(57)【要約】本発明は、一般に、インサイチュ生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、一部には、受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象において生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングを実施するための方法に関し、本方法は、対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程；該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程；および該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象における生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法であって、
（a）対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程；
（b）該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程；および
（c）該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生殖器に、NEPA21エレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ：ポアーリングパルス：50V、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10％減衰（±パルス方向）、およびトランスファーパルス：10V、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40％減衰（±パルス方向）のエレクトロポレーションを行う、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生殖器に、CUY21EDIT IIエレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ：矩形（mA）、（＋/−）、Pd V：60Vまたは80V、Pd A：150mA、Pdオン：5.00ms、Pdオフ：50ms、Pd N：3、減衰：10％、減衰タイプ：Logのエレクトロポレーションを行う、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の媒精が該対象を別の対象と交配することによって行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がマウスまたはラットである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生殖器が卵管である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬組成物が、該試薬組成物を卵管の内腔に注入することによって卵管に導入される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
対象の媒精後からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器であって、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を含む生殖器。
【請求項１５】
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、請求項14に記載の生殖器。
【請求項１６】
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、請求項15に記載の生殖器。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項１８】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項17に記載の生殖器。
【請求項１９】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項17に記載の生殖器。
【請求項２０】
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項２１】
前記対象がマウスまたはラットである、請求項14〜20のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項２２】
前記生殖器が卵管である、請求項14〜21のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項２３】
ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用。
【請求項２４】
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項26に記載の使用。
【請求項２９】
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、請求項23〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記対象がマウスまたはラットである、請求項23〜29のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記生殖器が卵管である、請求項23〜30のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月24日に出願された米国仮特許出願第62/549,644号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、EFS-Webを介して電子出願されており、.txt形式で電子提出された配列表を含む。この.txtファイルには、2018年8月23日に作成された「2018-08-23_6278-00007_ST25.txt」というタイトルの配列表が含まれ、そのサイズは15,296バイトである。この.txtファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
緒言
クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドロームリピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（CRISPR）/CRISPR関連タンパク質（CRISPR associated protein）（Cas）を使用したゲノム編集の最近の進歩により、遺伝子改変動物が簡単かつ迅速に作製できるようになった[1, 2, 3]。CRISPR動物ゲノムエンジニアリングの方法には、3つの大まかな工程が含まれる：雌の交配および接合子の単離；ゲノム編集コンポーネントの接合子への顕微注入；ならびに顕微注入された接合子の雌の卵管への移植[1, 2]。これらの工程は、（1）この手順を実施する技術者による非常に高度な技術的専門知識と、（2）マイクロマニピュレーターなどの高価な機器、を必要とする。そのプロトコルの複雑性のため、動物ゲノムエンジニアリング実験は個々の研究室で実施することが困難であり、一般的にはコアとなる中心施設で実施され、そこでは高度な訓練を受けた技術者が日々ゲノムエンジニアリングサービスを提供している。そのような複雑な工程を回避する方法の開発は、動物ゲノムエンジニアリング技術を、コアだけでなく、より多くの研究室で実施することを可能にする。一部のグループは、顕微注入に代わる方法として、接合子のインビトロのエレクトロポレーションの使用を研究し、このアプローチを使用してゲノム編集された胎仔と仔の作製に成功している[4, 5, 6, 7, 8, 9]。接合子のエレクトロポレーションは顕微注入工程を取り除くものの、この戦略は他の2つの困難な工程：エクスビボの操作（handling）のための接合子の単離、および偽妊娠雌への接合子の移植、をまだ必要とする。したがって、当技術分野では、遺伝子改変動物の作製を簡素化できる新しいゲノムエンジニアリング方法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明の一局面では、受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象において、生殖細胞系列（germline）ゲノムエンジニアリングを実施するための方法が提供される。この方法は、対象の媒精（insemination）からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程；該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程；および該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程を含むことができる。
【０００５】
別の局面では、本発明は、生殖器組成物に関する。この組成物は、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器を含むことができ、この生殖器には、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物が含まれる。
【０００６】
さらに別の局面では、本発明は、エレクトロポレーターの使用に関する。この使用には、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】GONADを実施するためのより早い時点の評価を示す。図1A：卵巣と卵管の解剖学的構造およびGONAD法に使用される手術器具を示す概略図。膨大部（ampulla）と漏斗部（infundibulum）の間の領域にある卵管壁にガラスマイクロピペットを直接挿入して、少量の溶液を注入する。注入直後に、卵管全体に対してインビボのエレクトロポレーションを実施する。図1B：GONAD法によるeGFP mRNAの送達後の8細胞期胚から桑実胚までにおけるeGFP蛍光の検出。妊娠0.7日の自然交配Jcl:MCH(ICR)雌で実施されたGONAD法の2日後に単離された、着床前胚におけるeGFP蛍光。図1C：0.4日目（左パネル）および0.7日目（右パネル）に解剖した卵管と接合子。0.4日目に解剖した卵管は膨大部の膨張（矢印）を示していることに留意されたい。0.4日目の膨大部から単離された接合子は通常、卵丘細胞の厚い層で取り囲まれている。これらの細胞は、卵管内に注入された後エレクトロポレーションを行われる外因性核酸/タンパク質の効率的な取り込みを妨げる可能性がある。0.7日目に解剖した卵管は膨大部の収縮（矢印）を示しており、0.7日目の膨大部から単離された接合子は卵丘細胞が少ないため、エレクトロポレーション時の外因性核酸/タンパク質の取り込みが妨げられる可能性は低いと考えられる。
【図２Ａ】GONAD法を用いた遺伝子不活性化動物モデルの作製を示す。図2A：Foxe3標的配列（SEQ ID NO: 1）を用いてFoxe3遺伝子を不活性化するためのターゲティング戦略とジェノタイピングに使用されるプライマーセットの概略図。
【図２Ｂ】GONAD法を用いた遺伝子不活性化動物モデルの作製を示す。図2B：図2Aに示されるプライマーセットを用いて創始（G0）マウスから増幅されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の直接配列決定の結果。エレクトロフェログラムの下の赤い矢印は、インデル（indel）変異のある領域を示す。
【図２Ｃ】GONAD法を用いた遺伝子不活性化動物モデルの作製を示す。図2C：G0マウスにおける変異型Foxe3アレル（SEQ ID NO: 2〜11）。ヌクレオチド配列の変化を赤で示し、また、変化のタイプ（挿入＋Xnt、または欠失Δ）を配列の右側に示す。
【図２Ｄ】GONAD法を用いた遺伝子不活性化動物モデルの作製を示す。図2Dおよび2E：G1マウスにおける白内障の表現型。
【図２Ｅ】GONAD法を用いた遺伝子不活性化動物モデルの作製を示す。図2Dおよび2E：G1マウスにおける白内障の表現型。
【図３Ａ】i-GONAD法を用いた小さな遺伝子変化の動物モデルの作製を示す。i-GONAD法による一本鎖オリゴドナー（ssODN）ベースのノックインによるアルビノJcl:MCH(ICR)マウスのTyr遺伝子の復元。図3A：Tyr遺伝子変異のレスキューを示す概略図。ガイド配列を含む標的領域とジェノタイピングプライマー結合部位が示される（SEQ ID NO: 12）。
【図３Ｂ】i-GONAD法を用いた小さな遺伝子変化の動物モデルの作製を示す。図3B：TyrをレスキューされたG0胎仔を示す代表的なE14.5同腹仔。該胎仔の有色素の目を黄色の矢印で示す。
【図３Ｃ】i-GONAD法を用いた小さな遺伝子変化の動物モデルの作製を示す。図3C：表3の＃5雌マウスから得られた、代表的なTyrをレスキューされたG0マウス同腹仔。＃番号で示されるG0マウス（黄色で表示）を生殖細胞系列伝達（germline transmission）解析に使用した（詳細については図7A〜7Bを参照）。
【図３Ｄ】i-GONAD法を用いた小さな遺伝子変化の動物モデルの作製を示す。図3D：図3BのG0胎仔から増幅されたPCR産物の直接配列決定の結果。変異/修正されたヌクレオチドの位置を赤い矢印で示す。
【図４Ａ】i-GONAD法を用いた大きな欠失の作製を示す。図4A：アグーチ（agouti）表現型を復元するための、C57BL/6JJclマウスゲノム中のレトロトランスポゾンからなる16.2kb配列の欠失を示す概略図。標的配列とジェノタイピングプライマーが示される（SEQ ID NO: 13および68）。該配列の中央にEcoRI部位を含むssODNを使用した。
【図４Ｂ】i-GONAD法を用いた大きな欠失の作製を示す。図4B：レスキューされたアグーチ表現型を示す代表的なマウス（黄色の矢印で表示）。これらのマウスは帝王切開にて回収され、Jcl:MCH(ICR)養母により養母の仔と一緒に育てられた。
【図４Ｃ】i-GONAD法を用いた大きな欠失の作製を示す。図4C：ジェノタイピング解析。予想される断片サイズ：M943/M948＝290または295bp（ssODNノックイン）、M943/M944＝337bp、M947/M948＝477bp。
【図４Ｄ】i-GONAD法を用いた大きな欠失の作製を示す。図4D：G0マウスから増幅されたPCR産物の直接配列決定の結果。接合部配列（junctional sequence）の位置を黄色の長方形で示す。
【図４Ｅ】i-GONAD法を用いた大きな欠失の作製を示す。図4E：M943/M948プライマーセットを用いてG0マウス（G0-＃3および-＃5）から増幅されたPCR産物のEcoRI消化。赤い矢印は消化された断片を示す。
【図５Ａ】i-GONAD法を用いたレポーターノックインマウスの作製を示す。図5A：Pitx3遺伝子座へのT2A-mCitrineカセットの挿入を示す概略図。標的配列とジェノタイピングプライマーセットが示される（SEQ ID NO: 14）。ivTRT法により合成された925塩基長のssDNAをドナーDNAとして使用した。
【図５Ｂ】i-GONAD法を用いたレポーターノックインマウスの作製を示す。図5B：E12.5で回収された胎仔におけるmCitrine蛍光。挿入図として胎仔の目が拡大されている。
【図５Ｃ】i-GONAD法を用いたレポーターノックインマウスの作製を示す。図5C：ノックインG0胎仔のジェノタイピング解析の例。予想される断片サイズ：M1035/M390＝948bp、M389/M1036＝956bp、M389/PP226＝809bp。N：陰性対照、M：サイズマーカー。
【図５Ｄ−１】i-GONAD法を用いたレポーターノックインマウスの作製を示す。図5D：挿入されたカセットの5'および3'接合部領域を示す代表的な配列決定クロマトグラム。cのG0-＃1から誘導された挿入を示す接合部配列が示される。赤い矢印は、アームとゲノム配列の間の接合部を示す。
【図５Ｄ−２】図５Ｄ−１の続きの図である。
【図６】Tyr遺伝子を編集するi-GONAD法から回収された胎仔を示す。データは、3つの異なるメーカーのエレクトロポレーターを使用して、i-GONADが同等レベルのゲノム編集をもたらし得ることを示している。該胎仔の有色素の目を黄色の矢印で示す。
【図７Ａ】Tyr遺伝子修正アレルの生殖細胞系列伝達を示す。G0マウス（表3の雌＃5マウスから得られたG0-＃8、-＃9、および-＃10；図3Cも参照）をJcl:MCH(ICR)マウスと交配させ、修復されたアレルの生殖細胞系列伝達を毛色の観察により確認した。図7A：G0-＃9および-＃10マウス（黄色の矢印で表示）をJcl:MCH(ICR)マウス（黒の矢印で表示）と交配させて、G1子孫を得た。
【図７Ｂ】Tyr遺伝子修正アレルの生殖細胞系列伝達を示す。G0マウス（表3の雌＃5マウスから得られたG0-＃8、-＃9、および-＃10；図3Cも参照）をJcl:MCH(ICR)マウスと交配させ、修復されたアレルの生殖細胞系列伝達を毛色の観察により確認した。図7B：各G0マウスから増幅されたPCR産物の直接配列決定の結果。赤い矢印は、変異/修正されたヌクレオチドの位置を示す。
【図８Ａ】i-GONAD法を用いたTis21遺伝子座でのレポーターノックインマウスの作製を示す。図8A：Tis21遺伝子座への「T2A-mCitrine」カセットの挿入を示す概略図。標的配列およびジェノタイピングに使用したプライマーセットが示される（SEQ ID NO: 15）。ivTRT法により合成された922塩基長のssDNAをドナーDNAとして使用した。
【図８Ｂ】i-GONAD法を用いたTis21遺伝子座でのレポーターノックインマウスの作製を示す。図8B：14.5日目に回収されたG0-＃2胎仔におけるmCitrine蛍光（右）；胎仔G0-＃1では蛍光は検出されなかった（左）。
【図８Ｃ】i-GONAD法を用いたTis21遺伝子座でのレポーターノックインマウスの作製を示す。図8C：G0胎仔におけるノックインアレルのジェノタイピング解析。予想される断片サイズ：M1037/M390＝964bp、M389/M1038＝1005bp、M389/PP227＝802bp。N：陰性対照、M：サイズマーカー。赤い矢印で表示されるPCRバンドは該カセットの正しい挿入を示し、青い矢印で表示されるバンドは部分的な挿入を示す。
【図８Ｄ−１】i-GONAD法を用いたTis21遺伝子座でのレポーターノックインマウスの作製を示す。図8D：挿入されたカセットの5'および3'接合部領域を示す配列決定クロマトグラム。図8BのG0-＃2胎仔での挿入を示す接合部配列が示される。赤い矢印は、アームとゲノム配列の間の接合部を示す。
【図８Ｄ−２】図８Ｄ−１の続きの図である。
【図９Ａ】i-GONADを用いた様々なマウス系統のTyr遺伝子座におけるインデル変異の作製を示す。図9A：Tyr遺伝子ターゲティング戦略およびジェノタイピングに使用されるプライマーセット（SEQ ID NO: 16）の概略図。
【図９Ｂ】i-GONADを用いた様々なマウス系統のTyr遺伝子座におけるインデル変異の作製を示す。図9B：Tyrノックアウト表現型（目の色素の消失）を示す代表的な胎仔。
【図９Ｃ−１】i-GONADを用いた様々なマウス系統のTyr遺伝子座におけるインデル変異の作製を示す。図9C：G0胎仔のそれぞれから増幅されたPCR産物の直接配列決定の結果。赤い矢印は、変異したヌクレオチドの位置を示す。
【図９Ｃ−２】図９Ｃ−１の続きの図である。
【図１０Ａ】i-GONADを用いたC3H/HeSlcおよびC57BL/6NCrSlcマウス系統のKit遺伝子座におけるインデル変異の作製を示す。図10A：Kit遺伝子ターゲティング戦略およびジェノタイピングに使用されるプライマーセット（SEQ ID NO: 17）の概略図。
【図１０Ｂ】i-GONADを用いたC3H/HeSlcおよびC57BL/6NCrSlcマウス系統のKit遺伝子座におけるインデル変異の作製を示す。図10B：Kitノックアウト表現型（体色表現型）を示す代表的な胎仔。
【図１０Ｃ】i-GONADを用いたC3H/HeSlcおよびC57BL/6NCrSlcマウス系統のKit遺伝子座におけるインデル変異の作製を示す。図10C：G0胎仔のそれぞれから増幅されたPCR産物の直接配列決定の結果。赤い矢印は、変異したヌクレオチドの位置を示す。
【図１１Ａ】i-GONADを用いたC57BL/6NCrlマウス系統のCdkn1aおよびCdkn2a遺伝子座へのssODNのノックインを示す。図11A：Cdkn1aまたはCdkn2a遺伝子を不活性化するためのターゲティング戦略およびジェノタイピングに使用されるプライマーセット（SEQ ID NO: 18および19）の概略図。
【図１１Ｂ−１】i-GONADを用いたC57BL/6NCrlマウス系統のCdkn1aおよびCdkn2a遺伝子座へのssODNのノックインを示す。図11B：G0胎仔のそれぞれから増幅されたクローン化PCR産物の配列決定の結果。赤い矢印は、アームとゲノム配列の間の接合部を示す。
【図１１Ｂ−２】図１１Ｂ−１の続きの図である。
【図１２Ａ】AsCpf1でのi-GONADを用いたssODNベースのノックインによるアルビノJcl:MCH(ICR)マウスのTyr変異の復元を示す。図12A：Tyr遺伝子変異のレスキューを示す概略図。AsCpf1用のガイド配列を含む標的領域およびジェノタイピングプライマー結合部位が示される（SEQ ID NO: 20）。
【図１２Ｂ】AsCpf1でのi-GONADを用いたssODNベースのノックインによるアルビノJcl:MCH(ICR)マウスのTyr変異の復元を示す。図12B：TyrをレスキューされたG0胎仔を示す代表的なE14.5同腹仔。該胎仔の有色素の目を黄色の矢印で示す。
【図１２Ｃ】AsCpf1でのi-GONADを用いたssODNベースのノックインによるアルビノJcl:MCH(ICR)マウスのTyr変異の復元を示す。図12C：（図12Bの）G0胎仔から増幅されたPCR産物の直接配列決定の結果。変異/修正されたヌクレオチドの位置を赤い矢印で示す。
【図１３】i-GONADに使用した雌が生殖能力を保持していることを示す。i-GONADに使用した雌マウス（表3の＃3、＃5、＃11）を、次のサイクルでJcl:MCH(ICR)雄と交配させた。i-GONADに使用した代表的な雌マウス＃3とその9匹の同腹仔。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
本明細書において、本発明者らは、非限定的な実施例において、卵管核酸送達を介した改良型ゲノム編集（improved-Genome editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery：i-GONAD）と呼ばれるロバストな方法を開示する。この方法により、単一塩基の変化、キロベースサイズの欠失、およびノックインを含むマウスモデルが作製される。i-GONADの効率は従来の顕微注入法の効率に匹敵しているが、顕微注入法は接合子のエクスビボの操作に依存しており、また、胚移植用のレシピエント動物を必要とする。対照的に、i-GONADは、これらの技術的に困難な工程を回避するものであり、簡便な機器と技術的専門知識が備わったどのような研究室でも実施することができる。さらに、i-GONADで処置された雌は生殖機能を保持しており、生殖細胞系列遺伝子治療に向けた該方法の将来の使用が示唆される。
【０００９】
方法
本発明の一局面では、受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象における生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法が提供される。この方法は、対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程；該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程；および該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程を含むことができる。
【００１０】
本明細書で使用する用語「対象」または「受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象」は、本明細書では交換可能に使用され、受精で生じた接合子を含む少なくとも1つの生殖器を有するヒトと非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、脊椎動物、例えば、哺乳類と非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、両生類、爬虫類など、または無脊椎動物、例えば昆虫などを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、対象はヒト患者である。対象は、その対象が保有する胚に遺伝子改変接合子または遺伝子改変細胞を必要とするヒト患者であり得る。いくつかの態様では、対象はマウスまたはラットである。
【００１１】
「生殖器」（reproductive organ）または「受精で生じた接合子を含む生殖器」は、受精で生じた接合子を含み得る対象の生殖器系（reproductive tract）の任意の器官または組織であり、例えば、卵管、子宮、または卵巣を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
いくつかの態様では、生殖器は卵管である。「卵管」は、卵巣からの卵子または卵が通過する管である。一部の対象においては、卵管は「子宮管」（uterine tube）（すなわち、雌性哺乳類）、「ファロピウス管」（Fallopian tube）（すなわち、雌性哺乳類）、または「繊毛管」（ciliated tube）（すなわち、両生類）とも呼ぶことができる。
【００１３】
対象から生殖器を分離または取得するには、該対象の生殖器を露出させるための適切な外科的処置が使用され得る。生殖器は、対象の身体から一時的に取り出されても、対象の体内にとどまってもよい。例えば、非限定的な実施例では、本発明者らは、麻酔をかけた雌マウスに外科手術を施した。マウスの背側の皮膚を切開した後に卵巣/卵管/子宮を露出させた。
【００１４】
本明細書で使用する「媒精を行う」、「媒精が行われる」、「媒精」などの用語は、対象の精子進入を行う（すなわち、対象の卵子を受精させる）目的で、その対象に精子を導入することを指す。自然または人工のいずれかの手段で対象の媒精を行うことができる。自然媒精には交尾・性交が含まれる。いくつかの態様では、対象の媒精は、該対象を別の対象と交配させることによって行われる。人工媒精は、子宮頚管内媒精または子宮腔内媒精などの、しかしこれらに限定されない、精子を対象に導入する非性交法を含み得る。
【００１５】
対象の生殖器は、対象の媒精後のある「期間」の後に分離または取得され得る。本発明者らは、以前に、媒精の約1.5〜1.7日後の生殖器を用いてGONAD法を実施した。この時期の妊娠では、胚は2細胞期にあり、本発明者らは、この時期のゲノム編集試薬の送達がモザイク胚またはモザイク胎仔を高頻度でもたらすことを発見した[10]。そこで、遺伝子編集コンポーネントを送達するための理想的な時期（1細胞期に相当し、そのため遺伝的モザイク現象を低減させると考えられる時期）を検討するために、本発明者らは、本明細書に記載の方法を0.4日目と0.7日目の2つの別々の時点で実施した。本発明者らは、媒精の0.7日後に実施した本明細書に記載の方法がゲノム編集およびモザイク現象の低減に効果的であったが、媒精の0.4日後では効果的なゲノム編集が誘発されなかったことを発見した。
【００１６】
この発見に一部基づいて、対象の媒精後の期間は、0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）、0.6日（14.4時間）〜1.3日（31.2時間）、0.7日（16.8時間）〜1.2日（28.8時間）、0.8日（19.2時間）〜1.1日（26.4時間）、またはその間の任意の範囲であり得る。いくつかの態様では、対象の媒精後の期間は、0.6日（14.4時間）〜0.8日（19.2時間）であり得る。
【００１７】
いくつかの態様では、対象の媒精後の期間は、約0.5日（12時間）、約0.6日（14.4時間）、約0.7日（16.8時間）、約0.8日（19.2時間）、約0.9日（21.6時間）、約1.0日（24時間）、約1.1日（26.4時間）、約1.2日（28.8時間）、約1.3日（31.2時間）、または約1.4日（33.6時間）であり得る。
【００１８】
媒精後の期間は、非限定的な実施例で本発明者らが行ったように測定することができる。簡単に説明すると、対象の雌マウスを雄と交配させた。交配を16：00〜17：00に設定し、翌朝（9:00〜10:00）に目視検査で膣栓（copulation plug）を確認した。Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual [30]に従って、0：00（真夜中）に妊娠0日目を指定し、膣栓のある雌を10：00で妊娠0.4日目、16：00で妊娠0.7日目と指定した。当業者であれば、同様の手順をマウス以外の対象に適合させることが可能である。
【００１９】
試薬組成物は、注射または顕微注入を含むがこれらに限定されない方法を用いて、生殖器に「導入」することができる。適切には、いくつかの態様では、卵管の内腔に試薬組成物を注入することによって、試薬組成物を卵管に導入する。
【００２０】
本明細書に開示される試薬組成物は、「ヌクレアーゼ系」を含むことができる。本明細書で使用する「ヌクレアーゼ系」は、細胞内のゲノムまたは他のDNA中の標的DNA配列を切断することが可能な、どのようなレアカッティング（rare-cutting）エンドヌクレアーゼ系を含んでもよい。このヌクレアーゼ系は、ゲノム内のいくつかの位置で切断できる他のエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）とは一般的に区別される、レアカッティングエンドヌクレアーゼを含み得る。このヌクレアーゼ系はまた、該エンドヌクレアーゼを特定のポリヌクレオチド配列に導くガイドポリヌクレオチドを含み得る。該ヌクレアーゼ系は、標的DNA配列に二本鎖切断を生じさせるか、標的DNA配列にニックを入れることができる。改変型メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR/Cas系などのヌクレアーゼ系は、当技術分野で公知である。本発明のヌクレアーゼ系は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR/Cas系から適切に選択される。ZFNおよびTALENは、特定の配列でDNAに結合して、それを切断できる人工エンドヌクレアーゼタンパク質である。ZFNおよびTALENの構造と機能性は当技術分野で公知である。例えば、Carlson et al., Molecular Therapy Nucleic Acids 1(1):e3 (2012)を参照されたい。
【００２１】
CRISPRは「Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats」の略である。Cas9やCpf1などのCasタンパク質は、シングルガイドRNA（sgRNA）によってDNAに特定の配列で結合して切断できるヌクレアーゼである。数種のCRISPR/Cas系が当技術分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第20140170753号、同第20140234972号；Mali et al., Science 339(6121): 823-826 (2013)；Cong et al., Science 339(6121):819-823；Shmakov et al., Molecular Cell 60:1-13 (2015)を参照されたい）。
【００２２】
適切には、本発明のヌクレアーゼ系にはCRISPR/Cas系が含まれる。いくつかの態様では、CRISPR/Cas系のRNAプログラム可能なヌクレアーゼは、Cas9ポリペプチドまたはCpf1ポリペプチドを含み得る。例示的なCas9およびCpf1ポリペプチドは実施例に開示されており、当技術分野で周知である。
【００２３】
前記ヌクレアーゼ系のエンドヌクレアーゼは、タンパク質またはポリペプチドであるか、ポリヌクレオチド（例：DNAまたはRNA）によりコードされ得る。該ヌクレアーゼ系のガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（例：DNAまたはRNA）であり得る。
【００２４】
CRISPR-Casヌクレアーゼ系を含む態様では、Casエンドヌクレアーゼはタンパク質であるか、ポリヌクレオチド（例：DNAまたはRNA）にコードされ得る。ガイドRNAは一本鎖RNAで構成されるか、DNAポリヌクレオチドにコードされ得る。ガイドRNAはシングルガイドRNAを含んでもよいし、crRNAとtracrRNA分子を含んでもよい（例えば、Integrated DNA TechnologiesのAlt-R（商標）CRISPRガイドRNAを参照されたい）。
【００２５】
いくつかの態様では、前記ヌクレアーゼ系は、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドとを含み得る。いくつかの態様では、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドはCas9またはCpf1ポリペプチドを含むことができ、ガイドRNAはcrRNAとtracrRNAを含むことができる。
【００２６】
本明細書に開示される試薬組成物は、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖DNA（dsDNA）修復テンプレートをさらに含み得る。ssDNA修復テンプレートは、比較的短いオリゴヌクレオチド（すなわち、10〜150ヌクレオチド）であっても、例えば200〜10,000ヌクレオチド長の、比較的長いヌクレオチド配列であってもよい。より長いssDNA修復テンプレートを使用する方法は、以前にWO 2016/196887に開示されており、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。より短いssDNA修復テンプレートおよびより長いdsDNA修復テンプレートを使用および調製する方法は、一般的に当技術分野で公知である。
【００２７】
本明細書に開示される試薬組成物は、「外因性ポリヌクレオチド」を含み得る。本明細書で使用する「外因性ポリヌクレオチド」には、DNA（二本鎖または一本鎖）またはRNAポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。外因性ポリヌクレオチドは、タンパク質産物、RNA産物、DNA調節要素、変異型DNA配列、またはそれらの任意の組み合わせをコードすることができる。
【００２８】
タンパク質産物は、全長タンパク質、エクソンなどのタンパク質の断片、融合タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであり得る。タンパク質産物は、外因性ポリヌクレオチドが細胞に導入されたときに発現され得る（例えば、外因性配列が転写および翻訳されて、タンパク質産物を生成する）。タンパク質産物は、外因性配列が標的DNA配列に導入されたときに細胞内で発現される融合タンパク質の一部になるか、または個々のタンパク質として発現され得る。
【００２９】
外因性ポリヌクレオチドはRNA産物であってもよい。そのRNA産物は、タンパク質合成に関与するRNA、転写後修飾もしくはDNA複製に関与するRNA、または調節性RNAを含むことができる。タンパク質合成に関与するRNAには、mRNA、rRNA、tRNA、またはSRP RNAが含まれるが、これらに限定されない。転写後修飾に関与するRNAには、snRNA、snoRNA、またはY RNAが含まれるが、これらに限定されない。調節性RNAには、アンチセンスRNA、CRISPR RNA、ガイドRNA、長鎖ノンコーディングRNA、マイクロRNA、siRNA、piRNA、tasiRNA、5'UTR配列、3'UTR配列、RNAスプライシング調節配列、IRES配列、またはポリAシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
外因性ポリヌクレオチドはDNA調節要素をコードしてもよい。DNA調節要素は、遺伝子の転写を調節するか、またはタンパク質産物もしくはRNA産物のための認識配列として役立つ、ノンコーディングDNA配列であり得る。例示的なDNA調節要素には、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、組織特異的調節要素、またはタンパク質産物もしくはRNA産物のための認識配列が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質産物またはRNA産物のための認識配列には、FRT、loxP、rox、attB/attP配列などの、部位特異的リコンビナーゼまたはインテグラーゼのための認識配列が含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施に有用なプロモーターには、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、一過性調節型、発生的調節型、化学的調節型、物理的調節型（例えば、光調節型または温度調節型）、組織優先型（tissue-preferred）のプロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターは、pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターを含むことができる。植物での発現に適したプロモーターには、以下が含まれるが、これらに限定されない：カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、ユビキチン、tCUPクリプティック（cryptic）構成的プロモーター、Rsyn7プロモーター、病原体誘導性プロモーター、トウモロコシIn2-2プロモーター、タバコPR-1aプロモーター、グルココルチコイド誘導性プロモーター、エストロゲン誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター。当業者は、様々な種類の細胞に使用できる多種多様な追加のプロモーターに精通している。
【００３１】
外因性ポリヌクレオチドは、「変異型DNA配列」をコードしてもよい。本明細書で使用する「変異型DNA配列」とは、参照DNA配列と異なる配列を有するDNA分子を指す。変異型DNA配列は、その変異型DNA配列が標的DNA配列で挿入される場合に反復（リピート）配列またはコピー数の多様化を生じる、1コピーまたは複数コピーのDNA配列を含み得る。変異型DNA配列は、標的DNA配列などの参照分子と比較して、ヌクレオチド塩基の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の挿入、欠失、または置換を有し得る。
【００３２】
外因性ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるタンパク質産物、RNA産物、またはDNA調節要素の任意の組み合わせをコードしてもよい。
【００３３】
外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、ウイルス粒子であっても、プラスミドなどのポリヌクレオチド上にコードされてもよい。細胞に効率的に感染または侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、ウイルス遺伝子を安定的に発現する特定のウイルスベクターの能力は、多くの様々なウイルスベクター系の開発と応用につながった（Robbins et al., 1998）。ウイルスベクター系は、エクスビボおよびインビボの遺伝子導入用のベクターとしての使用のために現在開発中である。例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが使用され得る。本発明に従って使用できる適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスベクターが含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターには、例えば、レンチウイルスベクターが含まれる。
【００３４】
本明細書で使用する「エレクトロポレーションを行う」または「エレクトロポレーション」とは、1つまたは複数の電気パルスを使用して細胞膜に孔をあけて物質（すなわち、DNA、RNA、またはタンパク質）を細胞に導入するプロセスを指す。本発明者らは、いくつかの異なるタイプのエレクトロポレーター（T820、NEPA21、またはCUY21EDIT II）とエレトロポレーターのパラメータを本発明において使用できることを見出した。エレクトロポレーターは、対象の生殖器を囲むように使用できるピンセット型電極を含むことができる。
【００３５】
T820エレクトロポレーターを用いて生殖器にエレクトロポレーションを施すことができる。そのような態様では、エレクトロポレーションパラメータは、パルス持続時間が5ms、パルス間隔が1sの8回の矩形波（square-wave）パルスを含み、電界強度は10V〜100Vの範囲（すなわち、10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、55V、60V、65V、70V、75V、80V、85V、90V、95V、または100V）であり得る。いくつかの態様では、エレクトロポレーションパラメータは、パルス持続時間が5ms、パルス間隔が1s、電界強度が50Vの8回の矩形波パルスを含むことができる。
【００３６】
NEPA21エレクトロポレーターを用いて生殖器にエレクトロポレーションを施すことができる。そのような態様では、エレクトロポレーションパラメータは、以下を含み得る：ポアーリングパルス：10V〜100V（すなわち、10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、55V、60V、65V、70V、75V、80V、85V、90V、95V、または100V）、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10％減衰（±パルス方向）、およびトランスファーパルス：5V〜100V（すなわち、5V、10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、55V、60V、65V、70V、75V、80V、85V、90V、95V、または100V）、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40％減衰（±パルス方向）。いくつかの態様では、エレクトロポレーションパラメータは、ポアーリングパルス：50V、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10％減衰（±パルス方向）、およびトランスファーパルス：10V、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40％減衰（±パルス方向）を含むことができる。
【００３７】
CUY21EDIT IIエレクトロポレーターを用いて生殖器にエレクトロポレーションを施すことができる。そのような態様では、エレクトロポレーションパラメータは、以下を含み得る：矩形（mA）、（＋/−）、Pd V：60Vまたは80V、Pd A：50mA〜300mA（すなわち、50mA、75mA、100mA、125mA、150mA、175mA、200mA、225mA、250mA、275mA、または300mA）、Pdオン：5.00ms、Pdオフ：50ms、Pd N：3、減衰：10％、減衰タイプ：Log。いくつかの態様では、エレクトロポレーションパラメータは、矩形（mA）、（＋/−）、Pd V：60Vまたは80V、Pd A：150mA、Pdオン：5.00ms、Pdオフ：50ms、Pd N：3、減衰：10％、減衰タイプ：Logを含むことができる。
【００３８】
生殖器組成物
別の局面では、本発明は、生殖器組成物に関する。この組成物は、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器を含むことができ、この生殖器には、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物が含まれる。
【００３９】
エレクトロポレーターの使用
さらに別の局面では、本発明は、エレクトロポレーターの使用に関する。この使用は、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用を含み得る。
【００４０】
本開示は、本明細書に記載される構成、構成要素の配置、または方法工程の具体的詳細に限定されない。本明細書に開示される組成物および方法は、以下の開示に照らして当業者には明らかであると考えられる様々な方法で作製し、実施し、使用し、実行し、かつ/または形成することが可能である。本明細書で使用される表現および用語は、説明のみを目的とするものであり、特許請求の範囲を限定するものとみなすべきではない。様々な構造または方法工程を指すために説明および特許請求の範囲で使用される第1、第2、第3などの序数標識は、具体的な構造もしくは工程、またはそのような構造もしくは工程に対する特定の順序もしくは配置を示すように解釈されるものではない。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に指示がない限り、または文脈が明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示を容易にすることを意図しており、特にクレームされない限り、本開示の範囲への限定を意味するものではない。本明細書中の言語および図面に示される構造はいずれも、非クレーム要素が開示された発明の実施に不可欠であることを示すものと解釈されるべきではない。本明細書における用語「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する」、およびその変形の使用は、その後に記載される要素およびその同等物だけでなく、追加の要素をも包含することを意図している。特定の要素を「含む」または「有する」と記載された態様は、それらの特定の要素「から本質的になる」および「からなる」とも考えられる。
【００４１】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に特に指示がない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に言及する簡潔な方法として役立つことを単に意図したものであり、各個別の値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。例えば、濃度範囲が1％〜50％と記載されている場合、2％〜40％、10％〜30％、1％〜3％などの値が本明細書に明示的に列挙されているものとする。これらは具体的に意図されたものの例にすぎず、列挙された最低値と最高値を含む、それらの間の数値の全ての可能な組み合わせは、本開示で明示的に述べられているとみなされるべきである。記載された特定の量または量の範囲を説明するための「約」という語の使用は、記載された量に非常に近い値（例えば、製造上の公差、測定値を得る際の機器的および人為的誤差などのために考慮され得るか、または必然的に考慮される値）がその量に含まれることを示すものである。量に関しての全ての百分率は、特に明記しない限り、重量パーセントである。
【００４２】
本明細書で引用された非特許文献または特許文献などの参考文献は先行技術を構成する、ということを認めるものではない。特に、他に明記しない限り、本明細書での任意の文献への言及は、これらの文献のいずれかが米国または他の国において当技術分野の一般常識の一部を形成する、という承認を構成するものではないことが理解されよう。参考文献の論考はどれも、その著者が主張していることを記述しており、本出願人は、本明細書で引用された文献の正確性と適切性に対し異議を唱える権利を留保する。本明細書で引用される全ての参考文献は、特に明記しない限り、その全体が参照により本明細書に完全に組み入れられる。引用された参考文献に見られる定義および/または説明の間に相違点がある場合には、本開示が支配するものとする。
【００４３】
文脈により特に指定または明記されない限り、用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、「1つまたは複数」を意味する。例えば、「1つのタンパク質（a protein）」または「1つのRNA（an RNA）」は、それぞれ、「1つまたは複数のタンパク質」または「1つまたは複数のRNA」を意味すると解釈されるべきである。
【００４４】
以下の実施例は、例示することのみを目的としており、本発明の範囲または添付の特許請求の範囲に対する限定を意図したものではない。
【実施例】
【００４５】
実施例1−CRISPRヌクレアーゼを用いたインサイチュ生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのためのロバストな方法であるi-GONAD
要約
本発明者らは、CRISPRリボ核タンパク質をインサイチュエレクトロポレーションによりE0.7胚に送達する、卵管核酸送達による改良型ゲノム編集（i-GONAD）と呼ばれるロバストな方法を提供する。この方法により、単一塩基の変化、キロベースサイズの欠失、およびノックインを含むマウスモデルが作製される。i-GONADの効率は、従来の顕微注入法の効率に匹敵するが、その顕微注入法は接合子のエクスビボの操作に依存しており、かつ胚移植用のレシピエント動物が必要である。対照的に、i-GONADは、これらの技術的に困難な工程を回避しており、簡便な機器と技術的専門知識が備わったどのような研究室でも実施することができる。さらに、i-GONAD処理された雌は生殖機能を保持しており、生殖細胞系列遺伝子治療に向けた該方法の将来の使用が示唆される。
【００４６】
背景
クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/CRISPR関連タンパク質9（Cas9）を用いたゲノム編集の最近の進歩により、遺伝子ノックアウト動物が簡単かつ迅速に作製できるようになった[1, 2, 3]。CRISPR動物ゲノムエンジニアリングの方法には、3つの大まかな工程が含まれる：過剰排卵処理した雌の交配と接合子の単離；ゲノム編集コンポーネントの接合子への顕微注入；および顕微注入された接合子の偽妊娠雌の卵管への移植[1, 2]。これらの工程は、（1）この手法を実施する技術者による非常に高度な技術的専門知識と、（2）マイクロマニピュレーターなどの高価な機器を必要とする。そのプロトコルの複雑性のため、動物ゲノムエンジニアリング実験は個々の研究室で実施することが困難であり、一般的にはコアとなる中心施設で実施され、そこでは高度な訓練を受けた技術者が日々ゲノムエンジニアリングサービスを提供している。そのような複雑な工程を回避する方法の開発は、動物ゲノムエンジニアリング技術を、コアだけでなく、より多くの研究室で実施できるようにする。一部のグループは、顕微注入に代わる方法として、接合子のインビトロのエレクトロポレーションの使用を研究し、このアプローチを用いてゲノム編集された胎仔と仔の作製に成功している[4, 5, 6, 7, 8, 9]。接合子のエレクトロポレーションは顕微注入工程を取り除いたものの、この戦略は他の2つの困難な工程：エクスビボの操作のための接合子の単離、および偽妊娠雌へのそれらの移植、をまだ必要とする。本発明者らは最近、接合子のインサイチュエレクトロポレーションを実施することにより、3つ全ての工程を迂回できることを実証した。
【００４７】
生殖細胞系列のゲノム編集を簡素化するために、本発明者らは卵管核酸送達を介したゲノム編集（GONAD）と呼ばれる方法を開発した。この方法は、接合子の単離または顕微注入のためのそのエクスビボの操作、その後のレシピエント雌への移植を必要としない[10]。GONADは、E1.5（2細胞期）胚を有する妊娠雌マウスに対して実施される。背側位置での切開により卵巣と卵管を外科的に露出させ、ガラス製のキャピラリーピペットを用いてゲノム編集試薬を卵管内腔に注入する。溶液注入の直後、卵管全体にピンセット型電極を使用してエレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーション後、卵巣と卵管を元の位置に戻し、切開部を縫合する。その後、インサイチュゲノム編集された胚を出産予定日まで発育させて、子孫を標的変異のジェノタイピングに供する。本発明者らは、一部の胎仔では標的遺伝子座にインデル変異を28％の効率（7/25）で生成できることを実証した[10]。この戦略の開発中に、本発明者らは、この方法が様々なパラメータを体系的に試験することによって大幅に改善され、正確なゲノム編集を達成できるようになることを認識した。達成する必要があった改善点には、以下が含まれる：（1）小さい点変異のノックインおよび大きいカセットのノックイン（インデルだけでない）；（2）創始者（G0）変異の生殖細胞系列伝達；（3）モザイク現象の低減、これは一般的にゲノム編集が2細胞期以降で起こる場合に発生する；（4）追加の市販のエレクトロポレーターのテスト（我々が初期の研究で使用したモデルはもう手に入らない）；（5）GONAD法後の雌の生殖能力の確認；および（6）2番目によく使用されるCRISPRファミリーのヌクレアーゼであるAsCpf1を用いてGONAD法が機能するか否かの判定。
【００４８】
この研究では、GONADを改善するために大きな変更が加えられた。この新しい方法は、はるかに高いゲノム編集効率をもたらすため、改良型GONAD（i-GONAD）と命名された。我々は、i-GONADアプローチを用いて、大きな欠失およびノックインなどの、遺伝的変化を有する生殖細胞系列改変G1子孫を作製できることを実証する。さらに、よく用いられる多くのエレクトロポレーターを使用できるため、i-GONADはロバストであることを実証する。こうした特徴により、i-GONADは、マイクロマニピュレーターなどの特殊な機器を操作するのに必要なスキルを持たない初心者や学生を含む、全ての実験室担当者にとって簡単に適応可能である。
【００４９】
結果
0.7日目でのGONAD
GONAD法に関する最初の報告では、実験を交配後約1.5〜1.7日に行った。この妊娠時期には、胚は2細胞期にある。この時期にゲノム編集試薬を送達すると、モザイク胚またはモザイク胎仔が高頻度で発生する[10]。遺伝子編集コンポーネントを送達するための理想的な時期は1細胞期に相当する時期であるが、それは、その時期が遺伝的モザイク現象を低減すると考えられるためである。編集コンポーネント送達の最も早い時期を検討するために、GONADを0.4日目と0.7日目の2つの異なる時点で試験した。高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）メッセンジャーRNA（mRNA）（1μg/μl）とトリパンブルーを含む溶液1.0〜1.5μlを卵管内腔に注入し（図1Aに示した概略図）、次に、以前[10]に記載された条件下でBTX T820機器を用いてインビボのエレクトロポレーションを実施した。mRNA送達の2日後、処理した雌から8細胞期の胚を単離して、eGFP蛍光の存在を観察した。0.4日の時点で処理した胚のいずれにも感知できるeGFPは観察されなかったが、0.7日の時点で処理した31個の胚のうち13個で均一なeGFP蛍光が観察された（図1B）。0.4日目で成功しなかった理由の1つは、卵丘細胞がこの時期の接合子を強固に取り囲んでいるためであると考えられ（図1C、左）、これは接合子への核酸の効率的な電気泳動送達を妨げる可能性がある。対照的に、0.7日目の大部分の接合子は厚い卵丘細胞がなくなっており（図1C、右）、接合子へのインジェクションミックスの接近を可能にするはずである。これらの結果から、交配後0.7日（約16時間）がGONADを実施するのに最適な時期であろうと示唆された。
【００５０】
改変型GONADプロトコルによるFoxe3ノックアウト系統の作製
次に、遺伝子破壊動物モデルを作製するためにGONAD法を使用できるかどうかを検討した。遺伝子ターゲティングのためにFoxe3遺伝子座を選択したが（図2A）、それは、Foxe3遺伝子の不活性化がマウスにおいて眼の発達異常と白内障を引き起こすためである[11, 12]。GONADは、Cas9 mRNAおよびFoxe3遺伝子を標的とするシングルガイド（sg）RNAを使用して、妊娠0.7日のJcl:MCH(ICR)雌に対して実施した。用いたエレクトロポレーション条件は50Vで波長5msのパルスを8回であった。GONAD処理された8匹の雌のうち7匹が仔を産んだ。G0子孫の耳から単離されたゲノムDNAの配列決定により、36匹のG0仔マウスのうち11匹（31％）は標的遺伝子座に変異したアレルを有することが実証された（図2Bおよび2C、表1）。注目すべきことに、モザイクのアレルを持つ仔マウスの頻度は依然として高く（82％[9/11]）、モザイク現象が見られなかった仔は2匹だけだった（18％[2/11]；図2BのG0-＃26および-＃32）。G0創始マウスの交配によりG1子孫を得た；そのうちの一部は予想された白内障表現型を示した（図2Dおよび2E）。白内障を有するG1マウスから単離されたゲノムDNAの配列決定により、変異アレルの生殖細胞系列伝達が明らかになった。まとめると、これらの結果は、GONADを用いて遺伝子破壊マウスモデルを作製できることを示している。
【００５１】
（表１）従来のGONADとi-GONADアプローチを用いたFoxe3ノックアウトマウスの作製
2020534024.tif 000002
【００５２】
CRISPR RNA（crRNA）＋トランス活性化型crRNA（tracrRNA）＋Cas9タンパク質（ctRNP）複合体を使用した、より高いゲノム編集効率
Cas9 mRNA [7, 13, 14]の代わりにCas9タンパク質を、シングルガイドRNA（sgRNA）の代わりのcrRNA＋tracrRNA（2部ガイドRNA）と一緒に使用すると、より高いゲノム編集効率が得られることが、今ではますます明らかになりつつある[13]。そこで、GONADを介したゲノム編集のために、これらのコンポーネント（crRNA＋tracrRNA＋Cas9タンパク質：ctRNP）を組み合わせて使用することを検討した。例として、Foxe3遺伝子を標的とし、以前の実験と同じガイド配列を使用したが、sgRNAの代わりにアニールされたcrRNA＋tracrRNAを使用し、かつCas9 mRNAの代わりにCas9タンパク質を使用した。ctRNP複合体の混合物を0.7日目に7匹の妊娠Jcl:MCH(ICR)雌の卵管内腔に注入した。その卵管に、前と同じエレクトロポレーターを使用して、またはCUY21Edit IIエレクトロポレーターを使用して、インビボのエレクトロポレーションを行った。胚をE13.5またはE17.5に単離した。7匹全ての雌が胎仔を抱えていた（合計36個体）。驚くべきことに、ほぼ全てがFoxe3標的配列内にインデル変異を有していた（35/36、97％）；これは、Cas9 mRNAを使用したときの頻度（31％、p＜0.001）よりはるかに高かった（表1；表2）。胎仔の57％（20/35）がモザイク現象を示したことに留意されたい。これは、Cas9 mRNAを使用したときに得られた頻度（82％）よりも低かったものの、統計的に有意ではなかった（p＝0.139）。これらの結果は、crRNAとtracrRNAsとCas9タンパク質（ctRNP）を組み合わせて使用することが、GONADによるゲノム編集の最高効率を与えることを示唆している。このRNPベースのGONADを改良型GONAD（improved GONAD）（i-GONAD）と命名した。
【００５３】
（表２）Foxe3遺伝子編集の効率
使用したCRISPRコンポーネントは、Cas9 mRNA/sgRNAまたはCas9タンパク質/CRISPR RNA（crRNA）/トランス活性化型crRNA（tracrRNA）のいずれかであった（詳細については表1を参照）
2020534024.tif 000003
【００５４】
i-GONADを用いた遺伝子修正動物モデルの作製
次に、小さな遺伝的変化を作製するためにi-GONADを使用できるかどうかを検討した。例として、チロシナーゼ（Tyr）遺伝子のコドン103を選択した。この位置にコドンTGT（システイン）を含むマウスは、毛および目に正常な色素を有し（野生型表現型と見なされる、例えばC3H/He系統マウス）、また、TCT（セリン）を含むマウスは、チロシナーゼ酵素活性の低下により、アルビノの毛色と透明な目をした無色素の表現型を有する（変異型表現型と見なされる、例えばJcl:MCH(ICR)系統）[15]。Jcl:MCH(ICR)系統（色素なし）の変異型表現型を野生型（色素あり）表現型へレスキューするために、点変異にまたがる領域のgRNAをデザインし、かつTyrの野生型配列に対応する一本鎖オリゴドナー（ssODN）を構築した（図3A）。
【００５５】
5匹の妊娠Jcl:MCH(ICR)雌においてi-GONADを実施した。これらの雌から合計32個体の子孫を異なる妊娠時期（E14.5からE19.5）に、または出生後に回収した。これらのサンプルのうち15個体（47％）は、濃い目の色（胎仔）またはアグーチの毛色（新生仔）の予想された表現型を示した（図3Bおよび3C）。配列解析から、正常な色素表現型を有する全ての子孫では、少なくとも一方のアレルが（CからGに）修正された配列を標的部位に有することが実証された（図3D；表3）。
【００５６】
（表３）i-GONAD法を用いたssODNノックインによるTyr変異の修正
2020534024.tif 000004
【００５７】
オリジナルの実験はBTX T820エレクトロポレーターを用いて実施したが、このモデルは現在製造されていない。そのため、2つの新しいエレクトロポレーターNEPA21（ネッパジーン（Nepa Gene Co））とCUY21EDIT II（ベックス（Bex Co））をテストした。NEPA21を用いて6匹の雌をi-GONADに供した。これにより32個体の子孫が得られ、そのうちの16個体（50％）は予想された遺伝的変化と目の色または毛色の表現型変化を示した（表3；表4）。CUY21EDIT IIエレクトロポレーターを用いて2匹の雌をi-GONADに供し、胎仔をE14.5で分析した。得られた10個体の胎仔のうち、5個体（50％）は予想された遺伝的変化と表現型変化（目の色または毛色）を示した（表3；表4）。したがって、3種類の異なるエレクトロポレーターから高度に一致したゲノム編集効率（47％、50％、および50％）が得られ（図6）、i-GONADのロバスト性と再現性が実証された。これらの結果から、ssODN修復ドナーの同時送達を介した高効率遺伝子修正にi-GONADを使用できることが示唆される。
【００５８】
（表４）i-GONAD法を用いたTis21遺伝子座のゲノム編集効率
2020534024.tif 000005
【００５９】
色素表現型を有する子孫の83％（30/36）は、3回の実験で、第2のアレルの標的領域の付近にインデル変異を有することが分かった（図3D）。注目すべきことに、修復されていないと考えられた無色素の子孫の79％（30/38）がインデル変異を有していた。遺伝子修正とインデルを一緒にすると、G0子孫の合計89％（66/74）がゲノム編集されていた（表3；表4）。これらの結果は、i-GONADが非常に高いゲノム編集効率をもたらすという結論をさらに裏付けている。
【００６０】
修復されたアレルを含む3匹の代表的な創始マウス（G0-＃8：5％モザイク、G0-＃9：60％モザイク、G0-＃10：100％モザイク[毛色に基づく]；図3C）をJcl:MCH(ICR)マウスと交配させて、修復アレルの生殖細胞系列伝達を評価した。G0-＃8（0/43）からはレスキューされた子孫が得られなかったが、アグーチの毛色を示す仔は、創始マウスG0-＃9およびG0-＃10（＃9[8/18]および＃10[30/30]）から得られた（図7Aおよび表5）。
【００６１】
（表５）生殖細胞系列伝達の割合
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【００６２】
i-GONAD法と顕微注入法のゲノム編集効率の比較
i-GONADのゲノム編集効率を顕微注入ベースのアプローチの該効率と比較した。この研究では、上記のi-GONADデータセットを使用し、それを単離された接合子の顕微注入と比較した。35匹の過剰排卵処理したJcl:MCH(ICR)雌からの卵母細胞を対外受精（IVF）させて、顕微注入用の接合子を作成した。339個のそのような接合子にCRISPR試薬を注入して、それらを培養した。これらのうち242個（71％）が2細胞期に進み、次に、それらを12匹のレシピエント雌に移植した（表6）。それらの雌をE14.5またはE15.5で安楽死させた。回収された62個の胎仔のうち、32個体（52％）が有色素の目を持っていた。塩基配列解析により、目に色素がある胎仔は標的部位に修正された配列を持つことが示された。遺伝子修正とインデルを一緒にすると、G0胎仔の合計79％（49/62）がゲノム編集されていた。i-GONADを用いたゲノム編集と標準的な顕微注入ベースの技法を直接比較したこれらのデータは、ゲノム編集効率が2つの戦略間で同等であることを明確に示している（p＝0.103）。顕微注入からのゲノム編集胎仔におけるモザイク現象（21/49、43％；表6）は、i-GONADアプローチ（40/66、61％；表3）と比較してやや低かったが、その差は統計的に有意でなかった（p＝0.059）。とりわけ、標準的な顕微注入ベースのアプローチでは、Jcl:MCH(ICR)系統を使用した場合に約2.5倍の動物が必要であった；すなわち、10匹の正確にゲノム編集されたマウスを得るために、20匹のマウス（卵子ドナーとしての雌11匹＋IVF用の精子ドナーとしての雄1匹＋偽妊娠雌4匹＋精管切除雄4匹）を必要とした。一方、i-GONADで使用したマウスは8匹だけであった（4匹の胚ドナーを4匹の種付け雄と交配させた）。
【００６３】
（表６）CRISPR/Cas9コンポーネントの接合子顕微注入によるTyr変異の修正
2020534024.tif 000007
【００６４】
i-GONADを用いた大きなゲノム欠失の動物モデルの作製
次に、i-GONAD法を用いて、C57BL/6JJclマウスのagouti遺伝子座の第1イントロンに存在するレトロトランスポゾン配列を標的とすることにより、大きなゲノム欠失を含むマウスを作製できるかどうかを検討した[16]。レトロトランスポゾン配列を含む16.2kbにわたるゲノム領域を、レトロトランスポゾン挿入部位に隣接する2箇所の切断部を作ることにより欠失の標的とした（図4A）。この領域の欠失は、マウスの毛色を黒からアグーチ色に変化させるはずである（図4B）。ゲノム末端の正確な結合を助けるために、2つの切断端に短い相同配列を含むssODNドナーを得た。このssODNには、制限酵素断片長多型（RFLP）アッセイで使用するためのEcoRI部位も含まれていた。8匹のE0.7妊娠C57BL/6JJcl雌の卵管内腔にCas9タンパク質、2種類のcrRNA/tracrRNA、およびssODNを含む溶液を注入して、インビボのエレクトロポレーションを施した。これらのうち、妊娠しているのは4匹のみであり、それらから6匹のG0仔を帝王切開により回収した。仔のジェノタイピングにより、3個体（50％）がagouti遺伝子座での大きな欠失（G0-＃3および-＃5）および/またはアグーチの毛色（G0-＃4および-＃5）を示したことが明らかになった（図4B〜4D；表7）。特に、1匹の仔（G0-＃3；1/6 [17％]）は標的部位にssODNが正確に挿入されていたが、アグーチの毛色を示す別の仔（G0-＃5）はssODNの挿入がなかった（図4Dおよび4E）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、G0-＃4アグーチ仔からアンプリコンを生成せず、プライマー結合部位の一方または両方が欠失された可能性があることを示唆した。興味深いことに、G0-＃6仔は、標的遺伝子座での大きな欠失もアグーチの毛色も示さなかった個体であるが、両方の切断部位にインデル変異を有していた（表7；表8）。（大きな欠失と短いインデルを一緒にすると）ゲノム編集された仔個体の割合は67％（4/6）であった（表8）。これらのデータは、i-GONADが大きなゲノム欠失を作製できることを示唆している。
【００６５】
（表７）i-GONAD法を用いたレトロトランスポゾン配列の除去によるagouti遺伝子発現の復元
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【００６６】
（表８）agouti遺伝子編集の効率（詳細については表7を参照）
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【００６７】
i-GONADを用いた長いssDNAドナーのノックイン
本発明者らは、長いDNA配列のノックインがssDNAドナーを使用することで効率的に達成できることを以前に実証した[17, 18, 19]。長いssDNAドナーをi-GONADで使用してノックインアレルを作製できるかどうかを検討した。T2A-mCitrine融合カセットを含むレポーターモデルを作製することを目的として、これらのノックイン実験のためにPitx3およびTis21遺伝子を選択した。図5A〜5Dおよび図8A〜8D；表9を参照されたい。
【００６８】
（表９）i-GONAD法を用いたTis21遺伝子座のゲノム編集効率
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【００６９】
Pitx3遺伝子の停止コドンのすぐ上流に783bpのT2A-mCitrineカセットを挿入した（図5A）。ssDNAドナーを、以前[17]に記載されたインビトロの転写および逆転写（ivTRT）法を用いて調製した。Cas9タンパク質（1mg/ml）とcrRNA/tracrRNA（30μM）の濃度は、前の実験で用いた濃度と同じであった。i-GONAD法ではssDNAドナーを1.3または1.4μg/μlの濃度で使用した。E12.5でG0胎仔を分析し、解剖顕微鏡下で蛍光を観察した。一部の胎仔のレンズは、融合カセットの正確な挿入を示唆して、蛍光を示した（図5B）。この観察は、以前に作製されたノックインモデルに類似する[20]。標的部位での該カセットの正確な挿入を標的領域のPCR増幅と配列決定により確認し（図5C）、サンプルの15％（5/34）がノックインカセットを含んでいたことが明らかになった（図5Dおよび表10）。注目すべきことに、これら5個体のサンプルの他のアレルにはインデル変異が含まれていた。また、T2A-mCitrineカセットの挿入を含まなかった16個体の胎仔もインデル変異を含んでいた（表10；表11）。合計するとと、ゲノム編集されたG0個体（ノックインおよび/またはインデル変異）の割合は62％（21/34）になった（表10）。標的挿入アレルを含まない胎仔にランダム挿入は検出されなかった。
【００７０】
（表１０）i-GONAD法によるPitx3遺伝子座のゲノム編集効率
2020534024.tif 000011
【００７１】
（表１１）ssDNAをドナーとして含むi-GONADを用いたレポーター遺伝子ノックインマウスの作製
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＊インデル変異、完全ノックインカセット、および部分ノックインを含むものが含まれる。
【００７２】
様々なマウス系統でのi-GONAD
次に、いくつかの近交系およびハイブリッドマウス系統での、また追加の遺伝子座でのi-GONADの性能を評価した（表12）。C3H/HeSlc、C57BL/6NCrSlc、DBA/2CrSlc、B6D2F1/Slc系統、およびB6D2F1/SlcとC57BL/6NCrSlcのハイブリッド系統のTyr遺伝子にインデル変異を導入するためにi-GONADを実施した（図9A〜9C）。また、C3H/HeSlcおよびC57BL/6NCrSlc系統ではKit遺伝子へのインデル導入も標的にした（図10A〜10C）。C57BL/6NCrl系統のCdkn1aとCdkn2a（図11A〜11B）およびBALB/cAJcl系統のTyrにssODNを介して小さな遺伝的変化を挿入した。結果は、試験した全ての遺伝子座で、また全てのマウス系統においてi-GONADがゲノム編集を行うことを示したが、C57BL/6NCrSlcマウスのTyr遺伝子座を標的とする場合は除外された。この結果は、C57BL/6NCrSlcコロニーでは妊娠した雌を得ることが難しいためであり得る。近交系の雌の全体的な妊娠率は低かった。非近交系とは異なり、膣栓の存在によって交配が確認された多くの近交系の動物は、着床した胚を含んでいなかった。まとめると、これらの結果は、i-GONADが多くのマウス系統で使用できるものの、その成功率は系統に依存し、特定の近交系ではさらなる最適化が必要であり得ることを示している。
【００７３】
（表１２）
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【００７４】
AsCpf1ヌクレアーゼを用いたi-GONAD
最近、アシダミノコッカス属菌種（Acidaminococcus sp.）由来のCpf1（AsCpf1）がゲノム編集ツールとして加わった[22, 23]。AsCpf1タンパク質をi-GONADで使用できるかどうかを検討した；6.3μMのAsCpf1タンパク質を、Hprt遺伝子座を標的とする30μMのcrRNAと共に、5匹の妊娠Jcl:MCH(ICR)マウスの卵管内腔に注入することにより実施した。E13.5で合計40個の胚を単離し、PCRと配列解析によりインデルの有無を分析した。1個体の胎仔からのDNAは、おそらくプライマー結合部位の欠失のため、PCRアンプリコンを生じなかった。25個体の胎仔からのDNAはインデル変異を含んでいた。その結果は、AsCpf1を用いたi-GONADの後に回収されたG0子孫の65％（26/40）がゲノム編集されていて、これらのサンプルの約65％（17/26）がモザイクであったことを示している（表13）。
【００７５】
（表１３）AsCpf1を用いたi-GONADによるHprt遺伝子座の編集
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【００７６】
また、AsCpf1を用いてTyr遺伝子のG308C変異を修正した。点変異にまたがる領域のcrRNAをデザインし、Cas9媒介ターゲティングについて記載したTyr修復実験で用いたのと同じssODNを使用した（図12A）。i-GONADを4匹の妊娠Jcl:MCH(ICR)雌に対して実施した。E13.5で合計19個体の胎仔を回収した。これらのサンプルのうち11個体（58％）は、修復の指標である目の色素を示した（図12Bおよび表14、表15）。配列解析により、有色素胎仔では少なくとも一方のアレルが（CからGに）修正された配列を標的部位に有し（図12C）、一部の胎仔はインデル変異を有することが実証された。遺伝子修正とインデルを合わせると、合計74％（14/19）のG0胎仔がゲノム編集されていて、モザイク現象の頻度は36％（5/14）であった（図12A〜12C）。これらの研究は、（少なくとも試験した2つの遺伝子座で）Cas9の代わりにAsCpf1ヌクレアーゼを使用した場合、i-GONADが高効率のゲノム編集をもたらし得ることを示している。
【００７７】
（表１４）Tyr遺伝子編集の効率
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【００７８】
（表１５）AsCpf1を用いたi-GONADによるTyr変異の修正
2020534024.tif 000022
【００７９】
i-GONADに使用された動物は生殖機能を保持する
接合子を単離するために雌胚ドナーを犠牲にする従来のゲノム編集アプローチとは異なり、i-GONAD法はドナー雌の安楽死を必要としない。したがって、i-GONADを受けた雌マウスが生殖機能を保持するかどうかを検討した。i-GONADを受けてゲノム編集された仔（表3のマウス-＃3、-＃5、および-＃11）を出産した3匹の雌マウスを、繁殖力のある雄マウスと自然交配させた。これらのうち2匹（67％；マウス-＃3および-＃11）は妊娠し、それぞれ9匹および12匹の仔を出産するのに成功した（図13および表16）。これらのデータは、これらのマウスの卵管が正常な機能を保持し、受精とその後の受精卵の子宮への卵管内輸送を可能にすることを示唆している。
【００８０】
（表１６）i-GONADに使用した3匹全ての雌の同腹仔数
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【００８１】
考察
i-GONADの開発
本発明者らは、以前に、GONADと呼ばれる原理証明（proof-of-principle）ゲノム編集法を示した[10]。GONADは、インサイチュで接合子に対して行われるため、接合子の単離、そのエクスビボでの操作、その後のレシピエント雌へのその移植の工程を迂回することができる；動物ゲノム編集のこれらの工程は、開発されてから30年以上にわたって実施されてきた。本研究では、我々は、GONAD法にいくつかの改良を加えて、この方法をゲノム編集動物モデルの日常的な作製に高度に適するものにした。まず最初に、最適な妊娠時期を評価し、0.7日目がGONADに適しており、この時期は膨大部への溶液の導入を容易にすることを示した。第二に、i-GONADと命名したアプローチにおいてCas9 mRNAをCas9タンパク質に置き換え、かつインビトロで転写されたsgRNAを合成コンポーネント（例えば、crRNA＋tracrRNA）に置き換えると、ゲノム編集効率が顕微注入ベースのアプローチのレベルにまで向上した。第三に、i-GONADは大きな欠失、点変異、および大きなカセットノックインのモデルの作製に使用できる。第四に、i-GONADは多くのマウス系統で機能する。第五に、i-GONADに使用した雌は、完全に機能的な生殖能力を保持する。第六に、i-GONAD法ではAsCpf1ヌクレアーゼを使用することもできる。最後に、市販の様々なタイプのエレクトロポレーターを使用してi-GONADを実施できることが分かった。エレクトロポレーターは顕微注入のセットアップの10分の1の費用ですみ、また専門の技術者を必要としないため、i-GONAD法は、一方または両方を備えていない多くの研究室で容易に適合され得る。
【００８２】
i-GONAD法のタイミングの評価
0.7日目（1細胞期後期に相当する）に実施したGONADは、ゲノム編集に効果的であることが分かった。この時期にGONADを実施することにはいくつかの利点がある。第一に、E0.7接合子は、より少ない卵丘細胞に取り囲まれており（図1C）、したがって、ゲノム編集コンポーネント（CRISPR関連核酸/タンパク質）の送達のためにより容易に近づきやすい。0.4日目に行った実験では、エレクトロポレーションを介したコンポーネントの効果的な送達が起こらないことが分かったが、それはおそらく、この時期の接合子が卵丘細胞のクラスターに囲まれているためである。第二に、0.7日目の卵管には、多くの場合にはっきりと見える膨大部があり、これは解剖顕微鏡下でのマイクロピペットによる溶液の導入を容易にする。第三に、1.5日目に実施された、以前に報告したGONAD法と比較して、0.7日目に導入される溶液の量を卵管あたり1.0〜1.5μlに減らすことができ、これは試薬の節約になる[10, 24]。第四に、E0.7接合子は卵管膨大部内のよりコンパクトな空間に存在するため、ゲノム編集コンポーネントが1.5日目よりも効率よく接合子に到達できると考えられる。
【００８３】
0.7日目に実施したGONADではモザイク現象が少ないと予想されたが、モザイク現象は依然として観察され、特にCas9 mRNA/sgRNAを使用した場合に認められた（＞82％）。ctRNPを使用した場合には、モザイク現象のレベルがかなり低くなった（約36〜65％）。非常に低い、またはゼロの、モザイク現象は、CRISPRコンポーネントをさらに早い時期（受精後約5時間）に送達することによって達成される可能性がある[4]。しかし、この時期にGONADを行うことは、次の2つの理由のためにかなり難しいであろう：（1）実験のタイミングに課題があり、自然交配マウスの場合、受精後5時間は一般的にきわめて早朝である；および（2）この妊娠初期の卵は、卵丘細胞複合体で強固に覆われており、接合子への試薬の効果的な送達を妨げる可能性がある。それにもかかわらず、ゲノム編集された創始マウスのほとんどは標的アレルをそれらの子孫に伝達するので、モザイク現象は必ずしも大きな制限事項ではない。
【００８４】
異なるタイプのCRISPR試薬の評価
接合子注入およびエクスビボのエレクトロポレーションベースのゲノム編集から蓄積されたデータは、RNPが、mRNA/sgRNAを用いて達成されたゲノム編集効率よりも優れた効率を引き出すことを示している[7, 13]。この研究において、本発明者らは、RNPコンポーネントが最大で約97％のゲノム編集効率へ向かわせたのに対し、sgRNA/Cas9 mRNAコンポーネントを用いて達成された効率は最大でも31％にすぎなかったことを見出した（図2f）。RNPプラットフォームの別の利点は、全てのコンポーネントを商業的に作ることができる点である。これにより、個々の研究室で調製された試薬に起因するばらつきが減るであろう。市販のRNA試薬はRNAコンポーネントの凍結乾燥形態で受け取ることができ、Cas9タンパク質は高濃度で購入可能である。これらの特徴により、所望の濃度のエレクトロポレーションミックスを調製することができる。GONADの場合、エレクトロポレーションミックスで必要とされる試薬の濃度は、通常、接合子への直接注入に用いられる該ミックスよりもはるかに高くなる。一部の雌では100％の接合子がゲノム編集されたという事実は、エレクトロポレーション時に、注入されたエレクトロポレーションミックスが卵管内の全ての接合子を取り囲むのに成功した、ことを示している。
【００８５】
i-GONADおよびEasi-CRISPR
i-GONAD処理されたサンプルにおけるssODNドナーのノックイン効率は49％であった（図3E）。遺伝子座と遺伝的改変の同じ組み合わせを用いることによって、この効率を顕微注入ゲノム編集法と直接比較し、その効率は52％であった（表6）。i-GONADに必要な動物の数は、顕微注入ベースのアプローチに必要な数の2.5分の1である。i-GONADの制限の1つは、顕微注入よりも高い濃度の試薬を必要とする点である。我々のデータは、i-GONADの効率が顕微注入の効率に匹敵することを示唆しているが、これら2つの方法の同等の効率を評価するには、より多くの遺伝子座と系統を試験する必要がある。
【００８６】
上述したように、i-GONADはゲノム編集動物を作製するための単純かつ便利な方法である。我々は、Jcl:MCH(ICR)系統（多数の同腹仔を出産する最も繁殖力のあるマウス系統の1つ）を使用して、i-GONAD手順の様々なパラメータを最適化した。我々はまた、i-GONADによるゲノム編集は様々なマウス系統で機能するが、その効率はまだ系統依存性であり、一部の近交系での胎仔/仔の回収は、おそらくこれらの系統での生殖能力の低さおよび/または同腹仔数の少なさのために、（特にC57BL/6で）低かった、ことを実証した。したがって、いくつかの近交系では、パラメータのさらなる最適化が必要であろう。注目すべきことに、我々は、最近、i-GONADを用いて遺伝子編集ラットを作製した（Matsuyama et al.: Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method［rGONAD法によるゲノム編集ラットの作製の成功］，準備中; Takabayashi et al.: Successful in situ genome editing of rat preimplantation embryos using the improved genome-editing via oviductal nucleic acids delivery (i-GONAD)［卵管核酸送達（i-GONAD）による改良型ゲノム編集を使用したラット着床前胚のインサイチュゲノム編集の成功］，準備中）。このことは、本明細書に記載した実験条件が、この方法を他の哺乳類に適用するための出発点として役に立つことを示唆している。
【００８７】
また、我々は、i-GONADを使用して、標的遺伝子座に長いssDNAドナー断片を挿入することに成功した。長いssDNAドナーは、我々の非常に効率のよいノックイン法である「Easi-CRISPR」で使用したivTRT法を用いて調製された[17, 18, 19]。i-GONADには大量のssDNAが必要であるため、サンプルの回収率が低いゲル精製に代わって、スピンカラムベースの核酸精製を使用した。顕微注入のアプローチは高濃度を必要としないので、接合子の顕微注入実験には一般的にゲル精製が使用される[17]。カラム精製されたssDNA（922〜925塩基）はアガロースゲル電気泳動後に単一のバンドを示し、それは、i-GONADドナーとして使用したとき、ノックインマウスをもたらした（図5A〜5D）。カラム精製された長いssDNAはまた、floxedマウス（すなわち、Easi-CRISPRを用いてloxPで挟まれた遺伝子遺伝子座を含むマウス）を作製するためのドナーとしても使用できる。ssODNノックインとは異なり、i-GONAD法により長いドナー断片を挿入する効率は、顕微注入（25〜67％）と比較して、低かった（最大15％）[18]。しかしながら、i-GONADは、使用する動物の数の点で顕微注入よりも優れていることがあり、その理由は、接合子の顕微注入とは異なって、精管切除した雄の維持と偽妊娠した雌の生産を必要としないからである。かくして、i-GONADは、ノックインアレルを作製するための接合子顕微注入の代替法として使用することができる。
【００８８】
i-GONADの利点と用途
いくつかのグループは、ゲノム編集されたげっ歯類を接合子のインビトロのエレクトロポレーションにより作製できることを実証している[4, 5, 6, 7, 8, 9]。GONAD法は、ゲノム編集用の核酸とCRISPRコンポーネントをインサイチュで胚に直接送達するということを考慮すると、インビトロのエレクトロポレーションより一歩先を行く。GONAD法は、インビトロのエレクトロポレーションベースのゲノム編集法よりもさらに多くの利点を提供する。それらは次のとおりである：（1）GONADは胚のエクスビボの操作を必要としない；（2）単離された胚のインビトロの培養を必要としない；（3）エクスビボで処理した胚の着床に偽妊娠雌マウスを必要としない；（4）偽妊娠雌を生産するために精管切除雄を必要としない（これは、接合子のエクスビボの操作方法および/または代理母を準備する方法などの生殖補助技術が確立されていない種では特に有利である）；および（5）GONAD処理された雌を接合子の単離のために犠牲にする必要がない。別の非常に重要な利点は、GONAD処理を受けた雌が生殖機能を保持しており、GONAD処置からの仔を出産した後で再び妊娠できることである。これは、2回目のGONAD法のために雌を再利用できることを示唆している。このことは、例えば、（1）GONAD実験に使用した動物が貴重である場合、および（2）新たに開発された遺伝子改変マウス株において別の遺伝子操作をすぐに実施する場合に、非常に重要な特徴である。これにより、顕微注入またはエクスビボのエレクトロポレーションのアプローチを使用する場合に生じるような、2番目の遺伝的変化を行うための何百もの接合子を生産するために該マウス株を増やすという面倒な要件が回避される。
【００８９】
本発明者らは、i-GONADを使用して、アルビノマウス（Jcl:MCH(ICR)およびBALB/cAJcl系統）とブラックマウス（C57BL/6JJcl系統）の色素異常を、それぞれ、Tyr遺伝子の点変異の修正およびagouti遺伝子中のレトロトランスポゾン配列の除去によりレスキューできることを示した。このような遺伝的変化は多くのヒト遺伝病でかなり一般的であり[25, 26]、我々の戦略は、疾患の原因となる変異を修正するためのヒト生殖細胞系列遺伝子治療に応用することができる。長い配列の挿入は、機能的遺伝子の追加に基づいた遺伝子治療戦略においても有用であろう[27]。ヒト生殖細胞系列遺伝子治療が、多くの場合、胚のエクスビボの操作（遺伝子発現に後成的変化（epigenetic changes）を引き起こし、胎児の発達に影響を与える可能性のあるインビトロの細胞培養工程を含む[28, 29]）と結びついていることを考慮すると、i-GONADは、エクスビボの操作またはGONAD処理した雌の犠牲を必要とせず、将来のヒト生殖細胞系列遺伝子治療に対する非常に有望なアプローチを提供する。
【００９０】
結論
動物ゲノムエンジニアリング実験には、3つの主要な、しかし重要な、工程が含まれる：犠牲にした雌からの接合子の単離；それらのエクスビボの顕微操作；その後の、処理した接合子の別の組の雌への移植。これらの工程は、過去40年間、ほとんど変わっていない。本明細書で、本発明者らは、i-GONADと呼ばれる新しい編集方法について説明し、そのような複雑で重要な工程を使用せずに、ポピュラーなマウスモデルを日常的に作製できることを示した。i-GONADはこれまで可能でなかったいくつかの有利な状況を提供する。第一に、i-GONADは高度な精密機器または専門的なスキルセットを必要としない。この特徴は、専門の研究室以外では実施できない従来の方法からの大きな脱却である。学生や初心者の技術者でもi-GONADを実施することができる。第二に、i-GONADは従来の方法で必要とされる動物の40％以下しか使用しない。第三に、現在使用されている方法で用いられた雌は必然的に安楽死させられるが、i-GONADに用いられた雌は再利用が可能である；したがって、ゲノム編集動物の作製を雌の損失なしに行うことができる。後者の2つのポイントは、動物福祉の観点から大きな恩恵をもたらす。第四に、本研究で確立されたi-GONAD法は、ラット、他のげっ歯類、霊長類、大型動物などの他の哺乳類でのゲノム編集に容易に適合させることができる。この方法は、接合子の回収のために犠牲にできない希少で貴重な動物および/または接合子のエクスビボの操作が確立されていない動物に対して特に力強い方法である。最後に、i-GONAD処理した雌は生殖機能を完全に保持している；したがって、このアプローチは、生殖細胞系列遺伝子修正のためのインビボの遺伝子治療ツールとして非常に有望である。
【００９１】
方法
CRISPR試薬
CRISPRガイドRNAは、CRISPR.mit.eduまたはCHOPCHOPを用いてデザインした（表17）。Foxe3のsgRNAは、プライマーセット（M1055/M939）とテンプレートとしてのpUC57-sgRNAベクター（Addgeneプラスミド番号：＃51132）を使用して、以前[10]に記載されるように合成した。eGFPおよびCas9のmRNAは、以前[10, 24]に記載されるようにインビトロで転写された。合成crRNAおよびtracrRNAは、米国イリノイ州Skokie所在のIntegrated DNA Technologies（IDT）からAlt-R（商標）CRISPRガイドRNAとして市販されているか、Cas9タンパク質（Alt-R（商標）S.p. CAS9 Nuclease 3NLS）と一緒に神奈川県のファスマック（FASMAC）から購入した。ssODNドナーは、IDTでカスタム合成された（Ultramer：Tyr-レスキュー実験[Tyr-レスキュー]およびagouti-レスキュー実験[agouti-レスキュー]の場合）か、または米国ケンタッキー州LouisvilleのEurofins Genomicsで合成された（Cdkn1aおよびCdkn2a遺伝子へのssODNノックインの場合）。長いssDNAドナー（Pitx3およびTis21レポーターの場合）は、以前[17]に記載されたivTRT法を使用し、若干の変更を加えて、二本鎖DNA（dsDNA）テンプレートから調製した。T2A-mCitrineカセットを、元のベクター（pP200）からプライマーセット（Pitx3ではM1051/M1052、Tis21ではM1053/M1054）を用いて増幅し、pUC119のSmaI部位に挿入すると、pP206（Pitx3の場合）およびpP209（Tis21の場合）が得られる。RNA合成用のテンプレートはこれらのベクターからプライマーセット（Pitx3ではPP226/M272、Tis21ではPP227/M272）を用いて増幅し、RNAはT7 RiboMax Express Large Scale RNA Productionシステム（Promega，Madison，ウィスコンシン州，米国）を用いて合成した。そのRNAをMEGAclearキット（Ambion）により精製し、SuperScript III逆転写酵素（Pitx3の場合）またはSuperScript IV逆転写酵素（Tis21の場合；Life Technologies）を使用し、Pitx3ではプライマーPP226、Tis21ではPP227を用いてcDNAを作成した。顕微注入用のcDNAを精製するために行われるゲル抽出の最終工程は、十分に高い濃度の最終ssDNAを得るために除外した。代わりに、NucleoSpin GelおよびPCR Clean-up（Macherey-Nagel，Dueren，ドイツ）を用いたスピンカラムベースの核酸精製を実施した。エタノール沈殿後、DNAペレットをEmbryoMaxインジェクションバッファー（Millipore）に溶解した。プライマーおよびssODNの配列を表18に示す。
【００９２】
（表１７）CRISPR標的配列および使用したgRNAのタイプ
2020534024.tif 000024
* 表17の配列は、それぞれSEQ ID NO: 21〜30である。
【００９３】
（表１８）本研究で使用したオリゴヌクレオチドの配列
2020534024.tif 000025
* 相同性の領域には下線が引いてある。表18の配列は、それぞれSEQ ID NO: 31〜67である。
【００９４】
動物
マウスは、東海大学・医学部、浜松医科大学、または重井医学研究所の動物施設で飼育した。成体Jcl:MCH(ICR)（もともとはJcl:ICR系統に由来するハイブリッド系統：http://www.clea-japan.com/en/animals/animal_g/g_01.html）、C57BL/6JJcl（近交系）、およびBALB/cAJcl（近交系）マウスは、日本クレア（CLEA Japan, Inc.）（東京都，日本）から入手した；C3H/HeSlc（近交系）、C57BL/6NCrSlc（近交系）、DBA/2CrSlc（近交系）、およびB6D2F1/Slc（ハイブリッド系）マウスは、日本エスエルシー（Japan SLC, Inc.）（静岡県，日本）から入手した；C57BL/6NCrl（近交系）マウスは日本チャールス・リバー（Charles River Laboratories Japan, Inc.）（横浜市，日本）から入手した。全ての動物実験は施設のガイドラインに従って行われ、施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された（許可番号は、東海大学での＃154014、＃165009、＃171003、浜松医科大学での＃2017062、重井医学研究所での＃17008）。
【００９５】
CRISPRエレクトロポレーション溶液の調製
この溶液は、インビトロで合成されたsgRNA（または商業的に調達されたcrRNA/tracrRNAミックス）および商業的に調達されたCas9タンパク質を含んでいた。エレクトロポレーション溶液にドナーDNAが含まれる場合、それらは商業的に合成されたssODNまたはivTRTで合成された長いssDNAのいずれかであった。Cas9 mRNA/sgRNA混合物は、我々が以前[10]に記載したとおりに調製した。eGFP mRNAを使用した場合、またはCas9をmRNAとして供給した場合にのみ、注入が成功したことのマーカーとして0.05％のトリパンブルー（ナカライテスク(Nacalai Tesque Inc.,)，京都市，日本）を使用した。凍結乾燥ssODNは、ヌクレアーゼフリー水に10μg/μlの濃度で再懸濁した。凍結乾燥状態のcrRNAとtracrRNAは、最初にRNaseフリーDuplex Bufferに200μMの濃度で再懸濁した。等量のcrRNAとtracrRNAを1.5mlチューブ内で組み合わせて、サーモサイクラーで94℃、2分間加熱し、その後室温に約10分間置いた。アニールしたcrRNAとtracrRNAをCas9タンパク質および/またはssODN/ssDNAと混合して、コンポーネントの最終濃度が30μM（crRNA/tracrRNA）、1mg/ml（Cas9タンパク質）、1または2μg/μl（ssODN）、0.85〜1.4μg/μl（ssDNA）になるようにした。AsCpf1 crRNA
2020534024.tif 000026
はIDTから好意で提供された。凍結乾燥crRNAを最初にRNaseフリー水に100μMの濃度で再懸濁し、その後サーモサイクラーで95℃、5分間加熱して、室温に約10分間置いた。AsCpf1タンパク質（IDT）をcrRNAと混合し、コンポーネントの最終濃度が30μM（crRNA）および6.3μM（AsCpf1タンパク質）になるようにした。エレクトロポレーション溶液は、その容量を1.5μl/卵管に調整するために、Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific）を用いて希釈することもあった。
【００９６】
GONAD法
この方法で使用した雌は、C57BL/6JJcl系統を除いて、過剰排卵処理を行わなかった。C57BL/6JJclを除く全ての系統では、発情期にある雌を種付けの雄と交配させた。交配を16:00〜17:00に設定し、膣栓を翌朝（9:00〜10:00）に目視検査で確認した。Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual [30]に従って、0：00（真夜中）に妊娠0日目を指定し、膣栓のある雌を10：00で妊娠0.4日目、16：00で妊娠0.7日目と指定し、この時間にそれらをエレクトロポレーション実験で使用した。
【００９７】
妊娠0.7日目（膣栓が確認された同じ日の16：00で、1細胞期後期の接合子に相当する）で麻酔をかけた雌に対して、解剖顕微鏡（SZ11；オリンパス（Olympus），東京都，日本）で観察しながら、以前[10, 24]に記載された方法に若干の変更を加えて、外科的処置を施した。背側の皮膚を切開した後に卵巣/卵管/子宮を露出させた。約1.0〜1.5μlのエレクトロポレーション溶液（37℃で10分間加温）を、マイクロピペットを用いて、膨大部の上流から卵管内腔に注入した。マイクロピペット器具は、ガラスキャピラリーニードル（P-97/IVF電動プラーを使って引き伸ばした; Sutter Instrument Co.、Novato，カリフォルニア州，米国）とニードルに取り付けられたマウスピースで構成されていた。溶液を注入した直後、卵管領域をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸した1枚の湿紙（キムワイプ（Kimwipe）；十條キンバリー（Jujo-Kimberly Co. Ltd.），東京都，日本）で覆い、その後ピンセット型電極（T820とNEPA21の場合はCUY652-3 [ネッパジーン（NEPA GENE Co. Ltd.），市川市，千葉県，日本]、CUY21EDIT IIの場合はLF650P3 [ベックス（BEX Co. Ltd.），東京都，日本]）で掴んだ。エレクトロポレーションは、矩形波パルス発生器T820（BTX Genetronics Inc.）、NEPA21（ネッパジーン）、またはCUY21EDIT II（ベックス）を使用して行った。エレクトロポレーションのパラメータは次のとおりであった：T820の場合は、パルス持続時間5ms、パルス間隔1s、電界強度50Vの8回の矩形波パルス；NEPA21の場合は、ポアーリングパルス：50V、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10％減衰（±パルス方向）、およびトランスファーパルス：10V、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40％減衰（±パルス方向）；CUY21EDIT IIの場合は、矩形（mA）、（＋/−）、Pd V：60Vまたは80V、Pd A：200mA、Pdオン：5.00ms、Pdオフ：50ms、Pd N：3、減衰：10％、減衰タイプ：Log。エレクトロポレーション後、卵管を元の位置に戻し、切開部を縫合した。動物を麻酔からの回復についてモニタリングし、さらなる分析のために飼育した。
【００９８】
顕微注入
CRISPRコンポーネントをEmbryoMaxインジェクションバッファー中で混合した。Cas9タンパク質、crRNA/tracrRNA、およびssODN（Tyr-レスキュー用）の最終濃度は、それぞれ50ng/μl、0.61μM、および10ng/μlであった。過剰排卵処理した雌マウス（Jcl:MCH(ICR)）から単離された未受精卵母細胞を、Jcl:MCH(ICR)雄マウスから新たに単離された精子との体外受精（IVF）に供した。体外受精卵の前核への混合物の顕微注入を行った。注入された胚を偽妊娠Jcl:MCH(ICR)雌の卵管に移植して、さらに発達させた。得られた胎仔（13.5日目または15.5日目）を回収して、ジェノタイピング解析にかけた。
【００９９】
mCitrine蛍光の観察
回収された胎仔は、mCitrine蛍光を検出するためのGFPフィルター付き蛍光実体顕微鏡（SZX-MGFPAを備えたOlympus SZX7）を使用して観察した。
【０１００】
CRISPR/Cas9誘発性の変異と挿入の解析
ゲノムDNAは、妊娠中期の胎仔の肢または生存マウスの耳片から、All-In-One Mouse Tail Lysis Buffer（ABP-PP-MT01500；クラボウ（Kurabo），大阪，日本）を用いて、55℃で3時間または一晩インキュベートし、続いて85℃で45分間不活性化することにより、単離した。標的遺伝子座Foxe3、Tyr、agouti、およびHprtの増幅のためのPCRは、5μlの2×GCバッファーI、0.2mMデオキシヌクレオチド（dNTP）、1μlの粗溶解物、プライマー対（表18）、および0.125UのTaKaRa r-Taq（タカラ（TaKaRa））を含む合計10μlの溶液中で、変性（95℃で5分）、95℃で45秒、58℃で30秒、72℃で1分を35サイクル、および伸長（72℃で5分）を用いて行った。標的遺伝子座Pitx3およびTis21の増幅では、PCR増幅は、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラ）を使用して、2μlの5×PrimeSTARバッファーI、0.2mM dNTP、1μlの粗溶解物、プライマー対（追加ファイル1：表S9）、および0.25UのPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼを含む合計10μlの溶液中で、変性（94℃で3分）、98℃で10秒、62℃または64℃で5秒、72℃で2分を35サイクル、および伸長（72℃で10分）を用いて行った。直接配列決定を、PCR産物と表18に示したプライマーを用いて行った。
【０１０１】
アレルのモザイク現象は、サンガー配列の結果の電気泳動図を観察することにより評価された。次の基準に基づいてモザイク現象を評価した：（1）3つを超えるピークからなる複数のピーク（または雄マウスのHprt遺伝子に2つのピーク）の存在、および（2）2つのオーバーラップするピークの一方が他方のピークよりも明らかに低いかまたは高い。性別の決定は、プライマーセットSry-F2およびSry-R2（表18）を用いてPCRで行った[31]。
【０１０２】
参考文献
2020534024.tif 000027
2020534024.tif 000028
2020534024.tif 000029
【図１】
2020534024.tif 000030
【図２Ａ】
2020534024.tif 000031
【図２Ｂ】
2020534024.tif 000032
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020534024.tif 000034
【図２Ｅ】
2020534024.tif 000035
【図３Ａ】
2020534024.tif 000036
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2020534024.tif 000040
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ−１】
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【図５Ｄ−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ−１】
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【図８Ｄ−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ−１】
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【図９Ｃ−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
2020534024.tif 000065
【図１１Ｂ−１】
2020534024.tif 000066
【図１１Ｂ−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020534024.tif 000072
2020534024.tif 000073