(57)【要約】三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体（例えば、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体）またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体（例えば、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２）またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法であって、
（ｉ）Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、前記抗体組成物を前記樹脂に接触させることと、
（ｉｉ）約３．８〜約５．０のｐＨの溶出組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｉｉｉ）前記樹脂から溶出したＨ２Ｌ２組成物を収集することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法であって、
（ｉ）Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、前記抗体組成物を前記樹脂に接触させることと、
（ｉｉ）約３００ｍＭ〜約６００ｍＭの塩濃度の溶出組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｉｉｉ）前記樹脂から溶出したＨ２Ｌ２組成物を収集することと、を含む、前記方法。
【請求項３】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の２％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の１％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の０．５％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、前記カチオン交換樹脂に適用された前記抗体組成物中に２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の前記Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜９のカラム体積から選択される１つ以上の溶出されたカラム体積を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜４の溶出されたカラム体積を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カチオン交換樹脂が、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カチオン交換樹脂が、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カチオン交換樹脂の粒径が、約５０μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カチオン交換樹脂が、二峰性孔径分布を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記二峰性孔径分布が、直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記カチオン交換樹脂が、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎ  ＸＳである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶出組成物が、塩を含む、請求項１または３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶出組成物中の前記塩が、塩化物塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩化物塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または塩化マグネシウムである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出組成物中の塩濃度が、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約３５０ｍＭ〜約４５０ｍＭである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出組成物中の前記塩濃度が、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭまたは約３５０ｍＭ〜約４５０ｍＭである、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶出組成物中の前記塩濃度が、約４００ｍＭである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶出組成物が、約３．８〜約６．５のｐＨを有する、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶出組成物が、約３．８〜約５．０のｐＨを有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶出組成物が、約４．２のｐＨを有する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、平衡組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させた後に、前記抗体組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させることを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記平衡組成物が、酢酸ナトリウムを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記平衡組成物中の前記酢酸ナトリウムの濃度が、約１０ｍＭ〜１５０ｍＭである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記平衡組成物中の前記酢酸ナトリウムの前記濃度が、約５０ｍＭである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記平衡組成物が、約３．８〜約６．５のｐＨを有する、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記平衡組成物が、約４．２のｐＨを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体組成物が、約１０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体組成物が、約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌまたは約３５ｇ／Ｌ〜約４５ｇ／Ｌのタンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体組成物が、約４０ｇ／Ｌのタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体組成物が、約３．８〜約６．５のｐＨを有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体組成物が、約４．２のｐＨを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約２０％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約１５％、または約５％〜約１５％、または約３％〜約１２％、または約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、前記カチオン交換樹脂に接触させた前記抗体組成物中に少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％の前記Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体組成物が、システイン操作抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記システイン操作抗体またはその抗原結合断片が、ＥＵ／ＯＵ番付位置４４２に操作されたシステイン残基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体組成物が、抗体を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体組成物が、抗体の抗原結合断片を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体組成物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体組成物が、ＣＨＯ細胞株から産生された抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を細胞毒にコンジュゲートして、イムノコンジュゲート組成物を形成することをさらに含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法により産生されたＨ２Ｌ２組成物。
【請求項４７】
２％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項４６に記載のＨ２Ｌ２組成物。
【請求項４８】
１％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項４７に記載のＨ２Ｌ２組成物。
【請求項４９】
０．５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項４８に記載のＨ２Ｌ２組成物。
【請求項５０】
請求項４５に記載の方法により産生されたイムノコンジュゲート組成物。
【請求項５１】
２％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５０に記載のイムノコンジュゲート組成物。
【請求項５２】
１％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５１に記載のイムノコンジュゲート組成物。
【請求項５３】
０．５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５２に記載のイムノコンジュゲート組成物。
【請求項５４】
（ｉ）前記カチオン交換樹脂が、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む二峰性孔径分布を有し、
（ｉｉ）前記溶出組成物が、約３００〜６００ｍＭの塩化物塩、及び約３．８〜約５．０のｐＨを含み、
（ｉｉｉ）前記抗体組成物が、約１０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質を含み、前記抗体組成物中の約１０％〜約１５％の前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、
（ｉｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜９のカラム体積から選択される１つ以上の溶出されたカラム体積を含み、
（ｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の２％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
（ｉ）前記カチオン交換樹脂が、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む二峰性孔径分布を有し、
（ｉｉ）前記溶出組成物が、約４００ｍＭ  ＮａＣｌ及び４．２のｐＨを有し、
（ｉｉｉ）前記抗体組成物が、約３０〜約５０ｇ／Ｌのタンパク質を含み、前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、
（ｉｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜４の溶出されたカラム体積を含み、
（ｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の１％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗ＣＤ１２３抗体組成物から分離する方法であって、
（ｉ）抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、前記抗ＣＤ１２３抗体組成物を前記樹脂に接触させることと、
（ｉｉ）約３．８〜約５．５のｐＨの溶出組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｉｉｉ）前記樹脂から溶出した抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２組成物を収集することと、を含み、
前記抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び前記抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む、前記方法。
【請求項５７】
抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗ＣＤ１２３抗体組成物から分離する方法であって、
（ｉ）抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、前記抗ＣＤ１２３抗体組成物を前記樹脂に接触させることと、
（ｉｉ）約３００ｍＭ〜約６００ｍＭの塩濃度の溶出組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｉｉｉ）前記樹脂から溶出した抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２組成物を収集することと、を含み、
前記抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び前記抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む、前記方法。
【請求項５８】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号１の可変重鎖配列を含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２の可変軽鎖配列を含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、システイン操作されている、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号３の重鎖配列を含む、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号４の軽鎖配列を含む、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の２％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の１％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の０．５％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片である、請求項５６〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、前記カチオン交換樹脂に接触させた前記抗体組成物中に２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の前記Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜９のカラム体積から選択される１つ以上の溶出されたカラム体積を含む、請求項５６〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜４の溶出されたカラム体積を含む、請求項５６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記カチオン交換樹脂が、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含む、請求項５６〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記カチオン交換樹脂が、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性を有する、請求項５６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記カチオン交換樹脂の粒径が、約５０μｍである、請求項５７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記カチオン交換樹脂が、二峰性孔径分布を有する、請求項５６〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記二峰性孔径分布が、直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記カチオン交換樹脂が、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎ  ＸＳである、請求項５６〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記溶出組成物が、塩を含む、請求項５６または５８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記溶出組成物中の前記塩が、塩化物塩である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記塩化物塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または塩化マグネシウムである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記溶出組成物中の塩濃度が、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約３５０ｍＭ〜約４５０ｍＭである、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記溶出組成物中の前記塩濃度が、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭまたは約３５０ｍＭ〜約４５０ｍＭである、請求項５７〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記溶出組成物中の前記塩濃度が、約４００ｍＭである、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記溶出組成物が、約３．８〜約６．５のｐＨを有する、請求項５７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記溶出組成物が、約３．８〜約５．０のｐＨを有する、請求項５６〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記溶出組成物が、約４．２のｐＨを有する、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記方法が、平衡組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させた後に、前記抗体組成物を前記カチオン交換樹脂に接触させることを含む、請求項５６〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記平衡組成物が、酢酸ナトリウムを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記平衡組成物中の前記酢酸ナトリウムの濃度が、約１０ｍＭ〜１５０ｍＭである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記平衡組成物中の前記酢酸ナトリウムの前記濃度が、約５０ｍＭである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記平衡組成物が、約３．８〜約６．５のｐＨを有する、請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記平衡組成物が、約４．２のｐＨを有する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体組成物が、約１０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質を含む、請求項５６〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗体組成物が、約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌまたは約３５ｇ／Ｌ〜約４５ｇ／Ｌのタンパク質を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体組成物が、約４０ｇ／Ｌのタンパク質を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗体組成物が、約３．８〜約６．５のｐＨを有する、請求項５６〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗体組成物が、約４．２のｐＨを有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約２０％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項５６〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約１５％、または約５％〜約１５％、または約３％〜約１２％、または約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｈ２Ｌ２組成物が、前記カチオン交換樹脂に接触させた前記抗体組成物中に少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％の前記Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５６〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記抗体組成物が、システイン操作抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５６〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記システイン操作抗体またはその抗原結合断片が、ＥＵ／ＯＵ番付位置４４２に操作されたシステイン残基を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗体組成物が抗体を含む、請求項５６〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗体組成物が、抗体の抗原結合断片を含む、請求項５６〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記抗体組成物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項５６〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記抗体組成物が、ＣＨＯ細胞株から産生された抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５６〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を細胞毒にコンジュゲートして、イムノコンジュゲート組成物を形成することをさらに含む、請求項５６〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
請求項５６〜１０５のいずれか１項に記載の方法により産生されたＨ２Ｌ２組成物。
【請求項１０７】
２％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０６に記載のＨ２Ｌ２組成物。
【請求項１０８】
１％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０７に記載のＨ２Ｌ２組成物。
【請求項１０９】
０．５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０８に記載のＨ２Ｌ２組成物。
【請求項１１０】
請求項１０５に記載の方法により産生されたイムノコンジュゲート組成物。
【請求項１１１】
２％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１１０に記載のイムノコンジュゲート組成物。
【請求項１１２】
１％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１１１に記載のイムノコンジュゲート組成物。
【請求項１１３】
０．５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１１２に記載のイムノコンジュゲート組成物。
【請求項１１４】
（ｉ）前記カチオン交換樹脂が、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む二峰性孔径分布を有し、
（ｉｉ）前記溶出組成物が、約３００〜６００ｍＭの塩化物塩、及び約３．８〜約５．０のｐＨを含み、
（ｉｉｉ）前記抗体組成物が、約１０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質を含み、前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、
（ｉｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜９のカラム体積から選択される１つ以上の溶出されたカラム体積を含み、
（ｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の２％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項５６に記載の方法。
【請求項１１５】
（ｉ）前記カチオン交換樹脂が、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む二峰性孔径分布を有し、
（ｉｉ）前記溶出組成物が、約４００ｍＭ  ＮａＣｌ及び４．２のｐＨを有し、
（ｉｉｉ）前記抗体組成物が、約３０〜約５０ｇ／Ｌのタンパク質を含み、前記抗体組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、
（ｉｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物が、１〜４の溶出されたカラム体積を含み、
（ｖ）前記Ｈ２Ｌ２組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の１％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項５７に記載の方法。
【請求項１１６】
抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片を含む組成物であって、前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の１％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む、前記組成物。
【請求項１１７】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号１の可変重鎖配列を含む、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２の可変軽鎖配列を含む、請求項１１６または１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、システイン操作されている、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号３の重鎖配列を含む、請求項１１６〜１１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号４の軽鎖配列を含む、請求項１１６〜１２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の０．５％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項１１６〜１２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２３】
抗ＣＤ１２３イムノコンジュゲートを含む組成物であって、前記イムノコンジュゲートが、ＤＧＮ５４９−Ｃに連結された抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の１％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む、前記組成物。
【請求項１２４】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号１の可変重鎖配列を含む、請求項１２３に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２の可変軽鎖配列を含む、請求項１２３または１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片が、システイン操作されている、請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号３の重鎖配列を含む、請求項１２３〜１２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記抗ＣＤ１２３抗体が、配列番号４の軽鎖配列を含む、請求項１２３〜１２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記イムノコンジュゲートが次の構造を有する、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の組成物。
【化４】
2020534332.tif 000011
【請求項１３０】
前記抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の０．５％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１２９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２２日出願の米国仮出願第６２／５６２，１８８号（参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
電子的に提出された配列表への言及
電子的に提出された配列表（名称：２９２１＿０９７ＰＣ０１＿ＳＴ２５；サイズ：１５，７３６バイト；及び作成日：２０１８年９月２１日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明の分野は、概して、三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体（例えば、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体）またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体（例えば、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２）またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
反応性システイン残基で操作された組換え抗体、すなわち、「システイン操作抗体」は、関心の薬物に共有結合的にコンジュゲートされて、標的治療を創出することができる。そのようなシステイン操作抗体を発現するように安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞が三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体として知られる高分子量種も分泌することが研究で示された（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（４）：７４８−６０（２０１０））。Ｈ２Ｌ３システイン修飾抗体は、余分な軽鎖とＨ２Ｌ２システイン修飾抗体上の操作されたシステイン残基のうちの１つとの間のジスルフィド結合形成の産物である。細胞培養物中のＨ２Ｌ３システイン修飾抗体のレベルは、細胞株及び培養条件に関係している。細胞培養条件は、Ｈ２Ｌ３形成を最小限に抑えるために修正することができる（例えば、細胞培養中に温度シフトを用いることにより）が、影響は細胞株に大きく依存する（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｆ．２６（５）：１４３８−４５（２０１０））。
【０００５】
単量体種との類似性により、Ｈ２Ｌ３抗体の分離は、モノクローナルＨ２Ｌ２システイン修飾抗体の下流精製中の課題となる。１つの特定の研究では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が、システイン操作されていないモノクローナル抗体の精製において、Ｈ２Ｌ３レベルを約３％から０．５％に低減することが分かった（Ｗｏｌｌａｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ５（６）：９２５−９３５（２０１３））。同じ研究において、カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、Ｈ２Ｌ３抗体を除去しようと試みた。しかしながら、修正した条件下でも、このプロセスは、試験した細胞株すべてにおいてＨ２Ｌ３のパーセンテージを１％未満に低下させるのに十分ではなかった。著者らは、カチオン交換クロマトグラフィーにおける静電作用がＨ２Ｌ３抗体を除去するのに十分に強くないと結論付けた。よって、最も一貫した抗体産物（例えば、治療用抗体及びそのような抗体を含有するイムノコンジュゲートのための）を達成するために、抗体精製中にＨ２Ｌ３種をより効果的に分離する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（４）：７４８−６０（２０１０）
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｆ．２６（５）：１４３８−４５（２０１０）
【非特許文献３】Ｗｏｌｌａｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ５（６）：９２５−９３５（２０１３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体を二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体から分離するための効果的な精製方法の開発に関する。本方法は、カチオン交換樹脂が主に電荷に基づいてタンパク質を分離するという事実を利用する。本明細書に提供されるように、樹脂のｐＨが関心の抗体のｐＨよりも低い場合（例えば、３．８〜６．５）、Ｈ２Ｌ３及びＨ２Ｌ２の両方を含むすべての抗体種はカチオン交換樹脂に結合する。高ｐＨ及び／または低塩濃度の溶出組成物を使用して抗体をカチオン交換樹脂から溶出する場合、Ｈ２Ｌ３種は、Ｈ２Ｌ２種の主ピークの溶出後の後の画分で溶出するだけでなく、所望のＨ２Ｌ２種を含有する初期の画分でも溶出する。しかしながら、本明細書で示されるように、より低いｐＨ及びより高い塩濃度の使用によるカチオン交換樹脂を最適化することにより、Ｈ２Ｌ３種の大半またはすべてをＨ２Ｌ２種の主ピークの溶出後の後の画分で溶出させることができる。最適化したＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳ強カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、抗体組成物中のＨ２Ｌ３抗体の量を１１％から１％未満に低減することができ、この低減レベルは様々な細胞株において再現性がある。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法は、（ｉ）Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、抗体組成物をこの樹脂に接触させることと、（ｉｉ）約３．８〜約５．０のｐＨの溶出組成物をカチオン交換樹脂に接触させることと、（ｉｉｉ）樹脂から溶出したＨ２Ｌ２組成物を収集することと、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法は、（ｉ）Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、抗体組成物をこの樹脂に接触させることと、（ｉｉ）約３００ｍＭ〜約６００ｍＭの塩濃度の溶出組成物をカチオン交換樹脂に接触させることと、（ｉｉｉ）樹脂から溶出したＨ２Ｌ２組成物を収集することと、を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗ＣＤ１２３抗体組成物から分離する方法は、（ｉ）抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、抗ＣＤ１２３抗体組成物をこの樹脂に接触させることと、（ｉｉ）約３．８〜約５．５のｐＨの溶出組成物をカチオン交換樹脂に接触させることと、（ｉｉｉ）樹脂から溶出した抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２組成物を収集することと、を含み、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗ＣＤ１２３抗体組成物から分離する方法は、（ｉ）抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、抗ＣＤ１２３抗体組成物をこの樹脂に接触させることと、（ｉｉ）約３００ｍＭ〜約６００ｍＭの塩濃度の溶出組成物をカチオン交換樹脂に接触させることと、（ｉｉｉ）樹脂から溶出した抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２組成物を収集することと、を含み、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及び抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の２％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の１％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の０．５％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、カチオン交換樹脂に接触させらされた抗体組成物中に２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜９のカラム体積から選択される１つ以上の溶出されたカラム体積を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜４の溶出されたカラム体積を含む。いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含む。いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂は、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性を有する。いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂の粒径は、約５０μｍである。いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂は、二峰性孔径分布を有する。いくつかの実施形態では、二峰性孔径分布は、直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む。いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂は、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎ  ＸＳである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、溶出組成物は、塩を含む。いくつかの実施形態では、溶出組成物中の塩は、塩化物塩である。いくつかの実施形態では、塩化物塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または塩化マグネシウムである。いくつかの実施形態では、溶出組成物中の塩濃度は、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約３５０ｍＭ〜約４５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出組成物中の塩濃度は、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭまたは約３５０ｍＭ〜約４５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出組成物中の塩濃度は、約４００ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出組成物は、約３．８〜約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出組成物は、約３．８〜約５．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出組成物は、約４．２のｐＨを有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本方法は、平衡組成物をカチオン交換樹脂に接触させた後に、抗体組成物をカチオン交換樹脂に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、平衡組成物は、酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、平衡組成物中の酢酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ〜１５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、平衡組成物中の酢酸ナトリウム濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、平衡組成物は、約３．８〜約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、平衡組成物は、約４．２のｐＨを有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗体組成物は、約１０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌまたは約３５ｇ／Ｌ〜約４５ｇ／Ｌのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、約４０ｇ／Ｌのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、約３．８〜約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、約４．２のｐＨを有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抗体組成物中の抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約２０％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体組成物中の抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約１５％、または約５％〜約１５％、または約３％〜約１２％、または約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、カチオン交換樹脂に接触させた抗体組成物中に少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％のＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、抗体組成物は、システイン操作抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、システイン操作抗体またはその抗原結合断片は、ＥＵ／ＯＵ番付位置４４２に操作されたシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、抗体の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、ＣＨＯ細胞株から産生された抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物中のＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を細胞毒にコンジュゲートして、イムノコンジュゲート組成物を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲート組成物は、本明細書に記載される方法により産生される。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲート組成物は、２％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲート組成物は、１％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲート組成物は、０．５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、本明細書に記載される方法により産生される。２％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項４６に記載のＨ２Ｌ２組成物。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、１％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２組成物は、０．５％以下のＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、（ｉ）カチオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む二峰性孔径分布を有し、（ｉｉ）溶出組成物は、約３００〜６００ｍＭの塩化物塩、及び約３．８〜約５．０のｐＨを含み、（ｉｉｉ）抗体組成物は、約１０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質を含み、抗体組成物中の抗体またはその抗原結合断片の約１０％〜約１５％は、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、（ｉｖ）Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜９のカラム体積から選択される１つ以上の溶出されたカラム体積を含み、（ｖ）Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の２％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、（ｉ）カチオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を含む二峰性孔径分布を有し、（ｉｉ）溶出組成物は、約４００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び約４．２のｐＨを含み、（ｉｉｉ）抗体組成物は、約３０〜約５０ｇ／Ｌのタンパク質を含み、抗体組成物中の抗体またはその抗原結合断片の約１０％〜約１５％は、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、（ｉｖ）Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜４の溶出されたカラム体積を含み、（ｖ）Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の１％以下が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片を含み、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の１％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体は、配列番号１の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２の可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、システイン操作されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体は、配列番号３の重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体は、配列番号４の軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の０．５％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＣＤ１２３イムノコンジュゲートを含み、イムノコンジュゲートは、ＤＧＮ５４９−Ｃに連結された抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片を含み、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の１％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号５〜７の可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、それぞれ、配列番号８〜１０の可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体は、配列番号１の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２の可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、システイン操作されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体は、配列番号３の重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体は、配列番号４の軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは次の構造を有する：
【化１】
2020534332.tif 000002
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片の０．５％未満が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】プロテインＡ精製後のシステイン操作モノクローナル抗体（ＣｙｓｍＡｂ）のサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＵＰＬＣ）のクロマトグラムを示す。示されるピークは、ＣｙｓｍＡｂ単量体、凝集体、三重軽鎖抗体（Ｈ２Ｌ３）、及び低分子量（ＬＭＷ）種を表す。クロマトグラムのｙ軸は、吸光度の強度の尺度（ＡＵ（またはＡｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）の単位）である。ｘ軸は、時間単位（分）であり、各ピークの保持時間を決定するために使用される。
【図２】異なるバイオリアクター産生バッチ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨ）における凝集体（暗灰色の棒）及びＨ２Ｌ３（薄灰色の棒）抗体のパーセンテージを示す。バッチＡ及びＢの凝集体及びＨ２Ｌ３抗体は細胞株Ａで産生された。バッチＣ及びＤの凝集体及びＨ２Ｌ３抗体は細胞株Ｂで産生された。バッチＥ、Ｆ、Ｇ、及びＨの凝集体及びＨ２Ｌ３抗体は細胞株Ｃで産生された。
【図３】様々な塩濃度（１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、または８５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液）下でのセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）精製後の溶出物中のＨ２Ｌ３抗体のパーセンテージを示す。充填Ｈ２Ｌ３％（暗灰色の棒）、溶出物Ｈ２Ｌ３％（薄灰色の棒）。
【図４】凝集体及びＨ２Ｌ３種の溶出プロファイルにオーバーレイしたシステイン操作ｍＡｂ種の溶出プロファイルを示す。画分収率％（黒線）、凝集体％（薄灰色の棒）、及びＨ２Ｌ３％（暗灰色の棒）は、画分１〜１０（Ｆ１〜Ｆ１０）（ｘ軸）の各々について測定された。
【図５】異なる溶出ｐＨの溶出プールにおけるＨ２Ｌ３のパーセンテージを示す。高ｐＨ（実線、黒丸）、中ｐＨ（点線、白丸）、低ｐＨ（破線、黒丸）、開始Ｈ２Ｌ３（黒の直線）。
【図６】様々なＮａＣｌ濃度（４２０ｍＭ、４１０ｍＭ、４００ｍＭ、３９０ｍＭ、及び３８０ｍＭ）及び収集体積（ＣＶ１〜３、ＣＶ１〜４、ＣＶ１〜５、及び７ＣＶ以下）の溶出物におけるＨ２Ｌ３のパーセンテージを示す。開始Ｈ２Ｌ３（黒の直線）。
【図７】ＣｙｓｍＡｂの精製についての統計上の望ましさ分析に基づくＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳカチオン交換クロマトグラフィーの最終溶出条件を示す。
【図８】図８Ａは、ＩＭＧＮ６３２の化学構造を示す。ＩＭＧＮ６３２は、亜硫酸水素ナトリウム中の細胞毒性ペイロードＤＧＮ５４９−Ｃに連結された抗ＣＤ１２３  Ｇ４７２３抗体を含有するイムノコンジュゲートを含む組成物である。組成物中の大半のイムノコンジュゲートは、図８Ａに示されるスルホン化型である。図８Ｂは、ＩＭＧＮ６３２組成物中にも存在し得る細胞毒性ペイロードＤＧＮ５４９−Ｃ（モノ−イミン構造）に連結された抗ＣＤ１２３  Ｇ４７２３抗体を含有するイムノコンジュゲートの非スルホン化形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、Ｈ２Ｌ３抗体（例えば、抗ＣＤ１２３  Ｈ２Ｌ３抗体）またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体（例えば、抗ＣＤ１２３抗体）またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法を提供する。
【００２９】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句を以下に定義する。
【００３０】
「カチオン交換樹脂」は、負に帯電しており、固相を通るまたは通過する水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する固相を指す。例えば、カルボキシレート、スルホネート、及びその他の、カチオン交換樹脂を形成するのに適した固相に結合された任意の負に帯電したリガンドを使用することができる。市販のカチオン交換樹脂としては、限定されないが、例えば、スルホネートベースの基、スルホエチルベースの基、スルホプロピルベースの基、スルホイソブチルベース、スルホキシエチルベースの基、カルボキシメチルベースの基、スルホン酸及びカルボン酸ベースの基、カルボン酸ベースの基、スルホン酸ベースの基、ならびにオルトホスフェートベースの基を有するものが挙げられる。本明細書に提供されるように、タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、カチオン交換樹脂の負に帯電した基とタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）上の正に帯電した基との間の相互作用に基づいて分離され得る。
【００３１】
「溶出」という用語及びその文法的変形は、関心のタンパク質が樹脂に結合することができず、したがって、樹脂（例えば、クロマトグラフィーカラム）から溶出されるように、適切な条件を使用すること、例えば、樹脂（例えば、クロマトグラフィー材料）の周囲の緩衝液のイオン強度もしくはｐＨを変更することにより、分子の疎水性を変更することにより、またはリガンドの化学性質（例えば、電荷）を変化させることにより、樹脂（例えば、クロマトグラフィー材料）からの分子、例えば、関心のポリペプチドの除去を指す。「溶出物」という用語は、溶出がカラムに適用されたとき、関心のポリペプチドを含有する樹脂（例えば、カラム）からの流出物を指す。関心のポリペプチドの溶出後、樹脂（例えば、カラム）は、必要に応じて、再生、消毒、及び保管される。
【００３２】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体が所望の生物活性を示す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及び任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のうちのいずれかであり得、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づく。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる及び周知のサブユニット構造ならびに三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであり得るか、または毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートされ得る。
【００３３】
「抗体断片」という用語は、カチオン交換樹脂に結合するのに十分な正の電荷を有する無傷の抗体の一部を指す。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合し、カチオン交換樹脂に結合するのに十分な正の電荷を有する無傷の抗体の一部を指す。抗原結合断片は、無傷の抗体の抗原決定可変領域を含有することができる。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、ならびに単鎖抗体が含まれる。
【００３４】
「三重軽鎖」もしくは「Ｈ２Ｌ３」抗体または抗原結合断片という用語は、２つの重鎖またはその断片及び３つの軽鎖またはその断片を含有する抗体またはその抗原結合断片を指す。
【００３５】
「二重軽鎖」もしくは「Ｈ２Ｌ２」抗体または抗原結合断片という用語は、２つの重鎖またはその断片及び２つの軽鎖またはその断片を含有する抗体またはその抗原結合断片を指す。
【００３６】
「抗体組成物」という用語は、抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を指す。抗体組成物は、細胞培養において（例えば、ＣＨＯ細胞から）産生され、プロテインＡカラムを使用して精製され、任意選択でアニオン交換カラムを使用してさらに精製された抗体及び他の構成成分を含み得る。抗体またはその抗原結合断片に加えて、抗体組成物は、例えば、トリス酢酸を含有し得る。抗体組成物は凝集体も含有し得る。
【００３７】
「Ｈ２Ｌ２」組成物は、カチオン交換樹脂に接触させた抗体組成物よりも大きい割合のＨ２Ｌ２種を含有するカチオン交換樹脂から溶出された組成物を指す。
【００３８】
「Ｈ２Ｌ３」組成物は、カチオン交換樹脂に接触させた抗体組成物よりも大きい割合のＨ２Ｌ３種を含有するカチオン交換樹脂から溶出された組成物を指す。
【００３９】
「システイン操作」抗体またはその抗原結合断片という用語は、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または重鎖の所与の残基に通常存在しない少なくとも１つのシステイン（「Ｃｙｓ」）を有する抗体またはその抗原結合断片を含む。「操作されたＣｙｓ」とも称される場合があるそのようなＣｙｓは、任意の従来の分子生物学または組換え技術を使用して（例えば、Ｃｙｓのコード配列を有する標的残基でコード配列を非Ｃｙｓ残基で置き換えることにより）操作することができる。例えば、元の残基が５’−ＵＣＵ−３’のコード配列を有するＳｅｒである場合、コード配列は、（例えば、部位特異的変異誘発により）Ｃｙｓをコードする５’−ＵＧＵ−３’に変異し得る。ある特定の実施形態では、Ｃｙｓ操作抗体またはその抗原結合断片は、重鎖に操作されたＣｙｓを有する。ある特定の実施形態では、操作されたＣｙｓは、重鎖のＣＨ３ドメインにまたはその近くにある。ある特定の実施形態では、操作されたＣｙｓは、重鎖の残基４４２にある（ＥＵ／ＯＵ番付；ＥＵ  ｉｎｄｅｘ，Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスにより番付される位置２３９、２８２、２８９、２９７、３１２、３２４、３３０、３３５、３３７、３３９、３５６、３５９、３６１、３８３、３８４、３９８、４００、４４０、４２２、及び４４２のうちの１つ以上にシステインを含む。ある特定の実施形態では、次の残基のうちの任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番付）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番付）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番付）。ある特定の実施形態では、例えば、ｓｃＦｖの可変軽鎖ドメインは、Ｋａｂａｔ位置１００にシステインを有する。ある特定の実施形態では、例えば、ｓｃＦｖの可変重鎖ドメインは、Ｋａｂａｔ位置４４にシステインを有する。システイン操作抗体は、米国特許第７，５２１，５４１号、米国特許第７，８５５，２７５号、米国公開出願第２０１１００３３３７８号、及びＷＯ２０１１／００５４８１に記載されるように生成され得る。
【００４０】
「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片は、単一の抗原決定基またはエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均一な抗体または抗原結合断片集団を指す。これは、典型的に、異なる抗原決定基に向けられる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片という用語は、無傷である完全長モノクローナル抗体、ならびに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子の両方を包含する。さらに、「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片は、限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物を含む任意の数の様式で作製された、そのような抗体及びその抗原結合断片を指す。
【００４１】
「ヒト化」抗体またはその抗原結合断片という用語は、最小の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有する特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはその断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体または抗原結合断片の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲからの残基で置き換えられるヒト免疫グロブリンである（「ＣＤＲグラフト」）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種からの抗体または断片の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片の特異性、親和性、及び／または能力を洗練及び最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域において及び／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかの追加の残基の置換によりさらに修飾され得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであるのに対し、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてを含有する少なくとも１つ、典型的には２つまたは３つの実質的にすべての可変ドメインを含む。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをさらに含むこともできる。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９−９７３（１９９４）、及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５−９０４（１９９６）に記載されている。いくつかの実施形態では、「ヒト化抗体」は、再表面化抗体である。
【００４２】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域の、単独または組み合わせのいずれかを指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより近接して一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技法が存在する：（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．），「Ｋａｂａｔ」）、及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７））。加えて、これらの２つのアプローチの組み合わせは、ＣＤＲを決定するために当技術分野で時おり使用される。
【００４３】
可変ドメインにおける残基を参照する場合（およそ残基１〜１０７の軽鎖及び残基１〜１１３の重鎖）、Ｋａｂａｔ番付システムが一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（５ｔｈ  Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（「Ｋａｂａｔ」）。
【００４４】
Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置の番付は、Ｋａｂａｔらにおける抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番付システムを指す（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（５ｔｈ  Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、「Ｋａｂａｔ」）。この番付システムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入される残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔ番付は、「標準的な」Ｋａｂａｔ番付された配列を伴う抗体の配列の相同性領域のアラインメントにより、所与の抗体について決定され得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ番付規定を使用して番付された場合のＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの終わりは、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で異なる（これは、Ｋａｂａｔ番付案が挿入をＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに配置するためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終了し、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用される。
【表Ａ】
2020534332.tif 000003
【００４５】
「ヒト」抗体またはその抗原結合断片という用語は、ヒトにより産生された抗体もしくはその抗原結合断片、または当該技術分野で知られている任意の技法を使用して作製された、ヒトにより産生された抗体もしくはその抗原結合断片に対応するアミノ酸配列を有する抗体もしくはその抗原結合断片を意味する。このヒト抗体またはその抗原結合断片の定義は、無傷または完全長抗体及びその断片を含む。
【００４６】
「キメラ」抗体またはその抗原結合断片という用語は、アミノ酸配列が２つ以上の種に由来する、抗体またはその抗原結合断片を指す。典型的に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の１種に由来する抗体または抗原結合断片の可変領域に対応し、一方、定常領域は、その種における免疫応答の誘発を避けるために、別（通常はヒト）に由来する抗体または抗原結合断片の配列と相同である。
【００４７】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書で互換的に使用され、特定の抗体によって認識され、特異的に結合され得る抗原のその部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置される隣接するアミノ酸及び非連続アミノ酸からの両方を形成し得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは典型的に、タンパク質の変性時に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは典型的に、タンパク質の変性時に欠失する。エピトープは、典型的に、独特の空間的高次構造において少なくとも３、より一般的には少なくとも５、または８〜１０のアミノ酸を含む。
【００４８】
「結合親和性」は、一般的に、分子の単一結合部位（例えば、抗体）と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記されない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方で、高親和性抗体は一般的に抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、そのいずれも本発明の目的に使用することができる。特定の例示的な実施形態が以下に記載される。
【００４９】
結合親和性を指すために本明細書で使用される場合の「またはより良い」とは、分子とその結合パートナーとの間のより強い結合を指す。本明細書で使用される場合の「またはより良い」とは、より小さな数値のＫｄ値によって表される、より強い結合を指す。例えば、抗体は、「０．６ｎＭまたはより良い」抗原に対する親和性を有し、抗原に対する抗体の親和性は＜０．６ｎＭ、すなわち０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭなど、または０．６ｎＭ未満の任意の値である。
【００５０】
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間にある相補性を伴うことを意味する。この定義により、抗体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するであろうよりも容易にその抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書において、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができるか、または抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００５１】
「優先的に結合する」とは、抗体が、関連の、同等の、相同の、または類似のエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。よって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープと交差反応することができても、関連エピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高いであろう。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得、それは、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断することができる。本用語はまた、天然に修飾されている、または介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分によるコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）ならびに当該技術分野で知られている他の修飾を含有するポリペプチドもまた、定義の中に含められる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくため、ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として存在し得ることが理解される。
【００５３】
本明細書で使用される「イムノコンジュゲート」または「コンジュゲート」という用語は、細胞結合剤（すなわち、抗ＣＤ１２３抗体またはその断片）に連結され、一般式：Ｃ−Ａによって定義される化合物またはその誘導体を指し、式中、Ｃ＝細胞毒（例えば、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）及び四環系ベンゾジアゼピン、例えばインドリノベンゾジアゼピンを含むベンゾジアゼピン化合物）、及びＡ＝抗体またはその抗原結合断片、例えば、抗ＣＤ１２３抗体または抗体断片である。イムノコンジュゲートは任意選択でリンカーを含有し、一般式Ｃ−Ｌ−Ａによって定義され得、式中、Ｃ＝細胞毒、Ｌ＝リンカー、及びＡ＝抗体またはその抗原結合断片、例えば、抗ＣＤ１２３抗体または抗体断片である。イムノコンジュゲートは、逆の順番の一般式：Ｃ−ＡまたはＡ−Ｌ−Ｃによっても定義することができる。イムノコンジュゲートは、抗体もしくはその抗原結合断片（Ａ）当たり複数の細胞毒（Ｃ）、または抗体もしくはその抗原結合断片（Ａ）当たり複数の細胞毒（Ｃ）及びリンカー（Ｌ）も含有し得る。
【００５４】
「リンカー」は、化合物、通常は薬物（メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）及び四環系ベンゾジアゼピン、例えばインドリノベンゾジアゼピンを含むベンゾジアゼピン化合物など）を、安定した共有結合様式で細胞結合剤（抗ＣＤ１２３抗体またはその断片など）に連結することができる任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件下で、例えば、ジスルフィド結合切断に対して感受性または実質的に耐性であり得る。好適なリンカーは、当技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基及びチオエーテル基を含む。
【００５５】
「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、製剤を含む他の成分及び／またはそれによって治療される哺乳動物に対して、化学的及び／または毒物学的に適合性でなければならないことを示す。
【００５６】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、製剤が投与され得る対象にとって許容できない毒性である追加構成成分を含有しない調製物を指す。製剤は、滅菌であり得る。
【００５７】
本明細書で互換的に使用される「（ヒト）ＩＬ−３Ｒα」、「インターロイキン−３受容体アルファ」、または「ＣＤ１２３」という用語は、特に明記しない限り、任意の天然（ヒト）ＩＬ−３ＲαまたはＣＤ１２３を指す。ＣＤ１２３タンパク質は、ヘテロ二量体サイトカイン受容体（ＩＬ−３受容体またはＩＬ−３Ｒ）のインターロイキン３特異的サブユニットである。本用語は、「完全長」の非プロセス型ＣＤ１２３ポリペプチドならびに細胞内でプロセシングによって生じるＣＤ１２３ポリペプチドの任意の形態を包含する。本用語は、ＣＤ１２３の天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型及び対立遺伝子変異型によってコードされるものも包含する。本明細書に記載されるＣＤ１２３ポリペプチドは、ヒト組織型または別の源からなどの様々な源から単離されるか、または組換え法もしくは合成法によって調製され得る。具体的に明記される場合、「ＣＤ１２３」は、ＣＤ１２３ポリペプチドをコードする核酸を指すように使用され得る。ヒトＣＤ１２３配列は知られており、例えば、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００２１７４＆ＮＭ＿００２１８３（ヒトＣＤ１２３変異型１のタンパク質及び核酸配列）及びＮＰ＿００１２５４６４２＆ＮＭ＿００１２６７７１３（ヒトＣＤ１２３変異型２のタンパク質及び核酸配列）と関連するそれらの配列を含む。本明細書で使用される、「ヒトＣＤ１２３」という用語は、配列含号１１または配列番号１２の配列を含むＣＤ１２３を指す。
【化２】
2020534332.tif 000004
【化３】
2020534332.tif 000005
【００５８】
「抗ＣＤ１２３抗体」または「ＣＤ１２３に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＤ１２３を標的とする診断剤及び／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＣＤ１２３に結合可能な抗体を指す（例えば、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体）。無関係な非ＣＤ１２３タンパク質への抗ＣＤ１２３抗体の結合の程度は、例えば放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される抗体のＣＤ１２３への結合の約１０％未満であり得る。
【００５９】
「ＩＭＧＮ６３２」という用語は、図８に示されるイムノコンジュゲート組成物を指す。イムノコンジュゲート組成物は、スルホン化型のｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７（「Ｇ４７２３Ａ」）抗体当たり平均１．５〜２．１のＤＧＮ５４９−Ｃ細胞毒性薬物を含むイムノコンジュゲートを含む（図８Ａ）。イムノコンジュゲート組成物は、非スルホン化イムノコンジュゲート（図８Ｂに示されるモノ−イミン構造）も含み得る。
【００６０】
本開示及び特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に指示しない限り、複数形を含む。
【００６１】
実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語と共に本明細書に記載される箇所はどこでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という点で記載される別の類似の実施形態も提供されることが理解される。
【００６２】
本明細書にて「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用される、「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、ならびに「Ｂ」の両方を含むように意図されている。同様に、Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような語句で使用される、「及び／または」という用語は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）のそれぞれを包含するように意図されている。
【００６３】
ＩＩ．カチオン交換樹脂
本明細書に提供される方法により、カチオン交換樹脂を使用して、三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体及びその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３ならびに二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体及びその抗原結合断片を含む組成物から分離することができる。
【００６４】
本明細書に提供される方法において有用な１つの例示的なカチオン交換樹脂は、最適化ＰＯＲＯＳ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎ  ＸＳ（Ｔｈｅｒｍｏｓ  Ｆｉｓｈｅｒ、以前のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；１０，０００ｍＬ＝カタログ番号４４０３３４；５，０００ｍＬ＝カタログ番号４４０４３３５；１，０００ｍＬ＝カタログ番号４４０４３３６；２５０ｍＬ＝カタログ番号４４０４３３７；１０ｍＬ＝カタログ番号８２０７１；及び５０ｍＬ＝カタログ番号８２０７２）である。
【００６５】
カチオン交換樹脂は、例えば、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含み得る。カチオン交換樹脂は、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性を有し得る。カチオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含み、かつスフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性を有し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムではない。いくつかの実施形態では、カチオン交換樹脂は、メタクリレートベースではない。
【００６７】
カチオン交換樹脂は、約５０μｍの粒径を有する。カチオン交換樹脂は、直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を有する、二峰性孔径分布を有し得る。カチオン交換樹脂は、約５０μｍの粒径、ならびに直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を有する二峰性孔径分布を有し得る。
【００６８】
カチオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含み、スフロプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）表面官能性を有し、約５０μｍの粒径を有し、かつ直径約５００ｎＭの細孔及び直径約２２ｎＭの細孔を有する二峰性孔径分布を有する。
【００６９】
カチオン交換樹脂は、特定のサイズのものであり得る。例えば、カチオン交換樹脂は、約１０〜約１５，０００ｍｌであり得る。カチオン交換樹脂は、約２０〜約２５ｍＬであり得る。カチオン交換樹脂は、約１００〜約１５０ｍＬであり得る。カチオン交換樹脂は、約１０，０００〜約１５，０００ｍＬであり得る。カチオン交換樹脂は、約１３，８００ｍＬであり得る。カチオン交換樹脂は、３２Ｌ以上であり得る。
【００７０】
カチオン交換樹脂はカラムであり得る。
【００７１】
ＩＩＩ．抗体及びその抗原結合断片
抗体及びその抗原結合断片（例えば、治療的に有用な抗体及びその抗原結合断片）は一般的に、２つの重鎖またはその断片と、２つの軽鎖またはその断片と、を含有する。しかしながら、２つの重鎖またはその断片及び３つの軽鎖またはその断片を含有する三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）種も観察されている。そのようなＨ２Ｌ３種は、例えば、Ｈ２Ｌ３種が余分な軽鎖と抗体またはその抗原結合断片上の操作されたシステインのうちの１つとの間に形成されたジスルフィド結合の結果である場合、システイン操作抗体及びその抗原結合断片において高い率で生じ得る。したがって、本明細書で使用される抗体組成物は、システイン操作抗体またはその抗原結合断片を含む。同様に、Ｈ２Ｌ２もしくはＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片は、システイン操作Ｈ２Ｌ２もしくはＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片であり得る。システイン操作抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ＥＵ／ＯＵ番付位置４４２に操作されたシステイン残基を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または断片は、再表面化抗体またはその抗原結合断片である。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、完全ヒト抗体またはその抗原結合断片である。
【００７３】
例として、抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、本方法において使用され得る。抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、下の表１〜３に示されるｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７抗体の配列を含有し得る。例えば、本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号５、６、及び７の可変重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、及びＣＤＲ−３配列と、それぞれ、配列番号８、９、及び１０の可変軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、及びＣＤＲ−３配列と、を含み得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に記載される配列を含む可変重鎖ドメインを含み得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２に記載される配列を含む可変軽鎖ドメインを含み得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に記載される配列を含む可変重鎖ドメインと、配列番号２に記載される配列を含む可変軽鎖ドメインと、を含み得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３に記載される配列を含む重鎖を含み得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４に記載される配列を含む軽鎖を含み得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３に記載される配列を含む重鎖と、配列番号４に記載される配列を含む軽鎖と、を含み得る。
【００７４】
１つの例では、本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、表１に記載される配列を含む可変重鎖ドメインと、可変軽鎖ドメインと、を含み得る。別の例では、本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、表２に記載される配列を含む重鎖と、軽鎖と、を含み得る。また別の例では、本明細書に提供される方法において使用するための抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、表３に記載される配列を含む可変重鎖及び軽鎖相補性決定領域を含み得る。
【表１】
2020534332.tif 000006
【表２】
2020534332.tif 000007
【表３−１】
2020534332.tif 000008
【表３−２】
2020534332.tif 000009
【００７５】
抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＣＤ１２３のアミノ酸２０５〜３４６内のエピトープに結合し得る。
【００７６】
本方法において使用するための抗体またはその抗原結合断片（例えば、システイン操作抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＣＤ１２３抗体もしくはその抗原結合断片、またはシステイン操作抗体もしくはその抗原結合断片）は、組換え産生され得る。例えば、本方法において使用するための抗体またはその抗原結合断片（例えば、システイン操作抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＣＤ１２３抗体もしくはその抗原結合断片、またはシステイン操作抗体もしくはその抗原結合断片）は、哺乳類細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞において産生され得る。
【００７７】
ＩＶ．抗体組成物
本明細書に提供される方法により、三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体及びその抗原結合断片と、二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体及びその抗原結合断片と、の両方を含む抗体組成物をカチオン交換樹脂に接触させて、Ｈ２Ｌ３及びＨ２Ｌ２種を分離することができる。
【００７８】
本明細書に提供される方法において使用するための抗体組成物は、抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約２０％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である組成物であり得る。本明細書に提供される方法において使用するための抗体組成物は、抗体組成物中の抗体またはその抗原結合断片の約１％〜約１５％、または約５％〜約１５％、または約３％〜約１２％、または約１０％〜約１５％が、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片である組成物であり得る。
【００７９】
本明細書に提供される方法において使用するための抗体組成物は、特定の充填密度がカチオン交換樹脂に適用されるように、特定のタンパク質濃度を含み得る。タンパク質濃度（充填密度）は、例えば、約１０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌであり得る。タンパク質濃度（充填密度）は、約３０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌであり得る。タンパク質濃度（充填密度）は、約３０ｇ／Ｌ〜約４５ｇ／Ｌであり得る。タンパク質濃度（充填密度）は、約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌであり得る。タンパク質濃度（充填密度）は、約４０ｇ／Ｌであり得る。
【００８０】
Ｈ２Ｌ２及びＨ２Ｌ３種に加えて、抗体組成物は、凝集体を含有し得る。例えば、抗体組成物は、約１〜約１０％の凝集体を含有し得る。抗体組成物は、約１〜約５％の凝集体を含有し得る。抗体組成物は、約２〜約５％の凝集体を含有し得る。
【００８１】
抗体組成物は、特定のｐＨ、例えば、約３．８〜約６．５を有し得る。抗体組成物は、約３．８〜約５．５のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約３．８〜約５．０のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約３．８〜約４．７のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約３．８〜約４．４のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約３．８〜約４．２のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約４．０〜約５．０のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約４．０〜約４．７のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約４．０〜約４．４のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約４．０〜約４．２のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約４．２のｐＨを有し得る。
【００８２】
抗体組成物のｐＨは、例えば、以下により詳細に記載されるように、抗体組成物がカチオン交換樹脂に接触させられる前にカチオン交換樹脂に接触させされ得る平衡組成物（結合組成物）のｐＨと同じであり得る。抗体組成物のｐＨは、例えば、以下により詳細に記載されるように、抗体組成物の後にカチオン交換樹脂に接触させてＨ２Ｌ２組成物を溶出することができる、溶出組成物のｐＨと同じであり得る。抗体組成物のｐＨは、平衡組成物（結合組成物）及び溶出組成物のｐＨと同じであり得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、抗体組成物は、６．０のｐＨを有しない。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、６．０未満のｐＨを有する。
【００８４】
抗体組成物は、プロテインＡ精製抗体またはその抗原結合断片を含み得る。抗体組成物は、プロテインＡ精製され、アニオン交換カラムにおいて精製された抗体またはその抗原結合断片を含み得る。したがって、抗体組成物は、可溶性Ｈ２Ｌ２及びＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片に加えて、緩衝液（例えば、トリス酢酸）及び／または抗体凝集体などの構成成分を含有し得る。
【００８５】
Ｖ．溶出溶液ならびにＨ２Ｌ２及びＨ２Ｌ３組成物を産生するための溶出方法
本明細書に提供される方法により、三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体及び抗原結合、ならびに二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体及びその抗原結合断片は、カチオン交換樹脂から別個に溶出することができる。
【００８６】
特に、溶出組成物は、優先的にＨ２Ｌ２種を溶出するようにカチオン交換樹脂（例えば、カラム）に接触させられ得、次いで、Ｈ２Ｌ２組成物は樹脂から収集され得る。そのような方法において使用するための溶出組成物が本明細書に提供される。
【００８７】
本明細書に提供される方法において使用するための溶出組成物は、塩を含み得る。塩は、塩化物塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または塩化マグネシウムであり得る。１つの場合では、塩は、塩化ナトリウムである。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、例えば、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約２００ｍＭ〜約６００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約３００ｍＭ〜約６００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約４００ｍＭ〜約６００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約４００ｍＭ〜約５００ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約３８０ｍＭ〜約４２０ｍＭであり得る。溶出組成物中の塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）は、約４００ｍＭであり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、溶出組成物は１００ｍＭの塩濃度を有しない。いくつかの実施形態では、溶出組成物は、１００ｍＭを超える塩濃度を有する。
【００８９】
本明細書に提供される方法において使用するための溶出組成物は特定のｐＨを有し得る。ｐＨは、例えば、約３．８〜約６．５であり得る。溶出組成物は約３．８〜約５．５のｐＨを有し得る。溶出組成物は約３．８〜約５．０のｐＨを有し得る。溶出組成物は約３．８〜約４．７のｐＨを有し得る。溶出組成物は約３．８〜約４．４のｐＨを有し得る。溶出組成物は約３．８〜約４．２のｐＨを有し得る。溶出組成物は約４．０〜約５．０のｐＨを有し得る。溶出組成物は約４．０〜約４．７のｐＨを有し得る。溶出組成物は約４．０〜約４．４のｐＨを有し得る。溶出組成物は約４．０〜約４．２のｐＨを有し得る。抗体組成物は、約４．２のｐＨを有し得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、溶出組成物は６．０のｐＨを有しない。いくつかの実施形態では、溶出組成物は、６．０未満のｐＨを有する。
【００９１】
本明細書に提供される方法において使用するための溶出組成物は、塩濃度及びｐＨの特定の組み合わせを有し得る。例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム）濃度は、約３００ｍＭ〜約６００ｍＭであり得、ｐＨは、約３．８〜約５．５であり得る。塩（例えば、塩化ナトリウム）濃度は、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭであり得、ｐＨは、約３．８〜約５．０であり得る。塩（例えば、塩化ナトリウム）濃度は、約３８０ｍＭ〜約４２０ｍＭであり得、ｐＨは、約４．０〜約４．４であり得る。塩（例えば、塩化ナトリウム）濃度は、約４００ｍＭであり得、ｐＨは、約４．２であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、溶出組成物は、６．０のｐＨで１００ｍＭ塩化ナトリウムを有しない。
【００９３】
本明細書で示されるように、本明細書に提供される溶出組成物（例えば、低ｐＨ及び高塩濃度を有する）を、Ｈ２Ｌ２及びＨ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を有する本明細書に提供される抗体組成物を含有する本明細書に提供されるカチオン交換樹脂に接触させることにより、Ｈ２Ｌ３汚染がほとんどまたは全くないＨ２Ｌ２組成物の溶出をもたらすことができる。これは、本明細書に提供される方法が、初期（Ｈ２Ｌ２溶出ピークと共に）と後（Ｈ２Ｌ２溶出ピークの後）の両方で溶出せずに、Ｈ２Ｌ３種を一貫して後（Ｈ２Ｌ２溶出ピークの後）に溶出させることができるためである。
【００９４】
よって、本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１つ以上の溶出されたカラム体積を含み得る。例えば、Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜９のカラム体積から選択される単一の溶出されたカラム体積を含み得る。Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜９のカラム体積から選択される２つの溶出されたカラム体積（例えば、カラム体積１及び２またはカラム体積３及び４）を含み得る。Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜９のカラム体積から選択される３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの溶出されたカラム体積を含む。Ｈ２Ｌ２組成物は、１〜９の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の９つのカラム体積のプール）も含み得る。本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１〜８の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の４つのカラム体積のプール）を含み得る。本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１〜７の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の４つのカラム体積のプール）を含み得る。本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１〜６の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の４つのカラム体積のプール）を含み得る。本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１〜５の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の４つのカラム体積のプール）を含み得る。本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１〜４の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の４つのカラム体積のプール）を含み得る。本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物は、１〜３の溶出されたカラム体積（すなわち、最初の４つのカラム体積のプール）を含み得る。
【００９５】
本明細書に提供される方法を使用して、Ｈ２Ｌ３種は、抗体組成物中のＨ２Ｌ２種から効率的に分離され得る。例えば、本明細書で使用される方法は、カチオン交換樹脂に接触させた抗体組成物中に存在したＨ２Ｌ３種の２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下を含むＨ２Ｌ２組成物の産生をもたらすことができる。一方、本明細書で使用される方法は、カチオン交換樹脂に接触させた抗体組成物中に存在したＨ２Ｌ３種の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むＨ２Ｌ３組成物の産生をもたらすことができる。
【００９６】
本明細書に提供される方法を使用することにより、抗体または抗原結合断片の２％以下、１％以下、または０．５％以下がＨ２Ｌ３種であるＨ２Ｌ２組成物を得ることができる。本明細書に提供される方法を使用することにより、Ｈ２Ｌ２組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片であるＨ２Ｌ２組成物を得ることができる。
【００９７】
本明細書に提供される方法を使用することにより、カチオン交換樹脂に接触させた抗体組成物よりも少ない凝集体を含有するＨ２Ｌ２組成物を得ることもできる。例えば、本明細書に提供される方法を使用して、１％以下の凝集体または０．５％以下の凝集体を含むＨ２Ｌ２組成物を得ることができる。本明細書に提供される方法を使用して、約０．３％の凝集体、約０．２％の凝集体、または約０．１％の凝集体を含むＨ２Ｌ２組成物を得ることができる。
【００９８】
有利に、本明細書に提供される方法は、高収率ももたらす。例えば、本明細書に提供される方法を使用して、カチオン交換樹脂に適用された抗体組成物中に少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％のＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含有するＨ２Ｌ２組成物を得ることができる。
【００９９】
カチオン交換樹脂を平衡させ、樹脂へのＨ２Ｌ２及びＨ２Ｌ３抗体結合を促進するために、平衡組成物（または結合組成物）を樹脂に接触させた後に、抗体組成物を樹脂に接触させることができる。平衡組成物（結合組成物）を使用して、樹脂のｐＨ及び／または伝導率を保持することができる。この目的のために使用することができる好適な緩衝液は、当該技術分野で周知であり、Ｈ２Ｌ３及びＨ２Ｌ２種を分離するためのクロマトグラフィーステップにおいて使用される選択された樹脂と適合性があるｐＨの任意の緩衝液を含む。平衡組成物（結合組成物）は、ｐＨを保持するのに十分に高いが、抗体組成物中の抗体及びその抗原結合断片のカチオン交換樹脂への結合を阻止するほどに高すぎない濃度で、例えば、酢酸ナトリウムを含有し得る。
【０１００】
平衡組成物（結合組成物）は、例えば、１０ｍＭ〜１５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含み得る。平衡組成物（結合組成物）は、例えば、２５ｍＭ〜１５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含み得る。平衡組成物（結合組成物）は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含み得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、平衡組成物（結合組成物）は、２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有しない。いくつかの実施形態では、平衡組成物（結合組成物）は、２０ｍＭを超える酢酸ナトリウムを含有する。
【０１０２】
平衡組成物（結合組成物）は、特定のｐＨ、例えば、約３．８〜約６．５も有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約３．８〜約５．５のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約３．８〜約５．０のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約３．８〜約４．７のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約３．８〜約４．４のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約３．８〜約４．２のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約４．０〜約５．０のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約４．０〜約４．７のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約４．０〜約４．４のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約４．０〜約４．２のｐＨを有し得る。平衡組成物（結合組成物）は、約４．２のｐＨを有し得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、平衡組成物（結合組成物）は、６．０のｐＨを有しない。いくつかの実施形態では、平衡組成物（結合組成物）は、６．０未満のｐＨを有する。
【０１０４】
本明細書で示されるように、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片を、Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む抗体組成物から分離する方法は、（ｉ）Ｈ２Ｌ３抗体またはその抗原結合断片及びＨ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片がカチオン交換樹脂に結合するように、抗体組成物をこの樹脂に接触させることと、（ｉｉ）溶出組成物をカチオン交換樹脂に接触させることと、（ｉｉｉ）樹脂から溶出したＨ２Ｌ２組成物を収集することと、を含み得る。本方法は、任意選択で、平衡組成物（結合組成物）をカチオン交換樹脂に接触させた後に、抗体組成物をカチオン交換樹脂に接触させることを含み得る。本明細書で示されるように、カチオン交換樹脂、ならびに溶出組成物のｐＨ及び塩濃度の選択は、有利に、Ｈ２Ｌ３種のすべてをＨ２Ｌ２のピーク溶出後に溶出させ、ほとんど（例えば、１％未満）〜全くＨ２Ｌ３種を有しないＨ２Ｌ２組成物の収集を可能にする。
【０１０５】
ＶＩ．Ｈ２Ｌ２組成物の使用
本明細書に提供される方法により、三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体及びその抗原結合断片を、二重軽鎖（Ｈ２Ｌ２）抗体及びその抗原結合断片から分離して、Ｈ２Ｌ２組成物を産生することができる。そのようなＨ２Ｌ２組成物は、例えば、治療目的に有用である。例えば、Ｈ２Ｌ２組成物は、高純度Ｈ２Ｌ２抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物、例えば、１％または０．５％以下のＨ２Ｌ３種を含む組成物を製剤化するために使用され得る。
【０１０６】
本明細書に提供される方法により産生されたＨ２Ｌ２組成物は、イムノコンジュゲートを産生するために使用することもできる。有利に、本明細書に提供されるＨ２Ｌ２組成物から産生したイムノコンジュゲートは、ほとんどまたは全くＨ２Ｌ３種を有しない。そのようなイムノコンジュゲートは、薬物またはプロドラッグを、そこで抗体または抗原結合断片に連結するために、連結基を使用することによって調製され得る。好適な連結基は当該技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸解離性基、光解離性基、ペプチダーゼ解離性基、及びエステラーゼ解離性基を含む。個々のイムノコンジュゲートは、例えば、抗体またはその抗原結合断片当たり、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０の薬物またはプロドラッグを含有し得る。そのようなイムノコンジュゲートを含む組成物は、抗体またはその抗原結合断片当たり、平均約１〜約１０、約１〜約５、約１〜約３、もしくは約１．５〜約２．１の薬物またはプロドラッグを有し得る。
【０１０７】
本明細書に提供される方法により産生されたイムノコンジュゲート組成物は、２％以下、１％以下、または０．５％以下のＨ２Ｌ３種を含み得る。本明細書に提供される方法により産生されたイムノコンジュゲート組成物は、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％のＨ２Ｌ２種を含み得る。
【０１０８】
例として、Ｈ２Ｌ２抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７；Ｇ４７２３Ａ）を含むＨ２Ｌ２組成物が、細胞毒性薬物にコンジュゲートされて、イムノコンジュゲートを形成する。細胞毒性薬物は、例えば、ＤＧＮ５４９−Ｃなどのインドリノン−ベンゾジアゼピンがん殺滅剤であり得る。例えば、ＷＯ２０１７／００４０２５及びＷＯ２０１７／００４０２６に提供されるそのようなイムノコンジュゲートの産生方法の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｌ２抗ＣＤ１２３抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７；Ｇ４７２３Ａ）を含むＨ２Ｌ２組成物は、ＤＧＮ５４９−Ｃにコンジュゲートされ得る。得られるイムノコンジュゲート組成物は、抗体（ｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７；Ｇ４７２３Ａ）当たり、平均約１．５〜約２．１の細胞毒（ＤＧＮ５４９−Ｃ）を含有し得る。イムノコンジュゲート組成物は、図８Ａ（及び８Ｂ）に示されるように、硫酸水素ナトリウムに製剤化されて、ＩＭＧＮ６３２を形成することができる。
【実施例】
【０１１０】
本明細書で説明する実施例及び実施形態は、単に例示の目的のためであり、その観点での様々な改変または変更が当業者に示唆され、それらは本出願の趣旨及び範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０１１１】
実施例１：Ｈ２Ｌ３レベルの評価
システイン操作抗体を発現するように安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞が三重軽鎖（Ｈ２Ｌ３）抗体として知られる高分子量種も分泌することが以前に報告されている（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１０  Ｍａｒ  １；１０５（４）：７４８−６０）。これらの抗体は、抗体上の操作されたシステインと会合する余分な（第３の）軽鎖を含有する。単量体種の類似性により、この新しい高分子量（ＨＭＷ）種の分離は、システイン操作モノクローナル抗体（ＣｙｓｍＡｂ）の下流精製中の課題となる。Ｈ２Ｌ３種を除去するための頑強かつ効果的な精製方法を開発するために、例示的な抗体中のＨ２Ｌ３含有量を評価し、Ｈ２Ｌ３を除去するための様々な方法が評価された。
【０１１２】
研究した例示的なモノクローナル抗体は、システイン操作ｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７（Ｇ４７２３Ａ）抗体であった（ＷＯ２０１７／００４０２５及びＷＯ２０１７／００４０２６を参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；上の表１〜３も参照されたい）。抗体は、ＣＨＯ細胞において発現され、次いで、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、除去した細胞培養上清から精製した。プロテインＡクロマトグラフィー後、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＵＰＬＣ）を使用して、抗体の純度（単量体、凝集体、Ｈ２Ｌ３、及び低分子量種の比率を含む）を評価した。ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析はＨ２Ｌ３種を示した（図１）。ＳＥＣ−ＵＰＬＣクロマトグラムは、ＣｙｓｍＡｂ組成物種）の各ピークの保持時間：単量体（１７．６８６分）、凝集体（１５．３３６分）、Ｈ２Ｌ３（１６．６３８分）、及び低分子量種（１９．００８及び２２．４４５分）を示す（図１）。
【０１１３】
同じ抗体の８つの異なるバイオリアクター産生バッチを使用した実験（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨ）を分析した。Ｈ２Ｌ３の量は、細胞株及び培養条件の両方により影響を受け、２〜１１％まで変動した（図２）。
【０１１４】
実施例２：セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーはＨ２Ｌ３分離には非効率的であった。
Ｈ２Ｌ３種の除去は、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーを使用して効率的に達成されなかった。（図３。）これらの実験において、ＣＨＴカラムは、ｐＨ６．７の２０ｍＭリン酸カリウムを含有する緩衝液で平衡化された。４．７％のＨ２Ｌ３種を有するＣｙｓｍＡｂを、ＣＨＴ（商標）樹脂（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に充填し、ｐＨ６．７の１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、または８５ｍＭリン酸カリウムを使用して、段階溶出により溶出した。溶出ピークは、１ＣＶ画分において５０ｍＡＵの上で収集した。各画分の抗体段階収率及びＨ２Ｌ３％を分析し、計算ならびに６カラム体積（ＣＶ）仮想プールの段階収率及びＨ２Ｌ３％との比較に使用した。高分子量種（すなわち、凝集体及びＨ２Ｌ３）はそれらのより大きいサイズによりＣＨＴ樹脂により強く結合し、後の画分において溶出されるだろうと考えられた。さらに、低ホスフェート濃度での溶出は、より広い溶出ピーク及び仮想プールの低段階収率をもたらすであろうが、分離を改善すると考えられた。しかしながら、図３は、Ｈ２Ｌ３種の除去が試験したホスフェート範囲にわたって改善されず、２．５％と高いままであったことを示す。塩濃度が異なる追加の実験もＨ２Ｌ３種を効率的に分離することができず、ＣＨＴカラムのｐＨを変更する余地はほとんどない。よって、ＣＨＴクロマトグラフィーはＨ２Ｌ３を効率的に分離することができなかった。
【０１１５】
実施例３：最適化カチオン交換クロマトグラフィーはＨ２Ｌ３を効率的に分離する
ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳ強カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、Ｈ２Ｌ３種の除去を試験した。ＰＯＲＯＳ（商標）  ｓｔｒｏｎｇ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅｓｉｎ  ＸＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した。３％の凝集体及び４％のＨ２Ｌ３種を有するＣｙｓｍＡｂ組成物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳカラム上に充填し、２０ＣＶにわたって０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌを使用して勾配溶出により溶出した。溶出ピークは、０．５ＣＶ画分において５０ｍＡＵの上で収集した。各画分の抗体段階収率、凝集体％、及びＨ２Ｌ３％を分析し、画分番号に対してプロットした。図４は、凝集体種が後の画分（Ｆ８〜Ｆ１０）で溶出され、溶出された抗体の主ピークから効率的に分離されたことを示す。Ｈ２Ｌ３種も溶出された抗体の主ピークとは異なる画分で溶出された。Ｈ２Ｌ３種のかなりの部分が後の画分において溶出され、Ｈ２Ｌ２抗体の主ピークから効率的に分離された（図４）。しかしながら、Ｈ２Ｌ３種の部分は、抗体ピークの初期の画分と共溶出された（図４）。初期に溶出するＨ２Ｌ３種はグルタチオンでキャッピングされているＨ２Ｌ３抗体の遊離システインに由来すると考えられる。グルタチオンキャッピング種は、より酸性であり（低ＰＩ）、したがって、初期の画分において溶出する。後に溶出するＨ２Ｌ３種は、システインでキャッピングされているＨ２Ｌ３抗体の遊離システインに由来すると考えられる。システインキャッピング種は、あまり酸性ではなく（高ＰＩ）、したがって、後の画分において溶出する。
【０１１６】
これらの結果を考慮して、Ｈ２Ｌ２種の主ピークからさらに効率的分離されるように、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳカラム結合及び溶出条件のさらなる最適化を設計して、初期に溶出するＨ２Ｌ３種を後の画分に溶出させた。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳクロマトグラフィーの結合及び溶出ｐＨの低減により、Ｈ２Ｌ３種の除去が大幅に改善されたことが分かった（図５）。
【０１１７】
ＮａＣｌ勾配溶出は、ｐＨ５．０、４．７、及び４．４（ｐＨ５．０、２０ＣＶにわたって１５０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ  ４．７及び４．４、２５ＣＶわたって０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ）のＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳクロマトグラフィーを使用して行った。ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳ樹脂充填材料（抗体組成物）は、およそ８．４％のＨ２Ｌ３種を有した。溶出ピークは、０．５ＣＶ画分において１００ｍＡＵの上で収集した。各画分の抗体段階収率及びＨ２Ｌ３％を分析した。異なる収集体積の仮想プールのＨ２Ｌ３％は、各仮想プールの収率に対してプロットされた。抗体ピークの初期の画分の共溶出Ｈ２Ｌ３種は、ｐＨの減少と共に減少した。図５は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳカラムの結合及び溶出ｐＨがＨ２Ｌ３種の除去を大幅に改善し、より低いｐＨでの溶出がより低いＨ２Ｌ３種の産生をもたらすことを示す。ｐＨ４．４で、Ｈ２Ｌ３は、抗体から効率的に分離され、後の画分においてのみ溶出された。より低いｐＨでの溶出は、より低いＨ２Ｌ３種を有する産物（Ｈ２Ｌ２組成物）をもたらした。
【０１１８】
溶出ピークの塩濃度及び収集体積もＨ２Ｌ３の除去に影響を及ぼすことが示された（図６）。これらの実験において、およそ４．１％のＨ２Ｌ３種を有する出発材料（抗体組成物）を、ｐＨ４．２の５０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化したＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳカラム上に充填した。結合抗体は、ｐＨ４．２の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中３８０ｍＭ〜４２０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。溶出ピークは、１ＣＶ画分において１００ｍＡＵの上で収集した。異なるＮａＣｌ濃度及び異なる収集体積で溶出された仮想プールのＨ２Ｌ３％を比較した。図６は、ＮａＣｌ濃度が低く、収集体積が低いほど、より低いＨ２Ｌ３％が溶出プールにおいて達成されたことを示す。試験したＮａＣｌ濃度の範囲にわたって、仮想プールのＨ２Ｌ３％はすべて４．１％〜＜１％に低減された。
【０１１９】
図６の実験結果は、ＪＭＰ（登録商標）予測プロファイリングツールを使用して分析された。数理モデルを構築して、異なる塩濃度及び収集体積下で、収率、凝集体％、Ｈ２Ｌ３％、及び総高分子量（ＨＭＷ）％を予測した。図７は、塩濃度が応答すべてに著しく影響を及ぼしたが、収集体積は段階収率にのみ著しく影響を及ぼしたことを示す。各応答の望ましさは、産物品質要件及び実施上の検討事項に基づいて設定された。全体的な最高の望ましさを伴う塩濃度及び収集体積の組み合わせが最終プロセス条件として考慮された。
【０１２０】
ｐＨ、塩濃度、充填密度、及び収集体積を含む結合及び溶出条件を最適化することにより、Ｈ２Ｌ３レベルは、最終産物において＜１％に一貫して低減された（表４；実験は、ｐＨ４．２、４００ｍＭ  ＮａＣｌを使用し、４ＣＶ（すなわち、カラム体積１〜４）を収集する、上述と同じＰＯＲＯＳ条件において実行された）。
【表４】
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【０１２１】
上述の実験に基づいて、ｐＨ、塩、充填密度、及び収集体積の理想的な範囲は次の通りであると決定された：約３．８〜６．５のｐＨ、約１００ｍＭ〜６００ｍＭの塩濃度、約１０〜１００ｇ／Ｌの充填密度、及び約１〜９ＣＶの収集体積。
＊  ＊  ＊
【０１２２】
発明の概要及び要約書のセクションではなく、発明を実施するための形態のセクションは、特許請求の範囲を説明するために使用されることが意図されることを理解されたい。発明の概要及び要約書のセクションは、発明者（ら）によって企図される、すべてではないが１つ以上の例示的な本発明の実施形態を記載し、よって、本発明及び添付の特許請求の範囲を制限することを決して意図しない。
【０１２３】
本発明は、特定の機能及びその関係の実施を図示する機能的ビルディングブロックを用いて上に記載されてきた。これらの機能的ビルディングブロックの限度は、説明の便宜上本明細書に任意に定義されてきた。特定の機能及びその関係が適切に行われる限り、別の限度を定義することができる。
【０１２４】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにしているため、当該技術分野の技術内の知識を利用することにより、本発明の一般概念から逸脱することなく、過度の実験をせずに、そのような特定の実施形態を容易に修正及び／または様々な用途に適応させることができる。したがって、そのような適応及び修正は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、開示の実施形態の等価物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書の表現または用語は、説明のためであり、限定するためのもではなく、そのため、本明細書の用語または表現は、教示及びガイダンスの観点から当業者によって解釈されるべきであることを理解されたい。
【０１２５】
本発明の広さ及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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