(57)【要約】  本発明は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとを含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体であって、可変ドメインが、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３と、抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３とをそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びに、ＩｇＡヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体に関し、また、ＧＤ２陽性腫瘍、好適には神経芽腫を有する対象をこれらの抗体で治療する方法に関する。
2020534370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとを含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体であって、前記可変ドメインが、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びに、ＩｇＡヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む、抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項２】
前記可変ドメインが、抗体ｃｈ１４．１８の前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項３】
前記可変ドメインが、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項４】
ＩｇＡ  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＡ  ＣＨ３ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項５】
前記ＩｇＡドメイン又はヒンジ領域が、ヒトＩｇＡドメイン又はヒトＩｇＡヒンジ領域である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項６】
前記ヒトＩｇＡドメイン又はヒトＩｇＡヒンジ領域が、ヒトＩｇＡ１ドメイン又はヒトＩｇＡ１ヒンジ領域である、請求項５に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項７】
好適なインビトロＡＤＣＣアッセイで測定した場合に、前記抗体ジヌツキシマブよりも高い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項８】
好適なインビトロＣＤＣアッセイで測定した場合に、前記抗体ジヌツキシマブよりも低い補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項９】
好適なインビトロＣＤＣアッセイで測定した場合に、前記抗体ジヌツキシマブの２０％以下の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項１０】
前記抗体の重鎖又は軽鎖に付着したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はＺＦｃＲＮペプチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ガングリオシドＧＤ２抗体。
【請求項１１】
ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療方法であって、治療上有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を、それを必要とする前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記対象におけるＧＤ２陽性腫瘍細胞中のガングリオシドＧＤ２を上方調節するのに有効な量のレチノイン酸を投与することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象における顆粒球数を増加させるのに有効な量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又はこれらの組み合わせを投与することを更に含む、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、アミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥ  ＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩ  ＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴ  ＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮ  ＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡ  ＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹ  ＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬ  ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ  ＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤ  ＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭ  ＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴ  ＶＳＳ
を有する重鎖可変領域及びアミノ酸配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶ  ＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷ  ＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫ  ＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦ  ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ  ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ  ＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶ  ＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰ  ＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬ  ＥＬＫ
を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）関連副作用の低減に使用するための改変抗体又はその断片であって、前記改変抗体又はその断片は、
ａ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、
ｂ）免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の定常領域又はその一部分と、
を含み、
前記改変抗体又はその断片は、同等量の対応するＩｇＧ抗体の投与と比較して、前記対象への投与時に少なくとも１つの副作用を低減させる、
改変抗体又はその断片。
【請求項１６】
ＩｇＧの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を更に含む、請求項１５に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項１７】
前記ＩｇＡの定常領域の一部分を含み、前記部分がヒンジ領域又は定常領域を含む、請求項１５に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項１８】
前記ＩｇＡのヒンジ領域及び定常領域を含む、請求項１７に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項１９】
前記定常領域が、前記ＩｇＡの定常重鎖及び定常軽鎖を含む、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２０】
前記ＩｇＡの定常領域又はその一部分が、ヒンジドメイン及び定常重ドメインを含む、請求項１７に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２１】
前記抗体又はその断片が、キメラ化、ヒト化、ヒト、又は非ヒト抗体又はその断片である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２２】
前記定常領域又はその一部分がヒト定常領域又はその一部分である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２３】
前記副作用が自然免疫応答を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２４】
前記自然免疫応答が補体応答を含む、請求項２３に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２５】
前記補体応答がＦｃγＲ又はＣ１ｑへの抗体結合を含む、請求項２４に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの副作用の低減が、フローサイトメトリ、インビトロアッセイ、又はこれらの組み合わせを実行することによって測定される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２７】
前記フローサイトメトリが、細胞の溶解、結合、細胞死、受容体発現、又はこれらの組み合わせを測定することを含む、請求項２６に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２８】
前記フローサイトメトリが、生細胞／死細胞染色を測定することを含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項２９】
前記インビトロアッセイが、ＥＬＩＳＡアッセイ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ、溶血アッセイ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の改変抗体又は断片。
【請求項３０】
前記抗体又はその断片が、対象に投与された場合に、前記対応するＩｇＧ抗体と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の減少をもたらす、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の改変抗体又は断片。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの副作用の低減が、前記同等量の対応するＩｇＧ抗体の投与と比較して、前記少なくとも１つの副作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の低減を含む、請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項３２】
前記抗体又はその断片が、抗原性細胞又は癌細胞上に存在する標的に結合する、請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項３３】
前記抗体又はその断片が、脳転移癌からの標的に結合する、請求項１５〜３２のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項３４】
前記抗体又はその断片が、ＧＤ２陽性癌又はＣＤ２０陽性癌に結合する、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項３５】
前記ＧＤ２陽性癌が、神経芽腫、網膜芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫又は平滑筋肉腫である、請求項３４に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項３６】
前記抗体又はその断片が神経芽腫細胞に結合する、請求項１５〜３５のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片。
【請求項３７】
請求項１５〜３６のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項３８】
請求項１５〜３６のいずれか一項に記載の改変抗体又はその断片及びその使用説明書を含むキット。
【請求項３９】
ａ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、
ｂ）免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の定常領域又はその一部分と、
を含む改変抗体又はその断片を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む方法であって、
同等量の対応するＩｇＧ抗体を投与することと比較して、前記対象への投与時に副作用が低減される、方法。
【請求項４０】
ＩｇＧの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＩｇＡの定常領域又はその一部分が、前記ＩｇＡのヒンジ領域又は定常領域を含む、請求項３９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記定常領域又はその一部分が、前記ＩｇＡのヒンジ領域及び定常領域を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記定常領域が、前記ＩｇＡの定常重鎖及び定常軽鎖を含む、請求項４１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＩｇＡの定常領域又はその一部分が、前記ＩｇＡのヒンジドメイン及び定常重ドメインを含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体又はその断片が、キメラ化、ヒト化、ヒト、又は非ヒト抗体又はその断片である、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記定常領域又はその一部分がヒト定常領域又はその一部分である、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記副作用が自然免疫応答を含む、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記自然免疫応答が補体応答を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記補体応答が、前記対象における疼痛、異痛、痛覚過敏又は感受性の増強をもたらす、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記補体応答がＦｃγＲ又はＣ１ｑへの抗体結合を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変抗体又はその断片を投与することが、同等量の前記対応するＩｇＧ抗体の投与と比較して、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を減少させることを含む、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
対象におけるＩｇＧ投与に関連する疼痛又は異痛を低減する方法であって、対象における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）関連副作用の低減に使用するための改変抗体又はその断片を前記対象に投与することを含み、前記改変抗体又はその断片は、
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、
前記改変抗体又はその断片が、同等量の対応するＩｇＧ抗体の投与と比較して、前記対象への投与時に疼痛又は異痛を低減させる、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の定常領域又はその一部分と、
を含む、方法。
【請求項５３】
対象におけるＩｇＧ投与に起因する補体活性化を低減する方法であって、対象における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）関連副作用の低減に使用するための改変抗体又はその断片を前記対象に投与することを含み、前記改変抗体又はその断片は、
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、
前記改変抗体又はその断片が、同等量の対応するＩｇＧ抗体の投与と比較して、前記対象への投与時に補体活性化を低減させる、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の定常領域又はその一部分と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の分野に関する。具体的には、本発明は、ガングリオシドＧＤ２に結合する抗体に関する。本発明は更に、医療方法及び検出方法におけるＧＤ２抗体の使用に関する。本発明は更に、抗体の生産のための細胞、核酸分子及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての小児癌患者の約１２％が、最も一般的な小児期の頭蓋外固形腫瘍である神経芽腫に罹患している。患者の大部分は、死亡率５０％の高リスク神経芽腫と診断される。神経芽腫の治療法は、重度の毒性を伴う集中的なマルチモダリティ治療からなる。高リスクの神経芽腫の治療法は、重度の短期及び長期の毒性を伴う集中的なマルチモダリティ治療からなる。再発率は高く、更なる治療選択肢は限られている。残存疾患は、集中化学療法、放射線療法、高用量化学療法に続く自家造血幹細胞のレスキュー及びイソトレチノインで治療される。腫瘍は、完全には根絶されない場合が多い（Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ  Ｖｏｌ  ３４１：ｐｐ１１６５−７３）。従来の治療法を集中的に行っても、結果の改善が見られず、却って毒性が増大してしまう。
【０００３】
２０１５年に、神経芽腫及び神経組織においてに均一に発現される糖鎖抗原である、ガングリオシドＧＤ２向けの抗体ジヌツキシマブ（商品名Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）が、神経芽腫治療に関してＦＤＡの承認を受けた。サイトカイン及び分化因子と組み合わされたこの抗体の適用は、患者の予後を改善し、神経芽腫が免疫療法に対して感受性があることを実証した（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，Ｖｏｌ３６３：ｐｐ１３２４−３４；及びＳｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ．，２０１５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｖｏｌ  １９：ｐ．３４９−６２）。ジヌツキシマブは、標準的な治療と比較して、イベントフリー生存率を有意に改善した。
【０００４】
ジヌツキシマブは、マウス抗ＧＤ２抗体１４．１８の可変重鎖領域及び軽鎖領域、並びにヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びκ軽鎖定常領域からなるキメラモノクローナル抗体である（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：ｐ．１９１−２０２）。ジヌツキシマブは、中枢神経系及び末梢神経の組織上、並びに神経芽腫を含む神経外胚葉性の多くの腫瘍上で細胞外発現されるジシアロガングリオシドであるＧＤ２の末端ペンタオリゴ糖を対象とする（Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ，２０１５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｖｏｌ  １９：ｐ．３４９−６２）。ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞内で産生される抗体は、天然ヒト抗体に対する異常なグリコシル化をもたらし得る。欧州では、この抗体は現在、ＣＨＯ細胞で産生されている。ＧＤ２が神経芽腫上では均一に発現され、他の組織上では低発現であることが、この腫瘍関連抗原を抗体療法の有望な標的としている。誘導療法後に応答が示された患者の高リスク神経芽腫に対する第一選択治療として、ジヌツキシマブをイソトレチノイン並びにＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦの交互投与と組み合わせて使用する（Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ，２０１５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｖｏｌ  １９：ｐ．３４９−６２）。
【０００５】
臨床研究は、ジヌツキシマブが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）を介してその抗腫瘍効果を媒介することを示している（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ  ５１：ｐ．１４４−９）。ＡＤＣＣ活性については、殆どの治療用抗体は、ＮＫ細胞及び、恐らくはマクロファージにその作用を依存している。驚くべきことに、神経芽腫に対するジヌツキシマブのＡＤＣＣ活性は、何らかの理由で顆粒球活性化にも依存している。このことは、患者の転帰が顆粒球活性化に部分的に依存することを示すことによって、インビトロ及びインビボで示されている（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ  ５１：ｐ．１４４−９；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，Ｖｏｌ  ３０：ｐ．４２６−３２；及びＢａｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ  ５：ｐ．４２５９−６３）。これらの観察結果は、顆粒球を更に刺激して神経芽腫に対する抗腫瘍応答を強化するために、現在の治療レジメンにＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦを含めることの根拠をなしている（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，Ｖｏｌ  ３０：ｐ．４２６−３２；及びＢａｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ  ５：ｐ．４２５９−６３）。
【０００６】
ジヌツキシマブは、良好な臨床効果を奏効する一方で、多くの毒性も伴う。最も一般的な毒性としては、頻脈、高血圧、低血圧、治療困難な疼痛、発熱、及び潰瘍が挙げられる。これらの毒性の多くは用量依存性であり、低用量では稀にしか認められない。他の毒性としては、低血糖症、低カリウム血症、悪心、嘔吐及び下痢が挙げられる（Ｍｏｒａ  Ｊ，２０１６，Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ１−７；（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５８６／１７５１２４３３．２０１６．１１６０７７５）。
【０００７】
本発明の抗ＧＤ２抗体及び治療方法は、改善された有効性を示す。加えて、ジヌツキシマブ治療に伴う毒性が低減され、特に、臨床前モデルで示されるように、疼痛関連の毒性が抑制される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとを含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体であって、可変ドメインが、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３と、抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３とをそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びに、ＩｇＡヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む抗体を提供する。可変ドメインは、好ましくは、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに、抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。好ましい一実施形態では、可変ドメインは、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【０００９】
本発明は更に、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療方法を提供し、この方法は、治療上有効量の本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。本方法は、好ましくは、当該対象のＧＤ２陽性腫瘍、好ましくは神経芽腫中のガングリオシドＧＤ２を上方調節するのに有効な量のレチノイン酸を投与することを更に含む。本方法は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又はこれらの組み合わせを当該対象に投与することを更に含んでもよい。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせは、対象における顆粒球数を増加させることができるが、殺細胞の誘導を改善する目的でも投与される。
【００１０】
本発明は更に、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療に使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は更に、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療に使用するための、レチノイン酸と組み合わせた本発明の抗体を更に提供する。本発明は更に、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療に使用するための、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせと組み合わせた本発明の抗体を更に提供する。本発明は更に、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療に使用するための、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせ及びレチノイン酸と組み合わせた本発明の抗体を更に提供する。
【００１１】
ＧＤ２陽性腫瘍は、好ましくは、神経外胚葉由来の腫瘍又は肉腫などのＧＤ２陽性神経芽腫である。好ましい一実施形態では、ＧＤ２陽性腫瘍は、ＧＤ２陽性神経芽腫、網膜芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、神経膠腫などの脳腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、小児及び成人におけるユーイング肉腫、或いは成人における脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫又は別の軟組織肉腫である。好ましい一実施形態では、ＧＤ２陽性腫瘍は神経芽腫である。本発明の方法又は使用で治療される神経芽腫は、好ましくは、高リスクの神経芽腫である。
【００１２】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥ  ＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩ  ＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴ  ＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮ  ＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡ  ＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹ  ＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬ  ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ  ＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤ  ＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭ  ＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴ  ＶＳＳ；
を有する重鎖可変領域及び、アミノ酸配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶ  ＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷ  ＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫ  ＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦ  ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ  ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ  ＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶ  ＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰ  ＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬ  ＥＬＫ；
を有する軽鎖可変領域並びに、ＩｇＡヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む重鎖を含む。
【００１３】
本明細書では、患者コンプライアンスの改善及び／又は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体療法に伴う副作用の低減に使用するための改変抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその断片を提供し、改変抗体又はその断片は、（ａ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、（ｂ）免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の定常領域又はその一部分とを含み、改変抗体又はその断片は、同等量の対応するＩｇＧ抗体の投与と比較して、対象への投与時に少なくとも１つの副作用を減少させる。
【００１４】
一態様では、改変抗体又はその断片は、ＩｇＧの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を更に含む。一態様では、ＩｇＡの定常領域又はその一部分は、ヒンジ領域、ＣＨ２定常領域、又はこれらの組み合わせを含む。一態様では、定常領域又はその一部分は、ＩｇＡのヒンジ領域及びＣＨ２定常領域を含む。一態様では、定常領域は、ＩｇＡの定常重鎖及び定常軽鎖を含む。一態様では、ＩｇＡの定常領域又はその一部分は、ヒンジドメイン及び定常重鎖ドメインを含む。一態様では、抗体又はその断片は、キメラ化、ヒト化、ヒト又は非ヒト抗体又はその断片である。一態様では、定常領域又はその一部分はヒト定常領域又はその一部分である。
【００１５】
一態様では、副作用は、自然免疫応答を含む。場合によっては、自然免疫応答は、補体応答を含む。場合によっては、補体応答は、ＦｃγＲ又はＣ１ｑに対するＩｇＧ結合を含む。幾つかの実施形態では、副作用は、疼痛、内臓過敏症、異痛、痛覚過敏、アレルギー性反応、及び感冒様症状のうちの１つ以上を含む。場合によっては、疼痛は、急性疼痛、片頭痛又は激しい内臓痛である。
【００１６】
場合によっては、副作用の低減は、フローサイトメトリ、インビトロアッセイ、又はこれらの組み合わせを実行することによって測定される。場合によっては、フローサイトメトリは、細胞の溶解、結合、細胞死、受容体発現、又はこれらの組み合わせを測定することを含む。場合によっては、フローサイトメトリは、生細胞／死細胞染色を測定することを含む。場合によっては、インビトロアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ、溶血アッセイ、又はこれらの組み合わせを含む。
【００１７】
場合によっては、改変抗体又はその断片は、投与された場合に、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む対応するＩｇＧ抗体と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の減少をもたらす。一態様では、減少は、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む同等のＩｇＧ抗体の投与と比較して、副作用が５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％から１００％であることを含む。
【００１８】
場合によっては、抗体又はその断片は、非癌性細胞、癌細胞、又はこれらの組み合わせ上に存在する標的に結合する。場合によっては、抗体又はその断片は、脳転移癌からの標的に結合する。場合によっては、抗体又はその断片は、ＧＤ２、ＡＬＫ、ｈＮＥＴ、ＧＤ３及びＣＤ２０のうちの１つ以上に結合する。場合によっては、ＧＤ２陽性腫瘍は、神経芽腫、網膜芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、及びこれらの任意の組み合わせである。一態様では、抗体又はその断片は、神経芽腫細胞に結合する。場合によっては、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）陽性腫瘍は、未分化大細胞リンパ腫、肺腺癌、神経芽腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、腎細胞癌、食道扁平上皮癌、乳癌、結腸腺癌、多形性膠芽腫又は甲状腺未分化癌である。場合によっては、ｈＮＥＴ（ヒトノルエピネフリン輸送体）陽性腫瘍は、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、神経芽腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、又は網膜芽腫である。場合によっては、ＧＤ３陽性腫瘍は、中枢神経系の神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、神経芽腫、網膜芽腫、上衣腫、肉腫、黒色腫、乳癌、卵巣癌、神経膠腫、ユーイング肉腫、又は小細胞肺癌である。場合によっては、ＣＤ２０陽性腫瘍は、白血病、リンパ腫又は神経芽腫である。
【００１９】
本明細書では、改変抗体又はその断片及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物が提供される。
【００２０】
本明細書では、改変抗体又はその断片及びその使用説明書を含むキットが提供される。
【００２１】
本明細書では、（ａ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、（ｂ）免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の定常領域又はその一部分と、を含む抗体又はその断片を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む方法であって、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む同等のＩｇＧ抗体を投与することと比較して、対象への投与時に副作用が低減される方法が提供される。
【００２２】
本明細書では、改変免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体断片が提供され、この改変ＩｇＧ抗体断片は、ヒトＩｇＡ抗体の少なくともヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む。場合によっては、改変ＩｇＧ抗体断片は、対象に投与された場合に、ヒトＩｇＡ抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインが存在しない同等の抗体断片と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の減少をもたらす。
【００２３】
本明細書では、ＩｇＧ投与に関連する疼痛又は異痛を治療する方法であって、ＩｇＡ抗体の定常領域を含む改変ＩｇＧ抗体又はその断片を対象に投与することを含む方法が提供される。本明細書では、ＩｇＡ抗体の定常領域を含む改変ＩｇＧ抗体又はその断片を対象に投与することを含む、ＩｇＧ投与に起因する補体活性化を低減する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ガングリオシドは、シグナル伝達並びに細胞の付着及び認識に重要な役割を果たすシアル酸含有スフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドＧＤ２は、シアル酸単位をその前駆体ＧＭ２に加えるために酵素ＧＤ３シンターゼ及びＧＤ２シンターゼを必要とするｂ系列ガングリオシドである。正常組織は一般に、ａ系列のガングリオシドを発現し、ｂ系列のガングリオシドは、胎児発達中に発現され、健康な成人では主に神経系に制限され、末梢神経及び皮膚メラニン細胞においては低レベルに制限される。ガングリオシドＧＤ２の構造を図１０に示す。
【００２５】
ガングリオシドＧＤ２は、神経芽腫、網膜芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、脳腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、小児及び成人におけるユーイング肉腫、並びに成人における脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫及びその他の軟組織肉腫を含む神経外胚葉由来の腫瘍及び肉腫で高度に発現される。健常者におけるＧＤ２発現は、脳並びに特定の末梢神経及びメラニン細胞に限定されると考えられている。通常、脳は正常な循環抗体ではアクセスできないため、ＧＤ２は腫瘍特異的療法における効果的な標的であると考えられる（Ｍａｈｉｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８８：２８８−２９７を参照されたい）。Ｍａｈｉｕｄｄｉｎらは、ＧＤ２特異性抗体が存在する様々なＧＤ２標的化アプローチを記載している。幾つかの標的療法は臨床試験段階に到達しており、第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相試験で有望であることが示されている。
【００２６】
様々なＧＤ２抗体が現在開発中である。抗体は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘導すると考えられており、特に神経芽腫は比較的感受性が高いと考えられる。標的化アプローチの有効性を改善し、毒性を低減するために、様々な手段が追求されている。最も頻繁に使用される抗体は全て、マウスＩｇＧ３抗体に由来する。マウス抗体は、近年ヒト化されている。多数の変異体が作製されている。マウス抗体１４．１８は、ｃｈ１４．１８にキメラ化され、ｈｕ１４．１８にヒト化されており、両方ともヒトＩｇＧ１バックグラウンドを有する（Ｍａｈｉｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８８：２８８−２９７）。マウスＩｇＧ３抗体３Ｆ８はヒトで使用されている。ヒトの抗マウス応答を低減し、抗体の有効性を向上させると同時に、毒性を低減するために、３Ｆ８のキメラ化（ｃｈ３Ｆ８）及び３Ｆ８のヒト化（ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１及びｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４）を行った。ＳＰＲによるＧＤ２結合研究では、ｃｈ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８は、ｍ３Ｆ８に匹敵するＫＤを維持した。他の抗ＧＤ２抗体とは異なり、ｍ３Ｆ８、ｃｈ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８は、実質的により遅いｋｏｆｆを有した。ｃｈ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８は双方とも、ｍ３Ｆ８と同様にインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害したが、他のガングリオシドとの交差反応性はｍ３Ｆ８のものと同等であった。ｃｈ３Ｆ８及びｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）−ＡＤＣＣ及び多形核白血球（ＰＭＮ）−ＡＤＣＣは双方とも、ｍ３Ｆ８よりも強力であった。ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４には、ＰＢＭＣ−ＡＤＣＣ及びＣＤＣは殆ど存在しなかった。ｈｕ３Ｆ８及びｍ３Ｆ８の生体内分布研究では、腫瘍と非腫瘍との比率が類似していた。神経芽腫異種移植片に対する抗腫瘍効果は、ｍ３Ｆ８よりもｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１の方が良好であった（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １．４：４７７−４８６を参照されたい）。
【００２７】
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体（Ａｂ）は、大きなタンパク質である。抗体は、免疫系の様々な構成成分と相互作用する。相互作用の幾つかは、これらの相互作用に関与する部位を含むＦｃ領域（基部に位置する）によって媒介される。
【００２８】
抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質である。これらは、典型的には２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する。抗原結合断片に結合され得る５つの異なる種類の結晶性断片（Ｆｃ）を画定する、幾つかの異なる種類の抗体重鎖が存在する。５つの異なる種類のＦｃ領域は、抗体を５つのアイソタイプにグループ化することを可能にする。特定の抗体アイソタイプのＦｃ領域は、その特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合できるため、抗原−抗体複合体は、結合するＦｃＲに応じて異なる役割を仲介することができる。ＩｇＧ抗体が対応するＦｃＲに結合する能力は、相互作用部位の有無と、Ｆｃ領域内の部位に存在するグリカン（存在する場合）の構造によって調節される。抗体がＦｃＲに結合する能力は、遭遇する異なる種類の異物ごとに適切な免疫応答を導くのに役立つ。
【００２９】
全ての抗体の大まかな構造は類似しているが、タンパク質の先端の領域は非常に多様であり、わずかに異なる先端構造又は抗原結合部位を有する数百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は、超可変領域として知られている。抗体による抗原結合の膨大な多様性は、主に超可変領域と超可変領域を含む可変ドメインとによって定義されている。
【００３０】
本発明の抗体は、典型的には「完全長」抗体である。「完全長抗体」という用語は、本質的に完全な免疫グロブリン分子を含むものとして定義されるが、必ずしも完全な免疫グロブリンの全ての機能を有するわけではない。誤解を避けるために、完全長抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する。各鎖は、定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含む。完全長抗体の重鎖は、典型的には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ領域、及びヒンジ領域を含む。完全長抗体の軽鎖は、典型的には、ＣＬ領域及びＶＬ領域を含む。
【００３１】
抗体は、Ｆａｂ部分に含まれる可変領域ドメインを介して抗原に結合する。抗体可変ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。本発明による完全長抗体は、所望の特性を提供する突然変異が存在し得る重鎖及び軽鎖を包含する。完全長抗体は、領域のうちのいずれの実質的な部分の欠失も有するべきではない。しかしながら、得られる抗体の抗原結合特性を本質的に変化させることなく、１つ又は幾つかのアミノ酸残基が置換され、挿入され、欠失され、又はこれらの組み合わせが行われているＩｇＧ分子は、用語「完全長」抗体内に包含される。例えば、「完全長」抗体は、好ましくは非ＣＤＲ領域に１〜１０個（両端を含む）のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又はそれらの組み合わせを有することができるが、欠失したアミノ酸は、抗体の結合特異性に必須ではない。
【００３２】
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び補体の第１の成分（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクタ機能をもたらす。ＩｇＧのＦｃγＲ又はＣ１ｑへの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン内に位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合にとって重要であり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４に固有の配列を有する。２３３位〜２３６位のＩｇＧ２残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に減少させることが示された。更に、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２Ａを含む異なる位置でのアラニン置換が補体活性化を有意に低減させることを示した。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメインにおける突然変異は、ＦｃγＲＩ及びＣ１ｑへの結合を低減させることが示された。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインに多数の変異が加えられ、インビトロでＡＤＣＣ及びＣＤＣに対するそれらの効果が試験された。特に、３３３位におけるアラニン置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増加させることが報告された。Ｆｃ受容体機能は、特にＢｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６−２５；Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４；Ｓｔｅｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５−７４；及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（４）：２５７１−５に概説されている。ＩｇＧ１抗体にはＣ１ｑ結合部位があり、これを介して古典的経路による補体活性化が達成される。ＩｇＡ抗体も補体を活性化できる。これは、代替経路、補体レクチン経路及び古典的経路を介して行うことができる（Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９；１４３（５）：１７０３−９；Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９８７；１７（３）：３２１−６；Ｐｆａｆｆｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９８２；１５５（１）：２３１−４７；Ｒｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７（５）：２８６１−８；Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ＤＯＩ：１０．３３２４／ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１１．０６１４０８；及びＬｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１１ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｊｈ．１４６２４）。
【００３３】
本発明者らは、改変されていない定常領域を有するマウスＩｇＧ、マウスキメラ化ＩｇＧ又はヒト化ＩｇＧ或いはヒトＩｇＭのＧＤ２抗体のＡＤＣＣ活性を、少なくともこれらのヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを、ヒトＩｇＡ抗体、好ましくはヒトＩｇＡ１抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインに置き換えることによって増加させることができることを見出した。好ましい一実施形態では、ＣＨ３ドメインもヒトＩｇＡ抗体のものである。好ましい一実施形態では、抗体は、本質的に完全なＩｇＡ定常領域を含む。従って、本発明は、ＧＤ２に結合することができ、ＡＤＣＣ活性を含み、ヒトＩｇＡ抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む抗体を提供する。本発明のＧＤ２抗体は、ＣＤＣを誘導する能力が低下している。本発明のＧＤ２抗体は、マウスＩｇＧ、マウスキメラ化ＩｇＧ又はヒト化ＩｇＧ或いはヒトＩｇＭの元のＧＤ２抗体と比較した場合、疼痛を誘発する能力が低下している。
【００３４】
ＩｇＡ定常ドメイン又はヒンジ領域は、生殖細胞系ＩｇＡドメイン又はヒンジ領域に対して、１つ以上の位置に、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有し得る。好ましくは、ＩｇＡドメイン又はヒンジ領域は、最大で４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせ、好ましくは最大で３個、２個又は好ましくは最大で１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。このようなタンパク質は、依然としてＩｇＡ定常ドメイン又はヒンジ領域である。ＩｇＡ定常ドメイン又はヒンジ領域は、生殖細胞系ＩｇＡに対して、１つ以上の位置に、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有し得る。ＩｇＡ定常部分（３つのドメイン及びヒンジ領域を含む）は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有することができる。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとを含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体であって、可変ドメインが、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びに、ＩｇＡヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む抗体を提供する。可変ドメインは、好ましくは、図１に示すように、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。可変ドメインは、好ましくは、図１に示すように、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
抗ガングリオシドＧＤ２抗体重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域である。１つ以上の位置は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、図１の抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域について示されている通りである。重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜３個、より好ましくは０〜２個、更に好ましくは０〜１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体における重鎖可変領域は、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。
【００３７】
抗ガングリオシドＧＤ２抗体軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域である。１つ以上の位置は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、図１の抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域について示されている通りである。軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜３個、より好ましくは０〜２個、更に好ましくは０〜１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体における軽鎖可変領域は、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。
【００３８】
別の一実施形態では、本発明は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとを含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体であって、可変ドメインが、抗体３Ｆ８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びに、ＩｇＡヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインを含む抗体を提供する。可変ドメインは、好ましくは、（図１に示すように）抗体３Ｆ８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。可変ドメインは、好ましくは、図１に示すように、抗体３Ｆ８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。抗ガングリオシドＧＤ２抗体重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体３Ｆ８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、抗体３Ｆ８の重鎖可変領域である。１つ以上の位置は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、図１の抗体３Ｆ８の重鎖可変領域について示されている通りである。重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体３Ｆ８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体３Ｆ８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜３個、より好ましくは０〜２個、更に好ましくは０〜１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体における重鎖可変領域は、図１に示す抗体３Ｆ８の重鎖可変領域配列に対して、０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。
【００３９】
抗ガングリオシドＧＤ２抗体軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体３Ｆ８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、抗体３Ｆ８の軽鎖可変領域である。１つ以上の位置は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、図１の抗体３Ｆ８の軽鎖可変領域について示されている通りである。軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体３Ｆ８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体３Ｆ８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜３個、より好ましくは０〜２個、更に好ましくは０〜１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体における軽鎖可変領域は、図１に示す抗体３Ｆ８の軽鎖可変領域配列に対して、０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。
【００４０】
ＩｇＡには２つのサブクラス（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）があり、単量体及び二量体の形態として産生され得る。本発明における抗体は、好ましくは単量体抗体である。本発明の抗体におけるＩｇＡ要素は、好ましくはヒトＩｇＡ要素である。ＩｇＡ要素は、ＩｇＡ１要素又はＩｇＡ２要素であり得る。本発明の抗体中のＩｇＡ要素は、全てのＩｇＡ１要素、又は全てのＩｇＡ２要素、又はＩｇＡ１要素とＩｇＡ２要素との組み合わせであり得る。ＩｇＡ要素は、好ましくはヒトＩｇＡ要素である。好ましくは、抗体中の全てのＩｇＡ要素はヒトＩｇＡ要素である。ＩｇＡ要素は、ＩｇＡ１要素、好ましくはヒトＩｇＡ１要素であり得る。ＩｇＡ要素はまた、ＩｇＡ２要素、好ましくはＩｇＡ２ｍ（１）要素、好ましくはヒトＩｇＡ１要素であり得る。抗体のＣＨ１ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメイン、又はこれらの組み合わせであり得る。ＣＨ１ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はこれらの組み合わせは、ＩｇＡ  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＡ  ＣＨ３ドメイン、又はこれらの組み合わせであることが好ましい。ＩｇＡ  ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域は、ヒトＩｇＡ  ＣＨ１ドメイン及び／又はヒトＩｇＡヒンジ領域であることが好ましい。当該ヒトＩｇＡ  ＣＨ１ドメイン及び／又はヒトＩｇＡヒンジ領域は、ヒトＩｇＡ１  ＣＨ１ドメイン又はヒトＩｇＡ１ヒンジ領域であることが好ましい。当該ヒトＩｇＡ  ＣＨ１ドメイン及び／又はヒトＩｇＡヒンジ領域は、ヒトＩｇＡ２ｍ（１）ＣＨ１ドメイン又はヒトＩｇＡ２ｍ（１）ヒンジ領域であることが好ましい。抗体の定常ドメイン及びヒンジ領域は、好ましくはヒト定常領域及びヒンジ領域であり、好ましくはヒトＩｇＡ抗体のものである。抗体の定常ドメイン及びヒンジ領域は、ヒトＩｇＡ１又はヒトＩｇＡ２ｍ（１）定常ドメイン及びヒンジ領域であることが好ましい。
【００４１】
ヒト定常領域は、自然界に見られるようなヒト対立遺伝子に対して０〜１５個のアミノ酸変化を有し得る。様々な理由でアミノ酸変化が導入される場合がある。非限定的な例としては、抗体の生産又は均質性の改善、循環における半減期の適応、ＨＣ／ＬＣの組み合わせの安定性の改善、グリコシル化の最適化、二量化又は複合形成の調節、ＡＤＣＣ活性の調節が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト定常領域は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個及び１５個のアミノ酸変化を、自然界に見られるようなヒト対立遺伝子に対して有し得る。変化したアミノ酸は、好ましくは、異なるアイソタイプの対応する位置におけるアミノ酸から選択されるものである。
【００４２】
一実施形態では、重鎖の定常領域は、ＩｇＡ２定常領域、好ましくはヒトＩｇＡ２定常領域、好ましくはヒトＩｇＡ２ｍ（１）である。一態様では、ヒト定常領域は変異したＩｇＡ２ｍ（１）配列である。
【００４３】
一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ２ｍ（１）配列の定常領域を含み、この配列は、好ましくは少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個で、好ましくは７個の以下の変異：Ｎ１６６Ｇ、Ｐ２２１Ｒ、Ｎ３３７Ｔ、Ｉ３３８Ｌ、Ｔ３３９Ｓ、Ｃ３３１Ｓを有し、ヒトＩｇＡ２ｍ（１）抗体であるＣ末端アミノ酸配列の変異は、「．．．ＶＤＧＴＣＹ」から「．．．ＶＤＧＴ」である。図１３は、ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ（１）及び、好ましい変位されたＩｇＡ２ｍ（１）（ｈＩｇＡ２．０）の配列を示す。図１３Ｅも参照されたい。
【００４４】
一実施形態では、ＧＤ２抗体は、図１３Ｅの定常領域を有する重鎖を含み、この領域は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個及び１５個のアミノ酸変化を、１６６位、２２１位、３３７位、３３８位、３３９位及び３３１位のアミノ酸が、１６６Ｇ、２２１Ｒ、３３７Ｔ、３３８Ｌ、３３９Ｓ及び３３１Ｓである場合の図１３Ｅの配列に対して有する。好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ（１）抗体であるＣ末端アミノ酸配列は、「．．．ＶＤＧＴＣＹ」が「．．．ＶＤＧＴ」となっている。
【００４５】
あらゆるサブタイプのヒトＩｇＡ配列は、抗体の重鎖に関連している。重鎖はアイソタイプスイッチングを受ける。
【００４６】
言及するＩｇＡ抗体は、好ましくは、ｃｈ１４．１８可変ドメイン又は３Ｆ８可変ドメイン、好ましくはｃｈ１４．１８可変ドメインを含む。
【００４７】
以下を含む抗ガングリオシドＧＤ２抗体：
図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域。１つ以上の位置は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、図１の抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域について示されている通りである。重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。重鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜３個、より好ましくは０〜２個、更に好ましくは０〜１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体における重鎖可変領域は、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の重鎖可変領域配列に対して、０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。
図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域。１つ以上の位置は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、図１の抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域について示されている通りである。軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜４個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。軽鎖可変領域は、好ましくは、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、１つ以上の位置に、０〜３個、より好ましくは０〜２個、更に好ましくは０〜１個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。ここで、１つ以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体における軽鎖可変領域は、図１に示す抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖可変領域配列に対して、０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する。
好ましくは図１３Ｅに示すアミノ酸配列を含むＩｇＡ重鎖で、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個及び１５個のアミノ酸変化を、１６６位、２２１位、３３７位、３３８位、３３９位及び３３１位のアミノ酸が、１６６Ｇ、２２１Ｒ、３３７Ｔ、３３８Ｌ、３３９Ｓ及び３３１Ｓである場合の図１３Ｅの配列に対して有する。好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ（１）抗体であるＣ末端アミノ酸配列は、「．．．ＶＤＧＴＣＹ」が「．．．ＶＤＧＴ」となっている。及び
好ましくは抗体ｃｈ１４．１８の軽鎖定常ドメイン。
【００４８】
本発明の抗ガングリオシドＧＤ２抗体は、好ましくは、好適なインビトロＡＤＣＣアッセイで測定した場合に、抗体ジヌツキシマブよりも高い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す。本発明の抗ガングリオシドＧＤ２抗体は、好ましくは、適切なインビトロＣＤＣアッセイで測定した場合に、抗体ジヌツキシマブよりも低い補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示す。様々なＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイが、当業者に利用可能である。本発明の文脈において、実施例に記載のＡＤＣＣアッセイ又はＣＤＣアッセイを使用することが好ましい。請求項に記載の抗体のＡＤＣＣ機能は、好ましくは古典的なクロム放出アッセイで（例えば実施例に記載されているように）測定される。請求項に記載の抗体のＣＤＣ機能は、好ましくは、フローサイトメトリにおける７−ＡＡＤ陽性に基づく方法で測定される（実施例を参照）。抗体は、好ましくは、適切なインビトロＣＤＣアッセイで測定した場合に、抗体ジヌツキシマブの２０％以下、より好ましくは１０％以下の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈する。好ましい一実施形態では、抗体は、抗体の重鎖又は軽鎖に結合したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。アルブミン結合ドメインの重鎖又は軽鎖への結合に関する詳細については、Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６；ＭＡｂｓ．Ｖｏｌ．８．Ｎｏ．１；を参照されたい。別の一実施形態では、抗体の半減期を延長するために、別のドメインが追加される。好ましい一実施形態では、ドメインヒトアルブミンのＤＩＩＩドメイン。そのようなドメインは、抗体のＩｇＡ部分の定常領域に物理的に結合していることが好ましい。
【００４９】
一態様では、ＩｇＧ抗体の可変領域及びＩｇＡ抗体の定常領域を含む、本明細書で提供される改変抗体又はその断片は、副作用を低減することができる。一態様では、本明細書で提供される改変抗体又はその断片は、ＩｇＧ抗体療法に関連する副作用を低減することができる。一態様では、本明細書で提供される改変抗体又はその断片は、自然免疫応答に関連する副作用を低減することができる。このような自然免疫応答に関連する副作用は、炎症、補体系活性化、白血球（マスト細胞、食細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好塩基球、好酸球、ナチュラルキラー細胞及びガンマデルタ細胞活性であり得る。場合によっては、本明細書で提供される改変抗体又はその断片は、補体系活性化に関連する副作用を低減することができる。
【００５０】
補体系活性化は、抗体又はその断片が病原体を除去するか、又は破壊のためにそれらを標識する能力を補完する免疫系の生化学的カスケードであり得る。補体カスケードは、肝臓で合成される様々な血漿タンパク質を含み、これらのタンパク質は、炎症性細胞の動員を誘発すること、破壊対象の病原体の標識（オプソニン化）、病原体の原形質膜の穿孔、中和された抗原−抗体複合体の排除、及びこれらの任意の組み合わせを含む様々な機能を有する。幾つかの態様では、副作用の低減は、補体系活性化の低減を含み得る。
【００５１】
一態様では、ＩｇＧ抗体又はその一部分は、標的と反応して、抗原結合ＩｇＧのＦｃ部分へのＣ１ｑの結合をもたらし、その後、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓが結合して補体活性化に関連する酵素であるＣ１を形成することができる。Ｃ１は、次いでＣ４を酵素によってＣ４ａ及びＣ４ｂに切断することができる。Ｃ４ｂは、標的の表面上の隣接するタンパク質及び炭水化物に結合し、次いでＣ２に結合する。活性化されたＣ１は、Ｃ２を、Ｃ２ａ及びＣ２ｂに切断し、Ｃ３転換酵素であるＣ４ｂ２ａを形成することができる。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３をＣ３ａ及びＣ３ｂに切断することができる。補体活性化経路の更なるステップでは、Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素であるＣ４ｂ２ａに結合して、Ｃ５をＣ５ａ及びＣ５ｂに切断できるＣ５転換酵素であるＣ４ｂ２ａ３ｂを形成することができる。Ｃ５ｂは、標的に結合し、また、Ｃ６、Ｃ７、ｃ８及びＣ９に結合して、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）であるＣ５ｂ６７８９ｎを形成することができる。ＭＡＣは、溶菌を引き起こすことにより、グラム陰性菌や外来抗原を表出している細胞（ウイルス感染細胞、腫瘍細胞など）を破壊することができる。一態様では、補体応答の低減は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ｂ２ａ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ２ａ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ５ｂ６７８９ｍ、ＭＡＣ及びこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つの不在又は低下したレベルによって測定することができる。一態様では、補体応答の低減は、本明細書に記載のＩｇＧ可変領域及びＩｇＡ定常領域又はその一部分を含む改変抗体に対するＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ｂ２ａ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ２ａ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ５ｂ６７８９ｍ及びＭＡＣのいずれか１つから選択される補体因子の結合の、同等量のＩｇＧ抗体と比較した場合の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％の低減を指すことができる。
【００５２】
補体応答の低減は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、血液分析又はインビトロアッセイを実施して、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ｂ２ａ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ２ａ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ５ｂ６７８９ｍ、ＭＡＣ及びこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つから選択される補体因子の量を定量化することによって判定できる。幾つかの態様では、本明細書で提供される抗体又はその断片は、提供されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含む同等の抗体又はその断片と比較して、より低いレベルの補体因子をもたらし得る。幾つかの態様では、本明細書で提供される改変ＩｇＧ−ＩｇＡ抗体又はその断片は、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む同等のＩｇＧ抗体又はその断片と比較して、より低いレベルの補体因子をもたらし得る。補体応答の低減は、実施例に記載するのと同様に、標的細胞の補体依存性溶解のフローサイトメトリによる定量化によっても測定することができる。
【００５３】
本明細書に記載の改変抗体又はその断片の投与によって、ＩｇＧの投与と比較して軽減又は低減され得る更なる副作用は、ＩｇＧ抗体療法に関連する任意の副作用を指すことができる。ＩｇＧ抗体療法に関連する副作用には、炎症、血栓塞栓事象、溶血事象、補体系関連事象、及びこれらの組み合わせが含まれ得る。場合によっては、ＩｇＧ抗体療法は、炎症、高血圧、低血圧、疼痛、発熱、蕁麻疹、アレルギー、悪寒、脱力感、下痢、悪心、嘔吐、かぶれ、掻痒、咳、便秘、浮腫、頭痛、発熱、息切れ、筋肉痛、疼痛、食欲低下、不眠症、めまい、アナフィラキシー、血栓症、心不全、出血、肝炎、腸炎、粘膜炎、サイトカイン症候群、甲状腺機能低下症、低ナトリウム血症、低カリウム血症、毛細管漏出症候群及び異痛などの副作用をもたらし得る。
【００５４】
一態様では、補体応答、補体関連の副作用又は毒性を低減することにより、それを必要とする対象の治療コンプライアンスを改善することができる。場合によっては、改変抗体などの本明細書で提供される抗体又はその断片は、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含む同等のＩｇＧ抗体と比較して、より高い用量、より長い治療期間、又はより多くの頻度で投与することができる。場合によっては、改変抗体などの、本明細書で提供される抗体又はその断片は、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含む同等のＩｇＧ抗体の用量よりも、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍高い用量で投与することができる。場合によっては、改変抗体などの、本明細書で提供される抗体又はその断片は、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含む同等のＩｇＧ抗体の期間よりも、約１時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１４日、２４日、３０日、毎月、隔月、隔年、毎年及び毎日、より長い期間投与することができる。場合によっては、改変抗体などの本明細書で提供される抗体又はその断片は、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含む同等のＩｇＧ抗体と比較して、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年などのより多くの頻度で投与することができる。
【００５５】
特定の位置でアミノ酸を変化させる理由が、免疫原性であってもよい。他の理由には、抗体の生産又は均質性の改善が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、マウスバックグラウンドに由来する可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を有する。このような可変ドメインを有する抗体をヒトに使用することができる。現在、このような可変ドメインを非免疫化することが好ましい。非免疫化は通常、マウス配列を可能な限りよりヒト配列に近い配列に改変することを伴う。典型的には、このような改変は、可変ドメインから１つ以上のＴ細胞エピトープ又は１つ以上のＢ細胞エピトープを除去することを目的とする。好ましい一実施形態では、１つ以上の（ヒト）Ｔ細胞エピトープが、このエピトープの少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することによって除去されている。多くの場合、いわゆる「アンカー」アミノ酸を置換すれば十分である。適切な置換アミノ酸は、特定のＶＨ又はＶＬの体細胞過剰変異体から得ることができる。ヒト抗体のその位置に天然に存在するアミノ酸による置換が好ましい。また、ヒトＢ細胞エピトープは、エピトープの少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することによって除去することができる。多くの場合、エピトープの１つのアミノ酸のみを置換すれば十分である。適切な置換アミノ酸は、特定のＶＨ又はＶＬの体細胞過剰変異体から得ることができる。ヒト抗体のその位置に天然に存在するアミノ酸による置換が好ましい。好ましくは、本発明の可変ドメインは、１つ以上の外部残基に関して修飾されている。そのような残基は、免疫系に容易に遭遇し、好適にはヒト残基と選択的に置き換えられて、弱免疫原性の表面又は実質的に非免疫原性の表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。適切な置換アミノ酸は、特定のＶＨ又はＶＬの体細胞過剰変異体から得ることができる。ヒト抗体のその位置に天然に存在するアミノ酸による置換が好ましい。従って、本発明は、ヒト化重鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域、又はこれらの組み合わせを含む本発明の抗体を更に提供する。本明細書で定義される抗体の軽鎖は、軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、対応する抗体の軽鎖定常領域であることが好ましい。ｃｈ１４．１８軽鎖可変領域を含む軽鎖は、好ましくは、ｃｈ１４．１８抗体の軽鎖定常領域も含む。３Ｆ８軽鎖可変領域を含む軽鎖は、好ましくは、３Ｆ８抗体の軽鎖定常領域も含む。
【００５６】
本発明は更に、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療方法を提供し、この方法は、治療上有効量の本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。また、ＧＤ２陽性腫瘍を有するか又はＧＤ２陽性腫瘍を有するリスクのある対象の治療に使用するための本発明の抗体も提供される。治療は、好ましくは、当該対象の神経芽腫細胞中のガングリオシドＧＤ２を上方調節するのに有効な量のレチノイン酸を投与することを更に含む。治療は、好ましくは、対象における顆粒球数を増加させる、及び／又はＡＤＣＣを増加させるのに有効な量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、又はこれらの組み合わせを投与することを更に含む。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせは、好ましくは、治療対象の種のものである。好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＧ−ＣＳＦ、又はこれらの組み合わせである。
【００５７】
ＧＤ２陽性腫瘍は、好ましくは、神経外胚葉由来の腫瘍又は肉腫などのＧＤ２陽性神経芽腫である。好ましい一実施形態では、ＧＤ２陽性腫瘍は、ＧＤ２陽性神経芽腫、網膜芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、脳腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、小児及び成人におけるユーイング肉腫、或いは成人における脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫又は別の軟組織肉腫である。好ましい一実施形態では、ＧＤ２陽性腫瘍は神経芽腫である。本発明の方法又は使用で治療される神経芽腫は、好ましくは、高リスクの神経芽腫である。
【００５８】
レチノイン酸は、好ましくは１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン）である。
【００５９】
本発明は更に、本発明の抗体又は本発明の使用のための方法又は抗体を提供し、抗体は、アミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥ  ＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩ  ＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴ  ＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮ  ＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡ  ＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹ  ＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬ  ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ  ＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤ  ＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭ  ＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴ  ＶＳＳ
を有する重鎖可変領域及び、アミノ酸配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶ  ＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷ  ＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫ  ＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦ  ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ  ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ  ＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶ  ＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰ  ＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬ  ＥＬＫ
有する軽鎖可変領域を含む。
【００６０】
本発明はまた、本明細書に記載の抗体の重鎖、軽鎖、又は好ましくは両方をコードする核酸分子又は複数の核酸分子からなる組み合わせを提供する。核酸分子又は組み合わせは、好ましくは、記載の抗体の発現のための１つ以上の配列を更に含む。これらのような発現配列の非限定的な例は、プロモータ、転写終結配列、エンハンサ、イントロンなどである。これらのような配列は、例えば細胞の染色体内の核酸の組み込み部位、又は当該核酸を含むベクターによってｉｎ  ｃｉｓで提供できるため、必ずしも核酸分子上に存在しなくてもよい。細胞染色体内の適切な組み込み部位は、例えば相同組換えにより容易に決定及び標的化することができる。
【００６１】
本明細書に記載の核酸分子又は組み合わせを含む細胞が更に提供される。
【００６２】
本発明の核酸分子又は組み合わせ、或いは本発明の核酸分子又は複数の核酸分子からなる組み合わせを含む細胞を使用して、本明細書に記載の抗体を生産するための手段及び方法が更に提供される。
【００６３】
本発明による核酸分子又は組み合わせは、例えば、細胞内に含まれる。この核酸がこの細胞内で発現されるとき、核酸分子の翻訳産物は、本発明の抗体であり得るか、又はその中に組み込まれ得る。従って、本発明はまた、本発明による核酸分子又は組み合わせを含む細胞も提供する。本発明は更に、本発明の核酸分子又は組み合わせを含み、本発明の抗体を産生することができる細胞を提供する。本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸分子を発現すること及び、培地、細胞又はこれらの組み合わせから抗体を回収することを含む細胞の培養を含む、本発明の抗体の生産方法が更に提供される。当該細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である。細胞は、好ましくは、ヒトで使用するための抗体の生産に通常使用される細胞である。このような細胞の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨＥＫ細胞、好ましくはＨＥＫ２９３Ｆ細胞及びＰＥＲ．Ｃ６細胞である。細胞を、特定の目的に合わせて特別に設計してもよく、例えば抗体の生産に使用される殆どの細胞株は、懸濁液中での増殖、高密度での増殖及び他の属性に適合されている。本発明の目的のために、好適な細胞は、本発明による抗体を含むことができ、好ましくは産生することができる任意の細胞である。
【００６４】
明確さ及び簡潔な説明のために、特徴は本明細書では同じ又は別個の実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】抗体ｃｈ１４．１８の可変重鎖アミノ酸及び可変軽鎖アミノ酸（それぞれパネルＡ及びＢ、下線部はＣＤＲ領域）。抗体ｃｈ１４．１８の可変重鎖及び可変軽鎖をコードするＤＮＡ配列（それぞれパネルＣ及びＤ）。３Ｆ８については、キメラガンマ１重鎖（配列番号１）及びキメラカッパ軽鎖（配列番号２）が示されている。それぞれのＣＤＲには下線が引かれている。
【図２】重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）との幾つかの比をトランスフェクション後のＩｇＡ  ｃｈ１４．１８の定量化。ＩｇＧ１及びＩｇＡ１生産に５つの異なる比を使用した。最適比を大規模生産に使用した。
【図３】Ａ：ＩｇＡ  ｃｈ１４．１８のカッパ軽鎖特異的親和性クロマトグラフィ。Ｂ：タンパク質濃度を表すＩｇＡ  ｃｈ１４．１８のＵＶ吸収のサイズ排除クロマトグラフィを、トレースによって示す。
【図４】社内で生産及び精製されたＩｇＧ１及びＩｇＡ  ｃｈ１４．１８のフローサイトメトリでのＧＤ２発現神経芽腫細胞株ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩへの結合。
【図５】ＩＭＲ３２細胞株とのインキュベーションの１時間後及び４時間後のＩｇＧ１及びＩｇＡのＣＤＣアッセイ。補体活性化による細胞溶解を、フローサイトメトリ分析によって分析した。１５％プールしたヒト血清を添加し、細胞を３７℃で６０分間及び４時間インキュベートした。細胞溶解の量を、７−ＡＡＤ染色によって測定した。
【図６】ＩｇＧ１及びＩｇＡをＩＭＲ３２（パネルＡ及びＢ）及びＳＫ−Ｎ−ＦＩ（パネルＣ及びＤ）細胞株と４時間インキュベーションした後の白血球（パネルＡ及びＣ）及びＰＭＮ（パネルＢ及びＤ）のＡＤＣＣアッセイ。赤血球を溶解し、残りのエフェクタ細胞をウェルに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、５１Ｃｒ放出を、ベータガンマカウンタによって毎分計数（ｃｐｍ）で測定した。特異的溶解の割合を、トリトンの存在下で最大溶解を求め、抗体及びエフェクタ細胞の不在下で基礎溶解を求めることにより計算した。
【図７】ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩ細胞株とのインキュベーションの４時間後の社内で生産及び精製されたＩｇＧ１及びＩｇＡの白血球ＡＤＣＣアッセイ。赤血球を溶解し、残りのエフェクタ細胞をサイトカインと共にウェルに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、５１Ｃｒ放出を、ベータガンマカウンタによって毎分計数（ｃｐｍ）で測定した。特異的溶解の割合を、トリトンの存在下で最大溶解を求め、抗体及びエフェクタ細胞の不在下で基礎溶解を求めることにより計算した。
【図８】ＩＭＲ３２又はＳＫ−Ｎ−ＦＩ細胞株とのインキュベーションの４時間後のＩｇＧ１及びＩｇＡ  ｃｈ１４．１８のＰＭＮ  ＡＤＣＣアッセイ。ＰＭＮを、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ分離によって単離した。続いて、様々な濃度のエフェクタ細胞、サイトカイン及び抗体を、標的細胞を含むマイクロタイタプレートに添加した。Ｅ：Ｔ比は、４０：１（ＰＭＮ）であった。３７℃で４時間インキュベートした後、５１Ｃｒ放出を、ベータガンマカウンタによって毎分計数（ｃｐｍ）で測定した。特異的溶解の割合を、トリトンの存在下で最大溶解を求め、抗体及びエフェクタ細胞の不在下で基礎溶解を求めることにより計算した。
【図９】異なる濃度のイソトレチノインに４日間連続して曝露した後のＩＭＲ３２細胞でのＧＤ２（パネルＡ）及びＭＨＣ−Ｉ（パネルＢ）の発現。細胞をＩｇＡ  ｃｈ１４．１８で染色し、二次抗ＩｇＡ  ＰＥ又は抗ＭＨＣ−Ｉ−ＰＥで検出した。
【図１０】ガングリオシドＧＤ２の概略図である。
【図１１】インビボでの機械的閾値の定量化。雌（８〜１２週齢）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して実験を行った。マウスに１００マイクログラムの抗体を静脈内注射した。機械的閾値を、Ｅｉｊｋｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：２１３８−２１４９及びＣｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３：５５−６３に記載されているように、上下方向の方法でフォンフレイ試験（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して求めた。全ての実験を、治療を盲検化した実験によって実施した。
【図１２】ＩｇＡ１／ＩｇＡ２．０ハイブリッド抗体の一次配列及びモデリング。Ａ、ｈＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ（１）及びＩｇＡ１／ＩｇＡ２Ｍ（１）ハイブリッド（ｈＩｇＡ２．０）の定常領域の一次配列のアライメント。骨髄腫ＩｇＡ１タンパク質（Ｂｕｒ）スキームに従って、残基に番号が付けられている。ドメイン境界は、配列上に縦線によって示されている。以下の特徴が強調されている：明るい灰色の下線を付した残基はＩｇＡ１に固有であり、暗い灰色の下線付きのアスパラギンは保存されたＮ−グリコシル化コンセンサス配列であり、黒い下線を付した残基はＩｇＡ２．０に固有である。Ｂ、２２５−ＩｇＡ２．０の重鎖がモデル化され、正面図と側面図に示されており、変異がマークされている。Ｃ、野生型及び変異体ＩｇＡ２の重鎖がモデル化されている。得られたアライメントは、恐らくＰ２２１Ｒ変異のために、ＩｇＡ２．０と比較してＩｇＡ２−ｗｔの重鎖におけるＣ２４１の方向が異なることを示している。Ｄ、２２５−ＩｇＡ２−ｗｔの尾部を拡大したものである（緑色、Ｃ４７１；）赤色、Ｙ４７２）及びＩｇＡ２．０（赤色）。モデルの予測及びアライメントは、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲを使用して実施した。モデルを３Ｄ−Ｍｏｌ  Ｖｉｅｗｅｒで修正した。Ｅ、ＩｇＡ２．０の重鎖の定常領域の核酸配列及びタンパク質配列。
【図１３】ＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８のＨＰ−ＳＥＣ分析。精製した抗体のＨＰ−ＳＥＣ分析を実施した。ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８（Ａ）及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８（Ｂ）は、双方とも高度に単量体性であることが示された。トレースは、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。
【図１４】ＩｇＧ１及びＩｇＡ１  ｃｈ１４：１８抗体の神経芽腫細胞株への結合。（Ａ）ＩｇＡ１−ＦＩＴＣ及びＩｇＧ１−ＦＩＴＣ  ｃｈ１４．１８のＧＤ２発現神経芽腫細胞株ＩＭＲ３２及びＧＤ２陰性細胞株ＧＩ−ＭＥ−Ｎへの抗体結合（Ｂ）ＩＭＲ３２細胞での神経芽腫抗体のリアルタイム細胞ベースの親和性測定。ＩＭＲ３２細胞株を１０ｎＭの抗体で１時間処理した後、抗体の濃度を２０ｎＭに１時間増加させた）。抗体含有培地を抗体なしの培地と交換することにより、１３０〜２５０分で解離を追跡した。細胞ベースの親和性測定から計算された親和性をＢに示す。
【図１５】神経芽腫細胞株パネルに対するＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８によるＡＤＣＣの特性評価。（Ａ）エフェクタ細胞として末梢血由来の白血球を用いた３つの異なる神経芽腫細胞株に対するＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８を用いたＡＤＣＣアッセイ。（Ｂ）単離されたＰＢＭＣを含むＩＭＲ−３２細胞株に対する、エフェクタ細胞としてＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８（Ｅ：Ｔ比１００：１）又はｈ単離好中球（Ｅ：Ｔ比４０：１）を使用したＡＤＣＣアッセイ。（Ｃ）単離されたＰＢＭＣを有するＩＭＲ３２細胞株に対する、エフェクタ細胞としてＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８（Ｅ：Ｔ比１００：１）又は単離された好中球（Ｅ：Ｔ比４０：１）を用いたＡＤＣＣアッセイ。１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、６５４５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、及び１０μＭの１１−ｃｉｓレチノイン酸との２４時間のプレインキュベーションによる共処理を行った。（Ｄ）エフェクタ細胞としての末梢血からの白血球を、１５％プールされたヒト補体活性血清と組み合わせたＡＤＣＣアッセイ。
【図１６】ＩｇＧ１及びＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８抗体による神経芽腫細胞株パネルに対する補体アッセイ。（Ａ）４つの異なる神経芽腫細胞株でのＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８抗体による溶解。細胞を４種類の異なる濃度の抗体及び１５％血清と共に１５分間及び４時間インキュベートした。（Ｂ）４つの異なる神経芽腫細胞株でのＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８抗体による溶解。細胞を４種類の異なる濃度の抗体及び１５％血清と共に１５分間及び４時間インキュベートした。（Ｃ）神経芽腫細胞株での補体調節タンパク質ＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９の発現。
【図１７】ＩｇＧ１及びＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８抗体のインビボ有効性。（Ａ）ＩｇＡ１又はＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８で２４時間処理した後の神経芽腫細胞の生物発光シグナルの定量化。（Ｂ））腫瘍細胞の静脈内注入後の処理３日目の生物発光シグナルの定量化。
【図１８】ＩｇＡ１への神経細胞曝露は、機械的離脱閾値の低下をもたらさない。（Ａ）静脈内注射の３時間後のＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８の血漿濃度。（Ｂ）フォンフレイ離脱閾値（Ｖｏｎ−Ｆｒｅｙ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ）。（Ｃ）蛍光標識ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８又はＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８の静脈内注入後のフォンフレイ離脱閾値。（Ｄ）左の列：坐骨神経に静脈内注射したＡｌｅｘａ−４８８標識抗体の可視化。右の列：Ａｌｅｘａ−５４９標識ＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８とのニューロンのインキュベーションによるＧＤ２のエックスビボ染色の可視化。
【実施例】
【００６６】
実施例１
抗ＧＤ２抗体産生ベクターの生成：
ｃｈ１４．１８からの可変領域のアミノ酸配列は、ジヌツキシマブのＦＤＡ登録申請書に見出された（申請１２５５１６；図１に示されている）。これらのアミノ酸配列を、最も可能性の高い非縮重コーディング配列を表すｃＤＮＡ配列に翻訳した。ｃＤＮＡを合成し（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）、ＩｇＡ１又はＩｇＧ１バックボーンのいずれかを含有するｐＥＥ１４．４発現ベクターにサブクローニングした（Ｂｅｙｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．「Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＩｇＡ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４６．１（２００９）：２６−３７に記載）。トランスフェクションのための重鎖ＤＮＡの軽鎖ＤＮＡに対する最適比が、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞での小規模試験トランスフェクションによって最初に決定された。次に、抗ヒトＩｇＧ（図２Ａ）又はＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ（図２Ｂ）によって抗体産生を定量した。
【００６７】
抗体の特性評価及び機能アッセイを可能にするために、産生をスケールアップした。再び、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、最適な重鎖と軽鎖とのトランスフェクション比でｐＥＥ１４．４  ＩｇＡ  ｃｈ１４．１８重鎖とｃｈ１４．１８カッパ軽鎖とをトランスフェクトした。産生されたＩｇＡ抗体を、一連の２つの液体クロマトグラフィステップによって精製した。最初に、ヒトκ軽鎖特異的親和性クロマトグラフィを使用して、ＩｇＡ  ｃｈ１４．１８を無血清上清から単離した（図３Ａ）。次に、分取プレパックＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６ｘ６００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィにより、無傷のＩｇＡを遊離軽鎖から分離した（図３Ｂ）。最後に、ＩｇＧ抗体をタンパク質親和性クロマトグラフィにより精製し、続いてＰＢＳで透析した。この多段階手順により、組換え単量体ＩｇＡの高純度調製物が得られる。
【００６８】
抗ＧＤ２抗体の特性評価
ＧＤ２発現細胞株ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩへの抗ＧＤ２抗体の結合を、複数の濃度の抗ＧＤ２抗体で４５分間、氷上で細胞を染色することにより分析した。細胞を洗浄し、二次ヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＰＥ又はＩｇＧ−ＰＥを、暗所で氷上で４５分間細胞に添加した。その後、フローサイトメトリ分析によって抗体結合を定量化した。
【００６９】
産生された抗体の補体活性化を、ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩ細胞と１５％プールされたヒト血清及び抗体（１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間及び４時間インキュベートすることで評価した。その後、生細胞／死細胞染色（７−ＡＡＤ）を実施し、フローサイトメトリ分析により細胞の溶解を定量化した。
【００７０】
神経芽腫細胞に対してエフェクタ細胞を動員するためのＩｇＡ及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８の有効性を評価するために、ＡＤＣＣアッセイを実施した。最初に白血球ＡＤＣＣを実施した。これに関して、健康なドナーからの末梢血をＲＢＣ溶解バッファで処理して赤血球を除去した。残りの白血球を洗浄し、ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦ（両方とも１０ｎｇ／ｍｌ）を含むか又は含まない放射線標識された神経芽腫細胞に添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、液体シンチレーションで測定した５１Ｃｒ放出によって細胞死を定量化した。特異的溶解の割合を、２．５％のトリトンＸ−１００の存在下で最大溶解を求め、抗体及びエフェクタ細胞の不在下で基礎細胞溶解を求めることにより計算した。
【００７１】
ＰＭＮがＩｇＡを介した殺滅の重要なエフェクタ細胞集団であるかどうかを評価するために、ＰＭＮをｆｉｃｏｌｌ−ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅによって健康なドナーの末梢血から分離し、４０：１のＥ：Ｔ比で、ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦ（両方とも１０ｎｇ／ｍｌ）を含むか又は含まない放射線標識された神経芽腫細胞に添加した。
【００７２】
結果及び考察
抗体の機能的特性評価を、ＧＤ２への結合能力、補体活性化及びエフェクタ細胞動員を測定することによって行った。ＧＤ２陽性細胞株ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩへの結合のフローサイトメトリ分析は、ＩｇＧ１及びＩｇＡの両方について同様の結合パターンを示した（図４）。１５％プールしたヒト血清及び複数の濃度の抗体とのインキュベーション後の生／死染色（７−ＡＡＤ）によって、産生された抗体の補体活性化を評価した。ＩｇＡ抗ＧＤ２抗体は補体の活性化を示さなかった一方で、同じ可変領域を有するＩｇＧ１変異体は、１時間のインキュベーション後に補体系を活性化した（図５Ａ）。インキュベーション時間が４時間に増加した場合、ＩｇＧの溶解は更に増加したが、ＩｇＡの補体活性化は観察されなかった（図５Ｂ）。
【００７３】
神経芽腫細胞に対してエフェクタ細胞を動員するためのＩｇＡ及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８の有効性を評価するために、ＡＤＣＣアッセイを実施した。最初に白血球ＡＤＣＣを実施した。ここで、ＩｇＡ抗ＧＤ２抗体は、ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩ細胞株の両方で優れていることが示された（図６）。ＰＭＮがＩｇＡを介した殺滅の重要なエフェクタ細胞集団であるかどうかを評価するために、ＰＭＮを健康なドナーの末梢血から分離した。ＩｇＡ抗ＧＤ２抗体は、ＩｇＧ１よりも良好にＰＭＮを刺激して、ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＦＩ細胞を殺滅することが示された（図６）。
【００７４】
細胞を臨床的に使用されているサイトカインＧＭ−ＣＳＦと共にインキュベートすると、ＩｇＡ抗ＧＤ２抗体によって誘導される最大溶解が大幅に増加したが、ＩｇＧ１変異体では最小限の効果しか見られなかった（図７）。更に、ＩＬ−２を添加しても、観察された溶解は増加しなかった（図７）。ＰＭＮ媒介ＡＤＣＣについても同様の効果が観察された（図８）。
【００７５】
本発明者らは、イソトレチノインによる神経芽腫細胞株の処理がＧＤ２発現に影響を与え得ることも示す。イソトレチノインとの４日間のインキュベーション後、ＩｇＡ  ｃｈ１４．１８の結合が増加する一方で、ＭＨＣ−Ｉ発現は安定したままであることが示された（図９）。
【００７６】
実施例は、ジヌツキシマブのＩｇＡアイソタイプ変異体は、神経芽腫の殺滅のためのＡＤＣＣ能力が高く、補体活性化がないことを示している。ＩｇＡ抗ＧＤ２抗体は、神経芽腫細胞の破壊を促進するが、神経障害性疼痛などの副作用は軽減される。
【００７７】
本発明では、ジヌツキシマブのＩｇＡへのアイソタイプ変換は、ジヌツキシマブ抗体の毒性問題の１つ以上に対する解決策を提供することが示されている。本発明の抗体は、強力なＡＤＣＣ活性を提供する一方で、少なくともジヌツキシマブ投与に伴う疼痛の問題を軽減する。本発明の抗体は、恐らくＦｃαＲ（ＣＤ８９）を介して好中球を効率的に活性化する。これにより、強力な抗腫瘍反応が生じる。本発明の抗体に対する神経芽腫細胞の感受性は、同じ可変ドメインを有するＩｇＧアイソタイプ変異体と比較した場合に、ＩｇＡ抗ＧＤ２が神経芽腫に対する改善された有効性を示し、同時に治療毒性を低減することを示す。これにより、抗神経芽腫の免疫療法が大幅に改善される。
【００７８】
抗体機能は、多数の要因によって支配される。標的と認識されるエピトープとは、標的が存在する細胞と同様に重要な役割を果たす。抗体のエフェクタ機能は、多くの場合、抗体のアイソタイプと相関している。これは一般的な規則として有用であるが、実際には多くの例外が存在する。このことは、例えば、ＡＤＣＣ活性についてはＲａｊａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；ＩｍｍｕｎｏＴａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ  ４：９１）に、ＣＤＣ活性についてはＬｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｊｈ１４６２４ｄｇｆ；及びＰａｓｃａｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９７．１１：１６８６−１６９４）に例示されている。
【００７９】
ＩｇＧをＩｇＡに変換すると、抗体と相互作用する受容体が変化する可能性がある。ＩｇＧの場合、ＩＴＡＭモチーフを有する活性化Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、白血球の抗体媒介活性化の主要なメディエータである。抑制性ＦｃγＲ及びＦｃγＲの多型性は、これらの効果を妨げる。これにより、ＩｇＧ治療が患者集団の一部に適さなくなる可能性がある。本発明者及びその他の研究者らは、ＩｇＡが好中球、単球及びマクロファージ上で発現されるＦｃ受容体ＦｃαＲを介して抗腫瘍効果を発揮することを示した。ＦｃαＲＩの抑制性受容体及び多型性は報告されていない。しかしながら、ＦｃαＲＩはマウスでは発現されないため、ＩｇＡ治療抗体を使用した必要な前臨床インビボ研究を長期間行うことができない。しかし、本発明者らの研究室では、ヒトＦｃαＲＩトランスジェニックマウスが生成された。このマウスは、ヒトと同様のヒトＦｃαＲＩの発現パターンを有する。これらのマウスを、ヒト腫瘍の成長のために、関連するバックグラウンド内で、即ちｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７Ｂ／Ｌ６及びＳＣＩＤで戻し交配させた。
【００８０】
治療用抗体としてのＩｇＡ
ＩｇＡは粘膜抗体として知られているが、その単量体形態では、ヒト血清中に存在する第２のクラスの抗体である。本発明者らは、以前の研究において、抗腫瘍抗体ＩｇＡがインビトロで有効であり得ることを示している。抗腫瘍機序は異なり、主に白血球の最も多い種類である好中球の動員を介して行われる。また、インビボＩｇＡは、治療用抗体として有効であり得る。ＩｇＡ分子の欠点は、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへのグリコシル化の相違と結合の欠如とにより、半減期が平均して比較的短いことである。本発明は、間接的にＩｇＡのＦｃＲｎへの適応グリコシル化及び標的化を提供することにより、ＧＤ２特異的ＩｇＡ抗体に関するこの問題を解決する（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  ＭＡｂｓ  Ｖｏｌ８：ｐｐ８７−９８）。
【００８１】
本発明では、抗ＧＤ２  ＩｇＡアイソタイプ抗体が、インビトロ、インビボ及び患者由来モデルにおいて神経芽腫を標的とすることを示す。
【００８２】
実施例２
ＡＤＣＣを誘発する抗ＧＤ２抗体の有効性を、ＧＤ２発現神経芽腫細胞株（例えば、ＡＴＣＣからの）ＩＭＲ−３２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＬＡＮ−５）の更なるパネルに対して、エクスビボの神経芽腫細胞を標的としてアッセイする。加えて、パネルには、原発性神経芽腫サンプルから生成され、従来の化学療法に対する耐性に関与する化学療法耐性細胞集団を表す幹細胞様細胞を含む腫瘍開始細胞が含まれる（Ｂａｔｅ−Ｅｙａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ５０．３：６２８−６３７）。健康なボランティア及び患者からの全血及び単離されたエフェクタ集団の両方をエフェクタ細胞として使用する。実際には、標的細胞を５１Ｃｒで２時間標識する。ＰＭＮ及びＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ分離によって単離する。続いて、様々な濃度のエフェクタ細胞及び培地を、標的細胞を含むマイクロタイタプレートに添加する。Ｅ：Ｔ比は、４０：１（ＰＭＮ）及び５０：１（ＰＢＭＣ）である。３７℃で４時間インキュベートした後、５１Ｃｒ放出を毎分計数（ｃｐｍ）で測定する。特異的溶解の割合を、トリトンの存在下で最大溶解を求め、抗体及びエフェクタ細胞の不在下で基礎溶解を求めることにより計算する。
【００８３】
神経芽腫患者由来のオルガノイドの試験
原発性神経芽腫サンプルから腫瘍由来のオルガノイドを生成した。腫瘍由来のオルガノイドは腫瘍の不均一性を反映しており、原発腫瘍組織を表している組織でこれらの機能性試験を実施することを可能にする。これらのオルガノイドにＩｇＡジヌツキシマブを使用する。結合及びＡＤＣＣを、Ｃ１ｑ及びｉＣ３ｂ検出抗体を使用した死標識及び補体沈着によって顕微鏡下で評価する。
【００８４】
ＦｃαＲトランスジェニックマウスにおけるインビボ実験
インビボ実験では、同系モデル、異種移植モデル及び患者由来の異種移植（ＰＤＸ）モデルを使用する。
【００８５】
同系モデルの場合、同所成長又は皮下成長させたＴＨ−ＭＹＣＮ  ９４６４Ｄベースの同系神経芽腫マウスモデルを使用する。
【００８６】
異種移植モデルの場合、Ｂｏｇｅｎｍａｎｎ  １９９６  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｖｏｌ  ６７：３７９；及びＲａｆｆａｇｈｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ  １９７（１−２）：ｐ．２０５−９に記載されているように、ＳＣＩＤマウスに移植されたＨＴＬＡ−２３０  ＮＢ細胞を使用する。以前、抗ＧＤ２抗体１４Ｇ２ａがこのモデルでテストされ、非常に効率的に機能することが示されたが、ＮＫ細胞及びマクロファージは存在しないままであった（Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００３上記）。これは、好中球がジヌツキシマブの重要なエフェクタ細胞であるという概念と符合する。これらのマウスでＩｇＡをテストする場合、マウスにはＦｃａＲがないため、研究室で入手可能なＳＣＩＤ／ＦｃαＲトランスジェニックマウスを使用する。これらのトランスジェニックＳＣＩＤマウスにおけるＩｇＧ及びＩｇＡの有効性を比較する。
【００８７】
ＰＤＸモデルの場合、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンマｎｕｌｌマウス）を使用する。これらのモデルにより、患者の腫瘍、増殖及びその後の治療の同所性ポジショニングが可能となる（Ｂｒａｅｋｅｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ  １；３７５（２）：３８４−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１６．０２．０４６）。
【００８８】
実施例３
神経芽腫患者の生存率の改善は２０１５年に始まり、神経芽腫細胞だけでなく末梢神経組織及び中枢神経組織にも発現するガングリオシドＧＤ２に対するＩｇＧ１アイソタイプのキメラ抗体であるｃｈ１４．１８のＦＤＡ承認を受けた。Ｃｈ１４．１８は、造血幹細胞移植後の高リスク神経芽腫の治療のために、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ及び１１−ｃｉｓレチノイン酸と組み合わせた二次治療として投与される。大規模な第ＩＩＩ相臨床試験（ｎ＝２２６）では、治療後２年で、ｃｈ１４．１８併用療法により、標準治療よりもイベントフリー生存率が２０％、全生存率が１０％増加することが示された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３（１４）：１３２４−１３３４）。免疫療法を含めることで神経芽腫患者の生存率は向上したが、ｃｈ１４．１８の投与によって引き起こされる重い副作用がある。これらのうち、重度の神経障害性疼痛が最も頻繁に起こる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３（１４）：１３２４−１３３４）。これは、Ａδ及びＣ疼痛線維上のＧＤ２へのｃｈ１４．１８の結合によって引き起こされ、補体系を局所的に活性化し、これが観察された疼痛の原因であると考えられている（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９７、Ｐａｉｎ  ６９（１−２）：１４５−１５１）。この疼痛は鎮痛剤への反応が良好でなく、用量を制限する可能性がある（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７（１）：８５−９１）。
【００８９】
ｃｈ１４．１８抗体オプソニン化腫瘍細胞は、白血球のＦｃ受容体への抗体結合に応じて、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して白血球によって殺滅される可能性がある。ｃｈ１４．１８は、腫瘍細胞表面の補体系を活性化することもでき、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を介して細胞の溶解を引き起こす。ＩｇＧ１抗体療法によって媒介されるＡＤＣＣの場合、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＡＤＣＣを媒介するための重要な細胞とみなされる。神経芽腫に関しては、抗ＧＤ２  ＩｇＧ１抗体で治療すると、顆粒球もＡＤＣＣを媒介する役割を果たすという証拠が存在する（Ｂｒｕｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ  １９８９，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２２（３）：２１７−２２０；Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７（１）：８５−９１；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３０（４）：４２６−４３２）。
【００９０】
結果
ＩｇＧ１及びＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８の生産及び精製
ＩｇＡ１及びＩｇＧ１抗体をｃｈ１４．１８  ＩｇＡ１可変領域と比較するために、両方の抗体を社内で生産及び精製した。全ての抗体をＨＰ−ＳＥＣにより分析して、その純度を確認した。ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８（図１３Ａ）及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８（図１３Ｂ）の両方が、９５％を超える純度の単量体であることが示された。
【００９１】
ＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８は同様の親和性でＧＤ２に特異的に結合する
次に、本発明者らは、神経芽腫細胞株パネルに対するＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８の結合を測定した。両方の抗体は、ＧＤ２を発現している神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２を同様に認識したが、ＧＤ２発現のないＧＩ−ＭＥ−Ｎ細胞株は結合していなかった（図１４Ａ）。アイソタイプをＩｇＡ１に変更した後に抗体の親和性が変化しないかどうかを確認するために、Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｒａｃｅｒを使用してＩＭＲ−３２細胞に対するリアルタイムの細胞ベースの親和性測定を実施した。抗体は、２つの異なる濃度（それぞれ１０ｎＭ及び２０ｎＭ）で同一の会合パターンを厳密にたどり、解離相でも重複する）。アッセイは、ＩＭＲ３２細胞への計算された親和性がＩｇＡ１とＩｇＧ１との間で有意な差がなかったことを示している（３．８ｎＭ対４．８ｎＭ）（図１４Ｂ）。
【００９２】
ＩｇＡ１抗体及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８抗体の作用機序
続いて、本発明者らは、これらの抗体の作用のインビトロ機序を比較した。ＡＤＣＣ及びＣＤＣは両方ともインビボで神経芽腫に対してｃｈ１４．１８によって誘導されることが知られている。エフェクタ細胞の混合による殺滅を比較するために、エフェクタ細胞として白血球を含むＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ及びＬＡＮ−１神経芽腫細胞株でＡＤＣＣアッセイを実施した。ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体は両方とも同様の程度までＩＭＲ−３２細胞を溶解したが、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ及びＬＡＮ−１細胞は、ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８でより良好に殺滅された（図１５Ａ）。ＦＡＣＳ上に検出可能なＧＤ２発現を有さないＧＩ−ＭＥ−Ｎ細胞株は、いずれの抗体によっても溶解できず、ＧＤ２発現がＡＤＣＣの前提条件であることを示している（データは図示せず）。ＡＤＣＣの媒介における特定の白血球サブセットの相対的重要性を評価するために、好中球と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とをエフェクタ細胞として別々に使用して、これらの抗体を用いた神経芽腫細胞株に対するそれぞれの細胞傷害能を測定した。
【００９３】
ＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用すると、ＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８はＩＭＲ３２細胞を効果的に溶解したが、ＩｇＡ抗体による溶解はこのようには機能しなかった（図１５Ｂ）。他の２つの神経芽腫細胞株でも同様であった（データは図示せず）。これに対し、好中球をエフェクタ細胞として使用した場合、ＩｇＡ  ｃｈ１４．１８は、ＩｇＧ１と比較して、全ての試験細胞株で優れたＡＤＣＣを媒介した（図１５Ｂ）。
【００９４】
臨床では、ｃｈ１４．１８は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２及びレチノイン酸との併用療法として投与される。次に、ＡＤＣＣに対するこれらの化合物の影響を、両方の抗体について評価した。ＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用した場合、ＧＭ−ＣＳＦを添加してもＩｇＧ１によるＡＤＣＣの増加は起こらなかった。ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−２の組み合わせにより、抗体が存在しなくても細胞死がわずかに増加し、ＰＢＭＣを介した殺滅が抗体に関係なく増加することを示した。最後に、１１−ｃｉｓレチノイン酸の前処理を以前の組み合わせに２４時間追加すると、ＩＭＲ３２細胞株及びＳＫ−Ｎ−ＦＩ細胞株の殺滅が更に増加することが示された（図１５Ｃ）。ＩｇＡでは、ＰＢＭＣによる抗体依存性の殺滅は誘導されなかったが、細胞はＩＬ−２とｃｉｓ−レチノイン酸との組み合わせで溶解し、ＰＢＭＣによる神経芽腫細胞の抗体に依存しない認識を示した（データは図示せず）。
【００９５】
ＩｇＧ１とは異なり、ＧＭ−ＣＳＦとＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８との組み合わせは、エフェクタ細胞として好中球を含むＡＤＣＣをブーストした（図１５Ｃ）。ＩＬ−２の存在は、好中球を介した殺滅をそれ以上増加させなかったが、１１−ｃｉｓ−レチノイン酸への前曝露で最大の溶解は増加した。ＩｇＧ１抗体の場合、ＧＭ−ＣＳＦは好中球による殺滅をわずかに改善したが、ＩＬ−２又はレチノイン酸の添加は殺滅をそれ以上促進しなかった（データは図示せず）。
【００９６】
最後に、ＡＤＣＣアッセイにヒトプール血清を添加して、ＣＤＣが神経芽腫細胞の溶解を促進し得るかどうかを調査した。ＩｇＧ１とＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８との両方について、血清添加後に溶解の有意な差は観察されなかった（図１５Ｄ）。
【００９７】
ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８は補体を活性化しない
ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８によって媒介される第２の効果は、補体系の活性化である。ｃｈ１４．１８は、インビトロでＣＤＣを介して神経芽腫標的細胞を溶解することが知られている。ＡＤＣＣアッセイで使用したものと同じ神経芽腫細胞株パネルで、これらの抗体によるインビトロの補体活性化を評価した。ＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８は、１５分後にＣＤＣを介してＳＫ−Ｎ−ＦＩを除く全ての試験対象の神経芽腫細胞株を溶解した（図１６Ａ）。これとは対照的に、ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８では溶解は観察されなかった（図１６Ｂ）。更に１時間長いインキュベーションでは、ＩｇＧ１の溶解量は更に増加したが、ＩｇＡ１を含む７−ＡＡＤの細胞は陰性のままであった（図１６Ａ、図１６Ｂ）。ＳＫ−Ｎ−ＦＩの補体調節タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９の量は、他の試験対象の神経芽腫細胞株よりも有意に高いため、この細胞株は、補体媒介溶解の傾向が低いと思われる（図１６Ｃ）。
【００９８】
ＩｇＡ１は、ＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８と比較してインビボでの腫瘍細胞の枯渇に優れている
最後に、２つの同系マウスモデルにおいてインビボでＧＤ２発現細胞を殺滅する抗体の能力を分析した。限局性腫瘍のモデルとして、動物にＧＤ２を自然発現しているＥＬ４細胞を腹腔内注射した。２４時間の増殖後、動物をＩｇＡ１又はＩｇＧ１で処理した。抗体の注射から２４時間後に腫瘍細胞の増殖を評価した。両方の抗体は、２つのエフェクタ機序のうちの１つのみを有するＩｇＡで平均腫瘍量の治療を低減させたが、より効果的であった（図１７Ａ）。
【００９９】
第２の全身性マウスモデルでは、腫瘍細胞の殺滅をより長期間にわたって評価した。ＥＬ４細胞を静脈内注射した。）細胞の注射後まもなく、生物発光イメージングで観察されるように、腫瘍細胞は肺に局在化した（データは図示せず）。３日間の処理後、ＩｇＡ１及びＩｇＧ１は両方とも腫瘍細胞を排除したが、ＰＢＳで処理したマウスには細胞が依然として存在していた（図１７Ｂ）。生物発光イメージングによって、マウスの腹部における増殖が観察された（データは示さず）。
【０１００】
抗ＧＤ２−ＩｇＡ１は疼痛を誘発しない
ＧＤ２に対するＩｇＧ１抗体の主な制限は、治療後の軽い接触に対する感度の増加である。ＩｇＡによる補体活性化の欠如がこの問題を軽減するかどうかを試験するために、マウスでインビボでの疼痛実験を行った。フォンフレイフィラメントによる刺激後の足収縮閾値を異痛の尺度として測定した。
【０１０１】
ＩｇＡ１とＩｇＧ１との半減期の差を補正するために、マウスに２４時間で１００μｇのＩｇＡの投与量に対応する低用量のＩｇＧ１（２０μｇ）又は高用量のＩｇＧ１（１００μｇ）のいずれかを腹腔内注射した（図１８Ａ）。２４時間後に血清中に戻った抗体濃度は、ｃｈ１４．１８治療後の臨床表現型と一致している。２０μｇのＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８による治療は、離脱閾値の有意な低下を示し、４８時間後にベースラインに戻った。治療量以下のＩｇＧ１（４μｇ）は、離脱閾値の有意な低下をもたらさなかった。ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＡ１の全ての試験用量は足収縮閾値を低下させず、ＩｇＡ１はＩｇＧと同等のレベルで異痛を誘発しないことを示している（図１８Ｂ）。蛍光標識されたＩｇＡ１及びＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８抗体を静脈内に注射した場合にも、同様の結果が得られた。ここでは、ＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８も離脱閾値を低下させたが、ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８は低下させなかった（図１８Ｃ。その後、坐骨神経での抗体の結合を評価した。２０μｇのＩｇＧ１と１００μｇのＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８とで抗体曝露が同程度に観察され、血清中に存在する抗体の量に対応した（図１８Ｄ）。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、坐骨神経では検出されなかった。ＧＤ２のエクスビボ染色は、直接標識された抗体からのシグナルと重なった。
【０１０２】
キット
本明細書では、改変抗体又はその断片の組成物を含むキットを提供する。本明細書では、補体活性化の低減など、補体応答の低減のためのキットも開示することができる。本明細書では、癌、病原体感染、免疫障害又は同種移植の治療用キットも開示する。一実施形態では、キットは、有効量の改変抗体を単位剤形で含有する治療用又は予防用組成物を含むことができる。幾つかの実施形態では、キットは、改変抗体又はその断片の治療用組成物を収容することができる無菌容器を含む。このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、又は当該技術分野において既知の他の好適な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬剤を保持するのに好適な他の材料で作製することができる。場合によっては、改変抗体及びその断片は、毒性、補体関連毒性、癌、病原体感染、免疫障害、又は同種移植を有するか又は発症するリスクを有する対象に、抗体又はその断片を投与するために説明書と共に提供され得る。説明書は、一般に、毒性、副作用、癌、病原体感染、免疫障害、又は同種移植を治療するために組成物を使用する投与方法に関する情報を含むことができる。
【０１０３】
議論
高リスクの神経芽腫に対するｃｈ１４．１８の承認により、神経芽腫患者の生存率が改善された。それでもなお、神経芽腫に対するＩｇＧ１抗体療法は、神経障害性疼痛や異痛などの重度の副作用を伴う。本発明者らは、ｃｈ１４．１８のアイソタイプをＩｇＧ１からＩｇＡ１に変更すると、この抗体誘発性異痛がなくなるかどうかを調査した。
【０１０４】
本発明は、ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８が、好中球媒介ＡＤＣＣを通じて驚くほど強力な抗腫瘍効果を発揮し、インビボで異痛を誘発しないことを示している。Ｃ５ａ受容体を拮抗薬で遮断すると、異痛が完全に停止した（Ｓｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，Ｐａｉｎ  １４９（１）：１３５−１４２）。これまで、ｃｈ１４．１８によって引き起こされる副作用を緩和するために、幾つかのアプローチが実施された。最初のアプローチは、ｃｈ１４．１８（Ｋ３２２Ａ）のＣ１ｑ結合部位を変異させることであった。この変異は、ｃｈ１４．１８の補体活性化を抑制すると考えられている（Ｓｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，Ｐａｉｎ  １４９（１）：１３５−１４２）。このアプローチでは補体の活性化が低下しただけであり、その結果、疼痛が残った。また、この抗体を使用した第Ｉ相臨床試験では、疼痛の形でグレード３〜４の毒性が患者の６８％で発生した（Ｎａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２（１４）：１４４５−１４５２）。
【０１０５】
ｃｈ１４．１８誘発異痛を回避する別のアプローチは、神経芽腫細胞上にのみ存在し、末梢神経組織上に存在しないＧＤ２（Ｏ−アセチル−ＧＤ２）の差次的なグリコシル化変異体を抗体ｃ．８Ｂ６によって標的化することによって実施された（Ｔｅｒｍｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（２）：ｅ８７２１０）。抗体ｃ．８Ｂ６は、疼痛線維の周囲の補体活性化を誘発しないが、この抗体は、有効性が低い可能性が高い。
【０１０６】
ｃｈ１４．１８の由来である親マウス抗体である１４．１８の最初の報告では、顆粒球が神経芽腫に対する効果を媒介したことが注目された（Ｂｒｕｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）；Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２２（３）：２１７−２２０）。後に、ＧＭ−ＣＳＦの添加により、それらの殺滅能力を高めることができることが示された。臨床研究では、顆粒球の活性化は、神経芽腫に対する抗体療法の良好な結果の指標であることが見出された（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３０（４）：４２６−４３２）。ＧＭ−ＣＳＦとの共治療に加えて、治療目的でこの標的細胞集団を更に関与させるアプローチが不足している。
【０１０７】
好中球を介した殺滅に対する神経芽腫細胞の固有の脆弱性に次いで、現在の治療プロトコルのタイミングもアプローチに有利であり、好中球がエフェクタ細胞として使用される。現在、患者には骨髄破壊的レジメンが処方されており、その後に自家幹細胞移植が行われる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３（１４）：１３２４−１３３４）。その後まもなく、免疫療法プロトコルが開始される。好中球は、多くの場合、生理学的レベルに回復される最初の白血球集団であり、従って、そのような免疫不全状態で活動する魅力的な白血球サブセットである。免疫療法の時点でＮＫ細胞の適切な免疫再構成に達した患者は２５％未満であった（Ｎａｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１８，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２４（３）：４５２−４５９）。ＮＫ細胞の代わりに好中球を対象とするアプローチでは、治療的のばらつきが低減される。
【０１０８】
本発明において、ＩｇＡを介した殺滅は、ＧＭ−ＣＳＦの添加によって改善されることが見出された。
【０１０９】
ＩＬ−２は、ＩｇＡ又はＩｇＧを介した殺滅を改善するとは考えられない。ＩＬ−２を、ｃｈ１４．１８で治療されたＧＤ２発現黒色腫及び肉腫患者で効果が見られた後に、臨床レジメンに追加した。しかしながら、神経芽腫療法に対するＩＬ−２の効果は、依然として不明である。このことは、ＩＬ−２を使用した場合と使用しない場合の免疫療法を比較した臨床試験で更に強調されている（Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  ＭＡｂｓ  ５（５）：８０１−８０９）。著者らは、ＩＬ−２の添加はＥＦＳ又はＯＳに有意な影響を及ぼさず、毒性による早期終了はＩＬ−２群で有意に高かったことを示している。
【０１１０】
ＩｇＡ１にはＣ１ｑ結合部位が存在しないが、ＩｇＡの補体活性化が報告されている。ＭＢＬ経路は高分子ＩｇＡによって活性化されることが示されたが、古典的な補体経路はＣＤ２０に向けられた単量体ＩｇＡに対してトリガされた（Ｒｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ；２００１；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７（５）：２８６１−２８６８及びＬｏｈｓｅ，Ｌｏｅｗ  ｅｔ  ａｌ；２０１８；Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １８１（３）：４１３−４１７）。それにもかかわらず、ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８は、神経芽腫細胞株のＣＤＣを誘発せず、マウスの補体依存性異痛を誘発しなかった。
【０１１１】
異痛はＩｇＡで解決できるが、エフェクタ機序としての補体も失われる。本発明では、驚くべきことに、予想される治療効果の損失が生じないことが示された。インビボ腫瘍モデルでは、ＩｇＡが腫瘍細胞の殺滅においてＩｇＧと少なくとも同程度に効率的であることが実際に分かる。抗ＧＤ２抗体によるインビボ補体消費が実証されており、補体活性化が起こることを示している（Ｃｈｅｕｎｇ  ａｔ  ａｌ  ２０１４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １３５（９）：２１９９−２２０５）。
【０１１２】
本発明者らの研究では、マウスの２つの抗体の半減期の差を調節するために、ＩｇＧ１と比較して５倍の量のＩｇＡをマウスに投与した。２つの抗体を使用しても、同様のニューロンへの曝露と血清濃度を達成できる。より長いモデルでは、これを説明するためにＩｇＡ１の複数の用量が注入された。ＩｇＡのインビボでの半減期はヒトでは約１週間であるが、マウスのＩｇＡの半減期を改善して将来の比較を改善するために、幾つかのアプローチを採用することが可能である（Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９７３，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３（４）：５２１−５２８）。アシアロ糖タンパク質受容体への結合によってＩｇＡのグリコシル化を抑制し、クリアランスを減少させることができる。複数のＩｇＡグリコシル化部位のサイレンシングは既に以前に達成されており、薬物動態の改善をもたらした（Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７６（２）：４０３−４１７）。ＩｇＧとは異なり、ＩｇＡは新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用しない。従って、内皮細胞による飲作用を受けた抗体は、リソソーム経路を介して分解される。アルブミン及びＩｇＧ１の両方の抗体は、この受容体に結合することによって分解を免れる。ＩｇＡは、薬物動態プロファイルと抗腫瘍効果とを改善したＣ末端アルブミン結合部位の導入により、ＦｃＲｎ結合を促進するために以前に修正された（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１６  ＭＡｂｓ  ８（１）：８７−９８）。
【０１１３】
本発明は、ｃｈ１４．１８  ＩｇＡが異痛を克服する利点と単一分子内の好中球活性化の改善との両方を提供することを示している。本発明者らの前臨床データは、ＩｇＡが副作用を伴わずにＩｇＧよりも高用量で投与され得ることを示している。
【０１１４】
材料及び方法
抗体の生産、単離及び品質管理
ｃｈ１４．１８の可変重鎖配列及び可変軽鎖配列を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １２５５１６から得た。可変重鎖配列はＩｇＡ１又はＩｇＧ１重鎖をコードするＬｏｎｚａ発現ベクター（ｐＥＥ１４．４）にクローニングし、可変軽鎖配列はカッパ軽鎖をコードするＬｏｎｚａ発現ベクター（ｐＥＥ１４．４）にクローニングした。重鎖、軽鎖及びｐＡｄｖａｎｔａｇｅ（受託番号Ｕ４７２９４；ｐｒｏｍｅｇａ）をコードするベクターを用いたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって、単量体抗体を産生した。製造元の指示書に従って、２９３Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用した。ＩｇＧ１抗体を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅｐｌｕｓクロマトグラフィシステム（ＧＥ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続されたプロテインＡカラム（Ｈｉ−ｔｒａｐプロテインＡ）を使用して精製した。結合した抗体を、０．１Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ２．５で溶出し、１ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８で中和した。溶出液をＰＢＳに対して透析した。カッパ軽鎖親和性クロマトグラフィカラム（Ｈｉ−ｔｒａｐ  ｋａｐｐａＳｅｌｅｃｔ）を使用してＩｇＡ１抗体を精製し、０．１Ｍのグリシン緩衝液ｐＨ２．５で溶出した。溶出液を、移動相としてＰＢＳを使用したＳＥＣカラムに装填した。単量体ＩｇＡを含む画分を回収し、１００ＫＤａスピンカラムで濃縮した。全ての抗体を０．２２μｍフィルタで濾過した。抗体の純度及び安定性を、２８０ｎｍで検出される移動相として１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．８を使用したＨＰ−ＳＥＣ（Ｙａｒｒａ  ３ｕ  ＳＥＣ−２０００カラム）で分析した。
【０１１５】
抗体の蛍光標識
精製した抗体を、撹拌しながらＮ−ヒドロキシ−スクシミジル−ＦＩＴＣと共に室温で２時間インキュベートすることによってフルオレセイン標識した。製造元の指示に従って、セファデックスカラム（ＮＡＰ−５、ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、未結合のＮＨＳ−フルオレセインを除去した。製造業者の指示に従って、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−４８８抗体標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で抗体を標識した。
【０１１６】
細胞株
全ての神経芽腫細胞株を、５％のＣＯ２を含む加湿インキュベータで、ＨＥＰＥＳ、グルタマックス、１０％のウシ胎児血清、１ｘペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地で３７℃で培養した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、８％のＣＯ２を含有するオービタルシェーカープラットフォームを備えた加湿インキュベータ内で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地中で３７℃で培養した。
【０１１７】
結合アッセイ
１００．０００個の神経芽腫細胞を９６ウェルプレートに播種し、１５００ＲＰＭで２分間遠心分離した。細胞を洗浄し、蛍光標識された抗体と共に４５分間、幾つかの濃度でインキュベートした。次に、細胞を１５００ＲＰＭで２分間遠心分離し、洗浄してＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞に結合した抗体の量を、フローサイトメトリ（ＢＤ  ＦａｃｓＣａｎｔｏ  ＩＩ、ＢＤ）によって定量化した。
【０１１８】
細胞ベースの親和性測定
１×１０６個のＩＭＲ３２神経芽腫細胞を１０ｃｍ培養皿の側面に楕円形にプレーティングし、プレートに付着させるために一晩インキュベートした。その後、プレートを培地で洗浄し、ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ装置（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に移した。１０ｎＭのフルオレセイン標識抗体を細胞に添加し、結合を１時間にわたって測定した。その後、抗体濃度を２０ｎＭに増加させて、１時間にわたり、より高い抗体濃度での結合を評価した。最後に、抗体を含まない培地の抗体含有溶液と交換することにより、解離を２時間にわたって測定した。抗体の親和性を、ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェア（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって計算した。
【０１１９】
ＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣを前述のように定量化した（Ｂｒａｎｄｓｍａｅｔ  ａｌ；２０１５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３（１２）：１３１６−１３２４）。略言すると、１０μＭの１１−ｃｉｓ−レチノイン酸の２４時間前処理を行ったか又は行っていない標的細胞を、３．７ＭＢｑの５１Ｃｒで２時間標識した。その後、細胞を３回洗浄して、過剰なクロムを除去した。ＡＤＣＣの血液は、ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔの健康なドナーから得た。白血球を分離するために、血液をデミウォーターと３０秒間インキュベートして赤血球を溶解した。その後、生理的浸透圧を回復するために１０ｘＰＢＳを追加した。細胞を培地で洗浄し、元の血液量に対応する培地に再懸濁させた。ウェルごと使用される白血球の数は、溶解前の血液５０μｌ中に存在する白血球の数に対応する。ＰＭＮ及びＰＢＭＣの分離のために、血液をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １１１９層の上に加え、制動なしに１５００ＲＰＭで２５分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣ及びＰＭＮを、血清とＦｉｃｏｌｌ層との間から、又はＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ層内でそれぞれ回収した。エフェクタ−標的比（Ｅ：Ｔ）は、ＰＢＭＣについては８０：１であり、ＰＭＮについては４０：１であった。エフェクタ細胞、様々な濃度の抗体、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２並びに放射線標識された腫瘍細胞を、丸底マイクロタイタプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に加え、５％のＣＯ２を含有する加湿インキュベータで３７℃でインキュベートした。プレートを１５００ＲＰＭで２分間遠心分離し、上清５０μｌをルマプレートに移した。放射性シグナル（ｃｐｍ）をベータガンマカウンタで定量した。式（（実験ｃｐｍ−基礎ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−基礎ｃｐｍ））ｘ１００を使用して特定の溶解を計算し、２．５％のトリトンで標識した細胞をインキュベートし、基礎放出を抗体及びエフェクタ細胞の非存在下で測定した。
【０１２０】
ＣＤＣアッセイ
１０５個の神経芽腫細胞をマイクロタイタプレートに加え、室温で様々な濃度の抗体と共に３０分間インキュベートした。その後、プールしたヒト血清（８人の異なる健康ドナーから）を１５％の濃度まで添加し、１時間又は４時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、７−ＡＡＤで１５分間染色した。細胞溶解を表す７−ＡＡＤ取り込みをフローサイトメトリにより定量した。
【０１２１】
マウス血清中の抗体濃度測定
ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳで希釈した０．５μｇ／ｍｌのヤギＩｇＧ抗ヒトカッパで一晩コーティングした。次に、ＴＷＥＥＮ  ２０を０．０５％含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを３回洗浄し、ＢＳＡを１％含有するＰＢＳＴでインキュベートすることで１時間ブロックした。ＢＳＡを１％含有するＰＢＳＴで血清サンプルを１：２０００に希釈し、ウェルに加え、室温で１．５時間インキュベートした。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＡ又は抗ヒトＩｇＧを使用して、ヒトＩｇＡ又はヒトＩｇＧにそれぞれ結合させた。プレートを、２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を用いて１０分間現像し、分光光度計で４１５ｎｍで読み取った。
【０１２２】
動物及び動物実験
マウスはユトレヒト大学の動物施設で飼育された。実験を、雄と雌の両方のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）を使用して行った。マウスは１２：１２明暗サイクルでグループ化されて収容され、食物と水は自由に摂取できた。マウスは実験開始の少なくとも１週間前から順応させた。サンプルのサイズは、実験の設計時に検出力解析で計算された。
【０１２３】
機械的閾値を、ＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８、ＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８、又はその蛍光標識変異体を静脈内注射した後のマウスでフォンフレイテストを使用して測定した（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ，ＵＳ）。上述の上下法を使用した（Ｅｉｊｋｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ；２０１６；Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ３６（２８）：７３５３−７３６３）。略言すると、較正済みのフォンフレイヘアモノフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を用いて機械的侵害受容をテストした。最初に、マウスを金属メッシュの床のある透明な箱に１５〜２０分間順応させた。フォンフレイヘアモノフィラメントを、メッシュ床を介して後足の足底の皮膚に押し付けた。機械的侵害受容を、無処理動物では応答を誘発しない０．０２ｍｇのフォンフレイヘアの一連の６回の押し付けに応答した足の引き込みの総数として測定した（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ−Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６  Ａｐｒ  ５；２６（１４）：３８６４−７４）。実験では、左足と右足との平均を独立した尺度とみなした。偏りを最小限に抑えるため、実験の開始前に動物を異なるグループにランダムに割り当て、全ての実験は治療を知らない実験者によって行われた。実験の終わりに、頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。機械的閾値を４８時間評価した。
【０１２４】
抗体のインビボ効力を評価するために、ＧＤ２を発現している５×１０６個のＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ）をマウスに腹腔内注射した。１日後、マウスに１００μｇのＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８又は１００μｇのＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８を腹腔内注射した。２日後、血液を採取し、マウスにルシフェリンを注入し、生物発光分析を行った。その後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。
【０１２５】
ニューロンへのＧＤ２抗体の結合を、２０μｇ又は１００μｇのａｌｅｘａ−４８８で標識されたＩｇＧ１  ｃｈ１４．１８或いは２０μｇのＩｇＡ１  ｃｈ１４．１８のｉ．ｖ．注入によって可視化した。坐骨神経を分離し、クライオスタットクライオトームで厚さ１０μｍのスライスを作成し、スライドに配置した。スライドを４％ＰＦＡ中で１０分間固定し、洗浄した。最後に、スライドをＤＡＰＩで対比染色し、洗浄し、ｆｌｕｏｒｓａｖｅで処理した。スライドを４℃で一晩乾燥させ、画像を蛍光顕微鏡で撮影した。
【図１−１】
2020534370.tif 000003
【図１−２】
2020534370.tif 000004
【図２】
2020534370.tif 000005
【図３】
2020534370.tif 000006
【図４】
2020534370.tif 000007
【図５】
2020534370.tif 000008
【図６】
2020534370.tif 000009
【図７】
2020534370.tif 000010
【図８】
2020534370.tif 000011
【図９】
2020534370.tif 000012
【図１０】
2020534370.tif 000013
【図１１】
2020534370.tif 000014
【図１２】
2020534370.tif 000015
【図１３】
2020534370.tif 000016
【図１４】
2020534370.tif 000017
【図１５】
2020534370.tif 000018
【図１６】
2020534370.tif 000019
【図１７】
2020534370.tif 000020
【図１８】
2020534370.tif 000021
【国際調査報告】
2020534370.tif 000022
2020534370.tif 000023
2020534370.tif 000024
2020534370.tif 000025
2020534370.tif 000026