(57)【要約】  本発明は、医薬の分野に関する。特に、本発明は、スターガルト病の治療、予防及び／又は遅延において使用することができる新規アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
好ましくは、配列番号１６２、１８１、８２、１０２、１２２、１４２若しくは配列番号２６２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
より好ましくは、配列番号１６０、１８０、８０、１００、１２０、１４０若しくは配列番号２６０、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
より好ましくは、配列番号１１若しくは配列番号３１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
より好ましくは、配列番号１２若しくは配列番号３２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
より好ましくは、配列番号１３、１６、１９、１６３、１６６、１６９、３３、３６、３９、４２、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、８３、８６、８９、１０３、１０６、１０９、１２３、１２６、１２９、１４３、１４６、１４９、２６３、２６６及び配列番号２６９、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
より好ましくは、配列番号１４、１７、２０、１６４、１６７、１７０、３４、３７、４０、４３、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、８４、８７、９０、１０４、１０７、１１０、１２４、１２７、１３０、１４４、１４７、１５０、２６４、２６８及び配列番号２７０、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である；
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である部分が、約８〜約４０ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜約２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜約２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有する、請求項１又は２に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１５、１８、２１、１６５、１６８、１７１、３５、３８、４１、４４、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、８５、８８、９１、１０５、１０８、１１１、１２５、１２８、１３１、１４５、１４８、１５１、２６５、２６８、及び配列番号２７１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項１〜３のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも１つのＥＳＥ（エクソンスプライスエンハンサー）モチーフを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
２’−Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、及び／又はこれらの修飾物の置換誘導体、例えば、ハロゲン化誘導体を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を促す条件下に置いた場合に、請求項１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項７に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
硝子体内投与用であり、片眼当たりのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計が０．０５ｍｇ〜５ｍｇの範囲の量で投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
硝子体内投与用であり、片眼当たりのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計が０．１〜１ｍｇの範囲の量、例えば、片眼当たりのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｍｇで投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
医薬品として使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項８に記載のベクター、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療において使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
医薬品の調製のための、請求項１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項８に記載のベクター、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１５】
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための医薬品の調製のための、請求項１〜６のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、又は請求項８〜１０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１６】
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための、請求項１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１７】
細胞内でＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートするための方法であって、前記細胞を、請求項１〜７のいずれかで定義したスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療を必要とする個体の前記ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための方法であって、前記個体の細胞を、請求項１〜７のいずれかで定義したスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１９】
ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態がスターガルト病である、請求項１２若しくは１３に記載の使用するための、スプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１５若しくは１６に記載の使用、又は請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。特に、本発明は、スターガルト病の治療、予防及び／又は遅延において使用することができる新規アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＢＣＡ４における常染色体劣性変異は、中心視力喪失によって特徴付けられ、全盲に至る場合も多い進行性障害である、スターガルト病の原因である。スターガルト病の典型的特質は、患者の眼底の至る所に分布した多くの黄斑（斑点）の存在である。ＡＢＣＡ４遺伝子は、５０個のエクソンから構成され、２２７３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。このタンパク質は錐体及び桿体光受容器細胞の外側セグメントにおいて発現され、光伝達後の老廃物の除去において重要な役割を果たす。
【０００３】
ＳＴＧＤ１の他に、ＡＢＣＡ４のバリアントは、対立遺伝子の重要度に応じて、標的黄斑症から常染色体劣性錐体桿体ジストロフィー（ａｒＣＲＤ；Cremers, F. P. M., van de Pol, D. J., van Driel, M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Deutman, A.；Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J. Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079）及び汎網膜ジストロフィー（Cremers, F. P. M., van de Pol, D. J., van Driel, M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Deutman, A.；Martinez-Mir, A., Paloma, E., Allikmets, R., Ayuso, C., del Rio, T., Dean, M., Vilageliu, L., Gonzalez-Duarte, R. & Balcells, S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR. Nat. Genet. 18, 11-12 (1998), doi:10.1038/ng0198-11；Shroyer et al, 2001；Duncker et al, 2014）までの範囲の網膜疾患の他の亜型ももたらす場合がある。
【０００４】
二対立遺伝子ＡＢＣＡ４のバリアントは、コーディング領域及び隣接スプライス部位の配列決定後に、ＳＴＧＤ１に関する症例のおよそ８０％（Allikmets, R., Singh, N., Sun, H., Shroyer, N. F., Hutchinson, A., Chidambaram, A., Gerrard, B., Baird, L., Stauffer, D., Peiffer, A., Rattner, A., Smallwood, P., Li, Y., Anderson, K. L., Lewis, R. A., Nathans, J., Leppert, M., Dean, M. & Lupski, J. R. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 15, 236-246 (1997), doi:10.1038/ng0397-236；Fujinami, K., Zernant, J., Chana, R. K., Wright, G. A., Tsunoda, K., Ozawa, Y., Tsubota, K., Webster, A. R., Moore, A. T., Allikmets, R. & Michaelides, M. ABCA4 gene screening by next-generation sequencing in a British cohort. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 6662-6674 (2013), doi:10.1167/iovs.13-12570；Lewis, R. A., Shroyer, N. F., Singh, N., Allikmets, R., Hutchinson, A., Li, Y., Lupski, J. R., Leppert, M. & Dean, M. Genotype/Phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 422-434 (1999), doi:10.1086/302251；Maugeri, A., van Driel, M. A., van de Pol, D. J., Klevering, B. J., van Haren, F. J., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Dahl, N., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. The 2588G-->C mutation in the ABCR gene is a mild frequent founder mutation in the Western European population and allows the classification of ABCR mutations in patients with Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 1024-1035 (1999)；Rivera, A., White, K., Stohr, H., Steiner, K., Hemmrich, N., Grimm, T., Jurklies, B., Lorenz, B., Scholl, H. P., Apfelstedt-Sylla, E. & Weber, B. H. A comprehensive survey of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-related macular degeneration. Am. J. Hum. Genet. 67, 800-813 (2000), doi:10.1086/303090；Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K., Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, B. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394-403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936；Webster, A. R., Heon, E., Lotery, A. J., Vandenburgh, K., Casavant, T. L., Oh, K. T., Beck, G., Fishman, G. A., Lam, B. L., Levin, A., Heckenlively, J. R., Jacobson, S. G., Weleber, R. G., Sheffield, V. C. & Stone, E. M. An analysis of allelic variation in the ABCA4 gene. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 42, 1179-1189 (2001)；Zernant, J., Schubert, C., Im, K. M., Burke, T., Brown, C. M., Fishman, G. A., Tsang, S. H., Gouras, P., Dean, M. & Allikmets, R. Analysis of the ABCA4 gene by next-generation sequencing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 8479-8487 (2011), doi:10.1167/iovs.11-8182；Zernant, J., Lee, W., Collison, F. T., Fishman, G. A., Sergeev, Y. V., Schuerch, K., Sparrow, J. R., Tsang, S. H. & Allikmets, R. Frequent hypomorphic alleles account for a significant fraction of ABCA4 disease and distinguish it from age-related macular degeneration. J. Med. Genet. 54, 404-412 (2017), doi:10.1136/jmedgenet-2017-104540）、及びａｒＣＲＤ（Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J. Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079）に関する症例のおよそ３０％において特定され得る。一般的に、ａｒＣＲＤ又は汎網膜ジストロフィーを有する個体は、２つの重度のＡＢＣＡ４対立遺伝子を保有する一方、ＳＴＧＤ１を有する個体は、２つの中等度のバリアント又は軽度のバリアントと重度のバリアントの組合せを保有する（Maugeri, A., van Driel, M. A., van de Pol, D. J., Klevering, B. J., van Haren, F. J., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Dahl, N., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. The 2588G-->C mutation in the ABCR gene is a mild frequent founder mutation in the Western European population and allows the classification of ABCR mutations in patients with Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 1024-1035 (1999)；van Driel, M. A., Maugeri, A., Klevering, B. J., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. ABCR unites what ophthalmologists divide(s). Ophthalmic Genet. 19, 117-122 (1998)）。ＳＴＧＤ１患者のＡＢＣＡ４欠落バリアントの大多数が遺伝子のイントロン領域に存在すると仮定されており、実際に、ここ数年にわたって、いくつかのグループによって、このようなディープイントロンバリアントの存在が実証された（Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, B. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716；Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, M. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, C. C., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717；Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367；Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y；Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K., Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, B. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394-403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936；Zernant et al, 2014）。２０１３年には、Braunと共同研究者ら（Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367）は、ＡＢＣＡ４のｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすことができると推定されるイントロン３０の２つのバリアント（ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ、それぞれ、以下でＭ１及びＭ２と示される。）について記載したが、未だ実験証拠は提供されていない。これまでに、Ｍ２は１３の症例で特定されている（Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, B. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716；Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, M. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, C. C., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717；Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367；Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y；Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K., Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, B. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394-403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936；Zernant et al, 2014）。Ｍ１は３１の症例で見出され、興味深いことに、オランダとベルギーの集団で特に頻度が高かった（Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, B. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716；Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, M. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, C. C., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions 
in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717；Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367；Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y；Zernant et al, 2014）。さらに、本発明者らは、潜在性のアクセプター若しくはスプライスドナー部位を活性化することによって、又は偽エクソンの内部に位置するＥＳＥモチーフを強化することによって、偽エクソンの挿入をすべてが導くいくつかのさらなるディープイントロンＡＢＣＡ４変異を特定した。これらのさらなる変異は、ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ、ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ、ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ、ｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔを含む。
【０００５】
現在、ＳＴＧＤ１に関するいくつかの臨床試験が、様々な治療戦略（http://www.clinicaltrials.gov）：ｉ）完全ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡ（約６．８ｋｂ）をレンチウイルスベクターによって送達することによる遺伝子置換療法（ＮＣＴ０１３６７４４４及びＮＣＴ０１７３６５９２）；ii）ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞（ｈＥＳＣ−ＲＰＥ）の網膜下移植（ＮＣＴ０２４４５６１２及びＮＣＴ０２９４１９９１）及びiii）Ｃ２０−Ｄ３−レチニルアセテートの投与（ＮＣＴ０２４０２６６０）を用いて行われている。これらの手法はそれぞれその制限を有し、これまでに、これらの臨床試験から有効なデータが報告されていない。
【０００６】
ＡＢＣＡ４における変異のかなりの量がＡＢＣＡ４のｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすため、これらは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に基づくスプライスモジュレーション療法に対する魅力的な標的を表す。したがって、スターガルト病に罹患する対象の機能的ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を可能とするＡＢＣＡ４遺伝子のスプライスモジュレーションのためのＡＯＮを開発するという要請が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cremers, F. P. M., van de Pol, D. J., van Driel, M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Deutman, A.
【非特許文献２】Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J. Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079
【非特許文献３】Martinez-Mir, A., Paloma, E., Allikmets, R., Ayuso, C., del Rio, T., Dean, M., Vilageliu, L., Gonzalez-Duarte, R. & Balcells, S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR. Nat. Genet. 18, 11-12 (1998), doi:10.1038/ng0198-11
【非特許文献４】Shroyer et al, 2001
【非特許文献５】Duncker et al, 2014
【非特許文献６】Allikmets, R., Singh, N., Sun, H., Shroyer, N. F., Hutchinson, A., Chidambaram, A., Gerrard, B., Baird, L., Stauffer, D., Peiffer, A., Rattner, A., Smallwood, P., Li, Y., Anderson, K. L., Lewis, R. A., Nathans, J., Leppert, M., Dean, M. & Lupski, J. R. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 15, 236-246 (1997), doi:10.1038/ng0397-236
【非特許文献７】Fujinami, K., Zernant, J., Chana, R. K., Wright, G. A., Tsunoda, K., Ozawa, Y., Tsubota, K., Webster, A. R., Moore, A. T., Allikmets, R. & Michaelides, M. ABCA4 gene screening by next-generation sequencing in a British cohort. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 6662-6674 (2013), doi:10.1167/iovs.13-12570
【非特許文献８】Lewis, R. A., Shroyer, N. F., Singh, N., Allikmets, R., Hutchinson, A., Li, Y., Lupski, J. R., Leppert, M. & Dean, M. Genotype/Phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 422-434 (1999), doi:10.1086/302251
【非特許文献９】Maugeri, A., van Driel, M. A., van de Pol, D. J., Klevering, B. J., van Haren, F. J., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Dahl, N., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. The 2588G-->C mutation in the ABCR gene is a mild frequent founder mutation in the Western European population and allows the classification of ABCR mutations in patients with Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 1024-1035 (1999)
【非特許文献１０】Rivera, A., White, K., Stohr, H., Steiner, K., Hemmrich, N., Grimm, T., Jurklies, B., Lorenz, B., Scholl, H. P., Apfelstedt-Sylla, E. & Weber, B. H. A comprehensive survey of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-related macular degeneration. Am. J. Hum. Genet. 67, 800-813 (2000), doi:10.1086/303090
【非特許文献１１】Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K., Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, B. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394-403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936
【非特許文献１２】Webster, A. R., Heon, E., Lotery, A. J., Vandenburgh, K., Casavant, T. L., Oh, K. T., Beck, G., Fishman, G. A., Lam, B. L., Levin, A., Heckenlively, J. R., Jacobson, S. G., Weleber, R. G., Sheffield, V. C. & Stone, E. M. An analysis of allelic variation in the ABCA4 gene. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 42, 1179-1189 (2001)
【非特許文献１３】Zernant, J., Schubert, C., Im, K. M., Burke, T., Brown, C. M., Fishman, G. A., Tsang, S. H., Gouras, P., Dean, M. & Allikmets, R. Analysis of the ABCA4 gene by next-generation sequencing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 8479-8487 (2011), doi:10.1167/iovs.11-8182
【非特許文献１４】Zernant, J., Lee, W., Collison, F. T., Fishman, G. A., Sergeev, Y. V., Schuerch, K., Sparrow, J. R., Tsang, S. H. & Allikmets, R. Frequent hypomorphic alleles account for a significant fraction of ABCA4 disease and distinguish it from age-related macular degeneration. J. Med. Genet. 54, 404-412 (2017), doi:10.1136/jmedgenet-2017-104540
【非特許文献１５】Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J. Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079
【非特許文献１６】van Driel, M. A., Maugeri, A., Klevering, B. J., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. ABCR unites what ophthalmologists divide(s). Ophthalmic Genet. 19, 117-122 (1998)
【非特許文献１７】Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, B. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716
【非特許文献１８】Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, M. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, C. C., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717
【非特許文献１９】Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367
【非特許文献２０】Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y
【非特許文献２１】Zernant et al, 2014
【非特許文献２２】http://www.clinicaltrials.gov
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
−  配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  好ましくは、配列番号１６２、１８１、８２、１０２、１２２、１４２若しくは配列番号２６２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１６０、１８０、８０、１００、１２０、１４０若しくは配列番号２６０、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１１若しくは配列番号３１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１２若しくは配列番号３２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１３、１６、１９、１６３、１６６、１６９、３３、３６、３９、４２、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、８３、８６、８９、１０３、１０６、１０９、１２３、１２６、１２９、１４３、１４６、１４９、２６３、２６６及び配列番号２６９、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１４、１７、２０、１６４、１６７、１７０、３４、３７、４０、４３、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、８４、８７、９０、１０４、１０７、１１０、１２４、１２７、１３０、１４４、１４７、１５０、２６４及び配列番号２７０、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である、
スプライシングを再指示する（redirect）ためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号１５、１８、２１、１６５、１６８、１７１、３５、３８、４１、４４、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、８５、８８、９１、１０５、１０８、１１１、１２５、１２８、１３１、１４５、１４８、１５１、２６５、２６８及び配列番号２７１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる、先行する請求項のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに提供する。
【００１０】
本発明は、エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を促す条件下に置いた場合に、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベクターをさらに提供する。
【００１１】
本発明は、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、医薬品として使用するための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に記載のベクター及び本発明に記載の組成物をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療において使用するための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に記載のベクター及び本発明に記載の組成物をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、医薬品の調製のための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に記載のベクター及び本発明に記載の組成物の使用をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に記載のベクター及び本発明に記載の組成物の使用をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、細胞内でＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートするための方法であって、前記細胞を、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に記載のベクター及び本発明に記載の組成物と接触させることを含む、方法をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、それを必要とする個体のＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療のための方法であって、前記個体の細胞を、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に記載のベクター及び本発明に記載の組成物と接触させることを含む、方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＡＢＣＡ４変異ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ及びｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔによって引き起こされたスプライス欠損のレスキューが、ミニ遺伝子アッセイにおけるＡＯＮの送達によって達成された、実施例Ａの結果を示す図である。
【図２】ＡＯＮによるＡＢＣＡ４変異ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａによって引き起こされたスプライス欠損のレスキューが、ＡＯＮの培養された患者由来光受容器前駆細胞への送達によって達成された、実施例Ｃの結果を示す図である。
【図３】ＡＯＮによるＡＢＣＡ４変異ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａによって引き起こされたスプライス欠損のレスキューが、ミニ遺伝子アッセイにおけるＡＯＮの送達によって達成された、実施例Ｂの結果を示す図である。
【図４Ａ−４Ｂ】（Ａ）は、ＡＢＣＡ４変異ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ（Ｍ１）及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ（Ｍ２）によって引き起こされたスプライス欠損が特定される、実施例Ｃの結果を示す図である。異常にスプライシングされたバンドが、特に、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処置（＋）後に検出された。アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＴ−ＰＣＲをコントロールとして使用した。（Ｂ）ＣＨＸを有する細胞株とＣＨＸを有さない細胞株のそれぞれについて、正確にスプライシングされたＡＢＣＡ４転写物と異常にスプライシングされたＡＢＣＡ４転写物の比の定量化を示すグラフである。
【図５】ディープイントロンバリアントＭ１（ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ）及びＭ２（ｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ）によって引き起こされた効果のインシリコでの特徴付けを示す図である。Ｍ１及びＭ２の位置を有する３４５ｂｐの偽エクソンの境界、スプライス部位のゲノムポジション、検出されるスプライシング事象、並びにアクセプターとドナーの両方に対するスプライス部位予測が模式的に表される。破線は、ポジションｇ．９４，４９５，０７４（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）におけるエクソン３０の潜在性スプライスドナー部位からエクソン３１の正常スプライスアクセプター部位（ｒ．４４６７＿４５３９ｄｅｌ、ｐ．Ｃｙｓ１４９０Ｇｌｕｆｓ＊１２）までのスプライシングを表す。コントロール及び変異体の状況におけるスプライスアクセプター及びドナー部位の予測値は、いかなる差も示さなかった。中央のパネルでは、新たなＥＳＥモチーフを増強又は作出するバリアントの効果が示される。スプライス部位ファインダー様（ＳＳＦＬ，SpliceSiteFinder-like）及びヒトスプライシングファインダー（ＨＳＦ，Human Splicing Finder）。
【図６Ａ−６Ｄ】（Ａ）バリアントの位置、最も高いスコアを有するＳＣ３５モチーフ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を示す偽エクソンの略図である。（Ｂ）ＡＯＮで処理した細胞に関するＲＮＡ分析を示す図である。コントロールのＡＢＣＡ４のエクソン３０からエクソン３１、ＡＯＮ送達に関するＭ１（ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ）及びＭ２（ｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ）含有光受容器前駆細胞（ＰＰＣ）のＲＴ−ＰＣＲ。アクチン（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡ増幅を使用して試料を正規化した。ＮＴ−：未処理及びシクロヘキシミド（ＣＨＸ）；ＮＴ＋：ＣＨＸの存在下で未処理；Ａ１：ＡＯＮ１；Ａ２：ＡＯＮ２；Ａ３：ＡＯＮ３；Ａ４：ＡＯＮ４；Ｓ：ＳＯＮ及びＭＱ：ＰＣＲネガティブコントロール。（Ｃ）すべてのＭ１及びＭ２試料における正確にスプライスされた転写物対異常にスプライスされた転写物の比の半定量化。（Ｄ）図３Ｃで観察された比率に基づいてＮＴ＋と比較した各ＡＯＮの修正のパーセンテージ。Ｍ１及びＭ２に対するＡＯＮの有効性における統計的有意差はアスタリスク（Mann-Whitney検定を使用して＊：ｐ≦０．０５）で示される。
【図７Ａ−７Ｂ】（Ａ）それぞれの親線維芽細胞株と比較した１つのコントロール及びＭ１／Ｍ２由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の遺伝子発現プロファイルを示すグラフである。（Ｂ）ｉＰＳＣと比較した、分化１カ月後の１つのコントロール及びＭ１／Ｍ２由来の光受容器前駆細胞（ＰＰＣ）の遺伝子発現プロファイルを示すグラフである。ＰＰＣの出現は、ＣＲＸ発現の増加によって推測することができる。光受容器様細胞への分化は、多能性遺伝子Ｏｃｔ３／４と比較したＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１Ｍ／ＬＷ、ＲＣＶ１及びＡＢＣＡ４の発現の増加によって示される。結果を平均±ＳＤとして示す。すべてのデータをＡＣＴＢの発現に対してプロットした。
【図８】ＣＨＸの非存在下（−）及びＣＨＸの存在下（＋）における、コントロール（ＣＯＮ）、Ｍ１（ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ）及びＭ２（ｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ）光受容器前駆細胞のＡＢＣＡ４のエクソン２からエクソン５のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ヒト成人の網膜ＲＮＡを対照として使用し、一方、ＭＱは反応のネガティブコントロールであった。
【図９】ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異によって引き起こされたスプライス欠損を修正する能力に関する合計２６個のＡＯＮ配列のスクリーニングを示す図である。（Ａ）患者由来ＰＰＣにおけるＡＢＣＡ４のエクソン３０からエクソン３１を検出するためのＲＴ−ＰＣＲの代表的電気泳動写真。下のバンドは正確な転写物を表し、一方、上のバンドは異常な転写物を表す。異常なバンドはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理後に検出され、これらの転写物がナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）を受けることを示す。２６個の異なるＡＯＮ分子が２つのＳＯＮ（ＳＯＮ１及びＳＯＮ２と称されるネガティブコントロール）と共に、一緒に細胞に送達された。結果を、ＣＨＸ（＋ＣＨＸ）の存在下で未処理細胞（ＮＴ）と比較した。アクチンをローディングコントロールとして使用した。ＭＱは、ＰＣＲのネガティブコントロールについて記載するものである。２つの独立した複製物の半定量化後の（Ｂ）正確な（修正された）転写物及び（Ｃ）異常な転写物のパーセンテージの表示。このパーセンテージに基づき、ＡＯＮ分子を、有効（灰色の塗りつぶし）、中程度に有効（水玉模様）、有効性に乏しい（縞模様）及び有効ではない（十字模様）に分類した。実線、点線及び破線は、異なるＡＯＮの有効性を決定する閾値を示す。異常な転写物の基本的レベルを示すコントロールは白色である。黒は、ＡＯＮで処理されず、かつ、ＣＨＸ処理に供されなかった試料。
【図１０】偽エクソンの包含の原因となるＡＢＣＡ４遺伝子における７つの変異に関するＡＯＮのスクリーニングを示す図である。ヒトにおいて見出されるこの変異を挿入するために、ミディ遺伝子を含有するゲノム領域を変異誘発した。次に、これらのミディ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２４時間後に、異なるＡＯＮをこれらの細胞に送達した。ＲＴ−ＰＣＲによって分析を実施した。すべてのバリアントに対して、３つのＡＯＮを設計し、ＳＯＮをネガティブコントロールとして送達した。ＮＴは、未処理について記載するものであり、ＡＯＮ処理に供されなかったトランスフェクト細胞を表す。ＨＥＫレーンは、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞に関してなる余分なネガティブコントロールである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列の説明
配列番号    名称：
１      ゲノムＤＮＡ  ＡＢＣＡ４
２      ｃＤＮＡ  ＡＢＣＡ４
３      タンパク質ＡＢＣＡ４
１０      偽エクソン３０−３１（６８）  ＲＮＡ
１１      偽エクソン３０−３１（６８）  ＲＮＡ；より小さい標的
１２      偽エクソン３０−３１  （６８）  ＲＮＡ；より小さい標的（ＡＯＮ面積＋１０）
１３      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１４      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１５      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （６８）
１６      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１７      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１８      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （６８）
１９      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２０      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２１      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （６８）
３０      偽エクソン３０−３１  （３４５）  ＲＮＡ
３１      偽エクソン３０−３１  （３４５）  ＲＮＡ；より小さい標的
３２        偽エクソン３０−３１  （３４５）  ＲＮＡ；より小さい標的（ＡＯＮ面積＋１０）
３３      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
３４      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
３５      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）
３６      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
３７      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
３８      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （３４５）
３９      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
４０      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
４１      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （３４５）
４２      ＡＯＮ−４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
４３      ＡＯＮ−４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
４４      ＡＯＮ−４  偽エクソン３０−３１  （３４５）
４５      ＳＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  配列番号３５のセンスバージョン
５０      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−３０−３１  野生型
５１      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−３０−３１  ｃ．４５３９＋１１００Ｇ
５２      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−３０−３１  ｃ．４５３９＋１１０６Ｔ
５３      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−３０−３１  ｃ．４５３９＋２００１Ａ
５４      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ２  Ｆｗ
５５      ＡＣＴＢ＿ｅｘ３  Ｆｗ
５６      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ３０  Ｆｗ
５７      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ２０／２１  Ｆｗ
５８      ＣＲＸ  Ｆｗ
５９      ＬＩＮ２８  Ｆｗ
６０      ＮＡＮＯＧ  Ｆｗ
６１      ＯＣＴ４  Ｆｗ
６２      ＯＰＮ１Ｍ／ＬＷ  Ｆｗ
６３      ＯＰＮ１ＳＷ  Ｆｗ
６４      ＲＣＶ１  Ｆｗ
６５      ＳＯＸ２  Ｆｗ
６６      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ５  Ｒｖ
６７      ＡＣＴＢ＿ｅｘ４  Ｒｖ
６８      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ３１  Ｒｖ
６９      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ２１  Ｒｖ
７０      ＣＲＸ  Ｒｖ
７１      ＬＩＮ２８  Ｒｖ
７２      ＮＡＮＯＧ  Ｒｖ
７３      ＯＣＴ４  Ｒｖ
７４      ＯＰＮ１Ｍ／ＬＷ  Ｒｖ
７５      ＯＰＮ１ＳＷ  Ｒｖ
７６      ＲＣＶ１  Ｒｖ
７７      ＳＯＸ２  Ｒｖ
８０      偽エクソン６−７  （１６２）
８１      偽エクソン６−７  （１６２）  より大きい標的＋隣接配列（＋５０ｎｔ）
８２      偽エクソン６−７  （１６２）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
８３      ＡＯＮ−１  偽エクソン６−７  （１６２）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
８４      ＡＯＮ−１  偽エクソン６−７  （１６２）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
８５      ＡＯＮ−１  偽エクソン６−７  （１６２）
８６      ＡＯＮ−２  偽エクソン６−７  （１６２）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
８７      ＡＯＮ−２  偽エクソン６−７  （１６２）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
８８      ＡＯＮ−２  偽エクソン６−７  （１６２）
８９      ＡＯＮ−３  偽エクソン６−７  （１６２）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
９０      ＡＯＮ−３  偽エクソン６−７  （１６２）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
９１      ＡＯＮ−３  偽エクソン６−７  （１６２）
１００      偽エクソン７−８  （１４１）
１０１      偽エクソン７−８  （１４１）  より大きい標的＋隣接配列（＋５０ｎｔ）
１０２      偽エクソン７−８  （１４１）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
１０３      ＡＯＮ−１  偽エクソン７−８  （１４１）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１０４      ＡＯＮ−１  偽エクソン７−８  （１４１）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１０５      ＡＯＮ−１  偽エクソン７−８  （１４１）
１０６      ＡＯＮ−２  偽エクソン７−８  （１４１）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１０７      ＡＯＮ−２  偽エクソン７−８  （１４１）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１０８      ＡＯＮ−２  偽エクソン７−８  （１４１）
１０９      ＡＯＮ−３  偽エクソン７−８  （１４１）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１１０      ＡＯＮ−３  偽エクソン７−８  （１４１）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１１１      ＡＯＮ−３  偽エクソン７−８  （１４１）
１２０      偽エクソン７−８  （５６）
１２１      偽エクソン７−８  （５６）  より大きい標的＋隣接配列（＋５０ｎｔ）
１２２      偽エクソン７−８  （５６）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
１２３      ＡＯＮ−１  偽エクソン７−８  （５６）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１２４      ＡＯＮ−１  偽エクソン７−８  （５６）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１２５      ＡＯＮ−１  偽エクソン７−８  （５６）
１２６      ＡＯＮ−２  偽エクソン７−８  （５６）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１２７      ＡＯＮ−２  偽エクソン７−８  （５６）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１２８      ＡＯＮ−２  偽エクソン７−８  （５６）
１２９      ＡＯＮ−３  偽エクソン７−８  （５６）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１３０      ＡＯＮ−３  偽エクソン７−８  （５６）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１３１      ＡＯＮ−３  偽エクソン７−８  （５６）
１４０      偽エクソン１３−１４  （１３４）
１４１      偽エクソン１３−１４  （１３４）  より大きい標的＋隣接配列（＋５０ｎｔ）
１４２      偽エクソン１３−１４  （１３４）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
１４３      ＡＯＮ−１  偽エクソン１３−１４  （１３４）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１４４      ＡＯＮ−１  偽エクソン１３−１４  （１３４）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１４５      ＡＯＮ−１  偽エクソン１３−１４  （１３４）
１４６      ＡＯＮ−２  偽エクソン１３−１４  （１３４）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１４７      ＡＯＮ−２  偽エクソン１３−１４  （１３４）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１４８      ＡＯＮ−２  偽エクソン１３−１４  （１３４）
１４９      ＡＯＮ−３  偽エクソン１３−１４  （１３４）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１５０      ＡＯＮ−３  偽エクソン１３−１４  （１３４）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１５１      ＡＯＮ−３  偽エクソン１３−１４  （１３４）
１６０      偽エクソン３０−３１  （６８）
１６１      偽エクソン３０−３１  （６８）  より大きい標的＋隣接配列（＋５０ｎｔ）
１６２      偽エクソン３０−３１  （６８）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
１６３      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１６４      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１６５      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （６８）
１６６      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１６７      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１６８      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （６８）
１６９      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１７０      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （６８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１７１      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （６８）
１８０      偽エクソン３０−３１  （３４５）
１８１      偽エクソン３０−３１  （３４５）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
１８２      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１８３      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１８４      ＡＯＮ−１  偽エクソン３０−３１  （３４５）
１８５      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１８６      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１８７      ＡＯＮ−２  偽エクソン３０−３１  （３４５）
１８８      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１８９      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１９０      ＡＯＮ−３  偽エクソン３０−３１  （３４５）
１９１      ＡＯＮ−４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１９２      ＡＯＮ−４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１９３      ＡＯＮ−４  偽エクソン３０−３１  （３４５）
１９４      ＡＯＮ−５  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１９５      ＡＯＮ−５  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１９６      ＡＯＮ−５  偽エクソン３０−３１  （３４５）
１９７      ＡＯＮ−６  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
１９８      ＡＯＮ−６  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
１９９      ＡＯＮ−６  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２００      ＡＯＮ−７  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２０１      ＡＯＮ−７  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２０２      ＡＯＮ−７  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２０３      ＡＯＮ−８  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２０４      ＡＯＮ−８  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２０５      ＡＯＮ−８  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２０６      ＡＯＮ−９  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２０７      ＡＯＮ−９  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２０８      ＡＯＮ−９  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２０９      ＡＯＮ−１０  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２１０      ＡＯＮ−１０  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２１１      ＡＯＮ−１０  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２１２      ＡＯＮ−１１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２１３      ＡＯＮ−１１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２１４      ＡＯＮ−１１  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２１５      ＡＯＮ−１２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２１６      ＡＯＮ−１２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２１７      ＡＯＮ−１２  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２１８      ＡＯＮ−１３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２１９      ＡＯＮ−１３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２２０      ＡＯＮ−１３  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２２１      ＡＯＮ−１４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２２２      ＡＯＮ−１４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２２３      ＡＯＮ−１４  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２２４      ＡＯＮ−１５  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２２５      ＡＯＮ−１５  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２２６      ＡＯＮ−１５  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２２７      ＡＯＮ−１６  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２２８      ＡＯＮ−１６  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２２９      ＡＯＮ−１６  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２３０      ＡＯＮ−１７  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２３１      ＡＯＮ−１７  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２３２      ＡＯＮ−１７  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２３３      ＡＯＮ−１８  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２３４      ＡＯＮ−１８  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２３５      ＡＯＮ−１８  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２３６      ＡＯＮ−１９  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２３７      ＡＯＮ−１９  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２３８      ＡＯＮ−１９  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２３９      ＡＯＮ−２０  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２４０      ＡＯＮ−２０  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２４１      ＡＯＮ−２０  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２４２      ＡＯＮ−２１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２４３      ＡＯＮ−２１  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２４４      ＡＯＮ−２１  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２４５      ＡＯＮ−２２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２４６      ＡＯＮ−２２  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２４７      ＡＯＮ−２２  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２４８      ＡＯＮ−２３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２４９      ＡＯＮ−２３  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２５０      ＡＯＮ−２３  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２５１      ＡＯＮ−２４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２５２      ＡＯＮ−２４  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２５３      ＡＯＮ−２４  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２５４      ＡＯＮ−２５  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２５５      ＡＯＮ−２５  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２５６      ＡＯＮ−２５  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２５７      ＡＯＮ−２６  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２５８      ＡＯＮ−２６  偽エクソン３０−３１  （３４５）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２５９      ＡＯＮ−２６  偽エクソン３０−３１  （３４５）
２６０      偽エクソン３６−３７  （１８８）
２６１      偽エクソン３６−３７  （１８８）  より大きい標的＋隣接配列（＋５０ｎｔ）
２６２      偽エクソン３６−３７  （１８８）  より大きい標的＋隣接配列（＋２０ｎｔ）
２６３      ＡＯＮ−１  偽エクソン３６−３７  （１８８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２６４        ＡＯＮ−１  偽エクソン３６−３７  （１８８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２６５      ＡＯＮ−１  偽エクソン３６−３７  （１８８）
２６６      ＡＯＮ−２  偽エクソン３６−３７  （１８８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２６７        ＡＯＮ−２  偽エクソン３６−３７  （１８８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２６８      ＡＯＮ−２  偽エクソン３６−３７  （１８８）
２６９      ＡＯＮ−３  偽エクソン３６−３７  （１８８）  標的部位及び隣接配列（＋１０ｎｔ）
２７０        ＡＯＮ−３  偽エクソン３６−３７  （１８８）  標的部位及び隣接配列（＋５ｎｔ）
２７１      ＡＯＮ−３  偽エクソン３６−３７  （１８８）
２８０      ＳＯＮ−１  （ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ、ＡＯＮ１  ３０−３１  （３４５）のセンスバージョン）
２８１      ＳＯＮ−２  （ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ、ＡＯＮ４  ３０−３１  （３４５）のセンスバージョン）
２８２      ＳＯＮ−３（ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ＡＯＮ２  １３−１４  （１３４）のセンスバージョン
２９０      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン６−イントロン７  野生型
２９１      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン６−イントロン７  ｃ．７６９−７８４Ｔ
２９２      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン６−イントロン１１  野生型
２９３      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン６−イントロン１１  ｃ．８５９−５４０Ｇ
２９４      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン６−イントロン１１  ｃ．８５９−５０６Ｃ
２９５      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン１１−イントロン１５  野生型
２９６      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン１１−イントロン１５  ｃ．１９３７＋４３５Ｇ
２９７      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン２９−イントロン３２  野生型
２９８      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン２９−イントロン３２  ｃ．４５３９＋１１００Ｇ
２９９      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン２９−イントロン３２  ｃ．４５３９＋１１０６Ｔ
３００      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン３１−イントロン３７  野生型
３０１      ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｒｈｏ−ＡＢＣＡ４−イントロン３１−イントロン３７  ｃ．５１９７−５５７Ｔ
３０２      ＲＨＯ＿ｅｘ３  ｆｗ
３０３      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ７  ｒｅｖ
３０４      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ７  ｆｗ
３０５      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ８  ｒｅｖ
３０６      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ１３  ｆｗ
３０７      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ１４  ｒｅｖ
３０８      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ３０  ｆｗ
３０９      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ３２  ｒｅｖ
３１０      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ３２  ｆｗ
３１１      ＡＢＣＡ４＿ｅｘ３７  ｒｅｖ
【００２０】
【表１】
2020500524.tif 000002
2020500524.tif 000003
2020500524.tif 000004
【００２１】
一部の変異は、偽エクソン内に位置する（例えば、変異が、次に偽エクソンを作出するＥＳＥを作出する場合、変異は偽エクソンの部分である）。スプライシングを再指示するために設計されたＡＯＮは、変異の部位に野生型配列に照らしてミスマッチを有することになる。これは、配列番号３５／１８４、１３１及び２２６に関するＡＯＮ並びに配列番号４５／２８０に関するＳＯＮに関する場合であり、野生型配列に照らした変異は太字と下線で示す。
【００２２】
【表２】
2020500524.tif 000005
【００２３】
表２は、ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変化によるＰＥ包含を再指示する有効性を試験した２６個のＡＯＮの特徴について記載する。ＡＯＮを偽エクソンの５’末端から３’末端まで列挙する。列２は、ＰＥに対する位置を列挙する。列３〜６は、予測エクソンスプライスエンハンサーモチーフ、すなわち、対応するＡＯＮと重複するＳＦ２、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５の数を列挙する。列７は、ＡＯＮの位置におけるＲＮＡの構成、すなわち、開放型、閉鎖型又は混合型立体配置を列挙する。
【００２４】
発明の詳細な説明
定義によって、ＡＯＮは、それらの標的に対して実質的に相補的であり（アンチセンス）、対応するｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子に結合して、それによって、スプライシングに必須のタンパク質の結合を妨げることを可能とする。本発明者らがＣＥＰ２９０におけるｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異について以前に示したように（Collin, R.W., den Hollander, A.I., van der Velde-Visser, S.D., Bennicelli, J., Bennett, J., and Cremers, F.P. (2012). Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Molecular therapy Nucleic acids 1, e14；Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563）、通常、この結合の欠如によって、標的エクソンのスキッピングがもたらされる。さらに、ＡＯＮは、隣接するスプライスアクセプター又はドナー部位へのスプライシング機構を再指示することができる。このことによって、本発明者らは、ＡＯＮに基づくスプライスモジュレーション療法にも適する場合のあるＡＢＣＡ４変異を選択するよう導かれた。これらの変異はすべて、新規スプライスアクセプター、スプライスドナー又はエクソンスプライスエンハンサー結合部位を作出するディープイントロンバリアントであり、対応する遺伝子のｍＲＮＡに対する偽エクソンの包含をもたらす。ＡＯＮは、偽エクソンの認識をブロックする（それによって、偽エクソンのスキッピングを誘導する）ために用いられ、それによって、野生型転写物及び対応するタンパク質機能を十分に回復させることになる。以下の変異が選択されている：
−  ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ。この変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン６と７の間に１６２ｎｔの偽エクソンの挿入をもたらす。
−  ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ。この変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン７と８の間に１４１ｎｔの偽エクソンの挿入をもたらす。
−  ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ．この変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン７と８の間に５６ｎｔの偽エクソンの挿入をもたらす。
−  ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ．この変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン１３と１４の間に１３４ｎｔの偽エクソンの挿入をもたらす。
−  ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ及びｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ。これらの変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン３０と３１の間に６８ｎｔの偽エクソンの同一の挿入をもたらし、したがって、同一のＡＯＮで処理され得る。
−  ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ。これらの変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン３０と３１の間に３４５ｎｔの偽エクソンの同一の挿入をもたらし、したがって、同一のＡＯＮで処理され得る。
−  ｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ。この変異は、ＡＢＣＡ４のエクソン３６と３７の間に１８８ｎｔの偽エクソンの挿入をもたらす。
【００２５】
本発明者らは、本明細書の上記で示される変異分類のためにスプライシングをモジュレートするＡＯＮを提供した；「スプライシングをモジュレートする」及び「スプライシングを再指示する」という用語は本明細書において互換的に使用され、本明細書の上記で示される変異に対するＡＯＮに基づくスプライスモジュレーション療法を包含する。
したがって、本発明は：
−  配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  好ましくは、配列番号１６２、１８１、８２、１０２、１２２、１４２若しくは配列番号２６２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１６０、１８０、８０、１００、１２０、１４０若しくは配列番号２６０、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１１若しくは配列番号３１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１２若しくは配列番号３２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１３、１６、１９、１６３、１６６、１６９、３３、３６、３９、４２、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、８３、８６、８９、１０３、１０６、１０９、１２３、１２６、１２９、１４３、１４６、１４９、２６３、２６６及び配列番号２６９、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１４、１７、２０、１６４、１６７、１７０、３４、３７、４０、４３、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、８４、８７、９０、１０４、１０７、１１０、１２４、１２７、１３０、１４４、１４７、１５０、２６４、２６８及び配列番号２７０、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である、
スプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２６】
本明細書では、「配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１及び配列番号２６１、又はその一部」に言及する。本発明の文脈では：
配列番号１１、１２、１３、１４、１６、１７、１９、２０、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６７、１６９及び１７０又はその一部はそれぞれ、配列番号１０及び１６１の好ましい部分であり；
配列番号１８１、１８０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５及び２５８又はその一部はそれぞれ、配列番号３０の好ましい部分であり；
配列番号８２、８０、８３、８６、８９、８４、８７及び９０又はその一部はそれぞれ、配列番号８１の好ましい部分であり；
配列番号１０２、１００、１０３、１０６、１０９、１０４、１０７及び１１０又はその一部はそれぞれ、配列番号１０の好ましい部分であり；
配列番号１２２、１２０、１２３、１２６、１２９、１２４、１２７及び１３０又はその一部はそれぞれ、配列番号１２１の好ましい部分であり；
配列番号１４２、１４０、１４３、１４６、１４９、１４４、１４７及び１５０又はその一部はそれぞれ、配列番号１４１の好ましい部分であり；
配列番号２６２、２６０、２６３、２６６、２６９、２６４、２６７及び２７０又はその一部はそれぞれ、配列番号２６１の好ましい部分である。
【００２７】
エクソンスキッピングという用語は、エクソンスキッピングを有さない成熟ｍＲＮＡにおいて存在する特定のエクソンを含有しない成熟ｍＲＮＡを誘導する、生成する又はその細胞内での生成を増加させるものとして本明細書において定義される。エクソンスキッピングは、例えば、スプライシングの酵素プロセスを可能とするために必要な（潜在性）スプライスドナー若しくは（潜在性）スプライスアクセプター配列などの配列に干渉することができる分子、又は成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンとしてヌクレオチドのストレッチの認識に必要なエクソン包含シグナルに干渉することができる分子に関する、前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞を提供することによって達成され、このような分子は、本明細書ではエクソンスキッピング分子と称される。ｐｒｅ−ｍＲＮＡという用語は、例えば、細胞核において、転写によって細胞のＤＮＡ鋳型から合成される、処理されていない又は部分的に処理された前駆体ｍＲＮＡを指す。
【００２８】
エクソンリテンションという用語は、（異常な）エクソンスキッピングを有さない成熟ｍＲＮＡにおいて存在するはずの特定のエクソンを保持しない成熟ｍＲＮＡを誘導する、生成する又はその細胞内での生成を増加させるものとして本明細書において定義される。エクソンリテンションは、例えば、通常のスプライス部位の上流又は下流の選択的スプライス部位などの配列に干渉することができるＡＯＮ分子に関する、前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞を提供することによって達成される。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＯＮ」という用語は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（異質核内ＲＮＡ）又はｍＲＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド分子を指すと理解される。アンチセンス配列の相補性（又は実質的相補性）の程度は、アンチセンス配列を含む分子が、生理学的状態においてＲＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成することができるようなものであることが好ましい。
【００２９】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「ＡＯＮ」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は本明細書において互換的に使用され、アンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを指すと理解される。ＡＯＮの標的への結合は、欧州特許第１６１９２４９号明細書に記載されたゲル移動度シフトアッセイのような当分野で公知の技法を使用して当業者によって容易に評価され得る。本発明の文脈において使用される「実質的相補性」という用語は、アンチセンス配列におけるいくつかのミスマッチが、機能的である、すなわち、エクソンスキッピング又はエクソンリテンションを誘導する限り許容されることを示す。好ましくは、相補性は、９０％〜１００％である。一般的に、これは、２０ヌクレオチドのＡＯＮにおいて１若しくは２個のミスマッチ、又は４０ヌクレオチドのＡＯＮにおいて１、２、３若しくは４個のミスマッチ、又は６０ヌクレオチドのＡＯＮにおいて１、２、３、４、５若しくは６個のミスマッチなどを許容する。前記ＡＯＮは、患者の網膜細胞へのトランスフェクションによってさらに試験されてもよい。エクソンのスキッピング又はエクソンのリテンションは、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、欧州特許第１６１９２４９号に記載されたものなど）によって評価されてもよい。相補性領域は、好ましくは、組み合わせた場合に、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエクソンに特異的であるように設計される。このような特異性は、系において他の（ｐｒｅ−）ｍＲＮＡ分子の実際の配列に応じて変わるため、種々の長さの相補性領域に関して作出され得る。ＡＯＮが１又は２以上の他のｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることもできるというリスクは、ＡＯＮのサイズの増加に従って減少する。相補性の領域においてミスマッチを含むが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの標的領域にハイブリダイズ及び／又は結合する能力を保持するＡＯＮを本発明において使用することができることは明らかである。しかし、相補性部分にミスマッチのないＡＯＮは、典型的には、１又は２の相補性領域にこのようなミスマッチを有するＡＯＮよりも高い有効性及び高い特異性を有するため、少なくとも相補性部分はこのようなミスマッチを含まないことが好ましい。系のスプライシング機構に干渉するプロセスの有効性を増加させるのに、ハイブリダイゼーション強度がより高いこと（すなわち、対抗する鎖との相互作用数が増加すること）が好ましいと考えられる。
【００３０】
本発明に記載のＡＯＮは、好ましくはＣｐＧのストレッチを含有せず、より好ましくはいかなるＣｐＧも含有しない。オリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧ又はＣｐＧのストレッチの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加と関連する（Dorn, A., and Kippenberger, S. (2008). Clinical application of CpG-, non-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Current opinion in molecular therapeutics 10, 10-20）。この免疫原性の増加は、治療される組織、すなわち、眼の損傷を誘導する場合があるため望ましくない。免疫原性は、ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋細胞並びに／又は炎症性単核球浸潤の存在を評価することによって、動物モデルで評価され得る。免疫原性は、当業者に公知の標準的免疫アッセイを使用して、中和抗体及び／又は前記ＡＯＮを認識する抗体の存在を検出することによって、本発明に記載のＡＯＮで処理した動物又はヒトの血液中で評価されてもよい。炎症反応、Ｉ型様インターフェロン産生、ＩＬ−１２産生及び／又は免疫原性の増加は、標準的免疫アッセイを使用して、中和抗体又は前記ＡＯＮを認識する抗体の存在又は増加量を検出することによって、評価されてもよい。本発明に記載のＡＯＮは、さらにより好ましくは、許容されるＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学特性を有する。ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；基礎的Ｔｍと最も近いモデルを使用する一本鎖ＲＮＡに関するオリゴヌクレオチド特性計算機（www. unc. edu/-cail/biotool/oligo/index）により計算した）、及び／又はＡＯＮ標的エクソン複合体（ＲＮＡ構造バージョン４．５を使用する）の遊離エネルギーによって、少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎる場合、ＡＯＮは特異性が低いと予想される。許容されるＴｍ及び遊離エネルギーは、ＡＯＮの配列に応じて変わる。したがって、これらのパラメーターのそれぞれに対して好ましい範囲を与えることは困難である。許容されるＴｍは、３５〜７０℃の間の範囲であり得、許容される遊離エネルギーは、１５〜４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の範囲であり得る。したがって、当業者は、本明細書で後に定義するように、配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部に結合する及び／又はそれに相補的である有効な治療用化合物として、ＡＯＮを最初に選択することができる。当業者は、本明細書で先に定義したように、前記ＡＯＮが前記配列に結合することができることをチェックすることができる。第２のステップでは、当業者は、ＣｐＧの非存在についてチェックすることによって並びに／又はＡＯＮ標的複合体のＴｍ及び／若しくは遊離エネルギーを最適化することによって、前記ＡＯＮをさらに最適化するために本発明を使用することができる。当業者は、ＡＯＮが相補的であるＡＢＣＡ４の別個の配列（配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１及び配列番号２６１、又はその一部を含む）を選択することによって、わずかなＣｐＧが得られるか、好ましくはＣｐＧが得られないか並びに／又はより許容されるＴｍ及び／若しくは遊離エネルギーが得られる。あるいは、配列番号１０若しくは３０内の所与のストレッチに相補的なＡＯＮが、ＣｐＧを含む、並び��／又は許容されるＴｍ及び／若しくは遊離エネルギーを有さない場合、ＡＯＮの長さを減少させることによって、及び／又はＡＯＮが相補的である配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１のいずれかの中の別個のストレッチを選択することによって、及び／又はＡＯＮの化学を変更することによって、これらのパラメーターのいずれかを改善してもよい。
【００３１】
本発明に記載のＡＯＮは、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定されるスキッピングのパーセンテージが、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％である場合、エクソンスキッピングを誘導すると言われる。
【００３２】
本発明に記載のＡＯＮは、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定されるリテンションのパーセンテージが、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％である場合、エクソンリテンションを誘導すると言われる。
【００３３】
好ましくは、配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部に（実質的に）相補的である部分を含む、本発明に記載のＡＯＮ、又はその一部は、（実質的な）相補性部分が、本発明に記載のＡＯＮの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％又はさらにより好ましくは少なくとも９５％、又はさらにより好ましくは９８％又はさらにより好ましくは少なくとも９９％、又はさらにより好ましくは１００％であるＡＯＮである。好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、配列番号１０又は３０の一部と相補的であるか又は実質的に相補的である配列を含むか又はそれからなる。例として、ＡＯＮは、配列番号１０又は３０の一部と相補的であるか又は実質的に相補的である配列を含み、さらなる隣接配列を含んでもよい。
【００３４】
好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、配列番号１０若しくは配列番号３０、又はその一部からなるヌクレオチド配列が、少なくとも１つのＥＳＥ（エクソンスプライスエンハンサー）モチーフ、好ましくは２、３、４又はそれより多いＥＳＥモチーフを含むＡＯＮである。ＥＳＥモチーフは当業者に公知である。ＥＳＥの特定及び決定は、好ましくは、本明細書の実施例のように実施される。実施形態では、本発明に記載のＡＯＮは、ＥＳＥモチーフを含まない。
【００３５】
好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに（実質的に）相補的である部分が、約８〜約４０ヌクレオチド、例えば、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜約２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有するＡＯＮである。好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに（実質的に）相補的である部分が、８〜４０ヌクレオチド、例えば、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１４〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有するＡＯＮである。好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又はその一部に（実質的に）相補的である部分が、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又はその一部に（実質的に）相補的である前記部分が、最大８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドの長さを有するＡＯＮである。
【００３６】
さらなる配列である（実質的な）相補性部分を使用して、タンパク質、例えば、スプライス促進因子のＡＯＮへの結合を改変するか、又はＡＯＮの熱力学特性を改変する、例えば、標的ＲＮＡ結合親和性を改変してもよい。
【００３７】
本発明に記載のスプライシングを再指示するための好ましいＡＯＮは、約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有する。本発明に記載のスプライシングを再指示するためのより好ましいＡＯＮは、８〜１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１４〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、本発明に記載のＡＯＮは、最大８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチドの長さを有する。
【００３８】
実施形態では、配列番号１５、１８、２１、１６５、１６８、１７１、３５、３８、４１、４４、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、８５、８８、９１、１０５、１０８、１１１、１２５、１２８、１３１、１４５、１４８、１５１、２６５、２６８及び配列番号２７１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。
【００３９】
好ましい実施形態では、配列番号１５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４０】
好ましい実施形態では、配列番号１８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４１】
好ましい実施形態では、配列番号２１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４２】
好ましい実施形態では、配列番号３５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号３５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４３】
好ましい実施形態では、配列番号３８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号３８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４４】
好ましい実施形態では、配列番号４１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号４１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４５】
好ましい実施形態では、配列番号４４からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号４４を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４６】
好ましい実施形態では、配列番号１６５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１６５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４７】
好ましい実施形態では、配列番号１６８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１６８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４８】
好ましい実施形態では、配列番号１７１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１７１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００４９】
好ましい実施形態では、配列番号１８４からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１８４を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５０】
好ましい実施形態では、配列番号１８７からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１８７を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５１】
好ましい実施形態では、配列番号１９０からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１９０を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５２】
好ましい実施形態では、配列番号１９３からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１９３を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５３】
好ましい実施形態では、配列番号１９６からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１９６を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５４】
好ましい実施形態では、配列番号１９９からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１９９を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５５】
好ましい実施形態では、配列番号２０２からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２０２を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５６】
好ましい実施形態では、配列番号２０５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２０５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５７】
好ましい実施形態では、配列番号２０８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２０８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５８】
好ましい実施形態では、配列番号２１１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２１１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００５９】
好ましい実施形態では、配列番号２１４からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２１４を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６０】
好ましい実施形態では、配列番号２１７からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２１７を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６１】
好ましい実施形態では、配列番号２２０からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２２０を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６２】
好ましい実施形態では、配列番号２２３からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２２３を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６３】
好ましい実施形態では、配列番号２２６からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２２６を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６４】
好ましい実施形態では、配列番号２２９からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２２９を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６５】
好ましい実施形態では、配列番号２３２からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２３２を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６６】
好ましい実施形態では、配列番号２３５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２３５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６７】
好ましい実施形態では、配列番号２３８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２３８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６８】
好ましい実施形態では、配列番号２４１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２４１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００６９】
好ましい実施形態では、配列番号２４４からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２４４を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７０】
好ましい実施形態では、配列番号２４７からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２４７を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７１】
好ましい実施形態では、配列番号２５０からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２５０を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７２】
好ましい実施形態では、配列番号２５３からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２５３を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７３】
好ましい実施形態では、配列番号２５６からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２５６を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７４】
好ましい実施形態では、配列番号２５９からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２５９を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７５】
好ましい実施形態では、配列番号８５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号８５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７６】
好ましい実施形態では、配列番号８８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号８８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７７】
好ましい実施形態では、配列番号９１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号９１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７８】
好ましい実施形態では、配列番号１０５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１０５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００７９】
好ましい実施形態では、配列番号１０８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１０８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８０】
好ましい実施形態では、配列番号１１１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１１１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８１】
好ましい実施形態では、配列番号１２５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１２５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８２】
好ましい実施形態では、配列番号１２８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１２８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８３】
好ましい実施形態では、配列番号１３１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１３１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８４】
好ましい実施形態では、配列番号１４５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１４５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８５】
好ましい実施形態では、配列番号１４８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１４８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８６】
好ましい実施形態では、配列番号１５１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号１５１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８７】
好ましい実施形態では、配列番号２６５からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２６５を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８８】
好ましい実施形態では、配列番号２６８からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２６８を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００８９】
好ましい実施形態では、配列番号２７１からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなるＡＯＮが提供される。配列番号２７１を含む好ましいＡＯＮは、好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチドを含むか、又は好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる。
【００９０】
本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、本明細書において以下にさらに詳述するように、１若しくは２以上のＲＮＡ残基（リボヌクレオチド）、又は１若しくは２以上のＤＮＡ残基（デオキシリボヌクレオチド）、及び／又は１若しくは２以上のヌクレオチドアナログ若しくは等価物を含んでもよい。
【００９１】
本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、及び／又は標的配列に対するアンチセンスオリヌクレオチドの親和性を増加させるために修飾される１又は２以上の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、ＡＯＮは、少なくとも１つのヌクレオチドアナログ又は等価物を含み、ヌクレオチドアナログ又は等価物は、修飾塩基、及び／若しくは修飾骨格、及び／若しくは非天然ヌクレオシド間結合、又はこれらの修飾の組合せを有する残基として定義される。
【００９２】
好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ又は等価物は、修飾骨格を含む。このような骨格の例は、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、並びにアミド骨格によって提供される。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、アンチセンス剤として以前に調査された修飾骨格オリヌクレオチドである。
【００９３】
モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が６員環によって置き換えられ、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合によって置き換えられている無電荷骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは酵素分解に耐性であり、ＲＮａｓｅ  Ｈを活性化することによるよりも、翻訳を阻止するか又はｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングに干渉することによってアンチセンス剤として機能するようである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって組織培養細胞に送達させることに成功したが、これらの方法のいくつかを比較する１つの研究により、スクレイプローディング（scrape loading）が送達の最も効率的な方法であることが見出された；しかし、モルホリノ骨格は無電荷であるため、カチオン脂質は、細胞へのモルホリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効なメディエーターではない。最近の報告は、モルホリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を実証し、非イオン骨格により、これらの研究は、モルホリノオリゴヌクレオチドは、マグネシウムの非存在下で三重鎖を形成することができることを示した。
【００９４】
骨格における残基間の結合、例えば、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１若しくは２以上の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合によって形成される結合が、リン原子を含まないことがさらに好ましい。
【００９５】
好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H., and Buchardt, O. (1991). Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254, 1497-1500）。ＰＮＡに基づく分子は、塩基対認識の点でＤＮＡ分子の真の模倣体である。ＰＮＡの骨格は、核酸塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に結合した、ペプチド結合によって結合したＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成される。選択的骨格は、一炭素伸長ピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju, T., and Kumar, V.A. (2005). Backbone-extended pyrrolidine peptide nucleic acids (bepPNA): design, synthesis and DNA/RNA binding studies. Chemical communications, 495-497）。ＰＮＡ分子の骨格は無電荷ホスフェート基を含有するため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、それぞれ、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定である（Egholm, M., Buchardt, O., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S.M., Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K., Norden, B., and Nielsen, P.E. (1993). PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature 365, 566-568）。さらに好ましい骨格は、リボース又はデオキシリボース糖が６員モルホリノ環で置き換えられたモルホリノヌクレオチドアナログ又は等価物を含む。最も好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、リボース又はデオキシリボース糖が６員モルホリノ環で置き換えられ、隣接するモルホリノ環の間の陰イオンホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置き換えられている、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ，phosphorodiamidate morpholino oligomer）を含む。
【００９６】
またさらなる実施形態では、本発明に記載のヌクレオチドアナログ又は等価物は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素のうちの１つの置換を含む。この修飾は、塩基対合をわずかに不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する顕著な耐性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチル及び３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート又はボラノホスフェートを含む。
【００９７】
本発明に記載のさらに好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、−ＯＨ；−Ｆ；１又は２以上のヘテロ原子によって割り込まれていてもよい置換又は無置換の、直鎖状又は分岐状低級（Ｃｌ−Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、又はアラルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；ジメチルアミノオキシエトキシ；及び−ジメチルアミノエトキシエトキシなどの２’、３’及び／又は５’位で一置換又は二置換される１又は２以上の糖部分を含む。糖部分は、ピラノース若しくはその誘導体、又はデオキシピラノース若しくはその誘導体、好ましくはリボース若しくはその誘導体、又はデオキシリボース若しくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化糖部分は２’炭素原子が、糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それによって、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ，Locked Nucleic Acid）を含む。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む（Morita, K., Hasegawa, C., Kaneko, M., Tsutsumi, S., Sone, J., Ishikawa, T., Imanishi, T., and Koizumi, M. (2001). 2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA) with nuclease-resistance and high affinity for RNA. Nucleic acids research Supplement, 241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログ又は等価物をＲＮａｓｅ  Ｈ及びヌクレアーゼ耐性とし、標的ＲＮＡに対する親和性を増加させる。別の実施形態では、本発明に記載のヌクレオチドアナログ又は等価物は、１又は２以上の塩基修飾又は置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン及び当技術分野で公知であるか又は公知となるであろうピリミジン及びプリン塩基の他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成及び天然の塩基を含む。
【００９８】
ＡＯＮのすべての位置が均一に修飾される必要はないことは当業者によって理解される。さらに、１つより多い前述のアナログ又は等価物は、単一のＡＯＮに又はさらにＡＯＮ内の単一の位置において組み込まれてもよい。ある特定の実施形態では、本発明に記載のＡＯＮは、少なくとも２つの異なるタイプのアナログ又は等価物を有する。
【００９９】
したがって、本発明に記載のスプライシングを再指示するための好ましいＡＯＮは、２’−Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、及び／又はハロゲン化誘導体などこれらの修飾の置換誘導体を含む。
【０１００】
本発明に記載の異なるＡＯＮを、効率的な療法のために組み合わせることができることも、当業者によって理解されるであろう。実施形態では、本発明に記載の２つの異なるＡＯＮ、本発明に記載の３つの異なるＡＯＮ、本発明に記載の４つの異なるＡＯＮ、又は本発明に記載の５つのＡＯＮなどの、本発明に記載の少なくとも２つのＡＯＮの組合せを使用する。
【０１０１】
本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、細胞、好ましくは網膜細胞におけるアンチセンスオリヌクレオチドの取り込みを増強する部分に連結され得る。このような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、これらに限定されないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータン及びオリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリシン又はポリリシンなどの正に荷電したアミノ酸を含む細胞貫通ペプチド、抗体によってもたらされるような抗原結合ドメイン、抗体のＦａｂ断片、又はラクダ様単一ドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインである。
【０１０２】
本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、当技術分野で公知の適切な手段を使用して、間接的に投与されてもよい。ＡＯＮは、例えば、いわゆる「ネイキッド」ＡＯＮとして、個体又は前記個体それ自体の細胞、組織若しくは器官に提供されてもよい。ＡＯＮはまた、本発明に記載の前記ＡＯＮの配列を含むＲＮＡ転写物をコードする発現ベクターの形態で投与されてもよい。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達媒体によって、細胞、組織、器官又は個体に導入される。好ましい実施形態では、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮの発現又は転写を駆動する発現カセット又は転写カセットを含むウイルスに基づく発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、スプライシングを再指示するためのアンチセンスオリヌクレオチドの発現を促す条件下に置かれた場合に、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリヌクレオチドを発現するウイルスベクターを提供する。細胞は、プラスミド由来アンチセンスオリゴヌクレオチド発現又はアデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクターによってもたらされるウイルス発現によって、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮに関して提供され得る。発現は、Ｕ７ＲＮＡプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター（Ｐｏｌ  II）又はＵ６ＲＮＡプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼIII（Ｐｏｌ  III）プロモーターによって駆動され得る。好ましい送達媒体は、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、又はレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組換え及び細胞のヒトゲノムにおける組込みのために有用なプラスミドは、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮの送達のために、適切に適用されてもよい。本発明に対して好ましいのは、転写がＰｏｌIIIプロモーターから駆動され、及び／又は転写物がＵ１又はＵ７転写物との融合形態であり、小転写物を送達するのに良好な結果をもたらす、これらのベクターである。適切な転写物を設計するのは、当業者の技術の範囲内である。好ましいのは、ＰｏｌIIIに駆動される転写物、好ましくはＵ１又はＵ７転写物との融合転写物の形態の転写物である。このような融合物を、以前に記載されたように得ることができる（Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schumperli, D., and Kole, R. (1998). Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 4929-4934）。
【０１０３】
本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮに対して好ましい発現系は、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターである。スプライシングの非常に効率的な再指示のためのアンチセンスヌクレオチド配列の発現の延長のために使用することができる短鎖及び二重鎖ＡＡＶに基づくベクターが開発されてきた。好ましいＡＡＶに基づくベクターは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター（Ｐｏｌ  III）又はＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター（Ｐｏｌ  II）によって駆動される発現カセットを含む。好ましいＲＮＡプロモーターは、例えば、Ｐｏｌ  III  Ｕ６  ＲＮＡプロモーター、又はＰｏｌ  II  Ｕ７  ＲＮＡプロモーターである。
【０１０４】
したがって、本発明は、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮの発現のためのＰｏｌ  II又はＰｏｌ  IIIプロモーターに駆動される発現カセットを含む、ウイルスに基づくベクターを提供する。
【０１０５】
本発明に記載のＡＡＶベクターは組換えＡＡＶベクターであり、本明細書の他の箇所で示したＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェルにカプシド形成された、本発明に記載のスプライシングを再指示するためにコードされたＡＯＮを含むＡＡＶゲノムの一部を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、アデノ随伴ウイルス血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などに由来する逆位末端配列（ＩＴＲ）を含有してもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質シェルは、ＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９などに由来してもよい。タンパク質シェルはまた、カプシドタンパク質シェルと称される場合もある。ＡＡＶベクターは、１つ又は好ましくはすべての野生型ＡＡＶ遺伝子を欠失していてもよいが、機能的ＩＴＲ核酸配列を依然として含んでもよい。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー及びパッケージングのために必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であってもよく、又は野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、又は１００％の配列同一性を有してもよく、又はそれらが機能的なままである限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、変異、欠失若しくは置換によって変更されてもよい。この文脈において、機能性は、ゲノムのカプシドシェルへのパッケージングを指示し、次いで、感染する宿主細胞又は標的細胞における発現を可能とする能力を指す。本発明の文脈では、カプシドタンパク質シェルは、ＡＡＶベクターのゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明に記載のＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含むカプシドタンパク質シェル、すなわち、正二十面体カプシドから構成されてもよく、一方、ＡＡＶ５ベクターに含有されるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む、上述のＡＡＶ血清型のいずれかのものであってよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、一方、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質シェルを含み、それによって、いずれかが、本発明に記載の任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲをカプシド形成してもよい。
【０１０６】
好ましくは、本発明に記載の組換えＡＡＶベクターは、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲがＡＡＶ血清型２、５、８、又はＡＡＶ血清型９に由来する、ＡＡＶ血清型２、５、８又はＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質シェルを含み、このようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、又はＡＡＶ９／９ベクターと称される。
【０１０７】
より好ましくは、本発明に記載の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲはＡＡＶ血清型５に由来する；このようなベクターはＡＡＶ２／５ベクターと称される。
【０１０８】
より好ましくは、本発明に記載の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲはＡＡＶ血清型８に由来する；このようなベクターはＡＡＶ２／８ベクターと称される。
【０１０９】
より好ましくは、本発明に記載の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲはＡＡＶ血清型９に由来する；このようなベクターはＡＡＶ２／９ベクターと称される。
【０１１０】
より好ましくは、本発明に記載の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来する；このようなベクターはＡＡＶ２／２ベクターと称される。
【０１１１】
選択された核酸配列によって表される本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮをコードする核酸分子、例えば、コード配列に作動可能に連結した発現調節エレメントと３’末端配列を含む発現コンストラクトは、好ましくは、上記で特定したＡＡＶゲノム又はＩＴＲ配列間に挿入される。「ＡＡＶヘルパー機能」は、一般的に、ＡＡＶの複製及びトランスでＡＡＶベクターに供給されるパッケージングに必要な対応するＡＡＶ機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターで欠落しているＡＡＶ機能を補完するが、ＡＡＶ  ＩＴＲ（ＡＡＶベクターのゲノムによって与えられる）を欠く。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域とｃａｐコード領域又はそれらの機能的に実質的に同一な配列を含む。Ｒｅｐ及びＣａｐ領域は当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる（Chiorini, J.A., Kim, F., Yang, L., and Kotin, R.M. (1999). Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5. Journal of virology 73, 1309-1319）又は米国特許第５，１３９，９４１号明細書を参照のこと。ＡＡＶヘルパー機能は、プラスミドであってもよい、ＡＡＶヘルパーコンストラクトに供給され得る。ヘルパーコンストラクトの宿主細胞への導入は、本明細書で特定したＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入前又はそれと同時に、例えば、形質転換、トランスフェクション、又は形質導入によって起こり得る。したがって、本発明に記載のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェルに対する血清型と、他方で前記ＡＡＶベクターの複製及びパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに対する血清型の所望の組合せを生じるように選択することができる。
【０１１２】
「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製及びパッケージングに必要なさらなる機能を提供する。適切なＡＡＶヘルパーウイルスとして、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型及び２型など）及びワクチンウイルスが挙げられる。ヘルパーウイルスによってもたらされるさらなる機能は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されているように、ベクターによって宿主細胞に導入することができる。
【０１１３】
好ましくは、本発明に記載の組換えＡＡＶベクターに存在するようなＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）又はｃａｐ（カプシド）遺伝子のような、ウイルスタンパク質をコードするいかなるヌクレオチド配列も含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子、又は当技術分野で公知の化学的、酵素的若しくは他の方法で検出可能及び／若しくは選択可能な生成物（例えば、ｌａｃＺ，ａｐｈなど）をコードする遺伝子などの、マーカー又はレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。
【０１１４】
好ましくは、本発明に記載のＡＡＶベクターは、参照により本明細書に組み込まれる（Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563）に記載の方法に従って構築及び生成される。
【０１１５】
本発明に記載の好ましいＡＡＶベクターは、
−  配列番号１０、１６１、３０、８１、１０１、１２１、１４１若しくは配列番号２６１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  好ましくは、配列番号１６２、１８１、８２、１０２、１２２、１４２若しくは配列番号２６２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１６０、１８０、８０、１００、１２０、１４０若しくは配列番号２６０、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１１若しくは配列番号３１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１２若しくは配列番号３２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１３、１６、１９、１６３、１６６、１６９、３３、３６、３９、４２、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、８３、８６、８９、１０３、１０６、１０９、１２３、１２６、１２９、１４３、１４６、１４９、２６３、２６６及び配列番号２６９、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１４、１７、２０、１６４、１６７、１７０、３４、３７、４０、４３、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、８４、８７、９０、１０４、１０７、１１０、１２４、１２７、１３０、１４４、１４７、１５０、２６４、２６８及び配列番号２７０、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である
配列を含むか、又は好ましくはそれからなるＡＯＮである、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを発現するＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９又はＡＡＶ２／２ベクターである。
【０１１６】
本発明に記載のさらに好ましいＡＡＶベクターは、配列番号１５、１８、２１、１６５、１６８、１７１、３５、３８、４１、４４、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、８５、８８、９１、１０５、１０８、１１１、１２５、１２８、１３１、１４５、１４８、１５１、２６５、２６８及び配列番号２７１からなる群から選択される配列を含むか、又は好ましくはそれからなる、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを発現している、本発明に記載のエクソンスキッピング分子又はエクソン１２リテンション分子を発現するＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９又はＡＡＶ２／２ベクターである。
【０１１７】
本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを有する個体又は前記個体の細胞、組織、器官を提供するための手段の改善は、これまでに既に達成された進展を考慮することが期待される。このような将来の改善は、当然のことながら、本発明に記載の方法を使用してｍＲＮＡの再構築に関して言及された効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、「ネイキッド」ＡＯＮとして、個体、前記個体の細胞、組織又は器官に、それ自体送達され得る。本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを投与する場合、分子は、送達方法と適合する溶液中に溶解されることが好ましい。網膜細胞は、水溶液中にプラスミドを提供することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドによりを提供され得る。
【０１１８】
あるいは、スプライシングを再指示するためのＡＯＮ又はこのようなＡＯＮの発現のためのプラスミドに対する好ましい送達方法は、ウイルスベクターであるか又はナノ粒子である。好ましくは、ウイルスベクター又はナノ粒子は、網膜又は他の関連細胞に送達される。網膜細胞又は他の関連細胞へのこのような送達は、インビボ、インビトロ又はエクスビボであってもよい；例えば、参照により本明細書に組み込まれる（Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563）を参照のこと。
【０１１９】
あるいは、プラスミドは、公知のトランスフェクション剤を使用するトランスフェクションによって提供され得る。静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内及び／又は脳質内投与のために、溶液は生理食塩水であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書で定義した構成要素のそれぞれの、細胞、好ましくは網膜細胞への及び／又は細胞中、好ましくは網膜細胞中への送達を補助する賦形剤又はトランスフェクション剤の使用である。好ましいのは、細胞膜を通ってベシクル又はリポソーム中で複合体形成したか又は捕捉された、本明細書で定義した各構成要素を送達する、複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクル及び／又はリポソームを形成することができる賦形剤又はトランスフェクション剤である。これらの賦形剤の多くは当技術分野で公知である。適切な賦形剤又はトランスフェクション剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，polyethylenimine；ExGen500 （MBI Fermentas社））、LipofectAMINE（商標）2000 （Invitrogen社）若しくはその誘導体、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ，polyethylenimine copolymer）及び誘導体を含む同様のカチオンポリマー、合成アンフィフィル（SAINT-18）、lipofectin（商標）、DOTAP及び／又は本明細書で定義した各構成要素を細胞、好ましくは網膜細胞に送達することができる粒子中に自己アセンブリーすることができるウイルスカプシドタンパク質を含む。このような賦形剤は、網膜細胞を含む多種多様な培養細胞に、ＡＯＮなどのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション能力を、全細胞生存に関して、予想される低から中程度の毒性と組み合わせる。構造的修飾の容易さを使用して、さらなる修飾並びにさらなる（インビボでの）核酸移入特徴及び毒性の分析を可能とすることができる。
【０１２０】
リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション剤の一例を表す。リポフェクチンは、２つの脂質成分、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（硫酸メチル塩であるＤＯＴＡＰと比較せよ）及び中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性成分は、細胞内放出を媒介する。別の群の送達系は、ポリマーナノ粒子である。
【０１２１】
ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知であるジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランなどのポリカチオンを、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、本明細書で定義した各構成要素、好ましくは本発明に記載のＡＯＮを細胞膜を通って細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化することができる。
【０１２２】
これらの一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドであるプロタミンは、オリゴヌクレオチドをコロイドと共に製剤化する別の手法をもたらす。このコロイド状ナノ粒子系は、いわゆるプロティクル（proticles）を形成することができるが、これは、パッケージングのための単純な自己アセンブリープロセスによって調製することができ、オリゴヌクレオチドの細胞内放出を媒介する。当業者であれば、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防、治療又は遅延のためにエクソンスキッピング分子を送達するために、本発明において使用するためのエクソンスキッピング分子をパッケージング及び送達するために、上記の又は他の市販の代替的賦形剤及び送達系のいずれかを選択し適合させることができる。「ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防、治療又は遅延」は、本明細書において、好ましくは、ＡＢＣＡ４遺伝子の遺伝的欠損によって引き起こされる部分的又は完全な視力障害又は盲目を予防する、止める、その進行を停止する、又は回復させるものと定義される。
【０１２３】
さらに、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、細胞、細胞質及び／又はその核への取り込みを促進するよう特異的に設計された標的リガンドに、共有結合により又は非共有結合により連結され得る。このようなリガンドは、（ｉ）細胞内取り込みを促進する細胞、組織若しくは器官特異的要素を認識する化合物（これらに限定されないが、ペプチド（様）構造を含む）並びに／又は（ii）細胞内への取り込み及び／若しくはベシクル、例えば、エンドソーム若しくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含むことができる。
【０１２４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮは、少なくとも１つの賦形剤及び／若しくは送達のための標的リガンド及び／若しくは細胞へのその送達デバイスと共に提供され、並びに／又はその細胞内送達を促進する、組成物又は医薬品又は組成物中で製剤化される。
【０１２５】
組成物が本明細書で後に定義される補助化合物などのさらなる構成要素を含む場合、組成物の各構成要素は、１つの単純な組合せ又は組成物又は調製物中で適切に製剤化することができないことが理解されるべきである。その同一性及び特異的特徴に応じて、当業者は、どのタイプの製剤が本明細書で定義する各構成要素に対して最も適当であるかを知ることとなる。好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ及び本明細書で後に定義するさらなる補助化合物を含むキットのパーツの形態である組成物又は調製物を提供する。
【０１２６】
必要な場合及び／又は所望の場合、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ又は本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを発現する、本発明に記載のベクター、好ましくはウイルスベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって、薬学的に活性な混合物に投入することができる。
【０１２７】
したがって、本発明はまた、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、又は本発明に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは医薬組成物も提供する。このような組成物は、本発明に記載のスプライシングを再指示するための単一のＡＯＮ又は本発明に記載のウイルスベクターを含んでもよいが、本発明に記載のスプライシングを再指示するための複数の別個のＡＯＮ又は本発明に記載のウイルスベクターを含んでもよい。このような医薬組成物は、担体、充填剤、保存剤、アジュバント、可溶化剤及び／又は希釈剤を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。このような薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、アジュバント、可溶化剤及び／又は希釈剤は、例えば、Remington, 2000に見出すことができる。前記組成物の各特徴は、本明細書で先に定義した。
【０１２８】
好ましい投与経路は、水溶液又は眼内投与用に特異的に適合した製剤の硝子体内注射によるものである。欧州特許第２４２５  ８１４号明細書は、ペプチド又は核酸薬物の眼内（硝子体内）投与に特に適合した水中油型エマルションを開示する。このエマルションは、硝子体液よりも密度が低く、そのため、エマルションは硝子体の上部に浮き、注射した薬物が視覚を損なうのを回避する。
【０１２９】
本発明に記載のスプライシングを再指示するための複数の別個のＡＯＮが使用される場合、本明細書で定義される濃度又は用量は、使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの総濃度若しくは用量、又は使用されるか若しくは添加される各エクソンスキッピング分子の濃度若しくは用量を指す場合がある。したがって、実施形態では、使用される本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮの各量又は総量が、片眼当たり０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される組成物が提供される。適切な硝子体内用量が提供され、片眼当たり０．０５ｍｇ〜５ｍｇの間、好ましくは０．１〜１ｍｇ、例えば、片眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ｍｇを含む。
【０１３０】
本発明に記載のスプライシングを再指示するための好ましいＡＯＮは、個体のＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療用である。本発明のすべての実施形態では、「治療」という用語は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防及び／又は遅延を含むものと理解される。本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを使用して治療される可能性のある個体は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を有すると既に診断されていてもよい。あるいは、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮを使用して治療することができる個体は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を有すると未だ診断されていなくてもよいが、個体の遺伝的背景があれば、将来、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を発症するリスクの増加を有する個体であってもよい。好ましい個体はヒトである。本発明のすべての実施形態では、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態は、好ましくはスターガルト病である。
【０１３１】
したがって、本発明は、医薬品として、好ましくはＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療のための医薬品として使用するための、及びＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防、治療又は遅延のための医薬品として使用するための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、又は本発明に記載のウイルスベクター、又は本発明に記載の（医薬）組成物をさらに提供する。本明細書のすべての医学的使用の実施形態の各特徴は、本明細書で先に定義されており、好ましくは本明細書で先に定義された特徴である。
【０１３２】
本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療方法であって、前記個体の細胞を、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、本発明に記載のベクター又は本発明に記載の（医薬）組成物と接触させることを含む、方法をさらに提供する。本明細書のすべての医学的使用の実施形態の各特徴は、本明細書で先に定義されており、好ましくは本明細書で先に定義された特徴である。
【０１３３】
本発明は、医薬品の調製のための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、本発明に記載のベクター又は本発明に記載の（医薬）組成物の使用をさらに提供する。本明細書のすべての医学的使用の実施形態の各特徴は、本明細書で先に定義されており、好ましくは本明細書で先に定義された特徴である。
【０１３４】
本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための医薬品の調製のための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、本発明に記載のベクター又は本発明に記載の（医薬）組成物の使用をさらに提供する。本明細書のすべての医学的使用の実施形態の各特徴は、本明細書で先に定義されており、好ましくは本明細書で先に定義された特徴である。
【０１３５】
本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、本発明に記載のベクター又は本発明に記載の（医薬）組成物の使用をさらに提供する。本明細書のすべての医学的使用の実施形態の各特徴は、本明細書で先に定義されており、好ましくは本明細書で先に定義された特徴である。
【０１３６】
本発明に記載の使用又は方法における治療は、好ましくは少なくとも１回であり、好ましくは少なくとも１週間、１カ月、数カ月、１年、２、３、４、５、６年又はより長く、例えば一生続く。本発明に記載のスプライシングを再指示するための各ＡＯＮ又は本発明に記載の使用のために本明細書で定義されるその等価物は、ＡＢＣＡ４関連疾患若しくは状態に既に罹患したか又はＡＢＣＡ４関連疾患若しくは状態を発症するリスクを有する個体の細胞、組織及び／又は器官にインビボで直接投与するのに適していてもよく、インビボ、エクスビボ又はインビトロで直接投与されてもよい。本発明に記載のＡＯＮ、組成物、化合物又は補助化合物の投与頻度は、例えば、疾患の重症度、患者の年齢、患者の変異、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮの数（すなわち、用量）、本発明に記載のＡＯＮ、組成物、化合物又は補助化合物の製剤、投与経路などのいくつかのパラメーターに依存し得る。投与頻度は、毎日、毎週、２週間、又は３週間又は４週間又は５週間又はより長い期間に少なくとも１回の間で変化してもよい。
【０１３７】
本発明に記載のＡＯＮ、組成物、化合物又は補助化合物の用量範囲は、好ましくは、厳格なプロトコール要件が存在する臨床試験（インビボでの使用）の漸増用量研究に基づき設計される。本発明に記載のＡＯＮは、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である用量で使用することができる。適切な硝子体内用量は、片眼当たり０．０５ｍｇ〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇ、例えば、片眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ｍｇとなる。
【０１３８】
好ましい実施形態では、０．１ｎＭ〜１μＭの範囲の、本明細書で定義したオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、網膜細胞又は網膜組織などの細胞モデルにおけるインビトロでの使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、１〜４００ｎＭ、さらにより好ましくは１０〜２００ｎＭ、さらにより好ましくは５０〜１００ｎＭの範囲である。複数の別個のＡＯＮが使用される場合、この濃度又は用量は、ＡＯＮの総濃度若しくは総用量又は添加される各ＡＯＮの濃度若しくは用量を指してもよい。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本発明に記載の分子のための送達媒体として、本明細書で先に記載したウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターは、注射当たり１×１０９〜１×１０１７個のウイルス粒子、より好ましくは注射当たり１×１０１０〜１×１０１２個のウイルス粒子の範囲の用量で投与される。
【０１４０】
上記で示したＡＯＮの濃度又は用量の範囲は、インビボ、インビトロ又はエクスビボでの使用に対して好ましい濃度又は用量である。当業者は、使用されるＡＯＮ、治療される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される培地並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件に応じて、使用されるＡＯＮの濃度又は用量はさらに変化し、さらに最適化される必要がある場合があることを理解する。
【０１４１】
本発明に記載の使用のための、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、又は本発明に記載のウイルスベクター、又は本発明に記載の組成物は、ＡＢＣＡ４関連疾患若しくは状態に既に罹患したか又はＡＢＣＡ４関連疾患若しくは状態を発症するリスクを有する個体の細胞、組織及び／又は器官にインビボで投与されてもよく、インビボ、エクスビボ又はインビトロで投与されてもよい。本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、又は本発明に記載のウイルスベクター、又は本発明に記載の組成物は、ＡＢＣＡ４関連疾患若しくは状態に既に罹患したか又はＡＢＣＡ４関連疾患若しくは状態を発症するリスクを有する個体の細胞、組織及び／又は器官にインビボで直接的又は間接的に投与されてもよく、インビボ、エクスビボ又はインビトロで直接的又は間接的に投与されてもよい。スターガルト病は網膜細胞に顕著な表現型を有するため、前記標的細胞が網膜細胞であることが好ましく、前記組織は網膜であることがさらに好ましく、前記器官が眼を含むか又は眼からなることがさらに好ましい。
【０１４２】
本発明は、細胞内でＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートするための方法であって、細胞、好ましくは網膜細胞を、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、又は本発明に記載のウイルスベクター、又は本発明に記載の（医薬）組成物と接触させることを含む、方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは本明細書で先に定義したものである。細胞を、本発明に記載のスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、又は本発明に記載のウイルスベクター、又は本発明に記載の組成物と接触させることは、当業者に公知の任意の方法によって実施され得る。本明細書で先に記載したスプライシングを再指示するためのＡＯＮ、ウイルスベクター及び組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させることは、直接的又は間接的であってもよく、インビボ、エクスビボ又はインビトロにおいてであってもよい。
【０１４３】
別段指定されていなければ、本明細書に記載したそれぞれの実施形態は、本明細書に記載した別の実施形態と組み合わせてもよい。
【０１４４】
定義
この文書において及びその特許請求の範囲において、動詞「含む（to comprise）」及びその活用形は、この単語の後の項目は含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味する非限定的意味において使用される。さらに、不定冠詞「１つの（a）」又は「１つの（an）」による要素への言及は、１つ及び１つだけの要素が存在すると文脈が明確に要求していなければ、１つより多い要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「１つの（a）」又は「１つの（an）」は、通常、「少なくとも１つの（at least one）」を意味する。
【０１４５】
単語「約（about）」又は「およそ（approximately）」は、数値と関連して使用する場合（例えば、約１０）、好ましくは、値がその値（１０）より５％多い又は５％少ない所与の値であってもよいことを意味する。
【０１４６】
本明細書に提供される配列情報は、誤って特定した塩基の包含を要求するために狭く解釈されるべきではない。当業者は、このように誤って特定された塩基を特定することができ、このようなエラーを修正する方法を知っている。配列エラーの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する配列番号１に存在する遺伝子の発現によって得ることができるポリペプチドの配列は優勢であるべきである。
【０１４７】
本明細書において引用されるすべての特許及び参照文献は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
本発明の実施形態
１．
−  配列番号１０若しくは配列番号３０、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  好ましくは、配列番号１１若しくは配列番号３１、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１２若しくは配列番号３２、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３９及び配列番号４２、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的であり；
−  より好ましくは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０及び配列番号４３、並びにその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である、スプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２.
配列番号１０若しくは配列番号３０、又はその一部からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的であるか又は実質的に相補的である部分が、約８〜約４０ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜約２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１に記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３.
約８〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１６〜約２４ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４．
配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１及び配列番号４４からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる、先行する実施形態のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５.
少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６.
少なくとも１つのＥＳＥ（エクソンスプライスエンハンサー）モチーフを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７.
２’−Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、及び／又はこれらの修飾物の置換誘導体、例えば、ハロゲン化誘導体を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８.
エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を促す条件下に置いた場合に、先行する実施形態のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベクター。
９.
実施形態１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施形態７に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
１０.
硝子体内投与用であり、片眼当たりのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計が０．０５ｍｇ〜５ｍｇの範囲の量で投与される、実施形態９に記載の医薬組成物。
１１.
硝子体内投与用であり、片眼当たりのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計が０．１〜１ｍｇの範囲の量、例えば、片眼当たりのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの合計が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ｍｇで投与される、実施形態１０に記載の医薬組成物。
１２.
医薬品として使用するための、実施形態１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態８に記載のベクター又は実施形態９〜１１のいずれかに記載の組成物。
１３.
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療において使用するための、実施形態１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態９に記載のベクター又は実施形態９〜１１のいずれかに記載の組成物。
１４.
医薬品の調製のための、実施形態１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態８に記載のベクター又は実施形態９〜１１のいずれかに記載の組成物の使用。
１５.
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための医薬品の調製のための、実施形態１〜６のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７に記載のベクター又は実施形態８〜１０のいずれかに記載の組成物の使用。
１６.
ＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を治療するための、実施形態１〜７のいずれかに記載のスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７に記載のベクター又は実施形態９〜１１のいずれかに記載の組成物の使用。
１７.
細胞内でＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートするための方法であって、前記細胞を、実施形態１〜７のいずれかで定義したスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７に記載のベクター又は実施形態９〜１１のいずれかに記載の組成物と接触させることを含む、方法。
１８.
それを必要とする個体のＡＢＣＡ４のスプライシングをモジュレートすることを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の治療のための方法であって、前記個体の細胞を、実施形態１〜７のいずれかで定義したスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７に記載のベクター又は実施形態９〜１１のいずれかに記載の組成物と接触させることを含む、方法。
１９.
ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態がスターガルト病である、実施形態１２若しくは１３に記載の使用するためのスプライシングを再指示するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態１５若しくは１６に記載の使用又は実施形態１８に記載の方法。
［実施例］
【０１４９】
最初に、本発明者らは、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞における、ＡＢＣＡ４のｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ及びｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異によるスプライス欠損を再指示するＡＯＮ数のインビトロでの有効性を評価した。このために、本発明者らは、ミニ遺伝子コンストラクト、すなわち、通常は、変異の有無にかかわらず所望の領域であり、各サイドで野生型ＡＢＣＡ４配列の少なくとも５００ｂｐまで隣接した、ＡＢＣＡ４遺伝子の一部の配列を保有するプラスミドを使用した。プラスミドはまた、ＡＢＣＡ４配列の各サイドに、それぞれ、ＲＨＯ遺伝子のエクソン３及び５のエクソン配列とイントロン−エクソン境界とを含有する。このように、対応するエクソン又は偽エクソンのスプライシングに関するＡＢＣＡ４バリアントの作用は容易に測定することができる。後に、本発明者らは、ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ、ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ、ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ及びｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔを含む、発見された他のディープイントロンバリアントの性質を評価するために、より長いコンストラクト（作出されたミディ遺伝子）を使用した。これらのミディ遺伝子の生成は、（Sangermano R, Khan M, Cornelis SS, Richelle V, Albert S, Elmelik D, Garanto A, Qamar R, Lugtenberg D, van den Born LI, Collin RWJ, Cremers FPM. Genome Res (2018), epub ahead of print, doi: 10.1101/gr.226621.117）に記載される。最終的に、ミニ遺伝子アッセイに加えて、本発明者らはまた、スプライス欠損をレスキューするＡＯＮの能力を評価するために、他の対立遺伝子上に、複合ヘテロ接合性ＡＢＣＡ４変異、すなわち、ｃ．４８９２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ１６３１Ｐｒｏ）と一緒にｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異を有する患者由来の光受容器前駆細胞（ＰＰＣ）を使用した。ＰＰＣはまた、ｃ．３０２＋６８Ｃ＞Ｔ及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ（Ｍ２）を含有する複合対立遺伝子と、他の対立遺伝子上に欠失ｃ．６１４８−６９８＿６６７０ｄｅｌｉｎｓTGTGCACCTCCCTAGを有する患者由来のスプライス欠損をレスキューするＡＯＮの能力を評価するために使用された（Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y）。最初に、材料及び方法の項目において、実験の詳細を記載し、一方、結果は、さらに以下の結果の項目において記載及び例証する。
【０１５０】
材料及び方法
Ａ）変異：ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ及びｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ  −  ミニ遺伝子
各変異に対するミニ遺伝子の生成
イントロン２９の部分、完全なエクソン３０、イントロン３０及びエクソン３１、並びにイントロン３１の部分を含むミニ遺伝子を作出した。このゲノム領域をGateway Systemを使用してpCI-Neo-Rhodopsinベクターにクローニングした。得られたベクター（作出したpCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31野生型、配列番号５０）を使用して、部位特異的変異誘発によってｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ及びｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ変異を導入した（新たなベクターを作出したpCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+1100G、配列番号５１及びpCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+1106T、配列番号５２）。コントロール及び変異ベクターをSanger配列決定によって確認した。次いで、ミニ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に回収し、スプライシング欠損を検出するためにＲＴ−ＰＣＲに供した。
【０１５１】
ＡＯＮの設計及び試験
ミニ遺伝子を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＮＡ分析は、偽エクソンの挿入からなるｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング欠損を示した。この偽エクソンの配列を使用して、いくつかのＡＯＮを設計した。次に、ミニ遺伝子を用いて、ＡＯＮをＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。ＡＯＮの有効性を確認するために、細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ＡＯＮのそれぞれの有効性を、同一量のミニ遺伝子と種々の濃度のＡＯＮを送達し、その後、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施することによって評価した。
【０１５２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、NucleoSpin RNA Clean-upキット（カタログ番号７４０９５５−５０；Macherey-Nagel、Duren、Germany）を使用して、製造業者のプロトコールに従って単離した。ＲＮＡを定量し、ｃＤＮＡを、iScript cDNA合成キット（カタログ番号１７０８８９１；Bio-Rad、Hercules、CA）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、１μｇのＲＮＡから合成した。最後に、ＡＯＮの有効性を、エクソン３０からエクソン３１までのＰＣＲ又はエクソン２９〜３４にわたるＰＣＲを実施することによって評価した。
【０１５３】
Ｂ）変異：ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ  −  ミニ遺伝子
ミニ遺伝子の生成
イントロン２９の部分、完全なエクソン３０、イントロン３０及びエクソン３１、並びにイントロン３１の部分を含むミニ遺伝子を作出した。このゲノム領域をGateway Systemを使用してpCI-Neo-Rhodopsinベクターにクローニングした。得られたベクター（作出したpCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31野生型、配列番号５０）を使用して、部位特異的変異誘発によってｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異を導入した（新たなベクターを作出したpCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001A、配列番号５３）。コントロールと変異ベクターの両方をSanger配列決定によって確認した。次いで、ミニ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に回収し、スプライシング欠損を検出するためにＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
【０１５４】
ＡＯＮの設計及び試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるミニ遺伝子pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001Aのトランスフェクションは、偽エクソンの挿入を示した。この偽エクソンの配列を使用して、いくつかのＡＯＮを設計した。ＡＯＮをミニ遺伝子と一緒にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達した。トランスフェクト細胞をＲＮＡ分析に供した。
【０１５５】
ＲＮＡ分析
全ＲＮＡを、NucleoSpin RNA Clean-upキット（カタログ番号７４０９５５−５０；Macherey-Nagel、Duren、Germany）を使用して、製造業者のプロトコールに従って単離した。ＲＮＡを定量し、ｃＤＮＡを、iScript cDNA合成キット（カタログ番号１７０８８９１；Bio-Rad、Hercules、CA）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、１μｇのＲＮＡから合成した。最後に、ＡＯＮの有効性を、エクソン３０からエクソン３１までのＰＣＲ又はエクソン２９〜３４にわたるＰＣＲを実施することによって評価した。
【０１５６】
Ｃ）変異：ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ  −  ＰＰＣ評価
光受容器前駆細胞（ＰＰＣ）の生成
ヘテロ接合性方式でｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ（Ｍ１）を有する患者及びヘテロ接合性状態でｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ（Ｍ２）を有する患者の皮膚生検を得て、線維芽細胞株を生成した。次に、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を以前に記載されたように（Sangermano, R., Bax, N.M., Bauwens, M., van den Born, L.I., De Baere, E., Garanto, A., Collin, R.W., Goercharn-Ramlal, A.S., den Engelsman-van Dijk, A.H., Rohrschneider, K., et al. (2016). Photoreceptor Progenitor mRNA Analysis Reveals Exon Skipping Resulting from the ABCA4 c.5461-10T-->C Mutation in Stargardt Disease. Ophthalmology 123, 1375-1385）再プログラミングし、（Sangermano, R., Bax, N.M., Bauwens, M., van den Born, L.I., De Baere, E., Garanto, A., Collin, R.W., Goercharn-Ramlal, A.S., den Engelsman-van Dijk, A.H., Rohrschneider, K., et al. (2016). Photoreceptor Progenitor mRNA Analysis Reveals Exon Skipping Resulting from the ABCA4 c.5461-10T-->C Mutation in Stargardt Disease. Ophthalmology 123, 1375-1385）又は（Flamier, A., Barabino, A. & Bernier, G. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors. Bio-protocol 6, e1870 (2016), doi:10.21769/BioProtoc.1870）から適合させた方法を使用して、光受容器前駆細胞（ＰＰＣ）に分化させた。分化した細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
【０１５７】
ＡＢＣＡ４転写物の分析
３０日の分化後、コントロールと患者由来のＰＰＣを回収した。逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、ＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン２（フォワード）及びエクソン５（リバース）又はエクソン３０（フォワード）及びエクソン３１（リバース）に配置したプライマーを使用して実施した。アクチン（ＡＣＴＢ）プライマーをコントロールとして使用した。プライマーの配列は、配列番号５４〜７７で表される。全反応混合物（５０μｌ）は、１０μＭの各プライマー対、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１Ｕ／μｌ（カタログ番号１１６４７６７９００１、Roche社、Basel、Switzerland）、ＭｇＣｌ２を含まない１０×ＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのｄＮＴＰ、及び５０ｎｇのｃＤＮＡを含有した。ＰＣＲ条件は、第１の変性ステップが９４℃で５分間、それに続いて、３５サイクルの融解（９４℃で３０秒）、アニーリング（５８℃で３０秒）、及び伸長（７２℃で１分）ステップと、７２℃で５分間の最終延長ステップであった。ＰＣＲ産物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、得られたバンドを切り出し、NucleoSpin(R)Gel & PCR cleanupキット（カタログ番号７４０６０９．２５０、Macherey-Nagel社）を用い、製造業者のプロトコールに従って精製した。最後に、１００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、3100 DNA Analyzer又は3730 DNA Analyzer （Thermo Fisher Scientific社）において、Sanger配列決定によって分析した。
【０１５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の設計
両サイドに隣接するＰＥプラス５０塩基対の配列を以前に記載したように（Aartsma-Rus, A. Overview on AON design. Methods Mol. Biol. 867, 117-129 (2012), doi:10.1007/978-1-61779-767-5_8）分析した。簡潔には、所望の領域の全ＲＮＡ構造を、部分的にオープン及びクローズド領域を特定するために、mfoldソフトウェア（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form、２０１７年７月２３日に最終アクセス）を用いて分析した。スプライスエンハンサーモチーフをESE finder 3.0（http://krainer01.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home、２０１７年７月２３日に最終アクセス）を使用して決定した。このようなモチーフの存在とＡＯＮの有効性の間に正の相関関係が存在することが実証されたため（Aartsma-Rus, A. Overview on AON design. Methods Mol. Biol. 867, 117-129 (2012), doi:10.1007/978-1-61779-767-5_8）、ＳＣ３５領域に特定の注意を払った。最初に、この分析によって、４つのＡＯＮ、すなわち、最も高いスコアのＳＣ３５モチーフと重複する２つ（ＡＯＮ２及びＡＯＮ３）、ＰＥの５’末端の１つ（ＡＯＮ４）及びｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異と重複する１つ（ＡＯＮ１）の設計が導かれた。後の段階で、２２個のさらなるＡＯＮが設計され、ＡＯＮの有効性と偽エクソンに対するそれらの位置の間の相関関係、ある特定のＥＳＥモチーフとのそれらの重複、及びそれらの特異性（すなわち、単一のヌクレオチドのミスマッチがその有効性を消失させるかどうか）を見出した。最終のＡＯＮ配列もまた、分子単独の遊離エネルギー、二量体を形成する可能性、及び所望の領域との相互作用に関して評価した。このために、ＲＮＡ二次構造とバイフォールド予測ツールを用いる、ＲＮＡ二次構造ツール（http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb、２０１７年７月２３日に最終アクセス）を使用した。本発明者らは、すべてのＡＯＮが、それら自身に−４を超える遊離エネルギー値、二量体として−１４を超える遊離エネルギー値及びＡＯＮ領域の結合に対して２１〜２８の間の遊離エネルギー値を有することを保証した。これは、所望の領域の推定エネルギーから領域に結合したＡＯＮのエネルギーを引いたものを使用して計算した。すべてのＡＯＮ配列は１９ヌクレオチド長を有し、４６℃を超えるＴｍと４０％〜６５％の間のＧＣ含量を有した。ＡＯＮの配列及び特性を表１に列挙する；偽エクソン３０〜３１（３４５）に対するＡＯＮのさらなる特性を表２に列挙する。ＡＯＮは、ホスホロチオエート骨格と２−Ｏ−メチル糖修飾２ＯＭｅ／ＰＳを各ヌクレオチドに付加することによって化学的に修飾され、Eurogentec（Liege、Belgium）から購入した。ＡＯＮを、ＰＢＳ  １×（２回オートクレーブした）中に溶解し、最終濃度を１００μＭとした。２つのセンスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ−１［配列番号２８０］及びＳＯＮ−２［配列番号２８１］）をネガティブコントロールとして使用されるよう同じ化学でオーダーした。
【０１５９】
ＡＯＮによる処理
分化後、ネイキッドＡＯＮを培養培地と直接混合することによって、ＰＰＣをＡＯＮ（０．５及び１μＭ）で処理した。２４時間後、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、カタログ番号Ｃ４８５９、Sigma Aldrich社）を最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌで添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。ＡＯＮ送達の４８時間後、細胞を回収し、ＰＢＳ中ですすぎ、ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成を、上述したように、１μｇのＲＮＡを使用して実施した。すべての反応物は、３０μｌの蒸留水を添加することによって、２０ｎｇ／μｌまで希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析として、８０ｎｇのｃＤＮＡをすべてのＡＢＣＡ４反応に対して使用し、一方４０ｎｇのｃＤＮＡをＡＣＴＢ分析に対して使用した。全反応混合物（２５μｌ）は、１０μＭの各プライマー対、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ／μｌ（カタログ番号１１６４７６７９００１、Roche社）、１ｍＭのＭｇＣｌ２を補充したＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液、２μＭのｄＮＴＰ、及び８０又は４０ｎｇのｃＤＮＡを含有した。エクソン３０〜３１までのＡＢＣＡ４断片に対するＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で２分間、３５サイクルの９４℃で３０秒、５８℃で３０秒及び７２℃で９０秒と、それに続いて、７２℃で２分間の最終ステップ。アクチン増幅として、延長時間を３０秒とした以外は同じ条件下でＰＣＲを実施した。ＡＢＣＡ４  ＰＣＲ産物の全体積と１０μｌのアクチンアンプリコンを２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで分解した。得られたバンドをSanger配列決定を使用して分析した。正しくスプライスされたバリアントと異常にスプライスされたバリアントの間の比率を、Fijiソフトウェア（Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. & Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9, 676-682 (2012), doi:10.1038/nmeth.2019）を使用して評価した。
【０１６０】
Ｄ）変異：ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ、ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ、ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ及びｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ  −  ミディ遺伝子
各変異に対するミディ遺伝子の生成
ミディ遺伝子を各変異に対して作出した（Sangermano R, Khan M, Cornelis SS, Richelle V, Albert S, Elmelik D, Garanto A, Qamar R, Lugtenberg D, van den Born LI, Collin RWJ, Cremers FPM. Genome Res (2018), epub ahead of print, doi: 10.1101/gr.226621.117）。これらのミディ遺伝子は、対応する変異の各サイドにＡＢＣＡ４ゲノムＤＮＡのかなりの断片を含み、１又は２以上の隣接エクソンを包含することも多い。このゲノム領域を、Gateway Systemを使用して、pCI-Neo-Rhodopsinベクターにクローニングした。得られたベクター（pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン６−イントロン７野生型（配列番号２９０）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン６−イントロン１１野生型（配列番号２９２）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン１１−イントロン１５野生型（配列番号２９５）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン２９−イントロン３２野生型（配列番号２９７）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン３１−イントロン３７野生型（配列番号３００））を使用して、ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ、ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ、ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ及びｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ変異を、部位特異的変異誘発によって対応するベクターに導入した（新たなベクターを作出したpCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン６−イントロン７  c.769-784T（配列番号２９１）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン６−イントロン１１  c.859-540G（配列番号２９３）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン６−イントロン１１  c.859-506C（配列番号２９４）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン１１−イントロン１５  c.1937+435G（配列番号２９６）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン２９−イントロン３２  c.4539+1100G（配列番号２９８）、pCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン２９−イントロン３２  c.4539+1106T（配列番号２９９）及びpCI-Neo-Rho-ABCA4−イントロン３１−イントロン３７  c.5197-557T（配列番号３０１））。コントロール及び変異ベクターは、Sanger配列決定によって確認した。次いで、ミディ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に回収し、スプライシング欠損を検出するためにＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
【０１６１】
ＡＯＮの設計及び試験
ミディ遺伝子を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＮＡ分析は、偽エクソンの挿入からなるｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング欠損を示した。この偽エクソンの配列を使用して、いくつかのＡＯＮを設計した。次に、ミディ遺伝子を用いて、ＡＯＮをＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。ＡＯＮの有効性を確認するために、細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ＡＯＮのそれぞれの有効性を、同一量のミニ遺伝子と種々の濃度のＡＯＮを送達し、その後、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施することによって評価した。各実験では、１つのＳＯＮをネガティブコントロールとして含んだ。最終チェックの間、本発明者らは、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ変異に対して設計されたＡＯＮ１が正しくオーダーされず、代わりに、ｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ変異に対するＡＯＮ３の配列が侵入し提供されたことを発見した。このことは、結果の解釈にも影響を及ぼす。
【０１６２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、NucleoSpin RNA Clean-upキット（カタログ番号７４０９５５−５０；Macherey-Nagel、Duren、Germany）を使用して、製造業者のプロトコールに従って単離した。ＲＮＡを定量し、ｃＤＮＡを、iScript cDNA合成キット（カタログ番号１７０８８９１；Bio-Rad、Hercules、CA）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、１μｇのＲＮＡから合成した。最後に、ＡＯＮの有効性を、対応するＡＢＣＡ４プライマーを使用するＰＣＲを実施することによって評価した（配列番号３０２、Rhodopsin ex3 fw；配列番号３０３、ABCA4 ex7 rev；配列番号３０４、ABCA4 ex7 fw；配列番号３０５、ABCA4 ex8 rev；配列番号３０６、ABCA4 ex13 fw；配列番号３０７、ABCA4 ex14 rev；配列番号３０８、ABCA4 ex30 fw；配列番号３０９、ABCA4 ex32 rev；配列番号３１０、ABCA4 ex32 tw；配列番号３１１、ABCA4 ex37 rev）。
【０１６３】
結果
Ａ）
ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ又はｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ変異を保有するミニ遺伝子コンストラクトを、野生型ＡＢＣＡ４配列を有するコンストラクトと一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。図１に示すように、いくつかの残存する野生型転写物も検出されたが、両変異は８６ｂｐの偽エクソンの転写物への挿入をもたらした（ＮＴとマークしたレーン）。３つの異なるＡＯＮのトランスフェクションは、両変異に対して、偽エクソンの挿入が、ＡＯＮ１（ＡＯＮ−１  偽エクソン３０〜３１（６８）、配列番号１５）及びＡＯＮ２（ＡＯＮ−２  偽エクソン３０〜３１（６８）、配列番号１８）の存在下で完全に消失し、一方、ＡＯＮ３（ＡＯＮ−３  偽エクソン３０〜３１（６８）、配列番号２１）は、スプライシング事象の部分的再指示をもたらしたことを示した（図１）。これらのデータは、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ又はｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ変異による異常なスプライシング事象を再指示するＡＯＮの能力を実証する。
【０１６４】
Ｂ）
ｃ．４５３９＋２００１Ａ＞Ｇ変異（Ａ）を保有するミニ遺伝子コンストラクトを、野生型ＡＢＣＡ４配列（Ｇ）を有するコンストラクトと一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異を保有するミニ遺伝子コンストラクトを、野生型ＡＢＣＡ４配列を有するコンストラクトと一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、これらの細胞に由来するＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析により、細胞が異常な転写物のナンセンス変異依存性の分解を阻害するために通常使用される薬剤であるシクロヘキシミドの存在下で（＋ＣＨＸ）培養された場合のみを除いて、イントロン３０における３４５ｂｐの配列に対応する偽エクソンが包含されることが明らかとなった。図３に示すように、４つのＡＯＮはすべて（ＡＯＮ１＝ＡＯＮ−１  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号３５、ＡＯＮ２＝ＡＯＮ−２  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号３８、ＡＯＮ３＝ＡＯＮ−３  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号４１、ＡＯＮ４＝ＡＯＮ−４  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号４４）、ＳＯＮと異なり、ＡＢＣＡ４スプライシングを完全に再指示した。ＷＴコンストラクト（左レーン）を使用して、予想された通り、正常な、偽エクソンを有さないインタクト生成物のみが検出された。ここで、ＡＯＮは、ＡＯＮ−ｎ及びＡＯＮｎ（式中、ｎは整数である）と互換的に示され、ＡＯＮは、「−」を用いて又は「−」を用いないで示されてもよい。
【０１６５】
Ｃ）
ＡＢＣＡ４のｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ（Ｍ１）変異をヘテロ接合的に有する患者に由来する光受容器前駆細胞において、これらの細胞に由来するＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析により、細胞が異常な転写物のナンセンス変異依存性の分解を阻害するために通常使用される薬剤であるシクロヘキシミドの存在下で（＋ＣＨＸ）培養された場合のみを除いて、イントロン３０における３４５ｂｐの配列に対応する偽エクソンが包含されることが明らかとなった。図２に例証するように、この偽エクソンを標的とする４つの異なるＡＯＮ（ＡＯＮ１＝ＡＯＮ−１  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号３５、ＡＯＮ２＝ＡＯＮ−２  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号３８、ＡＯＮ３＝ＡＯＮ−３  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号４１、ＡＯＮ４＝ＡＯＮ−４  偽エクソン３０〜３１（３４５）、配列番号４４）のトランスフェクションの際に、ＡＯＮ１及びＡＯＮ４の投与後、偽エクソンの挿入は完全に消滅した。これは、ＡＯＮ１の相補的配列を有するネガティブコントロールオリゴＳＯＮ（配列番号４５）に関する場合ではなく、ＡＯＮ１及びＡＯＮ４が、ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異によって引き起こされる異常なスプライシング事象を有効かつ特異的に再指示することを実証した。
【０１６６】
バリアントｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ（Ｍ１）及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ（Ｍ２）がＡＢＣＡ４のｐｒｅ−ｍＲＮＡの異常なスプライシングをもたらすかどうかを決定するために、２名の血縁ではないスターガルト病（ＳＴＧＤ１）患者から線維芽細胞株を生成した。Ｍ１を有するＳＴＧＤ１患者は、トランスにミスセンスバリアントｃ．４８９２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ１６３１Ｐｒｏ）を有した（Webster, A. R., Heon, E., Lotery, A. J., Vandenburgh, K., Casavant, T. L., Oh, K. T., Beck, G., Fishman, G. A., Lam, B. L., Levin, A., Heckenlively, J. R., Jacobson, S. G., Weleber, R. G., Sheffield, V. C. & Stone, E. M. An analysis of allelic variation in the ABCA4 gene. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 42, 1179-1189 (2001)）。Ｍ２を有するＳＴＧＤ１患者は、シスにディープイントロンバリアントｃ．３０２＋６８Ｃ＞Ｔを有し、一方、他方の対立遺伝子に欠失ｃ．６１４８−６９８＿６６７０ｄｅｌｉｎｓTGTGCACCTCCCTAG（ｐ．？）が存在した。さらに、健康なコントロール由来の線維芽細胞株を生成した。すべての細胞を、タンパク質切断変異を有するＲＮＡ生成物のナンセンス変異依存分解を抑制するために使用される化合物であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の非存在下及び存在下で培養した。エクソン３０及び３１に位置するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析により、エクソン３０及び３１を包含する所期生成物に対応する１つだけの清澄な生成物が明らかとなった（図４）。異常にスプライスされた生成物は、ＳＴＧＤ１患者由来の線維芽細胞において検出されなかった。
【０１６７】
２つのディープイントロンＡＢＣＡ４変異によって引き起こされる潜在的に網膜特異的なスプライシング欠損を調査するために、コントロール及び患者の線維芽細胞をYamanaka因子のレンチウイルスによる形質導入により（Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006), doi:10.1016/j.cell.2006.07.024）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラミングした。定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）（図７）及び免疫蛍光分析（図示せず）により、ｉＰＳＣの多能性が確認された。次に、これらのｉＰＳＣを、１カ月間、光受容器前駆細胞（ＰＰＣ）に分化させた。ＳＴＧＤ１に主に影響を及ぼす細胞は錐体光受容器細胞であるため、本発明者らは、Flamierとその共同研究者により以前に記載されたプロトコールを使用して（Flamier, A., Barabino, A. & Bernier, G. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors. Bio-protocol 6, e1870 (2016), doi:10.21769/BioProtoc.1870）、比較的均質な錐体細胞集団を得た。コントロール及び患者由来のＰＰＣの特徴付けによって、コントロールのｉＰＳＣよりコントロールＰＰＣにおいて約４０倍高いＡＢＣＡ４の発現の顕著な増加が明らかとなったが、Ｍ１−ｉＰＳＣ及びＭ２−ｉＰＳＣと比較してＭ１−ＰＰＣ及びＭ２−ＰＰＣでは約３倍しか高くなかった。ＰＰＣのさらなる特徴付けにより、コントロールのＰＰＣは、Ｍ１−ＰＰＣ及びＭ２−ＰＰＣと比較して多量のＣＲＸ及びＯＰＮ１ＳＷを発現したが、３つの細胞株のすべてがＳ錐体へと分化したことが明らかになった（図７Ｂ）。
【０１６８】
ＡＢＣＡ４がＰＰＣにおいて強く発現したため、本発明者らは、ＣＨＸ処理の際にＭ１由来ＰＰＣ及びＭ２由来ＰＰＣの両方において異常な転写物を示したが、コントロールのＰＰＣでは示さなかった、エクソン３０からエクソン３１のＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（図４Ａ）。ＣＨＸ処理試料の正しくスプライスされたバリアントと異常にスプライスされたバリアントの間の比率の半定量化により、Ｍ１を有する患者のＡＢＣＡ４転写物の約２５％及びＭ２を有する患者のＡＢＣＡ４転写物の約１５％が異常であった（図４Ｂ）。Sanger配列決定によるすべてのバンドのより詳細な分析により、切断されたタンパク質産物ｐ．Ａｒｇ１５１４Ｌｅｕｆｓ＊３６を生じることが予測される、未熟なストップコドンを含有する３４５ｎｔのＰＥが明らかとなった（図５）。興味深いことに、両バリアントは、ＣＨＸ処理の際のｍＲＮＡ転写物に同一のＰＥを含んだ。一旦配列が特定されると、本発明者らは、スプライシングに関する両バリアントの作用を研究した。すべての予測ソフトウェアによれば、Ｍ１もＭ２もスプライスアクセプター及びドナー部位の強度を変化させなかった（図５）。３４５ｎｔのＰＥのスプライスドナー部位は、Splice-Site-Finder-Like（SSFL）ソフトウェアによってのみ認識される基準のスプライス部位配列として「ＧＣ」を含有する。さらに、シリコでは、Ｍ１がエクソンスプライシングエンハンサーＳＦ２部位の強度を増加させ、新たなＳＲｐ５５モチーフを作出する一方で、Ｍ２が１つのＳＣ３５及び２つのＳＲｐ４０モチーフを作出するという予測が示された（図５）。
【０１６９】
ＲＴ−ＰＣＲによって観察されたすべてのバンドの次のインデプス分析によって、１つのバンドが、正確にスプライスされた転写物をＰＥを含有する転写物と併せたヘテロ二重鎖を含有したことが明らかになった（図４）。さらに、エクソン３０の最後の７３ｂｐを欠く余分な薄いバンドが、コントロールを含む、ＣＨＸで処理されたすべての試料で見られた。比較的弱いスプライスドナー部位（Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆｉｎｄｅｒ（ＨＳＦ）スコア：７５．９）が、ヘテロ二重鎖バンドにおいても検出されたこの選択的転写物について説明する（図４）。このスプライス生成物（ｒ．４４６７＿４５３９ｄｅｌ、ｐ．Ｃｙｓ１４９０Ｇｌｕｆｓ＊１２）はまた、エクソン３０の「天然の」スプライスドナー部位における非標準スプライス部位バリアントの結果として特定された（Sangermano, R., Bax, N.M., Bauwens, M., van den Born, L.I., De Baere, E., Garanto, A., Collin, R.W., Goercharn-Ramlal, A.S., den Engelsman-van Dijk, A.H., Rohrschneider, K., et al. (2016). Photoreceptor Progenitor mRNA Analysis Reveals Exon Skipping Resulting from the ABCA4 c.5461-10T-->C Mutation in Stargardt Disease. Ophthalmology 123, 1375-1385）。興味深いことに、この新たなドナー部位は、エクソン３０の最初の１１４ｂｐを欠くアイソフォームを作出するスプライスアクセプター部位（ＨＳＦスコア：８９．６）として以前に報告されていた（Gerber, S., Rozet, J. M., van de Pol, T. J., Hoyng, C. B., Munnich, A., Blankenagel, A., Kaplan, J. & Cremers, F. P. M. Complete exon-intron structure of the retina-specific ATP binding transporter gene (ABCR) allows the identification of novel mutations underlying Stargardt disease. Genomics 48, 139-142 (1998), doi:10.1006/geno.1997.5164）。
【０１７０】
調査されたＭ２を有する７つのＳＴＧＤ１の症例では、ｃ．３０２＋６８Ｃ＞Ｔがシスに見られた（R. Allikmets、未公開データ；Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367；Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y及びZernant et al., 2014）。このバリアントのＳＴＧＤ１病理に対する寄与を研究するために、本発明者らは、ＣＨＸで処理した及び処理していない、コントロールのＰＰＣ、Ｍ１−ＰＰＣ及びＭ２−ＰＰＣ由来の、並びに成人網膜のｍＲＮＡ由来のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを実施した。図８に示すように、エクソン２及び５に位置するＰＣＲプライマーは、すべてのＰＰＣとヒト網膜において、４５９ｎｔの錐体スプライス生成物を、３１７ｎｔより短い断片と共に生じた。Sanger配列決定によるバンドの確認により、３１７ｎｔの断片はエクソン３（サイズ：１４２ｂｐ）を欠如していることが明らかとなった。他のスプライス生成物は観察されず、ｃ．３０２＋６８Ｃ＞Ｔバリアントが潜在性スプライス部位及び／又はエクソンスプライスエンハンサーの活性化を生じないことを示す。
【０１７１】
Ｍ１バリアント及びＭ２バリアントに関連する分子機序が説明されると、本発明者らは、スプライシングモジュレーションに基づいて、ＰＥをスキップするための治療手法を設計することを目的とした。魅力的かつ効率的な方法は、細胞に侵入し、ｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合し、スプライシングパターンを改変することができるＲＮＡ小分子である、ＡＯＮの使用である。その結合親和性を増加させ、ＲＮａｓｅＨ活性化（したがって、転写物分解）を避けるために、本発明者らは、以前に報告されたホスホロチオエートを有する２−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡのＡＯＮ（２ＯＭｅ／ＰＳ）骨格を使用した（Collin, R.W., den Hollander, A.I., van der Velde-Visser, S.D., Bennicelli, J., Bennett, J., and Cremers, F.P. (2012). Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Molecular therapy Nucleic acids 1, e14；Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563；Gerard, X., Perrault, I., Hanein, S., Silva, E., Bigot, K., Defoort-Delhemmes, S., Rio, M., Munnich, A., Scherman, D., Kaplan, J., Kichler, A. & Rozet, J. M. AON-mediated exon skipping restores ciliation in fibroblasts harboring the common Leber congenital amaurosis CEP290 mutation. Mol. Ther. Nucleic Acids 1, e29 (2012), doi:10.1038/mtna.2012.21及びSlijkerman et al.、2016）。全体で、本発明者らは、４つのＡＯＮを設計した：ＰＥの３’末端に位置する最も高いスコアを有するＳＣ３５モチーフをブロックする２つ（ＡＯＮ２、ＡＯＮ３）、ＰＥの５’の２番目に高いスコアのＳＣ３５をブロックする１つ（ＡＯＮ４）、及びＭ１により新たに作出されたＳＲｐ５５モチーフをブロックする１つ（ＡＯＮ１；図６Ａ）。さらに、ＡＯＮ１に相補的であり、他のＡＯＮと同じ化学修飾を含有するがｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合できないセンスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）を同じ領域に設計した。ＡＯＮ及びＳＯＮを、約１カ月分化させたＰＰＣに送達し、４８時間後に、ＲＮＡを分析した。期待したように、ＣＨＸ処理は、未処理細胞における異常にスプライスした転写物の存在を増加させた（図６Ｂ及び６Ｃ）。さらに、未処理細胞とＳＯＮで処理した細胞の間に差は存在しなかった。本発明者らは、ＡＯＮがエクソンスキッピングにおいて効率的であることを実証した。本発明者らは、ＡＯＮ４が、２つの異なる濃度の両細胞株において、最大約７５％のＰＥスキッピングを効率的に生じることができ（図６Ｄ）、一方、ＡＯＮ１はＭ１細胞株において非常に効率的であったことを見出した。ＡＯＮ２は可変的な有効性を示したが、一方、ＡＯＮ３は、０．５μＭと１μＭの両方でスプライシングを再指示することができた（図６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ）。同じ領域を標的とするにもかかわらず、このように異なる挙動を示すＡＯＮ２とＡＯＮ３に対する１つの説明は、ＡＯＮの特性であろう（表１、表２）。ＡＯＮ２と比較してＡＯＮ３は、安定性及び結合能に影響を及ぼし得る低いＧＣ含量とＴｍを有し、したがって、その効率が低いことが説明される。
【０１７２】
ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異によって引き起こされるスプライス欠損を再指示するのに最も有効なＡＯＮに対する本発明者らの調査をさらに拡大するために、本発明者らは、２２個のさらなるＡＯＮ（ＡＯＮ５〜ＡＯＮ２６、それぞれ、配列番号１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３及び２５６）を設計して試験し、３４５ｎｔの偽エクソンの包含を妨げることによってＡＢＣＡ４のスプライシングを再指示する能力を評価した。以前に試験したＡＯＮ１〜４（それぞれ、配列番号３５／１８４、３８／１８７、４１／１９０及び４４／１９３）を２つのセンスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ１［配列番号２８０］及びＳＯＮ２［配列番号２８１］）と一緒に扱った。結果を図９に示す。ＡＯＮ１と４の他に、他の有効なＡＯＮは、ＡＯＮ９、ＡＯＮ１０、ＡＯＮ１４、ＡＯＮ１７、ＡＯＮ１８、ＡＯＮ２２、ＡＯＮ２３及びＡＯＮ２４を含んだ。中程度に有効なＡＯＮは、ＡＯＮ２、ＡＯＮ８、ＡＯＮ１１、ＡＯＮ１３、ＡＯＮ１６、ＡＯＮ２０及びＡＯＮ２１を含む。ほとんど有効ではないか又は全く有効ではないＡＯＮは、ＡＯＮ３、ＡＯＮ５、ＡＯＮ６、ＡＯＮ７、ＡＯＮ１２、ＡＯＮ１５、ＡＯＮ１９、ＡＯＮ２５及びＡＯＮ２６を含む。これらのＡＯＮの特性を比較する場合、いくつかの事が明らかとなる：
ｉ）偽エクソンの外側の領域を標的とするＡＯＮ（ＡＯＮ５、ＡＯＮ６、ＡＯＮ７、ＡＯＮ２５及びＡＯＮ２６）は、ＡＢＣＡ４スプライシングを再指示することができない。
ii）標的と単一のミスマッチを有するＡＯＮは有効ではない、すなわち、ＡＯＮ１はｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａに対して変異特異的であり、ｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ変異を有する患者のスプライシングを再指示しない（図６Ｄ）。同様に、ＡＯＮ１５は、ｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔ変化を有する偽エクソンに対して変異特異的であり、ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ変異によるスプライシング欠損を修正するのに有効ではない（図９）。
iii）スプライシングを再指示するのに有効なＡＯＮは、ＳＣ３５モチーフを保有する場合が多い（有効と中程度に有効の両方は、有効性に乏しいと有効でないＡＯＮと比較すると、平均して１．８倍及び１．４５倍多いＳＣ３５モチーフを保有する場合が多い）。ＳＦ２モチーフとＳＲｐ４０モチーフでは大きな差は観察されなかった。中程度に有効なＡＯＮでは、本発明者らは、それぞれ、有効と、有効性に乏しい及び有効でないＡＯＮの群と比較した場合、それぞれ４倍と２．６倍豊富なＳＲｐ５５モチーフを検出した。
iv）平均して、スプライシングを再指示するＡＯＮの長さとスプライシングを再指示しなかったＡＯＮの長さに差は存在しなかった。しかし、本発明者らは、融解温度（Ｔｍ）は、中程度に有効な群及び有効性に乏しいＡＯＮと有効でないＡＯＮから構成される群と比較した場合に、有効なＡＯＮでは平均して２〜３度高いことを観察した。
ｖ）また、平均して、有効なＡＯＮと中程度に有効なＡＯＮの両方は、５４％より高いＧＣ含量のパーセンテージを示したが、有効性に乏しいＡＯＮ又は有効でないＡＯＮの平均は４８％未満であった。
vi）本発明者らは、予測されたクローズド領域又はオープン領域のいずれかに結合するＡＯＮに対して、部分的にオープンな領域と部分的にクローズドな領域を有する予測された混合領域に結合するこれらのＡＯＮ間に明確な差を観察しなかった。
【０１７３】
Ｄ）
ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ、ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ、ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ又はｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ変異を保有するミディ遺伝子コンストラクトを、対応する野生型ＡＢＣＡ４配列を有するコンストラクトと一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。図１０に示すように、すべての変異が、可変性の長さを有する偽エクソンの、可変的な程度までの挿入を生じる（ＮＴでマークしたレーン）。３つの異なるＡＯＮのトランスフェクションは、各変異に対する１つの一般的なＳＯＮと同様に、すべての変異に対して、少なくとも１つのＡＯＮが、この変異に関連する偽エクソン挿入をレスキューするのに有効であったことを示した。具体的には、ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔに対して、ＡＯＮ１及びＡＯＮ２の添加が偽エクソンの減少を生じる一方、ＡＯＮ３はスプライス欠損を部分的にレスキューする。ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇに対して、ＡＯＮ１は有効ではなく、ＡＯＮ２が非常に有効であり、一方、ＡＯＮ３はスプライス欠損を部分的にレスキューする。しかし、最終チェックの間、本発明者らは、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ変異に対して設計されたＡＯＮ１が正しくオーダーされず、代わりに、ｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ変異に対するＡＯＮ３の配列が侵入し提供されたことを発見した。このことは、結果の解釈にも影響を及ぼす。したがって、使用された実際のＡＯＮは対応する偽エクソンに対して特異的ではないため、ＡＯＮ１に対して見られた負の結果が予想され、研究するべきではなかった。ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃに対して、ＡＯＮ１及びＡＯＮ３は、偽エクソンを含有する転写物の減少をもたらし、一方、ＡＯＮ２は有効ではない。ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇに対して、３つのＡＯＮすべてが、偽エクソンを保有するＡＢＣＡ４転写物の減少をもたらす。ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ及びｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ変異に対して、ＡＯＮ１及びＡＯＮ２は有効であるようであるが、一方、ＡＯＮ３は明らかに有効ではない。最後に、ｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ変異に対して、３つのＡＯＮすべてが、偽エクソンを有する転写物の減少をもたらす。全体として、これらのデータは、試験されるすべてのディープイントロンＡＢＣＡ４変異による異常なスプライシング事象を再指示するＡＯＮの能力を実証し、各偽エクソンに対して少なくとも１つのＡＯＮが有効である。
【０１７４】
考察
この研究では、本発明者らは、ＡＢＣＡ４における２つの近くにあるディープイントロンバリアント、ｃ．４５３９＋２００１Ｇ＞Ａ及びｃ．４５３９＋２０２８Ｃ＞Ｔが、ＡＢＣＡ４転写物の集団において、３４５ｎｔの偽エクソン（ＰＥ）の網膜特異的包含を生じることを示した。タンパク質の切断（ｐ．Ａｒｇ１５１４Ｌｅｕｆｓ＊３６）を導くことが予想されるこのＰＥは、ヒト網膜黄斑のＲＮＡのディープＲＮＡ配列決定を実施する際に、ＡＢＣＡ４の低含量選択的スプライス形態として見出された（Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367）。ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量により、Ｍ２によるよりもＭ１によるＰＥ挿入が多いことが明らかになった。Ｍ１を有するＳＴＧＤ１患者の眼の表現型、及びこれらの患者においてトランスで観察されるバリアントの性質を基準にして、Ｍ１は、重度のバリアントとして作用することが提案された（Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, B. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716；Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, M. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, C. C., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717；Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367）。対照的に、本発明者ら自身の観察、及びＭ２を有する一部のＳＴＧＤ１患者に利用可能な限定された臨床データ（Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y）に基づき、本発明者らは、Ｍ２が軽度から中程度に重度のバリアントとして作用すると仮定する。したがって、本発明者らは、トランスでミスセンスバリアントを有する、Ｍ１を有する患者における変異ｍＲＮＡの量が、正しい生成物の量に等しいはずであると期待する。より小さい生成物がより有効に増幅し、ＮＭＤ抑制が不完全である場合があるため、これは事実ではないが、この比較は難しい。Ｍ２によるＰＥ挿入は、Ｍ１に対するものよりもあまり顕著ではなく、これは、そのそれ程重度ではない特徴と一致する。しかし、本発明者らは、位置配列決定（Zernant et al, 2014）の間に失われた他のシスで作用するバリアントが、これらのイントロン３０のバリアントと共同して作用する可能性を排除することがで��ない。さらに、両方の患者由来ＰＰＣ株がコントロールのＰＰＣ株より不充分にしか分化しないため、細胞型特異的機序が役割を果たし、分化の遅延の可能性が示される。このことは、ＰＥ挿入の量に著しい影響を有する。ＰＥ認識に対する網膜分化の重要性の明確な例は、ＣＥＰ２９０のディープイントロンｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇバリアントについて記載された。一方、このヘテロ接合的変異を保有する患者のリンパ芽球腫及び線維芽細胞において、正しくスプライスされたＣＥＰ２９０と異常にスプライスされたＣＥＰ２９０の間の比率は約１：１であり（Collin, R.W., den Hollander, A.I., van der Velde-Visser, S.D., Bennicelli, J., Bennett, J., and Cremers, F.P. (2012). Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Molecular therapy Nucleic acids 1, e14；Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563；den Hollander, A. I., Koenekoop, R. K., Yzer, S., Lopez, I., Arends, M. L., Voesenek, K. E., Zonneveld, M. N., Strom, T. M., Meitinger, T., Brunner, H. G., Hoyng, C. B., van den Born, L. I., Rohrschneider, K. & Cremers, F. P. Mutations in the CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am. J. Hum. Genet. 79, 556-561 (2006)）、ｉＰＳＣ由来の光受容器細胞では、異常にスプライスされたＣＥＰ２９０の量は劇的に増加することが見出された（約１：４の比率；Parfitt, D. A., Lane, A., Ramsden, C. M., Carr, A. J., Munro, P. M., Jovanovic, K., Schwarz, N., Kanuga, N., Muthiah, M. N., Hull, S., Gallo, J. M., da Cruz, L., Moore, A. T., Hardcastle, A. J., Coffey, P. J. & Cheetham, M. E. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell stem Cell 18, 769-781 (2016), doi:10.1016/j.stem.2016.03.021）。この研究は、ＣＥＰ２９０の偏在する発現にもかかわらず、この変異が非症候性網膜表現型を生じる理由への洞察を明らかにするだけではなく、関連する細胞系におけるスプライス欠損を研究するために、患者由来のｉＰＳＣ由来網膜細胞を使用する非常に大きい力も実証した。
【０１７５】
以前の遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ，inherited retinal disease）に関連するイントロンバリアントは、ＰＥの挿入を可能にした新たなスプライスアクセプター又はドナー部位を作出した（Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, B. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367；Bonifert, T., Gonzalez Menendez, I., Battke, F., Theurer, Y., Synofzik, M., Schols, L. & Wissinger, B. Antisense oligonucleotide mediated splice correction of a deep intronic mutation in OPA1. Mol. Ther. Nucleic Acids 5, e390 (2016), doi:10.1038/mtna.2016.93；Webb, T. R., Parfitt, D. A., Gardner, J. C., Martinez, A., Bevilacqua, D., Davidson, A. E., Zito, I., Thiselton, D. L., Ressa, J. H., Apergi, M., Schwarz, N., Kanuga, N., Michaelides, M., Cheetham, M. E., Gorin, M. B. & Hardcastle, A. J. Deep intronic mutation in OFD1, identified by targeted genomic next-generation sequencing, causes a severe form of X-linked retinitis pigmentosa (RP23). Hum. Mol. Genet. 21, 3647-3654 (2012), doi:10.1093/hmg/dds194；van den Hurk, J. A., van de Pol, D. J., Wissinger, B., van Driel, M. A., Hoefsloot, L. H., de Wijs, I. J., van den Born, L. I., Heckenlively, J. R., Brunner, H. G., Zrenner, E., Ropers, H. H. & Cremers, F. P. M. Novel types of mutation in the choroideremia ( CHM) gene: a full-length L1 insertion and an intronic mutation activating a cryptic exon. Hum. Genet. 113, 268-275 (2003), doi:10.1007/s00439-003-0970-0；Vache, C., Besnard, T., le Berre, P., Garcia-Garcia, G., Baux, D., Larrieu, L., Abadie, C., Blanchet, C., Bolz, H. J., Millan, J., Hamel, C., Malcolm, S., Claustres, M. & Roux, A. F. Usher syndrome type 2 caused by activation of an USH2A pseudoexon: implications for diagnosis and therapy. Hum. Mutat. 33, 104-108 (2012), doi:10.1002/humu.21634；Rio Frio, T., McGee, T. L., Wade, N. M., Iseli, C., Beckmann, J. S., Berson, E. L. & Rivolta, C. A single-base substitution within an intronic repetitive element causes dominant retinitis pigmentosa with reduced penetrance. Hum. Mutat. 30, 1340-1347 (2009), doi:10.1002/humu.21071；Naruto, T., Okamoto, N., Masuda, K., Endo, T., Hatsukawa, Y., Kohmoto, T. & Imoto, I. Deep intronic GPR143 mutation in a Japanese family with ocular albinism. Sci. Rep. 5, 11334 (2015), doi:10.1038/srep11334；Mayer et al、2016；Liquori et al、2016；den Hollander, A. I., Koenekoop, R. K., Yzer, S., Lopez, I., Arends, M. L., Voesenek, K. E., Zonneveld, M. N., Strom, T. M., Meitinger, T., Brunner, H. G., Hoyng, C. B., van den Born, L. I., Rohrschneider, K. & Cremers, F. P. Mutations in the CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am. J. Hum. Genet. 79, 556-561 (2006)；Carss et al、2017）。本発明者らの知る限り、本発明者らは、この機序によるのではなく、おそらく、ＩＲＤにおける新たなＥＳＥモチーフの作出によるＰＥの挿入に関して報告する最初の者である。イントロン領域は、理論的にＰＥに隣接することができる予測されるスプライスアクセプター及びドナー部位の対で一杯になる。スプライス部位の作出により活性化されないさらなるＰＥの特定に関して、潜在性ＰＥを実在のＰＥにする配列モチーフを決定することが可能となる。
【０１７６】
Ｍ１及びＭ２に関連するＰＥ挿入は、いくつかのＡＯＮによって上手くブロックされた。Ｍ１特異的ＡＯＮはＭ１細胞株においてのみ有効であり、２倍のＡＯＮ濃度でさえも、ＡＯＮ１はＭ２細胞株におけるスプライス欠損を修正することが依然としてできなかった。さらに、ＰＥ配列に対して単一のミスマッチを有するＭ２特異的ＡＯＮは、Ｍ１を有する患者において有効ではなかった。これらの結果は、配列の特異性と、単一のヌクレオチドのミスマッチがＡＯＮの効率を変化させるのに十分であるという事実を強調する。新たに作出したＳＲｐ５５モチーフは、ＰＥの検出において重大な役割を果たし得る。両方のバリアントが同じＰＥを活性化し、ＡＯＮ４が両方の場合にＰＥをスキップすることができるなら、このことはさらに説明されるべきである。ＡＯＮの制限の１つは、これらが特異的配列に結合し、したがって、ヒトの配列の部分が動物のゲノムのオルソロガスな位置に挿入されるモデルが作出されなければ、保存ＤＮＡ／ＲＮＡ領域が存在しない場合、動物モデルにおいて同じＡＯＮを試験することが不可能であることである。しかし、２ＯＭｅ／ＰＳ化学及び２ＭＯＥ（２−Ｏ−メトキシエチル）／ＰＳが、いくつかの動物モデルにおいて示されるように、眼に対して毒性でないことが既に知られている（Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563；Gerard, X., Perrault, I., Munnich, A., Kaplan, J. & Rozet, J. M. Intravitreal injection of splice-switching oligonucleotides to manipulate splicing in retinal cells. Mol. Ther. Nucleic Acids 4, e250 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.24；Murray, S. F., Jazayeri, A., Matthes, M. T., Yasumura, D., Yang, H., Peralta, R., Watt, A., Freier, S., Hung, G., Adamson, P. S., Guo, S., Monia, B. P., LaVail, M. M. & McCaleb, M. L. Allele-specific inhibition of rhodopsin with an antisense oligonucleotide slows photoreceptor cell degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 6362-6375 (2015), doi:10.1167/iovs.15-16400）。さらに、最初に商品化されたＡＯＮを使用して、眼の状態であるＣＭＶ網膜炎を治療した（Fomivirsen approved for CMV retinitis: first antisense drug. AIDS treatment news, 7 (1998)）。したがって、ＡＯＮ技術は、眼の障害を治療する安全で有望な手法であると思われる。動物モデルの欠如により、ＡＢＣＡ４タンパク質の機能がこれらの細胞の処理後に回復され得るかどうかが説明される必要が依然としてあるが、ｉＰＳＣ由来光受容器の使用は適切な選択肢であるようである。
【０１７７】
結論として、Ｓ錐体に分化した患者由来のｉＰＳＣを使用することによって、本発明者らは、ＳＴＧＤ１の根底にある２つの再発する、近くにあるディープイントロンバリアントによる分子の欠損を特定することができた。スプライス欠損は、組織特異的であると思われ、新規スプライス部位の作出によってではなく、おそらく、新たに生じたエクソンスプライスエンハンサーの存在によって引き起こされる、３４５ｎｔのＰＥの挿入からなる。さらに、ＡＯＮに基づく治療手法が設計されて試験され、１つのＡＯＮが両方の変異細胞株においてスプライス欠陥を再指示することができたことを示す。さらに、バリアント特異的ＡＯＮは、Ｍ２に対してではなくＭ１に対して非常有効であり、１つの単一のヌクレオチドのミスマッチがＡＯＮの効率を劇的に変化させることができることを示した。ＡＢＣＡ４におけるいくつかの他のディープイントロン変異（すなわち、ｃ．７６９−７８４Ｃ＞Ｔ、ｃ．８５９−５４０Ｃ＞Ｇ、ｃ．８５９−５０６Ｇ＞Ｃ、ｃ．１９３７＋４３５Ｃ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１００Ａ＞Ｇ、ｃ．４５３９＋１１０６Ｃ＞Ｔ又はｃ．５１９７−５５７Ｇ＞Ｔ）に対して、本発明者らは、すべてが偽エクソンの挿入を生じることを示した。ＡＯＮはこれらの偽エクソンの包含をブロックするよう設計され、各偽エクソンに対して、少なくとも１つのＡＯＮが異常なＡＢＣＡ４転写物の量を有意に減少させることができた。全体として、これらの結果は、スターガルト病の治療ツールとしてのＡＯＮの可能性を強調する。
【０１７８】
（参照文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ１】
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【図７Ａ２】
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【図７Ａ３】
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【図７Ｂ１】
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【図７Ｂ２】
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【図７Ｂ３】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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