(57)【要約】本発明は、炎症を起こした皮膚のｅｘ−ｖｉｖｏモデル、それを得るためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、および抗炎症化合物のスクリーニングのためのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）あらかじめ哺乳動物から採取した健康な皮膚生検の真皮内に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の皮膚常在Ｔ細胞を活性化するための有効量および場合によってはＩＬ−２を含む組成物を注射するステップ、
ｂ）ステップａ）において活性化されたＴ細胞のＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７への極性化ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップａ）において得られた前記注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを得るためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項２】
ステップａ）が手動で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーションステップｂ）が少なくとも５日間続く、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）およびｂ）の間に、固化可能な液体マトリックス上に、ステップａ）の終了時に得られた前記注射した皮膚生検を堆積させる追加のステップａ’）を含み、前記マトリックス自体が細胞培養挿入物内に含まれており、その底部は多孔性膜からなり、前記挿入物が容器またはウェル内に配置されており、したがって、マトリックスが固化した後に、前記皮膚生検の３Ｄ完全性が維持されることを可能にする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法のステップ（ａ）で注射される前記組成物中の濃度が次のものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
−  前記抗ＣＤ３および前記抗ＣＤ２８抗体について１０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、好ましくは２０ｎｇ／μｌ〜８０ｎｇ／μｌ、および特に好ましくは３０ｎｇ／μｌ〜７０ｎｇ／μｌ、ならびに任意に
−  ＩＬ−２について１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、および特に好ましくは４ｎｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌ。
【請求項６】
前記方法のステップｂ）で使用される前記組成物の少なくとも１つの混合物中の濃度が、次のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
−  ＩＬ−１βおよびＴＧＦβについて１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは７ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、
−  ＩＬ−２３については１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ。
【請求項７】
化合物の抗炎症効果を評価することをさらに目的とし、次の追加のステップを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
ｃ）候補化合物と、ステップｂ）の終了時に得られ、ＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７極性化Ｔ細胞を含む炎症を起こした皮膚のモデルを接触させるステップ；
ｄ）炎症を起こした皮膚のモデルの少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｅ）ステップｄ）で得られた前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ；
ｆ）ステップｄ）で測定した前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。
【請求項８】
またステップｄ）においても、少なくとも３つ、特に少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、特に好ましくは少なくとも６つの、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群から選択される炎症マーカーの発現レベルを測定するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
真皮、表皮、表皮付属物、ならびにＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞を含む炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られ、少なくとも２つの炎症マーカー、または少なくとも３つもしくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、特に好ましくは少なくとも６つの炎症マーカーの発現によって特徴付けられ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群より選択される、ｅｘ  ｖｉｖｏモデル。
【請求項１０】
容器または培養ボックスウェルに含有されるのに適しており、その底部は多孔性膜（４０）からなる細胞培養挿入物（１０）であって、前記挿入物が、固化したマトリックス（２０）に埋め込まれている請求項９に記載の炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデル（３０）を含み、前記マトリックスが前記挿入物の内縁および前記多孔性膜に接触しており、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮が大気および真皮と接触しており、前記炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮付属物が前記固化マトリックスに浸漬されている、細胞培養挿入物（１０）。
【請求項１１】
抗炎症化合物、特に抗乾癬化合物を同定するための、請求項９に記載の炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルまたは請求項１０に記載の細胞培養挿入物の使用。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、哺乳動物から以前に採取された健康な皮膚生検、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の有効量を含む組成物Ａ、ならびに任意にＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３およびＴＧＦ−βの少なくとも混合物を含む組成物Ｂ、ならびに任意に注射装置を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１７年９月２６日に出願されたフランス特許出願第１７／７１０２０号の優先権を主張するものであり、本明細書に参照により組み込まれている。
【０００２】
本発明は、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを得るための方法、この方法を実施するためのキット、ならびに、特に乾癬の処置のための抗炎症効果を有する化合物を同定するための本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のモデルの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
乾癬は慢性炎症性自己免疫疾患であり、ヨーロッパ人集団の約２％が罹患し、しばしば刺激性の赤いプラークの形成および死滅した皮膚の蓄積（鱗屑）をもたらす表皮角化細胞の分化および増殖の異常により特徴づけられ、これは身体全体にわたって（最も多いのは腕、胴体、膝、足、爪、顔、頭皮）局在することがある。
【０００４】
これらの乾癬プラークの組織学的解析では、表皮の厚さの増加、角化細胞の不完全な分化および真皮−表皮接合部のホタテガイ状の外観、表皮における多核好中球の蓄積ならびに単核細胞、特にマクロファージおよびＴリンパ球（ＴＬ）による真皮の浸潤、ならびに有意な血管新生が認められる。
【０００５】
免疫組織化学的研究では、真皮はメモリーＣＤ４＋Ｔリンパ球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）から主に構成される浸潤の部位であり、一方ＣＤ８＋Ｔリンパ球は正常（非炎症）表皮で優勢であることが確認されている。
【０００６】
乾癬炎症は、上皮細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞およびＴ細胞間の相互作用の結果である。分子レベルでは、これらの相互作用は、疾患を開始し、相互細胞活性化の悪循環を維持するサイトカインの複雑なネットワークによって媒介され、それによって皮膚病変とその慢性を永続させる（非特許文献１）。炎症性樹状細胞により乾癬皮膚で産生される主なサイトカインは、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３であり、Ｔリンパ球のＴｈ１（ＬＴｈ１）またはＴｈ１７（ＬＴｈ２）系統への分化または膨張に重要な役割を果たしている（非特許文献２）。ＬＴｈ１ｓは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２を産生し、一方ＬＴｈ１７ｓは、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、および程度はより低いがＴＮＦαの合成に関与する。サイトカインのこの産生増加はケラチノサイトの活性化に関与し、次に抗菌ペプチド、炎症誘発性メディエーター（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ｃ、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、およびＣＣＬ２０）ならびにソリアシン（Ｓ１００Ａ７）の放出をもたらす。２０１４年に実施された研究では、ＩＬ−２２を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＩＬ−１７を産生するＣＤ８＋細胞が、有効な乾癬療法で処置された既傷の乾癬皮膚に依然として存在することが示されている。これらの結果は、乾癬患者からの正常に見える、病変のない皮膚移植片が、免疫不全マウスにおける乾癬病変の発症につながることを示す結果と類似している。本研究はすべて、皮膚に常在するＴ細胞が臨床的に消失した乾癬病変に存続し、当該疾患の一次病態を引き起こすことが知られているサイトカインを産生することを明らかにしている（非特許文献３）。
【０００７】
乾癬の処置は、主にコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス）、または紫外線療法の使用に基づく。さらに最近では、ＴＮＦαに対する抗体（インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ）、ＩＬ−１７−Ａ（セクキヌマブ、イキゼキズマブ）、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３（ウステキヌマブ、グセルクマブ、チルドラキズマブ）が、中等症から重症の形態の乾癬を抑制するために開発されているか、または臨床試験中である（非特許文献４）。これらの抗体の中には、乾癬の重症度に応じて数週間からさらに数年にわたって皮下投与されるものもある。この処置はいくぶん有効であることが示されているが、重大な副作用があり、乾癬を治癒させることはまだできない。これらの欠点を克服できる新しい化合物を同定することが本当に必要である。この目的のためには、炎症を起こした皮膚、特に乾癬皮膚のモデルを持つことが不可欠である。
【０００８】
乾癬のマウスモデルは、自然突然変異（Ｓｃｄ１ａｂ／Ｓｃｄ１ａｂ、Ｓｈａｒｐｉｎｃｐｄｍ／Ｓｈａｒｐｉｎｃｐｄｍ、Ｔｔｃ７ｆｓｎ／Ｔｔｃ７ｆｓｎ）、またはさまざまなシグナル伝達経路に関与する遺伝子の発現の人工モジュレーション、またはサイトカインもしくは成長因子のコード化に基づいている（非特許文献５）。しかし、これらのモデルは、ヒトにおける乾癬の表現型および組織学的特性の全てを有しているわけではなく、新たな化合物をスクリーニングするためのこれらの動物モデルの使用を制限する付加的特性を有しているわけでもない。さらに、ヒトと動物との間の生理学的な相違によっては、ヒトにおける免疫応答を確実に予測することは可能にならず、前臨床試験段階で多くの候補化合物を放棄することにつながった。
【０００９】
これらの困難性を回避するために、乾癬ヒト皮膚の異種移植がヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスで実施され、急性型乾癬のモデルを作製することが可能となっている。しかし、レシピエントマウスの免疫系は不完全であるため、これらの動物モデルから得られた結果をヒトに推定することはやはり困難である。
【００１０】
加えて、新しい規制要件と組み合わせた動物福祉の考慮は、ヒトの生理学により近いモデルの開発を推進している。したがって、人工皮膚または表皮のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、不活性ポリカーボネートマトリックス上のケラチノサイトおよび／または線維芽細胞培養から開発されている（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（商標）ＲＨＥ、ＥｐｉＳｋｉｎ（商標）、ＥＰＩＳＫＩＮ、フランス）。しかしながら、このようなモデルは表皮付属物も免疫系の成分も含まないため、刺激性の可能性のある化合物をスクリーニングするためのそれらの使用が制限される。
【００１１】
これらの欠点を克服するために、ヒト皮膚の最初のｅｘ−ｖｉｖｏモデルを、真皮および表皮サンプルを採取することにより、ヒト皮膚サンプルから作製した。ただし、これらのモデルの寿命は７日間を超えない。この寿命は、真皮および表皮に加えて、表皮付属物および毛包を摂取することによって延長することができた（特許文献１）。しかし、これらのモデルは炎症性皮膚状態とは一致しない。
【００１２】
乾癬のヒト皮膚等価物は、健康な皮膚線維芽細胞を刺激することによって、または乾癬患者由来の線維芽細胞を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られている（非特許文献６）。これら３Ｄモデルは表皮の肥厚と病態に特徴的な炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２２）の産生を示すが、免疫成分はまだ存在しない。
【００１３】
さらに最近では、培養培地に直接ＩＬ−１βを数日間添加することにより、ヒト皮膚外植片に急性炎症を誘発することが可能となった（特許文献２）。しかし、このモデルは、乾癬で観察される慢性炎症を説明するものではない。
【００１４】
Ｔｊａｂｒｉｎｇａらが開発したモデルの真皮下に、末梢血由来のＴ細胞を添加し、活性化またはＴｈ１もしくはＴｈ１７部分集団に分化させることにより、これらのＴ細胞が産生するサイトカインがケラチノサイトに及ぼす影響および炎症の発症を実証することが可能となった（非特許文献７）。しかし、Ｋｉ６７マーカーの発現、ケラチノサイト過剰増殖、表皮肥厚などの乾癬の特定の特徴は、このモデルにはまだ存在しない。さらに、末梢血由来のＴ細胞は皮膚の常在Ｔ細胞とは異なり、特に真皮および表皮のメモリー常在Ｔ（ＴＲＭ）細胞とは異なる（非特許文献８）。実際、ＴＲＭ細胞は、末梢血中の他のメモリーＴ細胞と区別する転写因子および表面マーカーをもっている。このように、Ｓ１ＰＲ１（スフィンゴシン−１−ホスレート受容体１）遺伝子の過少発現と組み合わさったＴＲＭ表面のＣＤ６９の存在は、それらを皮膚などの末梢組織に数カ月間留めることを可能にし、それによってそれらが血流中に再循環するのを妨げる。ＣＤ８＋ＴＲＭおよびＣＤ４＋ＴＲＭ集団の存在は、健康なヒト皮膚の表皮および真皮において広く観察されてきた；ＣＤ８＋ＣＤ４９ａ＋ＴＲＭ部分集団は、パーフォリンおよびＩＦＮγの合成に関与しており、一方ＣＤ８＋ＣＤ４９ａ−ＴＲＭ細胞は、主にＩＬ−１７を生成している（非特許文献９）。
【００１５】
ヒト皮膚生検における常在Ｔ細胞の活性化に基づく別のアプローチが、番号特許文献３下で公表された国際出願に記載された。しかし、このモデルでは乾癬に特徴的なタンパク質マーカーは同定できなかった。さらに、皮下脂肪組織を除去すると、厚さ３００μｍ以下の皮膚生検が得られる。このような細かさは、取り扱いを非常にデリケートにし、皮下注射を可能にしない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】欧州特許第２  ０１９  ３１６  Ｂ１号
【特許文献２】欧州特許第２  ８８５  ６３７  Ｂ１号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１８２６５５  Ａ１号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ＪＦ  ＮＩＣＯＬＡＳ，Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌｅ．Ｍｅｄ，２０１４，１９８（１），ｐｐ．１７−３０
【非特許文献２】ＰＥＣＫおよびＭＥＬＬＩＮＳ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９，１２９，ｐｐ．１４７−１５３
【非特許文献３】Ｒａｃｈａｅｌ  Ａ．ＣＬＡＲＣＫ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，２０１５，７（２６９）：２６９ｒｖ１
【非特許文献４】ＧＯＯＤＥＲＨＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｋｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌｅｔｔｅｒ，２０１５，２０（１），ｐｐ． １−５
【非特許文献５】ＭＰ  ＳＣＨＯＮ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００８，１７，ｐｐ． ７０３−７１２
【非特許文献６】ＴＪＡＢＲＩＮＧＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００８，１７３，ｐｐ．８１５−８２３
【非特許文献７】ＶＡＮ  ＤＥＮ  ＢＯＧＡＡＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１４，１３４，ｐｐ．７１９−７２７
【非特許文献８】ＭＵＥＬＬＥＲおよびＭＡＣＫＡＹ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１６，１６（２），ｐｐ．７９−８９
【非特許文献９】ＨＡＩＪＩＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｒｅｖ．，２０１８，ｐｐ． ９０６−９１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、新しいツール、特に炎症を起こしたヒト皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを開発することが真に必要である。この必要性は、特に、炎症モデリングでの使用に適したｅｘ  ｖｉｖｏ皮膚サンプルが、ｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇する条件からこれらのサンプルの挙動の顕著な逸脱を誘発することなく十分に長期間維持され得る培養条件の同定を含む。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、これらの全ての欠点を克服するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、生理病理学的文脈においてｉｎ  ｖｉｖｏで観察される炎症を起こした皮膚の環境をより正確かつ再現性よく反映する炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを提供することによって、上記の欠点を補うことを可能にする。
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、以下のステップ：
ａ）あらかじめ哺乳動物から採取した健康な皮膚生検の真皮内に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の皮膚常在Ｔ細胞を活性化するための有効量および場合によってはＩＬ−２を含む組成物を注射するステップ、
ｂ）ステップａ）において活性化されたＴ細胞のＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７への極性化ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップａ）において得られた注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを得るためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【００２２】
本発明の第２の目的は、真皮、表皮および表皮付属物を含み、ＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７に極性化された活性化Ｔ細胞が表皮ケラチノサイトの炎症を促進した、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルに関する。
【００２３】
皮膚炎症を調節する化合物を同定する方法における本発明の炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの使用は、炎症を起こした皮膚のｉｎ  ｖｉｖｏ環境をより正確に反映する、容易に生成されるモデルに依存する利点を提供し、それによって、偽陽性および／または偽陰性の形での化合物のスクリーニング試験における誤差が減少する。
【００２４】
従って、本発明による方法は、さらに化合物の抗炎症効果を評価することを目的とし、次の追加のステップを含む：
ｃ）候補化合物と、ステップｂ）の終了時に得られ、ＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７極性化Ｔ細胞を含む炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを接触させるステップ；
ｄ）炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｅ）ステップｄ）で得られた前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ；
ｆ）ステップｄ）で測定した前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。
【００２５】
本発明の方法により、皮膚炎症、特に乾癬を処置するための有効な抗炎症薬の探索が促進されるであろう。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、抗炎症候補化合物、特に乾癬を処置する可能性が高い候補化合物をスクリーニングする目的で本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの使用に関する。
【００２７】
最後に、本発明の別の目的は、本発明の方法を実施するためのキットに関するものであり、前記キットは、哺乳動物から以前に採取された健康な皮膚生検、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の有効量を含む組成物Ａ、ならびに任意にＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３およびＴＧＦβの少なくとも１つの混合物を含む組成物Ｂ、ならびに任意に注入注射用の装置を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、手動注射または注入によって得られる染色強度の勾配を比較することによって、皮膚生検への染色した溶液の手動（Ｍ）または注入（Ｐ）皮内注射とその拡散を示す。
【図２】図２は、未処置の（Ｃ）、または本発明の方法（Ｔｈ１７／Ｔｈ１）のステップａ）およびｂ）に従って処置した健康な皮膚生検の組織学的特徴を比較する。観察は、極性溶液中の本発明の方法のステップａ）からの注射した健常皮膚生検のインキュベーションを開始して５日後（Ｔ５）または７日後（Ｔ７）に行った。ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦβの少なくとも１つの混合物を含む組成物の存在下で７日間培養した後、表皮における海綿症（Ｓ）および表皮隆起（Ｅ）の伸長が観察された。
【図３】図３は、未処置での（Ｔ０）、および７日間培養で維持しての（Ｔ７）、健康な皮膚生検でランゲルハンス細胞（ＣＤ２０７）、レジデントＴ細胞（ＣＤ３）、樹状細胞（ＨＬＡ−ＤＲ）、肥満細胞（トリプターゼ）の存在の組織学的解析を示す。
【図４】図４は、本発明の方法のステップａ）およびｂ）に従って処置したモデルにおけるＬＴｈ１７およびＬＴｈ１の存在を示す、本発明の方法によって得られた炎症性皮膚のモデルによる炎症性サイトカインＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２２の分泌（Ｔｈ１７／Ｔｈ１）を示す。未処置の健康な皮膚生検（１−ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標））、本発明の方法のステップｂ）の極性カクテルの存在下で培養した健康な皮膚生検（２−ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）＋ｐｒｏ  Ｔｈ１７／Ｔｈ１）、本発明の方法のステップａ）およびｂ）に従い処置した健康な皮膚生検（３−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標））を比較する。結果はｐｇ／ｍｌで表す。
【図５】図５は、未処置（Ｃ）または本発明の方法のステップｂ）のみ（ＩＬ−１β＋ＩＬ−２３＋ＴＧＦβ）に従って、またはステップａ）およびｂ）（抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８＋ＩＬ−２＋ＩＬ−１β＋ＩＬ−２３＋ＴＧＦβ）に従って、および培養の７日後に処置した健康な皮膚生検の組織学的特徴を示す。これらの生検は、未治療（１）、プラセボゲル（２）、もしくはプラセボクリーム（４）で処置したか、または２種類の炎症阻害剤であるベタメタゾンジプロピオネート（３）およびホスホジエステラーゼ４型阻害剤（５）のいずれかで処置した。炎症抑制剤（３および５）による処置のみでは、表皮に組織学的異常が全く認められず、炎症誘発性サイトカイン分泌の、およびしたがってＬＴｈ１７／ＬＴｈ１細胞分化の阻害が示唆される。
【図６】図６は、予防的（Ａ）または治療的（Ｂ）処置としてのＩＬ−１７Ａタンパク質合成の阻害を示す。未処置の（１）、またはプラセボゲルで処置した（２）、ベタメタゾンジ−プロピオネートを含むゲルで処置した（３）、プラセボクリームで処置した（４）、またはＰＤＥ４阻害剤を含むクリームで処置した（５）、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のモデルを比較する。結果は、本発明の方法により得られた、および未処置のままにした（１）炎症を起こした皮膚のモデルに関連して％で表す。
【図７】図７は、予防的（Ａ）または治療的（Ｂ）処置としてのＩＬ−２２タンパク質合成の阻害を示す。未処置の（１）、またはプラセボゲルで処置した（２）、ベタメタゾンジ−プロピオネートを含むゲルで処置した（３）、プラセボクリームで処置した（４）、またはＰＤＥ４阻害剤を含むクリームで処置した（５）、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のモデルを比較する。結果は、本発明の方法により得られた、および未処置のままにした（１）炎症を起こした皮膚のモデルに関連して％で表す。
【図８】図８は、予防的（Ａ）または治療的（Ｂ）処置としてのＩＦＮγタンパク質合成の阻害を示す。未処置の（１）、またはプラセボゲルで処置した（２）、ベタメタゾンジ−プロピオネートを含むゲルで処置した（３）、プラセボクリームで処置した（４）、またはＰＤＥ４阻害剤を含むクリームで処置した（５）、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のモデルを比較する。結果は、本発明の方法により得られた、および未処置のままにした（１）炎症を起こした皮膚のモデルに関連して％で表す。
【図９】図９は、予防的（Ａ）または治療的（Ｂ）処置としてのＴＮＦαタンパク質合成の阻害を示す。未処置の（１）、またはプラセボゲルで処置した（２）、ベタメタゾンジ−プロピオネートを含むゲルで処置した（３）、プラセボクリームで処置した（４）、またはＰＤＥ４阻害剤を含むクリームで処置した（５）、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のモデルを比較する。結果は、本発明の方法により得られた、および未処置のままにした（１）炎症を起こした皮膚のモデルに関連して％で表す。
【図１０】図１０は、本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの模式図である。底部が多孔性膜（４０）からなる細胞培養挿入物（１０）は、固化したマトリックス（２０）に埋め込まれた炎症を起こした皮膚（３０）のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを含む。特定の実施形態では、細胞培養挿入物は、ラグ（６０）および炎症を起こした皮膚の前記ｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮表面に付着した疎水性物質（５０）からなるリングを有する。
【図１１】図１１は、ヒト皮膚生検の皮膚細胞を取り込む抗ＣＤ３抗体の能力を示す。生検の真皮への抗ＣＤ３ｅ抗体の直接的な注射（皮内注（ＩＩ）−左パネル）と、皮膚生検が浮遊する培養培地中に置いた抗ＣＤ３ｅ抗体の拡散（培養培地への添加（ＡＭＣ）−右パネル）を比較する。２つの別々の生検を検査した（反復（Ｒ）１および２）。白い矢印は、抗ＣＤ３抗体を取り込んだ真皮細胞を同定する。白い星は、皮膚生検の１つの表皮表面に抗ＣＤ３抗体が存在することを示している（右上のパネル）。
【図１２】図１２は、ヒト皮膚生検の真皮細胞における抗ＣＤ３抗体の細胞内局在を示す。生検の真皮に抗ＣＤ３ｅ抗体を直接注射した。
【図１３】図１３は、炎症を起こしていない（Ｃ）、本発明の方法に従って炎症を起こした（Ｉ）、予防的処置としての抗ＴＮＦ−α抗体の皮下注射により炎症を起こし、処置した（Ｉ＋抗ＴＮＦ−α−Ｐ）、または治療的処置（Ｉ＋抗ＴＮＦ−α−Ｔ）としての、皮膚生検の組織学的特徴を示す。
【図１４】図１４は、炎症を起こしていない（Ｃ）、本発明の方法に従って炎症を起こした（Ｉ）、本発明の方法に従って炎症を起こし、予防的処置として抗ＴＮＦ−α抗体の皮下注射により処置された（Ｉ＋抗ＴＮＦ−α−Ｐ）、または治療的処置として処置された（Ｉ＋抗ＴＮＦ−α−Ｔ）皮膚生検によるＩＬ−２２のタンパク質合成を示す。結果はｐｇ／ｍｌで表される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、皮膚炎症の軽減に関する化合物の活性を評価するための新しいツールを提供することを目的とする。
【００３０】
本発明の第１の目的は、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを得るためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
ａ）あらかじめ哺乳動物から採取した健康な皮膚生検の真皮内に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の皮膚常在Ｔ細胞を活性化するための有効量および場合によってはＩＬ−２を含む組成物を注射するステップ、
ｂ）ステップａ）において活性化されたＴ細胞のＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７への極性化ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップａ）において得られた注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む方法に関するものである。
【００３１】
「炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデル」とは、炎症性特性を有する皮膚の生検を意味する。これらの炎症性特性の同定は、タンパク質または遺伝子レベルでの炎症マーカーの発現の検出に基づく。炎症マーカーには、限定されるものではないが、サイトカイン、抗菌タンパク質、脂質生合成に関与するタンパク質、または発現レベルが炎症状態と非炎症状態との間で変化する任意の他の分子が含まれる（特にＳＥＲＨＡＮ  ＆  ＷＡＲＤ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照）。インターロイキンには、限定されるものではないが、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、およびＩＬ−３３、ならびにＩＬ−１０ＲＡ、ＩＬ−１０ＲＢ、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−５ＲＡ（ＣＤ１２５）、およびＩＬ−９Ｒを含むがこれには限定されないインターロイキン受容体が含まれる。ケモカインには、限定されるものではないが、Ｃ５、エオタキシン、ＭＣＰ−４、ＴＡＲＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３Ａ、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＭＩＰ−１Ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ８ＲＡ、ＩＮＰ１０、Ｌ８ＲＢ、およびＣＸＣＬ３、ならびにＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、およびＣＸＣＲ２を含むがこれには限定されないケモカイン受容体も含まれる。さらに、他のサイトカイン、例えば、限定されるものではないが、ＭＣＰ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦＳＦ５、ＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＴＮＦＳＦ６、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、ＴＮＦＢ、ＭＩＦ、ＮＡＭＰＴ、ＴＲＡＩＬ、およびＩＦＮＡ１、ならびに限定されるものではないが、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＴＮＦＳＦ５、ＦＡＳＬＧ、ＪＡＫ２、ＪＮＫ１、ＮＦｋＢ、ＲＡＧ１、ＳＴＡＴ１、Ｓ１００ファミリータンパク質、およびβデフェンシンを含む、炎症に関与する他の遺伝子が可能である。
【００３２】
好ましくは、本発明の方法によって得られる皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、上記の中から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、および特に好ましくは少なくとも４つの炎症マーカーの発現率が、健康な皮膚生検で観察されるものよりも高い場合（炎症を起こしていない、および／または本発明による方法のステップを受けていない）、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルであると考えられる。
【００３３】
なお好ましくは、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、参照により本明細書に組み込まれているＹａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳＯｎｅ，２００８，３（７），ｅ２７３７によって記事の表Ｓ１に記載された５０の中で、炎症マーカーに加えて、少なくとも１つの遺伝子またはその生成物の過剰発現が検出された場合に、乾癬患者において観察される乾癬病変と同等である。
【００３４】
特に好ましい方法では、本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、健康な皮膚生検で観察されるものよりも高い、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０から選択される少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、および特に好ましくは少なくとも６つの炎症マーカーのタンパク質および／または遺伝子発現率を有する。
【００３５】
炎症マーカーの存在または他の前述のマーカーの過剰発現に加えて、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいても生理学的変化が観察可能である。これらには、限定されるものではないが、表皮の海綿症、真皮における表皮隆起の伸長、表皮細胞における濃縮核および細胞質空胞化の存在、さらには炎症によって引き起こされる細胞死を示唆する剥離が含まれる。
【００３６】
「皮膚生検」とは、少なくとも表皮、真皮、および表皮付属物を含む皮膚断片を意味する。この皮膚断片または生検はまた、皮下組織とも呼ばれる皮下の組織の一部を含むことができる。皮下組織は真皮の直下に位置し、より深い臓器、筋肉、腱、骨を取り囲む線維性膜から皮膚を隔てる保護クッションを形成する。皮下組織は、脂肪細胞、神経、血液およびリンパ毛細血管のネットワーク、細胞外マトリックス成分の合成に関与する少数の線維芽細胞、ならびに樹状細胞およびマクロファージなどの免疫細胞からなる。皮下組織は脂肪細胞を含む脂肪小葉に分割され、神経および血管の通過を可能にする結合壁によって隔てられている。皮下組織の機能は、単離すること、皮膚細胞へのエネルギーの貯蔵を提供すること、身体的ストレスを吸収することである。さらに、研究は、ペプチドベースの薬物の吸収においてリンパ管輸送が果たす重要な役割を示している。
【００３７】
好ましくは、皮膚生検は、１ミリメートル（ｍｍ）〜１センチメートル（ｃｍ）、より特定的には３ｍｍ〜１ｃｍ、さらにより特定的には３ｍｍ〜８ｍｍ、さらにより特定的には５ｍｍ〜７ｍｍの範囲の厚さを有する。表皮、真皮、表皮付属物、および皮下組織を含む皮膚生検では、最大１ｃｍの厚さが得られる。いずれの場合も、皮膚生検の厚さは１ｍｍ以上である。
【００３８】
好ましくは、前記皮膚生検は、動物、特に哺乳動物、および好ましくはヒトから採取される。本発明の方法で用いることができる生検としては、手術廃棄物または屠殺場から得られる生検を挙げることができる。「手術廃棄物」とは、眼瞼形成術後、鼻形成術後、腹壁形成術後、または乳房縮小術後を含む美容外科から得られた皮膚サンプルを意味する。皮膚生検サンプリング技術は、当業者に周知である。
【００３９】
そのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存を確実にするためには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ならびに任意にＩＬ−２の有効量を含む組成物を注射する前に、１時間以内〜７２時間以内、好ましくは１時間以内〜４８時間以内にサンプリングを行わなければならない。
【００４０】
「健康な皮膚生検」とは、眼に知覚される炎症の徴候（すなわち、皮膚の破損、発赤、腫脹、加熱、または過剰なスケーリング・・・）を何ら示さない、または炎症マーカーを何ら発現しない皮膚断片を意味する。さらに、本発明の方法で使用される健康な皮膚生検は、皮膚科学的病理学、特に炎症性のない個体から採取することが必須である。
【００４１】
好ましくは、皮膚生検は円筒形形状を有する。
【００４２】
しかしながら、皮膚生検の任意の他の幾何学的形状、特に、正方形、長方形、楕円形、三角形などである形状も、本発明による方法に適している。
【００４３】
好ましくは、円筒形形状は、１ｍｍ〜５０ｍｍ、より特定的に５ｍｍ〜２０ｍｍ、さらに特定的に７ｍｍ〜１７ｍｍの範囲の直径、および１ｍｍ〜２０ｍｍ、より特定的に２ｍｍ〜１５ｍｍ、さらに特定的に２ｍｍ〜１０ｍｍ、さらにより特定的に２ｍｍ〜５ｍｍの範囲の厚さを有する。
【００４４】
「真皮」とは、密な血管および神経ネットワーク、ならびに表皮を伸長する角化した付属物を含む表皮の下部組織を意味し、組織は毛包、脂腺、および汗腺も含む。
【００４５】
真皮は、それぞれの細胞外マトリックスの組成および機構が異なる２つの部分に細分される。真皮乳頭層は、表皮の直下にある。それは、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの微細な原線維、および表皮に垂直に配向する弾性線維からなる疎性結合組織であり、それによりロウソク型構造を形成する。真皮乳頭層の下にある網状層は、大きなコラーゲン線維と弾性線維の束が織り合わさって構成される結合組織であり、それは、皮膚表面と平行に優先的に配向している。真皮網状層は、真皮乳頭層よりＩＩＩ型コラーゲンが少ない。
【００４６】
「真皮に注射する」とは、健康な皮膚生検の真皮構造に直接組成物を注射、導入または接種することを意味する。この真皮への注射は、注射装置、特に勾配付きもしくは勾配がない、死体積がない中空の針、または当業者に知られている任意の他の同等の機械的装置を用いて行われる。
【００４７】
好ましくは、表皮へのいかなる外傷をも避けるために、網状真皮内に注射を行う。本発明の方法で使用される皮膚生検において、表皮付属物の真皮下、および任意には皮下組織の下に存在することによって、それらに注射中の裂傷のリスクを制限する厚さが付与される。
【００４８】
文献国際公開第２０１４／１８２６５５  Ａ１号からの生検の真皮への注射は、皮下組織を含まないこれらの皮節のある生検の厚さが７５０μｍであることから、裂傷のリスク増大を提示すると考えられる（ＳＭＩＴＨ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１６  Ｆｅｂ  １２；１１（２）：ｅ０１４７９７９）。
【００４９】
健康な皮膚生検の真皮構造に組成物を直接注射する主な利点は、この組成物を生検のすべての組織へより均一かつ迅速に拡散させ、結果として真皮の常在Ｔ細胞をより良好に活性化させることである。このような性能は、文献国際公開第２０１４／１８２６５５  Ａ１号で使用されているような組成物の単純な受動的拡散によっては達成できない。
【００５０】
好ましくは尚、注射ステップは室温で行われる。
【００５１】
真皮に注入される組成物の体積は、健康な皮膚生検の大きさまたは表面積、特に後者が円筒形形状である場合にはその直径に応じて変化する。
【００５２】
好ましくは、健康な皮膚生検の直径が８ｍｍ以下である場合、注射される組成物の体積は１０μｌ以下である。
【００５３】
好ましくは、健康な皮膚生検の直径が１５ｍｍ以下である場合、注射される組成物の体積は３５μｌ以下である。
【００５４】
好ましくは、注射される組成物の体積は、少なくとも５μｌである。
【００５５】
注射に際しては、表皮を傷つけないことが重要である。このような結果は、皮膚生検が少なくとも１ｍｍ、好ましくは少なくとも２ｍｍ、より好ましくは少なくとも３ｍｍの厚さを有する場合にのみ得られ得る。
【００５６】
好ましくは、組成物の注射は、手動で、または注入によって行うことができる。
【００５７】
特定の実施形態によれば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の有効量、ならびに任意にＩＬ−２を含む組成物の健康な皮膚生検の真皮内への注射を、手動で行うことができる。
【００５８】
抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ならびに任意にＩＬ−２を含む組成物を健康な皮膚生検の真皮内に注射することにより、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体、ならびに任意にＩＬ−２を真皮細胞内に取り込むことが可能になる。
【００５９】
別の特定の実施形態によれば、有効量の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ならびに任意にＩＬ−２を含む組成物の健康な皮膚生検の真皮内への注射は、４〜１２μＬ／時の範囲の流量で注入によって行われる。この特定の実施形態では、注射は数時間継続し得る。一定の流量を確保するために、浸透圧ポンプまたは他の任意の制御された液体拡散システムの使用が可能である。
【００６０】
手動の注射とは逆に、潅流による注射は、皮膚生検の真皮における組成物のより均一な拡散を可能にする。「より均一な拡散」とは、注射部位から生検の端（すなわち外径）までの組成物中の化合物の濃度勾配の減少を意味する。また、注入による注射によって、より良好な再現性が確実になる。
【００６１】
「抗ＣＤ３抗体」とは、ＣＤ３抗原を特異的に結合することができる任意の抗体またはその断片を意味する。ＣＤ３は、未変化のＴ細胞の表面に存在する膜タンパク質複合体であり、１本のγ鎖、１本のδ鎖、２本のε鎖からなる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、および相補鎖ζと会合することによって、ＣＤ３は細胞内シグナルを伝達することができるＴＣＲ複合体の形成を可能にする。抗ＣＤ３抗体の市販の形態、例えばクローンＵＣＨＴ１（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  １６−００３８−８１、ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＣＢＬ１５０）、またはクローニングＡＰＡ１／１（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ０５−７８５、ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＭＡ１−１０１８２）がある。
【００６２】
好ましくは、ステップａ）で注射される組成物中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、１０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、好ましくは２０ｎｇ／μｌ〜８０ｎｇ／μｌ、特に好ましくは３０ｎｇ／μｌ〜７０ｎｇ／μｌの範囲である。
【００６３】
特定の実施形態によれば、ステップａ）で注射される組成物中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、５０ｎｇ／μｌである。
【００６４】
「抗ＣＤ２８抗体」とは、ＣＤ２８抗原と特異的に結合することができる任意の抗体またはその断片を意味する。ＣＤ２８は、特にＴ細胞の表面に存在し、その生存、クローン増殖、それらの代謝活性、ならびにＩＬ−２産生に関与する共刺激タンパク質である。抗ＣＤ２８抗体には市販の形態があり、例えばクローン１５Ｅ８（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ  １３０−０９３−３７５）またはクローンＣＤ２８．６（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  １６−０２８８−８１）がある。
【００６５】
好ましくは、ステップａ）で注射される組成物中の抗ＣＤ２８抗体の濃度は、１０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、好ましくは２０ｎｇ／μｌ〜８０ｎｇ／μｌ、特に好ましくは３０ｎｇ／μｌ〜７０ｎｇ／μｌの範囲である。
【００６６】
特定の実施形態によれば、ステップａ）で注入される組成物中の抗ＣＤ２８抗体の濃度は、５０ｎｇ／μｌである。
【００６７】
より特定の実施形態によれば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、ＣＤ３に対して特異的に指向される第１のＳｃＦＶ断片およびＣＤ２８に対して特異的に指向される第２のＳｃＦＶ断片を有する単一の二重特異的抗体によって置換される。この二重特異性抗体は、ＣＤ３およびＣＤ２８抗原の両方に結合活性を有し、常在Ｔ細胞活性化は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８単特異性抗体と同等に機能する。
【００６８】
「ＩＬ−２」とは、有糸分裂に、したがってＩＬ−２受容体を担持する細胞、特にＴヘルパー細胞の増殖に作用するサイトカインであるインターロイキン−２を意味する。
【００６９】
好ましくは、ステップａ）において注射される組成物中のＩＬ−２の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは４ｎｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００７０】
特定の実施形態によれば、ステップａ）で注射される組成物中のＩＬ−２濃度は、１０ｎｇ／ｍｌに等しい。
【００７１】
抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ならびに任意にＩＬ−２を含む組成物を健康な皮膚生検の真皮内に注射した後数時間以内に、真皮内の常在メモリーまたは未変化のＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の部分集団が活性化され、潜在的に増幅される。これらの細胞は少数であり、真皮内に無秩序に分布しているので、組成物が真皮全体に、場合によっては生検の表皮内に均一に拡散することが重要である。
【００７２】
「有効量」とは、期待される効果を達成するのに十分な量を意味する。この有効量の概念は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ−２にも適用可能である。本発明の意味の範囲内で、かつステップａ）に関連して、「期待される効果」は、真皮における真皮常在Ｔ細胞の活性化である。この効果は、組成物の注射が注入を介する場合に増強される。
【００７３】
真皮内の常在Ｔ細胞の活性化は、活性化マーカー、例えば、しかし限定されずにＣＤ６９を用いて直接強調することができる。
【００７４】
抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ−２の有効量は、皮膚生検のサイズによって変化する。
【００７５】
有効量の例としては、上記の濃度に関連した注射量の使用を挙げることができる。
【００７６】
特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップａ）において健康な皮膚生検の真皮内に注射された組成物中の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ−２の有効量は、直径が８ｍｍに等しい生検では、それぞれ５００ｎｇ、５００ｎｇ、および０．１ｎｇである。
【００７７】
別の特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップａ）において健康な皮膚生検の真皮に注射された組成物中の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ−２の有効量は、直径が１５ｍｍに等しい生検について、それぞれ１７５０ｎｇ、１７５０ｎｇ、および０．３５ｎｇである。
【００７８】
特定の実施形態によれば、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ステップｂ）の前に、ステップａ）の終了時に得られた注射された皮膚生検を凝固可能な液体マトリックス上に堆積させるステップａ’）を含み、前記マトリックスは、それ自体細胞培養挿入物に含まれ、その底部は多孔性膜からなり、前記挿入物は容器またはウェルに配置されており、したがってマトリックスが固化すると、皮膚生検の３Ｄ完全性を維持することが可能になる。
【００７９】
「凝固可能な液体マトリックス」とは、少なくとも１つの特定の化合物または組成物を含む任意の液体溶液を意味し、前記液体溶液中の濃度は、適切な条件、特に特定の温度条件を実施する場合に、液体溶液が固体またはゲル様のコンシステンシーを呈するようなものである。前記特定の化合物または組成物は、動物、植物または合成起源のものであってもよく、その性質およびその濃度は、固化したときのマトリックスの所望の物理化学的特性、特にマトリックスの柔軟性および強度に従って決定される。
【００８０】
本発明の方法の実施形態によれば、ステップａ’）において、前記固化可能な液体マトリックスは、好ましくは血漿または血漿由来の溶液から選択される、前記皮膚生検を構成する皮膚細胞の生存および培養に適合する特定の条件下で固化またはゲル化することができる任意の液体溶液、好ましくは栄養素から選択され、特に生理学的緩衝液として最大１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％および４０％に希釈された、フィブリノーゲン溶液、コラーゲン溶液、ゼラチン、合成ポリマーゲル、天然ゲル、例えばアガロースゲル、特に低融点のアガロースまたは寒天ゲル、デンプンまたは多糖ゲル、またはそれらの混合物である。
【００８１】
固化することができるマトリックスおよびその中に皮膚生検を配置する方法は、欧州特許出願ＥＰ  ２  ８８２  ２９０  Ａ１号に詳細に記載されており、参照により本明細書に引用されている。
【００８２】
固化することができるマトリックスの目的は、本発明の方法のステップａ）の終了時に得られた注射された皮膚生検を培養することを可能にし、その取り扱いをより容易にすることである。「培養」とは、皮膚生検の生理学的および形態学的状態、すなわち生検を構成するすべての組織および細胞の維持を意味する。
【００８３】
固化することができるマトリックスの目的はまた、本発明による方法によって常在Ｔ細胞が活性化された皮膚生検を保存および／または輸送することができるようにすることである。
【００８４】
固体化することができるマトリックスの性質は、皮膚生検細胞が生存し続けることを可能にしなければならず、すなわち、いかなる細胞毒性効果も持たず、室温（すなわち、１５℃から２５℃）での固化／重合温度を有する。
【００８５】
特定の一実施形態では、固化することができるマトリックスは、ヒトフィブリノーゲンの溶液である。
【００８６】
特定の実施形態によれば、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ステップａ’）の前に、ステップａ）の終了時に得られた注射された皮膚生検の表皮表面に、疎水性物質からなるリング、またはその中心に穿孔したディスクを取り付けるステップａ’’）を含み、前記リングの外径は皮膚生検の表皮表面の直径よりも大きく、前記リングの内径は皮膚生検の表皮表面の直径よりも小さい。
【００８７】
好ましくは、リングの疎水性材料は皮膚に対して毒性でない材料であり、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）（ＳＩＧＭＡ）のようなパラフィンポリマー、またはシリコンポリマーであってもよい。特定のモードによれば、リングは、疎水性材料のフィルムから、所望の寸法に従って前記フィルムを穿孔することによって製造される。リングの厚さは、好ましくは０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．５ｍｍ、さらに好ましくは０．１２〜０．２ｍｍである。
【００８８】
前記リングは、不透明または半透明の材料でできてもよい。特定の実施形態によれば、リングは不透明な材料でできている。
【００８９】
より特定の実施形態によれば、前記リングは、接着剤を用いて生検の表皮表面に付着され、好ましくはリングの下面に付加される。前記接着剤は、皮膚に対して毒性でなく、かつリングを皮膚に付着させる効果を有する任意の種類の材料から選択することができ、この材料はケイ素であり得る。好ましくは、前記接着剤は疎水性である。
【００９０】
この疎水性リングの材料、接着剤および付着方法は、欧州特許出願ＥＰ  ２  ８８２  ２９０  Ａ１号に詳述されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
「ステップａ）で得られた注射された皮膚生検をインキュベートする」とは、あらかじめ真皮に注射された皮膚生検を、有効量の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ならびに場合によってはＩＬ−２を含む組成物と、その生存に必要な全ての要素を含む培養培地中に置くステップを意味する。そのため、ステップｂ）は、ステップａ）の終了時に得られた皮膚生検を、その生存に必要なすべての要素を含む培養培地と接触させることによって行われる。
【００９２】
このステップｂ）では、ステップａ）の終了時に活性化された真皮内の常在Ｔ細胞は、さらにＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７細胞に分極する。「極性化」とは、活性化された常在Ｔ細胞がＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７ヘルパーＴ細胞系統に分化することを意味する。
【００９３】
「Ｔｈ１細胞」とは、サイトカインＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの影響下にある未変化のＣＤ４＋Ｔ細胞の分化に由来し、かつこの部分集団に特異的なサイトカイン合成プロファイル、すなわちＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を有するＴ細胞の部分集団を意味する。
【００９４】
「Ｔｈ１７細胞」とは、サイトカインＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１、およびＩＬ−２３の作用下にあるメモリーまたは未変化のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に由来し、この部分集団に特異的なサイトカイン合成プロファイル、すなわちＩＬ−１７、およびＩＬ−２２を有するＴ細胞の部分集団を意味する。
【００９５】
これら２つの細胞部分集団Ｔｈ１および／またはＴｈ１７に特異的なサイトカインの産生の測定は、これらの細胞の数と直接相関する。
【００９６】
この分化は、培養培地に、本発明の方法のステップａ）で定義されたように既に注射された健康な皮膚生検、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、および形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）の少なくとも１つの混合物の有効量を含む組成物を加えることによって誘導される。
【００９７】
「インターロイキン−１β」とは、細菌攻撃に応答してマクロファージおよび樹状細胞によって天然に分泌される前駆体のカスパーゼ１タンパク質分解に由来する約３０ｋＤａのタンパク質を意味する。このサイトカインは炎症応答の重要なメディエーターであり、増殖、分化、アポトーシスを含む多くの細胞活性に関与している。
【００９８】
「インターロイキン−２３」とは、ＩＬ−２３に特異的なｐ１９サブユニット、およびＩＬ−１２に共通のｐ４０サブユニットから構成される約６０ｋＤａのヘテロ二量体タンパク質を意味する。一部のＴ細胞の部分集団の表面に存在するヘテロ二量体受容体ＩＬ１２ＲＢ１およびＩＬ２３Ｒに結合することにより、このサイトカインはメモリーＴ細胞の刺激を可能にし、炎症誘発性サイトカインの合成を導く。
【００９９】
「ＴＧＦ−β」とは、前駆体として合成されるサイトカインの成熟型に対応する２５ｋＤａの二量体タンパク質を意味する。このサイトカインはマクロファージを含む多数の細胞によって分泌され、増殖からアポトーシスに至るまで細胞に対して多面的な効果を発揮する。ＴＧＦ−βはまた、炎症の制御において非常に重要な役割を果たす。
【０１００】
「有効量」により、本発明の意味の範囲内で、かつステップｂ）に関連して、ステップａ）で活性化されたＴ細胞のＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７への分極、ならびに炎症マーカーの合成を得るための有効量のＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βを意味する。
【０１０１】
好ましくは、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＩＬ−１βの濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは７ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＩＬ−１βの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０３】
好ましくは、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＩＬ−２３の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１０４】
特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＩＬ−２３の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０５】
好ましくは、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＴＧＦ−β濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは７ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＴＧＦ−βの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０７】
より特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）で使用される組成物の混合物中のＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０８】
本発明の方法のステップｂ）は、真皮の活性化されたＴＣＤ４＋細胞のＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞への極性化を可能にするのに十分長い期間、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で実施される。
【０１０９】
好ましくは、ステップａ）で得られた注射された皮膚生検を、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦβの少なくとも１つの混合物を含む組成物の存在下でインキュベートするステップｂ）は、少なくとも３日間、好ましくは３〜１０日間の期間実施される。
【０１１０】
好ましくは、本発明の方法のステップｂ）のインキュベーション期間は、５日以上とする。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、ステップａ）で得られた注射された皮膚生検を、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物を含む組成物の存在下でインキュベートするステップｂ）の継続期間は、７日間である。
【０１１２】
好ましくは、本発明の方法のステップｂ）で使用されるＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物を含む組成物は、混合物の成分の一定濃度を維持するために頻繁に更新され、溶液中のそれらの半減期は、数分から数時間である。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）で使用されるＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物を含む組成物は、このステップの期間を通して毎日更新される。
【０１１４】
別の特定の実施形態によると、本発明による方法は、化合物の抗炎症効果を評価することをさらに目的とし、次の追加のステップを含む：
ｃ）候補化合物と、ステップｂ）の終了時に得られ、ＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７極性化Ｔ細胞を含む炎症を起こした皮膚のモデルを接触させるステップ；
ｄ）炎症を起こした皮膚のモデルの少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｅ）ステップｄ）で得られた前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ；
ｆ）ステップｄ）で測定した前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。
【０１１５】
「抗炎症効果」とは、限定されるものではないが、炎症誘発性サイトカインの産生を低下させ、抗炎症性サイトカインの合成を促進し、免疫系細胞の増殖を調節するような、炎症を低下させる化合物の能力を意味する。
【０１１６】
「候補化合物」とは、炎症調節剤としての潜在的使用のために選択される任意の合成の、または天然の化学物質を意味する。候補化合物は、精製または混合することができる。候補化合物には、小分子、巨大分子、およびポリマーが含まれる。いくつかの実施形態において、候補化合物は、化学合成によって生成されるか、または組合せライブラリーに含まれる分子であり得る。いくつかの実施形態において、候補化合物は、その構造がコンピュータまたは三次元分析によって設計される分子または巨大分子であり得る。候補化合物には、有機源（例えば、動物抽出物、植物抽出物、および微生物溶解物）からの粗抽出物または精製抽出物も含まれる。本発明の方法の実施に使用される候補化合物は、不活性緩衝液（例えば、塩溶液）または適切な溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールおよびエタノールなどのアルコール、水溶液または化粧品組成物に使用される他の任意の化合物と組み合わせることができる。
【０１１７】
「炎症マーカー」とは、炎症を起こしていない細胞、組織または臓器と比較して、炎症を起こしている細胞、組織または臓器における発現量の変化を示す、発現可能な要素、またはそれによって発現される要素を意味する。炎症マーカーの中には、炎症を起こしていない細胞、組織または臓器と比較して、炎症を起こした細胞、組織または臓器における発現レベルにおいて統計学的に有意な差異（ｐ≦０．１０）を示すものもある。例えば、「炎症マーカー」は、炎症を起こしていない同様な組織に含まれる同型の細胞と比較して、炎症を起こした組織に含まれる細胞中で異なる速度で発現される遺伝子、遺伝子断片、またはコード領域であり得る。「炎症マーカー」は、タンパク質の物理的存在によって、またはタンパク質に特徴的な活性によって測定されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）産生またはタンパク質産生に対応し得る。炎症マーカーの一覧は、説明の前半に記載されている。
【０１１８】
炎症マーカー（ｍＲＮＡまたはタンパク質）の性質に応じて、当業者に周知の検出方法が適用されるであろう。これらには、限定されるものではないが、タンパク質の検出のためのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ型試験が含まれる。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現は、マイクロアレイ、ＲＮＡ−ＳｅｑまたはＮｅｘｔＧｅｎ配列決定技術を用いて決定することができる。また、炎症を起こした皮膚のモデルの培養培地、炎症を起こした皮膚のモデルの全部もしくは一部、または特に真皮もしくは表皮、または真皮および／もしくは表皮の特定の細胞サブタイプにおいて、炎症マーカーを直接測定することも可能である。
【０１１９】
ステップｃ）で候補化合物を炎症を起こした皮膚のモデルと接触させることは、局所的に、または培養培地中で直接行うことができる。局所適用の場合、候補化合物の適用前に、本発明の方法のステップａ）およびｂ）から得た炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮表面を乾燥する（すなわち、表皮からの液体の可能な微量を除去する）。
【０１２０】
また、ステップｃ）において候補化合物を炎症を起こした皮膚のモデルと接触させるこのステップは、皮下注射によって実施することも可能である。このような実施形態は、高分子量を有する、親水性が高い、または容易に分解される候補化合物に対して特に適切である。例として、このような化合物は、タンパク質性の候補化合物、特に抗体であり得る。
【０１２１】
好ましくは、候補化合物を炎症を起こした皮膚のモデルと接触させるステップｃ）は、数分から数時間、またはさらに数日続くことがある。候補化合物の性質、安定性、溶解性、または他のいずれかの物理化学的特性に応じて、前記接触はまた、７日の全継続期間にわたって毎日更新してもよい。
【０１２２】
好ましくは、本発明の方法のステップｄ）において、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に好ましくは少なくとも５つの炎症マーカーの発現レベルが測定される。
【０１２３】
炎症マーカーは、以前に定義されたとおりである。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、ステップｄ）はまた、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群から選択される少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、および特に好ましくは少なくとも６つの炎症マーカーの発現レベルを測定することを含む。
【０１２５】
対照の発現レベルは、ステップｂ）における本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のモデルにおいて、およびそれを候補化合物と接触させるステップｃ）の前に測定することができる。
【０１２６】
対照発現レベルはまた、炎症性皮膚状態、特に乾癬を有する１人以上の患者から採取した、特に乾癬病変を有する炎症を起こした皮膚の１つ以上のサンプルにおいて測定することもできる。
【０１２７】
好ましくは、本発明の方法のステップｆ）の終了時に、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、および特に好ましくは少なくとも８０％だけ、少なくとも２つの炎症マーカーのタンパク質および／または遺伝子発現のレベルの低下と関連する候補化合物を選択する。
【０１２８】
このような方法は、既存の炎症に対して治療効果を有する化合物を同定することを可能にする。
【０１２９】
このような影響は、文献国際公開第２０１４／１８２６５５  Ａ１号で開発されたモデルでは測定できない。実際、このモデルは、真皮の常在Ｔ細胞の活性化後、せいぜい４８時間でのみ解析できるようである。
【０１３０】
また、化合物が炎症の発生を防ぐ有効性を試験することも可能である。
【０１３１】
さらに別の特定の実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）およびｃ）は、試験中の候補化合物が抗炎症効果を有する場合に炎症の発症を防止するために同時に実施される。
【０１３２】
化合物の予防効果を試験することも可能である。
【０１３３】
この場合、本発明の方法のステップａ）、ｂ）、ｃ）の順序を逆にして、炎症の発症を防止する。この実施形態では、候補化合物を皮膚モデルと接触させるステップは、真皮内に常在するＴ細胞を活性化させるステップａ）および極性化させるステップｂ）の前に行われる。
【０１３４】
本発明の方法は、皮膚炎症を調節する候補化合物のための他のスクリーニング試験、例えば、限定されるものではないが、皮膚細胞部分集団に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、酵素試験、またはさらに炎症性皮膚疾患（すなわち、皮膚炎、乾癬病変・・・）を有する患者からの皮膚生検で実施されるｅｘ  ｖｉｖｏ試験に加えて用いることもできる。
【０１３５】
本発明の別の目的は、真皮、表皮、表皮付属物、および場合によっては皮下組織を含み、ＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７に極性化された活性化されたＴ細胞が表皮ケラチノサイトの炎症を促進した、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルに関する。
【０１３６】
好ましくは、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、真皮、表皮、表皮付属物、ならびにＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞を含み、少なくとも２つの炎症マーカーの発現、および任意にケラチノサイトの過剰増殖によって特徴づけられる。
【０１３７】
好ましくは依然として、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、真皮、表皮、表皮付属物、皮下組織、ならびにＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞を含み、少なくとも２つの炎症マーカーの発現、および任意にケラチノサイトの過剰増殖によって特徴づけられる。
【０１３８】
少なくとも２つの炎症マーカーの発現の測定は、タンパク質および／または遺伝子レベルで実施することができる。
【０１３９】
好ましい実施態様によれば、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、真皮、表皮、表皮付属物、ならびにＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞を含み、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群から選択される少なくとも２つの炎症マーカーおよび少なくとも３つ、特に少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、および特に好ましくは少なくとも６つの炎症マーカーのタンパク質および／または遺伝子レベルでの発現を特徴とする。
【０１４０】
別の好ましい実施態様によれば、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、真皮、表皮、表皮付属物、皮下組織、ならびにＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞を含み、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群から選択される少なくとも２つの炎症マーカーおよび少なくとも３つ、特に少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、および特に好ましくは少なくとも６つの炎症マーカーのタンパク質および／または遺伝子レベルでの発現を特徴とする。
【０１４１】
そのｅｘ  ｖｉｖｏでの生存維持、その取り扱いおよびその輸送を最適化するために、前記炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを、表皮を空気と接触させた状態に維持する固化したマトリックス中に置くことができ、前記マトリックスは、細胞培養挿入物中に含まれる。
【０１４２】
本発明の別の目的は、容器または培養ボックスウェルに含まれるのに適しており、その底部は、多孔性膜（４０）からなり、前記挿入物は、固化したマトリックス（２０）に埋め込まれた炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデル（３０）を含み、前記マトリックスは、挿入物の内縁および多孔性膜に接触しており、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮は、大気および真皮に接触しており、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮付属物は、固化したマトリックスに浸漬されている、細胞培養挿入物（１０）に関する。
【０１４３】
特定の実施形態によれば、底部が多孔性膜からなる前記細胞培養挿入物は、ナセル（すなわち、Ｕ）の形状の挿入物であり、好ましくは、その直径は５〜４０ｍｍ、より好ましくは９．５〜３０ｍｍの範囲である。
【０１４４】
別の特定の実施形態によれば、容器または培養ボックスウェルに含まれるのに適しており、その底部が多孔性膜（４０）からなる前記細胞培養挿入物（１０）は、固化したマトリックス（２０）に埋め込まれた本発明の方法のステップａ）の終了時に得られた注射された健康な皮膚生検（３０）を含み、前記マトリックスは挿入物の内縁および多孔性膜と接触しており、皮膚生検の表皮は大気および真皮と接触しており、皮膚生検の表皮付属物は固化したマトリックスに浸漬されている。任意に、固化したマトリックスはまた、少なくともＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの混合物を含む。
【０１４５】
なお好ましくは、前記細胞培養挿入物は、ラグ（６０）によって懸濁されているか、またはパイル上にある挿入物であり、好ましくは懸濁されている。
【０１４６】
別の特定の実施形態によれば、疎水性リング（５０）は、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮表面に付着している。
【０１４７】
なお好ましくは、前記多孔性膜は、液体マトリックスがその固化前に膜を通過するのを防ぐための多孔性を有する膜であり、好ましくは０．４〜８μｍ、より好ましくは０．４〜１．５μｍの範囲であり、０．８〜１．２μｍが好ましい多孔性である。
【０１４８】
なお好ましくは、前記多孔性膜は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ニトロセルロース、またはポリカーボネートから選択される膜である。
【０１４９】
細胞培養挿入物の中で、特にＮＵＮＣ社 （Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄａｎｅｍａｒｋ）、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ （ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ  Ｆｒａｎｃｅ  ＳＡＳ，３８ ８０１  Ｌｅ  Ｐｏｎｔ−Ｄｅ−Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）（ＥＭＤ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、またはＣｏｓｔａｒ（登録商標）（Ｇｒｏｓｓｅｒｏｎ  ＳＡＳ，４４８１９  Ｓａｉｎｔ−Ｈｅｒｂｌａｉｎ  Ｆｒａｎｃｅ）によって供給されるものに言及することができ、例えば、ポリカーボネート、ＰＥＴまたはニトロセルロースで作られた膜を有する挿入物は、６、８、１２、および２４ウェルを有するマルチウェルプレートに予めパッケージされており、その膜多孔度は０．４〜８μｍの間で変化し得、８ウェルボックスおよび／または膜の多孔度が０．８μｍから１μｍのボックスおよび／またはＰＥＴが最も好ましい。
【０１５０】
特定の実施形態によれば、前記細胞培養挿入物が配置される前記容器は、６、８、１２、２４、または４８ウェルを有する細胞培養プレートのウェルである。
【０１５１】
これらの培養プレートの中では、特にＮＵＮＣ、ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮにより供給されるもの、または参照Ｍｉｌｌｉｃｅｌ（登録商標）もしくはＣｏｓｔａｒ（登録商標）の下で供給されるものを挙げることができる。
【０１５２】
好ましくは、細胞培養挿入物の底部は、前記挿入物を含む容器の底部から、特に培養プレートのウェルの底部（または指定に応じてペトリ皿の底部）から１ｍｍ〜２．５ｍｍの距離に位置する。
【０１５３】
本発明の炎症を起こした皮膚のモデルの利点は、特に同じドナーまたは別々のドナー由来の健康な皮膚のサンプル（すなわち、生検）を繰り返し使用することによって、抗炎症化合物のスクリーニングを大規模で実施することが可能であることである。複数の候補化合物を、数十から数百、またはさらに数千までスクリーニングすることができる。数人のドナーから炎症を起こした皮膚のモデルを得る利点の１つは、炎症マーカーの比率の個人間調節を比較することができ、従って皮膚炎症を減少させるのに最も活性な候補化合物を同定することができることである。
【０１５４】
本発明のさらに別の目的は、抗炎症効果を有する化合物を同定するために上記の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの使用に関する。
【０１５５】
上述の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの構造は、皮下注射または局所適用後の抗炎症効果を有する化合物の適切な拡散を可能にし、それらのバイオアベイラビリティに事実上影響する。
【０１５６】
本発明のこの用途に従って同定された化合物は、急性または慢性の皮膚炎症を有する患者に対する治療的処置の開発のための基礎として役立つことができる。本発明によるこのような使用は、本発明の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のモデルに対して試験される種々の化合物の抗炎症効果の強度に従って、ある患者から別の患者に個別化できる療法を想定することを可能にする。
【０１５７】
炎症性皮膚疾患の中には、限定するものではないが、アトピー性皮膚炎、乾癬、湿疹、皮膚病、アレルギー性接触皮膚炎、苔癬、そう痒症、Ｎｅｔｈｅｒｔｏｎ症候群、尋常性魚鱗癬などが挙げられる。
【０１５８】
本発明の特定の実施形態によれば、上述の方法によって得られる炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、乾癬を処置するための化合物を同定することを可能にする。
【０１５９】
本発明の別の目的は、本発明の方法を実施するためのキットに関し、前記キットは、哺乳動物からあらかじめ採取された健康な皮膚生検、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の有効量を含む組成物Ａ、ならびに任意にＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３およびＴＧＦβの少なくとも１つの混合物を含む組成物Ｂ、ならびに任意に特に注入による注射装置を含む。
【０１６０】
好ましくは、組成物Ａ中の抗ＣＤ３の有効量は、１０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、好ましくは２０ｎｇ／μｌ〜８０ｎｇ／μｌ、および特に好ましくは３０ｎｇ／μｌ〜７０ｎｇ／μｌの範囲である。
【０１６１】
好ましくは、組成物Ａ中の抗ＣＤ２８の有効量は、１０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、好ましくは２０ｎｇ／μｌ〜８０ｎｇ／μｌ、および特に好ましくは３０ｎｇ／μｌ〜７０ｎｇ／μｌの範囲である。
【０１６２】
好ましくは、組成物Ａ中のＩＬ−２の有効量は、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは４ｎｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１６３】
特定の実施形態によれば、組成物Ａ中の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ−２の有効量は、それぞれ５０ｎｇ／μｌ、５０ｎｇ／μｌ、および１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１６４】
好ましくは、組成物Ｂの混合物中のＩＬ−１βの濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは７ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１６５】
好ましくは、組成物Ｂの混合物中のＩＬ−２３濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１６６】
好ましくは、組成物Ｂの混合物中のＴＧＦ−β濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは７ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０１６７】
特定の実施形態によれば、組成Ｂの混合物中のＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの量は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１６８】
本発明によるキットでは、眼に知覚可能な炎症のいかなる徴候（すなわち、皮膚の破損、発赤、腫脹、加熱、もしくは過度のスケーリング・・・）をも示さないか、またはいかなる炎症マーカーをも発現しない皮膚断片から、健康な皮膚生検を採取する。さらに、前記健康な皮膚生検は、少なくとも表皮、真皮、および表皮付属物、ならびに、場合によっては皮下組織とも称される皮下の組織の一部を含む。
【０１６９】
好ましくは、前記皮膚生検は、動物、特に哺乳動物、および好ましくはヒトから採取される。本発明のキットに使用することができる生検としては、手術廃棄物または屠殺場から得られる生検を挙げることができる。「手術廃棄物」とは、眼瞼形成術後、鼻形成術後、腹部形成術後、または乳房縮小術を含む美容外科から得られた皮膚外植片を意味する。皮膚生検サンプリング技術は、当業者に周知である。
【０１７０】
本発明によるキットでは、手動注射装置は、２６Ｓまたは２２Ｓフォーマットの針の中に死腔のないシリンジを含む。
【０１７１】
本発明によるキットにおいて、注入注射装置は、２８Ｇまたは３０Ｇフォーマットの針に接続されたカテーテルに接続された浸透圧ポンプを含む。
【０１７２】
本発明のさらに別の目的は、以下を含むキットに関する：
−  容器または培養ボックスウェルに含まれるのに適しており、その底部は、多孔性膜（４０）からなり、前記挿入物は、固化したマトリックス（２０）に埋め込まれた本発明の方法のステップａ）の終了時に得られた注射された健康な皮膚生検（３０）を含み、前記マトリックスは、挿入物の内縁および多孔性膜に接触しており、皮膚生検の表皮は、大気および真皮に接触しており、皮膚生検の表皮および表皮付属物は、固化したマトリックスに浸漬されている、少なくとも１つの細胞培養挿入物（１０）、
−  ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物を含む組成物Ｂ。
【０１７３】
別の特定の実施形態によれば、本発明の前記キットは、以下を含む：
−  容器または培養ボックスウェルに含まれるのに適しており、その底部は、多孔性膜（４０）からなり、前記挿入物は、少なくともＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの混合物を含有する固化したマトリックス（２０）に埋め込まれた本発明の方法のステップａ）の終了時に得られた注射された健康な皮膚生検（３０）を含み、前記マトリックスは、挿入物の内縁および多孔性膜に接触しており、皮膚生検の表皮は、大気および真皮に接触しており、皮膚生検の表皮および表皮付属物は、固化したマトリックスに浸漬されている、少なくとも１つの細胞培養挿入物（１０）、
−  ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物を含む組成物Ｂ。
【０１７４】
以下の実施例は、単に本発明の主題の例示によって示されており、決してその限界を構成するものではない。
【実施例】
【０１７５】
１−皮膚生検の調製
皮膚生検は、表皮、真皮、および皮下を含む完全な皮膚試料から調製する。これらの生検に基づき、試験すべき抗炎症化合物の性質に応じて、２つの異なる実施形態が可能である。
【０１７６】
第１の実施形態では、脂肪組織（すなわち、皮下組織）を、それを真皮から分離するために湾曲したはさみで切断する。厚さが約３ｍｍである生検（表皮と真皮）を、次いで金属製のパンチを使って切り出す。この第１の実施形態は、局所適用によって抗炎症化合物を試験するためである。
【０１７７】
第２の実施形態では、皮下組織は温存される。その後、厚さが約１ｃｍである生検（表皮、真皮、皮下組織）を、次いで金属パンチを用いて切り出す。この第２の実施形態は、皮下注射によって抗炎症化合物を試験するためである。
【０１７８】
調製後、生検は、常在Ｔ細胞活性化ステップまで緩衝生理食塩水中に浮遊して維持される。
【０１７９】
２−常在Ｔ細胞の活性化
クランプを使って、皮膚生検を、真皮を上にして平らに保つ。死腔のない針を、７０１Ｎまたは７０５Ｎのハミルトンシリンジ（それぞれ直径８ｍｍまたは１５ｍｍの生検用）を用いて真皮側から生検に挿入する。それぞれ直径８または１５ｍｍの生検についての活性化溶液（５０ｎｇ／μＬの抗ＣＤ３抗体、５０ｎｇ／μＬの抗ＣＤ２８抗体、および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２）の１０μＬまたは３５μＬを、生体検査の側面から、上皮への損傷を避けるために注射する。
【０１８０】
注入によって注射を行う場合、活性化溶液２００μＬを、浸透圧ポンプ（試験した２００１Ｄポンプモデル用）に負荷させる。生検の大きさに応じて溶液の濃度を調整した：２．５ｎｇ／μＬの抗ＣＤ３抗体、２．５ｎｇ／μＬの抗ＣＤ２８抗体、８ｍｍ直径の生検で０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２；８．７５ｎｇ／μＬの抗ＣＤ３抗体、８．７５ｎｇ／μＬの抗ＣＤ２８抗体、１５ｍｍ直径の生検で１．７５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２。
【０１８１】
次に、ポンプを、流量調節器を用いてカテーテルに接続する。次いでポンプをプライミングする：それを緩衝生理食塩水に入れ、３７℃で３時間インキュベートする。
【０１８２】
このインキュベーションの終わりに、カテーテルの自由端（ポンプに接続されていない）を、針に接続する。生検の真皮内への針の埋め込みは、上述と同様にして手動で行う：皮膚はクランプで平らに保持し、真皮を上に置く。表皮を傷つけないように、生検の側から針を真皮内に挿入する。
【０１８３】
次に、移植された生検を、適切な培養培地上に浮遊させて沈着させる。ポンプは、緩衝生理食塩水溶液に浸しておく。その全部を、３７℃、５％ＣＯ２、最高湿度のインキュベーターで２４時間インキュベートする。
【０１８４】
注入の２４時間の終了時に、針を生検から取り出し、ポンプを外す。
【０１８５】
３−ｅｘ  ｖｉｖｏ培養
活性化された常在Ｔ細胞が活性化されている皮膚生検は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したヒト皮膚または表皮外植片に対する物理的支持および栄養層としての天然マトリックスの使用に基づき、ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）モデルに使用されるのと同じ方法を用いて、培養挿入物に注入された液体マトリックス上にマウントされる。その後、外植片を、プレート（インキュベーター培養、毎日の培養培地の更新）で培養する。
【０１８６】
４−Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ１７への分化
ＷＩＬＬＩＡＭのＥ合成培養培地中で、以下のサプリメントを添加する：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２３、および１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ。培養は、３７℃でＣＯ２インキュベーター中で７日間行う。サプリメントを含む培養培地を、毎日交換する。
【０１８７】
真皮内の常在するＴ細胞の活性化および分化ステップに続いて、皮膚生検は、表皮および真皮を含む場合はＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）、または表皮、真皮および皮下を含む場合はＨｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）の商品名を有する。
【０１８８】
５−組織学的解析
５．１−ミクロトーム切断
この分析は、ミクロトームを用いた連続切片によりパラフィンブロックに含まれる試料について実施することができる。
【０１８９】
本発明の方法のステップａ）およびｂ）に従って処置された皮膚生検は、アルコール浴により脱水された後、キシレン浴に通じる。パラフィンの第１の浴は、皮膚外植片に以前に含まれていた水をパラフィンで置き換えることができる。
【０１９０】
パラフィンを含浸させた試料を浴から取り出し、容器に移し、その底部を吸収性紙で裏打ちし、埋め込みステーションの近傍まで採取する。
【０１９１】
組織学カセットに包まれた試料を５６℃の流動パラフィンに浸漬し、それらを含浸させたパラフィンを再溶融する。
【０１９２】
各サンプルについて：組織学カセットを開き、サンプルを場合により半分に切断する。包埋型に流動パラフィンを充填し、サンプル（または２個のサンプル片）を型に入れ、切断のために所望の方向に向かわせる。同時に、型を冷蔵ラックに移し、型の底部のパラフィンを固め、そこに試料を保持する。サンプル参照を上に置いた組織学カセットの蓋を上に置き、パラフィンがそこを通過するようにして（必要であればパラフィンを加えることができる）、次いでアセンブリを数分間（５〜６）冷蔵保存（冷蔵庫、冷凍庫、低温室・・・）に置き、パラフィンをブロックに固めるために、サンプルを右向きに、ブロックの支持体となる組織学カセットの蓋に捕獲する。
【０１９３】
ブロックが固くなった後、それを型から放出する。余分なパラフィンは、場合により埋め込みカセットの蓋の側面にヘラで擦り落とす。
【０１９４】
次に、試料を含むパラフィンブロックの全長に沿って、４〜５μｍで変動する厚さの連続切片を、作製する。
【０１９５】
図２は、Ｔｈ１および／またはＴｈ１７細胞に活性化された常在Ｔ細胞の分極培地中で培養５日または７日後に本発明の方法に従って処理された皮膚生検で実施されたこのような染色の結果を示す。組織学によるモデルの分析（例えば、ヘマトキシリンおよびエオジン染色）により、表皮における海綿症（Ｓ）の出現、ならびに極性培地中で活性化された生検の７日間の培養後の表皮隆起伸長（Ｅ）の形成を証明することが可能である。
【０１９６】
健康な皮膚生検に含まれる一部の細胞部分集団を同定するために、抗ＣＤ２０７、抗ＣＤ３、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗トリプターゼ免疫染色を用いて組織学的に解析を行った。ＤＡＰＩで核対比染色を行った。図３の結果は、健康な皮膚生検組織には、Ｔ０および培養７日後（Ｔ７）にランゲルハンス細胞（ＣＤ２０７）、常在Ｔ細胞（ＣＤ３）、樹状細胞（ＨＬＡ−ＤＲ）、および肥満細胞（トリプターゼ）が含まれていることを示している。
【０１９７】
５．２−低温切開片
また、脱水時の細胞／スフェロイド（複数可）の蛍光を変化させないために、凍結切片上で分析を行うこともできる。
【０１９８】
本発明の方法のステップａ）およびｂ）に従って処理した皮膚生検の培養を、１０％ホルマリンの容量の１０倍中で２４時間サンプルを固定することによって停止させる。次いで、外植片を１０倍量のＰＢＳで洗浄し、吸収性紙上にブロットし、エッペンドルフ管に移す。エッペンドルフ管は、外植片が凍結されるまで液体窒素に浸漬される。
【０１９９】
クリオスタット封入体では、凍結した外植片をＯＣＴで封入し、次いで、移植されたスフェロイド（複数可）を含む外植片の部分の３〜１５μｍの一定の厚さのスライスを作製する。スライスをスライド上に置き、少なくとも数時間乾燥させる。
【０２００】
ヘマトキシリンとエオジンによる従来の染色が行われる。
【０２０１】
６−炎症を起こした皮膚のモデルの検証
６．１−炎症マーカー
モデルにより産生されたサイトカインＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２およびＩＦＮγを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙからの特異的検出キット（Ｕ−ＰＬＥＸ  ＴＨ  １７  Ｃｏｍｂｏ  ２  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｋ１５０７６Ｋ）を用いた、およびｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙプラットフォーム（ＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ  １２０）を用いたＥＬＩＳＡアッセイにより、培養培地中で解析した。
【０２０２】
図４は、異なるモデルにおけるサイトカインアッセイで得られた結果を示す。ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）モデルは、表皮および真皮を含み、皮下組織を含まない皮膚生検である。プロＴｈ１７／Ｔｈ１極性カクテル（２）の存在下で培養した標準的なＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）（１）またはＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）モデルとは対照的に、サイトカインであるＩＬ−１７Ａ（図４Ａ）およびＩＬ−２２（図４Ｂ）は、本発明の方法によって得られたＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）モデル（３）によってのみ産生される。
【０２０３】
６．２−角化細胞の活性化
本発明の方法のステップｂ）の終了時において、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、乾癬患者の乾癬病変で観察されるものと同等の特徴的な徴候を示す。下の表は、これらのマーカーのいくつかの外観を示している。
【０２０４】
【表１】
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【０２０５】
ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−βの混合物の存在下で皮膚生検を５日間インキュベートした後、ケラチノサイトの過剰増殖に特徴的なマーカーＳ１００Ａ７（ソリアシン）およびケラチン１６（ＫＲＴ１６）の出現が観察される。これらのマーカーの割合は、Ｔｈ１／Ｔｈ１７に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の極性化が開始した７日後でも増加する。
【０２０６】
さらに、本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮のケラチノサイト内に、アポトーシスが観察される。
【０２０７】
７−抗炎症化合物のスクリーニング
本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のモデルの関連性を試験するために、それらの抗炎症作用について知られている化合物を試験した。これらは、ベタメタゾンジ−プロピオネートおよびＰＤＥ４阻害剤である。これらの生成物の局所適用（直径８ｍｍの生検で１０μＬの一定の体積）は、ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）モデル（予防的処置）の活性化および製造直後に、または処置（治療的処置）のない培養の３日後に実施し、培養の７日目まで毎日繰り返した。
【０２０８】
組織学的解析（図５）では、皮膚、特に表皮の完全性および構造、ならびに表皮細胞の生存性が、予防的処置としてのベタメタゾンジプロピオネートおよびＰＤＥ４阻害剤での処置中に、それぞれのプラセボ対照と比較して保たれていることが示されている。
【０２０９】
炎症誘発性サイトカインＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαの分泌の分析（図６〜９）によって、以下のことが示される：
−  ＩＬ−１７Ａ分泌（図６）は、それぞれのプラセボ対照と比較して、予防的処置としてベタメタゾンジプロピオネート（３）とＰＤＥ４阻害剤（５）によって強く阻害され（図６Ａ）、一方ベタメタゾンジプロピオネート（３）のみが、治療的処置としてＩＬ−１７Ａ分泌を阻害する（図６Ｂ）。
−  ＩＬ−２２の分泌（図７）は、ベタメタゾンジプロピオネート（３）によって強く阻害され、ＰＤＥ４阻害剤（５）によって、それぞれのプラセボ対照に比べて予防的処置としてさらにより強く阻害され（図７Ａ）、一方ベタメタゾンジプロピオネート（３）は、治療的処置としてＩＬ−２２分泌を阻害する（図７Ｂ）。
−  ＩＦＮγ分泌（図８）は、それぞれのプラセボ対照と比較して予防的処置としてベタメタゾンジプロピオネート（３）およびＰＤＥ４阻害剤（５）によって強く阻害され、一方ベタメタゾンジプロピオネート（３）のみが、治療的処置としてＩＦＮ分泌を阻害する（図８Ｂ）。
−  ＴＮＦα分泌（図９）は、それぞれのプラセボ対照と比較して予防的処置（図９Ａ）だけでなく、治療的処置（図９Ｂ）としてもベタメタゾンジプロピオネート（３）およびＰＤＥ４阻害剤（５）によって強く阻害される。
【０２１０】
８−抗ＣＤ３抗体の真皮細胞への取り込み
抗ＣＤ３抗体の取り込みに関する比較試験を、ヒト皮膚生検で実施した。蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｒｅｆ．Ａ５１００１）と結合した抗ＣＤ３ｅ抗体４０ｎｇ／μｌは、厚さ４ｍｍ、直径８ｍｍのヒト皮膚生検の真皮内に直接注入するか、または皮膚生検を浮遊状態に維持した培養培地に添加した。培養２４時間後、皮膚生検を１０％ホルマリン溶液に固定し、パラフィンブロックに包埋する。生検の一定の厚さ５μｍの連続切片を作製する。細胞核は、ＤＡＰＩでマークされている。分析には、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ５０００蛍光顕微鏡を用いる。
【０２１１】
真皮細胞への抗ＣＤ３ｅ抗体の取り込みは、この抗体の真皮への直接の注射を受けた２つの別々の生検（反復１および２）において矢印によって具体化される（図１１、左パネル−ＩＩ）。高倍率（図１２）では、抗ＣＤ３ｅ抗体が一部の真皮細胞の細胞質に取り込まれていることがわかる。
【０２１２】
逆に、抗ＣＤ３ｅ抗体を含む培養培地中でインキュベートされた２つの生検のうち、１つのみについて、この抗体の検出は視認可能であり、表皮の表面上でのみ星印により具体化される（図１１右パネル−ＡＭＣ／Ｒ１）。受動的拡散により抗ＣＤ３ｅ抗体を取り込むことができた皮膚細胞はなかった。
【０２１３】
これらの結果は、抗ＣＤ３抗体がこの組織に直接注入された場合にのみ皮膚細胞に到達することを示している。
【０２１４】
抗ＣＤ２８抗体でも同様の結果を得ることができる。
【０２１５】
９−抗炎症化合物のスクリーニング
本発明の方法により得られた炎症を起こした皮膚のモデル（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標））の妥当性を検証するために、その抗炎症作用について知られている抗体を試験した。これは、アダリムマブ抗ＴＮＦα抗体である。本発明の方法により、厚さ１ｃｍの炎症を起こした皮膚（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ）の生検を得た。Ｔ０（予防的処置、Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ＋抗ＴＮＦα−Ｐ）または炎症生検のｅｘ  ｖｉｖｏ培養の３日後（治療的処置、Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ＋抗ＴＮＦα−Ｔ）で、アダリムマブ５０ｎＭの皮下注射（すなわち真皮内）を行った。７日間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養後、培養培地を採取し、皮膚生検を１０％ホルマリン溶液に固定した後、パラフィンブロックに包埋する。生検組織の一定の厚さ５μｍの連続切片を作製する。皮膚生検の形態学的外観を、ヘマトキシリンおよびエオジン染色を用いて光学顕微鏡下で検討した。蛍光色素と結合した抗Ｓ１００Ａ７抗体を用いて、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ５０００顕微鏡）によりソリアシン（Ｓ１１０Ａ７）の存在を確認する。細胞核は、ＤＡＰＩでマークされている。炎症を起こしていない皮膚の生検（ＨｙｐｏＳｋｉｎ（登録商標）−表皮、真皮、および皮下を含む生検）を、対照に用いる。
【０２１６】
組織学的解析（図１３）は、皮膚、特に表皮、および表皮細胞の完全性と構造、および表皮細胞の生存率は、この抗体で処置されていない炎症を起こした皮膚の生検（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ）と比較して、予防的処置として（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ＋抗ＴＮＦα−Ｐ）および治療的処置として（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ＋抗ＴＮＦα−Ｔ）抗ＴＮＦα抗体アダリムマブで処置されたときに維持されることを示している。
【０２１７】
さらに、抗ＴＮＦ−αで処置した炎症生検からのサンプルでは、ソリアシンはほとんど検出不能になるため、炎症の消失が証明される。
【０２１８】
ＩＬ−２２炎症誘発性サイトカイン分泌の解析から、ＩＬ−２２分泌（図１４）は、本抗体により処置されていない炎症を起こした皮膚の生検（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ）と比較して、予防的処置として（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ＋抗ＴＮＦα−Ｐ）および治療的処置として（Ｈｙｐｏ−ＩｎｆｌａｍｍａＳｋｉｎ（登録商標）−Ｉ＋抗ＴＮＦα−Ｔ）抗ＴＮＦα抗体により強く阻害されることが示されている。
【０２１９】
これらの結果は、本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルが、抗炎症化合物、特に抗乾癬化合物のスクリーニングを可能にし、その投与経路は皮下注射であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2020535402.tif 000019
【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月19日(2020.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）あらかじめ哺乳動物から採取した健康な皮膚生検の真皮内に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の皮膚常在Ｔ細胞を活性化するための有効量を含む組成物を注射するステップ、
ｂ）ステップａ）において活性化されたＴ細胞のＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７への極性化ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの少なくとも１つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップａ）において得られた前記注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを得るためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項２】
前記注射された組成物が有効量のＩＬ−２をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が手動で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーションステップｂ）が少なくとも５日間続く、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）およびｂ）の間に、固化可能な液体マトリックス上に、ステップａ）の終了時に得られた前記注射した皮膚生検を堆積させる追加のステップａ’）を含み、前記マトリックス自体が細胞培養挿入物内に含まれており、その底部は多孔性膜からなり、前記挿入物が容器またはウェル内に配置されており、したがって、マトリックスが固化した後に、前記皮膚生検の３Ｄ完全性が維持されることを可能にする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法のステップ（ａ）で注射される前記組成物中の濃度が次のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
−  前記抗ＣＤ３および前記抗ＣＤ２８抗体について１０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、好ましくは２０ｎｇ／μｌ〜８０ｎｇ／μｌ、および特に好ましくは３０ｎｇ／μｌ〜７０ｎｇ／μｌ、ならびに任意に
−  ＩＬ−２について１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、および特に好ましくは４ｎｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌ。
【請求項７】
前記方法のステップｂ）で使用される前記組成物の少なくとも１つの混合物中の濃度が、次のものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
−  ＩＬ−１βおよびＴＧＦβについて１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは７ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、
−  ＩＬ−２３については１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ。
【請求項８】
化合物の抗炎症効果を評価することをさらに目的とし、次の追加のステップを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法：
ｃ）候補化合物と、ステップｂ）の終了時に得られ、ＬＴｈ１および／またはＬＴｈ１７極性化Ｔ細胞を含む炎症を起こした皮膚のモデルを接触させるステップ；
ｄ）炎症を起こした皮膚のモデルの少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｅ）ステップｄ）で得られた前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ；
ｆ）ステップｄ）で測定した前記少なくとも２つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。
【請求項９】
またステップｄ）においても、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つの、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群から選択される炎症マーカーの発現レベルを測定するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
真皮、表皮、表皮付属物、皮下組織、ならびにＴｈ１および／またはＴｈ１７細胞を含む炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルであって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られ、少なくとも２つの炎症マーカー、好ましくは少なくとも５つの炎症マーカーのタンパク質レベルでの発現によって特徴付けられ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１８、およびＣＣＬ２０からなる群より選択される、ｅｘ  ｖｉｖｏモデル。
【請求項１１】
容器または培養ボックスウェルに含有されるのに適しており、その底部は多孔性膜（４０）からなる細胞培養挿入物（１０）であって、前記挿入物が、固化したマトリックス（２０）に埋め込まれている請求項１０に記載の炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデル（３０）を含み、前記マトリックスが前記挿入物の内縁および前記多孔性膜に接触しており、炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮が大気および真皮と接触しており、前記炎症を起こした皮膚のｅｘ  ｖｉｖｏモデルの表皮付属物が前記固化マトリックスに浸漬されている、細胞培養挿入物（１０）。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、哺乳動物から以前に採取された健康な皮膚生検、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の有効量を含む組成物Ａ、ならびに任意にＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３およびＴＧＦ−βの少なくとも混合物を含む組成物Ｂを含む、キット。
【請求項１３】
注射装置をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ステップａ）で使用される哺乳動物から以前に採取された前記健康な皮膚生検が、真皮、表皮、表皮付属物、場合により皮下組織を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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