(57)【要約】  本発明は、虚血性傷害を予防および／または治療する方法において使用するための低濃度の相乗的なキセノン−アルゴンガス混合物アルゴンであって、キセノンの体積比率が５〜２０％であり、アルゴンの体積比率が５〜２０％であり、かつ医薬組成物が、１００％の体積比率に達するまでのガス補足物をさらに含み、方法が血流の回復を含み、かつガス混合物が、血流回復の前、間、または後に患者に投与される、混合物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性傷害を予防および／または治療する方法において使用するためのキセノンおよびアルゴンのガス混合物を含む医薬組成物であって、
−  キセノンの体積比率が５〜２０％であり、
−  アルゴンの体積比率が５〜２０％であり、かつ
−  前記医薬組成物が、１００％の体積比率に達するまでのガス補足物をさらに含み、
−  前記方法が、血流の回復および血流回復の前、間、または後の患者への前記医薬組成物の投与をさらに含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記虚血性傷害が、脳虚血、心虚血、腎虚血、網膜虚血、または下肢虚血である、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
血流が、自発的に、または血栓溶解誘導および／もしくは血栓切除術により医学的に回復される、請求項１または２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
血栓溶解が、血栓溶解特性を有する医薬物質を投与することにより誘導される、請求項３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
血栓溶解特性を有する前記医薬物質が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ（ヒト組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子またはｒｔＰＡ）、レテプラーゼまたはテネクテプラーゼのような血栓溶解剤である、請求項４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記虚血性傷害が減圧病により引き起こされ、かつ血流が再圧により回復される、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
−  キセノンの体積比率が１０〜２０％であり、かつ
−  アルゴンの体積比率が１０〜２０％である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
キセノン／アルゴンの体積比が４／１〜１／４、好ましくは１／１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
キセノンの体積比率が１５％であり、かつアルゴンの体積比率が１５％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
前記ガス補足物が、酸素、窒素、ヘリウム、ネオン、またはこれらの混合物を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
前記ガス補足物が２０％〜５０％の体積比率の酸素を含み、かつ、前記ガス補足物中のガスの残余が、窒素、ヘリウム、水素、ネオン、またはこれらの混合物、好ましくはヘリウムである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が圧縮ガス混合物として予め調整されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
患者に投与される前記医薬組成物が、ガスミキサー中でアルゴン、キセノンおよび前記ガス補足物を混合することにより得られたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器保護、特に神経保護、ならびに虚血性傷害の治療および／または予防における臓器保護剤、特に神経保護剤として使用するためのガス混合物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、一般に血管における要因、特に血栓塞栓症（血餅）に起因する血液供給の制約であり、壊死およびアポトーシスの機序を通じて組織機能障害および細胞死に繋がる。虚血は、臓器への血液供給の絶対的または相対的な不足である。相対的な不足は、組織における充分な酸素（およびグルコース）送達についての血液供給および血液需要のミスマッチを意味する。組織損傷の程度は、虚血のレベルおよび継続期間に主に依存する。不充分な血液供給に対して最も感受性の臓器の中には、心臓、腎臓、および脳がある。例えば、虚血性卒中（脳発作または急性脳虚血とも呼ばれる）および心筋梗塞（心臓発作または急性心虚血とも呼ばれる）は、ヒトにおいてがんと共に主要な死因である。世界中の心臓血管死は２０３０年に１７００万人の死から２３００万人より多くの死に増加すること、および脳卒中は２０２０〜２０２５年に疾患の全体的な影響力の６％より高くなり、男性の２５％および女性の２０％近くが８５歳に達する前に脳発作を患うことが推定されている。
【０００３】
タンパク質加水分解は、一般的な触媒性の生理学的プロセスであり、プロテアーゼと呼ばれる細胞酵素によるタンパク質の定方向（指向性）分解として定義することができる。線維素溶解は、タンパク質加水分解の特定の場合である。線維素溶解は、凝固生成物であるフィブリンクロットが破壊される生理学的プロセスである。血餅（フィブリンクロット）の産生のような血管損傷の場合、内皮細胞は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）と呼ばれるセリンプロテアーゼを放出し、ｔＰＡは、プロ酵素プラスミノーゲンを、フィブリンメッシュを切断するフィブリンの主な酵素であるプラスミンに変換する。健常対象において、このプロセスは、過度のクロット形成および虚血性障害の回避を可能とする。血栓塞栓症および虚血を患う患者において、ヒト組換え型の組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）の投与を通じて線維素溶解を刺激することができる。薬理学的手段による血餅のこの破壊は血栓溶解と呼ばれる。血栓溶解は、虚血性傷害を治療するための主要な治療戦略である。しかしながら、ある特定の条件下において、血栓溶解療法は、プラスミンの一般的なタンパク質分解特性に起因する出血性変化およびニューロン死の増強のリスクと関連付けられる。プラスミンのそのような有害な副作用を回避するために、ｒｔＰＡは、「治療ウインドウ」と呼ばれる適切な期間内に患者に投与される必要があり、治療ウインドウは、典型的に、現行の臨床および知識によれば虚血発症の３〜４．５時間後までである。
【０００４】
急性脳虚血は、脳における血流の低減により引き起こされる。これは、少なからず脳の機能障害および損傷ならびにニューロン死に繋がる。脳損傷の程度は、虚血のレベルおよび継続期間に主に依存する。虚血誘導性ニューロン死に関与する生理学的プロセスは複雑である。簡潔に述べれば、脳血流の低減は、組織のエネルギー貯蔵を劣化させ、酸素およびグルコースの欠乏に繋がる。細胞レベルでのこの代謝性枯渇の不可欠な帰結は、細胞内ナトリウム濃度の増加である。これは、グルタミン酸を含む多くの神経伝達物質の過大な流出および取込み不全に繋がる［１４］。グルタミン酸の過度の放出は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を過剰活性化させる。これは、ＮＭＤＡ受容体媒介性のニューロン脱分極およびニューロン内カルシウム流入を結果としてもたらし、これらにより生理学的縛りを超えて、壊死およびアポトーシスの機序を通じてニューロン死に繋がる［１５、１６］。したがって、虚血性卒中の治療のために２つの戦略：早期再潅流による血管傷害の制限および／またはグルタミン酸により開始される神経毒性カスケードの遮断が遂行されてきた。
【０００５】
今日、ｒｔＰＡ誘導性の血栓溶解による早期再潅流は、米国食品医薬品局および欧州医薬品庁により承認された卒中の唯一の医薬的治療である。しかしながら、上記のように、その有益な（ｂｅｎｅｆｉａｌ）効果にもかかわらず、血栓溶解療法は、出血性変化およびニューロン死の増強のリスクと関連付けられる［１７、１８］。
【０００６】
米国特許８，４３５，５６９号は、そのため、血栓溶解と亜酸化窒素、キセノン、アルゴン、ヘリウム、ネオン、およびこれらの混合物のような神経保護ガスとを組み合わせて虚血性傷害を治療および／または予防する方法を提案した。特に、米国特許８，４３５，５６９号は、虚血を治療するための組合せ医薬組成物の調製のための、ｒｔＰＡのような少なくとも１つの血栓溶解剤（Ａ）、ならびに亜酸化窒素、アルゴン、キセノン、ヘリウム、ネオン、およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのガス（Ｂ）の使用を開示している。より特には、亜酸化窒素、アルゴン、キセノン、ヘリウム、ネオン、およびこれらの混合物はｒｔＰＡと相互作用するので、米国特許８，４３５，５６９号は、血栓溶解剤（Ａ）の有益な血栓溶解効果を遮断または低減させないために、血栓溶解剤（Ａ）の前、それと共に、またはその後にこれらの神経保護ガスを投与する方法を開示している。しかしながら、米国特許８，４３５，５６９号は、コスト効率の良い、高度に治療的に効率的な、かつｒｔＰＡのような血栓溶解剤（Ａ）と相互作用しない、いかなるガスまたはガス混合物も開示していない。
【０００７】
低酸素性虚血性脳傷害のモデルにおける先行する研究は、化学的および代謝的に不活性のガスであるキセノンおよびアルゴンの神経保護潜在能力および毒性効果の欠如を実証した［１〜７］。
【０００８】
不活性な貴ガスおよび他の分子の中で、３５〜５０体積％より高い濃度のキセノンは、その強力な臓器保護および神経保護効果に起因してゴールドスタンダードと考えられている。残念なことに、キセノンはまた、ｔＰＡおよびｒｔＰＡの強力な阻害剤であり、ｔＰＡおよびｒｔＰＡの有益な血栓溶解効果を遮断するリスクに起因してｒｔＰＡの前にまたはそれと共に使用することを不可能にする条件となっている［１０］。加えて、過度の製造コストはその大規模な臨床使用をさらに制限する。
【０００９】
対照的に、アルゴンは、５０体積％およびそれより高い効率的な神経保護濃度において使用された時にｔＰＡおよびｒｔＰＡの有益な血栓溶解特性に対して阻害作用を示さないコスト効率の良いガスである［１１］。残念なことに、アルゴンは、急性虚血性卒中のモデルにおける神経保護の提供においてキセノンより有効性がはるかに低い［３、６］。
【００１０】
そのため、現在まで、特に、有利には任意の投与順序で、血栓溶解剤の投与の前に、それと共に、またはその後に使用することができる、コスト効率の良い臓器保護剤、特に神経保護剤の必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、低濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物が、血栓溶解を阻害することなく神経保護を提供し、したがって、血栓溶解剤の投与の前に、それと共に、またはその後にこれらのガス混合物を使用することが可能となることを発見した。
【００１２】
理論により縛られることを望まないが、低濃度のキセノンおよびアルゴンの相乗的な神経保護効果は、相補的な作用モードから生じるものと推定され、キセノンは主に、脳における主な興奮性受容体であるグルタミン酸作動性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）［８］におけるアンタゴニズムを通じて神経保護を提供すると考えられ、アルゴンは主に、脳における主な阻害性受容体であるγ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡ−Ａ）［９］受容体を増強することにより作用すると考えられる。
【００１３】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ調製物を使用して、１５（Ｘｅ−Ａｒ−１５）、２５（Ｘｅ−Ａｒ−２５）および３７．５体積％（Ｘｅ−Ａｒ−３７．５）の等モル濃度のキセノン（Ｘｅ）およびアルゴン（Ａｒ）を含有するガス混合物の、脳切片における酸素およびグルコース枯渇（ＯＧＤ）により誘導される細胞損傷、ＮＭＤＡの脳内注射に供されたラットにおける脳損傷、ならびに、ｒｔＰＡが作用し、血栓溶解が起こる基本的な機序である、ｒｔＰＡの触媒効率に対する効果を実際に調べた。特に、本発明者らは、神経保護の提供においてＸｅ−Ａｒ−１５＞Ｘｅ−Ａｒ−２５＞Ｘｅ−Ａｒ−３７．５であること、およびｒｔＰＡの触媒活性の低減においてＸｅ−Ａｒ−１５＜Ｘｅ−Ａｒ−２５＜Ｘｅ−Ａｒ−３７．５であることを発見した。興味深いことに、Ｘｅ−Ａｒ−１５は、５０体積％およびそれより高い体積％のキセノン単独と同等に強力な神経保護を提供するが、キセノンとは異なり、ｒｔＰＡの触媒活性および血栓溶解活性に対して効果を示さない。
【００１４】
したがって、第１の態様では、本発明は、虚血性傷害を予防および／または治療する方法において使用するためのキセノンおよびアルゴンのガス混合物を含む医薬組成物であって、
−  キセノンの体積比率が５〜２０％であり、
−  アルゴンの体積比率が５〜２０％であり、かつ
−  医薬組成物が、１００％の体積比率に達するまでのガス補足物をさらに含み、
−  方法が、血流の（自発的または医学的）回復および血流回復の前、間、または後の患者への前述の医薬組成物の投与をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、虚血性傷害を予防および／または治療するための医薬を製造するための、キセノンおよびアルゴンのガス混合物を含む医薬組成物の使用であって、
−  キセノンの体積比率が５〜２０％であり、
−  アルゴンの体積比率が５〜２０％であり、かつ
−  医薬組成物が、１００％の体積比率に達するまでのガス補足物をさらに含み、
方法が、血流の（自発的または医学的）回復、および血流回復の前、間、または後の患者への前述の医薬組成物の投与をさらに含む、使用に関する。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、虚血性傷害を予防および／または治療する方法であって、それを必要とする患者にキセノンおよびアルゴンのガス混合物を含む効果的な用量の医薬組成物を投与することを含み、
−  キセノンの体積比率が５〜２０％であり、
−  アルゴンの体積比率が５〜２０％であり、かつ
−  医薬組成物が、１００％の体積比率に達するまでのガス補足物をさらに含み，
方法が、血流の（自発的または医学的）回復および血流回復の前、間、または後の患者への前述の医薬組成物の投与をさらに含む、方法に関する。
【００１７】
本発明において、「患者」は、特に、動物、例えば哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明は、そのため、ヒトおよび獣医学用薬剤の両方において応用を有する。
【００１８】
虚血性傷害を予防および／または治療する方法において、キセノンおよびアルゴンのガス混合物は、臓器保護剤、特に神経保護剤として使用され、すなわち、それは臓器保護、より特には神経保護を提供する。
【００１９】
本発明において、「臓器保護」は、一次的または二次的な、直接的または間接的な、傷害に起因して機能不全となった臓器の細胞構造および機能の相対的な温存として理解される。臓器保護の提供は、そのため、臓器細胞死を停止または少なくとも緩慢化させることにより疾患進行を治療しかつ／または緩慢化させかつ／または予防することを目的とする。
【００２０】
本発明において、「神経保護」は、ニューロンの構造および／または機能の相対的な温存として理解される、特定の種類の臓器保護である。神経保護の提供は、そのため、ニューロン死（またはニューロンの喪失）を停止または少なくとも緩慢化させることにより疾患進行および二次的な損傷を治療しかつ／または緩慢化させかつ／または予防することを目的とする。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「医学的」血流回復は、自然にではなくヒトの介入により血流が回復されることを意味する。対照的に、自発的血流回復は、いかなるヒトの介入もなく、特に、いかなる医薬的（血栓溶解）剤の投与もなく、自然に起こる。
【００２２】
本明細書において使用される場合、ガスの「体積比率」（体積％）は、ガス組成物全体の体積に基づいて算出されるパーセンテージである。適切な場合、体積比率は、減圧された、再構成された、ガス組成物全体の体積に基づく。以下において、「ガスの濃度」は、前述のガスの体積比率として理解される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、虚血性傷害を予防および／または治療する方法において使用するためのキセノンおよびアルゴンのガス混合物を含む医薬組成物であって、
−  キセノンの体積比率が５〜２０％であり、
−  アルゴンの体積比率が５〜２０％であり、かつ
−  医薬組成物が、１００％の体積比率に達するまでのガス補足物をさらに含み、
−  方法が、血流の回復および血流回復の前、間、または後の患者への医薬組成物の投与をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００２４】
有利には、キセノン／アルゴンの体積比は、４／１〜１／４、好ましくは３／１〜１／３、より好ましくは２／１〜１／２、最も好ましくは１／１（すなわち、等モル混合物）である。
【００２５】
特定の実施形態では、医薬組成物は、キセノンおよびアルゴンのガス混合物を含み、
−  キセノンの体積比率は１０〜２０％であり、かつ
−  アルゴンの体積比率は１０〜２０％である。この実施形態では、ガス混合物は、有利には等モルである。
【００２６】
特定の例では、キセノンの体積比率は１５％であり、かつアルゴンの体積比率は１５％である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、任意の適切な投与経路、好ましくは吸入を通じた投与経路を意図する。本発明の相乗的な組成物は、そのため、好ましくは吸入可能である。それは、そのため、ガス補足物を含む。典型的に、ガス補足物は、酸素、窒素、ヘリウム、水素、ネオン、またはこれらの混合物を含む。当然、安定な非爆発的ガス混合物のみが想定される。特に、本発明において、ガス補足物が水素および酸素を含む場合、これらのガスは、安定な非爆発的な割合にある。
【００２８】
好ましくは、ガス補足物は、典型的に２０％〜５０％（例えば、２５％〜４５％または３０％〜４０％、例えば、酸素の体積比率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％である）の体積比率の酸素を含み、ガス補足物中のガスの残余は、有利には、窒素、ヘリウム、水素、ネオンまたはこれらの混合物であり、好ましくは、ガス補足物中のガスの残余は、有利には、窒素、ヘリウム、ネオンまたはこれらの混合物であり、よりいっそう好ましくは、ヘリウムである。最も好ましくは、ガス補足物は、典型的に２０％〜５０％の体積比率の酸素を含み、かつガス補足物中のガスの残余はヘリウムである。
【００２９】
第１の実施形態では、医薬組成物は、圧縮ガス混合物として予め調整され、かつ減圧ガス混合物として患者に投与される。
【００３０】
第２の実施形態では、患者に投与される医薬組成物は、ガスミキサー中でアルゴン、キセノンおよびガス補足物を混合することにより得られる（かつ減圧ガスの混合物として患者に投与される）。この第２の実施形態では、アルゴン、キセノンおよびガス補足物は、個々の与圧区画中で圧縮ガスとして予め調整され、かつ混合前または混合時に減圧される。なお、ガス補足物は、それ自体がガス混合物（典型的に酸素を含む）であってもよく、このガス混合物もまた、異なるガスをガスミキサー中で混合することにより得ることができる。したがって、この第２の実施形態では、アルゴン、キセノン、酸素および任意選択で他の個別化されたガスタンクがガスミキサーに接続され、ガスミキサー中でそれらは減圧時または減圧後に所望の体積比率で混合される。好ましくは、各ガスは、ガスミキサー中に導入される前に減圧される。
【００３１】
典型的に、虚血性傷害は、脳虚血、心虚血、腎虚血、網膜虚血、または下肢虚血である。それはまた、減圧病（減圧症または減圧障害としても公知）により引き起こされるものであってもよい。
【００３２】
キセノンおよびアルゴンの相乗的な混合物を含む本発明の組成物の「効果的な用量」は、例えば、投与経路および体重、年齢、性別、治療される病状の進行および治療される対象または患者の感度のような多数のパラメーターの関数として変動する。
【００３３】
血流は異なる方法により回復されてもよく、該方法は、虚血性傷害の原因にしたがって臨床医により選択され、それはまた、例えば、体重、年齢、性別、治療される病状の進行および治療される対象または患者の感度のような多数のパラメーターに依存することがある。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明の相乗的なキセノン−アルゴンガス状組成物は、血流回復前、特に、血流が血栓溶解誘導により回復される前に投与される。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明の相乗的なキセノン−アルゴンガス状組成物は、血流回復後に投与される。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明の相乗的なキセノン−アルゴンガス状組成物は、血流回復中、特に、血流が血栓溶解誘導により回復される時に投与される。
【００３７】
血流は、自発的または医学的に回復させることができる。
【００３８】
典型的に、医学的血流回復の場合、血流は、血栓溶解および／または血栓切除術により回復される。
【００３９】
血栓溶解は、例えば、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ（ヒト組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子またはｒｔＰＡ）、レテプラーゼまたはテネクテプラーゼといった血栓溶解剤のような血栓溶解特性を有する１つまたは１つより多くの医薬物質を投与することにより誘導されてもよい。本明細書において使用される場合、「血栓溶解特性を有する医薬物質」という用語は、例えば、Ｎ−アセチルシステインまたはＮ−アセチル−Ｌ−システインのような、血栓溶解剤として最初に開発された薬学的化合物として、または、たとえ最初に他の医療用途のために開発されたものであったとしても、血栓溶解特性を示す薬物として理解される。好ましい血栓溶解剤はｒｔＰＡである。
【００４０】
血栓切除術は、血餅の除去を可能とする周知の外科的処置である。
【００４１】
有利な実施形態では、血流は、好ましくは同時の血栓溶解を伴う、血栓切除術により回復される。血栓溶解および血栓切除術の両方が行われる場合、患者は、例えば、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ（ヒト組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子またはｒｔＰＡ）、レテプラーゼまたはテネクテプラーゼ（好ましくはｒｔＰＡ）といった血栓溶解剤のような血栓溶解特性を有する医薬物質を投与される。血栓切除術は、典型的に、患者が血栓溶解剤を与えられる前またはその後、好ましくは後に行われる。
【００４２】
ある特定の状況下で、虚血性傷害は減圧病により引き起こされる。そのような場合、血流は、有利には、血栓溶解および／または血栓切除術および／または再圧により回復される。好ましくは、そのような場合、血流回復は、再圧を含むまたはからなる。
【００４３】
（たとえどのような虚血性傷害が関わっていても）本発明の特定の実施形態では、血流回復は、血栓溶解剤のような血栓溶解特性を有する医薬物質の投与を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】１５体積％〜３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、ＯＧＤ前の値のパーセンテージとして表される酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）により誘導される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出に対する効果。Ｘｅ−Ａｒ−１５：１５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物；Ｘｅ−Ａｒ−２５：２５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物；Ｘｅ−Ａｒ−３７．５：３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物。Ｘｅ−Ａｒ−１５は、５０体積％のキセノンと類似の様式でＯＧＤ誘導性のＬＤＨ放出をおおよそ低減させた。有意差を星およびシャープにより記す。＊Ｐ＜０．０００１、ＯＧＤ切片に対して；＃Ｐ＜０．０００１、１５体積％または２５体積％のキセノンまたはアルゴン単独に対して。
【００４５】
【図２】１５体積％〜３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、ｍｍ３で表されるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）の脳内注射により誘導される脳損傷に対する効果。Ｘｅ−Ａｒ−１５：１５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物；Ｘｅ−Ａｒ−２５：２５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物；Ｘｅ−Ａｒ−３７．５：３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物。Ｘｅ−Ａｒ−１５は、５０体積％のキセノンと類似の様式でＮＭＤＡ誘導性の脳損傷をおおよそ低減させた。有意差を星、シャープ、またはプラス記号で記す。＊Ｐ＜０．０００１、ＯＧＤ切片に対して；＃Ｐ＜０．００２、１５体積％のキセノンに対して；＋＋Ｐ＜０．０２、１５体積％のアルゴンに対して；＋Ｐ＜０．０５、２５体積％のアルゴンに対して。
【００４６】
【図３】１５体積％〜３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、空気対照値のパーセンテージで表される組織プラスミノーゲン活性化因子の触媒効率に対する効果。Ｘｅ−Ａｒ−１５：１５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物；Ｘｅ−Ａｒ−２５：２５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物；Ｘｅ−Ａｒ−３７．５：３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含むガス混合物。Ｘｅ−Ａｒ−１５は、Ｘｅ−Ａｒ−２５およびＸｅ−Ａｒ−３７．５とは異なり、ｒｔＰＡの触媒効率を低減させない。有意差を星、シャープ、またはプラス記号で記す。＊Ｐ＜０．０００１、ＯＧＤ切片に対して；＋＋Ｐ＜０．０００１、２５体積％のキセノンに対して；＋Ｐ＜０．００２、２５体積％のキセノンに対して。＃Ｐ＜０．０００１、３７．５体積％のキセノンおよび３７．５体積％のアルゴンに対して。
【実施例】
【００４７】
本発明を以下の実施例により説明するが、これらの実施例は、いかなる意味でも本発明を限定するものと解されるべきではない。
【００４８】
材料および方法
動物
全ての動物使用手順は、ヘルシンキ宣言にしたがって行い、生物医学実験における動物の使用に関するフランス国の法律の枠組み内であった。体重２５０〜２８０ｇの成体雄スプラーグドーリーラット（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。使用前に、ラットを食餌および水への自由なアクセスと共にＰｅｒｓｐｅｘホームケージ中２１±０．５℃で飼育した。明／暗反転サイクルで光を維持し、光を午後８：００から午前８：００まで点灯した。
【００４９】
脳切片の調製およびインキュベーション
ハロタン麻酔下の断頭によりラットを屠殺した。脳を取り出し、氷冷した新たに調製した人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）に入れた。組織チョッパー（Ｍｉｃｋｉｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｇｏｍｓｈａｌｌ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を使用して線条体（ブレグマから頭部へ＋１．２〜＋２ｍｍ）を含む冠状脳切片（４００μｍの厚さ）を切断した。
【００５０】
乳酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイでの細胞損傷の測定
キセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、ＯＧＤにより誘導される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出に対する効果を以前に記載されたように評価した［６］。使用の前に、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．１９ｍＭのＭｇＳＯ４、１．１８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１１ｍＭのｄ−グルコース、および３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する１．３ｍｌの新たに調製した酸素添加ａＣＳＦを含む個々のバイアルに脳切片を移し、室温で４５分間回復させた。次に、脳切片を３６±０．５℃で、１．３ｍｌの新たに調製したａＣＳＦを含有する個々のバイアルに入れ、飽和させ、１００％の酸素（バイアル当たり２５ｍｌ／分）を用いて連続的にバブリングした。３０分の期間後、インキュベーションａＣＳＦ溶液を、３６℃に維持した酸素添加ａＣＳＦと交換し、切片を次に１時間インキュベートして、ＬＤＨの基礎レベルを記録した。対照切片を同じ条件でさらに２０分の期間インキュベートした一方、虚血群に対応する切片を、グルコースフリー溶液中でインキュベートし、飽和させ、１００％の窒素を用いて連続的にバブリングした（ＯＧＤ切片）。ＯＧＤのこの２０分の期間後、再潅流および治療を模倣するために、全ての群において新たに調製したａＣＳＦ溶液で培地を置換し、飽和させ、医療用空気または以下に記載するような体積比率でキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物のいずれかを用いて連続的にバブリングした（ガス薬理学的区分を参照；ｎ＝２０〜３６）。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＭＤＡ誘導性のニューロン死
キセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、ｔＰＡの触媒活性に対する効果を以前に記載されたように評価した［６］。手術の日に、ラットを麻酔箱中で酸素単独中の１．５％のハロタンを用いて麻酔し、切歯バーを水平０から３．９ｍｍ下にセットして定位装置に取り付けた。穿頭孔をドリルで空け、マイクロピペット（先端が１０μｍ未満）を右線条体（ブレグマから前へ０．６ｍｍ、横へ３．０ｍｍ、腹側へ５．８ｍｍ）に下げて、２分間の期間にわたる１μｌのリン酸（ｐｈｏｓｐａｈｔｅ）緩衝化溶液（ｐＨ７．４）中の７０ｎｍｏｌのＮＭＤＡの注射を可能とした。追加の５分の期間後に、マイクロピペットを除去した後、創傷を縫合した。手術の間、フィードバック制御されたサーモスタット加熱パッド（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｅｄｅｎｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて体温を３７±０．５℃に保った。動物は約１０分後にホームケージ中で目覚め、そこで食餌および水に自由にアクセスできるようにした。ＮＭＤＡ投与の６０分後、ラットを医療用空気またはキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物で処置した（ガス薬理学的区分を参照）。群当たりのラットの数はｎ＝７〜１１であった。
【００５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔＰＡ触媒活性アッセイ
キセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、ｔＰＡの触媒活性に対する効果を以前に記載されたように評価した［６］。組換え型のヒトｔＰＡ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  ａｍ  Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびその特異的な発色基質メチルスルホニル−Ｄ−フェニル−グリシル（ｇｌｙｃｉｌ）−アルギニン−７−アミノ−４−メチルクマリンアセテート（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ＸＦ、製品４４４；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を１．５ｍｌの無菌チューブ中で１ｍｌの蒸留水に別々に希釈した。０．４μＭのｔＰＡまたは１０μＭのｔＰＡ基質を含有する各チューブを医療用空気（対照）または以下に記載するような体積比率でキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物を用いて６０〜８０ｍｌ／分の流速で２０分間飽和させた（１濃度当たりｎ＝９〜１４）。３７℃に設定した分光蛍光計マイクロプレートリーダー中で５０μｌの基質と共に５０μｌのｔＰＡをインキュベートすることによりｔＰＡの触媒効率を初期速度法により評価した。
【００５３】
ガス薬理学
キセノン、アルゴン、窒素、および酸素をＡｉｒ  Ｌｉｑｕｉｄｅ  Ｓａｎｔｅ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。７５体積％の窒素および２５体積％の酸素から構成される医療用空気、ならびに３７．５体積％のキセノンおよび３７．５体積％のアルゴン（Ｘｅ−Ａｒ−３７．５）、２５体積％のキセノンおよび２５体積％のアルゴン（Ｘｅ−Ａｒ−２５）または１５体積％のキセノンおよび１５体積％のアルゴン（Ｘｅ−Ａｒ−１５）を含有し、２５体積％の酸素および必要な場合は残余が窒素であるキセノンおよびアルゴン混合物を、コンピューター駆動ガス質量流量計、および使用したガス混合物が低酸素性でないことをチェックするための酸素分析器を使用して得た。
【００５４】
統計解析
データを平均±平均に対する標準誤差として与える。キセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の効果をＳｔａｔｖｉｅｗソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて解析し、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を使用して対照実験、ならびにキセノンおよびアルゴン単独の効果と比較した。
【００５５】
結果
最初に、１５％〜３７．５％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の神経保護効果を脳虚血のモデルであるＯＧＤに曝露した脳切片、およびＮＭＤＡの脳内注射を投与したラットにおいて調べた。
【００５６】
ＯＧＤは、対照切片と比較してＬＤＨ放出の増加を誘導した（Ｐ＜０．０００１）。図１に示すように、ＯＧＤに曝露した脳切片において、細胞損傷のマーカーであるＬＤＨの放出の低減はＸｅ−Ａｒ−１５＞Ｘｅ−Ａｒ−２５＞Ｘｅ−Ａｒ−３７．５であることを我々は発見した。Ｘｅ−Ａｒ−１５は、５０％のキセノンと類似の様式でＬＤＨを減少させた（Ｐ＜０．０００１、空気処理ＯＧＤ切片に対して）。これは、Ｘｅ−Ａｒ−１５と１５体積％のキセノン（これはＯＧＤ誘導性のＬＤＨ放出に対してそれ自体では効果を有しなかった）との間（Ｐ＜０．０００１）、およびＸｅ−Ａｒ−１５と１５体積％のアルゴン（これもまたＯＧＤ誘導性のＬＤＨ放出に対してそれ自体では効果を有しなかった）との間（Ｐ＜０．０００１）の有意差に繋がった。Ｘｅ−Ａｒ−２５は、類似の大きさで２５〜３７．５体積％のキセノン単独よりもＯＧＤ誘導性のＬＤＨ放出を減少させた（Ｐ＜０．０００１）。これは、Ｘｅ−Ａｒ−２５と２５体積％のアルゴン（これはＯＧＤ誘導性のＬＤＨ放出に対してそれ自体では効果を有しなかった）との間（Ｐ＜０．０００１）の有意差に繋がったが２５体積％のキセノンとは有意差に繋がらず、それにより、Ｘｅ−Ａｒ−２５の神経保護効果は主に、ガス混合物中のキセノンの存在の結果としてもたらされることが指し示された。Ｘｅ−Ａｒ−１５およびＸｅ−Ａｒ−２５とは対照的に、Ｘｅ−Ａｒ−３７．５は、ＯＧＤ切片においてＬＤＨ放出を減少させないことを我々は発見した。
【００５７】
あるいは、空気で処置したラットにおけるＮＭＤＡの脳内注射は、生理食塩水を注射した空気処置対照と比較して脳損傷を誘導した（Ｐ＜０．０００１）。図２に示すように、ＮＭＤＡを注射したラットにおいて脳損傷の低減はＸｅ−Ａｒ−１５＞Ｘｅ−Ａｒ−２５＞Ｘｅ−Ａｒ−３７．５であることが発見された。Ｘｅ−Ａｒ−１５は、５０体積％のキセノン単独と類似の様式でＮＭＤＡ誘導性の脳損傷を低減させた（Ｐ＜０．００１）。これは、Ｘｅ−Ａｒ−１５と１５体積％のキセノン（これはＮＭＤＡ誘導性の脳損傷に対してそれ自体では効果を有しなかった）との間（Ｐ＜０．００２）、およびＸｅ−Ａｒ−１５と１５体積％のアルゴン（これもまたＮＭＤＡ誘導性の脳損傷に対してそれ自体では効果を有しなかった）との間（Ｐ＜０．０２）の有意差に繋がった。同様に、Ｘｅ−Ａｒ−２５は、類似の大きさで２５〜３７．５体積％のキセノン単独よりもＮＭＤＡ誘導性の脳損傷を低減させた（Ｐ＜０．０２）。これは、Ｘｅ−Ａｒ−２５と２５体積％のアルゴン（これはＮＭＤＡ誘導性の脳損傷に対してそれ自体では効果を有しなかった）との間（Ｐ＜０．０５）の有意差に繋がったが２５体積％のキセノンとは有意差に繋がらず、それにより、Ｘｅ−Ａｒ−２５の神経保護効果は主に、ガス混合物中のキセノンの存在の結果としてもたらされることが指し示された。Ｘｅ−Ａｒ−１５およびＸｅ−Ａｒ−２５とは対照的に、Ｘｅ−Ａｒ−３７．５は、脳内ＮＭＤＡを注射されたラットにおいて神経保護を示さなかった。
【００５８】
次に、キセノンおよびアルゴンの両方はｔＰＡと相互作用することを先行するデータが実証しているので［１０、１１］、１５体積％〜３７．５体積％の等モル濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物の、ｔＰＡの触媒活性に対する効果を試験した。図３に示すように、ｔＰＡの触媒効率の低減はＸｅ−Ａｒ−３７．５＞Ｘｅ−Ａｒ−２５＞Ｘｅ−Ａｒ−１５であることが発見された。Ｘｅ−Ａｒ−３７．５は、７５体積％のキセノン単独と類似の程度までｔＰＡの触媒効率を減少させた（Ｐ＜０．０００１）。これは、Ｘｅ−Ａｒ−３７．５と３７．５体積％のキセノンとの間（Ｐ＜０．０００１）、およびＸｅ−Ａｒ−３７．５と３７．５体積％のアルゴンとの間（Ｐ＜０．０００１）の有意差に繋がった。同様に、Ｘｅ−Ａｒ−２５もまた、５０体積％のキセノン単独と類似の程度までｔＰＡの触媒効率を減少させた（Ｐ＜０．０００１）。これは、Ｘｅ−Ａｒ−２５と２５体積％のキセノンとの間（Ｐ＜０．０００１）およびＸｅ−Ａｒ−２５と２５体積％のアルゴンとの間（Ｐ＜０．００２）の有意差に繋がった。２５体積％のキセノン単独ではｔＰＡの触媒効率に対して効果を有しなかったが、２５体積％のアルゴンはそれを有意に減少させ、それにより、ｔＰＡの触媒効率に対するＸｅ−Ａｒ−２５の低減効果は主に、２５体積％のアルゴンの効果の結果としてもたらされることが指し示された。対照的に、Ｘｅ−Ａｒ−１５はｔＰＡの触媒効率に対して効果を有しないことを我々は発見した。
【００５９】
考察
本研究では、１５体積％（Ｘｅ−Ａｒ−１５）または２５体積％（Ｘｅ−Ａｒ−２５）の各ガスの低濃度のキセノンおよびアルゴンを含有するガス混合物は神経保護を提供できることが示された。特に、Ｘｅ−Ａｒ−１５を含有するガス混合物は、５０体積％のキセノン単独と類似の程度までＯＧＤ誘導性の細胞損傷およびＮＭＤＡ誘導性の脳損傷を低減させることが発見され、それにより、Ｘｅ−Ａｒ−１５は強力な神経保護効果を有することが指し示された。Ｘｅ−Ａｒ−１５のこれらの強力な神経保護効果は、１５体積％のキセノン単独および１５体積％のアルゴン単独（データ示さず）のいずれも神経保護特性を有しなかったという事実と共に、脳における主な興奮性受容体であるＮＭＤＡ受容体［８］のキセノンによる阻害と、脳における主な阻害性受容体であるＧＡＢＡ−Ａ受容体［９］のアルゴンによる活性化との相乗効果に起因すると考えられる。Ｘｅ−Ａｒ−１５は神経保護の提供において５０体積％のキセノン単独と同等に強力であり、任意の濃度のアルゴン単独よりはるかに強力なので、Ｘｅ−Ａｒ−１５が作用する機序は、キセノンの主なニューロン標的［１０］であるＮＭＤＡ受容体を通じて主に媒介される可能性がある。Ｘｅ−Ａｒ−１５の強力な神経保護効果とは対照的に、Ｘｅ−Ａｒ−３７．５は神経保護を提供しないことが発見された。Ｘｅ−Ａｒ−３７．５の効果のこの欠如に関するより妥当と思われる原因は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの昏睡状態または麻酔に相当し得るニューロン活性の強力過ぎる一般的な低減である。このサポートとなるのは、神経保護は使用されるＸｅ−Ａｒの濃度の関数として減少した（Ｘｅ−Ａｒ−１５＞Ｘｅ−Ａｒ−２５＞Ｘｅ−Ａｒ−３７．５）という事実である。このさらなるサポートとなるのは、キセノンは３７．５体積％または５０体積％の麻酔域下濃度において神経保護を提供したが７５体積％またはより高い体積％の高い麻酔濃度において神経保護を提供しなかったことを示した先行するデータである［５、６］。
【００６０】
あるいは、Ｘｅ−Ａｒ−３７．５およびＸｅ−Ａｒ−２５を含有するガス混合物は、７５体積％および５０体積％の高濃度のキセノンと類似の程度までｔＰＡの触媒効率を低減させたが、Ｘｅ−Ａｒ−１５を含有するガス混合物はそうではなかったことがさらに示され、それにより、ｔＰＡレベルにおけるキセノンとアルゴンとの別の相乗的な機序の存在が示唆された［１０、１１］。興味深いことに、構造生物物理学的研究は、キセノンおよびアルゴンの両方が、ｔＰＡのモデルとして使用されたセリンプロテアーゼであるエラスターゼの活性部位に結合することを示した［１２］。これは、アルゴンは単独ではｔＰＡ誘導性の触媒活性の効果を有さず、さらにキセノンより低い親和性でエラスターゼに結合するので［１２］、主にキセノンを通じて媒介される可能性がある、ｔＰＡ誘導性の触媒活性の阻害におけるＸｅ−Ａｒ−２５およびＸｅ−Ａｒ−３７．５の相乗効果を説明すると考えられる。
【００６１】
血栓塞栓性卒中のラットモデルにおける先行するデータは、虚血内キセノンはｔＰＡ誘導性の血栓溶解および虚血性脳損傷のその後の低減を用量依存的に阻害することを示しており［１０］、それにより、キセノンはｔＰＡ誘導性の血栓溶解の前または一緒ではなく、後にのみ投与されるべきという結論に繋がる。ｔＰＡ誘導性の再潅流の２〜３時間後に１０％〜１５％の虚血性卒中患者において起こることが示された現象である再閉塞［１３］に有利に働かないように、キセノンの使用は、患者にとっての利益−リスクの医学的評価にしたがって遅延される必要がある可能性がさらに示唆された。そのような遅延は、約８時間の可能な治療ウインドウを有する［６］ことが示唆されたキセノンの神経保護潜在能力を劇的に妨げないはずであるが、虚血性卒中の治療のために時間は決定的に重要であるという一般的なコンセンサスがある。したがって、本研究に示すように、Ｘｅ−Ａｒ−１５はｔＰＡと相互作用せず、かつ神経保護の提供において５０体積％のキセノンと同等に強力であるので、Ｘｅ−Ａｒ−１５は、急性虚血性卒中の治療のための、キセノン単独に対する有望な代替となる、コスト効率の良い、神経保護戦略である。
【００６２】
参考文献
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【図１】
2020525511.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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