引き起こされ、湿疹などの症状をもたらす。ＡＣＤの感作期には、アレルゲン特異的エフェクターおよびメモリーＴ細胞の生成につながる免疫反応を活性化する皮膚感作剤が必要である（１）。感作についての既知の機構は、よく記載されている（１〜４）。要するに、皮膚感作剤は、生存可能な真皮へのアクセスを獲得し、そこでタンパク質と反応してハプテン−タンパク質複合体を形成する。これらのハプテン−タンパク質複合体は、炎症シグナルを発する様々な免疫細胞または構造細胞によって認識され得る。活性化された樹状細胞は、ハプテン−タンパク質複合体を処理し、リンパ節に移動して、ＭＨＣ分子上のナイーブＴ細胞に提示する。続いて、同じ感作剤に新たにさらした際に、炎症機能を誘発し、ＡＣＤの症状を引き起こす、エフェクターおよびメモリーＴ細胞が生成される（３）。皮膚接触時にアレルゲン性反応を誘発する化学物質の能力を評価するための従来の方法は、主に動物モデルを使用して実施されてきた（１）。法律および動向は、化学感作剤の評価のためのより良い、より倫理的なインビトロ方法を考え出すために研究を推進している（５〜７）。
【０１２８】
ゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）は、化学感作剤の評価のために、ルンド大学免疫工学科で開発されたインビトロアッセイである。樹状様細胞株からの転写プロファイルを使用して（８）、化学物質の感作可能性を予測する（９）。転写プロファイルは、感作剤を非感作剤から区別する上で最大の予測性能を有すると同定された遺伝子から構成されている。遺伝子は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイに由来する転写データの統計データマイニング法を使用して同定された。これらの同定のために、細胞株に特異的なシグネチャーを作成することができるＧＡＲＤ予測シグネチャー（ＧＰＳ）における遺伝子の先験的情報は使用しなかった（１０）。
【０１２９】
本発明者らは、これより、ＧＡＲＤアッセイでの使用に好適な天然に存在しない樹状様骨髄性白血病細胞株「ＳｅｎｚａＣｅｌｌ」（ＡＴＣＣで２０１７年３月９日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２３８７５）を提供する。ＳｅｎｚａＣｅｌｌは、ＧＡＲＤ法でも使用され得るＭＵＴＺ−３樹状様細胞株と比較されている。比較には、バイオマーカーのパネルの発現を比較する表現型分析、細胞株の転写レベルを比較する転写分析、それらのＤＮＡ配列の比較、ならびに表現型および転写プロファイルにおける多くの定量化可能な差異を明らかにする機能分析が含まれた。
【０１３０】
材料および方法
細胞維持
ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ；ＤＳＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ  ２９５））およびＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞を、２０％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）および４０ｎｇ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、最小必須培地アルファ（α−ＭＥＭ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で培養した。この報告全体を通して、培地は完全な培地と呼ばれる。細胞を、２００，０００細胞／ｍｌの濃度に維持し、培地を３〜４日ごとに更新した。細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で維持した。
【０１３１】
表現型の特徴づけ
成長する細胞を、採取し、計数し、完全培地で２００，０００細胞／ｍｌの濃度で播種した。染色用の細胞を準備するために、１ｍｌの細胞懸濁液を、ＦＡＣＳチューブに移した。細胞を、１％のＢＳＡ（Ｓａｖｅｅｎ  ＆  Ｗｅｒｎｅｒ，Ｌｉｍｈａｍｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）（ｗ／Ｖ）を含むＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である洗浄バッファー中で２回洗浄した。全ての洗浄工程を、１ｍｌの洗浄バッファーを加え、１２００ｒｐｍで４℃で遠心分離し、上清を除去することによって行った。２回目の洗浄後、細胞を、５０μｌの洗浄バッファーに再懸濁した。抗体、アイソタイプＰＥ／ＦＩＴＣ、ＣＤ４０  ＦＩＴＣ、ＣＤ５４  ＰＥ、ＣＤ８６  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＤ１ａ  ＦＩＴＣ、ＣＤ５  ＦＩＴＣ、ＣＤ１４  ＰＥ、ＣＤ１９  ＰＥ（ＤＡＫＯ）、ＣＤ１３  ＰＥ、ＣＤ１２３  ＰＥ、ＯＸ４０Ｌ  ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＤ１１ｂ  ＰＥ、ＣＤ３４  ＦＩＴＣ、ＣＤ３２  ＦＩＴＣ、ＣＤ８０  ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ  ＦＩＴＣ、ＣＤ１３７  ＰＥ、ＣＤ１６  ＰＥ、ＣＤ６４  ＰＥ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＢＤＣＡ−３  ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ２０９  ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＢＤＣＡ−１  ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＯＸ４０  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ＣＤ１５  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙ）、ＴＬＲ２  ＰＥ、ＴＬＲ４  ＰＥ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を再懸濁した細胞に加え、暗所で４℃で１５分間インキュベートした。染色後、細胞を、もう一度洗浄バッファーで洗浄し、次いで、２００μｌの洗浄バッファー中に再懸濁させた。フローサイトメトリーで分析するまで、細胞を４℃に保った。フローサイトメトリーは、データ取得プログラムとしてＢＤ  ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を搭載したＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で行われ、各サンプルに対して１０，０００個の事象が記録された。ＦＡＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖ３（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、データを分析した。アイソタイプコントロールおよび非染色細胞を使用して、適切なゲートを設定した。測定は、それぞれに技術的な重複がある３回の別個の実験で行われ、各マーカーおよび細胞株に対して６回の測定を行った。
【０１３２】
発現レベルを、ｔ試験を使用して比較し、生成されたｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で補正して、誤発見率を制御した。クラスタリングアルゴリズムを行って、細胞株を比較した。クラスタリングは、Ｒ（１５）を使用して行われた。ブートストラップアルゴリズムを行って、ｆｐｃ（１６）パッケージを使用して、発見されたクラスターの安定性を評価した。ブートストラップアルゴリズムを５０００回繰り返し実行し、計算された平均Ｊａｃｃａｒｄ係数をクラスターの安定性の指標として使用した。
【０１３３】
ＤＮＡ  −全ゲノム配列
ＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌの両方の細胞からのＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡ  ＴＭ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）を使用して単離した。単離は、以下のように行った；５×１０＾６個の細胞を採取し、遠心分離して、上清を除去した。残りの細胞ペレットを、Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡＴＭゲノム溶解バッファー中に溶解し、１０分間インキュベートした。溶解した細胞を、付属のスピンカラムに装填し、洗浄した。ＤＮＡを、ＲＮＡｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水に溶出した。ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して、ＤＮＡ濃度およびＤＮＡ純度を決定し、ゲル電気泳動によって品質を評価した。ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂｓ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって、ＤＮＡの全ゲノム配列決定を行った。ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂｓのサービスには、ライブラリーの準備、配列決定、およびベストプラクティスの基本分析が含まれた。３５０ｂｐのイルミナのＴｒｕＳｅｑ  ＰＣＲを含まないＤＮＡライブラリーを調製し、３０ＸカバレッジでＰＥ  ２ｘ１５０  ｂｐのイルミナのＨｉＳｅｑ  Ｘ  ｖ２．５で配列決定を行った。
【０１３４】
ベストプラクティスの基本分析には、ｂｗａ  −ｍｅｍを使用した、ヒトのアセンブリビルド３７への読み込みのマッピングが含まれた。続いて、ベストプラクティス分析のためのゲノム分析ツールキット（ＧＡＴＫ）ワークフロー（１７、１８）を、変異の呼び出しのために行い、ゲノムの変異コール形式（ｇＶＣＦ）ファイルは、ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂｓから送達された。得られたｇＶＣＦファイルは、ＧＡＴＫ遺伝子型ＧＶＣＦＳを使用してマージされ、遺伝子型が同定された。ＧＡＴＫワークフローで推奨されているように、ＧＡＴＫ変異品質スコアの再校正（ＶＱＳＲ）を使用して、変異をさらに処理した。ＶＱＳＲは、新しい変異品質スコアを計算し、機械学習を使用して誤ポジティブ発見と予測される変異をフィルタリングする。再校正された変異コールフォーマット（ＶＣＦ）ファイルに注釈が付けられ、ｓｎｐＥｆｆ（１９）を使用して、ヒューマンアセンブリビルドＧＲＣｈ３７．７５への変異効果を予測した。細胞株のいずれかに固有の変異を、ＳｎｐＳｉｆｔ（２０）を使用して同定し、他の変異を、ＳｎｐＳｉｆｔフィルターを使用してフィルタリングした。固有の変異のリストを、それらの遺伝子型の品質スコアによってフィルタリングし、＜２０のスコアを有する変異を除去した（２１）。最後に、さらなる分析のために、高いまたは中程度の影響があると予測される変異を保持した。ＰＡＮＴＨＥＲ分類システム（２２）を、変異によって影響されるように同定された遺伝子の分子機能の分類のために使用した。
【０１３５】
ＲＮＡ−ＲＮＡｓｅｑ
３つの実験でＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株の両方から全ＲＮＡを単離し、三重ＲＮＡｓｅｑサンプルを生成した。２００，０００個の細胞が単離され、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に溶解した。Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＲＮＡを単離した。溶解したサンプルをエタノールと混合し、スピンカラムに加えた。ＲＮＡを結合し、付属の洗浄バッファーで洗浄した。ＲＮＡを、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水に溶出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）により品質管理した。サンプルを、ＲＮＡ配列のためにＳｃｉＬｉｆｅＬａｂｓにドライアイスで出荷されるまで、−８０℃で保存した。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑストランドｍＲＮＡ、Ｐｏｌｙ−Ａ選択を使用して調製した。イルミナＨｉＳｅｑ  Ｒａｐｉｄモードｖ２，ＳＲ  １ｘ５０ｂｐを使用して、配列決定を行った。ベストプラクティスの基本分析を、ｔｏｐＨａｔ  ｖ２．０．４を使用して読み取りのマッピングを含むＳｃｉＬｉｆｅＬａｂｓによって行い（２３）、サムツールにより生成されたＢＡＭファイルを選別し（２４）、ピカール−ツールにより重複をマーキングし、ＨＴＳｅｑを使用して、カウントを定量化した（２５）。
【０１３６】
得られたカウント表をＲに読み込み、カウントデータへのネガティブ２項式モデルの正規化および適合を行い、効果的な差次的発現分析を可能にする、ｅｄｇｅＲ  ｖ３．１４．０（２６）およびＤＥＳｅｑ２  ｖ１．１２．４（２７）を使用して、差次的発現分析を行った。両方のパッケージについて、差次的発現（ＤＥ）分析についての推奨されるワークフローに従った。仮説試験のために使用されるモデルマトリクスは、サンプルのＰＣＡプロットを分析するときに発見されたバッチ効果により、モデルに実験バッチを組み込むように設計された。転写は、ｅｄｇｅＲおよびＤＥＳｅｑの両方が０．０５未満の誤発見率で有意に差次的に発現されたと呼ぶ場合に、差次的に発現されたと見なされた。同定された転写がマッピングされた分子機能および生物学的プロセスは、ＰＡＮＴＨＥＲ分類システムを使用して分析された。差異的に発現された転写の中で過剰または過少に表示された遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームを同定するために、ＰＡＮＴＨＥＲも使用して、過剰表現試験を行った。バックグラウンド参照リストは、ＤＥ分析に入力されたものと同じリストであるカウント表で取得された全てのゼロ以外のカウントとして送信された。同定されたＧＯタームのｐ値を、ボンフェローニ法で補正した。補正されたｐ値が０．０５未満であるＧＯタームは、有意に過大表示または過少表示と見なされた。追加的に、シグナル伝達経路影響分析ｖ２．２４．０（ＳＰＩＡ）（２８）およびＫＥＧＧ経路（２９，３０）リリース７９．０を使用して、経路分析を行った。重要なＤＥ転写のリストには、ログ２倍の変化値が付随して入力され、ゼロ以外の全ての転写がバックグラウンドとして入力された。ログ２倍の変化値は、ＤＥＳｅｑ２  ｖ１．１２．４を使用して計算された。
【０１３７】
最後に、表現型分析およびＲＮＡ配列分析の結果について、一致分析を行った。測定された表面マーカーに対応する遺伝子を、表面マーカー発現と比較した。比較は、クラスが有意な上方調節／発現されたか、有意に下方調節／発現されたか、または２つの細胞株間に有意な差のない分類の評価と同様に行われた。したがって、ＲＮＡ配列分析および表現型分析の両方で転写レベルまたは表面発現が著しく高いと呼ぶ場合、これは一致した結果と見なされるであろう。Ｃｏｈｅｎｓ  Ｋａｐｐａ（３１）は、分析方法間の一致の指標として計算された。
【０１３８】
機能分析
ＧＡＲＤアッセイにおいてＭＵＴＺ−３を使用して、ＳｅｎｚａＣｅｌｌと比較したＧＡＲＤ予測シグネチャーを使用して皮膚感作剤を非感作剤から区別する能力を評価した。以前に詳細に記載されているＧＡＲＤの標準的な操作手順に従った（９）。要するに、細胞（ＭＵＴＺ−３またはＳｅｎｚａＣｅｌｌ）を、２４ウェルプレートに１．８  ｍｌの容量および２２２，０００細胞／ｍｌの細胞濃度で播種した。刺激のために使用した化学物質は、（２，４）−ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）および２−ヒドロキシエチルアクリレートであった。非刺激サンプルも、ネガティブコントロールとして含まれた。ＤＮＣＢをＤＭＳＯに溶解して４ｍＭの濃度にし、２−ヒドロキシエチルアクリレートを水中に溶解して１００ｍＭの濃度にした。次いで、両方の化学物質を、１００倍の２０％のＦＣＳを補充したα−ＭＥＭ中で希釈し、最終的に、２００  μｌをウェルに加えて、もう一度１０倍に希釈した。刺激のためのウェル内濃度は、ＤＮＣＢおよび２−ヒドロキシエチルアクリレートについて、それぞれ、４  μＭおよび１００μＭであった。２００  μｌのＭＥＭ−アルファを非刺激細胞に桑手、サンプルごとに２００，０００細胞／ｍＬの細胞内濃度を得た。細胞を化学物質とともに５％のＣＯ２で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＲＮａｓｅを含まないエッペンドルフチューブに採取し、ＴＲＩｚｏｌに溶解した。細胞の生存率を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）染色を使用したフローサイトメトリーによって評価した。Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ  ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＲＮＡを抽出および精製した。記載されているようにＲＮＡを抽出し、≧８のＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）および≧２０ｎｇ／μｌのＲＮＡ濃度を有するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００サンプルを使用して、品質を制御した。ＧＰＳにおける遺伝子（以下の表Ａを参照）を、メーカーが供給するプロトコルおよび試薬を使用したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒシステム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を使用して、定量化した。遺伝子の生のカウントをＮａｎｏＳｔｒｉｎｇからエクスポートし、合計カウントごとのカウントによって正規化し、正規化では、各遺伝子のカウントを単一のサンプルについてカウントの合計によって除算する。Ｒパッケージｅ１０７１からのサポートベクターマシンによって、分類を行い（３２）、訓練セットは、複製における４０個の化学刺激の遺伝子プロファイルからなる（１０）。両方のデータセットにおける非刺激サンプルについての最初の４つの主成分のシフトを計算することによって、分類前にデータを訓練データと位置合わせした。次いで、計算されたシフトを使用して、試験サンプルからの全てのサンプルを調節した。
【０１３９】
ＧＡＲＤ予測シグネチャーを使用した非感作剤から皮膚感作剤を区別するための方法論も、ＷＯ  ２０１２／０５６２３６、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ａ  ｂｌｉｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ｓｔｕｄｙ．ＡＬＴＥＸ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｆｉｒｓｔ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １７，２０１７；Ｆｏｒｒｅｒｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｔｏ  ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｒｅａｄｏｕｔ−Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｗｉｔｈ  ＧＡＲＤ．Ｔｏｘｉｃｏｌｇｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘ  Ｓｃｉ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１１）に詳細に記載されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【表０−１】
2020534825.tif 000003
【表０−２】
2020534825.tif 000004
【表０−３】
2020534825.tif 000005
【表０−４】
2020534825.tif 000006
【表０−５】
2020534825.tif 000007
【表０−６】
2020534825.tif 000008
【０１４０】
表Ａの説明文。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＵＳＡ）のＮｅｔＡｆｆｘデータベースを使用して、遺伝子に注釈を付けた。見つかった場合、Ｕｎｉｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）ＩＤを、遺伝子識別子として選択した。Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＩＤが報告されなかった場合、最良の代替ＩＤが与えられた。
【０１４１】
結果
表現型分析
ＭＵＴＺ−３と比較した、ＳｅｎｚａＣｅｌｌにおける表現型の違いの任意の指標を調べるために、表面マーカーのパネルの発現（表Ｉ）を、両方の細胞株において測定した。選択される表面マーカーは、樹状細胞、骨髄細胞、造血細胞、または細胞活性化に関連する。ポジティブ細胞の集団を計算し、ｔ試験を使用して集団サイズを比較した。測定された２６個の表面マーカーのうち、誤発見率＜０．０５を有意と考えた場合、１２個は、細胞株間で有意に差次的に発現された、表Ｉの網掛けの行を参照されたい。差次的に発現された表面マーカーは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１５、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６４、トール様受容体（ＴＬＲ）４、およびＴＬＲ−２であった。しかしながら、ＣＤ５４の発現は、細胞株においてほぼ同一であり、取得可能な最高値に近いため、注意して解釈する必要がある。発現はまた、バイナリーとして、表面マーカーが検出された場合は＋として、かつ−別様に、考えられた。表面マーカーのバイナリー発現は、細胞株間で非常に類似した。異なるバイナリー発現を示した唯一の表面マーカーは、ＣＤ８０およびおそらくＯＸ４０Ｌであった。細胞株をさらに比較するために、階層的クラスタリングアルゴリズムを行った、図１を参照されたい。クラスタリングは、ＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌを２つの別個のクラスターにグループ化する。同定されたクラスターの安定性を評価するために、リサンプリングを用いたブートストラップアルゴリズムを行った。ＳｅｎｚａＣｅｌｌおよびＭＵＴＺ−３の平均Ｊａｃｃａｒｄ係数を、それぞれ、０．８５および０．８９であると決定し、これは、安定したクラスターの指標である。
【０１４２】
表Ｉ。バイオマーカーのパネルの発現は、ＳｅｎｚａＣｅｌｌおよびＭＵＴＺ−３の両方について測定した。発現値は、平均パーセントポジティブ細胞±標準偏差として与えられる。発現値の平均を比較するために、ｔ試験を行った。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を使用して、ｐ値を補正した。緑色で網掛けされた行は、０．０５未満の補正されたｐ値を有するマーカーを表す。計算は、生物学的な三重での６回の測定に基づいている。表面表現のバイナリー表現は、発現された場合は＋として、発現されない場合は−として表される。表面マーカーの対応する遺伝子の発現が与えられ、これは、有意差がある場合に最高の発現を示す細胞株を示す。ＨＬＡ−ＤＲは、その複雑な遺伝学のために、ＲＮＡ発現カラムにおいて報告されていない。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１４３】
全ゲノム配列決定
全ゲノム配列決定を行って、ＳｅｎｚａＣｅｌｌとＭＵＴＺ−３との間の遺伝的差異の指標を同定した。指標は、細胞株のいずれかでのみ発見された変異によって表すことができるであろう。調査した変異は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、または欠損からなる。細胞株で発見された生の変異の数は、それぞれ、ＳｅｎｚａＣｅｌｌおよびＭＵＴＺ−３において５，０８０，９１８個および５，０７３，３０７個であった。ｇＶＣＦファイルがマージされ、遺伝子型が同定され、出力されたＶＣＦファイルにおける変異品質スコアが再校正された。品質スコアが低い変異をフィルタリングし、さらなる分析から除去した。細胞株ゲノムと参照ゲノムとの間の類似性を、両方の細胞株について９９．８６％まで計算し、その結果、変異頻度は約７２０ｂｐあたり１変異であった。細胞株のいずれかに固有の変異は、１つの細胞株が同定された変異を有し、他の細胞株が参照ゲノムとホモ接合である位置を見つけることによって同定された。遺伝子型の品質スコアでフィルタリングすることによって、ホモ接合性細胞の確実性が低い変異を除去するために、さらにフィルタリングを行った。得られた変異リストは、ＳｅｎｚａＣｅｌｌでのみ見られる７，９７７個の変異、およびＭＵＴＺ−３細胞株に固有の５，６７２個の変異からなる。変異のリストは大幅に減少したが、細胞に影響を与える可能性のある変異を同定するには、さらなるフィルタリングが必要であった。したがって、影響の少ない変異を除去するために変異をフィルタリングした。ＳｅｎｚａＣｅｌｌに高いまたは中程度の影響を与えると予測された変異は表２に見ることができ、ＭＵＴＺ−３について同定された変異は表３に見ることができる。記載された基準に一致する１４個の変異がＳｅｎｚａＣｅｌｌで発見され、２８個がＭＵＴＺ−３で発見された。予測される効果は、アミノ酸置換から、新しい停止コドンの獲得またはスプライス部位の変化など、より重度の変異にまで及んだ。変異による影響を受けた遺伝子がマッピングされ得る生物学的プロセスを、ＰＡＮＴＨＥＲを使用して決定した、図２および図３を参照されたい。
【０１４４】
最後に、同様のフィルタリング戦略を行って、細胞株で同定され得る一般的な変異の数を決定し、これは、４，２９８，１１６個の変異を同定した。
【０１４５】
表２．高いまたは中程度の効果を有すると予測された、ＳｅｎｚａＣｅｌｌ（Ｓ）でのみ発見された固有の変異。予測される効果は、ｓｎｐＥｆｆを使用して決定された。遺伝子：変異による影響を受ける遺伝子の同定、ＣＨＲ：変異が呼び出された染色体、位置：染色体上の変異の位置、影響：変異の予測される影響、予測される効果：ｓｎｐＥｆｆによる予測される影響、Ｘ−ＧＱ：それぞれの細胞株についての遺伝子型品質についてのＰｈｒｅｄに基づく品質スコア：
【表２】
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【０１４６】
表３．高いまたは中程度の効果があると予測された、ＭＵＴＺ−３（Ｍ）でのみ見つかった、固有の変異。予測される効果を、ｓｎｐＥｆｆを使用して決定した。遺伝子：変異による影響を受ける遺伝子の同定、ＣＨＲ：変異が呼び出された染色体、位置：染色体上の変異の位置、影響：変異の予測される影響、予測される効果：ｓｎｐＥｆｆによる予測される影響、Ｘ−ＧＱ：それぞれの細胞株についての遺伝子型の品質についてのＰｈｒｅｄに基づく品質スコア：
【表３】
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【０１４７】
ＲＮＡ配列分析
細胞株のトランスクリプトームを比較して、正常な成長中の細胞の状態を評価し、それらの間の任意の違いを同定した。図４で、サンプルのＰＣＡプロットを作成し、階層的クラスタリング分析を行うことによって、データの最初の分析を行った。ＰＣＡプロットは、実験３からのサンプルとしてバッチ効果の存在が、最初の２つの実験からのサンプルと比較して、第２の主成分における逸脱値を示すことを示した。また、実験３のサンプルは、階層的クラスタリングにおいて別個のクラスターを形成し、バッチ効果がデータに影響を与えるという観察をさらに強化している。最初の２つの実験から得られたサンプルは、より類似しているように見え、同じ細胞株のサンプルは、別個の群およびクラスターを形成した。ＥｄｇｅＲおよびＤＥＳｅｑを使用して、細胞株間で差次的に発現される転写を検索し、一般化線形モデルは、観察されたバッチ効果を考慮して設計された。３６４４個の転写が有意に差次的に発現されたものとして同定された（補足表１に列挙）。同定された転写は、ＰＡＮＴＨＥＲを使用して分子機能および生物学的プロセスにマッピングされた（図３）。転写の大部分は、分子機能の触媒活性および結合、ならびに生物学的プロセスの細胞および代謝プロセスにマッピングされた。次いで、ＤＥ転写の中で任意の生物学的プロセスが大幅に過少または過大表示されているかどうかを調査するために、過大表示試験を行った。９４個のＧＯタームが、０．０５未満のボンフェローニ補正ｐ値で統計的に過小表示または過大表示であると同定されており、補足表２を参照されたい。細胞株間の違いについてさらに洞察を得るために、トポロジー経路分析も行った。経路分析により、ＳｅｎｚａＣｅｌｌと比較してＭＵＴＺ−３において１９個の活性化されたシグナル経路および２つの阻害されたシグナル経路が発見された（表４）。
【０１４８】
ＧＰＳで選択される遺伝子の調節は、ＧＡＲＤアッセイにおける感作剤および非感作剤の同定および分離に重要である。したがって、ＧＰＳにおける遺伝子をＤＥ転写と比較し、これは、両方のリストに４３個の転写が見つかったことを明らかにした。これにより、ＧＰＳの遺伝子のうちのほぼ２２％が細胞株間で差次的に発現していることが実証された。
【０１４９】
表現型における結果とＲＮＡ配列データとの間の比較を行って、分析方法を調査し、調査結果の妥当性を高めた。バイオマーカーのパネルおよびそれらに対応する遺伝子を、一致分析において比較した。比較は、ＳｅｎｚａＣｅｌｌと比較して、ＭＵＴＺ−３において有意に高い、有意に低い、または差のない群による分類タスクの評価として行った。分析の結果、Ｃｏｈｅｎｓ  Ｋａｐｐａ値は０．４４であり、これは、２つの方法間の一致を示唆しており、表１の各マーカーについての発現を参照されたい。発現の増加を示した１０個の表面マーカーのうちの８つも、ＲＮＡ配列分析において発現の増加を示した。ＣＤ５４は、表面マーカーの発現とは反対に、ＭＵＴＺ−３の遺伝子発現の増加を示している。ＴＬＲ２に対する遺伝子は、差次的に発現しているとは呼ばれない。有意であると呼ばれない１４個の表面マーカーのうちの８個は、いずれも差次的に発現された遺伝子を有していなかった。しかしながら、残りの６つのマーカーの遺伝子発現レベルは、差次的に発現されることがわかった。ＣＤ３４は、転写レベルおよび表面発現の両方において、ＭＵＴＺ−３の発現レベルが有意に低いことが判明した唯一のマーカーであった。ＨＬＡ−ＤＲは、その複雑な遺伝学のため、この比較から除外された。
【０１５０】
表４．ボンフェローニ法を使用したｐ値の補正後のＳＰＩＡとは有意に異なるシグナル伝達経路。ＳＰＩＡによって計算されたグローバルｐ値は、経路において影響を受ける遺伝子の数およびシグナル伝達経路の摂動の両方を考慮する。
【表４】
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【０１５１】
機能分析
よく構築されたアッセイワークフローにおける細胞を使用することによって化学的暴露を評価した後に、ＧＡＲＤ予測シグネチャー（ＧＰＳ）における遺伝子の発現を分析する際に皮膚感作剤を区別するＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌの能力。２−ヒドロキシエチルアクリレートおよびＤＮＣＢを使用して細胞を刺激し、非刺激サンプルをネガティブコントロールとして使用した。ＲＮＡを定量化し、ＳｅｎｚａＣｅｌｌからの遺伝子プロファイル上で訓練されたＳＶＭモデルを使用してサンプルを分類した。ＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌの両方を使用して、化学物質を感作剤として正しく分類し、非刺激サンプルを非感作剤として分類した（図６）。さらに、２−ヒドロキシエチルアクリレートがＤＮＣＢよりも高い予測値を有する予測パターンは、ＳｅｎｚａＣｅｌｌで得られるものに関してＭＵＴＺ−３と同様である。
【０１５２】
考察
アレルゲン性接触皮膚炎は、社会に多大なコストをもたらす有病率の増加を伴う状態である。皮膚感作剤との接触は、化学反応と生体分子との間に形成される複合体を攻撃する免疫反応を引き起こし、健康な組織を攻撃する可能性がある（１）。ＡＣＤを誘発する化学物質の能力の評価は、ＡＣＤによる影響を受ける人々の数を減らすために重要である。感作試験のためのゴールドスタンダードである局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）（３３）は、動物試験に依存しており、インビトロアッセイにおいてより倫理的に段階的に廃止されている（６、７、３４）。ＧＡＲＤアッセイは、ＧＡＲＤ予測シグネチャー内の遺伝子の遺伝子発現を分析することによって、感作剤と非感作剤とを区別するインビトロアッセイである。転写は、試験化学物質にさらされた樹状様細胞株から単離される。このアッセイは、細胞株の生来の意思決定に基づいて感作剤を認識し、その遺伝子発現を適応させることで、変化を定量化し、感作剤の認識を学習することを可能にする（９）。ＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌは、樹状細胞に似ている能力があるため、このタスクに好適な細胞であり、これは、抗原の認識および免疫反応の調整に重要である。
【０１５３】
ＳｅｎｚａＣｅｌｌを、その表現型、遺伝子型を特徴づけ、アッセイで使用した場合に感作剤を非感作剤から区別する細胞株の能力を評価することによって、ＭＵＴＺ−３と比較した。表面マーカーのパネルの発現レベルは、両方の細胞株について決定された。結果は、２６個の表面マーカーのうちの１２個が、ＳｅｎｚａＣｅｌｌと比較してＭＵＴＺ−３における発現レベルが異なることを実証した。ブートストラップを用いた階層的クラスタリングアルゴリズムは、細胞株を異なる安定したクラスターにグループ化する可能性も示し、これは、実験の過程で細胞株が他の細胞株よりも自身と類似していることを暗示している。ＭＵＴＺ−３においてより高い発現値を有した表面マーカーは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、およびＴＬＲ４であり、ＣＤ３４、ＣＤ５４、およびＨＬＡ−ＤＲは、より低い発現値を有した。ＭＵＴＺ−３細胞は、ＣＤ１４およびＣＤ３４の発現に基づいて、３つの亜集団；ＣＤ３４＋  ＣＤ１４−、ＣＤ３４−ＣＤ１４−、およびＣＤ３４−ＣＤ１４＋に分割することができる。集団の以前の分析では、ＣＤ３４＋ＣＤ１４−が他の集団を生じさせる増殖集団である（３５）。したがって、ＳｅｎｚａＣｅｌｌとＭＵＴＺ−３との間の違いのうちのいくつかは、亜集団間の違いによって説明することができる可能性があり、例えば、ＭＵＴＺ−３におけるＣＤ１４＋細胞の量の増加は、ＣＤ１１ｂ＋発現の増加を説明することができる可能性がある（３５）。しかしながら、利用可能なデータを考慮すると、表現の異なるレベルは、亜集団のサイズが異なるためだけでは説明することができない。ＣＤ１ａは、以前に未分化ＭＵＴＺ−３に記録されていない細胞株の両方において発現される（８、３５、３６）。したがって、ＣＤ１ａの発現は、より樹状細胞と類似する表現型へのＭＵＴＺ−３細胞の分化を示している可能性がある。ＭＵＴＺ−３は、ＣＤ１ａポジティブ細胞のより大きな集団を表示しており、これは、ＳｅｎｚａＣｅｌｌよりも分化していることを示している可能性がある。ＭＵＴＺ−３が、より分化され得ることをさらに暗示している証拠は、ＣＤ４０の発現の増加であり、これは、細胞がＤＣ表現型に向かって分化するにつれて発現が増加するマーカーである（３７）。ＭＵＴＺ−３において、ＣＤ１ａおよびＣＤ４０の両方がより高いレベルで発現しているが、他の表面マーカーの発現は、反対の証拠を示している。ＨＬＡ−ＤＲは、その発現がＳｅｎｚａＣｅｌｌにおいてより多く発現される分化とともに中程度に増加することが示されている別のマーカーであり、細胞株間の不均等な分化レベルに関するいかなる結論も引き出すことは困難である（３７）。さらに、細胞株の形態のいずれも、ＭＵＴＺ−３が分化するにつれて形成される特徴的な樹状突起を示さない（データは示されず）。差次的に発現される表面マーカーの役割を考慮すると、多くは骨髄細胞分化、例えば、ＦＣ−ガンマ受容体ＣＤ３２およびＣＤ６４（３８）、病原体認識受容体（ＰＲＲ）ＴＬＲ２およびＴＬＲ４（３９〜４１）、または炭水化物接着分子ＣＤ１５（４２）に関連している。これは、観察された差異の原因となる何らかの���式の差別化があることを示している可能性があるが、得られた発現値のみを使用して差次的プロセスの性質を判断することは困難である。
【０１５４】
細胞株のゲノムを比較し、遺伝的差異の指標を検索するために、全ゲノム配列決定を行った。典型的な人は参照ゲノムと比較して４１０万〜５００万個の部位で異なるため、同定された変異の数は予想の範囲内にある（４３）。細胞株のうちのいずれかに固有の変異を同定し、それらの予測される影響を評価した。合計で、ＳｅｎｚａＣｅｌｌで７，９７７個、ＭＵＴＺ−３で５，６７２個の固有の変異が発見された。発見された固有の変異の数を一般的な変異の数と比較すると、観察された違いは小さく見える。しかしながら、影響が少ない変異をフィルタリングし、影響が中程度または高いと予測される変異を評価すると、状況は逆転した。ＳｅｎｚａＣｅｌｌで１４個の変異、ＭＵＴＺ−３で２８個の変異が発見された。これらの結果の理由のうちの１つは、変異を同定するために使用される方法の非感受性による可能性がある。全ゲノムの配列決定は、数十億のリードを生成するハイスループット方法である。読み取りを解釈可能な結果に変換するプロセスは、困難であり、継続的な課題である。しかしながら、発見された変異が細胞株に固有のものであり、検出による人工物ではないと仮定すると、それらは他の生物学的プロセスの産物である可能性がある。遺伝的差異は、細胞株が成長するときの選択圧によって引き起こされる可能性がある。ＭＵＴＺ−３のゲノムにおいて異なる変異を有する亜集団が含まれている場合、それらのうちのいくつかがＳｅｎｚａＣｅｌｌにおいて失われている可能性がある。遺伝的異質性は、以前に細胞株で示されている（４４）。別の可能性として、ＭＵＴＺ−３がＳｅｎｚａＣｅｌｌと並行して拡張され、これにより発見された変異が生成された可能性がある。ＭＵＴＺ−３細胞株を並行して拡張すると、ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞には存在しない固有の変異が見つかる可能性があるが、変異は、より高い頻度で高いまたは中程度の影響を与える必要があるだろう。並行して拡張を続けると、細胞株間にさらに違いが生じる可能性がある。変異の影響を受けると予測される遺伝子にマッピングされた生物学的プロセスは、一般的な用語であり、機能的な結論を引き出すことは困難である。これは、変異の影響、例えば、結果として生じるタンパク質中のアミノ酸が別のアミノ酸に変化するミスセンス変異の影響を考慮すると、さらに難しくなる。しかしながら、遺伝子リストを研究すると、興味深い変異が明らかになる。ＭＹＢ遺伝子のＭＵＴＺ−３で見つかった影響の大きい変異は、関連する発見である可能性がある。ＭＹＢは、幹細胞および前駆細胞の調節において通常重要な機能を果たす同定された癌遺伝子である（４５）。もう１つの興味深い観察結果は、ＭＵＴＺ−３でもあるＷＩＳＰ１遺伝子における変異である。ＷＩＳＰ１は、ＷＮＴシグナル伝達経路において機能し、細胞間相互作用ならびに幹細胞の調節および制御に重要な役割を果たす（４６〜４８）。これらの変異は両方とも、細胞株の機能および調節にとって重要である可能性があり、ＳｅｎｚａＣｅｌｌにおいてこれらの変異がないことは、機能的な影響を有する可能性がある。
【０１５５】
細胞のトランスクリプトームの分析は、通常の培養中にＲＮＡ配列を使用して転写レベルを定量化することによって行われた。発現レベルの比較により、３６４４個の転写が差次的に発現していることが明らかになり、これは、ゼロカウントの転写を除去した後に分析された全ての転写のうちの１０％に近い。多数の差次的に発現する遺伝子は、細胞株間の大きな違いが分子レベルで観察され得ることを示唆している。同定された遺伝子が細胞に与える潜在的な影響をよりよく理解するために、過剰表現試験およびトポロジカル経路分析を行った。９４個の生物学的プロセスＧＯタームが、同定された転写の中で過剰または過少表示であると同定された。細胞株間の違いを同定する比較分析のため、過剰表現されたタームは最も重要である。例えば、細胞機能に必要な重要な生物学的プロセスを同定するなど、他の種類の分析では、過小表示のタームが興味深い場合がある。しかしながら、同定されたＧＯタームのうちのほとんどは、過剰に表示されていた。ＧＯタームのうちのいくつかを簡単に述べると、骨髄性白血球の活性化および白血球の走化性は、転写の予想数と観測数との間で最大の倍数変化を伴う生物学的プロセスとして同定された。これらのタームは両方とも、外部刺激に対する反応を示している（４９）。ＭＡＰキナーゼ活性のポジティブ調節も、多くの関連するＧＯタームにより同定された。ＭＡＰキナーゼは、細胞分化、細胞増殖、および細胞死などの重要な細胞プロセスを制御するシグナル伝達経路に関与している（５０）。様々な炎症反応および免疫プロセスも、過剰表示として同定されており、これは、ＧＡＲＤアッセイにおけるＳｅｎｚａＣｅｌｌの機能的役割のために重要である可能性がある。ＲＮＡ配列データの分析を継続し、細胞株間の違いに関するさらなる知識を得るために経路分析を行った。経路分析により、ＳｅｎｚａＣｅｌｌと比較して、ＭＵＴＺ−３細胞において有意に活性化された１９個のシグナル伝達経路および阻害された２つのシグナル伝達経路が発見された。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、ＭＵＴＺ−３において活性化されていることが同定された。ＭＡＰキナーゼ活性は、過剰に表示された生物学的プロセスとしても同定されており、細胞株間の細胞プロセスの変化のさらなる証拠を与えている。ＮＦ−カッパＢシグナル伝達は、活性化されたとして発見された別の興味深い経路であり、炎症反応に密接に関連している（５１）。これらの観察は、活性化されたトール様受容体シグナル伝達と一緒になって、炎症反応の結果である可能性がある。
【０１５６】
機能分析は、ＭＵＴＺ−３がアッセイにおいてＳｅｎｚａＣｅｌｌを使用した場合に達成されるものと同様の予測を生成することができることを示した。感作剤ＤＮＣＢおよび２−ヒドロキシエチルアクリレートは、ＧＰＳ内の遺伝子の転写レベルを評価することによって、感作剤として正しく予測された。予測された決定値も、２つの細胞株間で同様のパターンを示した。しかしながら、化学物質を分離する能力は、類似性の任意の尺度を直接与えるものではない。細胞が刺激と同様に反応し、ＧＰＳがこれらの変化をうまく捕捉する可能性がある。
【０１５７】
比較を要約するために、２６個の表面マーカーのうちの１２個がＭＵＴＺ−３とＳｅｎｚａＣｅｌｌとの間で差次的に発現されることを明らかにした表現型分析を完了した。発現値に対するクラスター分析は、細胞株を分離する２つの別個のクラスターを形成する。全ゲノム配列決定により、発見された全ての変異を評価する際に、ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株においてより固有の変異が同定された。影響の少ない亜種を除外する場合、ＭＵＴＺ−３細胞株には、ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株における１４個と比較して、２８個の変異が含まれていた。同定された変異のうちのいくつかは、細胞の機能に重要な影響を与える可能性がある。ＲＮＡ配列分析により、３６４４個の転写が見られ、それらは差次的に発現された。過剰表示試験および経路分析により、多くの生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路が差次的に活性化されていることが明らかになった。最後に、ＭＵＴＺ−３およびＳｅｎｚａＣｅｌｌをＧＡＲＤアッセイにおいて使用して、感作剤を認識し、予測を生成するそれらの能力を評価した。サンプルの分類により、全ての化学物質について正しい予測が得られ、これは、違いが観察されたにもかかわらず、両方の細胞株をアッセイで使用することができることを示している。
【０１５８】
結論として、表現型および遺伝子型の分析において、ＳｅｎｚａＣｅｌｌとＭＵＴＺ−３との間の多くの違いを同定した。全体として、ＳｅｎｚａＣｅｌｌには表面分子および細胞機能の固有の発現があるが、ＧＡＲＤアッセイでは両方の細胞株を使用することができることが示されている。
【０１５９】
補足表１。ＤＥＳｅｑ２およびｅｄｇｅＲ−を使用したＤＥ分析後に同定された、差次的に発現された転写のリスト
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
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【表５−２２】
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【表５−２３】
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【表５−２４】
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【表５−２５】
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【表５−２６】
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【表５−２７】
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【表５−２８】
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【表５−２９】
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【表５−３０】
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【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【表５−４０】
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【表５−４１】
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【表５−４２】
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【表５−４３】
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【表５−４４】
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【表５−４５】
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【表５−４６】
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【表５−４７】
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【表５−４８】
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【表５−４９】
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【表５−５０】
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【表５−５１】
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【表５−５２】
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【表５−５３】
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【表５−５４】
2020534825.tif 000068
【表５−５５】
2020534825.tif 000069
【表５−５６】
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【表５−５７】
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【表５−５８】
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【表５−５９】
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【表５−６０】
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【表５−６１】
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【表５−６２】
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【表５−６３】
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【表５−６４】
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【表５−６５】
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【表５−６６】
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【表５−６７】
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【表５−６８】
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【表５−６９】
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【表５−７０】
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【表５−７１】
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【表５−７２】
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【表５−７３】
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【表５−７４】
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【表５−７５】
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【表５−７６】
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【表５−７７】
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【０１６０】
補足の表２。ＤＥ転写を使用した過剰表現分析で過剰表現として同定されたＧＯ生物学的プロセス。提示されたＧＯタームは、ボンフェローニ補正Ｐ値が０．０５未満で有意と呼ばれた。補正されたｐ値を以下に報告する。参照からマッピングされたＩＤの数：１４７７４、参照からマッピングされていないＩＤ：１２８５４、ＤＥ転写からマッピングされたＩＤの数：３２９８、ＤＥ転写からマッピングされていないＩＤ：３４６。
【表６−１】
2020534825.tif 000092
【表６−２】
2020534825.tif 000093
【０１６１】
実施例２
ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株はまた、ＧＡＲＤプラットフォームを使用した呼吸器感作剤の分類、すなわち、哺乳動物の呼吸器感作を誘発することができる薬剤の同定のために、ゲノムバイオマーカーシグネチャーと一緒に使用することもできる。
【０１６２】
これらの方法は、皮膚感作剤を同定するための上記の実施例１の機能分析の項で議論された方法論に従って行われ得るが、以下の表Ｂおよび／または表Ｃのバイオマーカーシグネチャーを使用するように適合され得る。また、ＷＯ２０１３／１６０８８２、ＷＯ２０１６／０８３６０４、およびＦｏｒｒｅｒｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ＧＡＲＤ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０（３））に記載されている呼吸器感作を誘発することができる薬剤を同定するために具体的に記載されている詳細な方法論を参照されたい。
【０１６３】
表Ｂ
ＧＡＲＤ呼吸予測シグネチャーの「コア」、「好ましい」、および「任意の」バイオマーカー。
【表７−１】
2020534825.tif 000094
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
2020534825.tif 000099
【表７−７】
2020534825.tif 000100
【０１６４】
表Ｂ。遺伝子は、見つかった場合にＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤと注釈されている（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ）。Ｈｕｍａｎ  ＳＴ  １．０アレイのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＩＤが提供されている。検証呼び出し頻度（％）は、交差検証中に得られた２０個の検証バイオマーカーシグネチャーにおける各遺伝子の出現である。
【表８】
2020534825.tif 000101
【表９−１】
2020534825.tif 000102
【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表１０】
2020534825.tif 000109
【０１６５】
この表は、一方向ＡＮＯＶＡのｐ値フィルタリングおよび後方消去によって同定されるＧＲＰＳの予測遺伝子を示す。可能であれば、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写ＩＤを遺伝子識別子として使用した。Ｈｕｍａｎ  ＳＴ  １．０アレイのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＩＤが提供されている。
１検証の呼び出し頻度（％）は、交差検証によって得られた２０個のバイオマーカーシグネチャーの中の、各予測転写の出現を記載している。
【０１６６】
実施例３
ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株は、ＧＡＲＤプラットフォームを使用した皮膚感作剤の効力の分類、すなわち、試験薬剤の皮膚感作効力の決定にも使用することができる。
【０１６７】
そのような方法は、皮膚感作剤を同定するための上記の実施例１の機能分析の項に記載されているが、効力を決定するために表Ｄのバイオマーカーシグネチャーを使用するように適合された方法に従って行うことができる。Ｚｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．ＡＬＴＥＸ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｐｒｉｌ  １２，２０１７，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１４５７３／ａｌｔｅｘ．１７０１１０１に詳細に記載されており、ＷＯ２０１７／１６２７７３にも記載されている、特定の方法論も参照されたい。
【表１１−１】
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【表１１−２】
2020534825.tif 000111
【表１１−３】
2020534825.tif 000112
【０１６８】
実施例４
ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株は、哺乳動物においてアレルゲン性であるタンパク質の同定にも使用することができる。
【０１６９】
この方法は、皮膚感作剤を同定するための上記の実施例１の機能分析の項に従って行うことができるが、アレルゲン性タンパク質を同定するために表Ｅのバイオマーカーシグネチャーを使用するように適合され得る。Ｚｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｋｎｏｗｎ  ｔｏ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  ２０１７  Ｏｃｔ  ７；４６：１５５−１６２に記載されている方法論も参照されたい。
【０１７０】
タンパク質に対するアレルゲン性の予測を行う可能な方法を、以下のように提供する。これは、表ＥのＧＡＲＤタンパク質アレルゲン予測シグネチャーに基づく（本明細書で「ＧＡＲＤ  ＰＡＰＳ」と呼ばれる）。ＧＡＲＤの読み取り値は、ＧＡＲＤ予測シグネチャー（ＧＰＳ）と呼ばれるゲノム予測因子のセットである。
【０１７１】
細胞の遺伝物質を、試験物質で刺激される細胞サンプルから単離した。ＧＡＲＤ  ＰＡＰＳの転写レベルを定量化し、多変量統計予測モデルを使用して参照データセットと比較した。各サンプルには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイテクノロジーによって測定されたＧＡＲＤ  ＰＡＰＳの転写レベルに基づいて決定値が割り当てられる。最終予測は、生物学的三重サンプルの平均値に基づく。
【０１７２】
全てのタンパク質は、細胞毒性効果、および各タンパク質について構築されたＧＡＲＤ入力濃度についてスクリーニングされている。
【０１７３】
ＬＰＳは、サンプルによって生成された観察されるシグナルが、エンドトキシン汚染物質によるものではないことを確実にする、ネガティブコントロールとして使用することができる。サンプルのエンドトキシン含有量は、ＬＡＬ試験を使用して定量化され得る。ネガティブコントロールとして使用されるＬＰＳ濃度は、サンプル中に存在する最高のエンドトキシン濃度に対応するように設定することができる。
【０１７４】
全ての試験タンパク質および物質は、生物学的な三重でアッセイされる。記載されるように、試験物質の全ての複製には、ＧＡＲＤ  ＰＡＰＳ予測モデルを使用して決定値が割り当てられる（以下の材料および方法を参照されたい）。
【０１７５】
材料および方法
この例に従ってデータを生成するために使用されるＧＡＲＤ試験戦略についての包括的な資料および方法を以下に含む。
【０１７６】
標準プロトコルからの逸脱
試験タンパク質の細胞毒性効果は、１〜２５μｇ／ｍｌの濃度範囲で監視され得る。２５  μｇ／ｍｌをＧＡＲＤ入力濃度として使用することができる。
【０１７７】
試験物質で細胞を刺激する場合、タンパク質は、最初に、１０００  μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳに溶解され得る。次いで、５０  μｌの溶解されたタンパク質が、１．９５ｍｌの播種細胞に加わった。ＬＰＳは、０．１  μｇ／ｍｌの最終濃度になるまでＰＢＳ中に希釈され得、２  μｌが、１．９９８ｍｌの細胞懸濁液に加わった。
【０１７８】
細胞を、２４時間刺激し、その後、ＴＲＩｚｏｌ試薬に溶解する。ＲＮＡを精製し、標識し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイにハイブリダイズする。
【０１７９】
定量化転写レベルは、正規化単鎖配列（ＳＣＡＮ）、およびデータセットから抽出されたＧＡＲＤ  ＰＡＰＳである。予測モデルの構築に使用された試験サンプルおよび参照サンプルからの非刺激サンプルを使用して、データセット間のバッチ効果を除去することができる。
【０１８０】
最終分類は、ＧＡＲＤ  ＰＡＰＳを構築するために使用される基準サンプル上で訓練されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して行われる。
【０１８１】
細胞株の維持および刺激のための細胞の播種
ＳｅｎｚａＣｅｌｌ細胞株は、記載される（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ように、２０％（体積／体積）ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）および４０  ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を補充した、α−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）において維持され得る。拡張中の培地交換は、３〜４日ごとか、または細胞密度が５〜６００．０００細胞／ｍｌを超えた場合に行われる。増殖する前駆細胞が、アッセイのために使用され、さらなる分化工程は適用されない。培地交換中、細胞を計数し、２００．０００細胞／ｍｌまで懸濁する。培養物のワーキングストックは、最大２０継代または解凍後２か月間成長させる。細胞の化学的刺激のために、１．８．ｍｌを２２２．０００細胞／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに播種する。刺激のために使用される化合物を、２００  μｌの体積中に加え、インキュベーション中に細胞密度を２００．０００細胞／ｍｌに希釈する。
【０１８２】
表現型分析
化学的刺激の前に、定性的表現型分析を行って、増殖する細胞が未熟な段階にあることを確認する。全ての細胞表面染色および洗浄工程を、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳで行う。細胞を特定のマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）とともに４℃で１５分間インキュベートする。フローサイトメトリーについて、以下のｍＡｂを使用する：ＦＩＴＣ接合ＣＤ１ａ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＣＤ３４、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰＥ接合ＣＤ１４（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＣＤ５４およびＣＤ８０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＦＩＴＣまたはＰＥに接合したマウスＩｇＧ１を、アイソタイプコントロール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）として使用し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞生存率を評価する。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によるデータ取得のために使用される。１０，０００個の事象が取得され、光散乱特性に基づいてゲートが設定され、破片および生存不能な細胞が除外され、アイソタイプコントロールからのシグナルに従って象限が設定される。ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖ３（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、さらにデータ分析を行う。非刺激細胞の参照表現型については、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照されたい。
【０１８３】
化学的取り扱いおよび細胞毒性の評価
全ての化学物質は、化合物の安定性を確保するために、供給者からの指示に従って保存されている。化学物質は、可能であれば水に溶解するか、または疎水性化合物についてはＤＭＳＯに溶解する。多くの化学物質は、細胞に対する毒性効果を有するため、試験物質の細胞毒性効果が監視される。いくつかの化学物質は、細胞培地にほとんど溶解せず、したがって最大可溶性濃度も同様に評価される。試験される化学物質は、１  μＭから細胞培地における最大可溶性濃度の範囲の濃度に滴定される。自由に可溶可能な化合物について、５００  μＭが、滴定範囲の上限として設定されている。細胞刺激のために、化学物質は、ストックＡと呼ばれる、１０００倍のストックの標的ウェル内濃度としてその適切な溶媒に溶解される。ストックＢと呼ばれる１０倍のストックは、１０  μｌのストックＡ〜９９０  μｌの細胞培地を取ることによって調製される。次いで、２００μｌのストックＢを、１．８ｍｌを含むウェルに加え、細胞を播種した。ＤＭＳＯに溶解したサンプルの場合、ＤＭＳＯのウェル内濃度は、よって０．１％になるであろう。３７℃および５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、採取した細胞をＰＩで染色し、フローサイトメーターで分析する。ＰＩネガティブ細胞は生存可能と定義され、滴定範囲の各濃度で刺激された細胞の相対的生存率は、として計算される。
【数１】
2020534825.tif 000113
【０１８４】
毒性化合物について、９０％の相対生存率を生じる濃度（Ｒｖ９０）がＧＡＲＤアッセイに使用され、その理由は、免疫反応を損なうことはないが、この濃度が刺激のために使用される化合物の生物学的利用能を実証することである。非毒性化合物について、５００μＭの濃度が、可能な場合に使用される。細胞培地中に５００  μＭで不溶性である非毒性化合物について、最高可溶性濃度が使用される。これらの３つの基準のいずれが満たされていても、１つの濃度のみがゲノムアッセイに使用されるであろう。任意の所与の化学物質に使用される濃度は、「ＧＡＲＤ入力濃度」と呼ばれる。
【０１８５】
ＧＡＲＤに対する細胞の化学的暴露
アッセイされる化学物質についてのＧＡＲＤ入力濃度が構築されると、細胞は、上記に記載のように再び刺激されるが、今回は、ＧＡＲＤ入力濃度のみを使用する。試験物質の全ての評価を、生物学的三重試験においてアッセイし、異なる時点で、異なる細胞培養物を使用して行った。３７℃および５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、１つのウェルからの細胞を、０．５ｍｌの  ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解し、ＲＮＡが抽出されるまで−２０℃で保存する。並行して、刺激細胞の期待される相対的な生存率に確実に到達するために、刺激細胞の少量サンプルを、ＰＩ染色およびフローサイトメトリーによる分析のために採取する。
【０１８６】
ベンチマークコントロールの準備
キャンペーン内でアッセイされる任意の試験物質に加えて、予測モデルの校正および予測性能の推定を目的として、一連のベンチマークコントロールを行う。各特定のキャンペーンで使用されるベンチマークコントロールの詳細については、この付録が添付されている主な書類を参照されたい。
【０１８７】
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを使用したＲＮＡおよびＧＰＳの定量化の単離
溶解した細胞からのＲＮＡの単離は、市販のキット（Ｄｉｒｅｃｔ−Ｚｏｌ  ＲＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ，Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して行われる。全ＲＮＡは、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を使用して定量化および品質管理される。ＧＰＳ固有のレポータープローブＣｏｄｅＳｅｔ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いたハイブリダイゼーションアッセイでは、合計１００ｎｇのＲＮＡがサンプル入力として使用されている。ハイブリダイズされたＲＮＡ−ＣｏｄｅＳｅｔサンプルは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｐｒｅｐｓｔａｔｉｏｎを使用してチップ上で調製され、ＧＰＳの個々の転写は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇデジタルアナライザー（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）を使用して定量化される。
【０１８８】
データ取得および正規化
生データは、デジタルアナライザーからエクスポートされ、ＧＰＳの個々の転写のカウントは、合計カウントごとのカウントアルゴリズムでシングルチップ正規化される。正規化されたデータは、Ｓ行Ｖ列のマトリックスからなり、Ｓは、ＧＡＲＤキャンペーンにおけるサンプル数を示し、Ｖは、ＧＰＳの定量化された転写の数を示す。
【０１８９】
データ分析−校正されたサポートベクターマシンの決定値の生成
全てのさらなるダウンストリーム分析は、オープンソースの統計環境Ｒで開発されたアプリケーションベースのソフトウェアを使用して行われる。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、ＧＰＳの構築のために使用される履歴データを使用して訓練される（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。特定のＧＡＲＤキャンペーンからの試験物質およびベンチマークコントロールからの全てのサンプルは、訓練されたＳＶＭを使用して予測され、各サンプルにＳＶＭ決定値が割り当てられる。予測因子の性能は、予測されるクラスのベンチマークコントロールの受信者動作特性（ＲＯＣ  ＡＵＣ）の下の領域の同定によって推定される。
【０１９０】
試験物質のＧＡＲＤ分類
ＧＡＲＤ予測モデルは次のように定義される。
試験物質の全ての利用可能な生物学的複製の平均決定値がゼロより大きい場合、試験物質は感作剤として分類される。
【０１９１】
スクリプト
この方法を行うために使用され得るＲコードで記述されたスクリプトの詳細を以下に列挙する。
＃必要なファイル：
＃−ＧＡＲＤ＿ＰＡＰＳ．Ｒ
＃−ｓｕｂｄｉｒ：ｒａｗ＿ａｆｆｙ／における試験サンプルの生のａｆｆｙｍｅｔｒｉｘファイル
＃−非刺激サンプルを記載する新しいデータの注釈ｒａｗ＿ａｆｆｙ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｒｄｓ
＃−ｔｒａｉｎｉｎｇｓｅｔ．ｒｄｓに保存された履歴データ
＃必要な依存関係を読み込む
供給源（‘〜／ＧＡＲＤ＿ＰＡＰＳ．Ｒ’）
＃訓練データを読み取り
訓練＝読み取りＲＤＳ（‘〜／ｔｒａｉｎｉｎｇｓｅｔ．ｒｄｓ’）
＃新しいデータおよび注釈を読み取り
ｎｅｗ＿ｄａｔａ＝ｒｅａｄ＿ｒａｗ＿ａｆｆｙ（‘〜／ｒａｗ＿ａｆｆｙ／＊．ＣＥＬ’）
ｎｅｗ＿ｄａｔａ＿ｒｅｆ＝ｒｅａｄＲＤＳ（‘〜／ｒａｗ＿ａｆｆｙ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｒｄｓ’）
＃新しいデータを正規化する
ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＿ｄａｔａ＝ｎｏｒｍａｌｉｚｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｔｅｓｔ（ｔｒａｉｎ＝ｔｒａｉｎ，ｔｅｓｔ＝ｎｅｗ＿ｄａｔａ，ｔｅｓｔ＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＝ｎｅｗ＿ｄａｔａ＿ｒｅｆ）
＃履歴データ上でモデルを訓練する
モデル＝ｔｒａｉｎ＿ｓｖｍ（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＿ｄａｔａ＄ｔｒａｉｎ）
＃新しいサンプルを予測する
予測＝ｐｒｅｄｉｃｔ＿ｔｅｓｔ＿ｓａｍｐｌｅｓ（ｍｏｄｅｌ＝ｍｏｄｅｌ，ｄａｔａ＝ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＿ｄａｔａ＄ｔｅｓｔ）
【表１２−１】
2020534825.tif 000114
【表１２−２】
2020534825.tif 000115
【表１２−３】
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【表１２−４】
2020534825.tif 000117
【表１２−５】
2020534825.tif 000118
【表１２−６】
2020534825.tif 000119
【表１２−７】
2020534825.tif 000120
【表１２−８】
2020534825.tif 000121
【表１２−９】
2020534825.tif 000122
【表１２−１０】
2020534825.tif 000123
【表１２−１１】
2020534825.tif 000124
【表１２−１２】
2020534825.tif 000125
【表１２−１３】
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【表１２−１４】
2020534825.tif 000127
【表１２−１５】
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【表１２−１６】
2020534825.tif 000129
【表１２−１７】
2020534825.tif 000130
【表１２−１８】
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【表１２−１９】
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【表１２−２０】
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【表１２−２１】
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【表１２−２２】
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【表１２−２３】
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【表１２−２４】
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【表１２−２５】
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【表１２−２６】
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【表１２−２７】
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【表１２−２８】
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【表１２−２９】
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【表１２−３０】
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【表１２−３１】
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【表１２−３２】
2020534825.tif 000145
【表１２−３３】
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【表１２−３４】
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【表１２−３５】
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【表１２−３６】
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【表１２−３７】
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【表１２−３８】
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【表１２−３９】
2020534825.tif 000152
【表１２−４０】
2020534825.tif 000153
【表１２−４１】
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【表１２−４２】
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【表１２−４３】
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【表１２−４４】
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【表１２−４５】
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【表１２−４６】
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【表１２−４７】
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【表１２−４８】
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【表１２−４９】
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【表１２−５０】
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【表１２−５１】
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【表１２−５２】
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【表１２−５３】
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【表１２−５４】
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【表１２−５５】
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【表１２−５６】
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【表１２−５７】
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【表１２−５８】
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【０１９２】
参照文献
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３．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｆ．２０１５．Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ７２：２−１０．
４．ＭｃＦａｄｄｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｐ．Ｐｕａｎｇｐｅｔ，Ｄ．Ａ．Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｄｅａｒｍａｎ，ａｎｄ  Ｉ．Ｋｉｍｂｅｒ．２０１３．Ｗｈｙ  ｄｏｅｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｅｘｉｓｔ？Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １６８：６９２−６９９．
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６．Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．Ａｌｅｐｅｅ，Ｔ．Ａｓｈｉｋａｇａ，Ｊ．Ｂａｒｒｏｓｏ，Ｃ．Ｅｌｃｏｍｂｅ，Ｎ．Ｇｅｌｌａｔｌｙ，Ｖ．Ｇａｌｂｉａｔｉ，Ｓ．Ｇｉｂｂｓ，Ｈ．Ｇｒｏｕｘ，Ｊ．Ｈｉｂａｔａｌｌａｈ，Ｄ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｋｅｒｎ，Ｍ．Ｋｌａｒｉｃ，Ｓ．Ｋｏｌｌｅ，Ｊ．Ｋｕｅｈｎｌ，Ｎ．Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ，Ｍ．Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ，Ｍ．Ｍｉｌｌｅｔ，Ｓ．Ｍａｒｔｉｎｏｚｚｉ−Ｔｅｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｎａｔｓｃｈ，Ｄ．Ｐｅｔｅｒｓｏｈｎ，Ｉ．Ｐｉｋｅ，Ｈ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ａ．Ｓｃｈｅｐｋｙ，Ｍ．Ｔａｉｌｈａｒｄａｔ，Ｍ．Ｔｅｍｐｌｉｅｒ，Ｅ．ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ，ａｎｄ  Ｇ．Ｍａｘｗｅｌｌ．２０１５．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｓａｆｅｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２９：２５９−２７０．
７．Ｓｔｅｉｌｉｎｇ，Ｗ．２０１６．Ｓａｆｅｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｒｅｇａｒｄｉｎｇ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｋｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ３：１４．
８．Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｃ．Ｃ．Ｓｏｍｂｒｏｅｋ，Ｔ．Ｄ．Ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｌ，Ｙ．Ｍ．Ｇｒａｕｓ，Ｈ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ｓ．Ｍ．Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ，Ｈ．Ｍ．Ｐｉｎｅｄｏ，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｓｃｈｅｐｅｒ．２００２．ＭＵＴＺ−３，ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＣＤ３４＋ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １００：７０１−７０３．
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１０．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｍ．Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ，Ａ．−Ｓ．Ａｌｂｒｅｋｔ，ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ．２０１１．Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２：１−１９．
１１．Ｇｅｒａｇｈｔｙ，Ｒ．Ｊ．，Ａ．Ｃａｐｅｓ−Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｉ．Ｋｎｅｚｅｖｉｃ，Ｒ．Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ，Ｊ．Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｇ．Ｎ．Ｓｔａｃｅｙ，Ｐ．Ｔｈｒａｖｅｓ，ａｎｄ  Ｍ．Ｖｉａｓ．２０１４．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １１１：１０２１−１０４６．
１２．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｊ．，Ｄ．Ｅｕｗａｒｔ，Ｂ．Ｍｅｉ，Ｓ．Ｅｓｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ｋｓｈｉｒｓａｇａｒ．２０１５．Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：１−１３．
１３．Ｋａｕｒ，Ｇ．，ａｎｄＪ．Ｍ．Ｄｕｆｏｕｒ．２０１２．Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：Ｖａｌｕａｂｌｅ  ｔｏｏｌｓ  ｏｒ  ｕｓｅｌｅｓｓ  ａｒｔｉｆａｃｔｓ．Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２：１−５．
１４．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｐ．，Ｄ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｙ．Ｒｅｉｄ，Ｈ．Ｐａｒｋｅｓ，ａｎｄ  Ｃ．Ｇｅｌｂｅｒ．２００７．Ｔｈｅ  ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ，ｏｖｅｒ−ｐａｓｓａｇｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：ｈｏｗ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｎｅｅｄ？ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３：５７５，５７７−５７８，５８１−５７２  ｐａｓｓｉｍ．
１５．Ｔｅａｍ，Ｒ．Ｃ．２０１５．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．｛Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．
１６．Ｈｅｎｎｉｇ，Ｃ．２１０５．ｆｐｃ：Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．
１７．ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．，Ｍ．Ｈａｎｎａ，Ｅ．Ｂａｎｋｓ，Ａ．Ｓｉｖａｃｈｅｎｋｏ，Ｋ．Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ａ．Ｋｅｒｎｙｔｓｋｙ，Ｋ．Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｄ．Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｍ．Ｄａｌｙ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．ＤｅＰｒｉｓｔｏ．２０１０．Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ：ａ  ＭａｐＲｅｄｕｃｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０．
１８．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ａｕｗｅｒａ，Ｇ．Ａ．，Ｍ．Ｏ．Ｃａｒｎｅｉｒｏ，Ｃ．Ｈａｒｔｌ，Ｒ．Ｐｏｐｌｉｎ，Ｇ．ｄｅｌ  Ａｎｇｅｌ，Ａ．Ｌｅｖｙ−Ｍｏｏｎｓｈｉｎｅ，Ｔ．Ｊｏｒｄａｎ，Ｋ．Ｓｈａｋｉｒ，Ｄ．Ｒｏａｚｅｎ，Ｊ．Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｅ．Ｂａｎｋｓ，Ｋ．Ｖ．Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｄ．Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｇａｂｒｉｅｌ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．ＤｅＰｒｉｓｔｏ．２０１３．Ｆｒｏｍ  ＦａｓｔＱ  ｄａｔａ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｓ：ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｅｄｉｔｏｒａｌ  ｂｏａｒｄ，Ａｎｄｒｅａｓ  Ｄ．Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ．．．［ｅｔ  ａｌ．]１１：１１．１０．１１−１１．１０．３３．
１９．Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，Ｐ．，Ａ．Ｐｌａｔｔｓ，Ｌ．Ｗａｎｇ  ｌｅ，Ｍ．Ｃｏｏｎ，Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｌａｎｄ，Ｘ．Ｌｕ，ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｒｕｄｅｎ．２０１２．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳｎｐＥｆｆ：ＳＮＰｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｗ１１１８；  ｉｓｏ−２；  ｉｓｏ−３．Ｆｌｙ  ６：８０−９２．
２０．Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，Ｐ．，Ｖ．Ｍ．Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ｃｏｏｎ，Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ｌａｎｄ，Ｄ．Ｍ．Ｒｕｄｅｎ，ａｎｄ  Ｘ．Ｌｕ．２０１２．Ｕｓｉｎｇ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅｗ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ＳｎｐＳｉｆｔ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：３５．
２１．Ｃａｒｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｅ．Ｎ．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｋ．Ｂｒａｅｋｋａｎ，Ｋ．Ｊｅｐｓｅｎ，Ｊ．−Ｂ．Ｈａｎｓｅｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ａ．Ｆｒａｚｅｒ．２０１４．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｄａｔａ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：１−１５．
２２．Ｍｉ，Ｈ．，Ａ．Ｍｕｒｕｇａｎｕｊａｎ，Ｊ．Ｔ．Ｃａｓａｇｒａｎｄｅ，ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ．２０１３．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＰＡＮＴＨＥＲ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：１５５１−１５６６．
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２６．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｄ．Ｊ．ＭｃＣａｒｔｈｙ，ａｎｄ  Ｇ．Ｋ．Ｓｍｙｔｈ．２０１０．ｅｄｇｅＲ：ａ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２６：１３９−１４０．
２７．Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｗ．Ｈｕｂｅｒ，ａｎｄ  Ｓ．Ａｎｄｅｒｓ．２０１４．Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ＤＥＳｅｑ２．ｂｉｏＲｘｉｖ．
２８．Ｔａｒｃａ，Ａ．Ｌ．，Ｓ．Ｄｒａｇｈｉｃｉ，Ｐ．Ｋｈａｔｒｉ，Ｓ．Ｓ．Ｈａｓｓａｎ，Ｐ．Ｍｉｔｔａｌ，Ｊ．−ｓ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｐ．Ｋｕｓａｎｏｖｉｃ，ａｎｄ  Ｒ．Ｒｏｍｅｒｏ．２００９．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｍｐａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２５：７５−８２．
２９．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｇｏｔｏ．２０００．ＫＥＧＧ：ｋｙｏｔｏ  ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２７−３０．
３０．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，Ｙ．Ｓａｔｏ，Ｍ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｍ．Ｆｕｒｕｍｉｃｈｉ，ａｎｄ  Ｍ．Ｔａｎａｂｅ．２０１６．ＫＥＧＧ  ａｓ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：Ｄ４５７−４６２．
３１．Ｋｗｉｅｃｉｅｎ，Ｒ．，Ａ．Ｋｏｐｐ−Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｂｌｅｔｔｎｅｒ．２０１１．Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐａｒｔ  １６  ｏｆ  ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ａｒｚｔｅｂｌａｔｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １０８：５１５−５２１．
３２．Ｄａｖｉｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｅ．Ｄ．，Ｋｕｒｔ  Ｈｏｒｎｉｋ，Ａｎｄｒｅａｓ  Ｗｅｉｎｇｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｌｅｉｓｃｈ．２０１５．ｅ１０７１：Ｍｉｓｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ．
３３．Ｈａｎｅｋｅ，Ｋ．Ｅ．，Ｒ．Ｒ．Ｔｉｃｅ，Ｂ．Ｌ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｂ．Ｈ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ，ａｎｄ  Ｗ．Ｓ．Ｓｔｏｋｅｓ．２００１．ＩＣＣＶＡＭ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ．Ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｉｎｔｅｒａｇｅｎｃｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３４：２７４−２８６．
３４．Ｕｒｂｉｓｃｈ，Ｄ．，Ａ．Ｍｅｈｌｉｎｇ，Ｋ．Ｇｕｔｈ，Ｔ．Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．Ｈｏｎａｒｖａｒ，Ｓ．Ｋｏｌｌｅ，Ｒ．Ｌａｎｄｓｉｅｄｅｌ，Ｊ．Ｊａｗｏｒｓｋａ，Ｐ．Ｓ．Ｋｅｒｎ，Ｆ．Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ，Ａ．Ｎａｔｓｃｈ，Ｒ．Ｅｍｔｅｒ，Ｔ．Ａｓｈｉｋａｇａ，Ｍ．Ｍｉｙａｚａｗａ，ａｎｄ  Ｈ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．２０１５．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｈａｚａｒｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７１：３３７−３５１．
３５．Ｓａｎｔｅｇｏｅｔｓ，Ｓ．Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ａ．Ｊ．Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｓ，Ｓ．Ｍ．Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，Ｄ．Ｍ．Ｆｌｕｉｔｓｍａ，Ａ．Ｊ．Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ，Ｈ．Ｍ．Ｐｉｎｅｄｏ，Ｒ．Ｊ．Ｓｃｈｅｐｅｒ，ａｎｄ  Ｔ．Ｄ．ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｌ．２００６．Ａ  ＣＤ３４＋ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８０：１３３７−１３４４．
３６．Ｋｉｍ，Ｋ．Ｄ．，Ｓ．−Ｃ．Ｃｈｏｉ，Ｙ．−Ｗ．Ｎｏｈ，Ｊ．Ｗ．Ｋｉｍ，Ｓ．−Ｇ．Ｐａｉｋ，Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｋ．Ｉ．Ｋｉｍ，ａｎｄ  Ｊ．−Ｓ．Ｌｉｍ．００００．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｏ  ＬＰＳ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３８：７２−８４．
３７．Ｒａｓａｉｙａａｈ，Ｊ．，Ｍ．Ｎｏｕｒｓａｄｅｇｈｉ，Ｐ．Ｋｅｌｌａｍ，ａｎｄ  Ｂ．Ｃｈａｉｎ．２００９．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＭＵＴＺ−３  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｌｉｎｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２７：４２９−４４１．
３８．Ｆａｎｇｅｒ，Ｎ．Ａ．，Ｋ．Ｗａｒｄｗｅｌｌ，Ｌ．Ｓｈｅｎ，Ｔ．Ｆ．Ｔｅｄｄｅｒ，ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｇｕｙｒｅ．１９９６．Ｔｙｐｅ  Ｉ（ＣＤ６４）ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ（ＣＤ３２）Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：５４１−５４８．
３９．Ｉｗａｓａｋｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ．２００４．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：９８７−９９５．
４０．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．，Ｐ．Ｐｒｅｓｔｏｎ−Ｈｕｒｌｂｕｒｔ，ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ．１９９７．Ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｔｏｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３９４−３９７．
４１．Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓ．Ａｋｉｒａ．２００５．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１４．
４２．Ｇａｄｈｏｕｍ，Ｓ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ．２００８．Ｌｅｗｉｓ  ｘ／ＣＤ１５  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：７５１−７５７．
４３．Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｃ．２０１５．Ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２６：６８−７４．
４４．Ｎｕｇｏｌｉ，Ｍ．，Ｐ．Ｃｈｕｃｈａｎａ，Ｊ．Ｖｅｎｄｒｅｌｌ，Ｂ．Ｏｒｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ｕｒｓｕｌｅ，Ｃ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｅ．Ｊ．Ｄｏｕｚｅｒｙ，Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｔｈｅｉｌｌｅｔ．２００３．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＭＣＦ−７  ｓｕｂｌｉｎｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：１−１２．
４５．Ｒａｍｓａｙ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｇｏｎｄａ．２００８．ＭＹＢ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ８：５２３−５３４．
４６．Ｌｏｇａｎ，Ｃ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｎｕｓｓｅ．２００４．Ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：７８１−８１０．
４７．Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．２００８．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：５２３−５２７．
４８．Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．２０００．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４：１８３７−１８５１．
４９．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｔ．Ｇ．Ｏ．２０１５．Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ｇｏｉｎｇ  ｆｏｒｗａｒｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３：Ｄ１０４９−Ｄ１０５６．
５０．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｇ．，Ｆ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｔ．Ｂｅｅｒｓ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．Ｘｕ，Ｍ．Ｋａｒａｎｄｉｋａｒ，Ｋ．Ｂｅｒｍａｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｃｏｂｂ．２００１．Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２２：１５３−１８３．
５１．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｔ．２００９．Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−κＢ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：ａ００１６５１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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