(57)【要約】  核酸プローブ、固形担体に核酸プローブを固定する方法、固定された核酸プローブを含む固形担体、及び固形担体を含む試験デバイスが開示される。核酸プローブは、末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含み、末端アンカー鎖部分は、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドと任意選択的に塩基タイプグアニン（Ｇ）の１ヌクレオチドとを伴う塩基タイプＸの５ヌクレオチドまでのストレッチで構成された少なくとも１８ヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも９０％の類似性を有する配列を含み、各塩基タイプＸは、互いに独立して塩基タイプチミン（Ｔ）又は塩基タイプウラシル（Ｕ）を表す。少なくとも１つの超臨界角蛍光構造体（ＳＡＦ構造体）を有する固形担体を含む試験デバイスがさらに開示される。
2020536493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形担体に核酸プローブを固定する方法であって、
・末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含むように前記核酸プローブを提供することと、
・前記固形担体の表面上に前記核酸プローブを適用することと、
・ＵＶ光に暴露することにより前記固形担体に前記核酸プローブのアンカー鎖部分をアンカーすることと、
を含み、
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドと任意選択的に塩基タイプグアニン（Ｇ）の１ヌクレオチドとを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも９０％の類似性を有する配列を含み、前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、互いに独立して１〜５ヌクレオチドを含み、Ｎが少なくとも１８であり、且つ各塩基タイプＸが、互いに独立して塩基タイプチミン（Ｔ）又は塩基タイプウラシル（Ｕ）を表す、方法。
【請求項２】
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの前記配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを５％未満、たとえば、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを１又は０個含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、ピリミジン核酸塩基を有するヌクレオチドを排他的に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプＣの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸの２〜５ヌクレオチドのストレッチで構成された少なくともＮヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｎが少なくとも２０、たとえば少なくとも２６、たとえば少なくとも３０、たとえば少なくとも３４、たとえば少なくとも３８、たとえば少なくとも４０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプＣの１〜４ヌクレオチドにより互いに独立して分離される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、等しい長さ、好ましくは塩基タイプＸの２ヌクレオチドの長さ、塩基タイプＸの３ヌクレオチドの長さ、又は塩基タイプＸの４ヌクレオチドの長さである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、式
（−（Ｘ）Ｙ−（Ｃ）Ｚ−）Ｍ
（式中、Ｙは１〜５の整数であり、Ｚは１〜５の整数であり、Ｙ≧Ｚであり、且つＭは４〜２０の整数である）
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｙが２〜５の整数であり、Ｚが１〜４の整数であり、Ｙ＞Ｚであり、且つＭが４〜２０の整数である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚ＝１である、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｚ＝２である、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｙ＝２且つＭ≧１０、たとえばＭ≧１２、たとえばＭ≧１４であるか、
又は
Ｙ＝３且つＭ≧６、たとえばＭ≧８、たとえばＭ≧１０であるか、
又は
Ｙ＝４且つＭ≧４、たとえばＭ≧６、たとえばＭ≧８である、
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、式
（−（Ｘ）Ｙ２−（Ｃ）Ｚ−（Ｘ）Ｙ２−）Ｍ
（式中、Ｙ２は１〜４の整数であり、Ｚは１〜４の整数であり、且つＭは４〜２０の整数である）
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｙ２が２〜３の整数であり、且つＺが１〜３の整数である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｙ２≧Ｚ、好ましくはＹ２＞Ｚである、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｙ２＝２且つＭ≧１０、たとえばＭ≧１２、たとえばＭ≧１４であるか
又は
Ｙ２＝３且つＭ≧４、たとえばＭ≧６、たとえばＭ≧８である、
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｙ又はＹ２の数がＺの数よりも大きい、好ましくはＹ又はＹ２の数がＺの数の少なくとも２倍である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプＴのヌクレオチドのストレッチである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプＵのヌクレオチドのストレッチである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプＴのヌクレオチドと塩基タイプＵのヌクレオチドとの両方を含む、たとえば塩基タイプＴのヌクレオチドと塩基タイプＵのヌクレオチドとを交互に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記末端アンカーのＮヌクレオチドの配列が５’末端若しくは３’末端に位置するか、又は前記核酸プローブがその５’末端若しくはその３’末端の両方に末端アンカーを有し、前記５’末端及び前記３’末端それぞれのＮヌクレオチドの配列が互いに等しくても異なっていてもよい、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、又はＡＮＡ、それらのオリゴヌクレオチド、それらの断片、又はそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸プローブが天然源から得られるか又は全合成若しくは部分合成される、好ましくは前記核酸プローブ又は前記核酸プローブの少なくとも末端アンカー鎖部分が少なくとも部分合成、好ましくは全合成される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸プローブが一本鎖である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸プローブにおいてその長さの少なくとも一部が、たとえばそのキャプチャー部分の一部が二本鎖である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記キャプチャー部分が、プライマー伸長に適合化されたプライマーなどのプライマーを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
キャプチャー部分が、標的核酸プローブの相補的領域にハイブリダイズするように適合化された及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施するように適合化されたヌクレオチドの配列などのヌクレオチドの配列を含むハイブリダイゼーション鎖部分を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記キャプチャー部分が、約４〜約１００ヌクレオチド、たとえば約１０〜約５０ヌクレオチド、たとえば約２０〜約３０ヌクレオチドを有するヌクレオチド鎖を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分に直接結合される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記キャプチャー部分が、スペーサ、たとえば脱塩基スペーサ、たとえばある繰返し数のスペーサを介して前記末端アンカー鎖部分に結合される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記末端アンカー鎖部分が前記核酸プローブの５’末端又は３’末端に位置し、且つ前記キャプチャー部分Ｈが前記５’末端及び前記３’末端の他の一方に位置する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸プローブが５’末端及び３’末端の両方に末端アンカー鎖部分を含み、且つ前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分の間に位置し、任意選択的にその間にスペーサを有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸プローブが、マーカ、たとえば放射性マーカ又は蛍光マーカ、たとえばシアニン色素、たとえばＣｙ３（１，１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン）又はＣｙ５（１，１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン）を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸プローブがスポッティングにより前記固形担体の表面上に堆積され、好ましくは、前記スポッティングが、前記固形担体の表面上に溶媒中の前記核酸プローブをスポットすることを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸プローブが、溶媒中に１００μＭまでの濃度で、たとえば約１μＭ〜約８０μＭ、たとえば約３μＭ〜約７０μＭ、たとえば約５μＭ〜約６０μＭの濃度でスポットされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記スポットされた核酸プローブが、ＵＶ光に暴露される前に乾燥される、請求項３５又は請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記固形担体がポリマー担体又はガラス担体であり、好ましくは、前記担体が、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、又は上述したポリマーの１つ以上を含む混合物を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記固形担体がポリスチレン（ＰＳ）を含むか又はポリスチレン（ＰＳ）であり、好ましくは、前記固形担体の少なくとも表面はＰＳ表面、好ましくは非発泡基材である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記固形担体が、極性基を導入するために任意選択的に酸素リッチプラズマで成形後表面改質に付された射出成形固形担体である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記固形担体表面が、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基の１つ以上を本質的に含まない、好ましくは、前記担体表面が、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基のすべてを本質的に含まない、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記固形担体が、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの少なくとも一部であり、前記固形基材の表面が、前記チャネル表面の少なくとも一部を形成する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記チャネルが反応セクションを含み、前記方法が、前記チャネルの反応セクション内の表面に前記核酸プローブを固定することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記反応セクションが少なくとも１つの光学エレメントを含み、前記光学エレメントが、好ましくは、前記固定された核酸プローブの又は核酸プローブに接続された蛍光マーカ（フルオロフォア）から発せられた光をリダイレクトするように、好ましくはコリメートするように構築される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記光学エレメントがレンズ構造及び／又は超臨界角蛍光構造体（ＳＡＦ構造体）を含み、前記ＳＡＦ構造体が好ましくはトップ表面を有し、且つ前記方法が、前記トップ表面に前記核酸プローブを固定することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記光学エレメントが、切頭体角α、トップ表面、トップ直径Ｄ、及び高さｈを有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは、前記切頭体角αが、空気／ポリスチレン界面の場合、約３０°〜約７０°、たとえば約３５〜約６５、たとえば約４０°〜約６０°、たとえば約４０°若しくは約６０°、たとえば約３５°〜約５５°である、又は水／ポリスチレン界面の場合、約５５°〜約６５°である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記高さｈが、少なくとも約０．２ｍｍ、たとえば約０．２５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、たとえば約０．３ｍｍ〜約０．３５ｍｍである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記トップ直径が、約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、たとえば約０．１ｍｍ〜約０．３ｍｍである、請求項４６又は請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのＳＡＦ構造体が、約１．１以下、たとえば約１．０５以下、たとえば約１以下のトップ直径対高さのアスペクト比Ｄ／ｈを有し、好ましくは前記ＳＡＦ構造体がポリマーＳＡＦ構造体であり、より好ましくは前記ＳＡＦ構造体がポリスチレン（ＰＳ）である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのＳＡＦ構造体のトップ表面がトップ表面凹部を有し、前記トップ表面凹部が好ましくは丸形であり、より好ましくは前記トップ表面凹部が前記ＳＡＦ構造体の中心軸に平行な中心軸を有し、且つ好ましくは前記ＳＡＦ構造体の中心軸から多くとも約０．２ｍｍのオフセット、たとえば多くとも約０．１ｍｍのオフセットを有し、より好ましくは前記表面凹部の中心軸が前記ＳＡＦ構造体の中心軸に一致する、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記凹部が実質的にフラットな凹部フロアを有し、好ましくは前記凹部が、前記トップ直径Ｄの約１０％以上、たとえば前記トップ直径Ｄの約１５％〜約８０％、たとえば約２０％〜約５０の直径ｄを有し、好ましくは前記トップ表面の凹部を取り囲むエッジが少なくとも０．０１ｍｍの幅を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記凹部直径ｄが、約０．０１〜約０．２、たとえば約０．２５〜約０．１である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記凹部が、約０．０５ｍｍ以下、たとえば約０．０２以下の高さｈ１を有する、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記凹部が丸形凹部エッジを有し、好ましくは、前記凹部エッジが、約０．１ｍｍ以下、たとえば０．０１〜０．８ｍｍの丸形半径Ｒを有する丸形である、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記凹部が、前記フロアにより形成された表面により形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは前記凹部の円錐状切頭体形状が、約４０°〜約７０°、たとえば約５５°〜約６５°、たとえば約６０°である凹部切頭体角θを有し、より好ましくは前記凹部切頭体角θが、前記切頭体角αと実質的に同一である、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸のアンカー鎖部分が、約２５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内の波長を含む、好ましくは約２５４ｎｍ、約２６５ｎｍ、及び／又は約３６５ｎｍの少なくとも１つの波長を含むＵＶ光に暴露することにより前記固形担体にアンカーされる、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸のアンカー鎖部分が、約０．２ジュール／ｃｍ２〜約１５ジュール／ｃｍ２、たとえば約１ジュール／ｃｍ２〜約１０ジュール／ｃｍ２、たとえば約１．５ジュール／ｃｍ２〜約６ジュール／ｃｍ２、たとえば約１．６ジュール／ｃｍ２〜約３ジュール／ｃｍ２、たとえば約１．７ジュール／ｃｍ２〜約２ジュール／ｃｍ２のエネルギー量を用いてＵＶ光に暴露することにより前記固形担体にアンカーされる、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法により得られる固形基材である、固定された核酸プローブを含む固形担体。
【請求項５９】
固形担体に固定するのに好適な核酸プローブであって、前記核酸プローブが末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含み、前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも９０％の類似性を有する配列を含み、前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが互いに独立して２〜５ヌクレオチドを含み、Ｎが少なくとも１８であり、且つ各塩基タイプＸが互いに独立して塩基タイプチミン（Ｔ）又は塩基タイプウラシル（Ｕ）を表す、核酸プローブ。
【請求項６０】
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの前記配列を含む、請求項５９に記載の核酸プローブ。
【請求項６１】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを５％未満、たとえば、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを１又は０個含む、請求項５９又は請求項６０に記載の核酸プローブ。
【請求項６２】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、ピリミジン核酸塩基を有するヌクレオチドを排他的に含む、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６３】
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプＣの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸの２〜５ヌクレオチドのストレッチで構成された少なくともＮヌクレオチドの配列を含む、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６４】
Ｎが少なくとも２０、たとえば少なくとも２６、たとえば少なくとも３０、たとえば少なくとも３４、たとえば少なくとも３８、たとえば少なくとも４０である、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６５】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプＣの１〜４ヌクレオチドにより互いに独立して分離される、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６６】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、等しい長さ、好ましくは塩基タイプＸの２ヌクレオチドの長さ、塩基タイプＸの３ヌクレオチドの長さ、又は塩基タイプＸの４ヌクレオチドの長さである、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６７】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、式
（−（Ｘ）Ｙ−（Ｃ）Ｚ−）Ｍ
（式中、Ｙは１〜５の整数であり、Ｚは１〜５の整数であり、Ｙ≧Ｚであり、且つＭは４〜２０の整数である）
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６８】
Ｙが２〜５の整数であり、Ｚが１〜４の整数であり、Ｙ＞Ｚであり、且つＭが４〜２０の整数である、請求項５９〜６７のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項６９】
Ｚ＝１又はＺ＝２である、請求項６７〜６８のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７０】
Ｙ＝２且つＭ≧１０、たとえばＭ≧１２、たとえばＭ≧１４であるか、
又は
Ｙ＝３且つＭ≧６、たとえばＭ≧８、たとえばＭ≧１０であるか、
又は
Ｙ＝４且つＭ≧４、たとえばＭ≧６、たとえばＭ≧８である、
請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７１】
前記Ｎヌクレオチドの配列が、式
（−（Ｘ）Ｙ２−（Ｃ）Ｚ−（Ｘ）Ｙ２−）Ｍ
（式中、Ｙ２は１〜４の整数であり、Ｚは１〜４の整数であり、且つＭは４〜２０の整数である）
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７２】
Ｙ２が２〜３の整数であり、Ｚが１〜３の整数である、請求項７１に記載の核酸プローブ。
【請求項７３】
Ｙ２≧Ｚ、好ましくは
Ｙ２＝２且つＭ≧１０、たとえばＭ≧１２、たとえばＭ≧１４
又は
Ｙ２＝３且つＭ≧４、たとえばＭ＞＝６、たとえばＭ≧８である、
請求項７１又は請求項７２に記載の核酸プローブ。
【請求項７４】
Ｘの数がＺの数よりも大きい、好ましくはＸの数がＺの数の少なくとも２倍である、請求項５９〜７３のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７５】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプＴのヌクレオチドのストレッチである、請求項５９〜７４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７６】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプＵのヌクレオチドのストレッチである、請求項５９〜７４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７７】
前記塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプＴのヌクレオチドと塩基タイプＵのヌクレオチドとの両方を含む、たとえば塩基タイプＴのヌクレオチドと塩基タイプＵのヌクレオチドとを交互に含む、請求項５９〜７４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７８】
前記末端アンカーのＮヌクレオチドの配列が５’末端若しくは３’末端に位置するか、又は前記核酸プローブがその５’末端若しくはその３’末端の両方に末端アンカーを有し前記５’末端及び前記３’末端それぞれのＮヌクレオチドの配列が互いに等しくても異なっていてもよい、請求項５９〜７７のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項７９】
前記核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、又はＡＮＡ、それらのオリゴヌクレオチド、それらの断片、又はそれらのいずれかの組合せを含む、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８０】
前記キャプチャー部分が、プライマー伸長に適合化されたプライマーなどのプライマーを含む、請求項５９〜７９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８１】
キャプチャー部分が、標的核酸プローブの相補的領域にハイブリダイズするように適合化された及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施するように適合化されたヌクレオチドの配列などのヌクレオチドの配列を含むハイブリダイゼーション鎖部分を含む、請求項５９〜８０のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８２】
前記キャプチャー部分が、約４〜約１００ヌクレオチド、たとえば約１０〜約５０ヌクレオチド、たとえば約２０〜約３０ヌクレオチドを有するヌクレオチド鎖を含む、請求項５９〜８１のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８３】
前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分に直接結合される、請求項５９〜８２のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８４】
前記キャプチャー部分が、スペーサ、たとえば脱塩基スペーサ、たとえばある繰返し数のスパッターを介して前記末端アンカー鎖部分に結合される、請求項５９〜８２のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８５】
前記末端アンカー鎖部分が前記核酸プローブの５’末端又は３’末端に位置し、且つ前記キャプチャー部分Ｈが前記５’末端及び前記３’末端の他の１つに位置する、請求項５９〜８４のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８６】
前記核酸プローブが５’末端及び３’末端の両方に末端アンカー鎖部分を含み、且つ前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分間に位置し、任意選択的にその間にスペーサを有する、請求項５９〜８５のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８７】
前記核酸プローブが、マーカ、たとえば放射性マーカ又は蛍光マーカ、たとえばシアニン色素、たとえばＣｙ３（１，１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン）又はＣｙ５（１，１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン）を含む、請求項５９〜８６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項８８】
固形担体を含む試験デバイスであって、前記固形担体が少なくとも１つの超臨界角蛍光構造体（ＳＡＦ構造体）を含み、前記ＳＡＦ構造体が、切頭体角α、トップ表面、トップ直径Ｄ、及び高さｈを有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは、切頭体角αが、空気／ポリスチレン界面の場合、約３０°〜約７０°、たとえば約３５〜約６５、たとえば約４０°〜約６０°、たとえば約４０°又は約６０°、たとえば約３５°〜約５５°である、又は水／ポリスチレン界面の場合、約５５°〜約６５°である、試験デバイス。
【請求項８９】
前記高さｈが、少なくとも約０．２ｍｍ、たとえば約０．２５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、たとえば約０．３ｍｍ〜約０．３５ｍｍである、請求項８８に記載の試験デバイス。
【請求項９０】
前記トップ直径が、約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、たとえば約０．１ｍｍ〜約０．３ｍｍである、請求項８８又は請求項８９に記載の試験デバイス。
【請求項９１】
前記少なくとも１つのＳＡＦ構造体が、約１．１以下、たとえば約１．０５以下、たとえば約１以下のトップ直径対高さのアスペクト比Ｄ／ｈを有し、好ましくは前記ＳＡＦ構造体がポリマーＳＡＦ構造体である、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項９２】
前記固形担体がポリマー担体又はガラス担体であり、好ましくは、前記担体が、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、又は上述したポリマーの１つ以上を含む混合物若しくは組合せを含む、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項９３】
前記ＳＡＦ構造体がポリスチレン（ＰＳ）である、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項９４】
前記少なくとも１つのＳＡＦ構造体のトップ表面がトップ表面凹部を有し、前記トップ表面凹部が好ましくは丸形であり、より好ましくは前記トップ表面凹部が前記ＳＡＦ構造体の中心軸に平行な中心軸を有し、且つ好ましくは前記ＳＡＦ構造体の中心軸から多くとも約０．２ｍｍのオフセット、たとえば多くとも約０．１ｍｍのオフセットを有し、より好ましくは前記表面凹部の中心軸が前記ＳＡＦ構造体の中心軸に一致する、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項９５】
前記凹部が実質的にフラットな凹部フロアを有し、好ましくは前記凹部が、前記トップ直径Ｄの約１０％以上、たとえば前記トップ直径Ｄの約１５％〜約８０％、たとえば約２０％〜約５０の直径ｄを有し、好ましくは前記トップ表面の凹部を取り囲むエッジが少なくとも０．０１ｍｍの幅を有する、請求項９４に記載の試験デバイス。
【請求項９６】
前記凹部直径ｄが、約０．０１〜約０．２、たとえば約０．２５〜約０．１である、請求項９５に記載の試験デバイス。
【請求項９７】
前記凹部が、約０．０５ｍｍ以下、たとえば約０．０２以下の高さｈ１を有する、請求項８８〜９６のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項９８】
前記凹部が丸形凹部エッジを有し、好ましくは、前記凹部エッジが、約０．１ｍｍ以下、たとえば０．０１〜０．８ｍｍの丸形半径Ｒを有する丸形である、請求項８８〜９７のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項９９】
前記凹部が、前記フロアにより形成された表面により形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは前記凹部の円錐状切頭体形状が、約４０°〜約７０°、たとえば約５５°〜約６５°、たとえば約６０°である凹部切頭体角θを有し、より好ましくは前記凹部切頭体角θが、前記切頭体角αと実質的に同一である、請求項８８〜９８のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項１００】
前記試験デバイスが、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの少なくとも一部であり、前記少なくとも１つのＳＡＦ構造体を含む固形基材が、前記チャネル表面の少なくとも一部を形成する、請求項８８〜９９のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、マイクロ流体カートリッジなどの固形基材に核酸プローブを固定することに関する。かかる核酸プローブは、標的成分をキャプチャーするために及び／又はハイブリダイゼーションアッセイの目的のために有利に適用しうる。
【背景技術】
【０００２】
バイオ分子の研究及び／又は検出に使用するためのアッセイデバイスは、非常に重要なツールである。近年、ハイブリダイゼーションアッセイのための固定プローブを担持したさまざまなタイプのデバイスが開発され市販されてきた。
【０００３】
アッセイデバイスを改善するための及び所望のプローブを固定するためのいくつかの試みが提案されてきた。いくつかの先行技術の方法は、ヌクレオチド配列を担体構造上に直接合成することを含む。他のより有効な方法は、たとえば、天然源から単離することにより又は合成することにより、核酸プローブを最初に提供することを含む。
【０００４】
（非特許文献１）には、金表面へのプレ合成オリゴヌクレオチドのアセンブリーに及ぼすＤＮＡ長及びアンカー基の存在の影響の研究が開示されている。チオールアンカー基はオリゴヌクレオチド固定を強く増強するが、より長い鎖長では増強は低減されることが、研究から示される。２４塩基よりも長い鎖では、表面カバレッジはプローブ長と共に顕著に減少し始める。
【０００５】
（非特許文献２）には、アミン官能基化基材上への光化学的（２５４ｎｍ  ＵＶ）ＤＮＡ固定の研究が開示されている。ハイブリダイゼーション配列に装着されたウラシル、チミン、及び限られた範囲内でグアニンの短いホモオリゴマー配列（テール）は、固定を改善すると結論付けられた。アミン官能基化基材へのこうしたヌクレオチドのグラフトを説明する、可能性のある機序が提案された。
【０００６】
類似の固定方法は、（特許文献１）に開示されている。そこに開示される発明は、核酸を固定するためにより長い波長すなわち３００〜５００ｎｍを使用することに焦点を当てており、かかる長波長光を用いると核酸分子の損傷を引き起こすリスクが低減されると考えられる。開示された方法は、
（ａ）１つの塩基タイプのみのヌクレオチドストレッチを有する核酸を提供する工程であって、１つの塩基タイプのみのヌクレオチドストレッチが少なくとも核酸の３’又は５’末端に位置する、工程と、
（ｂ）光で架橋することにより固形担体上に核酸を固定する工程であって、光で架橋することが約３００〜５００ｎｍの波長で、好ましくは３６５ｎｍの波長で実施され、１つの塩基タイプのみのヌクレオチドストレッチが約７〜約１００ヌクレオチドの長さを有し、且つ架橋することが約０．５ジュール／ｃｍ２〜約１０ジュール／ｃｍ２の範囲内のエネルギー量を用いて実施される、工程と、
を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第２３３４８１０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａ．Ｂ．スティール（Ａ．Ｂ．Ｓｔｅｅｌ）ら著、ＤＯＩ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０００６−３４９５（００）７６３５１−Ｘ、「固体表面への核酸の固定：層アセンブリーに及ぼすオリゴヌクレオチド長の影響（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｔ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  ｏｎ  Ｌａｙｅｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）」、バイオフィジカル・ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第７９巻、２０００年８月、ｐ．９７５〜９８１
【非特許文献２】アンケ・ピエリク（Ａｎｋｅ  Ｐｉｅｒｉｋ）ら著、ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃ９０２５６１ｗ、「アミン官能基化固形基材上へのホモオリゴマーテールを有するオリゴヌクレオチドの固定及びハイブリダイゼーションに及ぼす影響（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｏｍｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｔａｉｌｓ  ｏｎｔｏ  Ａｍｉｎｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第８２巻、第４号、ｐ．１１９１〜１１９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、固形基材に核酸プローブを固定する単純且つ効果的な代替法を提供することである。
ある実施形態では、固形基材に核酸プローブを固定する方法であって、基材が、前処理、たとえば、固形担体のアミン官能基化又はチオール官能基化を含む前処理を必要としないものである、好ましくは、基材が、射出成形により作製された後でなんら表面官能基化を必要としない熱可塑性・射出成形性材料である、方法を提供することが目的である。
【００１０】
ある実施形態では、固形基材に核酸プローブを固定する方法であって、基材がＵＶ光による固定後に洗浄を必要としない、方法を提供することが目的である。それにより、固定プローブを担持した最終デバイス担体は、コストを削減して作製可能である。
【００１１】
本発明の目的は、きわめて有効に基材に核酸プローブを固定するための末端アンカー鎖部分を含むプローブを提供することであり、有利には基材は前処理を必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらの目的は、特許請求の範囲に規定される及び本明細書の以下に記載される本発明又はその実施形態により達成された。
本発明は、固形担体に核酸プローブを固定する新しい有効な方法を提供する。本発明の発明者らは、固定効率が驚くほど高い且つ核酸プローブの望ましくない損傷リスクが非常に低い、固形担体に核酸プローブを固定するための新規なアンカーチェンジを見いだした。
【００１３】
固形担体に核酸プローブを固定する方法である本方法は、
・末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含むように核酸プローブを提供することと、
・固形担体の表面上に核酸プローブを適用することと、
・ＵＶ光に暴露することにより固形担体に核酸プローブのアンカー鎖部分をアンカーすることと、
を含む。
【００１４】
核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドと任意選択的に塩基タイプグアニン（Ｇ）の１ヌクレオチドとを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも９０％の類似性を有する配列を含む。塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、互いに独立して１〜５ヌクレオチドを含む。Ｎは少なくとも１８であり、且つ各塩基タイプＸは、互いに独立して塩基タイプチミン（Ｔ）又は塩基タイプウラシル（Ｕ）を表す。ある実施形態では、Ｎは少なくとも２０である。
【００１５】
ある実施形態では、末端アンカー鎖部分は、塩基タイプＧの多くとも１ヌクレオチドを有するか又はそのヌクレオチドを含まない。
パーセント類似性は、塩基タイプＣの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸの１〜５ヌクレオチドのストレッチの組成と異なるＮヌクレオチドの配列中のヌクレオチドの数ｎをカウントして類似性パーセント１００×（Ｎ−ｎ）／Ｎを計算することにより決定される。
【００１６】
特定の塩基タイプ、たとえば、それぞれ塩基タイプシトシン（Ｃ）、塩基タイプチミン（Ｔ）、又は塩基タイプウラシル（Ｕ）のヌクレオチドという用語は、本明細書では、特定の塩基タイプを含むヌクレオチド、さらには機能的に等価なその誘導体又は修飾体をはじめとする相補的塩基と相互作用可能な当業者に公知のその化学誘導体を含めて用いられる。「機能的に等価な」という用語は、ヌクレオチド又はその由来源の塩基の非共有結合に化学的に類似した相補的塩基との非共有結合を確立する塩基の能力を意味する。かかる機能的に等価な又は修飾された塩基は、相補的塩基とのハイブリダイゼーション結合を依然として達成可能でありうる。
【００１７】
「末端アンカー鎖部分」、「ポリテール」、又は単に「アンカーチェンジ」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。
「標的成分」という用語は、キャプチャー部分よりキャプチャーされうる及び／又はハイブリダイゼーション、プライマー伸長、他の反応などによりキャプチャー部分で合成されうるいずれかの成分を意味する。
【００１８】
「先端」及び「基端」という用語は、最小侵襲手術との関連で使用される光トランスミッターデバイス又はいずれかの他のデバイスの向きを基準にして解釈すべきである。
「約」という用語は、一般的には、測定不確実性の範囲内のものを含むように用いられる。範囲で用いられた場合、「約」という用語は、本明細書では、測定不確実性の範囲内のものがその範囲に含まれることを意味するものとみなすべきである。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「を含む」という用語は、オープンタームであると解釈すべきことが強調されるべきである。すなわち、要素、単位、整数、工程、成分、それらの組合せなどの具体的に述べられた特徴の存在を特定するものとみなすべきであるが、１つ以上の他の述べられた特徴の存在又は追加を妨げるものではない。
【００２０】
とくに明記されていない限り又は文脈から明らかでない限り、「実質的に」という用語は、通常の測定不確実性又は製品のバラツキ及び許容度のどちらか大きい方が含まれることを意味する。
【００２１】
「本質的に」という用語は、本明細書では、当該目的には実用上無関係である変動が含まれることを意味するものとみなすべきである。
本明細書又は特許請求の範囲の全体を通じて、とくに明記されていない限り又は文脈上必要とされない限り、単数は複数を包含する。
【００２２】
「ある実施形態」という語句は、挙げられた実施形態の特徴を含む本発明の実施例を含むものと解釈すべきである。
範囲及び好ましい範囲を含めて、本明細書に記載の本発明の特徴及び本発明の実施形態はすべて、かかる特徴を組み合わせない特別な理由がない限り、本発明の範囲内で各種方法で組み合わせうる。
【００２３】
新規な核酸プローブを提供することにより、本発明の発明者らは、固形基材に核酸を固定する技術に大きな価値ある寄与を果たした。本発明者らにより提供された方法は、以下でさらに説明されるいくつかの非常に価値ある利点を有する。
【００２４】
ある実施形態では、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの前記配列を含む。塩基タイプＸと塩基タイプＣとの組合せは、高い固定効率を得るのに非常に有利であることが示された。そのため、ある実施形態では、Ｎヌクレオチドの少なくとも約９０％、たとえば少なくとも約９５％、たとえば各々は、互いに独立して塩基タイプＸ又は塩基タイプＣである。
【００２５】
塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、各ストレッチに対して塩基タイプＸの少なくとも１ヌクレオチドを含む。塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、等しい又は異なる長さを有しうる。ある実施形態では、塩基タイプＸのヌクレオチドのいくつかのストレッチ、たとえば、２つごと又は３つごとのストレッチは、第１の長さを有し、且つ塩基タイプＸのヌクレオチドのいくつかの他のストレッチ、たとえば、２つごと又は３つごとのストレッチは、２番目に長い長さを有する。
【００２６】
核酸プローブが、２〜５ヌクレオチドを含む塩基タイプＸのヌクレオチドの１つ以上のストレッチを含む場合、偽陰性を与えるプローブの脱離リスクは、大幅に低減されうることが見いだされた。
【００２７】
有利には、Ｎヌクレオチドの配列は、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを１０％未満、好ましくは５％未満、たとえば、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを１又は０個含む。
【００２８】
プリン核酸塩基を有するヌクレオチドは、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）である。プリン核酸塩基を有するヌクレオチドは、核酸プローブの固定効率を一般に低減することが見いだされた。この理由は、核酸プローブの高い固定効率がピリミジンのＣ＝Ｃ二重結合での反応による共有結合の形成により引き起こされることでありうると考えられる。そのため、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドは、この反応により固形担体に結合されないであろう。
【００２９】
有利には、Ｎヌクレオチドの配列は、ピリミジン核酸塩基を有するヌクレオチドを排他的に含む。
ある実施形態では、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、塩基タイプＣの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸの２〜５ヌクレオチドのストレッチで構成された少なくともＮヌクレオチドの配列を含む。
【００３０】
末端アンカー鎖部分のヌクレオチドの数Ｎは、有利には、少なすぎないようにすべきである。なぜなら、この結果、末端アンカー鎖部分と固形担体との間の結合が弱くなりすぎるおそれがあるからである。しかしながら、また、核酸プローブのヌクレオチドの全数は、多すぎないことが望まれる。なぜなら、この結果、単位面積当たりの固定された核酸プローブの数が少なくなるおそれがあるからであり、及び／又は核酸プローブが互いに部分的にブロックし合って比較的弱い固定を生じるおそれがあるからである。有利には、Ｎは、少なくとも２６、たとえば少なくとも３０、たとえば少なくとも３４、たとえば少なくとも３８、たとえば少なくとも４０である。
【００３１】
一般的には、末端アンカー鎖のヌクレオチドの数Ｎを６０超に増加させると、固定効率のさらなる増加は得られないと考えられる。ある実施形態では、末端アンカー鎖のヌクレオチドの数Ｎは５０未満である。
【００３２】
有利には、塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、塩基タイプＣの１〜４ヌクレオチドにより互いに独立して分離される。
ある実施形態では、塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、等しい長さ、好ましくは塩基タイプＸの２ヌクレオチドの長さ、塩基タイプＸの３ヌクレオチドの長さ、又は塩基タイプＸの４ヌクレオチドの長さである。
【００３３】
末端アンカー鎖部分が塩基タイプＸのヌクレオチドと塩基タイプＣのヌクレオチドとの繰返しサブ配列を含む場合、非常に高い固定効率が得られうるとともに、ＤＮＡ断片の増幅のためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で適用される熱サイクルなどの熱サイクルプロセスで提供されるような温度シフトに暴露されたときでさえも、固定された核酸プローブの脱離リスクが非常に低いことを見いだした。
【００３４】
きわめて好適な実施形態では、Ｎヌクレオチドの配列は、式
（−（Ｘ）Ｙ−（Ｃ）Ｚ−）Ｍ
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む。式中、Ｙは１〜５の整数であり、Ｚは１〜５の整数であり、Ｙ≧Ｚであり、且つＭは４〜２０の整数である。
【００３５】
有利には、Ｙは２〜５の整数であり、Ｚは１〜４の整数であり、Ｙ＞Ｚであり、且つＭは４〜２０の整数である。
ある実施形態では、Ｚ＝１である。ある実施形態では、Ｚ＝２である。ある実施形態では、Ｙ＝２且つＭ≧１０、たとえばＭ≧１２、たとえばＭ≧１４である。ある実施形態では、Ｙ＝３且つＭ≧６、たとえばＭ≧８、たとえばＭ≧１０である。ある実施形態では、Ｙ＝４且つＭ≧４、たとえばＭ≧６、たとえばＭ≧８である。
【００３６】
きわめて好適な他の一実施形態では、Ｎヌクレオチドの配列は、式
（−（Ｘ）Ｙ２−（Ｃ）Ｚ−（Ｘ）Ｙ２−）Ｍ
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む。式中、Ｙ２は１〜４の整数であり、Ｚは１〜４の整数であり、且つＭは４〜２０の整数である。
【００３７】
好ましくは、Ｙ２は２〜３の整数であり、Ｚは１〜３の整数である。ある実施形態では、Ｙ２≧Ｚ、好ましくはＹ２＞Ｚである。ある実施形態では、Ｙ２＝２且つＭ≧１０、たとえばＭ≧１２、たとえばＭ≧１４である。ある実施形態では、Ｙ２＝３且つＭ≧４、たとえばＭ≧６、たとえばＭ≧８である。
【００３８】
塩基タイプＸの数が塩基タイプＣの数よりも大きい実施形態は、非常に高い安定な固定効率を得るのに好適であることが見いだされた。
ある実施形態では、Ｙ又はＹ２の数はＺの数よりも大きく、好ましくはＹ又はＹ２の数はＺの数の少なくとも２倍である。
【００３９】
ある実施形態では、塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、塩基タイプＴのヌクレオチドのストレッチである。
ある実施形態では、塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、塩基タイプＵのヌクレオチドのストレッチである。
【００４０】
固形担体への末端アンカー鎖部分の結合は、ピリミジンのＣ＝Ｃ二重結合に局在する反応による共有結合の形成により生じる結合であると考えられるので、塩基タイプＵのヌクレオチドは、塩基タイプＴのヌクレオチドの結合効率に対応する結合効率を有するであろうと考えられる。
【００４１】
ある実施形態では、塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、塩基タイプＴのヌクレオチドと塩基タイプＵのヌクレオチドとを交互に含むなど、塩基タイプＴのヌクレオチド及び塩基タイプＵのヌクレオチドの両方を含む。
【００４２】
末端アンカーのＮヌクレオチドの配列は、核酸プローブのどちらかの末端に位置しうる。ある実施形態では、末端アンカーのＮヌクレオチドの配列は、５’末端に位置する。ある実施形態では、末端アンカーのＮヌクレオチドの配列は、３’末端に位置する。
【００４３】
ある実施形態では、核酸プローブは、その５’末端又はその３’末端の両方に末端アンカーを有し、５’末端及び３’末端のそれぞれのＮヌクレオチドの配列は、互いに等しくても異なっていてもよい。
【００４４】
核酸プローブのキャプチャー部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、又はＡＮＡ、それらのオリゴヌクレオチド、それらの断片、又はそれらのいずれかの組合せを含みうる。
【００４５】
ある実施形態では、キャプチャー部分は、ＲＮＡのアナログとして通常使用される２’Ｏ−メチルＲＮＡを含み、この場合、ヌクレオシドのリボース部分の２’ヒドロキシルにメチル基が付加されてメトキシ基が形成される。
【００４６】
ＤＮＡは、たとえば、Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、又はＺ−ＤＮＡの形態でありうる。ＲＮＡは、たとえば、ｐ−ＲＮＡすなわちピラノシル−ＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡやステム−ループＲＮＡのような構造修飾形の形態でありうる。
【００４７】
「ＰＮＡ」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似した人工的に合成されたポリマーであるペプチド核酸を意味する。これは生物学的研究及び医学的治療に使用されるが、天然に存在することが知られていない。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合により結合されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位を繰り返すことで構成されうる。
【００４８】
「ＨＮＡ」という用語は、ヘキシトール核酸、すなわち、標準的核酸塩基とリン酸化１，５−アンヒドロヘキシトール骨格とから構築されたＤＮＡアナログを意味する。
「ＬＮＡ」という用語は、ロックド核酸を意味する。典型的には、ロックド核酸は、修飾によりアクセス不能にしたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、たとえば、２’炭素と４’炭素とを接続する追加のブリッジで修飾される。
【００４９】
「ＡＮＡ」という用語は、アラビノン核酸又はその誘導体を意味する。
「ＣＮＡ」という用語は、アミノシクロヘキシルエタン酸核酸を意味する。そのうえさらに、この用語は、シクロペンタン核酸、すなわち、２’−デオキシカルバグアノシンなどを含む核酸分子を意味する。
【００５０】
ある実施形態では、核酸プローブのキャプチャー部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、及びＡＮＡのいずれか１つの組合せ又はその断片を含みうる。
ある実施形態では、核酸プローブのキャプチャー部分である本明細書に定義される核酸分子は、短いオリゴヌクレオチド、長いオリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの形態でありうる。
【００５１】
ある実施形態では、核酸プローブのキャプチャー部分は一本鎖である。ある実施形態では、核酸プローブのキャプチャー部分は二本鎖である。
ある実施形態では、核酸プローブは、天然源から得られるか又は全合成若しくは部分合成される。
【００５２】
一般的には、核酸プローブの少なくとも末端アンカー鎖部分は、少なくとも部分合成、好ましくは全合成されることが望ましい。
ある実施形態では、全核酸プローブは一本鎖である。
【００５３】
ある実施形態では、核酸プローブは、その長さの少なくとも一部、たとえば、そのキャプチャー部分の一部が二本鎖である。
キャプチャー部分は、原理的には、標的成分をキャプチャー可能ないずれかの種類の部分でありうる。
【００５４】
ある実施形態では、キャプチャー部分は、プライマー伸長に適合化されたプライマーなどのプライマーを含む。プライマー伸長は、たとえば、ＲＮＡの５’末端をマッピングするために使用される技術である。プライマー伸長は、たとえば、転写の開始部位を決定するために使用可能である。
【００５５】
ある実施形態では、キャプチャー部分は、標的核酸プローブの相補的領域にハイブリダイズするように適合化させた及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施するように適合化されたヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーション鎖部分を含む。ＰＣＲが固形担体に固定されたプライマー／プローブから実施される場合、それは固相ＰＣＲ又はＳＰ−ＰＣＲともいいうる。
【００５６】
ある実施形態では、キャプチャー部分は、マイクロアレイハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＷＧＡ（全ゲノム増幅）、ＨＤＡ、固相ＰＣＲなどの用途で相補的標的ＤＮＡをアニールするように適合化される。
【００５７】
ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）では、標的ＤＮＡの６〜８識別可能領域を認識する４〜６プライマーが使用される。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは合成を開始し、且つプライマーの２つは、増幅の後続ラウンドを容易にするためにループ構造を形成する。ＬＡＭＰは迅速で感度が良く、且つ増幅は非常に広範にわたり反応時に生成されたピロリン酸マグネシウムを目視可能であるので、ＬＡＭＰはフィールド診断に好適である。
【００５８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プライマーに含まれる部位に鎖限定制限エンドヌクレアーゼ又はニッキング酵素により形成されたニックで開始する鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、典型的にはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント、又はクレノウフラグメント（３’−５’エキソ−）に依拠する。ニッキング部位は、各ポリメラーゼ置換工程で再生され、指数関数的増幅をもたらす。ＳＤＡは、典型的には臨床診断に使用される。
【００５９】
ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）は、鎖を分離するヘリカーゼの二本鎖ＤＮＡ巻戻し活性を利用してプライマーのアニーリング及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を可能にする。ＰＣＲのように、このシステムは２つのプライマーのみを必要とする。ＨＤＡは、いくつかの診断デバイス及びＦＤＡ承認試験で利用されてきた。
【００６０】
ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）は、ニッキング酵素により形成されたニックで開始する鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを利用して標的配列から多くの短い核酸を迅速に生成する。このプロセスはきわめて迅速で感度が良いので、何分かで少ない標的量の検出を可能にする。ＮＥＡＲは、臨床用途及びバイオセーフティー用途で病原体検出に通常使用される。
【００６１】
定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）としても知られるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分子生物学の検査技術である。それは、ＰＣＲ時に、すなわち、従来のＰＣＲの場合のようにその終了時ではなくリアルタイムで標的ＤＮＡ分子の増幅をモニターする。
【００６２】
有利には、キャプチャー部分は、約２００ヌクレオチドまで、好ましくはより短いヌクレオチド鎖を含む。ある実施形態では、キャプチャー部分は、約４〜約１００ヌクレオチド、たとえば約１０〜約５０ヌクレオチド、たとえば約２０〜約３０ヌクレオチドを有するヌクレオチド鎖を含む。
【００６３】
キャプチャー部分は、末端アンカー鎖部分に直接結合しうる。
ある実施形態では、キャプチャー部分は、スペーサ、たとえば脱塩基スペーサ、たとえばある繰返し数のスペーサを介して末端アンカー鎖部分に結合される。
【００６４】
スペーサの例としては、スペーサＣ３、ＰＣ（光切断性）スペーサ、ヘキサンジオールスペーサ、スペーサ９、スペーサ１８、１’，２’−ジデオキシリボース（ｄスペーサ）、及びヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）スペーサが挙げられる。
【００６５】
スペーサＣ３は、オリゴヌクレオチドに短いスペーサアームを組み込むために使用される３炭素スペーサである。より長いスペーサが必要な場合、逐次付加によりスペーサＣ３を組込み可能である。スペーサ９は、９原子長（炭素数６＋酸素数３）のトリエチレングリコール鎖であり、オリゴヌクレオチドにスペーサアームを組み込むために使用される。スペーサ９は、より長いスペーサが必要な場合には常に、逐次付加により組込み可能である。スペーサ１８は、１８原子長（炭素数１２＋酸素数６）のヘキサエチレングリコール鎖であり、オリゴヌクレオチドに長いスペーサアームを組み込むために使用される。スペーサ１８は、より長いスペーサが必要な場合には常に、逐次付加により組込み可能である。
【００６６】
これらの及び他の好適なスペーサは、たとえば、米国ニューヨーク州のジーン・リンク・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．）又は米国テキサス州のバイオ−シンセシス・インコーポレーテッド（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．）から購入しうる。
【００６７】
ある実施形態では、末端アンカー鎖部分は、核酸プローブの５’末端又は３’末端に位置し、且つキャプチャー部分Ｈは、５’末端及び３’末端の他の１つに位置する。
ある実施形態では、核酸プローブは、５’末端及び３’末端の両方に末端アンカー鎖部分を含み、且つキャプチャー部分は、末端アンカー鎖部分間に位置し、それらの間に任意選択的にスペーサを有する。
【００６８】
ある特定の用途では、核酸プローブはマーカを含むことが望ましい。他の用途又は同一の用途では、標的成分はマーカを担持する。両方ともマーカを担持する場合、マーカは異なることが望ましいこともある。マーカは、原理的には、いずれの種類のマーカであってよい。
【００６９】
ある実施形態では、核酸プローブは、放射性マーカや蛍光マーカなどのマーカ、たとえば、シアニン色素、たとえば、Ｃｙ３（１，１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン）又はＣｙ５（１，１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン）を含む。
【００７０】
シアニン色素は、可視光波長で強力且つ安定な蛍光を呈するオリゴヌクレオチドの重要な化学修飾体である。シアニン色素は、シャープな吸収バンド、高い吸光係数、優れた耐光漂白性を有し、ＤＮＡ及び他のオリゴマーを高蛍光性にするので、単一分子でさえも観測可能である。
【００７１】
核酸プローブは、スポッティングなどのいずれかの方法により固形担体の表面上に堆積しうる。
「スポッティング」及び「プリンティング」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。
【００７２】
有利には、スポッティングは、固形基材の表面上に溶媒中の核酸プローブをスポットすることを含む。
スポッティングは、たとえば、コンピュータープリンターと同一の技術を用いてインクの代わりにプローブ溶液のナノリットル〜ピコリットルの体積のドロップレットを固形担体の表面上に吐出するスポッティングロボット及び／又はインクジェットプリンターを用いて実施しうる。代替的に、こうしたプローブは、ピンを用いて固形担体の表面上の特定の位置に直接適用可能である。
【００７３】
有利には、核酸プローブは溶媒で固形担体上に堆積される。溶媒中の核酸プローブの最適濃度は、主に核酸プローブの長さに依存する。しかしながら、以上に記載の好ましい末端アンカー鎖部分を有する核酸プローブを使用した場合、核酸プローブの濃度を増加させうることも見いだした。
【００７４】
ある実施形態では、核酸プローブは、１００μＭまでの濃度、たとえば約１μＭ〜約８０μＭ、たとえば約３μＭ〜約７０μＭ、たとえば約５μＭ〜約６０μＭの濃度の溶媒でスポットされる。ある実施形態では、核酸プローブは、約８００ｎｇ／μＬまで、たとえば約１ｎｇ／μＬ〜約５００ｎｇ／μＬの濃度の溶媒でスポットされる。
【００７５】
個別スポットは、たとえば約０．１ｎＬ〜約１ｎＬ、たとえば約０．０５ｎＬ〜約１ｎＬ、たとえば約０．１ｎＬ〜約０．８ｎＬ、たとえば約０．３ｎＬ〜約０．６ｎＬの体積を有しうる。
【００７６】
好適な溶媒の例としては、ＳＳＣ（生理食塩水クエン酸ナトリウム）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＮａＨＰＯ４（第二リン酸ナトリウム）、ＳＤＳ（ナトリウムドデシルスルフェート）、及びＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）が挙げられる。さらなる例としては、ＳＳＣと組み合わされたトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００が挙げられる。
【００７７】
固形担体上にスポットした後、核酸プローブは放置乾燥などにより乾燥される。その後、核酸プローブを含む固形担体はＵＶ処理に付される。
実際には、固形担体は、いずれの種類の材料であってもそれらの組合せであってもよい。有利には、固形担体は、ポリマー担体又はガラス担体であり、好ましくは、担体は、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、又は上述したポリマーの１つ以上を含む混合物を含む。
【００７８】
固形担体は層状担体でありうる。
好ましい実施形態では、固形担体は、ポリスチレン（ＰＳ）を含むか又はポリスチレン（ＰＳ）である。好ましくは、核酸プローブがスポットされた固形担体の少なくとも表面はＰＳ表面である。一般的には、基材は非発泡体であり、略低摩擦の平滑表面を有することが望ましい。
【００７９】
固形担体は、有利には射出成形固形担体でありうる。射出成形固形担体は、固形担体の表面に極性基を導入するために、任意選択的に酸素リッチプラズマによる成形後表面改質に付しうる。表面に親水特性を付与する場合、これはとくに有利でありうる。
【００８０】
核酸の固定効率のおかげで、固形担体へのいずれの前処理もいずれの官能基の付与も必要ないこともある。
そのため、ある実施形態では、固形担体表面は、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基の１つ以上を本質的に含まず、好ましくは、担体表面は、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基のすべてを本質的に含まない。
【００８１】
固形担体は、有利には、カートリッジ、ＥＬＩＳＡアッセイプレート、キュベット、マイクロプレート、又はそれらのいずれかの組合せの一部でありうるか又は一部を形成しうる。
【００８２】
かかるアッセイデバイスは一般に知られており、原理的には、これらはいずれも固形担体を形成しうる。
ある実施形態では、固形担体は、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの一部であるか又は一部を形成し、固形基材の表面は、チャネル表面の少なくとも一部を形成する。
【００８３】
ある実施形態では、チャネルは反応セクションを含み、本方法は、チャネルの反応セクション内の表面に核酸プローブを固定することを含む。反応はチャネルの長さセクションでありうる。
【００８４】
ある実施形態では、反応セクションは少なくとも１つの光学エレメントを含む。光学エレメントは、有利には、固定された核酸プローブの又は核酸プローブに接続された蛍光マーカ（フルオロフォア）から発せられた光をリダイレクトするように、好ましくはコリメートするように構築しうる。
【００８５】
ある実施形態では、光学エレメントは、レンズ構造体及び／又は超臨界角蛍光構造体（ＳＡＦ構造体）を含み、ＳＡＦ構造体は、好ましくはトップ表面を有し、且つ本方法は、トップ表面に核酸プローブを固定することを含む。
【００８６】
光学エレメントは、有利には、以下にさらに記載されるように円錐切頭体形状を有する。
有利には、固形基材は、以下にさらに記載される試験デバイスの一部であるか又は一部を形成する。
【００８７】
固形担体は、有利にはマイクロ流体カートリッジ、たとえば国際公開第１７１３３７４１号パンフレット（本出願をもって参照により組み込まれる）に開示されるマイクロ流体カートリッジでありうる。ある実施形態では、固形担体は、国際公開第１７１３３７４１号パンフレットに開示されるＳＡＦ構造体により提供され、且つ核酸プローブは、ＳＡＦ構造体のトップ表面に固定される。
【００８８】
比較的低いＵＶ光照射量を用いて固形担体上に核酸プローブを固定することにより、核酸プローブのキャプチャー部分の損傷リスクを比較的低くするかさらには回避することが保証されうることを見いだした。
【００８９】
ある実施形態では、核酸のアンカー鎖部分は、約２５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内の波長を含む、好ましくは約２５４ｎｍ、約２６５ｎｍ、及び／又は約３６５ｎｍの少なくとも１つの波長を含むＵＶ光に暴露することにより固形担体にアンカーされる。
【００９０】
ある実施形態では、核酸のアンカー鎖部分は、ごく少量のエネルギー、たとえば約０．２ジュール／ｃｍ２〜約１ジュール／ｃｍ２、たとえば約０．３ジュール／ｃｍ２以上を用いてＵＶ光に暴露することにより固形担体にアンカーされる。
【００９１】
ある実施形態では、核酸のアンカー鎖部分は、約０．４ジュール／ｃｍ２〜約１５ジュール／ｃｍ２、たとえば約１ジュール／ｃｍ２〜約１０ジュール／ｃｍ２、たとえば約１．５ジュール／ｃｍ２〜約６ジュール／ｃｍ２、たとえば約１．６ジュール／ｃｍ２〜約３ジュール／ｃｍ２、たとえば約１．７ジュール／ｃｍ２〜約２ジュール／ｃｍ２のエネルギー量を用いてＵＶ光に暴露することにより固形担体にアンカーされる。
【００９２】
ある実施形態では、核酸プローブは、スポットされて乾燥された核酸プローブを担持した固形担体を少なくとも３０秒間、たとえば約１〜約８分間、たとえば約２〜約６分間にわたりＵＶ照射に暴露することにより固定される。ＵＶ照射は、たとえばＵＶエミッター、たとえば３〜１２Ｗ  ＵＶエミッター、たとえば５〜１０Ｗ  ＵＶエミッターにより提供しうる。
【００９３】
少量の発せられたＵＶ光のみが核酸プローブに達して影響を及ぼすにすぎない。そのため、固形担体が単位面積当たり受けるエネルギー量を計算する場合、ＵＶエミッターと固形担体との間の距離さらには発せられたビームの発散を考慮していなければならない。
【００９４】
本発明はまた、以上に開示される方法により得られた固定された核酸プローブを含む固形担体を含む。
紫外光は、Ｃ＝Ｃ二重結合に局在する反応により共有結合の形成を誘発すると考えられる。ピリミジンダイマーは、光化学反応を介してＤＮＡ中のチミン塩基又はシトシン塩基から形成された損傷から形成された分子損傷である。したがって、理論上、ＤＮＡ分子自体の損傷は、実際にはプローブとＰＳとの間の結合を形成する。
【００９５】
以上に説明したように、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、ＰＳ固形担体などの固形担体への固定効率の増加をもたらす。この理由はＵＶ光がＣ＝Ｃ二重結合に局在する反応により共有結合の形成を誘発することにあるという仮説が立てられる。以下の実施例に示されるように、４２ＴＴＣＣＴＴ７ポリテールは、２０Ｔ１０Ｃ１０ポリテールと比較して固定効率を少なくとも１８倍に増加させた。ポリテールの命名は以下の通りである。第１の数は、末端アンカー鎖部分（ポリテール）の全長を示し、文字は、ヌクレオチドタイプを示し、上付きの数は、上述したヌクレオチド配列の繰返し回数を示す。
【００９６】
固形担体の表面の構造及び結合は、たとえば、「ＸＰＳ及びＳＩＭＳ技術によるポリマー表面の特徴付け（ＳＵＲＦＡＣＥ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲＳ  ＢＹ  ＸＰＳ  ＡＮＤ  ＳＩＭＳ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）」、ヤネス・コバ（Ｊａｎｅｚ  Ｋｏｖａ）著、マテリアルズ・アンド  テクノロジー（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第４５巻、第３号、ｐ．１９１〜１９７などに記載のＸ線光電子分光法による表面分析を用いて検査されうる。
【００９７】
本発明はまた、以上に開示される核酸プローブを含む。
新規な核酸プローブは、増加した固定効率で固形担体に固定可能である。核酸プローブは、末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含み、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、塩基タイプシトシン（Ｃ）の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチで構成されたＮヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも９０％の類似性を有する配列を含み、塩基タイプＸのヌクレオチドのストレッチは、互いに独立して２〜５ヌクレオチドを含み、Ｎは少なくとも１８である。
【００９８】
好ましい核酸プローブは、上に記載の核酸プローブである。
とくに好ましい核酸プローブは、Ｎヌクレオチドの配列が式
（−（Ｘ）Ｙ−（Ｃ）Ｚ−）Ｍ
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む核酸プローブである。式中、Ｙ、Ｚ、及びＭは、以上に記載した通りである。
【００９９】
他のとくに好ましい核酸プローブは、Ｎヌクレオチドの配列が式
（−（Ｘ）Ｙ２−（Ｃ）Ｚ−（Ｘ）Ｙ２−）Ｍ
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む核酸プローブである。式中、Ｙ２、Ｚ、及びＭは、以上に記載した通りである。
【０１００】
本発明はまた、以上に記載の方法に使用するのに好適な試験デバイスに関する。
試験デバイスは、以上に記載の固形担体でありうる固形担体を含む。固形担体は、少なくとも１つの超臨界角蛍光構造体（ＳＡＦ構造体）を含む。ＳＡＦ構造体は、切頭体角α、トップ表面、トップ直径Ｄ、及び高さｈを有する円錐状切頭体形状を有する。
【０１０１】
最適な切頭体角は、通常、フルオロフォアがその光のほとんどを発する角度と等しいであろう。この角度は、それぞれＳＡＦ構造体及びＳＡＦ構造体を取り囲んでそれに接触する媒体、すなわち、空気又はサンプル流体、たとえば、水又は水性流体（通常は水と同一の屈折率を有する）の２つの屈折率に依存する。水／ＰＳ界面では６０度が最良であり、一方、空気／ＰＳ界面では約５０度がより良好であることを見いだした。
【０１０２】
切頭体角αは、たとえば約４０度〜約７０度、たとえば５５度〜約６５度、たとえば約６０度でありうる。
一般的には、切頭体角αは、約３０度〜約７０度、たとえば約３５〜約６５、たとえば約４０度〜約６０度、たとえば約４０度又は約６０度であることが望ましい。ＳＡＦ構造体がポリスチレンであり且つＳＡＦ構造体の表面で空気／ポリスチレン界面を取り囲んでそれを形成する空気と併用するように適合化された実施形態では、切頭体角αは有利には約３５度〜約５５度である。ＳＡＦ構造体がポリスチレンであり且つＳＡＦ構造体の表面で空気／ポリスチレン界面を取り囲んでそれを形成する水（たとえば水性サンプル流体）と併用するように適合化された実施形態では、切頭体角αは有利には約５５度〜約６５度である。
【０１０３】
使用時、核酸プローブは、たとえば、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＳＡＦ構造体のトップ表面上にスポットして乾燥させうる。
有利には、ＳＡＦ構造体の高さｈは、少なくとも約０．２ｍｍ、たとえば約０．２５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、たとえば約０．３ｍｍ〜約０．３５ｍｍである。最適なシグナルを得るために高さが重要でありうることを見いだした。
【０１０４】
有利には、トップ直径は、約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、たとえば約０．１ｍｍ〜約０．３ｍｍである。一般的には、１つ好ましくはそれ以上のＳＡＦ構造体は比較的小さいことが望ましい。なぜなら、こうすれば同一の試験デバイスでより多くのＳＡＦ構造体が可能になるからである。それにより１つの試験デバイスを用いていくつかの試験を実施しうる。しかしながら、トップ直径が非常に小さい場合、核酸プローブのいくつかは、トップ表面のエッジさらにはトップ表面以外にスポットされるおそれがある。そのため、Ｄが約０．２未満である場合など非常に小さなトップ直径を有するＳＡＦ構造体は、スポッティングに対して低いロバスト性を有するおそれがある。
【０１０５】
少なくとも１つのＳＡＦ構造体がそのトップ直径と比較して相対的に高いことを保証することにより、得られる読取りシグナルが非常に良好な強度を有することを見いだした。有利には、ＳＡＦ構造体は、約１．１以下、たとえば約１．０５以下、たとえば約１以下のトップ直径対高さのアスペクト比Ｄ／ｈを有する。
【０１０６】
固形担体は、好ましくはポリマー担体又はガラス担体でありうる。好ましくは、担体は、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、又は上述したポリマーの１つ以上の混合物若しくは組合せを含む。
【０１０７】
担体材料は、有利には、少なくとも読取り又は励起に使用することが予想されるシグナル波長で透明でありうる。
たとえば、Ｃｙ３は、緑黄色の蛍光を発し（約５５０ｎｍ励起、約５７０ｎｍ発光）、一方、Ｃｙ５は、赤色領域に蛍光を発する（約６５０励起、６７０ｎｍ発光）。
【０１０８】
ある実施形態では、担体材料は、可視領域内及び可視領域外の１つ以上の波長に対して透明である。
ある実施形態では、ＳＡＦ構造体は、１．１以下のアスペクト比Ｄ／ｈを有するＰＳ  ＳＡＦ構造体である。
【０１０９】
ある実施形態では、少なくとも１つのＳＡＦ構造体のトップ表面は、トップ表面凹部を有する。かかるトップ表面凹部は、ＳＡＦ構造体のスポッティングロバスト性を改善しうるとともに、スポットされた核酸プローブを所望によりＳＡＦ構造体の中心に確実に位置決めしうることを見いだした。そのため、シグナル損失のリスクを低減しうる。
【０１１０】
トップ表面凹部は有利には丸形である。しかしながら、それは卵形や角形などの他の形状を有しうる。
有利には、トップ表面凹部は、ＳＡＦ構造体の中心軸に平行な中心軸を有する。凹部中心軸は、有利には、ＳＡＦ構造体の中心軸から多くとも約０．２ｍｍのオフセット、たとえば多くとも約０．１ｍｍのオフセットを有する。好ましくは、表面凹部の中心軸は、ＳＡＦ構造体の中心軸に一致する。
【０１１１】
有利には、凹部は、実質的にフラットな凹部フロアを有する。凹部は、たとえば、トップ直径Ｄの約１０％以上、たとえば約１５％〜約８０％、たとえばトップ直径Ｄの約２０％〜約５０の直径ｄを有しうる。約０．０１〜約０．２、たとえば約０．２５〜約０．１の凹部直径ｄが一般に望ましい。
【０１１２】
有利には、トップ表面の凹部を取り囲むエッジは、少なくとも０．０１ｍｍの幅を有する。実際には、トップ表面凹部と０．００５未満の幅を有する周囲エッジとを備えたＳＡＦ構造体を作製するのは高価でありうる。一方、非常に大きなエッジ幅、たとえば０．１以上、さらには０．２以上は、いくつかの用途では望ましくないおそれがある非常に小さな凹部直径ｄをもたらしうる。
【０１１３】
有利には、凹部を高すぎないようにすべきであることを見いだした。なぜなら、こうすると読取りシグナルが低減されるおそれがあるからである。好ましくは、凹部の高さｈ１をＳＡＦの高さｈの２５％未満、たとえばＳＡＦの高さｈの２０％未満にすべきであることが望まれる。
【０１１４】
ある実施形態では、凹部の高さｈ１は、約０．０５ｍｍ以下、たとえば約０．０２以下である。
凹部のエッジは、シャープであっても丸形であってもよい。ある実施形態では、凹部は丸形凹部エッジを有し、好ましくは、凹部エッジは、約０．１ｍｍ以下、たとえば０．０１〜０．８ｍｍの丸形半径Ｒを有する丸形である。
【０１１５】
好ましい実施形態では、凹部は、フロアにより形成された表面により形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有する。したがって、凹部円錐状切頭体形状は、ＳＡＦ円錐状切頭体形状を逆さまにしたものである。
【０１１６】
好ましくは、凹部円錐状切頭体形状は、約４０度〜約７０度、たとえば約５５度〜約６５度、たとえば約６０度の凹部切頭体角θを有する。凹部切頭体角θが切頭体角αに近い場合、たとえば５度までの度、好ましくは２度までの差である場合、シグナルを増加させうることを見いだした。好ましくは、凹部切頭体角θは、切頭体角αと実質的に同一である。
【０１１７】
好ましくは、試験デバイスは、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの一部であるか又は一部を形成し、少なくとも１つのＳＡＦ構造体を含む固形基材は、チャネル表面の少なくとも一部を形成する。
【０１１８】
カートリッジは、有利には、国際公開第２０１７／１３３７４１号パンフレットに記載のマイクロ流体カートリッジとして存在しうるが、ＳＡＦ構造体が本明細書に記載のものである点が異なる。
【０１１９】
本発明の以上の及び／又は追加の目的、特徴、及び利点は、添付の図面を参照すれば、限定されるものではないが以下の例示的な本発明の実施形態及び実施例の説明により、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】第１の実施例で試験されたいくつかの標識（ｍａｒｋｅｄ）ポリテールを示す図である（本発明のある実施形態に係るマイクロ流体カートリッジの模式的上面図）。
【図２】第１の実施例の標識ポリテールそれぞれの固定パーセントを示す図である。
【図３】さらなる実施例で適用されたプロセス図である。
【図４】さらなる実施例で試験されたいくつかの標識ポリテールの固定パーセントを示す図である。
【図５】さらなる実施例のポリテールのスポットの画像である。
【図６】本発明の実施形態の２つの核酸プローブと比較ポリテール（末端アンカー鎖部分）を有する１つの核酸プローブとを示す図である。
【図７】標識された図６ａ及び６ｂの核酸プローブのさまざまな濃度の画像を示す図である。
【図８】対照プローブ並びに２つの異なるキャプチャー部分、すなわち、サルモネラ菌を標的とするＦｌｉｃ遺伝子及びボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌を標的とするＢｒｆｚ遺伝子の画像である。
【図９ａ】ＳＰ−ＰＣＲを実施するための第１のプロセススキームを示す図である。
【図９ｂ】ＳＰ−ＰＣＲを実施するための第２のプロセススキームを示す図である。
【図１０ａ】スポットされた核酸プローブが洗浄あり及び洗浄なしでＳＰ−ＰＣＲに付された固形担体の画像である。
【図１０ｂ】図１０ａの画像の平均シグナル−バックグラウンドのプロットである。
【図１１】異なるＵＶ暴露時間を用いてポリテール／核酸プローブを固定したときのいくつかの標識ポリテール及び核酸プローブの固定パーセントを示す図である。
【図１２】標識ポリテールについてＵＶ暴露時間の関数として固定パーセントを示す図である。
【図１３ａ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、８Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１３ｂ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、８Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１３ｃ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、８Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１３ｄ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、８Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１３ｅ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、８Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１４ａ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、１６Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１４ｂ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、１６Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１４ｃ】異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られたいくつかの固定されたポリテール及び核酸プローブの画像であり、使用したＵＶエミッターは、１６Ｗ  ＵＶエミッターであった。
【図１５ａ】異なるポリテールを有するいくつかの標識核酸プローブのシグナル−バックグラウンドを示す図である。
【図１５ｂ】図１５ａの固定された核酸プローブの画像である。
【図１６ａ】異なるＵＶ暴露時間及びそれによるＵＶ照射量を用いて固形担体に固定された標識核酸プローブのシグナル−バックグラウンドを示す図であり、固定された核酸プローブはＳＰ−ＰＣＲに付された。
【図１６ｂ】図１６ａの固定された核酸プローブの画像である。
【図１７】固定された核酸プローブを含むＳＡＦ構造体の断面図である。
【図１８】カートリッジの反応チャネルのセクションの斜視図であり、反応セクションは、ＳＰ−ＣＰＲに付された固定された核酸プローブを有するＳＡＰ構造体を含む。
【図１９】切頭体角αを示すために点線で示されたトップ部と共に例示されたＳＡＦ構造体の斜視図である。
【図１９ａ】６０度の切頭体角を有する標準的ＳＡＦ構造体を例示する斜視図である。
【図１９ｂ】６０度の切頭体角を有する標準的ＳＡＦ構造体を例示する上面図である。
【図１９ｃ】６０度の切頭体角を有する標準的ＳＡＦ構造体を例示する側面図である。
【図１９ｄ】６０度の切頭体角を有する標準的ＳＡＦ構造体を例示する断面図である。
【図２０ａ】トップ表面凹部を有するＳＡＦ構造体を示す斜視図である。
【図２０ｂ】トップ表面凹部を有するＳＡＦ構造体を示す上面図である。
【図２０ｃ】トップ表面凹部を有するＳＡＦ構造体を示す側面図である。
【図２０ｄ】トップ表面凹部を有するＳＡＦ構造体を示す断面図である。
【図２０ｅ】トップ表面凹部を有するＳＡＦ構造体を示す図である。
【図２１ａ】トップ表面凹部を有す他のＳＡＦ構造体を示す斜視図である。
【図２１ｂ】トップ表面凹部を有す他のＳＡＦ構造体を示す上面図である。
【図２１ｃ】トップ表面凹部を有す他のＳＡＦ構造体を示す側面図である。
【図２１ｄ】トップ表面凹部を有す他のＳＡＦ構造体を示す断面図である。
【図２２】実施例１１で使用した７つの異なるＳＡＦ構造体を示す図である。
【図２３】実施例１１のシグナル強度の結果を示す図である。
【図２４】実施例１１の変動率の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
図は模式的であり、明確さを期して単純化されている。全体を通じて、同じの参照数字は同一の部分又は対応する部分に用いられる。
本発明のさらなる適用可能範囲は、これ以降に与えられた説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲に含まれる各種の変更形態及び修正形態は、この説明及び実施例から当業者には明らかになるであろうから、説明及び具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが単に例示を目的として与えられているにすぎないことを理解すべきである。
【０１２２】
各種基材上にＴＣタグ付きＤＮＡオリゴヌクレオチドを装着するために単純なＵＶ架橋プロセススキームを使用した。使用したプロセススキームは、サン  Ｙ（Ｓｕｎ  Ｙ）、パーチ−ニールセン  Ｉ（Ｐｅｒｃｈ−Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｉ）、デュフバ  Ｍ（Ｄｕｆｖａ  Ｍ）ら著、「迅速バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスにおけるＵＶ照射及びインテグレーションによる非修飾プラスチック上へのＤＮＡプローブの直接固定（Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｎ  ｎｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｌａｓｔｉｃｓ  ｂｙ  ＵＶ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｂｉｏａｓｓａｙ）」、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．）、２０１２年、第４０２巻、第２号、ｐ．７４１〜７４８．  ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２１６−０１１−５４５９−４に記載のプロセススキームに対応する。
【０１２３】
この技術は高い多用途性だけでなく、他の技術に匹敵する高い熱安定性も有することが示されている。本研究では、この方法を用いてＰＳ固形担体にさまざまな標識ポリテール及び標識核酸プローブを固定した。以下の実施例で使用したマーカは蛍光色素であった。蛍光色素として「クエーサ（Ｑｕａｓａｒ）５７０」及び「Ｃｙ３」を使用した。
【０１２４】
以下の表１に列挙されたものを含めていくつかの異なる標識ポリテール及び核酸プローブを実験に使用した。
【０１２５】
【表１】
2020536493.tif 000003
2020536493.tif 000004
核酸プローブ又は番号５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、及び２９のポリテールを含む核酸プローブは、本発明の実施例である。残りの核酸プローブ又はポリテールを含む核酸プローブは、比較例である。
【０１２６】
実施例１
この実施例では、核酸プローブ又は番号６、９、１０、１、２、３、４、５、７、８（図１に示される順に）のポリテールを含む核酸プローブ。
【０１２７】
０．０４％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国）を含む５×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国ウィスコンシン州）でポリテール／核酸プローブを希釈した。非接触サイフレックスアレイヤー（ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ）Ｓ１１スポッティング機（サイエニオン（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ）、独国）を用いて、クリーニングされたＰＳスライド上にポリテール／核酸プローブ溶液をスポットした。４スポット連続して各ポリテール／核酸プローブ溶液をスポットした。乾燥後、ウルトラバイオレット・クロスリンカー（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）（ＵＶＰ、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、デンマーク国）により１．８ジュール／ｃｍ２のエネルギーを用いて２５４ｎｍのＵＶ照射にスライドを暴露して基材の表面上にポリテール／核酸プローブを固定した。
【０１２８】
その後、ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得たミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水を用いて固形担体（ＰＳスライド）を５分間洗浄した。各種関係当局により定義されるように（たとえばＩＳＯ３６９６）、ミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）水は「タイプ１」の「超高純度」水であった。
【０１２９】
ＵＶ暴露後、以下のように固定効率（固定パーセント）を測定し決定した。
固定効率は、以下の式：
【０１３０】
【数１】
2020536493.tif 000005
で計算した。
【０１３１】
結果を図２に示す。ポリテール４０ＴＣ２０（上に列挙された番号５のポリテール）は、比較ポリテールよりもきわめて高い固定効率を有することが分かる。
実施例２
この実施例は、図３に示されるプロセス図に従って行った。
【０１３２】
種々の長さ及び構成のＴＣポリテール／種々のポリテールを有する核酸プローブを使用した。使用した標識ポリテール／核酸プローブは、次の通り番号１２、５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２２、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であった（図４に示される順に左から右に挙げる）。
【０１３３】
実施例１に記載のものと同一の手順を用いてポリテール／核酸プローブを固定した。その後、固形担体を洗浄した。
スポットしＵＶ架橋した後、異なるポリテール／プローブのシグナルを顕微鏡により得た。次いで、０．１×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液で５分間及びミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）水でさらに５分間にわたりスライドを洗浄し、装着されていないプローブ及び蛍光シグナルを除去した。
【０１３４】
固形担体のイメージングを行い、以下の式：
【０１３５】
【数２】
2020536493.tif 000006
で固定効率を計算した。
【０１３６】
各ポリテール／核酸プローブについての洗浄後の固定効率は、図４に第１のカラムとして示される。
実施例３
固定され洗浄されたポリテール／核酸プローブは、その後、厳しいＳＰ−ＰＣＲサーモサイクラー処理条件に対応する処理条件に付した。
【０１３７】
固定されたポリテール／プローブは、９４℃で２分間、続いて９４℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で２０秒間の３０サイクル、次いで、９４℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で２０秒間のさらなる１５ＰＣＲサイクルのＰＣＲプログラムにより、さまざまな温度に付した。フラットベッドＰＣＲサーモサイクラー（プロフレックス（Ｐｒｏｆｌｅｘ）、サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ））でポリテールを試験し、蛍光シグナルを得た。
【０１３８】
ＰＣＲサーモサイクラー処理後の固定効率は、以下：
【０１３９】
【数３】
2020536493.tif 000007
のように計算した。
【０１４０】
各ポリテール／核酸プローブについてのＰＣＲサーモサイクラー処理後の固定効率は、図４に第２のカラムとして示される。
洗浄後及びとくにＰＣＲサーモサイクラー処理後の固定効率は両方とも、本発明の核酸プローブではきわめて高いことが分かる。特に、上述した好ましい核酸プローブは、並外れた高い固定効率を示す。
【０１４１】
実施例２及び３においてＰＳスライド固形担体で得られた画像を図５に示す。明らかなように、より多くの塩基タイプＴを有するポリテールを備えた核酸プローブは、並外れた高い固定効率を有する。
【０１４２】
実施例４
次のものを含む３つの異なる核酸プローブを合成した。ａ）本発明のある実施形態に係る第１の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４０ＴＴＴＴＣ８のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、ｂ）本発明のある実施形態に係る第２の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４２ＴＴＣＣＴＴ７のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、且つｃ）比較核酸プローブは、ヌクレオチド配列２０Ｔ１０Ｃ１０のポリテールとサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を検出するためのｈｉｌＡ遺伝子を有するキャプチャー部分とを有していた。核酸プローブを図６に示す。
【０１４３】
固形担体（ＰＳ基材）に１μＭ〜６０μＭの異なる濃度で核酸プローブをプロットした。
２５μＬのＳＰ−ＰＣＲ反応混合物を調製した。ＳＰ−ＰＣＲ混合物は、１×フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）（登録商標）ヒト検体ＰＣＲ緩衝液（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、４００ｎＭ  ｈｉｌＡフォワードプライマー及び１６００ｎＭ  ｈｉｌＡリバースプライマー、並びに０．０５Ｕ／μＬフュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ホットスタートＩＩ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））からなる。ジーン・フレーム（Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｍｅ）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて固形担体プライマーアレイを取り囲む２５μＬ反応チャンバーを形成した。ピペットによりジーン・フレームにＰＣＲマスターミックスをロードし、カバースリップでシールした。ＰＳスライドに核酸プローブをスポットした。フラットベッドＰＣＲサーモサイクラーでＳＰ−ＰＣＲを行った。厚さ１ｃｍのポリスチレン断熱フォームのピースを用いてＰＣＲサーモサイクラーの蓋からスライドを分離した。ＳＰ−ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、続いて９４℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で２０秒間の３０サイクル、次いで、９４℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で２０秒間のさらなる１５ＰＣＲサイクルであった。ＳＰ−ＰＣＲを増強するために後段の１５ＰＣＲサイクルでより高いアニーリング温度を使用した。ＳＰ−ＰＣＲ後、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国ウィスコンシン州）でチャンバーを５分間洗浄し、次いで、脱イオン水で濯ぎ、そして室温で乾燥させた。スライドのスキャニングの準備ができた。
【０１４４】
ＳＰ−ＰＣＲ後、顕微鏡（ツァイス・アキシオバート（ＺＥＩＳＳ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００、独国）を用いてスライドをスキャンした。イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェア（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いてマイクロアレイ画像を分析した。円を描いてスポットのサイズに調整し、平均光強度値をシグナルとして決定した。近くにもう１つの円を描いて、バックグラウンドとして使用した。この研究ではアレイ上の４つのスポットのシグナルとしてシグナルを定義し、平均バックグラウンドを減算した。
【０１４５】
図７は、ＰＳ−ＰＣＲ後に異なる核酸プローブ濃度で得られた固定効率を示す。本発明の核酸プローブは、比較核酸プローブよりもかなり高い固定効率を有することが容易に分かる。
【０１４６】
図８は、対照プローブ並びに２つの異なるキャプチャー部分、すなわち、サルモネラ菌を標的とするＦｌｉｃ遺伝子及びボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌を標的とするＢｒｔｚ遺伝子の画像である。対照プローブとしてポリテール４２ＴＴＣＣＴＴ７を使用した。
【０１４７】
図７に示されるように、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を標的とするポリテール４２ＴＴＣＣＴＴ７は、ＳＰ  ＰＣＲ後、ＳＰ  ＰＣＲ前とほぼ同一の丸形形状を示した。つまり、４２ＴＴＣＣＴＴ７ポリテールは、全プローブを非常に高い結合効率で表面に固定させるのに役立つ。
【０１４８】
図９ａに示されるＳＰ−ＰＣＲを実施するための第１のプロセススキームは、標準的プロセススキームである。
図９ｂに示されるＳＰ−ＰＣＲを実施するための第２のプロセススキームは、新規なＳＰ−ＰＣＲプロセスであり、これは本発明のおかげで利用可能になった。核酸プローブ及び本発明の方法により提供される高い固定効率のおかげで、今や、ＵＶ架橋（固定）後の洗浄なしで及び／又はＰＳ−ＰＣＲ手順後の洗浄なしでＳＰ−ＰＣＲを実施しうる。
【０１４９】
図１０ａは、スポットされた核酸プローブが洗浄あり及び洗浄なしでＳＰ−ＰＣＲに付された固形担体の画像である。
実施例５
実施例５では、本発明の実施形態を提示する実施例５の２つの核酸プローブを使用した。すなわち、核酸プローブａ）として、本発明のある実施形態に係る第１の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４０ＴＴＴＴＣ８のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、核酸プローブｂ）として、本発明のある実施形態に係る第２の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４２ＴＴＣＣＴＴ７のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有していた。
【０１５０】
スポッティング及びＳＰ−ＰＣＲ手順は、６０μＭの核酸プローブ濃度を用いて実施例４の手順に従って実施した。
洗浄前及び洗浄後の結果を図１０ａに示す。図１０ｂは、洗浄あり及び洗浄なしでシグナル−バックグラウンドの平均を示しており、非洗浄サンプルでは偽陽性の量が比較的少ないことが分かる。
【０１５１】
実施例６
固定のためにいくつかの異なる標識ポリテール／核酸プローブを異なるＵＶ暴露時間及び異なるＵＶ照射量に付した。使用したポリテール／核酸プローブは図１に示した。
【０１５２】
実施例１に記載したように固形担体にポリテール／核酸プローブをプロットしたが、異なるＵＶ暴露を用いた。
各ポリテール／核酸プローブの４つのスポットを３分間にわたり８Ｗ  ＵＶエミッターからのＵＶ暴露に付した。各ポリテール／核酸プローブの４つのスポットを８分間にわたり１６Ｗ  ＵＶエミッターからのＵＶ暴露に付した。
【０１５３】
結果は図１１に示され、各ポリテール／核酸プローブに対する左側のプロットは、３分間処理の８Ｗ  ＵＶエミッターであり、且つ各ポリテール／核酸プローブに対する右側左側のプロットは、８分間処理の１６Ｗ  ＵＶエミッターである。３分間処理の８Ｗ  ＵＶエミッターは、８分間処理の１６Ｗ  ＵＶエミッターよりも良好であると思われる。
【０１５４】
実施例７
この試験では配列４０Ｔ／Ｃ（４０ＴＣ２０とも呼ばれる）を有する標識ポリテールを使用した。実施例１に記載したように固形担体にポリテールのサンプルをプロットしたが、異なるＵＶ暴露を用いた。
【０１５５】
いくつかのサンプルでは、８Ｗ  ＵＶエミッターを使用し、他のサンプルでは、１６Ｗ  ＵＶエミッターを使用した。図１２に示されるように暴露時間を変化させた。ここでは、２つのエミッターの各々で暴露時間の関数として洗浄後の固定効率をプロットした。
【０１５６】
ワット数の高いエミッターよりもワット数の低い方（８ワット  ＵＶエミッター）が良好であることが分かる。さらに、８Ｗエミッターは、約３分間で固定が最適となる。つまり、核酸プローブは、かなり低いＵＶ照射量で固定可能である。それによりキャプチャー部分の損傷リスクを低減さらには回避しうるので、このことはきわめて有利である。
【０１５７】
本発明のある実施形態では、ヌクレオチド配列４０ＴＴＴＴＣ８のポリテールを有し、ｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分が使用された。
３つの異なる核酸プローブを合成した。また、ｃ）比較核酸プローブは、ヌクレオチド配列２０Ｔ１０Ｃ１０のポリテールとサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を検出するためのｈｉｌＡ遺伝子を有するキャプチャー部分とを有する。核酸プローブを図６に示す。
【０１５８】
図１３ａ〜１３ｅには、８Ｗ  ＵＶエミッターを用いて異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られた固定されたポリテールの画像が示される。
図１４ａ〜１４ｃには、１６Ｗ  ＵＶエミッターを用いて異なるＵＶ暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られた固定されたポリテールの画像が示される。
【０１５９】
実施例８
異なる長さのポリテールを有する核酸プローブを試験した。核酸プローブは、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌を標的とするＢｒｔｚ遺伝子を含んでいた。
【０１６０】
実施例１に記載のプロセスに従って、核酸プローブをスポットし、固定し、そして洗浄した。図１５ａは、各種核酸プローブのシグナル−バックグラウンドを示す。非常に短いポリテールを有する核酸プローブは固定が困難であり、１８ヌクレオチド以上のポリテールを有する本発明の実施形態の核酸プローブは効果的な固定を示すことが分かる。図１５ｂは、固定された核酸プローブの画像である。
【０１６１】
実施例１０
ポリテール４２ＴＴＣＣＴＴ７とボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）細菌を標的とするキャプチャー部分とを有する本発明のある実施形態の核酸プローブのサンプルを試験した。
【０１６２】
実施例１に記載のプロセスに従って、核酸プローブサンプルをスポットし、固定し、そして洗浄したが、異なるＵＶ暴露時間を用いた。固定後、サンプルを実施例２に記載のＰＳ−ＰＣＲ処理に付した。
【０１６３】
ＰＳ−ＰＣＲ処理後、各サンプルのシグナル−バックグラウンドシグナルを決定した。図１６ａは結果を示しており、本発明の実施形態であれば、非常に低いＵＶ照射量を用いて核酸プローブの効果的固定を達成しうることが分かる。
【０１６４】
図１６ｂは、固定された核酸プローブの画像である。
ＳＡＦ構造体１は、国際公開第１７１３３７４１号に開示されたＳＡＦ構造体に対応しており、さらなる詳細は、この文献に見いだしうる。ＳＡＦ構造体は、マイクロ流体カートリッジのチャネルの反応セクションのボトム２に取り付けられる。フルオロフォアで標識された本発明のある実施形態の核酸プローブ３は、ＳＡＦ構造体１のトップ表面に取り付けられる。
【０１６５】
ＳＡＦ構造体１は、トップ表面を有する円錐状切頭体形状を有する。ＳＡＦ構造体１は、突出高さ、トップ表面直径、及びボトム直径を有する。励起されたフルオロフォアは、サンプル、空気、又は反応セクション内の液体よりも高い屈折率を有するＳＡＦ構造体内に超臨界角（θｃ）を超える角度で異方的に光を発する。発光光はコリメートされ、光の円としてリーダーにより読取り可能である。
【０１６６】
図１８は、カートリッジのエッジ１２を有する反応チャネルのセクションの斜視図であり、反応セクションは、ＳＰ−ＣＰＲに付された固定された核酸プローブを有するＳＡＰ構造体１１を含む。
【０１６７】
図１９は、切頭体角αを示すために点線で示されたトップ部と共に例示されたＳＡＦ構造体を示す。ＳＡＦ構造体２１は、固形担体の残りの部分に取り付けられるか又はインテグレートされるボトム外周２４を有する。そのボトム外周では、ＳＡＦ構造体はボトム直径ｄｂを有する。ＳＡＦ構造体は、直径Ｄを有するトップ表面２３を有する。ボトムからトップ表面まで、ＳＡＦ構造体は高さｈを有する。例示されたトップ部は、切頭体角を例示するために示された仮想トップである。
【０１６８】
図１９ａ〜１９ｄは、トップ表面３３を含む標準的ＳＡＦ構造体３１を例示する。ＳＡＦ構造体は、固形担体３２の残りの部分にインテグレートされる。固形担体の残りの部分のいくつかのみが示される。以上に説明したように、固形担体は、チャネルを有するカートリッジを形成しうるか又はその一部でありうる。
【０１６９】
図１９ａはＳＡＦ構造体３１の斜視図である。
図１９ｂはＳＡＦ構造体３１の上面図である。
図１９ｃはＳＡＦ構造体３１の側面図である。
【０１７０】
図１９ｄは、図１９ｃのセクションＡ−Ａに見られるＳＡＦ構造体３１の断面図である。
ＳＡＦ構造体は、高さｈ及びトップ直径Ｄを有する。Ｄ及びｈは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。ＳＡＦ構造体３１は、６０度の切頭体角で例示される。ＳＡＦ構造体は、本明細書の他の箇所に開示される他の切頭体角を有しうることを理解すべきである。
【０１７１】
トップ表面はフラットであることが分かる。
ある実施形態では、ＳＡＦ構造体３１は、次の寸法：Ｄ＝０．２ｍｍ、ｈ＝０．２５ｍｍを有するとともに、ＳＡＦ切頭体角αは６０度である。
【０１７２】
図２０ａ〜２０ｄは、凹部４４を有するトップ表面４３を含む好ましいＳＡＦ構造体４１を例示する。ＳＡＦ構造体は、固形担体４２の残りの部分にインテグレートされる。
図２０ａはＳＡＦ構造体４１の斜視図である。
【０１７３】
図２０ｂはＳＡＦ構造体４１の上面図である。
図２０ｃはＳＡＦ構造体４１の側面図である。
図２０ｄは、図２０ｃのセクションＡ−Ａに見られるＳＡＦ構造体４１の断面図である。
【０１７４】
図２０ｅは、図２０ａの一部を示しており、凹部エッジ幅Ｗが表されている。凹部エッジ幅Ｗは、有利には少なくとも約０．００８、たとえば少なくとも約０．０１、たとえば少なくとも約０．０１５である。
【０１７５】
ＳＡＦ構造体は、高さｈ及びトップ直径Ｄを有する。Ｄ及びｈは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。ＳＡＦ構造体の高さｈは、凹部４４を含まないトップ表面４３から決定される。
【０１７６】
凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる高さｈ１を有する。
凹部は実質的に丸形であり、その中心軸はＳＡＦの中心軸に一致するように位置決めされる。凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる高さｈ１を有する。
【０１７７】
見て分かるように、凹部フロアは実質的にフラットである。凹部直径ｄは凹部のフロアで決定され、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる。
凹部は、フロアにより形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有する。
【０１７８】
示された実施形態では、切頭体角θ及び切頭体角αは両方とも６０度である。凹部切頭体角θ及びＳＡＦ切頭体角αは、本明細書の他の箇所に開示される他の値を有しうることを理解すべきである。
【０１７９】
凹部は、スポッティングロバスト性を増加させるとともに、読取りシグナル強度を増加させる。
ある実施形態では、ＳＡＦ構造体４１は、次の寸法：Ｄ＝０．２ｍｍ、ｈ＝０．２５ｍｍ、ｄ＝０．０５ｍｍ、ｈ１＝０．０１ｍｍを有し、ＳＡＦ切頭体角αは６０度であり、且つ凹部切頭体角θは６０度である。
【０１８０】
他の一実施形態では、ＳＡＦ構造体４１は、次の寸法：Ｄ＝０．２ｍｍ、ｈ＝０．３ｍｍ、ｄ＝０．０５ｍｍ、ｈ１＝０．０１ｍｍを有し、ＳＡＦ切頭体角αは６０度であり、且つ凹部切頭体角θは６０度である。
【０１８１】
図２１ａ〜２１ｄは、凹部５４を有するトップ表面５３を含む他の好ましいＳＡＦ構造体５１を例示する。ＳＡＦ構造体は、固形担体５２の残りの部分にインテグレートされる。
【０１８２】
図２１ａはＳＡＦ構造体５１の斜視図である。
図２１ｂはＳＡＦ構造体５１の上面図である。
図２１ｃはＳＡＦ構造体５１の側面図である。
【０１８３】
図２１ｄは、図２１ｃのセクションＡ−Ａに見られるＳＡＦ構造体５１の断面図である。
Ｄ及びｈは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。Ｄ及びｈは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。ＳＡＦ構造体の高さｈは、凹部５４を含まないトップ表面５３から決定される。
【０１８４】
凹部５４は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる高さｈ１を有する。
凹部は実質的に丸形であり、その中心軸はＳＡＦの中心軸に一致するように位置決めされる。凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる高さｈ１を有する。
【０１８５】
見て分かるように、凹部フロアは実質的にフラットである。凹部直径ｄは凹部のフロアで決定され、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる。
凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる丸形半径Ｒを有する丸形凹部エッジを有する。
【０１８６】
ある実施形態では、ＳＡＦ構造体５１は、次の寸法：Ｄ＝０．２ｍｍ、ｈ＝０．２５ｍｍ、ｄ＝０．０８ｍｍ、ｈ１＝０．０１ｍｍを有し、凹部エッジは半径Ｒ＝０．０５ｍｍを有する丸形であり、且つＳＡＦ切頭体角αは６０度である。
【０１８７】
他の一実施形態では、ＳＡＦ構造体５１は、次の寸法：Ｄ＝０．２ｍｍ、ｈ＝０．３ｍｍ、ｄ＝０．０８ｍｍ、ｈ１＝０．０１ｍｍを有し、凹部エッジは半径Ｒ＝０．０５ｍｍを有する丸形であり、且つＳＡＦ切頭体角αは６０度である。
【０１８８】
実施例１１
ポリスチレンから７つのカートリッジを作製した。各カートリッジは、反応セクションと、反応セクションの壁から突出する８つの同一のＳＡＦ構造体と、を有するマイクロ流体チャネルを有していた。
【０１８９】
第１のカートリッジのＳＡＦ構造体は、図２２のＳＡＦ構造体ｎｏ．１として造形され、第２のカートリッジの構造体は、図２２のＳＡＦ構造体ｎｏ．２として造形され、以下同様であった。
【０１９０】
ＳＡＦ構造体ｎｏ．３は、図１９ａ〜１９ｄに示されるタイプであった。
ＳＡＦ構造体ｎｏ．５は、図２１ａ〜２１ｄに示されるタイプであり、ＳＡＦ構造体ｎｏ．６は、図２０ａ〜２０ｅに示されるタイプであった。
【０１９１】
それぞれのＳＡＦ構造体の各々のトップ表面上に等量のＣｙ３標識（ｌａｂｅｌｌｅｄ）オリゴをスポットし乾燥させた。
第１の試験ラウンドでは、反応チャンバーは、空気が充填された状態を維持した。Ｃｙ３標識を励起波長（約５５０ｎｍ）の光に暴露し、ＳＡＦ構造体発光シグナルのシグナル強度を検出した。
【０１９２】
各カートリッジで、ＳＡＦ構造体の平均空気／ＰＳ界面強度シグナルを決定した。
第２の試験ラウンドでは、それぞれのカートリッジの反応チャンバーに水を充填した。Ｃｙ３標識を励起波長（約５５０ｎｍ）の光に暴露し、ＳＡＦ構造体発光シグナルのシグナル強度を検出した。
【０１９３】
各カートリッジで、ＳＡＦ構造体の平均水／ＰＳ界面強度シグナルを決定した。
結果を図２３に示す。
それぞれのカートリッジのＳＡＦ構造体で変動率（ＣｏＶ）を決定した。
【０１９４】
ＳＡＦ構造体ｎｏ．１及び２は、空気／ＰＳ界面シグナルが比較的高い光強度であったことが分かる。しかしながら、空気／ＰＳ界面シグナル強度及び水／ＰＳ界面シグナルの両方で、ＣｏＶが比較的高かった。
【０１９５】
ＳＡＦ構造体ｎｏ．６は、水／ＰＳ界面シグナルで最も高い光強度を有しＣｏＶを有していた。しかしながら、空気／ＰＳ界面シグナル強度及び水／ＰＳ界面シグナルの両方で、ＣｏＶが比較的高かった。
【０１９６】
しかしながら、サンプル６のＣｏＶは比較的高かった。この比較的高いＣｏＶの理由は、ＳＡＦ構造体の一部が残りの固形担体にインテグレートされるボトム外周で、シグナル損失をもたらしうる小さな表面コルゲーション及び／又は突起を有することにあると考えられる。そのため、トップ直径対高さのアスペクト比Ｄ／ｈを減少させることにより、こうした光シグナルの損失可能性を軽減させうると予想される。高さをたとえば約０．３ｍｍ増加させることにより、シグナルを増加させうるとともにＣｏＶを減少させうると考えられる。
【０１９７】
ＳＡＦ構造体ｎｏ．５は、水／ＰＳ界面シグナルで最も高い光強度及び低いＣｏＶの両方を有していた。
凹部の丸形エッジにより非常に効率的且つロバストなスポッティングが確保され、低いＣｏＶが付与されると考えられる。
【０１９８】
ＳＡＦ構造体ｎｏ．６は、水／ＰＳ界面シグナルで最も高い光強度を有しＣｏＶを有していた。しかしながら、空気／ＰＳ界面シグナル強度及び水／ＰＳ界面シグナルの両方で、ＣｏＶが比較的高かった。
【図１】
2020536493.tif 000008
【図２】
2020536493.tif 000009
【図３】
2020536493.tif 000010
【図４】
2020536493.tif 000011
【図５】
2020536493.tif 000012
【図６】
2020536493.tif 000013
【図７】
2020536493.tif 000014
【図８】
2020536493.tif 000015
【図９ａ】
2020536493.tif 000016
【図９ｂ】
2020536493.tif 000017
【図１０ａ】
2020536493.tif 000018
【図１０ｂ】
2020536493.tif 000019
【図１１】
2020536493.tif 000020
【図１２】
2020536493.tif 000021
【図１３ａ】
2020536493.tif 000022
【図１３ｂ】
2020536493.tif 000023
【図１３ｃ】
2020536493.tif 000024
【図１３ｄ】
2020536493.tif 000025
【図１３ｅ】
2020536493.tif 000026
【図１４ａ】
2020536493.tif 000027
【図１４ｂ】
2020536493.tif 000028
【図１４ｃ】
2020536493.tif 000029
【図１５ａ】
2020536493.tif 000030
【図１５ｂ】
2020536493.tif 000031
【図１６ａ】
2020536493.tif 000032
【図１６ｂ】
2020536493.tif 000033
【図１７】
2020536493.tif 000034
【図１８】
2020536493.tif 000035
【図１９】
2020536493.tif 000036
【図１９ａ】
2020536493.tif 000037
【図１９ｂ】
2020536493.tif 000038
【図１９ｃ】
2020536493.tif 000039
【図１９ｄ】
2020536493.tif 000040
【図２０ａ】
2020536493.tif 000041
【図２０ｂ】
2020536493.tif 000042
【図２０ｃ】
2020536493.tif 000043
【図２０ｄ】
2020536493.tif 000044
【図２０ｅ】
2020536493.tif 000045
【図２１ａ】
2020536493.tif 000046
【図２１ｂ】
2020536493.tif 000047
【図２１ｃ】
2020536493.tif 000048
【図２１ｄ】
2020536493.tif 000049
【図２２】
2020536493.tif 000050
【図２３】
2020536493.tif 000051
【図２４】
2020536493.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月10日(2020.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
以上に説明したように、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、ＰＳ固形担体などの固形担体への固定効率の増加をもたらす。この理由はＵＶ光がＣ＝Ｃ二重結合に局在する反応により共有結合の形成を誘発することにあるという仮説が立てられる。以下の実施例に示されるように、４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）ポリテールは、２０Ｔ１０Ｃ１０（配列番号１）ポリテールと比較して固定効率を少なくとも１８倍に増加させた。ポリテールの命名は以下の通りである。第１の数は、末端アンカー鎖部分（ポリテール）の全長を示し、文字は、ヌクレオチドタイプを示し、上付きの数は、上述したヌクレオチド配列の繰返し回数を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
【表１】
2020536493.tif 000053
2020536493.tif 000054
核酸プローブ又は番号５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、及び２９のポリテールを含む核酸プローブは、本発明の実施例である。残りの核酸プローブ又はポリテールを含む核酸プローブは、比較例である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
実施例４
次のものを含む３つの異なる核酸プローブを合成した。ａ）本発明のある実施形態に係る第１の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４０ＴＴＴＴＣ８（配列番号１８）のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、ｂ）本発明のある実施形態に係る第２の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、且つｃ）比較核酸プローブは、ヌクレオチド配列２０Ｔ１０Ｃ１０（配列番号１）のポリテールとサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を検出するためのｈｉｌＡ遺伝子を有するキャプチャー部分とを有していた。核酸プローブを図６に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
図８は、対照プローブ並びに２つの異なるキャプチャー部分、すなわち、サルモネラ菌を標的とするＦｌｉｃ遺伝子及びボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌を標的とするＢｒｔｚ遺伝子の画像である。対照プローブとしてポリテール４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）を使用した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
図７に示されるように、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を標的とするポリテール４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）は、ＳＰ  ＰＣＲ後、ＳＰ  ＰＣＲ前とほぼ同一の丸形形状を示した。つまり、４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）ポリテールは、全プローブを非常に高い結合効率で表面に固定させるのに役立つ。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
図１０ａは、スポットされた核酸プローブが洗浄あり及び洗浄なしでＳＰ−ＰＣＲに付された固形担体の画像である。
実施例５
実施例５では、本発明の実施形態を提示する実施例５の２つの核酸プローブを使用した。すなわち、核酸プローブａ）として、本発明のある実施形態に係る第１の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４０ＴＴＴＴＣ８（配列番号１８）のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、核酸プローブｂ）として、本発明のある実施形態に係る第２の核酸プローブは、ヌクレオチド配列４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）のポリテールとｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有していた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
実施例７
この試験では配列４０Ｔ／Ｃ（４０ＴＣ２０とも呼ばれる）（配列番号５）を有する標識ポリテールを使用した。実施例１に記載したように固形担体にポリテールのサンプルをプロットしたが、異なるＵＶ暴露を用いた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
本発明のある実施形態では、核酸はヌクレオチド配列４０ＴＴＴＴＣ８（配列番号１８）のポリテールを有し、ｈｉｌＡ遺伝子を標的とするキャプチャー部分が使用された。
３つの異なる核酸プローブを合成した。また、ｃ）比較核酸プローブは、ヌクレオチド配列２０Ｔ１０Ｃ１０（配列番号１）のポリテールとサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を検出するためのｈｉｌＡ遺伝子を有するキャプチャー部分とを有する。核酸プローブを図６に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
実施例１０
ポリテール４２ＴＴＣＣＴＴ７（配列番号２２）とボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）細菌を標的とするキャプチャー部分とを有する本発明のある実施形態の核酸プローブのサンプルを試験した。
【国際調査報告】
2020536493.tif 000055
2020536493.tif 000056
2020536493.tif 000057
2020536493.tif 000058
2020536493.tif 000059
2020536493.tif 000060
2020536493.tif 000061
2020536493.tif 000062
2020536493.tif 000063
2020536493.tif 000064
2020536493.tif 000065