(57)【要約】本発明は、ＨＰＫ１を標的とするｇＲＮＡ及びＨＰＫ１遺伝子の編集方法に関する。本発明のＨＰＫ１  ｇＲＮＡ及びＨＰＫ１遺伝子の編集方法は、Ｔ細胞ＨＰＫ１遺伝子をノックアウトし、Ｔ細胞殺傷活性を強化し、末梢血単核細胞のＴｈ１サイトカインレベルを増加させることができ、また、Ｔ細胞ＨＰＫ１遺伝子のノックアウトは、Ｔ細胞表面におけるＰＤ−１及びＴＩＭ３の発現をダウンレギュレートし、Ｔ細胞の枯渇を抑制することもできる。したがって、本発明は、腫瘍治療用、特にキメラ抗原受容体細胞腫瘍標的療法（ＣＡＲ−Ｔ、ＣＡＲ−ＮＫ、ＣＡＲ−ＮＫＴ、ＣＡＲ−γδＴ細胞療法）用の医薬品の調製に使用することができる。
2020536514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）、及び／又は遺伝的破壊
を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を有する免疫細胞。
【請求項２】
前記遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１遺伝子の不活化、活性低下、及び／又は発現低下をもたら
すＨＰＫ−１遺伝子の欠失、突然変異、及び／又は挿入を含む、請求項１に記載の免疫細
胞。
【請求項３】
前記遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１遺伝子の少なくとも１つのエキソン（例えば、第１又は第
２エキソン）の少なくとも一部の欠失を含む、請求項１又は２に記載の免疫細胞。
【請求項４】
前記遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１遺伝子における挿入及び削除（インデル）に影響する非相
同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されるＨＰＫ−１遺伝子（例えば、第１又は第２エ
キソン）の二本鎖切断（ＤＳＢ）の作成を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免
疫細胞。
【請求項５】
前記薬剤が阻害性核酸分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項６】
前記阻害性核酸分子はＲＮＡ干渉剤であるか、又はそれを含む、請求項５に記載の免疫細
胞。
【請求項７】
前記阻害性核酸分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮ
Ａ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、前駆体マイクロＲＮ
Ａ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、それらを含むか、
又はコードする、請求項５又は６に記載の免疫細胞。
【請求項８】
前記阻害性核酸分子はＨＰＫ−１遺伝子の核酸配列に相補的な配列を含む、請求項５〜７
のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項９】
前記阻害性核酸分子は、ＨＰＫ−１遺伝子の核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌク
レオチドである、それを含むか、又はコードする、請求項５に記載の免疫細胞。
【請求項１０】
前記薬剤は、免疫細胞におけるＨＰＫ−１の発現を低下させるか又は低下させることがで
きる１つ以上の分子、又は１つ以上の分子をコードするポリヌクレオチドであるか、又は
それらを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１１】
前記１つ以上の分子は、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝
子編集ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エ
フェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ｍ又はＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認識、
又はハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、又はそれらを含む
か、コードする、請求項１０に記載の免疫細胞。
【請求項１２】
前記薬剤は、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラ
スター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９、及び／
又はＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、請求項１０又は１１に記
載の免疫細胞。
【請求項１３】
前記薬剤は、（ａ）ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを有する
ｇＲＮＡ（例えば、第１又は第２のエクソンに）、又は前記ｇＲＮＡをコードするポリヌ
クレオチド、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、又は前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド、又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含む、請求項１０〜１２のいずれか１
項に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
前記薬剤は、Ｃａｓ９分子と、ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメインと相補的な標的化ドメイ
ン（例えば、第１エクソンに）を有するｇＲＮＡとの複合体を含む、請求項１０〜１２の
いずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１５】
前記ｇＲＮＡは、配列番号１及び１１−１５から選択される標的配列と完全に相補的な配
列と同一であるか、又は３ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含む標的化ドメインを有す
る、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１６】
前記Ｃａｓ９は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９であり、必要に応じて核局在化配列を挿入する
ことにより修飾される（例えば、前記Ｃａｓ９分子のＣ末端及びＮ末端の一方又は両方に
挿入する）、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１７】
前記免疫細胞には、他の遺伝子が実質的に破壊されない、請求項１〜１６のいずれか１項
に記載の免疫細胞。
【請求項１８】
前記免疫細胞にＰＤ‐１又はＰＤＬ‐１ポリペプチドをコードする遺伝子の遺伝的破壊（
例えば、遺伝子ノックアウト）をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の免
疫細胞。
【請求項１９】
対象由来の初代細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２０】
白血球、又はヒト末梢血単核細胞などのヒト細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項
に記載の免疫細胞。
【請求項２１】
ＣＤ３陽性である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２２】
Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、αβＴ
細胞又はγ δＴ細胞）又はＮＫ細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の免
疫細胞。
【請求項２３】
癌に罹患している対象の初代細胞に由来し、前記癌は、リンパ腫、慢性リンパ性白血病（
ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨
髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多
発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、
肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、及
び／又は髄芽腫である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２４】
前記免疫細胞の表面に発現される組換え受容体又は組換え受容体をコードするポリヌクレ
オチドをさらに含み、前記組換え受容体は抗原に特異的に結合し、前記免疫細胞は、組換
え受容体が抗原に結合すると、細胞毒性を誘発し、サイトカインを増殖及び／又は分泌す
ることができる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２５】
前記組換え受容体は組換えＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である、請求項２４に記載
の免疫細胞。
【請求項２６】
前記組換え受容体は、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２
２、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３
３、ＣＤ３８、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２
、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、
ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖
、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソセリン、ＭＵＣ１
、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ
１００、胎児腫瘍性抗原、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立
腺特異抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、Ｃ
Ｄ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍
１（ＷＴ−１）、サイクリンＡｌ（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ及びインターロイキン１２か
ら独立して選択される１つ以上の抗原に特異的に結合する、請求項２４又は２５に記載の
免疫細胞。
【請求項２７】
前記組換え受容体は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、インテグリンαＶβ６、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ
ｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、及び／又はメソセリンに特異的に結合する、請
求項２４又は２５に記載の免疫細胞。
【請求項２８】
以下の１つ以上を特徴とする請求項１〜２７のいずれか１項に記載の免疫細胞を含む細胞
集団。
（１）細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％又は９５％が、内因性ＨＰＫ−１ポリペプチドを発現せず、連続ＨＰ
Ｋ−１遺伝子、ＨＰＫ−１遺伝子、及び／又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まないこと、
（２）例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウエスタンブロ
ット法に従う方法によって決定されるように、細胞集団におけるＨＰＫ−１遺伝子ノック
アウト効率は、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％又は９５％であること、
（３）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ−１、ＴＩＭ−
３、及び／又はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそ
れよりも低いこと、
（４）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発現
している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれよりも低いこと、
（５）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現
している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれよりも高いこと
【請求項２９】
前記細胞の少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％は細胞表面に請求
項２４〜２７のいずれか１項に記載の組換え受容体を発現する、請求項２８に記載の細胞
集団。
【請求項３０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の免疫細胞又は請求項２８又は２９に記載の細胞集
団、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記細胞内のＨＰＫ−１遺伝子の発現を低下させる、又は低下させることができる１つ以
上の分子をコードする、必要に応じて発現カセットである核酸分子。
【請求項３２】
前記１つ以上の分子は、ＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認識、又はハイブリダイズす
る、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子編集ヌクレアーゼ
、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクターヌクレア
ーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、それらを含むか、
又はコードする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記１つ以上の分子は、ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメイン（例えば、第１又は第２エクソ
ンに）と相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡである、それを含むか、又はコードする
、請求項３１又は３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記ｇＲＮＡは、配列番号１及び１１‐１５から選択される標的配列と完全に相補的な配
列と同一であるか、又は３ヌクレオチド以下だけ異なる標的化ドメインを含む、請求項３
３に記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記配列番号３及び配列番号４に示される配列を含む二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項３
３に記載の核酸分子。
【請求項３６】
前記抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、必要に応じて第２発現カセットである第２核酸
をさらに含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３８】
プラスミドベクターであるか、又はそれを含む、請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】
レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、
レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ベクターなどのウイル
スベクターであるか、又はそれらを含む、請求項３７に記載のベクター。
【請求項４０】
前記ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメイン（例えば、第１又は第２エクソンに）と相補的、結
合、認識、又はハイブリダイズする標的化ドメインを含むｇＲＮＡ。
【請求項４１】
前記標的化ドメインは、配列番号１及び１１〜１５から選択される標的配列と完全に相補
的な配列と同一であるか、又は３ヌクレオチド以下だけ異なる、請求項４０に記載のｇＲ
ＮＡ。
【請求項４２】
モジュラーｇＲＮＡである、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項４３】
単分子／キメラｇＲＮＡである、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項４４】
化膿レンサ球菌又は黄色ブドウ球菌ｇＲＮＡである、請求項４１〜４３のいずれか１項に
記載のｇＲＮＡ。
【請求項４５】
請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡとＣａｓ９分子を含むＣａｓ９／ｇＲ
ＮＡ分子複合体。
【請求項４６】
前記Ｃａｓ９分子は、１つ以上の核局在化配列で操作されたＣａｓ９である、請求項４５
に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項４７】
前記Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子である、請求項４
５又は４６に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項４８】
前記ＨＰＫ‐１遺伝子の標的ドメイン（例えば、第１又は第２エキソンに）を切断するこ
とができる、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項４９】
前記ＨＰＫ‐１遺伝子（例えば、第１又は第２エクソンに）に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作
成することができる、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子
複合体。
【請求項５０】
請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡをコードする核酸、又
は請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体、又はＣａｓ
９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む免疫細胞。
【請求項５１】
前記ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を誘発するか、誘発す
ることができる薬剤を免疫細胞に導入することを含む、遺伝子操作された免疫細胞の産生
方法。
【請求項５２】
前記薬剤は、ＨＰＫ−１の発現を低下させるか又は低下させることができる１つ以上の分
子、又は１つ以上の分子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の方法
。
【請求項５３】
前記１つ以上の分子は、ＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認識、又はハイブリダイズす
る、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子編集ヌクレアーゼ
、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクターヌクレア
ーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、これらを含むか、
これらをコードする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記薬剤は、（ｉ）請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、又は（ｉｉ）前
記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤は、請求項４５〜４９のいずれか１項のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体、又は前
記Ｃａｓ９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む、請求項５１〜５４のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記導入は、インビトロで免疫細胞を薬剤と接触させることを含む、請求項５１〜５５の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記導入はエレクトロポレーションを含む、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項５８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の組換え受容体をコードする核酸分子を前記免疫
細胞に導入することをさらに含む、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫細胞は対象由来の初代細胞である、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項６０】
前記免疫細胞は、白血球又はヒト末梢血単核細胞などのヒト細胞である、請求項５１〜５
９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫細胞はＣＤ３陽性である、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＮＫ
Ｔ細胞、αβＴ細胞又はγ δＴ細胞）又はＮＫ細胞である、請求項５１〜６１のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項６３】
複数の前記免疫細胞に対して実施される、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項６４】
請求項５１〜６３のいずれか１項に記載の方法により産生される免疫細胞又は細胞集団。
【請求項６５】
前記Ｔ細胞を、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を誘発する
か、誘発することができる薬剤と接触させることを含む、Ｔ細胞の改変方法。
【請求項６６】
前記薬剤は、ＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認識、又はハイブリダイズする、アンチ
センス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフ
ィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡ
ＬＥＮ）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、それらを含むか、又はコード
する１つ以上の分子を含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記薬剤は、（ｉ）請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、又は（ｉｉ）ｇ
ＲＮＡをコードする核酸を含む、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記薬剤は、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体、
又はＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む、請求項６５〜６７の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｔ細胞は、癌に罹患している対象由来であり、前記癌は、例えば、リンパ腫、慢性リ
ンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性
白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（
ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、乳癌、卵
巣癌、黒色腫、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星状細胞腫、中皮腫
、頭頸部癌、髄芽腫から選ばれる、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記薬剤との接触はインビトロ又はエクスビボである、請求項６５〜６９のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項７１】
核酸を前記Ｔ細胞に導入する条件下で、前記Ｔ細胞を請求項３６〜３９のいずれか１項に
記載の組換え受容体をコードする核酸と接触させることをさらに含む、請求項６５〜７０
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法により産生される改変されたＴ細胞又は細
胞集団。
【請求項７３】
免疫細胞集団の細胞毒性を強化し、疲弊化を抑制し、及び／又は脾臓及び／又は腫瘍にお
ける浸潤を強化する方法であって、
前記免疫細胞集団を、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を誘
発するか又は誘発することができる薬剤と接触させることを含む方法。
【請求項７４】
前記薬剤は、ＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認識、又はハイブリダイズする、アンチ
センス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフ
ィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡ
ＬＥＮ）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、これらを含むか、又はコード
する１つ以上の分子を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記薬剤は、（ｉ）請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、又は（ｉｉ）ｇ
ＲＮＡをコードする核酸を含む、請求項７３〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記薬剤は、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体、
又はＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む、請求項７３〜７５の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記接触は、前記免疫細胞におけるＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノッ
クアウト）を誘発して、以下の１つ以上を特徴とする細胞集団を提供するのに有効である
、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の方法。
（１）細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％又は９５％は内因性ＨＰＫ−１ポリペプチドを発現せず、連続ＨＰＫ
−１遺伝子、ＨＰＫ−１遺伝子、及び／又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まないこと、
（２）例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウエスタンブロ
ット法に従う方法によって決定されるように、細胞集団におけるＨＰＫ−１遺伝子ノック
アウト効率は、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％又は９５％であること、
（３）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ−１、ＴＩＭ−
３、及び／又はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合は、接触前に測定され
た免疫細胞集団の割合よりも低いこと、
（４）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発現
している細胞集団中の細胞の割合は、接触前に測定された免疫細胞集団の割合よりも低い
こと、
（５）フローサイトメトリーにより決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現す
る細胞集団中の細胞の割合は、接触前に測定された免疫細胞集団のそれよりも高いこと
【請求項７８】
前記ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を含む免疫細胞を選
択することをさらに含む、請求項７３〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を含む免疫細胞を増
殖することをさらに含む、請求項７３〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記増殖はインビトロ、エクスビボ、又はインビボで行われる、請求項７９に記載の方法
。
【請求項８１】
前記免疫細胞集団は、Ｔ細胞集団（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞集団）である、請求項７３〜
８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
（ａ）ヒト患者から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を得ることと、
（ｂ）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を免疫細胞（
例えば、Ｔ細胞）に導入することと、
（ｃ）前記薬剤を用いて前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）をインキュベートし、必要に応
じて増殖させ、ＨＰＫ−１遺伝子破壊免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）集団を提供することと
、を含む、免疫細胞の産生方法（例えば、Ｔ細胞を改変する）。
【請求項８３】
（ａ）ヒト患者（例えば、本明細書に記載のように）から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）集
団を得ることと、
（ｂ）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発することができる前記薬剤を前記免
疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団に導入することと、
（ｃ）前記薬剤を用いて前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）をインキュベートし、必要に応
じて増殖させ、前記薬剤を導入する前の細胞集団と比較して強化された細胞毒性、低減さ
れた疲弊化、及び／又は強化された脾臓及び／又は腫瘍における浸潤を有するＨＰＫ−１
遺伝子破壊免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）集団を提供することと、を含む、免疫細胞集団の
細胞毒性を強化し、疲弊化を抑制し、及び／又は脾臓及び／又は腫瘍における浸潤を強化
する方法。
【請求項８４】
前記核酸を前記免疫細胞に導入する条件下で、前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を、請求
項３６〜３９のいずれか１項に記載の組換え受容体をコードする核酸と接触させることを
さらに含み、前記免疫細胞への核酸の導入は、前記薬剤の導入と同時に、又は任意の順序
で行うことができる請求項８２又は８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記薬剤は、（ｉ）請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、又は（ｉｉ）ｇ
ＲＮＡをコードする核酸を含む、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記薬剤は、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体、
又はＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む、請求項８２〜８５の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ヒト患者は、癌に罹患しており、前記癌は、リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ
）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白
血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨
髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、
前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、及び／又
は髄芽腫である、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＨＰＫ−１遺伝子破壊免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）集団は、以下の１つ以上を特徴と
する請求項８２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
（１）細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％又は９５％は内因性ＨＰＫ−１ポリペプチドを発現せず、連続ＨＰＫ
−１遺伝子、ＨＰＫ−１遺伝子、及び／又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まないことと、
（２）例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウエスタンブロ
ット法に従う方法によって決定されるように、細胞集団におけるＨＰＫ−１遺伝子ノック
アウト効率は、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％又は９５％であること、
（３）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ−１、ＴＩＭ−
３、及び／又はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそ
れよりも低いこと、
（４）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発現
している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれよりも低いこと、
（５）フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現
している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれよりも高いこと
【請求項８９】
ａ．細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％又は９５％は内因性ＨＰＫ−１ポリペプチドを発現せず、連続ＨＰＫ−
１遺伝子、ＨＰＫ−１遺伝子、及び／又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まず、又は、例え
ば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウエスタンブロット法に従
う方法により決定されるように、細胞集団におけるＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト効率は
、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は
９５％であり、
ｂ．細胞の少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％は細胞表面にキメ
ラ抗原受容体を発現していることを特徴とするＣＡＲ−Ｔ細胞集団。
【請求項９０】
さらに
ａ．フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ−１、ＴＩＭ−３
、及び／又はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれ
よりも低いこと、
ｂ．フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発現し
ている細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれよりも低いこと、及び／又は
ｃ．フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現し
ている細胞集団中の細胞の割合は、対照細胞集団のそれよりも高いことを特徴とする、請
求項８９に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞集団。
【請求項９１】
癌患者由来のＴ細胞と、Ｔ細胞のＨＰＫ−１遺伝子をノックアウトする手段と、を含む組
成物。
【請求項９２】
前記Ｔ細胞は、癌患者由来の初代Ｔ細胞、ＣＡＲ‐Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、又はＮＫ
細胞である、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の免疫細胞又は細胞集団、請求項３０に記載の医薬
組成物、請求項６７、請求項７７に記載の改変されたＴ細胞又は細胞集団、請求項８９−
９０に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞集団、又は請求項９１−９２に記載の組成物を、それを必要
とする対象に、治療有効量で投与する、疾患又は障害を治療する方法。
【請求項９４】
（ａ）治療を必要とする対象から前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を得ることと、
（ｂ）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を前記免疫細
胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することと、
（ｃ）前記薬剤を用いて前記免疫細胞をインキュベートし、必要に応じて増殖させ、ＨＰ
Ｋ−１遺伝子破壊細胞集団を提供することと、
（ｄ）前記ＨＰＫ−１遺伝子破壊細胞集団を前記対象に投与することと、を含む、疾患又
は障害を治療する方法。
【請求項９５】
前記核酸を前記Ｔ細胞に導入する条件下で、前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を、請求項
３６〜３９のいずれか１項に記載の組換え受容体をコードする核酸と接触させることをさ
らに含み、前記免疫細胞への核酸の導入は、前記薬剤の導入と同時に、又は任意の順序で
行うことができる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記薬剤は、（ｉ）請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、又は（ｉｉ）前
記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む、請求項９４〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記薬剤は、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のＣａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体、
又は前記Ｃａｓ９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む、請求項９４〜９
６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記疾患又は障害は、感染性疾患又は状態、自己免疫疾患、炎症性疾患、もしくは腫瘍又
は癌である、請求項９３〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記疾患又は状態は、癌又は腫瘍であり、前記癌又は腫瘍は、白血病、リンパ腫、慢性リ
ンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、
急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、低悪
性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、
皮膚癌、黒色腫、骨癌、脳癌、上皮癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、ホジキンリンパ腫、子宮頸
癌、直腸結腸癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、
及び／又は中皮腫である、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年９月２０日に提出された中国出願番号２０１７１０８５３０９０．
２の優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている。
【技術分野】
【０００２】
様々な実施形態において、本発明は、分子生物学及び免疫学の技術分野に関し、より詳細
には、癌免疫療法に関する。例えば、様々な実施形態において、本発明は一般に、ＨＰＫ
１遺伝子を編集するための組成物及び方法、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞などのＨＰ
Ｋ１遺伝子を編集した細胞、該細胞を含む医薬組成物、並びに、これらの癌治療用等の使
用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍は、人間の健康を脅かす主要な疾患の一つであり、近年、腫瘍に対する免疫療法は、
徐々に腫瘍治療の研究のホットスポットになっている。腫瘍免疫細胞療法とは、人体から
採取した免疫細胞をインビトロで修飾、培養、増殖した後、患者の体に戻して体自身の免
疫機能を刺激・強化し、それによって腫瘍の成長を抑制し、腫瘍細胞を殺傷するという効
果を果たす。
【０００４】
多くの癌免疫療法のうち、キメラ抗原受容体Ｔ細胞腫瘍標的療法（ＣＡＲ−Ｔ細胞療法）
とＰＤ−１阻害剤療法は、比較的明確なメカニズムと効果のあるものである。ＣＡＲ−Ｔ
を含む細胞免疫療法は、血液腫瘍の治療で顕著な成功を達成しているが、固形腫瘍の治療
には障害がある。その主な理由は、Ｔ細胞の枯渇、活性低下、及び不十分な腫瘍殺傷能に
あり、したがって、新しいＴ細胞のインビトロ修飾部位と修飾方法の発見、Ｔ細胞の活性
と殺傷活性の向上、Ｔ細胞の枯渇の抑制が、将来の研究及び技術開発の方向である。
【０００５】
造血前駆キナーゼ１（ｈｐｋ１、ＨＰＫ１、ＨＰＫ−１、又はｍａｐ４ｋ１と略記）は、
哺乳類動物ｓｔｅ２０関連プロテインキナーゼのｍａｐ４ｋファミリーに属する造血特異
的セリン／スレオニンプロテインキナーゼである。Ｈｐｋ１は、主に造血組織及び細胞で
発現している。ｈｐｋ１は、ｍａｐｋ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナ
ル伝達、抗原受容体シグナル伝達、アポトーシスシグナル伝達、成長因子シグナル伝達や
サイトカインシグナル伝達など、多くのシグナル伝達カスケードに関与することが多くの
研究で示されている。ｈｐｋ１の活性化には、セリンリン酸化、スレオニンリン酸化、又
はチロシンリン酸化の３つの方法がある。ＰＣＲ技術が１９９６年にマウス造血前駆細胞
からｈｐｋ１をクローンするために最初に使用されて以来、研究によれば、ｈｐｋ１が主
に造血組織と細胞で発現されていることが示されている。現在、ｈｐｋ１についての研究
は、主に造血系に焦点を当てている。最近の研究では、ｈｐｋ１が癌に関連する可能性が
あることが示されている。Ｓａｗａｓｄｉｋｏｓｏｌ  Ｓ．らのマウスモデルの研究によ
り、Ｔ細胞及びＤＣ細胞のｈｐｋ１遺伝子の破壊は肺癌細胞の成長を阻害するのに役立つ
ことが見出されており、ｈｐｋ１は抗腫瘍免疫療法の新しい標的になると期待されている
。ＵＳ２０１６０１５８３６０は、癌を治療するために、ｈｐｋ１セリン／トレオニンプ
ロテインキナーゼ活性を阻害するｈｐｋ１アンタゴニストをＰＤ−１アンタゴニストと組
み合わせて使用することを開示している。
【発明の概要】
【０００６】
様々な実施形態において、本開示は、ＨＰＫ−１遺伝子破壊に関連する細胞、細胞組成物
、核酸、及びベクター、並びにそれらの調製方法及び使用方法を提供する。
【０００７】
本開示のいくつかの実施形態は、ＨＰＫ‐１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノック
アウト）、及び／又は遺伝的破壊を誘発するか、誘発することができる薬剤を含む免疫細
胞に関する。前記遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１遺伝子の欠失、突然変異、及び／又は挿入を
含み、ＨＰＫ−１遺伝子の不活化、活性低下、及び／又は発現低下をもたらすことができ
る。例えば、いくつかの実施形態では、前記遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１遺伝子の少なくと
も１つのエキソン（例えば、第１又は第２エキソン）の少なくとも一部の欠失を含むこと
ができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、前記遺伝的破壊は、ＨＰＫ−
１遺伝子における挿入及び削除（インデル）に影響する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によ
って修復されるＨＰＫ−１遺伝子（例えば、第１又は第２エキソン）の二本鎖切断（ＤＳ
Ｂ）の作成も含むことができる。いくつかの実施形態では、前記遺伝的破壊は、ＤＳＢに
続くドナー配列（例えば、本明細書に記載のＣＡＲをコードする配列）を挿入するための
相同性指向修復（ＨＤＲ）によって修復されるＨＰＫ−１遺伝子の二本鎖切断の作成も含
むことができる。いくつかの実施形態では、前記遺伝的破壊は、免疫細胞が内因性ＨＰＫ
−１ポリペプチドを発現しないこと、連続ＨＰＫ−１遺伝子、ＨＰＫ−１遺伝子、及び／
又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まないことのうちの１つ以上を含むことができる。
【０００８】
さまざまな薬剤は、本明細書の遺伝的破壊への影響に用いられ得る。例えば、いくつかの
実施形態では、前記薬剤は、ＲＮＡ干渉剤などの阻害性核酸分子であり得る。いくつかの
形態において、前記阻害性核酸分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮ
Ａ適合ｓｈＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、前駆
体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、こ
れらを含むか、又はコードする。いくつかの実施形態では、前記阻害性核酸分子は、ＨＰ
Ｋ−１遺伝子の核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的な配列を含む。いくつかの実施形
態において、前記薬剤は、免疫細胞におけるＨＰＫ−１の発現を低下させるか又は低下さ
せることができる１つ以上の分子、又は前記１つ以上の分子をコードするポリヌクレオチ
ドを含むことができる。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の分子は、アンチセ
ンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフィ
ンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬ
ＥＮ）、又はＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認識、又はハイブリダイズするＣＲＩＳ
ＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、これらを含むか、又はコードすることができる。
【０００９】
いくつかの特定の実施形態では、前記薬剤は、（ａ）ＨＰＫ‐１遺伝子の標的ドメインと
相補的な標的化ドメインを有するｇＲＮＡ、又は前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオ
チド、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、又は前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレ
オチド、又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態にお
いて、前記薬剤は、Ｃａｓ９分子のリボ核タンパク質複合体（又は分子複合体又は単に複
合体又はＲＮＰ）及びＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを有す
るｇＲＮＡを含むことができる。様々なｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質が適切であり、
本明細書に記載のものが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、
配列番号１及び１１〜１５から選択される標的配列に完全に相補的な配列と同一であるか
、又は１、２又は３ヌクレオチド以下だけ異なる標的化配列を有することができる。いく
つかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、配列番号１及び１１〜１５から選択される標的配
列に少なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％相補的であり、例えば、完全に
相補的である標的化配列を有することができる。前記ｇＲＮＡは、キメラ又はモジュラー
であり得る。いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ９タンパク質は化膿レンサ球菌Ｃ
ａｓ９である。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９タンパク質は、哺乳類動物、例え
ばヒトの免疫細胞の核へのＣａｓ９分子の進入を促進することができる核局在化配列（例
えば、Ｃａｓ９分子のＣ末端及びＮ末端の一方又は両方に挿入する）を挿入することによ
りさらに修飾される。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、前記ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９
の複合体は、二本鎖切断で標的ドメインを切断することができ、それにより、ＮＨＥＪ又
はＨＤＲを介したＨＰＫ‐１遺伝子の修復を可能にする。
【００１０】
いくつかの実施形態は、本明細書の薬剤をコードする核酸及びベクターにも関する。本明
細書に使用され得るベクターには、プラスミドベクター、及びウイルスベクター例えばレ
トロウイルスベクター、レンチウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクター又はア
デノ随伴ベクターなどの他のベクターが含まれるが、これらに限定されない。核酸又はベ
クターを含む細胞も本開示の一実施形態である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書の免疫細胞は、好ましくは、免疫細胞の表面に発現さ
れる組換え受容体又は組換え受容体をコードするポリヌクレオチドも含む。典型的には、
前記組換え受容体は抗原に特異的に結合し、前記免疫細胞は、組換え受容体が抗原に結合
すると、細胞毒性を誘発し、サイトカインを増殖及び／又は分泌することができる。本明
細書に記載されるものを含む様々な組換え受容体が適切である。例えば、いくつかの実施
形態では、前記組換え受容体は組換えＴ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、前
記組換え受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。非限定的な有用な組換えＴＣＲ及
びＣＡＲは本明細書に記載されている。例えば、いくつかの実施形態では、前記組換え受
容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、
ＣＤ２２、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、
ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰ
Ｈａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、Ｇ
Ｄ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、カッ
パ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソセリン、Ｍ
ＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１
、ｇｐ１００、胎児腫瘍性抗原、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）
、前立腺特異抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ
２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３  、ＣＥ７、ウィル
ムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡｌ（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ及びインターロイキ
ン１２から独立して選択される１つ以上の抗原に特異的に結合できる。
【００１２】
様々な免疫細胞は本開示の組成物及び方法に使用され得る。いくつかの実施形態では、前
記免疫細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞には、Ｃａｒ−Ｔ
細胞などのＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、前
記免疫細胞は養子免疫療法に使用することができる。いくつかの実施形態では、前記免疫
細胞は、リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−Ａ
ＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、
びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽細胞
腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵
臓癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、及び／又は髄芽腫などの癌に罹患している対象の
初代細胞に由来し得る。
【００１３】
本明細書のＨＰＫ−１遺伝的破壊を有する免疫細胞又は細胞集団は、遺伝的破壊を有さな
い対照免疫細胞と比較して、特定の強化された特徴を特徴とする。例えば、いくつかの実
施形態では、前記ＨＰＫ−１遺伝的破壊を有する免疫細胞又は細胞集団は、強化された細
胞毒性、減少されたアポトーシス、改善した持続性、及び／又は低減された疲弊化を特徴
とすることができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト効率が、例えば、実
施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウエスタンブロット法に従う方法
によって決定されるように、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％又は９５％であることを特徴とする、本明細書の免疫細胞（例えば
、Ｃａｒ−Ｔ細胞などのＴ細胞）を含む細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、
前記細胞集団は、さらに、細胞の少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、又は９
０％が細胞表面に組換え受容体（例えば、キメラ抗原受容体、例えば本明細書に記載のも
の）を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、さらに、フロ
ーサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び／
又はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合が、対照細胞集団よりも低いこと
、フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発現して
いる細胞集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも低いこと、及び／又はフローサ
イトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現している細胞集
団中の細胞の割合が、対照細胞集団のそれよりも高いことを特徴とする。
【００１５】
本開示のいくつかの実施形態は、免疫細胞の産生方法、例えば、Ｔ細胞の改変方法に関す
る。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝
子ノックアウト）を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を免疫細胞（例えば、Ｔ
細胞）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）ヒト患者（
例えば、本明細書に記載のように）から免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を得ることと、（ｂ
）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を免疫細胞（例え
ば、Ｔ細胞）に導入することと、（ｃ）前記薬剤を用いて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を
インキュベートし、必要に応じて増殖させ、ＨＰＫ−１遺伝子破壊免疫細胞（例えば、Ｔ
細胞）集団を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、組換え受
容体（例えば、本明細書に記載のＣＡＲ又はその産物）をコードする核酸を免疫細胞（例
えば、Ｔ細胞）に導入することをさらに含む。適切な免疫細胞及び薬剤には、本明細書に
記載のものが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫細胞には、例えば、ＨＰ
Ｋ−１遺伝子における二本鎖切断で標的ドメインを切断することができる任意のｇＲＮＡ
／Ｃａｓ９の複合体を導入することができ、これにより、免疫細胞におけるＮＨＥＪ又は
ＨＤＲを介したＨＰＫ−１遺伝子の修復を可能にする。本明細書の方法によって産生され
る免疫細胞又は細胞集団は、本明細書に記載のように、例えばＨＰＫ−１遺伝子ノックア
ウト効率、疲弊化マーカー、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び／又はＬａｇ−３の発現、アポ
トーシスマーカーアネキシンＶの発現、細胞毒性マーカーＣＤ１０７ａの発現などのいず
れかを特徴とすることができる。
【００１６】
本開示のいくつかの実施形態は、免疫療法用の免疫細胞の機能を強化する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞集団の細胞毒性を強化し、疲弊化を抑制し
、及び／又は脾臓及び／又は腫瘍における浸潤を強化する方法を提供し、前記方法は、免
疫細胞集団を、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を誘発する
か、誘発することができる薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記
方法は、（ａ）ヒト患者（例えば、本明細書に記載のように）から免疫細胞（例えば、Ｔ
細胞）集団を得ることと、（ｂ）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発すること
ができる薬剤を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）集団に導入することと、（ｃ）前記薬剤を用
いて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）をインキュベートし、必要に応じて増殖させ、薬剤を導
入する前の細胞集団と比較して強化された細胞毒性、低減された疲弊化、及び／又は脾臓
及び／又は腫瘍における強化された浸潤を有するＨＰＫ−１遺伝子破壊免疫細胞（例えば
、Ｔ細胞）集団を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、組換
え受容体（例えば、本明細書に記載のＣＡＲ又はその産物）をコードする核酸を免疫細胞
（例えば、Ｔ細胞）に導入することをさらに含む。適切な免疫細胞及び薬剤には、本明細
書に記載のものが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫細胞には、例えば、
ＨＰＫ−１遺伝子における二本鎖切断で標的ドメインを切断することができる任意のｇＲ
ＮＡ／Ｃａｓ９の複合体を導入することができ、これにより、免疫細胞におけるＮＨＥＪ
又はＨＤＲを介したＨＰＫ−１遺伝子の修復を可能する。
【００１７】
本開示のいくつかの実施形態は、ＨＰＫ−１遺伝的破壊を有する免疫細胞又は本明細書の
細胞組成物を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
本開示のいくつかの実施形態は、疾患又は障害を治療する方法に関する。いくつかの実施
形態では、前記疾患又は障害は、感染性疾患又は状態、自己免疫疾患、炎症性疾患又は腫
瘍又は癌である。いくつかの実施形態では、前記疾患又は障害は、癌又は腫瘍であっても
よく、前記癌又は腫瘍は、白血病、リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リン
パ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難
治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性癌、
結腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、皮膚癌、黒色腫、骨癌、脳癌、上皮癌
、腎細胞癌、膵臓腺癌、ホジキンリンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、膠芽腫、神経芽腫、
ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、及び／又は中皮腫である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、それを必要とする対象に、本明細書のＨＰＫ−１
遺伝的破壊を有する免疫細胞又は細胞組成物を治療的有効量で投与することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）治療を必要とする対象から免疫細胞（例え
ば、Ｔ細胞）を得ることと、（ｂ）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発するこ
とができる薬剤を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することと、（ｃ）前記薬剤を用い
て免疫細胞をインキュベートし、必要に応じて増殖させ、ＨＰＫ−１遺伝子破壊細胞集団
を提供することと、（ｄ）ＨＰＫ−１遺伝子破壊細胞集団を前記対象に投与することと、
を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、（ｅ）組換え受容体（例えば、本明細書
に記載のＣＡＲ又はその産物）をコードする核酸を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入す
ることをさらに含む。（ｂ）と（ｅ）の導入ステップは、同時に又は任意の順序で実行で
きる。適切な薬剤及び組換え受容体には、本明細書に記載のものが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読むことにより、様々な他の利点及び利益が当業
者にとって明らかになる。図面は、好ましい実施形態を例示するために過ぎず、本発明を
限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】精製されたインビトロ転写ｇＲＮＡの代表的なゲル電気泳動画像を左から右に示している。レーン１は空白対照ＮＣであり、レーン２は精製されたＨＰＫ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン３は精製されたＰＤ１  ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡである。
【図２】精製された発現組換えＣａｓ９タンパク質の代表的なゲル電気泳動画像を左から右に示している。レーン１はタンパク質分子量マーカーであり、レーン２は濃縮後の組換えＣａｓ９タンパク質（ＧＳＴタグ付き）であり、レーン３は、トロンビンによるＧＳＴタグの切除後のＣａｓ９タンパク質であり、レーン４は、濃縮前の組換えＣａｓ９タンパク質（ＧＳＴタグ付き）である。
【図３】アガロースゲル電気泳動の画像であり、さまざまな条件下での代表的な遺伝子ノックアウト効率を示している。実施例４に示されるように、Ｔ７Ｅ１酵素消化により検出された結果、左から右に、レーン１は４×１０６Ｔ細胞＋８μｇＣａｓ９タンパク質＋８μｇＨＰＫ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン２は４×１０６Ｔ細胞＋８μｇＣａｓ９タンパク質＋１６μｇＨＰＫ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン３は４×１０６Ｔ細胞＋１６μｇＣａｓ９タンパク質＋８μｇＨＰＫ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン４は、４×１０６Ｔ細胞＋１６μｇＣａｓ９タンパク質＋１６μｇＨＰＫ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン５は、４×１０６Ｔ細胞＋８μｇＣａｓ９タンパク質＋８μｇＰＤ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン６は、４×１０６Ｔ細胞＋８μｇＣａｓ９タンパク質＋１６μｇＰＤ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン７は、４×１０６Ｔ細胞＋１６μｇＣａｓ９タンパク質＋８μｇＰＤ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡであり、レーン８は、４×１０６Ｔ細胞＋１６μｇＣａｓ９タンパク質＋１６μｇＰＤ１ｇＲＮＡ  ｍＲＮＡである。
【図４】代表的な遺伝子ノックアウト効率を示すウエスタンブロット画像を示している。結果は、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞におけるＨＰＫ１の発現レベルが他の３つの群よりも有意に減少することを示している。β−アクチンを内部参照として使用した。
【図５】ＣＤ１９＋細胞、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞及びＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞の表面マーカーＣＡＲ１９及びＰＤ１受容体を検出するフローサイトメトリーの結果を示している。画像は、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞の表面上のＰＤ１受容体が、対照ＣＡＲ１９＋Ｔ細胞と比較して有意に減少していることを示している。ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞の表面上のＰＤ１受容体の発現レベルは、ＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞の発現レベルに近い。
【図６】異なる細胞組成物のＴ細胞殺傷活性を比較する棒グラフを示している：Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｔ細胞、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞及びＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞。図６Ａは、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２株に対する殺傷効果を比較している。図６Ｂは、リンパ芽球Ｒａｊｉ細胞株に対する殺傷効果を比較している。図６Ｃは、ヒトＢｕｒｋｋｉｔリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉに対する殺傷効果を比較している。
【図７Ａ】異なる細胞組成物のサイトカイン産物レベルを比較する棒グラフを示している：Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｔ細胞）、ＣＤ１９＋Ｔ細胞、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞及びＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞。図７Ａは、ＩＦＮ−γの生産レベルを比較している。
【図７Ｂ】異なる細胞組成物のサイトカイン産物レベルを比較する棒グラフを示している：Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｔ細胞）、ＣＤ１９＋Ｔ細胞、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞及びＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞。図７ＢはＩＬ−２の生産レベルを比較している。
【図８】異なる治療群間でのマウスの腫瘍体積の比較図を示している：Ｔ細胞治療群、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群（ｎ＝群あたり６マウス）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ検定。
【図９】Ｔ細胞、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯで処理したマウスの画像を示している。図９では、ＮＳＧマウスにＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃ細胞を接種し、７日後にＣＤ１９−ＣＡＲを発現する１ｘ１０６個のＴ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達モジュールを含む）、又はＥＧＦＲｔのみを発現するＴ細胞（群ごとにマウス４−５匹）で処理する。矢印はＴ細胞の移動の日を示す。腫瘍の成長を生物発光イメージングで分析し、個々のマウスの結果を異なるＣＡＲについてプロットした。異なるＣＡＲＴ細胞を受けたマウスのＴ細胞移植後７日（ｄ７）から移植後２８日（ｄ２８）までの画像が示されている。
【図１０】治療４０日後のマウスにおけるＴ細胞、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ細胞の持続性を示すグラフである。養子Ｔ細胞をマウスに移植した後に血液内のＴ細胞を定量化した。群あたりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（対応のないｔ検定による）。棒グラフと散布図は平均値±標準誤差を表す。
【図１１Ａ】各群（Ｔ細胞、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ細胞）のマウス腫瘍組織における細胞浸潤の様々な表面マーカー、アネキシンＶ／ＣＤ１０７ａ／ＰＤ１／Ｔｉｍ３／Ｌａｇ３の発現レベルの代表的な評価を示している。これら図は、養子移植後１４日目からのＣＡＲ  Ｔ細胞のアポトーシス、細胞毒性及び疲弊化マーカーの発現を評価している。図１１Ａは、腫瘍組織に浸潤している細胞上のアネキシンＶ／ＣＤ１０７ａ／ＰＤ１／Ｔｉｍ３／Ｌａｇ３の発現レベルを示すグラフを示している。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。
【図１１Ｂ】各群（Ｔ細胞、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ細胞）のマウス腫瘍組織における細胞浸潤の様々な表面マーカー、アネキシンＶ／ＣＤ１０７ａ／ＰＤ１／Ｔｉｍ３／Ｌａｇ３の発現レベルの代表的な評価を示している。これら図は、養子移植後１４日目からのＣＡＲ  Ｔ細胞のアポトーシス、細胞毒性及び疲弊化マーカーの発現を評価している。図１１Ｂは、腫瘍組織に浸潤しているＣａｒ−Ｔ細胞上のアネキシンＶ及びＣＤ１０７ａの発現レベルを示す棒グラフを示している。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。
【図１１Ｃ】各群（Ｔ細胞、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ細胞）のマウス腫瘍組織における細胞浸潤の様々な表面マーカー、アネキシンＶ／ＣＤ１０７ａ／ＰＤ１／Ｔｉｍ３／Ｌａｇ３の発現レベルの代表的な評価を示している。これら図は、養子移植後１４日目からのＣＡＲ  Ｔ細胞のアポトーシス、細胞毒性及び疲弊化マーカーの発現を評価している。図１１Ｃは、腫瘍組織に浸潤しているＣａｒ−Ｔ細胞上のＰＤ１、Ｔｉｍ３、及びＬａｇ３の発現レベルを示す棒グラフを示している。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。
【図１２】動物研究の一般的なフローチャートを示している。
【図１３Ａ】エクスビボ増殖中のｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊化を示している。Ａ．Ｔ細胞上のＨｅｒ２  Ｃａｒ発現
【図１３Ｂ】エクスビボ増殖中のｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊化を示している。Ｂ．ウェスタンブロットにより初期活性化後０日目のナイーブＴ細胞から１０日目までのＴ細胞上のＨＰＫ１の発現を評価し、３日目にＨｅｒ２  ＣＡＲを形質導入した。
【図１３Ｃ】エクスビボ増殖中のｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊化を示している。Ｃ．Ｆａｃｓにより０日目のナイーブＴ細胞から初期活性化後１０日目までのＴ細胞上のＨＰＫ１の発現を評価し、３日目にＨｅｒ２  ＣＡＲを形質導入した。
【図１３Ｄ】エクスビボ増殖中のｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊化を示している。Ｄ．蛍光顕微鏡により、異なるＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞でのＨＰＫ１発現（赤色）（ＰＤ１発現の高低）を検査した。
【図１４Ａ】Ｃａｓ９タンパク質を含むｓｇＲＮＡを使用したＨＰＫ１の切断効能を示すグラフ及び画像を示している。Ａ．ＦＡＣＳによりＴ細胞におけるＨｅｒ２  Ｃａｒ発現（形質導入後３日目）を分析した。
【図１４Ｂ】Ｃａｓ９タンパク質を含むｓｇＲＮＡを使用したＨＰＫ１の切断効能を示すグラフ及び画像を示している。Ｂ．ウェスタンブロットによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を標的としたＨＰＫ１又はＰＤ−１後のＨＰＫ１の発現を評価した。
【図１４Ｃ】Ｃａｓ９タンパク質を含むｓｇＲＮＡを使用したＨＰＫ１の切断効能を示すグラフ及び画像を示している。Ｃ．ＦＡＣＳにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を標的としたＨＰＫ１又はＰＤ−１後のＰＤ−１の発現を分析した。
【図１５Ａ】ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを伴うＨｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ効能の強化を示す画像とグラフを示している。図１５Ａでは、ＮＳＧマウスにＳＫＯＶ３−ｆｆｌｕｃ細胞を接種し、ＨＥＲ２−ＣＡＲを発現する１ｘ１０６個のＴ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達モジュールを含む）又はＥＧＦＲｔのみを発現するＴ細胞（群ごとにマウス４−５匹）で処理した。矢印はＴ細胞の移動日を示す。腫瘍の成長を生物発光イメージングで分析し、個々のマウスの結果を異なるＣＡＲについてプロットした。異なるＣＡＲＴ細胞を受けたマウスのＴ細胞移植後７日（ｄ７）から移植後２８日（ｄ２８）までの画像が示されている。
【図１５Ｂ】ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを伴うＨｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ効能の強化を示す画像とグラフを示している。図１５Ｂは、処理されたマウスの２８日間にわたる腫瘍成長を示すグラフを示している（１群あたりｎ＝６匹のマウス）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のないｔ検定。
【図１５Ｃ】ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを伴うＨｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ効能の強化を示す画像とグラフを示している。図１５Ｃは、マウスの生存率のカプラン・マイヤー分析を示している。ＳＫＯＶ−３担癌マウスを１×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処理した（１群あたりｎ＝６、ドット＝マウス１匹）。
【図１６】ＨＰＫ−１ノックアウトが腫瘍内のＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤を促進することを示す画像とグラフを示している。ＨＥＲ２−ＣＡＲを発現する１×１０６個のＴ細胞で処理した１０日後に、腫瘍組織をマウスから切除し、各組織を免疫組織化学（ＩＨＣ）に使用した。ＩＨＣ分析では、抗ＣＤ３抗体の組み合わせを一次染色に使用した。核をＤＡＰＩ（青）で染色した。ＩＨＣサンプルの顕微鏡検査は、倍率１００倍で実施された。腫瘍内のＣａｒ  Ｔ細胞を定量し、図１６のグラフはＣＡＲ−Ｔ細胞と腫瘍の比率も示している。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。
【図１７】ＨＰＫ−１ノックアウトが脾臓におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤を促進することを示す画像とグラフを示している。腫瘍浸潤Ｈｅｒ２  Ｃａｒ−ｔ細胞及び脾臓Ｈｅｒ２  Ｃａｒ−ｔ細胞を、ＨＥＲ２−ＣＡＲを発現する１×１０６個のＴ細胞で処理した２５日後に分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応のないｔ検定）。
【図１８Ａ】ＨＰＫ−１ノックアウトがインビボでＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞の疲弊化を改善することを示している。図１８Ａは、細胞毒性マーカーの分析を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意性なし。対応のないｔ検定。
【図１８Ｂ】ＨＰＫ−１ノックアウトがインビボでＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞の疲弊化を改善することを示している。図１８Ｂは、養子移植後１４日目のマウスからのＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊化マーカー発現の分析を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意性なし。対応のないｔ検定。
【図１９Ａ】ＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞のノックアウト及び感染効率を示している。図１９Ａは、ＣＡＲ−ＢＣＭＡレンチウイルスを７２時間形質導入した後の感染効率を示している。
【図１９Ｂ】ＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞のノックアウト及び感染効率を示している。図１９Ｂはウェスタンブロットの画像であり、ＨＰＲＮＡ−１遺伝子がエレクトロポローシス後に効率的にノックアウトされたことを示しており、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質比は約１：３である。
【図２０Ａ】ＰＤ−１ノックアウト前（上図  図２０Ａ）のＢＭＣＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞におけるＰＤ１の発現を示している。
【図２０Ｂ】ＰＤ−１ノックアウト後（下図  図２０Ｂ）のＢＭＣＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞におけるＰＤ１の発現を示している。
【図２１】ＨＰＫ−１編集Ｃａｒ  Ｔ細胞がインビトロで抗癌効能の強化を示すことを示すグラフを示している。Ｔ細胞及びＣＡＲ−ＢＣＭＡ  Ｔ細胞をＵ２６６（２１Ａ）、ＲＰＭＩ８２２６（２１Ｂ）、Ｋ５６２（２１Ｃ）及びＫ５６２−ＢＣＭＡ（２１Ｄ）と共培養し、１２時間後、細胞毒性をテストした。＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５。
【図２２】ＨＰＫ１編集ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビトロで増殖効能の向上を示すことを示す画像を示している。Ｔ細胞とＣＡＲ−ＢＣＭＡ  Ｔ細胞をＣＳＦＥとインキュベートし、次にＵ２６６とＲＰＭＩ８２２６と共培養し、４８時間後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図２３】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞が多発性骨髄腫ＰＤＸモデルの腫瘍サイズを有意に減少させたことを示すグラフを示している。この研究では、接種された腫瘍のサイズが１００ｍｍ３に達した後にＴ細胞を静脈内注射し、次に２９日間にわたって腫瘍体積を測定した。
【図２４】ＨＰＫ−１編集ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビボでＴ細胞疲弊化の減少を示すことを示す棒グラフである。該グラフは、Ｔ細胞の静脈内注射から７日後のＴ細胞疲弊化マーカーのフローサイトメトリー分析に基づいている。
【図２５】異なる標的化配列を有するさまざまなｓｇＲＮＡを使用したＨＰＫ−１ノックアウト効率を示している。
【図２６】ウェスタンブロットで測定されたノックアウト効率の代表的な定量化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
腫瘍細胞及び／又は腫瘍微小環境内の細胞は、ＰＤ−１のリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１
及びＰＤ−Ｌ２）をアップレギュレートすることが多く、ＰＤ−１を発現する腫瘍特異的
Ｔ細胞上のＰＤ−１が連結して、抑制シグナルを伝達することにつながる。ＰＤ−１はま
た、腫瘍微小環境内のＴ細胞（例えば腫瘍浸潤Ｔ細胞）でしばしばアップレギュレートさ
れ、それは、抗原受容体又は特定の他の活性化シグナルを介してシグナルが伝達された後
に発生することができる。場合によっては、このようなイベントはＴ細胞の疲弊化を引き
起こし、その結果、機能が低下する可能性がある。Ｔ細胞の疲弊化は、Ｔ細胞機能の進行
性の喪失及び／又は細胞の枯渇につながる可能性がある(Yi et al. (2010) Immunology, 
129:474-481)。Ｔ細胞の疲弊化及び／又はＴ細胞の持続性の欠如は、養子細胞療法の効能
及び治療結果に対する障壁となり得る。臨床試験では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）−
発現細胞へのより大きな及び／又はより長い曝露と治療結果との相関関係が明らかになる
。ＷＯ２０１６１９６３８８及びＷＯ２０１７１９３１０７は、ＰＤ‐１遺伝子を遺伝的
に破壊することによりＴ細胞中のＰＤ‐１又はＰＤＬ‐１の発現を減少させるための方法
及び組成物を記載している。
【００２３】
本開示以前は、免疫細胞機能（例えば、免疫療法における）に影響を与えるＨＰＫ−１の
役割はほとんど知られていない。様々な実施形態において、本発明者らは、免疫細胞（例
えば、Ｔ細胞）のＨＰＫ−１遺伝子を破壊、例えば、ノックアウトすることにより、その
細胞毒性を強化し、及び／又は疲弊化を低減させて持続性を改善することができることを
発見しており、その効能は、ＰＤＣＤ１遺伝子を破壊（例えば、ノックアウト）する場合
に類似し、又はそれよりも優れている。例えば、本明細書で詳細に示すように、様々なＣ
ａｒ−Ｔ細胞でＨＰＫ−１遺伝子をノックアウトすると、ＰＤ−１、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３
などの疲弊化マーカーの発現レベルも予想外に低下した。さらに、ＨＰＫ−１遺伝子をノ
ックアウトすると、さまざまなＣａｒ−Ｔ細胞表面上の細胞毒性マーカーＣＤ１０７ａの
発現レベルが予想外に増加した。ＨＰＫ−１遺伝子をノックアウトすると、表面マーカー
であるアネキシンＶのレベルが低下することから明らかなように、Ｃａｒ−Ｔ細胞のアポ
トーシスも予想外に減少した。これらの特徴は、癌治療などの養子免疫療法に用いられ得
る。例えば、本明細書の実施例に示されるように、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを有す
るＣａｒ−Ｔ細胞は、異なる動物の腫瘍モデルにおいて野生型Ｃａｒ−Ｔ細胞を予想外に
上回り、ＰＤ−１遺伝子ノックアウトを有する対応するＣａｒ−Ｔ細胞と同等以上の効能
を示している。さらに、インビボでテストした場合、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを有
するＣａｒ−Ｔ細胞は、野生型Ｃａｒ−Ｔ細胞及びＰＤ−１ノックアウトＣａｒ−Ｔ細胞
と比較して、有意に高い血漿レベルで長期間持続している。
【００２４】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細
胞）を含む新規細胞及び細胞組成物、並びに該細胞及び細胞組成物を産生・使用する方法
を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書の細胞は、ＨＰＫ−１ポリペプチドをコ
ードするＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊を有すること、及び／又は遺伝的破壊を誘発する
か、又は誘発することができる薬剤を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、
細胞は、例えば、癌患者に由来するＮＫ細胞などのヒトＴ細胞（例えば、Ｃａｒ‐Ｔ細胞
）などのヒト細胞である。本明細書では、ヒトＨＰＫ−１遺伝子の例示的な配列を提供す
る（配列番号１６及び１７を参照；また、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００７１
８１及びＮＭ＿００１０４２６００参照）。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、遺
伝的破壊は遺伝子ノックアウトであり得る。いくつかの実施形態では、遺伝的破壊は遺伝
子ノックダウンでもあり得る。いくつかの実施形態では、遺伝的破壊を有する細胞は内因
性ＨＰＫ−１ポリペプチドを発現せず、連続ＨＰＫ−１遺伝子、ＨＰＫ−１遺伝子、及び
／又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まない。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、本
明細書の細胞はまた、トランスジェニック又は操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はキ
メラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの組換え受容体を含むことができ、このような組換え受容
体は、そのような組換え受容体又はその産物をコードする１つ以上の核酸を導入すること
によって操作することができる。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、活性化、刺
激、及び共刺激ＣＡＲ、及びそれらの組み合わせを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）など
の操作ＴＣＲ及び機能的非ＴＣＲ抗原受容体であり得る。いくつかの実施形態では、組換
え受容体は抗原に特異的に結合し（例えば、本明細書に記載のように）、免疫細胞は、組
換え受容体が抗原に結合すると、細胞毒性を誘発し、サイトカインを増殖及び／又は分泌
することができる。いくつかの実施形態では、本明細書の細胞及び組成物は、養子細胞療
法、例えば、養子免疫療法に用いられ得る。
ＨＰＫ−１遺伝的破壊
【００２５】
本開示の様々な実施形態は、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊を有する、及び／又は遺伝的
破壊を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を含む免疫細胞に関する。特定の実施
形態では、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトが好ましいが、いくつかの実施形態では、機能
的ＨＰＫ−１遺伝子の発現を低下させる任意の遺伝的破壊も有用であり、本明細書で考え
られる。
【００２６】
本明細書における遺伝的破壊は、免疫細胞（例えば、Ｃａｒ−Ｔ細胞などのＴ細胞）にお
けるＨＰＫ−１の発現の低下、欠失、排除、ノックアウト又は破壊を含むことができる。
例えば、いくつかの実施形態では、遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１の少なくとも１つのエクソ
ン（例えば、第１及び／又は第２エクソン）の一部の欠失を含む。いくつかの形態におい
て、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊は、ノックアウト、挿入、ミスセンス、又はフレーム
シフト突然変異例えば２対立遺伝子フレームシフト突然変異、遺伝子の全部又は一部（例
えば１つ以上のエクソン又はその一部）の欠失、及び／又はノックインであり得る。
【００２７】
本明細書の遺伝的破壊は、様々な薬剤によってもたらされ得る。いくつかの実施形態にお
いて、免疫細胞におけるＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤、
ショート干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ
（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、及び／又はリボザイムなどの阻害性核酸分子など
の薬剤によってもたらされ得る。これらは、遺伝子の発現を選択的に抑制又は阻害するた
めに使用できる。ｓｉＲＮＡ技術には、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配
列と相同な配列、及び該ヌクレオチド配列に相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ分子を利
用するＲＮＡｉに基づく技術が含まれる。ｓｉＲＮＡは一般に、該遺伝子から転写される
ｍＲＮＡの１つの領域に相同的／相補的であるか、又は異なる領域に相同的／相補的であ
る複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、遺伝的破壊は、ＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、及びジンクフ
ィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡ
ＬＥＮｓ）などの遺伝子編集ヌクレアーゼを含む配列特異的又は標的化ヌクレアーゼと、
遺伝子又はその一部の配列を標的とするように特別に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレ
アーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡガイドヌクレアーゼと、を含む薬剤によってもたらされ得
る。
【００２９】
ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、及びＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然
に存在するジンクフィンガー又はＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域のエンジニア
リング（１つ以上のアミノ酸の改変）により、所定のヌクレオチド配列に結合するように
操作されることができる。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガー又はＴＡ
ＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的な基準には、置換ルールの
適用と、既存のＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥ設計の情報及び結合データを格納するデータベ
ース内の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムと、が含まれる。例えば、米
国特許第６,１４０,０８１、６,４５３,２４２及び６,５３４,２６１号；また、ＷＯ  ９
８／５３０５８、ＷＯ  ９８／５３０５９、ＷＯ  ９８／５３０６０、ＷＯ  ０２／０１
６５３６及びＷＯ  ０３／０１６４９６、並びに米国公開第２０１１０３０１０７３及び
ＵＳ２０１４０１２０６２２号を参照する。
【００３０】
本明細書のＣＲＩＳＰＲシステムで使用するｇＲＮＡを設計する方法は、例えば、ＷＯ２
０１７／１９３１０７に記載されているように、標的化ドメインを選択、設計及び検証す
る方法を含む当技術分野で公知のものを含む。本明細書では、例示的な標的化ドメインが
提供されており、それは、本明細書に記載のｇＲＮＡに組み込むことができる。
【００３１】
標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット分析の方法は、例えば、Mali et al., 201
3 SCIENCE 339(6121): 823-826; Hsu et al. NAT BIOTECHNOL, 31(9): 827-32; Fu et al
., 2014 NAT BIOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et
al., 2014 NAT METHODS l l(2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 2448
1216; Bae et al., 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014
BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24389662に記載されている。ユーザーの標的配列内のｇ
ＲＮＡの選択を最適化するソフトウェアツールも利用でき、該ソフトウェアツールは、本
明細に記載のＨＰＫ−１遺伝子をノックアウト又はノックダウンするのにさらに適したｇ
ＲＮＡを選択することにも使用できる。
【００３２】
いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的破壊は、遺伝子ノックアウトである。例えば、
いくつかの実施形態では、免疫細胞のＨＰＫ−１遺伝子座は、ＨＰＫ−１遺伝子に特異的
なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム（例えば、本明細書に記載されるように）など、クラ
スター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓシステムな
どのＲＮＡガイドヌクレアーゼを使用して編集することができる。いくつかの実施形態で
は、そのような遺伝子編集は、標的遺伝子座（ＨＰＫ−１遺伝子座）での挿入もしくは欠
失、又は標的遺伝子座の「ノックアウト」及びコードされたタンパク質の発現の排除をも
たらす。
【００３３】
理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態では、本明細書のＨＰＫ−１遺
伝子編集（例えば、ノックアウト用）は、標的二本鎖切断又は一本鎖切断を誘発し、誤り
がちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向修復（ＨＤＲ）を含む細胞ＤＮＡ修復
メカニズムを刺激することにより、正確な遺伝的修飾を行うことができる。いくつかの実
施形態では、ドナー核酸、例えば、ドナープラスミド又は遺伝子操作された抗原受容体を
コードする核酸が提供され、ＤＳＢの導入後に遺伝子編集部位でＨＤＲにより挿入される
。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子の破壊及び抗原受容体、例えばＣＡＲの
導入を同時に実施することができ、それにより遺伝子はＣＡＲをコードする核酸のノック
イン又は挿入によって部分的に破壊される。しかし、いくつかの実施形態では、ドナー核
酸は提供されない。いくつかの実施形態では、ＤＳＢの導入後のＮＨＥＪ媒介修復は、例
えばミスセンス変異及び／又はフレームシフトを作成することにより遺伝子破壊を引き起
こし得る挿入又は欠失変異をもたらす。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、非相同末端結合により修復されてＨＰＫ−１遺伝子
における挿入及び欠失（インデル）をもたらす二本鎖切断を生じさせることができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＨＰＫ−１遺伝子以外、免疫細胞内の他の遺伝子は実質的に破
壊されない。しかし、いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、免疫細胞にＰＤ−１
又はＰＤＬ−１ポリペプチドをコードする遺伝子を標的とする追加の薬剤を導入すること
により、免疫細胞の１つ以上の遺伝子をさらに破壊することも図られる。ＰＤ−１又はＰ
ＤＬ−１ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊するための特定の薬剤は、知られている
ものであり、例えばＷＯ２０１６／１９６３８８及びＷＯ２０１７／１９３１０７に記載
されているとおりである。
【００３５】
本明細書の免疫細胞のＨＰＫ−１遺伝的破壊効率は一般に、高い可能性がある。例えば、
いくつかの実施形態では、ＨＰＫ１遺伝子のノックアウト又は遺伝子破壊のための薬剤（
例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入された細胞組成物中の細胞の少なくとも約５０％、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、遺伝的破壊を
含み、内因性ＨＰＫ−１ポリペプチドを発現せず、連続ＨＰＫ−１遺伝子、ＨＰＫ−１遺
伝子、及び／又は機能的ＨＰＫ−１遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、本明細
書の免疫細胞、細胞組成物、及び方法は、ＨＰＫ−１遺伝子のノックアウト又は遺伝的破
壊用の薬剤（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入された細胞組成物の細胞中、ＨＰＫ−
１遺伝子内又はその近く（例えば、切断部位の上流又は下流の１００塩基対内又は約１０
０塩基対内、５０塩基対又は約５０塩基対内、又は２５塩基対内又は約２５塩基対内、又
は１０塩基対内又は約１０塩基対内）のＣａｓ９媒介切断効率（％インデル）が少なくと
も約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％又は９５％であることを
特徴とする。好ましい実施形態では、本明細書の免疫細胞、細胞組成物、及び方法は、例
えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウエスタンブロット法に
従う方法によって決定されるように、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト効率が少なくとも約
５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％であるこ
とを特徴とする。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＨＰＫ−１遺伝子破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を
有する細胞は、さらに、特定のペプチドの発現レベルを特徴とする。例えば、ＨＰＫ−１
遺伝子の遺伝的破壊がないこと、又は遺伝的破壊を誘発するか又は誘発することができる
薬剤のいずれにも導入されないことを除いて実質的に同じ対照免疫細胞と比較した場合、
本明細書の免疫細胞は通常、例えばフローサイトメトリーによって決定されるように、低
下させたＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び／又はＬａｇ−３のレベル、強化されたＣＤ１０７
ａのレベル及び／又は低下させたアネキシンＶのレベルを有することができる。
【００３７】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書の細胞、細胞組成物及び方法はまた、フロー
サイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及び／又
はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも低いこ
と、フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発現し
ている細胞集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも低いこと、及び／又はフロー
サイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現している細胞
集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも高いことを特徴としてもよい。
【００３８】
本明細書で使用する「対照（免疫）細胞」又は「対照（免疫）細胞集団」（「対応する組
成物」又は「対応する細胞集団」とも呼ばれる）、「参照組成物」、又は「参照細胞集団
」）は、免疫細胞におけるＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊（例えば遺伝子ノックアウト）
を誘発するか、又は誘発することができる薬剤（例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡ）が導入され
ていない細胞（例えば、Ｔ細胞又はＴ細胞集団）を除いて、同じ又は実質的に同じ条件下
で取得、単離、生成、産生及び／又はインキュベートされる免疫細胞（例えば、Ｃａｒ−
Ｔ細胞などのＴ細胞）を指す。いくつかの実施形態では、薬剤の導入を含まない以外、そ
のような細胞又はＴ細胞は、薬剤が導入されたＴ細胞又は細胞と同一又は実質的に同一に
処理され、細胞の活性又は特性（免疫細胞活性及び／又はＰＤ−１、ＨＰＫ−１、ＴＩＭ
−３、ＬＡＧ−３などの疲弊化マーカーに関連する１つ以上の分子のアップレギュレーシ
ョン又は発現を含む）に影響を与える可能性のある１つ以上の条件が、細胞の導入以外、
細胞間で変化しないか、実質的に変化しないようにする。例えば、１つ以上の分子（例え
ば、ＰＤ−１、ＨＰＫ−１、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３）の発現低下及び／又はアップ
レギュレーション阻害作用を評価する目的で、薬剤の導入を含むＴ細胞及び薬剤の導入を
含まないＴ細胞は、Ｔ細胞における１つ以上の分子の発現及び／又はアップレギュレーシ
ョンをもたらすことが知られているのと同じ条件下でインキュベートされる。
【００３９】
ＰＤ−１、ＨＰＫ−１、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３などの分子を含むＴ細胞マーカーの
発現及び／又はレベルを評価するための方法及び技術は、当技術分野で公知であり、本明
細書に例示されている。そのようなマーカーの検出のための抗体及び試薬は、当技術分野
で公知するものであり、容易に入手可能である。そのようなマーカーを検出するためのア
ッセイ及び方法には、細胞内フローサイトメトリーを含むフローサイトメトリー、ＥＬＩ
ＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、サイトメトリービーズアレイ又は他のマルチプレックス法、ウエ
スタンブロット及び他の免疫親和性に基づく方法が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞上のマーカーの表面発現を評価することは、投与後の対
象において投与された抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞を検出することを含む。対
象における抗原受容体（例えばＣＡＲ）発現細胞を検出し、表面マーカーのレベルを評価
することは、当業者のレベル内である。いくつかの実施形態では、対象の末梢血から得ら
れた細胞などの抗原受容体（例えばＣＡＲ）発現細胞は、フローサイトメトリー又は他の
免疫親和性に基づく方法によりそのような細胞に特有のマーカーの発現を検出し、次いで
そのような細胞を別のＴ細胞表面マーカーと共染色することができる。いくつかの実施形
態では、抗原受容体（例えばＣＡＲ）発現Ｔ細胞は、非免疫原性選択エピトープとして短
縮されたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）を含むように生成され、次いでそのような細胞を検出す
るマーカーとして使用できる（例えば米国特許第８,８０２,３７４号参照）。
組換え受容体を有する免疫細胞
【００４０】
本明細書の細胞は、通常、癌などの疾患又は障害を治療するために養子移植される免疫細
胞（例えばＴ細胞）（例えばＣＡＲ又はトランスジェニックＴＣＲを発現するように操作
された細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施
形態では、細胞は、対象の初代免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの対象由来の初代細胞に
由来するものであり、本明細書におけるＨＰＫ−１の遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発
することができる薬剤を導入することによりエクスビボで修飾できる。いくつかの実施形
態では、細胞は対象から単離され、操作され、同じ対象に投与される。いくつかの実施形
態では、それらはある対象から単離され、操作され、別の対象に投与される。本明細書で
使用する「導入」という用語は、形質転換、形質導入、トランスフェクション（例えばエ
レクトロポレーション）、及び感染を含む、インビトロ又はインビボでＤＮＡを細胞に導
入する様々な方法を包含する。ベクターは、ＤＮＡをコードする分子を細胞に導入するの
に用いられ得る。可能なベクターには、プラスミドベクターとウイルスベクターが含まれ
る。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はア
デノウイルスベクターやアデノ随伴ベクターなどの他のベクターが含まれる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞などの免疫細胞は、１つ以上の遺伝子操作された核酸又
はその産物、例えば、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び機能的な非ＴＣＲ抗
原受容体（例えば、活性化、刺激、及び共刺激ＣＡＲ、及びそれらの組み合わせを含むキ
メラ抗原受容体（ＣＡＲ））などを含む遺伝子操作された抗原受容体を導入することによ
り操作される。いくつかの実施形態では、細胞には、また、細胞内のＨＰＫ−１遺伝子を
誘発、減少、抑制又は破壊することができる薬剤が、同時に又は任意の順序で導入され得
る。
【００４２】
本明細書に例示されるように、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝子ノックアウトなどの遺伝的破壊
は、本明細書に記載の組換え受容体（例えばＣＡＲ）の機能特性又はそのような組換え受
容体の発現を妨げない。いくつかの実施形態では、同じ条件下で評価された場合に、組換
え受容体で操作され且つＨＰＫ−１遺伝子のノックアウトなどの遺伝的破壊を有する細胞
を含む本明細書の組成物は、対応する又は参照組成物の操作された細胞で発現される組換
え受容体（組換え受容体で操作されているが、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊を有さない
）と比較して、組換え受容体（例えばＣＡＲ）の機能特性又は活性を保持する。いくつか
の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、抗原への特異的結合を保持する。
いくつかの実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、抗原結合後、活性化又は
刺激活性を保持して、細胞内で細胞毒性、増殖、生存又はサイトカイン分泌を誘発する。
いくつかの実施形態では、同じ条件下で評価された場合に、提供される組成物の操作され
た細胞は、操作された細胞を含む対応する又は参照組成物（組換え受容体で操作されてい
るが、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊を含まない、又はＨＰＫ−１ポリペプチドを発現し
ない）と比較して、機能特性又は活性を保持する。いくつかの実施形態では、細胞は、そ
のような対応する組成物又は参照組成物と比較して、細胞毒性、増殖、生存又はサイトカ
イン分泌を保持する（又は強化する）。
【００４３】
いくつかの実施形態では、同じ条件下で評価された場合に、組成物中のＨＰＫ−１遺伝子
破壊細胞は、対応する又は参照組成物中の細胞の表現型と比較して、１種以上の免疫細胞
の表現型を保持する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞には、ナイーブ細胞、エ
フェクター記憶細胞、セントラル記憶細胞、ステムセントラル記憶細胞、エフェクター記
憶細胞、及び長寿命エフェクター記憶細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞
、又は組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現し且つＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊を含
むＴ細胞の割合は、非活性化、長寿命記憶又はセントラル記憶表現型を示し、組換え受容
体で操作された細胞の対応する又は参照細胞集団又は組成物と同じ又は実質的に同じであ
るが、遺伝的破壊を含まず、又はＨＰＫ−１ポリペプチドを発現しない。いくつかの実施
形態では、本開示の組成物は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）、及びＣＣＲ７＋、４‐
１ＢＢ＋（ＣＤ１３７＋）、ＴＩＭ３＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ１２７＋、Ｃ
Ｄ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ‐、ｔ−ｂｅｔｌｏｗ、ＩＬ−７Ｒａ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ
−２Ｒｐ＋、ＣＸＣＲ３＋又はＬＦＡ−１＋から選択される１つ以上の表現型マーカーを
含むＴ細胞を含む。
【００４４】
そのような特性、活性又は表現型を測定する方法は、当技術分野で知られており、例えば
、それらは、インビトロアッセイで測定することができ、例えば、抗原及び／又は１つ以
上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−１７）の存在下で、
３７℃＋２℃又は約３７℃＋２℃で細胞を最大１２、２４、３６、４８又は６０時間又は
約１２、２４、３６、４８又は６０時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、
評価された活性、特性又は表現型のいずれかは、エレクトロポレーション又は薬剤のその
他の導入後の様々な日、例えば、３、４、５、６、７日後又は最大３、４、５、６、７日
目に評価できる。いくつかの実施形態では、同じ条件下で評価された場合に、そのような
活性、特性又は表現型は、組換え受容体で操作された細胞を含む（ＨＰＫ−１遺伝子の遺
伝的破壊を含まない）対応する組成物のそれと比較して、組成物中の細胞の少なくとも８
０％、８５％、９０％、９５％又は１００％によって保持される。
細胞
【００４５】
本開示の組成物及び方法に様々な細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では
、前記細胞、例えば操作された細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞などの真核細胞で
ある。いくつかの実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、又はリンパ系器官に由来
し、自然免疫又は適応免疫の細胞などの免疫系の細胞、例えば、通常Ｔ細胞及び／又はＮ
Ｋ細胞であるリンパ球を含む骨髄細胞又はリンパ系細胞である。他の例示的な細胞には、
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性及び多能性幹細胞などの幹細胞が含まれる。
いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。前記細胞は典型的には、対象から
直接単離された細胞及び／又は対象から単離され凍結された細胞などの初代細胞である。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型の１つ以上のサブセットを
含み、例えば、Ｔ細胞集団全体、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びこれらの亜集団、例
えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、増殖、再循環、局在化及び／又は持続能力、
抗原特異性、抗原受容体の種類、特定の臓器又は区画内の存在、マーカー又はサイトカイ
ンの分泌プロファイル及び／又は分化度によって定義されるものである。治療される対象
に関して、細胞は同種異系及び／又は自家性であり得る。これらの方法には、従来の方法
が含まれる。いくつかの実施形態では、例えば、従来技術に対しては、細胞は、人工多能
性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞などのように、多能性及び／又は多分化能性である。
いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離
し、それらを調製、処理、培養、及び／又は操作し、凍結保存の前又は後に同じ患者にそ
れらを再導入することを含む。
【００４６】
Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団には、ナイ
ーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、記憶Ｔ細胞、及びそれらのサブ
タイプ例えば幹細胞記憶Ｔ（ＴＳＣＭＸセントラル記憶Ｔ（ＴＣＭ）、エフェクター記憶
Ｔ（ＴＥＭ）又は最終分化エフェクター記憶Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未熟
Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、粘膜関連インバ
リアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、自然発生及び適応制御Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細
胞例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２
細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞）がある。
【００４７】
いくつかの形態において、Ｔ細胞集団の１つ以上には、表面マーカーなどの１つ以上の特
定のマーカーに対して陽性（マーカー「１」）であり又は高レベル（マーカー高）で発現
する細胞、又は、表面マーカーなどの１つ以上に対して陰性（マーカー「０」）であり又
は比較的低レベル（マーカー低）で発現する細胞が濃縮又は枯渇している。いくつかの場
合は、そのようなマーカーは、特定のＴ細胞集団（例えば、非記憶細胞）に存在しないか
、比較的低いレベルで発現しているが、別のＴ細胞集団（例えば、記憶細胞）に存在する
か、比較的高いレベルで発現している。一実施形態では、細胞（ＣＤ８＋細胞又はＴ細胞
、例えばＣＤ３＋細胞など）には、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ
４４、ＣＤ１２７、及び／又はＣＤ６２Ｌに対して陽性であり又は高表面レベルで発現す
る細胞が濃縮されている（すなわち、陽性に選択された）、及び／又はＣＤ４５ＲＡに対
して陽性であり又は高表面レベルで発現する細胞により枯渇される（例えば、陰性に選択
された）。いくつかの実施形態において、細胞には、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ２５、
ＣＤ２７及び／又はＩＬ７−Ｒａ（ＣＤ  １２７）に対して陽性であり又は高表面レベル
で発現する細胞が濃縮又は枯渇している。いくつかの実施例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞には、
ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌ陽性（又はＣＤ４５ＲＡ陰性）の細胞が濃縮されている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団又はＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団、例え
ば、セントラル記憶（ＴＣＭ）細胞に富む亜集団であり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施
形態では、細胞は単球又は顆粒球、例えば、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細
胞、マスト細胞、好酸球、及び／又は好塩基球である。
組換え受容体
【００５０】
養子免疫療法に関しては、本明細書の細胞は典型的には組換え受容体を含む。例えば、い
くつかの実施形態では、細胞は、遺伝子工学を介して導入された１つ以上の核酸、及びそ
のような核酸の遺伝子組み換え産物を含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸
は異種であり、すなわち、通常、該細胞及び前記細胞から得られたサンプルに存在せず、
例えば他の生物又は細胞から得られたものが挙げられ、この他の生物又は細胞は、例えば
、通常、操作された細胞及び／又はそのような細胞が由来する生物に見つからない。いく
つかの実施形態では、自然界には見られない核酸などの核酸は天然には存在せず、複数の
異なる細胞型からの様々なドメインをコードする核酸のキメラ組み合わせを含むものが含
まれる。
【００５１】
細胞は一般に、機能的非ＴＣＲ抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む抗
原受容体、及びトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの他の抗原結合受容体な
どの組換え受容体を発現する。受容体には、他のキメラ受容体もある。
【００５２】
ＣＡＲを含む例示的な抗原受容体、並びにそのような受容体を操作して細胞に導入する方
法には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７
２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６
３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開
番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３
７、米国特許番号６,４５１,９９５、７,４４６,１９０、８,２５２,５９２、８,３３９,
６４５、８,３９８,２８２、７,４４６,１７９、６,４１０,３１９、７,０７０,９９５、
７,２６５,２０９、７,３５４,７６２、７,４４６,１９１、８,３２４,３５３、及び８,
４７９,１１８、欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６、及び／又は、Sadelain et al., 
Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e6
1338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol, 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al.
, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載されている。いくつかの実施形態では、抗原
受容体は、米国特許第７,４４６,１９０号に記載されているＣＡＲ、及び国際特許出願公
開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８  Ａ１号に記載されている抗原受容体を含む。ＣＡＲ
の実施例には、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ  ８,３３９,６４５、ＵＳ  ７,４４６,
１７９、ＵＳ  ２０１３／０１４９３３７、米国特許番号７,４４６,１９０、米国特許番
号８,３８９,２８２、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology,
10, 267-276 (2013);Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701;及びBrentje
ns et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)など、前述の刊行物のいずれかに開示されてい
るＣＡＲが含まれる。また、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ  ８,３３９,６４５、ＵＳ
７,４４６,１７９、ＵＳ  ２０１３／０１４９３３７、米国特許番号７,４４６,１９０
、及び米国特許番号８,３８９,２８２も参照する。ＣＡＲなどのキメラ受容体は、一般に
、抗体分子の一部などの細胞外抗原結合ドメインを含み、一般に抗体の可変重（ＶＨ）鎖
領域及び／又は可変軽（ＶＬ）鎖領域、例えば、ｓｃＦｖ抗体断片である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、受容体が標的とする抗原はポリペプチドである。いくつかの実
施形態では、それは炭水化物又は他の分子である。いくつかの実施形態では、抗原は、正
常又は非標的細胞又は組織と比較して、疾患又は状態の細胞、例えば腫瘍又は病原細胞で
選択的に発現又は過剰発現される。他の実施形態では、抗原は正常細胞で発現され、及び
／又は操作された細胞で発現される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、受容体（例えば、ＣＡＲ）の標的となる抗原には、オーファン
チロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、Ｃ
Ｄ２０、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＥＡ、及びＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２
３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧ
Ｐ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３又は４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン
受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋ
ｄｒ、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソセリン、ＭＵＣ
１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇ
ｐ１００、胎児腫瘍性抗原、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前
立腺特異抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容
体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、及びＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、
ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）などのサイクリン、及び
／又はビオチン化分子、及び／又はＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ又は他の病原体によって発現
される分子が含まれる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲは、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−
ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、Ｃ
Ｄ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、
ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、
胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ
−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子（ＣＤ１７１）、Ｍ
ＡＧＥ−Ａ１、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｎ
Ｙ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、胎児腫瘍性抗原、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−
Ｒ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロ
ゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡ
ＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、
ＢＣＭＡ及びインターロイキン１２から独立して選択される１つ以上の抗原に特異的に結
合する。いくつかの実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＣＤ１９、ＢＣ
ＭＡ、インテグリンαＶβ６、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ
２、及び／又はメソセリンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、組換え受容体
（例えば、ＣＡＲ）は病原体特異的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、組換え受
容体（例えば、ＣＡＲ）は、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ）、細菌抗
原、及び／又は寄生虫抗原に特異的である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの抗体部分は、ヒンジ領域、例え
ばＩｇＧ４ヒンジ領域、及び／又はＣＨ１／ＣＬ及び／又はＦｃ領域などの免疫グロブリ
ン定常領域の少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、定常領域又は部分
は、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１などのヒトＩｇＧのものである。いくつかの実施形態では、定
常領域の一部は、抗原認識成分、例えばｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間のスペーサー領域
として機能する。スペーサーは、スペーサーが存在しない場合と比較して、抗原結合後の
細胞の応答性を高める長さのものであり得る。例示的なスペーサー、例えばヒンジ領域に
は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４０３１６８７に記載されているものが含まれる。
いくつかの実施例において、スペーサーは、長さが約１２アミノ酸であるか、又は長さが
１２アミノ酸以下である。例示的なスペーサーには、少なくとも約１０〜２２９アミノ酸
、約１０〜２００アミノ酸、約１０〜１７５アミノ酸、約１０〜１５０アミノ酸、約１０
〜１２５アミノ酸、約１０〜１００アミノ酸、約１０〜７５アミノ酸、約１０〜５０アミ
ノ酸、約１０〜４０アミノ酸、約１０〜３０アミノ酸、約１０〜２０アミノ酸、又は約１
０〜１５アミノ酸であり、且つ、前記範囲のエンドポイント間の任意の整数を含む。いく
つかの実施形態では、スペーサー領域は、約１２アミノ酸以下、約１１９アミノ酸以下、
又は約２２９アミノ酸以下を有する。例示的なスペーサーには、ＩｇＧ４ヒンジのみ、Ｃ
Ｈ２及びＣＨ３ドメインにリンクされたＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＨ３ドメインにリンクさ
れたＩｇＧ４ヒンジが含まれる。
【００５７】
該抗原認識ドメインは、一般に１つ以上の細胞内シグナル伝達成分にリンクされており、
該シグナル伝達成分は、、ＴＣＲ複合体などの抗原受容体複合体を介して活性化、及びＣ
ＡＲの場合必要に応じて関連する共刺激シグナル、及び／又は別の細胞表面受容体を介し
たシグナルを模倣する。したがって、いくつかの実施形態では、抗原結合成分（例えば、
抗体）は、１つ以上の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインにリンクされている。いく
つかの実施形態では、膜貫通ドメインは細胞外ドメインに融合している。一実施形態では
、受容体、例えばＣＡＲ中のドメインの１つと自然に関連する膜貫通ドメインが使用され
る。いくつかの場合では、膜貫通ドメインはアミノ酸置換により選択又は修飾され、それ
により、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結
合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑える。
【００５８】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然源又は合成源のいずれかに由来する。
供給源が天然である場合、いくつかの実施形態では、該ドメインは、任意の膜結合タンパ
ク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、Ｔ細胞受容体α、β又はζ鎖、
ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２
、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ
１５４に由来する領域が含まれる（すなわち、少なくともその膜貫通領域が含まれる）。
あるいは、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは合成するものである。いくつかの
実施形態では、合成膜貫通ドメインは、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む
。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレ
ットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見られる。いくつかの実施形態では、リンケージ
は、リンカー、スペーサー、及び／又は膜貫通ドメインによるものである。
【００５９】
細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然の抗原受容体を介するシグナルを模倣した又
はそれに類似したシグナル（例えば、ＣＤ３シグナル）、共刺激受容体と組み合わせた受
容体を介するシグナル（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８シグナル）、及び／又は共刺激受容体
のみを介するシグナルがある。いくつかの実施形態では、短いオリゴ又はポリペプチドリ
ンカー、例えば、グリシン及びセリン、例えばグリシン−セリンダブレットを含むリンカ
ーなどの長さ２〜１０アミノ酸のリンカーが存在し、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シ
グナル伝達ドメインの間の結合が形成される。
【００６０】
受容体、例えばＣＡＲは、一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達成分を含む。い
くつかの実施形態では、受容体は、Ｔ細胞活性化及び細胞毒性を媒介するＴＣＲ  ＣＤ３
鎖、例えばＣＤ３ζ鎖などのＴＣＲ複合体の細胞内成分を含む。したがって、いくつかの
実施形態では、抗原結合部分は１つ以上の細胞シグナル伝達モジュールにリンクされてい
る。いくつかの実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールには、ＣＤ３膜貫通ドメイン
、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／又は他のＣＤ膜貫通ドメインが含まれる。
いくつかの実施形態において、受容体、例えばＣＡＲは、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４
、ＣＤ２５、又はＣＤ１６などの１つ以上の追加の分子の一部をさらに含む。例えば、い
くつかの実施形態では、ＣＡＲ又は他のキメラ受容体は、ＣＤ３−ζ又はＦｃ受容体γと
ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５又はＣＤ１６との間のキメラ分子を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又は他のキメラ受容体の連結により、該受容体の細胞質
ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、正常なエフェクター機能又は免疫細胞応答
の少なくとも１つを活性化し、例えば、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。
例えば、いくつかの場合において、ＣＡＲは、サイトカイン又は他の因子の分泌などの細
胞溶解活性又はＴヘルパー活性などのＴ細胞の機能を誘発する。いくつかの実施形態では
、例えば、抗原受容体成分又は共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分は、
エフェクター機能シグナルを伝達する場合、完全な免疫刺激鎖の代わりに使用される。い
くつかの実施形態では、この１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（
ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、いくつかの実施形態では、自然の状況では、抗原受容体が
関与した後にシグナル伝達を開始するようにそのような受容体と協働する共受容体の配列
も含む。
【００６２】
自然なＴＣＲの場合、完全な活性化には、通常、ＴＣＲを介したシグナル伝達だけでなく
、共刺激シグナルも必要である。したがって、いくつかの実施形態では、完全な活性化を
促進するために、二次信号又は共刺激信号を生成するための成分もＣＡＲに含まれる。他
の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激信号を生成するための成分を含まない。いくつかの実
施形態では、追加のＣＡＲが同じ細胞で発現され、二次又は共刺激信号を生成するための
成分を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列に
よって媒介されると説明されている：ＴＣＲ（一次細胞質シグナル伝達配列）を介して抗
原依存性の一次活性化を開始するものと、抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナ
ル（二次細胞質シグナル伝達配列）を提供するもの。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは
、そのようなシグナル伝達成分の一方又は両方を含む。
【００６４】
いくつかの形態において、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シ
グナル伝達配列を含む。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列には、免疫受容体
チロシンに基づく活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフが含
まれる場合がある。一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例には、ＴＣＲζ、Ｆ
ｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、Ｃ
Ｄ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ
内の細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部、又はＣＤ３ζ
に由来する配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、及
びＩＣＯＳなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメイン及び／又は膜貫通部分を含む。い
くつかの実施形態では、同じＣＡＲは、活性化成分と共刺激成分の両方を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、活性化ドメインは１つのＣＡＲに含まれるが、共刺激成分は別
の抗原を認識する別のＣＡＲによって提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、
活性化又は刺激性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲを含み、その両方はとも同じ細胞で発現される
（ＷＯ２０１４／０５５６６８参照）。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の刺
激性又は活性化ＣＡＲ及び／又は共刺激性ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、細胞
は、抑制性ＣＡＲ(iCAR、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 
2013)参照）、例えば、疾患又は障害に関連する及び／又は特異的抗原以外の抗原を認識
するＣＡＲを含み、それにより、疾患を標的とするＣＡＲを介して送達される活性化シグ
ナルがそのリガンドへの抑制性ＣＡＲの結合により減少又は阻害されることで、例えばオ
フターゲット効果を低減する。
【００６７】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ζ）
細胞内ドメインにリンクされたＣＤ２８膜貫通及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつ
かの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインにリンクさ
れたキメラＣＤ２８及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含
む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞質部分の１つ以上、例えば２つ以上の共刺激ド
メイン及び活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを包含する。例示的なＣＡＲには
、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４−１ＢＢの細胞内成分が含まれる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又は他の抗原受容体は、細胞表面マーカーなどのマーカ
ーをさらに含み、該マーカーは、受容体を発現する、例えば、短縮ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ
）などの細胞表面受容体の短縮型などを発現するように、細胞の形質導入又は操作を確認
するために使用できる。いくつかの実施形態では、該マーカーは、遺伝的操作、例えばう
まく操作された細胞を選択するためのマーカーとして使用される以外、いずれの治療機能
も果たさず、及び／又は、いずれの効果を奏しない。他の実施形態では、マーカーは、治
療分子又はそれ以外の何らかの所望の効果を発揮する分子であり得、このような分子は、
インビボで遭遇する細胞のリガンドなどであり、例えば、養子移植及びリガンドとの遭遇
時に細胞の応答を強化及び／又は減衰させるための共刺激又は免疫チェックポイント分子
などがある。
【００７０】
ＣＡＲは、第１、第２、及び／又は第３世代のＣＡＲと呼ばれることができる。いくつか
の実施形態では、第１世代のＣＡＲは、抗原結合時にＣＤ３鎖誘発シグナルのみを提供す
るものである。いくつかの実施形態では、第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８又はＣＤ１３７な
どの共刺激受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含むものなど、そのようなシグナ
ル及び共刺激シグナルを提供するものである。いくつかの実施形態では、第３世代のＣＡ
Ｒは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体又は抗体断片を含む細胞外部分を含
む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体又は断片を含む細胞外部分及び
細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの形態において、抗体又は断片はｓｃＦｖ
を含み、細胞内ドメインはＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝
達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖のζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態で
は、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインをリンクする膜
貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通部分
を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメ
インを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子はＣＤ２８又は４−１ＢＢであ
る。
【００７２】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用されることができ、アミノ酸
残基のポリマーを指すものであり、最小の長さに限定されない。提供される受容体及び他
のポリペプチド、例えばリンカー又はペプチドを含むポリペプチドは、アミノ酸残基を含
んでもよく、このアミノ酸残基には、天然及び／又は非天然のアミノ酸残基が含まれる。
該用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル
化、及びリン酸化も含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質が所望の活性を維持
する限り、ポリペプチドは天然又は天然の配列に関して修飾を含んでもよい。これらの修
飾は、部位特異的突然変異誘発によるように意図的なものであっても、タンパク質を産生
する宿主の突然変異又はＰＣＲ増幅により引き起こされるエラーによるような偶発的なも
のであってもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体には、天然のＴ細胞からクローニ
ングされた組換えＴ細胞受容体ＴＣＲ及び／又はＴＣＲが含まれる。いくつかの実施形態
では、標的抗原（例えば、癌抗原）用の高親和性Ｔ細胞クローンが患者から同定され、単
離され、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、標的抗原用のＴＣＲクローンは、
ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、又はＨＬＡ）で操作されたトランスジェ
ニックマウスで生成された。例えば、腫瘍抗原（例えば、Parkhurst et al. (2009) Clin
Cancer Res. 15: 169-180 and Cohen et al. (2005) Immunol. 175:5799-5808参照）を
参照する。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイは標的抗原に対するＴＣＲの
単離に使用される（例えば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14: 1390-1395 and
Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354参照）。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞クローンが得られた後、ＴＣＲα及びβ鎖が単離され、
遺伝子発現ベクターにクローン化される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα及びβ遺伝
子は、両方の鎖が共発現されるように、ピコルナウイルス２Ａリボソームスキップペプチ
ドを介してリンクされる。いくつかの形態において、ＴＣＲの遺伝子導入は、レトロウイ
ルス又はレンチウイルスベクター又はトランスポゾンを介して達成される（例えば、Baum
et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Th
erapy. 13: 1050-1063;Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the 
American Society of Gene Therapy. 18: 1748- 1757;及びHackett et al. (2010) Molec
ular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683参
照）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム
【００７５】
様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、本明細書の免疫細胞におけるＨＰＫ
−１遺伝子の遺伝子ノックアウトなどの遺伝的破壊を誘発することができる。通常、免疫
細胞には、Ｃａｓ９分子と、ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメインに相補的、結合、認識、又
はハイブリダイズする標的化ドメイン（例えば、第１又は第２エキソンに）又はＣａｓ９
及びｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを有するｇＲＮＡを含む薬剤とが
導入される。いくつかの実施形態では、免疫細胞に導入される薬剤は、Ｃａｓ９とＨＰＫ
−１を標的とする標的化ドメイン（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）を含むｇＲＮＡとのリ
ボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、
導入は、インビトロで薬剤又はその一部を免疫細胞と接触させることを含み、これは、最
大２４、３６又は４８時間又は３、４、５、６、７又は８日以上細胞及び薬剤を培養又は
インキュベートすることを含み得る。様々な実施形態において、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ又
はコード化ポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションにより細胞に直接導入す
ることができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、薬剤を細胞と接触させる前、接触中又は後に、及び／又は送達
（例えば、エレクトロポレーション）を行う前、送達中又は後に、細胞をサイトカイン、
刺激剤及び／又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖を誘発できる薬剤の存在下でインキ
ュベートすることができる。いくつかの形態において、インキュベーションは、少なくと
も部分的にＣＤ３特異的抗体、ＣＤ２８及び／又はサイトカイン特異的抗体であるか、又
はそれらを含む刺激剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーショ
ンは、少なくとも部分的に、１つのＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５などのサイトカイ
ンの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、エレクトロポ
レーションの前又は後の最大８時間、例えば最大２４時間、３６時間又は４８時間又は３
、４、５、６、７又は８日以上である。いくつかの実施形態では、刺激剤（例えば、抗Ｃ
Ｄ３／抗ＣＤ２８）及び／又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７及び／又はＩ
Ｌ−１５）の存在下でのインキュベーションは、エレクトロポレーションまでの最大２４
時間、２５時間前又は４８時間行われる。
ｇＲＮＡ
【００７７】
いくつかの実施形態では、細胞に導入される薬剤は、ＨＰＫ−１遺伝子座の領域を標的と
するｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮ
Ａ分子は、本明細書で「キメラ」ｇＲＮＡと呼ばれることもある単分子（単一のＲＮＡ分
子を有する）、又はモジュラー（２つ以上、典型的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）
であり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、５´から３´までを含むキメラｇＲＮＡであ
る：ＨＰＫ−１遺伝子からの配列（例示的な配列は、配列番号１６及び１７に提供され、
また、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００７１８１及びＮＭ＿００１０４２６００
参照））など、標的核酸に相補的な標的化ドメイン及び第１相補性ドメイン；リンクドメ
イン；第２相補性ドメイン（第１相補性ドメインと相補的である）；近位ドメイン；オプ
ションのテールドメイン。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、第１及び第２鎖を含むモジュラーｇＲＮＡである
。これらの場合、第１鎖は、好ましくは、５´から３´までを含む：ＨＰＫ−１遺伝子か
らの配列（例示的な配列は、配列番号１６及び１７に提供され、また、ＮＣＢＩアクセッ
ション番号：ＮＭ＿００７１８１及びＮＭ＿００１０４２６００も参照））など、標的核
酸に相補的な標的化ドメイン及び第１相補性ドメイン。第２鎖は、一般に、５´から３´
までを含む：必要に応じて５´伸長ドメイン；第２相補性ドメイン；近位ドメイン；及び
オプションのテールドメイン。
【００８０】
ｇＲＮＡの標的化ドメインは、標的核酸上（例えば、ＨＰＫ−１遺伝子、例えば、第１又
は第２エクソンなど）の標的配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％
相補的、例えば完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。標的配列を含む標
的核酸の鎖は、本明細書では、標的核酸の「相補鎖」と呼ばれる。標的化ドメインの選択
に関するガイダンスは、例えば、Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi:10.1038/nbt.
2808)及びSternberg SH et al, Nature 2014 (doi: 10.1038/naturel3011)に記載されて
いる。
【００８１】
標的化ドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって、ウラシル塩基（Ｕ）を含むが、
ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡはいずれもチミン塩基（Ｔ）を含む。理論に拘束される
ことを望まないが、一実施形態では、標的化ドメインと標的配列との相補性は、ｇＲＮＡ
分子／Ｃａｓ９分子複合体と標的核酸との相互作用の特異性に寄与すると考えられている
。標的化ドメインと標的配列のペアでは、標的化ドメインのウラシル塩基が標的配列のア
デニン塩基とペアになることが理解されている。一実施形態では、標的化ドメインは長さ
が５〜５０ヌクレオチドである。標的化ドメインと相補的である標的核酸の鎖は、本明細
書では、相補鎖と呼ばれる。このドメインのヌクレオチドの一部又はすべては、例えば、
分解を受けにくくする、生体適合性を改善するなどのために、修飾を有することができる
。非限定的な例として、標的化ドメインの骨格は、ホスホロチオエート、又はその他の修
飾により修飾できる。場合によっては、標的化ドメインのヌクレオチドは、２´修飾、例
えば２−アセチル化、例えば２´メチル化、又は他の修飾を含むことができる。
【００８２】
様々な実施形態では、本明細書のｇＲＮＡの標的化ドメインは、長さが１６〜２６ヌクレ
オチドである（すなわち、その長さが１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、又は１８、
１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６ヌクレオチドである）。
【００８３】
いくつかの形態において、標的配列（標的核酸）は、配列番号１６及び１７のＨＰＫ−１
コード配列の任意の部分などのＨＰＫ−１遺伝子座又はその付近にある。いくつかの形態
において、標的化ドメインに相補的な標的核酸は、目的の遺伝子、ここではＨＰＫ−１遺
伝子の初期コード領域に位置している。初期コード領域のターゲティングを使用して、Ｈ
ＰＫ−１遺伝子などの目的の遺伝子をノックアウトできる（つまり、その発現を排除する
）。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子（例えば、ＨＰＫ−１遺伝子）の初期コード
領域は、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）の直後、又は開始コドンの５００ｂｐ以内（例え
ば、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２０
０ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、又は１０
ｂｐ未満）の配列を含む。特定の実施例において、標的核酸は、開始コドンの２００ｂｐ
、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ又は１０ｂｐ以内
にある。いくつかの実施例では、標的核酸はＨＰＫ−１遺伝子の第１又は第２エキソンに
位置している。いくつかの実施例では、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、標的核酸（例えば
、ＨＰＫ−１遺伝子座における標的核酸）上の標的配列に相補的、例えば少なくとも８０
、８５、９０、９５、９８又は９９％相補的、例えば完全に相補的である。
【００８４】
いくつかの形態において、ＨＰＫ−１のノックアウト又はノックダウンのための標的ドメ
インは、配列番号１及び１１〜１５のいずれかから選択される配列であるか、又はそれら
を含む。
2020536514.tif 000003
【００８５】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、配列番号１及び１１〜１５から
選択される標的配列に完全に相補的な配列と同一であるか、又は１、２、又は３ヌクレオ
チド以下だけ異なる。
Ｃａｓ９
【００８６】
いくつかの実施形態では、前記薬剤は、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９をコードする核酸を含
むことができる。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体
（例えば、本明細書のｇＲＮＡのいずれかと本明細書のＣａｓ９のいずれかからなる）、
又はＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含むことができる。例えば
、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを例えば約１０：１〜約１
：１０の比（Ｃａｓ９とｇＲＮＡの質量比）で分離してインキュベートして、ｇＲＮＡ／
Ｃａｓ９複合体を形成し、その後、エレクトロポレーションなどによって免疫細胞に送達
できる。通常、遺伝的破壊に使用されるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の量は、約１〜１００
ｕｇ／１ｘ１０６個の細胞であり得る。
【００８７】
当業者に理解されるように、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（
ｇＲＮＡ）分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的ドメインとＰＡＭ配列を含
む部位に局在化するポリペプチド（例えば、化膿連鎖球菌の場合、ＮＧＧ  ＰＡＭ、黄色
ブドウ球菌の場合はＮＮＧＲＲ（例えば、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲＶ）ＰＡＭ、髄膜
炎菌の場合はＮＮＮＮＧＡＴＴ又はＮＮＮＮＧＣＴＴ  ＰＡＭ）である。
【００８８】
様々な種のＣａｓ９分子は、本明細書に記載の方法及び組成物で使用できる。いくつかの
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿連鎖球菌（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブ
ドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）、又は髄膜炎菌（Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃ
ａｓ９である。非限定的な有用なＣａｓ９分子には、化膿連鎖球菌（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）、ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、
アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏ  ａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチル
ス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃ
ｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓ
ｕｉｓ）、放線菌属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アリサイクリフィルス・デニ
トリフィカンス（Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス
・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、セレウス菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈ
ｉｉ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリ
ーナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒ
ａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌ
ｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔ
ｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒ
ｉ）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐｕｎｉｃｅｉｓｐ
ｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃ
ｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム−パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｘｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃ
ｏｘｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツル
ショッティイ（Ｃｏｘｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロ
セオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｘｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテ
リウム・ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバク
テリウム（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・デ
ィアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ
ｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒ
ｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓ
ｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘ
リコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバ
クター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キ
ンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉ
ａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏ
ｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）、メチロシスティス菌属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、メチロシナス
・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｘｉｕｍ）、モビ
ルカンス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシ
リフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネ
レア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  
ｌａｃｔａｍｉｃａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、
ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｘｔｈｉｉ）、ニトロソモナス菌属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａ
ｖａｍｅｎｔｉｖｏｘａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍ
ｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃ
ｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シ
ジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（
Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム菌属（Ｒｈｏｄ
ｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌ
ｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス菌属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、スポロラク
トバチルス・ビネア（Ｓｐｏｘｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、黄色ブ
ドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグ
ドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、連鎖球菌菌
属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サブドリグラヌルム菌属（Ｓｕｂｄｏｌｉ
ｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．）、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉ
ｌｉｓ）、トレポネーマ菌属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）又はベルミンフォロバクタ
ー・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法に使用されるＣａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９
分子である。通常、野生型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の２本の鎖を切断する。いくつ
かの実施形態では、改変されたヌクレアーゼ切断特性（又は他の特性）を有する修飾され
たＣａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチド、例えばニッカーゼ、又は標的核酸を切断する
能力を欠くものも使用できる。哺乳類動物発現の場合、いくつかの実施形態では、細菌Ｃ
ａｓ９  ｃＤＮＡは、コドン最適化することができ、例えば、ヒト化Ｃａｓ９  ｃＤＮＡ
に変換される。
【００９０】
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 7
27-737に記載されている。そのようなＣａｓ９分子には、クラスター１〜７８細菌ファミ
リーのＣａｓ９分子が含まれる。例示的な天然に存在するＣａｓ９分子には、クラスター
１細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。例には、化膿連鎖球菌（例えば、ＳＦ３７
０、ＭＧＡＳ  １０２７０、ＭＧＡＳ  １０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５
、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１及びＳＳＩ−１
菌株）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例
えば、ＬＭＤ−９菌株）、ストレプトコッカス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏ
ｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６菌株）、ストレプトコッカス・ミュ
ータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５菌株）、ストレプト
コッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８菌株）、スト
レプトコッカス・ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３
４、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２０６９菌株）、ストレプトコッカス・エキンス（Ｓ．ｅｑｕｉ
ｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ  ９８１２、ＭＧＣＳ  １２４菌株）、ストレプトコッカス
・ディジャラクティア（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ  １２４菌株
）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．  ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ  ７００３３
８菌株）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓ．  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば
、Ｆ０２１１菌株）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉ
ａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９菌株）、リステリアモノサイトゲネス（Ｆ６８
５４株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎ
ｅｓ）（Ｌ．  ｉｎｎｏｃｕａ、例えば、Ｃｌｉｐｌ  １２６２菌株）、イタロコッカス
・イタリカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５
９５２菌株）、又はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅ
ｃｉｕｍ）（例えば、１,２３１,４０８菌株）のＣａｓ９分子が含まれる。別の例示的な
Ｃａｓ９分子は、髄膜炎菌のＣａｓ９分子である（Hou et al., PNAS Early Edition 201
3, 1-6）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、適切なＣａｓ９分子は、ヒト免疫細胞の核へのＣａｓ９の進入
を容易にすることができる１つ以上のヒト配列、例えば核局在化配列（例えば、Ｃａｓ９
分子のＣ末端及びＮ末端の一方又は両方に挿入される）などを組み込むことによって修飾
することができる。「核局在化シグナル」又は「配列」（ＮＬＳ）は、核輸送によって「
細胞核」へインポートされるためにタンパク質に「タグを付ける」アミノ酸配列である。
通常、このシグナルは、タンパク質表面に露出した正に帯電したリジン又はアルギニンの
１つ以上の短い配列で構成される。異なる核局在化タンパク質は同じＮＬＳを共有する場
合がある。通常、Ｃａｓ９核活性は、ＮＥＪの導入によって維持され、それにより、ＮＨ
ＥＪ又はＨＤＲ修復のために二本鎖切断を作成できる。いくつかの実施形態では、ヒト細
胞などの哺乳類動物細胞での発現を促進するために、典型的には、コドン最適化されたＣ
ａｓ９  ｃＤＮＡを使用することができる。そのような「ヒト化Ｃａｓ９」の例としては
、例えば、Chang, N. et al., Cell Research 23:465-472 (2013)に記載されているもの
が知られており、その全内容は参照により組み込まれ、ヒト化、コドン最適化されたＣａ
ｓ９  ｃＤＮＡ配列及びそこに報告されているタンパク質配列が含まれる。他のＮＬＳも
、Ｃａｓ９の細胞核への進入を促進するのに適している可能性があり、例えば、ＵＳ  ８
,７９５,９６５のように報告されている。
核酸、ベクター及び送達
【００９２】
典型的には、本明細書のＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊は、ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発
するか、又は誘発することができる薬剤を免疫細胞に導入することにより達成され、その
後、遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を含む細胞をインキュベート、培養、増
殖及び／又は選択するようにしてもよい。
【００９３】
ＨＰＫ−１遺伝子を破壊するための薬剤は、当業者に知られている様々な方法により免疫
細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、１つ以上の分子を
含むことができ、前記分子は、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ
、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）、ＴＡ
Ｌ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＨＰＫ−１遺伝子に特異的に結合、認
識、又はハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の組み合わせである、それらを含む
か、又はコードする。いくつかの実施形態では、そのような薬剤は、例えば、エレクトロ
ポレーション、リポソーム又はナノ粒子などによって、免疫細胞に直接送達することがで
きる。
【００９４】
いくつかの形態において、１つ以上の分子をコードする核酸分子を免疫細胞に送達するこ
とができる。いくつかの実施形態では、このような核酸分子又はその複合体は、当技術分
野で周知の方法により、Ｔ細胞などの細胞に導入することができる。そのような方法には
、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス
）、リポソーム又はナノ粒子の形での導入が含まれるが、これらに限定されない。いくつ
かの実施形態では、方法は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子
衝撃、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮、圧搾を含むことができる。い
くつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞内で発現されることを考慮して、ベク
ター、より具体的にはプラスミド又はウイルスに含まれてもよい。いくつかの実施形態で
は、ベクターは、プラスミド、又はレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベク
ター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又
はアデノ随伴ベクターなどのウイルスベクターであり得、周知の方法により標的細胞（本
明細書中の細胞又は免疫細胞に導入するためのｇＲＮＡを産生するための細胞）に導入し
て発現させることができる。
【００９５】
本明細書のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９システムは、様々な方法、典型的にはインビトロ又はエク
スビボで標的細胞に導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９
分子及び／又はｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、本分野で公知する方法、例えば、ベ
クター（例えば、ウイルス又は非ウイルスベクター）、非ベクターベースによる方法（例
えば、裸のＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を使用）、又はそれらの組み合わせなどによって細胞
に送達することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター
（例えば、ウイルスベクター／ウイルス又はプラスミド）によって送達され得る。ベクタ
ーは、Ｃａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子をコードする配列を含むことができる。いく
つかの実施形態では、ベクターは、プロモーター、例えば、Ｕ６又はＴ７プロモーターな
どの調節／制御要素をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ベクター（例
えば、プラスミドベクター）は、本明細書のｇＲＮＡ分子をコードする配列、例えば、Ｈ
ＰＫ−１遺伝子の標的ドメイン（例えば、第１又は第２エクソンなどのＨＰＫ−１遺伝子
の少なくとも１つのエクソン、例えば配列番号１及び１１〜１５）と相補的（例えば、少
なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％相補的又は完全に相補的な）標的化ド
メインを含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、プラスミド
ベクター）は、ｇＲＮＡをコードする配列を含み、前記ｇＲＮＡは、配列番号１及び１１
−１５から選択る標的配列に完全に相補的な配列と同一であるか、又は１、２、又は３ヌ
クレオチド以下だけ異なる標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは
、配列番号３及び４に記載の配列を含むプラスミドベクターである。いくつかの実施形態
では、プラスミドベクターはｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ベクター又は送達担体はウイルスベクター（例えば、組換えウ
イルスの産生用）である。いくつかの実施形態では、ウイルスはＤＮＡウイルス（例えば
、ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡウイルス）である。いくつかの実施形態では、前記ウイルス
はＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。例示的なウイルスベクター／
ウイルスには、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイル
スが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは複製可能であってもよい。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは複製欠損のものであり得る。
【００９８】
いくつかの形態において、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を調製・単離し、その後、例
えばエレクトロポレーションにより標的細胞に導入することができる。例えば、いくつか
の実施形態では、ｇＲＮＡをコードする本明細書の核酸分子及び／又はベクターは、ｇＲ
ＮＡを調製するために使用することができる。次いで、本明細書の免疫細胞に送達するた
めに、ｇＲＮＡを単離及び／又は精製することができる。ｇＲＮＡは、例えばｇＲＮＡ／
Ｃａｓ９複合体として、Ｃａｓ９タンパク質とともに免疫細胞に送達できる。いくつかの
実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質とは別に免疫細胞に送達することができ
、別個のタンパク質又はＣａｓ９タンパク質をコードする核酸／ベクターのいずれかとし
て細胞に導入することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、免疫細胞に導入される薬剤は、Ｃａｓ９と、ＨＰＫ−１を標的
とする標的化ドメイン（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）を含むｇＲＮＡとのリボ核タンパ
ク質（ＲＮＰ）複合体であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、導入は、イ
ンビトロで薬剤又はその一部を免疫細胞と接触させることを含み、これは、細胞及び薬剤
を最大２４、３６又は４８時間又は３、４、５、６、７又は８日以上培養又はインキュベ
ートすることを含み得る。様々な実施形態において、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ又はコード化
ポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションにより細胞に直接導入することがで
きる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、薬剤を細胞と接触させる前、接触中又は後に、及び／又は送達
（例えば、エレクトロポレーション）を行う前、送達中又は後に、細胞をサイトカイン、
刺激剤及び／又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖を誘発できる薬剤の存在下でインキ
ュベートすることができる。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、少な
くとも部分的に、ＣＤ３特異的抗体、ＣＤ２８及び／又はサイトカイン特異的抗体である
か、又はそれらを含む刺激剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベ
ーションは、少なくとも部分的に、１つのＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５などのサイ
トカインの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、エレク
トロポレーションの前又は後の最大８時間、例えば最大２４時間、３６時間又は４８時間
又は３、４、５、６、７又は８日以上である。いくつかの実施形態では、刺激剤（例えば
、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）及び／又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７及び／
又はＩＬ−１５）の存在下でのインキュベーションは、エレクトロポレーションまで最大
２４時間、２５時間前又は４８時間行われる。
【０１０１】
ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質などの薬剤を送達する他の方法には、当技術分野で知ら
れている方法が含まれる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書の免疫細胞は、組換え受容体をさらに含み、薬剤（例
えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体）の導入は、本明細書に記載のＣＡＲなどの組換え受容
体をコードする核酸又はその産物の導入と同時に又は順に起こり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子（例えば、ＨＰＫ−１）のノックアウトの程度は、様々
な時点（例えば、薬剤の導入後２４〜７２時間）でのノックアウト効率とも呼ばれ、細胞
内の遺伝的破壊を評価するためのよく知られた複数のアッセイのいずれか、例えば、本明
細書の実施例部分に記載された方法を使用して評価できる。薬剤の導入後２４〜７２時間
など、さまざまな時点での遺伝子のノックダウンの程度は、細胞内の遺伝子発現を評価す
るためのよく知られた複数のアッセイのいずれかを使用して評価でき、例えば、転写又は
タンパク質発現又は細胞表面発現のレベルを測定する。
Ｔ細胞組成物及び方法
【０１０４】
特定の実施形態は、Ｔ細胞、より具体的には、ＣＡＲ（例えば、本明細書に記載のように
）を有するＴ細胞に関する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＨＰＫ−１遺伝子の
遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞
は、（ａ）本明細書のｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド又はベクタ
ーのいずれか１つ又は複数、（ｂ）本明細書のＣａｓ９タンパク質、又はＣａｓ９タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド又はベクターのいずれか１つ又は複数、又は（ａ）と
（ｂ）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は本明細書におけるｇ
ＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞組成物は、Ｔ細胞と、Ｔ細胞内のＨＰＫ‐１遺伝子をノ
ックアウトする手段と、を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト
癌患者由来の初代細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、リンパ腫、慢性リ
ンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性
白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（
ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、乳癌、卵
巣癌、黒色腫、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星細胞腫、中皮腫、
頭頸部癌、髄芽腫、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される癌に罹患している
。いくつかの実施形態では、ＨＰＫ−１遺伝子をノックアウトする手段は、ｇＲＮＡ／Ｃ
ａｓ９複合体であり、前記ｇＲＮＡは、配列番号１及び１１−１５から選択された標的配
列と完全に相補的な配列と同一であるか、１、２、又は３ヌクレオチド以下だけ異なる標
的配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＫ−１遺伝子をノックアウトするため
の手段は、本明細書の実施例部分に示されるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体である。いくつか
の実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲなどの組換え受容体をさらに含む。
【０１０６】
いくつかの特定の実施形態では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％、７５％、８０％
、８５％、又は９０％が細胞表面上の組換え受容体（例えば、本明細書に記載のキメラ抗
原受容体など）を含むこと、及び、例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又
は実施例５のウエスタンブロット法によって決定されるように、ＨＰＫ−１遺伝子ノック
アウト効率が少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％又は９５％であることを特徴とするＴ細胞集団（例えば、Ｃａｒ−Ｔ細胞集団）を
提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団（例えば、Ｃａｒ‐Ｔ細胞集団）は、フ
ローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＰＤ‐１、ＴＩＭ−３、及び
／又はＬａｇ−３を発現している細胞集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも低
いこと、フローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にアネキシンＶを発
現している細胞集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも低いこと、及び／又はフ
ローサイトメトリーによって決定されるように、細胞表面にＣＤ１０７ａを発現している
細胞集団中の細胞の割合が対照細胞集団のそれよりも高いことを特徴とするようにしても
よい。これらの特徴を有するＴ細胞集団は、本開示を考慮して当業者によって調製され得
る。当業者によって理解されるように、用語「Ｔ細胞集団」又は「Ｃａｒ−Ｔ細胞集団」
及び本明細書における同様の用語は、細胞集団が他の種類の細胞を含まないことを意味し
ないが、好ましくは、該細胞集団は、それぞれ大多数（例えば、少なくとも約５０％）の
Ｔ細胞又はＣａｒ−Ｔ細胞を含む必要がある。市販されている２つのＣａｒ−Ｔ療法薬で
あるＫｙｍｒｉａｈ（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）又はＹｅｓｃａｒｔａ（ａｘ
ｉｃａｂｔａｇｅｎｅ  ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）には、Ｃａｒ−Ｔ細胞に加えて、ＮＫ細
胞、ＮＫ−Ｔ細胞、Ｂ細胞なども含まれることがよく知られている。
【０１０７】
いくつかの特定の実施形態では、本開示は、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝
子ノックアウト）を誘発するか、又は誘発することができる薬剤とＴ細胞を接触させるこ
とを含む、Ｔ細胞の改変方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、（ａ）ヒ
ト患者（例えば、本明細書に記載のとおり）からＴ細胞を得ること、（ｂ）ＨＰＫ−１遺
伝的破壊を誘発するか、又は誘発することができる薬剤をＴ細胞に導入すること、（ｃ）
該薬剤を用いてＴ細胞をインキュベートし、必要に応じて増殖させ、ＨＰＫ−１遺伝子破
壊Ｔ細胞集団を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション
は、ＩＬ−２などのサイトカイン又は抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の存在下で実施
することができる。いくつかの実施形態では、該方法は、（ｄ）本明細書に記載のＣＡＲ
又はその産物などの組換え受容体をコードする核酸をＴ細胞に導入することをさらに含む
。適切な薬剤には、本明細書に記載の薬剤のいずれかが含まれる。いくつかの実施形態で
は、該方法は、（ａ）本明細書のｇＲＮＡ、又は該ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチ
ド又はベクターのいずれか１つ又は複数、（ｂ）本明細書のＣａｓ９タンパク質又はポリ
ヌクレオチド、又はＣａｓ９タンパク質をコードするベクターのいずれか１つ又は複数、
又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ｇＲＮＡ
／Ｃａｓ９複合体をＴ細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に
記載のように、本明細書の方法によって産生されるＨＰＫ−１遺伝子破壊Ｔ細胞集団は、
ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト効率、疲弊化マーカー（ＰＤ−１、ＴＩＭ−３及び／又は
Ｌａｇ−３）の発現、アポトーシスマーカーアネキシンＶの発現、細胞毒性マーカーＣＤ
１０７ａの発現などのいずれかを特徴とすることができる。例えば、いくつかの実施形態
では、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト効率は、例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセ
イ及び／又は実施例５のウエスタンブロット法に従う方法によって決定されるように、少
なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５
％であり得る。
【０１０８】
Ｔ細胞又はＴ細胞集団は、対象（例えば、癌に罹患しているヒト対象）から得られた初代
細胞などの細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルから得られた細胞、未分画のＴ細
胞サンプル、リンパ球サンプル、白血球サンプル、アフェレーシス製品又は白血球除去製
品を含むことができる。いくつかの実施形態では、陽性又は陰性の選択及び濃縮方法を使
用して、集団内のＴ細胞を濃縮するためにＴ細胞を分離又は選択することができる。いく
つかの実施形態では、細胞集団はＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を
含む。他の適切なタイプのＴ細胞には、本明細書に記載されるもののいずれかが含まれる
。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト癌患者由来の初代細胞である。いくつかの実
施形態では、ヒト患者は、リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ
性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリン
パ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣ
Ｃ）、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道
癌、肝細胞癌、膵臓癌、星細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫、及びそれらの組み合わせ
からなる群から選択される癌に罹患している。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、組換え受容体（例えば、遺伝子操作された抗原受容体）をコー
ドする核酸及びＨＰＫ−１遺伝子を破壊するための薬剤（例えば、本明細書のＣａｓ９／
ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）は同時に又は任意の順序でＴ細胞集団中の細胞に導入し得る。いくつ
かの実施形態では、組換え受容体（例えばＣＡＲ）及び薬剤（例えば本明細書のＣａｓ９
／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）の導入に続いて、細胞は、例えば本明細書に記載されるように、細
胞の増殖及び／又は増殖を刺激する条件下で培養又はインキュベートされる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、投与された遺伝子操作された（例えば、ＣＡＲ
＋）細胞の活性及び効力を増加させるなどにより、経時的に移植細胞に対する持続性又は
曝露を維持しながら、改善された効能を提供することを含む、養子細胞療法におけるＴ細
胞などの免疫細胞の機能を強化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は
、例えば、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的破壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を誘発するか
、又は誘発することができる薬剤を免疫細胞に導入することにより、免疫細胞のＨＰＫ−
１遺伝子を破壊することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、（ａ）本明細書の
ｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド又はベクターのいずれか１つ又は
複数、（ｂ）本明細書のＣａｓ９タンパク質、又はＣａｓ９タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド又はベクターのいずれか１つ又は複数、又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせを
含む。いくつかの実施形態では、該方法は、免疫細胞に本明細書のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複
合体を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞などのＨＰＫ‐
１遺伝子破壊を有する免疫細胞は、特定の利用可能な方法と比較して、対象にインビボで
投与された場合、増大した増殖及び／又は持続性を示す。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞集団（例えば、Ｃａｒ−Ｔ細胞などのＴ細
胞集団）の細胞毒性を強化し、疲弊化を抑制し、及び／又は脾臓及び／又は腫瘍における
浸潤を強化する方法も提供する。該方法は、免疫細胞集団を、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的破
壊（例えば、遺伝子ノックアウト）を誘発するか、又は誘発することができる薬剤と接触
させることを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、（ａ）ヒト患者（例えば、
本明細書に記載のように）から免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞）を得ることと、（ｂ）Ｈ
ＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発することができる薬剤を免疫細胞（例えば、
Ｔ細胞）集団に導入することと、（ｃ）前記薬剤を用いて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を
インキュベートし、必要に応じて増殖させ、薬剤を導入する前の細胞集団と比較して強化
された細胞毒性、低減させた疲弊化及び／又は脾臓及び／又は腫瘍における強化された浸
潤を有するＨＰＫ−１遺伝子破壊免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）集団を提供することと、を
含む。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載のＣＡＲ又はその産物などの
組換え受容体をコードする核酸を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することをさらに含
む。適切な薬剤には、本明細書に記載の薬剤のいずれかが含まれる。いくつかの実施形態
では、該方法は、（ａ）本明細書のｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチ
ド又はベクターのいずれか１つ又は複数、（ｂ）本明細書のＣａｓ９タンパク質、又はＣ
ａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はベクターのいずれか１つ又は複数、
又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせを免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を免疫細胞に
導入することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように、本明細書の方
法によって産生されるＨＰＫ−１遺伝子破壊Ｔ細胞集団は、ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウ
ト効率、疲弊化マーカー例えばＰＤ−１、ＴＩＭ−３及び／又はＬａｇ−３の発現、アポ
トーシスマーカーアネキシンＶの発現、細胞毒性マーカーＣＤ１０７ａの発現などのいず
れかを特徴とすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＰＫ−１遺伝子ノ
ックアウト効率は、例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５のウ
エスタンブロット法に従う方法により決定されるように、少なくとも約５０％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％であり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、免疫細胞集団はＣａｒ−Ｔ細胞集団である。いくつかの実施形
態では、Ｃａｒ−Ｔ集団は、細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％又は９５％が細胞表面に組換え受容体（例えば、例えば、本
明細書に記載されるようなキメラ抗原受容体）を含むことを特徴とする。いくつかの実施
形態では、該方法は、例えば、実施例４に記載のＴ７Ｅ１アッセイ及び／又は実施例５の
ウエスタンブロット法に従う方法により決定されるように、少なくとも約５０％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＨＰＫ−１遺伝子ノッ
クアウト効率を有するＣａｒ−Ｔ細胞集団を産生する。
【０１１３】
本明細書で詳述するように、Ｃａｒ−Ｔ細胞などの免疫細胞のＨＰＫ−１遺伝子を破壊す
ることにより、免疫細胞が強化された細胞毒性、増加した持続性及び低減させた疲弊化、
及び／又は脾臓及び／又は腫瘍における強化された浸潤を示すことは予想外である。この
ような効果は、対象に投与された場合にもインビボで観察されている。例えば、ある動物
の研究では、ＨＰＫ−１ノックアウトＣａｒ−Ｔ細胞は、野生型Ｃａｒ−Ｔ細胞又はＰＤ
−１ノックアウトＣａｒ−Ｔ細胞に比べて、治療動物の血漿中にはるかに高いレベルで残
っていることがわかる。投与された細胞の持続性の範囲又は程度は、対象への投与後に、
ｑＰＣＲ、フローサイトメトリーアッセイ、又は細胞に基づくアッセイにより検出又は定
量化することができる。これは、例えば養子免疫療法における本明細書の組成物及び方法
に関連する利点をさらに示している。
【０１１４】
当業者が本開示に基づいて理解できるように、本明細書の方法は、特定の免疫細胞又は特
定のＣＡＲに限定されない。いくつかの実施形態では、市販のＣａｒ−Ｔ細胞は、本明細
書の方法、例えばＨＰＫ−１遺伝子のノックアウトによって、その免疫療法の機能をさら
に改善することもでき、例えばＴ細胞疲弊化を減らす。例えば、Ｋｙｍｒｉａｈ（ｔｉｓ
ａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）又はＹｅｓｃａｒｔａ（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ  ｃｉ
ｌｏｌｅｕｃｅｌ）のＣａｒ−Ｔ細胞は、本明細書の方法によって修飾されることで、Ｈ
ＰＫ−１遺伝子をノックアウトされることができる。本明細書で検討されるように、その
ような実施形態では、ＨＰＫ−１遺伝子の遺伝的修飾のための薬剤の導入は、Ｋｙｍｒｉ
ａｈ又はＹｅｓｃａｒｔａのＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸の導入と同時又は任意の
順序で起こり得る。
【０１１５】
例えば、添付文書によれば、ＹＥＳＣＡＲＴＡを調製するために、患者自身のＴ細胞を回
収し、レトロウイルス形質導入によりエクスビボで遺伝的修飾して、ＣＤ２８及びＣＤ３
−ｚｅｔａ共刺激ドメインにリンクしているマウス抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
を含むキメラ抗原受容体を発現させる。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、増殖されて患者
に注入され、患者体内でＣＤ１９を発現している標的細胞を認識して排除することができ
る。
【０１１６】
より具体的には、ＹＥＳＣＡＲＴＡは、患者の末梢血単核細胞から調製することができ、
末梢血単核細胞は、標準の白血球除去法によって取得される。単核細胞はＴ細胞が濃縮さ
れ、ＩＬ−２の存在下、抗ＣＤ３抗体で活性化され、その後抗ＣＤ１９  ＣＡＲ導入遺伝
子を含む複製不能レトロウイルスベクターで形質導入される。形質導入されたＴ細胞は、
細胞培養物で増殖され、洗浄され、懸濁液に製剤化され、凍結保存される。この製品は、
患者専用の輸液バッグに入れた凍結懸濁液として出荷するために、無菌テストに合格する
必要がある。
【０１１７】
ＫＹＭＲＩＡＨ（TM）（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）は、抗ウイルス性抗ＣＤ１
９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするためにレンチウイルスベクターを使用して遺
伝的修飾された自己Ｔ細胞で構成される、ＣＤ１９指向の遺伝的修飾自己Ｔ細胞免疫療法
である。ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なマウス単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）から構成されて
おり、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインに融合した
ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域がマウス単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に続いている。
【０１１８】
ＫＹＭＲＩＡＨは、患者の末梢血単核細胞から調製することができ、末梢血単核細胞は、
標準の白血球除去法により取得される。単核細胞は、Ｔ細胞が濃縮され、抗ＣＤ１９  Ｃ
ＡＲ導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターで形質導入され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体
コーティングビーズで活性化される。形質導入されたＴ細胞は、細胞培養物で増殖され、
洗浄され、懸濁液に製剤化され、その後凍結保存される。この製品は、患者専用の輸液バ
ッグに入れた凍結懸濁液として出荷するために、無菌テストに合格する必要がある。この
製品は投与前に解凍される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、Ｋｙｍｒｉａｈ（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）又はＹ
ｅｓｃａｒｔａ（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ  ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）用のＣａｒ−Ｔ細
胞は、ＨＰＫ−１遺伝子をノックアウトできる薬剤（例えば、本明細書に記載のｇＲＮＡ
／Ｃａｓ９など）を導入することにより修飾することができ、薬剤の導入は、抗ＣＤ１９
ＣＡＲ導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターと同時に又は順次行われる。次に、得
られた細胞を細胞培養物で増殖させ、洗浄し、Ｋｙｍｒｉａｈ又はＹｅｓｃａｒｔａを調
製する手順と同様に製剤化することができる。
医薬組成物及び治療方法
【０１２０】
Ｃａｒ−Ｔ細胞などの修飾免疫細胞は、最近特定の癌の治療用として承認されている。例
えば、ＹＥＳＣＡＲＴＡは、特発性ではないびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ
Ｌ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ
腫から生じるＤＬＢＣＬを含む２回以上の全身療法後の再発又は難治性大細胞型Ｂ細胞リ
ンパ腫の成人患者の治療に適応するＣＤ１９指向の遺伝的修飾自己Ｔ細胞免疫療法である
。同様に、ＫＹＭＲＩＡＨは、難治性又は２回目以降の再発のＢ細胞前駆体急性リンパ芽
球性白血病（ＡＬＬ）に罹患している２５歳以下の患者、特発性ではないびまん性大細胞
型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫から生じ
たＤＬＢＣＬを含む２回以上の全身療法後の再発又は難治性（ｒ／ｒ）大Ｂ細胞リンパ腫
の成人患者治療に適応するＣＤ１９指向の遺伝的修飾自己Ｔ細胞免疫療法である。
【０１２１】
本明細書で検討されるように、Ｃａｒ−Ｔ細胞などの免疫細胞（例えば、Ｙｅｓｃａｒｔ
ａ又はＫｙｍｒｉａｈ用）のＨＰＫ−１遺伝子を遺伝的に破壊すると、細胞毒性の増加や
疲弊化の低減などの免疫療法の機能をさらに高めることができる。
【０１２２】
したがって、本明細書では、細胞、細胞集団、例えば、癌治療用などの養子免疫療法で使
用するための本明細書の方法のいずれかによって産生される細胞、細胞集団を含む医薬組
成物も提供する。医薬組成物及び製剤は、一般に、薬学的に許容される１つ以上の任意の
担体又は賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、該組成物は少なくとも１つの追加の治
療薬を含む。
【０１２３】
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性が有効になるよう
な形態であり、製剤が投与される対象により許容できないほど毒性の追加成分を含まない
製剤を指す。
【０１２４】
「薬学的に許容される担体」とは、医薬製剤中、活性成分以外、対象に対して無毒である
成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含ま
れるが、これらに限定されない。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science
s 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。いくつかの実施形態では、担
体の選択は、特定の細胞及び／又は投与方法によって部分的に決定される。
【０１２５】
適切な防腐剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、
及び塩化ベンザルコニウムが含まれる。いくつかの実施形態では、２つ以上の防腐剤の混
合物が使用される。防腐剤又はその混合物は、典型的には、全組成物の約０．０００１重
量％〜約２重量％の量で存在する。
【０１２６】
適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、
及び他のさまざまな酸及び塩が含まれる。いくつかの実施形態では、２つ以上の緩衝剤の
混合物が使用される。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、全組成物の約０．００１重
量％から約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は公知するも
のである。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmac
y, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)に記載されている。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患又は状態を治療又は予防するのに有効な量
、例えば治療的有効量又は予防的有効量の細胞を含む。いくつかの実施形態では、治療的
又は予防的効能は、治療対象の定期的な評価によって監視される。所望の投与量は、細胞
の単回ボーラス投与、細胞の複数回ボーラス投与、又は細胞の連続注入投与により送達す
ることができる。
【０１２８】
細胞及び組成物は、標準的な投与技術、製剤、及び／又は装置を使用して投与することが
できる。細胞の投与は、自己又は異種のものであり得る。例えば、免疫応答性細胞又は前
駆細胞を１人の対象から得て、同じ対象又は異なる適合性のある対象に投与することがで
きる。末梢血由来の免疫応答性細胞又はその継代細胞（例えば、インビボ、エクスビボ又
はインビトロ由来）は、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注
射、又は非経口投与などを介して投与できる。治療用組成物（例えば、遺伝的修飾された
免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、それは一般に、単位投与量の注射可
能な形態（溶液、懸濁液、乳液）に製剤化される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、組成物は、滅菌液体製剤、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマ
ルジョン、分散液、又は粘性組成物の形態として提供され、いくつかの実施形態では、選
択されたｐＨとなるまで緩衝され得る。細胞を溶媒に混入し、例えば、適切な担体、希釈
剤、又は滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの賦形剤と混合して滅菌
注射溶液を調製することができる。前記組成物は、所望の投与経路及び製剤に応じて、湿
潤剤、分散剤、又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は増粘
添加剤、防腐剤、矯味剤、及び／又は着色剤などの補助物質を含むことができる。いくつ
かの実施形態では、標準テキストを参照して適切な製剤を調製することができる。
【０１３０】
微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝液を含む、組成物の安定性と無菌性を向
上させるさまざまな添加剤を加えることができる。
【０１３１】
さまざまな抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソル
ビン酸によって微生物の活動を防止することができる。注射可能な医薬形態の長期吸収は
、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によ
りもたらされ得る。インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌である。無菌性は、例え
ば、滅菌ろ過膜を通してろ過することにより容易に達成することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞及び組成物を対象、例えばヒト患者に投与して
、癌を含む疾患、状態及び障害を治療又は予防するための方法、例えば治療方法をさらに
提供する。いくつかの実施形態では、細胞、集団、及び組成物は、例えば養子Ｔ細胞療法
などの養子細胞療法を介して、治療される特定の疾患又は状態を有する対象又は患者に投
与される。いくつかの実施形態において、インキュベート及び／又は他の処理工程後のＣ
ａｒ−Ｔ細胞及び生産終了組成物などの本明細書の方法により調製された細胞及び組成物
は、対象、又は疾患又は状態に罹患している又はそのリスクがある対象に投与される。そ
れにより、いくつかの実施形態では、該方法は、例えば、操作されたＴ細胞により認識さ
れる抗原を発現する癌の腫瘍負荷を軽減することにより、疾患又は状態などの１つ以上の
症状を治療する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、該方法は、それを必要とする対象に、本明細書のＨＰＫ−１遺
伝的破壊又は細胞組成物を含む免疫細胞を治療的有効量で投与することを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、該方法は、（ａ）治療を必要とする対象から免疫細胞（例えば
、Ｔ細胞）を得ることと、（ｂ）ＨＰＫ−１遺伝的破壊を誘発するか、又は誘発すること
ができる薬剤を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することと、（ｃ）前記薬剤を用いて
免疫細胞をインキュベートし、必要に応じて増殖させ、ＨＰＫ−１遺伝子破壊細胞集団を
提供することと、（ｄ）ＨＰＫ−１遺伝子破壊細胞集団を対象に投与することと、を含む
。いくつかの実施形態では、該方法は、（ｅ）本明細書に記載のＣＡＲ又はその産物など
の組換え受容体をコードする核酸を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することをさらに
含む。（ｂ）及び（ｅ）の導入ステップは、同時に又は任意の順序で実行できる。適切な
薬剤及び組換え受容体には、本明細書に記載のものが含まれる。
【０１３５】
養子細胞療法のための細胞投与方法は知られており、提供された方法及び組成物と組み合
わせて使用することができる。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂ
ｅｒｇらによる米国特許出願公開番号２００３／０１７０２３８、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに
よる米国特許番号４,６９０,９１５、Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577
-85)に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-
933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et 
al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は、細胞療法を受ける対象又
は該対象に由来するサンプルから細胞を単離及び／又は調製する自己移植により行われる
。したがって、いくつかの実施形態では、前記細胞は、治療を必要とする対象、例えば患
者に由来し、単離及び処理後、同じ対象に投与される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は、細胞治療を受ける又は最
終的に受ける対象以外の対象例えば第１対象から細胞を単離及び／又は調製する同種異系
移植により行われる。そのような実施形態では、次いで、細胞は、同じ種の異なる対象、
例えば第２対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２対象は遺伝的に同
一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２対象は遺伝的に類似している。いくつ
かの実施形態では、第２対象は、第１対象と同じＨＬＡクラス又はスーパータイプを発現
する。
【０１３８】
本明細書の方法によって治療される適切な疾患又は障害には、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、
及び黒色腫を含む腫瘍、並びにウイルス又は他の病原体、例えばＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ
、ＣＭＶによる感染などの感染症、寄生虫疾患が含まれる。いくつかの実施形態では、前
記疾患又は状態は、腫瘍、癌、悪性腫瘍、新生物、又は他の増殖性疾患又は障害である。
そのような疾患には、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ
芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治
性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性癌、結
腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、皮膚癌、黒色腫、骨癌、脳癌、上皮癌、
腎細胞癌、膵腺癌、ホジキンリンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、膠芽腫、神経芽腫、ユー
イング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、及び／又は中皮腫であり得る癌又は腫瘍である
疾患又は状態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、前記疾患又は障害は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯ
Ｒ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソセリ
ン、ＣＥＡ、及びＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、Ｃ
Ｄ３３、ＣＤ３８、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨ
ａ２、ＥｒｂＢ２、３又は４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、
ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、ルイス
Ｙ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣ
Ａ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、胎児腫瘍性抗
原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原
、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリン
Ｂ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、及びＭＡＧＥ  Ａ３及び／又はビ
オチン化分子、及び／又はＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ又は他の病原体によって発現される分
子からなる群から選択される抗原に関連する。例えば、いくつかの実施形態では、前記疾
患又は障害は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、インテグリンαＶβ６、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲｖＩＩ
Ｉ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、及び／又はメソセリンを発現する細胞に関連し得る。
【０１４０】
疾患の予防又は治療のために適切な投与量は、治療される疾患の種類、細胞又は組換え受
容体の種類、疾患の重症度及び経過、細胞が予防目的又は治療目的のいずれで投与される
か、治療履歴、対象の病歴、及び細胞に対する反応、担当医の裁量によって細胞が投与さ
れる。組成物及び細胞は、いくつかの実施形態では、一度に又は一連の治療にわたって対
象に適切に投与される。
【０１４１】
細胞は、任意の適切な手段、例えば、ボーラス注入、注射例えば静脈内又は皮下注射、眼
内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注
射、前房内注射、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｅｃｔｖａｌ）注射、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊ
ｕｎｔｉｖａｌ）注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射、又は強膜後方送達によ
って投与できる。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、及び鼻腔内によっ
て投与され、局所治療が所望される場合、病巣内投与によって投与される。非経口注入に
は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、細胞は、組み合わせ治療の一部として投与され、例えば、抗体
、操作された細胞、受容体若しくは細胞傷害剤又は治療剤などの薬剤など、別の治療的介
入と同時に又は任意の順序で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の
追加の治療薬と同時に投与されるか、又は別の治療的介入と同時に又は任意の順序で投与
される。いくつかの場合において、細胞は、細胞集団が１つ以上の追加の治療薬の効果を
強化するように、又はその逆のように、時間が十分に近い別の療法と同時に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療薬の前に投与される。いくつか
の実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療薬の後に投与される。いくつかの実施形
態では、１つ以上の追加の薬剤は、持続性を高めるために、例えばＩＬ−２などのサイト
カインを含む。いくつかの実施形態では、該方法は化学療法剤の投与を含む。
【０１４３】
細胞の投与後、いくつかの実施形態では、操作された細胞集団の生物学的活性は、例えば
、いくつかの既知の方法のいずれかによって測定することができる。評価するパラメータ
には、インビボでの、例えばイメージングによる、又はエクスビボでの、例えばＥＬＩＳ
Ａ又はフローサイトメトリーによる、人工又は天然Ｔ細胞又は他の免疫細胞の抗原への特
異的結合が含まれる。特定の実施形態では、標的細胞を破壊する操作された細胞の能力は
、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009),及びHerma
n et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載されている細胞毒性
アッセイなど、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して測定することがで
きる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ、ＩＬ−２、
及びＴＮＦなどの１つ以上のサイトカインの発現及び／又は分泌をアッセイすることによ
って測定される。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、腫瘍負荷又は腫瘍細胞量の
減少などの臨床結果を評価することにより測定される。
【０１４４】
特定の実施形態では、操作された細胞は、それらの治療的又は予防的効能が増加するよう
に、複数の方法でさらに修飾される。例えば、集団により発現される操作ＣＡＲ又はＴＣ
Ｒは、直接又はリンカーを介して間接的に標的化部分にコンジュゲートすることができる
。化合物、例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲを標的化部分にコンジュゲートする実施は、当技術
分野で知られていることである。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (
1995)、及び米国特許５,０８７,６１６を参照する。
定義
【０１４５】
本明細書で使用される「約」（ａｂｏｕｔ）という用語は、当業者に容易に知られている
それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値又はパラメータへの「約」の
使用は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び説明する）。
【０１４６】
本明細書で使用される単数形「１つ」（ａ）、「１つの」（ａｎ）、及び「該」（ｔｈｅ
）は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば
、「１つ」（ａ）、「１つの」（ａｎ）は「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味す
る。
【０１４７】
本開示全体にわたって、特許請求される主題の様々な実施形態が範囲形式で提供される。
範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、特許請求される主題
の範囲に対する固定した制限として解釈されるべきではないことを理解される。したがっ
て、範囲の説明は、すべての可能なサブ範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示
したと見なされるべきである。例えば、値の範囲が提供された場合、その範囲の上限と下
限の間の各中間値と、その記載された範囲内の他の記載値又は中間値は、請求特許される
主題に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、より小さ
な範囲に独立して含まれてもよく、前記範囲内の具体的に除外された制限を条件として、
特許請求された主題にも含まれる。記載された範囲に１つ又は２つの制限が含まれる場合
、それらの含まれる制限のいずれか又は両方を除外する範囲も、特許請求される主題に含
まれる。これは、範囲の広さに関係なく適用される。簡潔にするために、本明細書で使用
される場合、用語「少なくとも約」、「約」などの後に一連の数字が記載されている場合
、これらの数字のそれぞれの前にそのような用語があることを理解される。例えば、少な
くとも約５０％、６０％、７０％、又は８０％は、少なくとも約５０％、少なくとも約６
０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％として理解されるべきである。また
、簡潔にするために、コンテキストから同じ分母が意図されていることが明らかである場
合、記号「％」は省略されることがある。例えば、パーセンテージを説明する場合、約５
０、６０、．．．．又は９０％は、約５０％、約６０％又は約９０％と理解すべきである
。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して使用される
とき、「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」及び「同一性パーセント」は、候補配
列（例えば、ストレプトアビジンムテイン）中のアミノ酸残基の割合として定義され、こ
の候補配列は、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一であり、必要に応じて配列を
アラインメントさせ、ギャップを導入した後、いずれの保存的置換を配列同一性の一部と
して考慮することなく、配列同一性の最大パーセントを達成する。アミノ酸配列同一性の
パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、
ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能
なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内の様々な方法で達成できる。
当業者は、配列をアラインメントさせるための適切なパラメータを決定することができ、
この適切なパラメータには、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達
成するために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。
【０１４９】
２つの配列間の相同性又は配列同一性の計算（これらの用語は本明細書では互換的に使用
される）は次のように実行される。最適な比較のために、配列はアラインメントされる（
例えば、最適なアラインメントのためには、第１及び第２アミノ酸又は核酸配列の一方又
は両方にギャップを導入し、比較のためには、非相同配列を無視できる）。ＧＣＧソフト
ウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最適なアライメントを最高スコアとし
て決定し、ここで、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスでは、ギャップペナ
ルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５である。
次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置の残基又はヌクレオチドが比較される
。第１配列の位置が、第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占
められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、
配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【０１５０】
アミノ酸置換には、ポリペプチドの１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることが含
まれる場合がある。アミノ酸は、一般に、次の一般的な側鎖特性によってグループ化する
ことができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５１】
非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換すること
に係る。
【０１５２】
本明細書で使用される「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、例えば、標準ＮＨＥＪ（
ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（Ｍ
ＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、及び合成依存マイクロホモロジー媒介末端結
合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）を含む、連結媒介修復及び／又は非鋳型媒介修復を指す。
【０１５３】
「ｇＲＮＡ分子」とは、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特異的なター
ゲティング又はホーミングを促進する核酸を指し、例えば、細胞のゲノムＤＮＡ上の遺伝
子座である。
【０１５４】
分子の修飾に関して本明細書で使用される「置換」（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）又は「置
換された」（ｒｅｐｌａｃｅｄ）は、プロセスの制限を必要とせず、単に置換実体が存在
することを示す。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、対象には、ヒト及び他の哺乳類などの任意の生物が含まれる
。哺乳類には、人間、及び家畜、スポーツ動物、げっ歯類、ペットなどの人間以外の動物
が含まれるが、これらに限定されない。この用語には、哺乳類（例えば、ヒト、他の霊長
類、豚、げっ歯類（例えば、マウス、ラット又はハムスター）、ウサギ、モルモット、牛
、馬、猫、犬、羊、ヤギ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象
はヒトである。他の実施形態では、対象は家禽である。
【０１５６】
本明細書で使用される組成物は、２つ以上の製品、物質、又は化合物の任意の混合物を指
し、細胞を含む。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性又はそれ
らの任意の組み合わせであり得る。
【０１５７】
本明細書で使用される「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（及び「治療する」（ｔｒｅａｔ
）又は「治療している」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）などのその文法的変化）は、疾患又は状態
又は障害、又は関連する症状、副作用又は結果、又は関連する表現型の完全又は部分的な
改善又は低減を指す。治療の望ましい効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和
、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患の進行速度の低下、
病状の改善又は緩和、寛解又は予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。これら
用語は、疾患の完全な治癒、又はすべての症状又は結果に対する症状又は効果の完全な排
除を意味するものではない。
【０１５８】
本明細書で使用される「予防する」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）は、疾患に罹患しやすいか
もしれないが、まだ疾患に罹患していると診断されていない対象に対する疾患の発症又は
再発に関して予防を提供することを含む。いくつかの実施形態では、提供される細胞及び
組成物は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される
。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、機能又は活性を「抑制する」（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）とは、目標
条件又はパラメータを除いて同じ条件と比較した場合、又は別の条件と比較した場合、機
能又は活性を減らすことである。例えば、腫瘍の成長を抑制する細胞は、細胞の非存在下
での腫瘍の成長速度と比較して、腫瘍の成長速度を低下させる。
【０１６０】
投与された場合、薬剤、例えば医薬製剤、細胞又は組成物の「有効量」とは、治療又は予
防の結果などの所望の結果を達成するために、必要な投与量／量で必要な期間に有効な量
を指す。
【０１６１】
薬剤、例えば医薬製剤又は細胞の「治療的有効量」とは、疾患、状態又は障害の治療など
の所望の治療結果、及び／又は治療の薬物動態学的又は薬力学的効果を達成するために、
必要な投与量で必要な期間に有効な量を指す。治療的有効量は、対象の病状、年齢、性別
及び体重、及び投与された細胞の集団などの要因に応じて異なる。いくつかの実施形態で
は、提供される方法は、細胞及び／又は組成物を有効量、例えば治療的有効量で投与する
ことを含む。
【０１６２】
「予防的有効量」とは、所望の予防結果を達成するために、必要な投与量でかつ必要な期
間に有効な量を指す。必ずしもそうではないが、典型的には、疾患の前又は初期段階で対
象に予防用量が使用されるため、予防的有効量は治療的有効量よりも少なくなる。より低
い腫瘍負荷の場合、いくつかの実施形態では、予防的有効量は、治療的有効量よりも高い
。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、１つ以上の特定の細胞型又は細胞集団を指す場合、「濃縮」
（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）とは、例えば組成物中の細胞の総数又は体積と比較して、又は他
の細胞型と比較して、集団又は細胞によって発現されるマーカーに基づく陽性選択、又は
枯渇する細胞集団又は細胞に存在しないマーカーに基づく陰性選択などにより細胞型又は
細胞集団の数又は割合を増加させることを指す。この用語は、組成物から他の細胞、細胞
型又は集団を完全に除去する必要がなく、また、そのように濃縮された細胞が濃縮組成物
中に現れるか、又は１００％近くに存在することが必要ではない。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、細胞又は細胞集団が特定のマーカーに対して「陽性」であると
いう記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上又は細胞内の検出可能な
存在を指す。表面マーカーが言及される場合、この用語は、フローサイトメトリーにより
検出される表面発現の存在を指し、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、
前記抗体を検出し、ここで、前記染色は、フローサイトメトリーにより検出可能であり、
この検出レベルは、同一の条件下、アイソタイプ適合対照又は蛍光マイナス１（ＦＭＯ）
ゲーティング対照を用いて同じ手順を実行して検出される染色を実質的に上回るレベル、
及び／又は、マーカーに対して陽性であることが知られている細胞のレベルと実質的に同
様のレベル、及び／又は、マーカーに対して陰性であることが知られている細胞のレベル
よりも実質的に高いレベルである。
【０１６５】
本明細書において、細胞又は細胞集団が特定のマーカーに対して「陰性」であるという記
述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上又は細胞内に実質的に検出可能
な存在がないことを指す。表面マーカーが言及される場合、この用語は、フローサイトメ
トリーにより検出される表面発現の欠如を指し、例えば、マーカーに特異的に結合する抗
体で染色し、前記抗体を検出し、ここで、前記染色は、フローサイトメトリーにより検出
されず、この検出レベルは、同一の条件下、アイソタイプ適合対照又は蛍光マイナス１（
ＦＭＯ）ゲーティング対照を用いて同じ手順を実行して検出される染色を実質的に上回る
レベル、及び／又は、マーカーに対して陽性であることが知られている細胞のレベルと実
質的に低いレベル、及び／又は、マーカーに対して陰性であることが知られている細胞の
レベルよりも実質的に類似したレベルである。
【０１６６】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それがリンクされている別の核酸を伝
播することができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター
と、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターとが含まれる。特定のベ
クターは、それらが機能的にリンクされている核酸の発現を指示することができる。その
ようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１６７】
特に定義されていない限り、本明細に使用されるすべての用語、符号、その他の技術的用
語及び科学用語又は学術用語は、特許請求された主題が関係する当業者によって一般に理
解されているのと同じ意味を持つことを意図している。場合によっては、明確にするため
に及び／又は参照しやすくするために、一般に理解されている意味を持つ用語が本明細書
で定義されており、本明細書でそのような定義を含めることは、当技術分野の一般な理解
に対する実質的な区別を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
【０１６８】
本出願で言及される特許書類、科学論文及びデータベースを含むすべての出版物は、個々
の出版物が参照により個々に組み込まれるかのように、あらゆる目的のためにその全体が
参照により組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる
特許、出願、公開出願、及び他の刊行物に記載の定義に反する、又は一致しない場合、本
明細書に記載の定義は、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。
例示的な実施形態
【０１６９】
一実施形態では、本発明は、ｈｐｋ１タンパク質の機能が不活性化されるかその活性が低
下するようにＨＰＫ１遺伝子を遺伝的に修飾することを含む、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的修
飾方法を提供する。様々な実施形態において、本発明の方法は、操作が簡単で、ノックア
ウト効率が高く、Ｔ細胞の腫瘍殺傷活性を効果的に高める。本発明の方法により修飾され
たＴ細胞は、臨床応用の将来性が期待できる。
【０１７０】
本明細書における遺伝的修飾には、遺伝子ノックアウト、部分的遺伝子欠失、遺伝子置換
、及び挿入が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝的修飾は、ＨＰＫ１遺伝子の第２
エクソンを遺伝的に修飾することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝的修飾は、遺伝
子編集技術を使用してＨＰＫ１遺伝子を修飾することを含む。さまざまな遺伝子編集技術
を使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術には、胚性幹細胞に基
づくＤＮＡ相同組換え技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術、ジンクフィンガーヌクレアー
ゼ技術、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ技術、ホーミングエンドヌクレアー
ゼ又は他の分子生物学的技術が含まれ、好ましくは、遺伝的修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９に基づく遺伝子編集技術を使用して実行される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＰＫ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡでＨＰＫ１遺
伝子をノックアウトすることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはＨＰ
Ｋ１遺伝子の第２エクソンを標的とする。ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質は、通常ＨＰＫ
１遺伝子をノックアウトするために一緒に使用される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、該方法は、ｇＲＮＡを調製することを含む。いくつかの実施形
態では、ｇＲＮＡを調製する方法は、（１）ｇＲＮＡ担持プラスミドを構築することと、
（２）ｇＲＮＡをインビトロで転写することと、を含む。いくつかの実施形態では、ステ
ップ（１）は、ｇＲＮＡコード鎖及び相補鎖を合成し、コード鎖及び相補鎖をアニーリン
グすることによって形成された二本鎖ＤＮＡをｐＵＣ５７ベクターに挿入し、Ｔ７プロモ
ーターの制御下でｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを構築することを含む。いくつかの
実施形態では、ステップ（２）は、酵素消化及び配列決定により同定されたｇＲＮＡ担持
プラスミドｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを精製し、Ｔ７  ＲＮＡインビトロ転写キ
ットを使用してＨＰＫ１  ｇＲＮＡ／ＨＰＫ１  ｇＲＮＡをインビトロで転写し、転写産
物を精製して、ｇＲＮＡを得ることを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＫ１  ｇＲＮ
Ａ／ＨＰＫ１  ｇＲＮＡのインビトロ転写は、Ｔ７  ＲＮＡ  インビトロ転写キットを使
用して実行される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ鋳型配列は、配列
番号３及び配列番号４に記載されている通りである。
Ｆ：５´−ＴＡＧＧ  ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡ  −３  ´（配列番号３
）
Ｒ：５´−ＡＡＡＣ  ＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣ−３  ´（配列番号４）
。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧ
Ａの標的ドメインに相補的な標的化ドメインを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、該方法は、単核細胞のＨＰＫ１遺伝子を遺伝的に修飾すること
を含む。好ましくは、前記単核細胞はヒト末梢血単核細胞である。より好ましくは、前記
ヒト末梢血単核細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。より好ましくは、前記ヒ
ト末梢血単核細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞である。最も好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞は
、外因性キメラ抗原受容体をさらに発現する。例えば、いくつかの実施形態では、該方法
は、（１）ＨＰＫ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡを調製することと、（２）Ｃａｓ９タン
パク質を調製することと、（３）インビトロで単核細胞を培養及び増殖することと、（４
）ステップ（１）のｇＲＮＡ及びステップ（２）のＣａｓ９タンパク質をステップ（３）
の単核細胞に同時トランスフェクトすることと、を含む。
【０１７４】
ノックアウト効率は、当技術分野で知られている方法又は本明細書に記載されている方法
によって決定することができる。いくつかの実施形態では、該方法は、ステップ（４）の
同時トランスフェクション後、単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率を同
定することをさらに含み、好ましくは、ヒト末梢血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノ
ックアウト効率は、ＰＣＲ−酵素消化及び／又はウエスタンブロット法により同定される
。いくつかの実施形態では、単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、配
列番号７及び配列番号８に示されるプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ産
物に対して熱変性、アニーリング、復元を行い、次にＴ７エンドヌクレアーゼ処理を行い
、アガロースゲル電気泳動で切断効率を同定するような手順で同定することができ、ある
いは、単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、単核細胞中の総タンパク
質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、膜に移し、抗ＨＰＫ１抗体を一次抗体としてウエ
スタンブロットを行うような手順で同定することができる。いくつかの実施形態では、該
方法は、ステップ（４）で得られたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で同時トランスフェ
クトされた単核細胞においてヒト由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するステップ（
５）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ヒト由来キメラ抗原受容体は、ＣＡＲ
１９、ＢＣＭＡ、インテグリンαＶβ６、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＥＧ
ＦＲ、ＧＤ２、メソセリンである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、単核細胞の殺傷活性を強化する方法、又は単核細胞
のＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法も提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法を提供す
る。いくつかの実施形態では、該方法は、（１）ＨＰＫ１を標的とするｇＲＮＡを調製す
ることと、（２）Ｃａｓ９タンパク質を調製することと、（３）インビトロでヒト末梢血
単核細胞を培養及び増殖することと、（４）ステップ（１）のｇＲＮＡ及びステップ（２
）のＣａｓ９タンパク質をステップ（３）のヒト末梢血単核細胞に同時トランスフェクト
することと、を含む。
【０１７７】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、好ましくは、前記ヒト末梢
血単核細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞であり、より好ましくは、前記末梢血単核細
胞はＣＤ３＋Ｔ細胞である。
【０１７８】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、好ましくは、前記ヒト末梢
血単核細胞は、外因性キメラ抗原受容体をさらに発現する。
【０１７９】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、該方法は、ステップ（４）
で得られたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質でトランスフェクトされたＣＤ３＋ヒト末梢
血単核細胞においてヒト由来ＣＡＲを発現するステップ（５）をさらに含む。好ましくは
、前記ヒト由来キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、インテグリンαＶβ６、ＭＵ
Ｃ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、メソセリンである。
【０１８０】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、ステップ（４）は、ヒト末
梢血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率を同定することをさらに含む。
【０１８１】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、好ましくは、前記ヒト末梢
血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、ＰＣＲ−酵素消化及び／又は
ウエスタンブロット法により同定される。
【０１８２】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、ヒト末梢血単核細胞におけ
るＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、示されるプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行
い、配列番号７及び配列番号８において、ＰＣＲ産物に対して熱変性、アニーリング及び
復元を行い、次にＴ７エンドヌクレアーゼ処理を行い、アガロースゲル電気泳動により切
断効率を同定するような手順で同定される。
【０１８３】
本発明の末梢血単核細胞の殺傷活性を強化する方法において、ヒト末梢血単核細胞におけ
るＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、ヒト末梢血単核細胞中の総タンパク質を抽出し
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、膜に移し、抗ＨＰＫ１抗体を一次抗体としてウエスタンブロ
ットを行うような手順で同定される。
【０１８４】
さらに、本発明は、（１）ＨＰＫ１を標的とするｇＲＮＡを調製することと、（２）Ｃａ
ｓ９タンパク質を調製することと、（３）ヒト末梢血をインビトロで培養及び増殖するこ
とと、（４）ステップ（１）のｇＲＮＡとステップ（２）のＣａｓ９タンパク質をステッ
プ（３）のヒト末梢血単核細胞に同時トランスフェクトすることと、を含む、末梢血単核
細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法を提供する。
【０１８５】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞であり、より
好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞である。
【０１８６】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞は、外因性キメラ抗原受容体をさらに発現する
。
【０１８７】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、該方法は、ステップ（４）で得られたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質でトランスフ
ェクトされたＣＤ３＋ヒト末梢血単核細胞においてヒト由来ＣＡＲを発現させるステップ
（５）をさらに含み、好ましくは、前記ヒト由来キメラ抗原受容体はＣＡＲ１９である。
【０１８８】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、ステップ（４）は、ヒト末梢血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率
を同定することをさらに含む。
【０１８９】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、好ましくは、ヒト末梢血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、Ｐ
ＣＲ−酵素消化及び／又はウエスタンブロット法により同定される。
【０１９０】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、ヒト末梢血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、配列番号７及び
配列番号８に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物に対して熱変性
、アニーリング及び復元を行い、次にＴ７エンドヌクレアーゼ処理を行い、アガロースゲ
ル電気泳動により切断効率を同定するような手順で同定される。
【０１９１】
本発明の末梢血単核細胞におけるＴｈ１サイトカイン分泌レベルを増加させる方法におい
て、ヒト末梢血単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、ヒト末梢血単核
細胞中の総タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、膜に移し、抗ＨＰＫ１抗体を
一次抗体としてウエスタンブロットを行うような手順で同定される。
【０１９２】
第２実施形態では、本発明はまた、ｈｐｋ１タンパク質の機能が不活性化されるか又はそ
の活性が低下するように、ＨＰＫ１遺伝子を遺伝的に修飾するための試薬（ｒｅａｇｅｎ
ｔ）を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝的修飾には、遺伝子ノックアウト、部分
的遺伝子欠失、遺伝子置換、及び挿入が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝的修飾
は、ＨＰＫ１遺伝子の第２のエクソンを遺伝的に修飾することを含む。いくつかの実施形
態では、遺伝的修飾は、遺伝子編集技術を使用してＨＰＫ１遺伝子を修飾することを含む
。好ましくは、遺伝子編集技術には、胚性幹細胞に基づくＤＮＡ相同組換え技術、ＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ９技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術、転写活性化因子様エフェク
ターヌクレアーゼ技術、ホーミングエンドヌクレアーゼ又は他の分子生物学的技術が含ま
れ、より好ましくは、遺伝的修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集技術を
使用して実行される。いくつかの実施形態では、前記試薬は、ＨＰＫ１遺伝子を標的とし
てＨＰＫ１遺伝子をノックアウトするｇＲＮＡであり、好ましくは、ｇＲＮＡはＨＰＫ１
遺伝子の第２エクソンを標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１
に記載の配列と対合（例えば、相補的）可能である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ
を調製する方法は、（１）ｇＲＮＡ担持プラスミドを構築することと、（２）ｇＲＮＡを
インビトロで転写することと、を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（１）は、ｇ
ＲＮＡコード鎖及び相補鎖を合成し、コード鎖及び相補鎖をアニーリングすることによっ
て形成された二本鎖ＤＮＡをｐＵＣ５７ベクターに挿入し、Ｔ７プロモーターの制御下で
ｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを構築することを含む。いくつかの実施形態では、ス
テップ（２）は、酵素消化及び配列決定により同定されたｇＲＮＡ担持プラスミドｐＵＣ
５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを精製し、Ｔ７  ＲＮＡ  インビトロ転写キットを使用して
ＨＰＫ１  ｇＲＮＡ／ＨＰＫ１  ｇＲＮＡをインビトロで転写し、転写産物を精製してｇ
ＲＮＡを得ることを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ鋳型配列は
、配列番号３及び配列番号４に記載されている通りである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、前記薬剤（ａｇｅｎｔ）はさらにＣａｓ９タンパク質を含む。
好ましくは、Ｃａｓ９は組換え発現される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タン
パク質は、（１）ヒトＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列によりコドン最適化をした後、
完全長ヒトＣａｓ９  ｃＤＮＡを調製することと、（２）ステップ（１）の完全長ヒトＣ
ａｓ９  ｃＤＮＡの５´及び３´末端に核局在化シグナルを追加して、組換え発現プラス
ミドを構築することと、（３）組換え発現プラスミドを宿主細胞に導入して、組換えＣａ
ｓ９タンパク質を発現させることと、（４）組換え発現されたＣａｓ９タンパク質を精製
及び濃縮することと、（５）精製タグを切り取り、約１６０  ｋＤのＣａｓ９タンパク質
を回収することと、を含む方法により産生される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、前記試薬はキメラ抗原受容体をさらに含む。
【０１９５】
第３実施形態では、本発明は、遺伝的修飾における上記試薬のいずれか１つの使用をさら
に提供する。いくつかの実施形態では、前記用途は、単核細胞のＨＰＫ１遺伝子をノック
アウトするか、単核細胞の殺傷活性を高めるか、単核細胞のＴｈ１サイトカインレベルを
高めることである。
【０１９６】
第４実施形態では、本発明は、本明細書の方法のいずれか１つにより調製された単核細胞
を提供する。いくつかの実施形態では、前記単核細胞はヒト末梢血単核細胞であり、好ま
しくは、前記ヒト末梢血単核細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞であり、より好ま
しくは、ＣＤ３＋Ｔ細胞であり、さらに好ましくは、外因性ヒトキメラ抗原受容体を発現
するＣＤ３＋Ｔ細胞であり、最も好ましくは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、インテグリンαＶβ
６、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、メソセリンなどに特異
的な単鎖抗体でキメラ化されたＣＤ３＋Ｔ細胞である。
【０１９７】
非修飾末梢血単核細胞と比較して、ＨＰＫ１遺伝子が欠失した本発明の末梢血単核細胞は
、より強力な殺傷能力、及びより高いＴｈ１サイトカイン分泌レベルを有する。腫瘍に対
する特異性もあることが好ましい。
【０１９８】
第５実施形態では、本発明は、単核細胞のＨＰＫ１遺伝子を修飾するための、又は単核細
胞の殺傷活性を増加させるための医薬組成物の調製における、上記試薬又は上記単核細胞
のいずれか１つの使用をさらに提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は腫瘍の
治療用である。好ましくは、前記腫瘍はリンパ腫又は固形腫瘍である。
【０１９９】
第６実施形態では、本発明は、上記の試薬のいずれか１つ又は上記の単核細胞のいずれか
１つを含む医薬組成物をさらに提供する。
【０２００】
本発明の技術的解決策は、少なくとも以下の利点を有する。（１）操作が容易であり、ノ
ックアウト効率が高い。本発明において、複数の実験を通じてＴ細胞ゲノムＨＰＫ１の第
２エクソンに位置する標的配列を得て、ＨＰＫ１をより効率的に標的とすることができる
ｇＲＮＡを設計する。他のノックアウト方法と比較して、本発明の方法は、操作が容易で
あり、インビトロ培養Ｔ細胞の修飾に適している。他の標的配列と比較して、本発明の標
的配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術に特に適しており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓ９技術によりＴ細胞のＨＰＫ１を効率的にノックアウトすることができる。（２）Ｔ
細胞活性化の程度は高く、腫瘍殺傷効果は良い。本発明の修飾されたＴ細胞は、より速く
増殖するだけでなく、細胞ごとにより強い腫瘍殺傷活性も有する。腫瘍殺傷活性の実験結
果は、本発明の修飾されたＴ細胞の腫瘍殺傷活性が、ＰＤ１修飾されたＴ細胞よりも高い
か、さらには有意に高いことを示している。（３）他のＴ細胞修飾技術と組み合わせて、
相乗的な腫瘍殺傷活性を達成できる。本発明では、ＨＰＫ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９ノックアウトのＴ細胞修飾技術をＣＡＲ−Ｔ技術と組み合わせて相乗効果をもたらす
。インビトロ殺傷実験分析によれば、本発明は、単一のＣＡＲ−Ｔの技術的効果よりも優
れているだけでなく、ＰＤ−１ノックアウトと組み合わせたＣＡＲ−Ｔの技術的効果より
も優れている。（４）Ｔ細胞の枯渇を抑制することができる。本発明において、Ｔ細胞の
ＨＰＫ１遺伝子はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりノックアウトされ、フローサイトメトリ
ー分析は、ＨＰＫ１のノックダウンがＰＤ１及びＴＩＭ３発現レベルのダウンレギュレー
ションをもたらし得ることを示す。したがって、ＨＰＫ１ノックアウトは、Ｔ細胞の枯渇
を阻害することにより、Ｔ細胞が標的細胞を殺傷し、サイトカインを分泌する能力を高め
る可能性があることがわかった。
代替の例示的な実施形態１〜３４
【０２０１】
以下は、本開示のいくつかのさらなる例示的な実施形態を示す。
【０２０２】
１、ＨＰＫ１遺伝子の遺伝的修飾方法であって、ｈｐｋ１タンパク質の機能が不活性化
されるか又はその活性が低下するようにＨＰＫ１遺伝子を遺伝的に修飾する、ことを特徴
とする方法。
２．前記遺伝的修飾は、遺伝子ノックアウト、部分的遺伝子欠失、遺伝子置換、及び挿入
を含むことを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
３．前記遺伝的修飾は、ＨＰＫ１遺伝子の第２エクソンを遺伝的に修飾することを含む、
ことを特徴とする実施形態１〜２のいずれか１つに記載の方法。
４．前記遺伝的修飾は、遺伝子編集技術を使用してＨＰＫ１遺伝子を修飾することを含む
ことを特徴とする、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５、前記遺伝子編集技術は、胚性幹細胞に基づくＤＮＡ相同組換え技術、ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術、転写活性化因子様エフェクターヌク
レアーゼ技術、ホーミングエンドヌクレアーゼ又は他の分子生物学的技術を含み、好まし
くは、遺伝的修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集技術を使用して実行さ
れる、ことを特徴とする実施形態４に記載の方法。
６、ＨＰＫ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡでＨＰＫ１遺伝子をノックアウトすることを含
む、ことを特徴とする実施形態５に記載の方法。
７、前記ｇＲＮＡはＨＰＫ１遺伝子の第２エクソンを標的とする、ことを特徴とする実施
形態６に記載の方法。
８、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質はともにＨＰＫ１遺伝子をノックアウトする、こと
を特徴とする実施形態６〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．ｇＲＮＡを調製する方法は、
（１）ｇＲＮＡ担持プラスミドを構築することと、
（２）ｇＲＮＡをインビトロで転写することと、を含み、
ステップ（１）は、ｇＲＮＡコード鎖及び相補鎖を合成し、コード鎖及び相補鎖をアニー
リングすることによって形成された二本鎖ＤＮＡをｐＵＣ５７ベクターに挿入し、Ｔ７プ
ロモーターの制御下でｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを構築することを含み、
ステップ（２）は、酵素消化及び配列決定により同定されたｇＲＮＡ担持プラスミドｐＵ
Ｃ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを精製し、Ｔ７  ＲＮＡ  インビトロ転写キットを使用し
てＨＰＫ１  ｇＲＮＡ／ＨＰＫ１  ｇＲＮＡをインビトロで転写し、転写産物を精製して
ｇＲＮＡを得ることを含む、ことを特徴とする実施形態６〜８のいずれか１つに記載の方
法。
１０．前記ｇＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ鋳型配列は配列番号３及び配列番号４に記載されてい
る通りである、ことを特徴とする実施形態９に記載の方法。
１１．前記遺伝的修飾は単核細胞のＨＰＫ１遺伝子を遺伝的に修飾することを含み、好ま
しくは、前記単核細胞はヒト末梢血単核細胞であり、より好ましくは、前記ヒト末梢血単
核細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞であり、より好ましくは、前記ヒト末梢血単核
細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞であり、最も好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞はさらに外因性
キメラ抗原受容体を発現する、ことを特徴とする実施形態１〜１０のいずれか１つに記載
の方法。
１２、（１）ＨＰＫ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡを調製することと、
（２）Ｃａｓ９タンパク質を調製することと、
（３）インビトロで単核細胞を培養及び増殖することと、
（４）ステップ（１）のｇＲＮＡ及びステップ（２）のＣａｓ９タンパク質をステップ（
３）の単核細胞に同時トランスフェクトすることと、を含む、ことを特徴とする実施形態
１１に記載の方法。
１３．ステップ（４）の同時トランスフェクション後、単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子
のノックアウト効率を同定することをさらに含み、好ましくは、ヒト末梢血単核細胞にお
けるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率はＰＣＲ−酵素消化及び／又はウエスタンブロッ
ト法により同定される、ことを特徴とする実施形態１２に記載の方法。
１４．単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、配列番号７及び配列番号
８に示されるプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ産物に対して熱変性、ア
ニーリング、復元を行い、次にＴ７エンドヌクレアーゼ処理を行い、アガロースゲル電気
泳動で切断効率を同定するような手順で同定することができ、あるいは、単核細胞におけ
るＨＰＫ１遺伝子のノックアウト効率は、単核細胞中の総タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにかけ、膜に移し、抗ＨＰＫ１抗体を一次抗体としてウエスタンブロットを行う
ような手順で同定することができる、ことを特徴とする実施形態１３に記載の方法。
１５、ステップ（４）で得られたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質で同時トランスフェク
トされた単核細胞においてヒト由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるステップ（
５）をさらに含む、ことを特徴とする実施形態１２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６、前記ヒト由来キメラ抗原受容体はＣＡＲ１９である、ことを特徴とする実施形態１
５に記載の方法。
１７、ＨＰＫ１遺伝子の機能が不活性化されるか又はその活性が低下するようにＨＰＫ１
遺伝子を遺伝的に修飾する、ことを特徴とするＨＰＫ１遺伝子を遺伝的に修飾するための
試薬。
１８、前記遺伝的修飾には、遺伝子ノックアウト、部分的遺伝子欠失、遺伝子置換、及び
挿入が含まれる、ことを特徴とする実施形態１７に記載の試薬。
１９．前記遺伝的修飾はＨＰＫ１遺伝子の第２エクソンを遺伝的に修飾することを含む、
ことを特徴とする実施形態１７〜１８のいずれか１つに記載の試薬。
２０．前記遺伝的修飾は、遺伝子編集技術を使用してＨＰＫ１遺伝子を修飾することを含
み、好ましくは、遺伝子編集技術には、胚性幹細胞に基づくＤＮＡ相同組換え技術、ＣＲ
ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術、転写活性化因子様エフェ
クターヌクレアーゼ技術、ホーミングエンドヌクレアーゼ又は他の分子生物学的技術が含
まれ、より好ましくは、遺伝的修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集技術
を使用して実行される、ことを特徴とする実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の試
薬。
２１．前記試薬は、ＨＰＫ１遺伝子を標的としてＨＰＫ１遺伝子をノックアウトするｇＲ
ＮＡであり、好ましくは、ｇＲＮＡはＨＰＫ１遺伝子の第２エクソンを標的とする、こと
を特徴とする実施形態２０に記載の試薬。
２２、前記ｇＲＮＡは、配列番号１に記載の配列と対合することができる、ことを特徴と
する実施形態２１に記載の試薬。
２３、ｇＲＮＡを調製する方法は、
（１）ｇＲＮＡ担持プラスミドを構築することと、
（２）ｇＲＮＡをインビトロで転写することと、を含み、
ステップ（１）は、ｇＲＮＡコード鎖及び相補鎖を合成し、コード鎖及び相補鎖をアニー
リングすることによって形成された二本鎖ＤＮＡをｐＵＣ５７ベクターに挿入し、Ｔ７プ
ロモーターの制御下でｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを構築することを含み、
ステップ（２）は、酵素消化及び配列決定により同定されたｇＲＮＡ担持プラスミドｐＵ
Ｃ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡを精製し、Ｔ７  ＲＮＡ  インビトロ転写キットを使用し
てＨＰＫ１  ｇＲＮＡ／ＨＰＫ１  ｇＲＮＡをインビトロで転写し、転写産物を精製して
ｇＲＮＡを得ることを含む、ことを特徴とする実施形態２１〜２２のいずれか１つに記載
の試薬。
２４、前記ｇＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ鋳型配列は、配列番号３及び配列番号４に記載されて
いる、ことを特徴とする実施形態２３のいずれか１つに記載の試薬。
２５．前記薬剤はＣａｓ９タンパク質をさらに含み、好ましくは、Ｃａｓ９は組換えによ
り発現される、ことを特徴とする実施形態２１〜２４のいずれか１つに記載の試薬。
２６、前記Ｃａｓ９タンパク質は、
（１）ヒトＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列によりコドン最適化をした後、完全長ヒト
Ｃａｓ９  ｃＤＮＡを調製することと、
（２）ステップ（１）の完全長ヒトＣａｓ９  ｃＤＮＡの５´及び３´末端に核局在化シ
グナルを追加して、組換え発現プラスミドを構築することと、
（３）組換え発現プラスミドを宿主細胞に導入して、組換えＣａｓ９タンパク質を発現さ
せることと、
（４）組換え発現されたＣａｓ９タンパク質を精製及び濃縮することと、
（５）精製タグを切り取り、約１６０  ｋＤのＣａｓ９タンパク質を回収することと、を
含む以下の方法により産生される、ことを特徴とする実施形態２５に記載の試薬。
２７、前記試薬はキメラ抗原受容体をさらに含む、ことを特徴とする実施形態２１〜２６
のいずれか１つに記載の試薬。
２８、遺伝的修飾における実施形態１７〜２７のいずれか１つに記載の試薬の使用。
２９、単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子のノックアウト、単核細胞の殺傷活性の増加、又
は単核細胞におけるＴｈ１サイトカインレベルの増加である、ことを特徴とする実施形態
２８に記載の使用。
３０、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法により調製される、ことを特徴とする単核
細胞。
３１、前記単核細胞はヒト末梢血単核細胞であり、好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞
はＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞であり、より好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞
はＣＤ３＋Ｔ細胞であり、さらに好ましくは、前記ヒト末梢血単核細胞は外因性ヒトキメ
ラ抗原受容体を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、インテ
グリンαＶβ６、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、メソセリ
ンなどに特異的な単鎖抗体でキメラ化されたＣＤ３＋Ｔ細胞である、ことを特徴とする実
施形態３０に記載の単核細胞。
３２、医薬組成物の調製における、実施形態１７〜２７のいずれか１つに記載の試薬又は
実施形態３０〜３１のいずれか１つに記載の単核細胞の使用であって、前記医薬組成物は
、単核細胞におけるＨＰＫ１遺伝子を修飾するか、単核細胞の殺傷活性を高めるか、単核
細胞のＴｈ１サイトカインレベルを高めるためのものである、ことを特徴とする医薬組成
物。
３３、前記医薬組成物は腫瘍の治療用であり、好ましくは、前記腫瘍はリンパ腫又は固形
腫瘍である、ことを特徴とする実施形態３２に記載の使用。
３４．実施形態１７〜２７のいずれか１つに記載の試薬又は実施形態３０〜３１のいずれ
か１つに記載の単核細胞を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
実施例
【０２０３】
以下、添付の図面を参照して本開示の例示的な実施形態をより詳細に説明する。本開示の
例示的な実施形態が図面に示されているが、本開示は様々な形態で実施されてもよく、本
明細書に記載の実施形態によって限定されるべきではないことを理解されたい。むしろ、
これらの実施形態は、本開示がより完全に理解され、本開示の範囲が当業者に完全に伝え
られるために提供される。
実施例
一般的な方法及び材料
【０２０４】
本明細書の実施例に使用される試薬は、一般に市販されているか、又は当技術分野の標準
技術により調製することができる。例えば、実施例に使用されるさまざまな抗体は、次の
ように市販されている。
2020536514.tif 000004
2020536514.tif 000005
【０２０５】
細胞株：Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｋ５６２、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６及びＪｕｒｋａ
ｔ細胞株をＲＰＭＩ  １６４０で培養し、２９３Ｔを１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／
ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃
で培養した。ヒトＰＢＭＣを、Ｘ−ＶＩＶＯ１５中、５％ＣＯ２インキュベーターにおい
て３７℃で培養した。
【０２０６】
レンチウイルスベクターの産生及び形質導入：ＣＤ１９  ＣＡＲ、Ｈｅｒ２  ＣＡＲ、及
びＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルス上清を、レンチ−２９３Ｔ細胞株の一過
性トランスフェクションにより産生した。簡単に言えば、リポフェクタミン２０００（ラ
イフテクノロジーズ社）を介して、ＣＡＲ及びレンチウイルスエンベロープタンパク質を
コードするプラスミドをレンチ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェク
ションの４８時間後と７２時間後に上清を回収した。
【０２０７】
Ｔ細胞の単離及び修飾：ヒトＴ細胞を前述のように活性化及び形質導入した。簡単に言え
ば、健康なドナー末梢血又は白血球パック（西京病院）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
を単離した。すべての実験は、関連するすべての倫理規制に準拠し、ＩＲＢ  ０９５０９
１に従って行われた。形質導入前にＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌ  ＣＤ３抗体、３μｇ／ｍｌ
ＣＤ２８抗体、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２で２日活性化した。マウスＴ細胞を脾臓か
ら機械的に単離し、ＩＬ−２及び５μｇ／ｍｌ  ＣＤ３抗体、３μｇ／ｍｌ  ＣＤ２８抗
体を使用して活性化した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングされたプレート上で３
日間連続して活性化されたＰＢＭＣとレトロウイルス上清を遠心分離することで形質導入
を達成した（タカラバイオ社）。
【０２０８】
ｍＲＮＡ  インビトロ転写及びＣａｓ９タンパク質精製：Ｔ７  ｍｓｃｒｉｐｔシステム
キット（アンビオン社）を使用して、インビトロ転写ＲＮＡを生成した。Ｃａｓ９タンパ
ク質精製：Ｃａｓ９遺伝子を、既知の手順に従ってｐＧＥＸ４Ｔ−１プラスミド（インビ
トロジェン社）にクローニングした。ｐＧＥＸ４Ｔ−１−Ｃａｓ９プラスミドを、ワンス
テップクローニングキット（ｖａｚｙｍｅ社）を使用して構築した。タンパク質は、大腸
菌ＢＬ２１Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）で発現された。Ａ６００が０．６になるまで、５
０μｇ／  ｍｌカナマイシンと３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＴｅｒｒｉｆ
ｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地において３７℃で培養物（２Ｌ）を成長させた。培養物に０．２  
ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−ｄ−ガラクトピラノシドを添加し、絶えず振盪しなが
ら１６℃で１６時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収し、沈殿物を−８０
℃で保存した。その後のすべてのステップは４℃で実行された。ＥＤＴＡをまったく含ま
ないプロテアーゼ阻害剤錠剤（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ社）を添加した３０  ｍｌの
緩衝液Ａ（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、３００  ｍＭ  ＮａＣｌ、２
００  ｍＭ  Ｌｉ２ＳＯ４、１０  ｍＭイミダゾール）に解凍した細菌を再懸濁した。Ｔ
ｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を最終濃度０．１％まで添加した。３０分後、溶解物を超音波処
理して粘度を下げた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−３０５０ローターにて１７,０００ｒｐｍ
で１時間遠心分離することにより、不溶分を除去した。可溶性抽出物をバッチで結合して
、緩衝液Ａで事前に平衡化したＮｉ２＋−ニトリロ三酢酸−アガロース樹脂（キアゲン社
）５ｍｌと１時間混合した。樹脂を遠心分離で回収し、緩衝液Ａで十分に洗浄した。結合
タンパク質を、濃度が漸増するイミダゾールを含むＩＭＡＣ緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、２５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール）のアリコー
トで段階的に溶出した。Ｈｉｓ６−ＭＢＰタグ付きＣａｓ９ポリペプチドを含む２００ｍ
Ｍイミダゾール溶出液を合併した。２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５
０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを一晩透析する過程において、ＴＥＶプロテア
ーゼで切断することによりＨｉｓ６−ＭＢＰアフィニティタグを除去した。５  ｍｌ  Ｓ
Ｐ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  ライフサイエンス社）を使用して
、タグ無しＣａｓ９タンパク質を融合タグから分離した。２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ
ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１  ｍＭ  ＴＣＥＰ、及び５％グリセロールに
おいて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬを使用して、サイズ排除クロマ
トグラフィーにより、タンパク質をさらに精製した。サイズ排除からの溶出ピークを等分
して凍結し、−８０℃に保持した。
【０２０９】
遺伝子ターゲティング：Ｔ細胞の活性化を開始してから４８時間後、ＢＴＸ  ＥＭ８３０
（ハーバードアパレイタス社  ＢＴＸ）を使用してＣａｓ９タンパク質とｇＲＮＡをエレ
クトロトランスファーすることによりＴ細胞をトランスフェクトした。１×１０６個の細
胞を３μｇのＣａｓ９及び２μｇのｇＲＮＡと混合して０．２ｃｍキュベットに入れた。
エレクトロポレーション後、細胞を培地に希釈し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベート
した。ＣＡＲ−レンチウイルスを、エレクトロポレーションの２〜４時間後に、示された
感染多重度（１×１０５〜１×１０６の範囲）で培養物に加えた。その後、編集した細胞
を、標準条件（３７℃で培養し、Ｔ細胞増殖培地で増殖し、必要に応じて補充して２〜３
日ごとに約１ｘ１０６細胞／１ｍｌの密度を維持する）で培養する。
【０２１０】
インビボマウス研究：ＮＯＤ−ＳＣＩＤｇ／（ＮＳＧ）マウスは、中国のＣｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる。すべてのマウスは、清華大学
の実験動物研究センターと動物管理委員会のガイドラインに従って飼育された。すべての
動物は、病原体のない状態で維持され、実験動物管理ポリシー及び認証を評価及び認定す
るための国際協会に従って管理された。
【０２１１】
インビボ生物発光イメージング：ＰＢＳ（１５  ｍｇ／ｍｌ）に懸濁したＤ−ルシフェリ
ン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、収集する５分前にｉ
．ｐ．注射（１５０  ｍｇ／ｋｇ）した。生物発光画像をＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ス
ペクトラムイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で
収集した。リビングイメージソフトウェアバージョン３．０（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用し
て、生物発光イメージングデータセットを取得して定量化した。
【０２１２】
フローサイトメトリー：マウスから単離した腫瘍をハサミで細かく刻み、腫瘍解離キット
で消化し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ルテニーバイオテク社）を使用して粉砕して、単一細
胞懸濁液を生成した。脾臓を７０μｍフィルターで粉砕してその中の細胞を単離した。細
胞を洗浄した後、暗所で抗体を用いて１５分間染色し、フローサイトメトリーにより検出
した。細胞内染色の場合、固定及び透過処理キット（ＢＤ  バイオウサイエンス社）を使
用して細胞をさらに透過処理し、抗体で染色した。すべてのサンプルをＬＳＲ  Ｆｏｒｔ
ｅｓｓａ又はＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析し、データ
をＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。ＣＤ１９ＣＡＲを、ＴＨＥＴＭ  ＮＷＳＨＰＱ
ＦＥＫ  タグ抗体、ＦＩＴＣ及びヒトＣＤ３抗体で検出した。Ｈｅｒ２及びＢＣＭＡ  Ｃ
ＡＲは、ビオチン化プロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）及
びヒトＣＤ３抗体で検出された。ＣＡＲ  Ｔ細胞表現型データを示すすべてのＦＡＣＳプ
ロットは、ゲート制御ＣＡＲ＋細胞で実施された。模擬形質導入されたＴ細胞については
、全Ｔ細胞集団を分析に使用した。
【０２１３】
ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性アッセイ：標的に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の殺滅能力を、ａ
１２−ｈ  ＣｙｔｏＴｏｘ９６R非放射性細胞毒性アッセイでテストした。形質導入され
たＴ細胞とＵＴＤ  Ｔ細胞を解凍し、Ｔ細胞培地の６ウェルプレートに３７℃で２４時間
置いた。エフェクターとターゲットを、所定のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で
混合し、Ｔ細胞培地中のウェルあたりの総体積２００μｌで３×１０４個の標的細胞を含
む黒壁９６ウェル平底プレートで培養した。１２時間後、すべてのテストウェルと対照ウ
ェルから５０μｌのアリコートを新しい９６ウェルの平底透明プレートに移し、Ｃｙｔｏ
Ｔｏｘ９６RＲｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）５０μｌを各サンプルのアリコートに加えた
。プレートをホイル又は不透明な箱で覆い、光から保護し、室温で３０分間インキュベー
トした。９６ウェルプレートの各ウェルに停止液５０μｌを加え、最後にシリンジニード
ルを使用して大きな泡を取り除き、停止液を加えてから１時間以内に４９０ｎｍ又は４９
２ｎｍの吸光度を記録した。次の式の補正値を使用して、細胞毒性の割合を計算した。細
胞毒性の割合＝１００×実験的ＬＤＨ放出（ＯＤ４９０）／最大ＬＤＨ放出（ＯＤ４９０
）。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡアッセイ：標的細胞を洗浄し、ｘ−ｖｉｖｏ１５培地に１×１０６細胞／ｍＬ
の濃度で懸濁した。注目すべきことに、各標的細胞型１００ｍＬを９６ウェル丸底プレー
ト（コーニング社）に３回ずつ加えた。エフェクターＴ細胞を洗浄し、ｘ−ｖｉｖｏ１５
培地に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、次に１００ｍＬのＴ細胞を所定のウェルの標的
細胞と組み合わせた。プレートを３７℃で６〜１２時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイ（ベイバイオサイエンス社）にかけた。
【０２１５】
マウスをすべて安楽死させ、全血を採取し、室温で１時間凝固させた。５,０００ｒｐｍ
で遠心分離することにより血清を回収し、凍結保存（−８０℃）した。インターロイキン
２（ＩＬ−２）、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０のＬｕｍｉｎｅｘ
アッセイを、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイキットの製品の取扱書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）
に従って実施した。
【０２１６】
ウェスタンブロット：１５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％デ
オキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］）にて、１×プ
ロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤混合物（ＣＳＴ）及び０．５ｍＭバナジン酸ナトリウ
ム（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いて５×１０６個の洗浄済み細胞を溶解
し、ＣＡＲ  Ｔ細胞の全細胞分解液を生成し、次に氷上で３０分間インキュベートした。
サンプルを４℃で５分間超音波処理して、ＤＮＡを切断した。次に、抗ＨＰＫ１抗体又は
抗ＰＤ−１抗体の一次抗体を使用して、遠心分離されたサンプルの上清に対してウエスタ
ンブロットを実施した。
実施例１．ｇＲＮＡの設計及び合成
【０２１７】
１．ガイドＲＮＡの設計
【０２１８】
ｇＲＮＡを担持したプラスミドをｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ｇＲＮＡとして、ＨＰＫ１を
標的とするｇＲＮＡを設計し、ＰＤ１を標的とするｇＲＮＡを対照として使用した。ゲノ
ムと対合するＨＰＫ１を特異的に標的とするｇＲＮＡの配列はＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡ
ＣＴＧＡＡＧＡ（ＨＰＫ１の第２エクソンにあり、配列番号１）であり、そして、ゲノム
と対合するＰＤ１を特異的に標的とするｇＲＮＡの配列はＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣ
ＴＴＡＧＧＴである（ＰＤ１の第１エクソンにあり、配列番号：２）。
【０２１９】
ＨＰＫ１  ｇＲＮＡ：Ｆ：５´−ＴＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡ−３
´（配列番号３）
【０２２０】
Ｒ：５´−ＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣ−３´（配列番号４）
【０２２１】
ＰＤ１  ｇＲＮＡ：Ｆ：５´−ＴＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＧＴ−３
´（配列番号５）
【０２２２】
Ｒ：５´−ＡＡＡＣＡＣＣＴＡＡＧＡＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣ−３´（配列番号６）。
【０２２３】
ｇＲＮＡコード鎖及び相補鎖を合成し、ＨＰＫ１  ｇＲＮＡとＰＤ１  ｇＲＮＡの２つの
ＤＮＡ鎖をアニーリングすることによって２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成し、Ｔ７プロモーター
の制御下でｐＵＣ５７プラスミドベクターに挿入し、Ｔ７プロモーター、ｇＲＮＡ標的化
配列、及びキメラｇＲＮＡ足場を含むｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ＨＰＫ１ｇＲＮＡ及びｐ
ＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ＰＤ１ｇＲＮＡを構築した。
【０２２４】
２．ガイドＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡへのインビトロ転写
【０２２５】
シーケンシングにより正しいと検証されたプラスミドｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ＨＰＫ１
ｇＲＮＡ及びｐＵＣ５７ｋａｎ−Ｔ７−ＰＤ１ｇＲＮＡをＤｒａＩで消化してｇＲＮＡ転
写鋳型を取得し、精製キットを使用してｇＲＮＡ転写鋳型の精製を行った。Ｔ７ＲＮＡｋ
ｉｔ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ＿ｍＭＥＳＳＡＧＥ＿ｍＭＡ−ＣＨＩＮＥ＿Ｔ７）を使用
して精製産物に対してＨＰＫ１ｇＲＮＡ／ＨＰＫ１ｇＲＮＡのインビトロ転写を行い、Ｒ
ＮＡ精製キット（ＭＥＧＡｃｌｅａｒＴＭ  ｋｉ、Ａｍｂｉｏｎ）を使用して転写産物を
精製した。精製されたｇＲＮＡをアガロースゲル電気泳動で同定し、結果を図１に示した
。ｇＲＮＡの濃度及び純度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ウルトラマイクロ分光光度計で
検出し、ｇＲＮＡを分注して、−８０℃で保存して、使用に供した。
【０２２６】
追加のｇＲＮＡを設計、合成、精製した。これらのｇＲＮＡには、ＨＰＫ−１遺伝子の以
下の標的配列を標的とする配列がある。
2020536514.tif 000006
【０２２７】
いくつかの実施例では、これらのｇＲＮＡは、上記の配列番号１を標的とするｇＲＮＡの
置換として使用することができる。図２５は、実施例４の方法により検出された、これら
のｇＲＮＡのそれぞれを使用した代表的なＨＰＫ−１遺伝子編集効率を示す。図２５にお
いて、ＮＣは対照であり、３＃は配列番号１５を標的とするｇＲＮＡの結果を示し、４＃
は、配列番号１１を標的とするｇＲＮＡの結果を示し、５＃は、配列番号１２を標的とす
るｇＲＮＡの結果を示し、６＃は、配列番号１を標的とするｇＲＮＡの結果を示し、１＃
は、配列番号１３を標的とするｇＲＮＡの結果を示し、２＃は、配列番号１４を標的とす
るｇＲＮＡの結果を示している。
実施例２．Ｃａｓ９タンパク質の組換え発現及び精製
【０２２８】
文献報告された手順に従って、ヒト化Ｃａｓ９を調製した（配列は配列番号１８及び１９
に提供されている）。Chang, N. et al., Cell Research 23:465-472 (2013)の内容は、
全体として参照により本明細書に組み込まれており、、ヒト化、コドン最適化Ｃａｓ９  
ｃＤＮＡの配列及びそこに報告されているタンパク質配列を含む。簡単に言えば、ＰＧＥ
Ｘ４Ｔ−１をＣａｓ９を担持するためのプラスミドとして、ＰＣＲによってコドン最適化
された完全長ヒトｃａｓ９  ｃＤＮＡを得た。鋳型はプラスミドＰＵＣ１９−Ｔ７−ＣＡ
Ｓ９であった。核局在化シグナル（ＮＬＳ）をＣａｓ９配列の５´及び３´末端に追加し
て、ｃａｓ９タンパク質の核内移行を促進した。
【０２２９】
プラスミドの構築に成功した後、ＣＡＳ９タンパク質を大腸菌で発現させ、ＧＳＴカラム
で精製し、タンパク質を濃縮して収集し、トロンビンでＧＳＴタグを切除し、１６０  ｋ
ｄ付近で１本のタンパク質バンドを観察した（図２）。
実施例３．ヒト末梢血単核細胞のインビトロ増殖及びトランスフェクション
【０２３０】
ＦｉｃｏｌｌRメトリゾン酸ナトリウム溶液を使用して、遠心分離及び高速分離法により
ヒト末梢血単核細胞を抽出した。ＣＤ３陽性末梢血単核細胞をＣＤ３磁気ビーズで選別し
、Ｔ細胞をＣＤ３／２８抗体で活性化し、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を含むＬＯＮＺＡ−
Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地にて３７℃／５％  ＣＯ２の条件下で２日間培養した後、細胞の
ウイルストランスフェクションとエレクトロポレーションを実施した。
【０２３１】
ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ  ｍＲＮＡを一定の割合で混合し、室温で１０分間放置し
、一方、４．０ｘ１０６  ＣＤ３＋Ｔ細胞（インビトロでＣＤ３／ＣＤ２８抗体により４
８時間活性化）を１５ｍｌ遠心管に移した。細胞を５００×ｇで５分間遠心分離し、最適
化培地（ｃａｓ９とｇＲＮＡの混合物を含む）４００ｕｌに再懸濁した。細胞混合物を４
ｍｍのギャップを有するＢＴＸキュベットに移し、氷上に１０分間置いて、キュベットを
ＢＴＸ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｘ２エレクトロポレーターに入れて、電気的形質転換を行った。
電気的形質転換条件は５００Ｖ及び１ｍｓであった。エレクトロポレーションの終了直後
に、細胞懸濁液を、ＩＬ−２（１００  ＩＵ／ｍｌ）を含む培地（ＬＯＮＺＡ−Ｘ−ＶＩ
ＶＯ  １５）に加え、３７℃に予熱した。電気的形質転換の４時間後、ヒト由来ＣＤ１９
ＣＡＲを持っているウイルスを１０のＭＯＩ値で加え、ポリブレンを１０ｍｇ／ｍｌの
最終濃度で培地に加えた。ウイルスを添加してから２４時間後に培地を交換し、１日おき
に細胞継代を行った。
実施例４．酵素消化による遺伝子ノックアウト効率の同定（Ｔ７Ｅ１アッセイ）
【０２３２】
細胞の電気的形質転換３日間後、細胞を回収し、細胞ゲノムを抽出した。変異部位（ＣＲ
ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位）を有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。２対のプ
ライマー１＃及び２＃を設計し、そのうち、１＃プライマーを使用してＨＰＫ１ｇＲＮＡ
で形質転換した細胞ゲノムをＰＣＲ増幅し、２＃プライマーを使用してＰＤ１ｇＲＮＡで
形質転換した細胞ゲノムをＰＣＲ増幅した。２対のプライマー配列は次のとおりであった
。
１＃：Ｆ：５´−ａｇｃｇａｇａｇｔｇａｇｇａｇｇｇｇｇ−３´（配列番号７）
Ｒ：５´−ｔｔｃａｔｃａｃｃａｇａｇａｔａａｃｔｃｃｃ−３´（配列番号８）
２＃：Ｆ：５´−ｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｃｃｃａｇｔｃｃｔａｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃａｃ
ｃｃｃｔｃｃｔ−３´（配列番号９）
Ｒ：５´−ｇｇｔｃｃｃｔｃｃａｇａｃｃｃｃｔｃｇｃｔｃｃｇｇｇａｃｃｃｃｔｇｇｇ
ｃｔｇｃ−３´（配列番号１０）
【０２３３】
ＰＣＲ装置を使用して、増幅により得られたＰＣＲ産物に、熱変性、アニーリング及び復
元処理を行い、設定手順は次のとおりであった。
９５℃  ３ｍｉｎ、
８５℃  １．５ｍｉｎ（降温速度０．１℃／ｓ）、
７５℃  １．５ｍｉｎ（０．１℃／ｓ）、
６５℃  １．５ｍｉｎ（０．１℃／ｓ）
…
２５℃  １．５ｍｉｎ（０．１℃／ｓ）、
４℃。
【０２３４】
処理されたＰＣＲ産物混合物にＴ７エンドヌクレアーゼ１（ＮＥＢ）を添加し、３７℃で
１５分間放置し、次にアガロースゲル電気泳動（２％アガロースゲル）にかけて、消化効
率を測定した。結果を図３に示した。
実施例５．ウエスタンブロット法による遺伝子ノックアウト効率の同定
【０２３５】
細胞の電気的形質転換３日間後、細胞を収集し、細胞タンパク質を抽出し、ＨＰＫ１及び
β−アクチンの発現をウエスタンブロットにより検出した。結果を図４に示した。特定の
群を次の表に示した。
2020536514.tif 000007
【０２３６】
ヒト末梢血単核細胞のインビトロ増殖、電気的形質転換及びウイルストランスフェクショ
ンのステップは、実施例３に詳述された。
【０２３７】
図４は、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞におけるＨＰＫ１の発現レベルが、Ｔ細胞、
ＣＡＲ１９＋Ｔ細胞、及びＣＡＲ１９＋ＰＤ＋／−Ｔ細胞のそれと比較して、有意に減少
していることを示している。図２６は、ウエスタンブロット法によるノックアウト効率の
代表的な定量化を示している。
実施例６．フローサイトメトリーによるＣＡＲ１９のトランスフェクション効率及びＰＤ
１の発現の検出
【０２３８】
細胞にウイルスをトランスフェクトしてから７日後、各群から１×１０６個の細胞を採取
し、遮光下、４℃で抗体とインキュベートした後、Ｃａｒ及びＨＰＫ１の発現を検出した
。結果を図５に示した。特定の群分けを次の表に示した。
2020536514.tif 000008
【０２３９】
ヒト末梢血単核細胞のインビトロ増殖、電気的形質転換及びウイルストランスフェクショ
ンのステップは、実施例３に詳述された。
【０２４０】
図５は、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞及びＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞の表面
上のＰＤ１受容体の発現が、単純なＣＡＲ１９  Ｔ細胞の発現よりも有意に減少したこと
を示している。ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞とＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞の
表面でのＰＤ１受容体の発現レベルは類似しており、有意差がなかった。
実施例７．Ｔ細胞殺傷実験
【０２４１】
エフェクター細胞は、上記の電気的形質転換及びウイルストランスフェクションによりト
ランスフェクトされたＣＤ３＋ヒトＴ細胞であり、標的細胞はそれぞれＲａｊｉ、Ｄａｕ
ｄｉ、Ｋ５６２ヒト悪性リンパ腫細胞株であった。１００μｌの標的細胞を９６ウェルプ
レートに播種し、２４時間後にエフェクター細胞１００μｌ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）を
加え、各サンプルに対して３つの複製ウェルを作成した。５体積％の３７℃のＣＯ２イン
キュベーター内で細胞を１２時間インキュベートすることにより、上清を回収した。細胞
上清における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）含有量をｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ
９６R非放射性細胞殺傷試験キットを使用して測定した。マイクロオシレーターで５分
間振とうした後、４９０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーによって検出し、細胞殺
傷機能を次の式により算出した。
2020536514.tif 000009
特定の群分けを次の表に示した。
2020536514.tif 000010
【０２４２】
ヒト末梢血単核細胞のインビトロ増殖、電気的形質転換及びウイルストランスフェクショ
ンのステップは、実施例３に詳述された。
【０２４３】
３つのヒト悪性リンパ腫細胞株に対するＴ細胞の殺傷効果を図６に示した。図６では、Ｃ
ＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞がいずれのエフェクター：ターゲット比率（エフェクタ
ーとターゲットの比率が５：１のＫ５６２細胞株を除く）でも３つのヒト悪性リンパ腫細
胞株に対して最高の殺傷効果を有した。ＲａｊｉとＤａｕｄｉの両方の細胞株に対しては
、エフェクターとターゲットの比率が１：１と５：１の場合、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／
−Ｔ細胞の殺傷効果は他の群に比べて有意差があり、エフェクターとターゲットの比率が
１０：１の場合、ＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞の殺傷効果は他の群と比較して非常
に大きな有意差があった。
実施例８．Ｔ細胞による分泌サイトカインの検出
【０２４４】
ＣＡＲ１９＋ＣＤ３＋ヒトＴ細胞と３つの標的細胞（Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｋ５６２）
を２：１の比率で１２時間共培養した後、上清を収集し、上清におけるＩＦＮ−γ及びＩ
Ｌ−２の含有量のそれぞれをｅＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥのＥｌｉｓａ検出キットで検出した
。結果を図７に示した。
【０２４５】
図７では、Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉに対するＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞の殺傷効
果は、他の群のものよりも高くなった。Ｒａｊｉに対するＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ
細胞及びＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋／−Ｔ細胞の殺傷効果は、他の群のものとは非常に大きな
有意差があった。Ｄａｕｄｉに対するＣＡＲ１９＋ＨＰＫ１＋／−Ｔ細胞の殺傷効果は、
他の群のものとは非常に大きな有意差があり、Ｄａｕｄｉに対するＣＡＲ１９＋ＰＤ１＋
／−Ｔ細胞の殺傷効果は他の群のものとは有意差があった。
実施例９．ヒトリンパ腫のマウスモデルに対するＴ細胞の効果
【０２４６】
試験動物：雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス。すべてのマウスは、清華大学の実験動物研究セン
ターと動物管理委員会のガイドラインに従って飼育された。すべての動物は、病原体のな
い状態で維持され、実験動物管理ポリシー及び認証を評価及び認定するための国際協会に
従って管理された。
【０２４７】
試験方法：図１２は、インビボ動物試験の一般的なスケジュールを示している。簡単に言
えば、６〜１０週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤｇ／（ＮＳＧ）マウスの右脇腹に１×１０６個の
Ｒａｊｉ腫瘍細胞を０日目に皮下注射した。Ｒａｊｉ腫瘍接種後４日目に、尾静脈を介し
てマウスを１×１０６個のＴ細胞又はＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理し、両方の腫瘍の
体積を約１００ｍｍ３とした。腫瘍は７日ごとに測定された。連続した測定日に測定でき
る、目に見える又は触知可能な腫瘍のないマウスは、「完全退縮」とみなされた。動物が
苦痛の兆候を示した場合、又は総腫瘍サイズが２,５００ｍｍ３に達した場合、動物を安
楽死させた。
【０２４８】
雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス４０匹をランダムに６つの群に分け、各群に８匹のマウスとし
た。マウスの各群に皮下注射によりＲａｊｉ細胞を接種して、ヒトリンパ腫のマウスモデ
ルを構築した。Ｃｔｒｏｌ群は空白の対照群であり、投与した細胞の代わりに生理食塩水
２００μＬを使用された。Ｔ細胞治療群は陰性対照群であり、投与された細胞は１×１０
６個のＴ細胞であった。Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群に投与する細胞は、１×１０６個のＣＡ
Ｒ−Ｔ細胞であった。Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群に投与する細胞は、１×１０６
個のＨＰＫ１−／−ＣＡＲ−Ｔ細胞であった。Ｃａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群に投与す
る細胞は、１×１０６個のＰＤ１−／−ＣＡＲ−Ｔ細胞であった。マウスの各群は、単回
用量で投与された。
【０２４９】
（１）腫瘍体積の測定
【０２５０】
マウスの腫瘍体積を投与前に測定し、投与後、マウス腫瘍の長径と短径を週に２回測定し
、それにより腫瘍体積を計算して記録した。腫瘍体積は、マウスの腫瘍の増殖を反映でき
た。腫瘍の長径と短径をノギスで測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）＝腫瘍長径（ｍｍ）×腫
瘍短径２（ｍｍ２）×０．５。さまざまな用量群間の差異と、各用量群と陰性対照群の間
の差異を比較した。
【０２５１】
（２）インビボイメージング検出
【０２５２】
マウスをインビボイメージング検出にかけた。検出前にマウスの毛を剃り、ペントバルビ
タールナトリウム溶液（１５μｇ／ｇ体重）を腹腔内注射することで麻酔した。マウスの
各群に、１５ｇ／Ｌフルオレセイン溶液２００μｌを腹腔内注射し、５分後、インビボイ
メージング観察を実施した。
【０２５３】
（３）ＣＡＲ−Ｔ増殖アッセイ
【０２５４】
投与前にマウスの末梢血を採取し、マウスの末梢血中のＣＤ３陽性細胞の割合を測定し、
投与後、１０日ごとにマウスの末梢血を採取してマウスの末梢血のＣＤ３陽性細胞を測定
した。ＣＤ３陽性細胞の量は、マウスの末梢血中のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を反映している
。マウスの末梢血中のＣＤ３陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定した。
マウスの尾静脈を外科用ブレードで切り開いて血液を採取し、約１００μＬの末梢血を２
０μＬの０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ抗凝固剤溶液を含む１．５  ｍＬ  ＥＰチューブに採取し
た。完全に混合した後、１００μＬのＰＢＳを添加し、４００ｇで５分間遠心分離し、上
清を廃棄し、沈殿物を赤血球分解液１ｍＬに再懸濁し、４℃の冷蔵庫に１５分間置いて、
赤血球を完全に溶解した。４００ｇで５分間の遠心分離後、上清を廃棄し、沈殿物を２０
０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、完全に混合してから、フ
ローサイトメトリーで検出した。また、各用量群の間の差異及び各用量群と陰性対照群の
差異を比較した。
【０２５５】
（４）浸潤腫瘍組織のＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型の決定
【０２５６】
腫瘍組織に浸潤したｃａｒ−ｔ細胞上のＰＤ１／Ｔｉｍ３／Ｌａｇ３／ＣＤ１０７ａ／ア
ネキシンＶの発現を、腫瘍接種後２８日目に、フローサイトメトリーにより検出した。
【０２５７】
試験結果
【０２５８】
（１）腫瘍体積の測定
【０２５９】
図８は、マウスの各群の腫瘍体積を示している。図８に示すように、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治
療群、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群の腫瘍
体積はすべて、Ｔ細胞治療群と比較して減少しており、一方、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  Ｋ
Ｏ治療群のマウスの腫瘍体積は最小であった。
【０２６０】
（２）インビボイメージング検出
【０２６１】
図９は、マウスの各群のインビボイメージング結果を示している。図９から、Ｃａｒ−Ｔ
ＷＴ治療群、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群、及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療
群の治療効果はすべてＴ細胞の治療効果と比較して優れており、一方、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰ
Ｋ１  ＫＯ治療群のマウスの治療効果は最高であることがわかった。
【０２６２】
（３）ＣＡＲ−Ｔ増殖アッセイ
【０２６３】
図１０は、各群のマウスの投与後のマウスの末梢血中のＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の割合を示
している。図１０に示すように、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ
治療群、Ｃａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群では、末梢血ＣＡＲＴ細胞の割合はすべて、Ｔ
細胞治療群のそれよりも大きくなった。それは、Ｃａｒ−Ｔ細胞がマウスで増殖したこと
を示している。しかし、図１０に示すように、１０日目に、ＴＰＤ１  ＫＯ及びＣａｒ−
Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群のＣａｒ−Ｔ細胞の数は、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群のそれより
も有意に多かった。治療１０日後に比べて、治療の２０、３０、及び４０日後、Ｃａｒ−
Ｔ  ＷＴ治療群及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群のマウスの末梢血中のＣａｒ−Ｔ細
胞の数は、有意に減少した。Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群の細胞数はダウンレギュ
レートされているが、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群及びＣａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群の細
胞数よりもかなり多くなった。
【０２６４】
（４）ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型及び機能の検出
【０２６５】
図１１は、マウスの各群における投与２８日後のマウスの腫瘍におけるＣａｒ−Ｔ細胞の
表現型を示している。図１１に示すように、Ｔ細胞アポトーシス及び細胞殺傷実験では、
Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群と比較して、Ｃａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群は、少ないアポ
トーシス、強化された殺傷機能を示したが、Ｃａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群は、Ｃａｒ
−Ｔ  ＷＴ治療群と比較して有意差はなかった。Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群と比較して、Ｃ
ａｒ−Ｔ  ＨＰＫ１  ＫＯ治療群では、Ｔ細胞枯渇の表面マーカー分子ＰＤ１／Ｔｉｍ３
／Ｌａｇ３が有意にダウンレギュレートされているが、Ｃａｒ−Ｔ  ＷＴ治療群と比較し
て、Ｃａｒ−Ｔ  ＰＤ１  ＫＯ治療群では、ＰＤ１のみが有意に減少し、他の群の間に有
意差はなかった。
実施例１０．Ｈｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞におけるＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト
【０２６６】
また、Ｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、エクスビボ増殖研究中にも疲弊化を経験した。図１
３Ａ−１３Ｄを参照する。この実施例は、Ｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞に対するＨＰＫ−１
遺伝子ノックアウトの効果を示している。
【０２６７】
ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを有するＨｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製は、本明細書に
記載の「一般的方法及び材料」の部分に記載の手順に従った。このノックアウトに使用さ
れるｇＲＮＡは、ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメインを標的とする配列（配列番号１を含む
）を含む。実施例２に記載の手順に従ってＣａｓ９タンパク質を調製し単離した。ＰＤ−
１ノックアウトＨｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、実施例１に示した同じｇＲＮＡを使用して
調製し、対照として使用した。Ｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグ
ナル伝達モジュールを含むＨＥＲ２−ＣＡＲを発現した。細胞の増殖は、実施例３に記載
の手順と同様であった。
【０２６８】
実施例５の記載と同じ手順に従って、ウエスタンブロットによりＨＰＫ−１ノックアウト
効率を評価し、Ｈｅｒ２  Ｃａｒ発現をＦＡＣＳにより評価した。図１４Ａ−Ｃに示すよ
うに、ＨＰＫ−１ノックアウトはＴ細胞上のＨｅｒ２  ＣＡＲの形質導入と発現に影響を
与えなかった。図１４Ｂはまた、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９がＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞のＨＰ
Ｋ１遺伝子を効果的にノックアウトできることを示している。ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞
で観察されたものと同様に、ＨＰＫ１遺伝子をノックアウトすると、Ｔ細胞表面でのＰＤ
１の発現も大幅に減少し、ＰＤ−１ノックアウトＣＡＲ  Ｔ細胞と実質的に同じであった
。
実施例１１．ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞のインビボ効能
【０２６９】
本実施例では、ＨＰＫ−１ノックアウトＨｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ挙動を調べ
た。
【０２７０】
６〜１０週齢のＮＳＧマウスに５×１０６個のＳＫＯＶ−３腫瘍細胞を０日目にｉ．ｐ．
接種した。ＳＫＯＶ−３腫瘍接種後１０日目に、尾静脈を介してマウスを１×１０６個の
Ｔ細胞又はＨｅｒ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理し、両方の腫瘍の体積を約１００ｍｍ３にし
た。腫瘍は３〜４日ごとに測定された。連続した測定日に測定できる、目に見える腫瘍又
は触知可能な腫瘍のないマウスは、「完全退縮」とみなされた。動物が苦痛の兆候を示し
た場合、又は総腫瘍サイズが２,５００ｍｍ３に達した場合、動物を安楽死させた。
【０２７１】
結果を図１５−１８に示した。図１５に示すように、この腫瘍モデルでは、ＨＰＫ１ノッ
クアウトは、Ｈｅｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の効能を大幅に向上させた。ＨＰＫ１−Ｈｅｒ２
Ｃａｒ  Ｔ細胞で処理されたマウスは、２８日間内で腫瘍成長が最低であり、またマウ
スの生存期間が著しく延長した。他方、野生型Ｈｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞に比べて、ＰＤ
１−Ｈｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞の改善はそれほど顕著ではなかった。さらなる研究は、Ｈ
ＰＫ１ノックアウトがＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞の腫瘍（図１６を参照）及び脾臓（図１
７を参照）に浸潤する能力を高めることも示している。
［３００］ＣＤ１９  Ｃａｒ  Ｔ細胞で観察されたインビトロでの疲弊化マーカー研究と
同様に、ＨＰＫ１ノックアウトはインビボでＨｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞の疲弊化を改善す
ることも発見された。図１８を参照する。
実施例１２．ＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞におけるＨＰＫ−１遺伝子ノックアウト
【０２７２】
この実施例は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞でのＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを研究して
いる。
【０２７３】
ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトを有するＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製は、本明細書に
記載の「一般的方法及び材料」の部分に記載の手順に従った。このノックアウトに使用さ
れるｇＲＮＡは、ＨＰＫ−１遺伝子の標的ドメインを標的とする配列（配列番号１を含む
）を含む。実施例２に記載の手順に従ってＣａｓ９タンパク質を調製し単離した。ＰＤ−
１ノックアウトＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、実施例１に示したものと同じｇＲＮＡを使
用して調製し、対照として使用した。細胞の増殖は、実施例３で説明した手順と同様であ
った。
【０２７４】
実施例５の記載と同じ手順に従って、ウエスタンブロットによりＨＰＫ−１ノックアウト
効率を評価し、ＢＣＭＡ  Ｃａｒ発現をＦＡＣＳにより評価した。図１９Ａに示すように
、レンチウイルスを使用したＢＣＭＡ形質導入は成功した。図１９Ｂはまた、ｇＲＮＡ／
Ｃａｓ９がＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞のＨＰＫ１遺伝子をノックアウトするのに効果的で
あることを示している。ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察されたものと同様に、ＨＰＫ１
遺伝子をノックアウトすると、Ｔ細胞表面でのＰＤ１の発現も大幅に減少し、ＰＤ−１ノ
ックアウトＣＡＲ  Ｔ細胞と実質的に同じであった。図２０を参照する。
実施例１３．ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞のインビトロ効能
【０２７５】
該実施例では、ＨＰＫ−１ノックアウトＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ挙動を調
べた。
【０２７６】
この細胞毒性研究は、実施例７に記載の手順に従って行った。簡単に言えば、Ｔ細胞及び
ＣＡＲ−ＢＣＭＡ  Ｔ細胞をＵ２６６、ＲＰＭＩ８２２６、Ｋ５６２及びＫ５６２−ＢＣ
ＭＡと共培養し、１２時間の培養後、細胞毒性を測定した。結果を図２１に示した。図２
１に示すように、ＨＰＫ１ノックアウトは、さまざまな細胞株におけるＢＣＭＡ  ＣＡＲ
Ｔ細胞の細胞毒性を大幅に強化した。細胞毒性の改善は、ＰＤ−１ノックアウトよりも
大きいことも観察されている。図２２はまた、ＨＰＫ１編集ＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞が
インビトロで強化された増殖を示すことを示している。
実施例１４．ＨＰＫ−１遺伝子ノックアウトＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞のインビボ効能
【０２７７】
該実施例では、ＨＰＫ−１ノックアウトＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ挙動を調べ
た。
【０２７８】
６週齢のＮＳＧマウスに１０ｍｍ３の多発性骨髄腫の腫瘍組織を移植した。腫瘍が１００
ｍｍ３に達した後の３０日目に、尾静脈を介してマウスを２×１０６個のＴ細胞又はＢＣ
ＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理した。腫瘍は３〜４日ごとに測定された。連続した測定日に
測定できる、目に見える腫瘍又は触知可能な腫瘍のないマウスは、「完全退縮」とみなさ
れた。動物が苦痛の兆候を示した場合、又は総腫瘍サイズが２,５００ｍｍ３に達した場
合、動物を安楽死させた。
【０２７９】
結果を図２３に示した。図２３に示すように、この腫瘍モデルでは、ＨＰＫ１ノックアウ
トは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の効能を大幅に向上させた。ＨＰＫ１−ＢＣＭＡ  Ｃａ
ｒ  Ｔ細胞で処理されたマウスは、３３日間内で腫瘍成長が最低であった。図２３はまた
、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果の強化において、ＨＰＫ１ノックアウトがＰＤ
１ノックアウトよりも効果的であることを示している。
【０２８０】
Ｈｅｒ２  Ｃａｒ  Ｔ細胞で観察された疲弊化マーカーの研究と同様に、ＨＰＫ１ノック
アウトはインビボでＢＣＭＡ  Ｃａｒ  Ｔ細胞の疲弊化を改善することも発見された。図
２４を参照する。
【０２８１】
以上は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。当業者
が本発明により開示された技術的範囲内で容易に考えることができる修飾及び変更は、本
発明の範囲に含まれるものとする。したがって、本発明の保護範囲は、請求項の保護範囲
によって決定されるべきである。
配列表
SEQUENCE LISTING
<110>  Tsinghua University
<120>  A gRNA TARGETING HPK1 AND A METHOD FOR EDITING HPK1 GENE
<130>  1
<160>  19    
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  19
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  1
gacctggtgg cactgaaga                                                    19
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  2
ggccaggatg gttcttaggt                                                   20
<210>  3
<211>  23
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  3
tagggacctg gtggcactga aga                                               23
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  4
aaactcttca gtgccaccag gtc                                               23
<210>  5
<211>  24
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  5
taggggccag gatggttctt aggt                                              24
<210>  6
<211>  24
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  6
aaacacctaa gaaccatcct ggcc                                              24
<210>  7
<211>  19
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  7
agcgagagtg aggaggggg                                                    19
<210>  8
<211>  22
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  8
ttcatcacca gagataactc cc                                                22
<210>  9
<211>  39
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  9
ccaccctctc cccagtccta ccccctcctc acccctcct                              39
<210>  10
<211>  39
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  10
ggtccctcca gacccctcgc tccgggaccc ctgggctgc                              39
<210>  11
<211>  19
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  11
gctcgagaca aggtgtcag                                                    19
<210>  12
<211>  19
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  12
aaggtgtcag gggacctgg                                                    19
<210>  13
<211>  20
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  13
accactatga cctgctacag                                                   20
<210>  14
<211>  20
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  14
gacctgctac agcggctggg                                                   20
<210>  15
<211>  20
<212>  DNA/RNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  15
gctgggtggc ggcacgtatg                                                   20
<210>  16
<211>  2819
<212>  DNA/RNA
<213>  human
<400>  16
agcgagagtg aggagggggg aggccacagc ccgcggaggc aaggcgggtg cagggcttct       60
ggggacggag ggaggtgcca gaagttgagc cctgaggccc tgctggcccc tgggcgcagg      120
cccagctcag gcccccaggg atggacgtcg tggaccctga cattttcaat agagaccccc      180
gggaccacta tgacctgcta cagcggctgg gtggcggcac gtatggggaa gtctttaagg      240
ctcgagacaa ggtgtcaggg gacctggtgg cactgaagat ggtgaagatg gagcctgatg      300
atgatgtctc cacccttcag aaggaaatcc tcatattgaa aacttgccgg cacgccaaca      360
tcgtggccta ccatgggagt tatctctggt tgcagaaact ctggatctgc atggaattct      420
gtggggctgg ttctctccag gacatctacc aagtgacagg ctccctgtca gagctccaga      480
ttagctatgt ctgccgggaa gtgctccagg gactggccta tttgcactca cagaagaaga      540
tacacaggga catcaaggga gctaacatcc tcatcaatga tgctggggag gtcagattgg      600
ctgactttgg catctcggcc cagattgggg ctacactggc cagacgcctc tctttcattg      660
ggacacccta ctggatggct ccggaagtgg cagctgtggc cctgaaggga ggatacaatg      720
agctgtgtga catctggtcc ctgggcatca cggccatcga actggccgag ctacagccac      780
cgctctttga tgtgcaccct ctcagagttc tcttcctcat gaccaagagt ggctaccagc      840
ctccccgact gaaggaaaaa ggcaaatggt cggctgcctt ccacaacttc atcaaagtca      900
ctctgactaa gagtcccaag aaacgaccca gcgccaccaa gatgctcagt catcaactgg      960
tatcccagcc tgggctgaat cgaggcctga tcctggatct tcttgacaaa ctgaagaatc     1020
ccgggaaagg accctccatt ggggacattg aggatgagga gcccgagcta ccccctgcta     1080
tccctcggcg gatcagatcc acccaccgct ccagctctct ggggatccca gatgcagact     1140
gctgtcggcg gcacatggag ttcaggaagc tccgaggaat ggagaccaga cccccagcca     1200
acaccgctcg cctacagcct cctcgagacc tcaggagcag cagccccagg aagcaactgt     1260
cagagtcgtc tgacgatgac tatgacgacg tggacatccc cacccctgca gaggacacac     1320
ctcctccact tccccccaag cccaagttcc gttctccatc agacgagggt cctgggagca     1380
tgggggatga tgggcagctg agcccggggg tgctggtccg gtgtgccagt gggcccccac     1440
caaacagccc ccgtcctggg cctcccccat ccaccagcag cccccacctc accgcccatt     1500
cagaaccctc actctggaac ccaccctccc gggagcttga caagccccca cttctgcccc     1560
ccaagaagga aaagatgaag agaaagggat gtgcccttct cgtaaagttg ttcaatggct     1620
gccccctccg gatccacagc acggccgcct ggacacatcc ctccaccaag gaccagcacc     1680
tgctcctggg ggcagaggaa ggcatcttca tcctgaaccg gaatgaccag gaggccacgc     1740
tggaaatgct ctttcctagc cggactacgt gggtgtactc catcaacaac gttctcatgt     1800
ctctctcagg aaagaccccc cacctgtatt ctcatagcat ccttggcctg ctggaacgga     1860
aagagaccag agcaggaaac cccatcgctc acattagccc ccaccgccta ctggcaagga     1920
agaacatggt ttccaccaag atccaggaca ccaaaggctg ccgggcgtgc tgtgtggcgg     1980
agggtgcgag ctctgggggc ccgttcctgt gcggtgcatt ggagacgtcc gttgtcctgc     2040
ttcagtggta ccagcccatg aacaaattcc tgcttgtccg gcaggtgctg ttcccactgc     2100
cgacgcctct gtccgtgttc gcgctgctga ccgggccagg ctctgagctg cccgctgtgt     2160
gcatcggcgt gagccccggg cggccgggga agtcggtgct cttccacacg gtgcgctttg     2220
gcgcgctctc ttgctggctg ggcgagatga gcaccgagca caggggaccc gtgcaggtga     2280
cccaggtaga ggaagatatg gtgatggtgt tgatggatgg ctctgtgaag ctggtgaccc     2340
cggaggggtc cccagtccgg ggacttcgca cacctgagat ccccatgacc gaagcggtgg     2400
aggccgtggc tatggttgga ggtcagcttc aggccttctg gaagcatgga gtgcaggtgt     2460
gggctctagg ctcggatcag ctgctacagg agctgagaga ccctaccctc actttccgtc     2520
tgcttggctc ccccaggctg gagtgcagtg gcacgatctc gcctcactgc aacctcctcc     2580
tcccaggttc aagcaattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggatt acaggcctgt     2640
agtggtggag acacgcccag tggatgatcc tactgctccc agcaacctct acatccagga     2700
atgagtccct aggggggtgt caggaactag tccttgcacc ccctccccca tagacacact     2760
agtggtcatg gcatgtcctc atctcccaat aaacatgact ttagcctctg ctaaaaaaa      2819
<210>  17
<211>  2721
<212>  DNA/RNA
<213>  human
<400>  17
agcgagagtg aggagggggg aggccacagc ccgcggaggc aaggcgggtg cagggcttct       60
ggggacggag ggaggtgcca gaagttgagc cctgaggccc tgctggcccc tgggcgcagg      120
cccagctcag gcccccaggg atggacgtcg tggaccctga cattttcaat agagaccccc      180
gggaccacta tgacctgcta cagcggctgg gtggcggcac gtatggggaa gtctttaagg      240
ctcgagacaa ggtgtcaggg gacctggtgg cactgaagat ggtgaagatg gagcctgatg      300
atgatgtctc cacccttcag aaggaaatcc tcatattgaa aacttgccgg cacgccaaca      360
tcgtggccta ccatgggagt tatctctggt tgcagaaact ctggatctgc atggaattct      420
gtggggctgg ttctctccag gacatctacc aagtgacagg ctccctgtca gagctccaga      480
ttagctatgt ctgccgggaa gtgctccagg gactggccta tttgcactca cagaagaaga      540
tacacaggga catcaaggga gctaacatcc tcatcaatga tgctggggag gtcagattgg      600
ctgactttgg catctcggcc cagattgggg ctacactggc cagacgcctc tctttcattg      660
ggacacccta ctggatggct ccggaagtgg cagctgtggc cctgaaggga ggatacaatg      720
agctgtgtga catctggtcc ctgggcatca cggccatcga actggccgag ctacagccac      780
cgctctttga tgtgcaccct ctcagagttc tcttcctcat gaccaagagt ggctaccagc      840
ctccccgact gaaggaaaaa ggcaaatggt cggctgcctt ccacaacttc atcaaagtca      900
ctctgactaa gagtcccaag aaacgaccca gcgccaccaa gatgctcagt catcaactgg      960
tatcccagcc tgggctgaat cgaggcctga tcctggatct tcttgacaaa ctgaagaatc     1020
ccgggaaagg accctccatt ggggacattg aggatgagga gcccgagcta ccccctgcta     1080
tccctcggcg gatcagatcc acccaccgct ccagctctct ggggatccca gatgcagact     1140
gctgtcggcg gcacatggag ttcaggaagc tccgaggaat ggagaccaga cccccagcca     1200
acaccgctcg cctacagcct cctcgagacc tcaggagcag cagccccagg aagcaactgt     1260
cagagtcgtc tgacgatgac tatgacgacg tggacatccc cacccctgca gaggacacac     1320
ctcctccact tccccccaag cccaagttcc gttctccatc agacgagggt cctgggagca     1380
tgggggatga tgggcagctg agcccggggg tgctggtccg gtgtgccagt gggcccccac     1440
caaacagccc ccgtcctggg cctcccccat ccaccagcag cccccacctc accgcccatt     1500
cagaaccctc actctggaac ccaccctccc gggagcttga caagccccca cttctgcccc     1560
ccaagaagga aaagatgaag agaaagggat gtgcccttct cgtaaagttg ttcaatggct     1620
gccccctccg gatccacagc acggccgcct ggacacatcc ctccaccaag gaccagcacc     1680
tgctcctggg ggcagaggaa ggcatcttca tcctgaaccg gaatgaccag gaggccacgc     1740
tggaaatgct ctttcctagc cggactacgt gggtgtactc catcaacaac gttctcatgt     1800
ctctctcagg aaagaccccc cacctgtatt ctcatagcat ccttggcctg ctggaacgga     1860
aagagaccag agcaggaaac cccatcgctc acattagccc ccaccgccta ctggcaagga     1920
agaacatggt ttccaccaag atccaggaca ccaaaggctg ccgggcgtgc tgtgtggcgg     1980
agggtgcgag ctctgggggc ccgttcctgt gcggtgcatt ggagacgtcc gttgtcctgc     2040
ttcagtggta ccagcccatg aacaaattcc tgcttgtccg gcaggtgctg ttcccactgc     2100
cgacgcctct gtccgtgttc gcgctgctga ccgggccagg ctctgagctg cccgctgtgt     2160
gcatcggcgt gagccccggg cggccgggga agtcggtgct cttccacacg gtgcgctttg     2220
gcgcgctctc ttgctggctg ggcgagatga gcaccgagca caggggaccc gtgcaggtga     2280
cccaggtaga ggaagatatg gtgatggtgt tgatggatgg ctctgtgaag ctggtgaccc     2340
cggaggggtc cccagtccgg ggacttcgca cacctgagat ccccatgacc gaagcggtgg     2400
aggccgtggc tatggttgga ggtcagcttc aggccttctg gaagcatgga gtgcaggtgt     2460
gggctctagg ctcggatcag ctgctacagg agctgagaga ccctaccctc actttccgtc     2520
tgcttggctc ccccaggcct gtagtggtgg agacacgccc agtggatgat cctactgctc     2580
ccagcaacct ctacatccag gaatgagtcc ctaggggggt gtcaggaact agtccttgca     2640
ccccctcccc catagacaca ctagtggtca tggcatgtcc tcatctccca ataaacatga     2700
ctttagcctc tgctaaaaaa a                                               2721
<210>  18
<211>  4206
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  18
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggtg tcccagcagc catggacaag       60
aagtactcca ttgggctcga tatcggcaca aacagcgtcg gctgggccgt cattacggac      120
gagtacaagg tgccgagcaa aaaattcaaa gttctgggca ataccgatcg ccacagcata      180
aagaagaacc tcattggcgc cctcctgttc gactccgggg agacggccga agccacgcgg      240
ctcaaaagaa cagcacggcg cagatatacc cgcagaaaga atcggatctg ctacctgcag      300
gagatcttta gtaatgagat ggctaaggtg gatgactctt tcttccatag gctggaggag      360
tcctttttgg tggaggagga taaaaagcac gagcgccacc caatctttgg caatatcgtg      420
gacgaggtgg cgtaccatga aaagtaccca accatatatc atctgaggaa gaagcttgta      480
gacagtactg ataaggctga cttgcggttg atctatctcg cgctggcgca tatgatcaaa      540
tttcggggac acttcctcat cgagggggac ctgaacccag acaacagcga tgtcgacaaa      600
ctctttatcc aactggttca gacttacaat cagcttttcg aagagaaccc gatcaacgca      660
tccggagttg acgccaaagc aatcctgagc gctaggctgt ccaaatcccg gcggctcgaa      720
aacctcatcg cacagctccc tggggagaag aagaacggcc tgtttggtaa tcttatcgcc      780
ctgtcactcg ggctgacccc caactttaaa tctaacttcg acctggccga agatgccaag      840
cttcaactga gcaaagacac ctacgatgat gatctcgaca atctgctggc ccagatcggc      900
gaccagtacg cagacctttt tttggcggca aagaacctgt cagacgccat tctgctgagt      960
gatattctgc gagtgaacac ggagatcacc aaagctccgc tgagcgctag tatgatcaag     1020
cgctatgatg agcaccacca agacttgact ttgctgaagg cccttgtcag acagcaactg     1080
cctgagaagt acaaggaaat tttcttcgat cagtctaaaa atggctacgc cggatacatt     1140
gacggcggag caagccagga ggaattttac aaatttatta agcccatctt ggaaaaaatg     1200
gacggcaccg aggagctgct ggtaaagctt aacagagaag atctgttgcg caaacagcgc     1260
actttcgaca atggaagcat cccccaccag attcacctgg gcgaactgca cgctatactc     1320
aggcggcaag aggatttcta cccctttttg aaagataaca gggaaaagat tgagaaaatc     1380
ctcacatttc ggatacccta ctatgtaggc cccctcgccc ggggaaattc cagattcgcg     1440
tggatgactc gcaaatcaga agagaccatc actccctgga acttcgagga agtcgtggat     1500
aagggggcct ctgcccagtc cttcatcgaa aggatgacta actttgataa aaatctgcct     1560
aacgaaaagg tgcttcctaa acactctctg ctgtacgagt acttcacagt ttataacgag     1620
ctcaccaagg tcaaatacgt cacagaaggg atgagaaagc cagcattcct gtctggagag     1680
cagaagaaag ctatcgtgga cctcctcttc aagacgaacc ggaaagttac cgtgaaacag     1740
ctcaaagaag actatttcaa aaagattgaa tgtttcgact ctgttgaaat cagcggagtg     1800
gaggatcgct tcaacgcatc cctgggaacg tatcacgatc tcctgaaaat cattaaagac     1860
aaggacttcc tggacaatga ggagaacgag gacattcttg aggacattgt cctcaccctt     1920
acgttgtttg aagataggga gatgattgaa gaacgcttga aaacttacgc tcatctcttc     1980
gacgacaaag tcatgaaaca gctcaagagg cgccgatata caggatgggg gcggctgtca     2040
agaaaactga tcaatgggat ccgagacaag cagagtggaa agacaatcct ggattttctt     2100
aagtccgatg gatttgccaa ccggaacttc atgcagttga tccatgatga ctctctcacc     2160
tttaaggagg acatccagaa agcacaagtt tctggccagg gggacagtct tcacgagcac     2220
atcgctaatc ttgcaggtag cccagctatc aaaaagggaa tactgcagac cgttaaggtc     2280
gtggatgaac tcgtcaaagt aatgggaagg cataagcccg agaatatcgt tatcgagatg     2340
gcccgagaga accaaactac ccagaaggga cagaagaaca gtagggaaag gatgaagagg     2400
attgaagagg gtataaaaga actggggtcc caaatcctta aggaacaccc agttgaaaac     2460
acccagcttc agaatgagaa gctctacctg tactacctgc agaacggcag ggacatgtac     2520
gtggatcagg aactggacat caatcggctc tccgactacg acgtggatca tatcgtgccc     2580
cagtcttttc tcaaagatga ttctattgat aataaagtgt tgacaagatc cgataaaaat     2640
agagggaaga gtgataacgt cccctcagaa gaagttgtca agaaaatgaa aaattattgg     2700
cggcagctgc tgaacgccaa actgatcaca caacggaagt tcgataatct gactaaggct     2760
gaacgaggtg gcctgtctga gttggataaa gcaggcttca tcaaaaggca gcttgttgag     2820
acacgccaga tcaccaagca cgtggcccaa attctcgatt cacgcatgaa caccaagtac     2880
gatgaaaatg acaaactgat tcgagaggtg aaagttatta ctctgaagtc taagctggtc     2940
tcagatttca gaaaggactt tcagttttat aaggtgagag agatcaacaa ttaccaccat     3000
gcgcatgatg cctacctgaa tgcagtggta ggcactgcac ttatcaaaaa atatcccaag     3060
cttgaatctg aatttgttta cggagactat aaagtgtacg atgttaggaa aatgatcgca     3120
aagtctgagc aggaaatagg caaggccacc gctaagtact tcttttacag caatattatg     3180
aattttttca agaccgagat tacactggcc aatggagaga ttcggaagcg accacttatc     3240
gaaacaaacg gagaaacagg agaaatcgtg tgggacaagg gtagggattt cgcgacagtc     3300
cggaaggtcc tgtccatgcc gcaggtgaac atcgttaaaa agaccgaagt acagaccgga     3360
ggcttctcca aggaaagtat cctcccgaaa aggaacagcg acaagctgat cgcacgcaaa     3420
aaagattggg accccaagaa atacggcgga ttcgattctc ctacagtcgc ttacagtgta     3480
ctggttgtgg ccaaagtgga gaaagggaag tctaaaaaac tcaaaagcgt caaggaactg     3540
ctgggcatca caatcatgga gcgatcaagc ttcgaaaaaa accccatcga ctttctcgag     3600
gcgaaaggat ataaagaggt caaaaaagac ctcatcatta agcttcccaa gtactctctc     3660
tttgagcttg aaaacggccg gaaacgaatg ctcgctagtg cgggcgagct gcagaaaggt     3720
aacgagctgg cactgccctc taaatacgtt aatttcttgt atctggccag ccactatgaa     3780
aagctcaaag ggtctcccga agataatgag cagaagcagc tgttcgtgga acaacacaaa     3840
cactaccttg atgagatcat cgagcaaata agcgaattct ccaaaagagt gatcctcgcc     3900
gacgctaacc tcgataaggt gctttctgct tacaataagc acagggataa gcccatcagg     3960
gagcaggcag aaaacattat ccacttgttt actctgacca acttgggcgc gcctgcagcc     4020
ttcaagtact tcgacaccac catagacaga aagcggtaca cctctacaaa ggaggtcctg     4080
gacgccacac tgattcatca gtcaattacg gggctctatg aaacaagaat cgacctctct     4140
cagctcggtg gagacaagcg tcctgctgct actaagaaag ctggtcaagc taagaaaaag     4200
aaataa                                                                4206
<210>  19
<211>  1401
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  19
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 
1               5                   10                  15      
Ala Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser 
20                  25                  30          
Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys 
35                  40                  45              
Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu 
50                  55                  60                  
Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg 
65                  70                  75                  80  
Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile 
85                  90                  95      
Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp 
100                 105                 110         
Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys 
115                 120                 125             
Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala 
130                 135                 140                 
Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val 
145                 150                 155                 160 
Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala 
165                 170                 175     
His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn 
180                 185                 190         
Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr 
195                 200                 205             
Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp 
210                 215                 220                 
Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu 
225                 230                 235                 240 
Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly 
245                 250                 255     
Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn 
260                 265                 270         
Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr 
275                 280                 285             
Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 
290                 295                 300                 
Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser 
305                 310                 315                 320 
Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala 
325                 330                 335     
Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu 
340                 345                 350         
Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe 
355                 360                 365             
Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala 
370                 375                 380                 
Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met 
385                 390                 395                 400 
Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu 
405                 410                 415     
Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His 
420                 425                 430         
Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro 
435                 440                 445             
Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg 
450                 455                 460                 
Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala 
465                 470                 475                 480 
Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu 
485                 490                 495     
Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met 
500                 505                 510         
Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His 
515                 520                 525             
Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val 
530                 535                 540                 
Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu 
545                 550                 555                 560 
Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val 
565                 570                 575     
Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe 
580                 585                 590         
Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu 
595                 600                 605             
Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu 
610                 615                 620                 
Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu 
625                 630                 635                 640 
Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr 
645                 650                 655     
Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg 
660                 665                 670         
Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg 
675                 680                 685             
Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly 
690                 695                 700                 
Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr 
705                 710                 715                 720 
Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser 
725                 730                 735     
Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys 
740                 745                 750         
Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met 
755                 760                 765             
Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn 
770                 775                 780                 
Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg 
785                 790                 795                 800 
Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His 
805                 810                 815     
Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr 
820                 825                 830         
Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn 
835                 840                 845             
Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu 
850                 855                 860                 
Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn 
865                 870                 875                 880 
Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met 
885                 890                 895     
Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg 
900                 905                 910         
Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu 
915                 920                 925             
Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile 
930                 935                 940                 
Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr 
945                 950                 955                 960 
Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys 
965                 970                 975     
Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val 
980                 985                 990         
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His  Ala His Asp Ala Tyr  Leu Asn Ala 
995                 1000                 1005             
Val Val  Gly Thr Ala Leu Ile  Lys Lys Tyr Pro Lys  Leu Glu Ser 
1010                 1015                 1020             
Glu Phe  Val Tyr Gly Asp Tyr  Lys Val Tyr Asp Val  Arg Lys Met 
1025                 1030                 1035             
Ile Ala  Lys Ser Glu Gln Glu  Ile Gly Lys Ala Thr  Ala Lys Tyr 
1040                 1045                 1050             
Phe Phe  Tyr Ser Asn Ile Met  Asn Phe Phe Lys Thr  Glu Ile Thr 
1055                 1060                 1065             
Leu Ala  Asn Gly Glu Ile Arg  Lys Arg Pro Leu Ile  Glu Thr Asn 
1070                 1075                 1080             
Gly Glu  Thr Gly Glu Ile Val  Trp Asp Lys Gly Arg  Asp Phe Ala 
1085                 1090                 1095             
Thr Val  Arg Lys Val Leu Ser  Met Pro Gln Val Asn  Ile Val Lys 
1100                 1105                 1110             
Lys Thr  Glu Val Gln Thr Gly  Gly Phe Ser Lys Glu  Ser Ile Leu 
1115                 1120                 1125             
Pro Lys  Arg Asn Ser Asp Lys  Leu Ile Ala Arg Lys  Lys Asp Trp 
1130                 1135                 1140             
Asp Pro  Lys Lys Tyr Gly Gly  Phe Asp Ser Pro Thr  Val Ala Tyr 
1145                 1150                 1155             
Ser Val  Leu Val Val Ala Lys  Val Glu Lys Gly Lys  Ser Lys Lys 
1160                 1165                 1170             
Leu Lys  Ser Val Lys Glu Leu  Leu Gly Ile Thr Ile  Met Glu Arg 
1175                 1180                 1185             
Ser Ser  Phe Glu Lys Asn Pro  Ile Asp Phe Leu Glu  Ala Lys Gly 
1190                 1195                 1200             
Tyr Lys  Glu Val Lys Lys Asp  Leu Ile Ile Lys Leu  Pro Lys Tyr 
1205                 1210                 1215             
Ser Leu  Phe Glu Leu Glu Asn  Gly Arg Lys Arg Met  Leu Ala Ser 
1220                 1225                 1230             
Ala Gly  Glu Leu Gln Lys Gly  Asn Glu Leu Ala Leu  Pro Ser Lys 
1235                 1240                 1245             
Tyr Val  Asn Phe Leu Tyr Leu  Ala Ser His Tyr Glu  Lys Leu Lys 
1250                 1255                 1260             
Gly Ser  Pro Glu Asp Asn Glu  Gln Lys Gln Leu Phe  Val Glu Gln 
1265                 1270                 1275             
His Lys  His Tyr Leu Asp Glu  Ile Ile Glu Gln Ile  Ser Glu Phe 
1280                 1285                 1290             
Ser Lys  Arg Val Ile Leu Ala  Asp Ala Asn Leu Asp  Lys Val Leu 
1295                 1300                 1305             
Ser Ala  Tyr Asn Lys His Arg  Asp Lys Pro Ile Arg  Glu Gln Ala 
1310                 1315                 1320             
Glu Asn  Ile Ile His Leu Phe  Thr Leu Thr Asn Leu  Gly Ala Pro 
1325                 1330                 1335             
Ala Ala  Phe Lys Tyr Phe Asp  Thr Thr Ile Asp Arg  Lys Arg Tyr 
1340                 1345                 1350             
Thr Ser  Thr Lys Glu Val Leu  Asp Ala Thr Leu Ile  His Gln Ser 
1355                 1360                 1365             
Ile Thr  Gly Leu Tyr Glu Thr  Arg Ile Asp Leu Ser  Gln Leu Gly 
1370                 1375                 1380             
Gly Asp  Lys Arg Pro Ala Ala  Thr Lys Lys Ala Gly  Gln Ala Lys 
1385                 1390                 1395             
Lys Lys  Lys 
1400     
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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