(57)【要約】試料における１つまたは複数のタイプの微生物の多様な集団から遺伝物質を抽出する方法が本明細書に開示される。微生物は、原核生物または真核生物であり得、こうした微生物には、細菌、古細菌、真菌、原生動物、蠕虫、寄生虫、ウイルス、及びファージなどが含まれ得る。抽出は、単一の試料から行われるものであり得、その後の同定は、ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、標的シークエンシング、プルダウンシークエンシング、全ショットガンシークエンシング、または他の方法などの分子法によるものであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、解析のための試料を調製するための方法：
ａ）試料を、界面活性剤とキレート剤とを含む第１の溶解溶液と混合すること、
ｂ）リゾチームを含む第２の溶解溶液を、段階ａ）の混合物に添加すること、及び
ｃ）カオトロピック剤を含む第３の溶解溶液を、段階ｂ）の混合物に添加すること。
【請求項２】
前記第１の溶解溶液が、１つもしくは複数の緩衝剤、１つもしくは複数の穏和な界面活性剤、及び／または１つもしくは複数のプロテアーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３の溶解溶液が、ＳＤＳなどの界面活性剤をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の溶解溶液が、約０．１〜１０％ｗ／ｖの使用濃度でＳＤＳを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第３の溶解溶液の前記カオトロピック剤が酢酸リチウムであり、かつ前記混合物が、次に、熱ショック処理に供される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が、前記第３の溶解溶液での処理の後に、前記第３の溶解溶液の前記カオトロピック剤と同一であってもまたは異なっていてもよい第２のカオトロピック剤と、プロテイナーゼＫとを含む第４の溶解溶液で処理される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のカオトロピック剤が、前記第３の溶解溶液の前記カオトロピック剤と同一である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のカオトロピック剤が、前記第３の溶解溶液の前記カオトロピック剤と異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、前記第１の溶解溶液での処理の前に、前記試料中に存在する任意の細菌胞子及び／または真菌胞子の発芽を誘導する前処理段階に供される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記前処理段階が、前記試料を、Ｔｗｅｅｎ−８０などの穏和な界面活性剤と混合することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
物理的溶解を生じさせる機械的処理段階をさらに含む方法であって、該機械的処理段階が、超音波処理、ビーズによる混合、ビーズミルによるホモジナイゼーション、加圧、及び顕微溶液化などを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
そこから抽出された任意の遺伝物質をメタゲノム解析に供することをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、市販のプロバイオティクスまたは栄養補助食品のものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、対象の腸から得られる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
以下を含む、対象のプロバイオティクス治療をモニターする方法：
対象から得られた第１の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することであって、該遺伝物質が、請求項１〜１１のいずれか１項に従って抽出される、前記抽出すること、
前記第１の試料から抽出された前記遺伝物質をメタゲノム解析に供すること、
前記対象をプロバイオティクスで治療すること、及びその後、前記第１の試料からの遺伝物質の前記抽出と同一の様式で、前記対象から得られた第２の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出すること、
前記第２の試料から抽出された前記遺伝物質に対してメタゲノム解析を実施すること、ならびに
前記第１の試料の前記メタゲノム解析の結果と、前記第２の試料の前記メタゲノム解析の結果とを比較すること。
【請求項１６】
前記対象において所望の微生物集団を得るために前記プロバイオティクス治療を修正することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
適切なプロバイオティクス治療を決定するためにメタボロームマーカーを解析することをさらに含む、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
抗生物質、化学療法、薬剤、環境変化、旅行、汚染物消化、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）もしくは腸（ｇｕｔ）の梗塞、ストレス、または他の、微生物集団の崩壊を起こし得る作用がもたらされた後に、プロバイオティクス治療が行われる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
マイクロバイオームの調節によって、個体が健康であると認められたときの以前の微生物集団を該個体が取り戻すようになる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
プロバイオティクス及び／またはプレバイオティクスによるマイクロバイオームの調節によって、データベースで内部的にかまたは公的なデータベースで外部的にかのいずれかで定義される正常な腸へとマイクロバイオームプロファイルが回復するようになる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
正常が、
糞便物質移植において使用されるが、ディスバイオシスを回復させるためのプロバイオティクス／プレバイオティクスとして使用される糞便物質リポジトリ試料
のマイクロバイオームプロファイルと類似であるとして定義される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
メタゲノム解析が、
生物のゲノムデータを有し、そのような生物の同定に有用なデータベース
の使用を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記データベースが、全ゲノムとして処理され得るか、高次元のものに共通しかつ特定のものに特有のさまざまな長さのｋ  ｍｅｒとして処理され得るか、またはゲノムをシークエンシング結果と一致させるためにゲノムのバーコーディングを行う他の手段として処理され得る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
メタゲノム解析が、シークエンシング情報の前処理を含み、該前処理が、重複を除去すること、アダプターシークエンシングを除去すること、ベースコールのクオリティを改善するために５’シークエンシングまたは３’シークエンシングを除去すること、特定のクオリティ（すなわち、Ｑ２０以上）のベースコールのみを含めること、ヒトのリードをフィルタリングすること、ペアリードを作製するまたはそれらを分離すること、及びリードのオーバーラップを制限することから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
メタゲノム解析が、前記データベースへとシークエンシング情報をアライメントすることを含み、
該アライメントは、
該シークエンシング情報を、特定の長さのｋ  ｍｅｒへと断片化し、完全な断片として使用し、スキャフォールドにし、かつ大きな参照ゲノムへとアライメントし得るソフトウェアもしくはシステム
を使用することによって実施されるか、または
同定された生物、同定された生物の相対存在量、ゲノムサイズ、アライメントされた総断片、または株、種、属、科、目、綱、門、界、もしくはドメインにおいてアライメントされた特有の断片に関する報告を作製するための他の方法
を使用することによって実施される、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
マイクロバイオームプロファイルによって、疾患、障害、またはディスバイオシスを示す特定のシグネチャーを同定することが可能になり、ここで、プロバイオティクス及び／または栄養補助食品による治療は、根底にあるプロファイルを改善すべくマイクロバイオームを調節するために適用され得る、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
人口統計情報、表現型情報、または診断情報に基づいて群が作製され、かつプロファイルの該群にバーコードが割り当てられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
個体のマイクロバイオームプロファイルがデータベースにおける既知の群とどのくらい密接に関連するかを決定するために、統計解析が使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
統計解析が、主成分分析及び／または多因子分析を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
人口統計、表現型、診断、疾患、障害、またはプロファイルとの関連付けに使用するために、前記群にバーコードが割り当てられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
追加の化学的検査または遺伝子検査を伴うかまたは伴わずに、腸において検出されたプロバイオティクス生物からプロバイオティクススコアを計算することを含む方法。
【請求項３２】
前記スコアが、個体のマイクロバイオームプロファイル内で評価されるカテゴリーの加重平均を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
マイクロバイオームに対するスコアを計算することを含む方法であって、該スコアは、該マイクロバイオームがディスバイオシス、中立的、または安定的であるかを評価するために使用される、前記方法。
【請求項３４】
前記スコアが、ウイルス、細菌、真菌、古細菌、原生動物、アメーバ、または蠕虫の潜在的に病原性の種の検出に基づいて計算される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
メモリと、該メモリに結合された１つまたは複数のプロセッサとを含むコンピュータシステムであって、該１つまたは複数のプロセッサが、請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法を実施するための演算を実施するように構成される、前記コンピュータシステム。
【請求項３６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するための、自動化プラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１５日出願の米国出願第６２／３９５，３１６号及び２０１６年１０月２５日出願の米国出願第６２／４１２，７８７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく恩典を主張し、これらの文献は、参照によってそれらの内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、ゲノム解析に関し、より具体的には、生体試料における微生物の多様な集団から核酸分子を抽出及び解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
ヒトの体内及び体表には約１００兆個の微生物が生存しており、この数は、体に存在するヒト細胞数である約１０兆個をはるかに凌ぐものである。こうした通常は無害なウイルス、細菌、及び真菌は、片利共生生物または相利共生生物と称される。片利共生生物及び相利共生生物は、多くの点で我々の体の健康維持に役立っている。体内及び体表に生存する微生物は、共生、相利共生、及び病原性のものであり、これらはすべてまとめてマイクロバイオームと称され、それらの平衡及び関連メタボロームは個体の健康状態と密接に結び付いており、逆もまた同様である。
【０００４】
核酸シークエンシングが進んだことで、腸及び皮下組織に生息するマイクロバイオームが迅速かつ正確に同定及び特性解明される状況がつくられている。最適なフローラは、相乗的な様式で宿主免疫系とも相互作用することでその健康利点をさらに伝播させる。個体の関連メタボロームは、質量分析に基づく系によって特性を解明するか、またはゲノミクスに基づくメタボロームモデリング及びフラックスバランス解析を使用して特性を解明し、健康なメタボロームプロファイルの作成に使用することもできる。こうした方法論はすべて、微生物コミュニティーの複雑性の分析に使用することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、生体、環境、栄養補助食品、または他の生態学的微生物異種集団の試料における微生物の多様な集団から核酸分子を抽出する方法と、処理段階を通じた核酸または抽出物の使用と、個体へのプロバイオティクスのカスタマイズを決定するための分析とを対象とする。本発明に特有の処理段階には、ＲＮＡまたはＤＮＡの精製、断片化、分離、または消化と、下流の用途（ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、またはシークエンシングなど）のためのライブラリーまたは核酸の調製と、バイオインフォマティクスによるＱＣ、フィルタリング、アライメント、またはデータ分離のための前処理と、微生物種の分類学的割り当てのためのメタゲノミクスまたはヒトゲノムバイオインフォマティクスパイプラインと、他の生物アライメント、同定、及び変異解釈とが含まれる。
【０００６】
したがって、１つの態様では、本発明は、解析のための試料を調製するための方法を提供する。この方法は、ａ）試料を、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）とキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）とを含む第１の溶解溶液と混合すること、ｂ）リゾチームを含む第２の溶解溶液を、段階ａ）の混合物に添加すること、及びｃ）カオトロピック剤（例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン、及び同様のもの）を含む第３の溶解溶液を、段階ｂ）の混合物に添加することを含む。前処理段階は、物理的溶解を含み得、核酸の収率をさらに最適化するために使用され得る。機械的溶解の例には、超音波処理、ビーズによる混合、及びビーズミルによるホモジナイゼーションが含まれる。
【０００７】
別の態様では、本発明は、対象のプロバイオティクス治療をモニターする方法を提供する。この方法は、
対象から得られた第１の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することであって、当該遺伝物質が、請求項１〜１１のいずれか１項に従って抽出される、前記抽出すること、
第１の試料から抽出された遺伝物質をメタゲノム解析に供すること、
対象をプロバイオティクスで治療すること、及びその後、第１の試料からの遺伝物質の前記抽出と同一の様式で、対象から得られた第２の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出すること、
第２の試料から抽出された遺伝物質に対してメタゲノム解析を実施すること、ならびに
第１の試料のメタゲノム解析の結果と、第２の試料のメタゲノム解析の結果とを比較すること
を含む。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、追加の化学的検査または遺伝子検査を伴うかまたは伴わずに、腸において検出されたプロバイオティクス生物からプロバイオティクススコアを計算することを含む方法を提供する。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、マイクロバイオームに対するスコアを計算することを含む方法を提供し、該スコアは、該マイクロバイオームがディスバイオシス、中立的、または安定的であるかを評価するために使用される。
【００１０】
本発明は、メモリと、メモリに結合された１つまたは複数のプロセッサとを含むコンピュータシステムをさらに提供し、該１つまたは複数のプロセッサは、本発明の方法を実施するための演算を実施するように構成される。
【００１１】
本発明は、本発明の方法を実施するための自動化プラットフォームも提供する。
【００１２】
本発明は、生体、環境、栄養補助食品、または他の生態学的微生物異種集団の試料からの、微生物の多様なフローラに由来する核酸のオールインワンの抽出方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、プロバイオティクス及び環境試料における微生物のそれぞれの核酸を解析することによる、微生物の組成及び相対存在量の決定において使用され得る。ＤＮＡは、精製され、下流の核酸解析（特に、複数の種／亜種のゲノムが同定されるメタゲノム解析）に使用される。
【００１４】
前述の一般的な説明と下記の詳細な説明とは両方共、例示及び説明にすぎず、請求される本発明の追加説明を提供することを意図する。添付の図面はいずれも、本発明の理解促進のために含められており、こうした図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を示すと共に、説明と併せて本発明の原理説明に役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト（高タンパク質食、５０歳超、栄養補助食品使用者）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物を示す模式図である。
【図２Ａ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（細菌）を示す模式図である。
【図２Ｂ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（ウイルス及びファージ）を示す模式図である。
【図２Ｃ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（古細菌）を示す模式図である。
【図２Ｄ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（真菌及び他の真核生物）を示す模式図である。
【図３Ａ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（細菌）を示す模式図である。
【図３Ｂ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（ウイルス及びファージ）を示す模式図である。
【図３Ｃ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（古細菌）を示す模式図である。
【図３Ｄ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（真菌及び他の真核生物）を示す模式図である。
【図４Ａ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン食（非授乳））のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（細菌）を示す模式図である。
【図４Ｂ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン食（非授乳））のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（ウイルス及びファージ）を示す模式図である。
【図４Ｃ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン食（非授乳））のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（古細菌）を示す模式図である。
【図４Ｄ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン食（非授乳））のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物（真菌及び他の真核生物）を示す模式図である。
【図５】ヒトのマイクロバイオームシグネチャーにおける、より低い頻度で存在する生物と、日和見病原体の同定とを示す模式図である。
【図６】ヒトのマイクロバイオームシグネチャーにおいて検出される典型的なプロバイオティクスを示す模式図である。
【図７】ヒトのマイクロバイオームシグネチャーにおいて検出される典型的なプロバイオティクスを示す模式図である。
【図８】個体における相対存在量を正常な集団のデータベース平均値に対して比較したものを示すグラフ図である。
【図９】栄養補助食品混合培地から本発明の方法を介して同定された生物を示す表である。
【図１０】本発明のデータベースに保存されているさまざまな微生物の特有種の分類を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、試料における１つまたは複数のタイプの微生物の多様な集団から核酸分子を抽出するための普遍的方法を提供する。微生物のタイプには、グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子、グラム陰性細菌、古細菌、原生動物、蠕虫、藻類、真菌、真菌胞子、ウイルス、ウイロイド、バクテリオファージ、及びワムシが含まれる。いくつかの実施形態では、多様な集団は、同一のタイプの複数の異なる微生物（例えば、グラム陽性細菌）である。いくつかの実施形態では、多様な集団は、複数の異なるタイプの微生物（例えば、細菌（グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子、及び／またはグラム陰性）、真菌、ウイルス、ならびにバクテリオファージ）である。
【００１７】
異なるタイプの微生物は、それ自体の遺伝物質を保護するために異なる組成及び機構を有するため、あるタイプの微生物から遺伝物質の抽出を行うことについて、同一の生体試料における別のタイプの微生物の遺伝物質も併せて抽出するという能力を損なうことなく行うことは困難であることが多い。しかしながら、本発明によれば、同一の試料における別のタイプの微生物の遺伝物質が抽出されることによって、あるタイプの微生物から得ることができる遺伝物質の量を犠牲にすることなく、試料における異なるタイプの微生物から遺伝物質を抽出することが可能になる。本発明によれば、微生物を含む試料は、生体試料、環境試料、人工的に作製された試料（例えば、実験室の試験試料もしくは対照試料、プロバイオティクス組成物もしくは栄養補助食品の試料など）、または同様のものであり得る。生体試料の例には、組織試料、血液試料、血漿試料、脳脊髄液試料、尿試料、糞便試料、消化管から得られる物質の試料、生体分泌物（例えば、精液、腟分泌物、母乳、涙、唾液など）、及び同様のものが含まれる。固体試料は、液体とされるか、または溶液と混合され得、その後、液体試料、混合物、または混合物から得られる溶液に存在する微生物の遺伝物質が、本発明に従って抽出され得る。抽出された遺伝物質は、追加の処理及び解析（精製、増幅、及びシークエンシングなど）に供され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抽出された遺伝物質は、メタゲノム解析に供され、その結果、例えば、その遺伝物質の抽出元である試料における１つまたは複数のタイプの微生物が同定される。追加の実施形態では、ヒト糞便試料から調製された抽出核酸物質に対して全ゲノムショットガンシークエンシングを実施することができる。調製には、有機溶媒、不純物、塩、フェノール、及び処理の妨げになる他の混入物を除去するための核酸精製反応が含まれる。追加の調製には、それぞれの試料からの核酸ライブラリーの調製が含まれ、この調製では、合成による超並列シークエンシング、ナノポア、ロングリード、及び／またはＣＭＯＳ電子によるシークエンシング法などのシークエンシングプラットフォームでのシークエンシングのための試料を調製するための改変及び／または増幅にｇＤＮＡが供される。
【００１９】
本明細書に開示されるように、本発明の方法によれば、３つの異なる組成物に微生物を特定の順序で供することによって、同一の試料中に存在する１つまたは複数の異なるタイプの微生物から遺伝物質を良好に抽出することが可能になる。本発明による方法は、試料中に存在する任意のグラム陰性細菌を最初に溶解した後、試料中に存在する任意の酵母及び細菌の細胞壁の多糖成分を消化し、その後、第２の段階の後に無傷の任意の細胞壁をカオトロピック剤で破壊することを含む。
【００２０】
簡潔に記載すると、第１の段階は、試料を、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））とキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））とを含む第１の溶解溶液と混合することによって、試料中に存在する任意のグラム陰性細菌を溶解することを含む。第１の溶解溶液は、１つもしくは複数の緩衝剤（例えば、トリス）、１つもしくは複数の穏和な界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、及び／または１つもしくは複数のプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）をさらに含み得る。
【００２１】
第１の段階の後に、混合物中に存在する任意の酵母及び細菌の細胞壁の多糖成分を消化するために、試料は、リゾチームを含む第２の溶解溶液と混合される。リゾチームは、第１の溶解溶液の活性を阻害し得るため、試料と第２の溶解溶液との接触は、試料を第１の溶解溶液で処理した後に行われることが重要である。
【００２２】
第２の溶解溶液での処理の後に、第２の溶解溶液によって消化されなかった任意の細胞壁を破壊するために、カオトロピック剤（例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジンなど）を含む第３の溶解溶液が混合物に添加される。第３の溶解溶液は、ＳＤＳなどの界面活性剤を含み得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第１の溶解溶液と第３の溶解溶液とは両方共、１〜１０％ｗ／ｖの使用濃度でＳＤＳを含む。いくつかの実施形態では、第３の溶解溶液での処理の後に、カオトロピック剤（例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジンなど）とプロテイナーゼＫとを含む第４の溶解溶液で混合物がさらに処理される。第３の溶解溶液のカオトロピック剤が酢酸リチウムであるいくつかの実施形態では、混合物は、次に、熱ショック処理に供された後、第４の溶解溶液で処理され得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、試料が細菌及び／または真菌の胞子を含むか、またはそれを含むと疑われるのであれば、試料は、第１の溶解溶液との接触前に、胞子の細胞壁の発芽を誘導する前処理段階に供され得る。前処理段階は、試料を、穏和な界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０）などの化学物質と混合することによる発芽誘導、または発芽を誘導する条件（例えば、温度）下での試料の培養を含み得る。いくつかの実施形態では、化学物質で発芽が誘導される場合、化学物質は、好ましくは、第１の溶解溶液、第２の溶解溶液、及び第３の溶解溶液の活性または有効性を阻害、低減、または改変しないものである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、超音波処理、ビーズによる混合、ビーズミルによるホモジナイゼーション、加圧、顕微溶液化、及び同様のものを含めて、機械的方法によって物理的溶解を生じさせる１つまたは複数の機械的処理段階をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、機械的処理段階は、試料を第１の溶解溶液に供する前に実施される。
【００２６】
本発明による方法によって、さまざまな微生物から核酸分子を抽出することが可能であり、こうした微生物には、酵母（すなわち、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種）、グラム陰性細菌（例えば、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の種）、グラム陽性細菌（例えば、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の種）、ウイルス（例えば、スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属の種）、胞子（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種）、蠕虫（サナダムシ（エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の種））、原生動物（肉質虫（Ｓａｒｃｏｄｉｎａ）−アメーバ（例えば、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ））、及びファージ（例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のファージ）が含まれる。
【００２７】
下記の例は、例示を意図するが、本発明の限定を意図しない。
【００２８】
抽出方法
無菌の２ミリリットル（ｍＬ）のマイクロ遠心チューブに１０ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲の試料を添加した。４００マイクロリットル（μＬ）の純粋なビーズ混合物を添加し、８０００ｒｐｍで約３０秒間ボルテックスにより攪拌することによってビーズ破砕を任意選択で実施することができる。しかしながら、高分子量核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を得ることが望まれるのであれば、ビーズ破砕は避けることが好ましい。
【００２９】
第１の溶解溶液での処理段階
試料における任意のグラム陰性細菌を溶解するために、約４００μＬの消化緩衝液（１％ｗ／ｖのＳＤＳ、２５ｍＭのトリスＨＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリデント（ｔｒｉｄｅｎｔ）−ｘ１００、ｐＨ８）及び約２０μＬのプロテイナーゼＫを試料に添加することによって試料を第１の溶解溶液に供し、穏やかに混合した。その後、混合物を５５℃で約３０分間インキュベートした。
【００３０】
第２の溶解溶液での処理段階
試料における任意のグラム陽性細菌を溶解するために、グルコシドヒドロラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）（「リゾチーム」）を含む第２の溶解溶液を、第１の溶解溶液での処理段階から得られた混合物に添加し、リゾチームの最終濃度を１ｍｇ／ｍＬとし、ｐＨを約８．０とした。適切なグルコシドヒドロラーゼは、さまざまな動物の卵白、涙、または粘液もしくは唾液を含めて、さまざまな供給源から得ることができる。その後、混合物を３７℃で約１〜２４時間インキュベートした。
【００３１】
第３の溶解溶液での処理段階
試料中に存在する任意の真菌及び／または酵母細胞を溶解するために、蒸留無菌Ｈ２Ｏに酢酸リチウム（１Ｍ）及びＳＤＳ（５％ｗ／ｖ）を含む第３の溶解溶液を添加することで、第２の溶解溶液での処理段階から得られた混合物が約１：５で希釈された溶液を得た。処理した混合物を７０℃で１５分間インキュベートした後、９５℃で１分間熱ショックを与え、その後、２２℃の水浴に置くことによって室温とした。
【００３２】
第２の溶解溶液での処理段階及び第３の溶解溶液での処理段階は、バクテリオファージ及びウイルスの外皮の溶解に十分であるため、試料中に存在し得るバクテリオファージ及びウイルスからの遺伝物質の抽出に追加の段階は必要ではない。
【００３３】
核酸の精製
溶解した微生物から抽出された遺伝物質（すなわち、第１の溶解溶液での処理段階、第２の溶解溶液での処理段階、及び第３の溶解溶液での処理段階に供した後の混合物中に存在する核酸分子）は、次に、２つのマイクロ遠心チューブに混合物を分割添加することによってＤＮＡ精製及びＲＮＡ精製に供した。ＤＮＡは、約２０μＬのＲＮＡｓｅＡを添加し、室温で５分間インキュベートすることによって１つのチューブから抽出した。この混合物を生体高分子組織ホモジナイザーカラムに通した。ビーズ破砕を既に実施したのであれば、この混合物を組織ホモジナイザーカラムに供することは避けることが好ましい。
【００３４】
その後、溶出液を１０００ｇで５分間遠心分離した。約４００μＬのＤＮＡ溶解溶液（グアニジンＨＣｌ、トリス−ＥＤＴＡ、及び７０％のＥｔＯＨ）ならびに約２０μＬのプロテイナーゼＫで上清を処理し、混合した後、５５℃で１０分間インキュベートした。その後、−２２℃のＥｔＯＨを添加し、混合物を反転させることよって混合した。この混合物は、当該技術分野において知られる１つまたは複数の追加のＤＮＡ抽出方法及びＤＮＡ精製方法に供することができる。
【００３５】
ＲＮＡは、混合物を生体高分子組織ホモジナイザーカラムに通すことによって第２のマイクロ遠心チューブから抽出した。ビーズ破砕を既に実施したのであれば、この場合も先の場合と同様に、この混合物を組織ホモジナイザーカラムに供することは避けることが好ましい。その後、溶出液を１０００ｇで５分間遠心分離した。約４０μＬのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ）を含む２５ｍＭのＭｇＣｌ２溶液で上清を処理した後、３７℃で約１５分間インキュベートした。その後、この混合物を酸性チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルムによる抽出に供した。この混合物は、当該技術分野において知られる１つまたは複数の追加のＲＮＡ抽出方法及びＲＮＡ精製方法に供することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の定量的な発現が望まれる場合、ＲＮＡ核酸分子を確実に遊離させ、その分解を確実に制限するために、ＲＮＡ安定化緩衝液及びビーズ破砕を使用することが好ましい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、高分子量の核酸分子の抽出が望まれる場合、ビーズ破砕及び組織ホモジナイゼーションカラムは避けられ、シリカカラムに基づく抽出の代わりに、フェノール−クロロホルム−アルコールによる抽出が実施される。
【００３８】
メタゲノム解析
抽出及び精製した遺伝物質を、Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックスアダプターを使用するシークエンシングに向けて調製し、そのサイズ及び量を調べた。インプット量が５０ｎｇ未満のＤＮＡについてはいずれも、１〜２０サイクルの間で低サイクル数のＰＣＲを実施した。あるいは、５０ｎｇ以上の核酸については、ＰＣＲを使用しないライブラリー調製方法を利用することができる。Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用し、ゲルによる精製を実施した。Ｑｕｂｉｔ（商標）２．０蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、精製ＰＣＲ産物を定量化した。試料を等モル量で合わせた。ライブラリープールは、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）ＣＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｍｅｓ  ＩＡ）を使用してサイズを検証し、Ｑｕｂｉｔ（商標）高感度ｄｓＤＮＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して定量化した。ＰｈｉＸ（商標）Ｖ３ライブラリー対照（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を１％〜１０％となるように添加して希釈した後、プールの変性処理を等体積の０．１ＮのＮａＯＨにおいて５分間実施し、その後、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨＴ１緩衝液においてさらに希釈した。変性したＰｈｉＸ添加プールを、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプライマーと共にＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（商標）シークエンサーにロードし、５０〜５５０塩基のペアエンドリードまたはシングルリードが得られるように設定した。
【００３９】
短いインサートを使用する方法については、１０００以上の範囲のシークエンシングリードをこの方法に使用することができる。長いインサートを使用する方法（Ｐａｃ  Ｂｉｏ（商標）、Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）、または他の次世代遺伝子シークエンシング法など）では、１０００未満のシークエンシングリードを使用することができる。分類の割り当てを行う前に、バイオインフォマティクスによるクオリティフィルタリングを実施した。生のシークエンシングファイルのクオリティトリミングには、シークエンシングアダプターまたはインデックスの除去と、クオリティスコア（Ｑ２０＞）、末端の塩基対、またはシグナル強度に基づくリードの３’末端または５’末端のトリミングと、クオリティスコア、ＧＣ含量、またはアライメントされない塩基対に基づくリードの除去と、設定数の塩基対での重複リードの除去とが含まれ得る。処理されたシークエンシングファイルのアライメントは、ｒｅｆｓｅｑ（商標）、Ｇｒｅｅｎｇｅｅｎｓ（商標）、ＨＭＰ（商標）、ＮＣＢＩ（商標）、ＰＡＴＲＩＣ（商標）、または他の公的／私的なデータリポジトリもしくは社内のデータセットに由来する配列からなるカスタム微生物ゲノムデータベースを使用して実施した。このデータベースは、全ゲノムアライメントスキャフォールド、ｋ  ｍｅｒの断片のアライメント、またはメタゲノミクス及びバイオインフォマティクスの分野において実施される他のスキームとして使用することができる。データベースゲノムと一致するシークエンシングリード／断片の数に基づき、発明者らは、生物に共通または特有の分類学的独自性（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を割り当てている。この識別子は、バーコード、ヌクレオチド配列、または何らかの他の計算的なタグ（分類群内の生物もしくは株とシークエンシングリードが一致することと関連することになる）であり得る。識別子によっては、高次元のものとなり、こうした識別子によって、生物のドメイン、界、門、綱、目、科、または属が同定されることになる。
【００４０】
本発明によって、種内の株の最低次元で生物を同定することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、発明者らのデータベース（図１０）に含まれる１種または複数種の細菌の同定及び／または解析を含む。いくつかの選択的な例は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、アシネトバクター・インディカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の亜種であるインファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の亜種であるブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、及びエンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）の株である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、発明者らのデータベース（図１０）に含まれる１種または複数種の酵母の同定及び／または解析を含む。いくつかの選択的な例は、サッカロマイセス属の種であるブラウディ（Ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、発明者らのデータベース（図１０）に含まれる１種または複数種のファージまたはウイルスの同定及び／または解析を含む。いくつかの選択的な例は、バチルスのファージであるφ２９、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）のファージであるＨＫ０２２、ラクトバチルスのファージであるＡ２、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のファージであるＨＫ６３９、ファージｃｄｔＩ、スクレロティニア・スクレロティオラム・パルティティウイルス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）Ｓのセグメント２、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）のファージであるＢｃｅｐＭｕ、ラクトコッカスのプロファージであるｂＩＬ３１１、エンテロコッカスのファージであるφＦＬ４Ａ、及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のファージであるＳＭ１である。
【００４４】
将来的にデータベースが改善されることで、この方法によって検出することができる生物が増加するまたは洗練されることになる。
【００４５】
プロバイオティクス治療のモニタリング
いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるプロバイオティクス治療をモニターするのに使用され得る。例えば、プロバイオティクスでの治療の前に、対象の消化管から得られる試料が採取され得、そこに存在する微生物の遺伝物質が、本明細書に開示されるように抽出され、メタゲノム解析に供される。その後、所与のプロバイオティクスでの治療の間及び／または後に、対象の消化管から第２の試料が採取され得、第２の試料中に存在する微生物の遺伝物質が、本明細書に開示されるように抽出され、メタゲノム解析に供され、その結果が、第１の試料のメタゲノム解析の結果と比較される。その後、比較結果に基づき、対象の腸において微生物の所望の集団が得られるように、対象のプロバイオティクス治療が修正され得る。例えば、対象の腸においてその量が増加することが望まれる微生物を含むプロバイオティクスが対象に投与され得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、微生物の糞便コミュニティーのメタボロームを決定するために、糞便試料が混合または培養され得る。その後、個体に利益を与えると想定されるプロバイオティクス株を決定するために、メタボロームプロファイルを使用することができる。メタボロームプロファイルの例には、エネルギー代謝、栄養利用、インスリン抵抗性、脂肪症、脂質異常症、炎症、短鎖脂肪酸、有機酸、サイトカイン、神経伝達化学物質、または表現型に影響を与えるものが含まれると共に、他のメタボロームマーカーが含まれ得る。
【００４７】
マイクロバイオームのスクリーニング及びプロバイオティクスの選択
本発明は、さまざまな市販のプロバイオティクスの微生物含量の決定に使用することに成功している。さらに、本発明の方法は、さまざまなプロバイオティクスの微生物含量、及び対象の腸におけるマイクロバイオーム含量の決定に使用される。対象の腸におけるマイクロバイオーム含量及びそれに与えるいずれかの所望の変化に基づいて、対象のマイクロバイオームの健康において増加及び／または維持されることが望まれる微生物を含む１種または複数種のプロバイオティクスが選択され得る。マイクロバイオームが、そのマイクロバイオータ、ならびに細菌、真菌、ウイルス、ファージ、及び寄生虫由来のそこに含まれる生物の全体像を示す場合、例えば、本明細書に記載の方法を使用することで、対象の腸マイクロバイオームは、Ａを２５％含み、Ｂを７５％含むと決定され、プロバイオティクス１は、Ａを７５％含み、Ｂを２５％含むと決定され、プロバイオティクス２は、Ａを２５％含み、Ｂを７５％含むと決定される。対象の腸マイクロバイオームの維持が望まれるのであれば、対象への投与にはプロバイオティクス２が選択されることになる。しかしながら、対象の腸におけるＡの量とＢの量とを５０／５０にすることが望まれるのであれば、プロバイオティクス１とプロバイオティクス２との両方が選択され、対象に投与され得る。あるいは、プロバイオティクス１が選択され、対象の腸におけるＡの量とＢの量とが５０／５０に達するまで対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象に投与するためのプロバイオティクス製剤が特別調製され得、こうしたプロバイオティクス製剤は、例えば、等量、異なる量、または多様な量のＡ及びＢまたは他のプロバイオティクス株を含む。個体の腸に存在する微生物の相対存在量を利用する計算モデルは、プロバイオティクスに含める微生物のタイプ、用量、及び混合物の決定に役立つことになる。例えば、一般的な集団または以前のマイクロバイオーム解析と比較して生物Ａが減少しているか、または存在しないと決定されるのであれば、生物Ａの濃度を増加させると想定されるプロバイオティクスまたはプレバイオティクスを発明者らは提供することになる。このプロバイオティクスまたはプロバイオティクスは、生物Ａそのものであるか、または生物Ａの増殖を支援すると想定される別の生物であり得る。用量は、個体における生物の相対存在量、プレバイオティクス／プロバイオティクスの能力特性（増殖率、適合性、受容体もしくは受容体密度、遺伝子、もしくは発現パターン、またはメタボローム産物など）を考慮して投与されることになる。
【００４８】
特別調製されるプロバイオティクスは、個体の腸／糞便試料から検出される相対存在量に基づいて製剤化される量が異なり得る。こうした製剤は、健康状態へとマイクロバイオームを調節することを対象としている。マイクロバイオームの健康状態は、現存する私的及び公的な集約データベースを使用することによって決定され、こうした集約データベースは、ｍｅｔａＨＩＴ（商標）、Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｕｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（商標）、及び同様のものなどである。血液バイオマーカー検査の視点から個体が既知の問題を有さず、良好な健康状態にあり、その後、個体の完全なマイクロバイオームプロファイルが完成したときに、健康状態が個別に決定されることもあり得る。その個体について、１つまたはいくつかのマイクロバイオームシグネチャーが完成した後に、見出された微生物のいくつか／すべての平均を理解することができ、その平均からの変動を評価することで、その個体がディスバイオシスの状態にあるかを決定することができる。マイクロバイオームプロファイルは、群に集約することができ、その後、こうした群には、バイオインフォマティクスによる迅速な割り当てを行うためのバーコードが割り当てられる。群は、試料の採取元である個体と関連する１つまたは複数の表現型情報、診断情報、または人口統計情報によって作製することができる。特有の群は、統計モデルを使用することによって別の群から決定することができ、こうした統計モデルは、直線距離計算、多様性値、分類指標（Ｃ４．５デシジョンツリーなど）、またはＨｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ＰｒｏｊｅｃｔもしくはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｕｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔによって定義される「正常」などの既知の総集団と比較する主成分分析などである。
【００４９】
したがって、いくつかの実施形態では、所与の対象の腸マイクロバイオームをスクリーニングした後、対象の腸マイクロバイオームに基づいてその所与の対象に対するプロバイオティクスレジメンを特別調製するために本発明が使用され得る。
【００５０】
ディスバイオシスの治療
いくつかの実施形態では、負の副作用、障害、及び／または疾患を誘起または誘起し得るものへと、バランスのとれたマイクロバイオームから対象のマイクロバイオータをシフトさせた事象の後に、対象の腸フローラ及び／またはファウナをホメオスタシスへと回復させるために本発明が使用され得る。健康状態には、限定はされないが、ざ瘡及びアレルギーから、胃腸の不快感、肥満、及びがんまで、さまざまな状態が含まれ得る。そのようなディスバイオシスの１つの例は、肥満を発症している場合である。対象の腸における微生物のいくつかの株は、対象が被る肥満または体重の管理問題と関連することが示されている。例えば、Ｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０２：１１０７０−１１０７５を参照のこと。例えば、肥満の動物及びヒト対象では、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｄｅｓ）門とフィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門との微生物比が代謝能力において重要な役割を担っている。例えば、Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４１０７９を参照のこと。肥満及び体重の管理問題と関連することが知られるいくつかの腸微生物には、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・ペクチノフィラス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、メタノブレビバクター・スミシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、及びビフィドバクテリウム・アニマリスが含まれる。
【００５１】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して対象の腸における第１の所与の微生物と第２の所与の微生物との比が決定された後、その比が望ましくないか、または異常であるならば、所望の比へとその比を修正するための治療が対象に施される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して対象の腸におけるすべての微生物の総量と比較したときの、対象の腸における第１の所与の微生物の量が決定された後、第１の所与の微生物の相対量が望ましくないか、または異常であるならば、所望の量にその量を修正するための治療が対象に施される。そのような治療には、対象の腸においてその量が増加することが望まれる１種または複数種の微生物を含むプロバイオティクスを対象に投与すること、対象の腸においてその量が減少することが望まれる１種または複数種の微生物を死滅またはその増殖を遅延させるための抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤など）を対象に投与すること、健康な腸マイクロバイオームの増殖または維持を支援する食品及び／または栄養補助食品（例えば、プレバイオティクス、マグネシウム、魚油、Ｌ−グルタミン、ビタミンＤなど）を対象に投与すること、ならびに同様のものが含まれる。例えば、肥満の対象の腸マイクロバイオータは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）の存在量が高まっており、ビフィドバクテリウム・アニマリス及びメタノブレビバクター・スミシイは枯渇していることがＭｉｌｌｉｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．３６：８１７−８２５）によって示されている。したがって、本明細書に記載の方法を使用して対象の腸におけるラクトバチルス・ロイテリ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、及びメタノブレビバクター・スミシイの量を決定し、その量が、肥満と関連する腸マイクロバイオータに典型的なものであるか、またはそれを示すものであることが明らかになった後に、ビフィドバクテリウム・アニマリス及びメタノブレビバクター・スミシイを含んでおり、ラクトバチルス・ロイテリの含量が相対的に少量〜皆無のプロバイオティクスが対象に投与され得る。
【００５２】
対象者のマイクロバイオームのスコア付け
マイクロバイオームシグネチャー全体のスコア付けでは、表１に示されるものと類似のデシジョンツリー、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理ツリーが使用される。このシステムによれば、使用者が自身の腸マイクロバイオームがどのくらい健康であり、見つかった少数または多くの課題に対して使用者が対応策を講じる必要があるのかを理解することに役立つスコアを得ることが可能になるであろう。課題には、限定はされないが、既知の病原性生物の同定、日和見病原体（機会を得ると病原性作用を誘起することが知られる不顕性生物）の数及び同定、良好な微生物環境（その組成は除く）のための支援の欠如、または重要な株の欠如、上位１０以内に見られる特有の生物及びもしくは存在率が０．１％を超える生物の全体的多様性及び数が含まれ得る。
【００５３】
試料解析を集約したものから多様性カットオフ値を決定した。カットオフ値は、相対存在量ｘにおいて決定される。例えば、ｘ＝０．１％であるならば、３５２の特有の生物が平均健康プロファイルを構成する。その後、この数を中心として標準偏差を適用し、ガウス分布及び曲線下パーセンタイル解析を使用することで、発明者らは、発明者らのデータベース平均に由来する平均多様性数にどのくらい近いかをスコア付けすることができる。対象者における多様性数が少なくなればなるほど、平均値から離れれば離れるほど、対象者のマイクロバイオームに付けられることになるスコアが低くなる。数が多くなればなるほど、対象者における多様性が豊かであればあるほど、マイクロバイオームに付けられるスコアが高くなる。このタイプのスコア付けカテゴリーをプロバイオティクススコアと併せることで、対象者向けに数的及び視覚的に計量されたスコアが決定されることになり、その結果、その対象者のマイクロバイオームがどのくらい健康であるかが分かる。図的に視覚化する例が以下に示される。この場合、低は、マイクロバイオームのクオリティが低いことに相当し、高は、マイクロバイオームのクオリティ及びスコアが高いことに相当する。低（１００中＞３０）、中（１００中＞６５）、高（１００中６５以上）。
【００５４】
以下の表１には、スコア付け及びプロバイオティクスの式アルゴリズムの例が示される。表１は、デシジョンツリー、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理ツリーと表現することができる。そのようなデシジョンツリー、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理ツリーの機能は、検出されるプロバイオティクスと関連付けて個体のマイクロバイオームの健康のスコアを出力し、プロバイオティクスの使用向けに製剤化及び投薬の推奨事項を与えるであろう。
【００５５】
以下の表２には、微生物の分類先となり得る可能性のあるカテゴリーのリストの例が示される。
【００５６】
（表１）プロバイオティクスのスコア付け及び製剤化のためのデシジョンテーブルの例。プロバイオティクス株データベース、メタゲノム解析データベース、及び文献キュレーションデータベースの利用を含む。
2020500004.tif 000002
【００５７】
（表２）群の作製元となる、可能性のあるカテゴリー
2020500004.tif 000003
2020500004.tif 000004
【００５８】
本出願において使用される科学用語及び専門用語はすべて、別段の記載がない限り、当該技術分野において一般に使用される意味を有する。
【００５９】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物を含み、こうした脊椎動物は、例えば、哺乳類及び非哺乳類（非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ブタ、ニワトリ、ならびに獣医学的対象及び試験動物など）である。
【００６０】
単数の使用は、別段の具体的な記載がない限り、複数を含み得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数の参照対象を含み得る。「または」の使用は、別段の記載がない限り、「及び／または」を意味し得る。本明細書で使用される「及び／または」は、「及び」または「または」を意味する。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、「Ａ、Ｂ、またはＡとＢとの両方」を意味し、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／またはＤ」は、「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはそれらの組み合わせ」を意味し、当該「それらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意の部分集合を意味し、こうした部分集合は、例えば、メンバーが１つの部分集合（例えば、ＡもしくはＢもしくはＣもしくはＤ）、メンバーが２つの部分集合（例えば、Ａ及びＢ、Ａ及びＣなど）、またはメンバーが３つの部分集合（例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ、もしくはＡ、Ｂ、及びＤなど）、または４つすべてのメンバー（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）である。
【００６１】
本明細書で使用される「試料」及び「生体試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。細胞の試料は、任意の試料であり得、こうした試料には、例えば、非侵襲的手法または侵襲的手法（対象の生検など）によって得られる腸または糞便の試料が含まれる。１つの実施形態では、「試料」という用語は、対象の糞便物質または腸組織から得られる任意の調製物を指す。例えば、本明細書に記載の非侵襲的方法を使用して得られる細胞の試料を、本発明の方法のための核酸分子またはタンパク質を単離するために使用することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、解析は、任意の核酸を用いるものであり得、こうした核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、一本鎖、または二本鎖が含まれる。この核酸は、任意の長さのものであり得、こうした長さは、最短で約５ｂｐのオリゴから最長でメガ塩基対またはそれを超える長さにさえ至るものである。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、及びそれらの任意の化学的改変物を意味する。事実上任意の核酸改変が企図される。「核酸分子」は、ほとんど任意の長さのものであり得、こうした長さは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００、またはそれを超える塩基数の長さであり、最長で全長の染色体ＤＮＡ分子に達する。遺伝子の発現を解析する方法については、試料から単離される核酸は、典型的には、ＲＮＡである。
【００６３】
一本鎖核酸分子は、グアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）またはウリジン（Ｕ）と塩基対を形成する能力に基づき、もう一方の核酸分子のすべてまたは一部と塩基対を形成（ハイブリダイズ）することで二重らせん（二本鎖核酸分子）を形成することができるとき、別の一本鎖核酸分子に「相補的」である。例えば、５’−ＴＡＴＡＣ−３’というヌクレオチド配列は、５’−ＧＴＡＴＡ−３’というヌクレオチド配列に相補的である。
【００６４】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、塩基対形成を介して核酸鎖が相補鎖と結合するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション反応は、感受性かつ選択的であり得、その結果、特定の目的配列の存在濃度が低い試料においてさえ、その目的配列を同定することができる。インビトロの状況では、適切にストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液における塩もしくはホルムアミドの濃度によって定義するか、またはハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、こうした条件は、当該技術分野においてよく知られている。具体的には、ストリンジェンシーは、塩濃度を減らすか、ホルムアミド濃度を増やすか、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって増加させることができる。例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２℃の約５０％ホルムアミドにおいて生じ得る。ハイブリダイゼーションは、約３０℃〜３５℃の約３５％〜２５％のホルムアミドにおけるストリンジェンシー低減条件下で生じ得る。具体的には、ハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミド、５ＸのＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、及び剪断され、かつ変性した２００ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡにおける４２℃の高ストリンジェンシー条件下で生じ得る。ハイブリダイゼーションは、上記のとおりであるが、温度を３５℃に下げた３５％ホルムアミドにおけるストリンジェンシー低減条件下で生じ得る。特定レベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的核酸のプリンとピリミジンとの比を計算し、それに沿って温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記の範囲及び条件のバリエーションは、当該技術分野においてよく知られている。
【００６５】
本明細書で使用される「マイクロバイオーム」という用語は、微生物を指し、こうした微生物には、対象の腸に生息する細菌、ウイルス、及び真菌、古細菌、原生動物、アメーバ、または蠕虫が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）、または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）という用語は、任意の微細生物を指し、こうした微細生物には、原核生物もしくは真核生物、胞子、細菌、古細菌、真菌、ウイルス、または原生生物、単細胞、もしくは多細胞が含まれる。
【００６７】
本発明は、機能性要素及びさまざまな処理段階に関して部分的に記載されている。そのような機能性要素分及び処理段階は、特定の機能が実施され、さまざまな結果が達成されるように構成される任意の数の要素、操作、及び手法によって実現され得る。例えば、本発明では、さまざまな生体試料、バイオマーカー、要素、材料、コンピュータ、データソース、記憶システム及び記憶媒体、情報収集手法及び情報収集処理、データ処理基準、統計解析、回帰分析、ならびに同様のものが用いられ得、こうしたものは、さまざまな機能を担い得る。さらに、本発明は、医療診断の文脈で記載されているが、本発明は、任意の数の用途、環境、及びデータ解析と併せて実施され得る。本明細書に記載のシステムは、単に、本発明の用途例にすぎない。
【００６８】
本発明のさまざまな態様によるデータ解析方法は、任意の適切な様式で実行され得、例えば、コンピュータシステムで動作するコンピュータプログラムを使用して実行される。本発明のさまざまな態様による例示の解析システムは、コンピュータシステムと連動して実行され得、こうしたコンピュータシステムは、例えば、プロセッサ及びランダムアクセスメモリを備えた従来のコンピュータシステム（リモートアクセスが可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピュータ、またはワークステーションなど）である。コンピュータシステムは、追加のメモリデバイスまたは情報記憶システム（大容量記憶システムなど）、及びユーザーインターフェース（例えば、従来のモニター、キーボード、及び追跡デバイス）も適切に備える。しかしながら、コンピュータシステムは、任意の適切なコンピュータシステム及び関連機器を備え得るものであり、任意の適切な様式で構成され得る。１つの実施形態では、コンピュータシステムは、スタンドアローンのシステムを備える。別の実施形態では、コンピュータシステムは、サーバー及びデータベースを含む、コンピュータのネットワークの一部である。
【００６９】
遺伝情報の受容、処理、及び解析に必要なソフトウェアは、単一のデバイスで実行されるか、または複数のデバイスで実行され得る。ソフトウェアは、ネットワークを介してアクセス可能であり得、その結果、情報の記憶及び処理は、使用者に対してリモートで実行される。本発明のさまざまな態様による解析システム及びそのさまざまな要素は、データの収集、処理、解析、報告、及び／または診断などのマイクロバイオーム解析が容易になるように機能及び操作を提供する。本解析システムは、マイクロバイオーム及び試料に関する情報を維持し、解析及び／または診断を容易にし、例えば、本実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータプログラムを実行し、このコンピュータプログラムは、マイクロバイオームに関する情報を受容、記憶、検索、解析、及び報告し得る。コンピュータプログラムは、さまざまな機能または操作を実施する複数のモジュールを備え得るものであり、こうしたモジュールは、生データの処理及び補足データの収集のための処理モジュール、ならびに生データ及び補足データを解析するための解析モジュールなどであり、こうしたモジュールによって、モデル及び／または予測が生成される。
【００７０】
解析システムは、さまざまな追加のモジュール及び／または個々の機能も提供し得る。例えば、解析システムは、報告機能も備えることで、例えば、処理機能及び解析機能に関する情報を提供し得る。解析システムは、アクセス制御及び他の管制機能の実施などの、さまざまな管制機能及び管理機能も提供し得る。
【００７１】
本発明の開示の理解または完成に必要な範囲で、本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、それぞれが個別にそのように組み込まれるのと同程度にそこでの参照によって明確に組み込まれる。
【００７２】
本発明は、上記の例に関して説明されているが、改変及び変形が本発明の趣旨及び範囲に包含されると理解されることになる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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