(57)【要約】  本開示は、組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、（ｉｉ）培地中でＣＨＯ細胞を約３７℃の温度で培養することと、（ｉｉｉ）接種から少なくとも１日後、栄養補助剤の組み合わせであって、（ａ）１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２−メルカプトエタノールを含まない、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤、及び（ｂ）１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤を含む組み合わせを（ｉｉ）の細胞培養物に添加することと、（ｉｖ）接種から約８０時間〜１２０時間後、（ｉｉｉ）の細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、（ｖ）（ｉｖ）の細胞培養物から組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することとを含む方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、
（ｉｉ）前記培地中で前記ＣＨＯ細胞を約３６℃〜約３８℃、約３６．５℃〜約３７．５℃、特に約３７℃の温度で培養することと、
（ｉｉｉ）接種から少なくとも１日後、栄養補助剤の組み合わせであって、
（ａ）１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２−メルカプトエタノールを含まない、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤、及び
（ｂ）１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤
を含む組み合わせを（ｉｉ）の細胞培養物に添加することと、
（ｉｖ）前記接種から約８０時間〜１２０時間後、（ｉｉｉ）の前記細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、
（ｖ）（ｉｖ）の前記細胞培養物から前記組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む方法。
【請求項２】
前記培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比、特に７５／２５の比で含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記栄養補助剤の組み合わせは、１分〜２時間の範囲の期間にわたって添加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後に添加される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記栄養補助剤の組み合わせは、３つ以上の異なる時点で添加される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記栄養補助剤の組み合わせは、２〜６つの異なる時点で添加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記栄養補助剤の組み合わせは、４又は５つの異なる時点で添加される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後及び接種から３〜５日後に添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後、接種から３〜５日後、接種から５〜７日後、接種から７〜９日後及び接種から９〜１１日後に添加される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から約２日後、及び接種から約４日後、接種から約６日後、及び接種から約８日後、及び接種から約１０日後に添加される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約０．５％〜約４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．０５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ａであり、且つ前記第２の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約８０時間〜１５０時間後である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９０時間〜１００時間後である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９６時間後である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ２＋の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
約３０、５０、６０、９０、１５０又は２００μＭのＺｎ２＋の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
約９０μＭのＺｎ２＋の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
（ｖ）は、接種から１４日後に行われる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｖ）は、接種から１０日後に行われる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＩＶＣＣは、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の不在下での前記方法と比べて約３．０倍〜約６．５倍だけ増加される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ−Ｚ（式中、
Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、
Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び
前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）である、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含む、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ｎ＝１０である、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８−Ｋ７１４に示される配列を含む、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含み、且つその二量体である、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含む、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、
（ｉｉ）前記培地中で前記ＣＨＯ細胞を約３６℃〜約３８℃、約３６．５℃〜約３７．５℃、特に約３７℃の温度で培養することと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの栄養補助剤を細胞培養物に添加し、且つ約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ２＋、特に約３０μＭのＺｎ２＋〜１００μＭのＺｎ２＋、特に約９０μＭのＺｎ２＋を添加することと、
（ｉｖ）前記接種から約８０時間〜約１２０時間後、（ｉｉｉ）の前記細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、
（ｖ）（ｉｖ）の前記細胞培養物から前記組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む方法。
【請求項５５】
前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記栄養補助剤の組み合わせは、１分〜２時間の範囲の期間にわたって添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記栄養補助剤の組み合わせは、３つ以上の異なる時点で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記栄養補助剤の組み合わせは、２〜６つの異なる時点で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記栄養補助剤の組み合わせは、４又は５つの異なる時点で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後及び接種から３〜５日後に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６３】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後、接種から３〜５日後、接種から５〜７日後、接種から７〜９日後及び接種から９〜１１日後に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から約２日後、及び接種から約４日後、接種から約６日後、及び接種から約８日後、及び接種から約１０日後に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約０．５％〜約４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．０５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
前記第２の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ａであり、且つ前記第２の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７４】
（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約８０時間〜１５０時間後である、請求項１に記載の方法。
【請求項７５】
（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９０時間〜１００時間後である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９６時間後である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
少なくとも約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ２＋の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７８】
約３０、５０、６０、９０、１５０又は２００μＭのＺｎ２＋の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
約９０μＭのＺｎ２＋の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
（ｖ）は、接種から１４日後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８１】
（ｖ）は、接種から１０日後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８２】
前記クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８３】
組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８４】
前記活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＩＶＣＣは、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の不在下での前記方法と比べて約３．０倍〜約６．５倍だけ増加される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ−Ｚ（式中、
Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、
Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び
前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
前記ｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記ｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
ｎ＝１０である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８−Ｋ７１４に示される配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含み、且つその二量体である、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、（ｉｉ）培地中でＣＨＯ細胞を培養することと、（ｉｉｉ）接種から少なくとも１日後、栄養補助剤の組み合わせであって、（ａ）１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２−メルカプトエタノールを含まない、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤、及び（ｂ）１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤を含む組み合わせを（ｉｉ）の細胞培養物に添加することと、（ｉｖ）接種から約８０〜１２０時間後、（ｉｉｉ）の細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、（ｖ）（ｉｖ）の細胞培養物から組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することとを含む方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）は、機能的な組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の生産が不能になる重篤で極希少な遺伝性代謝障害である。それは、骨及び歯の低石灰化によって特徴付けられる非石灰化骨マトリックスの蓄積（例えば、くる病、骨軟化症）をもたらす。成長する骨が適切に石灰化しないとき、成長の障害により、関節及び骨の美観が損なわれる。この結果は、したがって、運動能力、呼吸機能に影響し、さらに死に至ることがある。ＨＰＰの様々な形態として、出生時、乳児性、若年性（又は小児性）及び成人ＨＰＰが挙げられる。近年、主として症状発現時の年齢に基づき、出生時、良性出生前、小児性、若年性、成人及び歯限局型ＨＰＰを含む６つの臨床形態が定義されている。アスホターゼアルファは、研究段階であり、内因性ＴＮＳＡＬＰレベルの欠陥に対処するように設計されたファーストインクラスの標的化酵素置換治療薬である。ＴＮＳＡＬＰを伴うＨＰＰの治療については、Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６６：９０４−１３を参照されたい。
【０００３】
アスホターゼアルファ（ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標），Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、ヒトＴＮＳＡＬＰの触媒ドメイン、ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメイン及び骨標的化ドメインとして用いられるデカアスパラギン酸ペプチド（すなわちＤ１０）からなる可溶性の融合糖タンパク質である。インビトロで、アスホターゼアルファは、ハイドロキシアパタイトに対し、デカアスパラギン酸ペプチドを欠如する可溶性のＴＮＳＡＬＰの場合よりも高い親和性で結合し、それにより、アスホターゼアルファのＴＮＳＡＬＰ部分は、余分な局所性の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を効率的に分解し、正常な石灰化を回復させることを可能にする。ピロリン酸加水分解は、骨石灰化を促進し、その効果は、非臨床試験において評価される種の中で類似している。有効性試験がＨＰＰのマウスモデル（Ａｋｐ２−／−マウス）において実施された。ＴＮＳＡＬＰ遺伝子を不活性化することによって作出されるＡｋｐ２−／−マウスモデル（Ｎａｒｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２０８：４３２−４６）は、非石灰化骨マトリックスの蓄積を含むヒト状態の多くの一般的特徴を共有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で開示されるのは、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の生産における効率を増加させるために用いることができる改善された生産プロセスである。本明細書に記載の方法は、組換えタンパク質、例えば培養されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって生産されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の酵素活性について維持、貯蔵、調節及び／又は改善するためにも用いられ得る。かかるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、治療における使用、例えば対象、例えばヒト対象における低下したアルカリホスファターゼタンパク質レベル及び／又は機能（例えば、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の不十分な切断）に関連した状態の治療に適している。
【０００５】
一態様では、本開示は、アルカリホスファターゼ機能を有する組換えポリペプチドを生産するための方法を提供する。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ機能は、当該技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る。かかる組換えポリペプチドは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含み得る。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、（ｉｉ）培地中のＣＨＯ細胞を約３７℃の温度で培養することと、（ｉｉｉ）接種から少なくとも１日後、栄養補助剤の組み合わせであって、（ａ）１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２−メルカプトエタノールを含まない、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤、及び（ｂ）１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤を含む組み合わせを（ｉｉ）の細胞培養物に添加することと、（ｉｖ）接種から約８０時間〜１２０時間後、（ｉｉｉ）の細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、（ｖ）（ｉｖ）の細胞培養物から組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することとを含む方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、（ｖ）は、接種から１４日後に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖ）は、接種から１０日後に行われる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される培地を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを含む培地を提供する。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比で含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、１分〜２時間の範囲の期間にわたって添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後に添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、３つ以上の異なる時点で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、２〜６つの異なる時点で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、４つの異なる時点で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後及び接種から３〜５日後に添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後、及び接種から３〜５日後、接種から５〜７日後、及び接種から７〜９日後に添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、接種から約２日後、及び接種から約４日後、接種から約６日後、及び接種から約８日後に添加される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、第１の栄養補助剤の各添加物が培地の０．５％〜４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加されることを提供する。いくつかの実施形態では、第１の栄養補助剤の各添加物は、培地の２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、第２の栄養補助剤の各添加物は、培地の０．０５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、第２の栄養補助剤の各添加物は、培地の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、第１の栄養補助剤の全添加物は、培地の５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、第１の栄養補助剤の全添加物は、培地の１２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、第２の栄養補助剤の全添加物は、培地の０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、第２の栄養補助剤の全添加物は、培地の１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、第１の栄養補助剤がＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ａであり、且つ第２の栄養補助剤がＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であることを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉｖ）の温度低下が接種から約８０時間〜１５０時間後又は約９０時間〜１００時間後であることを提供する。いくつかの実施形態では、（ｉｖ）の温度低下は、接種から約９６時間後である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、約２０μＭ〜約２００μＭの亜鉛濃度（Ｚｎ２＋）を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも約３０μＭまでの培地中の亜鉛濃度を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約５０μＭまでの亜鉛濃度を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約６０μＭまでの亜鉛濃度を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約９０μＭまでの亜鉛濃度を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、約２０μＭ〜約６０μＭまでの亜鉛濃度を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約１５０μＭまでの亜鉛濃度を提供することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約２００μＭまでの亜鉛濃度を提供することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、クロマトグラフィーステップを提供し、クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＶＣＣは、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の不在下での方法と比べて約３．０倍〜約６．５倍だけ増加される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ−Ｚ（式中、
Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、
Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び
前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む組換えアルカリホスファターゼを提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）である。いくつかの実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある。いくつかの実施形態では、ｎ＝１０である。いくつかの実施形態では、Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８−Ｋ７１４に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含む。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対する少なくとも９５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含み、且つその二量体である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、（ｉｉ）培地中でＣＨＯ細胞を約３６℃〜約３８℃、約３６．５℃〜約３７．５℃、特に約３７℃の温度で培養することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの栄養補助剤を細胞培養物に添加し、且つ約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ２＋、特に約３０μＭのＺｎ２＋〜１００μＭのＺｎ２＋、特に約９０μＭのＺｎ２＋を添加することと、（ｉｖ）接種から約８０時間〜約１２０時間後、（ｉｉｉ）の細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、（ｖ）（ｉｖ）の細胞培養物から組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】様々な最終時点での様々な培地、栄養補助剤の添加及び様々な亜鉛濃度を伴う、流加振盪フラスコからのデータの生産性及び活性分析の結果を提示する。
【図２ａ】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される培養物の生細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞生存度を表す。
【図２ｂ】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される培養物の生細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞生存度を表す。
【図３ａ−３ｂ】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される培養物の比生産性及びＰｒｏＡ結合力価を表す。コントロールプロセス及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５について示されるデータは、２回反復の平均である。
【図４ａ−４ｂ】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される培養物の比活性及び総括性を表す。コントロールプロセス及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５について示されるデータは、２回反復の平均である。
【図５】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される細胞での生成物の容量活性特性を表す。フィード１＝Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５；フィード２＝Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６；フィード３＝Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ。コントロールプロセス及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５について示されるデータは、２回反復の平均である。
【図６】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される細胞での生成物の比活性特性を表す。フィード１＝Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５；フィード２＝Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６；フィード３＝Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ。コントロールプロセス及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５について示されるデータは、２回反復の平均である。
【図７】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される細胞でのタンパク質不純物を表す。Ｂｒｘ−１＝温度変化を伴うコントロールプロセス；Ｂｒｘ−２＝温度変化を伴うコントロールプロセス；Ｂｒｘ−３＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５；Ｂｒｘ−４＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５；Ｂｒｘ５＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６；Ｂｒｘ−６＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６；Ｂｒｘ−７＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ；Ｂｒｘ−８＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ。１４日目の値が示される。
【図８】温度変化の存在下及び不在下で様々な栄養補助剤の添加とともに増殖される細胞でのタンパク質シアリル化を表す。Ｂｒｘ−１＝温度変化を伴うコントロールプロセス；Ｂｒｘ−２＝温度変化を伴うコントロールプロセス；Ｂｒｘ−３＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５；Ｂｒｘ−４＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５；Ｂｒｘ５＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６；Ｂｒｘ−６＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６；Ｂｒｘ−７＝温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ；Ｂｒｘ−８＝温度変化を伴わないＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ。１４日目の値が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
「約」、「およそ」：用語「約」及び「およそ」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の特定の細胞培養条件に適用される場合、その１つ以上の培養条件において定められた参照値に類似する種々の値を指す。特定の実施形態では、用語「約」は、その１つ以上の培養条件において定められた参照値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１パーセント又はそれを下回る範囲に含まれる種々の値を指す。
【００２４】
「アミノ酸」：用語「アミノ酸」は、本明細書で用いられるとき、通常、ポリペプチド又はそれらのアミノ酸の類似体若しくは誘導体の形態で用いられる２０の天然に存在するアミノ酸のいずれかを指す。本開示のアミノ酸は、細胞培養物に対する培地中に提供され得る。培地中に提供されるアミノ酸は、塩として又は水和物形態で提供され得る。
【００２５】
「培養物」及び「細胞培養物」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団の生存及び／又は増殖に適した条件下で培地（下記「培地」の定義を参照されたい）に懸濁される細胞集団を指す。当業者に明白であるように、これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指し得る。
【００２６】
「バッチ培養」：用語「バッチ培養」は、本明細書で用いられるとき、培地（下記「培地」の定義を参照されたい）を含む、最終的に細胞を培養するのに用いられる成分のすべて及び細胞自体が培養プロセスの開始時に提供される、細胞を培養する方法を指す。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分は、収集され、任意選択的に精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、バッチ培養において用いられる。
【００２７】
「バイオリアクター」：用語「バイオリアクター」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物）の増殖のために用いられる任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞の培養にとって有用である限り、任意のサイズであり得る。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットル、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００、２０，０００リットル若しくはそれを超えるか又はそれらの間の任意の容積となる。限定されないが、ｐＨ及び温度を含むバイオリアクターの内部条件は、典型的には、培養期間中に調節される。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック又は金属を含む、本開示の培養条件下の培地に懸濁される哺乳類又は他の細胞培養物を保持することに適した任意の材料から構成され得る。用語「生産バイオリアクター」は、本明細書で用いられるとき、目的のポリペプチド又はタンパク質の生産に用いられる最終バイオリアクターを指す。大規模細胞培養生産バイオリアクターの容積は、典型的には、少なくとも５００リットルであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００、２０，０００リットル若しくはそれを超えるか又はそれらの間の任意の容積であり得る。当業者は、本開示の実行における使用に適したバイオリアクターについて理解し、選択できるであろう。
【００２８】
「細胞密度」：用語「細胞密度」は、本明細書で用いられるとき、所与の培地の体積中に存在する細胞の数を指す。
【００２９】
「細胞生存度」：用語「細胞生存度」は、本明細書で用いられるとき、培養下の細胞が所与の培養条件又は実験バリエーションのセット下で生存する能力を指す。この用語は、本明細書で用いられるとき、特定の時点で生存している細胞の、その時点の培養下での細胞の総数（生存及び死滅）に対する割合も指す。
【００３０】
「培養物」及び「細胞培養物」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団の生存及び／又は増殖に適した条件下で培地（下記「培地」の定義を参照されたい）に懸濁される細胞集団を指す。当業者に明白であるように、これらの用語は、本明細書で用いられるとき、細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指し得る。
【００３１】
「流加培養」：用語「流加培養」は、本明細書で用いられるとき、培養プロセスの開始後のいずれかの時点で追加的成分が培養物に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に枯渇している、細胞のための栄養補助剤を含む。流加培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分は、収集され、任意選択的に精製される。流加培養は、対応する流加バイオリアクター内で実施され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、流加培養を含む。
【００３２】
「断片」：用語「断片」は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドを指し、所与のポリペプチドの、そのポリペプチドに固有の又は特徴的な任意の分離部分として定義される。この用語は、本明細書で用いられるとき、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の分離部分も指す。いくつかの実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である。他の実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。一実施形態では、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。この用語は、本明細書で用いられるとき、完全長ポリペプチド中に見出される少なくとも確立された配列要素を含む、所与のポリペプチドの任意の部分も指す。いくつかの実施形態では、配列要素は、完全長ポリペプチドの少なくとも４〜５アミノ酸に及ぶ。いくつかの実施形態では、配列要素は、完全長ポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸に及ぶ。
【００３３】
「積分生細胞密度」：用語「積分生細胞密度」又は「ＩＶＣＤ」は、本明細書で用いられるとき、培養期間にわたる生細胞の平均密度に、培養が実行されている時間を乗じたものを指す。生産されるポリペプチド及び／又はタンパク質の量が、培養期間にわたって存在する生細胞の数に比例すると仮定すると、積分生細胞密度は、培養期間にわたって生産されるポリペプチド及び／又はタンパク質の量を推定するための有用なツールである。
【００３４】
「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「細胞培地」及び「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、哺乳動物細胞の増殖に栄養を与える栄養分を含有する溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最低限の増殖及び／又は生存に対して細胞が必要とする必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質及び微量元素を提供する。溶液は、ホルモン及び増殖因子を含む、最小速度を超えて増殖及び／又は生存を増強する成分も含有し得る。溶液は、例えば、細胞生存及び増殖にとって最適なｐＨ及び塩濃度に向けて配合される。いくつかの実施形態では、培地は、「限定培地」、すなわちタンパク質、加水分解物又は未知組成物の成分を含有しない無血清培地であり得る。限定培地は、動物由来成分を含まず、すべての成分は、既知の化学構造を有する。いくつかの実施形態では、培地は、基礎培地、すなわち炭素源、水、塩、アミノ酸及び窒素の供給源（例えば、動物、例えば牛肉又は酵素抽出物）を含有する非限定培地である。様々な培地は、市販されており、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地（Ｓｉｇｎａｍ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣＤ  ＤＧ４４培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）又はそれらの混合物、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ培地とＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）との混合物から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを７０／３０〜９０／１０の比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地とＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地との組み合わせを７５／２５の比で含む。
【００３５】
「代謝廃棄生成物」：用語「代謝廃棄生成物」は、本明細書で用いられるとき、いくつかの様式では細胞培養物にとって、特に所望の組換えポリペプチド又はタンパク質の発現又は活性に関して有害である正常又は非正常代謝過程の結果として、細胞培養物によって生産される化合物を指す。例えば、代謝廃棄生成物は、細胞培養物の増殖又は生存度にとって有害であり得るか、生産される組換えポリペプチド又はタンパク質の量を減少させ得るか、発現されるポリペプチド又はタンパク質のフォールディング、安定性、グリコシル化又は他の翻訳後修飾を改変し得るか、又は様々な他の様式において細胞及び／又は組換えポリペプチド若しくはタンパク質の発現若しくは活性にとって有害であり得る。例示的な代謝廃棄生成物は、グルコース代謝の結果として生産される乳酸塩及びグルタミン代謝の結果として生産されるアンモニウムを含む。一実施形態では、細胞培養物中の代謝廃棄生成物の生産を遅延させるか、それを低減するか、又はさらに除去するための方法が採用される。
【００３６】
「重量モル浸透圧濃度」及び「容積モル浸透圧濃度」：重量モル浸透圧濃度は、水溶液中に溶解した溶質粒子の浸透圧の尺度である。溶質粒子は、イオン及び非イオン化分子の両方を含む。重量モル浸透圧濃度は、１ｋｇの溶液に溶解した浸透圧的に活性な粒子の濃度（すなわちオスモル）として表される（３８℃で１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧に等しい）。それに対し、「容積モル浸透圧濃度」は、１リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を指す。本明細書で用いられるとき、略記「ｍＯｓｍ」は、「ミリオスモル／ｋｇ溶液」を意味する。
【００３７】
「灌流培養」：用語「灌流培養」は、本明細書で用いられるとき、培養プロセスの開始後に追加的成分が培養物に連続的又は半連続的に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に枯渇している、細胞のための栄養補助剤を含む。培地中の細胞及び／又は成分の一部は、典型的には、連続又は半連続ベースで収集され、任意選択的に精製される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、本明細書に記載されるとき、灌流培養下で添加され、すなわち、それらは、定められた期間にわたって連続的に提供される。
【００３８】
「ポリペプチド」：用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、ペプチド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために用いられるが、当業者は、この用語が長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に連結される２つのアミノ酸を含む最小鎖を指し得ることを理解するであろう。
【００３９】
「タンパク質」：用語「タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、分離単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが分離機能単位であり、分離機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永久的な物理的会合を必要としない場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、交換可能に用いられる。
【００４０】
「組換え発現されるポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」：これらの用語は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている宿主細胞から発現されるポリペプチドを指す。組換え発現されるポリペプチドは、通常、哺乳類宿主細胞において発現されるポリペプチドに一致又は類似し得る。組換え発現されるポリペプチドは、宿主細胞に対して外来性でもあり得、すなわち通常、宿主細胞において発現されるペプチドに対して異種性であり得る。或いは、組換え発現されるポリペプチドは、ポリペプチドの一部が、通常、哺乳類宿主細胞において発現されるポリペプチドに一致又は類似するアミノ酸配列を有する一方、他の部分が宿主細胞に対して外来性である点でキメラであり得る。
【００４１】
「播種」：用語「播種」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物をバイオリアクター又は別の容器に提供するプロセスを指す。細胞は、別のバイオリアクター又は容器内で予め増殖され得る。或いは、細胞は、それらをバイオリアクター又は容器に提供する直前に凍結及び解凍され得る。この用語は、単細胞を含む任意の数の細胞を指す。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、細胞が約１．０×１０５細胞／ｍＬ、１．５×１０５細胞／ｍＬ、２．０×１０５細胞／ｍＬ、２．５×１０５細胞／ｍＬ、３．０×１０５細胞／ｍＬ、３．５×１０５細胞／ｍＬ、４．０×１０５細胞／ｍＬ、４．５×１０５細胞／ｍＬ、５．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ、６．０×１０５細胞／ｍＬ、６．５×１０５細胞／ｍＬ、７．０×１０５細胞／ｍＬ、７．５×１０５細胞／ｍＬ、８．０×１０５細胞／ｍＬ、８．５×１０５細胞／ｍＬ、９．０×１０５細胞／ｍＬ、９．５×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０６細胞／ｍＬ、１．５×１０６細胞／ｍＬ、２．０×１０６細胞／ｍＬの密度又はより高い密度で播種されるプロセスによって生産される。特定の一実施形態では、かかるプロセスにおいて、細胞は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ又は８．０×１０５細胞／ｍＬの密度で播種される。
【００４２】
「力価」：用語「力価」は、本明細書で用いられるとき、細胞培養物によって生産される組換え発現されたポリペプチド又はタンパク質の総量が所与量の培地容量で除されたものを指す。力価は、典型的には、１ｍＬの培地あたりの数ミリグラム単位のポリペプチド又はタンパク質で表される。
【００４３】
本明細書で用いられるアクロニムは、例えば、ＶＣＤ：生細胞密度；ＩＶＣＣ：積分生細胞濃度；ＴＳＡＣ：総シアル酸含量；ＨＰＡＥ−ＰＡＤ：アンペロメトリック電気化学検出を伴う高性能アニオン交換クロマトグラフィー；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー；ＡＥＸ：アニオン交換クロマトグラフィー；ＬｏＣ：ラボオンチップ；及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型を含む。
【００４４】
本明細書で用いられるとき、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム」は、固定相又は樹脂に対するタンパク質と疎水性基との間の疎水性相互作用により、目的タンパク質の断片及び凝集物、他のタンパク質若しくはタンパク質断片及び細胞片などの他の汚染物質を含む不純物、又は他の精製ステップからの残留不純物からタンパク質が分離される、固定相又は樹脂及び移動相又は液相を含むカラムを指す。固定相又は樹脂は、疎水性リガンドが結合される基材マトリックス又は支持体、例えば架橋アガロース、シリカ又は合成共重合体材料を含む。かかる固定相又は樹脂の例として、フェニル、ブチル、オクチル、ヘキシル及び他のアルキルで置換されたアガロース、シリカ又は他の合成高分子が挙げられる。カラムは、固定相を含む任意のサイズであり得るか、又はオープン及びバッチプロセスで処理され得る。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼは、ＨＩＣを用いて細胞培養物から単離される。
【００４５】
本明細書で用いられるとき、用語「調製物」は、目的のタンパク質を生産する細胞培養物からの目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼ）及び少なくとも１つの不純物を含む溶液、並びに／又は細胞培養物からかかる目的のタンパク質を抽出、濃縮及び／若しくは精製するために用いられる溶液を指す。例えば、目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の組換えアルカリホスファターゼ）の調製物は、細胞培養物中で増殖し、かかる目的のタンパク質を生産する細胞をホモジナイズ溶液中でホモジナイズすることによって調製され得る。いくつかの実施形態では、次に、調製物に１つ以上の精製／単離プロセス、例えばクロマトグラフィーステップが施される。
【００４６】
本明細書で用いられるとき、用語「溶液」は、液体形態での２つ以上の物質の均一の分子混合物を指す。詳細には、いくつかの実施形態では、精製されるべきタンパク質、例えば本開示における組換えアルカリホスファターゼ又はその融合タンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、溶液中の１つの物質を表す。用語「緩衝液」又は「緩衝溶液」は、その共役酸−塩基の範囲の作用により、ｐＨの変化に抗する溶液を指す。ｐＨを約ｐＨ５〜約ｐＨ７の範囲で制御する緩衝液の例として、ヘペス、クエン酸塩、リン酸塩及び酢酸塩並びに他のミネラル酸又は有機酸緩衝液、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。塩のカチオンは、ナトリウム、アンモニウム及びカリウムを含む。本明細書で用いられるとき、用語「負荷緩衝液／溶液」又は「平衡緩衝液／溶液」は、塩又はタンパク質調製物をクロマトグラフィーカラム、例えばＨＩＣカラムに負荷するためにタンパク質調製物と混合される塩を含有する緩衝液／溶液を指す。この緩衝液／溶液は、タンパク質を負荷する前にカラムを平衡化し、且つ負荷後にカラムを洗浄するためにも用いられる。「溶出緩衝液／溶液」は、タンパク質をカラムから溶出するために用いられる緩衝液／溶液を指す。本明細書で用いられるとき、用語「溶液」は、水を含む緩衝液又は非緩衝液のいずれかを指す。
【００４７】
用語「最小化する」又は他の類似の形式のものは、特定の溶液（例えば、組換えアルカリホスファターゼを含む調製物又はかかる組換えアルカリホスファターゼに対する精製プロセスで用いられる他の溶液、例えばクロマトグラフィーステップ、例えばＨＩＣステップのための溶液）中の特定の分子（例えば、金属イオンの少なくとも１つ）の濃度を好ましくは特定のレベル未満まで低減することを指す。例えば、本明細書に記載の方法は、細胞培養物によって生産される組換えアルカリホスファターゼを含む調製物中又はかかる組換えアルカリホスファターゼに対する少なくとも１つの精製プロセスのための溶液（例えば、クロマトグラフィーステップのための溶液）中の特定の金属イオン（例えば、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｍｎなど）の濃度を、かかる金属イオンが精製された組換えアルカリホスファターゼにおける亜鉛−酵素構造の配合物に干渉することのないような特定のレベル未満まで最小化又は低減することを含み得る。したがって、特定の金属イオンの濃度を前記特定のレベル未満まで最小化することにより、精製された組換えアルカリホスファターゼは、同プロセスを通じて精製されるが、前記特定の金属イオンの濃度の最小化を伴わない組換えアルカリホスファターゼと比べて増加した活性を有するか又はそれと同等の活性を失わない。
【００４８】
本開示は、細胞培養物（例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）によって発現される組換えタンパク質の収率及び酵素機能を改善する方法を提供する。具体的には、組換えタンパク質は、例えば、発酵プロセスを通じて特定の細胞型（例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）によって生産され得る。細胞の接種及び増殖、タンパク質発現の誘導及びタンパク質発現のための様々なパラメータの最適化の全プロセスは、上流処理ステップと称される。それに対し、下流処理ステップは、例えば、生産タンパク質の回収及び精製（すなわち細胞及び培地に由来する他の不純物並びに／又は汚染物質からの生産タンパク質の分離）を含み得る。例示的な下流プロセスステップは、例えば、収集物からのタンパク質の捕捉、宿主細胞片、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び宿主細胞ＤＮＡの除去、内毒素、ウイルス及びその他の封じ込め、緩衝液交換並びに配合調節などを含む。
【００４９】
本開示は、細胞培養によって生産されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の酵素機能を改善する方法を提供する。
【００５０】
本開示は、組換えタンパク質を発現する細胞（例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）を培養する方法を提供する。本開示は、細胞培養によるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の生産を意図した生産システムを提供する。特定の実施形態では、細胞増殖、生存度及び／又はタンパク質生産若しくは品質に対して有害である１つ以上の代謝生成物の生産を最小化するシステムが提供される。特定の実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、流加培養、培養又は連続培養である。
【００５１】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
本開示は、組換え細胞培養におけるアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）の生産に関する。アルカリホスファターゼタンパク質は、少なくともいくらかのアルカリホスファターゼ活性を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドを含む分子を含む。様々な実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、当該技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る、アルカリホスファターゼ機能を有する任意のポリペプチドを含む。
【００５２】
特定の実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、本明細書で開示される方法によって生産され、次いで精製された後、アルカリホスファターゼ関連疾患又は障害を治療又は予防するために用いられ得る。例えば、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、内因性アルカリホスファターゼの減少及び／又は機能不全を有するか、又は過剰発現された（例えば、正常レベルを超える）アルカリホスファターゼ基質を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、細胞型、組織（例えば、結合、筋肉、神経又は上皮組織）又は臓器（例えば、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、骨、軟骨、靱帯、腱など）を特異的に標的にする。例えば、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、完全長アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）又は少なくとも１つのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の断片を含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的部分（例えば、下記のような負に荷電したペプチド）に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、免疫グロブリン部分（完全長又は断片）に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。例えば、かかる免疫グロブリン部分は、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）を含み得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的部分と免疫グロブリン部分（完全長又は断片）との両方に連結される可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。本明細書で開示されるアルカリホスファターゼタンパク質のより詳細な説明については、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１０３２６３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレット（それらの両方の教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ−Ｘ、Ｘ−ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ−Ｙ、Ｙ−ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｙ、ｓＡＬＰ−Ｙ−Ｘ、Ｘ−ｓＡＬＰ−Ｙ、Ｘ−Ｙ−ｓＡＬＰ、Ｙ−ｓＡＬＰ−Ｘ及びＹ−Ｘ−ｓＡＬＰ（式中、Ｘは、本明細書に記載のように骨標的部分を含み、且つＹは、本明細書に記載のように免疫グロブリン部分を含む）からなる群から選択される構造のいずれか１つを含む。一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ／Ｅｎ−Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝８〜２０であり、及びｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である）の構造を含む。いくつかの実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリアスパラギン酸配列である。例えば、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸配列であり得、ここで、ｎは、８〜２０の任意の数（両方が含まれる）である（例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０であり得る）。一実施形態では、Ｄｎは、Ｄ１０又はＤ１６である。いくつかの実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎは、ポリグルタミン酸配列である。例えば、Ｅｎは、ポリグルタミン酸配列であり得、ここで、ｎは、８〜２０の任意の数（両方が含まれる）である（例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０であり得る）。一実施形態では、Ｅｎは、Ｅ１０又はＥ１６である。
【００５４】
例えば、かかるｓＡＬＰは、免疫グロブリン分子の完全長又は断片（例えば、結晶化可能領域断片（Ｆｃ））に融合され得る。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ−Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。一実施形態では、ｎ＝１０である。別の実施形態では、Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。一実施形態では、前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである。特定の一実施形態では、前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８−Ｋ７１４に示される配列を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ−Ｚ（式中、Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、Ｄｎは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）の構造を含む。かかるｓＡＬＰは、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の少なくとも１つの切断を触媒する能力がある。様々な実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある。かかるｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型のすべてのアミノ酸を含み得る。かかるＡＬＰは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）、胚細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）又は本明細書で開示されるそれらのキメラ若しくは融合型又は変異体の少なくとも１つであり得る。特定の一実施形態では、ＡＬＰは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。さらに別の実施形態では、本明細書で開示されるｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含む。
【００５６】
一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、ＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０（配列番号１、下に列挙の通り）の構造を含む。下線部のアスパラギン（Ｎ）残基は、予想されるグリコシル化部位（すなわちＮ１２３、２１３、２５４、２８６、４１３及び５６４）に対応する。太字下線部のアミノ酸残基（Ｌ４８６−Ｋ４８７及びＤ７１５−Ｉ７１６）は、それぞれｓＡＬＰとＦｃとの間及びＦｃとＤ１０ドメインとの間のリンカーに対応する。
【化１】
2020509744.tif 000003
【００５７】
各々のポリペプチド又は単量体は、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１−Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６−Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８−Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｄ７１５−Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７−Ｄ７２６（Ｄ１０）を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、Ｃｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に４つの鎖内ジスルフィド結合を有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間の２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳類アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。
【００５８】
ＡＬＰには、４つの既知のアイソザイム、すなわちさらに下に記される組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿１１２６０３及びＮＰ＿００１６２３に記述される通り）、胚細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号Ｐ１０６９６に記述される通り）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１６２２に記述される通り）が存在する。これらの酵素は、酷似する三次元構造を有する。それら触媒部位の各々は、２個のＺｎ及び１個のＭｇを含む、酵素活性にとって必要な金属イオンに対する４つの金属結合ドメインを有する。これらの酵素は、リン酸のモノエステルの加水分解を触媒し、高濃度のリン酸受容体の存在下でトランスリン酸化反応も触媒する。ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）に対する３つの既知の天然基質は、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：１４４０−１４４５）。これらのアイソザイム間の整列化は、国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレット（その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）の図３０に示される。
【００５９】
本開示におけるアルカリホスファターゼタンパク質は、任意のＡＬＰタンパク質の二量体又は多量体を単独で又は組み合わせて含み得る。キメラＡＬＰタンパク質又は融合タンパク質、例えばＫｉｆｆｅｒ−Ｍｏｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８９３７４（その全教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のキメラＡＬＰタンパク質も生産され得る。
【００６０】
特定の一実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に対して８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に対して９５％又は９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む。
【００６１】
ＴＮＡＬＰ
上に示される通り、ＴＮＡＬＰは、糖脂質を通じてそのＣ末端に固定される膜結合タンパク質である（ヒトＴＮＡＬＰについては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６を参照されたい）。この糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、翻訳後、一時的な膜アンカーとＧＰＩの付加に対するシグナルとの両方として役立つ疎水性Ｃ末端の除去後に付加される。したがって、一実施形態では、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、疎水性Ｃ末端配列の１番目のアミノ酸、すなわちアラニンが停止コドンで置換されるＴＮＡＬＰを含む。そのように形成された可溶性ＴＮＡＬＰ（本明細書中でｓＴＮＡＬＰと称される）は、ＧＰＩ膜アンカーを欠如する触媒部位の形成に必要である、ＴＮＡＬＰの天然アンカー型のすべてのアミノ酸を含有する。公知のＴＮＡＬＰとして、例えばヒトＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ−０００４６９、ＡＡＩ１０９１０、ＡＡＨ９０８６１、ＡＡＨ６６１１６、ＡＡＨ２１２８９及びＡＡＩ２６１６６］；アカゲザルＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＸＰ−００１１０９７１７］；ラットＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３７１９１］；イヌＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＦ６４５１６］；ブタＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＡＡＮ６４２７３］、マウスＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３１４５７］、ウシＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿７８９８２８、ＮＰ＿７７６４１２、ＡＡＭ８２０９及びＡＡＣ３３８５８］並びにネコＴＮＡＬＰ［ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００１０３６０２８］が挙げられる。
【００６２】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞外ドメイン」は、（例えば、ペプチドシグナルを伴わない）天然タンパク質の任意の機能的細胞外部分を指すことを意味する。元のアミノ酸１〜５０１（分泌時、１８〜５０１）、アミノ酸１〜５０２（分泌時、１８〜５０２）、アミノ酸１〜５０４（分泌時、１８〜５０４）又はアミノ酸１〜５０５（分泌時、１８〜５０５）を保持する組換えｓＴＮＡＬＰポリペプチドは、酵素活性がある（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２６：６９４−６９９を参照されたい）。これは、アミノ酸残基が天然タンパク質のＣ末端からその酵素活性に影響することなく除去され得ることを示す。さらに、可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、１つ以上のアミノ酸置換を含み得、かかる置換は、ｓＴＮＡＬＰの酵素活性を低下させないか又は少なくとも完全に阻害することはない。例えば、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の原因となることが知られる特定の突然変異は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレットに列挙されており、機能的ｓＴＮＡＬＰを維持するために回避される必要がある。
【００６３】
負に荷電したペプチド
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、所定の細胞型、組織又は臓器に対してアルカリホスファターゼタンパク質を特異的に標的にすることがある標的部分を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる所定の細胞型、組織又は臓器は、骨組織である。かかる骨標的部分は、任意の公知のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は当該技術分野で公知の小分子化合物を含み得る。例えば、負に荷電したペプチドは、骨標的部分として用いられ得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせ（例えば、少なくとも１つのアスパラギン酸と少なくとも１つのグルタミン酸とを含むポリペプチド、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の組み合わせを含む負に荷電したペプチド）であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ１８、Ｄ１９、Ｄ２０又は２０を超えるアスパラギン酸を有するポリアスパラギン酸であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ１８、Ｅ１９、Ｅ２０又は２０を超えるグルタミン酸を有するポリグルタミン酸であり得る。一実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、Ｄ１０〜Ｄ１６又はＥ１０〜Ｅ１６からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。
【００６４】
スペーサー
いくつかの実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ部分と標的部分との間にスペーサー配列を含む。一実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ（例えば、ＴＮＡＬＰ）部分と負に荷電したペプチド標的部分との間にスペーサー配列を含む。かかるスペーサーは、任意のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、かかるスペーサーは、結晶化可能領域断片（Ｆｃ）の断片を含み得る。有用なＦｃ断片は、ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧのＦｃ断片を含む。かかるＩｇＧは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４又はそれらの任煮の組み合わせのいずれかであり得る。
【００６５】
この理論に制限されることなく、骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）で用いられるＦｃ断片がスペーサーとして作用し、ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０の発現がｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０の発現よりも高いと仮定すると、タンパク質がより効率的に折り畳まれることを可能にすると考えられる（下の実施例２を参照されたい）。１つの考えられる説明は、Ｆｃ断片の導入が、本明細書に例示されるｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加される高度に負に荷電したＤ１０配列の存在によって引き起こされる斥力を軽減することである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０、ｓＡＬＰ−Ｄ１０−Ｆｃ、Ｄ１０−ｓＡＬＰ−Ｆｃ、Ｄ１０−Ｆｃ−ｓＡＬＰ、Ｆｃ−ｓＡＬＰ−Ｄ１０及びＦｃ−Ｄ１０−ｓＡＬＰからなる群から選択される構造を含む。他の実施形態では、上記構造中のＤ１０は、他の負に荷電したポリペプチド（例えば、Ｄ８、Ｄ１６、Ｅ１０、Ｅ８、Ｅ１６など）で置換される。
【００６６】
本開示にとって有用なスペーサーは、例えば、Ｆｃを含むポリペプチド並びにｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加される高度に負に荷電した骨標的配列（例えば、Ｄ１０）の存在によって引き起こされる斥力を軽減することができる親水性及び柔軟性ポリペプチドを含む。
【００６７】
二量体／四量体
具体的な実施形態では、本開示の骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質は、二量体又は四量体を形成するように会合される。
【００６８】
二量体立体配置では、鎖間ジスルフィド結合の形成によって課せられる立体障害は、おそらく、正常細胞内に存在する最小の触媒活性タンパク質二量体に会合するためのｓＡＬＰドメインの会合性を阻止する。
【００６９】
この理論に制限されることなく、その四量体構造中では、融合タンパク質の会合性は、ある二量体からの１つのｓＡＬＰドメインを異なる二量体の別のｓＡＬＰドメインと連結することを含むと考えられる。
【００７０】
骨標的化ｓＡＬＰは、任意選択的に、１）負に荷電したペプチド（例えば、骨標識剤）から下流、及び／又は２）負に荷電したペプチド（例えば、骨標識剤）とＦｃ断片との間、及び／又は３）スペーサー（例えば、Ｆｃ断片）とｓＡＬＰ断片との間に１つ以上の追加的なアミノ酸をさらに含み得る。例えば、骨標的コンジュゲートを作製するために用いられるクローニング方法により、これらの位置に外因性アミノ酸が導入される場合にこれが生じ得る。しかし、外因性アミノ酸は、さらなるＧＰＩアンカーシグナルをもたらさないように選択される必要がある。設計された配列が宿主細胞のトランスアミダーゼによって切断される可能性は、Ｉｋｅｚａｗａ，２００２  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２５：４０９−１７に記載のように予測可能である。
【００７１】
本開示は、例えば、本明細書中で明記されるものを含むグリコシル化、アセチル化、アミド化、封鎖、ホルミル化、γ−カルボキシグルタミン酸水酸化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸及び硫酸化によって翻訳後修飾される融合タンパク質も包含する。
【００７２】
アスホターゼアルファ
アスホターゼアルファは、２つのＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０ポリペプチド（それぞれ配列番号１に示されるような７２６アミノ酸を有する）からなる可溶性Ｆｃ融合タンパク質である。各々のポリペプチド又は単量体は、５つの部分から構成される。アミノ酸Ｌ１−Ｓ４８５を有する第１の部分（ｓＡＬＰ）は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第２の部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６−Ｋ４８７を有する。アミノ酸Ｄ４８８−Ｋ７１４を有する第３の部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分は、リンカーとしてＤ７１５−Ｉ７１６を有する。第５の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸Ｄ７１７−Ｄ７２６（Ｄ１０）を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、６つの予想されるグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を有する。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、４つの鎖内ジスルフィド結合をＣｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２との間に有する。２つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のＣｙｓ４９３間及び両方の鎖上のＣｙｓ４９６間での２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳類アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する２つの部位、マグネシウムに対する１つの部位及びカルシウムに対する１つの部位を含む４つの金属結合部位を有すると考えられる。
【００７３】
アスホターゼアルファは、次のようにも特徴付けることができる。Ｎ末端からＣ末端へ、アスホターゼアルファは、（１）ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の可溶性触媒ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６）、（２）ヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８５７）、及び（３）骨標的化ドメインとして用いられるデカアスパラギン酸ペプチド（Ｄ１０）を含む（Ｎｉｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ８８：２４４−２５５）。タンパク質は、２つの一次タンパク質配列からホモ二量体に会合する。この融合タンパク質は、６つの確認された複雑なＮ−グリコシル化部位を有する。これらのＮ−グリコシル化部位の５つは、ｓＡＬＰドメイン上に位置し、１つは、Ｆｃドメイン上に位置する。アスホターゼアルファ上に存在する別の重要な翻訳後修飾は、酵素とＦｃ−ドメイン構造とを安定化するジスルフィド架橋の存在である。全部で４つの分子内ジスルフィド架橋が１単量体あたりに存在し、２つの分子内ジスルフィド架橋が二量体中に存在する。アルカリホスファターゼドメインの１つのシステインが遊離している。
【００７４】
アスホターゼアルファは、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の治療のための酵素置換治療薬として用いられ得る。ＨＰＰを有する患者では、ＴＮＳＡＬＰをコードする遺伝子における機能欠失変異は、ＴＮＳＡＬＰ酵素活性の欠損を引き起こし、基質、例えば無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）の循環レベルの上昇をもたらす。アスホターゼアルファのＨＰＰを有する患者への投与により、ＰＰｉが切断され、カルシウムとの組み合わせのために無機リン酸塩が放出され、それによりハイドロキシアパタイト結晶形成及び骨石灰化が促進され、正常な骨格表現型が回復される。アスホターゼアルファ及び治療におけるその使用に関するさらなる詳細については、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１０３２６３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３８１３１号パンフレットを参照されたい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の通り、通常の手段により、活性に対して潜在的な負の影響を有する金属イオンの濃度を最小化するか、又は活性に対して潜在的な正の影響を有する金属イオンの濃度を増加させるか、又はその両方によって生産されるアルカリホスファターゼと比べて、生産されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の改善された酵素活性を有するアルカリホスファターゼ（アスホターゼアルファ）を提供する。活性は、任意の公知の方法によって測定され得る。かかる方法は、例えば、生産されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の、アルカリホスファターゼの基質、例えばホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）に対する酵素活性を測定するインビトロ及びインビボアッセイを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされる。かかる高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含み得る。
【００７７】
生産プロセス
本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、当該技術分野で公知の方法を用いて、哺乳類又は他の細胞、特にＣＨＯ細胞によって生産され得る。かかる細胞は、培養ディッシュ、フラスコガラス又はバイオリアクター内で増殖され得る。細胞培養及び組換えタンパク質生産のための特定のプロセスは、当該技術分野で公知であり、例えばＮｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｙｅｒ，１９９１  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１２−１４３及びＲｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｃｈ  ２００８，２０−２５に記載されている。例示的なバイオリアクターは、バッチ、流加及び連続反応器を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、流加バイオリアクター内で生産される。
【００７８】
細胞培養プロセスは、例えば、限定されないが、ｐＨの変化、温度、温度変化、温度変化のタイミング、細胞培地組成、細胞培養栄養補助剤、原料のロット間変動、培地ろ過用材料、バイオリアクター規模の差異、ガス処理方法（空気、酸素及び二酸化炭素）などを含む変動する物理化学的環境によって引き起こされる変動性を有する。本明細書で開示される通り、生産されるアルカリホスファターゼタンパク質の収率、相対活性特性及びグリコシル化特性は、１つ以上のパラメータにおける変更によって影響を受け得る。
【００７９】
細胞培養下での組換えタンパク質生産では、必要な転写調節エレメントを有する組換え遺伝子は、最初に宿主細胞に導入される。任意選択的に、レシピエント細胞に選択的利点を与える第２の遺伝子が導入される。遺伝子導入から数日後、適用され得る選択薬剤の存在下において、選択遺伝子を発現する細胞のみが生存する。選択のための２つの例示的遺伝子は、ヌクレオチド代謝に関与する酵素のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）である。両方の場合において、適切な代謝産物（ＤＨＦＲの場合にはヒポキサンチン及びチミジン、ＧＳの場合にはグルタミン）の不在下で選択が生じ、非形質転換細胞の増殖が阻止される。一般に、組換えタンパク質の効率的発現において、生物製剤をコードする遺伝子及び選択遺伝子が同じプラスミド上に存在するか否かは重要でない。
【００８０】
選択後、生存細胞は、単細胞として第２の培養容器に導入され得、培養物は、クローン集団を生成するために拡大される。最終的に、個別クローンは、組換えタンパク質の発現について評価され、最高の生産者は、さらなる培養及び分析のために保持される。これらの候補から、組換えタンパク質の生産のため、適切な増殖及び生産性特性を有する１つの細胞株が選択される。次に、生産需要及び最終生成物の要件によって決定される培養プロセスが開発される。
【００８１】
細胞
任意の哺乳動物細胞型又は非哺乳動物細胞型がポリペプチドを生産するために培養され得るが、本開示に従って利用され得る。用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例として、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，１９８０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ受入番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７  Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−Ｉ  ５８７）；ヒト頸部がん細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝腫瘍株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。特定の実施形態では、ポリペプチド及びタンパク質の培養及び発現は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から行われる。
【００８２】
加えて、ポリペプチド又はタンパク質を発現する任意の数の市販及び非市販のハイブリドーマ細胞株が本開示に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養の需要を有し得、且つ／又は最適な増殖及びポリペプチド若しくはタンパク質発現に対して異なる培養条件を必要とし得ることを理解し、且つ必要に応じて条件を変更することができるであろう。
【００８３】
上記の通り、多くの場合、細胞は、タンパク質又はポリペプチドを高レベルで生産するように選択又は改変されることになる。多くの場合、細胞は、タンパク質を高レベルで生産するため、例えば目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の導入により、且つ／又は目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内因性であるか又は導入される）の発現を調節する調節エレメントの導入により遺伝子操作される。
【００８４】
播種密度
本開示では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が培地に接種、すなわち播種される。様々な播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０４細胞／ｍＬ〜１．０×１０７細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、１．０×１０５細胞／ｍＬ〜１．０×１０６細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、４．０×１０５細胞／ｍＬ〜８．０×１０５細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、５．０×１０５細胞／ｍＬ〜６．０×１０５細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、５．５×１０５細胞／ｍＬの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、播種密度の増加は、ＳＥＣによって測定されるとき、アスホターゼアルファ品質の断片化に影響し得る。いくつかの実施形態では、播種密度は、断片生成のリスクを低減するために接種時に制御される。
【００８５】
温度
以前の結果によると、温度は、増殖速度、凝集、断片化及びＴＳＡＣを含むいくつかのパラメータに対する影響を有する可能性があることが示された。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、一定のままである。いくつかの実施形態では、温度は、ＣＨＯ細胞を培地で培養するとき、約３０℃〜約４０℃、又は約３５℃〜約４０℃、又は約３７℃〜約３９℃、又は約３７．５℃である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の４０〜２００時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の５０〜１５０時間、又は６０〜１４０時間、又は７０〜１３０時間、又は８０〜１２０時間、又は９０〜１１０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の８０〜１２０時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間又は１１０時間にわたって一定である。
【００８６】
温度変化
細胞培養プロセス、特に非連続プロセス（例えば、バイオリアクターにおける流加プロセス）の実行時間は、通常、典型的には実行期間にわたって減少する細胞の残存生存度によって制限される。したがって、細胞生存度における時間を延長することは、組換えタンパク質の生産を改善するために所望される。生成物品質への関心はまた、細胞死が培養上清にシアリダーゼを放出し得、発現されるタンパク質のシアル酸含量を減少させる可能性があることから、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するという動機付けをもたらす。タンパク質精製への関心は、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するというさらに別の動機付けをもたらす。培養物中の細胞片及び死細胞の内容物は、培養実行の終了時にタンパク質生成物を単離及び／又は精製する能力に対して負の影響を与え得る。したがって、細胞を培養下でより長期間にわたり生存可能に維持することにより、細胞によって生産される所望の糖タンパク質の品質における劣化及び究極的低下を引き起こすことがある、細胞性タンパク質及び酵素（例えば、細胞性プロテアーゼ及びシアリダーゼ）による培地の汚染において低下が認められる。
【００８７】
細胞培養物における高い細胞生存度を達成するため、多くの方法が適用され得る。１つは、正常温度での初期培養後に培養温度を低下させることを含む。例えば、Ｒｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：４２３−４２７）を参照されたい。一般に、目的のタンパク質を発現する能力がある哺乳類又は他の細胞型は、細胞数を増加させるため、最初に正常温度下で増殖される。各細胞型におけるかかる「正常」温度は、一般に約３７℃（例えば、約３５℃〜約３９℃、例えば３５．０℃、３５．５℃、３６．０℃、３６．５℃、３７．０℃、３７．５℃、３８．０℃、３８．５℃及び／又は３９．０℃など）である。特定の一実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための温度は、最初に約３７℃に設定される。適度に高い細胞密度が達成されるとき、そこでタンパク質生産を促進するため、全細胞培養物における培養温度が変更される（例えば、低減される）。ほとんどの場合、温度の低下により、細胞が細胞周期の非増殖Ｇ１部分の方に変化し、以前のより高い温度環境と比べて細胞密度及び生存度が増加することがある。さらに、より低い温度は、細胞性タンパク質の生産速度を増加させ、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を促進し、新規に生産されるタンパク質の断片化又は凝集を低減し、タンパク質のフォールディング及び三次元構造の形成を促進し（したがって活性を維持する）、且つ／又は新規に生産されるタンパク質の分解を低減することにより、組換えタンパク質の生産を促進する可能性もある。いくつかの実施形態では、温度は、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃低下する。いくつかの実施形態では、温度は、約２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃又は３５℃まで低下する。いくつかの実施形態では、より低い温度は、約３０℃〜約３５℃（例えば、３０．０℃、３０．５℃、３１．０℃、３１．５℃、３２．０℃、３２．５℃、３３．０℃、３３．５℃、３４．０℃、３４．５℃及び／又は３５．０℃）である。他の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための温度は、最初に約３５．０℃〜約３９．０℃に設定され、次に約３０．０℃〜約３５．０℃に変更される。一実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための温度は、最初に約３７．０℃に設定され、次に約３０℃に変更される。別の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための温度は、最初に約３６．５℃に設定され、次に約３３℃に変更される。さらに別の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための温度は、最初に約３７．０℃に設定され、次に約３３℃に変更される。さらなる実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための温度は、最初に約３６．５℃に設定され、次に約３０℃に変更される。他の実施形態では、温度変更の複数（例えば、２つ以上）のステップが適用され得る。例えば、温度は、最初の３７℃から３３℃に、次いでさらに３０℃に低下され得る。
【００８８】
異なる温度に変更する前、特定の温度で培養物を維持するための時間は、細胞生存度及び目的のタンパク質を生産する能力を維持しながら、十分な（又は所望の）細胞密度を達成するように決定され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約１０５細胞／ｍＬ〜約１０７細胞／ｍＬ（例えば、１×１０５、１．５×１０５、２．０×１０５、２．５×１０５、３．０×１０５、３．５×１０５、４．０×１０５、４．５×１０５、５．０×１０５、５．５×１０５、６．０×１０５、６．５×１０５、７．０×１０５、７．５×１０５、８．０×１０５、８．５×１０５、９．０×１０５、９．５×１０５、１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、７．０×１０６、７．５×１０６、８．０×１０６、８．５×１０６、９．０×１０６、９．５×１０６、１×１０７細胞／ｍＬ又はそれを超える）に達するまで増殖される。一実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５〜約３．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。別の実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５〜約３．２×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。さらに別の実施形態では、細胞培養物は、異なる温度に変更する前、初期温度下で生細胞密度が約２．５〜約２．８×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、タンパク質生産のために３０℃に変更する前、３７℃下で生細胞密度が約２．５〜２．８×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。他の実施形態では、細胞培養物は、タンパク質生産のために３０℃に変更する前、３７℃下で生細胞密度が約２．５〜３．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで増殖される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、温度変化が接種から５０〜１５０時間後、又は６０〜１４０時間後、又は７０〜１３０時間後、又は８０〜１２０時間後、又は９０〜１１０時間後に生じることを提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、温度が接種から約８０時間〜１５０時間後、接種から約９０時間〜１００時間後又は接種から約９６時間後に低下することを提供する。いくつかの実施形態では、温度変化は、接種から８０〜１２０時間後に生じる。いくつかの実施形態では、温度変化は、接種から９０時間後、９２時間後、９４時間後、９６時間後、９８時間後、１００時間後、１０２時間後、１０４時間後、１０６時間後、１０８時間後又は１１０時間後に生じる。いくつかの実施形態では、温度変化後の温度は、ＣＨＯ細胞が収集されるまで維持される。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、接種から１０日後に収集される。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、接種から１４日後に収集される。
【００９１】
ｐＨ
細胞培養下の増殖培地のｐＨの変更は、細胞タンパク質の分解活性、分泌及びタンパク質生産レベルに影響する可能性がある。細胞株の大部分は、約ｐＨ７〜８で十分に増殖する。細胞増殖における最適ｐＨの変動は、様々な細胞株の中で比較的小さいが、いくつかの正常な線維芽細胞株の挙動は、ｐＨ７．０〜７．７で最高であり、形質転換細胞の挙動は、典型的には７．０〜７．４のｐＨで最高である（Ｅａｇｌｅ，１９７３  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐＨ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８２：１−８）。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のｐＨは、約ｐＨ６．５〜７．７（例えば、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．３９、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５及び７．７０）である。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のｐＨは、約ｐＨ７．２０〜７．６０である。他の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のｐＨは、約ｐＨ６．９〜７．１である。特定の一実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のｐＨは、約ｐＨ６．９である。別の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のｐＨは、約ｐＨ７．３０である。さらに別の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のｐＨは、約ｐＨ７．３９である。
【００９２】
培地
いくつかの実施形態では、バッチ培養が用いられ、ここでは追加的な培地が接種後に添加されない。いくつかの実施形態では、流加培養が用いられ、ここでは１回以上のボーラス投与で培地が接種後に添加される。いくつかの実施形態では、２、３、４、５又は６回のボーラス投与で培地が接種後に添加される。
【００９３】
様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、培地が余分なボーラス投与で生産バイオリアクターに添加されるプロセスによって生産される。例えば、培地が１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。特定の一実施形態では、培地が３回のボーラス投与で添加される。様々な実施形態では、培地のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、培地のかかるボーラス投与は、生産バイオリアクターにおける培地の元の容量の約２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、６０％、６７％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１２５％、１３０％、１３３％、１４０％、１５０％、１６０％、１６７％、１７０％、１７５％、１８０％、１９０％、２００％又はそれを超える量で添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、元の容量の約３３％、６７％、１００％又は１３３％の量で添加され得る。様々な実施形態では、余分なボーラス投与のかかる添加は、細胞増殖又はタンパク質生産の期間中の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラス投与は、プロセスにおける１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目又はそれよりも後に添加され得る。特定の一実施形態では、培地のかかるボーラス投与は、一日おきに（例えば、（１）３日目、５日目及び７日目、（２）４日目、６日目及び８日目、又は（３）５日目、７日目及び９日目に添加され得る。実際、培地のボーラス投与での補助剤の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記の制限に従って自由に組み合わされ、実験練習によって決定され得る。
【００９４】
様々な培地が市販されている。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比で含む。いくつかの実施形態では、培地は、市販の培地、例えばＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを７５／２５の比で含む。
【００９５】
栄養補助剤
様々な栄養補助剤は、「フィード培地」とも称され、市販され、当業者に公知である。栄養補助剤は、接種が行われてから細胞培養物に添加される（培養培地と異なる）培地を含む。場合により、栄養補助剤は、培養下で増殖する細胞によって消費される栄養分を代替するために用いることができる。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、所望のタンパク質の生産を最適化するか又は所望のタンパク質の活性を最適化するために添加される。極めて多数の栄養補助剤が開発されており、市販されている。栄養補助剤の明示的な目的がプロセス開発の局面を高めることである一方、すべての細胞及び／又は生産されるすべてのタンパク質のために機能する普遍的な栄養補助剤は存在しない。所望の力価及び増殖特性を達成するため、所望の細胞株、生産タンパク質及び所与の基本培地と組み合わせて機能し得る、スケーラブルであり且つ適切な細胞培養栄養補助剤の選択は、ルーチン的でない。特定の細胞株、特定の生産タンパク質及び基本培地の組み合わせを用いて複数の市販の栄養補助剤をスクリーニングし、最適な補助剤を同定する典型的手法は、細胞培養プロセス中に存在する無数の変数に起因し、成功しない可能性がある。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃ＋ＡＧＴ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｇｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）４の組み合わせ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）５の組み合わせ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）６（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９６】
栄養補助剤中に存在する成分の多様性の例として、市販補助剤であるＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）の成分を列挙する表Ａを参照されたい。
【００９７】
【表１】
2020509744.tif 000004
【００９８】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤として説明することができ、第１のＡＤＣＦ栄養補助剤は、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２−メルカプトエタノールを含まない。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、化学的に規定された補助剤である。語句「動物由来成分を含まない」又は「ＡＤＣＦ」は、成分が直接的に動物供給源に由来しない、例えばウシ供給源に由来しない補助剤を指す。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａである。
【００９９】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤として説明することができ、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤には、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、化学的に規定された補助剤である。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、市販の栄養補助剤の組み合わせが用いられる。用語「栄養補助剤」は、単一の栄養補助剤とともに栄養補助剤の組み合わせの両方を指す。例えば、いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせは、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂの組み合わせを含む
【０１０１】
様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、栄養補助剤の余分な添加物が生産バイオリアクターに添加されるプロセスによって生産される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、ある期間、例えば１分〜２時間の範囲の期間にわたって添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、ボーラス投与で添加される。例えば、栄養補助剤は、１、２、３、４、５、６回又はそれを超えるボーラス投与で添加され得る。特定の一実施形態では、栄養補助剤は、１、２又は３回のボーラス投与で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、３つ以上の異なる時点、例えば２〜６つの異なる時点で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、４つの異なる時点で添加される。様々な実施形態では、栄養補助剤のかかる余分なボーラス投与は、様々な量で添加され得る。例えば、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、生産バイオリアクター内の培地の元の容量の約１％〜２０％、１％〜１０％又は１％〜５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。特定の一実施形態では、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、元の容量の１％〜２０％、１％〜１０％又は１％〜５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせが用いられ、第１の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、培地の０．５％〜４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせが用いられ、第１の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａは、培地の２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせが用いられ、第２の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、培地の０．０５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤の組み合わせが用いられ、第１の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂは、培地の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。栄養補助剤の組み合わせがＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂを含む特定の実施形態では、栄養補助剤のボーラス投与は、元の容量の１％〜２０％、１％〜１０％又は１％〜５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。栄養補助剤の組み合わせがＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂを含む特定の実施形態では、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ栄養補助剤のボーラス投与は、元の容量の１％〜２０％、１％〜１０％又は１％〜５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂ栄養補助剤のボーラス投与は、元の容量の０．１％〜２％、０．１％〜１％又は０．１％〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で添加され得る。
【０１０３】
複数の添加物、例えば栄養補助剤がボーラス投与で細胞培養物に添加されるいくつかの実施形態では、第１の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａの全添加物は、培地の５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。複数の添加物、例えば栄養補助剤がボーラス投与で細胞培養物に添加されるいくつかの実施形態では、第１の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａの全添加物は、培地の１２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。複数の添加物、例えば栄養補助剤がボーラス投与で細胞培養物に添加されるいくつかの実施形態では、第２の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂの全添加物は、培地の０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。複数の添加物、例えば栄養補助剤がボーラス投与で細胞培養物に添加されるいくつかの実施形態では、第２の栄養補助剤、例えばＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂの全添加物は、培地の１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される。
【０１０４】
様々な実施形態では、余分なボーラス投与のかかる添加は、接種後の様々な時点で行われ得る。例えば、ボーラス投与は、接種後の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目又はそれよりも後に添加され得る。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、接種から１〜３日後及び接種から３〜５日後に添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、接種から１〜３日後、接種から３〜５日後、接種から５〜７日後及び接種から７〜９日後に添加される。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、接種から２日後、接種から４日後、接種から６日後及び接種から８日後に添加される。特定の一実施形態では、栄養補助剤のかかるボーラス投与は、一日おきに（例えば、（１）３日目、５日目及び７日目、（２）４日目、６日目及び８日目、又は（３）５日目、７日目及び９日目に添加され得る。一実施形態では、栄養補助剤は、接種から２、４、６、８及び１０日後に添加される。栄養補助剤の組み合わせがＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂを含む特定の実施形態では、栄養補助剤のボーラス投与は、２日目、４日目、６日目、８日目及び１０日目に添加され得る。実際には、栄養補助剤のボーラス添加の頻度、量、時点及び他のパラメータは、上記制限に従って自由に組み合わされ、実験練習によって決定され得る。
【０１０５】
亜鉛補給
亜鉛イオンは、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の安定性に対して、その構造及び活性を維持することに役立つことから重要であることが知られている。例えば、２個の亜鉛原子は、１個の胎盤アルカリホスファターゼ分子と会合する（Ｈｅｌｅｎｅ  Ｌｅ  Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：９１５８−９１６５）。この比に基づき、小規模モデルで開発された例示的な生産プロセスによって生産される１ｇ／Ｌのアスホターゼアルファの力価について、約２０μＭの亜鉛がアスホターゼアルファ活性にとって必要である。２０μＭの亜鉛は、機能的なアスホターゼアルファを生産するのに理論的に十分である（すなわち亜鉛イオン２個／活性酵素）が、実際の亜鉛補給では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ、ＴＮＡＬＰ、ＰＡＬＰ、ＧＣＡＬＰ、ＩＡＰ又はその融合／変異タンパク質）の生産プロセスにおいて、有意により高い亜鉛濃度（例えば、１５０μＭ）が要求されることがある。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、組換えポリペプチドの生産中に亜鉛を前記培地に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、亜鉛は、前記培地中で約１〜約３００μＭの亜鉛濃度をもたらすように添加され得る。一実施形態では、亜鉛は、培地中で約１０〜約２００μＭ（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０μＭ）の亜鉛濃度をもたらすように添加され得る。いくつかの実施形態では、亜鉛は、約２５μＭ〜約１５０μＭ又は約６０μＭ〜約１５０μＭの培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。一実施形態では、亜鉛は、約３０、６０又は９０μＭの亜鉛の培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。一実施形態では、亜鉛は、８０μＭ、９０μＭ又は１００μＭの亜鉛、好ましくは約９０μＭの亜鉛の培地中の亜鉛濃度をもたらすように添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、前記培地にボーラス投与で連続的に、半連続的に又はそれらを組み合わせで添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、接種から１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後及び／又は１３日後に添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、接種後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３回のボーラス投与で添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、硫酸亜鉛の形態で添加される。亜鉛濃度は、Ｚｎ２＋濃度によって決定され、塩として任意の生理学的に適切な対イオンが提供され得る。
【０１０７】
収集
先行試験により、収集タイミングの遅延が生存度及びＴＳＡＣ低下に関連したため、収集タイミングが他のＣＱＡに対する潜在的影響を有し得ることが示唆された。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約２００時間、２１０時間、２２０時間、２３０時間、２４０時間、２５０時間、２６０時間、２６４時間、２７０時間、２８０時間、２８８時間（すなわち１２日）又は１２日以降の時点で収集される。特定の実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約１０日又は約１４日の時点で収集される。
【０１０８】
下流プロセス
用語「下流プロセス」は、本明細書で用いられるとき、一般に、再利用可能な成分の再利用並びに廃棄物の適切な処理及び処分を含む、培養細胞又は発酵培養液などの供給源から生産されるアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の回収及び精製のためのプロセスの全部又は一部を指す。
【０１０９】
一般に、下流処理は、純度及び濃度における前進的な改善を通じて、生成物をその天然状態から組織、細胞又は発酵培養液の成分としてもたらす。例えば、不溶物の除去は、微粒子を含まない液体中の溶質としての生成物の捕捉（例えば、細胞、細胞片又は他の微粒子状物質を発酵培養液から分離すること）を含む第１のステップであり得る。これを達成するための例示的操作は、例えば、ろ過、遠心分離、沈降、沈殿、綿状沈殿、電気集塵、重力沈降などを含む。追加的操作は、固体供給源、例えば植物及び動物組織から生成物を回収するために例えば粉砕、均質化又は浸出を含み得る。第２のステップは、その特性が所望の生成物の場合と著しく異なる成分を除去する「生成物単離」ステップであり得る。大部分の生成物において、水が主要な不純物であり、単離ステップは、その大部分を除去し、処理対象の材料の体積を低減し、生成物を濃縮するように設計される。溶媒抽出、吸着、限外ろ過及び沈降は、このステップにおいて単独で又は組み合わせて用いられ得る。次のステップは、物理及び化学特性において生成物と酷似する汚染物質を分離する生成物精製に関する。考えられる精製方法は、例えば、親和性、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、サイズ排除、逆相クロマトグラフィー、限外ろ過−ダイアフィルトレーション、結晶化及び分別沈殿を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される。いくつかの実施形態では、組換えアルカリホスファターゼＫｃａｔ及びＫｍ値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する。いくつかの実施形態では、本方法は、積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＣＣは、本明細書に記載のステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の不在下での方法と比べて約３．０倍〜約６．５倍だけ増加される。
【０１１１】
最終ステップは、生成物の研磨、すなわち安定であり、容易に輸送可能であり、且つ便宜的な形態での生成物のパッケージングで完了するプロセスとして用いられ得る。２〜８℃での貯蔵、−２０℃〜−８０℃での凍結、結晶化、乾燥、凍結乾燥、フリーズドライ及び噴霧乾燥は、この最終ステップにおける例示的方法である。生成物の研磨では、生成物及びその使用意図に応じて、さらに生成物を滅菌し、生成物の安全性を損なう可能性がある微量汚染物質（例えば、ウイルス、内毒素、代謝廃棄生成物及び発熱物質）を除去又は非活性化し得る。
【０１１２】
生成物回収方法は、本明細書で考察される２つ以上のステップを組み合わせ得る。例えば、吸着流動床（ＥＢＡ）では、不溶物の除去及び生成物単離が単一ステップで実施される。ＥＢＡのレビューとしては、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００５  Ｊｕｎ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ８：Ｕｎｉｔ  ８．８を参照されたい。さらに、親和性クロマトグラフィーでは、単離及び精製が単一ステップでなされることが多い。
【０１１３】
培養細胞において生産される組換えタンパク質を精製するための下流プロセスのレビューとしては、Ｒｅａ，２００８  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｃ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｍａｒｃｈ  ２：２０−２５を参照されたい。本明細書で開示されるアルカリホスファターゼのための下流プロセスは、以下の例示的ステップの少なくとも１つ又は任意の組み合わせを含み得る。
【０１１４】
−−  収集清澄化プロセス。このステップでは、無傷細胞及び細胞片が滅菌ろ過により除去され、生成物（すなわち生産されたアルカリホスファターゼ）が回収される。このステップで使用可能な溶液は、回収緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）を含み得る。
【０１１５】
−−  収集後限外ろ過（ＵＦ）及び／又はダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス。このステップにおける目的は、濃縮及び緩衝液希釈である。ＵＦプロセスにおける例示的ステップは、例えば、フィルター膜の使用前洗浄／貯蔵、洗浄後／貯蔵後流出、平衡化（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５０）を含有する緩衝液を用いる）、負荷、濃縮、希釈／流出／回収（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５０）を含有する緩衝液を用いる）及びフィルター膜の使用前流出／洗浄／貯蔵を含む。
【０１１６】
−−  ウイルス粒子を化学的に不活性化するための溶剤／洗剤ウイルス不活性化プロセス。例示的な溶剤／洗剤は、１０％ポリソルベート８０、３％ＴＮＢＰ、５０ｍＭリン酸ナトリウム及び１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有し得る。
【０１１７】
−−  さらに生成物を精製し且つ／又は不純物／汚染物質を分離するための特定のタイプのカラムクロマトグラフィー、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、親和性クロマトグラフィー、吸着流動床（ＥＢＡ）、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。生成物（すなわちアルカリホスファターゼ、例えばアスホターゼアルファ）を捕捉するため、親和性捕捉プロセス、例えばプロテインＡクロマトグラフィーを用い得る。例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡクロマトグラフィーのプロセスを用い得る。ＨＩＣクロマトグラフィーでは、ブチルセファロース又はＣＡＰＴＯ（登録商標）ブチルアガロースカラムを用い得る。プロテインＡクロマトグラフィーにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば平衡化／洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）、溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１．０）、ストリップ緩衝液（例えば、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）、流出緩衝液、洗浄液（例えば、０．１Ｍ  ＮａＯＨ）などが挙げられる。ＣＡＰＴＯ（登録商標）ブチルアガロースＨＩＣプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば添加希釈液／平衡化前緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．４Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５０）、平衡化緩衝液／洗浄緩衝液／溶出緩衝液（例えば、すべてがリン酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムを含有する）、ストリップ緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムを含有する）などが挙げられる。ブチルＨＩＣプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば添加希釈液／平衡化前緩衝液（例えば、１０ｍＭヘペス、２．０Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５０）、平衡化緩衝液／洗浄緩衝液／溶出緩衝液（例えば、すべてがリン酸ナトリウム又はヘペス及び硫酸アンモニウムを含有する）及びストリップ緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムを含有する）が挙げられる。
【０１１８】
−−  例えば、生成物濃縮及び／又は緩衝液交換のためのＨＩＣ後ＵＦ／ＤＦプロセス。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば平衡化緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）、ダイアフィルトレーション緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）などが挙げられる。
【０１１９】
−−  任意のウイルス粒子をさらに除去するためのウイルス減少ろ過プロセス。
【０１２０】
−−  混合モードクロマトグラフィー、例えばＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー。市販の混合モード材料として、例えば疎水力及び静電力の組み合わせによる中性又は弱塩基性ｐＨでの結合及び低ｐＨでの静電荷反発による溶出を可能にする、ヒドロカルビルアミンリガンドを含有する樹脂（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹからのＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ及びＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ）（Ｂｒｅｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．１１７７：２２６−２３３を参照されたい）；芳香族残基による疎水性相互作用を得て、硫黄原子がチオフィリック相互作用により標的タンパク質の結合を促進する、４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンドを含有する樹脂（ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ，Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｌｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．７：４２−４８）；異なる伝導率でタンパク質の塩耐性吸着をもたらす、イオン基の近傍に水素結合基及び芳香族残基を有するリガンドを含有する、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー及びＣＡＰＴＯ（登録商標）ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）などの樹脂（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．１２１７：２１６−２２４）；及び他の公知のクロマトグラフィー材料、例えば色素リガンドとの親和性樹脂、ハイドロキシアパタイト及びいくつかのイオン交換樹脂（限定されないが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ５０（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）又はＬｅｗａｔｉｔ  ＣＮＰ１０５（Ｌａｎｘｅｓｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ、ＤＥ）を含む）が挙げられる。例示的なアガロースＨＩＣクロマトグラフィーステップでは、このプロセスで用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば平衡化前緩衝液（例えば、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．００）、平衡化／洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、４４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５０）、添加滴定緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．７５）、プール希釈緩衝液（例えば、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）及びストリップ緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２０が挙げられる。
【０１２１】
−−  （例えば、サイズ排除による）ウイルスクリアランスのためのウイルスろ過。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えば使用前及び生産後流出緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．７５）が挙げられる。
【０１２２】
−−  配合（例えば、濃縮及び／又は緩衝液交換のためのＵＦ／ＤＦプロセスを含み得る）プロセス。このプロセスにおいて用いられる例示的な緩衝液及び溶液として、例えばフィルター流出／平衡化／ダイアフィルトレーション／回収緩衝液（例えば、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）が挙げられる。
【０１２３】
−−  滅菌ろ過（例示的なフィルターは、Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ６０又は同じサイズのＰＶＤＦフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）である）を含むバルク充填プロセス。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される通り、培養細胞からアルカリホスファターゼを生産、精製及び／又は分離するために用いられるステップは、収集清澄化プロセス（又は無傷細胞及び細胞片を細胞培養物から除去するための類似プロセス）、限外ろ過（ＵＦ）プロセス（又は生産されたアルカリホスファターゼを濃縮するための類似プロセス）、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は先行プロセスから生産されたアルカリホスファターゼを含む緩衝液を変更又は希釈するための類似プロセス）、ウイルス不活性化プロセス（又はウイルス粒子を不活性化又は除去するための類似プロセス）、親和性捕捉プロセス（又は生産されたアルカリホスファターゼを捕獲し、それを緩衝液／溶液成分の残りから分離するためのクロマトグラフィー方法のいずれか１つ）、配合プロセス及びバルク充填プロセスからなる群から選択されるステップの少なくとも１つをさらに含む。一実施形態では、培養細胞からアルカリホスファターゼを生産、精製及び／又は分離するためのステップは、本明細書で開示される通り、少なくとも、収集清澄化プロセス（又は無傷細胞及び細胞片を細胞培養物から除去するための類似プロセス）、収集後限外ろ過（ＵＦ）プロセス（又は生産されたアルカリホスファターゼを濃縮するための類似プロセス）、収集後ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は先行プロセスから生産されたアルカリホスファターゼを含む緩衝液を変更又は希釈するための類似プロセス）、溶媒／洗剤ウイルス不活性化プロセス（又はウイルス粒子を化学的に不活性化するための類似プロセス）、中間体精製プロセス（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は生産されたアルカリホスファターゼを捕獲し、それを緩衝液／溶液成分の残りから分離するためのクロマトグラフィー方法のいずれか１つ）、ＨＩＣ後ＵＦ／ＤＦプロセス（又は生産されたアルカリホスファターゼに対して濃縮及び／又は緩衝液交換するための類似プロセス）、ウイルス減少ろ過プロセス（又は任意のウイルス粒子又は他の不純物若しくは汚染物質をさらに除去するための類似プロセス）；混合モードクロマトグラフィー（例えば、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅアガロースクロマトグラフィー又は生産されたアルカリホスファターゼをさらに精製及び／若しくは濃縮するための類似プロセス）、配合プロセス及びバルク充填プロセスを含む。一実施形態では、本明細書に提供される方法の分離ステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉、ＨＩＣクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びそれらの組み合わせの少なくとも１つをさらに含む。
【０１２５】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により援用される。前述の本開示は、理解を明確にすることを意図して図面及び実施例を通じてある程度詳細に記載されているが、特定の小さい変更及び修正が実施されることは、当業者に自明である。したがって、説明及び実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１．アスホターゼアルファの生産性に対する培地、栄養補助剤及び亜鉛補充の評価
標準的な増殖プロセス「コントロールプロセス」を、先行プロセスにおいて用いられるＣＨＯ供給量を０．５％（ｗ／ｖ）から２．０％（ｗ／ｖ）に増加させることにより開発した。コントロールプロセスは、０．１２ｇ／Ｌの平均活性力価を有した。コントロールプロセスは、他の市販のＣＨＯに基づく上流プロセスと比べて著しく低い積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）及び体積力価を有した。複合栄養分の補充及び既存の供給量の増加を含む先行努力は、ほとんど又は全く成功していなかった。加えて、コントロールプロセスにおける温度変化は、標的のシアリル化を達成し、且つ活性レベルを最大化するのに重要であった。
【０１２７】
したがって、少なくとも２倍のプロセス収率増加を目標として、さらなるプロセス改善を検討した。
【０１２８】
予備試験では、総積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）、生産性及び活性レベルを増加させるなかで代替培地、複合フィード添加物及び金属補充の効果を評価した（図１）。予備試験では、栄養補助剤（Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５）により、１４日目にコントロールプロセスにおける１０日目の収集と比べて細胞増殖の増強、細胞寿命の維持及びプロテインＡ結合力価の２倍の増加がもたらされた。しかし、比活性は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２／５試験条件下でコントロールプロセスの場合よりも２０％低かった。結果として、最終容量活性は、１４日目にＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２／５試験条件下でコントロールプロセスと比べて６０％増加したにすぎなかった。
【０１２９】
アスホターゼアルファの比活性に関連して、アスホターゼアルファへの亜鉛の取り込みを評価している。研究時、栄養補助剤（Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５）を利用する研究において用いた亜鉛対アスホターゼアルファのモル比（９のモル比）は、以前のヒストリカルプロセスの場合（８のモル比）に、コントロールプロセスの場合（１９のモル比）よりも類似した（データは示さず）。コントロールプロセスにおけるモル比の１９への増加により、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ栄養添加剤とともに亜鉛補充への研究が導かれた。
【０１３０】
フォローアップ振盪フラスコ試験では、プロセスにおいて比活性を増強することに対する硫酸亜鉛補充の影響を評価した。試験条件の中で、総括性は、９０μＭの硫酸亜鉛条件下で最高であった（コントロールプロセス条件よりも約９７％高い）。２番目に高い総括性をもたらすプロセスは、３０μＭの硫酸亜鉛条件であった（コントロールプロセス条件よりも約７４％高い）。この試験では、すべての硫酸亜鉛を０日目に添加した。３０μＭの硫酸亜鉛条件では、４日目にかけてコントロールプロセスと同等の細胞増殖、また６日目から１４日目にかけてコントロールプロセスを上回る細胞増殖が示される一方、９０μＭの硫酸亜鉛条件では、６日目にかけてコントロールプロセスよりも低いＶＣＤ、８日目から１４日目にかけて同等のＶＣＤが示され、硫酸亜鉛補充における量及び添加タイミングが細胞増殖及び生存度における役割を担うことが示された。
【０１３１】
培地効果を評価する別の試験では、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＨＯ培地を２５％及び５０％（ｖ／ｖ）の濃度の培地に含めると、対照条件（１００％ＳＦＭ４ＣＨＯ培地）よりも高いピーク生細胞密度が得られ、少なくとも７日目（この試験中の試験で最長持続時間であった）にかけて細胞生存度が同等であることが示された。２５％ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ条件における平均力価測定値は、コントロールプロセスより４４％高く、２５％ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ条件下での平均比生産性は、コントロールプロセスより３０％高かった。
【０１３２】
後続試験では、２Ｌのバイオリアクター内での生産性に対する硫酸亜鉛（量及び添加タイミング）及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ補充の影響を評価した。総アスホターゼアルファ活性を最大化し、コントロールプロセスに匹敵する比生産性を標的にするため、この試験からのデータ並びに培地評価試験（実施例２）及び亜鉛補充試験（実施例１）からのデータを分析した（図１）。全部で４つのパラメータ（ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５、亜鉛及び収集日）は、総括性又は比生産性のいずれかに関して統計学的に有意な効果を有した（図１）。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５は、総括性又は比生産性の両方に関して統計学的に有意な効果を有した（図１）。
【０１３３】
これらの予備試験からの読み出し情報により、栄養フィードを補充し、その後の容積生産性に対して温度変化を遅らせることの潜在的な影響を評価する試験設計が導かれた。
【０１３４】
実施例２：アスホターゼアルファの生産プロセスにおける様々な培地の評価
本明細書に記載の通り、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ（ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０））を生産するための改善された生産プロセスを開発した。アスホターゼアルファを発現する安定なＣＨＯ細胞株を、遺伝子発現系、例えばＧＳ又はＤＨＦＲ遺伝子発現系を用いて発現させた。二次クローンを単回の限界希釈クローニングにおいて高生産性の一次クローンから誘導し、最終細胞株を選択した。
【０１３５】
３つの市販培地及び２つの培地の混合物に対し、アスホターゼアルファを発現する細胞について評価した。例示的な生産プロセスは、下記の通りである。マスター細胞バンクのバイアルを解凍し、総容量のバイアルを、表１に示すように、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地（Ｓｉｇｎａｍ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣＤ  ＤＧ４４培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）又はＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ培地とＳＦＭ４ＣＨＯ培地との混合物（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）のいずれかの培地で再懸濁及び増殖した。
【０１３６】
【表２】
2020509744.tif 000005
【０１３７】
細胞は、その培地としてＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地及びＣＤ  ＤＧ４４培地を用いるシードトレイン評価において十分に適応しなかった。したがって、これらの培地は、さらに試験しなかった。ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ培地を用いて増殖させた細胞は、シードトレイン評価において適切に適応した。シードトレイン評価への移行中、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ培地（２５％）とＳＦＭ４ＣＨＯ培地（７５％）との混合物を用いて増殖させた細胞は、最高の結果を達成した（データは示さず）。したがって、さらなる生産バイオリアクター試験における培地としてＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ／ＳＦＭ４ＣＨＯ培地を用いた。
【０１３８】
実施例３：細胞増殖及びタンパク質生産に関する栄養補助剤の評価
最終アルカリホスファターゼ生成物の完全性を破壊することなく収率を最大化するため、様々な化学的に規定された市販の栄養供給サプリメントをコントロールプロセスに対して評価した（表３）。この試験におけるバイオリアクターコントロールのための細胞培養プロセスパラメータを表２に提示する。
【０１３９】
表３に示す概要の通り、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃ＋ＡＧＴ（商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｇｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）４の組み合わせ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）２＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）５の組み合わせ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）６（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ａ＋Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）をすべて検討した。栄養補助剤を２ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ製生産バイオリアクター内又は１Ｌの振盪フラスコのいずれかにおいて温度変化の存在下及び不在下で評価した。
【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
【表４】
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【０１４２】
バイオリアクターＩＤ番号１〜８における実験を２Ｌのバイオリアクターで実施し、バイオリアクターＩＤ番号９及び１０における実験を１Ｌの振盪フラスコ内で実施した。細胞培養保持物（８日目、１０日目、１２日目及び１４日目）を遠心分離し、ＰｒｏＡ結合力価を決定した。１０日目と１４日目に各バイオリアクターにつき２００ｍＬの部分的収集を実施した。試料を遠心分離し（３０００ｇ、１０分）、０．２μｍでろ過し、−８０℃で貯蔵し、ハイスループットＰｒｏＡ精製を行った。総比生産性を、収集時（１０日目と１４日目）のＰｒｏＡ力価を同日のＩＶＣＣで除したものを用いて算出した。酵素に基づくアッセイを用いて、タンパク質活性レベルを測定した。プロセス不純物及びシアリル化レベルをＰｒｏＡ精製した収集試料中で測定した。清澄化した細胞培養液をｐＮＰＰ活性について分析し、ＰｒｏＡ精製試料についてＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を実施し、ＰｒｏＡ精製し、緩衝液交換した試料をＴＳＡＣについて分析した。
【０１４３】
図２は、バイオリアクターＩＤ番号１〜８における生細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞生存度データを表す。栄養フィードの添加により、すべての試験条件において細胞増殖が促進され、全体的により高いＩＶＣＣが得られた。
【０１４４】
コントロールプロセス及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５制御バイオリアクターは、類似の細胞培養性能、ヒストリカルデータに類似する傾向、すなわち総ＩＶＣＣにおける平均１．６倍の増加を示した。温度変化の存在下及び不在下でのＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６添加は、温度変化を伴うＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５が添加されたバイオリアクターに類似の細胞増殖を示した一方、温度変化を伴わないＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターにおいて最高ＶＣＤ（１４×１０６細胞／ｍＬ）が観測され、潜在的には総ＩＶＣＣにおける２．７倍の増加であった。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂリアクターから温度変化を除くことにより、３．７倍高いピークＶＣＤが得られ、温度変化のタイミングを調節することにより、細胞増殖を有意に改善する可能性が示された。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターにおいて設けた温度変化下において、ＶＣＤの成長は、他のＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔの添加条件と類似した。温度変化を遅くすることにより、細胞の対数増殖期が延長し、より高いピークのＶＣＤが得られた。それに対し、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６バイオリアクターから温度変化を除くことにより、ピークＶＣＤは有意に変化しなかったが、代わりに生細胞におけるより迅速な減少がもたらされた。より低い収集生存度は、生成物品質に対して有害であることが公知である。さらに、接種から９６時間後の温度変化は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクター内で細胞生存度低下率に影響しなかった。
【０１４５】
栄養補助剤Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃ＋及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋４の使用により、生産性における有意な増加は全く生じなかった（データは示さず）。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６の使用により、生産性が２倍増加した（生成物力価）。生産性の結果は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６バイオリアクターからの温度変化を除くことによって改善しなかった。
【０１４６】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂ条件の使用により、最も驚くべき結果が得られた。この特定のフィード添加により、温度変化の不在下で総生産性が６．５倍増加した。
【０１４７】
特定のアスホターゼアルファ活性及び生産性を評価した。バイオリアクターＩＤ番号１〜８におけるＰｒｏＡ結合力価、比生産性、総括性及び比活性データを図３及び図４に提示する。
【０１４８】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔフィードを添加したすべての条件では、コントロールプロセスをよりも高い力価及び比生産性が示された。細胞密度の増加は、細胞生産性に対して有害な効果を有しなかった。比生産性特性は、条件間で有意にドリフトしなかった。温度変化を伴わない、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターは、１４日目までに９８１ｍｇ／Ｌのタンパク質生成物を生産した（コントロールプロセスの約５倍の力価）一方、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂの組み合わせが供される条件下で温度変化を設けることにより、他のＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔの添加条件と類似レベルのタンパク質力価が得られた。これは、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが供される条件下での容量力価範囲が、温度変化のタイミングを変更することによってさらに調節され得たことを示す。
【０１４９】
温度変化条件下でのバイオリアクターの比生産性レベルは、８日目〜１４日目で概ね不変のままであった。温度変化を伴わないバイオリアクターにおいて、比生産性における段階的低下が見られた。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔが添加されたバイオリアクターにおいて見られるように、この効果は、より高度な細胞増殖を支持することを意図して、栄養分の欠乏及び／又は不十分なスパージングが原因となっている可能性が高かった。
【０１５０】
すべてのＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔが添加されたバイオリアクターは、より高い生産性レベルに一致する、コントロールプロセスよりも高い総容量活性を示した。温度変化条件下でのＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターは、実行全体を通じて類似の総容量活性を示した（１４日目で２３４Ｕ／ｍＬ）。しかし、温度変化条件を伴わないＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂの添加では、１２日目（２２９Ｕ／ｍＬ）〜１４日目（１３３Ｕ／ｍＬ）で総容量活性における低下が示された。
【０１５１】
温度変化を伴うすべての条件がコントロールプロセスと類似の比活性を示した一方、温度変化を伴わない場合、温度変化が比活性を増強するという以前の知見に一致し、コントロールプロセス条件よりもほぼ６０％低い比活性が示された。温度変化条件下における、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターにおける容量活性の低下は、１２日目（２７６Ｕ／ｍｇ）〜１４日目（１３６Ｕ／ｍｇ）のバイオリアクターにおける比活性の低下に起因した。
【０１５２】
タンパク質活性は、アスホターゼアルファ及び他の糖タンパク質を生産するのに重要である。総容量活性は、さらなるフィード添加により、増加したＩＶＣＣの結果として増強された。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ２＋５条件は、総括性における１．８倍の増加をもたらした一方、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂ条件は、コントロールプロセスと比べて２．２倍高い総括性をもたらした。比活性特性は、異なるフィード添加物を通じて変化しなかった。しかし、温度変化における遅延が比活性レベルを有意に妨げた。これらの結果は、最高百分率の活性生成物を保証するために温度変化のタイミングを調節することの重要性を強調している。図５及び図６を参照されたい。
【０１５３】
実施例４：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集物の決定
ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを表３及び図７に提示する。（温度変化を伴う）代替的なフィード条件における総ＩＶＣＣ及び生産性の増加は、収集時、プロセス不純物を有意に改変しなかった。しかし、条件から温度変化を除くことにより、コントロールの２．６倍程度高い不純物レベルがもたらされ、コントロールプロセスの不純物レベルに対する温度変化の重要性が強調された。一般に、すべての試験条件において、１０日目〜１４日目により高い凝集物が認められた。９６時間後の温度変化を伴う、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターは、コントロールプロセスバイオリアクター（１０日目に４．１及び４．２％）に類似した凝集物レベル（４．２％）を示したが、１４日目にそのほぼ２倍の生産性を示した。同じフィード方法の場合、温度変化を欠如した条件では、その対応する温度変化条件よりも高い凝集物がもたらされた。
【０１５４】
【表５】
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【０１５５】
実施例５：総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）の決定
タンパク質シアリル化は、重要なタンパク質生成物の属性であり、生理的条件下でタンパク質半減期に影響する。生産プロセスは、シアリル化レベルを許容できる制限内で厳密に制御するように選択される必要がある。
【０１５６】
ＴＳＡＣデータを表４及び図８に提示する。温度変化を伴うすべての代替的な栄養補助剤の条件によると、収集時、許容できるシアリル化レベルが報告された。温度変化を伴わないバイオリアクターは、温度変化を設ける場合よりも有意に高いＴＳＡＣをもたらした。温度変化条件下の、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加されたバイオリアクターは、１４日目に平均コントロールプロセスＴＳＡＣ値（３．４）に極めて近い３．９モル／モルのＴＳＡＣを示した。これらの結果により、生産プロセスにおける温度変化の重要性が確認される。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
最も有望な条件（ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔが培地に添加され、フィードとしてＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂが添加され、硫酸亜鉛が添加され、また温度変化が設けられる）により、２３４Ｕ／ｍＬの容量活性（コントロールプロセスよりも２倍高い）及びコントロールプロセスに対して同等の生成物品質属性（ＴＳＡＣ及びＳＥＣ）がもたらされた。さらに、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ／７ｂの組み合わせは、細胞増殖を増強することを介して容量生産性を増加させる大きい可能性を示した。
【０１５９】
結果は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ＋７ｂが最も有望な結果をもたらしたことを示唆し、生産性においてコントロールプロセスの上流プロセスと比べて６．５倍の増加を示す。温度変化を遅くすることにより、細胞の対数増殖期が延長され、より高い総ＩＶＣＣが促進される。その結果により、この上流の生産プロセスにおける所望の生成物品質を得るなかでの温度変化の重要性も確認される。
【０１６０】
実施例６：アスホターゼアルファ生産に対する亜鉛塩培地添加の評価
接種から少なくとも１日後、硫酸亜鉛を、実施例１〜５における条件に従い、２０μＭ〜２００μＭの範囲の濃度のＺｎ２＋でアスホターゼアルファ培地に添加する。１０日目及び１４日目に増殖、活性、比活性、生産性、凝集物及びシアリル化を評価する。限定されないが、硫化物、臭化物、塩化物、フッ化物、ヨウ化物、リン酸塩、セレン化物、硝酸塩などを含む、他の生理学的に許容できる市販の亜鉛塩についても評価する。
【０１６１】
実施例７：温度変化のタイミングの評価
温度変化の特定のタイミングを、栄養補助と併せて、ＣＨＯ細胞におけるアスホターゼアルファ生産について、実施例１〜６における条件に従ってさらに評価する。１０日目及び１４日目に増殖、活性、比活性、生産性、凝集物及びシアリル化を評価する。結果によると、最高活性の生成物レベルが得られる一方、生成物品質及び許容できる放出パラメータが保持される。
【０１６２】
上の本明細書に記述されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個別の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が詳細且つ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。本開示の上記方法の様々な修正形態及び変更形態、医薬組成物及びキットは、特許請求される本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白になるであろう。本開示は、具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修正形態が可能であり、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ−３ｂ】
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【図４ａ−４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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