(57)【要約】  本発明は、分取結晶化、結晶の分離、結晶を洗浄することおよび凍結乾燥することのプロセスを、加圧濾過を使用する単一の連続したプロセス内への統合について記載する。プロセスは時間の低減を促進し、および吸収された水の除去のための複数の有機溶媒の洗浄および窒素ガスのパージを使用する新規な設計を概説し、および品質仕様を満たす最終原薬を達成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンまたはインスリン類似体の結晶の、加圧濾過によって補助される、分離、洗浄および乾燥の単一の連続したプロセスであって、以下：
ａ）ＺｎＣｌ２および４．５と８．５との間のｐＨ調整を使用するインスリンおよびインスリン類似体の結晶懸濁物を調製するステップ；
ｂ）ステップａ）から得られる懸濁物を、加圧濾過ユニットの８０ｃｍ２〜１００ｃｍ２の範囲に及ぶ面積に位置する濾布にそそぐステップ；
ｃ）加圧濾過ユニットの入口ポートを通じて窒素ガスをパージするステップ；
ｄ）加圧濾過ユニットの出口ポートを通じて濾液を収集するステップ；
ｅ）１００％の有機溶媒を使用するケーキの複数の洗浄のために、ステップ「ｂ」および「ｃ」を繰り返すステップ；
ｆ）１ｂａｒ〜２．５ｂａｒの範囲に及ぶ圧力で窒素ガスを通すことによって乾燥させるステップ；
ｇ）乾燥した粉末の形態で、乾燥したケーキを除去するステップ、
を含む、前期単一の連続したプロセス。
【請求項２】
インスリンまたはインスリン類似体が、１〜４０μｍの範囲の結晶サイズを有する、請求項１に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項３】
アセンブリージュ（assemblage）内の温度が、２５〜３５℃の範囲で維持される、請求項１に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項４】
加圧濾過ユニットが、１〜１５μｍの範囲のポアサイズを備えるフィルター膜を有する、請求項１に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項５】
インスリンまたはインスリン類似体の結晶化の単一の連続した加圧濾過プロセスが、５〜１０分以内に完了する、請求項１に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項６】
織布フィルターが、加圧濾過ユニットのＳＳメッシュ支持体上に位置する、請求項１に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項７】
織布フィルターが、ポリエステル生地およびポリプロピレン生地から選択される、請求項５に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項８】
１００％の有機溶媒が、アセトニトリル、ブタノール、エタノール、酢酸エチルおよびイソプロパノールから選択される、請求項１に記載の単一の連続したプロセス。
【請求項９】
１００％の有機溶媒の体積が、結晶懸濁物の量の５〜１０％である、請求項１および９に記載のプロセス。
【請求項１０】
好ましくは、１００％の有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項９に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物製剤の下流の加工、より具体的に言うと、インスリンおよびその類似体の下流の加工に関する。本発明はさらには、インスリンおよびその類似体の精製のための単一の連続したプロセス中への、結晶の分離、これに続く結晶を洗浄することおよび凍結乾燥することの統合に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
従来、分取タンパク質の結晶化は、（沈降した結晶を）洗浄するステップおよび重力沈降ステップの一連を含む。分取タンパク質の結晶化の最終産物は、乾燥粉末形態で原薬（ＤＳ）を得るために、さらに真空補助下で凍結乾燥することによって加工される。結果として得られる原薬は、残留物質（ＲＳ）分析、水分含有量（ＬＯＤ−乾燥減量法）、硫酸塩灰分含有量（ＲＯＩ）および一般的な品質および規制の仕様による残留溶媒の制限による純度に準拠していなければならない。商業規模における分取結晶化の全体のプロセス、すなわちタンク中に結晶を沈降させること、および所望される品質要求を満たすために洗浄すること、ならびに凍結乾燥することは、最低で７日必要とする。明らかに、このプロセスの断続的であり、モジュール方式である性質は、エネルギー、費用および時間を集中させる。
【０００３】
インスリンまたはインスリン類似体の結晶化および精製の方法は、ＷＯ２０１５０８４６９４、ＵＳ８７６９８４１、ＷＯ１９９６０４０７３０、ＣＮ１０３５１２３１８およびＵＳ６４０８５３６において開示されている。
ＷＯ２０１５０８４６９４は、アルカリ性条件下でインスリンまたはインスリン類似体を結晶化させ、およびフィルターを通して濾過することによって精製し、ならびにフィルター上に捕捉された結晶を乾燥させて、結晶性インスリンまたはインスリン類似体の結晶組成物を精製するための方法が記載されている。結晶化ののちに、デカントされた結晶懸濁物の全体量は、次いでフィルター装置へと移される。ＷＯ２０１５０８４６９４に記載されるフィルター装置は、約５μｍのポアサイズを有するステンレス鋼スクリーンを有する、攪拌式ヌッチェフィルター（agitated Nutsche filter）である。
【０００４】
ＵＳ８７６９８４１は、第一の温度および圧力のレベルを有する少なくとも１つの第一ステップ（すなわち、一次乾燥フェーズ）および第一ステップに続く、第二の温度および圧力のレベルを有する少なくとも１つの第二ステップ（すなわち、二次乾燥フェーズ）を含む基本的に水性である溶液を凍結乾燥するプロセスを開示する。
ＷＯ１９９６０４０７３０は、アシル化タンパク質、すなわち水溶液からの沈殿または結晶化および後に続く濾過による回収に抵抗するそれらを、粉末として回収する方法を開示する。アシル化タンパク質は、あるアシル化プロインスリン、インスリンおよびインスリン類似体である。方法は、タンパク質の等電点付近のｐＨに水溶液を調整すること、および調整されたｐＨにおいて、濾過できる粒子の形態でタンパク質の沈殿を引き起こす好適なアルコール濃度を提供することの組み合わせを含む。
【０００５】
ＣＮ１０３５１２３１８は、インスリンの凍結乾燥（lyophilized）加工に関する、薬物の精製乾燥プロセスを開示しており、ここでプロセスは、インスリンについての凍結乾燥プロセスを開示する。不純物含有量は、従来の技術よりも低い。このプロセスは、有機溶媒の使用を避け、潜在的な人々および環境に対する弊害を除き、および２〜３日の乾燥時間を省き、産業上の生産性を改善する。
ＵＳ６４０８５３６は、水性のタンパク質結晶懸濁物からのタンパク質結晶を乾燥するためのプロセスを開示する。プロセスは、水性の懸濁物からの結晶をフィルターで取り除くこと、フィルターケーキを洗浄すること、同じものをスピン乾燥すること、湿潤窒素の流れを用いて流動床中で結晶を乾燥させること、および乾燥結晶を窒素圧のサージを使用してフランジ付き容器内へ移すことを含む。
【０００６】
いくつかの方法が、インスリンおよびその類似体の結晶化について利用可能であるが、結晶化、洗浄することおよび結晶の分離、ならびに同じものを乾燥させることの単純で最適化されたプロセスであって、産業上で同じ原理で働くより大きな規模の機器において実践され得るプロセスを備える代替的な方法の開発の必要性がある。
本発明は、インスリンおよびその類似体の分離および乾燥のための統合された単純なプロセスを提案する。
【０００７】
発明の目的
本発明の目的は、重大な品質特性およびプロセス性能特性の匹敵する基準を達成しながら、結晶化、結晶を洗浄すること、および凍結乾燥すること、といった個別のプロセスを加圧濾過を使用して単一の連続したプロセス内で統合することである。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、加圧濾過を使用して、単一の連続したプロセス内への分取インスリンおよびインスリン類似体の結晶化、結晶の分離および凍結乾燥することのプロセスの統合を記載する。プロセスは、時間の低減を促進し、および吸収された水の除去のために、複数の有機溶媒での洗浄および窒素ガスのパージを使用することの新規な設計を概説し、および主要な品質仕様を満たす最終原薬を達成する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、インスリンおよびインスリン類似体の精製についての加圧濾過のプロセスのフローチャートを表す。
【図２】図２は、実験室規模の圧力フィルターの代表的な画像を表す。
【図３】図３は、従来の（左）プロセスからの、および新しい（右）プロセスからの原薬を表す。
【図４】図４は、喪失％として産物喪失／回収についての変動性図を表す。
【図５】図５は、ＬＯＤ（乾燥減量）％として原薬中の残留含水量についての変動性図を表す。
【図６】図６は、高分子量産物（ＨＭＷＰ）％についての変動性図を表す。
【図７】図７は、純度％についての分散チャートを表す。
【００１０】
発明の詳細な記載
定義
用語「結晶懸濁物」は、インスリンまたはインスリン類似体への塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）の添加と、これに続く酸／アルカリを使用する４．５〜８．５の範囲でのｐＨ調整によって調製された溶液の量を指す。亜鉛の添加は、マルチマーの形成によってインスリンの物理的な安定性を改善する。
用語「フィルター」は、使用されるフィルター膜のポアサイズが「１〜１５μｍ」の間で変化し、いかなる遠心力も必要としない、「ブフナー漏斗」と同様である単純な装置を指す。
【００１１】
用語「加圧濾過」は、固体物質（結晶性インスリンおよびインスリン類似体）が、ケーキとして保持されるようにフィルター膜に対して溶液を押し、一方で（有機溶媒）母液は、透過液として通過する、制御された圧力によって補助された固体−液体の濾過を指す。この外来の圧力は、増加した有効な流速、膜にまたがった高い圧量勾配をもたらし、および不活性ガスの使用は、最終産物の安定性を確かにする。加圧濾過は、実験室規模で２〜５分および産業規模で４５〜６０分の間の作動時間を含む、瞬間的なプロセスである。
用語「インスリン」または「インスリン類似体」は、糖尿病の処置のために使用される５１アミノ酸のペプチドホルモンを指す。それはまた、インスリン前駆体またはインスリン類似体の前駆体、中間体インスリンまたは下流の加工の間に得られるインスリン類似体分子などの形態に関連する他のインスリンをも指す。
【００１２】
発明の説明
インスリンおよびインスリン類似体は、組み換えPichiaベースの発酵プロセスを使用して、細胞外で発現させた。形質転換したPichia pastoris酵母株は、培地中で発酵させた。分泌されたインスリンまたはインスリン類似体は、クロマトグラフィー法によって回収された。
インスリンおよびインスリン類似体は、クロマトグラフィー溶離プールから結晶化された。それは、さらに塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）の存在下および適切なｐＨ（４．５〜８．５の範囲で）において、酸またはアルカリの添加によって結晶懸濁物内で作製された。結晶懸濁物のプロファイル（固体のパーセンテージ、純度）が、決定された。結果として得られるインスリンまたはインスリン類似体の結晶は、高純度を有した。結晶懸濁物の全体量は、結晶化のために使用された沈殿剤の遊離したものを取り除くために水で洗浄され、およびさらに凍結乾燥の加工のために先に進めた。
結晶懸濁物は、乾燥ケーキを得るために、最初に加圧濾過プロセスを通して分離について加工された。この分離プロセスは、重力および遠心力が全くない。
乾燥ケーキは、水を吸収しており、その水は、有機溶媒による洗浄およびそれを通す窒素ガスのパージによって取り除かれる。
【００１３】
単一の連続したプロセスは、以下の４つのステップで描かれ得る。
１．結晶懸濁物の加圧濾過（結晶の初めの分離）
２．乾燥すること：吸収された水の排除のために有機溶媒を用いて洗浄すること
３．乾燥すること：残留有機溶媒を取り除くための窒素の最終パージ
４．ｃＧＭＰ環境中で乾燥した粉末を自動で分配すること。
結晶の分離、洗浄することおよび乾燥することの同様の統合は、インスリンおよびインスリン類似体の下流の加工の間の複数の先行する結晶化のステップにおいて実施され得る。
原材料（単数または複数）、試薬（単数または複数）および機器（単数または複数）は、夫々表１、２および３において以下にリストされるように使用された。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
【表３】
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【００１７】
試行は、８０ｃｍ２〜１００ｃｍ２のおおよそのフィルターの断面積を有する実験室規模の圧力フィルター装置において実施された。それは、圧縮不活性ガス（窒素）のための圧力入口、圧力計および安全放出弁、試料入口および出口ポートおよび水ジャケットもまた含む（図２）。
可変パラメータは、洗浄溶媒、溶媒量、洗浄の数、各洗浄についての窒素パージの時間および加工された結晶のサイズに依存する、フィルター媒体の任意の変更、であった。得られた原薬のプロセス性能および品質特性は、透過液中の結晶の喪失のパーセンテージを分析すること、および乾燥減量（ＬＯＤ）、純度および分子量（ＨＭＷＰ）によって測定された。装置の温度は、２５℃〜３５℃の範囲で維持された。
【００１８】
インスリンおよびインスリン類似体の結晶懸濁物の加圧濾過のプロセスによって形成されたケーキは、必須の厚さおよび質感を有した。しかしながら、目標は、ＬＯＤの許容し得る標準を達成するようにケーキを乾燥させることであり、極めて重要なことには従来のプロセスの結晶化〜凍結乾燥することを、単一の連続したプロセス内へと統合することである。フィルターケーキからの吸収された残留水の充分な排除を達成するために、種々の有機溶媒を用いた単一のまたは複数の洗浄戦略が研究された。洗浄ステップは、沈殿剤、および逆相（クロマトグラフィー）溶離プール中に存在する残留溶媒の有効な除去を可能とするように、および一般的な品質および規制の仕様に応じる原薬を得るようにもまた設計された。
【００１９】
連続的および自動化された様式において乾燥した粉末を達成するための器具（単数または複数）の構築は、以下の通りであった：
ｉ．機器は、要求される内部温度ならびに（不活性）ガスの通過の供給を維持するためのジャケットを有するＳＳシリンダ形状のアセンブリージュ（assemblage）であった。窒素ガスシリンダおよびユラボ社製（Julabo）水冷器が、これらの試行のために使用された。温度は、２５〜３５℃の範囲で維持された。
ｉｉ．８０ｃｍ２〜１００ｃｍ２の面積の濾布は、ＳＳメッシュ支持体上に位置し、およびアセンブリージュ中に収容された。織布フィルターは、ＰＥＴ  １７０３（ポリエステル生地）およびＳＫ−０１１（ポリプロピレン生地）から選択された。
【００２０】
ｉｉｉ．アセンブリージュは、シリコンガスケットで裏打ちされたＳＳディスクで密封され、およびクランプは、区画（compartment）が気密となるように固定されており、これに続き均一に整った懸濁物を槽の上端から注ぎ、加圧濾過を開始した。
ｉｖ．１ｂａｒ〜２．５の範囲でのｂａｒの圧力で窒素ガスが、ＮＲＶ／入口ポートを通じて適用された。
ｖ．濾液／透過液は、下部にある試料出口ポートを通じて収集された。
ｖｉ．ステップ「ｉｉｉ」および「ｉｖ」は、有機溶媒を使用する単一または複数のケーキの洗浄のために繰り返された。
ｖｉｉ．乾燥することは、アセンブリージュを解いたのちに、有機溶媒の添加およびさらにＮ２ガスを約３分間通すことによって実施された。
ｖｉｉｉ．ケーキを含有する生地は、慎重に取り除かれ、およびケーキを回収するためにやさしくタッピングし、ケーキは次いで滅菌された気密の琥珀色の容器内に移され、およびさらなる分析まで−２０℃で保管された。
【００２１】
２回の試行が行われた。第一は、予備的スクリーニングであり（試行Ｉ）、および第二（試行ＩＩ）は、実験計画法（ＤＯＥ）であった。
予備的スクリーニング試行（試行１）は、表４中に記載された設計を使用する種々の有機溶媒を用いて実験室規模のプロトタイプの産業用圧力フィルター（図２）で実施された。好ましい態様において、アセトニトリルが最良の実用有機溶媒であると考えられた。濾布は、研究され、およびそれらのポアサイズ、すなわち結晶の保持、質感、商業規模での加工性およびプロセスのｐＨおよび温度条件への復元性／不活性についてスクリーニングされた。２つの型の濾布、すなわちポリエステル生地およびポリプロピレン生地が使用された。有機溶媒は、ケーキから水を排除するそれらの能力およびそれらの揮発する性質に基づき選ばれた（表４）。許容し得る溶媒および最終原薬におけるそれらの残留制限へのＦＤＡガイドラインは、溶媒の選択についてもまた考えられた。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
上記の設計中の高いパーセンテージのＬＯＤ（乾燥減量）値を生じる溶媒および洗浄の組み合わせは除かれた。データセットは、表５および表６中に存在する。
表５および表６中のキャプチャされたデータセットは、結果として得られるインスリンおよびインスリン類似体の原薬が、最適な産物の回収を伴う従来の結晶化〜凍結乾燥するプロセスから作製された原薬に匹敵する品質特性を有することを示唆した（図３）。
【００２４】
試行（Trail）Ｉにおいて計画されたアセトニトリルでの２回の洗浄は、ＬＯＤのパーセンテージに関しては満足な成果を有する。しかしながら、規制の要件と一致するために、ＬＯＤのさらなる低減が望まれた。この実験の装置において研究されたパラメータは、以下を含んだ：ａ）洗浄の数；ｂ）乾燥時間およびｃ）フィルターケーキ中にトラップされた残留有機溶媒の蒸発を促進する温度の見込みを研究するための濾過中の温度。
試行（Trail）ＩＩ（ＤＯＥ）のために、ＨＭＷＰもまた決定された。
【００２５】
【表５】
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【００２６】
応答データに加えた要因実験の設計は、表６中に存在する。５０の実験が、以下の通りに個別に実施された（表６）。
【００２７】
【表６−１】
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【表６−２】
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【００２８】
試行１２、２３および３４からの原薬は、最も低いＬＯＤ値すなわち１０％未満の値（表７）を有する一方で、試行１１および４２からの原薬は、１２％未満のＬＯＤ値を有した。純度およびＨＭＷＰプロファイルにおいて有意な変更はなく、事前ステップでの喪失は、充分に範囲内であることが見出された。
結果のばらつきは、産物の喪失のパーセンテージ、ＬＯＤのパーセンテージ、ＨＭＷＰのパーセンテージおよび純度のパーセンテージについて夫々、図４、５、６および７においてもまた表されている。
【００２９】
【表７】
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【００３０】
多変量解析から、有機溶媒を用いたより多くの洗浄の数（３＞２＞１）が、フィルターケーキから吸収された水の充分な排除をもたらすことが発見された。１０％での洗浄１、５％または１０％での洗浄２および５％または１０％での洗浄３を包含する３回の洗浄が、ＬＯＤを低減させることにおいて最も有効であることが見出された。洗浄の量は、さらにプロセス要件により微調整され得る。乾燥時間を増加させることは、洗浄後のケーキにおいて吸収されているいくつかの溶媒を追い出すことに有用であった。濾過の間に温度を増加させることは、原薬のＬＯＤを低減させないが、原薬のどちらかのプロファイルに有意に影響を与えなかった。よって、温度は、２５〜３５℃の範囲で維持された。この多変量解析に基づき、さらにＬＯＤを＜４％にまで低減させるために、さらなる試行が、設計され、実行され得る。
この多変量解析の結果は、満足なものであり、より短く、連続的であり、より少ない資源を集中させ、および自動化された新規なプロセスに即座に注目を集めた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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