(57)【要約】  ポリペプチド複合体は、ＴＣＲ定常領域に各々融合された重鎖及び軽鎖の抗体可変領域を含む。二重特異性抗原結合性ポリペプチド複合体は、このポリペプチド複合体の第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分を含む。方法は、このポリペプチド複合体又は二重特異性抗原結合性ポリペプチド複合体を作製することを含む。疾患又は障害を治療する方法は、このポリペプチド複合体又は二重特異性抗原結合性ポリペプチド複合体を使用することを含む。ポリヌクレオチドは、このポリペプチド複合体及び／又は二重特異性抗原結合性ポリペプチド複合体をコードしている。ベクター又は宿主細胞は、このポリヌクレオチドを含んでいる。組成物及び医薬組成物は、このポリペプチド複合体及び／又は二重特異性抗原結合性ポリペプチド複合体を含有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド複合体であって：
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、第一のポリペプチド；及び
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第二のポリペプチド；を含み、
ここで、
Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、且つ
第一の抗体は、第一の抗原特異性を有する、ポリペプチド複合体。
【請求項２】
前記非天然型鎖間結合が、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に形成される、請求項１記載のポリペプチド複合体。
【請求項３】
前記第一及び第二の変異された残基の少なくとも１つが、システイン残基である、請求項２記載のポリペプチド複合体。
【請求項４】
前記非天然型鎖間結合が、ジスルフィド結合である、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項５】
前記第一の変異された残基が、Ｃ１の接触境界面内に含まれ、及び／又は第二の変異された残基が、Ｃ２の接触境界面内に含まれる、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項６】
少なくとも１つの天然型システイン残基が、Ｃ１及び／又はＣ２内に存在しないか又は存在する、請求項１〜５のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項７】
少なくとも１つの天然型Ｎ−グリコシル化部位が、Ｃ１及び／又はＣ２内に存在しないか又は存在する、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項８】
前記二量体が、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の非天然型鎖間結合を含み、任意に少なくとも１つの非天然型鎖間結合が、ジスルフィド結合である、請求項１〜７のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項９】
ａ）Ｃ１が、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２が、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１が、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２が、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１が、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２が、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１が、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２が、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１が、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２が、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１が、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２が、操作されたＣＧａｍｍａを含む：
請求項１〜８のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項１０】
前記第一のＶＨが、第一の接続ドメインで、Ｃ１へ機能的に連結され、且つ
第一のＶＬが、第二の接続ドメインで、Ｃ２へ機能的に連結される、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項１１】
前記第一及び／又は第二の接続ドメインが、抗体Ｖ／Ｃ接続のＣ末端断片の適切な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）、及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続のＮ末端断片の適切な長さ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）を含む、請求項１０記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２】
前記操作されたＣＢｅｔａが、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６及び１２２−１２７からなる群から選択された接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含み；並びに／又は
操作されたＣＡｌｐｈａが、アミノ酸残基６−２９、３７−６７、及び８６−９５からなる群から選択された接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む、請求項９記載のポリペプチド複合体。
【請求項１３】
前記操作されたＣＢｅｔａが、Ｓ５６Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｅ１４Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｌ６２Ｃ、Ｄ５８Ｃ、Ｓ７６Ｃ、及びＲ７８Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含み、並びに／又は操作されたＣＡｌｐｈａが、Ｔ４９Ｃ、Ｙ１１Ｃ、Ｌ１３Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｖ２３Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｔ４６Ｃ、Ｌ５１Ｃ、及びＳ６２Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含む、請求項９記載のポリペプチド複合体。
【請求項１４】
前記操作されたＣＢｅｔａ及び操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＴ４９Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＹ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＶ１２Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１４Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＶ２３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＬ６２Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＹ４４Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＤ５８Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＬ５１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＲ７８Ｃ及びＣａｌｐｈａ中のＳ６２Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、且つここでシステイン残基の対は、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である、請求項１３記載のポリペプチド複合体。
【請求項１５】
前記操作されたＣＢｅｔａの位置Ｃ７４に天然型システイン残基が、存在しないか又は存在する、請求項１２〜１４のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの天然型グリコシル化部位が、操作されたＣＢｅｔａ中及び／又は操作されたＣＡｌｐｈａ中に、存在しないか又は存在する、請求項１２〜１５のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項１７】
前記操作されたＣＢｅｔａ中の天然型グリコシル化部位が、Ｎ６９であり、及び／又は操作されたＣＡｌｐｈａ中の天然型グリコシル化部位（複数）が、Ｎ３４、Ｎ６８、Ｎ７９、及び任意のそれらの組合せから選択される、請求項１６記載のポリペプチド複合体。
【請求項１８】
前記操作されたＣＢｅｔａが、天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１−１１７を包含するＦＧループ及び／又は天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６−７１を包含するＤＥループを欠くか又は保持する、請求項１２〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項１９】
前記操作されたＣＡｌｐｈａが、配列番号：４３−４８を含み、及び／又は操作されたＣＢｅｔａが、配列番号：３３−４１を含む、請求項１２〜１８のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項２０】
前記Ｃ１が、操作されたＣＢｅｔａを含み、及びＣ２が、操作されたＣＡｌｐｈａを含み；並びに、ここで第一の接続ドメインが、配列番号：４９もしくは５０を含むかもしくはこれであり、並びに／又は第二の接続ドメインが、配列番号：５１もしくは５２を含むかもしくはこれである、請求項１０〜１９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項２１】
前記Ｃ１が、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、及びＣ２が、操作されたＣＢｅｔａを含み；並びに、ここで第一の接続ドメインが、配列番号：１２９もしくは１３０を含むかもしくはこれであり、並びに／又は第二の接続ドメインが、配列番号：４９もしくは５０を含むかもしくはこれである、請求項１２〜２０のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項２２】
前記操作されたＣＢｅｔａが、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６及び１２２−１２７からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含み；並びに／又は
操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａが、アミノ酸残基７−１９、２６−３４、５６−７５及び１０３−１０６からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む、請求項９記載のポリペプチド複合体。
【請求項２３】
前記操作されたＣＢｅｔａが、Ｓ１６Ｃ、Ａ１８Ｃ、Ｅ１９Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ａ１１Ｃ、Ｓ５６Ｃ、及びＳ７６Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含み、並びに／又は操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａが、Ｓ１１Ｃ、Ａ１３Ｃ、Ｉ１６Ｃ、Ｓ６２Ｃ、Ｔ６５Ｃ、及びＹ５９から選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含む、請求項９記載のポリペプチド複合体。
【請求項２４】
前記操作されたＣＢｅｔａ及び操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａが、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＡ１８Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１９Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＡ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＡ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＡ１１Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＩ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＴ６５Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＹ５９Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、且つここで変異されたシステイン残基の対が、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である、請求項２３記載のポリペプチド複合体。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの天然型グリコシル化部位が、操作されたＣＢｅｔａ中及び／又は操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中に存在しないか又は存在する、請求項２２〜２４のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項２６】
前記操作されたＣＢｅｔａ中に非存在又は存在するグリコシル化部位が、Ｎ６９であり、及び／又は操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中に非存在のグリコシル化部位が、Ｎ５０である、請求項２５記載のポリペプチド複合体。
【請求項２７】
前記操作されたＣＢｅｔａが、天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１−１０７を包含するＦＧループ及び／又は天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６−７１を包含する位置のＤＥループを欠くか又は保持する、請求項２２〜２６のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項２８】
前記操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａが、配列番号：８２−８３、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、もしくは３１８を含み、及び／又は操作されたＣＢｅｔａが、配列番号：８４、３３−４１、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、もしくは３２４を含む、請求項２２〜２７のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項２９】
前記Ｃ１が、操作されたＣＢｅｔａを含み、及びＣ２が、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み；並びに、ここで第一の接続ドメインが、配列番号：４９もしくは５０を含み、及び／又は第二の接続ドメインが、配列番号：８１もしくは１３１を含む、請求項１０〜１１及び２２〜２８のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項３０】
前記Ｃ１が、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、及びＣ２が、操作されたＣＢｅｔａを含み；並びに、ここで第一の接続ドメインが、配列番号：１３２もしくは１３３を含み、及び／又は第二の接続ドメインが、配列番号：４９もしくは５０を含む、請求項１０〜１１及び２２〜２８のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項３１】
前記操作されたＣＤｅｌｔａが、アミノ酸残基８−２６、４３−６４、及び８４−８８からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含み；並びに／又は、
操作されたＣＧａｍｍａが、アミノ酸残基１１−３５、及び５５−７６からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む、請求項９記載のポリペプチド複合体。
【請求項３２】
前記操作されたＣＧａｍｍａが、Ｓ１７Ｃ、Ｅ２０Ｃ、Ｆ１４Ｃ、Ｔ１２Ｃ、Ｍ６２Ｃ、Ｑ５７Ｃ、及びＡ１９Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含み、並びに／又は操作されたＣＤｅｌｔａが、Ｆ１２Ｃ、Ｍ１４Ｃ、Ｎ１６Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｖ５０Ｃ、Ｆ８７Ｃ、及びＥ８８Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含む、請求項９記載のポリペプチド複合体。
【請求項３３】
前記操作されたＣＧａｍｍａ及び操作されたＣＤｅｌｔａが、ＣＧａｍｍａ中のＱ５７Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＶ５０Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＡ１９Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＥ８８Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＳ１７Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＦ１２Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＥ２０Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＦ１２Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＦ１４Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＭ１４Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＴ１２Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＮ１６Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＭ６２Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＤ４６Ｃ、並びにＣＧａｍｍａ中のＡ１９Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＦ８７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、且つここで導入されたシステイン残基の対が、鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である、請求項３２記載のポリペプチド複合体。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの天然型グリコシル化部位が、操作されたＣＧａｍｍａ中及び／又は操作されたＣＤｅｌｔａ中に存在しないか又は存在する、請求項３１〜３３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項３５】
前記操作されたＣＧａｍｍａ中の天然型グリコシル化部位が、Ｎ６５であり、及び／又は操作されたＣＤｅｌｔａ中の天然型グリコシル化部位（複数）が、Ｎ１６及びＮ７９の一方又は両方である、請求項３４記載のポリペプチド複合体。
【請求項３６】
前記操作されたＣＧａｍｍａが、配列番号：１１３、もしくは１１４、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、もしくは３４０を含み、及び／又は操作されたＣＤｅｌｔａが、配列番号：１１５、１１６、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、もしくは３３２を含む、請求項３１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項３７】
前記Ｃ１が、操作されたＣＧａｍｍａを含み、及びＣ２が、操作されたＣＤｅｌｔａを含み；並びに、ここで第一の接続ドメインが、配列番号：１１７もしくは１１８を含み、及び／又は第二の接続ドメインが、配列番号：１１９もしくは１２０を含む、請求項１０〜１１及び３１〜３６のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項３８】
前記Ｃ１が、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、及びＣ２が、操作されたＣＧａｍｍａを含み；並びに、ここで第一の接続ドメインが、配列番号：１２３もしくは１２４を含み、及び／又は第二の接続ドメインが、配列番号：１２５もしくは１２６を含む、請求項１０〜１１及び３１〜３６のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項３９】
前記第一の抗原特異性が、外来性抗原、内在性抗原、自己抗原、ネオ抗原、ウイルス抗原又は腫瘍抗原に対し向けられる、請求項１〜３８のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項４０】
第二の抗原結合部分と会合された、第一の抗原結合部分を含む、二重特異性ポリペプチド複合体であって：
第一の抗原結合部分が：
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、第一のポリペプチド、及び
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第二のポリペプチド：を含み、
ここで、
Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
第一の抗体は、第一の抗原特異性を有し、
第二の抗原結合部分が、第一の抗原特異性とは異なる、第二の抗原特異性を有し、並びに
第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、誤対形成する傾向が少ない、二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４１】
第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する第二の抗原結合部分と会合された、第一の抗原特異性を有する、請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体を含む、第一の抗原結合部分を含み、並びに
第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、誤対形成する傾向が少ない、二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４２】
前記第二の抗原結合部分が、第二の抗原特異性を有する第二の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項４０〜４１のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４３】
前記第二の抗原結合部分が、Ｆａｂを含む、請求項４０〜４２のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４４】
前記第一の抗原特異性及び第二の抗原特異性が、２つの異なる抗原に対し向けられるか、又は一つの抗原上の２つの異なるエピトープに対し向けられる、請求項４０又は４３のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４５】
前記第一及び第二の抗原特異性の一方が、Ｔ細胞特異性受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異性受容体分子に対し向けられ、且つ他方が、腫瘍関連抗原に対し向けられる、請求項４４記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４６】
前記第一及び第二の抗原特異性の一方が、ＣＤ３に対し向けられ、且つ他方が、腫瘍関連抗原に対し向けられる、請求項４５記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４７】
前記第一及び第二の抗原特異性の一方が、ＣＤ３に対し向けられ、且つ他方が、ＣＤ１９に対し向けられる、請求項４６記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４８】
前記第一の抗原結合部分が更に、第一の二量体形成ドメインを含み、且つ第二の抗原結合部分が更に、第二の二量体形成ドメインを含み、ここで第一及び第二の二量体形成ドメインは会合されている、請求項４０〜４７のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４９】
前記会合が、コネクター、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、もしくは疎水性−親水性相互作用、又はそれらの組合せを介してである、請求項４８記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５０】
前記第一及び／又は第二の二量体形成ドメインが、任意にＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来した、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部分を含む、請求項４８記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５１】
前記第一及び／又は第二の二量体形成ドメインが更に、抗体ＣＨ２ドメイン、及び／又は抗体ＣＨ３ドメインを含む、請求項５０記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５２】
前記第一の二量体形成ドメインが、第三の接続ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結される、請求項４８記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５３】
ａ）前記Ｃ１が、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つ第三の接続ドメインが、配列番号：５３又は５４に含まれるか；
ｂ）Ｃ１が、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つ第三の接続ドメインが、配列番号：１３４、１３５、１４０又は１４１に含まれるか；
ｃ）Ｃ１が、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つ第三の接続ドメインが、配列番号：１３４、１３５、１４０又は１４１に含まれるか；
ｄ）Ｃ１が、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つ第三の接続ドメインが、配列番号：１２１又は１２２に含まれるか；あるいは
ｅ）Ｃ１が、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つ第三の接続ドメインが、配列番号：１２７又は１２８に含まれる、請求項５２記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５４】
前記第二の二量体形成ドメインが、第二の抗原結合部分の重鎖可変ドメインに機能的に連結される、請求項４９記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５５】
前記第一及び第二の二量体形成ドメインが、異なり、且つホモ二量体形成を妨げ、及び／又はヘテロ二量体形成に有利に働く様式で会合している、請求項４８〜５４のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５６】
前記第一及び第二の二量体形成ドメインが、ヘテロ二量体へ、ノブイントゥホール、疎水性相互作用、静電的相互作用、親水性相互作用、又は増大した可動性を介して、会合することが可能である、請求項５５記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５７】
前記第一の抗原結合部分が、キメラ定常領域へ機能的に連結されるＶＨを含む第一のポリペプチド、及びＣ２へ機能的に連結されるＶＬを含む第二のポリペプチドを含み、ここでキメラ定常領域及びＣ２が、配列番号：１７７／１７６、１７９／１７８、１８４／１８３、１８５／１８３、１８０／１７６、１８１／１７８、１８２／１７８、１８４／１８６、１８５／１８６、１８８／１８７、１９６／１８７、１９０／１８９、１９２／１９１、１９２／１９３、１９５／１９４、１９８／１９７、２００／１９９、２０２／２０１、２０３／２０１、２０３／２０４、２０５／２０４、２０６／２０４、２０８／２０７、２０８／２０９、２１１／２１０、２１３／２１２、２１３／１５１、２１４／２１２、２１４／１５１、２３４／２３３、２３２／２３１、２１６／２１５、２１８／２１７、２２０／２１９、２２２／２２１、２２４／２２３、２２６／２２５、２２７／２２３、２２９／２２８、２２９／２３０、２３６／２３５及び２３８／２３７からなる群から選択される配列の対を含む、請求項４０〜５６のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５８】
前記第一の抗原性が、ＣＤ３に対し向けられ、且つ第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、配列番号：２／１、４／３、５／１、６／３、７／３、９／８、１０／８、９／１１、１０／１１、１３／１２、１５／１４、１７／１６、１７／１８、２０／１９、２１／１２、６５／６４、６７／６６、６９／６８、７０／６８、７０／７１、７２／７１、７３／７１、７５／７４、７５／７６、７８／７７、８６／８５、９０／８９、９１／９２、９４／９３、９６／９５、９８／９７、９９／９５、１０１／１００、１０１／１０２、１０６／１０５、１０８／１０７、１１０／１０９、１１２／１１１、１３７／１３６、１３８／１３６、１３７／１３９及び１３８／１３９からなる群から選択される配列の対を含む、請求項４０〜５７のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５９】
前記第一の抗原結合部分が、ＣＤ３へ結合することが可能であり、且つ第二の抗原結合部分が、ＣＤ１９へ結合することが可能であり、且つ二重特異性ポリペプチド複合体が、配列番号：２２／１２／２４／２３、２５／１２／２６／２３、及び２５／１２／２７／２３からなる群から選択される４種のポリペプチド配列の組合せを含む、請求項４０〜５８のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項６０】
部分へコンジュゲートされた、請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は請求項４０〜５９のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体を含む、コンジュゲート。
【請求項６１】
請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は請求項４０〜５９のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体をコードしている、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項６１記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
【請求項６３】
請求項６１記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項６２記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６４】
請求項６３記載の宿主細胞を、ポリペプチド複合体、又は二重特異性ポリペプチド複合体が発現される条件下で培養することを含む、請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は請求項４０〜５９のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体を発現する、方法。
【請求項６５】
請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は二重特異性ポリペプチド複合体を製造する方法であって：
ａ）宿主細胞へ：
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及び
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド：を導入する工程であって、
ここで、Ｃ１及びＣ２が、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合が、二量体を安定化することが可能であり、並びに
第一の抗体が、第一の抗原特異性を有する工程；
ｂ）宿主細胞にポリペプチド複合体を発現させる工程：を含む、方法。
【請求項６６】
ａ）宿主細胞へ、
第二の抗原結合部分をコードしている追加のポリヌクレオチドを１又は複数導入する工程であって、
ここで、第二の抗原結合部分が、第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する工程；
ｂ）宿主細胞に、二重特異性ポリペプチド複合体を発現させる工程：を更に含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体を単離する工程を更に含む、請求項６４〜６６のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は請求項４０〜５９のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体を含有する、組成物。
【請求項６９】
請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は請求項４０〜５９のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体、及び医薬として許容し得る担体を含有する、医薬組成物。
【請求項７０】
請求項１〜３９のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、又は請求項４０〜５９のいずれか一項記載の二重特異性ポリペプチド複合体の治療的有効量を、対象へ投与することを含む、それを必要とする対象において状態を治療する方法。
【請求項７１】
前記状態が、第一の抗原及び第二の抗原が両方共調節された場合に、緩和、除去、治療、又は予防され得る、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
１）第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び
第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：を含む第一の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む：第一の抗原結合部分、並びに
２）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第二の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖定常（ＣＬ）ドメインへ機能的に連結された第二の抗体のＶＬ：を含む、第二の抗原結合部分であって；
ここで、第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、誤対形成する傾向が少ない第二の抗原結合部分：
を含む、ポリペプチド複合体。
【請求項７３】
抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＨ、及び抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＬを含む第三の抗原結合部分を更に含み、ここで第三の抗原結合部分のＣＨ１が、第二の抗原結合部分のＶＨへ機能的に連結された、請求項７２記載のポリペプチド複合体。
【請求項７４】
１）第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び
第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：を含む第一の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む：第一の抗原結合部分、並びに
２）Ｃ１へ機能的に連結された第二の抗体のＶＨ、及びＣ２へ機能的に連結された第二の抗体のＶＬ：を含む第二の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第二の抗原結合部分、並びに
３）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＬ：を含む第三の抗原結合部分；並びに
４）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＬ：を含む第四の抗原結合部分：
を含むポリペプチド複合体であり、
このポリペプチド複合体が、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメイン並びに第一及び第二の抗体ＣＨ３ドメインを更に含み、
ここで、第一の抗原結合部分由来のＶＨ及び第二の抗原結合部分由来のＶＨが、各々、第一及び第二の抗体ＣＨ３ドメインへ機能的に連結され、第三の抗原結合部分由来のＣＨ１及び第四の抗原結合部分由来のＣＨ１が、各々、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメインへ機能的に連結され、並びに第三の抗原結合部分及び第四の抗原結合部分が、二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体。
【請求項７５】
１）第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び
第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：を含む第一の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第一の抗原結合部分、並びに
２）Ｃ１へ機能的に連結された第二の抗体のＶＨ、及びＣ２へ機能的に連結された第二の抗体のＶＬ：を含む第二の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第二の抗原結合部分、並びに
３）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＬ：を含む第三の抗原結合部分；並びに
４）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＬ：を含む第四の抗原結合部分：
を含むポリペプチド複合体であり、
このポリペプチド複合体が、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメイン並びに第一及び第二の抗体ＣＨ３ドメインを更に含み、
ここで、第一の抗原結合部分由来のＣ１及び第二の抗原結合部分由来のＣ１が、各々、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメインへ機能的に連結され、第三の抗原結合部分由来のＶＨ及び第四の抗原結合部分由来のＶＨが、各々、第一及び第二の抗体ＣＨ３ドメインへ機能的に連結され、並びに第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分が、二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体。
【請求項７６】
１）第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び
第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：を含む第一の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第一の抗原結合部分；並びに
２）Ｃ１へ機能的に連結された第二の抗体のＶＨ、及びＣ２へ機能的に連結された第二の抗体のＶＬ：を含む第二の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第二の抗原結合部分、並びに
３）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＬ：を含む第三の抗原結合部分；並びに
４）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＬ：を含む第四の抗原結合部分：
を含むポリペプチド複合体であり、
このポリペプチド複合体が、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメイン並びに第一及び第二の抗体ＣＨ３ドメインを更に含み、
ここで、第三の抗原結合部分由来のＣＨ１及び第四の抗原結合部分由来のＣＨ１が、各々、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメインへ機能的に連結され、第一の抗原結合部分由来のＣ１が、第一の抗原結合部分由来のＶＨへ機能的に連結され、第二の抗原結合部分由来のＣ１が、第二の抗原結合部分由来のＶＨへ機能的に連結され、並びに第三の抗原結合部分及び第四の抗原結合部分が、二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体。
【請求項７７】
１）第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び
第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：を含む第一の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第一の抗原結合部分、並びに
２）Ｃ１へ機能的に連結された第二の抗体のＶＨ、及びＣ２へ機能的に連結された第二の抗体のＶＬ：を含む第二の抗原結合部分であって；
ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに
ここで、
ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；
ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；
ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；
ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又は
ｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む；第二の抗原結合部分、並びに
３）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第三の抗体のＶＬ：を含む第三の抗原結合部分；並びに
４）抗体重鎖ＣＨ１ドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＨ、及び
抗体軽鎖ＣＬドメインへ機能的に連結された第四の抗体のＶＬ：を含む第四の抗原結合部分：
を含むポリペプチド複合体であり、
このポリペプチド複合体が、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメイン並びに任意に第一及び第二の抗体ＣＨ３ドメインを更に含み、
ここで、第一の抗原結合部分由来のＣ１及び第二の抗原結合部分由来のＣ１が、各々、第一及び第二の抗体ＣＨ２ドメインへ機能的に連結され、第三の抗原結合部分由来のＣＨ１が、第一の抗原結合部分由来のＶＨへ機能的に連結され、第四の抗原結合部分由来のＣＨ１が、第二の抗原結合部分由来のＶＨへ機能的に連結され、並びに第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分が、二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体。
【請求項７８】
前記操作されたＣＢｅｔａが、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６及び１２２−１２７からなる群から選択される接触境界面内に変異されたシステイン残基を含み；並びに／又は
操作されたＣＡｌｐｈａが、アミノ酸残基６−２９、３７−６７、及び８６−９５からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む、請求項７２〜７７のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項７９】
前記操作されたＣＢｅｔａ及び操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４９Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＹ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＶ１２Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１４Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＶ２３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＬ６２Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＹ４４Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＤ５８Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ５１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＲ７８Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ６２Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、且つここでシステイン残基の対が、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である、請求項７８記載のポリペプチド複合体。
【請求項８０】
前記操作されたＣＢｅｔａが、Ｓ５６Ｃを含み、並びに操作されたＣＡｌｐｈａが、Ｔ４９Ｃを含む、請求項７９記載のポリペプチド複合体。
【請求項８１】
前記操作されたＣＢｅｔａの位置Ｃ７４での天然型システイン残基が存在しない、請求項７２〜８０のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項８２】
前記少なくとも１つの天然型グリコシル化部位が、操作されたＣＢｅｔａ及び／又は操作されたＣＡｌｐｈａ中に存在しない、請求項７２〜８１のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項８３】
前記操作されたＣＢｅｔａ中の天然型グリコシル化部位が、Ｎ６９であり、及び／又は操作されたＣＡｌｐｈａ中の天然型グリコシル化部位（複数）が、Ｎ３４、Ｎ６８、Ｎ７９、及び任意のそれらの組合せから選択される、請求項８２記載のポリペプチド複合体。
【請求項８４】
請求項７２〜８３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体をコードしている単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８５】
請求項８４記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
【請求項８６】
請求項８４記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項８５記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８７】
請求項７２〜８３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体を含有する、組成物。
【請求項８８】
請求項７２〜８３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体、及び医薬として許容し得る担体を含有する、医薬組成物。
【請求項８９】
請求項７２〜８３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体の治療的有効量を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象の状態を治療する方法。
【請求項９０】
前記操作されたＣＡｌｐｈａ中の少なくとも１つの天然型Ｓｅｒ残基が、Ｏ−グリコシル化を減少するように変異されている、請求項９〜２１及び７２〜８３のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項９１】
前記Ｃ１又はＣ２が、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、ここで操作されたＣＡｌｐｈａ中の少なくとも１つの天然型Ｓｅｒ残基が、Ｏ−グリコシル化を減少するように変異されている、請求項４０〜５６のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【請求項９２】
前記変異されたアミノ酸残基が、Ｓ１９、Ｓ３６、Ｓ４１、Ｓ９１及びＳ９４から選択される、請求項９０〜９１のいずれか一項記載のポリペプチド複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本開示は概して、ＴＣＲ定常領域に融合された抗体可変領域を含む可溶性ポリペプチド複合体、及びこれを含む二重特異性ポリペプチド複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（相互参照）
本出願は、２０１７年９月２２日に出願された国際特許出願PCT/CN2017/103030の優先権を主張するものであり、この出願の全内容は、引用により本明細書中に組み込まれている。
【０００３】
（背景）
二重特異性抗体は、治療用抗体の新たな範疇として成長している。これらは、２種の異なる標的又は標的上の２種の異なるエピトープに結合し、個別の抗体の作用を上回る相加作用又は相乗作用を生じることができる。多くの抗体操作の取組みで、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＢｉＴＥなどの、新規の二重特異性フォーマットが設計されている(Spiessら、Molecular Immunology, 67(2), 95-106 (2015)。しかしこれらのフォーマットは、潜在的に、安定性、溶解度、短い半減期、及び免疫原性において、様々な制限がある。
【０００４】
これらの二重特異性抗体フォーマットの中で、ＩｇＧ−様二重特異性抗体には、１個のアームは標的Ａに結合し、及び別のアームは標的Ｂに結合するという共通のフォーマットがある。構造的に、これは、天然ＩｇＧと類似したサイズ及び形状を持つ抗体Ａの半分及び抗体Ｂの半分から作製される。下流開発を促進するために、そのような二重特異性分子は、高い発現レベル及び正確に集成された形状を持ち、単独の宿主細胞から通常のＩｇＧのように容易に作製され得ることが望ましい。残念ながら、コグネイト軽鎖−重鎖の対形成、並びに２つの異なる半抗体の集成は、自動的に制御することができない。ランダムな様式でのあらゆる種類の誤対形成は、著しい生成物の不均質を生じ得る。
【０００５】
「ノブイントゥホール」(Ridgwayら、Protein Engineering, 9(7), 617-21 (1996)；Merchantら、Nature Biotechnology, 16(7), 667-681(1998))；静電的(Gunasekaranら、Journal of Biological Chemistry, 285(25), 19637-19646 (2010))、又はネガティブ状態のデザイン(Kreudensteinら、mAbs, 5(5), 646-654 (2013)；Leaver-Fayら、Structure, 24(4), 641-651, (2016))など、Ｆｃ領域に変異を導入することにより、２種の異なる重鎖の好ましいヘテロ二量体性集成体が成し遂げられている。しかし、個別の抗体の各々の軽鎖−重鎖の選択的対形成は、依然課題である。軽鎖−重鎖間の境界面は、可変ドメイン（ＶＨ−ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＨ１−ＣＬ）を含む。いくつかの戦略が、コグネイト対形成を促進するための、直交性境界面の設計に適用されている。Roche社は、ＣＨ１及びＣＬのドメインを交換し、CrossMabプラットフォームを作製し(Schaeferら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America, 108(27), 11187-11192, (2011))、MedImmune社は、代わりにジスルフィド結合を導入し(Mazorら、mAbs, 7(2), 377-389, (2015))、Amgen社は、ＣＨ１−ＣＬ領域を更に静電的とし(Liuら、Journal of Biological Chemistry, 290(12), 7535-7562, (2015))、並びにLilly社(Lewisら、Nature Biotechnology, 32(2), 191-198 (2014))及びGenentech社(Dillonら、mAbs, 9(2), 213-230, (2017))は、可変ドメイン及び定常ドメインの両方に変異を導入した。
【０００６】
従って、所望の発現レベル及び抗原に対する親和性を持つ二重特異性分子を設計する大きい必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
（発明の簡単な概要）
一つの態様において、本開示は、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、第一のポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第二のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、ここでＣ１及びＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに第一の抗体は、第一の抗原特異性を有するポリペプチド複合体を提供する。
【０００８】
一つの態様において、本開示は、第二の抗原結合部分と会合された、第一の抗原結合部分を含む、二重特異性ポリペプチド複合体であって、ここで第一の抗原結合部分は、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、第一のポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第二のポリペプチドを含み、ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、並びに第一の抗体は、第一の抗原特異性を有し、第二の抗原結合部分は、第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有し、並びに、第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、誤対形成する傾向が少ない、二重特異性ポリペプチド複合体を提供する。
【０００９】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する第二の抗原結合部分に会合された、第一の抗原特異性を有する本明細書に提供されるポリペプチド複合体を含む第一の抗原結合部分を含む、二重特異性ポリペプチド複合体を提供し、並びに第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、誤対形成する傾向が少ない。
【００１０】
一つの態様において、本開示は、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体の二重特異性の断片を提供する。
【００１１】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、部分へコンジュゲートされた、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、又は本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含む、コンジュゲートを提供する。
【００１２】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、又は本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体をコードしている単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含む単離されたベクターを提供する。
【００１４】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供される単離されたポリヌクレオチド、又は本明細書に提供される単離されたベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【００１５】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供される宿主細胞を、ポリペプチド複合体、又は二重特異性ポリペプチド複合体が発現される条件下で培養することを含む、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、又は本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を発現する方法を提供する。
【００１６】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体を作製する方法であって、ａ）宿主細胞へ、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド：を導入する工程であって、ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、Ｃ１及びＣ２の二量体を安定化することが可能であり、並びに、第一の抗体は、第一の抗原特異性を有する工程；ｂ）宿主細胞にポリペプチド複合体を発現させる工程：を含む方法を提供する。
【００１７】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を作製する方法であって、ａ）宿主細胞へ、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド、第二の抗体のＶＨを含む第三のポリペプチドをコードしている第三のポリヌクレオチド、及び第二の抗体のＶＬを含む第四のポリペプチドをコードしている第四のポリヌクレオチド：を導入する工程であって、ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ２間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、この二量体を安定化することが可能であり、並びに、第一の抗体は、第一の抗原特異性を有し、及び第二の抗体は第二の抗原特異性を有する工程；ｂ）宿主細胞に二重特異性ポリペプチド複合体を発現させる工程：を含む方法を提供する。
【００１８】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を作製する方法は、ポリペプチド複合体を単離する工程を更に含む。
【００１９】
一つの態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、又は本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含有する組成物を提供する。
【００２０】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、又は本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体、及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００２１】
一つの態様において、本開示は、本明細書において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、又は本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体の治療的有効量を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象の状態を治療する方法を提供する。特定の実施態様において、この状態は、第一の抗原及び第二の抗原が両方共調節(modulate)される場合に、緩和、除去、治療、又は予防され得る。
【００２２】
特定の実施態様において、非天然型鎖間結合は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基と、Ｃ２に含まれる第二の変異された残基の間に形成される。特定の実施態様において、第一及び第二の変異された残基の少なくとも１つは、システイン残基である。
【００２３】
特定の実施態様において、非天然型鎖間結合は、ジスルフィド結合である。
【００２４】
特定の実施態様において、第一の変異された残基は、Ｃ１の接触境界面内に含まれ、及び／又は第二の変異された残基は、Ｃ２の接触境界面内に含まれる。
【００２５】
特定の実施態様において、少なくとも１つの天然型システイン残基は、Ｃ１及び／又はＣ２内に存在しないか又は存在する。特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａの位置Ｃ７４で天然型システイン残基は、存在しないか又は存在する。特定の実施態様において、天然型Ｃ７４は、ＣＢｅｔａ中には存在しない。
【００２６】
特定の実施態様において、少なくとも１つの天然型Ｎ−グリコシル化部位は、Ｃ１及び／又はＣ２内に存在しないか又は存在する。特定の実施態様において、天然型Ｎ−グリコシル化部位は、Ｃ１及び／又はＣ２内に存在しない。
【００２７】
特定の実施態様において、二量体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれよりも多い非天然型鎖間結合を含む。特定の実施態様において、少なくとも１つの非天然型鎖間結合は、ジスルフィド結合である。特定の実施態様において、二量体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれよりも多いジスルフィド結合を含む。
【００２８】
特定の実施態様において、ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含むか；ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含むか；ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含むか；ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含むか；又はｆ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む。
【００２９】
特定の実施態様において、第一のＶＨは、第一の接続(conjunction)ドメインで、Ｃ１へ機能的に連結され、及び第一のＶＬは、第二の接続ドメインで、Ｃ２へ機能的に連結される。特定の実施態様において、第一のＶＨは、コネクターを介して、第一の接続ドメインでＣ１へ会合し、第一のＶＬは、コネクターを介して、第二の接続ドメインでＣ２へ会合する。
【００３０】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の接続ドメインは、抗体Ｖ／Ｃ接続のＣ末端断片の適切な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）、及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続のＮ末端断片の適切な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）を含む。
【００３１】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６及び１２２−１２７からなる群から選択された接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含み；及び／又は、操作されたＣＡｌｐｈａは、アミノ酸残基６−２９、３７−６７、及び８６−９５からなる群から選択された接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む。
【００３２】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、Ｓ５６Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｅ１４Ｃ、Ｌ６２Ｃ、Ｄ５８Ｃ、Ｓ７６Ｃ、及びＲ７８Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含み、並びに／又は操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｔ４９Ｃ、Ｙ１１Ｃ、Ｌ１３Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｖ２３Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｔ４６Ｃ、Ｌ５１Ｃ、及びＳ６２Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含む。
【００３３】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａ及び操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＹ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＶ１２Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１４Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＶ２３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＬ６２Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＹ４４Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＤ５８Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４９Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ５１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＲ７８Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ６２Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、且つここでシステイン残基の対は、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。
【００３４】
特定の実施態様において、少なくとも１つの天然型グリコシル化部位は、操作されたＣＢｅｔａ中及び／又は操作されたＣＡｌｐｈａ中に、存在しないか又は存在する。
【００３５】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａ中の天然型グリコシル化部位は、Ｎ６９であり、及び／又は操作されたＣＡｌｐｈａ中の天然型グリコシル化部位（複数）は、Ｎ３４、Ｎ６８、Ｎ７９、及び任意のそれらの組合せから選択される。
【００３６】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１−１１７を包含するＦＧループ及び／又は天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６−７１を包含するＤＥループを欠くか又は保持する。
【００３７】
特定の実施態様において、操作されたＣＡｌｐｈａは、配列番号：４３−４８のいずれかひとつを含み、及び／又は操作されたＣＢｅｔａは、配列番号：３３−４１及び３０６のいずれかひとつを含む。
【００３８】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、及びＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み；並びにここで、第一の接続ドメインは、配列番号：４９もしくは５０を含むかもしくはこれであり、並びに／又は第二の接続ドメインは、配列番号：５１もしくは５２を含むかもしくはこれである。
【００３９】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、及びＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含み；並びにここで、第一の接続ドメインは、配列番号：１２９もしくは１３０を含むかもしくはこれであり、並びに／又は第二の接続ドメインは、配列番号：４９もしくは５０を含むかもしくはこれである。
【００４０】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６及び１２２−１２７からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含み；並びに／又は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａは、アミノ酸残基７−１９、２６−３４、５６−７５及び１０３−１０６からなる群から選択される接触境界面内に変異されたシステイン残基を含む。
【００４１】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、Ｓ１６Ｃ、Ａ１８Ｃ、Ｅ１９Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ａ１１Ｃ、Ｓ５６Ｃ、及びＳ７６Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含み、並びに／又は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａは、Ｓ１１Ｃ、Ａ１３Ｃ、Ｉ１６Ｃ、Ｓ６２Ｃ、Ｔ６５Ｃ、及びＹ５９から選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含む。
【００４２】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａ及び操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａは、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＰｒｅ−ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＡ１８Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１９Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＡ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＡ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＡ１１Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＩ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＴ６５Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＹ５９Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、並びにここで、変異されたシステイン残基の対は、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。
【００４３】
特定の実施態様において、少なくとも１つの天然型グリコシル化部位は、操作されたＣＢｅｔａ中及び／又は操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中に存在しない。
【００４４】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａ中の非存在又は存在のグリコシル化部位は、Ｎ６９であり、及び／又は操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中の非存在のグリコシル化部位は、Ｎ５０である。
【００４５】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１−１０７を包含するＦＧループ及び／又は天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６−７１を包含する位置のＤＥループを欠くか又は保持する。
【００４６】
特定の実施態様において、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａは、配列番号：８２、８３、及び３１１−３１８のいずれか一つを含み；及び／又は、操作されたＣＢｅｔａは、配列番号：８４、３３−４１、及び３１９−３２４のいずれか一つを含む。
【００４７】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、及びＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み；並びにここで、第一の接続ドメインは、配列番号：４９もしくは５０を含み、及び／又は第二の接続ドメインは、配列番号：８１もしくは１３１を含む。
【００４８】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、及びＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含み；並びにここで、第一の接続ドメインは、配列番号：１３２もしくは１３３を含み、及び／又は第二の接続ドメインは、配列番号：４９もしくは５０を含む。
【００４９】
特定の実施態様において、操作されたＣＤｅｌｔａは、アミノ酸残基８−２６、４３−６４、及び８４−８８からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含み；並びに／又は、操作されたＣＧａｍｍａは、アミノ酸残基１１−３５、及び５５−７６からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む。
【００５０】
特定の実施態様において、操作されたＣＧａｍｍａは、Ｓ１７Ｃ、Ｅ２０Ｃ、Ｆ１４Ｃ、Ｔ１２Ｃ、Ｍ６２Ｃ、Ｑ５７Ｃ、及びＡ１９Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含み、並びに／又は操作されたＣＤｅｌｔａは、Ｆ１２Ｃ、Ｍ１４Ｃ、Ｎ１６Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｖ５０Ｃ、Ｆ８７Ｃ、及びＥ８８Ｃから選択された位置でアミノ酸残基と置換する変異されたシステイン残基を含む。
【００５１】
特定の実施態様において、操作されたＣＧａｍｍａ及び操作されたＣＤｅｌｔａは、ＣＧａｍｍａ中のＳ１７Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＦ１２Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＥ２０Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＦ１２Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＦ１４Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＭ１４Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＴ１２Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＮ１６Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＭ６２Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＤ４６Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＱ５７Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＶ５０Ｃ、ＣＧａｍｍａ中のＡ１９Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＥ８８Ｃ、並びにＣＧａｍｍａ中のＡ１９Ｃ及びＣＤｅｌｔａ中のＦ８７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸残基の対と置換する変異されたシステイン残基の対を含み、並びにここで、導入されたシステイン残基の対は、鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。
【００５２】
特定の実施態様において、少なくとも１つの天然型グリコシル化部位は、操作されたＣＧａｍｍａ中及び／又は操作されたＣＤｅｌｔａ中に存在しないか又は存在する。
【００５３】
特定の実施態様において、操作されたＣＧａｍｍａ中の天然型グリコシル化部位は、Ｎ６５であり、及び／又は操作されたＣＤｅｌｔａ中の天然型グリコシル化部位（複数）は、Ｎ１６及びＮ７９の一方又は両方である。
【００５４】
特定の実施態様において、操作されたＣＧａｍｍａは、配列番号：１１３、１１４、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、もしくは３４０を含み、及び／又は操作されたＣＤｅｌｔａは、配列番号：１１５、１１６、３１０、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、もしくは３３２を含む。
【００５５】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、及びＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み；並びにここで、第一の接続ドメインは、配列番号：１１７もしくは１１８を含み、及び／又は第二の接続ドメインは、配列番号：１１９もしくは１２０を含む。
【００５６】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、及びＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含み；並びにここで、第一の接続ドメインは、配列番号：１２３もしくは１２４を含み、及び／又は第二の接続ドメインは、配列番号：１２５もしくは１２６を含む。
【００５７】
特定の実施態様において、第一のポリペプチドは、抗体ＣＨ２ドメイン、及び／又は抗体ＣＨ３ドメインを更に含む。
【００５８】
特定の実施態様において、第一の抗原特異性及び第二の抗原特異性は、２つの異なる抗原に対し向けられるか、又は１つの抗原上の２つの異なるエピトープに対し向けられる。
【００５９】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、ＣＤ３に結合する。特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、ＣＤ１９に結合する。特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、ＣＤ１９に結合する。特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、ＣＤ３に結合する。
【００６０】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、ＣＴＬＡ−４に結合する。特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、ＰＤ−１に結合する。特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、ＰＤ−１に結合する。特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、ＣＴＬＡ−４に結合する。
【００６１】
特定の実施態様において、会合は、コネクター、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、もしくは疎水性−親水性相互作用、又はそれらの組合せを介してである。
【００６２】
特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、第二の抗原特異性を有する第二の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。
【００６３】
特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂを含む。
【００６４】
特定の実施態様において、第一の抗原特異性及び第二の抗原特異性は、２つの異なる抗原に対し向けられるか、又は一つの抗原上の２つの異なるエピトープに対し向けられる。
【００６５】
特定の実施態様において、第一及び第二の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異性受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異性受容体分子に対し向けられ、且つ他方は、腫瘍関連抗原に対し向けられる。
【００６６】
特定の実施態様において、第一及び第二の抗原特異性の一方は、ＣＤ３に対し向けられ、且つ他方は、腫瘍関連抗原に対し向けられる。
【００６７】
特定の実施態様において、第一及び第二の抗原特異性の一方は、ＣＤ３に対し向けられ、且つ他方は、ＣＤ１９に対し向けられる。
【００６８】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は更に、第一の二量体形成ドメインを含み、且つ第二の抗原結合部分は更に、第二の二量体形成ドメインを含み、ここで第一及び第二の二量体形成ドメインは会合されている。
【００６９】
特定の実施態様において、会合は、コネクター、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、もしくは疎水性-親水性相互作用、又はそれらの組合せを介してである。
【００７０】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の二量体形成ドメインは、任意にＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来した抗体ヒンジ領域の少なくとも一部分を含む。
【００７１】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の二量体形成ドメインは、二量体形成ドメインを更に含む。特定の実施態様において、二量体形成ドメインは、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部、抗体ＣＨ２ドメイン、及び／又は抗体ＣＨ３ドメインを含む。
【００７２】
特定の実施態様において、第一の二量体形成ドメインは、第三の接続ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結される。
【００７３】
特定の実施態様において、ａ）Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つ第三の接続ドメインは、配列番号：５３又は５４に含まれ；ｂ）Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つ第三の接続ドメインは、配列番号：１３４、１３５、１４０又は１４１に含まれ；ｃ）Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つ第三の接続ドメインは、配列番号：１３４、１３５、１４０又は１４１に含まれ；ｄ）Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つ第三の接続ドメインは、配列番号：１２１又は１２２に含まれるか；あるいは、ｅ）Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つ第三の接続ドメインは、配列番号：１２７又は１２８に含まれる。
【００７４】
特定の実施態様において、第二の二量体形成ドメインは、第二の抗原結合部分の重鎖可変ドメインに機能的に連結される。
【００７５】
特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、異なり、且つホモ二量体形成を妨げ、及び／又はヘテロ二量体形成に有利に働く様式で会合している。
【００７６】
特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、ヘテロ二量体へ、ノブイントゥホール、疎水性相互作用、静電的相互作用、親水性相互作用、又は増大した可動性を介して、会合することが可能である。
【００７７】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、キメラ定常領域へ機能的に連結されるＶＨを含む第一のポリペプチド、及びＣ２へ機能的に連結されるＶＬを含む第二のポリペプチドを含み、ここでキメラ定常領域及びＣ２は、配列番号：１７７／１７６、１７９／１７８、１８４／１８３、１８５／１８３、１８０／１７６、１８１／１７８、１８２／１７８、１８４／１８６、１８５／１８６、１８８／１８７、１９６／１８７、１９０／１８９、１９２／１９１、１９２／１９３、１９５／１９４、１９８／１９７、２００／１９９、２０２／２０１、２０３／２０１、２０３／２０４、２０５／２０４、２０６／２０４、２０８／２０７、２０８／２０９、２１１／２１０、２１３／２１２、２１３／２１５、２１３／１５１、２１４／２１２、２１４／１５１、２３２／２３１、２１６／２１５、２１８／２１７、２２０／２１９、２２２／２２１、２２４／２２３、２２６／２２５、２２７／２２３、２２９／２２８、２２９／２３０、２３６／２３５及び２３８／２３７からなる群から選択される配列の対を含む。
【００７８】
特定の実施態様において、第一の抗原性は、ＣＤ３に対し向けられ、且つ第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、配列番号：２／１、３／４／、５／１、６／３、７／３、９／８、１０／８、９／１１、１０／１１、１３／１２、１５／１４、１７／１６、１７／１８、２０／１９、２１／１２、６５／６４、６７／６６、６９／６８、７０／６８、７０／７１、７２／７１、７３／７１、７５／７４、７５／７６、７８／７７、８６／８５、９０／８９、９１／９２／、９４／９３、９６／９５、９８／９７、９９／９５、１０１／１００、１０１／１０２、１０６／１０５、１０８／１０７、１１０／１０９、１１２／１１１、１３７／１３６、１３８／１３６、１３７／１３９及び１３８／１３９からなる群から選択される配列の対を含む。
【００７９】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、配列番号：２２／１２／２４／２３、２５／１２／２６／２３、及び２５／１２／２７／２３からなる群から選択される４つの配列組合せを含み、ここで第一の抗原結合部分は、ＣＤ３へ結合することが可能であり、且つ第二の抗原結合部分は、ＣＤ１９へ結合することが可能である。
【００８０】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ビボディ、トリボディ、トリＦａｂ、タンデム連結Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ、タンデム連結Ｖドメイン、タンデム連結ｓｃＦｖ、及び他のフォーマットで作製することができる。
【００８１】
別の態様において、本開示は、疾患又は状態の検出、診断、予後判定、又は治療のための、本明細書に提供されるポリペプチド複合体を含むキットを提供する。
【００８２】
前記及び他の本発明の特徴及び利点は、添付図面を参照し進める以下のいくつかの実施態様の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、試験した抗体フォーマットの概略図を表す。抗−ＣＤ３抗体Ｔ３及び抗−ＣＤ１９抗体Ｕ４の両方を開発した。Ｔ３の定常領域（ＣＬ及びＣＨ１）を、ＴＣＲの定常ドメインと置き換え、通常の抗体に直交する独自の軽鎖−重鎖境界面を設計した。Ｆｃドメイン中の「ノブイントゥホール」変異による接続内のＴＣＲ−修飾したＴ３及び天然型Ｕ４を使用し、二重特異性の抗体フォーマットＥ１７及びＦ１６を設計した。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ−２Ｄは、抗体Ｆｖモデル及びＴＣＲ構造の重ねたポーズを表し、抗体ＦｖとＴＣＲ定常領域の融合の指針を提供する。図２Ａは、研究室内で開発した抗−ＣＤ３抗体Ｔ３の配列を基に構築された抗体Ｆｖ構造モデルを表す。図２Ｂは、ＰＤＢ  ４Ｌ４Ｔ由来のＴＣＲ構造を表す。図２Ｃは、異なる配向でＴＣＲ可変領域上に重ねた抗体Ｆｖ構造モデルを表す。ラフなキメラタンパク質は、図２Ｄに示したように、重ねたポーズのＴＣＲ可変ドメインを除去することにより、作製した。この接続領域中の重複した残基は、接続領域の設計を補助した。抗体ＶＬ鎖及びＴＣＲアルファ鎖は、白色で色づけした。ＶＨ鎖及びベータ鎖は、黒色に色づけした。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ−３Ｂは、ＴＣＲ定常領域と抗体Ｆａｂ定常領域の間の比較を示す。図３Ａは、ＰＤＢ  ４Ｌ４Ｔ由来のＴＣＲ結晶構造を示す。図３Ｂは、Ｔ３モデルのＦｖドメイン及びＰＤＢ  ５ＤＫ３由来の抗体の定常ドメインにより作製された抗体Ｆａｂ構造モデルを示す。ＴＣＲの定常ドメインと抗体Ｆａｂの定常ドメインの間のＦＧループ及びＤＥループの明らかな差異は、側鎖残基全てを表示することによりマークした。
【図４】図４は、ＣＡｌｐｈａ鎖及びＣＢｅｔａ鎖とのＴＣＲ−抗体のキメラ抗体の脱グリコシル化変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。試料は、全てＥｘｐｉ２９３発現の生成物から収集した上清であった。レーン１、３、５、７及び９は、各々、Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ、Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＡＡＡＡ、Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＳＫＥ、Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＡＳＫＥ及びＤｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱＱの非還元ＰＡＧＥである。レーン２、４、６、８及び１０は、対応する還元ＰＡＧＥである。
【図５】図５は、ＣＤ３−発現したＪｕｒｋａｔ細胞に結合する全ての脱グリコシル化された変異体の用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。全ての試料は、Ｅｘｐｉ２９３において発現された脱グリコシル化変異体の収集した上清であった。野生型抗−ＣＤ３抗体（Ｔ３−ＩｇＧ１）を、陽性対照として使用した。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、ＩｇＧ１（図６Ａ）及びＩｇＧ４（図６Ｂ）アイソタイプにおける抗体Ｔ３及びＵ４の鎖誤対形成試験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。レーン１−２は、各々、Ｔ３＿ｌｉｇｈｔ−Ｕ４＿ｈｅａｖｙ及びＴ３＿ｈｅａｖｙ−Ｕ４＿ｌｉｇｈｔの対である。レーン３−４は、レーン１−２と同じ対の順番であるが、ＴＣＲ定常領域を用い修飾したＴ３を伴う。両方の図におけるレーン１−４は、非還元試料であり、レーン５−８は、対応する還元試料である。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、（図７Ａ）ＩｇＧ１及び（図７Ｂ）ＩｇＧ４における精製された二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。ＩｇＧ１アイソタイプは、３工程精製により精製した：プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。ＩｇＧ４は、２工程精製後に得た：プロテインＡクロマトグラフィー及びＳＥＣ。図７Ｃ−７Ｄは、試料の純度を決定するための、ＩｇＧ１（図７Ｃ）及びＩｇＧ４（図７Ｄ）の精製した試料に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す。
【図８】図８は、Ni Sepharose(商標)エクセルクロマトグラフィーにより精製した、６×Ｈｉｓ−タグを持つキメラＴ３のＦａｂ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。レーン１及び３は、Ｔ３−Ｆａｂ−Ｄｅｓｉｇｎ＿２．ｈｉｓ１のバンドであり、レーン２及び４は、Ｔ３−Ｆａｂ−Ｄｅｓｉｇｎ＿２．ｈｉｓ２のバンドである。
【図９】図９は、ＴＣＲ−修飾したキメラＴ３のＦａｂ断片の用量依存的ＦＡＣＳ結合を図示している。野生型Ｔ３抗体の一価型（Ｔ３−Ｆａｂ−ＩｇＧ４）を、陽性対照として使用した。通常のヒトＩｇＧ４抗体を、陰性対照として使用した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｂは、設計された二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱのＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞への用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。野生型抗体Ｔ３及びＵ４、並びにそれらの一価型を、陽性対照として使用し（図１０Ａ）、並びに図１０ＢはＣＤ１９＋Ｒａｍｏｓ細胞に関する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方のアイソタイプを試験した。無関係のヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体を、陰性対照として使用した。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、２種の設計された二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ及びＦ１６−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱの、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３（図１１Ａ）及びＲａｍｏｓ細胞上に発現されたＣＤ１９（図１１Ｂ）へのＦＡＣＳ結合の比較を示す。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方のアイソタイプにおける二重特異性抗体を、試験した。通常のヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体を、陰性対照として使用した。
【図１２】図１２は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方において設計された二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱにより媒介された、悪性Ｂ細胞を死滅するように方向付けられたＴ細胞の細胞傷害性アッセイを図示している。親の単一特異性の抗−ＣＤ３抗体（Ｔ３−ＩｇＧ４）、抗−ＣＤ１９（Ｕ４−ＩｇＧ）抗体及び無関係のヒトＩｇＧ１抗体を、陰性対照として使用した。
【図１３】図１３は、Ｔ細胞エンゲージ悪性Ｂ細胞死滅の媒介における、２種の設計された二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ及びＦ１６−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱの活性を比較する。無関係のヒトＩｇＧ抗体を、陰性対照として使用した。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｂは、非還元条件（図１４Ａ）及び還元条件（図１４Ｂ）での、二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱのデコンボルーションされた質量スペクトルを示す。図１４Ａにおける１４８１８０．５３のピークは、インタクトなＷｕＸｉＢｏｄｙの正確な分子量である。２２８７７Ｄａのピークは、図１４Ｂの還元質量スペクトルにおいて認められた軽鎖を示している。図１４Ａの１４９１２８．４５Ｄａの小さいピークは、軽鎖上に配置されたＯ−グリコシル化（およそ（９４７．９２Ｄａより大きい）であると推定され、図１４Ｂにおいて示された。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けられたアルファ／ベータ境界面での抗体発現における鎖間ジスルフィド結合の役割を示す。図１５Ａは、ＣＡｌｐｈａとＣＢｅｔａの間に鎖間ジスルフィド結合を含む抗体を示し；図１５Ｂは、ＣＡｌｐｈａとＣＢｅｔａの間に鎖間ジスルフィド結合を伴わない抗体を示し；レーン１及び３は、各々、導入されたジスルフィド結合の有及び無のＤｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ−ＩｇＧ４の非還元ＰＡＧＥ結果である。レーン２及び４は、各々、導入されたジスルフィド結合の有及び無のＤｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ−ＩｇＧ４の還元ＰＡＧＥ結果である。
【図１６】図１６は、プレ−アルファ／ベータ境界面で設計されたジスルフィド結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１及び２は、各々、非還元条件で処理した、「Ｄｅｓｉｇｎ＿５＿Ｐｒｅ＿ＴＣＲ＿Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ’１＿Ｃｙｓ１３」及び「Ｄｅｓｉｇｎ＿６＿Ｐｒｅ＿ＴＣＲ＿Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ’１＿Ｃｙｓ１４」である。レーン４及びレーン５は、各々、還元条件で処理した、「Ｄｅｓｉｇｎ＿５＿Ｐｒｅ＿ＴＣＲ＿Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ’１＿Ｃｙｓ１３」及び「Ｄｅｓｉｇｎ＿６＿Ｐｒｅ＿ＴＣＲ＿Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ’１＿Ｃｙｓ１４」である。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａ−１７Ｂは、デルタ／ガンマ境界面で設計されたジスルフィド結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン６及びレーン８は、各々、「Ｄｅｓｉｇｎ＿２＿Ｃｙｓ５＿ｎｏ＿Ｇｌｙｃｏ」及び「Ｄｅｓｉｇｎ＿２＿ｈｙｐｅＣｙｓ２＿ｎｏ＿Ｇｌｙｃｏ」である。図１７Ａは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図１７Ｂは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１８Ａ−１８Ｅ】図１８Ａは、天然型ＴＣＲアルファ鎖配列及び変異されたシステイン残基を伴うその対応物の配列を示す。ＴＲＡＣ＿Ｈｕｍａｎは、アルファ鎖定常領域の天然配列である。４Ｌ４Ｔ＿Ａｌｐｈａ＿Ｃｒｙｓｔａｌは、鎖間ジスルフィド結合を形成することができるＳ５５Ｃ変異を伴う結晶構造の配列（ＰＤＢコード４Ｌ４Ｔ）である。灰色領域は、本発明においてキメラタンパク質の骨格として使用した定常領域である。図１８Ｂは、天然型ＴＣＲベータ鎖配列及び変異されたシステイン残基を伴うその対応物の配列を示す。ＴＲＢＣ１＿Ｈｕｍａｎ及びＴＲＢＣ２＿Ｈｕｍａｎは、ベータ定常領域の天然配列である。図１８Ｃは、天然型ＴＣＲプレ−アルファ鎖配列を示す。ＰＴＣＲＡ＿Ｈｕｍａｎは、プレ−アルファ鎖定常領域の天然配列である（プレ−アルファ鎖のみは可変領域を持たない）。３ＯＦ６＿ＰｒｅＡｌｐｈａ＿Ｃｒｙｓｔａｌは、結晶構造の配列（ＰＤＢコード３ＯＦ６）である。灰色領域は、番号付けを規定するために先に使用した定常領域である。図１８Ｄは、天然型ＴＣＲデルタ鎖の配列を示す。ＴＲＡ＠＿Ｈｕｍａｎは、デルタ定常領域の天然配列である。４ＬＦＨ＿Ｄｅｌｔａ＿Ｃｒｙｓｔａｌは、結晶構造のデルタ鎖配列（ＰＤＢコード４ＬＦＨ）の定常領域である。灰色領域は、番号付けを規定するために先に使用した定常領域である。図１８Ｅは、天然型ＴＣＲガンマ鎖の配列を示す。ＴＲＧＣ１＿Ｈｕｍａｎ及びＴＲＧＣ２＿Ｈｕｍａｎは、ガンマ定常領域の天然配列である。４ＬＦＨ＿Ｇａｍｍａ＿Ｃｒｙｓｔａｌは、結晶構造のガンマ鎖配列（ＰＤＢコード４ＬＦＨ）の定常領域である。灰色領域は、番号付けを規定するために先に使用した定常領域である。
【図１９Ａ−１９Ｅ】図１９Ａ−１９Ｅは、ＴＣＲ定常領域の配列及び番号付けを示す。図１９Ａは、ＴＣＲアルファ定常領域の配列及び番号付けを示す。図１９Ｂは、ＴＣＲベータ定常領域の配列及び番号付けを示す。図１９Ｃは、ＴＣＲプレ−アルファ定常領域の配列及び番号付けを示す。図１９Ｄは、ＴＣＲデルタ定常領域の配列及び番号付けを示す。図１９Ｅは、ＴＣＲガンマ定常領域の配列及び番号付けを示す。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ−２０Ｄは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４のノブイントゥホールの配列及び番号付けを示す。図２０Ａは、ＩｇＧ１「ノブ」変異の配列及び番号付けを示す。図２０Ｂは、ＩｇＧ４「ノブ」変異の配列及び番号付けを示す。図２０Ｃは、ＩｇＧ１「ホール」変異の配列及び番号付けを示す。図２０Ｄは、ＩｇＧ４「ホール」変異の配列及び番号付けを示す。
【図２１Ａ−２１Ｂ】図２１Ａ−２１Ｂは、ＥＬＩＳＡによる、ヒトＣ１Ｑへの、ＩｇＧ４（図２１Ａ）及び野生型ＩｇＧ１（図２１Ｂ）の両方のフォーマットにおけるＥ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱの結合を示す。ヒトＩｇＧ１抗体を、対照として使用した。
【図２２】図２２は、４種の対称性のＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットＧ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５及びＧ２５Ｒの概略的説明を示す。フォーマットＧ１９及びＧ２５に関して、２種のＴＣＲ−含有キメラＦａｂ−様ドメインは、各々、正常抗体のＣ−末端及びＮ−末端でグラフトされた。長方形は、ＴＣＲ定常ドメインを示し、且つ楕円形は、抗体の可変ドメイン及び定常ドメインを示す。フォーマットＧ１９及びＧ１９Ｒ又はＧ２５及びＧ２５Ｒの間の差は、正常Ｆａｂ及びキメラＦａｂのスイッチされた位置である。これらのフォーマットは、異なる抗体対からの異なる可変領域を収容することができ、通常分子量およそ２４０〜２５０ｋＤを有する。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ−２３Ｂは、Ｇ１９フォーマットの２種の精製された二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２３Ａ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図２３Ｂ）の特徴を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるレーン番号は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ図中の標示番号と一致する。レーン１及び２は、各々、Ｔ１Ｕ６及びＵ６Ｔ１抗体対である。Ｔ１Ｕ６において、Ｔ１（抗−ＣＴＬＡ−４）は、このフォーマットのＮ−末端上にあるのに対し、Ｕ６Ｔ１においては、Ｕ６（抗−ＰＤ−１）が、このフォーマットのＮ−末端上にある。両方の二重特異性分子は、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、純度およそ９０％を達成した。
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａ−２４Ｂは、ヒトＰＤ−１（図２４Ａ）及びＣＴＬＡ−４（図２４Ｂ）操作された細胞への、Ｇ１９フォーマットの精製されたＵ６Ｔ１及びＴ１Ｕ６抗体の用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。ＩｇＧ４抗体を、陰性対照として使用した。
【図２５Ａ−２５Ｂ】図２５Ａ−２５Ｂは、異なる対称性フォーマットのプロテインＡ精製した二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２５Ａ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図２５Ｂ）の特徴を示す。レーン１−３は、各々、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５ＲフォーマットのＵ６Ｔ１抗体対である。ＰＣは、分子量２５０ｋＤを有することがわかっている対照タンパク質である。これら３種の二重特異性分子は全て、純度９０％以上を有した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン番号は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ図の標示番号に一致している。
【図２６Ａ−２６Ｂ】図２６Ａ−２６Ｂは、ヒトＰＤ−１（図２６Ａ）及びＣＴＬＡ−４（図２６Ｂ）操作された細胞への、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５Ｒフォーマットの精製されたＵ６Ｔ１二重特異性抗体の用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図２７Ａ−２７Ｂ】図２７Ａ−２７Ｂは、各々、ＰＤ−１へのヒトＰＤ−Ｌ１結合をブロックする（図２７Ａ）及びＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０結合をブロックする（図２７Ｂ）ことへの、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５Ｒフォーマットの設計された二重特異性抗体のＦＡＣＳ競合アッセイを示す。ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図２８Ａ−２８Ｂ】図２８Ａ−２８Ｂは、異なる対称性フォーマットの、プロテインＡ精製された二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２８Ａ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図２８Ｂ）特徴を示す。レーン１−４は、各々、Ｇ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５ＲフォーマットのＵ６Ｔ５抗体対である。ＰＣは、分子量２５０ｋＤの対照タンパク質である。これら３種の二重特異性分子は全て、純度９０％以上を有した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン番号は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ図の標示番号と一致している。
【図２９Ａ−２９Ｂ】図２９Ａ−２９Ｂは、ヒトＰＤ−１（図２９Ａ）及びＣＴＬＡ−４（図２９Ｂ）操作された細胞への、Ｇ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５Ｒフォーマットの精製された二重特異性抗体の用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。ベンチマークの二重特異性の抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図３０】図３０は、２種の分子Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５及びＵ６Ｔ１．Ｇ２５ＲのＥＬＩＳＡデュアル結合アッセイを示す。ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図３１Ａ−３１Ｂ】図３１Ａ−３１Ｂは、各々、ヒトＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックする（図３１Ａ）、及びＣＤ８０のＣＴＬＡ−４への結合をブロックする（図３１Ｂ）ことへの、設計された二重特異性抗体Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５及びＵ６Ｔ１．Ｇ２５ＲのＦＡＣＳ競合アッセイを示す。ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図３２】図３２は、軽鎖−重鎖スイッチしたキメラＦａｂ−様ドメインを持つ、３種の対称性のフォーマットＧ２６、Ｇ２７、及びＧ２６Ｒの概略的説明を示す。
【図３３Ａ−３３Ｂ】図３３Ａ−３３Ｂは、Ｇ２７及びＧ２６Ｒフォーマットの、プロテインＡ−精製した二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３３Ａ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図３３Ｂ）の特徴を示す。レーン１−２は、各々、Ｇ２７及びＧ２６ＲフォーマットのＴ４Ｕ６抗体対である。Ｇ２６Ｒフォーマットのもののみ、精製後に純度９０％を達成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン番号は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ図の標示番号と一致している。
【図３４Ａ−３４Ｂ】図３４Ａ−３４Ｂは、ヒトＰＤ−１（図３４Ａ）及びＣＴＬＡ−４（図３４Ｂ）操作された細胞への、Ｇ２６Ｒフォーマットの精製された二重特異性Ｔ４Ｕ６抗体対の用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図３５Ａ−３５Ｂ】図３５Ａ−３５Ｂは、Ｇ２６フォーマットのプロテインＡ−精製した二重特異性Ｕ６Ｔ４抗体対のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３５Ａ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図３５Ｂ）の特徴を示す。これは、精製後に純度９０％を達成した。
【図３６Ａ−３６Ｄ】図３６Ａ−３６Ｄは、ヒトＰＤ−１（図３６Ａ）及びＣＴＬＡ−４（図３６Ｂ）操作された細胞への、Ｇ２６フォーマットの精製された二重特異性Ｕ６Ｔ４抗体対の用量依存的ＥＬＩＳＡ結合、並びにヒトＰＤ−１（図３６Ｃ）及びＣＴＬＡ−４（図３６Ｄ）操作された細胞への、Ｇ２６フォーマットの精製された二重特異性Ｕ６Ｔ４抗体対の用量依存的ＦＡＣＳ結合を示す。ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＡＬ−４×ＰＤ−１抗体（ＢＭＫ１．ＩｇＧ１）を対照として使用し、ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図３７】図３７は、カニクイザル−ＣＤ１９形質移入された細胞株ＷＢＰ７０１．ＣＨＯ−Ｋ１．ｃｐｒｏ１．ＦＬ．Ｃ９及びＣＨＯ−Ｋ１親細胞株のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。
【図３８】図３８は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｍ：タンパク質マーカー；レーン１：Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、非還元；レーン３：Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、還元。
【図３９】図３９は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４のＳＥＣ−ＨＰＬＣを示す。
【図４０】図４０は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｍ：タンパク質マーカー；レーン１：Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、非還元；レーン２：Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、還元。
【図４１】図４１は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＳＥＣ−ＨＰＬＣを示す。
【図４２Ａ−４２Ｂ】図４２Ａ−４２Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｒａｍｏｓ細胞（図４２Ａ）及びＪｕｒｋａｔ細胞（図４２Ｂ）への、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの結合を示す。
【図４３Ａ−４３Ｂ】図４３Ａ−４３Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｒａｍｏｓ細胞（図４３Ａ）及びＪｕｒｋａｔ細胞（図４３Ｂ）への、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの結合を示す。
【図４４】図４４は、ＦＡＣＳによる、カニクイザル−ＣＤ１９発現細胞への、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの結合を示す。
【図４５】図４５は、ＥＬＩＳＡによる、カニクイザルＣＤ３への、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの結合を示す。
【図４６Ａ−４６Ｂ】図４６Ａ−４６Ｂは、Ｒａｍｏｓ細胞（図４６Ａ）及びＪｕｒｋａｔ細胞（図４６Ｂ）への結合により測定した、ヒトＣＤ１９及びＣＤ３への、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの親和性を示す。
【図４７Ａ−４７Ｂ】図４７Ａ−４７Ｂは、ＣＤ１９＋細胞への、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ−媒介性ＣＤ３＋細胞結合を示す（図４７Ａ）。無関係のＩｇＧを、陰性対照として使用した（図４７Ｂ）。
【図４８Ａ−４８Ｂ】図４８Ａ−４８Ｂは、Ｒａｊｉ細胞を死滅するＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ媒介性Ｔ細胞の細胞傷害性活性（図４８Ａ）、及びＲａｊｉ細胞を死滅するＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ媒介性Ｔ細胞の細胞傷害性活性（図４８Ｂ）を示す。
【図４９Ａ−４９Ｄ】図４９Ａ−４９Ｄは、ＣＤ１９＋標的細胞の存在又は非存在下での、Ｔ細胞上のＣＤ６９及びＣＤ２５発現を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ６９＋発現Ｔ細胞の割合（図４９Ａ）；ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ６９発現Ｔ細胞の割合（図４９Ｂ）；ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５発現Ｔ細胞の割合（図４９Ｃ）；ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５発現Ｔ細胞の割合（図４９Ｄ）。
【図５０Ａ−５０Ｄ】図５０Ａ−５０Ｄは、ＣＤ１９＋標的細胞の存在又は非存在下での、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカイン放出を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおけるＩＦＮ−γの放出（図５０Ａ）；ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおけるＴＮＦ−αの放出（図５０Ｂ）；ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＩＦＮ−γの放出（図５０Ｃ）；ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＴＮＦ−αの放出（図５０Ｄ）。
【図５１Ａ−５１Ｂ】図５１Ａ−５１Ｂは、ヒト血清中のＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの安定性を示す。指定された日でのＲａｍｏｓへの血清中インキュベーションしたＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ試料の結合（図５１Ａ）；指定された日でのＪｕｒｋａｔへの血清中インキュベーションしたＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ試料の結合（図５１Ｂ）。
【図５２】図５２は、ＥＬＩＳＡによるＣ１ＱへのＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの結合を示す。ＩｇＧ１抗体を、対照として使用した。
【図５３】図５３は、Ｒａｊｉ異種移植腫瘍を有する混合型ＰＢＭＣヒト化マウスへの、異なる投与量でのＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの投与後の、腫瘍容積トレースを示す。データ点は、群平均を表し、エラーバーは、その平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図５４】図５４は、カニクイザルにおけるＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの薬物動態を示す。２匹のサル由来の血清試料を、ＥＬＩＳＡにより検出した。
【図５５Ａ−５５Ｂ】図５５Ａ−５５Ｂは、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの投薬前及び投薬後の両方を含む、サル＃１（図５５Ａ）及びサル＃２（図５５Ｂ）由来の血清試料中の抗−薬物抗体（ＥＬＩＳＡにより検出されたＡＤＡ）を示す。
【図５６Ａ−５６Ｂ】図５６Ａ−５６Ｂは、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ特徴（Ｍ：タンパク質マーカー、ＰＣ：およそ２５０ｋＤａの二重特異性抗体の陽性対照）（図５６Ａ）、並びにＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＳＥＣ−ＨＰＬＣ特徴（図５６Ｂ）を示す。
【図５７】図５７は、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、及びベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬの融解温度を示す。
【図５８】図５８は、ヒトＰＤ−１操作された細胞への、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ結合を示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬ、Ｗ３２４−ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４、及びＷ３２４−ＢＭＫ３．ｕＩｇＧ４は、ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の異なる型である。ＷＢＰ３０５−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＰＤ−１抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図５９】図５９は、カニクイザルＰＤ−１操作された細胞への、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ結合を示す。ＷＢＰ３０５５＿１．１５３．７．ｈＡｂ及びＷＢＰ３０５−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＰＤ−１抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６０】図６０は、ヒトＣＴＬＡ−４操作された細胞への、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ結合を示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬ、Ｗ３２４−ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４、及びＷ３２４−ＢＭＫ３．ｕＩｇＧ４は、異なるベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体である。ＷＢＰ３１６−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＣＴＬＡ−４−１抗体であり。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６１】図６１は、カニクイザルＣＴＬＡ−４操作された細胞への、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ結合を示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬは、ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体である。Ｗ３１６２＿１．１５４．８−ｚ３５−ＩｇＧ１Ｋ及びＷＢＰ３１６−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６２】図６２は、ＳＰＲにより測定した、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１に対する結合親和性をまとめている。ＷＢＰ３１６−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＣＴＬＡ−４−１抗体である。抗−ＰＤ−１の親抗体を、対照として使用した。
【図６３】図６３は、ＰＤ−１操作された細胞へのヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質結合をブロックすることへの、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ競合アッセイを示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬは、ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体である。ＷＢＰ３０５５＿１．１５３．７．ｈＡｂ及びＷＢＰ３０５−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＰＤ−１抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６４】図６４は、ＣＤ８０操作された細胞へのヒトＣＴＬＡ−４タンパク質結合をブロックすることへの、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ競合アッセイを示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬは、ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体である。Ｗ３１６２＿１．１５４．８−ｚ３５−ＩｇＧ１Ｋ及びＷＢＰ３１６−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６５】図６５は、ＣＤ８０操作された細胞へのカニクイザルＣＴＬＡ−４タンパク質結合をブロックすることへの、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳ競合アッセイを示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬは、ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体である。Ｗ３１６２＿１．１５４．８−ｚ３５−ＩｇＧ１Ｋ及びＷＢＰ３１６−ＢＭＫ１．ＩｇＧ４は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６６】図６６は、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＬＩＳＡデュアル結合アッセイを示す。ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ１．ＫＤＬは、ベンチマークの二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体である。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６７】図６７は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１への、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦＡＣＳデュアル結合を示す。ＩｇＧ４抗体を陰性対照として使用した。
【図６８Ａ−６８Ｂ】図６８Ａ−６８Ｂは、ヒトＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１へのＥＬＩＳＡデュアル結合により測定した、１４日間の血清中のＷ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの安定性（図６８Ａ）、並びにヒトＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１へのＥＬＩＳＡデュアル結合により測定した、１４日間の血清中のＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの安定性（図６８Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
（発明の詳細な説明）
本開示の以下の説明は、本開示の様々な実施態様を例証することのみを意図している。従って、考察した具体的修飾は、本開示の範囲を限定するものとしては解釈されない。様々な同等物、変更、及び修飾を、本開示の範囲を逸脱することなく行うことができ、且つそのような同等の実施態様は本明細書に含まれると理解されるべきであることは、当業者には明らかであろう。刊行物、特許及び特許出願を含む、本明細書において引用した全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
【００８５】
（定義）
【００８６】
冠詞(a、an及びthe)は、その冠詞の文法上の対象の１又は２以上（すなわち少なくとも１つ)を指すように本明細書において使用される。例えば、「ある(a)ポリペプチド複合体」は、１つのポリペプチド複合体又は２以上のポリペプチド複合体を意味する。
【００８７】
本明細書において使用される用語「約」又は「およそ」は、参照の分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対し、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％の量だけ変動する、分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。特定の実施態様において、用語「約」又は「およそ」は、数値に先行する場合、プラス又はマイナス１５％、１０％、５％、又は１％の範囲の値を示す。
【００８８】
本開示を通じて、別に状況が必要としない限りは、語句「らを含む」、「を含む」及び「を含んでいる」は、言及された一つの工程もしくは要素、又は複数の工程もしくは要素の群を包含することを暗示するが、いずれか他の一つの工程もしくは要素、又は複数の工程もしくは要素の群を排除することは暗示しないことが理解されるであろう。「からなる」は、句「からなる」に続くものを含み、かつこれらに限定されることを意味する。従って、語句「からなる」は、列挙された要素は、必要又は強制であること、並びに他の要素は存在しないことを指摘している。「から本質的になる」は、その語句の後に列挙された任意の要素を含み、且つ列挙された要素に関する開示において特定された活性又は作用と干渉しないか又はこれに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って語句「から本質的になる」は、列挙された要素は、必要又は強制されるが、他の要素は、任意であるか、もしくは列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを指摘している。
【００８９】
本開示を通じての言及「一実施態様」、「ある実施態様」、「特別な実施態様」、「関連する実施態様」、「特定の実施態様」、「追加の実施態様」、もしくは「更なる実施態様」又はそれらの組合せは、その実施態様と結びつけて説明された特別な特性、構造又は特徴が、本開示の少なくとも一つの実施態様に含まれることを意味する。従ってこの明細書を通じて様々な場所で先行する句の出現は、必ずしも同じ実施態様に言及している全てではない。更に、特別な特性、構造、又は特徴は、1以上の実施態様においていずれか好適な様式で組み合わされてよい。
【００９０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に利用され、アミノ酸残基のポリマー、又はアミノ酸残基の複数のポリマーの集成体を指す。これらの用語は、その中の１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に生じるアミノ酸ポリマー及び天然に生じないアミノ酸ポリマーに適用される。用語「アミノ酸」は、天然に生じる及び合成のアミノ酸、並びに天然に生じるアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然に生じるアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたもの、並びにその後修飾されるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンなどである。アミノ酸アナログは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち、水素に結合しているアルファ炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを指す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、依然天然に生じるアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アルファ炭素は、カルボニルなどの官能基に結合している第一の炭素原子を指す。ベータ炭素は、アルファ炭素に連結された第二の炭素原子を指し、このシステムは、ギリシャ文字によるアルファベットの順に炭素を命名し続ける。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と類似の様式で機能する化合物を指す。用語「タンパク質」は典型的には、大型のポリペプチドを指す。用語「ペプチド」は典型的には、短いポリペプチドを指す。ポリペプチド配列は通常、ポリペプチド配列の左側末端は、アミノ末端（Ｎ−末端）であり；ポリペプチド配列の右側末端は、カルボキシ末端（Ｃ−末端）であるとして、記載される。本明細書において使用される「ポリペプチド複合体」は、特定の機能を実行するように会合されている１以上のポリペプチドを含む複合体を指す。特定の実施態様において、このポリペプチドは、免疫に関連している。
【００９１】
本明細書において使用される用語「抗体」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、又は二重特異性（二価）抗体を包含している。天然型のインタクトな抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域（“ＨＣＶＲ”）並びに第一、第二、及び第三の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる一方で、各軽鎖は、可変領域（“ＬＣＶＲ”）及び定常領域（ＣＬ）からなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、及びμとして分類され、並びに哺乳動物の軽鎖は、λ又はκとして分類される。抗体は、「Ｙ字」型を有し、Ｙ字の幹は、ジスルフィド結合を介して一緒に結合された２本の重鎖の第二及び第三の定常領域からなる。このＹ字の各アームは、単独の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合された、単独の重鎖の可変領域及び第一の定常領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に寄与する。両方の鎖の可変領域は一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、３つの超可変ループを含む（軽（Ｌ）鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、重（Ｈ）鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む）。抗体のＣＤＲ境界は、Kabat、Chothia、又はAl-Lazikaniの慣習に従い規定又は同定される(Al-Lazikani、B., Chothia、C., Lesk, A. M.、J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997)；Chothia, C.ら、J Mol. Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C.及びLesk, A.M.、J.Mol. Biol., 196,901 (1987)；Chothia, C.ら、Nature. Dec 21-28; 342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.ら、National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。これら３種のＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知のフランキング配列(stretch)間に挟まれ、これらはＣＤＲよりもより高度に保存され、且つ超可変ループを支持するためにスカフォールドを形成する。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの各々は、４つのＦＲを含み、ＣＤＲ及びＦＲは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の定常領域は、抗原結合には関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列をベースにしたクラスに割り当てられる。５種の抗体の主要なクラス又はアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらは各々、α、δ、ε、γ、及びμ重鎖の存在により特徴付けられる。主要抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、又はＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。
【００９２】
本明細書において使用される抗体に関する用語「可変ドメイン」は、１以上のＣＤＲを含む抗体可変領域又はその断片を指す。可変ドメインは、インタクトな可変領域（ＨＣＶＲ又はＬＣＶＲなど）を含んでよいが、これは、抗原への結合能力又は抗原結合部位の形成能力を依然保持しているインタクト未満の可変領域を含むことも可能である。
【００９３】
本明細書において使用される用語「抗原結合部分」は、１以上のＣＤＲを含む抗体の部分から形成された抗体断片、又は抗原に結合するがインタクトな天然型抗体構造は含まない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合部分の例は、可変ドメイン、可変領域、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化されたダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化された単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、及び二価ドメイン抗体を含むが、これらに限定されるものではない。抗原結合部分は、親抗体が結合するものと同じ抗原への結合が可能である。特定の実施態様において、抗原結合部分は、１以上の異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体由来の１以上のＣＤＲを含んでよい。抗原結合部分のより多くの詳細なフォーマットについては、Spiessらの論文（2015(前掲)）、及びBrinkmanらの論文（mAbs, 9(2), pp.182-212 (2017)）に説明されており、これらの全体は引用により本明細書中に組み込まれている。
【００９４】
抗体に関連した「Ｆａｂ」は、１本の重鎖の可変領域及び第一の定常領域へ、ジスルフィド結合により会合している１本の軽鎖（可変領域及び定常領域の両方）からなる抗体の部分を指す。特定の実施態様において、軽鎖及び重鎖の両方の定常領域は、ＴＣＲ定常領域で置き換えられる。
【００９５】
「Ｆａｂ’」は、ヒンジ領域の部分を含むＦａｂ断片を指す。
【００９６】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂ’の二量体を指す。
【００９７】
「ビボディ」は、ｓｃＦｖの、軽鎖（Ｆａｂ−Ｌ−ｓｃＦｖ）又はＦｄ（Ｆａｂ−Ｈ−ｓｃＦｖ）のいずれかのＣ−末端への融合により形成された融合タンパク質を指す。
【００９８】
「トリボディ」は、ｓｃＦｖの、軽鎖及び重鎖の両方（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２）への融合により形成された融合タンパク質を指す。
【００９９】
「ＷｕＸｉＢｏｄｙ」は、可溶性キメラタンパク質を、抗体の可変ドメイン及びＴＣＲの定常ドメインと共に含む、二重特異性抗体であり、ここでＴＣＲ定常ドメインのサブユニット（アルファドメイン及びベータドメインなど）は、操作されたジスルフィド結合により連結されている。
【０１００】
抗体に関する「フラグメントディフィカルト（Ｆｄ）」は、軽鎖と組合せられＦａｂを形成することができる重鎖断片のアミノ末端の半分を指す。
【０１０１】
抗体に関する「Ｆｃ」は、ジスルフィド結合により、第二の重鎖の第二及び第三の定常領域に結合した、第一の重鎖の第二（ＣＨ２）及び第三の（ＣＨ３）定常領域からなる抗体の部分を指す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣなど、様々なエフェクター機能に寄与するが、抗原結合においては機能しない。
【０１０２】
抗体に関する「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５個のアミノ酸残基を含み、可動性があり、従って２つのＮ−末端の抗原結合領域が独立して動くようにする。
【０１０３】
本明細書において使用される「ＣＨ２ドメイン」は、慣習的番号付けスキームを使用し、例えばＩｇＧ抗体の約２４４アミノ酸から３６０アミノ酸まで広がる、重鎖分子の部分を含むことを指す(アミノ酸２４４から３６０、Kabat番号付けシステム；及び、アミノ酸２３１−３４０、EU番号付けシステム；Kabat, E.ら、U.S. Department of Health and Human Services, (1983)参照)。
【０１０４】
「ＣＨ３ドメイン」は、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインから、Ｃ−末端まで広がり、且つおよそ１０８個のアミノ酸を含む。特定の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＭは、更にＣＨ４領域を含む。
【０１０５】
抗体に関する「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を有する抗体の最も小さい断片を指す。Ｆｖ断片は、１本の重鎖の可変ドメインに結合した１本の軽鎖の可変ドメインからなる。数多くのＦｖデザインが、提供されており：２つのドメイン間の会合が、導入されたジスルフィド結合により増強されるｄｓＦｖ；並びに、１つのポリペプチドとして、２つのドメインを一緒に結合するためにペプチドリンカーを使用し形成することができる、ｓｃＦｖを含む。対応する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインに会合された免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含むＦｖ構築体もまた、作製されている。Ｆｖはまた、多量体化され、ダイアボディ及びトリボディを形成している(Maynardら、Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000))。
【０１０６】
「ｓｃＦａｂ」は、１本鎖Ｆａｂ断片（ｓｃＦａｂ）の形成を生じる、ポリペプチドリンカーを介し軽鎖に連結されたＦｄを伴う融合ポリペプチドを指す。
【０１０７】
「ＴｒｉＦａｂ」は、Ｆａｂ機能を持ち、３つのユニットで構成された、三価の二重特異性融合タンパク質を指す。ＴｒｉＦａｂは、非対称性のＦａｂ−様部分に融合された２つの通常のＦａｂを収容している。
【０１０８】
「Ｆａｂ−Ｆａｂ」は、第一のＦａｂアームのＦｄ鎖の、第二のＦａｂアームのＦｄ鎖のＮ−末端への融合により形成された融合タンパク質を指す。
【０１０９】
「Ｆａｂ−Ｆｖ」は、ＨＣＶＲのＦｄ鎖のＣ−末端への、並びにＬＣＶＲの軽鎖のＣ−末端への融合により形成された融合タンパク質を指す。「Ｆａｂ−ｄｓＦｖ」分子は、ＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインの間のドメイン間ジスルフィド結合の導入により、形成されることができる。
【０１１０】
「ｍＡｂ−Ｆｖ」又は「ＩｇＧ−Ｆｖ」は、ＨＣＶＲドメインの１本のＦｃ鎖のＣ−末端への、並びに個別に発現されたか又は他方のＣ−末端に融合されたかのいずれかのＬＣＶＲドメインへの融合により形成された融合タンパク質を指し、二重特異性の三価のＩｇＧ−Ｆｖ（ｍＡｂ−Ｆｖ）融合タンパク質を生じ、ドメイン間ジスルフィド結合により安定化されたＦｖを伴う。
【０１１１】
「ｓｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ２」及び「ｓｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ」は、一本鎖Ｆａｂの、Ｆｃ及びジスルフィド−安定化されたＦｖドメインとの融合により形成された融合タンパク質を指す。
【０１１２】
「付け加えられた(appended)ＩｇＧ」は、二重特異性の（Ｆａｂ）２−Ｆｃのフォーマットを形成するために、ＩｇＧへ融合されたＦａｂアームを伴う融合タンパク質を指す。これは、コネクターによるか又はよらずに、ＩｇＧ分子のＣ−末端又はＮ−末端に融合されたＦａｂを伴う「ＩｇＧ−Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ−ＩｇＧ」を形成することができる。特定の実施態様において、付け加えられたＩｇＧは、ＩｇＧ−Ｆａｂ４のフォーマットに更に修飾されることができる(Brinkmanら、2017、前掲参照)。
【０１１３】
「ＤＶＤ−Ｉｇ」は、第二の特異性の追加のＨＣＶＲドメイン及びＬＣＶＲドメインの、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖への融合により形成された、デュアル−可変−ドメイン抗体を指す。「ＣＯＤＶ−Ｉｇ」は、２つのＨＣＶＲドメイン及び２つのＬＣＶＲドメインが、可変ＨＣＶＲ−ＬＣＶＲドメインのクロスオーバー対形成を可能にする様式で連結されている、関連したフォーマットを指し、これは（Ｎ−末端からＣ−末端へ）順番ＨＣＶＲＡ−ＨＣＶＲＢ及びＬＣＶＲＢ−ＬＣＶＲＡ、又は順にＨＣＶＲＢ−ＨＣＶＲＡ及びＬＣＶＲＡ−ＬＣＶＲＢのいずれかで配置される。
【０１１４】
「ＣｒｏｓｓＭａｂ」は、未修飾の軽鎖の対応する未修飾の重鎖との対形成、並びに修飾した軽鎖の対応する修飾した重鎖との対形成の技術を指し、その結果軽鎖における誤対形成が減少した抗体を生じる。
【０１１５】
「ＢｉＴＥ」は、ＨＣＶＲ−ＬＣＶＲ配向で第二の特異性を持つ第二のｓｃＦｖに連結された、ＬＣＶＲ−ＨＣＶＲ配向で第一の抗原特異性を持つ第一のｓｃＦｖを含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子である。
【０１１６】
アミノ酸配列（又は核酸配列）に関する「パーセント（％）配列同一性」は、最大数の同一アミノ酸（又は核酸）を達成するように、配列の整列及び必要に応じたギャップの導入後の、参照配列中のアミノ酸（又は核酸）残基と同一である候補配列中のアミノ酸（又は核酸）残基の百分率として定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一の残基としてみなされてもみなされなくともよい。アミノ酸（又は核酸）配列の％同一性を決定する目的での整列は、例えば、BLASTN、BLASTp(米国立生物工学情報センター(NCBI)のウェブサイトから入手可能、同じくAltschul S.F.ら、J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)；Stephen F.ら、Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)参照)、ClustalW2(欧州バイオインフォマティクス研究所(EBI)のウェブサイトから入手可能、同じくHiggins D.G.ら、Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.ら、Bioinformatics(オックスフォード、英国), 23(21): 2947-8 (2007)参照)、並びにALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの、公に入手可能なツールを用いて、達成することができる。当業者は、ツールにより提供されたデフォルトパラメータを使用してよいか、又は例えば好適なアルゴリズムの選択などにより、整列に適するようにパラメータをカスタマイズしてよい。
【０１１７】
本明細書において使用される「抗原」又は「Ａｇ」は、細胞培養物又は動物において、抗体の産生又はＴ細胞反応を刺激することができる化合物、組成物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は物質を指し、細胞培養物に添加されるか（ハイブリドーマなど）、又は動物へ注入されるかもしくは吸収される組成物（癌特異性タンパク質を含むものなど）を含む。抗原は、異種抗原により誘導されたものを含む、特異的体液性又は細胞性免疫の産物（抗体など）と反応する。
【０１１８】
「エピトープ」又は「抗原決定基」は、それに結合体（抗体など）が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、タンパク質の三次元フォールディングにより並置された、近接アミノ酸（線状又は連続エピトープとも称される）又は非近接アミノ酸の両方から形成されることができる（立体配置的又は高次構造的エピトープとも称される）。近接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、タンパク質上に一次アミノ酸残基に沿って線形に配置され、且つ近接アミノ酸の小型セグメントは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合している抗原から消化されるか、又は変性溶媒への曝露時に保持され得るのに対し、三次元フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒による処理時に失われる。エピトープは、独自の空間高次構造において、典型的には少なくとも３個、より一般には少なくとも５個、約７、又は約８〜１０個のアミノ酸を含む。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、例えば抗体と抗原の間など、２つの分子間の無作為ではない結合反応を指す。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体は、結合親和性（ＫＤ）≦１０−６Ｍ（例えば、≦５×１０−７Ｍ、≦２×１０−７Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦５×１０−８Ｍ、≦２×１０−８Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦５×１０−９Ｍ、≦２×１０−９Ｍ、≦１０−９Ｍ、又は≦１０−１０Ｍ）で、抗原に特異的に結合する。本明細書において使用されるＫＤは、解離速度の会合速度に対する比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、これは例えばBiacoreなどの装置を使用する、表面プラズモン共鳴法を用いて決定されてよい。
【０１２０】
用語「機能的に連結する」又は「機能的に連結される」とは、２以上の関心対象の生物学的配列が、意図された様式でそれらが機能することを可能にする関係であるように、スペーサー又はリンカーを伴う又は伴わずに、該配列が近位であることを指す。ポリペプチドに関して使用される場合、そのポリペプチド配列は、連結された生成物が、意図された生物学的機能を有することを可能にするように連結されることを意味することが意図される。例えば、抗体可変領域は、抗原−結合活性を持つ安定した生成物を提供するように、定常領域に機能的に連結されてよい。この用語はまた、ポリヌクレオチドに関しても使用される。例として、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に機能的に連結される場合、このポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド由来のポリペプチドの調節された発現を可能にするように連結されることを意味することが意図される。
【０１２１】
アミノ酸配列（例えばペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）に関して使用される場合、用語「融合」又は「融合された」は、天然には存在しない、単独のアミノ酸配列への、例えば化学結合又は組換え手段による、２以上のアミノ酸配列の組合せを指す。融合アミノ酸配列は、２つのコード化ポリヌクレオチド配列の遺伝子組換えにより作製されてよく、且つ組換えポリヌクレオチドを含む構築体の宿主細胞への導入の方法により発現され得る。
【０１２２】
本明細書において使用される用語「スペーサー」は、ペプチド結合により結合され、且つ１以上のポリペプチドを連結するために使用される、１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基、又は長さ５から１５、２０、３０、５０もしくはそれよりも多いアミノ酸残基を有する、人工のアミノ酸配列を指す。スペーサーは、二次構造を有しても有さなくともよい。スペーサー配列は、当該技術分野において公知であり、例えば、Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)；Poljakら、Structure 2:1121-1123 (1994)を参照されたい。当該技術分野において公知の任意の好適なスペーサーを、使用することができる。例えば本開示において有用なスペーサーは、グリシン及びプロリン残基がリッチであってよい。例としては、TGGGG（配列番号：２６６）、GGGGS（配列番号：２６７）又はSGGGG（配列番号：２６８）などの、トレオニン／セリン及びグリシンで構成された単独配列又は反復配列、又はそのタンデム反復配列（例えば、２、３、４、又はそれよりも多い反復配列）を有するスペーサーが挙げられる。あるいは、スペーサーは、アミノ酸配列GAPGGGGGAAAAAGGGGG（配列番号：２６９）の１以上の連続もしくはタンデム反復配列を含む長いペプチド鎖であってよい。特定の実施態様において、スペーサーは、配列番号：２６９の１、２、３、４又はそれよりも多い連続又はタンデム反復配列を含む。 
【０１２３】
用語「抗原特異性」は、抗原結合分子により選択的に認識される特定の抗原又はそのエピトープを指す。
【０１２４】
本明細書において使用されるアミノ酸残基に関する用語「置換」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質における、1以上のアミノ酸の、別のアミノ酸による天然に生じるか又は誘導された置き換えを指す。ポリペプチドにおける置換は、ポリペプチドの機能の減退、増強、又は消失を生じ得る。
【０１２５】
置換はまた、アミノ酸配列に関して「保存的置換」であることができ、これは、アミノ酸残基の類似の物理化学的特性を持つ側鎖を有する異なるアミノ酸残基による置き換え、又はそのポリペプチドの活性にとって重要ではないそれらのアミノ酸の置換を指す。例えば、保存的置換は、非極性側鎖を持つアミノ酸残基間（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）、非帯電の極性側鎖を持つ残基間（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＧｌｎ）、酸性側鎖を持つ残基間（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性側鎖を持つアミノ酸間（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇ）、ベータ−分岐側鎖を持つアミノ酸間（例えば、Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＩｌｅ）、イオウ含有側鎖を持つアミノ酸間（例えば、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）、又は芳香族側鎖を持つ残基間（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＰｈｅ）で行うことができる。特定の実施態様において、置換、欠失又は付加はまた、「保存的置換」とみなすことができる。挿入又は欠失されるアミノ酸の数は、約１〜５個の範囲であることができる。保存的置換は通常、タンパク質の高次構造に著しい変化を引き起こさず、その結果そのタンパク質の生物活性を保持することができる。
【０１２６】
本明細書において使用されるアミノ酸残基に関する用語「変異」又は「変異された」は、アミノ酸残基の置換、挿入、又は付加を指す。
【０１２７】
本明細書において使用される「相同体配列」及び「相同配列」は、互換的に使用され、且つ任意に整列化した場合に、別の配列に対し、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（又はその相補鎖）又はアミノ酸配列を指す。
【０１２８】
本明細書において使用される「Ｔ細胞」は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たすリンパ球の型を指し、これはヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔへルーパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー３型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）並びにＣＤ８＋又はＣＤ４＋のいずれかである組織常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ））、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及び抑制性Ｔ細胞を含む。
【０１２９】
天然型「Ｔ細胞受容体」又は天然型「ＴＣＲ」は、シグナル伝達を媒介することが可能である複合体を形成するために、変種ＣＤ３鎖に会合される、ヘテロ二量体のＴ細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、且つ１本の重鎖及び１本の軽鎖を伴う半抗体に類似している。天然型ＴＣＲは、細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分を有する。ＴＣＲの細胞外ドメインは、膜近位の定常領域及び膜遠位の可変領域を有する。
【０１３０】
本明細書において使用される用語「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」は、疾患又は障害の診断、予後判定、改善、予防、及び／又は治療を必要とする、ヒト、又は哺乳動物もしくは霊長類を含む非ヒト動物を指す。哺乳動物の対象は、ヒト、家庭用動物、農場動物、及び動物園、スポーツ、又はペットの動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどを含む。
【０１３１】
（Ａ．ポリペプチド複合体）
【０１３２】
第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域に機能的に連結される抗体重鎖可変ドメイン、及び第二のＴＣＲ定常領域に機能的に連結される抗体軽鎖可変ドメインを含む、新規ポリペプチド複合体が、本明細書に提供され、ここで第一のＴＣＲ定常領域及び第二のＴＣＲ定常領域は、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を介して会合されている。ポリペプチド複合体は、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含み、その各々は、抗体由来の可変ドメイン及びＴＣＲ由来の定常領域を含む。ポリペプチド複合体の２本のポリペプチド鎖は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの対を含み、これは各々、ＴＣＲ定常領域の対に機能的に連結される。ＴＣＲ定常領域の対の例は、例えば、アルファ／ベータ、プレ−アルファ／ベータ、及びガンマ／デルタＴＣＲ定常領域を含む。本明細書に提供されるポリペプチド複合体中のＴＣＲ定常領域は、完全長又は断片であることができ、且つＴＣＲ定常領域の対が、互いに会合し二量体を形成することが可能である限りは、操作されることができる。
【０１３３】
驚くべきことに、少なくとも１つの非天然型鎖間結合（特に非天然型ジスルフィド結合）を伴う本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、組換え的に発現され且つ所望の高次構造へ集成されることができ、これはＴＣＲ定常領域二量体を安定化すると同時に、抗体可変領域の良好な抗原結合活性を提供することがわかった。更にポリペプチド複合体は、例えばグリコシル化部位の修飾、及び一部の天然配列の除去など、慣習的抗体操作に良く耐えることが分かった。更に本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、二重特異性のフォーマットへ組み込まれ得、これは容易に発現され且つ集成され、ポリペプチド複合体中のＴＣＲ定常領域の存在のために、抗原結合配列の誤対形成は最少であるか又は実質的にない。本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び構築体の追加の利点は、以下の開示においてより明白となるであろう。
【０１３４】
一つの態様において、本開示は、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結される第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、及びＮ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結される第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第二のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体を提供し、ここでＣ１及びＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つこの非天然型鎖間結合は、二量体を安定化することが可能であり、第一の抗体は、第一の抗原特異性を有する。
【０１３５】
（ｉ．ＴＣＲ定常領域）
【０１３６】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、ＴＣＲ由来の定常領域を含む。
【０１３７】
天然型ＴＣＲは、２本のポリペプチド鎖からなり、且つ一般に２つの型を有する：一方は、アルファ鎖及びベータ鎖からなり（すなわち、アルファ／ベータＴＣＲ）、他方は、ガンマ鎖及びデルタ鎖からなる（すなわち、ガンマ／デルタＴＣＲ）。これら２つの型は、構造的に類似しているが、異なる配置及び機能を有する。約９５％のヒトＴ細胞は、アルファ／ベータＴＣＲを有するのに対し、残り５％は、ガンマ／デルタＴＣＲを有する。アルファ鎖の前駆体もまた認められ、プレ−アルファ鎖と称される。２本のＴＣＲポリペプチド鎖の各々は、免疫グロブリンドメイン及び膜近位領域を含む。免疫グロブリン領域は、可変領域及び定常領域を含み、且つ免疫グロブリン型フォールド(fold)の存在により特徴付けられる。各ＴＣＲポリペプチド鎖は、システイン残基を有し（例えば、定常ドメインのＣ末端又は膜近位領域のＮ末端に）、これらは一緒に、２本のＴＣＲ鎖をまとめて繋ぐジスルフィド結合を形成することができる。
【０１３８】
図１８Ａ−１８Ｅは、ＴＣＲアルファ鎖、プレ−アルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖及びデルタ鎖の天然型ＴＣＲ定常領域のアミノ酸配列を示す。明確さ及び一貫性のために、これらの配列中の各アミノ酸残基は、図１９Ａ−１９Ｅに番号付けし、かつそのような番号付けは、特定のＴＣＲ定常領域上の特定のアミノ酸残基を指すために、本開示を通じて使用される。
【０１３９】
ヒトＴＣＲアルファ鎖定常領域は、ＴＲＡＣとして公知であり、ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ０１８４８、又は配列番号：２５４のアミノ酸配列である。
【０１４０】
ヒトＴＣＲベータ鎖定常領域は、ＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２として公知の（ＩＭＧＴ命名法）２つの異なる変種を有し、対応する配列は、各々、配列番号：２５６及び配列番号：２５７に示す(同じくToyonaga B,ら、PNAs, Vol. 82, pp.8624-8628, Immunology (1985)参照)。これらの２つのベータ定常ドメインは、エキソン１の４番目、５番目、及び３７番目のアミノ酸残基が異なる。具体的には、ＴＲＢＣ１は、エキソン１に４Ｎ、５Ｋ及び３７Ｆを有し、ＴＲＢＣ２は、エキソン１に４Ｋ、５Ｎ及び３７Ｙを有する。
【０１４１】
具体的には、天然型ＴＣＲベータ鎖は、位置７４に天然型システイン残基を含み（図１９Ｂ参照）、これは対形成されず、結果的に天然型アルファ／ベータＴＣＲ中にジスルフィド結合を形成しない。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体において、この天然型システイン残基は、存在しないか又は別の残基に変異される。これは、不正確な鎖内又は鎖間の対形成を避けるために、有用である。特定の実施態様において、天然型システイン残基は、別の残基、例えばセリン又はアラニンと置換される。特定の実施態様において、インビトロにおける、特定の実施態様での置換は、ＴＣＲリフォールディング効率を向上することができる。
【０１４２】
ヒトＴＣＲガンマ鎖定常領域は、ＴＲＧＣ１及びＴＲＧＣ２として公知の２つの変種を有し(Lefrancら、Eur. J. Immunol. 19:989-994 (1989)参照)、これらは各々、ＮＣＢＩ寄託番号Ａ２６６５９及びＰ０３９８６、又は各々、配列番号：２６３及び配列番号：２６５のアミノ酸配列を有する。
【０１４３】
ヒトＴＣＲデルタ鎖定常領域は、ＴＲＤＣとして公知であり、ＮＣＢＩ寄託番号Ａ３５５９１、配列番号：２６１のアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体におけるＴＣＲの定常領域はまた、プレ−Ｔ細胞抗原受容体（プレ−ＴＣＲ）に由来してもよい。プレ−ＴＣＲは、未熟な胸腺細胞により発現され、これは早期Ｔ細胞発達において、中心的役割を有する。プレ−ＴＣＲは、通常のベータ鎖を有するが、配列及び構造が通常のアルファ鎖のものとは異なる、利用可能な定常領域のみ伴う特別なプレ−アルファ鎖を有する(Harald von Boehmer、Nat Rev Immunol, Jul;5(7):571-7 (2005)参照)。ヒトプレ−アルファ鎖定常領域（ＰＴＣＲＡ）の配列は、ＮＣＢＩ寄託番号ＡＡＦ８９５５６．１、又は配列番号：２５９のアミノ酸配列を有する。
【０１４５】
本開示において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第一及び第二のＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲ定常領域間に、二量体を安定化することが可能である少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む、二量体を形成することが可能である。
【０１４６】
本明細書において使用される用語「二量体」は、共有的又は非共有的相互作用を介して、ポリペプチド又はタンパク質などの、２つの分子により形成された、会合された構造を指す。ホモ二量体又はホモ二量体形成は、２つの同じ分子により形成され、且つヘテロ二量体又はヘテロ二量体形成は、２つの異なる分子により形成される。第一及び第二のＴＣＲ定常領域により形成された二量体は、ヘテロ二量体である。
【０１４７】
鎖間結合は、１つのＴＣＲ定常領域上の１つのアミノ酸残基と、別のＴＣＲ定常領域上の別のアミノ酸残基の間に形成される。特定の実施態様において、非天然型鎖間結合は、２つのＴＣＲ定常領域を二量体へ会合することが可能である任意の結合又は相互作用であることができる。好適な非天然型鎖間結合の例は、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、又は疎水性−親水性相互作用、ノブイントゥホール又はそれらの組合せを含む。
【０１４８】
「ジスルフィド結合」は、構造Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’を持つ共有結合を指す。アミノ酸システインは、例えば別のシステイン残基由来の第二のチオール基と、ジスルフィド結合を形成することができるチオール基を含む。ジスルフィド結合は、各々、２つのポリペプチド鎖に存在する、２つのシステイン残基のチオール基間に形成され、これにより鎖間架橋又は鎖間結合を形成することができる。
【０１４９】
静電的相互作用は、非共有的相互作用であり、タンパク質のフォールディング、安定性、可動性及び機能において重要であり、イオン相互作用、水素結合及びハロゲン結合を含む。静電的相互作用は、例えば、ＬｙｓとＡｓｐの間、ＬｙｓとＧｌｕの間、ＧｌｕとＡｒｇの間、又は第一鎖のＧｌｕ、Ｔｒｐと第二鎖のＡｒｇ、ＶａｌもしくはＴｈｒの間で、ポリペプチドにおいて形成されることができる。
【０１５０】
塩橋は、Ａｓｐ又はＧｌｕのいずれかの陰イオン性カルボキシラートと、Ｌｙｓ由来の陽イオン性アンモニウム又はＡｒｇのグアニジニウムから主に生じる、近距離の静電的相互作用であり、これは、天然型タンパク質構造において反対に帯電された残基の空間的に近い対である。大きく疎水性の境界面内の帯電された残基及び極性残基は、結合のホットスポットとして作用することができる。中でも、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、及びＳｅｒなどのイオン化可能な側鎖を持つ残基はまた、塩橋の形成にも関与し得る。
【０１５１】
疎水性相互作用は、第一鎖の１以上のＶａｌ、Ｔｙｒ及びＡｌａと、第二鎖の１以上のＶａｌ、Ｌｅｕ、及びＴｒｐの間、あるいは第一鎖のＨｉｓ及びＡｌａと、第二鎖のＴｈｒ及びＰｈｅの間に形成することができる(Brinkmannら、2017, 前掲参照)。
【０１５２】
水素結合は、水素原子が、窒素、酸素、又はフッ素などの高度に電気陰性の原子に共有的に結合される場合の、２つの極性基間の静電引力により形成される。水素結合は、Ａｓｎの窒素基とＨｉｓの酸素基、又はＡｓｎの酸素基とＬｙｓの窒素基など、２つの残基の、各々、骨格酸素（例えば、カルコゲン基）とアミド水素（窒素基）の間にポリペプチドで形成され得る。水素結合は、ファンデルワールス相互作用よりもより強力であるが、共有結合又はイオン結合よりも弱く、二次構造及び三次構造を維持する上で重要である。例えば、アミノ酸残基のスペーシングがｉ位とｉ＋４位の間に規則的に生じる場合、アルファヘリックスが形成され、並びにベータシートは、２つのペプチドが少なくとも２又は３つの骨格水素結合により結合され、ねじれたプリーツシートを形成する場合に形成される、ペプチド鎖３〜１０個のアミノ酸長の配列である。
【０１５３】
本明細書において使用される「ノブイントゥホール」は、２つのポリペプチド間の相互作用を指し、ここで一方のポリペプチドは、嵩高な側鎖を有するアミノ酸残基（例えばチロシン又はトリプトファン）の存在のために、突起（すなわち「ノブ」）を有し、且つ他方のポリペプチドは、小さい側鎖のアミノ酸残基（例えばアラニン又はトレオニン）が存在する空洞（すなわち「ホール」）を有し、且つ２つのポリペプチドの相互作用を促進し、ヘテロ二量体又は複合体を形成するために、突起は、空洞内に配置可能である。ノブイントゥホールでポリペプチドを作製する方法は、例えば米国特許第5,731,168号に記載されたように、当該技術分野において公知である。
【０１５４】
特定の実施態様において、ＴＣＲ定常領域二量体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非天然型鎖間結合を含む。任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非天然型鎖間結合の少なくとも１つは、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、又は疎水性−親水性相互作用、又は任意のそれらの組合せである。
【０１５５】
本明細書において使用される「非天然型」鎖間結合は、天然型対応物のＴＣＲ定常領域の天然型会合において認められない鎖間結合を指す。例えば、非天然型鎖間結合は、各々、各ＴＣＲ定常領域上に存在する変異されたアミノ酸残基と天然型アミノ酸残基の間；あるいは、個々にＴＣＲ定常領域上に存在する２つの変異されたアミノ酸残基の間に形成され得る。特定の実施態様において、少なくとも１つの非天然型鎖間結合は、ポリペプチド複合体の第一のＴＣＲ定常領域に含まれる第一の変異された残基と第二のＴＣＲ定常領域に含まれる第二の変異された残基の間に形成される。
【０１５６】
「変異された」アミノ酸残基は、置換、挿入又は付加され、且つ対応する天然型ＴＣＲ定常領域において、その天然型対応物残基とは異なるものを指す。例えば、野生型のＴＣＲ定常領域における特定の位置のアミノ酸残基が、「天然型」残基として言及される場合、その変異された対応物は、天然型残基とは異なるが、ＴＣＲ定常領域上の同じ位置に存在する任意の残基である。変異された残基は、同じ位置で天然型残基を置換するか、又は天然型残基の前に挿入され、従ってその当初の位置を占めている、異なる残基であることができる。
【０１５７】
特定の実施態様において、変異された残基は、天然に生じるアミノ酸残基であってよい。特定の実施態様において、第一及び第二の非天然型アミノ酸残基の少なくとも１つは、変異されたシステイン残基である。特定の実施態様において、非天然型鎖間結合の１以上は、ジスルフィド結合である。特定の実施態様において、非天然型ジスルフィド結合は、各々、第一及び第二のＴＣＲ定常領域に含まれる２つの変異されたシステイン残基の間に形成され得る。
【０１５８】
特定の実施態様において、第一及び第二の変異された残基の少なくとも１つは、天然に生じないアミノ酸残基である。天然に生じないアミノ酸残基は、ヒトタンパク質において天然に認められないが、コード化ポリヌクレオチドへ導入されることができる核酸コドンを介して発現され得るアミノ酸残基を指す。例えば、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）などの、天然に生じないアミノ酸は、過ヨウ素酸が誘導した酸化により、システイン、ヒスチジン及びリジンなどの天然アミノ酸と反応し且つ架橋することができる。抗体へのＬ−ＤＯＰＡの組込みにより、非天然アミノ酸は、抗原上の残基に効果的に架橋することができ、結果共有結合した抗体−抗原複合体を生じることが示されている(Xu, J.ら、2014, 「抗体-抗原複合体を共有的に架橋するための構造ベースの非正準アミノ酸デザイン(Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex)」、Journal of Structural Biology, 185(2), pp.215-222.)。本明細書において、第一及び／又は第二のＴＣＲ定常領域中の変異されたアミノ酸残基は、天然アミノ酸残基（あるいは、天然に生じないアミノ酸残基）と架橋し、非天然型鎖間共有結合を形成することができる、Ｌ−ＤＯＰＡなどの、天然に生じないアミノ酸残基を含んでよいことが企図されている。
【０１５９】
特定の実施態様において、少なくとも１つの非天然型ジスルフィド結合は、変異されたシステイン残基と天然型システイン残基の間に形成される。特定の実施態様において、非天然型ジスルフィド結合は、２つの変異されたシステイン残基の間に形成される。特定の実施態様において、非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の少なくとも１つは、変異されたシステイン残基である。特定の実施態様において、非天然型ジスルフィド結合を形成する両方のシステイン残基は、各々、第一及び第二のＴＣＲ定常領域上の変異されたシステイン残基である。
【０１６０】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二のＴＣＲ定常領域は、非天然型鎖間結合の形成に寄与する１以上の変異されたアミノ酸残基を含むように、操作され得る。そのような変異された残基をＴＣＲ定常領域へ導入するために、ＴＣＲ領域のコード配列は、例えば天然型残基をコードしているコドンを変異された残基をコードしているコドンと置換するように、又は天然型残基のコドンの前に変異された残基をコードしているコドンを挿入するように、操作されることができる。１以上の所望の変異されたアミノ酸残基は、ＴＣＲ定常領域へ、例えばジスルフィド結合を形成することが可能であるか、２つのＴＣＲ定常領域の間の静電的相互作用に繋がり得るか、ＴＣＲ定常領域の可動性を増大することができるか、水素結合など、ＴＣＲ定常ドメインから離れた共有結合を形成するアミノ酸の少なくとも１つを配置するか、塩橋の形成に貢献することができる、１以上のアミノ酸残基（例えばシステイン残基）；疎水性相互作用に繋がり得る疎水性アミノ酸残基；並びに、親水性相互作用に繋がり得る親水性アミノ酸残基などへ導入されることができる。
【０１６１】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二のＴＣＲ定常領域は、１以上の変異されたシステイン残基を含むように、操作されることができる。例えば、非システイン残基は、システイン残基と置き換えることができるか、又はシステイン残基は、２つの当初の隣接天然型非システイン残基の間に挿入されることができる。置き換えの位置は、システイン残基への置き換え後に、非天然型鎖間ジスルフィド結合が、２つのＴＣＲ定常領域の間に形成されるように決定することができる。この目的のために、複数の要因が考慮され、例えば、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が、十分に近接していること、適切なアルファ−ベータ結合配向を有していること、システイン残基のチオール基がお互いに向き合い配向されること、置き換えられるべき残基が、システインの化学特性と比較的類似している化学特性を伴う側鎖を有すること、並びに／又は置き換えが、ＴＣＲ定常領域又はポリペプチド複合体それ自体の三次構造を実質的に攪乱しないことを含むことができる。
【０１６２】
当業者は、例えば、非限定的に、光検出による距離マップ、コンピュータモデリング、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶解析などの、当該技術分野において公知の好適な方法を用い、置き換えられるべき２つのアミノ酸残基の間の距離及び角度を決定することができる。例証的実施例において、関心のあるポリペプチド（ＴＣＲ定常領域など）について、そのタンパク質結晶構造は、ＰＤＢデータベースなどの、公開されたデータベースから得るか、あるいはＸ線結晶解析などの方法を用いて解明することができる。好適なコンピュータソフトウェアを使用し、タンパク質結晶構造データを基にアミノ酸残基間の距離及び角度を決定することができる。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体中の、ジスルフィド結合は、この複合体が正確にフォールディングされる場合、十分に近い、例えば距離が８Å未満、７Å、６Å、５Å、４Å、３Å、２Å、１Å又はそれ未満の、各ベータ炭素を有する変異されたシステイン残基の間に形成され得る。
【０１６３】
第一及び／又は第二のＴＣＲ定常領域への操作に関する更なる好適な位置は、ＴＣＲアルファとベータの間(Boulter, J.M.ら、Protein Engineering, 16(9), pp.707-711 (2003))、又はガンマとデルタの間(Allison, T.J.ら、Nature, 411(6839), pp.820-824 (2001)；Uldrich, A.P.ら、Nature Immunology, 14(11), pp.1137-1145 (2013))で、この複合体について公開された結晶構造データから選び取ることができる。一旦置き換えられるべき残基が決定されたならば、当業者は、変異されるべき関心のあるコドンを容易に同定し(例えば、ClustalW(EBIウェブサイト(www.ebi.ac.uk/index.html)などの現存するソフトウェアを使用する配列整列を通じて)、次にPCR変異誘発などの当該技術分野において公知の方法により、システインコドンへ、これを変異することができる。
【０１６４】
鎖間ジスルフィド結合の形成は、当該技術分野において公知の好適な方法により決定することができる。例えば、発現されたタンパク質生成物は、各々、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、引き続き生じるバンドを比較し、鎖間ジスルフィド結合の存在を示す可能性のある差を同定することができる。
【０１６５】
非天然型鎖間結合は、ポリペプチド複合体を安定化することが可能である。安定化におけるそのような作用は、様々な様式で実施され得る。例えば、変異されたアミノ酸残基又は非天然型鎖間結合の存在は、ポリペプチド複合体を、安定して発現させ、及び／又は高レベルで発現させ、及び／又は所望の生物活性（例えば抗原結合活性）を有する安定した複合体へ会合させ、及び／又は所望の生物活性を有する所望の安定した複合体を高レベルで発現及び集成させることができる。鎖間結合の第一及び第二のＴＣＲ定常領域を安定化する能力は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に標示された分子量、又は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）もしくは示差走査蛍光光度（ＤＳＦ）により測定された熱安定性などの、当該技術分野において公知の適切な方法を用いて評価することができる。例証的実施例において、本明細書に提供される安定したポリペプチド複合体の形成は、生成物が、第一及び第二のポリペプチドを一緒にした分子量と同等の分子量を示す場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認され得る。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、その熱安定性が、天然のＦａｂの熱安定性の５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％程大きい点で、安定している。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、その熱安定性が、天然Ｆａｂのそれと同等である点で、安定している。
【０１６６】
何らかの理論に結びつけられることは欲しないが、ポリペプチド複合体の第一と第二のＴＣＲ定常領域間に形成された非天然型鎖間結合（ジスルフィド結合など）は、ＴＣＲ定常領域のヘテロ二量体を安定化し、これにより、ヘテロ二量体の及びポリペプチド複合体の正確なフォールディングのレベル、構造安定性及び／又は発現レベルを増強することが可能であると考えられる。Ｔ細胞表面の膜にアンカーされた天然型ＴＣＲとは異なり、天然型ＴＣＲ細胞外ドメインのヘテロ二量体は、３Ｄ構造における抗体Ｆａｂとのその類似性にもかかわらず、遙かに少ない安定性であることが認められる。実際に、可溶性条件下での天然型ＴＣＲの不安定性は、その結晶構造の解明を妨害する著しい障害であるように使用された(Wang、Protein Cell, 5(9), 649-652, (2014)参照)。ＴＣＲ定常領域内のシステイン（Ｃｙｓ）変異対の導入及びこれにより可能な鎖間非天然型ジスルフィド結合の形成により、このポリペプチド複合体は、安定して発現される一方で、その間に抗体可変領域の抗原−結合能は保持される。
【０１６７】
変異された残基を含むＴＣＲ定常領域はまた、本明細書において、「操作された」ＴＣＲ定常領域とも称される。特定の実施態様において、ポリペプチド複合体の第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）は、操作されたＴＣＲアルファ鎖（ＣＡｌｐｈａ）を含み、且つ第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）は、操作されたＴＣＲベータ鎖（ＣＢｅｔａ）を含む。特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含む。特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＴＣＲプレ−アルファ鎖（ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ）を含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含む。特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含む。特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＴＣＲガンマ鎖（ＣＧａｍｍａ）を含み、且つＣ２は、操作されたＴＣＲデルタ鎖（ＣＤｅｌｔａ）を含む。特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む。
【０１６８】
特定の実施態様において、操作されたＴＣＲ定常領域は、１以上の変異されたシステイン残基を含む。特定の実施態様において、１以上の変異された残基は、第一及び／又は第二の操作されたＴＣＲ定常領域の接触境界面内に含まれる。
【０１６９】
本明細書において使用される用語「接触境界面」は、そこでポリペプチドが互いに相互作用／会合しているポリペプチド上の特定の領域（複数）を指す。接触境界面は、相互作用が生じた場合に接触又は会合するように対応するアミノ酸残基（複数）と相互作用することが可能である１以上のアミノ酸残基を含む。接触境界面中のアミノ酸残基は、連続配列の中であってもなくてもよい。例えば、境界面が三次元である場合、その境界面内のアミノ酸残基は、線状配列上の異なる位置に分離されてよい。
【０１７０】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６、及び１２２−１２７からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む。特定の実施態様において、操作されたＣＡｌｐｈａは、アミノ酸残基６−２９、３７−６７、及び８６−９５からなる群から選択される接触境界面内に、変異されたシステイン残基を含む。特定されない限り、本開示におけるＴＣＲ定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、図１９Ａ−１９Ｅに示しているものである。
【０１７１】
特定の実施態様において、１以上のジスルフィド結合は、操作されたＣＡｌｐｈａと操作されたＣＢｅｔａの間に形成され得る。ＣＢｅｔａ中の変異されたシステイン残基は、Ｓ５６Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｅ１４Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｌ６２Ｃ、Ｄ５８Ｃ、Ｓ７６Ｃ、及びＲ７８Ｃからなる群から選択される置換であることができ、並びに／又はＣＡｌｐｈａ中の変異されたシステイン残基は、Ｔ４９Ｃ、Ｙ１１Ｃ、Ｌ１３Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｖ２３Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｔ４６Ｃ、Ｌ５１Ｃ、及びＳ６２Ｃからなる群から選択される置換であることができる。特定の実施態様において、変異されたシステイン残基の対は、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＹ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＶ１２Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１４Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＶ２３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＬ６２Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＹ４４Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＤ５８Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＴ４９Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＬ５１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＲ７８Ｃ及びＣＡｌｐｈａ中のＳ６２Ｃからなる群から選択される置換の対であることができ、且つここでシステイン残基の対は、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。
【０１７２】
本出願を通じて本明細書において使用される、ＴＣＲ定常領域に関する「ＸｎＹ」は、ＴＣＲ定常領域上のｎ番目のアミノ酸残基Ｘ（本明細書に提供される図１９Ａ−１９Ｅの番号付けを基に）が、アミノ酸残基Ｙにより置き換えられることを意味し、ここでＸ及びＹは各々、特定のアミノ酸残基の１文字略語であることが意図される。数値ｎは、単に図１９Ａ−１９Ｅに提供された番号付けを基にしており、その実際の位置とはことなり得ることは、留意されなければならない。例証のために、配列番号：３４に示したＣＢｅｔａ（Ｓ５６Ｃ）（Ｎ６９Ｑ）の配列を使用する。ＳのＣへの置換は、配列番号：３４の４８番目の残基で起こる一方で、まさに(very)この残基は、図１９Ａ−１９Ｅの番号付けシステムを基に５６番目の残基として設計され、その結果ＳのＣへの置換は、Ｓ５６Ｃとして指定されるが、Ｓ４８Ｃではない。同様に、ＮのＱへの置換は、図１９Ａ−１９Ｅの番号付けシステムを基にＮ６９Ｑとして指定される。このアミノ酸残基置換の指定則は、別に特定しない限りは、本開示において全てのＴＣＲ定常領域に適用する。同様に、Ｆｃ領域に関して使用する場合の「ＸｎＹ」は、Ｆｃ定常領域上のｎ番目のアミノ酸残基Ｘ（本明細書に提供される図２０Ａ−２０Ｄの番号付けを基に）が、アミノ酸残基Ｙにより置き換えられることを意味する。
【０１７３】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、配列番号：３３−４１のいずれか一つを含むか又はこれであり、且つ操作されたＣＡｌｐｈａは、配列番号：４３−４８のいずれか一つを含むか又はこれである。
【０１７４】
特定の実施態様において、１以上の非天然型ジスルフィド結合は、ＣＰｒｅ−ＡｌｐｈａとＣＢｅｔａの間の接触境界面内に形成され得る。特定の実施態様において、ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ上の接触境界面は、アミノ酸残基７−１９、２６−３４、５６−７５及び１０３−１０６の位置での置換から選択される。特定の実施態様において、ＣＢｅｔａ上の接触境界面は、アミノ酸残基９−３５、５２−６６、７１−８６及び１２２−１２７の位置での置換から選択される。
【０１７５】
特定の実施態様において、１以上のジスルフィド結合は、操作されたプレ−ＴＣＲアルファ定常領域（ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ）とベータ鎖定常領域（ＣＢｅｔａ）の間に形成され得る。ＣＢｅｔａ中の変異されたシステイン残基は、Ｓ１６Ｃ、Ａ１８Ｃ、Ｅ１９Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ａ１１Ｃ、Ｓ５６Ｃ、及びＳ７６Ｃからなる群から選択される置換であることができ、並びに／又はＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中の変異されたシステイン残基は、Ｓ１１Ｃ、Ａ１３Ｃ、Ｉ１６Ｃ、Ｓ６２Ｃ、Ｔ６５Ｃ、及びＹ５９からなる群から選択される置換であることができる。特定の実施態様において、変異されたシステイン残基の対は、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＡ１８Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＥ１９Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ１１Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＦ１３Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＡ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ１６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＡ１３Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＡ１１Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＩ１６Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＳ６２Ｃ、ＣＢｅｔａ中のＳ５６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＴ６５Ｃ、並びにＣＢｅｔａ中のＳ７６Ｃ及びＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＹ５９Ｃからなる群から選択される置換の対であることができ、ここで変異されたシステイン残基の対は、非天然型鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。
【０１７６】
特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａは、配列番号：３３−４１のいずれか一つを含むか又はこれであり、且つ操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａは、配列番号：８２及び８３のいずれか一つを含むか又はこれである。
【０１７７】
特定の実施態様において、１以上の非天然型ジスルフィド結合は、ＣＧａｍｍａとＣＤｅｌｔａの間の接触境界面内に形成され得る。特定の実施態様において、ＣＧａｍｍａ上の接触境界面は、アミノ酸残基１１−３５及び５５−７６の位置での置換から選択される。特定の実施態様において、ＣＤｅｌｔａ上の接触境界面は、アミノ酸残基８−２６、４３−６４、及び８４−８８の位置での置換から選択される。
【０１７８】
特定の実施態様において、１以上のジスルフィド結合は、操作されたＣＧａｍｍａとＣＤｅｌｔａの間に形成され得る。ＣＧａｍｍａ中の変異されたシステイン残基は、Ｓ１７Ｃ、Ｅ２０Ｃ、Ｆ１４Ｃ、Ｔ１２Ｃ、Ｍ６２Ｃ、Ｑ５７Ｃ、及びＡ１９Ｃからなる群から選択される置換であることができ、並びに／又はＣＤｅｌｔａ中の変異されたシステイン残基は、Ｆ１２Ｃ、Ｍ１４Ｃ、Ｎ１６Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｖ５０Ｃ、Ｆ８７Ｃ、及びＥ８８Ｃからなる群から選択される置換であることができる。特定の実施態様において、変異されたシステイン残基の対は、ＣＧａｍｍａの中のＳ１７Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＦ１２Ｃ、ＣＧａｍｍａの中のＥ２０Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＦ１２Ｃ、ＣＧａｍｍａの中のＦ１４Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＭ１４Ｃ、ＣＧａｍｍａの中のＴ１２Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＮ１６Ｃ、ＣＧａｍｍａの中のＭ６２Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＤ４６Ｃ、ＣＧａｍｍａの中のＱ５７Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＶ５０Ｃ、ＣＧａｍｍａの中のＡ１９Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＦ８７Ｃ、並びにＣＧａｍｍａの中のＡ１９Ｃ及びＣＤｅｌｔａの中のＥ８８Ｃからなる群から選択される置換の対であることができ、ここで導入された変異されたシステイン残基の対は、鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。
【０１７９】
特定の実施態様において、操作されたＣＧａｍｍａは、配列番号：１１３及び１１４のいずれか一つを含むか又はこれであり、且つ操作されたＣＤｅｌｔａは、操配列番号：１１５及び１１６のいずれか一つを含むか又はこれである。
【０１８０】
非天然型アミノ酸残基に加え、操作されたＴＣＲ定常領域は、特定の実施態様において、野生型ＴＣＲ定常領域配列における１以上の天然型残基への追加の修飾を更に含んでよい。そのような追加の修飾の例は、天然型システイン残基への修飾、天然型グリコシル化部位への修飾、及び／又は天然型ループへの修飾などを含む。
【０１８１】
特定の天然型ＴＣＲ定常領域（ＣＢｅｔａなど）は、本開示の一部の実施態様において修飾（例えば除去）され得るか、あるいは一部の別の実施態様において保持され得る、天然型システイン残基を含む。特定の実施態様において、ＴＲＡＣとＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２定常ドメインの間の、すなわちＩＭＧＴ  ＴＣＲ命名法に従いＴＲＡＣのエキソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２のエキソン２のＣｙｓ２の間の、アルファ／ベータヘテロ二量体性ＴＣＲ上の天然型ジスルフィド結合は、存在してもしなくてもよい。
【０１８２】
特定の実施態様において、少なくとも１つの天然型システイン残基は、操作されたＣＢｅｔａ中に存在しないか又は存在する。例えば、ＣＢｅｔａのＣ７４位置の天然型システイン残基は、操作されたＣＢｅｔａ中に存在してもしなくてもよい。特定の実施態様において、天然型システイン残基Ｃ７４が存在しない操作されたＣＢｅｔａは、配列番号：３２−４１のいずれか一つを含むか又はこれである。
【０１８３】
何らかの理論に結びつけられることは欲しないが、本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、ＣＢｅｔａ上の天然型システイン残基の存在及び非存在の両方を容認する点において有利であると考えられる。可溶性ＴＣＲヘテロ二量体上の天然型システイン残基の存在は、ＴＣＲのリガンド結合能を損なうことが示唆された（例えば、米国特許第7,666,604号参照）が、本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、その抗原−結合活性に負の影響を及ぼすことなく、この天然型システイン残基の存在を容認することができる。更に、ＴＣＲヘテロ二量体中の天然型ジスルフィド結合は、ＴＣＲヘテロ二量体の安定化にとって良好であるというWuらにより対立する教示(mAbs, 7(2), pp.364-376 (2005))があるにもかかわらず、天然型システイン残基が存在しない本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、高レベルで発現した。
【０１８４】
特定の実施態様において、天然型ＴＣＲ定常領域に存在する１以上の天然型グリコシル化部位は、本開示に提供されるポリペプチド複合体内で、修飾（例えば除去）されるか、又は維持される。ポリペプチド配列に関して本明細書において使用される用語「グリコシル化部位」は、それに糖部分（例えばオリゴ糖構造）が結合され得る側鎖を伴うアミノ酸残基を指す。抗体のようなポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖、例えばアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンなどのトリペプチド配列中のアスパラギン残基への、糖部分の結合を指し、ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖のＮ−アセチル(aceyl)ガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの、ヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリンもしくはトレオニンへの結合を指す。天然型グリコシル化部位の除去は、好都合なことに、前述のトリペプチド配列の１以上（Ｎ−結合型グリコシル化部位について）又はセリンもしくはトレオニン残基の１以上（Ｏ−結合型グリコシル化部位について）が置換されるような、アミノ酸配列の変更により達成され得る。
【０１８５】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体における、少なくとも１つの天然型グリコシル化部位は、操作されたＴＣＲ定常領域に、例えば、第一及び／又は第二のＴＣＲ定常領域中に存在しないか又は存在する。何らかの理論に結びつけられることは欲しないが、本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、タンパク質の発現及び安定性に影響を及ぼすことなく、グリコシル化部位の全て又は一部の除去を容認し得ると考えられ、これはＣＡｌｐｈａ（すなわち、Ｎ３４、Ｎ６８、及びＮ７９）及びＣＢｅｔａ（すなわち、Ｎ６９）などの、ＴＣＲ定常領域上のＮ−結合型グリコシル化部位の存在は、タンパク質の発現及び安定性に必須であるという現存する教示(Wuら、Mabs, 7:2, 364-376, 2015参照)とは対照的である。
【０１８６】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体における、操作されたＣＡｌｐｈａ中のＮ−グリコシル化部位、例えばＮ３４、Ｎ６８、Ｎ７９及びＮ６１の少なくとも１つは、存在しないか又は存在している。特定の実施態様において、グリコシル化部位が存在しない操作されたＣＡｌｐｈａ配列は、配列番号：４４−４８のいずれか一つを含むか又はこれである。特定の実施態様において、操作されたＣＢｅｔａ中のＮ−グリコシル化部位、例えばＮ６９の少なくとも１つは、存在しないか又は存在する。グリコシル化部位の存在しない操作されたＣＢｅｔａ配列（ＴＲＢＣ１）は、配列番号：３４−３６のいずれか一つを含むか又はこれである。グリコシル化部位の存在しない操作されたＣＢｅｔａ配列（ＴＲＢＣ２）は、配列番号：３８−４０のいずれか一つを含むか又はこれである。
【０１８７】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体における、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ中のＮ−グリコシル化部位、例えばＮ５０の少なくとも１つは、存在しないか又は存在している。グリコシル化部位が存在しない操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ配列は、配列番号：８３を含むか又はこれである。
【０１８８】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体における、操作されたＣＧａｍｍａ中のＮ−グリコシル化部位、例えばＮ６５の少なくとも１つは、存在しないか又は存在している。特定の実施態様において、グリコシル化部位の存在しない操作されたＣＧａｍｍａ配列は、配列番号：１１４を含むか又はこれである。特定の実施態様において、操作されたＣＤｅｌｔａ配列中のＮ−グリコシル化部位、例えばＮ１６及びＮ７９のいずれか一つは、存在しないか又は存在する。グリコシル化部位が存在しない操作されたＣＤｅｌｔａ配列は、配列番号：１１６を含むか又はこれである。
【０１８９】
特定の実施態様において、天然型ＴＣＲ定常領域中に存在する１以上の天然型二次構造は、本開示に提供されるポリペプチド複合体において修飾（例えば除去）されるか又は維持されてよい。特定の実施態様において、天然型ループ（天然型ＣＢｅｔａのＦＧループ及び／又はＤＥループなど）は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体において修飾（例えば除去）されるか又は維持されてよい。用語「ＦＧループ」及び「ＤＥループ」は、ＴＣＲベータ鎖定常ドメインにおいて主に認められる構造である。ＦＧループは、天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１−１１７を包含し、且つＣＤ３に対するアルファ／ベータＴＣＲキャビティの一つの構成成分を形成する、通常伸長された、溶媒に曝される構造要素である。ＤＥループは、天然型ＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６−７１を包含する。ＴＣＲベータ鎖定常領域の配列の免疫グロブリンＣＨ１定常領域の配列との整列は、ＴＣＲベータ鎖定常領域のＦＧループは、著しく長いことを明らかにした。図３は、Ｔ細胞ベータ鎖と抗体重鎖の間の定常領域の差を示している。特定の実施態様において、ＦＧループの配列（YGLSENDEWTQDRAKPVT、配列番号：７９）は、存在しないか、及び／又はYPSN（配列番号：８０）と置き換えられている。特定の実施態様において、天然型ＤＥループの配列（QPALNDSR、配列番号：８８）は、存在しないか、及び／又はQSGR（配列番号：８７）と置き換えられている。特定の実施態様において、天然型ＦＧループの存在しないＣＢｅｔａ配列は、配列番号：３７−４０のいずれか一つを含むか又はこれである。特定の実施態様において、天然型ＦＧループ及び天然型ＤＥループの両方が存在しないＣＢｅｔａ配列は、配列番号：４１を含むか又はこれである。
【０１９０】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体において、ＴＣＲ由来の定常領域は、抗体由来の可変領域に機能的に連結される。抗体の重鎖又は軽鎖可変領域は、スペーサーを伴い又は伴わずに、ＴＣＲ定常領域へ機能的に連結され得る。
【０１９１】
特定の実施態様において、第一の抗体の可変ドメイン（ＶＨ）は、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ、第一の接続ドメインで融合され、第一の抗体の可変ドメイン（ＶＬ）は、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ、第二の接続ドメインで融合される。
【０１９２】
本明細書において使用される「接続ドメイン」は、２つのアミノ酸配列が融合又は組合せられる境界又はボーダー領域を指す。特定の実施態様において、接続ドメインは、第一の融合パートナー由来のＣ末端断片の少なくとも一部を含み、間にスペーサーを伴い又は伴わずに、第二の融合パートナー由来のＮ末端断片の少なくとも一部に融合される。そのような実施態様において、接続ドメインは、両方の融合パートナーの断片を含み、且つその融合点は、例えば、直接又はスペーサーを介して、２つの断片が互いに連結される点に存在する。特定の他の実施態様において、接続ドメインは、１つの融合パートナーの断片からなる。そのような実施態様において、融合点は、接続ドメインのいずれかの端であることができる。
【０１９３】
特定の実施態様において、第一の接続ドメインは、抗体Ｖ／Ｃ接続のＣ末端断片の少なくとも一部、及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続のＮ−末端断片の少なくとも一部を含む。
【０１９４】
本明細書において使用される用語「抗体Ｖ／Ｃ接続」は、抗体の可変ドメインと定常ドメインの境界、例えば、重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインの間の、又は軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインの間の境界を指す。同様に、用語「ＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続」は、ＴＣＲ可変ドメインと定常ドメインの境界、例えば、ＴＣＲアルファ可変ドメインと定常ドメインの間、又はＴＣＲベータ可変ドメインと定常ドメインの間の境界を指す。
【０１９５】
免疫グロブリンのＦｖ領域が、ＴＣＲ免疫グロブリン−様ドメインと整列される場合、抗体Ｖ／Ｃ接続及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続もまた整列される。例を、下記表１に示し、ここで抗体重鎖Ｖ／Ｃ接続（配列番号：２７０）は、ＴＣＲベータＶ／Ｃ接続（配列番号：２７１）と整列され、抗体軽鎖Ｖ／Ｃ接続（配列番号：２７２）は、ＴＣＲベータＶ／Ｃ接続（配列番号：２７３）と整列されている。
【０１９６】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第一及び／又は第二の接続ドメインは、抗体Ｖ／Ｃ接続のＣ末端断片の適切な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）、及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続のＮ末端断片の適切な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）を含むように選択され得る。例えば、表１に示したように、接続ドメインは、ＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続由来の全ての配列（例えば配列番号：１４５参照）、又はほとんどの配列（例えば配列番号：１４７参照）、又はＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続由来の一部の配列（例えば配列番号：１４６参照）を有するように、選択されてよい。更に例として表１を使用し、接続ドメインは、抗体Ｖ／Ｃ接続由来のものよりも、ＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続由来のより多くの残基を含んでよい（例えば配列番号：１４７参照）か、又はその逆が当てはまる（例えば配列番号：１４６参照）。
【０１９７】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第一及び／又は第二の接続ドメインは、抗体Ｖ／Ｃ接続のそれ又はＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続のそれと同等の全長を有する。
【０１９８】
適切な接続ドメインは、構造を基に決定することができる。例えば、抗体及びＴＣＲの三次元構造を重ね、重ねた構造上の抗体Ｖ／Ｃ接続及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続の重複を決定し、抗体又はＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続由来の配列の長さ又は比を決定する場合に考慮してよい。
【０１９９】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の接続ドメインは、抗体Ｖ／Ｃ接続及びＴＣＲ  Ｖ／Ｃ接続の断片の間に、スペーサーを含む。任意の好適な配列又は長さのスペーサー配列を、それがポリペプチド複合体の抗原結合又は安定性に負の影響を及ぼさない限りは、使用することができる。
【０２００】
抗体可変／定常ドメイン境界、及びＴＣＲ可変／定常ドメイン境界、及び抗体可変／ＴＣＲ定常領域境界の配列の例を、下記表１−６に提供している。
【０２０１】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＡｌｐｈａを含む。例証のために、表１は、ＴＣＲ  ＣＢｅｔａに融合された抗体ＶＨ、又はＴＣＲ  ＣＡｌｐｈａに融合された抗体ＶＬに有用な接続ドメインに関するデザインの例を示す。抗体ＶＨ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＢｅｔａ境界と整列され、抗体ＶＬ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＡｌｐｈａ境界と整列される。接続ドメインのデザインの例も、整列形で提供され（例えば配列番号：１４４、１４５、１４６、又は１４７参照）、第一又は第二の接続ドメインは下線を付けて示した。そのような実施態様において、第一の接続ドメインは、配列番号：４９又は５０を含むか又はこれである。そのような実施態様において、第二の接続ドメインは、配列番号：５１又は５２を含むか又はこれである。
【０２０２】
【表１】
2020534034.tif 000003
【０２０３】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含む。表２は、ＴＣＲ  ＣＡｌｐｈａに融合された抗体ＶＨ、又はＴＣＲ  ＣＢｅｔａに融合された抗体ＶＬに有用な接続ドメインに関するデザインの例を示す。抗体ＶＨ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＡｌｐｈａ境界と整列され、抗体ＶＬ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＢｅｔａ境界と整列される。接続ドメインのデザインの例も、整列形で提供され（例えば配列番号：１４８、１４９、又は１５０参照）、第一又は第二の接続ドメインは下線を付けて示した。そのような実施態様において、第一の接続ドメインは、配列番号：１２９又は１３０を含むか又はこれである。そのような実施態様において、第二の接続ドメインは、配列番号：４９又は５０を含むか又はこれである。
【０２０４】
【表２】
2020534034.tif 000004
【０２０５】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含む。表３は、ＴＣＲ  ＣＢｅｔａに融合された抗体ＶＨ、又はＴＣＲ  ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａに融合された抗体ＶＬに有用な接続ドメインに関するデザインの例を示す。抗体ＶＨ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＢｅｔａ境界と整列され、抗体ＶＬ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ境界と整列される。接続ドメインのデザインの例も、整列形で提供され（例えば配列番号：１７０、１７１、１６９、又は１５６参照）、第一又は第二の接続ドメインは下線を付けて示した。そのような実施態様において、第一の接続ドメインは、配列番号：４９又は５０を含むか又はこれである。そのような実施態様において、第二の接続ドメインは、配列番号：８１又は１３１を含むか又はこれである。
【０２０６】
【表３】
2020534034.tif 000005
【０２０７】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＢｅｔａを含む。表４は、ＴＣＲ  ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａに融合された抗体ＶＨ、又はＴＣＲ  ＣＢｅｔａに融合された抗体ＶＬに有用な接続ドメインに関するデザインの例を示す。抗体ＶＨ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ境界と整列され、抗体ＶＬ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＢｅｔａ境界と整列される。接続ドメインのデザインの例も、整列形で提供され（例えば配列番号：１７２、１７３、１７４、又は１７５参照）、第一又は第二の接続ドメインは下線を付けて示した。そのような実施態様において、第一の接続ドメインは、配列番号：８１、１３１、１３２、又は１３３を含むか又はこれである。そのような実施態様において、第二の接続ドメインは、配列番号：４９又は５０を含むか又はこれである。
【０２０８】
【表４】
2020534034.tif 000006
【０２０９】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＤｅｌｔａを含む。表５は、ＴＣＲ  ＣＧａｍｍａに融合された抗体ＶＨ、又はＴＣＲ  ＣＤｅｌｔａに融合された抗体ＶＬに有用な接続ドメインに関するデザインの例を示す。抗体ＶＨ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＧａｍｍａ境界と整列され、抗体ＶＬ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＤｅｌｔａ境界と整列される。接続ドメインのデザインの例も、整列形で提供され（例えば配列番号：１５７、１５８、１５９、又は１６０参照）、第一又は第二の接続ドメインは下線を付けて示した。そのような実施態様において、第一の接続ドメインは、配列番号：１１７又は１１８を含むか又はこれである。そのような実施態様において、第二の接続ドメインは、配列番号：１１９又は１２０を含むか又はこれである。
【０２１０】
【表５】
2020534034.tif 000007
【０２１１】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、且つＣ２は、操作されたＣＧａｍｍａを含む。表６は、ＴＣＲ  ＣＤｅｌｔａに融合された抗体ＶＨ、又はＴＣＲ  ＣＧａｍｍａに融合された抗体ＶＬに有用な接続ドメインに関するデザインの例を示す。抗体ＶＨ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＤｅｌｔａ境界と整列され、抗体ＶＬ／定常ドメイン境界は、ＴＣＲ可変／ＣＧａｍｍａ境界と整列される。接続ドメインのデザインの例も、整列形で提供され（例えば配列番号：１６１、１６２、１６３、又は１６４参照）、第一又は第二の接続ドメインは下線を付けて示した。そのような実施態様において、第一の接続ドメインは、配列番号：１２３又は１２４を含むか又はこれである。そのような実施態様において、第二の接続ドメインは、配列番号：１２５又は１２６を含むか又はこれである。
【０２１２】
【表６】
2020534034.tif 000008
【０２１３】
特定の実施態様において、第一のポリペプチドは、式（Ｉ）：ＶＨ−ＨＣＪ−Ｃ１のように機能的に連結されたドメインを含む配列を含み、且つ第二のポリペプチドは、式（ＩＩ）：ＶＬ−ＬＣＪ−Ｃ２のように機能的に連結されたドメインを含む配列を含み、ここで：
ＶＨは、抗体の重鎖可変ドメインであり；
ＨＣＪは、先に規定したような第一の接続ドメインであり；
Ｃ１は、先に規定したような第一のＴＣＲ定常ドメインであり；
ＶＬは、抗体の軽鎖可変ドメインであり；
ＬＣＪは、先に規定したような第二の接続ドメインであり；
Ｃ２は、先に規定したような第二のＴＣＲ定常ドメインである。
【０２１４】
特定の実施態様において、Ｃ１は、配列番号：４２−４８からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＡｌｐｈａであり、並びにＣ２は、配列番号：３２−４１からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＢｅｔａであり；ＨＣＪは、配列番号：４９及び５０からなる群から選択される配列を含むか又はこれであり；ＬＣＪは、配列番号：５１及び５２からなる群から選択される配列を含むか又はこれである。
【０２１５】
特定の実施態様において、Ｃ１は、配列番号：３２−４１からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＢｅｔａであり、並びにＣ２は、配列番号：４２−４８からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＡｌｐｈａであり；ＨＣＪは、配列番号：１２９及び１３０からなる群から選択される配列を含むか又はこれであり；ＬＣＪは、配列番号：４９及び５０からなる群から選択される配列を含むか又はこれである。
【０２１６】
特定の実施態様において、Ｃ１は、配列番号：３２−４１、８４、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、及び３２４からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＢｅｔａであり、並びにＣ２は、配列番号：３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、及び３１８からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａであり；ＨＣＪは、配列番号：４９及び５０からなる群から選択される配列を含むか又はこれであり；ＬＣＪは、配列番号：８１及び１３１からなる群から選択される配列を含むか又はこれである。
【０２１７】
特定の実施態様において、Ｃ１は、配列番号：３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、及び３１８からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａであり、並びにＣ２は、配列番号：３２−４１からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＢｅｔａであり；ＨＣＪは、配列番号：８１、１３１、１３２、及び１３３からなる群から選択される配列を含むか又はこれであり；ＬＣＪは、配列番号：４９及び５０からなる群から選択される配列を含むか又はこれである。
【０２１８】
特定の実施態様において、Ｃ１は、配列番号：１１３、１１４、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、及び３４０からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＧａｍｍａであり、並びにＣ２は、配列番号：３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３３２からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＤｅｌｔａであり；ＨＣＪは、配列番号：１１７及び１１８からなる群から選択される配列を含むか又はこれであり；ＬＣＪは、配列番号：１１９及び１２０からなる群から選択される配列を含むか又はこれである。
【０２１９】
特定の実施態様において、Ｃ１は、配列番号：３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３３２からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＤｅｌｔａであり、並びにＣ２は、配列番号：１１３、１１４、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、及び３４０からなる群から選択される配列を含むか又はこれである、操作されたＣＧａｍｍａであり；ＨＣＪは、配列番号：１２３及び１２４からなる群から選択される配列を含むか又はこれであり；ＬＣＪは、配列番号：１２５及び１２６からなる群から選択される配列を含むか又はこれである。
【０２２０】
米国特許第9,683,052号は、ＴＣＲ定常領域の間の接触境界面内の特定の残基は、２本の重鎖のヘテロ二量体対形成を促進するように、Ｆｃ領域へと操作され得ることを開示している。これにおいて開示されたＴＣＲ定常領域間の接触境界面内のそのような残基及び／又は対応する残基は、軽鎖と重鎖の間の対形成を促進するために、Ｆａｂ領域、例えばＣＨ１及びＣＬドメインへと操作されることもできる。
【０２２１】
（ｉｉ．抗体可変領域）
【０２２２】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。通常の天然型抗体において、可変領域は、例えば、Ｎ−末端からＣ−末端へ、下記式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で示されるような、フレームワーク（ＦＲ）領域をフランキングすることにより挟まれた３つのＣＤＲ領域を含む。本明細書に提供されるポリペプチド複合体は、そのような通常の抗体可変領域を含むことができるが、これに限定されるものではない。例えば、可変ドメインは、可変ドメインが抗原に特異的に結合することが可能である限りは、抗体重鎖又は軽鎖の、合わせて３個以下のＣＤＲ、合わせて４個以下のＦＲを含んでよい。
【０２２３】
第一の抗体は、第一の抗原特異性を有する。言い換えると、ＶＨ及びＶＬは、抗原又はエピトープへ特異的に結合することができる抗原結合部位を形成する。抗原特異性は、任意の好適な抗原又はエピトープへ、例えば、外来性抗原、内在性抗原、自己抗原、ネオ抗原、ウイルス抗原又は腫瘍抗原であるものなどに対して向けられ得る。外来性抗原は、吸入、経口摂取又は注入により体に侵入し、且つエンドサイトーシス又はファゴサイトーシスにより、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示され、ＭＨＣ  ＩＩ複合体を形成し得る。内在性抗原は、細胞の代謝、細胞内ウイルス又は細菌感染の結果として、正常細胞内で作製され、これはＭＨＣ  Ｉ複合体を形成する。自己抗原（例えば、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡなど）は、自己免疫疾患に罹患した患者の免疫系により認識されるのに対し、正常な状態の下では、この抗原は、その免疫系の標的であってはならない。ネオ抗原は、正常な体からは全体的に存在せず、腫瘍又は癌などの特定の疾患が原因で産生される。特定の実施態様において、この抗原は、特定の疾患（例えば、腫瘍又は癌、自己免疫疾患、感染症及び寄生虫症、心臓血管疾患、神経障害、神経精神医学的状態、外傷、炎症、凝固障害）と関連づけられている。特定の実施態様において、この抗原は、免疫系（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなどの免疫学的細胞）と関連づけられている。
【０２２４】
特定の実施態様において、第一の抗原特異性は、免疫関連抗原又はそのエピトープに向けられる。免疫関連抗原の例としては、Ｔ細胞特異性受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異性受容体分子が挙げられる。
【０２２５】
Ｔ細胞特異性受容体分子は、Ｔ細胞を結合させ、且つ追加シグナルが存在する場合には、抗原提示細胞又はＡＰＣと称される別の細胞により提示されたエピトープ／抗原により活性化され並びにこれと反応する。Ｔ細胞特異性受容体分子は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０とも称される）、４−１ＢＢ、ＣＤ５、及びＣＤ９５（Ｆａｓ受容体としても公知）であることができる。
【０２２６】
ＮＫ細胞特異性受容体分子の例は、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体及びＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ２を含む。
【０２２７】
特定の実施態様において、第一の抗原特異性は、腫瘍関連抗原又はそのエピトープへ向けられる。用語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞表面上に提示されているか又は提示することができ、且つ腫瘍細胞上又はその中に配置されている抗原を指す。一部の実施態様において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞によってのみ提示され得、正常細胞、すなわち非腫瘍細胞によっては提示されない。一部の他の実施態様において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞上に専ら発現され得るか、又は非腫瘍細胞と比べ腫瘍特異性変異を示す。一部の他の実施態様において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方において認められるが、非腫瘍細胞と比べた場合、腫瘍細胞上で過剰発現されるか、又は非腫瘍組織と比べ腫瘍組織のコンパクトさの少ない構造のために、腫瘍細胞における抗体結合にアクセス可能である。一部の実施態様において、腫瘍関連抗原は、腫瘍の血管上に配置される。
【０２２８】
腫瘍関連表面抗原の例証的例としては、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、Ｆｍｓ−様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ−関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テナシン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１−１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ−α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ−β（ＣＤ１４０ｂ）、エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１−８、及びＴｉｅ２が挙げられる。更なる例としては、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ−１（ＣＤｗ５２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ−ＣＡＭ、葉酸−結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ−様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３、ＣＤ１３５）、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ−２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ−関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ−１、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、及びＴＡＧ−７２が挙げられる。
【０２２９】
特定の実施態様において、第一の抗原特異性は、以下からなる群から選択される抗原又はそのエピトープに向けられる：ＣＤ３、４．１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｃｄＨ３、ＥｐＣＡＭ、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲ由来の変異体）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｄＬＬ３、ＢＣＭＡ、シアリル−Ｌｅａ、５Ｔ４、ＲＯＲ１、メラノーマ−関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、メソセリン、葉酸受容体１、ＶＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、プロテオグリカン、ＶＥＧＦ、ＦＧＦＲ、αＶβ３−インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ｃ−ｅｒｂ−２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ｐ９７、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＴ１ｂ、ＧＴ３、ＧＱ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＦＸ２、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４  Ｔｒｐ２、ｇｐ１００、チロシナーゼ、Ｍｕｃ−１、テロメラーゼ、サバイビン、Ｇ２５０、ｐ５３、ＣＡ１２５  ＭＵＣ、Ｗｕｅ抗原、ＬｅｗｉｓＹ抗原、ＨＳＰ−２７、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−７２、ＨＳＰ−９０、Ｐｇｐ、ＭＣＳＰ、ＥｐＨＡ２、及び細胞表面標的ＧＣ１８２、ＧＴ４６８又はＧＴ５１２。
【０２３０】
この抗体可変ドメインは、親抗体に由来することができる。親抗体は、例えば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又は動物抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど）を含む、任意の型の抗体であることができる。親抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることができる。
【０２３１】
特定の実施態様において、親抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え法、ファージディスプレイなど、当該技術分野において公知の様々な方法、又は任意のそれらの組合せにより作製され得る。
【０２３２】
ハイブリドーマ技術は、抗体を発現しているＢ細胞を不死化Ｂ細胞株と融合し、ハイブリドーマを作製することに関与しており、これは更に、抗体産生の高い産生レベル、ハイブリドーマ細胞の良好な成長、及び抗体の強力な結合又は良好な生物活性などの所望の特徴に関して、スクリーニングされる(例えば、Harlowら、(1988) Antibody: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版参照)。
【０２３３】
組換え法は、親抗体を作製する別の方式である。簡単には、関心対象の抗体を分泌しているリンパ球などの細胞を入手し、同定し、単独の細胞が単離され、引き続き逆転写酵素ＰＣＲにより、重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを作製する。これらの可変領域のｃＤＮＡ配列を用い、本明細書に提供されるポリペプチド複合体のコード配列を構築し、その後好適な宿主細胞において発現することができる（総説については、例えば、米国特許第5,627,052号；PCT公開WO 92/02551；及び、Babcockら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848を参照）。
【０２３４】
抗体ライブラリーは依然、親抗体を得るための代替法である。簡単には、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような組換え抗体ライブラリーのスクリーニングの方法は、当該技術分野において周知であり、且つ例えば、米国特許第5,223,409号；PCT公開WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；及び、WO 97/29131；Fuchsら、(1991) Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら、(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら、(1989) Science 246:1275-1281；McCaffertyら、(1990) Nature 348:552-554；Griffithsら、(1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkinsら、(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clacksonら、(1991) Nature 352:624-628；Gramら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garradら、(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboomら、(1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137；及び、Barbasら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；並びに、米国特許出願公開第20030186374に記載された方法を含む。
【０２３５】
親抗体を得るための別の例証的方法は、ファージディスプレイである(例えば、Brinkmanら、(1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Amesら、(1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleboroughら、(1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persicら、(1997) Gene 187 9-18；及び、米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号；及び、第5,969,108号参照)。抗体ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列を、ファージ粒子に導入し、様々な機能性抗体ドメインを提示しているファージ粒子のライブラリーを作製する。Ｆｄ及びＭ１３は、通常使用される線維状ファージであり、且つファージ粒子上にディスプレイされる機能性抗体ドメインは、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化されたＦｖ抗体ドメインであることができ、これはｇｅｎｅＩＩＩ又はｇｅｎｅＶＩＩＩによりコードされたファージタンパク質へ組換えにより融合される。ファージライブラリーは、例えば、任意に標識されるか又は固体基板（例えばビーズ）に結合もしくは捕獲された関心対象の抗原を用いてスクリーニングすることができる。選択されたファージに関して、抗体可変ドメインをコードしているそのポリヌクレオチド配列が得られ、本明細書に提供されるポリペプチド複合体の構築に使用される。同様に、抗体ドメインの酵母細胞壁への繋ぐ（例えば、米国特許第6,699,658号参照）により抗体可変ドメインをディスプレイしている酵母ライブラリーが作製され、その後結合した抗原によりスクリーニングされ、本明細書に提供されるポリペプチド複合体の構築に有用な親抗体を得ることができる。
【０２３６】
更に親抗体は、関心対象の抗原の、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全てを含むトランスジェニック非ヒト動物への注入により作製することもでき、これらの動物は例えば、ＯｍｎｉＲａｔ、ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ(例えば、Osborn M.ら、Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90；Ma B.ら、Journal of Immunological Methods 400-401 (2013) 78-86；Geurts A.ら、Science, 2009, 325:433；米国特許第8,907,157号；欧州特許第2152880B1号；欧州特許第2336329B1号参照)、ＨｕＭａｂマウス(詳細については、Lonberg, N.ら、Nature 368(6474): 856 859 (1994)参照)、Ｘｅｎｏマウス(Mendezら、Nat Genet., 1997, 15:146-156)、ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏマウス(Ishidaら、Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102)、及びＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅｍｏｕｓｅ(Murphyら、Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:5153-5158)、ＫｙＭｏｕｓｅ(Leeら、Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363)、及びトランスジェニックウサギ(Flisikowskaら、PLoS One, 2011, 6:e21045)がある。
【０２３７】
本明細書記載の親抗体は、例えば、異なるフレームワーク又はスカフォールドへＣＤＲ配列をグラフトするように、１以上のフレームワーク領域内の１以上のアミノ酸残基を置換するように、親和性成熟のため１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を置き換えるようになど、更に修飾することができる。これらは、通常の技術を使用し当業者により達成され得る。
【０２３８】
この親抗体はまた、例えば、治療もしくは診断用途のためにＦＤＡにより承認されたもの、又は状態の治療のために臨床試験中のもの、又は研究開発中のものなど、当該技術分野において公知の治療的抗体であることができる。公知の抗体の可変領域に関するポリヌクレオチド配列及びタンパク質配列は、例えば、www.ncbi.nlm nih gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.htmlなどの、公のデータベースから得ることができる。
【０２３９】
治療用抗体の例は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：リツキシマブ(リツキサン、IDEC/Genentech/Roche)(例えば、米国特許第5,736,137号参照)、非ホジキンリンパ腫治療に関して承認されたキメラ抗−ＣＤ２０抗体；HuMax-CD20、Genmabにより現在開発中の抗−ＣＤ２０、米国特許第5,500,362号記載の抗−ＣＤ２０抗体、AME-133(Applied Molecular Evolution)、hA20(Immunomedics社)、HumaLYM(Intracel)、及びPRO70769(PCT出願PCT/US2003/040426)；トラスツズマブ(ハーセプチン、Genentech)(例えば、米国特許第5,677,171号参照)、乳癌治療に関して承認されたヒト化抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Genentechにより現在開発中のペルツズマブ(rhuMab-2C4、オムニターグ)；米国特許第4,753,894号記載の抗−Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ(エルビタックス、Imclone)(米国特許第4,943,533号；PCT公開WO 96/40210)、様々な癌について臨床試験中のキメラ抗−ＥＧＦＲ抗体；Abgenix-Immunex-Amgenにより現在開発中のABX-EGF(米国特許第6,235,883号)；Genmabにより現在開発中のHuMax-EGFr(米国特許第7,247,301号)；425、EMD55900、EMD62000、及びEMD72000(Merck KGaA)(米国特許第5,558,864号；Murthyら、(1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2):549-60；Rodeckら、(1987) J. Cell. Biochem. 35(4):315-20；Kettleboroughら、(1991) Protein Eng. 4(7):773-83)；ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT公開WO 95/20045；Modjtahediら、(1993) J. Cell Biophys. 22(1-3):129-46；Modjtahediら、(1993) Br. J. Cancer 67(2):247-53；Modjtahediら、(1996) Br. J. Cancer 73(2):228-35；Modjtahediら、(2003) Int. J. Cancer 105(2):273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba(米国特許第5,891,996号；第6,506,883号；Mateoら、(1997) Immunotechnol. 3(1):71-81)；mAb-806(Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluthら、(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX、National Cancer Institute)(PCT公開WO 0162931)；及び、SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)；アレムツズマブ(キャンパス、Millenium)、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病治療について現在承認されたヒト化ｍＡｂ；ムロモナブ-CD3(オルトクローンOKT3)、Ortho Biotech/Johnson & Johnsonにより開発された抗−ＣＤ３抗体、イブリツモマブチウキセタン(ゼバリン)、IDEC/Schering AGにより開発された抗−ＣＤ２０抗体、ゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ)、Celltech/Wyethにより開発された抗−ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体、アレファセプト(アメビブ)、Biogenにより開発された抗−ＬＦＡ−３  Ｆｃ融合体)、Centocor/Lillyにより開発されたアブシキシマブ(レオプロ)、Novartisにより開発されたバシリキシマブ(シムレクト)、Medimmuneにより開発されたパリビズマブ(シナジス)、インフリキシマブ(レミケード)、Centocorにより開発された抗−ＴＮＦα抗体、アダリムマブ(ヒュミラ)、Abbottにより開発された抗−ＴＮＦα抗体、ヒュミケード、Celltechにより開発された抗−ＴＮＦα抗体、ゴリムマブ(CNTO-148)、Centocorにより開発された完全ヒトＴＮＦ抗体、エタネルセプト(エンブレル)、Immunex/Amgenにより開発されたｐ７５  ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、レネルセプト、Rocheにより開発されたｐ５５ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、ABX-CBL、Abgenixにより開発された抗−ＣＤ１４７抗体、ABX-IL8、Abgenixにより開発された抗−ＩＬ８抗体、ABX-MA1、Abgenixにより開発された抗−ＭＵＣ１８抗体、Pemtumomab(R1549、90Y-muHMFG1)、Antisomaにより開発された抗−ＭＵＣ１、Therex(R1550)、Antisomaにより開発された抗−ＭＵＣ１抗体、Antisomaにより開発されたAngioMab(AS1405)、Antisomaにより開発されたHuBC-1、Antisomaにより開発されたチオプラチン(AS1407)、アンテグレン(ナタリズマブ)、Biogenにより開発された抗−α−４−β１（ＶＬＡ−４）及びα−４−β−７抗体、VLA-1 mAb、Biogenにより開発された抗−ＶＬＡ−１インテグリン抗体、LTBR mAb、Biogenにより開発された抗−リンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）抗体、CAT-152、Cambridge Antibody Technologyにより開発された抗−ＴＧＦ−β．２抗体、ABT 874(J695)、Abbottにより開発された抗−ＩＬ−１２ｐ４０抗体、CAT-192、Cambridge Antibody Technology and Genzymeにより開発された抗−ＴＧＦ．β．１抗体、CAT-213、Cambridge Antibody Technologyにより開発された抗−エオタキシンｌ抗体、Cambridge Antibody Technology及びHuman Genome Sciences Inc.により開発されたリンホスタットＢ抗−Ｂｌｙｓ抗体、TRAIL-RlmAb、Cambridge Antibody Technology及びHuman Genome Sciences社により開発された抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体、アバスチンベバシズマブ、rhuMAb-VEGF)、Genentechにより開発された抗−ＶＥＧＦ抗体、Genentechにより開発された抗−ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、抗−組織因子(ATF)、Genentechにより開発された抗−組織因子抗体、ゾレア(オマリズマブ)、Genentechにより開発された抗−ＩｇＥ抗体、ラプチバ(エファリズマブ)、Genentech及びXomaにより開発された抗−ＣＤ１１ａ抗体、Genentech及びMillenium Pharmaceuticalsにより開発されたＭＬＮ−０２抗体(以前はLDP-02)、HuMax CD4、Genmabにより開発された抗−ＣＤ４抗体、HuMax-IL15、Genmab及びAmgenにより開発された抗−ＩＬ１５抗体、Genmab及びMedarexにより開発されたHuMax-Inflam、HuMax-Cancer、Genmab及びMedarex及びOxford GcoSciencesにより開発された抗−ヘパラナーゼＩ抗体、Genmab及びAmgenにより開発されたＨｕＭａｘ−リンパ腫、Genmabにより開発されたＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、IDEC-131、並びにIDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗−ＣＤ４０Ｌ抗体、IDEC-151(クレノリキシマブ)、IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗−ＣＤ４抗体、IDEC-114、IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗−ＣＤ８０抗体、IDEC-152、IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗−ＣＤ２３、IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗−マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、BEC2、Imcloneにより開発された抗-イディオタイプ抗体、IMC-1C11、Imcloneにより開発された抗−ＫＤＲ抗体、DC101、Imcloneにより開発された抗−ｆｌｋ−１抗体、Imcloneにより開発された抗−ＶＥカドヘリン抗体、CEA-Cide(ラベツズマブ)、Immunomedicsにより開発された抗−癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、LymphoCide(エプラツズマブ)、Immunomedicsにより開発された抗−ＣＤ２２抗体、Immunomedicsにより開発されたAFP-Cide、Immunomedicsにより開発されたMyelomaCide、Immunomedicsにより開発されたLkoCide、Immunomedicsにより開発されたProstaCide、MDX-010、Medarexにより開発された抗−ＣＴＬＡ４抗体、MDX-060、Medarexにより開発された抗−ＣＤ３０抗体、Medarexにより開発されたMDX-070、Medarexにより開発されたMDX-018、Osidem(IDM-1)、並びにMedarex及びImmuno-Designed Moleculesにより開発された抗−Ｈｅｒ２抗体、HuMax-CD4、Medarex及びGenmabにより開発された抗−ＣＤ４抗体、HuMax-IL15、Medarex及びGenmabにより開発された抗−ＩＬ１５抗体、CNTO 148、Medarex及びCentocor/J&Jにより開発された抗−ＴＮＦα抗体、CNTO 1275、Centocor/J&Jにより開発された抗−サイトカイン抗体、MOR101及びMOR102、MorphoSysにより開発された抗−細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４���抗体、MOR201、MorphoSysにより開発された抗−線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体、Nuvion(ビシリズマブ)、Protein Design Labsにより開発された抗−ＣＤ３抗体、HuZAF、Protein Design Labsにより開発された抗−インターフェロンγ抗体、Protein Design Labsにより開発された抗-α.5.β.1インテグリン、Protein Design Labsにより開発された抗−ＩＬ−１２、ING-1、Xomaにより開発された抗−Ｅｐ−ＣＡＭ抗体、ゾレア(オマリズマブ)、Genentech及びNovartisにより開発されたヒト化抗−ＩｇＥ抗体、並びにMLN01、Xomaにより開発された抗−β２インテグリン抗体。別の実施態様において、治療薬としては、KRN330(Kirin)；ｈｕＡ３３抗体(A33、Ludwig Institute for Cancer Research)；NTO95(αＶインテグリン、Centocor)；MEDI-522(αＶ．β．３インテグリン、Medimmune)；volociximab(αＶ．β．１インテグリン、Biogen/PDL)；ヒトｍＡｂ216(Ｂ細胞グリコシル化された(glycosolated)エピトープ、NCI)；BiTE MT103(二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３、Medimmune)；4G7×H22(二重特異性Ｂ細胞×ＦｃガンマＲ１、Medarex/Merck KGa)；rM28(二重特異性ＣＤ２８×ＭＡＰＧ、欧州特許第EP1444268号)；MDX447(EMD 82633)(二重特異性ＣＤ６４×ＥＧＦＲ、Medarex)；カツマキソマブ(レモマブ)(二重特異性ＥｐＣＡＭ×抗−ＣＤ３、Trion/Fres)；エルツマキソマブ(二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３、Fresenius Biotech)；オレゴボマブ(OvaRex)(ＣＡ−１２５、ViRexx)；Rencarex(WX G250)(カルボン酸脱水酵素ＩＸ、Wilex)；CNTO 888(ＣＣＬ２、Centocor)；TRC105(ＣＤ１０５（エンドグリン）、Tracon)；BMS-663513(ＣＤ１３７アゴニスト、Brystol Myers Squibb)；MDX-1342(ＣＤ１９、Medarex)；シプリツマブ(MEDI-507)(ＣＤ２、Medimmune)；オファツムマブ(Humax-CD20)(ＣＤ２０、Genmab)；リツキシマブ(リツキサン)(ＣＤ２０、Genentech)；ベルツズマブ(hA20)(ＣＤ２０、Immunomedics)；エプラツズマブ(ＣＤ２２、Amgen)；ルミリキシマブ(IDEC 152)(ＣＤ２３、Biogen)；ムロモナブ-CD3(ＣＤ３、Ortho)；HuM291(ＣＤ３  ｆｃ受容体、PDL Biopharma)；HeFi-1（ＣＤ３０、NCI)；MDX-060(ＣＤ３０、Medarex)；MDX-1401(ＣＤ３０、Medarex)；SGN-30(ＣＤ３０、Seattle Genentics)；SGN-33(リンツズマブ)(ＣＤ３３、Seattle Genentics)；ザノリムバブ(HuMax-CD4)(ＣＤ４、Genmab)；HCD122(ＣＤ４０、Novartis)；SGN-40(ＣＤ４０、Seattle Genentics)；カンパスlh(アレムツズマブ)(ＣＤ５２、Genzyme)；MDX-1411(ＣＤ７０、Medarex)；hLL1(EPB-1)(ＣＤ７４．３８、Immunomedics)；ガリキシマブ(IDEC-144)(ＣＤ８０、Biogen)；MT293(TRC093/D93)(切断型コラーゲン、Tracon)；HuLuc63(ＣＳ１、PDL Pharma)；イピリムマブ(MDX-010)(ＣＴＬＡ４、Brystol Myers Squibb)；トレメリムマブ(地知りムマブ、CP-675,2)(ＣＴＬＡ４、Pfizer)；HGS-ETR1(マパツムマブ)(ＤＲ４  ＴＲＡＩＬ−Ｒ１アゴニスト、Human Genome Science/Glaxo Smith Kline)；AMG-655(ＤＲ５、Amgen)；アポマブ(ＤＲ５、Genentech)；CS-1008(ＤＲ５、Daiichi Sankyo)；HGS-ETR2(レクサツムマブ)(ＤＲ５  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２アゴニスト、HGS)；セツキシマブ(エルビタックス)(ＥＧＦＲ、Imclone)；IMC-11F8(ＥＧＦＲ、Imclone)；ニモツズマブ(ＥＧＦＲ、YM Bio)；パニツムマブ(ベクタビックス)(ＥＧＦＲ、Amgen)；ザルツムマブ(HuMaxEGFr)(ＥＧＦＲ、Genmab)；CDX-110(ＥＧＦＲｖＩＩＩ、AVANT Immunotherapeutics)；アデカツマブ(MT201)(Ｅｐｃａｍ、Merck)；エドレコロマブ(Panorex、17-1A)(Ｅｐｃａｍ、Glaxo/Centocor)；MORAb-003(葉酸受容体ａ、Morphotech)；KW-2871(ガングリオシドＧＤ３、Kyowa)；MORAb-009(ＧＰ−９、Morphotech)；CDX-1307(MDX-1307)(ｈＣＧｂ、Celldex)；トラスツズマブ(ハーセプチン)(ＨＥＲ２、Celldex)；ペルツズマブ(rhuMAb 2C4)(ＨＥＲ２（ＤＩ）、Genentech)；アポリツマブ(ＨＬＡ−ＤＲβ鎖、PDL Pharma)；AMG-479(ＩＧＦ−１Ｒ、Amgen)；抗-IGF-1R R1507(ＩＧＦ１−Ｒ、Roche)；CP 751871(ＩＧＦ−Ｒ、Pfizer)；IMC-A12(ＩＧＦ１−Ｒ、Imclone)；BIIB022(ＩＧＦ−１Ｒ、Biogen)；Mik-β-1(ＩＬ−２Ｒｂ（ＣＤ１２２）、Hoffman LaRoche)；CNTO 328(ＩＬ６、Centocor)；抗-KIR(1-7F9)(キラー細胞Ｉｇ−様受容体（ＫＩＲ）、Novo)；Hu3S193(ルイス（ｙ）、Wyeth、Ludwig Institute of Cancer Research)；hCBE-11(ＬＴＢＲ、Biogen)；HuHMFG1(ＭＵＣ１、Antisoma/NCI)；RAV12(Ｎ−結合型糖エピトープ、Raven)；CAL(副甲状腺ホルモン−関連タンパク質（ＰＴＨ−ｒＰ）、University of California)；CT-011(ＰＤ１、CureTech)；MDX-1106(オノ-4538)(Ｐ
Ｄ１, Medarex/Ono)；MAb CT-011(ＰＤ１、Curetech)；IMC-3G3(ＰＤＧＦＲａ、Imclone)；バビツキシマブ(ホスファチジルセリン、Peregrine)；huJ591(ＰＳＭＡ、Cornell Research Foundation)；muJ591(ＰＳＭＡ、Cornell Research Foundation)；GC1008(ＴＧＦｂ（ｐａｎ）インヒビター（ＩｇＧ４）、Genzyme)；インフリキシマブ(レミケード)(ＴＮＦα、Centocor)；A27.15(トランスフェリン受容体、Salk Institute, INSERN WO 2005/111082)；E2.3(トランスフェリン受容体、Salk Institute)；ベバシズマブ(アバスチン)(ＶＥＧＦ、Genentech)；HuMV833(ＶＥＧＦ、Tsukuba Research Lab)PCT公開WO/2000/034337、University of Texas)；IMC-18F1(ＶＥＧＦＲ１、Imclone)；IMC-1121(ＶＥＧＦＲ２、Imclone)が挙げられる。
【０２４０】
ａ）抗−ＣＤ３結合部分
【０２４１】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分又は第二の抗原結合部分は、配列番号：３４２−３４４からなる群から選択される１、２、もしくは３つの重鎖ＣＤＲ配列、及び／又は配列番号：３４５−３４７から選択される１、２、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、抗−ＣＤ３抗体由来の抗−ＣＤ３結合部分である。
【０２４２】
これらのＣＤＲ配列は、下記表Ａに示した抗−ＣＤ３抗体に由来する。ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４抗体のＣＤＲ配列を、以下に提供する。
【０２４３】
【表７】
2020534034.tif 000009
【０２４４】
ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４抗体の重鎖及びκ軽鎖可変領域の配列を、以下に提供する。
【０２４５】
ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４−ＶＨ
アミノ酸配列（配列番号：３４８）：
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWISPGNVNTKYNENFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQGTTLTVSS
核酸配列（配列番号：３４９）：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCCGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAATGTTAATACTAAATACAATGAAAACTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACTGCAGACCTATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGATATTCCCTGTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
【０２４６】
ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４−ＶＬ
アミノ酸配列（配列番号：３５０）：
DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGGGTKLEIK
核酸配列（配列番号：３５１）：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
【０２４７】
ＣＤＲは、抗原結合に寄与することはわかっているが、全てではないが６つのＣＤＲは、必須で交換できないことはわかっている。言い換えるとＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４由来の抗−ＣＤ３結合部分において、依然ＣＤ３への特異的結合親和性を実質的に保持しつつ、１以上のＣＤＲを置換え又は変更又は修飾することは可能である。
【０２４８】
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗−ＣＤ３結合部分は、抗−ＣＤ３抗体ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４の一つの重鎖ＣＤＲ３配列を含む。特定の実施態様において、本明細書に提供される抗−ＣＤ３結合部分は、配列番号：３４４を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原−結合部位の中心に位置し、従って抗原との最大の接触を生じ、且つ抗原への抗体の親和性に対する最大の自由エネルギーを提供すると考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、複数の多様化の機序により、長さ、アミノ酸組成及び高次構造に関して、抗原−結合部位の圧倒的に最大の多様なＣＤＲであることも考えられる(Tonegawa S.、Nature. 302:575-81 (1983))。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、ほとんどの抗体特異性(Xu JL、Davis MM.、Immunity. 13:37-45 (2000))、並びに所望の抗原結合親和性(Schier Rら、J Mol Biol. 263:551-67 (1996))を生じるのに十分である。
【０２４９】
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗−ＣＤ３結合部分は、抗−ＣＤ３結合部分が、ＣＤ３に特異的に結合することができる限りは、好適なフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。表Ａに提供されるＣＤＲ配列は、マウス抗体から得られるが、これらは組換え技術などの当該技術分野において公知の好適な方法を用い、とりわけマウス、ヒト、ラット、ウサギなどの任意の好適な種の、任意の好適なＦＲ配列にグラフトされ得る。
【０２５０】
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗−ＣＤ３結合部分は、ヒト化されている。
【０２５１】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるヒト化抗原結合部分は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて、実質的に全てヒト配列で構成される。一部の実施態様において、可変領域ＦＲ、及び存在するならば定常領域は、全面的に又は実質的にヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒトＦＲ配列及びヒト定常領域配列は、異なるヒト免疫グロブリン遺伝子に由来してよく、例えば、ＦＲ配列は１種のヒト抗体に及び定常領域は別のヒト抗体に由来してよい。一部の実施態様において、ヒト化抗原結合部分は、ヒトＦＲ１−４を含む。
【０２５２】
抗−ＣＤ３ヒト化抗体ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４−ｚ１の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を、以下に提供する。
【０２５３】
ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４−ｚ１−ＶＨ
アミノ酸配列（配列番号：３５２）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
核酸配列（配列番号：３５３）：
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
【０２５４】
ＷＢＰ３３１１＿２．３０６．４−ｚ１−ＶＬ
アミノ酸配列（配列番号：３５４）：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
核酸配列（配列番号：３５５）：
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
【０２５５】
ｂ）抗−ＣＤ１９抗体
【０２５６】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分又は第二の抗原結合部分は、配列番号：３５６−３５９からなる群から選択される１、２、もしくは３つの重鎖ＣＤＲ配列、及び／又は配列番号：３６０−３６２から選択される１、２、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、抗−ＣＤ１９抗体由来の抗−ＣＤ１９結合部分である。
【０２５７】
これらのＣＤＲ配列は、下記表Ｂに示した抗体に由来する。これらの抗−ＣＤ１９抗体のＣＤＲ配列を、以下に提供する。
【０２５８】
【表８】
2020534034.tif 000010
【０２５９】
ＷＢＰ７０１１＿４．１５５．８抗体の重鎖及びκ軽鎖可変領域の配列を、以下に提供する。
【０２６０】
ＷＢＰ７０１１−４．１５５．８−ＶＨ
アミノ酸配列（配列番号：３６３）：
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTTAYAMDYWGQGTSVTVSS
核酸配列（配列番号：３６４）：
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTACAATGGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCACTACGGCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
【０２６１】
ＷＢＰ７０１１−４．１５５．８−ＶＬ
アミノ酸配列（配列番号：３６５）：
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSTVNYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK
核酸配列（配列番号：３６６）：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGAAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
【０２６２】
特定の実施態様において、本明細書に開示された抗−ＣＤ１９結合部分は、抗−ＣＤ１９  抗体  ＷＢＰ７０１１＿４．１５５．８又はＷ７０１１−４．１５５．８−ｚ１−Ｐ１５の重鎖ＣＤＲ３配列を含む。特定の実施態様において、本明細書に提供される抗−ＣＤ１９結合部分は、配列番号：３５８を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原−結合部位の中心に位置し、従って抗原との最大の接触を生じ、且つ抗原への抗体の親和性に対する最大の自由エネルギーを提供すると考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、複数の多様化の機序により、長さ、アミノ酸組成及び高次構造に関して、抗原−結合部位の圧倒的に最大の多様なＣＤＲであることも考えられる(Tonegawa S.、Nature. 302:575-81 (1983))。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、ほとんどの抗体特異性(Xu JL、Davis MM.、Immunity. 13:37-45 (2000))、並びに所望の抗原−結合親和性(Schier Rら、J Mol Biol. 263:551-67 (1996))を生じるのに十分である。
【０２６３】
特定の実施態様において、本明細書に開示された抗−ＣＤ１９抗体は、ヒト化されている。抗−ＣＤ１９ヒト化抗体Ｗ７０１１−４．１５５．８−ｚ１−Ｐ１５に関する重鎖及び軽鎖可変領域の配列を、以下に提供する。
【０２６４】
Ｗ７０１１−４．１５５．８−ｚ１−Ｐ１５−ＶＨ
アミノ酸配列（配列番号：３６７）：
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
核酸配列（配列番号：３６８）：
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
【０２６５】
Ｗ７０１１−４．１５５．８−ｚ１−Ｐ１５−ＶＬ
アミノ酸配列（配列番号：３６９）：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
核酸配列（配列番号：３７０）：
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
【０２６６】
（二重特異性ポリペプチド複合体）
【０２６７】
一つの態様において、本開示は、二重特異性ポリペプチド複合体を本明細書において提供する。本明細書において使用される用語「二重特異性」は、２つの抗原結合部分が存在し、その各々が、異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができることを意味する。本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に機能的に連結された第一の重鎖可変ドメイン及び第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に機能的に連結された第一の軽鎖可変ドメインを含む第一の抗原結合部分を含み、ここでＣ１及びＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも１つの非天然型の安定した鎖間結合を含む二量体を形成することが可能である。本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は更に、第二の抗原結合部位を含むが、ＴＣＲ定常領域由来の配列は含まない第二の抗原結合部分を含む。
【０２６８】
特定の実施態様において、本開示は、第二の抗原結合部分に会合された第一の抗原結合部分を含む、二重特異性ポリペプチド複合体を提供し、ここで：
第一の抗原結合部分は：
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、第一のポリペプチド；及び
Ｎ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第二のポリペプチド；を含み、
ここで、
Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ
第一の抗体は、第一の抗原特異性を有し、
第二の抗原結合部分は、第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有し、並びに
第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、誤対形成の傾向が少ない。
【０２６９】
本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、誤対形成された重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する傾向が著しく少ない。何らかの理論に結びつけられることは欲しないが、第一の抗原結合部分中の安定化されたＴＣＲ定常領域は、互いに特異的に会合することができ、その結果意図されたＶＨ１とＶＬ１の高度に特異的な対形成に寄与する一方で、ＶＨ１又はＶＬ１の他の意図された抗原結合部位を提供しない可変領域との望ましくない誤対形成は妨げることが考えられる。
【０２７０】
ＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットの二重特異性ポリペプチド複合体は、他のフォーマットの二重特異性ポリペプチド複合体と比べた場合に、より長いインビボ半減期を有し、且つ製造することが比較的容易である。
【０２７１】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体の第二の抗原結合部分は、第二の抗体の第二の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第二の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む。特定の実施態様において、ＶＨ２及びＶＬ２の少なくとも一方は、抗体定常領域へ機能的に連結されるか、又はＶＨ２及びＶＬ２の両方は、各々、抗体重鎖及び軽鎖定常領域へ機能的に連結される。特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、ＶＨ２へ機能的に連結された抗体定常ＣＨ１ドメイン、及びＶＬ２へ機能的に連結された抗体軽鎖定常ドメインを更に含む。例えば、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂを含む。
【０２７２】
第一、第二、第三、及び第四の可変ドメイン（例えば、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ１及びＶＬ２）が、一つの細胞において発現される場合、ＶＨ１はＶＬ１と特異的に対形成し、且つＶＨ２はＶＬ２と特異的に対形成することは高度に望ましく、その結果生じる二重特異性タンパク質生成物は、正確な抗原結合特異性を有するであろう。しかし、ハイブリッド−ハイブリドーマ（又はクアドローマ）などの現存する技術において、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ１及びＶＬ２のランダム対形成が起こり、結果的に最大１０の異なる種の生成が生じ、その中でただ一つが、機能的二重特異性抗原結合分子である。これは、生成収量を低下するのみではなく、標的生成物の精製を複雑化もする。
【０２７３】
本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、可変ドメインは、第一及び第二の両方の抗原結合部分が天然のＦａｂの対応物である場合の別のものよりも、誤対形成する傾向が少ない点が、例外的である。例証的実施例において、第一の抗原−結合ドメインは、ＶＬ１−Ｃ２と対形成したＶＨ１−Ｃ１を含み、及び第二の抗原−結合ドメインは、ＶＬ２−ＣＬと対形成したＶＨ２−ＣＨ１を含む。驚くべきことに、Ｃ１及びＣ２は互いに優先的に会合し、且つＣＬ又はＣＨ１と会合する傾向が少なく、これによりＣ１−ＣＨ、Ｃ１−ＣＬ、Ｃ２−ＣＨ、及びＣ２−ＣＬなどの望ましくない対の形成は妨げられ、著しく減少されることがわかった。Ｃ１−Ｃ２の特異的会合の結果として、ＶＨ１はＶＬ１と特異的に対形成し、これにより第一の抗原結合部位とし、並びにＣＨ１はＣＬと特異的に対形成し、これにより第二の抗原結合部位を提供するＶＨ２−ＶＬ２の特異的対形成を可能にする。従って、第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、ミスマッチの傾向が少なく、及び例えば、ＶＨ１−ＶＬ２、ＶＨ２−ＶＬ１、ＶＨ１−ＶＨ２、ＶＬ１−ＶＬ２の間の誤対形成は、第一及び第二の両方の抗原結合部分が、例えばＶＨ１−ＣＨ１、ＶＬ１−ＣＬ、ＶＨ２−ＣＨ１、及びＶＬ２−ＣＬの形で、天然Ｆａｂ対応物である場合別のものよりも、有意に減少される。
【０２７４】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞から発現される場合、同等の条件で発現された参照分子よりも、有意に低い誤対形成生成物（例えば、少なくとも１、２、３、４、５それ以上、より少ない誤対形成生成物）及び／又は有意に高い生成物収率（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上、より高い収率）を有し、ここで参照分子は、Ｃ１の代わりに天然型ＣＨ１及びＣ２の代わりに天然型ＣＬを有する以外は、二重特異性ポリペプチド複合体と同一である。
【０２７５】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の抗原結合部分は、二価、三価、四価など、多価である。本明細書において使用される用語「価数」は、所定の分子中の特定された数の抗原結合部位の存在を指す。従って、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、各々、抗原結合分子中の、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を意味する。二価の分子は、２つの結合部位が、両方共同じ抗原又は同じエピトープに特異的に結合する場合に、単一特異性であることができる。同様に、三価の分子は、例えば、２つの結合部位が、第一の抗原（又はエピトープ）に対し単一特異性であり、且つ第三の結合部位が、第二の抗原（又はエピトープ）に特異性である場合に、二重特異性であることができる。特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体における第一及び／又は第二の抗原結合部分は、同じ抗原又はエピトープに特異性のある少なくとも２つの結合部位を持つ、二価、三価、又は四価であることができる。これは、特定の実施態様において、一価の対応物よりも、抗原又はエピトープへのより強力な結合を提供する。特定の実施態様において、二価の抗原結合部分における第一の価数の結合部位及び第二の価数の結合部位は、構造的に同一である（すなわち同じ配列を有する）か、又は構造的に異なる（すなわち同じ特異性を持つとしても異なる配列を有する）。
【０２７６】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の抗原結合部分は、多価であり、且つスペーサーを伴うか又は伴わずに、一緒に機能的に連結された２以上の抗原結合部位を含む。
【０２７７】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の抗原結合部分は、１以上のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに前掲のSpiessら(2015)及び前掲のBrinkmannら(2017)の論文に記載の他の断片、又はそれらの組合せを含み、これらは、重鎖及び／又は軽鎖でスペーサーを伴うか又は伴わずに連結され、且つ少なくとも１つの形は、第二の抗体に結合することが可能である。
【０２７８】
特定の実施態様において、第二の抗原結合部分は、第二の抗体の２以上のＦａｂを含む。２つのＦａｂは、互いに機能的に連結され得、例えば、第一のＦａｂは、間にスペーサーを伴うか又は伴わずに、第二のＦａｂへ重鎖を介して、共有的に結合され得る。
【０２７９】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は更に、第一の二量体形成ドメインを含み、且つ第二の抗原結合部分は、第二の二量体形成ドメインを更に含む。本明細書において使用される用語「二量体形成ドメイン」は、互いに会合し二量体を形成することが可能であるか、又は一部の例において、２つのペプチドの自発的な二量体形成ができる、ペプチドドメインを指す。
【０２８０】
特定の実施態様において、第一の二量体形成ドメインは、第二の二量体形成ドメインと会合され得る。この会合は、例えば、コネクター、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、又は疎水性−親水性相互作用、又はそれらの組合せを介して、任意の好適な相互作用又は連結又は結合を介することができる。例証的二量体形成ドメインは、抗体ヒンジ領域、抗体ＣＨ２ドメイン、抗体ＣＨ３ドメイン、並びに互いに二量体形成及び会合が可能な他の好適なタンパク質単量体を含むが、これらに限定されるものではない。ヒンジ領域、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４など、任意の抗体アイソタイプに由来することができる。
【０２８１】
特定の実施態様において、第一及び／又は第二の二量体形成ドメインは、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。特定の実施態様において、第一及び／又は第二の二量体形成ドメインは、抗体ＣＨ２ドメイン、及び／又は抗体ＣＨ３ドメインを更に含んでよい。特定の実施態様において、第一及び／又は第二の二量体形成ドメインは、ヒンジ−Ｆｃ領域、すなわちヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。特定の実施態様において、第一の二量体形成ドメインは、第一のＴＣＲ定常領域のＣ末端へ機能的に連結され得る。特定の実施態様において、第二の二量体形成ドメインは、第二の抗原結合部分の抗体ＣＨ１定常領域のＣ末端へ機能的に連結される。
【０２８２】
特定の実施態様において、第一の二量体形成ドメインは、第三の接続ドメインで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ（間にスペーサーを伴う又は伴わずに）機能的に連結される。
【０２８３】
免疫グロブリンのＦｖ領域がＴＣＲ免疫グロブリン−様ドメインと整列される場合、抗体ヒンジＮ末端及びＴＣＲヒンジＮ末端も、整列される。例を下記表７に示し、ここで抗体ヒンジＮ末端（配列番号：２７８又は２７９）は、ＴＣＲベータヒンジＮ末端（配列番号：２８０）と整列される。
【０２８４】
本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体の第三の接続ドメインは、抗体ヒンジＮ末端の適切な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）、及びＴＣＲヒンジＮ末端の適当な長さ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基）を含むように選択することができる。本明細書において使用される用語「ヒンジＮ末端」は、ヒンジ領域のＮ末端断片のほとんどを指す。例えば接続ドメインは、抗体ヒンジＮ末端由来又はＴＣＲヒンジＮ末端由来の配列の全て、又はほとんど、又は一部を有するように選択されてよいか、あるいはＴＣＲヒンジＮ末端由来よりも、より多くの抗体ヒンジＮ末端由来の残基を含むか、又はその逆であってよい。
【０２８５】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第三の接続ドメインは、抗体ヒンジＮ末端の長さ又はＴＣＲヒンジＮ末端の長さと同等の合計の長さを有する。
【０２８６】
同様に、適切な第三の接続ドメインは、構造を基に決定することができる。例えば、抗体及びＴＣＲの三次元構造を重ね、且つ抗体又はＴＣＲヒンジのＮ末端由来の配列の長さ又は特性を決定する場合に、重ねた構造上の抗体ヒンジＮ末端とＴＣＲヒンジＮ末端の重複を決定し、考慮する。
【０２８７】
特定の実施態様において、第三の接続ドメインは、抗体ヒンジＮ末端及びＴＣＲヒンジＮ末端由来の断片の間にスペーサーを含む。抗原結合又はポリペプチド複合体の安定性に悪い影響を及ぼさない限りは、任意の好適な配列又は長さのスペーサー配列を使用することができる。
【０２８８】
抗体ヒンジＮ末端、ＴＣＲヒンジＮ末端、及び第三の接続ドメインの配列の例は、下記表７、８、９及び１０に提供している。
【０２８９】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＢｅｔａを含み、並びに第一の二量体形成ドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃを含む。表７は、抗体ヒンジに融合されたＴＣＲ  ＣＢｅｔａに有用な接続ドメインのデザインの例を示す。抗体ヒンジＮ末端は、ＴＣＲ  ＢｅｔａヒンジＮ末端と整列される。接続ドメインのデザインの例もまた、整列形で提供される（例えば、配列番号：１５２又は１５３参照）。そのような実施態様において、第三の接続ドメインは、配列番号：５３又は５４（これは第三の接続ドメイン及びヒンジＣ末端を含む）に含まれている。
【表９】
2020534034.tif 000011
【０２９０】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＡｌｐｈａ又はＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含み、並びに第一の二量体形成ドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃを含む。表８は、抗体ヒンジに融合されたＴＣＲ  ＣＡｌｐｈａ又はＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａに有用な接続ドメインのデザインの例を示す。抗体ヒンジＮ末端は、ＴＣＲ  Ａｌｐｈａ又はＣＰｒｅ−ＡｌｐｈａヒンジＮ末端と整列される。そのような実施態様において、第三の接続ドメインは、配列番号：１３４、１３５、１４０、又は１４１（これは第三の接続ドメイン及びヒンジＣ末端を含む）に含まれている。
【０２９１】
【表１０】
2020534034.tif 000012
【０２９２】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＧａｍｍａを含み、並びに第一の二量体形成ドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃを含む。表９は、抗体ヒンジに融合されたＴＣＲ  ＣＧａｍｍａに有用な接続ドメインのデザインの例を示す。抗体ヒンジＮ末端は、ＴＣＲ  ＧａｍｍａヒンジＮ末端と整列される。接続ドメインのデザインの例もまた、整列形で提供される（例えば、配列番号：１６５又は１６６参照）。そのような実施態様において、第三の接続ドメインは、配列番号：１２１又は１２２（これは第三の接続ドメイン及びヒンジＣ末端を含む）に含まれている。
【０２９３】
【表１１】
2020534034.tif 000013
【０２９４】
特定の実施態様において、Ｃ１は、操作されたＣＤｅｌｔａを含み、並びに第一の二量体形成ドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃを含む。表１０は、抗体ヒンジに融合されたＴＣＲ  ＣＤｅｌｔａに有用な接続ドメインのデザインの例を示す。抗体ヒンジＮ末端は、ＴＣＲ  ＤｅｌｔａヒンジＮ末端と整列される。接続ドメインのデザインの例もまた、整列形で提供される。そのような実施態様において、第三の接続ドメインは、配列番号：１２７、又は１２８（これは第三の接続ドメイン及びヒンジＣ末端を含む）に含まれている。
【０２９５】
【表１２】
2020534034.tif 000014
【０２９６】
特定の実施態様において、第一の二量体形成ドメインは、操作されたＴＣＲ定常領域のＣ−末端へ機能的に連結され、且つ一緒にキメラ定常領域を形成する。言い換えると、このキメラ定常領域は、操作されたＴＣＲ定常領域と機能的に連結された第一の二量体形成ドメインを含む。
【０２９７】
特定の実施態様において、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来の第一のヒンジ−Ｆｃ領域に結合した操作されたＣＢｅｔａを含む。そのようなキメラ定常領域の配列の例は、表１１、１２、１３及び１４に提供している。
【０２９８】
特定の実施態様において、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来の第一のヒンジに結合された操作されたＣＡｌｐｈａを含む。そのようなキメラ定常領域の配列の例は、表１１、１２、及び１３に提供している。
【０２９９】
特定の実施態様において、キメラ定常領域は、配列番号：１３４、１３５、１４０又は１４１を含むか又はこれである第三の接続ドメインで、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来の第一のヒンジに結合された操作されたＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａを含む。そのようなキメラ定常領域の配列の例は、表１５及び１６に提供している。
【０３００】
特定の実施態様において、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来の第一のヒンジに結合された操作されたＣＧａｍｍａを含む。そのようなキメラ定常領域の配列の例は、表１７、１８に提供している。
【０３０１】
特定の実施態様において、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来の第一のヒンジに結合された操作されたＣＤｅｌｔａを含む。そのようなキメラ定常領域の配列の例は、表１７及び１８に提供している。
【０３０２】
特定の実施態様において、キメラ定常領域は、第一の抗体ＣＨ２ドメイン、及び／又は第一の抗体ＣＨ３ドメインを更に含む。例えば、キメラ定常領域は、第三の接続ドメインのＣ−末端に結合された第一の抗体ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを更に含む。そのようなキメラ定常領域の配列の例は、表１９に提供している。
【０３０３】
特定の実施態様において、第一のキメラ定常領域及び第二のＴＣＲ定常ドメインは、表１９に示したような、配列番号：１７７／１７６、１７９／１７８、１８４／１８３、１８５／１８３、１８０／１７６、１８１／１７８、１８２／１７８、１８４／１８６、１８５／１８６、１８８／１８７、１９６／１８７、１９０／１８９、１９２／１９１、１９２／１９３、１９５／１９４、１９８／１９７、２００／１９９、２０２／２０１、２０３／２０１、２０３／２０４、２０５／２０４、２０６／２０４、２０８／２０７、２０８／２０９、２１１／２１０、２１３／２１２、２１３／１５１、２１４／２１２、２１４／１５１、２３４／２３３、２３２／２３１、２１６／２１５、２１８／２１７、２２０／２１９、２２２／２２１、２２４／２２３、２２６／２２５、２２７／２２３、２２９／２２８、２２９／２３０、２３６／２３５及び２３８／２３７からなる群から選択される配列の対を含む。
【０３０４】
これらのキメラ定常領域及び第二のＴＣＲ定常ドメインの対は、本明細書開示されたポリペプチド複合体を提供するように、これらが、所望の抗体可変領域へ融合するように操作され得る点で有用である。例えば、抗体重鎖可変領域は、キメラ定常領域（Ｃ１を含む）へ融合され、これにより本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第一のポリペプチド鎖とし；並びに、同様に、抗体軽鎖可変領域は、第二のＴＣＲ定常ドメイン（Ｃ２を含む）へ融合され、これにより本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第二のポリペプチド鎖とされる。
【０３０５】
これらのキメラ定常領域及び第二のＴＣＲ定常ドメインの対は、明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体の第一の抗原結合部分を作製するためのプラットフォームとして使用することができる。例えば、第一の抗体の可変領域を、プラットフォーム配列のＮ−末端で融合することができる（例えば、ＶＨをキメラ定常ドメインへ、且つＶＬをＴＣＲ定常ドメインへ、各々融合する）。本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体へ会合するために、第二の抗原結合部分が設計され且つ作製され、二重特異性ポリペプチド複合体を作製することができる。
【０３０６】
特定の実施態様において、第二の二量体形成ドメインは、ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４などの抗体に由来してよい。特定の実施態様において、第二の二量体形成ドメインは、任意に更に、抗体ＣＨ２ドメイン、及び／又は抗体ＣＨ３ドメイン、例えばヒンジ−Ｆｃ領域などを含む。ヒンジ領域は、第二の抗原結合部位（例えばＦａｂ）の抗体重鎖に結合されてよい。
【０３０７】
二重特異性ポリペプチド複合体において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、二量体に会合することが可能である。特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、異なり、且つホモ二量体形成を妨げ及び／又はヘテロ二量体形成を促進する様式で会合する。例えば、第一及び第二の二量体形成ドメインは、同一ではないよう、及びそれらの中にホモ二量体を形成するよりもむしろ互いの間で優先的にヘテロ二量体を形成するように、選択され得る。特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、ノブイントゥホールの形成、疎水性相互作用、静電的相互作用、親水性相互作用、又は増大した可動性を介して、ヘテロ二量体に会合することが可能である。
【０３０８】
特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、各々、ノブイントゥホールの形成が可能であるように変異されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む。ノブは、第一のＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチドにおいて、小型のアミノ酸残基の、より大きい残基との置き換えにより得ることができ、且つホールは、大型の残基のより小さい残基との置き換えにより得ることができる。ノブのホールへの変異部位の詳細については、前掲のRidgwayら(1996)、Spiessら(2015)及びBrinkmannら(2017)の論文を参照されたい。
【０３０９】
特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、Ｓ１３９Ｃ及びＴ１５１Ｗ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプの第一のＣＨ３ドメイン（配列番号：２９５、ノブ）、並びにＹ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ及びＹ１９２Ｖ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプの第二のＣＨ３ドメイン（配列番号：２９６、ホール）を含む。別の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、Ｓ１３６Ｃ及びＴ１４８Ｗ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプの第一のＣＨ３ドメイン（配列番号：２９８、ノブ）、並びにＹ１３１Ｃ、Ｔ１４８Ｓ、Ｌ１５０Ａ及びＹ１８９Ｖ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプの第二のＣＨ３ドメイン（配列番号：２９９、ホール）を含む。野生型Ｆｃ  ＩｇＧ１（配列番号：２９４）及びＦｃ  ＩｇＧ４（配列番号：２９７）の配列及び番号付けは、図２０Ａ−２０Ｄに示している。先に注記したように、ＸｎＹは、Ｆｃ領域（例えばＦｃ領域のＣＨ３ドメイン）に言及する場合、アミノ酸残基の番号付けは、図２０Ａ−２０Ｄに示した番号付けを基にしている。
【０３１０】
特定の実施態様において、第一及び第二の二量体形成ドメインは、第一のヒンジ領域及び第二のヒンジ領域を更に含む。例えば、置換の電荷対は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２のヒンジ領域へ導入され、ヘテロ二量体形成を促進することができる。詳細は、前掲のBrinkmannらの論文(2017)を参照されたい。
【０３１１】
二重特異性フォーマット
【０３１２】
本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、当該技術分野において公知のいずれか好適な二重特異性フォーマットであることができる。特定の実施態様において、二重特異性ポリペプチド複合体は、参照二重特異性の抗体フォーマットを基にしている。二重特異性フォーマットに関して本明細書において使用される「基にしている」とは、一つの抗原結合部分が、Ｃ１に機能的に連結されるＶＨ及びＣ２へ機能的に連結されるＶＬを含むように修飾され、ここでＣ１及びＣ２は、先に規定したように、少なくとも１つ非天然型鎖間結合により会合されていること以外は、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体が、参照二重特異性抗体と同じ二重特異性フォーマットをとることを意味する。当該技術分野において公知の参照二重特異性抗体フォーマットの例は、（ｉ）対称性のＦｃを持つ二重特異性抗体、（ｉｉ）非対称性のＦｃを持つ二重特異性抗体、（ｉｉｉ）追加の抗原結合部分が付け加えられた通常の抗体、（ｉｖ）二重特異性抗体断片、（ｖ）追加の抗原結合部分が付け加えられた通常の抗体断片、（ｖｉ）ヒトアルブミン又はヒトアルブミン−結合ペプチドが付け加えられた二重特異性抗体を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３１３】
ＢｓＩｇＧは、各抗原について一価であり、且つ単独の宿主細胞における２本の軽鎖及び２本の重鎖の同時−発現により作製することができる。付け加えのＩｇＧは、操作され、軽鎖又は重鎖のいずれかのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに、追加の抗原結合ユニットを付け加えることにより、二重特異性ＩｇＧを形成する。追加の抗原−結合ユニットは、ＤＶＤ−Ｉｇなどの単一ドメイン抗体（対形成しないＶＬ又はＶＨ）、対形成した抗体可変ドメイン（例えば、Ｆｖ又はｓｃＦｖ）又は操作されたタンパク質スカフォールドであることができる。ＢｓＩｇＧ中のいずれかの抗原−結合ユニット、特に対形成したＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬは、本明細書に開示されたようにＣＨ１をＣ１へ及びＣＬをＣ２へ置き換えるように修飾し、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体とすることができる。
【０３１４】
二重特異性抗体断片は、抗体に由来するが、抗体定常ドメインの一部又は全てを欠いている抗原−結合断片である。そのような二重特異性抗体断片の例は、例えば、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びダイアボディなどを含む。本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体とするために、二重特異性抗体断片中の抗原−結合部位（例えば特に対形成したＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬ）は、本明細書に開示されたポリペプチド複合体（例えば、ＶＨ−Ｃ１／ＣＬ−Ｃ２）を含むように修飾することができる。
【０３１５】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、全ＩｇＧ又はＩｇＧ−様分子などの「全」抗体のフォーマット、並びにタンデム単鎖可変領域分子（ｔａＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）及びこれらの様々な他の誘導体などの小型の組換えフォーマットを基にしている(Byrne H.ら、(2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632により説明されたような二重特異性抗体フォーマットと比較）。二重特異性抗体の例は、クアドローマ、化学的にカップリングされたＦａｂ（抗原結合断片）、及びＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）を含むが、これらに限定されるものではないフォーマットを基にしている。
【０３１６】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、以下から選択された二重特異性のフォーマットを基にしている：トリオマブ；ハイブリッドハイブリドーマ(クアドローマ)；多重特異性アンチカリンプラットフォーム(Pieris)；ダイアボディ；単鎖ダイアボディ；タンデム単鎖Ｆｖ断片；TandAb、三重特異性Ａｂ(Affimed)；Darts(デュアル親和性再標的化；Macrogenics)；二重特異性Xmab(Xencor)；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(Bite；Amgen；55kDa)；Triplebodies；トリボディ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）融合タンパク質(CreativeBiolabs)多機能性組換え抗体誘導体；デュオボディプラットフォーム(Genmab)；ドックアンドロックプラットフォーム；ノブイントゥホール(KIH)プラットフォーム；ヒト化二重特異性IgG抗体(REGN1979)(Regeneron)；Ｍａｂ２二重特異性抗体(F-Star)；ＤＶＤ−Ｉｇ（デュアル可変ドメイン免疫グロブリン)(Abbvie)；カッパ−ラムダボディ；TBTI(四価二重特異性タンデムIg)；並びに、CrossMab。
【０３１７】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、CrossMab；DAF(ツーインワン)；DAF(フォーインワン)；DutaMab；ＤＴ−ＩｇＧ；ノブイントゥホール共通LC；ノブイントゥホール集成体；荷電対；Ｆａｂ−アーム交換；SEEDbody；トリオマブ；LUZ-Y；Ｆｃａｂ；カッパ-ラムダ−ボディ；及び直交性Ｆａｂを含む、二重特異性ＩｇＧ−様抗体(BsIgG)から選択された二重特異性フォーマットを基にしている。二重特異性抗体フォーマットの詳細な説明については、Spiess C.、Zhai Q.及びCarter P. J.の(2015) Molecular Immunology 67: 95-106を参照し、この論文はその全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【０３１８】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ＤＶＤ−ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ；ｓｃＦＶ−（Ｌ）ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ；ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ；Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ；Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ；ＫＩＨ  ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ；２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ；ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ４−Ｉｇ；ｓｃＦｖ４−Ｉｇ；Ｚｙｂｏｄｙ；及び、ＤＶＩ−ＩｇＧ（フォーインワン）を含む、追加の抗原結合部分を持つ、ＩｇＧが付け加えられた抗体から選択される、二重特異性フォーマットを基にしている（同文献参照)。
【０３１９】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ナノボディ；ナノボディ−ＨＡＳ；ＢｉＴＥ；ディアボディ；ＤＡＲＴ；ＴａｎｄＡｂ；ｓｃディアボディ；ｓｃ−ディアボディ−ＣＨ３；ディアボディ−ＣＨ３；トリプルボディ；ミニ抗体；ミニボディ；ＴｒｉＢｉミニボディ；ｓｃＦｖ−ＣＨ３  ＫＩＨ；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２；ｓｃＦｖ−ＫＩＨ；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ；四価ＨＣＡｂ；ｓｃディアボディ−Ｆｃ；ディアボディ−Ｆｃ；タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ；及び、イントラボディを含む、二重特異性抗体断片から選択されたフォーマットを基にしている（同文献参照）。
【０３２０】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ドック及びロック；ImmTAC；HSAbody；ｓｃディアボディ−ＨＡＳ；及び、タンデムｓｃＦｖ−毒素などの二重特異性フォーマットを基にしている（同文献参照）。
【０３２１】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ＩｇＧ−ＩｇＧ；Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ；及び、ｓｃＦｖ１−ＰＥＧ−ｓｃＦｖ２を含む、二重特異性抗体コンジュゲートから選択されたフォーマットを基にしている（同文献参照）。
【０３２２】
特定の実施態様において、第一の抗原結合部分及び第二の結合部分は、Ｉｇ−様構造に会合することができる。Ｉｇ−様構造は、抗原結合のための２本のアーム並びに会合及び安定化のための１本のステムを持つ、Ｙ字型の構築体を有する天然抗体のようである。天然抗体との類似性は、良好なインビボにおける薬物動態、所望の免疫学的反応、及び安定性などの、様々な利点を提供し得る。本明細書に提供される第二の抗原結合部分に会合された本明細書に提供される第一の抗原結合部分を含むＩｇ−様構造は、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）のそれと同程度の熱安定性を有することはわかっている。特定の実施態様において、本明細書に提供されるＩｇ−様構造は、天然ＩｇＧの少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％である。
【０３２３】
特定の実施態様において、二重特異性ポリペプチド複合体は、ｉ）ＶＨ１−Ｃ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；ｉｉ）ＶＬ１−Ｃ２；ｉｉｉ）ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、及びｉｖ）ＶＬ２−ＣＬの４つのポリペプチド鎖を有し、ここでＣ１及びＣ２は、少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ２つのヒンジ領域及び／又は２つのＣＨ３ドメインは、二量体形成を促進することができる１以上の鎖間結合を形成することが可能である。
【０３２４】
二重特異性複合体の抗原特異性
【０３２５】
本明細書に提供される二重特異性複合体は、２種の抗原特異性を有する。第一及び第二の抗原結合部分は、各々、第一及び第二の抗原特異性に向けられる。
【０３２６】
第一及び第二の抗原特異性は、同一であってよく、言い換えると第一及び第二の抗原結合部分は、同じ抗原分子、又は同じ抗原分子の同じエピトープへ結合してよい。
【０３２７】
あるいは、第一及び第二の抗原特異性は、異なってよい。例えば、第一及び第二の抗原−結合部分は、異なる抗原に結合することができる。そのような二重特異性ポリペプチド複合体は、例えば、２つの異なる抗原を密に近接させ、これによりそれらの相互作用を促進する（例えば、免疫学的細胞を、腫瘍抗原又は病原体抗原に密に近接させ、これにより免疫系によるそのような抗原の認識又は除去を促進する）ことにおいて有用である。別の例は、第一及び第二の抗原−結合部分は、１つの抗原の異なる（及び任意に重複しない）エピトープに結合することができる。これは、標的抗原、特に変異を受けやすい抗原（例えばウイルス抗原）の認識を増強するか又はこれに結合することにおいて有用である。
【０３２８】
一部の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性複合体の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異性受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異性受容体分子に向けられる。一部の実施態様において、第一及び第二の抗原結合部分の一方は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５又はＣＤ９５へ特異的に結合することが可能であり、且つ他方は、腫瘍関連抗原へ特異的に結合することが可能である。
【０３２９】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性複合体の抗原特異性の一つは、ＣＤ３に向けられる。特定の実施態様において、二重特異性複合体の第一の抗原結合部分は、ＣＤ３へ特異的に結合することが可能である。特定の実施態様において、二重特異性複合体の第二の抗原結合部分は、ＣＤ３へ特異的に結合することが可能である。
【０３３０】
特定の実施態様において、二重特異性複合体の抗原結合部分は、両方共抗−ＣＤ３抗体に由来したＶＨ１及びＶＬ１を含む。特定の実施態様において、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、配列番号：２／１、３／４／、５／１、６／３、７／３、９／８、１０／８、９／１１、１０／１１、１３／１２、１５／１４、１７／１６、１７／１８、２０／１９、２１／１２、２８／３、２９／３、３０／１２、３１／１２、６５／６４、６７／６６、６９／６８、７０／６８、７０／７１、７２／７１、７３／７１、７５／７４、７５／７６、７８／７７、８６／８５、９０／８９、９１／９２／、９４／９３、９６／９５、９８／９７、９９／９５、１０１／１００、１０１／１０２、１０６／１０５、１０８／１０７、１１０／１０９、１１２／１１１、１３７／１３６、１３８／１３６、１３７／１３９及び１３８／１３９からなる群から選択される配列の対を含み、ここで表２０に示したように、抗−ＣＤ３抗体の可変領域（Ｔ３）が、ＴＣＲ定常領域へ融合されている、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体が本明細書に提供される。
【０３３１】
一部の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性複合体の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異性受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異性受容体分子へ向けられ、他方の抗原特異性は、腫瘍関連表面抗原へ向けられる。特定の実施態様において、二重特異性複合体の第一の抗原結合部分は、Ｔ細胞特異性受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異性受容体分子（ＣＤ３など）へ特異的に結合することが可能であり、並びに第二の抗原結合部分は、腫瘍関連抗原（ＣＤ１９など）へ特異的に結合することが可能であり、又はその逆もあてはまる。
【０３３２】
特定の実施態様において、二重特異性ポリペプチド複合体は、実施例８及び表２０に示したような、配列番号：２２／１２／２４／２３（Ｅ１７、ＩｇＧ１）、２５／１２／２６／２３（Ｅ１７、ＩｇＧ４）、及び２５／１２／２７／２３（Ｆ１６）からなる群から選択される４−配列組合せを含み、ここで第一の抗原結合部分はＣＤ３へ結合し、第二の抗原結合部分はＣＤ１９へ結合する。Ｅ１７のデザインは、二重特異性の二価抗体であり、並びにＦ１６のデザインは、抗−ＣＤ１９抗体Ｆａｂの２つの反復配列を持つ二重特異性で三価の抗原−結合複合体である。
【０３３３】
特定の実施態様において、二重特異性ポリペプチド複合体は、ＣＴＬＡ−４に結合する第一の抗原結合部分、及びＰＤ−１に結合する第二の抗原結合部分を含み、又はその逆もあてはまる。
【０３３４】
特定の実施態様において、二重特異性ポリペプチド複合体は、以下を含む、４つのポリペプチド鎖を含む：ｉ）第一のキメラ定常領域に機能的に連結されたＶＨ１；ｉｉ）第二のキメラ定常領域に機能的に連結されたＶＬ１；ｉｉｉ）通常の抗体重鎖定常領域に機能的に連結されたＶＨ２、及びｉｖ）通常の抗体軽鎖定常領域に機能的に連結されたＶＬ２。特定の実施態様において、第一のキメラ定常領域は、各々先に規定したようにＣ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むことができる。特定の実施態様において、第二のキメラ定常領域は、先に規定したようにＣ２を含むことができる。特定の実施態様において、通常の抗体重鎖定常領域は、各々先に規定したようにＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むことができる。特定の実施態様において、通常の抗体軽鎖定常領域は、先に規定したようにＣＬを含むことができる。
【０３３５】
以下の構築体の名称を、本開示においては互換的に使用する：Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱとＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ；Ｆ１６−Ｄｅｓｉｇｎ−２−ＱＱＱＱとＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ；Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５．ＩｇＧ４とＷ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ；及び、Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ．ＩｇＧ４とＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ。
【０３３６】
調製方法
【０３３７】
本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、及び二重特異性ポリペプチド複合体をコードしている単離された核酸又はポリヌクレオチドを提供する。
【０３３８】
本明細書において使用される用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖型又は二本鎖型のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限りは、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し且つ天然に生じるヌクレオチドに類似した様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含むポリヌクレオチドを包含している。別に指定しない限りは、特定のポリヌクレオチド配列はまた、それらの保存的に修飾された変種（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰｓ、及び相補配列、並びに明確に指定された配列を暗示的に包含している。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（又は全ての）コドンの第三の位置が、混合された(mixed)−塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換されているような配列を作製することにより、達成され得る(Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及び、Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)参照)。
【０３３９】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体をコードしている核酸又はポリヌクレオチドは、組換え技術を用いて、構築され得る。この目的のために、親抗体の抗原結合部分（ＣＤＲ又は可変領域など）をコードしているＤＮＡは通常の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）を用い、単離され、且つ配列決定される。同様に、ＴＣＲ定常領域をコードしているＤＮＡもまた得ることができる。例として、可変ドメイン（ＶＨ）をコードしているポリヌクレオチド配列及び第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）をコードしているポリヌクレオチド配列を入手し、且つ宿主細胞における転写及び発現ができるように機能的に連結され、第一のポリペプチドを作製する。同様に、宿主細胞おける第二のポリペプチドの発現ができるように、ＶＬをコードしているポリヌクレオチド配列は、Ｃ１をコードしているポリヌクレオチド配列へ機能的に連結される。必要ならば、１以上のスペーサーに関するコード化ポリヌクレオチド配列もまた、他のコード配列に機能的に連結され、所望の生成物の発現ができる。
【０３４０】
コード化ポリヌクレオチド配列は更に、任意に発現ベクター中で、１以上の調節配列へ機能的に連結され、第一及び第二のポリペプチドの発現又は生成は、実行可能であり且つ適切な制御下にあることができる。
【０３４１】
コード化ポリヌクレオチド配列（複数）は、当該技術分野において公知の組換え技術を用い、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、ベクターへ挿入することができる。別の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体は、当該技術分野において公知の相同組換えにより作製されてよい。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分は一般に、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）、並びに転写終結配列の１以上を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３４２】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現をもたらすように、機能的に挿入されているビヒクルを指す。典型的には、この構築体はまた、適切な調節配列も含む。例えば、ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞における所望の転写体／遺伝子の発現を可能にする様式で、コード配列へ機能的に連結された、ガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列及び／又は位置指定されたポリペプチド修飾をコードしているヌクレオチド配列の５’−フランキング領域に位置した、調節配列を含むことができる。ベクターは、宿主細胞内に保有される遺伝子エレメントの発現をもたらすように、宿主細胞を形質転換、形質導入、又は形質移入するために使用されてよい。ベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１−由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、並びに動物ウイルスを含む。ベクターとして使用される動物ウイルスの種類は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）がある。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御するための様々なエレメントを含んでよい。加えて、ベクターは、複製起点を含んでよい。ベクターはまた、非限定的にウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質コーティングを含む、細胞へのその侵入を補助する物質を含んでよい。
【０３４３】
一部の実施態様において、ベクター系は、哺乳動物、細菌、酵母などの系統を含み、非限定的に、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２などのプラスミド、並びに他の研究室で及び商業的に入手可能なベクターを含む。好適なベクターは、プラスミド、又はウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなど）を含んでよい。
【０３４４】
本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列（複数）を含むベクターは、クローニング又は遺伝子発現のために、宿主細胞へ導入することができる。本明細書において使用される語句「宿主細胞」は、それに外来性ポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入される細胞を指す。
【０３４５】
本明細書におけるベクター内のＤＮＡのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、先に説明したような、原核細胞、酵母、又はより高等な真核細胞である。この目的に適した原核細胞は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌などの真正細菌、例えば、大腸菌などのエシェリキア属、エンテロバクター属、エルウィニア属などの腸内細菌科、クレブシエラ属、プロテウス属、例えばサルモネラ・ティフィムリウスなどのサルモネラ属、例えばセラチア・マルセッセンスなどのセラチア属、及びシゲラ属、並びにＢ．ズブチリス及びＢ．リケニホルミスなどのバチルス属、Ｐ．アエルギノーサなどのシュードモナス属、及びストレプトマイセス属などを含む。
【０３４６】
原核生物に加え、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、ポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体をコードしているベクターのクローニング又は発現の宿主に適している。サッカロミセス・セレビシアエ、又は通常のパン酵母は、より下等な真核宿主微生物の中でも最も一般的に使用される。しかし、以下の数多くの他の属、種及び株が一般に入手可能であり、且つここで有用である：シゾサッカロミセス・ポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクチス、Ｋ．フラギリス(ATCC 12,424)、Ｋ．ブルガリカス(ATCC 16,045)、Ｋ．ウィケラミ(wickeramii)(ATCC 24,178)、Ｋ．ワルチ(waltii)(ATCC 56,500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC 36,906)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアヌス；ヤロウイア属(EP 402,226)；ピキア・パストリス(EP 183,070)；カンジダ属；トリコデルマ・レーシア(EP 244,234)；アカパンカビ(Neurospora crassa)；シュワニオミセス属、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリスなど；並びに、糸状菌、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、並びにアスペルギルス属宿主、Ａ．ニジュランス及びＡ．ニジェールなど。
【０３４７】
本明細書に提供されるグリコシル化されたポリペプチド複合体、二重特異性ポリペプチド複合体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。宿主由来の数多くのバキュロウイルス株及び変種並びに対応する許容状態の昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（ケムシ）、アエデス・アエジプチ（蚊）、アエデス・アルボピクツス（蚊）、ドロソフィラ・メラノガステル（ミバエ）、及びボンミクス・モリが、同定されている。形質移入のための様々なウイルス株は、公に入手可能であり、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶのＬ−１変種及びボンミクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株があり、並びにそのようなウイルスは、本発明に従い本明細書におけるウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のためのウイルスとして使用される。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。
【０３４８】
しかし、最も興味深いのは、脊椎動物細胞であり、且つ培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、慣習的手順となりつつある。有用な哺乳動物の宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ATCC CRL 1651)；ヒト胎児腎株(懸濁培養における成長のためにサブクローニングした２９３又は２９３細胞、Grahamら、J. Gen Virol. 36:59 (1977))、例えばＥｘｐｉ２９３など；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather、Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎細胞（ＣＶ１、ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL 2)；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34)；Ｂｕｆｆａｌｏ系ラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、HB 8065)；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ATCC CCL51)；ＴＲＩ細胞(Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及び、ヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【０３４９】
前述の発現ベクター又はクローニングベクターにより形質転換される宿主細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又はクローニングベクターの増幅のために適切に改変された通常の栄養培地において培養され得る。
【０３５０】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体の作製のために、発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、様々な培地内で培養されてよい。ハムＦ１０(Sigma)、最少必須培地（ＭＥＭ）(Sigma)、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Sigma)などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。加えて、Hamら、Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnesら、Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；又は、第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；又はU.S. Pat. Re. 30,985に記載された培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用してよい。これらの任意の培地は、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮細胞増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と規定される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充してよい。任意の他の必要な補給物もまた、当業者に公知である適当な濃度で含んでよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞でこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０３５１】
一つの態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体を発現する方法を提供し、これは本明細書に提供される宿主細胞を、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体が発現される条件下で培養することを含む。
【０３５２】
特定の実施態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体を作製する方法を提供し、これは、ａ）宿主細胞へ：Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、及びＮ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドを導入する工程であって：ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、Ｃ１及びＣ２の二量体を安定化することが可能であり、並びに第一の抗体は、第一の抗原特異性を有する工程；ｂ）宿主細胞にポリペプチド複合体を発現させる工程：を含む。
【０３５３】
特定の実施態様において、本開示は、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を作製する方法を提供し、これは、ａ）宿主細胞へ：Ｎ−末端からＣ−末端へ、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）機能的に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードしている第一のポリヌクレオチド、Ｎ−末端からＣ−末端へ、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）へ機能的に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチド、並びに第二の抗原結合部分をコードしている１以上の追加のポリヌクレオチドを導入する工程であって：ここで、Ｃ１及びＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異された残基とＣ２に含まれる第二の変異された残基の間に少なくとも１つの非天然型鎖間結合を含む二量体を形成することが可能であり、且つ非天然型鎖間結合は、Ｃ１及びＣ２の二量体を安定化することが可能であり、第一の抗原結合部分及び第二の抗原結合部分は、第一の抗原結合部分が天然Ｆａｂ対応物である場合の別のものよりも、減少された誤対形成を有し、並びに第一の抗体は、第一の抗原特異性を有し、且つ第二の抗体は、第二の抗原特異性を有する工程；ｂ）宿主細胞に二重特異性ポリペプチド複合体を発現させる工程：を含む。
【０３５４】
特定の実施態様において、本方法は更に、ポリペプチド複合体を単離することを含む。
【０３５５】
組換え技術を使用する場合、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞内、細胞膜周辺腔内で生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。生成物が細胞内で生成される場合、第一の工程として、宿主細胞又は溶解した断片のいずれかの微粒子デブリを、例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。Carterら、Bio/Technology 10:163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔へ分泌される抗体を単離する手順を説明している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間かけて解凍する。細胞デブリは、遠心分離により除去することができる。生成物が培地へ分泌される場合、そのような発現系由来の上清を、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用い、最初に濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、PMSFなどのプロテアーゼインヒビターを、前述の工程のいずれかにおいて含んでよく、且つ抗生物質を、偶発的な夾雑物の成長を防ぐために含んでよい。
【０３５６】
細胞から調製された本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、及び親和性クロマトグラフィーなどを用い精製することができ、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
【０３５７】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体が、免疫グロブリンＦｃドメインを含む場合、ポリペプチド複合体に存在するＦｃドメインの種類及びアイソタイプに応じて、プロテインＡを、親和性リガンドとして使用することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖を基にしたポリペプチド複合体の精製に使用することができる(Lindmarkら、J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される(Gussら、EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。それに親和性リガンドが結合されたマトリクスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。制御された多孔質ガラス(CPG)又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの、機械的に安定したマトリクスは、アガロースにより達成され得るものよりも、より速い流量及びより短い処理時間が可能である。
【０３５８】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX樹脂(J. T. Baker、Phillipsburg、N.J.)が、精製に有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、SEPHAROSE（商標）、陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラムなど)、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製の他の技術も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。
【０３５９】
任意の予備精製工程（複数）に続けて、関心対象のポリペプチド複合体及び夾雑物を含有する混合物を、好ましくは低い塩濃度で実行される（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用し、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供する。
【０３６０】
特定の実施態様において、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、通常の方法を用いて、高い収率で容易に精製することができる。二重特異性ポリペプチド複合体の利点の一つは、重鎖と軽鎖の可変ドメイン配列の間の誤対形成の著しい減少である。これは、望ましくない副産物の生成を減少し、且つ比較的簡単な精製プロセスを用い、高い収率で高純度の生成物を得ることを可能にする。
【０３６１】
誘導体
【０３６２】
特定の実施態様において、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、所望のコンジュゲートとのコンジュゲートの基本として使用することができる。
【０３６３】
様々なコンジュゲートは、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体に連結されることが企図される(例えば、「コンジュゲートワクチン(Conjugate Vaccines)」、Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse及びR. E. Lewis, Jr.(編集)、Carger Press, New York, (1989)参照)。これらのコンジュゲートは、他の方法の中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、配合(blending)、又は付加により、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体に連結されてよい。
【０３６４】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、１以上のコンジュゲートに結合するために利用されるエピトープ結合部分の外側に特異部位を含むように、操作されてよい。例えば、そのような部位は、コンジュゲートへの共有的連結を促進するために、例えば、システイン残基又はヒスチジン残基などの１以上の反応性アミノ酸残基を含んでよい。 
【０３６５】
特定の実施態様において、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、コンジュゲートへ、間接的に、又は例えば別のコンジュゲートを通じてもしくはリンカーを通じて間接に、連結されてよい。
【０３６６】
例えば、システインなどの反応性残基を有するポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、その中の反応基が、例えばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィドなどのチオール−反応性物質、又は他のチオール−反応性コンジュゲーションパートナーへ連結されてよい(Haugland、2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley、1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman、1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means、(1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Hermanson, G.、Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671)。
【０３６７】
別の例に関して、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、ビオチンにコンジュゲートされ、次にアビジンにコンジュゲートされている第二のコンジュゲートへ間接的にコンジュゲートされる。更に別の例に関して、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、コンジュゲートへ更に連結するリンカーに連結されてよい。リンカーの例は、二官能性カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスヘレート(suherate)など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びｈｉｓ−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）がある。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド連結を提供する、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）(Carlssonら、Biochem. J. 173:723-737 (1978))、及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）である。
【０３６８】
このコンジュゲートは、検出可能なラベル、薬物動態修飾部分、精製部分、又は細胞傷害性部分であってよい。検出可能なラベルの例は、蛍光ラベル（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、又はテキサスレッド）、酵素−基質ラベル（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ(luceriferases)、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、放射性同位体（例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、及び３２Ｐ、他のランタノイド、ルミネセンスラベル）、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、検出のためのＤＮＡ分子又は金を含んでよい。特定の実施態様において、コンジュゲートは、抗体の半減期の延長を助けるＰＥＧなどの、薬物動態修飾部分であることができる。他の好適なポリマーは、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどを含む。特定の実施態様において、コンジュゲートは、磁気ビーズなどの、精製部分であることができる。「細胞傷害性部分」は、細胞に有害であるか、又は細胞を損傷もしくは死滅する任意の物質であることができる。細胞傷害性部分の例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン及びそれらのアナログ、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに有糸分裂阻害薬（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３６９】
コンジュゲートを抗体、免疫グロブリン又はそれらの断片などのタンパク質へコンジュゲーションする方法は、例えば、米国特許第5,208,020号；第6,441,163号；WO2005037992；WO2005081711；及び、WO2006/034488に認めることができ、これらの全体は引用により本明細書中に組み込まれている。
【０３７０】
医薬組成物
【０３７１】
本開示はまた、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体、及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物も提供する。
【０３７２】
用語「医薬として許容し得る」は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数）、及び／又は塩が、一般に製剤を構成するその他の成分と化学的及び／又は物理的に適合可能であり、且つレシピエントと生理学的に適合可能であることを指摘する。
【０３７３】
「医薬として許容し得る担体」は、許容し得る生体活性があり且つ対象に対し無毒である、活性成分以外の製剤処方中の成分を指す。本明細書において開示された医薬組成物中で使用するための医薬として許容し得る担体は、例えば、医薬として許容し得る液体、ゲル、又は固形担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、緩衝液、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁化剤／分散剤、金属イオン封鎖剤又はキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は無毒の補助物質、当該技術分野において公知の他の成分、又はそれらの様々な組合せを含んでよい。
【０３７４】
好適な成分は、例えば、抗酸化剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、滑沢剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、又は糖及びシクロデキストリンなどの安定剤を含んでよい。好適な抗酸化剤は、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化されたヒドロキシアニソール、ブチル化されたヒドロキシトルエン、及び／又は没食子酸プロピルを含んでよい。本明細書に開示したように、本明細書に提供される医薬組成物中のメチオニンなどの１以上の抗酸化剤の包含は、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体の酸化を減少する。この酸化の減少は、結合親和性の喪失を防止又は減少し、これによりタンパク質安定性を向上し、且つ半減期を最大化する。従って、特定の実施態様において、本明細書開示のポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体並びにメチオニンなどの１以上の抗酸化剤を含有する組成物が提供される。
【０３７５】
更なる例証のために、医薬として許容し得る担体は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張ブドウ糖注射液、滅菌水注射液、又はブドウ糖加乳酸リンゲル注射液などの水性ビヒクル、植物起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、又はピーナッツ油などの非水性ビヒクル、静菌又は静真菌濃度の抗菌剤、塩化ナトリウム又はブドウ糖などの等張化剤、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液などの緩衝液、硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はポリビニルピロリドンなどの懸濁化剤及び分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの金属イオン封鎖剤又はキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、又は乳酸を含んでよい。担体として利用される抗菌剤は、フェノール又はクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む反復投与用容器内で、医薬組成物へ添加されてよい。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、又はエタノールを含んでよい。好適な無毒の補助物質は、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解増強剤、又は酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアート、もしくはシクロデキストリンなどの物質を含んでよい。
【０３７６】
本医薬組成物は、溶液の液剤、懸濁剤、乳剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤、又は散剤であることができる。経口製剤は、医薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。
【０３７７】
特定の実施態様において、本医薬組成物は、注射用組成物へ製剤化される。注射用医薬組成物は、通常の形状、例えば、溶液の液剤、懸濁剤、乳剤など、あるいは溶液の液剤、懸濁剤又は乳剤を作製するのに適している固形形状で調製されてよい。注射用の調製品は、そのまま注射できる無菌及び／又は非発熱性の溶液、皮下注射用錠剤を含む、使用直前に溶媒とそのまま一緒にされる凍結乾燥した散剤など無菌の乾燥可溶性製品、そのまま注射できる無菌の懸濁液、使用直前にビヒクルとそのまま一緒にされる無菌の乾燥不溶性製品、並びに無菌及び／又は非発熱性の乳剤を含んでよい。これらの溶液は、水性又は非水性のいずれかであってよい。
【０３７８】
特定の実施態様において、単位投与量の非経口調製品は、アンプル、バイアル又は有針注射器に包装される。非経口的投与のための全ての調製品は、当該技術分野において公知で実践されるように、無菌であり非発熱性でなければならない。
【０３７９】
特定の実施態様において、無菌の凍結乾燥した散剤が、好適な溶媒中に本明細書に開示されたポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体を溶解することにより、調製される。溶媒は、安定性を向上する賦形剤又は散剤もしくは散剤から調製された再構成溶液の他の薬理学的成分を含んでよい。使用される賦形剤は、水、ブドウ糖、ソルビタール、フルクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、ショ糖又は他の好適な物質を含むが、これらに限定されるものではない。溶媒は、一実施態様において、ほぼ中性のｐＨの、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはカリウムなどの緩衝液、又は他の当業者に公知のそのような緩衝液を含んでよい。この溶液の後続の滅菌濾過、それに続く当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥は、所望の製剤を提供する。一実施態様において、生じる溶液は、凍結乾燥のためのバイアルへ分配される。各バイアルは、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、二重特異性ポリペプチド複合体又はそれらの組成物の単回用量又は反復用量を含むことができる。１回投与量又は投与量のセットに必要とされる量を少し上回って過充填しているバイアル（例えば約１０％）は、正確な試料の採取及び正確な投薬を促進するために、許容される。凍結乾燥された散剤は、約４℃〜室温など、適切な条件下で貯蔵することができる。
【０３８０】
凍結乾燥した散剤の注射用水による再構成は、非経口的投与に使用するための製剤を提供する。一実施態様において、再構成のために、無菌及び／又は非発熱性の水又は他の液体の好適な担体が、凍結乾燥された散剤へ添加される。正確な量は、行われる選択された療法によって決まり、経験的に決定することができる。
【０３８１】
治療方法
【０３８２】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与し、これにより状態又は障害を治療又は予防することを含む、治療方法もまた提供される。特定の実施態様において、対象は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体に恐らく反応する障害又は状態を有するとして確定されている。
【０３８３】
本明細書において使用される状態を「治療する」又は「治療」は、状態を予防又は緩和、状態の発生又は発達速度を遅延、状態の発達リスクを減少、状態に関連した症状の発達を予防又は遅延、状態に関連した症状を軽減又は終結、状態の完全な又は部分的な退行を発生、状態を治癒すること、又はそれらのいくつかの組合せを含む。
【０３８４】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体及び二重特異性ポリペプチド複合体の治療的有効量は、例えば、体重、年齢、病歴、現在の服薬、対象の健康状態、並びに交差−反応、アレルギー、過敏及び有害副作用の可能性、更には、投与経路及び疾患発達の程度など、当該技術分野において公知の様々な要因によって決まるであろう。用量は、これら及び他の状況又は必要要件により指摘されるように、当業者（例えば、医師又は獣医師）により、比例して増減されてよい。
【０３８５】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、又は約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療的有効量で投与されてよい。特定のこれらの実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与され、並びに特定のこれらの実施態様において、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施態様において、投与量は、治療過程にわたり変化してよい。例えば、特定の実施態様において、初回投与量は、その後の投与量よりも多いことがある。特定の実施態様において、投与量は、対象の反応に応じて治療過程にわたり変動してよい。
【０３８６】
投薬計画は、最適な所望の反応（例えば治療的反応）を提供するように調節されてよい。例えば、単回投与量が投与されるか、又は数回の分割量が時間をかけて投与されてよい。
【０３８７】
本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、例えば、非経口経路（例えば、皮下、腹腔内、静脈内点滴を含む静脈内、筋肉内、又は皮内注射）又は非経口でない(non-parenteral)経路（例えば、経口、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸内、又は局所）など、当該技術分野において公知の任意の経路で投与されてよい。
【０３８８】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体により治療される状態又は障害は、癌又は癌性状態、自己免疫疾患、感染症及び寄生虫症、心臓血管疾患、神経障害、神経精神医学的状態、外傷、炎症、又は凝固障害である。
【０３８９】
本明細書において使用される「癌」又は「癌性状態」は、新生物形成性又は悪性の細胞の成長、増殖、又は転移により媒介される任意の医学的状態を指し、固形癌及び白血病などの非固形癌の両方を含む。本明細書において使用される「腫瘍」は、新生物形成性及び／又は悪性の細胞の固形塊を指す。
【０３９０】
癌に関して、「治療する」又は「治療」は、新生物形成性又は悪性の細胞の成長、増殖、又は転移の阻害もしくは緩慢化、新生物形成性又は悪性の細胞の成長、増殖、又は転移の発達の予防又は遅延、又はいくつかのそれらの組合せを指す。腫瘍に関して、「治療する」又は「治療」は、全て又は一部の腫瘍を根絶、腫瘍の成長及び転移を阻害又は緩慢化、腫瘍の発達を予防又は遅延すること、又はそれらのいくつかの組合せを含む。
【０３９１】
例えば、癌を治療するための本明細書開示のポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体の使用に関して、治療的有効量は、全て又は一部の腫瘍を根絶、腫瘍の成長を阻害又は緩慢化、癌性状態を媒介する細胞の成長又は増殖を阻害、腫瘍細胞転移を阻害、腫瘍又は癌性の状態に関連した任意の症状又はマーカーを改善、腫瘍又は癌性状態の発達を予防又は延期すること、又はそれらのいくつかの組合せが可能であるポリペプチド複合体の用量又は濃度である。
【０３９２】
特定の実施態様において、状態及び障害は、腫瘍及び癌、例えば、非−小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、中皮腫、メラノーマ、頭頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、胸腺癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉腫、メルケル細胞癌など、及び他の血液系悪性疾患、例えば古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞／組織球豊富型Ｂ−細胞リンパ腫、ＥＢＶ−陽性及び−陰性ＰＴＬＤ、並びにＥＢＶ−関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、及びＨＨＶ８−関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫など、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物形成、例えば原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫などがある。
【０３９３】
特定の実施態様において、状態及び障害は、ＣＤ１９−関連疾患又は状態、例えばＢ細胞リンパ腫、任意にホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫などがあり、ここで非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺＬ）、粘膜−関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ球性白血病、ＣＬＬ）、又はマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）などを含む。
【０３９４】
特定の実施態様において、状態及び障害は、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１による免疫応答の調節を介して治療することができる、高増殖性状態又は感染症を含む。高増殖性状態の例は、固形癌、血液癌、軟組織腫瘍、及び転移性病巣を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３９５】
本ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、単独で、又は１以上の追加の治療的手段もしくは物質と組合せて投与されてよい。
【０３９６】
特定の実施態様において、癌又は腫瘍又は増殖性疾患の治療に使用される場合、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、化学療法、放射線治療、癌治療のための手術（例えば腫瘍切除）、化学療法から生じる合併症の治療のための１以上の制吐薬もしくは他の治療、又は癌もしくは関連した医学的障害の治療における使用のための任意の他の治療薬と組合せて、投与されてよい。本明細書において使用される「組合せて投与された」とは、同じ医薬組成物の一部として同時に、個別の組成物として同時に、又は個別の組成物として異なる時点で投与することを含む。別の物質の前後に投与される組成物は、組成物及び第二の物質が異なる経路を介して投与されるとしても、その語句が本明細書において使用されるように物質と「組合せ」て投与されると考えられる。可能であるならば、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体と組合せて投与される追加の治療薬は、追加の治療薬の添付文書に列挙されたスケジュールに従い投与されるか、又は「医師用医薬品便覧」(Physicians' Desk Reference、第70版(2016))又は当該技術分野において周知のプロトコールに従い投与される。
【０３９７】
特定の実施態様において、本治療薬は、癌に対する免疫応答を誘導又はブーストすることができる。例えば、腫瘍ワクチンは、特定の腫瘍又は癌に対する免疫応答を誘導するために、使用することができる。サイトカイン療法もまた、免疫系に対する腫瘍抗原提示を増強するために使用することができる。サイトカイン療法の例は、インターフェロン−α、−β及び−γなどのインターフェロン、マクロファージ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、及び顆粒球−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、及びＩＬ−１２などのインターロイキン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子を含むが、これらに限定されるものではない。免疫抑制性標的を失活する物質、例えば、ＴＧＦ−βベータインヒビター、ＩＬ−１０インヒビター、及びＦａｓリガンドインヒビターなども、使用することができる。別の物質のグループは、腫瘍細胞又は癌細胞に対する免疫反応を活性化するもの、例えば、Ｔ細胞活性化を増強するもの（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＯＸ−４０などのＴ細胞共刺激分子のアゴニスト）、並びに樹状細胞機能及び抗原提示を増強するものを含む。
【０３９８】
キット
【０３９９】
本開示は更に、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体を含むキットを提供する。一部の実施態様において、キットは、生物学的試料中の１以上の関心対象の標的の存在もしくはレベルを検出、又はこれを捕獲もしくは濃縮するのに有用である。生物学的試料は、細胞又は組織を含むことができる。
【０４００】
一部の実施態様において、キットは、検出可能な標識とコンジュゲートされた本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体を含む。特定の他の実施態様において、キットは、標識されない本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体を含み、並びに更に標識されない本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体へ結合することが可能である標識された二次抗体を含む。このキットは更に、使用説明書、及びキット中の各成分を分ける包装を含んでよい。
【０４０１】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体は、基板又は装置に会合されている。有用な基板又は装置は、例えば、磁気ビーズ、マイクロタイタープレート、又は試験片であることができる。それらは、結合アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）、イムノグラフアッセイ、生物学的試料中の標的分子の捕獲又は濃縮に有用であり得る。
【０４０２】
以下の実施例は、請求された発明をより良く例証するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。以下に説明する全ての具体的組成物、材料、及び方法は、全部又は一部において、本発明の範囲内に収まる。これらの具体的組成物、材料、及び方法は、本発明を限定することは意図しないが、単に本発明の範囲内に収まる具体的実施態様を例証する。当業者は、発明的能力の行使を伴わず及び本発明の精神から逸脱することなく、同等の組成物、材料、及び方法を開発してよい。本明細書記載の手順において多くの変更を行うことができる一方で、依然本発明の境界内に保持されることは理解されるであろう。そのような変更は本発明の範囲内に含まれることは、本発明者らの意図である。
【０４０３】
【表１３】
2020534034.tif 000015
【０４０４】
【表１４】
2020534034.tif 000016
【０４０５】
【表１５】
2020534034.tif 000017
【０４０６】
【表１６】
2020534034.tif 000018
【０４０７】
【表１７】
2020534034.tif 000019
【０４０８】
【表１８−１】
2020534034.tif 000020
【表１８−２】
2020534034.tif 000021
【０４０９】
【表１９】
2020534034.tif 000022
【０４１０】
【表２０−１】
2020534034.tif 000023
【表２０−２】
2020534034.tif 000024
【０４１１】
【表２１−１】
2020534034.tif 000025
【表２１−２】
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【表２１−３】
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【表２１−４】
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【表２１−５】
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【表２１−６】
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【表２１−７】
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【表２１−８】
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【表２１−９】
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【表２１−１０】
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【表２２−１】
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【表２２−２】
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【表２２−３】
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【表２２−４】
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【表２２−５】
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【表２２−６】
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【表２２−７】
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【表２２−８】
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【表２２−９】
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【表２２−１０】
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【表２２−１１】
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【表２２−１２】
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【表２２−１３】
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【表２２−１４】
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【表２２−１５】
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【表２２−１６】
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【表２２−１７】
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【表２２−１８】
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【表２２−１９】
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【表２２−２０】
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【表２２−２１】
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【表２２−２２】
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【表２２−２３】
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【表２２−２４】
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【実施例】
【０４１２】
（実施例１：抗体及びＴＣＲキメラタンパク質のデザイン及び操作）
（ＴＣＲ配列）
【０４１３】
ＴＣＲは、２本鎖で作製されたヘテロ二量体タンパク質である。約９５％のヒトＴ細胞は、アルファ鎖及びベータ鎖からなるＴＣＲを有するのに対し、残りの５％は、ガンマ鎖及びデルタ鎖で構成されるＴＣＲを有する。ヒトアルファ鎖の定常領域は、１つの遺伝子ＴＲＡＣのみを有する。ヒトベータ鎖の定常領域は、２つのサブクラス、遺伝子ＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２を有する。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）において、ＴＲＢＣ１の結晶構造の数は、ＴＲＢＣ２のものよりも比較的多く、そのためＴＲＢＣ１配列を、本明細書に開示されたポリペプチド複合体（“ＷｕＸｉＢｏｄｙ”）をデザインするための主要骨格として選択した。ＴＲＢＣ１の典型的アミノ酸配列は、ＰＤＢ構造４Ｌ４Ｔで認めることができる。
【０４１４】
（ＴＣＲの鎖間ジスルフィド結合）
【０４１５】
ＴＣＲ結晶構造を用い、本発明者らのＷｕＸｉＢｏｄｙデザインを導いた。Ｔ細胞表面の膜上にアンカーされた天然型ＴＣＲとは異なり、可溶性ＴＣＲ分子は、安定性は低いが、その３Ｄ構造は抗体Ｆａｂに非常に類似している。実際のところ、使用される可溶性条件でのＴＣＲの不安定性は、その結晶構造の解明を妨げる大きい障害である(Wang、2014、前掲)。本発明者らは、Ｃｙｓ変異の対をＴＣＲ定常領域に導入する戦略を採用し、且つこれが鎖集成を著しく改善し及び発現を増強することができることを認めた。
【０４１６】
鎖間ジスルフィド結合の抗体発現に対する作用
【０４１７】
ジスルフィド結合が、ＷｕＸｉＢｏｄｙ構造の維持において役割を果たすかどうかを決定するために、本キメラ抗体のＴＣＲ定常領域内にジスルフィド結合を持つ及び／又は持たない構築体を、発現させた。発現されたＷｕＸｉＢｏｄｙのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を、図１５−１７に示した。全ての発現されたＷｕＸｉＢｏｄｙは、２つの同一アームを伴う、全ＩｇＧ−様構築体であった。ＣＢｅｔａのＳ５６とＣＡｌｐｈａのＴ４９の間にシステイン変異を持つ及び持たない構築体の発現、ＣＢｅｔａのＳ１６又はＡ１８とＣＰｒｅ−ＡｌｐｈａのＳ１１の間、ＣＧａｍｍａのＱ５７とＣＤｅｌｔａのＶ５０の間、及びＣＧａｍｍａのＡ１９とＣＤｅｌｔａのＥ８８の間にシステイン変異を持つ構築体の発現を、試験した。
【０４１８】
ＣＢｅｔａ／ＣＡｌｐｈａにジスルフィド結合が存在しない構築体（配列番号：３２／４２）発現の結果は、ジスルフィド結合が存在しない構築体は、抗体構造を維持することができないことを示している（図１５Ｂ参照）。ＣＢｅｔａ／ＣＰｒｅ−Ａｌｐｈａ及びＣＧａｍｍａ／ＣＤｅｌｔａにジスルフィド結合が存在しない構築体の発現もまた試験し、且つ同様の結果を示している。対照的に、変異されたシステイン残基を含む構築体は、鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、これは、Ｉｇ−様構造を維持することが可能であった（図１５Ａ参照）。
【０４１９】
ＷｕＸｉｂｏｄｙのキメラドメインのデザイン
【０４２０】
ＴＣＲ定常領域のシステイン対変異（図１９Ａ−１９Ｅの配列に準拠した番号付け）を、ＴＣＲキメラ抗体の異なる構築体デザインに導入し、これを表２１に示した。
【０４２１】
【表２３】
2020534034.tif 000059
【０４２２】
ＴＣＲアルファ−ベータ定常領域中の対形成したＣｙｓ変異に関して、Ｔ４９Ｃ−Ｓ５６Ｃジスルフィド結合を、全てのデザインに使用した。
【０４２３】
抗体可変ドメイン及びＴＣＲ定常ドメインを結びつける接続、それらの相対融合配向(fusion orientation)、並びにＦｃを結びつける接続は全て慎重に微調整し、安定し且つ機能的なＷｕＸｉＢｏｄｙを作製した。ＴＣＲ構造は抗体Ｆａｂに非常に類似しているので、本発明者らは、抗体ＦｖホモロジーモデルをＴＣＲ可変領域上に重ねた（ＰＤＢ  ４Ｌ４Ｔ、図２Ｂ）。重ねた構造は、抗体Ｆｖは、ＴＣＲ定常ドメインと構造的に同等であることを指摘している。この構造整列化及び対応する配列を基に、全ての関連した操作パラメータを、以下に例示したように設計した。
【０４２４】
（ドメイン配向）
【０４２５】
ＶＨ−ＣＢｅｔａ／ＶＬ−ＣＡｌｐｈａ及び交差した(crossed)ＶＨ−ＣＡｌｐｈａ／ＶＬ−ＣＢｅｔａの両方の融合配向は、キメラタンパク質を正確に集成することができるので、本発明者らは、両方の配向を設計し且つ試験した。ＶＨ−ＶＬの配列相同性は、ＴＣＲ  ＶＢｅｔａ−ＶＡｌｐｈａに近い。本発明者らは、ＶＨ−ＣＢｅｔａ／ＶＬ−ＣＡｌｐｈａ式を「正常配向(normal orientation)」と、及びＶＨ−ＣＡｌｐｈａ／ＶＬ−ＣＢｅｔａを「交差配向(crossed orientation)」と命名した。
【０４２６】
（第一及び第二の接続ドメイン）
【０４２７】
本発明者らは、構造整列化を基に抗体及びＴＣＲの配列を整列させ、且つ生殖系列配列に規定された接続は、その構造上に表示するものと常には一致しないことを認めた。例えば、配列規定から、ＶＨとＣＨ１を結びつける接続は、ＶＨ領域中の最後の２個「ＳＳ」残基の後ろの右側から始まるはずである。しかし構造的に、これらの２個の残基は、既に接続の一部である。本発明者らは、自分たちの接続を、配列よりもむしろ構造を基に規定した。
【０４２８】
本開示の表１及び表２は、２つの試験した配向に関する構造ベースの配列整列化を示した。どのドメインがどの接続ドメインと適合可能であるかを予測することは課題が多いので、本発明者らは、どのように抗体及びＴＣＲ接続が重ねた構造上で重複されたかをチェックし、且つ一つずつ使用し可能性のある配置を推定した。この接続ドメインのデザインは、表１及び表２に列挙している。
【０４２９】
（第三の接続ドメイン）
【０４３０】
先に説明したものと同様の戦略を使用し、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４ヒンジを、ＴＣＲ膜近位領域（すなわちＴＣＲヒンジ）と整列させ、且つ構造レベルでのそれらの重複を更にチェックした。本開示の表７及び表８は、第三の接続ドメインのデザインを列挙している。
【０４３１】
（ＦＧループ及びＤＥループ）
【０４３２】
ＴＣＲ定常領域構造の抗体構造との整列は、ＴＣＲベータ鎖のＦＧループ及びＤＥループは、抗体ＣＨ１中の対応する領域よりも長いことを明らかにした。図３Ａ−３Ｂは、Ｔ細胞ベータ鎖と抗体重鎖の間の定常領域の差異を示している。ＣＨ１がＴＣＲベータにより置き換えられた場合に、どのようにこれら２つのループがその構造を混乱させるかを試験するために、これら２つのループを持つ及び持たない構築体を設計した。
【０４３３】
先に言及した考察により、表２２及び表２３に列挙したように、合計９種の構築体を、これらのパラメータの組合せにより設計した。
【０４３４】
【表２４】
2020534034.tif 000060
【０４３５】
【表２５】
2020534034.tif 000061
【０４３６】
（実施例２：単一特異性ＴＣＲ／抗体キメラの作製及び特徴決定）
ＴＣＲ定常ドメインを二重特異性抗体構築体へ融合する前に、定型的単一特異性ＩｇＧへのそれらの導入の実行可能性を、最初に評価した。Ｔ３と称する、研究室内で開発した抗−ＣＤ３抗体を選択し、この概念実証（ＰＯＣ）試験を実行した。Ｔ３  ＩｇＧの定常ドメインＣＨ１及びＣＬを、対応するＴＣＲ定常領域（ＣＡｌｐｈａ及びＣＢｅｔａ）により置き換えた。表２２に列挙した９種の異なる戦略全て（前記参照）を適用し、全ての構築体をＥｘｐｉ２９３システムにおいて発現した。
【０４３７】
表２４は、Ｑ−ＥＬＩＳＡにより定量した収集した上清中の設計したタンパク質の発現レベルを列挙した。概して、ほとんどの「正常配向」デザインは、「交差配向」フォーマットよりもよりよい発現を有し、且つほとんどの「ＴＣＲ接続」は、「抗体接続」よりもより良い。「正常配向」の２つの構築体、Ｄｅｓｉｇｎ＿５及びＤｅｓｉｇｎ−６は、Ｄｅｓｉｇｎ＿２と同等の発現を有した。「交差配向」の２つの構築体について、Ｄｅｓｉｇｎ＿７、８は、Ｄｅｓｉｇｎ＿３、４よりもより良い発現を有した。ＴＣＲ  ＣＢｅｔａ内の必要以上に長い(extra-long)ＦＧループの低い発現が認められ、これは、このＦＧループは、融合した抗体ＶＬドメインと著しい立体的クラッシュを引き起こし得ることを示唆している。
【０４３８】
【表２６】
2020534034.tif 000062
【０４３９】
これらの結果は、Wuらが彼等の類似の抗体−ＴＣＲキメラデザインで観察したもの(Wuら、2015、前掲)とは完全に異なり：彼等の「交差配向」デザインは、低い発現を有した。彼等の「正常配向」デザインは、発現さえしなかった。
【０４４０】
発現されたタンパク質が、正確なフォールディングを有し、且つ当初の機能を保持しているかどうかを確認するために、本発明者らは、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞上でのそれらの結合を試験した。全ての試料のＦＡＣＳ結合は、３種の異なる濃度で行った：５．０、０．４及び０．０３２ｎｍ。当初の野生型抗体Ｔ３を、陽性対照として使用した。用量依存的ＣＤ３結合データは、表２４の３−５列に列挙している。Ｄｅｓｉｇｎ＿２、Ｄｅｓｉｇｎ＿６及びＤｅｓｉｇｎ＿６ａは、天然型抗体Ｔ３と同等の、最良の結合能を示した。これら３種全ての構築体が、哺乳動物細胞において、図らずも最良の３種の発現フォーマットであったことは、興味深い。この強力な相関関係は、この発現又は結合のレベルは、同じ分子起源から、すなわち抗体可変ドメインとＴＣＲ定常ドメインの間の適合性から生じ、これは、接続ドメイン及び鎖間ジスルフィド結合などの構成成分の慎重なデザインを必要とすることを示唆した。
【０４４１】
この発現レベル及び結合活性を基に、Ｄｅｓｉｇｎ＿２を、先に進める最終フォーマットとして選択した。
【０４４２】
（実施例３：脱グリコシル化）
抗体上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）のＮ−グリコシル化部位は、タンパク質の不均一を引き起こし、開発段階での課題となり始めている。従って、ＴＣＲ定常領域上のＮ−グリコシル化部位を除去することを試みた。ＴＣＲ定常領域に認められた合計４つのＮ−グリコシル化部位が存在する。１つは、ＣＢｅｔａ上（Ｎ６９、配列番号：２４４参照）であり、他の３つは、ＣＡｌｐｈａ上（Ｎ３４、Ｎ６８及びＮ７９、配列番号：２４１参照）である。本開示の発現データは、これらの部位、特にＣＡｌｐｈａ上の部位は、この分子が哺乳動物細胞で発現された場合に、実際に重度にグリコシル化されたことを示唆した。
【０４４３】
Ｄｅｓｉｇｎ＿２上の全てのグリコシル化部位は、４つのＡｓｎ残基のＧｌｎ又はＡｌａによる置換により除去した（Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ又は-ＡＡＡＡと称す、表２５参照）。この戦略はタンパク質操作において非常に一般的であるが、Ｇｌｎ／Ａｌａ変異は、ＴＣＲ／抗体キメラタンパク質の発現レベルに影響を及ぼし得ることが報告されている(Wuら、2015、前掲)。このリスクを軽減するために、対応する位置で、Ｐｒｅ−ＴＣＲ（ＣＡｌｐｈａ上のＮ６８Ｓ）及びマカクＴＣＲ（ＣＡｌｐｈａ上のＮ７９、ＣＢｅｔａ上のＮ６９Ｅ）由来の残基（Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＳＫＥ及び−ＡＳＫＥと称す）も使用した（表２５参照）。加えて、ＣＡｌｐｈａ上に非定型グリコシル化部位（Ｎ６１）が存在することも報告された(Wollscheidら、Nature Biotechnology, 27(4), 378-386 (2009)、「N-結合型細胞表面糖タンパク質の質量分析同定及び相対定量」、Wollsheid B.、Baush-Fluck D.、Henderson C.、O’Brien R.、Bubel M.、Schiess R.、Aebersold R.、Watts J.D.、Nat. Biotechnol. 27:378-386(2009) [PubMed][Europe PMC])。従ってこの残基は、Ｇｌｎにも変異された（Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱＱと称す、表２５参照）。全ての変異体は、更なる試験のためにＥｘｐｉ２９３において発現した。
【０４４４】
【表２７】
2020534034.tif 000063
【０４４５】
【表２８】
2020534034.tif 000064
【０４４６】
上清中の発現量は、表２５においてＱ−ＥＬＩＳＡにより概算した。興味深いことに、本発明者らのただ１種の脱グリコシル化デザインは、発現レベルをわずかに減少した。Ｇｌｎ又はＡｌａによる単純な変異は、非還元ゲルに対し、いかなる負の作用も有さず（図４）、１５０ｋｄバンドが認められた。還元ゲル上では（図４）、２５ｋｄバンドが認められた。両方は、軽鎖及び重鎖上のグリコシル化の除去が成功したことを指摘している。ＴＣＲ定常領域上のＮ−グリカンの除去による変異タンパク質は、ＣＤ３−結合について試験した。図５は、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞への異なる変異タンパク質結合を示した。変異タンパク質の曲線は、野生型抗体Ｔ３と比べ右側へわずかにのみシフトし、これはキメラよりも、ヒトＩｇＧに対しより感受性のある抗体の検出に起因している。最大結合に変化はなかった。全般的に、ほとんどの脱グリコシル化デザインは、発現又は結合のいずれかにおいて明確な差異を示さなかった。Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱを、更なる試験のためのデザインとして選択した。
【０４４７】
Wuらにより実行された類似の試験において(Wuら、2015、前掲)、彼等は、彼等の「正常配向」フォーマットは発現しなかったので、彼等の「交差配向」フォーマットに対し脱グリコシル化変異を行った。
【０４４８】
（実施例４：ＴＣＲプレ−アルファ／ベータベースのＷｕＸｉＢｏｄｙのデザイン）
未熟胸腺細胞により発現されたプレ−Ｔ細胞抗原受容体（ｐｒｅ−ＴＣＲ）は、初期Ｔ細胞発達において中心的役割を有する。プレ−ＴＣＲは、定型的ベータ鎖を有するが、その配列及び構造は定型的アルファ鎖のものとは全く異なる利用可能な定常領域のみ伴う特別なプレ−アルファ鎖は有さない。定型的ＴＣＲの定常領域は、抗体可変領域と適合可能であるので、プレ−ＴＣＲ（ＰＤＢ  ３ＯＦ６、配列番号：２４６参照）も、キメラタンパク質のデザインを助けると期待された。抗体デザインは、表２７に示した。
【０４４９】
【表２９】
2020534034.tif 000065
【０４５０】
表２８に列挙したように、合計１０種のキメラ構築体を、これらのパラメータの組合せにより、設計した。
【０４５１】
【表３０】
2020534034.tif 000066
【０４５２】
【表３１−１】
2020534034.tif 000067
【表３１−２】
2020534034.tif 000068
【０４５３】
実施例１−３において学んだ経験は、「正常配向」及びより多くのＴＣＲ残基を伴う接続ドメインは、良好なキメラタンパク質の作製により適していることを示唆した。従って同じ戦略を採用し、表３及び表４に示したような軽鎖及び重鎖接続ドメインを設計した。定型的アルファ鎖とは異なり、ＴＣＲプレ−アルファ鎖内にはただ１つのグリコシル化部位（Ｎ５０）が存在し、これはＧｌｎ残基へ変異された（配列番号：２４７参照）。ベータ定常領域を持つ重鎖全体は、表２２のＤｅｓｉｇｎ＿２のそれと同じであり、Ｇｌｎ残基へ置換されたＮ−グリコシル化部位（Ｎ６９）を伴う（配列番号：２４４参照）。
【０４５４】
正常配向での第三の接続ドメインは、表７におけるものと同一に設計され、且つ交差配向での第三の接続ドメインは、表８におけるものと同一に設計された（ＴＣＲアルファ／ベータベースのキメラ抗体）。
【０４５５】
プレ−ＴＣＲは、第三の接続ドメイン上に、天然型鎖間ジスルフィド結合を有さなかった。定型的ＴＣＲについて行った操作作業と同様に、本発明者らは論理的に、このキメラタンパク質の安定性を向上するために、定常領域内のベータ及びプレ−アルファ境界面で、ジスルフィド結合を導入した（表１１参照）。プレ−ＴＣＲ結晶構造（ＰＤＢ  ３ＯＦ６）上の全ての境界面残基を検証し、そのＣＡｌｐｈａ及びＣＢｅｔａ炭素原子が、それぞれ、７Å及び５Å以内である鎖間対のリストを得た（表１１参照）。定義した各対は、次にＣｙｓ残基へ置換し、この変異タンパク質を、Ｅｘｐｉ２９３細胞において発現した。
【０４５６】
（実施例５：ＴＣＲガンマ／デルタベースのキメラ抗体のデザイン）
ガンマ鎖及びデルタ鎖で作製されたＴＣＲは余り一般的ではないが、このタンパク質のヘテロ二量体の性質も同じく、新規キメラフォーマットのデザインを助けることができる。実施例１において検証した同じ戦略及び手順に従い、本発明者らは、デルタ−ガンマＴＣＲの定常領域を、抗体の対応する領域と置き換えるために使用し、新規キメラを設計した。抗体とＴＣＲの間の構造がガイドした配列整列を促進するために、デルタ−ガンマＴＣＲの構造（ＰＤＢ  ４ＬＦＨ、配列番号：２４９及び２５２参照）を使用した。
【０４５７】
表５及び表６は、各々、「正常配向」及び「交差配向」に関して設計された接続ドメインを列挙した。異なる配向の対応するＩｇＧ１及びＩｇＧ４接続ドメインを、表９及び表１０に示した。デルタ−ガンマＴＣＲの構造は、アルファ−ベータＴＣＲよりもむしろ、抗体により類似している。追加のＦＧ及びＤＥループのデザインは、行わなかった。Ｎ−グリコシル化部位（ガンマ上のＮ６５、並びにデルタ上のＮ１６及びＮ７９、配列番号：２５０参照）は、全てＧｌｎ（Ｑ）置換により除去した。接触境界面ジスルフィド結合は、実施例４において導入された同じ戦略を基に設計した。
【０４５８】
【表３２】
2020534034.tif 000069
【０４５９】
表３１に列挙したように、合計１３種のキメラ構築体を、これらのパラメータの組合せにより設計した。
【０４６０】
【表３３】
2020534034.tif 000070
【０４６１】
【表３４−１】
2020534034.tif 000071
【表３４−２】
2020534034.tif 000072
【０４６２】
（実施例６：抗体重−軽鎖誤対形成試験）
ＩｇＧ−様フォーマットの二重特異性抗体を作製する際の一つの課題は、軽鎖及び重鎖の制御できない誤対形成である。本発明者らは、ＴＣＲベータ及びアルファ−置き換えたＣＨ１及びＣＬドメインは、単独の宿主細胞において同時発現した場合に、正常なＩｇＧ重鎖及び軽鎖と集成することができるかどうかを、評価した。
【０４６３】
抗−ＣＤ３抗体Ｔ３に加え、本発明者らは、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９を標的化するモノクローナル抗体Ｕ４を開発した。２種の天然抗体の軽鎖及び重鎖が誤対形成され得る見込みがどの程度かをチェックするために、Ｔ３及びＵ４の軽鎖−重鎖対を、意図的にスイッチし（Ｔ３＿ｌｉｇｈｔ−Ｕ４＿ｈｅａｖｙ、Ｔ３＿ｈｅａｖｙ−Ｕ４＿ｌｉｇｈｔ）、且つＥｘｐｉ２９３細胞において同時発現した。ＴＣＲ−修飾したＴ３を使用する同じ試験をまた、並列比較として実行した。図６Ａ−６Ｂは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥデータを示した。天然型抗体を使用しスイッチされた対に関して、非還元ＰＡＧＥにおける１５０ｋｄバンド、及び還元ＰＡＧＥにおける５０ｋｄ、２３ｋｄバンドは、誤対形成されたＩｇＧタンパク質の集成体を明確に確認した。しかし、ＴＣＲ−修飾したＴ３の導入後、１５０ｋｄバンドは、もはやゲルからは認められず、これはいずれの非コグネイト対も、抗体−様分子に集成することができないことを指摘している。これらのデータは、本発明者らの設計されたＴＣＲ−修飾したＦａｂは、非認識鎖(non-cognitive chain)の誤対形成を効果的に防止することができることを確認した。
【０４６４】
（実施例７：Ｆａｂ−ＴＣＲキメラの作製及び特徴決定）
ＴＣＲ−修飾した抗体Ｆａｂを使用し、二重特異性抗体をデザインすることができることを確認するために、２つの位置で切断したＦａｂ断片を、構築した。図８は、Ｎ−グリカン除去によりＴＣＲ−修飾したＴ３  Ｆａｂは、巧く発現され、且つ精製されたことを示している（Ｔ３−Ｆａｂ−Ｄｅｓｉｇｎ＿２．ｈｉｓ１（配列番号：３０／１２）及びＴ３−Ｆａｂ−Ｄｅｓｉｇｎ＿２．ｈｉｓ２（配列番号：３１／１２））。それらのＣＤ３への結合能もまた、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞において評価し、且つ野生型Ｔ３の一価型と比較した。図９は、キメラＦａｂ及び一価Ｔ３は、定性的に類似した結合挙動を有することを示した。これらのずれは、Ｈｉｓ及びＦｃタグによるタンパク質検出法における差異から生じ得る。
【０４６５】
（実施例８：ＴＣＲベースのノブイントゥホール二重特異性抗体の作製及び特徴決定）
ＴＣＲ定常ドメインを単一特異性抗体Ｔ３へ巧く融合し、且つ新規フォーマットは、抗体Ｕ４との鎖誤対形成効果的に防止することができることを確認した後、本発明者らは、二重特異性フォーマットの構築に進んだ。
【０４６６】
Ｆｃ  ＣＨ３ドメインで利用した「ノブイントゥホール」変異を持つＴＣＲ−修飾したＴ３及び野生型Ｕ４を、Ｅｘｐｉ２９３細胞から同時発現した。「ノブイントゥホール」に関する変異を、ＩｇＧ１アイソタイプにおいて、Ｔ３のＣＨ３ドメイン中のＳ１３９Ｃ及びＴ１５１Ｗ（配列番号：２９５、ノブ）、並びにＵ４のＣＨ３ドメイン中のＹ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ及びＹ１９２Ｖ（配列番号：２９６、ホール）に作製した。あるいはノブイントゥホール変異を、ＩｇＧ４アイソタイプにおいて、Ｔ３のＣＨ３ドメインのＳ１３６Ｃ及びＴ１４８Ｗ（配列番号：２９８、ノブ）、並びにＵ４のＣＨ３ドメインのＹ１３１Ｃ、Ｔ１４８Ｓ、Ｌ１５０Ａ及びＹ１８９Ｖ（配列番号：２９９、ホール）に作製した。図７Ａ−７Ｂは、精製後にＩｇＧ１及びＩｇＧ４において作製されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥデータを示す。第一工程プロテインＡ精製後の収量は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に関して、各々、１２５ｍｇ／Ｌ及び１７３．７ｍｇ／Ｌに達した。正確な分子量、すなわち非還元ゲルでのおよそ１５０ｋｄのバンドに加え、還元ゲルでのおよそ５０及び２５ｋｄのバンドが、全て明確に観察された。精製した試料を更に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより検証した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の純度は、９８．６３％及び１００％に達した。このデータは、ＩｇＧ−様分子、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方が、良好に発現され且つ集成されたことを指摘している。これらのＴＣＲ−関連した新規二重特異性フォーマットは、「Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ」と称した（ＩｇＧ１に関して配列番号：２２／１２／２４／２３及びＩｇＧ４に関して配列番号：２５／１２／２６／２３）。
【０４６７】
予想された分子量は、設計された二重特異性抗体に関して認められたが、各アームは、それらの個別のコグネイト抗原に対するそれらの当初の結合能を維持したかどうかを検証することは必要であった。各標的に関して、Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２は、一価の結合体であるので、本発明者らはまた、並列比較を行うために、天然型Ｔ３及び天然型Ｕ４の一価型を構築した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、各々、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｒａｍｏｓ細胞に対する設計された二重特異性抗体のＦＡＣＳ結合の結果を示した。ＴＣＲ−修飾したＴ３のアームは、野生型Ｔ３に比べて中程度の結合喪失を示したが、ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１よりもより良く、且つ天然型タンパク質に近かった。Ｕ４アームの結合は、近傍にある操作されたＴ３アームにより減少されなかった。これは一価型において、当初のＵ４抗体に対するものと類似の結合を有した。しかし興味深いことに、今回、ＩｇＧ１は、ＩｇＧ４よりもより良く性能を発揮した。アイソタイプが、一価の結合の維持において重要である理由は、明らかではない。ＴＣＲ定常領域の安定性、第三の接続ドメインデザインの選択、又は２つのＦａｂアーム間の相互作用のような要因は、観察された現象を生じることができる。
【０４６８】
ＴＣＲ−修飾した二重特異性フォーマットのＣＤ３及びＣＤ１９への一価の結合は、それらの二価の親抗体と比べ、両方共減少された。ＣＤ３結合を介したＴ細胞活性化は、極めて敏感であることはわかっている。Ｔ細胞への強力な刺激は、副作用を引き起こし得る。従って、比較的弱いＣＤ３−結合は、恐らく許容することができ、安全性の理由についてさえも望ましかった。しかし、弱いＣＤ１９−結合は、Ｂ細胞死滅に向けられた二重特異性抗体におけるその能力に直接影響を及ぼし、結果的に薬効を減少する。ＣＤ１９結合の重要性を確認し、且つ本発明者らのキメラデザインの普遍性を試験するために、本発明者らは、ＩｇＧ４において「Ｆ１６−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ」と称する別の二重特異性構築体を製造し、ここで設計されたＴ３アームは依然一価であるが、Ｕ４アームは二価であった。
【０４６９】
この新規構築体を、発現させ且つ精製し、その結合実験を、直接行った。図１１Ａ−１１Ｂは、先に設計されたＥ１７及び２つの親抗体Ｔ３及びＵ４と比較した、そのＦＡＣＳ結合データを示している。Ｆ１６−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱは、ＣＤ３−及びＣＤ１９−結合の両方を向上した（ＨＣ／ＬＣ（抗−ＣＤ３）／ＨＣ／ＬＣ（抗−ＣＤ１９）の順に配列番号：２５／１２／２７／２３）ことは、興味深い。そのＣＤ１９−結合（配列番号：２７／２３）は、野生型抗体Ｕ４と同等であった。このデータは、本発明者らのＴ３に対するキメラデザインは、異なる二重特異性フォーマットに適用することができることを確認した。
【０４７０】
（実施例９：二重特異性抗体−指向性(directed)腫瘍細胞死滅のインビトロアッセイ）
インビトロ機能アッセイを、悪性Ｂ細胞のＴ細胞エンゲージされた死滅における設計された二重特異性フォーマットの活性をチェックするために行った。Ｅ１７構築体を、最初に試験した。親単一特異性抗体Ｔ３及びＵ４を、陰性対照として使用した。図１２は、このＥ１７二重特異性フォーマットの用量依存型の細胞死滅機能を示している。Ｅ１７−ＩｇＧ４（ＥＣ５０＝５７ｐＭ）は、Ｅ１７−ＩｇＧ１（ＥＣ５０＝６２４ｐＭ）よりも、より強力であった。この細胞死滅の活性を向上するために、２つのＣＤ１９−結合部位を有するＦ１６フォーマットも、Ｅ１７と比較した。図１３に示したように、Ｅ１７（ＥＣ５０＝１７．７ｐＭ）と比べ、Ｆ１６（ＥＣ５０＝５．５ｐＭ）の効能は、３倍向上した。このデータは、ＣＤ１９の結合は、細胞死滅作用に影響を及ぼすことを確認した。無関係のヒトＩｇＧ４抗体を、陰性対照として使用した。
【０４７１】
（実施例１０：質量分析特徴決定）
作製された二重特異性抗体は正確な集成体を有したことを確認するために、本発明者らは、分子Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱを質量分析で特徴決定した。２本の重鎖と２本の軽鎖の間の理論的分子量の差異は、各々、およそ４０００Ｄａ及び５００Ｄａである。図１４Ａは、非還元条件でのタンパク質のスペクトルを示した。１４８１８０Ｄａのピークは、正確に集成された二重特異性抗体の予想された分子量であった。Ｆｃ領域における「ノブイントゥホール」変異、及び本発明者らのＴＣＲ−置換えＣＨ１／ＣＬ領域が、所望の４本鎖を適切に対形成するように働いたことを示す他のピークは、観察されなかった。非還元質量スペクトルは、両方の軽鎖が誤対形成されたＩｇＧから、正確に集成された二重特異性抗体の識別を助けることができないことは、注目に値する。しかし実施例４は、誤対形成した重鎖と軽鎖は、発現も集成もされず、これは重鎖及び軽鎖の両方の対の誤対形成の可能性を排除しないことを指摘している。
【０４７２】
非還元条件において（図１４Ａ参照）、１４９１２８Ｄａにピークがあり、これは計算した分子量よりもおよそ９４７Ｄａ大きい。質量分析をまた、還元条件でのタンパク質を用いて実行した。図１４Ｂは、ＶＬ−ＣＡｌｐｈａキメラ軽鎖から９４８Ｄａ離れたピークが存在したことを示し、これは軽鎖上のＯ−グリカン修飾（ＧｌｃＮＡｃ＋Ｈｅｘ＋２＊ＮｅｕＡｃ）を指摘している。 
【０４７３】
（実施例１１：熱安定性試験）
本発明者らは更に、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を用い、タンパク質融解温度Ｔｍを測定することにより、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方において、設計された二重特異性抗体の熱安定性を試験し且つ比較した。天然型単一特異性Ｔ３及びＴＣＲ−修飾したＴ３（Ｄｅｓｉｇｎ＿２及びＤｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱ）を、対照として使った。
【０４７４】
表３３は、新規構築体の測定したＴｏｎ値、Ｔｍ値を列挙した。全般的に、全ての分子は、妥当な熱安定性を示した。ＩｇＧ１−様分子は、ＩｇＧ４−様分子よりも、より安定していた。天然型Ｔ３抗体のＴｍ値は、７４℃であった。ＴＣＲ抗体キメラタンパク質は、およそ６０℃の比較的低いＴｍを有し、このことは、ＴＣＲ  ＣＢｅｔａ−ＣＡｌｐｈａは、正常抗体のＣＨ１−ＣＬと比べ、高温に対する抵抗が少ないことを示唆している。このことは、Wuらの研究(Wuら、2015、前掲)で報告されたものと一致し、且つＣＡｌｐｈａドメインは、ＣＢｅｔａよりも安定性が低いことを示唆した(Toughiriら、mAbs, 862(7月)、1276-1285(2016))。
【０４７５】
ＴＣＲ定常領域上のＮ−グリコシル化を除去する変異は、このキメラタンパク質の熱安定性に影響を及ぼさなかった。本発明者らの二重特異性抗体Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱは、Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱのものと同様のＴｍ、及び天然Ｔ３よりも低いＴｍを有した。
【０４７６】
【表３５】
2020534034.tif 000073
【０４７７】
（実施例１２：材料及び方法）
（抗体Ｔ３  Ｆｖホモロジーモデリング）
【０４７８】
抗体Ｆｖ構造モデルは、そのＦｖアミノ酸配列を基に、ソフトウェアDiscovery Studio(BIOVIA)を使用し、構築した。軽鎖配列及び重鎖配列の両方を、３つのＣＤＲ、並びに各鎖のフレームワークを同定するために、最初にKabat番号付けで注釈した。次に各セグメント（ＣＤＲ又はフレームワークのいずれか）を、抗体データベースにおいて、ＰＤＢ中の全ての抗体構造由来の配列で、BLAST検索した。高解像及び低Ｂ因子(B factor)を有する場合、最もマッチした配列の構造を使用し、ホモロジーモデルを構築した。次に全てのモデル化されたセグメントを集成し、軽鎖及び重鎖構造モデルを構築した。これら２つのモデル化された鎖間の相対配向を、最も類似している全体の配列を有する抗体構造の角度を測ることにより、推定した。全ての分子可視化及び分析作業は、PyMOLソフトウェア(Schrodinger)を用いて行った。
【０４７９】
（ベクター構築）
【０４８０】
ＶＬ、ＶＨ、Ｃｋ、ＣＨ１遺伝子を、現存する研究室のＤＮＡ鋳型から、ＰＣＲにより増幅した。ＣＡｌｐｈａ及びＣＢｅｔａ遺伝子は、Genewiz社により合成した。天然型又はキメラ軽鎖遺伝子は、ＣＭＶプロモーター及びカッパシグナルペプチドを含む線状ベクターに挿入した。ＶＨ−ＣＨ１又はＶＨ−ＣＢｅｔａのＤＮＡ断片は、ヒトＩｇＧ４／ＩｇＧ１定常領域ＣＨ２−ＣＨ３を含む線状ベクターに挿入した。このベクターは、ＣＭＶプロモーター及びヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む。プラスミドのライゲーション、形質転換、ＤＮＡ調製は、標準の分子生物学プロトコールを用いて行った。部位特異的変異誘発は、変異原性プライマーを使用するＰＣＲ増幅、それに続く鋳型ＤＮＡのＤｐｎＩ消化により実行した。
【０４８１】
（タンパク質発現）
【０４８２】
重鎖及び軽鎖の構築されたベクターを、Ｅｘｐｉ２９３細胞(Thermofisher Scientific)へ、同時形質移入した。同時形質移入に関する異なるベクターの比は、抗体の予想される構造に従い調節し、且つ最初の発現結果が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に示された。簡単に述べると、プラスミド４０μｇ及びイクスピフェクタミン(expifectamine)１０８μｌを、容積４０ｍｌの１．２×１０８個細胞を形質移入するのに使用した。エンハンサー１及びエンハンサー２を、形質移入の２０時間後に添加した。形質移入した細胞を、１２０ｒｐｍで回転する楕円振盪機において、８％ＣＯ２、３７℃で培養した。形質移入の５日後、上清を、遠心分離により収集し、且つ０．２２μｍフィルタリングにより、細胞断片を除去した。
【０４８３】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現検出）
【０４８４】
５日目に収集した上清を、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（４×）、ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（１０×）及びＨ２Ｏと混合した。還元した試料を、７５℃で加熱し、その後ゲルに装加した。ゲルを、定圧２００Ｖを用いて３５分間泳動した。次にゲルを、SimplyBlue（商標）SafeStain(Invitrogen、LC6065)により染色し、５分間マイクロフェーブにかけた。脱色は、水と共にインキュベーションすることにより行い、７分間マイクロウェーブにかけた。ゲルの画像を、Universal HoodIII(Bio-Rad)を用いて撮影した。
【０４８５】
（精製）
【０４８６】
プロテインAクロマトグラフィー精製
【０４８７】
MabSelect（商標）SuRe（商標）(MSS)プロテインＡ樹脂を、GE Healthcareから入手し、ガラスカラム(BioRad)に充填した。プロテインＡクロマトグラフィーによる精製は、流量０．２ｍｌ／分で動力源として蠕動ポンプを用い、室温で実施した。試料を装加した後、１０カラム容積（ＣＶ）の１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．５）を、溶出に使用し、異なる画分を収集した。異なる画分中のタンパク質濃度を、NanoDrop（商標）2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。このタンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣにより検出した。
【０４８８】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
【０４８９】
ＩＥＣクロマトグラフィー実験を、AKTA Pureシステム(GE Healthcare)を備えた、GE Healthcare life sciencesからのHi trap SP HPの１ｍｌカラムを用いて行った。プログラムされた方法の設定は、以下であった：１０ＣＶの洗浄緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０）によるカラム洗浄；試料注入口を使用する試料の適用；カラムの、１０ＣＶ洗浄緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０）による平衡化；洗浄緩衝液Ａ及び洗浄緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）による、カラムの溶出。勾配溶出条件は、３０％洗浄緩衝液Ｂで５０ＣＶの線状工程、１００％洗浄緩衝液Ｂで５ＣＶの線状工程、並びに１００％洗浄緩衝液Ｂで１０ＣＶで充満による工程として適用した。画分を、ＵＶ吸光度値に従い１本のチューブにつき０．５ｍｌとして収集した（収集閾値は、５ｍＡＵに設定した）。
【０４９０】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
【０４９１】
このクロマトグラフィー実験は、Superdex（商標）200インクリース10/300 GLカラム及びGE Healthcare life sciencesからのAKTAシステムを用いて行った。実験は、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０Ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）を０．５ｍｌ／分で用いて行った。画分は、各画分０．５ｍｌで、自動収集プログラムを用いて収集した（収集値は、ＵＶ吸光度の５ｍＡＵとして設定した）。
【０４９２】
Ni Sepharose（商標）Excelクロマトグラフィー精製
【０４９３】
Ni Sepharose（商標）Excelクロマトグラフィーを使用する６×Ｈｉｓ−タグ付きタンパク質の精製のため、Ni Sepharose（商標）excel樹脂をGE Healthcareから購入した。この樹脂を、ガラスカラム(BioRad)に充填した。樹脂貯蔵用緩衝液を除去するためにカラムを１０カラム容積（ＣＶ）ｄｄＨ２Ｏで洗浄した後、これを、６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質の精製に使用した。簡単に述べると、Ｎｉカラムによる精製は、流量０．２ｍｌ／分で蠕動ポンプを用い、室温で行った。試料の装加後、１０ＣＶのＰＢＳ（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を洗浄に使用し、引き続き５ＣＶ溶出緩衝液１（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）により、弱く結合したタンパク質を除去した。１０ＣＶ溶出緩衝液２（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）を使用し、結合したタンパク質を溶出した。溶出後、収集したタンパク質を、NanoDrop（商標）2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。溶出したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣにより検出した。カラムを、１０ＣＶのｄｄＨ２Ｏ、１０ＣＶストリッピング緩衝液（５０ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を汚染処理(sanitation)のため、１０ＣＶの６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ７．４）及び１０ＣＶの０．１Ｍ硫酸ニッケルを用いて再生した。再生したカラムを、２０％エタノールと共に充満させ、４℃で貯蔵した。
【０４９４】
サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
【０４９５】
試料の純度を、Tosoh BioscienceからのTSK-GEL G3000SWXLカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）、及びAgilent 1200 HPLCシステム(Agilent Technologies)を用いて分析した。カラムは、流量１．０ｍｌ／分のリン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）により平衡化した。５０μｌのタンパク質試料が濾過及び注入された後、ＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニタリングした。純度は、このクロマトグラムの積分により概算した。
【０４９６】
ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
【０４９７】
ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（２００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中の２００ｎｇ／ｍｌのヤギ抗−ヒトＩｇＧ−Ｆｃ由来の（Ｆａｂ）２によりコーティングした。４℃で一晩のインキュベーションした後、プレートを、ディープウェル洗浄機(Biotek ELx405)を用い、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後プレートを、ＰＢＳ緩衝液中の２％ＢＳＡによりブロックし、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄し、陽性対照抗体及び希釈した試料を添加した。２時間インキュベーションした後、プレートを３００μｌ洗浄緩衝液で６回洗浄し、ビオチン化したヤギ抗−ヒトＩｇ−Ｆｃ（Bethyl、１００μｌ／ウェル、２％ＢＳＡ中１：５０００希釈）を、検出抗体として添加した。インキュベーション工程及び洗浄工程の後、ＳＡ−ＨＲＰ（Invitrogen、２％ＢＳＡ中１：８０００希釈）を添加した。次にプレートを、室温で更に１時間インキュベーションした。プレートを、３００μｌ／ウェル洗浄緩衝液により６回洗浄した。基質ＴＭＢを添加し、１０分間呈色させた。停止溶液（２Ｍ  ＨＣｌ、１００μｌ／ウェル）を添加し、更なる発色を停止させ、プレートリーダー(Molecular Device SpectraMax(登録商標)M5e)を使用し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０４９８】
標的−結合アッセイ
【０４９９】
設計された分子の結合能は、各々、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株及びＣＤ１９＋Ｒａｍｏｓ細胞株を用いて評価した。両方の細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手し、且つ１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Corning、カタログ番号35-076-CV)を補充したＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen、カタログ番号22400105)において維持した。
【０５００】
１ウェルあたり１０５個細胞のアリコートを収集し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、BovoGen-BSAS)により洗浄し、引き続き９６−ウェル丸底プレート(Corning、カタログ番号3799)中で、連続希釈した試験用抗体と共に、４℃で１時間インキュベーションした。１％ＢＳＡにより２回洗浄した後、プレートを更に、ＰＥ−コンジュゲートしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体(Jackson Immuno Research Laboratories、カタログ番号109-115-098)と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。プレートを再度２回洗浄した後、細胞を、FACSCanto IIサイトメーター(BD Biosciences)を使用するフローサイトメトリーにより分析し、関連した蛍光強度を、FlowJoソフトウェアを用いて定量した。４パラメータの非線形回帰解析を使用し、Prismソフトウェア(GraphPad Software社)において、ＥＣ５０値を得た。
【０５０１】
（二重特異性抗体−指向性腫瘍細胞死滅）
【０５０２】
ヒトＴ細胞を得るために、健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処理した静脈血から、Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare-17-1440-03)密度勾配遠心分離により、新たに単離した。１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液(Sciencell、カタログ番号：0503)、５０ユニット／ｍＬヒトＩＬ−２リガンドタンパク質及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗体(EBioscience、カタログ番号16-0037-85)を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において６日間培養した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮のために、ＰＢＭＣを、EasySep(Stemcell、カタログ番号：19053)カラムを通過させた。ネガティブ選択カラムからのＣＤ８＋Ｔ細胞を、エフェクター細胞として使用した。
【０５０３】
細胞傷害アッセイにおいて、標的細胞としてＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を、２０ｎＭのCell Trace ファーレッド(Invitrogen、カタログ番号C34564)により、３７℃で３０分間、予め標識した。次に細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを補充したフェノール−非含有ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen、カタログ番号11835030)により２回洗浄した。９６−ウェル丸底プレート(Corning、カタログ番号3799)において、ファーレッド染色したＲａｊｉ  Ｂ細胞（２０，０００個細胞／ウェル）を、単離したＣＤ８＋Ｔ細胞（標的細胞：エフェクター細胞の比１：５）、及び連続希釈した二重特異性抗体と共に、３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、３μＭヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Invitrogen、カタログ番号P3566)を添加し、十分に混合し、死滅細胞を確定した。１５分後、細胞を、FACSCanto IIサイトメーターを使用するフローサイトメトリーにより分析した。二重特異性抗体−媒介した細胞傷害性を、ファーレッド−陽性標的細胞中のＰＩ−陽性標的細胞の割合（％）として規定することができる。Ｔ細胞エンゲージされた細胞傷害性のＥＣ５０は、Prismソフトウェア(GraphPad Software社)を用いて決定した。
【０５０４】
（質量分析特徴決定）
【０５０５】
このタンパク質を、０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬ中のPNGase F(Glyko、GKE-5006D)１μＬ（タンパク質対酵素比４０：１）と、３７℃で少なくとも４時間インキュベーションすることにより、脱グリコシル化した。脱グリコシル化した二重特異性抗体のアリコートを、２μＬの１Ｍ  ＤＴＴを添加することにより、最終濃度２０ｍＭとなるよう、室温で１５分間、部分的に還元した。各試料２μｇを、Acquity UPLC BEH300 C4カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）上に、０．４ｍＬ／分で注入した。移動相Ａは、ＨＰＬＣ等級水中の０．１％ギ酸（ＦＡ）であった。移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ＦＡであった。非還元条件及び還元条件の両方に関して、３．０分から１５．０分まで、２４％Ｂから３４％Ｂまでの有効溶出勾配を使用した。RP UPLCによる分離後、非還元条件及び還元条件中の二重特異性タンパク質の質量を、Waters Xevo G2 Q-TOFにより検出した。ＭＳシグナルを、BiophamaLynx 1.3ソフトウェアを用いデコンボルーションした。軽鎖及び重鎖の構成成分の理論的質量平均分子量は、GPMawプログラム(v.6.00)を用いて決定した。
【０５０６】
（ＤＳＦによる熱安定性試験）
【０５０７】
ＤＳＦアッセイを、7500 FastリアルタイムＰＣＲシステム(Applied Biosystems)を用いて行った。簡単に述べると、抗体溶液１９μＬを、６２．５×ＳＹＰＲＯオレンジ溶液(Invitrogen)の１μＬと混合し、９６ウェルプレート(Biosystems)に添加した。このプレートを、２℃／分の速度で、２６℃から９５℃まで加熱し、生じる蛍光データを収集した。異なる温度に関する蛍光変化の負の微分係数(negative derivaritive)を計算し、最大値を、融解温度Ｔｈとして規定した。タンパク質が複数のアンフォールディング転移を有する場合、最初の２つのＴｈが報告され、Ｔｈ１及びＴｈ２と命名した。Ｔｈ１は常に、異なるタンパク質の間の比較を促進するための、正式な融解温度Ｔｍとして解釈される。データ収集及びＴｈ計算は、その操作ソフトウェアにより、自動的に行った。一旦異なる温度の負の微分係数のプロットが、このソフトウェアにより報告されたならば、転移前ベースラインから減少するよう始まる曲線プロット中の点を、開始温度Ｔｏｎとして大まかに概算することができる。
【０５０８】
（実施例１３：Ｏ−グリカン同定）
先の質量分析データは、ＴＣＲ−修飾したＴ３軽鎖上のＯ−グリカンを発見した。アミノ酸配列パターンを基に配置され得るＮ−グリコシル化部位とは異なり、Ｏ−グリコシル化部位は、配列から予測することは困難である。このＴ３  ＴＣＲ−キメラ軽鎖は、Ｔ３親抗体のＶ領域、並びにＴＣＲアルファ鎖の定常領域で構成された。両方の領域は、潜在的にＯ−グリコシル化部位を有し得る。質量分析を、当初のＴ３モノクローナル抗体に対し再度行い、且つこの親抗体は、Ｏ−グリカンを有さないことを認め、これはＯ−グリカンは、ＴＣＲアルファ定常領域内に配置されていることを指摘している。
【０５０９】
Ｏ−グリコシル化は、ほとんどＳｅ残基又はＴｈｒ残基に起こり、且つＴＣＲアルファ定常領域の配列中には２１個のＳｅｒ／Ｔｈｒ残基が存在する（下記配列中太字で示す）ことは、わかっている。Ｏ−グリコシル化部位の正確な位置を配置するために、個別のＳｅｒ／Ｔｈｒを各々Ａｌａと置換するためのＡｌａ走査を実行し、２１種のＴＣＲ−修飾した単一特異性Ｔ３分子を構築した。各変異体上の潜在的Ｏ−グリカンを、タンパク質から放出し、２−アミノ安息香酸により標識し、蛍光検出装置と組合せたＨＰＬＣにより定量した。Ｏ−グリカンシグナルの喪失は、Ｏ−グリコシル化部位の位置を示すことができる。
【０５１０】
【表３６】
2020534034.tif 000074
【０５１１】
Ｏ−グリカンの同定及び量を定量するために、酸加水分解及びＨＰＬＣベースの方法を開発した。試料を、２Ｍ  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により加水分解し、Ｏ−グリカンの単糖を放出させた。Ｏ−グリカンのＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン）及びＧａｌ（ガラクトース）から放出されたＧａｌＮ（ガラクトサミン）を、２−アミノ安息香酸で標識し、ＦＬＤ（蛍光検出装置）と組合せたＨＰＬＣにより分析し、外部較正曲線により定量した。放出されたＧａｌＮ含量はＯ−グリカンに対する特異的単糖であるので、これは、Ｏ−グリカンの量に直接相関した。これらの結果は、１モルタンパク質あたりのＧａｌＮのモル数を報告し、これは１モルタンパク質が含むＯ−グリカンのモル量を表す。
【０５１２】
表３４は、全ての変異体について定量したＯ−グリカンレベルを示す。二重特異性分子Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱを、対照タンパク質として使用した。このデータは、Ｅ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱタンパク質１モル上に利用可能な０．２４ｍｏｌのＯ−グリカンが存在することを示した。これはただ１つのＴＣＲ−修飾したＴ３軽鎖を有する二重特異性抗体であるので、２本の鎖のＯ−グリカンレベルの合計は、２倍すべきであり、すなわちおよそ０．４８ｍｏｌ／ｍｏｌである。２１種の変異体全ての中で、それらのほとんどは、予測されたＯ−グリカン量を保持した。試料＃３、＃８、＃１０及び＃２０は、わずかなシグナル減少を有した。試料＃１９は、明確なＯ−グリカン喪失を示した。そのシグナルは、対照タンパク質のものよりも低くさえあった。従って、位置Ｓ９１を、主要なＯ−グリコシル化部位として同定した。Ｓ１９、Ｓ３６、Ｓ４１及びＳ９４は、可能性のあるＯ−グリコシル化部位として同定した。
【０５１３】
【表３７】
2020534034.tif 000075
【０５１４】
（実施例１４：Ｆｃγ受容体、Ｃ１ｑ、及びＦｃＲｎへの結合）
（方法）
【０５１５】
（ＳＰＲによるＦｃγ受容体結合親和性）
【０５１６】
ＦｃγＲｓへの抗体結合親和性は、Biacore T200(又はBiacore 8K)を用いて検出した。各受容体を、抗−ｈｉｓ抗体固定したCM5センサーチップ(GE)上に捕獲した。異なる濃度の抗体を、センサーチップ上に、流量３０ｕＬ／分で注入し、会合相６０秒間、引き続きの解離相６０秒間であった。次に各結合サイクル後、このチップを、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）により再生した。
【０５１７】
ブランク表面及び緩衝液チャンネルのセンサーグラムを、被験センサーグラムから減算した。この実験データを、ラングミュア解析を使用する１：１モデル（ＦｃγＲＩに関して）又は定常状態モデル（他の受容体に関して）によりフィッティングさせた。分子量１５０ＫＤａを使用し、抗体のモル濃度を計算した。
【０５１８】
（ＥＬＩＳＡによるＣ１ｑ結合）
【０５１９】
ＥＬＩＳＡプレート(Nunc)を、３μｇ／ｍＬの抗体試料により、４℃で一晩コーティングした。ブロック及び洗浄後、Ｃ１ｑを、６００μｇ／ｍＬから始めて勾配希釈し、室温で２時間インキュベーションした。次にプレートを洗浄し、引き続きヒツジ抗−ヒトＣ１ｑ  Ａｂ−ＨＲＰと共に１時間インキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ  ＨＣｌにより停止した。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を用い測定した。
【０５２０】
（ＳＰＲによるＦｃＲｎ結合親和性）
【０５２１】
ＦｃＲｎに対する抗体結合親和性を、Biacore T200(又はBiacore 8K)を用いて検出した。各抗体は、CM5センサーチップ(GE)上に固定した。送液緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中の異なる濃度のＦｃＲｎを、センサーチップ上に、流量３０ｕＬ／分で注入し、会合相６０秒間、引き続き解離相６０秒間であった。次に各結合サイクル後、このチップを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により再生した。
【０５２２】
ブランク表面及び緩衝液チャンネルのセンサーグラムを、被験センサーグラムから減算した。この実験データを、定常状態モデルによりフィッティングさせた。分子量４５ＫＤａを使用し、ＦｃＲｎのモル濃度を計算した。
【０５２３】
（結果）
【０５２４】
先に言及した全てのＩｇＧ１は、ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧ１であるので、ＩｇＧ４及び野生型ＩｇＧ１（Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−２．（２）．ｕＩｇＧ１（ノブイントゥホール型の野生型ＩｇＧ１））の両方におけるＥ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱの、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１６７）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１７６）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１７６）及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合活性を、ＳＰＲにより調べた。
【０５２５】
【表３８】
2020534034.tif 000076
【０５２６】
親和性は、表３５（ＩｇＧ４）及び表３６（野生型ＩｇＧ１）にまとめた。両方の分子は、全てのＦｃγ受容体に対する典型的ヒトＩｇＧ４及び野生型ＩｇＧ１結合親和性を示した。
【０５２７】
【表３９】
2020534034.tif 000077
【０５２８】
【表４０】
2020534034.tif 000078
【０５２９】
抗体のＣ１Ｑへの結合活性を、ＥＬＩＳＡにより調べた（図２１Ａ−２１Ｂ）。ＩｇＧ４中のＥ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱは、ＥＬＩＳＡにおいて、結合シグナルを示さない（図２１Ａ）のに対し、野生型ＩｇＧ１及び対照ヒトＩｇＧ１抗体中のＥ１７−Ｄｅｓｉｇｎ＿２−ＱＱＱＱは、正常な結合シグナルを示した（図２１Ｂ）。
【０５３０】
（実施例１５：対称フォーマットＧ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、Ｇ２５Ｒ）
安全性の懸念のために、ＣＤ３×ＣＤ１９のような抗体治療標的は、一価のＣＤ３結合を伴う二重特異性抗体から恩恵を受ける。これを考慮し、ＷｕＸｉＢｏｄｙ  Ｆａｂをインテグレートすること、並びにノブイントゥホール技術により、非対称性二重特異性フォーマットＥ１７及びＦ１６を設計し、且つ良好に作製した。しかしＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１のような一部の二重特異性標的は、対称性フォーマットから恩恵を受け、これは、２種の異なる抗体を集成すると同時に、それらの当初の価数を保持し（すなわち合計四価）、所望の相乗作用を達成することができる。ＷｕＸｉＢｏｄｙのコアユニットは、キメラＦａｂであり、これは、コグネイト軽鎖−重鎖の正確な対形成を確実にするために、非対称性及び対称性の両方のフォーマットに容易に組み込むことができる。４種のＷｕＸｉＢｏｄｙベースの対称性フォーマット、すなわちＧ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５及びＧ２５Ｒを設計した。
【０５３１】
図２２は、４種の対称性フォーマットの概略的説明を提供する。Ｇ１９及びＧ２５において、２種のＷｕＸｉＢｏｄｙキメラＦａｂは、各々、正常抗体のｃ−末端及びｎ−末端でグラフトされた。Ｇ１９とＧ１９Ｒの間、又はＧ２５とＧ２５Ｒの間の差異は、各個別のフォーマットにおける正常及びキメラＦａｂの逆転した位置である。２つのＦａｂ並びにＩｇＧ−Ｆｃの重鎖部分は、１本の鎖にインテグレートされるのに対し、２本の軽鎖は、独立してフォールディング及び集成するよう自由であった。３種のベクターを、宿主細胞へ同時形質移入した場合、重鎖−重鎖会合は、発現プロセス時に正常抗体のように働くと予想されるのに対し、各軽鎖は、重鎖上のそれ自身のコグネイトパートナーに自己集成すると予想された。
【０５３２】
対称性ＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマット中の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体を、設計した。新規抗−ＰＤ−１抗体Ｗ３０５５＿１．１５３．７（Ｕ６と称す）及び市販の抗−ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ（Ｔ１と称す）を、この新規フォーマットにつなぐために採用した。ＩｇＧ４アイソタイプを、その分子に対するＡＤＣＣ及びＣＤＣ作用の枯渇を確実にするために選択した。Ｕ６及びＴ１は両方共、このフォーマットの頂上側又は底側に配置することができるので（各々、Ｕ６Ｔ１及びＴ１Ｕ６と称す）、単独フォーマットＧ１９を、両方のケースを調べるために、最初に使用した。
【０５３３】
被験ＷｕＸｉＢｏｄｙの関連配列を、以下に提供する：
【０５３４】
【表４１−１】
2020534034.tif 000079
【表４１−２】
2020534034.tif 000080
【表４１−３】
2020534034.tif 000081
【表４１−４】
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【表４１−５】
2020534034.tif 000083
【表４１−６】
2020534034.tif 000084
【０５３５】
Ｕ６Ｔ１及びＴ１Ｕ６の両構築体は、Ｅｘｐｉ２９３システムにおいて正常に発現され、且つ発現されたタンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィーの一工程精製後、純度およそ９０％に達した。図２３Ａ−２３Ｂは、精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣの特徴を示した。それらの結合能を検証するために、その後ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の両標的への細胞ベースの結合アッセイを行った。図２４Ａ−２４Ｂは、Ｕ６及びＴ１の両方が、フォーマットの底側に配置される場合、低下した結合を有したことを示した。ＰＤ−１の機能は、ＣＴＬＡ−４のそれよりも比較的より重要であること（ＣＴＬＡ−４抗体はより重度の副作用を有することがわかっている）を考慮すると、ＰＤ−１結合側は、Ｕ６結合を最大にするために（すなわち、Ｔ１Ｕ６よりもむしろＵ６Ｔ１）、並びに底側に配置されたＣＴＬＡ−４結合をどのように最適化するかを試験するために、頂上に配置された。
【０５３６】
他の３種のＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットＧ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５Ｒ（図２２に示した）も更に調べた。加えて、臨床試験において使用されているＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体であるベンチマーク抗体ＡＫ−１０４(Akeso Biopharma社)を入手し、且つ直接比較のための対照として使用した。
【０５３７】
ＰＤ−１機能の重要性のために、Ｕ６は、全てのフォーマットの頂上側に保持し、ＰＤ−１結合を最大化する一方で、Ｔ１は底側に保持し、まずまずのＣＴＬＡ−４結合を認めた。全ての構築された分子は、Ｅｘｐｉ２９３において良好に発現され、且つプロテインＡクロマトグラフィーの一工程精製後、純度＞９０％が容易に達成された。図２５Ａ−２５Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにＳＥＣ−ＨＰＬＣにより特徴決定された精製されたタンパク質を示した。
【０５３８】
次にＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の両方への細胞ベースの結合アッセイを行い、新たに構築した分子全ての結合能をチェックした。図２６Ａ−２６Ｂは、設計された構築体とベンチマーク抗体の間の結合曲線の比較を示した。データは、全てのタンパク質は、ベンチマーク抗体と非常に類似したＰＤ−１結合を有したことを示した。加えて、ＣＴＬＡ−４結合は、Ｇ２５及びＧ２５Ｒフォーマットにおいて有意に改善され、且つベンチマーク抗体と同等の性能が達成された（≦２倍）。しかしＧ１９Ｒフォーマットは、依然良好には働かなかった。恐らくＧ１９とＧ１９Ｒは、Ｔ１の効果的結合を妨げるという同じ問題点を共有するのであろう。
【０５３９】
これらの分子の機能を、２つの標的ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ８０の各リガンドへのそれらの競合能の検証により更に特徴付けた。図２７Ａ−２７Ｂは、これらの分子は、ＰＤ−Ｌ１との競合において、ベンチマークと同等の性能を有することを確認した。ＣＴＬＡ−４側に関して、フォーマットＧ２５Ｒは、ＣＤ８０との競合において、ベンチマークと類似の能力を示した。他の２種のフォーマットは、かなり悪い結果を有した。Ｇ２５とＧ２５Ｒの間の差異は、ＴＣＲ定常領域の位置である。Ｔ１のＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットへの転換は、Ｔ１の活性を促進したように見えるが、Ｔ１は依然Ｕ６の下であった。これは、機能性リード(lead)は、限定された数のＷｕＸｉＢｏｄｙ由来のフォーマットの走査により効果的にスクリーニングされ得ることを明らかにする良好な例を提供した。
【０５４０】
従って、ベンチマーク抗体に類似した機能性ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体を得た。ＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットは、非常に普遍的であり、すなわちいずれの新規抗体も、これらのフォーマットにフィットし、且つその機能を発揮することができる。良好な親抗体が入手できるならば、これをベンチマーク抗体よりも優れた分子を作製するために使用することができる。
【０５４１】
この概念を証明するために、イピリムマブよりもはるかに強力な親和性を有する別の抗−ＣＴＬＡ−４抗体であるＷ３１６２＿１．１５４．８−ｚ３５（Ｔ５と称す）を、図２２に示した４種のフォーマットＧ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５、及びＧ２５Ｒ全てにおいて、開発し且つ実行した。再度、新規構築体全てを、Ｅｘｐｉ２９３細胞において良好に発現させ、一工程プロテインＡクロマトグラフィーにより容易に精製した。これらのタンパク質の純度は、図２８Ａ−２８Ｂに示した。
【０５４２】
全てのＵ６Ｔ５分子、先に同定したＵ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ分子、並びにベンチマーク抗体の結合を全て実行し、且つ比較した。結果は、図２９Ａ−２９Ｂに列挙している。ＰＤ−１側は、先に観察されたような当初の結合挙動を保持し、その理由は、ＰＤ−１抗体はこれらのフォーマットのいずれにおいても置き換えられなかったからである。しかしＣＴＬＡ−４側に関して、Ｕ６Ｔ５構築体（Ｇ１９及びＧ１９Ｒフォーマットであっても）は全て、Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ並びにベンチマーク分子よりも明らかに優れた結合を示した。Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５は、これらの新規タンパク質全ての中で最も強力であり、これは、ベンチマーク抗体と比べ、１．６×向上されたＥＣ５０及び＞３×向上された最高値を有した。この分子は更に、ＥＬＩＳＡデュアル結合アッセイ及びＦＡＣＳ競合アッセイにおいて特徴付けた。図３０は、これらの分子は、両方の標的へ同時に効果的デュアル結合することを証明した。図３１Ａ−３１Ｂのデータは、Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５は、ＣＴＬＡ−４に対し有意に向上されたＣＤ８０との競合能を有することを確認した。これは、ＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットは、異なる親抗体を操作するのに十分に柔軟であることを証明した。この分子をＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットに組み込んだ(plug)場合、親抗体の優れた部分は、良好に保存され、且つ反映される。
【０５４３】
これら４種の対称性フォーマットの全てをカバーする分子の熱安定性を特徴付けた。これらの分子のほとんどは、およそ６０℃の融解温度を示し（表３７参照）、これは先に示した非対称性フォーマットと一致した。
【０５４４】
【表４２】
2020534034.tif 000085
【０５４５】
（実施例１６：軽−重スイッチしたキメラＦａｂ）
合計で１１１種の可能性のあるＷｕＸｉＢｏｄｙベースのフォーマットを、うまく設計した。先に示したＥ１７、Ｆ１６、Ｇ１９、Ｇ１９Ｒ、Ｇ２５及びＧ２５Ｒに加え、軽−重交差したＴＣＲ−キメラＦａｂを伴う新規フォーマットも数種類設計した。これらは、図３２に示したように、Ｇ２６、Ｇ２６Ｒ、及びＧ２７と称した。今回は、抗体対Ｕ６及びＴ４を使用し、ここでＴ４は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体ＷＢＰ３１６２−１．１４６．１９−ｚ１２であった。Ｔ４Ｕ６対を、フォーマットＧ２７及びＧ２６Ｒについて開発した。図３３Ａ−３３Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣにより特徴付けした精製したタンパク質を示した。両方のタンパク質が発現され、Ｔ４Ｕ６．Ｇ２７．ＩｇＧ４は低い純度を有したが、Ｔ４Ｕ６．Ｇ２６Ｒ．ＩｇＧ４は、正確な分子量及び高い純度を有した。後者の分子の結合能を、ＦＡＣＳ結合において特徴付けた。図３４Ａ−３４Ｂは、ＰＤ−１結合は、底側に配置されるので、これは影響を受けることを示したのに対し、ＣＴＬＡ結合側は、フォーマットの頂上側に配置されるので、完全に回復したことを示した。
【０５４６】
Ｕ６Ｔ４対を、フォーマットＧ２６について試みた。発現及び精製の両工程は、図３５Ａ−３５Ｂにおいて示したように良好に働いた。ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合を両方共行い、データは、図３６Ａ−３６Ｄに示した。これらのデータは、軽−重交差したキメラＦａｂは、依然良好に働くことができることを証明した。表３８に示したように、この分子の融解温度は、およそ６３．４であった。
【０５４７】
【表４３】
2020534034.tif 000086
【０５４８】
（実施例１７：二重特異性抗−ＣＤ１３×ＣＤ１９  ＷｕＸｉＢｏｄｙ）
背景
【０５４９】
（標的生物学）
【０５５０】
ヒトＣＤ１９は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質である(Carterら、Curr Dir Autoimmun, 2004, 7:4-32)。これは、ほとんどのＢ細胞上で発現されるが、形質細胞、幹細胞、又は正常骨髄細胞系上では検出されない(Tedder、Nat Rev Rheumatol, 2009, 5(10):572-577)。ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）−依存型及び非依存型シグナル伝達の両方を調節することを通じて、内因性Ｂ細胞シグナル伝達閾値の確立に、決定的に関与している(Wangら、Experimental Hematology & Oncology, 2012, 1:36)。ＣＤ１９は、ＣＤ２０よりも広範な発現を有する。ＣＤ１９発現のパターンは、Ｂ細胞悪性変換において維持され、これは、緩徐進行型から攻撃型までＢ細胞リンパ腫の全ての亜型、並びにＢ細胞慢性リンパ球性白血病及び急性非Ｔリンパ芽球性白血病へ転換し、且つリツキシマブにより標的化することができない、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）など早期Ｂ細胞の腫瘍指標を標的化することを可能にする。いくつかのＣＤ１９モノクローナル抗体が、リンパ腫療法について調べられている(米国特許出願公開20140072587 A1、米国特許第8,242,252 B2号、及び米国特許第8,097,703 B2号)。
【０５５１】
ＣＤ３  Ｔ細胞共受容体は、４本の異なる鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及び２本のＣＤ３イプシロン鎖で構成されたタンパク質複合体である。４本の鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知の分子及びゼータ鎖と会合し、Ｔリンパ球における活性化シグナルを作製する。ＴＣＲ、ゼータ鎖、及びＣＤ３分子は、ＴＣＲ複合体を構成し、ここでサブユニットとしてのＴＣＲは、抗原を認識し且つ結合し、サブユニットとしてのＣＤ３は、抗原刺激をシグナル伝達経路に移行及び運搬し、並びに最終的にはＴ細胞活性を調節する。ＣＤ３タンパク質は、事実上全てのＴ細胞に存在する。ＣＤ３−ＴＣＲ複合体は、自然免疫応答及び養子免疫応答の両方においてＴ細胞機能を調節し、並びに細胞性及び体液性免疫機能を調節する。これらは、広範囲の細胞傷害性作用による病原性生物の排除及び腫瘍成長の制御を含む。ヒトＣＤ３に特異的なマウスモノクローナル抗体、例えばＯＫＴ３(Kungら、Science, 1979, 206: 347-9)は、治療のために開発された第一世代ＣＤ３抗体であった。ＯＫＴ３は強力な免疫抑制効能を有すが、その臨床使用は、その免疫原性及び分裂促進性の能力に結びつけられた重篤な副作用により、阻止された(Chatenoud、Nature Reviews, 2003, 3:123-132)。ＯＫＴ３は、抗−グロブリン反応を誘導し、それ自身迅速なクリアランス及び中和を促進する(Chatenoudら、Eur. J. Immunol., 1982, 137:830-8)。加えてＯＫＴ３は、インビトロにおいてＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を誘導し、且つインビボにおけるサイトカインの大規模放出につながった(Hirschら、J. Immunol, 1989, 142: 737-43)。そのような重篤な副作用は、移植におけるＯＫＴ３のより広範な使用、並びに自己免疫などの他の臨床分野へのその使用の拡大を制限した（同書）。
【０５５２】
ＣＤ３及びＣＤ１９を標的化する二重特異性抗体は、Ｔ細胞及びＢ細胞に同時に結合することができる。一旦この二重特異性抗体がＣＤ３−陽性Ｔ細胞及びＣＤ１９−陽性Ｂ細胞に結合したならば、細胞溶解性シナプスが形成される。次に細胞傷害性は、細胞傷害性Ｔ細胞の顆粒からのパーフォリン及びグランザイムの放出により誘導され、後者は悪性Ｂ細胞のアポトーシス及び溶解を誘導する。
【０５５３】
ブリナツモマブの活性は、クラスＩ  ＭＨＣによる抗原提示及びＴＣＲ認識とは無関係であることが証明されている。従って、これは、抗原提示の仕組みの機能障害及び腫瘍微小環境における負の共刺激シグナルの活性化など、様々な腫瘍−媒介性免疫回避機序を迂回することができる。
【０５５４】
満たされない医学的必要性
【０５５５】
成人の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療は、依然課題が多く、新規療法が必要とされている。現在の療法により、奏功率は、最初の寛解期間、年齢及び細胞遺伝学に応じて、３０〜５０％の範囲である。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のサブセットに関する全奏功率は、第一世代の抗−ＣＤ２０抗体を利用するレジメン下では、現在９０％以上である。しかしいくつかのＮＨＬ亜型は、これらの療法に反応せず、反応性ＮＨＬ患者の大部分は、標準の免疫療法／化学療法併用レジメンの後で、最終的には再発する。従ってこれらの満たされない必要性のために、新規の第一順位の療法及び新規救済レジメンの両方が、必要である。
【０５５６】
材料及び方法
【０５５７】
（カニクイザルＣＤ１９発現細胞株の作製）
【０５５８】
完全長ヒト又はカニクイザルＣＤ１９の遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．３ベクターへクローニングした。次に各発現ベクターを、リポフェクタミン２０００を使用し、それぞれ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞へ形質移入した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含むＦ１２−Ｋ中で培養した。形質移入後の２４〜４８時間に、ブラストサイジンを添加した。選択のために２〜３代継代した後、細胞を、ＰＥコンジュゲートされた抗−ＣＤ１９抗体及び抗−ＰＥマイクロビーズ(Miltenyi-013-048-801)により濃縮した。安定した単独細胞クローンを、限定希釈により単離し、抗−ＣＤ１９抗体を使用するＦＡＣＳによりスクリーニングした。
【０５５９】
（標的−発現する腫瘍細胞株）
【０５６０】
Ｒａｊｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を、ATCCから得た。Ｒａｍｏｓ細胞は、ECACCから得た。これらの腫瘍細胞は全て、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳにおいて培養した。
【０５６１】
（ＷｕＸｉＢｏｄｙ  Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの構築）
【０５６２】
ＶＬ、ＶＨ、Ｃκ、ＣＨ１遺伝子は、現存する研究室のＤＮＡ鋳型から、ＰＣＲにより増幅した。ＣＡｌｐｈａ及びＣＢｅｔａ遺伝子は、Genewiz社により合成した。抗ＣＤ１９天然型又は抗ＣＤ３キメラの軽鎖遺伝子を、ＣＭＶプロモーター及びカッパシグナルペプチドを含む線状化されたベクターへ挿入した。抗ＣＤ３ＶＨ−ＣＢｅｔａのＤＮＡ断片を、ノブ変異を伴うヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ定常領域ＣＨ２−ＣＨ３を含む線状化されたベクターへ挿入した。抗ＣＤ１９  ＶＨ−ＣＨ１のＤＮＡ断片を、ホール変異を伴うヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ定常領域ＣＨ２−ＣＨ３を含む線状化されたベクターへ挿入した。このベクターは、ＣＭＶプロモーター及びヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む。
【０５６３】
（Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの発現及び精製）
【０５６４】
重鎖及び軽鎖発現プラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞へ、Ｅｘｐｉ２９３発現システムキット(ThermoFisher-A14635)を製造業者の指示に従い用い、同時形質移入した。形質移入の５日後、上清を収集し、タンパク質をプロテインＡカラム(GE Healthcare-17543802)及び更にサイズ排除カラム(GE Healthcare-17104301)を用いて精製した。抗体濃度は、Nano Dropにより測定した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ−ＳＥＣにより評価した。
【０５６５】
（ＦＡＣＳによる標的結合）
【０５６６】
二重特異性抗体のＣＤ３−及びＣＤ１９−発現細胞への結合を、各々、Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｍｏｓを用いて評価した。無関係の抗体を、アイソタイプ対照として使用した。細胞を、９６−ウェルプレート(Corning-3799)に密度１０５個細胞／ウェルで播種し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄した。抗体を連続希釈し、細胞と４℃で１時間インキュベーションした。ＰＥ−コンジュゲートしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体(Jackson-109-115-098)を、検出のために使用した。洗浄及び再懸濁後、細胞を、フローサイトメトリー(Canto II, BD Biosciences)により分析した。データは、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。４パラメータ非線形回帰解析を使用し、Prism GraphPadソフトウェアを用い、ＥＣ５０値を算出した。
【０５６７】
（カニクイザルＣＤ３への結合）
【０５６８】
ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体のカニクイザルＣＤ３への結合を、タンパク質結合ＥＬＩＳＡにより試験した。９６−ウェル高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート(Nunc MaxiSorp、ThermoFisher、Thermo-442404)を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１８０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中の１μｇ／ｍｌカニクイザルＣＤ３イプシロンタンパク質(Acro、#CDE-C5226)の１００ｕｌにより、４℃で一晩コーティングした。全てのウェルを、ＰＢＳ／０．５‰Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）の３００μＬ／ウェルで、１回洗浄した。次にウェルを、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ(BOVOGEN、#BSAS)の２００μＬにより、室温で１時間ブロックし、ＰＢＳ／０．５‰Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）の３００μＬ／ウェルにより、３回洗浄した。一次抗体結合に関して、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中に連続希釈したＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体を、関連ウェル中に添加し、室温で２時間インキュベーションした。プレートを、先と同様に３回洗浄し、その後１００ｎｇ／ｍｌ二次抗体ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ(Bethyl、#A80-304P)の１００ｕｌを添加した。プレートを、室温で１時間インキュベーションし、引き続き先に説明したように６回洗浄した。結合検出のために、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液(Sigma-860336)１００ｕｌを、全てのウェルに、暗所室温で１０分間添加し、その後２Ｍ  ＨＣｌの１００ｕｌにより反応を停止した。カニクイザルＣＤ３への二重特異性抗体結合の程度を、SpectraMax(登録商標)M5eマイクロプレートリーダーを用い、ＯＤ４５０吸光度を測定することにより、決定した。適切ならば、結合ＥＣ５０値を、GraphPad Prism5ソフトウェアを使用する、４パラメータ非線形回帰解析から得た。
【０５６９】
（カニクイザルＣＤ１９への結合）
【０５７０】
ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体のＣＨＯＫ１細胞上に発現されたカニクイザルＣＤ１９標的タンパク質への結合を、フローサイトメトリー分析により決定した。簡単に述べると、カニクイザルＣＤ１９を過剰発現した安定した細胞株(WBP701.CHOK1.cPro1.C9、WuXi Biologics)を、トリプシンにより収集し、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中に１×１０６個細胞／ｍｌに希釈した。１×１０５個細胞／ウェル（１００ｕｌ）を、９６−ウェルＵ-プレート(Corning、#3799)の各ウェルに添加し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し(Eppendorf、#5810R)、その後上清を除去した。１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中に連続希釈した抗体を、ペレット化した細胞へ、１００ｕｌ／ウェルで添加し、４℃で１時間インキュベーションした。無関係のｈＩｇＧ４抗体を、アイソタイプ対照として使用した。細胞を、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳの１８０ｕｌ／ウェルで２回洗浄し、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。ペレット化された細胞を、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中に１：１５０希釈した蛍光−標識した抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体(Jackson、#109-115-098)の１００ｕｌ／ウェルの中に、４℃で３０分間、暗所において再懸濁した。その後細胞を、前述のように２回洗浄した。最終洗浄後、細胞を、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳの８０ｕｌ中に再懸濁し、蛍光値を、FACS Canto IIサイトメーター(BD Biosciences)により測定した。細胞表面結合した抗−ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体の量を、平均蛍光（ＭＦＩ）を測定することにより、評価した。ＦＡＣＳ生データを、FlowJoソフトウェアにより解析し、抗体を含まないか又は二次抗体のみを含有するウェルを使用し、バックグラウンド蛍光を確立した。結合ＥＣ５０値を、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用する、４パラメータ非線形回帰解析により得た。
【０５７１】
（ＦＡＣＳによる親和性）
【０５７２】
ＣＤ３及びＣＤ１９への結合親和性を、各々、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＲａｍｏｓ細胞を使用する、フローサイトメトリーにより決定した。細胞を、９６−ウェルＵ底プレート(BD)へ、密度５×１０４個細胞／ウェルで、移した。試験する抗体を、１％１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に、１：２倍で連続希釈し、細胞と４℃で１時間インキュベーションした。次に、プレートを１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を廃棄した。二次抗体Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ(Jackson、カタログ番号109-605-098)又はＦＩＴＣコンジュゲートしたヤギ抗−Ｈｉｓ(Bethyl、カタログ番号A190-113F)を、再懸濁した細胞へ添加し、暗所において４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡの１００μＬ中に再懸濁した。蛍光強度を、フローサイトメトリー(BD Canto II)により測定し、FlowJoにより解析した。蛍光強度を、定量的ビーズ(QuantumTM MESF Kits、Bangs Laboratories)を基に、結合した分子／細胞へ変換した。ＫＤを、Graphpad Prism5により算出した。
【０５７３】
（標的細胞への二重結合）
【０５７４】
二重特異性抗体のＣＤ３  Ｔ細胞及びＣＤ１９  Ｂ細胞へ架橋する能力を、ＦＡＣＳにより試験した。Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＲａｊｉ細胞を、２０ｎＭのCellTrace ファーレッド(Invitrogen-C34564)及び５０ｎＭのカルセイン−ＡＭ(Invitrogen-C3099)により個別に３７℃で３０分間予め標識し、密度１×１０６個細胞／ｍｌとした。予め標識した細胞ペレットを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡにより２回洗浄し、次に１：１で混合し、最終密度１×１０６個細胞／ｍｌとした。この細胞混合物を遠心分離し、１０ｎＭ抗体と共に再懸濁し、引き続き１時間インキュベーションした。インキュベーション直後に、細胞混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。架橋の割合（％）は、同時に標識されたFar-Red及びカルセインである事象(event)の割合（％）として計算した。
【０５７５】
（細胞傷害性アッセイ）
【０５７６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処理した静脈血から、フィコール-Paque PLUS(GE Healthcare-17-1440-03)密度勾配遠心分離により、新たに単離した。次に得られたＰＢＭＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮のために、EasySep(StemCell-19053)カラムを通過させ、これをエフェクター細胞として使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞溶解を媒介する抗体の有効性を、フローサイトメトリーにより決定した。細胞傷害性アッセイにおいて、標的細胞としてのＲａｊｉ  ＣＤ１９  Ｂ細胞を、２０ｎＭ CellTraceファーレッド(Invitrogen-C34564)により、３７℃で３０分間予め標識し、引き続き細胞ペレットを、１％ＦＢＳを補充したフェノール−非含有ＲＰＭＩ１６４０(Invitrogen-11835030)により、２回洗浄した。ファーレッド染色したＲａｊｉ細胞（２００００個細胞／ウェル）を、９６−ウェル丸底プレート(Corning-3799)において、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞／標的細胞の比は５：１）及び連続希釈した抗体と共に、３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、３μＭヨウ化プロピジウム(ＰＩ、Invitrogen-P3566)を、死滅した細胞を同定するために、完全に混合した。１５分後、細胞を、FACSCanto IIサイトメーターを使用するフローサイトメトリーにより分析した。Ａｂ−媒介した細胞傷害性を、ファーレッド−陽性標的細胞中のＰＩ−陽性標的細胞割合（％）として規定することができる。細胞傷害性のＥＣ５０は、Prismを用いて決定した。
【０５７７】
（Ｔ細胞活性化アッセイ）
【０５７８】
（分泌されたサイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγ）
【０５７９】
Ｔ細胞が活性化されるかどうかは、上清へ分泌されたＴＮＦα及びＩＦＮγの量により反映された。ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の単離手順は、セクション「Ｔ細胞活性化（細胞内サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγ染色）」に記載している。ＲａｊｉヒトＢ細胞（２×１０４個細胞／ウェル）、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞（１×１０５個細胞／ウェル）、及び抗体の混合物を、３７℃で２４時間同時インキュベーションした。上清を収集し、引き続き反応混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清中のＴＮＦα及びＩＦＮγの量を、各々、ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット(R&D-DY210)及びヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡセット（捕獲Ａｂ：Thermo Fisher-M700A、検出Ａｂ：Thermo Fisher-M701B、標準物質：PEROTECH- 300-02)により決定した。
【０５８０】
サンドイッチＥＬＩＳＡの手順は、以下であった。９６−ウェル高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート(ThermoFisher-442404)を、キットの仕様書に従い、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１８０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中の５０μｌ／ウェルの捕獲抗体により、４℃又は室温で、一晩コーティングした。全てのウェルを、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）の３００μｌ／ウェルにより３回洗浄し、このアッセイにおける後続の洗浄工程は、全て同様に行った。その後ウェルを、ＴＮＦαについてＰＢＳ／２％ＢＳＡ(BovoGen Biologicals-BSAS)により、及びＩＦＮγについて１００％カゼイン(Pierce-37528)により１時間ブロックし、３回洗浄し、引き続き収集した上記上清又は標準物質（５０μｌ／ウェル）の結合を室温で１時間行い、その後３回洗浄した。検出抗体結合のために、ＴＮＦαについてＰＢＳ／２％ＢＳＡ中及びＩＦＮγについて５０％カゼイン中に希釈した対応する抗体を、関連ウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、その後二次抗体ＳＡ−ＨＲＰの５０μｌを添加した。プレートを、室温で１時間インキュベーションし、引き続き前述のように６回洗浄した。結合検出のために、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液(Sigma-860336)5０μｌを、全てのウェルに１０分間添加し、その後２Ｍ  ＨＣｌの５０μｌにより、反応を停止した。ＴＮＦα及びＩＦＮγの量を、ＯＤ４５０吸光度を、SpectraMax(登録商標)M5eマイクロプレートリーダーを用い測定することにより、決定した。
【０５８１】
（Ｔ細胞活性化アッセイ−表面マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９発現）
【０５８２】
Ｔ細胞が活性化されたかどうかは、表面受容体ＣＤ２５及びＣＤ６９のシグナルを染色することにより反映された。ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の単離手順は、セクション「Ｔ細胞活性化（細胞内サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγ染色）」に記載されている。ＲａｊｉヒトＢ細胞（２×１０４個細胞／ウェル）、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞（１×１０５個細胞／ウェル）、及び抗体の混合物を、３７℃で２４時間同時インキュベーションした。１％ＢＳＡで１回洗浄後、細胞ペレットを、ＦＩＴＣマウス抗−ヒトＣＤ４(BD-550628)又はＰｅｒＣｐＣｙ５．５マウス抗−ヒトＣＤ８(BD-560662)、ＰＥマウス抗−ヒトＣＤ６９(BD-560968)及びＡＰＣマウス抗−ヒトＣＤ２５(BD-555434)を含有する染色緩衝液により再懸濁させ、引き続き４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を２回洗浄した後、ＦＩＴＣ又はＰｅｒＣｐＣｙ５．５陽性細胞中のＰＥ及びＡＰＣ陽性細胞の割合（％）を、フローサイトメトリーにより決定した。
【０５８３】
（熱安定性（ＤＳＦ））
【０５８４】
抗体の融解温度（Ｔｍ）は、QuantStudio(商標)7 FlexリアルタイムＰＣＲシステム(Applied Biosystems)を用いて調べた。抗体溶液１９μＬを、６２．５×ＳＹＰＲＯオレンジ溶液(Invitrogen)の１μＬと混合し、９６ウェルプレート(Biosystems)へ移した。このプレートを、２６℃から９５℃へ、０．９℃／分の速度で加熱し、生じた蛍光データを収集した。異なる温度に関する蛍光変化の負の微分係数を計算し、最大値を融解温度Ｔｍとして定義した。タンパク質が、複数のアンフォールディング転移を有する場合、最初の２つのＴｍを報告し、Ｔｍ１及びＴｍ２と称した。データ収集及びＴｍ計算は、操作ソフトウェアにより自動的に行った。
【０５８５】
（血清安定性）
【０５８６】
ヒト血液を、選択したドナーから、抗凝固剤を含まないポリスチレンチューブへ、新たに採取した。室温で３０分間静置した後、ヒト血液を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清層を収集した。遠心分離工程は、血清が透明になるまで繰り返した。検出した抗体を、収集した血清と１：９の比で混合し、アリコートを、３７℃で指定された時間で採取した：０日目、１日目、４日目、７日目及び１４日目。これらの試料を、異なる時点で液体窒素中で急速凍結し、使用時まで−８０℃で貯蔵した。試料を、ＦＡＣＳにより分析し、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ３  Ｔ細胞及びＲａｍｏｓ  ＣＤ１９  Ｂ細胞への結合能を、血清処理しない対応する抗体のそれとの比較により、評価した。
【０５８７】
（ＳＰＲによるＦｃγ受容体結合親和性）
【０５８８】
ＦｃγＲへの抗体結合親和性を、Biacore T200(又はBiacore 8K)を用いて検出した。各受容体を、抗−ｈｉｓ抗体固定したＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）上に捕獲した。異なる濃度の抗体を、センサーチップ上に、流量３０ｕＬ／分で注入し、会合相６０秒間、引き続きの解離相６０秒間であった。その後チップを、各結合サイクル後に、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）により再生した。
【０５８９】
ブランク表面及び緩衝液チャネルのセンサーグラムを、被験センサーグラムから減算した。実験データを、ラングミュア解析（ＦｃγＲＩに関して）又は定常状態モデル（他の受容体に関して）を使用し、１：１モデルにフィットさせた。分子量１５０ＫＤａを使用し、抗体の分子濃度を計算した。
【０５９０】
（ＥＬＩＳＡによるＣ１ｑ結合）
【０５９１】
ＥＬＩＳＡプレート(Nunc)を、抗体試料により、３μｇ／ｍＬで、４℃で一晩コーティングした。ブロッキング及び洗浄後、Ｃ１ｑを、６００μｇ／ｍＬから始めて、勾配希釈し、室温で２時間インキュベーションした。その後プレートを洗浄し、引き続きヒツジ抗−ヒトＣ１ｑ  Ａｂ−ＨＲＰと共に１時間インキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、その相互作用を、２Ｍ  ＨＣｌにより停止した。４５０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を用いて測定した。
【０５９２】
（ＳＰＲによるＦｃＲｎ結合親和性）
【０５９３】
ＦｃＲｎへの抗体結合親和性を、Biacore T200(又はBiacore 8K)を用いて検出した。各抗体を、CM5センサーチップ(GE)上に固定した。送液緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中の異なる濃度のＦｃＲｎを、センサーチップ上に、流量３０ｕＬ／分で注入し、会合相６０秒間、引き続きの解離相６０秒間であった。その後チップを、各結合サイクル後に、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により再生した。
【０５９４】
ブランク表面及び緩衝液チャネルのセンサーグラムを、被験センサーグラムから減算した。実験データを、定常状態モデルによりフィットさせた。分子量４５ＫＤａを使用し、ＦｃＲｎの分子濃度を計算した。
【０５９５】
（マウスのＲａｊｉ／ＰＢＭＣモデルにおける有効性試験）
【０５９６】
Ｒａｊｉ腫瘍細胞(ATCC(登録商標)CCL-86(商標))を、インビトロにおいて、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中の単層培養物として、空気中５％ＣＯ２の大気において、３７℃で維持した。腫瘍細胞は、週に２回慣習的に継代培養した。指数関数的増殖相の成長する細胞を収集し、腫瘍播種をカウントした。
【０５９７】
ヒトＰＢＭＣを、フィコール-Paque Plusを製造業者の指示に従い使用し、ヘパリン全血から単離した。
【０５９８】
各マウスを、Ｄ０に、ＰＢＳの０．２ｍｌ中のMatrigel及び新鮮ＰＢＭＣと混合したＲａｊｉ腫瘍細胞により、右側側腹部皮下に同時接種した。抗体注射は、３日目（Ｄ３）から行った（静注、ＢＩＷ×４回）。
【０５９９】
（試験製品調製）
【０６００】
【表４４】
2020534034.tif 000087
【０６０１】
(腫瘍測定及びエンドポイント)
【０６０２】
主要エンドポイントは、腫瘍成長が遅延されるか又はマウスが治癒したかであった。腫瘍サイズは、キャリパーを用い、２方向で週に２回測定し、容積は、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂは、各々、腫瘍の長径及び短径である）を用い、ｍｍ３で表した。Ｔ／Ｃ値（％）は、抗腫瘍効果の指標である。
【０６０３】
ＴＧＩは、各群について、式：ＴＧＩ（％）＝［１−（Ｔｉ−Ｔ０）／（Ｖｉ−Ｖ０）］×１００を用いて計算した；Ｔｉは、所定日の治療群の平均腫瘍容積であり、Ｔ０は、治療開始日の治療群の平均腫瘍容積であり、Ｖｉは、Ｔｉと同じ比のビヒクル対照群の平均腫瘍容積であり、及びＶ０は、治療開始日のビヒクル群の平均腫瘍容積である。
【０６０４】
（カニクイザルＰＫ、毒性及び免疫原性）
【０６０５】
１匹の雄及び１匹の雌のカニクイザルに、ＷＢＰ３４３８の１ｍｇ／ｋｇを、ボーラス投与により１回投与した。この製剤は、２０ｍＭ NaAc-HAc、７．０％（ｗ／ｗ）ショ糖、０．０２％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０、ｐＨ５．０中に製剤化した。ＰＫ用血液試料は、投与前（−１日目）、０．２５時間、０．５時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、３日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に採取した。抗薬物抗体（ＡＤＡ）試料は、３日目、１４日目（３１２時間）及び２８日目（４８０時間）に採取した。
【０６０６】
血清試料中のＷＢＰ３４３８及びＡＤＡの血清濃度を、ＥＬＩＳＡにより決定した。サルにおけるＷＢＰ３４３８の血清濃度は、Phoenix WinNonlinソフトウェア(バージョン6.3、Pharsight, Mountain View, CA)を使用することにより、ノンコンパートメント薬物動態分析に供した。線形／対数台形公式を、ＰＫパラメータを得るために適用した。
【０６０７】
全般的健康状態及び外観に関するケージサイド観察、特に皮膚過敏を、観察した。血液学（ＣＢＣ）のための全血試料分析及び化学検出のための血清分析を、各々、血液学的分析装置(ADVIA2120)及び化学(HITACHI 7180)により決定した。
【０６０８】
結果
【０６０９】
（カニクイザルＣＤ１９発現細胞株の作製）
【０６１０】
カニクイザルＣＤ１９発現細胞株ＷＢＰ７０１．ＣＨＯ−Ｋ１．ｃｐｒｏ１．ＦＬ．Ｃ９の発現は、フローサイトメトリーにより、抗−ＣＤ１９抗体を用いて検出した。ＷＢＰ７０１．ＣＨＯ−Ｋ１．ｃｐｒｏ１．ＦＬ．Ｃ９は、サルＣＤ１９の高発現を示した（図３７）。
【０６１１】
（ＷｕＸｉＢｏｄｙ作製及び最適化）
【０６１２】
図１は、試験した抗体及びフォーマットの概略的表示を示す。抗−ＣＤ３抗体Ｔ３及び抗−ＣＤ１９抗体Ｕ４の両方を開発した。定型的抗体に直交する独自の軽鎖−重鎖境界面をデザインするために、Ｔ３の定常領域（ＣＬ及びＣＨ１）を、ＴＣＲの定常ドメインにより置き換えた。二重特異性抗体フォーマットＥ１７及びＦ１６をデザインするために、Ｆｃドメインの「ノブイントゥホール」変異との接続したＴＣＲ−修飾したＴ３及び天然型Ｕ４を、使用した。
【０６１３】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ由来の抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ１９結合部分の可変重鎖及び軽鎖配列を、以下に提供する：
【０６１４】
【表４５】
2020534034.tif 000088
【０６１５】
完全長Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ配列を、以下に提供する：
【０６１６】
【表４６】
2020534034.tif 000089
【０６１７】
【表４７】
2020534034.tif 000090
【０６１８】
（Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの作製）
【０６１９】
抗体Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの発現力価は、一過性発現を通じて９０ｍｇ／Ｌよりも高い。２工程精製後、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの純度は、９７．５％に達した（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、図３９）。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、見かけの分子量７５ｋＤａ、５５ｋＤａ及び２５ｋＤａで移動し、これらは２本の重鎖及び２本の軽鎖に対応している。２本の軽鎖は、類似した分子量のために、重複している。この抗体は、非還元条件下では、見かけの分子量２００ｋＤａで移動し、これはインタクトな二重特異性分子を示している（図３８）。
【０６２０】
（Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの作製）
【０６２１】
抗体Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの発現力価は、一過性発現を通じて１００ｍｇ／Ｌよりも高い。２工程精製後、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの純度は、９５％に達した（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、図４１）。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、見かけの分子量５４ｋＤａ、５６ｋＤａ及び２５ｋＤａで移動し、これらは２本の重鎖及び２本の軽鎖に対応している。２本の軽鎖は、類似した分子量のために、重複している。この抗体は、非還元条件下では、見かけの分子量１５０ｋＤａで移動し、これはインタクトな二重特異性分子を示している（図４０）。
【０６２２】
（標的結合）
【０６２３】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＣＤ１９及びＣＤ３への結合を、Ｒａｍｏｓ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞上で、フローサイトメトリーにより試験した（図４２Ａ−４２Ｂ）。抗体Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、Ｒａｍｏｓ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞に対し、各々、ＥＣ５０値が１５．６ｎＭ及び４７ｎＭの、強力な結合活性を示した。
【０６２４】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＣＤ１９及びＣＤ３への結合を、Ｒａｍｏｓ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞上で、フローサイトメトリーにより試験した（図４３Ａ−４３Ｂ）。抗体Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、Ｒａｍｏｓ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞に対し、各々、ＥＣ５０値が１．８ｎＭ及び１９．３ｎＭの、強力な結合活性を示した。
【０６２５】
（交差種結合）
【０６２６】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのカニクイザルＣＤ１９への結合を、ＷＢＰ７０１．ＣＨＯ−Ｋ１．ｃｐｒｏ１．ＦＬ．Ｃ９細胞（ＣＤ１９−発現細胞）において、フローサイトメトリーにより試験した（図４４）。結合ＥＣ５０は、２６ｎＭであった。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのカニクイザルＣＤ３への結合を、Ｗ３３１−ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（カニクイザルＣＤ３イプシロンタンパク質）において、ＥＬＩＳＡにより試験した（図４５）。結合ＥＣ５０は、０．０４ｎＭであった。
【０６２７】
（標的細胞への親和性）
【０６２８】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのヒトＣＤ１９及びＣＤ３への結合親和性を、Ｒａｍｏｓ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞において、フローサイトメトリーにより試験した。結合ＩｇＧ／遊離ＩｇＧ、対、結合ＩｇＧを、図４６Ａ及び４６Ｂにプロットした。ＣＤ１９及びＣＤ３への結合のフィットしたＫＤ値は、各々、２３ｎＭ及び９．０ｎＭであった。
【０６２９】
（標的細胞でのデュアル結合）
【０６３０】
ＣＤ３  Ｔ細胞及びＣＤ１９  Ｂ細胞を架橋するＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの活性を、予め標識したＪｕｒｋａｔ細胞及びＲａｊｉ細胞を用い、フローサイトメトリーにより試験した（図４７Ａ−４７Ｂ）。Ｑ２は、架橋したＪｕｒｋａｔ細胞及びＲａｊｉ細胞の集団を示す。陰性対照と比較すると、おおまかに細胞の１８％は、二重特異性抗体Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰを通じて架橋された。
【０６３１】
（細胞傷害性アッセイ）
【０６３２】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの細胞傷害活性を、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＲａｊｉ細胞を用いて評価した。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、４時間のインキュベーション後に迅速且つ有効な細胞溶解を誘導し（図４８Ａ）、ＥＣ５０値は１５ｎＭであった。最大細胞死滅割合は、９０％であった。
【０６３３】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの細胞傷害活性を、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＲａｊｉ細胞を用いて評価した。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｆ１６−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、４時間のインキュベーション後に迅速且つ有効な細胞溶解を誘導し（図４８Ｂ）、ＥＣ５０値は３．２ｎＭであった。最大細胞死滅割合は、９０％であった。
【０６３４】
（標的特異的Ｔ細胞活性化）
【０６３５】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰを、ＣＤ１９＋標的細胞の存在又は非存在下で、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５を通じて、Ｔ細胞活性化を示すアッセイにおいて調べた。結果は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、ＣＤ１９＋標的細胞の存在下でのみ、用量依存型の様式でＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の発現を誘導することを明らかにした（図４９Ａ−４９Ｄ）。Ｂ細胞が存在しない場合、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットにおいて、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現は、認められなかった。
【０６３６】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰはまた、ＣＤ１９＋標的細胞の存在又は非存在下で、サイトカイン放出のＴ細胞活性化アッセイにおいて調べた。結果は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、ＣＤ１９＋標的細胞の存在下でのみ、用量依存型の様式でＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出を誘導することを明らかにした（図５０Ａ−５０Ｄ）。Ｂ細胞が存在しない場合、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットにおいて、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αは検出されなかった。
【０６３７】
（熱安定性）
【０６３８】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの熱安定性を、リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＴｍ１及びＴｍ２は、６０．２℃及び７２．７℃である。
【０６３９】
（血清安定性）
【０６４０】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰを、血清中、３７℃で１４日間インキュベーションした。０、１、４、７及び１４日間インキュベーションした抗体の結合活性を、フローサイトメトリーにより検出した。結果は、Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＣＤ３及びＣＤ１９の両細胞への結合活性は、ヒト血清中で１４日間インキュベーションした後、変化しなかったことを示している（図５１Ａ−５１Ｂ）。
【０６４１】
（Ｆｃγ受容体結合）
【０６４２】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１６７）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１６７）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１７６）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１７６）及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合活性を、ＳＰＲにより調べた。親和性は、表３９にまとめた。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、全てのＦｃγ受容体に対し、典型的ヒトＩｇＧ４結合親和性を示した。
【０６４３】
【表４８】
2020534034.tif 000091
【０６４４】
抗体のＣ１Ｑへの結合活性を、ＥＬＩＳＡにより試験した。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、ＥＬＩＳＡにおいて結合シグナルを示さず（図５２）、対照ヒトＩｇＧ１抗体は、通常の結合シグナルを示した。
【０６４５】
（ＦｃＲｎ結合）
【０６４６】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＦｃＲｎへの結合を、ＳＰＲにより、ｐＨ６．０で試験した。親和性は、ヒトＩｇＧ４のＦｃＲｎへの典型的親和性である、２．５８μＭにフィットした。
【０６４７】
（ＰＢＭＣ／Ｒａｊｉ異種移植モデルの有効性試験）
【０６４８】
この試験において、ＮＯＧマウスにおいてＲａｊｉ細胞を有する混合したＰＢＭＣヒト化モデルにおけるＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの抗−腫瘍有効性を、調べた。腫瘍成長曲線を、図５３に示している。
【０６４９】
１４日目に、アイソタイプ対照治療群の平均腫瘍サイズは、３４２ｍｍ３に達した。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩＧ４．ＳＰの１．５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇによる治療は、著しい抗腫瘍活性を生じた。平均腫瘍サイズは、各々、７８ｍｍ３（Ｔ／Ｃ＝２３．０％、ＴＧＩ＝９３．９％、ｐ＝０．０１６）及び７５ｍｍ３（Ｔ／Ｃ＝２２．０％、ＴＧＩ＝９５．３％、ｐ＝０．０１４）であり、且つ高投与量レベル群の１匹の動物の腫瘍は、根絶されていた。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、非常に低い投与量（０．０６ｍｇ／ｋｇ）では、いかなる抗腫瘍活性も示さなかった。
【０６５０】
（カニクイザルにおけるＷｕＸｉＢｏｄｙの薬物動態）
【０６５１】
カニクイザル血清中のＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの濃度を、ＥＬＩＳＡにより試験した（図５４）。計算したＰＫパラメータを、表４０に列挙した。１ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ注射に関するＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの半減期は、１５２時間であった。Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、チンパンジーにおいて非常に短い半減期（１．５〜２．６時間）を有するブリナツモマブ(欧州医薬品庁審査報告書EMA/CHMP/469312/2015)よりも、はるかに長い半減期をサルにおいて示した。
【０６５２】
【表４９】
2020534034.tif 000092
【０６５３】
（毒性）
【０６５４】
全てのサルは、本試験の全過程期間中、本薬物の忍容性が良かった。本試験の生存相(in-life phase)において、有害作用は認められなかった。食物摂取及び体重に明らかな変化はなかった。ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＷＢＣ、ＨＧＢ及びＨＣＴを含む、血液学及び臨床化学に関するパラメータは一般に、基準範囲内であった。
【０６５５】
（免疫原性）
【０６５６】
Ｗ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの免疫原性試験結果を、図５５Ａ−５５Ｂに示している。投与後３、１４及び２８日目のサル血清中のＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の力価は、投薬前と有意差を示さなかった。従ってＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの１ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶ注射は、サルにおいて免疫原性ではないように見える。
【０６５７】
（実施例１８：二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＷｕＸｉＢｏｄｙ）
（背景）
【０６５８】
癌免疫療法は、癌治療に関する活発な研究領域となってきている。細胞傷害性Ｔリンパ球−関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）は、免疫チェックポイントの検証された標的の一つである。Ｔ細胞活性化後、ＣＴＬＡ−４はそれらのＴ細胞上に、迅速に、一般にＴＣＲとの抗原エンゲージメントの１時間以内に、発現される。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８との競合を通じて、Ｔ細胞のシグナリングを阻害することができ、これはよく特徴付けられたＴ細胞共刺激シグナルを媒介する。抗原提示細胞上のそのリガンドＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６（Ｂ７−２）へのＣＤ２８結合は、インターロイキン−２及び抗−アポトーシス因子の産生を誘導することにより、Ｔ細胞増殖へつながる。ＣＴＬＡ−４のＣＤ８０及びＣＤ８６への親和性結合が、ＣＤ２８のそれよりもはるかに高いために、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ８０及びＣＤ８６上のＣＤ２８結合を打ち負かすことができ、これはＴ細胞活性化の抑制につながる。ＣＴＬＡ−４は、活性化されたＴ細胞上の誘導された発現に加え、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の表面上にも構成的に発現され、このことは、ＣＴＬＡ−４は、接触媒介性抑制に必要であり、且つトランスフォーミング増殖因子β及びインターロイキン−１０などの免疫抑制性サイトカインのＴｒｅｇ産生と関連していることを示唆している。
【０６５９】
ＣＴＬＡ−４ブロックは、数多くの前臨床試験及び臨床試験において明らかにされたように、腫瘍退縮を誘導することができる。ＣＴＬＡ−４に対する２種の抗体が、臨床開発中である。イピリムマブ(MDX-010、BMS-734016)はＩｇＧ１−κアイソタイプの完全ヒト抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体であるが、これは進行したメラノーマの治療のための単剤療法として承認された免疫調節薬である。提唱されたイピリムマブの作用機序は、活性化されたＴ細胞のサブセット上で発現されるＣＴＬＡ−４の、プロフェッショナル抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６分子との相互作用の妨害である。これは、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６の相互作用により促進されたＴ細胞活性化の阻害性調節のブロックに起因した、Ｔ細胞の増強を生じる。生じるＴ細胞の活性化、増殖及び腫瘍へのリンパ球浸潤は、腫瘍細胞死に繋がる。その市販の剤形は、点滴用液剤について濃度５ｍｇ／ｍｌである。イピリムマブはまた、前立腺癌及び肺癌を含む他の腫瘍型について臨床研究中でもある。臨床開発中の第二の抗−ＣＴＬＡ−４抗体であるトレメリムマブは、メラノーマ及び悪性中皮腫の単剤療法において評価された。
【０６６０】
プログラム細胞死−１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９）は、活性化されたＴ細胞及び他の免疫細胞上に発現されるＣＤ２８ファミリーの一員である。ＰＤ−１のエンゲージメントは、これらの免疫細胞の機能を阻害する。ＰＤ−１は、２つの公知のリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）を有し、両方共Ｂ７ファミリーに属する。ＰＤ−Ｌ１発現は、リンパ球及び末梢組織の様々な細胞型上で誘導性であるのに対し、ＰＤ−Ｌ２は、樹状細胞を含む骨髄細胞へ制限される。ＰＤ−１経路の主な役割は、組織及び臓器における炎症性免疫応答を減弱することである。
【０６６１】
ＣＴＬＡ−４をブロックするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（イピリムマブ）及びＰＤ−１をブロックするｍＡｂ（ニボルマブ）の併用による免疫療法は、いずれかのｍＡｂ単独により認められるものを超える臨床恩恵を示している。二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＷｕＸｉＢｏｄｙは、両方のチェックポイント分子の同時ブロックを通じて抗腫瘍免疫を誘導するために、開発された。
【０６６２】
材料及び方法
【０６６３】
（全般的材料）
【０６６４】
全般的研究材料及びそれらの供給元を、下記表に列挙している：
【０６６５】
【表５０−１】
2020534034.tif 000093
【表５０−２】
2020534034.tif 000094
【０６６６】
（可溶性抗原の作製）
【０６６７】
ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン配列をコードしているＤＮＡ配列(Uniport番号：Q15116)を、Sangon Biotech(上海、中国)において合成し、次にＣ−末端に６×ｈｉｓを持つ改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターへサブクローニングした。ヒト、カニクイザル及びマウスのＣＴＬＡ−４並びにマウス及びカニクイザルのＰＤ−１のタンパク質を、Sino Biologicalから購入した。
【０６６８】
Ｅｘｐｉ２９３細胞(Invitrogen-A14527)を、精製した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３により形質移入した。細胞を５日間培養し、上清を、Ni-NTAカラム(GE Healthcare、175248)を使用するタンパク質精製のために収集した。得られたヒトＰＤ−１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣにより品質管理（ＱＣ）し、その後−８０℃で貯蔵した。
【０６６９】
（参照抗体の作製）
【０６７０】
抗−ＣＴＬＡ−４抗体（ＷＢＰ３１６−ＢＭＫ１）、抗−ＰＤ−１抗体（ＷＢＰ３０５−ＢＭＫ１）の可変領域をコードしているＤＮＡ配列を、Sangon Biothech(上海、中国)において合成し、次にヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域を持つ改変したｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターへサブクローニングした。抗−ＰＤ−１  ＷＢＰ３０５５−１．１５３．７．ｕＩｇＧ４ｋ及びＷＢＰ３０５５−１．１０３．１１．ｕＩｇＧ４ｋ抗体が、ヒトＰＤ−１及びマウスＰＤ−１によるラットの免疫処置後に産生され、これらをＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）フォーマットに変換した。ベンチマーク二重特異性抗−ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体（ＷＢＰ３２４−ＢＭＫ１．ＩｇＧ１．ＫＤＬ）をコードしているＤＮＡ配列を合成した。
【０６７１】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子を含むプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞へ同時形質移入した。細胞を、５日間培養し、上清を収集し、プロテインＡカラム(GE Healthcare、175438)及びプロテインＧカラム(GE Healthcare、170618)を使用し、タンパク質精製した。得られた抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣにより試験し、その後−８０℃で貯蔵した。
【０６７２】
（標的−発現細胞株の作製）
【０６７３】
リポフェクタミン２０００を使用し、ＣＨＯ−Ｓ細胞又は２９３Ｆ細胞を、完全長ヒトＰＤ−１又はマウスＰＤ−１をコードしている遺伝子を含む発現ベクターにより、形質移入した。細胞を、適切な選択マーカーを含有する培地において培養した。ヒトＰＤ−１高発現性安定細胞株（ＷＢＰ３０５．ＣＨＯ−Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６）及びマウスＰＤ−１高発現性安定細胞株（ＷＢＰ３０５．２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｂ４）を、限界希釈により得た。
【０６７４】
（二重特異性の抗−ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体の作製）
【０６７５】
Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの構築：５’末端から３’末端へ連結された、抗−ＰＤ−１重鎖可変領域、定常領域１、抗−ＣＴＬＡ−４重鎖可変領域、ＴＣＲベータ定常領域、並びにＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域２及び３をコードしているＤＮＡ配列を、改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターへクローニングした。ＴＣＲアルファ定常領域の５’側の抗−ＣＴＬＡ−４抗体軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ配列を、別の改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにクローニングした。抗−ＰＤ−１軽鎖を、第三の改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターへクローニングした。
【０６７６】
Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの構築：５’末端から３’末端へ連結された、抗−ＰＤ−１重鎖可変領域、ＴＣＲベータ鎖定常領域、抗−ＣＴＬＡ−４重鎖可変領域及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）をコードしているＤＮＡ配列を、改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターへクローニングした。ＴＣＲアルファ定常領域の５’側の抗−ＰＤ−１抗体軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ配列を、別の改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにクローニングした。抗−ＣＴＬＡ−４軽鎖を、第三の改変したｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターへクローニングした。
【０６７７】
Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの関連配列を、以下に提供する：
【０６７８】
【表５１】
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【０６７９】
Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの関連配列を、以下に提供する：
【０６８０】
【表５２】
2020534034.tif 000096
【０６８１】
両方の二重特異性抗体に関して、１種の重鎖発現ベクター及び２種の軽鎖発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３細胞(ThermoFisher-A14527)へ、製造業者の指示に従い、同時形質移入した。形質移入の５日後、上清を収集し、プロテインＡカラム(GE Healthcare-17543802)及び更にサイズ排除クロマトグラフィー(GE Healthcare-17104301)を用いて精製した。抗体濃度は、Nano Dropにより測定した。エンドトキシン検出キット(GenScript-L00350)を用いることにより、低エンドトキシンレベルが確認され、２種の二重特異性抗体のエンドトキシンレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満であった。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ−ＳＥＣにより評価した。
【０６８２】
（インビトロ特徴決定）
【０６８３】
（示差走査蛍光測定（ＤＳＦ））
【０６８４】
ＤＳＦアッセイを、7500 FastリアルタイムＰＣＲシステム(Applied Biosystems)を用いて行った。簡単に述べると、二重特異性抗体溶液１９μＬを、６２．５×ＳＹＰＲＯオレンジ溶液(TheromFisher-S6650)１μＬと混合し、９６ウェルプレートへ加えた。このプレートを、２６℃から９５℃まで、２℃／分の速度で加熱し、生じる蛍光データを収集した。データを、その操作ソフトウェアにより自動的に解析し、Ｔｈを、温度に関する発生蛍光データの負の微分係数の最大値を採用することにより、算出した。Ｔｏｎは、転移前ベースラインから減少するように始まる負の微分係数プロットの温度として、おおまかに決定することができる。
【０６８５】
（ＦＡＣＳによるヒトＰＤ−１結合）
【０６８６】
操作したヒトＰＤ−１発現細胞Ｗ３０５−ＣＨＯ−Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６を、Ｕ−底９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)に、１×１０５個細胞／ウェルで播種した。２００ｎＭから０．００２ｎＭまで、１％ＢＳＡ  ＤＰＢＳにおいて３．１６倍でタイトレーションした抗体を、細胞へ添加した。プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。１：１２５希釈したＰＥ−標識ヤギ抗−ヒト抗体(Jackson 109-115-098)の１００μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。抗体の細胞上への結合を、フローサイトメトリーにより試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をFlowJoにより解析した。
【０６８７】
（ＦＡＣＳによるカニクイザルＰＤ−１−結合）
【０６８８】
操作したカニクイザルＰＤ−１発現細胞Ｗ３０５−２９３Ｆ．ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＦＬ．ｐｏｏｌを、Ｕ底９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)に、１×１０５個細胞／ウェルで播種した。４０μｇ／ｍｌから０．０００１５２６μｇ／ｍｌまで、１％ＢＳＡ  ＤＰＢＳにおいて４．０倍でタイトレーションしたＡｂを、細胞へ添加した。プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、１：１５０希釈したＰＥ−標識ヤギ抗−ヒト抗体(Jackson 109-115-098)の１００μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。抗体の細胞への結合を、フローサイトメトリーにより試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をFlowJoにより解析した。
【０６８９】
（ＦＡＣＳによるヒトＣＴＬＡ−４結合）
【０６９０】
操作したヒトＣＴＬＡ−４発現細胞Ｗ３１６−２９３Ｆ．ｈＰｒｏ１．ＦＬを、Ｕ−底９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)に、１×１０５個細胞／ウェルで播種した。２００ｎＭから０．００２ｎＭまで、１％ＢＳＡ  ＤＰＢＳにおいて３．１６倍でタイトレーションしたＡｂを、細胞へ添加した。プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、１：１５０希釈したＰＥ−標識ヤギ抗−ヒト抗体(Jackson 109-115-098)の１００μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。抗体の細胞への結合を、フローサイトメトリーにより試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をFlowJoにより解析した。
【０６９１】
（ＦＡＣＳによるカニクイザルＣＴＬＡ−４結合）
【０６９２】
操作したヒトＣＴＬＡ−４発現細胞Ｗ３１６−２９３Ｆ．ｃｙｎｏＰｒｏ１．Ｆ１．Ｐｏｏｌを、Ｕ底９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)に、１×１０５個細胞／ウェルで播種した。４０μｇ／ｍｌから０．００００４μｇ／ｍｌまで、１％ＢＳＡ  ＤＰＢＳにおいて４．０倍でタイトレーションしたＡｂを、細胞へ添加した。プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、１：１５０希釈したＰＥ−標識ヤギ抗−ヒト抗体(Jackson 109-115-098)の１００μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。抗体の細胞への結合を、フローサイトメトリーにより試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をFlowJoにより解析した。
【０６９３】
（ＥＬＩＳＡによるｈＰＤ−１及びｈＣＴＬＡ−４デュアル結合）
【０６９４】
二重特異性抗体は、ｈＰＤ−１及びｈＣＴＬＡ−４の両方に結合することができるかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、以下のように開発した。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート(Nunc MaxiSorp、ThermoFisher)を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌ抗原−１（ｈＰＤ−１−ＥＣＤ、Ｗ３０５−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）により、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中に溶解した２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(Pierce)による１時間のブロック工程後、２％ＢＳＡ  ＰＢＳを含有するＰＢＳ中の異なるＰＤ−１×ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の連続希釈物を、プレート上で室温で１時間インキュベーションした。インキュベーションに続けて、プレートを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。０．５μｇ／ｍｌ抗原−２（ｈＣＴＬＡ−４−ＥＣＤ、Ｗ３１６−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ．ビオチン）をプレートへ添加し、この混合物を１時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Lifetechnologies、#SNN1004)（１：２００００希釈した）を添加し、プレート上で、室温で１時間インキュベーションした。０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで６回洗浄した後、検出のために、１ウェルあたり１００μＬテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。およそ５分後、１００μＬ／ウェルの２Ｍ  ＨＣｌの添加により、反応を停止した。ウェルの吸光度を、マルチウェルプレートリーダー(SpectraMax(登録商標)M5e)により、４５０ｎｍで測定した。
【０６９５】
（ＦＡＣＳによるｈＰＤ−１及びｈＣＴＬＡ−４デュアル結合）
【０６９６】
この二重特異性抗体が、ｈＰＤ−１及びｈＣＴＬＡ−４の両方へ結合することができるかどうかを試験するために、ＦＡＣＳアッセイを以下のように開発した。操作したヒトＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４発現細胞Ｗ３０５−ＣＨＯ−Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６及びＷ３１６−２９３Ｆ．ｈＰｒｏ１．Ｆ１を、各々、５０ｎＭのカルセイン−ＡＭ(Corning-354216)及び２０ｎＭのファーレッド(Invitrogen-C34572)で、３７℃で２０分間染色した。ＰＢＳ中に溶解した１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(Pierce)で２回洗浄した後、混合したｈＰＤ−１（５Ｅ４）及びｈＣＴＬＡ−４（５Ｅ４）細胞を、Ｕ底９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)中に１×１０５個細胞／ウェルで播種した。上清の除去後、１％ＢＳＡ  ＤＰＢＳで７．５ｎＭから０．８３ｎＭまで３×連続希釈した抗体を、細胞へ添加した。プレートを、４℃で１．５時間インキュベーションした。細胞を、フローサイトメトリーにより試験し、二重陽性細胞の割合（％）を、FlowJoにより解析した。
【０６９７】
（ヒトＰＤ−１−競合的ＦＡＣＳ）
【０６９８】
この二重特異性抗体が、ｈＰＤ−１タンパク質へのｈＰＤ−Ｌ１結合をブロックするかどうかを試験するために、競合的ＦＡＣＳを行った。簡単に述べると、操作されたヒトＰＤ−１発現細胞Ｗ３０５−ＣＨＯ−Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６（研究室内）を、Ｕ底９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)内に１×１０５個細胞／ウェルで播種し、５ｕｇ／ｍｌのヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質Ｗ３１５−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃと結合させた２００ｎＭから０．００２ｎＭまでのヒトＰＤ−Ｌ１を、細胞へ添加した。プレートを、４℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、Ｗ３１５−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃのヒトＰＤ−１発現細胞への結合を、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−マウス抗体(abcam 98716、１：１２５）により検出した。抗体の細胞への競合結合を、フローサイトメトリーにより試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、FlowJoにより解析した。
【０６９９】
（ヒトＣＤ８０へのヒト／カニクイザルＣＴＬＡ−４結合のブロック）
【０７００】
ＥＬＩＳＡを使用し、この二重特異性抗体は、ｈＣＤ８０タンパク質へのｈＣＴＬＡ−４結合をブロックするかどうかを試験した。簡単に述べると、平底９６−ウェルプレート(Nunc MaxiSorp、ThermoFisher)を、０．５μｇ／ｍｌ  Ｗ３１６−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃにより、４℃で一晩予めコーティングした。２％ＢＳＡでブロックした後、０．５μｇ／ｍｌヒトＣＤ８０タンパク質Ｗ３１６−ｈＰｒｏ１Ｌ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓに結合させた４００ｎＭから０．０４ｎＭのＡｂまでの、３．１６倍でタイトレーションしたＡｂの１００μＬを、各ウェルにピペッティングし、外界温度で１時間インキュベーションした。インキュベーションに続き、プレートを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで３回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌビオチン−標識抗−Ｈｉｓ  ｍＡｂ(GenScript-A00613)の１００μＬ／ウェルを、プレートへ添加し、１時間インキュベーションした。６回洗浄後、Ｗ３１５−ｈＰｒｏ１Ｌ１．ＥＣＤ．ＨｉｓのＷＢＰ３１６−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃへの結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Lifetechnologies、#SNN1004)（１：２００００希釈した）により検出した。ＴＭＢ基質１００μＬを分散することにより、発色させ、次に１００μＬの２Ｎ  ＨＣｌにより停止した。吸光度を、マイクロプレート分光光度計(SpectraMax(登録商標)M5e)を用い、４５０ｎｍで測定した。
【０７０１】
競合的ＦＡＣＳを使用し、これらの抗体は、細胞表面上のｈＣＤ８０へのヒト又はカニクイザルＣＴＬＡ−４結合をブロックするかどうかを試験した。簡単に述べると、ヒトＣＤ８０−発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、９６−ウェルプレート(COSTAR 3799)の各ウェルへ、１×１０５個／ウェルで添加し、１５００ｒｐｍで、４℃で４分間遠心分離し、その後上清を除去した。被験抗体の連続希釈物、陽性対照及び陰性対照を、ビオチン化したヒトＣＴＬＡ−４．ＥＣＤ．ｈＦｃと混合した。細胞表面上のリガンドの異なる密度のために、ｈＣＴＬＡ−４．ＥＣＤ．ｈＦｃ−ビオチンの０．０６６〜０．０３７μｇ／ｍＬを、ヒトＣＤ８０−発現細胞のために使用した。次に、抗体及びＣＴＬＡ−４の混合物を、細胞へ添加し、４℃で１時間インキュベーションした。細胞を、２００μｌのＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）により２回洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液中に１〜６００希釈したストレプトアビジンＰＥ(BD Pharmingen-554061)を、細胞へ添加し、４℃で１時間インキュベーションした。追加の洗浄工程を、２００μＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液により２回行い、引き続き１５００ｒｐｍで、４℃で４分間遠心分離した。最後に、細胞を、１００μＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液中に再懸濁し、蛍光値を、フローサイトメトリーにより測定し、FlowJoにより解析した。
【０７０２】
（ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１への親和性）
【０７０３】
ＳＰＲ技術を使用し、抗体のＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１のＥＣＤへの会合定数（ｋａ）及び解離定数（ｋｄ）を測定した。親和定数（ＫＤ）を、結果的に決定した。
【０７０４】
Biacore T200、シリーズＳセンサーチップＣＭ５、アミン結合キット、及び１０×ＨＢＳ−ＥＰは、GE Healthcareから購入した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体は、Jackson ImmunoResearch Lab(カタログ番号109-005-098)から購入した。固定工程において、活性化緩衝液を、４００ｍＭ  ＥＤＣ及び１００ｍＭ  ＮＨＳを、注入の直前に混合することにより調製した。ＣＭ５センサーチップを、活性化緩衝液により４２０秒間活性化した。次に１０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）中のヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ抗体３０μｇ／ｍＬを、Ｆｃ１−Ｆｃ４チャネルへ、２００秒間かけて、流量５μＬ／分で注入した。チップは、１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ(GE)により、失活させた。その後抗体を、チップ上で捕獲した。簡単に述べると、送液緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋）中の抗体４μｇ／ｍＬを、Ｆｃ３チャネルへ、３０秒かけて、流量１０μＬ／分で個別に注入した。ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１の被検体ＥＣＤの８種の異なる濃度（２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５及び０．１５６２５ｎＭ）及びブランク送液緩衝液を、Ｆｃ１−Ｆｃ４チャネルへ、流量３０μＬ／分で順に、１２０秒の会合相、それに続く２４００秒の解離相で注入した。各解離相の後、再生緩衝液（１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５）を、１０μＬ／分で３０秒間注入した。
【０７０５】
（ヒト血清安定性）
【０７０６】
抗体を、新たに単離されたヒト血清中で、３７℃でインキュベーションした。指定した時点で、血清処理試料のアリコートを、インキュベーターから取りだし、液体窒素で瞬間凍結し、その後デュアル−結合ＥＬＩＳＡ試験が準備できるまで、−８０℃で貯蔵した。凍結試料は、安定性試験の直前に、迅速に解凍した。簡単に述べると、プレートを、ｈＣＴＬＡ４．ＥＣＤ．ｈＦｃ（研究室内）の０．５μｇ／ｍＬにより、４℃で一晩予めコーティングした。１時間ブロックした後、被験抗体を、様々な濃度で、プレートへ添加した。プレートを、外界温度で１時間インキュベーションした。インキュベーションに続けて、プレートを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。次に０．１μｇ／ｍｌのｈＰＤ−１−ＥＣＤ．ビオチンをプレートへ添加し、この混合物を、１時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Lifetechnologies、#SNN1004)（１：２００００希釈した）を添加し、プレート上で室温で１時間インキュベーションした。０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで６回洗浄した後、検出のために、１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。反応を、およそ５分後に、１００μＬ／ウェルの２Ｍ  ＨＣｌの添加により停止した。ウェルの吸光度を、マイクロウェルプレートリーダー(SpectraMax(登録商標)M5e)により、４５０ｎｍで測定した。
【０７０７】
結果
【０７０８】
（二重特異性抗体の発現及び精製）
【０７０９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５６Ａ）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図５６Ｂ）の両方で分析した、二重特異性抗体の純度は、９０％以上であった。
【０７１０】
（ＷｕＸｉＢｏｄｙのＤＳＦ）
【０７１１】
ＤＳＦを使用し、ＷｕＸｉＢｏｄｙのＴｍを測定した。図５７に示したように、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰは、各々、６０．８℃及び６３．４℃のＴｈ１を有した。
【０７１２】
（ヒト及びカニクイザルＰＤ−１への結合）
【０７１３】
この二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−１（図５８）及びカニクイザルＰＤ−１（図５９）へ結合することができる。Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのヒトＰＤ−１−結合活性は、ＦＡＣＳにおいて、ＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰよりもわずかに良かった。Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰは、各々、１．２４ｎＭ及び１．３２ｎＭのヒトＰＤ−１への親和性を有した（図６２）。
【０７１４】
（ヒト及びカニクイザルＣＴＬＡ−４への結合）
【０７１５】
精製した二重特異性抗体は、ＦＡＣＳにおいて試験したように、ヒトＣＴＬＡ−４へ結合した（図６０）。２種の二重特異性抗体はまた、カニクイザルＣＴＬＡ−４へも結合した（図６１）。Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰは、各々、０．０３５６ｎＭ及び０．３５７ｎＭの、ヒトＣＴＬＡ−４への親和性を有した（図６２）。
【０７１６】
（ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１への同時結合）
【０７１７】
この二重特異性抗体は、両方の標的へ結合することができるかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳを使用した。ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＰＤ−１を、プレート上にコーティングした。二重特異性抗体の添加後、ビオチン化したＣＴＬＡ−４を使用し、結合した二重特異性抗体を検出した。図６６に示したように、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰは、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の両方へ結合することができ、ＥＣ５０は０．１０７２ｎＭから０．０７１０ｎＭであり、これは二重特異性参照抗体のＷＢＰ３２４  ＢＭＫ１（ＥＣ５０＝０．０５９９ｎＭ）と同等であった。ＦＡＣＳにおいて、Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰの両方は、ＰＤ−１＋細胞及びＣＴＬＡ−４＋細胞へ同時に結合することができる（図６７）。
【０７１８】
（ヒト又はカニクイザルＣＴＬＡ−４のＣＤ８０結合への結合ブロック）
【０７１９】
競合的ＦＡＣＳを使用し、ＣＴＬＡ−４のそのリガンドＣＤ８０の二重特異性抗体によるブロックを試験した。Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰは、ＣＤ８０へのＣＴＬＡ−４結合をブロックし、ＩＣ５０は４．３００ｎＭ及び０．７５８１ｎＭであった（図６４）。同様に、二重特異性抗体はまた、ヒトＣＤ８０＋細胞へのカニクイザルＣＴＬＡ−４の結合もブロックする（図６５）。
【０７２０】
（ＰＤ−１のそのリガンドへの結合のブロック）
【０７２１】
競合的ＦＡＣＳを使用し、ＰＤ−１のそのリガンドＰＤ−Ｌ１の二重特異性抗体によるブロックを試験した。Ｗ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰは、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合をブロックし、ＩＣ５０は、１．６７０ｎＭ及び１．９１７ｎＭであった（図６３）。
【０７２２】
（血清安定性）
【０７２３】
２種の二重特異性抗体は、３７℃のヒト血清で、１４日間インキュベーションし、ヒトＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１へのそれらのデュアル結合を、ＥＬＩＳＡにおいて測定した。図６８Ａ及び６８Ｂに示したように、標的へのＷ３２４８−Ｕ６Ｔ１．Ｇ２５Ｒ−１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ及びＷＢＰ３２４８−Ｕ６Ｔ５．Ｇ２５−１−ｕＩｇＧ４．ＳＰのデュアル結合は、経時的に変化せず、このことはこれら２種の二重特異性抗体は、３７℃のヒト血清中で少なくとも１４日間は安定していたことを示唆している。
【０７２４】
本開示は、特に具体的実施態様を参照して示され且つ説明されているが、形状及び詳細における様々な変更を、本明細書において開示されたような本開示の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者により理解されなければならない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2020534034.tif 000102
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2020534034.tif 000106
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
2020534034.tif 000142
【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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