(57)【要約】同種移植片拒絶反応の予測は、ドナー遺伝子型の非存在下での移植由来循環セルフリーＤＮＡ（ｄｄ−ｃｆＤＮＡレベル）の定量化に基づいて提供される。本開示の技術は、ゲノム移植ダイナミクス（ＧＴＤ）の実施に対する障壁のいくつかを軽減し、それにより、臨床用途をさらに広げるであろう。【選択図】図１
2020515278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー遺伝子型の非存在下で、移植由来の循環ドナー由来セルフリーＤＮＡを定量化する方法であって、
（ａ）移植レシピエントから血液サンプルを抽出するステップと、
（ｂ）抽出された前記血液サンプルの血漿から循環ヌクレオチド酸を単離するステップと、
（ｃ）第１のコンピュータ実施方法を用いて、単離された前記循環ヌクレオチド酸の非バイアスの配列決定を行うステップと、
（ｄ）第２のコンピュータ実施方法を用いて、前記移植レシピエントのみからの遺伝子型決定に基づいて前記移植由来のドナー由来セルフリーＤＮＡを推定し定量化するステップと、
（ｅ）定量化された前記移植由来の循環ドナー由来セルフリーＤＮＡを出力するステップと、を含み、
当該方法はドナー遺伝子型の非存在下で実施され、
前記第１のコンピュータ実施方法及び前記第２のコンピュータ実施方法と、前記出力とはコンピュータ装置によって実行され、かつ、
当該方法は標的ＰＣＲ増幅法を用いない、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記移植レシピエントのみからの前記遺伝子型決定は、遺伝子型決定アレイ、セルフリーＤＮＡ配列決定、または、低カバレッジ全ゲノム配列決定及びそれに続くインピュテーションに基づいて行われることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記移植レシピエントは、固形臓器移植レシピエント、骨髄移植レシピエント、または造血幹細胞移植レシピエントであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同種移植片またはホストの損傷を測定するための方法及びシステムに関する。より詳細には、本発明は、ドナーの遺伝子型情報の非存在下で、ショットガン配列決定法を用いてドナー由来セルフリーＤＮＡ（ｄｄ−ｃｆＤＮＡ）をモニタリングする方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、固形臓器移植が一般的に行われているが、臨床転帰は依然として不良のままである（生存率の中央値は、肺移植では５．３年、心臓移植では１１年）。移植レシピエントの長期生存には、同種移植片の健康の正確なモニタリングが不可欠である。同種移植片拒絶反応サーベイランスの現在の最も標準的な方法は生検（肺移植では経気管支生検、心臓移植では心内膜心筋生検）であるが、この侵襲的技術は、高いコスト及び無数の合併症に悩まされている。
【０００３】
「２ゲノム（two-genomes）」法と呼ばれるショットガンベースのゲノム移植ダイナミクス（ＧＴＤ）の現在の実施は、ドナーとレシピエントとの両方の遺伝子型決定を必要とする。レシピエントの遺伝子型は入手しやすいが、それとは対照的に、ドナーの遺伝子型は入手できない場合が多い。そこで、本発明者らは、ドナーの遺伝子型情報の非存在下で、ショットガン配列決定法を用いてｄｄ−ｃｆＤＮＡのモニタリングを可能にする方法、すなわち「１ゲノム（one-genome）」法の開発に着手した。本発明では、例示的な実施形態として、本発明者らは、この１ゲノム法を肺移植レシピエント及び心臓移植レシピエントのコホートデータに適用し、１ゲノム法の性能が２ゲノム法の性能に匹敵することを実証した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
移植臓器由来の循環血液中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の定量化は、移植後の損傷をモニタリングするための強力なアプローチである。ゲノム移植ダイナミクス（ＧＴＤ）は、ゲノム全体に分布する一塩基多型（ＳＮＰ）を利用してドナー及びレシピエントのＤＮＡ分子を識別することによって、ドナー由来ｃｆＤＮＡ（ｄｄ−ｃｆＤＮＡ）を定量化する。現在の実施では、ＧＴＤは、移植レシピエントとドナーとの両方の遺伝子型決定を必要とする。しかしながら、実際には、ドナーの遺伝子型情報は入手できない場合が多い。
【０００５】
本発明では、この問題は、ドナー遺伝子型の非存在下でｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルを推定するアルゴリズムを開発することによって解決する。本発明に係る方法は、従来のＧＴＤと同様の精度で、心臓及び肺の同種移植片拒絶反応を予測する。さらに、本発明者らは、骨髄及び腎臓の移植での一般的なシナリオである、近縁のレシピエント及びドナーに対処するために、本発明に係る方法を改良した。本発明者らは、ゲノムに沿った同祖性（ＩＢＤ）状態の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して、ドナーの非血縁または兄弟姉妹である骨髄移植患者におけるｄｄ−ｃｆＤＮＡを推定することが可能であることを示した。最後に、本発明者らは、白血球中のドナーＤＮＡとｄｄ−ｃｆＤＮＡとの割合と比較することにより、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の再発と発症とを識別できることを示した。これらの方法は、ＧＴＤの実施に対する障壁のいくつかを軽減し、それにより、臨床用途をさらに広げるであろう。
【０００６】
例示的な実施形態では、本発明は、ドナー遺伝子型の非存在下で、移植由来の循環ドナー由来セルフリーＤＮＡを定量化する方法であって、（ａ）移植レシピエントから血液サンプルを抽出するステップと、（ｂ）抽出された血液サンプルの血漿から循環ヌクレオチド酸を単離するステップと、（ｃ）第１のコンピュータ実施方法を用いて、単離された循環ヌクレオチド酸の非バイアスの配列決定を行うステップと、（ｄ）第２のコンピュータ実施方法を用いて、移植レシピエントのみからの遺伝子型決定に基づいて移植由来のドナー由来セルフリーＤＮＡを推定し定量化するステップと、（ｅ）定量化された移植由来の循環ドナー由来セルフリーＤＮＡを出力するステップと、を含む方法を提供する。第１のコンピュータ実施方法及び第２のコンピュータ実施方法と、上記の出力との両方とは、コンピュータ装置によって実行される。本方法は、標的ＰＣＲ増幅法を用いないことに留意されたい。移植レシピエントのみからの遺伝子型決定は、遺伝子型決定アレイ、セルフリーＤＮＡ配列決定、または、低カバレッジ全ゲノム配列決定及びそれに続くインピュテーション（imputation）に基づいて行うことができる。
【０００７】
移植レシピエントは、固形臓器移植レシピエント（例えば、心臓、肺、腎臓、肝臓など）、骨髄移植レシピエント、または造血幹細胞移植レシピエントである。
【０００８】
本発明の実施形態は、方法、コンピュータ実施方法、ソフトウェア、またはシステムとして実施することができる。いくつかの方法ステップは、コンピュータハードウェア、デバイス、チップ、システム、及び／またはプロセッサによって実行可能なコンピュータ実施ステップとして実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の方法の例示的な実施形態を示す。（ａ）非血縁個体におけるｄｄ−ｃｆＤＮＡの推定のための「１ゲノム法」統計モデルの図解図。パラメータ（比較的明るい灰色の背景）、隠しパラメータ、及びデータ（比較的暗い灰色の背景）が、テキストボックスによって示されている。（ｂ）個体が近縁である場合（本発明では骨髄移植の場合）、ドナーの遺伝子型は、レシピエントの遺伝子型、並びに、レシピエントの遺伝子型及びドナーの遺伝子型間の同祖性（ＩＢＤ）状態に依存する。ＩＢＤ状態は、ゲノムに沿った約２ｃＭのブロックについてモデル化されている。ＩＢＤ状態間の遷移は、直近の二倍体の共通祖先（ＭＲＣＡ１及びＭＲＣＡ２）を考えると、レシピエント・ドナー染色体の各対を分離する減数分裂の数に依存する。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｄは、本発明の例示的な実施形態による、心臓移植レシピエント及び肺移植レシピエントにおける１ゲノム法及び２ゲノム法により予測されたｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルの比較を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び図２Ｂは、２ゲノム法（Ｘ軸）及び１ゲノム法（Ｙ軸）により予測されたｄｄ−ｃｆＤＮＡのレベルの比較である。
【図２Ｃ】図２Ｃ及び図２Ｄは、１ゲノム法及び２ゲノム法の臓器拒絶反応の予測可能性の比較を示す。
【図２Ｄ】グラフの各バーは、生検を用いて測定された２つの拒絶状態を、ｄｄ−ｃｆＤＮＡ割合推定値を使用して識別する曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。エラーバーは、ＡＵＣの９５％信頼区間を示す。ＤｅＬｏｎｇ両側検定を用いて、１ゲノム法及び２ゲノム法の対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）間の差の有意性を調べた。１ゲノム法と２ゲノム法のバーの灰色レベルは、同じに見える。グラフのバーの各灰色ブロックについては、下側のバーを１ゲノム法、上側のバーを２ゲノム法と解釈されたい。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、骨髄移植レシピエントにおける１ゲノム法及び２ゲノム法により予測されたｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルの比較を示す。図３Ａは、ドナーとレシピエントとの血縁関係を学習する場合（オレンジ）、または、ドナーとレシピエントとが非血縁関係であると単純に仮定する場合（青）における、２ゲノム法（Ｘ軸）及び１ゲノム法（Ｙ軸）によって予測されたｄｄ−ｃｆＤＮＡのレベルの比較である。後者は、レシピエントとドナーとが兄弟姉妹である場合、ｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルを過小評価する。破線は、１：１の比及び２：１の比を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ドナーの兄弟姉妹である１人の骨髄移植レシピエント（Ｉ６）におけるｃｆＤＮＡレベルの推定の例である。
【図４】図４は、本発明の例示的な実施形態による、レシピエント由来ｃｆＤＮＡの割合とレシピエント由来血液細胞の割合との比較によってＧＶＨＤを検出できることを示す。レシピエント由来ｃｆＤＮＡの割合とレシピエント由来血液細胞の割合との差という、１人の骨髄移植レシピエント（患者Ｉ８）における原理証明は、ＧＶＨＤの発症を示すことができる。２つの測定値の差は、損傷組織由来のｃｆＤＮＡに起因する。対照的に、再発が生じた場合、両方の測定値は、レシピエント由来割合の増加を示すであろう（この図では示されていない）。このことは、骨髄移植患者におけるＧＶＨＤと再発とを識別するのに役立つ。
【図５】図５は、本発明の例示的な実施形態による、ｃｆＤＮＡ配列決定及び遺伝子型決定のデータ処理パイプラインを示す。このパイプラインは、ｃｆＤＮＡ配列決定及び遺伝子型決定の生の測定値から、各レシピエント遺伝子型ＳＮＰのｃｆＤＮＡ断片中の対立遺伝子数を読み出すのに使用される。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｄは、本発明の例示的な実施形態による、様々な患者（レシピエント）についての、ｄｄ−ｃｆＤＮＡの予測される割合と、レシピエント及びドナーの性別が異なる場合にＸ染色体にマッピングされるリードの割合との比較を示す。患者Ｉ１は、女性ドナーから移植を受けた男性である。
【図６Ｂ】患者Ｉ２は、女性ドナーから移植を受けた男性である。
【図６Ｃ】患者Ｉ４は、女性ドナーから移植を受けた男性である。
【図６Ｄ】患者Ｉ８は、男性ドナーから移植を受けた女性である。
【図７】図７は、本発明の例示的な実施形態を示す。骨髄移植患者のｃｆＤＮＡレベルの予測における、１ゲノム法と２ゲノム法との比較。各パネルは１人の患者の結果を示す。一点鎖線は、生着が検出された日を示す（連続した３日間で、絶対好中球数（ＡＮＣ）＞５００）。紫色の破線は、臨床診断を示す。ＩＢＤを学習する１ゲノム法の予測は、２ゲノム法の予測と類似しているが、１ゲノム法を非血縁レシピエント・ドナー状態（ＩＢＤ＝０）に固定すると、ｄｄ−ｃｆＤＮＡの割合が過小評価されることが分かる。
【図８Ａ】図８Ａ及び図８Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、心臓移植レシピエント及び肺移植レシピエントにおける１ゲノム法及び２ゲノム法によるｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルの推定を用いた予測診断の比較を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ及び図８Ｂは、１ゲノム法及び２ゲノム法の臓器拒絶反応の予測可能性の比較を示す。図２Ａ〜図２Ｄとは対照的に、２ゲノム予測は、誤差推定により補正されなかった。グラフの各バーは、生検を用いて測定された２つの拒絶反応状態を、ｄｄ−ｃｆＤＮＡ分画推定値を使用して識別する曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。エラーバーは、ＡＵＣの９５％信頼区間を示す。ＤｅＬｏｎｇ両側検定を用いて、１ゲノム法及び２ゲノム法の対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）間の差の有意性を調べた［３１、３２］。１ゲノム法と２ゲノム法のバーの灰色レベルは、同じに見える。グラフのバーの各灰色ブロックについては、下側のバーを１ゲノム法、上側のバーを２ゲノム法と解釈されたい。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明の例示的な実施形態による、肺移植レシピエントに対する２つのゲノム予測の関数としての絶対差を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、心臓移植レシピエントに対する２つのゲノム予測の関数としての絶対差を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、本発明の例示的な実施形態による、骨髄移植レシピエントに対する２つのゲノム予測の関数としての絶対差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
肺移植レシピエント及び心臓移植レシピエントにおけるドナー由来セルフリーＤＮＡ（ｄｄ−ｃｆＤＮＡ）の定量化
【００１１】
ドナー遺伝子型情報の非存在下で、ドナー由来及びレシピエント由来のｃｆＤＮＡ断片を定量化する統計的手法及びコンピュータソフトウェア方法を開発した（モデルの正式な説明については、後述する方法セクションを参照されたい）。ｃｆＤＮＡ配列中の遺伝子型決定された各ＳＮＰの対立遺伝子の観察された存在量を定量化するために（図５）、まず、低品質のリード、すなわち、ゲノムに対して一意的にマッピングされていないリード、及び遺伝的変異性によってマッピングがバイアスされた可能性のあるリードをフィルタリングする。次に、重複したリードを除外し、遺伝子型決定された各ＳＮＰの対立遺伝子の出現数をカウントする（ＳＡＭｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐ関数）。ホモ接合型であるがレシピエント及びドナー間で異なるＳＮＰのみを使用する「２ゲノム」法とは対照的に、本発明に係る１ゲノム法では、遺伝子決定されたすべてのＳＮＰを使用する。ｃｆＤＮＡ及びレシピエント遺伝子型において観察された対立遺伝子の出現数は、本発明に係る「１ゲノム」モデルへの入力である。
【００１２】
観察されたｃｆＤＮＡの確率を算出するために、まず、各可能性のあるドナー及びレシピエントの遺伝子型の確率を算出した。レシピエントの遺伝子型は、レシピエントの測定された遺伝子型及び遺伝子型決定エラー率に依存する。重要臓器ドナーがレシピエントの近縁者であることはまれである。したがって、心臓及び肺の移植については、本発明に係る「１ゲノム」モデルは、ドナー遺伝子型がヒト個体群からランダムに選択されると仮定する。この仮定によれば、特定のドナー対立遺伝子の確率は、ヒト個体群中での頻度である。本発明に係るアルゴリズムは、ドナーの最も可能性の高い祖先集団を検出するために、１０００ゲノムプロジェクト個体群及び超個体群に対して反復適用される。このモデルは、肺及び心臓の移植では十分な性能を達成するが、ドナー及びレシピエントがしばしば関係している骨髄移植の対処に改良が必要である。
【００１３】
まとめると、ｃｆＤＮＡ断片中に特定の対立遺伝子が観察される確率は、すべての可能性のあるレシピエント及びドナー遺伝子型にわたって積分することにより算出され、配列決定のエラー率、レシピエント血漿中のｄｄ−ｃｆＤＮＡの割合、及び、ドナー由来またはレシピエント由来であると条件付けされる対立遺伝子が観察される確率に依存する（図１中に（ａ）で示す）。最後に、本発明者らは、ＳＮＰが独立的であると仮定して（この仮定は２ゲノム法でもなされる）、すべてのＳＮＰについての対数尤度を合計することによって、データの対数尤度を算出した。最尤パラメータ値を見つけるために最適化アルゴリズムを使用した。
【００１４】
肺及び心臓の拒絶反応予測の性能
【００１５】
１ゲノムモデルの性能を評価するために、１ゲノム法及び２ゲノム法によるｄｄ−ｃｆＤＮＡの推定値を比較した。本発明者らは、肺レシピエント（５１人の患者、３８２個のサンプル）におけるｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルの予測値は、２つの方法間で高度に相関することを見出した（ピアソンのＲ２＝０．９９、スピアマンのρ＝０．９４；図２Ａ）。したがって、上記の２つの方法は、臓器の拒絶反応レベル（生検により測定された；図２Ｃ）の差異の識別においても、同様に機能した。心臓移植レシピエント（５９人の患者、４３５個のサンプル）では、上記の２つの方法のｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルの推定値は高度に相関した（ピアソンのＲ２＝０．９９、スピアマンのρ＝０．６７；図２Ｂ）。しかしながら、とりわけ、ｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルが約０．５％未満の場合、上記の２つの方法の一致度は、肺コホートほど高くない。これは、ｄｄ−ｃｆＤＮＡを非常に低い割合で含むサンプルは、ドナー遺伝子型に関する情報が少なく、これにより、推測が困難になるためである。２ゲノム法は、急性拒絶反応のグレード間の識別においてわずかに優れているが、差異はほとんど有意ではなかった。したがって、そのｄｄ−ｃｆＤＮＡ推定は、わずかにより正確であり得る（図２Ｄ）。本発明者らは、肺移植レシピエントについては、ドナー遺伝子型決定は必要ないと結論を下した。ドナー遺伝子型決定は心臓移植レシピエントにおいても避けることができるが、検査の精度はわずかに低下し得る。
【００１６】
骨髄移植レシピエントにおけるドナー由来ｃｆＤＮＡの定量化
【００１７】
骨髄ドナーはレシピエントの近親者である場合が多いため、ドナーが個体群からランダムに選択されるという仮定はもはや成立しない。近縁の個体群の染色体は、同じ遺伝子型の長い断片を含んでいる。これらの断片は、同祖的（ＩＢＤ）であると言える。ＩＢＤ断片の存在量及び長さは、２本の染色体を分離する減数分裂の数と組換え率に依存する。ＩＢＤを無視すると、ｄｄ−ｃｆＤＮＡレベルの過小評価につながる恐れがある。そのため、本発明者らは、レシピエント・ドナーの近縁性を学習することにより、可能性のあるＩＢＤを考慮して本発明に係るモデルを拡張した。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を３つの状態で実施した（図１；詳細については、下記の方法セクションを参照されたい）。ＩＢＤでない場合（ＩＢＤ＝０）、モデル出力確率は、上記の非血縁ドナー・レシピエントモデルに類似する。また、一方の染色体対がＩＢＤである場合（ＩＢＤ＝１）、一方のドナー対立遺伝子の遺伝子型は、一方のレシピエント対立遺伝子と類似し、他方のドナー対立遺伝子の尤度は個体群中における該遺伝子の存在量に依存する（レシピエント遺伝子型とは独立的に）。そして、両方の染色体対がＩＢＤである場合（ＩＢＤ＝２）、レシピエントの遺伝子型とドナーの遺伝子型とは互いに同一である。本発明に係るモデルでは、ＩＢＤ状態間の遷移は、事前に算出された２センチモルガンブロック間でのみ起こる。遷移の確率は、ドナー・レシピエント染色体の各対を分離させる減数分裂の数によって表される、レシピエント・ドナーの血縁度に依存する（図１中に（ｂ）で示す）。言い換えれば、本発明に係るモデルでは、ドナー遺伝子型は、局所的なＩＢＤ状態にしたがったレシピエント遺伝子型及び個体群中の対立遺伝子の頻度に依存する。
【００１８】
骨髄移植レシピエントにおけるｄｄ−ｃｆＤＮＡレベル推定の正確さ
【００１９】
改良された１ゲノム法の性能を評価するために、改良された１ゲノム法を、８人の骨髄移植レシピエント患者（図３Ａ及び図３Ｂ、図５Ａ及び図５Ｂ）から取得した７６個のサンプルに対して適用した。ドナーのうちの２人（患者Ｉ４及び患者Ｉ５）はレシピエントとは血縁関係がなく、ドナーのうちの６人はレシピエントの兄弟姉妹であった。予想通り、１ゲノム法の単純な実施では、ＩＢＤに起因して遺伝子型の約５０％を共有する兄弟姉妹ドナー（図３Ａ及び図３Ｂ）ではｄｄ−ｃｆＤＮＡが過小評価されるが（図３Ａ及び図３Ｂ）、非血縁ドナーでは過小評価されない。本発明に係るモデルが、ドナーとレシピエントと間の関係を学習するように設定されている場合、そのｄｄ−ｃｆＤＮＡレベル推定値は２ゲノム法と一致する。（ピアソンのＲ２＝１、スピアマンのρ＝０．９９；図３Ａ）。確かに、これらの予測値は、ドナーとレシピエントとの性別が異なる場合に、Ｘ染色体からのリードの割合と強く相関する（図６Ａ〜図６Ｄ）。本発明者らは、骨髄レシピエントにおけるｄｄ−ｃｆＤＮＡの正確な推定は、ドナー遺伝子型決定を必要としないという結論に達した。これらの結果は、腎臓移植などの他の状況にも適用され得る。
【００２０】
骨髄移植レシピエントにおける再発と移植片対宿主病との識別
【００２１】
骨髄移植の成功は、癌の再発及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）によってしばしば損なわれる。この２つを診断して識別することは、依然としてこの分野における大きな課題である。生着を成功させるための現在の最も標準的な方法は、連続した３日間で絶対好中球数が５００を超えることである。これは、患者の４７〜８２％ｄｄ−ｃｆＤＮＡ（図６Ａ〜図６Ｄ）に相当する。再発した患者（患者Ｉ３）、急性ＧＶＨＤを発症した患者（患者Ｉ１及び患者Ｉ８）、慢性ＧＶＨＤを発症した患者（患者Ｉ２）では、ｃｆＤＮＡの値はピークに達した後に低下する（それぞれ、２４％、３３％、１１％、２４％）。本発明者らのコホートは有意性を評価するのには小さすぎるが、この観察は、ＧＴＤが骨髄移植の健康をモニタリングするのに使用できることを示唆する。
【００２２】
レシピエント由来のｃｆＤＮＡのレベルの増加についての可能性のある説明は下記の通りである。癌が再発すると、レシピエント由来のリンパ球の割合が増加する。そのため、ｃｆＤＮＡは、レシピエント由来リンパ球の割合の増加を反映する。一方、ＧＶＨＤの場合、レシピエント由来のリンパ球の割合は増加しない。この場合、ｄｄ−ｃｆＤＮＡの増加は、レシピエント組織の損傷によって引き起こされる。そのため、本発明者らは、細胞及び血漿（無細胞）分画中のレシピエント由来ＤＮＡの差異によって、再発とＧＶＨＤとを識別できると仮定した。原理証明として、患者Ｉ８におけるｃｆＤＮＡと細胞画分との両方の配列決定を行った。本発明者らの仮説と一致して、２つの値は、急性ＧＶＨＤの発症までは一致した（ほとんどのｃｆＤＮＡはリンパ球由来であるため）。そして、２つの値は、ＧＶＨＤの発症後は互いに異なるものとなり、細胞画分について低いままであり、ｃｆＤＮＡレベルは増加した（図４）。このＮ−ｏｆ−ｏｎｅ試験（単一被験者試験）は、再発とＧＶＨＤとの識別におけるＧＴＤの大きな可能性（この分野で急務の満たされていないニーズ）を実証した。
【００２３】
方法セクション
【００２４】
ｃｆＤＮＡ配列決定及び遺伝子型データ収集
【００２５】
心臓移植レシピエント及び肺移植レシピエントのｃｆＤＮＡ配列決定及び遺伝子型決定データは、本発明者らの以前の研究［８、９］から入手した。追加のｄｄ−ｃｆＤＮＡ測定が、以前に説明された方法［８、９］を用いて、骨髄移植患者（８人の患者、７６個のサンプル）に対して実施された。要するに、レシピエント血漿は、移植処置前のいくつかの時点（２つの時点）及び移植後のいくつかの時点で収集された。ｃｆＤＮＡは、血漿から精製され、配列決定された（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２００またはＨｉＳｅｑ２５００  １×５０ｂｐまたは２×１００ｂｐ）。ドナー及びレシピエントの遺伝子型決定は、移植前にＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムアレイＨｕｍａｎＯｍｎｉ  ２．５−８またはＨｕｍａｎＯｍｎｉ１を使用して行った。
【００２６】
ｃｆＤＮＡ断片中の対立遺伝子の出現数の推定
【００２７】
ｃｆＤＮＡ配列リードに対していくつかのステップを適用して、遺伝子型決定された各ＳＮＰの対立遺伝子の出現数をカウントした。第１に、低品質のリードを除外した（読み取り精度の５０％以上が２０未満のリード）。第２に、ｂｏｗｔｉｅ２［２８］使用して、リードをヒトゲノム（ＵＣＳＣバージョンｈｇ１９）にマッピングした（パラメータは次の通り：-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50 -I 20 -X 500 --no-mixed --no-discordant --no-unal -t）。そして、ＳＡＭｔｏｏｌｓ［２９］を使用して、リードの一方がマッピングされていないペアエンドリード（ペアエンドリードについてはフラグ−ｆ３−Ｆ３８５２、シングル・エンド・リードについてはＦ３８４４）、または、Ｐ＞０．０５であり非一意的にマッピングされるリードをフィルタリングした。第３に、ＷＡＳＰ［１４］を適用して、遺伝子型によってマッピングがバイアスされた可能性のあるリードを除去した。第４に、重複したリード（全く同じ場所にマッピングされたリード）を、重複したリードをランダムに選択するスクリプトによって除去し、特定の遺伝子型に偏らないように維持した。第５に、ＨＴＳｅｑ［３０］を用いて、染色体カバレッジを算出した。第６に、ＳＡＭｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐ関数を用いて、各ＳＮＰ対立遺伝子を含むｃｆＤＮＡリードの数を算出した。これらのカウントを、モデルの入力として用いた。
【００２８】
ドナーとは血縁関係がないレシピエントにおけるドナー由来ｃｆＤＮＡの推定
【００２９】
心臓や肺などの重要臓器は死後に提供されるため、ドナーは通常、レシピエントとは血縁関係がない。したがって、本発明に係るモデルでは、ドナーは、ある祖先集団からランダムに選択されたと仮定する。これは明らかに仮定である。すなわち、ドナーは混血の祖先を有し、ドナーのＭＨＣはしばしばレシピエントのＭＨＣと一致する。それにもかかわらず、本発明者らは、このように仮定することによって、良好な性能を達成できることを見出した（本発明者らは、混血の祖先のモデル化が予測を改善しなかったことに注目した）。ドナーが抽出された個体群（集団）を考えると、ドナー中の各対立遺伝子が観察される事前確率は、個体群中の対立遺伝子頻度と正確に一致する（ハーディ・ワインベルグ平衡と仮定する）。ドナー個体群は未知であるため、最適化関数は１０００以上のゲノムプロジェクト個体群及び超個体群［１６］に対して反復適用され、尤度を最大化する個体群を選択する。本発明に係るモデルの目的は、レシピエントから測定した遺伝子型と、ｃｆＤＮＡのリードとから、ドナー由来のｃｆＤＮＡの割合（ｄｄ−ｃｆＤＮＡ）を推定することである（図１中に（ａ）で示す）。
【００３０】
下記の式において、下記の要素は、次の通りとする。
Ｎは、レシピエントにおける遺伝子型決定された二対立遺伝子のＳＮＰの数である。
Ａ及びＢは、ｉ∈｛１、２、・・・、Ｎ｝であるＳＮＰｉについての２つの可能性のある対立遺伝子である。
【００３１】
【数１】
2020515278.tif 000003
【００３２】
は、ＳＮＰｉにおけるレシピエントの真の遺伝子型である。
【００３３】
【数２】
2020515278.tif 000004
【００３４】
は、ＳＮＰｉにおいて観察（測定）されたレシピエントの遺伝子型である。
【００３５】
【数３】
2020515278.tif 000005
【００３６】
は、ＳＮＰｉにおけるドナーの真の遺伝子型である。
【００３７】
【数４】
2020515278.tif 000006
【００３８】
は、個体群ｍにおけるＳＮＰｉの対立遺伝子Ａの頻度である。
【００３９】
【数５】
2020515278.tif 000007
【００４０】
は、ｃｆＤＮＡ断片中の真のＳＮＰｉ対立遺伝子である。
【００４１】
【数６】
2020515278.tif 000008
【００４２】
は、この断片の配列決定リードにより観察されたＳＮＰｉの対立遺伝子である。
【００４３】
したがって、観察されたデータ（Ｒ＊、Ｃ＊）は、Ｎ個のＳＮＰで測定されたレシピエントの遺伝子型と、ｃｆＤＮＡ配列決定リードにおいて観察されたそれらのＳＮＰの対立遺伝子である。
【００４４】
さらに、下記のモデルパラメータ（θ）は、次のように定義される。
ｄ∈［０、１］は、ドナー由来（ｄｄ−ｃｆＤＮＡ）のｃｆＤＮＡ断片の割合である。
ｅｓ∈［１０−９、１０−２］は、配列決定のエラー率である。
ｅｇ∈［１０−９、１０−４］は、遺伝子型決定のエラー率である。
Ｐｏｐｍ∈｛１、・・・、Ｍ｝は、Ｍ祖先集団、及び、ドナーがランダムに選ばれた１０００ゲノムプロジェクトの超個体群のうちの１つである。
【００４５】
モデルの配列決定のエラー率及び遺伝子型決定のエラー率は、技術的に現実的な範囲に制限されていた。本発明に係るモデルの目的は、ｄｄ−ｃｆＤＮＡの割合であるｄを推定することである。
【００４６】
本発明に係るモデルでは、ＳＮＰｉの観察されたレシピエント遺伝子型の真の遺伝子型への依存性は、遺伝子型決定のエラー率に関与する。例えば、下記の通りである。
【００４７】
【数７】
2020515278.tif 000009
【００４８】
同様に、配列決定されたｃｆＤＮＡ断片中のＳＮＰｉの真の対立遺伝子上のＳＮＰｉにマッピングされる配列決定リードにおける観察された対立遺伝子の依存性は、配列決定エラー率（これは、ＰＣＲ増幅エラーもキャプチャする）に関与する。
【００４９】
【数８】
2020515278.tif 000010
【００５０】
ドナーが個体群から無作為に抽出されたと仮定すると、ＳＮＰｉの遺伝子型は、個体群中のＳＮＰｉ対立遺伝子の頻度に依存し、そのため、ＳＮＰｉ対立遺伝子の頻度の推定は祖先集団を使用して達成することができる。
【００５１】
【数９】
2020515278.tif 000011
【００５２】
最後に、ＳＮＰｉにマッピングされるｃｆＤＮＡがＳＮＰｉの特異的対立遺伝子を含む確率は、レシピエント及びドナーの真の遺伝子型に依存し、ドナー由来ｃｆＤＮＡの割合（ｄ）に関与する。例えば、下記の通りである。
【００５３】
【数１０】
2020515278.tif 000012
【００５４】
観察されたレシピエントのゲノム型の尤度と、配列決定測定値とをまとめると、ＳＮＰｉへのマッピングは、下記のようになる。
【００５５】
【数１１】
2020515278.tif 000013
【００５６】
個体群中の対立遺伝子頻度のデータを使用して、レシピエント遺伝子型の確率
【００５７】
【数１２】
2020515278.tif 000014
【００５８】
をモデル化することも可能であるが、ここでは、一様な確率を仮定する。なぜなら、実際には、遺伝子型決定のエラー率は非常に低く、したがって、測定されたレシピエントの遺伝子型は、真のレシピエントの遺伝子型について非常に有益であるからである。
【００５９】
最後に、ＳＮＰが独立していると仮定すると（遺伝子型決定されたＳＮＰのみを使用するので、これは妥当な仮定である）、尤度関数は下記のようになる。
【００６０】
【数１３】
2020515278.tif 000015
【００６１】
式中、Ｒ＊、Ｃ＊は、ゲノム全体で測定されたレシピエント遺伝子型であり、すべてのマッピングされた配列決定リードに対応する。
【００６２】
本発明者らはＬ−ＢＦＧＳ−Ｂを用いて、可能性のある各ドナーの祖先集団の負の対数尤度を最小にし、最小の負の対数尤度を入手する集団を選択した。
【００６３】
血縁関係があるレシピエント及びドナーにおけるドナー由来ｃｆＤＮＡの推定ＩＢＤ
【００６４】
肺や心臓とは対照的に、骨髄や腎臓などの臓器は、レシピエントの近縁者から提供される場合が多い。したがって、ドナーが個体群（集団）から無作為に選ばれるという仮定は、もはや妥当ではない。近縁者は、最近共通祖先から遺伝した同一のハプロタイプを共有しており、この現象は、同祖性（ＩＢＤ）として知られている。染色体の各対について、ＩＢＤ断片の長さ分布及び全長は、それらの最近共通祖先（ＭＲＣＡ）からの減数分裂の数に依存する。このモデルは、ゲノム中の各位置がＩＢＤ＝０、ＩＢＤ＝１またはＩＢＤ＝２の３つの状態のいずれかであり、染色体の０、１つまたは２つの対が同祖的である非均一な隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて、ＩＢＤを説明する（図１中に（ｂ）で示す）。効率のため、及び連鎖不平衡（ＬＤ）の強力な影響を避けるため、組換え率マップ［２２］を使用して予め算出された約２ｃＭブロック間でのみ遷移が許可される。各ブロックにおいて、ドナー・レシピエントゲノムの２つの単数体対の各々は、ＩＢＤ状態または非ＩＢＤ状態であり得る。各単数体対のＩＢＤ状態間の遷移は、ｐｌｉｎｋ法［１３］と同様に、ブロック間の平均遺伝距離、及びＩＢＤになる対の限界確率に依存する。要するに、ｍ≧２減数分裂事象によって分離されたｃ１及びｃ２を有する、共通の二倍体の祖先を共有する２つの単数体（ｃ１及びｃ２）を考えると、ｍ＝１−ｌｏｇ２（ＰＩＢＤ）となる。式中、ＰＩＢＤ∈［０、１］は、対がＩＢＤ状態になる限界確率である。ｌｂ、ｂ＋１を、互いに隣接する２つの遺伝子座ｂ、ｂ＋１間の遺伝的距離（ここでは、ｃＭｏｒｇａｎ単位のブロック間の平均遺伝距離で近似される）と定義する。奇数回の組換えイベントの確率θは、下記のようになる。
【００６５】
【数１４】
2020515278.tif 000016
【００６６】
また、下記のように定義した。
【００６７】
【数１５】
2020515278.tif 000017
【００６８】
２つの単数体の遷移行列は、下記のようになる。下記の式中、ｉ∈｛１２｝である。
【００６９】
【数１６】
2020515278.tif 000018
【００７０】
２つの単数体対のＩＢＤ状態の遷移行列は、２つの単数体対の遷移行列の単純な組み合わせであり、それらの２つのＩＢＤパラメータＰＩＩＢＤ及びＰＩＩＩＢＤに依存する。ＰＬＩＮＫと同様に、２つのＩＢＤパラメータＰＩＩＢＤ及びＰＩＩＩＢＤは、最大０．５に制限した。これにより、親子関係は、ドナー・レシピエント関係から除外される。本研究では取り上げなかったが、親子ドナー・レシピエントのｄｄ−ｃｆＤＮＡは、血縁関係がないと仮定して、ＩＢＤによってそれらが常染色体ＤＮＡの正確に５０％を共有することを説明することによって推定することができる（親とは血縁関係がないと仮定する）。
【００７１】
各ＩＢＤ状態における各ＳＮＰの出力確率は、上記の尤度関数に類似しているが、１つ違いがあり、ドナー遺伝子型の確率は、（祖先集団への依存に加えて）レシピエント遺伝子型にも依存する。
【００７２】
【数１７】
2020515278.tif 000019
【００７３】
下記の表は、ＩＢＤｉ＝０、１、２において、ＰｏｐｍでｆＡ及びｆＢの頻度でそれぞれ発生する、２つの可能性のある対立遺伝子を有する二対立遺伝子ＳＮＰｉについての、
【００７４】
【数１８】
2020515278.tif 000020
【００７５】
を示す。
【００７６】
【表１】
2020515278.tif 000021
【００７７】
【表２】
2020515278.tif 000022
【００７８】
【表３】
2020515278.tif 000023
【００７９】
モデルのパラメータをまとめると、
ｄは、ｄｄ−ｃｆＤＮＡの割合、
ｅｓは、配列決定エラー確率、
ｅｇは、遺伝子型決定の確率、
ＰＩＩＢＤ及びＰＩＩＩＢＤは、２つの単数体対についてのＩＢＤ確率である。
【００８０】
Ｖｉｔｅｒｂｉアルゴリズムを用いて特定のパラメータ値に対する最尤経路の尤度を算出し、Ｌ−ＢＦＧＳ−Ｂを用いてその尤度を最適化した。
【００８１】
臓器拒絶反応の予測可能性における１ゲノム法と２ゲノム法との比較
【００８２】
心臓及び肺の拒絶反応の異なるレベルを識別するのに、それぞれの方法のｄｄ−ｃｆＤＮＡ予測がどの程度良好に使用できるかを評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。片肺ドナーのｄｄ−ｃｆＤＮＡ予測は、両肺ドナーのレベルに一致するように二倍され、心臓及び肺の移植前の１４日以前まで及び移植後の６０日以降の各測定は、分析から除去した。両側ＤｅＬｏｎｇ検定［３１］（Ｒ  ｐＲＯＣパッケージに実装された［３２］）を用いて、２つの対応するＲＯＣ曲線間の差の有意性を評価した。
【００８３】
データ及び試料の利用可能性
【００８４】
骨髄コホートの配列データは配列リードアーカイブ（一時サブミットＩＤ：ＳＵＢ２０７７０９３）に保管されている。コードは、ｇｉｔｈｕｂ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｅｉｌｏｎ−ｓ／ｃｆＤＮＡＧ１．）から入手できる。
【００８５】
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【図１】
2020515278.tif 000024
【図２Ａ】
2020515278.tif 000025
【図２Ｂ】
2020515278.tif 000026
【図２Ｃ】
2020515278.tif 000027
【図２Ｄ】
2020515278.tif 000028
【図３Ａ】
2020515278.tif 000029
【図３Ｂ】
2020515278.tif 000030
【図４】
2020515278.tif 000031
【図５】
2020515278.tif 000032
【図６Ａ】
2020515278.tif 000033
【図６Ｂ】
2020515278.tif 000034
【図６Ｃ】
2020515278.tif 000035
【図６Ｄ】
2020515278.tif 000036
【図７】
2020515278.tif 000037
【図８Ａ】
2020515278.tif 000038
【図８Ｂ】
2020515278.tif 000039
【図９Ａ】
2020515278.tif 000040
【図９Ｂ】
2020515278.tif 000041
【図９Ｃ】
2020515278.tif 000042
【国際調査報告】
2020515278.tif 000043