(57)【要約】  本発明は、対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに基づく、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法に関する。本発明は、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置、非一時的記憶媒体、及びコンピュータプログラムにさらに関する。本発明は、対象の試料中のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキット、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキット、及び方法の実施におけるこのようなキットの使用にさらに関する。
2020536530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、前記推測することが、
前記対象の試料中で測定される、前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを受信するステップと、
前記対象の前記試料中の３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の転写を制御する、Ｎｏｔｃｈ転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、前記決定は、前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の前記発現レベルを、前記Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの前記活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデルを査定することに基づく、前記決定するステップと、
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の前記活性を、前記対象の前記試料中の前記Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップと
を有し、
前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＲＰ、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、ここで、２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＥＰＨＢ３、ＮＦＫＢ２、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択される、
コンピュータにより実施される方法。
【請求項２】
前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が前記対象において異常に作動しているのかどうかを、前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき決定するステップ
をさらに有する、請求項１に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項３】
前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の異常な作動を是正する薬物を、前記対象に処方することを推奨するステップ
をさらに有し、
前記推奨は、前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が、前記対象において異常に作動すると、前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づき決定される場合に実施される、請求項２に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項４】
前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の前記異常な作動は、前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が前記対象において腫瘍プロモーターとして作動する作動である、請求項２又は３に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項５】
以下のアクティビティ：
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく診断；
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく予後診断；
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく薬物処方；
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく薬物有効性の予測；
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく有害作用の予測；
薬物有効性のモニタリング；
薬物の開発；
アッセイの開発；
経路の探索；
がんの病期分類；
前記対象における前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく臨床試験における前記対象の登録；
実施される後続の試験の選択；及び
コンパニオン診断試験の選択
のうちの少なくとも１つにおいて使用される、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項６】
較正された前記数学的経路モデルが、前記Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの前記活性レベルと、前記３つ若しくはこれを超えるＮｏｔｃｈ標的遺伝子の前記発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は前記数学的経路モデルが、前記３つ若しくはこれを超えるＮｏｔｃｈ標的遺伝子の前記発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づく、請求項１から５のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項７】
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置であって、前記装置は、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む、装置。
【請求項８】
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体であって、前記非一時的記憶媒体は、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する、非一時的記憶媒体。
【請求項９】
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムであって、前記コンピュータプログラムは、前記コンピュータプログラムがデジタル処理デバイス上で実行される場合に、前記デジタル処理デバイスに、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法を実施させるためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム。
【請求項１０】
対象の試料中の前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットであって、前記キットは、
前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子を対象とするポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーと、
前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子を対象とするプローブと、
請求項７に記載の装置、請求項８に記載の非一時的記憶媒体、又は請求項９に記載のコンピュータプログラムと
を含み、
前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＲＰ、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、ここで、２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＥＰＨＢ３、ＮＦＫＢ２、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択される、
キット。
【請求項１１】
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットであって、前記キットは、
前記対象の試料中の前記Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するための１つ又は複数の構成要素と、
請求項７に記載の装置、請求項８に記載の非一時的記憶媒体、又は請求項９に記載のコンピュータプログラムと
を含み、
前記１つ又は複数の構成要素が、好ましくは、ＤＮＡアレイチップ、オリゴヌクレオチドアレイチップ、タンパク質アレイチップ、抗体、複数のプローブ、例えば、標識されたプローブ、ＲＮＡ逆転写酵素シーケンシング構成要素のセット、及び／又はｃＤＮＡ、増幅プライマーを含む、ＲＮＡ若しくはＤＮＡからなる群から選択され、
ここで、前記３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＲＰ、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、ここで、２つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＥＰＨＢ３、ＮＦＫＢ２、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択される、
キット。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法の実施における、請求項１０又は１１に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、バイオインフォマティクス、ゲノムデータ処理、プロテオームデータ処理、及び、これらの関連技術の分野に関する。より詳細には、本発明は、デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、推測することが、対象の試料中で測定されるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに基づく、コンピュータにより実施される方法に関する。本発明は、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置であって、装置は、方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む装置、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体であって、非一時的記憶媒体は、上記方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する非一時的記憶媒体、及び対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムがデジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、方法を実施させるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムにさらに関する。本発明は、対象の試料中のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキット、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキット、及び方法の実施におけるキットの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析及びプロテオーム解析は、多様ながんが、がんの増殖及び進化、例えば、細胞の増殖及び転移において役割を果たす、特異的な遺伝子について、ゲノム突然変異／変異の特異的な組合せ、及び／又は高度若しくは低度の発現レベルと関連することが知られている腫瘍学など医療分野における臨床適用のためにかなり実現され、潜在的な可能性を有する。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈとは、胚の発生、免疫応答、及びがんに関与する多くの遺伝子の発現を調節する、誘導型転写因子である。がん（例えば、乳がん又は卵巣がん）などの病理学的障害に関して、異常なＮｏｔｃｈ経路活性は、重要な役割を果たす（Ａｓｔｅｒ  Ｊ．Ｃ．ら、「Ｔｈｅ  ｖａｒｉｅｄ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１２巻、１号、２０１６年１２月、２４５〜２７５頁を参照されたい）。Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路は、Ｎｏｔｃｈファミリーに由来するタンパク質受容体と（細胞結合型）リガンドのファミリー（ＤＳＬファミリー）とからなり、リガンドのファミリーは結合型受容体の切断を誘導し、このとき、切断された細胞内断片が、核へと移行し、ここで、他のタンパク質と併せて、活性の転写因子複合体を形成し、これが、標的遺伝子の十分に規定されたセットに結合し、転写活性化させる。（また、Ｇｕｒｕｈａｒｓｈａ  Ｋ．Ｇ．ら、「Ｔｈｅ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：ｒｅｃｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３巻、２０１２年９月、６５４〜６６６頁に基づく、図１も参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ターゲティングされた薬による処置の正しい選択を可能とするためには、例えば、がんにおける、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関して、異常なＮｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出することが可能であることは重要である。現在、抗Ｎｏｔｃｈ療法が開発されている（Ｅｓｐｉｎｏｚａ  Ｉ．及びＭｉｅｌｅ  Ｌ．、「Ｎｏｔｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、  １３９巻、２号、２０１３年８月、９５〜１１０頁を参照されたい）。しかし現在、その活性の状態において、例えば、その不活性状態と比較して、腫瘍促進性である可能性が高いことを指し示す、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の機能状態及び活性のそれぞれについて評価するのに利用可能な臨床アッセイは存在しない。したがって、がん、例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、若しくは前立腺がん、又は免疫障害などの疾患であって、異常なＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性により、少なくとも部分的に駆動され、したがって、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の阻害剤に応答する可能性が高い疾患を有する患者を特徴付ける可能性を改善することが可能であることが所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主要な態様に従い、上記の問題は、デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、推測することが、
対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、以上の標的遺伝子の発現レベルを受信するステップと、
対象の試料中の３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の転写を制御する、Ｎｏｔｃｈ転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、決定するステップは、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルを、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける較正された数学的経路モデルを査定することに基づく、決定するステップと、
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料中のＮｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップと
を有し、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、２、３、４以上の、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される、
コンピュータにより実施される方法により解決される。
【０００６】
本明細書に、ＴＦエレメントの「活性レベル」とは、その標的遺伝子の転写に関する、ＴＦエレメントの活性のレベルを表示する。
【０００７】
本発明は、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路内で生じる作用を同定する、適切な方式は、（とりわけ）Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路により制御される、Ｎｏｔｃｈ転写因子（ＴＦ）エレメントにより制御される、標的遺伝子の転写である、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路シグナル伝達出力の測定に基づきうるという、本発明者らによる、新しい考え方に基づく。本発明者らによる、この新しい考え方は、ＴＦ活性レベルが、試料では、準定常状態にあり、これは、（とりわけ）Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現値により検出されうることを仮定する。本明細書で標的とされるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路は、増殖、分化、及び創傷の治癒など、ヒトの、多くの細胞型において、多くの機能を制御することが知られている。がん（例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がん）などの病理学的障害に関して、異常なＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達活性は、重要な役割を果しており、これは標的遺伝子の発現プロファイル内で検出可能であり、したがって、較正された数学的経路モデルの手段として利用される。
【０００８】
本発明は、（ｉ）対象の試料中の、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルを決定するステップであって、決定するステップは、その転写が、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントにより制御される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づく、決定するステップと、（ｉｉ）対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料中のＮｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップとにより、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を決定することを可能とする。これは、がん、例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がんなどの疾患であって、異常なＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性により、少なくとも部分的に駆動され、したがって、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の阻害剤に応答する可能性が高い疾患を有する患者を特徴付ける可能性の改善を可能とすることが好ましい。特定の実施形態では、処置の決定は、特異的なＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性に基づきうる。特定の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達状態は、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズのカットオフ値、例えば、１０：１、５：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：５、又は１：１０に設定することができる。
【０００９】
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈ転写因子エレメント」又は「Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメント」又は「ＴＦエレメント」という用語は、Ｎｏｔｃｈタンパク質のうちの１つの、少なくとも細胞内ドメイン（対応する細胞内ドメインである、Ｎ１ＩＣＤ、Ｎ２ＩＣＤ、Ｎ３ＩＣＤ、及びＮ４ＩＣＤを伴う、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４）を、特異的なＤＮＡ配列への結合が可能な、ＤＮＡ結合性転写因子ＣＳＬ（ＣＢＦ１／ＲＢＰ−Ｊκ、Ｓｕ（Ｈ）、及びＬＡＧ−１）、及び、好ましくは、転写を活性化させ、これにより、標的遺伝子の転写を制御するのに要求される、ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ−ｌｉｋｅ（ＭＡＭＬ）ファミリー（ＭＡＭＬ１、ＭＡＭＬ２、及びＭＡＭＬ３）に由来する、１つの共活性化因子タンパク質などの補因子と共含有するタンパク質複合体であると規定される。好ましくは、用語は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（Ｎ１ＩＣＤ、Ｎ２ＩＣＤ、Ｎ３ＩＣＤ、及びＮ４ＩＣＤ）を結果としてもたらす、Ｎｏｔｃｈタンパク質（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４）のうちの１つの切断により誘発される、タンパク質又はタンパク質複合体である転写因子を指す。例えば、近傍の細胞上で発現する、ＤＳＬリガンド（ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、Ｊａｇｇｅｄ１、及びＪａｇｇｅｄ２）は、Ｎｏｔｃｈタンパク質／受容体の細胞外ドメインに結合し、細胞内のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を誘発し、このＮｏｔｃｈ細胞内ドメインは、発現を制御するＮｏｔｃｈシグナル伝達カスケードに参与することが知られている。
【００１０】
較正された数学的経路モデルは、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルと、３つ若しくはこれを超えるＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであってもよく、又は３つ若しくはこれを超えるＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づいてもよい。特に、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性の推測は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において開示される通りに、又は国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において記載される通りに実施される。標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の推測に関するさらなる詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁において見出されうる。
【００１１】
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の生物を指す。一部の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト対象、好ましくは、医学的対象である。さらに他の実施形態では、対象は、細胞系である。
【００１２】
本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、その転写が、Ｎｏｔｃｈ転写因子エレメントにより、直接的に、又は間接的に制御される遺伝子を意味する。「標的遺伝子」は、「直接的標的遺伝子」及び／又は「間接的標的遺伝子」（本明細書で記載される）である。さらに、「標的遺伝子」は、「直接的標的遺伝子」及び／又は「間接的標的遺伝子」（本明細書で記載される）である。
【００１３】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ４４、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ４４、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択される方法（本明細書で記載される）が特に好ましい。
【００１４】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＲＰ、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＥＰＨＢ３、ＮＦＫＢ２、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択される方法（本明細書で記載される）が特に好ましい。
【００１５】
特に適するＮｏｔｃｈ標的遺伝子については、以下の本文の節のほか、下記の例（例えば、下記の表１〜３を参照されたい）においても記載される。
【００１６】
したがって、好ましい実施形態に従い、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子は、下記の表１、表２、又は表３に列挙されるＮｏｔｃｈ標的遺伝子からなる群から選択される。
【００１７】
本発明者らにより、連鎖的な短いリストの中のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ますます、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を決定するための証拠となることが見出されている。
【００１８】
本発明の別の態様は、
Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が対象において異常に作動しているのかどうかを、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき決定するステップ
をさらに有する方法（本明細書で記載される）に関する。
【００１９】
本発明はまた、
Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の異常な作動を是正する薬物を、対象に処方することを推奨するステップ
をさらに有し、
推奨するステップは、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が、対象において異常に作動すると、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき決定される場合に実施される、方法（本明細書で記載される）にも関する。
【００２０】
「細胞シグナル伝達経路は、作動が異常である」という語句は、経路の「活性」が、予期される通りではない場合を指し、この場合、「活性」という用語は、標的遺伝子を発現へと駆動するときの、転写因子複合体の活性、すなわち、標的遺伝子が転写される速度を指す。「正常」とは、不活性であることが予期される組織内で不活性であり、活性であることが予期される組織内で活性である場合である。さらに、「正常」と考えられる、ある特定のレベルの活性が存在し、これより高いか、又は低い、何らかのレベルは、「異常」であると考えられる。
【００２１】
本発明はまた、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の異常な作動が、対象において腫瘍プロモーターとしてＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が作動するような作動である方法（本明細書で記載される）にも関する。
【００２２】
本発明に従い使用される試料は、抽出された試料、すなわち、対象から抽出された試料でありうる。試料の例は、対象の組織、細胞、血液、及び／又は体液を含むがこれらに限定されない。対象が、がんを有するか、又はがんを有する可能性がある医学的対象である場合、試料は、例えば、好ましくは、生検手順又は他の試料抽出手順を介して、がん病変、又はがんが疑われる病変、又は転移性腫瘍、又は体液が存在する体腔であって、がん細胞で汚染された体腔（例えば、胸腔又は腹腔又は膀胱腔）、又はがん細胞を含有する他の体液などから得られた試料でありうる。試料が抽出される細胞はまた、血液悪性腫瘍（白血病又はリンパ腫など）に由来する腫瘍細胞でもある。場合によって、細胞試料はまた、循環腫瘍細胞、すなわち、血流に入り、適切な単離技法、例えば、アフェレーシス又は従来の静脈の血採取法を使用して抽出される腫瘍細胞でもある。血液以外に、試料が抽出される体液は、尿、消化管内容物、又は滲出物である。本明細書で使用される「試料」という用語はまた、例えば、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が、対象から採取され、例えば、顕微鏡のスライドガラス上に置かれ、特許請求される方法を実施するために、この試料の一部が、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により、又はスライドガラスから、関心のある細胞を削ぎ落とすことにより、又は蛍光活性化細胞分取技法により抽出される場合も包摂する。加えて、本明細書で使用される「試料」という用語はまた、例えば、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が、対象から採取され、 顕微鏡のスライドガラス上に置かれ、特許請求される方法が、スライドガラス上で実施される場合も包摂する。加えて、本明細書で使用される「試料」という用語はまた、例えば、細胞系及び／又は細胞培養物が、対象から採取された細胞／組織／体液に基づき作出される場合も包摂する。
【００２３】
開示される別の態様に従い、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置は、本明細書で記載される、本発明の方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む。
【００２４】
開示される別の態様に従い、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体は、本明細書で記載される、本発明の方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する。非一時的記憶媒体は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光学ディスク若しくは他の光学記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリなどのコンピュータ−読取り型記憶媒体、又は他の電子記憶媒体、ネットワークサーバーなどである。デジタル処理デバイスは、携帯型デバイス（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型コンピュータ又はタブレット型デバイス、リモートネットワークサーバーなどである。
【００２５】
開示される別の態様に従い、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムが、デジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、本明細書で記載される、本発明の方法を実施させるためのプログラムコード手段を含む。デジタル処理デバイスは、携帯型デバイス（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型コンピュータ又はタブレット型デバイス、リモートネットワークサーバーなどでありえる。
【００２６】
開示される別の態様に従い、対象の試料中のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットは、
対象の試料中の３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルを決定するための１つ又は複数の構成要素
を含み、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される。
【００２７】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ４４、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ４４、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択されるキット（本明細書で記載される）が特に好ましい。
【００２８】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＲＰ、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＥＰＨＢ３、ＮＦＫＢ２、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択されるキット（本明細書で記載される）が特に好ましい。
【００２９】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルを測定するための１つ又は複数の構成要素又は手段は、ＤＮＡアレイチップ、オリゴヌクレオチドアレイチップ、タンパク質アレイチップ、抗体、複数のプローブ、例えば、標識されたプローブ、ＲＮＡ逆転写酵素シーケンシング構成要素のセット、及び／又はｃＤＮＡ、増幅プライマーを含む、ＲＮＡ若しくはＤＮＡからなる群から選択されうる。ある実施形態では、キットは、本明細書で記載される、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の、ｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列の部分を対象とする標識されたプローブのセットを含む。ある実施形態では、キットは、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の、ｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列の部分を対象とするプライマー及びプローブのセットを含む。ある実施形態では、標識されたプローブは、標準化された９６ウェルプレート内に含有される。ある実施形態では、キットは、基準遺伝子のセットを対象とするプライマー又はプローブをさらに含む。このような基準遺伝子は、例えば、本明細書で記載される、標的遺伝子発現レベルの正規化又は標準化に有用な、構成的に発現させた遺伝子でありうる。
【００３０】
ある実施形態では、対象の試料中のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットは、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子を対象とするポリメラーゼ連鎖反応プライマーと、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子を対象とするプローブと
を含み、
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＣＲＡ、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＤＬＧＡＰ５、ＥＰＨＢ３、ＦＡＢＰ７、ＧＦＡＰ、ＧＩＭＡＰ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＫＬＦ５、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、ＳＯＸ９、及びＴＮＣからなる群から選択される。
【００３１】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ４４、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＨＥＹＬ、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＮＲＡＲＰ、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＣＤ４４、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹＬ、ＮＦＫＢ２、ＮＯＸ１、ＰＢＸ１、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択されるキット（本明細書で記載される）が特に好ましい。
【００３２】
３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＥＰＨＢ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＲＰ、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択され、好ましくは、ここで、２つ以上の、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰからなる群から選択され、１つ又は複数の、例えば、３つ、４つ、以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、ＥＰＨＢ３、ＮＦＫＢ２、ＰＩＮ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＳＯＸ９からなる群から選択されるキット（本明細書で記載される）が特に好ましい。
【００３３】
開示される別の態様に従い、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットは、
本明細書で記載される、本発明のキットと、
本明細書で記載される、本発明の装置、本明細書で記載される、本発明の非一時的記憶媒体、又は本明細書で記載される、本発明のコンピュータプログラムと
を含む。
【００３４】
開示される別の態様に従い、本明細書で記載される、本発明のキットは、本明細書で記載される、本発明の方法の実施において使用される。
【００３５】
本明細書で記載される本発明は、例えば、以下のアクティビティ：
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく診断；
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく予後診断；
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく薬物処方；
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の、論された活性に基づく薬物有効性の予測；
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく有害作用の予測；
薬物有効性のモニタリング；
薬物の開発；
アッセイの開発；
経路の探索；
がんの病期分類；
対象における、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく臨床試験における対象の登録；
実施される後続の試験の選択；及び
コンパニオン診断試験の選択
のうちの少なくとも１つにおいてもまた、有利に使用されうる。
【００３６】
さらなる利点は、添付の図面、以下の記載を読み、これらを理解すれば、特に、本明細書の下記に提示される詳細な例を読めば、当業者に明らかであろう。
【００３７】
請求項１に記載の方法、請求項９に記載の装置、請求項１０に記載の非一時的記憶媒体、請求項１１に記載のコンピュータプログラム、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のキット、及び請求項１５に記載のキットの使用は、特に、従属請求項において規定される通り、類似の好ましい実施形態及び／又は同一の好ましい実施形態を有することを理解されたい。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態はまた、従属請求項又は上記の実施形態の、それぞれの独立請求項との任意の組合せでもありうることを理解されたい。
【００３９】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、本明細書の後出で記載される実施形態から明らかであり、これらを参照することにより解明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路を、概略的、かつ、例示的に示す図である。経路は、Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインが、ＤＳＬリガンドに結合すると、活性化する。受容体の切断の後、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは、核へと移行し、他のタンパク質と併せて、活性の転写因子複合体を形成する（Ｇｕｒｕｈａｒｓｈａ  Ｋ．Ｇ．ら、「Ｔｈｅ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：ｒｅｃｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３巻、２０１２年９月、６５４〜６６６頁を参照されたい；「ＴＳ」＝転写スイッチ；「ＴＧ」＝標的遺伝子）。
【図２】本明細書では、ベイジアンネットワークモデルである、数学的モデルであって、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の転写プログラムをモデル化するのに使用される数学的モデルを、概略的、かつ、例示的に示す図である。
【図３】対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の発現レベルに基づき、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図４】本明細書で記載される、較正された数学的経路モデルを得るための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図５】本明細書で記載される、対象の試料中の、Ｎｏｔｃｈ転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図６】離散可観測量を使用して、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図７】連続可観測量を使用して、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図８】Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析から、Ｃｑ値を決定するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図９】１１例の正常卵巣（群１）試料、及び２０例の高悪性度漿液性乳頭状卵巣癌（群２）試料について公開されている発現データセット（データセット：ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ９８９１、ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ１８５２０、ＧＳＥ２９４５０、ＧＳＥ３６６６８から採取された試料のサブセット）を使用する、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリスト、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの較正結果を示す図である。
【図１０】１１例の正常卵巣（群１）試料、及び２０例の高悪性度漿液性乳頭状卵巣癌（群２）試料について公開されている発現データセット（データセット：ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ９８９１、ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ１８５２０、ＧＳＥ２９４５０、ＧＳＥ３６６６８から採取された試料のサブセット）を使用する、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの較正結果を示す図である。
【図１１】データセット：ＧＳＥ６４９５に由来する、ＭＯＬＴ４細胞系の、３つの独立の培養物についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１２】データセット：ＧＳＥ６４９５に由来する、ＭＯＬＴ４細胞系の、３つの独立の培養物についての、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１３】誘導型Ｎｏｔｃｈ３細胞内構築物をトランスフェクトされたＩＭＲ３２細胞についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１４】漸増用量のプラスチック固定化Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ１  ｅｘｔ−ＩｇＧを伴い、７２時間にわたり培養されたＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｌｉｎ−ＨＰＣ（データセット：ＧＳＥ２９５２４）についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１５】高Ｎｏｔｃｈ活性を有することが知られているＣＵＴＬＬ１細胞についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１６】高Ｎｏｔｃｈ活性を有することが知られているＣＵＴＬＬ１細胞についての、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１７】ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞（データセット：ＧＳＥ３３３０１）についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１８】ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ９１９５、ＧＳＥ１２２７６、ＧＳＥ２０６８５、ＧＳＥ２１６５３、及びＥＭＴＡＢ３６５に由来する試料中の乳がん亜群についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１９】プラスチック固定化Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ１  ｅｘｔ−ＩｇＧの段階的投与を伴い、７２時間にわたり培養されたＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｌｉｎ−ＨＰＣ（データセット：ＧＳＥ２９５２４）についての、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図２０】高Ｎｏｔｃｈ活性を有することが知られているＣＵＴＬＬ１細胞についての、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図２１】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）、及び表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストのそれぞれを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルの間の相関を示す図である。
【図２２】１０のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストと対比した７つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストを使用する、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測についての比較を示す図である。
【図２３】１２のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストと対比した８つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストを使用する、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測についての比較を示す図である。
【図２４】２例の対照胚性幹細胞（ＥＳｃ）、２例の対照中胚葉前駆細胞（ＭＰｃ）、ＯＨＴ処理されていない、タモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する、２例のＥＳｃ試料、ＯＨＴ処理された、タモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する、２例のＥＳｃ試料、ＯＨＴ処理されていない、タモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する、４例のＭＰｃ試料、及びＯＨＴ処理された、タモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する、４例のＭＰｃ試料を含有する、公開されている発現データセットであるＧＳＥ１５２６８を使用する、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリスト、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンモデルの較正結果を示す図である。
【図２５】構成的に活性の誘導型Ｎｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ１）を伴うマウス乳腺（データセット：ＧＳＥ５１６２８）についての、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図２６】Ｎｏｔｃｈ１を活性化させる、条件付きトランスジェニック系を伴うマウス卵黄嚢組織、及びＲＢＰＪ（Ｎｏｔｃｈ転写因子複合体の一部）機能喪失を伴うトランスジェニックマウスに由来するマウス卵黄嚢組織（データセット：ＧＳＥ２２４１８）についての、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図２７】Ｎｏｔｃｈ２受容体の、条件付き機能獲得対立遺伝子を伴うマウス骨髄細胞（成体骨髄赤血球前駆細胞）（データセット：ＧＳＥ４６７２４）についての、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の例は、特に、好ましい方法、及びこれと関連する、選択された態様を例示するだけのものである。例においてもたらされる教示は、例えば、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の異常な活性を検出、予測、及び／又は診断するためのいくつかの試験及び／又はキットの構築に使用される。さらに、本明細書で記載される方法を使用すると、薬物処方を、有利に誘導することができ、薬物応答の予測及び薬物の有効性（及び／又は有害作用）のモニタリングを行うことができ、薬物耐性を予測及びモニタリングして、例えば、（コンパニオン診断試験のような）実施される後続の試験を選択することができる。以下の例は、本発明の範囲を限定するものとは見なさないものとする。
【００４２】
［実施例１］
数学的モデルの構築
国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている通り、確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルを構築し、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路である細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルと、本明細書では、細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の転写を制御するＴＦエレメントであるＮｏｔｃｈ  ＴＦエレメントである転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルとの間に、条件付き確率関係を組み込むことにより、このようなモデルを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性を、高精度で決定することができる。さらに、確率モデルは、条件付き確率を補正し、かつ／又はさらなる情報源を表すように、新たなノードを、モデルへと付加することにより、その後の臨床研究により得られる、さらなる知見を組み込むように、たやすく更新することができる。このようにして、確率モデルは、最新の医学的知見を具体化するために、適宜更新されうる。
【００４３】
国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている、理解及び解釈が容易な、別の手法では、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性は、細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルと、本明細書では、細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の転写を制御するＴＦエレメントである、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントである転写因子（ＴＦ）エレメントのレベルとの間の関係を組み込むことで、線形モデル又は（疑似）線形モデルを構築及び査定することにより、決定することができ、この線形モデルは、３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく。
【００４４】
いずれの手法でも、３つ以上の標的遺伝子の発現レベルは、好ましくは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列と関連するプローブを使用する、（ＲＴ）ＰＣＲ技法及びマイクロアレイ技法、並びにＲＮＡシーケンシングの結果でありうる、ｍＲＮＡレベルの測定値である。別の実施形態では、３つ以上の標的遺伝子の発現レベルは、タンパク質レベル、例えば、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の濃度及び／又は活性により測定することもできる。
【００４５】
前述の発現レベルは、任意選択で、適用によく適合する場合もあり、よく適合しない場合もある、多くの方式で転換される。例えば、発現レベル、例えば、マイクロアレイベースのｍＲＮＡレベルの、４つの異なる変換は、
「連続データ」、すなわち、ＭＡＳ５．０及びｆＲＭＡなど、よく知られているアルゴリズムを使用して、マイクロアレイの前処理の後で得られる発現レベル、
「ｚスコア」、すなわち、全ての試料にわたる平均が０であり、標準偏差が１であるようにスケーリングされた、連続発現レベル、
「離散」、すなわち、ある特定の閾値を上回る、あらゆる発現を１とし、これを下回る値を０とする（例えば、プローブセットについての閾値は、多数の陽性臨床試料、及び同じ数の陰性臨床試料のセット内のその値の（重み付け）中央値として選び出される）、
「ファジー」、すなわち、以下のフォーマット：１／（１＋ｅｘｐ（（ｔｈｒ−ｅｘｐｒ）／ｓｅ））のシグモイド関数を使用して、連続発現レベルが、０〜１の間の値へと転換されるが、式中、ｅｘｐｒは、連続発現レベルであり、ｔｈｒは、前述の閾値であり、ｓｅは、０〜１の間の差違に影響を及ぼすソフトニングパラメータである、連続発現レベル
である。
【００４６】
構築されうる、最も簡単な線形モデルのうちの１つは、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントである、転写因子（ＴＦ）エレメントを表すノードを、第１の層に有し、例えば、マイクロアレイ実験又は（ｑ）ＰＣＲ実験において、特定の標的遺伝子と、特に、高度に相関する、例えば、１つのプローブセットによる、標的遺伝子発現レベルの直接的測定を表す、重み付けノードを、第２の層に有するモデルである。重みは、トレーニングデータセットに由来する計算に基づくか、計算専門家の知見に基づくかのどちらかである。標的遺伝子１つ当たり、おそらく、複数の発現レベルが測定される場合に（例えば、１つの標的遺伝子が、複数のプローブセットにより測定されうる、マイクロアレイ実験の場合に）、標的遺伝子１つ当たり、１つの発現レベルだけを使用する、この手法は、特に、簡単である。特定の標的遺伝子に使用される、１つの発現レベルを選択する、具体的な方式は、トレーニングデータセットの活性試料と、不活性試料とを、最も良好に分離することが可能なプローブセットに由来する発現レベルを使用することである。このプローブセットを決定する１つの方法は、統計学的検定、例えば、ｔ検定を実施し、ｐ値が最小となるプローブセットを選択することである。ｐ値が最小となるプローブセットの、トレーニングデータセットの発現レベルとは、定義上、（知られている）活性試料の発現レベルと、及び不活性試料の発現レベルとが重複する確率が最小となるプローブセットの発現レベルである。別の選択方法は、オッズ比に基づく。このようなモデルでは、１つ又は複数の発現レベルは、３つ以上の標的遺伝子の各々についてもたらされ、１つ又は複数の線形結合は、３つ以上の標的遺伝子の各々について、重み付け項を含む線形結合を含み、各重み付け項は、それぞれの標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルのうちの、１つの発現レベルだけに基づく。上記で記載した標的遺伝子１つ当たり、１つの発現レベルだけが選び出される場合、モデルを、「最も弁別力のあるプローブセット」モデルと呼ぶ。
【００４７】
「最も弁別力のあるプローブセット」モデルに対する代替法では、標的遺伝子１つ当たり、おそらく、複数の発現レベルが測定される場合に、標的遺伝子１つ当たりにもたらされる、全ての発現レベルを使用することも可能である。このようなモデルでは、１つ又は複数の発現レベルは、３つ以上の標的遺伝子の各々についてもたらされ、１つ又は複数の線形結合は、３つ以上の標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルの、全ての発現レベルの線形結合を含む。言い換えれば、３つ以上の標的遺伝子の各々について、それぞれの標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルの各々は、線形結合において、それ自身の（個別の）重みにより重み付けされる。この変化形は、「全てのプローブセット」モデルと呼ばれる。「全てのプローブセット」は、もたらされる全ての発現レベルを使用しながら、比較的簡単であることの利点を有する。
【００４８】
上記で記載したいずれのモデルも、それらが、ＴＦエレメントの活性レベルが、３つ以上の標的遺伝子についての、１つ又は複数のプローブセットの発現レベルの線形結合に基づき計算される「単一層」モデルと考えられるものであるという点を共有する。
【００４９】
それぞれのモデルを査定することにより、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントである、ＴＦエレメントの活性レベルを決定した後で、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性を推測するために、決定されたＴＦエレメントの活性レベルを閾値化することができる。このような適切な閾値を計算するのに好ましい方法は、不活性の細胞シグナル伝達経路を有することが知られているトレーニング試料の、決定されたＴＦエレメントの活性レベルｗｌｃ（重み付け線形結合）と、活性の細胞シグナル伝達経路を伴うトレーニング試料のｗｌｃとを比較することによる方法である。このようにする方法であって、また、これらの群における分散も考慮する方法は、閾値
【数１】
2020536530.tif 000003
を使用することにより与えられ、式中、σ及びμは、トレーニング試料についての、決定された、ＴＦエレメントの活性レベルｗｌｃの標準偏差及び平均値である。活性のトレーニング試料中及び／又は不活性のトレーニング試料中で、少数の試料だけが利用可能な場合、２つの群の分散の平均に基づき、シュードカウントを計算された分散に加算する：
【数２】
2020536530.tif 000004
式中、νは、群について決定されたＴＦエレメントの活性レベルｗｌｃの分散であり、ｘは、正のシュードカウント、例えば、１又は１０であり、ｎａｃｔ及びｎｐａｓは、活性試料及び不活性試料のそれぞれの数である。次に、分散νの平方根を取ることにより、標準偏差σを得ることができる。
【００５０】
解釈を容易とするために、閾値を、決定されたＴＦエレメントの活性レベルであるｗｌｃから差し引く結果として、負の値が、不活性の細胞シグナル伝達経路に対応し、正の値が、活性の細胞シグナル伝達経路に対応する、細胞シグナル伝達経路の活性スコアをもたらすことができる。
【００５１】
上記で記載された「単一層」モデルに対する代替法として、例ではまた、「二層」も使用される。このようなモデルでは、合計値は、その関連するプローブセットの、測定された強度に基づく線形結合を使用して、あらゆる標的遺伝子について計算される（「第１（下）層」）。その後、さらなる線形結合を使用して、計算された合計値を、細胞シグナル伝達経路の、他の標的遺伝子についての合計値と組み合わせる（「第２（上）層」）。ここでもまた、重みは、トレーニングデータセットから学習されるか、専門家の知見に基づくかのどちらか、又はこれらの組合せもある。言い換えれば、「二層」モデルでは、１つ又は複数の発現レベルは、３つ以上の標的遺伝子の各々についてもたらされ、１つ又は複数の線形結合は、３つ以上の標的遺伝子の各々について、それぞれの標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルの、全ての発現レベルのうちの、第１の線形結合を含む。モデルは、３つ以上の標的遺伝子の各々について、重み付け項を含む、さらなる線形結合にさらに基づき、各重み付け項は、それぞれの標的遺伝子についての、第１の線形結合に基づく（「第２（上）層」）。
【００５２】
「二層」モデルの好ましい変化形では、合計値の計算は、トレーニングデータを使用して、各標的遺伝子について、閾値を規定することと、計算された線形結合から、閾値を差し引くことと、標的遺伝子の合計を求めることとを含む。この場合、閾値は、負の標的遺伝子合計値が、下方調節される標的遺伝子に対応し、正の標的遺伝子合計値が、上方調節される標的遺伝子に対応するように選び出される。また、例えば、上記で記載された変換（ファジー変換、離散変換など）のうちの１つを使用して、標的遺伝子の合計値を、「第２（上）層」において組み合わせる前に変換することも可能である。
【００５３】
「二層」モデルを査定することにより、ＴＦエレメントの活性レベルを決定した後で、上記で記載した通りに、細胞シグナル伝達経路の活性を推測するために、決定されたＴＦエレメントの活性レベルを、閾値化することができる。
【００５４】
以下では、上記で記載したモデルを、「（疑似）線形」モデルとして、総体的に表示する。トレーニング及び確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルの使用についてのより詳細な記載は、下記の実施例３に提示される。
【００５５】
［実施例２］
標的遺伝子の選択
転写因子（ＴＦ）とは、特異的ＤＮＡ配列への結合により、標的遺伝子からの転写を調節し、これにより、ＤＮＡから、ｍＲＮＡへの遺伝情報の転写を制御することことが可能な、タンパク質複合体（すなわち、特異的構造内で一体に結合したタンパク質の組合せ）又はタンパク質である。本明細書では、ＴＦ複合体のこの作用により直接的に産生されるｍＲＮＡを、「直接的標的遺伝子」（転写因子の）と称する。細胞内シグナル伝達経路の活性化はまた、「間接的標的遺伝子」と称する、より副次的な遺伝子転写も結果としてもたらす。以下では、細胞シグナル伝達経路活性と、ｍＲＮＡレベルとの直接的連関としての、直接的標的遺伝子を含むか、又はこれからなる、（疑似）線形モデル、又はベイジアンネットワークモデル（例示的な数学的モデルとしての）が好ましいが、直接的標的遺伝子と、間接的標的遺伝子との区別は、常に明白であるわけではない。本明細書では、利用可能な学術文献データに基づくスコアリング関数を使用して、直接的標的遺伝子を選択する方法が提示される。しかしながら、限定的な情報のほか、生物学的ばらつき、及び不確実性に起因して、間接的標的遺伝子の、意想外の選択を除外することはできない。標的遺伝子を選択するために、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ」においてアクセス可能であり、本明細書ではさらに、「Ｐｕｂｍｅｄ」とも称する、米国国立保健研究所のＭＥＤＬＩＮＥデータベースを援用して、標的遺伝子のリストを作成した。さらに、それらの発現の証拠となる性質に基づき、標的遺伝子の、２つのさらなるリストを選択した。
【００５６】
２０１６年の第４四半期〜２０１７年の第１四半期の期間において、「“Ｎｏｔｃｈ”ＡＮＤ“ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ”」などのクエリーを使用して、推定Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子を含有する刊行物を検索した。Ｎｏｔｃｈ経路は、胚系統に応じて異なる（が、重複する）標的遺伝子プロファイルを活性化させる、胚性経路である（Ｍｅｉｅｒ−Ｓｔｉｅｇｅｎ  Ｆ．ら、「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｎｏｔｃｈ１  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ａｎｄ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５巻、７号、２０１０年７月を参照されたい）。検索は、外胚葉及び内胚葉由来の臓器／組織／細胞内で発現する標的遺伝子に、特段の重点を置いて、３つの異なる胚系統（外胚葉、内胚葉、中胚葉）からの、細胞型／組織／臓器派生物の間で、示差的に発現する、標的遺伝子のセットに焦点を絞った。結果として得られる刊行物を、下記で、より詳細に記載される方法に従い、手作業で、さらに解析した。
【００５７】
証拠が蓄積される科学的実験の種類に応じて、特異的な標的遺伝子についての科学的証拠に評定を与える、ランク付けシステムを使用することにより、特異的な細胞シグナル伝達経路のｍＲＮＡ標的遺伝子を、学術文献から選択した。一部の実験の証拠が、例えば、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が活性であることが知られている細胞系のマイクロアレイ上の、プローブセットの強度の増大により検出される、ｍＲＮＡの増大のように、遺伝子が、直接的標的遺伝子であることを示唆するに過ぎないのに対し、他の証拠は、同定されたＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路のＴＦ結合部位と、細胞内の特異的細胞シグナル伝達経路の刺激の後の、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにおける、この部位の回収と、細胞系内の細胞シグナル伝達経路の、特異的な刺激の後における、ｍＲＮＡの増大との組合せのように、極めて強力でありうる。
【００５８】
学術文献では、特異的な細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子を見出すための、いくつかの種類の実験を同定することができる：
１．関心のある細胞シグナル伝達経路のＴＦの、ゲノム上のその結合部位への、直接的結合を示すＣｈＩＰ実験。例：例えば、Ｎｏｔｃｈリガンドを伴う刺激、又はＮＩＣＤのトランスフェクションによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の能動的誘導を伴うクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）技術、及びこの能動的誘導を伴わないＣｈＩＰ技術を使用することにより、細胞系のＤＮＡ内の、推定機能性Ｎｏｔｃｈ  ＴＦ結合部位を、ヌクレオチド配列に純粋に基づいて認識される結合部位のサブセットとして同定した。推定機能性は、ＴＦが、ＤＮＡ結合部位に結合することを見出す、ＣｈＩＰ由来の証拠として同定した。
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＴＦの、結合配列を含有するＤＮＡの断片への結合を示す、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。ＣｈＩＰベースの証拠と比較して、ＥＭＳＡベースの証拠は、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況へと置きかえることができないので、それほど強力ではない。
３．細胞シグナル伝達経路の刺激、及びマイクロアレイ、ＲＮＡシーケンシング、定量的ＰＣＲ、又は他の技法を使用する、ｍＲＮＡの発現の測定であり、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路誘導型細胞系を使用し、少なくとも１つであるが、好ましくは、誘導（タンパク質への翻訳を阻害するので、誘導されたｍＲＮＡを、直接的標的遺伝子であると仮定する、シクロヘキシミドの存在下における）の後の、いくつかの時点において測定される、ｍＲＮＡプロファイルを測定する。
４．３と同様であるが、代替的に、さらに下流における、ウェスタンブロットなど、タンパク質の存在度の測定を伴いながら、ｍＲＮＡの発現を測定する。
５．Ｎｏｔｃｈ阻害剤、例えば、ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）を使用する、細胞シグナル伝達経路の阻害、及びマイクロアレイ、ＲＮＡシーケンシング、定量的ＰＣＲ、又は他の技法を使用する、ｍＲＮＡの発現の測定であり、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性細胞系を使用し、少なくとも１つであるが、好ましくは、阻害の後の、いくつかの時点において測定される、ｍＲＮＡプロファイルを測定する。
６．５と同様であるが、代替的に、さらに下流における、ウェスタンブロットなど、タンパク質の存在度の測定を伴いながら、ｍＲＮＡの発現を測定する。
７．バイオインフォマティクス手法を使用する、ゲノム内のＴＦ結合部位の同定。Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントについての例：ＣＳＬ／ＲＢＰ−Ｊ結合モチーフである５’−ＣＧＴＧＧＧＡＡ−３’を使用して、ソフトウェアプログラムを、ヒトゲノム配列上で実行し、潜在的結合部位を、遺伝子プロモーター領域内、及び他のゲノム領域内の両方において同定した。
８．シクロヘキシミドの非存在下であることを除き、３と同様である。
９．シクロヘキシミドの非存在下であることを除き、４と同様である。
【００５９】
最も簡単な形態では、遺伝子を、転写因子のＮｏｔｃｈファミリーの標的遺伝子であると同定した、これらの実験の手法の各々について、あらゆる潜在的な遺伝子に、１ポイントを与えることができる。この相対ランク付け戦略を使用して、最も信頼できる標的遺伝子のリストを作成することができる。
【００６０】
代替的に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける直接的標的遺伝子の、最も大きな証拠をもたらす技術に、大きな数のポイントを与えることによる、別の方式によるランク付けを使用して、直接的標的遺伝子である可能性が最も高い標的遺伝子を同定することができる。上記のリストでは、これは、実験の手法１）については、９ポイント、２）については、８ポイントを意味し、実験の手法９）については、１ポイントへと低下することを意味する。このようなリストは、「標的遺伝子についての一般リスト」と呼ばれる。
【００６１】
生物学的変動及び不確実性にもかかわらず、本発明者らは、直接的標的遺伝子が、組織非依存的に誘導される可能性が最も高いことを仮定した。これらの標的遺伝子のリストは、「標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト」と呼ばれる。このような、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリストを使用して、異なる組織供給源に由来する試料へと適用されうる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の算出モデルを構築した。
【００６２】
以下は、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路について、証拠をキュレートした標的遺伝子リストの選択を、どのように具体的に構築したのかを、例示的に説明する。
【００６３】
ＣｈＩＰ、ＥＭＳＡ、示差的発現、ノックダウン／ノックアウト、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイ、刊行物において報告された配列解析など、各種の実験の証拠にポイントを与える、スコアリング関数を導入した。さらなる解析を実施して、１又は２種類の実験の証拠、例えば、示差的発現だけではなく、多様な種類の実験の証拠を有する遺伝子だけを許容した。２種類を超える、利用可能な実験の証拠を有する遺伝子（表１において示される）を選択した。
【００６４】
本発明者らは、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（表２に列挙される、「１８の標的遺伝子についてのショートリスト」）のさらなる選択を行った。この選択は、証拠をキュレートしたリストの標的遺伝子であって、比較的少数の証拠、例えば、見出された１つの論考だけにおいて見出され、かつ／又は例えば、血液又は脳組織に高度に特異的な証拠を有する標的遺伝子を除外することにより行った。トレーニング試料から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性を決定するときに、強力な証拠となる「１８の標的遺伝子についてのショートリスト」の標的遺伝子を、「１２の標的遺伝子についてのショートリスト」（表３に列挙される、「１２の標的遺伝子についてのショートリスト」）のために選択した。本明細書では、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／；最終アクセス日：２０１６年１２月３日）による高悪性度漿液性乳頭状卵巣がん患者（ＧＳＥ２１０９及びＧＳＥ９８９１から取り出された、Ｎｏｔｃｈ活性サブセット）のセットと、正常卵巣組織試料の対応するセット（ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ１８５２０、ＧＳＥ２９４５０及びＧＳＥ３６６６８から取り出された、Ｎｏｔｃｈ不活性サブセット）のそれぞれに由来する患者試料との間で、最大のオッズ比（下記を参照されたい）を有し、かつ／又は証拠のランク付けで、極めて高いスコアを示した、１２の標的遺伝子を選択した。
【００６５】
表1: Notch細胞シグナル伝達経路モデルにおいて使用される、Notch細胞シグナル伝達経路の「標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト」(26の標的遺伝子リスト)、及び標的遺伝子のmRNAの発現レベルを測定するのに使用される、関連するプローブセット
【表１】
2020536530.tif 000005
【００６６】
表2: Notch標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリストに基づく、Notch標的遺伝子の「18の標的遺伝子についてのショートリスト」(関連するプローブセットは、表1の場合と同じである
【表２】
2020536530.tif 000006
【００６７】
表3: Notch標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリストに基づく、Notch標的遺伝子の「12の標的遺伝子についてのショートリスト」(関連するプローブセットは、表1の場合と同じである)
【表３】
2020536530.tif 000007
【００６８】
［実施例３］
数学的モデルのトレーニング及び使用
数学的モデルを使用して、対象における、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性を推測しうる前に、モデルを、適切にトレーニングしなければならない。
【００６９】
数学的経路モデルが、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルと、対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルである場合、トレーニングは、好ましくは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている通りに実施される。
【００７０】
数学的経路モデルが、対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく場合、トレーニングは、好ましくは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている通りに実施される。
【００７１】
本明細書では、図２に示される、例示的なベイジアンネットワークモデルを使用して、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の転写プログラムを、簡単にモデル化した。モデルは、３種類のノード：（ａ）第１の層である１における、転写因子（ＴＦ）エレメント（「存在しない」状態及び「存在する」状態を伴う）；（ｂ）第２の層である２における、標的遺伝子ＴＧ１、ＴＧ２、ＴＧｎ（「低下」状態及び「上昇」状態を伴う）、及び；（ｃ）第３の層である３における、標的遺伝子の発現レベルへと連関させた測定ノードからなる。これらは、好ましくは、本明細書で使用されるマイクロアレイプローブセットである、ＰＳ１，１、ＰＳ１，２、ＰＳ１，３、ＰＳ２，１、ＰＳｎ，１、ＰＳｎ，ｍ（「低度」状態及び「高度」状態を伴う）でありうるが、また、ＲＮＡｓｅｑ又はＲＴ−ｑＰＣＲなど、他の遺伝子発現測定値でもありうる。
【００７２】
本明細書では、例示的なベイジアンネットワークモデルである数学的モデルの適切な実施は、マイクロアレイデータに基づく。モデルは、（ｉ）標的遺伝子の発現レベルが、ＴＦエレメントの活性化に、どのくらい依存するのか、及び（ｉｉ）同様に、プローブセットの強度が、それぞれの標的遺伝子の発現レベルに、どのくらい依存するのかについて記載する。（ｉｉ）のために、プローブセットの強度は、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）及びＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）から、広く入手可能な、ｆＲＭＡにより前処理された、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイから取る。
【００７３】
例示的なベイジアンネットワークモデルは、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路についての生物学の簡略化であり、生物学的測定は、典型的に、ノイズに富むので、確率的手法を選び取る、すなわち、（ｉ）ＴＦエレメントと、標的遺伝子との関係、及び（ｉｉ）標的遺伝子と、それらのそれぞれのプローブセットとの関係を、確率的に記載する。さらに、腫瘍の増殖を駆動する、発がん性の細胞シグナル伝達経路の活性は、一過性、かつ、劇的に変更されるのではなく、長期的又はさらに不可逆的に変更されることを仮定した。したがって、静的な細胞状態を解釈するための、例示的なベイジアンネットワークモデルを開発した。この理由で、複雑な動的細胞シグナル伝達経路の特徴は、モデルへと組み込まなかった。
【００７４】
例示的なベイジアンネットワークモデルを、構築し、較正すると（下記を参照されたい）、第３層である３における観測値としてのプローブセットの測定値を入力し、ＴＦエレメントが「存在する」ためには、確率はいくつでなければならなかったのかを、モデルにおいて後ろ向きに推測することにより、モデルを、新たな試料のマイクロアレイデータに対して使用することができる。この場合、「存在する」とは、ＴＦエレメントが、ＤＮＡに結合し、細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の転写を制御している現象であると考えられ、「存在しない」とは、ＴＦエレメントが、転写を制御していない現象であると考えられる。よって、この確率は、本明細書では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性を指し示すのに使用される、一次リードアウトである。これは、次に、細胞シグナル伝達経路が活性である確率に対する細胞シグナル伝達経路が不活性である確率との比（すなわち、オッズは、ｐ／（１−ｐ）により与えられ、ここで、ｐは、細胞シグナル伝達経路が活性であることの予測確率である）を取ることにより、細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズへと置きかえることができる。
【００７５】
例示的なベイジアンネットワークモデルでは、定量的な確率的推測を可能とするために、確率的関係は定量化された。組織型にわたる一般化挙動を改善するために、（ｉ）ＴＦエレメントと、標的遺伝子との確率的関係について記載するパラメータを、注意深く厳選した。ＴＦエレメントが「存在しない」場合、標的遺伝子は「低下」する可能性が極めて高く、よって、０．９５の確率を、このために選び出し、０．０５の確率を、標的遺伝子が「上昇」することのために選び出す。０．０５（非ゼロ）の確率は、標的遺伝子が、他の因子により調節されるか、又は意想外に「上昇」することが観察される（例えば、測定ノイズのために）、（稀少な）確率に相応する。ＴＦエレメントが「存在する」場合、０．７０の確率で、標的遺伝子は「上昇」すると考えられ、０．３０の確率で、標的遺伝子は「低下」すると考えられる。０．３の値は、標的遺伝子は、ＴＦエレメントが存在する場合であっても、高度に発現しない原因がいくつかあるために、例えば、遺伝子のプロモーター領域がメチル化されているため、このように選び出される。標的遺伝子が、ＴＦエレメントにより上方調節されず、下方調節される場合も、確率は、同様に選び出されるが、ＴＦエレメントの存在時における下方調節を反映する。（ｉｉ）標的遺伝子と、それらのそれぞれのプローブセットとの関係について記載するパラメータを、実験データ上で較正した。後者について、この例では、実験データのために、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路を有することが知られている患者試料に由来するマイクロアレイデータを使用する一方で、異なるデータセットに由来する正常な健常試料を、不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路試料として使用したが、これはまた、細胞系による実験、又は既知の細胞シグナル伝達経路活性状態を伴う、他の患者試料を使用しても実施されうる。結果として得られる条件付き確率表を、以下により示す：
【００７６】
【表４】
2020536530.tif 000008
【００７７】
【表５】
2020536530.tif 000009
【００７８】
これらの表では、変数である、ＡＬｉ，ｊ、ＡＨｉ，ｊ、ＰＬｉ，ｊ、ａｎｄ  ＰＨｉ，ｊは、それぞれ、「低度」（Ｌ）又は「高度」（Ｈ）のプローブセットの強度を有する、転写複合体が「存在しない」（Ａ）か、又は「存在する」（Ｐ）較正試料の数を指し示す。０〜１の極端な確率を回避するために、ダミーカウントを加算した。
【００７９】
観察されたプローブセットの強度を離散化するために、各プローブセットＰＳｉ，ｊについて、それを下回る観測値が「低度」と呼ばれ、それを上回る観測値が「高度」と呼ばれる、閾値ｔｉ，ｊを使用した。この閾値は、使用される較正データセット内のプローブセットの、（重み付け）中央値強度となるように選び出された。マイクロアレイデータのノイズ性のために、観察されたプローブセットの強度を、その閾値と比較する場合に、報告された強度の近傍において、標準偏差を０．２５とする（ｌｏｇ２スケール上で）正規分布を仮定し、閾値を下回る確率質量及び閾値を上回る確率質量を決定することにより、ファジー法を使用した。
【００８０】
上記で記載した、例示的なベイジアンネットワークの代わりに、上記の実施例１で記載された（疑似）線形モデルを援用した場合、ノードと閾値との相関の符号及び大きさを指し示す重みであって、ノードが「存在しない」のか、「存在する」のかを判定する重みを、モデルを使用して、被験試料中の、細胞シグナル伝達経路活性を推測しうる前に決定する必要がある。専門家の知見を使用して、重み及び閾値を、事前に充填しうるが、典型的には、好ましくは、そのグラウンドトゥルースが知られている、トレーニング試料の代表的セット、例えば、既知の「存在する」転写因子複合体（＝活性の細胞シグナル伝達経路）、又は「存在しない」転写因子複合体（＝不活性の細胞シグナル伝達経路）を伴う、試料中のプローブセットの発現データを使用して、モデルをトレーニングする。
【００８１】
本分野では、モデルの出力、ここでは、重み付け線形スコアを最適化するように、モデルトポロジーを考慮に入れ、モデルパラメータ、ここでは、重み及び閾値を変化させる、多数のトレーニングアルゴリズム（例えば、回帰）が知られている。代替的に、また、最適化アルゴリズムを必要とせずに、観察された発現レベルから直接、重みを計算することも可能である。
【００８２】
本明細書で「ブラックアンドホワイト」法と称する第１の方法は、各重みが、集合｛−１、０、１｝の要素である、三元システムへと縮約される。これを生物学的コンテキストで述べれば、−１及び１は、細胞シグナル伝達経路活性の場合、それぞれ、下方調節及び上方調節された、標的遺伝子又はプローブセットに対応する。プローブセット又は標的遺伝子が、上方調節又は下方調節されることが、統計学的に実証できない場合、プローブセット又は標的遺伝子は、０の重みを受け取る。一例では、活性の細胞シグナル伝達経路試料の発現レベルを、不活性の細胞シグナル伝達経路を伴う試料の発現レベルと対比した、左側及び右側の、２つのｔ検定を使用して、使用されるトレーニングデータを与えたときに、プローブ又は遺伝子が、上方調節されるのか、下方調節されるのかを決定することができる。活性試料の平均が、不活性試料の平均より、統計学的に大きい、すなわち、ｐ値が、ある特定の閾値、例えば、０．３を下回る場合、標的遺伝子又はプローブセットは、上方調節されることが決定される。逆に、活性試料の平均が、不活性試料の平均より、統計学的に小さい場合、標的遺伝子又はプローブセットは、細胞シグナル伝達経路の活性化時に、下方調節されることが決定される。万一、最小のｐ値（左側又は右側）が、前述の閾値を超える場合、標的遺伝子又はプローブセットの重みは、０であると規定することができる。
【００８３】
本明細書で「対数オッズ」法と称する第２の方法は、対数（例えば、底をｅとする）オッズ比に基づく。各標的遺伝子又は各プローブセットについてのオッズ比は、プローブセット／標的遺伝子のレベルが、対応する閾値、例えば、全てのトレーニング試料の（重み付け）中央値を上回る場合、及びこれを下回る場合の、陽性のトレーニング試料の数及び陰性のトレーニング試料の数に基づき計算する。ゼロによる除算を回避するために、疑似カウントを加算することができる。さらなる精緻化は、プローブセット／標的遺伝子レベルが、例えば、ある特定の指定された標準偏差（例えば、２ｌｏｇスケールで、０．２５）、その観察された値の近傍に正規分布することを仮定し、閾値を上回る確率質量、確率質量これを下回る確率質量をカウントすることにより、いくぶんか、より確率的に、閾値を上回る／下回る試料をカウントすることである。本明細書に、決定論的測定値の代わりに、疑似カウントと組み合わせ、確率質量を使用して計算されたオッズ比を、「ソフトな」オッズ比と呼ぶ。
【００８４】
標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の推測に関するさらなる詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁において見出されうる。
【００８５】
本明細書では、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／；最終アクセス日：２０１６年１２月３日）による高悪性度漿液性乳頭状卵巣がん患者（データセット：ＧＳＥ２１０９及びＧＳＥ９８９１）のセット、及び正常卵巣組織試料の対応するセット（データセット：ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ１８５２０、ＧＳＥ２９４５０及びＧＳＥ３６６６８）のそれぞれに由来する患者試料の発現について公開されているデータを使用した。高悪性度漿液性卵巣がんは、大半の症例において、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路を有することが知られているのに対し、正常卵巣組織試料は、不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路を有する。較正試料を選択する前に、データセットに対して、品質管理を実施して、試料が信頼できることを確認した。較正の目的で、Ｎｏｔｃｈが最も活性である卵巣がん試料であって、全ての標的遺伝子、各個別の試料について、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘｍによるＲＮＡ発現値を加算し、その後、合計値に従い、試料をランク付けすることにより決定される卵巣がん試料を、利用可能なセットから選択した。ランク付けが最高位である、２０例の試料を、Ｎｏｔｃｈ活性であると仮定した。品質管理に合格した、１２例の正常卵巣試料から、試料番号：ＧＳＭ１７６２３７、ＧＳＭ７２９０４８、ＧＳＭ４６２６５１、ＧＳＭ７２９０５０、ＧＳＭ７２９０５１、ＧＳＭ１７５７８９、ＧＳＭ４６２６５２、ＧＳＭ１７６１３１、ＧＳＭ１７６３１８、ＧＳＭ８９８３０６、ＧＳＭ８９８３０７である、１１例の試料を、Ｎｏｔｃｈ不活性の較正試料（１例の正常卵巣試料は、Ｎｏｔｃｈ活性であることが見出された）として選び出した（データセット：ＧＳＥ４２２５９に由来する試料もまた、Ｎｏｔｃｈ不活性の較正試料と考えられたが、品質管理の後、これらの試料のいずれも、残らなかった）。これらを使用して、Ｎｏｔｃｈの活性及び不活性のそれぞれについて、モデルを較正した。較正されたモデルを、ＧＥＯデータベースに由来する、多数の公開データセットであって、Ｎｏｔｃｈ活性に関するグラウンドトゥルース、すなわち、Ｎｏｔｃｈ活性が、誘導又は阻害された細胞系（例えば、ガンマ−セクレターゼなどのＮｏｔｃｈ阻害剤で処理されるか、又はＮｏｔｃｈ３の細胞内発現を誘導する可能性を有する細胞系）を含有する公開データセット上で査定した。適用例として、モデルを、生存データが知られている乳がん試料のデータセット上で実行した。
【００８６】
図９は、１１例の正常卵巣（群１）試料、及び２０例の高悪性度漿液性乳頭状卵巣癌（群２）試料について公開されている発現データセット（データセット：ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ９８９１、ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ１８５２０、ＧＳＥ２９４５０、ＧＳＥ３６６６８から採取された試料のサブセット）を使用する、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリスト、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの較正結果を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。モデルは、不活性の較正試料を、活性の較正試料から、明確に分離することが可能であった。
【００８７】
図１０は、１１例の正常卵巣（群１）試料、及び２０例の高悪性度漿液性乳頭状卵巣癌（群２）試料について公開されている発現データセット（データセット：ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ９８９１、ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ１８５２０、ＧＳＥ２９４５０、ＧＳＥ３６６６８から採取された試料のサブセット）を使用する、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの較正結果を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ここでもまた、モデルは、不活性の較正試料を、活性の較正試料から、明確に分離することが可能であった。
【００８８】
以下では、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）、及び１８の標的遺伝子についてのショートリストのそれぞれを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルについてのバリデーション結果を、図１１〜１８に示す。
【００８９】
図１１は、データセット：ＧＳＥ６４９５に由来する、ＭＯＬＴ４細胞系の、３つの独立の培養物についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＭＯＬＴ４細胞系は、高度なＮｏｔｃｈシグナル伝達を示すことが知られており、モデルは、これを、正確に予測した（群１）。細胞を、ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）である、５μＭのＤＡＰＴで、４８時間にわたり処理した（群２）。ＧＳＩは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することが知られており、モデルは、この群における、Ｎｏｔｃｈ活性の低下を正確に検出した（Ｄｏｈｄａ  Ｔ．ら、「Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＳＫＰ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ２７Ｋｉｐ１  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１３巻、１４号、２００７年８月、３１４１〜３１５２頁を参照されたい）。
【００９０】
図１２は、データセット：ＧＳＥ６４９５に由来する、ＭＯＬＴ４細胞系の、３つの独立の培養物についての、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＭＯＬＴ４細胞系は、高度なＮｏｔｃｈシグナル伝達を示すことが知られており、モデルは、これを、正確に予測した（群１）。細胞を、ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）である、５μＭのＤＡＰＴで、４８時間にわたり処理した（群２）。ＧＳＩは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することが知られており、モデルは、この群における、Ｎｏｔｃｈ活性の低下を正確に検出した（Ｄｏｈｄａ  Ｔ．ら、「Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＳＫＰ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ２７Ｋｉｐ１  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１３巻、１４号、２００７年８月、３１４１〜３１５２頁を参照されたい）。
【００９１】
図１３は、誘導型Ｎｏｔｃｈ３細胞内構築物をトランスフェクトされたＩＭＲ３２細胞についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。５０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下で、Ｎｏｔｃｈ３の細胞内発現を駆動する、２つの独立の単一細胞由来のクローン（ｃ６、ｃ８）が示される。ｔ＝０時間において、両方のクローンについて、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、低度のＮｏｔｃｈ活性を検出する。Ｎｏｔｃｈ３の細胞内発現の誘導の後、Ｎｏｔｃｈ活性は、両方のクローンにおいて上昇し、ｔ＝２４時間において安定化することを正確に観察する。（データセット：ＧＳＥ１６４７７；ｖａｎ  Ｎｅｓ  Ｊ．ら、「Ａ  ＮＯＴＣＨ３  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻、１３号、２０１３年７月、３４８５〜３４９４頁）。
【００９２】
図１４は、漸増用量のプラスチック固定化Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ１  ｅｘｔ−ＩｇＧを伴い、７２時間にわたり培養されたＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｌｉｎ−ＨＰＣ（データセット：ＧＳＥ２９５２４）についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、対照（群１）と比較した、デルタ１ｅｘｔ−ＩｇＧ（群２）上で培養された細胞内の、高度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。
【００９３】
図１５は、高Ｎｏｔｃｈ活性を有することが知られているＣＵＴＬＬ１細胞についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）による処理は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する。データセット：ＧＳＥ２９５４４では、ＧＳＩのウォッシュアウトの２時間後、Ｎｏｔｃｈ活性は、高度であることが観察された。この図では、いずれの場合にも、Ｎｏｔｃｈ活性は、高度であることが予期されるので、非処理ＣＵＴＬＬ１細胞、及びＧＳＩのウォッシュアウト後におけるＣＵＴＬＬ１細胞に由来するデータをプールする。６つの群を識別することができる：１）非処理ＣＵＴＬＬ１細胞、及びＧＳＩのウォッシュアウト後におけるＣＵＴＬＬ１細胞の群である。この場合、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、この群における、高度なＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。２）ＧＳＩで処理されたＣＵＴＬＬ１細胞であり、これらについて、モデルは、低度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。３＋４）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に影響を及ぼすことが予期されない、空のＭｉｇＲＩレトロウイルスで処理されたＣＵＴＬＬ１細胞である。この場合、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、ＧＳＩのウォッシュアウト後における細胞（群３）、及びＧＳＩで処理された細胞（群４）について、高度なＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。５＋６）ＭｉｇＲＩ−ドミナントネガティブのＭＡＭＬ１ウイルスを形質導入されたＣＵＴＬＬ細胞である。ＤＮＭＡＭＬ１は、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストであり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、これらの細胞内で、低度であることが予期される。モデルは、ＧＳＩのウォッシュアウト後における細胞（群５）、及びＧＳＩで処理された細胞（群６）のいずれについても、低度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する（Ｗａｎｇ  Ｈ．ら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ１／ＲＢＰＪ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、１０８巻、３６号、２０１１年、１４９０８〜１４９１３頁を参照されたい）。
【００９４】
図１６は、高Ｎｏｔｃｈ活性を有することが知られているＣＵＴＬＬ１細胞についての、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）による処理は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する。データセット：ＧＳＥ２９５４４では、ＧＳＩのウォッシュアウトの２時間後、Ｎｏｔｃｈ活性は高度であることが観察された。この図では、いずれの場合にも、Ｎｏｔｃｈ活性は、高度であることが予期されるので、非処理ＣＵＴＬＬ１細胞、及びＧＳＩのウォッシュアウト後におけるＣＵＴＬＬ１細胞に由来するデータをプールする。６つの群を識別することができる：１）非処理ＣＵＴＬＬ１細胞、及びＧＳＩのウォッシュアウト後におけるＣＵＴＬＬ１細胞の群である。この場合、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、この群における、高度なＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。２）ＧＳＩで処理されたＣＵＴＬＬ１細胞であり、これらについて、モデルは、低度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。３＋４）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に影響を及ぼすことが予期されない、空のＭｉｇＲＩレトロウイルスで処理されたＣＵＴＬＬ１細胞である。この場合、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、ＧＳＩのウォッシュアウト後における細胞（群３）、及びＧＳＩで処理された細胞（群４）について、高度なＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。５＋６）ＭｉｇＲＩ−ドミナントネガティブのＭＡＭＬ１ウイルスを形質導入されたＣＵＴＬＬ細胞である。ＤＮＭＡＭＬ１は、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストであり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、これらの細胞内で、低度であることが予期される。モデルは、ＧＳＩのウォッシュアウト後における細胞（群５）、及びＧＳＩで処理された細胞（群６）のいずれについても、低度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する（Ｗａｎｇ  Ｈ．ら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ１／ＲＢＰＪ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、１０８巻、３６号、２０１１��、１４９０８〜１４９１３頁を参照されたい）。
【００９５】
図１７は、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞（データセット：ＧＳＥ３３３０１）についての、表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を抑制することが知られている（Ｙｏｕ  Ｌ．Ｒ．ら、「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｖｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ」、４３５巻、７０３８号、２００５年５月、９８〜１０４頁を参照されたい）。表２による、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞（群２）において、対照細胞（群１）と比較して高度のＮｏｔｃｈ活性を正確に検出する（Ｃｈｅｎ  Ｘ．ら、「ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、２６巻、８号、２０１２年８月、１２６８〜１２７７頁を参照されたい）。
【００９６】
図１８は、ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ９１９５、ＧＳＥ１２２７６、ＧＳＥ２０６８５、ＧＳＥ２１６５３、及びＥＭＴＡＢ３６５に由来する試料中の乳がん亜群についての、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示す。Ｎｏｔｃｈ活性は、これらのデータセット内の、全ての乳がん試料中で高度であることが観察される。一元ＡＮＯＶＡに続いて、ゲームズ−ハウウェル事後検定を行う結果は、Ｂａｓａｌと対比したＮｏｒｍＬ及びＨＥＲ２と対比したＬｕｍＡを除き、ほぼ全ての群が有意差を有することを示す。表４（亜群：Ｂａｓａｌ、ＨＥＲ２、ＬｕｍＡ＝Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ、ＬｕｍＢ＝Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ、ＮｏｒｍＬ＝正常様）を参照されたい。
【００９７】
表4:図18に示される、乳がん試料の異なる亜群を比較する、ゲームズ−ハウウェル事後検定の結果。<0.05のp値を、有意であると考える。
【表６】
2020536530.tif 000010
【００９８】
表５は、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用して、図１８で使用されるデータセット上でトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルのための、Ｎｏｔｃｈ活性についてのＣｏｘ回帰の結果を示す。全ての試料を併せて、かつ、より具体的にＬｕｍｉｎａｌ  Ａ及びＬｕｍｉｎａｌ  Ｂについては、本発明者らのモデルにより予測されるＮｏｔｃｈ活性の増大と共に、予後の大幅な増悪が見られる。これは、Ｎｏｔｃｈ１について試験結果が陽性である患者は、無病生存が短いことを見出した、近年の刊行物により裏付けられる（Ｚｈｏｎｇ  Ｙ．ら、「ＮＯＴＣＨ１  ｉｓ  ａ  Ｐｏｏｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、９巻、２０１６年１１月、６８６５〜６８７１頁を参照されたい）。
【００９９】
表5:表2による、18の標的遺伝子についてのショートリストを使用して、図18で使用されるデータセット上でトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルのための、Notch活性についてのCox回帰の結果
【表７】
2020536530.tif 000011
【０１００】
図１９は、プラスチック固定化Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ１  ｅｘｔ−ＩｇＧの段階的投与を伴い、７２時間にわたり培養されたＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｌｉｎ−ＨＰＣ（データセット：ＧＳＥ２９５２４）についての、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、対照（群１）と比較した、デルタ１ｅｘｔ−ＩｇＧ（群２）上で培養された細胞内の、高度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。
【０１０１】
図２０は、高Ｎｏｔｃｈ活性を有することが知られているＣＵＴＬＬ１細胞についての、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。略図では、垂直軸は、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）による処理は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する。データセット：ＧＳＥ２９５４４では、ＧＳＩのウォッシュアウトの２時間後、Ｎｏｔｃｈ活性は高度であることが観察された。この図では、いずれの場合にも、Ｎｏｔｃｈ活性は、高度であることが予期されるので、非処理ＣＵＴＬＬ１細胞、及びＧＳＩのウォッシュアウト後におけるＣＵＴＬＬ１細胞に由来するデータをプールする。６つの群を識別することができる：１）非処理ＣＵＴＬＬ１細胞、及びＧＳＩのウォッシュアウト後におけるＣＵＴＬＬ１細胞の群である。この場合、１８の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、この群における、高度なＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。２）ＧＳＩで処理されたＣＵＴＬＬ１細胞であり、これらについて、モデルは、低度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。３＋４）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に影響を及ぼすことが予期されない、空のＭｉｇＲＩレトロウイルスで処理されたＣＵＴＬＬ１細胞である。この場合、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルは、ＧＳＩのウォッシュアウト後における細胞（群３）、及びＧＳＩで処理された細胞（群４）について、高度なＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する。５＋６）ＭｉｇＲＩ−ドミナントネガティブのＭＡＭＬ１ウイルスを形質導入されたＣＵＴＬＬ細胞である。ＤＮＭＡＭＬ１は、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストであり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、これらの細胞内で、低度であることが予期される。モデルは、ＧＳＩのウォッシュアウト後における細胞（群５）、及びＧＳＩで処理された細胞（群６）のいずれについても、低度のＮｏｔｃｈ活性を正確に予測する（Ｗａｎｇ  Ｈ．ら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ１／ＲＢＰＪ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、１０８巻、３６号、２０１１年、１４９０８〜１４９１３頁を参照されたい）。
【０１０２】
図２１は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）、及び表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストのそれぞれを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルの間の相関を示す。略図では、水平軸は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルにより予測される、活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路及び不活性のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれ（ｌｏｇ２のスケールにおける）を指し示す。垂直軸は、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリスト（データセット：ＧＳＥ５６８２、ＧＳＥ５７１６、ＧＳＥ６４９５、ＧＳＥ９３３９、ＧＳＥ１４９９５、ＧＳＥ１５９４７、ＧＳＥ１６４７７、ＧＳＥ１６９０６、ＧＳＥ１８１９８、ＧＳＥ２００１１、ＧＳＥ２０２８５、ＧＳＥ２０６６７、ＧＳＥ２４１９９、ＧＳＥ２７４２４、ＧＳＥ２９５２４、ＧＳＥ２９５４４、ＧＳＥ２９８５０、ＧＳＥ２９９５９、ＧＳＥ３２３７５、ＧＳＥ３３３０１、ＧＳＥ３３５６２、ＧＳＥ３４６０２、ＧＳＥ３５３４０、ＧＳＥ３６１７６、ＧＳＥ３７６４５、ＧＳＥ３９２２３、ＧＳＥ４２２５９、ＧＳＥ４６９０９、ＧＳＥ４９６７３、ＧＳＥ５３５３７、ＧＳＥ５４３７８、ＧＳＥ５７０２２、ＧＳＥ６１８２７、ＧＳＥ７４９９６、ＧＳＥ８１１５６、ＧＳＥ８２２９８）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルにより予測される、同じ情報を指し示す。２つのモデルは、２．２×１０−１６のｐ値、及び０．９２９の相関係数により、有意に相関する。
【０１０３】
図２２及び図２３は、（ｉ）７つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリスト（ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、及びＮＲＡＲＰ）、及び１０のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリスト（７つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子に、ＥＰＨＢ３、ＳＯＸ９、及びＮＦＫＢ２を加えたリスト）、並びに（ｉｉ）８つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリスト（ＤＴＸ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ４、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＮＲＡＲＰ、及びＰＴＣＲＡ）、及び１２のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリスト（８つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子に、ＨＥＹＬ、ＨＥＹ１、ＰＬＸＮＤ１、及びＧＦＡＰを加えたリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測についてのさらなる比較を示す。７つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、表１〜３による標的遺伝子のリストの各々に含まれ、８つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）だけ含まれる、さらなる標的遺伝子（ＰＴＣＲＡ）を含む。１０のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストのうちの、３つのさらなる標的遺伝子は、表３による、１２の標的遺伝子についてのショートリストから取り出され、１２のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストのうちの、４つのさらなる標的遺伝子であって、３つのさらなる標的遺伝子と異なる標的遺伝子は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）から取り出された。比較は、例示的に、表１〜３による標的遺伝子のリストの各々のサブセットである、７つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリスト、及び表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２６の標的遺伝子のリスト）のサブセットである、８つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子ついてのリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測が、それぞれのリストに由来する、さらなる標的遺伝子を付加することにより、さらに改善されうることを示す。
【０１０４】
図２２は、１０のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストと対比した７つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストを使用する、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測についての比較を示す。モデルを、誘導型Ｎｏｔｃｈ３細胞内構築物をトランスフェクトされたＩＭＲ３２細胞に由来する試料に対して実行した。略図では、水平軸は、時間単位の時間を指し示し、垂直軸は、相対Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性（ｌｏｇ２のオッズスケールにおける）を指し示す。いずれのモデルも、Ｎｏｔｃｈ３細胞内構築物の誘導の後における、Ｎｏｔｃｈ活性の予期される増大を正確に示す。しかし、１０の標的遺伝子によるモデル（点線）は、７つの標的遺伝子によるモデル（実線）と比較して、より大きな活性の増大を示す。Ｎｏｔｃｈ活性は、ｔ＝０時間において、０とし、比較を容易とした（データセット：ＧＳＥ１６４７７；また、ｖａｎ  Ｎｅｓ  Ｊ．ら、「Ａ  ＮＯＴＣＨ３  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻、１３号、２０１３年７月、３４８５〜３４９４頁も参照されたい）。
【０１０５】
図２３は、１２のＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストと対比した８つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子についてのリストを使用する、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測についての比較を示す。モデルを、Ｊａｇ１レトロウイルスを感染させた子宮内膜間質細胞に由来する試料（データセット：ＧＳＥ１６９０６）に対して実行した。Ｊａｇ１とは、結合すると、Ｎｏｔｃｈ受容体の切断を誘導し、これにより、最終的に、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の転写を誘導するＮｏｔｃｈリガンドである。１２の標的遺伝子によるモデル（グラフの右側）は、対照細胞（図中の「Ｃ」）と、Ｊａｇ１感染させた細胞（図中の「Ｊａｇ１  ＩＮＦ」）との間の、Ｎｏｔｃｈ活性（ｌｏｇ２によるオッズとして、垂直軸に示される）の、８つの標的遺伝子によるモデル（グラフの左側）と比較した、良好な分離を示す（また、Ｍｉｋｈａｉｌｉｋ  Ａ．ら、「Ｎｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、３８８巻、３号、２００９年１０月、４７９〜４８２頁も参照されたい）。
【０１０６】
較正された数学的モデル、例えば、例示的なベイジアンネットワークモデルを、マイクロアレイ又はＲＮＡシーケンシングに由来する、入力されたｍＲＮＡデータに適用する代わりに、臨床適用では、例えば、ｑＰＣＲを使用して、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定する、統合型プラットフォーム上で、試料測定を実施するための、専用アッセイを開発することが有益である。次いで、開示された標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡ配列を使用して、どのプライマー及びプローブを、このようなプラットフォーム上で選択するのかを決定する。
【０１０７】
このような専用アッセイのバリデーションは、マイクロアレイベースの数学的モデルを、基準モデルとして使用し、開発されたアッセイが、バリデーション試料のセットに対して、同様な結果をもたらすのかどうかを検証することにより行うことができる。専用アッセイに次いで、このバリデーションもまた、ＲＮＡシーケンシングデータを、入力された測定値として使用する、同様な数学的モデルを構築し、較正するために行うことができる。
【０１０８】
較正された数学的モデル、例えば、例示的なベイジアンネットワークモデルを使用する、マイクロアレイ／ＲＮＡシーケンシングベースの探索に基づき、特異的な細胞シグナル伝達経路活性を、最もよく指し示すことが見出された、標的遺伝子のセット、例えば、表１〜３は、対象の試料及び／又はコンピュータ上で実施される、マルチプレックス定量的ＰＣＲアッセイに移行し、発現測定値を解釈し、かつ／若しくはＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することができる。細胞シグナル伝達経路活性についての、このような試験（例えば、セントラルサービスラボにおける、ＦＤＡの承認若しくはＣＬＩＡの認証を受けた試験、又は探索使用だけのための、検査室により開発された試験）を開発するためには、規制機関による承認を得るのに、臨床試験における臨床の場でのバリデーションを必要とする、標準化された試験キットの開発が要求される。
【０１０９】
本発明は、デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、推測することが、対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに基づく、コンピュータにより実施される方法に関する。本発明は、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置であって、装置は、方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサを含む装置、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体であって、非一時的記憶媒体は、方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する非一時的記憶媒体、及び対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムが、デジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、方法を実施させるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムにさらに関する。
【０１１０】
方法は、例えば、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の（異常な）活性の診断、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく予後診断、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく臨床試験における対象の登録、実施される後続の試験の選択、コンパニオン診断試験の選択、臨床決定支援システムなどにおいて使用される。この点で、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）、及びこれらの適用について、より詳細に記載する、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁が参照される。
【０１１１】
［実施例４］
マウス組織についてのさらなる結果
シグナル伝達経路は、異なる種にわたり保存されていることが多く、同様な機能、及び同様な直接的標的遺伝子を有する。しかし、異なる種の間で、直接的標的遺伝子は、完全に同じではなく、遺伝子のＤＮＡ／ｍＲＮＡ配列も、一般に異なる。種間の遺伝子配列類似性（相同性）は、これらの種の間の、進化距離に依存し、例えば、マウスとヒトとの差違は、ヒトとトカゲとの差違より小さい。
【０１１２】
これらの種間の類似性のために、（臓器／組織）の発生、細胞分裂、及び疾患などの生物学的過程について研究するために、動物モデルを使用することが多い。マウスは、そのヒトとの遺伝学的近接性のために、一般的なモデル生物である。例は、てんかん及びアルツハイマー病などの神経障害について研究するための、マウスモデルの使用である。このような障害については、ヒト組織を得ることが侵襲的であり（どのみち腫瘍の生検を採取することが多い、がんとは対照的に）、障害を模倣するマウスモデルが開発されている。
【０１１３】
マウスモデルにおいて、シグナル伝達経路活性について評価することが可能であることは、それが、抽出された組織内の細胞の機能状態について、何ごとかを語りかけるので、極めて有用である。疾患マウスモデルの場合、これらのマウスモデルは通例、ヒト疾患を、可能な最良の形で反映するように作出されるので、シグナル伝達経路活性は、疾患のヒト変化形についての情報をもたらしうる。
【０１１４】
Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路モデルは、元来、ヒト組織のために開発された、すなわち、表１〜３において選択された標的遺伝子は、ヒトにおける直接的標的遺伝子であり、モデルのための入力は、ヒトｍＲＮＡ（例えば、マイクロアレイ実験、ｑＰＣＲ実験、又はＲＮＡｓｅｑ実験）の発現レベルであり、較正は、ヒト試料に由来する発現データ上で行われる。
【０１１５】
本明細書ではまた、マウスにおける使用のための、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路モデルも示される。マウスにおける直接的Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子を選択し、適切な較正試料（公開データベースに由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータ）を使用することにより、マウスｍＲＮＡ発現レベルを入力として使用し、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性をこの入力から推測するモデルを創出した。次いで、独立試料（公開データベースに由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータ）を使用して、このモデルが、マウスにおけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を正確に測定することを示すため、このモデルをバリデーションした。
【０１１６】
マウスＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路モデルのための直接的標的遺伝子の選択は、既に記載したのと同様な形で行った。ヒトＮｏｔｃｈモデルのために使用した、２６の遺伝子リストを、出発点として使用した。このリストを、証拠スコア（これは、既に記載した通りに計算した）によりランク付けし、「“ｍｏｕｓｅ”ＡＮＤ“ｄｉｒｅｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ”」などの検索キーワード、及びヒト直接的標的遺伝子について、既に見出された文献に由来する基準を使用して、ランク付けが首位の遺伝子について、文献検索を実施した。
【０１１７】
まず、遺伝子が、マウスにおいて、実際に存在することを確認し、次いで、遺伝子がまた、マウスにおける、直接的Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子でもあることを確認した。これは、ヒト標的遺伝子について使用されたのと同様な証拠（すなわち、転写因子複合体結合部位の存在、ＣｈＩＰ、ルシフェラーゼアッセイ、示差的発現、ＧＳＩ処理など、実験の証拠）を使用して行った。証拠の複数の典拠が見出された場合は、遺伝子を、マウスＮｏｔｃｈについての直接的標的遺伝子として受け入れた。このようにして、表６において示される通り、Ｎｏｔｃｈマウスモデルについて、１０の直接的標的遺伝子の選択を行った。
【０１１８】
表6: Notch標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリストに基づく、Notch標的遺伝子の「10の標的遺伝子についてのマウスリスト」(Affymetrixマウスゲノム430 2.0アレイに由来する)
【表８】
2020536530.tif 000012
【０１１９】
Ｎｏｔｃｈマウスモデルを、ＧＥＯ（遺伝子発現オムニバス）データベースに由来する公開データセットである、データセットＧＳＥ１５２６８に由来する試料上で較正した。このデータセットは、ＮｏｔｃｈＩＣ（Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン）誘導型構築物（ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の添加により誘導される）を伴うマウス胚性幹細胞に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータを含有する。このデータセットから、ＮｏｔｃｈＩＣを誘導しなかった４例の試料を、Ｎｏｔｃｈ不活性試料（ＧＳＭ３８１３１２、ＧＳＭ３８１３１３、ＧＳＭ３８１３１７、ＧＳＭ３８１３１６）として使用し、ＯＨＴを添加することにより、Ｎｏｔｃｈを誘導した４例の試料を、Ｎｏｔｃｈ活性試料（ＧＳＭ３８１３２４、ＧＳＭ３８１３２５、ＧＳＭ３８１３２０、ＧＳＭ３８１３２１）として使用した。
【０１２０】
次いで、較正されたＮｏｔｃｈマウスモデルを、いくつかのデータセット：較正セット上、及びいくつかの独立バリデーションセット上で実行して、モデルが、Ｎｏｔｃｈ活性試料を、Ｎｏｔｃｈ不活性試料から、完全に区別するのに成功しうることを示した。これらの結果を、図２４〜図２７に示す。
【０１２１】
図２４は、２例の対照胚性幹細胞（図中のＣ  ＥＳｃ）、２例の対照中胚葉前駆細胞（図中のＣ  ＭＰｃ）、ＯＨＴ処理されていないタモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する２例のＥＳｃ試料（図中の「ＮＥＲＴ  ＥＳｃ、ＯＨＴなし」）、ＯＨＴ処理されたタモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する２例のＥＳｃ試料（図中の「ＮＥＲＴ  ＥＳｃ、ＯＨＴ」）、ＯＨＴ処理されていないタモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する４例のＭＰｃ試料（図中の「ＮＥＲＴ  ＭＰｃ、ＯＨＴなし」）、及びＯＨＴ処理されたタモキシフェン誘導型ＮＥＲＴ構築物（ＮｏｔｃｈＩＣ）を含有する４例のＭＰｃ試料（図中の「ＮＥＲＴ  ＭＰｃ、ＯＨＴ」）を含有する、公開されている発現データセットであるＧＳＥ１５２６８を使用する表６による１０の標的遺伝子についてのマウスリスト、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンモデルの較正結果を示す。モデルは、不活性の較正試料（対照ＥＳ及び対照ＭＰｃ）を、活性の較正試料（ＮＥＲＴ  ＭＰｃ、ＯＨＴ）から、明確に分離することが可能であった。データセット内の他の試料もまた、正確に分離された（また、Ｍｅｉｅｒ−Ｓｔｉｅｇｅｎ  Ｆ．ら、「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｎｏｔｃｈ１  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｎｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ｉｎｃｌｕｄｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５巻、７号、２０１０年７月も参照されたい）。
【０１２２】
図２５は、構成的に活性の誘導型Ｎｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ１）を伴うマウス乳腺（データセット：ＧＳＥ５１６２８）についての、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。ＮＩＣＤ１が誘導されない乳腺試料（図中の「Ｍｇ」）について、Ｎｏｔｃｈマウスモデル（１０の標的遺伝子）は、低度のＮｏｔｃｈ活性を検出する。予期される通り、ドキシサイクリンを使用して、ＮＩＣＤ１が誘導される乳腺試料（図中の「Ｍｇ、ＮＩＣＤ１  ａ」）は、大幅に高度のＮｏｔｃｈ活性を正確に示す。この図では、４８時間後及び９６時間後の時点が組み合わされている（また、Ａｂｒａｖａｎｅｌ  Ｄ．Ｌ．ら、「Ｎｏｔｃｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｏｒｍａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、  １２５巻、６号、２０１５年６月、２４８４〜２４９６頁も参照されたい）。
【０１２３】
図２６は、Ｎｏｔｃｈ１を活性化させる、条件付きトランスジェニック系を伴うマウス卵黄嚢組織、及びＲＢＰＪ（Ｎｏｔｃｈ転写因子複合体の一部）機能喪失を伴うトランスジェニックマウスに由来するマウス卵黄嚢組織（データセット：ＧＳＥ２２４１８）についての、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。野生型試料（図中の「Ｗｔ」）及びＲＢＰＪ機能喪失試料（図中の「ＲＢＰＪ  ｌ−ｏ−ｆ」）のいずれも、低度のＮｏｔｃｈ活性を示し、Ｎｏｔｃｈ１が活性化させられる、卵黄嚢組織に由来する試料（図中の「Ｎｏｔｃｈ１  ａ」）は、予期される通り、Ｎｏｔｃｈ活性の上昇を示す（また、Ｃｏｐｅｌａｎｄ  Ｊ．Ｎ．ら、「Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｙｏｌｋ  ｓａｃ」、ＢＭＣ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年２月も参照されたい）。
【０１２４】
図２７は、Ｎｏｔｃｈ２受容体の、条件付き機能獲得対立遺伝子を伴うマウス骨髄細胞（成体骨髄赤血球前駆細胞）（データセット：ＧＳＥ４６７２４）についての、表６による、１０の標的遺伝子についてのマウスリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルによる、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。マウスＮｏｔｃｈモデル（１０の標的遺伝子）は、ＩＣＮ２陽性（細胞内Ｎｏｔｃｈ２）試料（図中の「ＩＣＮ２  ｐ」）について、ＩＣＮ２陰性試料（図中の「ＩＣＮ２  ｎ」）と比較して、高度のＮｏｔｃｈ活性を正確に計算する（また、Ｏｈ  Ｐ．ら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｎｏｔｃｈ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ」、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１３巻、１号、２０１３年８月、１９０〜２０４頁も参照されたい）。
【０１２５】
［実施例５］
本発明を例示するためのさらなる情報
（１）遺伝子発現のレベルの測定
本明細書で記載される方法を使用して、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するのに、本明細書で記載される標的遺伝子の固有のセットから導出されるデータを、さらに活用する。
【０１２６】
抽出された試料中の遺伝子発現レベルを解析するための方法は、一般に知られている。例えば、方法など、ノーザンブロット法、ＰＣＲ、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、又はマイクロアレイの使用は、いずれも、遺伝子発現レベルのデータを導出するのに使用することができる。本明細書では、標的遺伝子の遺伝子発現を解析するための、当技術分野で知られている全ての方法が想定される。
【０１２７】
ＰＣＲベースの方法を使用して、遺伝子の発現産物を決定する方法は、特に、有用である。ＰＣＲを使用して、遺伝子発現のレベルを定量するためには、各増幅サイクルの後における、リアルタイムのＰＣＲ産物の蓄積を測定するのに、従来の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、関心のある各ＰＣＲ産物の量を推定することが典型的である。これは、典型的に、挿入色素、副溝結合色素、又は光の適用が、蛍光を発するように、レポーターを励起する、蛍光発生プローブなど、検出可能なレポーターを活用し、結果として得られる蛍光は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７１３，２９７号において開示されているＣＣＤカメラ又は光電子増倍検出システムなどの、ＣＣＤカメラ又は光電子増倍検出システムを使用して検出されることが典型的である。
【０１２８】
一部の実施形態では、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイにおいて、ＰＣＲ産物の検出に使用されるプローブは、蛍光マーカーを含みうる。多数の蛍光マーカーが市販されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）は、多種多様な蛍光色素を販売している。非限定例は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、及びＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）を含む。さらなる蛍光マーカーは、ｑＰＣＲアッセイにおける、従来の５’加水分解型プローブを伴う、ＩＤＴ  ＺＥＮ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｑｕｅｎｃｈｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓを含みうる。これらのプローブは、例えば、３’  ＴＡＭＲＡ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、３’  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はインターナル型のＺＥＮ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ及び３’  Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＩＢＦＱ）を伴う５’ＦＡＭ色素を含有しうる。
【０１２９】
当技術分野でよく知られている方法を使用して、本発明に従う、有用な蛍光色素を、オリゴヌクレオチドプライマーへと接合させることができる。例えば、蛍光標識を、オリゴヌクレオチドへと付加するための、一般的な方式は、色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを、標的上の反応性アミノ基と反応させることである。ヌクレオチドは、例えば、ヌクレオ塩基上の、アリルアミン基の組入れにより、反応性アミノ基を保有するように修飾することができる。アリルアミンを介する標識付けについては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７６，９２８号及び同第５，９５８，６９１号において記載されている。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドを、蛍光標識付けする他の手段は、当業者によく知られている。
【０１３０】
他の蛍光発生手法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４３６，１３４号及び同第５，６５８，７５１号において開示される通り、任意の遺伝子発現産物から増幅されたＤＮＡと共に挿入されると、蛍光を発する、ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ色素など、一般的な検出システムの使用を含む。
【０１３１】
標的遺伝子発現レベルを決定するための、別の有用な方法は、異なる整理学的条件の間の、遺伝子発現レベルの差違、又は発生時に、若しくは疾患進行の経過にわたり生じる変化を含む、トランスクリプトーム解析のために使用される、強力な解析ツールである、ＲＮＡ−ｓｅｑを含む。
【０１３２】
遺伝子発現レベルを決定するための、別の手法は、マイクロアレイ、例えば、当技術分野でよく知られている、ＲＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマイクロアレイの使用を含む。マイクロアレイを使用して、多数の遺伝子の発現を、同時に定量することができる。
【０１３３】
（２）Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達の活性を決定するための、一般的ワークフロー
Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達の活性を、対象から単離された試料から推測するための工程を例示的に図解するフローチャートを、図３に示す。第１に、試料からｍＲＮＡを単離する（１１）。第２に、当技術分野で知られている、遺伝子発現を測定するための方法を使用して、本明細書で記載される、少なくとも３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の固有のセットのｍＲＮＡ発現レベルを測定する（１２）。次に、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルを、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデル（１４）を使用して、Ｎｏｔｃｈ転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベル（１３）を決定する。最後に、対象の試料中の、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの、決定された活性レベルに基づき、対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する（１５）。例えば、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路を、活性が、ある特定の閾値を上回れば、活性であると決定し、活性が、ある特定の閾値を下回れば、不活性であると類別することができる。
【０１３４】
（３）較正された数学的経路モデル
本明細書で想定される通り、本明細書で記載される、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の固有のセットの発現レベルは、本明細書でさらに記載される、較正された数学的経路モデルを使用して、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルを決定するのに使用される。較正された数学的経路モデルは、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルを、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントの活性レベルへと関連付ける。
【０１３５】
本明細書で想定される通り、較正された数学的経路モデルは、数学的経路モデルの適用に基づく。例えば、較正された数学的経路モデルは、確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデル、又は線形モデル若しくは疑似線形モデルに基づきうる。
【０１３６】
ある実施形態では、較正された数学的経路モデルは、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントと、３つ以上のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける、条件付き確率関係を組み込む確率モデルである。ある実施形態では、確率モデルは、ベイジアンネットワークモデルである。
【０１３７】
代替的実施形態では、較正された数学的経路モデルは、線形モデルの場合もあり、疑似線形モデルの場合もある。ある実施形態では、線形モデル又は疑似線形モデルは、本明細書でさらに記載される、線形結合モデル又は疑似線形結合モデルである。
【０１３８】
較正された数学的経路モデルを作出するための工程を、図４を例示的に図解するためのフローチャートに示す。最初のステップとして、ｍＲＮＡ発現レベルのトレーニングデータを、収集し、正規化する。データは、例えば、当技術分野で知られている、マイクロアレイプローブセットの強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲのＣｑ値（１０２）、ＲＮＡｓｅｑの生リード（１０３）、又は代替的測定モダリティー（１０４）を使用して収集することができる。次いで、発現レベルの生データを、各方法に応じて、それぞれ、正規化アルゴリズム、例えば、フローズンロバストマルチアレイ解析（ｆＲＭＡ）又はＭＡＳ５．０を使用する正規化（１１１）、基準遺伝子の平均Ｃｑに照らした正規化（１１２）、リードの、マッピングされたリード１００万当たりの転写物１キロベース当たりのリード／フラグメント量（ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ）への正規化（１１３）、又は基準遺伝子／タンパク質に照らした正規化（１１４）を使用する正規化により正規化することができる。この正規化手順は、各方法に応じて、それぞれ、正規化されたプローブセットの強度（１２１）、正規化されたＣｑ値（１２２）、正規化されたＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化された測定値（１２４）をもたらし、これらは、トレーニング試料中の標的遺伝子発現レベルを指し示す。
【０１３９】
トレーニングデータを正規化すると、１つ又は複数のトレーニング試料ＩＤ（１３１）を得、これらの特異的試料のトレーニングデータを、遺伝子発現を決定するための方法のうちの１つから得る（１３２）。トレーニング試料からの、最終的な遺伝子発現結果を、トレーニングデータ（１３３）として出力する。多様なトレーニング試料に由来するデータ（例えば、閾値、例えば、確率的ネットワーク又はベイジアンネットワークの場合のＣＰＴ、例えば、線形モデル又は疑似線形モデルの場合の重みなどを含む）の全てを組み込んで、モデルを較正する（１４４）。加えて、経路の標的遺伝子及び測定ノード（１４１）を使用して、例えば、図２に記載されるモデル構造を作出する（１４２）。次いで、結果として得られる、経路のモデル構造（１４３）を、トレーニングデータ（１３３）と共に組み込んで、モデルを較正するが（１４４）、ここで、標的遺伝子の遺伝子発現レベルは、転写因子エレメントの活性を示す。トレーニング試料中の、ＴＦエレメントの決定の結果として、較正された経路モデル（１４５）を作出し、これにより、トレーニング試料中の標的遺伝子発現レベルに基づき、その後検討される関心のある試料、例えば、がんを伴う対象に由来する試料のＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性に割り当てる。
【０１４０】
（４）ＴＦエレメントの決定
ＴＦエレメントの活性レベルを決定するための工程を例示的に図解するフローチャートを、図５に示す。対象から抽出された試料に由来する発現レベルのデータ（被験データ）（１６３）を、較正された数学的経路モデル（１４５）へと入力する。数学的経路モデルは、確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデル、線形モデル、又は疑似線形モデルである。
【０１４１】
数学的経路モデルは、Ｎｏｔｃｈ  ＴＦエレメントと、対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ若しくはこれを超える標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は対象の試料中で測定される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の３つ若しくはこれを超える標的遺伝子の発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づく。特に、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性の決定は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において開示される通りに実施される。略述すると、データを、ベイジアンネットワーク（ＢＮ）推測エンジン判定（例えば、ＢＮＴツールボックス）へと入力する（１５４）。これは、ＢＮ内の全てのノードの、計算された周辺ＢＮ確率についての値のセット（１５５）をもたらす。これらの確率から、転写因子（ＴＦ）ノードの確率を決定し（１５６）、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を確立する。
【０１４２】
代替的に、数学的モデルは、線形モデルである。例えば、線形モデルは、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において記載される通りに使用されうる。標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用して、細胞シグナル伝達経路活性を計算／決定することに関する、さらなる詳細はまた、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁においても見出されうる。略述すると、データを、計算された重み付け線形結合スコア（ｗ／ｃ）へと入力する（１５１）。これは、計算された重み付け線形結合スコアのための値のセット（１５２）をもたらす。これらの重み付け線形結合スコアから、転写因子（ＴＦ）ノードの重み付け線形結合スコアを決定し（１５３）、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を確立する。
【０１４３】
（５）離散可観測量のための手順
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を、離散可観測量として推測するための工程を、図６を例示的に図解するためのフローチャートに示す。まず、被験試料を抽出し、被験試料ＩＤ（１６１）を与える。次に、ｍＲＮＡの発現レベルについての被験データを収集し、正規化する（１６２）。被験データは、図５で、トレーニング試料について論じたのと同じ方法を使用して、マイクロアレイプローブセットの強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲのＣｑ値（１０２）、ＲＮＡｓｅｑの生リード（１０３）、又は代替的測定モダリティー（１０４）を使用して収集することができる。次いで、発現レベルの生データを、各方法に応じて、それぞれ、アルゴリズム、例えば、ｆＲＭＡ又はＭＡＳ５．０を使用する正規化（１１１）、基準遺伝子の平均Ｃｑに照らした正規化（１１２）、リードの、ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭへの正規化（１１３）、及び基準遺伝子／タンパク質に照らした正規化（１１４）を使用する正規化により正規化することができる。この正規化手順は、各方法に応じて、それぞれ、正規化されたプローブセットの強度（１２１）、正規化されたＣｑ値（１２２）、正規化されたＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化された測定値（１２４）をもたらす。
【０１４４】
被験データを正規化すると、結果として得られる被験データ（１６３）を、較正された数学的経路モデル（１４５）に基づく閾値化ステップ（１６４）において解析する結果として、閾値化された被験データ（１６５）をもたらす。１つの非限定的な例では、離散可観測量を使用すると、ある特定の閾値を上回るあらゆる発現には、例えば、１の値を与え、閾値を下回る値には、０の値を与えるか、又は、代替的実施形態では、本明細書で記載される閾値を上回る確率質量を、閾値化された値として使用する。較正された数学的経路モデルに基づくと、この値は、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を表し、次いで、これを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性を計算する（１７１）。最終的な出力は、対象における、細胞シグナル伝達経路の活性（１７２）をもたらす。
【０１４５】
（６）連続可観測量のための手順
対象におけるＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性を、連続可観測量として推測するための工程を、図７を例示的に図解するためのフローチャートに示す。まず、被験試料を抽出し、被験試料ＩＤ（１６１）を与える。次に、ｍＲＮＡの発現レベルについての被験データを収集し、正規化する（１６２）。被験データは、図５で、トレーニング試料について論じたのと同じ方法を使用して、マイクロアレイプローブセットの強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲのＣｑ値（１０２）、ＲＮＡｓｅｑの生リード（１０３）、又は代替的測定モダリティー（１０４）を使用して収集することができる。次いで、発現レベルの生データを、各方法に応じて、それぞれ、アルゴリズム、例えば、ｆＲＭＡ（１１１）、基準遺伝子の平均Ｃｑに照らした正規化（１１２）、リードの、ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭへの正規化（１１３）、又は基準遺伝子／タンパク質に照らした正規化（１１４）を使用する正規化により正規化することができる。この正規化手順は、各方法に応じて、それぞれ、正規化されたプローブセットの強度（１２１）、正規化されたＣｑ値（１２２）、正規化されたＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化された測定値（１２４）をもたらす。
【０１４６】
被験データを正規化すると、結果として得られる被験データ（１６３）を、較正された数学的経路モデル（１４５）により解析する。１つの非限定的な例として、連続可観測量を使用すると、本明細書で、さらに詳細に記載される通り、シグモイド関数を使用して、発現レベルを、０〜１の間の値へと転換する。本明細書で記載されるＴＦエレメントの決定を使用して、被験データを、較正された数学的経路モデルと組み合わせて解釈すると、結果として得られる値は、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を表し、次いで、これを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性（１７１）を計算する。最終的な出力は、対象における、細胞シグナル伝達経路の活性（１７２）をもたらす。
【０１４７】
（７）標的遺伝子発現レベルの決定手順
標的遺伝子発現レベルを、対象から抽出された試料から導出するための工程を、例示的に図解するフローチャートを、図８に示す。例示的な実施形態では、試料を、検査室で受領し、登録する。試料は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料（１８１）又は新鮮凍結（ＦＦ）試料（１８０）を含みうる。ＦＦ試料は、直接溶解させることができる（１８３）。ＦＦＰＥ試料については、プロテイナーゼＫ添加時における、加熱インキュベーションステップにより、パラフィンを除去することができる（１８２）。次いで、細胞を溶解させ（１８３）、これにより、細胞膜及び核膜を破壊し、これにより、核酸（ＮＡ）を、さらなる加工のために利用可能とする。核酸を、例えば、ビーズ又はフィルターでありうる固相へと結合させる（１８４）。次いで、核酸を、洗浄緩衝液で洗浄して、溶解の後で存在する、全ての細胞破砕物を除去する（１８５）。次いで、清浄な核酸を、溶離緩衝液により、固相から引き離す（１８６）。ＤＮＡを、ＤＮアーゼ処理により除去して、ＲＮＡだけが、試料中に存在することを確保する（１８７）。次いで、核酸試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲ試料ミックス中で、直接使用することができる（１８８）。ＲＴ−ｑＰＣＲ試料ミックスは、ＲＮＡ試料、ｃＤＮＡを、ＲＮＡ試料から調製するＲＴ酵素、及びｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ酵素、酵素の機能を確認する緩衝液を含有し、潜在的に、一定の濃縮物容量を設定するための分子グレードの水を含有しうる。次いで、試料ミックスを、乾燥ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを含有する、マルチウェルプレート（すなわち、９６ウェル又は３８４ウェルプレート）へと添加することができる（１８９）。次いで、指定されたプロトコールに従い、ＰＣＲマシン内で、ＲＴ−ｑＰＣＲを作動させることができる（１９０）。例 ＰＣＲプロトコールは、ｉ）５０℃で、３０分間；ｉｉ）９５℃で、５分間；ｉｉｉ）９５℃で、１５秒間；ｉｖ）６０℃で、４５秒間；ｖ）ステップｉｉｉ及びｉｖを反復する５０サイクルを含む。次いで、生データに対して、二次導関数法を使用することにより、Ｃｑ値を決定する（１９１）。解析のために、Ｃｑ値をエクスポートする（１９２）。
【０１４８】
（８）Ｎｏｔｃｈに媒介される疾患及び障害、並びに処置の方法
本明細書で想定される通り、本発明の方法及び装置を活用して、対象、例えば、疾患若しくは障害を有することが疑われるか、又はこれを有する対象における、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性について評価することができ、ここで、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の状態は、疾患の存在又は進行の、全体的又は部分的な証拠となる。ある実施形態では、本明細書では、対象を処置する方法であって、処置する方法は、本明細書で記載される方法を使用して、対象から抽出された試料から導出される、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性状態に関する情報を受信するステップと、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路の活性に関する情報が、活性のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を示す場合、対象へと、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を投与するステップとを含む、処置する方法が提示される。特定の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路活性の指数は、Ｎｏｔｃｈ細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズについての、１０：１、５：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：５、１：１０のカットオフ値に設定される。
【０１４９】
本発明で使用されるＮｏｔｃｈ阻害剤は、よく知られている。Ｎｏｔｃｈ阻害剤の例は、ＤＡＰＴ、ＰＦ−０３０８４０１４、ＭＫ−０７５２、ＲＯ−４９２９０９７、ＬＹ４５０１３９、ＢＭＳ−７０８１６３、ＬＹ３０３９４７８、ＩＭＲ−１、ジベンザゼピン、ＬＹ４１１５７５、ＦＬＩ−０６を含むがこれらに限定されない。
【０１５０】
Ｎｏｔｃｈ経路は、多数の疾患において、役割を果たし、とりわけ、異なる種類の新生物、例えば、癌腫、肉腫、及び血液悪性腫瘍、免疫媒介性疾患、変性疾患、炎症性疾患、感染性疾患において、役割を果たす。これらの疾患は、胚系統由来の臓器又は組織に従い類別することができ、これらの臓器又は組織、例えば、脳、乳腺、皮膚、食道、消化管、血液（血液学的）、卵巣などにおいて、主に生じる。
【０１５１】
特定の実施形態では、対象は、乳がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、脳がん、血液学的がん、卵巣がんを患っているか、又はこれらを患っていることが疑われる。特定の実施形態では、対象は、乳がんを患っているか、又はこれを患っていることが疑われる。
【０１５２】
別の特定の実施形態では、対象は、脳がん、又はより好ましくは、神経芽細胞腫性がんを患っているか、又はこれを患っていることが疑われる。別の特定の実施形態では、対象は、血液がん、又はより好ましくは、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病を患っているか、又はこれを患っていることが疑われる。
【０１５３】
本出願は、いくつかの好ましい実施形態について記載する。前出の詳細な記載を読み、理解すれば、他の研究者らは、改変及び変更に想到する。本出願は、それらが、付属の特許請求の範囲又はそれらの同等物の範囲内に収まる限りにおいて、全てのこのような改変及び変更を含むものとみなされる。
【０１５４】
開示される実施形態に対する、他の変動も、図面、本開示、及び付属の特許請求の範囲の検討から、当業者により理解され、特許請求された本発明の実施においてなされうる。
【０１５５】
特許請求の範囲では、「〜を含むこと」という語は、他の要素又はステップを除外せず、単数形は、複数形を除外しない。
【０１５６】
単一のユニット又はデバイスは、特許請求の範囲において列挙された、いくつかの項目の機能を果たす。ある特定の手段が、互いに異なる従属請求項内に列挙されるという事実だけで、これらの手段の組合せを使用しても有利でありえないことが指し示されるわけではない。
【０１５７】
１つ又はいくつかのユニット又はデバイスにより実施される、危険性スコアの決定などの計算は、他の任意の数のユニット又はデバイスにより実施することができる。
【０１５８】
コンピュータプログラムは、光学記憶媒体又は半導体媒体など、適切な媒体上に保存／分配され、他のハードウェアと併せて、又はこの一部として供給されるが、また、インターネット又は他の有線若しくは無線の通信システムなど、他の形態でも供給される。
【０１５９】
［実施例６］
本出願において使用される配列表
配列表：
配列番号        遺伝子：
配列番号１      ＣＤ２８
配列番号２      ＣＤ４４
配列番号３      ＤＬＧＡＰ５
配列番号４      ＤＴＸ１
配列番号５      ＥＰＨＢ３
配列番号６      ＦＡＢＰ７
配列番号７      ＧＦＡＰ
配列番号８      ＧＩＭＡＰ５
配列番号９      ＨＥＳ１
配列番号１０    ＨＥＳ４
配列番号１１    ＨＥＳ５
配列番号１２    ＨＥＳ７
配列番号１３    ＨＥＹ１
配列番号１４    ＨＥＹ２
配列番号１５    ＨＥＹＬ
配列番号１６    ＫＬＦ５
配列番号１７    ＭＹＣ
配列番号１８    ＮＦＫＢ２
配列番号１９    ＮＯＸ１
配列番号２０    ＮＲＡＲＰ
配列番号２１    ＰＢＸ１
配列番号２２    ＰＩＮ１
配列番号２３    ＰＬＸＮＤ１
配列番号２４    ＰＴＣＲＡ
配列番号２５    ＳＯＸ９
配列番号２６    ＴＮＣ
【図１】
2020536530.tif 000013
【図２】
2020536530.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020536530.tif 000019
【図８】
2020536530.tif 000020
【図９】
2020536530.tif 000021
【図１０】
2020536530.tif 000022
【図１１】
2020536530.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
2020536530.tif 000025
【図１４】
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【図１５】
2020536530.tif 000027
【図１６】
2020536530.tif 000028
【図１７】
2020536530.tif 000029
【図１８】
2020536530.tif 000030
【図１９】
2020536530.tif 000031
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020536530.tif 000034
【図２３】
2020536530.tif 000035
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2020536530.tif 000041
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