(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、細胞標識を分類する、例えば、シグナル細胞標識を識別する方法及びシステムである。幾つかの実施形態では、方法は、バーコードを使用してバーコーディングされた細胞中の標的を使用して作成されたバーコード付き標的の配列データを取得することを含み、バーコードは、細胞標識及び分子標識を含む。細胞標識をランク付けた後、累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することができる。方法を使用して、細胞標識は、細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識閾値に基づいて、シグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として分類することができる。【選択図】図６Ｂ
2020500017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル細胞標識を識別する方法であって、
（ａ）複数のバーコードを使用して複数の細胞における複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード付き標的を作成することであって、前記複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、
（ｂ）前記複数のバーコード付き標的の配列データを取得することと、
（ｃ）前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することと、
（ｄ）前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、
（ｅ）（ｃ）において特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された前記細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、
（ｆ）前記累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、
（ｇ）前記累積和プロットの前記二次導関数プロットの最小を特定することであって、前記二次導関数プロットの前記最小は細胞標識閾値に対応する、特定することと、
（ｈ）（ｃ）において特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｇ）において決定された細胞標識閾値に基づいて、前記細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、
を含む、方法。
【請求項２】
（ｈ）において、前記複数のバーコードの細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、前記識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を（ｂ）において得られた前記配列データから除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する前記分子標識の数が、分子標識発生閾値を上回る場合、（ｂ）において得られた前記配列データから、前記複数の標的のうちの前記標的に関連付けられた別個の配列を有する前記分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）において前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、前記配列データから、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた非一意の分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記累積和プロットは、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｌｏｇ−ｌｏｇプロットはｌｏｇ10−ｌｏｇ10プロットである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）において特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された前記細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することは、
前記細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、前記ランクの前記累積和は、より低いランクを有する前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定すること
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記累積和プロットの前記二次導関数プロットを生成することは、前記細胞標識の第１のランクの累積和と、前記細胞標識の第２のランクの累積和との差が、前記第１のランクと前記第２のランクとの差を超えると判断することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のランクと前記第２のランクとの前記差は１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記最小は大域的最小である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記二次導関数プロットの前記最小を特定することは、前記二次導関数プロットの最小が、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、前記複数の細胞における細胞の数に基づいて決定される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記二次導関数プロットの前記最小を特定することは、前記二次導関数プロットの最小が、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、前記複数の細胞における細胞の数に基づいて決定される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞標識のそれぞれは、（ｃ）において特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、前記細胞標識閾値よりも大きい場合、前記シグナル細胞標識として識別される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞標識のそれぞれは、（ｃ）において特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、前記細胞標識閾値よりも大きくない場合、前記ノイズ細胞標識として識別される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）前記複数の標的の１つ又は複数について、
（１）前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、
（２）（１）においてカウントされた前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記標的の数を推定することと、
を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
シグナル細胞標識を特定する方法であって、
（ａ）複数のバーコード付き標的の配列データを取得することであって、前記複数のバーコード付き標的は、複数のバーコードを使用してバーコーディングされた複数の細胞中の複数の標的から作成され、前記複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、取得することと、
（ｂ）前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、
（ｃ）前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれの前記ランクに基づいて、細胞標識閾値を決定することと、
（ｄ）前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｃ）において特定された前記細胞標識閾値に基づいて、前記細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、前記配列データから、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた非一意の分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれの前記ランクに基づいて、前記細胞標識閾値を決定することは、
前記細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、前記ランクの前記累積和は、より低いランクを有する前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定することと、
前記ランクｎの累積及び次のランクｎ＋１の累積和における最大変化を有する前記細胞標識のランクｎを決定することであって、前記累積和及び前記次のランクｎ＋１の前記累積和における最大変化を有する前記細胞標識の前記ランクｎは、前記細胞標識閾値に対応する、決定することと、
を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて前記細胞標識閾値を決定することは、
ランクｎを有する前記細胞標識の累積和及び次のランクｎ＋１を有する前記細胞標識の累積和における最大変化を有する前記細胞標識を特定することであって、前記細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数は、前記細胞標識閾値に対応する、特定すること
を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれの前記ランクに基づいて、前記細胞標識閾値を決定することは、
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された前記細胞標識の前記ランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、
前記累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、
前記累積和プロットの前記二次導関数プロットの最小を特定することであって、前記二次導関数プロットの前記最小は前記細胞標識閾値に対応する、特定することと、
を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された前記細胞標識のそれぞれの前記ランクに基づいて、前記累積和を生成することは、
前記細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、前記ランクの前記累積和は、より低いランクを有する前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定すること
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記累積和プロットの前記二次導関数プロットを生成することは、前記細胞標識の第１のランクの累積和と、前記細胞標識の第２のランクの累積和との差が、前記第１のランクと前記第２のランクとの差を超えると判断することを含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のランクと前記第２のランクとの前記差は１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ｄ）において、前記複数のバーコードの細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、（ａ）において取得された前記配列データから、前記識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、分子標識発生閾値を超える場合、（ａ）において取得された前記配列データから、前記複数の標的のうちの前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記累積和プロットは、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットである、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｌｏｇ−ｌｏｇプロットはｌｏｇ10−ｌｏｇ10プロットである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記最小は大域的最小である、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記二次導関数プロットの前記最小を特定することは、前記二次導関数プロットの最小が、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含む、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、前記複数の細胞における細胞の数に基づいて決定される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記二次導関数プロットの前記最小を特定することは、前記二次導関数プロットの最小が、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む、請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、前記複数の細胞における細胞の数に基づいて決定される、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞標識のそれぞれは、特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、前記細胞標識閾値よりも大きい場合、前記シグナル細胞標識として識別される、請求項２０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞標識のそれぞれは、特定された前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、前記細胞標識閾値よりも大きくない場合、前記ノイズ細胞標識として識別される、請求項２０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
（ｅ）前記複数の標的の１つ又は複数について、
（１）前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、
（２）（１）においてカウントされた前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記標的の数を推定することと、
を含む、請求項２０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
シグナル細胞標識を識別する方法であって、
（ａ）細胞の複数の標的の配列データを取得することであって、各標的には、複数の細胞標識の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が関連付けられる、取得することと、
（ｂ）前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、細胞標識閾値を決定することと、
（ｃ）前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び前記細胞標識閾値に基づいて、前記細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、
を含む、方法。
【請求項４４】
配列データを取得することは、
複数のバーコードを使用して前記細胞の前記複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード付き標的を作成することであって、前記複数のバーコードのそれぞれは、前記複数の細胞標識の細胞標識及び分子標識を含む、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、
前記複数のバーコードの前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することと、
を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数の標的の１つ又は複数について、
（１）前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、
（２）（１）においてカウントされた前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記標的の数を推定することと、
を含む、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数のバーコードの細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、前記配列データから、前記識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、分子標識発生閾値を超える場合、前記配列データから、前記複数の標的のうちの前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
（ｃ）において前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、前記配列データから、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた非一意の分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞標識閾値を決定することは、
累積和プロットの変曲点を特定すること
を含み、前記累積和プロットは、前記複数の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び前記細胞標識のそれぞれのランクに基づき、
前記変曲点は、前記細胞標識閾値に対応する、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記累積和プロットの変曲点を特定することは、
前記複数の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び前記細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、前記累積和プロットを生成することと、
前記累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、
前記累積和プロットの前記二次導関数プロットの最小を特定することであって、前記二次導関数プロットの前記最小は前記細胞標識閾値に対応する、特定することと、
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞標識閾値を決定することは、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記複数の細胞標識のそれぞれの前記ランクを決定することを含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記累積和プロットは、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットである、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｌｏｇ−ｌｏｇプロットはｌｏｇ10−ｌｏｇ10プロットである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び前記細胞標識のそれぞれの前記ランクに基づいて、前記累積和プロットを生成することは、
前記細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、前記ランクの前記累積和は、より低いランクを有する前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定すること
を含む、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記累積和プロットの前記二次導関数プロットを生成することは、前記細胞標識の第１のランクの累積和と、前記細胞標識の第２のランクの累積和との差が、前記第１のランクと前記第２のランクとの差を超えると判断することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１のランクと前記第２のランクとの前記差は１である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記最小は大域的最小である、請求項４３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記二次導関数プロットの前記最小を特定することは、前記二次導関数プロットの最小が、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含む、請求項４３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、前記複数の細胞における細胞の数に基づいて決定される、請求項５８又は５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記二次導関数プロットの前記最小を特定することは、前記二次導関数プロットの最小が、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む、請求項４３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、前記複数の細胞における細胞の数に基づいて決定される、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞標識のそれぞれは、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、前記細胞標識閾値よりも大きい場合、前記シグナル細胞標識として識別される、請求項４３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞標識のそれぞれは、前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、前記細胞標識閾値よりも大きくない場合、前記ノイズ細胞標識として識別される、請求項４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
シグナル細胞標識を識別する方法であって、
（ａ）複数のバーコードを使用して複数の細胞における複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード付き標的を作成することであって、前記複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、前記複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、前記複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、
（ｂ）前記複数のバーコード付き標的の配列データを取得することと、
（ｃ）前記複数のバーコード付き標的の各細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、前記特徴ベクトルは、前記各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、
（ｄ）前記特徴ベクトルに基づいて、前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識のクラスタを特定することと、
（ｅ）前記クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、
を含む、方法。
【請求項６７】
前記特徴ベクトルに基づいて前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識の前記クラスタを特定することは、特徴ベクトル空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記特徴ベクトルに基づいて前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識の前記クラスタを特定することは、
前記特徴ベクトルを前記特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することと、
前記より低次元の空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることと、
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記より低次元の空間は、二次元空間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記特徴ベクトルを前記特徴ベクトル空間から前記より低次元の空間に投影することは、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）法を使用して、前記特徴ベクトルを前記特徴ベクトル空間から前記より低次元の空間に投影することを含む、請求項６８又は６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記より低次元の空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることは、密度ベースの方法を使用して、前記より低次元の空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることを含む、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記密度ベースの方法は、ノイズを含むアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）法を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞標識は、前記クラスタ内の細胞標識の数が、前記クラスタサイズ閾値を下回る場合、シグナル細胞標識として識別される、請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞標識は、前記クラスタ内の細胞標識の数が、前記クラスタサイズ閾値を下回らない場合、ノイズ細胞標識として識別される、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいて前記クラスタサイズ閾値を決定することを含む、請求項６６〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記クラスタサイズ閾値は、前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいて前記クラスタサイズ閾値を決定することを含む、請求項６６〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記クラスタサイズ閾値は、前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数のバーコードの各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記クラスタ閾値サイズを決定することを含む、請求項６６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
（ｆ）前記複数の標的の１つ又は複数について、
（１）前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、
（２）（１）においてカウントされた前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記標的の数を推定することと、
を含む、請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
シグナル細胞標識を識別する方法であって、
（ａ）複数のバーコード付き標的の配列データを取得することであって、前記複数のバーコード付き標的は、複数のバーコードを使用してバーコーディングされた複数の細胞中の複数の標的から作成され、前記複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、前記複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、前記複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、取得することと、
（ｂ）前記複数のバーコード付き標的の各細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、前記特徴ベクトルは、前記各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、
（ｃ）前記特徴ベクトルに基づいて、前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識のクラスタを特定することと、
（ｄ）前記クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、
を含む、方法。
【請求項８２】
前記特徴ベクトルに基づいて前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識の前記クラスタを特定することは、特徴ベクトル空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記特徴ベクトルに基づいて前記複数のバーコード付き標的の前記各細胞標識の前記クラスタを特定することは、
前記特徴ベクトルを前記特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することと、
前記より低次元の空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることと、
を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記より低次元の空間は、二次元空間である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記特徴ベクトルを前記特徴ベクトル空間から前記より低次元の空間に投影することは、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）法を使用して、前記特徴ベクトルを前記特徴ベクトル空間から前記より低次元の空間に投影することを含む、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記より低次元の空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることは、密度ベースの方法を使用して、前記より低次元の空間における前記クラスタへの前記特徴ベクトルの距離に基づいて、前記各細胞標識を前記クラスタにクラスタリングすることを含む、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記密度ベースの方法は、ノイズを含むアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）法を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞標識は、前記クラスタ内の細胞標識の数が、前記クラスタサイズ閾値を下回る場合、シグナル細胞標識として識別される、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞標識は、前記クラスタ内の細胞標識の数が、前記クラスタサイズ閾値を下回らない場合、ノイズ細胞標識として識別される、請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいて前記クラスタサイズ閾値を決定することを含む、請求項８３〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記クラスタサイズ閾値は、前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいて前記クラスタサイズ閾値を決定することを含む、請求項８３〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記クラスタサイズ閾値は、前記複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記複数のバーコードの各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記クラスタ閾値サイズを決定することを含む、請求項８３〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
（ｅ）前記複数の標的の１つ又は複数について、
（１）前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、
（２）（１）においてカウントされた前記配列データ中の前記標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、前記標的の数を推定することと、
を含む、請求項８３〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
シグナル細胞標識を識別する方法であって、
（ａ）細胞の複数の第１の標的の配列データを取得することであって、第１の各標的には、複数の細胞標識の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が関連付けられる、取得することと、
（ｂ）前記細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、前記細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、
（ｃ）（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された前記複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別し、又は（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された前記細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することと、
を含む、方法。
【請求項９７】
前記識別閾値は、細胞標識閾値、クラスタサイズ閾値、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
分子標識数の閾値を下回る別個の配列を有する分子標識の数にそれぞれ関連付けられた前記複数の細胞標識の１つ又は複数の細胞標識を除去することを含む、請求項９６又は９７に記載の方法。
【請求項９９】
（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された前記複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別することは、
前記複数の第１の標的の中で、多様性閾値を上回る１つ又は複数の多様性指示をそれぞれ有する前記複数の第１の標的のうちの複数の第２の標的を特定することと、
前記複数の細胞標識のそれぞれについて、前記複数の第２の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び前記識別閾値に基づいて、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された前記複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別することと、
を含む、請求項９６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記第２の標的の前記１つ又は複数の多様性指示は、前記第２の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識及び前記配列データ中の前記複数の細胞標識のうちの細胞標識の数の平均、最大、メジアン、最小、分散、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第２の標的の前記１つ又は複数の多様性指示は、前記複数の第２の多様性指示標的のサブセットの標準偏差、正規化分散、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項９９又は１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記多様性閾値は、前記複数の第２の標的の前記サブセットの前記サイズ以下である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された前記複数の細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することは、
関連性閾値を超える、（ｃ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識と関連性をそれぞれ有する前記複数の第１の標的のうちの複数の第３の標的を特定することと、
前記複数の細胞標識のそれぞれについて、前記複数の第３の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び前記識別閾値に基づいて、（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された前記細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することと、
を含む、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記関連性閾値を超える、（ｃ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識と関連性をそれぞれ有する前記複数の第１の標的のうちの複数の第３の標的を特定することは、
（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された前記細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別した後、シグナル細胞標識として識別された複数の残りの細胞標識を特定することと、
前記複数の第３の標的を特定することであって、
前記複数の細胞標識のそれぞれについて、前記複数の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数、及び
前記複数の残りの細胞標識のそれぞれについて、前記複数の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数
に基づいて、前記複数の第３の標的を特定することと、
を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
標的の数を特定するコンピュータシステムであって、
ハードウェアプロセッサと、
命令が記憶された非一時的メモリと、
を備え、前記命令は、前記ハードウェアプロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法を実行させる、コンピュータシステム。
【請求項１０６】
請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法を実行する方法を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４１９１９４号明細書及び２０１７年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４４５５４６号明細書の優先権を主張するものである。これらの関連出願のそれぞれの内容は全体的に、参照により明示的に本明細書に援用される。
【０００２】
分野
本開示は、一般的には分子バーコーディングの分野に関し、より詳細には、ノイズ細胞標識を識別して修正することに関する。
【背景技術】
【０００３】
確率的バーコーディング等の方法及び技法は、細胞分析、特に遺伝子発現プロファイルを解読して、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して細胞の状態を特定するのに有用である。しかしながら、これらの方法及び技法は、修正されない場合、細胞カウントの過大評価に繋がり得るエラーを導入する恐れがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ａ）複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して細胞の試料中の複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）して、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することであって、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）複数のバーコードの細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することと、（ｄ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数のバーコードの細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｅ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、（ｆ）累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、（ｇ）累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することと、（ｈ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｇ）において決定された細胞標識閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【０００５】
幾つかの実施形態では、本方法は、（ｈ）において、複数のバーコードの細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を（ｂ）において得られた配列データから除去することを含む。本方法は、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、分子標識発生閾値を上回る場合、（ｂ）において得られた配列データから、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含むことができる。
【０００６】
幾つかの実施形態では、（ｃ）において細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、配列データから、細胞標識のそれぞれに関連付けられた非一意の分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む。累積和プロットは、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットであることができる。ｌｏｇ−ｌｏｇプロットはｌｏｇ10−ｌｏｇ10プロットであることができる。
【０００７】
幾つかの実施形態では、（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することは、細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、ランクの累積和は、より低いランクを有する細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む。累積和プロットの二次導関数プロットを生成することは、細胞標識の第１のランクの累積和と、細胞標識の第２のランクの累積和との差が、第１のランクと第２のランクとの差を超えると判断することを含むことができる。第１のランクと第２のランクとの差は１であることができる。
【０００８】
幾つかの実施形態では、最小は大域的最小である。二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値である。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、細胞の試料における細胞の数に基づいて決定される。
【００１０】
幾つかの実施形態では、二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、細胞の試料における細胞の数に基づいて決定することができる。
【００１１】
幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれは、（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きい場合、シグナル細胞標識として識別される。細胞標識のそれぞれは、（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きくない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。
【００１２】
幾つかの実施形態では、本方法は、（ｉ）複数の標的の１つ又は複数について、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含む。
【００１３】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を特定する方法である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ａ）複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の配列データを取得することであって、複数のバーコード付き標的は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用してバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）された細胞の試料中の複数の標的から作成され、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、取得することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的（又はバーコード）の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数のバーコード付き標的（又はバーコード）の細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｃ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された複数のバーコード付き標的（又はバーコード）の細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、細胞標識閾値を決定することと、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｃ）において特定された細胞標識閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、本方法は、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することを含む。細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、配列データから、細胞標識のそれぞれに関連付けられた非一意の分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含むことができる。
【００１５】
幾つかの実施形態では、複数のバーコード付き標的の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、細胞標識閾値を決定することは、ランクｎを有する細胞標識の累積和及び次のランクｎ＋１を有する細胞標識の累積和における最大変化を有する細胞標識を特定することを含み、細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数は、細胞標識閾値に対応する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、複数のバーコード付き標的の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された複数のバーコード付き標的の細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、細胞標識閾値を決定することは、細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、ランクの累積和は、より低いランクを有する細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定することと、ランクｎの累積及び次のランクｎ＋１の累積和における最大変化を有する細胞標識のランクｎを決定することであって、累積和及び次のランクｎ＋１の累積和における最大変化を有する細胞標識のランクｎは、細胞標識閾値に対応する、決定することとを含む。
【００１７】
幾つかの実施形態では、複数のバーコード付き標的の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された複数のバーコードの細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、細胞標識閾値を決定することは、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された細胞標識のランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することとを含む。細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和を生成することは、細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、ランクの累積和は、より低いランクを有する細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定することを含むことができる。累積和プロットの二次導関数プロットを生成することは、細胞標識の第１のランクの累積和と、細胞標識の第２のランクの累積和との差が、第１のランクと第２のランクとの差を超えると判断することを含むことができる。
【００１８】
幾つかの実施形態では、第１のランクと第２のランクとの差は１である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ｄ）において、複数のバーコード付き標的の細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、（ａ）において取得された配列データから、識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む。本方法は、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、分子標識発生閾値を超える場合、（ａ）において取得された配列データから、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含むことができる。累積和プロットは、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットであることができる。ｌｏｇ−ｌｏｇプロットはｌｏｇ10−ｌｏｇ10プロットであることができる。
【００１９】
幾つかの実施形態では、最小は大域的最小である。二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含むことができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、細胞の試料における細胞の数に基づいて決定することができる。
【００２０】
幾つかの実施形態では、二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、細胞の試料における細胞の数に基づいて決定することができる。
【００２１】
幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれは、（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きい場合、シグナル細胞標識として識別される。細胞標識のそれぞれは、（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きくない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本方法は、（ｅ）複数の標的の１つ又は複数について、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含む。
【００２３】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ａ）細胞の複数の標的の配列データを取得することであって、各標的には、複数の細胞標識の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が関連付けられる、取得することと、（ｂ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、細胞標識閾値を決定することと、（ｃ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、配列データを取得することは、複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード付き標的を作成することであって、複数のバーコードのそれぞれは、複数の細胞標識の細胞標識及び分子標識を含む、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、複数のバーコードの細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することとを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、複数の標的の１つ又は複数について、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含む。本方法は、複数のバーコードの細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、配列データから、識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を除去することを含むことができる。本方法は、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、分子標識発生閾値を超える場合、配列データから、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含むことができる。幾つかの実施形態では、（ｃ）において細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、配列データから、細胞標識のそれぞれに関連付けられた非一意の分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む。
【００２５】
幾つかの実施形態では、細胞標識閾値を決定することは、累積和プロットの変曲点を特定することを含み、累積和プロットは、複数の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識のそれぞれのランクに基づき、変曲点は、細胞標識閾値に対応する。累積和プロットの変曲点を特定することは、複数の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することとを含むことができる。細胞標識閾値を決定することは、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数の細胞標識のそれぞれのランクを決定することを含むことができる。累積和プロットは、ｌｏｇ１０−ｌｏｇ１０プロット等のｌｏｇ−ｌｏｇプロットであることができる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することは、細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、ランクの累積和は、より低いランクを有する細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定することを含む。累積和プロットの二次導関数プロットを生成することは、細胞標識の第１のランクの累積和と、細胞標識の第２のランクの累積和との差が、第１のランクと第２のランクとの差を超えると判断することを含むことができる。第１のランクと第２のランクとの差は１であることができる。最小は大域的最小であることができる。二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含むことができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、複数の細胞における細胞の数に基づいて決定することができる。
【００２７】
幾つかの実施形態では、二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、複数の細胞における細胞の数に基づいて決定することができる。
【００２８】
幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれは、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きい場合、シグナル細胞標識として識別することができる。細胞標識のそれぞれは、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きくない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。
【００２９】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ａ）複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して細胞の試料における複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）して、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することであって、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、特徴ベクトルは、各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、（ｄ）特徴ベクトルに基づいて、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識のクラスタを特定することと、（ｅ）クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、特徴ベクトルに基づいて複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することは、特徴ベクトル空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、複数のバーコード付き標的の各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることを含む。特徴ベクトルに基づいて複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することは、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することと、より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることとを含むことができる。
【００３１】
幾つかの実施形態では、より低次元の空間は、二次元空間である。特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することは、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）法を使用して、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することを含むことができる。より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることは、密度ベースの方法を使用して、より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることを含むことができる。密度ベースの方法は、ノイズを含むアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）法を含むことができる。
【００３２】
幾つかの実施形態では、細胞標識は、クラスタ内の細胞標識の数が、クラスタサイズ閾値を下回る場合、シグナル細胞標識として識別される。細胞標識は、クラスタ内の細胞標識の数が、クラスタサイズ閾値を下回らない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。本方法は、（ｆ）複数の標的の１つ又は複数について、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含むことができる。
【００３３】
幾つかの実施形態では、本方法は、複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいてクラスタサイズ閾値を決定することを含む。クラスタサイズ閾値は、複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合であることができる。幾つかの実施形態では、本方法は、複数のバーコードの細胞標識の数に基づいてクラスタサイズ閾値を決定することを含む。クラスタサイズ閾値は、複数のバーコードの細胞標識の数の割合である。幾つかの実施形態では、本方法は、複数のバーコードの各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、クラスタ閾値サイズを決定することを含む。
【００３４】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ａ）複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の配列データを取得することであって、複数のバーコード付き標的は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用してバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）された細胞の試料中の複数の標的から作成され、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、取得することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的の各細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、特徴ベクトルは、各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、（ｃ）特徴ベクトルに基づいて、複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することと、（ｄ）クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、複数のバーコード付き標的の各細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００３５】
幾つかの実施形態では、特徴ベクトルに基づいて複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することは、特徴ベクトル空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、複数のバーコード付き標的の各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることを含む。特徴ベクトルに基づいて複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することは、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することと、より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることとを含む。より低次元の空間は、二次元空間であることができる。
【００３６】
幾つかの実施形態では、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することは、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）法を使用して、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することを含む。より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることは、密度ベースの方法を使用して、より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることを含むことができる。密度ベースの方法は、ノイズを含むアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）法を含むことができる。
【００３７】
幾つかの実施形態では、細胞標識は、クラスタ内の細胞標識の数が、クラスタサイズ閾値を下回る場合、シグナル細胞標識として識別することができる。細胞標識は、クラスタ内の細胞標識の数が、クラスタサイズ閾値を下回らない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。
【００３８】
幾つかの実施形態では、本方法は、複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいてクラスタサイズ閾値を決定することを含む。クラスタサイズ閾値は、複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合であることができる。幾つかの実施形態では、複数のバーコード付き標的の細胞標識の数に基づいてクラスタサイズ閾値を決定すること。クラスタサイズ閾値は、複数のバーコードの細胞標識の数の割合であることができる。幾つかの実施形態では、本方法は、複数のバーコードの各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、クラスタ閾値サイズを決定することを含む。
【００３９】
幾つかの実施形態では、本方法は、（ｅ）複数の標的の１つ又は複数について、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含む。
【００４０】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、本方法は、（ａ）細胞の複数の第１の標的の配列データを取得することであって、第１の各標的には、複数の細胞標識の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が関連付けられる、取得することと、（ｂ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、（ｃ）（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別し、又は（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することとを含む。各細胞標識を識別すること、シグナル細胞標識として複数の細胞標識の少なくとも１つを再識別すること、又はノイズ細胞標識として複数の細胞標識の少なくとも１つを再識別することは、本開示と同一の細胞標識識別方法又は異なる細胞標識識別方法に基づくことができる。識別閾値は、細胞標識閾値、クラスタサイズ閾値、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。本方法は、分子標識数の閾値を下回る別個の配列を有する分子標識の数にそれぞれ関連付けられた複数の細胞標識の１つ又は複数の細胞標識を除去することを含むことができる。
【００４１】
幾つかの実施形態では、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別することは、複数の第１の標的の中で、多様性閾値を上回る１つ又は複数の多様性指示をそれぞれ有する複数の第１の標的のうちの複数の第２の標的を特定することと、複数の細胞標識のそれぞれについて、複数の第２の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別することとを含む。第２の標的の１つ又は複数の多様性指示は、第２の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識及び配列データ中の複数の細胞標識のうちの細胞標識の数の平均、最大、メジアン、最小、分散、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。第２の標的の１つ又は複数の多様性指示は、複数の第２の標的のサブセットの多様性指示標準偏差、正規化分散、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。多様性閾値は、複数の第２の標的のサブセットのサイズ以下であることができる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することは、関連性閾値を超える、（ｃ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識と関連性をそれぞれ有する複数の第１の標的のうちの複数の第３の標的を特定することと、複数の細胞標識のそれぞれについて、複数の第３の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することとを含む。関連性閾値を超える、（ｃ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識と関連性をそれぞれ有する複数の第１の標的のうちの複数の第３の標的を特定することは、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別した後、シグナル細胞標識として識別された複数の残りの細胞標識を特定することと、複数の第３の標的を特定することであって、複数の細胞標識のそれぞれについて、複数の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数、及び複数の残りの細胞標識のそれぞれについて、複数の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数の第３の標的を特定することとを含むことができる。
【００４３】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別するコンピュータシステムである。幾つかの実施形態では、本システムは、ハードウェアプロセッサと、命令が記憶された非一時的メモリとを備え、命令は、ハードウェアプロセッサによって実行されると、プロセッサに、本明細書に開示される任意の方法を実行させる。本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別するコンピュータ可読媒体である。幾つかの実施形態では、本コンピュータ可読媒体は、本明細書に開示される任意の方法を実行するコードを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】非限定的で例示的なバーコード（例えば、確率的バーコード）を示す。
【図２】バーコーディング及びデジタルカウント（例えば、確率的バーコーディング及びデジタルカウント）の非限定的で例示的な作業フローを示す。
【図３】複数の標的からバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の索引付きライブラリを生成する非限定的で例示的なプロセスを示す概略図である。
【図４】シグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として細胞を識別する非限定的で例示的な方法を示すフローチャートである。
【図５】シグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として細胞を識別する非限定的で例示的な方法を示すフローチャートである。
【図６Ａ】真の細胞に関連付けられた標識をノイズ細胞から区別する非限定的で例示的な方法を示す流れ図である。
【図６Ｂ】真の細胞に関連付けられた標識をノイズ細胞から区別する別の非限定的で例示的な方法を示す流れ図である。
【図７】最もバリアブルな遺伝子の識別を示す非限定的で例示的な概略図であり、真の細胞に関連付けられた標識をノイズ細胞から区別する方法（例えば、実施例４に示される、図６Ａを参照して説明される方法６００ａ）は、最もバリアブルな遺伝子の識別を含むことができる。
【図８Ａ】各遺伝子に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の損失が最大である遺伝子の識別を示す非限定的で例示的なプロットであり、真の細胞に関連付けられた標識をノイズ細胞から区別する方法（例えば、実施例４に示される、図６Ａを参照して説明される方法６００ａ）は、各遺伝子の別個の配列に関連付けられた分子標識の数の損失が最大である遺伝子の識別を含むことができる。
【図８Ｂ】各遺伝子に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の損失が最大である遺伝子の識別を示す非限定的で例示的なプロットであり、真の細胞に関連付けられた標識をノイズ細胞から区別する方法（例えば、実施例４に示される、図６Ａを参照して説明される方法６００ａ）は、各遺伝子の別個の配列に関連付けられた分子標識の数の損失が最大である遺伝子の識別を含むことができる。
【図９】本開示の方法を実施するように構成される例示的な計算システムのブロック図である。
【図１０】非限定的で例示的な累積和プロットを示す。
【図１１】図１０における累積和プロットの非限定的な二次導関数プロットを示す。
【図１２】シグナル又はノイズ細胞標識の非限定的なｔＳＮＥプロットを示す。
【図１３Ａ】３つの別個の乳がん細胞株を有するＢＤ（商標）乳がん遺伝子パネル及びドナー単離ＰＢＭＣを使用して処理された試料についての図４を参照して示した方法４００により識別された細胞（図１３Ａ）と、図６Ａを参照して示した方法６００ａにより識別された細胞（図１３Ｂ）との比較を示す非限定的で例示的なプロットであり、図１３Ａ及び図１３Ｂの両方で青く標識されたドットは、両方法により検出された共通の細胞であり、図１３Ａにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞であり、図１３Ｂにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａにより識別された追加の真の細胞である。
【図１３Ｂ】３つの別個の乳がん細胞株を有するＢＤ（商標）乳がん遺伝子パネル及びドナー単離ＰＢＭＣを使用して処理された試料についての図４を参照して示した方法４００により識別された細胞（図１３Ａ）と、図６Ａを参照して示した方法６００ａにより識別された細胞（図１３Ｂ）との比較を示す非限定的で例示的なプロットであり、図１３Ａ及び図１３Ｂの両方で青く標識されたドットは、両方法により検出された共通の細胞であり、図１３Ａにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞であり、図１３Ｂにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａにより識別された追加の真の細胞である。
【図１４Ａ】方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、赤く標識された細胞は、識別された追加の細胞（図４を参照して示した方法４００により識別された細胞と比較して）であり、細胞は、Ｂ細胞（図１４Ｂ）、ＮＫ細胞（図１４Ｃ）、及びＴ細胞（図１４Ｄ）等のＰＢＭＣの発現によって着色される。
【図１４Ｂ】方法６００ａによって識別された追加の細胞が実際に真の細胞であることを示す。
【図１４Ｃ】方法６００ａによって識別された追加の細胞が実際に真の細胞であることを示す。
【図１４Ｄ】方法６００ａによって識別された追加の細胞が実際に真の細胞であることを示す。
【図１５Ａ】健康なドナーから単離されたＰＢＭＣと共にＢＤ（商標）血液遺伝子パネルを使用して処理された試料についての図４を参照して示した方法４００により識別された細胞（図１５Ａ）と、図６Ａを参照して示した方法６００ａにより識別された細胞（図１５Ｂ）との比較を示す非限定的で例示的なプロットであり、図１５Ａ及び図１５Ｂの両方で青く標識されたドットは、両方法により検出された共通の細胞であり、図１５Ａにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞であり、図１５Ｂにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａにより識別された追加の真の細胞である。
【図１５Ｂ】健康なドナーから単離されたＰＢＭＣと共にＢＤ（商標）血液遺伝子パネルを使用して処理された試料についての図４を参照して示した方法４００により識別された細胞（図１５Ａ）と、図６Ａを参照して示した方法６００ａにより識別された細胞（図１５Ｂ）との比較を示す非限定的で例示的なプロットであり、図１５Ａ及び図１５Ｂの両方で青く標識されたドットは、両方法により検出された共通の細胞であり、図１５Ａにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞であり、図１５Ｂにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａにより識別された追加の真の細胞である。
【図１６Ａ】方法４００により識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、図１６Ａでは、赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞であり、図１６Ｂでは、細胞は、ＣＤ１４及びＳ１００Ａ６等の単核細胞マーカー遺伝子群の発現により着色され、改善されたアルゴリズムによって識別された「ノイズ」細胞は主に、単核細胞の発現が低かった。
【図１６Ｂ】方法４００により識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、図１６Ａでは、赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞であり、図１６Ｂでは、細胞は、ＣＤ１４及びＳ１００Ａ６等の単核細胞マーカー遺伝子群の発現により着色され、改善されたアルゴリズムによって識別された「ノイズ」細胞は主に、単核細胞の発現が低かった。
【図１７Ａ】方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、と標識された細胞は、識別された追加の細胞であり、細胞は、Ｔ細胞の発現（図１７Ｂ）、重要遺伝子ＬＡＴの発現（図１７Ｃ）、及びＩＬ７Ｒの発現（図１７Ｄ）により着色される。
【図１７Ｂ】方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、と標識された細胞は、識別された追加の細胞であり、細胞は、Ｔ細胞の発現（図１７Ｂ）、重要遺伝子ＬＡＴの発現（図１７Ｃ）、及びＩＬ７Ｒの発現（図１７Ｄ）により着色される。
【図１７Ｃ】方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、と標識された細胞は、識別された追加の細胞であり、細胞は、Ｔ細胞の発現（図１７Ｂ）、重要遺伝子ＬＡＴの発現（図１７Ｃ）、及びＩＬ７Ｒの発現（図１７Ｄ）により着色される。
【図１７Ｄ】方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、と標識された細胞は、識別された追加の細胞であり、細胞は、Ｔ細胞の発現（図１７Ｂ）、重要遺伝子ＬＡＴの発現（図１７Ｃ）、及びＩＬ７Ｒの発現（図１７Ｄ）により着色される。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部をなす添付図面を参照する。図面中、同様のシンボルは通常、状況により別段のことが示される場合を除き、同様の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される説明のために実施形態は、限定を意味しない。本明細書に提示される趣旨の意図又は範囲から逸脱せずに、他の実施形態が利用可能であり、他の変更が可能である。本開示の態様が、本明細書に概説され、図に示されるように、多種多様な異なる構成で配置、置換、結合、分離、及び設計することが可能であり、これらが全て本明細書において明示的に意図され、本開示の一部をなすことが容易に理解される。
【００４６】
本明細書において引用される全ての特許、公開特許出願、他の公開物、及びＧｅｎＢａｎｋからの配列、並びに他のデータベースは全体的に、関連技術に関して参照により本明細書に援用される。
【００４７】
少数の拡散又は標的、例えば、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子の定量化は、例えば、様々な開発段階又は様々な環境状況下で発現される遺伝子を特定するのに臨床的に重要である。しかしながら、特に分子数が非常に小さい場合、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の絶対数を特定するのは非常に難しい問題であり得る。試料中の分子の絶対数を特定する一方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、ＰＣＲは、各サイクルで分子の理想的なコピーを生成する。しかしながら、ＰＣＲには、各分子が推計学的確率で複製され、この確率がＰＣＲサイクル及び遺伝子配列で変化し、その結果、増幅バイアス及び不正確な遺伝子発現測定が生じるような欠点があり得る。
【００４８】
一意の分子標識（ＭＬ、分子インデックス（ＭＩ）とも呼ばれる）を有するバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して、分子数をカウントすることができる。各細胞標識に一意の分子標識を有するバーコードを使用して、各細胞内の分子数をカウントすることができる。バーコーディングする非限定的で例示的なアッセイには、Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト））、Ｒｅｓｏｌｖｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト））、又はＲｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト））がある。しかしながら、これらの方法及び技法はエラーを導入する恐れがあり、エラーは、修正されない場合、細胞カウントの過大評価に繋がり得る。
【００４９】
Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイは、ＲＴステップ中、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド上に多数の、例えば、６５６１〜６５５３６個の一意の分子標識を有するバーコード（例えば、確率的バーコード）の非枯渇性プールを利用して、試料中の全てのポリ（Ａ）−ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。分子標識に加えて、バーコードの細胞標識を使用して、マイクロウェルプレートの各ウェル内の１つの各細胞を同定することができる。バーコードは、ユニバーサルＰＣＲプライミング部位を含むことができる。ＲＴ中、標的遺伝子分子はランダムにバーコードと反応する。各標的分子はバーコード（例えば、確率的バーコード）にハイブリダイズすることができ、その結果、バーコード付き相補的リボヌクレオチド酸（ｃＤＮＡ）分子（例えば、確率的バーコード付きｃＤＮＡ分子）を生成する。標識後、マイクロウェルプレートのマイクロウェルからのバーコード付きｃＤＮＡ分子は、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングに向けて１本の管にプールすることができる。生のシーケンシングデータを分析して、一意の分子標識を有するバーコードの数を生成することができる。
【００５０】
シグナル細胞標識を識別する方法及びシステムが、本明細書に開示される。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して細胞の試料中の複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）して、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することであって、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）複数のバーコードの細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することと、（ｄ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数のバーコードの細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｅ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、（ｆ）累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、（ｇ）累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することと、（ｈ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識閾値に基づいて、細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００５１】
幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の配列データを取得することであって、複数のバーコード付き標的の配列データは、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用してバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）されて、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成した細胞の試料中の複数の標的からのものであり、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、取得することと、（ｂ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数のバーコードの細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｃ）累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、累積和プロットは、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された各細胞標識のランクに基づき、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することと、（ｄ）細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識閾値に基づいて、細胞標識をシグナル細胞標識（細胞に関連付けられている）又はノイズ細胞標識（細胞に関連付けられていないとしてしきべつすることとを含む。
【００５２】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して細胞の試料中の複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）して、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することであって、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、複数の細胞のうちの１つの細胞から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、バーコーディングして、バーコード付き標的を作成することと、（ｂ）バーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、特徴ベクトルは、細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、（ｄ）特徴ベクトルに基づいて細胞標識のクラスタを特定することと、（ｅ）クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００５３】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別するシステムである。幾つかの実施形態では、システムは、ハードウェアプロセッサと、命令が記憶された非一時的メモリとを備え、命令は、ハードウェアプロセッサによって実行されると、プロセッサに、本明細書に開示される任意の方法を実行させる。本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別するコンピュータ可読媒体である。幾つかの実施形態では、本コンピュータ可読媒体は、本明細書に開示される任意の方法を実行するコードを含む。
【００５４】
定義
別段のことが定義される場合を除き、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら著、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）参照。本開示では、以下の用語は以下のように定義される。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「アダプター」は、関連付けられた核酸の増幅又はシーケンシングを促進する配列を意味することができる。関連付けられた核酸は、標的核酸を含むことができる。関連付けられた核酸は、空間標識、標的標識、試料標識、索引付け標識、バーコード、確率的バーコード、又は分子標識の１つ又は複数を含むことができる。アダプターは線形であることができる。アダプターは、プレアデニル化アダプターであることができる。アダプターは、二本鎖又は一本鎖であることができる。１つ又は複数のアダプターは、核酸の５’又は３’末端に配置することができる。アダプターが５’又は３’末端に既知の配列を含む場合、既知の配列は同じ又は異なる配列であることができる。ポリヌクレオチドの５’又は３’末端に配置されたアダプターは、表面上で固定化された１つ又は複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である。アダプターは、幾つかの実施形態では、ユニバーサル配列を含むことができる。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸分子に共通するヌクレオチド配列の領域であることができる。２つの以上の核酸分子は、異なる配列の領域を有することができる。したがって、例えば、５’アダプターは同一及び／又はユニバーサル核酸配列を含むことができ、３’アダプターは同一及び／又はユニバーサル核酸配列を含むことができる。複数の核酸分子の異なるメンバに存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的なシングルユニバーサルプライマーを使用して複数の異なる配列の複製又は増幅を可能にすることができる。同様に、核酸分子の集まりの異なるメンバに存在し得る少なくとも１つ、２つ（例えば、ペア）、又はそれを超える数のユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的な少なくとも１つ、２つ（例えば、ペア）、又はそれを超える数のシングルユニバーサルプライマーを使用して複数の異なる配列の複製又は増幅を可能にすることができる。したがって、ユニバーサルプライマーは、そのようなユニバーサル配列にハイブリダイズすることができる配列を含む。標的核酸配列担持分子は、ユニバーサルアダプター（例えば、非標的核酸配列）を異なる標的核酸配列の一端部又は両端部に付着させるように修飾し得る。標的核酸に付着した１つ又は複数のユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマーがハイブリダイズする部位を提供することができる。標的核酸に付着した１つ又は複数のユニバーサルプライマーは、互いと同じ又は異なることができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「関連付けられた」又は「と関連付けられた」という用語は、２つ以上の種が、ある時点で同じ場所にあるものとして識別可能なことを意味することができる。関連性は、２つ以上の種が同様の容器内にある又はあったことを意味することができる。関連性はインフォマティクス関連性であることができ、その場合、例えば、２つ以上の種に関するデジタル情報が記憶され、種の１つ又は複数がある時点で同じ場所に配置されたとの判断に使用することができる。関連性は物理的な関連性であることができる。幾つかの実施形態では、２つ以上の関連付けられた種は、互いに又は共通の固体若しくは半固体表面に「テザリングされ」、「付着し」、又は「固定化され」る。関連性は、標識をビーズ等の固体又は半固体支持体に付着させる共有結合又は非共有結合手段と呼び得る。関連性は、標的と標識との間の共有結合であり得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのヌクレオチドを精密にペアリングする能力を指すことができる。例えば、核酸の所与の位置におけるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合可能な場合、それらの２つの核酸は、その位置において互いに相補的であると見なされる。ヌクレオチドの幾つかのみが結合する２つの単鎖核酸分子間の相補性は、「部分的」であり得、又は完全相補性が単鎖分子間に存在する場合、完全であり得る。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列と相補的である場合、第２の配列の「相補」であると言うことができる。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が、第２の配列の逆（すなわち、ヌクレオチドの順序が逆）である配列と相補的である場合、第２の配列の「逆相補」であると言うことができる。本明細書で使用される場合、「相補」、「相補的」、及び「逆相補」という用語は同義で使用することができる。本開示から、分子を別の分子にハイブリダイズすることができる場合、その分子は、ハイブリダイズしている分子の相補であり得ることが理解される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「デジタルカウント」という用語は、試料中の標的分子の数を推定する方法を指すことができる。デジタルカウントは、試料中の標的に関連付けられた一意の標識の数を特定するステップを含むことができる。この確率的方法論は、分子をカウントする問題を、同一分子を見つけて同定することから、１組の予め定義される標識の検出に関する一連のイエス／ノーデジタル質問に変換する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「標識」又は「複数の標識」という用語は、試料内の標的に関連付けられた核酸コードを指すことができる。標識は、例えば、核酸標識であることができる。標識は、全体的又は部分的に増幅可能な標識であることができる。標識は、全体的又は部分的にシーケンシング可能な標識であることができる。標識は、別個として識別可能なネイティブ核酸の部分であることができる。標識は既知の配列であることができる。標識は、核酸配列の接合部、例えば、ネイティブ配列と非ネイティブ配列との接合部を含むことができる。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「インデックス」、「タグ」、又は「標識タグ」という用語と同義で使用することができる。標識は情報を伝達することができる。例えば、様々な実施形態では、標識を使用して、試料の識別情報、試料のソース、細胞の識別情報、及び／又は標的を特定することができる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「非枯渇性リザーバ」という用語は、多くの異なる標識で構成された確率的バーコードのプールを指すことができる。非枯渇性リザーバは、非枯渇性リザーバに標的のプールが関連付けられる場合、各標的が一意の確率的バーコードに関連付けられる可能性が高いような多数の異なる確率的バーコードを含むことができる。標識された各標的分子の一意性は、ランダム選択の統計によって決まることができ、標識の多様性と比較した、集まり中の同一標的分子のコピー数に依存する。その結果生成される、標識された標的分子の集合のサイズは、バーコーディングプロセスの確率性によって決まることができ、そして、検出された確率的バーコードの数の分析により、元の集まり又は試料中に存在する標的分子数を計算することができる。存在する標的分子の数と一意の確率的バーコードの数との比率が低い場合、標識された標的分子は高度に一意である（すなわち、２つ以上の標的分子が所与の標識で標識される確率は非常に低い）。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド配列又はその断片を指す。核酸はヌクレオチドを含むことができる。核酸は、細胞に対して外因性又は内因性であることができる。核酸は、無細胞環境に存在することができる。核酸は遺伝子又はその断片であることができる。核酸はＤＮＡであることができる。核酸はＲＮＡであることができる。核酸は、１つ又は複数の類似体（例えば、改変骨格、糖、又はヌクレオ塩基）を含むことができる。類似体の幾つかの非限定的な例には、５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルフォリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖にリンクされたローダミン又はフルオロセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチンリンクヌクレオチド、蛍光塩基類似体、ＣｐＧ島、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、及びワイオシンがある。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド」、及び「標的核酸」は、同義で使用することができる。
【００６２】
核酸は、核酸に新しい又は強化された特徴（例えば、改善された安定性）を提供する１つ又は複数の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾）を含むことができる。核酸は、核酸親和性タグを含むことができる。ヌクレオチドは塩基−糖の組合せであることができる。ヌクレオチドの塩基部分は、複素環塩基であることができる。そのような複素環塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオチドであることができる。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、又は５’ヒドロキシル部分にリンクすることができる。核酸を形成するに当たり、リン酸基は隣接するヌクレオチドを互いに共有結合して、線状ポリマー化合物を形成することができる。そして、この線状ポリマー化合物の各末端を更に接合して、環形化合物を形成することができるが、線状化合物が一般に適する。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得、したがって、完全又は部分的な２本鎖化合物を生成するように折り畳むことができる。核酸内で、リン酸基は一般に、核酸のヌクレオシド骨格を形成するものとして見なすことができる。リンク又は骨格は３’〜５’ホスホジエステル結合であることができる。
【００６３】
核酸は、修飾骨格及び／又は修飾ヌクレオシド結合を含むことができる。修飾骨格は、リン原子を骨格内に保持するもの及び骨格にリン原子を有さないものを含むことができる。リン原子を内部に含む、適した修飾核酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミダイト及びアミノアルキルホスホラミダイトを含めたホスホラミダイト、チオノホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、２’−５’結合類似体、並びに１つ又は複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’又は２’−２’結合である、反転極性を有する骨格を挙げることができる。
【００６４】
核酸は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド、混合型のヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は１つ若しくは複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間連結により形成されるポリヌクレオチド骨格を含むことができる。これらは、モルフォリノ連結部を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的には形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合型のＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の部分を有する他のものを含むことができる。
【００６５】
核酸は核酸ミメティックを含むことができる。「ミメティック」という用語は、フラノース環のみ又はフラノース環及びヌクレオチド間連結の両方が非フラノース基で置換されたポリヌクレオチドを含むものとすることができ、フラノース環のみの置換は、糖代替物（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）と呼ぶことができる。複素環塩基部分又は修飾複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。１つのそのような核酸はペプチド核酸（ＰＮＡ）であることができる。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換することができる。ヌクレオチドは保持することができ、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える２つ以上の連結されたアミノエチルグリシンユニットを含むことができる。複素環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合することができる。
【００６６】
核酸はモルフォリノ骨格構造を含むことができる。例えば、核酸は、リボース環の代わりにモルフォリノ六員環を含むことができる。これらの実施形態の幾つかでは、ホスホロジアミデート又は他の非ホスホジエステルヌクレオシド連結がホスホジエステル結合を置換することができる。
【００６７】
核酸は、モルフォリノ環に付着した複素環塩基を有する、連結されたモルフォリノユニット（すなわち、モルフォリノ核酸）を含むことができる。連結基は、モルフォリノ核酸においてモルフォリノ単量体ユニットを連結することができる。非イオンモルフォリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用がより少ないことができる。モルフォリノベースのポリヌクレオチドは、核酸の非イオン模倣体であることができる。モルフォリノクラス内の多種多様な化合物は、異なる連結基を使用して接合することができる。ポリヌクレオチドの更なるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ぶことができる。核酸分子に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置換することができる。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護されたホスホラミダイトモノマーを準備し、ホスホラミダイト化学構造を使用するオリゴマー化合物合成に使用することができる。核酸鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を高めることができる。ＣｅＮＡ少アデニルは、ネイティブ錯体と同様の安定性を有する、核酸相補体との錯体を形成することができる。更なる修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結し、それにより、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン連結部を形成し、それにより、二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。連結部は、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であることができ、ここで、ｎは１又は２である。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的核酸との非常に高い二本鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０°Ｃ）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、及び優れた溶解特性を示すことができる。
【００６８】
核酸は、ヌクレオ塩基（多くの場合、単に「塩基」と呼ばれる）修飾又は置換を含むこともできる。本明細書で使用される場合、「非修飾」又は「天然」ヌクレオ塩基は、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ））、並びにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ））を含むことができる。修飾ヌクレオ塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノ−アデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ−ル、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン等の他の合成及び天然ヌクレオ塩基を含むことができる。修飾ヌクレオ塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等のＧクランプ、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）等のＧクランプを含むことができる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、標的を含む組成物を指すことができる。開示される方法、デバイス、及びシステムによる分析に適した試料には、細胞、組織、臓器、又は有機体がある。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「サンプリングデバイス」又は「デバイス」という用語は、試料の一部を採取し得、及び／又はその一部を基板に配置し得るデバイスを指すことができる。試料デバイスは、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）機、セルソーター機、生検ニードル、生検デバイス、組織切片デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、及び／又はミクロトームを指すことができる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、複数の確率的バーコードを付着させることができる離散した固体又は半固体表面を指すことができる。固体支持体は、任意のタイプの固体、多孔性、又は中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダ、又は核酸を固定化（例えば、共有結合又は非共有結合で）し得る、プラスチック、セラミック、金属、若しくはポリマー材料（例えば、ヒドロゲル）で構成される他の同様の構成を包含し得る。固体支持体は、球形（例えば、小球体）を有してもよく、又は立方体、立方骨、ピラミッド形、円柱形、円錐形、楕円形、若しくは円盤形等の非球形若しくは不規則な形状を有してもよい離散粒子を含み得る。アレイにおいて離間された複数の固体支持体は、基板を含まないことがある。固体支持体は、「ビーズ」という用語と同義で使用し得る。
【００７２】
固体支持体は「基板」と呼ぶことができる。基板は一種の固体支持体であることができる。基板は、本開示の方法を実行し得る連続した固体又は半固体表面を指すことができる。基板は、例えば、アレイ、カートリッジ、チップ、デバイス、及びスライドを指すことができる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「空間標識」という用語は、空間における位置に関連付けることができる標識を指すことができる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード」という用語は、標識を含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。確率的バーコードは、確率的バーコーディングに使用することができるポリヌクレオチド配列であることができる。確率的バーコードは、試料内の標的を定量化するのに使用することができる。確率的バーコードは、標識が標的に関連付けられた後に生じ得るエラーの制御に使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅又はシーケンシングのエラーの評価に使用することができる。標的に関連付けられた確率的バーコードは、確率的バーコード−標的又は確率的バーコード−タグ標的と呼ぶことができる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子固有確率的バーコード」という用語は、標識及び遺伝子固有である標的結合領域を含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。確率的バーコードは、確率的バーコーディングに使用することができるポリヌクレオチド配列であることができる。確率的バーコードは、試料内の標的を定量化するのに使用することができる。確率的バーコードは、標識が標的に関連付けられた後に生じ得るエラーの制御に使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅又はシーケンシングのエラーの評価に使用することができる。標的に関連付けられた確率的バーコードは、確率的バーコード−標的又は確率的バーコード−タグ標的と呼ぶことができる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「確率的バーコーディング」という用語は、核酸のランダム標識（例えば、バーコーディング）を指すことができる。確率的バーコーディングは、再帰ポアソン法を利用して、標識を標的に関連付け、標的に関連付けられた標識を定量化することができる。本明細書で使用される場合、「確率的バーコーディング」は、「遺伝子固有確率バーコーディング」と同義で使用することができる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、確率的バーコードを関連付けることができる組成物を指すことができる。開示される方法、デバイス、及びシステムによる分析に適した例示的な標的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡ等がある。標的は一本鎖又は二本鎖であることができる。幾つかの実施形態では、標的はタンパク質であることができる。幾つかの実施形態では、標的は脂質である。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「逆転写酵素」という用語は、逆転写活性を有する（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する）酵素群を指すことができる。一般に、そのような酵素には、限定ではなく、レトロウィルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、最近逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素、及びそれらの変異体、バリアント、又は誘導体がある。非レトロウィルス逆転写酵素には、非ＬＴＲレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写こう素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｉｐｔａｓｅｓ）、及びグループＩＩイントロン逆転写酵素がある。グループＩＩイントロン逆転写酵素の例には、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロン逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＴｅＩ４ｃイントロン逆転写酵素、又はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧｓＩ−ＩＩＣイントロン逆転写酵素がある。他のクラスの逆転写酵素としては、多くのクラスの非レトロウィルス逆転写酵素（すなわち、特にレトロン、グループＩＩイントロン、及び多様性を生じさせるレトロエレメント（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ））を挙げることができる。
【００７９】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別するシステム及び方法である。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数の確率的バーコードを使用して細胞の試料中の複数の標的を確率的バーコーディングして、複数の確率的バーコード付き標的を作成することであって、複数の確率的バーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、確率的バーコーディングして確率的バーコード付き標的を作成することと、（ｂ）複数の確率的バーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）複数の確率的バーコードの細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することと、（ｄ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数の確率的バーコードの細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｅ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、（ｆ）累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、（ｇ）累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することと、（ｈ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｇ）において決定された細胞標識閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【００８０】
バーコード
確率的バーコーディング等のバーコーディングは、例えば、米国特許出願第２０１５０２９９７８４号明細書、国際公開第２０１５０３１６９１号パンフレット、並びにＦｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ｍａｙ  ３１；１０８（２２）：９０２６−３１及びＦａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３４７（６２２２）：１２５８３６７に記載されてきており、これらの公開物の内容は全体的に、参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバーコードは、標的を確率的に標識する（例えば、バーコード付け、タグ付け）するのに使用し得るポリヌクレオチド配列であることができる確率的バーコードであることができる。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数と標識すべき標的のいずれかの発生数との比率が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、又は約これらの値若しくは範囲であることができる場合、確率的バーコードと呼ぶことができる。標的は、例えば、同一又は略同一の配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であることができる。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数と標識すべき標的のいずれかの発生数との比率が、少なくとも又は多くとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、又は１００：１である場合、確率的バーコードと呼ぶことができる。確率的バーコードのバーコード配列は、分子標識と呼ぶことができる。
【００８１】
バーコード、例えば確率的バーコードは、１つ又は複数の標識を含むことができる。例示的な標識は、ユニバーサル標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、試料標識、プレート標識、空間標識、及び／又はプレ空間（ｐｒｅ−ｓｐａｔｉａｌ）標識を含むことができる。図１は、空間標識を有する例示的なバーコード１０４を示す。バーコード１０４は、バーコードを固体支持体１０５に連結し得る５’アミンを含むことができる。バーコードは、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、及び／又は分子標識を含むことができる。バーコードにおける異なる標識（限定ではなく、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、及び分子標識を含む）の順序は様々であることができる。例えば、図１に示されるように、ユニバーサル標識は、５’−モスト（ｍｏｓｔ）標識であり得、分子標識は３’−モスト標識であり得る。空間標識、次元標識、及び細胞標識は任意の順序であり得る。幾つかの実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、及び分子標識は、任意の順序である。バーコードは、標的結合領域を含むことができる。標的結合領域は、試料中の標的（例えば、標的核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）と相互作用することができる。例えば、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールと相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含むことができる。幾つかの場合、バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、及びバーコード配列）は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個、又はそれよりも多いヌクレオチドで離間し得る。
【００８２】
標識、例えば細胞標識は、誤り修正機能を提供するように設計することができる、定義された長さ、例えば、それぞれ７ヌクレオチド（幾つかのハミング誤り修正コードに使用されるビット数と同等）の一意の組の核酸サブ配列を含むことができる。１組の誤り修正サブ配列は、７つのヌクレオチド配列を含み、１組中の配列の任意のペア毎の組合せが、定義された「遺伝距離」（又はミスマッチ塩基の数）を示すように設計することができ、例えば、１組の誤り修正サブ配列は、３つのヌクレオチドの遺伝距離を示すように設計することができる。この場合、標識された標的核酸分子の１組の配列データでの誤り修正配列のレビュー（より十分に後述）により、増幅エラー又はシーケンシングエラーを検出又は修正することができる。幾つかの実施形態では、誤り修正コードの作成に使用される核酸サブ配列の長さは様々であることができ、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、３１個、４０個、５０個、又はこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、他の長さの核酸サブ配列を誤り修正コードの作成に使用することができる。
【００８３】
バーコードは、標的結合領域を含むことができる。標的結合領域は、試料中の標的と相互作用することができる。標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールをそれぞれ含むＲＮＡ、又はそれらの任意の組合せであることができ、又はこれ（ら）を含むことができる。幾つかの実施形態では、複数の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むことができる。
【００８４】
幾つかの実施形態では、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールと相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含むことができる。バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、及びバーコード配列（例えば、分子標識））の１つ又は複数は、バーコードの別の残りの標識の１つ又は２つからスペーサによって分離することができる。スペーサは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれを超える数のヌクレオチドであることができる。幾つかの実施形態では、バーコードの標識はいずれも、スペーサによって分離されない。
【００８５】
ユニバーサル標識
バーコードは、１つ又は複数のユニバーサル標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に付着する１組のバーコード内の全てのバーコードで同じであることができる。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のユニバーサル標識は、複数のビーズに付着した全てのバーコードで同じであることができる。幾つかの実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーにハイブリダイズ可能な核酸配列を含むことができる。シーケンシングプライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードのシーケンシングに使用することができる。シーケンシングプライマー（例えば、ユニバーサルシーケンシングプライマー）は、高スループットシーケンシングプラットフォームに関連付けられたシーケンシングプライマーを含むことができる。幾つかの実施形態では、ユニバーサル標識は、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズ可能な核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマー及びＰＣＲプライマーにハイブリダイズ可能な核酸配列を含むことができる。シーケンシングプライマー又はＰＣＲプライマーにハイブリダイズ可能なユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と呼ぶことができる。ユニバーサル標識は、バーコードの転写の開始に使用することができる配列を含むことができる。ユニバーサル標識は、バーコード又はバーコード内の領域の拡張に使用することができる配列を含むことができる。ユニバーサル標識は、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチドの長さ又は約これ（ら）の長さであることができる。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含むことができる。ユニバーサル標識は、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、２００個、又は３００個のヌクレオチドの長さを含むことができる。幾つかの実施形態では、開裂可能リンカー又は修飾されたヌクレオチドは、バーコードが支持体から開裂できるようにするために、ユニバーサル標識配列の部分であることができる。
【００８６】
次元標識
バーコードは、１つ又は複数の次元標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、次元標識は、標識（例えば、確率的標識）が発生した次元についての情報を提供する核酸配列を含むことができる。例えば、次元標識は、標的が確率的にバーコーディングされた時間についての情報を提供することができる。次元標識に、試料におけるバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）の時間を関連付けることができる。次元標識は、標識の時間に活性化することができる。異なる次元標識を異なる時間に活性化することができる。次元標識は、標的、標的群、及び／又は試料が確率的にバーコーディングされた順序についての情報を提供する。例えば、細胞の集団は、細胞サイクルのＧ０フェーズにおいて確率的にバーコーディングすることができる。細胞は、細胞サイクルのＧ１フェーズにおいて再びバーコード（例えば、確率的バーコード）でパルスすることができる。細胞は、細胞サイクルのＳフェーズで再びバーコードでパルスすることができ、以下同様である。各パルス（例えば、細胞サイクルの各フェーズ）におけるバーコードは、異なる次元標識を含むことができる。このようにして、次元標識は、どの標的が細胞サイクルのどのフェーズで標識されたかについての情報を提供する。次元標識は、多くの異なる生物時間を照合することができる。例示的な生物時間には、限定ではなく、細胞サイクル、転写（例えば、転写開始）、及び転写物分解がある。別の例では、試料（例えば、細胞、細胞の集団）は、薬剤及び／又は治療を用いた処置前及び／又は後に確率的に標識することができる。別個の標的のコピー数の変化は、薬剤及び／又は治療への試料の応答を示すことができる。
【００８７】
次元標識は活性化可能であることができる。活性化可能な次元標識は、特定の時点で活性化することができる。活性化可能な標識は、例えば、恒常的に活性化（例えば、オフにされない）することができる。活性化可能な次元標識は、例えば、可逆的に活性化する（例えば、活性化可能な次元標識は、オンオフ切り替えすることができる）ことができる。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれを超える回数、可逆的に活性化可能であることができる。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれを超える回数、可逆的に活性化可能であることができる。幾つかの実施形態では、次元標識は、蛍光、光、化学イベント（例えば、開裂、別の分子のライゲーション、修飾の追加（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、メチル化、脱アセチル化、脱メチル化）、光化学イベント（例えば、フォトケージ化）、及び非天然ヌクレオチドの導入を用いて活性化することができる。
【００８８】
次元標識は、幾つかの実施形態では、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着した全てのバーコード（例えば、確率的バーコード）で同一であることができるが、異なる固体支持体（例えばビーズ）で異なることもできる。幾つかの実施形態では、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％は、同じ次元標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも６０％は、同じ次元標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも９５％は、同じ次元標識を含むことができる。
【００８９】
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）において表される１０6個以上の多くの一意の次元標識配列があることができる。次元標識は、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。次元標識は、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、２００個、又は３００個のヌクレオチドの長さであることができる。次元標識は、約５個〜約２００個のヌクレオチドを含むことができる。次元標識は、約１０個〜約１５０個のヌクレオチドを含むことができる。次元標識は、約２０個〜約１２５個のヌクレオチドの長さを含むことができる。
【００９０】
空間標識
バーコードは、１つ又は複数の空間標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、空間標識は、バーコードに関連付けられた標的分子の空間配向についての情報を提供する核酸配列を含むことができる。空間標識に、試料中の座標を関連付けることができる。座標は固定座標であることができる。例えば、座標は基板を参照して固定することができる。空間標識は、二次元又は三次元格子を参照することができる。座標は、陸標を参照して固定することができる。陸標は空間で識別可能であることができる。陸標は、撮像することができる構造物であることができる。陸標は、生体構造物、例えば、解剖学的陸標であることができる。陸標は、細胞陸標、例えば細胞小器官であることができる。陸標は、カラーコード、バーコード、磁性、蛍光性、放射性、又は一意のサイズ若しくは形状等の識別可能な識別子を有する構造物等の非天然陸標であることができる。空間標識には、物理的パーテーション（例えば、ウェル、容器、又は液滴）を関連付けることができる。幾つかの実施形態では、複数の空間標識を一緒に使用して、空間中の１つ又は複数の位置を符号化する。
【００９１】
空間標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着した全てのバーコードで同一であることができるが、異なる固体支持体（例えばビーズ）で異なることもできる。幾つかの実施形態では、同じ空間標識を含む同じ固体支持体のバーコードの割合は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、同じ空間標識を含む同じ固体支持体のバーコードの割合は、少なくとも又は多くとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％であることができる。幾つかの実施形態では、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも６０％は、同じ空間標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも９５％は、同じ空間標識を含むことができる。
【００９２】
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）において表される１０6個以上の多くの一意の空間標識配列があることができる。空間標識は、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。空間標識は、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、２００個、又は３００個のヌクレオチドの長さであることができる。空間標識は、約５個〜約２００個のヌクレオチドを含むことができる。空間標識は、約１０個〜約１５０個のヌクレオチドを含むことができる。空間標識は、約２０個〜約１２５個のヌクレオチドの長さを含むことができる。
【００９３】
細胞標識
バーコードは、１つ又は複数の細胞標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞から来たのかを判断するための情報を提供する核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着した全てのバーコードで同一であることができるが、異なる固体支持体（例えばビーズ）で異なることもできる。幾つかの実施形態では、同じ細胞標識を含む同じ固体支持体のバーコードの割合は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、同じ細胞標識を含む同じ固体支持体のバーコードの割合は、少なくとも又は多くとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％であることができる。例えば、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも６０％は、同じ細胞標識を含むことができる。別の例として、同じ固体支持体のバーコードの少なくとも９５％は、同じ細胞標識を含むことができる。
【００９４】
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）において表される１０6個以上の多くの一意の細胞標識配列があることができる。細胞標識は、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。細胞標識は、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、２００個、又は３００個のヌクレオチドの長さであることができる。例えば、細胞標識は、約５個〜約２００個のヌクレオチドを含むことができる。別の例として、細胞標識は、約１０個〜約１５０個のヌクレオチドを含むことができる。細胞標識は、約２０個〜約１２５個のヌクレオチドの長さを含むことができる。
【００９５】
バーコード配列
バーコードは、１つ又は複数のバーコード配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定のタイプについての識別情報を提供する核酸配列を含むことができる。バーコード配列は、バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生のカウンタ（例えば、大まかな近似を提供する）を提供する核酸配列を含むことができる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、多様な組のバーコード配列が所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着する。幾つかの実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個若しくはこれらの値の任意の２つの間の若しくは範囲の一意の分子標識配列があり、又は約これらの値若しくは範囲の一意の分子標識配列であることができる。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個のバーコード配列を含むことができる。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個のバーコード配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、少なくとも又は多くとも１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、又は１０9個の一意のバーコード配列があることができる。一意の分子標識配列は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着することができる。
【００９７】
バーコードは、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。バーコードは、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、２００個、又は３００個のヌクレオチドの長さであることができる。
【００９８】
分子標識
確率的バーコードは、１つ又は複数の分子標識を含むことができる。分子標識はバーコード配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、分子標識は、確率的バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定のタイプについての識別情報を提供する核酸配列を含むことができる。分子標識は、確率的バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生のカウンタを提供する核酸配列を含むことができる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、多様な組の分子標識が所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着する。幾つかの実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個若しくは数若しくは範囲の一意の分子標識配列があり、又は約これらの値若しくは範囲の一意の分子標識配列であることができる。例えば、複数の確率的バーコードは、別個の配列を有する約６５６１個の分子標識を含むことができる。別の例として、複数の確率的バーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個の分子標識を含むことができる。幾つかの実施形態では、少なくとも又は多くとも１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、又は１０9個の一意の分子標識配列があることができる。一意の分子標識配列は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着することができる。
【０１００】
複数の確率的バーコードを使用する確率的バーコーディングの場合、異なる分子標識配列の数と任意の標的の発生数との比率は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１若しくはこれらの値の任意の２つの間の若しくは範囲の比率であることができ、又は約これらの値若しくは範囲の一意の比率であることができる。標的は、同一又は略同一の配列を有するｍＲＮＡ分祀を含むｍＲＮＡ種であることができる。幾つかの実施形態では、異なる分子標識配列の数と任意の標的の発生数との比率は、少なくとも又は多くとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、又は１００：１であることができる。
【０１０１】
分子標識は、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。分子標識は、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、２００個、又は３００個のヌクレオチドの長さであることができる。
【０１０２】
標的結合領域
バーコードは、捕捉プローブ等の１つ又は複数の標的結合領域を含むことができる。幾つかの実施形態では、標的結合領域は、関心のある標的とハイブリダイズすることができる。幾つかの実施形態では、標的結合領域は、標的（例えば、標的核酸、標的分子、例えば、分析する細胞核酸）、例えば、特定の遺伝子配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、標的結合領域は、特定の標的核酸の特定のロケーションに付着（例えば、ハイブリダイズ）することができる核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、標的結合領域は、制限酵素部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイズが可能な核酸配列を含むことができる。次に、バーコードは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートすることができる。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、標的結合領域は、非特異標的核酸配列を含むことができる。非特異標的核酸配列とは、標的核酸の特定の配列から独立して、複数の標的核酸に結合することができる配列を指すことができる。例えば、標的結合領域は、ランダム多量体配列又はｍＲＮＡ分子上のポリ（Ａ）テールにハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）配列を含むことができる。ランダム多量体配列は、例えば、ランダム二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、又は任意の長さのそれよりも高い多量体配列であることができる。幾つかの実施形態では、標的結合領域は、所与のビーズに付着した全てのバーコードで同じである。幾つかの実施形態では、所与のビーズに付着した複数のバーコードの標的結合領域は、２つ以上の異なる標的結合配列を含むことができる。標的結合領域は、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。標的結合領域は、多くとも約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、又は約５０個のヌクレオチド個数分の長さであることができる。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、標的結合領域は、ポリアデニル化された末端を含むｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるオリゴ（ｄＴ）を含むことができる。標的結合領域は、遺伝子特異的であることができる。例えば、標的結合領域は、標的の特定の領域にハイブリダイズするように構成することができる。標的結合領域は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。標的結合領域は、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、又は３０個のヌクレオチドの長さであることができる。標的結合領域は、約５個〜約３０個のヌクレオチドの長さであることができる。バーコードが遺伝子特異的な標的結合領域を含む場合、本明細書では、バーコードは遺伝子特異的バーコードと呼ぶことができる。
【０１０５】
配向特性
バーコードは、バーコードの配向（例えば、位置合わせ）に使用することができる１つ又は複数の配向特性を含むことができる。バーコードは、等電点電気泳動部分を含むことができる。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を含むことができる。これらのバーコードが試料に導入されると、試料は等電点電気泳動を受けて、バーコードを既知のように配向させることができる。このようにして、配向特性を使用して、試料中にバーコードの既知のマップを作成することができる。例示的な配向特性としては、電気泳動移動度（例えば、バーコードのサイズに基づく）、等電点、スピン、伝導性、及び／又は自己集合を挙げることができる。例えば、自己集合の配向特性を有するバーコードは、特定の配向（例えば、核酸ナノ構造）に自己集合することができる。
【０１０６】
親和特性
バーコードは、１つ又は複数の親和特性を含むことができる。例えば、空間標識は親和特性を含むことができる。親和特性は、別のエンティティ（例えば、細胞レセプタ）へのバーコードの結合を促進することができる化学及び／又は生物学的部分を含むことができる。例えば、親和特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分（例えば、レセプタ）に特異的な抗体を含むことができる。幾つかの実施形態では、抗体は、バーコードを特定の細胞タイプ又は分子にガイドすることができる。特定の細胞タイプ又は分子における及び／又はその近傍における標的は、確率的に標識することができる。親和特性は、幾つかの実施形態では、抗体はバーコードを特定のロケーションにガイドすることができるため、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることができる。抗体は、ヒト化又はキメラ化することができる。抗体は、裸の抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は融合抗体（ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であることができる。
【０１０７】
抗体は、全長（すなわち、天然発生若しくは正常免疫グロブリン遺伝子断片組み換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）又は抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫活性（すなわち、特異的結合）部分であることができる。
【０１０８】
抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等の抗体の一部であることができる。幾つかの実施形態では、抗体断片は、全長抗体によって認識される同じ抗原と結合することができる。抗体断片は、重鎖、軽鎖、並びに軽及び重可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）によって接続された組み換え単鎖ポリペプチド分子の可変領域からなる「Ｆｖ」断片等の抗体の可変領域からなる、単離された断片を含むことができる。例示的な抗体としては、限定ではなく、がん細胞の抗体、ウィルスの抗体、細胞表面レセプター（ＣＤ８、ＣＤ３４、ＣＤ４５）に結合する抗体、及び治療用抗体を挙げることができる。
【０１０９】
ユニバーサルアダプタープライマー
バーコードは、１つ又は複数のユニバーサルアダプタープライマーを含むことができる。例えば、遺伝子特異確率的バーコード等の遺伝子特異的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含むことができる。ユニバーサルアダプタープライマーとは、全てのバーコードにわたりユニバーサルなヌクレオチド配列を指すことができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードの構築に使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲のヌクレオチド個数分の長さであることができ、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、又は３０個のヌクレオチドの長さであることができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、５個〜３０個のヌクレオチドの長さであることができる。
【０１１０】
リンカー
バーコードが２つ以上のタイプの標識（例えば、２つ以上の細胞標識又は１つの分子標識等の２つ以上のバーコード配列）を含む場合、標識間にリンカー標識配列が混じり得る。リンカー標識配列は、少なくとも約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、又はそれよりも多くの個数のヌクレオチドの長さであることができる。リンカー標識配列は、多くとも約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、又はそれよりも多くの個数のヌクレオチドの長さであることができる。幾つかの場合、リンカー標識配列は、１２個のヌクレオチドの長さである。リンカー標識配列は、バーコードの合成を促進するのに使用することができる。リンカー標識は、誤り修正（例えば、ハミング）コードを含むことができる。
【０１１１】
固体支持体
本明細書に開示される確率的バーコード等のバーコードには、幾つかの実施形態では、固体支持体を関連付けることができる。固体支持体は、例えば、合成粒子であることができる。幾つかの実施形態では、固体支持体上の複数のバーコード（例えば、第１の複数のバーコード）の確率的バーコード（例えば、第１のバーコード配列）の分子標識等のバーコード配列の幾つか又は全ては、少なくとも１つのヌクレオチド、異なる。同じ固体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであることができる。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチド、異なることができる。例えば、第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識は、同じ配列を有することができ、第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、同じ配列を有することができる。第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識及び第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチド、異なることができる。細胞標識は、例えば、約５個〜約２０個のヌクレオチド長であることができる。バーコード配列は、例えば、約５個〜約２０個のヌクレオチド長であることができる。合成粒子は、例えば、ビーズであることができる。
【０１１２】
ビーズは、例えば、シリカゲルビーズ、孔が制御されるガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、又はそれらの任意の組合せであることができる。ビーズは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性材料、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、又はそれらの任意の組合せ等の材料を含むことができる。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、ビーズは、ポリマービーズ、例えば、バーコード又は確率的バーコードで官能化された変形可能なビーズ又はゲルビーズ（１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）からのゲルビーズ等であることができる。幾つかの実施態様では、ゲルビーズはポリマー系ゲルを含むことができる。ゲルビーズは、例えば、１つ又は複数のポリマー前駆体を液滴中に封入することにより生成することができる。ポリマー前駆体を促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に露出させると、ゲルビーズを生成し得る。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、粒子は分解可能であることができる。例えば、ポリマービーズは、例えば、所望の条件下で溶解、溶融、又は分解することができる。所望の条件は、環境条件を含むことができる。所望の条件は、ポリマービーズを制御された様式で溶解、溶融、又は分解させ得る。ゲルビーズは、化学的刺激、物理的刺激、生物学的刺激、熱的刺激、磁気的刺激、電気的刺激、光刺激、又はそれらの任意の組合せに起因して、溶解、溶融、又は分解し得る。
【０１１５】
例えばオリゴヌクレオチドバーコード等の分析物及び／又は試薬は、ゲルビーズの内面（例えば、オリゴヌクレオチドバーコード及び／又はオリゴヌクレオチドバーコードの生成に使用される材料の拡散を介したアクセス可能な内部）及び／又はゲルビーズの外面又は本明細書に記載される任意の他のマイクロカプセルに結合／固定化し得る。結合／固定化は、任意の形態の化学結合（例えば、共有結合、イオン結合）又は物理現象（例えば、ファンデルワールス力、双極子−双極子相互作用等）を介し得る。幾つかの実施形態では、ゲルビーズ又は本明細書に記載される任意の他のマイクロカプセルへの試薬の結合／固定化は、例えば、不安定部分等を介して（例えば、本明細書に記載される化学的架橋剤を含めた化学的架橋剤を介して）可逆的であり得る。刺激を適用すると、不安定部分は開裂し得、固定化された試薬を自由にする。幾つかの実施形態では、不安定部分はジスルフィド結合である。例えば、オリゴヌクレオチドバーコードがジスルフィド結合を介してゲルビーズに固定化される場合、還元剤へのジスルフィド結合の露出により、ジスルフィド結合を開裂し、オリゴヌクレオチドバーコードをビーズから解放することができる。不安定部分は、ゲルビーズ又はマイクロカプセルの部分として、試薬又は分析物をゲルビーズ又はマイクロカプセルに連結する化学的リンカーの部分として、及び／又は試薬又は分析物の部分として包含し得る。幾つかの実施形態では、複数のバーコードの少なくとも１つのバーコードは、粒子に固定化、粒子上に部分的に固定化、粒子内に封入、粒子内に部分的に封入、又はそれらの任意の組合せであることができる。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、ゲルビーズは、限定ではなく、ポリマー、熱過敏性ポリマー、感光性ポリマー、磁性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、塩感応性ポリマー、化学感応性ポリマー、高分子電解質、多糖類、ペプチド、タンパク質、及び／又はプラスチックを含む広範囲の異なるポリマーを含むことができる。ポリマーは、限定ではなく、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｍ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（ジアリルジメチル・アンモニウム・クロリド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）、ポリ（ビニルピリジン）（ＰＶＰ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（メチルメタクリル酸）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ（テトラヒドロフラン）（ＰＴＨＦ）、ポリ（フタルアデヒド（ｐｈｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ）（ＰＴＨＦ）、ポリ（ヘキシルビオロゲン）（ＰＨＶ）、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＡＲＧ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）等の材料を含み得る。
【０１１７】
多くの化学的刺激を使用して、ビーズの崩壊、溶解、又は分解をトリガーすることができる。これらの化学変化の例としては、限定ではなく、ビーズ壁へのｐＨ媒介変更、架橋結合の化学的開裂を介したビーズ壁の崩壊、ビーズ壁の脱重合のトリガー、及びビーズ壁スイッチング反応を挙げ得る。ビーズの崩壊のトリガーにバルク変更を使用することもできる。
【０１１８】
様々な刺激を通してのマイクロカプセルへのバルク又は物理的な変更は、試薬をリリースするようにカプセルを設計することにおいて多くの利点も提供する。バルク又は物理的な変更は、巨視的なスケールで行われ、ビーズの破裂は、刺激によって誘導される機械−物理力の結果である。これらのプロセスは、限定ではなく、圧力誘導破裂、ビーズ壁溶融、又はビーズ壁の多孔性の変化を含み得る。
【０１１９】
ビーズの崩壊、溶解、又は分解のトリガーに生物学的刺激を使用することもできる。一般に、生物学的刺激は化学的トリガーに類似するが、多くの例は、生体分子又は酵素、ペプチド、糖類、脂肪酸、核酸等の生体系で一般に見られる分子を使用する。例えば、ビーズは、特定のプロテアーゼによる開裂を受けやすいペプチド架橋を有するポリマーを含み得る。より具体的には、一例は、ＧＦＬＧＫペプチド架橋を含むマイクロカプセルを含み得る。プロテアーゼＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ等の生物学的トリガーを添加すると、シェル壁のペプチド架橋は開裂し、ビーズの内容物がリリースされる。他の場合、プロテアーゼは熱活性化し得る。別の例では、ビーズは、セルロースを含むシェル壁を備える。加水分解酵素であるキトサンの添加は、セルロース結合の開裂、シェル壁の脱重合、及びその内容物のリリースの生物学的トリガーとして機能する。
【０１２０】
熱刺激の印加により、ビーズの内容物のリリースをトリガーするように誘導することもできる。温度変化は、ビーズに様々な変化を生じさせることができる。熱変化は、ビーズ壁が崩壊するようにビーズを溶融させ得る。他の場合、熱は、ビーズが崩壊又は爆発するようにビーズの内部構成要素の内圧を増大させ得る。更に他の場合、熱は、ビーズを収縮脱水状態に変換し得る。熱はまた、ビーズの壁内の熱過敏性ポリマーに対して作用して、ビーズを崩壊させることもできる。
【０１２１】
マイクロカプセルのビーズ壁に磁性ナノ粒子を包含することにより、ビーズの崩壊をトリガーし、アレイ内でビーズをガイドすることができる。本開示のデバイスは、いずれの目的での磁性ビーズも含み得る。一例では、ビーズを包含した高分子電解質へのＦｅ3Ｏ4ナノ粒子の組み込みは、発振磁場刺激の存在下で崩壊をトリガーする。
【０１２２】
ビーズは、電気刺激の結果として崩壊、溶解、又は分解することもできる。前のセクションに記載された磁性粒子と同様に、電気の影響を受けやすいビーズは、ビーズの崩壊のトリガー及び電場での整列、導電性、又は酸化還元反応等の他の機能の両方を可能にすることができる。一例では、電気の影響を受けやすい材料を含むビーズは、内部試薬のリリースを制御することができるように電場において整列する。他の例では、電場は、多孔性を増大させ得るビーズ壁自体内に酸化還元反応を誘導し得る。
【０１２３】
光刺激もビーズの崩壊に使用することができる。多くの光トリガーが可能であり、特定の範囲の波長の光子を吸収可能なナノ粒子及び発色団等の様々な分子を使用するシステムを含み得る。例えば、金属酸化物被膜は、カプセルトリガーとして使用することができる。ＳｉＯ2で被膜された高分子電解質カプセルのＵＶ照射は、ビーズ壁を崩壊させ得る。更に別の例では、アゾベンゼン基等の光スイッチング可能材料をビーズ壁に組み込み得る。ＵＶ又は可視光を印加すると、これらの等の化学物質は、光子の吸収により、可逆的なシス体からトランス体への異性化を受ける。この態様では、光子スイッチの組み込みにより、光トリガーが印加されると崩壊し得るか、又はより多孔性になり得るビーズ壁が生成される。
【０１２４】
例えば、図２に示されるバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）の非限定的な例では、ブロック２０８において、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに単一の細胞等の細胞を導入した後、ブロック２１２において、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルにビーズを導入することができる。各マイクロウェルは１つのビーズを含むことができる。ビーズは、複数のバーコードを含むことができる。バーコードは、ビーズに付着した５’アミン領域を含むことができる。ビーコードは、ユニバーサル標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的結合領域、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１２５】
本明細書に開示されるバーコードには、固体支持体（例えば、ビーズ）を関連付ける（例えば、付着させる）ことができる。固体支持体に関連付けられたバーコードはそれぞれ、一意の配列を有する少なくとも１００個又は１０００個のバーコード配列を含む群から選択されたバーコードを含むことができる。幾つかの実施形態では、固体支持体に関連付けられた異なるバーコードは、異なる配列のバーコード配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、固体支持体に関連付けられたバーコードのうちのある割合のバーコードは、同じ細胞標識を含む。例えば、割合は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。別の例として、割合は、少なくとも又は多くとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％であることができる。幾つかの実施形態では、固体支持体に関連付けられたバーコードは、同じ細胞標識を有することができる。異なる固体支持体に関連付けられたバーコードは、一意の配列を有する少なくとも１００個又は１０００個の細胞標識を含む群から選択される異なる細胞標識を有することができる。
【０１２６】
本明細書に開示されるバーコードには、固体支持体（例えば、ビーズ）を関連付ける（例えば、付着させる）ことができる。幾つかの実施形態では、試料中の複数の標的を確率的にバーコーディングすることは、複数のバーコードが関連付けられた複数の合成粒子を含む固体支持体を用いて実行することができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、複数のバーコードが関連付けられた複数の合成粒子を含むことができる。異なる固体支持体上の複数のバーコードの空間標識は、少なくとも１つのヌクレオチド、異なることができる。固体支持体は、例えば、二次元又は三次元で複数のバーコードを含むことができる。合成粒子はビーズであることができる。ビーズは、シリカゲルビーズ、孔が制御されるガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、又はそれらの任意の組合せであることができる。固体支持体は、ポリマー、マトリックス、ヒドロゲル、ニードルアレイデバイス、抗体、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は自由に浮動することができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、半固体又は固体アレイに組み込むことができる。バーコードに固体支持体を関連付けなくてもよいことがある。バーコードは個々のヌクレオチドであることができる。バーコードには基板を関連付けることができる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「テザリングされる」、「付着する」、又は「固定化される」という用語は、同義で使用され、バーコードを固体支持体に付着させる共有結合又は非共有結合手段を指すことができる。任意の様々な異なる固体支持体が、予め合成されたバーコードを付着させる又はバーコードのｉｎ  ｓｉｔｕ固体フェーズ合成のための固体支持体として使用することができる。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、固体支持体はビーズである。ビーズは、１つ又は複数のタイプの固体、多孔性、又は中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダ、又は核酸を固定化（例えば、共有結合又は非共有結合で）することができる他の同様の構成であることができる。ビーズは、例えば、プラスチック、セラミック、金属、ポリマー材料、又はそれらの任意の組合せで構成することができる。ビーズは、球体（例えば、小球体）である離散粒子であることができ、若しくは含むことができ、又は立方体、立方骨、ピラミッド形、円柱形、円錐形、楕円形、若しくは円盤形等の非球形若しくは不規則な形状を有することができる。幾つかの実施形態では、ビーズは非球形であることができる。
【０１２９】
ビーズは、限定ではなく、常磁性体（例えば、マグネシウム、モリブデン、リチウム、及びタンタル）、超常磁性体（例えば、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4；磁鉄鉱）ナノ粒子）、強磁性体（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、それらの何らかの合金、及び何らかの希土類金属化合物）、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、シリカ、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、アガロース、ヒドロゲル、ポリマー、セルロース、ナイロン、又はそれらの任意の組合せを含め、様々な材料を含むことができる。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、ビーズ（例えば、標識が付着するビーズ）はヒドロゲルビーズである。幾つかの実施形態では、ビーズはヒドロゲルを含む。
【０１３１】
本明細書に開示される幾つかの実施形態は、１つ又は複数の粒子（例えば、ビーズ）を含む。各粒子は、複数のオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）を含むことができる。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、バーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、及び標的結合領域（例えば、オリゴ（ｄＴ）配列、遺伝子特異的配列、ランダム多量体、又はそれらの組合せ）を含むことができる。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの細胞標識配列は、同じであることができる。異なる粒子上のオリゴヌクレオチドの細胞標識配列は、異なる粒子上のオリゴヌクレオチドを識別することができるように異なることができる。異なる細胞標識配列の数は、異なる実施態様では異なることができる。幾つかの実施形態では、細胞標識配列の数は、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、１０9の個数、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、又は約これらの値若しくは範囲、又は１０9を超える個数であることができる。幾つかの実施形態では、細胞標識配列の数は、少なくとも又は多くとも１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、又は１０9の個数であることができる。幾つかの実施形態では、複数の粒子のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、又はそれを超える個数は、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数の粒子は、多くとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれを超える割合であることができる。幾つかの実施形態では、複数の粒子のいずれも同じ細胞標識配列を有さない。
【０１３２】
各粒子上の複数のオリゴヌクレオチドは、異なるバーコード配列（例えば、分子標識）を含むことができる。幾つかの実施形態では、バーコード配列の数は、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、１０9の個数、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、バーコード配列の数は、少なくとも又は多くとも１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、又は１０9の個数であることができる。例えば、複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１００個は、異なるバーコード配列を含む。別の例として、１つの粒子において、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、１５０００個、２００００個、５００００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲又は５００００個を超える個数は、異なるバーコード配列を含む。幾つかの実施形態は、バーコードを含む複数の粒子を提供する。幾つかの実施形態では、標識する標的の発生（又はコピー又は数）と異なるバーコード配列との比率は、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、又はそれを超える比率であることができる。幾つかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、試料標識、ユニバーサル標識、又は両方を更に含む。粒子は、例えば、ナノ粒子又はマイクロ粒子であることができる。
【０１３３】
ビーズのサイズは様々であることができる。例えば、ビーズの直径は０．１μｍから５０μｍの範囲であることができる。幾つかの実施形態では、ビーズの直径は０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、又は約これらの値若しくは範囲であることができる。
【０１３４】
ビーズの直径は、基板のウェルの直径に関連することができる。幾つかの実施形態では、ビーズの直径は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、約これらの値若しくは範囲で、ウェルの直径よりも長い又は短い値であることができる。ビーズの直径は、細胞（例えば、基板のウェルによって取り込まれる１つの細胞）の直径に関連することができる。幾つかの実施形態では、ビーズの直径は、少なくとも又は多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ウェルの直径よりも長い又は短い値であることができる。ビーズの直径は、細胞（例えば、基板のウェルによって取り込まれる１つの細胞）の直径に関連することができる。幾つかの実施形態では、ビーズの直径は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、約これらの値若しくは範囲で、ウェルの直径よりも長い又は短い値であることができる。幾つかの実施形態では、ビーズの直径は、少なくとも又は多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は３００％、ウェルの直径よりも長い又は短い値であることができる。
【０１３５】
ビーズは基板に付着させ、且つ／又は基板に埋め込むことができる。ビーズは、ゲル、ヒドロゲル、ポリマー、及び／又はマトリックスに付着させ、且つ／又は埋め込むことができる。基板（例えば、ゲル、マトリックス、スキャフォールド、又はポリマー）内のビーズの空間位置は、ロケーションアドレスとして機能することができるビーズ上のバーコードに存在する空間標識を使用して識別することができる。
【０１３６】
ビーズの例としては、限定ではなく、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）ミクロビーズ、抗体共役ビーズ、（例えば、抗免疫グロブリンミクロビーズ）、タンパク質Ａ共役ビーズ、タンパク質Ｇ共役ビーズ、タンパク質Ａ／Ｇ共役ビーズ、タンパク質Ｌ共役ビーズ、オリゴ（ｄＴ）共役ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンミクロビーズ、抗蛍光色素ミクロビーズ、及びＢｃＭａｇ（商標）カルボキシル末端磁性ビーズを挙げることができる。
【０１３７】
ビーズには、量子ドット又は蛍光染料を関連付けて（例えば、含浸させて）、１つの蛍光光学チャネル又は複数の光学チャネルで蛍光させることができる。ビーズには、酸化鉄又は酸化クロムを関連付けて、常磁性又は強磁性にすることができる。ビーズは識別可能であることができる。例えば、ビーズはカメラを使用して撮像することができる。ビーズは、ビーズに関連付けられた検出可能なコードを有することができる。例えば、ビーズはバーコードを含むことができる。ビーズは、例えば、有機溶液又は無機溶液中での膨張に起因してサイズを変更することができる。ビーズは疎水性であることができる。ビーズは親水性であることができる。ビーズは生体適合性を有することができる。
【０１３８】
固体支持体（例えば、ビーズ）は、視覚化することができる。固体支持体は、視覚化タグ（例えば、蛍光染料）を含むことができる。固体支持体（例えば、ビーズ）には識別子（例えば、数字）をエッチングすることができる。識別子は、ビーズの撮像を通して視覚化することができる。
【０１３９】
固体支持体は、不溶解性、半溶解性、又は不溶解性物質を含むことができる。固体支持体は、リンカー、スキャフォールド、構築ブロック、又は付着した他の反応性部分を含む場合、「機能化」と呼ぶことができ、一方、付着したそのような反応性部分がない場合、「非機能化」と呼ぶことができる。固体支持体は、マイクロタイタウェル形式；カラム中等のフロースルー形式；又はディスプレイスティック等の溶液中で自由に利用することができる。
【０１４０】
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、被膜面、平面、ガラス、スライド、チップ、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。固体支持体は、樹脂、ゲル、小球体、又は他の幾何学的構成の形態をとることができる。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、毛管、ガラス繊維フィルタ、ガラス面、金属面（鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素、及び銅）等の平面支持体、ガラス支持体、プラスチック支持体、ケイ素支持体、チップ、フィルタ、膜、マイクロウェルプレート、スライド、マルチウェルプレート又は膜（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、フッ化ポリビニリデンで形成される）を含むプラスチック材料、及び／又はウェーハ、コーム、ピン、又はニードル（例えば、組合せ合成又は分析に適するピンのアレイ）、又はピンのアレイ若しくはウェーハ（例えば、シリコンウェーハ）、フィルタ底部がある又はないピンを有するウェーハ等の平面のナノリットルウェル内のビーズを含むことができる。
【０１４１】
固体支持体は、ポリマーマトリックス（例えば、ゲル、ヒドロゲル）を含むことができる。ポリマーマトリックスは、細胞内空間（例えば、細胞小器官の周囲）に浸透可能であり得る。ポリマーマトリックスは、循環器系全体を通してポンピング可能であり得る。
【０１４２】
固体支持体は、生体分子であることができる。例えば、固体支持体は、核酸、タンパク質、抗体、ヒストン、細胞コンパートメント、脂質、炭水化物等であることができる。生体分子である固体支持体は、増幅、翻訳、転写、分解、及び／又は修飾（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、メチル化）することができる。生体分子である固体支持体は、生体分子に付着した空間標識に加えて、空間情報及び時間情報を提供することができる。例えば、生体分子は、修飾されない場合、第１の確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を含むことができるが、修飾された場合、第２の確認に変化することができる。異なる構造は、本開示のバーコード（例えば、確率的バーコード）を標的に露出させることができる。例えば、生体分子は、生体分子の折り畳みに起因してアクセス不可能であるバーコードを含むことができる。生体分子が修飾される（例えば、アセチル化）と、生体分子は、バーコードを露出するように構造を変更することができる。修飾のタイミングは、本開示のバーコーディング方法に別の時間次元を提供することができる。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、本開示のバーコード試薬を含む生体分子は、細胞の細胞質内に配置することができる。活性化されると、生体分子は、細胞核に移ることができ、そこでバーコーディングを行うことができる。このようにして、生体分子の修飾は、バーコードによって識別される標的の追加の空間−時間情報を符号化することができる。
【０１４４】
基板及びマイクロウェルアレイ
本明細書で使用される場合、基板は一種の固体支持体を指すことができる。基板は、本開示のバーコード及び確率的バーコードを含むことができ固体支持体を指すことができる。基板は、例えば、複数のマイクロウェルを含むことができる。例えば、基板は、２つ以上のマイクロウェルを含むウェルアレイであることができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、画定された容量の小型反応チャンバを含むことができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは１つ又は複数の細胞を取り込むことができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの細胞を取り込むことができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１つ以上の固体支持体を取り込むことができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの固体支持体を取り込むことができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１つの細胞及び１つの固体支持体（例えば、ビーズ）を取り込む。マイクロウェルは、本開示の組合せバーコード試薬を含むことができる。
【０１４５】
バーコーディングの方法
本開示は、物理的試料（例えば、組織、臓器、腫瘍、細胞）における別個のロケーションにおける別個の標的の数を推定する方法を提供する。方法は、バーコード（例えば、確率的バーコード）を試料の近傍に配置すること、試料を溶解させること、別個の標的にバーコードを関連付けること、標的を増幅すること、及び／又は標的をデジタル的にカウントすることを含むことができる。方法は、バーコード上の空間標識から得られた情報を分析し、且つ／又は視覚化することを更に含むことができる。幾つかの実施形態では、方法は、試料中の複数の標的を視覚化することを含む。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップ又は三次元マップを生成することを含むことができる。二次元マップ及び三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的にバーコーディング）する前又は後、生成することができる。試料中の複数の標的を視覚化することは、複数の標的を試料のマップにマッピングすることを含むことができる。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップ又は三次元マップを生成することを含むことができる。二次元マップ及び三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする前又は後、生成することができる。幾つかの実施形態では、二次元マップ及び三次元マップは、試料の溶解前又は後、生成することができる。二次元マップ又は三次元マップの生成前又は後に試料を溶解させることは、試料を加熱すること、洗剤で試料に触れること、試料のｐＨを変更すること、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、複数の標的をバーコーディングすることは、複数のバーコードを複数の標的にハイブリダイズして、バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することを含む。複数の標的をバーコーディングすることは、バーコード付き標的の索引付きライブラリを生成することを含むことができる。バーコード付き標的の索引付きライブラリの生成は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を含む固体支持体を用いて実行することができる。
【０１４７】
試料とバーコードとの接触
本開示は、試料（例えば、細胞）を本開示の基板に接触させる方法を提供する。例えば、細胞、臓器、又は組織の薄切片を含む試料をバーコード（例えば、確率的バーコード）に接触させることができる。細胞には、例えば、細胞が沈殿し、単層を作る重力フローによって接触することができる。試料は、組織の薄切片であることができる。薄切片は、基板に配置することができる。試料は一次元であることができる（例えば、平面を形成する）。試料（例えば、細胞）は、例えば、基板上で細胞を成長させる／培養することによって基板にわたり広げることができる。
【０１４８】
バーコードが標的の近傍にあるとき、標的はバーコードにハイブリダイズすることができる。バーコードには、別個の各標的に本開示の別個のバーコードを関連付けることができるような非枯渇可能な比率で接触することができる。標的とバーコードとの効率的な関連付けを保証するために、標的はバーコードに架橋することができる。
【０１４９】
細胞溶解
細胞及びバーコードの分配に続き、細胞を溶解して、標的分子を遊離させることができる。細胞溶解は、任意の多種多様な手段により、例えば、化学的又は生物学的手段により、浸透圧ショックにより、又は熱溶解、機械的溶解、若しくは光学溶解により達成することができる。細胞は、洗剤（例えば、ＳＤＳ、リチウムドデシル硫酸、トリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、若しくはＮＰ−４０）、有機溶媒（例えば、メタノール若しくはアセトン）、消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ、ペプシン、若しくはトリプシン）、又はそれらの任意の組合せを含む細胞溶解バッファーの添加によって溶解することができる。標的とバーコードとの関連付けを増すために、標的分子の拡散速度は、例えば、溶解物の温度を下げ、且つ／又は溶解物の粘度を上げることによって変更することができる。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、試料は濾紙を使用して溶解することができる。濾紙は、濾紙の上部を溶解バッファーに浸すことができる。濾紙は、試料の溶解及び基板への試料標的のハイブリダイズを促進することができる圧力で試料に適用することができる。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、溶解は、機械的溶解、熱溶解、光学溶解、及び／又は化学溶解によって実行することができる。化学溶解は、プロテイナーゼＫ、ペプシン、及びトリプシン等の消化酵素の使用を含むことができる。溶解は、溶解バッファーを基板に添加することによって実行することができる。溶解バッファーはトリス塩酸を含むことができる。溶解バッファーは、少なくとも約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ，０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、又はこれを超えるトリス塩酸を含むことができる。溶解バッファーは、多くとも約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、又はこれを超えるトリス塩酸を含むことができる。溶解バッファーは、約０．１Ｍのトリス塩酸を含むことができる。溶解バッファーのｐＨは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超える値であることができる。溶解バッファーのｐＨは、多くとも約約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超える値であることができる。幾つかの実施形態では、溶解バッファーのｐＨは約７．５である。溶解バッファーは塩（例えば、ＬｉＣｌ）を含むことができる。溶解バッファー中の塩の濃度は、少なくとも約０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、又はそれを超える濃度であることができる。溶解バッファー中の塩の濃度は、多くとも約０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、又はそれを超える濃度であることができる。幾つかの実施形態では、溶解バッファー中の塩の濃度は、約０．５Ｍである。溶解バッファーは、洗剤（例えば、ＳＤＳ、リチウムドデシル硫酸、トリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＮＰ−４０）を含むことができる。溶解バッファー中の洗剤の濃度は、少なくとも約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、又はそれを超える濃度であることができる。溶解バッファー中の洗剤の濃度は、多くとも約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、又はそれを超える濃度であることができる。幾つかの実施形態では、溶解バッファー中の洗剤の濃度は、約１％のリチウムドデシル硫酸であることができる。溶解の方法に使用される時間は、使用される洗剤の量に依存することができる。幾つかの実施形態では、使用される洗剤が多いほど、溶解に必要な時間は短い。溶解バッファーは、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を含むことができる。溶解バッファー中のキレート剤の濃度は、少なくとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、又はそれを超える濃度であることができる。溶解バッファー中のキレート剤の濃度は、多くとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、又はそれを超える濃度であることができる。幾つかの実施形態では、溶解バッファー中のキレート剤の濃度は、約１０ｍＭである。溶解バッファーは、還元剤（例えば、βメルカプトエタノール、ＤＴＴ）を含むことができる。溶解バッファー中の還元剤の濃度は、少なくとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ���２０ｍＭ、又はそれを超える濃度であることができる。溶解バッファー中の還元剤の濃度は、多くとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、又はそれを超える濃度であることができる。幾つかの実施形態では、溶解バッファー中の還元剤の濃度は、約５ｍＭである。幾つかの実施形態では、溶解バッファーは、トリス塩酸約０．１Ｍ、約ｐＨ７．５、ＬｉＣｌ約０．５Ｍ、リチウムドデシル硫酸約１％、ＥＤＴＡ約１０ｍＭ及びＭＤＴＴ約５ｍを含むことができる。
【０１５２】
溶解は、約４°Ｃ、１０°Ｃ、１５°Ｃ、２０°Ｃ、２５°Ｃ、３０°Ｃの温度で実行することができる。溶解は、約１分、５分、１０分、１５分、２０分、又はそれを超える時間にわたり実行することができる。溶解した細胞は、少なくとも約１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、又はそれを超える標的核酸分子を含むことができる。溶解した細胞は、多くとも約１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、又はそれを超える標的核酸分子を含むことができる。
【０１５３】
標的核酸分子へのバーコードの付着
細胞の溶解及びそこからの核酸分子の遊離に続き、核酸分子に、共存下の固体支持体のバーコードをランダムに関連付けることができる。関連付けは、バーコードの標的認識領を標的核酸分子の相補部分にハイブリダイズする（例えば、バーコードのオリゴ（ｄＴ）は標的のポリ（Ａ）テールと相互作用することができる）ことを含むことができる。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件（例えば、バッファーｐＨ、イオン強度、温度等）は、特定の安定したハイブリッドの形成を促進するように選ぶことができる。幾つかの実施形態では、溶解した細胞から遊離した核酸分子には、基板上の複数のプローブを関連付ける（例えば、基板のプローブとハイブリダイズする）ことができる。プローブがオリゴ（ｄＴ）を含む場合、ｍＲＮＡ分子をプローブにハイブリダイズさせ、逆転写することができる。オリゴヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）部分は、ｃＤＮＡ分子の第１鎖合成のプライマーとして機能することができる。例えば、図２に示されるバーコーディングの非限定的な例では、ブロック２１６において、ｍＲＮＡ分子をビーズ上のバーコードにハイブリダイズすることができる。例えば、単鎖ヌクレオチド断片をバーコードの標的結合領域にハイブリダイズすることができる。
【０１５４】
付着は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の一部とのライゲーションを更に含むことができる。例えば、標的結合領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）への特異的なハイブリダイズを可能にすることができる核酸配列を含むことができる。アッセイ手順は、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で標的核酸を処理して、制限部位オーバーハングを作成することを更に含むことができる。次に、制限部位オーバーハングと相補的な配列を含む任意の核酸分子にバーコードをライゲートすることができる。リガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）を使用して、２つの断片を接合することができる。
【０１５５】
例えば、図２に示されるバーコーディングの非限定的な例では、ブロック２２０において、複数の細胞（又は複数の試料）（例えば、標的バーコード分子）からの標識された標的は続けて、例えば、管にプールすることができる。標識された標的は、例えば、標的バーコード分子が付着したバーコード及び／又はビーズを回収することによってプールすることができる。
【０１５６】
付着した標的バーコード分子の固体支持体ベースの集まりの回収は、磁性ビーズ及び外部印加磁場の使用によって実施することができる。標的バーコード分子がプールされると、全ての更なる処理は１つの反応容器内で進めることができる。更なる処理は、例えば、逆転写反応、増幅反応、開裂反応、分離反応、及び／又は核酸伸長反応を含むことができる。更なる処理反応は、マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞からの標識された標的核酸分子を最初にプールせずに、実行することができる。
【０１５７】
逆転写
本開示は、逆転写を使用して標的バーコード共役を作成する方法を提供する（例えば、図２のブロック２２４において）。標的バーコード共役は、バーコードと、標的核酸の全て又は一部の相補配列（すなわち、確率的バーコード付きｃＤＮＡ分子等のバーコード付きｃＤＮＡ分子）とを含むことができる。関連付けられたＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーの添加により行うことができる。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダム六塩基プライマー、又は標的特異オリゴヌクレオチドプライマーであることができる。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、ヌクレオチド１２〜１８個分又は約１２〜１８個分の長さであることができ、哺乳類ｍＲＮＡの３’末端における内因性ポリ（Ａ）テールに結合することができる。ランダム六塩基プライマーは、多種多様な相補部位においてｍＲＮＡに結合することができる。標的特異オリゴヌクレオチドプライマーは通常、関心のあるｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、標識されたＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加によって行うことができる。幾つかの実施形態では、逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダム六塩基プライマー、又は標的特異オリゴヌクレオチドプライマーである。一般に、オリゴ（ｄＴ）プライマーはヌクレオチド１２個〜１８個の長さであり、哺乳類ｍＲＮＡの３’末端における内因性ポリ（Ａ）テールに結合する。ランダム六塩基プライマーは、多種多様な相補部位においてｍＲＮＡに結合することができる。標的特異オリゴヌクレオチドプライマーは通常、関心のあるｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
【０１５９】
逆転写を繰り返し行って、複数の標識されたｃＤＮＡ分子を生成することができる。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、又は２０回、逆転写反応を行うことを含むことができる。方法は、少なくとも約２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回、６５回、７０回、７５回、８０回、８５回、９０回、９５回、又は１００回、逆転写反応を行うことを含むことができる。
【０１６０】
増幅
１つ又は複数の核酸増幅反応（例えば、図２のブロック２２８における）を実行して、標識された標的核酸分子の複数のコピーを作成することができる。増幅は多重化して実行することができ、複数の標的核酸配列は同時に増幅される。増幅反応を使用して、シーケンシングアダプターを核酸分子に追加することができる。増幅反応は、試料標識が存在する場合、試料標識の少なくとも一部を増幅することを含むことができる。増幅反応は、細胞標識及び／又はバーコード配列（例えば、分子標識）の少なくとも一部を増幅することを含むことができる。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード（例えば、分子標識）、標的核酸、又はそれらの組合せの少なくとも一部を増幅することを含むことができる。増幅反応は、複数の核酸の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％、又はそれらの値の任意の２つの間の範囲若しくは数字、増幅することを含むことができる。方法は、１つ又は複数のｃＤＮＡ合成反応を行い、試料標識、細胞標識、空間標識、及び／又はバーコード配列（例えば、分子標識）を含む標的バーコード分子の１つ又は複数のｃＤＮＡコピーを生成することを更に含むことができる。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実行することができる。本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長によって特定のＤＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する反応を指すことができる。本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、限定ではなく、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネストＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、及びアセンブリＰＣＲを含め、反応の誘導体を包含することができる。
【０１６２】
標識された核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含むこともできる。非ＰＣＲベースの方法の例には、限定ではなく、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅又はサークル−サークル増幅がある。他の非ＰＣＲベースの増幅方法には、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的を増幅する多サイクルのＤＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼ誘導ＲＮＡ転写増幅又はＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成及び転写、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ（Ｑβ）法、回文プローブ（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｐｒｏｂｅ）の使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用したオリゴヌクレオチド誘導増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズし、その結果生成された二本鎖が、伸長反応及び増幅の前に開裂する増幅法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用した鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、並びに分岐伸長増幅（ＲＡＭ）がある。幾つかの実施形態では、増幅は環状転写物を生成しない。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、標識された核酸（例えば、標識されたＲＮＡ、標識されたＤＮＡ、標識されたｃＤＮＡ）に対してポリメラーゼ連鎖反応を行い、標識された増幅産物（例えば、確率的に標識された増幅産物）を生成することを更に含む。標識された増幅産物は、二本鎖分子であることができる。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、又はＤＮＡ分子にハイブリダイズしたＲＮＡ分子を含むことができる。二本鎖分子の一方又は両方の鎖は、試料標識、空間標識、細胞標識、及び／又はバーコード配列（例えば、分子標識）を含むことができる。標識された増幅産物は、単鎖分子であることができる。単鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組合せを含むことができる。本開示の核酸は、合成核酸及び改変核酸を含むことができる。
【０１６４】
増幅は、１つ又は複数の非天然ヌクレオチドの使用を含むことができる。非天然ヌクレオチドは、感光性又はトリガー可能（ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）ヌクレオチドを含むことができる。非天然ヌクレオチドの例としては、限定ではなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を挙げることができる。非天然ヌクレオチドは、増幅反応の１つ又は複数のサイクルに追加することができる。非天然ヌクレオチドの追加を使用して、増幅反応における特定のサイクル又は時点として産物を識別することができる。
【０１６５】
１つ又は複数の増幅反応を行うことは、１つ又は複数のプライマーの使用を含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、又はそれを超える個数のヌクレオチドを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、又はそれを超える個数のヌクレオチドを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、１２個〜１５個未満のヌクレオチドを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、複数の標識された標的（例えば、確率的に標識された標的）の少なくとも一部にアニールすることができる。１つ又は複数のプライマーは、複数の標識された標的の３’末端及び５’末端にアニールすることができる。１つ又は複数のプライマーは、複数の標識された標的の内部領域にアニールすることができる。内部領域は、複数の標識された標的の３’末端からの少なくとも約５０個、１００個、１５０個、２００個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個、５１０個、５２０個、５３０個、５４０個、５５０個、５６０個、５７０個、５８０個、５９０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、又は１０００個のヌクレオチドであることができる。１つ又は複数のプライマーは、プライマーの固定パネルを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１つ又は複数のカスタムプライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１つ又は複数のコントロールプライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１つ又は複数の遺伝子特異的プライマーを含むことができる。
【０１６６】
１つ又は複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含むことができる。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールすることができる。１つ又は複数のカスタムプライマーは、最初の試料標識、次の試料標識、空間標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的、又は任意のそれらの組合せにアニールすることができる。１つ又は複数のプライマーは、ユニバーサルプライマー及びカスタムプライマーを含むことができる。カスタムプライマーは、１つ又は複数の標的を増幅するように設計することができる。標的は、１つ又は複数の試料中の合計核酸のサブセットを含むことができる。標的は、１つ又は複数の試料中の標識された合計標的のサブセットを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも９６個以上のカスタムプライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも９６０個以上のカスタムプライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも９６００個以上のカスタムプライマーを含むことができる。１つ又は複数のカスタムプライマーは、２つ以上の異なる標識核酸にアニールすることができる。２つ以上の異なる標識核酸は、１つ又は複数の遺伝子に対応することができる。
【０１６７】
本開示の方法では、任意の増幅方式を使用することができる。例えば、一方式では、１回目のＰＣＲは、遺伝子特異的プライマー及びユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１配列に対するプライマーを使用して、ビーズに付着した分子を増幅することができる。２回目のＰＣＲは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー２配列に隣接したネスト遺伝子特異的プライマー及びユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１配列に対するプライマーを使用して、１回目のＰＣＲの産物を増幅することができる。３回目のＰＣＲは、Ｐ５及びＰ７並びに試料インデックスを追加して、ＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリにする。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用したシーケンシングは、リード１で細胞標識及びバーコード配列（例えば、分子標識）を明らかにし、リード２で遺伝子を明らかにし、インデックス１リードで試料インデックスを明らかにすることができる。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、核酸は、化学開裂を使用して基板から取り外すことができる。例えば、核酸に存在する化学基又は修飾塩基を使用して、固体支持体からの核酸の取り外しを促進することができる。例えば、酵素を使用して、核酸を基板から取り外すことができる。例えば、核酸は、制限エンドヌクレアーゼによる消化を通して基板から取り外すことができる。例えば、ウラシル−ｄ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いた、ｄＵＴＰ又はｄｄＵＴＰを含む核酸の処理を使用して、基板から核酸を取り外すことができる。例えば、核酸は、脱プリン／脱ピリミジン塩基（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ等の塩基除去修復酵素等のヌクレオチド除去を実行する酵素を使用して、基板から取り外すことができる。幾つかの実施形態では、核酸は、光開裂可能基及び光を使用して基板から取り外すことができる。幾つかの実施形態では、開裂可能リンカーを使用して、核酸を基板から取り外すことができる。例えば、開裂可能リンカーは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、Ｉｇ−タンパク質Ａ、感光性リンカー、酸若しくは塩基不安定性リンカー基、又はアプタマーの少なくとも１つを含むことができる。
【０１６９】
プローブが遺伝子特異的である場合、分子はプローブにハイブリダイズし、逆転写及び／又は増幅することができる。幾つかの実施形態では、核酸が合成（例えば、逆転写）された後、核酸を増幅することができる。増幅は、多重化して実行することができ、複数の標的核酸配列は同時に増幅される。増幅は、シーケンシングアダプターを核酸に追加することができる。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、増幅は、例えば、ブリッジ増幅を用いて基板で実行することができる。ｃＤＮＡは、基板上のオリゴ（ｄＴ）プローブを使用してブリッジ増幅するためのコンパチブル末端を生成するために、ホモポリマーテール化することができる。ブリッジ増幅では、鋳型核酸の３’末端と相補的なプライマーは、固体粒子に共有結合で付着した各ペアのうちの第１のプライマーであることができる。鋳型核酸を含む試料が粒子に接触し、１回の熱サイクルが実行されると、鋳型分子を第１のプライマーにアニールすることができ、第１のプライマーは、ヌクレオチドの追加により順方向に伸長して、鋳型分子と、鋳型と相補的な新たに形成されたＤＮＡ鎖とからなる二本鎖分子を形成する。次のサイクルの加熱ステップにおいて、二本鎖分子を変性させ、鋳型分子を粒子から解放し、第１のプライマーを通して相補ＤＮＡ鎖を粒子に付着させたままにすることができる。アニーリングするアニーリング段階及び続く伸長ステップにおいて、相補鎖を第２のプライマーにハイブリダイズすることができ、これは、第１のプライマーから取り外されたロケーションにおける相補鎖のセグメントに相補的である。このハイブリダイゼーションは、相補鎖に、第１のプライマーと第２のプライマーとの間に、第１のプライマーには共有結合により固定され、第２のプライマーにはハイブリダイゼーションにより固定されたブリッジを形成させることができる。伸長段階では、第２のプライマーは、同じ反応混合物へのヌクレオチドの追加により逆方向に伸長し、それにより、ブリッジを二本鎖ブリッジに変換することができる。次に、次のサイクルが開始され、二本鎖ブリッジを変性させて、２つの単鎖核酸分子を生成することができる、各単鎖核酸分子は、第１及び第２のプライマーを介してそれぞれ粒子表面に付着した一端部と、それぞれ付着していない他端部とを有する。この２回目のサイクルのアニール及び伸長ステップにおいて、各鎖は、同じ粒子上の、前は使用されなかった更なる相補プライマーとハイブリダイズして、新しい単鎖ブリッジを形成することができる。ここでハイブリダイズされた、前は使用されなかった２つのプライマーは伸長して、２つの新しいブリッジを二本鎖ブリッジに変換する。
【０１７１】
増幅反応は、複数の核酸の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％を増幅することを含むことができる。
【０１７２】
標識された核酸の増幅は、ＰＣＲベースの方法又は非ＰＣＲベースの方法を含むことができる。標識された核酸の増幅は、標識された核酸の指数的増幅を含むことができる。標識された核酸の増幅は、標識された核酸の線形的増幅を含むことができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により実行することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅の反応を指すことができる。ＰＣＲは、限定ではなく、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネストＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、抑制ＰＣＲ、半ＰＣＲ抑制、及びアセンブリＰＣＲを含め、反応の誘導体を包含することができる。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、標識された核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含む。非ＰＣＲベースの方法の例には、限定ではなく、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅又はサークル−サークル増幅がある。他の非ＰＣＲベースの増幅方法には、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的を増幅する多サイクルのＤＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼ誘導ＲＮＡ転写増幅又はＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成及び転写、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ（Ｑβ）法、回文プローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用したオリゴヌクレオチド誘導増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズし、その結果生成された二本鎖が、伸長反応及び増幅の前に開裂する増幅法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用した鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、及び／又は分岐伸長増幅（ＲＡＭ）がある。
【０１７４】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、増幅された増幅産物（例えば、標的）に対してネストポリメラーゼ連鎖反応を行うことを更に含む。増幅産物は二本鎖分子であることができる。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、又はＤＮＡ分子にハイブリダイズしたＲＮＡ分子を含むことができる。二本鎖分子の一方又は両方の鎖は、試料タグ又は分子識別子標識を含むことができる。代替的には、増幅産物は単鎖分子であることができる。単鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組合せを含むことができる。本開示の核酸は、合成核酸及び改変核酸を含むことができる。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、方法は、標識された核酸を繰り返し増幅して、複数の増幅産物を生成することを含む。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、又は２０回の増幅反応を行うことを含むことができる。代替的には、方法は、少なくとも約２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回、６５回、７０回、７５回、８０回、８５回、９０回、９５回、又は１００回の増幅反応を行うことを含む。
【０１７６】
増幅は、複数の核酸を含む１つ又は複数の試料に１つ又は複数のコントロール核酸を追加することを更に含むことができる。増幅は、１つ又は複数のコントロール核酸を複数の核酸に追加することを更に含むことができる。コントロール核酸はコントロール標識を含むことができる。
【０１７７】
増幅は、１つ又は複数の非天然ヌクレオチドの使用を含むことができる。非天然ヌクレオチドは、感光性又はトリガー可能ヌクレオチドを含むことができる。非天然ヌクレオチドの例には、限定ではなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）がある。非天然ヌクレオチドは、増幅反応の１つ又は複数のサイクルに追加することができる。非天然ヌクレオチドの追加を使用して、増幅反応における特定のサイクル又は時点として産物を識別することができる。
【０１７８】
１つ又は複数の増幅反応を行うことは、１つ又は複数のプライマーの使用を含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。１つ又は複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７個〜９個のヌクレオチドを含むことができる。１つ又は複数のオリゴヌクレオチドは、１２個〜１５個未満のヌクレオチドを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、複数の標識された核酸の少なくとも一部にアニールすることができる。１つ又は複数のプライマーは、複数の標識された核酸の３’末端及び／又は５’末端にアニールすることができる。１つ又は複数のプライマーは、複数の標識された核酸の内部領域にアニールすることができる。内部領域は、複数の標識された核酸の３’末端からの少なくとも約５０個、１００個、１５０個、２００個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個、５１０個、５２０個、５３０個、５４０個、５５０個、５６０個、５７０個、５８０個、５９０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、又は１０００個のヌクレオチドであることができる。１つ又は複数のプライマーは、プライマーの固定パネルを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１つ又は複数のカスタムプライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１つ又は複数のコントロールプライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、少なくとも１つ又は複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含むことができる。１つ又は複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含むことができる。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールすることができる。１つ又は複数のカスタムプライマーは、最初の試料タグ、次の試料タグ、分子識別子標識、核酸、又はその産物にアニールすることができる。１つ又は複数のプライマーは、ユニバーサルプライマー及びカスタムプライマーを含むことができる。カスタムプライマーは、１つ又は複数の標的核酸を増幅するように設計することができる。標的核酸は、１つ又は複数の試料中の合計核酸のサブセットを含むことができる。幾つかの実施形態では、プライマーは、本開示のアレイに付着したプローブである。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、試料中の複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）することは、バーコード付き断片の索引付きライブラリを生成することを更に含む。異なるバーコードのバーコード配列（例えば、異なる確率的バーコードの分子標識）は、互いと異なることができる。バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の索引付きライブラリを生成することは、試料中の複数の標的から複数の索引付きポリヌクレオチドを生成することを含む。例えば、第１の索引付き標的及び第２の索引付き標的を含むバーコード付き標的の索引付きライブラリの場合、第１の索引付きポリヌクレオチドの標識領域は、第２の索引付きポリヌクレオチドの標識領域から、少なくとも又は多くとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、又はこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチド分、異なることができる。幾つかの実施形態では、バーコード付き標的の索引付きライブラリを生成することは、ポリ（Ｔ）領域及び標識領域を含む複数のオリゴヌクレオチドで複数の標的、例えば、ｍＲＮＡ分子に接触することと、逆転写酵素を使用して第１の鎖合成を行い、ｃＤＮＡ領域及び標識領域をそれぞれ含む単鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成することとを含み、複数の標的は、異なる配列の少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、複数のオリゴヌクレオチドは、異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。バーコード付き標的の索引付きライブラリの生成は、単鎖標識ｃＤＮＡ分子を増幅して、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成することと、ネストＰＣＲを二本鎖標識ｃＤＮＡ分子に対して行い、標識された増幅産物を生成することとを更に含むことができる。幾つかの実施形態では、方法は、アダプター標識増幅産物を生成することを含むことができる。
【０１８０】
確率的バーコーディングは、核酸バーコード又はタグを使用して、個々の核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）分子を標識することができる。幾つかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子がｍＲＮＡから生成されると、ＤＮＡバーコード又はタグをｃＤＮＡ分子に追加することを含む。ネストＰＣＲを実行して、ＰＣＲ増幅バイアスを最小に抑えることができる。アダプターは、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用するシーケンシングの場合、追加することができる。例えば、図２のブロック２３２において、シーケンシング結果を使用して、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、及び標的の１つ又は複数のコピーのヌクレオチド断片の配列を特定することができる。
【０１８１】
図３は、バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）、例えば、ｍＲＮＡの索引付きライブラリを生成する非限定的で例示的なプロセスを示す概略図である。ステップ１に示されるように、逆転写プロセスは、一意のバーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、及びユニバーサルＰＣＲ部位を各ｍＲＮＡにコードすることができる。例えば、ＲＮＡ分子３０２を逆転写して、１組のバーコード（例えば、確率的バーコード）３１０）をＲＮＡ分子３０２のポリ（Ａ）テール領域３０８にハイブリダイズすることにより、ｃＤＮＡ領域３０６を含む標識されたｃＤＮＡ分子３０４を生成することができる。各バーコード３１０は、標的結合領域、例えばポリ（ｄＴ）領域３１２、バーコード配列又は分子標識３１４、及びユニバーサルＰＣＲ領域３１６を含むことができる。
【０１８２】
幾つかの実施形態では、細胞標識は３個〜２０個のヌクレオチドを含むことができる。幾つかの実施形態では、バーコード配列（例えば、分子標識）は、３個〜２０個のヌクレオチドを含むことができる。幾つかの実施形態では、複数の確率的バーコードのそれぞれは、ユニバーサル標識及び細胞標識の１つ又は複数を更に含み、ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードで同じであり、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードで同じである。幾つかの実施形態では、ユニバーサル標識は、３個〜２０個のヌクレオチドを含むことができる。幾つかの実施形態では、細胞標識は、３個〜２０個のヌクレオチドを含むことができる。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、標識領域３１４は、バーコード配列又は分子標識３１８及び細胞標識３２０を含むことができる。幾つかの実施形態では、標識領域３１４は、ユニバーサル標識、次元標識、及び細胞標識の１つ又は複数を含むことができる。バーコード配列又は分子標識３１８は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の長さであることができる。細胞標識３２０は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の長さであることができる。ユニバーサル標識は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の長さであることができる。ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードで同じであることができ、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードで同じである。次元標識は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の長さであることができる。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、標識領域３１４は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数のバーコード配列又は分子標識３１８及び細胞標識３２０等の異なる標識を含むことができる。各標識は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の長さであることができる。１組のバーコード又は確率的バーコード３１０は、１０個、２０個、４０個、５０個、７０個、８０個、９０個、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、１０10個、１０11個、１０12個、１０13個、１０14個、１０15個、１０20個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数のヌクレオチドの長さであることができ、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数のバーコード又は確率的バーコード３１０を含むことができる。そして、１組のバーコード又は確率的バーコード３１０は、例えば、それぞれ、一意の標識領域３１４を含むことができる。標識されたｃＤＮＡ分子３０４は精製されて、余分なバーコード又は確率的バーコード３１０を取り外すことができる。精製はＡｍｐｕｒｅビーズ精製を含むことができる。
【０１８５】
ステップ２に示されるように、ステップ１における逆転写プロセスからの産物は、１つの管にプールし、第１世代ＰＣＲプライマープール及び第１世代ユニバーサルＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅することができる。プールは、一意の標識領域３１４により可能である。特に、標識されたｃＤＮＡな分子３０４を増幅して、ネストＰＣＲ標識増幅産物３２２を生成することができる。増幅は、多重ＰＣＲ増幅を含むことができる。増幅は、単一反応容量中の９６個の多重プライマーを用いる多重ＰＣＲ増幅を含むことができる。幾つかの実施形態では、多重ＰＣＲ増幅は、単一反応容量中の１０個、２０個、４０個、５０個、７０個、８０個、９０個、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、１０10個、１０11個、１０12個、１０13個、１０14個、１０15個、１０20個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の多重プライマーを利用することができる。増幅は、特定の遺伝子を標的としたカスタムプライマー３２６Ａ〜Ｃの第１世代ＰＣＲプライマープール３２４及びユニバーサルプライマー３２８を含むことができる。カスタムプライマー３２６は、標識されたｃＤＮＡ分子３０４のｃＤＮＡ部分３０６’内の領域にハイブリダイズすることができる。ユニバーサルプライマー３２８は、標識されたｃＤＮＡ分子３０４のユニバーサルＰＣＲ領域３１６にハイブリダイズすることができる。
【０１８６】
図３のステップ３に示されるように、ステップ２におけるＰＣＲ増幅からの産物は、ネストＰＣＲプライマープール及び第２世代ユニバーサルＰＣＲプライマーを用いて増幅することができる。ネストＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスを最小に抑えることができる。例えば、ネストＰＣＲ標識増幅産物３２２は、ネストＰＣＲによって更に増幅することができる。ネストＰＣＲは、単一反応容量中に、ネストＰＣＲプライマー３３２ａ〜ｃのネストＰＣＲプライマープール３３０と、第２世代ユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’とを有する多重ＰＣＲを含むことができる。ネストＰＣＲプライマープール３２８は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲の個数、約これらの個数、少なくともこれらの個数、又は多くともこれらの個数の異なるネストＰＣＲプライマー３３０を含むことができる。ネストＰＣＲプライマー３３２は、アダプター３３４を含むことができ、標識された増幅産物３２２のｃＤＮＡ部分３０６’’内の領域にハイブリダイズすることができる。ユニバーサルプライマー３２８’は、アダプター３３６を含むことができ、標識された増幅産物３２２のユニバーサルＰＣＲ領域３１６にハイブリダイズすることができる。したがって、ステップ３は、アダプター標識された増幅産物３３８を生成する。幾つかの実施形態では、ネストＰＣＲプライマー３３２及び第２世代ユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’は、アダプター３３４及び３３６を含まなくてよい。アダプター３３４及び３３６は代わりに、ネストＰＣＲの産物にライゲートして、アダプター標識された増幅産物３３８を生成することができる。
【０１８７】
ステップ４に示されるように、ステップ３からのＰＣＲ産物は、ライブラリ増幅プライマーを使用して、シーケンシングに向けてＰＣＲ増幅することができる。特に、アダプター３３４及び３３６を使用して、１つ又は複数の追加のアッセイをアダプター標識された増幅産物３３８に対して行うことができる。アダプター３３４及び３３６は、プライマー３４０及び３４２にハイブリダイズすることができる。１つ又は複数のプライマー３４０及び３４２は、ＰＣＲ増幅プライマーであることができる。１つ又は複数のプライマー３４０及び３４２は、シーケンシングプライマーであることができる。１つ又は複数のアダプター３３４及び３３６は、アダプター標識された増幅産物３３８の更なる増幅に使用することができる。１つ又は複数のアダプター３３４及び３３６は、アダプター標識された増幅産物３３８のシーケンシングに使用することができる。プライマー３４２は、同じ組のバーコード又は確率的バーコード３１０を使用して生成された増幅産物が、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用した１つのシーケンシング反応でシーケンシングすることができるようなプレートインデックス３４４を含むことができる。
【０１８８】
細胞標識識別におけるエラー
確率的バーコーディング等のバーコーディング、例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト））は、ビーズに基づくことができる。異なる細胞からのｍＲＮＡ等の分子又は標的は、異なるビーズ上のバーコード（例えば、確率的バーコード）にハイブリダイズすることができる。異なるビーズ上のバーコードは、異なる細胞標識を有することができ、同じビーズ上のバーコードは細胞標識を有することができる。例えば、１個のビーズが１個の細胞とペアになる前ように、１個の細胞及び１個のビーズをマイクロウェルプレートのマイクロウェルに追加することができる。したがって、細胞標識は、ビーズ上の全てのオリゴヌクレオチドで同じであるが、異なるビーズ間で事なり、したがって、１個の細胞からの全ての分子は、配列データ中の同じ細胞標識を用いて識別することができる。幾つかの実施形態では、バーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）からの生の配列データは、実験の細胞入力数よりも多数の細胞標識を含むことができる。例えば、１，０００個の細胞の幾つかの分子をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）することができるが、生の配列データは、２００００個〜２０００００個の細胞標識を示し得る。
【０１８９】
より多数の細胞標識のソースは、異なる実施態様で異なり得る。いかなる特定の理論にも縛られずに、幾つかの実施形態では、ビーズとペアにならない細胞が溶解することができ、それらの核酸内容物が拡散し、いかなる細胞ともペアになっていないビーズに関連付けられ、それにより、誤った細胞標識シグナルが生成され得ると考えられる。幾つかの実施形態では、ビーズの製造プロセス中、細胞標識は、ある細胞標識を別の細胞標識に変換する突然変異を有し得る。この場合、同じ細胞からの分子は、２つの異なる細胞からの分子であるように見え得る（例えば、細胞標識が突然変異したため、それらの分子がまるで、２つの異なるビーズからのものであるかのように）。さらに、シーケンシング前、ＰＣＲ増幅中、細胞標識における置換エラー及び非置換エラーが生じ得る。幾つかの実施形態では、エキソヌクレアーゼ処理（例えば、図２のステップ２１６における）は、ＰＣＲプロセス中、ビーズ上の単鎖ＤＮＡがハイブリダイズし、ＰＣＲキメラを形成し得るように、効率的ではないことがある。
【０１９０】
修正されない場合、生の配列データ中の細胞標識の過度の数は、細胞カウントの過大評価に繋がる恐れがある。本明細書に開示される方法は、シグナル細胞標識（真の細胞標識とも呼ばれる）をノイズ細胞標識から分離又は区別するこがきる。
【０１９１】
二次導関数に基づく細胞標識のシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識としての識別
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数の確率的バーコードを使用して細胞の試料中の複数の標的を確率的バーコーディングして、複数の確率的バーコード付き標的を作成することであって、複数の確率的バーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、確率的バーコーディングして確率的バーコード付き標的を作成することと、（ｂ）複数の確率的バーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）複数の確率的バーコードの細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することと、（ｄ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数の確率的バーコードの細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｅ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｄ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成することと、（ｆ）累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、（ｇ）累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することであって、二次導関数プロットの最小は細胞標識閾値に対応する、特定することと、（ｈ）（ｃ）において特定された細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｇ）において決定された細胞標識閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識（細胞に関連付けられている）又はノイズ細胞標識（細胞に関連付けられていない）として識別することとを含む。
【０１９２】
ノイズ細胞標識の原因は、異なる実施態様で異なり得る。幾つかの実施形態では、ノイズ細胞標識は、１つ又は複数のＰＣＲ又はシーケンシングエラーから生じ得る。幾つかの実施形態では、ノイズ細胞標識は、死んだ細胞からリリースされたＲＮＡ分子から生じ得る。幾つかの実施形態では、ノイズ細胞標識は、細胞に関連付けられていないビーズに付着した、ビーズに関連付けられていない細胞からリリースされたＲＮＡ分子から生じ得る。
【０１９３】
幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の配列データを取得することであって、複数のバーコード付き標的は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用してバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）された細胞の試料中の複数の標的から作成され、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含む、取得することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的（又はバーコード）の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数のバーコード付き標的（又はバーコード）の細胞標識のそれぞれのランクを決定することと、（ｃ）細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｂ）において決定された複数のバーコード付き標的（又はバーコード）の細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、細胞標識閾値を決定することと、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び（ｃ）において特定された細胞標識閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【０１９４】
図４は、細胞をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別する非限定的で例示的な方法４００を示すフローチャートである。ブロック４０４において、方法４００は、任意選択的に、図２及び図３を参照して説明したように、バーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して細胞中の標的（例えば、確率的バーコード付き標的）をバーコーディングして、バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することができる。各バーコードは、細胞標識及び分子標識を含むことができる。複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有することができる。複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有することができる。
【０１９５】
ブロック４０８において、方法４００は、本明細書のシーケンシングというタイトルのセクションにおいて説明したように、バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の配列データを取得することができる。ブロック４１２において、方法４００は、任意選択的に、バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することができる。バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含むことができる。幾つかの実施形態では、ブロック４０８において取得される配列データは、バーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む。
【０１９６】
幾つかの実施形態では、方法は、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、分子標識発生閾値を上回るか、又は下回る場合、ブロック４０８において得られた配列データから、複数の標的のうちの標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識に関連付けられた配列情報を除去することを含むことができる。分子標識発生閾値は、異なる実施態様において異なることができる。幾つかの実施形態では、分子標識発生域値は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、分子標識発生閾値は、少なくとも又は多くとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、又は１０００００であることができる。幾つかの実施形態では、分子標識発生閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、分子標識発生閾値は、少なくとも又は多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることができる。
【０１９７】
ブロック４１６において、方法４００は、バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識のランクを決定することができる。バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識のランクは、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づくことができる。
【０１９８】
ブロック４２０において、方法４００は、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた細胞標的閾値及びブロック４１６において決定された複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識のランクを決定することができる。幾つかの実施形態では、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて細胞標識閾値を決定することは、ランクｎを有する細胞標識の累積和及び次のランクｎ＋１を有する細胞標識の累積和における最大変化を有する細胞標識を特定することを含み、細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数は、細胞標識閾値に対応する。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及びブロック４１６において決定された複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、細胞標識閾値を決定することは、細胞標識の各ランクの累積和を特定することであって、ランクの累積和は、より低いランクを有する細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の和を含む、特定することと、ランクｎの累積及び次のランクｎ＋１の累積和における最大変化を有する細胞標識のランクｎを決定することであって、累積和及び次のランクｎ＋１の累積和における最大変化を有する細胞標識のランクｎは、細胞標識閾値に対応する、決定することとを含む。
【０２００】
幾つかの実施形態では、細胞標識閾値を決定することは、各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び４１６において決定された各細胞標識のランクに基づいて、累積和プロットを生成することを含むことができる。細胞標識閾値を決定することは、累積和プロットの二次導関数プロットを生成することと、累積和プロットの二次導関数プロットの最小を特定することとを更に含むことができる。二次導関数プロットの最小は、細胞標識閾値に対応することができる。
【０２０１】
幾つかの実施形態では、各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び４１６において決定された各細胞標識のランクに基づいて、累積和プロットを生成することは、細胞標識の各ランクの和を特定することを含むことができ、ランクの累積和は、より低いランクを有する各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数の合算を含む。累積和プロットの二次導関数プロットを生成することは、細胞標識の第１のランクの累積和と、細胞標識の第２のランクの累積和との差が、第１のランクと第２のランクとの差を超えると判断することを含むことができる。幾つかの実施形態では、第１のランクと第２のランクとの差は１である。累積和プロットは、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットであることができる。ｌｏｇ−ｌｏｇプロットはｌｏｇ１０−ｌｏｇ１０プロットであることができる。
【０２０２】
幾つかの実施形態では、最小は大域的最小である。二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値を超えると判断することを含むことができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、細胞の試料における細胞の数に基づいて決定することができる。例えば、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、細胞の試料中の細胞数がより大きい場合、より大きな値であることができる。
【０２０３】
細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、少なくとも又は多くとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、又は１０００００であることができる。幾つかの実施形態では、細胞標識のそれぞれに関連付けられた分子標識の最小数の閾値は、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、８０％、９０％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、分子標識発生閾値は、少なくとも又は多くとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、８０％、又は９０％であることができる。
【０２０４】
幾つかの実施形態では、二次導関数プロットの最小を特定することは、二次導関数プロットの最小が、各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値を下回ると判断することを含む。各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、パーセンタイル閾値であることができる。各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、細胞の試料中の細胞数に基づいて決定することができる。例えば、各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、細胞の試料中の細胞数がより大きい場合、より大きな値であることができる。
【０２０５】
各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、少なくとも又は多くとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、又は１０００００であることができる。幾つかの実施形態では、各細胞標識に関連付けられた分子標識の最大数の閾値は、１０％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、分子標識発生閾値は、少なくとも又は多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることができる。
【０２０６】
ブロック４３２において、方法４００は、細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び細胞標識閾値に基づいて、細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することができる。各細胞標識は、（ｃ）において特定された各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きい場合、シグナル細胞標識として識別される。各細胞標識は、（ｃ）において特定された各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が、細胞標識閾値よりも大きくない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。幾つかの実施形態では、方法は、４３２において、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識がノイズ細胞標識として識別される場合、ブロック４０８において得られた配列データから、識別された細胞標識に関連付けられた配列情報を除去することを含む。
【０２０７】
クラスタリングに基づく細胞標識のシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識としての識別
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して細胞の試料中の複数の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）して、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することであって、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、バーコーディングしてバーコード付き標的を作成することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的の配列データを取得することと、（ｃ）複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、特徴ベクトルは、各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、（ｄ）特徴ベクトルに基づいて、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識のクラスタを特定することと、（ｅ）クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【０２０８】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法である。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の配列データを取得することであって、複数のバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用してバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）された細胞の試料中の複数の標的から作成され、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識及び分子標識を含み、複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有し、複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有する、取得することと、（ｂ）複数のバーコード付き標的の各細胞標識の特徴ベクトルを特定することであって、特徴ベクトルは、各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む、特定することと、（ｃ）特徴ベクトルに基づいて、複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することと、（ｄ）クラスタ内の細胞標識の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、複数のバーコード付き標的の各細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することとを含む。
【０２０９】
図５は、細胞をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別する別の非限定的で例示的な方法を示すフローチャートである。ブロック５０４において、方法５００は、任意選択的に、図２及び図３を参照して説明したように、確率的バーコードを使用して細胞中の標的をバーコーディング（例えば、確率的バーコーディング）して、バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）を作成することができる。各バーコードは、細胞標識及び分子標識を含む。複数の細胞の異なる細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる細胞標識を有することができる。複数の細胞の同じ細胞の標的から作成されたバーコード付き標的は、異なる分子標識を有することができる。
【０２１０】
ブロック５０８において、方法５００は、バーコード付き標的の配列データを取得することができる。ブロック５０８において、方法５００は、任意選択的に、バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することができる。バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を特定することは、（１）配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数をカウントすることと、（２）（１）においてカウントされた配列データ中の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、標的の数を推定することとを含むことができる。幾つかの実施形態では、ブロック５０８において取得される配列データは、バーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含む。
【０２１１】
ブロック５１２において、方法５００は、細胞標識の特徴ベクトルを特定することができる。特徴ベクトルは、細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数を含むことができる。例えば、特徴ベクトルの各要素は、細胞標識に関連付けられた分子標識の数を含むことができる。別の例として、特徴ベクトルの１要素は、細胞標識に関連付けられた分子標識の数を含むことができ、特徴ベクトルの別の要素は、細胞標識に関連付けられた別の分子標識の数を含むことができる。
【０２１２】
ブロック５１６において、方法５００は、特徴ベクトルに基づいて細胞標識のクラスタを特定することができる。幾つかの実施形態では、特徴ベクトルに基づいてバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識のクラスタを特定することは、特徴ベクトル空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、バーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることを含む。特徴ベクトルに基づいて複数のバーコード付き標的の各細胞標識のクラスタを特定することは、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することと、より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることとを含む。より低次元の空間は、二次元空間である。
【０２１３】
幾つかの実施形態では、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することは、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）法を使用して、特徴ベクトルを特徴ベクトル空間からより低次元の空間に投影することを含む。より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることは、密度ベースの方法を使用して、より低次元の空間におけるクラスタへの特徴ベクトルの距離に基づいて、各細胞標識をクラスタにクラスタリングすることを含むことができる。密度ベースの方法は、ノイズを含むアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）法を含むことができる。
【０２１４】
ブロック５２０において、方法５００は、クラスタ内の細胞の数及びクラスタサイズ閾値に基づいて、細胞標識をシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することができる。幾つかの実施形態では、細胞標識は、クラスタ内の細胞標識の数が、クラスタサイズ閾値を下回る場合、シグナル細胞標識として識別することができる。細胞標識は、クラスタ内の細胞標識の数が、クラスタサイズ閾値を下回らない場合、ノイズ細胞標識として識別することができる。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、方法は、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識の数に基づいてクラスタサイズ閾値を決定することを含む。クラスタサイズ閾値は、複数のバーコード付き標的の細胞標識の数の割合であることができる。幾つかの実施形態では、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識の数に基づいてクラスタサイズ閾値を決定すること。クラスタサイズ閾値は、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の細胞標識の数の割合であることができる。幾つかの実施形態では、方法は、複数のバーコード（又はバーコード付き標的）の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、クラスタ閾値サイズを決定することを含む。
【０２１６】
ノイズ細胞からの真の細胞に関連付けられた細胞標識の区別
本明細書に開示されるのは、真の細胞に関連付けられた標識（例えば、細胞標識）とノイズ細胞に関連付けられた標識（例えば、細胞標識）とを確実に区別する方法の実施形態である。真の細胞に関連付けられた細胞標識は、本明細書では、シグナル細胞標識と呼ばれる。ノイズ細胞は、本明細書では、ノイズ細胞標識と呼ばれる。方法は、幾つかの実施形態では、異なる細胞タイプ／クラスタに対応する真の細胞（又はシグナル細胞標識）の大半を検出又は識別し得る。方法は、単核細胞及び血漿等の特定の細胞タイプ内の低発現であるノイズ細胞を自動的になくすことが可能であり得る。
【０２１７】
図６Ａは、真の細胞に関連付けられた標識をノイズ細胞から区別する非限定的で例示的な方法６００ａを示す流れ図である。方法６００ａは、１つ又は複数の細胞標識識別又は分類方法（例えば、図４又は図５を参照して説明した方法４００又は５００）に基づくことができる。方法６００ａは、幾つかの実施形態では、これらの細胞標識識別を改善することができる。方法は、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）パイプラインの分類に使用することができる。
【０２１８】
方法６００ａは、複数のステップ又は動作を含む。ブロック６０４において、方法６００ａは、細胞標識識別方法（例えば、図４又は図５を参照して説明した方法４００又は５００）を実行して（又は走らせて）、複数の真の細胞（又は図６におけるフィルタリングされた細胞（Ａ）と呼ばれるシグナル細胞標識）を特定することを含む。例えば、細胞標識識別方法は、ｌｏｇ１０変換累積リード曲線に基づくことができる。細胞標識識別方法を使用して、曲線が横ばいを開始する変曲点を特定することができる。例えば、主要変曲点は、真の細胞とノイズ細胞との分離であることができる。
【０２１９】
方法６００ａは、例えば、大部分の細胞（例えば、全細胞）にわたり高バリアブル（例えば、最高バリアブル）遺伝子に制限し、細胞標識識別方法を実行することにより、ノイズ細胞を除去することを含むことができる。例えば、方法６００ａは、全細胞にわたり最高バリアブル遺伝子に対して、ブロック６０４において実行した細胞標識識別方法を再実行することを含むことができる。方法６００ａは、ブロック６０８において、大部分の細胞（例えば、全細胞）にわたり高バリアブル遺伝子を識別することを含むことができる。細胞標識識別方法は、ブロック６１２において、ブロック６０８において識別された最高バリアブル遺伝子に対して実行されて、１つ又は複数の真の細胞（又はシグナル細胞標識、図６においてノイズ細胞（Ｂ）と呼ばれる場所）を特定することができる。高バリアブル遺伝子を識別するために、方法６００ａは、任意選択的に、各細胞内の各遺伝子のリードカウント（例えば、各細胞標識の各遺伝子に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数）を対数変換して、遺伝子発現を特定することを含むことができる。例えば、リードカウントは、以下の式［１］を使用して対数変換することができる。
ｌｏｇ（カウント＋１）    式［１］
【０２２０】
ブロック６０８において、方法６００ａは、平均発現（又は最大、メジアン、又は最小発現）及びばらつき（例えば、分散／平均）等の各遺伝子の発現の１つ又は複数野尺度又は指示を特定することを含むことができる。方法６００ａは、各遺伝子（又は各遺伝子の発現プロファイル）を複数の便の１つに割り当てることを含むことができる。例えば、遺伝子は、各遺伝子の平均（又は最大、メジアン、又は最小）発現に基づいて２０個のビンに割り当てることができる。ビンの数は、異なる実施態様では異なることができる。幾つかの実施形態では、ビンの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、ビンの数は、少なくとも又は多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００であることができる。
【０２２１】
ブロック６０８において、方法６００ａは、各ビン内で、全遺伝子のばらつき尺度の１つ若しくは複数の尺度又は指示を特定することを含むことができる。例えば、全遺伝子のばらつき尺度の平均及び標準偏差（ＳＴＤ）を特定することができる。方法６００ａは、例えば、式［２］を使用して各遺伝子の正規化されたばらつき尺度を特定することを含むことができる。
正規化分散＝（分散−平均）／標準偏差    式［２］
【０２２２】
ブロック６０８において、方法６００ａは、正規化されたばらつきに１つ又は複数の異なるカットオフ値を適用して、同様の平均発現を有する遺伝子と比較した場合であっても、発現値が高バリアブルな（例えば、閾値を超えるバリアブルを有する）遺伝子を識別することを含むことができる。カットオフ値の数は、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、カットオフ値の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、カットオフ値の数は、少なくとも又は多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００であることができる。
【０２２３】
幾つかの実施形態では、方法６００ａは、細胞が、カットオフ値の閾値数又は全カットオフ値の閾値割合（例えば、少数、多数、又は全てのカットオフ値）におけるノイズ細胞として識別される場合のみ、細胞をノイズ細胞（又は細胞標識又はノイズ細胞標識）として決定することができる。幾つかの実施形態では、カットオフ値の閾値数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、カットオフ値の閾値数は、少なくとも又は多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００であることができる。幾つかの実施形態では、カットオフ第１の閾値割合は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、１００％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、カットオフ第１の閾値割合は、少なくとも又は多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％であることができる。幾つかの実施形態では、そのようなノイズ細胞識別は、識別されたノイズ細胞の精度を改善する（例えば、真の細胞をノイズ細胞として識別する可能性を低減する）ことができる。図７は、最もバリアブルな遺伝子の識別を示す非限定的で例示的な概略図である。
【０２２４】
図６Ａを参照すると、ブロック６１６において、方法６００ａは、例えば、任意のドロップアウト遺伝子があるか否かを判断することにより、ブロック６０４において誤って決定された（例えば、識別されなかった）可能性がある真の細胞（又はシグナル細胞標識）を特定又は識別することを含むことができる。その可能性がある場合、方法６００ａは、ブロック６２０において、細胞標識識別方法（例えば、ブロック６０４又は６１２において使用された細胞標識識別方法）を実行又は再実行して、ブロック６０４において識別されなかった、１つ又は複数の失われた真の細胞（又は失われたシグナル細胞標識）を特定することを含むことができる。ブロック６２０において特定された、失われた真の細胞は、図６Ａにおいて、損失細胞（Ｄ）と呼ばれる。ドロップアウト遺伝子を識別することは、遺伝子毎に、全細胞及びブロック６２５において特定されたクリーンアップ細胞からの合計リードカウントを特定することを含むことができる。クリーンアップ細胞（ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｃｅｌｌ）は、式［３ａ］又は式［３ｂ］を使用して特定することができ、式中、Ｃはクリーンアップ細胞を示し、Ａは、ブロック６０４において決定されたフィルタリングされた又は真の細胞を示し、Ｂは、ブロック６１２において特定された損失細胞を示す。
Ｃ＝ｓｅｔ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａ，ｓｅｔ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａ，Ｂ）    ［３ａ］
Ｃ＝Ａ−（Ａ−Ｂ）    式［３ａ］
【０２２５】
ドロップアウト遺伝子の識別は、全細胞からのカウントと比較して、クリーンアップ細胞からのカウントにおいて大きな損失（例えば、最大の損失）を有する遺伝子を識別することを含むことができる。例えば、最大の損失を有する遺伝子は、合計カウントをプロットし、最適な当てはめ直線を見つけて、少なくとも１等の全遺伝子の残余のメジアンから離れた標準偏差閾値数の大きな残余（例えば、最大残余）を有する遺伝子を特定していることにより、特定することができる（図８Ａ及び図８Ｂ参照）。幾つかの実施形態では、平均の代わりにメジアンを使用して、外れ値の影響を最小に抑えることができる。標準偏差の閾値数は、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、標準偏差の閾値数は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、標準偏差の閾値数は、少なくとも又は多くとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０であることができる。
【０２２６】
ブロック６２４において、方法６００ａは、ブロック６２０及びブロック６２４において識別された細胞（又は細胞標識）を結合して、最終的な１組の真の細胞（図６においてフィルタリングされた細胞Ｆと呼ばれる）を特定することを含むことができる。
【０２２７】
図６Ｂは、ノイズ細胞から真の細胞に関連付けられた標識を区別する別の非限定的で例示的な方法６００ｂを示す流れ図である。図６Ｂにおけるブロック６０４〜６２８において実行される動作は、図６Ａを参照して説明した方法６００ａの対応するブロックにおいて実行される動作と同様であることができる。方法６００ｂは、ｌｏｇ１０変換累積リード曲線に基づくアルゴリズムを実行することを含み、ブロック６０４において、曲線が横ばいになる変曲点を見つけることができる。主要変曲点は、細胞とノイズとの分離である。方法６００ｂは、以下のステップの１つ又は複数を含むことができる。全ての細胞から開始して、遺伝子のばらつき尺度ｚスコアカットオフを使用して最もバリアブルな遺伝子を取得する。最もバリアブルな遺伝子のみにフォーカスし、現在のアルゴリズムを通して実行して、真の細胞を推測し、この組をＢとして示す。パネル内の全ての遺伝子を使用して他の細胞標識識別方法によって検出されたが、最もバリアントな遺伝子のみを使用したアルゴリズムによっては検出されない細胞、すなわち、ｓｅｔｄｉｆｆ（Ａ，Ｂ）を特定し、がノイズ細胞として特定される。幾つかの実施形態では、より保守的になるために、複数のばらつきｚカットオフ値を試み、細胞が、幾つか、大部分、又は全てのカットオフ値でノイズとして分類される場合のみ、細胞をノイズと特定する。ノイズ細胞を組Ａから除去し、上記式［３ａ］又は［３ｂ］を使用して更新された１組の細胞を取得する。
【０２２８】
方法６００ｂは、ブロック６０８において、全細胞にわたり最もバリアブル又は高バリアブルな遺伝子に制限することにより、ノイズ細胞を除去することと、ブロック６１２において、アルゴリズム（例えば、ブロック６０４において実行された）を再実行することとを含むことができる。例えば、方法は、以下のステップの１つ又は複数を含むことができる。真の細胞を取り出す。遺伝子毎に、全細胞及び組Ｃ内の細胞からの合計リードカウントを計算する。組Ｃにおいて殆どドロップされた遺伝子を見つける。ドロップされた遺伝子にフォーカスし、ブロック６０４において実行された方法を通して実行して、失われた可能性がある任意に真の細胞を取り出して、個のステップにおいて識別された細胞をＣとして示す。
【０２２９】
方法６００ｂは、ブロック６１６において任意のドロップされた遺伝子があるか否かをチェックすることにより、ブロック６０４において誤検出又は誤特定された可能性がある真の細胞を回復することを含むことができる。ドロップされた遺伝子がある場合、方法６００ｂは、ドロップされた遺伝子（過小評価された遺伝子とも呼ばれる）に制限し、ブロック６２０において、アルゴリズム（例えば、ブロック６０４において実行された）を再実行して、失われた真の細胞を拾うことを含むことができる。最終的な細胞リストＦは、式［４］を使用して特定することができる。
Ｆ＝ｕｎｉｏｎ（Ｃ，Ｄ）    式［４］
【０２３０】
幾つかの実施形態では、ブロック６３２において、ブロック６２８からの細胞は、十分に多い数の分子を担持しない細胞を除去することにより、クリーンアップ又は磨きをかけることができる。例えば、分子カウントの最小閾値は、以下のルールによって特定することができる。ステップ（ａ）下部１／４にある細胞の合計分子カウントにおける大きなギャップ（例えば、最大のギャップ、２番目に最大のギャップ、３番目に最大のギャップ等）を見つけ、ギャップの値としてカットオフを決定する。ステップ（ｂ）ステップ（ａ）において決定されたカットオフ未満の分子カントを有する細胞を見つけ、任意選択的に、低分子カウントに起因して除去された細胞の割合を計算する。ステップ（ｃ）以下の２つの条件の一方又は両方下で、上で決定された適応カットオフを使用せず、固定されたカットオフ、例えば、分子２０個を使用する：条件（ｉ）低分子カウントに起因して除去された細胞の割合が閾値割合（例えば、２０％）よりも大きい又は少なくとも閾値割合であり、且つ／又はギャップは閾値数（例えば、５００）未満である、及び条件（ｉｉ）全細胞の合計分子カウントにおける最大のギャップは、例えば、１である。クリーンアップ後の細胞は、方法６００ｂによって検出された、最終的な組のフィルタリングされた細胞の部分である。
【０２３１】
ステップ（ｃ）における固定されたカットオフは、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、カットオフは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、カットオフは、少なくとも又は多くとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００であることができる。条件（ｉ）における閾値割合は、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、閾値割合は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、閾値割合は、少なくとも又は多くとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、又は５０％であることができる。条件（ｉ）におけるギャップの閾値数は、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、ギャップの閾値数は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。幾つかの実施形態では、ギャップの閾値数は、少なくとも又は多くとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。条件（ｉｉ）における最大のギャップは、異なる実施態様で異なることができる。幾つかの実施形態では、最大のギャップは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数字若しくは範囲又は約これらの値若しくは範囲であることができる。この実施形態では、最大のギャップは、少なくとも又は多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００であることができる。
【０２３２】
本明細書に開示されるのは、シグナル細胞標識を識別する方法の実施形態である。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）細胞の複数の第１の標的の配列データを取得することであって、第１の各標的には、複数の細胞標識の各細胞標識に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数が関連付けられる、取得することと、（ｂ）方法４００又は５００を賜与好いて、方法６００ａ又は６００ｂのブロック６０４等において、細胞標識のそれぞれに関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、細胞標識のそれぞれをシグナル細胞標識又はノイズ細胞標識として識別することと、（ｃ）方法４００又は５００を使用して、方法６００ａ又は６００ｂのブロック６０８、６１２等、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別し、又は方法６００ａ又は６００ｂのブロック６１６、６２０等、（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することとを含む。各細胞標識を識別すること、シグナル細胞標識として複数の細胞標識の少なくとも１つを再識別すること、又はノイズ細胞標識として複数の細胞標識の少なくとも１つを再識別することは、本開示の同一の細胞標識識別方法又は異なる細胞標識識別方法（図４又は図５を参照して説明した方法４００又は５００等）に基づくことができる。識別閾値は、細胞標識閾値、クラスタサイズ閾値、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。方法は、図６Ａを参照して説明した方法６００ｂのブロック６２８等において、分子標識数の閾値を下回る別個の配列を有する分子標識の数にそれぞれ関連付けられた複数の細胞標識の１つ又は複数の細胞標識を除去することを含むことができる。
【０２３３】
幾つかの実施形態では、方法６００ａ又は６００ｂのブロック６０８等において、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別することは、複数の第１の標的の中で、多様性閾値を上回る１つ又は複数の多様性指示をそれぞれ有する複数の第１の標的のうちの複数の第２の標的を特定することと、方法６００ａ又は６００ｂのブロック６１２等において、複数の細胞標識のそれぞれについて、複数の第２の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別することとを含む。第２の標的の１つ又は複数の多様性指示は、第２の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識及び配列データ中の複数の細胞標識のうちの細胞標識の数の平均、最大、メジアン、最小、分散、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。第２の標的の１つ又は複数の多様性指示は、複数の第２の標的のサブセットの多様性指示標準偏差、正規化分散、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。多様性閾値は、複数の第２の標的のサブセットのサイズ以下であることができる。
【０２３４】
幾つかの実施形態では、（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された複数の細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することは、方法６００ａ又は６００ｂのブロック６１６等において、関連性閾値を超える、（ｃ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識と関連性をそれぞれ有する複数の第１の標的のうちの複数の第３の標的を特定することと、方法６００ａ又は６００ｂのブロック６２０等において、複数の細胞標識のそれぞれについて、複数の第３の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数及び識別閾値に基づいて、（ｂ）においてシグナル細胞標識として識別された細胞標識の少なくとも１つをノイズ細胞標識として再識別することとを含む。関連性閾値を超える、（ｃ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識と関連性をそれぞれ有する複数の第１の標的のうちの複数の第３の標的を特定することは、（ｂ）においてノイズ細胞標識として識別された細胞標識の少なくとも１つをシグナル細胞標識として再識別した後、シグナル細胞標識として識別された複数の残りの細胞標識を特定することと、複数の第３の標的を特定することであって、複数の細胞標識のそれぞれについて、複数の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数、及び複数の残りの細胞標識のそれぞれについて、複数の標的に関連付けられた別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数の第３の標的を特定することとを含むことができる。
【０２３５】
シーケンシング
幾つかの実施形態では、異なるバーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）の数を推定することは、標識された標的、空間標識、分子標識、試料標識、細胞標識、又はこれらの任意の産物（例えば、標識された増幅産物又は標識されたｃＤＮＡ分子）の配列を特定することを含むことができる。増幅された標的はシーケンシングを受けることができる。バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）又はその任意の産物の配列を特定することは、シーケンシング反応を行い、試料標識、空間標識、細胞標識、分子標識、標識された標的（例えば、確率的に標識された標的）の少なくとも一部、その相補物、その逆相補物、又はそれらの任意の組合せの少なくとも一部の配列を特定することを含むことができる。
【０２３６】
バーコード付き標的又は確率的バーコード付き標的（例えば、増幅された核酸、標識された核酸、標識された核酸のｃＤＮＡコピー等）の配列を特定することは、限定ではなく、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（ＳＢＨ）、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＢＬ）、定量的増分蛍光ヌクレオチド付加シーケンシング（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的なライゲーション及び切断、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎレポータープローブ消化、ピロシーケンシング、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕシーケンシング（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ、ゆらぎシーケンシング（ｗｏｂｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、多重シーケンシング、重合コロニー（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ）（ＰＯＬＯＮＹ）シーケンシング；ナノグリッドローリングサークル配列決定法（ＲＯＬＯＮＹ）、アレル特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲートされた線形プローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の読み取りを使用した単一鋳型分子ＯＬＡ、ライゲートされたパッドロックプローブ、又はライゲートされた環状パッドロックプローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の読み取りを使用した単一鋳型分子ＯＬＡ）等を含めた多種多様なシーケンシング方法を使用して実行することができる。
【０２３７】
幾つかの実施形態では、バーコード付き標的（例えば、確率的バーコード付き標的）又はその任意の産物の配列を特定することは、ペアードエンドシーケンシング、ナノポアシーケンシング、高スループットシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ダイターミネータシーケンシング、マルチプライマーＤＮＡシーケンシング、プライマーウォーキング、サンガージデオキシ（Ｓａｎｇｅｒ  ｄｉｄｅｏｘｙ）シーケンシング、マキシム−ギルバート（Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）シーケンシング、ピロシーケンシング、ｔＳＭＳ（ｔｒｕｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、又はそれらの任意の組合せを含む。代替的には、バーコード付き標的又はその任意の産物の配列は、電子顕微鏡法又は化学感応電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイにより特定することができる。
【０２３８】
Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢＩ−ＳＯＬｉＤ、ＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、又はＰｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォーム等のプラットフォームを使用するサイクルアレイシーケンシング等の高スループットシーケンシング法を利用することができる。幾つかの実施形態では、シーケンシングは、ＭｉＳｅｑシーケンシングを含むことができる。幾つかの実施形態では、シーケンシングは、ＨｉＳｅｑシーケンシングを含むことができる。
【０２３９】
標識された標的（例えば、確率的に標識された標的）は、有機体のゲノムの遺伝子の約０．０１％から有機体のゲノムの遺伝子の約１００％を表す核酸を含むことができる。例えば、有機体のゲノムの遺伝子の約０．０１％から有機体のゲノムの遺伝子の約１００％は、試料から相補配列を含む遺伝子を捕捉することにより、複数の多量体を含む標的相補領域を使用してシーケンシングすることができる。幾つかの実施形態では、バーコード付き標的は、有機体のトランスクリプトームの転写産物の約０．０１％から有機体のトランスクリプトームの転写産物の約１００％を表す核酸を含む。例えば、有機体のトランスクリプトームの転写産物の約０．５０１％から有機体のトランスクリプトームの転写産物の約１００％は、試料からｍＲＮＡを捕捉することにより、ポリ（Ｔ）テールを含む標的相補領域を使用してシーケンシングすることができる。
【０２４０】
複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）の空間標識及び分子標識の配列を特定することは、複数のバーコードの０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、１００％、又はこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲をシーケンシングすることを含むことができる。複数のバーコードの標識、例えば、試料標識、空間標識、及び分子標識の配列を特定することは、複数のバーコードのうちの１個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、１０10個、１０11個、１０12個、１０13個、１０14個、１０15個、１０16個、１０17個、１０18個、１０19個、１０20個、又はこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲をシーケンシングすることを含むことができる。複数のバーコードのうちの幾つか又は全てをシーケンシングすることは、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個分、若しくはこれらの値の任意の２つの間の数若しくは範囲、約これらの個数、多くとも若しくは少なくともこれらの個数のヌクレオチド又は塩基のリード長を有する配列を生成することを含むことができる。
【０２４１】
シーケンシングは、少なくとも又は少なくとも約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、又はそれを超える数のバーコード付き標的のヌクレオチド又は塩基対をシーケンシングすることを含むことができる。例えば、シーケンシングは、複数のバーコード付き標的に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実行することにより、５０個、７５個、１００個、又はそれを超える個数のヌクレオチドのリード長を有する配列を有するシーケンシングデータを生成することを含むことができる。シーケンシングは、少なくとも又は少なくとも約２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、又はそれを超える数のバーコード付き標的のヌクレオチド又は塩基対をシーケンシングすることを含むことができる。シーケンシングは、少なくとも又は少なくとも約１５００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、又はそれを超える数のバーコード付き標的のヌクレオチド又は塩基対をシーケンシングすることを含むことができる。
【０２４２】
シーケンシングは、１実行当たり少なくとも約２００回、３００回、４００回、５００回、６００回、７００回、８００回、９００回、１，０００回、又はそれを超える回数のシーケンシングリードを含むことができる。幾つかの実施形態では、１実行当たり少なくとも又は少なくとも約１５００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、又はそれを超える回数のシーケンシングリードを含む。シーケンシングは、１実行当たり約１，６００，０００，０００回以下のシーケンシングリードを含むことができる。シーケンシングは、１実行当たり約２００，０００，０００回以下のリードを含むことができる。
【０２４３】
試料
幾つかの実施形態では、複数の標的は、１つ又は複数の試料に含まれることができる。試料は、１つ若しくは複数の細胞又は１つ若しくは複数の細胞からの核酸を含むことができる。試料は、単一の細胞又は単一の細胞からの核酸であることができる。１つ又は複数の細胞は、１つ又は複数の細胞タイプのものであることができる。１つ又は複数の細胞タイプの少なくとも１つは、脳細胞、心臓細胞、がん細胞、循環腫瘍細胞、臓器細胞、上皮細胞、転移細胞、良性細胞、初代細胞、循環細胞、又はそれらの任意の組合せであることができる。
【０２４４】
本開示の方法で使用される試料は、１つ又は複数の細胞を含むことができる。試料とは、１つ又は複数の細胞を指すことができる。幾つかの実施形態では、複数の細胞は１つ又は複数の細胞タイプを含むことができる。１つ又は複数の細胞タイプのうちの少なくとも１つは、脳細胞、心臓細胞、がん細胞、循環腫瘍細胞、臓器細胞、上皮細胞、転移細胞、良性細胞、初代細胞、循環細胞、又はそれらの任意の組合せであることができる。幾つかの実施形態では、細胞は、がん組織、例えば、乳がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、脳腫瘍、メラノーマ又は非メラノーマ皮膚がん等から切除されたがん細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、がん由来であるが、体液（例えば、循環腫瘍細胞）から集められる。がんの非限定的な例としては、腺腫、腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、小細胞がん、大細胞未分化がん、軟骨肉腫、及び線維肉腫を挙げることができる。試料は、組織、細胞単層、固定細胞、組織切片、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。試料は、生体試料、臨床試料、環境試料、生体体液、組織、又は被験者からの細胞を含むことができる。試料は、人間、哺乳類、イヌ、ラット、マウス、魚、蠅、ワーム、植物、菌類、バクテリア、ウィルス、脊椎動物、又は無脊椎動物から取得することができる。
【０２４５】
幾つかの実施形態では、細胞は、ウィルスに感染し、ウィルスオリゴヌクレオチドを含む細胞である。幾つかの実施形態では、ウィルス感染は、単鎖（＋鎖又は「センス」）ＤＮＡウィルス（例えば、パルボウィルス）又は二本鎖ＲＮＡウィルス（例えば、レオウィルス）等のウィルスによって生じ得る。幾つかの実施形態では、細胞はバクテリアである。これらは、グラム陽性又はグラム陰性バクテリアを含むことができる。幾つかの実施形態では、細胞は菌類である。幾つかの実施形態では、細胞は原生動物又は他の寄生生物である。
【０２４６】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は１つ又は複数の細胞を指すことができる。幾つかの実施形態では、細胞は、正常細胞、例えば、発達の異なる段階にあるヒト細胞又は異なる臓器若しくは組織タイプからのヒト細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は非ヒト細胞、例えば、他のタイプの哺乳類細胞（例えば、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウシ、又はウマ）である。幾つかの実施形態では、細胞は、他のタイプの動物又は植物の細胞である。他の実施形態では、細胞は任意の原核生物又は真核生物の細胞であることができる。
【０２４７】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞をビーズに関連付ける前、ソートされる。例えば、細胞は、蛍光活性化細胞ソート、磁気活性化細胞ソート、又はより一般にはフローサイトメトリによってソートすることができる。細胞は、サイズにより濾過することができる。幾つかの実施形態では、被保持物は、ビーズに関連付けるべき細胞を含む。幾つかの実施形態では、フロースルーが、ビーズに関連付けるべき細胞を含む。
【０２４８】
試料は、複数の細胞を指すことができる。試料は、細胞の単層を指すことができる。試料は、薄切片（例えば、組織の薄切片）を指すことができる。試料は、アレイ上の一方向に配置ができる細胞の固体又は半固体の集まりを指すことができる。
【０２４９】
実行環境
本開示は、方法（例えば、図４、５、６Ａおよび６Ｂに関連して説明される、方法４００、方法５００、方法６００ａ又は方法６００ｂ）を実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図９は、本明細書に開示される任意の方法を実施するようにプログラム又は他の方法で構成されたコンピュータシステム７００を示す。コンピュータシステム７００は、ユーザの電子デバイス又は電子デバイスからリモートに配置されたコンピュータシステムであることができる。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであることができる。
【０２５０】
コンピュータシステム７００は、中央演算処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも）７０５を含み、これは、シングルコア若しくはマルチコアプロセッサ、又は並列処理用の複数のプロセッサであることができる。コンピュータシステム７００は、メモリ又はメモリロケーション７１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット７１５（例えば、ハードディスク）、１つ又は複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース７２０（例えば、ネットワークアダプタ）、及びキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、及び／又は電子ディスプレイアダプタ等の周辺機器７２５も含む。メモリ７１０、記憶ユニット７１５、インターフェース７２０、及び周辺機器７２５は、マザーボード等の通信バス（実線）を通してＣＰＵ７０５と通信する。記憶ユニット７１５は、データを記憶するデータ記憶ユニット（又はデータリポジトリ）であることができる。コンピュータシステム７００は、通信インターフェース７２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）７３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク７３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、又はイントラネット及び／又はインターネットと通信するエクストラネットであることができる。幾つかの場合、ネットワーク７３０は、電気通信ネットワーク及び／又はデータネットワークである。ネットワーク７３０は、クラウド計算等の分散計算を可能にすることができる１つ又は複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク７３０は、幾つかの場合、コンピュータシステム７００を用いて、ピアツーピアネットワークを実施することができ、これにより、コンピュータシステム７００に結合されたデバイスがクライアント又はサーバとして挙動できるようにし得る。
【０２５１】
ＣＰＵ７０５は、機械可読命令シーケンスを実行することができ、命令シーケンスはプログラム又はソフトウェアで実施することができる。命令は、メモリ７１０等のメモリロケーションに記憶し得る。命令はＣＰＵ７０５に向けることができ、続けて、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ７０５をプログラム又は他の方法で構成することができる。ＣＰＵ７０５によって実行される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを挙げることができる。ＣＰＵ７０５は、集積回路等の回路の部分であることができる。システム７００の１つ又は複数の他の構成要素が、回路に含まれることができる。幾つかの場合、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０２５２】
記憶ユニット７１５は、ドライバ、ライブラリ、及び保存されたプログラム等のファイルを記憶することができる。記憶ユニット７１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザプリファレンス及びユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム７００は、幾つかの場合、イントラネット又はインターネットを通してコンピュータシステム７００と通信するリモートサーバに配置される等のコンピュータシステム７００の外部にある１つ又は複数の追加のデータ記憶ユニットを含むことができる。
【０２５３】
コンピュータシステム７００は、ネットワーク７３０を通して１つ又は複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム７００は、ユーザ（例えば、微生物学者）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレート又はタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイド対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、又は個人情報端末がある。ユーザは、ネットワーク７３０を介してコンピュータシステム７００にアクセスすることができる。
【０２５４】
コンピュータシステム７００は、例えば、ストリングによって表される微生物の複数の分類群のストリング共起（ｓｔｒｉｎｇ  ｃｏ−ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）又は相互作用を示す出力を提供するユーザインターフェース（ＵＩ）７４０を備える電子ディスプレイ７３５を含むか、又はそれと通信することができる。ＵＩの例には、限定ではなく、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザインターフェースがある。
【０２５５】
本明細書に記載される方法は、例えば、メモリ７１０又は電子記憶ユニット７１５等のコンピュータシステム７００の電子記憶ロケーションに記憶される機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能又は機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ７０５によって実行することができる。幾つかの場合、コードは、記憶ユニット７１５から検索され、プロセッサ７０５による容易なアクセスのためにメモリ７１０に記憶することができる。幾つかの状況では、電子記憶ユニット７１５をなくすことができ、機械実行可能命令はメモリ７１０に記憶される。
【０２５６】
コードは、コードを実行するように構成されたプロセッサを有した機械と併用されるように事前にコンパイルされ構成してもよく、又は実行時中にコンパイルされてもよい。コードは、コードを事前にコンパイルされるか、又はコンパイルされたままで実行できるようにするように選択することができるプログラミング言語で供給することができる。
【０２５７】
コンピュータシステム７００等の本明細書に提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで実施することができる。本技術の様々な態様は、通常、一種の機械可読媒体で運ばれるか、又は一種の機械可読媒体内で実施される機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連付けられたデータの形態の「製品」又は「製造品」として考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）等の電子記憶ユニット又はハードディスクに記憶することができる。「記憶」型媒体は、コンピュータ、プロセッサ等のありとあらゆる有形メモリ又は様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等のそれに関連付けられたモジュールを含むことができ、これらは非一時的記憶をソフトウェアプログラミングに随時提供し得る。ソフトウェアの全て又は部分には、時折、インターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを通して通信し得る。そのような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサに、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームにソフトウェアをロードできるようにし得る。したがって、ソフトウェア要素を担持し得る別のタイプの媒体としては、ローカルデバイス間の物理的インターフェースにわたり、有線及び光学陸線網を通して、並びに様々なエアリンクを介して使用される等の光波、電波、及び電磁波が挙げられる。有線又は無線リンク、光学リンク等のそのような波を搬送する物理的要素も、ソフトウェアを担持する媒体として見なし得る。本明細書で使用される場合、非一時的有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」等の用語は、実行のために命令をプロセッサに提供することに参加する任意の媒体を指す。
【０２５８】
したがって、コンピュータ実行可能コード等の機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるデータベース等の実施に使用し得る等の任意のコンピュータ内の任意の記憶デバイス等の光ディスク又は磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリ等のダイナミックメモリを含む。有形伝送媒体は、コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含め、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成される等の電気信号、電磁信号、音響信号、又は光波の形態をとり得る。したがって、一般的な形態のコンピュータ可読媒体は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ、データ若しくは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブル若しくはリンク、又はコンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読み取り得る任意の他の媒体を含む。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つ又は複数の命令の１つ又は複数のシーケンスを実行のためにプロセッサに搬送することに関わり得る。
【０２５９】
幾つかの実施形態では、コンピュータシステム７００の分析機能の幾つか又は全ては、１つのソフトウェアパッケージにパッケージングすることができる。幾つかの実施形態では、完全な組のデータ分析機能は、ソフトウェアパッケージ一式を含むことができる。幾つかの実施形態では、データ分析ソフトウェアは、アッセイ機器システムから独立してユーザに提供されるスタンドアロンパッケージであることができる。幾つかの実施形態では、ソフトウェアは、ウェブベースであることができ、ユーザがデータを共有できるようにすることができる。幾つかの実施形態では、市販のソフトウェアを使用して、データ分析の全て又は一部を実行することができ、例えば、Ｓｅｖｅｎ  Ｂｒｉｄｇｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／）ソフトウェアを使用して、細胞の集まり全体の各細胞で行われる１つ又は複数の遺伝子のコピー数のテーブルを編纂することができる。
【０２６０】
本開示の方法及びシステムは、１つ又は複数のアルゴリズム又は方法によって実施することができる。方法は、中央演算処理装置７０５によって実行されるソフトウェアによって実施することができる。ソフトウェアによって実施されるアルゴリズム又は方法の例示的な用途には、配列データ処理（例えば、統合、フィルタリング、トリミング、クラスタリング）のバイオインフォマティクス方法、アラインメント及びコール、並びにストリングデータ及び光学密度データ（例えば、最確数及び培養可能存在度特定（ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ））の処理がある。
【０２６１】
例示的な実施形態では、コンピュータシステム７００は、単一細胞確率的バーコーディングアッセイを実行することにより生成された配列データセットに対してデータ分析を実行することができる。データ分析機能の例には、限定ではなく、（ｉ）試料標識、細胞標識、空間標識、及び分子標識、並びにアッセイの実行において作成された確率的バーコードライブラリをシーケンシングすることによって提供される標的配列データをデコード／逆多重化するアルゴリズム、（ｉｉ）データに基づいて、１細胞当たりの１遺伝子当たりのリード数及び１細胞当たりの１遺伝子当たりの一意の転写分子の数を特定し、サマリテーブルを作成するアルゴリズム、（ｉｉｉ）例えば、遺伝子発現データにより細胞をクラスタリングし、又は１細胞当たりの１遺伝子当たりの転写分子の数を特定すること等の信頼区間を予測する、配列データの統計分析、（ｉｖ）例えば、主成分分析、階層クラスタリング、ｋ−平均クラスタリング、自己組織化マップ、神経系統等を使用して希な細胞の部分集団を同定するアルゴリズム、（ｖ）遺伝子配列データを既知の参照配列のアラインメントし、突然変異、多型マーカー、及びスプライスバリアントを検出する配列アラインメント機能、並びに（ｖｉ）増幅エラー又はシーケンシングエラーを補償する分子標識の自動クラスタリングがある。幾つかの実施形態では、コンピュータシステム７００は、有用なグラフィカルフォーマット、例えば、細胞の集まりのうちの各細胞で生じる１つ又は複数の遺伝子のコピー数を示すヒートマップでシーケンシング結果を出力することができる。幾つかの実施形態では、コンピュータシステム７００は、例えば、細胞の集まりのうちの各細胞で生じる１つ又は複数の遺伝子のコピー数を細胞のタイプ、希な細胞のタイプ、又は特定の疾患若しくは状態を有する被験者から導出された細胞に相関付けることにより、シーケンシング結果から生物学的意味を抽出するアルゴリズムを実行することができる。幾つかの実施形態では、コンピュータシステム７００は、異なる生体試料にわたる細胞の集団を比較するアルゴリズムを実行することができる。
【実施例】
【０２６２】
上述した自体の幾つかの態様について、本開示の範囲の限定を決して意図しない以下の実施例において更に詳細に考察する。
【０２６３】
実施例１
シグナル細胞標識とノイズ細胞標識との分離−二次導関数
この実施例は、細胞標識に関連付けられたリード（又は分子）の数に基づいてシグナル細胞標識（真の細胞標識とも呼ばれる）とノイズ細胞標識とを分離することについて説明する。
【０２６４】
幾つかの状況では、ノイズ細胞標識は、シグナル細胞標識よりも、関連付けられたリード（又は分子）数が少ないことがある。例えば、ノイズ細胞標識は、ビーズとペアになっていない細胞が溶解し、それらの核酸内容物が拡散し、いかなる細胞ともペアになっていないビーズに関連付けられたことから生じ得る。このタイプのノイズ細胞標識は、細胞の総合拡散内容物の一部を含み得る。したがって、同じ細胞からの分子が、２つの異なる細胞からの分子であるように見え得る（例えば、細胞標識が突然変異したため、それらの分子がまるで、２つの異なるビーズからのものであるかのように）。
【０２６５】
別の例として、ノイズ細胞標識は、ビーズの製造プロセス中の突然変異によって生じ得る。また、ノイズ細胞標識は、ＰＣＲプロセス中、ビーズ上の単鎖ＤＮＡがハイブリダイズし、ＰＣＲキメラを形成し得る不十分なエキソヌクレアーゼ処理（例えば、図２のステップ２１６における）によっても生じ得る。これらの２つのタイプのノイズ細胞標識は、ランダム且つ希に生じ得る。
【０２６６】
図１０は、非限定的で例示的な累積和プロットを示す。ｌｏｇ−ｌｏｇ尺度での累積リード数とソートされた細胞標識インデックスとの関係。赤い線は、真の細胞標識とノイズ細胞標識との間のカットオフを示す。図１０では、リード数に基づいて全細胞標識をソートした場合、累積リード（又は分子）数の急な傾き変化が観測された。真の細胞標識とノイズ細胞標識との間のカットオフを見つけるために、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットの二次導関数を計算した。図１１は、図１０における累積和プロットの非限定的な二次導関数プロットを示す。ｌｏｇ１０変換累積リード数の二次導関数とｌｏｇ１０変換ソート細胞標識インデックスの二次導関数と関係。大域最小は、真の細胞標識とノイズ細胞標識との間のカットオフとして推測された。
【０２６７】
幾つかの実施形態では、推測された細胞数は、細胞数入力及び画像分析で観測された細胞数と一致しないことがある。その代わり、図１１を使用して決定されたカットオフは、高発現レベルのシグナル細胞と低発現レベルのシグナル細胞との分離又は異なるタイプのノイズ標識の分離のいずれかを反映し得る。これらの場合で細胞数を正確に推測するために、シグナル細胞標識におけるリード（又は分子）の割合の制限は、経験データに基づいて４５％〜９２％の範囲に設定される。画像分析から観測された細胞数は、この値が利用可能である場合、任意選択的に制約として設定することができる。
【０２６８】
全体で、これらのデータは、真の細胞標識（シグナル細胞標識とも呼ばれる）及びノイズ細胞標識を識別することが、真の細胞標識とノイズ細胞標識とを区別する細胞標識閾値に対応する二次導関数プロットの最小を特定することにより達成することができることを示す。
【０２６９】
実施例２
シグナル細胞標識とノイズ細胞標識との分離−クラスタリング
この実施例は、発現パターン（特徴ベクトルとも呼ばれる）に基づいてシグナル細胞標識（真の細胞標識とも呼ばれる）とノイズ細胞標識とを分離することについて説明する。
【０２７０】
幾つかの実施形態では、確率的バーコーディング実験の試料は、広範囲の発現レベルを有する細胞タイプを含むことができる。そのような実験では、幾つかの細胞タイプは、ノイズ細胞標識と非常によく似た分子数を有することができる。関連付けられた分子の数が区別不可能な場合、真の細胞標識をノイズ細胞標識から分離するために、クラスタリング技法を使用して、ノイズ細胞標識及び低発現レベルを有する各細胞タイプを分類することができる。方法は、同じ細胞タイプ内の細胞標識が、異なる細胞タイプ間の細胞標識よりも類似した発現パターンを有し、ノイズ細胞標識も、互いに対して、真の細胞標識よりも類似する特徴ベクトルを有するという仮定に基づくことができる。
【０２７１】
図１２は、シグナル又はノイズ細胞標識の非限定的なｔＳＮＥプロットを示す。ＰＢＭＣ細胞を確率的にバーコーディングした。図１２における５４５０個の細胞標識は、低発現レベルを有する真の細胞標識２４０個及びノイズ細胞標識５２１０個を含んだ。特に、分類は、まず、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）を使用して発現ベクトルを二次元（２Ｄ）空間に投影し、ノイズを含むアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳｃａｎ）により２Ｄ座標をクラスタリングすることにより行われた。５４５０個の細胞標識の大半がノイズ細胞標識であるという知識を用いて、支配的なクラスタはノイズ標識クラスタであると結論付けられ、他の３つの小さなクラスタは、３つの異なる細胞タイプの真の細胞標識であると結論付けられた。
【０２７２】
全体で、これらのデータは、真の細胞標識及びノイズ細胞標識を識別することは、真の細胞標識に関連付けられた発現パターンのクラスタリングによって達成できることを示す。
【０２７３】
実施例３
真の細胞標識及びノイズ細胞標識の識別−二次導関数
この実施例は、細胞（又は細胞標識）に関連付けられたリード（又は分子）数に基づいて、真の細胞（シグナル細胞標識又は真の細胞標識とも呼ばれる）及びノイズ（ノイズ細胞又はノイズ細胞標識とも呼ばれる）を分離することについて説明する。
【０２７４】
実施例データセット１
このデータセットは、３つの別個の乳がん細胞株を有するＢＤ（商標）乳がん遺伝子パネル（ＢｒＣａ４００）及びドナー単離ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を使用して処理された。図４を参照して説明した方法４００ｂは、８０１７個の細胞を識別し、そのうち、１８６個の細胞は、図６を参照して説明した方法６００ａによってノイズ細胞と識別された。方法６００ａは、追加の１２６３個の細胞を検出し、これらは主にＰＢＭＣであると確認された。図１３Ａ、図１３Ｂ、図１４Ａ〜図１４Ｄ参照。図１３Ａ及び図１３Ｂは、３つの別個の乳がん細胞株を有するＢＤ（商標）乳がん遺伝子パネル及びドナー単離ＰＢＭＣを使用して処理された試料についての図４を参照して示した方法４００により識別された細胞（図１３Ａ）と、図６Ａを参照して示した方法６００ａにより識別された細胞（図１３Ｂ）との比較を示す非限定的で例示的なプロットである。図１３Ａ及び図１３Ｂの両方で青く標識されたドットは、両方法により検出された共通の細胞である。図１３Ａにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞である。図１３Ｂにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａにより識別された追加の真の細胞である。図１４Ａは、方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、赤く標識された細胞は、識別された追加の細胞（図４を参照して示した方法４００により識別された細胞と比較して）である。細胞は、Ｂ細胞（図１４Ｂ）、ＮＫ細胞（図１４Ｃ）、及びＴ細胞（図１４Ｄ）等のＰＢＭＣの発現によって着色さる。図１４Ｂ〜図１４Ｄは、方法６００ａによって識別された追加の細胞が実際に真の細胞であることを示す。
【０２７５】
実施例データセット２
このデータセットは、健康なドナーから単離されたＰＢＭＣと共にＢＤ（商標）血液遺伝子パネル（Ｂｌｏｏｄ５００）を使用して処理された。図４を参照して説明した方法４００ｂは、１３，９５０個の細胞を識別し、そのうち、１，３３３個の細胞は、図６を参照して説明した方法６００ａによってノイズ細胞と識別された。方法６００ａは、追加の３，８４２個の細胞を検出し、これらは主にＴ細胞であると確認され、ＬＡＴ（Ｔ細胞活性化のリンカー）及びＩＬ７Ｒ（インターロイキン７レセプター）等の重要遺伝子において発現した。図１５Ａ、図１５Ｂ、図１６Ａ、図１６Ｂ、及び図１７Ａ〜図１７Ｄ参照。図１５Ａ及び図１５Ｂは、健康なドナーから単離されたＰＢＭＣと共にＢＤ（商標）血液遺伝子パネルを使用して処理された試料についての図４を参照して示した方法４００により識別された細胞（図１５Ａ）と、図６Ａを参照して示した方法６００ａにより識別された細胞（図１５Ｂ）との比較を示す非限定的で例示的なプロットである。図１５Ａ及び図１５Ｂの両方で青く標識されたドットは、両方法により検出された共通の細胞である。図１５Ａにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞である。図１５Ｂにおいて赤く標識されたドットは、方法６００ａにより識別された追加の真の細胞である。図１６Ａ及び図１６Ｂは、方法４００により識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットである。図１６Ａでは、赤く標識されたドットは、方法６００ａによりノイズとして識別された細胞である。図１６Ｂでは、細胞は、ＣＤ１４及びＳ１００Ａ６等の単核細胞マーカー遺伝子群の発現により着色される。改善されたアルゴリズムによって識別された「ノイズ」細胞は主に、単核細胞の発現が低かった。図１７Ａは、方法６００ａにより識別された細胞を示す非限定的で例示的なプロットであり、赤く標識された細胞は、識別された追加の細胞である。細胞は、Ｔ細胞の発現（図１７Ｂ）、重要遺伝子ＬＡＴの発現（図１７Ｃ）、及びＩＬ７Ｒの発現（図１７Ｄ）により着色される。
【０２７６】
全体で、シグナル細胞標識又は真の細胞標識を識別する方法の異なる実施形態が、異なる性能を有し、互いに相補的であり得ることデータ。
【０２７７】
上述した実施形態の少なくとも幾つかでは、実施形態で使用された１つ又は複数の要素は、別の実施形態での置換が技術的に実現可能ではない場合を除き、別の実施形態において交換可能に使用することができる。特許請求の範囲に記載される趣旨の範囲から逸脱せずに、様々な他の省略、追加、及び改変を上述した方法及び構造に行い得ることが当業者には理解される。そのような可変及び変更は全て、添付の特許請求の範囲により規定される趣旨の範囲内にあることが意図される。
【０２７８】
本明細書での略あらゆる複数の及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は、状況及び／又は用途に適切なように、複数から単数に及び／又は単数から複数に変換することができる。様々な単数／複数の置換は、明確性を目的として、本明細書に明示的に記載され得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、状況により明確に別段のことが示される場合を除き、複数形を含む。本明細書での「又は」への任意の言及は、別段のことが記載される場合を除き、「及び／又は」を包含することが意図される。
【０２７９】
一般に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）において使用される用語が一般に、「オープン」ターム（例えば、「含み（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語が、「限定ではなく、〜を含み」として解釈されるべきであり、「有し」という用語が「少なくとも〜を有し」として解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語が、「限定ではなく、〜を含む」として解釈されるべきである等）として意図されることが当業者により理解される。導入される請求項の記載において特定の数が意図される場合、そのような記載は請求項において明確に記載され、そのような記載がない場合、そのような意図は存在しないことが当業者により更に理解される。例えば、理解の助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、「少なくとも１つの」及び「１つ又は複数の」という導入句を使用して、請求項の記載を導入することがある。しかしながら、このような句の使用は、たとえ同一のクレームに「１つ又は複数の」又は「少なくとも１つの」という導入句及び「ａ」又は「ａｎ」等の不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の記載の導入が、そのような導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項も、そのような記載を１つのみ含む実施形態に限定することを暗示すると解釈されるべきではなく（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、「少なくとも１つの」又は「１つ又は複数の」を意味すると解釈されるべきである）、定冠詞を使用して請求項の記載を導入する場合にも同じことが当てはまる。加えて、導入される請求項の記載において特定の数が明確に記載される場合も、そのような記載は、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は理解する（例えば、他に修飾語のない、単なる「２つの記載事項」という記載は、少なくとも２つの記載事項、又は２つ以上の記載事項を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣ等の少なくとも１つ」に類する表現が用いられる場合、一般に、そのような表現は、当業者がその表現を理解する意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」には、限定ではなく、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢの両方、Ａ及びＣの両方、Ｂ及びＣの両方、及び／又はＡ、Ｂ、及びＣの全て等を有するシステムが含まれる）。「Ａ、Ｂ、及びＣ等の少なくとも１つ」に類する表現が用いられる場合、一般に、そのような表現は、当業者がその表現を理解する意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」には、限定ではなく、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢの両方、Ａ及びＣの両方、Ｂ及びＣの両方、及び／又はＡ、Ｂ、及びＣの全て等を有するシステムが含まれる）。さらに、２つ以上の代替可能な用語を表す実質的に任意の離接語及び／又は離接句は、説明、請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、用語のうち１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性が意図されると理解されるべきであることが、当業者には理解される。例えば、「Ａ又はＢ」という句は、「Ａ」若しくは「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むことが理解される。
【０２８０】
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループによって記載されると、それにより本開示がマーカッシュグループのあらゆる個々の要素又は要素のサブグループの観点からも記載されるということを当業者は認識する。
【０２８１】
当業者に理解されるように、記述を提供する等のあらゆるかつ全ての目的のため、本明細書に開示される全ての範囲は、あらゆるかつ全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組合せをも含む。挙げられたあらゆる範囲は、少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等へと細分化される同一の範囲を十分に記載し、且つ可能にしていることが容易に認識される。非限定的な例として、明細書で記載される各範囲は、下部３分の１、中部３分の１、上部３分の１等に容易に分けられる。また、当業者には理解されるように、例えば、「まで（ｕｐ  ｔｏ）」「少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ）」「より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）」「未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）」等の全ての文言は、記載される数を含み、上述のような部分範囲に続いて細分化し得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は個々の要素を含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１個、２個、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に１〜５個の細胞を有する群は、１個、２個、３個、４個、又は５個の細胞を有する群等を指す。
【０２８２】
様々な態様及び実施形態が本明細書に開示されたが、他の態様及び実施形態が当業者に明らかになろう。本明細書に開示される様々な態様及び実施形態は、例示を目的とし、限定を意図せず、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2020500017.tif 000003
【図２】
2020500017.tif 000004
【図３】
2020500017.tif 000005
【図４】
2020500017.tif 000006
【図５】
2020500017.tif 000007
【図６Ａ】
2020500017.tif 000008
【図６Ｂ】
2020500017.tif 000009
【図７】
2020500017.tif 000010
【図８Ａ】
2020500017.tif 000011
【図８Ｂ】
2020500017.tif 000012
【図９】
2020500017.tif 000013
【図１０】
2020500017.tif 000014
【図１１】
2020500017.tif 000015
【図１２】
2020500017.tif 000016
【図１３Ａ】
2020500017.tif 000017
【図１３Ｂ】
2020500017.tif 000018
【図１４Ａ】
2020500017.tif 000019
【図１４Ｂ】
2020500017.tif 000020
【図１４Ｃ】
2020500017.tif 000021
【図１４Ｄ】
2020500017.tif 000022
【図１５Ａ】
2020500017.tif 000023
【図１５Ｂ】
2020500017.tif 000024
【図１６Ａ】
2020500017.tif 000025
【図１６Ｂ】
2020500017.tif 000026
【図１７Ａ】
2020500017.tif 000027
【図１７Ｂ】
2020500017.tif 000028
【図１７Ｃ】
2020500017.tif 000029
【図１７Ｄ】
2020500017.tif 000030
【国際調査報告】
2020500017.tif 000031
2020500017.tif 000032
2020500017.tif 000033