(57)【要約】本開示は、赤血球を全血から溶解するための方法およびキットを提供する。この方法は、等張性で中性ｐＨ条件下、全血サンプル中のＲＢＣの急速溶解を可能にし、第１の混合物を形成するために、赤血球および白血球を含むサンプルと定着剤を含む第１の緩衝剤を接触させるステップであって、第１の緩衝剤の溶質濃度は、サンプルの溶質濃度を上回るステップと、第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を、サンプルおよび第１の緩衝剤によって形成される第１の混合物に添加するステップを含み得る。
2020519873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を溶解する方法であって、
赤血球および白血球を含むサンプルと定着剤を含む第１の緩衝剤を接触させるステップであって、前記第１の緩衝剤の溶質濃度は、前記サンプルの溶質濃度を上回り、前記サンプルおよび前記第１の緩衝剤は、第１の混合物を形成する、ステップと、
第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を前記第１の混合物に添加するステップであって、前記第２の混合物中の溶質濃度は、前記サンプルの溶質濃度の少なくとも９０％であって、それによって、前記サンプル中の赤血球は、溶解される、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルは、全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の緩衝剤を添加するステップの前に、カルシウムキレート剤を添加するステップをさらに含み、前記カルシウムキレート剤は、カルシウムをキレート化することによって、前記赤血球中のカルシウム依存輸送を遮断する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の緩衝剤はさらに、カルシウムキレート剤を含み、前記カルシウムキレート剤は、前記赤血球中のカルシウム依存輸送を遮断する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させるステップはさらに、０．５分〜２０分の期間にわわたって、前記第１の混合物をインキュベートすることを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記方法のステップはさらに、０．５分〜２０分の第２の期間にわたって、前記第２の混合物をインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の緩衝剤は、０×〜１×のＰＢＳを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第１の混合物は、約０．５〜３％ホルムアルデヒドと、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡと、１．２〜１．８×のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第１の緩衝剤は、約０．５％〜１０％ホルムアルデヒドと、０．０１ｍＭ〜２０ｍＭのＥＤＴＡと、６．５〜８．５のｐＨにおける１５０ｍＭ〜６００ｍＭの塩とを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の緩衝剤は、１×〜３×のＰＢＳを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触させるステップは、０．２：１〜１：１に及ぶ体積比において、前記第１の緩衝剤と前記サンプルを混合することを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
全血サンプルを処理する方法であって、
全血のサンプルと、定着剤と、高張性食塩水と、カルシウムキレート剤とを含む、第１の混合物を形成するステップであって、前記高張性食塩水の溶質濃度は、前記全血の溶質濃度を上回る、ステップと、
等張性の第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を前記第１の混合物に添加するステップと、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記第１の混合物は、０．５〜３％ホルムアルデヒドと、３〜７ｍＭのＥＤＴＡとを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の混合物は、０．０１〜２％ホルムアルデヒドを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の緩衝剤は、０×〜１×のＰＢＳである、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１または前記第２の混合物の細胞を染色するステップと、溶解後の染色された細胞を血球計数器の中に導入するステップとをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
赤血球溶解キットであって、
高張性食塩水と、０．５％〜１０％ホルムアルデヒドと、０．０１ｍＭ〜２０ｍＭのＥＤＴＡとを含む、第１の試薬であって、前記第１の試薬の溶質濃度は、全血サンプルの溶質濃度を上回る、第１の試薬と、
０×〜１×のＰＢＳを含む、第２の試薬と、
を含む、赤血球溶解キット。
【請求項１８】
前記高張性食塩水は、１５０ｍＭ〜６００ｍＭの塩濃度を有し、６．５〜８．５のｐＨである、請求項１７に記載の赤血球溶解キット。
【請求項１９】
前記第２の試薬は、０×〜１×のＰＢＳを含む、請求項１７または１８に記載の赤血球溶解キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する特許出願
本出願は、２０１７年５月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５０３，２０２号の利益を主張している。この仮特許出願の全体の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、赤血球を溶解するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
赤血球（ＲＢＣ）は、内因性全血サンプル中に白血球（ＷＢＣ）に対して１，０００：１の比率で存在し、これは、ＷＢＣ集団を全血中で稀な事象にする。フローサイトメトリーによって、全血サンプル中のＷＢＣを適切に分析するために、ＲＢＣは、ＷＢＣ集団を濃縮し、入手物から有意義なデータを提供するため、最初に、排除される必要がある。
【０００４】
現在のＲＢＣ溶解方法は、低張性、塩、ｐＨ変化、洗剤、さらに、ＲＢＣ酵素活性の修正をも伴い、内部ｐＨおよび体積変化を誘発し、深刻な短所を有する。低張性に基づく溶解方法は、多くの場合、矛盾する結果をもたらし、一部のＷＢＣ集団（主に、顆粒球）の破裂を生じさせ得る。その結果、本方法は、多くの場合、細胞活性化状態における改変を誘発し、ＷＢＣ集団の光散乱プロファイルにおける改変を生じさせる。ＮＨ４Ｃｌベースの溶解等の塩ベースの溶解は、低速であって、血清成分によって著しく影響され得る。これらの方法は、多くの場合、完全な溶解を達成するために、非常に大きな体積および長期のインキュベーション時間を要求し、これは、細胞死の増加を生じさせ得る。加えて、塩ベースの溶解は、多くの場合、急速なｐＨ変化を伴い、これは、細胞エピトープおよびＷＢＣを損傷させ得る。洗剤ベースの溶解は、多くの場合、経年劣化サンプルでは、非効果的である。洗剤は、高価であって、また、広範囲のロット間変動を有する。実際、非常にわずかな洗剤のみが、ＷＢＣ（例えば、一部のサポニン）もまた溶解せずに、ＲＢＣを溶解することができる。赤血球の代謝に依拠する、溶解方法は、ドナー間変動を有し、また、経年劣化試料では、非効果的であり得る。
【０００５】
加えて、これらの現在の方法の多くは、多くの場合、種々の特殊緩衝剤を要求し、したがって、血液ベースのサンプルのために、ワークフロー自動化において使用されることが困難である。使用される緩衝剤の溶液粘度の差異は、分注される体積または細胞計数を正確に測定するための器具の能力を損なわせ得る。これらの方法は、多くの場合、大量の緩衝剤を使用し、したがって、また、サンプル体積を低減させるために、溶解後、サンプルの遠心分離を要求し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な要旨
本発明は、等張性で中性ｐＨ条件下、全血サンプル中のＲＢＣの急速溶解を可能にする。本開示は、赤血球を溶解する方法であって、第１の混合物を形成するために、赤血球および白血球を含むサンプルと定着剤を含む第１の緩衝剤を接触させるステップであって、第１の緩衝剤の溶質濃度は、サンプルの溶質濃度を上回る、ステップと、第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を、サンプルおよび第１の緩衝剤によって形成される第１の混合物に添加するステップであって、第２の混合物中の溶質濃度は、サンプルの溶質濃度と実質的に同一であって、それによって、サンプル中の赤血球が溶解される、ステップとを含む、方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、サンプルは、全血サンプルである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、第２の緩衝剤を添加する前に、カルシウムキレート剤を添加するステップであって、カルシウムをキレート化することによって、赤血球中のカルシウム依存輸送を遮断するステップを含む。いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤はさらに、カルシウムキレート剤を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、接触させるステップはさらに、約０．５分〜約２０分の期間にわたって、第１の混合物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、約０．５分〜約２０分の第２の期間にわたって、第２の混合物をインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、第２の緩衝剤は、約０×（０Ｘ）〜約１×（１Ｘ）のＰＢＳ、例えば、約０．９×〜１×のＰＢＳを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第１の混合物は、約０．５〜３％、例えば、１．６％ホルムアルデヒドと、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、例えば、５ｍＭのＥＤＴＡと、１．２〜１．８×のＰＢＳ、例えば、１．５×のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とを含む。いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、約３．２％ホルムアルデヒドと、約１０ｍＭのＥＤＴＡと、約ｐＨ７．４における約３２３ｍＭの塩とを含む。いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、約２×のＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、１：１体積比において、第１の緩衝剤とサンプルを混合することを含む。
【００１１】
また、本開示に提供されるのは、全血サンプルを処理する方法であって、全血のサンプルと、定着剤と、高張性緩衝剤と、カルシウムキレート剤とから本質的に成る第１の混合物を形成するステップであって、高張性食塩水の溶質濃度は、全血の溶質濃度を上回る、ステップと、等張性の第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を第１の混合物に添加するステップとを含む、方法である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１の混合物は、約０．５％〜３％ホルムアルデヒドおよび／または約０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、約０．０１〜２％ホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、第２の緩衝剤は、約０．５〜１．５×のＰＢＳである。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、第２の混合物の細胞を染色するステップと、染色された細胞を血球計数器の中に導入するステップとを含む。
【００１３】
また、本開示に提供されるのは、赤血球溶解キットであって、高張性食塩水と、約３．２％ホルムアルデヒドと、約１０ｍＭのＥＤＴＡとから本質的に成る、第１の試薬であって、第１の試薬の溶質濃度は、全血サンプルの溶質濃度を上回る、第１の試薬と、約０．９×〜約１×のＰＢＳを含む、第２の試薬とを含む、キットである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、赤血球溶解緩衝剤中の高張性食塩水は、約３２３ｍＭの塩濃度を有し、ｐＨ７．４である。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、約０．９×のＰＢＳを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるような赤血球を溶解する方法は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるような赤血球を溶解する方法は、ヒトまたは動物身体上で実践されない。いくつかの実施形態では、赤血球を含有するサンプルは、赤血球を含有する、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）サンプルである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１は、３ドナーパネルのフローサイトメトリー分析の結果を示し、本明細書に開示される赤血球分解キット（「ＲＤＫ」）を使用したＲＢＣ溶解の結果対市販の緩衝剤システム（「慣例緩衝剤」）を使用したＲＢＣ溶解の結果を比較する。
【図１−２】図１は、３ドナーパネルのフローサイトメトリー分析の結果を示し、本明細書に開示される赤血球分解キット（「ＲＤＫ」）を使用したＲＢＣ溶解の結果対市販の緩衝剤システム（「慣例緩衝剤」）を使用したＲＢＣ溶解の結果を比較する。
【００１７】
【図２】図２は、ＲＤＫまたは慣例緩衝剤で溶解されたＫ３−ＥＤＴＡ血液のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【００１８】
【図３】図３は、ＲＤＫまたは慣例緩衝剤で溶解されたヘパリン血液のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【００１９】
【図４】図４は、ＲＤＫまたは慣例緩衝剤で溶解されたＡＣＤ血液のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【００２０】
【図５−１】図５は、乾燥Ｂ細胞抗体パネル管内のＲＤＫを使用した赤血球の溶解の性能を示す。
【図５−２】図５は、乾燥Ｂ細胞抗体パネル管内のＲＤＫを使用した赤血球の溶解の性能を示す。
【００２１】
【図６−１】図６は、湿潤Ｂ細胞パネルを用いて、慣例緩衝剤を使用した赤血球の溶解の性能を示す。
【図６−２】図６は、湿潤Ｂ細胞パネルを用いて、慣例緩衝剤を使用した赤血球の溶解の性能を示す。
【００２２】
【図７】図７は、１×のＰＢＳの低減された体積を使用したＲＢＣの溶解の結果を示す。
【００２３】
【図８Ａ】図８Ａ−Ｂは、最終１×濃度まで調節されたＰＢＳの低減された体積を使用したＲＢＣの溶解の結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ−Ｂは、最終１×濃度まで調節されたＰＢＳの低減された体積を使用したＲＢＣの溶解の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
続く説明では、いくつかの用語が、広範に使用され、以下の定義は、本発明の種々の側面の理解を促進するために提供される。用語の例を含む、明細書中の例の使用は、例証的目的のみのためのものであって、本明細書の本発明の実施形態の範囲および意味を限定することを意図するものではない。数値範囲は、明細書中の範囲を画定する数を包含し、単語「〜を含む」は、非限定的用語として使用され、語句「限定ではないが、〜を含む」の実質的に均等物であって、単語「〜を備える」は、対応する意味を有する。
【００２５】
用語「約」は、値と併用されるとき、例えば、約３００ｍＭは、その値に合理的に近似する値、すなわち、値の±５％の範囲を意味する。特に、その値自体を含むであろう。
【００２６】
用語「実質的に同一」は、第１の値が、第２の値とほぼ同じであって、２つの値間の差異は、意図される目的のために有意ではなく、例えば、２つの値間の差異は、２つのより大きい方の値の１０％未満、９％未満、８％未満、５％未満、４％未満、または２％未満であるという事実を指す。換言すると、液体Ｂの溶質濃度と実質的に同一である、液体Ａ（混合物または緩衝剤）の溶質濃度は、液体Ａの溶質濃度が、液体Ｂの溶質濃度の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％少なくとも９６％、少なくとも９８％、例えば、１００％であることを指す。
【００２７】
本開示では、有用、好適、または同等物であるように列挙または説明される濃度範囲は、端点を含む、その範囲内の任意および全ての濃度が、述べられたと見なされるべきであることが意図される。例えば、範囲「１００ｍＭ〜３００ｍＭ」は、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの連続体に沿ったそれぞれおよびあらゆる可能性として考えられる数を示すものとして読まれるべきである。
【００２８】
用語「ＡＣＤ血液」、「ヘパリン血液」、および「Ｋ３−ＥＤＴＡ血液」は、それぞれ、抗凝血性クエン酸デキストロース、ヘパリン、およびＫ３−ＥＤＴＡで処理された血液サンプルを指す。
【００２９】
そうではないことが別様に明示的に述べられない限り、本開示内の全てのパーセンテージは、重量パーセンテージを指す。
１．緒言
【００３０】
本開示は、全血サンプル中の白血球に有害な影響を及ぼさずに、等張性の中性ｐＨ条件下、赤血球を効率的に溶解するための方法および組成物を提供する。本方法は、高張性緩衝剤を添加し、細胞を収縮させ、次いで、低濃度の定着剤を使用して、細胞を軽く固定し、ＲＢＣの表面上の輸送体が開放しないように防止し、浸透圧の変化を補償する。低張性緩衝剤は、サンプルを希釈し、サンプルを等張性状態に復元するために使用される。等張性状態に戻ることに応じて、ＷＢＣは、膨潤して元に戻る一方、ＲＢＣおよび血小板は、補償することが不可能であって、したがって、破裂する。これは、より良好に浸透圧変化を補償することが可能なＷＢＣと異なり、ＲＢＣおよび休止血小板の浸透圧変化を補償するための一次チャネルである、ガルドスチャネルが、恒常的に低レベルの内部カルシウムを有することに起因して閉鎖されるという事実に起因する。固定に際し、ＲＢＣおよび血小板膜上のアクアポリンは、架橋結合され、ガルドスチャネルは、活性化のために必要とされるカルシウムの量が存在するときでも、再開放することが不可能となる。その結果、等張性状態への復元に応じて、赤血球は、その正常サイズに膨張して元に戻ることができず、破裂する。加えて、高張性期間の間、外側のより高い塩濃度もまた、ＲＢＣ中でより速い速度で内部濃度と平衡し始め、溶解をさらに可能にする。
【００３１】
故に、本明細書に開示される方法は、溶質濃度が全血の溶質濃度を上回る条件下において、赤血球に定着剤を負荷するステップと、溶質濃度が全血の溶質濃度と実質的に同一である条件下において、負荷された赤血球を溶解するステップとを含む。本方法は、比較的短時間内に、効率的ＲＢＣ溶解を提供する。
２．方法
溶液張性を上昇させ、細胞を固定する
【００３２】
本開示の方法は、赤血球および白血球を含むサンプルと定着剤を含む第１の緩衝剤を接触させるステップを含む。第１の緩衝剤は、サンプルの溶質濃度を上回る、溶質濃度を有する。本ステップは、サンプルの張性を上昇させ、細胞を軽く固定するためのものである。本第１の緩衝剤は、本明細書では、「ＲＢＣ溶解緩衝剤」または「ＲＢＣ分解緩衝剤」と称される。本開示全体を通して使用される用語「溶質」は、水分中に分解される任意の物質、例えば、塩を指す。生物学的材料を調製するために好適な任意の塩が、本発明において使用されることができる。ＲＢＣ溶解緩衝剤は、１つまたはそれを上回る塩を含む、塩溶液を含み、総塩の濃度は、全血の溶質濃度を上回る限り、変動し得る。典型的には、血液の溶質濃度は、１×のＰＢＳまたは０．８〜０．９％のＮａＣｌの均等物である。いくつかの実施形態では、塩濃度は、１５０ｍＭ〜６００ｍＭ、例えば、２６０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または２８０ｍＭ〜４００ｍＭ、または約３２３ｍＭに及び得る。ＲＢＣ溶解緩衝剤のために使用され得る、塩の非限定的実施例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウムであって、約３００ｍＭの濃度において、ＲＢＣ溶解緩衝剤中に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ溶解緩衝剤は、２×のリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）を含み、これは、約３１４ｍＭ  ＮａＣｌと、９ｍＭ  ＫＣ１と、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸緩衝剤とを含む。いくつかの実施形態では、高張性緩衝剤は、約１×〜３×のＰＢＳ、例えば、約２．５×または約３×のＰＢＳである。
【００３３】
ＲＢＣ溶解緩衝剤において使用される、定着剤は、細胞膜上のタンパク質の架橋結合を生じさせ得る、任意の定着剤であることができる。本開示において使用される、定着剤は、細胞死を生じさせないが、細胞膜に浸透し、ＲＢＣ分解緩衝剤からの溶質が、膜を急速に横断し、細胞の内側に到達することを可能にし得るように、比較的に低濃度で存在する。好適な定着剤は、ホルマリンを含む、ホルムアルデヒドを含む。ＲＢＣ分解緩衝剤中の定着剤の濃度は、０．５％〜１０％、例えば、５％〜７％、２％〜５％、３％〜４％、または約３．２％に及び得る。
【００３４】
ＲＢＣ溶解緩衝剤はまた、カルシウムキレート剤を含んでもよい。カルシウムキレート剤は、カルシウムを血液から除去し、これは、ガルドスチャネルを活性化するために要求される。その結果、赤血球は、それらが低張性または等張性状態を受けると、膨潤して戻る能力を喪失し、したがって、破裂する。低減された血清カルシウムはまた、単核球の特性である、浸透圧の変化に起因して、細胞活性化を低減させる。任意のカルシウムキレート剤が、本方法のために使用されることができる。カルシウムキレート剤の非限定的な例は、Ｋ３−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＴＰＥＮ、およびＢＡＰＴＡを含む。カルシウムキレート剤は、ＲＢＣ溶解緩衝剤中、０．０１ｍＭ〜２０ｍＭ、例えば、１０ｍＭ〜１５ｍＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、１ｍＭ〜５ｍＭ、４ｍＭ〜１２ｍＭ、例えば、約１０ｍＭに及ぶ濃度で存在することができる。カルシウムキレート剤はまた、２つまたはそれを上回る前述のカルシウムキレート剤の混合物であることができる。
【００３５】
ＲＢＣ溶解緩衝剤のｐＨは、緩衝剤中の定着剤および塩の両方のための滴定に影響を及ぼし得る。ＲＢＣ溶解緩衝剤のｐＨは、典型的には、約６．５〜約８．５の範囲内である。好ましい実施形態では、ｐＨは、標準的生理学的ｐＨ、すなわち、約７．４である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、塩（典型的には、高張性食塩水とも称される、塩溶液の形態である）、定着剤、および／またはカルシウムキレート剤は、ＲＢＣ溶解緩衝剤中で混合され、同時に、サンプルに添加される。いくつかの実施形態では、塩、定着剤、および／またはカルシウムは、その順序において、連続して、サンプルに添加される。いくつかの実施形態では、塩および定着剤は、サンプルにともに添加された後、カルシウムキレート剤の添加が続く。
【００３７】
要求されるＲＢＣ溶解緩衝剤の体積は、サンプル体積およびＲＢＣ溶解緩衝剤の溶質濃度に依存する。一般に、ＲＢＣ溶解緩衝剤の溶質濃度が高いほど、負荷ステップのために要求されるＲＢＣ溶解緩衝剤の体積は小さく、混合物を等張性状態にもたらすために要求される低張性緩衝剤の体積は小さい。ある場合には、負荷ステップは、１：１体積比において、ＲＢＣ溶解緩衝剤と全血サンプルを混合するステップを含む。
【００３８】
本方法の接触させるステップはさらに、ある時間期間にわたって、ＲＢＣ溶解緩衝剤を赤血球および白血球を含むサンプルに添加することによって形成される、第１の混合物をインキュベートすることを含んでもよい。一般に、より小さい体積のより濃縮されたＲＢＣ溶解緩衝剤および／またはより大きい体積の平衡希釈緩衝剤は、より短いインキュベーション時間を要求する。いくつかの実施形態では、第１の混合物のインキュベーションは、約０．５分〜約２０分、例えば、約４５秒〜約１０分続く。
【００３９】
第１の混合物中の種々の成分、すなわち、塩、定着剤、およびカルシウムキレート剤の濃度は、赤血球が、下記に説明されるような後続ステップにおいて溶解されるために十分に調製されるように、合理的動作範囲内になければならない。一般に、低定着剤濃度は、不十分なＲＢＣ溶解をもたらし得、高定着剤濃度は、潜在的に、細胞を損傷させ得る。本発明者らは、約１％〜３％、例えば、約１．２５％〜２．５％、または約１〜２％の範囲内である、第１の混合物中の定着剤の濃度が、概して、良好なＲＢＣ溶解を生産することを発見した。但し、性能は、濃度範囲の両端において次第に低下する。好ましい実施形態では、定着剤は、約１．６％〜約１．８％に及ぶ濃度である。カルシウムキレート剤は、約３ｍＭ〜７ｍＭ、例えば、５ｍＭの濃度で存在する。第１の混合物は、１．２〜１．８×のＰＢＳ、例えば、約１．５×のＰＢＳ中の塩濃度に匹敵する塩濃度を有してもよい。
サンプル混合物を等張性状態まで復元する
【００４０】
サンプルが、上記に説明されるように、第１の緩衝剤で処理された後、第２の緩衝剤が、細胞およびＲＢＣ溶解緩衝剤を含む、第１の混合物に添加され、等張性の第２の混合物を形成する。第２の緩衝剤は、典型的には、溶質濃度全血とほぼ同一である、塩濃度を有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝剤は、第１の緩衝剤と同一の塩または複数の塩を含む。第２の緩衝剤の体積および濃度は、第２の緩衝剤の添加が、第２の混合物中の溶質濃度を、溶液張性の上昇前の赤血球および白血球を含むサンプルの溶質濃度と実質的に同一であるレベルまで、または１×のＰＢＳの溶質濃度と実質的に同一であるレベルまで復元し得る限り、変動してもよい。そのような溶質濃度を有する、第２の混合物は、等張性混合物と称され、細胞は、ここで、等張性状態になる。いくつかの実施形態では、第２の緩衝剤は、０〜１×のＰＢＳ、例えば、０．５〜１×のＰＢＳ、０．７〜０．９×のＰＢＳ、０．９〜１×のＰＢＳ、または約０．９×のＰＢＳ、または約１×のＰＢＳである。いくつかの実施形態では、添加される第２の緩衝剤の体積と第１の混合物の体積との間の比率は、少なくとも１：１、例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、または少なくとも５：１である。一般に、第２の緩衝剤の溶質濃度が高いほど、より大きい体積の緩衝剤が、等張性の第２の混合物を形成するために、第１の混合物に添加するために要求され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、第２の緩衝剤はさらに、典型的には、生物学的サンプル、例えば、胎児ウシ血清（「ＦＢＳ」）を調製するために使用される、他の成分を含んでもよい。ある場合には、第２の緩衝剤は、サンプルを洗浄し、特定のアッセイのためのサンプルを調製するために使用される、同一緩衝剤である。例えば、１×のＰＢＳ＋ＦＢＳまたはＢＳＡもしくはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製Ｌ＆Ｌ／Ｓｏｌａｓｔｒａ洗浄緩衝剤を含む、緩衝剤であることができる。
【００４２】
第２の緩衝剤のｐＨは、典型的には、約７．０〜約８．０の範囲内、例えば、約７．４である。
【００４３】
随意に、本方法はさらに、約０．５分〜約２０分の時間期間にわたって、第２の混合物をインキュベートするステップを含む。第２の混合物は、典型的には、約０．０１％〜２％定着剤、例えば、約０．５％〜１．５％、または約０．８％〜約１．２％を含む。
【００４４】
故に、本発明はまた、全血のサンプルと、定着剤と、高張性食塩水と、カルシウムキレート剤とから本質的に成る、第１の混合物を形成することによって、全血サンプルを処理する方法を提供する。高張性食塩水ならびに形成された第１の混合物中の溶質濃度は、全血の溶質濃度を上回る。上記に説明される実施形態のいずれかはまた、本発明の側面のために含まれることができる。
分析または貯蔵
【００４５】
ＲＢＣ溶解の完了に応じて、サンプル中の白血球は、塩、定着剤、および他のパラメータが、フローサイトメトリー分析のために適切である、溶液中に浸漬される。洗浄が必要である場合、溶解直後に遠心分離機されることができる。サンプルは、溶解前または後ののいずれかにおいて、当技術分野において周知である方法を使用して、適切な検出可能細胞マーカで染色され、フローサイトメトリー分析を受けることができる。
【００４６】
サンプルは、次いで、標準的設備およびいったん貯蔵用緩衝剤中に入れられた後の長期サンプル安定性の見込みのみを前提として、所望または必要に応じた期間にわたって、本溶液中に残されることができる。
３．キット
【００４７】
本開示はまた、赤血球を溶解するためのキットを提供する。本キットは、本開示全体を通して、赤血球分解キット（「ＲＤＫ」）とも称される。キットは、ユーザが、上記に説明されるような方法ステップを行うことを可能にする。好ましい実施形態では、キットは、第１の試薬（「試薬１」）、すなわち、本質的に、高張性食塩水と、約３．２％ホルムアルデヒドと、約１０ｍＭのＥＤＴＡとから成る、ＲＢＣ溶解緩衝剤と、約０．９Ｘ〜約１×のＰＢＳを含む、第２の試薬とを含む。第１の試薬中の塩濃度は、１５０ｍＭ〜６００ｍＭ、例えば、２６０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または２８０ｍＭ〜４００ｍＭ、または約３２３ｍＭに及び得る。１つの特定の実施形態では、高張性食塩水は、約３２３ｍＭの塩濃度を有し、ｐＨ７．４を有する。いくつかの実施形態では、高張性食塩水は、約２．５×または約２×のＰＢＳである。別の特定の実施形態では、第２の試薬は、約０．９×のＰＢＳを含む。
４．用途
【００４８】
本開示における方法およびキットは、いくつかの既存のフローサイトメトリー分析用途に適合する。ある場合では、方法およびキットは、乾燥Ｂ細胞抗体パネル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）において使用される。ＲＢＣ分解緩衝剤が、上記に説明されるように、乾燥Ｂ細胞抗体パネル管内に設置された全血サンプルに添加されることができ、低張性緩衝剤が、次いで、添加され、混合物を等張性状態に復元する。全血中の赤血球は、その結果、溶解され、サンプルは、染色され、フローサイトメトリーによって、分析されることができる。
【００４９】
本開示における方法およびキットはまた、カッパ／ラムダ染色のために一般に使用される、Ｌ＆Ｌ洗浄と併用されることができる。全血サンプル中の赤血球は、Ｌ＆Ｌ洗浄手技自体において使用される洗浄緩衝剤で溶解された後、ＲＤＫを用いたインキュベーションが続くことができる。処理されたサンプルは、次いで、急速に遠心分離され、デカントされる。１つの特定の実施形態では、洗浄緩衝剤は、１×のＰＢＳと、２％ＦＢＳとを含む。一般に、Ｌ＆Ｌ洗浄緩衝剤を溶解ステップのための緩衝剤として使用することによって、サンプル調製時間を１時間超から約１５〜２０分まで短縮させる。
５．例示的実施形態
【００５０】
実施形態１．赤血球を溶解する方法であって、赤血球および白血球を含むサンプルと定着剤を含む第１の緩衝剤を接触させるステップであって、第１の緩衝剤の溶質濃度は、サンプルの溶質濃度を上回り、サンプルおよび第１の緩衝剤は、第１の混合物を形成する、ステップと、第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を第１の混合物に添加するステップであって、第２の混合物中の溶質濃度は、サンプルの溶質濃度の少なくとも９０％であって、それによって、サンプル中の赤血球は、溶解される、ステップとを含む、方法。
【００５１】
実施形態２．サンプルは、全血である、実施形態１に記載の方法。
【００５２】
実施形態３．第２の緩衝剤を添加するステップの前に、カルシウムキレート剤を添加するステップをさらに含み、カルシウムキレート剤は、カルシウムをキレート化することによって、赤血球中のカルシウム依存輸送を遮断する、実施形態１に記載の方法。
【００５３】
実施形態４．第１の緩衝剤はさらに、カルシウムキレート剤を含み、カルシウムキレート剤は、赤血球中のカルシウム依存輸送を遮断する、実施形態１に記載の方法。
【００５４】
実施形態５．接触させるステップはさらに、０．５分〜２０分の期間にわわたって、第１の混合物をインキュベートすることを含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【００５５】
実施形態６．方法のステップはさらに、０．５分〜２０分の第２の期間にわたって、第２の混合物をインキュベートすることを含む、実施形態１に記載の方法。
【００５６】
実施形態７．第２の緩衝剤は、０×〜１×のＰＢＳを含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００５７】
実施形態８．第１の混合物は、０．５〜３％ホルムアルデヒドと、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡと、１．２−１．８×のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とを含む、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
【００５８】
実施形態９．第１の緩衝剤は、０．５％〜１０％ホルムアルデヒドと、０．０１ｍＭ〜２０ｍＭのＥＤＴＡと、６．５〜８．５のｐＨにおける１５０ｍＭ〜６００ｍＭの塩とを含む、実施形態４に記載の方法。
【００５９】
実施形態１０．第１の緩衝剤は、１×〜３×のＰＢＳを含む、実施形態９に記載の方法。
【００６０】
実施形態１１．接触させるステップは、０．２：１〜１：１に及ぶ体積比において、第１の緩衝剤とサンプルを混合することを含む、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００６１】
実施形態１２．全血サンプルを処理する方法であって、全血のサンプルと、定着剤と、高張性食塩水と、カルシウムキレート剤とを含む、第１の混合物を形成するステップであって、高張性食塩水の溶質濃度は、全血の溶質濃度を上回る、ステップと、等張性の第２の混合物を形成するために、第２の緩衝剤を第１の混合物に添加し、ステップとを含む、方法。
【００６２】
実施形態１３．第１の混合物は、０．５〜３％ホルムアルデヒドと、３〜７ｍＭのＥＤＴＡとを含む、実施形態１２に記載の方法。
【００６３】
実施形態１４．第２の混合物は、０．０１〜２％ホルムアルデヒドを含む、実施形態１２または１３に記載の方法。
【００６４】
実施形態１５．第２の緩衝剤は、０×〜１×のＰＢＳである、実施形態１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【００６５】
実施形態１６．第１または第２の混合物の細胞を染色するステップと、溶解後の染色された細胞を血球計数器の中に導入するステップとをさらに含む、実施形態１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【００６６】
実施形態１７．赤血球溶解キットであって、高張性食塩水と、０．５％〜１０％ホルムアルデヒドと、０．０１ｍＭ〜２０ｍＭのＥＤＴＡとを含む、第１の試薬であって、第１の試薬の溶質濃度は、全血サンプルの溶質濃度を上回る、第１の試薬と、０×〜１×のＰＢＳを含む、第２の試薬とを含む、赤血球溶解キット。
【００６７】
実施形態１８．高張性食塩水は、１５０ｍＭ〜６００ｍＭの塩濃度を有し、６．５〜８．５のｐＨである、実施形態１７に記載の赤血球溶解キット。
【００６８】
実施形態１９．第２の試薬は、０×〜１×のＰＢＳを含む、実施形態１７または１８に記載の赤血球溶解キット。
（実施例）
以下の実施例は、例証のために提供されるが、請求される発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６９】
本実施例では、ＲＢＳ分解緩衝剤は、：１）３．２％ホルムアルデヒドと、２）２×のＰＢＳ（約２７４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣ１、および２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ならびに３．６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４））と、３）１０ｍＭＫ  ３−ＥＤＴＡとから構成された。緩衝剤は、１：１の体積／体積比で全血サンプルに添加され、次いで、約４５秒〜１０分の時間にわたってインキュベートされた。１：１希釈に応じた最終濃度は、１）１．６％ホルムアルデヒド、２）１．５×のＰＢＳ、および３）５ｍＭＫ３−ＥＤＴＡであったが、緩衝剤の実際の濃度は、それらがまた、これらの最終濃度をもたらすことを前提として、異なる体積を可能にするように改変されることができる。０．９×〜１×のＰＢＳまたはＩｓｏＦｌｏｗを用いた初期サンプル体積の４×を上回る任意の値までの希釈に応じて、ＲＢＣおよび休止血小板は、第１の試薬でインキュベートされるのとほぼ同一時間フレーム内で完全に溶解された（すなわち、それぞれ、約４５秒〜１０分）。体積はさらに、溶液が、１×のＰＢＳにより近い最終塩濃度を提供するように調節される場合、より小さい体積において低減および／または最適化され得る。一般的使用に関して、０．９×のＰＢＳは、１×のＰＢＳより良好に最終濃度を復元するために機能するであろうが、１×は、大部分の場合、良好に作用し、より便宜的である。
【実施例２】
【００７０】
開示される方法およびキットは、いくつかの既存のフローサイトメトリー分析用途に適合する。そのような用途のうちの１つは、乾燥Ｂ細胞抗体パネル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）である。あるアッセイでは、１５０ｍＬのＲＢＣ分解緩衝剤、すなわち、ＲＤＫの第１の試薬が、５０ｍＬのＰＢＳと混合され、２００ｍＬ混合物を生成した。混合物は、染色後、１００ｍＬ血液に添加された。１×のＰＢＳが、混合物を等張性状態に復元するために使用された。別のアッセイでは、２００μＬのＲＤＫの第１の試薬が、５０ｍＬ全血サンプルに添加された。２分のインキュベーション後、０．９×のＰＢＳが、添加され、混合物を等張性状態に復元した。さらに別のアッセイでは、１５０μＬのＲＤＫの第１の試薬が、１００μＬ血液および５０μＬの抗体に添加され、２分にわたるインキュベーション後、０．９×のＰＢＳが、添加され、混合物を等張性状態に復元した。サンプルは、次いで、フローサイトメトリー分析のために使用される。
【００７１】
カッパ／ラムダ染色のためのＬ＆Ｌ洗浄の場合、サンプルは、直接、洗浄緩衝剤で溶解された。３回の緩慢な遠心分離および吸引を用いた洗浄（洗浄に約４５分かかった後、２０分の溶解が続く）の代わりに、サンプルは、１分のＲＤＫ＋ＰＢＳ／２％ＦＢＳ洗浄緩衝剤で溶解され、次いで、急速に遠心分離および傾瀉された（洗浄あたり約５〜６分かかる）。その結果、サンプル調製時間は、有意に、すなわち、合計＞６０分から約１５〜２０分まで低減された。
【実施例３】
【００７２】
ＲＢＣ分解キット（ＲＤＫ）が、ＲＢＣ全血を溶解するために使用された。全ての溶解物は、正確に１０分にわたって実施され、ＲＤＫは、試薬１での２分のインキュベーション後、１×のＰＢＳでの８分が続く。
【００７３】
図１は、ＲＤＫと慣例緩衝剤の３ドナー比較である。上パネルは、ＣＤ４５対側散乱（ＳＳ）ドットプロットを比較する一方、下パネルは、そのＣＤ４５集団毎に、個別の前方散乱（ＦＳ）およびＳＳプロファイルを実証する。全ての散乱プロファイルは、一貫し、結果は、全ての場合において、ＲＢＣがＲＤＫによって完全に溶解されたことを示す。ＣＤ４５対ＳＳプロットでは、「非ＷＢＣ」と題された集団は、ＲＢＣおよび休止血小板から成る一方、非ＷＢＣとＣＤ４５ゲート間の集団は、活性化血小板から成る。活性化血小板は、典型的には、任意の方法によって溶解しないが、それらは、ある場合には、低減され得る、または時として、ＣＤ４５集団の中に紛れ込む。
【００７４】
図２は、ＥＤＴＡ血液を使用した、ＲＤＫ試薬１を用いた２および４分のインキュベーション対慣例緩衝剤を用いたインキュベーションの比較である。上パネルは、ＣＤ４５対ＳＳである一方、下パネルは、ＦＳ対ＳＳである。２つの方法で処理されたサンプルの散乱プロファイルは、類似し、結果は、ＲＤＫがサンプルを完全に溶解したことを示した。ＲＤＫ試薬または慣例緩衝剤のいずれを用いた場合にも、２分対４分インキュベーション時間に関する散乱プロファイルには、差異は認められなかった。
【００７５】
図３は、図２と同様に、ヘパリン血液を使用した、ＲＤＫ試薬１対慣例緩衝剤を用いた２および４分のインキュベーションの比較である。散乱プロファイルは、類似し、ＲＤＫは、サンプルを完全に溶解した。散乱プロファイルには、２分にわたってＲＤＫ試薬１または慣例緩衝剤を用いてインキュベートされたサンプル対４分にわたってインキュベートされたサンプルに関する有意な差異は認められなかった。
【００７６】
図４もまた、図２と同様に、ＡＣＤ血液を使用した、ＲＤＫ試薬１対慣例緩衝剤を用いた２および４分のインキュベーションの比較である。２つの方法で処理されたサンプルの散乱プロファイルは、類似し、結果は、ＲＤＫがサンプルを完全に溶解したことを示した。２分対４分インキュベーション時間に関する散乱プロファイルには、ＲＤＫ試薬または慣例緩衝剤のいずれを用いた場合にも、差異は認められなかった。
【００７７】
図５は、乾燥Ｂ細胞抗体管を用いたＲＤＫの性能の実証である。左から右に、ゲーティングワークフローは、Ｂ細胞をゲーティングするためのＣＤ４５対ＳＳ、ＦＳ対ＳＳ、ＣＤ１９対ＣＤ２０（リンパ液およびＬの両方内の全ての事象から成るリンパ球ブールゲートを使用して）、最後に、Ｂ細胞集団のためのカッパ対ラムダ信号を実証する。上パネルは、ＥＤＴＡ血液である一方、中央パネルは、ヘパリン血液であって、下パネルは、ＡＣＤ血液である。サンプルは、最初に、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで３回まとめて洗浄された。最終体積は、洗浄緩衝剤を使用して、オリジナルサンプル体積の１×に戻るように調節された。１００μＬの洗浄された血液が、各Ｂ細胞乾燥Ｂ細胞抗体管に添加され、２０分にわたってインキュベートされ、細胞を染色した。インキュベーション後、ＲＢＣは、ＲＤＫで溶解され、２回洗浄され（１回目の洗浄としてのＲＤＫ緩衝剤）を含む、次いで、流動血球計数器上で読み取られた。これらのサンプルに関する散乱プロファイルは、良好に認められ、多くの場合、より低い前方散乱（「ＦＳ」）領域へのＷＢＣ集団偏移をもたらす、他の溶解方法で見られるような細胞死は、殆ど認めらなかった。カッパ／ラムダ染色は、非常に良好に作用した。
【００７８】
図６は、湿潤抗体試薬を使用した、同一パネルを用いた慣例緩衝剤の性能を示す。ＲＤＫは、乾燥抗体パネル管中でＲＢＣを直接溶解するために、湿潤試薬を用いた慣例緩衝剤と同じく良好に作用した。ＲＤＫは、使用される抗凝固剤のタイプにかかわらず、乾燥抗体パネル管内のサンプルを溶解した。図５に見られるように、乾燥抗体パネルを使用して染色されたサンプルを用いたＲＤＫの性能は、本図に見られるように、湿潤Ｂ細胞パネルを使用して染色されたサンプルを用いた慣例緩衝剤の性能に類似した。ワークフローは、図５および図６の両方に関して同一であったが、１つの慣例緩衝剤は、湿潤抗体と併用された一方、ＲＤＫは、乾燥Ｂ細胞抗体管内で乾燥された抗体を使用して使用された。慣例緩衝剤は、乾燥試薬管内でサンプルを溶解することが不可能であった。
【００７９】
図７は、ＲＤＫが、４００μＬの１×のＰＢＳが使用されたときのみ、赤血球を完全に溶解したことを示す。体積がさらに３００μＬまで低減されたとき、部分的溶解が、観察された。図７は、異なる体積の１×のＰＢＳが第２の緩衝剤のために使用される場合のシステムの溶解効率性を実証する。４００μＬのサンプルは、１００μＬの血液が、２分にわたって、１：１でＲＤＫ試薬と混合された後、４００μＬの１×のＰＢＳ中への希釈および８分にわたるインキュベーションが続くことを表す。１，０００μＬのサンプルは、１００μＬの血液が、２分にわたって、１：１でＲＤＫ試薬と混合された後、１ｍＬの１×のＰＢＳ中への希釈および８分にわたるインキュベーションが続くことを表す。３００μＬの１×のＰＢＳを緩衝剤２のために使用するとき、部分的溶解が、観察されたが、１×のＰＢＳでの溶解のための有効下限は、４００μＬであった。これらの結果は、洗浄を伴わなかった。図８は、異なる体積の緩衝剤２が１×のＰＢＳに匹敵する最終濃度を有するように平衡される場合のシステムの溶解効率性を実証する。３００μＬのサンプルは、１００μＬの血液が、２分にわたって、１：１でＲＤＫ試薬と混合された後、３００μＬの０．６７×のＰＢＳ中への希釈および８分にわたるインキュベーションが続くことを表す。１，０００μＬのサンプルは、１００μＬの血液が、２分にわたって、１：１でＲＤＫ試薬と混合された後、１ｍＬの０．９×のＰＢＳおよび８分にわたるインキュベーションが続くことを表す。これらの結果は、洗浄を伴わなかった。図８は、最終濃度が１×のＰＢＳ（すなわち、３００μＬ＝＋３００μＬの０．６７×のＰＢＳ、４００μＬ＝＋４００μＬの０．７５×のＰＢＳ等）と等しいように調節されたより小さい体積を使用したＲＢＣの溶解を示す。パネルＡは、ＣＤ４５対ＳＳプロファイルから成る一方、パネルＢは、ＦＳ対ＳＳプロファイルから成る。パネルＡは、ＲＤＫが、３００μＬまでの溶液の全ての体積において、ＲＢＣを完全に溶解することが可能であったことを示し、約５００μＬは、最良定質的結果が取得されるおおよその体積であると考えられる。この場合、３００μＬ混合物は、１００μＬ血液と、１００μＬＲＤＫ試薬１と、３００μＬの０．６７×のＰＢＳとから成る。パネルＢは、全体的散乱プロファイルが、良好に認められたが、より低い体積が、可能性として、ＲＢＣおよび血小板断片との同時発生に起因して、少し不明瞭になることを示す。不明瞭性は、サンプル入手率を低減させ、ひいては、同時発生を低減させることによって改良され得る。洗浄されていないサンプル中のＲＢＣおよび血小板断片との同時発生は、そのような小体積比中で溶解が可能である場合、全ての溶解緩衝剤にとって問題となる可能性が高いであろう。
【００８０】
本明細書に説明される実施例および実施形態は、例証的目的のみのためのものであって、それに照らした種々の修正または変更が、当業者に示唆され、本願の精神および権限および添付の請求項の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。本明細書に引用される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
2020519873.tif 000011
【図７】
2020519873.tif 000012
【図８Ａ】
2020519873.tif 000013
【図８Ｂ】
2020519873.tif 000014
【国際調査報告】
2020519873.tif 000015
2020519873.tif 000016
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