(57)【要約】  本発明は、ベータ−カロテンの立体選択的変換によってビタミンＡアルデヒド（レチナール）を生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、ベータ−カロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）としての活性を有し、特にトランス−レチナールに対する優先性を有するトランス選択的酵素の使用を含む。前記プロセスは特に、ビタミンＡの生物工学的生産のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体選択的ベータ−カロテン酸化酵素（ＢＣＯ）を含むカロテノイド産生宿主細胞であって、前記宿主細胞がシス−及びトランス−レチナールを含むレチナール混合物を産生し、前記宿主細胞によって産生される前記混合物中のトランス−レチナールの割合が、少なくとも約６５％、好ましくは、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までである、カロテノイド産生宿主細胞。
【請求項２】
トランス−及びシス−レチナールを含む前記レチナール混合物中のトランス−レチナールの割合が、前記宿主細胞により産生されるレチナールの総量を基準として、少なくとも約６５〜９８％、好ましくは少なくとも約６５〜９５％、より好ましくは少なくとも約６５〜９０％の範囲である、請求項１に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項３】
異種立体選択的ＢＣＯを含む、請求項１又は２に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項４】
前記ＢＣＯが真菌、植物又は動物から選択され、好ましくは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）、イクタルルス属（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）、エソックス属（Ｅｓｏｘ）、ラティメリア属（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ）から選択され、より好ましくは、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、クロクス・サティブス（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、イクタルルス・プンクタトゥス（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、エソックス・ルキウス（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）、ラティメリア・カルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ  ｃｈａｌｕｍｎａｅ）から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項５】
前記ＢＣＯが、ＥＡＫ８１７２６、ＡＪ８５４２５２、Ｑ８４Ｋ９６．１などのデータベースから知られている配列に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有するか、又はＱ９０ＷＨ４のようなデータベースから知られている配列に従うポリペプチドに対して少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項４に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項６】
配列番号１、３、５若しくは７に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチド、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７に従うポリペプチド配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する、請求項５に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、パラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、及びブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）からなる群から選択され、好ましくは、酵母を含む真菌から選択され、より好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から、最も好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項８】
前記トランス−レチナールがさらにビタミンＡに変換される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項９】
立体選択的ＢＣＯの酵素活性によってトランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物を生産するためのプロセスであって、ベータ−カロテンを前記ＢＣＯと接触させることを含み、前記レチナール混合物中のトランス−レチナール対シス−レチナールの比率が少なくとも約２：１である、プロセス。
【請求項１０】
ベータ−カロテンの酵素切断から生じるシス−レチナールの量を低減するためのプロセスであって、前記プロセスが、ベータ−カロテンを立体選択的ＢＣＯと接触させることを含み、ベータ−カロテンの切断から得られる前記レチナール混合物中のシス−レチナールの量がレチナールの総量を基準として約３５％以下の範囲である、プロセス。
【請求項１１】
ベータ−カロテンの酵素切断から生じるトランス−レチナールの量を増大させるためのプロセスであって、前記プロセスが、ベータ−カロテンを立体選択的ＢＣＯと接触させることを含み、前記レチナール混合物中のトランス−レチナールの量がレチナールの総量を基準として少なくとも約６５〜９８％の範囲である、プロセス。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞を用いる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
（ａ）立体選択的ＢＣＯをコードする核酸分子を適切なカロテン産生宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）ベータ−カロテンを、シス−及びトランス−レチナールを含むレチナール混合物に酵素変換するステップであって、前記トランス−レチナールの割合がレチナールの総量を基準として少なくとも約６５％である、ステップと、
（ｃ）適切な培養条件下でトランス−レチナールをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【請求項１４】
２：１の比率のトランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物を生産するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞の使用であって、前記宿主細胞がトランス−アイソフォームの産生に対する立体選択性を有する異種ＢＣＯを発現する、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ベータ−カロテンの立体選択的変換によってビタミンＡアルデヒド（レチナール）を生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、ベータ−カロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）としての活性を有し、特にトランス−レチナールに対する優先性を有するトランス選択的酵素の使用を含む。前記プロセスは特に、ビタミンＡの生物工学的生産のために有用である。
【０００２】
レチナールは、特にビタミンＡの生産プロセスなどのレチノイドの生産プロセスにおける重要な中間体／前駆体である。ビタミンＡを含むレチノイドは、栄養による供給を受けなければならないヒトにとって非常に重要で不可欠な栄養素の１つである。レチノイドは、特に視覚、免疫系及び成長に関して、ヒトの健康な状態を促進する。
【０００３】
ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドの現在の化学的生産方法は、例えば、高エネルギー消費、複雑な精製工程及び／又は望ましくない副産物などのいくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、過去数十年間にわたって、ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドを製造するために、より経済的且つ生態学的であり得る、微生物変換工程を含む他のアプローチが研究されている。
【０００４】
一般に、レチノイドを産生する生物系は産業的に扱いが困難であり、且つ／或いは非常に低レベルの化合物を生じるので、商業規模の単離が実用的でない。これには、このような生物系におけるレチノイドの不安定性、又は比較的高い副産物の生成を含むいくつかの理由がある。
【０００５】
したがって、ベータ−カロテンからビタミンＡへの酵素変換の産物特異性及び／又は生産性を改善することが継続中の課題である。特に、最も安定したアイソフォームであると考えられるトランス−アイソフォーム、例えば、トランス−レチナールの産生に対するベータ−カロテンの変換に関与する酵素の選択性を最適化することが望ましい。
【０００６】
驚くことに、我々は今回、様々な種から単離されたいわゆるトランス切断酵素、すなわちベータ−カロテンをレチナール、特にトランス−レチナールに選択的に変換することができる酵素を特定することができた。ここで、トランス−アイソフォームの産生に対するこのような酵素の生産性及び／又は選択性は、トランス−アイソフォームとシス−アイソフォームとの間の産物比が少なくとも約２であるレチナール混合物をもたらし、好ましくは、トランス−アイソフォームの産生は、レチノイドの総量を基準として少なくとも約６５％の範囲である。
【０００７】
特に、本発明は、例えばトランス−レチナールなどのトランス−アイソフォームに対してベータ−カロテンを立体選択的に酸化する活性、すなわち、ベータ−カロテンを、トランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物に変換する活性を有するＢＣＯに関し、ここで、レチナールの総量を基準として、シス−レチナールの量はトランス−レチナールの量に対して低減又は消失されており、特に、レチナールの総量を基準として約３５％以下の割合のシス−レチナールをもたらす。
【０００８】
本発明は、好ましくは、本明細書で定義されるような選択的ＢＣＯを含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞、特にレチノイド産生宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、シス−及びトランス−レチナールの両方を含むレチナール混合物を産生し、トランス−レチナールの割合は、前記宿主細胞により産生されるレチナールの総量を基準として少なくとも約６５％、好ましくは６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までである。
【０００９】
「ベータ−カロテン酸化酵素」、「ベータ−カロテンオキシゲナーゼ」、「ベータ−カロテン酸化活性を有する酵素」又は「ＢＣＯ」という用語は本明細書において互換的に使用され、ベータ−カロテンからレチナールへの変換を触媒することができる酵素を指し、特に、ベータ−カロテンからシス−アイソフォーム、例えばシス−レチナールなどへの酸化に対する活性が、トランス−アイソフォーム、例えばトランス−レチナールなどへの酸化に対する活性と比べて低減又は消失されている。このようなＢＣＯは、本明細書では立体選択的酵素と呼ばれ、シス−アイソフォームよりもトランス−アイソフォームの産生に対して優先性を有する。
【００１０】
記載されるＢＣＯの作用によってレチナールをもたらす、すなわち本明細書で定義されるトランス−及びシス−アイソフォームの混合物をもたらすベータ−カロテンの酵素触媒作用に関連する「変換」、「酸化」、「切断」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００１１】
本明細書で使用される場合、ＢＣＯに関して「立体選択的」、「選択的」、「トランス選択的」酵素という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらは、トランス異性体に対する触媒活性が増大された、すなわちベータ−カロテンからトランス−レチナールへの触媒作用に対する活性が増大された酵素、すなわち本明細書に開示されるＢＣＯを指す。本発明に従う酵素は、例えばトランス−レチナールなどのトランス−アイソフォームの割合が、このような酵素又はこのような酵素を含む／発現するようなカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約６５％の範囲であればトランス特異的である。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「真菌宿主細胞」という用語は、特に、宿主細胞としての酵母、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などを含む。
【００１３】
シス−アイソフォーム、特にシス−レチナールの産生の低減又は消失をもたらす本明細書で定義される立体選択的酵素は適切な宿主細胞に導入される、すなわち異種酵素として発現されてもよいし、又は内在性酵素として発現されてもよい。これらは、植物、動物、藻類、真菌又は細菌、好ましくは真菌、藻類、植物、動物を含む任意のカロテノイド産生生物、例えばレチノイド産生生物から得ることができる。
【００１４】
例えば、配列番号７に従うドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＢＣＯなどの既知のＢＣＯと比較して、本発明に従う適切な立体選択的ＢＣＯは、ベータ−カロテンの変換から生じるトランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物中のトランス−アイソフォーム、例えばトランス−レチナールの産生に対して改善された産物比を示し、これは、既知のドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＢＣＯ配列（配列番号７）の使用と比較して、トランス−アイソフォームに対して少なくとも約６％増大される。好ましくは、トランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物中のトランス−レチナールの量は、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＢＣＯにより産生されるトランス−レチナールの量と比較して、少なくとも約１０、２０、３０、４０、４５、４８、５０、５５、５６、６０、６１、６２、６３、６４％増大され、又はさらに少なくとも約７０〜１００％％増大され、すなわち、少なくとも約６５〜９０％、少なくとも約９５若しくは９８％又はさらに最大約１００％までの範囲のトランス−レチナールである、レチナール混合物中のトランス−レチナールの量がもたらされる。
【００１５】
一実施形態では、本明細書で定義されるＢＣＯ活性、好ましくはトランス−レチナールの形成に対する立体選択的な作用を有するポリペプチドは、子嚢菌門又は担子菌門から選択される真菌を含むがこれらに限定されない、真菌、特にディカリアから得ることができ、特に、本明細書で定義されるような前記ポリペプチド及び／又は前記ＢＣＯをコードする遺伝子は、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）に由来し、好ましくは、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）又はＵ．マイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）から単離される。
【００１６】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性、好ましくはベータ−カロテンからトランス−レチナールへの酸化活性を有し、レチナールの総量を基準としてシス−レチナールと比較してトランス−レチナールの量が少なくとも約６５％であるポリペプチドは、例えば、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）（ＵｍＣＣＯ１）からのＢＣＯなどのＥＡＫ８１７２６に由来するポリペプチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなどを含む、配列番号１に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１７】
１つの特定の好ましい実施形態では、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、例えば、本明細書で定義されるウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）又はフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）などから選択される真菌ＢＣＯを含み、前記宿主細胞は、２より少ないＢＣＯ遺伝子のコピー数で、又は特にヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＥＮＯ１遺伝子受託ＸＭ＿５０５５０９．１の４００塩基対上流などの低発現プロモーターにおいて成長され、前駆体及び／若しくは細胞成分、又はＨＹＰＯ、ＨＳＰ、ＣＷＰ、ＴＰＩ  ＥＮＯ、ＡＬＫなどの他の特に有用なプロモーター要素に対する低非特異性の酸化活性のために、レチナール産物の産出量の増大がもたらされる（国際公開第２０１５１１６７８１号パンフレット）。当業者には、本明細書で定義される真菌ＢＣＯの最適活性のためにそれぞれの宿主細胞をさらに改変する方法が分かる。
【００１８】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性、好ましくはベータ−カロテンからトランス−レチナールへの酸化活性を有し、レチナールの総量を基準としてシス−レチナールと比較してトランス−レチナールの量が少なくとも約６５％であるポリペプチドは、例えば、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（ＦｆＣａｒＸ）からのＢＣＯなどのＡＪ８５４２５２．１に由来するポリペプチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなどを含む、配列番号３に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１９】
さらなる実施形態では、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性、好ましくはトランス−レチナールの形成に対する立体選択的作用を有するポリペプチドは、真核生物、特に、被子植物を含むがこれに限定されない植物から得ることができ、特に、本明細書で定義されるような前記ポリペプチド及び／又は前記ＢＣＯをコードする遺伝子は、クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）に由来し、好ましくは、Ｃ．サティブス（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）から単離される。
【００２０】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性、好ましくはベータ−カロテンからトランス−レチナールへの酸化活性を有し、レチナールの総量を基準としてシス−レチナールと比較してトランス−レチナールの量が少なくとも約６５％であるポリペプチドは、例えば、クロクス・サティブス（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（ＣｓＺＣＯ）からのＢＣＯなどの配列Ｑ８４Ｋ９６．１に由来するポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなどを含む、配列番号５に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００２１】
さらなる実施形態では、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性、好ましくはトランス−レチナールの形成に対する立体選択的作用を有するポリペプチドは、真核生物、特に、条鰭類を含むがこれらに限定されない魚綱（ｐｅｓｃｅｓ）から得ることができ、特に、本明細書で定義されるような前記ポリペプチド及び／又は前記ＢＣＯをコードする遺伝子は、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）、イクタルルス属（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）、エソックス属（Ｅｓｏｘ）、又はラティメリア属（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ）に由来し、好ましくは、Ｄ．レリオ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、Ｉ．プンクタトゥス（Ｉ．ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、Ｅ．ルキウス（Ｅ．ｌｕｃｉｕｓ）又はＬ．カルムナエ（Ｌ．ｃｈａｌｕｍｎａｅ）から単離される。
【００２２】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性、好ましくはベータ−カロテンからトランス−レチナールへの酸化活性を有し、レチナールの総量を基準としてシス−レチナールと比較してトランス−レチナールの量が少なくとも約６５％であるポリペプチドは、例えば、配列番号１０、１２、１４、１６又は１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、配列番号９、１１、１３、１５又は１７に従うポリペプチドに対して少なくとも５０％、例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００２３】
レチナール混合物中のトランス異性体の産生を増大は、既知のドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（配列番号７）を用いるプロセスで得られるトランス−レチナールの量と比較して、ベータ−カロテンの酵素変換により生じるレチナールの総量を基準として少なくとも約６％のトランス−レチナールの増大を意味する。これは、本明細書に記載される真菌、植物又は魚類の立体選択的ＢＣＯの使用によって達成することができる。
【００２４】
本明細書で定義される「異種発現される」は、本明細書で定義されるＢＣＯの１つを発現する遺伝子がカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入されることを意味する。外来性核酸分子を、本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などの細胞に導入するための技術は、当該技術分野において知られている。これらには、種々の強度のプロモーター及びターミネーター、並びに重要な遺伝子の発現に対するトランス効果を制限するためのアイソレーターの使用が含まれる。さらに、合成生物学の出現は、これらの技術の使用を日常的なものにした。本発明に従う宿主細胞は、好ましくは、例えば、本明細書で開示される真菌ＢＣＯ、例えば、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）又はフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）などから単離されるＢＣＯ、より好ましくは、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）又はＵ．マイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）からのＢＣＯ、最も好ましくは、配列番号１又は２に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するＢＣＯをコードするポリヌクレオチドのただ１つのコピーを含む、本明細書で定義される真菌ＢＣＯを含み得る／発現し得る。或いは、真菌ＢＣＯは、低発現プロモーターの制御下で発現され得る。
【００２５】
本明細書で定義される宿主細胞に、遺伝子及び／又はタンパク質、例えば、本明細書で定義されるトランス−レチノールの形成に対する選択性を有する立体選択的ＢＣＯなどのコピーをより多く生じさせるための改変は、強力なプロモーター、適切な転写及び／若しくは翻訳エンハンサーの使用、又はカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌細胞への１つ若しくは複数の遺伝子コピーの導入を含み、所与の時間におけるそれぞれの酵素の蓄積の増大をもたらし得る。当業者には、宿主細胞に基づいてどの技術を使用するかが分かる。遺伝子発現の増大又は低減は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。これらの技術は特に、非真菌ＢＣＯの発現に有用である。
【００２６】
核酸又はアミノ酸への突然変異の発生、すなわち突然変異誘発は、例えば、ランダム若しくは部位特異的（ｓｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、例えば放射線などの作用物質によって生じる物理的損傷、化学的処理、又は遺伝因子の挿入などによる種々の方法で実施され得る。当業者には、突然変異を導入する方法が分かる。
【００２７】
本明細書で定義されるＢＣＯは、当業者に知られているように、それぞれの宿主細胞における発現に適したプラスミドにおいて発現され得る。
【００２８】
したがって、本発明は、発現ベクター、又は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた本明細書に記載されるＢＣＯをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。本明細書に記載されるＢＣＯをコードする、発現ベクター上の又は染色体ＤＮＡに組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むこのようなカロテノイド産生宿主細胞は、組換え宿主細胞と呼ばれる。カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、本明細書で定義されるＢＣＯ、例えば、配列番号１、３若しくは５に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７に従うポリペプチドに対して少なくとも約５０％の同一性を有するポリペプチドなどをコードする遺伝子の１つ又は複数のコピーを含有し、本明細書で定義されるＢＣＯをコードするこのような遺伝子の過剰発現をもたらし得る。本明細書で定義される真菌ＢＣＯに関して、遺伝子コピーは１であるのが好ましい。遺伝子発現の増大は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００２９】
本明細書で開示される配列と、トランス−アイソフォームに対する優先性、すなわち立体選択的な活性とに基づいて、ベータ−カロテンから、レチナール、特にレチナールの総量を基準としてシス−レチナールと比較して少なくとも約６５％のトランス−レチナールへの変換に使用され得る、本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ活性を有するポリペプチドをコードするさらなる適切な遺伝子を容易に推定することができる。したがって、本発明は、新規の立体選択的ＢＣＯを同定するための方法に関し、ここで、トランス−アイソフォームの産生に対する優先性を有する新規の立体選択的ＢＣＯのスクリーニングプロセスにおけるプローブとして、配列番号１、３若しくは５に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するか、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７に従うポリペプチドに対して少なくとも約５０％の同一性を有するポリペプチドが使用される。立体選択的作用が、産生されたレチナール混合物中のシス−レチナールの量と比較して少なくとも約６５％のトランス−レチナールをもたらす限り、ＢＣＯ活性を有するあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されるベータ−カロテンからのレチナールの産生のために使用され得る。したがって、本発明に従うプロセスのために使用される適切なＢＣＯは、ベータ−カロテンの変換からのレチナールの総量を基準として約３５％以下のシス−アイソフォーム、例えば、約３５％以下のシス−レチナールを産生することができる酵素を含む。
【００３０】
本発明は特に、トランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物の生産プロセスにおけるこのような立体選択的ＢＣＯの使用に関し、ここで、シス−レチナールの生産は低減又は消失され、トランス−レチナールの生産は増大されており、レチナール混合物中のトランス−レチナールとシス−レチナールの比率は少なくとも約２になる。このプロセスは、前記立体選択的ＢＣＯを発現する適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いて実施することができ、好ましくは、前記ＢＣＯをコードする遺伝子は異種発現される、すなわち前記宿主細胞に導入される。レチナール、好ましくはトランス−レチナールはさらに、（既知の）適切な機構の作用によってビタミンＡに変換され得る。
【００３１】
したがって、本発明は、レチナール混合物中のシス−レチナールの割合を低減するためのプロセス、又はレチナール混合物中のトランス−レチナールの割合を増大させるためのプロセスに関し、ここで、レチナールは、本明細書で定義されるＢＣＯの１つをベータ−カロテンと接触させることによって生成され、少なくとも約６５〜９８％の割合のトランス−レチナール又は約３５％以下割合のシス−レチナールを有するレチナール混合物がもたらされる。特に、前記プロセスは、（ａ）本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯの１つをコードする核酸分子を本明細書で定義される適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入することと、（ｂ）前記発現された立体選択的ＢＣＯの作用によってベータ−カロテンをシス−／トランス−レチナール混合物に酵素切断し、レチナールの総量を基準として、混合物中のトランスレチナールの割合が少なくとも６５％であることと、任意選択的に（３）当業者に知られている適切な条件下でレチナール、好ましくはトランス−レチナールをビタミンＡに変換することを含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、ベータ−カロテンからシス−アイソフォーム、例えばシス−レチナールへの変換に対する活性の低減又は消失、すなわちトランス−アイソフォーム、例えばトランス−レチナールへのベータ−カロテン変換に対する産物比の改善は、トランス対シス、例えば、トランス−レチナール対シス−レチナールの産物比が少なくとも約２：１、例えば、少なくとも約３：１、特に４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、９．２：１、９．５：１、９．８：１又はさらに最大１０：１までであることを意味し、この産物比は、本明細書で定義される立体特異的ＢＣＯを用いて達成される。
【００３３】
レチナール混合物中のシス異性体の産生の低減又は消失は、ベータ−カロテンの酵素変換によって産生されるレチナールの総量を基準としてシス−レチナールが約３５％以下の量に限定されることを意味する。これは、本明細書に記載される立体選択的ＢＣＯの使用によって達成することができる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、トランス−アイソフォームの産生に関して、特に本明細書で定義されるＢＣＯを用いたベータ−カロテンの変換からのトランス−レチナールの産生に関して「少なくとも約６５％」という用語は、産生したレチナールの少なくとも約６５％、例えば、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までがトランス−レチナールの形態であることを意味する。シス−アイソフォームの産生に関して、特に本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯを用いたベータ−カロテンの変換からのシス−レチナールの産生に関して「約３５％以下」という用語は、産生したレチナールの約３５％以下、例えば、３０、２５、２０、１５、１０、５、２又は０％までがシス−レチナールの形態であることを意味する。
【００３５】
「配列同一性」、「同一性％」又は「配列相同性」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的で、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性の割合を決定するために、配列は最適な比較を目的として整列されることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアライメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アライメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって行われてもよい。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列はいずれも、このアルゴリズムによって整列され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列につては、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択的パラメータは、１０のギャップ−オープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらの異なるパラメータ全てがわずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを用いたときに２つの配列の全体の同一性の割合は有意に変化されないことを認識するであろう。
【００３６】
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメントの後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：両方の配列内の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメント内の対応する位置の数を、アライメント内のギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「最長同一性」として標識される。比較される両方のアミノ酸配列が、そのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、これらは同一である、すなわち１００％の同一性を有する。本明細書で定義される植物に由来する酵素に関して、当業者は、植物由来の酵素が例えば葉緑体プロセシング酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素により切断され得る葉緑体標的シグナルを含有し得る事実を知っている。
【００３７】
宿主細胞に応じて、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に従うポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどは、それぞれの宿主細胞における発現のために最適化され得る。当業者には、このような改変ポリヌクレオチドを作成する方法が分かる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、このような宿主最適化核酸分子が本明細書で定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、これらも包含することが理解される。
【００３８】
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＢＣＯをコードするポリヌクレオチドを含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、これは、宿主細胞又は酵素の成長又は発現パターンに影響を与えずに、前記宿主細胞における発現のために最適化されている。特に、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択され、本明細書で定義されるＢＣＯをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６に対して少なくとも少なくとも約６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性、又は配列番号１０、１２、１４、１６若しくは１８に対して少なくとも約５０％、例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリヌクレオチドから選択される。
【００３９】
本明細書で定義されるＢＣＯは、酵素活性を変更しないアミノ酸置換を保有する酵素も包含し、すなわちこれらは野生型酵素に関して同じ特性を示し、ベータ−カロテンからレチナール、特に少なくとも約６５％の量のトランス−レチナールへの変換を触媒する。このような突然変異は「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載される酵素の（酵素）活性を変更しない。
【００４０】
本発明に従う核酸分子は、本発明により提供される核酸配列の一部のみ又は断片、例えば、本明細書に記載の配列であり、プローブ若しくはプライマーとして使用され得る断片、又は本明細書で定義されるＢＣＯの一部をコードする断片を含み得る。ＢＣＯ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種からの他の相同体の同定及び／又はクローニングにおいて使用するために設計されるプローブ及びプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、これは通常、本明細書に記載される配列のヌクレオチド配列又はその断片又は誘導体の少なくとも約１２又は１５、好ましくは約１８又は２０、より好ましくは約２２又は２５、さらにより好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５以上の連続ヌクレオチドに対して好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００４１】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃における６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃における１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回又は複数回の洗浄である。
【００４２】
高ストリンジェント条件には、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むか又は含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、又は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、及び２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含む溶液などの溶液中でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識化系；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙを用いて調製）を用いた４２℃における２時間〜４日間のインキュベーションと、その後、室温において２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で５〜１５分間フィルターを２回洗浄し、次に、６５〜６８℃において０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ又は０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５〜３０分間２回洗浄することが含まれる。
【００４３】
本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯの１つをコードする酵素／ポリヌクレオチドの発現は、カロテノイド／レチノイドの産生に適しており、且つ本明細書に記載される機能的等価物又は誘導体を含む本明細書で開示される酵素の１つをコードする核酸の発現を可能にする（微）生物を含む任意の宿主系において達成することができる。適切なカロテノイド／レチノイド産生宿主（微）生物の例は、細菌、藻類、酵母を含む真菌、植物又は動物細胞である。好ましい細菌は、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、例えばパラコックス・ゼアキサンチニファキエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などのパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）のものである。好ましい真核微生物、特に酵母を含む真菌は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）などのフィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、例えばブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）などのブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。特に好ましいのは、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）若しくはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞における発現、又はエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）における発現であり、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現である。
【００４４】
本発明に関して、例えば、微生物、真菌、藻類又は植物などの生物は、原核生物の国際命名規約又は藻類、真菌、及び植物の国際命名規約（メルボルン規約）によって定義されるような、同じ生理学的特性を有するこのような種の同義語又はバソニムも含むことが理解される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、カロテノイド、例えばベータ−カロテンの産生をもたらす宿主細胞である。カロテノイド産生宿主細胞を作成するための遺伝子及び方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットが参照される。産生されるカロテノイドに応じて、異なる遺伝子が関与し得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、レチノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、ベータ−カロテンの酵素変換によって、レチノイド、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体の産生をもたらす宿主細胞である。これらのポリペプチドは、本明細書で定義されるＢＣＯを含む。ビタミンＡ経路の遺伝子、及びレチノイド産生宿主細胞の作成方法は、当該技術分野において知られている。好ましくは、ベータ−カロテンは本明細書で定義されるＢＣＯの作用によってレチナールに変換され、レチナールはレチノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素の作用よってさらにレチノールに変換され、レチノールは、アセチル−トランスフェラーゼ酵素、例えばＡＴＦ１などの作用によって酢酸レチノールに変換される。酢酸レチノールは、宿主細胞から単離される最適なレチノイドであり得る。
【００４７】
本発明は、本明細書に記載されるＢＣＯの作用によるベータ−カロテンの酵素変換によってレチナール、特に、少なくとも６５％の量のトランス−レチナールを有するトランス−アイソフォームのレチナールを生産するためのプロセスに関し、ここで、ＢＣＯは、好ましくは、本明細書に記載される適切な条件下、適切な宿主細胞において異種発現される。産生されるレチナール、特にトランス−レチナールは、培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。さらなる実施形態では、レチナール、特にトランス−レチナールは、ビタミンＡをもたらす多段階プロセスにおける前駆体として使用することができる。ビタミンＡは、当該技術分野で知られているように培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。
【００４８】
ベータ−カロテン産生遺伝子、本明細書で定義されるＢＣＯ、及び／又は任意選択的に、ビタミンＡの生合成に必要とされるさらなる遺伝子を発現することができる宿主細胞、すなわち微生物、藻類、真菌、動物又は植物細胞は、好気性又は嫌気性条件下で適切な栄養分が補充され、種々の宿主細胞に対して当業者により知られているような水性培地中で培養され得る。任意選択的に、このような培養は、本明細書で定義される電子の移動に関与するタンパク質及び／又は補助因子の存在下で行われる。宿主細胞の培養／成長は、バッチ、流加バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、半連続又は連続モードで行うことができる。宿主細胞に応じて、好ましくは、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体（レチナールなど）などのレチノイドの産生は、当業者に知られているように異なり得る。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択されるベータ−カロテン及びレチノイド産生宿主細胞の培養及び単離は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される宿主細胞におけるレチノイドの産生に関して、方法は、例えば、Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１０：９５（２０１１）に記載されている。例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母宿主細胞においてベータ−カロテン及びレチノイドを生産するための特定の方法は、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットに開示されている。
【００４９】
本明細書で使用される場合、酵素に関して「比活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。比活性は、規定温度において所与の期間に規定量のタンパク質によって消費される基質及び／又は産生される産物の量を定義する。通常、比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）で略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）という比活性の単位の定義は、本文書を通して互換的に使用される。酵素は、インビボで、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内、又は適切な基質が存在する系内でその触媒活性を実施すれば活性である。当業者には、酵素活性、特に、本明細書で定義されるＢＣＯの活性の測定方法が分かる。ベータ−カロテンの変換からのトランス−レチナールの産生について本明細書で定義される適切なＢＣＯの能力を評価するための分析方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの実施例４などに記載されている。簡単には、トランス−レチナール、シス−レチナール、ベータ−カロテンなどの産物の力価は、ＨＰＬＣによって測定することができる。
【００５０】
本明細書で使用されるレチノイドは、レチナール、レチノール酸、レチノール、レチノイン酸メトキシド（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）、酢酸レチニル、レチニルエステル、４−ケト−レチノイド、３ヒドロキシ−レチノイド又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されないアポカロテノイドとしても知られているベータカロテン切断産物を含む。レチノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。
【００５１】
本明細書で使用されるレチナールは、ＩＵＰＡＣ名（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエナールで知られている。これは、本明細書では互換的にレチンアルデヒド又はビタミンＡアルデヒドと称され、シス−及びトランス−アイソフォームの両方、例えば、１１−シスレチナール、１３−シスレチナール、トランス−レチナール及び全トランスレチナールなどが含まれる。シス−及びトランス−レチナールの混合物は本明細書では「レチナール混合物」と呼ばれ、トランス−レチナールに関して「少なくとも約６５％」、又はシス−レチナールに関して「約３５％以下」という割合は、このようなレチナール混合物中のトランス−レチナール対シス−レチナールの比率を指す。
【００５２】
本明細書で使用される「カロテノイド」という用語は、当該技術分野においてよく知られている。これは、２つの２０炭素ゲラニルゲラニルピロリン酸分子の連結により天然で形成される長い４０炭素の結合イソプレノイドポリエンを含む。これらには、４−ケト位置又は３−ヒドロキシ位置で酸化されてカンタキサンチン、ゼアキサンチン、又はアスタキサンチンをもたらし得る、フィトエン、リコペン、及び例えばベータ−カロテンなどのカロテンが含まれるが、これらに限定されない。カロテノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットに記載される。
【００５３】
本明細書で使用されるビタミンＡは、水溶液中に見られるビタミンＡの任意の化学形態（例えば、その遊離酸形態で非解離、又はアニオンとして解離）であり得る。本明細書で使用される用語は、生物工学的ビタミンＡ経路における全ての前駆体又は中間体を含む。また、酢酸ビタミンＡも含む。
【００５４】
特に、本発明は、本実施形態を特徴とする。
【００５５】
−  立体選択的ベータ−カロテン酸化酵素（ＢＣＯ）を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞がシス−及びトランス−レチナールを含むレチナール混合物を産生し、前記宿主細胞によって産生される混合物中のトランス−レチナールの割合が、少なくとも約６５％、好ましくは、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までである、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５６】
−  トランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物中のトランス−レチナールの割合が、前記宿主細胞により産生されるレチナールの総量を基準として、少なくとも約６５〜９８％、好ましくは少なくとも約６５〜９５％、より好ましくは少なくとも約６５〜９０％の範囲である、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５７】
−  異種立体選択的ＢＣＯを含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５８】
−  宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、酵母を含む真菌から、より好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から、さらにより好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。
【００５９】
−  宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）又はパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。
【００６０】
−  ＢＣＯが真菌、植物又は魚類から選択され、好ましくは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）又はイクタルルス属（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）から選択され、より好ましくは、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、クロクス・サティブス（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、イクタルルス・プンクタトゥス（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、エソックス・ルキウス（Ｅｓｏｘ  ｌｕｃｉｕｓ）、ラティメリア・カルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ  ｃｈａｌｕｍｎａｅ）から選択され、最も好ましくは、配列番号１、２若しくは３に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有する、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７に従うポリペプチドに従うポリペプチドに対して少なくとも約５０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００６１】
−  トランス−レチナールがさらにビタミンＡに変換される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００６２】
−  本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯの酵素活性によってトランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物を生産するためのプロセスであって、ベータ−カロテンを前記ＢＣＯと接触させることを含み、レチナール混合物中のトランス−レチナール対シス−レチナールの比率が少なくとも約２：１である、プロセス。
【００６３】
−  ベータ−カロテンの酵素切断から生じるシス−レチナールの量を低減するためのプロセスであって、前記プロセスが、ベータ−カロテンを本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯと接触させることを含み、ベータ−カロテンの切断から得られるレチナール混合物中のシス−レチナールの量がレチナールの総量を基準として約３５％以下の範囲である、プロセス。
【００６４】
−  ベータ−カロテンの酵素切断から生じるトランス−レチナールの量を増大させるためのプロセスであって、前記プロセスが、ベータ−カロテンを本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯと接触させることを含み、レチナール混合物中のトランス−レチナールの量がレチナールの総量を基準として少なくとも約６５〜９８％の範囲である、プロセス。
【００６５】
−  立体選択的ベータ−カロテン酸化酵素（ＢＣＯ）を含む本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いる、上記の及び本明細書で定義されるプロセスであって、前記宿主細胞が、シス−及びトランス−レチナールを含むレチナール混合物を産生し、トランス−レチナールの割合が、前記宿主細胞により産生されるレチナールの総量を基準として、少なくとも約６５％、好ましくは６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までである、プロセス。
【００６６】
−  （ａ）本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯをコードする核酸分子を適切なカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）ベータ−カロテンを、シス−及びトランス−レチナールを含む本明細書で定義されるレチナール混合物に酵素変換するステップであって、トランス−レチナールの割合が、レチナールの総量を基準として少なくとも約６５％であるステップと、
（ｃ）適切な培養条件下でトランス−レチナールをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【００６７】
−  ２：１の比率のトランス−及びシス−レチナールを含むレチナール混合物を生産するための、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞の使用であって、前記宿主細胞が、トランス−アイソフォームの産生に対する立体選択性を有する異種ＢＣＯを発現する、使用。
【００６８】
以下の実施例は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは全く意図されない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に国際公開第２００６１０２３４２号パンフレット、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレット又は国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの内容は、参照によって本明細書に援用される。
【００６９】
［実施例］
［実施例１：一般的な方法、菌株、及びプラスミド］
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。
【００７０】
［振とうプレートアッセイ］
通常、８００μｌの０．０７５％酵母抽出物、０．２５％ペプトン（０．２５Ｘ  ＹＰ）に、１０μｌの新たに成長させたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を播種し、２００μｌのＤｒａｋｅｏｌ５鉱油でオーバーレイし、炭素源として鉱油中５％のコーン油及び／又は水相中５％のグルコースを用いた。２４ウェルプレート（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、３０℃、８００ＲＰＭ）において、形質転換体をＹＰＤ培地中で２０％のドデカンと共に４日間成長させた。鉱油画分を振とうプレートウェルから取り出し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて、順相カラムでＨＰＬＣにより分析した。
【００７１】
［ＤＮＡ形質転換］
菌株をＹＰＤプレート培地上で一晩成長させることにより形質転換させる。５０μｌの細胞をプレートからこすり取り、１μｇの形質転換ＤＮＡ、通常は組込み形質転換のための直鎖ＤＮＡ、４０％のＰＥＧ  ３５５０ＭＷ、１００ｍＭの酢酸リチウム、５０ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌ中、４０℃で６０分間のインキュベーションにより形質転換させ、選択培地に直接プレーティングするか、或いは優性抗生物質マーカー選択の場合は、細胞をＹＰＤ液体培地において３０℃で４時間増殖させた後、選択培地にプレーティングする。
【００７２】
［ＤＮＡ分子生物学］
ｐＵＣ５７ベクターにおいてＮｈｅｌ及びＭｌｕｌ末端を用いて遺伝子を合成した。国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットの場合のように、通常、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換におけるマーカー選択のために、遺伝子をＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」、ＭＢ６１５７ＨｙｇＲ、及びＭＢ８３２７ＮａｔＲベクターにサブクローニングした。遺伝子及びマーカーＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌ（ＭＢ５０８２）又はＰｖｕｌｌ（ＭＢ６１５７及びＭＢ８３２７）のランダム非相同末端結合によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれゲル電気泳動及びＱｉａｇｅｎゲル精製カラムにより精製した。
【００７３】
［プラスミドのリスト］
使用するプラスミド、菌株、及びコドン最適化された配列は、表１、２及び配列表に記載される。ヌクレオチド配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現に対してコドン最適化される。
【００７４】
【表１】
2020535794.tif 000002
【００７５】
【表２】
2020535794.tif 000003
【００７６】
［順相レチノール法］
Ｗａｔｅｒｓ  ７１７オートサンプラーに取り付けたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリーポンプを用いて、サンプルを注入した。安全シリカガードカラムキットを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｓｉｌｉｃａ（２），１５０ｘ４．６ｍｍを使用して、レチノイドを分離した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、３０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸、又はゼアキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、６０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸のいずれかからなる。それぞれの流速は、０．６ｍＬ／分である。カラム温度は周囲温度である。注入容積は２０μＬである。検出器は、２１０ｎｍから６００ｎｍまでを収集するフォトダイオードアレイ検出器である。表３に従って分析物を検出した。
【００７７】
【表３】
2020535794.tif 000004
【００７８】
［サンプル調製］
条件に応じて種々の方法によりサンプルを調製した。全培養液又は洗浄培養液サンプルのために、培養液を秤量したＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）管に入れ、移動相を添加した。製造指示書に従って最高設定３ＸにおいてＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｃｏｒｐ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）内でサンプルを処理した。洗浄培養液中、サンプルを微量遠心管において１００００ｒｐｍで１分間、１．７ｍｌ管内で回転させ、培養液をデカントし、１ｍｌの水を添加し、混合し、ペレットにし、デカントして、元の容積にした。混合物を再度ペレットにし、適切な量の移動相中に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ビーズビーティングにより処理した。鉱油画分の分析のために、サンプルを４０００ＲＰＭで１０分間回転させ、ポジティブディスプレイスメントピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）により油を上部からデカントして除去し、移動相中に希釈し、ボルテックスにより混合し、ＨＰＬＣ分析によりレチノイド濃度を測定した。
【００７９】
［発酵条件］
発酵は既に記載された条件と同一であり、鉱油のオーバーレイと、０．５Ｌ〜５Ｌの全容積のベンチトップ反応器内に供給されたコーン油である攪拌槽とを用いた（国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットを参照）。一般的に、生産性が増大された流加バッチ攪拌漕反応器を用いて同じ結果が観察され、レチノイドの生産のためのシステムの有用性が実証された。
【００８０】
［実施例２：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるトランス−レチナールの産生］
通常、ＵＲＡ３栄養マーカーに連結されたコドン最適化断片を含有するベータカロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）のＨｉｎｄｌｌ及びＸｂａｌ媒介による制限エンドヌクレオチド切断により、ベータカロテン菌株ＭＬ１７５４４を精製直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。形質転換ＤＮＡは、ＭＢ６７０２ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＮｉｎａＢ  ＢＣＯ遺伝子、ＭＢ６７０３クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）ＢＣＯ遺伝子、ＭＢ８４５６フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＢＣＯ遺伝子、ＭＢ８４５７ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）ＢＣＯ遺伝子及びＭＢ６０９８ダリオ属（Ｄａｒｉｏ）ＢＣＯ遺伝子に由来し、それにより、コドン最適化配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２）が使用された。次に、遺伝子を成長させ、振とうプレート分析において６〜８の単離株をスクリーニングし、うまく機能する単離株を流加バッチ攪拌漕反応器において８〜１０日間実行させた。国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットに記載されるような標準パラメータを用いるが、レチノイド分析物の精製標準物を用いて較正して、ＨＰＬＣによりシス−及びトランス−レチナールの検出を行った。レチナール混合物中のトランス−レチナールの量は、それぞれ、９０％（クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）ＢＣＯを使用）、９５％（フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＢＣＯを使用）、９８％（ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）ＢＣＯを使用）及び９８％（ダリオ属（Ｄａｒｉｏ）ＢＣＯを使用）まで増大させることができた。ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（配列番号７）からのＢＣＯとの比較では、レチナールの総量を基準として６１％のトランス−レチナールが得られた（表４を参照）。
【００８１】
【表４】
2020535794.tif 000005
【００８２】
［実施例３：サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるトランス−レチナールの産生］
通常、ベータカロテン菌株は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０１３０６２８号明細書又は国際公開第２００９１２６８９０号パンフレットに記載される）ような標準的方法に従って、ベータカロテンを産生している構築されたゲラニルゲラニルシンターゼ、フィトエンシンターゼ、リコペンシンターゼ、リコペンシクラーゼなどの酵素をコードする異種遺伝子で形質転換される。さらに、本明細書によるベータカロテンオキシダーゼ遺伝子で形質転換される場合、レチナールを産生することができる。任意選択的に、レチノールデヒドロゲナーゼで形質転換されると、レチノールを産生することができる。レチノールは任意選択的に、アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子による形質転換によってアセチル化され得る。任意選択的に、内在性レチノールアシル化遺伝子を欠失させることができる。さらに、酵素は任意選択的に、レチノールのトランス形態を産生及びアセチル化して、それぞれ、全トランス酢酸レチニル及びトランスレチノールの長鎖エステルをもたらすように選択することができる。このアプローチを用いて、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を宿主とする本明細書のトランス−レチナールに対する特異性に関して同様の結果が得られる。
【００８３】
［実施例４：真菌ＢＣＯを用いたトランス−レチナールの産生の最適化］
通常、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）ＢＣＯをヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に対してコドン最適化し、以下の表５のベクターにＭｌｕＩ／ＮｈｅＩを用いてサブクローニングし、活性について調べた。次に、これらのプラスミドをカロテン産生菌株ＭＢ１７５４４、リコペン産生菌株、ＭＢ１４９２５（ｅｒｇ９：：ｕｒａ３  ｃａｒＢ  ＨＭＧ−ｔｍ  ＧＧＳ  ｃａｒＲＰ（Ｅ７８Ｇ）ａｌｋ１Ｄ  ａｌｋ２Ｄ）及びフィトエン産生菌株、ＭＢ７２０６（ｅｒｇ９：：ｕｒａ３ｂａｒｔ  ｃａｒＢ  ＨＭＧ  ＧＧＳ  ｕｒａ３  ａｄｅ１）に形質転換した（表５を参照）。驚くことに、最適な活性が存在し、より低活性のプロモーターＡＬＫ１及びＡＣＴ１からレチノールの産生が増大されていることを示すことができた。また、リコペン及びフィトエン菌株における前駆体の減弱の低下も観察された。
【００８４】
【表５】
2020535794.tif 000006
【配列表】
2020535794000001.app
【国際調査報告】
2020535794.tif 000007
2020535794.tif 000008
2020535794.tif 000009
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2020535794.tif 000011
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