(57)【要約】本開示の主題は、単胃動物飼料用の飼料添加物製剤に関する。特に、本開示の製剤は、単離されたキシラナーゼ酵素およびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を含む。飼料添加物製剤は、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１をさらに含んでもよい。本開示の製剤は動物の能力を相乗的に増進するために、単胃動物用の飼料への添加に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたキシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む、単胃動物飼料用の飼料添加物製剤。
【請求項２】
バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む、請求項１に記載の飼料添加物製剤。
【請求項３】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−キシラナーゼである、請求項１に記載の飼料添加物製剤。
【請求項４】
前記製剤が、固体、粉末、懸濁濃縮物、液体、または顆粒である、請求項１に記載の飼料添加物製剤。
【請求項５】
担体をさらに含む、請求項１に記載の飼料添加物製剤。
【請求項６】
前記担体が石灰石を含む、請求項５に記載の飼料添加物製剤。
【請求項７】
前記キシラナーゼが１０，０００〜２００，０００単位／グラムの範囲であり、バチルス・リケニフォルミスが１０８〜１０１２ＣＦＵ／グラムの範囲である、請求項１に記載の飼料添加物製剤。
【請求項８】
前記キシラナーゼが１０，０００〜２００，０００単位／グラムの範囲であり、バチルス・リケニフォルミスが１０８〜１０１２ＣＦＵ／グラムの範囲であり、バチルス・アミロリケファシエンスが１０８〜１０１２ＣＦＵ／グラムの範囲である、請求項２に記載の飼料添加物製剤。
【請求項９】
請求項１に記載の飼料添加物製剤を含む、単胃動物用飼料組成物。
【請求項１０】
バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む、請求項９に記載の飼料組成物。
【請求項１１】
前記キシラナーゼが５〜３０単位／グラム（飼料）の範囲であり、バチルス・リケニフォルミスが少なくとも５×１０４ＣＦＵ／グラム（飼料）の範囲である、請求項９に記載の飼料組成物。
【請求項１２】
前記キシラナーゼが５〜３０単位／グラム（飼料）の範囲であり、バチルス・リケニフォルミスおよびバチルス・アミロリケファシエンスの各々が少なくとも１０５ＣＦＵ／グラム（飼料）の範囲であり、総量が少なくとも１×１０５ＣＦＵ／グラム（飼料）である、請求項１０に記載の飼料組成物。
【請求項１３】
単胃動物の能力を向上させる方法であって、キシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む飼料組成物の有効量を、単胃動物に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記飼料組成物が、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−キシラナーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が家禽である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物がブロイラーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物がブタである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
能力の向上が、１日平均体重増加量の増加、総体重増加量の増加、飼料転換率の増進、病変スコアの減少、死亡率の減少、疾患の減少、および病原体発生率の減少の１つまたはこれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患および病変スコアの一方または両方が、クロストリジウム・パーフリンジェンス、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマ、アイメリア・テネラおよびコクシジウム症誘発寄生虫の１つまたはこれらの組合せの結果である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が家禽であり、
能力の向上が、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびアイメリア属の１つまたはこれらの組合せから生じる病変スコアの減少を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物が家禽であり、
病原体発生率の減少がサルモネラ発生率の減少である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
キシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む製剤を飼料組成物に添加することを含む、単胃動物用飼料組成物を調製する方法。
【請求項２４】
前記製剤が、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キシラナーゼがエンド−１，４−β−キシラナーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記製剤が、固体、粉末、懸濁濃縮物、液体、または顆粒である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記キシラナーゼが５〜３０単位／グラム（飼料）の範囲であり、バチルス・リケニフォルミスが少なくとも５×１０４ＣＦＵ／グラム（飼料）の範囲である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記キシラナーゼが５〜３０単位／グラム（飼料）の範囲であり、バチルス・リケニフォルミスおよびバチルス・アミロリケファシエンスの各々が少なくとも１０５ＣＦＵ／グラム（飼料）の範囲であり、総量が少なくとも１×１０５ＣＦＵ／グラム（飼料）である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の参照〕
本出願は２０１７年３月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，８４８号の優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔技術分野〕
本開示の主題は、概して、飼料添加物製剤、ならびに本開示の製剤を製造および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
何十年もの間、動物の健康を維持し生産性を増進するために、動物生産は抗生物質成長促進剤（ＡＧＰ）に依存してきた。多くの国での動物生産からのＡＧＰの除去に伴い、生産者は、有機酸、酵素、およびプロバイオティクスなどの様々な飼料添加物を、様々なレベルの有効性および一貫しない結果で使用することを試みてきた。特に、現在市場で使用されている多くの酵素およびプロバイオティック製品は費用がかかり、産業飼料および動物生産プロセスで使用される場合に不安定であることが証明されている。したがって、動物飼料に添加した場合に動物の生産能力特性を有意に増進する酵素とプロバイオティクスとの新規な組合せを提供することが有益であろう。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本開示の主題は、単胃動物飼料用の飼料添加物製剤を対象とする。特に、製剤は、単離されたキシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む。いくつかの実施形態においては、製剤がバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本開示の主題は、単離されたキシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む、単胃動物用の飼料組成物を対象とする。いくつかの実施形態においては、飼料組成物がバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示の主題は、単胃動物の能力を向上させる方法を対象とする。本方法は、キシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む飼料組成物の有効量を動物に投与することを含む。本方法のいくつかの実施形態においては、飼料組成物はバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示の主題は、単胃動物用の飼料組成物を調製する方法を対象とする。特に、本方法は、キシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む製剤を飼料組成物に添加することを含む。本方法のいくつかの実施形態においては、製剤がバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】リステリア・イノキュアとバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１との相互作用を示す３つの寒天拡散アッセイの写真である。
【図１ｂ】サルモネラ・エンテリカとバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１との相互作用を示す３つの寒天拡散アッセイの写真である。
【図２ａ】大腸菌とバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１との相互作用を示す３つの寒天拡散アッセイの写真である。
【図２ｂ】サルモネラ・エンテリカとバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１との相互作用を示す３つの寒天拡散アッセイの写真である。
【図２ｃ】リステリア・イノキュアとバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１との相互作用を示す３つの寒天拡散アッセイの写真である。
【図３ａ】ｐＨ３．０で０、１、２、または３時間インキュベートした後の２４時間にわたるバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の増殖を示す線グラフである。
【図３ｂ】ｐＨ３．０で０、１、２、または３時間インキュベートした後の２４時間にわたるバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の増殖を示す線グラフである。
【図４ａ】０、１、２、または３時間のＬＢ培地中の雄牛の胆汁への初期暴露での、８時間にわたるバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の増殖を示す線グラフである。
【図４ｂ】０、１、２、または３時間のＬＢ培地中の雄牛の胆汁への初期暴露での、８時間にわたるバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の増殖を示す線グラフである。
【図５】緩衝液、ウシ血清アルブミンおよび豚粘液の存在下でのバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１、バチルス・サブチルス株１６８およびバチルス・サブチルス株Ｃ１０２の増殖を示す棒グラフである。
【図６】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた１４日齢、２１日齢、および４２日齢のブロイラー、および対照の病変スコアを示す一連の棒グラフである。
【図７ａ】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた２１日齢のブロイラー、および対照の体重を示す棒グラフである。
【図７ｂ】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた４２日齢のブロイラー、および対照の体重を示す棒グラフである。
【図８ａ】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた２１日齢のブロイラー、および対照の飼料転換率（ＦＣＲ）を示す棒グラフである。
【図８ｂ】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた４２日齢のブロイラー、および対照の飼料転換率（ＦＣＲ）を示す棒グラフである。
【図９ａ】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた２１日齢のブロイラー、および対照のサルモネラ発生率（％）を示す棒グラフである。
【図９ｂ】バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびキシラナーゼの両方を補充した動物飼料を与えた４２日齢のブロイラー、および対照のサルモネラ発生率（％）を示す棒グラフである。
【図１０】抗生物質成長プロモーター（ＡＧＰ）、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（キシラナーゼ＋バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１＋バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を様々な濃度で補充した動物飼料を与えた２１日齢のブロイラーの体重、および対照を示す棒グラフである。
【図１１ａ】ＡＧＰ、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（キシラナーゼ＋バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１＋バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を様々な濃度で補充した動物飼料を与えた２１日齢のブロイラー、および対照の飼料転換率を示す棒グラフである。
【図１１ｂ】ＡＧＰ、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（キシラナーゼ＋バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１＋バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を様々な濃度で補充した動物飼料を与えた４２日齢のブロイラー、および対照の飼料転換率を示す棒グラフである。
【図１２ａ】ＡＧＰ、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（キシラナーゼ＋バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１＋バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を様々な濃度で補充した動物飼料を与えた２１日齢のブロイラー、および対照の死亡率を示す棒グラフである。
【図１２ｂ】ＡＧＰ、キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（キシラナーゼ＋バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１＋バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を様々な濃度で補充した動物飼料を与えた４２日齢のブロイラー、および対照の死亡率を示す棒グラフである。
【図１３】キシラナーゼ（１０Ｕ／ｇ（飼料））、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（１×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（５×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））の組合せ（「Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ」）またはサリノマイシンナトリウム（「コクシジオスタット」）を補充した動物飼料を与えた２８日齢のブロイラー、対照ブロイラーおよび未接種ブロイラーと比較した、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマおよびアイメリア・テネラのコクシジオスタット感受性株の強制経口投与による接種後の死亡率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本開示の主題は、いくつかの（すべてではないが）実施形態が示されている添付の図面を参照して、完全に説明される。本明細書に開示された主題の多くの変形例および他の実施形態は、前述の説明および関連する図面に提示された教示の恩恵を受ける当業者には思い浮かぼう。したがって、現在開示されている主題は開示されている特定の実施形態に限定されず、変更例および他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されていることが理解される。
【００１０】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１１】
長年にわたる特許法の条約に従い、「a」、「an」、および「the」という文言は、特許請求の範囲を含む、本出願で使用される場合、１つまたは複数を指す。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は文脈が明らかに逆でない限り、複数のタンパク質を含む。
【００１２】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、「約（about）」という文言は１つまたは複数の数または数値範囲に関連して使用される場合、範囲内のすべての数を含むすべてのそのような数を指すと理解されるべきであり、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を修正する。終点による数値範囲の記載はその範囲内に包含されるすべての数、例えば、その分数を含む整数を含み（例えば、１〜５の記載は１、２、３、４、および５、ならびにその分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）、およびその範囲内の任意の範囲を含む。
【００１３】
本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、および「含む（comprising）」という文言は、文脈が逆であることを示す場合を除いて、包括的な意味で使用される。同様に、「含む（include）」および「有する（have）」という文言および文法的変形は、リスト内の項目の記載が、リスト項目に置換または追加され得る他の同様の項目を除外するものではないように、非限定的であることが意図される。
【００１４】
本開示の主題は、単胃動物飼料と共に使用する飼料添加物製剤に関する。特に、本開示の製剤は、単離されたキシラナーゼ酵素と、少なくとも１つの微生物プロバイオティクス株バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有するその変異体とを含む。本開示の製剤は動物飼料に添加することができ、その結果、以下により詳細に記載されるように、予想外の相乗的に増進された動物特性が得られる。
【００１５】
したがって、本開示の飼料添加物製剤は、必須成分として単離されたキシラナーゼ酵素を含む。本明細書で使用される「キシラナーゼ」という文言は、鎖状多糖β−１，４−キシランをキシロースに分解し、したがって植物細胞壁の主要成分の１つヘミセルロースを分解する酵素のクラスを指す。いくつかの実施形態においては、キシラナーゼはエンド−１，４−β−キシラナーゼである。本明細書で使用される「単離された」という文言は実質的に純粋である（すなわち、汚染分子を含まない）酵素を指す。
【００１６】
本開示の製剤における使用に適したキシラナーゼ酵素は、当技術分野で周知の方法を使用して製造することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、キシラナーゼは、バッチ、フェドバッチ、および連続フロープロセスを含む、固体培養または浸漬培養によって産生され得る。あるいはまたはさらに、キシラナーゼは任意の市販のキシラナーゼであり得る。キシラナーゼは、液体または乾燥（粉末）調製物として提供され得る。
【００１７】
キシラナーゼは、バチルス属、ストレプトマイセス属、クロストリジウム属、サーモノスポラ（Thermonospora）属、トリコデルマ属、サーモマイセス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ミクロテトラスポラ属、ルミノコッカス属などから選択される細菌など、当技術分野で公知または使用される任意の好適な供給源から得ることができる。あるいはまたはさらに、キシラナーゼはトリコデルマ属、アスペルギルス属、フミコーラ属、ネオカリマスチクス属などから選択される真菌から得ることができる。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、キシラナーゼが動物の胃腸管に見出される状態またはそれに近いｐＨおよび温度で安定かつ活性である。
【００１９】
本開示の製剤は、微生物バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む。バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１は、米国特許第４，９０８，２２０および米国特許第４，９５９，３１１に記載されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態においては、本開示の製剤がバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含む。バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１は米国特許公開公報第２０１０／０１４３３１６号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
「生物学的に純粋な培養物」という文言は、異なる特性の微生物から物理的に分離された培養物を指す。本明細書中で使用される場合、「細菌株の生物学的に純粋な培養物」という語句は、細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の胞子、細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の栄養細胞、細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の１つ以上のプロダクト、細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の培養固体、細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の培養上清、細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の抽出物、および細菌株の生物学的に純粋な発酵培養物の１つ以上の代謝物の１つまたは組合せを指す。
【００２１】
本明細書で使用される「変異体」という文言は親株（すなわち、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１またはバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）に由来する遺伝子変異体を指す。いくつかの実施形態においては、変異体が親株と同様に、または親株よりも良好に機能する（例えば、親株と同様に、または親株よりも良好に、動物の成長を維持または増進する）。
【００２２】
バチルス・リケニフォルミスおよび／またはバチルス・アミロリケファシエンス株は、研究所または培養収集物から得ることができる。生物学的に純粋な培養物は当該分野で周知の方法を使用して（例えば、無菌技術を使用した、そして適切な条件（すなわち、ｐＨ、温度、酸素レベルなど）下での培養特異的培地中での培養によって）産生され得る。
【００２３】
本開示の実施例１および２は、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１がリステリア・イノキュア（Listeria innocua）、大腸菌（E. coli）およびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enteric）を含むヒト病原体および動物病原体の増殖を阻害することを示す。図１ａおよび１ｂはそれぞれ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が、リステリア・イノキュアおよびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enteria）を過剰増殖させることを示す。図２ａおよび２ｂはそれぞれ、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１が、大腸菌およびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）の増殖を阻害することを示す。図２ｃは、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１がリステリア・イノキュアよりも増殖することを示す。
【００２４】
本開示の実施例３は、腸内を通過する前に動物の腸内に存在する過酷な酸性条件に微生物株が暴露されるため、プロバイオティクス微生物の重要な特徴である、酸性環境への耐性をバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１が有することを示す。図３ａに示すように、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の酸性環境への暴露は、中性培地と比較して３時間増殖を遅延させた。バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を酸性環境に１時間、２時間、および３時間暴露すると回復し、増殖することが観察された。図３ｂに示すように、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１も酸暴露から回復することができたが、バチルス・リケニフォルミス株で観察されたよりも遅かった。
【００２５】
同様に、胃環境におけるプロバイオティクス微生物の生存には、低ｐＨ環境だけでなく、胆汁中の胃腸管に分泌される酵素も含まれる。本開示の実施例４は、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１が、胃環境の代表として伝統的に使用されてきた雄牛の胆汁（アルコールと混合された雌牛の胆汁）への暴露後に回復することができたことを示す。図４ａおよび４ｂは、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の両方がＬＢ培地中の雄牛の胆汁への３時間までの暴露後に回復することができたことを示す。
【００２６】
腸粘液へのプロバイオティック株の付着は、粘液内層への病原体の接近を制限するので望ましい。本開示の実施例５は、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１が豚粘液に付着する能力を有することを示す。図５は、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が対照株であるバチルス・サブチルス株Ｃ１０２に匹敵する水準で豚粘液に付着することを示す。
【００２７】
本開示の実施例６は、市販のブロイラー家禽の食餌へのキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の添加の効果を示す研究を説明する。鳥には、１０６ＣＦＵ／ｇのバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１および１５Ｕ／ｇのキシラナーゼを含む飼料組成を与えた（表１）。試験環境は重度のストレスと同様に、作製した同腹仔床敷き（built up litter bedding）による細菌／球菌接種（challenge）などの軽度のストレスを含んでいた。具体的には、１日目、７日目、および１０日目（ふ化後）に、１０７個よりも多い細菌量（鳥１羽あたりの細胞）のクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、鳥１羽あたり細胞１０４個のアイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、および鳥１羽あたり細胞１０３個のアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）を含む、複数の病原体を鳥に接種した。腸病変スコアを、１４、２１、および４２日齢で測定した。より低いスコアが望ましい。各食餌はトウモロコシ／大豆ベースであったが、標準的なブロイラー食餌と比較して１００ｋｃａｌ／ｋｇ少ない代謝可能エネルギー（ＭＥ）を有した（表２）。様々な期間のＢＷＧ（体重増加）群およびＦＣＲ（飼料転換率）群を、ＢＷ（体重）およびＦＩ（食物摂取）に基づいて計算した（表３）。
【００２８】
本研究からの病変スコア分析の結果を、以下の表４および図６に示す。
【００２９】
【表１】
2020509743.tif 000003
【００３０】
表４および図６のデータはキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せが、病原体を接種した鳥における腸病変の低下に対して予想外に有益な作用を有したことを示す。具体的には、それぞれ０．９０および０．７８のキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の両方を含む飼料を与えた鳥の２１日目および４２日目の病変スコアの減少が各成分単独の場合の相加効果（すなわち、それぞれ０．５９および０．３３）よりも有意に大きかった。４２日目の時点で、組合せ飼料による増進は相加的な減少の２倍を超えるところで顕著であった（すなわち、０．７８対０．３３の減少）。したがって、キシラナーゼとバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１との組合せは、動物の健康において相乗的な増進を示す。
【００３１】
本開示の実施例６はまた、市販のブロイラー家禽の食餌にキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を添加した場合の、体重（ＢＷ）、飼料転換率（ＦＣＲ）、およびサルモネラ発生率に対する効果を説明する。図７ａおよび７ｂは、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が２１日齢および４２日齢の鳥のＢＷを有意に増進した（ｐ＜０．０５）ことを示す。さらに、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せによる増進は、いずれかの成分単独の場合よりも大きいことが示された。
【００３２】
結果は、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が２１日齢および４２日齢でＦＣＲを有意に（ｐ＜０．０５）増進したことをさらに示す（図８ａおよび８ｂ）。さらに、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せの増進は図８ａおよび８ｂに示されるように、いずれかの成分単独の場合よりも大きかった。
【００３３】
図９ａおよび９ｂは、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が２１日齢および４２日齢でサルモネラ発生率を有意に（ｐ＜０．０５）減少させたことを示す。さらに、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せの増進は、いずれかの成分単独の場合よりも大きかった。
【００３４】
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１と組み合わせたキシラナーゼは、トウモロコシ／大豆食餌に添加した場合、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよび複数のアイメリア種接種下でブロイラー成長能力を有意に増進することができる。
【００３５】
本開示の実施例７は、市販のブロイラーの食餌へのキシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の添加の効果を説明する。ブロイラー飼料は１５単位／グラム（飼料）の濃度でキシラナーゼを含み、バチルス・リケニフォルミスおよびバチルス・アミロリケファシエンス株の各濃度は、１０４〜１０６の範囲であった（表５）。
【００３６】
図１０に示すように、キシラナーゼおよびバチルス株（バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を２×１０５ＣＦＵ／ｇ以上で飼料に補充すると、２１日齢で体重が有意に増進した（ｐ＜０．０５）。
【００３７】
図１１ａおよび１１ｂに示すように、２×１０５ＣＦＵ／ｇ以上の飼料でキシラナーゼおよびバチルス株（バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を飼料に補充すると、２１日齢および４２日齢でＦＣＲが有意に増進した（ｐ＜０．０５）。
【００３８】
さらに、図１２ａおよび１２ｂは、飼料にキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１を２×１０５ＣＦＵ／ｇ以上で供給すると、２１日齢および４２日齢の鳥の死亡率が有意に低下した（死亡率は４２日齢で８０％低下した）ことを示す（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＡＧＰ（抗生物質ＢＭＤ（バシトラシンメチレンジアリシレート））の含有は、対照の死亡率から有意に増進しなかった。
【００３９】
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１と組み合わせたキシラナーゼは、トウモロコシ／大豆食に添加した場合、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよび複数のアイメリア種接種下でブロイラー成長能力を有意に増進することができる。
【００４０】
本開示の実施例８は、キシラナーゼ（１０Ｕ／ｇ（飼料））、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（１×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（５×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））の組合せ（「Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ」と称する）について、消化管病変の重篤度を最小限に抑える効力、および通常のトウモロコシ−大豆食を与えられ、重篤なコクシジウムの接種条件下で飼育されたブロイラーの全体的な存率を増進する効力を評価するための研究を説明する。本研究では、ニワトリに、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマおよびアイメリア・テネラ（Eimeria tenella）の高免疫原性コクシジオスタット感受性株の生オーシストを含有する生ワクチンを、強制経口投与によって２回接種し、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙの組合せを、図１３において「コクシジオスタット」と称するサリノマイシンナトリウムと比較した。
【００４１】
接種後７日目（１４日齢）に、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙの単独は、接種した対照（challenged control）と比較して、３６％上管病変スコアを低下させた（データは図示せず）。接種後１４日目に、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙの単独は、接種した対照と比較して、中管病変スコアを５０％低下させた（データ図示せず）。図１３に示されるデータは、接種した対照と比較して、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ処理において、死亡率が８７％有意に減少した（Ｐ＜０．０２）ことを実証する。比較して、コクシジオスタット処理は、死亡率を２５％減少させただけであった。２８日目に、接種した対照に対して、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ処理において、飼料転換率を７ポイント低下させた（データは図示せず）。
【００４２】
キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の組合せは、コクシジオスタット単独の場合よりも、重度のアイメリア感染を患う鳥の死亡率を最小限に抑えるのに有効であり得る。
【００４３】
したがって、単胃動物用の飼料組成物に添加するための飼料添加物製剤が本明細書において提供される。飼料添加物製剤は、例えば家禽および豚のような単胃動物の健康および／または能力を増進を目的として飼料組成物に添加するために提供される。能力の向上には、１日平均体重増加量の増加、総体重増加量の増加、飼料転換率の増進、病変スコアの減少、死亡率の減少、疾患の減少、または病原体発生率の減少、のうちの１つまたは組合せが含まれる。病原体にはクロストリジウム・パーフリンジェンス、アイメリア属、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマ、アイメリア・テネラ、サルモネラ属、またはコクシジウム症誘発寄生虫の１つまたは組合せが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態においては、動物は家禽であり、能力の向上はクロストリジウム・パーフリンジェンスまたはアイメリア属の１つまたは組合せに起因する病変スコアの低下を含む。
【００４４】
一実施形態においては、単離されたキシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む、単胃動物飼料用の飼料添加物製剤が提供される。飼料添加物製剤は、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）のまたはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含んでもよい。
【００４５】
一実施形態においては、本開示の飼料添加物製剤を含む、単胃動物用飼料組成物が提供される。
【００４６】
一実施形態においては、キシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有する変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む製剤を飼料組成物に添加することを含む、単胃動物用の飼料組成物を調製する方法が提供される。この方法において、製剤は、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含み得る。
【００４７】
一実施形態においては、単胃動物の能力を向上させる方法が提供される。本方法はキシラナーゼ酵素と、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（アクセッション番号５３７５７）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物とを含む飼料組成物の有効量を単胃動物に投与することを含む。飼料組成物は、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（アクセッション番号ＤＳＭ２１８３６）またはその同定特性をすべて有するその変異体の生物学的に純粋な培養物をさらに含み得る。
【００４８】
一実施形態においては、キシラナーゼが約１０，０００〜２００，０００単位／グラムの範囲の量で本開示の製剤中に存在する。キシラナーゼは、約３０，０００〜２００，０００単位／グラムの範囲の量で本開示の製剤中に存在し得る。したがって、キシラナーゼは、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００；１１０，０００；１２０，０００；１３０，０００；１４０，０００；１５０，０００；１６０，０００；１７０，０００；１８０，０００；１９０，０００；または２００，０００単位／グラムの量で存在し得る。キシラナーゼ活性の１ユニットは、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中、５０℃で０．５％キシラン（Sima X4253、Beechwood）から毎秒１ナノモルの還元糖（キシロース当量）を放出するのに必要な酵素の量として定義される。
【００４９】
いくつかの実施形態においては、バチルス・リケニフォルミス株が１０８〜１０１２ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位／ｇ）の量で本開示の製剤中に存在する。いくつかの実施形態においては、バチルス・リケニフォルミス株が本開示の製剤中に少なくともグラム１０９ＣＦＵ／ｇの量で存在する。いくつかの実施形態において、バチルス・アミロリケファシエンスおよびバチルス・リケニフォルミス株は、約１０８〜１０１２ＣＦＵ／ｇの量で本開示の製剤中に存在する。いくつかの実施形態において、バチルス・アミロリケファシエンスおよびバチルス・リケニフォルミス株は、本開示の製剤中に少なくとも約１０９ＣＦＵ／ｇの量で存在する。したがって、株は本開示の製剤中に、少なくとも約１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、または１０１３ＣＦＵ／ｇの量で存在し得る。
【００５０】
キシラナーゼおよび細菌株に加えて、本開示の製剤は、製造、安定性、および／または能力特性を増進するための担体をさらに含んでいてもよい。本明細書で使用される「担体」という文言は、本開示の製剤への成分の均一な組み込みを容易にするために成分が添加される食用材料を指す。適切な担体としては石灰石、マルトロデキストリン、シクロデキストリン、コムギ、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、活性成分対キャリアの比率が約１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１であり得る。
【００５１】
本開示の製剤は固体、粉末、懸濁濃縮物、液体、または顆粒を含む（しかし、これらに限定されない）任意の所望の形態であり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本開示の製剤は、約７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃までの加熱処理に対して、約１、５、１０、１５、３０、または６０分までの間、熱的に安定であり得る。本明細書で使用される「熱的に安定」という文言は、特定の温度に加熱する前に製剤中に存在する成分の少なくとも７５％が室温に冷却した後に依然として存在することを示す。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本開示の製剤は、３０、４０、５０、６０、７０、または８０週間を超える貯蔵寿命を有していてもよい。所望の長さの時間および通常の貯蔵寿命は、貯蔵温度、加工条件、包装材料、包装装置などによって変化し得ることが理解されるべきである。
【００５４】
本開示の製剤は、単胃動物による消費用の飼料組成物に添加してもよい。製剤は動物飼料と直接混合してもよく、および／または飼料添加物（すなわち、ビタミン飼料添加物、ミネラル飼料添加物、アミノ酸飼料添加物など）と混合し、次いで動物飼料と混合してもよい。あるいはまたはそれに加えて、本開示の製剤は動物の飲料水に添加してもよい。
【００５５】
本明細書で使用される「動物飼料」または「飼料」は、単胃動物による摂取に適した、またはそれを意図した任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を指す。いくつかの実施形態において、飼料は家禽飼料またはブタ飼料組成物を含んでいてもよい。本明細書で使用される「単胃動物」という文言は反芻動物を除いて、単一の胃を有する任意の動物を含み、ほとんどの肉食動物および雑食動物に適用される。したがって、いくつかの実施形態においては、適切な単胃動物は家禽（例えば、ブロイラーヒヨコ、産卵鶏、シチメンチョウ）および／またはブタ（例えば、ブタまたは子ブタ）を含み得る（しかし、これらに限定されない）。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、本開示の製剤を動物飼料に添加してもよい。したがって、本開示の製剤を動物飼料に添加して、所望の量のキシラナーゼおよび本開示の細菌株を含有する飼料を生成することができる。当業者に理解されるように、希釈量は単胃動物の飼料の必要性、動物の年齢、および意図される用途（例えば、産卵鶏または鶏肉用のブロイラー（layers or broilers for chickens））によって決定され得る。例えば、いくつかの実施形態において、キシラナーゼの濃度は、約５〜３０単位／グラム（飼料）の範囲である。いくつかの実施形態においては、キシラナーゼの濃度が約７．５〜３０単位／グラム（飼料）（すなわち、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、または３０）の範囲である。いくつかの実施形態においては、飼料組成物中のバチルス・リケニフォルミスの量は少なくとも約５×１０４ＣＦＵ／グラム（飼料）の範囲である。いくつかの実施形態においては、飼料組成物中のバチルス・リケニフォルミスの量は少なくとも約１０５ＣＦＵ／ｇの範囲である。いくつかの実施形態においては、飼料組成物中のバチルス・リケニフォルミスの量は少なくとも約１０６ＣＦＵ／ｇの範囲である。いくつかの実施形態においては、飼料組成物は少なくとも約１０５ＣＦＵ／グラム（飼料）濃度で、本開示のバチルス・アミロリケファシエンス株をさらに含む。いくつかの実施形態においては、飼料組成物は少なくとも約１０５ＣＦＵ／グラム（飼料）の両方の株の総濃度を含む。いくつかの実施形態においては、飼料組成物は少なくとも約２．０×１０５ＣＦＵ／ｇの両方の株の総濃度を含む。
【００５７】
単胃動物に投与される場合、本開示の製剤を含む飼料組成物の有効量は、本開示の製剤を欠く飼料組成物と比較して動物の能力を向上させることが示されている。「有効量」という文言は、有意な有害な副作用を生じることなく動物の能力を向上させるのに十分な飼料の量を指す。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、能力の向上は単胃動物における１日平均体重増加の増加および／または総体重増加の増加を含む。１日平均体重増加とは、ある期間にわたるすべての動物の総体重増加を、動物の総数および期間中の日数で割ったものを指す。総体重増加は、ある期間にわたるすべての動物の全体重増加を指す。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、向上した能力が単胃動物の増進された飼料転換率（ＦＣＲ）を含む。飼料転換率は、飼料質量を増加した体重に転換する際の動物の効率を指す。
【００６０】
いくつかの実施形態においては、能力の向上が単胃動物における病変スコアの低下を含む。例えば、いくつかの実施形態において、動物は家禽であり、病変はクロストリジウム・パーフリンジェンスまたはアイメリア属（アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・テネラ、および／またはアイメリア・マキシマなどであるが、これらに限定されない）に起因する。
【００６１】
いくつかの実施形態においては、能力の向上が単胃動物における死亡率の低下を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態においては、能力の向上が単胃動物における疾患の減少を含む。病原体には、クロストリジウム・パーフリンジェンス、アイメリア属、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・テネラ、アイメリア・マキシマ、および／またはコクシジウム症誘発性寄生虫が含まれる（しかしこれらに限定されない）。疾患および病変スコアの一方または両方は、クロストリジウム・パーフリンジェンス、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・テネラ、アイメリア・マキシマ、またはコクシジウム症誘発寄生虫の１つまたは組合せの結果であり得る。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、能力の向上が病原体発生率の減少を含む。いくつかの実施形態においては、病原体の発生率が動物の生産環境（すなわち、床飼の同腹仔（floor pen litter））および／または動物の腸において低減される。一実施形態においては、動物は家禽であってもよく、能力の向上はクロストリジウム・パーフリンジェンスまたはアイメリア属の１つまたは組合せに起因する病変スコアの低下を含む。別の実施形態において、動物は家禽であり、病原体発生率の減少はサルモネラ発生率の減少である。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例は、本明細書に開示される主題の代表的な実施形態を実施するためのガイダンスを当業者に提供するために含まれている。本発明および当業者の一般的な水準に照らして、当業者は、以下の実施例が単に例示的であることが意図され、現在開示されている主題の範囲から逸脱することなく、多数の変更、修正、および改変が実施され得ることを理解することができる。
【００６５】
〔実施例１〕
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１のプロバイオティクス特性の評価
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を、一連の寒天ウェル拡散アッセイを介して、病原体サロゲート（pathogen surrogate）である大腸菌（E. coli）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、およびカンピロバクター・ハイオインテスティナリス（Campylobacter hyointestinalis）に対して試験した。各アッセイにおいて、病原体サロゲートの１つを３つの寒天プレート上に広げ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を各プレートのウェル内に入れた。次いで、これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。そして写真撮影を行い、病原体とバチルス・リケニフォルミスとの相互作用を示した。
【００６６】
図１ａおよび１ｂは、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１がリステリア・イノキュアおよびサルモネラ・エンテリカそれぞれを過剰増殖させることを示す。
【００６７】
〔実施例２〕
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１のプロバイオティクス特性の評価
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の代わりにバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１を用いて、実施例１の実験を繰り返した。
【００６８】
図２ａおよび２ｂは、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１が大腸菌およびサルモネラ・エンテリカそれぞれの増殖を阻害することを示す。図２ｃは、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１がリステリア・イノキュアよりも増殖することを示す。
【００６９】
〔実施例３〕
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の耐酸性試験
酸性環境に対するプロバイオティクス微生物の耐性は、腸内を通過する前に動物の腸内に存在する過酷な酸性条件にプロバイオティックが暴露されるため、重要な特徴である。バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を、０、１、２、および３時間の時点で、ｐＨ３．０でＬＢ培地に供した。次いで、培地をｐＨ７．０に中和し、そして増殖を６００ｎｍでの吸光度において観察した。バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１について実験を繰り返した。
【００７０】
図３ａに示すように、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の酸性環境への暴露は、中性培地と比較して３時間増殖を遅延させた。バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を酸性環境に１、２、３時間暴露すると回復し、増殖開始することが観察された。図３ｂに示すように、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１も酸暴露から回復することができたが、バチルス・リケニフォルミス株で観察されたよりも遅かった。
【００７１】
〔実施例４〕
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の胆汁耐性試験
胃環境におけるプロバイオティクス微生物の生存には、低ｐＨ環境だけでなく、胃腸管に分泌される酵素も含まれる。伝統的に、雄牛の胆汁（アルコールと混合された雌牛の胆汁）は、胃環境の代表として使用されてきた。バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を、ＬＢ培地中０．３％雄牛の胆汁に０、１、２、または３時間暴露し、図４ａに示すように、６００ｎｍでの吸光度において８時間増殖を観察した。図４ｂに示すように、バチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１について実験を繰り返した。
【００７２】
これらの図は、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の両方がＬＢ培地中の雄牛の胆汁への３時間までの暴露後に回復することができたことを示す。
【００７３】
〔実施例５〕
バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の腸粘膜への接着
腸粘液へのプロバイオティック株の付着は、粘液内層への病原体の接近を制限するので望ましい。バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１を試験し、豚粘液への付着能を評価した。対照としてＡＴＣＣからのバチルス・サブチルス株１６８−ａおよびバチルス・サブチルス株Ｃ１０２（Calsporin）も試験した。タンパク質コーティング（緩衝液のみ）およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）は、対照として使用しなかった。図５に示すように、各株の増殖を観察したところ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１は、バチルス・サブチルス株Ｃ１０２に匹敵する水準で豚粘液に付着していることが示された。
【００７４】
〔実施例６〕
市販ブロイラーへのキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の添加の効果の研究
対象：日齢、混合性別、Ｒｏｓｓ７０８ブロイラー。
【００７５】
統計的設計：無作為化完全ブロックデザイン（ＲＣＢＤ）。
【００７６】
処理：以下の表１に示すように、キシラナーゼ（米国ノースカロライナ州のダーラムのＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なＸＹＬＡＭＡＸ）およびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（「ＰｒｏＢ」）を２つの因子として用いた２×２要因配置（factorial arrangement）。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
持続期間：０〜４２日。
【００７９】
反復：１檻当たり５２羽、１処理当たり８檻。
【００８０】
食餌：すべての処理は以下の表２に示されるように、３段階の食餌（すなわち、開始剤、成長剤、および仕上げ剤）を含んだ。各食餌はトウモロコシ／大豆ベースであったが、標準的なブロイラー食餌と比較して１００ｋｃａｌ／ｋｇ少ない代謝可能エネルギー（ＭＥ）を有した。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
疾患の接種：本研究では、「穏やかな野外様の無症状の接種モデル」を作成するために、作製した同腹仔を使用した。細菌には、クロストリジウム・パーフリンジェンス、アイメリア・アセルブリナ、およびアイメリア・マキシマが含まれた。
【００８３】
反応測定（response measure）：以下の表３に示す。ＢＷ（体重）およびＦＩ（食物摂取量）に基づいて、様々な期間のＢＷＧ（体重増加）群およびＦＣＲ（飼料転換比）群を計算した。
【００８４】
【表４】
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【００８５】
統計的方法：ＡＮＯＶＡ（分散分析）およびＬＳＤ（最小有意差）によって分析した。差は、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなされた。
【００８６】
結果：図６に示すように、キシラナーゼは１４日齢、２１日齢および４２日齢で病変スコアを有意に（ｐ＜０．０５）減少させ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１は１４日齢および２１日齢で病変スコアを有意に（ｐ＜０．０５）減少させた。キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せによる増進は、いずれかの成分の単独の場合よりも大きいことが示された。特に、２１日目および４２日目において、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１を組み合わせる効果は、いずれかの成分の単独の合計よりも大きく、相乗効果を示した（以下の表４も参照のこと、＊は強い相乗効果を示す）。４２日目の時点で、組合せ飼料による増進は、各成分の単独の２倍を超えて顕著であった。したがって、キシラナーゼとバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１との組合せは、動物の健康において相乗的な増進を示す。
【００８７】
【表５】
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【００８８】
図７ａおよび７ｂは、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が２１日齢および４２日齢の鳥のＢＷを有意に増進した（ｐ＜０．０５）ことを示す。さらに、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せによる増進は、いずれかの成分の単独の場合よりも大きいことが示された。
【００８９】
この結果は、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が２１日齢および４２日齢でＦＣＲを有意に（ｐ＜０．０５）増進したことをさらに示す（図８ａおよび８ｂ）。さらに、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せの増進は図８ａおよび８ｂに示されるように、いずれかの成分の単独の場合よりも大きかった。
【００９０】
図９ａおよび９ｂは、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１が２１日齢および４２日齢でサルモネラ発生率を有意に（ｐ＜０．０５）減少させたことを示す。さらに、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せの増進は、いずれかの成分の単独の場合よりも大きかった。
【００９１】
結論：キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１は、トウモロコシ／大豆食餌と併用すると、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよび複数のアイメリア種接種下でブロイラー成長能力および腸の健康を有意に増進した。このデータは、キシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１の組合せの効果が動物の健康に対する相乗的な有益な作用を含むという結論を裏付ける。
【００９２】
〔実施例７〕
キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の市販ブロイラーへの添加の効果の研究
対象：日齢、混合性別、Ｒｏｓｓ７０８ブロイラー。
【００９３】
統計的設計：無作為化完全ブロックデザイン（ＲＣＢＤ）。
【００９４】
処理：表５に示すように、キシラナーゼ（米国ノースカロライナ州のダーラムのＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なｘｙｌ）、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（ＰｒｏＢ）、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（ＰｒｏＹ）、および抗生物質ＢＭＤ（バシトラシンメチレンジシリケート）を変数として用いた６回の処理。
【００９５】
【表６】
2020509743.tif 000008
【００９６】
持続期間：０〜４２日。
【００９７】
反復：１檻当たり５２羽、１処理当たり１０〜６檻。
【００９８】
食餌：すべての処理は上記の表５に示されるように、３段階の食餌（すなわち、開始剤、成長剤、および仕上げ剤）を含んだ。各食餌はトウモロコシ／大豆ベースであったが、標準的なブロイラー飼料比較して１００ｋｃａｌ／ｋｇ少ない代謝可能エネルギー（ＭＥ）を有した。
【００９９】
疾患の接種：本研究では、「穏やかな野外様の無症状の接種モデル」を作成するために、作製した同腹仔を使用した。細菌には、クロストリジウム・パーフリンジェンス、アイメリア・アセルブリナ、およびアイメリア・マキシマ、ならびにアイメリア・テネラが含まれた。
【０１００】
反応測定：上記表５に示すように、種々の期間のＢＷＧ（体重増加）群およびＦＣＲ（飼料転換比）群を、ＢＷ（体重）およびＦＩ（食物摂取）に基づいて計算した。
【０１０１】
統計的方法：データをＡＮＯＶＡおよびＬＳＤによって分析した。差は、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなされた。
【０１０２】
結果：図１０に示すように、２×１０５ＣＦＵ／ｇ以上のキシラナーゼおよびバチルス株（バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を飼料に補充すると、２１日齢で体重が有意に増進した（ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
図１１ａおよび１１ｂに示すように、２×１０５ＣＦＵ／ｇ以上の飼料でキシラナーゼおよびバチルス株（バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）を飼料に補充すると、２１日齢および４２日齢でＦＣＲが有意に増進した（ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
さらに、図１２ａおよび１２ｂは、飼料にキシラナーゼおよびバチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１を２×１０５ＣＦＵ／ｇ以上で供給すると、２１日齢および４２日齢の鳥の死亡率が有意に低下した（ｐ＜０．０５）ことを示す（死亡率は４２日齢で８０％低下した）。対照的に、ＡＧＰ（ＢＭＤ）含有物は、対照からの死亡率を有意に増進しなかった。
【０１０５】
結論：バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１と組み合わせたキシラナーゼは、トウモロコシ／大豆食餌に添加された場合、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよび複数のアイメリア種接種下でブロイラー成長能力を有意に増進した。このデータは、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１とバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１をキシラナーゼと組み合わせると、様々な含有レベル（１０５〜１０６ＣＦＵ／ｇ（飼料））で効果的であることを裏付ける。
【０１０６】
〔実施例８〕
重度のコクシジウム症接種条件下での市販ブロイラーの食餌へのキシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１、およびアミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１の添加の効果
本研究の目的は、消化管病変の重症度を最小限に抑え、標準的なトウモロコシ／大豆食餌を与えられかつ重度のコクシジウム症接種条件下で飼育したブロイラーの全生存率を増進するために、キシラナーゼ（１０Ｕ／ｇ（飼料））、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（１×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（５×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））の組合せの１００ｇ／メートルトン含有の有効性を評価することであった。
【０１０７】
材料および方法：４００匹の雄Ｒｏｓｓ７０８ブロイラーヒヨコを、４つの食餌処理のうちの１つに無作為に割り当て、１処理あたり７回のバタリーケージ（ただし、４回のケージを含む未接種陽性対照である処理１を除く）、そして１ケージあたり１６羽の鳥を用いた。鳥を２８日間飼育し、マッシュ、トウモロコシ−大豆ベースの食餌を自由に与えた。処理２〜４の鳥を、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマおよびアイメリア・テネラの高免疫原性コクシジオスタット感受性株の生オーシストを含む生ワクチンで、１ｍＬ／鳥の割合（ワクチン製造業者の推奨用量の１０倍）で強制経口投与によって２回接種した。処理１の鳥、すなわち、未接種陽性対照を、１ｍＬ／鳥の割合の蒸留水で強制経口投与した。すべての処理群において、１日齢および７日齢の両方で強制経口投与を行った。処理３および４では、飼料にキシラナーゼ（１０Ｕ／ｇ（飼料））、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（１×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））、およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（５×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））（「Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ」と称する）または市販のコクシジオスタット（サリノマイシンナトリウム）（「コクシジオスタット」と称する）のいずれかを補充した。評価した主要パラメータは、上管腸病変スコア、中管腸病変スコア、死亡率／生存率、および飼料転換率（ＦＣＲ）であった。
【０１０８】
結果および考察：上腸の球菌関連肉眼病変はアイメリア・アセルブリナ感染と密接に関連しており、最初の感染から７日以内に最も重篤であることが多い。接種後７日目（１４日齢）に、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙの単独では、接種した対照と比較して、３６％上管病変スコアを低下させた（データは図示せず）。
【０１０９】
腸の中央部（回腸ならびに十二指腸および空腸の一部からなる）は、アイメリア・マキシマに最も感染しやすい。接種後１４日目に、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙの単独では、接種した対照と比較して、中管病変スコアを５０％低下させた（データ図示せず）。
【０１１０】
本研究で実施されたアイメリア接種レジメンは、接種された対照群の２８日死亡率において、未接種対照と比較して有意な増加（Ｐ＜０．０２）をもたらした。データを図１３に示す。しかし、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ処理では接種した対照と比較して、死亡率が８７％有意に減少した（Ｐ＜０．０２）。対して、コクシジオスタット処理は、死亡率を２５％減少させただけであった。
【０１１１】
２８日目に、接種した対照に対して、Ｘｙｌ＋Ｂ＋Ｙ処理において、飼料転換率を７ポイント低下させた。２８日目の体重は、処理によって影響されず、一連の処理にわたって平均１２２６ｇ／鳥であった（データは図示せず）。
【０１１２】
結論として、重度のコクシジウムの条件下ではキシラナーゼ（１０Ｕ／ｇ（飼料））、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１（１×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１（５×１０５ＣＦＵ／ｇ（飼料））の組合せのみにおいて、腸病変の重症度を低下させることによってブロイラーの腸の健康を効果的に保護し、それによって腸機能を維持し、栄養素の効果的な利用を促進することができる。この組合せ（キシラナーゼ、バチルス・リケニフォルミス株ＰＷＤ−１およびバチルス・アミロリケファシエンス株Ｂａ−ＢＰＤ１）は、コクシジオスタット単独の場合よりも、重篤なアイメリア感染を患う鳥の死亡率を最小限に抑えるのに有効であり得る。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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