(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＤ４０受容体に特異的に結合し、Ｆｃｙに仲介されるＣＤ４０受容体架橋に依存しないＣＤ４０シグナル伝達を誘導することができる、ヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片に関する。本発明の抗体は、ＣＤ４０リガンドのエピトープと重複するＣＤ４０エピトープに結合し、ヒトＡＰＣを活性化することができる。本発明はまた、前記抗体を含む組成物、並びにがんを患っている患者の治療における抗体及び組成物の使用も提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ４０受容体に特異的に結合し、Ｆｃγに仲介されるＣＤ４０受容体架橋に依存しないＣＤ４０シグナル伝達を誘導することができる、アゴニスト性モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項２】
抗体がヒト化ＩｇＧ１ＬＡＬＡ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
少なくともヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又はヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅにおいてアミノ酸置換を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ＣＤ４０Ｌの結合部位と重複するエピトープに結合する、前記請求項の何れかに記載の抗体。
【請求項５】
抗体がヒトＡＰＣを活性化する、前記請求項の何れかに記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、単球、骨髄細胞、及び腫瘍細胞を含む群から選択される細胞を活性化する、前記請求項の何れかに記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、腫瘍細胞に間接的な免疫細胞に仲介される細胞傷害性効果を有する、前記請求項の何れかに記載の抗体。
【請求項８】
前記請求項の何れかに記載の抗体であって、
（ａ）Ｆｃγ受容体に結合しない；
（ｂ）４９．５ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴うＣＤ４０細胞結合親和性を有する、
（ｃ）１５．７ｎＭ以下のＫＤ値を有する；
（ｄ）１０．３ｎＭ以下のＫＤ値を伴いカニクイザルＣＤ４０と交差反応性である；
（ｅ）ＣＤ４０へ結合することによりＣＤ４０Ｌを阻害する；
（ｆ）ＣＤ４０Ｌに仲介される機能の相乗的及び相加的効果を防ぐ；
（ｇ）２０８ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴う、ＩＬ１２ｐ７０放出により測定される、
及び／又は、１４８ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴う、樹状細胞における少なくとも７．５倍のＣＤ８６の誘導により測定される、
抗原提示細胞の成熟を誘導する；及び／又は
（ｈ）細胞表面上のＣＤ４０のレベルを５０％未満に減少させる、
の少なくとも１つの特性を更に有する抗体。
【請求項９】
前記請求項の何れかに記載の抗体であって、該抗体が、
ａ）配列番号２９＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号４３＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号５７＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＨ領域の群から選択され、ここでｎは０から１３からなる群から選択される数であるＶＨ領域である、及び
ｂ）配列番号７１＋ｍのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号８５＋ｍのＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号９９＋ｍのＣＤＲ３Ｌ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＬ領域の群から選択され、ここでｍは０から１３からなる群から選択される数であるＶＬ領域である、
を含み、
ここでＣＤＲは本発明に従う活性を減少させない任意の１つ以上のアミノ酸変異を含んでもよい、抗体。
【請求項１０】
抗体が、配列番号１から１４のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域と少なくとも８５％同一である重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、前記何れかの請求項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体が、配列番号１５から２８のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域と少なくとも８５％同一である軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、前記何れかの請求項に記載の抗体。
【請求項１２】
がんを患っている患者の治療に使用するための、前記何れかの請求項に記載の抗体。
【請求項１３】
がんが固形腫瘍である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
がんが、膵臓がん（pancreas cancer）、進行膵臓がん腫肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞（bronchioloalviolar cell）肺がん、骨がん、膵臓がん（pancreatic cancer）、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、腎臓がん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、胆嚢がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、唾液腺がん、又は子宮がんを含む群から選択される、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が、細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤、放射療法、標的療法、免疫療法、又は手術と組み合わせてがんの治療において使用される、請求項  〜請求項１４の何れかに記載の抗体。
【請求項１６】
医薬的に許容可能な担体、及び前記何れかの請求項に記載の抗体の治療有効量を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ４０受容体に特異的に結合し、Ｆｃγに仲介されるＣＤ４０架橋に依存しないＣＤ４０シグナル伝達を誘導することができる、ヒト化アゴニスト性のモノクロ−ナル抗体、又はその抗原結合断片に関連する。本発明は前記抗体及びそれらを含む医薬組成物の使用にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
がんの免疫療法における近年の成功は、免疫系は大部分とは言わないまでも多くのがんを制御することが可能であるという仮説を復活させ、幾つかの場合では多くの低分子薬剤では見られない方法で持続する応答を作製する。アゴニスト性のＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍａｂ）は、様々な機構により抗がん免疫性を生成する潜在力を有する、新たな治療の選択肢を提供する。
【０００３】
ＣＤ４０は細胞表面分子であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。それは多くの非免疫細胞と広範囲の腫瘍と共に、樹状細胞、Ｂ細胞、及び単球等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に広く発現している。
【０００４】
ＣＤ４０の天然のリガンドはＣＤ１５４であり、それは活性化されたＴリンパ球の表面上に主として発現し、免疫応答のためにＴ細胞を「助ける」主要な成分を提供する。ＡＰＣ上のＣＤ４０を介したシグナル伝達は、ヘルパーＴ細胞がＡＰＣにライセンスする能力の大部分を仲介する。ＤＣ上のＣＤ４０のライゲーションは、例えば、共刺激性及びＭＨＣ分子の表面発現の増加、炎症誘発性サイトカインの産生、及びＴ細胞のトリガー作用（triggering）の促進を誘導する。休止しているＢ細胞上のＣＤ４０のライゲーションは、抗原提示機能と増殖を増加させる。
【０００５】
ＣＤ４０シグナル伝達の結果は多面的であり、ＣＤ４０を発現している細胞の型と、ＣＤ４０シグナルが提供されている微小環境に依存する。ＴＮＦ受容体ファミリーの幾つかの他のメンバーと同様に、ＣＤ４０シグナル伝達は、ＣＤ４０細胞質末端の内在的なシグナル伝達活性によるというよりも、むしろアダプター分子により仲介される。受容体が集合した（assembled）ときに下流のキナーゼは活性化され、多成分のシグナル伝達複合体はＣＤ４０からサイトゾルに移動し（translocate）、特性がよく知られた幾つかのシグナル伝達経路が活性化される。
【０００６】
拮抗性のヒトＣＤ４０抗体は、先行技術の中で知られている。各自のアンタゴニスト性の抗体は、Ｆｃγに仲介されるＣＤ４０受容体架橋の減少を示す、サイレントなＦｃ変異体であってもよい。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の各自の変異は、例えば米国公開番号２０１８／０１１８８４３の中に述べられている。
【０００７】
近年に設計された免疫調節的なアプロ−チにおいて、免疫系ががん細胞を認識して破壊する能力を促進するために、ＣＤ４０を標的としたアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が使用された。各自の前臨床試験はアゴニスト性のＣＤ４０ｍＡｂはＡＰＣを活性化して、抗腫瘍性Ｔ細胞応答を促進し、Ｔ細胞免疫性の非存在下でがんを制御する潜在力を有する細胞傷害性の骨髄細胞を育てることができると示している。よってアゴニスト性のＣＤ４０ｍＡｂは、ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１等の、ネガティブなチェックポイント分子を阻害することによる免疫活性化を達成するｍＡｂとは基本的に異なっている。
【０００８】
ＣＰ−８７０，８９３はＣＤ４０の強力且つ選択的なアゴニストとして作動する、最初の完全なヒトＩｇＧ２ｍＡｂである。興味深いことにＣＰ−８７０，８９３の結合は、ＣＤ４０との結合においてＣＤ１５４とは競合しない。前臨床試験において、ＣＰ−８７０，８９３は、腫瘍細胞の生存について免疫系に依存する効果と依存しない効果の両方を仲介すると示されている。最初のヒト内試験において、有望な抗腫瘍活性が、特に黒色腫の患者において観察された。薬力学的にＣＰ−８７０，８９３の投与は、末梢血Ｂ細胞の一時的な減少と、ＡＰＣ上のマーカーの活性化の上方制御（upregulation）をもたらす。
【０００９】
よってアゴニスト性のＣＤ４０ｍＡｂは、新規ながん療法のための有望な戦略を提示する。しかしながら、それらの潜在的な細胞傷害性の副作用に対する懸念も引き起された。アゴニスト性のモノクローナルＣＤ４０抗体は、サイトカイン放出症候群、自己免疫反応、血栓塞栓性症候群（血小板と内皮細胞によるＣＤ４０の発現による）、活性化誘導性の細胞死又は寛容（tolerance）をもたらす過剰免疫刺激、及び腫瘍血管新生を引き起こす、という可能性がある。これらの効果は、不都合な毒性又は腫瘍成長の促進を引き起こすかもしれない。機構的には、アゴニスト性のＣＤ４０と他のＴＮＦ受容体ファミリーが抗体を標的化してＦｃγ受容体と相互作用する能力は、動物研究における毒性の発生と関連付けられている（Li & Ravetch 2012, Xuら, 2003, Byrneら, 2016）。
【００１０】
試験された最も強いアゴニストであるＣＰ−８７０，８９３について、報告されている最も一般的な副作用は、寒気、発熱、悪寒として現れるサイトカイン放出症候群、及び注入直後の他の症候群である。またＣＰ−８７０，８９３について、血栓塞栓イベントのケースも幾つか観察されている。ダセツズマブについて、非感染性の炎症性眼疾患が観察されている。
【００１１】
従って細胞毒性が低下し、臨床上の副作用をより少なくする一方で、それらの効力と臨床上の有効性を維持している、アゴニスト性のＣＤ４０ｍＡｂを提供する必要性がある。本発明のアゴニスト性のＣＤ４０ｍＡｂはこの必要性を充たすことが可能であり、アゴニスト性のＣＤ４０抗体の免疫調節性の潜在力を最大限に引き出すことができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ヒトＣＤ４０受容体に特異的に結合し、Ｆｃγに仲介されるＣＤ４０受容体架橋に依存しないＣＤ４０シグナル伝達を誘導するモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供する。より特異的には、本発明の抗体は、ＣＤ４０リガンドのエピトープと重複するＣＤ４０エピトープに結合し、ヒトＡＰＣを活性化することができる。本発明は前記抗体を含む組成物、及び、がんを患っている患者の治療等、免疫系の刺激が望まれている障害（condition）又は疾患（disease）の治療におけるその抗体と組成物の使用も提供する。
【００１３】
定義
用語「抗体」は、抗体全体及び抗体断片を含むが、それが本発明に従った性質を示す限り、それに限定されるものではなく、様々な型の抗体構造を包含する。
【００１４】
「抗体断片」とは、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体の部分を含む、無傷抗体以外の分子を言う。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’-ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異的な抗体が挙げられるが、それらに限定される訳ではない。
【００１５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクロ−ナル抗体組成物」とは、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を言う。
【００１６】
用語「ヒト化抗体」又は「ヒト化バージョンの抗体」とは、抗体エンジニアリングの結果として、重鎖と軽鎖の両方がヒト化されている抗体を言う。ヒト化された鎖は典型的にはＶ領域のアミノ酸配列が変えられている鎖であって、それによって、全体として解析されると、元の種の生殖系列配列よりもヒトの生殖系列配列に、ホモロジーにおいてより近いものである。ヒト化の評価は、結果として得られたアミノ酸配列に基づいて行われ、方法論それ自体に基づいて行われるものではない。
【００１７】
本明細書で使用される用語「標的又は抗標的抗体に対して特異的に結合する」とは、ＥＬＩＳＡにより測定された、それぞれの抗原（標的）又は抗原発現細胞への抗体の結合を言うものであり、ここで前記ＥＬＩＳＡは好ましくは、それぞれの抗原を固相担体へ被覆すること、それぞれの抗原又はタンパク質との免疫複合体の形成を許容する条件下において前記抗体を添加すること、本発明による抗体に対して結合する二次抗体を使用し、且つペルオキシダーゼに仲介される発色を使用して、光学密度値（ＯＤ）の測定による前記免疫複合体を検出することを含む。
【００１８】
本発明における用語「抗原」とは、免疫接種のために使用される抗原、又はタンパク質であって前記抗原をそのタンパク質配列の一部として含むものを言う。例えば、免疫接種のために、タンパク質の細胞外ドメインの断片（例えば最初の２０アミノ酸）を使用することができ、検出／アッセイ等のために、そのタンパク質の細胞外ドメイン又は全長タンパク質を使用することができる。
【００１９】
本明細書における「特異的に結合する」又は「特異的に認識される」とは、抗原について適切な親和性を示す抗体、好ましくは顕著な交差反応性を示さない抗体を意味する。
【００２０】
「顕著な交差反応性を示さない」抗体とは、望ましくない他のタンパク質と、かなりの結合しない（と思われる）ものである。特異的な結合は、そのような結合を測定するための任意の分野で認識される手段、例えばＥＬＩＳＡ等の競合的結合アッセイにより測定することができる。
【００２１】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、ある抗体であって、参照抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上阻害する抗体、及び逆に、参照抗体が、その抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上阻害する抗体を言う。
【００２２】
本明細書で使用される「本発明による抗体の可変領域（又はドメイン）」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））とは、抗原の抗体への結合に直接的に関与する、軽鎖と重鎖の領域のペアのそれぞれを意味する。可変軽鎖及び重鎖領域は同じ一般構造を有し、それぞれの領域は４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、その配列は広く保存され、３つの相補性決定領域であるＣＤＲにより連結されている。
【００２３】
本明細書で使用する用語「抗体の抗原結合部分」とは、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を言う。抗体の抗原結合部分は、好ましくは「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ配列は、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)により規定される。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖のアミノ酸配列は、可変領域のＦＲ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に相当する、より少ない又は追加のアミノ酸を含んでもよい。例えば重鎖可変領域は、Ｈ２の残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含んでもよい。所定の抗体についての残基のＫａｂａｔの番号付けは、「標準」のＫａｂａｔ番号付けがされた配列との、その抗体の配列の相同な領域におけるアラインメントにより決定されてもよい。
【００２４】
「定常領域（定常部分）」は抗体の抗原への結合に直接的には関与していないが、例えばエフェクター機能も示す。ヒトＩｇＧ１に対応する重鎖定常領域遺伝子断片はγ１鎖と呼ばれる。ヒトＩｇＧ３に対応する重鎖定常領域遺伝子断片はγ３鎖と呼ばれる。ヒト定常γ重鎖は、Kabat, E.A.ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)により、及びBrueggemann, M.ら, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W.ら Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527により詳細に述べられている。
【００２５】
本明細書中の用語「Ｆｃ領域」とは、少なくとも定常領域の一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。その用語は天然配列のＦｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。
【００２６】
本明細書中で特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の中に述べられている通りの、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ番号付けシステムに従う。
【００２７】
「変異体Ｆｃ領域」はアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列は、本明細書中で規定された少なくとも１つの「アミノ酸修飾」のために、「天然」又は「野生型」のＦｃ領域配列のそれとは異なっている。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「Ｆｃ変異体」とは、Ｆｃドメインの中に修飾を含んでいるポリペプチドをいう。その修飾は付加、欠失、又は置換であることができる。置換は天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。変異体は非天然アミノ酸を含んでもよい。
【００２９】
用語「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」は、抗体等のＦｃ領域を含むポリペプチドをいう。
【００３０】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を述べるために使用される。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（ガンマ受容体）には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子の変異体及びオルタナティブスプライシング型を含む）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）を含み、それらは類似したアミノ酸配列を有するが、主としてその細胞質ドメインにおいて異なっている。活性化受容体であるＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインの中に、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体であるＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインの中に免疫受容体チロシンに基づく抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234の中の総説を見よ）。ＦｃＲは、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capelら, Immunomethods 4 (1994) 25-34;及びde Haasら J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-41に総説されている。将来に同定されるべきものを含めて他のＦｃＲは、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に包含される。その用語は新生児の受容体であるＦｃＲｎも含み、それは母親のＩｇＧの胎児への運搬を担っている（Guyerら, J. Immunol. 117 (1976) 587 及びKimら, J. Immunol. 24 (1994) 249）。
【００３１】
本明細書中で使用される「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」とは、任意の生物に由来する、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。ＦｃリガンドにはＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌タンパク質Ａ、連鎖球菌タンパク質Ｇ、及びウイルスＦｃγＲが含まれるが、それらに限定される訳ではない。ＦｃリガンドはＦｃ受容体のホモログ（ＦｃＲＨ）も含むが、それはＦｃγＲと相同性を有するＦｃ受容体のファミリーである（Davisら, Immunological Reviews 190 (2002) 123-136、全体として参照することにより組み込まれる）。ＦｃリガンドはＦｃに結合する未発見の分子を含んでもよい。特定のＩｇＧ  ＦｃリガンドはＦｃＲｎとＦｃガンマ受容体である。本明細書中で使用される「Ｆｃリガンド」は、任意の生物に由来し、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、又は「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によりコードされるタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味するものである。ヒトにおいてこのファミリーは、アイソフォームであるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、及びＦｃγＲＩＣを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩＡ（アロタイプＨ１３１とＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ−１とＦｃγＲＩＩＢ−２を含む）、及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；並びにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩＡ（アロタイプＶ１５８とＦ１５８を含む）、及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ１とＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Jefferisら, Immunol Lett 82(2002)）のみならず、任意の未発見のヒトＦｃγＲ若しくはＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプを含むが、それらに限定されるものではない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含むが、それらに限定されるものではなく、任意の生物に由来してよい。マウスＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）のみならず、任意の未発見のマウスＦｃγＲ若しくはＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプを含むが、それらに限定されるものではない。
【００３３】
本明細書中で使用される「ＦｃＲｎ」又は「新生児のＦｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によりコードされるタンパク質を意味するものである。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含むが、それらに限定されるものではなく、任意の生物に由来してもよい。本技術分野で知られているように、機能を有するＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖と軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によりコードされている。本明細書中で特に明記しない限り、ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とベータ−２−ミクログロブリンの複合体をいう。
【００３４】
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」とは、配列のアラインメントとギャップの導入を行った後に、もし必要ならば、最大パーセントの配列同一性を達成するために、如何なる保存的置換も配列同一性の一部分として考慮することなく、候補配列の中のアミノ酸残基が、特定のペプチド又はポリペプチド配列の中のアミノ酸残基と同一であるパーセンテージであると規定される。アミノ酸配列の同一性のパーセントを決定する目的のアラインメントは、例えば、公表されているコンピューターソフトウェアであるＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等を使用して、本技術分野の技能の範囲内である種々な方法により達成することができる。
【００３５】
「抗体依存性細胞仲介性細胞傷害」と「ＡＤＣＣ」とは、細胞に仲介される反応をいい、その反応においてＦｃＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、引き続いてその標的細胞の溶解を引き起こす。ＡＤＣＣを仲介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、RavetchとKinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492の464ページの表３に要約されている。
【００３６】
用語「抗体依存性細胞貪食」と「ＡＤＣＰ」とは、抗体に被覆された細胞が、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する貪食性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞）により、全体的又は部分的のいずれにせよ取り込まれる（internalized）プロセスをいう。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「抗体エフェクター機能（複数可）」又は「エフェクター機能」とは、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（複数可）（例えば免疫グロブリンのＦｃ領域）が寄与している機能をいう。そのような機能は、例えば、Ｆｃエフェクタードメイン（複数可）の、貪食若しくは溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体への結合により、又はＦｃエフェクタードメインの補体系の成分のへの結合によりもたらされる。典型的なエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣである。
【００３８】
「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域のための結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒとＣ１ｓと共に、複合体Ｃ１を形成し、それは補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）経路の最初の成分である。
【００３９】
抗体の「クラス」とは、それの重鎖が持つ定常ドメイン又は定常領域の型をいう。抗体の主要なクラスは５つあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、これらの幾つかをさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けてもよい。免疫グロブリンの異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４０】
薬剤例えば医薬製剤の「有効量」とは、望まれる治療又は予防の結果を達成するために、投与量において必要な期間有効である量をいう。
【００４１】
本明細書中において使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞（bronchioloalviolar cell）肺がん、骨がん、膵臓がん（pancreatic cancer）、進行膵臓がん腫皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管のがん腫、子宮内膜のがん腫、子宮頸部のがん腫、膣のがん腫、外陰部のがん腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞がん腫、腎盂のがん腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫（schwanomas）、上衣腫（ependymonas）、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体線腫、リンパ腫、リンパ球性白血病（上記のがんの何れかの難治性のバージョンを含む）又は上記のがんの1つ以上の組み合わせであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】細胞結合  抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体の、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞（インビボゲン）上に細胞発現したＣＤ４０抗原への結合について試験した。ＥＣ５０値は試験された抗体の強力な結合を実証する。
【図２】８点解析でのＨＥＫ−ＢｌｕｅのＥＣ５０測定  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体のアゴニスト活性を、細胞に基づくＮＦ−κＢ遺伝子レポーターアッセイで試験した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞（インビボゲン）を、様々な濃度の抗体と２４時間インキュベートした。ＥＣ５０値は抗体のＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導する効力を実証する。
【図３】ＣＤ４０−リガンドエピト−プ競合  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が、ＣＤ４０Ｌ結合部位と重複するエピトープに結合するかどうかを試験するために、ＣＤ４０Ｌ競合ＥＬＩＳＡを行った。様々な濃度の抗ＣＤ４０抗体を組み換えＣＤ４０タンパク質とプレインキュベートし、結合複合体を形成した。続いてその複合体を、組み換え４０Ｌで被覆されたマイクロタイタープレートに添加した。洗浄の後に、結合したＣＤ４０−抗ＣＤ４０複合体を、ペルオキシダーゼ結合抗ヒト−Ｆ（ａｂ）２抗体を使用して検出した。参照ＣＰ−８７０，８９３抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルは、ＣＤ４０Ｌと競合はなく、よってＣＤ４０Ｌ結合部位とは異なるエピトープへの結合を示唆する。そのデータは、試験されたヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体は、ＣＤ４０Ｌ結合部位と重複するエピト−プへ結合することを実証する。
【図４】カニクイザルＣＤ４０結合活性  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体のカニクイザル（Macaca fascicularis）への結合活性を、組み換えカニクイザルＣＤ４０（アクロ  バイオシステムズ）を使用してＥＬＩＳＡで試験した。ＥＣ５０値は抗体の結合の効力を示す。ｎ．ｄ．＝試験した範囲の濃度では検出できない
【図５Ａ】樹状細胞成熟の誘導  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体の初代標的細胞上でのアゴニスト活性を試験するために、単球由来の、未熟な樹状細胞の成熟を解析した。インビトロで単球から分化した未熟な樹状細胞を、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体と５μｇ／ｍｌの濃度で４８時間インキュベートした。引き続いて、樹状細胞由来の、分泌されたＩＬ１２ｐ４０を、培地上清において、生化学的ＥＬＩＳＡにより定量化した。
【図５Ｂ】樹状細胞成熟の誘導  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体の初代標的細胞上でのアゴニスト活性を試験するために、単球由来の、未熟な樹状細胞の成熟を解析した。インビトロで単球から分化した未熟な樹状細胞を、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体と５μｇ／ｍｌの濃度で４８時間インキュベートした。引き続いて、樹状細胞由来の、分泌されたＩＬ１２ｐ４０を、培地上清において、生化学的ＥＬＩＳＡにより定量化した。
【図６】樹状細胞の成熟  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が、樹状細胞によるＩＬ１２ｐ４０分泌を刺激する活性を様々な抗体濃度において測定し、その活性を様々なＦｃ部分（ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ、ＩｇＧ２及びＩｇＧ１−Ｖ１１）を有するＣＰ−８７０，９０３抗体と比較した。抗体をインビトロで分化させた未熟な樹状細胞と４８時間インキュベートした。ＩＬ１２ｐ４０放出をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図７】樹状細胞成熟における抗ＣＤ４０抗体のＥＣ５０の測定  樹状細胞に仲介されるＩＬ１２ｐ４０分泌における、ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体のＥＣ５０値を、１０〜０．００５μｇ／ｍｌの範囲の抗体濃度で試験することにより測定した。抗体を、インビトロで分化させた未熟な樹状細胞と４８時間インキュベートした。ＩＬ１２ｐ４０放出をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図８】サイトカイン放出アッセイ  ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体を、１０μｇ／ｍｌで、高密度ＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイで試験して、ＴＮＦ−アルファ等の炎症性サイトカインの全般的な誘導を測定した。そのデータは、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体とは対照的に、その抗ＣＤ４０抗体は顕著なＴＮＦ−アルファ分泌を誘導しないことを示唆する。
【図９】細胞の抗体パルスチェイスアッセイ  細胞のパルスチェイスアッセイで、抗体結合の動力学とインターナリゼーションを試験した。抗体を０．８μｇ／ｍｌの濃度で、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞培養液と１５分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を再び洗浄して残っている細胞表面に局在化した抗ＣＤ抗体をアレクサ−４８８標識した二次抗体で検出する前に、抗体を６０分間取り込ませた（allowed to internalize）。インターナリゼーションを許容しない条件下において細胞を同様に処理したが、抗体を１５分間のみインキュベートし、続いて洗浄して二次抗体とインキュベーションした。そのデータは、インターナリゼーションを許容する条件下では、試験されたヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体について、表面に局在化した抗体からのシグナルは様々な程度に低下することを示す。全てのＣＰ−８７０，８９３抗体アイソフォームについて強いシグナルの低下が観察される。
【図１０】ヒト化抗ＣＤ４０抗体の遺伝子レポーター誘導と樹状細胞成熟活性の相関関係  ８８のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体を、それらのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ遺伝子レポーターにおける活性と、樹状細胞成熟アッセイについて試験した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ遺伝子レポーター活性を、誘導されたＳＥＡＰ分泌に相当する６５５におけるＯＤにより定量化し、樹状細胞成熟はＩＬ１２ｐ４０放出（ＥＬＩＳＡ）により定量化した。
【図１１】アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体による樹状細胞上の共刺激性受容体の刺激  インビトロで分化させた未熟なｉＤＣを、アゴニスト性ＣＤ４０抗体、アイソタイプコントロ−ル抗体、又はＣＤ４０Ｌで４８時間刺激した。共刺激性受容体分子の発現をフローサイトメトリ−により測定した。平均蛍光強度を、アイソタイプコントロール抗体処理に対して、又はＣＤ４０Ｌの場合には未処理試料に対して標準化した。発現の誘導をコントロール処理に対する誘導の倍数（ＦＯＩ）として表す。
【図１２】抗ＣＤ４０処理された樹状細胞によるサイトカイン放出  インビトロで分化させた未熟なｉＤＣを、アゴニスト性ＣＤ４０抗体、アイソタイプコントロール抗体、又はＣＤ４０Ｌにより４８時間刺激した。ＥＬＩＳＡ（ＩＬ−１２ｐ４０）又はＢＤサイトメトリックビーズアレイを使用したフローサイトメトリ−により、サイトカイン放出を測定した。
【図１３】アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体による樹状細胞上の共刺激性受容体の用量依存性刺激  インビトロで分化させた未熟なｉＤＣを、アゴニスト性ＣＤ４０抗体、又はアイソタイプコントロール抗体により、１００００〜５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で４８時間刺激した。共刺激性受容体分子の発現をフローサイトメトリーにより測定した。平均蛍光強度を、アイソタイプコントロール処理に対して標準化した。発現の誘導を、コントロール処理に対する誘導の倍数（ＦＯＩ）として表す。計算されたＥＣ５０値を表中に示す。
【図１４】抗ＣＤ４０処理された樹状細胞による用量依存的なサイトカイン放出  インビトロで分化させた未熟なｉＤＣを、アゴニスト性ＣＤ４０抗体とアイソタイプコントロールにより４８時間刺激した。ＢＤサイトメトリックビーズアレイを使用したフローサイトメトリ−により、サイトカイン放出を測定した。
【図１５】アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体によるＢ細胞上の共刺激性受容体の用量依存的な刺激  Ｂ細胞を、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアイソタイプコントロ−ル抗体により、５００〜０．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で４８時間刺激した。共刺激性受容体分子の発現をフローサイトメトリーにより測定した。平均蛍光強度を、アイソタイプコントロール処理に対して標準化した。発現の誘導を、コントロ−ル処理に対する誘導の倍数（ＦＯＩ）として表す。計算されたＥＣ５０値を表中に示す。
【図１６】細胞に発現したＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの結合の、抗ＣＤ抗体との競合  １００００〜９．８ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でＣＤ４０Ｌを添加する前に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞を、抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体とＥＣ９０の濃度でプレインキュベートした。細胞表面上に発現したＣＤ４０と、抗ＣＤ４０抗体及びＣＤ４０Ｌの結合を、フルオロフォアが結合した様々な二次抗体を使用して検出した。
【図１７】ＣＤ４０Ｌと組み合わせたアゴニスト性ＣＤ４０抗体によるＦａｓＲ（ＣＤ９５）細胞死受容体の発現誘導  ラモスＢリンパ腫細胞を、ＣＤ４０Ｌ単独、若しくはアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体又はアイソタイプコントロ−ル抗体と組み合わせて、一晩刺激した。フロ−サイトメトリーによりＣＤ９５発現を定量化した。発現の上方調節（upregulation）を、コントロ−ル処理に対する誘導の倍数（ＦＯＩ）として表す。
【図１８】ヒト化した、アゴニスト性の抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体の親和性  生化学的な親和性を、ＢｉｏｃｏｒｅＴ２００ＳＰＲ装置で、表面プラズモン共鳴により測定した。動力学的データを、ラングミュアの１：１結合モデルを使用して測定した。
【図１９】ＣＤ４０結合に関する抗体の競合  ＨＩＳタグを付したＣＤ４０タンパク質と様々な抗ＣＤ４０抗体をプレインキュベーションした混合液の、様々な抗ＣＤ４０抗体で被覆されたプレートへの結合。両方の抗ＣＤ抗体の連続的な結合を、抗ＨＩＳ  ＰＯＤ標識された抗体により検出する。
【図２０】ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗ＣＤ４０抗体の抗体に仲介されるエフェクター機能  抗ＣＤ４０抗体に仲介されるエフェクター機能を、ジャーカットエフェクタールシフェラーゼ遺伝子レポーター細胞株及び標的細胞としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）を使用して解析した。ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ又はＩｇＧ１抗ＣＤ４０抗体を１００００〜０．００２ｎｇ／ｍｌの範囲の用量で、標的及びエフェクター細胞と６時間インキュベートした。測定されたルシフェラーゼ活性の誘導の倍数は、抗ＣＤ４０抗体に仲介されるエフェクター細胞の活性化を示す。
【図２１−１】ヒト化マウスモデルにおけるアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体療法の安全性  ３μｇ／ｇのＭＡＢ−１６−０４５１又はＣＰ−８７０，８９３抗ＣＤ４０抗体を、Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／ｇａｍｍａ（ｃ）（ｎｕｌｌ）ＦｃＲｇ−／−マウスに０日目に注射した。注射前と注射後の様々な時点で体温を測定した。ＣＰ−８７０，８９３で処理され、著しい体温低下を示した３匹のマウスは、３日後に屠殺せざるを得なかった。
【図２１−２】ヒト化マウスモデルにおけるアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体療法の安全性  ３μｇ／ｇのＭＡＢ−１６−０４５１又はＣＰ−８７０，８９３抗ＣＤ４０抗体を、Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／ｇａｍｍａ（ｃ）（ｎｕｌｌ）ＦｃＲｇ−／−マウスに０日目に注射した。注射前と注射後の様々な時点で体温を測定した。ＣＰ−８７０，８９３で処理され、著しい体温低下を示した３匹のマウスは、３日後に屠殺せざるを得なかった。
【図２２−１】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−２】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−３】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−４】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−５】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−６】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−７】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−８】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【図２２−９】配列（一文字表記でのアミノ酸）可変領域（ＶＲ）の完全な配列：重鎖：完全なＶＨ：配列番号１〜１４軽鎖：完全なＶL：配列番号１５〜２８相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２９〜４２      ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号４３〜５６      ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号５７〜７０軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７１〜８４      ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号８５〜９８      ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９９〜１１２
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、低下した細胞毒性を示し、臨床上の副作用をより少なくする一方で、先行技術のアゴニスト性ＣＤ４０抗体と比較して、それらのシグナル伝達効力と臨床上の有効性が、増加しないまでも、少なくとも維持されている、アゴニスト性のＣＤ４０ｍＡｂを提供する需要に応じる。
【００４４】
本発明の抗体又は抗体結合断片は、それらはヒトＣＤ４０受容体に特異的に結合し、Ｆｃγに仲介されるＣＤ４０受容体架橋に依存しないＣＤ４０シグナル伝達を誘導することができるので、それらの有益な性質を提供する。
【００４５】
好適な態様において本発明の抗体は、ヒトＦｃ１領域の２３４位及び２３５位において少なくとも２つのアラニンアミノ酸を有する、ヒト化ＩｇＧ１ＬＡＬＡ抗体、ヒト化ＩｇＧ１型抗体である。よって好適な態様によれば、ＩｇＧ１ＬＡＬＡはヒトＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む。
【００４６】
本発明の抗体が組み換え分子であることは更に好適である。
【００４７】
本発明により、ヒトＣＤ４０受容体に結合し、Ｆｃγに仲介されるＣＤ４０受容体架橋に依存しないＣＤ４０シグナル伝達を誘導することができる、アゴニスト性モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片が提供される（実施例５、図６、及び下記のテキストも見よ）。更に本発明の抗体は、野生型のＩｇＧ  Ｆｃγ受容体シグナル伝達又は先行技術の抗体のＦｃγシグナル伝達と比較したときに、ヒトＦｃγ受容体を介したシグナル伝達能力の低下又は枯渇を示すかもしれない。
【００４８】
特定の態様では、本発明のアゴニスト性のモノクローナルＣＤ抗体、又はその抗原結合断片は、野生型のＩｇＧ  Ｆｃγと比較して、ヒトＦｃγ受容体に対する親和性の低下又は枯渇を示すかもしれない。好適な態様によれば、本発明の抗体はＦｃγ受容体に結合せず、それによって本発明の抗体はＦｃγに仲介されるＣＤ４０受容体架橋を引き起こさない。
【００４９】
好適な態様において、本発明の抗体は少なくとも、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａにおいて、又はヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅにおいてアミノ酸置換を含む。
【００５０】
本発明において、抗体が、ＣＤ４０Ｌ結合部位と重複するＣＤ４０エピトープに結合することは更に好適である。図３と１６は、試験されたヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体について、このエプトープ重複を実証する。そのＣＤ４０抗体がＣＤ４０受容体との結合について、ＣＤ４０Ｌと競合することも好適である。従ってエピト−プ競合アッセイにおいて、本発明の抗体はＣＤ４０Ｌと競合する。そのようなアッセイは実施例３と１１に述べられており、本発明の抗体による実験結果は図３と１６に描かれている。よって更なる好適な態様によれば、本発明の抗体は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０受容体の結合を阻害する。図１９は、ＣＤ４０との結合において、本発明の抗体はＣＰ−８７０，８９３と競合しないことを実証する。
【００５１】
本発明による抗体は、ＣＤ４０受容体に対する非常に高い結合活性を有する。よって実施例１に述べられた細胞結合アッセイにおいて、本発明による抗体は最大でも４９．５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を伴う結合活性を示す。好ましくは、ＥＣ５０は２５ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満、９ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ未満である。最も好ましくは、実施例１の中で述べられ、図１に描かれたような細胞結合アッセイにおいて、ＥＣ５０は３ｎｇ／ｍｌである。
【００５２】
本発明によるヒト化アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体は、可溶性のヒト又はカニクイザルのＣＤ４０三量体タンパク質についての生化学的親和性により特徴付けられてもよい（実施例１３、図１８を参照せよ）。本発明の抗体はヒトＣＤ４０について１５．７ｎＭ以下のＫＤ値を示してもよい。本発明の抗体は、１０．３ｎＭ以下のＫＤ値を有し、カニクイザルＣＤ４０タンパク質と交差反応性であってもよい。
【００５３】
更に本発明の抗体は、高い効力で細胞のＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導することができる。実験の概要（実施例２を参照せよ）は図２に描かれており、１１２７〜６２４３ｎｇ／ｍｌの範囲のＥＣ５０結合値を示している。そのＥＣ５０値は、その抗体がＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導する効力が大きいことを実証する。
【００５４】
本発明の抗体はカニクイザルのＣＤ４０に結合できることもまた、理解されるであろう。ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が、カニクイザル（Macaca fascicularis）に結合する活性は、組み換えカニクイザルＣＤ４０組み換えタンパク質を使用したＥＬＩＳＡ実験に示されている（実施例４を参照せよ）。図４に示されたＥＣ５０値は、その抗体の強い結合を示唆するものである。
【００５５】
本発明の抗体の他の特徴は、それらはヒトＡＰＣを活性化できるというものである。例えばその抗体は、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、単球及び骨髄細胞を含む群から選択される細胞を活性化することができる。好ましくは、抗体はＤＣを活性化する。
【００５６】
ＡＰＣ活性化におけるこの強力なＣＤ４０アゴニスト活性は、ＣＤ４０タンパク質のＦｃγ受容体に仲介される架橋によるものではない（図５、６、７に示され、実施例５に述べられている実験結果を参照せよ）。
【００５７】
従って、１態様において本発明の抗体は、実施例５に述べられる樹状細胞成熟アッセイにおいて、ＩＬ-１２ｐ４０の放出を誘導する。そのようなアッセイにおいて本発明の抗体を用いて行われた実験の結果を図５〜７に示す。
【００５８】
更に好適な態様において本発明の抗体は、ＩＬ１２ｐ７０放出により測定される抗原提示細胞の成熟を誘導し、その放出はＣＰ−８７０，８９３−ＩｇＧ２抗体による刺激により誘導される放出と少なくとも同等であり、２０８ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴う（図１２と１４）。更に本発明の抗体は、ＣＤ８６の誘導により測定される抗原提示細胞の成熟を少なくとも７．５倍に誘導し、１４８ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を伴う（図１１と１３）。
【００５９】
好ましくは、本抗体は単球由来のＤＣからＩＬ１２ｐ４０の放出を誘導し、それはＣＰ−８７０，８９３-ＩｇＧ２抗体による刺激によって誘導される放出と少なくとも同等である（図６を参照せよ）。先に述べたように、ＤＣの成熟を誘導するこの潜在力は、Ｆｃ受容体を介したシグナル伝達によるものではない。本発明のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクロ−ナル抗体は、Ｆｃγ受容体に依存しない様式で、単球由来の樹状細胞の活性化を強力に誘導する（実施例５と図６を見よ）。図６は、ＣＰ−８７０，８９３変異体により誘導されるＩＬ１２ｐ４０放出レベルは、その変異体がＦｃ受容体へ結合する能力と相関している（ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ＜ＩｇＧ２＜ＩｇＧ１＜ＩｇＧ１−Ｖ１１）ことを実証する。際立ったことに、本発明のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体による刺激は、ＣＰ−８７０，８９３変異体により得られる範囲をカバーし、それを上回りさえする、Ｆｃに依存しないＩＬ１２ｐ４０分泌レベルをもたらす。よって本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質のＦｃγ受容体に仲介される架橋無しに、初代の単球由来の樹状細胞に強力なアゴニスト活性を提供する。
【００６０】
更に本発明の抗体は、その活性化が非常に特異的である。それらは、ＴＮＦ−アルファ等の炎症性サイトカインの全般的な放出を誘導することは無い（実施例６と図８を参照せよ）
【００６１】
本発明の抗体の他の特徴は、細胞表面からの抗体のクリアランスが低下していることである。ＣＰ−８７０，８９３は、細胞上のＣＤ４０受容体に結合した後に取り込まれる（internalize）と知られている。細胞のインターナリゼーションにより引き起こされるかもしれない、患者における大きなＣＤ４０受容体の埋没（sink）を反映して、ＣＰ-８７０，８９３は推定で６時間未満定の半減期で患者の循環から迅速に除去されることが臨床試験で示された（Ruter ら 2010）。
【００６２】
本発明の抗体は、エンドサイトーシスとインターナリゼーションを許容する条件下で、細胞表面に保持される（実施例７と図９を参照せよ）。それに対してＣＰ−８７０，８９３変異体は、エンドサイトーシスとインターナリゼーションを許容する条件下で、細胞表面に保持されない（図９を参照せよ）。
【００６３】
本発明の抗体が、腫瘍細胞死に間接的な（免疫に仲介される）効果を有することは、理解されるであろう。よって本抗体は腫瘍細胞に、免疫細胞に仲介される間接的な細胞傷害性効果を示す。
【００６４】
一つの特定の態様において本発明の抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、又はＣＤＣの機構によりＣＤ４０を発現する免疫細胞の枯渇をもたらすことはない。
【００６５】
従って要するに、本発明の抗体は更に、
（ａ）Ｆｃγ受容体に結合しない；
（ｂ）約４９．５ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴うＣＤ４０細胞結合親和性を有する、
（ｃ）約１５．７ｎＭ以下のＫＤ値を有する；
（ｄ）約１０．３ｎＭ以下のＫＤ値を伴いカニクイザルＣＤ４０と交差反応性である；
（ｅ）ＣＤ４０へ結合することによりＣＤ４０Ｌを阻害する；
（ｆ）ＣＤ４０Ｌに仲介される機能の相乗的及び相加的効果を防ぐ；
（ｇ）ＣＰ−８７０，８９３−ＩｇＧ２抗体による刺激により誘導される放出と少なくとも同等であり、約２０８ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴う、ＩＬ１２ｐ７０放出により測定される、
及び／又は、約１４８ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を伴う、樹状細胞における少なくとも７．５倍のＣＤ８６の誘導により測定される、
抗原提示細胞の成熟を誘導する；
（ｈ）細胞表面上のＣＤ４０のレベルをＣＰ−８７０，８９３より低い程度に減少させる、
ことにより特徴付けされてもよい。
【００６６】
好適な態様によれば本発明の抗体は、上記の性質（ａからｈ）の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、若しくは８つ、又は全てを有することにより特徴付けられる。
【００６７】
本発明の抗体は好ましい性質を有し、そのためにヒトの腫瘍の成長を阻害することが可能である。
【００６８】
特定の態様において、本発明の抗体は、配列番号２９＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号４３＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号５７＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域（ここでｎは０〜１３からなる群から選択される数である）、及び、配列番号７１＋ｍのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号８５＋ｍのＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号９９＋ｍのＣＤＲ３Ｌ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域（ここでｍは０〜１３からなる群から選択される数である）を含んでもよく、ここでＣＤＲは本発明によるそれらの活性を減少させない任意の１つ以上のアミノ酸変異を含んでもよい。
【００６９】
好ましくは、本抗体は、配列番号２９＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号４３＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号５７＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域（ここでｎは０〜１３からなる群から選択される数である）、及び、配列番号７１＋ｍのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号８５＋ｍのＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号９９＋ｍのＣＤＲ３Ｌ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域（ここでｍは０〜１３からなる群から選択される数である）を含む。
【００７０】
特定の態様において、本発明の抗体は、配列番号２９＋ｎのＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号４３＋ｎのＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号５７＋ｎのＣＤＲ３Ｈ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域、及び、配列番号７１＋ｎのＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号８５＋ｎのＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号９９＋ｎのＣＤＲ３Ｌ領域からなる群から選択されるＣＤＲ領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含んでもよく、ここでｎは０〜１３からなる群から選択される数であり、ここでＣＤＲは本発明によるそれらの活性を減少させない任意の１つ以上のアミノ酸変異を含んでもよい。
【００７１】
好ましくは、ＣＤＲは、それらの各々の配列番号と、少なくとも９１％、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７２】
他の態様において、本発明の抗体又は抗原結合断片は、配列番号１〜１４の重鎖可変（ＶＨ）領域からなる群から選択されるＶＨ領域と、少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一である、ＶＨ領域を含む。
【００７３】
好ましくは、前記抗体は、配列番号１〜１４の重鎖可変（ＶＨ）配列の群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
【００７４】
特定の態様では、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含み、それによって本抗体は各々の抗原と特異的に結合する本発明の能力を保持する。
【００７５】
本発明は、配列番号１〜１４の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体も包含する。
【００７６】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、配列番号１、あるいは配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４である。
【００７７】
本発明は、配列番号１５〜２８の軽鎖可変（ＶＬ）領域からなる群から選択されるＶＬ領域と、少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一であるＶＬ領域を含む抗体にも関連する。
【００７８】
好ましくは、前記抗体は、配列番号１５〜２８のＶＬ配列の群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
【００７９】
特定の態様では、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含み、それによって本抗体は各々の抗原と特異的に結合する本発明の能力を保持する。
【００８０】
本発明は、配列番号１５〜２８の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体も包含する。
【００８１】
好ましくは、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列は、配列番号１５、あるいは配列番号１６、又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、又は配列番号２８である。
【００８２】
特定の態様では、前記ＶＬ配列において、合計で１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失している。他の態様では、前記ＶＨ配列において、合計で１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失している。特定の態様では、前記ＶＨ又はＶＬ配列のそれぞれにおいて、合計で１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失している。前記置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわちＦＲにおいて）生じてもよい。
【００８３】
本発明は、本技術分野で知られた方法により作製することができる、親和性成熟抗体も含む。Marksら, Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、ＶＨとＶＬドメインのシャッフリングによる親和性成熟を述べている。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基の無作為な突然変異生成は: Barbasら, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schierら, Gene 169: 147-155 (1995); Yeltonら, J. Immunol. 1 55:1994-2004 (1995); Jacksonら, J. Immunol. 1 54(7):3310-9 (1995); 及び Hawkinsら, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) 及び国際公開２０１０／１０８１２７により述べられている。
【００８４】
本発明は、図１０に列挙された抗体（すなわち、ＭＡＢ−１６−０２８３、ＭＡＢ−１６−０３７７、ＭＡＢ−１６−０２６７、ＭＡＢ−１６−０３８６、ＭＡＢ−１６−０４５１、ＭＡＢ−１６−０３４６、ＭＡＢ−１６−０３２５、ＭＡＢ−１６−０３８８、ＭＡＢ−１６−０４６４、ＭＡＢ−１６−０２６２、ＭＡＢ−１６−０４０６、ＭＡＢ−１６−０４８４、ＭＡＢ−１６−０４００、ＭＡＢ−１６−０４８９抗体を含む）を含む群から選択される抗体の、各々のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域及びＶＬ領域を含む抗体も包含する。
【００８５】
本発明は配列番号１と１５、又は配列番号２と１６を含む抗体も包含する。本発明による抗体は配列番号３と１７、又は配列番号４と１８、又は配列番号５と１９、又は配列番号６と２０、又は配列番号７と２１、又は配列番号８と２２、又は配列番号９と２３、又は配列番号１０と２４、又は配列番号１１と２５、又は配列番号１２と２６も含んでよい。あるいは、本発明の抗体は、配列番号１３と２７、又は配列番号１４と２８を含む。
【００８６】
他の観点では、本発明の抗体は、がんを患っている患者の治療に使用するためのものである。
【００８７】
前記がんは、膵臓がん（pancreas cancer）、進行膵臓がん腫肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞（bronchioloalviolar cell）肺がん、骨がん、膵臓がん（pancreatic cancer）、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、腎臓がん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、胆嚢がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、唾液腺がん、又は子宮がんを含む群から選択される１つ以上の型のがんであり得る。
【００８８】
特定の態様では、がんは固形腫瘍である。
【００８９】
態様によっては、がんはＣＤ４０発現がんであることも可能である。しかしながら、これは本発明の抗体の効果的な機能のためには必要ではない。
【００９０】
本発明の抗体を患者において、がんの単独治療として、又は、組み合わせ治療（その更なる治療は、医薬細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤、放射療法、標的療法、及び／又は手術であってもよい）の一部として使用してもよい。
【００９１】
よって、患者はがんの１つ以上の更なる治療、例えば、医薬（細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤、標的療法等）、放射療法、及び／又は手術も受けてよい。
【００９２】
よって、態様によっては、本発明の抗体は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤、放射療法、標的療法、及び／又は免疫療法と組み合わせて、がんの治療において使用される。
【００９３】
本発明の抗体は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤、放射療法、標的療法、及び／又は免疫療法に対して応答が不十分である及び／又は耐性である患者の治療において使用することもできる。
【００９４】
前記放射療法は、外部照射療法、接触ｘ線近接照射療法、近接照射療法、全身放射線療法、又は術中放射線療法を含む群から選択されてもよい。
【００９５】
本発明の細胞毒性又は細胞増殖抑制抗がん剤は、タキサン、アントラサイクリン、アルキル化剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチドアナログ、ペプチド抗生物質、及び白金に基づく薬剤を含む群に由来してもよい。
【００９６】
好ましくは標的とされる抗がん剤が標的療法の中で使用され、下記：セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ等の抗ＥＧＦＲ化合物、トラスツズマブ、アド−ラスツズマブ、エムタンシン、ペルツズマブ等の抗ＨＥＲ２化合物、ベバシズマブ、アフリベルセプト、及びペガプタニブ等のＶＥＧＦ標的化化合物、並びにスニチニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、及びレゴラフェニブ（Regorafinib）等のチロシンキナーゼ阻害剤、の１つ又はその組み合わせから選択される。
【００９７】
患者が免疫療法を受けている場合には、これは免疫チェックポイント阻害剤であり得、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を使用してもよい。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ１３７、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＯＸ４０、及び／又は抗ＧＩＴＲを含む群から選択されてもよい。
【００９８】
本発明の抗体を、ヒトＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲと特異的に結合する抗体と組み合わせて、及び／又は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブの薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【００９９】
本発明により幾つかの態様では、毎週から毎月の投与計画（weekly to monthly dosing regimen）において、その抗体はがんの治療において使用される。
【０１００】
この発明の特別の利点の１つは、それらのＦｃ領域における変異のために、先行技術の抗体と比較して、本抗体は用量又は治療を制限する毒性を示すことが少ないということである。本抗体がＣＤ４０抗体の典型的な副作用を引き起こすことは、仮にあったとしても、非常に限られた程度にすぎない。そのような副作用は、サイトカイン放出症候群、血栓症、脳塞栓症、トランスアミナーゼ上昇、リンパ球減少症、倦怠感、末梢神経障害、脱毛症、便秘、吐き気、及び好中球減少症を含む群から選択される障害（condition）である。
【０１０１】
他の観点において本発明は、医薬的に許容可能な担体、及び本発明の抗体の治療有効量を含む医薬組成物に関連する。
【０１０２】
本発明の医薬組成物を、がんを患っている患者の治療において使用できる。そのようながんは固形腫瘍であり得る。そのがんを、膵臓がん（pancreas cancer）、進行膵臓がん腫肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞（bronchioloalviolar cell）肺がん、骨がん、膵臓がん（pancreatic cancer）、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、腎臓がん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、胆嚢がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、唾液腺がん、又は子宮がんを含む群から選択することもできる。
【０１０３】
本組成物を、化学療法、放射療法、標的療法、及び／又は免疫療法と組み合わせて、がんの治療において使用することもできる。前記免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。
【０１０４】
前記組成物により治療される患者は、化学療法、放射療法、標的療法、及び／又は免疫療法に対して応答が不十分である及び／又は耐性であってもよい。
【０１０５】
本発明の医薬組成物を、１つ以上の細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、又は標的化された抗がん化合物と組み合わせて、がんの治療において使用してもよい。
【０１０６】
がんの治療において、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤とそれを組み合わせて使用することも可能であり、ここで前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ１３７、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＯＸ４０、及び／又は抗ＧＩＴＲを含む群から選択されてもよい。
【０１０７】
本組成物をヒトＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲと特異的に結合する抗体と組み合わせて、及び／又は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブの薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【０１０８】
毎週から毎月の投与計画（weekly to monthly dosing regimen）において、それをがんの治療において使用することもできる。
【０１０９】
本発明の抗体及び組成物は、何らかの用量又は治療を制限する毒性を示すことは、仮にあったとしても、非常に限られた程度でしかなく、且つ重要なことに、先行技術の抗体及び組成物よりも低い程度であることは、特に患者に理解されるであろう。他の観点において本発明は、必要性がある個体に本発明の抗体の有効量を投与することを含む、治療方法にも関連する。そのような個体は、がんを患っている患者でもよい。よって本発明はがんの治療方法にも関連し、ここでがんは固形腫瘍でもよい。
【０１１０】
その必要性がある個体に投与する工程は、患者の腫瘍への局所投与（例えば、腫瘍内又は腫瘍周辺投与）等の局所投与を含んでもよい。
【０１１１】
抗体に基づく本発明の薬剤は、ＣＤ４０の活性化が治療利益を提供し得る任意の型のがんの治療において使用するのに適しており、前記抗体の投与を含む方法は、ＣＤ４０の活性化が治療利益を提供し得る任意の型のがんの治療にも適している。
【０１１２】
例えばがんは、前立腺がん；乳がん；結腸直腸がん；膵臓がん（pancreatic cancer）；卵巣がん；肺がん；子宮頚がん；横紋筋肉腫；神経芽細胞腫；多発性骨髄腫；白血病；急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱がん及び膠芽腫：からなる群から選択されてもよい。
【０１１３】
本発明の治療方法は、本発明の抗体に基づいた薬剤の患者への単独投与、又は、組み合わせ治療（その更なる治療は、医薬細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤、放射療法、標的療法、及び／又は手術であってもよい）の一部としての投与を含んでもよいことは、更に理解されるであろう。
【０１１４】
実際に、上述した本発明の抗体の全ての特徴と好ましい性質は、治療方法及び本発明による抗体の使用にも反映され且つ含まれる。
【実施例】
【０１１５】
下記の実施例は図と表と共に本発明を説明するために使用される。
【０１１６】
実施例１：抗ＣＤ４０抗体の細胞結合
ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が、細胞に発現したＣＤ４０に結合する効力を測定するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）（インビボゲン）細胞を、細胞培地で処理された透明な底の３８４ウェルのプレートの中の、１０％のＦＢＳを含んでいる２５μｌのＤＭＥＭの中に、１０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。培地５μｌの中に抗体を添加して、最終濃度を１．２５μｇ／ｍｌ〜０．０１ｎｇ／ｍｌの範囲とした。アレクサ−フルオロ−４８８が結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソンラボラトリーズ）を２０μｌの培地中に０．８μｇ／ｍｌの濃度で添加する前に、２４時間後に２５μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン）により細胞を３回洗浄した。４時間後に、培地中の５μｌのヘキスト色素を添加して、最終濃度を５μｇ／ｍｌにした。蛍光細胞の結合シグナルをＣｅｌｌｉｎｓｉｇｈｔ自動化高含有量イメージャー（サーモフィシャーサイエンティフィック）を使用して測定した。エクセル（マイクロソフト）とＸｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、適合曲線とＥＣ５０の計算を得た。図１は、３〜４９．５ｎｇ／ｍｌの範囲のＥＣ５０結合値の概要を示す。
【０１１７】
実施例２：抗ＣＤ４０アゴニスト性抗体による細胞内ＮＦ−κＢシグナル伝達の誘導
ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体のアゴニスト活性を、ＮＦ−κＢ誘導性の分泌型胎児アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子コンストラクトを有する、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）（インビボゲン）細胞を刺激することにより試験した。細胞培地で処理された透明な底の３８４ウェルのプレートの中の、１０％のＦＢＳを含んでいる２０μｌのＤＭＥＭの中に、２５０００細胞／ウェルを播種し、一晩培養した。その後培地５μｌの容量で抗体を添加し、最終濃度を２０〜０．０１３μｇ／ｍｌの範囲とした。３７℃と５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後に、各ウェルの５μｌの培地上清を、２０μｌの２ｘＱＵＡＮＴ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（インビボゲン）を含んでいる、白く透明な底の３８４ウェルのプレートに移した。３７℃と５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後に、ＮＦ−κＢに依存しているホスファターゼ分泌の活性化を反映している、６２０ｎｍの波長における光学密度を測定した。エクセル（マイクロソフト）とＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、適合曲線とＥＣ５０の計算を得た。図２のＥＣ５０値は、抗ＣＤ４０抗体が、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＣＤ４０（商標）細胞株の中でＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導する効力を示す。
【０１１８】
実施例３：ＣＤ４０Ｌ結合との競合
ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体のＣＤ４０への結合の、ＣＤ４０Ｌとの競合を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験した。３８４ウェルのＮｕｎｃ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートの表面を、２５μｌの用量のＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ４０Ｌで、室温で１時間被覆した。５μｇ／ｍｌの濃度の抗体を、１．７μｇ／ｍｌの濃度の組み換えＣＤ４０タンパク質と共に、合計用量４０μｌで、室温で１．５時間、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン）中でプレインキュベートした。Ｎｕｎｃ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ツイーン）で３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％ツイーンにより室温で１時間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後に、２５μｌの抗体−ＣＤ４０複合体をＮｕｎｃ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後にウェルを、ＥＬＩＳＡ緩衝液中の抗ヒトペルオキシダーゼが結合した、ヤギ由来の種特異的なＦ（ａｂ）２断片（ＡｂＤセロテック）の１：２０００の希釈液の２５μｌと共に、室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄し、３０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（インビトロゲン）を添加した。室温で１０分後に、停止溶液（１Ｍ  ＨＣｌ）をウェル当たり３０μｌ添加し、テカンＭ１０００マイクロタイタープレートリーダーを使用して４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長における吸光度を測定した。ＣＰ−８７０，８９３とインキュベートした試料のＥＬＩＳＡシグナルは、ＣＤ４０Ｌとの競合を欠くことを示唆し、一方、本発明のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体のＣＤ４０への結合は、ＣＤ４０Ｌと競合した（図３を見よ）。
【０１１９】
実施例４：カニクイザルＣＤ４０結合活性
ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体の、カニクイザルＣＤ４０タンパク質への結合を、生化学的ＥＬＩＳＡで試験した。組み換えカニクイザルＣＤ４０タンパク質（アクロバイオシステムズ）を、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの濃度で、３８４ウェルのＮｕｎｃ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートの中で、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ツイーン）で３回洗浄した後に、プレートをＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％ツイーンにより室温で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液により再び３回洗浄し、ＰＢＳ中の５００〜０．０３ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗体、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーンを、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液中で３回洗浄した後にウェルを、ＥＬＩＳＡ緩衝液中の抗ヒトペルオキシダーゼが結合した、ヤギ由来の種特異的なＦ（ａｂ）２断片（ＡｂＤセロテック）の１：３０００の希釈液の１２．５μｌと共に、室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（インビトロゲン）を添加した。室温で１０分後に、停止溶液（１Ｍ  ＨＣｌ）をウェル当たり１５μｌ添加し、テカンＭ１０００マイクロタイタープレートリーダーを使用して４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長における吸光度を測定した。エクセル（マイクロソフト）とＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、適合曲線とＥＣ５０の計算を得た。図４に見られるように、多くの抗体は８と３１．８ｎｇ／ｍｌの間のＥＣ５０値で、カニクイザルＣＤ４０へ結合した。
【０１２０】
実施例５：樹状細胞成熟の誘導
ａ．単球由来の樹状細胞を作製し、ＩＬ１２ｐ４０サイトカインの分泌により測定される、ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が樹状細胞の成熟を刺激する能力を試験した。インビトロで単球から樹状細胞を分化させるために、様々なドナーに由来するヒトバフィーコート調製物を使用した。バイエルンの赤十字から受け取ったバフィーコートをＤＰＢＳで１：４に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア）密度グラジエントで積層した。遠心分離の後に、相の間にある末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＤＰＢＳで３回洗浄し、磁気ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニー・バイオテック）を使用して製造者の指示書に従い、単球を単離した。Ｔ−１７５細胞培養フラスコ中で、１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、１０％ＦＣＳ、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、１ｘＬ−グルタミン、５０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、及び１０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含んでいるＲＰＭＩ−１６４０の中で単球を培養した。４８時間毎に培地の９０％を、新鮮でサイトカインを含んでいる培地と交換した。インビトロで分化させた未熟な樹状細胞（ｉＤＣ）を５日目に採取し、１００μｌの同じ培地の中に１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、細胞培養９６ウェルプレートに播いた。
【０１２１】
ｂ．１つの実験では、抗ＣＤ４０抗体を５μｇ／ｍｌの濃度で添加することにより、ｉＤＣを刺激した。刺激して４８時間後、製造業者の指示書に従って市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用し、分泌されたＩＬ１２ｐ４０サイトカインを培地上清中で定量化した。図５は、ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体は、単球由来の樹状細胞によるＩＬ１２ｐ４０放出を、１ｎｇ／ｍｌ未満〜２４ｎｇ／ｍｌ超の範囲の様々な程度で刺激する一方で、ＣＤ４０に結合しないコントロールのＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体は検出可能なレベルのＩＬ１２ｐ４０の刺激をもたらさなかったことを示す。
【０１２２】
ｃ．本発明のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体は、単球由来の樹状細胞上に発現したＦｃγ受容体へ結合することができなかった。これらの抗体を様々なＦｃγ受容体結合活性を持つ抗体と比較するために、我々は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ−Ｖ１１Ｆｃ部分を含む参照ＣＰ−８７０，８９３抗ＣＤ４０抗体を構築し、単球由来の樹状細胞をこれらの抗体の様々な濃度で刺激した。ＩｇＧ１−Ｖ１１形は、重鎖Ｆｃ部分に４つの変異（Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ）を有する。これらの変異は、Ｆｃ受容体ＲＩＩＢに対する親和性を選択的に増加させると述べられている（Mimoto ら 2013）。図６は、ＣＰ−８７０，８９３変異体はＩＬ１２ｐ４０の放出を、Ｆｃ依存的な様式で刺激することを実証している（ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ＜ＩｇＧ２＜ＩｇＧ１＜ＩｇＧ１−Ｖ１１）。際立ったことに、本発明のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体による刺激は、ＣＰ−８７０，８９３変異体によりもたらされる範囲をカバーし、それを超えさえするレベルの、Ｆｃ非依存的なＩＬ１２ｐ４０分泌をもたらした。それによって本発明の抗ＣＤ４０抗体は、Ｆｃγ受容体が仲介するＣＤ４０タンパク質の架橋無しに、初代の、単球由来の樹状細胞に強力なアゴニスト活性を提供する。
【０１２３】
ｄ．他の実験では、ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が単球由来の樹状細胞によるＩＬ１２ｐ４０分泌を誘導する効力を、０．００５〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗体で刺激することにより測定した。図７は、様々な抗体のＥＣ５０値は３８０〜７４３ｎｇ／ｍｌの間の範囲であることを示す。
【０１２４】
実施例６：高密度ＰＢＭＣアッセイにおけるＴＮＦ−アルファ放出
ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡモノクローナル抗体が、血液細胞においてサイトカインの全般的な放出を誘導するかどうかを決定するために、Romerら 2011のプロトコールに従ってＰＢＭＣを抗体で刺激した。前に述べたようにしてＰＢＭＣを単離し、Ｔ１７５細胞培養フラスコ中で１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で、１０％ヒトＡＢ血清と１ｘ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含んでいるＲＰＭＩ−１６４０の中で培養した。細胞を二日後に採取し、９６ウェルの細胞培養プレート中に三連（triplicate）で、１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加してＰＢＭＣと共に３日間、３７℃、５％ＣＯ２、及び９５％の湿度でインキュベートした。実験の中にポシティブコントロ−ルとして、ＯＫＴ−３抗体（アブカム）を含めた。製造業者の指示書に従って市販のヒトＴＮＦアルファＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用し、細胞培養上清中に放出されたＴＮＦ−アルファを定量化した。図８は、ＯＫＴ-３抗体とは対照的に、本発明の抗ＣＤ４０抗体及びＣＤ４０に結合しないＩｇＧ１−ＬＡＬＡコントロール抗体は、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−アルファの顕著な放出を刺激することは無かったことを示す。
【０１２５】
実施例７：細胞のパルスチェイスアッセイ
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞（インビボゲン）を使用したパルスチェイスアッセイにおいて、抗ＣＤ４０抗体の細胞結合とインターナリゼーションの動力学を解析した。透明な底を有する２つの黒色の３８４ウェルのプレート中の、１０％ＦＣＳを含んでいるＤＭＥＭ培地中に、２０００細胞／ウェルを播種した。一晩培養した後に、本発明の抗ＣＤ４０抗体と上記で述べたＣＰ−８７０，８９３  Ｆｃ変異体抗体を、０．８μｇ／ｍｌの濃度で１つのプレートに添加し、３７℃と５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。続いて、両方のプレートを細胞洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン）で３回洗浄し、培養培地中で１時間インキュベートした。最後の１５分において、０．８μｇ／ｍｌの濃度で抗体を２つめのプレートに添加した。その後両方のプレ−トを細胞洗浄緩衝液で３回洗浄し、氷上に置き、０．８μｇ／ｍｌの二次抗ヒトアレクサ−フルオロ−４８８結合抗体（ジャクソンラボラトリーズ）及び５μｇ／ｍｌのヘキスト染色（インビトロゲン）と、氷上で３０分間インキュベートした。細胞表面の蛍光シグナルを、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ高含有量イメージャー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して定量化した。図９は、ＣＰ−８７０，８９３変異体抗体は、インターナリゼーションを許容する条件で１時間インキュベートした後に、表面シグナルを強く低下させたことを示す。それに対して、本発明の抗ＣＤ４０抗体の多くは同じ条件下でインキュベーションしても、細胞表面シグナルの僅かな低下をもたらすのみであり、インターナリゼーションの比率が制限されていることを示唆している。
【０１２６】
実施例８：ヒト化抗ＣＤ抗体の遺伝子レポーター誘導と樹状細胞成熟活性の相関関係
ａ．細胞遺伝子レポーター（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標））と樹状細胞（ＤＣ）成熟アッセイを、それぞれ、実施例２と５において述べたように行った。ＤＣアッセイにおいては５μｌ／ｍｌで、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）遺伝子レポーターアッセイでは１３〜２００００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、抗体を使用した。図１０は、遺伝子レポーターアッセイにおいて観察された最大の誘導と、５μｌ／ｍｌの抗体で刺激した後のＤＣによるＩＬ１２ｐ４０サイトカイン放出とを比較している。８８のヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体は全て遺伝子レポーター発現を同じ程度まで誘導する一方で、幾つかの抗体はＤＣによるＩＬ１２ｐ４０放出の非常に高い刺激を示す。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞はＦｃγ受容体を発現しない。そのアッセイは、基礎的な、Ｆｃγ受容体結合に依存しないＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を捕捉している。ＤＣはＦｃγ受容体を発現し、ＣＰ−８７０，８９３等の抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性はＦｃγ受容体結合に依存している（実施例５）。それにも関わらず、８８のＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体の多くはＤＣの強い活性化を欠いているものの、僅かな一部分は、Ｆｃγ受容体に仲介される架橋無しでＤＣの非常に強い活性化を誘導することができる。よって、アゴニスト性が高い抗ＣＤ４０抗体であって、初代樹状細胞でのその活性がＦｃγ受容体架橋に依存しないというのは稀なケースであり、同定するには基礎的なアゴニスト活性を有する候補抗体を数多くスクリーニングする必要がある。
【０１２７】
実施例９：アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体による樹状細胞における共刺激性受容体とサイトカイン放出の刺激
ａ．ヒト化したアゴニスト性の抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体の、共刺激性受容体発現とＤＣによる炎症性サイトカイン放出の刺激における活性を試験するために、実施例５の中で述べたように、３人の別個のドナーから、未熟な単球由来のＤＣ（ｉＤＣ）を作製した。２μｇ／ｍｌの濃度の抗体又は２０μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄシステムズ６２４５−ＣＬ−０５０）により、ｉＤＣを４８時間処理した。刺激されて成熟したＤＣを採取し、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ５４、及びＣＤ９５（全てミルテニー・バイオテックから）に対する蛍光標識された抗体を使用して染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ装置でフローサイトメトリ−により解析した。図１１はアイソタイプコントロール抗体処理に対する誘導の倍数として表した受容体の刺激を表す。そのデータは共刺激性受容体、特にＣＤ８６の強い誘導を実証する。ＣＰ−８７０，８９３は、本発明のＭＡＢ−１６−０２６２、ＭＡＢ−１６−０４５１、ＭＡＢ−１６−０４６４及びＭＡＢ−１６−０４０６抗体と比較して、全体としてより低い活性を示す。ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ定常部分を含んでいるＣＰ−８７０，８９３変異体を使用したときには、更なる活性の低下が観察され、この抗体のＦｃγ受容体結合依存性が確認された。
【０１２８】
ｂ．図１２は、ＢＤヒト炎症性サイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ  ＃５５１８１１）を製造業者の指示書に従って使用し、ＤＣ培養液の上清の中でサイトカインを測定した結果を示す。本発明のＭＡＢ−１６−０２６２、ＭＡＢ−１６−０４５１、ＭＡＢ−１６−０４６４及びＭＡＢ−１６−０４０６抗体は、非常に高レベルのＩＬ−１２−ｐ４０とＩＬ−１２ｐ７０の放出を示し、その一方で他のサイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６）を産生して分泌する程度はずっと低かった。ＣＰ−８７０，８９３  ＩｇＧ２とＩｇＧ１の変異体で処理されたＤＣの、ＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ１２ｐ７０の放出は、本発明の抗体で観察された放出と比較して顕著に低かった。類似の実験において、３人の別個のドナーに由来するインビトロで分化したｉＤＣを、１００００〜５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度のアゴニスト性の抗ＣＤ４０抗体により４８時間処理した。受容体発現とサイトカイン放出を上述したように解析した。エクセル（マイクロソフト）とＸｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、適合曲線とＥＣ５０の計算を得た。図１３と１４に示したデータは、１人のドナーにおいて観察された例示的な用量依存性効果を示す。２人の更なるドナーの結果は定量的に類似した効果を示す。要するに、ＥＣ５０値により測定された本発明のヒト化抗ＣＤ４０抗体の効力は、ＣＰ−８７０，８９３の効力と類似しているが、一方、特にＩＬ−１２サイトカイン放出と共受容体発現に関する最大誘導効果は、ＣＰ−８７０，８９３の最大誘導効果と比較して顕著に大きかった。
【０１２９】
実施例１０：アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体によるＢ細胞上の共刺激性受容体の刺激
ａ．ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体による共刺激性受容体の刺激も、Ｂ細胞で試験した。Ｆｉｃｏｌｌ密度グラジエント遠心分離により、ヒトのバフィーコートから３人の異なるドナーに由来するＰＢＭＣを単離し、製造業者の指示書に従ってＢ細胞アイソレーションキットＩＩ（ミルテニー・バイオテック）を使用し、ネガティブな磁気濃縮（negative magnetic enrichment）により、手つかずの（untouched）Ｂ細胞を精製した。２×１０５のＢ細胞をＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ヒトＡＢ血清１００μｌの中で、５００〜０．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗体で４８時間刺激した。刺激されたＢ細胞を採取し、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ８０に対するフルオロフォア標識された抗体（全てミルテニー・バイオテックから）を使用して染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ装置でフローサイトメトリ−により解析した。図１５は、アイソタイプコントロ−ル抗体処理に対する誘導の倍数としての、１人のドナーＢ細胞における用量依存性の受容体発現の刺激を表す。エクセル（マイクロソフト）とＸｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、適合曲線とＥＣ５０の計算を得た。この結果は、本発明の抗体はＢ細胞上の共刺激性受容体も刺激するが、上方調節（upregulation）のレベルはＤＣで観察されたレベルよりも低いことを示している。
【０１３０】
実施例１１：細胞上のＣＤ４０と抗ＣＤ４０抗体の結合の、ＣＤ４０Ｌとの競合
ａ．ＣＤ４０Ｌの存在下で、本発明のＣＤ４０抗体のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞への結合を試験し、その抗体が細胞表面ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌ結合部位へ結合するかどうかを検証した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞を抗体と、それらのＥＣ９０結合濃度で、４０℃で３０分間プレインキュベートした。マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ（ＡＢバイオサイエンス）を含んでいるＣＤ４０Ｌを、１００００〜９．８ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加し、細胞を４℃で６０分間インキュベートした。細胞に発現したＣＤ４０へ結合した抗ＣＤ４０抗体とＣＤ４０Ｌを、二次ＤｙＬｉｇｈｔ４０５−結合抗マウスＩｇＧとアレクサ−フルオロ−４８８結合抗ヒトＩｇＧ（ジャクソンラボラトリーズ）を使用して検出し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ装置（ＢＤ）を使用して解析した。図１６Ａは、ＣＰ−８７０，８９３を除いて抗ＣＤ４０は（複数の）濃度で安定な結合を示し、ＣＰ−８７０，８９３の抗体結合シグナルはより高いＣＤ４０Ｌにおいて僅かに低下した。ＣＤ４０Ｌは細胞に用量依存的な様式で結合し、ＣＰ−８７０，８９３がＣＤ４０Ｌとの結合に大きく干渉することはなかった（図１６Ｂ）。それに対して本発明の抗体は、細胞に発現したＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を強く防ぎ、これらの抗体はＣＤ４０のＣＤ４０Ｌ結合部分へ結合し、ＣＤ４０ＬがＣＤ４０へ結合することを阻害することを示唆している（図１６Ｂ）。
【０１３１】
実施例１２：ＣＤ４０Ｌと組み合わせたアゴニスト性ＣＤ４０抗体によるＦａｓＲ（ＣＤ９５）細胞死受容体発現の誘導
ａ．細胞上で抗ＣＤ４０抗体に仲介される効果についてのＣＤ４０Ｌの干渉を試験するために、ＣＤ４０Ｌ単独又はアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体と組み合わせて、ラモス細胞を処理した。９６ウェルのプレート中の１０％ＦＣＳを含んでいるＲＰＭＩの中に、１．２５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度でラモス細胞を播種した。抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度でウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％で１０分間インキュベートした。その後ＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄシステムズ）を幾つかのウェルに添加して最終濃度を１０μｇ／ｍｌとし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％で一晩インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＣＤ９５に対するＦＩＴＣ標識した抗体（ミルテニー・バイオテック）で染色した。図１７は、ＣＰ−８７０，８９３によるＣＤ９５の誘導が、ＣＤ４０Ｌの添加により強く増加する一方で、試験された全ての本発明の抗ＣＤ４０抗体との共処理によりＣＤ４０Ｌの効果は低減することを示す。そのデータは、ＣＤ４０上でＣＤ４０Ｌ結合部位に結合する本発明のアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体が、ＣＤ４０Ｌによる相乗的及び相加的な効果を防ぎ、それにより制御され且つ安全な薬理を可能とすることを示す。
【０１３２】
実施例１３：ヒト化した、アゴニスト性の抗ＣＤ４０ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体の親和性
ａ．本発明の抗体の生化学的な親和性を、表面プラズモン共鳴測定により測定した。抗ヒトＦｃ抗体を介して、ＣＭ５センサーチップの表面に抗体を可逆的に固定化した。固定化された抗体と、可溶性のヒト又はカニクイザルのＣＤ４０単量体タンパク質（アクロバイオシステムズ）の間の相互作用の動力学を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ＳＰＲ装置で解析した。動力学データをラングミュアの１：１結合モデルを使用して測定した。図１８は、ＭＡＢ−１６−０４５１とＭＡＢ−１６−０４６４抗体は、１．２と２．６のＫＤを有し、その一方で、ＭＡＢ−１６−０２６２とＣＰ−８７０，８９３は、それぞれ、１５．７又は８．９のＫＤ値を示すことを実証する。カニクイザルのＣＤ４０タンパク質を使用して作製されたＫＤ値は親和性が類似することを実証した。
【０１３３】
実施例１４：抗ＣＤ抗体のＣＤ４０への競合的な結合
ａ．本発明のヒト化した、アゴニスト性の抗ＣＤ４０抗体がＣＤ４０分子上の重複領域に結合するかどうかを試験するために、競合的結合ＥＬＩＳＡを行った。３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中の６２５ｎｇ／ｍｌの濃度の抗体で６０分間被覆し、続いて、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％ツイーンで７０分間のブロッキング工程を行った。３３０ｎｇ／ｍｌのＨＩＳタグを付したＣＤ４０組み換えタンパク質（アクロバイオシステムズ）及び４μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼを結合させた抗ＨＩＳ検出抗体（シグマ−アルドリッチ）と共に、全ての抗体をチューブの中で個別に１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン）の中で６０分間インキュベートした。抗体／ＨＩＳ−ＣＤ４０／抗ＨＩＳペルオキシダーゼ混合物をプレートのウェルへ添加する前に、プレートをＰＢＳ、０．１％ツイーンで３回洗浄した。プレートを６０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ、０．１％ツイーンで６回洗浄し、１５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（インビトロゲン）を添加した。反応を１５μｌ／ウェルの停止溶液（１Ｍ  ＨＣｌ）で停止し、４５０と６２０ｎｍの波長における吸光度を、テカンＭ１０００マイクロプレートリーダーを使用して測定した。図１９は、本発明の抗体が、ＣＤ４０との結合についてＣＰ−８７０，９０３と競合しないことを実証する。しかしながら各抗体は、本発明の何れかの他の抗体と競合し、それはこれらの抗体がＣＤ４０の同じ領域へ結合することを実証する。重要なことに、本発明の抗体のアゴニスト活性は広い範囲をカバーするので（実施例９と１０）、これは、アゴニスト性の抗ＣＤ４０抗体のパラト−プが主として抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を決定することを示している。
【０１３４】
実施例１５：ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗ＣＤ４０抗体の抗体に仲介されるエフェクター機能
ａ．抗体に仲介されるエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ）の減少における、ＩｇＧ１抗体の定常部分におけるＬＡＬＡ変異の効力を試験するために、製造業者の指示書に従ってジャーカットエフェクター細胞レポーター細胞株に基づくアッセイ（プロメガＡＤＣＣバイオアッセイ、＃Ｇ７０１Ａ）を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞を標的細胞として使用して適用した。白色の平底の３８４ウェルのアッセイプレート中の、２５μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳの中に、ウェル当たり５０００のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＣＤ４０Ｌ（商標）細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。ウェル当たり４０００のエフェクター細胞を８μｌの同じ培地中に添加する前に、培地を４％の低ＩｇＧ  ＦＣＳを含んでいるＲＰＭＩ培地８μｌと置き換えた。最終的に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ１−ＬＡＬＡのＦｃ部分のいずれかを含んでいるＣＰ−８７０，９０３  抗ＣＤ４０抗体を、１００００〜０．００２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、８μｌの培地中に添加した。そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。製造業者の指示書に従ってＢｉｏＧｌｏルシフェラーセアッセイ試薬（プロメガ）を使用し、エフェクター細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。テカンＭ１０００マイクロプレートリーダーを使用して発光強度を読み取った。誘導の倍数を、式ＲＬＵ（抗体処理−バックグラウンド）／ＲＬＵ（ベヒクル−バックグラウンド）により計算した。エクセル（マイクロソフト）とＸｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、適合曲線を得た。図２０は、ＩｇＧ１におけるＬＡＬＡ変異は、エフェクター細胞におけるＦｃ受容体に仲介されるシグナル伝達を止めることを実証する。
【０１３５】
実施例１６：ヒト化マウスモデルにおけるアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体療法の安全性
ａ．安全性を評価するために、幹細胞ヒト化マウスモデルを適用した。Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／ｇａｍｍａ（ｃ）（ｎｕｌｌ）ＦｃＲｇ−／−マウスは、マウスのＦｃ活性化受容体を欠損している。よってこのモデルにおいてはマウスＦｃ受容体結合により、ヒト免疫細胞による治療抗体のＦｃ受容体結合が損なわれることはない。生まれた後の最初の２４時間以内に、マウスに１．４Ｇｙの致死以下の放射線照射を行った。４〜６時間後にマウスに、臍帯血から単離された２００００〜５００００のヒト造血幹細胞を静注で移植した。移植の１２週間後にヒト免疫細胞の存在を末梢血細胞のフロ−サイトメトリーにより検証した。ヒト化が成功したマウスに、３μｇ／ｇのＣＰ−８７０，８９３、ＭＡＢ−１６−０４５１又はアイソタイプコントロール抗体を１回静脈注射した。処理前と抗体注入後の様々な時点において、体重と体温を測定した（図２１）。データは、ＣＰ−８７０，８９３で処理されたマウスの６匹中の３匹において顕著に体温が低下したことを示し、これらのマウスは体調の重篤な障害のために屠殺せざるを得なかった。それに対してＭＡＢ−１６−０４５１で処理されたマウスは体温における顕著な影響を示さず、その他の如何なる体調障害の明らかな兆候も無かった。これは、Ｆｃ受容体結合活性を欠損しているアゴニスト性が高い抗ＣＤ４０−ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体は、明らかな毒性の兆候無しに治療に適用することができることを示唆し、その一方で、活性がより低いアゴニスト性のＣＰ−８７０，８９３−ＩｇＧ２抗体の有毒な効果が、このモデルにおいてインビボで実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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