(57)【要約】  短い核酸を増幅するために多重ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法及び組成物が本明細書に提供される。
2020534817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）５’〜３’を含む第１のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第１標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）第１アーム配列；
ｉｉｉ）第１ステム配列；
ｉｖ）ループ配列；
ｖ）前記第１ステム配列に相補的な第２ステム配列；
ｖｉ）第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）第１標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｂ）５’〜３’を含む第２のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第２標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）前記第１アーム配列；
ｉｉｉ）前記第１ステム配列；
ｉｖ）前記ループ配列；
ｖ）前記第１ステム配列に相補的な前記第２ステム配列；
ｖｉ）前記第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）前記第２標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｃ）前記第１標的核酸の前記逆転写産物に相補的な第１標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、
ｄ）前記第２標的核酸の逆転写産物に相補的な第２標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、
ｅ）前記第１アーム配列、第１ステム配列及び／又はループ配列に相補的なユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーを含み、
ｆ）５’〜３を含む第１検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）前記第２ステム配列及び／又は前記第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）前記第１標的核酸の３’端に相補的な前記配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）前記第１標的核酸の逆転写産物に相補的な配列；並びに
ｇ）５’〜３を含む第２検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）前記第２ステム配列及び／又は前記第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）前記第２標的核酸の３’端に相補的な前記配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）前記第２標的核酸の逆転写産物に相補的な配列を含む、反応混合物。
【請求項２】
ｈ）５’〜３’を含む第３のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第３標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）前記第１アーム配列；
ｉｉｉ）前記第１ステム配列；
ｉｖ）前記ループ配列；
ｖ）前記第１ステム配列に相補的な前記第２ステム配列；
ｖｉ）前記第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）前記第３標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｉ）前記第３標的核酸の前記逆転写産物に相補的な第３標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、並びに
ｊ）５’〜３を含む第３検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）前記第２ステム配列及び／又は前記第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）前記第３標的核酸の３’端に相補的な前記配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）前記第３標的核酸の前記逆転写産物に相補的な配列をさらに含む、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
ｋ）５’〜３’を含む第４のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第４標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）前記第１アーム配列；
ｉｉｉ）前記第１ステム配列；
ｉｖ）前記ループ配列；
ｖ）前記第１ステム配列に相補的な前記第２ステム配列；
ｖｉ）前記第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）前記第４標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｌ）前記第４標的核酸の前記逆転写産物に相補的な第４標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、並びに
ｍ）５’〜３を含む第４検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）前記第２ステム配列及び／又は前記第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）前記第４標的核酸の３’端に相補的な前記配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）前記第４標的核酸の前記逆転写産物に相補的な配列をさらに含む、請求項２に記載の反応混合物。
【請求項４】
それぞれの前記標的核酸の５’端に相補的な前記配列が、独立して、４〜１０ヌクレオチド長である、請求項１〜３の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項５】
それぞれの前記標的核酸の５’端に相補的な前記配列が、独立して、５〜８ヌクレオチド長である、請求項１〜４の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項６】
それぞれの前記標的核酸の３’端に相補的な前記配列が、独立して、４〜１０ヌクレオチド長である、請求項１〜５の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項７】
それぞれの前記標的核酸の３’端に相補的な前記配列が、独立して、５〜８ヌクレオチド長である、請求項１〜６の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項８】
前記検出可能に標識されるプローブがフルオロフォア及びクエンチャーを含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項９】
前記検出可能に標識されるプローブが異なるラベルで標識される、請求項１〜８の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項１０】
前記検出可能に標識されるプローブの少なくとも１つが少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項１１】
逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項１２】
少なくとも１つの標的核酸をさらに含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの標的核酸が、１５〜５０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ分子が、１６〜３０ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
ａ）少なくとも１つの標的核酸を含む試料を請求項１〜１４に記載の反応混合物と接触し、
ｂ）工程ａ）の前記混合物との逆転写反応を実施して、逆転写産物を形成し、
ｃ）工程ｂ）の前記逆転写産物とのＰＣＲ反応を実施して、少なくとも１つの標的核酸の増幅産物を形成し、
ｄ）前記増幅産物を検出し、それによって１５〜５０ヌクレオチド長の少なくとも１つのＲＮＡ分子を特異的に検出することを含む、１５〜５０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子の特異的多重検出の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
非侵襲性試料の回収（例えば、血液、結晶、唾液、尿）は、容易な及び低コストの試料の回収によってより一般的になり、増加している。液体細胞診の核酸バイオマーカーは短いことが多く、例えば、２５０ヌクレオチド長未満である。液体細胞診の疾患に関連するバイオマーカーの例は、ｍｉＲＮＡ分子であり、そのいくつかは様々な疾患状態の異常なレベルで見つけられる。ｍｉＲＮＡ分子は、通常、１６〜３０ヌクレオチド長である。
【０００２】
バイオマーカー核酸は、通常、液体細胞診において極めて希少であり、そのため、バイオマーカー核酸の増幅は、検出の感度を増加するために有利である。しかしながら、短い核酸配列の特異的増幅は、課題がある。増幅プライマーは、１５〜２５ヌクレオチドの範囲にあることが多く、より短い相補的配列は、結果的に特異性を減少させる可能性がある。そのため、増幅及び検出技術は、通常、２つのプライマー及びプローブを必要とし、これらの要素のそれぞれが、液体細胞診の標的とされる核酸と大体、同じサイズであり得る。
【０００３】
短い核酸配列の増幅及び検出に対する１つのアプローチが国際公開第２０１６０２７１６２号に記載される。この文書は、ツーテール（two-tailed）逆転写（ＲＴ）プライマーを使用して、ｍｉＲＮＡ及びその他の短い核酸のＲＴ−ｑＰＣＲ検出を開示する。以前に開示されたツーテールプライマーは、ＲＴ及びＰＣＲウェルにつき１つのｍｉＲＮＡを検出するように設計され、標的特異的フォワード及びリバースＰＣＲプライマーを使用する。
【０００４】
多くの診断適用について、各試料について、１つ以上のバイオマーカー、並びに外部及び／又は内部コントロールのレベルをモニタリングすることが望ましい。本開示は、特異的多重増幅及び短い核酸の検出のための新規組成物及び方法を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
多重の短い核酸を検出するためのプライマー、キット、アッセイ及び方法が本明細書に開示される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、反応混合物が提供され、この反応混合物は、
ａ）５’〜３’を含む第１のツーテール(two tailed)プライマーを含み：
ｉ）第１標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）第１アーム配列；
ｉｉｉ）第１ステム配列；
ｉｖ）ループ配列；
ｖ）第１ステム配列に相補的な第２ステム配列；
ｖｉ）第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）第１標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｂ）５’〜３’を含む第２のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第２標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）第１アーム配列；
ｉｉｉ）第１ステム配列；
ｉｖ）ループ配列；
ｖ）第１ステム配列に相補的な第２ステム配列；
ｖｉ）第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）第２標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｃ）第１標的核酸の逆転写産物に相補的な第１標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、
ｄ）第２標的核酸の逆転写産物に相補的な第２標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、
ｅ）第１アーム配列、第１ステム配列及び／又はループ配列に相補的なユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーを含み、
ｆ）５’〜３を含む第１検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）第２ステム配列及び／又は第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）第１標的核酸の３’端に相補的な配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）第１標的核酸の逆転写産物に相補的な配列；並びに
ｇ）５’〜３を含む第２検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）第２ステム配列及び／又は第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）第２標的核酸の３’端に相補的な配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）第２標的核酸の逆転写産物に相補的な配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、さらに
ｈ）５’〜３’を含む第３のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第３標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）第１アーム配列；
ｉｉｉ）第１ステム配列；
ｉｖ）ループ配列；
ｖ）第１ステム配列に相補的な第２ステム配列；
ｖｉ）第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）第３標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｉ）第３標的核酸の逆転写産物に相補的な第３標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、並びに
ｊ）５’〜３を含む第３検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）第２ステム配列及び／又は第２アーム配列と相補的な配列；
ｉｉ）第３標的核酸の３’端に相補的な配列に相補的な配列；及び
ｉｉｉ）第３標的核酸の逆転写産物に相補的な配列を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、さらに
ｋ）５’〜３’を含む第４のツーテールプライマーを含み：
ｉ）第４標的核酸の５’端に相補的な配列；
ｉｉ）第１アーム配列；
ｉｉｉ）第１ステム配列；
ｉｖ）ループ配列；
ｖ）第１ステム配列に相補的な第２ステム配列；
ｖｉ）第２アーム配列；及び
ｖｉｉ）第４標的核酸の３’端に相補的な配列；
ｌ）第４標的核酸の逆転写産物に相補的な第４標的特異的リバースＰＣＲプライマーを含み、並びに
ｍ）５’〜３を含む第４検出可能に標識されたプローブを含み：
ｉ）第２ステム配列及び／又は第２アーム配列と相補的な配列；並びに
ｉｉ）第４標的核酸の３’端に相補的な配列に相補的な配列；並びに
ｉｉｉ）第４標的核酸の逆転写産物に相補的な配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、それぞれの標的核酸の５’端に相補的な配列は、独立して、４〜１０ヌクレオチド長である（例えば、それぞれが独立して４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド）。
【００１０】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたプローブは、フルオロフォアで標識される（例えば、各標的特異的プローブについて異なるフルオロフォア）。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたプローブは、フルオロフォア及びクエンチャーで標識される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能に標識されたプローブは、修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡヌクレオチドを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸は、１５〜５０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である（例えば、１６〜３０、又は１８〜２５ヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、標的核酸の全ては、１５〜５０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である（例えば、ｍｉＲＮＡ又はその他の断片化された細胞遊離ＲＮＡ）。
【００１２】
１５〜５０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子の特異的多重検出の方法がさらに提供され：
ａ）少なくとも１つの標的核酸を含む試料を本明細書に記載の反応混合物と接触し、
ｂ）工程ａ）の混合物との逆転写反応を実施して、逆転写産物を形成し、
ｃ）工程ｂ）の逆転写産物とのＰＣＲ反応を実施して、少なくとも１つの標的核酸の増幅産物を形成し、並びに
ｄ）増幅産物を検出し、それによって１５〜５０ヌクレオチド長の少なくとも１つのＲＮＡ分子を特異的に検出することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、それぞれ、逆転写及びリアルタイムＰＣＲ工程の模式図を示す。図１Ａは、短い核酸（ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズされるツーテールＲＴ−ＰＣＲプライマーを示す。多重反応において、全てのＲＴプライマーは、同じアーム−ステム−ループ配列を有するが、標的配列に特異的な５’及び３’端が異なる。したがって、ＲＴプライマーは、ＲＴ反応における複数の標的を区別する。図１Ｂは、ＲＴ反応（第１鎖ｃＤＮＡ）の産物との次のＰＣＲ反応並びにプライマー及びプローブの例示的な位置を示す。プローブは、３’端の標的特異的配列、並びに５’端のユニバーサルアーム及びステム配列を含む。リバースプライマーは、標的特異的であり（ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲリバースプライマー）であり、ＰＣＲフォワードプライマーはユニバーサルである。ユニバーサルＰＣＲフォワードプライマーの使用は、多重反応において、オリゴヌクレオチドの複雑性を減少させる。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、それぞれ、逆転写及びリアルタイムＰＣＲ工程の模式図を示す。図１Ａは、短い核酸（ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズされるツーテールＲＴ−ＰＣＲプライマーを示す。多重反応において、全てのＲＴプライマーは、同じアーム−ステム−ループ配列を有するが、標的配列に特異的な５’及び３’端が異なる。したがって、ＲＴプライマーは、ＲＴ反応における複数の標的を区別する。図１Ｂは、ＲＴ反応（第１鎖ｃＤＮＡ）の産物との次のＰＣＲ反応並びにプライマー及びプローブの例示的な位置を示す。プローブは、３’端の標的特異的配列、並びに５’端のユニバーサルアーム及びステム配列を含む。リバースプライマーは、標的特異的であり（ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲリバースプライマー）であり、ＰＣＲフォワードプライマーはユニバーサルである。ユニバーサルＰＣＲフォワードプライマーの使用は、多重反応において、オリゴヌクレオチドの複雑性を減少させる。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、ユニバーサルＰＣＲフォワードプライマーを、使用した増幅曲線を、特異的ＰＣＲフォワードプライマーを使用した増幅曲線と比較する。図２Ａ及び図２Ｂの両方について、ＲＴＮＴＣ＝ＲＮＡコントロールなし；４ＲＮＡ−ｍｉｘ＝４つの標的ＲＮＡ（ＰＣＲステップにおけるｃＤＮＡ／ＤＮＡ）の混合物；４ｐｌｅｘ−ｓｐｅｆｗｄ＝標的フォワードプライマーを使用したＰＣＲ；４ｐｌｅｘ−ｕｎｉｆｗｄ＝ユニバーサルフォワードプライマーを使用したＰＣＲである。図２Ａは、ユニバーサルフォワードプライマーとの反応のほうが、標的特異的フォワードプライマーとの反応より効率的な増幅を生じたことを示す。標的特異的フォワードプライマーを有するＲＮＡコントロールなしは、約３６のＣｔであるが、シグナルを示した。このバックグラウンド増幅シグナルは、アッセイの感受性及びダイナミックレンジに負に影響する。図２Ａは、したがって、ＰＣＲ工程におけるユニバーサルフォワードの使用が結果的に少ないバックグラウンドを示す。図２Ｂは、同様に、ユニバーサルフォワードプライマーとの反応がより効率的な増幅曲線を生じたことを再度、示す。図２Ｂでは、標的特異的フォワードプライマーを有するＲＮＡコントロールなしは、約３２のＣｔを有する重要なシグナルを示した。図２Ｂは、したがって、ユニバーサルフォワードプライマーが、少ないバックグラウンドで優れた性能を有することも示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び図２Ｂは、ユニバーサルＰＣＲフォワードプライマーを、使用した増幅曲線を、特異的ＰＣＲフォワードプライマーを使用した増幅曲線と比較する。図２Ａ及び図２Ｂの両方について、ＲＴＮＴＣ＝ＲＮＡコントロールなし；４ＲＮＡ−ｍｉｘ＝４つの標的ＲＮＡ（ＰＣＲステップにおけるｃＤＮＡ／ＤＮＡ）の混合物；４ｐｌｅｘ−ｓｐｅｆｗｄ＝標的フォワードプライマーを使用したＰＣＲ；４ｐｌｅｘ−ｕｎｉｆｗｄ＝ユニバーサルフォワードプライマーを使用したＰＣＲである。図２Ａは、ユニバーサルフォワードプライマーとの反応のほうが、標的特異的フォワードプライマーとの反応より効率的な増幅を生じたことを示す。標的特異的フォワードプライマーを有するＲＮＡコントロールなしは、約３６のＣｔであるが、シグナルを示した。このバックグラウンド増幅シグナルは、アッセイの感受性及びダイナミックレンジに負に影響する。図２Ａは、したがって、ＰＣＲ工程におけるユニバーサルフォワードの使用が結果的に少ないバックグラウンドを示す。図２Ｂは、同様に、ユニバーサルフォワードプライマーとの反応がより効率的な増幅曲線を生じたことを再度、示す。図２Ｂでは、標的特異的フォワードプライマーを有するＲＮＡコントロールなしは、約３２のＣｔを有する重要なシグナルを示した。図２Ｂは、したがって、ユニバーサルフォワードプライマーが、少ないバックグラウンドで優れた性能を有することも示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、プローブ修飾がシグナル及び特異性に与える効果を示す。図３Ａは、未修飾プローブを使用したＰＣＲについての増幅曲線を示す。ポジティブコントロールは、約３０のＣｔを有する強いシグナルを示すが、約３３のＣｔを有する重要なバックグラウンド（交差反応性ｃＤＮＡからのシグナル）がある。図３Ｂは、ＬＮＡ修飾プローブを使用した、ＰＣＲについての増幅曲線を示す。再び、ポジティブコントロールは、約３０のＣｔで良好に遂行するが、バックグラウンドシグナルは、大部分が除去される。図３Ｂは、したがって、プローブの修飾がバックグラウンドシグナルをかなり減少させることを示す。このことは、特に、この反応における標的配列がプローブにハイブリダイズする３’領域に類似する場合にあてはまる。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、プローブ修飾がシグナル及び特異性に与える効果を示す。図３Ａは、未修飾プローブを使用したＰＣＲについての増幅曲線を示す。ポジティブコントロールは、約３０のＣｔを有する強いシグナルを示すが、約３３のＣｔを有する重要なバックグラウンド（交差反応性ｃＤＮＡからのシグナル）がある。図３Ｂは、ＬＮＡ修飾プローブを使用した、ＰＣＲについての増幅曲線を示す。再び、ポジティブコントロールは、約３０のＣｔで良好に遂行するが、バックグラウンドシグナルは、大部分が除去される。図３Ｂは、したがって、プローブの修飾がバックグラウンドシグナルをかなり減少させることを示す。このことは、特に、この反応における標的配列がプローブにハイブリダイズする３’領域に類似する場合にあてはまる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｉ．はじめに
本開示は、特異的多重増幅及びｍｉＲＮＡ等の短い核酸の検出のための組成物（例えば、反応混合物）及び方法を提供する。短い核酸の特異的及び高感度検出を可能にする少なくとも３つの要素：（ｉ）ＲＴ反応に関与するオリゴヌクレオチドの複雑性を減少するための同アーム、ステム及びループ配列を有するツーテールＲＴプライマー（例えば、図１Ａを参照のこと）；（ｉｉ）ＰＣＲ反応に関与するオリゴヌクレオチドの複雑性を減少し、非特異的増幅を減少するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー（例えば、図１Ｂを参照のこと）；及び（ｉｉｉ）多重アッセイにおいてプローブの特異性を増強するために同様の標的配列を標的するプローブにおいて、修飾核酸の使用が提供される。
【００１５】
要素（ｉ）に関して、多重反応の特異性を増加させるアプローチは、多重反応において、各標的のツーテールプライマーにおいて、異なるアーム、ステム及び／又はループ配列を使用する。しかしながら、このアプローチは、反応の効率を減少し、多重標的特異性は、例えば、修飾ヌクレオチドを使用してプローブの設計に対応することができる。
【００１６】
ＩＩ．定義
本開示の文脈において、「細胞遊離核酸」、「細胞遊離ＲＮＡ」、「細胞遊離ＤＮＡ」という用語及び同様の用語は、細胞の大部分を除去するように処理された個体の非組織試料（例えば、液体細胞診）を指す。非組織試料の例として、血液及び血液成分、尿、唾液、涙、粘液等が挙げられる。
【００１７】
「バイオマーカー」という用語は、例えば、癌対非癌試料といった個体の試料を区別するために使用される任意の検出可能なマーカーを指すことができる。バイオマーカーとして、修飾（例えば、ＤＮＡのメチル化、タンパク質のリン酸化）、差次的発現変動、並びに変異及び変異型（例えば、一塩基変形例、挿入物、削除物、スプライス変異型及び融合変異型）が挙げられる。バイオマーカーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質試料において検出することができる。ｍｉＲＮＡバイオマーカーの場合、試料の標的ｍｉＲＮＡの存在及び量が通常、決定される。
【００１８】
「多重」という用語は、１つ以上の標的が、同管、ウェル又はマイクロチャンバにおいて検出されるアッセイを指す。
【００１９】
「容器」、「入れ物」、「管」、「チャンバ」、「マイクロチャンバ」等の用語は、試薬又はアッセイを保持することができる収容空間を指す。容器がキットにあり、試薬を保持し、又は増幅反応に使用されている場合、この容器は汚染又は蒸発を回避するために閉じられ又は密封することができる。この容器がアッセイに使用される場合、少なくともアッセイの設定の間、開いている又は接近することができる。
【００２０】
「独立して検出される」又は「独立した検出」という用語は、マーカー遺伝子又はマーカー遺伝子産物を指し、多重反応の各マーカーが検出されることを示す。したがって、各マーカーは、異なる標識（別々に標識されたプローブによって検出される）に結合される。
【００２１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを指し（例えば、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）、天然の（例えば、アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル及びチミジン）及び非天然の（ヒト修飾された）核酸を含む。この用語はポリマーの長さ（例えば、モノマーの数）によって限定されない。核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、概して、いくつかの場合において、ヌクレオチド類似体がその他の結合を有し得るが、５’−３’リン酸ジエステル結合を含む。モノマーは、通常、ヌクレオチドとして示される。「非天然ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾窒素塩基、糖又はリン酸基を含み、又はその構造に非天然部分を組み込むヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例として、ＬＮＡ、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化、アミノ化、脱アミノ化、アルキル化、ベンジル化及び蛍光体標識されたヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
「ＬＮＡ」はロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を指す。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素及び４’炭素を接続する余分な橋で修飾される修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの任意の部分において、ＤＮＡ又はＲＮＡと混合し、ワトソン−クリック塩基対律に従ってＤＮＡ又はＲＮＡでハイブリダイズすることができる。ロックドリボースコンフォメーションは、ハイブリダーゼーション特性を増強する（例えば、溶解温度を高める）。
【００２３】
「プライマー」という用語は、適切な条件下で、核酸ポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖合成の開始点として作用する短い核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。ポリヌクレオチド合成及び増幅反応は、通常、適切なバッファ、ｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ、並びに１つ以上の任意の補助因子を含み、適切な温度で実施される。プライマーは、通常、（例えば、０、１又は２個のミスマッチを有する）標的配列に少なくとも実質的に相補的である少なくとも１つの標的−ハイブリダイズ領域を含む。本開示の目的のために、この領域は、通常、約４〜約１０ヌクレオチド長、例えば、５〜８ヌクレオチドである。「プライマー対」は、標的配列に対して反対方向に向いており、増幅条件において、増幅産物を作製するフォワード及びリバースプライマーを指す。「フォワード」及び「リバース」という用語は、恣意的に配置される。当業者は、フォワード及びリバースプライマー（プライマー対）が、増幅産物の境界を規定することを理解する。いくつかの実施形態において、複数のプライマー対は、１つの共通フォワード又はリバースプライマーに依存する。例えば、複数の対立遺伝子特異的フォワードプライマーは、例えば、複数の対立遺伝子が互いに非常に近くにある場合、同じ共通のリバースプライマーを有するプライマー対の部分と考えることができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「プローブ」は、明白に意図された標的生体分子、例えば、プローブにハイブリダイズする目的の核酸配列に選択的に結合することができる任意の分子を意味する。プローブは、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分で検出可能に標識される。いくつかの実施形態において、プローブは、フルオロフォア及びクエンチャーで標識される。
【００２５】
「相補的」又は「相補性」という用語は、第２ポリヌクレオチドにおいて別の核酸と塩基対を形成するポリヌクレオチドの核酸の能力を指す。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔ（ＲＮＡについてはＡ−Ｇ−Ｕ）は、配列Ｔ−Ｃ−Ａ（ＲＮＡについてはＵ−Ｃ−Ａ）に相補的である。相補性は部分的であってもよく、核酸のいくつかだけが塩基対形成に従って適合する、又は核酸の全てが塩基対形成に従って適合する場合、完成する。プローブ又はプライマーは、標的配列に少なくとも部分的に相補的である場合、標的配列に「特異的である」と考えられる。条件に応じて、標的配列に対する相補性の程度は、通常、プライマー等のより短い核酸のほうがより長い配列より高い（例えば、８０％、９０％、９５％又は９８％超）。いくつかの実施形態において、プライマー及び／又はプローブは、標的配列に１００％相補的である。
【００２６】
「特異的に増幅する」という用語は、プライマーの組が統計学的に有意なレベルで、非標的配列よりも多く標的配列を増幅することを示す。「特異的に検出するという用語は、プローブが統計学的に有意なレベルで、非標的配列よりも多く標的配列を検出することを示す。当該技術分野で理解されるように、特異的な増幅及び検出は、ネガティブコントロール、例えば、試験試料と同じ核酸を含むが、標的配列を含まない試料又は核酸を欠いている試料を使用して決定することができる。例えば、標的配列を特異的に増幅及び検出するプライマー及びプローブは、結果的にバックグラウンド（非標的配列）と容易に区別することができるＣｔ、例えば、バックグラウンドより少なくとも２、３、４、５、５〜１０、１０〜２０又は１０−３０サイクル未満であるＣｔになる。用語「対立遺伝子特異的」ＰＣＲは、標的配列の特定の対立遺伝子変異型を特異的に増幅するプライマーを使用して、標的配列を増幅することを指す。通常、フォワード又はリバースプライマーは、その位置で、対立遺伝子変異型の厳密な相補体を含む。
【００２７】
２つ以上の核酸又は２つ以上のポリペプチドにおいて、「同一な」又は「同一率」という用語は、デフォルト値を有するＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又はマニュアルアライメント及び目視検査によって測定されるように、同じである又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸の特定された割合（例えば、比較ウィンドウ又は指定された領域について最大一致で比較され及び整列される場合、特定の領域において約６０％の同一性、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の少なくとも何れかの同一性）、又は特定の領域においてより高い同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい。このような配列は、「実質的に同一」と言われる。同一率は、通常、最適に整列された配列で決定され、この定義は、削除及び／又は追加を有する配列、並びに置換を有する配列に適用する。当該技術分野で一般に使用されるアルゴリズムは、ギャップ等を説明する。通常、同一性は、少なくとも約８〜２５アミノ酸若しくはヌクレオチド長である配列を含む領域、又は５０〜１００アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域、又は参照配列の全長に存在する。
【００２８】
「単離する」、「分離する」、「精製する」等の用語は、絶対であることを意図していない。例えば、ＲＮＡの単離は、１００％の非ＲＮＡ分子が取り除かれることを必要としない。当業者は、所与の状況について許容可能なレベルの純度を認識する。
【００２９】
「キット」という用語は、本明細書に記載のＲＮＡ又はＤＮＡを特異的に増幅、捕捉、タグ付け／変換又は検出するために、核酸プローブ又はプローブプール等の少なくとも１つの試薬を含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）を指す。
【００３０】
「増幅条件」という用語は、プライマーのハイブリダイゼーション及びテンプレート依存的伸長を可能にする核酸の増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅）における条件を指す。「アンプリコン」又は「増幅産物」という用語は、標的核酸配列の全て又は断片を含み、任意の適切な増幅方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏの増幅産物として形成される核酸分子を指す。プライマーに適用される場合、「増幅産物を生成する」という用語は、適切な条件下（例えば、ヌクレオチドポリメラーゼ及びＮＴＰの存在下）で、プライマーが規定の増幅産物を作製することを示す。様々なＰＣＲ条件は、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｉｎｎｉｓ等、１９９５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１４章；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ等、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０）に記載される。
【００３１】
「増幅産物」という用語は、増幅反応の産物を指す。増幅産物は、各ラウンドのポリヌクレオチド合成を開始するために使用されるプライマーを含む。「アンプリコン」は、増幅のために標的にされる配列であり、この用語は、増幅産物を指すために使用することもできる。アンプリコンの５’及び３’境界は、フォワード及びリバースプライマーによって規定される。「逆転写産物」、「ＲＴ産物」等の用語は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによってＲＮＡテンプレートにＲＴプライマーを伸長することによって、作製されるｃＤＮＡ分子を指す。
【００３２】
「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義に使用される。個体は、診断前、診断後であってもよいが、治療前、治療中、又は治療後であってもよい。本開示において、個体は通常、医療を望んでいる。
【００３３】
「試料」又は「生体試料」は、核酸を含み、又は含むと推定される任意の組成物を指す。この用語は、細胞、組織又は血液の精製され又は分離された成分、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細胞遊離部分、又は細胞可溶化物を含む。試料は、例えば、腫瘍又は転移病変からのＦＦＰＥＴであってもよい。試料は、凍結又は新鮮な組織、又は液体試料、例えば、血液又は血液成分（血漿又は血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、涙、リンパ液、脳脊髄液、口／喉リンス、気管支肺胞洗浄液、スワブから洗浄された物質等であってもよい。試料は、また、細胞株を含む個体から得られる細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の構成要素及び成分を含み得る。試料は、個体、例えば、細胞可溶化物又は赤血球細胞が枯渇した血液から直接的に得られる試料から部分的に処理されてもよい。
【００３４】
「個体から試料を得ること」という用語は、個体からの生体試料が試験のために提供されることを意味する。この得ることは、個体から直接的であってもよく、又は個体からの試料を直接的に得る第三者からでもよい。
【００３５】
「個体に治療を提供すること」という用語は、治療が処方され、推奨又は個体に利用可能であることを意味する。治療は、第三者（例えば、入院注射）によって、又は個体自身によって実際に提供することができる。
【００３６】
「コントロール」試料又は値は、試験試料又は試験条件と比較するために、参照、通常は知られている参照として提供される値を指す。例えば、試験試料は、試験条件、例えば、癌を有することが疑われる個体から採取することができ、知られている条件、例えば、癌を有しない個体（ネガティブコントロール）、又は癌若しくは目的の標的配列を有することが知られている個体（ポジティブコントロール）からの試料を比較することができる。本開示において、試験試料は、通常、癌患者又は癌を有することが疑われる患者からの試料である。コントロールは、また、試験又は結果の数から集められた平均値又は範囲を示すこともできる。コントロールは、反応条件のために調製することもできる。例えば、核酸の存在、品質及び／又は量（例えば、内部コントロール）は、試料に存在することが知られている配列を検出するプライマー又はプローブを含むことができる（例えば、ベータアクチン、ベータグロビン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、リボソームタンパク質Ｌ３７及びＬ３８、ＰＰＩａｓｅ、ＥＩＦ３、真核生物の翻訳伸長因子２（ｅＥＦ２）、ＤＨＦＲ、又はコハク酸脱水素酵素）。いくつかの実施形態において、内部コントロールは、通常は（例えば、異なるエキソンの）変異型ではない同遺伝子の領域からの配列であってもよい。知られている加えられるポリヌクレオチドは、例えば、所定の長さを有し、加えることもできる。ネガティブコントロールの例は、核酸を含まないもの、又は例えば、異なる種からの試料に存在しない配列に特異的なプライマー又はプローブを含むものである。当業者は、コントロールの選択が、特性のアッセイに依存し、例えば、コントロールは細胞種及び生物適用的である。当業者は、コントロールが任意の数のパラメーターの評価のために設計することができることを認識する。例えば、コントロールは、薬理学的データ（例えば、半減期）又は治療法に基づいて治療的利益を比較する（例えば、利益及び／又は副作用の比較）ために考案することができる。コントロールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適用のために設計することができる。当業者は、所与の条件においてどのコントロールが価値があるのかを理解し、コントロールの値を比較することに基づいて、データを分析することができる。コントロールは、また、データの有意性を決定するために価値がある。例えば、所与のパラメーターについての値が、コントロールにおいて広く異なり、試験試料の変化例は重要であるとは考えられない。
【００３７】
「ラベル」、「タグ」、「検出可能部分」等の用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又はその他の物理学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用なラベルとして、蛍光染色（フルオロフォア）、発光性剤、放射性同位体（例えば、32Ｐ、3Ｈ）、高電子密度試薬、又は親和性に基づく部分、例えば（ポリ−Ｔと相互作用する）ポリ−Ａ又は（ポリ−Ａと相互作用する）ポリ−Ｔタグ、（Ｎｉと相互作用する）Ｈｉｓタグ、又は（ビオチンと分離できる）ストレプトアビジンタグが挙げられる。当業者は、核酸と結合される検出可能なラベルは、天然ではないことを理解する。
【００３８】
他で規定されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味である。例えば、Ｌａｃｋｉｅ、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（第４版２００７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。「ａ」又は「ａｎ」という用語は、「１つ以上」を意味することを意図する。「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、工程又は要素の記載に先立つ場合、さらなる工程又は要素の追加が任意であり、除外されないことを意味する。
【００３９】
ＩＩＩ．核酸の試料
バイオマーカーの検出のための試料は、核酸を含むと思われる任意の源、例えば、組織、皮膚、スワブ（例えば、頬側、腟）、尿、唾液等から得ることができる。本開示のいくつかの実施形態において、試料は、血液又は血液画分から得られる。
【００４０】
細胞を含む試料において、細胞は、（例えば、サイズに基づくろ過又は遠心分離を使用して）分離することができ、それによってエキソーム、微小胞、ウイルス粒子、又は自由に循環する物質を含む細胞遊離核酸（ｃｆＮＡ）を残す。
【００４１】
核酸を生体試料から単離する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されるように知られており、いくつかのキットが市販されている（高純度ＲＮＡ単離キット、高純度ウイルス核酸キット、及びＭａｇＮＡ純粋ＬＣ全核酸単離キット、細胞及び組織のためのＤＮＡ単離キット、哺乳動物の血液のためのＤＮＡ単離キット、高純度ＦＦＰＥＴ  ＤＮＡ単離キット、Ｒｏｃｈｅから入手可能）。本開示の方法において、ＲＮＡは回収され、いくつかの実施形態において、ＤＮＡは回収及び単離することができる。
【００４２】
ＩＶ．癌関連の核酸
本開示の方法は、疾患をり患する又は疾患のリスクを有する個体からの血液試料に存在するバイオマーカーを検出するのに有用である。特に、血液成分は、例えば、血液中に運ばれる核酸において、疾患に関連するバイオマーカーを運ぶことが知られている。例えば、血清及び血漿における細胞遊離核酸は、通常、５０〜２００ヌクレオチドの断片に存在するが、液体細胞診からのｍｉＲＮＡ分子は、１５〜５０、又は１６〜３０ヌクレオチド長の範囲にあり得る。
【００４３】
癌に関連する癌変異についての包括的な源は、ウェブサイトｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８１  Ｍａｙ  ２０１７）で利用できるＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）データベースである。ＣＯＳＭＩＣデータベースは、起源の組織、治療効果及びシグナル伝達経路を含むいくつかの方法において、バイオマーカーを分類する。したがって、医療提供者は、関連するマーカー、例えば、前立腺癌の患者については前立腺癌を選択し、その後、患者が第一線の治療に反応して奏功しない又は緩和する場合、薬物耐性に関連する変異についてのデータベースを調べる。
【００４４】
ＮＣＢＩからの源は、その他の疾患に関連するバイオマーカーの情報を提供する。これらは、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）及びＧｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ（ｄｂＧａＰ）のデータベースを含む。したがって、ＣＯＳＭＩＣと同様に、医療提供者は、所与の疾患、例えば、糖尿病についてのデータベースを検索し、関連するバイオマーカーを見つけることができる。
【００４５】
疾患に関連するバイオマーカーの検出を使用して、疾患を診断し、疾患の発症可能性を予測し、患者について適切な治療を選択し、治療中の患者の治療的進行をモニタリングし、又は患者の予後を提供することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、疾患に関連するバイオマーカーの存在又は非存在に基づいて、標的治療が患者に処方、提供又は投与される。いくつかの薬剤が特定のバイオマーカー特性で明白に設計される（例えば、特定のＥＧＦＲ変異についてＴａｒｃｅｖａ及びＴａｇｒｉｓｓｏ）。新しく標的治療が開発されて、いくつかの特異的な変異に対応し、したがって、当業者は、その時の個体にとっての標的治療を選択するために最良の地位にいる。
【００４７】
さらに、癌患者は、標準化学療法の利益を得ることができる。したがって、いくつかの実施形態において、癌に関連するバイオマーカーの存在又は非存在に基づいて、化学療法が患者に処方、提供又は投与される。これは、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン）又はＲ−ＣＨＯＰを含み、さらに、リツキシマブ及び／又はエトポシドを含む。カクテルは、一定期間、又は腫瘍サイズ及び／又は症状の減少が検出されるまで、周期的に投与することができる。例えば、ＣＨＯＰ又はＲ−ＣＨＯＰは、２又は３週間ごとに投与することができる。
【００４８】
どの治療が選択されるにもかかわらず、一般的に治療は副作用が決定することができるように低用量から開始し、副作用が現れる、又は患者の忍容性の範囲にある、又は臨床的利益が観察されるまで、用量は増加する。
【００４９】
Ｖ．増幅及び検出
核酸試料は、例えば、核酸増幅を使用して、例えば、ツーテールＲＴ−ＰＣＲプライマーを使用した多重増幅を使用して、検出及び定量化するために使用することができる。ＲＮＡ試料のバイオマーカーを検出するために、予備的逆転写工程が実施される（また、リアルタイムＰＣＲと混同しないようにＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる）。例えば、Ｈｉｅｒｒｏ等（２００６）７２：７１４８を参照されたい。本明細書で使用する場合に、「ｑＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、逆転写定量ＰＣＲを指す。例えば、両方の反応は、例えば、試薬を加えるという中断なく１つの管で実施することができる。例えば、ポリＴプライマーを使用して、試料の全ｍＲＮＡをポリＡ尾で逆転写することができ、ランダムオリゴヌクレオチドを使用することができ、又はｃＤＮＡに逆転写される特定の標的転写物に特異的であるプライマーを設計することができる。試料からのｃＤＮＡ又はＤＮＡは、定量的増幅（リアルタイム又は定量的ＰＣＲ、すなわち、ＲＴＰＣＲ又はｑＰＣＲ）のための最初のテンプレートを形成することができる。ｑＰＣＲは、信頼できる検出及びＰＣＲ工程の各サイクルの間に精製される産物の測定値を提供する。このような技術は当該技術分野で周知であり、キット及び試薬は、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ等から市販されている。例えば、Ｐｆａｆｆｌ（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑＰＣＲ、ｖｏｌ．５０を参照されたい。
【００５０】
別々の逆転写酵素及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、２つの工程（逆転写、次にＤＮＡポリメラーゼの添加及び増幅）又は（一度に加えられる両方の酵素を有する）組み合わせ反応を使用することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、逆転写酵素活性とＤＮＡテンプレート依存活性の両方で、耐熱性ポリメラーゼで増幅される。例示的な酵素として、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ．ｔｈｅｒｍポリメラーゼシステム、及び米国特許出願第２０１４０１７０７３０号明細書及び米国特許出願第２０１４００５１１２６号明細書に開示されるものを含む。
【００５１】
本明細書に記載される使用のためのプローブは、フルオロフォア及び任意にクエンチャーで標識することができる（例えば、ＴａｑＭａｎ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ又はＤｕａｌ  Ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ）。適切なフルオロフォアとして、限定されないが、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ５４０、ＨＥＸ、ＶＩＣ、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇ５６０、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｑｕａｓａｒ５７０、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０、Ｒｏｘ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙａｎｉｎｅ５、Ｑｕａｓａｒ６７０及びＣｙａｎｉｎｅ５．５が挙げられる。適切なクエンチャーとして、限定されないが、ＴＡＭＲＡ（ＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴについて）、ＤＡＢＣＹＬ、及びＢＨＱ１−３が挙げられる。
【００５２】
検出装置は、当該技術分野で知られており、選択されるラベルに適するものとして選択することができる。定量的ＰＣＲに適した検出装置として、ｃｏｂａｓ（登録商標）及びＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）、ＰＲＩＳＭ  ７０００及び７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられる。６つのチャンネル検出は、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びＲｏｔｏｒｇｅｎｅＱ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することができ、より程度の高い多重化が可能になる。
【００５３】
ＰＣＲ検出について、閾値サイクルについて結果を表すことができる（Ｃｔとして、いくつかの例ではＣｑ又はＣｐとして省略される）。より低いＣｔ値は、例えば、より高い標的核酸濃度又はより効率的な増幅のため、所定の閾値レベルの素早い達成を反映する。より高いＣｔ値は、より低い標的核酸濃度又は非効率的な又は阻害された増幅を反映し得る。閾値サイクルは、概して、所与の標的について、直線範囲の増幅にあるように選択される。いくつかの実施形態において、Ｃｔは、例えば、ベースラインに関係して、又は増殖曲線の第２誘導の最大を決定することによって、増殖シグナルが予め定義された閾値ラインを超えるサイクルとして設定される。Ｃｔの決定は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願第７３６３１６８号明細書に記載される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を使用して、癌関連バイオマーカーを検出することができる。例えば、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して、非常に低濃度で、あっても、試料の標的核酸の絶対測定を決定することができる。ｄＰＣＲ方法は、デジタル希釈又はドロップレット生成、ＰＣＲ増幅、検出及び（任意に）分析の工程を含む。パーティショニング工程は、それぞれが核酸の増幅を実施するために必要な試薬を含む複数の個別の反応量（例えば、ドロップレット又はパーティション）の生成を含む。ＰＣＲ増幅工程は、分割された容量を、核酸の標的の増幅に適した熱サイクリング条件に供することを含む。検出は、アンプリコンを含み、含まない分割された容量の識別を含む。この分析工程は、試料における標的核酸の濃度、絶対量又は（別の標的と比較した）相対量を生み出す定量化を含む。市販されているｄＰＣＲシステムは、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから利用可能である。ｄＰＣＲの記述は、例えば、米国特許出願第２０１４０２４２５８２号明細書、Ｋｕｙｐｅｒｓ等（２０１７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ５５：１６２１；及びＷｈａｌｅ等（２０１６）Ｂｉｏｍｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｑｕａｎｔｉｆ１０：１５に見つけることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、疾患に関連するバイオマーカーは、シークエンシング、例えば、ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳ）又は次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用して検出される。次世代シークエンシング方法は、数百万の単一ＤＮＡを並行してクローン的に増殖する。それぞれのクローン集団は、その後、個別に配列決定される。ＮＧＳ法として、合成によるシークエンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ナノポアシーケンシング（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、単一分子リアルタイムシークエンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、イオン半導体に基づくシークエンシング（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）、及びピロシーケンス（４５４／Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。細胞遊離核酸は、短い断片、例えば、約５０〜２００ｂｐに存在し、そのため、このシークエンシング法の読み取りの長さの限界は、問題になりそうもない。いくつかの実施形態において、このシークエンシング法は、任意の標的富化工程、例えば、増幅工程を含む。いくつかの実施形態において、その他の標的富化方法が使用され、例えば、標的富化のライブラリベース又はプローブベースの方法（例えば、米国特許出願第７８６７７０３号明細書又は米国特許出願第８３８３３３８号明細書）が使用される。ＮＧＳ法は例えば、Ｘｕ、Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ２０１４；Ｍａ等（２０１７）Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ１１：０２１５０１；Ｋｅｌｌｙ（２０１７）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｎｕｒｓ３３：２０８；ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｔｉ等（２０１６）Ｏｎｃｏ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ９：７３５５に記載される。
【００５６】
ＶＩ．キット
ツーテールＲＴ−ＰＣＲプライマーを使用した多重増幅を実施するためのキットが本明細書で提供される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、キットは、血液回収容器（例えば、管、バイアル、マルチウェルプレート又は多槽式カートリッジ）を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、キットは、核酸の精製のために試薬及び／又は成分を含む。例えば、キットは、溶解バッファ（例えば、洗剤、カオトロピック試薬  、緩衝剤を含む）、試料のタンパク質又はその他の望まれない材料（例えば、プロテイナーゼＫ、デオキシリボヌクレアーゼ）を変性するための酵素又は試薬、核酸を保存するための酵素（デオキシリボヌクレアーゼ及び／又はリボヌクレアーゼ阻害剤）を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、核酸を分離するための成分、例えば、クロマトグラフィーマトリックス等の固体又は半固体マトリックス、磁性ビーズ、磁性ガラスビーズ、ガラス繊維、シリカフィルター等を含む。いくつかの実施形態において、キットは、固体又は半固体マトリックスから核酸を精製及び放出するための洗浄及び／又は溶出バッファを含む。例えば、キットは、ＭａｇＮＡ純粋ＬＣ全核酸単離キット、哺乳動物の血液のためのＤＮＡ単離キット、高純度又はＭａｇＮＡ純粋ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）、ＤＮｅａｓｙ又はＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＤＮＡ又はＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）等からの成分を含むことができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、キットは、特定の標的核酸、例えば、癌又はその他の疾患に関連する標的核酸を検出するための試薬を含む。例えば、キットは、特定のｍｉＲＮＡ、変異又は癌のコピー数の変形例を有することが知られている配列等の癌関連バイオマーカーに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、検出試薬は、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｄＰＣＲ、シークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ又はＮＧＳ）のためである。
【００６０】
キットは、さらに、増幅のための試薬、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファ、並びに／又は逆転写及び／若しくは増幅に適したその他の要素（例えば、補助因子又はアプタマー）をさらに含むことができる。一般的に、試薬混合物（複数可）は濃縮され、アリコートが試料（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）酵素及び／又は水と共に、最終容量に加えられる。いくつかの実施形態において、キットは、さらに、逆転写酵素（又は逆転写酵素活性を有する酵素）、及び／又はＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、ＺＯ５等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びその誘導体）を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、キットは、さらに、少なくとも１つのコントロール試料、例えば、非疾患試料（又はプールされた試料）からの核酸、又は標的配列（又はプールされた試料）を有することが知られている試料からの核酸を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ネガティブコントロール、例えば、核酸を欠いている、又は標的核酸配列を欠いていることを含む。いくつかの実施形態において、キットは、さらに、消耗部品、例えば、核酸の調製のためのプレート又は管、試料の回収のための管又はプレート、管、又はＰＣＲ若しくはｑＲＴ−ＰＣＲのためのマイクロチップを含む。いくつかの実施形態において、キットは、さらに、使用説明書、ウェブサイトのリファレンス、又はソフトウェアを含む。
【実施例】
【００６２】
ＶＩＩ．実施例
実施例１：多重アッセイにおけるユニバーサルプライマーの使用が、特異性及びシグナル強度を改善する
本開示の結果は、全ての逆転写産物（例えば、ＲＴプライマーからのスパンニングアーム、ステップ及び／又はループ配列）の部分に相補的な単一のフォワードプライマーの使用がほとんどない又は非特異的増殖がなくなることが分かる。プライマーの模式図については図１Ａ及び図１Ｂを参照されたい。図２Ａ及び図２Ｂは、標的特異的フォワードプライマー（４ｐｌｅｘ−ｓｐｅｆｗｄ）によるＲＴ−ｑＰＣＲランの結果及びユニバーサルフォワードプライマー（４ｐｌｅｘ−ｕｎｉｆｗｄ）によるＲＴ−ｑＰＣＲランの結果を比較する。図２Ａ及び図２Ｂの非ＲＮＡネガティブコントロールは、ユニバーサルプライマーに比べて、標的特異的フォワードプライマーで有意に高いシグナルを示す。さらに、ＲＮＡポジティブ試料についてのシグナルは、ユニバーサルプライマーを使用した反応に比べて、標的特異的フォワードプライマーによる反応においてそれほど強くない。４つの標的ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−３９（外部コントロール）、ｍｉＲ−２１（肺癌バイオマーカー）、ｍｉＲ−４２３（内部コントロール）及びｍｉＲ−１２６（肺癌バイオマーカー）であった。
【００６３】
実施例２：プローブ修飾は、多重アッセイにおいて交差反応性を減少する
標的ＲＮＡ分子が３’端において、同様の配列を有する場合、プローブは交差反応することができる。多重反応における特異性に対応するための１つの選択肢は、ＲＴ反応において組み合わされる一組のｍｉＲＮＡのためのＲＴプライマーを有することである。その後、ｃＤＮＡのアリコートは、１つのＰＣＲ反応において、ｍｉＲＮＡ標的の同じ組のｍｉＲＮＡ標的についての（ＲＴ産物）についてのフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの混合物を使用して、ｍｉＲＮＡ標的特異的プローブと共に増幅される。この場合のプローブは、第２鎖ｃＤＮＡのフォワード及びリバースプライマーとの間の配列を標的にし、特異的検出についての各ｍｉＲＮＡ標的についての固有のフルオロフォアで標識される。この設計スキームにおいて、プローブは、同５’端、標的化アーム、ステム及び／又はループ配列、次に８〜１０標的特異的ヌクレオチドを共有する。このアプローチは、非常に類似する３’配列を有するいくつかのｍｉＲＮＡにとって問題であり、その理由は、プローブが３’端の近くの２、３ヌクレオチドによって異なるだけでなく、交差反応性又は非特異的検出を導くためである。
【００６４】
プローブの特異性を増加させる別の選択肢は、様々なｍｉＲＮＡアーム／ステム／ループ特異的プローブの検出を可能にする異なるアーム、ステム及び／又はループ配列で、ツーテールＲＴプライマーを設計することである。我々は、異なるアーム／ステム／ループ配列が、同様のｍｉＲＮＡの検出にプローブの高い特異性を提供することが分かった。しかしながら、ＲＴプライマーの異なるアーム／ステム／ループ配列は、ＲＴ反応のオリゴヌクレオチドの複雑性をさらにもっと増加し、プライマー二量体のさらに強い形成を導き、結果として、任意の意味のある測定値を妨げるＰＣＲ反応において、非特異的シグナルになる。
【００６５】
３’端配列を有する標的の例は、ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−１６であり、前に説明したように、ルーチン的な多重設計が、配列間を良好に区別しないプローブを生成する。図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ非修飾及び修飾プローブを使用して、これらの配列のＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。この場合において、プローブは、ハイブリダイゼーション特異性及びＴｍを増加するＬＮＡで修飾された。図３Ａは、約Ｃｔ３２で出現するバックグラウンドで、非修飾ｍｉＲ−１２６プローブを使用して、多重反応の交差反応性を示す。対照的に、図３Ｂは、ＬＮＡ修飾ｍｉＲ−１２６プローブによる結果を示す。バックグラウンドシグナルは、ほぼ検出することができない。
【００６６】
以下のプローブ配列が使用された。下線のヌクレオチドは、（ＲＴプライマーからの）ステム及び／又はアーム配列にハイブリダイズされるヌクレオチドであり、その残りは、ｍｉＲＮＡ標的特異的である。太字のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドプローブのＬＮＡである。
ｍｉＲ１２６：５’ＦＡＭ−ＡＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＣＡＴＴＡＴＴ−ＢＨＱ（ＳＥＱ  ＮＯ：１）
ｍｉＲ１６：５’ＦＡＭ−ＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＴＡ−ＢＨＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
【００６７】
実施例３：既存の技術との比較
我々は、４つの標的の多重反応に対する本開示のツーテールＲＴプライマーアプローチからの結果を、ＡＢＩから市販されている同ｍｉＲＮＡ標的についての単一の標的アッセイからの結果と比較した。４つのｍｉＲＮＡ標的は、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ４２３及びｍｉＲ３９である。以下の表は、多重ツーテールＲＴプライマーアプローチ（上の表）及びシングルプレックスＡＢＩアッセイ（下の表）を使用した滴定ＲＴ−ＰＣＲ反応のＣｔ値を示す。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
この結果は、本開示の多重アプローチの感受性及び特異性が、現在のシンプレクスアッセイの感受性及び特異性と類似することを示す。２つのアプローチからの増幅曲線は、多重アッセイにおけるより効率的な増幅を明らかにする（データ示さず）。したがって、本開示の多重アッセイは、現在のシンプレクス方法より良くない場合、少なくとも同じくらい良い。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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