(57)【要約】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子は、多様な器官および組織（そのうちの一つは網膜である）への遺伝子送達のために有用なビヒクルとして現れつつある。ここで提供されるのは、バリアントＡＡＶ（例えばバリアント血清型２（ＡＡＶ２））キャプシドタンパク質および網膜細胞に形質導入する能力が増強された粒子を含むバリアントキャプシドタンパク質である。
2020508667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変領域（ＶＲ）Ｖ（ＶＲＶ）における配列ＤＧＥおよびＤＦ、ならびに以下の配列および／または置換のセット：
（ａ）ＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４）、
（ｂ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）、
（ｃ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４）、
（ｄ）ＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）置換，
（ｅ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＧＲＥＧＤＡＥＸＸＤ（配列番号６）、
（ｆ）ループＩにおけるＱからＡへの置換；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４）、
（ｇ）ループＩにおけるＱからＡへの置換；ＶＲＶにおけるＫからＴへの置換；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４）、ならびに
（ｈ）位置２６７におけるＳからＷへの置換；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４）；
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であってよい、
のうちのいずれか１つを含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドタンパク質。
【請求項２】
以下の配列および／または置換のセット：
（ａ）ＶＲＩにおけるＮＡ；位置４４４におけるＦ；およびＶＲＩＶにおけるＤＥＡＸＳＥＸＫＸＴＸＲ（配列番号７）、
（ｂ）ＶＲＩＩにおけるＱ３２５Ｋ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＳ４５２Ａ、Ｔ４５４ＮおよびＴ４５５Ｖ；ならびにＶＲＶＩにおけるＫ５２７Ｒ、Ｅ５３０ＤおよびＥ５３１Ｄ、
（ｃ）ＶＲＩにおけるＱ２６３Ａ；ＶＲＶにおけるＫ４９０Ｔ、Ｓ４９２Ｐ、Ｅ４９９ＤおよびＹ５００Ｆ；ならびにＶＲＶＩにおけるＥ５３０Ｄ、
（ｄ）ＶＲＩにおけるＮＡ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＰ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５ＶおよびＲ４５９Ｔ；ならびにＶＲＶＩにおけるＲＸＸＤＤ（配列番号８）、
（ｅ）ＶＲＶＩにおけるＥ５３０Ｄ、
（ｆ）ＱＤＸＥ（配列番号９）、ならびにＶＲＶにおける置換Ｙ５００ＦおよびＴ５０３Ｐ、ならびに
（ｇ）ＶＲＩにおけるＥＡ；ＶＲＶにおけるＴ４９１ＶおよびＹ５００Ｆ；ならびにＶＲＶＩＩにおけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０）、
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であってよい、
のうちのいずれか１つを含む、バリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項３】
アミノ酸Ｘが、配列番号１に記載されるとおりの野生型ＡＡＶ２配列におけるアミノ酸である、請求項１または２に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４】
キャプシドタンパク質が、ＶＲＶにおける配列ＤＧＥおよびＤＦ、およびセット（ａ）の配列を含む、請求項１に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項５】
キャプシドタンパク質が、ＶＲＶにおける配列ＤＧＥおよびＤＦ、およびセット（ｂ）の配列を含む、請求項１に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項６】
置換Ｙ４４４Ｆをさらに含む、請求項１に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項７】
キャプシドタンパク質が、（ｃ）および（ｅ）〜（ｇ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｙ４４４Ｆをさらに含む、請求項２に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項８】
置換Ｙ７３０Ｆをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項９】
置換Ｙ２７２Ｆをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１０】
キャプシドタンパク質が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｙ５００Ｆをさらに含む、請求項２に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１１】
置換Ｔ４９１Ｖをさらに含む、請求項１および６〜１０のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１２】
キャプシドタンパク質が、（ａ）〜（ｅ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｔ４９１Ｖをさらに含む、請求項２に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１３】
キャプシドタンパク質が、ＶＰ３タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１４】
キャプシドタンパク質が、ＶＰ２タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１５】
キャプシドタンパク質が、ＶＰ１タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、バリアント組み換えＡＡＶ２粒子。
【請求項１７】
逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む核酸をさらに含む、請求項１６に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２粒子。
【請求項１８】
目的の遺伝子を含む核酸をさらに含む、請求項１６または１７に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２粒子。
【請求項１９】
核酸が、一本鎖である、１６〜１８のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ粒子。
【請求項２０】
核酸が、二本鎖である、１６〜１８のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ粒子。
【請求項２１】
１６〜２０のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２粒子を複数含む、組成物。
【請求項２２】
薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ある型の網膜細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法であって、網膜細胞に、請求項２１または２２に記載の組成物を提供することを含み、およびここで、組成物中のＡＡＶ２粒子が、目的の遺伝子を含む、前記方法。
【請求項２４】
組成物が、網膜細胞を担持する対象への硝子体内注射を介して網膜細胞に提供される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、網膜細胞を担持する対象への網膜下注射を介して網膜細胞に提供される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
網膜細胞が、視細胞、線維柱帯網、網膜神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、アマクリン細胞、星状膠細胞、水平細胞および網膜色素上皮細胞からなる群より選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
上衣細胞またはプルキンエ細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法であって、請求項１に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含む組み換えＡＡＶ２粒子を複数含む組成物を提供することを含み、ここで、キャプシドタンパク質が、（ｂ）の配列および／または置換のセットを含み、およびここで、組成物中のＡＡＶ２粒子が、目的の遺伝子を含む、前記方法。
【請求項２８】
組成物が、上衣細胞またはプルキンエ細胞を担持する対象への脳室内注射を介して上衣細胞またはプルキンエ細胞に提供される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象が、哺乳動物である、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物が、ヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
目的の遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の配列および／または置換を含む、血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ここで、配列および／または置換が、ＡＡＶ２の可変領域に対して相同である、血清型２以外の血清型のキャプシドタンパク質の可変領域中に位置する、前記血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３４】
血清型１、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のものである、請求項３３に記載の血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３５】
バリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質が、血清型１または６のものである、請求項３３に記載の血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３６】
配列番号２９の可変領域（ＶＲ）において、以下の配列：
（ａ）ＶＲＩにおけるＸＸ；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；およびＴ５０３Ｐ、
（ｂ）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＳＤ、ＩＤ、および／またはＮＸＭ；Ｓ４９２Ａ；ＶＲＶにおけるＤＦ；ならびにＶＲＶＩにおけるＤＧ、
（ｃ）ＶＲＩにおけるＸＸおよび／またはＸ；Ｙ４４４Ｆ；Ｔ４５０Ｄ；Ｔ４５４Ｓ；ＶＲＩＶにおけるＭＸＴＸＲ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；ならびにＥ５３１Ｄ、
（ｄ）ＶＲＩにおけるＮＡ；可変ＶＲＶにおけるＤＧＥおよびＤＦ；ならびにＱ５４５Ｅ、
（ｅ）ＶＲＩにおけるＤＡＸＸＴ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＡＸＭＸＫＸＨ（配列番号３０）；ＶＲＶにおけるＹＮ；Ｙ５００Ｆ；Ｋ５０７Ｔ；およびＶＲＩＶにおけるＤＸＲ、
（ｆ）Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＧＡＸＮＭＸＴＸＡＸＲ（配列番号３１）；可変ＶＲＶにおけるＴＸＰおよびＤＦ；ならびにＥ５３０Ｄ、
（ｇ）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０）、
（ｈ）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｅ５３０Ｄ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＧＲＡＤＩＸＸＸＳ（配列番号３３）、
（’）ＶＲＩにおけるＸＸおよび／またはＸ；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；Ｔ５０３Ｐ；ならびにＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）、
（ｊ）Ｑ５４５Ｅ、
（ｋ）ＶＲＩにおけるＮＡ；Ｙ５００Ｆ；Ｔ５０３Ｐ；およびＫ５０７Ｔ、
（ｌ）Ｑ２６３Ａ；Ｙ４４４Ｆ；Ｐ４５１Ａ；Ｔ４５４Ｎ；Ｔ４５５Ｖ；Ｒ４５９Ｔ；およびＶＲＶＩにおけるＲＸＸＤＤ、
（ｍ）Ｑ２６３Ａならびに可変ＶＲＶにおけるＤＧＥおよびＤＦ、
（ｎ）ＶＲＩにおけるＮＡ；ならびに可変ＶＲＶにおけるＤＧＥおよびＤＦ、
（ｏ）Ｑ２６３Ａ；Ｅ５３０Ｄ；Ｅ５３１Ｄ、
（ｐ）Ｑ２６３Ａ；可変ＶＲＶにおけるＤＧＥおよびＤＦ；ならびにＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）、
（ｑ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＱ５４５Ｅ、
（ｒ）ＶＲＩにおけるＧＴ；Ｙ５００Ｆ；Ｋ５０７Ｔ；ＶＲＶＩにおけるＲＸＸＤＸＲ、ならびに／あるいは
（ｓ）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｙ５００Ｆ；Ｋ５０７Ｔ；ＶＲＶＩにおけるＲＸＸＤＸＲ、
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であってよい
のうちの１つ以上を含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドタンパク質。
【請求項３７】
アミノ酸Ｘが、配列番号１に記載されるとおりの野生型ＡＡＶ２配列におけるアミノ酸である、請求項３６に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項３８】
置換Ｙ４４４Ｆをさらに含む、請求項３６または３７に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項３９】
キャプシドタンパク質が、（ａ）〜（ｄ）および（ｅ）〜（ｉ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｙ４４４Ｆをさらに含む、請求項３６に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４０】
以下の配列：
（ｉ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＮＡ、ＥＡ、ＤＡ、ＡＳ、ＡＡ、ＤＴ、ＮＳ、ＧＡ、ＧＳ、ＲＳ、ＴＡ、ＴＳ、ＥＳ、ＧＴ、ＱＡ、またはＴＴ；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；およびＴ５０３Ｐ、
（ｉｉ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＮＴ、ＥＳ、ＧＳ、ＮＡ、ＡＳ、ＡＡ、ＧＡまたはＤＳ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＳＤ、ＩＤ、および／またはＮＸＭ；Ｓ４９２Ａ；ＶＲＶにおけるＤＦ；ならびにＶＲＶＩにおけるＤＧ、
（ｉｉｉ）ＶＲＩにおけるＱＳＧＡＳ（配列番号４６）、ＮＡＧＡＳ（配列番号４７）、ＴＴＧＡＴ（配列番号４８）、ＥＡＧＡＳ（配列番号４９）、ＴＴＧＡＳ（配列番号５０）またはＧＡＧＡＳ（配列番号５１）、
（ｉｖ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＥＡ、ＱＡ、ＮＡ、ＡＳまたはＥＳ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０）、
（ｖ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＤＳ、ＮＡ、ＡＳ、ＤＡまたはＡＴ；Ｅ５３０Ｄ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＧＲＡＤＩＸＸＸＳ（配列番号３３）、ならびに／あるいは
（ｖｉ）ＶＲＩにおけるＱＳＧＡＳ（配列番号４６）、ＮＡＧＡＳ（配列番号４７）、ＡＳＧＡＳ（配列番号５２）、ＧＡＧＡＳ（配列番号５１）、ＴＡＧＡＳ（配列番号５３）、ＱＴＧＡＳ（配列番号５４）またはＴＴＧＡＳ（配列番号５０）；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；Ｔ５０３Ｐ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）
のうちの１つ以上を含む、請求項３６または３７に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４１】
置換Ｙ４４４Ｆをさらに含む、請求項４０に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４２】
キャプシドタンパク質が、（ａ）〜（ｉ）または（ｉ）−（ｖｉ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｙ４４４Ｆをさらに含む、請求項４０に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４３】
置換Ｙ７３０Ｆをさらに含む、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４４】
置換Ｙ２７２Ｆをさらに含む、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４５】
キャプシドタンパク質が、（ａ）〜（ｉ’）または（ｉ）〜（ｖｉ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｙ５００Ｆをさらに含む、請求項３７または４１に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４６】
置換Ｔ４９１Ｖをさらに含む、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４７】
キャプシドタンパク質が、（ａ）〜（ｉ’）または（ｉ）〜（ｖｉ）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Ｔ４９１Ｖをさらに含む、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項４８】
図２４または２５において示される変異のうちの１つ以上を含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドタンパク質。
【請求項４９】
キャプシドタンパク質が、ＶＰ３タンパク質である、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項５０】
キャプシドタンパク質が、ＶＰ２タンパク質である、請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項５１】
キャプシドタンパク質が、ＶＰ１タンパク質である、請求項３６〜４９のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項５２】
請求項３６〜５１のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、バリアント組み換えＡＡＶ２粒子。
【請求項５３】
逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む核酸をさらに含む、請求項５２に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２粒子。
【請求項５４】
目的の遺伝子を含む核酸をさらに含む、請求項５２または５３に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２粒子。
【請求項５５】
核酸が、一本鎖である、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ粒子。
【請求項５６】
核酸が、二本鎖である、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ粒子。
【請求項５７】
請求項５２〜５６のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２粒子を複数含む、組成物。
【請求項５８】
薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
ある型の網膜細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法であって、網膜細胞に請求項５７または５８に記載の組成物を提供することを含み、ここで、組成物中のＡＡＶ２粒子が、目的の遺伝子を含む、前記方法。
【請求項６０】
組成物が、網膜細胞を担持する対象への硝子体内注射を介して網膜細胞に提供される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
組成物が、網膜細胞を担持する対象への網膜下注射を介して網膜細胞に提供される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
網膜細胞が、視細胞、線維柱帯網、網膜神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、アマクリン細胞、星状膠細胞、水平細胞および網膜色素上皮細胞からなる群より選択される、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
対象が、哺乳動物である、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
哺乳動物が、ヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
目的の遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項３６〜５１のいずれか一項に記載の配列および／または置換を含む、血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ここで、配列および／または置換が、ＡＡＶ２の可変領域に対して相同である、血清型２以外の血清型のキャプシドタンパク質の可変領域中に位置する、前記血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６８】
バリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質が、血清型１、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のものである、請求項６７に記載の血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６９】
バリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質が、血清型１または６のものである、請求項６８に記載の血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項７０】
以下のペプチド：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６６）、ＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号６７）、ＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号６８）、ＧＥＡＲＩＳＡ（配列番号６９）、ＳＧＮＳＧＡＡ（配列番号７０）、ＥＳＧＬＳＱＳ（配列番号７１）、ＥＹＲＤＳＳＧ（配列番号７２）、ＤＬＧＳＡＲＡ（配列番号７３）、ＰＲＳＡＤＬＡ（配列番号７４）、ＰＲＳＴＳＤＰ（配列番号７５）、およびＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号７６）のうちのいずれか１つを１つ以上さらに含む、請求項１〜１５または３６〜４８のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項７１】
ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６６）、ＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号６７）、ＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号６８）、ＧＥＡＲＩＳＡ（配列番号６９）、ＳＧＮＳＧＡＡ（配列番号７０）、ＥＳＧＬＳＱＳ（配列番号７１）、ＥＹＲＤＳＳＧ（配列番号７２）、ＤＬＧＳＡＲＡ（配列番号７３）、ＰＲＳＡＤＬＡ（配列番号７４）、ＰＲＳＴＳＤＰ（配列番号７５）、およびＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号７６）のうちの１つ以上が、アミノ酸５８５と５８８との間に存在する、請求項７０に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【請求項７２】
以下の置換：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖのうちのいずれか１つを１つ以上さらに含む、請求項１〜１５、３６〜４８、７０および７１のいずれか一項に記載のバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年２月２１日に出願された米国仮出願番号62/461,770、および２０１８年２月２日に出願された米国仮出願番号No. 62/625,486の利益を主張し、これらの全開示は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与されたRO1EY024280およびHL097088-05A1下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子は、遺伝子送達のために有用なビヒクルとして現れつつある。異なるＡＡＶ血清型は、特定の器官指向性を有し、このことは、遺伝子に基づく治療薬を標的器官に対してターゲティングするために有利であり得るが（例えば、Surace et al., Vision Res. 2008, 48(3):353-9；Zincarelli et al., Mol Ther. 2008,16(6):1073-80を参照）、一方で、ＡＡＶにおける特定の器官または組織を標的とすることについての効率の増大は、多大な利益となるであろう。かかる組織の一例は、網膜である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
ＡＡＶ粒子の器官または組織への指向性は、完全にではないとしても高度に、粒子表面の構造またはキャプシドに依存する。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、網膜に対する指向性を有し、網膜に遺伝子を送達するために用いられる（例えば、Vandenberghe et al., Gene Ther. 2012, 19(2):162-8を参照）。ＡＡＶ２キャプシドは、３つのタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される。本明細書において提供されるのは、バリアント（例えば修飾された）ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）キャプシドタンパク質および網膜細胞（例えば視細胞（photoreceptor）、網膜神経節細胞および網膜神経細胞）に形質導入する効率が改善されている粒子についての組成物および方法である。本開示は、少なくとも部分的に、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質中にアミノ酸の置換または変異を有するキャプシドバリアントを含むＡＡＶ２キャプシドライブラリーの、マウスモデルおよびマカクモデルにおけるin vivoスクリーニングを用いる、網膜細胞に形質導入する効率が野生型キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ２粒子と比較して高い修飾キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ２（ＡＡＶ２）バリアントタンパク質（例えば修飾ＡＡＶ２キャプシドタンパク質）および組み換え粒子の同定に基づく。
【０００５】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、バリアント（例えば修飾された）組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドタンパク質であって、これは、可変領域（ＶＲ）Ｖ（ＶＲＶ）における配列ＤＧＥおよび／またはＤＦ、ならびに以下の配列および／または置換のセット：
（ａ）ＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４において記載されるとおり）、
（ｂ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５において記載されるとおり）、
（ｃ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４において記載されるとおり）、
（ｄ）ＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５において記載されるとおり）置換、
（ｅ）ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５において記載されるとおり）、
（ｆ）ループＩにおけるＱからＡへの置換；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４において記載されるとおり）、
（ｇ）ループＩにおけるＱからＡへの置換；ＶＲＶにおけるＫからＴへの置換；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４において記載されるとおり）、ならびに
（ｈ）位置２６７におけるＳからＷへの置換；およびＶＲＶＩＩにおけるＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４において記載されるとおり）
のうちのいずれか１つ以上を含む。Ｘは、任意のアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはバリン）であってよい。
【０００６】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよび／またはＤＦを含むバリアント（例えば修飾された）組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよび／またはＤＦ、ならびにＶＲＩにおけるＮＡを含む、バリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質である。
【０００７】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、以下の配列および／または置換のセット：
（ａ’’’）ＶＲＩにおけるＮＡ；位置４４４におけるＦ；およびＶＲＩＶにおけるＤＥＡＸＳＥＸＫＸＴＸＲ（配列番号７において記載されるとおり）、
（ｂ’’’）ＶＲＩＩにおけるＱ３２５Ｋ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＳ４５２Ａ、Ｔ４５４ＮおよびＴ４５５Ｖ；およびＶＲＶＩにおけるＲＸＸＤＤ（配列番号８において記載されるとおり）、
（ｃ’’’）ＶＲＩにおけるＱ２６３Ａ；ＶＲＶにおけるＫ４９０Ｔ、Ｓ４９２Ｐ、Ｅ４９９ＤおよびＹ５００Ｆ；ならびにＶＲＶＩにおけるＥ５３０Ｄ、
（ｄ’’’）ＶＲＩにおけるＮＡ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＰ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５ＶおよびＲ４５９Ｔ；およびＶＲＶＩにおけるＲＸＸＤＤ（配列番号８において記載されるとおり）、
（ｅ’’’）ＶＲＶＩにおけるＥ５３０Ｄ、
（ｆ’’’）ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ（配列番号９において記載されるとおり）ならびに置換Ｙ５００ＦおよびＴ５０３Ｐ、ならびに
（ｇ’’’）ＶＲＩにおけるＥＡ；ＶＲＶにおけるＴ４９１ＶおよびＹ５００Ｆ；ならびにＶＲＶＩＩにおけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０において記載されるとおり）、
のうちのいずれか１つを含む、バリアント（例えば修飾された）組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質である。Ｘは、任意のアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはバリン）であってよい。
【０００８】
いくつかの態様において、Ｘにより表されるアミノ酸は、配列番号１に記載されるとおりの野生型ＡＡＶ２配列におけるアミノ酸である。例えば、配列ＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲは、配列番号４において記載されるとおり、配列番号１において記載されるような野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１タンパク質のＶＲＶＩＩにおけるアミノ酸５４５〜５５６に対して相同である。したがって、いくつかの態様において、配列ＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲは、配列ＥＤＡＴＥＮＮＩＤＩＤＲであってもよい。同様に、いくつかの態様において、配列ＲＸＸＤＤ（配列番号８）は、配列ＲＤＤＤＤである。
【０００９】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよび／またはＤＦ、ならびにＶＲＶＩＩにおいて配列ＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４において記載される）を含む。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよび／またはＤＦ、ならびにＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおいてＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５において記載される）を含む。
【００１０】
本開示はまた、部分的に、合理的なキャプシドの設計に基づいてより多くのアミノ酸置換を導入することによる、網膜細胞に形質導入する効率が野生型よりも高いｒＡＡＶ２キャプシドバリアントの性能のさらなる改善に基づく。したがって、また、いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、合理的に設計されるアミノ酸置換をさらに含む、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質である。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ４４４Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＶにおける配列ＤＧＥおよび／またはＤＦ、上記のようなセット（ａ’’’）〜（ｃ’’’）および（ｅ’’’）〜（ｈ’’’）における配列および／または置換のうちのいずれか１つ、ならびに置換Ｙ４４４Ｆを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ７３０Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよび／またはＤＦを含むバリアント（例えば修飾された）組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、以下の置換：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの態様において、ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよび／またはＤＦおよびＶＲＩにおけるＮＡを含むバリアント（例えば修飾された）組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、以下の置換：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖをさらに含む。
【００１１】
本明細書において開示されるバリアント（例えば修飾された）ｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ２５２Ｆをさらに含んでもよい。本明細書において開示される修飾ｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ２７２Ｆをさらに含んでもよい。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ５００Ｆをさらに含んでもよい。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ７００Ｆをさらに含んでもよい。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ７０４Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、バリンがその位置において既に存在しない場合には、置換Ｔ４９１Ｖをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のような配列および／または置換のセット（ａ’’’）、（ｂ’’’）、（ｃ’’’）および（ｅ’’’）のうちのいずれか１つを含み、置換Ｙ５００Ｆをさらに含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本明細書において開示される修飾キャプシドのうちのいずれか１つは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の位置５８７または５８８において６〜８個のアミノ酸の挿入を含んでもよい。
いくつかの態様において、修飾されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＰ３タンパク質である。いくつかの態様において、修飾されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＰ２タンパク質である。いくつかの態様において、修飾されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＰ１タンパク質である。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示される修飾されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つを含む、ｒＡＡＶ粒子である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子は、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む核酸を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２粒子のうちのいずれか１つは、目的の遺伝子を含む核酸を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子中に含まれる核酸は、一本鎖である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子中に含まれる核酸は、二本鎖である。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２粒子のうちのいずれか１つを複数含む組成物である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。
【００１４】
いくつかの側面において、ここで提供されるのはまた、網膜細胞に遺伝子で形質導入するために、本明細書において開示される粒子のうちのいずれか１つを使用する方法である。いくつかの態様において、視細胞（photoreceptor cell）および／または網膜神経節細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法は、視細胞に、本明細書において開示される組成物のうちのいずれか１つを提供することを含む。いくつかの態様において、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供されるＡＡＶ２粒子は、目的の遺伝子を含む。いくつかの態様において、組成物は、視細胞および／または網膜神経節細胞を担持する対象への硝子体内注射を介して、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供される。いくつかの態様において、組成物は、視細胞および／または網膜神経節細胞を担持する対象への網膜下注射を介して、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供される。いくつかの態様において、組成物は、視細胞および／または網膜神経節細胞を担持する対象への内境界膜下注射を介して、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供される（例えば、Hum Gene Ther. 2016 Aug;27(8):580-97を参照）。
【００１５】
本明細書において提供されるのはまた、上衣細胞またはプルキンエ細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法である。いくつかの態様において、方法は、上衣細胞またはプルキンエ細胞に、バリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含む複数の組み換えＡＡＶ２粒子を含む組成物を提供することを含み、ここで、キャプシドタンパク質は、ＶＲＶにおける配列ＤＧＥおよび／またはＤＦ、ならびにＶＲＩにおけるＮＡ；ならびにＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５において記載されるとおり）を含む。いくつかの態様において、組成物は、上衣細胞またはプルキンエ細胞を担持する対象への脳室内注射を介して、上衣細胞またはプルキンエ細胞に提供される。
【００１６】
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。治療用タンパク質は、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質であってよい。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、リボザイムＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどの遺伝子発現を制御するためのＲＮＡ、または遺伝子編集のためのガイドＲＮＡをコードする。
【００１７】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、以下を含むバリアント（例えば修飾された）組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドタンパク質である：（ａ’）可変領域Ｉ（ＶＲＩ）におけるＸＸ；可変領域Ｖ（ＶＲＶ）におけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；およびＴ５０３Ｐ、（ｂ’）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｙ４４４Ｆ；可変領域ＩＶ（ＶＲＩＶ）におけるＳＤ、ＩＤ、および／またはＮＸＭ；Ｓ４９２Ａ；ＶＲＶにおけるＤＦ；および可変領域ＶＩ（ＶＲＶＩ）におけるＤＧ、（ｃ’）ＶＲＩにおけるＸＸおよび／またはＸ；Ｙ４４４Ｆ；Ｔ４５０Ｄ；Ｔ４５４Ｓ；ＶＲＩＶにおけるＭＸＴＸＲ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；およびＥ５３１Ｄ、（ｄ’）ＶＲＩにおけるＮＡ；可変ＶＲＶにおけるＤＧＥおよびＤＦ；およびＱ５４５Ｅ、（ｅ’）ＶＲＩにおけるＤＡＸＸＴ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＡＸＭＸＫＸＨ（配列番号３０）；ＶＲＶにおけるＹＮ；Ｙ５００Ｆ；Ｋ５０７Ｔ；およびＶＲＩＶにおけるＤＸＲ、（ｆ’）Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＧＡＸＮＭＸＴＸＡＸＲ（配列番号３１）；ＶＲＶにおけるＴＸＰおよびＤＦ；およびＥ５３０Ｄ、（ｇ’）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；および可変領域ＶＩＩ（ＶＲＶＩＩ）におけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０）、（ｈ’）ＶＲＩにおけるＸＸ；Ｅ５３０Ｄ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＧＲＡＤＩＸＸＸＳ（配列番号３３）、あるいは（ｉ'）ＶＲＩにおけるＸＸおよび／またはＸ；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；Ｔ５０３Ｐ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）。ここで、Ｘは任意のアミノ酸（例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはバリン）であってよい。いくつかの態様において、任意の１つ以上のＸ（例えば全てのＸ）は、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質における対応する位置において存在する野生型アミノ酸である。
【００１８】
いくつかの態様において、バリアント（例えば修飾された）組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、以下を含む：（ａ’’）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＮＡ、ＥＡ、ＤＡ、ＡＳ、ＡＡ、ＤＴ、ＮＳ、ＧＡ、ＧＳ、ＲＳ、ＴＡ、ＴＳ、ＥＳ、ＧＴ、ＱＡ、またはＴＴ；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；およびＴ５０３Ｐ、（ｂ’’）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＮＴ、ＥＳ、ＧＳ、ＮＡ、ＡＳ、ＡＡ、ＧＡまたはＤＳ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＳＤ、ＩＤ、および／またはＮＸＭ；Ｓ４９２Ａ；ＶＲＶにおけるＤＦ；およびＶＲＶＩにおけるＤＧ、（ｃ’’）ＶＲＩにおけるＱＳＧＡＳ（配列番号４６）、ＮＡＧＡＳ（配列番号４７）、ＴＴＧＡＴ（配列番号４８）、ＥＡＧＡＳ（配列番号４９）、ＴＴＧＡＳ（配列番号５０）またはＧＡＧＡＳ（配列番号５１）、（ｄ’’）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＥＡ、ＱＡ、ＮＡ、ＡＳまたはＥＳ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０）、（ｅ’’）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＤＳ、ＮＡ、ＡＳ、ＤＡまたはＡＴ；Ｅ５３０Ｄ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＧＲＡＤＩＸＸＸＳ（配列番号３３）、あるいは（ｆ’’）ＶＲＩにおけるＱＳＧＡＳ（配列番号４６）、ＮＡＧＡＳ（配列番号４７）、ＡＳＧＡＳ（配列番号５２）、ＧＡＧＡＳ（配列番号５１）、ＴＡＧＡＳ（配列番号５３）、ＱＴＧＡＳ（配列番号５４）またはＴＴＧＡＳ（配列番号５０）；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；Ｔ５０３Ｐ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）。
【００１９】
本開示はまた、部分的に、合理的なキャプシドの設計に基づいてより多くのアミノ酸置換を導入することによる、網膜細胞に形質導入する効率が野生型よりも高いｒＡＡＶ２キャプシドバリアントの性能のさらなる改善に基づく。したがって、またいくつかの態様において本明細書において提供されるのは、合理的に設計されるアミノ酸置換をさらに含む、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質である。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ４４４Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のような（ａ’）〜（ｉ’）または（ａ’’）〜（ｆ’’）のセットにおける配列および／または置換のうちのいずれか１つ、および置換Ｙ４４４Ｆを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ７３０Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のような（ａ’）〜（ｉ’）または（ａ’’）〜（ｆ’’）のセットにおける配列および／または置換のうちのいずれか１つ、および置換Ｙ７３０Ｆを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ２７２Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のような（ａ’）〜（ｉ’）または（ａ’’）〜（ｆ’’）のセットにおける配列および／または置換のうちのいずれか１つ、および置換Ｙ２７２Ｆを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、バリンがその位置において既に存在しない場合には、置換Ｔ４９１Ｖをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のような（ａ’）〜（ｉ’）または（ａ’’）〜（ｆ’’）のセットにおける配列および／または置換のうちのいずれか１つ、および置換Ｔ４９１Ｖを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、置換Ｙ５００Ｆをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のような（ａ’）〜（ｉ’）または（ａ’’）〜（ｆ’’）の配列および／または置換のセットのうちのいずれか１つを含み、および置換Ｙ５００Ｆをさらに含む。
【００２０】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＰ３タンパク質である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＰ２タンパク質である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＰ１タンパク質である。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれかを含むｒＡＡＶ粒子である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子は、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む核酸を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２粒子のうちのいずれか１つは、目的の遺伝子を含む核酸を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子中に含まれる核酸は、一本鎖である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子中に含まれる核酸は、二本鎖である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ２粒子中に含まれる核酸は、自己相補性ｒＡＡＶゲノム（例えばｓｃＡＡＶ２ゲノム）である。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ２粒子のうちのいずれか１つを複数含む組成物である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。
【００２２】
いくつかの側面において、ここで提供されるのはまた、網膜細胞に、遺伝子（例えば目的の遺伝子）により形質導入するために、本明細書において開示される粒子のうちのいずれか１つを使用する方法である。いくつかの態様において、視細胞および／または網膜神経節細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法は、視細胞に、本明細書において開示される組成物のうちのいずれか１つを提供することを含む。いくつかの態様において、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供されるＡＡＶ２粒子は、目的の遺伝子を含む。いくつかの態様において、組成物は、視細胞および／または網膜神経節細胞を担持する対象への硝子体内注射を介して、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供される。いくつかの態様において、組成物は、視細胞および／または網膜神経節細胞を担持する対象への網膜下注射を介して、視細胞および／または網膜神経節細胞に提供される。
【００２３】
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。治療用タンパク質は、例えば、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質であってよい。
【００２４】
ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）のヘパリン結合ドメインにおいて挿入される特定のペプチド配列は、形質導入効率を増強することが知られている。例えば、Koerbelinら（EMBO Mol Med. 2016 Jun 1;8(6):609-25）、Michelfelderら（PLoS One. 2009;4(4):e5122. doi：10.1371/journal.pone.0005122）、およびKoerbelinら（Mol Ther. 2016 Jun;24(6):1050-1061. doi：10.1038/mt.2016.62）を参照。したがって、いくつかの態様において、本明細書において開示される任意の１つのバリアントキャプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の位置５８７または５８８において６〜８個のアミノ酸の挿入を含んでもよい。いくつかの態様において、ここで開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、ペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、ペプチドは、Koerbelinら（EMBO Mol Med. 2016 Jun 1;8(6):609-25）、Michelfelderら（PLoS One. 2009;4(4):e5122. doi：10.1371/journal.pone.0005122）、およびKoerbelinら（Mol Ther. 2016 Jun;24(6):1050-1061. doi：10.1038/mt.2016.62）において開示されるペプチドのうちのいずれか１つであってよい。いくつかの態様において、ここで開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、以下のペプチドのうちのいずれか１つを１つ以上さらに含む：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６６）、ＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号６７）、ＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号６８）、ＧＥＡＲＩＳＡ（配列番号６９）、ＳＧＮＳＧＡＡ（配列番号７０）、ＥＳＧＬＳＱＳ（配列番号７１）、ＥＹＲＤＳＳＧ（配列番号７２）、ＤＬＧＳＡＲＡ（配列番号７３）、ＰＲＳＡＤＬＡ（配列番号７４）、ＰＲＳＴＳＤＰ（配列番号７５）、およびＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号７６）。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つのいくつかの態様において、ペプチドは、アミノ酸位置５８７と５８８との間に挿入される。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つのいくつかの態様において、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６６）、ＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号６７）、ＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号６８）、ＧＥＡＲＩＳＡ（配列番号６９）、ＳＧＮＳＧＡＡ（配列番号７０）、ＥＳＧＬＳＱＳ（配列番号７１）、ＥＹＲＤＳＳＧ（配列番号７２）、ＤＬＧＳＡＲＡ（配列番号７３）、ＰＲＳＡＤＬＡ（配列番号７４）、ＰＲＳＴＳＤＰ（配列番号７５）、およびＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号７６）のうちの１つ以上が、アミノ酸５８５と５８８との間に存在する。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つのいくつかの態様において、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号６６）、ＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号６７）、ＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号６８）、ＧＥＡＲＩＳＡ（配列番号６９）、ＳＧＮＳＧＡＡ（配列番号７０）、ＥＳＧＬＳＱＳ（配列番号７１）、ＥＹＲＤＳＳＧ（配列番号７２）、ＤＬＧＳＡＲＡ（配列番号７３）、ＰＲＳＡＤＬＡ（配列番号７４）、ＰＲＳＴＳＤＰ（配列番号７５）、およびＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号７６）のうちの１つ以上が、���ミノ酸５８７と５８８との間に存在する。
【００２５】
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、以下の置換：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖ、またはこれらの任意の組み合わせ（例えばこれらのうちの２、３、４、５、もしくは６つ、またはこれらの７つ全ての任意の組み合わせ）のうちのいずれか１つを１つ以上さらに含む。
【００２６】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに示すために含まれており、本開示のある側面は、本明細書において提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせたこれらの図面のうちの１つ以上への参照により、よりよく理解され得る。図面において説明されるデータは、決して本開示の範囲を限定するものではないことが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＡＡＶキャプシドライブラリーの一例の特徴を示す。図１Ａは、可変ループを有する野生型ＡＡＶ２タンパク質の構造を示す。図１Ｂは、野生型ＡＡＶ２キャプシドの構造を示す。図１Ｃは、ＣＡＰＬＩＢ−７キャプシドライブラリーを表し、これは、インプット（input）プラスミドおよびキャプシドの多様性を示す。
【図２】図２は、網膜細胞に形質導入することについて、マウスにおいてどのようにしてＣＡＰＬＩＢ−７  ＡＡＶキャプシドライブラリーをスクリーニングしたかを表す。３回のスクリーニングを行い、ここで、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスに、コンビナトリアルなＡＡＶライブラリーおよび出現率に基づいて同定したＡＡＶバリアントを、硝子体内注射した。
【００２８】
【図３】図３は、ＡＡＶキャプシドライブラリーの硝子体内注射の後のＮｒｌ−ＧＦＰマウスにおける３回のスクリーニングの後の結果を示す。出現率の順にバリアントを示し、一番上が最も出現率が高いものである。
【図４】図４は、網膜細胞、特に視細胞（ＰＲ）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に形質導入することについて、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてどのようにしてＣＡＰＬＩＢ−７  ＡＡＶ２キャプシドライブラリーをスクリーニングしたかを示す。霊長類網膜において、外側膝状核（ＬＧＮ）中へのＴＲＩＴＣ−デキストラン−ビオチンの直接注射および逆行性輸送によるＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ＧＦＰおよび網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の網膜下注射を介して、視細胞（ＰＲ）を含む選別可能な細胞集団を作出した。硝子体内（Ｉｖｔ）注射による生体内（in-life）相の間にキャプシドライブラリーを送達した。
【００２９】
【図５】図５は、霊長類スクリーニングから同定された最も出現率が高いＡＡＶ２バリアントを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃ。図６Ａは、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスにおけるＡＡＶ２バリアントＶａ粒子を担持するＳｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの硝子体内注射の３週間後に撮影された眼底画像を示す。図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＱｕａｄＹＦ＋Ｔ−Ｖ）またはＡＡＶ２−Ｖａを硝子体内注射したＮｒｌ−ＧＦＰマウスからの網膜細胞の代表的な蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）散布図を示す。図６Ｃは、ＦＡＣＳにより示されるとおりのＮｒｌ−ＧＦＰマウスの形質導入率の定量を示す。数値は、ベクター１つあたりの６個の眼の平均である。黒いバーは、桿体視細胞を表し、灰色のバーは、非桿体神経網膜細胞を表す。
【００３０】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、Ｓｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙを担持するＡＡＶ２−Ｖａ粒子を脳室（第三脳室）内注射されたマウスからの脳切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す。図７Ａは、上衣細胞を含む切片におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。図７Ｂは、プルキンエ細胞を含む切片におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃ。図８Ａは、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスにおけるＡＡＶ２バリアントＶｂ粒子を担持するＳｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの硝子体内注射の３週間後に撮影された眼底画像を示す。図８Ｂは、ＡＡＶ２（ＱｕａｄＹＦ＋Ｔ−Ｖ）またはＡＡＶ２−Ｖｂを硝子体内注射したＮｒｌ−ＧＦＰマウスからの網膜細胞の代表的な蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）散布図を示す。図８Ｃは、ＦＡＣＳにより示されるとおりの、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスにおける形質導入率の定量を示す。数値は、ベクター１つあたりの６個の眼の平均である。黒いバーは、桿体視細胞を表し、灰色のバーは、非桿体神経網膜細胞を表す。
【００３１】
【図９】図９は、ＡＲＰＥ１９網膜上皮細胞におけるＡＡＶ２−Ｖ２バリアントの形質導入効率を示す。細胞を、１０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）において感染させた。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＡＡＶ２バリアントＶ２についての形質導入効率を示す。図１０Ａは、眼底検査を用いて観察されるとおりの、マウス網膜におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。図１０Ｂは、ＡＡＶ２−Ｖ２またはＡＡＶ２（ＱｕａｄＹＦ＋Ｔ−Ｖ）を硝子体内注射したＮｒｌ−ＧＦＰマウスの代表的なＦＡＣＳ散布図を示す。マウスを、注射の４週間後に安楽死させた。図１０Ｃは、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）と比較した形質導入効率を示す。マウスを、１．２ｅ１２ｖｇ／ｍｌのＳｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの注射の４週間後に安楽死させた。数値は、ベクター１つあたりの６個の眼の平均である。
【００３２】
【図１１】図１１は、ＡＲＰＥ１９細胞におけるＡＡＶ２−Ｖ３の形質導入効率を示す。細胞を、１０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）において感染させた。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＡＡＶ２バリアントＶ３についての形質導入効率を示す。図１２Ａは、眼底検査を用いて観察されるとおりの、マウス網膜におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。図１２Ｂは、ＡＡＶ２−Ｖ３またはＡＡＶ２（ＱｕａｄＹＦ＋Ｔ−Ｖ）を硝子体内注射したＮｒｌ−ＧＦＰマウスの代表的なＦＡＣＳ散布図を示す。マウスを、注射の４週間後に安楽死させた。図１２Ｃは、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）と比較した形質導入効率を示す。マウスを、１．２ｅ１２ｖｇ／ｍｌのＳｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの注射の４週間後に安楽死させた。数値は、ベクター１つあたりの６個の眼の平均である。
【００３３】
【図１３】図１３は、さらなるＴからＦへ、および／またはＴからＶへの置換を有するＶａおよびＶｂ  ＡＡＶ２キャプシドバリアントを提供された網膜の眼底画像を示す。ＹＦは、Ｙ４４４ＦおよびＹ７３０Ｆ変異を表す；ＹＦ＋ＴＶは、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４ＦおよびＹ７３０Ｆ、ならびにＴ２９１Ｖ変異を表す。
【図１４】図１４は、図１３において定義されるとおりの、さらなるＴからＦへ、および／またはＴからＶへの置換を有するＶａおよびＶｂ  ＡＡＶ２キャプシドバリアントの、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスにおける形質導入率を説明するＦＡＣＳデータの定量を示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、マカク（網膜下ＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ＧＦＰ＋ＬＧＮ  microruby）およびマウス（Ｎｒｌ−ＧＦＰ）についての処置手順を示す。
【図１６】図１６は、霊長類における２回のスクリーニングの後で回収された組織中の主要なバリアントの分布を示す。Ｘ軸は、網膜中の異なる細胞型および位置を表す。ＰＲ：視細胞；ＲＧＣ：網膜神経節細胞：ＲＰＥ：網膜色素上皮；Ａ：中心窩（central）／黄斑（macula）；ＢＣ：周辺部網膜。
【００３５】
【図１７】図１７は、ＶＲによる主要なバリアントおよび置換の位置を示す。
【図１８】図１８は、形質導入効率の定量を示す。バーは、ベクターＡＡＶ２（Ｙ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）およびＡＡＶ−７ｍ８により示される桿体細胞の形質導入のレベルを表す。
【図１９】図１９は、２ｅ９のベクターゲノムのＩｖｔ注射の４週間後の眼底検査およびＶ２および未加工のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。
【００３６】
【図２０】図２０は、バーコード付けされたベクターを利用する、マカクおよびマウスの網膜におけるキャプシドバリアントの相対的な形質導入および導入遺伝子発現の効率の評価を示す。
【図２１】図２１は、バーコード付けされたベクターのＩｖｔ注射の２週間後におけるＲＧＣ標識された動物（１および２）を示す。
【００３７】
【図２２】図２２は、バーコード付けされたベクターのＩｖｔの２０日後におけるＰＲ標識された動物３を示す。バーコード付けされたベクターの増強された形質導入は、ＡＡＶ５−ＧＦＰの黄斑下注射のための網膜切開部の近位で明らかである。ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、ＯＤおよびＯＳにおける視野の外側の周辺部に存在する。
【図２３】図２３は、バーコード付けされたベクターのＩｖｔの２０日後におけるＰＲ標識された動物４を示す。バーコード付けされたベクターの増強された形質導入は、ＡＡＶ５−ＧＦＰの黄斑下注射のための網膜切開部近位で明らかである。ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、ＯＤにおける視野の外側の周辺部に存在する。
【００３８】
【図２４】図２４は、３回目のスクリーニングの結果を示す。上から下へ、配列番号４５、および３６〜４４に対応する配列である。
【図２５】図２５は、さらなる３回目のスクリーニングの結果を示す。上のパネルにおいて、上から下へ、配列番号４５、２５、１２、２４、５６〜５９、１４、１１、６０〜６４、ならびに下のパネルにおいて、上から下へ、配列番号４５、３６、６５、３９、３７、４０、４１、３８、４３および４４に対応する配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
ＡＡＶ由来のベクターは、他のベクターと比較して低い病原性、エピソームの局在、および安定な導入遺伝子発現に起因して、ヒト遺伝子治療の適用のための有望なツールである。ＡＡＶ粒子は、眼への、特に網膜への治療用遺伝子の送達のために、多大な見込みを示す（Pierce et al. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015, 5(9):a017285；Schon et al., Eur J Pharm Biopharm. 2015 95(Pt B):343-52；Barnard et al., Cold Spring Harb Perspect Med. 2014, 5(3):a017293；Trapani et al., Prog Retin Eye Res. 2014,43:108-28；Carvalho and Vandenberghe, Vision Res. 2015,111(Pt B):124-33；Dalkara and Sahel, C R Biol. 2014, 337(3):185-92；Petrs-Silva and Linden, Clin Ophthalmol. 2014;8:127-36）。網膜細胞に対する指向性を有するＡＡＶ粒子の形質導入効率を改善することは、したがって、非常に有益であろう。血清型２のＡＡＶは、特定の眼細胞、例えば網膜細胞に対する指向性を有することが既に知られている。したがって、本明細書において提供されるのは、同じ細胞型におけるキャプシドバリアントのうちのいずれかを有していない対応するｒＡＡＶの形質導入効率と比較して（例えば、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有する対応するｒＡＡＶ２と比較して）、キャプシドタンパク質において置換を有する野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）粒子のバリアント、かかる粒子の組成物、ならびにこれらの組成物を用いて１つ以上の特定の細胞型（例えば視細胞、網膜神経節細胞、神経網膜細胞、プルキンエ細胞および上衣細胞）に形質導入する方法である。
【００４０】
ＡＡＶの構造およびキャプシドタンパク質
ＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成され、これは、プラス鎖（positive-sensed）またはマイナス鎖（negative-sensed）のいずれかである。ＤＮＡ鎖の各々の末端に存在するのは、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）である。ＩＴＲの間に存在するのは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）：ｒｅｐおよびｃａｐである。ｒｅｐ  ＯＲＦは、ＡＡＶの生活環にとって必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複する遺伝子からなる。ｃａｐ  ＯＲＦは、キャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の重複するヌクレオチド配列を含み、これらは、互いに相互作用して、正二十面体対称のキャプシドを形成する。
【００４１】
キャプシドタンパク質は、ｐ４０と名付けられた同じプロモーターにより制御され、同じｍＲＮＡから翻訳される。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、それぞれ、８７、７２および６２キロダルトンである。ＡＡＶキャプシドは、６０個のキャプシドタンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなり、これらは、１：１：１０の比において正二十面体対称に配置される。
【００４２】
配列番号１は、野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１アミノ酸配列の一例に相当する。ＡＡＶ２  ＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質は、それぞれ、ＶＰ１のアミノ酸１３８〜７３５および２０４〜７３５に相当する。配列番号２および３は、野生型ＡＡＶ２  ＶＰ２およびＡＡＶ２  ＶＰ３アミノ酸配列の例に相当する。
野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１アミノ酸配列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL（配列番号１）
野生型ＡＡＶ２  ＶＰ２アミノ酸配列：
MAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL（配列番号２）
野生型ＡＡＶ２  ＶＰ３  アミノ酸配列：
MATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL（配列番号３）
【００４３】
バリアント組み換えＡＡＶタンパク質
ＡＡＶ粒子の組織指向性および形質導入効率は、キャプシドの表面において暴露されるアミノ酸残基の性質により決定される（Wu et al., J Virol. 2006, 80(22):11393-7）。したがって、キャプシドタンパク質のアミノ酸を操作することにより、粒子の組織指向性を微調整する、およびまた形質導入効率を改善する機会が提供される。しかし、キャプシドタンパク質の特定の操作（例えばアミノ酸の置換）によっては、キャプシドタンパク質がミスフォールディングされたり、全くキャプシドを形成しなかったりする場合がある。タンパク質のミスフォールディングおよびキャプシドのミスフォールディングの問題を回避するために、キャプシドタンパク質の可変ループのみにおいて置換を行うことにより構成されたバリアントＡＡＶ２キャプシドライブラリーから、本明細書において開示される組み換えＡＡＶ２（ｒＡＡＶ２）バリアントタンパク質および粒子を同定した。本明細書において、「可変ループ」はまた「可変領域」としても言及される。ＡＡＶ２は、ＶＲＩ〜ＶＲＩＸと番号付けされた９つの可変領域を有する。図１Ａは、可変ループを有する野生型ＡＡＶ２タンパク質の構造を示す。Marsicら（Mol Ther. 2014, 22(11):1900-9）は、かかるＡＡＶ２キャプシドライブラリーを作製した方法、ならびにその特徴を記載する。
【００４４】
マウスモデルならびにマカクモデルにおけるＡＡＶ２キャプシドライブラリーのスクリーニングは、網膜細胞（例えばＰＲ、ＲＧＣおよび神経網膜細胞）に形質導入する効率が野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の形質導入効率と比較して増強されたＡＡＶ２バリアントタンパク質の同定をもたらした。
【００４５】
したがって、本明細書において提供されるのは、野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１配列（例えば配列番号１において記載されるようなもの）と比較して置換を含む、ｒＡＡＶ２キャプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸置換は、野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１タンパク質により定義されるような可変領域において存在する。本明細書において記載されるようなアミノ酸の任意の配置は、配列番号１において記載されるような野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１配列の配列に関するものであることが、理解されるべきである。ＡＡＶ２  ＶＰ１の多様な可変領域に対応するアミノ酸は、表１において示されるとおりである。
表１：ＡＡＶ２キャプシドタンパク質可変領域および対応するアミノ酸
【表１】
2020508667.tif 000003
【００４６】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、任意の１つの可変領域（例えばＶＲＩ、ＶＲＩＩ、ＶＲＩＩＩ、ＶＲＩＶ、ＶＲＶ、ＶＲＶＩ、ＶＲＶＩＩ、ＶＲＶＩＩＩまたはＶＲＩＸ）において１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、１つより多くの可変領域（例えばＶＲＩおよびＶＲＩＩ、ＶＲＩおよびＶＲＶＩＩ、ＶＲＶおよびＶＲＶＩＩ、ＶＲＶおよびＶＲＩおよびＶＲＶＩＩまたはＶＲＩＶおよびＶＲＩＩ）において１つ以上のアミノ酸置換を有する。本明細書において開示されるようなバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、１つより多くの可変領域の任意の組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有していてもよく、本明細書において上または他の箇所において提供される例に限定されないことが、理解されるべきである。
【００４７】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、表２における配列または置換において示されるアミノ酸置換のうちのいずれか１つ以上を含む。例えば、いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、可変領域ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥを有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、可変領域ＶＲＶにおいて配列ＤＦを有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、可変領域ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよびＤＦを有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、可変領域ＶＲＶにおいて配列ＤＧＥおよびＤＦを、ならびにＶＲＩにおいて配列ＮＡを有する。いくつかの態様において、ＤＧＥは、アミノ酸位置４９２〜４９４において存在する。いくつかの態様において、ＤＦは、アミノ酸位置４９９〜５００において存在する。表２において列記される位置は、多くの可能なアミノ酸位置のうちのほんの１つであり、非限定的であることが、理解されるべきである。例えば、ＤＧＥ配列は、可変領域ＶＲＶ（例えば４９０〜４９２、４９５〜４９７、４９６〜５００または５００〜５０３）中の何処に存在してもよい。本明細書において何処かに開示されるアミノ酸置換の全ては、本明細書において開示される他のアミノ酸置換のうちのいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。例えば、アミノ酸位置４９６〜５００におけるＤＧＥ配列を、アミノ酸位置４９９および５００におけるＤＦ配列と組み合わせて、ＶＲＶにおいてＤＧＥＤＦ配列（配列番号３２）をもたらしてもよい。
【００４８】
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、表２の第２列において列記されるアミノ酸を有する。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）は、図３４において見出される配列に対応するアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、かかるアミノ酸は、表２において表される位置から偏った位置において存在してもよい。いくつかの態様において、偏り（offset）の幅は、表２において表される位置に対していずれかの方向（上流および下流）において、５アミノ酸まで（例えば１、２、３、４または５アミノ酸）である。例えば、プロリンは、ＶＲＶにおける位置４９２において指定されているが、プロリンは、４９０から４９７までの任意の位置において存在してもよい（ＶＲＶにおける位置４９２におけるＳからＰへの置換を参照されたい）。いくつかの態様において、表２の第２列において列記されるアミノ酸は、ＡＡＶ２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質におけるもの、例えば、ＡＡＶ１、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３の相同な可変領域におけるものである。
【００４９】
いくつかの態様において、Ｘにより表されるアミノ酸は、配列番号１に記載されるとおりの野生型ＡＡＶ２配列におけるアミノ酸である。例えば、配列番号４において記載される配列ＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲは、配列番号１において記載される野生型ＡＡＶ２  ＶＰ１タンパク質のＶＲＶＩＩにおけるアミノ酸５４５〜５５６に相同である。したがって、いくつかの態様において、配列ＥＤＡＴＥＮＸＩＸＸＤＲ（配列番号４）は、配列ＥＤＡＴＥＮＮＩＤＩＤＲ（配列番号３４）であってよい。同様に、いくつかの態様において、配列ＲＸＸＤＤ（配列番号８）は、配列ＲＤＤＤＤ（配列番号３５）である。いくつかの態様において、Ｘにより表されるアミノ酸は、他のＡＡＶ血清型（例えば１、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）における相同な位置におけるアミノ酸である。
表２：バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質におけるアミノ酸の置換または配列
【表２】
2020508667.tif 000004
2020508667.tif 000005
【００５０】
バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質のいくつかの非限定的な例を、図３および５において示す。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１１〜２３（図３を参照）または配列番号２４〜２８（図５を参照）または３６〜４４（図２４を参照）または５６〜６５（図２５を参照）のうちのいずれか１つにおいて記載される配列を有する。例えば、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５により記載されるような配列を有していてもよい。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１１により記載されるような配列を有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１２により記載されるような配列を有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号２４の配列を有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号２５の配列を有する。
【００５１】
いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＶにおいて、および配列番号４の配列において記載されるとおりＶＲＶＩＩにおいて、配列ＤＧＥおよびＤＦを有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＩにおいて配列ＮＡを有し、ＶＲＶにおいて、および配列番号５の配列において記載されるとおりＶＲＶＩＩにおいて、配列ＤＧＥおよびＤＦを有する。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質は以下を含む：（ａ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＮＡ、ＥＡ、ＤＡ、ＡＳ、ＡＡ、ＤＴ、ＮＳ、ＧＡ、ＧＳ、ＲＳ、ＴＡ、ＴＳ、ＥＳ、ＧＴ、ＱＡ、またはＴＴ；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；およびＴ５０３Ｐ、（ｂ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＮＴ、ＥＳ、ＧＳ、ＮＡ、ＡＳ、ＡＡ、ＧＡまたはＤＳ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＳＤ、ＩＤおよび／またはＮＸＭ；Ｓ４９２Ａ；ＶＲＶにおけるＤＦ；ならびにＶＲＶＩにおけるＤＧ、（ｃ）ＶＲＩにおける、ＱＳＧＡＳ（配列番号４６）、ＮＡＧＡＳ（配列番号４７）、ＴＴＧＡＴ（配列番号４８）、ＥＡＧＡＳ（配列番号４９）、ＴＴＧＡＳ（配列番号５０）またはＧＡＧＡＳ（配列番号５１）、（ｄ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＥＡ、ＱＡ、ＮＡ、ＡＳまたはＥＳ；Ｔ４９１Ｖ；Ｙ５００Ｆ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＡＡＤＤＸＥＸＤＧ（配列番号１０）、（ｅ）ＶＲＩにおけるＱＳ、ＤＳ、ＮＡ、ＡＳ、ＤＡまたはＡＴ；Ｅ５３０Ｄ；およびＶＲＶＩＩにおけるＡＧＲＡＤＩＸＸＸＳ（配列番号３３）、あるいは（ｆ）ＶＲＩにおける、ＱＳＧＡＳ（配列番号４６）、ＮＡＧＡＳ（配列番号４７）、ＡＳＧＡＳ（配列番号５２）、ＧＡＧＡＳ（配列番号５１）、ＴＡＧＡＳ（配列番号５３）、ＱＴＧＡＳ（配列番号５４）またはＴＴＧＡＳ（配列番号５０）；ＶＲＶにおけるＱＤＸＥ；Ｙ５００Ｆ；Ｔ５０３Ｐ；およびＶＲＶＩＩにおけるＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５）。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＩＶ領域について表２における１つ以上の置換を有する。いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、ＶＲＶＩＩ領域について表２における１つ以上の置換を有する。
【００５２】
マウスおよびマカクモデルにおけるスクリーニングを用いてバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質を同定した後、形質導入効率を改善するためにさらなる修飾を行った。例えば、Ｒｈｏ−ＧＦＰマウスにおける組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにより視細胞の相対的な形質導入を定量するための方法を用いて、硝子体内注射の後で外側網膜の形質導入を行うことができる合理的に設計されたキャプシドバリアント、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）を同定した（Kay et al., PLoS One. 2013, 8(4):e62097）。したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載されるＡＡＶ２バリアントタンパク質のうちのいずれか１つは、以下のアミノ酸置換：Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖのうちのいずれか１つ、またはこれらの組み合わせをさらに含んでもよい。例えば、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１〜２８のうちのいずれか１つにおいて記載される配列を有し、既に有していない場合には、位置２７２、２７２、５００および７３０のうちの１つ以上においてフェニルアラニンを有する。別の例において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、置換Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００ＦおよびＹ７３０Ｆを含む。別の例において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、置換Ｙ２７２ＦおよびＹ４４４Ｆを含む。
【００５３】
いくつかの態様において、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１〜２８のうちのいずれか１つにおいて記載される配列を有し、既に有していない場合には、位置４９１においてバリンを有する。例えば、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、ＶＲＶにおいて、配列番号４の配列において記載されるとおりＶＲＶＩＩにおいて配列ＤＧＥおよびＤＦを、およびＹ４４４Ｆ置換を含んでもよい。いくつかの態様において、本明細書において記載されるＡＡＶ２バリアントタンパク質のうちのいずれか１つは、以下のアミノ酸置換：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ７００ＦおよびＹ７０４Ｆのうちのいずれか１つ、またはこれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、バリアントＶＰ１タンパク質（例えばバリアントＡＡＶ２  ＶＰ１タンパク質）である。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、ＡＡＶ  ＶＰ２タンパク質（例えばバリアントＡＡＶ２  ＶＰ２タンパク質）である。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、ＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質（例えばバリアントＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質）である。バリアントのうちの任意のものが、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質におけるものであってよいことが、理解されるべきである。
【００５５】
本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つは、本明細書において記載される任意の１つの単一のアミノ酸置換を有していても、本明細書において記載されるアミノ酸置換の任意の組み合わせを有していてもよいことが、理解されるべきである。 例えば、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質は、配列ＲＸＸＤＤ（配列番号８において記載される）を唯一の置換として有していてもよく、またはそれは、さらなるアミノ酸置換（例えばＶＲＩにおけるＮＡ；Ｙ４４４Ｆ；ＶＲＩＶにおけるＰ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖおよび／またはＲ４５９Ｔ）を有していてもよい。
【００５６】
本明細書において企図されるのはまた、血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書において記載されるアミノ酸置換のうちのいずれか１つは、ＡＡＶ２の可変領域に対して相同である、血清型２以外の血清型のキャプシドタンパク質の可変領域におけるものである。いくつかの態様において、血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２以外の任意の血清型（例えば１、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）のものである。いくつかの態様において、血清型２以外の血清型のバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質は、緊密に関係する血清型（例えばＡＡＶ１またはＡＡＶ６）のものである。ＰＣＴ出願公開番号WO2015121501A1を参照。
【００５７】
バリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸
本明細書において提供されるのはまた、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質のうちのいずれか１つをコードする核酸である。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸は、プラスミド中に含まれる。
【００５８】
組み換えＡＡＶ粒子
本明細書において提供されるのは、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子である。いくつかの態様において、粒子は、空の粒子（例えば目的の遺伝子を含む核酸ベクターを含まないもの）である。いくつかの態様において、ＡＡＶ２粒子は、目的の遺伝子を含む核酸ベクターを含む。本明細書において用いられる場合、「目的の遺伝子」とは、目的のＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５９】
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のうちのいずれか１つを含むｒＡＡＶ２粒子は、血清型２のＩＴＲおよび／またはｒｅｐ  ＯＲＦを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ２粒子は、シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子であり、これは、以下を含む；（ａ）血清型２から誘導されたキャプシドタンパク質からなるキャプシド、および（ｂ）別の血清型（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）からのＩＴＲを含む核酸ベクター。例えば、粒子は、血清型５のＩＴＲおよび血清型２のキャプシドを有していてもよい。かかるシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５／２と指定されるであろう。
【００６０】
目的のタンパク質は、検出可能なマーカーまたは治療用タンパク質であってもよい。検出可能なマーカーとは、可視化することができる（例えば、裸眼を用いて、または顕微鏡下において）分子である。いくつかの態様において、検出可能なマーカーは、蛍光分子、生物発光分子、または色を提供する分子（例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼおよびスフェリオデノン（spheriodenone））である。いくつかの態様において、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質または機能性ペプチドまたはその機能性ポリペプチドである。
【００６１】
いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用タンパク質をコードし、「治療用遺伝子」として言及される。治療用遺伝子は、それが送達される細胞、組織または器官において治療効果を提供し得る。例えば、眼（または２つの眼）の硝子体内の空間に送達された治療用遺伝子は、当該遺伝子が送達された眼（または２つの眼）の網膜の視細胞に利益をもたらし得る。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、それが送達されるもの以外の細胞、組織または器官に治療上の利益を提供する。例えば、脳へ送達された遺伝子は、視神経を介して眼の網膜に到達し得、１つ以上の型の網膜細胞（例えば網膜神経節細胞）に利益をもたらし得る。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、抗体、ペプチボディ、増殖因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、血栓溶解剤、酵素、骨形成タンパク質、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝血剤、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは遺伝子編集のための他の核酸もしくはタンパク質をコードする。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用ＲＮＡ、例えば、小分子干渉ＲＮＡをコードする。
【００６２】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ２粒子中に含まれる核酸ベクターは、以下の１つ以上を含む：（ａ）目的の遺伝子を含む１つ以上の異種性核酸領域、および（ｂ）１つ以上の核酸領域（例えば異種性核酸領域）に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む１つ以上の領域。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子中の核酸ベクターは、異種性核酸領域の発現を促進する制御配列（例えばプロモーター）を含む、１つ以上の核酸領域を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ２粒子中の核酸ベクターは、対象のゲノム中への異種性核酸領域の（任意に、発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域と共に）組み込みを促進する配列を含む、１つ以上の核酸領域を含む。
【００６３】
発現制御配列の非限定的な例として、プロモーター、インシュレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナルおよびポリ（Ａ）テイルが挙げられる。かかる制御配列の任意の組み合わせが、本明細書において企図される（例えばプロモーターおよびエンハンサー）。
いくつかの態様において、１つ以上のプロモーターを、異種性核酸中のコードヌクレオチド配列に作動的に連結させてもよい。プロモーターは、プロモーター配列が、当該ヌクレオチド配列の転写を制御および／または調節する場合に、ヌクレオチド配列に「作動的に連結される」。プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであってよい。
【００６４】
例えば、異なる強度の構成的プロモーターを用いることができる。本明細書において記載される核酸ベクターは、転写を促進することにおいて一般に活性であるウイルスプロモーターまたは哺乳動物遺伝子からのプロモーターなどの１つ以上の構成的プロモーターを含んでもよい。構成的ウイルスプロモーターの非限定的な例として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ  Ｅ１Ａサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。構成的哺乳動物プロモーターの非限定的な例として、β−アクチンプロモーター（例えばニワトリβ−アクチンプロモーター）およびヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーターにより例示されるような多様なハウスキーピング遺伝子プロモーターが挙げられる。いくつかの態様において、キメラウイルス／哺乳動物プロモーターとして、キメラＣＭＶ／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ、ＣＢまたはＣＡＧ）プロモーターを挙げることができる。
【００６５】
誘導性プロモーターおよび／または調節エレメントはまた、目的のタンパク質またはポリペプチドの適切な発現レベルを達成するために企図され得る。好適な誘導性プロモーターの非限定的な例として、チトクロムＰ４５０遺伝子、ヒートショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子などの遺伝子、およびエストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子からのものが挙げられる。誘導性プロモーターの別の例は、テトラサイクリンに対して応答性であるｔｅｔＶＰ１６プロモーターである。
【００６６】
組織特異的プロモーターおよび／または調節エレメントもまた、本明細書において企図される。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子を、またバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子と同じ細胞、組織または器官を標的とするプロモーターと組み合わせることは、有益であり得る。例えば、網膜の視細胞を標的とするバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子は、また視細胞または網膜を標的とするプロモーターを含む核酸を、全体としてキャプシド形成し得る。いくつかの態様において、網膜を標的とする細胞型特異的プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１）である。ｈＧＲＫ１プロモーターの非限定的な例は、Beltran et al., 2010, Gene Ther. 17:1162、Zolotukhin et al., 2005, Hum Gene Ther. 16:551およびJacobson et al., Mol Ther. 13:1074において見出すことができる。いくつかの態様において、網膜特異的プロモーターは、Pleiadesミニプロモーター（例えばＰｌｅ１５５）である。いくつかの態様において、網膜特異的プロモーターは、グリア繊維酸性タンパク質プロモーターである。網膜細胞型特異的プロモーターとして用いることができるプロモーターの他の非限定的な例として、ｒｅｄオプシンプロモーター「ＰＲ２．１」（これは、ＭおよびＬ錐体細胞を標的とする）、キメラ「ＩＲＢＰｅ−ＧＮＡＴ２’プロモーター（これは、全てのコーンを標的とする）、ＩＲＢＰプロモーター（これは、桿体細胞を標的とする）、Ｇｒｍ６−ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター（これは、双極細胞を標的とする）、Ｔｈｙ１（これは、ＲＧＣを標的とする）、他のPleiadesプロモーター、桿体細胞オプシンプロモーター（これは、桿体細胞を標的とする）、錐体アレスチンプロモーター（これは、全ての錐体細胞を標的とする）、ＶＭＤ２またはベストロフィンプロモーター（これは、ＲＰＥ細胞桿体細胞を標的とする）。
【００６７】
いくつかのプロモーターは、公共で利用可能であり、記載されている。例えば、Ｐｌｅ１５５プロモーターは、Addgeneプラスミドリポジトリを通して利用可能であり（Addgeneプラスミド＃29011、addgene.org/29011/）、Scalabrinoら（Hum Mol Genet. 2015, 24(21):6229-39）において記載されている。Yeら（Hum Gene Ther.；27(1):72-82）は、ＰＲ１．７と称されるこのプロモーターのより短いバージョンを記載する。Ｔｈｙ１プロモーターコンストラクトもまた、Addgeneプラスミドリポジトリを通して利用可能である（Addgene プラスミド＃20736、addgene.org/20736/）。ＧＲＭ６プロモーターコンストラクトはまた、Addgeneプラスミドリポジトリを通して利用可能である（Addgene プラスミド＃66391、addgene.org/66391/）。Guziewiczら（PLoS One. 2013 Oct 15;8(10):e75666）およびEsumiら（J Biol Chem. 2004, 279(18):19064-73）は、ＶＭＤ２プロモーターの使用の例を提供する。Dykaら（Adv Exp Med Biol. 2014；801：695-701）は、ＩＲＢＰおよびＩＲＢＰｅ−ＧＮＡＴ２プロモーターを含む、遺伝子治療における使用のための錐体特異的プロモーターを記載する。ＰＲ２．１プロモーターの使用は、Komaromyら（Gene Ther. 2008 Jul;15(14):1049-55）において、その特徴づけは、Karimら（Tree Physiol. 2015 Oct;35(10):1129-39）において示されている。Aartsenら（PLoS One, 5(8):e12387）は、ミュラーグリア細胞においてＧＦＰ発現を駆動するためのＧＦＡＰプロモーターの使用を記載する。ミュラーグリア特異的プロモーターの他の例は、ＲＬＢＰ１およびＧＬＡＳＴである（Vazquez-Chona, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009, 50(8):3996-4003；Regan et al., Journal of Neuroscience, 2007, 27(25)：6607-6619）。
【００６８】
合成プロモーターもまた、本明細書において企図される。合成プロモーターは、例えば、既知のプロモーター、調節エレメント、転写因子結合部位、エンハンサーエレメント、リプレッサーエレメントなどの領域を含んでもよい。
プロモーターは、プロモーターは、本明細書において開示されるプロモーターのうちのいずれか１つのフラグメント、または完全なプロモーターの部分的なプロモーター活性（例えば活性の１０〜９０、３０〜６０、５０〜８０、８０〜９９または９０〜９９．９％）を保持するものであってもよいことが理解されるべきである。
【００６９】
本明細書において記載される任意の核酸ベクターは、ウイルスのキャプシドによりキャプシド形成され得る。いくつかの態様において、ｃａｐ遺伝子は、検出可能なマーカーおよびＡＡＶ血清型２のＶＰタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように修飾される。いくつかの態様において、ペプチドは、位置５８７／５８８において、またはＶＰ２のＣ末端において、キャプシドタンパク質中に挿入される。いくつかの態様において、核酸ベクターは、環状である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、一本鎖である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、二本鎖である。いくつかの態様において、二本鎖核酸ベクターは、例えば、当該核酸ベクターの別の領域に相補的な核酸ベクターの領域を含む自己相補的ベクターであってよく、これは、核酸ベクターの二本鎖性の形成を開始させる。
【００７０】
ｒＡＡＶ粒子を作製する方法
ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを生成する多様な方法が知られている（例えば、本明細書において参考として援用されるZolotukhin et al. Production and purification of serotypes 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.  Methods 28 (2002) 158-167；ならびに米国特許出願番号US20070015238およびUS20120322861；ならびにＡＴＣＣおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照）。いくつかの態様において、目的の遺伝子を含むベクター（例えばプラスミド）は、核酸ベクターがキャプシドの内部にパッケージングまたはキャプシド形成されて、その後精製されるように、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えばＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）ならびにｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードし、これらは、本明細書において記載されるような修飾されたＶＰ領域を含む）を含む、１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせて、ヘルパーまたは産生株（producer）細胞と称される組み換え細胞中に遺伝子導入されてもよい。
【００７１】
哺乳動物ヘルパー細胞の非限定的な例として、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、またはＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６５１（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６５０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１０（商標）、またはＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１（商標）を参照）が挙げられる。昆虫ヘルパー細胞の非限定的な例は、Ｓｆ９細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１７１１（商標）を参照）である。ヘルパー細胞は、Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質をコードするｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含んでもよい。いくつかの態様において、パッケージングは、in vitroで（例えば細胞の外側で）行われる。
【００７２】
いくつかの態様において、目的の遺伝子を含む核酸ベクター（例えばプラスミド）は、例えば、ｒＡＡＶ粒子が、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子および同じ血清型または異なる血清型のｃａｐ遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わされてパッケージングされるように、ヘルパー細胞中に導入される。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、および以下のヘルパー遺伝子：Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子のうちの１つ以上を含む第２のヘルパープラスミドを含む。明確性のために、ヘルパー遺伝子とは、ヘルパータンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡをコードする遺伝子である。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、PlasmidFactory（Bielefeld, Germany）製のｐＤＦ６、ｐＲｅｐ、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミドを参照；他の製品およびサービスは、以下から入手可能である：Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA；pxx6；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adeno associated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188）。特定の血清型についての野生型ＡＡＶコード領域をコードするプラスミドもまた、公知であり、入手可能である。例えば、ｐＳｕｂ２０１は、野生型ＡＡＶ２ゲノムのコード領域を含むプラスミドである（Samulski et al. (1987), J Virology, 6:3096-3101）。
【００７３】
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、以下から入手可能な製品およびサービスを参照：Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA；およびGene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine（商標）.  Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201（著作権により保護）Humana Press Inc. 2003. Chapter 10.  Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第5,139,941号および同第5,962,313号、これらの全ては、本明細書において参考として援用される）。
ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列についてのGenebank参照番号は、特許公開WO 2012064960において列記され、これは、その全体において本明細書において参考として援用される。
【００７４】
ｒＡＡＶ粒子の生成方法のうちの非限定的な方法を、次に記載する。所望されるＡＡＶ血清型についてのｒｅｐおよびｃａｐ  ＯＲＦならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブなプロモーターの転写制御下において含む、１つ以上のヘルパープラスミドを生成または入手する。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、および任意にアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子のうちの１つ以上を、それらのネイティブなプロモーターの転写制御下において含む。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、所望されるＡＡＶ血清型についてのｃａｐ  ＯＲＦ（および任意にｒｅｐ  ＯＲＦ）、ならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブなプロモーターの転写制御下において含む。ｃａｐ  ＯＲＦはまた、本明細書において記載されるような修飾されたキャプシドタンパク質を生成するための、１つ以上の修飾を含んでもよい。一例として、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）に、ＣａＰＯ４媒介型トランスフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの脂質またはポリマー性分子を介して、ヘルパープラスミドおよび核酸ベクターを含むプラスミドを導入する。ＨＥＫ２９３細胞を、次いで、少なくとも６０時間にわたりインキュベートして、ｒＡＡＶ粒子を産生させる。あるいは、ＨＥＫ２９３細胞に、上記の方法を介して、１つ以上の目的の遺伝子を含むＡＡＶ−ＩＴＲ、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドを導入し、ヘルパーウイルスを共導入する。ヘルパーウイルスとは、ＡＡＶの複製を可能にするウイルスである。ヘルパーウイルスの例は、アデノウイルスおよびヘルパーウイルスである。
【００７５】
あるいは、別の例において、Ｓｆ９ベースの産生株である安定な細胞株に、核酸ベクターを含む単一の組み換えバキュロウイルスを感染させる。さらなる代替として、別の例において、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ  細胞株に、核酸ベクターを含むＨＳＶと、任意に本明細書において記載されるようなｒｅｐおよびｃａｐ  ＯＲＦ、アデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子をそれぞれのネイティブなプロモーターの転写制御下においてを含む１つ以上のヘルパーＨＳＶとを感染させる。ＨＥＫ２９３、ＢＨＫまたはＳｆ９細胞を、次いで、少なくとも６０時間にわたりインキュベートして、ｒＡＡＶ粒子を産生させる。ｒＡＡＶ粒子を、次いで、当該分野において公知であるか本明細書において記載される任意の方法を用いて、例えば、イオジキサノール段階勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿により、精製してもよい
【００７６】
ヘルパーウイルスベースの系を用いるＡＡＶの大規模生成のための方法は、公知である。例えば、Clementら（Hum Gene Ther. 2009, 20(8):796-806）を参照。中和性の抗ＡＡＶ抗体に対してより耐性であり得るエキソソーム関連ＡＡＶを生成する方法もまた、公知である（Hudry et al., Gene Ther. 2016, 23(4):380-92；Macguire et al., Mol Ther. 2012, 20(5):960-71）。
シュードタイプ化ｒＡＡＶベクターを生成および使用するための方法もまた、当該分野において公知である（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001；Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000；Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照）。
【００７７】
組成物
ｒＡＡＶ粒子の使用を容易にするための多様な処方が開発されてきた。例えば、ｒＡＡＶ粒子の注射可能な水溶液の投与のために、溶液を好適に緩衝化して、必要な場合には、液体の希釈剤をはじめに十分な塩またはグルコースで等張にしてもよい。いくつかの態様において、本明細書において提供されるような組成物は、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子のうちのいずれか１つを複数含む。いくつかの態様において、組成物は、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子の１つより多くを複数含む。いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、対象に、その材料が薬理学的に有用である様式において材料を提供することを意味する。
【００７８】
したがって、いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアを含む。用語「キャリア」とは、それと共にｒＡＡＶ粒子を投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる医薬用キャリアは、無菌の液体（例えば、水、油脂、食塩水、デキストロースおよびグリセロールの水溶液）、懸濁剤、保存剤（例えば安息香酸メチル、安息香酸エチル、およびプロピルヒドロキシ安息香酸）、およびｐＨ調整剤（無機および有機の酸および塩基など）
であってよい。いくつかの態様において、キャリアは、緩衝化食塩水（例えばリン酸緩衝化食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水）を含む。ＵＳＰグレードのキャリアおよび賦形剤は、ヒト対象へのｒＡＡＶ粒子の送達のために特に有用である。かかる組成物は、さらに任意にリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロパーティクル、ナノスフェア、またはナノパーティクルを含んでもよく、あるいは、それを必要とする対象の細胞、組織、器官または身体への投与のために、別段に処方されてもよい。かかる組成物を作製するための方法は、周知であり、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２２版（Pharmaceutical Press、2012年）において見出すことができる。
【００７９】
いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、０．０１４％のTween 20（ポリソルベート２０）を添加した平衡塩類溶液（ＢＳＳ）を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に、０．００１％のPluronic F-68を添加したものを含む。
【００８０】
典型的には、組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えばｒＡＡＶ粒子）またはそれより多くを含んでもよいが、活性剤のパーセンテージは、変化し得、便利に、処方物全体の重量または容積の約１または２％と約７０％または８０％またはそれより多くとの間であってよい。当然ながら、各々の治療上有用な組成物中の治療剤（例えばｒＡＡＶ粒子）の量は、化合物の所与の単位用量において好適な投与量が得られるような方法において、調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品の保存期限、ならびに他の薬理学的な考慮点などの要因は、かかる医薬処方物を調製する当業者により企図され、多様な投与および処置のレジメンが望ましい場合がある。
【００８１】
注射可能な用途のためのｒＡＡＶ粒子組成物の医薬形態として、無菌の水性の溶液または分散が挙げられる。いくつかの態様において、形態は、容易な注射針通過性（syringability）が存在する程度まで、無菌かつ液体である。いくつかの態様において、形態は、製造および貯蔵の条件下において安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されている。いくつかの態様において、形態は、無菌である。キャリアは、例えば、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および／または植物性油脂を含む、溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
【００８２】
対象への投与のための組成物の調製は、当該分野において公知である。例えば、投与量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解して、１０００ｍｌの皮下点滴液（hypodermoclysis fluid）に添加しても、または注入が提案される部位において注射してもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第１５版、１０３５〜１０３８および１５７０〜１５８０頁を参照）。処置されている対象の状態に依存して、投与量におけるいくらかのバリエーションが、必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象にとって適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与のために、調製物は、無菌性、発熱性、ならびに、例えばＦＤＡの生物製剤部（Office of Biologics）の基準により要求されるような一般的な安全性および純度の標準に合致すべきである。
【００８３】
細胞に形質移入する方法
ｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つ、または本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、細胞、組織または器官に形質導入するために用いることができる。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶのうちのいずれか１つ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）の粒子を用いて形質導入される細胞、組織または器官は、治療用遺伝子であり得るか、または研究のために所望されるものである、目的の遺伝子を導入される。いくつかの態様において、細胞、組織または器官は、当該細胞、組織または器官が培地中でインキュベートされるかまたはこれを灌流されるin vitroでのセッティングにおいて、形質導入される。細胞は、特定の条件下において培養される多くの細胞のうちの１つであっても、採取される器官の一部であっても、オルガノイドの一部であっても、または生物であってもよい。
【００８４】
いくつかの態様において、細胞、組織または器官は、in vivoで、例えば、疾患を処置することを目的として、形質導入される。いくつかの態様において、かかるｒＡＡＶ粒子は、治療用タンパク質またはＲＮＡをコードする目的の遺伝子を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、眼（もしくは２つの眼）または脳の細胞または組織に形質導入する方法である。いくつかの態様において、眼（もしくは２つの眼）または脳における特定の組織が標的とされる。例えば、網膜または網膜の１つ以上の細胞型を標的としてもよい（例えば視細胞（ＰＲ）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、双極細胞、線維柱帯網、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、アマクリン細胞、星状膠細胞、水平細胞、ミクログリア、またはミュラーグリア）。
【００８５】
本明細書において提供される組成物のうちのいずれか１つを用いて処置することができる網膜の疾患のいくつかの非限定的な例として、以下が挙げられる：加齢黄斑変性、全脈絡膜萎縮、色覚障害、レーバー先天黒内障、網膜色素変性、シュタルガルト病、１色覚、青錐体色覚異常（Blue cone monochromacy）、錐体杆体ジストロフィー、先天性停止性夜盲症、レーバー遺伝性視神経症および緑内障。網膜の神経細胞ならびに脳および耳などの感覚器などの他の神経細胞を、本明細書において提供される組成物のうちのいずれか１つを用いて処置することができる、いくつかの非限定的な症候性疾患の例として、バルデ・ビードル症候群、糖原病、セロイド・リポフスチン沈着（Ceroid lipofuscinosis）、カナバン病、フリードライヒ運動失調症、ポンペ・アッシャー症候群（Pompe’s and Usher’s syndrome）が挙げられる。したがって、本明細書において開示されるようなバリアントｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つまたは本明細書において開示されるようなバリアントｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、内耳を標的とするために用いることができる。
【００８６】
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子のうちのいずれか１つ以上を含む組成物は、視細胞（ＰＲ）に提供される。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子のうちのいずれか１つ以上を含む組成物が、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に提供される。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ（例えばバリアントｒＡＡＶ２）粒子を含む組成物は、ＰＲおよび／またはＲＧＣを担持する対象への硝子体内注射を介して、ＰＲおよび／またはＲＧＣに提供される。いくつかの態様において、組成物は、網膜下注射を介して提供される。いくつかの態様において、組成物は、内境界膜下注射を介して提供される。本明細書において開示されるような組成物を対象の眼（または２つの眼）へ投与する経路の他の非限定的な例として、前房内、眼窩周囲および結膜下注射が挙げられる。いくつかの態様において、組成物は、対象の外側膝状核中に注射することができる。かかる方法は、ＲＧＣを標的とするために用いることができる。いくつかの態様において、組成物は、対象の眼または２つの眼へ局所的に（例えば点眼剤中で）投与することができる。
【００８７】
いくつかの態様において、標的とされる脳の組織は、プルキンエ細胞または上衣細胞を含む。プルキンエ細胞は、深部小脳核に投射し、小脳皮質の唯一の出力細胞である。プルキンエ細胞に関連する状態として、毛細血管拡張性運動失調症およびニーマン・ピック病Ｃ型、ならびに小脳性本態性振戦が挙げられる。プルキンエ細胞はまた、アルツハイマー病および狂犬病ウイルスにおいても損傷を受け得る。プルキンエ細胞はまた、小脳の変性性疾患において役割を果たす（Ferrer et al., Clin Neuropathol. 1988, 7(1):22-8）。
【００８８】
上衣細胞は、脳および脊髄の中心管の脳室系の上皮性の裏打ち層である上衣を構成する。上衣細胞は、ＣＦＳの生成および制御において重要な役割を果たし、前脳におけるリザーバ細胞として作用し、これは、脳卒中の後で、in vivoおよびin vitroで幹細胞として脊髄において活性化され得る。したがって、これらの細胞は、ＣＳＦと接触する他の細胞に有益な分子を供給するために用いることができる。例えば、上衣細胞は、それらを１つ以上の増殖因子をコードする遺伝子で形質導入することにより、他の細胞に増殖因子を提供するために、用いることができる。
【００８９】
いくつかの態様において、上衣またはプルキンエ細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法は、上衣細胞またはプルキンエ細胞に、本明細書において提供される組成物のうちのいずれか１つを提供することを含む。いくつかの態様において、かかる組成物は、脳室内注射を介して対象に投与される。いくつかの態様において、プルキンエおよび／または上衣細胞に目的の遺伝子で形質導入するために用いられるバリアントｒＡＡＶ粒子は、ＶＲＶにおける配列ＤＧＥおよびＤＦ、ＶＲＩにおけるＮＡ；およびＶＲＶＩＩにおける配列番号５を含む。いくつかの態様において、組成物は、くも膜下腔内注射、大槽内注射、頭蓋内（例えば視床、脳室内または腹側被蓋）注射を介して、対象に投与される。
【００９０】
いくつかの態様において、細胞、組織または器官が形質導入される対象は、脊椎動物（例えば哺乳動物または爬虫類）である。いくつかの態様において、哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ハムスター、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、ロバまたはウサギである。非ヒト霊長類対象の非限定的な例として、マカク（例えばカニクイザルまたはアカゲザルマカク）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジーおよびオランウータン。いくつかの態様において、対象は、特定の疾患についてのモデルであるか、または目的の遺伝子によりコードされるタンパク質またはｓｉＲＮＡの薬物動態および／または薬物動態を研究するために用いられる。
【００９１】
疾患を「処置する」こととは、当該用語が本明細書において用いられる場合、対象により経験される疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重篤度を低下させることを意味する。本明細書において上または他の箇所において記載される組成物は、典型的には、望ましい結果を提供することができる量である有効量において対象に投与される。望ましい結果は、投与されている活性剤に依存するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、発現コンストラクトを宿主細胞、組織または器官にトランスファーすることができる粒子の量であってよい。治療上受入可能な量は、疾患、例えばレーバー先天黒内障を処置することができる量であってよい。医学および獣医学の分野において周知であるとおり、任意の一個体の対象のための投与量は、対象のサイズ、対表面積、年齢、投与されるべき特定の組成物、組成物中の活性剤、投与の時間および経路、一般的な健康、ならびに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。
【００９２】
例
例１：ＡＡＶキャプシドライブラリー
ＡＡＶキャプシドライブラリーは、存在するパルボウイルスの「天然」のバリエーションのうちのなるべく多くを包含するように作製した（図１Ａ〜１Ｃを参照）。キャプシドライブラリーは、ＡＡＶ２  ｃａｐ骨格により、構造情報に基づいたアプローチ（structure informed approach）を用いて構築した。多様化は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の可変ループに限定し、このことは、適切に組み立てられてパッケージングされるバリアントを作製する可能性を増大する。ＡＡＶキャプト霊長類（それぞれ、例２および３）においてシドライブラリーを、次いで、マウスおよび非ヒスクリーニングして、最も出現率が高いＡＡＶバリアントを同定し、これらをその後、検証して特徴づけた。
【００９３】
例２：マウススクリーニング
ＡＡＶキャプシドライブラリー（図１Ａ〜１Ｃ）を、図２において示すとおり、マウスにおいてスクリーニングした。スクリーニングのために用いたトランスジェニックマウスは、神経網膜ロイシンジッパー（ｎｒｌ）遺伝子プロモーターの制御下において、桿体視細胞（ＰＲ）において特異的に、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する。
キャプシドバリアントは、切断型ＣＢＡプロモーター駆動性ｍＣｈｅｒｒｙ（ｓｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現を担持する自己相補的ＡＡＶゲノムを含んだ。形質導入を、眼細胞株を用いてin vitroで定量した。
【００９４】
ＡＡＶライブラリーを、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスに硝子体内注射した。ＧＦＰ陽性の視細胞を、ＦＡＣＳにより選別した。視細胞からの総ＤＮＡを単離し、ＡＡＶキャプシド遺伝子についてのＰＣＲを行い、濃縮されたライブラリーを構築した。３回のスクリーニングの後で、最も出現率が高いバリアントのサブセットを同定した（図３）。図３において示されるとおり、１番目に最も出現率が高いＡＡＶ２キャプシドバリアントは、約３２％の相対頻度を有し、２番目に最も出現率が高いＡＡＶ２キャプシドバリアントは、約２１％の相対頻度を有する。これらの高濃縮されたバリアントを、さらなる分析のために選択した。
【００９５】
例３：ＮＨＰスクリーニング
ＡＡＶキャプシドライブラリー（図１Ａ〜１Ｃ）をまた、マカク（Macacca fascicularis）において、硝子体内（Ｉｖｔ）注射の後でＰＲおよびＲＧＣを標的とするＡＡＶバリアントを同定するために、スクリーニングした。
本明細書においてその全体において参考として援用される特許出願番号62/296,056において記載される方法を用いて、霊長類網膜において選別可能な細胞集団を作製した。この方法は、Choudhury, et al., Front Neurosci. 2016,10:551においてもまた記載される。簡略に述べると、マカクのＰＲおよびＲＧＣを、それぞれ、ＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ＧＦＰの網膜下注射および外側膝状核（ＬＧＮ）からのMICRO-RUBY（商標）（ＴＲＩＴＣ−デキストラン−ビオチン）の逆行性輸送により蛍光標識した。図４において示されるとおり、キャプシドライブラリーを、注射の後で、生体内（in-life）相の間にＩｖｔ注射によりＬＧＮ中に送達した。網膜を、解剖学的に異なる領域に分離し、各々の領域からの細胞に、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）を行った（図４を参照）。
【００９６】
図５は、マカクにおけるキャプシドライブラリーの２回のスクリーニングの後で単離された、最も出現率が高いＡＡＶ２キャプシドバリアントを示す。４つの最も出現率が高いＡＡＶバリアント、Ｖ１（これはＶｂと同じである）〜Ｖ４（これは同じＶａと同じである）を、検証およびさらなる分析のために選択し、これらの全てが、in vitroで、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比較して実質的に改善された形質導入を示した。興味深いことに、バリアントＶ１（これはＶｂと同じである）〜Ｖ４（これは同じＶａと同じである）はまた、マウススクリーニングにおいても、２番目に出現率が高い（Ｖｂ）および最も出現率が高い（Ｖａ）バリアントとして同定された。
【００９７】
例４：ＡＡＶ２バリアントＶａの形質導入プロフィールの評価
マウスおよびマカクモデルにおけるスクリーニングにより最も出現率が高いＡＡＶ２バリアントを同定した後、上記のとおり、最も出現率が高いバリアントを、ベクター化（vectorize）し、網膜細胞に形質導入する効率について試験した。
ＡＡＶ２バリアントＶａは、マウススクリーニングにおいては最も出現率が高く、マカクスクリーニングにおいては４番目に最も出現率が高いことを見出した。図６Ａ〜６Ｃは、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスに、１μｌの２ｅ１２ｖｇ／ｍｌのＳｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙをＶａバリアントＡＡＶ２キャプシド中にパッケージングしたものを硝子体内注射した後の、Ｖａの形質導入プロフィールを示す。注射の３週間後、眼底検査（図６Ａを参照）およびＦＡＣＳ（図６Ｂおよび６Ｃを参照）により、形質導入を評価した。網膜細胞において増強された形質導入効率を有することが知られるＡＡＶ２バリアントであるＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）を、対照として含めた。図６Ａにおいて、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙについての遺伝子を担持するＡＡＶ２  Ｖａバリアント粒子が、より多数ではないとしても同じくらい多くの網膜細胞を、かつ、細胞１つあたり、より高い発現量でないとしても、細胞１つあたり、同じくらい高い発現量で、形質導入することができたことが観察され得る。
【００９８】
ＶａバリアントＡＡＶ２粒子の注射の４週間後、マウスを安楽死させ、網膜細胞を解離させて、ＧＦＰ発現およびｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出するために、サイトメーターにおけるPE-Texas Redチャネルを用いた。図６Ｂにおいて、右上の４象限は、ｒＡＡＶベクターにより形質導入された桿体視細胞の集団（ＧＦＰ＋かつｍＣｈｅｒｒｙ＋）に相当し、右下の４象限は、ｒＡＡＶベクターにより形質導入された非桿体の神経網膜細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ＋のみ）に相当する。
【００９９】
図６Ｃは、硝子体内注射または網膜下注射のいずれかによりマウスに投与された場合の、ＡＡＶ２バリアントＶａについての形質導入率を示す。マウスを、ＡＡＶ２バリアント粒子の注射の４週間後に安楽死させた。２ｘ１０９ｖｇを注射した。ウイルス粒子を硝子体内で送達した場合と比較して、網膜下投与されたＡＡＶ２−Ｖａは、より多数の非桿体の神経網膜細胞に形質導入することができた。網膜下注射の後で桿体ＰＲおよび非桿体の神経網膜細胞の両方において達成された形質導入のレベルは、２．５倍多くの野生型ＡＡＶ２ウイルスにより達成されたものに匹敵した。
【０１００】
網膜細胞の形質導入について試験することに加えて、ＡＡＶ２バリアントＶａキャプシドが上衣およびプルキンエ細胞に形質導入する能力を評価するために実験を行った。マウスに、Ｓｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙを担持する４ｘ１０９ｖｇのウイルス粒子を注射した。その４週間後、マウスを安楽死させ、脳の切片を作製した。図７Ａにおいて示されるとおり、ＡＡＶ２−Ｖａは、上衣細胞の形質導入を促進する。これはＣＳＦを分泌する原因であり、神経保護的遺伝子治療のための魅力的な標的である。図７Ｂにおいて示されるとおり、ＡＡＶ２−Ｖａ粒子はまた、プルキンエ細胞にも形質導入することができた。
【０１０１】
例５：ＡＡＶ２バリアントＶｂの形質導入プロフィールの評価
ＡＡＶ２バリアントＶｂは、マウススクリーニングにおいては２番目に最も出現率が高く、マカクスクリーニングにおいては最も出現率が高いことを見出した。図８Ａ〜８Ｃは、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスに、１μｌの２ｅ１２ｖｇ／ｍｌのＳｃ−ｓｍＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙをＶｂバリアントＡＡＶ２キャプシド中にパッケージングしたものを硝子体内注射した後の、Ｖｂの形質導入プロフィールを示す。注射の３週間後、プロフィール（図８Ａを参照）およびＦＡＣＳ（図８Ｂおよび８Ｃを参照）により、形質導入を評価した。変異Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＴ４９１Ｖを有するＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙについての遺伝子を担持するＡＡＶ２  Ｖｂバリアント粒子は、より多数の網膜細胞に、細胞１つあたりより高い発現量で形質導入することができた（図８Ａ）。
【０１０２】
ＶｂバリアントＡＡＶ２粒子の注射の４週間後、マウスを安楽死させ、網膜細胞を解離させ、ＧＦＰ発現およびｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出するために、サイトメーターにおけるPE-Texas Redチャネルを用いた。図８Ｂにおいて、右上の４象限は、ｒＡＡＶベクターにより形質導入された桿体視細胞の集団に相当し（ＧＦＰ＋かつｍＣｈｅｒｒｙ＋）、右下の４象限は、ｒＡＡＶベクターにより形質導入された非桿体の神経網膜細胞に相当する（ｍＣｈｅｒｒｙ＋のみ）。
図８Ｃは、硝子体内注射または網膜下注射のいずれかによりマウスに投与された場合の、ＡＡＶ２バリアントＶａについての形質導入率を示す。マウスを、ＡＡＶ２バリアント粒子の注射の４週間後に安楽死させた。２ｘ１０９ｖｇを注射した。網膜下注射の後で桿体ＰＲおよび非桿体の神経網膜細胞の両方において達成された形質導入のレベルは、２．５倍多くの野生型ＡＡＶ２ウイルスにより達成されたものに匹敵した。
【０１０３】
例６：ＡＡＶ２バリアントＶ２の形質導入プロフィールの評価
ＡＲＰＥ１９細胞において形質導入効率を測定し、結果は、図９において観察することができる。ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）バリアントウイルスと比較して、ＡＡＶ２−Ｖ２バリアントウイルスは、約７倍高いｍＣｈｅｒｒｙの発現レベルをもたらすことができた。
マウスにおいて、ＡＡＶ２バリアントＶａおよびＶｂと同様の様式において試験された場合、眼底検査により観察されるマウス網膜におけるＡＡＶ−Ｖ２の形質導入効率は、対照ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）と比較して、はるかに高かったことを見出した（図１０Ａ）。ＡＡＶ２−Ｖ２で形質導入された網膜細胞についての特徴的なＦＡＣｓプロットを、図１０Ｂにおいて示す。ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）に相対的な形質導入効率を、図１０Ｃにおいて示す。観察されるとおり、ＡＡＶ２−Ｖ２バリアントは、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）バリアントウイルスより優れている。
【０１０４】
例７：ＡＡＶ２バリアントＶ３の形質導入プロフィールの評価
形質導入効率を、ＡＲＰＥ１９細胞において測定し、結果は、図１１において観察することができる。ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）バリアントウイルスと比較して、ＡＡＶ２−Ｖ３バリアントウイルスは、約５倍高いｍＣｈｅｒｒｙの発現レベルをもたらすことができた。
マウスにおいて、ＡＡＶ２バリアントＶａ、ＶｂおよびＶ２と同様の様式において試験された場合、眼底検査により観察されるマウス網膜におけるＡＡＶ２−Ｖ３の形質導入効率は、対照ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）と比較して、はるかに高かった（図１２Ａ）。ＡＡＶ２−Ｖ３により形質導入された網膜細胞についての特徴的なＦＡＣｓプロットを、図１２Ｂにおいて示す。ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）に相対的な形質導入効率を、図１２Ｃにおいて示す。観察されるとおり、ＡＡＶ２−Ｖ３  バリアントは、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹ−Ｆ＋Ｔ−Ｖ）バリアントウイルスより優れている。
【０１０５】
例８：合理的に設計されたバリアント
特定の変異がＡＡＶ粒子が網膜細胞に形質導入する効率を増強することは知られているので、マウスおよびマカクモデルにおけるスクリーニングにより同定されたバリアントに対して、それらの能力をさらに改善するために、より高い網膜形質導入能力を有するように、これらの変異を重ねた。図１３は、眼底検査を用いた、さらなるＹからＦへおよびＴからＶへの置換を有するＡＡＶ２バリアントＶａおよびＶｂの形質導入プロフィールを示す。Ｖａ−ＹＦは、バリアントＶａの配列に加えて位置４４４および７３０においてさらなるフェニルアラニンを有するバリアントを表す。同様に、Ｖｂ−ＹＦは、バリアントＶｂの配列に加えて位置４４４および７３０においてさらなるフェニルアラニンを有するバリアントを表す。ＡＡＶ２バリアントＶｂ−ＹＦ−ＴＶは、バリアントＶｂの配列に加えて、位置２７２、４４４および７３０においてさらなるＦ、ならびに位置４９１においてバリンを有するバリアントを表す。これらの置換が形質導入効率を大きく増強することは、眼底画像におけるｍＣｈｅｒｒｙの蛍光から明らかである（図１３）。ＦＡＣＳデータの定量もまた、これらのさらなる変異が、ＡＡＶ２キャプシドバリアントが網膜細胞に形質導入する効率を大きく改善することを示す（図１４）。
【０１０６】
例９：硝子体内注射による網膜の効率的な形質導入を促進するさらなるＡＡＶキャプシドバリアント
例１において記載される多様性が高いＡＡＶキャプシドライブラリーであるＣＡＰＬＩＢ−７から、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において行った３回のin vivoでの選択により、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）バリアントを単離した。選択は、初めに、選別可能な視細胞（ＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ＧＦＰの網膜下注射を介して）および網膜神経節細胞（外側膝状核中への逆行性トレーサー色素の注射を介して）を有するＮＨＰを作製することを含む。選別可能な細胞の作製の後で、ＮＨＰへのキャプシドライブラリーの硝子体内注射を行った。この後、ＮＨＰの視細胞（ＰＲ）と網膜神経節細胞（ＲＧＣ）との個別の分離を行い、その後、各々の細胞型から個別にキャプシドバリアントを回収し、別々のＰＲとＲＧＣとのサブライブラリーを再生した。その後のスクリーニングを、次いでＲＧＣサブライブラリーを投与したＮＨＰと平行して行い、ＲＧＣを単離した。ＰＲサブライブラリーについても同様である。霊長類における２回目の選択の後で、多数の新規のキャプシドバリアントを同定した。これらのバリアントのサブセットを単離し、レポーターコンストラクトによりベクター化した場合、それらは、細胞培養において増大した形質導入効率を有することが示された。ベクターをマウスに硝子体内注射した場合、形質導入効率は、ＡＡＶ２に対して大きく改善され、ほとんどの場合において、ｑｕａｄＹＦ＋Ｔ−Ｖよりも良好であった。この後に、霊長類における３回目のスクリーニングを行い、さらなるキャプシドバリアントを同定した。これらのさらなるキャプシドバリアントは、本明細書において開示され、これらのうちの多くは、最初の２回の選択においては観察されなかった。新たなキャプシドバリアントは、２つの広範なグループに分類される：１）２回目のスクリーニングから３回目のスクリーニングで、ＰＲおよびＲＧＣの両方においてそれらの相対量が増大しているキャプシドバリアント、および、２）網膜神経節細胞（ＲＧＣ）または視細胞（ＰＲ）のいずれかに対して分布の偏りを示すキャプシドバリアント。グループ１のバリアントは、Ｐ３−８、Ｖｂ、Ｐ３−３およびＰ３−４を含む。グループ２のバリアントは、霊長類網膜神経節細胞において濃縮を、視細胞においては低い量を示すＰ３−ＲＧＣ１、Ｐ３−ＲＧＣ２およびＰ３−ＲＧＣ３、ならびに逆に網膜神経節細胞よりも視細胞において実質的に濃縮されていたＰ３−ＰＲ１、Ｐ３−ＰＲ２およびＰ３−ＰＲ３を含む（図２４および２５）。
【０１０７】
例１０：
霊長類網膜においてキャプシドライブラリーをスクリーニングするための方法は、以下のとおりであった。それは、細胞内に含まれる核酸の完全性を維持しつつ網膜細胞を選択的に「選別」する能力に依存し、ＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ＧＦＰの網膜下送達および／または外側膝状核（ＬＧＮ）からの蛍光色素の注射による網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の逆行性標識を介する、視細胞における緑色蛍光タンパク質の発現により達成した。
３回目のスクリーニングの結果を評価し、視細胞およびＲＧＣが濃縮されたバリアントを同定した（図２４および２５）。バリアントは、視細胞とＲＧＣとの間で「偏った」分布で現れた。
【０１０８】
本明細書において記載される特定のバリアントを、合理的な設計によりさらに増強した。Ｖａ、ＶｂおよびＶ３を、網膜の形質導入を増強することが先に同定されている、さらなるチロシンからフェニルアラニンへ、およびトレオニンからバリンへの変異を組み込むように修飾した。Ｖａ（Ｙ４４４＋７３０Ｆ）を試験した。Ｖａ（Ｙ２７２＋４４４＋７３０Ｆ）＋Ｔ４９１Ｖもまた作製したが、低い効率でパッケージングされた（ｎ＝３）。Ｖｂ（Ｙ４４４＋７３０Ｆ）およびＶｂ（Ｙ２７２＋４４４＋７３０Ｆ）＋Ｔ４９１Ｖもまた試験した。Ｖ３（Ｙ２７２＋５００＋７３０Ｆ）＋Ｔ４９１Ｖもまた試験した。
【０１０９】
マウス網膜の形質導入を、Ｉｖｔ注射の後で特徴づけた。キャプシドバリアントを、ｓｍＣＢＡプロモーター駆動性ｍＣｈｅｒｒｙを有する自己相補的ＡＡＶを含むようにベクター化した。それらを、スモールスケールの２セルスタックでパッケージングし、イオジキサノール勾配により精製した。それらに、中程度の用量の２ｅ９ｖｇにおいて、１ｕｇにおいて、Ｎｒｌ−ＧＦＰマウスに硝子体内注射した（各々のバリアントについて、Ｎ＝６またはそれより多く）。注射の４週間後に、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光（生体内）についての眼底検査により、および解離させた神経網膜（ＲＰＥを取り除いたもの）のＦＡＣＳにより、導入遺伝子発現を評価し、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する桿体視細胞（ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ二重陽性の細胞）のパーセンテージを定量した。これは、形質導入効率を同定するための公開された方法と同一である（Boye et al. J Virol. 2016 Mar 28;90(8):4215-31）。
【０１１０】
同定されたキャプシドバリアントは、親キャプシドＡＡＶ２と比較して実質的に改善された、マウス網膜の形質導入を示す。合理的な設計によりガイドされた変異誘発は、キャプシドバリアントＶａおよびＶｂにおける形質導入をさらに増強した。５つのキャプシドバリアントは、ベンチマークベクターよりも優れている。ＩＨＣは、広い細胞指向性を示すキャプシドバリアントを示す。
表３．霊長類網膜において、「バーコード付けされた」レポーターコンストラクトを用いて、形質導入について選択されたキャプシドバリアント。結果を、図１６において示す。
【表３】
2020508667.tif 000006
*同じマウスモデルおよび方法（Boye et al. 2016 J. Virology）においてＡＡＶ２を他のＡＡＶ２キャプシドバリアントと比較する先の実験に基づいた数値
【０１１１】
マカクおよびマウスの網膜における相対的なキャプシドバリアントの形質導入および導入遺伝子発現の効率を、バーコード付けされたベクターを利用して評価した。方法を、図１５〜１９において示す。ユニークな５ヌクレオチドの「バーコード」を除いて同一であるＣＢＡプロモーター駆動性ｍＣｈｅｒｒｙを有するベクターコンストラクト（図２０）を、選択されたキャプシドバリアントにおいて個々にパッケージングした。バーコードの位置は、組織／細胞からの回収の後で、各々のキャプシドバリアントに関連するＤＮＡ（ベクターゲノム）およびＲＮＡ（導入遺伝子発現）の同定を可能にする。バーコード付けされたベクターを、三重トランスフェクションにより作製し、連続的な二重のイオジキサノール濃度勾配と、その後のイオン交換クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、Ｑ−カラム）により精製した。ベクターを、以下について評価した：タンパク質ゲルによる純度、Endosafe PTSによるエンドトキシン（Charles River）、５Ｅｕ／ｍＬ未満のスペック、電子顕微鏡による充填（full）・対・空の比、および＞５０％に充填されたキャプシドのスペック。ＥＭにおいて観察されたキャプシドの凝集に起因して、および凍結溶解のサイクルの後でのゲノムの力価の喪失により、いくつかのベクターを作り直した。これらのベクターを、１５０ｍＭのＮａＣｌを添加したＢＳＳ−tweenの高塩バッファー中に入れた。バーコード付けされたプールにおいて利用された全てのベクター調製物は規格を通った。
【０１１２】
「バーコード付けされた」ベクタープール：２つの「プールされた」混合物を作製した：１．０×の混合物、３ｅ１２ｖｇ／ｍｌの総濃度、各々のバリアントを約２．３ｅ１１ｖｇ／ｍｌで有する；および０．１×の混合物、３ｅ１１ｖｇ／ｍｌの総濃度、各々のバリアントを約２．３ｅ１０ｖｇ／ｍｌで有する。両方のバーコード付けされたベクタープールを、ＢＳＳ tweenバッファー中で希釈した。１．０×のプールを、高塩中で溶離したベクター調製物の包含に起因する、３９８ｍＯｓｍ対３００ｍＯｓｍの生理学であると計算した。Ｉｖｔ注射によりベクターの著しい希釈が起こったことに注目した。プールは、別々に作製した（すなわち、０．１×のプールは、１．０×のプールの１：１０希釈ではない）。
【０１１３】
ＮＨＰについてのバーコード付けされた実験計画：２個体のM. fascicularis（カニクイザル）は、ＦＡＣＳによる単離のために標識されたＲＧＣを有した。それらは、１回の１００ｕｌのバーコード付けされたプールの硝子体内注射を受けた。一方の眼に、１．０×のプールを投与し、他方の眼に０．１×のプールを投与した。バーコード付けされたベクターのＩｖｔ注射の３週間後、それらは、「緑色」色素のＬＧＮ注射を受け、１週間後（バーコード付けされたベクター注射の４週間後）に安楽死させた。２つのＮＨＰが有したＰＲは、ＦＡＣＳによる単離のために標識されていた。複数の網膜下ブレブが、視細胞をＡＡＶ５−ＧＲＫ１−ＧＦＰ標識した。３日後、それらに、１００ｕｌのバーコード付けされたプールのＩｖｔ注射を投与した（上記のものと同じ）。バーコード付けされたベクターのＩｖｔ注射の６週間後、動物を安楽死させた。安楽死は、もともとはバーコードのＩｖｔの４週間後に予定されていたが、約１週間半遅らせた。全てのＮＨＰを、抗ＡＡＶ２  ＮＡｂについて予めスクリーニングした。選択された動物は、ナイーブであると考えられた。
表４．ＮＨＰの情報
【表４】
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【０１１４】
ＲＧＣを標識された動物を、以下のとおりイメージングした：注射の１週間前、カラー眼底検査（color fundus）のみ；バーコードのＩｖｔ注射の２日後、カラー眼底検査のみ；Ｉｖｔバーコードの２および３週間後、カラー眼底検査＋ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光；Ｉｖｔバーコードの４週間後およびトレーサー注射のＬＧＮ注射６〜７日後、ＦＩＴＣ＋ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光。ＰＲを標識された動物を、イメージングした：ＡＡＶ５−ＧＦＰの網膜下注射（ＰＲ標識）の４日前、網膜下ＡＡＶ５−ＧＦＰの９日後、カラー眼底検査のみ；網膜下ＡＡＶ５−ＧＦＰの２３日後、およびＩｖｔバーコードの２０日後、カラー眼底検査＋ＦＩＴＣ＋ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光、網膜下ＡＡＶ５−ＧＦＰおよびＩｖｔバーコードの４および５週間後、カラー眼底検査＋ＦＩＴＣ＋ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光；網膜下ＡＡＶ５−ＧＦＰおよびＩｖｔバーコードの６週間後、ＦＩＴＣ＋ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光。イメージングの結果を、図２１、２２および２３において示す。
【０１１５】
他の態様
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせることができる。本明細書において開示される各々の特徴は、同じ、等価、または類似の目的にかなう代替的な特徴により置き換えることができる。したがって、別段に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の等価または類似の特徴の一例に過ぎない。
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、開示を多様な用途および条件に適用させるために、その多様な変更および改変を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲の範囲内である。
【０１１６】
均等物
本発明のいくつかの態様を、本明細書において記載および説明してきたが、当業者は、機能を行うため、ならびに／または、本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つ以上を得るための、多様な他の手段および／または構造を、容易に想起するであろう。本明細書において記載される利点のうちの１つ以上、ならびにかかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるものとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および立体構造が、例示的なものであることを意図されること、ならびに、実際のパラメーター、寸法、材料および／または立体構造は、それのために本発明の教示が用いられる特定の用途に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される本発明の具体的な態様に対する多くの均等物を認識するかまたは確認することができるであろう。したがって、前述の態様は、単に例として提示されること、ならびに、添付の請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載され請求されるものとは別段に実施することができることが理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法に仕向けられている。加えて、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法のうちの２つ以上の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に不一致でない場合には、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１１７】
本明細書において定義され用いられる全ての定義は、辞書の定義、参考として援用される文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味に対して優先される。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される手段に関して参考として援用され、これは、いくつかの場合においては、当該文書全体を包含し得る。
【０１１８】
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書において明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、明らかに逆であることが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
句「および／または（and/or）」は、本明細書において明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素、すなわち、いくつかの場合においては接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素のうちの「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または（and/or）」と共に列記される複数の要素は、同じ様式におけるもの、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」と解釈されるべきである。「および／または（and/or）」節により特に同定される要素以外の他の要素は、それらの特に同定された要素に関連するか関連しないかにかかわらず、任意に存在してよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、「含む」などのオープンエンド式の語法により接続して用いられる場合、一態様においてはＡのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を；別の態様においてはＢのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）を指し得る、など。
【０１１９】
本明細書において明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、「または（or）」は、上で定義される「および／または（and/or）」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または（or）」または「および／または（and/or）」は、包括的であるもの、すなわち、多数の要素または要素のリストのうちの少なくとも１つの包含であるが、１つより多く、および任意にさらなる列記されていない項目をも含むとして解釈されるべきである。「〜のうちの１つのみ」または「〜のうちの正確に１つ」、または請求の範囲において用いられる場合には、「〜からなる（consisting of）」などの、用語が明らかに逆であることが示される場合のみは、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般に、用語「または（or）」は、本明細書において用いられる場合、「いずれか（either）」、「〜のうちの１つ（one of）」、「〜のうちの１つのみ（only one of）」、または「〜のうちの正確に１つ（exactly one of）」などの排他性の用語により先行される場合、排他的選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるべきである。「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられる場合のその通常の意味を有するべきである。
【０１２０】
本明細書において明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、１つ以上の要素のリストを参照する句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される、少なくとも１つ要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に特に列記される各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを含むものではなく、要素のリスト中の要素の組み合わせを除外するものではないことが、理解されるべきである。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に同定される要素以外の要素が、それらの特に同定される要素に関連するか関連しないかにかかわらず、任意に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、等しく、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、等しく、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一態様においては、Ｂが存在しない状態での（および任意にＢ以外の要素を含む）、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＡを；別の態様においては、Ａが存在しない状態での（および任意にＡ以外の要素を含む）、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＢを；さらに別の態様においては、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＡ、および少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＢ（および任意に他の要素を含む）をを指し得る、など。
【０１２１】
また、明らかに逆であることが示されない限り、１つより多くのステップまたは行為を含む、本明細書において請求される任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、当該方法のステップまたは行為が記述される順序に限定されないことも、理解されるべきである。
【０１２２】
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、全ての移行句、例えば「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（including）」、「〜を担持する（carrying）」、「〜を有する（having）」、「〜を含む（（containing）」、「〜を含む（（involving）」、「〜を保持する（holding）」、「〜からなる（composed of）」などは、オープンエンドである、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、クローズまたはセミクローズな移行句であるべきであり、これは、米国特許庁特許審査便覧（Manual of Patent Examining Procedures）、セクション2111.03において記載されるとおりである。この文書において、オープンエンドの移行句（例えば「〜を含む（comprising）」）を用いて記載される態様もまた、代替的態様において、オープンエンドの移行句により記載される特徴「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」ものとして、企図される。例えば、開示が、「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、当該開示はまた、代替的態様である「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」をも企図する。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｃ−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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