(57)【要約】  本発明は、タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）のインビトロ形成及び／又は検出のための方法であって、ＰＨＦの形成を促進する条件下で所定の期間タウタンパク質調製物とポリアニオン性補助因子を含む混合物をインキュベートすることを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）のインビトロ形成のための方法であって、ＰＨＦの形成を促進する条件下で所定の期間タウタンパク質調製物とポリアニオン性補助因子を含む混合物をインキュベートすることを含む方法。
【請求項２】
ＰＨＦの形成を促進する前記条件が、３５０〜５００ｃｐｍ、好ましくは４００〜４５０ｃｐｍ、特に４２５ｃｐｍでインキュベーション混合物を振盪することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タウタンパク質が、全長組換えタウタンパク質であり、好ましくは２つのＮ末端インサート及び４つの微小管結合ドメインを含有する最長のアイソフォームである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タウタンパク質調製物が実質的に純粋なタウ調製物である、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーション混合物中のタウタンパク質の濃度が、１０〜３０μＭ、好ましくは１２〜２０μＭの範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タウタンパク質が還元型である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベーションが、６．０と７．４の間のｐＨ、好ましくは６．５と７．０の間のｐＨ、より好ましくは６．７のｐＨで実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベーションが、３６℃と３８℃の間の温度、好ましくは３７℃の温度で実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリアニオン性補助因子がヘパリンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）の形成を検出するためのインビトロの方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を使用してＰＨＦの形成を誘導する工程；及び
（ｂ）顕微鏡的手段又は分光学的手段によって、形成されたＰＨＦを検出する工程
を含むインビトロの方法。
【請求項１１】
前記分光学的手段が、蛍光分光法、好ましくはチオフラビンＴ蛍光アッセイを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タウタウタンパク質の対らせん状細線維の形成を阻害又は促進することができる化合物の同定のためのインビトロの方法であって、
（ａ）試験化合物の非存在下及び存在下で請求項１０又は１１に記載の方法を実施する工程；並びに
（ｂ）前記試験化合物の非存在下でのＰＨＦの形成の動力学を、前記試験化合物の存在下でのＰＨＦの形成の動力学と比較する工程
を含むインビトロの方法。
【請求項１３】
前記化合物が抗体又はその断片である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タウの対らせん状細線維（ＰＨＦ）のインビトロ形成及び検出のための新規の方法に関する。これらの方法は、病的なタウ−タウタンパク質の会合及び病的な神経細線維凝集を調節する、例えば、阻害することができる化合物の選択のために使用することができる。本発明の方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防及び治療のための化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、記憶、思考、行動及び日常活動を行う能力に支障を来すいくつもの進行性障害によって引き起こされ得る症候群である。現在、全世界で約３６００万人が認知症に罹患している。認知症者数は２０３０年までに倍増し、２０５０年までには３倍を超えて１億１５４０万人に上ることが予想されている。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的なタイプの認知症である。現在、６５歳以上の９人に１人（１１パーセント）及び８５歳を超える人のほぼ半数がアルツハイマー病を患っている。国際アルツハイマー病協会によれば、これらの患者にかかる医療コストは、現在では世界全体で年間６０００億ドルを超える。これらのコストは、特に発展途上国世界において、さらなる公的な社会医療制度の出現、及び所得の向上による機会費用の高まりに伴い、疾患の罹患率を上回ってさらに急速に上昇する可能性が高い。
【０００４】
ＡＤは、罹患した個体の脳における２種類の病的なタンパク質沈着物、すなわち、主としてβアミロイド（Ａβ）ペプチド（アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の誘導体）から構築されるアミロイド線維からなるアミロイド斑及び神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）によって特徴づけられる。ＮＦＴは、タウとして知られる微小管結合タンパク質を過剰リン酸化して、不溶性形態で凝集させるか、又は集まらせることによって形成される。過剰リン酸化されたタウタンパク質のこれらの凝集は、ＰＨＦ、すなわち「対らせん状細線維」とも称される。これらの凝集は、ＡＤだけでなく多くの神経変性疾患の病理組織学的特徴であり、一括してタウオパチーとして知られる。タウオパチーには、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）が含まれる。
【０００５】
疾患の鑑別診断及びステージ分類のためのマーカーとして機能することに加えて、タウ凝集体はまた、疾患の伝播を促進し得る。したがって、タウ凝集を阻害するための多様な戦略が、神経原線維病変の形成及び疾患進行に対する有望な治療法として研究されている。ＰＨＦのインビトロ形成に関するいくつかのアッセイが先行技術において記載されている（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，３７：１０２２３−１０２３０；Ｂａｒｇｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，４１：１４８８５−１４８９６；Ｍｏｒｏｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３，５２：６９６０−６９６７）。こうして、ポリアニオンのような化合物、並びに脂肪酸（及び誘導体）を加えることによって、タウの集合から線維への変化をインビトロで再現することができた。しかしながら、これらの方法は再現性を欠くことが示されており、これまでのところタウオリゴマーの均質な集団を調製する信頼性のない方法が利用可能であり、タウオリゴマーの毒性及び疾患におけるその考えられる役割を評価することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、とりわけ、ＡＤなどのタウオパチーの診断及び／又は治療に有用な新規の効果的な薬物を選択するのに有用であり得る、上記の病的なタウの集合を妨げ得る有望な薬物の試験のために使用することができる、新規且つ信頼性のある方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）のインビトロ形成のための方法であって、ＰＨＦの形成を促進する条件下で所定の期間タウタンパク質調製物とポリアニオン性補助因子を含む混合物をインキュベートすることを含む方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）の形成を検出するためのインビトロの方法であって、
（ａ）ＰＨＦの形成を促進する条件下で所定の期間タウタンパク質調製物とポリアニオン性補助因子を含む混合物をインキュベートする工程；及び
（ｂ）顕微鏡的手段又は分光学的手段によって、形成されたＰＨＦを検出する工程
を含むインビトロの方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、タウタウタンパク質の対らせん状細線維の形成を阻害又は促進することができる化合物の同定のためのインビトロの方法であって、
（ａ）試験化合物の非存在下及び存在下で上記の方法を実施する工程；並びに
（ｂ）前記試験化合物の非存在下でのＰＨＦの形成の動力学を、前記試験化合物の存在下でのＰＨＦの形成の動力学と比較する工程
を含むインビトロの方法を提供する。
【００１０】
本発明は、病的なタウ−タウタンパク質の会合及び病的な神経細線維凝集を調節する、例えば、促進又は阻害することができる化合物の同定及び選択に有用であり得る、ＰＨＦの形成及び検出のための新規且つ信頼性のある方法を提供する。本発明の方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防及び治療のための化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＴｈＴ蛍光分光法によって観測されたｒＴａｕ（１５μＭ、ｐＨ＝７．４）の凝集動力学。示されるとおり、データは低い再現性を示した（４回の反復実験）。
【図２】ＴｈＴ蛍光分光法によって観測されたｒＴａｕの１０μＭ（○）及び２０μＭ（▲）、ｐＨ７．４の凝集動力学。データは低い再現性を示した（各濃度で２回の反復実験）。
【図３】先行技術の方法からの結果。
【図４】ＴｈＴ蛍光分光法によって観測された、１ｍＭのＴＣＥＰの非存在下（○）及び存在下（●）での１０μＭのｒＴａｕの凝集動力学（各濃度で３回の反復実験）。
【図５】ＴｈＴ蛍光分光法によって観測されたｒＴａｕ（ＰＢＳ中のＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ、凍結）の１５μＭ、ｐＨ７．４の凝集動力学。測定はゲイン６０を用いて記録された。データは低い再現性を示した（５回の反復実験）。
【図６】ＴｈＴ蛍光によって測定されたｒＴａｕ（ＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で凍結）の１５μＭの凝集動力学に関する４回の反復実験。測定はゲイン８０を用いて記録された。
【図７】ＴｈＴ蛍光によって測定されたｒＴａｕ（ＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ、ＰＢＳ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ６．５中で凍結乾燥）の１５μＭの凝集動力学に関する４回の反復実験。測定はゲイン８０を用いて記録された。
【図８】ＰＢＳ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ６．５中で凍結乾燥された１５μＭのＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕに関するＡＦＭ画像。Ａ：１μｍズーム画像；Ｂ：３００ｎｍズーム画像。
【図９】シーディングのデータ：ＴｈＴ蛍光によって測定されたｒＴａｕ（ＰＢＳ中のＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、凍結乾燥）の１５μＭ、ｐＨ６．５に関する凝集動力学。データは、それぞれシードの非存在下（●）において、又は前もって形成されたシードを２．５％（〇）、０．６３％（△）若しくは０．１６％（□）添加することによって示される。
【図１０】濃度依存性データ：ＴｈＴ蛍光によって測定されたｒＴａｕ（ＰＢＳ中のＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、凍結乾燥）の５μＭ（△）、１０μＭ（〇）、１５μＭ（▽）及び２０μＭ（□）に関する凝集動力学。測定はゲイン８０を用いて記録された。臨界濃度（凝集するのに必要な最小のタウ濃度）は、５μＭと１０μＭの間と検出された。
【図１１】ＣＢＴＡＵ  ２７．１の非存在下及び存在下でのＴｈＴ蛍光によって測定されたｒＴａｕ（ＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ、ｐＨ６．７）の１５μＭの凝集動力学（ｒＴａｕ単独−直線、又はＣＢＴＡＵ−２７．１を３μＭ−ドット；６μＭ−ダッシュ／ドット；９μＭ−ダッシュで伴う）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ＮＦＴは、タウタンパク質を過剰リン酸化して、不溶性形態で凝集を引き起こすことによって形成される微小管結合タンパク質タウの神経細胞内凝集体である。過剰リン酸化されたタウタンパク質のこれらの凝集はまた、「対らせん状細線維」（ＰＨＦ）とも称され得る。濃縮体形成の詳細な機構は完全には理解されておらず、濃縮体が疾患において主要な原因因子となるか、又はそれほど重要ではない役割を果たすのかは依然として議論されている問題である。しかしながら、ＰＨＦは神経変性に関係づけられるため、凝集の基盤となる原理の理解及びその過程を予防するか、又は逆転させる手段の発見を期待して、インビトロで凝集過程を再構成することは注目に値する。
【００１３】
タウ凝集は、２つの異なるステップ：核形成段階（誘導期）及び凝集の末期プラトーレベルまでの成長期（誘導期後の指数的成長）があるシグモイド曲線をもたらす核生成依存性重合（ＮＤＰ）機構に追従することが知られている。ＮＤＰ機構に関する基準は通常、以下の：
−誘導期後の指数的成長を示すシグモイドの動力学；
−核形成をバイパスする効率的なシーディング（すなわち、シードを加えるとき、指数的成長が観察されるはずであり、且つ誘導期が完全にバイパスされる；及び
−濃度依存性
である。
【００１４】
本発明によれば、核生成依存性重合機構の期待される特徴を示すＰＨＦの形成のためのインビトロアッセイが開発された。
【００１５】
したがって、第１の態様において、本発明は、タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）の形成のためのインビトロの方法であって、ＰＨＦの形成を促進する条件下で所定の期間タウタンパク質調製物とポリアニオン性補助因子をインキュベートすることを含むインビトロの方法を提供する。
【００１６】
ある種の実施形態において、ＰＨＦの形成を促進する条件は、３５０〜５００ｃｐｍ、好ましくは４００〜４５０ｃｐｍ、特に４２５ｃｐｍでインキュベーション混合物を振盪することを含む。
【００１７】
タウタンパク質は、単一の遺伝子に起源をもち、且つサイズが３５２〜４４１アミノ酸（３６．８〜４５．９ｋＤａ）で変動する成熟タンパク質をもたらす選択的ｍＲＮＡスプライスバリアントに由来する。それぞれ３１〜３２アミノ酸の３つ又は４つの微小管結合リピート（Ｒ）を有し、且つそれぞれ２９アミノ酸のアミノ末端インサート（Ｎ）を２つ、１つ有するか又は全く有しない、互いに異なる６種のタウアイソフォームが存在する。ある種の実施形態において、タウタンパク質は、全長組換えタウタンパク質であり、好ましくは２つのＮ末端インサート及び４つの微小管結合ドメインを含有する最長のアイソフォーム、特にＴａｕ４４１である。
【００１８】
ある種の実施形態において、タウタンパク質調製物は実質的に純粋なタウ調製物である。本明細書で使用する場合、実質的に純粋なタウタンパク質調製物は、少なくとも９９％純粋なタウタンパク質調製物を指す。
【００１９】
ある種の実施形態において、インキュベーション混合物中のタウタンパク質の濃度は、１０〜３０μＭ、好ましくは１２〜２０μＭの範囲である。ある種の実施形態において、インキュベーション混合物中のタウタンパク質の濃度は１５μＭである。
【００２０】
ある種の実施形態において、タウタンパク質は還元型である。これは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤をインキュベーション混合物に加えることによって達成することができる。あるいは、ある種の実施形態において、タウタンパク質は変異体組換えタウタンパク質であり、システイン残基が変異されている。したがって、タウタンパク質は還元型のままとなり、還元剤を必要としない。
【００２１】
ある種の実施形態において、インキュベーションは、６．０〜７．４、好ましくは６．５〜７．０のｐＨ、より好ましくは６．７のｐＨで実施される。
【００２２】
ある種の実施形態において、インキュベーションは、３６℃と３８℃の間の温度、好ましくは３７℃の温度で実施される。
【００２３】
ある種の実施形態において、ポリアニオン性補助因子はヘパリンである。ある種の実施形態において、へパリン：タウタンパク質の比は、１：２である。
【００２４】
ある種の実施形態において、所定の期間は２０〜６０時間、好ましくは２５〜４５時間、特に約４０時間である。
【００２５】
本発明によれば、高度に精製されたタウタンパク質調製物及び最適化されたインキュベーション条件を使用することによって、タウ凝集を極めて再現性のある様式でインビトロにおいて模倣することができることが見出された。本発明の方法は、核生成依存性重合機構の期待される特徴（誘導期に続く指数的成長及び定常期）を示す。得られた凝集体は、原子間力顕微鏡画像によって確認されるとおりＰＨＦ様形態を示し、タウの新たな凝集をシーディングする際に極めて有効である。
【００２６】
本発明はさらに、タウタンパク質の対らせん状細線維（ＰＨＦ）の形成を検出するためのインビトロの方法であって、
（ａ）ＰＨＦの形成を促進する条件下で所定の期間タウタンパク質とポリアニオン性補助因子をインキュベートする工程；及び
（ｂ）顕微鏡的手段又は分光学的手段によって、形成されたＰＨＦを検出する工程
を含むインビトロの方法を提供する。
【００２７】
形成されたＰＨＦを検出するためのいくつかの方法が知られている。本発明によれば、形成されたＰＨＦの検出は、電子顕微鏡法（ＥＭ）若しくは原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）などの顕微鏡的手段、又は分光学的手段を使用して実施され得る。ある種の実施形態において、分光学的手段は、蛍光分光法、好ましくはチオフラビンＴ蛍光分光法を含む。
【００２８】
本発明はさらに、タウタンパク質の対らせん状細線維の形成を阻害又は促進することができる化合物の同定のためのインビトロの方法であって、試験化合物の非存在下及び存在下の両方で上記の方法を実施すること；並びに前記試験化合物の非存在下でのＰＨＦの形成の動力学を、前記試験化合物の存在下でのＰＨＦの形成の動力学と比較することを含むインビトロの方法を提供する。
【００２９】
試験化合物がＰＨＦの形成を阻害する場合、動力学はより遅くなり、長い誘導期及び／又は浅い成長期及び／又は低いプラトーによって特徴づけられることになる。
【００３０】
試験化合物がＰＨＦの形成を促進する場合、動力学は、短い誘導期及び／又は急勾配の成長期及び／又は高いプラトーを有することになる。
【００３１】
本発明に従って使用される用語「ＰＨＦ形成」は、タウタンパク質又はその断片が、集合又は凝集して対らせん状細線維になることを意味する。ＰＨＦは、原線維性の形態を有するミスフォールドしたタウ分子の高次の集合によって特徴づけられる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＨＦ形成を阻害する」は、（完全に）「阻害する」ことに限定されず、好適なインビトロ条件下でＰＨＦ形成を「遅延させる」ことも含む。
【００３３】
本発明によれば、ＰＨＦ形成を促進又は阻害することができる化合物は、抗体、又はその誘導体及び／若しくは断片であり得る。
【００３４】
本発明の方法によりスクリーニングされる有望な他の誘発剤又は阻害剤としては、タウの適切な部位に結合し、干渉し、且つ／又は占有する小分子が挙げられる。本発明は、有望なＰＨＦ形成阻害剤を評価する際に特に有用である。
【００３５】
本発明はさらに実施例で示されるが、これは決して本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：キュベット形式におけるインビトロ凝集アッセイ
全長タウを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させ、Ｈｉｓ−トラップアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、−８０℃でＰＢＳ  ｐＨ＝７．４（一定分量）中に保存した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液５００μＭを、乾燥粉末（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）をＰＢＳ、ｐＨ７．４中で溶解させることによって調製し、滅菌０．２２μｍ孔径ＰＥＳメンブランフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に通して濾過した。２２０００Ｍ−１  ｃｍ−１の吸光係数を用いた４１１ｎｍでの吸光度測定によって濃度を決定した。ヘパリン原液を、乾燥粉末（Ｍｗ＝１７〜１９ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）をＰＢＳ、ｐＨ７．４中で溶解させることによって新たに調製し、滅菌０．２２μｍ孔径ＰＶＤＦメンブランフィルタ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｕｌｌａｇｒｅｅｎ、Ｃｏｒｋ、ＩＲＬ）に通して濾過した。
【００３７】
２５μＭの最終ＴｈＴ濃度、ｒＴａｕ１０〜１５μＭ（０．３１ｍｌ  ｍｇ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いた２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定された濃度）及びｒＴａｕ：ヘパリン＝２：１の比のヘパリンを有する２００μｌの試料を、ＩＫＡ  Ｌｏｏｐｓｔｅｒデジタルローター（１５ｒｐｍ）で継続的に振盪しながら０．５ｍｌエッペンドルフチューブ中において３７℃でインキュベートした。
【００３８】
少量の上記のインキュベート反応（１０μｌ）を定期的に取り出し、最終体積５００μｌの２５μＭ  ＴｈＴ溶液と混合した。ＴｈＴ蛍光動力学測定は、ＡＴＦ  １０５示差／比率分光蛍光光度計（Ａｖｉｖ、ＮＪ、ＵＳＡ）において５ｍｍ光路の石英セル（Ｈｅｌｌｍａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中２５℃で行われた。６００〜４６０ｎｍの発光スキャンが、４ｎｍの帯域幅及び電圧７００／２６０Ｖを用いて、４４０ｎｍの励起波長について記録された（最大：４８２ｎｍ）。ｒＴａｕの線維形成中において、凝集の誘導期、成長及び末期プラトーレベルの再現性は観察されなかった（図１及び図２）。核生成依存性重合（ＮＤＰ）の基準は満たされなかった。これは、文献においても観察された（図３）。公開されているデータの大部分が、ｒＴａｕ断片及び全長ではないｒＴａｕに関連し、はるかに速く凝集する。データでは全般的に再現性がないことが観察された；明確な誘導期に続く指数的成長のないシグモイドの動力学、あるいは他方では、非効率的なシーディングが示された。
【００３９】
タウ分子は、凝集動力学に大きな影響を及ぼす異なる立体構造をもたらす、ジスルフィド架橋を形成することができる２つのシステインを含有する。ジスルフィド架橋を還元するために、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）をタンパク質溶液に加えた。凝集過程の動力学は、ＴＣＥＰの非存在下及び存在下でのＴｈＴ蛍光を後に伴った（図４）。
【００４０】
ＴＣＥＰ存在下での結果は、より高い再現性及び異なる動力学の傾向を示した。ＴＣＥＰ非存在下では、異なる挙動が観察された（バッチ間の変動性）。ジスルフィド架橋は小型の単量体又は二量体を形成することができ、ジスルフィド架橋が還元されるとき、タウ分子は開いた単量体になると期待される。一方では、小型の単量体の存在が誘導期を延長することになり、また凝集の末期プラトーレベルも低下させることになる。他方では、二量体の存在が凝集過程を著しく加速させることになる。異なる分子立体構造の組み合わせが、凝集の末期プラトーレベルに影響を及ぼし得る。
【００４１】
これらの結果に基づいて、変異体タウタンパク質（ＤＣｙｓＭ  ｒＴａｕ）を使用することが決定されたが、ここで、システイン残基は、それらをアラニンによって置換することにより変異される。
【００４２】
実施例２：プレートリーダー形式におけるインビトロ凝集アッセイ
全長タウ二重システイン変異体（ＤＣｙｓＭ  Ｔａｕ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させ、Ｈｉｓ−トラップアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、
−８０℃でＰＢＳ  ｐＨ＝７．４（一定分量）中に保存した。ＴｈＴ蛍光動力学測定を、４４０ｎｍの励起波長及び４８５ｎｍの発光波長で、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２マルチ−モードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）中の９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖａｎｔａａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において３７℃で行った。
【００４３】
５０μＭの最終ＴｈＴ濃度、８μＭのヘパリン及び１５μＭのｒＴａｕ（０．３１ｍｌ  ｍｇ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いた２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定された濃度）を有する２００μｌの試料を、プレートシーラー（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で密閉した。出発ｒＴａｕ材料に関して還元剤及び保存条件の効果を評価することによって、アッセイを最適化した（図５〜６）。継続的に振盪しながら（４２５ｃｐｍ、３ｍｍ）、データを９００秒毎に記録した。ＮＤＰ基準を満たす最終アッセイ条件が図７〜１０に示される：
−誘導期後の指数的成長を示すシグモイドの動力学（図７）
−凝集体は原線維構造を示す（図８）
−核形成をバイパスする効率的なシーディング（シードを加えるとき、シードと単量体の間で１００％の適合性がある場合、指数的成長が観察されるはずである；図９）
−濃度依存性（図１０）
【００４４】
実施例３：プレートリーダー形式におけるインビトロ凝集アッセイ：シーディング
ｒＴａｕの凝集した試料を５０時間後にプールし、ｒｔａｕの新たな凝集のためのシードとして使用した（図９）。超音波処理した凝集体をｒＴａｕの新しい溶液に加えることによって、ｒＴａｕの自発的転換において観察される誘導期の完全なバイパス（ＮＤＰ機構の厳密な基準の１つ）を引き起こした。
【００４５】
実施例４：プレートリーダー形式におけるインビトロ凝集アッセイ：阻害剤のためのシーディング
１５μＭのｒＴａｕを、５０μＭのＴｈＴ、８μＭのヘパリン及び０．５ｍＭのＴＣＥＰを含有する２００μｌのＰＢＳ溶液中において、単独又は３μＭ、６μＭ及び９μＭのＣＢＴＡＵ  ２７．１（タウ結合抗体）の存在下でインキュベートした。プレートをプレートシーラー（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で密閉し、継続的に振盪しながら（４２５ｃｐｍ、３ｍｍ）、測定値を９００秒毎に記録した（図１１を参照のこと）。９μＭのＣＢＴＡＵ−２７．１の存在下で、ｒｔａｕの転換が、アッセイの全期間（１６０時間）完全に阻止されることを観察することができた。６μＭのＣＢＴＡＵ−２７．１の存在下では、転換の誘導期が７０時間に延長され、転換は、１６０時間のアッセイ期間において完了しなかった。３μＭのＣＢＴＡＵ−２７．１もまた、ｒｔａｕの転換を阻害しており、長い誘導期と低い最終的なプラトーによって強調される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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