(57)【要約】  本発明は、心不全の予防および治療のための医薬組成物に関する。特に、本発明は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドおよびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクト、ならびに心不全を予防または治療するための効果的な成分として前記コンストラクトを含む医薬組成物に関する。心不全の予防および治療のための本発明による医薬組成物は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質とＣＣＮ５タンパク質の共発現のための方法で使用される。心筋細胞の喪失を予防し、心筋細胞の活性を増大させるというＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の機能、ならびに心臓の細胞および組織の線維化を抑制するというＣＣＮ５タンパク質の機能を介して相乗的治療効果を発揮するように設計されるので、医薬組成物は、様々な病因学的因子によって誘導される複合障害である心不全を予防または治療するのに有用であり得る。
2020536519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、
および
（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列
を含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項２】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質が配列番号１によって表されるアミノ酸である、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項３】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号２によって表される配列である、請求項２に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項４】
ＣＣＮ５タンパク質が配列番号３によって表されるアミノ酸である、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項５】
ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号４によって表される配列である、請求項４に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
ヌクレオチド配列（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する自己切断配列を含む、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
自己切断配列が、ブタテッショウウイルス−１、ゾセア・アシグナウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルスまたは口蹄疫ウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項６に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
自己切断配列がブタテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項６に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項９】
自己切断配列が配列番号６によって表されるヌクレオチド配列である、請求項６に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列（ｉ）および（ｉｉ）を、５’から３’の方向で（ｉ）−（ｉｉ）の順に含む、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１１】
作動可能に連結したプロモーター配列をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１２】
プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーターならびに合成の筋肉および心臓制限プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトを搭載している組換え発現ベクター。
【請求項１４】
プラスミドベクターおよびコスミドベクターからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルス。
【請求項１６】
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１５に記載の組換えウイルス。
【請求項１７】
アデノ随伴ウイルスである、請求項１５に記載の組換えウイルス。
【請求項１８】
活性成分として、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト、請求項１３に記載の組換え発現ベクターまたは請求項１５に記載の組換えウイルスを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法。
【請求項２０】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクター、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２１】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２２】
（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与する工程、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法。
【請求項２３】
投与工程（ｉ）および（ｉｉ）が同時に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
投与工程（ｉ）または（ｉｉ）の後に、残りの投与工程が所定の時間間隔で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを投与する工程、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法。
【請求項２６】
投与工程（ｉ）および（ｉｉ）が同時に行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
投与工程（ｉ）または（ｉｉ）の後に、残りの投与工程が所定の時間間隔で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
心不全を予防または治療するための、請求項１に記載の遺伝子コンストラクトの使用。
【請求項２９】
心不全を予防または治療するための、請求項１３に記載の組換え発現ベクターの使用。
【請求項３０】
心不全を予防または治療するための、請求項１５に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項３１】
心不全を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、請求項１に記載の遺伝子コンストラクトの使用。
【請求項３２】
心不全を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、請求項１３に記載の組換え発現ベクターの使用。
【請求項３３】
心不全を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、請求項１５に記載の組換えウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全を予防または治療するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクト、ならびに活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全（ＨＦ）は、血液を入れるかまたは排出する心室のポンプ機能の構造的および機能的障害が原因で複合症状が生じる疾患である。心不全は癌よりも死亡率が高い疾患であり、診断から５年以内の死亡率は５０％以上である。心不全の患者数は世界中で３８００万人と推定され、その有病率も加齢とともに増加している。しかし、心不全に対する根治療法はなく、現在の治療は疾患の進行を遅らせることができるだけである。したがって、その医療は、多くの治療費を招き、これは、患者に対して大きな負担である（Braunwald E. Lancet, 2015; 385: 812-824）。
【０００３】
心不全は、心臓の状態、遺伝的欠陥および全身性疾患に起因する幅広い心疾患によって引き起こされる。心不全の発症に関係している疾患としては、典型的には、虚血性疾患、高血圧性疾患および心臓弁疾患が挙げられ、原発性心筋症、アミロイド症を含めた続発性心筋症、先天性心疾患、心膜疾患などのも挙げられ、これらは、遺伝的原因または後天的原因が理由で発生する（Maron BJ. et al., Circulation., 2006; 113: 1807-1816）。様々な心疾患から発生する心不全は、心臓の構造変化および機能不全につながる病的心臓リモデリングをもたらす。特に、リモデリングに関して、心筋細胞のサイズ、形および機能の変化によって引き起こされる細胞レベルでのリモデリング、および細胞外基質（ＥＣＭ）の過剰な蓄積に起因する心臓組織の線維化によって引き起こされる組織レベルでのリモデリングが存在する。そのような病的心臓リモデリングは、心筋細胞における転写的、シグナリング的、構造的、電気生理学的および機能的役割の疾患関連変化をともなう。
【０００４】
心筋細胞外基質（ＥＣＭ）は、心筋細胞の効率的な収縮および弛緩のための機械的機能を支持し、心筋内の微小環境において、力の適切な伝達、電気信号伝達、細胞間情報伝達、代謝産物の交換などを促進する役割を果たす精巧な構造体である。心臓壁におけるストレスの増大、損傷および疾患は、細胞外基質において線維化の進行をもたらし、それによって、心筋細胞および筋線維の運動機能、例えば、収縮および弛緩に対して損傷を引き起こす（Li AH. et al., Circ Res., 2014; 114(5): 916-27）。
【０００５】
さらに、病的リモデリングは、心筋の収縮および弛緩の機能不全、ならびに心筋細胞の消失をもたらす。細胞レベルでの心筋細胞の肥大および死は、心筋の興奮収縮連関に影響を及ぼし、心筋細胞収縮、細胞生存、エネルギー代謝および酸化ストレスに関係するミトコンドリア機能を調節する分子メカニズムにおいて病的変化ももたらす（Koitabashi N., et al., Nat. rev. Cardiol., 2012; 9:147-157）。
【０００６】
心臓組織は、病的構造変化、例えば、筋線維芽細胞の生成および線維化の促進、血管平滑筋の硬化、血管内皮細胞の機能不全ならびに免疫細胞の炎症作用を受ける。細胞レベルでのそのような疾患の進行は、統合されたプロセス、例えば、心筋細胞の肥大および死、血管の喪失、線維化、炎症、代謝機能不全および電気生理学的リモデリングを介して組織レベルでのリモデリングにつながり、それによって、心不全を引き起こす（Burchfield JS et al., Circulation. 2013; 128: 388-400）。
【０００７】
この４０年間、心不全患者に対する治療として、神経ホルモン遮断薬が使用されている。しかし、症状を軽減し、心臓の過負荷されたストレスを低下させるという心不全治療の有効性にもかかわらず、心不全患者の予後は極めて不良であり、心不全患者の死亡率は発症の５年後に５０％に達し、発症の１０年後に９０％に達する。さらに、心不全が激しく進行する場合では、心臓補助装置および心臓移植以外の治療方法はない。したがって、心不全に対する根治療法および心臓を回復させるための新規療法の開発が緊急に必要である。
【０００８】
新規療法に関して、近年、治療の開発が活発に行われている分野としては、疾患関連シグナリングシステムを調節する、薬物、細胞療法、ｍｉＲＮＡおよび遺伝子療法が挙げられる。上記の治療の中で、いくつかの薬物は、動物の心不全疾患モデルにおいて、または小規模の第ＩＩ相臨床試験において、効果的であることが報告されている（Braunwald E. Lancet, 2015; 385: 812-824, VonLueder TG. et al., Nat. Rev. Cardiol., 2015; 12: 730-740）。
【０００９】
特に、心疾患の疾患機構を遺伝子レベルで理解すること、治療遺伝子の発見、遺伝子媒体についての設計およびパッケージング技法、デリバリー技法の急速な開発などの理由で、動物における心疾患の治療についての様々な前臨床試験が行われている（Gorski PA, et al. Cell Metabol. 2015; 21: 183-194）。
【００１０】
近年では、多数の研究によって、心不全動物モデルへのＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子のデリバリーが生存率の増加および心臓収縮性の増大をもたらすことが報告されている。しかし、２５０人もの多数の臨床患者が参加する、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ−ＳＥＲＣＡ２ａを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）を用いる第ＩＩｂ相臨床試験において、心不全の遺伝子療法は、ブタ、ヒツジ、イヌ、さらに霊長類における実験結果と異なり、妥当な臨床的有用性を示さなかった（Rincon M Y. et al., Cardiovas. Res., 2015; 108: 4-20）。
【００１１】
心不全の治療のための薬物の開発においてでさえ、第ＩＩ相臨床試験で治療効果を示した新薬が、期待される有効性未満しか示さないか、または第ＩＩＩ相臨床試験で失敗に終わる場合が報告されている（Vaduganathan M, et al., Nat. Rev. Cardiol., 2013; 10: 85-97）。
【００１２】
心不全のための現在の治療は、症状を軽減すること、および心臓の過負荷されたストレスを低下させることに焦点を合わせている。しかし、治療の有効性にもかかわらず、心不全患者の予後は極めて悲観的であり、心不全患者の死亡率は発症の５年後に５０％に達し、発症の１０年後に９０％に達する。心不全のための治療を開発する分野で新たに理解された疾患機構の中で、心臓のポンプ機能に直接的に影響を及ぼす線維化をともなう心臓リモデリングと心筋細胞の損傷がお互いに相互作用し、その結果、これらは密接に関連して、疾患の発生、進行および予後に影響を及ぼし、悪循環を作ることが見出された。
【００１３】
したがって、単一の薬物標的または疾患機構の治療は、心不全の治療において不十分な結果を引き起こし得るので、細胞レベルで機能的回復を達成するために、および心臓の組織学的リモデリングを治療するために、新規の複合治療に関する研究が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは心不全のための効果的な治療を開発するために研究し、その結果、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をそれぞれが含む、遺伝子コンストラクト、発現ベクターおよび組換えウイルスが、心不全が複数の病因によって誘導されているマウスモデルにおいて、心不全によって引き起こされる機能不全に対して相乗的治療効果を示すことを確認し、それによって、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様では、（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトが提供される。
【００１６】
本発明の別の態様では、遺伝子コンストラクトが搭載された組換え発現ベクターが提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の態様では、遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルスが提供される。
【００１８】
本発明のさらになお別の態様では、活性成分として、遺伝子コンストラクト、組換え発現ベクターまたは組換えウイルスを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００１９】
本発明のさらになお別の態様では、対象に医薬組成物を投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらになお別の態様では、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクター、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００２１】
本発明のさらになお別の態様では、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物、が提供される。
【００２２】
本発明のさらになお別の態様では、（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクター、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらになお別の態様では、（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを対象に投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法が提供される。
【発明の効果】
【００２４】
心不全の共通の特徴は、心筋細胞が消失し、心臓組織の線維化が進行し、心臓のこの構造的リモデリングが心臓ポンプの機能不全を引き起こすことである。しかし、心筋細胞の消失および心臓組織の線維化は、疾患進行の段階によって変動する可能性があり、お互いに相互作用して悪循環を示す可能性がある。したがって、心筋細胞の消失と心臓組織の線維化を同時に治療することが最も効果的な治療であり得る。
【００２５】
心不全を予防および治療するための本発明の医薬組成物は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質とＣＣＮ５タンパク質が同時に発現するようなものである。医薬組成物は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質によって達成される、心筋細胞の消失の予防およびその活性の増大、ならびにＣＣＮ５タンパク質によって達成される、心臓の細胞および組織の線維化の予防を介して、相乗的治療効果を発揮することができ、それにより、様々な病因によって誘導される複合疾患である心不全の予防または治療に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１ａ】図１ａはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａベクターの構造を図示する。
【図１ｂ】図１ｂはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５ベクターの構造を図示する。
【図１ｃ】図１ｃはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５ベクターの構造を図示する。
【図１ｄ】図１ｄはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａベクターの構造を図示する。
【図２ａ】図２ａは、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５およびｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の細胞内発現および細胞外発現についての結果を図示する。
【図２ｂ】図２ｂは、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５またはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａで形質転換された細胞で発現させたＳＥＲＣＡ２ａタンパク質のＣａ２＋再取り込み活性を比較した結果を図示する（ｎ＝５、＊＊＜０．０１）。
【図２ｃ】図２ｃは、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５またはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａで形質転換された細胞におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現レベルについての結果を図示する。
【図３】心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図４ａ】図４ａは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を確認した結果を図示する。
【図４ｂ】図４ｂは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現レベルを比較した結果を図示する。
【図４ｃ】図４ｃは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織（ｎ＝５、＊＊＜０．０１）におけるＣＣＮ５タンパク質の発現レベルを比較した結果を図示する。
【図５】図５は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、マウスから摘出した心臓を示す写真を図示する。赤線で印を付けた領域は、心臓組織が梗塞している領域を示す。
【図６】図６は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与し、ピクロシリウスレッド方法を使用して心臓組織の横断面を染色することによって得られた、マウスから摘出した心臓を示す写真を図示する。赤線で印を付けた領域は、心臓組織が経壁的に梗塞している領域を示す。
【図７】図７は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、摘出した心臓（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）における梗塞巣の比率を定量化した結果を図示する。
【図８】図８は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与し、次いで、心エコー検査を行うことによって得られた、短縮率（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１）を示す結果を図示する。
【図９ａ】図９ａは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与し、次いで、血行動態を測定することによって得られた、収縮末期圧容量関係（ＥＳＰＶＲ）（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１）を示す結果を図示する。
【図９ｂ】図９ｂは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスに投与し、次いで、血行動態を測定することによって得られた、拡張末期圧容量関係（ＥＤＰＶＲ）（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）を示す結果を図示する。
【図１０】図１０は、心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図１１ａ】図１１ａは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を確認した結果を図示する。
【図１１ｂ】図１１ｂは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現レベルを比較した結果を図示する。
【図１１ｃ】図１１ｃは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織（ｎ＝５、＊＊＜０．０１）におけるＣＣＮ５タンパク質の発現レベルを比較した結果を図示する。
【図１２】図１２は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与し、マッソン−３色染色方法を使用して心臓組織の横断面を染色することによって得られた、マウスから摘出した心臓を示す写真を図示する。
【図１３】図１３は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与し、次いで、心エコー検査を行うことによって得られた、短縮率（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）を示す結果を図示する。
【図１４ａ】図１４ａは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与し、次いで、血行動態を測定することによって得られた、収縮末期圧容量関係（ＥＳＰＶＲ）（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）を示す結果を図示する。
【図１４ｂ】図１４ｂは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスに投与し、次いで、血行動態を測定することによって得られた、拡張末期圧容量関係（ＥＤＰＶＲ）（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）を示す結果を図示する。
【図１５】心不全がアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）の注入によって誘導されているマウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図１６ａ】図１６ａは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を確認した結果を図示する。
【図１６ｂ】図１６ｂは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織（ｎ＝５、＊＊＜０．０１）におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現レベルを比較した結果を図示する。
【図１６ｃ】図１６ｃは、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスに投与することによって得られた、心臓組織（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）におけるＣＣＮ５タンパク質の発現レベルを比較した結果を図示する。
【図１７】図１７は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスに投与し、マッソン−３色染色方法を使用して心臓組織の横断面を染色することによって得られた、マウスから摘出した心臓を示す写真を図示する。
【図１８】図１８は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスに投与し、次いで、心エコー検査を行うことによって得られた、左室壁厚（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＊＜０．０１）を示す結果を図示する。
【図１９】図１９は、ＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えウイルスを心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスに投与し、次いで、心エコー検査を行うことによって得られた、短縮率（ｎ＝５、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１）を示す結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一態様では、（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、を含む遺伝子コンストラクトが提供される。ここで、ヌクレオチド配列はｍＲＮＡの形態でもよい。
【００２８】
本明細書で使用する場合、筋小胞体カルシウムＡＴＰａｓｅ  ２ａの省略形である、用語「ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質」は、ＡＴＰエネルギーを使用して筋小胞体中へのカルシウムの再取り込みを引き起こすように機能するタンパク質を指す。特に、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列を有することができる。さらに、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号１３によって表される配列でもよい。
【００２９】
さらに、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の断片は、断片がＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の活性を維持する限り、野生型ＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端および／またはＣ末端の一部のトランケーションによって得られるものでもよい。特に、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の断片は、Ｎ末端またはＣ末端から１〜１００個、１〜５０個、１〜２０個または１〜１０個のアミノ酸のトランケーションによって得られるものでもよい。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＣＮ５タンパク質」は、血管疾患誘導、血管新生、腫瘍発生、線維化疾患誘導、細胞分化および生存などの細胞機能の調節において様々な役割を果たすＣＣＮファミリーに属するマトリックス細胞タンパク質を指す。ＣＣＮ５タンパク質は、他のＣＣＮファミリータンパク質と異なって、Ｃ末端ドメインがなく、ＷＩＳＰ−２、ＨＩＣＰ、Ｃｏｐ１、ＣＴＧＦ−Ｌなどとも呼ばれる。さらに、ＣＣＮ５タンパク質は、２５０アミノ酸を有する単一ポリペプチド鎖からなる。Ｎ末端にある２２アミノ酸の分泌性リーダー配列のために、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され、シグナルタンパク質として機能する。
【００３１】
特に、ＣＣＮ５タンパク質は、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を有し得る。さらに、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４または配列番号１４によって表される配列でもよい。
【００３２】
さらに、ＣＣＮ５タンパク質の断片は、断片がＣＣＮ５タンパク質の活性を維持する限り、野生型ＣＣＮ５のＮ末端および／またはＣ末端の一部のトランケーションにより得ることができる。特に、ＣＣＮ５タンパク質の断片は、Ｎ末端またはＣ末端から１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個のアミノ酸のトランケーションによって、得ることができる。
【００３３】
遺伝子コンストラクトは、ヌクレオチド配列（ｉ）とヌクレオチド配列（ｉｉ）の間に位置する自己切断配列をさらに含むことができる。自己切断配列は、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、イフラウイルス（Ｉｆｌａｖｉｒｕｓｅｓ）、テトラウイルス（Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）およびジシストロウイルス（Ｄｉｓｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）などのプラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する２Ａペプチド配列、またはロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ）、サイポウイルス（Ｃｙｐｏｖｉｒｕｓｅｓ）およびトティウイルス（Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ）などの二本鎖ＲＮＡウイルスに由来する２Ａペプチド配列でもよい（Garry A Luke, et al Journal of General Virology, 2008; 89: 1036-1042）。
【００３４】
研究で一般に広く使用されている、ブタテッショウウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）−１、ゾセア・アシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）または口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドとＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドの間に存在してもよい。特に、自己切断配列は、限定されないが、ブタテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、自己切断配列は、配列番号６によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３５】
ブタテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号５によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３６】
ゾセア・アシグナウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号７によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３７】
ウマ鼻炎Ａウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号９によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０によって表される配列でもよい。
【００３８】
口蹄疫ウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３９】
代表的な自己切断配列である２Ａペプチド配列を除いては、様々な自己切断配列が存在し、これらには、プラス鎖ＲＮＡウイルスの中では、哺乳動物中に存在するピコルナウイルス２Ａ配列［例えば、脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、タイラー様ウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、サフォードウイルス（Ｓａｆｆｏｌｄ  ｖｉｒｕｓ）、ウマ鼻炎Ｂウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、ウシライノウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ユンガンウイルス（Ｌｊｕｎｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、セネカバレーウイルス（Ｓｅｎｅｃａ  Ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、アヒル肝炎ウイルス（ｄｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に由来する］、および昆虫中に存在する、イフラウイルス［例えば、伝染性軟化病ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｆｌａｃｈｅｒｉｅ  ｖｉｒｕｓ）、エクトロピスオブリカピコルナ様ウイルス（Ｅｃｔｒｏｐｉｓｏｂｌｉｑｕａ  ｐｉｃｏｒｎａ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、スキバドクガピコルナ様ウイルス（Ｐｅｒｉｎａ  ｎｕｄａ  ｐｉｃｏｒｎａ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）］、テトラウイルス［例えば、ユープロステルナエラエアサウイルス（Ｅｕｐｒｏｓｔｅｒｎａ  ｅｌａｅａｓａ  ｖｉｒｕｓ）、プロビデンスウイルス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  ｖｉｒｕｓ）］、またはジシストロウイルス（Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）［例えば、クリケット麻痺ウイルス（ｃｒｉｃｋｅｔ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ショウジョウバエＣウイルス（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、急性蜂麻痺ウイルス（Ａｃｕｔｅ  ｂｅｅ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、カシミール蜂ウイルス（Ｋａｓｈｍｉｒ  ｂｅｅ  ｖｉｒｕｓ）、イスラエル急性蜂麻痺ウイルス（Ｉｓｒａｅｌｉ  ａｃｕｔｅ  ｂｅｅ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）］に由来する２Ａ配列が含まれる。さらに、二本鎖ＲＮＡウイルスの中では、その例としては、哺乳動物中に存在するロタウイルス２Ａ配列（例えば、ブタロタウイルスＡ、ウシロタウイルスＣ、ヒトロタウイルスＣ、成人下痢症ウイルスに由来する）、昆虫中に存在するサイポウイルス２Ａ配列［例えば、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マイマイガサイポウイルス（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ  ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ）、デンドロリムスプンクタツスサイポウイルス（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ  ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ）、ナミスジフユナミシャクサイポウイルス（Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ  ｂｒｕｍａｔａ  ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ）に由来する］、およびクルマエビ中に存在するトティウイルス２Ａ配列［例えば、伝染性筋壊死症ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に由来する］を挙げることができる。したがって、様々な２Ａ配列が存在する可能性があり、それらは上記に限定されない。
【００４０】
さらに、遺伝子コンストラクトにおいて、ヌクレオチド配列（ｉ）および（ｉｉ）は、５’から３’の方向で、（ｉ）−（ｉｉ）の順に含まれ得る。遺伝子コンストラクトの一実施形態であるＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５が細胞中で発現する場合、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は筋小胞体膜中に挿入され得、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され得る。さらに、本発明の遺伝子コンストラクトの一実施形態であるＣＣＮ５−Ｐ２ａ−ＳＥＲＣＡ２ａが細胞中で発現する場合、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は筋小胞体膜中に挿入され得、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され得る。
【００４１】
さらに、（ｉ）または（ｉｉ）の遺伝子コンストラクトは、それらに作動可能に連結したプロモーター配列を含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「に作動可能に連結した」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列または一連の転写因子結合部位）と他のヌクレオチド配列の間の機能的連結を指す。調節配列は、他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節する。
【００４３】
特に、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結したプロモーターは、動物細胞で、好ましくは哺乳類細胞で、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子またはＣＣＮ５遺伝子の転写を調節するように作動し得る。プロモーターとしては、哺乳類ウイルスに由来するプロモーターおよび哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーターを挙げることができる。さらに、プロモーターとしては、筋肉および心臓特異的発現を増大することを目的とした、哺乳類細胞のゲノム配列の組み合わせによって得られた合成プロモーター（合成の筋肉および心臓制限プロモーター、ＳＰＣ５−１２）が挙げられる。プロモーターは、心臓細胞において特異的に作動することができ、任意の細胞で作動することもできる。
【００４４】
一実施形態では、プロモーターは、ｉ）プロモーター−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−プロモーター−ＣＣＮ５、ｉｉ）プロモーター−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａ、ｉｉｉ）プロモーター−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５、またはｉｖ）プロモーター−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａの形態で連結され得る。
【００４５】
プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーター、ならびに合成の筋肉および心臓制限プロモーター（ＳＰＣ５−１２）からなる群から選択されるいずれか１つでもよい。しかし、プロモーターはこれらに限定されない。特に、プロモーターはＣＭＶプロモーターでもよい。
【００４６】
さらに、本発明の遺伝子コンストラクトは、リポソームを使用して細胞中にデリバリーされ得る。リポソームは、水性相中に分散したリン脂質によって自動的に形成され、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を含むリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着または血漿細胞膜との融合などの機構を介して、細胞と相互作用することができ、それによって、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を細胞中にデリバリーする。
【００４７】
本発明では、本発明の医薬組成物が、遺伝子コンストラクトを含むウイルスベクターに基づいて調製される場合、医薬組成物を投与する方法は、当技術分野で既知のウイルス感染方法に従って行うことができる。さらに、本発明では、遺伝子コンストラクトが裸の組換えＤＮＡ分子またはプラスミド中に含まれる場合、遺伝子を細胞中に導入するために、マイクロインジェクション方法、リポソーム媒介トランスフェクション方法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理方法および遺伝子銃方法を使用することができる。
【００４８】
本発明の別の態様では、遺伝子コンストラクトを搭載している組換え発現ベクターが提供される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「発現ベクター」は、標的宿主細胞中で標的タンパク質を発現することができる組換えベクターを指し、組換えベクターは、遺伝子挿入断片が発現するように遺伝子挿入断片に作動可能に連結した必須調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトである。
【００５０】
さらに、発現ベクターは、細胞がタンパク質分泌をしやすくするために、シグナル配列を含むことができる。特定の開始シグナルも、挿入された核酸配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。こうしたシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび連続する配列を含む。適切な転写または翻訳増強エレメントの導入によって、発現効率を高めることができる。
【００５１】
発現ベクターは、プラスミドベクターおよびコスミドベクターからなる群から選択されるいずれか１つでもよい。
【００５２】
プラスミドベクターとしては、限定されないが、市販のプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤおよびｐＩＤＴＳＡＭＲＴ−ＡＭＰを挙げることができる。
【００５３】
本発明のさらに別の態様では、遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルスが提供される。
【００５４】
ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどからなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、ウイルスは、限定されないが、アデノ随伴ウイルスでもよい。
【００５５】
アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞範囲および優れた感染力が理由で、遺伝子導入ベクターとして広く使用されている。そのゲノムは、ＤＮＡ複製およびパッケージングに必須のシスエレメントである１００〜２００ｂｐの逆位末端配列（ＩＴＲ）に挟まれ得る。アデノウイルスは、ウイルスのＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードするゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）をさらに含むことができる。
【００５６】
アデノウイルスベクターの中で、Ｅ１領域を欠く複製能力がないアデノウイルスを使用することができる。その一方で、Ｅ３領域は、外来遺伝子の挿入のための部位を提供するために、従来のアデノウイルスベクターから除去される。
【００５７】
したがって、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を含む本発明の遺伝子コンストラクトは、除去されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／もしくはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域中に挿入することができる。一実施形態では、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を含む遺伝子コンストラクトは、Ｅ３領域中に挿入することができる。
【００５８】
さらに、およそ１０５％までの野生型ゲノムをアデノウイルス中にパッケージングすることができるので、約２ｋｂをアデノウイルス中にさらにパッケージングすることができる。したがって、アデノウイルス中に挿入される外来配列をアデノウイルスゲノムにさらに連結させることができる。
【００５９】
アデノウイルスは、４２の異なる血清型および亜群Ａ〜Ｆを有する。一実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、亜群Ｃに属するアデノウイルス５型から得ることができる。アデノウイルス５型に関する生化学情報および遺伝情報は周知である。
【００６０】
アデノウイルスによってデリバリーされる外来遺伝子は、エピソームと同じ方法で複製するので、宿主細胞に対して非常に低い遺伝毒性しか有さない。
【００６１】
レトロウイルスは遺伝子導入ベクターとして広く使用されており、なぜならば、レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノム中に挿入することができ、大量の外来遺伝物質をデリバリーすることができ、感染することができる広範囲の細胞を有するからである。レトロウイルスベクターを構築するために、レトロウイルスの配列の代わりに、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を含む遺伝子コンストラクトをレトロウイルスゲノムに挿入して、複製能力がないウイルスを生成することができる。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現し、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）およびΨ配列を発現しないパッケージング細胞株を構築し、使用することができる。
【００６２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明の遺伝子デリバリーシステムとして適切であり、なぜなら、このウイルスは非分裂細胞に感染することができ、様々なタイプの細胞に感染する能力を有するからである。ＡＡＶベクターの構築および使用の詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号で開示されている。典型的には、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを有するＡＡＶは、２つのＡＡＶ末端反復に挟まれているＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子およびＣＣＮ５遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを含むプラスミドと末端反復を欠く野生型ＡＶＶコード配列を含む発現プラスミドとの同時形質転換によって生成することができる。
【００６３】
ＣＣＮ５遺伝子およびデリバリーされる標的ヌクレオチド配列を細胞中にデリバリーするために、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたは単純ヘルペスウイルスに由来するベクターも使用することができる。
【００６４】
本発明のさらになお別の態様では活性成分として、本発明の遺伝子コンストラクト、組換え発現ベクターまたは組換えウイルスを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００６５】
本発明の医薬組成物を製造物にする場合、その中に含まれる医薬的に許容可能な担体の例としては、限定されないが、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルを挙げることができる。
【００６６】
医薬組成物の剤形は、使用方法によって変わる可能性があり、注射剤にしてもよい。
【００６７】
本発明の医薬組成物の用量は、望ましくは、患者の年齢、性別、状態、体内への活性成分の吸収度、不活性化速度および組み合わせて使用される薬物を考慮して決定され、医薬組成物がウイルスである場合、医薬組成物は、成人基準で１日あたり１．０×１０３〜１．０×１０２０ウイルスゲノムの量で投与することができる。特に、本発明の医薬組成物は、成人基準で１日あたり１．０×１０３〜１．０×１０２０、１．０×１０８〜１．０×１０１６、１．０×１０１２〜１．０×１０１５または１．０×１０１３〜１．０×１０１４ウイルスゲノムの量で投与することができる。
【００６８】
さらに、医薬組成物がプラスミドベクターである場合、医薬組成物は、成人基準で１日あたり０．１μｇ／１μｌ〜１ｍｇ／１μｌの濃度で投与することができる。さらに、医薬組成物がプラスミドベクターである場合、用量は、０．１ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたはそれ以上を含むことができ、それらの間のすべての値および範囲を含むことができる。
【００６９】
本発明のさらになお別の態様では、活性成分として、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質を含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００７０】
本発明の医薬組成物は非経口的に投与され、非経口投与としては、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与、組織中への直接注射のための方法などが挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「許容可能な担体」は、以下の物質のいくつかまたはすべてを指し、特定の投与に適したものを含む：溶媒、希釈剤、液体媒体、分散剤、懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増ちょう剤、乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤など。Alfanso R. Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th edition, 1995, Macna Publishing Co. Easton, PAは、既知の技法および組成物を用いて医薬組成物で使用するための様々な担体を提示する。医薬組成物の医薬的に許容可能な担体の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。グルコース、ショ糖、デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン、セルロースならびにその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末状のトラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター、座薬用ワックス、ピーナッツバター、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝水、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、着色剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤および芳香剤、抗酸化剤などは、化合物製造者の裁量で含めることができる。
【００７２】
本発明のさらになお別の態様では、対象に医薬組成物を投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法が提供される。
【００７３】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、心不全を罹患しているか、または心不全の危険性があり得る、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物である。
【００７４】
本発明のさらになお別の態様では、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを搭載している発現ベクター、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを搭載している発現ベクターを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００７５】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片は、遺伝子コンストラクトについて上述した通りである。ＣＣＮ５タンパク質またはその断片は、遺伝子コンストラクトについて上述した通りである。
【００７６】
さらに、遺伝子コンストラクトは、それに作動可能に連結したプロモーター配列を含むことができる。
【００７７】
特に、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列に連結したプロモーターは、好ましくは動物細胞で、より好ましくは哺乳類細胞で、ＣＣＮ５遺伝子の転写を調節するように作動し得る。プロモーターとしては、哺乳類ウイルスに由来するプロモーターおよび哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーターが挙げられる。プロモーターは、心臓細胞において特異的に作動することができ、任意の細胞で作動することもできる。
【００７８】
プロモーターは上記の通りであり、特にＣＭＶプロモーターでもよい。
【００７９】
本発明のさらになお別の態様では、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルス、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルスを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００８０】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトおよびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトは、「ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを搭載している発現ベクター、およびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを搭載している発現ベクターを含む、心不全を予防または治療するための医薬組成物」について述べられる通りである。
【００８１】
本発明のさらになお別の態様では、（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与する工程、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法が提供される。
【００８２】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、心不全を罹患しているか、または心不全の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００８３】
投与工程（ｉ）および（ｉｉ）は同時に行うことができる。さらに、投与工程（ｉ）または（ｉｉ）の後に、残りの投与工程を、所定の時間間隔で行うことができる。
【００８４】
本発明のさらになお別の態様では、（ｉ）ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを投与する工程、および（ｉｉ）ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを投与する工程を含む、心不全を予防または治療するための方法が提供される。
【００８５】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、心不全を罹患しているか、または心不全の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００８６】
投与工程（ｉ）および（ｉｉ）は同時に行うことができる。さらに、投与工程（ｉ）または（ｉｉ）の後に、残りの投与工程を、所定の時間間隔で行うことができる。
【００８７】
本発明のさらになお別の態様では、心不全を予防または治療するための、本発明の遺伝子コンストラクトの使用が提供される。
【００８８】
本発明のさらになお別の態様では、心不全を予防または治療するための、本発明の組換え発現ベクターの使用が提供される。
【００８９】
本発明のさらになお別の態様では、心不全を予防または治療するための、本発明の組換えウイルスの使用が提供される。
【００９０】
本発明のさらになお別の態様では、心不全を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、本発明の遺伝子コンストラクトの使用が提供される。
【００９１】
本発明のさらになお別の態様では、心不全を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、本発明の組換え発現ベクターの使用が提供される。
【００９２】
本発明のさらになお別の態様では、心不全を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、本発明の組換えウイルスの使用が提供される。
【００９３】
本発明の形態
以下に、実験例および実施例として本発明を詳細に記載する。しかし、以下の実験例および実施例は本発明を例示するためだけであり、本発明は、以下の調製例および実施例に限定されない。
【００９４】
調製例１．遺伝子コンストラクトおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の構築
ＣＣＮ５タンパク質およびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を個々にまたは同時に発現させるために、遺伝子コンストラクト、ＰＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５およびｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣ２ａを構築した（図１ａ〜１ｄ）。
【００９５】
ＳＥＲＣＡ２ａ部分は、ヒトＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の完全ｃＤＮＡ配列からなる。次に連結されたＰ２Ａ部分はブタテッショウウイルス−１に由来する自己切断部位であり、２２アミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなる。最後に、ＣＣＮ５部分はヒトＣＣＮ５タンパク質の完全ｃＤＮＡ配列からなる。
【００９６】
ｐＴＲ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼベクターからルシフェラーゼ部分を除去し、その代わりにＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５遺伝子コンストラクトを挿入することによって、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えプラスミドを完成させた。組換えプラスミドによって生成されるタンパク質は、Ｐ２Ａ部位にある２１番目のアミノ酸、グリシンと２２番目のアミノ酸、プロリンの間の自己切断によって、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質とＣＣＮ５タンパク質に分けられる。ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は小胞体膜中に残存したままであり得、その固有の機能を果たし得る。さらに、ＣＣＮ５タンパク質は小胞体中に移動することができ、次いで、シグナルペプチドが切断されている形態で細胞外へ分泌され得、それによって、固有の機能を果たす。その一方で、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼベクターからルシフェラーゼ部分を除去し、その代わりにＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子コンストラクトを挿入することによって、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣＡ２ａ組換えプラスミドも構築した。再び、これによって生成されるタンパク質は、Ｐ２Ａ配列の同じ機能によって、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質とＣＣＮ５タンパク質に分けられる。
【００９７】
自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、血清型９）を生成するために、ヒトＣＣＮ５遺伝子およびＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子をｐｄｓ−ＡＡＶ２−ＥＧＦＰベクターにクローニングした。ウイルスパッケージングおよびウイルスデリバリーの効率を向上させるために、ＡＡＶベクターの構築中にｅＧＦＰ配列を除去した。２９３Ｔ細胞を使用して組換えＡＡＶを構築した。細胞培養中のＡＡＶ粒子を収集し、硫酸アンモニウムで沈殿させた。イオジキサノール勾配を使用する超遠心分離法によって、生成物を精製した。遠心分離を使用してイオジキサノールを乳酸リンゲル溶液と交換するような方式で、いくつかの希釈および濃縮プロセスを通して、ＡＡＶ粒子を濃縮した。定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ＡＡＶの濃度を定量化した。
【００９８】
実験方法１．カルシウム取り込みアッセイ
遺伝子を発現させた２９３Ｔ細胞株を４０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３００ｍＭショ糖および０．５ｍＭ  ＤＴＴを含むｐＨ７．０の溶液中でホモジナイズし、５００μｇの可溶化液を、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＮ３、０．５Ｍ  ＥＧＴＡおよび４０ｍＭイミダゾールからなるｐＨ７．０の取り込み反応緩衝液に加えた。カルシウム含有放射性同位体のｐＣａ６（０．０１８５μＭｏｌ）を使用して、取り込み実験を行った。１μＭルテニウムレッド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、生成物を３７℃の温度で３分間静置させた。次いで、５ｍＭ  Ｋ−シュウ酸およびＭｇ−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理しながら、反応を開始させた。１分間隔で最大で４分まで、０．４５μＭのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して５００μｌの反応生成物を濾過し、シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して、カウント毎分（ｃｐｍ）を測定した。
【００９９】
実験方法２．ウエスタンブロッティング
広域性プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えた最少用量のｐＨ７．４の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中で、細胞または心臓組織をホモジナイズした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、これをフッ化ポリビニリデン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にトランスファーした。５％（ｗ／ｖ）スキムミルクで１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＳＥＲＣＡ２ａ抗体（２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＣＣＮ５抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と膜を反応させた。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と膜を反応させ、化学発光基質（Ｄｏｇｅｎ）を使用して発光させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。ＬＡＳソフトウェアを使用して生成物を撮影し、定量化した。
【０１００】
実験方法３．組織染色
心臓組織を動物モデルから得て、次いで、室温で５日間、１０％（ｗ／ｖ）ホルマリンで固定した。次いで、ＰＢＳで洗浄した。各試料をパラフィンに包埋し、組織ブロックを７μｍ厚の切片に切断した。心臓の線維化および梗塞の程度を調べるために、ピクロシリウスレッド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびマッソン−３色（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で生成物を染色した。次いで、光学顕微鏡下で観察した。
【０１０１】
実験方法４．心エコー検査による心筋機能の測定
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ、心エコー検査を行った。記録は、２次元イメージングおよびＭモードトラッキング機能を介して行い、短縮率および心室サイズ比を決定した（ＧＥ  Ｖｉｖｉｄ  Ｖｉｓｉｏｎ）。
【０１０２】
実験方法５．血行動態による心筋機能の測定
１．２Ｆｒの圧容量コンダクタンスカテーテル（Ｓｃｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｃ．、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での血行動態の測定を行った。ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ、気管開口術によってこのマウスに挿管し、機械的空気流を７μｌ／ｇの１回呼吸量および１分あたり１２０回の呼吸に調整することによって、人工呼吸を行った。圧容量（ＰＶ）カテーテルを左心室に設置し、ＩＯＸ２ソフトウェア（ｅｍｋａ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用して、圧容量データを解析した。
【実施例１】
【０１０３】
タンパク質発現の確認
本発明の組換えプラスミドによるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を観察するために、実験例１で調製した、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＡ２ａ、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５またはｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を、リポフェクタミンを使用して培養細胞中にデリバリーした。得られた細胞および培養物を実験方法２と同様の方式でウエスタンブロッティングにかけて、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＣＣＮ５およびＧＡＰＤＨタンパク質の発現を調べた。
【０１０４】
結果として、単一プロモーターによって発現させる場合、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は細胞質中に保持され、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌されることが確認された（図２ａ）。
【０１０５】
さらに、タンパク質の発現レベルおよび活性を比較するために、リポフェクタミンを使用して、実験例１で調製したｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５とｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣ２ａを培養細胞中にデリバリーした。実験方法１と同様の方式で、得られた細胞および培養物をカルシウム取り込みアッセイにかけた。
【０１０６】
結果として、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質とＣＣＮ５タンパク質の間で、発現レベルに関して有意な違いは観察されず、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５−Ｐ２Ａ−ＳＥＲＣ２ａ発現細胞は、低いカルシウム再取り込み活性を示した（図２ｂおよび２ｃ）。
【０１０７】
これは、ＣＣＮ５タンパク質が分泌タンパク質であるという特性が理由であり、これは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質がＳＥＲＣＡ２ａ−ＣＣＮ５の順で発現する場合、両方のタンパクは、それらの正常な構造で発現するが、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質がＣＣＮ５−ＳＥＲＣＡ２ａの順で発現する場合、ＣＣＮ５タンパク質の後で翻訳されるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は、その本来のトポロジーと逆のトポロジーを有する異常なタンパク質として生成され得ることを示唆する。
【０１０８】
Ｉ．心不全治療効果の確認
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルスの、および本発明の心不全治療効果を確認するために、心不全が複数の病因によって誘導されているマウスを使用した。
【０１０９】
心不全誘導マウスについては、虚血再灌流障害誘導性心不全モデル、大動脈縮窄術誘導性心不全モデルおよびアンギオテンシンＩＩ誘導性心不全モデルを生成した。心不全誘導マウスをＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群に分け、それらの心不全治療効果を比較した。
【０１１０】
実験例１．心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスにおける心不全治療効果の確認
実験例１．１．心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスの生成および組換えウイルスの注射
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、８〜１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに麻酔をかけ、手術を行った。虚血は、直径１ｍｍのポリエチレン１０（ＰＥ１０）チューブを左前下行枝の上部に設置し、結束することによって、誘導した。３０分後、ＰＥ１０チューブをほどいて除去することによって再灌流を誘導した。再灌流を誘導すると同時に、１×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇｓ）のＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａまたはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を、尾静脈を介して各マウスに注射した。４週間後に、心筋機能測定および組織学的解析を行った（図３）。
【０１１１】
実験例１．２．ＣＣＮ５タンパク質および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現の確認
最初に、ウイルスゲノムの効果的なデリバリーが行われるかどうかを確認するために、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を実験方法２と同様の方式でウエスタンブロッティングによって調べた。
【０１１２】
結果として、ＡＡＶ９−対照投与群と比較した場合、ＣＣＮ５タンパク質の発現はＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群において有意に増大し、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現はＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群において有意に正常化することが確認された。さらに、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群において、ＣＣＮ５タンパク質およびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現は有意に増大することが確認された（図４ａ〜４ｃ）。
【０１１３】
実験例１．３．心臓梗塞巣−低下効果の確認
さらに、心不全が虚血再灌流障害によって誘導されているマウスから心臓を摘出し、これを撮影した。実験方法３と同様の方式で組織染色を行った。
【０１１４】
結果として、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群は、ＡＡＶ９−対照投与群の梗塞巣と比較した場合、梗塞巣サイズの有意な低下を示した。特に、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群は、梗塞巣サイズの著しい低下を示した（図５および６）。さらに、全心臓面積から梗塞巣の比率を定量化することによって得られたグラフからでさえ、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群は、梗塞巣比率の著しい低下を示すことが確認された（図７）。
【０１１５】
実験例１．４．心臓収縮性−増大効果の確認
心臓組織の形態変化が実際に心臓収縮性に影響を及ぼすかどうかを確認するために、心エコー検査および血行動態検査を行った。
【０１１６】
心臓収縮性のパラメーターである短縮率（ＦＳ）を測定するために、実験方法４と同様の方式で心エコー検査を行った。結果として、虚血再灌流障害によって低下した短縮率がＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群において、有意に回復することが確認された。特に、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ群は短縮率の著しい増大を示した（図８）。
【０１１７】
さらに、心臓収縮性を正確に解析するために、実験方法５と同様の方式で血行動態測定を行った。結果として、収縮期心筋強度のパラメーターである収縮末期圧容量関係（ＥＳＰＶＲ）は、虚血再灌流障害によって低下した。ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群はＥＳＰＶＲの有意な増大を示し、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群はＥＳＰＶＲの有意な増大を示さなかった。これは、ＣＣＮ５の研究において既知であるものと同じ現象であり、ＣＣＮ５は心不全に影響を及ぼさないという事実を支持する。さらに、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ群はＥＳＰＶＲの相乗的増大を示した（図９ａ）。
【０１１８】
さらに、拡張期心筋強度のパラメーターである拡張末期圧容量関係（ＥＤＰＶＲ）は、虚血再灌流障害の際に増大することが確認された。ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群は、ＥＤＰＶＲの有意な低下を示し、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群はＥＤＰＶＲの有意な低下を示さなかった。これは、以前の研究と同じ実験結果であり、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質が拡張期心不全に影響を及ぼさないという事実を支持する。さらに、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群は、ＥＤＰＶＲの著しい低下を示した（図９ｂ）。
【０１１９】
これらのデータに基づいて、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与によって、相乗的治療効果が得られることが確認された。
【０１２０】
実験例２．心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスにおける心不全治療効果の確認
実験例２．１．心不全が大動脈縮窄術によって誘導されているマウスの生成および組換えウイルスの注射
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、８〜１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに麻酔をかけ、手術を行った。２〜３ｍｍの近位胸骨を縦方向に切り裂いて、大動脈弓の視野を確保した。その後、２７ゲージのニードルを使用して、無名動脈と頸動脈を接続した。次いで、結束し、ニードルを除去し、それによって、横大動脈の縮窄を引き起こした。縮窄による心不全の誘導から８週後に、１×１０１１ｖｇｓのＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａまたはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を、尾静脈を介して各マウスに注射した。８週間後に、心筋機能測定および組織学的解析を行った（図１０）。
【０１２１】
実験例２．２．ＣＣＮ５タンパク質および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現の確認
最初に、ウイルスゲノムの効果的なデリバリーが行えたかどうかを確認するために、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を実験方法２と同様の方式でウエスタンブロッティングによって調べた。結果として、ＡＡＶ９−対照投与群と比較した場合、ＣＣＮ５タンパク質の発現はＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群において有意に増大し、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現はＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群において有意に増大することが確認された。さらに、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群においてでさえ、ＣＣＮ５タンパク質およびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現が有意に増大することが確認された（図１１ａ〜１１ｃ）。
【０１２２】
実験例２．３．心臓の内部寸法サイズ−低下効果の確認
心不全が虚血再灌流障害によって誘導されたマウスから心臓を摘出し、実験方法３と同様の方式で、マッソン−３色で心臓組織を染色した。結果として、ＡＡＶ９−対照投与群は、心臓の内部寸法サイズの増大を示すことが確認され、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、心臓の内部寸法サイズの低下を示すことが確認された。特に、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、内部寸法サイズの著しい低下を示すことが確認された。さらに、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、心不全によって引き起こされる心臓の線維化の程度の低下を示すことが確認された（図１２）。
【０１２３】
実験例２．４．心臓収縮性−増大効果の確認
心臓組織の形態変化が実際に心臓収縮性に影響を及ぼすかどうかを確認するために、心エコー検査および血行動態解析を行った。
【０１２４】
心臓収縮性のパラメーターである短縮率（ＦＳ）を測定するために、実験方法４と同様の方式で心エコー検査を行った。結果として、大動脈縮窄によって低下した短縮率が、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群において、有意に回復することが確認された。特に、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、短縮率の著しい増大を示した（図１３）。
【０１２５】
さらに、心臓収縮性を正確に解析するために、実験方法５と同様の方式で血行動態解析を行った。結果として、収縮期心筋強度のパラメーターである収縮末期圧容量関係（ＥＳＰＶＲ）は、大動脈縮窄によって低下した。ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群はＥＳＰＶＲの有意な回復を示し、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群はＥＳＰＶＲの有意な回復を示さなかった。さらに、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、ＥＳＰＶＲの著しい増大を示した（図１４ａ）。
【０１２６】
さらに、拡張期心筋強度のパラメーターである拡張末期圧容量関係（ＥＤＰＶＲ）は、虚血再灌流障害の際に増大することが確認された。ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群は、ＥＤＰＶＲの有意な低下を示し、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群はＥＤＰＶＲの有意な低下を示さなかった。さらに、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、ＥＤＰＶＲの著しい低下を示した（図１４ｂ）。これに基づいて、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５によって相乗的治療効果が得られることが確認された。
【０１２７】
実験例３．心不全がアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）の注入によって誘導されているマウスにおける心不全治療効果の確認
実験例３．１．心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されているマウスの生成および組換えウイルスの注射
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、８〜１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに麻酔をかけ、アンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）  の皮下注入によって心不全を誘導した。アンギオテンシンＩＩは、小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  １００２、Ａｌｚｅｔ）を使用して、１日あたり３ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間皮下注入した。Ａｎｇ  ＩＩで心不全を誘導してから２週間後に、１×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇｓ）のＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａまたはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を、尾静脈を介して各マウスに注射した。４週間後に、心筋機能測定および組織学的解析を行った（図１５）。
【０１２８】
実験例３．２．ＣＣＮ５タンパク質および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現の確認
最初に、ウイルスゲノムの効果的なデリバリーが行われるかどうかを確認するために、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質およびＣＣＮ５タンパク質の発現を実験方法２と同様の方式でウエスタンブロッティングによって調べた。
【０１２９】
結果として、ＡＡＶ９−対照投与群と比較した場合、ＣＣＮ５タンパク質の発現が、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群において有意に回復し、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現が、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群において有意に回復することが確認された。さらに、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群においてでさえ、ＣＣＮ５タンパク質およびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現が有意に増大することが確認された（図１６ａ〜１６ｃ）。
【０１３０】
実験例３．３．心臓の内部寸法サイズ−低下効果および心臓の内壁厚の変化の確認
心不全がアンギオテンシンＩＩの注入によって誘導されたマウスから心臓を摘出し、実験方法３と同様の方式で、マッソン−３色で心臓組織を染色した。
【０１３１】
結果として、ＡＡＶ９−対照投与群は、心臓の内部寸法サイズの増大を示すことが確認され、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、心臓の内部寸法サイズの低下を示すことが確認された。特に、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、内腔サイズの著しい低下を示すことが確認された（図１７）。
【０１３２】
さらに、心臓の内壁厚を測定するために、実施例６と同様の方式で心エコー検査を行った。心臓の内壁厚の変化を定量化し、図表で表した。
【０１３３】
結果として、心臓の内壁厚はアンギオテンシンＩＩの注入によって減少することが確認され、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、有意に回復した心臓の内壁厚の増加を示すことが確認された（図１８）。
【０１３４】
実験例３．４．心臓収縮性−増大効果の確認
心臓組織の形態変化が実際に心臓収縮性に影響を及ぼすかどうかを確認するために、心エコー検査および血行動態検査を行った。
【０１３５】
心臓収縮性のパラメーターである短縮率（ＦＳ）を測定するために、実験方法４と同様の方式で心エコー検査を行った。結果として、大動脈縮窄によって低下した短縮率が、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５投与群、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ投与群およびＡＡＶ９−ＣＣＮ５とＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａの組み合わせ投与群において、有意に回復することが確認された。特に、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５投与群は、短縮率の著しい回復を示した（図１９）。これに基づいて、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５によって相乗的治療効果が得られることが確認された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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