(57)【要約】  ８００個以内のアミノ酸からなり、式（ＮＴ）−ＲＥＰ−ＣＴに従って配置される複数のドメインの組を含む組換クモ糸タンパク質であって、ここで任意のＮＴドメインが存在する場合、前記ＮＴドメインはクモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１００〜１６０個のアミノ酸残基の配列を含み、前記ＲＥＰドメインは、クモ糸タンパク質の反復セグメントに由来する３０〜６００個のアミノ酸残基の配列を含み、前記ＣＴドメインは：前記クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列；配列番号１５又は配列番号６２の〜６５又は６７〜７３の何れかに対して少なくとも８５％の同一性を有する配列；並びに、配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列：から選択される、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７０〜１２０個のアミノ酸残基の配列配列を含む。その溶液、ポリマー、用途、及び製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８００個以内のアミノ酸からなり、式（ＮＴ）−ＲＥＰ−ＣＴに従って配置される複数のドメインの組を含む組換クモ糸タンパク質であって、ここで
ａ．前記任意のＮＴドメインが、存在する場合には、クモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１００〜１６０個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｂ．前記ＲＥＰドメインが、クモ糸タンパク質の反復セグメントに由来する３０〜６００個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｃ．前記ＣＴドメインが、
i．クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列、
ii．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも８１％の同一性を有する配列、及び
iii．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列
から選択される、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７０〜１２０個のアミノ酸残基の配列からなる、組換クモ糸タンパク質。
【請求項２】
前記ＣＴドメインが、配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列からなると共に、前記配列が、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む、請求項１に記載の組換クモ糸タンパクｓ質。
【請求項３】
前記ＣＴドメインが、配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも８１％の同一性を有する配列からなる、請求項１又は２に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項４】
前記ＮＴドメインが存在すると共に、大瓶状腺（major ampullate gland）クモ糸タンパク質（ＭａＳＰ）のＮ末端ドメインに由来する配列からなる、請求項１〜３の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項５】
前記ＮＴドメインが存在すると共に、配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性、及び／又は、配列番号１若しくは表２に示す何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる、請求項１〜４の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項６】
前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで各Ａセグメントは、８〜２０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であると共に、前記アミノ酸残基の少なくとも６０％はＡｌａであり、ここで各Ｇセグメントは、１２〜４０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であると共に、前記アミノ酸残基の少なくとも３０％はＧｌｙである、請求項１〜５の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項７】
前記ＲＥＰドメインが、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、ＬＧ（ＡＧ）ｎＬからなる群より選択され、ここでｎは２〜１０の整数であり、
各Ａセグメントは、８〜１８個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基のうち０〜３個はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり、
各Ｇセグメントは、１２〜３０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり、
各Ｌセグメントは、０〜３０個のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である、請求項１〜６の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項８】
前記ＣＴドメインが、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列からなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項９】
前記ＣＴドメインが、配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、８５％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１〜８の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項１０】
前記ＣＴドメインが、配列番号６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１〜９の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項１１】
前記ＣＴドメインが、配列番号６４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなり、ここで前記配列が、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質のポリマー。
【請求項１４】
前記ポリマーが、長さ少なくとも１０ｍ且つ直径≦１００μｍの繊維である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１５】
靱性が≧４０ＭＪ／ｍ３である、請求項１３又は１４に記載のポリマー。
【請求項１６】
クモ糸タンパク質のポリマーを製造する方法であって、
ａ．請求項１〜１２の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質を少なくとも２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む第１の液体培地を供給する工程、
ｂ．前記クモ糸タンパク質の重合を許容するように前記第１の液体培地の特性を調節する工程、
ｃ．前記クモ糸タンパク質にポリマーを形成させる工程、及び、
ｄ．前記クモ糸タンパク質ポリマーを単離する工程
を含む方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）〜（ｄ）において、前記第１の液体培地の特性が、ｐＨ６．３以下であり、前記クモ糸タンパク質が重合するのに十分な塩濃度の存在下となるように調節される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩濃度が少なくとも１００ｍＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質の非変性溶液であって、前記クモ糸タンパク質のタンパク質濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍＬである溶液。
【請求項２０】
請求項１〜１２の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質、又は、請求項１３〜１５の何れか一項に記載のポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドの製造における使用。
【請求項２１】
請求項１〜１２の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質、又は、請求項１３〜１５の何れか一項に記載のポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変クモ糸タンパク質と、斯かるタンパク質の繊維を製造するための方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸は腹腺で産生されるスピドロイン（spｉｄroin）からなる。多くのクモは最大７種の異なる糸を異なる腺から産生する。これらはそれぞれ異なる目的に使用され、異なる力学特性を有する。コガネグモ類（orbweavers）が産生する最も強靭な糸として、引き綱（dragline silk）（大瓶状腺（major ampullate gland）由来）及び小瓶状糸（minor ampullate silk）（小瓶状腺（minor ampullate gland）由来）の２つが挙げられる。大瓶状スピドロイン（major ampullate spｉｄroins：ＭａＳｐ）及び小瓶状スピドロイン（minor ampullate spｉｄroins：ＭｉＳｐ）を含むスピドロインの大半は、非反復Ｎ末端ドメイン（N-Terminal domain：ＮＴ）、長大な反復領域（repetitive region：ＲＥＰ）、及び非反復Ｃ末端ドメイン（C-Terminal domain：ＣＴ）からなる共通の構造を有している。クモは縄張りを有し、その生産する糸は少量に過ぎないことから、クモ糸を何らかの工業用途に供するには、組換スピドロインを産生し、人工クモ糸繊維を生成することが必要となる。スピドロインは、例えば細菌、酵母、及び虫の細胞で産生することができるが、こうして得られた組換タンパク質は殆どの場合、その基となる天然産物とは大きく異なり、末端ドメインの一方又は両方が欠落していると共に、反復領域もコンセンサスリピートの繰り返しから変わっていることが多い。更に、こうして生産されるスピドロインは、製法をスケーラブルとするにはあまりにも収率が低く、及び／又は、水溶性が低い。その理由の一つは、おそらくこれらのスピドロインが本質的に自己集合しやすい傾向を有する点にあると思われる。しかし、産生レベル及び溶解性に関しては、最適でないスピドロインコンストラクトの使用が、旧来の欠点の原因となっている可能性がある。驚くべきことに、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）やギ酸等の溶媒を用いた場合でも、組換スピドロインの溶解性は、天然のドープにおけるスピドロインの極めて高い溶解性（タンパク質濃度３０〜５０％ｗ／ｗ、即ち３００〜５００ｍｇ／ｍＬを示す）には遠く及ばない。
【０００３】
クモ糸腺及び紡糸管（spinning duct）における条件の解析が進展し、これらの腺に沿ってｐＨが７．６から≦５．７へと徐々に低下していることが分かってきた。斯かる条件の変化によって、末端ドメインに独自の立体構造変化が生じる結果、ロック・アンド・トリガー（lock and trigger）機構を通じて繊維が形成される。糸腺内で中性ｐＨで保存されている間、ＮＴはモノマーで極めて溶解性が高く、これがスピドロイン全体の高い溶解性に寄与しているものと考えられる。本願においてより重要なのは、紡糸管内でｐＨが低下する際に、ＮＴが安定なダイマーを形成する結果、スピドロインが大きなネットワーク内に固定されるということである。ｐＨがＣＴに対して与える作用はまだ決定されておらず、異なる作用が観察されている。ある研究によれば（Andersson et al, PLoS Biol 12(8): e1001921. doi:10.1371/ journal.pbio.1001921）、ｐＨの低下がＣＴを不安定化させ、折り畳み構造を解放して、βシートアミロイド様原線維へと変換する。斯かるＣＴの構造変換が、アミロイド原線維形成に見られる核形成現象の場合と同様に、反復領域のβシート構造への転移を誘発するとの仮説が示されている。斯かる糸腺の管に沿って紡糸ドープ（spinning dope）の脱水が生じると共に、徐々に狭まる菅に沿って剪断力が発生し、これがスピドロインの末端ドメインに影響を与える可能性が高い。分子動力学シミュレーションの結果は、反復領域の構造変換においても、剪断力が重要な役割を果たしていることを示している。
【０００４】
改変された組換クモ糸タンパク質が、国際公開第２００７／０７８２３９号に記載されている。クモ糸タンパク質のポリマーを製造する方法が、国際公開第２０１０／１２３４５０号に記載されている。
【０００５】
斯かる公知の改変クモ糸タンパク質及びその製造方法は、前記のような欠点を有することから、本技術分野では改良された改変クモ糸タンパク質が求められている。
【０００６】
即ち、本発明の目的の一つは、特に水への高い溶解性を有し、スケーラブルな産生が可能であると共に、生体模倣的な仕方で重合し、真にクモ糸様の有用な繊維を形成することが可能な、改良された改変クモ糸タンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、改変クモ糸タンパク質の繊維を製造するための改良された方法であって、特に公知の紡糸された状態の（in as-spun state）繊維と比較して、改良された有用な力学特性を有する繊維を得ることが可能な方法を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の項に関する。以下の項に開示される主題は、添付の特許請求の範囲において開示された主題と同様に開示されたものと見做すべきである。
【０００８】
１．８００個以内のアミノ酸からなり、式（ＮＴ）−ＲＥＰ−ＣＴに従って配置される複数のドメインの組を含む組換クモ糸タンパク質であって、ここで
ａ．前記任意のＮＴドメインが、存在する場合には、クモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１００〜１６０個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｂ．前記ＲＥＰドメインが、クモ糸タンパク質の反復セグメントに由来する３０〜６００個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｃ．前記ＣＴドメインが、
i．クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列、
ii．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも８１％の同一性を有する配列、及び
iii．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列
から選択される、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７０〜１２０個のアミノ酸残基の配列からなる、組換クモ糸タンパク質。
【０００９】
２．前記ＣＴドメインが、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１０】
３．前記ＣＴドメインが、配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して 少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１１】
４．前記ＣＴドメインが、配列番号６４に対して少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１２】
５．前記ＣＴドメインが、配列番号６４に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８３％、８５％、８７％、又は８９％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなり、ここで前記配列が、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１３】
６．前記ＣＴドメインが、少なくとも８０個、好ましくは少なくとも９０個のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１４】
７．前記ＣＴドメインが、１１０個未満のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１５】
８．前記ＣＴドメインが、８７〜９７個のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１６】
９．前記ＣＴドメイン配列が、ヘリックス４の初めの箇所にＣ残基を含まない、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１７】
１０．前記ＣＴドメイン配列が、配列番号４９の位置４７〜５５にアラインする位置にＣ残基を含まない、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１８】
１１．前記ＮＴドメインが存在する、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００１９】
１２．前記ＮＴドメインが存在すると共に、大瓶状腺クモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する配列からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２０】
１３．前記ＮＴドメインが存在すると共に、配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性、及び／又は、配列番号１若しくは表２に示す何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２１】
１４．前記ＮＴドメインが存在すると共に、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２２】
１５．前記ＮＴドメインが存在すると共に、少なくとも１１０個、好ましくは少なくとも１２０個のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２３】
１６．前記ＮＴドメインが存在すると共に、最大１６０個、好ましくは１４０個未満のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２４】
１７．前記ＮＴドメインが存在すると共に、１３０〜１４０個のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２５】
１８．前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富なＡセグメントと、グリシン豊富なＧセグメントとを交互に含む、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２６】
１９．前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで前記ＲＥＰドメインにおけるＡセグメントの数とＧセグメントの数との合計が３〜３０個、好ましくは４〜２０個、より好ましくは４〜１０個、最も好ましくは４〜８個である、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２７】
２０．前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで各Ａセグメントは、８〜２０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％がＡｌａである、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２８】
２１．前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで各Ｇセグメントは、１２〜４０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも４０％がＧｌｙである、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００２９】
２２．前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで各Ａセグメントが、連続する５個の、好ましくは連続する６個のＡ残基の配列を少なくとも１つ含む、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００３０】
２３．前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで各Ｇセグメントが、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＧＧＸモチーフ（ここでＸは任意のアミノ酸を指す）を含む、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００３１】
２４．前記ＲＥＰドメインが、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、ＬＧ（ＡＧ）ｎＬからなる群より選択され、ここで
ｎは２〜１０の整数であり、
各Ａセグメントは、８〜１８個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基のうち０〜３個はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり、
各Ｇセグメントは、１２〜３０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり、
各Ｌセグメントは、０〜３０個、好ましくは０〜２５個のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００３２】
２５．各Ａセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２及び１０６０〜１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有し、
各Ｇセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９及び１０７４〜１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する、項２４に記載の組換クモ糸タンパク質。
【００３３】
２６．ｎが２又は４である、項２４〜２５の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質。
【００３４】
２７．前記選択されたＲＥＰドメインが、ＬＧ（ＡＧ）２Ｌ又はＬＧ（ＡＧ）４Ｌである、項２６に記載の組換クモ糸タンパク質。
【００３５】
２８．前記選択されたＲＥＰドメインが、ＬＧ（ＡＧ）２Ｌである、項２７に記載の組換クモ糸タンパク質。
【００３６】
２９．前記ＲＥＰドメインが、４０〜６００個、好ましくは５０〜５００個、より好ましくは６０〜４００個、最も好ましくは７０〜３００個のアミノ酸からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００３７】
３０．前記クモ糸タンパク質が、式ＮＴ−Ｌ−ＲＥＰ−Ｌ−ＣＴに従った複数のドメインの組を含み、ここで各Ｌセグメントは、１〜２０個のアミノ酸残基からなるリンカーアミノ酸配列である、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００３８】
３１．前記クモ糸タンパク質が、総計６００個以下、好ましくは５００個以下、より好ましくは４００個以下、より一層好ましくは３００個以下、最も好ましくは２５０個以下のアミノ酸残基からなる、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００３９】
３２．前記タンパク質が、極めてｐＨ依存性の高い溶解性を示す、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００４０】
３３．前記タンパク質が、極めてｐＨ依存性の高い溶解性を示すと共に、斯かる溶解性が、５００ｍＭ 酢酸Ｎａ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０の緩衝水溶液よりも、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝水溶液に対して、少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍高い溶解性を示すことにより規定される、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００４１】
３４．前記タンパク質が、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝水溶液に溶解しうると共に、５００ｍＭ 酢酸Ｎａ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０の水溶液中、５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは３００ｍｇ／ｍＬの濃度で重合する、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００４２】
３５．配列番号１１に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００４３】
３６．配列番号１１と同一の配列を含む、前記の項の何れかに係る組換クモ糸タンパク質。
【００４４】
３７．前記の項の何れかに係るクモ糸タンパク質の非変性溶液であって、前記クモ糸タンパク質のタンパク質濃度が、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは２００ｍｇ／ｍＬである溶液。
【００４５】
３８．項１〜３６の何れかに係るクモ糸タンパク質のポリマー、好ましくは繊維、フィルム、発泡体、ネット又はメッシュ。
【００４６】
３９．長さ少なくとも１０ｃｍ、好ましくは少なくとも１ｍ、より好ましくは少なくとも５ｍ、より一層好ましくは少なくとも１０ｍ、より一層好ましくは少なくとも５０ｍ、最も好ましくは少なくとも１００ｍの繊維である、項３８に記載のポリマー。
【００４７】
４０．直径≦１００μｍ、好ましくは５０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１０μｍ未満の繊維である、項３８〜３９の何れか一項に記載のポリマー。
【００４８】
４１．靱性≧３ＭＪ／ｍ３、好ましくは≧１０ＭＪ／ｍ３、より好ましくは≧２０ＭＪ／ｍ３、最も好ましくは≧４０ＭＪ／ｍ３である、項３８〜４０の何れか一項に記載のポリマー。
【００４９】
４２．クモ糸タンパク質のポリマーを製造するための方法であって、
ａ．項１〜３６の何れかに係るクモ糸タンパク質を、培地に溶解した状態で、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは３００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、第１の液体培地を提供する工程、
ｂ．前記クモ糸タンパク質の重合を生じさせるように、前記第１の液体培地の特性を調節する工程、
ｃ．前記クモ糸タンパク質にポリマーを形成させる工程、及び、
ｄ．前記クモ糸タンパク質ポリマーを単離する工程
を含む方法。
【００５０】
４３．前記第１の液体培地の特性の調節が、前記クモ糸タンパク質の重合を生じさせる特性を有する第２の流体培地内に、前記クモ糸タンパク質の溶液を押し出すことにより行われる、項４２に記載の方法。
【００５１】
４４．工程（ａ）における第１の液体培地が、少なくとも６．４のｐＨを有する、項４２〜４３の何れか一項に記載の方法。
【００５２】
４５．工程（ａ）における第１の液体培地が、１００ｍＭ未満の塩濃度を有する、項４２〜４４の何れか一項に記載の方法。
【００５３】
４６．工程（ａ）における第１の液体培地が、有機溶媒濃度１０％（ｖ／ｖ）未満の水溶液である、項４２〜４５の何れか一項に記載の方法。
【００５４】
４７．工程（ｂ）〜（ｄ）において、前記第１の液体培地の特性が、ｐＨ６．３以下、且つ、前記クモ糸タンパク質が重合するのに十分な塩濃度の存在下に調節される、項４２〜４６の何れか一項に記載の方法。
【００５５】
４８．工程（ｂ）〜（ｄ）において、前記第１の液体培地の特性が、塩濃度少なくとも１００ｍＭ、且つ、ｐＨ６．３以下に調節される、項４２〜４７の何れか一項に記載の方法。
【００５６】
４９．工程（ｂ）〜（ｄ）において、前記第１の液体培地の特性が、重合を生じさせるのに十分な有機溶媒濃度となるように調節される、項４２〜４８の何れか一項に記載の方法。
【００５７】
５０．前記第２の流体培地が、ｐＨ６．３以下であり、且つ、前記クモ糸タンパク質が重合するのに十分な塩濃度を有する、項４２に記載の方法。
【００５８】
５１．前記第２の流体培地が、重合を生じさせるのに十分な濃度の有機溶媒を含む、項４２又は５０に記載の方法。
【００５９】
５２．前記第２の流体培地が、吸湿性ポリマー、例えばＰＥＧを含む、項４２又は５０〜５１の何れか一項に記載の方法。
【００６０】
５３．前記押し出しが、前記間隔内の断面積が２０〜５００００μｍ２、好ましくは３０〜３００００μｍ２、より好ましくは４０〜１００００μｍ２、より一層好ましくは５０〜５０００μｍ２、最も好ましくは７０〜８００μｍ２の開口を有する毛細管を通じて行われる、項４２又は５０〜５２の何れか一項に記載の方法。
【００６１】
５４．前記押し出しが、０．１〜５００ｍｍ／ｓ、より好ましくは０．５〜２００ｍｍ／ｓ、最も好ましくは１〜１００ｍｍ／ｓの線流速で行われる、項４２又は５０〜５２の何れか一項に記載の方法。
【００６２】
５５．前記 ポリマーが繊維、フィルム、発泡体、ネット又はメッシュ、好ましくはa 繊維、より好ましくは項３８〜４１の何れかに係るポリマーである、項４２〜５４の何れか一項に記載の方法。
【００６３】
５６．項１〜３６の何れかに係るタンパク質をコードする核酸。
【００６４】
５７．プロモーターに作動式に連結された項５６に係る核酸を含む発現。
【００６５】
５８．項５６に係る核酸又は項５７に係る発現ベクターを含む宿主細胞。
【００６６】
５９．組換クモ糸タンパク質を製造する方法であって、
ａ．項５８に係る宿主細胞を、前記タンパク質の産生を許容する条件下で培養し、
ｂ．前記培養物から前記タンパク質を単離する
ことを含む方法。
【００６７】
６０．前記ポリマーが３Ｄ印刷機から押し出される、項４２〜５５の何れか一項に記載の方法。
【００６８】
６１．項１〜３６の何れかに係るクモ糸タンパク質又は項３８〜４１の何れかに係るポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドの製造における使用。
【００６９】
６２．項１〜３６の何れかに係るクモ糸タンパク質又は項３８〜４１の何れかに係るポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドとしての使用。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１：表２に示すスピドロインＮＴドメインのClustalWを用いたアラインメント。
【図２】図２：ＮＴ２ＲｅｐＣＴは、高い発現レベル及び水溶性を有する。（ａ）精製されたＮＴ２ＲｅｐＣＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び異なる精製工程。Ｍ＝Spectra Broadrangeタンパク質マーカー（サイズは左側にキロダルトンで示す）、Ｌ＝総細胞溶解物、Ｐ＝ペレット、Ｓｕｐ＝全細胞溶解物の遠心分離後の上清、ＦＴ＝Ｎｉ−ＮＴＡカラムのフロー、Ｅ＝Ｎｉ−ＮＴＡカラムから溶出した標的タンパク質ＮＴ２ＲｅｐＣＴ。（ｂ）タンパク質濃度３００ｍｇ／ｍＬで形成されたＮＴ２ＲｅｐＣＴのゲル写真。スケールバーは０．１ｃｍ。（ｃ）ＮＴ２ＲｅｐＣＴの０．００１ｍｇ／ｍＬでのＣｒｙｏ−ＥＭ。スケールバーは５０ｎｍ。
【図３】図３：人工クモ糸の生体模倣紡糸。（ａ）高濃縮ＮＴ２ＲｅｐＣＴ紡糸ドープをシリンジから、サイズ１０〜３０μｍの先端を低ｐＨの採集用水槽に浸した芯引きガラス毛細管にポンプで注入する。前記採集用槽から繊維を引き上げ（矢印）、フレームに巻き付ける。（ｂ）低ｐＨの採集用水槽内で防止した繊維の写真。（ｃ）低ｐＨ緩衝剤中の湿繊維ネスト。（ｄ）フレームに巻き付けた繊維。（ｂ）〜（ｃ）の繊維直径は約４０μｍ。（ｄ）の繊維直径は１５μｍ。スケールバーは（ｂ）３ｍｍ、（ｃ）〜（ｄ）５ｍｍ。
【図４】図４：ＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の特性決定。（ａ）異なるｐＨ値の緩衝剤中での紡糸。緩衝剤から引き上げてフレームに巻き付けることが可能な連続した繊維は、３．０≦ｐＨ≦５．５の緩衝剤中で形成される。（ｂ）ｐＨ５．５でインキュベートしたＮＴ２ＲｅｐＣＴのｎＥＳＩ−ＭＳ経時変化。低ｐＨに長時間暴露することで、ＮＴ２ＲｅｐＣＴの凝集が誘導される。この凝集体に濃縮ギ酸を添加するとモノマーが放出されるが、アセトニトリルの添加では放出されない。ユビキチンを内部標準として用い、残存するＮＴ２ＲｅｐＣＴダイマーの時間依存的なシグナル減少を追跡した。（ｃ）ｐＨ７．５では、安定な天然ダイマーの集団が検出された（白丸）のに対し、ｐＨ５．５でインキュベーションすると、可溶性のＮＴ２ＲｅｐＣＴが数分間で完全に消失する（黒丸）。
【図５】図５：ＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の引張特性。８本の個別のＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の機械（Engineering）応力／歪み曲線。
【図６】図６：ＮＴ２ＲｅｐＣＴのサイズ排除クロマトグラフィー。クロマトグラム上のタンパク質サイズは較正（calibrant）タンパク質に基づく。
【図７】図７：ＮＴ２ＲｅｐＣＴミセルの電子顕微鏡写真。ａ）陰性染色したミセルの透過型電子顕微鏡に基づくサイズ分布。ｂ）低温電子顕微鏡に基づくミセルのサイズ分布。ｃ）陰性染色したミセルの透過型電子顕微鏡写真。スケールバー ５０ｎｍ。
【図８】図８：ＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の走査型電子顕微鏡。（Ａ）紡糸直後の繊維。（Ｂ）フレームに巻き付けた紡糸直後の繊維。（Ｃ）５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）中で２００％内に伸張した後の繊維。（Ｄ）繊維の内部コアを調べるために破断した伸張後繊維の断面。何れの繊維も５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）の採集用槽内で紡糸。スケールバーは（Ａ−Ｂ）が１０μｍ、（Ｃ−Ｄ）が２μｍ。
【図９】図９：ＮＴ２ＲｅｐＣＴのフーリエ変換赤外分光。溶液中のＮＴ２ＲｅｐＣＴタンパク質（点線）及びＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維（実線）のＦＴＩＲスペクトル。
【図１０】図１０：単離されたＮＴ及びＣＴにｐＨの変化が与える作用。（Ａ）ＮＴは低ｐＨで二量体化する。（Ｂ）低ｐＨによりＣＴのダイマーは不安定化し、ＮＴ２ＲｅｐＣＴの凝集について観察されたのと同じ時間スケール内で、タンパク質はより高い荷電状態へと変化する。
【図１１】図１１：イソプロパノール内で紡糸したＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の走査型電子顕微鏡。スケールバーは５μｍ。
【図１２Ａ】図１２：３Ｄプリンティングでのパイロット試験。Ａ．低ｐＨ緩衝剤中にＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維で印刷した名前。Ｂ．ＮＴ２ＲｅｐＣＴゲル内で印刷した名前。Ｃ．ＮＴ２ＲｅｐＣＴゲルで名前を印刷した後、印刷された構造体にｐＨ５の酢酸ナトリウム緩衝剤を注いで固化。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１３】図１３：ＮＴ２＋２ＲｅｐＣＴの精製プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＴＰ＝総タンパク質；Ｓｕｐ＝溶解後の上清；Ｐ＝溶解後のペレット；Ｐ−ｓ＝一晩凍結したペレットの上清；ＦＴ＝（Ｎｉ−ＮＴＡカラムの）通過液（flow through）；Ｅ＝カラムから溶出したタンパク質。
【図１４】図１４：異なる採集用槽に紡糸した、又は異なる槽内で伸張した後のＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の応力対歪み曲線。１６０２２３＿１：５００ｍＭ ＮａＡｃ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５内に紡糸。１６０２２３＿２：５００ｍＭ ＮａＡｃ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１５％ ＰＥＧ、ｐＨ５内に紡糸。１６０２２３_４：５０％メタノール及び５００ｍＭ ＮａＡｃ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中で伸張後。１６０２２３_５：３０％ ＰＥＧ中で伸張後。
【図１５】図１５：１６０３０３＿４：５００ｍＭ ＮａＡｃ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．２５中に紡糸したＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の力／変位曲線。
【図１６】図１６：１６０３０３＿５ａ：５００ｍＭ ＮａＡｃ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中に室温で紡糸し、次いで８０％イソプロパノール水溶液中で伸張した後のＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の力／変位曲線。
【図１７】図１７：１６０３０３＿５ｂ：５００ｍＭ ＮａＡｃ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中に室温で紡糸し、次いで８０％イソプロパノール水溶液に浸漬した後のＮＴ２ＲｅｐＣＴ繊維の力／変位曲線。
【図１８】図１８：表１のＣＴドメイン配列の系統樹。
【図１９】図１９：Ａ）ｈｆｃＭＳＣはクモ糸発泡体上で膨張させた場合にｌｓｌ１＋及びＦ−アクチンの発現を維持する。ＤＡＰＩ染色（青）により核を示す。Ｂ）紡糸した繊維は集合して〜１ｃｍ直径の球を形成する（左）。稠密な繊維球の上で胎児心臓前駆細胞を培養。繊維球を切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ；中央）並びにＤＡＰＩで染色。Ｃ）クモ糸球上の低温切断細胞は、ラミニンα４、ＣＤ３１、及びヘパラン硫酸塩の発現を示す。
【図２０】図２０：精製されたＮＴ２ＲｅｐＣＴ（ＭｉＳｐ Ｄｓ）及び異なる精製段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍ＝Spectra Broadrangeタンパク質マーカー（左にサイズをキロダルトンで示す）、Ｔｏｔ＝総細胞溶解物、ＰｅｌＬ＝ペレット、Ｓｕｐ＝全細胞溶解物の遠心分離後の上清、ＦＴ＝Ｎｉ−ＮＴＡカラム通過液（flow through）、Ｗ＝洗浄液、Ｅ＝Ｎｉ−ＮＴＡカラムから流出した標的タンパク質ＮＴ２ＲｅｐＣＴ（ＭｉＳｐ Ｄｓ）。
【図２１】図２１：（１）ＮＴ２ＲｅｐＣＴ（ＭａＳｐ１ Ｅａ）及び（２）ＮＴ２ＲｅｐＣＴ（ＡＤＦ−４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍ＝Spectra Broadrangeタンパク質マーカー（左にサイズをキロダルトンで示す）、Ｔｏｔ＝総細胞溶解物、ＰｅｌＬ＝ペレット、Ｓｕｐ＝全細胞溶解物の遠心分離後の上清。
【図２２】図２２：ＮＴ２ＲｅｐＣＴ（ＭｉＳｐ Ｌｈ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍ＝Spectra Broadrangeタンパク質マーカー（左にサイズをキロダルトンで示す）、Ｔｏｔ＝総細胞溶解物、ＰｅｌＬ＝ペレット、Ｓｕｐ＝全細胞溶解物の遠心分離後の上清。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
定義
スピドロイン及びクモ糸タンパク質という語は、本明細書を通じて相互交換可能に用いられ、文脈に応じて天然タンパク質又は組換タンパク質を意味する。
【００７２】
ミニスピドロインという語は、スピドロインの改変された変異体であって、天然スピドロインよりも反復領域がはるかに短いものを意味する。
【００７３】
パーセンテージで表される配列同一性（sequence ｉｄentity）（或いは同意語である％同一性（% ｉｄentity））は、最適となるようにアラインされた２つの配列を、比較ウィンドウ全体に亘って比較して決定される値として定義される。ここで、これら２つの配列のアラインメントが最適となるように、比較ウィンドウ内において、（付加又は欠失を含まない）参照配列と比較して、もう一方の配列の一部が付加又は欠失（即ちギャップ）を有していてもよい。斯かるパーセンテージを求めるには、両配列で同一のアミノ酸残基が現れる位置の数を一致した位置の数とし、斯かる一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを算出する。別途断りなき限り、比較ウィンドウは対象となる配列の全長である。なお、ここで最適なアラインメントとは、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩハンドブック［インターネット］チャプター１６、出願日時点の最新版を参照）によりオンラインで実行されるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより、以下のインプットパラメーターで生成されるアラインメントである：Word length = 3、Matrix = BLOSUM62、Gap Cost＝11、Gap extension cost = 1。
【００７４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用される％類似性（% similarity）とは、疎水性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、及びＣｙｓは互いに類似し、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓは互いに類似し、酸性残基Ｇｌｕ及びＡｓｐは互いに類似し、親水性非荷電残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒは互い類似すると見做すことを除いては、％同一性と同様に算出される。ここでは、残る天然アミノ酸Ｇｌｙは、他の何れのアミノ酸とも類似しないとされる。
【００７５】
本明細書において、可溶（soluble）及び溶液（solution）という語は、問題のタンパク質を溶媒に溶解した場合に、視認できる凝集が生じず、６００００ｇでも溶媒から沈殿が生じないことを意味する。
【００７６】
本明細書で引用するGenbank受入番号は、本出願日における最新版のGenbankデータにおけるエントリーを指す。
【００７７】
詳細な説明
本発明者等は、人工クモ糸の生体模倣紡糸を実現するために満たすべき必須要件は、ｐＨ応答性であり、天然紡糸ドープにおけるスピドロインに匹敵するレベルの水溶性を示すスピドロインを得ることであると想定した。ここから本発明者等は、異なる種類のクモ及び異なる種類の糸に由来するスピドロインでは、ＮＴの水溶性及びＣＴのｐＨ応答性も異なるとの発想を得た。
【００７８】
更に、本発明者等は、高可溶性のＮＴと、同様に高可溶性のＣＴとを含む組換ミニスピドロインが、十分なｐＨ感受性を有し、溶解性の観点から有利ではないかとの仮説を立てた。斯かる仮説を検証するべく、本発明者等は、Ｅ．アウストラリス（E. australis）ＭａＳｐ１由来のＮＴとＡ．ベントリコスス（A. ventricosus）ＭｉＳｐ由来のＣＴとで、Ｅ．アウストラリス（E. australis）由来の短い反復配列を挟み込んだ（実施例１）ミニスピドロインを設計したところ、斯かるミニスピドロインが、かつてないほどの溶解性を有すると共に、従来技術のミニスピドロイン（比較例１１）と比較して、有用且つある面では優れた繊維を、生体模倣的且つｐＨ依存的に形成する能力を兼ね備える（実施例２〜１０）ことを見出した。
【００７９】
更なる実験によれば、Ｅ．アウストラリス（E. australis）由来の短い反復領域に連結された、Ａ．ベントリコスス（A. ventricosus）ＭｉＳｐ由来のＣＴを含むミニスピドロイン（実施例１２）も、ｐＨ依存的に繊維を形成することが示された。斯かるｐＨ依存的な繊維の形成は、これまでＮＴドメインを含まないミニスピドロインでは観察されたことがない。
【００８０】
実施例１の二倍の長さの反復領域を有する改変ミニスピドロインについて、更なる検討を行ったところ、高可溶性且つｐＨ感受性のＮＴ及びＣＴを組み合わせることによる利点は、極めて短い反復領域を有するミニスピドロインに限定されないことが示された（実施例１３）。
【００８１】
設計されたクモ糸タンパク質
本発明の第１の観点によれば、好ましくは８００個以内のアミノ酸からなる、組換クモ糸タンパク質であって、式（ＮＴ）−ＲＥＰ−ＣＴに従って配置される複数のドメインの組を含み、ここで、
ａ．前記任意のＮＴドメインが、存在する場合には、クモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１００〜１６０個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｂ．前記ＲＥＰドメインが、クモ糸タンパク質の反復セグメントに由来する３０〜６００個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｃ．前記ＣＴドメインが、
i．クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列、
ii．配列番号１５又は配列番号６２の〜６５又は６７〜７３の何れかに対して少なくとも８１％の同一性を有する配列、及び
iii．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列
から選択される、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７０〜１２０個のアミノ酸残基の配列からなる、
組換クモ糸タンパク質が提供される。
【００８２】
慣例に従い、式は左側がＮ末端、右側がＣ末端である。
【００８３】
ＣＴドメインの特性
生理学的なクモ糸の重合におけるＮＴドメインの役割は、早くから理解されてきた（例えば、国際公開第２０１０／１２３４５０号参照）。ＮＴドメインの極めて高い溶解性が、生理学的な（天然）クモ糸ドープにおいて見られ得る極めて高いタンパク質濃度の形成に寄与するものと考えられている。特に、ＮＴドメインが有するｐＨ依存性の高い特性が、ドープの急速重合を可能とする上で極めて重要な因子であると認識されてきた。
【００８４】
一方で、（これまで最も研究されてきた）大瓶状腺（major ampullate gland）糸由来のＣＴドメインの殆どは、顕著な溶解性を示さず、ｐＨ５〜７．５の範囲でｐＨ感受的な溶解性を示すこともない。
【００８５】
しかし、本発明者等は、他の種類の糸、例えば小瓶状腺（minor ampullate gland）糸に由来する特定のＣＴドメインが、実はｐＨ依存的に顕著な溶解性を示すことを見出した。
【００８６】
本発明者等は、ＣＴの一次構造のアラインメントを分析している際に、これらが荷電アミノ酸残基の数に違いがあること、即ち、エウプロステノプス・アウストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１由来のＣＴが４つの荷電残基を含むのに対して、アラネウス・ベントリコスス（Araneus ventricosus）ＭｉＳｐのＣＴは７つの荷電残基を有することを見出した。ここから、本発明者等は、ＣＴの電荷の数が、ＣＴの溶解性と正の相関を有し、惹いては高荷電アミノ酸残基の数を有するＣＴが、組換により作製されたスピドロインの溶解性に有益であるとの仮説を立てた。従って、特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者等は、生理学的条件下で荷電性を示すクモ糸腺内の残基（Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤ）が、溶解性及びｐＨ依存性にとって重要であると考えている。なお、ヒスチジンは、ここでいう荷電を有するとは見做さない。生理学的条件下、関連性のあるｐＨでは、概ねのところ非荷電であるからである。
【００８７】
下記の表１に示すように、大瓶状腺（major ampullate gland）クモ糸ＣＴドメインは、検討した限りにおいては、顕著な溶解性及び／又はｐＨ依存的な溶解性を示さないように見受けられるが、斯かる荷電残基の数が７未満である。これに対して、小瓶状腺（minor ampullate gland）クモ糸ＣＴドメインの殆どは、これらの荷電残基を少なくとも７つ有する。斯かる観察は、天然又は遺伝子工学的に荷電残基の数を変えた複数の異なるＣＴドメインを比較することにより、実験的に検証された（実施例１５参照）。
【００８８】
即ち、前記ＣＴドメイン配列は、例えばクモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７２〜１１０個のアミノ酸残基の配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列とすることができる。
【００８９】
好ましくは、前記ＣＴドメイン配列は、ＰＤＢ ｉｄ ２ＭＦＺ（ＭｉＳｐ ＣＴ、Ａ．ベントリコスス（A. ventricosus））又は２Ｍ０Ｍ（ＭｉＳｐ Ｎ．アンチポディアナ（N. Antipodiana））のＮＭＲ構造に従い定義されるヘリックス４の冒頭にＣ残基を含まない。ＣＴドメインの構造が実験により決定されていない場合には、例えばpsipred等の二次構造予測アルゴリズムを用いてヘリックス４を決定してもよい。Ｃ残基は、大瓶状腺（major ampullate gland）のＣＴドメインに特有の特徴であるが、小瓶状腺（minor ampullate gland）のＣＴドメインには概ね存在しない。好ましくは、前記ＣＴドメイン配列が、配列番号４９の位置４７〜５５にアラインする位置にＣ残基を含まない。
【００９０】
前記ＣＴドメインは、例えば配列番号６２の〜６５又は６７〜７３の何れか一つに対して、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列であってもよい。
【００９１】
前記ＣＴドメインは、例えば配列番号６４に対して、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列であってもよい。
【００９２】
前記ＣＴドメイン配列は、例えば配列番号６４又は配列番号６２の〜６５又は６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８３％、８５％、８７％、又は８９％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列（但し、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列）であってもよい。
【００９３】
【表１−１】
2020536843.tif 000002
【表１−２】
2020536843.tif 000003
【表１−３】
2020536843.tif 000004
【表１−４】
2020536843.tif 000005
【表１−５】
2020536843.tif 000006
【表１−６】
2020536843.tif 000007
【００９４】
ＣＴドメインは通常、７０〜１２０個のアミノ酸残基からなる。ＣＴドメインは、少なくとも７０個、又は８０個超、好ましくは９０個超のアミノ酸残基を含む。また、前記ＣＴドメインが、最大１２０個、又は１１０個未満のアミノ酸残基、より好ましくは１００個未満の残基を含むことが好ましい。一般に好ましいＣＴドメインとしては、約８７〜９７個のアミノ酸残基を含むものが挙げられる。
【００９５】
ＲＥＰドメインの特性
ＲＥＰドメインは、重合可能なドメインであれば、その具体的な配列又は構成は本発明においては重要ではなく、多種多様なクモ糸ＲＥＰドメインが本発明のタンパク質に適していると考えられる。Rising et al., Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:169-184では、本分野において組換スピドロインに使用される数種のＲＥＰドメインを論じているところ、本文献の教示に基づくＲＥＰドメインは、本発明においても有用であると考えられる。
【００９６】
一般的には、ＲＥＰドメインは反復を特徴とし、好ましくはアラニン豊富な配列部分（Ａセグメント）とグリシン豊富な配列部分（Ｇセグメント）とが交互に現れる配列を有する。
【００９７】
本発明のＲＥＰドメインは、アラニン豊富なＡセグメントとグリシン豊富なＧセグメントとを含むと共に、ＲＥＰドメイン中のＡセグメントの数とＧセグメントの数との合計が、３〜３０個、好ましくは４〜２０個、より好ましくは４〜１０個、最も好ましくは４〜８個であってもよい。
【００９８】
前記ＲＥＰドメインは、アラニン豊富なＡセグメントとグリシン豊富なＧセグメントとを含むと共に、各Ａセグメントは８〜２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸残基の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％がＡｌａであってもよい。
【００９９】
前記ＲＥＰドメインは、アラニン豊富なＡセグメントとグリシン豊富なＧセグメントとを含むと共に、各Ｇセグメントは１２〜４０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸残基の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも４０％がＧｌｙであってもよい。
【０１００】
前記ＲＥＰドメインは、アラニン豊富なＡセグメントとグリシン豊富なＧセグメントとを含むと共に、各Ａセグメントが、連続する５個の、好ましくは連続する６個のＡ残基からなる、少なくとも１つの配列部分を含んでいてもよい。前記ＲＥＰドメインは、アラニン豊富なＡセグメントとグリシン豊富なＧセグメントとを含むと共に、各Ｇセグメントが少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＧＧＸモチーフ（ここでＸは任意のアミノ酸を指す）を含んでいてもよい。
【０１０１】
前記ＲＥＰドメインは、４０〜６００個、好ましくは５０〜５００個、より好ましくは６０〜４００個、最も好ましくは７０〜３００個のアミノ酸を含んでいてもよい。
【０１０２】
前記ＲＥＰドメインは通常、３０個超、例えば７０個超、且つ、６００個未満、好ましくは３００個未満、例えば２４０個未満のアミノ酸残基を含むと共に、以下に詳細に説明するように、それ自体幾つかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニン豊富）セグメント、及びＧ（グリシン豊富）セグメントに分割される。通常、任意のリンカーセグメントは、ＲＥＰドメインの末端に存在するのに対し、残りのセグメントは順にアラニン豊富及びグリシン豊富となる。すなわち、ＲＥＰドメインは例えば概ね以下の何れかの構造を有する（ここでｎは整数である）。
Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ａ６Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｌ；又は
Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｇ６Ｌ。
【０１０３】
従って、アラニン豊富なセグメント又はグリシン豊富なセグメントの何れが、Ｎ末端又はＣ末端リンカーセグメントに隣接するかは重要ではない。ここでｎは２〜１０の整数であり、好ましくは２〜８、好ましくは４〜８、より好ましくは４〜６、即ちｎ＝４、ｎ＝５、又はｎ＝６であることが好ましい。
【０１０４】
本発明のＲＥＰドメインのアラニン含量は、例えば２０％超、好ましくは２５％超、より好ましくは３０％超であり、且つ、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満であってもよい。アラニン含量が多いほど、より硬く、及び／又は、より強く、及び／又は、より伸びにくい繊維が得られると考えられることから、これは有利な特徴と言える。
【０１０５】
前記ＲＥＰドメインはプロリン残基を欠いている、即ち、前記ＲＥＰドメイン内にＰｒｏ残基が存在しないことが好ましい。
【０１０６】
次ぎに本発明のＲＥＰドメインを構成するセグメントについて説明すると、特に強調されるのは、各セグメントが独自であること、即ち、ある特定のＲＥＰドメイン内の任意の２つのＡセグメント、任意の２つのＧセグメント、又は任意の２つのＬセグメントが、互いに同一であってもよく、異なっていてもよいという点である。即ち、ある特定のＲＥＰドメイン内の各種類のセグメントが同一であるというのは、本発明の一般的な特徴ではない。むしろ、当業者であれば以下の開示を指針として、どのように個々のセグメントを設計し、それらのセグメントを組み立ててＲＥＰドメインとし、本発明に係る機能的なクモ糸タンパク質の一部とすればよいかを、理解するであろう。
【０１０７】
個々のＡセグメントは、８〜１８個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。各Ａセグメントは、１３〜１５個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。また、Ａセグメントの多数、即ち３つ以上のＡセグメントが、１３〜１５個のアミノ酸残基を含み、Ａセグメントの少数、即ち例えば１又は２のＡセグメントが、８〜１８個のアミノ酸残基、例えば８〜１２個又は１６〜１８個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。これらのアミノ酸残基の大多数がアラニン残基である。より具体的に、前記アミノ酸残基のうち０〜３個がアラニン以外の残基であり、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。即ち、各Ａセグメントのアミノ酸残基の全てが例外なく、或いは１個、２個、又は３個のアミノ酸残基（アミノ酸であってもよい）を例外として残りがアラニン残基である。アラニンを置換するアミノ酸は天然アミノ酸であることが好ましく、独立にセリン、グルタミン酸、システイン、及びグリシンからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはセリンである。もちろん、前記Ａセグメントのうち１又は２以上のセグメントが、完全にアラニンのみからなるセグメントであって、残りのＡセグメントが１〜３個の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン、又はグリシンを含むセグメントであってもよい。
【０１０８】
各Ａセグメントは、例えば１３〜１５個のアミノ酸残基を含んでいてもよく、前述したように、それらのうち１０〜１５個がアラニン残基で、０〜３個が非アラニン残基であってもよい。中でも、各Ａセグメントが１３〜１５個のアミノ酸残基を含み、前述したように、それらのうち１２〜１５個がアラニン残基で、０〜１個が非アラニン残基であることが好ましい。
【０１０９】
各Ａセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基７〜１９、４３〜５６、７１〜８３、１０７〜１２０、１３５〜１４７、１７１〜１８３、１９８〜２１１、２３５〜２４８、２６６〜２７９、２９４〜３０６、３３０〜３４２、３５７〜３７０、３９４〜４０６、４２１〜４３４、４５８〜４７０、４８９〜５０２、５１７〜５２９、５５３〜５６６、５８１〜５９４、６１８〜６３０、６４８〜６６１、６７６〜６８８、７１２〜７２５、７４０〜７５２、７７６〜７８９、８０４〜８１６、８４０〜８５３、８６８〜８８０、９０４〜９１７、９３２〜９４５、９６９〜９８１、９９９〜１０１３、１０２８〜１０４２及び１０６０〜１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される、エウプロステノプス・アウストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質の天然配列のセグメントに対応する。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。或いは、各Ａセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基１４３〜１５２、１７４〜１８６、２０４〜２１８、２３３〜２４７及び２６５〜２７８の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、本発明に係る発現対象の非天然クモ糸タンパク質であって、適切な条件下で糸繊維を形成する能力を有するタンパク質のセグメントに対応する。すなわち、本発明に係るある態様によれば、各Ａセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一である。何ら特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、本発明に係るＡセグメントは、らせん構造又はベータシートを形成すると推定される。
【０１１０】
本明細書を通じて、本発明に係る別の態様は、先に詳述した同一性のパーセンテージの代わりに、対応する類似性のパーセンテージを充足する。他の別の態様は、先に詳述した同一性のパーセンテージに加えて、各配列の好ましい同一性のパーセンテージの群から選択される、より高い類似性のパーセンテージを充足する。例えば、ある配列が他の配列に対して７０％の類似性を示してもよく、他の配列に対して７０％の同一性を有してもよく、他の配列に対して７０％の同一性と９０％の類似性とを有してもよい。
【０１１１】
更に、実験データによれば、各Ｇセグメントは、１２〜３０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。各Ｇセグメントは、１４〜２３個のアミノ酸残基からなることが好ましい。各Ｇセグメントのアミノ酸残基の少なくとも４０％はグリシン残基である。通常、各Ｇセグメントのグリシン含量は、４０〜６０％の範囲である。
【０１１２】
各Ｇセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、５７〜７０、８４〜１０６、１２１〜１３４、１４８〜１７０、１８４〜１９７、２１２〜２３４、２４９〜２６５、２８０〜２９３、３０７〜３２９、３４３〜３５６、３７１〜３９３、４０７〜４２０、４３５〜４５７、４７１〜４８８、５０３〜５１６、５３０〜５５２、５６７〜５８０、５９５〜６１７、６３１〜６４７、６６２〜６７５、６８９〜７１１、７２６〜７３９、７５３〜７７５、７９０〜８０３、８１７〜８３９、８５４〜８６７、８８１〜９０３、９１８〜９３１、９４６〜９６８、９８２〜９９８、１０１４〜１０２７、１０４３〜１０５９及び１０７４〜１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される、エウプロステノプス・アウストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質の天然配列のセグメントに対応する。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。或いは、各Ｇセグメントが、配列番号３のアミノ酸残基１５３〜１７３、１８７〜２０３、２１９〜２３２、２４８〜２６４及び２７９〜２９６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、本発明に係る発現対象の非天然クモ糸タンパク質であって、適切な条件下で糸繊維を形成する能力を有するタンパク質のセグメントに対応する。すなわち、各Ｇセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されるアミノ酸配列と同一であることが好ましい。
【０１１３】
本発明に係る各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではないことが好ましい。
【０１１４】
本発明に係るＧセグメントには３つのサブタイプが存在する。この分類は、エウプロステノプス・アウストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質配列（国際公開第２００７／０７８２３９号）の入念な分析に基づく分類であり、斯かる情報は、非天然クモ糸タンパク質の構築の際に利用及び検証した情報である。
【０１１５】
本発明に係るＧセグメントの第１のサブタイプは、アミノ酸１文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡＧＳＳ（配列番号４）により表される。この第１の（そして通常は最も長い）Ｇセグメントのサブタイプは、通常は２３個のアミノ酸残基を含むが、１７個のアミノ酸残基からなる小型のセグメントの場合もあり、荷電残基を有さないか、１個の荷電残基を有する。すなわち、この第１のＧセグメントサブタイプは、１７〜２３個のアミノ酸残基を含むことが好ましいが、少ない場合には１２個のアミノ酸残基、多い場合には３０個のアミノ酸残基を含むものであってもよいと考えられる。何ら特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、このサブタイプはコイル構造又は３１−ヘリックス構造を形成すると推定される。この第１のサブタイプの代表的なＧセグメントとしては、配列番号３のアミノ酸残基２０〜４２、８４〜１０６、１４８〜１７０、２１２〜２３４、３０７〜３２９、３７１〜３９３、４３５〜４５７、５３０〜５５２、５９５〜６１７、６８９〜７１１、７５３〜７７５、８１７〜８３９、８８１〜９０３、９４６〜９６８、１０４３〜１０５９及び１０７４〜１０９２が挙げられる。本発明に係るこの第１のサブタイプの各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではないことが好ましい。
【０１１６】
本発明に係るＧセグメントの第２のサブタイプは、アミノ酸１文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号５）により表される。前記この第２の（そして通常は中型の）Ｇセグメントサブタイプは、通常は１７個のアミノ酸残基を含むと共に、荷電残基を有さないか、１個の荷電残基を有する。この第２のＧセグメントサブタイプは、１４〜２０個のアミノ酸残基を含むことが好ましいが、少ない場合には１２個のアミノ酸残基、多い場合には３０個のアミノ酸残基を含んでいてもよいと考えられる。何ら特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、このサブタイプは、コイル構造を形成すると推定される。この第２のサブタイプの代表的なＧセグメントとしては、配列番号３のアミノ酸残基２４９〜２６５、４７１〜４８８、６３１〜６４７及び９８２〜９９８；及び、配列番号３のアミノ酸残基１８７〜２０３が挙げられる。
【０１１７】
本発明に係るＧセグメントの第３のサブタイプは、アミノ酸１文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号６）により表される。この第３のＧセグメントサブタイプは、通常は１４個のアミノ酸残基を含み、通常は本発明に係るＧセグメントサブタイプの中でも最も短い。この第３のＧセグメントサブタイプは、１２〜１７個のアミノ酸残基を含むことが好ましいが、多い場合には２３個のアミノ酸残基を含んでいてもよいと考えられる。何ら特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、このサブタイプは、ターン構造を形成すると推定される。この第３のサブタイプの代表的なＧセグメントとしては、配列番号３のアミノ酸残基５７〜７０、１２１〜１３４、１８４〜１９７、２８０〜２９３、３４３〜３５６、４０７〜４２０、５０３〜５１６、５６７〜５８０、６６２〜６７５、７２６〜７３９、７９０〜８０３、８５４〜８６７、９１８〜９３１、１０１４〜１０２７；及び、配列番号３のアミノ酸残基２１９〜２３２が挙げられる。
【０１１８】
すなわち、各Ｇセグメントは、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有することが好ましい。
【０１１９】
ＲＥＰドメインのＡ及びＧセグメントが交互に現れる配列において、Ｇセグメントが１つおきに第１のサブタイプであり、残りのＧセグメントが第３のサブタイプである構造、例えば．．．Ａ１ Ｇshort Ａ２ Ｇlong Ａ３ Ｇshort Ａ４ Ｇlong Ａ５ Ｇshort．．．であることが好ましい。
【０１２０】
或いは、ＲＥＰドメインにおいて、Ｇセグメントの中に定期的に第２のサブタイプのＧセグメントが一つ挿入されて中断される構造、例えば ．．．Ａ１ Ｇshort Ａ２ Ｇlong Ａ３ Ｇmid Ａ４ Ｇshort Ａ５ Ｇlong．．．であることが好ましい。
【０１２１】
個々のＬセグメントは、例えば０〜３０個のアミノ酸残基、好ましくは０〜２５個のアミノ酸残基、例えば０〜１０個のアミノ酸残基を含んでいてもよい、任意のリンカーアミノ酸配列を表す。このセグメントは任意であり、クモ糸タンパク質の機能にとって重要ではないが、このセグメントが存在しても十分に機能的なクモ糸タンパク質を得ることができ、本発明に係るクモ糸繊維を形成することができる。エウプロステノプス・アウストラリス（Euprosthenops australis）のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号３）にも、リンカーアミノ酸配列が存在する。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、前述したＡ又はＧセグメントの何れかと類似していてもよいが、通常は本明細書に記載の要件を十分に満たさなくともよい。
【０１２２】
国際公開第２００７／０７８２３９号に示すように、ＲＥＰドメインのＣ末端部分に配置されるリンカーセグメントは、アミノ酸１文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳ（配列番号７）及びＡＳＡＡＳＡＡＡ（配列番号８）という、アラニン豊富な配列で表すことができる。事実、第２の配列は、本発明に係るＡセグメントと考えることができ、第１の配列は、本発明に係るＡセグメントに対して高度の類似性を有する。本発明に係るリンカーセグメントの他の例としては、１文字アミノ酸配列ＧＳＡＭＧＱＧＳ（配列番号９）という、グリシン豊富であり、本発明に係るＧセグメントに対して高度の類似性を有する配列が挙げられる。リンカーセグメントの他の例としては、ＳＡＳＡＧ（配列番号１０）が挙げられる。リンカーセグメントの更なる例としては、Ａ．ベントリコスス（A. ventricosus）ＭｉＳＰ ＣＴタンパク質由来のＶＴＳＧＧＹＧＹＧＴＳＡＡＡＧＡＧＶＡＡＧＳＹＡ（配列番号１１の一部）が挙げられる（実施例１を参照）。
【０１２３】
代表的なＬセグメントとしては、配列番号３のアミノ酸残基１〜６及び１０９３〜１１１０；並びに、配列番号３のアミノ酸残基１３８〜１４２が挙げられるが、当業者であれば容易に認識するように、これらのセグメントとして他にも多数の適切なアミノ酸配列が存在する。本発明のＲＥＰドメインにおいて、Ｌセグメントの一つが０個のアミノ酸を含むものであってもく、即ち、Ｌセグメントの一つが不在であってもよい。本発明のＲＥＰドメインにおいて、Ｌセグメントの両方が０個のアミノ酸を含むものであってもく、即ち、Ｌセグメントの両方が不在であってもよい。すなわち、本発明に係るＲＥＰドメインのこれらの態様を模式的に表すと次の通りとなる：（ＡＧ）ｎＬ、（ＡＧ）ｎＡＬ、（ＧＡ）ｎＬ、（ＧＡ）ｎＧＬ；Ｌ（ＡＧ）ｎ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡ、Ｌ（ＧＡ）ｎ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧ；及び（ＡＧ）ｎ、（ＡＧ）ｎＡ、（ＧＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎＧ。これらのＲＥＰドメインの何れも、先に規定したＣＴドメインとの使用に適している。
【０１２４】
ｎは、２又は４であることが好ましい。選択されるＲＥＰドメインは、ＬＧ（ＡＧ）２Ｌ又はＬＧ（ＡＧ）４Ｌであることが好ましい。選択されるＲＥＰドメインは、ＬＧ（ＡＧ）２Ｌであることが最も好ましい。
【０１２５】
クモ糸タンパク質は、式ＮＴ−Ｌ−ＲＥＰ−Ｌ−ＣＴに従う複数のドメインの組を含んでいてもよい。ここで、各Ｌセグメントは、１〜３０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜２５個のアミノ酸残基からなるリンカーアミノ酸配列である。
【０１２６】
ＲＥＰドメインは、３０〜６００個、より好ましくは５０〜５００個、最も好ましくは７０〜３００個のアミノ酸残基からなる配列であることが好ましい。
【０１２７】
任意のＮＴドメインの特性
前述した任意のＮＴドメインは、存在することが好ましい。言うまでもなく、ＮＴに関する以下の定義は、ＮＴドメインが実際に存在する場合にのみ当てはまることになる。
【０１２８】
前記ＮＴドメインは、クモ糸タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に対して、高度の類似性を有する。図１に示すように、このアミノ酸配列は、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む広範な種及びクモ糸タンパク質の間で、高度に保存されている。図１では、以下のスピドロインのＮＴドメインをアラインしている。なお、当てはまる場合にはGenBankの受入番号を併せて示す。
【０１２９】
【表２】
2020536843.tif 000008
【０１３０】
各配列のＮ末端断片に対応する部分のみを示し、シグナルペプチドは省略している。Nc Flag及びNlm Flagは、Rising A. et al. Biomacromolecules 7, 3120-3124 (2006)に従って翻訳及び編集した。
【０１３１】
本発明に係るクモ糸タンパク質において、具体的にどのＮＴドメインが存在するかは重要ではない。すなわち、本発明に係るＮＴドメインは、表２に示すアミノ酸配列、及び、高度の類似性を有する配列の何れかから選択することができる。本発明に係るクモ糸タンパク質では、多種多様なＮ末端配列を用いることができる。図１の相同配列に基づけば、以下の配列がコンセンサスＮＴアミノ酸配列を構成する。
【表３】
2020536843.tif 000009
【０１３２】
本発明に係るＮＴドメインの配列は、図１のアミノ酸配列に基づく配列番号２のコンセンサスアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％の同一性を有していてもよい。本発明に係るＮＴドメインの配列は、配列番号２のコンセンサスアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％の同一性を有することが好ましい。中でも、本発明に係るＮＴドメインは、配列番号２のコンセンサスアミノ酸配列に対して、更に７０％、最も好ましくは８０％の類似性を有することがより好ましい。
【０１３３】
本発明に係る代表的なＮＴドメインとしては、配列番号１のエウプロステノプス・アウストラリス（Euprosthenops australis）配列が挙げられる。ＮＴドメインは、配列番号１又は表２に示す何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有することが好ましい。中でも、ＮＴドメインが、配列番号１又は表２に示す何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有することがより好ましい。特に、ＮＴドメインが、配列番号１又は表２に示す何れかのアミノ酸配列、特にＥａ ＭａＳｐ１に対して、同一であることが最も好ましい。
【０１３４】
ＮＴドメインは、１００〜１６０個のアミノ酸残基を含む。前記ＮＴドメインが、少なくとも１００個、又は１１０個超、好ましくは１２０個超のアミノ酸残基を含むことが好ましい。また、ＮＴドメインが、最大１６０個、又は１４０個未満のアミノ酸残基を含むことが好ましい。特に、ＮＴドメインが、約１３０〜１４０個のアミノ酸残基を含むことが最も好ましい。
【０１３５】
クモ糸タンパク質のＮ末端部分が、クモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する２個以上のドメイン（ＮＴ）を含む場合、更に１個又は２個以上のリンカーペプチドを含んでいてもよい。斯かるリンカーペプチドは、２つのＮＴドメインの間に配置され、スペーサーとして機能してもよい。
【０１３６】
キメラクモ糸タンパク質の特性及び特徴
組換クモ糸タンパク質は、極めてｐＨ依存性の高い溶解性を示すことが好ましい。中でも、５００ｍＭ 酢酸Ｎａ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０の水溶液よりも、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝水溶液に対して、少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍高い溶解性を示すことにより規定される、極めてｐＨ依存性の高い溶解性を有することがより好ましい。
【０１３７】
中でも、組換クモ糸タンパク質は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝水溶液に対し、１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは３００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解しうると共に、５００ｍＭ 酢酸Ｎａ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０の水溶液中で重合しうることが好ましい。
【０１３８】
中でも、第１の観点に係るタンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことが好ましい。特に、第１の観点の組換クモ糸タンパク質は、配列番号１１と同一の配列からなることが最も好ましい。
【０１３９】
クモ糸タンパク質は、６００個以下、好ましくは５００個以下、より好ましくは４００個以下、より一層好ましくは３００個以下、最も好ましくは２５０個以下のアミノ酸残基を含むことが好ましい。一般に小さいタンパク質ほど組換による大量生産が容易である。
【０１４０】
キメラクモ糸タンパク質の溶液
本発明の第２の観点によれば、以上の態様の何れかに係るクモ糸タンパク質の非変性溶液であって、クモ糸タンパク質のタンパク質濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも２００ｍｇ／ｍＬであるクモ糸タンパク質の非変性溶液が提供される。言うまでもなく、非変性溶媒は、特にｐＨ、塩濃度、及び有機溶媒の何れの点でも、前記タンパク質の重合を誘発しない組成を有する。例えば、溶媒としては、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝水溶液等が挙げられる。ｐＨとしては、６．４以上、例えば７．０以上、好ましくは７．５〜８．５であることが好ましい。
【０１４１】
キメラクモ糸タンパク質のポリマー
第３の観点によれば、第１の観点に係るクモ糸タンパク質のポリマーが提供される。ポリマーとしては、例えば繊維、フィルム、発泡体、ネット又はメッシュが挙げられるが、繊維が好ましい。
【０１４２】
ポリマーは、例えば少なくとも１０ｃｍ、好ましくは少なくとも１ｍ、より好ましくは少なくとも５ｍ、より一層好ましくは少なくとも１０ｍ、より一層好ましくは少なくとも５０ｍ、最も好ましくは少なくとも１００ｍの長さの繊維である。
【０１４３】
繊維の直径は、例えば１００μｍ、好ましくは５０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１０μｍ未満である。
【０１４４】
ポリマーの靱性は、例えば≧３ＭＪ／ｍ３、好ましくは≧１０ＭＪ／ｍ３、より好ましくは≧２０ＭＪ／ｍ３、最も好ましくは≧４０ＭＪ／ｍ３である。好ましくは、靱性とは紡糸直後の（as-spun）ポリマー、即ち、後延伸又は同様の事後処理を受けていない状態の靱性を指すことが好ましい。
【０１４５】
クモ糸タンパク質のポリマーを製造するための方法
第４の観点によれば、クモ糸タンパク質のポリマーを製造するための方法であって、
ａ．第１の液体培地中に、第１の観点に係るクモ糸タンパク質を、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは３００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を提供する工程；
ｂ．クモ糸タンパク質の重合を生じさせるように、第１の液体培地の特性を調節する工程；
ｃ．クモ糸タンパク質にポリマーを形成させる工程；及び
ｄ．クモ糸タンパク質ポリマーを単離する工程
を含む方法が提供される。
【０１４６】
第１の液体培地の特性は、クモ糸タンパク質の溶液を、クモ糸タンパク質の重合を許容する第２の流体培地に押し出すことにより調節される。
【０１４７】
工程（ａ）における第１の液体培地のｐＨは、少なくとも６．４であることが好ましい。
【０１４８】
工程（ａ）における第１の液体培地の塩濃度は、１００ｍＭ未満であることが好ましい。
【０１４９】
工程（ａ）における第１の液体培地は、有機溶媒含有量が１０％（ｖ／ｖ）未満の水溶液であることが好ましい。
【０１５０】
工程（ｂ）〜（ｄ）において、第１の液体培地の特性は、前記クモ糸タンパク質が重合するのに十分な塩濃度の存在下で、ｐＨが６．３以下となるように調節されることが好ましい。
【０１５１】
工程（ｂ）〜（ｄ）において、第１の液体培地の特性は、例えば塩濃度が少なくとも１００ｍＭ、及び、ｐＨが６．３以下となるように調節される。
【０１５２】
工程（ｂ）〜（ｄ）において、第１の液体培地の特性は、例えば有機溶媒の濃度が重合を誘発するのに十分な濃度となるように調節される。
【０１５３】
第２の流体培地は、例えばｐＨが６．３以下であり、クモ糸タンパク質が重合するのに十分な塩濃度を有していてもよい。
【０１５４】
第２の流体培地は、重合を生じさせるのに十分な濃度の有機溶媒を含んでいてもよい。
【０１５５】
第２の流体培地は、吸湿性ポリマー、例えばＰＥＧを含んでいてもよい。
【０１５６】
前記押し出しは、例えば間隔２０〜５００００μｍ２、好ましくは３０〜３００００μｍ２、より好ましくは４０〜１００００μｍ２、より一層好ましくは５０〜５０００μｍ２、最も好ましくは７０〜８００μｍ２の断面積の開口を有する毛細管を通じて行うことができる。
【０１５７】
前記押し出しは、例えば０．１〜５００ｍｍ／ｓ、より好ましくは０．５〜２００ｍｍ／ｓ、最も好ましくは１〜１００ｍｍ／ｓの線流速で行うことができる。
【０１５８】
ポリマーを３Ｄ印刷機から押し出すことにより、所定のパターンの形成を可能とするのも好ましい。
【０１５９】
ポリマーは、繊維、フィルム、発泡体、ネット又はメッシュを形成してもよく、繊維を形成することが好ましい。
【０１６０】
ポリマーを更なる処理、例えば異なる水性緩衝剤及び／又はアルコール槽、及び／又は、例えばポリエチレングリコール （ＰＥＧ）等の脱水溶液内での後延伸処理等に供してもよい。
【０１６１】
ＤＮＡ配列、コンストラクト、宿主細胞、製造方法
第５の観点によれば、第１の観点に係るタンパク質をコードする核酸が提供される。
【０１６２】
第６の観点によれば、第５の観点に係る核酸を、プロモーターに作動式に連結された状態で含む発現ベクターが提供される。
【０１６３】
第７の観点によれば、第５の観点に係る核酸、又は、第６の観点に係る発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０１６４】
第８の観点によれば、組換クモ糸タンパク質を製造する方法であって、
ａ．第７の観点に係る宿主細胞を、前記タンパク質の産生を許容する条件下で培養し、
ｂ．培養物からタンパク質を単離する
ことを含む方法が提供される。
【０１６５】
前記本発明に係るクモ糸タンパク質は、通常は組換により、種々の適切な宿主、例えば細菌、酵母、哺乳類細胞、植物、虫細胞、及び、トランスジェニック動物等を用いて製造される。本発明に係るクモ糸タンパク質は、細菌により製造することが好ましい。
【０１６６】
クモ糸タンパク質の用途
上に論じた組換クモ糸タンパク質及びこれに由来するポリマーは、クモ糸タンパク質の既知の用途の何れにおいても有用である。
【０１６７】
第９の観点によれば、第１の観点に係るクモ糸タンパク質、又は、第３の観点に係るポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドの製造における使用が提供される。
【０１６８】
第１０の観点によれば、第１の観点に係るクモ糸タンパク質、又は、第３の観点に係るポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドとしての使用が提供される。
【０１６９】
本開示に関する一般的事項
「含む」（comprising）という語は、含む（including）という意で解すべきであるが、限定されるものではない。参照文献は何れも引用により本明細書に組み込まれる。本明細書は見出しを付して複数の項目に分割したが、これらは単に読みやすさのためであり、如何なる意味でも限定的に解すべきではない。特にこうした分割は、異なる見出しの項目から複数の特徴を組み合わせることを、如何なる意味でも除外又は制限するものではない。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例を限定的であるとみなしてはならない。実験の詳細に関するさらなる情報については、当業者は「材料および方法」という表題の別の節を参照のこと。
【０１７１】
実施例１：キメラミニスピドロインNT2RepCTの製造
本発明者らは、ガシキバラヒタキ(E. australis) MaSp1由来のNTおよびE. australisからの短い反復領域を挟むオニグモ(A. ventricosus) MiSp由来のCTからなるミニスピドロインを設計した。キメラNT2RepCTタンパク質は、振盪フラスコ大腸菌培養液中でこれまでにない高レベルで産生され、精製後の収量はＬ細胞培養物あたり約125mgのタンパク質であった。ほぼ全てのタンパク質が発現し、溶解後に可溶性であり、かつNi-NTAカラムに効率的に結合した（図２Ａ）。溶出液は95%を超える純度のNT2RepCTを含み、SDS PAGEゲルに固定されたタンパク質のサイズは予想される分子量（33 kDa）とよく一致した（図２Ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーは、100 kDaの質量を示し（図６）ており、二量体（ＣＴの構成的二量体の性質による）および反復部分の非球状構造とよく一致した。
【０１７２】
実施例２： キメラミニスピドロインNT2RepCTは極端な溶解性を示す
水中で高濃度の紡糸ドープを得ることは長年の大きな目標であったが、今までは、非生理学的溶媒を使用したとしても、報告されている人工紡糸ドープの濃度は10〜30%の範囲であった。実施例１のNT2RepCTは、溶解性に関してあらゆる予想をはるかに上回った。それはpH 8の水性緩衝液中で沈殿なしに500 mg/mlに濃縮することができ、この濃度はクモの紡糸ドープ中のタンパク質濃度と等しいかそれを超えることさえある。このような高濃度では、タンパク質は黄色のヒドロゲルを形成した（図２Ｂ）。天然のクモ絹糸ドープは、直径100〜200 nmのミセルとして貯蔵されていることが分かっており、おそらくシェルに末端ドメインおよびコアに遮蔽された反復領域を持っている。これは、カイコ絹糸腺内の貯蔵メカニズムであることも提案されている。この点でNT2RepCTタンパク質は天然の絹タンパク質として機能し、約10 nmのミセルに集合している（図２Ｃ、図７）。天然クモ絹ドープ中のミセルと比較して、組み換えスピドロインからなるミセルの直径が小さいことから、NT2RepCTの反復領域が短いことから予想される。500 mg/mlのNT2RepCTは、繊維を形成する能力を維持しながら、4℃で数週間、また-20℃で数ヶ月間保存することができた（下記参照）。人工紡糸ドープ溶液の報告されている典型的な安定性は3〜5日なので、これは驚くべきことである。
【０１７３】
公表されている精製プロトコルは、硫酸アンモニウムによる発現タンパク質の沈殿、凍結乾燥、さらにHFIPまたはチオシアン酸グアニジニウムへの可溶化を含んでいた。製造中に非水性溶媒または他の変性剤が存在すると、天然構造の形成が妨げられる可能性があり、我々はNT2RepCTの高い溶解度および経時安定性は天然に折り畳まれたNTおよびCTの存在に関連していることを提案するが、これは、天然様ミセル構造の観察により支持されている推測である。さらに、溶液中のNT2RepCTタンパク質のフーリエ変換赤外（FTIR）分光法は、波数約1545および1650 cm-1にそれぞれアミドＩおよびＩＩの最大吸収帯を示した（図９）。この結果はαらせん構造を示している。これは、NTとCTの両方の天然の五本のらせん束構造とよく一致している。
【０１７４】
実施例３：NT2RepCTミニ スピドロインの生物模倣紡糸
生物模倣紡糸を達成するのに満たされる必要がある別の前提条件は、クモ絹糸腺の状態を模倣することができる紡糸装置を設計することである。我々は細いガラス製毛細管（ここから高濃度のNT2RepCTドープを酸性の水性緩衝回収槽に注入する）から、単純だが効率的な第一世代の紡糸装置を設計した（図３）。この設定によりpHが低下し、ドープが毛細管の先端を進む際に剪断力がドープに作用し、その結果、連続的な固体繊維が形成される（図３Ａ〜Ｂ）。繊維は、数百メートルを超える長さで空気中で回転するフレームに容易に巻き取られる（図３Ｃ）。繊維を紡糸することができるドープ濃度間隔は100〜500 mg/mlの範囲であった。200 mg/mlを超える濃度のドープから紡糸された繊維は取り扱いがより簡単で、破断することなく連続繊維に紡糸することができた。紡糸直後(as-spun)の繊維は、SEMで判断されるように、約10〜20 μmの直径で均質であった（図８）。低pH浴中で後延伸した繊維は、紡糸直後の繊維と比較して直径がわずかに減少した。切れるまで延伸された繊維の破断面は、緻密で均質な内部核を示す（図８）。
【０１７５】
NT2RepCT繊維のフーリエ変換赤外分光(FTIR)分析によると、アミドＩおよびＩＩピーク分布の移動から分かるように、可溶性状態と比較してβシート立体配座が増加した（図９）。
【０１７６】
実施例４： pHの繊維紡糸に及ぼす影響
pHの繊維紡糸に及ぼす影響をさらに調べるために、ドープを2.0〜7.5の範囲のpHを有する水浴中に押出した。浴のpHが6.0〜6.5の間にあるときは、不連続な繊維様構造体が形成された（図４Ａ）。pHが3.0〜5.5の間では連続繊維が形成され（図４Ａ）、繊維は回収浴から容易に引き出され、フレームに巻き取ることができた（図３および４）。回収浴のpHが2.5以下の場合は、繊維は見られなかった（図４Ａ）。
【０１７７】
実施例５：分子レベルでのNT2RepCTの集合
分子レベルでNT2RepCTのpHに依存する集合をさらに調べるために、我々はナノエレクトロスプレー質量分析法（nESI-MS）を使用した。予想通り、pH 7.5でnESI-MSからは、天然のNT2RepCT二量体に対応する66560 Daの主要分子種の存在が確認された。pHを約5.5に下げると、四次構造の著しい変化が引き起こされる。オリゴマー（主に四量体、図４Ｂの矢印）を、エレクトロスプレー毛細管中の試料にギ酸を直接添加した後1分まで観察することができた。より重合度の高いオリゴマーがなくなった後、二量体に対応する低強度のピークのみを検出することができ、これは5分の間にさらにベースラインまで減少した（図４Ｂ）。これらの知見は、末端ドメインのpH依存性による固定あるいは開始作用とよく相関している。NTはそれ自体が低pHで急速な逆平行二量体化を受ける（図１０）が、このことはスピドロインの無限重合体への架橋をもたらすことを示唆している。一方、CTを単独で使用すると、モノマーの量が増えることから分かるように、低pHにさらされると徐々に折り畳みが解け、最終的にはいくつかのより高い荷電状態で示されるようにアミロイド様βシート核となる（図１０）。アミロイド様フィブリルと同様に（Solvent effects on self-assembly of beta-amyloid peptide（ベータ-アミロイドペプチドの自己集合に及ぼす溶媒効果）。Shen CL, MurpHy, RM. BiopHys J. 1995 Aug; 69(2) ：640-51）、アセトニトリルを添加してもより高重合度のNT2RepCTのオリゴマーは溶解できなかったが、濃ギ酸はモノマーの信号を回復し、これは変性による凝集体の解離を示している（図４Ｂ）。
【０１７８】
実施例６：紡糸したNT2RepCT繊維の機械的性質
天然のドラグライン繊維の強度と伸びは、クモの種類によって大きく異なり、湿度や温度などの環境要因にも大きく依存するが、それらはすべて降伏点までの初期弾性挙動を示し、その後塑性変形が起こる。応力をかけたときの紡糸後のNT2RepCT繊維の挙動は、天然のドラグライン絹糸と似ているが、引張強度はより低く歪みはより高い（図５）。pH 5の水性回収浴中に紡糸したNT2RepCT繊維は45±7 MJ/m3の靭性を持つ（図５、表３）が、A. trifasciataのドラグライン絹糸（100 ± 40 MJ/m3）の靭性39に近づく（表３）。ヤング率は約6 GPaで、天然のArgiope trifasciataのドラグライン絹糸の半分である。
【０１７９】
【表４】
2020536843.tif 000010
【０１８０】
参考文献 1. Plaza, G. R., Perez-Rigueiro, J., Riekel, C., Perea, G.B., Agullo-Rueda, F., Burghammer, M., Guinea, G.V., Elices, M. . Relationship between microstructure and mechanical properties in spider silk fibers: identification of two regimes in the microstructural changes（クモ絹繊維の微細構造と機械的性質の関係：微細構造変化における２つの型の同定）. Soft matter 8, 6015-6026, (2012).
【０１８１】
参考文献 2. Heidebrecht, A. et al. Biomimetic fibers made of recombinant spidroins with the same toughness as natural spider silk（天然クモ絹糸と同じ靭性を有する組み換え型スピドロインでできた生体模倣型繊維）. Adv Mater 27, 2189-2194, (2015).
【０１８２】
参考文献 3. Copeland, C. G., Bell, B.E., Christensen, C.D., Lewis, R.V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk（合成クモ絹糸の紡糸法の開発）. ACS Biomaterials Science and Engineering 1, 577-584, (2015).
【０１８３】
参考文献 4. Teule, F. F., W.A.; Cooper, A.R.; Duncan, J.R.; Lewis R.V. Modifications of spider silk sequences in an attempt to control the mechanical properties of the synthetic fibers（合成繊維の機械的性質を制御する試みにおけるクモ絹配列の改変）. J Mater Sci 42, 8974-8985, (2007).
【０１８４】
参考文献 5. Albertson, A. E., Teule, F., Weber, W., Yarger, J. L. & Lewis, R. V. Effects of different post-spin stretching conditions on the mechanical properties of synthetic spider silk fibers（合成クモ絹繊維の機械的性質に及ぼす異なる紡糸後延伸条件の影響）. J Mech Behav Biomed Mater 29, 225-234, (2014).
【０１８５】
参考文献 6. Adrianos, S. L. et al. Nephila clavipes Flagelliform silk-like GGX motifs contribute to extensibility and spacer motifs contribute to strength in synthetic spider silk fibers（合成のクモ絹繊維では、NepHila clavipes鞭毛の絹様GGXモチーフは伸張性に寄与し、スペーサーのモチーフは強度に寄与する. Biomacromolecules 14, 1751-1760, (2013).
【０１８６】
今までに公表された人工のクモ絹繊維を製造する方法には、エレクトロスピニング、ハンドドローイング、マイクロ流体装置による紡糸、および湿式紡糸が含まれ、しばしば水性アルコールの凝固浴中で行われる。これらの方法はどれも、おそらく製造および紡糸工程で変性されたタンパク質同士の組合せおよび生物模倣条件が欠如しており、天然のクモドラグライン絹糸の性質と同等の機械的特性を有する繊維を形成しなかった。紡糸後の繊維は、14〜55 MPaの範囲の最大引張応力、および1〜7%の歪みレベルをもち、最大2 MJ/m3の靭性を持つ（表３）。繊維の機械的性質を高めるには、別の紡糸後処理が必要である。500%の後延伸した末端ドメインを持たない天然サイズの組換えタンパク質について、最大500 MPaの応力および15 ± 5%の歪みを持つこれまでに発表された最も靭性の高い繊維が得られたが、紡糸後の繊維の応力水準は報告されなかった。これらの結果を考慮すると、我々の紡糸後の繊維は、天然の反復領域の僅かに約2％がミニ スピドロインに含まれていることを考えると、驚くほど良好な機械的性質を持っている。NT2RepCT繊維は、我々の知る限りでは、これまで製造された中で最も堅牢な紡糸繊維である（表３）。
【０１８７】
実施例７：乾燥繊維の種々の溶媒への溶解度
乾燥繊維を重水(dH 2O)に溶解する。本発明者らは、乾燥繊維の溶解を起こさずに使用することができる水性緩衝液および溶媒を研究した。
【０１８８】
実施例３に記載のように、繊維の紡糸をガラス毛細管中で行った。繊維を500 mM NaAcおよび200 mM NaCl、pH 5を有する回収浴中に紡糸した。紡糸後の繊維を回収浴から引き上げて乾燥させ、その後、単繊維を種々の溶液に浸して溶解したかどうかを確認した。
【０１８９】
試験に使用した浸漬溶液：
1. 200 mM クエン酸, pH 3
2. 500 mM NaAc および200 mM NaCl, pH 5
3. 1M NaCl, pH 6.6
4. dH2O
5. 20 mM Hepes/Mes, pH 5.5
6. 20 mM Hepes/Mes, pH 7.5
7. Mes, pH 5.15
8. 20 mM トリス, 100 mM NaCl, pH 8
【０１９０】
繊維は浸漬溶液１〜３には溶解しなかったが、溶液４〜８には溶解した。pHとイオン強度の組み合わせが溶解度に影響を及ぼす要因であると結論付けた。
【０１９１】
実施例８：種々の回収浴へのNT2RepCTの紡糸
NT2RepCT繊維の紡糸に及ぼす回収浴の組成およびイオン強度の影響を調べるために、回収浴中の溶液以外は実施例３と同様の設定で追加の試験を行った。
【０１９２】
試験に使用した回収浴：
1. 400 mM NaCl, pH 5を含む1000 mM NaAc緩衝液
2. 200 mM NaCl, pH 5を含む500 mM 酢酸ナトリウム(NaAc)緩衝液 
3. 20 mM NaAc 緩衝液, pH 5
4. 20 mM リン酸緩衝液, pH 6.2
5. 20 mM トリス, 500 mM NaCl, pH 7.2
6. 80%の２−プロパノールと水の混合液
7. 40%の２−プロパノールと水の混合液, 500 mM NaAc, 200 mM NaCl
8. 60 %のメタノール, 40%の水
9. 60 % のメタノールと水の混合液, 500 mM NaAc, 200 mM NaCl
10. 33% PEG 6000(ポリエチレングリコール6000)
11. 16.5% PEG 6000, 500 mM NaAc, 200 mM NaCl, pH 5
【０１９３】
回収浴１〜２、６〜１１中に連続繊維が形成された。回収浴３〜５からは、容易に溶解する短い繊維のみが得られた。PEG繊維は酢酸ナトリウム緩衝液中で調製された繊維と非常に類似しているように見えたが、２−プロパノール（図１１）およびメタノール繊維は異なる巨視的外観をしていた。２−プロパノール繊維は、NaAc繊維よりも不透明度が低かった。メタノール繊維は完全に透明で、よりゲル状であった。
【０１９４】
最も強度が高いと思われる繊維は回収浴２(500mM NaAc、200mM NaCl pH5)で製造された。紡糸後に空気中で後延伸するのが最も容易な（すなわち、より伸張性の）繊維は回収浴１１(16.5%PEG、500mM NaAc緩衝液、200mM NaCl pH5)中で製造された。
【０１９５】
実施例９：種々の回収浴中で、異なる温度で紡糸した、または種々の浴中で後延伸したNT2RepCT繊維の引張特性および二次構造
【０１９６】
目的
1) NT2RepCT繊維の引張特性に及ぼす回収浴の組成の影響を研究すること
2) NT2RepCT繊維の引張特性に及ぼす後延伸の影響を研究すること
【０１９７】
方法
研究１）：NT2RepCT繊維を実施例３に記載のようにして以下の異なる回収浴中に紡糸した： 
160223_1: 500 mM NaAc, 200 mM NaCl, pH 5
160223_2: 500 mM NaAc, 200 mM NaCl, 15% PEG, pH 5 
160303_4: 500 mM NaAc, 200 mM NaCl, pH 4.25
【０１９８】
研究２）：NT2RepCT繊維を、実施例３に記載のようにして、500mM NaAc、200mM NaCl、pH5を含む回収浴中に紡糸し、続いて：
160223_4：50% MetOhおよび500 mM NaAc, 200 mM NaCl, pH 5中で後延伸した；
160223_5：30% PEG中で後延伸した；
160303_5a：80%の２−プロパノール中で後延伸した；あるいは
160303_5b：80%の２−プロパノール（延伸せず）に浸漬した。
【０１９９】
引張試験（160223試料）を実施例３に記載のように行った。あるいは、引張試験機をShimadzu（島津）製に変えて、実施例３に記載のものと同じ手順で（160303試料）引張試験を行った。
【０２００】
結果
ＰＥＧを含む回収浴中へ紡糸すると、500 mMのNaAc、200 mMのNaCl、pH 5のみを含む回収浴に比べて、繊維の靭性が増加する。ただし、500 mMのNaAc、200 mMのNaCl、pH 5に紡糸されたNT2RepCT繊維(160223_1)は、他のバッチからのNT2RepCT繊維よりも靱性がはるかに低かった。
【０２０１】
メタノールの存在下で後延伸すると繊維の引張強度が高くなり、一方30% PEG中で後延伸すると繊維の歪みが大きくなる。
【０２０２】
pHを4.25に下げると、得られた繊維は非常に脆い。
【０２０３】
２−プロパノール中で後延伸すると引張強度は高くなるが、歪みは低くなる。一方２−プロパノールに浸漬したのみだと歪みが高くなる。
【０２０４】
実施例１０：NT2RepCTによる３Ｄ印刷の予備研究
この研究の狙いは、NT2RepCT蛋白質を用いる繊維構造の印刷とNT2RepCTゲル繊維の印刷を試験することであった。
【０２０５】
実施例１に記載のようにNT2RepCTを発現・精製し、次いで濃縮した。
【０２０６】
紡糸の設定は実施例３に記載のとおりであった。引き上げたガラス毛細管を紡糸しながらあちこちに移動させて名前と記号を印刷した。
【０２０７】
ゲル実験のために、高濃度のNT2RepCTタンパク質を注射器に入れ、27Gの針からペトリ皿に押し出した。ゲル構造体を印刷した後、低pH緩衝液(500 mM NaAc、200 mM NaCl、pH 5)をペトリ皿に注いだ。
【０２０８】
どちらの研究も、３Ｄ印刷機を用いたNT2RepCTの印刷の実現可能性を示している。両方の研究で、名前と記号を印刷することができた（図１２Ａ〜Ｃ）。従って、３Ｄ印刷機は、乾いた状態でも低pHの湿った状態でも印刷することができた。
【０２０９】
比較例１１：比較例の繊維の形成
３つの異なる構築物：MaSpCT、NT4rep、および4repCT（全ての構築物はMaSpからの部分を含む、すなわち、MiSp CTを含まない）を発現・精製し、基本的に2007年にStarkらが記載したようにガラス管中で緩傾斜法を用いて繊維形成を行った。ただし、pHを下げる添加剤により異なるミニスピドリン構築物の繊維形成特性に及ぼすpHの影響の研究が可能になった。
【０２１０】
方法
グリセリン保存液から20 mLのLB培地（カナマイシンを含む）を接種して、種々の構築物の一晩培養物を調製した。一晩培養物を30℃、200 rpmで増殖した。
【０２１１】
5 mlのON培養液を500 mlの新鮮なLB培地（カナマイシンを含む）に加え、30℃、200 rpmでOD 0.9まで増殖させ、その後温度を25℃に下げ、IPTGを加えた（最終濃度0.3 mM）。発現を４時間続けた後、培養物を5000 rpm、4℃で20分間遠心分離した。ペレットを30 mlの20 mM トリスpH 8に溶解し、-20℃で保存した。
【０２１２】
解凍しながら600 μlのリゾチームを添加して細胞を溶解した。細胞が融解したら、15 μlのDNaseおよび60 μl（1 M）のMgCl2を加え、試料を氷上で30分間インキュベートした。溶解物を15000 rpm、4℃で30分間遠心分離した後、上清を精製のためにNi-セファロースカラムに充填した。カラムを20 mMトリス pH 8、次いで20 mMトリスpH 8および10 mMイミダゾールで洗浄した。タンパク質を20 mMトリス、300 mMイミダゾールpH 8で溶出した。トロンビン（1 μg/mgタンパク質）を融合タンパク質に加え、試料を20 mMトリスpH 8に向けて4℃で一晩透析した。透析して切断した試料をNi-セファロースカラムに充填し、精製タンパク質を含む通過画分を回収した後、タンパク質の純度をSDS-PAGEで確認し、タンパク質濃度を280 nmで測定した。
【０２１３】
種々の構築物のタンパク質収率は次の通り：
NT4rep：１Ｌの震盪フラスコ培養で21 mg、
4repCT：１Ｌの震盪フラスコ培養で24 mg、
MaSpCT：１Ｌの震盪フラスコ培養で14 mg。
【０２１４】
タンパク質を≦3 mg/mlに濃縮し、次いで試料を異なるpHおよび塩条件の緩衝液中で1 mg/mlに希釈した。4RepCTの最大濃度は10 mg/mlであり、その後タンパク質を沈殿させた。
【０２１５】
繊維形成に使用された方法は、（Starkら 2007年に記載されているように）ガラス管内で穏傾斜させることであった。
【０２１６】
３つの異なるpHで試験した：pH 7.5、6.5および5.5の約10 mMのHepes/Mes。154 mM NaClを添加あるいは無添加。
【０２１７】
結果
MaSpCTは、約3時間の穏傾斜の後、短繊維（≦5 mm）を形成する。pHおよび塩条件は繊維形成速度と繊維のサイズのどちらにも影響しない。
【０２１８】
NT4repはpHや塩の状態に関係なく繊維を形成しない。
4repCTはすべてのpHで繊維（長さ約2 cm）を形成するが、繊維形成はpH 5.5では遅くなる。繊維形成はpH 6.5および7.5で同じくらいに速いが、繊維はpH値が下がると小さくなる。
【０２１９】
NT4repと4repCT（それぞれ0.5 mg / ml）の混合物からは（3 cm以下）の長繊維が形成され、pH 6.5または7.5よりもpH 5.5の方が形成速度は速いが、4repCT単独よりもはるかに遅い。
【０２２０】
実施例１２：2RepCTの製造と紡糸
2RepCTは100 mg/ml超に濃縮することができ、紡糸装置からタンパク質を送り出すことで繊維に紡糸される。
【０２２１】
実施例１のNT2RepCTについて記載のとおりにPGB1-2RepCTを発現・精製する。His - PGB1-タグを4℃で一晩トロンビンで切断し、続いて逆IMACで除去し、その後2RepCTを170 mg/mlに濃縮する（NT2RepCTで説明したように行う）。
【０２２２】
外径1.0 mmおよび内径0.6 mmの円形ガラス毛細管（G1、Narishige）を先端直径25 μmまで引き延ばす(Micro Electrode Puller、Stoelting co.51217)。ルアーロック(Luer Lok)先端(BD)を有する1 ml注射器を2RepCT (170 mg/ml)で満たし、0.40 mmの外径を持つ27G鋼針(Braun)に接続する。針はポリエチレン管を介して延伸ガラス毛細管に接続される。neMESYS低圧(290N)注射器ポンプ(Cetoni)を用いて、50 mlのファルコンチューブ内に500 mM NaAc、200 mM NaCl、pH 5.0または50％メタノールおよび50％NaAC (500mM）、NaCl (200 mM) pH5のいずれかを含む回収浴に20 μl/minの流速でPGB1-KL4を出射する。
【０２２３】
2RepCTを毛細管先端からメタノール／低pH回収浴中に押し出すと連続繊維が即座に形成され、回収浴から引き上げると同時にファルコンチューブの底部に集まる。
【０２２４】
結論として、2RepCTを天然条件で高収率・高純度で製造することができ、7から5へのpH低下に応答し、pH 7〜8の水性緩衝液への溶解性が高い。
【０２２５】
実施例１３： NT 2 + 2RepCTミニ スピドロインの発現と紡糸
NcoIHisNt2x2RepCtHindIIIのDNA配列は配列番号17に従った。発現されたタンパク質のアミノ酸配列は配列番号18に従った。
【０２２６】
発現
発現を大腸菌BL21細胞中で行った。LB培地（70 μg/mLカナマイシンを含む）中で37℃で一晩置いた細胞培養物5 mLを、500 mLのLB培地（70 μg/mLカナマイシンを含む）に移し、OD600が0.8から1.0になるまで30℃で振盪フラスコ中で培養した。次いで温度を20℃に下げ、150 μlの1M IPTG（最終濃度0.3 mM）を加えて発現を誘導した。一晩培養後、5,000 rpm、4℃で15分間遠心分離して細胞を回収した。500 mlの培養液からの細胞を30 mlの20 mM pH 8トリス緩衝液に再懸濁し、-20℃で一晩保存した。
【０２２７】
溶解と精製
細胞を解凍し、30 mlの細胞を２本の試験管に分け、各試験管をトリス緩衝液（pH 8.0）で30 mlまで満たした。次に、600 μlのリゾチームを各チューブに加え、次いでこれを氷上で1.5時間インキュベートし、その後、15 μlのDNAseと60 μlの1M MgCl2を加えて、試料を氷上で１時間インキュベートした。次いで溶解物を4℃、27,000gで30分間遠心分離した。最初の上清（上清１）をNi-NTAカラムに充填した。次いでペレットを30 mlのトリス緩衝液（pH 8.0）に再懸濁し、-20℃で一晩貯蔵した。翌日、ペレットを解凍し、27,000g、4℃で30分間遠心分離し、次に第二の上清を回収してNi-NTAカラムに充填した。
【０２２８】
上清を重力流Ni-NTAカラムに充填した。カラムを（１）20 mMトリスpH 8.0、（２）100 mM NaClを含む20 mMトリスpH 8.0緩衝液、および（３）10 mMイミダゾールを含む20 mMトリスpH 8.0緩衝液で洗浄した。タンパク質を、300 mMイミダゾールを含む20 mMトリスpH 8.0緩衝液で溶出した。目的タンパク質を含む溶出液を、20 mMトリス、pH 8.0に対して6-8 kDaの分子量カットオフを有するSpectra/Por（登録商標）透析膜を用いて冷室で一晩透析してイミダゾールを除去した。
【０２２９】
収量は次の通り： 
1)上清１から41 mgのタンパク質、
2)上清２から46 mgのタンパク質。
【０２３０】
従って収量は1LのLB培地振盪フラスコ培養からは87 mgである。精製工程のSDS-PAGE分析を図１３に示す。
【０２３１】
濃度と溶解度
NT2×2RepCTタンパク質は、20 mMトリス中、pH 8.0で300 mg/ml超に濃縮することができた。
【０２３２】
紡糸
繊維はNT2RepCTに関する記載の通り紡糸に成功した。NT2RepCTとNT2 + 2RepCTとの間でマクロ構造または繊維形成能力に明らかな違いはなかった。
【０２３３】
実施例１４：細胞培養マトリックスとしてのクモ絹糸
ヒト胎児心臓間葉系間質細胞(hfMSC)は、6〜9週目のヒト胎児心臓に由来した(Mansson-Broberg et al., Wnt/b-Catenin Stimulation and Laminins Support Cardiovascular Cell Progenitor Expansion from Human Fetal Cardiac Mesenchymal Stromal Cells（Wnt/β-カテニン刺激およびラミニンはヒト胎児心臓間葉系間質細胞からの心血管細胞前駆体の増殖を支持する）, Stem Cell Reports, 2016)。
【０２３４】
細胞を、2％ウシ胎児血清、2% B27、グルタミンおよびMycozap（マイコプラズマ除去試薬）を供給したダルベッコ改変イーグル培地 F12（DMEM / F12、Sigma）からなる培地中のクモ絹糸マトリックスに播種した。培地は週に２〜３回交換した。
【０２３５】
培養10日後、細胞を含むクモ絹糸マトリックスを急速冷凍し、5 μmの切片を調製した。これらを4%ホルムアルデヒドを含むPBS液中で固定し、免疫組織化学のために5%ウサギ血清を含むPBS中でブロックした。ラミニンα４およびKi67染色については、抗原回収のためにスライドをクエン酸緩衝液pH 7（Invitrogen）中で煮沸した。一次抗体はすべてマウス抗ヒト抗体であり、以下に従ってブロック緩衝液に加えた：α平滑筋アクチン(αSMA、A2547、Sigma) 1/250、CD31 (M0823、Dako) 1/300、トロポニンＴ(ab8295、Abcam) 1/800、ヘパラン硫酸(370255-1、Amsbio) 1/500、ラミニンα４(CL3183、Atlas antibodies) 1/200、Ki67 (MIB1、Dako) 1/75。スライドを湿室中、室温で一晩インキュベートし、PBSで洗浄し、二次抗体、ウサギ抗マウス(Alexa fluor 488)をブロックバッファー1/700に加えた。スライドを湿度室内で室温で90分間インキュベート、洗浄し、Dapi蛍光色素で標本化した。
【０２３６】
細胞はクモの絹糸に容易に付着して増殖することができ、多くの細胞がKi67を発現することがわかった。細胞はαSMA、ラミニンα４およびヘパラン硫酸を発現し、このことは細胞外マトリックスと基底膜の形成を示している。インビボでは、このことが細胞の移植後の生残を助けることができると思われる、というのは、それらは固定部位およびよく知られた細胞外マトリックスとなるからである。アノイキス、すなわち足場の喪失によるアポトーシスは、それによって最小になり、移植後の細胞生存率が増加すると思われる。
【０２３７】
実施例１５：ミニスピドロインの溶解度に及ぼすＣ末端ドメインの荷電残基数(K/R/E/D)の影響
本発明者らは、NT2RepCT（配列番号１１、実施例１参照）と同一のミニスピドロインを発現させた。ただしCTは以下のものと交換した：
【０２３８】
−MiSp Ds CT（配列番号７３）：小瓶状(minor ampullate)絹タンパク質Deinopis spinosa。ジェンバンク登録番号ABD61589、NT2RepCT (MiSp Ds)、配列番号７４が得られた。このＣＴは１１個の荷電残基を含む。
【０２３９】
−MaSp1 Ea CT（配列番号２７）：大瓶状(major ampullate)スピドロイン1 Euprosthenops australis。ジェンバンク登録番号CAJ00428.1、配列番号７５のNT2RepCT (MaSp1 Ea)が得られた。ＣＴ中に４つの荷電残基を含む。
【０２４０】
−ADF-4（配列番号５６）：Araneus diadematusフィブロイン−４。ジェンバンク登録番号ADU47856。CT中に５個の荷電残基を含むNT2RepCT (ADF-4)（配列番号７６）が得られた。
【０２４１】
−MiSp Lh CT（配列番号４５）：小瓶状スピドロインLatrodectus hesperus。ジェンバンク登録番号ADM14322.1。CT中に５個の荷電残基を含む、配列番号７７のNT2RepCT (MiSp Lh)が得られた。
【０２４２】
本発明者らはまた、NT2RepCT（配列番号１１）のCT中の２つの荷電アミノ酸残基（アラニンに対してそれぞれR38およびD105）を個々に変異させて、NT2RepCTR38AおよびNT2RepCTD105A（それぞれ配列番号７８および７９）を得た。この置換により、ＣＴドメイン中の荷電残基の数が７から６に減少する。
【０２４３】
これら６つの新規なタンパク質は、NT2RepCTに関する記載のようにして発現された。タンパク質が可溶性画分中に十分な収率で見出された場合、タンパク質をIMACクロマトグラフィーにより精製・濃縮し、続いてNT2RepCTに関する記載のように繊維に紡糸した。
【０２４４】
結果：NT2RepCT (MiSp Ds)を発現させることができ、可溶性画分中に見出され、精製し、300 mg/ml超に濃縮することができ、NT2RepCTと同じ方法で紡糸させることができた。SDS PAGE分析によれば、NT2RepCT (MaSp1 Ea)、NT2RepCT (ADF-4)およびNT2RepCT (MiSp Lh)はすべて不溶性画分中に見出された（図２０〜２２）。
【０２４５】
NT2RepCTR38Aは高収率で発現されたが、主に不溶性画分中に見られた。NT2RepCTD105Aは発現が乏しく、タンパク質濃度および繊維紡糸に十分な量を得ることができなかった。
【０２４６】
結論：これらの結果は、ＣＴ中の少なくとも７個の荷電残基が、精製、濃縮および水性溶媒中での紡糸に対して十分に可溶性のNT2RepCT種のミニスピドロインを得るのに必要であるという結論を支持している。
【０２４７】
材料および方法
タンパク質の発現と精製
構築物NT2RepCT（配列番号１１）は、6×Hisタグ(MGHHHHHHM)および次のドメインからなる、配列番号１２のタンパク質をコードする：
【０２４８】
E. australisのMaSp1配列に基づくＮ末端ドメイン：(SHTTPWTNPGLAENFMNSFMQGLSSMPGFTASQLDDMSTIAQSMVQSIQSLAAQGRTSPNKLQALNMAFASSMAEIAASEEGGGSLSTKTSSIASAMSNAFLQTTGVVNQPFINEITQLVSMFAQAGMNDVSA)
【０２４９】
E. australisのMaSp1由来の２つのポリアラニン／グリシンに富む反復領域からなる反復部分：(GNSGRGQGGYGQGSGGNAAAAAAAAAAAAAAAGQGGQGGYGRQSQGAGSAAAAAAAAAAAAAAGSGQGGYGGQGQGGYGQSGNS)
【０２５０】
２５個のアミノ酸のリンカーの前のA. ventricosus MiSp配列に基づくＣ末端ドメイン： (VTSGGYGYGTSAAAGAGVAAGSYAGAVNRLSSAEAASRVSSNIAAIASGGASALPSVISNIYSGVVASGVSSNEALIQALLELLSALVHVLSSASIGNVSSVGVDSTLNVVQDSVGQYVG)
【０２５１】
構築物をpT7プラスミドにクローニングし、BL21 (DE3)大腸菌に形質転換した。カナマイシン(70mg/l)を含むルリアブロス培地にNT2RepCTを含有する大腸菌のグリセリン保存液を接種し、振盪(200 rpm)しながら37℃で一晩増殖させた。一晩培養物をカナマイシンを含む500 mlのLB培地の1/100接種に使用し、次いでそれをOD600が0.8に達するまで振盪(200 rpm)しながら30℃で培養し、その後温度を20℃に下げ、イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を0.3 mMの最終濃度まで加えてタンパク質発現を誘導した。細胞を振盪(200 rpm)しながら20℃で一晩培養し、次いで4℃、5000 rpmで20分間遠心分離して回収した。ペレットを20 mMトリスpH 8に再懸濁し-20℃で凍結するか、または再懸濁直後に溶解した。
【０２５２】
溶解は、細胞破砕機（T-S 系列の機械、Constant Systems Limited、イギリス）中で、30 kPsiで行い、その後、溶解物を27000 g、4℃で30分間遠心分離した。上清をNi-NTAカラムに充填し、タンパク質を300 mMイミダゾールで溶出した。溶出したタンパク質を、6〜8 kDaの分子量カットオフを有するSpectra / Por透析膜を用いて、4℃で一晩、20 mMトリスpH 8に対して透析した。SDS-ポリアクリルアミド（12%）ゲル電気泳動およびクマシーブリリアントブルー染色によりタンパク質の純度を決定した。広域タンパク質ラダー（ThermoFisher Scientific）をサイズ標準として使用した。
【０２５３】
タンパク質を、遠心分離濾過装置（Vivaspin 20、GE healthcare）を用いて、4000 gで10 kDaの分子量カットオフで20分間回転して濃縮した。タンパク質濃度を決定するために、1 μlのタンパク質を20 mMトリス中で400倍に希釈し、280 nmでの吸光度を記録した。
【０２５４】
サイズ排除クロマトグラフィー
Superdex 200 HRカラム（Amersham Biosciences）を用いて、TBS泳動用バッファー（20 mMトリス、150 mM NaClおよび1 mM EDTA、pH 8.0）中で精製タンパク質試料200 μlを泳動した。使用した流速は0.5 ml/分であった。分子量標準リボヌクレアーゼＡ(13.7 kDa)、炭酸脱水酵素 (29 kDa)、オボアルブミン(43 kDa)、コナルブミン(75 kDa)、アルドラーゼ (158 kDa)およびフェリチン(440 kDa)を較正に使用した。
【０２５５】
質量分析
質量分析のために、NT2RepCTをバイオスピン緩衝液交換カラム（Bio-Rad Laboratories）を用いて100 mM酢酸アンモニウム、pH 7.5に再構成した。微量遠心分離管内でギ酸を最終濃度0.02%まで加えて絹の集合を誘導し、pHは5.5であった。スピドロインの時間依存性集合の基準として、ギ酸を加える前に、ウシユビキチン（Sigma）を最終濃度0.2 mg/mLでNT2 RepCT試料に加えた。次に、試料をすぐに自社製の金被覆ホウケイ酸毛細管に装填し、スペクトルを1走査／秒で10分間連続的に取得した。原線維溶解のために、pH 5.5でNT2RepCTを30分間インキュベートした後、濃ギ酸またはアセトニトリルのいずれかを50%の最終濃度まで添加した。飛行時間モードで操作され、高質量分析用の32k四重極を備えたSynapt G1 T波質量イオン移動度分光計(Waters)でスペクトルを取得した。設定は以下の通り：毛細管電圧1.4 kV、試料コーン20 V、試料源温度20℃、トラップ衝突エネルギー100 V、移動衝突エネルギー10 V、トラップＤＣバイアス8V。背圧を約7ミリバールに維持した。MassLynx 4.1ソフトウェアパッケージ（Waters）を用いてデータを分析した。各時点について、60回のスキャンを組み合わせ、スペクトル強度をユビキチン信号に対して正規化した。相対強度をミリ質量(mMass)を用いて抽出し、GrapHPad 5.0を用いてプロットした。
【０２５６】
繊維の紡糸
外径1.0 mmおよび内径0.6 mmの円形ガラス毛細管(G1、Narishige)を先端直径10〜30 μmに延伸した(Micro Electrode Puller、Stoelting co.51217)。ルアーロック先端(BD)を有する1 ml注射器を高濃度(100〜500 mg/ml)のNT2 RepCTで満たし、0.40 mmの外径を持つ27G鋼針(Braun)に接続した。針をポリエチレン管を介して延伸ガラス毛細管に接続した。neMESYS低圧（290N）注射器ポンプ（Cetoni）を用いて、500 mM酢酸ナトリウム緩衝液および200 mM NaCl（pH 5）からなる低pH回収浴中に1〜20 μl/分の流速でNT2RepCTを出射した。形成後、繊維を回収浴から引き出してプラスチックの上に置いて乾燥させるか、または枠に巻き取った。繊維を低pH浴（200mM NaClを含む500 mM NaAc、pH 5）中で２本のピンセットの間に数秒間保持して後延伸し、次いで元の長さの２倍に延伸し、プラスチック上で乾燥した。
【０２５７】
紡糸に及ぼすpHの影響を試験するために、いくつかの緩衝系を使用しそれらの緩衝系のモル濃度を変えた。すなわちpH > 5.5ではリン酸ナトリウム（100 mM）、pH 5.5〜4では酢酸ナトリウム（100〜500 mM）、pH < 4ではクエン酸（100〜300mＭ）を使用。
【０２５８】
フーリエ変換赤外（FTIR）分光法
FTIR分析は、室温でiD5 ATRを備えたThermo Scientific Nicolet iS5を用いて液体試料および固体試料に対して実施した。溶液中のタンパク質については、各スペクトルについて２５４回の走査を積算したが、繊維については１６回の走査を行なった。各種類の試料について３つのスペクトルを得て、曲線の平均を取った。
【０２５９】
繊維の引張強度測定
テープおよび接着剤（Loctite（登録商標）Super Glue Professional）を用いて、繊維試料を20 mmゲージ長のプラスチック枠に取り付けた。繊維は、40倍対物レンズを用いて光学顕微鏡(Leica DMI3000 B)で可視可した。繊維の長さに沿って３つの顕微鏡写真を撮影し、Carl Zeiss Zen 2012を用いて顕微鏡写真から直径を測定して、個々の繊維片の平均直径を得た。プラスチック枠の側面を切り取り、試験片をInstron 4411引張試験機に取り付けた。力をPrecisa XT 220天秤（分解能±1μN）で測定した。ピンと張ってはいるが荷重のかかっていない繊維の長さを測定した。引張試験は、公称環境条件24℃および30%相対湿度で1 mm/分の引っ張り速度で行った。全ての引張特性は、KaleidaGraphを用いて計算した。真応力および真歪みの計算のために、試験中は繊維容積を一定と仮定した。以下の式を用いた：
σT = σE (1 + εE) (1)
εT = ln (1 + εE) (2)
ここで、
σT = 真応力
σE = 工学的応力
εT = 真ひずみ
εE = 工学的ひずみ
【０２６０】
繊維の走査型電子顕微鏡
乾燥繊維（500 mM NaAc 200 mM NaCl pH 5.0中で紡糸後の状態または後延伸した状態）を走査型電子顕微鏡スタブに置き、金／パラジウムで２分間被覆した後、Zeiss Supra 35VP走査型電子顕微鏡で観察・写真撮影した。
【０２６１】
TEMと低温EMによるミセル構造の研究
NT2RepCT（5 mg/ml）を20 mMトリス緩衝液、pH 8.0に0.001 mg/mlに希釈した。試料を１滴の2%リンタングステン酸、pH 7.8中で30秒間インキュベートし、過剰の溶液を吸い取ってそれを乾燥させて、ネガティブ染色グリッドを調製した。低温電子顕微鏡法のために、試料の3 μl分割量(aliquot)をグロー放電400メッシュQuantifoilホーリー炭素網に付着させた。低温試料は、自動化Vitrobot（FEI、オランダ、アイントホーフェン）を用いて、16℃、湿度100%の制御環境で調製した。データは、200 kVおよび公称倍率80000倍で操作したJEOL JEM - 2100f顕微鏡を用いて得た。画像はTVIPS TemCam-F415 4k x 4k CCDカメラ（Tietz Video and Image Processing Systems GmbH、Gauting、ドイツ）を用いて収集した。ミセルのサイズは、画像処理プログラムImageJを用いて推定した。
PGB1-2RepCT
【０２６２】
PGB1-2RepCTのDNA配列は配列番号１３に従うが、PGB1-2RepCTのタンパク質配列は配列番号１４に従った。
【図１】
2020536843.tif 000011
【図２】
2020536843.tif 000012
【図３】
2020536843.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2020536843.tif 000023
【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020536843.tif 000027
【図１６】
2020536843.tif 000028
【図１７】
2020536843.tif 000029
【図１８】
2020536843.tif 000030
【図１９】
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【図２０】
2020536843.tif 000032
【図２１】
2020536843.tif 000033
【図２２】
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【配列表】
2020536843000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月24日(2020.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質濃度少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの組換クモ糸タンパク質の溶液であって、前記組換クモ糸タンパク質が、８００個以内のアミノ酸からなると共に、式（ＮＴ）−ＲＥＰ−ＣＴに従って配置される複数のドメインの組を含み、ここで
ａ．前記任意のＮＴドメインが、存在する場合には、クモ糸タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１００〜１６０個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｂ．前記ＲＥＰドメインが、クモ糸タンパク質の反復セグメントに由来する３０〜６００個のアミノ酸残基の配列からなり、
ｃ．前記ＣＴドメインが、
i．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも８１％の同一性を有する配列、及び
ii．配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列
から選択される、クモ糸タンパク質のＣ末端ドメインに由来する７０〜１２０個のアミノ酸残基の配列からなる、組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項２】
前記溶液のｐＨが６．４以上である、請求項１に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項３】
前記溶液の塩濃度が１００ｍＭ未満である、請求項１又は２に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項４】
前記ＮＴドメインが存在すると共に、大瓶状腺（major ampullate gland）クモ糸タンパク質（ＭａＳＰ）のＮ末端ドメインに由来する配列からなる、請求項１〜３の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項５】
前記ＮＴドメインが存在すると共に、配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性、及び／又は、配列番号１若しくは表２に示す何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる、請求項１〜４の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項６】
前記ＲＥＰドメインが、アラニン豊富な複数のＡセグメントと、グリシン豊富な複数のＧセグメントとを含み、ここで各Ａセグメントは、８〜２０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であると共に、前記アミノ酸残基の少なくとも６０％はＡｌａであり、ここで各Ｇセグメントは、１２〜４０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であると共に、前記アミノ酸残基の少なくとも３０％はＧｌｙである、請求項１〜５の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項７】
前記ＲＥＰドメインが、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、ＬＧ（ＡＧ）ｎＬからなる群より選択され、ここでｎは２〜１０の整数であり、
各Ａセグメントは、８〜１８個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基のうち０〜３個はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり、
各Ｇセグメントは、１２〜３０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで前記アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり、
各Ｌセグメントは、０〜３０個のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である、請求項１〜６の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項８】
前記ＣＴドメインが、
(I) 配列番号６４、又は、配列番号６２〜６５若しくは６７〜７３の何れかに対して、８５％の配列同一性を有する配列、
(II) 配列番号６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、又は、
(III) 配列番号６４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列であって、Ｋ、Ｒ、Ｅ及びＤから独立に選択される少なくとも７個の残基を含む配列
からなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項９】
配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜８の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質の溶液。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に記載の組換クモ糸タンパク質のポリマー。
【請求項１１】
前記ポリマーが、長さ少なくとも１０ｍ且つ直径≦１００μｍの繊維である、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
靱性が４０ＭＪ／ｍ３以上である、請求項１０又は１１に記載のポリマー。
【請求項１３】
クモ糸タンパク質のポリマーを製造する方法であって、
ａ．請求項１〜９の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質を少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む第１の液体培地を供給する工程、
ｂ．前記クモ糸タンパク質の重合を許容するように前記第１の液体培地の特性を調節する工程、
ｃ．前記クモ糸タンパク質にポリマーを形成させる工程、及び、
ｄ．前記クモ糸タンパク質ポリマーを単離する工程
を含み、
ここで、工程（ｂ）〜（ｄ）において、前記第１の液体培地の特性が、ｐＨ６．３以下であり、前記クモ糸タンパク質が重合するのに十分な塩濃度の存在下となるように調節されると共に、
前記塩濃度が少なくとも１００ｍＭである、方法。
【請求項１４】
請求項１〜９の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質、又は、請求項１０〜１２の何れか一項に記載のポリマーの、埋込可能な材料又は細胞培養スキャフォールドの製造におけるインビトロでの使用。
【請求項１５】
請求項１〜９の何れか一項に記載のクモ糸タンパク質、又は、請求項１０〜１２の何れか一項に記載のポリマーの、細胞培養スキャフォールドとしてのインビトロでの使用。
【国際調査報告】
2020536843.tif 000035
2020536843.tif 000036