(57)【要約】バイオリアクタ本体であって、第１の基板および対向する第２の基板を含む、バイオリアクタ本体と、バイオリアクタ本体を通して延在し、第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路と、第１の流体流を第１のチャネルに導入するための第１の入口と、第２の流体流を第２のチャネルに導入するための第２の入口と、第１の流体流が第１のチャネルから流出することを可能にするための第１の出口と、第２の流体流が第２のチャネルから流出することを可能にするための第２の出口と、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の経路の中に配置され、第１のチャネルの中で生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ生物学的産物がバイオリアクタから収集されることを可能にするようなサイズにされる複数の細孔を有する、膜とを含む、バイオリアクタ。
2020509759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクタであって、
１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体であって、少なくとも１つのバイオリアクタ本体は、第１のチャネルと、対向する第２のチャネルとを含み、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料は、事前判定された調節可能な流速において前記第１のチャネルに送達される、１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体と、
前記第１のチャネルと第２のチャネルとの間に配置される膜であって、前記第１のチャネルの中で前記生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ前記生成された生物学的産物が前記第１のチャネルから収集されること、または前記膜を通して前記第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる複数の細孔を含む、膜と、
を備え、前記第１のチャネルおよび前記第２のチャネルのうちの１つまたはそれを上回るものは、前記流速の調節と関連して、前記生物学的原材料上の剪断応力および所与の速度における前記膜を通した圧力を維持するようなサイズおよび形状にされる、
バイオリアクタ。
【請求項２】
前記第１および第２のチャネルの一方または両方は、前記膜に沿った前記生物学的原材料の一様な分配を確実にするようなサイズおよび形状にされる、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３】
前記生物学的原材料上の前記剪断応力および前記圧力の制御は、前記剪断応力および前記圧力が相互から独立して調節され得るように分断される、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項４】
前記剪断応力および圧力は、前記膜にわたる前記生物学的供給源産物の播種密度を調節することによって独立して制御されることができる、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項５】
前記細孔の径は、前記生物学的原材料の本質的に全てまたは全てが前記第１のチャネルの中に捕獲される一方で、前記生物学的産物の全てまたは本質的に全てが収集のために前記第２のチャネルの中に入ることを可能にされるように選択される、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項６】
バイオリアクタであって、
１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体であって、少なくとも１つのバイオリアクタ本体は、第１の基板と、前記第１の基板と係合される、対向する第２の基板とを含む、１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体と、
前記バイオリアクタ本体を通して延在し、前記第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび前記第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路であって、前記第２のチャネルは、前記第１のチャネルと整合している、経路と、
第１の流体流を前記第１のチャネルに導入するための第１の入口と、
第２の流体流を前記第２のチャネルに導入するための第２の入口と、
前記第１の流体流が前記第１のチャネルから流出することを可能にするための第１の出口と、
前記第２の流体流が前記第２のチャネルから流出することを可能にするための第２の出口と、
前記第１のチャネルと第２のチャネルとの間の前記経路の中に配置される膜であって、前記膜は、複数の細孔を含み、前記細孔は、前記第１のチャネルの中で、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ前記生成された生物学的産物が前記第１のチャネルから収集されること、または前記膜を通して前記第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる、膜と、
を備える、バイオリアクタ。
【請求項７】
前記経路は、蛇行経路である、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項８】
前記生物学的原材料は、幹細胞、および／または造血性内皮、造血前駆細胞、巨核球、内皮細胞、白血球、赤血球、骨髄細胞、血液細胞、肺細胞、基底膜を含む細胞等の幹細胞分化の中間ならびに／もしくは最終産物を含む、細胞、および／またはＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロース、ならびにコラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、マトリゲル、Ｆｌｔ−３、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＰＬＬ、ＩＬ３、６、９、１ｂ、ビトロネクチンを含む、細胞外マトリックスタンパク質を含む、小分子、もしくはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
前記生物学的産物は、前記生物学的原材料の産物、前記生物学的原材料の成分、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む、請求項８に記載のバイオリアクタ。
【請求項１０】
前記生物学的原材料は、巨核球を含み、前記生物学的産物は、血小板前駆体、血小板前駆細胞、血小板、またはそれらの成分産物のうちの１つまたはそれを上回るものを含む、請求項９に記載のバイオリアクタ。
【請求項１１】
前記第１の流体流および前記第２の流体流のうちの少なくとも１つは、細胞培地、全血、血漿、血小板添加溶液、懸濁媒体、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む、１つまたはそれを上回る生物学的物質を含む、流体媒体を含む、請求項８に記載のバイオリアクタ。
【請求項１２】
前記生物学的原材料を前記第１のチャネルに導入するための第３の入口をさらに備える、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項１３】
前記第１の流体流を前記第１の出口から前記第１の入口に再循環させるための第１の再循環ラインと、
前記第２の流体流を前記第１の出口から前記第２の入口に再循環させるための第２の再循環ラインと、
をさらに備える、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項１４】
前記第１の再循環ラインを通して前記第１の流体流を圧送するための第１のポンプと、
前記第２の再循環ラインを通して前記第２の流体流を圧送するための第２のポンプと、
をさらに備える、請求項１３に記載のバイオリアクタ。
【請求項１５】
前記第１の再循環ラインを通して前記第１の流体流を圧送するため、および前記第２の再循環ラインを通して前記第２の流体流を圧送するための単一のポンプをさらに備える、請求項１３に記載のバイオリアクタ。
【請求項１６】
前記膜の細孔はさらに、前記生物学的原材料および生物学的産物が前記膜を通過しないように防止するようなサイズにされる、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項１７】
前記第１および第２のチャネルの中の前記第１および第２の流体流の流速を制御し、生物学的産物の産生を促進するように選択される事前判定された範囲内で前記膜における剪断速度を生成するように構成される、流量コントローラをさらに備える、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項１８】
前記膜において生成される前記剪断速度は、生理学的に適切であり、約１０秒−１〜５，０００秒−１の範囲内である、請求項１７に記載のバイオリアクタ。
【請求項１９】
前記第１のチャネルまたは前記第２のチャネルのうちの少なくとも１つの中の流動は、蠕動流または層流のうちの１つである、請求項１５に記載のバイオリアクタ。
【請求項２０】
前記蠕動流は、１分あたり４０〜１２０パルスの生理学的に適切な周波数を伴って脈動する、請求項１９に記載のバイオリアクタ。
【請求項２１】
前記脈動蠕動流中に前記膜において生成される剪断速度は、２５０秒−１〜１，８００秒−１の生理学的に適切な範囲を通して変動する、請求項２０に記載のバイオリアクタ。
【請求項２２】
前記第１の基板は、前記第２の基板に接合される、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項２３】
前記膜は、前記第１基板と第２の基板との間に接合される、請求項２２に記載のバイオリアクタ。
【請求項２４】
前記第１のチャネルの高さおよび前記第２のチャネルの高さは、前記経路の長さに沿って前記膜を横断して一様な圧力降下を生じるようなサイズにされる、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項２５】
前記第１のチャネルの高さおよび前記第２のチャネルの高さは、前記経路の長さに沿った前記膜の表面における一様な剪断または前記膜を通した圧力を生じるようなサイズにされる、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項２６】
各チャネルの表面と前記膜との間に形成されるテーパ角は、約０〜５度の範囲内である、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項２７】
前記基板は、熱可塑性物質、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、コーティングされたポリスチレン、コーティングされたガラス、シルク、ヒドロゲル、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項２８】
前記膜は、熱可塑性物質、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、コーティングされたポリスチレン、コーティングされたガラス、シルク、ヒドロゲル、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項２９】
前記細孔は、約０．１マイクロメートル〜５０マイクロメートルの範囲内のサイズである、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項３０】
前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとの間の圧力差プロファイルは、前記膜の少なくとも一部にわたって実質的に一様である、請求項６に記載のバイオリアクタ。
【請求項３１】
生物学的産物を生成するための方法であって、
第１の基板と、前記第１の基板と係合される、対向する第２の基板とを含む、少なくとも１つのバイオリアクタ本体と、
前記バイオリアクタ本体を通して延在し、前記第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび前記第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路であって、前記第２のチャネルは、前記第１のチャネルと整合している、経路と、
前記第１のチャネルと第２のチャネルとの間の前記経路の中に配置される膜であって、前記膜は、複数の細孔を含み、前記細孔は、前記第１のチャネルの中で、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ前記生成された生物学的産物が前記膜を通して前記第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる、膜と、
を備える、バイオリアクタを提供するステップと、
前記バイオリアクタに播種するために、前記生物学的原材料を前記第１のチャネルに導入するステップと、
前記所望の生物学的産物を生成するために、事前判定された第１の流速において前記バイオリアクタの第１の入口を介して、第１の流体流を前記第１のチャネルに、事前判定された第２の流速において前記バイオリアクタの第２の入口を介して、第２の流体流を前記第２のチャネルに導入するステップと、
前記バイオリアクタアセンブリから前記所望の生物学的産物を収穫するステップと、
を含む、方法。
【請求項３２】
第１の再循環ラインを介して前記第１のチャネルの第１の出口から前記第１の入口に前記第１の流体流を再循環させるステップと、
第２の再循環ラインを介して前記第２のチャネルの第２の出口から前記第２の入口に前記第２の流体流を再循環させるステップと、
をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１のポンプによって、前記第１の再循環ラインを通して前記第１の流体流を圧送するステップと、
第２のポンプによって、前記第２の再循環ラインを通して前記第２の流体流を圧送するステップと、
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
単一のポンプによって、前記第１の再循環ラインを通して前記第１の流体流を圧送し、前記第２の再循環ラインを通して前記第２の流体流を圧送するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝臓、卵黄嚢、脾臓、または多能性幹細胞から前記生物学的原材料を生成するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記生物学的原材料を導入するステップはさらに、前記生物学的原材料を含有する流体を前記第１のチャネルに流入させるステップを含み、前記膜に沿った前記生物学的原材料の分配は、前記生物学的原材料を含有する前記流体の流動によって媒介される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物学的原材料は、前記細孔のうちの１つによって選択的に捕捉されたとき、前記細孔を封鎖する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記選択的に捕捉された生物学的原材料による前記細孔の封鎖は、前記膜を通した流体流を媒介する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとの間の前記膜を横断した圧力降下を監視するステップと、
前記圧力降下から、前記生物学的原材料を含有する、前記導入された流体内の前記生物学的原材料の密度を判定するステップと、
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記判定された密度に応答して、前記生物学的原材料を含有する、前記導入された流体の導入量を調節するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
バイオリアクタであって、
１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体であって、少なくとも１つのバイオリアクタ本体は、第１の基板と、前記第１の基板と係合される、対向する第２の基板とを含む、１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体と、
前記バイオリアクタ本体を通して延在し、前記第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび前記第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路であって、前記第２のチャネルは、前記第１のチャネルと整合している、経路と、
第１の流体流を前記第１のチャネルに導入するための第１の入口と、
第２の流体流を前記第２のチャネルに導入するための第２の入口と、
生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を前記第１のチャネルに送達するための第３の入口と、
前記第１の流体流が前記第１のチャネルから流出することを可能にするための第１の出口と、
前記第２の流体流が前記第２のチャネルから流出することを可能にするための第２の出口と、
前記第１のチャネルと第２のチャネルとの間の前記経路の中に配置される膜であって、前記膜は、複数の細孔を含み、前記細孔は、前記第１のチャネルの中で、前記生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ前記生成された生物学的産物が前記第１のチャネルから収集されること、または前記膜を通して前記第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる、膜と、
を備える、バイオリアクタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１７年３月７日に出願された米国仮出願番号第６２／４６８，００８号に基づく優先権および利益を主張しており、この仮出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（政府支援の陳述）
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された１Ｒ４４ＨＬ１３１０５０−０１の下、政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（分野）
本開示は、概して、流体システムに関し、より具体的には、バイオリアクタに関する。
【背景技術】
【０００４】
（本開示の背景）
医療実践では、種々の生物学的産物が、種々の疾患、感染症、悪性腫瘍、および外傷を治療するために使用されることができる。加えて、そのような生物学的産物（例えば、血漿、血小板、白血球、赤血球）は、患者内の欠乏した生物学的産物に取って代わるために使用されることができる。そのような生物学的産物の産生は、種々の幹細胞からの産生等の種々の技法を使用して試行されてきた。利用される幹細胞は、典型的には、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、および人工多能性幹細胞を含んでいる。他の幹細胞源は、骨髄、胎児肝臓、および末梢血中で見出される幹細胞を含んでいる。しかしながら、研究室内のいくつかの生物学的産物の成功した産生にもかかわらず、多くの限界が、臨床設定での使用に残っている。
【０００５】
したがって、上記を踏まえて、増大する臨床需要を満たし、ドナー収穫および貯蔵と関連付けられる危険性および費用を回避し得る、生物学的産物の臨床的に関連する収率を生じるための効率的な方法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（開示の要旨）
本開示は、生物学的原材料から臨床的および商業的に関連する生物学的産物を生成することを目的としている、いくつかの特徴および能力を含む、種々のバイオリアクタ実施形態およびそれらの使用方法を説明する。いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるシステムおよび方法は、血小板注入に使用可能な高い血小板収率を生成するために使用されてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタが、提供される。バイオリアクタは、１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体を含み、少なくとも１つのバイオリアクタ本体は、第１のチャネルと、対向する第２のチャネルとを含む。動作時、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料は、事前判定された調節可能な流速において第１のチャネルに送達され、バイオリアクタはさらに、第１のチャネルと第２のチャネルとの間に配置される膜であって、第１のチャネルの中で生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ生成された生物学的産物が第１のチャネルから収集されること、または膜を通して第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる複数の細孔を含む、膜とを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、第１および第２のチャネルの一方または両方は、膜に沿った生物学的原材料の一様な分配を確実にするようなサイズおよび形状にされる。いくつかの実施形態では、本バイオリアクタは、生物学的原材料上の剪断応力および膜貫通圧力の分断、ならびに剪断応力および圧力を相互から独立して変動させることを可能にする。いくつかの実施形態では、本バイオリアクタは、膜にわたる生物学的供給源の産物の播種密度を調節し、剪断応力および圧力の複合性質を補償することによって、剪断応力および圧力が独立して調節され得るように構成される。いくつかの実施形態では、細孔径は、生物学的原材料の本質的に全てまたは全てが第１のチャネルの中に捕獲される一方で、生物学的産物の全てまたは本質的に全てが収集のために第２のチャネルの中に入ることを可能にされるように選択される。いくつかの実施形態では、本バイオリアクタは、流動媒体が、独立して、膜ならびに第１および第２のチャネルの一方または両方を通して再循環され得るように構成される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、膜は、膜が圧力下で伸張すること、または第１もしくは第２のチャネルに向かって湾曲することを可能にする、材料から作製される。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、単一ユニットとして作製される。代替として、バイオリアクタは、第１のチャネルを有する第１の基板および第２のチャネルを有する第２の基板から作製されてもよく、第１の基板および第２の基板は、第１のチャネルまたは第２のチャネルからの漏出を防止する様式で、接着剤によって等、ともに接合される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本バイオリアクタは、播種された細胞の殆ど（＞８０％）に関して緊密な範囲内でチャネルを通した剪断および圧力の制御を可能にする。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ剪断プロファイルは、チャネルの幾何学形状を調節することによって調整されることができる。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、その入口および出口の任意の組み合わせを通して動作中に再循環を可能にする。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、そのサイズが膜細孔径を上回る生物学的材料を効果的に保定することができ、そのサイズが膜細孔径を下回る生物学的産物の通過を可能にする。
【００１１】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタが、提供される。バイオリアクタは、１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体を含み、少なくとも１つのバイオリアクタ本体は、第１の基板と、第１の基板と係合される、対向する第２の基板とを含む。バイオリアクタはまた、バイオリアクタ本体を通して延在し、第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路も含み、第２のチャネルは、第１のチャネルと整合している。バイオリアクタはまた、第１の流体流を第１のチャネルに導入するための第１の入口も含む。バイオリアクタはまた、第２の流体流を第２のチャネルに導入するための第２の入口も含む。バイオリアクタはまた、第１の流体流が第１のチャネルから流出することを可能にするための第１の出口も含む。バイオリアクタはまた、第２の流体流が第２のチャネルから流出することを可能にするための第２の出口も含む。バイオリアクタはまた、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の経路の中に配置される膜も含み、膜は、複数の細孔を含み、細孔は、第１のチャネルの中で、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ生成された生物学的産物が第１のチャネルから収集されること、または膜を通して第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、経路は、蛇行経路である。いくつかの実施形態では、生物学的原材料は、幹細胞、および／または造血性内皮、造血前駆細胞、巨核球、内皮細胞、白血球、赤血球、骨髄細胞、血液細胞、肺細胞、基底膜を含む細胞等の幹細胞分化の中間ならびに／もしくは最終産物を含む、細胞、および／またはＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロース、ならびにコラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、マトリゲル、Ｆｌｔ−３、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＰＬＬ、ＩＬ３、６、９、１ｂ、ビトロネクチンを含む、細胞外マトリックスタンパク質を含む、小分子、もしくはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む。いくつかの実施形態では、生物学的産物は、生物学的原材料の産物、生物学的原材料の成分、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む。いくつかの実施形態では、生物学的原材料は、巨核球を含み、生物学的産物は、血小板前駆体、血小板前駆細胞、血小板、またはそれらの成分産物のうちの１つまたはそれを上回るものを含む。本開示の方法およびデバイスは、生物学的原材料としての巨核球、および生物学的産物としての血小板前駆体、血小板前駆細胞、血小板、またはそれらの成分産物との関連で説明され得るが、本方法およびデバイスはまた、他の生物学的産物を生成する他の生物学的原材料と併用され得ることに留意されたい。いくつかの実施形態では、第１の流体流および第２の流体流のうちの少なくとも１つは、細胞培地、成長因子、全血、血漿、血小板添加溶液、懸濁媒体、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む、１つまたはそれを上回る生物学的物質を含む、流体媒体を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタはまた、生物学的原材料を第１のチャネルに導入するための第３の入口も含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタはまた、第１の流体流を第１の出口から第１の入口に再循環させるための第１の再循環ラインと、第２の流体流を第１の出口から第２の入口に再循環させるための第２の再循環ラインとを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタはまた、第１の再循環ラインを通して第１の流体流を圧送するための第１のポンプと、第２の再循環ラインを通して第２の流体流を圧送するための第２のポンプとを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタはまた、第１の再循環ラインを通して第１の流体流を圧送するため、および第２の再循環ラインを通して第２の流体流を圧送するための単一のポンプを含む。いくつかの実施形態では、膜の細孔はさらに、生物学的原材料および生物学的産物が膜を通過しないように防止するようなサイズにされる。いくつかの実施形態では、バイオリアクタはまた、第１および第２のチャネルの中の第１および第２の流体流の流速を制御し、生物学的産物の産生を促進するように選択される事前判定された範囲内で膜における剪断速度を生成するように構成される、流量コントローラも含む。いくつかの実施形態では、膜において生成される剪断速度は、生理学的に適切であり、約１０秒−１〜５，０００秒−１の範囲内である。いくつかの実施形態では、第１のチャネルまたは第２のチャネルのうちの少なくとも１つの中の流動は、蠕動流または層流のうちの１つである。いくつかの実施形態では、蠕動流は、１分あたり４０〜１２０パルスの生理学的に適切な周波数を伴って脈動する。いくつかの実施形態では、脈動蠕動流中に膜において生成される剪断速度は、２５０秒−１〜１，８００秒−１の生理学的に適切な範囲を通して変動する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の基板は、第２の基板に接合される。いくつかの実施形態では、膜は、第１基板と第２の基板との間に接合される。いくつかの実施形態では、第１のチャネルの高さおよび第２のチャネルの高さは、経路の長さに沿って膜を横断して一様な圧力降下を生じるようなサイズにされる。いくつかの実施形態では、第１のチャネルの高さおよび第２のチャネルの高さは、経路の長さに沿った膜の表面において一様な剪断を生じるようなサイズにされる。いくつかの実施形態では、各チャネルの表面と膜との間に形成されるテーパ角は、約０〜５度の範囲内である。いくつかの実施形態では、基板は、熱可塑性物質、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、コーティングされたポリスチレン、コーティングされたガラス、シルク、ヒドロゲル、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るもの含む。いくつかの実施形態では、膜は、熱可塑性物質、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、コーティングされたポリスチレン、コーティングされたガラス、シルク、ヒドロゲル、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含む。いくつかの実施形態では、細孔は、約０．１マイクロメートル〜５０マイクロメートルの範囲内のサイズである。いくつかの実施形態では、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の圧力差プロファイルは、膜の少なくとも一部にわたって実質的に一様である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、生物学的産物を生成するための方法が、提供される。本方法は、バイオリアクタを提供するステップを含む。バイオリアクタは、第１の基板と、第１の基板と係合される、対向する第２の基板とを含む、少なくとも１つのバイオリアクタ本体を含む。バイオリアクタはまた、バイオリアクタ本体を通して延在し、第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路も含み、第２のチャネルは、第１のチャネルと整合している。バイオリアクタはまた、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の経路の中に配置される膜も含み、膜は、複数の細孔を含み、細孔は、第１のチャネルの中で、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ生成された生物学的産物が膜を通して第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる。本方法はまた、バイオリアクタに播種するために、生物学的原材料を第１のチャネルに導入し、ステップも含む。本方法はまた、所望の生物学的産物を生成するために、事前判定された第１の流速においてバイオリアクタの第１の入口を介して、第１の流体流を第１のチャネルに、事前判定された第２の流速においてバイオリアクタの第２の入口を介して、第２の流体流を第２のチャネルに導入するステップも含む。本方法はまた、バイオリアクタアセンブリから所望の生物学的産物を収穫するステップも含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本方法はまた、第１の再循環ラインを介して第１のチャネルの第１の出口から第１の入口に第１の流体流を再循環させるステップと、第２の再循環ラインを介して第２のチャネルの第２の出口から第２の入口に第２の流体流を再循環させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、第１のポンプによって、第１の再循環ラインを通して第１の流体流を圧送するステップと、第２のポンプによって、第２の再循環ラインを通して第２の流体流を圧送するステップとを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、単一のポンプによって、第１の再循環ラインを通して第１の流体流を圧送し、第２の再循環ラインを通して第２の流体流を圧送するステップも含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝臓、卵黄嚢、脾臓、または多能性幹細胞から生物学的原材料を生成するステップも含む。いくつかの実施形態では、生物学的原材料を導入するステップはさらに、生物学的原材料を含有する流体を第１のチャネルに流入させるステップを含み、膜に沿った生物学的原材料の分配は、生物学的原材料を含有する流体の流動によって媒介される。いくつかの実施形態では、生物学的原材料は、細孔のうちの１つによって選択的に捕捉されたとき、細孔を封鎖する。いくつかの実施形態では、選択的に捕捉された生物学的原材料による細孔の封鎖は、膜を通した流体流を媒介する。いくつかの実施形態では、本方法はまた、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の膜を横断した圧力降下を監視するステップと、圧力降下から、生物学的原材料を含有する、導入された流体内の生物学的原材料の密度を判定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、判定された密度に応答して、生物学的原材料を含有する、導入された流体の導入量を調節するステップも含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタが、提供される。バイオリアクタは、１つまたはそれを上回るバイオリアクタ本体を含み、少なくとも１つのバイオリアクタ本体は、第１の基板と、第１の基板と係合される、対向する第２の基板とを含む。バイオリアクタはまた、バイオリアクタ本体を通して延在し、第１の基板の中に画定される第１のチャネルおよび第２の基板の中に画定される対向する第２のチャネルによって形成される、経路も含み、第２のチャネルは、第１のチャネルと整合している。バイオリアクタはまた、第１の流体流を第１のチャネルに導入するための第１の入口も含む。バイオリアクタはまた、第２の流体流を第２のチャネルに導入するための第２の入口も含む。バイオリアクタはまた、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を第１のチャネルに送達するための第３の入口も含む。バイオリアクタはまた、第１の流体流が第１のチャネルから流出することを可能にするための第１の出口も含む。バイオリアクタはまた、第２の流体流が第２のチャネルから流出することを可能にするための第２の出口も含む。バイオリアクタはまた、第１のチャネルと第２のチャネルとの間の経路の中に配置される膜も含み、膜は、複数の細孔を含み、細孔は、第１のチャネルの中で、生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ生成された生物学的産物が第１のチャネルから収集されること、または膜を通して第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる。
【００１８】
本開示の前述および他の側面ならびに利点が、以下の説明から明白である。説明では、本明細書の一部を形成し、例証として本開示の好ましい実施形態が示される、付随する図面が参照される。そのような実施形態は、必ずしも本開示の全範囲を表すわけではないが、しかしながら、したがって、本開示の範囲を解釈するために、請求項および本明細書が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
（開示の詳細な説明）
本開示される実施形態はさらに、同様の構造がいくつかの図の全体を通して同様の数字によって参照される、添付図面を参照して解説される。示される図面は、必ずしも一定の縮尺ではないが、代わりに、概して、本開示される実施形態の原理を図示することを強調している。
【００２０】
【図１】図１は、骨髄中の生体内血小板産生を示す、説明図である。
【００２１】
【図２】図２は、種々の実施形態による、生物学的産物を産生するためのシステムを図示するブロック図である。
【００２２】
【図３−１】図３Ａおよび３Ｂは、種々の実施形態による、バイオリアクタの実施形態を示す斜視および上面図である。
【００２３】
【図３−２】図３Ｃは、種々の実施形態による、バイオリアクタの断面正面図である。
【００２４】
【図３−３】図３Ｄは、種々の実施形態による、バイオリアクタの断面側面図である。図３Ｅおよび３Ｆは、種々の実施形態による、バイオリアクタの図３Ｄの側面図の詳細図である。
【００２５】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、種々の実施形態による、バイオリアクタの可撓性膜の静止位置および伸張位置を図示する、断面側面図である。
【００２６】
【図５】図５は、種々の実施形態による、再循環バイオリアクタを示す概略図である。
【００２７】
【図６】図６は、種々の実施形態による、気泡トラップを有するポートの断面図である。
【００２８】
【図７Ａ】図７Ａは、種々の実施形態による、バイオリアクタチャネルの一区分に沿った巨核球分配を示す画像である。
【００２９】
【図７Ｂ】図７Ｂは、種々の実施形態による、バイオリアクタチャネルに沿った種々のステーションにおける巨核球分配を示す画像である。
【００３０】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、種々の実施形態による、バイオリアクタに播種するための圧力波方法を図示する機能フロー図である。
【００３１】
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、種々の実施形態による、バイオリアクタに播種するための圧力波方法を図示する機能フロー図である。
【００３２】
【図９】図９は、種々の実施形態による、バイオリアクタに播種するための直接注入方法を図示する機能フロー図である。
【００３３】
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、バイオリアクタ内の細胞の播種に先立つ（図１０Ａ）および細胞の播種後（図１０Ｂ）の大型有核細胞および血小板サイズの粒子の混合集団を示す、フローサイトメトリプロットである。
【００３４】
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、種々の実施形態による、モジュール式拡張可能バイオリアクタシステムから形成される、タブレット、積層タブレット、および工業用バイオリアクタを図示する。
【００３５】
【図１２】図１２は、種々の実施形態による、単一リザーバ容器バイオリアクタの実施形態を示す断面図である。
【００３６】
【図１３】図１３は、種々の実施形態による、バイオリアクタに播種するための方法を図示するフロー図である。
【００３７】
上記で識別される図面は、本開示される実施形態を記載するが、他の実施形態もまた、議論に記述されるように考慮される。本開示は、限定ではなく代表として、例証的実施形態を提示する。本開示される実施形態の原理の範囲および精神内に入る、多数の他の修正および実施形態が、当業者によって考案されることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（本開示の詳細な説明）
本開示は、血小板および他の生物学的産物の効率的かつ拡張可能な産生が可能なシステムおよび方法を提供する。
【００３９】
医療実践では、種々の生物学的産物が、種々の疾患、感染症、悪性腫瘍、および外傷を治療するために使用されることができる。加えて、そのような生物学的産物（例えば、血漿、血小板、白血球、赤血球）は、患者内の欠乏した生物学的産物に取って代わるために使用されることができる。そのような生物学的産物の産生は、種々の幹細胞からの産生等の種々の技法を使用して試行されてきた。利用される幹細胞は、典型的には、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、および人工多能性幹細胞を含んでいる。他の幹細胞源は、骨髄、胎児肝臓、および末梢血中で見出される幹細胞を含んでいる。しかしながら、研究室内のいくつかの生物学的産物の成功した産生にもかかわらず、多くの限界が、臨床設定での使用に残っている。
【００４０】
凍結乾燥血小板（ＰＬＴ）、低温貯蔵ＰＬＴ、および不溶解性ＰＬＴ膜のような代用生物学的産物（例えば、血小板代用産物または赤血球代用産物）が研究中であるが、ドナーＰＬＴベースの産物によってもたらされる細菌汚染および免疫原性の著しい危険性が、これらの産物において持続し、それらは、依然として、供給不足および限定された貯蔵期間の影響下にある。発熱性非溶血性反応、同種免疫誘発不応性、移植片対宿主病、免疫抑制、および急性肺炎症／損傷の危険性は、ドナー血液の広範なスクリーニングおよび血清学的検査ならびに著しい付加的費用における白血球除去プロセスによって、部分的にのみ低減されることができる。
【００４１】
合成生物学的産物（例えば、合成ＰＬＴまたは赤血球）が、解決策として提案されており、ＰＬＴ模倣接着または凝集を助長するモチーフで合成粒子を修飾する、いくつかの設計が研究されている。これらの設計における近年の改善は、単一の粒子プラットフォーム上で接着および凝集機能性を組み合わせることと、天然ＰＬＴの形状、サイズ、および弾性も模倣する粒子を構築し、辺縁趨向および壁相互作用に影響を及ぼすこととを伴っている。合成ＰＬＴ類似体の最適な設計は、血小板の物理機械的性質および生物学的機能性の効率的統合を要求する。しかしながら、合成生物学的産物は、２つの主要な複雑な事態をもたらす。
【００４２】
第１に、合成生物学的産物は、好ましくは、それらの模倣された生物学的産物の生物学的性質を模倣する。例えば、合成ＰＬＴは、経時的に凝固および血管治癒をもたらす、止血性質および部位選択的活性化を具体的に模倣しなければならない。これは、ＰＬＴが、炎症、リンパおよび血管修復、ならびに腫瘍転移を調整することを含む、複数の役割（既知および未知の両方）を果たすという観察によって、複雑化される。合成ＰＬＴが、ＰＬＴ表面上の単一または対合受容体／タンパク質の発現を複製することに焦点を当てるため、「活性化」は、非常に具体的な（ある時は予測不可能な）誘因に限定され、部分的な生理学的応答のみを生じる。これは、歴史的に、後続の臨床試験において不良な部位選択性および毒性の高い危険性をもたらしている。生体内のＰＬＴの個々の役割に焦点を当てることによって、合成ＰＬＴが、ＰＬＴが体内で果たす複数の機能（既知および未知の両方）を完全に再現できる可能性は低い。
【００４３】
第２に、それらの形状、サイズ、および機械的弾性率を含む、生物学的産物の物理機械的性質は、それらの機能性に有意に影響を及ぼすことが示されている。例えば、ＰＬＴの形状、サイズ、および機械的弾性率は、血行動態血流下でそれらの循環、分配、細胞間および細胞・壁間相互作用に影響を及ぼす。そのような性質は、容易に人工的に再現されない。合成ＰＬＴ代用品の種々の設計が、過去２０年間に提案されているが、それらは、一貫して本物に及んでいない。
【００４４】
対照的に、ヒト生物学的原材料の補充可能源からのバイオリアクタ由来の生物学的産物産生（例えば、ＰＬＴを産生するためのｉＰＳＣ）が、既存の生物学的産物代用品および合成生物学的産物の限界の全てに対処し、生物学的産物の安全性および満たされていない需要の問題に対処する。
【００４５】
例えば、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔまたはｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）は、血液中で循環し、止血、血管形成、および先天性免疫のために不可欠である、不規則な円盤形の細胞断片である。生体内で、血小板は、巨核球として公知である細胞によって産生される。図１に図示されるように、骨髄中で生成される巨核球は、血管を裏打ちする内皮細胞に向かって移動し、その上に沈殿する。そこで、それらは、内皮の中の間隙を通して血管空間の中に血小板前駆細胞と呼ばれる長い分岐細胞構造を伸長させる。血流に起因する剪断速度を受けると、血小板前駆細胞は、伸長し、循環の中に血小板を放出する。一般に、正常な血小板数は、１マイクロリットルの血液あたり１５０，０００〜４００，０００個の血小板に及ぶ。しかしながら、血小板数が低いレベルまで低下する（例えば、１マイクロリットルあたり１５０，０００個の血小板を下回る）とき、患者は、血小板減少症として公知の症状を発症し、出血に起因する死亡の危険性がある状態になる。血小板減少症の既知の原因は、悪性腫瘍およびそれを治療するために使用される化学療法、免疫障害、遺伝性疾患、感染症、および外傷を含む。
【００４６】
有害な免疫系応答、敗血症およびウイルス汚染に起因する危険性に対する深刻な臨床的懸念にもかかわらず、血小板減少症の治療は、概して、完全にヒトドナーに由来する代替血小板を使用することを伴う。しかしながら、輸血から血小板を取得するプロセスは、冗長で、高価であり、多くの場合、複数の合致ドナーを見出すことを要求する。加えて、収穫された血小板の使用可能性は、細菌検査および劣化の理由による短い保存可能期間に起因して限定される。また、現在、存在することを把握していないウイルスに関してスクリーニングを行うことができない。需要の増加および近静的ドナー集団によって生成される不足と組み合わせられ、医療専門家が、血小板減少症および低血小板数に関連する他の症状がある患者のための適切な処置を提供することは、より困難になっている。輸血の代替案は、人工血小板代用品の使用を含んでいるが、これらは、今までのところ（例えば、上記で解説される理由により）生理学的血小板産物に取って代わることができていない。
【００４７】
いくつかのアプローチでは、機能的ヒト血小板の産生は、種々の細胞培養技法を使用して試行されてきた。具体的には、血小板は、種々の幹細胞から取得される巨核球を使用して、研究室内で産生されてきた。しかしながら、研究室内の機能的血小板の成功した産生にもかかわらず、多くの限界が、臨床設定での使用に残っている。
【００４８】
例えば、ヒト巨核球の約１０％のみが、最先端の培養方法を使用して、血小板前駆細胞産生を開始することが示されている。これは、それら自体が限定された可用性である、ＣＤ３４＋臍帯血由来または胚性幹細胞由来巨核球あたり１〜１００個の血小板の収率をもたらしている。例えば、平均的な単一のヒト臍帯血単位は、およそ５・１０６個のＣＤ３４＋幹細胞を産生することができる。これは、生体外血小板産生において有意な障害をもたらす。加えて、細胞培養は、生理学的微小環境を再現することができておらず、細胞外マトリックス組成、骨髄剛性、内皮細胞接触、および血管剪断速度の限定された個々の制御を提供している。また、細胞培養は、血小板前駆細胞産生を合成することに成功しておらず、ほぼ血小板保存可能期間である、６〜８日の周期にわたって非一様な血小板放出をもたらしている。さらに、そのような非効率性は、例えば、要求される大量の流体細胞培地、小分子、サイトカイン、および成長因子と関連付けられる、複合費用に起因して、高い産生費用をもたらす。他の生物学的産物の産生の方法も、類似欠点に悩まされている。
【００４９】
したがって、上記を踏まえて、増大する臨床需要を満たし、ドナー収穫および貯蔵と関連付けられる危険性および費用を回避し得る、生物学的産物の臨床的に関連する収率を生じるための効率的な方法の必要性が残っている。
【００５０】
本開示に照らして明白であるように、流体バイオリアクタ、例えば、ミリ流体バイオリアクタまたはマイクロ流体バイオリアクタが、細胞培養を支援するために使用されることができる。バイオリアクタを通した任意の流速が、細胞型および所望の収率に応じて細胞培養を達成するために使用され得ることを理解されたい。種々の実施形態によると、バイオリアクタは、細胞培養の実質的な費用削減を可能にする、はるかに小さい体積における高収率細胞培養を支援することができる。そのような費用削減は、生物学的産物の商業的に実現可能で費用効率的な産生を提供し、それによって、臨床使用のための商業的に実現可能な工業生産への生産プロセスの変換を可能にすることができる。
【００５１】
ここで図２を参照すると、血小板および他の生物学的産物を産生するための例示的システム１００の概略図が、示されている。一般に、システム１００は、生物学的供給源１０２と、バイオリアクタアセンブリ１０４と、出力１０６とを含み、生物学的供給源１０２および出力１０６は、それぞれ、アセンブリ１０４の種々の入力および出力に接続可能である。
【００５２】
具体的には、生物学的供給源１０２は、アセンブリ１０４の中に異なる生物学的原材料、物質、ガス、または流体媒体を導入し、例えば、血小板等の望ましい生物学的産物を効率的に産生するための種々の能力を伴って構成されることができる。例えば、生物学的供給源１０２は、バイオリアクタアセンブリ１０４内で流体媒体を送達する、持続させる、および／または循環させるための１つまたはそれを上回るポンプを含むことができる。例は、限定ではないが、流体ポンプ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、空気圧ポンプ、および同等物を含む。生物学的原材料は、限定ではないが、細胞、細胞培地、小分子化合物、ガスおよびガス混合物、ならびに栄養素を含むことができる。
【００５３】
図２に示されるように、いくつかの実施形態では、システム１００はまた、生物学的供給源１０２を制御するためのコントローラ１０８を含むこともできる。具体的には、コントローラ１０８は、その中に導入される生物学的原材料、物質、流体媒体、またはガスのタイミング、量、およびタイプを含む、バイオリアクタアセンブリ１０４の動作を制御するように構成される、プログラマブルデバイスまたはシステムであり得る。いくつかの側面では、コントローラ１０８は、アセンブリ１０４を選択的に機能化および／または動作させ、人体内の細胞分化（例えば、血小板産生）と関連付けられる生理学的条件およびプロセスを再現するように構成されることができる。例えば、コントローラ１０８は、選択された数の巨核球をアセンブリ１０４に送達するようにプログラムされることができる。加えて、コントローラ１０８は、バイオリアクタアセンブリ１０４内の流体流速または流体圧力を制御し、血小板前駆細胞（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）伸長および血小板産生を促進することができる。例えば、コントローラ１０８は、バイオリアクタアセンブリ１０４内に構成される種々のチャネルの中で最大１５０，０００マイクロリットル／時間の流速、または播種された巨核球からの血小板産生もしくは他の生物学的産物を誘起する局所剪断速度を確立するために必要な任意の流速を確立することができる。
【００５４】
コントローラ１０８は、生物学的供給源１０２から分離しているものとして図２に示されるが、これらは、単一のユニットに組み合わせられ得ることが理解され得る。いくつかの実施形態では、生物学的供給源１０２およびコントローラ１０６は、プログラマブル流体ポンプまたは注入システムで具現化されることができる。加えて、いくつかの実装では、コントローラ１０８および／または生物学的供給源１０２はまた、バイオリアクタアセンブリ１０４の温度、光暴露、振動、圧力、剪断速度、剪断応力、伸張、および他の条件を調整し得る、システムまたはハードウェア（図２に示されていない）を含む、それと通信する、またはそこからフィードバックを受信することもできる。一例として、図１３は、温度を維持、監視、および制御するための１つまたはそれを上回る加熱器および１つまたはそれを上回る熱電対と通信する温度制御ユニット（Ｔ．Ｃ．Ｕ）を含む、バイオリアクタシステム１３００を示す。図１３に示される構成は、非限定的であり、任意の数の加熱器および加熱器配列が可能であり得ることが理解され得る。さらに、種々の実施形態によると、例えば、圧力センサ、インライン圧力読取機、または任意の他の好適な構成要素等の任意の数の付加的構成要素もまた、含まれ得ることが明白である。
【００５５】
再度、図２を参照すると、一般に、出力１０６は、バイオリアクタアセンブリ１０４の中で生成される種々の生物学的産物を含有する流体媒体を受容するように構成される。いくつかの実施形態では、そのような流出物は、バイオリアクタアセンブリ１０４の中に戻るように再指向または循環されることができる。このようにして、より少ない流体体積が、利用されてもよく、生成される生物学的産物は、より濃縮されることができる。いくつかの側面では、出力１０６はまた、受容された流体媒体を収集する、貯蔵する、および／またはさらに処理するための能力を含むこともできる。いくつかの実施形態では、そのような特徴は、有利なこととして、生物学的産物生成プロセスの効率を向上させ、それによって、製造費用を削減することができる。
【００５６】
上記に説明されるシステム１００は、広範囲の機能性を有し、生理学的条件またはプロセスを複製することにも、血小板を産生することにも限定される必要はないことが理解され得る。すなわち、システム１００は、多種多様な生物学的産物を生成するために使用されることができる。例えば、システム１００は、細胞培養を支援し、および／または種々の生物学的原材料または物質、それらの分化プロセスの種々の段階における細胞を分離し、それらの産物もしくは内容物を収集するために、使用されることができる。具体的には、媒体組成、流体流、および圧力、ならびに他の条件を制御することによって、種々の生物学的原材料が、産生および放出され、続いて、収穫されてもよい。例示的生物学的産物は、限定ではないが、細胞混合物から、または分化の種々の段階における細胞の単離、成長因子、抗体、および細胞中で見出される他の成分を含む。化合物またはタンパク質の温度、ｐＨ、濃度等の動作条件を制御することは、血小板活性化状態、血小板化合物またはタンパク質装填、タンパク質構造、および産物収率等の生物学的産物の性質に影響を及ぼすために使用されることができる。本開示による、生成された生物学的産物は、臨床使用に加えて、細胞混合物からの細胞の単離、細胞前駆体の分化、組織の生成、および細胞培地ならびに化粧品、シャンプー、皮膚添加剤、クリーム、または洗浄剤等の薬用化粧品の成分として等を含む、種々の用途における使用を見出すことができる。
【００５７】
上記のシステム１００の種々の実施形態が、ここで説明される。これらは、非限定的な例であり、実際に、種々の修正および組み合わせが可能であり、当業者によって本願の意図された範囲内であると見なされることが理解され得る。
【００５８】
ここで図３Ａ−３Ｆを参照すると、種々の実施形態によるバイオリアクタが、示されている。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ１０４は、第１の基板１１２と、第１の基板１１２と係合される、対向する第２の基板１１４とを含む、バイオリアクタ本体１１０と、少なくとも部分的にその間に配列される膜１１６とを含む。例えば、図３Ｆに示されるように、膜は、可撓性材料、または膜が圧力下で伸張もしくは湾曲することを可能にし得る材料から作製されてもよい。いくつかの実施形態では、これはさらに、膜を通して圧力を調節することを支援する一方で、膜の表面上または膜の内側に分配され得る生物学的原材料を損傷することを回避し得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ本体１１０は、それを通して延在し、第１の基板１１２の中に画定される第１のチャネル１２０および第２の基板１１４の中に画定される第１のチャネル１２０と整合される第２のチャネル１２２によって形成される、蛇行経路１１８を含むことができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタ１０４はさらに、複数の入口（チャネルあたり少なくとも１つの入口）と、複数の出口（チャネルあたり少なくとも１つの出口）とを含むことができる。例えば、図３Ａ−３Ｂに示されるように、いくつかの実施形態では、バイオリアクタ１０４は、第１の流体流を第１のチャネル１２０に提供するための第１の入口１３０と、第２の流体流を第２のチャネル１２２に提供するための第２の入口１３２と、生物学的原材料を第１のチャネル１２０の中に導入するための第３の入口１３４とを含むことができる。図３Ａ−３Ｂにさらに示されるように、いくつかの実施形態では、バイオリアクタ１０４は、第１の流動が第１のチャネル１２０から流出することを可能にするための第１の出口１３６と、第２の流動が第２のチャネル１２２から流出することを可能にするための第２の出口１３８とを含むことができる。しかしながら、任意の数の入口および出口が、チャネルの中および外に流体または材料を供給または除去するために提供され得、付加的導管もまた、図３Ａ−３Ｆのバイオリアクタの基板に形成され得ることが明白である。例えば、いくつかの実施形態では、灌流チャネルもまた、バイオリアクタの中に含まれることができる。そのような実施形態では、灌流チャネルは、例えば、続いて、基板材料を通して第１および第２のバイオリアクタチャネルの中に灌流し得る、ガスの流動を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、約５％ＣＯ２〜約１０％ＣＯ２を有するガス混合物が、適切なｐＨ緩衝を提供するように、チャネルのうちの１つまたはそれを上回るものの中に灌流されることができる。いくつかの実施形態では、約４％Ｏ２〜約２０％Ｏ２を有するガス混合物が、異なる代謝要求を伴う細胞のための適切な酸素含有量を提供するように、チャネルのうちの１つまたはそれを上回るものの中に灌流されることができる。いくつかの実施形態では、約４％Ｏ２〜約１０％ＣＯ２を含むガス混合物が、チャネルのうちの１つまたはそれを上回るものの中に灌流されることができ、種々の細胞分化用途に使用されることができる。いくつかの実施形態では、約２０％Ｏ２〜約５％ＣＯ２を含むガス混合物が、チャネルのうちの１つまたはそれを上回るものの中に灌流されることができ、種々の細胞成長用途に使用されることができる。
【００６０】
上側チャンバの入口に進入する入力材料は、細胞および細胞混合物、細胞培地、緩衝剤、タンパク質溶液、ならびに小分子化合物を含むことができる。そのサイズがバイオリアクタの膜のサイズを上回る、そのような入力の成分は、上側チャンバの中に残留する一方で、その閾値を下回るものは、下側チャンバに移動することを可能にされる。下側チャンバの入力は、細胞培地、緩衝剤、タンパク質溶液、および小分子化合物を含むことができる。開放または閉鎖されて動作し得る、上側チャンバの出力は、血小板またはタンパク質等の入力材料、ならびに細胞および培地等の入力材料の産物を含むことができる。下側チャンバの出力は、膜細孔のサイズを下回る上側チャンバからの入力の産物、ならびに入力から第２のチャンバの中への産物を含むことができる。例えば、血小板およびタンパク質である。例えば、図３では、上側チャネル入口は、ＭＫおよびＳ入口であり、上側チャネル出口は、ＭＫ出口であり、下側チャネル入口は、ＰＬＴ入口であり、下側チャネル出口は、ＰＬＴ出口である。
【００６１】
基板は、いくつかの実施形態では、例えば、１０ｍｍ〜１００ｍｍの範囲内の側方寸法と、１〜１０ｍｍの範囲内の厚さとを含む、任意の好適なサイズであり得るが、種々の実施形態によると、他の寸法も、使用されることができる。基板は、いくつかの実施形態では、生体適合性材料、不活性材料、ならびに加圧ガスおよび流体流、またはガス拡散を支援し、構造支持を提供し得る材料の任意の組み合わせを使用して、製造されることができる。いくつかの側面では、バイオリアクタで利用される材料は、挿入鋳造等の具体的製造プロセスに適合し得る。加えて、利用される材料は、バイオリアクタの種々の部分の中に存在する、または流動する、流体媒体および他の物質の可視化を可能にするように、光学的に透明であり得る。基板は、いくつかの実施形態では、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、１つまたはそれを上回るポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、コーティングされたポリスチレン、コーティングされたガラス、ポリウレタン（ＰＵ）、シリコーンエラストマ、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものから構築されることができる。種々の実施形態による、基板およびチャネルは、ブロックベース材料の中の流動チャネルの機械加工、鋳造、熱エンボス加工、ソフトリソグラフィ、熱成形、挿入鋳造、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものによって、構築されることができる。基板は、例えば、膜の各側面に基板を接着させるためのレーザ切断感圧性接着剤の２つの部品の適用、機械的締め付け、溶剤接合、熱接合、拡散接合、それらの組み合わせによって、その間に膜を伴って組み立てられる、またはさらに射出成形を通して１つの部品に製造されることができる。
【００６２】
基板を通して形成されるチャネルは、長さ、サイズ、および形状が変動し得る。いくつかの実施形態では、第１および第２のチャネルのそれぞれの長さは、約１０，０００〜約１，０００，０００マイクロメートルの範囲内、またはより具体的には、約２５，０００〜約３２０，０００マイクロメートルの範囲内であり得る一方で、第１および第２のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの側方寸法は、約１００〜約３，０００マイクロメートルの範囲内、より具体的には、約５００〜約１，０００マイクロメートルの範囲内であり得る。しかしながら、第１および第２のチャネルは、種々の実施形態によると、任意の長さまたは幅であり得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、第１および第２のチャネルは、同じ長さおよび側方寸法を有することができる。いくつかの実施形態では、第１および第２のチャネルは、異なる幅および／または側方寸法を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１のチャネルは、第２のチャネルよりも広くまたは狭くあり得る。これらの幾何学的修正は、独立して各チャネルの流体動的性質を制御するために使用されることができる。さらに、いくつかの実施形態では、線Ｘを通した図３Ａのバイオリアクタの断面図を図示する図３Ｄに示されるように、各チャネルはまた、活性接触面積にわたってチャネルの間の剪断速度または圧力差を制御し、膜を通した灌流を調整するように、蛇行経路の全長にわたって、または蛇行経路の長さの一部にわたってのいずれかで、テーパ状であり得る。
【００６３】
バイオリアクタの種々の実装が、具体的使用または用途に応じて可能である。例えば、バイオリアクタの種々の構成要素の寸法、形状、および他の特徴が、バイオリアクタの所望の出力に基づいて選択されることができる。特に、いくつかの実施形態では、第１および第２のチャネルは、バイオリアクタの他の流体要素とともに、骨髄および血管中で見出されるもの等の生理学的条件を再現するように成形および定寸されることができる。いくつかの実施形態では、チャネル形状および寸法は、例えば、図１を参照して説明されるような生体内血小板産生と関連付けられるものに類似する、生理学的流速、剪断速度、流体圧力、および／または圧力差を達成するように選択されることができる。
【００６４】
図３Ｃを参照すると、いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、入口から出口まで流体を駆動する、入口と出口との間の圧力降下を有することによって、動作することができる。チャネルの一方または両方の幾何学形状は、チャネル全体を通して一様であるように膜を横断した圧力差を設定するように、調節されることができる。一方または両方のチャネルの幾何学形状はまた、デバイスチャネルの全長を通した膜における一定もしくはほぼ一定の剪断速度を達成するように、調節されることもできる。例えば、チャネルの幅（ｗ）がその高さ（ｈ）よりもはるかに大きい体制では、膜における剪断速度（τ）は、チャネルの長さを横断してほぼ一定に保持されることができ、体積流速（Ｑ）は、以下の関係に従って、チャネルの高さを減少または増加させることによって、減少または増加している。
【数１】
2020509759.tif 000003
【００６５】
いくつかの実施形態では、本バイオリアクタは、圧力および剪断応力が分断され、相互から独立して変動し得るように、構成されることができる。いくつかの実施形態では、本バイオリアクタは、剪断応力が、動作流速を変化させることによて改変され得る一方で、そのような流速変化と関連付けられる膜貫通圧力が、例えば、膜細孔の閉塞の数を修正することによって、膜を通した流動を減少させることによって、相殺され得るように、設計される。代替として、剪断速度が、流速を増加させることによって増加されることができる一方で、膜を横断した圧力は、細胞播種密度を減少させることによって一定に保たれることができる。これは、血小板産生等の具体的な生物学的プロセスを可能にする、生物物理的パラメータの適切な体制の識別を可能にすることができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、第１のチャネル、第２のチャネル、または両方は、膜にわたって生物学的原材料の一様な播種を確実にするようなサイズおよび形状にされることができる。いくつかの実施形態では、そのような一様な播種は、チャネルの減少する高さによって膜に沿ってほぼ一定の剪断分配を維持すること、ならびに膜を横断した一定の圧力差を維持することによって、達成されることができる。これは、両方のチャネル上の流動の方向を反転させることによって、膜の両側で達成されることができる。
【００６７】
加えて、バイオリアクタの構成は、顕微鏡またはカメラ等の他の計装との協働を可能にするように選定されることができる。例えば、バイオリアクタは、標準マイクロプレート寸法を順守するように構成されることができる。しかしながら、本開示に照らして、種々の実施形態によると、任意の数の寸法または構成が、任意の数およびタイプの器具、動作可能なインフラストラクチャデバイス、および／または付加的バイオリアクタへの接続を可能にするために使用され得ることが明白である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、第１および第２のチャネルは、図３Ａ−３Ｆに示されるように、それらの個別の基板の中で終端し、それぞれ、第１の入口から第１の出口まで、および第２の入口から第２の出口までの単一の流体導管を作成する。すなわち、第１の入口の中に導入される流体媒体は、必然的に第１の出口から抽出され、第２の入口の中に導入される流体媒体は、必然的に第２の出口から抽出される。しかしながら、本開示に照らして、付加的入口および出口もまた、バイオリアクタでは可能であり、基板を通して第１および第２のチャネルまたは任意の付加的チャネル（例えば、図３Ａ−３Ｆに示されるような第３の入口）に接続され得ることを理解されたい。付加的入口が、異なる生物学的材料を導入するために使用されることができる。付加的出口が、例えば、一様に、またはチャネル内のそれらの位置付けに影響を及ぼす産物の固有の性質の差を利用してのいずれかで、生物学的産物の成果を分画するために使用されることができる。
【００６９】
第１のチャネルと第２のチャネルとの間に形成される膜は、種々の方法で形成されることができる。いくつかの実施形態では、膜は、その中に形成される流体経路を介して、対応する入口チャネルおよび出口チャネルを接続するように構成される、任意の剛性または可撓性層、フィルム、メッシュ、もしくは材料構造を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜は、例えば、ポリカーボネートトラックエッチ−無ポリビニルピロリドン（ＰＣＴＥＦ）、ポリカーボネートトラックエッチ−ＰＶＰコーティング（ＰＣＴＥ）、親水性ポリカーボネート、疎水性ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエステル、酢酸セルロース、ポリプロピレン、ＰＴＦＥ、ポリウレタン（ＰＵ）、シリコーンエラストマ、またはそれらの組み合わせを含む、任意の好適な材料から形成されることができる。いくつかの実施形態では、膜の中の流体経路は、膜を中心として周期的または非周期的のいずれかで任意の密度を伴って分配される、細孔、間隙、またはマイクロチャネルを使用して、形成されることができる。いくつかの実施形態では、膜は、それを通した流体を可能にするように配列される、織合マイクロまたはナノファイバを使用して形成される、３次元構造を含むことができる。形状が長方形として図３Ａ−３Ｆに示されているが、膜は、円形、卵形等を含む、任意の形状を有し得ることが理解され得る。本開示の側面によると、膜は、具体的生物学的原材料または物質を選択的に捕捉し、所望の生物学的産物を産生するように構成されることができる。例えば、膜は、血小板産生細胞を選択的に捕捉し、それを通した血小板前駆細胞伸長および血小板を可能にするように構成されてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、膜は、患者内の脈動血流をより密接に模倣するように可撓性であり得る。そのような実施形態では、図４Ａ−４Ｂに示されるように、膜は、図４Ａに示されるような静止パルス中の実質的に平坦な静止位置と図４Ｂに示されるような圧力パルス中の伸張構成との間で遷移することができる。
【００７１】
膜の寸法もまた、可変である。いくつかの実施形態では、膜は、約１〜約１００ミリメートルの範囲内の縦および側方寸法を含み、約０．１〜約２０マイクロメートルの範囲内の厚さを有することができるが、他の寸法も可能である。また、膜は、約１マイクロメートル〜約２０マイクロメートル、例えば、約５〜約８マイクロメートルの範囲内のサイズである細孔、間隙、またはマイクロチャネルを含むことができる。いくつかの実施形態では、細孔、間隙、またはマイクロチャネルのサイズ、数、および密度は、限定ではないが、所望の生物学的産物および産物収率、ならびに流動インピーダンス、剪断速度、圧力差、流体流速、および他の動作パラメータを含む、いくつかの因子に依存し得る。いくつかの実施形態では、膜は、１ｍｍ２あたり約５００〜約１０，０００個の細孔の密度で、細孔、間隙、またはマイクロチャネルを含むことができる。
【００７２】
図３Ａ−３Ｆから理解されるように、対向する第１および第２のチャネルは、重複して整合しており、膜内の活性接触面積を画定する。例えば、活性接触面積は、約１ｍｍ２〜約２０ｍｍ２の範囲内であってもよいが、利用されるのチャネルの寸法および数に応じて、他の活性面積も可能である。いくつかの実装では、活性接触面積は、膜特性とともに、所望の生物学的産物収率を取得するように最適化されることができる。例えば、４７ｍｍの直径、５％の活性接触面積、および約１・１０５個の細孔／ｃｍ２の細孔密度を伴う膜は、所望の血小板収率等の所望の生物学的産物収率を生成するために約２００，０００個の潜在的部位を提供し得る。いくつかの用途では、活性接触面積は、少なくとも約１・１０４個の巨核球を捕獲するように構成されることができる。
【００７３】
基板および膜は、いくつかの異なるプロセスによって製造されることができる。一例として、第１の基板または第２の基板、もしくは両方、またはその一部は、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等の細胞不活性シリコンベースの有機ポリマー材料、環状オレフィンポリマー（「ＣＯＰ」）等の熱可塑性材料、ガラス、アクリル等を使用して、製造されることができる。他方では、膜１１６は、ＰＤＭＳ、熱可塑性物質、シルク、ヒドロゲル、細胞外マトリックスタンパク質、ポリカーボネート材料、ポリエステルスルホン材料、ポリ塩化ビニル材料、ポリエチレンテレフタレート材料、ポリウレタン（ＰＵ）、シリコーンエラストマ、および他の合成または有機材料を使用して、製造されることができる。加えて、バイオリアクタは、射出成形等のプロセスを通して、１つの部品として、および一連のバイオリアクトとして、製造されることができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、例えば、血小板等の生物学的産物を産生するために、生体内生理学的条件を複製するように機能化されることができる。例えば、種々の物質が、バイオリアクタ内の反応に影響を及ぼすように、膜の表面上に、またはチャネルのうちの１つまたはそれを上回るものの中に導入されることができる。いくつかの実施形態では、膜の頂面が、例えば、細胞外マトリックスタンパク質または機能的ペプチドもしくは他の分子で選択的にコーティングされることができる一方で、底面は、異なるタンパク質もしくは物質でコーティングされることなく残されることができる、またはコーティングされることができる。いくつかの実施形態では、一方または両方のチャネルは、３Ｄマトリックス内でヒドロゲル捕獲細胞および他の材料で充填されることができる。第２のチャネルがヒドロゲルを含有する、１つのチャネル内の媒体の選択的灌流は、例えば、細胞遊走もしくは分化を指向する、または小分子、サイトカイン、成長因子拡散を研究するために使用され得る、濃度勾配をゲルの中に生成することができる。
【００７５】
そのようなコーティングは、例えば、第１の基板内の入力および出力を使用して、細胞外マトリックスタンパク質を含有する第１の流体媒体を注入することによって、達成されることができる。実質的に同時に、第２の流体媒体流が、個別の入力および出力を使用して、第２の基板の中で維持されることができ、第２の流体媒体は、タンパク質を含有しないか、または異なるタンパク質もしくは物質を含有することができるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、第１および第２の流体媒体の流速は、流体混合が殆どまたは全く起こらないように構成されることができる。そのような選択的機能化は、例えば、頂面上に静止するようになる、導入された血小板産生細胞が、細胞外マトリックスタンパク質に接触し得る一方で、血小板前駆細胞が、膜を通して伸長し、そこから放出される血小板が、細胞外マトリックスタンパク質に接触しないか、または異なるタンパク質もしくは生物学的物質に接触することを確実にすることができる。いくつかの実施形態では、膜は、代わりに、バイオリアクタ内の組立前に事前コーティングされることができる。
【００７６】
バイオリアクタを機能化するための生物学的物質および材料の非限定的な例は、巨核球、内皮細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、幹細胞、血液細胞、間葉細胞、肺細胞、および基底膜含む細胞等のヒトおよび非ヒト細胞を含むことができる。他の例は、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−３、ＩＬ６、９、３、１ｂ、ＴＰＯ、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロース等の小分子を含むことができる。さらに他の例は、ウシ血清アルブミン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、ビトロネクチン（ＰＬＬ）、またはこれらの分子に由来する任意のペプチド配列等の細胞外マトリックスタンパク質を含むことができる。特に、３次元細胞外マトリックス編成および生理学的骨髄剛性を複製するために、細胞が、ヒドロゲル溶液の中に注入されることができ、これは、続いて、重合され得る。ヒドロゲル溶液は、限定ではないが、アルギン酸塩、マトリゲル、アガロース、コラーゲンゲル、フィブリン／フィブリノゲンゲル、およびポリエチエレングリコールゲル等の合成ゲルを含んでもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、バイオリアクタの種々の部分は、組立および分解を可能にするように構成されることができる。いくつかの実施形態では、第１の基板、膜、および第２の基板は、相互に除去可能に結合されるように構成されることができる。例えば、締結具、クリップ、または他の解放可能係止機構を使用して係合されたとき、気密シールが、次いで、第１および第２の入口と第１および第２の出口との間の流体経路完全性を回復するように、基板の種々の表面と膜との間に形成されることができる。任意のタイプのコネクタが、気密シールが達成され得る限り、バイオリアクタの種々の構成要素を接続するために使用され得ることを理解されたい。本能力は、上記で説明されるような準備、ならびに反復使用のための清掃を促進することができる。加えて、分解は、別の目的で使用すること、または急速プロトタイピングのために、種々の構成要素の迅速な交換を可能にする。例えば、異なる細孔径を有する膜、または異なる準備が、容易に交換されることができる。
【００７８】
代替として、バイオリアクタは、単一デバイスとして製造されることができる。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、挿入鋳造技法、または膜が基板に成形され得る射出成形技法を使用して、単一デバイスとして形成されることができる。そのような実装は、有利なこととして、大規模製造技法に統合されることができる。いくつかの実施形態では、第１および第２の基板は、別個に製造され、次いで、第１の基板、膜、および第２の基板をともに恒久的に結合するように、接着剤および／または熱接合を使用することによって、ともに接合されることができる。任意の技法が、単一バイオリアクタを生産するために使用され得、これは、バイオリアクタのチャネルからの漏出がないことを確実にするために望ましくあり得ることを理解されたい。
【００７９】
バイオリアクタはまた、チャネルに接続され、入口と出口との間に延在する種々の流体経路に沿った種々の点において配列される、いくつかの流体濾過および抵抗要素を含むこともできる。図５は、濾過および抵抗要素を含む、バイオリアクタ５００の例示的実施形態を図示する。例えば、１つまたはそれを上回る濾過要素（図示せず）が、入力された流体媒体から汚染物質または望ましくない物質もしくは材料を捕捉するように、入口のうちの１つまたはそれを上回るものに近接して設置されることができる。加えて、１つまたはそれを上回る抵抗要素５０２もまた、流動力を制御する、または流速の変動を減衰させるように、含まれることができる。抵抗要素および濾過要素に加えて、付加的要素もまた、含まれることができる。例えば、入口のうちの１つまたはそれを上回るものは、いかなる気泡もバイオリアクタに進入しないように防止するように構成される気泡トラップを含むことができる。いくつかの実施形態では、入口のうちの１つまたはそれを上回るものは、例えば、生物学的原材料を用いて第１の流体流を均質化する、または、例えば、生物学的産物を用いて第２の流体流を均質化するためのインライン混合器を含むことができる。
【００８０】
非限定的な例として、図６は、種々の実施形態による、例示的バイオリアクタの入口６０４に結合される流体コネクタまたはポート６０２を含む、ポート６００を図示する。示されるように、入口６０４は、メッシュ６１２によって分離される、拡張領域６０８と、円錐形領域６１０とを含む、気泡トラップ６０６を有する。メッシュ６１２のサイズは、変動し得るが、ある実施形態では、メッシュ６１２は、約１４０マイクロメートルのサイズを有することができるが、他の値も可能であり得る。構成されると、気泡トラップは、気泡がバイオリアクタに進入しないように防止することが可能である。
【００８１】
図５に示されるように、いくつかの実施形態では、バイオリアクタが、再循環バイオリアクタ５００の中に含まれることができる。いくつかの実施形態では、再循環バイオリアクタ５００は、図３Ａ−３Ｆを参照して上記で説明されるようなバイオリアクタ１０４を含むことができる。いくつかの実施形態では、再循環バイオリアクタ５００は、第１および第２の出口５１２、５１４から、第１および第２の再循環ライン５１６、５１８を介して、第１および第２の入口５０８、５１０に戻るように流動を再循環させるための第１および第２のポンプ５０４、５０６を含むことができる。いくつかの実施形態では、再循環バイオリアクタは、第３の入口５２２を介して生物学的原材料を第１のチャネル５２４に送達するための第３のポンプ５２０（例えば、示されるようなシリンジポンプ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを上回る弁が、そこへの流動を可能にする、防止する、または制御するように、入口および出口のそれぞれと流体連通して位置付けられることができる。図示される実施形態では、各入口５０８、５１０および各出口５１２、５１４は、弁５２６、５２８、５３０、５３２と関連付けられる。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを上回るリザーバ５３２、５３６が、動作中に第１および／または第２の流動の過剰な流体媒体を貯蔵するように含まれることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリザーバは、第２の流動から生物学的産物を分離するように構成されることができる。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを上回る流動抵抗器５０２が、バイオリアクタ内の流速および圧力に対する付加的制御を提供するように、再循環ラインのうちの１つまたはそれを上回るものに追加されることができる。
【００８２】
種々の実施形態による、第１および第２のポンプ５０４、５０６は、原動力エネルギーを第１および第２の流体流に付与し、第１および第２のチャネルならびに第１および第２の再循環ライン５１６、５１８を通した流動を助長することが可能である、任意の好適なポンプであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１および第２のポンプ５０４、５０６は、インペラ、蠕動ポンプ、容積型ポンプ、歯車ポンプ、スクリュポンプ、任意の他の好適なポンプ、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを上回るものを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１および第２のポンプ５０４、５０６はそれぞれ、第１および第２のチャネルのそれぞれの中の独立流動制御を提供するために、別個に動作可能かつ可逆性であり得る。いくつかの実施形態では、ポンプ５０４、５０６は、第１および第２のチャネルのそれぞれの内側の圧力、流動、および／または剪断のうちの１つまたはそれを上回るものを変動させ、バイオリアクタを通して脈動流を提供するように構成されることができる。いくつかの実施形態では、パルス繰り返し率、圧力、剪断、および／または流動が、ヒト血流を実質的に模倣するように提供されることができる。例えば、いくつかの実施形態では、動作中に、第１および第２のチャネル内で循環する流動の灌流速は、約１ｍＬ／時間〜約５０ｍＬ／時間、例えば、約１２．５ｍＬ／時間であり、約２５０秒−１〜約１，８００秒−１，例えば、８００秒−１〜約１，２００秒−１の壁剪断速度を生じることができる。種々の実施形態による、パルス繰り返し率は、約０．５ｈｚ〜約５ｈｚ、例えば、約１ｈｚ〜約２ｈｚであり得る。
【００８３】
種々の実施形態による、第３のポンプ５２０は、好適である、または生物学的原材料を第１のチャネルの中に注入する、任意のポンプであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、第３のポンプ５２０は、シリンジポンプ、ピストンポンプ、往復ポンプ、ダイヤフラムポンプ、任意の他の好適なポンプ、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、第３のポンプ５２０は、膜に生物学的原材料を播種するために純分な速度で生物学的原材料を送達するように構成されることができる。例えば、いくつかの実施形態では、生物学的原材料は、約０．１ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間、例えば、約１ｍＬ／時間の速度で注入されることができる。しかしながら、本開示に照らして、種々の実施形態によると、任意の好適な流速が使用され得ることが明白である。
【００８４】
種々の実施形態による、流動抵抗器５０２は、例えば、ノズル、管延在部、流体流を計測もしくは制限するために好適な任意の他のデバイス、またはそれらの組み合わせを含むことができる。弁は、いくつかの実施形態では、第１もしくは第２のチャネルおよび／または第１もしくは第２の再循環ラインを通した流動を選択的に可能にする、または防止するための当技術分野で公知である任意の弁であり得る。第１および第２のリザーバは、任意の好適なビーカ、試験管、フラスコ、ボトル、瓶、タンク、または流体媒体を保定するための任意の他の好適なリザーバであり得る。いくつかの実施形態では、第２のリザーバはさらに、分割器、セパレータ、分別器、または中空ファイバもしくは交差濾過デバイス等の第２の流体流から１つまたはそれを上回る生物学的産物を除去するための任意の他のデバイスのうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００８５】
図３Ａ−３Ｆ、４Ａ−４Ｂ、および５を参照して上記で説明されるような再循環バイオリアクタは、第１のチャネルの長さに沿って生物学的原材料を用いた膜の一様な播種を提供することができる。例えば、図７Ａは、種々の実施形態による、バイオリアクタチャネルの一区分に沿った巨核球分配を示す例示的画像である。示されるように、１つの具体的な局所的面積の中で群集化するのではなく、巨核球は、膜を横断し、かつそれに沿って実質的に一様に分配される。図７Ｂは、種々の実施形態による、バイオリアクタチャネルに沿った種々のステーションにおける例示的巨核球分配を図示する。図７Ｂに示されるように、１つの具体的な局所的面積の中で群集化するのではなく、巨核球は、各ステーションにおいて膜を横断し、かつそれに沿って実質的に一様に分配されるが、バイオリアクタチャネルの長さに沿ってステーションのそれぞれの間に実質的に一様に分配される。播種された生物学的原材料のそのような一様な分配は、例えば、図５、８Ａ−８Ｂ、および９を参照して下記に説明される方法のうちの１つまたはそれを上回るものを含む、複数の方法で達成されることができる。
【００８６】
非限定的な例として、図５に示されるように、本開示のバイオリアクタは、複流播種技法を使用して播種されることができる。複流播種技法では、流体媒体中に分散される生物学的原材料が、第３の入口を介して第１のチャネルに追加され、第１の流体流が第１のチャネルおよび第１の再循環ラインを通して提供され、第２の流動が第２のチャネルおよび第２の再循環ラインを通して提供されるように、両方のポンプが動作している。生物学的原材料の（膜による捕捉を伴わない）連続再循環を防止する、または低減させるために、流動抵抗器は、膜を横断して圧力を増加させるようにアクティブ化されることができる。複流播種技法は、有利なこととして、直接注入方法と比較して、生物学的原材料のより均等な分配を提供することができる。
【００８７】
さらに、図５に描写される動作構成もまた、生物学的産物を産生するための再循環バイオリアクタの実際の動作のために、使用される播種技法にかかわらず、播種後に使用されることができる。いくつかの実施形態では、流動抵抗器５０２が、例えば、第１のチャネルと出口との間の圧力降下を増加させることによって、第１のチャネル内の圧力を増加させるために、使用されることができる。いくつかの実施形態では、流動抵抗器５０２は、播種細胞が通過するために十分大きいが、圧力の所望の上昇を生成するために十分小さい（かつ十分長い）内径を有する、１本の管類として提供されることができる。第１のチャネル内の圧力の増加は、膜細孔に対して播種された生物学的原材料を保持し、それによって、播種された生物学的原材料が膜細孔内でそれらの位置を維持し、より高い動作流体媒体流速等の他の力によって押し流されない、または遊離されないことを可能にするための圧力差を生成することができる。
【００８８】
図８Ａおよび８Ｂは、圧力波播種技法を使用して播種される再循環バイオリアクタ８００の実施形態を図示する。圧力波播種技法では、流体媒体中に分散される生物学的原材料が、第３の入口を介して第１のチャネル８０２に追加され、弁８０６、８１０、８１２が、第１の入口、第１の出口、および第２の出口を閉鎖した状態で制御し、弁８０８が、第２の入口を開放した状態で制御する。閉鎖したものとして本明細書に説明されるが、第１の入口と関連付けられる弁８０６は、いくつかの実施形態では、最小限に開放し得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１または第２の入口の一方または入口は、それを通した小流動を可能にし、したがって、第１または第２の入口内の生物学的原材料の不慮の収集を防止するように、約１０％開放し得る。流体媒体は、次いで、第３の入口から第２の入口まで流動される。弁の閉鎖により、第１の入口および第１ならびに第２の出口は、封鎖される。したがって、流体媒体は、膜を通過し、バイオリアクタ８００から流出する。膜内の細孔が生物学的原材料を捕捉するようなサイズおよび構成されるため、生物学的原材料は、膜の細孔の中に引っ掛かる。最初に、図８Ａに示されるように、生物学的原材料は、第３の入口に最も近い細孔によって捕捉され、次いで、最も近い細孔が封鎖されると、後続の生物学的原材料は、チャネルを通して進行し、図８Ｂに示されるように次の利用可能な開放細孔に到達する。故に、圧力波播種方法は、流動が膜を通して徐々に封鎖されるにつれて、各細孔上に１つの細胞を伴う細胞の層を横たえる。圧力波播種方法は、有利なこととして、膜の全体を通して生物学的原材料の均等な設置を提供する。加えて、流動が膜を通して徐々に封鎖されるため、本プロセス中の膜を横断した圧力降下を測定することによって、開放および充填細孔の数が、推定されることができる。
【００８９】
図９は、直接注入播種技法を使用して播種される再循環バイオリアクタ９００の実施形態を図示する。直接注入播種技法では、流体媒体中に分散される生物学的原材料が、第３の入口を介して第１のチャネル９０２に追加され、全ての弁９０６、９０８、９１０、９１２が、開放している。第１のポンプ９１４は、非アクティブであり、第２のポンプ９１６は、第２のチャネル９０４および第２の再循環ラインを通して流動を提供するように動作される。本方法は、第１のポンプ９１４が非アクティブであるため、生物学的原材料が播種中に再循環されないように防止する。いくつかの実施形態では、直接注入播種は、バイオリアクタの中央部分の中に比較的に少ない生物学的原材料を伴って、第１の入口および第１の出口に近接して生物学的原材料の濃縮をもたらす。しかしながら、本開示に照らして、いくつかの実施形態では、第１のポンプは、第１の入口における生物学的原材料の不慮の収集を防止するために、生物学的原材料の再循環を回避するために十分遅い速度、例えば、約１０％動作流速で、動作され得ることが明白である。
【００９０】
上記のように、いくつかの実施形態では、本バイオリアクタで使用される膜は、第１のチャネルの中で、生物学的産物を生成することが可能な生物学的原材料を選択的に捕捉するように、かつ生成された生物学的産物が膜を通して第２のチャネルの中に入ることを可能にするようなサイズにされる、細孔を含むことができる。例えば、図１０Ａおよび図１０Ｂのフローサイトメトリプロットは、細孔径よりも大きい全ての有核細胞がバイオリアクタ内に残留する一方で、より小さい粒子が膜細孔を通して流動することを示す、バイオリアクタ内の細胞の播種に先立った大型有核細胞および血小板サイズの粒子、ならびに事実上播種後の流出中の血小板サイズの粒子のみの混合集団を示す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、適切な播種は、膜細孔の実質的に全て（例えば、約９９．９％またはそれを上回る）に、播種された生物学的原材料を捕捉させ、したがって、それによって充填または封鎖させ得る。そのような実施形態では、チャネルが単位長にわたって類似圧力降下を維持し、それによって、流動抵抗器が膜を横断して一定の圧力降下を生じることを可能にするように、等しい流動が、第１および第２のチャネルに供給されることができる。いくつかの実施形態では、細孔の一部のみが占有される（例えば、膜細孔の約９９．９％未満）場合、少なくともある程度の流動は、膜を通過することができ、したがって、膜を横断した圧力降下は、膜の長さに沿って変動するである。貫流は、第１および第２のチャネルから流出する流速の不均衡を生成し得る。したがって、そのような実施形態では、流体は、再循環された流体が欠乏し、空気をバイオリアクタの中に圧送させないように、第１のチャネル再循環ループに追加される必要があり得る。
【００９２】
ここで図１１Ａ−１１Ｃを参照すると、図３Ａ−３Ｆ、４Ａ−４Ｂ、および５を参照して本明細書に説明されるバイオリアクタ等のバイオリアクタを使用する、生物学的産物の産生は、第１および第２の基板が複数のバイオリアクタ本体を含むようなサイズにされる、モジュール式タブレットバイオリアクタ設計の実装によって、ユーザの必要性に従ってスケーリングされることができる。図１１Ａに示されるように、タブレットバイオリアクタ構成の第１の基板は、その中に画定された複数の第１のチャネルを含むことができ、タブレット構成の第２の基板は、複数の第１のチャネルと整合している、その中に画定された複数の対向する第２のチャネルを含むことができる。図１１Ａにさらに示されるように、モジュール式タブレットバイオリアクタ内に形成されるバイオリアクタ本体はそれぞれ、上記で説明されるように、第１、第２、および第３の入口と、第１および第２の出口とを含むことができる。多重化バイオリアクタチャネルは、複数のチャネルが流体的に接続される、または独立して並列化される、円形プラットフォームの中で半径方向に整合される等、他の構成で配列されることができる。
【００９３】
タブレット内に形成される個々のバイオリアクタ本体は、いくつかの実施形態では、並列または直列に動作するように構成されることができる。例えば、各バイオリアクタ本体（またはバイオリアクタ本体の複数の群）は、独立して並列に動作されることができ、各バイオリアクタ本体またはバイオリアクタ本体の群は、図５を参照して上記で説明されるように、第１および第２のポンプと、第１および第２の再循環ラインとを含む。いくつかの実施形態では、例えば、バイオリアクタ本体のうちの２つまたはそれを上回るものは、いったん播種されると、一対の第１および第２のポンプが、直列に接続されたバイオリアクタ本体のそれぞれを通して流動するように構成され得るように、直列に接続されることができる。本開示に照らして、いくつかの実施形態では、ポンプ入力流速は、直列のバイオリアクタ本体の数から独立し得るが、より大型のリザーバが、システム体積に適応するために要求され得ることを理解されたい。
【００９４】
ここで図１１Ｂを参照すると、さらなるスケーラビリティが、産生容量の増加のためにスタックに配列された複数（例えば、示されるように１０個）のモジュール式タブレットバイオリアクタを含む、積層バイオリアクタの使用によって考慮される。ここで図１１Ｃを参照すると、なおもさらなるスケーラビリティが、産生容量のなおもさらなる増加のために複数の積層バイオリアクタを含む、工業用バイオリアクタの使用によって考慮される。
【００９５】
図１２に示されるように、いくつかの実施形態では、１つまたはそれを上回る再循環バイオリアクタはそれぞれ、図５、８、９、および１０に描写されるような２つの別個のリザーバではなく、単一のリザーバを提供されることができる。図１２に示されるように、バイオリアクタ１２００は、膜１２０３によって分割される、第１の部分１２０１ａと、第２の部分１２０１ｂとを有する、リザーバ１２０１を含むことができる。リザーバ１２０１はまた、第１の部分１２０１ａから流動を送達および流出させるために、第１の入口１２０５と、第１の出口１２０７とを含むことができる。リザーバ１２０１はまた、第２の部分１２０１ｂから流動を送達および流出させるために膜１２０３を通して延在する、第２の入口１２０９と、第２の出口１２１１とを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の出口１２０７は、第１の部分１２０１ａの中に設置され、膜１２０３から離間される。第１の入口１２０５は、第１の部分１２０１ａの底部に沈殿する生物学的原材料を収集し得るように、膜１２０３に近接して第１の部分１２０１ａの中に設置される。第２の入口１２０９は、第２の部分１２０１ｂの中に設置され、第２の部分１２０１ｂの底部に沈殿する生物学的産物を吸引しないように防止するように、第２の部分１２０１ｂの底部から離間される。第２の出口１２１１は、第２のチャンバ１２０１ｂの底部に近接して設置される。（例えば、上記で説明されるような流動抵抗器によって）第１の出口１２０７と第２の出口１２１１との間の流速の差または他の非対称性が生成されるとき、単一のリザーバ１２０１は、第１の部分１２０１ａへの流体の追加の必要性を排除し、第１の出口１２０７と第１の入口１２０５との間の再循環ループ（図示せず）を持続させることができる。特に、過剰な液体が、第２の出口１２１１から流出し、第２の入口１２０９を介して第２の部分１２０１ｂの中に再循環され、次いで、膜１２０３を通して上向きに流動し、第１の出口１２０７と第１の入口１２０５との間の再循環のために第１の部分１２０１ａに流体をさらに供給することを可能にされる。本システム１２００はまた、後続の抽出および収穫のために第２の部分１２０１ｂの中の生物学的産物を濃縮する。
【００９６】
上記で提示される種々の構成は、例にすぎず、いかようにも本開示の範囲を限定するように意図されていない。本明細書に説明される構成の変形例が、当業者に明白であるが、そのような変形例は、本願の意図された範囲内である。特に、上記に説明される構成のうちの１つまたはそれを上回るものからの特徴は、上記に明示的に説明されない場合がある、特徴の副次的組み合わせから構成される代替的構成を作成するように選択されてもよい。加えて、上記に説明される構成のうちの１つまたはそれを上回るものからの特徴は、上記に明示的に説明されない場合がある、特徴の組み合わせから構成される代替的構成を作成するように選択され、組み合わせられてもよい。そのような組み合わせおよび副次的組み合わせに好適な特徴は、本願の全体としての精査に応じて、当業者に容易に明白である。本明細書および記載される請求項に説明される主題は、技術の全ての好適な変更を網羅および包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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