(57)【要約】  本発明は、生体分子、たとえばサンプル中のタンパク質間の相互作用の度合いを決定する方法に関し、第一および第二の情報伝達（ＩＣ）オリゴヌクレオチドを提供することを含む。ここで第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは第一および第二の生体分子に結合する能力を有する第一のおよび第二の親和性試薬、たとえば抗体に共有結合または非共有結合で結合している。ここで第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは、ここで上記第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは別のオリゴヌクレオチドの部分に相補的な少なくとも一つの一本鎖ストレッチをそれぞれ含み、それによって、第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチドの少なくとも一つにある少なくとも一つの一本鎖ストレッチが別のオリゴヌクレオチドの相補的部分にハイブリダイズすると、サンプル中の相互作用する、および相互作用しない第一および第二の生体分子の相対的割合の測定を、単一細胞または単一分子レベルで可能にする。さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために必要なオリゴヌクレオチドおよび試薬を含むキットに関する。
2020511122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子、たとえば試料中のタンパク質間の相互作用の度合いを決定する方法であって、第一のおよび第二の情報伝達（ＩＣ）オリゴヌクレオチドを提供することを含み、ここで第一のおよび第二の情報伝達（ＩＣ）オリゴヌクレオチドは共有結合または非共有結合により、第一のおよび第二の親和性試薬、たとえば、第一のおよび第二の生体分子に結合する能力を有する抗体に結合しており、ここで第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチドはそれぞれ、別のオリゴヌクレオチドの一部に相補的な少なくとも一つの一本鎖ストレッチを含み、それによって、当該少なくとも一つの第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチド中の当該少なくとも一つの一本鎖ストレッチの別のオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズすることで、単細胞または単分子レベルでサンプル中の相互作用および非相互作用の第一および第二の生体分子の相対的割合の測定を可能にする、方法。
【請求項２】
前記第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチドの一本鎖ストレッチは、（ａ）第一のおよび／または第二のＩＣオリゴヌクレオチドおよび情報受信（ＩＲ）オリゴヌクレオチド間、（ｂ）第一のおよび／または第二のＩＣオリゴヌクレオチドおよび活性化オリゴヌクレオチド間、または（ｃ）直接第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチド間、の相互作用を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．  一本鎖情報受容（ＩＲ）ＤＮＡ分子は環状または線状であり、少なくとも第一および第二の切断モチーフを有し、ここで当該切断モチーフは、切断を可能にするために当該切断モチーフ部位が必ず二重鎖になるよう選択される、ＩＲ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｂ．  第一の切断モチーフを有するＩＲ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第一の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子の出現はサンプル中の第一の生体分子の量を反映する、第一のＩＣ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｃ．  第二の切断モチーフを有するＩＲ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第二の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子の出現はサンプル中の第二の生体分子の量を反映する、第二のＩＣ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｄ．  相補的な一本鎖ストレッチの結合を可能にする条件下で工程ａ〜ｃのＤＮＡ分子を混合する；
ｅ．  消化酵素を追加し、二本鎖になった切断モチーフ部位にニックを引き起こし、それにより
ｉ．  第一のＩＣ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含む、第一のレポータータグＤＮＡ分子または配列の結合を可能にする第一のレポータータグ結合部位、および／または
ｉｉ．  第二のＩＣ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含む、第二のレポータータグＤＮＡ分子または配列の結合を可能にする第二のレポータータグ結合部位、
を形成する；
ｆ．  以下の選択肢のいずれか一つによってレポータータグＤＮＡ配列を組み込む：
ｉ．  第一のレポータータグＤＮＡ分子および第二のレポータータグＤＮＡ分子を追加することにより、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のレポータータグＤＮＡ分子は、第一のレポータータグ結合部位でＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込まれる、および／または第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のレポータータグＤＮＡ分子は、第二のレポータータグ結合部位でＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込まれる；または
ｉｉ．  ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドを使用して、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のＩＣオリゴヌクレオチド上の第一のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第一のレポータータグＤＮＡ配列をＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込む、および／または
第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のＩＣオリゴヌクレオチド上の第二のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第二のレポータータグＤＮＡ配列をＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込む；および
ＩＲ  ＤＮＡ分子をライゲーションするライゲーション酵素を追加して、それにより再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｇ．  工程ｆで再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子を任意で増幅する；
ｈ．  サンプル中の第一のおよび／または第二の生体分子の出現および／または相互作用の測定（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）として、再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子中の第一のおよび／または第二のレポータータグの組み込みを測定する（ｍｏｎｉｔｏｒ）、
工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記切断モチーフ部位は、ウラシルまたは制限部位から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
切断モチーフ部位においてニックを引き起こすために使用される前記消化酵素（単数または複数）は、
ｉ．  二本鎖制限部位の３’をニッキングするニッキングエンドヌクレアーゼ３’  Ｎｂ．Ｂｓｒ．ＤＩ、
ｉｉ．  二本鎖制限部位の５’をニッキングするニッキングエンドヌクレアーゼ５’  、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、または
ｉｉｉ．  二本鎖部位においてウラシル塩基を除去するウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ；ＵＤＧ）、および脱ピリミジン部位を除去するＥｎｄｏＩＶの組み合わせ、
から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）は、
ａ．  第一のレポータータグＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な第一の標識検出オリゴヌクレオチド、および第二のレポータータグＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な第二の標識検出オリゴヌクレオチド、を提供する、および
ｂ．  第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチドを、場合により増幅される再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせる、
工程によって実行される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
線状の再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子が増幅され、その後分離方法、たとえば電気泳動またはクロマトグラフィーによって分離され、ここで異なるサイズを有する分離産物が異なるレポータータグの組み込みを示す、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記異なるレポータータグの組み込みはシーケンシングによってモニター（ｍｏｎｉｔｏｒ）される、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子が形成されたサンプル中でたとえば顕微鏡によってモニター（ｍｏｎｉｔｏｒ）される、または前記再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子が形成されたサンプルから、続いてたとえば顕微鏡による単一分子の分類および分析によって回収される、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
脱塩基性部位を除去し、検出効率を改善するための請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法であって、前記レポータータグ分子が追加され、第一の、および／または第二のレポータータグがＩＲに組み込まれた後で、以下の工程が実行される、方法：
ｉ．  消化テンプレートをＩＲ  ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせて残りの脱塩基部位周辺を二本鎖にする；
ｉｉ．  好適な制限酵素、たとえばＥｎｄｏＩＶで二本鎖領域を消化することにより、脱塩基部位を除去する；
ｉｉｉ．  好適なポリメラーゼ、たとえばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで消化領域をギャップ充填し、欠損塩基、たとえばチミジンを追加する；およびＩＲ  ＤＮＡ分子をリガーゼ、たとえばＴ４リガーゼでライゲーションし、再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子を提供する。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の方法であって、
ａ．  ここで、第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されるヘアピン構造を含み、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光できるよう設計されており、そしてここで各フルオロフォアは固有のシグナルを有する；
ｂ．  ここで、第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチド中のヘアピンは、
ｉ．  第一または第二のＩＣオリゴヌクレオチドに相補的な活性化オリゴヌクレオチドを提供し、それにより第一または第二のＩＣオリゴヌクレオチドに結合する、または
ｉｉ．  一つまたは両方のＩＣオリゴヌクレオチドのヘアピン中の鎖の一つを分解し、それにより第一、および／または第二のＩＣオリゴヌクレオチドの一本鎖ストレッチを解放する、
のいずれかによって破壊または不安定化され、そのため、第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは互いに相互作用し、フルオロフォアおよびクエンチャーの再配置を引き起こすことができる；
ｃ．  ここで、第一または第二のＩＣオリゴヌクレオチドに結合した親和性試薬を含む複合体のペアが、親和性試薬が結合する二つの生体分子間の近接性を調べる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ために使用され、ここで第一のフルオロフォアのシグナルパターンは第一のおよび第二の生体分子間の相互白湯により示され、そして第二のフルオロフォアのシグナルパターンは、第一および第二の生体分子間の相互作用によってオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置の再構築を引き起こす結果として、第一のおよび第二の生体分子間の相互作用の欠損により示される。
【請求項１２】
前記第一のおよび前記第二の生体分子はタンパク質またはポリペプチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは、一つまたは複数の細胞の生物サンプル、またはタンパク質の混合物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一のＩＣ  ＤＮＡ分子は、第一の生体分子に等価なまたは標的とする第一の抗体分子に結合し、そして前記第二のＩＣ  ＤＮＡ分子は、第二の生体分子に等価なまたは標的とする第二の抗体分子に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
単一細胞または単一分子におけるタンパク質間相互作用を分析するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ａ．  第一および第二の切断モチーフを有する、一本鎖情報受容（ＩＲ）ＤＮＡ分子；
ｂ．  サンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する、第一および第二の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子であって、ここで前記第一および第二のＩＣ  ＤＮＡ分子は親和性試薬に結合されているか、またはキット使用者によって結合される化学部分を備える；
ｃ．  任意でＩＲ  ＤＮＡ分子の切断モチーフ部位にニックを引き起こすための酵素；
ｄ．  第一および第二のレポータータグＤＮＡ分子；
ｅ．  任意で再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子の増幅のための試薬；
ｆ．  任意で第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチド；および
ｇ．  任意で脱塩基部位を除去するためのＤＮＡ分子および酵素
を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項１７】
ａ．  フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されたヘアピン構造を含む第一および第二の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子であって、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが固有のシグナルを有し、それによりサンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する能力を有し、ここで前記第一および第二のＩＣ  ＤＮＡ分子は親和性試薬に結合されているか、またはキット使用者によって結合される化学部分を備える；および
ｂ．  前記第一または第二のＩＣ  ＤＮＡ分子に相補的であり、それにより前記第一または第二のＩＣ  ＤＮＡ分子に結合する能力を有する活性化オリゴヌクレオチド
を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、たとえばサンプル中のタンパク質間の相互作用の度合いを決定する方法に関する。また、本発明は、本発明の方法における使用のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用の度合いを決定する方法は、細胞シグナル伝達活性の解析に不可欠である。長年にわたり、これを容易にするために多くの方法が開発されてきた。いくつかのそのような方法は、候補タンパク質が、相互作用により機能的レポーターを再構成するレポーター分子と融合している遺伝子構築物、すなわちタンパク質間相互作用検出系（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）に基づく。そのような方法の例は、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４０（６２３０）：  ２４５−２４６）、哺乳類膜ツーハイブリッド（ＭａＭＴＨ）（Ｐｅｔｓｃｈｎｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４，  ＮＡＴ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（５）：  ５８５−５９２）、および二分子蛍光補完法（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ＢｉＦＣ）（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９（４）：  ７８９−７９８）に基づく。別の一般的なアプローチは、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して蛍光融合タンパク質の結合を決定することであり、放出の同時変化を伴う。天然タンパク質間の相互作用を決定するために、タンパク質を標的とする抗体に基づいたいくつかの方法、たとえば共免疫沈降抗体ベースのＦＲＥＴ、または近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）があり、抗体はタンパク質複合体の分離または検出を行うために官能基と結合している。
【０００３】
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）（たとえば、国際公開第２００９／０２１０３１号）は、二つのその後追加される（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｄｄｅｄ）環状化オリゴヌクレオチドの環状分子へのライゲーションを鋳型にする、近接プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドに結合した抗体に基づく。近接プローブ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｐｒｏｂｅ）のペアが隣接するエピトープに結合する場合のみ、環状レポーター分子の構築が許容される。近接プローブの一つに接するオリゴヌクレオチドは、次にローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を開始する。単一近接プローブは、ＲＣＡによって増幅できない直鎖状分子のライゲーションを鋳型にする。したがって、近接事象（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｅｖｅｎｔ）、たとえばタンパク質間相互作用のみが検出される。
【０００４】
国際公開第２０１５／１１８０２９号では、ハイブリダイゼーション連鎖反応に基づく検出を伴う近接アッセイが開示されている。
【発明の概要】
【０００５】
ＰＬＡ、および他の公知の近接アッセイは、タンパク質間相互作用を検出するための高感度かつ選択的な方法であるが、タンパク質のプールのどの程度の割合が相互作用に実際に関与しているかを判断することはできない。
【０００６】
本明細書に記載の二つの方法の態様は、相互作用タンパク質および遊離タンパク質の両方に関する情報を提供する。設計の一つは、タンパク質が相互作用するかどうかに関する情報を受け取ったＤＮＡオリゴヌクレオチドを増幅するＤＮＡポリメラーゼを用いて、単一分子を検出するための単一増幅を提供するが、もう一方はタンパク質が遊離または相互作用している場合に異なる色でレポートするように、フルオロフォアおよびクエンチャーを配置するＤＮＡハイブリダイゼーションにのみ基づく。
【０００７】
したがって、一般に、本発明は、サンプル中の生体分子、たとえばタンパク質間の相互作用の度合いを決定する方法に関し、第一のおよび第二の情報伝達（ＩＣ）オリゴヌクレオチドを提供することを含む。ここで上記第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは、第一および第二の生体分子に結合する能力を有する第一のおよび第二の親和性試薬、たとえば抗体に共有結合または非共有結合で結合している。ここで上記第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは別のオリゴヌクレオチドの部分に相補的な少なくとも一つの一本鎖ストレッチをそれぞれ含み、それによって、上記第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチドの少なくとも一つにある少なくとも一つの一本鎖ストレッチが別のオリゴヌクレオチドの相補的部分にハイブリダイズすると、サンプル中の相互作用する、および相互作用しない第一および第二の生体分子の相対的割合の測定を、単一細胞または単一分子レベルで可能にする。
【０００８】
この文脈において、「共有結合または非共有結合」は、親和性試薬、たとえば抗体が、分析される生体分子同士の相互作用を許容するのに結合が十分強い限り、あらゆる種類の化学結合によってＩＣオリゴヌクレオチドに結合することを意味する。
【０００９】
「親和性試薬」は、通常、抗体、または抗体を含む試薬を意味するが、「親和性試薬」が分析される生体分子に結合する能力を有し、そしてそれによって発明の目的を達成する限り、他のタイプの分子が使われてもよい。「他のタイプの分子」は、たとえば分析される生体分子に結合する能力を有する、あらゆるタイプの生体分子、たとえば核酸分子、ポリペプチドまたはその他の種類であってもよい。
【００１０】
「ＩＣプローブ」、または「プローブ」は、親和性試薬に結合するＩＣオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１１】
相互作用する、および相互作用しない生体分子の「相対的割合の測定」は、測定することが可能な互いに結合し、および互いに結合しない生体分子の相対的な量を意味し、それは本発明の重要な目的である。
【００１２】
「単一細胞または単一分子レベル」は、生体分子間の相互作用および非相互作用の測定は、単一細胞または単一分子に対して実行できること、すなわち、先行技術の方法と比較して改善された読み出し特性を意味する。
【００１３】
第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドの「一本鎖ストレッチ」は、（ａ）上記第一、および／または第二のＩＣオリゴヌクレオチド、および情報受容（ＩＲ）オリゴヌクレオチド間、（ｂ）上記第一、および／または第二のＩＣオリゴヌクレオチド、および活性化オリゴヌクレオチド間、または（ｃ）直接第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチド間、の相互作用を可能にする。一本鎖ストレッチは、一本鎖ストレッチと別のオリゴヌクレオチドの相補部分とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さを有する必要がある。
【００１４】
「活性化オリゴヌクレオチド」は、ＩＣオリゴヌクレオチドに結合すると、ＩＣオリゴヌクレオチドの分子内（ｉｎｔｒａｏｌｅｃｕｌａｒ）ハイブリダイゼーションの再構築を引き起こし、そしてそれによって別のＩＣオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのストレッチを明らかにし、二つの異なるＩＣオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを可能し、フルオロフォアおよびクエンチャーの再配置をもたらすオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１５】
相互作用するタンパク質、および相互作用しないタンパク質のプールの両方を検出できるようにするために、本発明の発明者は、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂ間の相互作用を視覚化すると同時に、単一細胞または単一分子レベルにおける非相互作用のタンパク質Ａまたは非相互作用のタンパク質Ｂの量をレポートすることができる方法の第一の態様を開発した。本発明の方法のこの態様によれば、分析されるタンパク質または生体分子のアイデンティティに関する情報を運ぶオリゴヌクレオチド（情報担体（ＩＣ））が提供される。これらに、あらかじめ形成された一本鎖ＤＮＡ分子（情報レシーバー（ＩＲ））は、環状であってもよく、二本鎖である領域、すなわちＩＲ分子がＩＣ分子にハイブリダイズする領域、においてハイブリダイズし、切断される。切断の際、ＩＣ分子に相補的な短いオリゴヌクレオチドタグがＩＲ分子に組み込まれる。今般再構築されたＩＲ分子は、ＲＣＡ（環状の場合）、またはＰＣＲ（線形の場合）によって増幅することができ、組み込まれたタグのアイデンティティは、たとえばフルオロフォア標識検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって視覚化される。ここで、一つまたは二つのタグの組み込みは、分析されるタンパク質または生体分子間の相互作用についての情報、ならびに遊離および相互作用する生体分子またはタンパク質の相対量を提供する。分子ブール（ＭｏｌＢｏｏｌｅａｎ）分析のためのこの方法は、シグナル伝達経路活性の数学的モデリングの要件である、遊離タンパク質および相互作用するタンパク質の関係を決定するためのユニークなツールを提供する。
【００１６】
したがって、第一の態様では、本発明の方法は以下の工程を含む：
ａ．  一本鎖情報受容（ＩＲ）ＤＮＡ分子は環状または線状であり、少なくとも第一および第二の切断モチーフを有し、ここで当該切断モチーフは、切断を可能にするために当該切断モチーフ部位が必ず二重鎖になるよう選択される、ＩＲ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｂ．  第一の切断モチーフを有するＩＲ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第一の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子の出現はサンプル中の第一の生体分子の量を反映する、第一のＩＣ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｃ．  第二の切断モチーフを有するＩＲ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な一本鎖ストレッチを含み、ここで第二の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子の出現はサンプル中の第二の生体分子の量を反映する、第二のＩＣ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｄ．  相補的な一本鎖ストレッチの結合を可能にする条件下で工程ａ〜ｃのＤＮＡ分子を混合する；
ｅ．  消化酵素を追加し、二本鎖になった切断モチーフ部位にニックを引き起こし、それにより、
ｉ．  第一のＩＣ  ＤＮＡ分子の部分に相補的なストレッチを含む、第一のレポータータグＤＮＡ分子または配列の結合を可能にする第一のレポータータグ結合部位、および／または
ｉｉ．  第二のＩＣ  ＤＮＡ分子の部分に相補的なストレッチを含む、第二のレポータータグＤＮＡ分子または配列の結合を可能にする第二のレポータータグ結合部位、
を形成する；
ｆ．  以下の選択肢のいずれか一つによってレポータータグＤＮＡ配列を組み込む：
ｉ．  第一のレポータータグＤＮＡ分子および第二のレポータータグＤＮＡ分子を追加することにより、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のレポータータグＤＮＡ分子は、第一のレポータータグ結合部位でＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込まれる、および／または第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のレポータータグＤＮＡ分子は、第二のレポータータグ結合部位でＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込まれる；または
ｉｉ．  ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドを使用して、
第一の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第一のＩＣオリゴヌクレオチド上の第一のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第一のレポータータグＤＮＡ配列をＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込む、および／または
第二の切断モチーフ部位にニックが引き起こされた場合、第二のＩＣオリゴヌクレオチド上の第二のレポータータグ結合部位に相補的なギャップを埋めることにより、
第二のレポータータグＤＮＡ配列をＩＲ  ＤＮＡ分子に組み込む；および
ＩＲ  ＤＮＡ分子をライゲーションするライゲーション酵素を追加して、それにより再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子を提供する；
ｇ．  工程ｆで再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子を任意で増幅する；
ｈ．  サンプル中の第一のおよび／または第二の生体分子の出現および／または相互作用の測定（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）として、再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子中の第一のおよび／または第二のレポータータグの組み込みを測定する（ｍｏｎｉｔｏｒ）。
【００１７】
ＩＲ  ＤＮＡ分子は線状であっても環状であってもよい。ＩＲ  ＤＮＡ分子は、ＩＣ  ＤＮＡ分子に結合すると切断される能力を有することが重要であり、そしてＩＣ  ＤＮＡ分子に部分的に相補的である必要がある。
【００１８】
ＩＣ  ＤＮＡ分子はＩＲ  ＤＮＡ分子に部分的に相補的である必要があり、切断されたＩＲ  ＤＮＡ分子への相補配列の挿入を鋳型にする追加のＤＮＡ塩基を含む。
【００１９】
生体分子の「量を反映する」は、ＩＣ  ＤＮＡ分子の相対的な量、または出現、およびその後のＩＲ  ＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーション／結合が、サンプル中の遊離および相互作用する生体分子の相対的な出現または量の測定であることを意味する。したがって、第一および第二のＩＣ  ＤＮＡ分子の相対量は、サンプル中のそれぞれ遊離および相互作用する第一のおよび第二の生体分子の量または出現の相対測定である。
【００２０】
「相補的一本鎖ストレッチの結合を可能にする条件」は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にするとみなされる条件を意味する。当業者は、実際のハイブリダイゼーション反応に好適な条件を知っている、および／または容易に見出すであろう。
【００２１】
「切断モチーフ」は、本発明の文脈において、制限酵素等が認識できるＤＮＡ分子のモチーフまたは短い配列を意味する。切断モチーフを認識する制限酵素等は、次に、切断モチーフの部位（すなわち、「切断モチーフ部位」）に結合し、そして特定の条件下で、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断、または「ニックを引き起こす」ことができ、そのため短いレポータータグＤＮＡ分子の結合部位、すなわち「レポータータグ結合部位」が作成される。
【００２２】
モチーフが二本鎖になったときにのみ切断を可能にする限り、多くの有望な（ｐｏｓｓｉｂｌｅ）切断モチーフを使用してもよい。好ましい切断モチーフは、ウラシルまたは制限部位から選択される。
【００２３】
さらに、切断モチーフ部位にニックを引き起こすために使用される消化酵素は、好ましくは、
ｉ．  二本鎖制限部位の特定の鎖をニッキングする、ニッキングエンドヌクレアーゼ、たとえばＮｂ．Ｂｓｒ．ＤＩ、またはＮｔ．ＢｓｍＡＩ、または
ｉｉ．  二本鎖部位においてウラシル塩基を除去するウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）、脱ピリミジン部位を除去するＥｎｄｏＩＶの組み合わせ、
から選択される。
【００２４】
他の酵素、または酵素の組み合わせ、たとえば、制限酵素、ＤＮＡ修復に使用される酵素、たとえばＭｕｔＹ、または改変制限酵素、たとえば転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔａｌｅｎ）も、選択された酵素または酵素の組み合わせが二本鎖部位で一本のＤＮＡ鎖を切断できる限り、十分に可能である。
【００２５】
一つの実施形態では、第一のＩＣ  ＤＮＡ分子は、第一の生体分子に等価であるか、または標的とする第一の抗体分子に結合し、第二のＩＣ  ＤＮＡ分子は、第二の生体分子に等価であるか、または標的とする第二の抗体分子に結合する。
【００２６】
レポータータグＤＮＡ分子は、ＩＣ  ＤＮＡ分子の部分に相補的な短いＤＮＡ分子である。
【００２７】
レポータータグＤＮＡ分子を提供する代替手段として、ＤＮＡポリメラーゼを使用してヌクレオチドを追加することにより、レポータータグＤＮＡ配列が作製される（それぞれ、工程ｆ（ｉ）、およびｆ（ｉｉ）を参照のこと）。
【００２８】
したがって、配列情報をＩＲ分子に転送する代替アプローチは、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＩＣのヌクレオチドによって鋳型化されたヌクレオチドを追加し、ＩＲ−ＩＣハイブリッドへのニッキングによって、形成されたギャップをふさぐことである。
【００２９】
ライゲーション酵素は、たとえば、ＤＮＡリガーゼ、またはその他の選択肢から選んでもよい。
【００３０】
この方法の増幅工程は、たとえば、環状ＩＲ  ＤＮＡ分子の場合にはＲＣＡ（ローリングサークル増幅）、線状ＩＲ  ＤＮＡ分子の場合にはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、またはその他の一般的に使用される方法によって実行されうる。当業者は、好適な増幅方法を容易に知るであろう。
【００３１】
本発明の方法の測定工程は、
ａ．  ＩＲに組み込まれた第一のレポータータグＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な第一の標識検出オリゴヌクレオチド、およびＩＲに組み込まれた第二のレポータータグＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な第二の標識検出オリゴヌクレオチド、を提供する、および
ｂ．  第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチドを、場合により増幅される再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせる、
によって実行することができる。ここで、第一および第二の検出オリゴヌクレオチドの標識は、異なる読み出し波長を有するフルオロフォア、クエンチャーと組み合わせたフルオロフォア（図３）、酵素（たとえば、基質を着色沈殿物に転換できる西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）、および質量の異なる分子（質量タグは、質量分析計で記録できる）から選択される。標識は、測定および記録できる特定の特性を含む限り、もちろん異なるように選択されうる。
【００３２】
一つの実施形態では、線状の再構築ＩＲ  ＤＮＡ分子は増幅され、その後、分離方法、たとえば電気泳動、特にゲル電気泳動、またはクロマトグラフィーによって分離され、ここで異なるサイズを有する分離生成物は、異なるレポータータグの取り込みを示す。
【００３３】
別の実施形態では、異なるレポータータグのアイデンティティは、シーケンシングによってモニターされる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子は、形成されたサンプル中でたとえば顕微鏡によってモニターされる、または再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子が形成されたサンプルから、続いてたとえば顕微鏡による単一分子の分類および分析によって回収される。
【００３５】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは抗体に結合しており、オリゴヌクレオチドは各抗体のアイデンティティに関する情報（情報担体（ＩＣ））を保有する。これらの複合体に、事前に形成された一本鎖ＤＮＡ環（情報レシーバー（ＩＲ））がハイブリダイズし、そして二本鎖の領域、すなわちＤＮＡ環が抗体−オリゴヌクレオチド複合体にハイブリダイズする領域で切断される。切断の際、抗体−オリゴヌクレオチド複合体に相補的な短いオリゴヌクレオチドタグが環に組み込まれ、その後にライゲーションされる。今般再構築された環はＲＣＡによって増幅され、そして組み込まれたタグのアイデンティティは、フルオロフォア標識検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって視覚化される。ＲＣＡ産物が、一つのタグのみが組み込まれた環から生成された場合、一つの波長のみで蛍光を発するが、二つのタグが組み込まれた場合、二つの異なるフルオロフォアで標識される。
【００３６】
さらに別の実施形態では、検出効率を改善するために、脱塩基部位が除去される。これは、レポータータグ分子が追加され、そして第一および／または第二のレポータータグがＩＲに組み込まれた後に実行でき、以下の工程が実行される。
ｉ．  消化テンプレートをＩＲ  ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせて残りの脱塩基部位周辺を二本鎖にする；
ｉｉ．  好適な制限酵素、たとえばＥｎｄｏＩＶで二本鎖領域を消化する；
ｉｉｉ．  好適なポリメラーゼ、たとえばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで消化領域をギャップ充填し、欠損塩基、たとえばチミジンを追加する；およびＩＲ  ＤＮＡ分子をリガーゼ、たとえばＴ４リガーゼでライゲーションし、再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子を提供する。
【００３７】
この方法で脱塩基部位を除去し、環状分子をライゲーションすると、レポータータグの取り込み後に脱塩基部位（脱プリン塩基部位または脱ピリミジン部位）が残っているＩＲ  ＤＮＡ分子の検出効率が改善する。「検出効率の改善」は、脱塩基部位が除去されたＩＲ  ＤＮＡ分子に対してより多くの増幅産物が生成されることを意味する。
【００３８】
「消化テンプレート」は、通常、脱塩基部位の除去後も、ＩＲ  ＤＮＡ分子にハイブリダイズするのに十分な長さを有するオリゴヌクレオチドである。通常、長さは約２０〜３０ヌクレオチドであるが、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で消化テンプレートがＩＲ  ＤＮＡ分子とハイブリダイズする限り、変動が生じうる。
【００３９】
この実施形態は、ＩＲ  ＤＮＡ分子における切断のモチーフがウラシルであり、それによりギャップ充填プロセスにおいてチミジンが添加される状況に特に有用である。
【００４０】
これらの工程を実行した後、場合により増幅することができる、再構築されたＩＲ  ＤＮＡが得られ、その後、第一のおよび／または第二のレポータータグの組み込みがモニターされる。
【００４１】
第二の態様では、本発明は方法に関し、ここで：
ａ．  第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されるヘアピン構造を含み、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光できるよう設計されており、そしてここで各フルオロフォアは固有のシグナルを有する；
ｂ．  第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチド中のヘアピンは、
ｉ．  第一または第二のＩＣオリゴヌクレオチドに相補的な活性化オリゴヌクレオチドを提供し、それにより第一または第二のＩＣオリゴヌクレオチドに結合する、または
ｉｉ．  一つまたは両方のＩＣオリゴヌクレオチドのヘアピン中の鎖の一つを分解し、それにより第一、および／または第二のＩＣオリゴヌクレオチドのＤＮＡの一本鎖ストレッチを解放する、
のいずれかによって破壊または不安定化され、そのため、第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは互いに相互作用し、フルオロフォアおよびクエンチャーの再配置を引き起こすことができる；および
ｃ．  第一または第二のＩＣオリゴヌクレオチドに結合した親和性試薬を含む複合体のペアが、親和性試薬が結合する二つの生体分子間の近接性を調べる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ために使用され、ここで第一のフルオロフォアのシグナルパターンは第一のおよび第二の生体分子間の相互作用により示され、そして第二のフルオロフォアのシグナルパターンは、第一および第二の生体分子間の相互作用によってオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置の再構築を引き起こす結果として、第一のおよび第二の生体分子間の相互作用の欠損により示される。
【００４２】
「ヘアピン構造」は、配列の二つのストレッチが互いに相補的であり、そしてそれにより互いにハイブリダイズして間にハイブリダイズされていない配列のストレッチを残し、その結果、この部分の分子がヘアピン様構造を形成する、オリゴヌクレオチドの部分を意味する。
【００４３】
「ＩＣオリゴヌクレオチドのヘアピン」が「破壊される、または不安定化される」は、ヘアピンを形成するオリゴヌクレオチドの部分が破壊され、その結果、ヘアピンが溶解し、そしてオリゴヌクレオチドの他の構造が形成されることを意味する。
【００４４】
「ヘアピンの鎖の一つを分解する」は、ヘアピン部分の少なくとも一部のヌクレオチド配列構造が溶解することを意味する。
【００４５】
ＩＣオリゴヌクレオチドを「解放する（ｌｉｂｅｒａｔｉｎｇ）」は、解放されたストレッチが、たとえばヘアピン構造の相補的部分にもはや結合せず、そして代わりに少なくとも部分的に、別のオリゴヌクレオチドまたは同一のオリゴヌクレオチドの部分にハイブリダイズできることを意味する。
【００４６】
「互いに相互作用するＩＣオリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの一部の一本鎖ストレッチが互いにハイブリダイズし、ＩＣオリゴヌクレオチド内のフルオロフォアおよびクエンチャーの「再配置」、および／または「位置の再構築」を引き起こすことを意味する。
【００４７】
「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」は、親和性試薬がＩＣオリゴヌクレオチドに共有結合または非共有結合している、親和性試薬およびＩＣオリゴヌクレオチドの組み合わせを意味する。したがって、「複合体のペア」は、それぞれ親和性試薬に結合し、それにより親和性試薬は互いに相互作用しうる、二つのＩＣオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４８】
「近接性を調べる」は、親和性試薬間の近接、および／または相互作用がモニターされることを意味する。
【００４９】
「フルオロフォアシグナルパターン」は、フルオロフォアシグナル（たとえば、異なる波長の一つまたは二つのフルオロフォアシグナル）が読み取り可能であることを意味し、そしてこのシグナルパターンはＩＣオリゴヌクレオチド間の特定の相互作用／構造に対して固有である一方、ＩＣオリゴヌクレオチド間の別の相互作用／構造は別の「フルオロフォアシグナルパターン」を有する。
【００５０】
この態様は、オリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光できるよう配置されている、フルオロフォアおよびクエンチャーで修飾された二つ以上のオリゴヌクレオチドに基づいている。これらのオリゴヌクレオチドは活性化できるため、そのようなオリゴヌクレオチドに結合した一対の抗体が近位に結合すると、オリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズできる。それにより、フルオロフォアおよびクエンチャーの位置を変更し、以前は発光していたものがクエンチされるようにし、そして発光可能な新規のフルオロフォアを明らかにする（すなわち、タンパク質間相互作用を報告する）。
【００５１】
これにより、提示された二つの態様により、従来技術の技術的課題を解決し、そして単一細胞レベルで遊離タンパク質および複合結合タンパク質の両方に関する情報を提供することにより、従来技術の方法と比較して改善された読み出し特性を提供する方法が提供される。タンパク質間相互作用の検出のために使用される従来技術の方法、たとえばＰＬＡまたはＹ２Ｈは、相互作用のレベルに関する情報を提供するが、非相互作用タンパク質のレベルに関しては提供しない。したがって、記録された相互作用のレベルの違いが相互作用するタンパク質の異なる発現レベルによるのか、または相互作用がたとえばタンパク質の翻訳語就職によって調節されるのかを判断することはできなかった。タンパク質の発現レベルおよびこれらのタンパク質からなるタンパク質複合体に関与している割合の両方に関する情報を取得することにより、−たとえば翻訳後修飾によって引き起こされるタンパク質の立体構造変化を反映して−単一細胞で、解離定数の変化を視覚化することが可能になる。本発明の方法は、細胞シグナル伝達活性の研究および理解を容易にし、そしてしたがって広範な臨床応用を伴う新規研究ツールを提供する。
【００５２】
本発明の方法の第一および第二の生体分子は、たとえばタンパク質またはポリペプチドであってもよく、他の生体分子、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂質、抗体、またはその他の生体分子もモニターすることができる。
【００５３】
通常、サンプルは生体サンプル、たとえば一つまたは複数の細胞、またはタンパク質の混合物である。本発明の方法は、多くの用途に使用することができる。好ましい実施形態では、この方法は、たとえば単一細胞、組織切片、体液またはタンパク質抽出物におけるタンパク質間相互作用の分析のために使用される。
【００５４】
第三の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の方法における使用のためのキットに関し、
ａ．  第一および第二の切断モチーフを有する、一本鎖情報受容（ＩＲ）ＤＮＡ分子；
ｂ．  サンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する、第一および第二の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子であって、ここで第一および第二のＩＣ  ＤＮＡ分子は親和性試薬に結合されているか、またはキット使用者によって結合のために使用される化学部分を備える；
ｃ．  任意でＩＲ  ＤＮＡ分子の切断モチーフ部位にニックを引き起こすための酵素；
ｄ．  第一および第二のレポータータグＤＮＡ分子；および
ｅ．  任意で再構築されたＩＲ  ＤＮＡ分子の増幅のための試薬；
ｆ．  任意で第一および第二の標識検出オリゴヌクレオチド；および
ｇ．  任意で脱塩基部位を除去するためのＤＮＡ分子および酵素
を含む。
【００５５】
「脱塩基部位を除去するためのＤＮＡ分子および酵素」は、脱塩基部位の除去に関する実施形態で上述したように、たとえば上記で定義した消化テンプレート、ならびに好適な制限酵素、ポリメラーゼ、および／またはリガーゼを意味する。
【００５６】
「結合のために使用される化学部分」は、ＩＣ  ＤＮＡ分子が、後の段階で親和性試薬への結合に使用されうる化学部分を備えることを意味する。そのような「化学部分」は、たとえば、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ＮＨＳ−エステル、マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）、ヒドラゾン、アルデヒド、アルキン、アジド、チオール、アミン、または他の好適な化学部分から選択されてもよい。当業者は、他の候補の部分（ｍｏｉｅｔｙ）を知っているだろう。
【００５７】
第四の態様では、本発明は、本発明の第二の態様の方法における使用のためのキットに関し、
ａ．  フルオロフォアおよびクエンチャーが配置されたヘアピン構造を含む第一および第二の情報伝達（ＩＣ）ＤＮＡ分子であって、ここでヘアピン構造はオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光可能であり、そしてここでそれぞれのフルオロフォアは固有のシグナルを有し、それによりサンプル中の第一および第二の生体分子の量を反映する能力を有し、ここで第一および第二のＩＣ  ＤＮＡ分子は親和性試薬、たとえば抗体に結合されているか、またはキット使用者によって結合される化学部分を備える；および
ｂ．  第一または第二のＩＣ  ＤＮＡ分子に相補的であり、それにより第一または第二のＩＣ  ＤＮＡ分子に結合する能力を有する活性化オリゴヌクレオチド
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】オリゴヌクレオチド設計の概略図。ＩＲ環は、抗体（ＡおよびＢとして示されている）に結合したＩＣオリゴヌクレオチドからなる、二つの（上列）それぞれ一つのＩＣプローブ（下列）にハイブリダイズする（左パネル）。ＩＲ環は酵素処理によって消化され、ＩＲ環はＩＣプローブにハイブリダイズし、そしてタグオリゴヌクレオチドがＩＣプローブに侵入する（中央パネル）。ＩＲ環は再ライゲーションされ、そしてタグ配列が組み込まれる（右パネル）。
【図２】ウラシル塩基、および制限部位の位置を示す、ＩＲ環の酵素消化の様々な設計の概略図。
【図３】β−カテニン、Ｅ−カドヘリン、およびβ−カテニン−Ｅ−カドヘリンの相互作用の検出のためのＭｏｌＢｏｏｌｅａｎ法を使用した三つの別々の画像からのシグナルの平均数＋／−標準偏差（ｍｅａｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｓ  ＋／−  ＳＤ）の定量化。β−カテニン、Ｅ−カドヘリン、およびβ−カテニン−Ｅ−カドヘリンの相互作用について標識された細胞を示す画像。画像において、細胞核の境界は区切られている。
【図４】三つのＡｌｅｘａ色素、および二つのブラックホールクエンチャーを使用した、Ｉｎｖａｄｅｒ−ＭｏｌＢｏｏｌｅａｎの設計の概略図。  （Ａ）近接プローブ（ＩＣオリゴヌクレオチド１または２に結合した抗体（表を参照のこと））が個々の抗原に結合すると、プローブあたり一つのフルオロフォアが発光できる：Ａｌｅｘａ５５５（Ａ５５５）およびＡｌｅｘａ６４７（Ａ６４７）、一方、Ａｌｅｘａ４８８（Ａ４８８）はクエンチャー（ＢＨＱ１）の近くに位置するため、クエンチされる。  （Ｂ）アクティベーターオリゴヌクレオチドを添加すると、それはＩＣオリゴヌクレオチド１に侵入する。近接プローブが極めて近接している場合、開いたＩＣオリゴヌクレオチド１はＩＣオリゴヌクレオチド２にハイブリダイズし、それによりフルオロフォアおよびクエンチャーの位置を再構築する。これで、Ａ５５５はＢＨＱ１の近くに、Ａ６４７はクエンチャー（ＢＨＱ３）の近くに配置される−これらのフルオロフォアの両方はクエンチされるが、一方でＡ４８８はこれでクエンチャーＢＨＱ１から分離され、発光する。
【図５】ギャップ充填工程の概略図。最初に、消化テンプレートはＡＰ部位にハイブリダイズし、ＥｎｄｏＩＶによって環が消化される。その後、引き起こされたニック（矢印）はチミジンを組み込むＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで充填できる。リガーゼは、ニックの入った環をふさぐため、プロトコルの次の工程で増幅できる。
【図６】ギャップ充填設計によるｉｎ  ｓｉｔｕタンパク質検出。プローブは、四つの異なる条件下においてＨａＣａｔ細胞でインキュベートされた：抗Ｅ−カドヘリン抗体および抗β−カテニン抗体の両方、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗β−カテニン抗体、または一次抗体なし（バックグラウンド）。示されているすべての条件は、バックグラウンド条件を差し引くことによって正規化される。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
発明の詳細な説明
本発明の発明者らは、生体分子、たとえばサンプル中のタンパク質間の相互作用の度合いを決定するための一般的な方法であって、第一および第二の情報伝達（ＩＣ）オリゴヌクレオチドを提供することを含み、ここで第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは、共有結合または非共有結合により、第一および第二の親和性試薬、たとえば第一および第二の生体分子に結合する能力を有する抗体に結合しており、ここで第一および第二のＩＣオリゴヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチドの一部に相補的な少なくとも一つの一本鎖ストレッチをそれぞれ含み、それによって、少なくとも一つの第一のおよび第二のＩＣオリゴヌクレオチド中の少なくとも一つの一本鎖ストレッチを別のオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズすることで、単一細胞または単一分子レベルでサンプル中の相互作用および非相互作用の第一および第二の生体分子の相対的割合の測定を可能にする、方法を開発した。
【００６０】
本明細書では、この方法を二つの代替アプローチによって例示する；ＩＣオリゴヌクレオチドあたり一つのフルオロフォアのみが発光できるように設計されたＩＣオリゴヌクレオチドのヘアピン構造と組み合わせてフルオロフォア／クエンチャー技術を使用するもの、およびＩＣオリゴヌクレオチドに加え、切断を可能にするために二本鎖になる必要がある、少なくとも二つの切断モチーフ部位を有するＩＲ（情報受容）オリゴヌクレオチドを使用するものである。これらのアプローチのいずれかを使用することにより、サンプル内の相互作用する、および相互作用しない生体分子の相対的割合の測定は、単一細胞または単一分子レベルで測定することができる。
【００６１】
したがって、本発明の方法の態様の一つについて、本発明の発明者らは、切断の動機（ｍｏｔｉｖｅ）、たとえばウラシルまたは制限部位を有する一本鎖環状ＤＮＡ分子（情報受容（ＩＲ））からなるオリゴヌクレオチドシステムを設計した。オリゴヌクレオチドシステムは、切断が、部位が二本鎖であることを必要とするように作成されたが、これは相補的な短いオリゴヌクレオチドに結合する場合のみ起こる。これらの相補的なオリゴヌクレオチド（情報担体（ＩＣ））は、ＩＲ環に相補的な一本鎖ＤＮＡのストレッチが側面にあるヘアピン構造からなるよう設計された。ＩＲ環で引き起こされたニックは、後から追加されたＩＣプローブの一部に相補的な、短いタグオリゴヌクレオチドがＩＣオリゴヌクレオチドのヘアピンに侵入し、そしてＩＲ環にライゲーションされるのを促進する。あるいは、ＩＣプローブのテンプレートを使用して、ＤＮＡポリメラーゼでギャップ充填をすることができる。ギャップをふさぎ、そして環状ＤＮＡを再構築するため、ＤＮＡリガーゼが添加される。ＩＣオリゴヌクレオチドの固有のタグおよびヘアピンを使用して、ＩＣオリゴヌクレオチドが結合したＩＲ環に情報を伝達できる。ＩＲ環が二つの異なるＩＣオリゴヌクレオチドに結合すると、両方の対応するタグが組み込まれる。一つの実施形態におけるように、ＩＣオリゴヌクレオチドを抗体に結合させることにより、発明者らは、二つのタンパク質が相互作用しているかどうか、すなわち両方のタグがＩＲ環に組み込まれているかどうか、をモニターするためにＩＲ環を使用できる方法を作成した。抗体は、研究対象のタンパク質に対して選択される。相互作用していないタンパク質の場合、一つのタグのみがＩＲ環に組み込まれる（図１）。
【００６２】
環を切断し、そしてタグを組み込むための様々なアプローチが検証された。IR環は、二本鎖ターゲットの鎖の一つのみを切断するニッキングエンドヌクレアーゼによって切断できる。あるいは、ＵＮＧ、およびＥｎｄｏＩＶの酵素の組み合わせの助けを借りてウラシル塩基を除去することにより、ニックを引き起こすことができる。ニッキングエンドヌクレアーゼについて、本発明者らは二つの異なる酵素：ヘアピンの３’側を切断するＮｂ．Ｂｓｒ．ＤＩ（３’  Ｎｂ．Ｂｓｒ．ＤＩ）、および５’側を切断するＮｔ．ＢｓｍＡＩ（５’  、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ）を試験した。本発明者はまた、ヘアピンに関して３’側、または５’側（３’ウラシルおよび５’ウラシル）のいずれかにウラシル塩基を組み込むことにより、切断の効率を試験した（図２）。Ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇの助けを借りて、発明者らはすべてのオリゴヌクレオチド配列を設計および分析し、正しい二次構造とハイブリダイゼーションを確認した（表１）。
【００６３】
組み込まれたタグを含む、再構築されたＩＲ環は、次に、ＩＣプローブの一つからプライミングされたローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅することができる。ＲＣＡ産物は、数百のＩＲの相補的反復（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｐｅａｔｓ）を含む。次に、ＲＣＡ産物のアイデンティティを、タグが組み込まれたＲＣＡ産物の部分に相補的な標識検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによってデコードできる。検出オリゴヌクレオチドの標識は、使用する読み取り値に応じて、たとえば異なるフルオロフォア、酵素、または異なる質量を有する分子であってもよい。単一標識ＲＣＡ産物は、組み込まれたタグが一つだけの結果であり、一方で二重標識ＲＣＡ産物は二つのタグの組み込みの結果である。
【００６４】
結果がどのようであるかの例を図３に示す。ここで、本発明者らは、５’ウラシル設計を使用し、ＩＣオリゴヌクレオチドを抗マウス、および抗ウサギ抗体に結合させた。これらのＩＣプローブは、Ｅ−カドヘリンをターゲットとするマウス抗体、およびβ−カテニンを標的とするウサギ抗体で標識されたＭＣＦ１０細胞株で試験された。β−カテニン、およびＥ−カドヘリンを含む複合体は、Ｃｙ３、およびＦＩＴＣの両方で検出されるＲＣＡ産物をもたらすが、非相互作用のタンパク質は、Ｃｙ３、またはＦＩＴＣのいずれかで標識されたＲＣＡ産物を生じた。ＲＣＡ産物の異なるアイデンティティは、ソフトウェアＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して決定され、様々なタイプのＲＣＡ産物は、β−カテニンおよびＥ−カドヘリン、ならびに個々のタンパク質、β−カテニンおよびカドヘリン間の相互作用を視覚化するために、疑似色付けされた。
【００６５】
情報を抽出する代替アプローチは、ＩＲ環または線状ＩＲ分子を使用して、ＩＣプローブ間の近接性を調べることである。タグ配列のライゲーション後、再構築されたＩＲ分子はＰＣＲによって増幅し、そしてゲル電気泳動によって分離することができる。サイズの違いは、異なるタグの組み込みを示す。また、アンプリコンのシーケンシングによって単一のＩＲ分子を増幅し、そして異なるタグのアイデンティティをデコードすることもできる。
【００６６】
ＭｏｌＢｏｏｌｅａｎ解析は、細胞、タンパク質混合物（バルク混合物中、またはたとえばゲル電気泳動で分離されたもののいずれか）で行うことができる。再構築されたＩＲ分子は、読み出しプラットフォームが単一分子の検出をサポートしている場合、それらが形成されたサンプルで直接調べることができ（図３に示すように、たとえば顕微鏡検査によって）、または再構築されたＩＲ分子を収集し、そして単一分子がその後個別にソートおよび分析することができる。
【００６７】
場合によっては、ＩＲ分子に残存している脱塩基部位（ＡＰ部位）が増幅および／または検出効率を妨げる可能性がある。検出効率を改善し、そしてシグナルの検出を防ぐために環状ＩＲ分子の未消化の脱塩基部位（ＡＰ部位）のリスクを減らすための手段として、本発明者らは、代替設計バージョンで設計を修正した（図５）。脱塩基部位を除去するために、タグが組み込まれる工程の後に二つの工程が追加された。最初の追加工程では、消化テンプレートがＤＮＡ環にハイブリダイズし、ＡＰ部位の周囲の領域が二本鎖となった。その後、脱塩基部位はＥｎｄｏＩＶによる消化によって除去された。次の工程では、欠落したチミジンを追加するＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、およびライゲーションによってニックを閉じるＴ４リガーゼを用いてギャップ充填が行われた。
【００６８】
ギャップ充填設計は、前述のＥ−カドヘリンおよびβ−カテニンの相互作用アッセイ（図６）を使用して評価された。Ｅ−カドヘリンおよびβ−カテニンの相互作用は、その抗体のみが存在する場合のＥ−カドヘリンの総量に等しい、顕著に豊富な量の総Ｅ−カドヘリンとともに検出された。同様に、β−カテニンの総量は、その抗体が使用された両方の条件において同程度のレベルのままである。
【００６９】
本発明の方法の他の態様について、本発明者らは遊離タンパク質および相互作用するタンパク質の両方をモニターする代替アプローチを開発した。このアプローチでは、抗体に結合しているＩＣオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造を含むように設計できる。そのようなヘアピンにフルオロフォア、およびクエンチャーを結合させることにより、フルオロフォアは、クエンチャーから距離が離れている場合のみ発光することができる。フルオロフォア、およびクエンチャーの配置により、そのような各ＩＣオリゴヌクレオチドの一つのフルオロフォアのみが発光できるようになる。ＩＣオリゴヌクレオチドがターゲットに結合し、それらに結合した抗体によって誘導されると、ヘアピン構造の一つが活性化オリゴヌクレオチドの侵入によって不安定化される。これがＩＣオリゴヌクレオチドの構造を変化させ、そして以前は二番目のＩＣオリゴヌクレオチドのストレッチと逆相補的であるステムに隠れていたＤＮＡのストレッチを明らかにする。不安定化／安定化された最初のＩＣオリゴヌクレオチドは、近接するターゲットに結合した場合のみ、第二のＩＣオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、フルオロフォアおよびクエンチャーを再配置し、それにより、以前に発光していたものはそのときクエンチされ、そしてＩＣオリゴヌクレオチドの一つにおいてクエンチされたフルオロフォアはクエンチャーから分離する。このフルオロフォアは、ＩＣオリゴヌクレオチドのペアが互いにハイブリダイズした場合にのみ発光できる。したがって、遊離タンパク質および相互作用するタンパク質の経口を同時に異なる波長で記録することができる。本明細書ではＩｎｖａｄｅｒ−ＭｏｌＢｏｏｌｅａｎと呼ばれるこの方法は、図４に示される。Ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇの助けを借り、本発明者らはすべてのオリゴヌクレオチド配列を設計および分析し、正しい二次構造およびハイブリダイゼーションを確認した（表１）。
【００７０】
ここで、以下の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１−  β−カテニンおよびＥ−カドヘリンの相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ検出：
情報受容ＤＮＡ環は、適切なハイブリダイゼーションを保証するモチーフ、すなわち環内の二つのヘアピン構造を有する、二つの一本鎖断片（すなわち、ＩＲ環断片１および２（表１を参照））をライゲーションすることにより、作成された。二つのオリゴヌクレオチドは、Ｔ４  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで最終濃度１μＭで混合された。その後、０．０２Ｕ／μｌのＴ４リガーゼを混合物に添加し、３７℃で2時間インキュベートした後、４℃で４８時間インキュベートした。
【００７２】
結合したＰＬＡプローブあたり３５０μｇの抗体、ロバ抗ウサギまたはロバ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）を、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）１０Ｋ遠心式フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国）を使用して、製造元の指示に従い、ＰＢＳ中の濃度３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。Ｓ−ＨｙＮｉｃ架橋剤（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、サンディエゴ州、米国）をＤＭＳＯに２０ｍＭになるよう溶解し、そして架橋剤および抗体を２５倍モル過剰の架橋剤と混合した。混合物を、室温で、光から保護して、２時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。抗体の活性化後、予洗したＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  ７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、緩衝液を１００ｍＭ  ＮａＨＰＯ4、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０の緩衝液に交換した。緩衝液交換に続いて、抗体を１：３の抗体：オリゴヌクレオチド比でアルデヒド修飾オリゴヌクレオチド（表１）と混合した。アニリンを最終濃度１０ｍＭで追加し、反応を触媒した。抗体オリゴヌクレオチド混合物を、室温で、光から保護して、２時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション直後に、予洗したＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  ７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、緩衝液をＰＢＳに交換した。結合後、複合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＡＫＴＡＰｕｒｅ  ＨＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）によって、非結合抗体およびオリゴヌクレオチドから精製した。ＨＰＬＣ精製から回収された画分を、製造元の指示に従い、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）１０Ｋ遠心式フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって８０μｌに濃縮し、電気泳動により検証した。複合体をＮｏｖｅｘ  ＴＢＥ−Ｕｒｅａサンプルバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、１０％  Ｎｏｖｅｘ  ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルで１８０Ｖで５０分間分離した。ＤＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して視覚化し、タンパク質をクマシー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、米国）を使用して視覚化した。ゲルをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ−Ｄｏｃ  ＸＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で視覚化した。複合体の濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定された。
【００７３】
顕微鏡スライド上の細胞を３．７％ＰＦＡで１０分間固定し、次に０．２％トリトンＸ１００を含む１×ＰＢＳで透過処理した後、ブロッキング溶液；５０％  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｃａｔ．♯９２７−５００００、ＬｉＣｏｒ）  ｉｎ  １×ＴＢＳを加える前に１×ＰＢＳで２回洗浄した。湿室で３７℃で３０分間ブロッキングした後、細胞をブロッキング溶液で４℃で一晩、抗Ｅ−カドヘリン（ｃａｔ．♯ＢＤ６１０１８２、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１００に希釈）および抗β−カテニン（ｃａｔ．♯ｓｃ７１９９、ｓａｎｔａｃｒｕｚ、１：２００に希釈）でインキュベートした。各スライドを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）を含む１×ＴＢＳで３分間、３回洗浄した。
【００７４】
Ｍｏｌｂｏｏｌｅａｎ  ＩＣプローブをブロッキング溶液に混合し、最終濃度を１００ｎｇ／ｍｌにして、細胞とともに３７℃で６０分間インキュベートした。次に、スライドをＴＢＳＴで３分間、３回洗浄した。Ｍｏｌｂｏｏｌｅａｎ  ＩＲ環を０．２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＴ４ライゲーションバッファーで０．０２５μＭに希釈し、細胞とともに３７℃で３０分間インキュベートしながら、環のＩＣプローブへのハイブリダイゼーションを可能にした。その後、細胞をＴＢＳＴで２回、それぞれ３分間洗浄し、そして設計に応じた消化酵素と３７℃でインキュベートした。５’ウラシル設計（５’  Ｕｒａｃｉｌ  ｄｅｓｉｇｎ）は、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７，６）バッファー中の０．１Ｕ／μｌ  ＥｎｄｏＩＶおよび０．０５Ｕ／μｌ  ＵＮＧによって、洗浄前に４５分間消化される。一方、５’Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ設計（５’Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ  ｄｅｓｉｇｎ）は、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを添加し、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ  Ｃｕｔ  ｓｍａｒｔで希釈した０．１２５Ｕ／μｌ  Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ酵素と1時間インキュベートされる。細胞をＴＢＳＴで３分間、２回洗浄し、そしてその後、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを添加したＴ４ライゲーションバッファー中において０．０５Ｕ／μＬ  Ｔ４リガーゼの存在下でタグ１および２とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ライゲーション後、ＴＢＳＴでさらに線状する（２×３分）。
【００７５】
ギャップ充填設計は二つの追加工程を導入する。スライドを、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）バッファー中の０．０１Ｕ／μｌのＥｎｄｏＩＶとともに０．０５μＭの消化テンプレートとともに室温で６０分間インキュベートした。スライドをＴＢＳＴで３回、３分間洗浄した。ギャップを充填するために、スライドを０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．１ｍＭ  ｄＮＴＰを添加した１×Ｔ４リガーゼバッファー中の０．０２５Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび０．０５Ｕ／μｌ  Ｔ４リガーゼとともに室温で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＴＢＳＴで２回、それぞれ３分間洗浄した。
【００７６】
その後、新たに形成された環に対してＲＣＡ反応を実行し、３７℃で６０分間、シグナルを増幅する。ＲＣＡは、次の溶液中の０．５Ｕ／μｌ  ｐｈｉ２９により触媒される：３３  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−、１０ｍＭ  Ｍｇ−酢酸、６６ｍＭ  Ｋ−酢酸、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＤＴＴ、７．５ｎｇ／ｍｌ  ＰｏｌｙＡ、および０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ。それをＴＢＳＴで２回、３分間洗浄した。ＲＣＡ産物は、０．００２５μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを添加したＰＢＳ中で０．０２５μＭ  ＤＯ１および２をハイブリダイズすることにより検出され、そして混合物は核染色用に０．０４ｍｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２も含んでいた。染色に続いて、１×ＴＢＳで１０分間、２回洗浄し、そして０．２×ＴＢＳで１５分間洗浄し、その後スライドを７０％ｅｔＯＨで乾燥させ、そしてＶｅｃｔａｓｈｅｌｄを使用して封入（ｍｏｕｎｔ）した。
【００７７】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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