(57)【要約】  本開示は、ＣＤ３８ポリペプチド、例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する結合タンパク質を提供する。例えば、結合タンパク質は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質である。本開示は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する結合タンパク質を作製するための方法およびこのような結合タンパク質の使用も提供する。【選択図】図３Ａ
2020536543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位は：
（ａ）ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）またはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）またはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに
（ｂ）ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）またはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）またはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む前記結合タンパク質。
【請求項２】
抗原結合部位は、
（ａ）ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに
（ｂ）ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８６）、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８７）、またはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ（配列番号８８）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹ（配列番号９０）またはＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ（配列番号９１）を含み；ＦＲ３は、配列ＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９３）またはＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９４）を含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）を含む、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
抗原結合部位は：
（ａ）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに
（ｂ）ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８６）、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８７）、またはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ（配列番号８８）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹ（配列番号９０）またはＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ（配列番号９１）を含み；ＦＲ３は、配列ＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９３）またはＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９４）含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）含む、請求項１または１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１または１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位が：
（ａ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに
（ｂ）ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む前記結合タンパク質。
【請求項１７】
ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項１６または１７に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
抗体結合部位は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する、請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
抗原結合部位は、２．１ｎＭまたはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
抗原結合部位は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチドに結合する、請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
抗原結合部位は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
抗原結合部位は、１．３ｎＭまたはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する、請求項２３に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
キメラまたはヒト化抗体である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
ヒト抗体である、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
モノクローナル抗体である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
Ｆｃ領域を含む１つまたはそれ以上の全長抗体重鎖を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体結合および／またはＦｃ領域のエフェクター機能を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＦｃ領域である、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである、請求項３０に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである、請求項３０に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである、請求項３３または３４に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である、請求項３３または３４に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
抗体Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
細胞毒性剤または標識にコンジュゲートされる、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４０】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位、第２の抗原結合部位、および第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４１】
第１の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、第２および第３の抗原結合部位はそれぞれ、Ｔ細胞表面タンパク質に結合する、請求項４０に記載の結合タンパク質。
【請求項４２】
第１の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、（ａ）第２の抗原結合部位は、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合し、第３の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３ポリペプチドに結合するか、または（ｂ）第２の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３ポリペプチドに結合し、第３の抗原結合部位は、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する、請求項４１に記載の結合タンパク質。
【請求項４３】
それぞれ、１つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、３つの抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する前記結合タンパク質。
【請求項４４】
配列番号１または配列番号１０５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する、請求項４３に記載の結合タンパク質。
【請求項４５】
配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する、請求項４３または４４に記載の結合タンパク質。
【請求項４６】
ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位ならびにそれぞれＴ細胞表面タンパク質に結合する２つの抗原結合部位を含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４７】
ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合部位、ならびにヒトＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む、請求項４６に記載の結合タンパク質。
【請求項４８】
３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
（ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；
（ｂ）ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；または
（ｃ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４９】
（ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む；
（ｂ）ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む；
（ｃ）ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む；
（ｄ）ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む；
（ｅ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む；または
（ｈ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項４８に記載の結合タンパク質。
【請求項５０】
（ａ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む；または
（ｂ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項４９に記載の結合タンパク質。
【請求項５１】
（ａ）ＶＨ３ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＶＨ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＶＨ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＶＨ３ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；または
（ｅ）ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の結合タンパク質。
【請求項５２】
３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
（ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；
（ｂ）ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；または
（ｃ）ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項５３】
ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項５２に記載の結合タンパク質。
【請求項５４】
ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の結合タンパク質。
【請求項５５】
（ａ）ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）ＶＨ２ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）ＶＨ１ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）ＶＨ２ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む
（ｅ）ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む；
（ｆ）ＶＨ２ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む；
（ｇ）ＶＨ１ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む；または
（ｈ）ＶＨ２ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項５６】
（ａ）ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む；または
（ｂ）ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の結合タンパク質。
【請求項５７】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項５８】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項５９】
（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるかもしくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含み；または（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６０】
（ａ）Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は、配列Ｓを含み、Ｌ４は、配列ＲＴを含む；
（ｂ）Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である；
（ｃ）Ｌ１は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である；または
（ｄ）Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ２は、０アミノ酸長であり、Ｌ３は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ４は、０アミノ酸長である、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６１】
第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６２】
第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６３】
第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである、請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６４】
第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６５】
第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６６】
第２のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６７】
第２のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項６８】
第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項４８または５２に記載の結合タンパク質。
【請求項６９】
第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項４８または５２に記載の結合タンパク質。
【請求項７０】
第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項４８または５２に記載の結合タンパク質。
【請求項７１】
第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項４８または５２に記載の結合タンパク質。
【請求項７２】
第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項４８または５２に記載の結合タンパク質。
【請求項７３】
第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項４８または５２に記載の結合タンパク質。
【請求項７４】
それぞれ、１つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し；
（ａ）第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである；または
（ｂ）第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である前記結合タンパク質。
【請求項７５】
ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、ならびにＶＨ３およびＶＬ３のうちの少なくとも１対は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する、請求項７４に記載の結合タンパク質。
【請求項７６】
ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、ならびにＶＨ３およびＶＬ３のうちの１、２、または３対は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤＨ１、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１、ＣＳＦ−２、ＣＳＦ−３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１からなる群から選択される抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項７４に記載の結合タンパク質。
【請求項７７】
ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、およびＶＨ３およびＶＬ３のうちの第１の対は、ヒトＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、およびＶＨ３およびＶＬ３のうちの第２の対は、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ならびにＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、およびＶＨ３およびＶＬ３のうちの第３の対は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤＨ１、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１、ＣＳＦ−２、ＣＳＦ−３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１からなる群から選択されるヒト抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項７４に記載の結合タンパク質。
【請求項７８】
ポリヌクレオチドのキットであって：
（ａ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７４の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７７の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７９の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８０の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８２の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチド；または
（ｆ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８３の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチド
を含む前記キット。
【請求項７９】
請求項１〜７７のいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８０】
請求項７９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８１】
宿主細胞であって、請求項７８に記載のポリヌクレオチドのキット、請求項７９に記載のポリヌクレオチド、または請求項８０に記載のベクターを含む前記宿主細胞。
【請求項８２】
結合タンパク質を産生する方法であって、結合タンパク質が産生されるように、請求項８１に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項８３】
宿主細胞から結合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
請求項１〜７７のいずれか１項に記載の結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項８５】
患者のがんを防止および／または処置する方法であって、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの結合タンパク質または請求項８４に記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む前記方法。
【請求項８６】
結合タンパク質は、Ｔ細胞表面タンパク質に結合する１つの抗原結合部位とヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する別の抗原結合部位を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合部位、ＣＤ２８に結合する第２の抗原結合部位、およびヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
少なくとも１つ結合タンパク質は、化学療法剤とともに同時投与される、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
がんは、多発性骨髄腫である、請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞リンパ腫である、請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
患者は、ヒトである、請求項８５〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
がん細胞がそれらの細胞表面にヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドを発現するため、患者は、処置のために選択される、請求項８５〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１７年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／５７０，６５５号、２０１７年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／５７０，６６０号、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／６７６，２２１号、および２０１８年８月３日に出願されたＥＰ出願第ＥＰ１８１８７１８６．４号の優先権の利益を主張し、これらのすべてを参照によってその全体として本明細書に組み入れる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容を参照によってその全体として本明細書に組み入れる：配列表のコンピュータで読み込み可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１８３９５２０２９９４１ｓｅｑｌｉｓｔ．ＴＸＴ、記録日：２０１８年１０月８日、サイズ：１５８ＫＢ）。
【０００３】
本開示は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質を含む、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）に結合する結合タンパク質、ならびにそれに関連するポリヌクレオチド、宿主細胞、産生方法、および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
モノクローナル抗体をベースとする生物治療薬は、新薬開発のための重要な手段となっている。モノクローナル抗体技術は、特異的ターゲティング、特定の細胞集団への正確なシグナル伝達送達および／またはペイロードをもたらし、そのＦｃ機能を介して長期間持続する生物学的効果を提供する。抗体エンジニアリングにおける努力によって、様々な生物学的適用のために複数のモノクローナル抗体の特異性を組み合わせる多重特異性抗体を開発し、抗体薬物開発の範囲を広げることが可能になった。
【０００５】
ＣＤ３８は、種々のリンパ系腫瘍細胞の細胞表面で発現されるため、魅力的な薬物標的である（非特許文献１を参照されたい）。ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標）（ダラツムマブ）は、多発性骨髄腫の処置において使用を承認された抗ＣＤ３８抗体である。しかしながら、以下に限定されないが、ＣＤ３８への高親和性結合、ヒトＣＤ３８ポリペプチドとカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの間の交差反応性、リンパ腫細胞（例えば、多発性骨髄腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株）への結合、ならびにアポトーシスおよび／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）およびＴ細胞介在抗腫瘍活性を誘導する能力を含む、異なる作用方式および／または改良された特性を有するＣＤ３８を標的とする治療薬に対する需要が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（２００６）  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２：３４５〜３４６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する少なくとも１つの抗原結合部位を有する単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質を含む、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）に結合する結合タンパク質が、本明細書において提供される。有利なことに、これらの結合タンパク質は、がん細胞の近位へとＴ細胞を動員し、次に、Ｔ細胞を活性化し、グランザイム／パーフォリン機構を介して活性化Ｔ細胞による隣接がん細胞の殺滅を促進し、ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標）（ダラツムマブ）のような抗ＣＤ３８抗体に由来する抗腫瘍活性とは異なる作用方式を提供する能力を有する。さらに、ヒトＣＤ３８ポリペプチドとカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの両方に結合する能力により、例えば、後の臨床用途のためのそれらの安全性プロファイルを評価するために、前臨床毒性学研究において結合タンパク質を容易に試験することが可能になる。
【０００８】
一部の実施形態では、ヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する単一特異性結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトアイソフォームＡおよびアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、以下の構成のうちの１つまたはそれ以上を（任意の組合せで）有する：ＳＰＲによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲによってアッセイされる場合、１．５ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲによってアッセイされる場合、３．５ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、７．５ｎＭまたはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；その細胞表面でＣＤ３８を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する；ならびに１つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩへの結合の減少をもたらす１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｆｃ領域において）を有する。例示的なアッセイとして、実施例１、３、および４を参照されたい。一部の実施形態では、ＫＤは、４℃または２５℃で測定される。
【０００９】
一部の実施形態では、ヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する三重特異性結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、細胞表面で発現される）および第２の細胞の表面で発現される１つまたはそれ以上の他の標的抗原に（例えば、同時に）結合し、それによって、ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞の近位に第２の細胞を動員する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、細胞表面で発現される）およびＴ細胞表面で発現される１つまたは２つの標的抗原に（例えば、同時に）結合し、それによって、ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞の近位にＴ細胞を動員する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化するおよび／またはＴ細胞にＣＤ２８介在性同時刺激シグナルをもたらす。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ヒトアイソフォームＡおよびアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの１つまたはそれ以上を（任意の組合せで）有する：ＳＰＲによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲによってアッセイされる場合、１．５ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲによってアッセイされる場合、３．５ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、７．５ｎＭまたはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ド��インに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；その細胞表面でＣＤ３８を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する；ならびに１つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩへの結合の減少をもたらす１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｆｃ領域において）を有する；Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖を誘導する；Ｂｃｌ−ｘＬのＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）による発現を誘導する；ＣＤ３８＋細胞のアポトーシスを誘導する；細胞表面で発現されるＣＤ３８およびＴ細胞表面で発現される１つまたはそれ以上のＴ細胞標的抗原に結合する；細胞表面で発現されるＣＤ３８、Ｔ細胞表面で発現されるＣＤ２８、およびＴ細胞表面で発現されるＣＤ３に結合する；Ｔ細胞受容体の活性化を刺激する；Ｔ細胞受容体のシグナル伝達の同時刺激を誘導する（例えば、ＣＤ２８によって介在される場合）；ならびに１つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、ＰＢＭＣによるサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、および／またはＴＮＦ−α）の誘導の低下をもたらす１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｆｃ領域に）を有する；ＣＤ３８＋標的細胞の存在下でＰＢＭＣによるサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−６）を誘導する。例示的なアッセイとして、実施例１、３、および４を参照されたい。一部の実施形態では、ＫＤは、４℃または２５℃で測定される。
【００１０】
一部の実施形態では、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位が：（ａ）ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに／または（ｂ）ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、抗原結合部位は：（ａ）ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに／または（ｂ）ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は：（ａ）ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに／または（ｂ）ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８６）、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８７）、またはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ（配列番号８８）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹ（配列番号９０）またはＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ（配列番号９１）を含み；ＦＲ３は、配列ＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９３）またはＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９４）を含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は：（ａ）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに（ｂ）ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８６）、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８７）、またはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ（配列番号８８）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹ（配列番号９０）またはＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ（配列番号９１）を含み；ＦＲ３は、配列ＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９３）またはＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９４）含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位が：（ａ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに（ｂ）ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体結合部位は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、２．１ｎＭまたはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、１．３ｎＭまたはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する。
【００１２】
上記実施形態のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合タンパク質は、キメラまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、Ｆｃ領域を含む１つまたはそれ以上の全長抗体重鎖を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体結合および／またはＦｃ領域のエフェクター機能を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＦｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列ＥＦＬＧＧがＰＶＡＧによって置きかえられる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、抗体Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞毒性剤または標識にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位、第２の抗原結合部位、第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、第２および第３の抗原結合部位はそれぞれ、Ｔ細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、（ａ）第２の抗原結合部位は、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合し、第３の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３ポリペプチドに結合するか、または（ｂ）第２の抗原結合部位は、ヒトＣＤ３ポ��ペプチドに結合し、第３の抗原結合部位は、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する。
【００１３】
一部の実施形態では、それぞれ、１つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、３つの抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１または配列番号１０５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位ならびにそれぞれＴ細胞表面タンパク質に結合する２つの抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合部位、ならびにヒトＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
（ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；
（ｂ）ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；または
（ｃ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
（ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；
（ｂ）ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；または
（ｃ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；またはＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；またはＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む；ＶＨ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；ＶＨ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；ＶＨ３ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；またはＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
（ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；
（ｂ）ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含み；または
（ｃ）ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；ＶＨ２ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；ＶＨ１ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；ＶＨ２ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む；ＶＨ２ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む；ＶＨ１ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む；またはＶＨ２ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む；またはＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である。一部の実施形態では、（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるかもしくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含み；または（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は、配列Ｓを含み、Ｌ４は、配列ＲＴを含む；Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である；Ｌ１は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である；またはＬ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ２は、０アミノ酸長であり、Ｌ３は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の
ポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、それぞれ、１つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し；
（ａ）第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである；または（ｂ）第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列ＥＦＬＧＧがＰＶＡＧによって置きかえられる。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、ならびにＶＨ３およびＶＬ３のうちの少なくとも１対は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、ならびにＶＨ３およびＶＬ３のうちの１、２、または３対は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤＨ１、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１、ＣＳＦ−２、ＣＳＦ−３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩ���、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１からなる群から選択される抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、およびＶＨ３およびＶＬ３のうちの第１の対は、ヒトＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、およびＶＨ３およびＶＬ３のうちの第２の対は、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ならびにＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、およびＶＨ３およびＶＬ３のうちの第３の対は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤＨ１、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１、ＣＳＦ−２、ＣＳＦ−３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮ��ＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１からなる群から選択されるヒト抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。
【００１５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットであって：（ａ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７４の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７７の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７９の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８０の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８２の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチド；または（ｆ）配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８３の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含むキットが本明細書において提供される。
【００１６】
一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか１つの結合タンパク質を含むポリヌクレオチドが本明細書において提供される。一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか１つの結合タンパク質を含むポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書において提供される。
【００１７】
一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドのキット、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む宿主細胞が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質を産生する方法であって、結合タンパク質が産生されるように、上記実施形態のうちのいずれか１つの宿主細胞を培養することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞から結合タンパク質を回収することをさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか１つの結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
【００１９】
一部の実施形態では、患者のがんを防止および／または処置する方法であって、上記実施形態のうちのいずれか１つの少なくとも１つの結合タンパク質または上記実施形態のうちのいずれか１つの医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合部位、ＣＤ２８に結合する第２の抗原結合部位、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１つ結合タンパク質は、化学療法剤とともに同時投与される。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。一部の実施形態では、がん細胞がそれらの細胞表面にヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチド（例えば、配列番号１０５に示されるような）を発現するため、患者は、処置のために選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、ＣＤ３８およびＣＤ２８を発現する。一部の実施形態では、がん細胞は、ＣＤ３８を発現し、ＣＤ２８を発現しない。
【００２０】
一部の実施形態では、患者（例えば、がんを有する患者のような、それを必要とする患者）のがんを防止および／または処置する際に使用するための上記実施形態のうちのいずれか１つの少なくとも１つの結合タンパク質または上記実施形態のうちのいずれか１つの医薬組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、患者（例えば、がんを有する患者のような、それを必要とする患者）のがんを防止および／または処置するための医薬の製造において使用するための上記実施形態のうちのいずれか１つの少なくとも１つの結合タンパク質または上記実施形態のうちのいずれか１つの医薬組成物が本明細書において提供される。上記実施形態のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合部位、ＣＤ２８に結合する第２の抗原結合部位、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１つ結合タンパク質は、化学療法剤とともに同時投与されるべきである。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。一部の実施形態では、がん細胞がそれらの細胞表面にヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチド（例えば、配列番号１０５に示されるような）を発現するため、患者は、処置のために選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、ＣＤ３８およびＣＤ２８を発現する。一部の実施形態では、がん細胞は、ＣＤ３８を発現し、ＣＤ２８を発現しない。
【００２１】
本明細書に記載の様々な実施形態の特性の１つ、一部、またはすべてを本発明の他の実施形態を形成するために組み合わせることができることが理解されるべきである。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者にとって明らかとなると予想される。本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに記載される。
【００２２】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を有するこの特許または特許出願の公報のコピーは、請求と必要な手数料の支払いにより特許庁によって提供されると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−１】フローサイトメトリーを使用してＳＵ−ＤＨＬ−８ヒトリンパ腫細胞またはＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫細胞への抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ１（上）およびイサツキシマブ（下）の結合を示すグラフである。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１の続き。
【図１Ｂ】それらの表面にカニクイザルＣＤ３８を発現する細胞への抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ１またはイサツキシマブの結合（結合は確認されなかった）を調査するフローサイトメトリー結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図２Ａ−１】図２Ａ〜２Ｉは、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドへの抗ＣＤ３８抗体の結合を特徴付けるアッセイの結果を示すグラフである。図２Ａは、ＥＬＩＳＡによって可溶性ヒトＣＤ３８（上、「ｈＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）またはカニクイザルＣＤ３８（上、「ｃｙｎｏＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）へのヒト化抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ２の結合、およびフローサイトメトリーによってヒトＣＤ３８（下、示す通り）またはカニクイザルＣＤ３８（下、示す通り）を発現する細胞表面へのｍＡｂ２の結合を示すグラフである。
【図２Ａ−２】図２Ａ−１の続き。
【図２Ｂ】図２Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってヒトＣＤ３８（上）またはカニクイザルＣＤ３８（下）へのｍＡｂ２の結合を示すグラフである。
【図２Ｃ−１】図２Ｃは、ＥＬＩＳＡによって、可溶性ヒトＣＤ３８（上、「ｈＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）またはカニクイザルＣＤ３８（上、「ｃｙｎｏＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）へのヒト化抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ３の結合、およびフローサイトメトリーによってヒトＣＤ３８（下、示す通り）またはカニクイザルＣＤ３８（下、示す通り）を発現する細胞表面へのｍＡｂ３の結合を示すグラフである。
【図２Ｃ−２】図２Ｃ−１の続き。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＳＰＲによってヒトＣＤ３８（上）またはカニクイザルＣＤ３８（下）へのｍＡｂ３の結合を示すグラフである。
【図２Ｅ−１】図２Ｅは、ＥＬＩＳＡによって可溶性ヒトＣＤ３８（上、「ｈＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）またはカニクイザルＣＤ３８（上、「ｃｙｎｏＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）へのヒト化抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ５の結合、およびフローサイトメトリーによってヒトＣＤ３８（下、示す通り）またはカニクイザルＣＤ３８（下、示す通り）を発現する細胞表面へのｍＡｂ５の結合を示すグラフである。
【図２Ｅ−２】図２Ｅ−１の続き。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＳＰＲによってヒトＣＤ３８（上）またはカニクイザルＣＤ３８（下）へのｍＡｂ５の結合を示すグラフである。
【図２Ｇ−１】図２Ｇは、ＥＬＩＳＡによって可溶性ヒトＣＤ３８（上、「ｈＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）またはカニクイザルＣＤ３８（上、「ｃｙｎｏＣＤ３８：：Ｈｉｓｔａｇ」）へのヒト抗ＣＤ３８抗体ｈｈｙ１３７０の結合、およびフローサイトメトリーによってヒトＣＤ３８（下、示す通り）またはカニクイザルＣＤ３８（下、示す通り）を発現する細胞表面へのｈｈｙ１３７０の結合を示すグラフである。
【図２Ｇ−２】図２Ｇ−１の続き。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＳＰＲによってヒトＣＤ３８（上）またはカニクイザルＣＤ３８（下）へのｈｈｙ１３７０の結合を示すグラフである。
【図２Ｉ】図２Ｉは、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、およびＦＡＣＳ実験からの結合データ、ならびにヒトＶ領域の配列への各抗体のＶＨ（「Ｈ」）またはＶＬ（「Ｌ」）ドメインの同一性パーセンテージをまとめる表であり、上から下へ、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、およびｍＡｂ６（最終行）に対応する（１１９５  ＨＨＫＫ−３は、以下の本文でそのＶＬ／ＶＨアミノ酸配列によって記載されていない）。
【図２Ｊ】３７℃で７２時間のインキュベーション後のｍＡｂ７およびｍＡｂ１によるＳＵ−ＤＨＬ−８細胞のアポトーシスの濃度依存性誘導を示すグラフである。
【図２Ｋ】ＮＫ９２細胞の存在下でのＳＵ−ＤＨＬ−８細胞に対するイサツキシマブおよびｍＡｂ１の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示すグラフである。
【図２Ｌ】３７℃で４時間後のＮＫ９２細胞存在下でのＳＵ−ＤＨＬ−８細胞に対するイサツキシマブ（右）およびｍＡｂ１（左）の濃度依存性抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示すグラフである。
【図２Ｍ】ＳＵ−ＤＨＬ−８腫瘍細胞に対して示した抗ＣＤ３８抗体を使用するアポトーシス誘導アッセイの結果を示すグラフである。フローサイトメトリーによりアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムの二重取り込みを測定することによって、アポトーシスを定量した。図２Ｍは、各抗体によって誘導されるアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。
【図２Ｎ】図２Ｎ〜２Ｑは、抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ｎ）、ｍＡｂ３（図２Ｏ）、ｍＡｂ４（図２Ｐ）、およびｍＡｂ５（図２Ｑ）によるＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞におけるアポトーシスの用量依存性誘導、ならびに各抗体に関するＩＣ５０を示す。
【図２Ｏ】図２Ｎ〜２Ｑは、抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ｎ）、ｍＡｂ３（図２Ｏ）、ｍＡｂ４（図２Ｐ）、およびｍＡｂ５（図２Ｑ）によるＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞におけるアポトーシスの用量依存性誘導、ならびに各抗体に関するＩＣ５０を示す。
【図２Ｐ】図２Ｎ〜２Ｑは、抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ｎ）、ｍＡｂ３（図２Ｏ）、ｍＡｂ４（図２Ｐ）、およびｍＡｂ５（図２Ｑ）によるＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞におけるアポトーシスの用量依存性誘導、ならびに各抗体に関するＩＣ５０を示す。
【図２Ｑ】図２Ｎ〜２Ｑは、抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ｎ）、ｍＡｂ３（図２Ｏ）、ｍＡｂ４（図２Ｐ）、およびｍＡｂ５（図２Ｑ）によるＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞におけるアポトーシスの用量依存性誘導、ならびに各抗体に関するＩＣ５０を示す。
【図３Ａ】３つの標的タンパク質：ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ３８に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質の模式図を提供する。ポリペプチドの第１の対は、ＣＤ３とＣＤ２８を認識する２つの抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向（ＶＨ１−ＶＨ２およびＶＬ２−ＶＬ１）を有する二重可変ドメインを有し、ポリペプチドの第２の対は、ＣＤ３８を認識する単一の抗原結合部位を形成する単一可変ドメイン（ＶＨ３およびＶＬ３）を有する。図３Ａで示される三重特異性結合タンパク質は、「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」変異を有するＩｇＧ４定常領域を使用し、ノブは単一可変ドメインを有するポリペプチドの第２の対上にある。
【図３Ｂ】そのコグネイト抗原に結合する抗ＣＤ３８／抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質の各抗原結合ドメインの能力を調査するためのＳＰＲベースのアッセイの模式図を提供する。
【図３Ｃ】抗ＣＤ３８／抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質に結合するＣＤ３８を調査するためのＳＰＲベースのアッセイの結果を示すグラフである。三重特異性結合タンパク質へのヒトＣＤ３８の結合を、単独で（上段左）、ＣＤ３との予備結合後に（上段中央）、ＣＤ２８との予備結合後に（上段右）、ＣＤ３次いでＣＤ２８への予備結合後に（下段左）、またはＣＤ２８次いでＣＤ３への予備結合後に（下段右）調査した。
【図４】ＳＰＲによってアッセイした場合に、抗ＣＤ３８／抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質へのヒトＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ３８ポリペプチドの連続的結合を示すグラフである。
【図５】ＳＰＲによって測定した場合に、それらのコグネイト抗原（ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ３８）に対する表示した三重特異性結合タンパク質の結合親和性をまとめる表である。
【図６Ａ−１】フローサイトメトリーによってアッセイした場合に、ヒトＩｇＧ１フォーマット（２枚目のシート）におけるかまたは三重特異性結合タンパク質フォーマットにおけるイサツキシマブ抗原結合ドメインの、ヒト（上）またはカニクイザル（下）ＣＤ３８ポリペプチドに結合するためのイサツキシマブ、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（図３Ａ；１枚目のシートによるフォーマット）との見かけの親和性を比較するグラフである。
【図６Ａ−２】図６Ａ−１の続き。
【図６Ｂ】図６Ｂ〜６Ｄは、フローサイトメトリーによってアッセイした場合に、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合するための三重特異性結合タンパク質ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ、または単一特異性抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ２の見かけの親和性を比較するグラフである。図６Ｂは、ヒト（上）またはカニクイザル（下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への三重特異性結合タンパク質ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄの結合を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヒト（上）またはカニクイザル（下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への三重特異性結合タンパク質ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄの結合を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ヒト（上）またはカニクイザル（下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への単一特異性抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ２の結合を示す。
【図６Ｅ−１】フローサイトメトリーによってアッセイした場合に、ヒト（上）またはカニクイザル（下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合するための三重特異性結合タンパク質ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄまたは単一特異性抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ６の見かけの親和性を比較するグラフである。
【図６Ｅ−２】図６Ｅ−１の続き。
【図６Ｆ】ＳＰＲまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定した場合に、ヒトＣＤ３８に対する表示した抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質の結合親和性をまとめる表である。
【図６Ｇ】フローサイトメトリーによってアッセイされる場合に、ヒト（上）またはカニクイザル（下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合するための抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを欠く三重特異性結合タンパク質ΔＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄの見かけの親和性を示すグラフである。
【図７Ａ】ヒトおよびアカゲザルＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ３８ポリペプチドに対する様々な抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３  ＩｇＧ４三重特異性結合タンパク質、または対照抗体の結合親和性を決定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】ヒトおよびアカゲザルＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ３８ポリペプチドに対する様々な抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３  ＩｇＧ４三重特異性結合タンパク質、または対照抗体の結合親和性を決定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質および対照抗体を使用する３名の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣによるＣＤ３８＋細胞の抗体介在性特異的死滅の結果を示すグラフである。多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２６６（図８Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図８Ｂ）、ＫＭＳ−２６（図８Ｃ）、およびＫＭＳ−１１（図８Ｄ）細胞株を使用する代表的結果が示され、ＥＣ５０値が表Ｎに提供される。ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＫＭＳ−２６、およびＫＭＳ−１１細胞を使用することによって得られるＥＣ５０値が表Ｏ−Ｑに提供される。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質および対照抗体を使用する３名の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣによるＣＤ３８＋細胞の抗体介在性特異的死滅の結果を示すグラフである。多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２６６（図８Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図８Ｂ）、ＫＭＳ−２６（図８Ｃ）、およびＫＭＳ−１１（図８Ｄ）細胞株を使用する代表的結果が示され、ＥＣ５０値が表Ｎに提供される。ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＫＭＳ−２６、およびＫＭＳ−１１細胞を使用することによって得られるＥＣ５０値が表Ｏ−Ｑに提供される。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質および対照抗体を使用する３名の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣによるＣＤ３８＋細胞の抗体介在性特異的死滅の結果を示すグラフである。多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２６６（図８Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図８Ｂ）、ＫＭＳ−２６（図８Ｃ）、およびＫＭＳ−１１（図８Ｄ）細胞株を使用する代表的結果が示され、ＥＣ５０値が表Ｎに提供される。ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＫＭＳ−２６、およびＫＭＳ−１１細胞を使用することによって得られるＥＣ５０値が表Ｏ−Ｑに提供される。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質および対照抗体を使用する３名の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣによるＣＤ３８＋細胞の抗体介在性特異的死滅の結果を示すグラフである。多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２６６（図８Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図８Ｂ）、ＫＭＳ−２６（図８Ｃ）、およびＫＭＳ−１１（図８Ｄ）細胞株を使用する代表的結果が示され、ＥＣ５０値が表Ｎに提供される。ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＫＭＳ−２６、およびＫＭＳ−１１細胞を使用することによって得られるＥＣ５０値が表Ｏ−Ｑに提供される。
【図８Ｅ】バリアントＦｃ領域および対照抗体を有する表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質を使用する２名の異なるドナーからのＰＢＭＣによるＣＤ３８＋細胞の抗体介在性特異的死滅の結果を示すグラフである。ＣＤ３８＋  ＫＭＳ−１１（図８Ｄ）およびＵ２６６（図８Ｅ）細胞株を使用する代表的結果が示され、ＥＣ５０値が表Ｑ２およびＱ３に提供される。
【図８Ｆ】バリアントＦｃ領域および対照抗体を有する表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質を使用する２名の異なるドナーからのＰＢＭＣによるＣＤ３８＋細胞の抗体介在性特異的死滅の結果を示すグラフである。ＣＤ３８＋  ＫＭＳ−１１（図８Ｄ）およびＵ２６６（図８Ｅ）細胞株を使用する代表的結果が示され、ＥＣ５０値が表Ｑ２およびＱ３に提供される。
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび１０は、様々な抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質または対照抗体で２４時間処置したヒトＴ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示すグラフである。図９Ａは、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図９Ｂは、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図１０は、ヒトＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示す。
【図１０】図９Ａ、９Ｂおよび１０は、様々な抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質または対照抗体で２４時間処置したヒトＴ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示すグラフである。図９Ａは、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図９Ｂは、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図１０は、ヒトＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を示す。
【図１１Ａ】Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ，Ｒ．ら（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：３３２５〜３３３１頁に記載されるドライプレート法に基づき、表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質または対照抗体で処置したヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカイン放出評価の結果を示すグラフである。図１１Ａは、５μｇ／ｍＬの表示した抗体を使用する結果を示す。図１１Ｂは、２５ｎｇ／ｍＬの表示した抗体を使用する結果を示す。
【図１１Ｂ】Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ，Ｒ．ら（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：３３２５〜３３３１頁に記載されるドライプレート法に基づき、表示した抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質または対照抗体で処置したヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカイン放出評価の結果を示すグラフである。図１１Ａは、５μｇ／ｍＬの表示した抗体を使用する結果を示す。図１１Ｂは、２５ｎｇ／ｍＬの表示した抗体を使用する結果を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｅは、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞で移植されたＣＤ３４＋臍帯血細胞ヒト化ＮＳＧマウスモデルにおける、抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。図１２Ａは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける１８日目の平均腫瘍体積を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける平均末期腫瘍重量（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける実験期間にわたる平均腫瘍成長曲線を示す。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスの実験期間にわたる複数の時点における体重変化の平均を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｆは、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞で移植したＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスモデルにおける抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。図１３Ａは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける４日目の腫瘍体積を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける２１日目の腫瘍体積を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける２１日目の平均腫瘍体積を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける末期腫瘍重量の平均を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置されたマウスに対する表示した濃度の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質で処置されたマウスにおける実験期間にわたる複数の時点における平均腫瘍体積を示す。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｕは、非ヒト霊長類において、抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）、抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）、抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）、および抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を使用する用量漸増試験（０．５、２．５、１２．５μｇ／ｋｇ）の結果を示すグラフである。図１４Ａは、様々な用量の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ３＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図１４Ｂは、様々な用量の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ３＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図１４Ｃは、様々な用量の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ３＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図１４Ｄは、様々な用量の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ３＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化（ＣＤ６９＋）を示す。図１４Ｅは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｆは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｇは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｈは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｉは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｊは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｋは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｌは、表示した用量の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの変化を示す。図１４Ｍは、１２．５μｇ／ｋｇの表示した三重特異性結合タンパク質を投与した６、２４、および４８時間後のＣＤ４＋Ｔ細胞の総数の変化を示す。図１４Ｎは、１２．５μｇ／ｋｇの表示した三重特異性結合タンパク質を投与した６、２４、お��び４８時間後のＮＫ細胞の総数の変化を示す。図１４Ｏは、１２．５μｇ／ｋｇの表示した三重特異性結合タンパク質を投与した６、２４、および４８時間後のＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の変化を示す。図１４Ｐは、１２．５μｇ／ｋｇの表示した三重特異性結合タンパク質を投与した６、２４、および４８時間後のＢ細胞の総数の変化を示す。図１４Ｑは、３つの逐次漸増用量（０．５、２．５、１２．５μｇ／ｋｇ）の抗ＣＤ３８（ＶＨ１）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した６時間後のサイトカインレベルの変化（「１１７０６５」および「１１７０６６」と標識された異なる試験動物からの結果）を示す。図１４Ｒは、３つの逐次漸増用量（０．５、２．５、１２．５μｇ／ｋｇ）の抗ＣＤ３８（ＶＨ１）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した６時間後のサイトカインレベルの変化（「１１７０６７」および「１１７０６８」と標識された異なる試験動物からの結果）を示す。図１４Ｓは、３つの逐次漸増用量（０．５、２．５、１２．５μｇ／ｋｇ）の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した６時間後のサイトカインレベルの変化（「１１７０６９」および「１１７０７０」と標識された異なる試験動物からの結果）を示す。図１４Ｔは、３つの逐次漸増用量（０．５、２．５、１２．５μｇ／ｋｇ）の抗ＣＤ３８（ｈｈｙ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した６時間後のサイトカインレベルの変化（「１１７０７１」および「１１７０７２」と標識された異なる試験動物からの結果）を示す。図１４Ｕは、３つの逐次漸増用量（０．５、２．５、１２．５μｇ／ｋｇ）の表示した三重特異性結合タンパク質を投与した２４時間後のサイトカインレベルの変化（すべての試験動物から示される結果）を示す。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１４−３】図１４−２の続き。
【図１４−４】図１４−３の続き。
【図１４−５】図１４−４の続き。
【図１４−６】図１４−５の続き。
【図１４−７】図１４−６の続き。
【図１４−８】図１４−７の続き。
【図１４−９】図１４−８の続き。
【図１４−１０】図１４Ｖおよび１４Ｗは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）および抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質が、より高い用量において非ヒト霊長類の血中Ｔ細胞の枯渇を誘導した（投与の６時間後）ことを示すグラフである。
【図１４−１１】図１４Ｘおよび１４Ｙは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、抗ＣＤ３８（ＨＨＹ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）および抗ＣＤ３８（ＨＨＹ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質が、より高い用量において非ヒト霊長類の血中Ｔ細胞の枯渇を誘導した（投与の６時間後）ことを示すグラフである。
【図１４−１２】図１４Ｚおよび１４ＡＡは、抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）または抗ＣＤ３８（ＶＨＩ）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の経時的な非ヒト霊長類における血中Ｔ細胞量を示すグラフである。
【図１４−１３】図１４ＡＢおよび１４ＡＣは、抗ＣＤ３８（ＨＨＹ１３７０）×ＣＤ２８（ｓｕｐ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）または抗ＣＤ３８（ＨＨＹ１３７０）×ＣＤ２８（ｃｖｎ）×ＣＤ３（ｍｉｄ）三重特異性結合タンパク質を投与した後の経時的な非ヒト霊長類における血中Ｔ細胞量を示すグラフである。
【図１４−１４】図１４ＡＤおよび１４ＡＥは、非ヒト霊長類において１００μｇ／ｋｇ用量を投与した後の三重特異性結合タンパク質と結合したＣＤ４＋Ｔ細胞量を示すグラフである。
【図１４−１５】図１４ＡＤおよび１４ＡＥは、非ヒト霊長類において１００μｇ／ｋｇ用量を投与した後の三重特異性結合タンパク質と結合したＣＤ４＋Ｔ細胞量を示すグラフである。
【図１４−１６】図１４ＡＦおよび１４ＡＧは、非ヒト霊長類において１００μｇ／ｋｇ用量を投与した後の三重特異性結合タンパク質と結合したＣＤ８＋Ｔ細胞量を示すグラフである。
【図１４−１７】図１４ＡＦおよび１４ＡＧは、非ヒト霊長類において１００μｇ／ｋｇ用量を投与した後の三重特異性結合タンパク質と結合したＣＤ８＋Ｔ細胞量を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲ  Ｉ（図１５Ａ）、ＦｃγＲ  ＩＩａ（図１５Ｂ）、およびＦｃγＲ  ＩＩＩｂ／ｃ（図１５Ｃ）への様々なＦｃバリアントの結合またはその欠如を示すグラフである。試験したバリアントは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、およびＦＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ４であった。
【図１６】ＦｃＲｎへの、ＦＡＬＡ変異を有するまたはそれを有さないヒトＩｇＧ４の結合を示すグラフである。
【図１７】ＮＳＧマウスにおける表示した三重特異性結合タンパク質（ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ａ、およびＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ）のＰＫパラメータをまとめる表である。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｃは、野生型またはＦＡＬＡバリアントＦｃ領域を有する三重特異性結合タンパク質とともにインキュベートしたヒトＰＢＭＣによるＩＮＦ−γ（図１８Ａ）、ＩＬ−２（図１８Ｂ）、またはＴＮＦ−α（図１８Ｃ）のＦｃ／ＦｃＲ相互作用媒介性（非特異的）放出を示すグラフである。
【図１８−２】図１８Ａ〜１８Ｃは、野生型またはＦＡＬＡバリアントＦｃ領域を有する三重特異性結合タンパク質とともにインキュベートしたヒトＰＢＭＣによるＩＮＦ−γ（図１８Ａ）、ＩＬ−２（図１８Ｂ）、またはＴＮＦ−α（図１８Ｃ）のＦｃ／ＦｃＲ相互作用媒介性（非特異的）放出を示すグラフである。
【図１８−３】図１８Ｄは、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質、ならびにそのＩｇＧ１およびＩｇＧ４  ＦｃバリアントによるヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化を示すグラフである。
【図１９−１】図１９Ａおよび１９Ｂは、三重特異性結合タンパク質ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄによるＣＤ４＋（図１９Ａ）またはＣＤ８＋（図１９Ｂ）Ｔ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬの誘導には、ＣＤ３抗原結合ドメインとＣＤ２８抗原結合ドメインの両方が必要であることを示す図である。棒グラフ＝３名のＰＢＭＣドナーからの平均および標準偏差。＊ｐ＝＜０．００９。
【図１９−２】図１９Ｃおよび１９Ｄは、ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃを有するＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８×ＣＤ３が、ＣＤ４＋（図１９Ｃ）またはＣＤ８＋（図１９Ｄ）Ｔ細胞のＢｃｌ−ｘＬをベンチマーク二重特異性抗体よりも高度に上方調節することを示す図である。棒グラフ＝３名のＰＢＭＣドナーからの平均および標準偏差。＊ｐ＝＜０．０４５
【図１９−３】図１９Ｅは、ジャーカットＴ細胞受容体株におけるＩＬ−２発現によってアッセイした場合に、抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質によるＴ細胞活性化が、抗ＣＤ３抗原結合ドメインに依存することを示すグラフである。
【図１９−４】図１９Ｆは、変異した抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３８、または抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３８、および抗ＣＤ３、ならびにベンチマークを有する結合タンパク質と比較した場合に、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質によるサイトカインＴＮＦ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の放出を示す図である。
【図１９−５】図１９Ｇは、ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃを有する抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質、ベンチマーク抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体、またはアイソタイプ対照（変異した結合ドメインを有するＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃを有する三重特異性結合タンパク質）によって活性化されたＴ細胞の増殖を示す図である。
【図２０】ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃを有する抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質、ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃおよびＣＤ３８、ＣＤ２８、またはＣＤ３抗原結合ドメインにおける変異を有する抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質、またはアイソタイプ対照（３つの変異した結合ドメインを有するＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃを有する三重特異性結合タンパク質）によって活性化されたＴ細胞の増殖を示す図である。
【図２１】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスのＮＣＩ−Ｈ９２９−Ｌｕｃ播種性腫瘍モデルにおいて、表示した用量で投与されたＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ三重特異性結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２２】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスのＮＣＩ−Ｈ９２９−Ｌｕｃ播種性腫瘍モデルにおいて、表示した用量で投与されたＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ三重特異性結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２３−１】図２３Ａおよび２３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究で使用されるヒトＰＢＭＣを使用する、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質、およびベンチマーク抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体を有するＮＣＩ−Ｈ９２９−Ｌｕｃ細胞の有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍殺滅活性を示すグラフである。エフェクター：ＰＢＭＣ比１０：１で２４時間インキュベートした後に、２名のドナーに由来するヒトＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスを使用した。
【図２３−２】図２３Ｃは、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスのＮＣＩ−Ｈ９２９−Ｌｕｃ播種性腫瘍モデルにおいて、ベンチマーク抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体と比較した場合に、表示した用量で投与されたＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質のより優れたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。３０μｇ／ｋｇで、毎週、腹腔内（ＩＰ）注射により結合タンパク質を投与した。
【図２４Ａ】１０ｎＭ濃度のＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄならびにその単一結合部位のＫＯおよび三連のＫＯ突然変異体による刺激後に、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＩＬ−２−ｌｕｃ２Ｐジャーカット細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示すグラフである。
【図２４Ｂ】抗ＣＤ３×ＣＤ２８ＣＯＤＶ−Ｆａｂ抗体の最適化を示すグラフである。ＣＯＤＶ二重特異性Ｆａｂの代わりの位置におけるα−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８の最適な立体配置を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒトＰＢＭＣを使用するサイトカイン放出アッセイによって評価した。２４時間後の上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌に基づき、遠位ＣＤ２８×近位ＣＤ３を最適な配置として同定した。
【図２５】初代Ｔ細胞におけるＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄに誘導されるＢｃｌ−２ファミリーのメンバーであるＢｃｌ−ｘＬの上方調節がＣＤ２８依存性であることを示すグラフである。
【図２６】三重特異性Ａｂにおける抗ＣＤ２８が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初代Ｔ細胞の増殖をサポートするのに必須の二次シグナル伝達を提供したことを示すグラフである。
【図２７】親抗体で色分けした三重特異性抗体の立体配置を示す図である（左）。濃い色合い（紫または緑）は重鎖ペプチドを示し；明るい色合いは軽鎖ペプチドを示す。抗ＣＤ３８ ＶＨ１  ＦａｂおよびＣＤ２８ｓｕｐ／ＣＤ３ｍｉｄ  ＣＯＤＶ  Ｆａｂの結晶構造に基づくＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性Ａｂの構造モデルも示す（右）。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、高い（ＲＰＭＩ−８２２６；図２８Ａ）および低い（ＫＭＳ−１１；図２８Ｂ）ＣＤ３８表面発現を有する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞が、様々な濃度の三重特異性ＡｂとともにインキュベートされたヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１）によって効率的に溶解されたことを示すグラフである。各結合部位による殺滅活性への寄与は、表示されるように、結合部位のＫＯ変異によって実証された。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｃは、三重特異性Ａｂの抗ＣＤ２８ｓｕｐのＫＯ突然変異体によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＤ３８ｈｉｇｈ、ＣＤ３８ｍｉｄおよびＣＤ３８ｌｏｗ  ＭＭ細胞に対して著しく低下した抗腫瘍活性を示したことを示すグラフである。ＲＰＭＩ−８２２６（図２９Ａ）、Ｕ２６６（図２９Ｂ）、またはＫＭＳ−１１（図２９Ｃ）細胞を使用するアッセイも示される。
【図３０】ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ＿ＦＡＬＡ三重特異性抗体処置群における腫瘍負荷の低減が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したヒト初代Ｔ細胞により再構築されたＮＳＧマウスを使用する播種性ヒト多発性骨髄腫細胞株モデルにおいて、用量依存性であり、統計的に異なっていたことを示すグラフである。
【図３１】図３１Ａおよび３１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒト初代Ｔ細胞の存在下のＣＤ３８三重特異性Ａｂによる骨髄腫細胞の細胞溶解の生体顕微鏡分析を示す写真である。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）紅色色素で標識したＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞株とともにインキュベートしたヒトＰＢＭＣを使用して、陰性対照（三連のＫＯ三重特異性；図３１Ａ）またはＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性Ａｂ（図３１Ｂ）を使用する顕微鏡画像のタイムラプス撮影を実施した。表示された画像は、２４時間のインキュベーション後に収集した。スケールバー：５０μｍ。
【図３２】Ｆｃ受容体結合アッセイにおける分析のために調製したＩｇＧ４のＦｃ領域における代わりの変異を示す図である。配列番号１１１〜１１６（それぞれ、上から下へ）が示される。
【図３３】表示したヒトＦｃ受容体への特定したＩｇＧ４  Ｆｃバリアントの親和性を測定するためのＳＰＲアッセイの結果を示すグラフである。
【図３４】最少のＦｃＲ結合を有するＣＤ３８三重特異性結合タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒトＰＢＭＣによる非特異的サイトカイン放出を低減したことを示すグラフである。ヒトＩｇＧ４アイソタイプにおける炎症促進効果について、様々なＦｃＲ不活性化変異（表示したような）を分析した。ヒトＰＢＭＣを培地（刺激されていない）中でまたは骨髄腫細胞、ＲＰＭＩ−８２２６（刺激された）の存在下でインキュベートし、バーはＥＬＩＳＡによって測定した上清中のＩＦＮ−γレベルを示す。
【図３５】最少のＦｃＲ結合を有するＣＤ３８三重特異性結合タンパク質が、様々なＣＤ３８発現レベルを有するヒト多発性骨髄腫細胞を溶解したことを示すグラフである。表示した腫瘍標的を含むヒトＰＢＭＣを使用して、ＩｇＧ４または表示したＦｃ変異を有する骨髄腫細胞の細胞溶解をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。
【図３６】細胞株ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６、およびＫＭＳ−１１（Ｅ：Ｔ＝１０：１）に対するエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用して測定した、三重特異性抗ＣＤ３８／ＣＤ２８／ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ３８抗体であるダラツムマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解活性の比較を示すグラフである。
【図３７−１】図３７Ａ〜３７Ｄは、ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８に応答したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴付けを示すグラフである。外因性サイトカインの非存在下で、３５０ｎｇ／ウェルのＣＤ３８三重特異性Ａｂを有するウェルをコーティングすることによって、Ｔ細胞サブセット拡大の評価を実施した。表示した時点において、Ｔ細胞集団を測定した。三重突然変異体の三重特異性Ａｂを陰性対照として使用した。実施例１２に記載したように、フローサイトメトリーを使用して、セントラルおよびエフェクターメモリーＣＤ４Ｔ細胞（図３７Ａ）、ヘルパーＴ細胞（図３７Ｂ）、セントラルおよびエフェクターメモリーＣＤ８Ｔ細胞（図３７Ｃ）、ならびにＣＭＶ  ｐｐ６５−特異的ＣＤ８細胞（図３７Ｄ）を決定した。ＣＤ３８三重特異性または三重の陰性対照で処置したＨＬＡ−Ａ２  ＣＭＶ＋ドナーに由来するＰＢＭＣのペンタマー染色によって、ＣＭＶ特異的ｐｐ６５エフェクター細胞の分析を実施した。
【図３７−２】図３７−１の続き。
【図３７−３】図３７−２の続き。
【図３７−４】図３７−３の続き。
【図３８】ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８による細胞溶解への感受性に対する標的細胞上でのＣＤ２８発現の寄与を示す図である。ＣＤ２８は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ９遺伝子ターゲティングを使用して、ＫＭＳ−１１細胞においてノックアウトされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞溶解標的として使用された。フローサイトメトリーによって実証されたように、親ＫＭＳ−１１と比較すると、ＣＤ３８発現は保存されたが、一方、ＣＤ２８は排除された（上のパネル、ＫＭＳ−１１対ＫＭＳ−１１（ＣＤ２８ＫＯ））。ＣＤ２８  ＫＯ細胞の細胞溶解を、ＷＴまたはＣＤ２８三重特異性欠損に関して調査した（下のパネル；三重特異性対三重特異性（ＣＤ２８ＫＯ））。
【図３９】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ（ＫＧ−１））、Ｂ細胞リンパ腫（ＯＣＩ−Ｌｙ１９）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＡＬＬ（ＫＯＰＮ８））、および慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ（Ｚ−１３８））を含む表示したＣＤ３８+ＣＤ２８−株に対するＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性ＦＡＬＡ突然変異体Ａｂの細胞溶解活性を示すグラフである。
【図４０】α−ＣＤ２８スーパーアゴニストによるヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化には、抗体の二価性が必要とされることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含む結合タンパク質を提供する。
【００２５】
Ｉ．一般的定義
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。文脈によって別段に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段に明確に定義されない限り、複数形を含む。よって、例えば、「分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、場合により、２つまたはそれ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
【００２６】
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解されよう。
【００２７】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを指す。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態である。このような修飾として、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が挙げられる。具体的には、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。
【００２８】
「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）単離されたポリヌクレオチドが天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連していない、（２）天然に連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、または（３）より大きな配列の一部として天然に生じない、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組合せである。
【００２９】
「単離されたポリペプチド」は、（１）通常、ともに見られる少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、（２）同一供給源に由来する、例えば、同一種に由来する他のポリペプチドを本質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、（４）天然に会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の材料のうち少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）「単離されたポリペプチド」が天然に会合しているポリペプチドの部分と会合していない（共有結合性または非共有結合性相互作用によって）、（６）天然には会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有結合性または非共有結合性相互作用によって）、または（７）天然には生じないものである。このような単離されたポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡによってコードされるか、合成起源のものであるか、またはそれらの任意の組合せである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その使用（治療的、診断的、予防的、研究的または他の）を干渉すると予想される、その天然環境において見られるポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
【００３０】
天然に存在する抗体は、典型的には、四量体を含む。このような四量体はそれぞれ、典型的には、２つの同じポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの全長「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。用語「重鎖」および「軽鎖」は、本明細書で使用される場合、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識を担う約１００から１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能を担う定常ドメインを定義する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインは、カルボキシル末端にある。
【００３１】
ヒト軽鎖は、典型的には、カッパおよびラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、以下に限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、以下に限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、以下に限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに同様に細分される。全長軽鎖および重鎖内で、可変および定常ドメインは、典型的には、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって、約１０個多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む重鎖と接続される。例えば、すべての目的のために参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接続された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的には、特定のエピトープとの結合を可能にするフレームワーク領域によってアラインされる。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。
【００３２】
用語「ＣＤＲセット」は、抗原に結合することが可能な、単一可変領域中に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系によって様々に定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））によって記載された系は、抗体のいかなる可変領域にも適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと称されることがある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８３頁）は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内の特定の一部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。これらの一部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と表され、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表す。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ばれることもあり、これは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ、１９９５、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１３３〜３９頁；ＭａｃＣａｌｌｕｍ、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２６２（５）：７３２〜４５頁；およびＬｅｆｒａｎｃ、２００３、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：５５〜７７頁によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書の系のものを厳密にたどらない場合もあるが、それにもかかわらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するが、それらは、特定の残基または残基の群または全ＣＤＲでさえも、抗原結合に有意に影響を与えないという予測または実験的知見を鑑みて、短縮されるかまたは延長される。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができるが、ある特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を使用する予測されるＣＤＲの同定は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ．、Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．編  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、３３〜５１頁（２０１０）中の、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」においてなど、当技術分野で周知である。重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はまた、配列超可変性の領域を決定するために、他の従来方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列との比較によって、ＣＤＲの配列を同定するために検査される。番号付けされた配列は、目視によって、またはＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９４、Ｎｕｃｌ��ｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３〜８０頁に記載されるようなＣＬＵＳＴＡＬスーツのプログラムのうちの１つのようなアラインメントプログラムを用いることによって、アラインすることができる。分子モデルは、フレームワークおよびＣＤＲ領域を正確に描写し、よって、配列ベースの割り当てを補正するために従来のように使用される。
【００３３】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃら  Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、２７（１）：５５〜７７頁；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定されるべきである。
【００３４】
用語「Ｆｃ」は、本明細書で使用される場合、単量体形態であるか多量体形態であるかにかかわらず、抗体の消化に起因するかまたは他の手段によって産生され、ヒンジ領域を含有する非抗原結合断片の配列を含む分子を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、免疫グロブリンのいずれかである。Ｆｃ分子は、共有結合的（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合的会合によって二量体形態または多量体形態に連結される単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２、およびＩｇＧ４）に応じて１から４の範囲である。Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合された二量体である。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書で使用される場合、単量体、二量体、および多量体形態に対して包括的である。
【００３５】
Ｆ（ａｂ）断片は、典型的には、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、Ｆ（ａｂ）断片のＶＨ−ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用される場合、Ｆ（ａｂ）断片はまた、アミノ酸リンカーによって分けられた２つの可変ドメインを含有する１つの軽鎖ならびにアミノ酸リンカーによって分けられた２つの可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１つの重鎖を含むことができる。
【００３６】
Ｆ（ａｂ’）断片は、典型的には、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、１つの軽鎖および定常領域のより多く（ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間）を含有する１つの重鎖の部分を含む。
【００３７】
用語「結合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの標的抗原、例えば、本開示のＣＤ３８ポリペプチドに特異的に結合する天然に存在しない（または組換えもしくは操作された）分子を指す。
【００３８】
「組換え」分子は、組換え手段によって、調製され、発現され、作製され、または単離されたものである。
【００３９】
本開示の一実施形態は、１から３つの間の標的抗原に対して生物学的および免疫学的特異性を有する結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、このような結合タンパク質を発現する（すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む）宿主細胞を提供する。
【００４０】
用語「交換可能性（ｓｗａｐａｂｉｌｉｔｙ）」は、本明細書で使用される場合、結合タンパク質形式内の、フォールディングおよび最終的な結合親和性を保持した可変ドメインの互換性を指す。「完全交換可能性」は、結合親和性の保持によって証明されるような結合タンパク質の完全機能を維持しながら、式Ｉのポリペプチド鎖または式ＩＩのポリペプチド鎖中のＶＨ１およびＶＨ２ドメイン両方の順序、したがって、ＶＬ１およびＶＬ２ドメインの順序を交換する（すなわち、順序を逆転する）能力を指す。さらに、注目すべきは、命名ＶＨおよびＶＬは、最終形態における特定のタンパク質鎖上のドメインの位置のみを指すことである。例えば、ＶＨ１およびＶＨ２は、親抗体中のＶＬ１およびＶＬ２ドメインに由来し、結合タンパク質中のＶＨ１およびＶＨ２位置中に位置する。同様に、ＶＬ１およびＶＬ２は、親抗体中のＶＨ１およびＶＨ２ドメインに由来し、結合タンパク質中のＶＨ１およびＶＨ２位置に位置する。よって、ＶＨおよびＶＬ命名は、親抗体中の元の位置ではなく現在の位置を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬドメインは、「交換可能」である。
【００４１】
用語「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」は、本明細書で使用される場合、結合タンパク質によって結合されることができ、その抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を産生するために動物において使用することがさらに可能な分子または分子の一部を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有する場合がある。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識する無傷の抗体と競合することが可能である。
【００４２】
「ＣＤ３８」は、分化３８ポリペプチドのクラスターであり、多くの免疫細胞表面に見られる糖タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する。例示的なＣＤ３８細胞外ドメインポリペプチド配列として、以下に限定されないが、ヒト３８の細胞外ドメイン（例えば、配列番号１で表されるような）およびカニクイザルＣＤ３８の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３０で表されるような）が挙げられる。
【００４３】
用語「Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）」は、宿主の免疫系、より詳細にはＴ細胞の細胞傷害性活性を対象とする、ならびに腫瘍標的タンパク質を対象とする結合タンパク質を指す。
【００４４】
用語「単一特異性結合タンパク質」は、１つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
【００４５】
用語「一価の結合タンパク質」は、１つの抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。
【００４６】
用語「二重特異性結合タンパク質」は、２つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、２つの異なる抗原に結合する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。
【００４７】
用語「二価の結合タンパク質」は、２つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。
【００４８】
用語「三重特異性結合タンパク質」は、３つの異なる抗原標的と特異的に結合する結合タンパク質を指す。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、３つの異なる抗原に結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、同じ抗原上の１つ、２つ、または３つの異なるエピトープに結合する。
【００４９】
用語「三価の結合タンパク質」は、３つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、三価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価の結合タンパク質は、２つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、３つの抗原標的に結合することができる。
【００５０】
「単離された」結合タンパク質は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑物成分は、結合タンパク質の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む場合がある。一部の実施形態では、結合タンパク質は、（１）ローリー方法によって決定される場合、抗体の９５重量％超、最も好ましくは、９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を使用して、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されことになる。単離された結合タンパク質は、組換え細胞内にｉｎ  ｓｉｔｕの結合タンパク質を含むが、これは、結合タンパク質の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないからである。
【００５１】
用語「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」は、本明細書で使用される場合、存在する優先種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）化合物または種を指す。一部の実施形態では、実質的に精製された画分は、種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種のうちの約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超を含む。また他の実施形態では、種は、本質的に均一となるまで精製され（夾雑物種を従来の検出方法によって組成物中で検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。
【００５２】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面群化を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有する。エピトープは、抗体または結合タンパク質が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、平衡解離定数が≦１０−８Ｍである場合に、より好ましくは平衡解離定数が≦１０−９Ｍである場合に、最も好ましくは解離定数が≦１０−１０Ｍである場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。
【００５３】
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）の間のリアルタイム結合相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリクス上の結合タンパク質）を固定化することおよびリガンド（標的抗原）を提示することによって実施することができる。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、特定の結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
【００５４】
用語「に結合する」は、結合タンパク質に言及して本明細書で使用される場合、結合タンパク質またはその抗原結合断片の、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、もしくはそれ以上のＫｄでエピトープを含有する抗原に結合する能力、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍より大きい親和性でエピトープに結合する能力を指す。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、２つまたはそれ以上の抗原、例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示の抗原結合ドメインおよび／または結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド、例えば、配列番号１（ヒトＣＤ３８アイソフォームＡ）、配列番号１０５（ヒトＣＤ３８アイソフォームＥ）および配列番号３０（カニクイザルＣＤ３８）のようなＣＤ３８細胞外ドメインと「交差反応する」。抗原１（Ａｇ１）に結合する結合タンパク質は、ＥＣ５０が両方の抗原に対して同様の範囲内である場合、抗原２（Ａｇ２）に対して「交差反応性」である。本出願では、Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、Ａｇ１の親和性に対するＡｇ２の親和性の比が１０に等しいかまたは１０未満（例えば、５、２、１または０．５）である場合（親和性は両方の抗原に関して同じ方法で測定される）、Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、Ａｇ２に対して交差反応性である。
【００５６】
Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、親和性が２つの抗原に関して大きく異なる場合、Ａｇ２に対して「有意に交差反応性ではない」。Ａｇ２に関する親和性は、結合応答が低すぎる場合には測定不能である。本出願では、Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、Ａｇ２に対する結合タンパク質の結合応答が同じ実験設定でかつ同じ抗体濃度でＡｇ１に対する同じ結合タンパク質の結合応答の５％未満である場合、Ａｇ２に対して有意に交差反応性ではない。実際には、使用される結合タンパク質の濃度は、ＥＣ５０またはＡｇ１で得られた飽和プラトーに達するのに必要とされる濃度である。
【００５７】
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、軽鎖および重鎖のドメインがクロスオーバー二重可変領域免疫グロブリンにフォールディングするのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメイン間に挿入された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーは、配列レベルで、それぞれ、可変ドメインの間または可変ドメインと定常ドメインの間の遷移部に挿入される。免疫グロブリンドメインのおよそのサイズが十分に理解されているため、ドメイン間の遷移部を特定することができる。ドメイン遷移部の正確な位置は、実験データによって実証されるように、またはモデリング技法もしくは二次構造予測によって推定することができるように、ベータシートまたはアルファへリックスのような二次構造エレメントを形成しないペプチドストレッチを位置付けることによって決定することができる。本明細書に記載のリンカーは、ＶＬ２のＣ末端とＶＬ１ドメインのＮ末端の間の軽鎖上に位置するＬ１；およびＶＬ１のＣ末端とＣＬドメインのＮ末端の間の軽鎖上に位置するＬ２と称される。重鎖リンカーは、ＶＨ１のＣ末端とＶＨ２ドメインのＮ末端の間に位置するＬ３；およびＶＨ２のＣ末端とＣＨ１ドメインのＮ末端の間に位置するＬ４として知られている。
【００５８】
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、コーディング情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を含む。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に挿入することができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるため、用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書において互換的に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【００５９】
語句「組換え宿主細胞」（または「宿主細胞」）は、本明細書で使用される場合、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことを意図する。変異または環境的影響のいずれかのために、特定の修飾が続く世代において起こる場合があるので、このような後代は、実際には、その親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される場合、このような細胞は、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。結合タンパク質を発現させるために、細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む多種多様な宿主細胞発現系を使用することができる。好適な細菌発現ベクターの一例は、ｐＵＣ１９である。結合タンパク質を組換えによって発現させるために、宿主細胞は、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を運ぶ１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ、その結果、宿主細胞においてポリペプチド鎖が発現され、好ましくは、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、その培地から、結合タンパク質を回収することができる。
【００６０】
用語「形質転換」は、本明細書で使用される場合、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞は、新規ＤＮＡを含有するように改変されている場合に形質転換されている。例えば、その天然状態から遺伝的に改変されている細胞は、形質転換されている。形質転換後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に組み込まれることによって細胞のものと組換えられるか、または複製されずにエピソームエレメントとして一過的に維持されるか、またはプラスミドとして独立して複製する場合がある。細胞は、ＤＮＡが細胞分裂とともに複製される場合に安定に形質転換されていると考えられる。用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用される場合、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されている場合に「トランスフェクトされている」。いくつかのトランスフェクション技法が当技術分野において周知である。このような技法を使用して、１つまたはそれ以上の外因性ＤＮＡ分子を好適な宿主細胞中に導入することができる。
【００６１】
本明細書で使用され、物体に対して適用される場合、用語「天然に存在する」は、その物体が自然の中で見出され、ヒトによって操作されていないという事実を指す。例えば、自然の中で供給源から単離することができ、ヒトによって意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在する。同様に、「天然に存在しない」は、本明細書で使用される場合、自然の中で見出されない、または、ヒトによって構造的に改変または合成されている物体を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、２０種の従来のアミノ酸およびその略語は、従来の利用に従う。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）；非天然アミノ酸およびα−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来アミノ酸のような類似体も、結合タンパク質のポリペプチド鎖に関する好適な成分である。非従来アミノ酸の例として、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表示法では、標準的な利用および慣習に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向が、カルボキシル末端方向である。
【００６３】
天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。
【００６４】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーの、同一クラスの別のメンバーとの交換に関与する。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラスに由来するメンバーとの交換に関与する。
【００６５】
当業者であれば、周知の技法を使用して、結合タンパク質のポリペプチド鎖の好適なバリアントを決定できると予想される。例えば、当業者は、活性にとって重要であると考えられていない領域を標的とすることによって、活性を破壊することなく変更することができるポリペプチド鎖の好適な領域を同定することができる。あるいは、当業者は、同様のポリペプチドの間で保存されている残基および分子の部分を同定することができる。さらに、生体活性にとってまたは構造にとって重要である領域でさえ、生体活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換に付される場合がある。
【００６６】
用語「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象（例えば、イヌ、ブタ、ウマ、ネコ、ウシなどのような哺乳動物）を含む。
【００６７】
用語「処置」または「処置する」は、本明細書で使用される場合、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。処置を必要とするものとして、障害を有するものおよび障害を有する傾向があるものまたは障害が防止されるべきものが挙げられる。特定の実施形態では、がんを有するヒト、もしくはがんに対して感受性のヒトを処置するために、またはヒト対象においてがんを軽快するために、結合タンパク質を使用することができる。結合タンパク質を、ヒト患者においてがんを防止するために使用することもできる。特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｈｅｒ２＋乳がんのような乳がん、前立腺がん、胚中心Ｂ細胞リンパ腫またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病である。
【００６８】
用語「医薬組成物」または「治療用組成物」は、本明細書で使用される場合、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することが可能な化合物または組成物を指す。
【００６９】
用語「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、結合タンパク質の送達を達成または増強するのに好適な１つまたはそれ以上の製剤化材料を指す。
【００７０】
用語「有効量」および「治療有効量」は、１つまたはそれ以上の結合タンパク質を含む医薬組成物に関連して使用される場合、所望の治療結果をもたらすのに十分な量または投薬量を指す。より詳細には、治療有効量は、処置されている状態と関連する臨床上定義された病理過程のうちの１つまたはそれ以上をしばらくの期間阻害するのに十分な結合タンパク質の量である。有効量は、使用されている特定の結合タンパク質に応じて変化し、また、処置されている患者と関連する種々の因子および状態並びに障害の重症度に左右される。例えば、結合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される予定である場合、これらの因子の中でも、患者の年齢、体重、および健康ならびに前臨床動物研究において得られた用量応答曲線および毒性データのような因子が考慮される。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７１】
本開示の一実施形態は、薬学的に許容される担体および結合タンパク質の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００７２】
ＩＩ．抗ＣＤ３８結合タンパク質
本開示のある特定の態様は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、単一特異性および／もしくは一価、二重特異性および／もしくは二価、三重特異性および／もしくは三価、または多重特異性および／または多価である。
【００７３】
例示的な単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質の様々な特徴が本明細書に記載されている。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片は、ヒトＣＤ３８（例えば、ヒトＣＤ３８アイソフォームＡおよび／またはアイソフォームＥポリペプチド）およびカニクイザルＣＤ３８と交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３８＋細胞のアポトーシスを誘導する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３８＋細胞へとＴ細胞を動員し、場合によりＴ細胞を活性化する（例えば、ＴＣＲ刺激および／または同時刺激による）。
【００７４】
一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；またはＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；またはＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、表Ｇ、Ｈ、またはＩに示されるように、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ２×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ、ｍＡｂ２×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ａ、ｍＡｂ２×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＮＮＳＡ、ｍＡｂ６×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ、ｍＡｂ６×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ａ、またはｍＡｂ６×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＮＮＳＡの抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列に由来する１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲを含む。
【００７５】
一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）またはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）またはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびにＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）またはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）またはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。
【００７６】
一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；またはＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびにＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。他の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；またはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびにＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８６）、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８７）、またはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ（配列番号８８）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹ（配列番号９０）またはＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ（配列番号９１）を含み；ＦＲ３は、配列ＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９３）またはＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９４）を含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｌ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｌ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｌ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳ（配列番号９７）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹ（配列番号９９）を含み；ＦＲ３は、配列ＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号１０１）を含み；ＦＲ４は、配列ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１０３）を含む。
【００７８】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；および／またはＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；および／またはＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；またはＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は：ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびにＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号８９）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ（配列番号９２）を含み；ＦＲ３は、配列ＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号９５）を含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｌ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｌ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｌ３−ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ（配列番号９８）を含み；ＦＲ２は、配列ＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１００）を含み；ＦＲ３は、配列ＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（配列番号１０２）を含み；ＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０４）を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；および／またはＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖または配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｇに示される抗体配列の１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｈに示される抗体配列の、１、２、３、４、５、もしくは６個のＣＤＲ配列、ＶＨドメイン配列、および／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｉに示される抗体配列の、１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ配列、ＶＨドメイン配列、および／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｉに示される１、２、３、または４個のポリペプチド配列を含む。
【００８９】
【表１】
2020536543.tif 000003
【００９０】
【表２】
2020536543.tif 000004
【表３】
2020536543.tif 000005
【００９１】
【表４】
2020536543.tif 000006
【表５】
2020536543.tif 000007
【表６】
2020536543.tif 000008
【表７】
2020536543.tif 000009
【表８】
2020536543.tif 000010
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
2020536543.tif 000015
【００９２】
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
2020536543.tif 000028
【００９３】
ＣＤ３８ポリペプチド
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位を含む。抗原結合部位が抗原に結合するか否かを決定するための例示的なアッセイは本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ＳＰＲアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、それらの細胞表面にＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって決定される。例えば、実施例１、３、および４を参照されたい。
【００９４】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１および／または３０のアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチドまたはその断片に結合する（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲによって測定されるように）。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、細胞の表面に発現される場合、配列番号１および／または３０のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。（例えば、フローサイトメトリーによって測定されるように）。
【００９５】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）ＣＤ３８アイソフォームＡポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むが配列番号１の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号１０５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１０５のアミノ酸配列から本質的になる）ＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）ＣＤ３８アイソフォームＡポリペプチドおよび（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むが配列番号１の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号１０５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１０５のアミノ酸配列から本質的になる）ＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドに結合する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドへの結合は、例えば、本開示の結合タンパク質をＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドを発現する細胞に対して標的とする際に、有利であると考えられる。
【００９６】
ヒトＣＤ３８アイソフォームＡ細胞外ドメインポリペプチド配列
ＲＷＲＱＱＷＳＧＰＧＴＴＫＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＩＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＨＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＭＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＩＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＴＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＳＫＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＦＡＥＡＡＣＤＶＶＨＶＭＬＮＧＳＲＳＫＩＦＤＫＮＳＴＦＧＳＶＥＶＨＮＬＱＰＥＫＶＱＴＬＥＡＷＶＩＨＧＧＲＥＤＳＲＤＬＣＱＤＰＴＩＫＥＬＥＳＩＩＳＫＲＮＩＱＦＳＣＫＮＩＹＲＰＤＫＦＬＱＣＶＫＮＰＥＤＳＳＣＴＳＥＩ（配列番号１）
ヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチド配列
ＲＷＲＱＱＷＳＧＰＧＴＴＫＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＩＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＨＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＭＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＩＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＴＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＳＫＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＨＦＷＥＣＧＳＰ（配列番号１０５）
【００９７】
一部の実施形態では、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
カニクイザルＣＤ３８ポリペプチド配列
ＲＷＲＱＱＷＳＧＳＧＴＴＳＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＶＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＹＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＶＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＴＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＭＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＦＥＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＦＡＥＴＡＣＧＶＶＨＶＭＬＮＧＳＲＳＫＩＦＤＫＮＳＴＦＧＳＶＥＶＨＮＬＱＰＥＫＶＱＡＬＥＡＷＶＩＨＧＧＲＥＤＳＲＤＬＣＱＤＰＴＩＫＥＬＥＳＩＩＳＫＲＮＩＲＦＦＣＫＮＩＹＲＰＤＫＦＬＱＣＶＫＮＰＥＤＳＳＣＬＳＧＩ（配列番号３０）
【００９８】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、または多重特異性）結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位および異なる標的抗原に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位および１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、 １つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位、第２の抗原結合部位、および第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。例えば、一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの１つは、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメイン）に結合し、抗原結合部位のうちの１つまたは２つは、Ｔ細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの１つは、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメイン）に結合し、抗原結合部位のうちの１つは、ヒトＣＤ３ポリペプチドに結合し、抗原結合部位のうちの１つは、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する。ヒトＣＤ３およびＣＤ２８ポリペプチドは、当技術分野で公知である。ヒトＣＤ３およびＣＤ２８ポリペプチドに結合する例示的かつ非限定的な抗体可変ドメインのアミノ酸配列が本明細書において提供される。
【０１００】
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の標的タンパク質にそれぞれ結合する３つの抗原結合部位を含む結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、３つの抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３８ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、および／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位ならびにＴ細胞表面タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２８ポリペプチドおよび／またはヒトＣＤ３ポリペプチド）にそれぞれ結合する２つの抗原結合部位を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の標的タンパク質（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチド）および１つまたはそれ以上のＴ細胞標的タンパク質に結合する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つの腫瘍標的タンパク質（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチド）および単一のＴ細胞標的タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つの腫瘍標的タンパク質（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチド）および２つの異なるＴ細胞標的タンパク質（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ３）に結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つのＴ細胞標的タンパク質および単一の腫瘍標的タンパク質（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチド）上の２つの異なるエピトープに結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つのＴ細胞標的タンパク質および２つの異なる腫瘍標的タンパク質（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドおよび別の腫瘍標的タンパク質）に結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖は、２つのＴ細胞標的タンパク質を標的とする２つの抗原結合部位を形成し、結合タンパク質の第３および第４のポリペプチド鎖は、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、結合タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖は、２つの腫瘍標的タンパク質（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドおよび別の腫瘍標的タンパク質）を標的とする２つの抗原結合部位を形成し、結合タンパク質の第３および第４のポリペプチド鎖は、Ｔ細胞標的タンパク質に結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＴ細胞標的タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＤ３およびＣＤ２８である。
【０１０２】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドおよびＴ細胞受容体複合体を含むＴ細胞上の１つまたはそれ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。これらのＴ細胞エンゲージャー結合タンパク質は、標的細胞へとＴ細胞を一過的に動員し、同時に、Ｔ細胞の細胞溶解活性を活性化することが可能である。Ｔ細胞上の標的タンパク質の例として、とりわけ、ＣＤ３およびＣＤ２８が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原標的または標的タンパク質のさらなる例は、上に提供される。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、２つまたはそれ以上の単一特異性抗体（親抗体）の抗原結合ドメインを組み合わせて１つの抗体とすることによって生成することができる。
【０１０３】
二重特異性結合タンパク質形式
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上（例えば、２つ）の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する４つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２／１３５３４５号に記載された構造を有する）を含む二重特異性および／または二価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、二価および／または二重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および／または四重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および／または二重特異性である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメイン）に結合する。
【０１０４】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、式：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を有する２つのポリペプチド鎖を含み
２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ      ［ＩＩ］
で表される構造を有し、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
【０１０５】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｆｃ
を含み、
第２のポリペプチド鎖は、
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨＩ−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ
を含み、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
第１および第２のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
【０１０６】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ
を含み、
第２のポリペプチド鎖は、
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨＩ−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ
を含み、
第３のポリペプチド鎖は、抗体Ｆｃ領域を含み、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
第１および第２のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
【０１０７】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、式：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含む第１のポリペプチド鎖、および式：
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１      ［ＩＩ］
で表される構造を含む第２のポリペプチド鎖を含み、
式中:
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、 ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
【０１０８】
上に記載された二重特異性タンパク質のいずれかでは、ＣＤ３８以外の標的抗原は、以下の例示的な抗原標的のいずれかである：Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１としても公知）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａとしても公知）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂとしても公知）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても公知）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３としても公知）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２としても公知）、ＣＣＬ１１（エオタキシンとしても公知）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄとしても公知）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣとしても公知）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂとしても公知）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａとしても公知）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２としても公知）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２としても公知）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても公知）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３としても公知）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥに対する受容体であるＦＣＥＲ２としても公知）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知）、ＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４としても公知）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても公知）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２としても公知）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１としても公知）、ＣＤ２７５（Ｂ７Ｈ２としても公知）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３としても公知）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１としても公知）、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリンとしても公知）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−２（ＧＭ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−３（ＧＣＳＦとしても公知）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１としても公知）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１としても公知）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ（ＩＬ２５に対する受容体としても公知）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリンとしても公知）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容���、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３に対する受容体としても公知）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａに対する補助受容体としても公知）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１としても公知）。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの１つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
【０１０９】
上に記載された二重特異性結合タンパク質のうちのいずれかでは、本明細書に記載された任意のリンカーまたはリンカーの組合せが使用される。例えば、一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるかまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は、配列Ｓを含み、Ｌ４は、配列ＲＴを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ２は、０アミノ酸長であり、Ｌ３は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ４は、０アミノ酸長である。
【０１１０】
ＣＤ３８ポリペプチドに結合する三重特異性結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上（例えば、３つ）の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および／または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメイン）に結合する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上（例えば、３つ）の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および／または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメイン）に結合する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結したＦｃ領域をさらに含み、Ｆｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、２つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、結合対を形成し、第１の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、結合対を形成し、第２の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３）に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８）に結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３）に結合し、第１の抗原結合部位は、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８）に結合する。一部の実施形態では、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは、第３の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ３およびＶＬ３は、結合対を形成し、第３の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第３の抗原結合部位は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび場合によりカニクイザルＣＤ３８）に結合する。本発明における使用を企図したクロスオーバー配向を有する例示的な結合タンパク質形式は、米国特許出願第１５／４８７，２４３号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４８８号にも記載されている。
【０１１３】
本明細書に記載の二重特異性、三重特異性、または多重特異性結合タンパク質のいずれかにおける一部の実施形態では、抗原結合部位は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび場合によりカニクイザルＣＤ３８）に結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性、三重特異性、または多重特異性結合タンパク質のいずれかの他の（例えば、ＣＤ３８に結合していない）抗原結合部位は、ＣＤ２８またはＣＤ３に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ１ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ２ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ１ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ２ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはＶＬ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、またはＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含み、ならびに／またはＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む、および／またはＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
本開示の三重特異性結合タンパク質のいずれかの一部の実施形態では、１つの抗原結合ドメインはＣＤ３ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３）に結合し、１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８）に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号４９または５１に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５０または５２に由来する３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号４９または５１に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５０または５２に由来する３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５３または８４に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５４または８５に由来する３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５３または８４に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５４または８５に由来する３つのＣＤＲを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるポリペプチドを含む。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
上に記載された三重特異性結合タンパク質のいずれかでは、ＣＤ３８以外の標的抗原は、以下の例示的な抗原標的のいずれかである：Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１としても公知）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａとしても公知）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂとしても公知）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても公知）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３としても公知）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２としても公知）、ＣＣＬ１１（エオタキシンとしても公知）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄとしても公知）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣとしても公知）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂとしても公知）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａとしても公知）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２としても公知）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２としても公知）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても公知）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３としても公知）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥに対する受容体であるＦＣＥＲ２としても公知）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知）、ＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４としても公知）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても公知）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２としても公知）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１としても公知）、ＣＤ２７５（Ｂ７Ｈ２としても公知）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３としても公知）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１としても公知）、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリンとしても公知）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−２（ＧＭ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−３（ＧＣＳＦとしても公知）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１としても公知）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１としても公知）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ（ＩＬ２５に対する受容体としても公知）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリンとしても公知）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板���容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３に対する受容体としても公知）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａに対する補助受容体としても公知）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１としても公知）。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの１つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。
【０１３０】
本開示の結合タンパク質は、例えば、ヒト、マウス、またはヒト化抗体を含む任意のヒトまたは非ヒト抗体から得られるかまたはそれに由来するドメインまたは配列を使用して調製することができる。
【０１３１】
リンカー
一部の実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸なし（長さ＝０）から約１００アミノ酸長、または１００、５０、４０、３０、２０、または１５アミノ酸未満またはそれ以下の範囲である。リンカーはまた、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸長である。１つの結合タンパク質におけるＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、すべて同じアミノ酸配列を有するかまたはすべて異なるアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
好適なリンカーの例として、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基；ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；トリペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；４つのグリシン残基を有するペプチド；５つのグリシン残基を有するペプチド；６つのグリシン残基を有するペプチド；７つのグリシン残基を有するペプチド；および８つのグリシン残基を有するペプチドが挙げられる。ペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ペプチドＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ペプチドＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびペプチドＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）のようなアミノ酸残基の他の組合せが使用される場合もある。上記で列挙された例は、決して本開示の範囲を限定するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される無作為に選択されたアミノ酸を含むリンカーが、結合タンパク質において好適であることが示されている。リンカー配列のさらなる説明については、例えば、ＷＯ２０１２１３５３４５および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４８８号を参照されたい。
【０１３３】
リンカー中のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカーにおいて達成するのに必要な二次構造エレメントの種類に応じて変わる。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンは、最大の可動性を有するリンカーにとって最良である。より強固な延長したリンカーが必要である場合には、グリシン、プロリン、トレオニン、およびセリンのいくつかの組合せが有用である。所望の特性に応じて、必要に応じて、より大きなペプチドリンカーを構築するために、任意のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と組み合わせてリンカーとして考えられる。
【０１３４】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍であり、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ１は、３から１２個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、３から１４個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１から８個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、１から３個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は、５から１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、５から８個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１から５個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、１から２個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は、７個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、５個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、２個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は、１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、０個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４はそれぞれ、０から１５個のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸）から独立に選択された長さを有し、リンカーのうち少なくとも２つは、１から１５個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４はそれぞれ、０アミノ酸長である。
【０１３５】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および／またはＬ４は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインの間の接合部に、天然に存在する配列に由来する配列を含む（例えば、ＷＯ２０１２／１３５３４５に記載されるように）。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、内因性ＶＨおよびＣＨ１ドメインの間、または内因性ＶＬおよびＣＬドメイン（例えば、カッパまたはラムダ）の間の遷移部に見られる配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、内因性ヒトＶＨおよびＣＨ１ドメインの間、または内因性ヒトＶＬおよびＣＬドメイン（例えば、ヒトカッパまたはラムダ）の間の遷移部に見られる配列を含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるかまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は、配列Ｓを含み、Ｌ４は、配列ＲＴを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ２は、０アミノ酸長であり、Ｌ３は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ４は、０アミノ酸長である。
【０１３８】
Ｆｃ領域および定常ドメイン
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、全長抗体重鎖またはＦｃ領域を含むポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、場合によりＣＨ４ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、上に記載された変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたは２つのＦｃバリアントを含む。用語「Ｆｃバリアント」は、本明細書で使用される場合、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す。例示的なＦｃバリアント、およびそれらのサルベージ受容体との相互作用は、当技術分野で公知である。よって、用語「Ｆｃバリアント」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子または配列を含む場合がある。さらに、天然Ｆｃは、本発明の抗体様結合タンパク質にとって必要ではない構造的特徴または生体活性を提供するため、除去することができる領域を含む。よって、用語「Ｆｃバリアント」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現の際のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすかまたはそれに関与している、１つもしくはそれ以上の天然Ｆｃ部位もしくは残基を欠くか、または１つもしくはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が改変されている分子または配列を含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体結合および／またはＦｃ領域のエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体介在性抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および／または３２９位に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および／または３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＹ３００Ｓである。
【０１４２】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＩおよび／またはＦｃγＩＩ結合を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさないＦｃγＩおよび／またはＦｃγＩＩ結合を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および／または４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐおよび／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および／または２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、および／または４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３３〜２３６、および／または４０９位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、Ｓ２２８Ｐ；Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失；ならびに／またはＲ４０９Ｋである。
【０１４３】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、精製試薬に対する親和性をモジュレートすることによって、精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の２つのＦｃ領域のうち１つがプロテインＡへの結合を低減または排除する変異を含有する場合には、それらのホモ二量体形態から離して選択的に精製できることが知られており、これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりも、プロテインＡベースの精製に対して中間の親和性を有し、例えば、異なるｐＨの使用によってプロテインＡから選択的に溶出できるためである（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ら（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．  ５：１７９４３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域のうち一方のみは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１４４】
一部の結合タンパク質（例えば、二重特異性または三重特異性結合タンパク質）の収率を改善するために、例えば、国際公開第ＷＯ９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７〜２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７〜８１頁においていくつかの実施例を用いて詳細に記載されている「ノブイントゥーホール」技術によって、ＣＨ３ドメインを変更することができる。詳細には、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増大するように変更される。２つのＣＨ３ドメインの（２つの重鎖の）それぞれは「ノブ」である場合があるが、もう一方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８；Ａｔｗｅｌｌら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６〜３５頁）、収率を増大する。特定の実施形態では、ノブは、単一の可変ドメインを有するポリペプチドの第２の対上にある。その他の実施形態では、ノブは、クロスオーバー配向を有するポリペプチドの第１の対上にある。さらにその他の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ノブインホールを含まない。
【０１４５】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質（例えば、三重特異性結合タンパク質）は、第２のポリペプチド鎖上に「ノブ」変異および第３のポリペプチド鎖上に「ホール」変異を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、第３のポリペプチド鎖上の「ノブ」変異および第２のポリペプチド鎖上の「ホール」変異を含む。一部の実施形態では、「ノブ」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および／または３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、またはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｙである。一部の実施形態では、「ノブ」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、「ホール」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７位、場合により、３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、場合により、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａである。一部の実施形態では、「ホール」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。
【０１４６】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６位、場合により３５４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙ、場合によりＳ３５４Ｃであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７位、場合により３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、場合により、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａである。
【０１４７】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７位、場合により３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、場合によりＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６位、場合により３５４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙ、場合によりＳ３５４Ｃである。
【０１４８】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６、３６８、および／または４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖである。
【０１４９】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６、３６８、および／または４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｗである。
【０１５０】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１５１】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋである。
【０１５２】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３５４、および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、およびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３５４、および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、およびＴ３６６Ｗである。
【０１５３】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋである。
【０１５４】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するために１つまたはそれ以上の変異を含む（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１）：３４６〜５６頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み、第１および／または第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに血清半減期を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１５５】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域および／または二量体界面の、安定性を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．ら（２０１３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：２６５８３〜２６５９３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに安定性を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１５６】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、精製試薬に対する親和性をモジュレートすることによって、精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の２つのＦｃ領域のうち１つがプロテインＡへの結合を低減または排除する変異を含有する場合には、それらのホモ二量体形態から離して選択的に精製できることが知られており、これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりも、プロテインＡベースの精製に対して中間の親和性を有し、例えば、異なるｐＨの使用によってプロテインＡから選択的に溶出できるためである（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ら（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．  ５：１７９４３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域のうち一方のみは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１５７】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するために１つまたはそれ以上の変異を含む（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１）：３４６〜５６頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み、第１および／または第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに血清半減期を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０１５８】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体媒介性抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第１および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第１および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第��および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。
【０１５９】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびにエフェクター機能を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。３２９位のＦｃ変異についてのさらなる記載として、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１〜６６０４頁およびＷＯ１９９９０５１６４２を参照されたい。
【０１６０】
一部の実施形態では、上に記載された変異の種類は、任意の順序または組合せで組み合わせることができる。例えば、本開示の結合タンパク質は、２つもしくはそれ以上の「ノブ」および「ホール」変異、血清半減期を改善するための１つもしくはそれ以上の変異、ＩｇＧ４の安定性を改善するための１つもしくはそれ以上の変異、精製を改善するための１つもしくはそれ以上の変異、ならびに／または上に記載されたエフェクター機能を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、以下に限定されないが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片を含む抗体断片を含む。
【０１６２】
アッセイ
本開示は、ヒトおよび／もしくはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合し、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖を誘導し、ならびに／またはＣＤ３８＋細胞のアポトーシスを誘導する抗原結合タンパク質を提供する。これらのパラメータを測定し、このような結合タンパク質を同定するための例示的なアッセイが、本明細書において提供される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片と精製されたＣＤ３８ポリペプチドの間の結合親和性は、ＳＰＲによって測定され（例えば、上に記載されているように）、結合タンパク質またはその抗原結合断片と細胞表面で発現されたＣＤ３８ポリペプチドの間の結合親和性は、フローサイトメトリーによって測定される（例えば、上に記載されているように）。
【０１６３】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質の抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、それらの細胞表面に配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって測定される場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、１ｎＭもしくはそれ以下、または０．８ｎＭもしくはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、それらの細胞表面に配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって測定される場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、１ｎＭもしくはそれ以下、または０．７５ｎＭもしくはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドを使用するＳＰＲアッセイによって測定される場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、１ｎＭもしくはそれ以下、または０．８３ｎＭもしくはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを使用するＳＰＲアッセイによって測定される場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、３．５ｎＭもしくはそれ以下、１．５ｎＭもしくはそれ以下、または１．０ｎＭもしくはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、配列番号３０のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する。本明細書で実証されるように、一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、本明細書に記載の例示的な結合特性のうちの１つまたはそれ以上を有する。一部の実施形態では、ＫＤは、４℃または２５℃で測定される。
【０１６４】
一部の実施形態では、本開示の単一特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの１つまたはそれ以上を有する：ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、または１．５ｎＭもしくはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてのヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、または１ｎＭもしくはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、２０ｎＭまたはそれ以下、１５ｎＭまたはそれ以下、１２ｎＭまたはそれ以下、１０ｎＭまたはそれ以下、５ｎＭまたはそれ以下、２ｎＭまたはそれ以下、１ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてのカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、２０ｎＭまたはそれ以下、１５ｎＭまたはそれ以下、１２ｎＭまたはそれ以下、１０ｎＭまたはそれ以下、５ｎＭまたはそれ以下、２ｎＭまたはそれ以下、１ｎＭまたはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；その細胞表面でＣＤ３８を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する；ならびに１つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較��て、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩへの結合の減少をもたらす１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｆｃ領域において）を有する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、または１ｎＭもしくはそれ以下のＥＣ５０で、細胞表面で発現されるＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトまたはカニクイザル）に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、または１ｎＭもしくはそれ以下のＥＣ５０で、精製タンパク質としてのＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトまたはカニクイザル）に結合する。一部の実施形態では、ＫＤは、４℃または２５℃で測定される。
【０１６５】
一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの１つまたはそれ以上を有する：Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖を誘導する；Ｂｃｌ−ｘＬのＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）による発現を誘導する；ＣＤ３８＋細胞のアポトーシスを誘導する（例えば、アネキシンＶ染色および／またはヨウ化プロピジウムの取り込みによって測定される場合）；細胞表面で発現されるＣＤ３８およびＴ細胞表面で発現される１つまたはそれ以上のＴ細胞標的抗原に結合する；細胞表面で発現されるＣＤ３８、Ｔ細胞表面で発現されるＣＤ２８、およびＴ細胞表面で発現されるＣＤ３に結合する；Ｔ細胞受容体の活性化を刺激する（例えば、ＣＤ６９発現によって測定される場合）；Ｔ細胞受容体のシグナル伝達の同時刺激を誘導する（例えば、ＣＤ２８によって介在される場合）；１つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、ＰＢＭＣによるサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、および／またはＴＮＦ−α）の誘導の低下をもたらす１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｆｃ領域に）を有する；ＣＤ３８＋標的細胞の存在下でＰＢＭＣによるサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−６）を誘導する（例えば、イムノアッセイによって測定される場合）；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、１．５ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてのヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、１２ｎＭまたはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、３．５ｎＭまたはそれ以下のＫＤで、精製タンパク質としてのカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、７．５ｎＭまたはそれ以下の見かけのＫＤで、細胞表面で発現されるカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームＥ  ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）の細胞外ドメインに結合する；その細胞表面でＣＤ３８を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する；ならびに１つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩへの結合の減少をもたらす１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｆｃ領域において）を有する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、または１ｎＭもしくはそれ以下のＥＣ５０で、細胞表面で発現されるＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトまたはカニクイザル）に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされる場合、２０ｎＭもしくはそれ以下、１５ｎＭもしくはそれ以下、１２ｎＭもしくはそれ以下、１０ｎＭもしくはそれ以下、５ｎＭもしくはそれ以下、２ｎＭもしくはそれ以下、または１ｎＭもしくはそれ以下のＥＣ５０で、精製タンパク質としてのＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトまたはカニクイザル）に結合する。
【０１６６】
核酸
結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクター中に組み込み、このようなベクターを宿主細胞中に導入するために、標準組換えＤＮＡ方法が使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載の解析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびにその実験手順および技法は、周知のものであり、当技術分野において通常使用される。同様に、従来の技法は、化学的合成、化学的解析、医薬品製造、製剤化、送達、および患者の処置のために使用される。
【０１６７】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関連する。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６０〜８３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９%、または１００％同一である、および／または表Ｊに示されている配列を含む。
【０１６８】
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチドのキットに関する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。キットは、とりわけ、本明細書に記載の結合タンパク質のうちの１つまたはそれ以上、例えば、本開示の三重特異性結合タンパク質を産生する際に使用を見出すことができる。一部の実施形態では、キットは、表Ｊにおいて示されている１、２、３、または４つのポリヌクレオチドを含む（例えば、ｍＡｂ２×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ、ｍＡｂ２×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ａ、ｍＡｂ２×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＮＮＳＡ、ｍＡｂ６×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ、ｍＡｂ６×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ａ、またはｍＡｂ６×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＮＮＳＡのもの）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７４の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７７の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７９の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８０の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８２の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８３の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、単離された核酸は、結合タンパク質をコードする核酸配列の転写を指示するために異種プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列を指す。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して位置する場合に、第２の核酸配列に作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、結合タンパク質のコード配列に作動可能に連結される。プロモーターの例として、以下に限定されないが、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのような）のゲノムから得られたプロモーター、異種真核細胞プロモーターから得られたプロモーター（アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどのような）、ＣＡＧ−プロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １０８（２）：１９３〜９頁、１９９１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：ｅ４３頁、２００５）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母アルファ接合因子のプロモーターを挙げることができる。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成プロモーター、誘導プロモーター、または本明細書に記載の任意の他の好適なプロモーターまたは当業者によって容易に認識される他の好適なプロモーターの制御下にある。
【０１７０】
一部の実施形態では、単離された核酸は、ベクター中に組み込まれる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つまたはそれ以上の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。好適なエンハンサーの例として、以下に限定されないが、哺乳動物遺伝子由来エンハンサー配列（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−胎児タンパク質、インスリンなど）、および真核細胞ウイルス由来のエンハンサー配列（複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなどのような）を挙げることができる。好適なベクターの例として、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、麻疹、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を挙げることができる。発現ベクターは、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞のような宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。宿主において発現および複製可能な生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当技術分野で公知であり、目的の任意の細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
【０１７１】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかの第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系に関する。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖をコードする第２のベクター、結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖をコードする第３のベクター、および結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖をコードする第４のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第３および第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第３のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第２および第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第２および第３のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターを含む。ベクター系の１つまたはそれ以上のベクターは、本明細書に記載のベクターのいずれかである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のベクターは、発現ベクターである。
【０１７２】
単離された宿主細胞
本開示の他の態様は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞、ポリヌクレオチドのキット、ベクター、および／またはベクター系に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例として、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（例えば、Ｓ２細胞）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞（例えば、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞）およびツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えば、Ｓｆ２１またはＳｆ９細胞）を挙げることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例として、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ細胞、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝細胞腫系統（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞）を挙げることができる。
【０１７３】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかを産生する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ａ）宿主細胞が結合タンパク質を発現するような条件下で、単離された核酸、ベクター、および／またはベクター系（例えば、本明細書に記載の単離された核酸、ベクター、および／またはベクター系のいずれか）を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載の宿主細胞のいずれか）を培養する工程と；ｂ）宿主細胞から結合タンパク質を単離する工程とを含む。タンパク質を発現するための条件下で宿主細胞を培養する方法は、当業者に周知である。例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーを含む、２工程アフィニティークロマトグラフィー）を含む、培養宿主細胞からタンパク質を単離する方法は当業者に周知である。
【０１７４】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、場合によりラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、場合によりカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、２つのＦｃ領域を含み、２つのＦｃ領域はそれぞれＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ３ドメインの一方のみが、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、順に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、次いで場合により、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、順に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、次いで場合により、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質を、プロテインＡと接触させ、０または２つの、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆであるアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下でプロテインＡから溶出し、カッパ軽鎖親和性媒体（例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂において使用されるような；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と接触させ、ラムダＣＬドメインのみを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下で（例えば、製造業者の使用説明書に従って）カッパ軽鎖親和性媒体から溶出する。プロテインＡ溶出に好適な条件は当技術分野で公知であり、制限するものではないが、ｐＨ４．５〜２．８の段階的溶出勾配を含む。一部の実施形態では、タンパク質精製に有用なプロテインＡまたはプロテインＡのバリアントが用いられる。一部の実施形態では、プロテインＡは、例えば、クロマトグラフィー媒体の一部として、基板または樹脂に付着される。一部の実施形態では、カッパ軽鎖親和性媒体からの溶出後、結合タンパク質を、ラムダ軽鎖親和性媒体（例えば、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂において使用されるような；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と接触させ、カッパＣＬドメインのみを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下で（例えば、製造業者の使用説明書に従って）、ラムダ軽鎖親和性媒体から溶出する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＨＩＣクロマトグラフィーを使用して検出される。一部の実施形態では、結合タンパク質は：ラムダＣＬドメインを含む第１のポリペプチド鎖；ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換がＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメイン；ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆである第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメイン；ならびにカッパＣＬドメインを含む第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、宿主細胞によって産生される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞培養培地または宿主細胞抽出物から精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、宿主細胞によって分泌されるかまたは宿主細胞から産生され、抽出される（例えば、プロテインＡと接触させる前に）。一部の実施形態では、結合タンパク質は、プロテインＡと接触させる場合に、細胞培養培地または宿主細胞抽出物中にある。一部の実施形態では、結合タンパク質は、他の結合タンパク質、ポリペプチド、および／または他の細胞成分から離して精製される。
【０１７５】
ＩＩＩ．三重特異性結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上（例えば、３つ）の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および／または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は、２つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。上述のように、第２および第３のポリペプチド鎖は、ＦＣ領域（例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む）を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域のうちの一方または両方は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３３〜２３６、および／または４０９位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、Ｓ２２８Ｐ；Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失；ならびに／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、一方または両方のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および／または３２９位に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および／または３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＹ３００Ｓである。
【０１７６】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上（例えば、３つ）の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および／または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも１つは、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメイン）に結合する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ      ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１      ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１      ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ      ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結したＦｃ領域をさらに含み、Ｆｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、一方または両方のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３〜２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３３〜２３６、および／または４０９位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、Ｓ２２８Ｐ；Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失；ならびに／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、一方または両方のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および／または３２９位に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および／または３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＹ３００Ｓである。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１は、結合対を形成し、第１の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２とＶＬ２は、結合対を形成し、第２の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ３とＶＬ３は、結合対を形成し、第３の抗原結合部位を形成する。結合タンパク質はまた、がん、関節炎、および／または炎症性障害を処置するための細胞活性化、腫瘍ターゲティング、サイトカイン活性の中和、ウイルス感染の中和、多重シグナル伝達事象の組合せのために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、具体的には、結合タンパク質は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１としても公知）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａとしても公知）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂとしても公知）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても公知）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３としても公知）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２としても公知）、ＣＣＬ１１（エオタキシンとしても公知）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄとしても公知）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣとしても公知）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂとしても公知）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａとしても公知）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２としても公知）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２としても公知）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても公知）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３としても公知）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥに対する受容体であるＦＣＥＲ２としても公知）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知）、ＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４としても公知）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても公知）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２としても公知）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１としても公知）、ＣＤ２７５（Ｂ７Ｈ２としても公知）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３としても公知）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１としても公知）、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリンとしても公知）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−２（ＧＭ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−３（ＧＣＳＦとしても公知）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１としても公知）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１としても公知）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ���２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ（ＩＬ２５に対する受容体としても公知）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリンとしても公知）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３に対する受容体としても公知）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａに対する補助受容体としても公知）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１としても公知）から選択される１、２、３つの抗原標的に結合する。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの１つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
【０１７８】
一部の実施形態では、３つの抗原結合部位のうちの１つは、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３ポリペプチド）に結合し、３つの抗原結合部位のうちの１つは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８ポリペプチド）に結合し、３つの抗原結合部位のうちの１つは、第３のポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、具体的には、ＣＤ３またはＣＤ２８以外の抗原標的に結合する抗原結合部位は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１としても公知）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａとしても公知）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂとしても公知）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても公知）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３としても公知）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２としても公知）、ＣＣＬ１１（エオタキシンとしても公知）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄとしても公知）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣとしても公知）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂとしても公知）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａとしても公知）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２としても公知）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２としても公知）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても公知）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３としても公知）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥに対する受容体であるＦＣＥＲ２としても公知）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知）、ＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４としても公知）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても公知）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２としても公知）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１としても公知）、ＣＤ２７５（Ｂ７Ｈ２としても公知）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３としても公知）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１としても公知）、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリンとしても公知）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−２（ＧＭ−ＣＳＦとしても公知）、ＣＳＦ−３（ＧＣＳＦとしても公知）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１としても公知）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１としても公知）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ（ＩＬ２５に対する受容体としても公知）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２���、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリンとしても公知）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３に対する受容体としても公知）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａに対する補助受容体としても公知）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１としても公知）から選択される抗原標的に結合する。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの１つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
【０１７９】
上に記載された三重特異性結合タンパク質のうちのいずれかでは、本明細書に記載の任意のリンカーまたはリンカーの組合せを使用することができる。例えば、一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるかまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は、配列Ｓを含み、Ｌ４は、配列ＲＴを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ２は、０アミノ酸長であり、Ｌ３は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ４は、０アミノ酸長である。
【０１８０】
ＩＶ．結合タンパク質に関する使用
結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量化のための、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような任意の公知のアッセイ方法において用いることができる。結合タンパク質は、用いられているアッセイ方法にとって適当である親和性で、１つまたはそれ以上の標的抗原と結合する。
【０１８１】
診断適用のために、ある特定の実施形態では、結合タンパク質を検出可能な部分を用いて標識することができる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで産生可能である任意のものである。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、もしくは６７Ｇａのような放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンのような蛍光もしくは化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素である。
【０１８２】
結合タンパク質はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにとって有用である。検出可能な部分を用いて標識された結合タンパク質を、動物に、好ましくは、血流中に投与することができ、宿主における標識された抗体の存在および位置がアッセイされる。結合タンパク質を、核磁気共鳴、放射線学、または当技術分野で公知の他の検出手段によってなされるかどうかにかかわらず、動物において検出可能である任意の部分を用いて標識することができる。
【０１８３】
臨床または研究適用のために、ある特定の実施形態では、結合タンパク質を細胞毒製剤にコンジュゲートさせることができる。細胞毒製剤に連結された様々な抗体（すなわち、抗体−薬物コンジュゲート）を使用して、細胞毒性ペイロードを特定の腫瘍細胞に対して標的とした。細胞毒製剤と抗体に対してその製剤をコンジュゲートするリンカーは、当技術分野で公知である；例えば、Ｐａｒｓｌｏｗ，Ａ．Ｃ．ら（２０１６）  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ４：１４頁およびＫａｌｉｍ，Ｍ．ら（２０１７）  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．  １１：２２６５〜２２７６頁を参照されたい。
【０１８４】
本開示はまた、結合タンパク質および生体サンプルにおける標的抗原レベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照サンプル、ならびに検出試薬を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の任意の結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、ベクター系、および／または宿主細胞を含む組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、容器および容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含む。好適な容器として、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成される。容器は、それ自体でまたは別の組成物と組み合わせて、状態を処置、防止および／または診断するのに有効である組成物を保持し、かつ滅菌アクセスポートを有する（例えば、容器は、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルである）。一部の実施形態では、ラベルまたは添付文書は、選択した状態を防止、診断、および／または処置するために組成物が使用されることを示す。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、静菌性注射水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを含む、商業的およびユーザー的観点から望まれる他の材料をさらに含む場合がある。
【０１８５】
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、がんの処置または防止のために、それを必要とする患者に投与される。一部の実施形態では、本開示は、増殖性疾患または障害（例えば、がん）を防止および／または処置する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の結合タンパク質、またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも１つの治療有効量を患者に投与することを含む。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者の増殖性疾患または障害（例えば、がん）を防止および／または処置するための、本明細書に記載の結合タンパク質、またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者の増殖性疾患または障害（例えば、がん）を防止および／または処置するための医薬の製造において使用するための本明細書に記載の結合タンパク質、またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも１つに関する。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、Ｔ細胞表面のタンパク質に結合する１つの抗原結合部位および、例えば、上の項目ＩＩに記載されているように、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する別の抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位、ヒトＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合部位、およびヒトＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、がん細胞は、それらの細胞表面にヒトＣＤ３８アイソフォームＡポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）を発現する。一部の実施形態では、がん細胞は、それらの細胞表面にヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）を発現する。一部の実施形態では、がん細胞がそれらの細胞表面にヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチド（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む）を発現するため、患者は、処置のために選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、ＣＤ３８およびＣＤ２８を発現する。一部の実施形態では、がん細胞はＣＤ３８を発現するが、ＣＤ２８を発現しない。
【０１８７】
一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｈｅｒ２＋乳がんのような乳がん、前立腺がん、胚中心Ｂ細胞リンパ腫またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病である。ある特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞リンパ腫である。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫の処置のために、ダラツムマブおよびイサツキシマブのような抗ＣＤ３８抗体を試験してきた。しかし、多発性骨髄腫は処置可能であると考えられる一方で、ほとんどすべての患者で再発を避けることができず、処置−難治性疾患の発症をもたらす。一部の実施形態では、がんは、再発性または難治性多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、患者は、以前の多発性骨髄腫処置を用いて処置されてきた。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、多発性骨髄腫に関するファーストライン、セカンドライン、またはサードライン処置として患者に投与される。理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３結合タンパク質は、例えば、抗ＣＤ３８（または抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３８）による腫瘍細胞へのＴ細胞の動員、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によりエンゲージされたＴ細胞の活性化、および／またはパーフォリン／グランザイムベースの機構を介する腫瘍細胞の殺滅によって、多発性骨髄腫を処置するのに有用であると考えられる。ＣＤ２８は、多発性骨髄腫に対する新規がんマーカーとして報告されている。Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｒ．ら（２０１１）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８７：１２４３〜１２５３頁を参照されたい。
【０１８９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗がん治療（例えば、化学療法剤または治療のような、当技術分野で公知の任意の抗がん治療）と組み合わせて投与される（または投与されるべきである）。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１回またはそれ以上の抗がん治療の前に投与される（または投与されるべきである）。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１回またはそれ以上の抗がん治療と同時に投与される（または投与されるべきである）。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１回またはそれ以上の抗レトロウイルス治療の後に投与される（または投与されるべきである）。
【０１９０】
Ｖ．結合タンパク質治療用組成物およびその投与
結合タンパク質を含む治療用組成物または医薬組成物は、本開示の範囲内である。このような治療用組成物または医薬組成物は、治療有効量の結合タンパク質、または結合タンパク質−薬物コンジュゲートを、投与様式との適合性について選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤と混合して含む場合がある。
【０１９１】
許容可能な製剤材料は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
【０１９２】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有することができる。好適な製剤材料として、以下に限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのような）、抗微生物剤、抗酸化物質（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムのような）、緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸のような）、嵩高剤（マンニトールまたはグリシンのような）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンのような）、増量剤、単糖類、二糖類、および他の炭化水素（グルコース、マンノース、またはデキストリンのような）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは、免疫グロブリンのような）、着色剤、矯味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンのような）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムのような）、保存料（塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素のような）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのような）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールのような）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）のような）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールのような）、浸透圧増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム−またはマンニトールソルビトールのような）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバント（例えば、いずれかの目的のために、参照によって本明細書に組み入れる、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）および同一物のその後の版を参照されたい）。
【０１９３】
最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に応じて、熟練した技術者によって決定される。このような組成物は、結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出の速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を及ぼす場合がある。
【０１９４】
医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に、水性または非水性のいずれかである。例えば、注射用の好適なビヒクルまたは担体は、おそらくは非経口投与用組成物において一般的な他の材料を補充した、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液である。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な医薬組成物は、ソルビトールまたは好適な代用物をさらに含むことができる、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含む。本開示の一実施形態では、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意選択の製剤と混合することによって、結合タンパク質組成物を保存のために調製することができる。さらに、結合タンパク質は、スクロースのような適当な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０１９５】
本開示の医薬組成物は、非経口送達または皮下用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用または、経口的のような、消化管を介する送達用に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の範囲内である。
【０１９６】
製剤成分は、投与部位にとって許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨに、典型的には、約５から約８のｐＨ範囲内で維持するために使用される。
【０１９７】
非経口投与が企図される場合には、使用するための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の結合タンパク質を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容される水溶液の形態である。非経口注射用の特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中では、結合タンパク質が、適宜保存される滅菌等張性溶液として製剤化される。さらに別の調製は、製品の徐放または持続放出をもたらし、次いで、デポー注射によって送達することができる注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸のような）、ビーズ、またはリポソームのような薬剤を用いる、所望の分子の製剤化に関与する。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、循環における持続期間を促進する効果を有する。所望の分子の導入のための他の好適な手段として、埋め込み可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０１９８】
一実施形態では、医薬組成物を吸入用に製剤化することができる。例えば、結合タンパク質を吸入用の乾燥散剤として製剤化することができる。エアゾール送達用に噴射剤を用いて、結合タンパク質吸入溶液も製剤化することができる。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧することができる。
【０１９９】
ある特定の製剤を経口投与することができることも企図される。本開示の一実施形態では、この様式で投与される結合タンパク質を、錠剤およびカプセル剤のような固体剤型の配合において習慣的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。例えば、カプセル剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最小化される場合に、胃腸管において製剤の活性部分をその時点で放出するよう設計することができる。結合タンパク質の吸収を促進するために、追加の薬剤を含めることができる。希釈剤、矯味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も用いることができる。
【０２００】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物における、有効量の結合タンパク質に関与する場合がある。滅菌水、または別の適当なビヒクル中に錠剤を溶解することによって、溶液を単位用量形態で調整することができる。好適な賦形剤として、以下に限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムのような不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムのような結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクのような滑沢剤が挙げられる。
【０２０１】
持続送達または制御送達製剤中の結合タンパク質に関与する製剤を含む、本開示の追加の医薬組成物が当業者には明らかであると予想される。リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射液のような種々の他の持続送達または制御送達手段を製剤化するための技法も当業者に公知である。持続放出調製物の追加の例として、成型品形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスとして、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸を挙げることができる。持続放出組成物として、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも挙げることができる。
【０２０２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用されるべき医薬組成物は、典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合には、凍結乾燥および再構築前または後のいずれかで、この方法を使用する滅菌法を行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
【０２０３】
医薬組成物が製剤化されると、医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水されたもしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中で保存することができる。このような製剤は、すぐに使える形態で、または投与に先立って再構築を必要とする形態（例えば、凍結乾燥した）のいずれかで保存することができる。
【０２０４】
本開示は、単回用量投与単位を産生するためのキットも包含する。キットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含有することができる。また、単一および複数チャンバーの事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットも、本開示の範囲内に含まれる。
【０２０５】
治療上用いられるべき結合タンパク質医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に応じて変わる。よって、当業者であれば、処置のための適当な投薬量レベルは、幾分かは、送達される分子、結合タンパク質が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器の大きさ）および状態（年齢および全身の健康）に応じて変わることを認識していると予想される。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を用量設定し、投与経路を修正することができる。
【０２０６】
投薬頻度は、使用されている製剤中の結合タンパク質の薬物動態パラメータに応じて変わる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与することになる。したがって、組成物を、単回用量として、２回もしくはそれ以上の用量（同量の所望の分子を含有する場合も含有しない場合もある）として経時的に、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルによる連続注入として投与することができる。適当な投薬量のさらなる精緻化は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される課題の範囲内である。適当な投薬量は、適当な用量応答データの使用によって確認することができる。
【０２０７】
医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従うものであり、例えば、経口的に；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射によって；持続放出系によって；または埋め込みデバイスによって。所望の場合には、組成物をボーラス注射によって、または注入によって、もしくは埋め込みデバイスによって連続的に投与することができる。
【０２０８】
組成物は、その上に所望の分子が吸収されているかまたはカプセル化されている膜、スポンジ、または他の適当な材料の埋め込みによって局所投与することもできる。埋め込みデバイスが使用される場合には、デバイスは、任意の好適な組織または臓器中に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、持効性ボーラス、または連続投与によるものである。
【実施例】
【０２０９】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態の例示、およびその様々な使用である。それらは、単に説明目的で示され、決して本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【０２１０】
以下の用語は、特定の抗ＣＤ３８抗原結合ドメインまたは抗体を指すために、本発明の実施例および図面において互換的に使用される：
抗ＣＤ３８＿Ｃ２−ＣＤ３８−１：ｍＡｂ１
抗ＣＤ３８＿Ｃ２−ＣＤ３８−１＿ＶＨ１−ＶＬ１またはＣＤ３８ＶＨ１：ｍＡｂ２
抗ＣＤ３８＿Ｃ２−ＣＤ３８−１＿ＶＨ３−ＶＬ３：ｍＡｂ３
抗ＣＤ３８＿Ｃ２−ＣＤ３８−１＿ＶＨ５−ＶＬ３：ｍＡｂ４
抗ＣＤ３８＿Ｃ２−ＣＤ３８−１＿ＶＨ６−ＶＬ３：ｍＡｂ５
抗ＣＤ３８＿１３７０またはＣＤ３８ＨＨＹ１３７０：ｍＡｂ６
抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９またはイサツキシマブ：ｍＡｂ７。
【実施例１】
【０２１１】
モノクローナル抗ＣＤ３８抗体の生成および特徴付け
以下の実施例は、モノクローナル抗ＣＤ３８抗体の生成および特徴付けについて記載する。有利には、ヒトおよびサルＣＤ３８タンパク質と交差反応し、それによって安全性研究と臨床研究の両方のために使用することができる分子を提供する抗体が本明細書において提供される。これらの抗体は、アポトーシスおよび抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることも可能である。
【０２１２】
この実施例は、単一のマウスＢ細胞に由来するＣＤ３８特異的かつ交差反応性モノクローナル抗体を生成するための効率的ワークフローについて記載する。
【０２１３】
材料および方法
モノクローナル抗体の生成
ヒトＣＤ３８細胞外ドメインＲ４５−Ｉ３００（配列番号１）を使用して、ヒトＣＤ３８への抗体を生成した。Ｑ．Ｌｉｕ、Ｉ．Ｋｒｉｌｋｓｕｎｏｖ、Ｒ．Ｇｒａｅｆｆ、Ｃ．Ｍｕｎｓｈｉ、Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ、およびＱ．Ｈａｏ  ２００５  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３：：１３３１〜１３３９頁を参照されたい。ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む正常ＢａｌｂＣマウスまたはトランスジェニックＴｒｉａｎｎｉ  Ｍｉｃｅ（商標）（Ｔｒｉａｎｎｉ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）のいずれかに対して、免疫原を、免疫応答を刺激するためにアジュバントとともに直接投与した。
【０２１４】
異なるタグと点突然変異を有するアイソフォームＡに由来する様々な組換えＣＤ３８タンパク質を使用し（配列番号２、３、４、および２８）、Ｒ４５−Ｐ２０３由来のＣＤ３８細胞外ドメインを包含するＣＤ３８アイソフォームＥ（配列番号１０５）のタグ付けバージョンを使用した。哺乳動物細胞における一過的発現によってタンパク質を産生した。ＣＭＶエンハンサー／プロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルの下で、コーディングＤＮＡ配列を哺乳動物発現プラスミドへとクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ｋ９０００−１０）を、製造業者の使用説明書に従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ２９３発現システムを使用して、発現プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトした。
【０２１５】
マウスの免疫化および単一Ｂ細胞の選択
骨髄腫細胞に融合させずに、抗ＣＤ３８抗体もまた、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を使用して、ｍＡｂ１のようないくつかの抗ＣＤ３８抗体を得た（ＶＨおよびＶＬ配列については、それぞれ、配列番号５および６、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号７および８を参照されたい）。簡潔には、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓ０８２３４２；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、  ＭＥ）はそれぞれ、Ａ．  Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇら（１９９３  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １４３：１０５０〜１０５４頁）に記載された古典的方法を使用して、４１日をかけて３回の免疫化を受けた。マウスの腹側の部位に抗原を腹腔内投与した。最後の注射の３日後に、マウスを屠殺し、脾臓を無菌で単離し、新鮮なＲＰＭＩ培地で洗浄した。リンパ球を脾臓から放出させ、蛍光抗体と二重のヒトおよびサルＣＤ３８タンパク質のパネルを含む４色の選別戦略を使用して選別する前に、単一細胞の懸濁液をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー細胞選別を使用して分離し、ヒト／サル交差反応性ＩｇＧ−ＣＤ３８特異的Ｂ細胞を単離した。単一細胞をＰＣＲチューブへと直接選別し、ＲＴ−ＰＣＲによってＶＨおよびＶＬ遺伝子のコグネイト対を増幅させた（Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒ、Ｃ．ＢｕｓｓｅおよびＨ．  Ｗａｒｄｅｍａｎｎ  ２００９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５０：１８３〜１９３頁）。得られたＤＮＡをシークエンシングした。
【０２１６】
製造業者の使用説明書に従いＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ２９３発現システムを使用して、得られたＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞における一過的発現のためにそれぞれヒトＩｇＧ１またはヒトＣｋドメインをコードする哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。バッチをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）によって精製した。溶出液をＰＢＳに対して透析した後、滅菌濾過し、４℃で保存した。
【０２１７】
ヒト免疫グロブリン導入遺伝子マウスにおける免疫化による抗体の生成およびハイブリドーマ技法を使用する選択
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら  １９９７  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１３８９頁に記載されているヒトＣＤ３８の細胞外ドメインを有するＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を使用して、免疫化、融合およびスクリーニングを実施した。Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋらによって記載されたＲＩＭＭＳ方法を使用して、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む６〜８週齢の雌トランスジェニックＴｒｉａｎｎｉ  Ｍｉｃｅ（商標）はそれぞれ、３〜４日間隔で１４日かけて４回の免疫化を受けた。ＲＩＢＩのアジュバント（Ｓｉｇｍａ  番号Ｔ２６８４）中に乳化されたＣＤ３８タンパク質を、マウスの背に沿った流入領域リンパ節の近位の６つの部位および腹部に沿った６つの並列部位に皮下投与した。最後の注射の４日後に、マウスを屠殺した。両側の膝窩、浅鼠径、腋窩および上腕のリンパ節を無菌で単離し、新鮮なＲＰＭＩ培地で洗浄した。リンパ球をリンパ節から放出させ、ポリエチレングリコールを使用してＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３骨髄腫細胞と融合させる前に、単一細胞の懸濁液をＲＰＭＩ培地で２回洗浄した。融合後に、細胞混合物をインキュベーター中で、３７℃にて１６〜２４時間インキュベートした。得られた細胞調製物を選択的半固体培地中に移し、１００ｍｍのペトリ皿中に無菌でプレートアウトし、３７℃でインキュベートした。選択開始の１０日後に、ハイブリドーマの成長についてプレートを調査し、目に見えるコロニーをピックアップし、成長培地２００μＬを含有する９６ウェルプレート中に置いた。９６ウェルプレートを、インキュベーター中で、３７℃にて２から４日間保持した。この技法、および上述の免疫原を使用し、ｍＡｂ６のようないくつかの抗ＣＤ３８キメラ抗体を得た（ＶＨおよびＶＬ配列については、それぞれ、配列番号９および１０、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号１１および１２を参照されたい）。ＶＨおよびＶＬ配列をＲＴ−ＰＣＲによって回収し、上述したように一過的発現によってｍＡｂ６を産生した。
【０２１８】
可溶性ＣＤ３８細胞外ドメインに対する結合親和性
抗ｈｕＣＤ３８ｍａｂの結合特性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｕｐｐｓａｌａ、ＮＪ）を使用して評価した。簡潔には、ＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップを機器へとドッキングし、室温で、１：１のＮＨＳ／ＥＤＣ  ２５０μＬで活性化した。マウス抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  番号ＢＲ−１００８−３９）（０．０５Ｍの酢酸緩衝液中１３．５μｇ／ｍＬ、ｐＨ５）をフローセル１中の活性化チップ上で固定化した。固定化は、流速５μＬ／分で行った。次いで、エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）５５μＬの注射によってチップをブロックし、続いて、５０ｍＭのＮａＯＨ、１ＭのＮａＣｌで５回洗浄した。ヒトＣＤ３８タンパク質またはｃｙｎｏＣＤ３８タンパク質への抗ＣＤ３８ｍａｂの結合を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ）中２μｇ／ｍＬの抗体を使用した。抗原（ヒトＣＤ３８−ｈｉｓｔａｇ（ＩＤ２）またはｃｙｎｏＣＤ３８−ｈｉｓｔａｇ（ＩＤ３））を３から１０００ｎＭ注射した。注射期の完了後、同じ流速で３６０秒間、ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液中で解離をモニタリングした。５０ｍＭのＮａＯＨ−１ＭのＮａＣｌ  ３０μＬを使用して、注射間に表面を再生した。ＢＩＡｓｉｍｕｌａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、個々のセンソグラムを解析した。
【０２１９】
ヒトＣＤ３８発現ｐｒｅＢ細胞に対する結合親和性
組換えマウスプレＢ：：３００．１９細胞表面で発現されるＣＤ３８への抗ＣＤ３８抗体の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。組換え細胞株は、Ｊ．Ｄｅｃｋｋｅｔら  ２０１４  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：４５７４〜４５８３頁に記載されていた。マウスｐｒｅＢ：：３００．１９  ＣＤ３８発現細胞を、９６ウェルＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄプレート（ＭＳＤ  Ｌ１５ＸＢ−３）上に４０，０００細胞／ウェルでコーティングし、抗ＣＤ３８抗体１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；番号１０９−５４５−０９８）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  １００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで３回洗浄した。遠心分離とＰＢＳ中１％のＢＳＡ  ２００μｌ／ウェルを添加することによる細胞の再懸濁後に、抗体結合を評価し、Ｇｕａｖａ（登録商標）  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値を、それぞれ、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
【０２２０】
結果
ヒトＳＵ−ＤＨＬ−８またはＭＯＬＰ−８細胞への新たに単離したｍＡｂ１の結合を、フローサイトメトリーを使用して、イサツキシマブのものと比較した（図１Ａ）。両方の抗体は、両方の細胞株に対して高親和性の結合を示した。しかしながら、ｍＡｂ１だけが、それらの表面にカニクイザルＣＤ３８を発現する細胞に結合することができた（図１Ｂ）。
【０２２１】
ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインへの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、新たに単離された抗体ｍＡｂ１およびｍＡｂ６について調査した。ＳＰＲの結果を表Ａにまとめる。
【０２２２】
【表２７】
2020536543.tif 000029
【０２２３】
また、フローサイトメトリーを使用して、それらの細胞表面にヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現するマウスｐｒｅＢ細胞へのｍＡｂ１およびｍＡｂ６抗ＣＤ３８抗体の結合を調査した。結果を表Ｂに示す。試験した両方の抗体は、ｐｒｅＢ：：３００．１９  ｈｕＣＤ３８またはｃＣＤ３８発現細胞への高親和性の結合を示した。
【０２２４】
【表２８】
2020536543.tif 000030
【０２２５】
これらの結果は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの両方に、高い親和性で結合する抗体の生成を実証する。これらの抗体は、他のＣＤ３８抗体と異なり、可溶性細胞外形態の、または哺乳動物細胞表面で発現されたヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドと交差反応する。
【実施例２】
【０２２６】
ヒト化抗ＣＤ３８バリアントのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの設計
この実施例は、実施例１で生成した抗体のヒト化について記載する。
【０２２７】
ｍＡｂ１可変ドメインの配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで解析した。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（ＩＭＧＴ）の定義を使用して、相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。
【０２２８】
最初に、並行して、検索を行って、各可変鎖に対する最も類似するマウス生殖細胞およびヒト生殖細胞タンパク質配列の組合せを同定した。これは、マウスおよびヒト生殖細胞タンパク質配列データベースに対して、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９〜３４０２頁）検索を使用して実施した。各抗体鎖に対して、最も類似するＶおよびＪマウスおよびヒトタンパク質配列を見つけた。このタンパク質配列の高い同一性の定量は、Ｖ領域同一性パーセンテージによって測定した。ｍＡｂ１軽鎖および重鎖に対する検索の結果を、それぞれ、表ＣおよびＤに表す。
【０２２９】
【表２９】
2020536543.tif 000031
【０２３０】
【表３０】
2020536543.tif 000032
【０２３１】
次に、ｍＡｂ１の可変ドメイン配列を、脱アミド化、酸分解、酸化、またはイソアスパルテート形成部位のような配列ライアビリティ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）についてスクリーニングした。分子内または分子間でアミノ酸残基がどのように相互作用するかを定義するために、ｍＡｂ１の構造を、相同性による３Ｄモデリングによって解析した。この工程により、ＣＤＲの立体構造および抗原結合のようなｍＡｂ１の機能性について構造的に重要であるアミノ酸残基の群の特定が導かれた。これらのアミノ酸残基を、ヒト化ｍＡｂ１の可変配列に存在するよう選択した。
【０２３２】
親マウスｍＡｂ１由来のＣＤＲを、関連するフレームワーク上にグラフトした。上記解析に基づき、ＩＧＫＪ１＊０１と連結したヒトＩＧＫＶ３−２０＊０２およびＩＧＨＪ４＊０１と連結したヒトＩＧＨＶ１−３＊０１を、それぞれ、ｍＡｂ１可変軽鎖および可変重鎖のヒト化に対する基礎となるよう選択した。ｍＡｂ１軽鎖は、選択したヒトＩＧＫＶ３−２０＊０２生殖細胞と、Ｖ領域にわたって６４．５２％の同一性を示した。ｍＡｂ１重鎖は、選択したヒトＩＧＨＶ１−３＊０１生殖細胞と、Ｖ領域にわたって６９．３９％の同一性を示した。ヒト化プロセスの間、親マウスｍＡｂ１  ＣＤＲを、標準的抗体可変配列を再構成するために、選択された生殖細胞のフレームワーク間に移植した。上記で留意したように、その機能性に対して構造的に重要であるｍＡｂ１アミノ酸残基の以前に同定した群に注目した。必要な場合、これらのアミノ酸残基を、それらの正確に対応するｍＡｂ１残基によって新たに作成された配列中に再配置した。これは、適切な親配列のアミノ酸残基を組み込む逆突然変異工程に相当する。一部のＣＤＲ変異を、ヒト化と親ＣＤＲにおける配列ライアビリティを避けることとの両方のために組み込んだ。新たに作成された軽鎖および重鎖可変配列を使用して、ヒト化ｍＡｂ１可変領域の３Ｄ相同性モデルを生成した。３Ｄモデルは、ＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｓｕｉｔｅからのＭｏｄｅｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋを使用して構築した。
【０２３３】
ＣＤＲグラフトの手法に基づき、可変軽鎖に関する２つのバリアント（ＶＬ１およびＶＬ３）と可変重鎖に関する４つのバリアント（ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５およびＶＨ６）を生成した。ｍＡｂ１可変軽および重配列とそれらのヒト化バージョンの間で変化するアミノ酸残基の特定の組合せを、それぞれ、表Ｅと表Ｆに示す。
【０２３４】
【表３１】
2020536543.tif 000033
【０２３５】
【表３２】
2020536543.tif 000034
【０２３６】
配列番号１４を有するヒト化ＶＬ１バリアントは、配列番号６を有するｍＡｂ１配列の親ＶＬと比較して、合計２２個の変異（ＦＲに１８個およびＣＤＲに４個）を示す。このバリアントは、ｍＡｂの構造、ＣＤＲの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた８個の逆突然変異を有するＩＧＫＪ１＊０１に連結したヒト生殖細胞ＩＧＫＶ３−２０＊０２のフレームワークに由来した。親ＣＤＲの４つの位置が変異し、ヒト化速度が加速するかまたは配列ライアビリティが回避された。
【０２３７】
配列番号１８を有するヒト化ＶＬ３バリアントは、配列番号６を有するｍＡｂ１配列の親ＶＬと比較して、合計１８個の変異（ＦＲに１８個）を示す。このバリアントは、ｍＡｂの構造、ＣＤＲの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた８個の逆突然変異を有するＩＧＫＪ１＊０１に連結したヒト生殖細胞ＩＧＫＶ３−２０＊０２のフレームワークに由来した。
【０２３８】
配列番号１３を有するヒト化ＶＨ１バリアントは、配列番号５を有するｍＡｂ１配列の親ＶＨと比較して、合計１７個の変異（ＦＲに１４個およびＣＤＲに３個）を示す。このバリアントは、ｍＡｂの構造、ＣＤＲの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた１１個の逆突然変異を有するＩＧＨＪ４＊０１に連結したヒト生殖細胞ＩＧＨＶ１−３＊０１のフレームワークに由来した。親ＣＤＲの３つの位置が変異し、ヒト化速度が加速するかまたは配列ライアビリティが回避された。
【０２３９】
配列番号１７を有するヒト化ＶＨ３バリアントは、配列番号５を有するｍＡｂ１配列の親ＶＨと比較して、合計１４個の変異（ＦＲに１４個）を示す。このバリアントは、ｍＡｂの構造、ＣＤＲの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた１１個の逆突然変異を有するＩＧＨＪ４＊０１に連結したヒト生殖細胞ＩＧＨＶ１−３＊０１のフレームワークに由来した。
【０２４０】
配列番号２１を有するヒト化ＶＨ５バリアントは、配列番号５を有するｍＡｂ１配列の親ＶＨと比較して、合計１１個の変異（ＦＲに１１個）を示す。このバリアントは、ｍＡｂの構造、ＣＤＲの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた１４個の逆突然変異を有するＩＧＨＪ４＊０１に連結したヒト生殖細胞ＩＧＨＶ１−３＊０１のフレームワークに由来した。
【０２４１】
配列番号２３を有するヒト化ＶＨ６バリアントは、配列番号５を有するｍＡｂ１配列の親ＶＨと比較して、合計１２個の変異（ＦＲに１２個）を示す。このバリアントは、ｍＡｂの構造、ＣＤＲの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた１３個の逆突然変異を有するＩＧＨＪ４＊０１に連結したヒト生殖細胞ＩＧＨＶ１−３＊０１のフレームワークに由来した。
【０２４２】
得られた軽および重ヒト化可変配列を、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）データベース（（ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌ（２００５）  ３（３）ｅ９１頁）ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）に対する配列類似性に関してブラストし、いずれの配列も、そこに列挙された公知のＢまたはＴ細胞エピトープを一切含有しないことを確認した。
【０２４３】
ｍＡｂ１の完全なアミノ酸可変配列ならびにヒト化軽および重可変ドメインは、表Ｇに示される。これらのヒト化軽および重可変ドメインを組み合わせて、ｍＡｂ１の親可変ドメインのいくつかのヒト化バージョンを生成した。ｍＡｂ２可変ドメインは、ヒト化ＶＬ１と組み合わせたヒト化ＶＨ１の会合に相当する。ｍＡｂ３可変ドメインは、ヒト化ＶＬ３と組み合わせたヒト化ＶＨ３の会合に相当する。ｍＡｂ４可変ドメインは、ヒト化ＶＬ３と組み合わせたヒト化ＶＨ５の会合に相当する。ｍＡｂ５可変ドメインは、ヒト化ＶＬ３と組み合わせたヒト化ＶＨ６の会合に相当する。表Ｇに示されている三重特異性結合タンパク質を実施例４においてより詳細に説明する。
【０２４４】
１に上述したヒト化ＶＨおよびＶＬバリアントの対応するコーティングＤＮＡ配列を、実施例１に記載している一過的発現および精製のために、それぞれ、ヒトＩｇＧ１またはヒトＣｋドメインをコードする哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。ｍＡｂ１に由来する全長ヒト化抗ＣＤ３８バリアントのアミノ配列を、ｍＡｂ２（重鎖：ＨＣ１、配列番号１５；軽鎖：ＬＣ１、配列番号１６）、ｍＡｂ３（重鎖：ＨＣ３、配列番号１９；軽鎖：ＬＣ３、配列番号２０）、ｍＡｂ４ 重鎖：ＨＣ５、配列番号２２；軽鎖：ＬＣ３、配列番号２０）、およびｍＡｂ５（重鎖：ＨＣ６、配列番号２４；軽鎖：ＬＣ３、配列番号２０）として列挙する。
【実施例３】
【０２４５】
抗ＣＤ３８抗体の交差反応性およびアポトーシス誘導
次に、実施例２で生成したヒト化抗ＣＤ３８バリアントを、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドへの結合ならびにアポトーシス誘導について特徴付けた。
【０２４６】
材料および方法
アポトーシス誘導アッセイ
表示した抗体１．５μｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）を含む完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン）中で、３７℃にて２０時間、５％のＣＯ２とともに、２×１０５細胞／ｍＬの細胞をインキュベートした。製造業者の使用説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣで染色した。ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌとデータ解析のためのＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを有するＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）フローサイトメーター（いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、フローサイトメトリーによってサンプルを解析した。
【０２４７】
結果
上述したように産生した、選択された抗ヒトＣＤ３８抗体の結合特性を調査した（図２Ａ〜２Ｈ）。可溶性ヒトＣＤ３８およびカニクイザルＣＤ３８への抗体の結合を、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲを使用して調査した。ＥＬＩＳＡのデータを使用して、ヒト化抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ａ）、ｍＡｂ３（図２Ｃ）、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５（図２Ｅ）、およびヒト抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ６（図２Ｉ）について、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８への抗体結合のＥＣ５０を決定した。
【０２４８】
ＣＤ３８へのヒト化抗ＣＤ３８バリアントまたはヒト抗ＣＤ３８  ｍＡｂの結合も、上述のＳＰＲアッセイを使用して評価した。ＳＰＲデータを使用して、ヒト化抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ｂ）、ｍＡｂ３（図２Ｄ）、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５（図２Ｆ）、およびヒト抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ６（図２Ｈ）について、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８への抗体結合のＫＤおよびＫｏｆｆを決定した。結合データは表Ｋにまとめられ、すべての抗ＣＤ３８  ｍＡｂが、類似する結合の特徴でＣＤ３８に結合することを示す。
【０２４９】
【表３３】
2020536543.tif 000035
【０２５０】
ＣＤ３８発現細胞に結合するためのヒト化抗ＣＤ３８バリアントの能力を、上述のＦＡＣＳベースの結合アッセイを使用して評価した。ＦＡＣＳデータを使用して、ヒト化抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２（図２Ａ）、ｍＡｂ３（図２Ｃ）、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５（図２Ｅ）、およびヒト抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ６（図２Ｇ）について、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８への抗体結合のＥＣ５０を決定した。表Ｌに示されている結合データは、すべてのヒト化抗ＣＤ３８バリアントが、細胞表面のＣＤ３８に対して類似する結合親和性を示したことを示す。
【０２５１】
【表３４】
2020536543.tif 000036
【０２５２】
３つのアッセイからの結合データを、ヒトＶ領域に対するＶＨおよびＶＬドメインの配列同一性と一緒に、図２Ｉにまとめる。
【０２５３】
次に、アポトーシスを誘導する親ｍＡｂ１抗体およびｍＡｂ７の能力を調査した。両抗体は、アネキシンＶ染色とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みを増加させた。細胞の４０％は、ｍＡｂ７による処置後に、アネキシンＶとＰＩについて二重陽性となり、一方、ｍＡｂ１で処置した細胞の６０％が二重陽性であった。両抗体は、ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞において類似する濃度依存性アポトーシス効果を示した（図２Ｊ）。同様に、両抗体は、ＮＫ９２細胞の存在下で、ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞に対するＡＤＣＣ活性を促進させ（図２Ｋ）、３７℃で４時間後に、最大６０％の細胞傷害と４〜６ｐＭのＩＣ５０をもたらした（図２Ｌ）。
【０２５４】
ＣＤ３８アイソフォームＥをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定し、多発性骨髄腫の患者由来のＮＫ細胞、ＰＢＭＣ、およびＢＭＭＣならびにがん細胞株（ＭＯＬＰ−８、ＣＵ１７０２、およびＣＵ２３３２）からの転写レベルで検証した。ＣＤ３８アイソフォームＥについては、Ｈｕｍａｎ  ＲｅｆＳｅｑ転写物データベースリリース２０１３１２１６におけるＢＬＡＳＴＮ  ２．２．２６（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．  Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．  Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ、およびＤａｖｉｄ  Ｊ．  Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９〜３４０２頁）プログラムを使用する核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）データベースによるスクリーニングによって証明した。配列の低複雑度領域をマスキングすることなく、１００核酸残基長のストレッチに関してヒトＣＤ３８アイソフォームＡの核酸配列と少なくとも９８．５％の同一性を最小限とみなしてＢＬＡＳＴＮプログラムを適用した。このスクリーニングから強調される配列を、ヒトＣＤ３８遺伝子の転写形態（同じイントロン−エクソンのゲノム構造）であると検証されるように、ＣＤ３８遺伝子の遺伝子座に関して再編成した。ＣＤ３８アイソフォームＥの核酸配列は、ヒトＣＤ３８遺伝子の転写形態であると検証された配列のものであった。
【０２５５】
ヒトＣＤ３８アイソフォームＡとＥの両方に結合するための抗ＣＤ３８抗体の能力も調査した。ＣＤ３８アイソフォームＡおよびアイソフォームＥへの結合を評価するために、捕捉抗原としてアイソフォームＡおよびアイソフォームＥタンパク質（実施例１に記載したように調製した）を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ウェルのいずれかのアイソフォームでコーティングし、抗体１００μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するＰＢＳで５回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした１：２５，０００希釈の抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｆ：１０９−０３５−０９８）１００μＬを各ウェルに添加した。 ３７℃で１時間、暗所でのインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用してＥＣ５０値を推定した。
【０２５６】
ＣＤ３８アイソフォームＡ（配列番号１）およびアイソフォームＥ（配列番号１０５）への様々な抗体の結合親和性を、表Ｌ２に示されるように決定した。表Ｍは、様々な抗ＣＤ３８抗体に対する結合特性の比較を提供する。
【０２５７】
【表３５】
2020536543.tif 000037
【０２５８】
【表３６】
2020536543.tif 000038
【０２５９】
結論として、ｍＡｂ７とｍＡｂ１の両方は、ＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫細胞において類似するアポトーシス、ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞に対して類似する濃度依存性アポトーシス作用、およびＳＵ−ＤＨＬ−８細胞に対して類似する濃度依存性ＡＤＣＣ活性を誘導する。しかし、ｍＡｂ１だけが、ナノモル以下の親和性で、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８の両方に結合し、ＣＤ３８アイソフォームＡおよびＥに結合した。
【０２６０】
アポトーシスを誘導するヒト化抗ＣＤ３８バリアントの能力は、上述したように蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）によっても評価した。様々な機能特性を有するいくつかの抗ＣＤ３８抗体が以前に同定されているが、これらのうちのいくつかは、細胞増殖またはアポトーシスに関する直接的影響により、ＣＤ３８＋細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの殺滅を媒介することができる。図２Ｍに示されるようなアポトーシス誘導アッセイの結果。実施例１および２で生成したすべての抗体は、ｍＡｂ６を除いてアポトーシスを誘導することができた。抗ＣＤ３８抗体であるｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、およびｍＡｂ５は、ＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞においてアポトーシスの用量依存性誘導をもたらした；各抗体のＩＣ５０を図２Ｎから２Ｑに提供する。
【実施例４】
【０２６１】
三重特異性抗ＣＤ３８結合タンパク質の生成
次に、実施例１〜３に記載した選択した抗ＣＤ３８抗体の抗原結合ドメインの結合特性を、図３Ａに示した三重特異性形式において解析した。
【０２６２】
ＳＰＲを使用して、ＣＤ３８のコグネイトリガンドが他の抗原結合ドメインに結合した場合に、抗ＣＤ３８抗原結合ドメインをＣＤ３８に結合する能力について三重特異性形式（抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３）で試験した。連続的リガンド結合アッセイを図３Ｂに示す。それぞれの三重特異性Ａｂへの３つの抗原の連続的結合のために、飽和濃度（＞１０ＫＤ）の各抗原を８分間注射し、続いて、５分間解離させた。１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．５を３０μｌ／分で６０秒間注射することによって表面再生を行った。データを１：１動力学的結合モデルに適合させ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ｓ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ  １．０を使用して解析した。会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を使用して、平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。
【０２６３】
図３Ｃに示したように、このＳＰＲベースのアッセイは、ＣＤ３８のコグネイト抗原がまたＣＤ３および／またはＣＤ２８抗原結合ドメインに結合したか否かにかかわらず、三重特異性結合タンパク質がＣＤ３８に結合することができることを示した。例示的な連続的結合アッセイの結果を図４に示す。ＳＰＲによって測定される場合の動力学的パラメータを表Ｍ２に提供する。
【０２６４】
【表３７】
2020536543.tif 000039
【０２６５】
これらの結果は、３つすべての標的が同時に、三重特異性結合タンパク質に結合することができることを実証する。三重特異性結合タンパク質をＣＤ２８、ＣＤ３、またはその両方（いずれかの順序で）と事前結合させることによって、ＣＤ３８に対する結合動力学または結合親和性は変化しなかった。
【０２６６】
次に、ＣＤ３８ＳＢ１９×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質のそれぞれの抗原結合ドメインを、飽和した他の２つの抗原結合ドメインの有無にかかわらず、コグネイト抗原に結合する能力について、ＳＰＲによって評価した。表Ｍ３およびＭ４は、これらのアッセイの結果を示す。
【０２６７】
【表３８】
2020536543.tif 000040
【０２６８】
【表３９】
2020536543.tif 000041
【０２６９】
表Ｍ３およびＭ４で実証されるように、抗原との事前結合によって飽和した２つの標的を有することは、ＣＤ３８またはＣＤ２８に対する第３の標的の動力学または結合親和性に影響を及ぼさなかった。ＣＤ３結合の場合には、事前結合したＣＤ３８および／またはＣＤ２８は、より速い動力学をもたらした（ＫｏｎおよびＫｏｆｆ値におよそ４倍の影響を及ぼす）。
【０２７０】
抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを、２つの抗ＣＤ２８抗原結合ドメイン（スーパーアゴニスト、「ｓｕｐ」、および従来のアゴニスト、「ｃｎｖ」）および２つの抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（「ｍｉｄ」および「ｌｏｗ」）とともに三重特異性形式で試験した。これらの抗原結合ドメインに関する可変ドメイン配列を以下のように提供する：抗ＣＤ２８ｓｕｐ：配列番号４９（ＶＨ）および配列番号５０（ＶＬ）；抗ＣＤ２８ｃｖｎ：配列番号５１（ＶＨ）および配列番号５２（ＶＬ）；抗ＣＤ３ｍｉｄ：配列番号５３（ＶＨ）および配列番号５４（ＶＬ）；抗ＣＤ３ｌｏｗ：配列番号８４（ＶＨ）および配列番号８５（ＶＬ）。三重特異性結合タンパク質の結合を調査するＳＰＲアッセイの結果を図５に示す。三重特異性結合タンパク質形式において、３つの抗ＣＤ３８結合ドメインは、単一特異性形式とおおよそ同じ結合親和性を有した。両方のＣＤ３結合ドメインは、単一特異性、二重特異性、および三重特異性形式において、おおよそ同じ結合親和性を有した。ＣＤ２８結合ドメインは、単一特異性と比較して、二重特異性または三重特異性形式における結合親和性をわずかに低下させた（しがし、依然としてナノモルであった）。他の２つの抗原結合ドメインが飽和されている場合、抗ＣＤ３８ＳＢ１９および抗ＣＤ２８ｓｕｐ結合ドメインは、他の２つの抗原結合ドメインが抗原に結合していない場合と比較して、類似する結合親和性を有した。しかしながら、抗ＣＤ３ｍｉｄ結合ドメインは、他の２つの抗原結合ドメインが飽和されている場合、より速い動力学を示した。これらの結果は、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ３結合ドメインが、三重特異性結合タンパク質形式に関する使用に適合することを実証する。
【０２７１】
本発明において生成した抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを、ｍＡｂ７の既存の抗ＣＤ３８抗原結合ドメイン（それぞれ、ＶＨ配列については配列番号４７、ＶＬ配列については配列番号４８を参照されたい）に対しても比較した。組換えマウスｐｒｅＢ：：３００．１９細胞表面で発現されるＣＤ３８への三重特異性分子の結合をフローサイトメトリーによって決定し、対応する抗ＣＤ３８の一価の抗体を並行してアッセイした。組換え細胞株については、Ｊ．Ｄｅｃｋｋｅｔら  ２０１４  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：４５７４〜４５８３頁に記載されていた。マウスｐｒｅＢ：：３００．１９のＣＤ３８発現細胞を、９６ウェルＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄプレート（ＭＳＤ  Ｌ１５ＸＢ−３）上で、４０，０００細胞／ウェルでコーティングし、三重特異性分子１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；番号１０９−５４５−０９８）１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで３回洗浄した。遠心分離とＰＢＳ中１％のＢＳＡ  ２００μｌ／ウェルを添加することによる細胞の再懸濁後に、抗体結合を評価し、Ｇｕａｖａ（登録商標）  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値を、それぞれ、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
【０２７２】
上述したように、フローサイトメトリーを使用して、それらの表面にヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現するマウスｐｒｅＢ細胞への、ｍＡｂ７またはｍＡｂ７抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有する三重特異性結合タンパク質の結合について調査した。図６Ａに示されるように、ｍＡｂ７抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、ｍＡｂ７単一特異性抗体（右上）よりも８分の１低い見かけの親和性で、ヒトＣＤ３８を発現する細胞（左上）に結合した。ｍＡｂ７単一特異性抗体（右下）もｍＡｂ７抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有する三重特異性結合タンパク質（左下）もいずれも、カニクイザルＣＤ３８を発現する細胞に結合しなかった。
【０２７３】
ヒト化抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ２の結合ドメインも、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への結合について、三重特異性形式で試験した。図６Ｂ〜６Ｄに示されるように、ｍＡｂ７と異なり、ｍＡｂ２抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質、ならびにｍＡｂ２単一特異性抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの両方に結合することができた。ｍＡｂ２抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、親ｍＡｂ２抗体よりも９分の１低い見かけの親和性で（図６Ｃの上を図６Ｄの上と比較して）、ヒトＣＤ３８を発現する細胞に結合した。ｍＡｂ２抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、親ｍＡｂ２抗体よりも７．５分の１低い見かけの親和性で（図６Ｃの下を図６Ｄの下と比較して）、カニクイザルＣＤ３８を発現する細胞に結合した。ｍＡｂ２抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、ｍＡｂ２抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質よりも２．５分の１低い見かけの親和性で（図６Ｃの上を図６Ｂの上と比較して）、ヒトＣＤ３８を発現する細胞に結合した。
【０２７４】
ヒト化抗ＣＤ３８抗体ｍＡｂ６の結合ドメインも、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への結合について、ｍＡｂ６単一特異性抗体に対して比較した。ｍＡｂ６単一特異性抗体は、ｎＭの範囲でヒト（右上）またはカニクイザル（右下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合したが（図６Ｅ）、ｍＡｂ６抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有するＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、飽和していないヒト（左上）またはカニクイザル（左下）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合した。
【０２７５】
結論として、ヒトＣＤ３８へ結合するＣＤ３８ＳＢ１９×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質に関する親和性は、ＳＰＲによって組換えヒトＣＤ３８への結合を調査したかまたはフローサイトメトリーによって細胞表面で発現されるヒトＣＤ３８への結合を調査したかにかかわらず、同じ範囲内にあることが分かった（図６Ｆ）。同様に、ヒトＣＤ３８への結合に対するＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ／ｌｏｗ（ｍＡｂ２の抗ＣＤ３８結合ドメイン）およびＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ／ｌｏｗ三重特異性結合タンパク質（ｍＡｂ２の抗ＣＤ３８結合ドメイン）の親和性も、両方のアッセイで同じ範囲内であった。ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ（ｍＡｂ６の抗ＣＤ３８結合ドメイン）では、ヒトＣＤ３８に結合するためのＫＤを、ＳＰＲによって１ｎＭであると決定したが、正確なＥＣ５０値はフローサイトメトリーによって推定することができなかった。様々な抗ＣＤ３８結合ドメインを有する三重特異性結合タンパク質の見かけのＫＤ値（ＦＡＣＳ分析によって得られる）の概要を表Ｍ５に提供する。
【０２７６】
【表４０】
2020536543.tif 000042
【０２７７】
期待されたように、抗ＣＤ３８結合ドメインを欠くΔＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合しなかった（図６Ｇ）。このことは、このアッセイで観察された結合が、ＣＤ３８抗原結合ドメインに対して特異的であったことを示す。
【実施例５】
【０２７８】
抗ＣＤ３８  ｍＡｂ２および抗ＣＤ３８  ｍＡｂ６を含有する三重特異性結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの特徴付け
以下の実施例は、ｍＡｂ２およびｍＡｂ６抗体に由来する可変ドメインを含有する新規Ｔ細胞エンゲージャーの安定性、結合特性、および活性を特徴付けるための実験について記載する。三重特異性結合タンパク質の抗ＣＤ３８、ＣＤ３およびＣＤ２８アームのバリアントを含む追加の抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３抗体を生成した。新規の抗ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体は：１）抗ＣＤ３８結合ドメイン（ｍＡｂ２またはｍＡｂ６）；２）抗ＣＤ３結合ドメイン（ＣＤ３ｈｉｇｈまたはＣＤ３ｌｏｗ；それぞれ、抗ＣＤ３ｌｏｗ  ＶＨおよびＶＬ配列についての配列番号８４および８５を参照されたい）；３）抗ＣＤ２８結合ドメイン（ＣＤ２８ｓｕｐまたはＣＤ２８ｃｖｎ）において異なる。可能な組合せ内で、抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３の回収を設計し、産生し、次に、様々な機能について試験した。
【０２７９】
材料および方法
三重特異性結合タンパク質の産生および精製
製造業者の使用説明書に従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、４つの発現プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞へと一過的にトランスフェクションすることによって、三重特異性結合タンパク質を産生した。簡潔には、２５％（ｗ／ｗ）の各プラスミドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、予め希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬と、室温（ＲＴ）で２０〜３０分間混合し、Ｅｘｐｉ２９３細胞中に添加した（２．５×１０６細胞／ｍｌ）。良好な収率および純度を有する三重特異性結合タンパク質を産生するために、プラスミドの最適な比率を決定するためのトランスフェクションの最適化が使用されることが多かった。
【０２８０】
トランスフェクションの４〜５日後、トランスフェクト細胞からの上清を回収し、０．４５μｍのフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過した。上清中の三重特異性結合タンパク質を、３工程手順を使用して精製した。最初に、タンパク質Ａアフィニティー精製を使用し、結合したＡｂを「ＩｇＧ溶出緩衝液」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶出した。第２に、生成物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して終夜透析し、ＰＢＳ緩衝液を２回交換した。次の工程の前に、０．４５μｍのフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通す濾過によって、すべての沈殿物を清澄化した。第３に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製（Ｈｉｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、またはＨｉｌｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して凝集物を、分取で異なる種を除去した。画分を還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、それらを組み合わせる前に単量体三重特異性結合タンパク質を含有する画分を特定した。精製抗体をアリコートし、−８０℃で長期間保存した。
【０２８１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
精製抗体の結合特性を、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲのいずれかの方法を使用して解析した。ＥＬＩＳＡでは、三重特異性結合タンパク質の各結合部位に対応する抗原を使用して、４℃で終夜９６ウェルＩｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ  ４３９４５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコーティングした（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２μｇ／ｍｌの各抗体を使用する）。ＰＢＳ中５％のスキムミルク＋２％ＢＳＡを使用して、ＲＴで１時間、コーティングしたプレートをブロックし、続いて、ＰＢＳ＋０．２５％のＴｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した（Ａｑｕａ  Ｍａｘ  ４００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。抗体（三重特異性および対照のＡｂ）の連続希釈液を調製し、ＥＬＩＳＡプレート上に添加し（二連で１００μｌ／ウェル）、ＲＴで１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ＋０．２５％のＴｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄した。
【０２８２】
洗浄後、ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗ヒトＦａｂ（１：５０００、カタログ番号１０９−０３５−０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ）を各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．２５％のＴｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄した後、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４  ５０μｌを添加することによって反応を終結させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ４５０を測定し、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して解析した。最終データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移し、示したようにプロットした。同じソフトウェアを使用してＥＣ５０を計算した。
【０２８３】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＣＤ３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＬＬＣ  カタログ番号０３−０１−００５１）、ＣＤ２８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＬＬＣ  カタログ番号０３−０１−０３０３）、およびＣＤ３８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＬＬＣ  カタログ番号０３−０１−０３６９）への
抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体またはアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ４）の結合を決定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした抗Ｆａｂ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ  番号１０９−０３５−０９７）を使用して、結合した抗体を検出した。
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死滅アッセイ
様々な三重特異性結合タンパク質を使用する様々ながん細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイのために、精製されたヒトＰＢＭＣを使用していた。簡潔には、９６ウェルＶ底プレートにおいて死滅アッセイを設定した。各プレートについて、各ドナーからのＰＢＭＣ  ４０ｍｌを２×１０＾６細胞／ｍｌでプレーティングし、２．５ｘ１０＾５細胞／ｍｌのＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ  番号ＭＩＮＩ２６）３０ｍｌで標識した標的細胞（最大１×１０＾７個の細胞を染色するための色素４μＬ）を調製した。最初に、様々な濃度の２０μＬ／ウェルの試験タンパク質またはＰＭＡを、各ウェル中に添加し、続いて、８０μＬ／ウェルの標識された標的細胞を、各ウェル中に添加した（２×１０＾４細胞／ウェル）。次いで、ＰＢＭＣ  １００μＬを、各ウェルに添加し、Ｅ：Ｔ＝１０：１ウェル（２×１０＾５細胞／ウェル）に達し、３７℃にて５％のＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。細胞を遠沈させ、上清をサイトカイン放出を測定するために回収するか、または破棄した。細胞を、Ｖｉｖｉｄ  ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  ＶｉｏｌｅＴ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  番号Ｌ３４９５５）を用いて染色した（染色緩衝液は、Ｖｉｖｉｄ試薬６０μＬをＰＢＳ  ６０ｍｌ中添加することによって調製した）。暗所でＲＴにて１５分間のインキュベーションによって細胞を染色緩衝液１００μＬ中に再懸濁した。細胞を１×ＰＢＳを用いて洗浄した後、細胞を０．５％パラホルムアルデヒドを有するＰＢＳ  ２００μＬ中に再懸濁し、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によってＰＫＨ２６＋Ｖｉｖｉｄ＋がん細胞を回収し、続いて、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して解析した。死滅のパーセンテージを、特定の死滅−特発性死滅／総細胞として計算し、示されるようにプロットした。 
【０２８５】
サイトカイン放出アッセイ
ＣＤ３４＋臍帯細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性化アッセイにおいて炎症性サイトカイン濃度を測定するために、および毒性研究のために、細胞培養上清を回収し、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｉｔｙ  Ｔ細胞  １３−ｐｌｅｘキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して製造業者のプロトコールに従って血清サンプルを希釈した。次に、これらをＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）システム、およびＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｔ  ５．１ソフトウェアによって解析した。
【０２８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルおよび有効性の研究
ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を移植されたＮＳＧマウス（ｈｕ−ＣＤ３４）を、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルとして使用した。これらのマウスは、複数系統のヒト免疫細胞を発達させ、癌免疫療法有効性研究の検証されたプラットフォームである（例えば、Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ら（２０１４）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．  ２０１４：６９４〜７０８頁を参照のこと）。ｈｕ−ＣＤ３４＋  ＮＳＧマウスは、ＣＤ３４＋造血幹細胞を注射することによって作成され、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびいくつかの他の集団を含むヒト免疫細胞集団の有効な複数系統移植を示す（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｓ．Ｐ．ら（２０１０）  Ｂｌｏｏｄ  １１６：１９３〜２００頁）。複数系統造血発生は１２週間以内に起こる。移植は、移植片対宿主病を伴わず、１年間にわたって安定である。
【０２８７】
ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスを使用する有効性研究のために、マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）から購入し、使用前にヒト細胞集団を検証した。一般的に、各マウスにおいて腫瘍を接種するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（５０％ｖ／ｖ）中で混合した５×１０６個の腫瘍細胞を使用した。腫瘍の大きさが１００〜１５０ｍｍ３の範囲に達すると、マウスを研究用に選択し、各群に無作為化した。抗体を、週に３回、所与の用量で静脈内に与えた。体重を週に１〜３回モニターした。腫瘍の大きさを、ノギス腫瘍測定によって週に１〜３回測定した。腫瘍の大きさが１，５００ｍｍ３に達した場合、または最終投与の２４時間後に、すべてのマウスを終結させた。最終血液サンプル（０．３ｍＬ）を、血清セパレーターチューブ中に回収し、穏やかに５回反転することによって混合し、チューブラックに入れた。最終腫瘍も回収し、秤量し、その後、免疫組織化学解析のために固定液中に入れた。
【０２８８】
ヒトＰＢＭＣヒト化（ｈｕ−ＰＢＭＣ）ＮＳＧマウスを、別のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルとして使用した。これらのマウスは、健常なドナー由来の精製ヒトＰＢＭＣを注射することによって作成され、これらは、成人末梢血単核細胞を使用すると最も速い移植速度を有し、強力なエフェクターおよびメモリーＴ細胞ならびにＮＫ細胞の機能を必要とする短期間の研究を可能にし、移植片対宿主病による短期間有効性研究（３〜４週間）に好適である。
【０２８９】
ｈｕ−ＰＢＭＣ  ＮＳＧマウスを使用する有効性研究のために、８〜１０週齢のＮＳＧマウス（カタログ番号：００５５５７、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）から購入した。各マウスの皮下に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（５０％ｖ／ｖ）中で混合した５×１０６個の腫瘍細胞を接種した。腫瘍の大きさが５０〜１００ｍｍ３の範囲に達すると、健常なドナー由来の１０×１０６個のヒトＰＢＭＣを各マウスに対して腹腔内に（ＩＰ）再構成させた。翌日、ヒト細胞再構成を検証した。腫瘍の大きさが１００〜１５０ｍｍ３の範囲に到達すると、マウスを研究用に選択し、各群に無作為化した。抗体を、週に３回、所与の用量で静脈内に与えた。体重を週に１〜３回モニターした。腫瘍の大きさを、ノギス腫瘍測定によって週に１〜３回測定した。腫瘍の大きさが１，５００ｍｍ３に達した時点、または最終投与の２４時間後に、すべてのマウスを終結させた。最終血液サンプル（０．３ｍＬ）を、血清セパレーターチューブ中に回収し、穏やかに５回反転することによって混合し、チューブラックに入れた。最終腫瘍も回収し、秤量し、その後、免疫組織化学解析のために固定液中に入れた。
【０２９０】
播種ｈｕ−ＰＭＢＣ  ＮＳＧマウスモデルでは、１〜５×１０６個の細胞を、０日目に各マウス中に静脈内注射した。３日目にベースラインの輝度イメージングを無作為化のために得た。４日目に、健常なドナー由来の１０×１０６個のヒトＰＢＭＣを各マウスに対して腹腔内に（ＩＰ）再構成させた。５、１２、１９日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、１０、１７、２４日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
【０２９１】
結果
３つの標的抗原すべてに結合する抗体の能力をＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｌｏｗ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｌｏｗ  ＩｇＧ４は、ヒトおよびサルのＣＤ３およびＣＤ３８に対して類似する結合親和性を示したが、ＣＤ２８ｓｕｐに関して、ＣＤ２８（ヒトおよびサルは、同一の細胞外ドメインを有する）に対する可変結合親和性は、より良好な親和性を示した（図７Ａ）。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントならびにＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｐ３２９ＡおよびＮＮＡＳバリアントはすべて、ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ３８に対して類似する結合を示した（図７Ｂ）。
【０２９２】
次に、三重特異性抗ＣＤ３８×ＣＤ３×ＣＤ２８結合タンパク質バリアントを、Ｔ細胞活性化および抗体介在性腫瘍細胞死滅を誘導するそれらの能力について試験した（図８Ａ〜８Ｄ）。図８Ａは、Ｅ：Ｔ＝１０の３名の異なるドナー由来のＰＢＭＣを使用して、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６に対するＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの死滅活性を示す。死滅活性のＥＣ５０を計算し、表Ｎにまとめた。ＣＤ２８ｓｕｐを含有する抗ＣＤ３８×ＣＤ３×ＣＤ２８三重特異性結合タンパク質は両方、より良好な死滅活性を示した。これらの分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの死滅活性もＮＣＩ−Ｈ９２９（図８Ｂ）、ＫＭＳ−２６（図８Ｃ）、およびＫＭＳ−１１細胞株を使用して調査した（図８Ｄ）。
【０２９３】
ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｐ３２９ＡおよびＮＮＡＳバリアント、またはＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントを有する抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８三重特異性結合タンパク質はまた、多発性骨髄腫ＫＭＳ−１１（図８Ｅ）およびＵ２６６（図８Ｆ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの死滅を示した。各細胞株に対する各抗体に関するＥＣ５０を計算し、表Ｑ２（ＫＭＳ−１１）およびＱ３（Ｕ２６６）にまとめた。
【０２９４】
図９Ａ、９Ｂ、および１０は、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４およびＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｌｏｗ  ＩｇＧ４のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞活性化プロファイルを示す。両抗体は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞について類似する活性化の活性を示した。各細胞株に対する各抗体に関するＥＣ５０を計算し、表Ｎ（ＲＰＭＩ−８２２６）、表Ｏ（ＮＣＩ−Ｈ９２９）、表Ｐ（ＫＭＳ−２６）、および表Ｑ（ＫＭＳ−１１）にまとめた。
【０２９５】
【表４１】
2020536543.tif 000043
【０２９６】
【表４２】
2020536543.tif 000044
【０２９７】
【表４３】
2020536543.tif 000045
【０２９８】
【表４４】
2020536543.tif 000046
【０２９９】
【表４５】
2020536543.tif 000047
【０３００】
【表４６】
2020536543.tif 000048
【０３０１】
Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ，Ｒ．ら（２００７）（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７９：３３２５〜３３３１頁）に記載の方法を使用して、プレートを表示した抗体でコーティングし、続いて、２種の濃度の試験抗体（５μｇ／ｍｌおよび２５ｎｇ／ｍｌ）を使用して、ヒトＰＢＭＣと２４時間インキュベートすることによって、三重特異性結合タンパク質バリアントによって誘導されるサイトカイン産生についても調査した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。２４時間の培養上清を回収し、上記したように上清中のＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、およびＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの濃度を測定するために使用した。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４はすべて、５μｇ／ｍｌの有意なレベルのＩＬ２、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの産生を刺激したが、２つのヒト化ＮＳＧマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す用量である、２５ｎｇ／ｍｌの測定可能なレベルのいずれのサイトカインの誘導にも失敗した。
【０３０２】
上述したように、抗腫瘍活性を三重特異性結合タンパク質バリアントに関してｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルで試験した（図１２Ａ〜１３Ｆ）。図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒトＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６を移植したヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を移植したＮＳＧマウス（ｈｕ−ＣＤ３４）モデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験の結果を示す。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４およびベンチマーカー対照ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体を使用して、表示した用量を３ＱＷ（合計６用量）で、腫瘍保有マウスを処置した。各マウスに関する体重および腫瘍成長を測定し、プロットした（図１２Ａおよび１２Ｅ）。各群に関する平均腫瘍成長曲線（図１２Ｄ）、１８日目の腫瘍体積（図１２Ｂ）および１９日目の最終腫瘍重量（図１２Ｃ）もプロットした。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４で処置したすべての群は、ＰＢＳ対照と比較した統計的有効性を示しただけでなく、対照のＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体と比較した１μｇ／ｋｇの統計的により良好な有効性も示した。
【０３０３】
図１３Ａ〜１３Ｆは、ヒトＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６と移植したヒトＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスモデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験の結果を示す。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４およびベンチマーク対照ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体を使用して、表示した用量を３ＱＷ（合計８用量）で、腫瘍保有マウスを処置した。各マウスに関する腫瘍成長を測定し、プロットした（図１３Ａ）。各群に関する平均腫瘍成長曲線（図１３Ｆ）、４日目の腫瘍体積（処置の開始日；図１３Ｂ）、２１日目の腫瘍体積（最終処置の日；図１３Ｃ）、２１日目の平均腫瘍体積（図１３Ｄ）および２２日目の最終腫瘍重量（図１３Ｅ）もプロットした。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４で処置したすべての群を、ＰＢＳ対照と比較して統計的有効性を示しただけでなく、対照のＣＤ３８×ＣＤ３二重特性抗体と比較した複数用量で統計的に良好な有効性も示し、三重特異性抗ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による優れたｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を示した。
【０３０４】
ベンチマーク対照ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体は、以下の配列を含んだ：
配列番号１０８：ベンチマーク重鎖１（ＣＤ３８に結合する）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＳＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＮＰＱＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＧＮＷＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＤＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＫＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＥＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＤＶＳＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＤＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＥＱＧＤＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１０９：ベンチマーク重鎖２（ＣＤ３に結合する）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＫＳＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＫＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＱＭＴＫＮＱＶＫＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１１０：ベンチマーク軽鎖（ＣＤ３８に結合する）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【実施例６】
【０３０５】
抗ＣＤ３８  ｍＡｂ２およびｍＡｂ６含有三重特異性結合タンパク質に関する用量漸増研究
材料および方法
すべてのＮＨＰ研究は、Ｃｏｖａｎｃｅ  ＩＣＵＣＡプロトコールに従って、Ｃｏｖａｎｃｅ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）によって行った。薬物およびタンパク質ナイーブまたはタンパク質ナイーブ雄カニクイザルをすべての研究において使用した。研究設計に基づき、各三重特異性結合タンパク質について、サルを選択し、グループ化した。伏在静脈を介して、１時間、静脈内注入することによって抗体を与えた。漸増用量を、低用量（＜１０μｇ／ｋｇ）で連日与えたが、１〜２日の間隔を空けて、観察を目的として高用量（＞１０μｇ／ｋｇ）で与えた。特定したように、各投与後に、すべての動物に関して、注入開始から０時間目（１日目のみ）、０．５時間目（中間の注入）、１、および６時間目に血液サンプルを回収した。追加の予定外の血液サンプルを、研究責任者、病理学者、および／または臨床獣医師の裁量で回収した。６０日目に、すべての動物をコロニーに返却した。標準的方法を使用して、ＰＢＭＣと血清を血液サンプルから調製し、将来の解析のために保存した。
【０３０６】
処置した非ヒト霊長類由来の血液を、Ｔ細胞マーカーおよびヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片に対して蛍光的にコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
【０３０７】
結果
ｍＡｂ２含有ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、およびｍＡｂ６含有ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ｍＡｂ２含有ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、およびｍＡｂ６含有ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４三重特異性結合タンパク質を使用する用量漸増毒性研究を非ヒト霊長類で行った。４つの結合タンパク質における３つの結合ドメインはすべて、カニクイザルＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８ポリペプチドと交差反応性である。分子の潜在的毒性プロファイルを評価するためにこの研究を考案した。血清およびＰＢＭＣの単離のために血液サンプルを回収した。Ｔ細胞亜集団の活性化（ＣＤ６９＋）（図１４Ａ〜１４Ｄ）と一緒に、循環Ｔ細胞集団を各投与後に調査した（図１４Ｅ〜１４Ｈ）。循環するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージは、用量漸増とともに低下した。有意なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞活性化は、２．５μｇ／ｋｇの用量での開始で顕著であり、ｍＡｂ２およびｍＡｂ６含有分子に関する有効な活性化能力を示唆した。有意な循環Ｔ細胞の欠失は、１２．５μｇ／ｋｇのすべてのタンパク質で見られ（図１４Ｉ〜１４Ｌ）、再度、有効性と相関した。循環Ｔ細胞の欠失はむしろ一過的であり、２４〜４８時間後に処置前のレベルに戻った（図１４Ｍ〜１４Ｐ）。いくつかのサイトカインの血清レベルも測定した。すべての分子に関して１２．５μｇ／ｋｇで、有意なＩＬ−６およびＩＬ−１０放出が確認されたが、これはむしろ一過的であり、２４時間でベースラインに戻った（図１４Ｕ）。
【０３０８】
ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４（図１４Ｖ）およびＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４（図１４Ｗ）は両方、より高い用量で、血中のＴ細胞の欠乏を誘導した。同様に、ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４（図１４Ｘ）およびＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４（図１４Ｙ）もまた、より高い用量で、血中のＴ細胞の欠乏を誘導した。しかし、Ｔ細胞は、４つの三重特異性結合タンパク質のいずれかで処置した２４時間後の血中に再度出現し始めた（図１４Ｚ〜１４ＡＣ）。図１４ＡＤおよび１４ＡＥは、１００μｇ／ｋｇ用量投与後のＣＤ４＋Ｔ細胞に結合したＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４の量を示す。図１４ＡＦおよび１４ＡＧは、１００μｇ／ｋｇ用量投与後のＣＤ８＋Ｔ細胞に結合したＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４の量を示す。これらのデータにより、三重特異性Ａｂ  ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４が、時間を延長した場合（４８〜７２時間）に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞に結合することができることが明確に実証された。
【実施例７】
【０３０９】
Ｆｃバリアントによる薬物動態／薬力学の最適化
材料および方法
Ｃ末端６−Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＦｃγ  ＲＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号１２５７−ＦＣ−０５０）、Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＦｃγ  ＲＩＩＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号１３３０−ＣＤ−０５０／ＣＦ）およびＣ末端ＨＰＣ４タグ付き組換えヒトＦｃγＲＩＩＩ（Ｖ１５８またはＦ１５８）をＢｉａｃｏｒｅチップに捕捉した。２００、１００および５０ｎＭの抗体を２分間注射し、続いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２００を使用して、３０μＬ／分の流速で、ＨＢＳ−Ｐ＋、２ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）緩衝液中で２分解離された。２００ｎＭの結合曲線を示した。
【０３１０】
Ｃ末端ＨＰＣ４タグ付き組換えヒトＮｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して、様々なＦｃ修飾を有する三重特異性結合タンパク質の結合特性を測定した。簡潔には、組換えヒトＮｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）を使用して、終夜、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ８００４０ＬＥ）をコーティングした（ＰＢＳ中２ｕｇ／ｍｌ）。様々なＦｃ修飾を有する連続希釈した三重特異性結合タンパク質を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体ともに洗浄およびインキュベートした。
【０３１１】
結果
次に、上述の三重特異性結合タンパク質のバリアントを、薬物動態（ＰＫ）／薬力学（ＰＤ）を最適化するために様々なＦｃ受容体への結合についてアッセイした。
【０３１２】
ヒトＦｃバリアントを、上述したように、ＦｃγＲ  Ｉ（図１５Ａ）、ＦｃγＲ  ＩＩａ（図１５Ｂ）、およびＦｃγＲ  ＩＩＩｂ／ｃ（図１５Ｃ）への結合について特徴付けた。試験したバリアントは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、および対照三重特異性結合タンパク質に関してＦＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ４（ＥＵインデックスに従い、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）であった。
【０３１３】
図１５Ａ〜１５Ｃにおいて示したように、野生型ＩｇＧ１およびＩｇＧ４は、以前に報告されたように、ＦｃγＲ  ＩおよびＦｃγＲ  ＩＩａに結合することができるが、ＦｃγＲ  ＩＩＩｂ／ｃには結合することができなかった。ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ変異によって、ＦｃγＲ  ＩおよびＦｃγＲ  ＩＩａ結合が排除された。理論に拘束されることを望むものではないが、ＦｃγＲ  ＩおよびＦｃγＲ  ＩＩａ結合を排除することによって、Ｆｃ／ＦｃγＲの相互作用を介する意図しないクラスター形成を取り除くことによりＰＫ／ＰＤを改善することができると考えられる。
【０３１４】
次に、ＦｃＲｎへの結合についてＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントを調査した。野生型ＩｇＧ４と同様に、バリアントはＦｃＲｎに結合した（図１６）。これらの結果により、ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ変異が、ＩｇＧ４とＦｃＲｎの間の相互作用に影響を及ぼさないことが実証され、結合タンパク質の半減期に関する最小限の影響を意味する。
【０３１５】
ＮＳＧマウスにおいて決定されたように、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４ＦＡＬＡ、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｐ３２９Ａ、およびＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡのＰＫパラメータを図１７にまとめる。ＩｇＧ４  Ｆｃの改変により、マクロファージに豊富に存在するＮＳＧ−特異的ＦｃγＲＩへの結合を排除することによる、ＮＳＧマウスにおける半減期およびＡＵＣの有意な改善が示された。
【実施例８】
【０３１６】
抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化およびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
材料および方法
ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出
ヒトＰＭＢＣを、１００ｐＭの結合タンパク質と２４時間インキュベートした。上清を回収し、Ｄｒｏｐ  Ａｒｒａｙプレートを使用するＬｕｍｉｎｅｘによって、サイトカインを測定した（三連で）。腫瘍標的細胞を使用する実験では、ヒトＰＭＢＣを、１０：１のＥ：Ｔ比で、２４時間、抗体１００ｐＭと（ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞の有無にかかわらず）インキュベートした。ＰＭＢＣを三重特異性タンパク質とともにインキュベートした後、上清を回収し、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）  ＭＡＰキットを用いてサイトカインについてアッセイし、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍで解析した。
【０３１７】
Ｂｃｌ−ｘＬアッセイ
ＰＢＭＣから負選別（磁性）したＴ細胞を、１００ｎＭのプレートに結合したＡｂとともに、１日間インキュベートした。次いで、Ｔ細胞を洗浄し、Ｔ細胞マーカーおよびＢｃｌ−ｘＬに特異的な蛍光的にコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
【０３１８】
Ｔ細胞の増殖
ＰＢＭＣから負選別した（磁性ビーズ細胞分離）Ｔ細胞を、プレートに結合したＡｂ（１００ｎＭ）とともに、１から６日間インキュベートした。インキュベーション開始の特定日数後に、ビーズの計数を使用するフローサイトメトリーによって、細胞総数を計数した。０日目の細胞計数（５００細胞／ｕＬ）から倍率変化を計算した。結果は３名のＰＢＭＣドナーに由来する。
【０３１９】
ＩＬ−２の発現
ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＩＬ２−ｌｕｃ２Ｐ  Ｊｕｒｋａｔ細胞を、三重特異性タンパク質と６時間インキュベートし、次いで、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を検出した。
【０３２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化におけるＰＢＭＣ
抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体または対照のＩｇＧ４結合タンパク質で処置したヒトＰＢＭＣ細胞の活性化（ＣＤ６９＋）を決定した。
【０３２１】
播種腫瘍モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
播種ｈｕ−ＰＭＢＣ  ＮＳＧマウスモデルでは、１〜５×１０６個の細胞を、０日目に各マウス中に静脈内注射した。３日目に、ベースラインの輝度イメージングを無作為化のために得た。４日目に、健常なドナー由来の１０×１０６個のヒトＰＢＭＣを各マウスに対して腹腔内に（ＩＰ）再構成させた。５、１２、１９日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、１０、１７、２４日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
【０３２２】
結果
ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃ領域を有するｍＡｂ２含有抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質は、野生型Ｆｃ領域を有する類似する結合タンパク質と比較して、ヒトＰＢＭＣにおける非特異的ＩＦＮ−γ放出レベルを著しく低下させた（図１８Ａ）。ＩＬ−２（図１８Ｂ）およびＴＮＦ−α（図１８Ｃ）の放出に関して、同様の結果が観察された。重要なことに、サイトカイン放出は、ベンチマーク二重特異性抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体に対するよりも、これらのＦｃバリアント三重特異性結合タンパク質で有意に低かった。これらの結果は、非特異的サイトカイン放出の低下に起因するＦｃバリアントに関する三重特異性結合タンパク質の安全性プロファイルの改善を意味する。
【０３２３】
ｍＡｂ２含有ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびｍＡｂ６含有ＣＤ３８ＨＨ７１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄの両方のＩｇＧ１およびＩｇＧ４  Ｆｃバリアントによって、ヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化ももたらされた（図１８Ｄ）。
【０３２４】
ＣＤ２８のライゲーションによる免疫共刺激は、Ｔ細胞の生存および増殖に必要であり；ＴＣＲシグナル伝達は、単独でＴ細胞の増殖をもたらさない（ＳｈａｒｍｅｅおよびＡｌｌｉｓｏｎ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８：５６〜６１頁）。三重特異性結合タンパク質ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄにより、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞においてＢｃｌ−ｘＬの誘導がもたらされるが、ＣＤ２８またはＣＤ３抗原結合ドメインのいずれかを除去することにより、この作用が排除された（図１９Ａおよび１９Ｂ）。これらの結果は、期待された通り、ＣＤ３およびＣＤ２８結合アームの両方が、抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質によるＴ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬ誘導に必要であり、それによって、Ｔ細胞への生存促進シグナルが送達されることを実証する。三重特異性結合タンパク質の抗ＣＤ２８アームは、Ｔ細胞における生存促進性Ｂｃｌ−ｘＬの上方調節に対して重要である。ベンチマーク抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体と比較する場合、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性結合タンパク質によって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬのより程度の高い上方調節がもたらされた（図１９Ｃおよび１９Ｄ）。
【０３２５】
ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質によるＴ細胞活性化の主要な駆動因子を決定するために、ヒトＩＬ２プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターを含有するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞レポーターＪｕｒｋａｔ株中のＩＬ−２発現を使用して、活性化を測定した。抗ＣＤ３結合ドメインのノックアウト変異によって、Ｔ細胞活性化の排除が導かれ、Ｔ細胞の活性化がＣＤ３ライゲーションの特異的作用であることが実証された（図１９Ｅ）。これらの結果は、抗ＣＤ３が三重特異性結合タンパク質によるＴ細胞活性化の主要な駆動因子であること、および抗ＣＤ２８もＴ細胞活性化シグナルに対して有意に寄与することを示す。サイトカイン放出の主要な駆動因子についても、ヒトＰＢＭＣを使用して調査した（図１９Ｆ）。ＴＮＦ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の放出を調査することによって、ＣＤ３がサイトカイン放出の主要な決定因子であることが判明した。ＣＤ２８の寄与は最も少ないことが分かった。抗ＣＤ３８ＶＨ１を有する三重特異性結合タンパク質は、ベンチマークコンパレーターよりも少ないサイトカイン放出しか誘導しないことも判明した。
【０３２６】
Ｔ細胞の増殖についても調査した。ＩｇＧ４  ＦＡＬＡバリアントＦｃを有する抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質を使用するＴ細胞の活性化により、ベンチマークまたはアイソタイプ対照よりも多い増殖がもたらされた（図１９Ｇ）。この活性化は、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ３抗原結合ドメインの変異の際に低下した（図２０）。
【０３２７】
次に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの固形腫瘍成長実験のために、ヒト化ＮＳＧマウスモデルを使用した。６〜８週目に、ＲＰＭＩ８２２６ヒト骨髄腫細胞をマウスに移植した。９週目にヒトＰＢＭＣをｉｐ注射によって導入し、ｈＰＢＭＣを再構成し、１０〜１３週目に抗腫瘍治療を投与した。５６頭の雌のＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスに、５０％のマトリゲル中５百万個のＲＰＭＩ８２２６細胞を移植し、移植の５または６日後に、マウスを選択して研究への無作為化した。このモデルは、ヒト成熟Ｔ細胞を有するマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルとしての役割を果たす。
【０３２８】
ＮＣＩ−Ｈ９２９−Ｌｕｃヒト骨髄腫細胞を使用し、バイオルミネセンスにより腫瘍成長をアッセイする播種腫瘍成長のＮＳＧマウスモデルにおいて、三重特異性結合タンパク質もアッセイした。ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ  Ｆｃバリアントを有するＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、３０μｇ／ｋｇで、この播種腫瘍モデルにおいて、統計的に有意な、用量依存性抗腫瘍有効性を示した（図２１）。ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ  Ｆｃバリアントを有するＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質もまた、３０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇで、この播種腫瘍モデルにおいて、統計的に有用な、用量依存性抗腫瘍有効性を示した（図２２）。
【０３２９】
三重特異性結合タンパク質であるｍＡｂ２含有ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡおよびｍＡｂ６含有ＣＤ３８ｈｈｙ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡは、２頭のドナーヒト化ＮＳＧマウス由来のヒトＰＢＭＣを使用して、ＮＣＩ−Ｈ９２９−Ｌｕｃ骨髄腫細胞に対して有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍死滅活性を示した（図２３Ａおよび２３ｂ）。ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ三重特異性結合タンパク質は、播種腫瘍モデルにおいて、ベンチマーク二重特異性抗体と比較して、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍活性を示した（図２３Ｃ）。ビヒクル対照（ＰＢＳ）との比較のＰ値を以下のように決定した：
ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ：ｐ＝０．００２３；ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ  ＩｇＧ４  ＦＡＬＡ：ｐ＝０．００８８；ベンチマーク二重特異性ＣＤ３８×ＣＤ３  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ：ｐ＝０．６０４５。
【０３３０】
まとめると、これらの結果は、半減期の増加、非特異的サイトカイン放出の低下、およびより高いｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を示す、バリアントＦｃ領域を有する改善された抗ＣＤ３８候補物質を実証する。
【実施例９】
【０３３１】
抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のさらなる特徴付け
最適なエフェクター機能および増殖維持のために、Ｔ細胞を刺激するための２つのシグナルが必要とされる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体に介在される活性化によって、サイトカイン分泌をもたらす転写活性化が誘導される。第２の表面膜タンパク質であるＣＤ２８の会合により、代わりのシグナル伝達経路が刺激され、プログラム細胞死が阻害される（Ｅｓｅｎｓｔｅｎ  ＪＨ、Ｈｅｌｏｕ  ＹＡら  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４４：９７３〜８８頁（２０１６）；Ｈｕｉ  Ｅ、Ｃｈｅｕｎｇ  Ｊら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５５：１４２８〜１４３３頁（２０１７））。第２のシグナルの非存在下で、ＣＤ３のみによるＴ細胞刺激によって、典型的には、活性化誘導細胞死がもたらされる（Ｃｈａｉ  ＪＧ、Ｌｅｃｈｌｅｒ  ＲＩ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：９３５〜４４頁（１９９７））。Ｔ細胞の増殖は、これらの２つの異なる標的に対する特異性を組み合わせることによって増加すると仮定された。
【０３３２】
図２４Ａは、１０ｎＭの濃度のＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄならびにその単一の結合部位ＫＯおよび三重性ＫＯ突然変異体による刺激後にＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＩＬ２−ｌｕｃ２Ｐ  Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行ったルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。これらのデータは、Ｔ細胞刺激（例えば、ＮＦＡＴシグナル伝達）に対するＣＤ２８の寄与について例証する。
【０３３３】
クロスオーバー二重可変（ＣＯＤＶ）二重特異性Ａｂ形式（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  Ａら  ＭＡｂｓ  ８：８６７〜８７８頁（２０１６））を使用して、αーＣＤ３ε（シグナル１）およびα−ＣＤ２８（シグナル２）Ｆｖの組合せを評価し、これらの細胞表面分子の二重会合によってＴ細胞活性化が刺激され、維持されるかどうかを決定した（図２４Ｂ）。媒体親和性（ＫＤ〜２０ｎＭ）抗ＣＤ３ε  Ａｂを使用して、高レベルのサイトカイン放出を引き起こし、サイトカイン放出症候群のリスクを増加させる高親和性Ｔ細胞受容体刺激を回避した。Ｔ細胞の増殖を支持することが以前に示されたスーパーアゴニストのＣＤ２８  Ａｂと組み合わせた二重アームの両方の位置で、このＣＤ３アゴニストを試験した（Ｗａｉｂｌｅｒ  Ｚ，Ｓｅｎｄｅｒ  ＬＹら  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ１７０８頁（２００８））。これらの一価の二重特異性抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、インターフェロン−γとＩＬ−２の分泌によってＴ細胞刺激を測定した。両方の配向が活性であったが、これらのサイトカインの最適な放出は、近位のＣＤ３と遠位のＣＤ２８で観察された（図２４Ｂ）。次いで、この二重アームを、三重特異性Ａｂ形式の抗ＣＤ３８抗体との対合のために選択した（Ｘｕ  Ｌ，Ｐｅｇｕ  Ａら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５８：８５〜９０頁（２０１７））。
【０３３４】
図２５は、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄによって誘導された初代Ｔ細胞におけるＢｃｌ−２ファミリーのメンバーであるＢｃｌ−ｘＬの上方調節がＣＤ２８依存性であることを示す。これらのデータは、Ｔ細胞の生存に対するＣＤ２８の寄与について例証する。
【０３３５】
図２６は、三重特異性Ａｂの抗ＣＤ２８が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、初代Ｔ細胞の増殖を支持するのに必須の二次的シグナル伝達をもたらしたことを示す。これらのデータは、Ｔ細胞の増殖に対するＣＤ２８の寄与について例証する。
【０３３６】
まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体における抗ＣＤ２８ｓｕｐが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｔ細胞の活性化、生存および増殖における重要な機能性をもたらすことを示す。
【０３３７】
図２７は、親抗体によってコードされる三重特異性抗体の構造を示す。抗ＣＤ３８  ＶＨ１  ＦａｂおよびＣＤ２８ｓｕｐ／ＣＤ３ｍｉｄ  ＣＯＤＶ  Ｆａｂ（右）の結晶構造に基づいて得られたＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性Ａｂの構造モデルも示される。
【０３３８】
図２８Ａおよび２８Ｂは、高い（ＲＰＭＩ−８２２６；図２８Ａ）および低い（ＫＭＳ−１１；図２８Ｂ）ＣＤ３８表面発現を有する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を、様々な濃度の三重特異性ＡｂとともにインキュベートしたヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１）によって効率的に溶解したことを示す。各結合部位による死滅活性への寄与を、結合部位のＫＯ変異によって実証した。これらのデータは、ＣＤ３８三重特異性抗体が、ＣＤ３８とＣＤ２８の両方を認識することによりヒトＭＭ細胞を溶解したことを実証する。多発性骨髄腫細胞で発現されるＣＤ２８により、その死滅活性を有意に増強するＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ＿ＦＡＬＡ三重特異性抗体による二次標的がもたらされた。
【０３３９】
図２９Ａ〜２９Ｃは、三重特異性Ａｂの抗ＣＤ２８ｓｕｐ  ＫＯ突然変異体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＤ３８ｈｉｇｈ、ＣＤ３８ｍｉｄおよびＣＤ３８ｌｏｗ  ＭＭ細胞に対して著しく低下した抗腫瘍活性を示したことを示す。ＲＰＭＩ−８２２６（図２９Ａ）、Ｕ２６６（図２９Ｂ）、またはＫＭＳ−１１（図２９Ｃ）細胞を使用するアッセイを示す（図２９Ｃ）。ＭＭ細胞におけるＣＤ２８発現によって、ＣＤ３８三重特異性抗体に介在される細胞溶解に対するそれらの感受性が増加した。
【０３４０】
図３０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅されたヒト初代Ｔ細胞で再構成されたＮＳＧマウスを使用する、播種ヒト多発性骨髄腫細胞株モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性研究の結果を示す。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ＿ＦＡＬＡ三重特異性抗体処置群における腫瘍負荷の低下は、用量依存性であり、統計的に異なった。よって、ＣＤ３８三重特異性抗体によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの播種ヒトＭＭ細胞の腫瘍成長に対する保護が与えられた。
【０３４１】
顕微鏡研究により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、三重特異性抗体に介在される初代ヒトＴ細胞によるがん細胞の死滅がさらに実証された。図３１Ａおよび３１Ｂは、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ＿ＦＡＬＡ三重特異性抗体に介在されるヒトＰＢＭＣによって溶解されたＲＰＭＩ−８２２６（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ染料で標識したヒトＭＭ細胞）を実証する顕微鏡画像を示す。図３１Ａは対照を示すが、図３１Ｂは、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ＿ＦＡＬＡ三重特異性抗体に介在される溶解を示す。２４時間のインキュベーションでは、１０：１のＥ：Ｔ比を使用した。三連のヌル突然変異体対照Ａｂへの曝露によって、２４時間にわたり、腫瘍細胞の生存率には最小限の変化しか誘導されなかった（図３１Ａ）。対照的に、活性ＣＤ３８三重特異性Ａｂとのインキュベーションにより、腫瘍細胞の周囲にＴ細胞の実質的なクラスター形成が誘導され、それらのほぼ完全な溶解がもたらされた（図３１Ｂ）。これらのデータにより、ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８三重特異性抗体がＴ細胞による骨髄腫細胞の細胞溶解を介在したことが実証される。
【実施例１０】
【０３４２】
抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のＩｇＧ４  Ｆｃ領域におけるＦｃ受容体結合部位の改変により非特異的炎症が低減される
抗体のＦｃ領域は、非特異的炎症を誘導する単球およびＮＫ細胞上の細胞受容体に結合し、処置対象をサイトカイン放出症候群に罹りやすくする場合がある。サイトカイン放出を刺激する際のＦｃ受容体の役割を、ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩａ，ｂおよびＦｃγＩＩＩ結合を排除した突然変異体を試験することによって調査した。このために、補体を固定しないＩｇＧ４アイソタイプを使用した。
【０３４３】
ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおける結合を使用して、チップ上に固定した表示されたヒトＦｃ受容体に対する特定のＩｇＧ４  Ｆｃバリアントの親和性を測定した。１５０ｎＭで、ＩｇＧ４  Ｆｃバリアントを使用した。ＥＬＩＳＡを使用し、プレート上にヒトＦｃＲｎ抗原をコーティングすることによって、ヒトＦｃＲｎへの結合を行った。
【０３４４】
以前に記載された（Ａｌｅｇｒｅ  ＭＬ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＬＪら  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７〜４３頁（１９９４）；実施例７〜９も参照されたい）Ｆｃ領域における変異（「ＦＡＬＡ」）により、すべてのＦｃ受容体への結合が排除された（図３２および３３）。非特異的サイトカイン放出について試験する場合、刺激されていないＰＢＭＣでは、ＩＦＮ−γの放出が抑制されたが、一方、ＣＤ３８を発現した腫瘍標的の存在下で、最大限の刺激が可能となった（図３４、左対右、ＦＡＬＡ）。このＦｃ突然変異体は、異なるレベルのＣＤ３８を発現する細胞において、Ｆｃ野生型対照に匹敵する骨髄腫腫瘍標的上でその細胞溶解活性を保持した（図３５）。同様に、Ｆｃ受容体（図３３）への結合を排除した別の変異したＩｇＧ４  Ｆｃ領域（「ＰＶＡ」、図３２を参照されたい）もまた、刺激されていないＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ放出を抑制したが、一方、ＣＤ３８を発現した腫瘍標的の存在下で、最大限の刺激を可能とし（図３４、左対右、ＰＶＡ）、異なるレベルのＣＤ３８を発現する細胞において、Ｆｃ野生型対照に匹敵する骨髄腫腫瘍標的上でその細胞溶解活性を保持した（図３５）。
【実施例１１】
【０３４５】
三重特異性結合タンパク質の細胞溶解活性に対する抗ＣＤ３８および抗ＣＤ２８の寄与
各結合部位または結合部位の組合せに関する三重特異性Ａｂ突然変異体を生成し、高い（ＲＰＭＩ−８２２６）または低い（ＫＭＳ−１１）ＣＤ３８およびＣＤ２８の表面発現を有する多発性骨髄腫細胞株に対するそれらの細胞溶解活性について試験した。
【０３４６】
図２８Ａおよび２８Ｂにおいて上に示したように、ＣＤ３特異的結合の変異は細胞溶解を抑制したが、一方、抗ＣＤ３８およびＣＤ２８のヌル変異は死滅の著しい低下を示し、しかしながら、一部の残りの機能は保持され、抗ＣＤ３８とＣＤ２８の両方が腫瘍細胞の死滅に寄与することを示した。
【０３４７】
ダラツムマブ（多発性骨髄腫の処置に対して承認されたα−ＣＤ３８モノクローナル抗体；ＭｃＫｅａｇｅ  Ｋ．  Ｄｒｕｇｓ．  ７６：２７５〜８１頁（２０１６）を参照されたい）と比較して、三重特異性Ａｂは、ＣＤ３８ｈｉｇｈとＣＤ３８ｌｏｗの両方の多発性骨髄腫細胞を含む様々なＣＤ３８発現細胞株に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、３〜４ｌｏｇの顕著に高い死滅効力を示した（図３６）。
【実施例１２】
【０３４８】
ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８  Ａｂは、セントラルメモリーＣＤ４およびＣＤ８、Ｔｈ１ならびに抗原特異的応答を刺激する
ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８三重特異性Ａｂが細胞の免疫機能を増強することができるかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大されたＴ細胞の表現型を評価した。
【０３４９】
材料と方法
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）により回収された健常なヒトドナーの血液から、末梢血単核細胞を単離した。ＰＢＭＣを、以前に上記したように、抗体をコーティングしたプレート（３５０ｎｇ／ウェル）に添加し（５×１０５細胞／ｍＬ）、３７℃で３および７日間インキュベートした。特定の時点で、細胞を回収し、Ｔ細胞のサブセット：ナイーブ（ＣＣＲ７＋  ＣＤ４５ＲＯ−）、Ｔｃｍ（ＣＣＲ７＋  ＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｔｅｍ（ＣＣＲ７−  ＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ４＋  Ｆｏｘｐ３＋  ＣＤ２５ｈｉ）についてフローサイトメトリーで解析した。細胞内のサイトカイン発現：Ｔｈ１（ＣＤ４＋  ＩＦＮ−γ＋）、Ｔｈ２（ＣＤ４＋  ＩＬ−４＋）、およびＴｈ１７（ＣＤ４＋  ＩＬ−１７＋）を決定するために、フロー染色の少なくとも６時間前に、細胞をモネシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）でも処置した。ＰＢＭＣドナーのＨＬＡ（Ａ＊０２：０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）に限定される蛍光標識五量体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｅｎｔａｍｅｒ）を使用して、ＣＭＶ  ｐｐ６５−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を検出した。公知のＣＭＶ陽性集団およびＨＬＡ型を有するドナー由来のＨｅｍａＣａｒｅ（Ｖａｎ  Ｎｕｙｓ、ＣＡ）から、ＰＢＭＣを得た。限定しているＨＬＡ型に対して陰性のドナー由来のＰＭＢＣを陰性対照として使用した。製造業者のプロトコールにより染色を行った。
【０３５０】
結果
ヒトのＰＢＭＣを、サイトカインの非存在下で、三重特異性Ａｂまたは三連の変異陰性対照とともに、７日間インキュベートした。ＣＤ４サブセットの解析により、セントラルメモリープールにおいて最も多い増殖が明らかとなり、エフェクターメモリー細胞ではより少ない増加しかなかった（図３７Ａ）。また、ＣＤ４サブセットの解析により、Ｔｈ２またはＴｈ１７細胞（図３７Ｂ）と比較したＴｈ１細胞（６倍を超える）の最も高い増殖も明らかとなった（図３７Ｂ）。ＣＤ８サブセットでは、７日目までに、セントラルメモリーＣＤ８サブセットにおいて１５０倍を超える増加があり、エフェクターメモリー細胞では、増加はより少なかった（図３７Ｃ）。重要なことに、四量体染色（Ｇｒａｔａｍａ  ＪＷ、ｖａｎ  Ｅｓｓｅｒ  ＪＷら  Ｂｌｏｏｄ  ９８：１３５８〜１３６４頁（２００１））を使用する血清陽性ＨＬＡ−Ａ２ドナーのｐｐ６５エピトープを対象とするＣＭＶに対する既存の抗原特異的ＣＤ８の応答は、陰性対照と比較して、ＣＤ３８三重特異性の存在下で４４倍を超えて増加した（図３７Ｄ）。
【０３５１】
まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８三重特異性Ａｂが、Ｔｈ１機能およびｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫を増強する傾向のある保護的ＣＤ８メモリーＴ細胞応答を刺激することを示す。
【実施例１３】
【０３５２】
多発性骨髄腫細胞上のＣＤ２８は、Ｔ細胞の認識と細胞溶解を増加させる
材料および方法
フローサイトメトリー
記載したように（Ｓ４）、ＱＩＦＩキット（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号Ｋ００７８１１）を使用するフローサイトメトリーによって、表示した腫瘍細胞株上のＣＤ２８およびＣＤ３８のレベルを決定した。簡潔には、マウス抗ヒトＣＤ３８（クローンＡＴ１３／５、マウスのＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号５９０２８）および抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８.２、マウスＩｇＧ１、ｋ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９１２３）を、製造業者のプロトコールを使用して、細胞株上の表面ＣＤ３８およびＣＤ２８を検出するために、一次抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）として使用した。ＱＩＦＩキットの較正標準物質およびキットによって提供された配合を使用して、表面密度を計算した。
【０３５３】
ＣＲＩＳＰＲ介在性ノックアウトを使用するＣＤ２８  ＫＯヒト多発性骨髄腫細胞株の生成
ＫＭＳ−１１細胞株では、ＣＲＩＳＰＲ  ＣＤ２８ヒトノックアウトキット（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、ＣＤ２８のノックアウトを実施した。キットは、ＧＦＰ−ピューロマイシンの機能的カセットを含むドナーベクターと、異なる予め設計されたガイドＲＮＡ（ＣＤ２８のエクソン１およびイントロン１をそれぞれ標的とするｇＲＮＡ  １：ＴＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡ（配列番号１１７）およびｇＲＮＡ  ２：ＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴ（配列番号１１８））をそれぞれ有する２つの別個のＣａｓ−９ベクターとを含有する。１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｍｅｄｉｕｍ中、３．１０５細胞／ウェルの密度で、細胞を６ウェルプレート中に播種し、製造業者の使用説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３つのベクターすべてを用い、２４時間後に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、最終濃度０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加した。６．２５μＬ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００、各Ｃａｓ−９／ｇＲＮＡベクター１．２５μｇおよびＧＦＰ−ピューロマイシンドナーベクター２．５μｇを使用する場合、トランスフェクション効率は３０％であった。ＣＤ２８ｓｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲオールインワンレンチウイルスセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、ＲＰＭＩ  ８２２６細胞株上でＣＤ２８のノックアウトを実施した。これは、Ｃａｓ９遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子および様々なｓｇＲＮＡ（ＣＤ２８エクソン２を標的とするｓｇＲＮＡ  １：ＡＴＴＧＴＣＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡ（配列番号１１９）およびｓｇＲＮＡ  ２：ＣＡＡＡＡＧＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＣ（配列番号１２０）およびＣＤ２８エクソン３を標的とするｓｇＲＮＡ  ３：ＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧ（配列番号１２１））を発現する３つのレンチウイルスオールインワンベクターのセットからなる。レンチウイルス粒子（１０ＵＩ／細胞）、８μｇ／ｍＬのポリブレンおよび１：１００のＶｉｒａｌＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．）と混合した２．１０５細胞を用いるスピノキュレーションプロトコールを使用して、細胞を感染させた。混合物を、室温で２０分間プレインキュベートし、次いで、３２℃にて、８００×ｇで３０分間遠心分離し、１２ウェルプレート中に播種した。感染の４８時間後に、最終濃度０．２５μｇ／ｍＬでピューロマイシンを添加した。両細胞株を少なくとも５回（または細胞生存率が安定となるまで）継代した後、フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルでＣＤ２８のノックダウンを確認した（ＣＤ２８ＰＥ  Ｃｌｏｎｅ  ２８．２抗体−ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。次いで、ＣＤ２８陰性細胞を、Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒで選別し、０．２５μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン、１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した培地中で培養した。次いで、限定希釈によって細胞をクローニングし、フローサイトメトリーによってならびに以下に列挙したフォワードおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒシークエンスによってＣＤ２８ノックアウトを検証した。
【０３５４】
【表４７】
2020536543.tif 000049
【０３５５】
結果
ＣＤ２８を三重特異性Ａｂ中に組み込み、Ｔ細胞の増殖および生存を改善した；しかしながら、細胞表面のマーカーを多発性骨髄腫細胞上で評価した場合、細胞株の大多数（＞９５％）は、ＣＤ２８糖タンパク質を発現することが判明した（表Ｓ）。
【０３５６】
【表４８】
2020536543.tif 000050
【０３５７】
ＣＤ２８の発現は、正常な血漿細胞上には存在しないが（Ａｌｍｅｉｄａ  Ｊら  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １０７：１２１〜１３１頁（１９９９））、新たに診断された患者のおよそ３分の１において、主要な骨髄腫血漿細胞上で検出される（Ｍａｔｅｏ  Ｇら  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：３６６１〜３６６７頁（２００５））ことが報告されている。さらに、これは、骨髄腫の進行中に頻度が増加し、予後不良と骨髄腫の悪性度の高い特徴と相関する（Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ  Ｎ、Ｊｅｇｏ  Ｇら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：１５２１〜６頁（１９９８）；Ｎａｉｒ  ＪＲ、Ｃａｒｌｓｏｎ  ＬＭら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８７：１２４３〜５３頁（２０１１））。
【０３５８】
標的細胞上のＣＤ２８の発現がＴ細胞の認識および溶解性を改善することができるかどうかを決定するために、様々な度合いのＣＤ３８およびＣＤ２８発現を有する３つの独立した骨髄腫株上の野生型対ＣＤ２８ヌル三重特異性Ａｂの活性を比較した。実施例９において上で注記し、図２９Ａ〜２９Ｃにおいて示したように、ＣＤ３８三重特異性ＡｂによるＣＤ２８の発現レベルにかかわらず、細胞溶解は３つの株すべてで観察された；しかしながら、すべての細胞株に対して、ＣＤ２８ヌル三重特異性Ａｂの細胞溶解活性は、３０〜１００分の１まで低下し、最も低いＣＤ３８発現を示したＫＭＳ−１１細胞株で実質的減少が最大であった（ＷＴ対ΔＣＤ２８、図２９Ｃ対図２９Ａまたは図２９Ｂを比較されたい）。
【０３５９】
腫瘍細胞の認識および溶解に対するＣＤ２８の寄与について、骨髄腫標的細胞上のＣＤ２８のＣＲＩＳＰＲ介在性ノックアウトを使用してさらに確認した。ＣＤ２８の発現は、親株と比較して、ＣＤ２８ＫＯ  ＫＭＳ−１１細胞上で検出不能であった（図３８、上のパネル、右対左）。Ｔ細胞の細胞溶解に対するＣＤ２８ＫＯ  ＫＭＳ−１１細胞の感受性は、１０〜１００分の１倍同時に低下した（図３８、下のパネル、左）。この効果と一致して、ＣＤ３８  ＫＯ標的細胞上のＣＤ２８ヌル突然変異体の三重特異性と比較して、ＣＤ３８三重特異性では細胞溶解における差は見られなかった（図３８、下のパネル、右）。
【実施例１４】
【０３６０】
ＣＤ３８＋血液がん細胞株に対するＣＤ３８三重特異性Ａｂの細胞溶解
以前の実施例は、多発性骨髄腫細胞の細胞溶解を促進する三重特異性抗ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体について実証する。他のがん細胞株の細胞溶解を促進するこれらの抗体の能力を試験した。
【０３６１】
図３９に示したように、ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性ＦＡＬＡ突然変異体Ａｂは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ（ＫＧ−１））、Ｂ細胞リンパ腫（ＯＣＩ−Ｌｙ１９）、急性Ｔリンパ球性白血病（ＡＬＬ（ＫＯＰＮ８））、および慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ（Ｚ−１３８））を含むＣＤ３８＋ＣＤ２８−株を標的とする細胞溶解活性を有した。これは、三重特異性抗ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体が、ＣＤ２８−であるものを含む他のＣＤ３８＋血液がん細胞株に対する活性を有することを実証する。
【実施例１５】
【０３６２】
α−ＣＤ２８スーパーアゴニストによるヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化には抗体の二価性が必要とされる
ＴＧＮ１４１２（ＴＧＮ）、単一結合アームＴＧＮ１４１２（ＴＧＮｓｌｇ）および単一結合アーム抗ＣＤ２８ｓｕｐ（ＣＤ２８ｓｕｐｓｌｇ）によるヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化を記載されているように実施した（Ｆｉｎｄｌａｙ  Ｌ、Ｅａｓｔｗｏｏｄ  Ｄら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５２：１〜１２頁（２０１０））。以前に記載されているように、表示した抗体で２４時間ドライコーティングしたポリプロピレン９６ウェルプレート（１ｕｇ／ウェル）上に、１０５個のヒトＰＢＭＣを播種した。上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ２のようなサイトカインを、実施例８に記載したＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。
【０３６３】
ＣＤ２８スーパーアゴニストが単一の特異性を含むことによって、ヒトにおける天然のＩｇＧのように、その悪影響を以前より伴う（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ  Ｇ、Ｐｅｒｒｙ  ＭＲら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５：１０１８〜１０２８頁（２００６））ＣＤ２８スーパーアゴニストｍＡｂ（図４０）に関して見られる非特異的サイトカイン放出も低減した。代わりに、三重特異性Ａｂによる同時刺激によって、腫瘍を溶解し、腫瘍に対して保護するＴ細胞の効力および生存が増加した。より興味深いことに、ＣＤ３８三重特異性Ａｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｔｈ１およびＴｃｍ細胞集団を優先的に増幅し、Ｔｒｅｇを伝播させ耐性を誘導するために使用されるα−ＣＤ３アゴニストまたはα−ＣＤ２８スーパーアゴニストモノクローナルＡｂと異なる重要な構成を示す（Ｐｅｎａｒａｎｄａ  Ｃ１、Ｔａｎｇ  Ｑ、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ＪＡ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８７：２０１５〜２２頁（２０１１）；Ｔａｂａｒｅｓ  Ｐ、Ｂｅｒｒ  ｓら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：１２２５〜３６頁（２０１４））。
【０３６４】
まとめると、実施例１〜１５において表示されるデータは、２つのＴ細胞シグナル伝達受容体を会合させ、標的細胞の認識を増強することによって、有効な抗腫瘍免疫を刺激する三重特異性抗ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を実証する。ＣＤ３およびＣＤ２８結合によって、Ｂｃｌ−ｘＬを上方調節し、Ｔ細胞のアポトーシスを阻害するＴ細胞受容体シグナル伝達が誘発され、Ｔ細胞のエフェクター機能および生存が増加した。多発性骨髄腫細胞上で高度に発現される三重特異性Ａｂの第３のアームがＣＤ３８と相互作用した。同時に、ＣＤ２８は、ほとんどの骨髄腫由来の細胞上でも発現され；したがって、三重特異性Ａｂは、標的化を改善すると同時に、Ｔ細胞の活性化と細胞溶解も増強した。最適化された三重特異性抗体は、抗ＣＤ３８  ｍＡｂ治療薬であるダラツムマブより１０００倍超もより有効に骨髄腫細胞を溶解し、ヒト化マウスモデルにおいて有効なｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を示した。
【０３６５】
本開示は、様々な実施形態を含むが、変形および修正が当業者にとって生じることが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲が、本開示の範囲内にあるこのような均等な変形をすべて網羅することが意図される。さらに、本明細書で使用される項目の見出しは、単に構成上の目的に過ぎず、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【０３６６】
本明細書に記載された各実施形態は、逆に明確に指示されていなければ、任意の他の実施形態（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましいかまたは有利であることが示されている任意の構成または実施形態を、逆に明確に指示されていなければ、好ましいかまたは有利であると示されている任意の他の構成（複数可）または実施形態（複数可）と組み合わせることができる。
【０３６７】
この出願で引用されたすべての参照文献は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ−１】
2020536543.tif 000051
【図１Ａ−２】
2020536543.tif 000052
【図１Ｂ】
2020536543.tif 000053
【図２Ａ−１】
2020536543.tif 000054
【図２Ａ−２】
2020536543.tif 000055
【図２Ｂ】
2020536543.tif 000056
【図２Ｃ−１】
2020536543.tif 000057
【図２Ｃ−２】
2020536543.tif 000058
【図２Ｄ】
2020536543.tif 000059
【図２Ｅ−１】
2020536543.tif 000060
【図２Ｅ−２】
2020536543.tif 000061
【図２Ｆ】
2020536543.tif 000062
【図２Ｇ−１】
2020536543.tif 000063
【図２Ｇ−２】
2020536543.tif 000064
【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
2020536543.tif 000066
【図２Ｊ】
2020536543.tif 000067
【図２Ｋ】
2020536543.tif 000068
【図２Ｌ】
2020536543.tif 000069
【図２Ｍ】
2020536543.tif 000070
【図２Ｎ】
2020536543.tif 000071
【図２Ｏ】
2020536543.tif 000072
【図２Ｐ】
2020536543.tif 000073
【図２Ｑ】
2020536543.tif 000074
【図３Ａ】
2020536543.tif 000075
【図３Ｂ】
2020536543.tif 000076
【図３Ｃ】
2020536543.tif 000077
【図４】
2020536543.tif 000078
【図５】
2020536543.tif 000079
【図６Ａ−１】
2020536543.tif 000080
【図６Ａ−２】
2020536543.tif 000081
【図６Ｂ】
2020536543.tif 000082
【図６Ｃ】
2020536543.tif 000083
【図６Ｄ】
2020536543.tif 000084
【図６Ｅ−１】
2020536543.tif 000085
【図６Ｅ−２】
2020536543.tif 000086
【図６Ｆ】
2020536543.tif 000087
【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
2020536543.tif 000089
【図７Ｂ】
2020536543.tif 000090
【図８Ａ】
2020536543.tif 000091
【図８Ｂ】
2020536543.tif 000092
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2020536543.tif 000094
【図８Ｅ】
2020536543.tif 000095
【図８Ｆ】
2020536543.tif 000096
【図９】
2020536543.tif 000097
【図１０】
2020536543.tif 000098
【図１１Ａ】
2020536543.tif 000099
【図１１Ｂ】
2020536543.tif 000100
【図１２Ａ】
2020536543.tif 000101
【図１２Ｂ】
2020536543.tif 000102
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
2020536543.tif 000105
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020536543.tif 000107
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2020536543.tif 000109
【図１３Ｅ】
2020536543.tif 000110
【図１３Ｆ】
2020536543.tif 000111
【図１４−１】
2020536543.tif 000112
【図１４−２】
2020536543.tif 000113
【図１４−３】
2020536543.tif 000114
【図１４−４】
2020536543.tif 000115
【図１４−５】
2020536543.tif 000116
【図１４−６】
2020536543.tif 000117
【図１４−７】
2020536543.tif 000118
【図１４−８】
2020536543.tif 000119
【図１４−９】
2020536543.tif 000120
【図１４−１０】
2020536543.tif 000121
【図１４−１１】
2020536543.tif 000122
【図１４−１２】
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【図１４−１３】
2020536543.tif 000124
【図１４−１４】
2020536543.tif 000125
【図１４−１５】
2020536543.tif 000126
【図１４−１６】
2020536543.tif 000127
【図１４−１７】
2020536543.tif 000128
【図１５】
2020536543.tif 000129
【図１６】
2020536543.tif 000130
【図１７】
2020536543.tif 000131
【図１８−１】
2020536543.tif 000132
【図１８−２】
2020536543.tif 000133
【図１８−３】
2020536543.tif 000134
【図１９−１】
2020536543.tif 000135
【図１９−２】
2020536543.tif 000136
【図１９−３】
2020536543.tif 000137
【図１９−４】
2020536543.tif 000138
【図１９−５】
2020536543.tif 000139
【図２０】
2020536543.tif 000140
【図２１】
2020536543.tif 000141
【図２２】
2020536543.tif 000142
【図２３−１】
2020536543.tif 000143
【図２３−２】
2020536543.tif 000144
【図２４Ａ】
2020536543.tif 000145
【図２４Ｂ】
2020536543.tif 000146
【図２５】
2020536543.tif 000147
【図２６】
2020536543.tif 000148
【図２７】
2020536543.tif 000149
【図２８】
2020536543.tif 000150
【図２９】
2020536543.tif 000151
【図３０】
2020536543.tif 000152
【図３１】
2020536543.tif 000153
【図３２】
2020536543.tif 000154
【図３３】
2020536543.tif 000155
【図３４】
2020536543.tif 000156
【図３５】
2020536543.tif 000157
【図３６】
2020536543.tif 000158
【図３７−１】
2020536543.tif 000159
【図３７−２】
2020536543.tif 000160
【図３７−３】
2020536543.tif 000161
【図３７−４】
2020536543.tif 000162
【図３８】
2020536543.tif 000163
【図３９】
2020536543.tif 000164
【図４０】
2020536543.tif 000165
【配列表】
2020536543000001.app
【国際調査報告】
2020536543.tif 000166
2020536543.tif 000167
2020536543.tif 000168
2020536543.tif 000169
2020536543.tif 000170
2020536543.tif 000171
2020536543.tif 000172
2020536543.tif 000173
2020536543.tif 000174