(57)【要約】  本発明は、好ましくはエタノールと共同する、シクロデキストリンを用いるバイオプロテーゼ組織の処理に関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオプロテーゼ組織、特に心臓血管のプロテーゼのために使用される生物学的組織を処理するための方法であって、バイオプロテーゼ組織からリン脂質をそれ自体で除去できるシクロデキストリンの使用を含む、前記方法。
【請求項２】
シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオプロテーゼ組織の石灰化を低減させるための、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルデヒドフリー溶液中にバイオプロテーゼを保存するために、バイオプロテーゼ組織の残留毒性を低減させるための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
組織の脱水を達成するためのポリエチレングリコール、および滅菌のためのエチレンオキシドと共同する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
すすぎ工程をさらに含み、シクロデキストリンは、組織から残存する遊離アルデヒド分子を除去するために使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
シクロデキストリンは、以下の群：γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、硫酸化β−シクロデキストリン、マルトシルβ−シクロデキストリン
で選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
エタノールの使用をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
エタノールおよびシクロデキストリンは、同時に使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
エタノールの後に、シクロデキストリンを連続的に使用する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
シクロデキストリンの後に、エタノールを連続的に使用する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
架橋プロセスを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
架橋プロセスは、シクロデキストリンの使用後に起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
シクロデキストリンの第２の使用を含み、該第２の使用が、架橋プロセスの後に起こる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
架橋プロセスは、シクロデキストリンの使用前に起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
バイオプロテーゼ組織、特に心臓血管の組織を処理するための生成物であって、シクロデキストリンを含む、前記生成物。
【請求項１７】
シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンである、請求項１６に記載の生成物。
【請求項１８】
エタノールをさらに含む、請求項１６または１７に記載の生成物。
【請求項１９】
バイオプロテーゼ組織を処理するためのキットであって、２つの別個の生成物、すなわちシクロデキストリンを含有する第１の生成物と、エタノールを含有する第２の生成物とを含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオプロテーゼ組織の、特に、心臓血管のバイオプロテーゼに使用される生物学的組織の処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
石灰化は、グルタルアルデヒドで前処理されたウシ心膜またはブタ大動脈弁由来の、バイオプロテーゼ心臓弁の不全の主原因の１つである１−３。そのような前処理は、例えば、特許文献１に開示されている。このタイプの病的石灰化のメカニズムは、完全には理解されていない。動物モデルでは、初期のカルシウム核形成部位は、失活した細胞の、細胞膜、核、およびミトコンドリアのような細胞内小器官であることが示されてきた。移植の継続時間が増大すると、細胞に関連する石灰性沈着物のサイズおよび数が増大する。尖（ｃｕｓｐｓ）の直接的なコラーゲン性石灰化および大動脈壁のエラスチン石灰化が、その後起こる。レシピエントが幼齢である場合のような様々な宿主因子、およびグルタルアルデヒド固定のような移植因子も、石灰化事象を悪化させる。
【０００３】
生物学的組織は、現在、長期的移植のために、主に心臓血管の分野で、バイオプロテーゼを製造するために多く使用されている。典型的には、心臓血管のバイオプロテーゼのために使用される生物学的組織は、主にウシまたはブタ組織由来の異種移植片（例えば、自己弁、心嚢、血管、腱等…）が代表的である。これらの生物学的組織は、バイオプロテーゼを製造するために使用され、その後移植される前に、あらゆる異物組織応答または免疫学的組織応答を回避または軽減するために、化学的に処理されなければならない。
【０００４】
典型的には、この研究分野では、生物学的組織は、コラーゲンおよびエラスチン繊維をともに結合し、細胞外マトリックスを安定させることを目的とする「架橋」と呼ばれる化学反応により、化学的に安定化させられる。架橋処理は、その必要な長期耐久性を与えるために、組織の機械的特性を増大させる利点も有する。この最後の態様は、心膜組織、または大動脈、僧帽弁、三尖弁、もしくは肺の病的なヒト弁と置き換える、心臓弁バイオプロテーゼを組み立てるために使用される自己動物弁の尖に対して、特に関心が持たれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，９３１，９６９号（Ｂａｘｔｅｒ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
架橋化学反応は、過去５０年、多くの研究の主題であった。様々な分子を使用するいくつかの方法が適用されてきたが、最近でも依然として使用され、心臓弁製造業者により多く適用されているものは、グルタルアルデヒドである。
【０００７】
しかしながら、グルタルアルデヒドの架橋または固定反応は、グルタルアルデヒドの遊離アルデヒド基、リン脂質、脂肪酸、およびコレステロールと、生物学的組織の残存抗原性との間の化学プロセスが原因で、異栄養性石灰化を促進する１、２、３。基礎研究による長年にわたる相当な努力は、グルタルアルデヒド固定された異種移植片組織の石灰化を防止する組織治療プロセスの開発を対象としてきた。主な抗石灰化戦略は、脂質を抽出すること４、または毒性アルデヒド残留物を中和すること５を目的とする。グルタルアルデヒド固定された異種移植片は、細胞性／体液性拒絶反応を有しており、二次的に石灰化す
る３。生体弁石灰化は、主として失活させられた残留細胞内でも発生する１。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
シクロデキストリン
シクロデキストリンの構造的態様
シクロデキストリンは、α−１，４グリコシド結合と一緒に接合され、閉じて円錐環形態（図１）を生じさせる、Ｄ−（＋）グルコピラノースの６、７、または８つのモノマーにより構成された環状天然オリゴ糖である。３つの最も一般的な形状は、α−ＣＤ（６単位）、β−ＣＤ（７単位）、およびγ−ＣＤ（８単位）である。
【０００９】
これらの巨大分子は、分子内水素結合の形成のおかげで、ＣＨ２ＯＨ基を含む外部表面、および疎水性の特徴を有する内部空洞を備える、トロイダルタイプの三次元剛構造をとる。最後のものは、シクロデキストリンを構成する単位の数に依存する寸法を有する６。
【００１０】
親水性のアルコール官能基に由来する水溶性と一緒にその空洞が存在することにより、シクロデキストリンに、水溶液中での複合体形成の能力が与えられる。
【００１１】
室温では、シクロデキストリンは、無臭で、優しい甘味を有する、結晶状の白色粉体の態様である。
【００１２】
その三次元構造は、外部境界にヒドロキシル基を留める一方で、空洞内には、水素および酸素の結合しか存在しない。この条件により、中央の空洞の疎水性の特徴が生み出される一方で、外部表面は親水性である。このように、シクロデキストリンは、空洞の内側に疎水性分子をホストするおよび同時に水溶性である可能性を獲得する。それどころか、外部表面に存在するヒドロキシル基は、溶液中に最終的に存在するアルデヒド基と連結できる。
【００１３】
このことが、疎水性物質の水溶性を増大させるというシクロデキストリンの能力を説明する。都合の良い極性および寸法の分子が内部のシクロデキストリン空洞へとホストされるときに、超分子包接複合体が作成される。包接物を生成する押力は、立体嵌合、疎水性効果、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、および水素の連結のような様々な寄与に関与している。シクロデキストリンが「ホスト」と呼ばれる一方で、シクロデキストリンの空洞へとホストされる物質は「ゲスト」と呼ばれる。
【００１４】
包接複合体形成の第２の利点は、薬物安定性、バイオアベイラビリティ、経口投与、および生体膜または細胞との薬物相互作用を改善させるような多くの様式で、目的の分子（より正確には、本発明者らの場合における「薬物」）の特性を大幅に改変することにある。この後者の利点により、シクロデキストリンが、これほど大きな注目を集め、食品、化粧品、環境工学から、化学的、薬学的な生産および開発までの多くの産業領域で世界的に売買された理由が、容易に説明できる。
【００１５】
シクロデキストリンのうち、最も使用されたものはβファミリーであるが、これは、αファミリーがあまりにも小さな空洞しか持たない一方で、γファミリーが非常に効果的であるにもかかわらず、製造コストが非常に高いためである。
【００１６】
β−シクロデキストリン（図３）は、経口投与される場合に毒性がないおかげで、薬学的分野で使用できる。この分野では、それらは、特に水溶性が増大したおかげで、いくつかの薬物の不快な風味を隠し、固体化合物内に液体化合物を覆い、さらに、多くの薬物のバイオアベイラビリティプロファイルを改善するというホスト性能のおかげで、しばしば使用される。
【００１７】
天然のβ−シクロデキストリンは、腎毒性であるので非経口投与に使用できないが、これらのシクロデキストリンのヒドロキシプロピル誘導体（ＨＰ  β−ＣＤ）（Ｃａｖａｓｏｌ（登録商標）として商業的に公知）、およびα−シクロデキストリンは、いかなる毒性も示さず、完全に非水溶性の薬物の製剤化を可能とするので、非経口投与に使用できる（図２）。
【００１８】
これに反して、メチル化β−シクロデキストリン（Ｍ  β−シクロデキストリン）は、親水性シクロデキストリン誘導体よりも、膜とより容易に相互作用するが、非経口投与に適切ではなく、多少脂肪親和性であっても、無作為に、脂肪親和性膜に容易に浸透することはない。
【００１９】
スルホブチルエーテル７β−シクロデキストリン（ＳＢＥ７  β−ＣＤ）７は、ごく最近になって合成された別のβ−シクロデキストリンである。ＳＢＥ７  β−ＣＤは、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）としての市販されている、β−シクロデキストリンの高水溶性誘導体である。ＳＢＥ７  β−ＣＤの水溶性（２５℃で、約７０ｇ／１００ｍｌ）は、親のβ−シクロデキストリン（２５℃で、１．８５ｇ／１００ｍｌ）よりも著しく高い。それは、非経口的使用に既に認可されており、その高い溶解性のおかげで、ＨＰ  β−ＣＤよりもさらに効果的である可能性がある。したがって、ＳＢＥ７  β−シクロデキストリンは、ＨＰ  β−シクロデキストリンの有望な代替品である可能性がある。ここで、以下の図４に、ＳＢＥ７  β−シクロデキストリンの３つの異性体構造の構造を表す。
【００２０】
シクロデキストリンおよび誘導体の毒性プロファイルは、広範囲に評価されてきた９。経口投与した場合、シクロデキストリンは、腸関門を超えないので、一般的に安全であると考えられているが、同じシクロデキストリン関して、投与経路によって、天然のβ−シクロデキストリンで実証されるようなその毒性を改変でき、動物に経口投与した後には、国際化学物質安全性計画（ＩＰＣＳ；ＷＨＯ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３２）により、一日摂取許容量が５ｍｇ／ｋｇ体重に制限されるので、限定的な毒性しか示さないが、より高用量での非経口または皮下の注射は、近位尿細管に影響を与える腎毒性となる。生物からシクロデキストリンクリアランスの機序もまた、投与経路に依存する。例えば、ＨＰ  β−シクロデキストリンは、主に、ラットの静脈内注射後に、腎臓の糸球体濾過により取り除かれ、尿へと排泄されるが、経口投与では、主に、ラットおよびイヌにおいて糞便を介して排泄される。
【００２１】
要約すると、全ての毒性研究は、経口投与されたシクロデキストリンが、胃腸管からの吸収不足が原因で、実際には非毒性であることを実証してきた。さらに、いくつかの安全性評価は、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、硫酸化β−シクロデキストリン、およびマルトシルβ−シクロデキストリンが、非経口投与された場合でさえ安全であると思われることを示してきた８。
【００２２】
シクロデキストリンの作用機序
薬学的分野では、商業的目的の新規なシクロデキストリンベースの技術は、絶えず開発されており、主に、薬物送達、生物学的安全性、および治療効率に関して、シクロデキストリンの生物学的パフォーマンスが好まれている９。これらの新規なシクロデキストリンは、主に、天然のβ−シクロデキストリンに由来し、それらの特性は、主に、それらの置換の程度に依存する（図５）。これらは、神経変性障害およびアテローム動脈硬化症の処置のために現在評価されている、無作為にメチル化されたβ−シクロデキストリン（１２．６および４つのメチル基をそれぞれ示す、ＲＡＭＥβおよびＫＬＥＰＴＯＳＥ（登録商標）ＣＲＹＳＭＥβ）、β−シクロデキストリン分子に無作為に置換されたヒドロキシプロピル基を含むＨＰ−β−シクロデキストリン、ならびにまた、スルホエチルエーテル−７−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ７−β−シクロデキストリン）のような、メチル化β−シクロデキストリン誘導体を含む。加えて、γ−シクロデキストリンは、Ｓｕｇａｍｍａｄｅｘとは異なり、それらがいかなる過敏症反応も示さなかったので、治療に非常に役立つと証明されてきた。神経脈管遮断薬の効果を逆転させるために麻酔に使用される、この改変されたシクロデキストリンは、一部の患者におけるアレルギー応答に関与してきた。治療剤として、シクロデキストリンおよびそれらの誘導体の作用機序は、２つの様式で起こる可能性がある。第１の様式は、細胞膜に対するシクロデキストリンの直接的な生物作用を意味するが、第２の様式は、むしろ間接的であり、薬物キャリアとして、シクロデキストリンのカプセル封入可能性を使用する。
【００２３】
細胞に対するシクロデキストリンの直接的作用は、脂質二重層の分子組成、したがってそれらの特性を改変する細胞膜から、脂質（コレステロールおよびリン脂質）ならびにいくらかのタンパク質を抽出することにある（図５）。α−シクロデキストリンが、リン脂質を除去し、β−シクロデキストリンが、リン脂質およびコレステロールを抽出するが、γ−シクロデキストリンが、他のシクロデキストリンほど脂質選択的ではないということが説明されてきた。
【００２４】
第２の様式では、シクロデキストリンは、これらの分子が、親水性、疎水性、ならびに親油性の薬物の送達およびバイオアベイラビリティを改善するので、鼻粘膜、肺の関門、眼の関門、皮膚の関門、腸の関門および脳の関門を介する薬物送達キャリアとして広く使用される。
【００２５】
シクロデキストリンはまた、活性薬物化合物と共に複合体へと組み入れられる場合に、バイオコンパティビリティおよび増強されたバイオアベイラビリティを改善するために広範囲に使用され、したがって薬物効能を増強してきた。シクロデキストリンおよび薬物化合物の複合体への組合せは、アテローム動脈硬化症、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患の治療のための研究において適用されてきた。加えて、シクロデキストリンは、例えば、報告されるように、アテローム動脈硬化症におけるコレステロール結晶検出のために、目的の生体分子に対する選択的な結合を可能とするキャリアとして使用できる。
【００２６】
したがって、シクロデキストリンの直接的作用機序は、細胞膜の脂質ラフトからのコレステロールおよびリン脂質の効果的な抽出を促進する、細胞に対する効果を証明した。間接的作用機序は、脂質およびアルデヒド基のより効果的な除去を可能とするシクロデキストリンの複合体形成性能を際立たせる。
【００２７】
エタノール
エタノールは、大動脈プロテーゼ尖のようなバイオプロテーゼ組織、ウシまたはブタ心膜組織の処理のために、長期に移植される場合に異栄養性石灰化のプロセスを緩和することを目的として、数年前から使用されてきた。
【００２８】
エタノールは、通常は、グルタルアルデヒドを用いて得られる架橋処理後に、単独または他の物質と共に処理に適用されてきた。
【００２９】
以下に、エタノール（単独または他の分子と組み合わせる）に基づく異なるバイオプロテーゼ組織の処理に関する科学的概説を示す。抗石灰化法としての、エタノールの、起こり得る作用メカニズムおよび効能を分析した。
【００３０】
グルタルアルデヒド架橋尖の８０．０％エタノールの前処理は、尖サンプルから、ほぼ全てのコレステロールおよびリン脂質を抽出した１０。バイオプロテーゼの失活した細胞に存在するリン脂質は、リン酸エステルの加水分解のため、心臓弁石灰化におけるリンの初期ソースであると仮定されてきた。他の研究では、コレステロールと、動脈硬化プラークにおける石灰化との間にも関連性が見られた。コレステロール値が、年齢と共に累進的に増加し、冠動脈疾患のリスクと直接互いに関連することが示されてきた。コレステロールは、動脈平滑筋細胞における、細胞膜にわたるカルシウム輸送、細胞質ゾルカルシウムレベル、および膜流動性も変える。細胞膜のコレステロール含有量が細胞内の石灰化と互いに関係するメカニズムは、完全には理解されていないままである。
【００３１】
これらのデータは、コラーゲン立体構造におけるエタノールの前処理によりもたらされる変化は安定しており、抗石灰化メカニズムを説明する際に重要である可能性があることを強く示唆する。そのような立体構造の変化が、エタノールの前処理が原因で、観察された脂質またはタンパク質の尖吸着の低減の要因である可能性がある。このことが、バイオプロテーゼ心臓弁石灰化における、コラーゲンに対するタンパク質−タンパク質およびタンパク質−脂質の相互作用、ならびにそれらの役割についてのさらなる研究を正当化する１０。
【００３２】
エタノール処理により誘発された尖コラーゲン立体構造の変化は、持続的であった。加えて、コラゲナーゼによる消化に対する抵抗性があった。したがって、エタノールの前処理によりもたらされた抗石灰化の影響およびコラーゲン立体構造の変化が、より耐久性のあるバイオプロテーゼを生じさせる可能性があると仮定できる１０。
【００３３】
グルタルアルデヒドで架橋されたブタ大動脈弁バイオプロテーゼのエタノールプレインキュベーションは、６０日間のラットの皮下移植およびヒツジの僧帽弁置換（１５０日）の両方において、ブタ大動脈弁尖の石灰化を防止するための非常に効果的な前処理である。エタノールは、骨線細胞（ｂｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ）ならびに線維芽細胞の、カルシウムの細胞代謝におけるその公知の干渉のため、抗石灰化剤として選択された１１、１２。エタノールの存在が、細胞膜を破壊し、多くの細胞活動に影響を及ぼすリン脂質のアシル鎖を無秩序化することが示されてきた１３。さらに、エタノールが、水とのその相互作用が原因で、リン酸カルシウムの核形成および相転移を著しく阻害することが示されてきた１４。バイオプロテーゼ心臓弁尖石灰化のエタノール阻害に関する先の刊行物１５では、８０．０％エタノールの前処理により、グルタルアルデヒド架橋尖から、ほぼ全てのリン脂質およびコレステロールが抽出された。
【００３４】
バイオプロテーゼ心臓弁石灰化の防止におけるエタノールの作用メカニズムを理解するために、葉状部（ｌｅａｆｌｅｔ）サンプルを、前処理前後に、脂質およびコレステロールの含有量の合計に関して分析した。
【００３５】
濃度が５０．０％超のエタノールは、コレステロールおよびリン脂質の両方の非常に効率的な抽出剤であり、図６に記載されているように、両方の抽出はほぼ完全である１５。膜結合リン脂質は、アルカリホスファターゼによる加水分解のために、バイオプロテーゼ心臓弁の無機化の初期段階におけるリンのドナーであると考えられる。石灰化の初期部位であるリン脂質の完全な除去は、エタノールの作用メカニズムを部分的に説明できる。しかしながら、クロロホルム−メタノール（２：１）処理の結果は、この脱脂レジメンが、総コレステロールおよびリン脂質の両方の抽出を完全に生じさせたことを実証した（表１）。
【００３６】
ラット皮下モデルにおいて、移植継続時間を６０日まで延長させた。対照は、重度に石灰化した（カルシウムレベル、２３６±６．１μｇ／ｍｇ組織）。８０．０％エタノールの前処理（ｐＨ７．４で２４時間）は、石灰化の完全な阻害により最も効果的であり、カルシウムレベルは、未移植のバイオプロテーゼ組織に匹敵していた（カルシウムレベル、１．８７±０．２９μｇ／ｍｇ組織）が、６０．０％エタノールの前処理は、部分的に効果的であった（カルシウムレベル、２８．５±１２．０μｇ／ｍｇ組織）。したがって、８０．０％エタノールの前処理は、２１および６０日のラット皮下モデルの両方において、葉状部石灰化を防止するための最良の条件であることが分かった。
【００３７】
エタノールで処理され、かつヒツジモデルに１５０日間移植されたブタ大動脈弁バイオプロテーゼは、表２に記載されるように、対照（グルタルアルデヒド固定葉状部）に対して、葉状部カルシウム蓄積の著しい低減を示した。
【００３８】
【表１】
2020508193.tif 000002
【００３９】
したがって、これらのデータは、脂質の抽出が、エタノールの作用メカニズムにおける役割を担う可能性があるが、脂質の抽出単独では、エタノールの抗石灰化の効能を完全に説明することができず、メタノールが、無機化に影響を及ぼす他の因子を変えている可能性があることを示す（表１）。
【００４０】
【表２】
2020508193.tif 000003
【００４１】
エタノールで処理された組織の応力ひずみ特性は、ブタ組織尖の大動脈弁で評価された１６。この研究は、未処理のブタ大動脈尖の一軸応力ひずみ特性を、グルタルアルデヒド処理された尖のもの、およびグルタルアルデヒドに続くエタノールインキュベーションのものと比較する。
【００４２】
未処理の尖を、対照（Ｃ）として用意した一方で、グルタルアルデヒド処理尖（Ｇ）およびグルタルアルデヒド固定後のエタノール処理された尖（Ｇ＋Ａ）を、試験サンプルとした。
【００４３】
グループ（Ｃ）と（Ｇ＋Ａ）との間には、最大負荷というパラメーターに関して、有意差が存在した（ｐ＝０．００２）。最大応力というパラメーターに関して、グループ（Ｇ＋Ａ）と、グループ（Ｇ）および（Ｃ）の両方との間には、有意差が存在し、ｐ値は、それぞれ０．０４７および０．００７であった。グループ（Ｇ＋Ａ）は、グループ（Ｇ）および（Ｃ）の両方と比較して、応力に対して伸長する能力（最大変位）の増大も示した｛それぞれ、ｐ＝０．０２５およびｐ＝０．０４９｝。グループ（Ｇ＋Ａ）は、グループ（Ｇ）および（Ｃ）の両方と比較して、著しくより高い最大ひずみも示した｛それぞれ、ｐ＝０．００６およびｐ＝０．０２７｝。
【００４４】
グルタルアルデヒド処理組織（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ｔａｎｎｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）のエタノール処理は、グルタルアルデヒド処理後に増大する引張強さを維持するだけではなく、周方向の一軸試験における伸長性も改善する。この物理的特性の変化は、大動脈尖の耐久性の維持を助けることができる。石灰化する傾向の低減、および尖組織が応力に対して延長する能力は、構造的機能障害の防止を容易にすることもある。しかしながら、アルコールで処理されたグルタルアルデヒド処理ブタ大動脈弁の長期的なインビボ耐久性研究を考慮して、この仮説をインビボで試験することが適切であろう。
【００４５】
別の研究では、グルタルアルデヒド架橋に関連するエタノールの抗石灰化効果が評価された。その著者は、低分子量アルコール（メタノール、エタノール、およびイソプロパノール）が、ブタ大動脈弁尖のカルシウム緩和に効果的であったと述べる。エタノール処理後にグルタルアルデヒド中に組織を保存すると、石灰化が部分的に戻り、これにより、組織の石灰化の防止におけるエタノール−グルタルアルデヒドの相互作用に関する役割が示唆された。しかしながら、ブタの尖がエタノール性グルタルアルデヒド（ｅｔｈａｎｏｌｉｃ  Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）中に保存された場合、エタノールの抗石灰化効果は持続した１７。
【００４６】
別の研究であるＣａｒｐｅｎｔｉｅｒ、２００１では、０．６％グルタルアルデヒドで前処理された心膜サンプルに対する、エタノール、エーテル、および界面活性剤の処理の効果が研究された１８。エタノール、エーテル、またはＴｗｅｅｎ８０界面活性剤、およびそれらの組合せが使用されて、脂質の抽出が実行された。処理組織は、５０匹の幼若ラットに、４および６ヶ月間皮下移植された。移植の６ヶ月後、界面活性剤を用いるエタノール、および界面活性剤を用いるエーテルのグループにおいてのみ、カルシウムレベルが、対照グループにおけるよりも著しく低かった。以前の研究では、エタノールがリン脂質の抽出にかなり効果的であり、それらが石灰化のプロセスにおける重要な役割を果たすことが示されていた１０。これに反して、その分析は、エタノールの抽出は、ウシ心膜のトリグリセリドを完全には取り除かないが、エーテルによる抽出が、トリグリセリドを完全に除去したことを示した。しかしながら、これらの２つのグループのカルシウム含有量は、移植６ヶ月後に有意差があることはなく、カルシウム沈着におけるトリグリセリドの役割が重要でないことを暗示した。結論として、エタノールもしくはエーテルによるか、または界面活性剤単独による処理は、これらの処理の組合せほど効率的ではない。処理の組合せがいずれの単一処理よりも効率的であるという事実は、抽出のメカニズム、および各処理により抽出された生成物がわずかに異なることを証明するのに役立つ。この成果の実用的な結論として、バイオプロテーゼ弁の保護の現在使用されている手順では、エタノールの濃度またはインキュベーションの長さを増大させることか、またはエーテル処理を界面活性剤処理に追加することが有益である可能性があると言える。
【００４７】
最も効率的な前処理は、界面活性剤単独（４２．９±１２．７μｇ／ｍｇ乾燥組織）と比較して、エタノールおよび界面活性剤の組合せ（カルシウム含有量：移植６ヶ月後に１５．５±６．８μｇ／ｍｇ乾燥組織）またはエタノール、エーテル、および界面活性剤の組合せ（１３．１±６．２μｇ／ｍｇ乾燥組織）であった。
【００４８】
エタノールの抗石灰化の効果は、いくつかの科学刊行物から十分に明白である。ブタ大動脈尖および心膜組織の両方に対するエタノール処理の効果にもかかわらず、いくらかの細かな残留石灰化が、依然として存在し、研究者に対する、組織における石灰性の異栄養性沈着をさらに緩和するための追加の併用処理の探索への示唆となった。
【００４９】
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ１９は、エタノール処理されたブタ大動脈尖の、水素化ホウ素ナトリウムを用いた後処理を評価した。エタノールの前処理は、対照（１３．３＋／−５．６対１１９．２＋／−６．６  Ｃａ  μｇ／ｍｇ組織；ｐ＜０．００１）と比較して、石灰化を著しく阻害した。しかしながら、エタノールの前処理と組み合わせられた、最適条件下での水素化ホウ素ナトリウムの還元により、石灰化を最適に低減させた（１．１６＋／−０．１  Ｃａ  μｇ／ｍｇ；ｐ＜０．０５）が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム処理後のレベル（２３．６＋／−１０．４  Ｃａ  μｇ／ｍｇ）は、エタノール単独処理後のレベルと有意差はなかった。どちらの還元剤も、エタノールの前処理なしでは、石灰化を阻害するのに効果的ではなかった。
【００５０】
他の数人の著者２０は、他のアミノ酸と一緒に、リン脂質溶媒としてエタノールを採用して、心膜組織を解毒した。ウシ心膜サンプルのグループは、０．５％ＧＡで固定された。ウラゾールおよびグルタメートは、ウシ心膜組織のリン脂質含有量を低減させるために、遊離アルデヒドおよび一部の溶媒（オクタノールまたはオクタンジオールを含むエタノール）を中和するように使用された。ウラゾールおよびグルタメートは、単独で、Ｃａ２＋および無機リン（ＩＰ）の濃度を著しく減少させた（抗石灰化処理を用いずに、Ｃａ２＋：２７７．８５±１７．５１μｇ／ｍｇ；ＩＰ：１４７．０７±８．３２μｇ／ｍｇ）が、有機溶媒と共に使用された場合に、Ｃａ２＋および無機リンの濃度は、最も低かった（Ｃａ２＋：０．０５±０．０４μｇ／ｍｇ；ＩＰ：３．３６±０．６１μｇ／ｍｇ）。
【００５１】
Ｋｉｍ２１により公開された研究の目的は、石灰化および組織弾性の観点から、グルタルアルデヒド処理されたブタ心膜において、エタノールおよびＬ−リジンと比較して、Ｌ−アルギニンおよび水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を使用する同期性の相乗効果（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）を評価することであった。ブタ心膜は、０．６２５％グルタルアルデヒドで固定された（４℃で２日後、室温で７日）。エタノール（８０％；室温で１日）、またはＬ−リジン（０．１Ｍ；３７℃で２日）、またはＬ−アルギニン（０．１Ｍ；３７℃で２日）の中間工程の後に、グルタルアルデヒド固定を完了させた。Ｌ−リジンおよびＮａＢＨ４の前処理（１８３．８±４２．６μｇ／ｍｇ、ｐ＝０．８０４）、ならびにＬ−アルギニンおよびＮａＢＨ４の前処理（１６３．３±２７．５μｇ／ｍｇ、ｐ＝０．６２１）は、対照（１７５．５±４５．３μｇ／ｍｇ）と比較して、著しく石灰化を阻害することはなかったが、エタノールおよびＮａＢＨ４の前処理（３８．５±３７．３μｇ／ｍｇ、ｐ＝０．００３）は、著しく阻害した。最後に、ＮａＢＨ４の前処理は、グルタルアルデヒドで固定されたブタ心膜の石灰化を減少させるように思えたが、エタノールを用いた場合のみであった。
【００５２】
単独またはエタノールと共に塩化アルミニウムの効率を評価して、グルタルアルデヒドに固定され、かつ若年ラットに皮下移植されたブタ大動脈壁の断片で、石灰化および炎症反応を防止するために、別の研究２２が強化された。ブタ大動脈壁のサンプルは、皮下組織に移植された。被検物は、処理の３つの異なる方法に予め供された：Ｉ（グルタルアルデヒド）、ＩＩ（グルタルアルデヒド＋アルミニウム）、ＩＩＩ（グルタルアルデヒド＋エタノール＋アルミニウム）。原子吸光分光法は、グループＩＩおよびＩＩＩの両方に関しては類似のカルシウムレベルを示したが、グループＩより著しく低かった。塩化アルミニウムを用いる処理は、移植後に大動脈壁の被検物の石灰化を阻害し、かつ炎症反応を低減させる。塩化アルミニウムとエタノールを組み合わせた使用はまた、石灰化を阻害し、かつ炎症反応を縮少させるのにより効率的である。
【００５３】
上で議論された文献の概説は、バイオプロテーゼ組織のエタノール処理が、通常は、動物モデルにおける長期的な移植後に、組織の異栄養性石灰化を防止するのに大いに効果的であることを明白に示す。対照に対する組織のカルシウム含有量の低減は、生体材料がエタノールで前処理され、グルタルアルデヒドで架橋した場合、常に著しい。
【００５４】
エタノールは、石灰化を引き起こす要因である主要なものとして特定される細胞膜から脂質ラフト（コレステロールおよびリン脂質）を可溶化し、抽出するのに効果的である。脂質の抽出に関して最も良い効率は、８０％の濃度で得られるが、良好な組織石灰化の低減は、既に５０％の濃度で見て明らかである１５。
【００５５】
代替的な組織架橋処理（トリグリシジルアミン、ゲニピン、ネオマイシン）の適用、またはウラゾール、グルタメート、水素化ホウ素ナトリウム、塩化アルミニウム等のような後処理は、エタノールにと関連している場合にのみ、石灰化の傾向をさらに低減させている。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、一般に、バイオプロテーゼ組織の処理におけるシクロデキストリンの新規かつオリジナルの使用に関する。
【００５７】
この処理でシクロデキストリンを使用することで、移植後に、長期的な機械的かつ生物学的耐久性を有するバイオプロテーゼ組織が提供される。そのような特性は、心臓弁バイオプロテーゼに対して特に重要である。
【００５８】
シクロデキストリンは、分子の大きなファミリーに属するが、本発明に関しては、最も功績があるものは、βファミリーのものである。官能性のβ−シクロデキストリン、ならびに特に、ＨＰ  β−シクロデキストリンおよびＳＢＥ  β−シクロデキストリンは、非経口的使用に認可されている。したがって、それらは、微量に存在する場合でさえ、排出器官に対していかなる被害も与えることなく、所望の化学作用の全てを発現している。
【００５９】
有利には、シクロデキストリンは、エタノールと組み合わせて使用される。
【００６０】
５０％を超える水中濃度のエタノールに基づく組織処理が、リン脂質を抽出するのに大いに効果的であることを実証した。エタノールの効果は、バイオプロテーゼ組織のグルタルアルデヒド架橋と密接に関係する。メカニズムは不明であるが、エタノール処理は、グルタルアルデヒドベースの架橋プロセス後に適用された場合に、より効果的であるように見える。
【００６１】
シクロデキストリンの作用は、脂質分子の一次抽出による直接的なもの、および既に抽出された脂質分子の複合体形成による間接的なものとして表現できる。シクロデキストリンが、エタノールにより既に可溶化されたリン脂質と複合体を形成できるのは、この第２の作用機序による。
【００６２】
一般的に、シクロデキストリンの作用は、生物学的組織に適用された場合、その疎水性の空洞と脂質分子との間の、立体的相互作用または弱い共有結合として説明できる。別の言い方では、これは、いかなる化学反応も起こすことのない、シクロデキストリンと脂質分子との弱い共有結合に関する。
【００６３】
生物学的組織を処理するためのシクロデキストリンの特定の誘導体の使用は、特許出願であるＵＳ２００２／１３７０２４に開示されている。この従来技術は、スルホン化および硫酸化ポリアニオンが、プロテーゼデバイスのために使用される生物学的組織のカルシウム核形成部位を遮断できることを教示する。これらの化学物質の作用メカニズムは、記載されていないが、誰であっても、スルホン化および／または硫酸化された官能基が、カルシウム核形成部位の遮断の要因であるというこの文献の教示から、明確に推論できる。実際のところ、ＵＳ２００２／１３７０２４で報告された例は、スルホン酸／硫酸基のみを共通して有する完全に異なる分子に言及している。ＵＳ２００２／１３７０２４において述べられたポリアニオンの少数の例は、まさにそれらのうちの１つである硫酸化シクロデキストリンである。スルホン酸／硫酸基がカルシウム核形成部位を遮断できるが、これは、おそらくカルシウムアニオンと硫酸アニオンとの間の親和性によることが推測可能である。言い換えれば、リン脂質のリン酸基に対する、硫酸／スルホン酸アニオンの一種の競合作用であり、これは、従来技術において既に周知されているのにも関わらず、カルシウム核形成部位としてＵＳ２００２／１３７０２４で明白に特定されている。
【００６４】
一般的に、シクロデキストリンは、官能性のスルホン酸または硫酸基を含まない。シクロデキストリンが、通常は中性分子であり、イオン化合物ではないことが強調されるべきである。硫酸化シクロデキストリンは、シクロデキストリンのうちの大きいクラスの１つの誘導体にすぎず、官能化は、静脈注射のためのより可溶性または耐容性の分子を得ることを目的としている。したがって、ＵＳ２００２／１３７０２４には、カルシウム核形成部位の遮断剤としてのシクロデキストリン自体の使用を示唆するものは何も存在しない。実際に、ＵＳ２００２／１３７０２４は、カルシウム核形成部位の遮断剤としての、シクロデキストリン自体の使用の阻害要因（ｔｅａｃｈｉｎｇ  ａｗａｙ）でさえある。
【００６５】
本発明では、選択されたシクロデキストリンは、ＵＳ２００２／１３７０２４に記載されたものに対して完全に異なる様式で作用している。シクロデキストリン自体は、リン脂質脂肪鎖を隔離するであろうその疎水性の空洞のおかげで、組織からリン脂質を除去している。
【００６６】
エタノールおよびシクロデキストリンは、任意の順序で、同時にまたは別々に使用できる。
【００６７】
バイオプロテーゼ組織（自己弁尖、ウシまたはブタ心膜組織）は、欠損のないものおよび厚さで選択される。選択されたパッチまたは尖は、あらゆる免疫学的反応または異物組織応答を回避するために、コラーゲンを安定化することを目的とする架橋プロセスに供される。架橋プロセスは、様々な分子で実行できるが、典型的には、０．１％〜１％の間の範囲の濃度のグルタルアルデヒドが、１２時間〜４８時間以上の期間使用される。
【００６８】
好ましくは、組み合わせた脱脂処理（図７）は、ＰＨ７．４の緩衝液中に可溶化した３５％〜８０％の間の濃度のエタノールを、１０ｍＭ〜２００ｍＭのβ−シクロデキストリンと組み合わせて、２５℃〜４０℃の間の範囲の温度で、２時間〜２４時間実施される。
【００６９】
その脱脂処理後に、そのパッチは、半完成または完成組立品に組み立てられ、その後、短鎖アルコール分子が最終的に添加されるアルデヒドベースの溶液で化学的に滅菌される。
【００７０】
その後、完成デバイスは、０．１％〜１％の濃度のアルデヒドからなり、１０％〜５０％の濃度の短鎖アルコール分子が最終的に添加される溶液中に保存される。
【００７１】
移植前にバイオプロテーゼからアルデヒド自由分子を除去することを目的とする組織無害化プロセスを追加するために、移植前のすすぎ手順が実施される。
【００７２】
この移植前のすすぎは、１５℃〜３０℃の温度で、１０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度のβ−シクロデキストリン溶液５００ｍｌの３つのアリコートを用いて実施される。
【００７３】
別の実施形態では、リン脂質抽出は、組織架橋後に、二相に分離した様式で実施できる（図８）。初めに、エタノール処理を実施した後、β−シクロデキストリン処理を実施する。両方の処理は、同じ濃度および図７に記載された条件で実施した。
【００７４】
リン脂質抽出は、図８に記載されるように、同じ濃度および条件で、β−シクロデキストリンに対する暴露を先行した後にエタノール処理を行う反対の様式で実行できる。
【００７５】
エタノールおよびβ−シクロデキストリンの併用処理は、架橋手順（図９）の前にバイオプロテーゼ組織に直接β−シクロデキストリン処理を先行した後に、エタノール溶液を用いて処理することによって実施できる。エタノールおよびβ−シクロデキストリンの濃度は、図７に記載されているものと同じであってもよい。この分けられた処理は、必要に応じて、反対の順序で適用できる。
【００７６】
架橋手順（図９）の前に、β−シクロデキストリン処理を先行するための論理的根拠は、バイオプロテーゼ組織を直接脱脂するシクロデキストリンの直接的活性機序に基づく。これは、これらの分子が動脈血管の動脈硬化プラークからコレステロールおよび他の脂質を抽出できた実験で観察された、シクロデキストリンにより発現された同じ活性抽出性能である（ＦＤＡは、幼児が２〜３歳で動脈硬化プラークと共にコレステロールの異常に高い血漿中濃度を示す、珍しい小児疾患のオーファンドラッグ処置として、シクロデキストリンを認可した）。
【００７７】
別の実施形態では、エタノールおよびシクロデキストリンを用いる先の処理に記載されるようなリン脂質の抽出後に、そのプロセスは、残留アルデヒド分子を効果的な様式で除去することを目的とする、シクロデキストリンに基づくさらなる無害化プロセスを含むことができる（図１０）。この化学的処理の変形形態の目的は、静菌性のアルデヒドフリー保存溶液中にバイオプロテーゼを保存するために必要である。先に記載されたように、保存溶液からアルデヒドを除去することは、グルタルアルデヒド中にバイオプロテーゼを保存することで、エタノール処理から得られた有益な抗石灰化の効果が部分的に無効なる可能性が実証されているため、かなり重要である。これが、先の実施形態において、図７〜９に記載される保存媒体が、特定量の短鎖アルコールが添加されるグルタルアルデヒド溶液に基づく理由である。
【００７８】
バイオプロテーゼ組織処理における重要な前進は、エチレンオキシド滅菌と共同する組織脱水により示される。これは、バイオプロテーゼを、特に経カテーテル手順において折り畳んで使用しなければならない場合に、化学殺菌および操作を回避して、より容易に保存するために行われる。
【００７９】
前に提示された先の処理の実施形態は、可能な変形形態として、組織の脱水手順に関連することもある。図１１の例に関して、脱脂後に、無害化プロセスは、β−シクロデキストリンを用いて実施され、組織からアルデヒド分子を除去する目的で完了する。無害化が完了すると、組織の脱水手順を開始できる。この処理は、８０％から９０％までの範囲の水溶液中のポリエチレングリコール（例えば、ＭＷ１００〜８００）を用いて得られたバイオプロテーゼ組織からの水の段階的除去に基づく。その処理は、２０℃〜５０℃の間の温度で、１２時間〜４８時間実施される。より効果的な脱水を達成するために、短鎖アルコールを、１０％〜２０％の濃度で添加できる。
【００８０】
脱水プロセスは、清浄環境における数時間の組織乾燥で完了する。それは、エチレンオキシドによる滅菌に供される乾燥パッケージ中への、バイオプロテーゼの最終的な保存を可能とする。
【００８１】
上記した全ての処理プロセスは、半完成組立品に対し、または直接最終組み立てされたバイオプロテーゼに対して実施できる。この場合は、そのプロセスは、個々のプロテーゼ処理として適用できる。
【００８２】
参考文献
1.  Schoen FJ, Levy RJ. Calcification of tissue heart valve substitutes: progress toward understanding and prevention. Ann Thorac Surg 2005;79:1072-80.
2.  Konakci KZ, Bohle B, Blumer R, Hoetzenecker W, Roth G, Moser B, Boltz-Nitulescu G, Gorlitzer M, Klepetko W, Wolner E, Ankersmit HJ. Alpha-GAL on bioprostheses: xenograft immune response in cardiac surgery. Eur J Clin Invest 2005;35:17-23.
3.  Manji RA, Zhu LF, Nijjar NK, Rayner DC, Korbutt GS, Churchill TA, Rajotte RV, Koshal A, Ross DB. Glutaraldehyde-fixed bioprosthetic heart valve conduits calcify and fail from xenograft rejection. Circulation 2006;114:318-27.
4.  Vyavahare N, Hirsch D, Lerner E, Baskin JZ, Schoen FJ, Bianco R, Kruth HS, Zand R, Levy RJ. Prevention of bioprosthetic heart valve calcification by ethanol preincubation. Efficacy and mechanisms. Circulation 1997;95:479-88.
5.  Jorge-Herrero E, Ferna'ndez P, Escudero C, Garci'a-Pa'ez JM, Castilo-Olivares JL. Calcification of pericardial tissue pretreated with different amino acids. Biomaterials 1996;17:571-5.
6.  Bina Gidwani, Amber Vyas. A comprehensive review on cyclodextrin-based carriers for celivery of chemotherapeutic cytotoxic anticancer drugs. BioMed Research International Volume 2015, Article ID 198268, 15 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/198268.
7.  Ankitkumar S. Jain, Abhijit A. Date, Raghuvir R. S. Pissurlenkar, Evans C. Coutinho, Mangal S. Nagarsenker. Sulfobutyl Ether7β-Cyclodextrin (SBE7 β-CD) Carbamazepine complex: preparation, characterization, molecular modeling, and evaluation of in vivo anti-epileptic activity. AAPS PharmSciTech, Vol. 12, No. 4, December 2011; 1163-75.
8.  E.M. Martin Del Valle. Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochemistry 39 (2004) 1033-1046.
9.  Caroline Coisne, Sebastien Tilloy, Eric Monflier, Daniel Wils, Laurence Fenart, Fabien Gosselet. Cyclodextrins as emerging therapeutic tools in the treatment of cholesterol-associated vascular and neurodegenerative diseases. Molecules 2016, 21, 1748.
10.  Narendra R. Vyavahare, Danielle Hirsch, Eyal Lerner, Jonathan Z. Baskin, Robert Zand, Frederick J. Schoen, Robert J. Levy. Prevention of calcification of glutaraldehyde-crosslinked porcine aortic cusps by ethanol preincubation: Mechanistic studies of protein structure and water-biomaterial relationships. J Biomed Mater Res, 40, 577-585, 1998.
11.  W. K. Ramp and D. N. Demaree, ‘‘Inhibition of net calcium efflux from bone by ethanol in vitro,’’ Am. J. Physiol., 246, C30- C36 (1984).
12.  K. E. Friday and G. A. Howard, ‘‘Ethanol inhibits human bone cell proliferation and function in vitro,’’ Metabolism, 40, 562-565 (1991).
13.  E. Rubin and R. Hagai, ‘‘Ethanol-induced injury and adaptation in biological membranes,’’ Fed. Proc., 41, 2465-2471 (1982).
14.  M. S. Tung and T. J. O’Farrell. The effect of ethanol on the solubility of
dicalcium phosphate dihydrate in the system Ca(OH)2-H3PO4-H2O at 37°C. J. Mol.
Liq., 56, 237-243 (1993).
15.  Narendra Vyavahare, Danielle Hirsch, Eyal Lerner, Jonathan Z. Baskin, Frede
rick J. Schoen, Richard Bianco, Howard S. Kruth, Robert Zand, Robert J. Levy. Prevention of bioprosthetic heart valve calcification by ethanol preincubation. Circulation. 1997;95:479-488.
16.  Anil Madhav Patwardhan, M.Ch., Pradeep Vaideeswar. Stress strain characteristics of glutaraldehyde treated porcine aortic valve tissue following ethanol treatment. IJTCVS 2004; 20: 67-71.
17.  Vyavahare NR, Jones PL, Hirsch D, Levy RJ. Prevention of glutaraldehyde-fixed bioprosthetic heart valve calcificatio by alcohol pretreatment: further mechanistic studies. J Heart Valve Dis. 2000 Jul; 9(4):561-6.
18.  Ming Shen, Ali Kara-Mostefa, Lin Chen, Michel Daudon, Marc Thevenin, Bernard Lacour, and Alain Carpentier. Effect of ethanol and ether in the prevention of calcification of bioprostheses. Ann Thorac Surg 2001;71:S413-6.
19.  Connolly JM, Alferiev I, Kronsteiner A, Lu Z, Levy RJ. Ethanol inhibition of porcine bioprosthetic heart valve cusp calcification is enhanced by reduction with sodium borohydride. J Heart Valve Dis. 2004 May;13(3):487-93.
20.  Hyoung Woo Changa, Soo Hwan Kimb, Kyung-Hwan Kima, Yong Jin Kima. Combined anti-calcification treatment of bovine pericardium with amino compounds and solvents. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 12 (2011) 903-907.
21.  Kwan-Chang Kim, Soo-Hwan Kim, Yong-Jin Kim. Detoxification of glutaraldehyde treated porcine pericardium using L-Arginine & NABH4. Korean J Thorac Cardiovasc Surg 2011;44:99-107.
22.  Evandro Antonio Sardeto, Francisco Diniz Affonso da Costa, Iseu do Santo Elias Affonso da COSTA, Joao Gabriel Roderjan, Eduardo Discher, Ricardo Alexandre Schneider, Carlos Henrique Gori Gomes, Claudinei Colattusso, Daniel Precoma, Andrea Dumsch, Sergio Veiga Lopes, Jairo Leal. Efficacy of AlCl3 and ethanol in the
prevention of calcification of fragments of porcine aortic wall fixed in GDA.
【国際調査報告】
2020508193.tif 000004
2020508193.tif 000005