(57)【要約】  本発明は、レチナールの変換によってビタミンＡアルコール（レチノール）を生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、レチナールレダクターゼとしての活性を有する異種酵素の使用を含み、特に、この反応は、レチナールからレチノールへの少なくとも約９０％の変換をもたらす。前記プロセスは特に、ビタミンＡの生物工学的生産のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］、好ましくは異種レチノールデヒドロゲナーゼを含むカロテノイド産生宿主細胞であって、前記宿主細胞がレチナール及びレチノールを含むレチノイド混合物を産生し、前記レチノイド混合物中に存在する前記レチナールの量と比較して、前記レチノールの割合が少なくとも約９０％、好ましくは、９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％である、カロテノイド産生宿主細胞。
【請求項２】
前記レチノールデヒドロゲナーゼの作用によって還元され得る前記レチナールが、トランス−レチナール及びシス−レチナールの混合物を含み、前記レチナール混合物中のトランス−レチナールの割合が、少なくとも約６１〜９８％、好ましくは少なくとも約６１〜９５％、より好ましくは少なくとも約６１〜９０％の範囲である、請求項１に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項３】
前記レチノールデヒドロゲナーゼが真菌、好ましくはフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から選択され、より好ましくは、前記レチノールデヒドロゲナーゼがフザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）レチノールデヒドロゲナーゼ（ＦｔＲＤＨ）である、請求項１又は２に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項４】
前記ＦｔＲＤＨが、配列番号１に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項３に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、パラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、及びブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）からなる群から選択され、好ましくは、酵母を含む真菌から選択され、より好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から、最も好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項６】
前記レチノールがさらにビタミンＡに変換される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項７】
ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から選択される、ベータ−カロテンからレチナール混合物への変換を触媒する立体選択的ベータ−カロテン酸化酵素であって、前記混合物が、前記混合物中のレチナールの総量を基準として、少なくとも約６１％、好ましくは６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は最大１００％までのトランス−アイソフォームのレチナールを含み、より好ましくは、配列番号３に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列から選択される立体選択的ベータ−カロテン酸化酵素をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項８】
レチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］の酵素活性によってレチノール及びレチナールを含むレチノイド混合物を生産するためのプロセスであって、レチナールを前記レチノールデヒドロゲナーゼと接触させることを含み、前記レチノイド混合物中のレチノール対レチナールの比率が少なくとも約９：１である、プロセス。
【請求項９】
レチノールデヒドロゲナーゼの酵素作用から生じるレチノイド混合物中のレチナールの量を低減するためのプロセスであって、前記プロセスが、レチナールをレチノールデヒドロゲナーゼと接触させることを含み、前記酵素作用から得られる前記レチノイド混合物中のレチナールの量がレチノールの量と比較して約１０％以下の範囲である、プロセス。
【請求項１０】
レチノールデヒドロゲナーゼの酵素作用から生じるレチノイド混合物中のレチノールの量を増大させるためのプロセスであって、前記プロセスが、レチナールをレチノールデヒドロゲナーゼと接触させることを含み、前記酵素作用から得られる前記レチノイド混合物中のレチノールの量がレチノールの量と比較して少なくとも約９０％の範囲である、プロセス。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞を用いる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
（ａ）レチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］をコードする核酸分子を適切なカロテン産生宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）レチナールを、少なくとも約９：１の比率のレチノール及びレチナールを含むレチノイド混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下でレチノールをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【請求項１３】
９：１の比率のレチノール及びレチナールを含むレチノイド混合物を生産するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、レチナールの変換によってビタミンＡアルコール（レチノール）を生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、レチナールレダクターゼとしての活性を有する異種酵素の使用を含み、特に、この反応は、レチナールからレチノールへの少なくとも約９０％の変換をもたらす。前記プロセスは特に、ビタミンＡの生物工学的生産のために有用である。
【０００２】
レチノールは、特に、ビタミンＡの生産プロセスなどのレチノイドの生産プロセスにおける重要な中間体／前駆体である。ビタミンＡを含むレチノイドは、栄養による供給を受けなければならないヒトにとって非常に重要で不可欠な栄養素の１つである。レチノイドは、特に視覚、免疫系及び成長に関して、ヒトの健康な状態を促進する。
【０００３】
ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドの現在の化学的生産方法は、例えば、高エネルギー消費、複雑な精製工程及び／又は望ましくない副産物などのいくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、過去数十年間にわたって、ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドを製造するために、より経済的且つ生態学的であり得る、微生物変換工程を含む他のアプローチが研究されている。
【０００４】
一般に、レチノイドを産生する生物系は産業的に扱いが困難であり、且つ／或いは非常に低レベルの化合物を生じるので、商業規模の単離が実用的でない。これには、このような生物系におけるレチノイドの不安定性、又は比較的高い副産物の生成を含むいくつかの理由がある。
【０００５】
したがって、ベータ−カロテンからビタミンＡへの酵素変換の産物特異性及び／又は生産性を改善することが継続中の課題である。特に、レチノールに対するレチナールの変換に関与する酵素の生産性を最適化すること、すなわち、高レチナール還元活性を有する酵素を探すことが望ましい。
【０００６】
驚くことに、我々は今回、レチノールの生成に対して少なくとも約９０％の全変換率で、レチナールをレチノールに変換することができる特異的なレチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）を特定することができた。
【０００７】
特に、本発明は、適切な宿主細胞、例えば、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などにおいて異種発現され、レチナールをレチノールに還元する活性を有するＲＤＨ、好ましくは真菌ＲＤＨに関し、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として、レチノールの産生に対する全変換率は少なくとも約９０％、好ましくは９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％であり、すなわち、宿主細胞により産生された前記レチノイド混合物中に存在するレチナールの量と比較して、レチノールの量は少なくとも約９０％である。
【０００８】
本発明は、１つの態様では、好ましくは、本明細書で定義されるようなＲＤＨを含むカロテノイド産生宿主細胞、特にレチノイド産生宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、レチノール及びレチナールの両方を含むレチナール混合物を産生し、レチノールの割合は、レチノール混合物中のレチノイド（レチナール／レチノールを含む）の総量を基準として少なくとも約９０％、好ましくは９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％である。
【０００９】
「レチナールレダクターゼ」、「レチノールデヒドロゲナーゼ」、「レチナール還元活性を有する酵素」又は「ＲＤＨ」という用語は本明細書において互換的に使用され、レチナールからレチノールへの変換と、さらにレチナールをもたらす逆反応とを触媒することができる酵素［ＥＣ１．１．１．１０５］を指し、後者の活性は、本発明に従って、約１０％以下まで低減され得る。
【００１０】
レチノールの酵素触媒作用に関連する「変換」、「酸化」、「還元」という用語は本明細書において互換的に使用され、本明細書で定義されるＲＤＨの作用を指す。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「真菌宿主細胞」という用語は、特に、宿主細胞としての酵母、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などを含む。
【００１２】
レチナールの酵素触媒作用からのレチノールの産生に対する少なくとも約９０％の全変換率をもたらす本明細書で定義されＲＤＨは、好ましくは適切な宿主細胞に導入される、すなわち異種酵素として発現されるか、又は内在性酵素として発現されてもよい。好ましくは、本明細書に記載される酵素は異種酵素として発現される。
【００１３】
本発明の目的で、レチノールの形成に対して少なくとも約１８％、例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％の増大をもたらす任意のレチナール還元酵素を本明細書で定義されるプロセスにおいて使用することができ、このような増大は、適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）菌株又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株などに存在する内在性ＲＤＨを用いてレチノール形成において計算される。
【００１４】
本明細書で定義されるような、レチノール形成、すなわちレチナール還元反応に対する活性を有するＲＤＨは、例えば、植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌などの任意の供給源から得ることができる。
【００１５】
一実施形態では、本明細書で定義されるＲＤＨ活性を有する、すなわちレチノールに対して少なくとも９０％の全変換率を有するポリペプチドは、子嚢菌門又はケカビ目から選択される真菌を含むがこれらに限定されない真菌、特にディカリア又はケカビ（Ｍｙｃｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）から得ることができ、好ましくは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はムコール属（Ｍｕｃｏｒ）から得られ、より好ましくは、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）又はＭ．キルキネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）から単離され、例えば、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ＦｆＲＤＨ１２（ＥＸＫ２７０４０に由来するポリペプチド配列）又はＭ．キルキネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＭｃＲＤＨ１２（ＥＰＢ８５５４７．１に由来するポリペプチド配列）に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号２に従うポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなど含む、配列番号１に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドなどである。
【００１６】
さらなる実施形態では、本明細書で定義されるＲＤＨ活性を有する、すなわちレチノールに対して少なくとも９０％の全変換率を有するポリペプチドはヒトを含む動物から得ることができ、好ましくは、ラット又はヒトから得られ、例えば、ヒトＨｓＲＤＨ１２（ＮＰ＿６８９６５６．２に由来するポリペプチド配列）又はラットＲｎＲＤＨ１２（ＮＰ＿００１１０１５０７．１に由来するポリペプチド配列）、例えば、配列番号５又は６によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドなどである。
【００１７】
一実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、レチノールの産生に対して少なくとも約９０％、好ましくは９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％の全変換率でレチナールを変換することができる。好ましくは、このような変換は、少なくとも約６１％の割合をトランス−レチナールとして含む、例えば、約６１〜９０％のトランス−アイソフォームを含む、宿主細胞において産生されるレチナール混合物から得られる。レチナールは、それぞれのベータ−カロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）、例えば、好ましくはドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＢＣＯ、ＤｍＮｉｎａＢ、又は配列番号３に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチドにより触媒される、ベータ−カロテンからレチナールへの変換によって得ることができる。好ましくは、本明細書で定義されるＲＤＨの作用によりレチノールに変換され得るレチナール混合物は、少なくとも６１〜６５％のトランス−レチナール、例えば、約６１〜９０％トランス−アイソフォームを含むが、本発明に従うＲＤＨの活性／変換は、トランス−及びシス−レチナールの割合に無関係である。
【００１８】
したがって、一実施形態では、本発明は、（１）ベータ−カロテンからシス−及びトランス−レチナール混合物への変換を触媒し、レチナール混合物中のトランス−レチナールの割合が少なくとも６１％である、立体選択的ベータ−カロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）、すなわちトランス特異的ＢＣＯと、（２）レチナール、例えば混合物中のレチナールの総量を基準として少なくとも６１％の割合のトランス−レチナールを有するレチナール混合物からレチノールへの変換を触媒し、レチノールに対する全変換率が少なくとも約９０％である、本明細書で定義される特異的ＲＤＨと、を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。
【００１９】
本明細書で定義されるようなＢＣＯの例は、例えば、植物、動物、細菌、真菌、藻類などの任意の供給源から得ることができる。特に有用な立体選択的ＢＣＯは、子嚢菌門又は担子菌門から選択される真菌を含むがこれらに限定されない真菌、特にディカリアから得られ、好ましくはフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）から得られ、より好ましくはＦ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）又はＵ．マイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）から単離され、例えば、ＦｆＣａｒＸ（ＡＪ８５４２５２に由来するポリペプチド配列）、ＵｍＣＣＯ１（ＥＡＫ８１７２６に由来するポリペプチド配列）などである。さらに、特に有用な立体選択的ＢＣＯは昆虫、特に双翅目から得られ、好ましくはドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から、より好ましくはＤ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から得られ、例えば、ＤｍＮｉｎａＢ又はＤｍＢＣＯ（ＮＰ＿６５０３０７．２に由来するポリペプチド配列）などである。さらに、特に有用な立体選択的ＢＣＯは植物、特に被子植物から得られ、好ましくはクロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）から、より好ましくはＣ．サティブス（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）得られ、例えば、ＣｓＺＣＯ（Ｑ８４Ｋ９６．１に由来するポリペプチド配列）などである。さらに、特に有用な立体選択的ＢＣＯは真核生物、特に魚綱（ｐｅｓｃｅｓ）から得られ、好ましくはダニオ属（Ｄａｎｉｏ）又はイクタルルス属（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）から、より好ましくはＤ．レリオ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）又はＩ．プンクタトゥス（Ｉ．ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）から得られ、例えば、ＤｒＢＣＯ１（Ｑ９０ＷＨ４に由来するポリペプチド配列）、ＩｐＢＣＯ（ＸＰ＿０１７３３３６３４に由来するポリペプチド配列）などである。
【００２０】
本発明の１つの好ましい態様では、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、（１）Ｄ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などのドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から選択される立体選択的ＢＣＯ、好ましくは配列番号３に従うポリペプチドと、（２）真菌、例えば、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、好ましくはＦ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、より好ましくはＦｆＲＤＨ１２（配列番号１）から選択される、本明細書で定義されるレチノールの生成に対する活性を有するＲＤＨとを含む。
【００２１】
本明細書で定義される宿主細胞に、遺伝子及び／又はタンパク質、例えば、本明細書で定義されるレチノールの形成に対する選択性を有するトランス選択的ＢＣＯ又はＲＤＨなどのコピーをより多く生じさせるための改変は、強力なプロモーター、適切な転写及び／若しくは翻訳エンハンサーの使用、又はカロテノイド産生宿主細胞への１つ若しくは複数の遺伝子コピーの導入を含み、所与の時間におけるそれぞれの酵素の蓄積の増大をもたらし得る。当業者には、宿主細胞に基づいてどの技術を使用するかが分かる。遺伝子発現の増大又は低減は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００２２】
核酸又はアミノ酸への突然変異の発生、すなわち突然変異誘発は、例えば、ランダム若しくは部位特異的（ｓｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、例えば放射線などの作用物質によって生じる物理的損傷、化学的処理、又は遺伝因子の挿入などによる種々の方法で実施され得る。当業者には、突然変異を導入する方法が分かる。
【００２３】
したがって、本発明は、発現ベクター、又は宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれた本明細書に記載されるＲＤＨをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。本明細書に記載されるＲＤＨをコードする、発現ベクター上の又は染色体ＤＮＡに組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むこのようなカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、組換え宿主細胞と呼ばれる。カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、本明細書で定義されるＲＤＨをコードする遺伝子、例えば、配列番号１に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの１つ又は複数のコピーを含有し、本明細書で定義されるＲＤＨをコードするこのような遺伝子の過剰発現をもたらし得る。遺伝子発現の増大は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００２４】
本明細書で開示される配列と、少なくとも約９０％の全変換率を有するレチナールからレチノールへの還元に対する優先性とに基づいて、レチナールからレチノールへの変換に使用され得る、本明細書で定義されるレチナール還元活性を有するポリペプチドをコードするさらなる適切な遺伝子を容易に推定することができ、特に、変換され得るレチナール混合物中のトランス−レチナールの割合は、レチナール混合物中に存在するトランス−レチナールが少なくとも約６１％、例えば、少なくとも約６１〜９０％である。したがって、本発明は、新規のレチナール還元酵素を同定するための方法に関し、ここで、少なくとも約９０％の全変換率のレチノールの産生に対する優先性を有する新規のレチナール還元酵素のスクリーニングプロセスにおけるプローブとして、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ＲＤＨ１２（配列番号１）に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドが使用される。還元作用が、反応混合物中のレチナールの量と比較して少なくとも約９０％のレチノールをもたらす限り、ＲＤＨ活性を有するあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されるレチナールからのレチノールの産生のために使用され得る。したがって、本発明に従うプロセスのために使用される適切なＲＤＨは、例えば、レチノールからレチナールへの変換（逆反応）から得られるレチノイドの総量に基づいて、約１０％以下のレチナールを産生することができる酵素を含む。
【００２５】
本発明は特に、レチノールの生産プロセスにおけるこのような新規のレチナール還元酵素の使用に関し、ここで、本明細書で定義される前記ＲＤＨの作用によるレチナールの産生は低減又は消失され、レチノールの産生は増大されており、レチノイド混合物中のレチノールとレチナールの比率は少なくとも約９：１になる。このプロセスは、前記ＲＤＨを発現する適切なカロテノイド産生宿主細胞を用いて実施することができ、好ましくは、前記ＲＤＨをコードする遺伝子は異種発現される、すなわち前記宿主細胞に導入される。レチノールはさらに、（既知の）適切な機構の作用によってビタミンＡに変換され得る。
【００２６】
レチノールからレチナールへの変換に対する活性の低減又は消失は、本明細書で使用される場合、レチナールの産生に対する活性がレチノールの産生に対する酵素活性と比べて低下されることを意味する。本明細書で使用される場合、レチノールからレチナールへの変換に対する活性の低減又は消失、すなわちレチナールからレチノールへの還元に対する産物比の改善は、レチノイド混合物中のレチノールとレチナールの産物比が少なくとも約９：１、例えば、９．１：１、９．２：１、９．５：１、９．８：１又は最大１０：１までであることを意味し、この産物比は、本明細書で定義される特異的なＲＤＨを用いて達成される。
【００２７】
レチノイド混合物中のレチナールの量の低減又は消失は、本明細書で定義されるＲＤＨの酵素作用によって産生されるレチノイドの総量を基準として、レチノイド混合物中のレチナールを約１０％以下まで制限することを意味する。
【００２８】
本明細書で定義されるレチナール還元酵素の使用は、レチナールの低減に関するさらなる遺伝子改変を有さない、すなわち宿主細胞中に存在する内在性真菌ＲＤＨ相同体を発現する、例えばヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などのこのような真菌宿主細胞において内在性ＲＤＨ（のみ）を保有する非改変宿主細胞と比較して、全変換率の少なくとも約１８％、例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％などの増大をもたらす。
【００２９】
本明細書で使用される場合、レチノールの産生に関して、特に本明細書で定義されるＲＤＨを用いたレチナールの変換からのレチノールの産生に関して「少なくとも約９０％」という用語は、少なくとも約９０％、例えば、９２、９５、９８％又は最大１００％までのレチナールがレチノールに変換されることを意味する。レチナールの産生に関して、特に本明細書で定義されるＲＤＨを用いたレチノールの変換からのレチナールの産生に関して「約１０％以下」という用語は、約１０％以下、例えば、８、７、５、２又は０％までの産生したレチノールが変換されてレチナールに戻ることを意味する。これらの数値は全て、本明細書で定義される適切なカロテノイド産生宿主細胞中に存在するレチノイド混合物中のレチナール及びレチノールの量を基準とする。
【００３０】
「配列同一性」、「同一性％」又は「配列相同性」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的で、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性の割合を決定するために、配列は最適な比較を目的として整列されることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアライメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アライメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって行われてもよい。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列はいずれも、このアルゴリズムによって整列され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列につては、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択的パラメータは、１０のギャップ−オープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらの異なるパラメータ全てがわずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを用いたときに２つの配列の全体の同一性の割合は有意に変化されないことを認識するであろう。
【００３１】
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメントの後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：両方の配列内の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメント内の対応する位置の数を、アライメント内のギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「最長同一性」として標識される。比較される両方のアミノ酸配列が、そのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、これらは同一である、すなわち１００％の同一性を有する。本明細書で定義される植物に由来する酵素に関して、当業者には、植物由来の酵素が例えば葉緑体プロセシング酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素により切断され得る葉緑体標的シグナルを含有し得ることが分かる。
【００３２】
宿主細胞に応じて、本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、それぞれの宿主細胞における発現のために最適化され得る。当業者には、このような改変ポリヌクレオチドを作成する方法が分かる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、このような宿主最適化核酸分子が本明細書で定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、これらも包含することが理解される。
【００３３】
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＲＤＨをコードするポリヌクレオチドを含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、これは、宿主細胞又は酵素の成長又は発現パターンに影響を与えずに、前記宿主細胞における発現のために最適化されている。特に、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択され、本明細書で定義されるＲＤＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２、５、６、又は７に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリヌクレオチドから選択される。
【００３４】
本明細書で定義されるＲＤＨは、酵素活性を変更しないアミノ酸置換を保有する酵素も包含し、すなわちこれらは野生型酵素に関して同じ特性を示し、特に、レチノールの産生に対して、少なくとも約９０％の全変換率で、レチナールからレチノールへの変換を触媒する。このような突然変異は「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載される酵素の（酵素）活性を変更しない。
【００３５】
本発明に従う核酸分子は、例えば配列番号２、４、５、６又は７に従うポリヌクレオチド配列などの、本発明により提供される核酸配列の一部のみ又は断片、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得る断片、又は本明細書で定義されるＲＤＨの一部をコードする断片を含み得る。ＲＤＨ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種からの他の相同体の同定及び／又はクローニングにおいて使用するために設計されるプローブ及びプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、これは通常、配列番号２、４、５、６又は７に従うヌクレオチド配列の少なくとも約１２又は１５、好ましくは約１８又は２０、より好ましくは約２２又は２５、さらにより好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５以上の連続ヌクレオチド又はその断片又は誘導体に対して好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００３６】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃における６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃における１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回又は複数回の洗浄である。
【００３７】
高ストリンジェント条件には、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むか又は含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、又は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、及び２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含む溶液などの溶液中でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識化系；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙを用いて調製）を用いた４２℃における２時間〜４日間のインキュベーションと、その後、室温において２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で５〜１５分間フィルターを２回洗浄し、次に、６５〜６８℃において０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ又は０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５〜３０分間２回洗浄することが含まれる。
【００３８】
本明細書で定義される特異的ＲＤＨの１つをコードする酵素／ポリヌクレオチドの発現は、カロテノイド／レチノイドの産生に適しており、且つ本明細書に記載される機能的等価物又は誘導体を含む本明細書で開示される酵素の１つをコードする核酸の発現を可能にする（微）生物を含む任意の宿主系において達成することができる。適切なカロテノイド／レチノイド産生宿主（微）生物の例は、細菌、藻類、酵母を含む真菌、植物又は動物細胞である。好ましい細菌は、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、例えばパラコックス・ゼアキサンチニファキエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などのパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）のものである。好ましい真核微生物、特に酵母を含む真菌は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）などのフィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、例えばブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）などのブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。特に好ましいのは、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）若しくはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞における発現、又はエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）における発現、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現である。
【００３９】
本発明に関して、例えば、微生物、真菌、藻類、又は植物などの生物は、原核生物の国際命名規約又は藻類、真菌、及び植物の国際命名規約（メルボルン規約）によって定義されるような、同じ生理学的特性を有するこのような種の同義語又はバソニムも含むことが理解される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、カロテノイド、例えばベータ−カロテンの産生をもたらす宿主細胞である。カロテノイド産生宿主細胞を作成するための遺伝子及び方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットが参照される。産生されるカロテノイドに応じて、異なる遺伝子が関与し得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、レチノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、ベータ−カロテンからレチナール及びレチノールへの酵素変換によって、レチノイド、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体の産生をもたらす宿主細胞である。これらのポリペプチドは、本明細書で定義されるＲＤＨを含む。ビタミンＡ経路の遺伝子、及びレチノイド産生宿主細胞の作成方法は、当該技術分野において知られている。好ましくは、ベータ−カロテンはベータ−カロテン酸化酵素の作用によってレチナールに変換され、レチナールは本明細書で定義されるＲＤＨの作用によってさらにレチノールに変換され、レチノールは、アセチル−トランスフェラーゼ酵素、例えばＡＴＦ１などの作用によって酢酸レチノールに変換される。酢酸レチノールは、宿主細胞から単離される最適なレチノイドであり得る。
【００４２】
本発明は、本明細書に記載されるＲＤＨの作用によるレチナールの還元によって、特に少なくとも９０％の全変換率でレチノールを生産するための方法に関し、生産されるレチノイド混合物中のレチナールの量は約１０％以下であり、レチナール還元酵素は、好ましくは、本明細書に記載される適切な条件下、適切な宿主細胞において異種発現される。産生されるレチノールは培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。さらなる実施形態では、レチノールは、ビタミンＡをもたらす多段階プロセスにおける前駆体として使用することができる。ビタミンＡは、当該技術分野で知られているように培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。
【００４３】
したがって、本発明は、レチノイド混合物中のレチナールの割合を低減するため、又はレチノイド混合物中のレチノールの割合を増大させるためのプロセスに関し、レチノールは、本明細書で定義されるＲＤＨの１つと、レチナールとを接触させ、少なくとも約９０％の割合のレチノール又は約３５％以下のレチナールを有するレチノール／レチナール混合物をもたらすことによって生成される。特に、前記プロセスは、（ａ）本明細書で定義されるＲＤＨの１つをコードする核酸分子を、本明細書で定義される適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入することと、（ｂ）前記発現されたＲＤＨの作用によってレチナールをレチノールに酵素切断し、レチノールの割合が、レチノイド混合物中のレチナール及びレチノールの総量を基準として少なくとも９０％であることと、任意選択的に（３）当業者に知られている適切な条件下でレチノール、好ましくはトランス−レチノールをビタミンＡに変換することとを含む。
【００４４】
ベータ−カロテン産生遺伝子、本明細書で定義されるＲＤＨ遺伝子、任意選択的に、ベータ−カロテン酸素化酵素をコードする遺伝子、及び／又は任意選択的に、ビタミンＡの生合成に必要とされるさらなる遺伝子を発現することができる宿主細胞、すなわち微生物、藻類、真菌、動物又は植物細胞は、好気性又は嫌気性条件下で適切な栄養分が補充され、種々の宿主細胞のために当業者により知られているような水性培地中で培養され得る。任意選択的に、このような培養は、本明細書で定義される電子の移動に関与するタンパク質及び／又は補助因子の存在下で行われる。宿主細胞の培養／成長は、バッチ、流加バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、半連続又は連続モードで行うことができる。宿主細胞に応じて、好ましくは、例えば、ビタミンＡ及び前駆体（レチナール、レチノールなど）などのレチノイドの産生は、当業者に知られているように異なり得る。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択されるベータ−カロテン及びレチノイド産生宿主細胞の培養及び単離は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される宿主細胞におけるレチノイドの産生に関して、方法は、例えば、Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１０：９５（２０１１）に記載されている。例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母宿主細胞においてベータ−カロテン及びレチノイドを生産するための特定の方法は、例えば、国際公開第２０１４９６９９２号パンフレットに開示されている。
【００４５】
本明細書で使用される場合、酵素に関して「比活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。比活性は、規定温度において所与の期間に規定量のタンパク質によって消費される基質及び／又は産生される産物の量を定義する。通常、比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）で略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）という比活性の単位の定義は、本文書を通して互換的に使用される。酵素は、インビボで、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内、又は適切な基質が存在する系内でその触媒活性を実施すれば活性である。当業者には、酵素活性、特に、本明細書で定義されるＲＤＨの活性の測定方法が分かる。レチナールの変換からのレチノールの産生について本明細書で定義される適切なＲＤＨの能力を評価するための分析方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの実施例４などに記載されている。簡単には、レチノール、トランス−レチナール、シス−レチナール、ベータ−カロテンなどの産物の力価は、ＨＰＬＣによって測定することができる。
【００４６】
本明細書で使用されるレチノイドは、レチナール、レチノール酸、レチノール、レチノイン酸メトキシド（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）、酢酸レチニル、レチニルエステル、４−ケト−レチノイド、３ヒドロキシ−レチノイド又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されないアポカロテノイドとしても知られているベータカロテン切断産物を含む。レチナール及びレチノールを含む混合物は、本明細書では「レチノイド混合物」と呼ばれ、レチノールに関して「少なくとも約９０％」、又はレチナールに関して「約１０％以下」の割合は、このようなレチノイド混合物中のレチノール対レチナールの比率を指す。レチノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。
【００４７】
本明細書で使用されるレチナールは、ＩＵＰＡＣ名（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエナールで知られている。これは、本明細書では互換的にレチンアルデヒド又はビタミンＡアルデヒドと称され、シス−及びトランス−アイソフォームの両方、例えば、１１−シスレチナール、１３−シスレチナール、トランス−レチナール及び全トランスレチナールなどが含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される「カロテノイド」という用語は、当該技術分野においてよく知られている。これは、２つの２０炭素ゲラニルゲラニルピロリン酸分子の連結により天然で形成される長い４０炭素の結合イソプレノイドポリエンを含む。これらには、４−ケト位置又は３−ヒドロキシ位置で酸化されてカンタキサンチン、ゼアキサンチン、又はアスタキサンチンをもたらし得る、フィトエン、リコペン、及び例えばベータ−カロテンなどのカロテンが含まれるが、これらに限定されない。カロテノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットに記載される。
【００４９】
本明細書で使用されるビタミンＡは、水溶液中に見られるビタミンＡの任意の化学形態（例えば、その遊離酸形態で非解離、又はアニオンとして解離）であり得る。本明細書で使用される用語は、生物工学的ビタミンＡ経路における全ての前駆体又は中間体を含む。また、酢酸ビタミンＡも含む。
【００５０】
特に、本発明は、本実施形態を特徴とする：
【００５１】
−  レチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞がレチナール及びレチノールを含むレチノイド混合物を産生し、前記レチノイド混合物中に存在するレチナールの量と比較して、レチノールの割合が少なくとも約９０％、好ましくは９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％である、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５２】
−  レチノールデヒドロゲナーゼの作用によって還元され得るレチナールが、トランス−レチナール及びシス−レチナールの混合物を含み、前記レチナール混合物中のトランス−レチナールの割合が、少なくとも約６１〜９８％、好ましくは少なくとも約６１〜９５％、より好ましくは少なくとも約６１〜９０％の範囲である、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５３】
−  異種レチノールデヒドロゲナーゼを含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５４】
−  宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、酵母を含む真菌から、より好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から、さらにより好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。
【００５５】
−  宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）又はパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。
【００５６】
−  レチノールデヒドロゲナーゼが、真菌、好ましくはフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、より好ましくはフザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）から選択され、最も好ましくは、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ＲＤＨ１２の群から選択され、特に、配列番号１に従うポリペプチド、又は配列番号２に従うポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５７】
−  レチノールがさらにビタミンＡに変換される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。
【００５８】
−  ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から選択される、ベータ−カロテンからレチナール混合物への変換を触媒するトランス選択的ベータ−カロテン酸化酵素であって、混合物が、混合物中のレチナールの総量を基準として、少なくとも約６１％、好ましくは６５、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は最大１００％までのトランス−アイソフォームのレチナールを含み、より好ましくは、配列番号３に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列から選択されるトランス選択的ベータ−カロテン酸化酵素をさらに含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５９】
−  レチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］の酵素活性によってレチノール及びレチナールを含むレチノイド混合物を生産するためのプロセスであって、レチナールを前記レチノールデヒドロゲナーゼと接触させることを含み、レチノイド混合物中のレチノール対レチナールの比率が少なくとも約９：１である、プロセス。
【００６０】
−  レチノールデヒドロゲナーゼの酵素作用から生じるレチノイド混合物中のレチナールの量を低減するためのプロセスであって、前記プロセスが、レチナールを本明細書で定義されるレチノールデヒドロゲナーゼと接触させることを含み、前記酵素作用から得られるレチノイド混合物中のレチナールの量がレチノールの量と比較して約１０％以下の範囲である、プロセス。
【００６１】
−  レチノールデヒドロゲナーゼの酵素作用から生じるレチノイド混合物中のレチノールの量を増大させるためのプロセスであって、前記プロセスが、レチナールを本明細書で定義されるレチノールデヒドロゲナーゼと接触させることを含み、前記酵素作用から得られるレチノイド混合物中のレチノールの量がレチノールの量と比較して少なくとも約９０％の範囲である、プロセス。
【００６２】
−  レチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いる、上記に従う及び本明細書で定義されるプロセスであって、前記宿主細胞がレチナール及びレチノールを含むレチノイド混合物を産生し、前記レチノイド混合物中に存在するレチナールの量と比較して、レチノールの割合が少なくとも約９０％、好ましくは９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％である、プロセス。
【００６３】
−  （ａ）本明細書で定義されるレチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］をコードする核酸分子を適切なカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）レチナールを、少なくとも約９：１の比率のレチノール及びレチナールを含むレチノイド混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下でレチノールをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【００６４】
−  ９：１の比率のレチノール及びレチナールを含むレチノイド混合物を生産するための、上記の及び本明細書で定義されるレチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］の使用であって、レチノールデヒドロゲナーゼが適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において異種発現される、使用。
【００６５】
以下の実施例は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは全く意図されない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に国際公開第２００６１０２３４２号パンフレット、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレット又は国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの内容は、参照によって本明細書に援用される。
【００６６】
［実施例］
［実施例１：一般的な方法、菌株、及びプラスミド］
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。
【００６７】
［振とうプレートアッセイ］
通常、８００μｌの０．０７５％酵母抽出物、０．２５％ペプトン（０．２５Ｘ  ＹＰ）に、１０μｌの新たに成長させたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を播種し、２００μｌのＤｒａｋｅｏｌ５鉱油でオーバーレイし、炭素源として鉱油中５％のコーン油及び／又は水相中５％のグルコースを用いた。２４ウェルプレート（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ，３０℃、８００ＲＰＭ）において、形質転換体をＹＰＤ培地中で２０％のドデカンと共に４日間成長させた。鉱油画分を振とうプレートウェルから取り出し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて、順相カラムでＨＰＬＣにより分析した。
【００６８】
［ＤＮＡ形質転換］
菌株をＹＰＤプレート培地上で一晩成長させることにより形質転換させる。５０μｌの細胞をプレートからこすり取り、１μｇの形質転換ＤＮＡ、通常は組込み形質転換のための直鎖ＤＮＡ、４０％のＰＥＧ  ３５５０ＭＷ、１００ｍＭの酢酸リチウム、５０ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌ中、４０℃で６０分間のインキュベーションにより形質転換させ、選択培地に直接プレーティングするか、或いは優性抗生物質マーカー選択の場合は、細胞をＹＰＤ液体培地において３０℃で４時間増殖させた後、選択培地にプレーティングする。
【００６９】
［ＤＮＡ分子生物学］
ｐＵＣ５７ベクターにおいてＮｈｅｌ及びＭｌｕｌ末端を用いて遺伝子を合成した。国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットの場合のように、通常、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換におけるマーカー選択のために、遺伝子をＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」、ＭＢ６１５７ＨｙｇＲ、及びＭＢ８３２７ＮａｔＲベクターにサブクローニングした。遺伝子及びマーカーＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌ（ＭＢ５０８２）又はＰｖｕｌｌ（ＭＢ６１５７及びＭＢ８３２７）のランダム非相同末端結合によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれゲル電気泳動及びＱｉａｇｅｎゲル精製カラムにより精製した。
【００７０】
［プラスミドのリスト］
使用するプラスミド、菌株、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表１、２及び配列表に記載される。ヌクレオチド配列番号２、４、５、６、及び７は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現に対してコドン最適化される。
【００７１】
【表１】
2020534808.tif 000002
【００７２】
【表２】
2020534808.tif 000003
【００７３】
［順相レチノール法］
Ｗａｔｅｒｓ  ７１７オートサンプラーに取り付けたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリーポンプを用いて、サンプルを注入した。安全シリカガードカラムキットを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｓｉｌｉｃａ（２），１５０ｘ４．６ｍｍを使用して、レチノイドを分離した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、３０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸、又はゼアキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、６０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸のいずれかからなる。それぞれの流速は、０．６ｍＬ／分である。カラム温度は周囲温度である。注入容積は２０μＬである。検出器は、２１０ｎｍから６００ｎｍまでを収集するフォトダイオードアレイ検出器である。表３に従って分析物を検出した。
【００７４】
【表３】
2020534808.tif 000004
【００７５】
［サンプル調製］
条件に応じて種々の方法によりサンプルを調製した。全培養液又は洗浄培養液サンプルのために、培養液を秤量したＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）管に入れ、移動相を添加した。製造指示書に従って最高設定３ＸにおいてＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｃｏｒｐ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）内でサンプルを処理した。洗浄培養液中、サンプルを微量遠心管において１００００ｒｐｍで１分間、１．７ｍｌ管内で回転させ、培養液をデカントし、１ｍｌの水を添加し、混合し、ペレットにし、デカントして、元の容積にした。混合物を再度ペレットにし、適切な量の移動相中に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ビーズビーティングにより処理した。鉱油画分の分析のために、サンプルを４０００ＲＰＭで１０分間回転させ、ポジティブディスプレイスメントピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）により油を上部からデカントして除去し、移動相中に希釈し、ボルテックスにより混合し、ＨＰＬＣ分析によりレチノイド濃度を測定した。
【００７６】
［発酵条件］
発酵は既に記載された条件と同一であり、鉱油のオーバーレイと、０．５Ｌ〜５Ｌの全容積のベンチトップ反応器内に供給されたコーン油である攪拌槽とを用いた（国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットを参照）。一般的に、生産性が増大された流加バッチ攪拌漕反応器を用いて同じ結果が観察され、レチノイドの生産のためのシステムの有用性が実証された。
【００７７】
［実施例２：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチノイドの産生］
通常、異種ＲＤＨの発現のために、ベータカロテン菌株ＭＬ１７７６７を、ＵＲＡ３プロモーターへのレチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）遺伝子断片リンカーを含有するプラスミド由来の精製ＨｉｎＤＩＩＩ／Ｘｂａｌ断片で形質転換した。６〜８の単離株を振とうプレートアッセイレチノール：レチナール比の低下についてスクリーニングし、成功した単離株を流加バッチ攪拌漕反応器において８日間実行させ、プロセスの生産性の一桁の増大が示され、大規模生産における有用性が示された。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＲＤＨ１２相同体を用いて最良の結果が得られ、上記のような８日間の振とうフラスコインキュベーションの後に維持された残留レチナールはわずか２％であった。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）配列に由来する単離株は、下記の表に示すようにレチノールの還元の増大を実証した。
【００７８】
［実施例３：サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチノイドの産生］
通常、ベータカロテン菌株は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０１３０６２８号明細書又は国際公開第２００９１２６８９０号パンフレットに記載される）ような標準的方法に従って、ベータカロテンを産生している構築されたゲラニルゲラニルシンターゼ、フィトエンシンターゼ、リコペンシンターゼ、リコペンシクラーゼなどの酵素をコードする異種遺伝子で形質転換される。さらに、ベータカロテンオキシダーゼ遺伝子で形質転換される場合、レチナールを産生することができる。さらに、レチノールデヒドロゲナーゼで形質転換されると、レチノールを産生することができる。このアプローチを用いて、レチノールに対する生産性に対する特異性に関して同様の結果が得られる。
【００７９】
［実施例４：ベータ−カロテンからのレチノールの生産］
実施例２、３及び４に記載される単一の改変に加えて、異種ＦｔＲＤＨ１２と一緒に異種を保有する菌株を構築した。レチノイドの発酵及び分析を上記のように行った。
【００８０】
ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＤｍＮｉｎａＢからの異種ＢＣＯ（ＤｍＢＣＯ１；配列番号３）を発現するために、ベータカロテン菌株ＭＬ１７５４４を、ＵＲＡ３栄養マーカーに連結されたコドン最適化断片を含有するベータカロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）のＨｉｎｄｌｌ及びＸｂａｌ媒介による制限エンドヌクレオチド切断によって、精製直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。形質転換ＤＮＡは、ＭＢ６７０２ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＮｉｎａＢ  ＢＣＯ遺伝子に由来し、それにより、コドン最適化配列（配列番号４）が使用された。次に、遺伝子を成長させ、振とうプレート分析において６〜８の単離株をスクリーニングし、うまく機能する単離株を流加バッチ攪拌漕反応において８〜１０日間実行させた。国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットトに記載されるような標準パラメータを用いるが、レチノイド分析物の精製標準物を用いて較正して、ＨＰＬＣによりシス−及びトランス−レチナールの検出を行った。ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からのＢＣＯ（配列番号３）を異種発現するレチナール混合物中のトランス−レチナールの量は、レチナールの総量を基準として、６１％のトランス−レチナールという結果であった（図示せず）。
【００８１】
異種ＦｔＲＤＨ１２の存在は、分析物中で検出されるレチナールの量を２０％から４％に低減し、これは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＲＤＨ１２の特異的なレチナール還元活性の良好な表示であり（実施例２を参照）、トランス−レチノールの割合は、依然として少なくとも６１％の範囲である。
【配列表】
2020534808000001.app
【国際調査報告】
2020534808.tif 000005
2020534808.tif 000006
2020534808.tif 000007
2020534808.tif 000008