(57)【要約】  本発明は、組み換え発現された糖タンパク質と共に、アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び／又はアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現させることによって、上記糖タンパク質において複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化を減少させる方法に関する。また、上記方法で使用され得る細胞株、各組み換え糖タンパク質、及び上記細胞株において組み換え糖タンパク質を発現させる方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え発現された糖タンパク質において複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化を減少させる方法であって、前記糖タンパク質と共に、β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び／又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記糖タンパク質が、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現を伴わずに発現された前記組み換え糖タンパク質と比較して、複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化が著しく減少されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組み換え発現された糖タンパク質の前記複合型Ｎ−グリカンアンテナの少なくとも８０％がフコシル化されていない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖タンパク質が、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）、アルカリフォスファターゼ、及びＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１−阻害因子；Ｃ１  Ｉｎｈ）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質が、哺乳動物の、好ましくはヒトの、糖タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）が前記糖タンパク質と共に過剰発現されていない、及び／又は、
（ｉｉ）α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＩＶａ）、α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＢ（ＧｎＴＩＶｂ）、及びα−１，６−マンノシル糖タンパク質６−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＶ）の発現が減少していない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び／又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現させるように遺伝子改変されている、細胞株。
【請求項８】
前記細胞株が、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする内因性遺伝子（複数の場合もある）を含み、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現を引き起こすのに適した１つ以上の位置のゲノムに挿入される、プロモーター、増強エレメント、及び安定化エレメントからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝要素を更に有する、請求項７に記載の細胞株。
【請求項９】
前記細胞株が、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする外因性核酸（複数の場合もある）を含む、請求項７又は８に記載の細胞株。
【請求項１０】
前記細胞株がＡＧＥ．ＣＲ（商標）細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＡＧＥ１．ＨＮ（商標）細胞、ＮＣ５Ｔ１１細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＨＭＣＬ細胞、ＭＭ．１細胞、Ｕ２６６細胞、ＲＰＭＩ１８２２６細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＮＭ細胞、ＮＭ−Ｆ９細胞、及びＣＡＰ細胞からなる群より選択される細胞株に由来する細胞株である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項１１】
前記細胞株が、アデノウイルスのＥ１領域及びｐＩＸ領域の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸を含む、ヒト初代羊膜細胞に由来する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項１２】
前記細胞株が、
（ｉ）β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）を過剰発現させる、及び／又は、
（ｉｉ）α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＩＶａ）、α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＢ（ＧｎＴＩＶｂ）、及びα−１，６−マンノシル糖タンパク質６−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＶ）の発現を減少させるように遺伝子改変されていない、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項１３】
複合型Ｎ−グリカンを有する組み換え糖タンパク質であって、前記組み換え糖タンパク質の前記複合型Ｎ−グリカンアンテナの少なくとも８０％がフコシル化されないように、前記複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化が減少されている、組み換え糖タンパク質。
【請求項１４】
前記糖タンパク質が、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）、アルカリフォスファターゼ、及びＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１−阻害因子；Ｃ１  Ｉｎｈ）からなる群より選択される、請求項１３に記載の組み換え糖タンパク質。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の組み換え糖タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項７〜１２のいずれか一項に記載の細胞株を準備する工程と、
（ｂ）前記細胞株において前記組み換え糖タンパク質を発現させる工程と、
（ｃ）前記細胞又は前記細胞培養上清から前記組み換え糖タンパク質を単離する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え発現された糖タンパク質において複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化を減少させる方法、該方法で使用され得る細胞株、各組み換え糖タンパク質、及び上記細胞株において組み換え糖タンパク質を発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も流通している組み換え治療用タンパク質は糖タンパク質である。糖タンパク質は、アスパラギンのアミノ基（Ｎ結合型グリカン）、又はセリン若しくはトレオニンの水酸基（Ｏ結合型グリカン）に付着した糖残基を有する。グリカンの構造は、特定のタンパク質及び組み換え発現に使用される宿主に応じて非常に変化しやすい。
【０００３】
哺乳類発現プラットフォームによって発現された糖タンパク質に見られるＮ−グリカンの非常に共通する構造は、コア糖配列Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ−を特徴とする、いわゆる複合型Ｎ−グリカンである。このコア構造は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から開始される「アンテナ」によって伸長される。典型的には、複合型タイプのＮ−グリカンは、２個、３個又は４個のアンテナを有するが、ごく稀に５個又は６個のアンテナが見られることもある。ジアンテナ型複合型タイプのＮ−グリカンの典型的な構造を図１Ａに図示する。
【０００４】
複合型Ｎ−グリカンはフコシル化され得る。哺乳動物細胞では、フコースは、図１Ｂに示されるα１−６結合によって近位ＧｌｃＮＡｃ（コアフコース）に、又はα１−３結合によって１つ若しくは幾つかのアンテナの遠位ＧｌｃＮＡｃ（アンテナ型フコース；いわゆるＬｅｗｉｓＸ抗原（ＬｅＸ）、ＣＤ１５、又はＳＳＥＡ−１）のいずれかに結合される。ＬｅｗｉｓＸ構造（Ｇａｌ（β−４）［Ｆｕｃ（α）］ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）が追加のシアル酸を抱える場合、得られる構造は、図１Ｃに示されるシアリル−ＬｅｗｉｓＸ、シアリル−ＬｅＸ、又はＳＬｅＸ（ＮｅｕＡｃ（α１→４）Ｇａｌ（β−４）［Ｆｕｃ（α１→３）］ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）である。シアリルＬｅｗｉｓＸ構造は、様々なフコシルトランスフェラーゼによって触媒される遠位ＧｌｃＮＡｃでのシアリル化された複合型タイプのＮ−グリカンのフコシル化によって現れる。コアα１−６フコシル化の役割は、抗体について広く研究されてきた。ＩｇＧクラスの抗体は、典型的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中にＮ−グリカンを持つ。これらのＮ−グリカン上のコアフコースの存在は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体によって媒介されるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の応答を著しく減少させる。ＡＤＣＣは通常、治療用抗体の非常に望ましい作用であることから、ＩｇＧ上のコアフコースの存在を減少させる幾つかのアプローチがとられている。高免疫原性のコアα１−３結合型フコース構造は、植物及び無脊椎動物にのみ存在し、ヒト細胞には存在しない。
【０００５】
免疫グロブリンには、典型的にはアンテナ型フコースは見られないが、ＬｅｗｉｓＸ構造又はシアリル−ＬｅｗｉｓＸ構造は、他の血清糖タンパク質で容易に検出される。これまで、その生理学的役割についてはほとんど知られていない。アンテナ型フコースがセレクチン相互作用を介して炎症部位に対する標的化を増強する可能性があるという証拠は存在するが、それを除けば、アンテナ型フコシル化の生理学的役割についてはほとんど知られていない。
【０００６】
血漿タンパク質が組み換え発現される場合、生成物は、しばしば、血漿中の天然起源の相当物と比較して、高いレベルのアンテナ型フコースを示す。補充療法で使用される組み換えタンパク質の可能性のある免疫原性の作用を減少させるため、それらのタンパク質は内因性タンパク質にできる限り類似していることが望ましい。組み換え治療用タンパク質のアンテナ型フコースの減少は、この目標に向けた重要な一歩である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、各組み換え糖タンパク質及びそれを産生する手段と並んで、組み換え発現された糖タンパク質において複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化（ＬｅＸ又はＳＬｅＸ）を減少させる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の技術的課題に対する解決方法は、特許請求の範囲に特徴づけられる実施形態によって実現される。
【０００９】
特に、第１の態様では、本発明は、糖タンパク質と共にβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）、及び／又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現させる工程を含む、組み換え発現された糖タンパク質において、ＬｅＸ又はシアリル−ＬｅＸのいずれかの複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化を減少させる方法に関する。
【００１０】
本明細書で使用される「複合型Ｎ−グリカン」という用語は、コア糖配列Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ−を特徴とするＮ−グリカンに関する。この複合型Ｎ−グリカンコア糖配列は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から開始される２個〜６個のアンテナによって伸長され得て、典型的には２個、３個又は４個のアンテナがある。上記アンテナは、本明細書では「複合型Ｎ−グリカンアンテナ」と称されることがある。さらに、本明細書で使用される「複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化」という用語は、少なくとも１つの複合型Ｎ−グリカンアンテナの遠位ＧｌｃＮＡｃに対するフコースのα１−３結合を指す。これに関して、「遠位ＧｌｃＮＡｃ」という用語は、グリカンの最初のＧｌｃＮＡｃではないアンテナに存在する任意のＧｌｃＮＡｃを指す。
【００１１】
「複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化を減少させる」という用語は、本発明によれば、糖タンパク質と共にＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現させることにより、従来の組み換え糖タンパク質と比較して、フコシル化された複合型Ｎ−グリカンアンテナの量が少ない組み換え糖タンパク質が生成されるという事実に関する。かかる組み換え糖タンパク質は、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現を伴わずに発現される同じ組み換え糖タンパク質と比較して、複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化の著しい減少を特徴とすることが好ましい。
【００１２】
特に好ましい実施の形態では、組み換え発現された糖タンパク質の複合型Ｎ−グリカンアンテナの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％以上がフコシル化されていない。
【００１３】
本発明の方法に供される糖タンパク質は、複合型Ｎ−グリカン及び各複合型Ｎ−グリカンアンテナを有する糖タンパク質である限り、特に限定されない。好ましい実施の形態では、糖タンパク質は、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）、アルカリフォスファターゼ、及びＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１−阻害因子；Ｃ１  Ｉｎｈ）からなる群より選択される。さらに、糖タンパク質は、好ましくは哺乳動物の、より好ましくはヒトの糖タンパク質である。
【００１４】
本明細書で使用される「組み換え発現された糖タンパク質」という用語は、遺伝子改変された生物又は細胞においてバイオテクノロジーによって産生された糖タンパク質に関する。
【００１５】
かかる糖タンパク質と共にＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現させる方法と並んで、糖タンパク質を組み換え発現させる方法は、特に限定されず、当該技術分野において知られている。これに関する更なる詳細は、以下で、本発明の細胞株に関する本発明の第２の態様に関して提供される。
【００１６】
本発明の具体的な実施の形態では、ＳＴ６Ｇａｌ１とＳＴ３Ｇａｌ４の両方が、組み換え糖タンパク質と共に過剰発現される。
【００１７】
本発明の更に具体的な実施の形態では、（ｉ）β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）は、組み換え糖タンパク質と共に過剰発現されていない、及び／又は、（ｉｉ）α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＩＶａ）、α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＢ（ＧｎＴＩＶｂ）、及びα−１，６−マンノシル糖タンパク質６−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＶ）の発現は、減少していない。
【００１８】
これに関して、「ＳＴ３Ｇａｌ１は組み換え糖タンパク質と共に過剰発現されていない」という用語は、本来のＳＴ３Ｇａｌ１発現と比較して、ＳＴ３Ｇａｌ１発現が何ら増加されていないという事実に関する。特定の実施の形態では、ＳＴ３Ｇａｌ１は全く発現されない。さらに、「ＧｎＴＩＶａ、ＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの発現が減少していない」という用語は、上記タンパク質の本来の発現と比較して、上記タンパク質の発現が何ら減少していないという事実に関する。
【００１９】
第２の態様において、本発明は、β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び／又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現するように遺伝子改変されている、細胞株、好ましくは昆虫、鳥類、又は哺乳動物の細胞株、より好ましくは哺乳動物、特にヒトの細胞株に関する。
【００２０】
本明細書で使用される「ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現させるように遺伝子改変されている細胞株」という用語は、遺伝子改変によって、細胞株の個々の細胞が、それらの細胞が遺伝子改変以前に発現していたよりも高い各シアリルトランスフェラーゼ（複数の場合もある）発現を示すことを指す。
【００２１】
所与のタンパク質を過剰発現させる遺伝子改変は、特に限定されず、当該技術分野において知られている。特定の例において、例えばヒト細胞株等の細胞株はＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする内因性遺伝子（複数の場合もある）を含む。このような場合、細胞をプロモーター、増強エレメント、及び／又は安定化エレメントを上記核酸を過剰発現させるのに適した位置の細胞のゲノムに挿入することにより遺伝子改変することができる。これは、ＴＡＬＥＮＳ、Ｚｎフィンガータンパク質、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９を用いた相同組み換え、又は当該技術分野において既知の他の方法により行うことができる。したがって、好ましい実施の形態において、細胞株がＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする内因性遺伝子（複数の場合もある）を含み、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現させるのに適した１つ以上の位置のゲノムに挿入される、プロモーター、増強エレメント、及び安定化エレメントからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝要素を更に有する。好適なプロモーター、増強エレメント、及び安定化エレメントは特に限定されず、当該技術分野において知られている。例えば、プロモーターには、構成型プロモーター、例えばＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＵｂＣ、ＣＡＧ、ＢＯＳ、又はＰＧＫプロモーター及び誘導型プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導型プロモーター又は当該技術分野において既知の他の誘導型プロモーターがある。さらに、増強エレメント（エンハンサー）には、ＣＭＶエンハンサー、βグロビンエンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー、及びＰＧＫエンハンサーがある。さらに、安定化エレメント（クロマチンエレメント）には、マトリクス付着領域（ＭＡＲ）、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、及び遍在的作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）がある。
【００２２】
代替法として、細胞がＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする内因性遺伝子（複数の場合もある）を含まない場合、又はさらに、細胞がＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする内因性遺伝子（複数の場合もある）を含む場合、細胞の遺伝子改変は、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする核酸（複数の場合もある）を細胞に導入することにより実現することができる。核酸を細胞に導入する方法は特に限定されず、当該技術分野において知られている。例えば、上記の核酸を、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、顕微注入、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを介して、試薬ベースの方法、例えば脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、又は当該技術分野において既知の他の方法により、環状形態又は直鎖形態において細胞に導入することができる。核酸を、エピソーム系により、又は核酸のゲノムへの安定した組込みにより細胞に一時的又は安定して導入することができる。上記核酸は、１つ以上の発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ、ｐＣＥＰ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＥｎｔｒ、ｐＤｅｓｔ、ｐＥＦ、ｐＥＡＫ、ｐＣＭＶ、ｐＳｔｂｌ、又は当該技術分野において既知の他の発現ベクターの形態において、細胞内に存在することができる。ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４の発現は、構成型プロモーター、例えばＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＵｂＣ、ＣＡＧ、ＢＯＳ、若しくはＰＧＫプロモーター、内因性プロモーター、又は誘導型プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導型プロモーター若しくは当該技術分野において既知の他の誘導型プロモーターの制御下にあり得る。さらに、ＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする核酸は、１つの連続した核酸として存在することができ、又は個別の核酸として、例えば個別の発現ベクターとして存在することができる。上記核酸は、コード領域及びプロモーターに加え、好適な制限部位、Ｋｏｚａｋ配列、リボゾーム結合部位、クロマチン調節エレメント、選択カセット、エピソーム複製系、例えば当該技術分野において既知の、エプスタイン−バー核抗原及びｏｒｉ  Ｐ又はＳＶ４０  ｏｒｉ及びＳＶ４０Ｔラージ抗原、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシングシグナル、及びポリアデニル化シグナルを含有することができる。したがって、好ましい実施の形態において、細胞株はＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする外因性核酸（複数の場合もある）を含む。
【００２３】
細胞株のトランスフェクションに好適なＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする遺伝子は特に制限されず、ＳＴ６Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４活性を有するタンパク質をコードする任意の供給源由来の任意の遺伝子を含む。好ましくは、かかる遺伝子は、哺乳動物の、より好ましくはヒトのＳＴ６Ｇａｌ１遺伝子及びＳＴ３Ｇａｌ４遺伝子である。
【００２４】
本発明による細胞株は、当該技術分野において既知の細胞株、例えば哺乳動物の細胞株から得ることができる。好ましい実施の形態において、本発明の細胞株は、Ｍｕｓｃｏｖｙ  Ｄｕｃｋ細胞（ＡＧＥ．ＣＲ（商標））、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト肝細胞癌の細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト神経前駆体細胞（ＡＧＥ１．ＨＮ（商標）及びＮＣ５Ｔ１１）、ヒト胚網膜芽細胞（Ｐｅｒ．Ｃ６）、骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ、ＭＭ．１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）、ＣＭＬ腫瘍細胞株（ＮＭ、ＮＭ−Ｆ９）、ハイブリッドＨＥＫ２９３及びリンパ腫細胞（ＨＫＢ１１）、又はヒト羊膜細胞（ＣＡＰ；欧州特許第１２３０３５４号を参照）から得ることができ、この場合ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＣＡＰ細胞が好ましく、ＣＡＰ細胞が特に好ましい。
【００２５】
これに関して、ＣＡＰ細胞は、アデノウイルス、特にアデノウイルス５型（Ａｄ５）のＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域の遺伝子産物をコードする核酸を含む永久羊膜細胞株（amniocytic cell lines）である。ＣＡＰ細胞は、Ａｄ５のＥ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする核酸により形質転換される初代ヒト羊膜細胞に由来する。
【００２６】
したがって好ましい実施の形態では、本発明による細胞株は、アデノウイルスのＥ１領域及びｐＩＸ領域、好ましくはヌクレオチド５０５〜４０７９のアデノウイルス５型（Ａｄ５）のＥ１領域及びｐＩＸ領域の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸を含み、Ｅ１Ａがネズミ科ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターの制御下にあるのに対し、Ｅ１Ｂ及びｐＩＸの発現がそれらの天然プロモーターにより制御される、ヒト初代羊膜細胞に由来し得る。Ｅ１Ｂの下流イントロン、スプライスアクセプタ、及びｐｏｌｙＡシグナルは、ＳＶ４０由来の対応するモチーフによって置換される。
【００２７】
本発明の具体的な実施の形態では、本発明の細胞株は、ＳＴ６Ｇａｌ１とＳＴ３Ｇａｌ４の両方を過剰発現させるように遺伝子改変される。
【００２８】
本発明の更に具体的な実施の形態では、本発明の細胞株は、（ｉ）β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）を過剰発現させる、及び／又は、（ｉｉ）α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＩＶａ）、α−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＢ（ＧｎＴＩＶｂ）、及びα−１，６−マンノシル糖タンパク質６−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡ（ＧｎＴＶ）の発現を減少させるように遺伝子改変されていない。
【００２９】
これに関して、「細胞株はＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現させるように遺伝子改変されていない」という用語は、ＳＴ３Ｇａｌ１発現が、その細胞株の本来のＳＴ３Ｇａｌ１発現と比較して、何ら増加されていないという事実に関する。特定の実施の形態では、ＳＴ３Ｇａｌ１は全く発現されない。さらに、「細胞株はＧｎＴＩＶａ、ＧｎＴＩＶｂ及びＧｎＴＶの発現を減少させるように遺伝子改変されていない」という用語は、細胞株において上記タンパク質の本来の発現と比較して、上記タンパク質の発現が何ら減少していないという事実に関する。
【００３０】
本発明のこの第２の態様による細胞株は、上記細胞株において発現される組み換え糖タンパク質中の複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化を減少させることができる。
【００３１】
第３の態様では、本発明は、複合型Ｎ−グリカンを有する組み換え糖タンパク質であって、組み換え糖タンパク質の複合型Ｎ−グリカンアンテナの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％以上がフコシル化されないように、該複合型Ｎ−グリカンのアンテナ型フコシル化が減少されている、組み換え糖タンパク質に関する。
【００３２】
この態様では、本発明の第１及び第２の態様について上に挙げる全ての関連する定義及び限定が、同様にあてはまる。
【００３３】
各組み換え糖タンパク質は、本明細書に記載される通りに、例えば組み換え糖タンパク質と共にＳＴ６Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現によって産生され得る。好ましくは、上記糖タンパク質は、本明細書に記載される本発明による細胞株において産生される。
【００３４】
第４の態様では、本発明は、本発明による組み換え糖タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）本発明による細胞株を準備する工程と、
（ｂ）上記細胞株において組み換え糖タンパク質を発現させる工程と、
（ｃ）細胞又は細胞培養上清から糖タンパク質を単離する工程と、
を含む、方法に関する。
【００３５】
この態様では、本発明の第１、第２及び第３の態様について上に挙げる全ての関連する定義及び限定が、同様にあてはまる。特に、組み換え糖タンパク質及び細胞株は上に定義される通りである。
【００３６】
本発明の細胞株においてタンパク質を発現させる手段は特に限定されず、当該技術分野において知られている。これに関して、上記細胞株において目的の糖タンパク質を発現させる工程（ｂ）は、それぞれのコードする核酸を上記細胞株にトランスフェクションした後、糖タンパク質を実際に発現させることを包含する。さらに、細胞培養物から目的の糖タンパク質を単離する手段は特に制限されず、当該技術分野において知られている。
【００３７】
関連する態様では、本発明は、本発明による組み換え糖タンパク質の産生に対する本発明による細胞株の使用に関する。
【００３８】
この態様では、本発明の組み換え糖タンパク質及び本願の細胞株に関して記載される定義、並びに好ましい及び／又は具体的な実施の形態は全て、該当する場合には同じように適用される。
【００３９】
図面は以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】可能性のある変異体のサブセットを示すＬｅｗｉｓ糖エピトープファミリーを示す図である。ＬｅＸ糖エピトープは、ＧｌｃＮＡｃ単糖に対するα１−３結合にフコースを持つ。Ａ）シアリル化され、フコシル化されていないＧｌｃＮＡｃ；Ｂ）ＣＤ１５又はＳＳＥＡ−１とも呼ばれるＬｅｗｉｓＸ（ＬｅＸ）；Ｃ）シアリルＬｅｗｉｓＸ（ｓＬｅＸ）。
【図２】ＩＥＦ（等電点電気泳動）分析は、操作されていないｈＡＡＴ発現ＣＡＰ細胞から精製されたｈＡＡＴと比較して、ｈＡＡＴと、ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１とを安定的に組み換え発現する糖最適化ＣＡＰ細胞から精製されたｈＡＡＴのシアリル化の増加を示す。１レーン当たり５μｇの親和性精製されたｈＡＡＴを等電点電気泳動法に供した。プール生成の間の種々の時間点を示す。試料：シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４と並んでヒトＡＡＴを安定的に発現するＣＡＰ細胞に由来するｈＡＡＴであるＣＡＰ−ｈＡＡＴ−ＳＴ３Ｇａｌ４、シアリルトランスフェラーゼＳＴ６Ｇａｌ１と並んでヒトＡＡＴを安定的に発現するＣＡＰ細胞に由来するｈＡＡＴであるＣＡＰ−ｈＡＡＴ−ＳＴ６Ｇａｌ１。非糖最適化ＣＡＰ細胞に由来するｈＡＡＴである血漿由来ｈＡＡＴ（プロラスチン）、及びＣＡＰ細胞に由来する脱シアリル化ｈＡＡＴを対照とした。
【図３】組み換えＡＡＴの比較レクチンブロット分析は、フコシル化量の減少がシアリル化量の増加と相関することを明らかにする。野生型ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞又はＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞のいずれかに由来する精製されたヒトｒＡＡＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットし、特異的レクチンによって検出した。対応するデンシトメトリー分析（Ｂ）をマッチングウェスタンブロット（matching western blot）におけるＡＡＴタンパク質含量に対して正規化した。エリスリナ・クリスタ−ガッリレクチン（ＥＣＬ−レクチン：Erythrina crista-galli lectin）分析は、不完全なシアリル化を示すＮ−グリカン上の遊離ガラクトースを検出する。α１−３結合型フコースをロータス・テトラゴノロブスアグルチニン（ＬＴＡ：Lotus tetragonolobus agglutinin）によって検出する。
【図４】操作されていないＣＡＰ細胞と比較して、ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１を安定的に発現する糖最適化ＣＡＰ細胞の細胞表面糖タンパク質のＦＡＣＳ分析は、これら２つのシアリルトランスフェラーゼのうち１つの過剰発現が、発現された糖タンパク質の大半に対してシアリル化の程度を高めるだけではないことを明らかにする。また、Ｎ−グリカン構造上のアンテナ型フコース量を減少させて、ＬｅｗｉｓＸ構造量の減少をもたらす。
【図５】操作されていないＣＡＰ細胞に由来する細胞培養上清から精製されたｈＡＡＴと比較して、ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１のいずれかを安定的に発現するＣＡＰ細胞から精製されたｈＡＡＴにおけるシアル酸（ＮＡＮＡ）量の増加、及びフコース（Ｆｕｃ）量の減少を示す図である。血漿由来ｈＡＡＴ（プロラスチン）を対照として示す。アンペロメトリック電気化学検出法による高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ  ＰＡＤ）により、単糖分析を行った。
【図６】組み換えＣ１−阻害因子の比較レクチンブロット分析は、シアリル化の増加がアンテナ型フコシル化の減少と相関することを明らかにする。野生型ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞、又はＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞のいずれかから精製されたＣ１−阻害因子をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットし、特異的レクチンによって検出した。対応するデンシメトリー分析（Ｂ）を、マッチングウェスタンブロットにおけるＣ１−Ｉｎｈタンパク質含量に対して正規化した。エリスリナ・クリスタ−ガッリレクチン（ＥＣＬ−レクチン）分析（Ａ及びＢ）は、不完全なシアリル化を示すＮ−グリカン上の遊離ガラクトースを検出する。α１−３結合型フコースをロータス・テトラゴノロブスアグルチニン（ＬＴＡ）によって検出する。
【図７】組み換えＣ１−阻害因子のＭＳ−ＭＳ分析：野生型ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞、又はＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞のいずれかから精製されたＣ１−阻害因子に由来するＰＮＧａｓｅ  Ｆ放出完全メチル化Ｎ−グリカンをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦによって分析した。野生型由来Ｃ１−阻害因子のＭＳ１において３１９６．８のシグナル（Ａ）のみが２つのフコース残基を含み、ＭＳ２においてアンテナ型フコースに特徴的な断片化パターン（Ｍ／ｚ６３８、５０５、２６０；Ｄ）を含んでいた。ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４（Ｂ）及びＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１（Ｃ）では、３１９６．８のシグナルを検出することができず、また、ＭＳ１の他のシグナルも、ＭＳ２においてアンテナ型フコースの断片化パターンを含まなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明を以下の実施例にて更に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【００４２】
実験手順
細胞培養及び発酵
永久ヒト羊膜細胞株ＣＡＰ  １Ｄ５を、６ｍＭの安定なグルタミン（ドイツ国、Biochrom）を添加した既知組成の動物成分不含ＣＡＰ−ＣＤＭ培地（ドイツ国、CEVEC Pharmaceuticals）、又は４ｍＭの安定なグルタミン（ドイツ国、Biochrom）を添加した血清不含ＰＥＭ培地（Life Technologies）のいずれかにおいて懸濁培養した。ＣＡＰ細胞を、５％ＣＯ２及び１８５ｒｐｍで振盪フラスコ（Corning、４３１１４３番、１２５ｍＬ（２５ｍＬ  ｗｖ）又は４３１２５２番、３０００ｍＬ（１０００ｍＬ  ｗｖ））において３７℃で培養した。発酵の間、３日目、５日目及び７日目にＣＡＰ細胞に１０％ＣＡＰ−ＣＤＭフィード溶液（ドイツ国、CEVEC Pharmaceuticals）及び４ｍＭの安定なグルタミン（ドイツ国、Biochrom）を与えた。
【００４３】
クローニング
ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１を安定に発現するＣＡＰ細胞株を生成するため、対応する核酸コンストラクトを用いて細胞にヌクレオフェクションを行った。表１は、このプロジェクトのため作製された全ての細胞株を収載する。
【００４４】
ＳＴ３Ｇａｌ４  ｃＤＮＡの設計のため、前駆体タンパク質及び成熟タンパク質の配列情報は、データベースエントリーＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１１２０６（配列番号１）に基づいた。クローニングのため、ｐＳｔｂｌ−Ｎｅｏ−ＣＭＶ−ＭＣＳ（−）ベクター中、ＣｌａＩ制限酵素部位及びコザック配列をヒトＳＴ３Ｇａｌ４  ｃＤＮＡの開始コドンの５’に付加し、ＥｃｏＲＶ制限酵素部位をＣｌａＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＶ制限酵素部位との間に挿入される停止コドンの３’に付加して、発現プラスミドｐＳｔｂｌ−Ｎｅｏ−ＣＭＶ−ＳＴ３Ｇａｌ４を得た。このベクターは、目的の遺伝子の発現を駆動するＣＭＶプロモーターの後に、改善されたスプライシング媒介ｍＲＮＡ輸送のためのＳＶ４０イントロン、及び目的の遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む。選択マーカーは、ヒトユビキチン（ＵｂＣ）プロモーターによって駆動される。ｃＤＮＡ合成をＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ国、Life Technologies）で行った。
【００４５】
【表１】
2020515254.tif 000002
【００４６】
ＳＴ６Ｇａｌ１  ｃＤＮＡの設計のため、前駆体タンパク質及び成熟タンパク質の配列情報は、データベースエントリーＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１５９０７（配列番号２）に基づいた。クローニングのため、ｐＳｔｂｌ−Ｎｅｏ−ＣＭＶ−ＭＣＳ（−）ベクター中、ＣｌａＩ制限酵素部位及びコザック配列をヒトＳＴ６Ｇａｌ１  ｃＤＮＡの開始コドンの５’に付加し、ＥｃｏＲＶ制限酵素部位をＣｌａＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＶ制限酵素部位との間に挿入される停止コドンの３’に付加して、発現プラスミドｐＳｔｂｌ−Ｎｅｏ−ＣＭＶ−ＳＴ６Ｇａｌ１を得た。ｃＤＮＡ合成をＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ国、Life Technologies）で行った。
【００４７】
ヌクレオフェクション及びプール生成
ヌクレオフェクションは、製造業者のプロトコルに従って適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（ＫｉｔＶ）を備えるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（LONZA）を使用して行った。簡潔には、培養物の指数増殖期の間に１×１０７個の細胞を遠心分離（１５０ｇで５分間）により採取し、１００μｌの完全Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁し、合計５μｇのプラスミドと混合した。Ｘ００１プログラムを使用して、ヌクレオフェクションを行った。パルスの後、１２５ｍｌ容の振蕩フラスコ中、１２ｍｌの完全細胞培養培地において細胞を回収した。先のように、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び１８５ｒｐｍで培養した。
【００４８】
ヌクレオフェクションの７２時間後〜９６時間後、２００μｇ／ｍｌのネオマイシンで細胞を選択して安定なプールを生成した。
【００４９】
ウエスタンブロット分析
精製されたタンパク溶液を、製造業者の指示に従って、還元条件下でＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ上で分離した。分離したタンパク質を、Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Invitrogen）（３０Ｖにて室温で６０分間）によりＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬメンブレン（１００Ｖにて室温で６０分間）に転写した。メンブレンをＰＢＳＴＢ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０及び１％ＢＳＡを添加）で室温にて１時間ブロッキングした。その後、ＰＢＳＴＢに希釈した特異的セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体と共にメンブレンをインキュベートした。ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加）でメンブレンを洗浄した後、タンパク質を、化学発光検出器（INTAS）により、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  ＷＢ基質キットを使用して検出した。
【００５０】
レクチン免疫ブロッティング
レクチンは特定の炭水化物構造に結合するタンパク質である。したがって、ビオチン結合型レクチンを使用してＮ結合型グリカンを分析することができる。エリスリナ・クリスタ−ガッリ（ＥＣＬ）レクチンはＮ結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出し、サンブカス・ニグラアグルチニン（ＳＮＡ：Sambucus nigra agglutinin）はα２，６結合型シアル酸に優先的に結合するのに対し、マキア・アムレンシスレクチン（ＭＡＬ：Maackia amurensis lectin）はα２，３結合型シアル酸に優先的に結合する。α１−３結合型フコースは、ロータス・テトラゴノロブスアグルチニン（ＬＴＡ）によって検出され、アレウリア・アウランティアレクチン（ＡＡＬ：Aleuria aurantia lectin）はα１−２−、−３、又は−６結合型フコースを検出する。
【００５１】
ＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１の共発現を伴う又はそれを伴わない親ＣＡＰ細胞から精製されたタンパク質溶液を上に記載される通りに分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（GE healthcare）にブロットした。メンブレンをＰＢＳＴＢ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０及び１％ＢＳＡを添加）により室温で１時間ブロッキングした。その後、メンブレンを、ＰＢＳＴＢで希釈したレクチンと共にインキュベートした。ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加）でメンブレンを洗浄した後、メンブレンを室温で１時間、ストレプトアビジン結合型セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＰＢＳＴＢで希釈）で染色した。ＨＲＰシグナルを、抗ストレプトアビジンＩｇＧ及び抗ＩｇＧ−ＨＲＰを使用して増幅した。化学発光検出器（INTAS）により、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  ＷＢ基質キットを使用してタンパク質を検出した。
【００５２】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析
ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１の更なる発現を伴って、又はそれを伴わずにｒｈＡＡＴを発現するＣＡＰ細胞から精製されたｒｈＡＡＴの等電点（ｐＩ）を分析するため、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。シアリル化の程度は、所与のタンパク質の酸性度、したがってそのｐＩと相関する。ＩＥＦ分析を製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って行った。簡潔には、５μｇの精製されたタンパク質をｐＨ３〜ｐＨ７のゲルにロードし、電気泳動（１時間  １００Ｖ、１時間  ２００Ｖ、３０分間  ５００Ｖ）に供した。製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って、タンパク質をＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【００５３】
実施例１：
ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１細胞から精製されたｈＡＡＴタンパク質のＬｅｗｉｓＸ構造の量の著しい減少
α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害因子である。ＡＡＴは、セリンプロテアーゼ、特に好中球エラスターゼの強力な阻害因子である。ＡＡＴは、３つのＮ−グリコシル化部位を持つ５２ｋＤａの糖タンパク質である。
【００５４】
ヒトＡＡＴを既に安定的に発現するヒト羊膜細胞株ＣＡＰの細胞を、更に、Ｎ−グリカンの末端ガラクトースの２，３結合型シアリル化の増加を達成するためのシアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４、又はＮ−グリカンの末端ガラクトースの２，６−シアリル化の増加を達成するためのシアリルトランスフェラーゼＳＴ６Ｇａｌ１のいずれかをコードするプラスミドで安定的にトランスフェクトした。
【００５５】
シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現による２，３−又は２，６−シアリル化の増強を、精製されたｈＡＡＴの等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析によって判断した（図２）。
【００５６】
種々のｒｈＡＡＴ（組み換えｈＡＡＴ）の骨格は同一であることから、ＩＥＦの変化はシアル酸含量の変化を示す。ＳＴ３Ｇａｌ４の更なる発現を伴ってＣＡＰ細胞で発現される組み換えｈＡＡＴは、酸性ｐＩへと著しくシフトする改変ｒｈＡＡＴをもたらしてシアリル化の程度の増加を示し、ＳＴ６Ｇａｌ１を過剰発現する親ＣＡＰ細胞で発現されたｒｈＡＡＴもまたより酸性のｐＩへとシフトするが程度は低い（図２）。これは、おそらくは、ＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ６Ｇａｌ１の異なる基質親和性に起因するものである。ＳＴ６Ｇａｌ１は、Ｎ−グリカンの一次分岐鎖のシアリル化を触媒するのに対し、ＳＴ３Ｇａｌ４は、Ｎ−グリカンの一次分岐鎖だけでなく、トリ−及びテトラアンテナ型Ｎ−グリカンの追加の分岐鎖のシアリル化も触媒する。したがって、ＳＴ３Ｇａｌ４は、ＳＴ６Ｇａｌ１よりも多くの利用可能なアクセプター基質を有する。
【００５７】
この結果は、レクチンブロット分析（図３）によって確認され得る。シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現によるα２，３−又はα２，６−シアリル化量の増加を、エリスリナ・クリスタガッリ（ＥＣＬ）レクチンブロット分析によって判断した。ＥＣＬレクチンは、Ｎ結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。したがって、ＥＣＬブロットのシグナル減弱は、シアリル化量の増加と相関する。ＡＡＴを発現する対照ＣＡＰ細胞から精製されたＡＡＴは、ＥＣＬレクチンブロットで明らかなシグナルを示し、不完全なシアリル化を証明した。ＳＴ６Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するＣＡＰ細胞に由来するＡＡＴは、ＥＣＬシグナルの強力な減少又は完全な不在を示し、ごくわずかな量のＮ結合型グリカンのシアリル化されていないβ１−４結合型ガラクトースがこれらの調製物に存在することを示した（図３）。
【００５８】
注目すべきことに、アンテナ型フコース（ＬｅｗｉｓＸ抗原）の程度は、図３のロータス・テトラゴノロブスアグルチニン（ＬＴＡレクチン）ブロット分析におけるシグナル強度の低減によって証明されるように、ＳＴ６Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４の共発現により、ｒｈＡＡＴに対して減少される。ロータス・テトラゴノロブスアグルチニン（ＬＴＡ）は、α１−３結合型アンテナ型フコースを特異的に検出する。したがって、シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現は予想外ではあったが、望ましくない免疫原性となり得るＮ結合型グリカン上のＬｅｗｉｓＸ構造の量を著しく減少させる適切な方法である。
【００５９】
実施例２：
ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１を発現するＣＡＰ細胞の細胞表面上の糖タンパク質のＦＡＣＳ分析
シアリルトランスフェラーゼの過剰発現によるシアリル化の程度の増加を伴う細胞表面上の糖タンパク質のフコシル化の程度を判断するため、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を行った（図４）。
【００６０】
細胞表面上の糖エピトープを分析するため、ＣＡＰ−ｈＡＡＴ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞又はＣＡＰ−ｈＡＡＴ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞を種々の抗体及びレクチンで染色した。典型的には、１×１０７個の細胞を１４０×ｇで１０分間遠心分離し、１００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁した。１０μｌ（１０６個の細胞）を１０μｌの抗体又はレクチン（１ｍｇ／ｍｌ；ＦＩＴＣ結合抗ＤＩＧ抗体と組み合わせてＦＩＴＣ複合化されている又はＤＩＧ結合している）と混合し、９０μｌのＰＢＳ／ＢＳＡを添加した。４℃で１０分後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した。細胞ペレットを５００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータでＦＡＣＳ分析に供した。死細胞をヨウ化プロピジウムで染色することにより識別し、排除した。典型的には、３００００の事象を数え、分析した。ＦＩＴＣ又はＰＥで染色された細胞を、染色していない細胞と図面上で重ねた。
【００６１】
図４は、親ＣＡＰ−ｈＡＡＴ細胞又はα２，３（ＣＡＰ−ｈＡＡＴ＋ＳＴ３Ｇａｌ４）若しくはα２，６（ＣＡＰ−ｈＡＡＴ＋ＳＴ６Ｇａｌ１）のシアリルトランスフェラーゼをそれぞれ安定的に発現するＣＡＰ−ｈＡＡＴ細胞を示す。細胞を、α２，３結合型ノイラミン酸、ＭＡＡ（マキア・アムレンシスアグルチニン）若しくはα２，６結合型ノイラミン酸残基、ＳＮＡ（サンブカス・ニグラアグルチニン）に特異的なレクチン、又はα１，３結合型フコース残基（ＬｅＸ）を認識するＬＴＡ（ロータス・テトラゴノロブスアグルチニン）のいずれかで染色した。ＦＩＴＣ結合抗ＤＩＧ抗体のみとインキュベートした細胞と並んで、親ＣＡＰ−ｈＡＡＴ細胞、ＨＬ６０細胞（ＬｅＸ陽性）、ＬｅＸ陰性ＨＥＫ２９３細胞（ＬｅＸ陰性）を対照として示す。
【００６２】
予想通り、α２，３−又はα２，６−シアリルトランスフェラーゼの過剰発現は、細胞表面糖タンパク質のＮ−グリカン上の各結合型ノイラミン酸残基を増加させる。興味深いことに、ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１の発現は、レクチンＬＴＡによる染色の著しい減少によって示されるように、細胞表面の糖タンパク質上の好ましくないＬｅＸ構造の量を減少させる。
【００６３】
実施例３：
ＨＰＡＥＣ  ＰＡＤ分析によるＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞又はＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞で発現されたｈＡＡＴの単糖分析
ＣＡＰ細胞から精製された組み換えｈＡＡＴのシアル酸及びフコースの総量がシアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１の追加的な発現によって変化するかどうかを判断するため、アンペロメトリック電気化学検出法による高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ  ＰＡＤ）で単糖分析を行った。
【００６４】
図５は、ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１のいずれかをコードするプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＣＡＰ−ｈＡＡＴ細胞中でＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる単糖分析によって特定されたシアル酸及びフコースの相対量を示す。
【００６５】
図５は、ヒトシアリルトランスフェラーゼを発現させることにより、シアリル酸含量が上昇されるのに対し、ｒｈＡＡＴ  １分子当たりのフコースの量はトランスフェクトされていない対照と比べて著しく減少されることを明らかにし、好ましくないＬｅＸ又はシアリル−ＬｅＸ構造の量はシアリルトランスフェラーゼの過剰発現によって減少されることを示す。この実験で留意すべきは、フコースの総量が、Ｎ−グリカンのアンテナ型フコース残基（α１−３結合型フコース）とコアフコース（α１−６結合型フコース）とを区別することなく特定されることである。シアリルトランスフェラーゼの追加的な発現がアンテナ型α１−３結合型フコースの量にのみ影響し、比較的豊富なコアフコースには影響しないことから、シアリルトランスフェラーゼの過剰発現による特定されたフコースの２５％（ＳＴ６Ｇａｌ１）及び３０％（ＳＴ３Ｇａｌ４）の全体的な減少は、アンテナ型α１−３結合型フコースの絶対量の明らかな減少を示す。
【００６６】
フコース残基の全体的な減少は、ＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現によって増加されるシアリル化複合型Ｎ−グリカン（ＮｅｕＡｃ（α１→４）Ｇａｌ（β−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）由来の遠位ＧｌｃＮＡｃがフコシルトランスフェラーゼＦｕｔ５、Ｆｕｔ６及びＦｕｔ７に対する基質であることから、非常に驚くべきことである。したがって、ＳＴ３Ｇａｌ４としてのシアリルトランスフェラーゼの過剰発現は、フコース残基の全体的な減少ではなく、むしろシアリル−ＬｅｗｉｓＸ構造の増加をもたらすはずである。
【００６７】
実施例４：
ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞又はＳＴ６Ｇａｌ１細胞から精製されたｈＣ１阻害因子タンパク質のＬｅｗｉｓＸ構造量の減少
ヒト羊膜細胞株ＣＡＰ−ｈＣ１  Ｉｎｈの細胞を、Ｎ−グリカンの末端ガラクトースのα２，３結合型シアリル化の増加を達成するためのシアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４、又はＮ−グリカンの末端ガラクトースのα２，６−シアリル化の増加を達成するためのシアリルトランスフェラーゼＳＴ６Ｇａｌ１のいずれかをコードするプラスミドで安定的にトランスフェクトした。
【００６８】
シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現によるα２，３−又はα２，６−シアリル化量の増加を、エリスリナ・クリスタ−ガッリ（ＥＣＬ）レクチンブロット分析によって判断した。ＥＣＬレクチンは、Ｎ結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。図６に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現は、非糖変性ＣＡＰ細胞に由来する細胞培養上清から精製されたＣ１  Ｉｎｈと比較して、Ｎ結合型グリカンのシアリル化の増加をもたらす。また、ＳＴ６Ｇａｌ１の過剰発現も非糖変性Ｃ１−Ｉｎｈと比較して、Ｎ結合型グリカンの末端ガラクトースのシアリル化の増加をもたらすが、その効果は、ＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現によるものほど明白ではない。これは、実施例１において説明されるようにＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ６Ｇａｌ１の異なる基質親和性に起因する可能性が最も高い。
【００６９】
種々のＣ１  Ｉｎｈタンパク質調製物（ＣＡＰ対照、ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４、ＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１）におけるアンテナ型α１−３結合型フコースの量を、ロータス・テトラゴノロブスアグルチニン（ＬＴＡ）ブロット分析によって特定した。図６は、ＳＴ６Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現によるシアリル化の増加が、ＬＴＡレクチンブロット分析におけるシグナル強度の低減によって証明されるアンテナ型フコシル化の量の減少と相関することを明らかにする。
【００７０】
これらの結果は、ＣＡＰ対照細胞、ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞、又はＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞に由来するＣ１  ＩｎｈからのＮ−グリカンのＭＳ−ＭＳ分析によって確認された（図７）。対照ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４細胞、又はＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１細胞のいずれかから精製されたＣ１−阻害因子に由来する、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ放出完全メチル化Ｎ−グリカンをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦによって分析した。野生型由来Ｃ１−阻害因子のＭＳ１において３１９６．８のシグナル（図７Ａ）のみが２つのフコース残基を含み、ＭＳ２においてアンテナ型フコースに特徴的な断片化パターン（Ｍ／ｚ６３８、５０５、２６０；Ｄ）を含んでいた。ＣＡＰ−ＳＴ３Ｇａｌ４及びＣＡＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１（図７Ｂ及び図７Ｃ）では、３１９６．８のシグナルを検出することができなかった。さらに、ＭＳ１の他のシグナルは、ＭＳ２におけるアンテナ型フコースの断片化パターンを含んでいなかった。
【００７１】
本発明は、以下のアミノ酸配列に関する。
【００７２】
配列番号１
ヒトＳＴ３Ｇａｌ４
ＭＶＳＫＳＲＷＫＬＬＡＭＬＡＬＶＬＶＶＭＶＷＹＳＩＳＲＥＤＲＹＩＥＬＦＹＦＰＩＰＥＫＫＥＰＣＬＱＧＥＡＥＳＫＡＳＫＬＦＧＮＹＳＲＤＱＰＩＦＬＲＬＥＤＹＦＷＶＫＴＰＳＡＹＥＬＰＹＧＴＫＧＳＥＤＬＬＬＲＶＬＡＩＴＳＳＳＩＰＫＮＩＱＳＬＲＣＲＲＣＶＶＶＧＮＧＨＲＬＲＮＳＳＬＧＤＡＩＮＫＹＤＶＶＩＲＬＮＮＡＰＶＡＧＹＥＧＤＶＧＳＫＴＴＭＲＬＦＹＰＥＳＡＨＦＤＰＫＶＥＮＮＰＤＴＬＬＶＬＶＡＦＫＡＭＤＦＨＷＩＥＴＩＬＳＤＫＫＲＶＲＫＧＦＷＫＱＰＰＬＩＷＤＶＮＰＫＱＩＲＩＬＮＰＦＦＭＥＩＡＡＤＫＬＬＳＬＰＭＱＱＰＲＫＩＫＱＫＰＴＴＧＬＬＡＩＴＬＡＬＨＬＣＤＬＶＨＩＡＧＦＧＹＰＤＡＹＮＫＫＱＴＩＨＹＹＥＱＩＴＬＫＳＭＡＧＳＧＨＮＶＳＱＥＡＬＡＩＫＲＭＬＥＭＧＡＩＫＮＬＴＳＦ
【００７３】
配列番号２
ヒトＳＴ６Ｇａｌ１
ＭＩＨＴＮＬＫＫＫＦＳＣＣＶＬＶＦＬＬＦＡＶＩＣＶＷＫＥＫＫＫＧＳＹＹＤＳＦＫＬＱＴＫＥＦＱＶＬＫＳＬＧＫＬＡＭＧＳＤＳＱＳＶＳＳＳＳＴＱＤＰＨＲＧＲＱＴＬＧＳＬＲＧＬＡＫＡＫＰＥＡＳＦＱＶＷＮＫＤＳＳＳＫＮＬＩＰＲＬＱＫＩＷＫＮＹＬＳＭＮＫＹＫＶＳＹＫＧＰＧＰＧＩＫＦＳＡＥＡＬＲＣＨＬＲＤＨＶＮＶＳＭＶＥＶＴＤＦＰＦＮＴＳＥＷＥＧＹＬＰＫＥＳＩＲＴＫＡＧＰＷＧＲＣＡＶＶＳＳＡＧＳＬＫＳＳＱＬＧＲＥＩＤＤＨＤＡＶＬＲＦＮＧＡＰＴＡＮＦＱＱＤＶＧＴＫＴＴＩＲＬＭＮＳＱＬＶＴＴＥＫＲＦＬＫＤＳＬＹＮＥＧＩＬＩＶＷＤＰＳＶＹＨＳＤＩＰＫＷＹＱＮＰＤＹＮＦＦＮＮＹＫＴＹＲＫＬＨＰＮＱＰＦＹＩＬＫＰＱＭＰＷＥＬＷＤＩＬＱＥＩＳＰＥＥＩＱＰＮＰＰＳＳＧＭＬＧＩＩＩＭＭＴＬＣＤＱＶＤＩＹＥＦＬＰＳＫＲＫＴＤＶＣＹＹＹＱＫＦＦＤＳＡＣＴＭＧＡＹＨＰＬＬＹＥＫＮＬＶＫＨＬＮＱＧＴＤＥＤＩＹＬＬＧＫＡＴＬＰＧＦＲＴＩＨＣ
【００７４】
配列番号３
ヒトＡＡＴ
ＭＰＳＳＶＳＷＧＩＬＬＬＡＧＬＣＣＬＶＰＶＳＬＡＥＤＰＱＧＤＡＡＱＫＴＤＴＳＨＨＤＱＤＨＰＴＦＮＫＩＴＰＮＬＡＥＦＡＦＳＬＹＲＱＬＡＨＱＳＮＳＴＮＩＦＦＳＰＶＳＩＡＴＡＦＡＭＬＳＬＧＴＫＡＤＴＨＤＥＩＬＥＧＬＮＦＮＬＴＥＩＰＥＡＱＩＨＥＧＦＱＥＬＬＲＴＬＮＱＰＤＳＱＬＱＬＴＴＧＮＧＬＦＬＳＥＧＬＫＬＶＤＫＦＬＥＤＶＫＫＬＹＨＳＥＡＦＴＶＮＦＧＤＴＥＥＡＫＫＱＩＮＤＹＶＥＫＧＴＱＧＫＩＶＤＬＶＫＥＬＤＲＤＴＶＦＡＬＶＮＹＩＦＦＫＧＫＷＥＲＰＦＥＶＫＤＴＥＥＥＤＦＨＶＤＱＶＴＴＶＫＶＰＭＭＫＲＬＧＭＦＮＩＱＨＣＫＫＬＳＳＷＶＬＬＭＫＹＬＧＮＡＴＡＩＦＦＬＰＤＥＧＫＬＱＨＬＥＮＥＬＴＨＤＩＩＴＫＦＬＥＮＥＤＲＲＳＡＳＬＨＬＰＫＬＳＩＴＧＴＹＤＬＫＳＶＬＧＱＬＧＩＴＫＶＦＳＮＧＡＤＬＳＧＶＴＥＥＡＰＬＫＬＳＫＡＶＨＫＡＶＬＴＩＤＥＫＧＴＥＡＡＧＡＭＦＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱＫ
【００７５】
配列番号４
ヒトＣ１  Ｉｎｈ
ＭＡＳＲＬＴＬＬＴＬＬＬＬＬＬＡＧＤＲＡＳＳＮＰＮＡＴＳＳＳＳＱＤＰＥＳＬＱＤＲＧＥＧＫＶＡＴＴＶＩＳＫＭＬＦＶＥＰＩＬＥＶＳＳＬＰＴＴＮＳＴＴＮＳＡＴＫＩＴＡＮＴＴＤＥＰＴＴＱＰＴＴＥＰＴＴＱＰＴＩＱＰＴＱＰＴＴＱＬＰＴＤＳＰＴＱＰＴＴＧＳＦＣＰＧＰＶＴＬＣＳＤＬＥＳＨＳＴＥＡＶＬＧＤＡＬＶＤＦＳＬＫＬＹＨＡＦＳＡＭＫＫＶＥＴＮＭＡＦＳＰＦＳＩＡＳＬＬＴＱＶＬＬＧＡＧＥＮＴＫＴＮＬＥＳＩＬＳＹＰＫＤＦＴＣＶＨＱＡＬＫＧＦＴＴＫＧＶＴＳＶＳＱＩＦＨＳＰＤＬＡＩＲＤＴＦＶＮＡＳＲＴＬＹＳＳＳＰＲＶＬＳＮＮＳＤＡＮＬＥＬＩＮＴＷＶＡＫＮＴＮＮＫＩＳＲＬＬＤＳＬＰＳＤＴＲＬＶＬＬＮＡＩＹＬＳＡＫＷＫＴＴＦＤＰＫＫＴＲＭＥＰＦＨＦＫＮＳＶＩＫＶＰＭＭＮＳＫＫＹＰＶＡＨＦＩＤＱＴＬＫＡＫＶＧＱＬＱＬＳＨＮＬＳＬＶＩＬＶＰＱＮＬＫＨＲＬＥＤＭＥＱＡＬＳＰＳＶＦＫＡＩＭＥＫＬＥＭＳＫＦＱＰＴＬＬＴＬＰＲＩＫＶＴＴＳＱＤＭＬＳＩＭＥＫＬＥＦＦＤＦＳＹＤＬＮＬＣＧＬＴＥＤＰＤＬＱＶＳＡＭＱＨＱＴＶＬＥＬＴＥＴＧＶＥＡＡＡＡＳＡＩＳＶＡＲＴＬＬＶＦＥＶＱＱＰＦＬＦＶＬＷＤＱＱＨＫＦＰＶＦＭＧＲＶＹＤＰＲＡ
【図１】
2020515254.tif 000003
【図２】
2020515254.tif 000004
【図３】
2020515254.tif 000005
【図４】
2020515254.tif 000006
【図５】
2020515254.tif 000007
【図６】
2020515254.tif 000008
【図７Ａ】
2020515254.tif 000009
【図７Ｂ】
2020515254.tif 000010
【図７Ｃ】
2020515254.tif 000011
【図７Ｄ】
2020515254.tif 000012
【配列表】
2020515254000001.app
【国際調査報告】
2020515254.tif 000013
2020515254.tif 000014
2020515254.tif 000015