(57)【要約】本発明は、限定されないが、好気性細菌細胞および嫌気性細菌細胞を含む微生物細胞、ならびに酵母細胞、ならびにこれら細胞を生成するための方法、細胞を含む飼料添加物および組成物、ならびに動物に細胞を投与することを含む使用に関する。上記微生物細胞は、好ましくは、少なくとも２種の炭素源を含む培養培地で嫌気性条件下で培養されて収穫され得る。収穫後、上記微生物細胞は、必要に応じて濃縮、凍結／フリーズドライされ得る。
2020508696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプンおよびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件下で調製するステップと、
（ｂ）嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、
を含み、
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される、
方法。
【請求項２】
前記少なくとも２種の炭素源が、約５０〜９０％の第１の炭素源、および約１０〜５０％の第２の炭素源からなり、前記第２の炭素源が、前記第１の炭素源とは異なり、前記少なくとも２種の炭素源の１００％が、前記第１の炭素源および前記第２の炭素源からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、
（ｂ）前記培養物がその対数増殖期を終えた後の１２時間以内、かつ前記培養物がその定常増殖期を開始する前に、嫌気性条件下で前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと
を含み、
フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される、方法。
【請求項４】
前記収穫するステップが、遠心分離、濾過、透析、逆浸透およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの技法を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記濾過がタンジェンシャルフロー濾過を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培養物が液体を含み、前記収穫するステップが、前記液体の約６０％〜約１００％を除去することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結するステップが、約−８０℃〜約−２１０℃の温度におけるものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、
（ｂ）前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）収穫の５時間以内に、約−８０℃〜約−２１０℃の温度で前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと
を含み、
フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される、方法。
【請求項９】
前記凍結するステップが、前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む容器を液体窒素と接触させることを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結するステップが、前記細胞を液体窒素と接触させることを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結するステップが、約−１９６℃の温度におけるものであり、前記細胞を含む凍結ペレットを生成し、前記凍結ペレットの直径が、約０．００１〜約０．５インチである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
収穫前の前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養物のｐＨが、約４．５〜約７．０の間である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇの前記フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が、少なくとも２週間、約２５℃の温度での保管後、生存可能である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇの前記フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が、少なくとも１か月間、約４℃での保管後、生存可能である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養物が、少なくとも１つの凍結保護物質をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの凍結保護物質が、フルクトース、グルコース、スクロース、粉ミルク、乳児用調製粉乳、脱脂粉乳、トレハロース、マルトデキストリン、ベタインおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの凍結保護物質が、前記培養物の約１％〜約２０％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉが、商業規模で生成される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養物の体積が、少なくとも約５０リットルである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
約１×１０３〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が、フリーズドライ後、生存可能である、請求項３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養物中の前記細胞が、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞からなる、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む固形飼料添加物。
【請求項２３】
別の微生物をさらに含む、請求項２２に記載の固形飼料添加物。
【請求項２４】
粉末、顆粒、微粒子、ペレット、ケーキまたはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の固形飼料添加物。
【請求項２５】
プロバイオティックである、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の固形飼料添加物。
【請求項２６】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、または請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物を含む組成物。
【請求項２７】
カプセル剤である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物を含むキット。
【請求項２９】
動物にＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与する方法であって、前記動物に、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
動物の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、前記動物に、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３１】
前記状態または障害が、アシドーシスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記状態または障害が、第一胃アシドーシスである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記状態または障害が、呼吸器疾患である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記状態または障害が、蹄葉炎である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記状態または障害が、感染症である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記感染症が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記動物に、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３８】
前記日和見微生物が、病原性である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記日和見微生物が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
動物の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、前記動物に、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
動物における成長成績を改善する方法であって、前記動物に、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の固形飼料添加物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物の有効量を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項４２】
前記フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、前記固形飼料添加物または前記組成物が、動物に食物を与える前、それと同時に、またはその後に投与される、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
投与前に、前記フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞または前記固形飼料添加物を液体と混合するステップをさらに含む、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記液体が、経口的に、または前記動物に前記液体を噴霧することによって投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物の単回投与を含む、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物の毎日の投与を含む、請求項２９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
１日に、前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物の１回より多い投与を含む、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記動物が、反芻動物である、請求項２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、バッファローおよびトナカイからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が、非反芻動物である、請求項２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記非反芻動物が、ウマ科、家禽およびブタからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記動物が、家禽動物である、請求項２９から３３、３５から４７、５０または５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記家禽動物が、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウまたはハトからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記家禽動物が、ブロイラー、ブロイラー種ニワトリおよび産卵用ニワトリからなる群から選択される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記家禽動物が、ニワトリである、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記動物が、ウマ科である、請求項２９から４７、５０または５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ウマ科が、ウマ、ポニー、ロバまたはラバである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
家禽動物の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、前記家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項５９】
前記状態または障害が、アシドーシスである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記状態または障害が、呼吸器疾患である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記状態または障害が、感染症である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記感染症が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
家禽動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項６４】
前記日和見微生物が、病原性である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記日和見微生物が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
家禽動物の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、前記家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項６７】
家禽動物の成長成績を改善する方法であって、前記家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項６８】
前記家禽動物が、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウまたはハトからなる群から選択される、請求項５８から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記家禽動物が、ブロイラー、ブロイラー種ニワトリおよび産卵用ニワトリからなる群から選択される、請求項５８から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記家禽動物が、ニワトリである、請求項５８から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ウマ科の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、前記ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項７２】
前記状態または障害が、アシドーシスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記状態または障害が、呼吸器疾患である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記状態または障害が、蹄葉炎である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記状態または障害が、感染症である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記感染症が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ウマ科の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項７８】
前記日和見微生物が、病原性である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記日和見微生物が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
ウマ科の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、前記ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項８１】
ウマ科の成長成績を改善する方法であって、前記ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産量、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項８２】
前記ウマ科が、ウマ、ポニー、ロバまたはラバである、請求項７１から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
飼料添加物が、前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む、請求項５８から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記飼料添加物が、粉末、顆粒、微粒子、ペレット、ケーキ、液体、ゲルまたはそれらの組合せである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
組成物が、前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞または前記細胞を含む飼料添加物を含む、請求項５８から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記組成物が、カプセル剤である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が、フリーズドライ細胞である、請求項５８から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が、液体で投与される、請求項５８から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
飼料添加物またはフリーズドライ細胞を再水和して、前記液体を生成するステップをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記液体が、経口強制飼養によって、または前記動物に前記液体を噴霧することによって投与される、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が、前記動物に食物を与える前、それと同時に、またはその後に投与される、請求項５８から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の単回投与を含む、請求項５８から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の毎日の投与を含む、請求項５８から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
１日に、前記Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の１回より多い投与を含む、請求項５８から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
カプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件下で調製するステップと、
（ｂ）嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、
（ｅ）前記細胞をカプセル封入するステップと
を含み、
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞が生成される、
方法。
【請求項９６】
動物にＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与する方法であって、前記動物に、請求項９５に記載の方法によって生成される前記カプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項９７】
動物の成長成績を改善する方法であって、前記動物に、有効量の請求項９５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項９８】
動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記動物に有効量の請求項９５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項９９】
請求項９５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を含む組成物。
【請求項１００】
フリーズドライ嫌気性細菌細胞を生成する方法であって、
（ａ）嫌気性細菌細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件または部分嫌気性条件下で調製するステップと、
（ｂ）嫌気性条件または部分嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと
を含み、
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライ嫌気性細菌細胞が生成される、
方法。
【請求項１０１】
動物に嫌気性細菌細胞を投与する方法であって、前記動物に、請求項１００に記載の方法によって生成される前記フリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１０２】
動物の成長成績を改善する方法であって、前記動物に、有効量の請求項１００に記載の方法によって生成されるフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項１０３】
動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記動物に有効量の請求項１００に記載の方法によって生成されるフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１０４】
請求項１００に記載の方法によって生成されるフリーズドライ嫌気性細菌細胞を含む組成物。
【請求項１０５】
カプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を生成する方法であって、
（ａ）嫌気性細菌細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件または部分嫌気性条件下で調製するステップと、
（ｂ）嫌気性条件または部分嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、
（ｅ）前記細胞をカプセル封入するステップと
を含み、
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞が生成される、
方法。
【請求項１０６】
動物に嫌気性細菌細胞を投与する方法であって、前記動物に、請求項１０５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１０７】
動物の成長成績を改善する方法であって、前記動物に、有効量の請求項１０５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項１０８】
動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記動物に有効量の請求項１０５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１０９】
請求項１０５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を含む組成物。
【請求項１１０】
フリーズドライ好気性細菌および／または酵母細胞を生成する方法であって、
（ａ）好気性細菌細胞および／または酵母細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、好気性条件下で調製するステップと、
（ｂ）前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと
を含み、
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライ好気性細菌および／または酵母細胞が生成される、
方法。
【請求項１１１】
動物に好気性細菌および／または酵母細胞を投与する方法であって、前記動物に、請求項１１０に記載の方法によって生成されるフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１１２】
動物の成長成績を改善する方法であって、前記動物に、有効量の請求項１１０に記載の方法によって生成されるフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項１１３】
動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記動物に有効量の請求項１１０に記載の方法によって生成されるフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１１４】
請求項１１０に記載の方法によって生成されるフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を含む組成物。
【請求項１１５】
カプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を生成する方法であって、
（ａ）好気性細菌細胞および／または酵母細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、好気性条件下で調製するステップと、
（ｂ）好気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、
（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、
（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、
（ｅ）前記細胞をカプセル封入するステップと
を含み、
約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞が生成される、
方法。
【請求項１１６】
動物に好気性細菌および／または酵母細胞を投与する方法であって、前記動物に、請求項１１５に記載のカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１１７】
動物の成長成績を改善する方法であって、前記動物に、有効量の請求項１１５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含み、前記動物の前記成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法。
【請求項１１８】
動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、前記動物に有効量の請求項１１５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１１９】
請求項１１５に記載の方法によって生成されるカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の背景
発明の分野
本発明は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成するための方法、細胞を含む飼料添加物および組成物、ならびに例えば、成長成績の改善および／または健康のためを含めた、細胞を動物に投与することを含む使用に関する。本発明はまた、限定されないが、好気性細菌、嫌気性細菌および酵母細胞を含めた微生物細胞、微生物細胞を生成するための方法、微生物細胞を含む飼料添加物および組成物、ならびに例えば、成長成績の改善および／または健康のためを含めた、微生物細胞を動物に投与することを含む使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ（すなわち、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）は、好ましい炭素源としてラクテートを利用し、アシドーシスを予防する一助となり得る非運動性のグラム陰性双球菌であり、このアシドーシスは、毎年、数百万の肉牛および乳牛が罹患している一般的な消化器障害である。
【０００３】
ウシおよび他の反芻動物は、多量のデンプン系食物（例えば、穀物）または単糖を摂取すると、胃内の日和見微生物が、これらの化合物を速やかに乳酸へと発酵させることがある。乳酸は、強力な有機酸であり、乳酸アシドーシスをもたらす恐れがあり、この乳酸アシドーシスは、反芻動物において、正常な消化活性を撹乱して、消化管の内層に広範囲に及ぶ損傷を引き起こす恐れがある。罹患動物は、成績が不十分である。さらに、乳酸アシドーシスの最も急性な形態は、動物の消化系および呼吸系への非可逆的な損傷、ならびに死亡率の増加を引き起こす恐れがある。
【０００４】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉは、乳酸を、無害な有機化合物である揮発性脂肪酸（ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ：ＶＦＡ；例えばブチレート、プロピオネートおよびアセテート）に変換する細菌の能力によって乳酸アシドーシスを制御する一助となり得る。しかし、反芻動物の胃腸管中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ集団は、多くの場合、アシドーシスのリスクを予防するにはレベルが低すぎる。したがって、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの株に由来する生細胞の液体培養物、すなわちＬａｃｔｉｐｒｏ（登録商標）が、反芻動物の胃腸管中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの定着速度を増加させるために開発された。例えば、米国特許第７，５５０，１３９号を参照されたい。しかし、生物が必要とする嫌気性条件下でＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物を維持することが困難であること、および生産施設から最終使用する場所に１４日以内（これを過ぎると、製品中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの生存率が大幅に低下する）にＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物を輸送することが困難であることを含めた、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する製品の使用を制限している実用上の制約が存在する。
米国特許第４，１３８，４９８号は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを凍結乾燥する可能性を、概して論じているが、既存の商業的制限を克服するための、商業的規模で使用され得るフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを生成するためのいかなる方法も提供していない。さらに、少なくとも１つのグループは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉなどの嫌気性菌を含めた、微生物をフリーズドライすることは、商業的に実用的ではないことを最近、報告した。例えば、ＷＯ２０１７／０１５０２２を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，５５０，１３９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，１３８，４９８号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１７／０１５０２２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、既存の制限を克服する、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞などのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞が、それらを生成する方法を含め、必要とされている。既存の制限を克服する、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの他の微生物細胞も、それらを生成する方法を含め、必要とされている。
【０００７】
開示の簡単な要旨
本開示は、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法であって、（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件下で調製するステップと、（ｂ）嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される、方法を対象とする。
【０００８】
ある特定の実施形態では、少なくとも２種の炭素源は、約５０〜９０％の第１の炭素源、および約１０〜５０％の第２の炭素源からなり、第２の炭素源は、第１の炭素源とは異なり、少なくとも２種の炭素源の１００％は、第１の炭素源および第２の炭素源からなる。
【０００９】
本開示は、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法であって、（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、（ｂ）培養物がその対数増殖期を終えた後の１２時間以内、かつ培養物がその定常増殖期を開始する前に、嫌気性条件下で細胞を収穫するステップと、（ｃ）細胞を凍結するステップと、（ｄ）細胞をフリーズドライするステップとを含み、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される、方法を対象とする。
【００１０】
ある特定の実施形態では、収穫するステップは、遠心分離、濾過、透析、逆浸透およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの技法を含む。ある特定の実施形態では、濾過は、タンジェンシャルフロー濾過を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、培養物は液体を含み、収穫するステップは、液体の約６０％〜約１００％を除去することを含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、凍結するステップは、約−８０℃〜約−２１０℃の温度におけるものである。
【００１３】
本開示は、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法であって、（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、（ｂ）細胞を収穫するステップと、（ｃ）収穫の５時間以内に、約−８０℃〜約−２１０℃の温度で細胞を凍結するステップと、（ｄ）細胞をフリーズドライするステップとを含み、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される、方法を対象とする。
【００１４】
ある特定の実施形態では、凍結するステップは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む容器を液体窒素と接触させることを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、凍結するステップは、細胞を液体窒素と接触させることを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、凍結するステップは、約−１９６℃の温度におけるものであり、細胞を含む凍結ペレットを生成し、凍結ペレットの直径は、約０．００１〜約０．５インチである。
【００１７】
ある特定の実施形態では、収穫前のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養物のｐＨは、約４．５〜約７．０の間である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、少なくとも２週間、約２５℃の温度での保管後、生存可能である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、少なくとも１か月間、約４℃での保管後、生存可能である。
【００２０】
ある特定の実施形態では、培養物は、少なくとも１つの凍結保護物質をさらに含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの凍結保護物質は、フルクトース、グルコース、スクロース、粉ミルク、乳児用調製粉乳、脱脂粉乳、トレハロース、マルトデキストリン、ベタインおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２２】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの凍結保護物質は、培養物の約１％〜約２０％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉは、商業規模で生成される。
【００２４】
ある特定の実施形態では、培養物の体積は、少なくとも約５０リットルである。
【００２５】
ある特定の実施形態では、約１×１０３〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、フリーズドライ後、生存可能である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、培養物中の細胞は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞からなる。
【００２７】
本開示は、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む固形飼料添加物を対象とする。
【００２８】
ある特定の実施形態では、固形飼料添加物は、別の微生物をさらに含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、固形飼料添加物は、粉末、顆粒、微粒子、ペレット、ケーキまたはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３０】
ある特定の実施形態では、固形飼料添加物は、プロバイオティックである。
【００３１】
本開示は、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、または上記の固形飼料添加物のいずれかを含む組成物を対象とする。
【００３２】
ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル剤である。
【００３３】
本開示は、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、上記の固形飼料添加物のいずれか、または上記の組成物のいずれかを含むキットを対象とする。
【００３４】
本開示は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を動物に投与する方法であって、動物に、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、上記の固形飼料添加物のいずれか、または上記の組成物のいずれかを投与するステップを含む方法を対象とする。
【００３５】
本開示は、動物の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、動物に、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、上記の固形飼料添加物のいずれか、または上記の組成物のいずれかの有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００３６】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、アシドーシスである。
【００３７】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、第一胃アシドーシスである。
【００３８】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、呼吸器疾患である。
【００３９】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、蹄葉炎である。
【００４０】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、感染症である。
【００４１】
ある特定の実施形態では、感染症は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである。
【００４２】
本開示は、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、動物に、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、上記の固形飼料添加物のいずれか、または上記の組成物のいずれかの有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００４３】
ある特定の実施形態では、日和見微生物は、病原性である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、日和見微生物は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである。
【００４５】
本開示は、動物の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、動物に、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、上記の固形飼料添加物のいずれか、または上記の組成物のいずれかの有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００４６】
本開示は、動物の成長成績を改善する方法であって、動物に、上記の方法のいずれかによって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、上記の固形飼料添加物のいずれか、または上記の組成物のいずれかの有効量を投与するステップを含み、動物の成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉（ｃａｒｃａｓｓ）の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法を対象とする。
【００４７】
ある特定の実施形態では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、固形飼料添加物または組成物は、動物に食物を与える前、それと同時に、またはその後に投与される。
【００４８】
ある特定の実施形態では、方法は、投与前に、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞または固形飼料添加物を液体と混合するステップをさらに含む。
【００４９】
ある特定の実施形態では、液体は、経口的に、または動物に液体を噴霧することによって投与される。
【００５０】
ある特定の実施形態では、投与するステップは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物の単回投与を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、投与するステップは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物の毎日の投与を含む。
【００５２】
ある特定の実施形態では、投与するステップは、１日に、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物の１回より多い投与を含む。
【００５３】
ある特定の実施形態では、動物は、反芻動物である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、反芻動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、バッファローおよびトナカイからなる群から選択される。
【００５５】
ある特定の実施形態では、動物は、非反芻動物である。
【００５６】
ある特定の実施形態では、非反芻動物は、ウマ科、家禽およびブタからなる群から選択される。
【００５７】
ある特定の実施形態では、動物は、家禽動物である。
【００５８】
ある特定の実施形態では、家禽動物は、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウまたはハトからなる群から選択される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、家禽動物は、ブロイラー、ブロイラー種ニワトリおよび産卵用ニワトリからなる群から選択される。
【００６０】
ある特定の実施形態では、家禽動物は、ニワトリである。
【００６１】
ある特定の実施形態では、動物は、ウマ科である。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ウマ科は、ウマ、ポニー、ロバまたはラバである。
【００６３】
本開示は、家禽動物の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００６４】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、アシドーシスである。
【００６５】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、呼吸器疾患である。
【００６６】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、感染症である。
【００６７】
ある特定の実施形態では、感染症は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである。
【００６８】
本開示は、家禽動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００６９】
ある特定の実施形態では、日和見微生物は、病原性である。
【００７０】
ある特定の実施形態では、日和見微生物は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである。
【００７１】
本開示は、家禽動物の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００７２】
本開示は、家禽動物の成長成績を改善する方法であって、家禽動物に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含み、動物の成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法を対象とする。
【００７３】
ある特定の実施形態では、家禽動物は、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウまたはハトからなる群から選択される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、家禽動物は、ブロイラー、ブロイラー種ニワトリおよび産卵用ニワトリからなる群から選択される。
【００７５】
ある特定の実施形態では、家禽動物は、ニワトリである。
【００７６】
本開示は、ウマ科の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００７７】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、アシドーシスである。
【００７８】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、呼吸器疾患である。
【００７９】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、蹄葉炎である。
【００８０】
ある特定の実施形態では、状態または障害は、感染症である。
【００８１】
ある特定の実施形態では、感染症は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである。
【００８２】
本開示は、ウマ科の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００８３】
ある特定の実施形態では、日和見微生物は、病原性である。
【００８４】
ある特定の実施形態では、日和見微生物は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである。
【００８５】
本開示は、ウマ科の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
【００８６】
本開示は、ウマ科の成長成績を改善する方法であって、ウマ科に有効量のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与するステップを含み、動物の成長成績の改善が、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産量、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である、方法を対象とする。
【００８７】
ある特定の実施形態では、ウマ科は、ウマ、ポニー、ロバまたはラバである。
【００８８】
ある特定の実施形態では、飼料添加物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、飼料添加物は、粉末、顆粒、微粒子、ペレット、ケーキ、液体、ゲルまたはそれらの組合せである。
【００９０】
ある特定の実施形態では、組成物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、または細胞を含む飼料添加物を含む。
【００９１】
ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル剤である。
【００９２】
ある特定の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、フリーズドライ細胞である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、液体で投与される。
【００９４】
ある特定の実施形態では、方法は、飼料添加物またはフリーズドライ細胞を再水和して液体を生成するステップをさらに含む。
【００９５】
ある特定の実施形態では、液体は、経口強制飼養によって、または動物に液体を噴霧することによって投与される。
【００９６】
ある特定の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、動物に食物を与える前、それと同時に、またはその後に投与される。
【００９７】
ある特定の実施形態では、投与するステップは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の単回投与を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態では、投与するステップは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の毎日の投与を含む。
【００９９】
ある特定の実施形態では、投与するステップは、１日に、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の１回より多い投与を含む。
【０１００】
本開示は、カプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を生成する方法であって、（ａ）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件下で調製するステップと、（ｂ）嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、（ｅ）前記細胞をカプセル封入するステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞が生成される、方法を対象とする。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、方法は、動物に、カプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与するステップを含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績を改善する方法は、動物に、有効量のカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与するステップを含む。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績の改善は、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法は、動物に有効量のカプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与するステップを含む。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル封入したフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を含む。
【０１０６】
本開示は、フリーズドライ嫌気性細菌細胞を生成する方法であって、（ａ）嫌気性細菌細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件または部分嫌気性条件下で調製するステップと、（ｂ）嫌気性条件または部分嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライ嫌気性細菌細胞が生成される、方法を対象とする。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、方法は、動物に、フリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績を改善する方法は、動物に、有効量のフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績の改善は、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法は、動物に有効量のフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、組成物は、フリーズドライ嫌気性細菌細胞を含む。
【０１１２】
本開示は、カプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を生成する方法であって、（ａ）嫌気性細菌細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件または部分嫌気性条件下で調製するステップと、（ｂ）嫌気性条件または部分嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、（ｅ）前記細胞をカプセル封入するステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞が生成される、方法を対象とする。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、方法は、動物に、カプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績を改善する方法は、動物に、有効量のカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績の改善は、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法は、動物に有効量のカプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を投与するステップを含む。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル封入したフリーズドライ嫌気性細菌細胞を含む。
【０１１８】
本開示は、フリーズドライ好気性細菌および／または酵母細胞を生成する方法であって、（ａ）好気性細菌細胞および／または酵母細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、好気性条件下で調製するステップと、（ｂ）前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライ好気性細菌および／または酵母細胞が生成される、方法を対象とする。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、方法は、動物に、フリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績を改善する方法は、動物に、有効量のフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績の改善は、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法は、動物に有効量のフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、組成物は、フリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を含む。
【０１２４】
本開示は、カプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を生成する方法であって、（ａ）好気性細菌細胞および／または酵母細胞、ならびにカゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、好気性条件下で調製するステップと、（ｂ）好気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップと、（ｅ）前記細胞をカプセル封入するステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞が生成される、方法を対象とする。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、方法は、動物に、カプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績を改善する方法は、動物に、有効量のカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、動物の成長成績の改善は、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法は、動物に有効量のカプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与するステップを含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル封入したフリーズドライ好気性細菌細胞および／または酵母細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、対数の（「Ｌｏｇ１０」）スケールにおける、１ミリリットルあたりのコロニー形成単位（「ＣＦＵ／ｍＬ」）でのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の収量に関する、２８日間にわたるＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５の液体培養物の生存率に対する保管温度の効果を示す。
【０１３１】
【図２】図２は、Ｌｏｇ１０スケールにおける、ＣＦＵ／ｍＬでのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の収量に関する、室温で０、７、１４、２１および２８日間、保管した後のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５の液体培養物の生存率を示す。
【０１３２】
【図３】図３は、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）システムの概略図を示す。
【０１３３】
【図４】図４は、ＴＦＦシステムによって処理した後のＬｏｇ１０スケールにおける、ｙ軸上の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）のＣＦＵ／ｍＬでのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の収量を示す。ｘ軸は、システムによる７０％、８０％または９０％の体積低下を示す。「目標」とは、ＴＦＦ処理後のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の理論上の回収率を指す。「濃」とは、保持液中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の実際の回収率を指し、これは、明記した体積低下後に残留している濃縮細胞の体積である。
【０１３４】
【図５】図５は、緩慢（１３５ｍＴｏｒｒで３８時間）または急速（２５０ｍＴｏｒｒで１８．５時間）なサイクルを使用して、−８０℃において、または液体窒素（ＬｉｑＮ）中で細胞を凍結し、細胞をフリーズドライした後の細胞喪失を示す。細胞は、凍結保護物質として、８％マルトデキストリン／１５％脱脂粉乳（Ｍ／ＳＭ）または８％トレハロース／１５％脱脂粉乳（Ｔ／ＳＭ）のいずれかを有する培養物のＴＦＦによる７０％、８０％または９０％の体積低下後の保持液に由来した。
【０１３５】
【図６】図６は、最初に迅速（液体窒素）または緩慢（−２０℃）凍結した後、フリーズドライ（１５％マルトデキストリン、および０％または７．５％トレハロースの存在下）した後のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞の収量を示す。
【０１３６】
【図７】図７は、−８０℃において、または液体窒素（ＬｉｑＮ）中のいずれかでの、４％トレハロースもしくは７．５％脱脂粉乳と共に、またはこれらを含まないで凍結させたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞において観察された細胞喪失を示す。
【０１３７】
【図８】図８は、急速サイクルを使用して、−８０℃において、または液体窒素（ＬｉｑＮ）中で凍結し、フリーズドライし、室温または４℃で、嫌気性条件下、最大２４週間保管した、８％トレハロース／１５％脱脂粉乳（Ｔ／ＳＭ）または８％マルトデキストリン／１５％脱脂粉乳（Ｍ／ＳＭ）と混合した、９０％体積が低下した保持液から得られたフリーズドライ試料に関して観察された細胞喪失を示す。
【０１３８】
【図９】図９は、急速サイクルを使用して、−８０℃において、または液体窒素（ＬｉｑＮ）中で凍結し、フリーズドライし、室温または４℃で、嫌気性条件下、２４週間保管した、８％トレハロース／１５％脱脂粉乳（Ｔ／ＳＭ）または８％マルトデキストリン／１５％脱脂粉乳（Ｍ／ＳＭ）と混合した、９０％体積が低下した保持液から得られたフリーズドライ試料に関して観察された細胞喪失を示す。共通の上付き文字のないバーは、統計的に異なる。Ｐ＜０．０２。
【０１３９】
【図１０】図１０は、４℃または２５℃で嫌気性条件下、１２、１６、２０または２４週間の保管後に、急速なサイクルを使用して、液体窒素（ＬｉｑＮ）中で凍結し、フリーズドライした、８％トレハロース／１５％脱脂粉乳（Ｔ／ＳＭ）または８％マルトデキストリン／１５％脱脂粉乳（Ｍ／ＳＭ）と混合した、９０％体積が低下した保持液から得られた非フリーズドライまたは再水和フリーズドライ生成物に関して行った増殖曲線を示す。光学密度（ＯＤ）は、０時間〜２０時間測定する、６００ナノメートル（ｎｍ）で示す。黄色の線＝非フリーズドライ、赤色の線＝Ｔ／ＳＭ、青色の線＝Ｍ／ＳＭ、点線＝４℃で保管、および実線＝２５℃で保管。
【０１４０】
【図１１】図１１は、最大１１か月間、４℃において保管したフリーズドライバイアルに由来するＬｏｇ１０スケールにおける、１グラムあたりのＣＦＵ（「ＣＦＵ／ｇ」）でのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを示す。各データ点は、２種の異なるフリーズドライの実施に由来する３つのバイアルの平均収量に相当する（合計６バイアル）。
【０１４１】
【図１２】図１２は、トップドレス処置物（すなわち、飼料中に処置物を混合する、または飼料の上部に処置物を置くことによる、動物用飼料に追加される処置物）として毎日与えられるフリーズドライ生成物中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度（ＣＦＵ／頭／日）を示す。サンプリングの週は、ｘ軸に示しており、サンプリング効果は、Ｐ＜０．０００１である。水平の実線は、毎日送達される、目標Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度（ＣＦＵ／頭／日）を表す。
【０１４２】
【図１３】図１３は、フリーズドライ生成物をトップドレスし、太陽に直接曝露させないで、室温の実験室中（室内）、または太陽に直接曝露させて、最大９５°Ｆの１日の平均温度において室外（室外）で、大気条件に０〜４時間曝露させた粉砕トウモロコシ中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度を示す。曝露時間および保管条件の複合効果、Ｐ＝０．０００７；曝露時間効果、Ｐ＜０．０００１；保管条件効果、Ｐ＜０．０００１。
【０１４３】
【図１４】図１４は、各群：対照群（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けていない）、非フリーズドライ群（１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ液体培養物５０ｍＬを受けた）、再水和群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受けた）、およびトップドレス群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受け、同様に毎日のトップドレスとして配合された、１０８ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物も受けた）に関して、第１の給餌の２６時間後に得られた、第一胃の流体試料中の（第一胃中の細菌溶解の指標として測定される）内毒素濃度（ＥＵ／ｍＬ）を示す。処置の効果、Ｐ＝０．３４６２。
【０１４４】
【図１５】図１５は、各群：対照群（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けていない）、非フリーズドライ群（１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ液体培養物５０ｍＬを受けた）、再水和群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受けた）、およびトップドレス群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受け、毎日のトップドレスとして配合された、１０８ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物を受けた）に関して、１時間の間隔で測定した第一胃のｐＨを示す。処置および日の複合効果、Ｐ＜０．００１、処置の効果、Ｐ＜０．００１、日の効果、Ｐ＜０．００１。標準誤差（ＳＥＭ）＝０．０４１。
【０１４５】
【図１６】図１６は、各群：対照群（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けていない）、非フリーズドライ群（１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ液体培養物５０ｍＬを受けた）、再水和群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受けた）、およびトップドレス群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受け、同様に毎日のトップドレスとして配合された、１０８ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物も受けた）に関して、第一胃液を接種した半規定ラクテート培地の６００ｎｍにおける光学密度の変化を示す。処置および時間の複合効果、Ｐ＜０．０２、処置の効果、Ｐ＜０．０１、時間の効果、Ｐ＜０．０１。ＳＥＭ＝０．０４。
【０１４６】
【図１７】図１７は、各群：対照群（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉをうけていない）、非フリーズドライ群（１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ液体培養物５０ｍＬを受けた）、再水和群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物を受けた）、およびトップドレス群（投与直前に再水和された、１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥培養物の投与を受け、同様に毎日のトップドレスとして配合された、１０８ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有する、凍結乾燥Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物も受けた）に関して、混合第一胃微生物を接種した半規定ラクテート培地のＬ−ラクテートの濃度（ｍＭ）の変化を示す。ａ，ｂ，ｃ異なる上付き文字を有するバーは、互いに統計学的に異なる。Ｐ＜０．０５。
【０１４７】
【図１８】図１８は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞中のフィターゼ活性を示す。ｘ軸は、培養の開始（「０」時間）から、その後、２時間の間隔で、すなわち、培養の開始後、「２」、「４」、「６」および「８」時間での、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞の培養物から採取した細胞試料を示す。フィターゼ活性は、１分間あたりのマイクロモルでの、試料の細胞ペレットから放出された無機リンの量（「放出されたＰ／分のμｍｏｌ」）としてｙ軸に示されている。無機リン酸塩（ＫＨ２ＰＯ４）を含有する培地中で培養された細胞におけるフィターゼ活性は明るい灰色で示されている一方、フィチン酸塩を含有する培地中で培養された細胞中のフィターゼ活性は、暗い灰色で示されている。
【０１４８】
【図１９】図１９は、１５日齢のブロイラーヒナドリに由来する盲腸試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ濃度に対するＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの効果を示す。ｘ軸は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉによる処置なし（「対照」）、液体Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉを含有するボトル式フィーダーに自由に接近できる自由（「自由」）、毎日のフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ（「フリーズドライ」）または０日目に液体Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの経口強制飼養による処置を示す。ｙ軸は、処置群に関して、Ｌｏｇ１０スケールにおける、１ミリリットルあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ濃度を示す。
【０１４９】
【図２０】図２０は、１５日齢のブロイラーヒナドリに由来する盲腸試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの罹患率を示すグラフである。ｘ軸は処置群を示す。ｙ軸は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに陽性の盲腸試料の百分率を示す。
【０１５０】
【図２１】図２１は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａによる処置なし（「対照」）、またはフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉにより処置した（「フリーズドライ」）、１８日齢のブロイラーヒナドリにおける、飼料の体重増加に対する比（ｙ軸）を示す。飼料の体重増加に対する比は、消費された合計飼料の増加した総重量に対する比である。
【０１５１】
【図２２】図２２は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉによる処置なし（「対照」）、各７日間の処置期間の１日目にＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの経口用ドレンチ剤（「ドレンチ剤」）、または毎日のフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ（「フリーズドライ」）により処置したウマに由来する盲腸試料のｐＨを示す。
【０１５２】
【図２３】図２３は、７０％ラクテートおよび３０％グルコースを含有する半規定培地での、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株（ＮＣＩＭＢ４１１２５、ＡＴＣＣ２５９４０、ＮＣＩＭＢ７０２２６１、ＮＣＩＭＢ７０２２６２およびＮＣＩＭＢ７０２４１０）の増殖を示す。
【０１５３】
【図２４】図２４は、６０％ラクテートおよび４０％グルコースを含有する半規定培地での、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株（ＮＣＩＭＢ４１１２５、ＡＴＣＣ２５９４０、ＮＣＩＭＢ７０２２６１、ＮＣＩＭＢ７０２２６２およびＮＣＩＭＢ７０２４１０）の増殖を示す。
【０１５４】
【図２５】図２５は、４０％ラクテートおよび６０％グルコースを含有する半規定培地での、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株（ＮＣＩＭＢ４１１２５、ＡＴＣＣ２５９４０、ＮＣＩＭＢ７０２２６１、ＮＣＩＭＢ７０２２６２およびＮＣＩＭＢ７０２４１０）の増殖を示す。
【０１５５】
【図２６】図２６は、方法２を使用してカプセル封入し、好気性環境中、室温で保管した、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの安定性を示す。
【０１５６】
【図２７】図２７は、方法３を使用してカプセル封入し、好気性環境中、室温で保管した、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの安定性を示す。
【０１５７】
【図２８】図２８は、４０または７５°Ｆにおいて、（Ｍ．ｅ．＋マルトデキストリン）を含む、またはマルトデキストリン（Ｍ．ｅ．）を含まない、Ｍｙｌａｒパウチに保管した、フリーズドライ生成物中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５濃度（Ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／パウチ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５８】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成するための方法、細胞を含む飼料添加物および組成物、ならびに例えば、成長成績の改善および／または健康のためを含めた、細胞を動物に投与することを含む使用に関する。本発明はまた、限定されないが、好気性細菌、嫌気性細菌および酵母、ならびに例えばＢ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含めた微生物細胞、ならびに微生物細胞、微生物細胞を含む飼料添加物および組成物を生成するための方法、ならびに例えば、成長成績の改善および／または健康のためを含めた、微生物細胞を動物に投与することを含む使用に関する。
【０１５９】
本明細書において明記されているすべての刊行物、特許および他の参考文献は、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ、参照により組み込まれているよう具体的かつ個々に示されているかのごとく、すべての目的のため、その全体が参照により組み込まれている。さらに、本出願における、いかなる参考文献の引用または特定も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であると認められたものとして解釈されるものではない。
用語法
【０１６０】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学用語はすべて、発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めた本出願が制御する。文脈により特に要求されない限り、単数用語は複数形を含むものとし、複数用語は単数形を含むものとする。
【０１６１】
セクションの表題が使用される程度に、これらの表題は、必ずしも限定として解釈されるべきではない。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含めた、複数の化合物を含んでもよい。用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、例えば、本明細書において互換的に使用することができる。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、本発明に関連する量を修飾するために使用される場合、例えば、型通りの試験および取扱いによって；このような試験および取扱いにおける偶発的な誤差によって；本発明に用いられる成分の製造、供給源または純度の差異などによって生じ得る数量のばらつきを指す。用語「約」によってか修飾されていか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、引用されている量の等価量を含む。一部の実施形態では、用語「約」は、報告されている数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
【０１６４】
本出願の全体にわたり、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜性および簡潔性のために過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、具体的に開示されているすべての可能な部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を有するとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６などの具体的に開示されている部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を有するとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１６５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの同語源は、相互交換可能であり、「を含むが、以下に限定されない」ことを意味する。態様が、文体「含む」と共に本明細書に記載されている場合は必ず、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ    ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｌｙ  ｏｆ）」に関して記載されている他の類似の態様も提供されていると理解される。
【０１６６】
用語「からなる」は、「を含み、これに限定する」を意味する。
【０１６７】
用語「から本質的になる」は、組成物の指定材料、または方法の指定ステップ、および材料または方法の基礎的特徴に実質的に影響しない追加材料またはステップを意味する。
【０１６８】
用語「および／または」は、本明細書で使用する場合、他のものを含むまたは含まない、２つの指定した特徴または構成成分の各々を具体的に開示しているとしてみなされる。したがって、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの言い回しにおいて使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの言い回しにおいて使用される用語「および／または」は、以下の態様：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
【０１６９】
用語「培養する」、「培養すること」および「培養している」は、本明細書で使用する場合、細胞増殖もしくは分裂を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で、細胞をインキュベートすること、または細胞を生存状態で維持することを意味する。用語「培養物」はまた、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下でインキュベートされた細胞を指すよう使用することができる（例えば、液体増殖培地でインキュベートされた細胞）。
【０１７０】
用語「プロバイオティック」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の生存微生物（細菌および／または酵母）を指し、適量で投与されると、動物または対象に対して、健康、消化および／または成績の利益をもたらすことができる、他の成分を含んでも含まなくてもよい。
【０１７１】
用語「直接給餌型微生物生成物」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の生存微生物（細菌および／または酵母）を含有し、他の成分を含んでも含まなくてもよく、飼料混合物、ボーラス剤および／または経口ペースト剤で、動物または対象に投与され得、適量で投与されると、動物または対象に対して健康の利益をもたらすことができる生成物を指す。
【０１７２】
用語「飼料添加物」は、本明細書で使用する場合、栄養素中で、単独または一緒に使用される、１種または複数の成分、生成物または物質（例えば、細胞）を指す（例えば、食物（例えば、動物用飼料）の品質を改善するため、動物の成績および健康を改善するため、ならびに／または食物もしくは食物内の材料の消化性を増強するため）。飼料添加物は、例えば、プロバイオティックであり得る。
【０１７３】
用語「増殖培地」および「培養培地」は、本明細書で使用する場合、細胞の増殖を支援する構成成分を含有する、固体（例えば、寒天）、半固体（例えば、寒天）または液体（例えば、ブロス）組成物を指す。
【０１７４】
用語「収穫する」および「収穫すること」は、本明細書で使用する場合、培養物から細胞を採集すること、例えば、培養物から増殖培地中の細胞を採集すること、細胞からある量の増殖培地を除去することによって（例えば、液体培養物中の細胞を濃縮する、または増殖培地から細胞を分離することによって）細胞を採集すること、または細胞の培養することを停止することを指す。用語は、細胞が濃縮された量を含めた、液体培養物から細胞を含む多量の液体を採集するまたは除去することを含む。
【０１７５】
用語「単離された」は、本明細書で使用する場合、分離株が精製される程度を必ずしも反映するわけではないが、天然形態または天然環境からの単離または分離を示す。分離株は、以下に限定されないが、単離された微生物、単離されたバイオマスまたは単離された培養物を含むことができる。
【０１７６】
用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、所望の結果を実現する量を指す。
【０１７７】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「臨床有効量」は、例えば、単独で、または他の構成成分と組み合わせて使用されているかにかかわらない量を含めた、所望の治療的結果を実現する量を指す。治療的結果は、例えば、症状の軽減、生存の延長、運動性の改善などであり得る。治療的結果は、「治癒」である必要はない。
【０１７８】
本明細書で使用する場合、「賦形剤」は、本明細書において開示されている飼料添加物、食物または組成物に望ましい特徴を付与するために使用される、構成成分または構成成分の混合物を指す。本発明の賦形剤は、医薬組成物に添加される場合、「薬学的に許容される」賦形剤として記載することができ、賦形剤は、所望の接触期間にわたり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題となる合併症なしに、妥当な利益／リスク比に見合う、健全な医療的判断の範囲内で、動物（すなわち、ヒトおよび非ヒト動物）の組織と接触させるのに好適な化合物、材料、組成物、塩および／または剤形であることを意味する。
【０１７９】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、治療的処置と防止的または予防的手段の両方を指し、目的は、望ましくない生理学的状態、疾患もしくは障害を予防もしくは減速（軽減）すること、または有益なもしくは所望の生理学的結果（例えば、臨床的、医療的および／または獣医学的結果）を得ることである。本発明の目的に関して、有益なまたは所望の結果には、以下に限定されないが、状態、疾患もしくは障害に関連する症状もしくは前兆の緩和もしくは排除；状態、疾患もしくは障害の程度の縮小；状態、疾患もしくは障害の安定化（すなわち、状態、疾患または障害が悪化しない）；状態、疾患もしくは障害の発症もしくは進行の遅延；状態、疾患もしくは障害の回復；状態、疾患もしくは障害の寛解（部分的または全体であるかにかかわらず、および検出可能であるか検出不能であるかにかかわらない）；または状態、疾患もしくは障害の増強もしくは改善が含まれる。処置は、過度の副作用のない生理学的に重要な応答の誘発を含む。処置はまた、処置を受けない場合、予想される生存と比べて、生存を延長することを含む。
【０１８０】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」および「予防すること」は、感染症、疾患、障害および／もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の前兆、症状、特色もしくは兆候（例えば、臨床的または生理学的前兆、症状、特色または兆候）の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；感染症、特定の疾患、障害および／もしくは状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染症、疾患、障害および／もしくは状態に関連する病理を発症するリスクを低減することを指す。
【０１８１】
本明細書で使用する場合、用語「収量」は、特定の体積（例えば、１ミリリットルあたりのコロニー形成単位（「ＣＦＵ／ｍＬ」））、または特定の重量（例えば、１グラムあたりのＣＦＵ（「ＣＦＵ／ｇ」））での量を含めた、生存しているまたは生存可能な細胞の量を指す。
【０１８２】
本明細書で使用する場合、用語「生存可能な」は、生存している生物（単数または複数）（例えば、生きている微生物細胞（単数または複数））を指す。「生存率」は、とりわけ、ある特定の条件下で、生存する能力を指す。
【０１８３】
本明細書で使用する場合、「精製する」、「精製された」および「精製」は、不必要な構成成分、物質汚染、混和物または不完全性から本質的に純粋にすること、またはこれらをなくすことを意味する。
【０１８４】
用語「発明」および「開示」は、記載されている場合、互換的に使用する、または例えば、言い回し「本発明」もしくは「本開示」で使用することができる。
【０１８５】
用語「動物」または「対象」は、動物界に属する任意の生物を指し、非限定的に、魚などの水性動物および陸生動物；商業用魚；観賞魚；仔魚；二枚貝類；軟体動物；甲殻類；貝類；エビ；稚エビ；アルテミア；ワムシ；ブラインシュリンプ；フィルターフィーダー；両生類；爬虫類；哺乳動物；ヒト；非ヒト動物；飼育動物；農場動物；動物園の動物；スポーツ用動物；種畜；競走用動物；共進会用動物；エアルーム動物（ｈｅｉｒｌｏｏｍ  ａｎｉｍａｌ）；希少または絶滅危惧動物；コンパニオン動物；イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスまたはウマなどのペット動物；サル（例えば、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタスモンキー、カニクイザルおよびｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）、類人猿、オランウータン、ヒヒ、テナガザルおよびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオカミなどのイヌ科；ネコ、ライオンおよびトラなどのネコ科；ウマ，ポニー、ロバ、ラバおよびシマウマなどのウマ科；雌牛、バッファロー、ウシ、ブタ、家禽およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；鳥類（すなわち、トリ）；ニワトリ、カモ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウ、ハト、エミュー、ダチョウ、ならびにブロイラー、ブロイラー種ニワトリおよび産卵用ニワトリを含めた食用または農場動物として使用される任意の他のトリなどの家禽；マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類などを含む。動物用飼料には、以下に限定されないが、水産養殖用飼料、ペット用飼料を含む飼育動物用飼料、動物園動物用飼料、作業動物用飼料、家畜用飼料およびそれらの組合せが含まれる。食物は、動物用飼料およびヒト食物を含む。
【０１８６】
明確にするため、個々の実施形態の文脈において記載されている本発明のある特定の特色はまた、単一の実施形態において、組み合わせて提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするため、単一の実施形態の文脈において記載されている本発明の様々な特色はまた、個別に、または任意の好適な部分組合せで、または本発明の任意の他の記載されている実施形態に好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈において記載されているある特定の特色は、実施形態が、それらの要素なしに実施不能でない限り、それらの実施形態の必須の特色であるとはみなされない。
【０１８７】
本明細書に記載されているものと類似または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載されている。材料、方法および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本発明の他の特色および利点は、詳細な説明からおよび特許請求の範囲から明白になろう。
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ
【０１８８】
任意の株、または株の任意の組合せに由来するＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を、本明細書に記載されている発明に使用することができる。
【０１８９】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株（単数または複数）は、ストックカルチャーコレクション（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ（登録商標）」）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（「ＮＣＩＭＢ」）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（「ＮＣＴＣ」）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（「ＡＲＣ」）カルチャーコレクション（すなわち、「ＮＲＲＬ」）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＡＨ）カルチャーコレクション）から選択することができるか、または天然源から（例えば、反芻動物の胃腸管から）単離された株であり得る。
【０１９０】
カルチャーコレクションから選択することができる、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株の例は、以下に限定されないが、表１中の寄託番号によって列挙されている株を含む。寄託番号の代替表示記号も示されている。
【表１】
2020508696.tif 000003
【０１９１】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、表１中の代替表示記号のいずれかを含めた、ＡＴＣＣ（登録商標）２５９４０、ＡＴＣＣ（登録商標）１７７５２、ＡＴＣＣ（登録商標）１７７５３、ＮＣＩＭＢ７０２２６１、ＮＣＩＭＢ７０２２６２、ＮＣＩＭＢ７０２２６４、ＮＣＩＭＢ７０２３３１、ＮＣＩＭＢ７０２４０９、ＮＣＩＭＢ７０２４１０、ＮＣＩＭＢ４１１２５、ＮＣＩＭＢ４１７８７、ＮＣＩＭＢ４１７８８、ＮＲＲＬ１８６２４、ＮＩＡＨ１１０２およびそれらの組合せからなる群から選択される、寄託番号を有する株に由来する。
【０１９２】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、反芻動物（例えば、雌牛）から単離された株に由来する。例えば、米国特許第７，５５０，１３９号を参照されたい。
【０１９３】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、非反芻動物（例えば、ヒト）から単離された株に由来する。
【０１９４】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、ラクテート利用（例えば、糖の存在下でラクテートを利用する株）、イオノフォア抗生物質に耐性、比較的高い増殖速度、主にアセテートを生成する能力、５．０未満および４．５という低いｐＨ値で増える能力、揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の生成、フィターゼ活性ならびにそれらの組合せが理由で選択された株に由来する。例えば、米国特許第７，５５０，１３９号を参照されたい。
【０１９５】
一部の実施形態では、ラクテート利用が理由で選択された株は、可溶性炭水化物（例えば、グルコースおよび／またはマルトース）の存在下で、好ましい炭素源としてラクテートを利用する。ラクテート利用は、例えば、可溶性炭水化物を補給した同じ培地と比べて、ラクテートを含有し、かつ可溶性炭水化物を欠如している培地中での増殖に基づいて決定することができる。
【０１９６】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、他の株と比較して、高い増殖速度を有する株に由来する。様々な株の増殖速度は、例えば、液体培地中で細胞を培養し、光学密度の増加を経時的にモニタリングすることによって決定することができる。
【０１９７】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、例えばガスクロマトグラフィーによって決定することができる、ＶＦＡを生成することが可能な株に由来する。一部の実施形態では、ＶＦＡは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａおよび／またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの増殖を阻害することが可能な、６炭素脂肪酸である。一部の実施形態では、ＶＦＡは、カプロン酸である。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａおよび／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉである。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび／またはＥｎｔｉｒｉｔｉｄｉｓである。一部の実施形態では、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉである。
【０１９８】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、フィターゼ活性を有する株に由来する。
【０１９９】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株であるＮＣＩＭＢ４１１２５に由来する。Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉのこの株は、高い比増殖速度（０．９４発生／時）を有し、４．５〜６．５またはそれより高いｐＨ範囲で増殖することができ、その好ましい基質としてＤ−およびＬ−ラクテートを使用するが、グルコースおよび他の炭水化物も利用する能力を有しており、イオノフォアに耐容する。
【０２００】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株であるＮＣＩＭＢ４１７８７に由来する。一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株であるＮＣＩＭＢ４１７８８に由来する。
【０２０１】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株であるＡＴＣＣ（登録商標）２５９４０に由来する。
【０２０２】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、ストックカルチャーコレクションから選択される株に由来するか、または天然源から単離される。ある株に「由来する」細胞は、例えば、下位分離株（ｓｕｂ  ｉｓｏｌａｔｅ）、変異体、バリアントまたは組換え株などの、天然または人工誘導体であり得る。
嫌気性、好気性および／または酵母細胞を含む培養物の調製
【０２０３】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉは、最大収量および生存率を得るため、厳密な嫌気性条件下で培養されなければならない嫌気性細菌である。
【０２０４】
一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の１種または複数の株を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の単一株を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の１種または複数の株からなる（すなわち、培養物中の細胞は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、例えば、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の１種または複数の株からなる）。一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の単一株からなる。
【０２０６】
一部の実施形態では、培養物は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞および増殖培地を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、培養物は、嫌気性細菌細胞および増殖培地を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、および増殖培地を含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、培養物は、好気性細菌細胞および増殖培地を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ細胞および増殖培地を含む。
【０２０９】
一部の実施形態では、培養物は、酵母細胞および増殖培地を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を含む。
【０２１０】
連続発酵（すなわち、連続培養）またはバッチ発酵（すなわち、バッチ培養）を含めた、微生物細胞の接種、増殖および収穫に関する様々な発酵パラメーターを使用することができる。例えば、米国特許第７，５５０，１３９号を参照されたい。
【０２１１】
微生物細胞用の増殖培地は、固体、半固体または液体であり得る。培地は、増殖を可能にする必須要素および特定の因子を提供する栄養素を含有することができる。様々な微生物学的培地および変形が、当技術分野で周知である。培地は、培養の開始、培養中、または断続的／連続的を含めた、任意の時間に培養物に添加することができる。
【０２１２】
増殖培地の例には、以下に限定されないが、（１）ペプトン、３ｇ／Ｌ；酵母、３ｇ／Ｌ；ビタミン溶液、２ｍＬ／Ｌ；無機溶液、２５ｍＬ／Ｌ；インジゴカルミン（０．５％）、１ｇ／Ｌ；１２．５％Ｌ−システイン、２ｇ／Ｌ；１２．５％硫化ナトリウム、２ｇ／Ｌを含有し、乳酸Ｎａ（半規定ラクテート乳酸塩、ＳＤＬ）、グルコース（半規定グルコース、ＳＤＧ）またはマルトース（半規定マルトース、ＳＤＭ）のいずれかを補給した半規定培地；（２）ペプトン、１０ｇ／Ｌ；肉牛抽出物、１０ｇ／Ｌ；酵母抽出物、３ｇ／Ｌ；デキストロース５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ；可溶性デンプン、１ｇ／Ｌ；Ｌ−システインＨＣｌ、０．５ｇ／Ｌ；酢酸ナトリウム、３ｇ／Ｌ；およびレサズリン（０．０２５％）、４ｍＬ／Ｌを含有する改変強化クロストリジウム寒天培地／ブロス培地（事前還元型）；（３）脱線維素ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天／ブロス；（４）乳酸Ｎａ（７０％）、１０ｇ／ｌ；ペプトン、２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．０６ｇ／ｌ；ビタミン（塩酸ピリドキソール、４ｍｇ／ｌ；ピリドキサミン、４ｍｇ／ｌ；リボフラビン、４ｍｇ／ｌ；塩化チアミニウム、４ｍｇ／ｌ；ニコチンアミド、４ｍｇ／ｌ；Ｄ−パントテン酸Ｃａ、４ｍｇ／ｌ；４−アミノ安息香酸、０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン、０．２ｍｇ／ｌ、葉酸、０．１ｍｇ／ｌおよびシアノコバラミン、０．０２ｍｇ／１）；Ｎａ２Ｓ．９Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ｌ；システイン、０．２５ｇ／ｌ；消泡剤、０．０７ｍｌ／ｌおよびモネンシン、１０ｍｇ／ｌを含有し；乳酸Ｎａおよび無機溶液をレザーバーボトルに添加し、６０分間、オートクレーブする；３００ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏにペプトンを溶解し、個別にオートクレーブする；予めビタミン溶液および２種の還元剤を濾過滅菌する；オートクレーブ後、レザーバーボトルを嫌気性ガスで一晩ガス通気する；冷却後、個別に他の構成物質を添加する；および５Ｎ  ＨＣｌでｐＨを所望の値に調節することによって調製される、半規定第一胃液不含培地；ならびに（５）４００ｍｌのｌｕｃｅｒｎｅ給餌ヒツジに由来するインキュベートされた清澄第一胃液、３７１ｍｌ蒸留水、２ｇペプトン、１５ｇ寒天、１００ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）Ｄ、Ｌ−乳酸ナトリウム溶液、１００ｍｌの０．０４％（ｗ／ｖ）ブロモクレゾールパープル溶液および４０ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４；１２０ｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；８ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏおよび２．４ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを含有する無機溶液２５ｍｌを含有するインキュベートされた第一胃液アセテート（「ＩＲＦＬ」）培地であって、乳酸（９０％  ｗ／ｖ）を使用して、ｐＨを５．５に調節した後、１２１℃で２５分間オートクレーブし、次いで、嫌気性ガス混合物を通気しながら５０℃の水浴中で冷却した後、Ｎａ２Ｓ．９Ｈ２Ｏ（１２．５％ｗ／ｖ）およびシステイン．ＨＣｌ．Ｈ２Ｏ（１２．５％ｗ／ｖ）の各々を２ミリリットル添加する、培地が含まれる。
【０２１３】
一部の実施形態では、培養物は、少なくとも１種の炭素源を含む増殖培地を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の炭素源は、カゼイン、デンプン（例えば、ゼラチン化デンプンおよび／または可溶性デンプン）、ラクテート（すなわち、乳酸）、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２１４】
一部の実施形態では、培養物は、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種の炭素源は、カゼイン、デンプン（例えば、ゼラチン化デンプンおよび／または可溶性デンプン）、ラクテート（すなわち、乳酸）、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２１５】
一部の実施形態では、少なくとも２種の炭素源は、約１〜９９％の第１の炭素源（例えば、本明細書に記載されている任意の炭素源）、および約１〜９９％の第２の炭素源（例えば、第１の炭素源とは異なる、本明細書に記載されている任意の炭素源）からなり、少なくとも２種の炭素源の１００％は、第１の炭素源および第２の炭素源からなる。一部の実施形態では、少なくとも２種の炭素源は、約５０〜６０％の第１の炭素源および約４０〜５０％の第２の炭素源、約５０〜７０％の第１の炭素源および約３０〜５０％の第２の炭素源、約５０〜８０％の第１の炭素源および約２０〜５０％の第２の炭素源、または約５０〜９０％の第１の炭素源および約１０〜５０％の第２の炭素源からなる。別の実施形態では、少なくとも２種の炭素源は、約６５〜７５％の第１の炭素源および約２５〜３５％の第２の炭素源からなる。一部の実施形態では、第１の炭素源はラクテートである。
【０２１６】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、約３９℃〜約４０℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃で増殖させられる。
【０２１７】
一部の実施形態では、微生物細胞は、約１５℃〜約４５℃、約２０℃〜４０℃、２５℃〜３５℃、３０℃〜３９℃で増殖させられる。一部の実施形態では、微生物細胞は、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃で増殖させられる。
【０２１８】
一部の実施形態では、微生物細胞は、保管のために約１８℃〜約２５℃に冷却される。
【０２１９】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、培養中および／または収穫時）を含む培養物のｐＨは、約４．５〜約７．０、約４．５〜約６．５、約４．５〜約６．０、約４．５〜約５．５、約４．５〜約５．０、約４．６〜約６．９、約４．７〜約６．８、約４．８〜約６．７、約４．９〜約６．６、約５．０〜約７．０、約５．０〜約６．５、約５．０〜約６．０、約５．０〜約５．５、約５．１〜約６．９、約５．２〜約６．８、約５．３〜約６．７、約５．４〜約６．６、約５．５〜約７．０、約５．５〜約６．５、約５．１〜約６．４、約５．２〜約６．３、約５．３〜約６．２、約５．４〜約６．１、約５．５〜約６．０、約５．０〜約６．１、約５．０〜約６．２、約５．０〜約６．３、約５．０〜約６．４、約５．１〜約６．５、約５．２〜約６．５、約５．３〜約６．５、または約５．４〜約６．５である。
【０２２０】
一部の実施形態では、微生物細胞（例えば、培養中および／または収穫時）を含む培養物のｐＨは、約４．０〜約９．０の間、約４．５〜約８．５の間、約５．０〜約８．０の間、約５．５〜約７．５の間、約６．０〜約７．０の間である。
【０２２１】
微生物細胞を培養するため、嫌気性条件を維持する、異なるサイズおよび設計の発酵槽を使用することができる。発酵槽は、例えば、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の商業生成に十分な培養体積を発酵させることが可能であり得る。一部の実施形態では、培養体積は、約２リットル、約１０リットル、約５０リットル、約１００リットル、約１５０リットル、約２００リットル、約２５０リットル、約３００リットル、約３５０リットル、約４００リットル、約４５０リットル、約５００リットル、約６００リットル、約８００リットル、約１，０００リットル、約１，２００リットル、約１，５００リットル、約１，８００リットル、約２，０００リットル、約２、２００リットル、約２，５００リットル、約２，７５０リットル、約３，０００リットル、約４，０００リットル、約５，０００リットル、約６，０００リットル、約７，０００リットル、約８，０００リットル、約９，０００リットル、約１０，０００リットル、少なくとも約２０，０００リットル、少なくとも約５０，０００リットル、または少なくとも約７５，０００リットルである。一部の実施形態では、発酵体積は、約２リットル〜約７５，０００リットル、約２５０リットル〜約７５０リットル、約３００リットル〜約８００リットル、約３５０リットル〜約８５０リットル、約４００リットル〜約９００リットル、約４５０リットル〜約９５０リットル、約５００リットル〜約１，０００リットル、約７５０リットル〜約１，２５０リットル、約１，０００リットル〜約２，０００リットル、約２，０００リットル〜約４，０００リットル、約４，０００リットル〜約８，０００リットル、約５，０００リットル〜約１０，０００リットル、約５０リットル〜約７５，０００リットル、約５０リットル〜約５０，０００リットル、約５０リットル〜約２５，０００リットル、約５０リットル〜約２０，０００リットル、約５０リットル〜約１５，０００リットル、約５０リットル〜約１０，０００リットル、約１００リットル〜約１０，０００リットル、約１００リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約４，０００リットル、約１００リットル〜約３，０００リットル、約１００リットル〜約２，９００リットル、約１００リットル〜約２，８５０リットル、約１００リットル〜約２，８００リットル、約１００リットル〜約２，７５０リットル、約２リットル、約１０リットル、約５０リットル、約１００リットル、約２００リットル、約５００リットル、約１，０００リットル、約１，５００リットル、約１０，０００リットル、約２０，０００リットル、約５０，０００リットル、または約７５，０００リットルである。
【０２２２】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む培養物はまた、別の微生物（すなわち、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞ではない微生物細胞）を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、および偏性嫌気性菌である別の微生物を含む。一部の実施形態では、培養物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、ならびにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓからなる群から選択される別の微生物を含む。
フリーズドライ好気性、嫌気性および酵母細胞
【０２２３】
一態様では、本発明は、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法を対象とする。
【０２２４】
別の態様では、本発明は、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を対象とする。
【０２２５】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を対象とする。
【０２２６】
別の態様では、本発明は、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を生成する方法を対象とする。
【０２２７】
別の態様では、本発明は、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を対象とする。
【０２２８】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を対象とする。
【０２２９】
別の態様では、本発明は、フリーズドライ嫌気性細菌細胞を生成する方法を対象とする。
【０２３０】
別の態様では、本発明は、フリーズドライした、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を生成する方法を対象とする。
【０２３１】
別の態様では、本発明は、フリーズドライ嫌気性細菌細胞を対象とする。
【０２３２】
別の態様では、本発明は、フリーズドライした、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を対象とする。
【０２３３】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライ嫌気性細菌を対象とする。
【０２３４】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライした、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を対象とする。
【０２３５】
別の態様では、本発明は、フリーズドライ好気性細菌細胞を生成する方法を対象とする。
【０２３６】
別の態様では、本発明は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのフリーズドライＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を生成する方法を対象とする。
【０２３７】
別の態様では、本発明は、フリーズドライ好気性細菌細胞を対象とする。
【０２３８】
別の態様では、本発明は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのフリーズドライＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を対象とする。
【０２３９】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライ好気性細菌細胞を対象とする。
【０２４０】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのフリーズドライＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を対象とする。
【０２４１】
別の態様では、本発明は、フリーズドライ酵母細胞を生成する方法を対象とする。
【０２４２】
別の態様では、本発明は、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのフリーズドライＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を生成する方法を対象とする。
【０２４３】
別の態様では、本発明は、フリーズドライ酵母細胞を対象とする。
【０２４４】
別の態様では、本発明は、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのフリーズドライＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを対象とする。
【０２４５】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライ酵母細胞を対象とする。
【０２４６】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている方法によって生成される、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのフリーズドライＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を対象とする。
【０２４７】
別の態様では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、細胞を収穫するステップと、細胞を凍結するステップと、細胞をフリーズドライするステップとを含み、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される。一部の実施形態では、方法は、培養物を調製するステップ、次いで、細胞を収穫するステップ（すなわち、培養した細胞を収穫するステップ）、次いで、細胞を凍結するステップ（すなわち、収穫した細胞を凍結するステップ）、次いで、細胞をフリーズドライするステップ（すなわち、凍結した細胞をフリーズドライするステップ）の順序で行われる。
【０２４８】
一部の実施形態では、方法は、嫌気性条件下で行われる。一部の実施形態では、方法は、嫌気性条件下で、培養物を調製するステップ、細胞を収穫するステップ、細胞を凍結するステップ、細胞をフリーズドライするステップおよびそれらの組合せを含む。
【０２４９】
方法は、本明細書に記載されている培養物を調製する方法のいずれかを含むことができる。方法の培養物はまた、本明細書に記載されている培養物の特性のいずれかを含むことができる。
【０２５０】
一部の実施形態では、培養物中の細胞は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む。一部の実施形態では、培養物中の細胞は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞からなる。
【０２５１】
一部の実施形態では、増殖培地は、カゼイン、ラクテート（すなわち、乳酸）、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプンおよびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、方法は、培養物がその対数増殖期を終えた後の１２時間以内、かつ培養物がその定常増殖期を開始する前に、細胞を収穫するステップを含む。培養物は、収穫時に増殖を停止させるために、室温に冷却することができる。
【０２５３】
一部の実施形態では、培養物は液体を含み、方法は、液体の百分率で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、濃縮Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞）を収穫するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、約１％〜約４０％、約１％〜約３５％、約１％〜約３０％、約１％〜約２５％、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％の液体とともに細胞を回収することを含む。一部の実施形態では、方法は、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の液体とともに細胞を回収することを含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、培養物は液体を含み、方法は、ある割合の液体を除去することによって、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、濃縮Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞）を収穫するステップを含む。一部の実施形態では、細胞を回収することは、約５０％〜約１００％の液体、約５５％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、または約９５％〜約１００％の液体を除去することを含む。一部の実施形態では、細胞を回収することは、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の液体を除去することを含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、方法は、細胞を濃縮することによって、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を収穫するステップを含む。一部の実施形態では、細胞を収穫するステップは、遠心分離、濾過、透析、逆浸透およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの技法によって細胞を濃縮するステップを含む。一部の実施形態では、濾過は、クレイ濾過を含む。一部の実施形態では、濾過は、クロスフロー濾過としても公知のタンジェンシャルフロー濾過を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、回収時のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む培養物のｐＨは、約４．５〜約７．０、約４．５〜約６．５、約４．５〜約６．０、約４．５〜約５．５、約４．５〜約５．０、約４．６〜約６．９、約４．７〜約６．８、約４．８〜約６．７、約４．９〜約６．６、約５．０〜約７．０、約５．０〜約６．５、約５．０〜約６．０、約５．０〜約５．５、約５．１〜約６．９、約５．２〜約６．８、約５．３〜約６．７、約５．４〜約６．６、約５．５〜約７．０、約５．５〜約６．５、約５．１〜約６．４、約５．２〜約６．３、約５．３〜約６．２、約５．４〜約６．１、約５．５〜約６．０、約５．０〜約６．１、約５．０〜約６．２、約５．０〜約６．３、約５．０〜約６．４、約５．１〜約６．５、約５．２〜約６．５、約５．３〜約６．５、または約５．４〜約６．５である。
【０２５７】
一部の実施形態では、方法は、発酵槽中の増殖培地にＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む接種材料を接種して、培養物を調製するステップと、培養物のｐＨが約６．０になるまで、約３９℃の温度で培養物をインキュベートするステップとを含む。一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む接種材料は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞またはその一部のフラスコ培養物である。一部の実施形態では、方法は、発酵槽中の増殖培地に、１／５０〜１／４，０００の接種材料の培地に対する比を接種するステップを含む。一部の実施形態では、接種材料の培地に対する比は、１／１００である。
【０２５８】
一部の実施形態では、培養物は、少なくとも１つの凍結保護物質をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの凍結保護物質は、フルクトース、グルコース、スクロース、粉ミルク、乳児用調製粉乳、脱脂粉乳、トレハロース、マルトデキストリン、ベタインおよびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの凍結保護物質は、培養物の約１％〜約５０％（ｗ／ｖ）、培養物の約１％〜約４０％（ｗ／ｖ）、培養物の約１％〜約３０％（ｗ／ｖ）、培養物の約１％〜約２０％（ｗ／ｖ）、培養物の約１％〜約１０％（ｗ／ｖ）、培養物の約１％〜約５％（ｗ／ｖ）、培養物の約１０％〜約２０％（ｗ／ｖ）、培養物の約１５％〜約２５％（ｗ／ｖ）、培養物の約２０％〜約３０％（ｗ／ｖ）、培養物の約３０％〜約４０％（ｗ／ｖ）、培養物の約４０％〜約５０％（ｗ／ｖ）、培養物の約６０％〜約７０％（ｗ／ｖ）、培養物の約７０％〜約８０％（ｗ／ｖ）の量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、粉末凍結保護物質を濃縮Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞に直接添加することによって、添加される。一部の実施形態では、凍結保護物質は、１／１の比、１／５の比または１／１０の比で凍結保護物質の溶液を濃縮Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞に直接添加することによって、添加される。
【０２５９】
一部の実施形態では、細胞を凍結するステップは、細胞を冷凍庫中に入れるステップ、または細胞をドライアイス、液体窒素もしくはそれらの組合せと接触させるステップを含む。細胞を凍結するステップは、細胞が容器内に存在している間に、細胞を凍結するステップを含む。細胞を接触させるステップは、細胞を含む容器を、細胞を凍結するための媒体と接触させるステップを含む。細胞を凍結するための媒体は、以下に限定されないが、冷凍庫、アセトン−ドライアイス浴、液体窒素またはそれらの組合せを含む。
【０２６０】
一部の実施形態では、方法は、約−２０℃〜約−２１０℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−２０℃〜約−８０℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−８０℃〜約−２１０℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−２０℃〜約−１９６℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−８０℃〜約−１９６℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−２０℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−８０℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、約−１９６℃の温度で細胞を凍結することを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を液体窒素と接触させることによって、細胞を凍結するステップを含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、方法は、嫌気性条件下、細胞を凍結するステップを含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、凍結するステップにより、細胞を含む凍結ペレットが生成する。例えば、凍結するステップは、フラッシュ冷凍庫（例えば、モデル２５０−Ｓ０１  Ｃｒｙｇｒａｎ、ＩＦＱ  Ｉｎｃ．）を使用して実現することができる。
【０２６３】
一部の実施形態では、凍結ペレットの直径は、約０．００１〜約１．０インチ、約０．０１〜約１．０インチ、約０．１〜約１．０インチ、約０．２〜約１．０インチ、約０．３〜約１．０インチ、約０．４〜約１．０インチ、約０．５〜約１．０インチ、約０．６〜約１．０インチ、約０．７〜約１．０インチ、約０．８〜約１．０インチ、約０．９〜約１．０インチ、約０．００１〜約０．９インチ、約０．０１〜約０．９インチ、約０．１〜約０．９インチ、約０．２〜約０．９インチ、約０．３〜約０．９インチ、約０．４〜約０．９インチ、約０．５〜約０．９インチ、約０．６〜約０．９インチ、約０．７〜約０．９インチ、約０．８〜約０．９インチ、約０．００１〜約０．８インチ、約０．０１〜約０．８インチ、約０．１〜約０．８インチ、約０．２〜約０．８インチ、約０．３〜約０．８インチ、約０．４〜約０．８インチ、約０．５〜約０．８インチ、約０．６〜約０．８インチ、約０．７〜約０．８インチ、約０．００１〜約０．７インチ、約０．０１〜約０．７インチ、約０．１〜約０．７インチ、約０．２〜約０．７インチ、約０．３〜約０．７インチ、約０．４〜約０．７インチ、約０．５〜約０．７インチ、約０．６〜約０．７インチ、約０．００１〜約０．６インチ、約０．０１〜約０．６インチ、約０．１〜約０．６インチ、約０．２〜約０．６インチ、約０．３〜約０．６インチ、約０．４〜約０．６インチ、約０．５〜約０．６インチ、約０．００１〜約０．５インチ、約０．０１〜約０．５インチ、約０．０５〜約０．５インチ、約０．１〜約０．５インチ、約０．１５〜約０．５インチ、約０．２〜約０．５インチ、約０．３〜約０．５インチ、または約０．４〜約０．５インチである。
【０２６４】
凍結Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、凍結保管（例えば、０℃未満）した後、フリーズドライすることができるか、または直ちにフリーズドライすることができる。一部の実施形態では、凍結Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、約０℃未満、約−１０℃未満、約−２０℃未満、約−５０℃未満、約−８０℃または約−１９６℃未満の温度で保管される。一部の実施形態では、凍結Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、約−２０℃、約−３０℃、約−４０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、約−１００℃、約−１５０℃、約−１９６℃または約−２１０℃の温度で保管される。
【０２６５】
一部の実施形態では、凍結Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、凍結乾燥される。一部の実施形態では、凍結Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、フリーズドライされる。フリーズドライするステップは、例えば、凍結細胞からの液体の除去を含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞をフリーズドライするステップは、フリーズドライ機に凍結細胞を入れることを含む。一部の実施形態では、フリーズドライするステップは、凍結細胞を減圧に供して、細胞を室温に徐々に加温するステップを含む。
【０２６７】
一部の実施形態では、方法は、嫌気性条件下、細胞をフリーズドライするステップを含む。
【０２６８】
一部の実施形態では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉは、商業規模で生成される。
【０２６９】
一部の実施形態では、約１×１０３〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、本明細書において開示されている方法によって生成される。一部の実施形態では、約１×１０３〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、フリーズドライ後、生存可能である。
【０２７０】
一態様では、本開示に従うフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法は、（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、ならびにカゼイン、ラクテート（例えば、乳酸）、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む増殖培地を含む培養物を、嫌気性条件下で調製するステップと、（ｂ）嫌気性条件下、前記細胞を収穫するステップと、（ｃ）前記細胞を凍結するステップと、（ｄ）前記細胞をフリーズドライするステップとを含み、約１×１０３〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される。
【０２７１】
別の態様では、本開示によるフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法は、（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、（ｂ）培養物がその対数増殖期を終えた後の１２時間以内、かつ培養物がその定常増殖期を開始する前に、嫌気性条件下で細胞を収穫するステップと、（ｃ）細胞を凍結するステップと、（ｄ）細胞をフリーズドライするステップとを含み、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される。
【０２７２】
別の態様では、本開示によるフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を生成する方法は、（ａ）Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および増殖培地を含む培養物を調製するステップと、（ｂ）細胞を収穫するステップと、（ｃ）収穫の５時間以内に、約−８０℃〜約−２１０℃の温度で細胞を凍結するステップと、（ｄ）細胞をフリーズドライするステップとを含み、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が生成される。
【０２７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示の方法によって生産されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の量および／またはフリーズドライの後に生存可能なＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の量は、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０４ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０４ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ、または約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇである。
【０２７４】
一部の実施形態では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、約１４日〜約２４か月の間約−８０℃、約−２０℃、約４℃、約２５℃、またはそれらの組合せの温度で生存可能である。一部の実施形態では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、少なくとも約１４日、少なくとも約１か月、少なくとも約６か月、少なくとも約８か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１２か月、少なくとも約１５か月、少なくとも約１８か月、または少なくとも約２４か月の間約−８０℃、約−２０℃、約４℃、約２５℃、またはそれらの組合せの温度で生存可能である。
【０２７５】
一部の実施形態では、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｍＬ〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０４ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０４ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ、または約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、少なくとも約１４日、少なくとも約１か月、少なくとも約６か月、少なくとも約８か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１２か月、少なくとも約１５か月、少なくとも約１８か月、または少なくとも約２４か月の間約−８０℃、約−２０℃、約４℃、またはそれらの組合せの温度での保管の後、生存可能である。
【０２７６】
一部の実施形態では、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０４ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０３ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０４ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ、約１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ、または約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇ〜約１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇのフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、少なくとも約１４日、少なくとも約１か月、少なくとも約６か月、少なくとも約８か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１２か月、少なくとも約１５か月、少なくとも約１８か月、または少なくとも約２４か月の間約２５℃の温度での保管の後、生存可能である。
飼料添加物、組成物およびキット
【０２７７】
一態様では、飼料添加物は、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む。
【０２７８】
一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されているフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む。
【０２７９】
一態様では、飼料添加物は、本明細書において開示されているＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を含む。
【０２８０】
一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されているフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を含む。
【０２８１】
一態様では、飼料添加物は、本明細書において開示されている嫌気性細菌細胞を含む。別の態様では、飼料添加物は、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。
【０２８２】
一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されているフリーズドライ嫌気性細菌細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライ嫌気性細菌細胞を含む。
【０２８３】
一部の実施形態では、飼料添加物は、フリーズドライした、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成される、フリーズドライした、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。
【０２８４】
一態様では、飼料添加物は、本明細書において開示されている好気性細菌細胞を含む。別の態様では、飼料添加物は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。
【０２８５】
一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されているフリーズドライ好気性細菌細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライ好気性細菌細胞を含む。
【０２８６】
一部の実施形態では、飼料添加物は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのフリーズドライＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのフリーズドライＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。
【０２８７】
一態様では、飼料添加物は、本明細書において開示されている酵母細胞を含む。別の態様では、飼料添加物は、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を含む。
【０２８８】
一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されているフリーズドライ酵母細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライ酵母細胞を含む。
【０２８９】
一部の実施形態では、飼料添加物は、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのフリーズドライＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を含む。一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されている方法によって生成される、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのフリーズドライＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を含む。
【０２９０】
一部の実施形態では、飼料添加物は、固形（すなわち、「固形飼料添加物」）または液体（すなわち、「液体飼料添加物」）である。一部の実施形態では、飼料添加物は、半固形またはゲル状（すなわち、「半固形またはゲル状飼料添加物」）である。ゲル状飼料添加物は、酸素捕捉剤（例えば、アスコルビン酸）を含有することができる。
【０２９１】
一部の実施形態では、固形飼料添加物は、粉末（例えば、流動性粉末）、細粒（すなわち、顆粒）、粒子（すなわち、微粒子）、ペレット、ケーキ、水溶性濃縮物、ペースト、ボーラス、錠剤、微粉、それらの構成成分またはそれらの組合せである。
【０２９２】
一部の実施形態では、液体飼料添加物は、溶液（例えば、水性、有機または水性有機溶液）、懸濁液、エマルション、ドレンチ剤、噴霧剤、注射剤、飲料（例えば、代用乳）、それらの構成成分またはそれらの組合せである。
【０２９３】
一部の実施形態では、ゲル状飼料添加物は、有機ゲルである。一部の実施形態では、ゲル状飼料添加物は、経口ゲル（すなわち、経口投与用けのゲル）である。
【０２９４】
一部の実施形態では、飼料添加物は、トップドレスとして使用するためのものである（すなわち、食物の表面に添加する、または食物（例えば、動物用飼料）と混合するため）。一部の実施形態では、飼料添加物は、液体として投与するためのものである。
【０２９５】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、液体中でフリーズドライ細胞を、再水和、溶解、可溶化および／または懸濁することによって、液体飼料添加物として使用することができる。
【０２９６】
一部の実施形態では、飼料添加物は、担体（すなわち、１種または複数の担体）を含む。
【０２９７】
好適な担体の例には、以下に限定されないが、植物性材料（すなわち、乾燥もしくは加工植物または植物の一部を含めた、植物全体または植物の一部（例えば、種子、茎、葉、花および／または根））、乾燥穀物（例えば、乾燥蒸留穀物残渣）、アルファルファ、コーンミール、シトラスミール（ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅａｌ）、発酵残留物、粉砕したカキの殻、アタパルガスクレイ（ａｔｔａｐｕｌｇｕｓ  ｃｌａｙ）、コムギショート（ｗｈｅａｔ  ｓｈｏｒｔ）、糖蜜可溶物（ｍｏｌａｓｓｅｓ  ｓｏｌｕｂｌｅ）、コーンコブミール、可食植物性物質、きな粉、ダイズミル飼料、抗生物質菌糸体、バーミキュライト、ダイズグリッツ、乳清、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、ナトリウムシリカアルミネート、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエトラル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにそれらの組合せが含まれる。
【０２９８】
一部の実施形態では、飼料添加物は、以下に限定されないが、結晶セルロース；ラクトース；クエン酸ナトリウム；炭酸カルシウム；リン酸水素カルシウムおよびグリシン；デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある特定の複合シリケートなどの崩壊剤；ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの造粒結合剤；マルトデキストリンなどの増量剤；二酸化ケイ素などの水分捕捉剤；アスコルビン酸などの酸素捕捉剤；ならびに／またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの滑沢剤を含めた、賦形剤（すなわち、１種または複数の賦形剤）を含む。
【０２９９】
一部の実施形態では、飼料添加物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および／または飼料添加物を含むコア、ならびにコアの上にコーティングを含む細粒である。一部の実施形態では、コーティングは、水和されたバリア塩である。塩コーティングは、熱耐性の改善、保管安定性の改善、ならびにこれがない場合、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および／または飼料添加物に対して（例えば、安定性に対して）有害な効果を有し得る、細粒中の他の構成成分からの保護をもたらすことができる。
【０３００】
一部の実施形態では、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉは、以下に限定されないが、増殖基質、酵素、糖、炭水化物、抽出物および増殖促進性微量成分を含む、添加物の乾燥配合物と混和される。糖は、以下に限定されないが、ラクトース、マルトース、デキストロース、マルトデキストリン、グルコース、フルクトース、マンノース、タガトース、ソルボース、ラフィノース、アミロース、デンプンおよびガラクトースを含むことができる。糖は、個々にまたは組み合わせてのいずれかで、５０〜９５％の範囲であり得る。抽出物は、以下に限定されないが、５〜５０％の範囲の酵母または乾燥酵母発酵可溶物を含むことができる。増殖基質は、以下に限定されないが、５〜２５％の範囲のトリプチケース；５〜３０％の範囲の乳酸ナトリウム；および１〜５％の範囲のＴｗｅｅｎ８０を含むことができる。炭水化物は、以下に限定されないが、マンニトール、ソルビトール、アドニトールおよびアラビトールを含むことができる。炭水化物は、個々にまたは組み合わせて、５〜５０％の範囲であり得る。微量成分は、以下に限定されないが、０．５〜５．０％の範囲の炭酸カルシウム；０．５〜５．０％の範囲の塩化カルシウム；０．５〜５．０％の範囲のリン酸二カリウム；０．５〜５．０％の範囲のリン酸カルシウム；０．２５〜１．００％の範囲のマンガンタンパク質；および０．２５〜１．００％の範囲のマンガンを含むことができる。
【０３０１】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ飼料添加物は、細胞および／またはフリーズドライ細胞を含む培養物を含むＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を飼料添加物の任意の追加の構成成分（例えば、担体および／または賦形剤）と混合すること（例えば、ミキサーにより）によって調製される。一部の実施形態では、構成成分は混合されて、均一混合物が得られる。
【０３０２】
一部の実施形態では、飼料添加物は、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞および担体を含むトップドレス動物用飼料添加物（例えば、フリーズドライ細胞）である。一部の実施形態では、担体は、乳清、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、石灰岩（すなわち、炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプンおよびナトリウムシリカアルミネート、ミルク、水ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【０３０３】
一部の実施形態では、動物用飼料添加物は、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）および水溶性担体を含む代用乳のドレンチ剤、噴霧剤または補助食品である。一部の実施形態では、担体は、乳清、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン、ナトリウムシリカアルミネート、ミルク、水およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０３０４】
一態様では、本発明は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、本明細書において開示されているフリーズドライ細胞、例えば本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライ細胞）および／または本明細書において開示されている飼料添加物を含む食物（例えば、動物用飼料）を対象とする。食物生成物は、動物消費（すなわち、非ヒト動物またはヒト）用の任意の食物であり、固形組成物と液体組成物の両方を含む。食物は、以下に限定されないが、一般的な食物；水、ミルク、ビバレッジ、治療用飲料および栄養飲料を含む液体生成物；機能性食物；補助食品；栄養補助食品；早産児用の調製粉乳を含めた乳児用（すなわち、非ヒトおよびヒト乳児を含む）調製粉乳；妊娠または授乳動物用の食物；成体動物用の食物；ならびに老年用食物を含む。一部の実施形態では、食物は、飼料添加物を含む液体（例えば、飲料、例えば、水、ミルクまたは代用乳）を含む。
【０３０５】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）および／または飼料添加物を含む組成物を対象とする。一部の実施形態では、組成物は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む。
【０３０６】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）および／または飼料添加物は、任意の公知技法によって、組成物の要件に基づいて、さらに化学的もしくは物理的に修飾され得るか、または加工され得る。
【０３０７】
本発明の組成物は、１種または複数の賦形剤を含むことができる。一部の実施形態では、賦形剤は、以下に限定されないが、アルカリ剤、安定剤、抗酸化剤、付着剤、分離剤、コーティング剤、外部相構成成分（ｅｘｔｅｒｉｏｒ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、制御放出構成成分、溶媒、界面活性剤、保湿剤、緩衝化剤、充填剤、エモリエント、またはそれらの組合せであり得る。賦形剤は、本明細書において議論されているものに加えて、以下に限定されないが、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（２００５年）に列挙されている賦形剤を含むことができる。本明細書における特定の分類中の賦形剤（例えば、「溶媒」）を含ませることは、賦形剤の役割を制限するのではなく、例示することを意図している。特定の賦形剤は、複数の分類に収まり得る。
【０３０８】
一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物（例えば、非ヒト動物またはヒトの処置のための）である。一部の実施形態では、組成物は、医療用食物（例えば、獣医学的食物）である。医療用食物は、医師（例えば、獣医師）の管理下で、消費されるまたは外部から投与される組成物中に存在する、および認識されている科学的原理に基づいた独自の栄養上の要件が、医療的評価によって確立されている、状態の特定の食事管理を意図する食物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制機関により承認を受けている、または動物、より特にヒトにおいて使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認識されている国際薬局方に列挙されていることを意味する。
【０３０９】
組成物の経口投与の場合、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）または飼料添加物は、当技術分野で周知の賦形剤と組み合わされ得る。このような担体により、本発明のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞または飼料添加物を、例えば、処置される対象による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして配合することが可能となり得る。一部の実施形態では、組成物は、錠剤、丸剤、カプレット剤またはカプセル剤である。好適な賦形剤は、以下に限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールを含む糖；以下に限定されないが、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、ガムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物などの充填剤を含むが、これらに限定されない。所望の場合、以下に限定されないが、架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加することができる。経口的に使用され得る組成物は、以下に限定されないが、ゼラチンから作製されたカプセル剤、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作製された軟質密封カプセル剤を含む。一部の実施形態では、剤形は、菜食主義者用剤形であり、この場合、剤形は、動物源に由来する任意の構成成分から形成されておらず、これらを含有しない。一部の実施形態では、菜食主義者用剤形は、菜食主義者用カプセル剤である。
【０３１０】
一態様では、本発明は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）および／または本明細書において開示されている飼料添加物を含むカプセル剤を対象とする。一部の実施形態では、カプセル剤は、ゼラチンカプセル剤である。一部の実施形態では、カプセル剤は、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、または本明細書において開示されている飼料添加物を含む。一部の実施形態では、カプセル剤は分解性である。一部の実施形態では、カプセル剤は、分解性ゼラチンカプセル剤である。
【０３１１】
別の態様では、本発明は、嫌気性細菌細胞を含むカプセル封入したフリーズドライ組成物であって、フリーズドライ粉末が、加熱油にフリーズドライ粉末を分注することによってカプセル封入される、カプセル封入したフリーズドライ組成物を対象とする。別の態様では、本発明は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含むカプセル封入したフリーズドライ組成物であって、フリーズドライ粉末が、加熱油にフリーズドライ粉末を分注することによってカプセル封入される、カプセル封入したフリーズドライ組成物を対象とする。
【０３１２】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されている、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物、食物および／または組成物を含むキットまたはパッケージを対象とする。キットまたはパッケージは、飼料添加物、食物、組成物またはそれらの組合せのユニット（例えば、１つまたは複数のユニット）を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されているカプセル剤を含む。
動物に嫌気性細菌細胞、好気性細菌細胞および／または酵母細胞を投与する方法
【０３１３】
一態様では、本発明は、動物にＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を投与する方法を対象とする。
【０３１４】
一態様では、本発明は、動物にＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ細胞を投与する方法を対象とする。
【０３１５】
一態様では、本発明は、動物に嫌気性細菌細胞を投与する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、動物に、Ｂ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｌ．ｃａｓｅｉ細胞などのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を投与する方法を対象とする。
【０３１６】
一態様では、本発明は、動物に好気性細菌細胞を投与する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、動物にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞などのＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を投与する方法を対象とする。
【０３１７】
一態様では、本発明は、動物に酵母細胞を投与する方法を対象とする。別の態様では、本発明は、動物にＳ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞などのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞を投与する方法を対象とする。
【０３１８】
一部の実施形態では、方法は、動物に、本明細書に記載されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物、食物、または組成物（例えば、カプセル剤）を投与するステップを含む。
【０３１９】
投与は、例えば、経口的なもの（すなわち摂取可能な液体もしくは固体、経口用ドレンチ剤、飼料添加物、食物、組成物またはカプセル剤）を含めた適合可能な任意の経路によって、または身体上に噴霧する（すなわち、ミスト噴霧することによって）および／もしくは注射によることができる。
【０３２０】
一部の実施形態では、方法は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を含む固体、液体またはゲルを投与するステップを含む。
【０３２１】
一部の実施形態では、方法は、細胞を含む固形飼料添加物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、固形飼料添加物は、粉末（例えば、流動性粉末）、細粒（すなわち、顆粒）、粒子（すなわち、微粒子）、ペレット、ケーキ、水溶性濃縮物、ペースト、ボーラス、錠剤、微粉、それらの構成成分またはそれらの組合せである。
【０３２２】
一部の実施形態では、方法は、細胞を含む液体飼料添加物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を液体で投与するステップを含む。一部の実施形態では、液体は、溶液（例えば、水性、有機または水性有機溶液）、懸濁液、エマルション、ドレンチ剤、噴霧剤、注射剤、飲料（例えば、代用乳）、それらの構成成分またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、液体は、経口的に、または動物に液体を噴霧することによって投与される。
【０３２３】
一部の実施形態では、方法は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、または細胞を含む飼料添加物を、動物用飼料に添加するために、別の動物用飼料添加物と組み合わせて、補助食品またはプレミックスを形成するステップを含む。一部の実施形態では、他の飼料添加物は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ以外の細胞を含む。
【０３２４】
一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）は、液体（例えば、ブロス中、または例えば、再水和フリーズドライ細胞を含めたブロス等価物）、復元細胞ペーストとして、または凍結乾燥（例えば、フリーズドライ）細胞として、飼料添加物に添加され得る。フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを含む微生物はまた、飼料添加物への添加前に、カプセル封入され得る。剤形（例えば、所定の体積のドレンチ剤またはカプセル剤）もまた、形成され得、所望の場合、微生物は、動物用飼料の上から液体ブロスおよび／もしくはフリーズドライ細胞をまき散らすことにより、または飼料に混合することによって、飼料に、直接添加され得る。
【０３２５】
一部の実施形態では、方法は、固形飼料添加物（例えば、粉末、顆粒、微粒子、ペレット、ケーキ、フリーズドライ細胞またはそれらの組合せ）を再水和して、投与用の液体を生成するステップを含む。
【０３２６】
一部の実施形態では、方法は、バッチごとを含めて、固形飼料添加物またはフリーズドライ細胞を再水和する送達系により、動物用飼料にＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を適用するステップを含む。例えば、フリーズドライ粉末は、粉末を希釈し、これを混合される飼料に噴霧するフラッシングシステムにポリビニル製ホッパーから予測することができる。
【０３２７】
一部の実施形態では、方法は、保管用ビンを備える体積計量用装置を使用して、動物用飼料にＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞を適用するステップを含む。例えば、フリーズドライ細胞（例えば、細胞を含む粉末）は、保管用ビン中で保管され、動物用飼料に噴霧される直前に、水または水浴に投入され得る。
【０３２８】
一態様では、本発明は、動物の胃腸管における乳酸産生に関連する状態または障害を処置または予防するための方法であって、動物に、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物（例えば、カプセル剤）の有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。
【０３２９】
一部の実施形態では、状態または障害は、アシドーシスである。一部の実施形態では、状態または障害は、第一胃アシドーシスである。一部の実施形態では、状態または障害は、呼吸器疾患である。一部の実施形態では、状態または障害は、蹄葉炎である。一部の実施形態では、状態または障害は、感染症である。一部の実施形態では、感染症は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによるものである。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａおよび／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉである。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび／またはＥｎｔｉｒｉｔｉｄｉｓである。一部の実施形態では、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉである。
【０３３０】
別の態様では、本発明は、動物の胃腸管における日和見微生物の増殖を予防するまたは低下させるための方法であって、動物に、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。
【０３３１】
一部の実施形態では、日和見微生物は、病原性である。一部の実施形態では、日和見微生物は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａおよび／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉである。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび／またはＥｎｔｉｒｉｔｉｄｉｓである。一部の実施形態では、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉである。
【０３３２】
別の態様では、本発明は、動物の食餌における植物由来のリンの生体利用率を改善する方法であって、動物に、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態では、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞は、フィターゼ活性を含む。一部の実施形態では、方法は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の非存在下で、動物用食餌の投与に起因する環境上のリン廃棄物を低減する。
【０３３３】
別の態様では、本発明は、動物の成長成績を改善する方法であって、動物に、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態では、動物の成長成績の改善は、飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、飼料転換比、枝肉の重量増加、ミルク生産動物におけるミルク生産量、家禽における産卵数、骨石灰化またはそれらの組合せの改善である。
【０３３４】
別の態様では、本発明は、動物の胃腸管下部を酸性化する方法であって、動物に、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の有効量を投与するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態では、胃腸管下部は、家禽動物の盲腸である。
【０３３５】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物または本明細書において開示されている組成物は、動物に食物を与える前、それと同時に、またはその後に投与される。
【０３３６】
一部の実施形態では、方法は、投与前に、本明細書において開示されているフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライ細胞または本明細書において開示されている固形飼料添加物を液体と混合するステップをさらに含む。
【０３３７】
一部の実施形態では、液体は、経口（例えば、経口用ドレンチ剤）的に、または動物に液体を噴霧する（例えば、ミスト噴霧することによって）ことにより投与される。
【０３３８】
一部の実施形態では、方法は、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の単回投与を含む。
【０３３９】
一部の実施形態では、方法は、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の毎日の投与を含む。一部の実施形態では、投与は、少なくとも毎日１回、少なくとも毎日２回、少なくとも毎日３回、または毎日３回より多い。一部の実施形態では、投与は、自由（例えば、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、飼料添加物または組成物を含む、利用可能な液体を飲むまたは利用可能な食物を食することによる自己投与）である。
【０３４０】
一部の実施形態では、方法は、１日に、本明細書において開示されているＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞（例えば、フリーズドライ細胞）、本明細書において開示されている方法によって生成されるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞、本明細書において開示されている飼料添加物、または本明細書において開示されている組成物の１回より多い投与を含む。一部の実施形態では、投与は、１日に、２回、３回、４回、５回、６回またはそれより多い投与である。一部の実施形態では、方法は、１日に１回より多い投与の後、投与なしの１日または複数日を含む。一部の実施形態では、投与なしの１日または複数日は、投与なしの１、２、３、４、５または６日間、１週間、２週間、３週間または４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月または６か月である。
【０３４１】
一部の実施形態では、動物は、反芻動物である。一部の実施形態では、反芻動物は、以下に限定されないが、ウシ、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、シカ、トナカイ、オオジカ、キリン、ヤクおよびヘラジカであり得る。一部の実施形態では、反芻動物は、ウシ、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、シカおよびトナカイからなる群から選択される。
【０３４２】
一部の実施形態では、動物は、非反芻動物である。一部の実施形態では、非反芻動物は、以下に限定されないが、ウマ科、家禽、ブタ、イヌおよびネコであり得る。一部の実施形態では、非反芻動物は、ウマ科、家禽およびブタからなる群から選択される。
【０３４３】
一部の実施形態では、動物は、動物園の動物である。
【０３４４】
一部の実施形態では、動物は、家禽動物である。一部の実施形態では、家禽動物は、以下に限定されないが、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウ、ハト、エミューまたはダチョウを含めた、食用動物として使用される、鳥類（すなわち、トリ）である。一部の実施形態では、家禽動物は、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウまたはハトからなる群から選択される。一部の実施形態では、家禽動物は、ブロイラー、ブロイラー種ニワトリおよび産卵用ニワトリからなる群から選択される。一部の実施形態では、家禽動物は、ニワトリである。
【０３４５】
一部の実施形態では、動物は、ウマ科である。一部の実施形態では、ウマ科は、ウマ、ポニー、ロバまたはラバである。
【実施例】
【０３４６】
これより、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上の説明と共に、本発明の一部の実施形態を非限定的様式で例示する。
（実施例１）
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの液体培養物の収量に対する温度の効果
【０３４７】
０、７、１４、２１および２８日後に、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５の液体培養物（Ｌａｃｔｉｐｒｏ（登録商標））中の細胞の生存率を評価するため、４℃、２０℃および３９℃の保管温度を試験した。結果により、４℃において生成物を保管すると、サンプリング日に関係なく、２０℃または３９℃での保管に比べて、培養物の生存率が大幅に改善（Ｐ＜０．００１）することが明らかになった。２８日後、４℃で保管した生成物は、２０℃または３９℃で保管した生成物の場合、それぞれ１ミリリットルあたり１．２６×１０６および６．３×１０５のコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）と比べて、３．９８×１０６ＣＦＵ／ｍＬを有した（Ｐ＜０．０１；図１）。したがって、結果は、保管温度を低下すると、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５の液体培養物の生存率が改善することを示す。
【０３４８】
別個の研究からの追加データにより、室温において０、７、１４、２１および２８日間保管した後に、液体培養物中のＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５（Ｌａｃｔｉｐｒｏ  ａｄｖａｎｃｅ（登録商標））の収率は、低下することが示される（図２）。
（実施例２）
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの培養物を濃縮するためのタンジェンシャルフロー濾過の使用
【０３４９】
タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を、ハイスループットで多量の培養物を濃縮するための方法として検討した。
【０３５０】
パイロットスケールのＴＦＦシステム（図３を参照されたい）を、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの生産ラインに統合し、５００リットル（Ｌ）の生産実施について試験し、７０％、８０％および９０％の体積低下レベルでパイロットスケールシステムを評価した。１つのＲＣ１００ｋＤａ膜（０．８７５ｍｍのチャネル高さ）を備えるＴＦＦモジュールを使用した。合計で９回の実施に対する各低下レベルについて、３回の生産実施を行った。各実施のため試料を採集し、ｐＨ、光学密度（ＯＤ）、好気性汚染物の有無、オスモル濃度、揮発性脂肪酸プロファイル、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度および増殖特徴について分析した。濾過の開始前の９つのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養物（「非フリーズドライ」）、システムにより除去された体積である透過液（「透過液」）から、および体積低下後に残留している細胞を含む濃縮Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養物体積である保持液（「保持液」）から試料を採集した。
【０３５１】
濃縮プロセスの初期、中期および終期に採集した透過液試料は、体積低下レベル全体にわたり、一貫したＯＤ読取り値を有しており、すべてが、０．０４５未満であった（データは示さず）。濃縮プロセスにわたって透過液中で回収されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの量は増加した（Ｐ＝０．０００６）が、保持液中で採集した細胞の量と比べて、依然として無視できた（３×１０４ＣＦＵ／ｍＬ未満）（＜０．００２％）。体積低下レベルは、透過液中で回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃縮物に対して効果を有しなかった（Ｐ＞０．９；表２）。
【表２】
2020508696.tif 000004
【０３５２】
保持液中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの収量は、各バッグ詰めプロセスの初期、中期または終期に採集したバッグで差異はなかった（Ｐ＝０．６０８８；データは示さず）。保持液の収量は、体積低下レベルによって影響を受けた（Ｐ＜０．０００１；表２および図４）。９０％の体積低下保持液は、７０％および８０％の体積が低下した保持液よりも高い収量を有した（Ｐ＜０．０００１）。しかし、７０％および８０％の保持液は、互いに差異はなかった（Ｐ＞０．０９）。
【０３５３】
濾過プロセスは、ＳＤＬ−２０培地に戻して接種した場合、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞が増殖する能力に影響を及ぼさなかった（表３）。対数期の傾きは、体積低下レベルによって影響を受けなかった（Ｐ＞０．３）が、試料のタイプによって影響を受けた：「保持液」対「非フリーズドライ」（Ｐ＜０．００１）。時間のずれは、体積低下レベルおよび試料タイプの両方によって影響を受けた（Ｐ＜０．００１）。保持液に関する時間のずれは、体積低下の増加に伴って低下し、これは、より高い細胞濃度を代表した。
【表３】
2020508696.tif 000005
（実施例３）
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉに関する凍結およびフリーズドライパラメーター
Ａ．保持液の凍結およびフリーズドライ
【０３５４】
ＴＦＦによって得られた保持液を使用して、凍結プロトコール、凍結保護物質の含有、および様々なフリーズドライパラメーターを試験した。
【０３５５】
保持液を滅菌、脱気した血清ボトルに移し、様々な凍結保護物質配合物（ｗ／ｖ）：凍結保護物質なし（Ｃｔｒｌ）、脱脂粉乳（ＳＭ）、トレハロース（Ｔ）およびベタインと無菌混合した。適切な凍結保護物質と混合した保持液をサンプリングして、フリーズドライ前のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度（すなわち、生存数）を決定した。混合物を１０ｍＬのバイアル（４ｍＬ／バイアル）に移して、液体窒素中で急凍結するか、または−８０℃で一晩、ゆっくりと凍結した。緩慢または急速なサイクルのいずれかを使用して、バイアルを凍結乾燥させるフリーズドライ機に移した。フリーズドライが完了すると、嫌気性チャンバー中の凍結乾燥生成物を嫌気性希釈剤で再懸濁して、これを室温で４０分間再水和し、次いで、ＳＤＬ２０寒天にプレート培養することによって、細菌の生存を決定した。
【０３５６】
細胞喪失は、フリーズドライ後に回収されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの濃度を凍結保護物質と混合したまたは混合しない対応する保持液中で測定されるＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの初期濃度から減算することにより算出した。ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェアを使用して、体積低下レベル（７０％、８０％または９０％）、フリーズドライサイクル（緩慢対急速）、凍結方法（−８０℃対液体窒素）、凍結保護物質（なし、ベタイン、トレハロース、脱脂粉乳、マルトデキストリン、トレハロース／脱脂粉乳（Ｔ／ＳＭ）およびマルトデキストリン／脱脂粉乳（Ｍ／ＳＭ））の間での相互作用を分析することにより、細胞喪失データを算出した。
【０３５７】
他の基準にかかわらず、対照処置（凍結保護物質なし）において観察された細胞喪失は、５Ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）またはそれより高かった。同様に、他の基準にかかわらず、ベタイン処置において観察された細胞喪失は、３．９６Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬまたはそれより高かった。許容される細胞喪失限界値は、１．６ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬに設定した。Ｔ／ＳＭまたはＭ／ＳＭと混合した保持液は、緩慢または急速サイクルを使用して、−８０℃で凍結してフリーズドライしたＴ／ＳＭを除いて、使用したフリーズドライサイクルまたは凍結方法にかかわらず、すべてがその閾値未満であった（図５）。
Ｂ．保管に対するフリーズドライ条件の効果
【０３５８】
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を、濾過装置を使用して１０×に濃縮し、様々な特徴：急速または緩慢な初期凍結（液体窒素対−２０℃）、トレハロースを用いるまたは用いない（０％、４％、７．５％および１０％）、および穏やかまたは急速なフリーズドライサイクル（２×１０−６Ｔｏｒｒで３８時間対１３５×１０−６Ｔｏｒｒで１６．５時間）を試験するフリーズドライアッセイを行った。試験したフリーズドライプロセスはすべて、生成物を、再水和後、室温で４〜１２か月の長期保管後でさえも、培養物の増殖を開始するのに十分な生存率を保持させることができた。それでも、使用されるフリーズドライ特徴に依存する細菌生存率の差異が観察された（図６）。最終水分活性を０．０４より高く維持する、緩慢凍結、７．５％トレハロース配合および穏やかなフリーズドライステップは、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉのより高い生存を伴った。
Ｃ．フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの生存率に対する凍結保護物質の効果
【０３５９】
遠心分離したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞濃縮物を、凍結乾燥前に乳児用調製粉乳に再懸濁させて、細胞を続いて再水和させると、細胞生存率が１ｌｏｇしか低下しなかった。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃縮物への４％のトレハロースおよび７．５％の脱脂粉乳の添加を試験した後、−８０℃で緩慢凍結、または液体窒素中で急凍結して、初期凍結プロセス中に遭遇する細胞喪失を決定した。図７に示されている通り、４％のトレハロースまたは７．５％の脱脂粉乳と共に急凍結すると、生存細胞の最高回収率を得た（生存細胞数が０．７９ｌｏｇの低下）。凍結保護物質を添加しない生成物は、使用した凍結技法にかかわらず、２．３４〜１．９５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの間のＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉを失った。
（実施例４）
フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの収量および安定性に対する保管条件の効果
【０３６０】
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５の増殖特徴および保存可能期間に対するフリーズドライプロトコールおよび保管条件の効果を決定するため、９０％の体積低下から得られた保持液を、急速サイクルを使用して、８％トレハロース／１５％脱脂粉乳（Ｔ／ＳＭ）または８％マルトデキストリン／１５％脱脂粉乳（Ｍ／ＳＭ）と混合し、−８０℃または液体窒素（ＬｉｑＮ）中で凍結し、フリーズドライした。次に、増殖曲線分析およびスプレッドプレート培養技法を使用して、０、２、４、８、１２、１６、２０および２４週間、好気性または嫌気性条件において、４℃または２５℃で保管している間の、細菌の増殖特徴および細胞生存について、保持液試料を試験した。手短に述べれば、保管した生成物をサンプリングし、段階希釈し、ＳＤＬ寒天プレートにプレート培養した。さらに、増殖培地（ＳＤＬ）に再水和フリーズドライ生成物を接種（１：１００）して、培養物が定常期に到達するまで、光学密度（ＯＤ、６００ｎｍ）を記録した。実験を異なる３日間、繰り返し、すべての処置は、三連で行った。希釈しないと、吸光度は、脱脂粉乳の存在のために限界値を超えるので、増殖曲線を作製するため、再水和フリーズドライ試料を希釈した。増殖曲線の比較を容易にするため、対照として使用した非フリーズドライ試料に同じ希釈を行った。
【０３６１】
結果：試料をフリーズドライし、６か月間、好気性または嫌気性条件下で、室温または４℃で保管した。処置にかかわらず、好気性条件で保管した試料は、わずか２週間の保管後に、０．４〜３．２Ｌｏｇの範囲の嫌気性相当物と比べて、急速に崩壊しさらなる細胞喪失を伴った。これらの結果に基づき、図面の明確さを改善するため、嫌気的に保管したフリーズドライ生成物において観察された細胞喪失のみ図８に提示する。嫌気性条件での保管の間、室温で保管した試料は、液体窒素中に凍結させたＴ／ＳＭ試料を除いて、４℃で保管したそれらの相当物よりも速く崩壊した。液体窒素中で凍結し、フリーズドライ後に室温で保管したＴ／ＳＭ試料は、１６週間の保管期間にわたり、４℃で保管したそれらの相当物よりも統計的に多く細胞を失うことはなかった（Ｐ＞０．１）。しかし、２０週間の保管後に、室温と４℃での保管の間で、試料間の差異は顕著となり（Ｐ＝０．０００２）、２０週間後に０．８４ｌｏｇの差異、２４週間の保管後に０．８９ｌｏｇの差異となった。Ｍ／ＳＭ試料はすべて、それらのＴ／ＳＭ相当物よりも速く崩壊した。２４週間の保管後（図９）、液体窒素中で凍結し、嫌気性条件下、４℃で保管したＴ／ＳＭ試料の細胞喪失は、他の処置のいずれよりもかなり低かった（Ｐ＜０．０２）。液体窒素中で凍結し、嫌気性条件下、４℃で保管したＴ／ＳＭ試料は、フリーズドライ前に観察されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度に比べて、２．１６ｌｏｇの喪失を有し、０．８２ｌｏｇ喪失が、２４週間の保管期間から生じた。各サンプリング日に、フリーズドライ生成物と非フリーズドライ生成物との増殖特徴を比較するため、増殖曲線実験を行った。図１０は、液体窒素中で凍結し、急速サイクル（２５０ｍＴｏｒｒで１８．５時間）でフリーズドライし、４℃または室温で嫌気的に保管した試料に関して作製した増殖曲線を示す。各増殖曲線に使用した非フリーズドライ試料は、「新しい」（２日間以下の古さ）であった。４℃で保管したフリーズドライ生成物は、室温で保管したフリーズドライ生成物よりも短い時間のずれを有し、これは、これらの試料において観察されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度の差異と一致する（表４）。Ｔ／ＳＭ試料は、保管温度にかかわらず、１６週間の保管後に、Ｍ／ＳＭ試料よりも短い時間のずれを有した。
【表４】
2020508696.tif 000006
【０３６２】
１２週間、２５℃で保管した、非フリーズドライおよびＭＳＭ処置、ならびに１６週間、２０℃で保管したＭＳＭ処置の傾きは、異常に低かった（表５）。２０および２４週間の保管後、フリーズドライ試料の対数期の傾きは、非フリーズドライ対照と、数字上、差異はなかった。
【表５】
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（実施例５）
ウシにおけるフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの効力および安全性
Ａ．フリーズドライ生成物の調製および保存可能期間。
【０３６３】
実験の開始の５６日前に、前もって再水和したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養物（再水和およびトップドレス処置のため）としてこの試験において使用したバイアルを調製し、使用を待つ間、４℃で冷蔵庫で保管した。各バイアルは、５ｍＬのフリーズドライ生成物の等価物を含有した。バイアルを、６つの異なるフリーズドライの実施で、フリーズドライした。各実施について、３つのバイアルをフリーズドライ後に再水和し、３つの追加のバイアルを、研究の当日に再水和し、バイアルあたりのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度を決定した（表６）。再水和およびトップドレス群からの動物各々に、１．８４×１０１０ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉに等価なバイアルの内容物をドレンチで与えた。
【表６】
2020508696.tif 000008
【０３６４】
実験の開始後、実施＃５および＃６からの余分のバイアルを４℃で維持し、これらの実施の各実施からの３つのバイアルを、毎月、再水和した（図１１）。
【０３６５】
バイアル中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、４℃で１１か月間の保管の間、４．９６×１０１０ＣＦＵ／ｇから４．１７×１０１０ＣＦＵ／ｇに変化し、わずか０．０７ｌｏｇの収量喪失を示した。
【０３６６】
実験の開始の約３０日前に、毎日のトップドレスＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ培養物としてこの試験において使用した生成物（トップドレス処置）を調製し、ポリフォイルバッグ中で、冷蔵庫に保管した。トップドレス生成物を、６つの異なるフリーズドライの実施においてフリーズドライし、１５個の個々のポリフォイルバッグ（飼料に対して１バッグ／日）にパッケージングし、窒素でフラッシュし、密封し、使用するまで−８０℃に保管した。各フリーズドライの実施について、３つのパッケージを、フリーズドライ後に再水和した。平均Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、４×１０１０ＣＦＵ／パッケージであった。３つの追加のパッケージを各週の開始時に再水和し、使用して、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞に再水和溶液を添加し、細胞を４０分間置き、細胞を希釈させ、細胞をプレート培養することによって、毎日、動物に与えたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度を決定した（図１２）。統計分析により、経時的な細胞濃度の増加が示された。生成物はすべて、研究の開始の３０日前に調製し、トップドレスとして使用した生成物は、研究の終わりには、約８０日の古さであった。動物は、毎日、平均で２．１９×１０８ＣＦＵのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けた（２．４５×１０１０ＣＦＵ／パッケージ）。
Ｂ．ウシでの研究
【０３６７】
去勢牛（ｎ＝４６２；初期体重９００ｌｂｓ）を体重ごとにブロック分けして、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けない対照群（１７の畜舎；７頭／畜舎）；前もって２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ（１０１０ＣＦＵのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５）を含有する５０ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ生成物を受けた非フリーズドライ群（１６の畜舎；７頭／畜舎）；前もって、投与直前に再水和した凍結乾燥培養物（１０１０ＣＦＵのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５）を受けた再水和群（１６の畜舎；７頭／畜舎）；ならびに前もって、投与直前に再水和された凍結乾燥培養物（１０１０ＣＦＵのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５）、および研究期間の間、毎日、トップドレスとして食餌に配合した凍結乾燥生成物（１０８ＣＦＵのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５、毎日；１７の畜舎；７頭／畜舎）を受けたトップドレス群からなる４つの処置の１つに無作為に割り当てた。去勢牛の非フリーズドライ群、再水和群およびトップドレス群を、前もってＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉのドレンチ剤を受けた後に１０日間のステップアッププログラムに入れた一方、対照群は、２１日間のステップアッププログラムに入れた。最初の配給分を与えて２６時間後に、第一胃穿刺により第一胃液を抽出した。ｐＨ、揮発性脂肪酸濃度、内毒素レベルおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消失アッセイにおける乳酸の利用能に関して、第一胃液の試料を分析した。ラクテート消失アッセイに関すると、半規定ラクテート培地を含有する１０本の１０ｍＬ管に、０．１ｍＬの第一胃液を接種した。６時間ごとに、２４時間、二連で光学密度を測定し、一次基質として、乳酸による増殖の能力を評価した。乳酸濃度を続けて決定するため、光学密度を観察した直後に、管を冷凍庫に入れた。畜舎あたり１頭の去勢牛に、連続高周波ボーラスを装着し、５６日間の研究にわたり、ｐＨ測定値を追跡した。０、２８および５６日目に去勢牛を秤量して、１日あたりの平均体重増加、乾燥物質の摂取および飼料効率を決定した。
【０３６８】
動物によって摂取された生存可能なＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを評価するため、フリーズドライ生成物を、アルミニウム製鍋中で無菌化粉砕トウモロコシにトップドレスして、実験室中または日なたの室外で周囲大気への曝露の０、１、２および４時間後に試料を採集した。この実験を、２０１６年７月および８月にわたって、４回繰り返した（図１３）。統計分析により、曝露時間対保管条件の相互作用（Ｐ＝０．０００７）、曝露時間の効果（Ｐ＜０．０００１）および保管条件の効果（Ｐ＜０．０００１）が明らかになった。粉砕トウモロコシと混合し、実験室中の大気に曝露したフリーズドライ生成物中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、４時間の曝露中、数値的に低下したが、その初期濃度から著しい差異はなかった。室外条件に曝露した試料中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、かなり速く低下した。１時間の曝露後、最初に存在したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの６．４％のみが回収された。室外条件に曝露した試料中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、初期濃度、ならびに２および４時間の曝露後に室温で維持したそれらの相当物と著しい差異があった。これらの試料中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、大きな標準偏差によって示される通り、実験ごとに非常に変動があった。これは、室外条件（熱および湿度）の差異に起因している可能性があるが、熱および湿度に多少なりとも耐性を有し得る、使用されたフリーズドライ生成物の差異によっても起因している可能がある。動物研究の間に、給餌直前に、フリーズドライ生成物を粉砕トウモロコシと混合し、次いで、試料を飼い葉桶に入れた際に、速やかにトップドレスした。動物は、粉砕トウモロコシに飛びつき、その結果、フリーズドライ生成物は、混合後、１時間未満に摂食された可能性が高かった。生成物は１時間以内に摂食されたと仮定すると、動物は、約１．４×１０７ＣＦＵ／頭／日の生存細胞を受けたはずである（トップドレス生成物２．２×１０８ＣＦＵ／頭／日中、６．４％の平均濃度）。
【０３６９】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置した去勢牛の加速ステップアップにより、類似した２８日間の体重（Ｐ＝０．５３；表７）、１日あたりの平均体重増加（Ｐ＝０．７１）および飼料効率（Ｐ＝０．６９）がもたらされた。トップドレス処置は、対照よりも乾燥物質の摂取は低かった（Ｐ＝０．０５）。給餌の最初の５６日間にわたる飼養場成績は、処置間で類似した結果を生じた（Ｐ＞０．１０）。保守的な２１日間のステップアップ期間を受けた対照の場合、処置間のこれらの類似性により、ウシの健康または飼養場成績に悪影響を及ぼすことなく、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置の３つの形態のいずれかを使用する加速ステップアッププログラムが実施可能であることが示される。
【０３７０】
第一胃液のｐＨ（最初の食餌を与えて２６時間後に抽出）は、処置間で類似した（Ｐ＞０．１０；表８）。合計のＶＦＡ濃度に差異があり、トップドレス処置は、他の処置よりも著しく高かった（Ｐ＜０．０１）。トップドレス処置は、再水和処置よりも高いアセテート濃度を有した（Ｐ＝０．０２）。アセテート濃度に著しい差異があったが、アセテート：プロピオネートの比は、処置間で類似した（Ｐ＝０．９６）。他のＶＦＡは、処置間で類似した（Ｐ＞０．１８）。
【０３７１】
第一胃液中の内毒素濃度（最初の食餌を与えて２６時間後に抽出）は、処置間で類似した（Ｐ＝０．３４６２；表１４）。第一胃内の細菌溶解の指標として、内毒素レベルを測定した。アシドーシスに罹患している動物は、１５０，０００ＥＵ／ｍＬを超える内毒素レベルを有することが報告されている。この研究において測定された内毒素レベルは、処置にかかわらず、すべてがその閾値未満であった。
【０３７２】
３２の畜舎中の各々における１頭の去勢牛に、５６日間の研究にわたり、１時間ごとに、第一胃のｐＨ測定値を報告する、留置型第一胃ｐＨプローブ（８頭の去勢牛／処置）を装備した（図１５）。各処置の第一胃の平均ｐＨ測定値を、図１５中に、１時間の間隔で報告する。第一胃のｐＨに関して、処置対日の相互作用（Ｐ＜０．０１）を検出した。第一胃のｐＨに対する処置（Ｐ＜０．０１）および給餌日（Ｐ＜０．０１）の効果もあった。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置の加速ステップアップにより、第一胃の平均ｐＨは、臨床的アシドーシスの状態へと低下しなかった。給餌日数が増加するにつれて、凍結乾燥処置（再水和物およびトップドレス）は、対照および非フリーズドライ処置のそれよりも高い第一胃のｐＨを維持する。
【表７】
2020508696.tif 000009
【表８】
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【０３７３】
光学密度測定を２４時間の期間にわたり６時間の間隔で観察して、半規定ラクテート培地に接種した混合第一胃微生物の増殖曲線を決定し、これらのデータを図１６に提示する。処置と検出時間との間に相互作用があった（Ｐ＜０．０２）。処置（Ｐ＜０．０１）および時間（Ｐ＜０．０１）の個々の効果も見出された。再水和フリーズドライが、毎日フリーズドライ（Ｐ＜０．０２）および対照（Ｐ＝０．００７）よりも高い場合、１２時間まで、処置間の差異は検出されなかった。２４時間時に、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置間に差異はなかったが（Ｐ＞０．１０）、対照処置は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置のすべてよりも微生物増殖は著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。
【０３７４】
図１７は、混合第一胃微生物を接種して、０、６、１２、１８または２４時間、インキュベートした半規定ラクテート培地のＬ−ラクテートの消失を例示する。処置と時間との間の相互作用が、処置（Ｐ＝０．０１）およびインキュベーション時間（Ｐ＜０．０００１）の効果と共に検出された（Ｐ＝０．００７）。非フリーズドライ処置は、時間０において他の処置よりも低いＬ−ラクテートを含有した（Ｐ＝０．０４）。Ｌ−ラクテートの濃度は、６、１２および１８時間の時間点にわたり、処置間で類似した（Ｐ＞０．１０）。上記の光学密度の結果と同様に、対照の去勢牛に由来する第一胃の微生物は、２４時間のインキュベーション時に合計で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置よりもラクテートの利用が少なかった（Ｐ＜０．００３）一方、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置間で差異は検出されなかった（Ｐ＞０．１０）。これらのデータは、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉにより処置された去勢牛に由来する第一胃の微生物は、対照の去勢牛に由来する微生物よりも半規定ラクテート培地中で効率的に増殖していることを例示しており、これらの処置において乳酸利用能力がより高いことを示唆している。さらに、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ処置は、Ｌ−乳酸の利用能力に関して類似した。
【０３７５】
光学密度およびラクテート消失アッセイに使用した試料に関して、ＶＦＡ濃度を測定し、表９に提示する。全ＶＦＡ（Ｐ＝０．００２）、アセテート（Ｐ＝０．０００２）、イソブチレート（Ｐ＝０．０４）、ブチレート（Ｐ＜０．０００１）、イソバレレート（Ｐ＝０．０００７）およびバレレート（Ｐ＜０．０００１）の濃度に関して、ならびにアセテート：プロピオネートの比（Ｐ＝０．０２）に関して、処置対時間の相互作用が検出された。時間の効果は、全ＶＦＡおよびすべての個々のＶＦＡ（Ｐ＜０．０００１）に関して見出された。処置間の差異は、イソブチレート（Ｐ＝０．０２）、ブチレート（Ｐ＝０．０００４）、およびバレレート（Ｐ＝０．００１）に関して見出された。１８時間時のイソブチレートの濃度は、対照および再水和と比べた場合、非フリーズドライ群およびトップドレス処置群（それぞれ、Ｐ＜０．００５およびＰ＜０．００４）では、より低かった。２４時間の時間点において、トップドレスは、非フリーズドライおよび再水和処置よりも少ないイソブチレートを有したが（Ｐ＝０．００２）、対照と類似した（Ｐ＞０．１０）。再水和試料のブチレート濃度は、１８時間のインキュベーション後に、トップドレスのそれよりも高かった（Ｐ＝０．０２）。対照処置は、２４時間で、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置（Ｐ＜０．０００１）よりも少ないブチレートを生成した。ブチレートの差異は、再水和処置よりも高い濃度を含有する非フリーズドライ試料の場合、この時間点でも、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ処置の間で検出された（Ｐ＝０．０１）。１８時間により、他の処置と比べた場合、再水和に対してバレレート濃度がより低いことが明らかになった（Ｐ＝０．０１）。２４時間のインキュベーション時に、バレレートおよびブチレートの濃度に関して、類似の観察を行った。対照は、すべてのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置よりもバレレートを少なく含有した（Ｐ＜０．０００１）一方、濃度は再水和中よりも非フリーズドライ試料中での方が高かった（Ｐ＝０．０３）。他のＶＦＡの場合、処置の主な効果は検出されなかった（Ｐ＞０．０５）。無視できる濃度のイソカプロエート、カプロエートおよびヘプタノエートが測定された。アセテート：プロピオネートの比、および時間の効果（Ｐ＞０．０００１）に関する処置×時間相互作用（Ｐ＝０．０２）が見出されたが、処置間で類似した（Ｐ＝０．５７）。
【表９−１】
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【表９−２】
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（実施例６）
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉのフィターゼ活性
【０３７６】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏフィターゼ活性を評価した。
【０３７７】
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞を、リン源として無機リン酸塩（ＫＨ２ＰＯ４）またはフィチン酸塩のいずれかを含有する半規定ラクテート培地中で、本明細書に記載されている通り、嫌気性条件下で培養した。培養の開始（０時間）から８時間まで、２時間の間隔で、１ミリリットル（ｍＬ）の試料を培養物から取り出し、遠心分離して細胞ペレットを形成した。次いで、モリブデン青法を使用して細胞ペレット中のフィターゼ活性を決定した。Ｙａｎｋｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４巻：１５６５〜１５７３頁（１９９８年）を参照されたい。手短に述べれば、ｐＨ５．０、３７℃で３０分以内のインキュベーションで酵素的開裂によって放出された無機リン酸塩を、７００ナノメートル（ｎｍ）で分光測定法によって定量化し、標準曲線と比較した。フィターゼ活性は、試験条件下、１分あたりに細胞ペレットから放出された無機リンの量として決定した。
【０３７８】
図１８は、フィチン酸塩の存在下または非存在下のいずれかで、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ細胞の増殖により、顕著なフィターゼ活性がもたらされることを示し、これは、（１）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５細胞が、フィターゼを産生する、（２）フィターゼ産生が、培地中のリンの存在により阻害されない、および（３）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉによるフィターゼ産生が、培地中のフィチン酸塩の存在下により多いように見えることを裏付ける。
（実施例７）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ濃度および罹患率に対するＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの効果
【０３７９】
日齢のブロイラーヒナドリ（ｎ＝３８４）を４つの異なる処置群：１）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａを受けない対照群、２）液体Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を含有するボトル式フィーダーに自由に接近できる自由群、３）飼料中に毎日、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を受けるフリーズドライ群、および４）０日目に、液体Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を受ける経口強制飼養群に無作為に割り付けた。
【０３８０】
４つの処置の各々は、それぞれ６羽のトリを含有する１６個のケージによって示した。動物の重量、飼料の消費量および飼料転換は、１５日間の試験期間にわたって記録した。１５日間の給餌期間後、ケージ１個あたり２羽の動物を無作為に選択し、屠殺し、盲腸を回収してＳａｌｍｏｎｅｌｌａ罹患率を決定した。手短に述べれば、盲腸を取り出しＺｉｐｌｏｃバッグに入れ、氷上で保管した。次いで、盲腸を７０％エタノールで洗浄し、手作業で揉んで、内容物を抽出した。回収した内容物の１ミリリットルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に段階希釈し、ブリリアントグリーン寒天（ＢＧＡ）上にプレート培養した。ＢＧＡプレートを３７℃で２４時間、インキュベートした。推定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａコロニー（ピンク色コロニー）を計数し、Ｏｘｏｉｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｌａｔｅｘ  ｔｅｓｔ  ＦＴ０２０３（Ｏｘｏｉｄ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａとして確認した。さらに、盲腸内容物試料の１ミリリットルを、選択的富化のために、９ｍＬのＲａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ（ＲＶ）に添加した。検出可能なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ増殖がＢＧＡプレート上で観察されなかった場合、ＲＶ富化物をＢＧＡプレートにプレート培養し、３７℃で２４時間インキュベートし、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの存在を評価した。直接プレート培養した場合、増殖はないが、ＲＶ富化の場合、増殖が陽性であった試料を、任意計数９（１未満が理論検出限界）とし、直接プレート培養またはＲＶ富化のいずれかにおいて増殖のない試料を計数０とした。
【０３８１】
結果により、フリーズドライした材料を受けたトリは、対照群と比較すると、−１Ｌｏｇの差異で、より低い１ミリリットルあたりのコロニー形成単位数（ＣＦＵ／ｍＬ）中の盲腸のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ濃度を有したことが示された。図１９を参照されたい。対照群と比較した場合、フリーズドライ群の試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの罹患率も、１３％低下した。図２０を参照されたい。
（実施例８）
ブロイラーニワトリの成長成績および盲腸の特徴に対するＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの効果
Ａ．実験設計および処置
【０３８２】
日齢の雄を使用して、無作為完全ブロック設計における３つの処置の２４回の反復を、処置の開始時に１日齢であったＣｏｂｂ５００ブロイラーヒナドリを使用して行った（Ｃｏｂｂ−Ｖａｎｔｒｅｓｓ、Ｓｉｌｏａｍ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ａｒｋａｎｓａｓ）。処置は、経口強制飼養、またはトリおよび対照（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉなし）の身体表面に適用したエアゾール化ミストのいずれかとして投与されたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５（ＭＳ−Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）であった。トリを７２の畜舎に収容し、各畜舎は、実験の開始時に３５羽のトリを含有した（合計で２，５２０羽のトリ）。
【０３８３】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの投与前に、新しい培養物の５Ｌフォイルバッグを激しく振とうして、内容物を均一にした。Ｔｙｇｏｎチューブを使用して、手動操作型投薬用装置をバッグに接続した。投薬用装置のレザーバーは、充填と分注を数回繰り返し、空気を排気した。酸素指示体を含有する培養物がその通常の色調を保持している場合、内容物は、周囲空気を含まないとみなした。
【０３８４】
ヒナドリを３５の群に割り付け、各群の重量を記録した。トリの群は、ブロックごとに処理し、実験処置は、各ブロック内で無作為に割り当てた。
【０３８５】
Ｓｃｏｒｅｘ  Ｃｌａｓｓｉｃ１７３．０５００５自動充填シリンジ（Ｅｃｕｂｌｅｎｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１．９７×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５を含有する新しい培養物０．２ｍＬを経口強制飼養によって、２４の畜舎（３５羽のトリ／畜舎；合計８４０羽のトリ）に投薬した。技術者は、親指および人差し指を使用することによってトリを押さえつけて、くちばしを開けた状態に保持しながら、シリンジの内容物を、トリの口腔に直接投入した。
【０３８６】
噴霧先端部を装備した空気圧式ドレンチ用装置によって適用した、１．９７×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５を含有する新しい培養物のエアゾール化ミストによって、２４の畜舎（３５羽のトリ／畜舎；合計８４０羽のトリ）に投薬した。トリをプラスチック製の桶（５０ｃｍ×３５ｃｍ×４０ｃｍ）に入れて、培養物を畜舎あたり６０ｍＬの量（約１．７ｍＬ／トリ）で、噴霧化ミストとして、トリの身体表面に施用した。
【０３８７】
２４の畜舎（３５羽のトリ／畜舎；合計８４０羽のトリ）は、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉと接触させず、対照として働いた。処置したトリとの交差汚染を防止するため、対照のトリは、処置したトリと接触しなかった指定管理者によってのみ取り扱われ、指定荷台に入れて秤量し、畜舎に移した。一例において、トリの数え間違いがあり、畜舎５１は、技術者の間違いにより、３５羽のトリではなく、３３羽のトリが収容された。
Ｂ．給餌および給水
【０３８８】
水の供給ラインから吊るしたストロー（６本のストロー／畜舎）により、新鮮な水を自由に与えた。ストローの高さは、試験全体を通して、トリの増殖を受け入れるよう調節した。以下の表１０は、実験に使用した食餌を示す。食餌はすべて、畜舎の中央に吊るした重力式フィーダーで与えた。必要に応じて飼料を添加し、研究期間全体を通して、自由な接近を確実にした。畜舎内にトリを入れる前に、５ｋｇのスターター食餌を重力式フィーダーに入れた。
【表１０】
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【０３８９】
スターター食餌は、研究の１６日目に畜舎から除去した。残存した飼料は、秤量し、各フィーダーから除去し、畜舎番号に対応して番号付けしたビンに入れた。フィーダーにグロアー食餌を補充した。このプロセスを研究の３０日目に繰り返し、この機に、グロアー食餌を仕上げ食餌と交換した。３６日目に、実験を終了し、残存した仕上げ餌を秤量して、各畜舎について記録した。
【０３９０】
各期（スターター、グロアーおよび仕上げ）に対する畜舎あたりの全飼料消費量は、添加した飼料量−回収した飼料量として計算した。
【０３９１】
１日あたりのトリあたりの摂取量は、消費した全飼料量÷［畜舎内の１日あたりの羽数×給餌した全日数］として計算した。
Ｃ．トリ重量
【０３９２】
畜舎重量を、各給餌期間（スターター、グロアー、仕上げ）の終わりに記録した。スターター期間の終わり（１６日目）に、各畜舎内のすべてのトリを桶（５０ｃｍ×３５ｃｍ×４０ｃｍ）に入れ、秤量した。桶の重量を総重量から減算して、畜舎内のトリの重量を決定した。グロアー期間の終わり（３０日目）に、各畜舎内のすべてのトリを重量の等しい２つの桶（各１０３ｃｍ×５５ｃｍ×４１ｃｍ）に入れ、秤量し、重量を一緒に加算した。各桶の重量（トリを桶に入れる前に秤量）を総重量から減算して、畜舎中のトリの重量を決定した。仕上げ期間の終わり（３６日目）に、各畜舎のすべてのトリを、重量が等しい２つの桶（各１０３ｃｍ×５５ｃｍ×４１ｃｍ）に入れ、秤量した。この機に、適切な場所で、秤で風袋を計測した。次いで、各桶中のトリの重量を加算して、合計の畜舎重量を決定した。糞の蓄積を補償するために、秤で、再度、畜舎間の風袋を測定した。秤量期間の各々において、トリを桶に入れたときに、羽数の確認を行った。
Ｄ．サンプリング手順
【０３９３】
各週（７、１４、２１、２８および３５日目）に、１〜３羽のトリを各畜舎から無作為に選択し、頸椎脱臼によって安楽死させた。盲腸内容物（０．５ｇ）を採集し、ボルテックスミキサーを使用して、２０ｍＬのＨＤＰＥシンチレーションバイアル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．；０３−３３７−２３Ｂ）中で脱イオン水（２ｍＬ）と混合した。携帯型ｐＨ計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｉｏｎ  ３−ｓｔａｒ携帯型ｐＨ計、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ｐＨを決定した。１部の２５％  ｗ／ｖメタリン酸溶液に盲腸の混合物の４部を添加して、ボルテックスミキサーを使用して均一にした。次いで、試料を１ｍＬのアリコートで、２つのマイクロ遠心管に移し、−１８℃で凍結して、揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の分析に待機した。
【０３９４】
７および２１日目に、盲腸内容物を２つのアリコートに分けた。一方のアリコートをＶＦＡ分析に使用し、上で説明した通り調製した。他方（０．５ｇ）は、個々の２０ｍＬ  ＨＤＰＥシンチレーションバイアル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．；０３−３３７−２３Ｂ）に直接入れて、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、細菌数の定量のするため、凍結した（−８０℃）。
Ｅ．盲腸のｐＨおよび揮発性脂肪酸の分析
【０３９５】
以前に希釈し、酸性化した盲腸試料を解凍し、ボルテックスミキサーを使用して均一にし、２４  ｘ  ｇで１８分間遠心分離した。水性上澄み液をガスクロマトグラフィー用バイアルに移した。ＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ×０．５ｍｍフィルム厚さ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および水素炎イオン化検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ７８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、揮発性脂肪酸を測定した。２２ｃｍ／ｓの流速、１μＬのスプリット注入およびスプリット流５０：１で、キャリアガスとしてヘリウムを使用した。初期オーブン温度を８０℃とし、温度を１０℃／分で２２０℃に昇温した。導入口および検出器温度は２５０℃とした。揮発性脂肪酸は、アセテート、プロピオネート、イソブチレート、ブチレート、イソバレレート、バレレート、イソカプロエート、カプロエートおよびヘプタノエートを含有する、公知の標準品（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｖｏｌａｔｉｌｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｉｘ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と比較することによって定量した。
Ｆ．枝肉測定
【０３９６】
トリを５週齢で屠殺して、枝肉測定値を決定した。屠殺の約４時間前に、給餌を止めた。５羽の平均サイズのトリを各畜舎から選択して、加工領域に輸送するため、捕獲箱に入れた。５羽のトリを畜舎ごとに秤量して、生重量を決定し、この直後に、気絶させて全血採取することによって屠殺した。トリを２分間出血させ、次いで、６３℃の回転式煮沸器に約３０秒間入れた。羽を除去するため、トリを回転ドラム式機械摘採機に３０秒間移した。脚部、頭部およびすねを除去し、肛門周辺の切開部から、枝肉の内臓を取り除いた。次いで、枝肉を畜舎ごとに秤量して、温枝肉収量を決定した。
Ｇ．統計分析
【０３９７】
ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェアバージョン９．４の複合手順を使用してデータを分析した。モデルは、処置の固定効果、ブロックの変量効果、および実験単位としての畜舎を含んだ。有意性は、Ｐ＜０．０５で示した。最小二乗平均値間の差異は、ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェアのＰＤｉｆｆオプションを使用して決定した。
Ｈ．結果
【０３９８】
ブロイラーは、処置間で、類似した飼料摂食量、飼料効率、および１日あたりの平均体重増加であることを実証した。トリ重量および死亡率も、処置によって影響を受けなかった。しかし、対照のトリまたはエアゾール化ミストとしてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたトリのものと比べて、経口強制飼養としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたトリの場合、枝肉量はより少なかった。
【０３９９】
盲腸のｐＨは、対照のトリのものと比べて、ミストまたは経口施用のいずれかによって、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたトリでは、より低かった（Ｐ＜０．０１；表１１）。
【表１１−１】
2020508696.tif 000014
【表１１−２】
2020508696.tif 000015
【０４００】
対照、エアゾール化ミストおよび経口強制飼養の処置に対する盲腸の平均ｐＨは、それぞれ、６．７６、６．６３および６．６０であった。処置対日の相互作用を、盲腸のアセテート（Ｐ＜０．０１）、プロピオネート（Ｐ＝０．０３）、ブチレート（Ｐ＜０．０１）、アセテート：プロピオネートの比（Ｐ＝０．０１；Ａ：Ｐ比）、カプロエート（Ｐ＝０．００２）および全ＶＦＡ（Ｐ＜０．０１）濃度に関して検出した（表４）。アセテートは、７日目から１４日目に増加し、１４日目にピークとなった。経口強制飼養としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたトリの盲腸内容物は、１４日目の対照のトリのものよりも、高いアセテート、ブチレートおよびカプロエート濃度含有した（Ｐ＜０．０１）。２１日目までに、すべての処置にわたり、アセテート濃度は低下したが、盲腸中のアセテートの濃度は、エアゾール化ミストまたは経口強制飼養のいずれかにより処置されたトリと比べた場合、対照のトリでは高かった（Ｐ＜０．０１）。プロピオネートおよびブチレート濃度は、２１日目に、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉにより処置されたトリのものよりも、対照のトリの盲腸内容物において、やはり高かった（Ｐ＜０．０１）。プロピオネート濃度は、すべての処置において２１日目にピークとなり、３５日目まで上昇し続けたが、それらは、２８日目から３５日目までの処置にわたり差異がなかった（Ｐ＞０．０５）。Ａ：Ｐ比は、７日目に、対照に比べて、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉにより処置したトリの盲腸内容物においてより大きく、Ａ：Ｐ比は、対照、エアゾール化ミストおよび経口強制飼養で、それぞれ、３１．９６、４１．３３および４２．０３であった。１４日目の、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ（４０．４４ｍＭ）のエアゾール化ミストにより処置したトリの盲腸のＡ：Ｐ比は、対照のトリ（２９．８０ｍＭ）またはＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの経口強制飼養を受けたトリ（３３．６９；Ｐ＜０．０３）のＡ：Ｐ比よりも大きかった。盲腸のＡ：Ｐ比は、２１日目〜３５日目の処置にわたり、差異はなかった（Ｐ＞０．０５）。盲腸内容物中のイソブチレート、バレレート、イソバレレート、イソカプロエートおよびヘプタノエート濃度は、処置によって影響を受けなかった（Ｐ＞０．１０）。盲腸のＶＦＡ濃度の合計は、１４日目の対照のトリに比べて、経口強制飼養されたトリにおいてより大きかった（Ｐ＜０．００１）。しかし、ＶＦＡ濃度の合計は、２１日目では、対照（８７．５７ｍＭ）のものよりも、エアゾール化ミストまたは経口強制飼養（それぞれ、６４．９０ｍＭおよび６４．８２ｍＭ）としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたトリの盲腸内容物中では低かった（Ｐ＜０．０５）。盲腸のＶＦＡ濃度の合計は、７日目、２８日目および３５日目の処置にわたり類似した（Ｐ＞０．３０）。
（実施例９）
ブロイラーニワトリの成長成績に対するＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの効果
Ａ．実験設計および処置−研究１
【０４０１】
処置の開始時に１日齢であったＣｏｂｂ５００ブロイラーヒナドリ（Ｃｏｂｂ−Ｖａｎｔｒｅｓｓ、Ｓｉｌｏａｍ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ａｒｋａｎｓａｓ）を使用して、バタリーによっておよび段によってブロック分けした、６つの処置の１８回の反復を行った。処置は、対照（プロバイオティックなし）、経口強制飼養として投与した、Ｌａｃｔｉｐｒｏ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５の非フリーズドライ液体培養物、ＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）、経口強制飼養として投与したＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＫＳ２４９培養物、経口強制飼養として投与したＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＡＴＣＣ（登録商標）２５９４０、エアゾールとしてトリの身体表面に施用したＬａｃｔｉｐｒｏ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５の非フリーズドライ液体培養物、ＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）、およびフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５（ＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）であった。トリを１０８の畜舎に収容し、各畜舎は、実験の開始時に８羽のトリを含有した（合計で１，１５２羽のトリ）。
【０４０２】
トリを８つの群に計数し、各群の重量を記録した。トリの群は、ブロックごとに処理し、実験処置は、各ブロック内で無作為に畜舎に割り当てた。
【０４０３】
１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）に、１．９７×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５の非フリーズドライ液体培養物を含有するＬａｃｔｉｐｒｏ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）０．２ｍＬを経口（強制飼養）投薬した。１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）に、未知濃度のＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＫＳ２４９を含有する新しい培養物０．２ｍＬを経口（強制飼養）投薬した。この株に関するＣＦＵ／ｍＬを評価する試みは、成功しなかった。１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）に、１．０６×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＡＴＣＣ（登録商標）２５９４０を含有する新しい培養物０．２ｍＬを経口（強制飼養）投薬した。すべての経口処置を投与されたトリを、技術者の手のひらに押さえつけ、親指および人差し指を使用して、くちばしを開けた状態に保持し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅリピーターピペット（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、培養物を口腔に直接投入した。
【０４０４】
１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）に、１．９７×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５（約１．８８ｍＬ／トリ）を含有するＬａｃｔｉｐｒｏ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）を、畜舎あたり１５ｍＬをミストした。トリをプラスチック製桶（５０ｃｍ長×３５ｃｍ幅×４０ｃｍ深さ）に入れて、噴霧用先端部を装備した空気圧式ドレンチ用装置を使用して、培養物を噴霧化ミストとしてトリの身体表面に施用した。交差汚染を最小化するため、ミストしたトリは、指定管理者により取り扱い、秤量、施用および畜舎への移送のために、指定荷台に入れた。
【０４０５】
１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）に、トリあたりティースプーン４分の１の割合で、１．１８×１０７ＣＦＵ／ｇのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５を含有するトップドレッシング（食餌およびフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの混合物）を施した。処置は、研究の１０日目に開始して、１３００時間時に、毎日、トラフフィーダーに直接添加した。
【０４０６】
残りの１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）は対照として働き、プロバイオティック生成物との接触はなかった。処置したトリによる交差汚染を最小化するため、対照のトリは指定管理者により取り扱い、秤量および畜舎への移送のために、指定荷台に入れた。
Ｂ．実験設計および処置−研究２
【０４０７】
日齢のＣｏｂｂ５００ブロイラーヒナドリ（Ｃｏｂｂ−Ｖａｎｔｒｅｓｓ、Ｓｉｌｏａｍ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ａｒｋａｎｓａｓ）を使用して、バタリーによっておよび段によってブロック分けした、２つの処置の１８回の反復を行った。処置は、対照（プロバイオティックなし）またはフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５（ＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）であった。トリを１０８の畜舎に収容し、各畜舎は、実験の開始時に８羽のトリを含有した（合計で１，１５２羽のトリ）。
【０４０８】
トリを８つの群に計数し、各群の重量を記録した。トリは、ブロックごとに処理し、実験処置は、各ブロック内の畜舎に無作為に割り当てた。１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）に、トリあたりティースプーン４分の１の割合で、１．１８×１０７ＣＦＵ／ｇのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５を含有するトップドレッシング（食餌およびフリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの混合物）を施した。処置は、研究の１０日目に開始して、１３００時間時に、毎日、トラフフィーダーに直接添加した。
【０４０９】
残りの１８の畜舎（８羽のトリ／畜舎；合計で１４４羽のトリ）は対照として働き、プロバイオティック生成物との接触はなかった。処置したトリによる交差汚染を最小化するため、対照のトリは指定管理者により取り扱い、秤量および畜舎への移送のために、指定荷台に入れた。
Ｃ．給餌および給水−研究１および２
【０４１０】
新しい水を自由に摂れた。畜舎内にトリを入れる前に、９．５ｋｇの一般的なスターター食餌（表１２）を各畜舎に沿ったトラフフィーダーに入れた。
【表１２】
2020508696.tif 000016
【０４１１】
必要に応じて飼料を継ぎ足し、研究全体を通して、自由接近を確実にした。実験の終了（１８日目）に際して、消費されなかった飼料を各フィーダーから取り出し、秤量し、記録した。畜舎ごとに消費された飼料の合計を、フィーダーに添加した量とフィーダーから回収した量との間の差異として計算した。トリあたりの毎日の飼料摂取量は、消費した全飼料量÷［畜舎内の１日あたりの羽数×給餌した全日数］として計算した。
Ｄ．トリ重量−研究１および２
【０４１２】
研究の終わりに、畜舎内のトリはすべて、桶（５０ｃｍ長さ×３５ｃｍ幅×４０ｃｍ深さ）に入れて、秤量した。トリを桶に入れる前に桶の重量を量り、総重量から減算し、畜舎中のトリの重量を確認した。羽数の確認もこのときに行った。
Ｅ．統計分析−研究１および２
【０４１３】
ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェア９．４の複合手順を使用してデータを分析した。モデルは、処置の固定効果、ブロックの変量効果、および実験単位としての畜舎を含んだ。有意性は、Ｐ＜０．０５で示した。最小二乗平均値間の差異は、ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェアのＰＤｉｆｆオプションを使用して決定した。
Ｆ．結果−研究１および２
【０４１４】
研究１に関すると、すべての処置群にわたるブロイラーは、類似した毎日の飼料摂食量、１日あたりの平均体重増加、体重増加：飼料量および死亡率を示した。
【０４１５】
しかし、表１３に示されている通り、研究２により、１日あたりの平均体重増加（Ｐ＝０．０２）および体重増加：飼料量（Ｐ＝０．０４）は、対照のトリと比べた場合、フリーズドライＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたトリでは、どちらもより大きいことが示された。飼料量：体重増加の比を示す、図２１を参照されたい。飼料摂食量および死亡率は処置群間で差異はなかった。
【表１３】
2020508696.tif 000017
（実施例１０）
ウマ科の盲腸の発酵に対するＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉの効果
Ａ．実験設計および処置
【０４１６】
盲腸用カニューレ（Ｂｅａｒｄら、ＪＡＳ、８９巻（８号）：２４２５〜２４２９頁（２０１１年））が前もって取り付けられた、８頭のクオーターホース、４頭の雌馬および４頭の去勢馬（平均体重＝５４０ｋｇ；ＳＥＭ＝７５ｋｇ）を３つの処置期間にわたって反復した３×３（処置×ウマ）の不完全ラテン方格法に使用した。各処置期間は、２８日間のウォッシュアウト期によって分離した。処置は、（１）陰性対照（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉなし；対照）、（２）経口用ドレンチ剤（ドレンチ剤）により投与した１．９７×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５（Ｌａｃｔｉｐｒｏ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）、ＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）を含有する、５０ｍＬの新しい培養物、および（３）２つの糖蜜をベースとするウマ処置物（フリーズドライ）により投与された、７．０２×１０８ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５（ＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｗａｍｅｇｏ、Ｋａｎｓａｓ）を含有する、０．４０ｇのフリーズドライ培養物であった。ウマを処置に無作為に割り当てた（表１４）。
【表１４】
2020508696.tif 000018
【０４１７】
１つの小屋内の個々の馬房（３．０５×３．６６ｍ）にウマを収容し、マツの木クズを敷き詰めた。小屋の位置に基づいた、考えられる通気または温度の変動を補償するために、ウマを各処置期間、異なる馬房に無作為に割り当てた。ウマは、処置期間の間、運動のため、毎日歩かせた。
【０４１８】
経口用ドレンチ剤を受けたウマに、各処置期間の１日目の給餌の直前に、手動操作型投薬用装置（６０ｍＬの可変自動ドレンチャーＭＫＩＩＩ、ＮＪ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、１．９７×１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５を含有する５０ｍＬの新しい培養物を投薬した。プロバイオティック培養物の投与前に、新しい培養物の５Ｌバッグを激しく振とうして、内容物を均一にした。Ｔｙｇｏｎチューブを使用して手動操作型投薬用装置をバッグに取り付け、レザーバーを充填した。約１００〜２００ｍＬの培養物を廃棄用容器に廃棄し、チューブおよび装置の両方に酸素がないことを確実にした。
【０４１９】
フリーズドライプロバイオティック処置群中のウマに、毎日朝に給餌する前に、２本のトウモロコシ、およびフリーズドライ生成物を含有する糖蜜をベースとする処置物を与えた。研究に先立って、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株ＮＣＩＭＢ４１１２５をフリーズドライし、各々平均７．０２×１０８ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉと共に、約０．４０ｇのフリーズドライ細菌を含有する、真空で密封した小袋にパッケージした。１つの試料を毎日、プレート培養し、各処置期間を通じて、一貫した細菌の生存率を確実にした。ウマが処置物を拒絶した場合、フリーズドライ生成物は、ボーラスとして手によって投与した。
【０４２０】
残りのウマは、対照として働いた期間中、プロバイオティックへの曝露がなかった。
Ｂ．給餌および給水
【０４２１】
処置期間中、ウマに、２回の給餌の間で均等に分けた干し草および濃縮物を１日２回、与えた。各ウマに、ｂｒｏｍｅ干し草中の給餌物として、１日あたり、その体重の１％を与えた（表１５）。
【表１５】
2020508696.tif 000019
【０４２２】
各ウマは、１日目から５日目まで、１日あたりその体重の０．２％の割合で、加工濃縮物（上の表１５中に分析、以下の表１６に組成）中にその体重の１％に増やし、次いで、５日目から７日目までの間、穀物中で１％ＢＷ  ＡＦに維持した。拒否はすべて、秤量して記録した。新しい水を自由に与えるため、馬房に自動給水器を装備した。給水器を清浄し、１日あたり複数回、適切に機能するか確認した。
【表１６】
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ウォッシュアウト期の間、ウマを乾燥区画に収容し、自由なｂｒｏｍｅ干し草の食餌（表＊＊）のを維持した。各ウォッシュアウト期の終了時にウマを秤量し、処置期間中に与えられた飼料の量を確実に正確に計算した。
Ｄ．サンプリング手順
【０４２３】
各７日間の処置期間の間、４時間ごとに、盲腸用カニューレにより盲腸試料を採集した。ウマに、毎日、１０００時間および２２００時間で給餌し、給餌後の４、８および１２時間時に試料を採集した後、次の給餌を行った。各処置期間の０日目に、投薬または給餌前に試料を採集して、後腸におけるｐＨ、ＶＦＡおよびＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ集団のベースライン値を確立した。
【０４２４】
試料は、カニューレ栓を外し、カニューレから試料が流れ出すと、盲腸内容物を捕捉することによって試料を採集した。盲腸の流体は、チーズクロスの４つの層に通して濾し、次いで、１００ｍＬの検査カップに入れた。重力流により、十分な試料が採集されない場合、手持ち式ポンプを使用して盲腸内容物を抽出した。０、１、３および７日目の１０００時間時に、ＰＣＲ分析のため、追加の盲腸試料を採集した。第１の処置期間の間に、未濾過試料を２０ｍＬのＨＤＰＥシンチレーションバイアル（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉ．；０３−３３７−２３Ｂ）に採集した。これらの未濾過試料が、ＤＮＡ抽出するために試料を分離する難題をもたらしたため、残りの２つの処置期間については、濾した盲腸の流体を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎコニカル遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．３５２０７０；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に採集し、直ちに−８０℃に凍結して、ＰＣＲ分析に待機した。専門家は、各ウマ間で手袋を交換した。
Ｄ．盲腸のｐＨおよび揮発性脂肪酸の分析
【０４２５】
濾した盲腸の流体のｐＨは、携帯型ｐＨ計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｉｏｎ  ３  Ｓｔａｒ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  ｐＨ  Ｍｅｔｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｃｃｕｍｅｔ  ｐｒｏｂｅ）を使用して採集後、直ちに測定した。ｐＨを記録した後、試料を１ｍＬのアリコートで２つのマイクロ遠心管に移し、除タンパク質のため、２５％メタリン酸０．２５ｍＬと混合した。ＶＦＡ分析前の少なくとも２４時間、試料を−１８℃で冷凍した。
【０４２６】
酸性化して凍結した盲腸試料を解凍し、ボルテックスミキサーを使用して均一にし、２４  ｘ  ｇで１８分間、遠心分離した。次いで、水性上澄み液をガスクロマトグラフィー用バイアルに移した。ＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（１０ｍｍ×０．１０ｍｍ×０．１ｍｍフィルム厚さ；Ａｇｉｌｅｎｔ  ａｎｄ  Ｊ＆Ｗ  ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）および水素炎イオン化検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ７８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、揮発性脂肪酸を測定した。４６ｃｍ／秒の流速、１μＬのスプリット注入およびスプリット流５０：１で、キャリアガスとして水素を使用した。初期オーブン温度を７０℃とし、温度を１５℃／分で１３０℃に昇温し、次いで、６０℃／分で２２０℃に昇温し、２分間保持した。導入口および検出器温度は、それぞれ２６０℃および３００℃とした。揮発性脂肪酸は、アセテート、プロピオネート、イソブチレート、ブチレート、イソバレレート、バレレート、イソカプロエート、カプロエートおよびヘプタノエートを含有する、公知の標準品（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｖｏｌａｔｉｌｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｉｘ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と比較することによって定量した。
Ｅ．統計分析
【０４２７】
ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェアバージョン９．４のＧｌｉｍｍｉｘ手順を使用して、データを分析した。モデルは、処置の固定効果およびウマ、期間、および処置対期間の相互作用の変量効果を含んだ。ウマは、実験単位として働いた。処置対１日内の時間の効果（Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｈｏｕｒ  ｗｉｔｈｉｎ  ｄａｙ  ｅｆｆｅｃｔ）は、いずれのパラメーターに対しても有意性はなく、したがって、モデルから除外した。有意性は、Ｐ＜０．０５で示し、傾向は、０．０５＜Ｐ＜０．１０であるみなした。最小二乗平均値間の差異は、ＳＡＳ（登録商標）ソフトウェアのＰＤｉｆｆオプションを使用して決定した。
Ｆ．結果
【０４２８】
盲腸のｐＨは、対照と比較して、食餌中に含ませる穀物が増加すると、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉにより処置したウマではより大きくなる傾向があった。図２２を参照されたい。経口用ドレンチ剤としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを投与されたウマの盲腸のｐＨは、５日目、すなわち穀物の十分な割り付け分が与えられた初日に、対照を超えて上昇した（それぞれ、７．００および７．１９；Ｐ＝０．０９）。７日目に、フリーズドライ処置物としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたウマは、対照（６．９９；Ｐ＝０．０９）よりも大きな盲腸のｐＨ（７．１９）を有する傾向があった。
【０４２９】
表１７は、処置群のＶＦＡプロファイルを示す。
【表１７−１】
2020508696.tif 000021
【表１７−２】
2020508696.tif 000022
【０４３０】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの補給は、盲腸において、アセテートまたはプロピオネートの濃度に対して効果を有さなかった（Ｐ＞０．１０；表＊＊）。しかし、処置対日の相互作用が、アセテート：プロピオネート（Ａ：Ｐ）比において検出された（Ｐ＜０．０５）。盲腸のＡ：Ｐ比は、７日目に、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けなかったウマ（２．４１）、または経口用ドレンチ剤としてＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたウマ（２．６０；Ｐ＜０．０５）の比よりもフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたウマの方が高かった（２．８３）。盲腸のバレレートは、７日目に、対照動物（０．０４ｍＭ）、またはＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの経口用ドレンチ剤を受けたウマ（０．０７ｍＭ；Ｐ＜０．０２）よりも、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを受けたウマ（０．１５ｍＭ）の方が高かった。盲腸のバレレートは、５日目に、対照動物（Ｐ＜０．０１）よりドレンチ剤処置したウマで低かったが、フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉにより処置したウマのバレレートと同程度であった（Ｐ＞０．１０）。ヘプタノエートおよびイソカプロエートの濃度は、無視でき、処置または相互作用の効果は検出されず、したがって、これらのＶＦＡは、表＊＊から除外した。
【０４３１】
盲腸のｐＨおよび発酵生成物は、５日目から７日目までＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの補給により最も影響を受け、これらの日に、最大量の穀物が消費された。
（実施例１１）
ブロイラーニワトリにおける液体培養物Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５（Ｌａｃｔｉｐｒｏ（登録商標））の施用の評価
【０４３２】
Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにおいて、パイロットブロイラーの成績研究を行って、ブロイラーヒナドリの成長成績に対する、ミストされたまたは強制飼養されたＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５の影響を評価した。
【０４３３】
０日目に、Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂの噴霧ワクチン接種された日齢ブロイラーヒナドリ（ｎ＝７２０）を、６つの異なる処置：（１）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａを受けない陰性対照群（ｎＣＯＮ）、（２）それらの孵卵所木枠にいる場合、０日目に、ミスト（１〜２ｍＬ／トリ）による、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を受けたミスト群（ｄ０  ミスト）、（３）７日目に、２時間の断食および１時間の水断食後に、経口強制飼養によって、２ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を受けた７日目の強制飼養群（ｄ７  ＧＡＶ）、（４）１４日目に、２時間の断食および１時間の水断食後に、経口強制飼養によって、５ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を受けた１４日目の強制飼養群（ｄ１４  ＧＡＶ）、（５）２１日目に、２時間の断食および１時間の水断食後に、経口強制飼養によって、１０ｍＬのＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を受けた２１日目の強制飼養群（ｄ２１  ＧＡＶ）、ならびに６）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａを受けなったが、ＢＭＤ（５０ｇ／ｔ）で処置したスターターおよびグロアー飼料、およびＳｔａｆａｃ（２０ｇ／ｔ）により処置した仕上げ飼料を受けた、陽性対照群（ｐＣＯＮ）に無作為に割り付けた。
【０４３４】
各処置は、それぞれ３０羽のトリを含有する４個のケージにより示した。トリに与えた食餌は、以下の通りとした：０〜１８日目に、スターター飼料、１８〜３５日目にグロアー飼料、および３５〜３９日目に仕上げ飼料。動物の重量、飼料の消費量および飼料転換を、３９日間の試験期間にわたって記録した。
【表１８】
2020508696.tif 000023
【０４３５】
結果は、表１８に提示する。総合的な死亡率は、処置全体にわたり差異はなかった（表１８）。ｄ０  ミスト群の場合の飼料転換は、２５日目のすべての他の処置よりもかなり低く、ｐＣＯＮよりも５．３％の改善、およびｎＣＯＮよりも６．５％の改善であった。給餌の３９日後に、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ処置群の飼料転換は、ｐＣＯＮとは大幅な差異はないが、ｄ７  ＧＡＶを除いて、数字上、低くなる傾向があった。ｄ２１  ＧＡＶ群の場合の飼料転換は、ｎＣＯＮよりもかなり低く、７．７％の飼料転換の改善であった。
（実施例１２）
２種の炭素源を補給した半規定増殖培地に対するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの様々な株の増殖
Ａ．実験設計
【０４３６】
この実施例では、以下の細菌株を使用した：（１）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５、（２）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＡＴＣＣ２５９４０、（３）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ７０２２６１、（４）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ７０２２６２、および（５）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ７０２４１０。
【０４３７】
株はすべて、血清ボトル中の半規定ラクテート増殖培地上で増殖させた。次いで、得られた培養物を使用して、２種の炭素源：６０％のラクテートおよび４０％のグルコース、７０％のラクテートおよび３０％のグルコース、または４０％のラクテートおよび６０％のグルコースからなる乳酸Ｎａおよびグルコースを補給した半規定増殖培地を含有する９６ウェルプレートに接種した。
【０４３８】
次いで、嫌気性条件下、３９℃で、９６ウェルプレートをインキュベートし、光学密度（６００ｎｍ）を１５分間の間隔で自動記録した。
Ｂ．様々な２種の炭素培地に対する、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株の増殖特徴の分析
【０４３９】
増殖特徴を比較するため、様々な半規定培地において、様々なＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株で得られた増殖曲線を、インキュベーション時間をｘ軸に、および光学密度の読取り値をｙ軸にプロットした（図２３〜２５）。
【０４４０】
この実験において試験したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの株はすべて、６０％のラクテートおよび４０％のグルコース、７０％のラクテートおよび３０％のグルコース、または４０％のラクテートおよび６０％のグルコースからなる半規定培地上で増殖させると、類似した増殖特徴を示した。
（実施例１３）
２種の炭素源を補給した半規定増殖培地に対するＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの様々な株の増殖と、その後の細胞のフリーズドライ
Ａ．実験設計
【０４４１】
この実施例では、以下の細菌株を使用した：（１）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５、（２）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＡＴＣＣ２５９４０、（３）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ７０２２６１、（４）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ７０２２６２、および（５）Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ７０２４１０。
【０４４２】
株はすべて、血清ボトル中の半規定ラクテート増殖培地上で増殖させた。次いで、得られた培養物を使用して、２種の炭素源：６０％のラクテートおよび４０％のグルコース、または７０％のラクテートおよび３０％のグルコースからなる乳酸Ｎａおよびグルコースを補給した半規定増殖培地を含有する５Ｌ発酵装置槽に接種した。
【０４４３】
増殖の８、１０、１２、１４および１６時間後に培養物の試料を採集し、室温に冷却し、液体の９９％を除去することによって、細胞を無菌的かつ嫌気的に収穫した。無菌および嫌気性条件下、保持液を１／５の比で凍結保護物質（スクロース）の溶液と混合して、５％  ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得た。混合物をサンプリングして、フリーズドライ前のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度（すなわち、生存数）を決定した。
【０４４４】
得られた混合物のアリコートを、１０ｍＬのバイアル（４ｍＬ／バイアル）に移し、液体窒素中で急凍結させた。バイアルをフリーズドライ機に移して、急速サイクルに従い凍結乾燥させた。フリーズドライが完了すると、嫌気性チャンバー中の凍結乾燥生成物を嫌気性希釈剤で再懸濁して、これを室温で４０分間再水和し、次いで、半規定ラクテート寒天にプレート培養することによって、細菌の生存を決定した（すなわち、生存数）。
【０４４５】
細胞喪失は、フリーズドライ後に回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの濃度をＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの初期（フリーズドライ前）濃度から減算することにより算出した。
Ｂ．様々な半規定培地で増殖させて、増殖中に様々な時間で収穫およびフリーズドライした、様々なＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ株のフリーズドライ後の細胞喪失の比較
【０４４６】
この実験において試験したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉのすべての株は、フリーズドライ後に細胞が生存していた。許容される細胞喪失限界値は、１．６ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬに設定した。株または収穫時期にかかわらず、７０％のラクテートおよび３０％のグルコース（表１９）を含有する半規定培地上で増殖させた細胞のフリーズドライ中に遭遇した細胞喪失は、すべて、許容可能な限界値未満であり、０．３〜１．３ｌｏｇの範囲であった。
【表１９】
2020508696.tif 000024
【０４４７】
６０％のラクテートおよび４０％のグルコースを含有する半規定培地上で増殖させた細胞のフリーズドライ中に遭遇した細胞喪失（表２０）は、収穫時期によってより影響を受けたが、すべての株は、依然として、収穫時期の少なくとも３つに関して許容可能な限界値未満の細胞喪失となった。フリーズドライ前の収穫時期の最適化は、フリーズドライ後の回収率のさらなる改善をもたらすことができる。
【表２０】
2020508696.tif 000025
【０４４８】
全体として、本明細書に記載されている方法は、使用したＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ株にかかわらず、生存細胞を含有するフリーズドライ生成物をもたらした。
（実施例１４）
フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉのカプセル封入、およびその安定性の決定
【０４４９】
ＴＦＦを通して得られたＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５保持液を、１／５の比で無菌的に凍結保護物質溶液（スクロース）と混合して、５％スクロース（ｗ／ｖ）の最終濃度を得た。混合物を液体窒素中で急凍結し、急速なサイクルを使用して、凍結乾燥するフリーズドライ機に移した。フリーズドライが完了すると、嫌気性チャンバー中の凍結乾燥生成物を嫌気性希釈剤で再懸濁して、これを室温で４０分間、再水和し、次いで、半規定ラクテート寒天にプレート培養することによって、細菌の生存を決定した。
【０４５０】
次いで、得られたフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ粉末を担体（増量剤）と混合し、粉末を加熱パーム油蒸留物またはステアリン酸に分注することによってカプセル封入した。次いで、混合物を急速に冷却し、得られた生成物をサンプリングして細菌の生存を決定した。嫌気性希釈剤で嫌気性チャンバー中において試料を再懸濁し、１５秒間ブレンドして、室温で４０分間再水和させた後、半規定ラクテート寒天上にプレート培養した。様々な加熱温度および異なるタイプの油を使用して、この実験を３回繰り返した（方法１、２および３）。方法１は、１１０℃の加熱温度、およびカプセル封入材料としてのパーム油蒸留物を使用する。方法２は、５２℃の加熱温度、ならびにカプセル封入材料としてパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸のモノおよびジグリセリドの混合物を使用する。方法３は、６５℃の加熱温度、ならびにカプセル封入材料としてパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸のモノおよびジグリセリドの混合物を使用する。
【０４５１】
喪失率は、フリーズドライ後に回収した濃度からカプセル封入後に回収したＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの濃度を減算して、これをフリーズドライ後に回収した濃度によって除算することにより算出した。
【０４５２】
方法２および方法３を使用して、カプセル封入した生成物から追加の試料を採集し、好気性条件下、４か月の期間、室温で保管して、生成物の安定性を評価した。嫌気性希釈剤で嫌気性チャンバー中において試料を再懸濁し、１５秒間混合して、室温で４０分間再水和させた後、半規定ラクテート寒天上にプレート培養した。図２６および２７は、方法２または３を使用して、カプセル封入したフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの安定性は、約１ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇしか失われなかったことを示す。
【表２１】
2020508696.tif 000026
【０４５３】
フリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉをカプセル封入するために使用した方法２および３は、６７．９％より高い細胞回収率をもたらした（表２１）。
【０４５４】
さらに、方法２または方法３に従ってカプセル封入したフリーズドライ試料は、最大４か月間、標準酸素および湿度条件下、室温での保管の間、細胞生存率が１ｌｏｇ低下した。
【０４５５】
方法２および３に従ったフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉのカプセル封入により、酸素および水分からの細菌のさらなる保護がもたらされた。このプロセスにより、いかなる特定のパッケージングもなしで、カプセル封入したフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉを室温で保管することが可能となり、飼料中の生成物の添加が可能となる。
（実施例１５）
パイロットスケールで生成したフリーズドライＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉの保存可能期間。
Ａ．実験設計
【０４５６】
７０％のラクテートおよび３０％のグルコースからなる半規定培地の６００リットルのバッチをこの実験に使用して、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ  ＮＣＩＭＢ４１１２５を増殖させた。３９℃で１４時間のインキュベーション後、得られた培養物を室温に冷却し、実施例２に記載されているタンジェンシャルフロー濾過システムを使用して細胞を収穫した。液体体積の９９パーセントを培養物から除去し、次いで、保持液を、１：５の比でスクロース凍結保護物質溶液に再懸濁して、５％ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得た。
【０４５７】
次いで、混合物を液体窒素中で凍結し、凍結ペレットをフリーズドライ機に移して急速サイクルに従い凍結乾燥した。フリーズドライが完了すると、凍結乾燥粉末を採集し、嫌気性条件下、Ｍｙｌａｒパウチに、単独（「Ｍ．ｅ．」）でまたは増量剤としてマルトデキストリンと共（「Ｍ．ｅ．＋マルトデキストリン」）にパッケージ（表２２）した。
【表２２】
2020508696.tif 000027
【０４５８】
フリーズドライ生成物（処置あたり３つの試料）中のＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度を、嫌気性チャンバー中において凍結乾燥生成物を嫌気性希釈剤で再懸濁することによって決定し、これを室温で４０分間再水和し、次いで、半規定ラクテート寒天にプレート培養した（すなわち、生存数）。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、ＣＦＵ／パウチとして示し、ｌｏｇ変換した。
Ｂ．保存可能期間の研究
【０４５９】
様々な処置を含有するＭｙｌａｒパウチを室温（７５°Ｆ；２５℃）または４０°Ｆ（４℃）のいずれかで保管した。保管の０．５、１、２、３、４および６か月後に、追加の試料を得、以前に記載した方法と同様に処理（１時間点あたり１処置あたり３つの試料）して、生成物の保存可能期間を決定した。Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、ＣＦＵ／パウチとして表し、ｌｏｇ変換した。
【０４６０】
保存可能期間のデータを図２８に提示する。経時的なＭ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ濃度は、保管温度によって影響を受けた。保管の６か月後に、４０°Ｆ（４．４℃）で保管した試料は、マルトデキストリンの有無にかかわらず、安定である一方、７５°Ｆ（２３．９℃）で保管した試料は、「Ｍ．ｅ．」処置の場合、約１．６ｌｏｇ、および「Ｍ．ｅ．＋マルトデキストリン」処置の場合、約０．８ｌｏｇが失われた。
（実施例１６）
微生物細胞増殖、培地、温度およびｐＨ
【０４６１】
嫌気性細菌を、３種のカテゴリー、（１）偏性嫌気性菌；（２）酸素耐性嫌気性菌；および（３）条件的嫌気性菌に分けることができる。偏性嫌気性菌は、標準大気圧濃度の酸素中では生存しない細菌である。一部の偏性嫌気性菌は、最大８％の酸素中で生存することがきる一方、他は、酸素濃度が０．５％未満でなければ生存することができない。酸素耐性嫌気性菌は、酸素の存在下で生存することができるが、増殖のために酸素を利用しない。条件的嫌気性菌は、好気性呼吸のために酸素を使用することができるが、酸素が存在しない場合、嫌気性呼吸をやはり使用することができる。
【０４６２】
同様に、好気性細菌は、２つのカテゴリー：（１）偏性好気性細菌；および（２）微好気性菌に分けることができる。偏性好気性細菌は、細胞が呼吸を行うために酸素を必要とし、標準大気圧濃度の酸素中で生存することができる。微好気性菌は、細胞の増殖に酸素を必要とするが、標準大気圧濃度の酸素によって損傷を受ける。
【０４６３】
酵母は、菌界のメンバーとして分類される単細胞真核微生物である。酵母は、偏性好気性菌または条件的嫌気性菌であり得る。
【０４６４】
Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉなどのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａおよびＢ．ｂｒｅｖｅなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、偏性嫌気性菌の代表的な種である。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓなどのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、酸素耐性嫌気性菌の代表的な種である。Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなどのＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓおよびＬ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、条件的嫌気性菌の代表的な種である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓは、偏性好気性菌の代表的な種である。Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、酵母の代表的な種である。
【０４６５】
好気性細菌、嫌気性細菌および酵母は、カゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１種の炭素源を含む培地上で増殖させる。また、好気性細菌、嫌気性細菌および酵母は、カゼイン、ラクテート、デキストロース、フルクトース、フルクタン、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、アセテート、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、酢酸ナトリウム、アラビノース、ダイズタンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母抽出物およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも２種の炭素源を含む培地上で増殖させる。嫌気性細菌は、嫌気性条件下で、または必要な酸素条件で増殖させ、嫌気性細菌細胞増殖を促進し、好気性細菌および酵母は、適切な酸素条件下、上記からの少なくとも２種の炭素源を含む培地を用いて、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの場合１５℃〜４５℃、ならびにＢ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの場合、２０℃〜４５℃の間温度で増殖させる。これらの株に対する最適温度は、３０℃を好むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを除いて、３７℃である。培地のｐＨは、４．０〜９の間、より具体的には、ｐＨ４．０〜４．５、４．５〜５．５、５．５〜６．５、６．５〜７．５、７．５〜８．５または８．５〜９．０の間である。微生物は、対数増殖期が終了するまで、すなわち、少なくとも１時間〜６時間、６時間〜１２時間、１２時間〜２４時間、２４時間〜３６時間、３６時間〜４８時間、４８時間〜７２時間、７２時間〜９６時間または９６時間〜１２０時間、増殖させる。
【０４６６】
培地が少なくとも１×１０３ＣＦＵ／ｇを含有すると、微生物は、適切な条件下で収穫され、微生物は、動物用飼料配合物での使用のため、フリーズドライおよび／またはカプセル封入される。
（実施例１７）
好気性細菌、嫌気性細菌および酵母の培養物を濃縮するためのタンジェンシャルフロー濾過の使用
【０４６７】
実施例２において提示されている方法を、実施例１６に開示されている好気性細菌、嫌気性細菌および酵母を用い、最適な微生物細胞増殖を可能にする適切な培地を使用して、この実施例中で使用する。Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉと同様に、好気性細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、嫌気性細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）および酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にタンジェンシャルフロー濾過を使用すると、濃縮プロセスにわたって、透過液および保持液中に回収される生存可能な微生物の量に関して類似した結果をもたらす。さらに、濾過プロセスは、濾過後の微生物の生存性に対して、または微生物が増殖する能力に対して効果を有さない。したがって、微生物は、液体ブロス中で増殖させ、濾過し、凍結、フリーズドライおよび／またはカプセル封入するために調製される。
（実施例１８）
好気性細菌、嫌気性細菌および酵母に関する凍結およびフリーズドライパラメーター
【０４６８】
様々なタイプの好気性細菌、嫌気性細菌および酵母に対する様々な凍結およびフリーズドライパラメーターの効果を決定するため、実施例１７に従った実施例を行う。実施例３と同様に、許容される細胞喪失限界値は、１．６ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬに設定する。
【０４６９】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの保持液を、凍結乾燥前に、凍結保護物質、脱脂粉乳、トレハロース、スクロースもそれらの組合せも含有しない、凍結保護物質溶液中で再懸濁する。次いで、各混合物をバイアルに移して、−８０℃でゆっくりと凍結するか、または液体窒素中で急凍結した後、急速サイクルまたは緩慢サイクルのいずれかを使用して、凍結乾燥させるフリーズドライ機に入れる。
【０４７０】
凍結保護物質と混合しない保持液はすべて、フリーズドライサイクルにも凍結方法にもかかわらず、凍結保護物質溶液と混合した保持液よりも高い細胞喪失、および閾値よりも大きな細胞喪失を有する。
【０４７１】
さらに、試験したフリーズドライプロセスはすべて、室温または少なくとも４℃で４〜１２か月の長期保管後でさえも、再水和後、培養物の増殖を開始するのに十分な生存率を保持することが可能な生成物をもたらす。
（実施例１９）
フリーズドライ好気性細菌、嫌気性細菌および酵母の収量および安定性に対する保管条件の効果
【０４７２】
実施例４に提示されている細胞生存および微生物増殖特徴に関する試験方法を、実施例１６に開示されている好気性細菌、嫌気性細菌および酵母を用い、最適な微生物細胞増殖を可能にする適切な培地を使用して、この実施例で使用する。
【０４７３】
次いで、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、実施例１８と同様に生成するフリーズドライ培養物の増殖特徴および保存可能期間に対するフリーズドライプロトコールおよび保管条件の効果を決定するため、増殖曲線分析およびスプレッドプレート培養技法を使用して、０、２、４、８、１２、１６、２０および２４週間、好気性または嫌気性条件において、４℃または２５℃での保管の間の、微生物増殖特徴および細胞生存について試験した。
【０４７４】
好気性条件で保管されているフリーズドライ嫌気性細菌に由来する試料は、処置にかかわらず、それらの嫌気性保管した相当物と比べて、さらなる細胞喪失を伴ってより急速に崩壊する。
【０４７５】
２５℃で保管した試料は、４℃で保管したそれらの相当物よりも速く崩壊する。
【０４７６】
液体窒素中で凍結させ、フリーズドライ後に２５℃で保管した試料は、１６週間の保管期間にわたり、４℃で保管したそれらの相当物ほど細胞を多く失わないが、試料間の差異は、２０および／または２４週間の保管後、２５℃と４℃の保管との間で顕著である。
【０４７７】
各サンプリング日に、フリーズドライ生成物と非フリーズドライ生成物との増殖特徴を比較するため、増殖曲線実験を行う。各増殖曲線に使用する非フリーズドライ試料は、「新しい」（２日間以下の古さ）ものである。４℃で保管したフリーズドライ生成物は、２５℃で保管したフリーズドライ生成物よりも時間のずれは短い。１６週間の保管後、凍結保護物質を含有する、液体窒素中で凍結させ、フリーズドライし、嫌気性条件下で保管した、嫌気性細菌に由来する試料はすべて、生き返り、再び生存可能である。同様に、凍結保護物質を含有する、液体窒素中で凍結させ、フリーズドライした、好気性細菌および酵母に由来する試料はすべて、生き返り、やはり再び生存可能である。
（実施例２０）
カプセル封入したフリーズドライ好気性、嫌気性細菌および酵母の収量および安定性に対する保管条件の効果
【０４７８】
様々な好気性細菌、嫌気性細菌および酵母の保持液の凍結およびフリーズドライは、実施例１６〜１９に記載されている通りに行う。フリーズドライ後、嫌気性細菌は、担体（増量剤）と混合し、実施例１４に記載されている通り、加熱油にフリーズドライ粉末を分注することによってカプセル封入する。次いで、混合物を急速に冷却し、得られた生成物をサンプリングして細菌の生存を決定する。嫌気性希釈剤で嫌気性チャンバー中において嫌気性微生物試料を再懸濁し、１５秒間混合して、室温で４０分間再水和させた後、半規定ラクテート寒天上にプレート培養する。好気性微生物試料を、希釈剤で、標準大気圧濃度の酸素中で再懸濁し、１５秒間混合して、室温で４０分間再水和させた後、半規定ラクテート寒天上にプレート培養する。様々な加熱温度および様々なタイプの油を使用して、この実験を３回繰り返す（方法１、２および３）。方法１は、１１０℃の加熱温度、およびカプセル封入材料としてパーム油蒸留物を使用する。方法２は、５２℃の加熱温度、ならびにカプセル封入材料として、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸のモノおよびジグリセリドの混合物を使用する。方法３は、６５℃の加熱温度、ならびにカプセル封入材料として、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸のモノおよびジグリセリドの混合物を使用する。
【０４７９】
カプセル封入からの細胞喪失率は、方法２または３を使用すると、４０％未満である。様々な好気性細菌、嫌気性細菌および酵母のカプセル封入後、標準大気圧酸素条件下、室温で保管したカプセル封入微生物は、保管にわたって、細胞生存率のほんのわずかな低下を有する（例えば、０．５〜２ｌｏｇの細胞生存率の低下）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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