(57)【要約】  本開示は、組換え宿主細胞で発現されたポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、発酵後に、セレナイトおよび／またはその塩若しくは誘導体を組換え宿主細胞の収穫溶液に加えることを含み、ここで、ポリペプチド中のジスルフィド結合は還元されないままである、方法に関する。【選択図】図１
2020536083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞で発現されたポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、発酵後に、セレナイトを組換え宿主細胞の収穫溶液に加えることを含み、ここで、ポリペプチド中のジスルフィド結合は還元されないままである、方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが抗体の生物学的に機能的な断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が真核細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞が哺乳動物細胞を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
セレナイトを収穫物溶液に０．０１〜１００ミリモルの範囲で加える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記セレナイトを収穫物溶液に０．１〜１０ミリモルの範囲で加える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記セレナイトが、亜セレン酸カルシウム、亜セレン酸ナトリウム、および亜セレン酸カリウムからなる群から選択される亜セレン酸塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＩｇＧ抗体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ２を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
収穫された細胞培養液（ＨＣＣＦ）からポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
収穫された細胞培養液（ＨＣＣＦ）からポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記セレナイトが：
（ａ）五水和物の形態または無水形態であり；
（ｂ）０．０１〜１００ミリモルの濃度で添加され：
（ｃ）０．１〜１０ミリモルの濃度で添加され；
（ｄ）０．１〜４ミリモルの濃度で添加され；または
（ｅ）前記収穫前または収穫された培養液中のセレナイト濃度の少なくとも約２倍の濃度で添加される、
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術背景】
【０００１】
技術背景
バイオ医薬品業界では、細胞培養を使用してさまざまな治療用タンパク質を生産している。原核生物と真核生物の両方を含むさまざまな細胞型が、組換え治療用タンパク質を発現させることに使用できる。バイオ医薬品業界は、適切に折りたたまれた、翻訳後修飾されたタンパク質を生成する能力があるため、哺乳動物細胞に大きく依存している。治療用タンパク質の製造は通常、バイオリアクターで細胞を培養することから始まる。さまざまな栄養素とプロセスパラメータが、最適な細胞増殖とタンパク質産生を確実にするためにモニターされる。治療用タンパク質は通常分泌されるため、タンパク質を回収する最初のステップは細胞を取り除くことである。バイオリアクター内および細胞除去中に、細胞は溶解し、組換えタンパク質を変化または分解する可能性のある成分を放出する。例えば、酵素や収穫物中の他の成分は、ジスルフィド結合を還元する可能性がある。無傷のジスルフィド結合はタンパク質の構造と機能を維持するために重要であるため、ジスルフィドの還元を防ぐ方法は非常に重要である。
【技術分野】
【０００２】
概要
実施形態は、発酵後、セレナイト（ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、その塩および／または誘導体を組換え宿主細胞の収穫溶液に添加することを含む、ここで、ポリペプチドにおけるジスルフィド結合は還元されないままでいる、組換え宿主細胞において発現されるポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
図面の簡単な説明
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するであろう。図面は、本教示または特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【図１】図１は、プロジェクト１の収穫物（ＩｇＧ２を発現するＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞）とさまざまな濃度の亜セレン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を使用したジスルフィド還元アッセイを示す。
【図２】図２は、プロジェクト２の収穫物（ＩｇＧ１を発現するＣＨＯ−Ｍ細胞）および様々な濃度の亜セレン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を使用するジスルフィド還元アッセイを示す。
【図３】図３は、ＴＦＰＩ収穫物および最小限の細胞溶解を使用して行われた最初の実験結果を示す。
【図４】図４は、ＴＦＰＩ収穫物および完全に溶解した細胞を使用して実施した２回目の実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
詳細な説明
この開示は、ポリペプチドのジスルフィド結合還元の防止に関する方法を提供する。
【０００５】
定義
適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、逆もまた同様である。以下に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている文書を含む他の文書におけるその単語の使用と矛盾する場合、反対の意味が明確に意図されていない限り（例えば、その用語が最初に使用された文書において）、以下に示す定義は、本明細書とその関連請求項を解釈する目的で常に制御する。「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。ここで、「１つ（ａ）」の使用は、特に明記しない限り、又は「１つ以上」の使用が明らかに不適切でない限り、「１つ以上」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ，）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ，）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ，）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ，）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は交換可能であり、限定的でない。例えば、「含む」という用語は「含むがそれに限定されない」ことを意味するものとする。
【０００６】
本明細書で使用される「ＴＦＰＩ」という用語は、細胞によって自然に発現され、血漿中に存在するその形態のＴＦＰＩの任意の変異体、アイソフォーム、および／または種ホモログを指す。
【０００７】
本明細書で使用される「ＴＦＰＩ」という用語は、本明細書で使用されるＴＦＰＩの活性化形態を指し、「抗体」は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖を指す。この用語は、天然に存在するか、通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組み換えプロセスによって形成される完全長免疫グロブリン分子（ＩｇＧ抗体など）、又は特異的結合活性を保持する抗体フラグメントなどの免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分を含む。構造に関係なく、抗体断片は完全長抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体フラグメントは、ＴＦＰＩのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行できる。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）孤立した相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９−５７参照）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；および（ｉｘ）ＩｇＮＡＲを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは組み換え法を使用して、ＶＬとＶＨ領域がペアになって一価の分子を形成する単一のたんぱく質鎖として作成できるようにする合成リンカーによって結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及び  Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じ方法で有用性について分析される。
【０００８】
さらに、抗原結合フラグメントは、抗体ミメティックに包含され得ることが企図される。本明細書で使用される「抗体ミメティック」または「ミメティック」という用語は、抗体と同様の結合を示すが、より小さい代替抗体または非抗体タンパク質であるタンパク質を意味する。このような抗体ミメティックは、足場に含まれ得る。「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」という用語は、調整された機能と特性を備えた新製品を設計するためのポリペプチドプラットフォームを指す。
【０００９】
本明細書で使用される場合、「抗ＴＦＰＩ抗体」という用語は、そのエピトープおよびそのヘパリン関連複合体に特異的に結合する抗体を指す。インビボでＴＦＰＩのエピトープに結合すると、本明細書に開示される抗ＴＦＰＩ抗体は、血液凝固カスケードの１つまたは複数の局面を増強する。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「結合を阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「結合を遮断する（ｂｌｏｃｋｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」（例えば、ＴＦＰＩ基質のＴＦＰＩへの結合の阻害／遮断を指す）は互換的に使用され、その基質によるタンパク質の部分的および完全な阻害または遮断の両方を包含し、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の阻害または遮断が包含される。本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」は、示された数値の＋／−１０％を意味する。
【００１１】
ＴＦＰＩへのＴＦＰＩ基質の結合の阻害および／または遮断に関して、阻害および遮断という用語には、抗ＴＦＰＩ抗体と接触していない場合と比較して、抗ＴＦＰＩ抗体と接触している場合の生理学的基質に対するＴＦＰＩの結合親和性の測定可能な減少も含まれ、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％のＴＦＰＩとその基質との相互作用を阻害することを含む。
【００１２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、単一のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、ランダムな、またはインビトロでの部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。
【００１３】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する抗体を含む他の生体分子を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離された抗体は、ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、乾燥重量で少なくとも約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、約９９．９％または約１００％純粋である。いくつかの実施形態では、純度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などの方法によって測定することができる。しかしながら、ヒトＴＦＰＩのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離された抗体は、例えば、他の種（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）由来の他の関連する抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないことが可能である。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、「特異的結合」を示す抗体は、少なくとも約１０−５Ｍの親和性で抗原に結合し、無関係な抗原に関する親和性よりも高い親和性、例えば、少なくとも２倍高い親和性で、その抗原に結合する（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「最小結合（ｍｉｎｉｍａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、特定の抗原に結合しない、および／または特定の抗原に対して低い親和性を示す抗体を指す。典型的には、抗原への最小結合を有する抗体は、約１０２Ｍ−１よりも低い親和性でその抗原に結合し、無関係な抗原に結合するよりも高い親和性で所定の抗原に結合しない。
【００１５】
本明細書で使用する場合、ＩｇＧ抗体などの抗体の「高親和性（ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）」という用語は、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも１つの実施形態では少なくとも約１０−８Ｍの結合親和性を指し、いくつかの実施形態では、少なくとも約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１若しくはより大きい、例えば、１０１３Ｍ−１若しくはより大きい結合親和性を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプによって異なり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合は、少なくとも約１０７Ｍ−１の結合親和性を指す。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【００１７】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合した抗原の三次元構造に相補的であるＮ末端抗原結合表面を形成する抗体分子の、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３つの超可変領域の１つを指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これら相補性決定領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される［Ｗｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｂｉｌｏｆｓｋｙ  Ｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９７５  Ｄｅｃ；７２（１２）：５１０７およびＷｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９７０  Ａｕｇ  １；１３２（２）：２１１］。ＣＤＲは抗原−抗体結合に関与しており、ＣＤＲｓは抗原−抗体結合に特異的な固有の領域を含む。したがって、抗原−結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲ領域を含む、６つのＣＤＲｓを含むことができる。「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、抗体が特異的に結合または相互作用する抗原の領域（ａｒｅａ）または領域（ｒｅｇｉｏｎ）を指し、いくつかの実施形態では、抗原が抗体と物理的に接触している場所を示す。逆に、「パラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）」という用語は、抗原が特異的に結合する抗体の領域（ａｒｅａ）または領域（ｒｅｇｉｏｎ）を指す。対応する抗体の結合が相互に排他的である場合、つまり、ある抗体の結合が別の抗体の同時結合を排除する場合、競合結合を特徴とするエピトープは重複していると言える。抗原が対応する両方の抗体の結合に同時に対応できる場合、エピトープは別（ユニーク（ｕｎｉｑｕｅ））であるという。
【００１８】
本明細書で使用される「競合する抗体」という用語は、本明細書に記載のＴＦＰＩに対する抗体とほぼ、実質的または本質的に同じ、またはさらには同じエピトープに結合する抗体を指す。「競合する抗体」には、エピトープ特異性が重複する抗体が含まれる。したがって、競合する抗体は、ＴＦＰＩへの結合について、本明細書に記載の抗体と効果的に競合することが可能である。いくつかの実施形態では、競合する抗体は、本明細書に記載される抗体と同じエピトープに結合することができる。別の見方をすれば、競合する抗体は、本明細書に記載される抗体と同じエピトープ特異性を有する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」は、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失をもたらさない類似の生化学的特性を有するアミノ酸への１つ以上のアミノ酸の置換を含むポリペプチドの修飾を指す。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００２０】
本開示の抗体は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有することができるが、抗原結合活性を保持している。
【００２１】
核酸およびポリペプチドの場合、「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸または２つのポリペプチド、またはその指定された配列が、最適に整列および比較された場合、適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または削除と同一であることを示し、少なくとも約８０％の核酸またはアミノ酸、通常は８５％で同一であることを示し、いくつかの実施形態では約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％、少なくとも１つの実施形態では少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、または９９．５％のヌクレオチドまたはアミノ酸で同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合、核酸の実質的な相同性が存在する。本明細書に記載される特定の核酸配列およびアミノ酸配列と実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列も含まれる。２つのシーケンス間の同一性の割合は、２つのシーケンスの最適なアラインメントのために導入する必要がある各ギャップの長さおよびギャップがいくつあるかを考慮した、シーケンスによって共有される同一の位置の数の関数である（つまり、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数ｘ１００）。シーケンスの比較と２つのシーケンス間の同一性の割合の決定は、数学アルゴリズム、例えば限定なしに、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸＴＭモジュール、を使用して達成できる。ＡｌｉｇｎＸＴＭの場合、マルチプルアライメントのデフォルトパラメータは、ギャップ開始ペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アライメントディレイの同一性％：４０。
【００２２】
２つのシーケンス間の同一性の割合は、２つのシーケンスの最適なアラインメントのために導入する必要がある各ギャップの長さおよびギャップがいくつあるかを考慮した、シーケンスによって共有される同一の位置の数の関数である（つまり、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数ｘ１００）。シーケンスの比較と２つのシーケンス間の同一性の割合の決定は、数学アルゴリズム、例えば限定なしに、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＴＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸＴＭモジュール、を使用して達成できる。ＡｌｉｇｎＸＴＭの場合、マルチプルアライメントのデフォルトパラメータは、ギャップ開始ペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アライメントディレイの同一性％：４０（差に詳細は以下を参照、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡＣｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｆｏｒ−  ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌ）。
【００２３】
クエリ配列（本開示の配列）とグローバル配列アラインメントとも呼ばれる対象配列との間の最良の全体的な一致を決定する別の方法は、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、２（２２）：４６７３−４６８０）を使用して決定することができ、これはＨｉｇｇｉｎｓらのアルゴリズムに基づいている（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）、１９９２、８（２）：１８９−  １９１）。配列アラインメントでは、クエリと対象の配列はどちらもＤＮＡ配列である。前記グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントである。ペアワイズアライメントを介して同一性％を計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにおいて使用できるパラメーターは、マトリクス＝ＩＵＢ、ｋ−タプル＝１、上部対角線の数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１である。複数のアライメントの場合、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメーターが使用できる：ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長パラメーター＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アライメントディレイの同一性％＝４０。
【００２４】
核酸は、細胞全体、細胞溶解物、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。核酸は、それが自然環境で通常関連している他の細胞成分から精製されたときに「単離されており」または「実質的に純粋にされている」。核酸を分離するには、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィーなどの標準的な技術を使用できる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、提供された単位値の±１０％を指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、関心のある特徴または特性の全体またはおおよその程度を示す定性的状態を指す。生物学的技術の当業者は、生物学的および化学的組成物および材料の試験、製造、および保管に影響を与える多くの変数のために、および生物学的および化学的物質、組成物および材料の試験、製造、および保管に使用される機器および機器に固有の誤差のために、生物学的および科学的現象が絶対的な結果を達成または回避することはほとんどないことを理解している。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるために使用される。
【実施例】
【００２７】
実施例１−材料
細胞培養液は、標準的な製造手順を使用して生成された。簡単に説明すると、抗体を発現するＣＨＯ細胞を、２Ｌまたは５Ｌのガラス製攪拌タンクバイオリアクターに接種するのに十分な細胞数に達するまで、振とうフラスコで培養した。接種後、溶存酸素、ｐＨ、温度、および攪拌速度を制御し、毎日のサンプルを分析して精度を確保した。接種後２日目から濃縮栄養飼料を継続的に添加し、必要に応じてグルコース溶液を添加して十分な栄養を提供した。細胞培養液を接種の１４日後に採取した。特に明記しない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【００２８】
実施例２−小規模還元アッセイ
採取した細胞培養液を、窒素を満たしたグローブバッグ（Ａｔｍｏｓｂａｇ、Ｓｉｇｍａ）に入れた。４０ｍＬの収穫物を氷上で５０ｍＬのコニカルチューブに注ぎ、２０分間冷却した。次に、収穫物を氷上（Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  １００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、パワー３で６０秒間超音波処理した。この設定により、約９９％の細胞溶解が生じた。コニカルチューブをしっかりと閉じ、バッグから取り出し、４０００ｘｇで１５分間遠心分離した。次にチューブをバッグに戻し、窒素で再度パージした。溶解した細胞上清を０．４５ｕｍ滅菌フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、９６ディープウェルプレートに移した。溶解した細胞の上清を、酸素に曝すことなく室温でインキュベートした。各時点で、２００ｕＬのサンプルを１７．４ｕＬの２５０ｍＭ  ＮＥＭでクエンチして、すべての遊離チオールをキャップした。クエンチしたサンプルは、精製および／または分析まで４Ｃで保存した。インヒビターを試験するために、３Ｍ亜セレン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のストック溶液を、０〜１９０ｍＭの範囲の濃度になるように、溶解した細胞の上清にインキュベーションの開始時に加えた。阻害剤の添加後０、２４、および４８時間で、試料を採取し、急冷した。
【００２９】
実施例３−バッチプロテインＡの精製
抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅアフィニティー樹脂を使用して、採取した細胞培養液から精製した。平衡化緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。洗浄バッファーは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２であった。溶出バッファーは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．７で、中和バッファーは１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０であった。９６ウェルフィルタープレートで、２０ｕＬの樹脂スラリー（平衡バッファー中５０％ｖ／ｖ）を１７０ｕＬのクエンチした回収細胞培養液と混合した。プレートを３０分間インキュベートし、次に９６ウェルプレートを用いて遠心分離し、フロースルーをキャッチしたが、これは廃棄した。すべての遠心分離ステップは４０００ｘｇで１０分間行った。樹脂を１２０ｕＬの洗浄バッファーで洗浄し、遠心分離した後、１２０ｕＬの平衡化バッファーで洗浄し、再度遠心分離した。２回の洗浄ステップの後、５０ｕＬの溶出バッファーをフィルタープレートに加え、３分間インキュベートしました。きれいな９６ウェルプレートに２８ｕＬの中和バッファーを準備し、溶出液の回収に使用した。抗体溶液を上下にピペッティングして混合し、分析するまで−７０℃で保存した。
【００３０】
実施例４−キャリパーアッセイ
キャピラリー電気泳動測定は、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  ＩＩで取得した。メーカーの指示に従って行った。デジタルゲルのような画像は、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸソフトウェアを使用して生成された。
【００３１】
還元は、無酸素環境で収穫された細胞培養液を完全に溶解することによって研究された。これにより、細胞内還元成分の放出が最大化され、酸素干渉が最小化され、酸素によるジスルフィドの再酸化が防止された。これにより、「最悪のケース」または可能な限りの還元条件下で還元阻害剤を試験することができた。溶解した細胞液から抗体を精製し、サイズに基づいてタンパク質を分離し、鎖間ジスルフィド結合の切断を検出できる非還元キャピラリー電気泳動を使用してそれを分析することにより、抗体ジスルフィド還元を経時的にモニターした。
【００３２】
ジスルフィド還元を防ぐためのセレナイトの効果をテストするために、様々な濃度の亜セレン酸ナトリウムを、プロジェクト１（ＩｇＧ２を発現するＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞）およびプロジェクト２（ＩｇＧ２を発現するＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞）の嫌気性溶解細胞培養物に加え、結果を図１及び図２に示す。２４時間の還元を防ぐためのセレナイトの最小濃度は、プロジェクト１の場合は０．２〜０．３ｍＭ、プロジェクト２の場合は０．８〜１．６ｍＭである。プロジェクト２の還元を防ぐには、より高濃度のセレナイトが必要だった。これはＩｇＧ１分子がＩｇＧ２分子よりも還元を受けやすいこと、または２つの細胞株における還元酵素の発現の違いが原因である可能性がある。このアッセイでは、最も還元性が高い状態で必要な阻害剤の濃度を測定した（すべての細胞内還元成分が放出され、酸素は導入されなかった）。より現実的な明確化された収穫条件下での還元を防ぐには、より低い濃度で十分かもしれない。高濃度のセレナイトも効果的である。
【００３３】
注目すべきことに、収穫した細胞培養液（ＨＣＣＦ）に亜セレン酸ナトリウムを添加することにより、抗体のジスルフィド還元を防ぐことが発見された。セレナイトは、チオレドキシン還元酵素およびグルタチオン還元酵素、抗体の還元に貢献するかもしれない２つの細胞内酵素のための基質です。どちらの酵素も、ジスルフィドを還元するためにＮＡＤＰＨを必要とした。 セレナイトは、おとりの基質として作用することがある。したがって、理論的に、酵素はセレナイトを還元し、抗体の還元が起こる前にＮＡＤＰＨの供給を枯渇させる。
【００３４】
実施例５−実験
実験１：
デプスフィルターを使用して、ＴＦＰＩ細胞培養収穫物を明確にした。亜セレン酸ナトリウムの濃縮溶液を得られた無細胞収穫物に添加して、０、１５０、および５００ｕＭの濃度を達成した（図３を参照）。次に、収穫物を窒素下（酸素阻害を防ぐため）で２４時間保持した。窒素保持後、抗体を精製し、キャピラリー電気泳動を使用してジスルフィド還元を分析した。還元は５００ｕＭのセレナイトによって防止されたが、１５０ｕＭのセレナイトによっては防止されなかった。
【００３５】
実験２：
ＴＦＰＩ細胞培養物を、ソニケーターを使用して窒素下で溶解した。細胞片を取り除き、亜セレン酸ナトリウムの濃縮溶液を加えて、セレナイトの濃度を０〜５００ｕＭにした（図４を参照）。サンプルを窒素下で４８時間保管した。次に抗体を精製し、キャピラリー電気泳動を使用してジスルフィド還元を分析した。還元は３００ｕＭのセレナイトによって完全に防止されたが、２００ｕＭのセレナイトによっては防止さなかった。したがって、これらの収穫条件下で必要な濃度は２００〜３００ｕＭである。実験間の主な違い（テストしたセレナイトの濃度以外）：実験１は、デプスフィルターを使用して明確にし、２４時間保持されたＴＦＰＩ収穫物で行われた。この明確化の間、最小限の細胞溶解が起こるはずである。実験２は、細胞がすべて完全に溶解され、還元に寄与する可能性のあるすべての内部成分を放出し、４８時間保持されたＴＦＰＩ採取で行われた。これは、抗体還元の最悪のシナリオである。セレナイトは、この最悪のシナリオにおいて、還元を防ぐのに依然として効果的であった。
【００３６】
実施形態は、様々なセレナイト溶液の可能な使用を提供する。セレナイト溶液は、例えば、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウムなどを含み得る。それは哺乳類の細胞、細菌、酵母などで産生されたタンパク質に効果的であるはずである。抗体だけでなく、ジスルフィド結合を持つすべてのタンパク質に効果的であるはずである。セレナイトは特別な装置を必要とせず、製品の安定性に影響を与える可能性が低いため、、還元を防ぐための他の技術（金属の追加、グルタチオンの追加、空気／Ｏ２スパージングなど）よりも優れている。  還元を防ぐために金属を追加すると、たんぱく質の沈殿（Ｌｉ，Ｏｓｂｏｒｎｅら、２０１２）、酸化（Ｌｉ，Ｎｇｕｙｅｎら、１９９５；Ｍａｓａｒａｗら、２００９）、および／または切断（ＲｕｓｔａｎｄおよびＷａｎｇ  ２００１、ＹａｎおよびＢｏｙｄ  ２０１１）が誘発され、抗体の安定性に悪影響を及ぼす可能性がある。空気または酸素を使って収穫物をスパージングすると、気液界面でのタンパク質の変性や凝集が増加する可能性がある（Ｗｉｅｓｂａｕｅｒら、２０１３；Ｒｕｄｉｋら、２０１２）。また、収穫物スパージングには専用の収穫物タンクが必要である。酸化されたグルタチオンは、収穫物中の成分によって一旦還元されると、ジスルフィド結合または酸化剤を還元する可能性がある。
【００３７】
本実施形態を特定の実施形態および実施例を参照して説明したが、添付の特許請求の範囲の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更が可能であり、同等物を代用できることを理解されたい。したがって、明細書および実施例は、制限的な意味ではなく、例示的なものと見なされるべきである。さらに、本明細書で言及されるすべての記事、本、特許出願および特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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