(57)【要約】本発明は、循環ｃｆＤＮＡの悪影響を制限し、様々な病気を治療するために、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）およびオリゴヌクレオチドを含む）を含む患者の血液中の実質的にすべてのタイプのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去するためのアフェレシスデバイスおよびその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のアフィニティーマトリックスを含むアフェレシスを実行するように構成されたデバイスであって、前記１つまたは複数のアフィニティーマトリックスは、対象の血液または血漿から、ヌクレオソーム結合セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡを捕捉することができる、デバイス。
【請求項２】
前記非結合ｃｆＤＮＡが、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記デバイスが２つ以上のアフィニティーマトリックスを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
（ｉ）第１の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスが、ヌクレオソーム結合セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および／またはエキソソーム結合ｃｆＤＮＡを捕捉することができ、かつ（ｉｉ）第２の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスが非結合ｃｆＤＮＡを捕捉することができ、前記第１および第２のアフィニティーマトリックスがデバイス内に任意の順序で配置されている、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
（ｉ）前記第１の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスが、ＤＮＡ結合タンパク質、抗ヒストン抗体、抗ヌクレオソーム抗体、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ結合ポリマー、抗ＤＮＡ抗体、レクチン、またはその任意の組合せを含み、かつ（ｉｉ）前記第２の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスが、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ結合ポリマー、抗ＤＮＡ抗体、またはその任意の組合せを含む、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記ＤＮＡ結合タンパク質がヒストンである、請求項４または５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記ヒストンがＨ１ヒストンである、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合ポリマーがポリアミドアミンデンドリマーである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合ポリマーがカチオン性ポリマーである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記カチオン性ポリマーがポリ−Ｌ−リジンまたはポリエチレンイミンである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記ポリ−Ｌ−リジンがハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンである、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記ポリエチレンイミンがハイパーブランチポリエチレンイミンである、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ＤＮＡインターカレート剤がＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２である、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記抗ヒストン抗体が抗ヒストンＨ２Ａ抗体である、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記レクチンが、スノードロップレクチン（Galanthus nivalis Lectin）（ＧＮＡ）、ラッパズイセンレクチン（Narcissus Pseudonarcissus Lectin）（ＮＰＡ）、コンカナバリンＡ（Conconavalin A）、フィトヘマグルチニン（phytohemagluttanin）、またはシアノビリン（cyanovirin）である、請求項５〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記レクチンがスノードロップレクチン（ＧＮＡ）である、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記２つ以上のアフィニティーマトリックスが、２つ以上のアフィニティーカラムとして連続的に配置されている、請求項３〜１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
配列の最初のアフィニティーマトリックスがＤＮＡ結合ポリマーまたはＤＮＡインターカレート剤を含む、請求項３〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ結合ポリマーがカチオン性ポリマーである、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記カチオン性ポリマーがポリ−Ｌ−リジンまたはポリエチレンイミンである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記ポリ−Ｌ−リジンがハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンである、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記ポリエチレンイミンがハイパーブランチポリエチレンイミンである、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記カチオン性ポリマーがポリアミドアミンデンドリマーである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記ＤＮＡインターカレート剤がＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２である、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２５】
任意の順序で配置された以下のカラムの組合せの１つを含む、請求項１７に記載のデバイス：
（ａ）（ｉ）ＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム、および（ｉｉ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム；または
（ｂ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム；または
（ｃ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）カラム；または
（ｄ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）カラム；または
（ｅ）（ｉ）抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラム、（ｉｉ）レクチンアフィニティーカラム、および（ｉｉｉ）ヒストンＨ１アフィニティーカラム、もしくはポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）カラム、もしくはハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）カラム、もしくはＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム。
【請求項２６】
単一のアフィニティーマトリックスを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記アフィニティーマトリックスがヒストンを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記ヒストンがＨ１ヒストンである、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記ヒストンがＨ１．３ヒストンである、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記アフィニティーマトリックスがＤＮＡ結合ポリマーを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ結合ポリマーがポリアミドアミンデンドリマーである、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ結合ポリマーがハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンである、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記アフィニティーマトリックスがＤＮＡインターカレート剤を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記ＤＮＡインターカレート剤がＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２である、請求項３３に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記アフィニティーマトリックスが抗ＤＮＡ抗体を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記デバイスが、単回のアフェレシス処置ごとに少なくとも３０ｍｇのｃｆＤＮＡを捕捉する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３７】
前記デバイスが、単回のアフェレシス処置ごとに、ｃｆＤＮＡの血中レベルを少なくとも２５％低下させる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記デバイスが、単回のアフェレシス処置ごとにｃｆＤＮＡの血中レベルを少なくとも５０％低下させる、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記デバイスは、単回のアフェレシス処置ごとにｃｆＤＮＡの血中レベルを少なくとも７５％低下させる、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
対象の血液中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルを低下させる方法であって、
（ａ）対象から血液または血漿を請求項１〜３９のいずれか一項に記載のアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および
（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を対象に戻すこと；
を含み、前記アフェレシス処置により、対象の血液中のヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡのレベルが低下する、方法。
【請求項４１】
前記対象が、血液中のｃｆＤＮＡレベルの上昇を特徴とする疾患を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、神経変性疾患、がん、化学療法関連毒性、放射線誘発毒性、臓器不全、臓器損傷、臓器梗塞、虚血、急性血管イベント、脳卒中、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、外傷、老化、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、子癇、不妊症、妊娠関連合併症、凝固障害、および感染症からなる群より選択される疾患を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
必要とする対象において疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象から血液または血漿を請求項１〜３９のいずれか一項に記載のアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および
（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を対象に戻すこと；
を含み、前記アフェレシス処置により、対象の血液中のヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡのレベルが低下する、方法。
【請求項４４】
前記疾患が、血液中のｃｆＤＮＡレベルの上昇を特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が、神経変性疾患、がん、化学療法関連毒性、放射線誘発毒性、臓器不全、臓器損傷、臓器梗塞、虚血、急性血管イベント、脳卒中、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、外傷、老化、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、子癇、不妊症、妊娠関連合併症、凝固障害、および感染症からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
対象の血液中のｃｆＤＮＡのレベルを監視することをさらに含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
対象の血液中のｃｆＤＮＡのレベルが少なくとも２５％低下するまで前記アフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ｃｆＤＮＡのレベルが少なくとも５０％低下するまで、前記アフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ｃｆＤＮＡのレベルが少なくとも７５％低下するまで、前記アフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも３０ｍｇのｃｆＤＮＡが対象の血液から除去されるまで、前記アフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記アフェレシス処置が２回以上繰り返される、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記アフェレシス処置のための血液が門脈から供給される、請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記非結合ｃｆＤＮＡが、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象がヒトである、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１７年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／５５９，８２２号に基づく優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、循環ｃｆＤＮＡの悪影響を制限し、様々な病気を治療するために、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）およびオリゴヌクレオチドを含む）を含む患者の血液中の実質的にすべてのタイプのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去するためのアフェレシスデバイスおよびその使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
セルフリー（または無細胞）ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）とも呼ばれる循環細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）は、健康な個体の血液中に少量存在する。
【０００４】
循環ｃｆＤＮＡのレベルの上昇は、がん、転移がん、急性臓器不全、臓器梗塞（心筋梗塞および虚血性脳卒中を含む）、出血性脳卒中、自己免疫障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（または多臓器機能障害症候群）（ＭＯＤＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、外傷、高齢者の炎症性状態(proinflammatory status)、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、自己免疫疾患、子癇、不妊症、凝固障害、妊娠関連合併症および感染症を含むがこれらに限定されない多くの疾患および病的状態のマーカーとして現在広く受け入れられている。循環セルフリーＤＮＡの様々なサブタイプは、特定の疾患および病的状態の進行に重要な役割を果たす可能性がある。
【０００５】
不妊症（特許文献１）；心血管障害（特許文献２）；がん；敗血症、移植片対宿主病（ＧＢＨＤ）；臓器不全；糖尿病；アテローム性動脈硬化症；遅延型過敏症反応（特許文献３〜７）の治療のために、循環ｃｆＤＮＡを特異的に加水分解するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素の全身投与を使用することが提案された。
【０００６】
しかしながら、初期の動物モデルとは異なり、実際の臨床設定でのデータは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素の全身投与による循環ｃｆＤＮＡの量を低減する効果が限定的であることを示す。
【０００７】
Ｈａｚｏｕｔ，Ａ（ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０５６３２１）は、高レベルの循環ｃｆＤＮＡ（＞８０ｎｇ／μＬ）を有する１０人の女性を、筋肉内経路で０．１ｍｇ/ｋｇのＤＮａｓｅ  Ｉで１日２回、７日間毎日治療して、循環ｃｆＤＮＡのレベルの平均２６％の低下しか見られなかったことを記載している。彼らの結果は、血漿中４０〜１００ｎｇ／ｍＬの触媒的に有効なデオキシリボヌクレアーゼ濃度の達成にもかかわらず、１９日間にわたる１回の静脈内注射と１０回の皮下注射の合計として２５μｇ／ｋｇ用量のヒト組換えデオキシリボヌクレアーゼを受けたループス腎炎患者において、αｄｓＤＮＡの循環レベルの低下を実証できなかったＤａｖｉｓらの報告（非特許文献１）と一致した。
【０００８】
最も豊富なタイプの循環ｃｆＤＮＡは、ヌクレオソーム結合ＤＮＡに代表される。ヌクレオソームは核クロマチンのサブユニットであり、２分子ずつのコアヒストンの八量体により形成された中心コアタンパク質と約１４７塩基対の二本鎖ＤＮＡとから構成されている（非特許文献２）。ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡは、モノヌクレオソームとして、またはオリゴヌクレオソームなどの高次構造として、あるいは５０〜１００ｘ１０３塩基対以上のＤＮＡを含むクロマチンのフラグメントとしても血液中を循環する。この特定のタイプの循環ｃｆＤＮＡは、壊死またはアポトーシスを起こしている細胞に由来する。ｃｆＤＮＡを循環させる別の供給源は好中球のネトーシス（ＮＥＴｏｓｉｓ）である。好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）は、活性化好中球から放出された脱凝縮ＤＮＡの細胞外ストランドであり、１０〜３０ｎｍの３Ｄ網状構造に編成された１５ｘ１０３塩基対以上のＤＮＡ長を有している。ＮＥＴｏｓｉｓ起源のｃｆＤＮＡは、粒子フリーまたは粒子結合のいずれかであり得る。ＮＥＴsはまた、好中球内部空間に由来する高細胞毒性の酵素および細胞毒性タンパク質を含む（非特許文献３）。最近、好中球だけでなくマクロファージもＮＥＴ様構造を生成する可能性があることが示された（非特許文献４）。
【０００９】
循環粒子結合ｃｆＤＮＡのもう１つの重要なタイプは、エキソソーム結合ＤＮＡである。エキソソームは、エキソソームの内部または外部空間に、２．５〜１０ｘ１０３塩基対の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）および二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を含み得るほとんどの細胞タイプによって分泌されるエキソサイトーシス起源の小さな膜小胞（３０〜１００ｎｍ）である（非特許文献５）。
【００１０】
粒子を含まない循環ｃｆＤＮＡのかなりの部分は、がん細胞、活性化免疫細胞、およびその他の特定の細胞タイプによって分泌される線状および環状のｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡに代表される。このタイプのｃｆＤＮＡは、通常２５０〜１０００塩基対以上の長さであり、独特なゲノム配列を豊富に含み得る（非特許文献６）。粒子を含まない循環ｃｆＤＮＡのもう１つの重要な成分は、様々な長さのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）である。
【００１１】
別の最近発見された粒子フリー循環ｃｆＤＮＡの別のタイプは、サブヌクレオソーム長（すなわち、通常〜１４７塩基対未満）の超短鎖二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドに代表される。この特定のｃｆＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、微生物起源のＤＮＡ、および突然変異ヒトゲノム配列を豊富に含むことが示された（非特許文献７）。重要なことに、このタイプの循環ｃｆＤＮＡは、患者の血液中のＤＮａｓｅ  Ｉ酵素による粒子結合ＤＮＡの分解後に現れるものと類似した低分子量ＤＮＡフラグメントも含む。
【００１２】
体外除去技術を使用して、患者血液から循環ｃｆＤＮＡプールの特定成分を取り除いて浄化するいくつかの試みが行われている。例えば、特許文献８および９、ならびに非特許文献８を参照のこと。
【００１３】
高循環レベルの血中ｃｆＤＮＡに関連する疾患を治療する新しい体外法、およびそのような方法を実現するための新しいより効果的なデバイスが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第８，９１６，１５１号明細書
【特許文献２】米国特許第９，６４２，８２２号明細書
【特許文献３】米国特許第９，２４８，１６６号明細書
【特許文献４】米国特許第８，５３５，６６３号明細書
【特許文献５】米国特許第７，６１２，０３２号明細書
【特許文献６】米国特許第８，３８８，９５１号明細書
【特許文献７】米国特許第８，４３１，１２３号明細書
【特許文献８】米国特許第９，３６４，６０１号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７／００９２５０９号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Davis J.C. et al., Recombinant human Dnase I (rhDNase) in patients with lupus nephritis Lupus (1999) Vol 8 (1), pp. 68-76
【非特許文献２】Oudet P, Gross-Bellard M, Chambon P. Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. Cell. 1975; 4:281-300
【非特許文献３】Soerensen, O.E. and Borregaard, N., Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J. Clin. Invest. 2016 May 2; 126(5): 1612-20.
【非特許文献４】Nat Med., 2018, 24(2):232-238
【非特許文献５】Thakur, B.K. et al., Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection, Cell Research (2014) 24:766-769
【非特許文献６】Kumar, P. et al., Normal and cancerous tissues release extrachromosomal circular DNA (eccDNA) into the circulation, Mol. Cancer. Res., June 20, 2017 DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-17-0095
【非特許文献７】Burnham P., Single-stranded DNA library preparation uncovers the origin and diversity of ultrashort cell-free DNA in plasma, Scientific Reports 6, Article number: 27859 (2016), doi:10.1038/srep27859
【非特許文献８】Kusaoi et al., Ther. Apher. Dial, 2016, 20:348-353
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記の背景技術の欄に明記するように、高レベルの循環血中ｃｆＤＮＡに関連する疾患を治療する新しい体外法、およびそのような方法を実現するための新しいより効果的なデバイスが必要とされている。本発明は、アフェレシスデバイスおよび関連するプロセスを提供することにより、このニーズおよび他のニーズに対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様では、本発明は、１つまたは複数のアフィニティーマトリックスを含むアフェレシスを実行するように構成されたデバイスを提供し、前記１つまたは複数のアフィニティーマトリックスは、対象の血液または血漿からヌクレオソーム結合セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡを捕捉することができる。
【００１８】
一部の実施形態では、非結合ｃｆＤＮＡは、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明のデバイスは、２つ以上のアフィニティーマトリックスを含む。一部の実施形態では、（ｉ）第１の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスは、ヌクレオソーム結合セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および／またはエキソソーム結合ｃｆＤＮＡを捕捉でき、（ｉｉ）第２の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスは非結合ｃｆＤＮＡを捕捉でき、第１および第２のアフィニティーマトリックスは、任意の順序でデバイス内に配置される。一部の実施形態では、（ｉ）第１の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスには、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストン［例えば、Ｈ１ヒストン］）、抗ヒストン抗体（例えば、抗ヒストンＨ２Ａ抗体）、抗ヌクレオソーム抗体（例えば、ＡＮ−１、ＡＮ−４４）、ＤＮＡインターカレート剤（例えば、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）色素［例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２など］）、ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、カチオン性／塩基性ポリマー［例えば、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、臭化ヘキサジメトリン、アミノ末端（−ＮＨ２）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー］、非イオン性／中性ポリマー［例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、ポリ（４−ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）］、アニオン性／酸性ポリマー；線状ポリマー［例えば、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン］、分岐ポリマー［例えば、ハイパーブランチ（hyper-branched）ポリ−Ｌ−リジン、ハイパーブランチポリエチレンイミン］、デンドリマーポリマー［例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー］）、抗ＤＮＡ抗体（例えば、マウスモノクローナルＩｇＭ抗−ｄｓ＋ｓｓＤＮＡ抗体（［４９／４Ａ１］、ａｂ３５５７６、Ａｂｅａｍ）、レクチン（例えば、スノードロップレクチン（Galanthus nivalis Lectin）（ＧＮＡ）、ラッパズイセンレクチン（Narcissus Pseudonarcissus Lectin）（ＮＰＡ）、コンカナバリンＡ（Conconavalin A）、フィトヘマグルチニン（phytohemagluttanin）、またはシアノビリン（cyanovirin））、およびそれらの任意の組合せが含まれ、（ｉｉ）第２の１つまたは複数のアフィニティーマトリックスには、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストン［例えば、Ｈ１ヒストン］）、ＤＮＡインターカレート剤（例えば、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）色素［例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２など］）、ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、カチオン性／塩基性ポリマー［例えば、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、臭化ヘキサジメトリン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）アミノ終端（−ＮＨ２）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー］、非イオン性／中性ポリマー［例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、ポリ（４−ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）］、アニオン性／酸性ポリマー；線状ポリマー［例えば、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン］、分岐ポリマー［例えば、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジ���、ハイパーブランチポリエチレンイミン］、デンドリマーポリマー［例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー］）、抗ＤＮＡ抗体（例えば、マウスモノクローナルＩｇＭ抗ｄｓ＋ｓｓＤＮＡ抗体（［４９／４Ａ１］、ａｂ３５５７６、Ａｂｅａｍ）、およびそれらの任意の組合せが含まれる。一部の実施形態では、前記２つ以上のアフィニティーマトリックスが、２つ以上のアフィニティーカラムとして連続的に配置される。一部の実施形態では、配列中の最初のアフィニティーマトリックスは、ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、アミノ末端（−ＮＨ２）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジン、またはハイパーブランチポリエチレンイミン）、あるいはＤＮＡインターカレート剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を含む。ある実施形態では、アフィニティーマトリックスはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーではない。
【００２０】
有用なカラムの組合せ（任意の順序で配置される）の非限定的な例は次のとおりである：
（ａ）（ｉ）ＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム、および（ｉｉ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム；または
（ｂ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム；または
（ｃ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）カラム；または
（ｄ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）カラム；または
（ｅ）（ｉ）抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラム、（ｉｉ）レクチンアフィニティーカラム、および（ｉｉｉ）ヒストンＨ１アフィニティーカラム、またはポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）カラム、またはハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）カラム、またはＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明のデバイスは単一のアフィニティーマトリックスを含む。単一のアフィニティーマトリックスとして使用できる有用なマトリックスの非限定的な例には、ヒストン（例えば、ヒストンＨ１．３などのヒストンＨ１）を含むアフィニティーマトリックス、ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、アミノ末端（−ＮＨ２）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーまたはハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンなどのカチオン性ポリマー）を含むアフィニティーマトリックス、ＤＮＡインターカレート剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を含むアフィニティーマトリックス、抗ＤＮＡ抗体（例えば、マウスモノクローナルＩｇＭ抗−ｄｓ＋ｓｓＤＮＡ抗体（［４９／４Ａ１］、ａｂ３５５７６、Ａｂｅａｍ））を含むアフィニティーマトリックスが含まれる。ある実施形態では、アフィニティーマトリックスはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーではない。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明のデバイスは、単回のアフェレシス処置（apheresis procedure）あたり少なくとも３０ｍｇのｃｆＤＮＡを捕捉する。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明のデバイスは、単回のアフェレシス処置あたりｃｆＤＮＡの血中レベルを少なくとも２５％低下させる。一部の実施形態では、本発明のデバイスは、単回のアフェレシス処置あたりｃｆＤＮＡの血中レベルを少なくとも５０％低下させる。一部の実施形態では、本発明のデバイスは、単回のアフェレシス処置あたりｃｆＤＮＡの血中レベルを少なくとも７５％低下させる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、対象の血液中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルを低下させる方法を提供し、この方法は、（ａ）対象から血液または血漿を本発明のアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を対象に戻すこと；を含み、アフェレシス処置により、対象の血液中のヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡのレベルが低下する。一部の実施形態では、対象は、血液中のｃｆＤＮＡレベルの上昇を特徴とする疾患を有する。一部の実施形態では、対象は、神経変性疾患、がん、化学療法関連毒性、放射線誘発毒性（例えば、急性放射線症候群）、臓器不全、臓器損傷、臓器梗塞、虚血、急性血管イベント、脳卒中、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、外傷、老化、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、子癇、不妊症、妊娠関連合併症、凝固障害、および感染症からなる群より選択される疾患を有する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする対象において疾患を治療する方法を提供し、この方法は、（ａ）対象から血液または血漿を本発明のアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低下した血液または血漿を対象に戻すことを含み、アフェレシス処置により、対象の血液中のヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡのレベルが低下する。一部の実施形態では、対象は、血液中のｃｆＤＮＡレベルの上昇を特徴とする疾患を有する。本発明の方法により治療可能な疾患の非限定的な例には、例えば、神経変性疾患、がん、化学療法関連毒性、放射線誘発毒性（例えば、急性放射線症候群）、臓器不全、臓器損傷、臓器梗塞、虚血、急性血管イベント、脳卒中、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、外傷、老化、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、子癇、不妊症、妊娠関連合併症、凝固障害、および感染症が含まれる。
【００２６】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、その方法は、対象の血液中のｃｆＤＮＡのレベルを監視することをさらに含む。
【００２７】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、その方法は、ｃｆＤＮＡのレベルが少なくとも２５％低下するまでアフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む。本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、その方法は、ｃｆＤＮＡのレベルが少なくとも５０％低下するまでアフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む。本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、その方法は、ｃｆＤＮＡのレベルが少なくとも７５％低下するまでアフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む。
【００２８】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、その方法は、少なくとも３０ｍｇのｃｆＤＮＡが対象の血液から除去されるまでアフェレシス処置を継続または繰り返すことを含む。
【００２９】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、アフェレシス処置は２回以上繰り返される。
【００３０】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、アフェレシス処置のための血液は門脈から供給される。
【００３１】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、非結合ｃｆＤＮＡは、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む。
【００３２】
本発明の上記方法のいずれかの一部の実施形態において、対象はヒトである。
【００３３】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明、特許請求の範囲および図面において当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】転移がん患者の血漿からの循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを示す。
【図２】実施例３に従ってＤＮＡで処置したマウスから切除した腫瘍を示し、抗ヒストン抗体を含むアフィニティーマトリックス、およびガランサス・ニバリス（Galanthus nivalis）（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックスで血液を浄化した。図２Ａは、対照群のマウスから切除した腫瘍を示す。図２Ｂは、ヌクレオソームおよびエキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡを除去されたＮＳＣＬＣ  Ｔ３Ｎ２Ｍ＋患者のＤＮＡで処置したマウスから切除した腫瘍を示す。
【図３】転移がん患者および脳卒中患者の血漿からの循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを示す。
【図４】全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）の患者の血漿からの循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを示す。
【図５】細胞培養実験で使用された循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを示す。
【図６】循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイル、ＤＮａｓｅ  Ｉのウェスタンブロット、ＤＮａｓｅ  Ｉ活性および循環ｃｆＤＮＡの定量を示す。
【図７】敗血症患者の血漿からの循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを示す。
【図８】体積吸着試験（volume adsorption test）の前後のｃｆＤＮＡ富化モデル血漿の１％アガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン１は、インキュベーション前のｃｆＤＮＡ富化モデル血漿である；レーン２は、エタノールアミンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ対照とのインキュベーション後のｃｆＤＮＡ富化モデル血漿である；レーン３は、ＰＤＡＭとのインキュベーション後のｃｆＤＮＡ富化モデル血漿である；レーン４は、ＰＬＬＡＭとのインキュベーション後のｃｆＤＮＡ富化モデル血漿である；レーン５は、Ｈ１．３アフィニティーマトリックスとのインキュベーション後のｃｆＤＮＡ富化モデル血漿である。
【図９】体積吸着試験の前後の歯原性敗血症と診断された患者の血漿の１％アガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン１は、エタノールアミンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ対照とのインキュベーション後の歯原性関連敗血症患者の血漿である；レーン２は蒸留水ブランクラインである；レーン３は、Ｈ１．３アフィニティーマトリックスとのインキュベーション後の歯原性敗血症患者の血漿である；レーン４は蒸留水ブランクラインである；レーン５は、ＰＤＡＭとのインキュベーション後の歯原性関連敗血症患者の血漿である；レーン６は、ＰＬＬＡＭとのインキュベーション後の歯原性関連敗血症患者の血漿である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３６】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及には、１つまたは複数の本明細書に記載のおよび／または本開示を読むと当業者に明らかになるタイプの方法、および／またはステップが含まれる。
【００３７】
「約」または「およそ」という用語には、ある値の統計的に意味のある範囲内にあることが含まれる。そのような範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であってよい。「約」または「およそ」という用語に含まれる許容可能な変動は、検討中の特定のシステムに依存し、当業者はそれを容易に理解することができる。
【００３８】
本明細書で使用される「デバイス」という用語は、例えば、限定はされないが、任意の中空器具（hollow-ware）、カラム、カラムマトリックス、フィルター、膜、半透性材料、ビーズ（例えば、マイクロビーズもしくはナノビーズ）、またはチューブなどの、液体溶液の浄化を可能にする当技術分野で公知の任意のアセンブリを指す。用語「カラム」および「カートリッジ」は、本明細書では、アフェレシスデバイスの文脈で交換可能に使用される。
【００３９】
本明細書で使用される「アフィニティーマトリックス」という用語は、（ｉ）リガンド（例えば、ｃｆＤＮＡ結合分子）が固定される固体支持体、または（ｉｉ）リガンド自体によって形成される固体支持体（例えば、水−不溶性ＤＮＡ結合ポリマー）を指す。
【００４０】
「ＤＮＡ結合タンパク質」という用語は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合するタンパク質を指す。ＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的な様式で（例えば、転写因子およびヌクレアーゼ）または配列非特異的に（例えば、ポリメラーゼおよびヒストン）、ＤＮＡに結合できる。リンカーヒストンＨ１ファミリーのメンバーは、クロマチンの主要な構成要素であり、ＤＮＡの入口および出口部位周辺のヌクレオソームコア粒子に結合する。
【００４１】
本明細書で使用する用語「循環ＤＮＡ」、「セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）」、「循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）」、「細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）」、および「循環細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）」は、造血起源および非造血起源の循環細胞の外部にある、血液中または血漿中に存在するＤＮＡを指すために交換可能に使用される。
【００４２】
ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡは、ヌクレオソームに結合しているＤＮＡである。ヌクレオソームは核クロマチンのサブユニットである。ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡは、モノヌクレオソーム、またはオリゴヌクレオソームなどの高次構造、または５０〜１００ｘ１０３塩基対以上のＤＮＡを含むクロマチンのフラグメントとして、血液中を循環し得る。循環ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡは、壊死またはアポトーシスを起こしている細胞および好中球ＮＥＴｏｓｉｓに由来し得る。
【００４３】
エキソソーム結合ｃｆＤＮＡは、エキソソームに結合するまたはエキソソーム中に存在するｃｆＤＮＡである。エキソソームは、エキソソームの内部または外部空間に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含み得るほとんどの細胞タイプによって分泌されるエキソサイトーシス起源の小さな膜小胞（約３０〜１００ｎｍ）である。
【００４４】
「非結合ｃｆＤＮＡ」または「粒子を含まないｃｆＤＮＡ」または「粒子フリーｃｆＤＮＡ」という用語は、エキソソームにもヌクレオソームにも結合せず、サブヌクレオソームサイズの超短ＤＮＡ分子（通常１４７塩基対未満）を含む、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、線状または環状のもの、およびオリゴヌクレオチドを包含するｃｆＤＮＡを指す。
【００４５】
本明細書で使用する「対象」および「患者」という用語は互換的に使用され、ヒトなどの哺乳動物、獣医動物（例えば、猫、犬、牛、馬、羊、豚など）および実験動物モデルを含む、動物を指す。ある実施形態では、対象は、大人および子供集団における両方の性別を含む、ヒト患者を指す。
【００４６】
本明細書において列挙される疾患状態のいずれかに関する限り、本発明の文脈において、用語「治療する（treat）」、「治療（treatment）」などは、そのような状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減または緩和する、またはそのような状態の進行を遅らせるもしくは止めることを意味する。本発明の意味の範囲内で、「治療する」という用語は、発病（すなわち、疾患の臨床症状発現前の期間）を阻止し、遅らせ、および／または疾患を発症または悪化させるリスクを減らすことも意味する。状況、障害または状態に関して「治療する」、「治療」などの用語には、（１）その状況、障害または状態を煩っているまたはその素因を有している可能性があるが、その状況、障害または状態の臨床的または無症候性症状をまだ経験または表示していない対象において、その状況、障害または状態の少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状の出現を予防または遅延させる；または（２）その状況、障害または状態を阻害する、すなわち、疾患またはその再発（維持治療の場合）あるいはそれらの少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状を停止、軽減または遅延させる；または（３）疾患を軽減する、すなわち、状況、障害または状態あるいはそれらの臨床症状または無症候症状の少なくとも１つの退縮を引き起こすことが含まれる。
【００４７】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業技術の範囲内である統計解析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、コンジュゲーション化学および生化学の従来技術を使用する。そのようなツールおよび技術は、例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; and Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ.   Hermanson (2013) Bioconjugate Techniques, 3rd ed., Academic Press; Niemeyer (2004) Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods, Springer Science & Business Media and Hermanson et al. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Pressに詳細に記載されている。追加技術は、例えば、米国特許第７，９１２，６９８号、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０２３２２号および同第２０１１／０３０７４３７号に説明されている。
【００４８】
本発明のデバイスおよび方法
背景技術の欄に記載されているように、当技術分野において、血液中の実質的にすべてのタイプの循環ｃｆＤＮＡのレベルを低下させるための新しい方法およびデバイスを開発することに対する大きなニーズがある。本開示は、アフェレシスデバイスが、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させるアフェレシスデバイスおよび方法を提供することにより、このニーズおよび他のニーズに対処する。
【００４９】
体外除去技術の使用は、循環からｃｆＤＮＡを取り除き、それに相応して循環ｃｆＤＮＡのレベルおよび悪影響を低下させるための、効果的な解決法を提供することができる。治療的アフェレシスは、患者から血液成分を除去する体外治療である；それは、血液中の病原性物質または成分が疾患の発症を引き起こしている状態の治療に使用される：例えば、Ward M.D., Conventional Apheresis Therapies: A Review Journal of Clinical Apheresis 26:230-238 (2011)を参照のこと。
【００５０】
驚くべきことに、本明細書で実証されるように、実質的にすべてのタイプの循環ｃｆＤＮＡの体外除去は、血液中のｃｆＤＮＡの循環レベルの上昇を特徴とする疾患の治療にプラスの影響を与える。
【００５１】
本開示は、対象の血液から、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを除去して循環ｃｆＤＮＡの悪影響を減らすことにより、ｃｆＤＮＡの循環レベルの上昇を特徴とする疾患を治療する方法を提供する。
【００５２】
理論に拘束されることを望まないが、循環ｃｆＤＮＡのレベルが上昇する特定の疾患では、異なるタイプの循環ｃｆＤＮＡが、それぞれが疾患の進行および患者の死亡につながる異なる分子経路をトリガーすることにより共同して作用し得る；異なるタイプの循環ｃｆＤＮＡが一緒に作用すると、相乗的な毒性を生じる可能性があり、すなわち、２つ以上のタイプの循環ｃｆＤＮＡの毒性（負の）効果は、別個に引き出される各タイプのｃｆＤＮＡの効果の合計よりも大きい。
【００５３】
本発明者らは、循環ｃｆＤＮＡのレベルが上昇した患者の血液からの、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ［ｄｓＤＮＡ］、一本鎖ＤＮＡ［ｓｓＤＮＡ］およびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡの除去が、それら循環ｃｆＤＮＡによって媒介される病原的作用（pathogenic effects）を効果的に低減させるか、あるいは完全に無効にすることさえできることを見出した。ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡの除去は、ｃｆＤＮＡによって媒介される病原的作用を低減するのに重要と思われる。
【００５４】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、実質的にすべてのタイプの循環ｃｆＤＮＡの除去が、内因性デオキシリボヌクレアーゼの再活性化につながり得ることを見つけた。
【００５５】
本明細書では、いくつかのアフィニティーマトリックスまたはその組合せが、必要とする患者の血液から、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを効果的に捕捉できることをさらに説明する。本発明のアフェレシスデバイスおよび方法に有用なアフィニティーマトリックスの例には、（ｉ）ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストン［例えば、Ｈ１ヒストン］）を含むマトリックス、（ｉｉ）抗ヒストン抗体（例えば、抗ヒストンＨ２Ａ抗体）、抗ヌクレオソーム抗体（例えば、ＡＮ−１、Ａ−４４）を含むマトリックス、（ｉｉｉ）ＤＮＡインターカレート剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などのヘキスト色素）を含むマトリックス、（ｉｖ）ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、カチオン性／塩基性ポリマー［例えば、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、臭化ヘキサジメトリン、アミノ末端（−ＮＨ２）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー］、非イオン性／中性ポリマー［例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、ポリ（４−ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）］、アニオン性／酸性ポリマー；線状ポリマー［例えば、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン］、分岐ポリマー［例えば、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジン、ハイパーブランチポリエチレンイミン］、デンドリマーポリマー［例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー；例えば、Kaur et al., J Nanopart Res., 2016, 18:146を参照のこと］；追加の例に関して、米国特許第７，７１３，７０１号、およびMorozov et al., General Reanimatology, 2016, 12:6を参照のこと）を含むマトリックス、（ｖ）抗ＤＮＡ抗体を含むマトリックス、（ｖｉ）レクチン（例えば、スノードロップレクチン（Galanthus nivalis Lectin）（ＧＮＡ）、ラッパズイセンレクチン（Narcissus Pseudonarcissus Lectin）（ＮＰＡ）、コンカナバリンＡ（Conconavalin A）、フィトヘマグルチニン（phytohemagluttanin）、またはシアノビリン（cyanovirin））を含むマトリックス、およびそれらの任意の組合せが含まれる。一部の実施形態では、２つ以上のアフィニティーマトリックスが、２つ以上のアフィニティーカラムとして連続的に配置される。一部の実施形態では、配列中の最初のアフィニティーマトリックスは、ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、アミノ末端（−ＮＨ２）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジン、またはハイパーブランチポリエチレンイミン）、あるいはＤＮＡインターカレート剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を含む。
【００５６】
本明細書に記載されるのは、アフィニティーマトリックスおよびそのようなマトリックスを含むアフェレシスデバイスである。本発明のアフェレシスデバイスは、例えば米国特許出願公開第２０１７／００３５９５５号（Ｅｌｉａｚ  Ｉｓｓａｃ．２０１７年２月９日公開）に記載されているように、当業者の知識に従って構成され得る。アフェレシスデバイスの１つの可能な実施形態では、アフィニティーマトリックスは様々なアフィニティーカラムまたはカートリッジに入れられる。アフェレシスデバイスは、ろ過カートリッジ、および入口と出口とを有する１つまたは複数のアフィニティーカラムを備えていてよく、このデバイスは、患者の血液または血漿から、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を捕捉することができる。一部の実施形態では、デバイスは、順次に２つ以上のアフィニティーカラムを含む。入口および出口は、入口から入ってくる血液が出口を通って出る前に必ずアフィニティーマトリックスに接触するように、アフィニティーマトリックスに対して配置することができる。好ましくは、デバイスの幾何学的形状は、デバイスを通過する間の血液（または血漿）のアフィニティーマトリックスとの接触を最大化するように設計される。様々なそのような設計が当技術分野で知られている。例えば、デバイスは、一方の端部に入口を有しかつ反対の端部に出口を有する、ビーズに固定化されたアフィニティーリガンドを詰めた中空シリンダであってよい。微小管アレイなどの他のデバイスも構築できる。容器の幾何学的形状および容積、ならびにその中に含まれるアフィニティーマトリックスのそのようなすべてのバリエーションは、既知の原理に従って設計することができる。アフィニティーマトリックスカラムを調製する際に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％のカラム体積までアフィニティーマトリックスを装填することができる。適切なバッファー（ＰＢＳ、特に冷ＰＢＳ）を使用して、カラムを平衡化させてよい。
【００５７】
一態様において、セルロースビーズおよび組換えヒトヒストンＨ１．３を含み、組換えヒトヒストンＨ１．３がセルロースビーズ上に固定化され、ビーズのサイズは５０〜３５０マイクロメートルである、ヒストンアフィニティーマトリックスを提供する。一部の実施形態では、ビーズのサイズは１００〜２５０マイクロメートルである。
【００５８】
一部の実施形態では、ヒストンアフィニティーマトリックスは、以下のステップを含むプロセスによって調製される：
ａ）１００〜２５０マイクロメートルの間のサイズを有するセルロースビーズを酸化させて活性化セルロースビーズを得る；
ｂ）活性化セルロースビーズを洗浄する；
ｃ）組換えヒトヒストンＨ１．３の濃縮溶液を調製する；
ｄ）活性化セルロースビーズを組換えヒトヒストンＨ１．３の濃縮溶液とインキュベートする；および
ｅ）活性化セルロースビーズ上の遊離ＣＨＯ基をブロックする。
【００５９】
一部の実施形態では、そのプロセスは、ｆ）活性化セルロースビーズをバッファーで洗浄するステップをさらに含む。
【００６０】
一部の実施形態では、ステップａ）において、セルロースビーズは水性懸濁液中にあり、ＮａＩＯで酸化させる。一部の実施形態では、ステップｂ）において、重炭酸ナトリウム、塩酸および水で活性化セルロースビーズを洗浄する。一部の実施形態では、ステップｃ）は、組換えヒトヒストンＨ１．３の溶液を透析し、透析された溶液をｐＨ７〜９の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中に濃縮することを含む。一部の実施形態では、透析された溶液はｐＨ８の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中に濃縮される。一部の実施形態では、ステップｄ）において、インキュベーションは１５〜３０℃で３〜５時間行われる。一部の実施形態では、ステップｄ）において、インキュベーションは室温で４時間行われる。一部の実施形態では、ステップｅ）において、ブロックステップは、１Ｍのエタノールアミンを活性化セルロースビーズに添加し、１５〜３０℃で３０分〜２時間反応させることを含む。一部の実施形態では、ステップｆ）において、活性化セルロースビーズをＴＢＳバッファーで洗浄する。
【００６１】
上記の態様および実施形態のいずれかのヒストンアフィニティーマトリックスを含むカラムも提供する。
【００６２】
別の態様では、以下のステップを含むプロセスに従って調製されるレクチンアフィニティーマトリックスを提供する：
ａ）レクチンを活性化アガロースビーズと反応させて、レクチン結合アガロースを得る；および
ｂ）レクチン結合アガロースをバッファーで洗浄する。
【００６３】
一部の実施形態では、レクチンは、ガランサス・ニバリス（Galanthus nivalis）（スノードロップ）に由来する。一部の実施形態では、活性化アガロースビーズは、ＣＮＢｒ活性化アガロースビーズである。一部の実施形態では、バッファーは、ｐＨ７．２〜７．４の滅菌冷ＰＢＳなどのＰＢＳである。
【００６４】
上記の態様および実施形態のいずれかのレクチンアフィニティーマトリックスを含むカラムも提供する。
【００６５】
さらに別の態様では、以下のステップを含むプロセスによって調製されるポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）を提供する：
ａ）エタノールおよび水でセルロースビーズを洗浄する；
ｂ）洗浄済みセルロースビーズを（±）−エピクロロヒドリンおよびＮａＯＨとインキュベートして、活性化セルロースビーズを得る；
ｃ）活性化セルロースビーズをポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーと反応させてＰＤＡＭビーズを得て、さらに活性化セルロースビーズと反応しなかったＰＡＭＡＭデンドリマーを除去する；および
ｄ）ＰＤＡＭビーズ上の未変換エポキシ基をブロックする。
【００６６】
一部の実施形態では、そのプロセスは、ｅ）ＰＤＡＭビーズを０．１Ｍリン酸バッファーおよび水で洗浄するステップをさらに含む。
【００６７】
一部の実施形態では、ステップａ）において、９８％エタノールおよび蒸留水でセルロースビーズを洗浄する。一部の実施形態では、ステップｂ）において、洗浄済みセルロースビーズを、（±）−エピクロロヒドリンと２．５Ｍ  ＮａＯＨの混合物とともにインキュベートする。一部の実施形態では、ステップｃ）において、活性化セルロースビーズを、エチレンジアミンコアを有するＰＡＭＡＭデンドリマーの２０％溶液を用いて懸濁させる。一部の実施形態では、ステップｃ）において、懸濁は０〜３０℃で３〜６時間行われる。一部の実施形態では、ステップｃ）において、懸濁は２４℃で５時間行われる。
【００６８】
上記のＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）を含むカラムも提供する。一部の実施形態では、カラムはＰＴＦＥカラムであり、ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックスは滅菌されている。
【００６９】
別の態様では、以下のステップを含むプロセスにより調製される抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを提供する：
ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをアガロースビーズと架橋することにより、活性化アガロースビーズを調製する；
ｂ）活性化アガロースビーズを、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌを含むカップリングバッファーで洗浄する；
ｃ）二本鎖および一本鎖ＤＮＡに対する抗体をカップリングバッファーに添加する；
ｄ）抗体を含むカップリングバッファーを活性化アガロースビーズとインキュベートして、抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを得る；および
ｅ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを、カプリングバッファーおよび酢酸バッファーで洗浄する。
【００７０】
一部の実施形態では、アガロースビーズは９０マイクロメートルの平均サイズを有する。一部の実施形態では、カップリングバッファーは、０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３および０．５Ｍ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ８．３である。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体はマウス抗体である。一部の実施形態では、洗浄ステップは少なくとも３回行われる。一部の実施形態において、酢酸バッファーは、ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸バッファーである。
【００７１】
上記の抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを含むカラムも提供する。
【００７２】
一部の実施形態では、カラムは、抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを滅菌Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーとインキュベートすることにより調製される。一部の実施形態では、滅菌Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーはｐＨ７．４である。
【００７３】
別の態様では、以下のステップを含むプロセスにより調製される抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を提供する：
ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをアガロースビーズと架橋することにより、活性化アガロースビーズを調製する；
ｂ）活性化アガロースビーズを、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌを含むカップリングバッファーで洗浄する；
ｃ）ヌクレオソームに結合する抗体をカップリングバッファーに添加し、その抗体はＭＲＬ／Ｍｐ（−）＋／＋マウスで調製されたものである；
ｄ）抗体を含むカップリングバッファーを活性化アガロースビーズとインキュベートして、抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックスを得る；および
ｅ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックスを、カップリングバッファーおよび酢酸バッファーで洗浄する。
【００７４】
一部の実施形態では、そのマトリックスはヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡに結合し、かつそのマトリックスは、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡに結合しない。
【００７５】
上記の抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を含むカラムも提供する。
【００７６】
さらに別の態様では、以下のステップを含むプロセスにより調製されるＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４２アフィニティーマトリックスを提供する：
ａ）セルロースビーズを酸化させる；
ｂ）酸化セルロースビーズを洗浄する；
ｃ）洗浄済み酸化セルロースビーズを、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を含む溶液と反応させて、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２固定化セルロースビーズを得る；および
ｄ）Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２固定化セルロースビーズを洗浄する。
【００７７】
一部の実施形態では、ステップａ）において、セルロースビーズを３〜５時間、ＮａＩＯで酸化させる。一部の実施形態では、ステップｂ）において、１Ｍの重炭酸ナトリウム、０．１Ｍの塩酸および水で酸化セルロースビーズを洗浄する。一部の実施形態では、ステップｃ）において、溶液はｐＨ緩衝溶液である。一部の実施形態では、ステップｄ）において、洗浄は少なくとも３回行われる。
【００７８】
別の態様では、以下のステップを含むプロセスにより調製されるハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）を提供する：
ａ）Ｌ−リジン一塩酸塩を水に溶解し、ＫＯＨで中和してＬ−リジン溶液を得る；
ｂ）Ｌ−リジン溶液を加熱して、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む溶液を得る；
ｃ）ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む溶液からＬ−リジンと塩を除去する；
ｄ）ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む溶液を分画して、平均分子量２１，０００〜３２，０００のハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む画分を得る；
ｅ）平均分子量２１，０００〜３２，０００のハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む画分を透析および凍結乾燥して、凍結乾燥物を得る；
ｆ）凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、ＮａＨＣＯ３に対して透析して、ＨＢＰＬを含む溶液を得る；および
ｇ）ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む溶液を、ＮａＨＣＯ３に懸濁した臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとインキュベートして、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックスを調製する。
【００７９】
一部の実施形態では、ステップｂ）において、Ｌ−リジン溶液を窒素流下で４８時間１５０℃に加熱する。一部の実施形態では、ステップｃ）において、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンを含む溶液を水に対して透析する。一部の実施形態では、ステップｄ）において、サイズ排除カラムを用いて分画を行う。一部の実施形態では、ステップｄ）において、ゲルろ過カラムを用いて分画を行う。
【００８０】
上記のハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）を含むカラムも提供する。
【００８１】
さらに別の態様では、アフィニティーマトリックスを含む１つまたは複数のアフィニティーカラムを含むアフェレシスを実行するように構成され、患者の血液または血漿から実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを除去するように構成されたデバイスを提供する。一部の実施形態では、そのデバイスは、連続的に２つ以上のアフィニティーカラムを含む。一部の実施形態では、デバイスは濾過カートリッジをさらに含む。一部の実施形態では、濾過カートリッジは入口および出口を有する。一部の実施形態では、アフィニティーカラムのうちの１つ以上は、入口および出口を有する。
【００８２】
一部の実施形態では、デバイスは、任意の順序で配置された以下のアフィニティーカラムのうちの２つ以上を備える：
ａ）ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストン）アフィニティーマトリックスを含むカラム；
ｂ）レクチン（例えば、スノードロップレクチン（Galanthus nivalis Lectin）（ＧＮＡ）、ラッパズイセンレクチン（Narcissus Pseudonarcissus Lectin）（ＮＰＡ）、コンカナバリンＡ（Conconavalin A）、フィトヘマグルチニン（phytohemagluttanin）、またはシアノビリン（cyanovirin））アフィニティーマトリックスを含むカラム；
ｃ）ＤＮＡ結合ポリマー（例えば、アミノ末端（−ＮＨ２）ＰＡＭＡＭデンドリマー、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンまたはハイパーブランチポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマー）アフィニティーマトリックスを含むカラム；
ｄ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを含むカラム；
ｅ）ＤＮＡインターカレート剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４２）アフィニティーマトリックスを含むカラム；
ｆ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を含むカラム；および
ｇ）抗ヒストン抗体アフィニティーマトリックスを含むカラム。
【００８３】
一部の実施形態では、デバイスは、任意の順序で配置された以下のカラムの組合せのうちの１つを含む：
（ａ）（ｉ）ＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム、および（ｉｉ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム；または
（ｂ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム；または
（ｃ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）カラム；または
（ｄ）（ｉ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）カラム、および（ｉｉ）ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）カラム；または
（ｅ）（ｉ）抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラム、（ｉｉ）レクチンアフィニティーカラム、および（ｉｉｉ）ヒストンＨ１アフィニティーカラム、またはポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）カラム、またはハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）カラム、またはＤＮＡインターカレート剤Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム。
【００８４】
別の態様では、濾過カートリッジと、入口および出口を有する１つまたは複数のアフィニティーカラムとを備えたアフェレシスデバイスを提供し、このデバイスは、患者の血液または血漿から、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを捕捉することができる。
【００８５】
一部の実施形態では、デバイスは、連続的に２つ以上のアフィニティーカラムを含む。一部の実施形態では、配列中の最初のアフィニティーカラムは、ＤＮＡ結合ポリマーまたはＤＮＡインターカレート剤を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、デバイスは、レクチンアフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、ヒストンアフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。一部の実施形態では、デバイスは、ＰＡＭＡＭアフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前にあるレクチンアフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、ヒストンアフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。一部の実施形態では、デバイスは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４２アフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。一部の実施形態では、デバイスは、ＰＡＭＡＭアフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。
【００８７】
一部の実施形態では、アフェレシスデバイスは、単回のアフェレシス処置ごとに少なくとも３０ｍｇのｃｆＤＮＡを捕捉する。一部の実施形態では、アフィニティーカラムは、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）の１つまたは複数を捕捉するのに有効な固定化部分を含む。一部の実施形態において、固定化部分は、ＤＮＡ結合抗体、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合ポリマー、レクチン、抗ヌクレオソーム抗体、および抗ヒストン抗体からなる群より選択される。
【００８８】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質はヒストンＨ１（例えば、Ｈ１．３）である。
【００８９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリマーはカチオン性ポリマーである。一部の実施形態では、カチオン性ポリマーはポリ−Ｌ−リジンである。一部の実施形態では、ポリ−Ｌ−リジンはハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンである。一部の実施形態では、カチオン性ポリマーはポリエチレンイミンである。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンはハイパーブランチポリエチレンイミンである。一部の実施形態では、カチオン性ポリマーはアミノ末端（−ＮＨ２）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである。
【００９０】
上記の一部の実施形態では、アフェレシスデバイスは、２つの連続アフィニティーカラムを含み、一方のカラムはヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソーム結合ＤＮＡを捕捉し、他方のカラムはｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡを捕捉する。一部の実施形態では、固定化部分は、以下の部分の２つ以上の組合せからなる群より選択される：ＤＮＡ結合抗体、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合ポリマー、レクチン、抗ヌクレオソーム抗体、または抗−ヒストン抗体。
【００９１】
別の態様では、患者の血液中のｃｆＤＮＡのレベルを低下させる方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。
【００９２】
一部の実施形態では、この方法は、多臓器不全、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、がん、敗血症、敗血症性腎損傷、放射線誘発毒性（例えば、急性放射線症候群）、および化学療法関連毒性の１つまたは複数を治療するのに有効である。
【００９３】
一部の実施形態では、患者は、がん、転移がん、急性臓器不全、臓器梗塞、出血性脳卒中、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、放射線誘発毒性（例えば、急性放射線症候群）、化学療法関連毒性、外傷、高齢者の炎症性状態、糖尿病、アテローム性動脈硬化、神経変性疾患、自己免疫疾患、子癇、不妊症、凝固障害、および感染症からなる群より選択される疾患を有する。
【００９４】
一部の実施形態では、この方法は、患者における疾患を治療するのに有効であり、疾患は、がん、転移性がん、急性臓器不全、臓器梗塞（心筋梗塞および虚血性脳卒中を含む）、出血性脳卒中、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、外傷、高齢者の炎症性状態、糖尿病、アテローム性動脈硬化、神経変性疾患、自己免疫疾患、子癇、不妊症、凝固障害、妊娠関連合併症および感染症から選択される。一部の実施形態では、患者は疾患の治療を必要としている。
【００９５】
さらに別の態様では、患者における多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させて浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者はＭＯＤＳの治療を必要としている。
【００９６】
別の態様では、患者における神経変性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者は神経変性疾患の治療を必要としている。
【００９７】
別の態様では、患者におけるアルツハイマー病を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム−結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム−結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者はアルツハイマー病の治療を必要としている。
【００９８】
別の態様では、患者におけるがんを治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者はがんの治療を必要としている。
【００９９】
別の態様では、患者における敗血症を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者は敗血症の治療を必要としている。
【０１００】
別の態様では、患者における腎臓損傷を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者は腎臓損傷の治療を必要としている。
【０１０１】
別の態様では、患者における化学療法関連毒性を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、患者は化学療法関連毒性の治療を必要としている。
【０１０２】
別の態様では、患者における放射線誘発毒性（例えば、急性放射線症候群）を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させてｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。アフェレシス処置は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態において、患者は、放射線誘発毒性の治療を必要としている。
【０１０３】
上記方法のいずれかの一部の実施形態において、患者の門脈から血液を迂回させる。
【０１０４】
上記の一部の実施形態において、浄化された血液は、アフェレシス処置前の患者からの血液中のｃｆＤＮＡのレベルと比較して、ｃｆＤＮＡのレベルが低下している。
【０１０５】
一部の実施形態では、浄化された血液は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびにｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡのすべてのレベルが低下している。一部の実施形態において、この方法は、患者の血液中の循環ｃｆＤＮＡのレベルを定期的に監視（モニタリング）し、アフェレシス処置を完了する前にｃｆＤＮＡの循環レベルを少なくとも２５％低下させるためにアフェレシス処置を継続することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、患者の血液中の循環ｃｆＤＮＡのレベルを定期的に監視し、アフェレシス処置を完了する前にｃｆＤＮＡの循環レベルを少なくとも５０％低下させるために患者においてアフェレシス処置を継続することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、患者の血液中の循環ｃｆＤＮＡのレベルを定期的に監視し、アフェレシス処置を完了する前に循環ｃｆＤＮＡのレベルを少なくとも７５％低下させるために患者においてアフェレシス処置を継続することをさらに含む。
【０１０６】
上記のいずれかの一部の実施形態において、少なくとも３０ｍｇのｃｆＤＮＡが、１回または数回の連続的なアフェレシス処置中に患者の血液から除去される。
【０１０７】
上記の一部の実施形態において、方法のステップは繰り返されるか、またはスケジュールに従って実施される。方法のステップは、１日に２回、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、１１日ごと、１２日ごとなどで実施してよい。患者から血液サンプルを採取し、ｃｆＤＮＡのレベルを検査して、治療方法を実施する頻度を評価することができる。
【０１０８】
アフィニティーカラムを連続的に配置することで、患者の血液または血漿から、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、および非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む、実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを捕捉することができる。
【０１０９】
本明細書では様々な順序が説明されており、任意の順序を使用できる。一部の実施形態では、デバイスは、レクチンアフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、ヒストンアフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。一部の実施形態では、デバイスは、ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）を含むカラムの上流または前にあるレクチンアフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、ヒストンアフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。一部の実施形態では、デバイスは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４２アフィニティーマトリックスを含むカラムの上流または前に、抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを含むカラムを備える。一部の実施形態では、デバイスは、ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）を含むカラムの上流または前に、抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を含むカラムを備える。
【０１１０】
本出願全体に記載されている様々な側面の一部として、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させて浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行し；さらに（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低減された浄化された血液または血漿を患者に戻す。
【０１１１】
アフェレシスデバイスは、ヒストンアフィニティーマトリックスを含んでいてよい。ヒストンアフィニティーマトリックスは、組換えヒトヒストンＨ１．３を含んでいてよい。ヒストンアフィニティーマトリックスは、アフィニティーカラムの一部であってよい。ヒストンアフィニティーマトリックスカラムにおいて支持体として使用されるビーズは、ヒストンとのカップリング前に酸化剤で酸化させたセルロースビーズであってよい。ビーズは、例えばセファロースビーズであってよい。あるいは、ビーズ以外の形態の支持体を使用することもできる（中空糸、膜、チューブなど）。アフィニティーマトリックスの支持体は、当業者に知られている他の有機および無機化合物、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ハイパーフルオロカーボン、アガロース（架橋アガロース）、アルギン酸塩、カラギーナン、キチン、デンプン、セルロース、ニトロセルロース、セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）、ガラス、シリカ、珪藻土、ジルコニア、アルミナ、酸化鉄、多孔性炭素、前記固体支持体の混合物および／または誘導体；ならびに、この分離材料のプロトン化および脱プロトン化形態から作られていてよい。
【０１１２】
ビーズをＤＮＡ結合タンパク質でコーティングしてもよい。ヒストンや抗ＤＮＡ抗体などのＤＮＡ結合タンパク質は、多糖類ビーズなどの固体不溶性支持体マトリックスに化学的にカップリングさせることで固定化できる。例えば、臭化シアンを使用してアガロースビーズを活性化し、ｃｆＤＮＡ捕捉タンパク質を活性化アガロースとインキュベートして、カップリングを生じさせる。バッファーで洗浄することにより非結合材料を除去し、タンパク質結合アガロースを対象のアフェレシスデバイス／アフィニティカートリッジに充填する。タンパク質を様々な不溶性支持体マトリックスに化学的にカップリングさせる多くの異なる方法がある。当業者に公知のこれらおよび他のマトリックス材料およびタンパク質カップリング方法は、本明細書に記載の方法およびデバイスのいずれでも使用することができる。
【０１１３】
例えば、ｃｆＤＮＡ捕捉分子の固体支持体への付着は、アミン、チオール、イミド（すなわち、水溶性カルボジイミド）を介する、あるいはポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドを固体支持体に付着させるための当業者に知られている他の化学的付着方法によるものであってよい。
【０１１４】
ビーズのサイズは、例えば、３０〜２００μｍ、４０〜１８０μｍ、４５〜１６５μｍ、６０〜１５０μｍの範囲であってよい。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ）などの、任意の数の酸化剤を使用してよい。あるいは、セルロースの第一級ヒドロキシル基を、ピペリジンオキソアンモニウム塩（ＴＥＭＰＯ）によって媒介される酸化を介して選択的に変換して６−デオキシ−６−カルボキシセルロースを生成する、または亜塩素酸塩で酸化することができる。例えば、Eyle, S. and Thielemans, W., Surface modifucation of  cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756kを参照のこと。また、セルロース（またはアガロース）支持体を、例えば、クロム酸、三酸化クロム−ピリジン、ジメチルスルホキシドなどの、当業者に既知の他の化合物によって酸化することもできる（例えば、Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J.Biotechnology, 5 (1987) 255-265を参照のこと）。次に、酸化されたビーズを、組換えヒトヒストンＨ１．３などのヒストンタンパク質の十分に精製および濃縮された溶液とインキュベートする。反応を停止させ、次いでバッファーで洗浄して、可溶性タンパク質混入物を除去することができる。あるいは、セルロースの第一級ヒドロキシル基を、ピペリジンオキソアンモニウム塩（ＴＥＭＰＯ）によって媒介される酸化を介して選択的に変換して６−デオキシ−６−カルボキシセルロースを生成する、または亜塩素酸塩で酸化することができる。例えば、Eyle, S. and Thielemans, W., Surface modifucation of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756kを参照のこと。また、セルロース（またはアガロース）支持体を、例えば、クロム酸、三酸化クロム−ピリジン、ジメチルスルホキシドなどの当業者に知られている他の化合物によって酸化することもできる。例えば、Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J.Biotechnology, 5 (1987) 255-265を参照のこと。
【０１１５】
アフェレシスデバイスは、ヒストンアフィニティーマトリックスを含んでいてよい。ヒストンアフィニティーマトリックスは、組換えヒトヒストンＨ１．３を含んでいてもよい。ヒストンアフィニティーマトリックスは、アフィニティーカラムの一部であってよい。ヒストンアフィニティーマトリックスカラムで使用されるビーズは、酸化剤で酸化されたセルロースビーズであってよい。ビーズは、例えばセファロースビーズであってよい。ビーズはストレプトアビジンでコーティングされていてもよい。ビーズのサイズは、例えば、３０〜２００μｍ、４０〜１８０μｍ、４５〜１６５μｍ、６０〜１５０μｍの範囲であってよい。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ）などの、任意の数の酸化剤を使用してよい。あるいは、ピペリジンオキソアンモニウム塩（ＴＥＭＰＯ）により媒介される酸化により、セルロースの第一級ヒドロキシル基を選択的に変換して、６−デオキシ−６−カルボキシセルロースを生成することができる。例えば、Eyle, S. and Thielemans, W., Surface modifucation of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756kを参照のこと。また、セルロース（またはアガロース）支持体を、例えば、クロム酸、三酸化クロム−ピリジン、ジメチルスルホキシドなどの、当業者に知られている他の化合物によって酸化することもできる（例えば、Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J.Biotechnology, 1987, 5:255-265を参照のこと）。次に、酸化されたビーズを、組換えヒトヒストンＨ１．３などのヒストンタンパク質の十分に精製および濃縮された溶液とともにインキュベートする。反応を停止させ、次いでバッファーで洗浄して、可溶性タンパク質混入物を除去することができる。
【０１１６】
ヒストンアフィニティーマトリックスは、以下のステップを含むプロセスにより調製される：
ａ）１００〜２５０マイクロメートルのサイズを有するセルロースビーズを酸化させて、活性化セルロースビーズを生成する；
ｂ）活性化セルロースビーズを洗浄する
ｃ）組換えヒトヒストンＨ１．３の濃縮溶液を調製する；
ｄ）活性化セルロースビーズを組換えヒトヒストンＨ１．３の濃縮溶液とインキュベートする；および
ｅ）活性化セルロースビーズ上の遊離ＣＨＯ基をブロックする。
【０１１７】
上記のプロセスは、ｆ）活性化セルロースビーズをバッファーで洗浄するステップをさらに含んでもよい。
【０１１８】
任意の酸化剤をステップａ）で使用できる。１つの例示的な酸化剤はＮａＩＯである。ステップｂ）では、あらゆる方法で洗浄を行うことができる。例えば、活性化セルロースビーズを、重炭酸ナトリウム、塩酸および水で洗浄する。透析または他の方法をステップｃ）で使用してもよい。例えば、組換えヒトヒストンＨ１．３の溶液を透析し、透析溶液をｐＨ７〜９またはｐＨ８の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中に濃縮する。ステップｄ）では、インキュベーションは１５〜３０℃で３〜５時間、または室温で４時間行ってもよい。ステップｅ）において、ブロックステップは、１Ｍのエタノールアミンを活性化セルロースビーズに添加し、１５〜３０℃で３０分〜２時間反応させることを含む。ステップｆ）では、活性化セルロースビーズをＴＢＳバッファーで洗浄してもよい。
【０１１９】
ビーズを、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）カラムなどのカラムに装填してよい。他の例示的なカラムは、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、あるいは血液または血液成分の体外処置用デバイスの製造のためにＦＤＡまたはＥＭＥＡにより承認されている他のポリマー材料で作られた壁を有していてもよい。
【０１２０】
カラムまたはカートリッジデバイスは、非毒性の材料で作られていてよく、内部にアフィニティーマトリックスを固定支持する。典型的には、その材料は、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、ポリスチレンなどのプラスチック組成物、あるいは血液または血液成分の体外処置用デバイスの製造用にＦＤＡまたはＥＭＥＡなどの規制当局によって承認されている他の同様の材料である。一部の実施形態では、アフィニティーマトリックスがデバイスから出るのを防ぐために、カラム（カートリッジ）の底部に内部フィルターがある。一部の実施形態では、デバイス内にアフィニティーマトリックスを含むために、デバイスの上部にも内部フィルターがある。一部の実施形態では、これらフィルターは、プラスチックおよび／またはセルロース材料で構成され、血漿などの流体の通過を可能にするが、アフィニティーマトリックスなどの微粒子材料は通過させない細孔を有する。
【０１２１】
ヒストンアフィニティーマトリックスカラムの調製において、ヒストンアフィニティーマトリックスを少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％カラム体積まで装填してもよい。ＰＢＳ、特に冷ＰＢＳを使用してカラムを平衡化させてよい。他の適切なバッファーを使用してカラムを平衡化させてもよい。
【０１２２】
アフェレシスデバイスは、レクチンアフィニティーマトリックスを含んでいてもよい。有用なレクチンの非限定的な例には、例えば、ガランサス・ニバリス（スノードロップ）レクチン（ＧＮＡ）、ラッパズイセンレクチン（Narcissus Pseudonarcissus Lectin）（ＮＰＡ）、コンカナバリンＡ（Conconavalin A）、フィトヘマグルチニン（phytohemagluttanin）、およびシアノビリン（cyanovirin）が含まれる。一実施形態では、中性からわずかにアルカリ性のｐＨで一晩インキュベートすることにより、レクチンをアガロースアフィニティーマトリックスに結合させることができる。このようなインキュベーションの後、ｐＨ７．０〜７．５付近のバッファーで十分に洗浄して、非結合レクチンを除去することができる。
【０１２３】
レクチンアフィニティーマトリックスは、以下のステップを含むプロセスに従って調製することができる：
ａ）レクチンを活性化アガロースビーズと反応させて、レクチン結合アガロースを得る；および
ｂ）レクチン結合アガロースをバッファーで洗浄する。
【０１２４】
アフェレシスデバイスは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）またはポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーアフィニティーマトリックスを含んでいてもよい。例えば、Kaur et al., J Nanopart Res., 2016, 18:146を参照のこと。デンドリマーは、高度に分岐した構造および球状の形状を有するナノメートル寸法の独特な合成ポリマーである。デンドリマーの中でも、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）は、これらマクロ分子が生理学的ｐＨでＤＮＡに結合するため、遺伝子送達のための潜在的トランスフェクション剤として最も注目されている。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、アルキルジアミンコアと第三級アミン分岐から構成されている。５種類の異なるコアタイプと１０種類の表面官能基を有する１０世代（Ｇ０−１０）で利用できる。ＤＮＡおよびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、核酸の負電荷を有するリン酸基と、ポリマーのプロトン化（正電荷を有する）アミノ基との間の静電相互作用に基づいて複合体を形成する。高分子量および高密度複合体の形成は、主にＤＮＡ濃度に依存し、デンドリマーとＤＮＡの電荷比を増加させることにより強化される（Shcharbin, D. et al., Practical Guide to Studying Dendrimers. Book, iSmithers Rapra Publishing: Shawbury, Shrewsbury, Shropshire, UK, 2010. 120 p. ISBN: 978-1-84735-444-0）。
【０１２５】
ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックスは、以下のステップを含むプロセスによって調製される：
ａ）エタノールおよび水でセルロースビーズを洗浄する；
ｂ）洗浄済みセルロースビーズを（±）−エピクロロヒドリンおよびＮａＯＨとインキュベートして、活性化セルロースビーズを得る；
ｃ）活性化セルロースビーズをＰＡＭＡＭデンドリマーと反応させてＰＡＭＡＭビーズを得て、さらに活性化セルロースビーズと反応しなかったＰＡＭＡＭデンドリマーを除去する；および
ｄ）ＰＡＭＡＭビーズ上の未転化エポキシ基をブロックする。
【０１２６】
そのビーズを、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）カラムなどのカラムに装填してもよい。他の例示的なカラムは、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、あるいは血液または血液成分の体外処置用デバイスの製造のためにＦＤＡまたはＥＭＥＡによって承認されている他のポリマー材料で作られた壁を有していてもよい。
【０１２７】
ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックスを含むアフェレシスデバイスは、ヒストンアフィニティーマトリックスとレクチンアフィニティーマトリックスとを含むアフェレシスデバイスを使用するよりも、ｃｆＤＮＡの除去でより有効である、あるいはｃｆＤＮＡをより完全に除去することができる、あるいは特定の血液サンプル中のより多くの全体量のｃｆＤＮＡを除去することができる。
【０１２８】
ある実施形態では、アフェレシスデバイスは、ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス、ヒストンアフィニティーマトリックス、およびレクチンアフィニティーマトリックスのすべてを含んでいてもよい。
【０１２９】
アフェレシスデバイスは、抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスを含んでいてもよい。ＤＮＡに対する抗体は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはその両方に結合する抗核抗体（抗ｄｓ＋ｓｓＤＮＡ抗体）のサブグループを構成する。それらは、例えば、ＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体のサブクラスのいずれかであってよい。一本鎖ＤＮＡのみに結合する抗体は、その成分の塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびリボース−リン酸骨格に結合でき、これらはすべてＤＮＡの一本鎖に露出している。二本鎖ＤＮＡに結合する抗体は、リボース−リン酸骨格、塩基対（デオキシグアノシン−デオキシシチジンおよびデオキシアデノシン−デオキシチミジン）、または二重らせんの特定の立体構造に結合できる（Bevra Hannahs Hahn, Antibodies to DNA. N Engl J Med 1998; 338:1359-1368）。ＤＮＡに対する抗体は、ヌクレオソームやクロマチンなどの超分子構造を含むＤＮＡにも結合する場合がある。
【０１３０】
抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などでアガロースビーズを活性化することで調製できる。その後、活性化ビーズを、抗体またはＤＮＡに親和性を有する他の試薬とインキュベートしてよい。次いで、過剰な抗体／試薬を洗浄により除去する。
【０１３１】
抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）は、以下のステップを含むプロセスにより調製される：
ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをアガロースビーズと架橋させることにより活性化アガロースビーズを調製する；
ｂ）活性化アガロースビーズを、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌを含むカップリングバッファーで洗浄する；
ｃ）ヌクレオソームに結合する抗体をカップリングバッファーに添加し、その抗体はＭＲＬ／Ｍｐ（−）＋／＋マウスで調製されたものである；
ｄ）抗体を含むカップリングバッファーを活性化アガロースビーズとインキュベートして、抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックスを得る；および
ｅ）抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックスをカップリングバッファーおよび酢酸バッファーで洗浄する。
【０１３２】
アフェレシスデバイスは、ＤＮＡインターカレーター（またはインターカレート剤）アフィニティーマトリックスを含んでいてもよい。分子がＤＮＡと相互作用できる方法はいくつかある。リガンドは、共有結合、静電結合、またはインターカレーション（挿入）によりＤＮＡと相互作用し得る。適切なサイズおよび化学的性質のリガンドがＤＮＡの塩基対の間にうまく収まると、インターカレーションが生じる。ＤＮＡ結合剤は、２つの一般様式：（ｉ）疎水性結合、静電結合および水素結合相互作用の混合により安定化された溝結合様式の縫い込み型（threading）のインターカレーション；および（ｉｉ）平面的ヘテロ芳香族部分がＤＮＡ塩基対間に入り込む挿入的な会合による古典的なインターカレーション；を介して宿主ＤＮＡ分子と非共有結合的に相互作用する傾向がある。最も一般的に研究されている挿入結合は、ＤＮＡ二重らせんの塩基対間に平面複素環式芳香環を挿入することにより生じる非共有スタッキング相互作用である。http://nptel.ac.in/courses/104103018/35を参照のこと。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、二本鎖ＤＮＡの副溝のＡＴリッチ配列に結合するビスベンズイミド誘導体である。この色素の複素環部分が、ＤＮＡ二重らせんと効率的に相互作用してＨｏｅｃｈｓｔ−ＤＮＡ複合体をより安定化させるのに重要である。
【０１３３】
ＤＮＡインターカレーターアフィニティーマトリックスは、セルロースビーズ（支持体）などのビーズを酸化（活性化）させ、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡ結合部分、すなわちＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を支持表面と連結させるＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）などの化合物（リンカー）と反応させることにより調製できる。その後、ビーズを洗浄する。
【０１３４】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４２アフィニティーマトリックスは、以下のステップを含むプロセスによって調製される：
ａ）セルロースビーズを酸化する；
ｂ）酸化セルロースビーズを洗浄する；
ｃ）洗浄済み酸化セルロースビーズを、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を含む溶液と反応させて、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２固定化セルロースビーズを得る；および
ｄ）Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２固定化セルロースビーズを洗浄する。
【０１３５】
アフェレシスデバイスは、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックスを含んでいてもよい。ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックスは、以下のステップを含むプロセスによって調製できる：
ａ）Ｌ−リジン一塩酸塩を水に溶解し、ＫＯＨで中和してＬ−リジン溶液を得る；
ｂ）Ｌ−リジン溶液を加熱して、ポリ−Ｌ−リジンを含む溶液を得る；
ｃ）ポリ−Ｌ−リジンを含む溶液からＬ−リジンおよび塩を除去する；
ｄ）ポリ−Ｌ−リジンを含む溶液を分画して、平均分子量２１，０００〜３２，０００のポリ−Ｌ−リジンを含む画分を得る；
ｅ）平均分子量２１，０００〜３２，０００のポリ−Ｌ−リジンを含む画分を透析および凍結乾燥して、凍結乾燥物を得る；
ｆ）凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、ＮａＨＣＯ３に対して透析して、ＨＢＰＬを含む溶液を得る；および
ｇ）ＨＢＰＬを含む溶液を、ＮａＨＣＯ３に懸濁した臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとインキュベートする。
【０１３６】
ある実施形態では、アフェレシスデバイスは、以下のすべてまたは任意の数を含むことができる：ＤＮＡインターカレーターアフィニティーマトリックス、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーマトリックス、抗ＤＮＡアフィニティーマトリックス、ＰＡＭＡＭアフィニティーマトリックス、ヒストンアフィニティーマトリックス、レクチンアフィニティーマトリックス、およびポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス。
【０１３７】
様々なアフェレシス手順および処置方法を本出願の全体を通して説明している。様々な方法および手順は、（ａ）患者から血液または血漿をアフェレシスデバイスに迂回させて浄化された血液または血漿を生成することを含むアフェレシス処置を実行すること；および（ｂ）ｃｆＤＮＡのレベルが低下した浄化された血液または血漿を患者に戻すことを含む。血液の最適な迂回のために任意の静脈を選択できる。例えば、患者の門脈から血液を迂回させてよい。あるいは、患者の大腿静脈または頸静脈から血液を迂回させてもよい。
【０１３８】
治療の様々な実施形態では、アフェレシス処置を、２回以上、または２回、例えば１日目および３日目に、実行してもよい。腎障害を治療する場合、各アフェレシス処置の前に、レフロトロンプラス（Ｒｏｃｈｅ  Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ  Ｐｌｕｓ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて血清クレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを測定することにより腎障害のレベルを評価してもよい。
【０１３９】
循環ｃｆＤＮＡは、従来のＴＨＰ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｈｅａｔ−Ｐｈｅｎｏｌ）法で血漿サンプルから抽出できる(Breitbach et al., PLoS ONE, 2014, 9(3):e87838)。抽出されたｃｆＤＮＡを、製造元の指示に従って、例えばＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オランダ）などの様々なアッセイで定量化できる。以下の実施例で説明するように、アガロースゲルにおけるｃｆＤＮＡを視覚化するために、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄｉａｍｏｎｄ（商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｙｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などのよく知られたＤＮＡ染色色素を使用できる。色素は、ゲル染色剤またはプレキャスト剤として使用してもよく、あるいは直接サンプル装填バッファー中に予め添加してもよい。
【０１４０】
様々な実施形態において、アフェレシス処置の実施は、血液を血漿に分離することをさらに含む。その後、血漿部分を、ｃｆＤＮＡを除去するように１つまたは複数のアフィニティーマトリックスに迂回させる。
【実施例】
【０１４１】
本発明を、以下の実施例によって説明および実証する。しかしながら、本明細書のいずれにおいてもこれらおよび他の例の使用は単なる例示にすぎず、本発明または例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書で説明した特定の好ましい実施形態のいずれにも限定されない。実際に、本明細書を読めば、本発明の多くの修正および変形が当業者には明らかであり、そのようなバリエーションは本発明の精神または範囲から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語、ならびにそれら特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲によってのみ限定されるべきである。
【０１４２】
実施例１：ヒストンＨ１アフィニティーマトリックスおよびアフィニティーカラムの調製
ヒストンＨ１アフィニティーマトリックスおよびアフィニティーカラムは次のように調製した：セルロースビーズ（ビーズサイズ１００〜２５０マイクロメートル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させた。これを達成するために、１０ｍＬの水中のビーズ（３ｇ、５ｍＬ）およびＮａＩＯ（０．１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の水性懸濁液を室温で４時間振盪した。活性化されたビーズを収集し、１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．１Ｍ塩酸および２００ｍＬの水で洗浄した。組換えヒトヒストンＨ１．３（≧９８％純度、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｏｓｃｏｗ）の溶液を透析し、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８）中に濃縮した（１０ｍＬ；５ｍｇ／ｍＬ）。次に、その溶液を撹拌しながら酸化ビーズ（５ｍＬ）とともに室温で４時間インキュベートした。インキュベーション後、１Ｍのエタノールアミン（１．５ｍＬ）を活性化ビーズ懸濁液（１５ｍＬ）に添加して、遊離ＣＨＯ基をブロックした；反応を室温で１時間継続した。得られた固定化ヒストンＨ１を有するセルロースビーズをＴＢＳバッファーで３回洗浄して、可溶性タンパク質混入物を除去し、ヒストンＨ１アフィニティーマトリックスを提供した。固定化ヒストンＨ１を有するセルロースマトリックスを４ｍＬ〜３０ｍＬのポリカーボネートカラムに（その体積の７０〜９０％まで）装填した。
【０１４３】
実施例２：異なるタイプの循環ｃｆＤＮＡからのがん患者の血液の浄化
非結合循環ｃｆＤＮＡからの粒子結合タイプのｃｆＤＮＡ（すなわち、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合ｃｆＤＮＡ）の分離は次のように実施した：血液をクエン酸塩処理チューブに収集し、冷却遠心分離機を使用して２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集することにより、進行胃腺がんならびに肺および肝臓への多発転移を有するがん患者（Ｔ４Ｎ２Ｍ１）の血漿を調製した。
【０１４４】
ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合ｃｆＤＮＡは、それぞれ国際公開第２００７／０４９２８６号および米国特許第９３６４６０１号に記載されているように、抗ヒストン抗体ベースのアフィニティーマトリックスおよびレクチンベースのアフィニティーマトリックスを含む２つの連続アフィニティーカラムを使用して除去した。
【０１４５】
簡単に説明すると、抗ヒストン抗体アフィニティーマトリックスおよびカラムは次のように調製した：０．５ｍＬ（１体積）のストレプトアビジン被覆セファロースビーズ（平均ビーズサイズ：４５〜１６５μｍ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）をグラスウール上に１．３体積（１．３ｍＬ）のポリスチレンカラムに詰めた。カラムを２ｍＬ（４体積）のＰＢＳで平衡化した。ビオチン化抗ヒストン抗体（Ｈ２Ａ．Ｘ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１００μｇ／ｍＬ溶液１ｍＬ（体積）をカラムに添加してゲルベッドに入れた。ボトムキャップとトップキャップを連続して交換し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍＬ（４体積）の冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でカラムを洗浄した。
【０１４６】
レクチンアフィニティーマトリックスは次のように調製した：ガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチン２ｍＬ（１体積）、すなわち、ｐＨ９．５の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中の１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＧＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を、２ｍＬ（１体積）のＣＮＢｒ活性化アガロースビーズ（臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＭＢ、６％アガロース、直径２００〜３００μｍのマクロビーズ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加し、ｐＨ７．４〜８．０で低温において一晩反応させた。反応が完了すると、レクチン結合アガロースを、ｐＨ７．２〜７．４の滅菌冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄した。調製したレクチンアフィニティーマトリックスを０．６ｘ６ｃｍのポリスチレンカラムに移した。
【０１４７】
ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡから浄化するために、血漿１．０ｍＬを第１のアフィニティーカラム（抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーマトリックスを含む）に添加し、通過させた。次に、血漿を第２のアフィニティー（エキソソーム結合）カラム（レクチン［ＧＮＡ］アフィニティーマトリックスを含む）に添加し、通過させた。
【０１４８】
あるいは、同じ量の患者血漿を、実施例１に記載のように調製した単一のヒストンＨ１アフィニティーカラム（固定化ヒストンＨ１．３と結合したセルロースビーズ）を通過させた。
【０１４９】
すべての血漿サンプルを、アフェレシスの前およびアフェレシスの完了後に、蛍光ＤＮＡ色素染色を用いるゲル電気泳動により分析した。
【０１５０】
ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソームの除去前（レーンＡ）、抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラムを用いた連続アフィニティー浄化後（レーンＢ）、ならびにヒストンＨ１．３アフィニティーカラムを用いたアフィニティー浄化後（レーンＣ）の、がん患者の血漿からの循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを図１に示す。
【０１５１】
ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびエキソソームは血漿から除去されたが、真ん中のレーンに示されているサンプルには、１００〜１０００塩基対の分子範囲内で視覚化されるかなりの量の循環ｃｆＤＮＡがまだ含まれていた。右のレーンに示すように、ヒストンＨ１．３アフィニティーカラムを通過後のサンプルでは、ＤＮＡは全く可視化されなかった。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質（ヒストンＨ１．３）を含むアフィニティーマトリックスを通した患者血漿のアフェレシス／浄化により、大部分の、ほぼすべての、またはすべてのヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびにｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡを患者血液から除去することができる。
【０１５２】
実施例３：ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソームから浄化された循環ｃｆＤＮＡは腫瘍成長を促進する
転移性非小細胞肺がん患者（ＮＳＣＬＣ  Ｔ３Ｎ２Ｍ＋）から数日間連続して６０ｍＬの血漿を収集し、抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラムを使用して、したがって実施例２（抗ヒストン抗体を含むアフィニティーマトリックスおよびガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）に記載のように、循環ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡおよびエキソソームから浄化した。アフィニティーカラムの調製には、ポリカーボネート２．０ｘ７．０ｃｍのカラムを使用した。それぞれを、対応するマトリックスを使用してカラム体積の７０〜８０％に装填した。古典的なフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を使用して、浄化された血漿から残りの循環ｃｆＤＮＡを抽出した（Stirling, D. et al, DNA extraction from plasma and serum, In: Methods in Molecular Biology, vol. 226: PCR Protocols, Second Edition, Ed. by J.M.C. Bartlett and D. Stirling, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003, 556 pages）。乾燥抽出ｃｆＤＮＡを−７０℃で保存した。ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡから浄化後の患者血漿から回収された残留ＤＮＡの総量は９．７μｇであった。ｃｆＤＮＡをＰＢＳに再溶解し、下記の動物実験に使用した。
【０１５３】
ヌクレオソームおよびエキソソームに結合していないｃｆＤＮＡの腫瘍成長に対する効果を、Ｐａｎｃ０２／Ｃ５７／ＢＬ６同所性モデル（Jiang Y-J, Lee C-L, Wang Q, et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model. World Journal of Gastroenterology: WJG. 2014; 20(28):9476-9485）を用いて試験した。氷冷したＭａｒｔｉｇｅｌに懸濁した１ｘ１０６のＰａｎｃ０２細胞を各動物の膵尾部に注射した（０日目）。２４匹の担腫瘍マウスを、各８匹ずつのマウスの３群に分けた。対照群のマウスには、１０日目から２０日目まで１０日間、ＰＢＳ（１００μＬ；眼窩後静脈洞）を毎日１回注射した。群１のマウスには、１００ｎｇの上記のように浄化されたがん患者のｃｆＤＮＡを毎日注射し、群２のマウスには、１００ｎｇの平均サイズ２，０００塩基対以下のＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）Ｓａｌｍｏｎ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（非特異的対照として）を同じスケジュールおよび方法を用いて投与した。
【０１５４】
以下の表１は、治療動物および対照群における腫瘍重量に対するＤＮＡ注射の効果を要約する。２３日目の研究終了時に腫瘍重量を測定した。
【表１】
2020534028.tif 000002
【０１５５】
図２Ａは、対照群マウスから切除した腫瘍を示す。図２Ｂは、ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡから浄化されたＮＳＣＬＣ  Ｔ３Ｎ２Ｍ＋患者由来のｃｆＤＮＡで処置したマウスから切除した腫瘍を示す。対照群の腫瘍は、はるかに小さく、密集しており、隣接臓器から十分に分離されており、壊死や出血はなかった。
【０１５６】
ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡから浄化されたがん患者の血漿由来の循環ｃｆＤＮＡは、顕著な腫瘍形成特性(tumorigenic properties)を保持した。したがって、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ＣＦＤＡ、ならびにｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡのすべてのレベルを下げることが有益となり得る。
【０１５７】
実施例４：ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックスおよびアフィニティーカラムの調製
ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）およびＰＤＡＭを含むカラムは、Ｗａｎｇ(Wang, Y., et al., New method for the preparation of adsorbent with high adsorption capacity, Chinese Science Bulletin 2005, Vol. 50, No. 21, pp 2432-2435)に従い、次のように調製した。セルロースビーズ（Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ｂｅａｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＭＴ  ５００、粒子サイズ１００〜２５０μｍ、Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ、チェコ共和国）を９８％エタノールと蒸留水で２回洗浄した。ビーズ１グラムを、１．０ｍＬの（±）−エピクロロヒドリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と３．０ｍＬの２．５Ｍ  ＮａＯＨとの混合物とともにインキュベートした。活性化反応は、シェーカー内で４０℃で２．５時間行った。活性化ビーズを蒸留水で十分に洗浄した。樹脂のエポキシ含有量は、チオ硫酸ナトリウムを塩化水素で滴定することにより、約０．３１ｍｍｏｌ／ｇ乾燥ビーズと決定された。４．０ｍＬの調製した湿潤活性化セルロースビーズを、アミノ末端（−ＮＨ２）ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア、第３．０世代、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｒｉｃｈ）の２０％溶液９．０ｍＬで懸濁させ、２４℃で５時間振盪した。修飾後、蒸留水で洗浄することにより未反応のＰＡＭＡＭを除去し、ビーズ上の残りの未変換エポキシ基をエチルアミンと反応させることによりブロックした。次に、機能化アフィニティーマトリックスを０．１Ｍリン酸バッファーとＭｉｌｌｉＱ水で洗浄した。２．０〜２０．０ｍＬの調製したアフィニティーマトリックスを、パイロジェンフリーのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（０．５〜３．０）ｃｍ  ｘ（１．０〜１０．０）ｃｍのカラムに入れた（カラム体積の７０〜９０％まで装填）。調製したアフィニティーカラムを１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌した。
【０１５８】
実施例５：異なるタイプの循環ｃｆＤＮＡからのがん患者および脳卒中患者の血漿の浄化
次に、虚血性脳卒中患者（脳卒中発症から２４時間）と肺および肝臓に多発性転移を伴う進行胃腺がん（Ｔ４Ｎ２Ｍ１）のがん患者の両方の血漿サンプルの１．０ｍＬアリコートを、実施例２に記載のように抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラムとレクチンアフィニティーカラム（抗ヒストンＨ２Ａ抗体を含むアフィニティーマトリックスとガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）の両方により、あるいは実施例４に記載のように調製したポリアミドアミンデンドリマーアフィニティー０．６ｘ１０．０ｃｍカラム（ＰＡＭＡＭデンドリマーを結合させたセルロースビーズのアフィニティーマトリックス）単独により、浄化した。
【０１５９】
すべての血漿サンプルを、浄化前および浄化完了後、蛍光ＤＮＡ色素染色を用いてゲル電気泳動で分析した。
【０１６０】
ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡおよびエキソソームの除去前、抗ヒストン抗体アフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラムによるアフィニティアフェレシス後、ならびにポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーカラムによるアフィニティー浄化後の、これら患者の血漿由来の循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを図３に示す。
【０１６１】
抗ヒストン抗体アフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラムを用いたがん患者の血漿の結果として生じる浄化により、粒子結合循環ｃｆＤＮＡの大部分が除去された；しかしながら、目に見える量のヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡ、ならびにモノヌクレオソームサイズおよびサブヌクレオソームサイズ（〜１４７塩基対長未満）の循環ｃｆＤＮＡが血漿中に残っていた。ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーアフィニティーカラムを使用した血漿浄化は、がん患者の血漿からの循環ｃｆＤＮＡの完全な除去をもたらした。脳卒中患者では、ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーカラム（単一ステップとして使用）でのアフィニティー浄化により、血漿から実質的にすべてのタイプの循環ｃｆＤＮＡが、検出不能となる程度に十分に除去された。
【０１６２】
したがって、ＤＮＡ結合ポリマーを含むアフィニティーマトリックスを用いて、ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡから患者の血漿を浄化できる。
【０１６３】
実施例６：ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソームから浄化された血漿のｃｆＤＮＡは凝固促進活性を有する
米国特許第９，６４２，８２２号は、好中球ＮＥＴｓの形態の高分子量循環ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡが、進行がんおよび急性血管イベントを有する患者において凝固促進活性を有することを開示する。脳卒中患者（発症から２４時間後）、ならびに肺および肝臓に多発性転移を伴う進行胃腺がん（Ｔ４Ｎ２Ｍ１）のがん患者の血漿をサンプリングし、レクチンアフィニティーカラムおよび抗ヒストン抗体アフィニティーカラム（実施例２に記載のように調製（抗ヒストンＨ２Ａ抗体を含むアフィニティーマトリックスとガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス））の両方により、あるいはポリアミドアミンデンドリマーアフィニティー１．０ｘ５．０ｃｍカラム（実施例４に記載のように調製）により浄化した。浄化したおよび未処理の血漿サンプルを、３，０００ｇで２０分間回転させ、０．２２μｍフィルターでろ過することにより、さらに線維素を除去した。サンプルを１．０ｍＬプラスチックチューブに分注し、５０℃の水浴で２５分間振盪し、１０，０００ｇ（１０分間）で遠心分離した。上清を−８０℃で保存し、その後で次のようにトロンビン生成アッセイで試験した：２５μＬの希釈（１：９）トロンボプラスチン（Ｓｉｇｍａ）と、２５μＬの０．９％ＮａＣｌと、５０μＬの線維素除去された血漿の１：１希釈物（すべての試薬を０．９％ＮａＣｌで希釈した）との混合物。
【０１６４】
トロンビン生成アッセイの試薬はすべて０．９％ＮａＣｌで希釈した。２５μＬのトロンボプラスチンと、２５μＬの０．９％ＮａＣｌと、５０μLの試験すべき線維素除去された血漿の１：１希釈物との混合物をマイクロタイタープレートのウェルに添加し、１０分間３７℃に予熱した。次に、トロンビンの発色基質である１μＭスペクトロザイム５０μＬ、および３０μＭ塩化カルシウム５０μＬを連続して添加した。自動化酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、室温で１０００秒および４０５ｎｍでプレートを読み取った。すべての測定を３重で行った。この試験では、ＯＤ値が血漿の凝固促進活性（トロンビン生成）に比例する。
【表２】
2020534028.tif 000003
【０１６５】
結果を表２に示す。ヌクレオソームおよびエキソソームに結合した循環ｃｆＤＮＡのみならず、非結合ｃｆＤＮＡもがんおよび急性血管イベントで凝固促進活性を有する。したがって、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含むすべてのタイプのｃｆＤＮＡのレベルを下げることは有益である。
【０１６６】
実施例７：抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスおよびカラムの調製
抗ＤＮＡ抗体アフィニティーマトリックスおよびアフィニティーカラムは次のように調製した：５ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化４％高度架橋アガロースの球状ビーズ、平均ビーズサイズ９０マイクロメートル（ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。活性化マトリックスを冷（２〜４℃）カップリングバッファー（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で２回洗浄した。１０００μｇの高親和性マウスモノクローナルＩｇＭ抗−ｄｓ＋ｓｓＤＮＡ抗体（［４９／４Ａ１］、ａｂ３５５７６、Ａｂｅａｍ）をカップリングバッファーに対して透析し、製造元の手順に従ってＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにカップリングさせた。カップリングバッファーおよびその後の０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）での３サイクルの洗浄により、過剰の未結合抗ＤＮＡ抗体を除去した。洗浄したアフィニティーマトリックス４ｍＬを５ｍＬカラムに注ぎ、アフィニティーカラムを滅菌Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）で平衡化した。
【０１６７】
実施例８：ＤＮＡインターカレーターアフィニティーマトリックスおよびカラムの調製
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーマトリックスおよびアフィニティーカラムは次のように調製した：セルロースビーズ（ビーズサイズ１００〜２５０マイクロメートル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させた。１０ｍＬの水中のビーズ（３ｇ、５ｍＬ）およびＮａＩＯ（０．１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の水懸濁液を室温で４時間振盪した。活性化されたビーズを収集し、１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．１Ｍ塩酸および２００ｍＬの水で洗浄した。４５０ｍｇの活性化セルロースビーズを、０．０４７ｍｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．４ｍｇ／ｍＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を含有する１０００ｍＬのｐＨ緩衝溶液と混合し、３２℃で１時間一定の渦速度で反応させた。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を固定化させたビーズを脱イオン水で３回洗浄して、未反応の色素を除去した。調製したＤＮＡインターカレーターアフィニティーマトリックスを４ｍＬ体積のプラスチック（ポリカーボネート）カラムに入れた。カラムを４℃で保管した。
【０１６８】
実施例９：全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）の患者の血液からの異なるタイプの循環ｃｆＤＮＡの分離
急性膵炎に続発する多臓器不全（多臓器不全症候群、ＭＯＤＳ）を伴う全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）と診断された集中治療室（ＩＣＵ）に入院した患者から血漿を採取した。治療的血漿交換をレスキュー療法として行った。取り出された患者血漿１ｍＬのアリコートを、実施例２に記載のレクチンアフィニティーカラムと抗ヒストン抗体アフィニティーカラム（抗ヒストン抗体を含むアフィニティーマトリックスとガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）の両方により、あるいは実施例８に記載のＤＮＡインターカレーターアフィニティーカラム（ＤＮＡインターカレーターアフィニティーマトリックスであるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２結合セルロースビーズ）により浄化した。すべての血漿サンプルを、浄化前および浄化後に、蛍光ＤＡ色素染色を用いてゲル電気泳動で分析した。
【０１６９】
図４に示すように、ＳＩＲＳ患者の血漿は、かなりの量の循環ｃｆＤＮＡを含んでおり、蛍光ＤＮＡ色素で染色すると強い蛍光シグナルが生じた。抗ヒストン抗体アフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラムを用いたアフィニティー浄化により、ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡが除去された；しかしながら、一定量のヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよび循環サブヌクレオソームｃｆＤＮＡ（１４７塩基対未満の長さ）が血漿中に残存した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラムによるアフィニティー浄化により、循環サブヌクレオソームｃｆＤＮＡは除去されたが、一定量のヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡがまだ存在していた。したがって、発明者らは、異なるカラムを用いる連続浄化を試験した：抗ヒストン抗体アフィニティーカラムとレクチンアフィニティーカラムの連続使用に関して実施例２に記載されているやり方で、患者血漿のアリコート１ｍＬを、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２アフィニティーカラム、続いて抗ｄｓＤＮＡ抗体アフィニティーカラムにより連続的に浄化した。蛍光ＤＮＡ色素染色を用いるゲル電気泳動により血漿をさらにチェックしたが、循環ｃｆＤＮＡは検出されなかった。
【０１７０】
したがって、本発明の２つのアフィニティーマトリックスを含むアフィニティーマトリックスによる浄化は、患者の体の血液または血漿から、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む、患者の血液中の実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを除去することができる。
【０１７１】
実施例１０：ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソームから浄化された血漿の循環ｃｆＤＮＡは炎症誘発性活性を有し、敗血症における臓器機能不全に寄与する
急性膵炎に続発する多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）を伴う全身性炎症反応症候群と診断された集中治療室（ＩＣＵ）に入院した患者から血漿を採取した。治療的血漿交換をレスキュー療法として行った。取り出された患者血漿１００ｍＬをレクチンアフィニティーカラムおよび抗ヒストン抗体アフィニティーカラム（実施例２に記載のもの、すなわち、抗ヒストン抗体を含むアフィニティーマトリックスおよびガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）の両方により２回浄化して、ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡからの完全な浄化を行った。実施例３に記載されているように、ヌクレオソームおよびエキソソームから浄化された血漿から残りの循環ｃｆＤＮＡを抽出した。（ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡから前に浄化された患者の血漿から回収された）残留ＤＮＡの総量は約５０μｇであった。次に、ＤＮＡをｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、以下に説明するように動物実験に使用した。
【０１７２】
１０週齢のＣ５７／ＢＬ６雄マウス８匹に、抽出されたｃｆＤＮＡを１時間間隔で３回静脈内注射した。動物は、採血のために最後のＤＮＡ注入の４時間後に安楽死させた。
【０１７３】
血漿クレアチニンレベルは酵素アッセイにより測定した。血漿ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１２レベルは蛍光磁気ビーズベースイムノアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）により測定した。結果を以下の表３に要約する。
【表３】
2020534028.tif 000004
【０１７４】
したがって、ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソームから浄化された血漿のｃｆＤＮＡは強い炎症誘発性活性を有し、臓器機能を損なわせる。
【０１７５】
実施例１１：ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソーム結合ＤＮＡから浄化されたが粒子フリーＤＮＡから浄化されていない患者血漿の循環ｃｆＤＮＡはＴＬＲ９活性化を引き起こす
ＴＬＲ９受容体の活性化は、全身性宿主炎症反応、臓器不全、がん浸潤および転移、脳卒中における神経損傷、自己免疫、子癇、および老化（加齢）に伴う炎症性状態につながる免疫の年齢依存性調節解除の重要な要素として最近認識されている。
【０１７６】
患者は、３３歳の男性で、急性骨髄性白血病に罹患し、ＨＬＡ適合骨髄移植（ＢＭＴ）を受け、その後に標準的な免疫抑制および抗生物質予防が行われた。ＢＭＴの約１ヶ月後、患者はＧＶＨＤグレードＩＩＩと一致する紅斑性発疹および重度の下痢を発症した。患者の入院時に血漿サンプルを採取し、続いて実施例２に記載のように抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラム（抗ヒストン抗体を含むアフィニティーマトリックスおよびガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）で浄化するか、あるいは実施例１に記載のように調製されたヒストンＨ１．３アフィニティーカラム（ヒストンＨ１．３を結合させたセルロースビーズのアフィニティーマトリックス）で浄化した。
【０１７７】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を培地ですすいで培養フラスコから剥がし、細胞を製造元のプロトコルで指定された細胞密度に再懸濁した。ウェルあたり１８０μＬの細胞懸濁液を、６０μＬの未処理患者血漿で２４時間（３７℃、５％ＣＯ）刺激した。患者血漿を、レクチンアフィニティーカラムと抗ヒストン抗体アフィニティーカラムの両方で浄化するか、あるいはＨ１．３アフィニティーカラムで（単一ステップとして）浄化した。インキュベーション後、製造元の説明書に記載されていようにＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ検出媒体を使用して分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分析を行った。マイクロプレートリーダーを使用して、６５０ｎｍでの吸光度の検出を測定した。
【表４】
2020534028.tif 000005
【０１７８】
ＴＬＲ９活性化の定量化は、６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を読み取ることで行った（Ｎ＝３）。結果を表４に示す。驚くべきことに、エキソソーム結合循環ｃｆＤＮＡおよびヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡの除去は、患者の血漿によるＴＬＲ９活性化をかなり限定的に防いだのに対して、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む実質的にすべてのタイプの粒子結合および非結合ｃｆＤＮＡの除去は、患者の血漿によるＴＬＲ９活性化をほぼ完全に防いだ。
【０１７９】
実施例１２：ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）およびアフィニティーカラムの調製
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）などのカチオン性ポリアミノ酸は、プラスミドＤＮＡをコンパクトなナノ構造に凝縮するのに優れていることが知られており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡ結合に使用されている。
【０１８０】
カチオン性ＤＮＡ結合ポリマー、すなわちハイパーブランチポリ−Ｌ−リジン（ＨＢＰＬ）は、Kadlecova, Z. et al, A comparative study on the in vitro cytotoxicity of linear, dendritic and hyperbranched polylysine analogs, Biomacromolecules, v. 13 (2012) pp 3127-3137)に記載のように調製した：２７．４５ｇのＬ−リジン一塩酸塩（試薬グレード、≧９８％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を５５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、８．４ｇのＫＯＨで中和した。次いで、その溶液を窒素気流下で４８時間、１５０℃に加熱した。次に、過剰な塩および残存Ｌ−リジンを除去するために、重合生成物を透析膜チューブでＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して透析した（Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，スイス、分子量カットオフ：３０００ｇ／ｍｏｌ）。透析産物を凍結乾燥し、その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、スイス）で分画した：カラムに０．０１Ｍ  ＨＣｌ中の２ｍｇ／ｍＬのＨＢＰＬ溶液５０ｍＬをロードし、続いて０．０１Ｍ  ＨＣｌで溶出した。２０ｍＬの画分を収集し、凍結乾燥した。重量平均分子量が２１０００〜３２０００の画分（サイズ排除クロマトグラフィーで測定）を収集し、凍結乾燥した。凍結乾燥画分を再蒸留水に溶解し、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に対して透析し、アフィニティーマトリックスの調製に使用した。固定化ＨＢＰＬを含むアガロースマトリックスは、次のように従来の方法で調製した：臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（湿重量１０ｇ、Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に懸濁し、１０ｍＬの２１０００〜３２０００  ＨＢＰＬ画分（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中５ｍｇ／ｍＬ）と混合し、４℃で２４時間攪拌した。調製されたＨＢＰＬ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ビーズ懸濁液１ｍＬあたり４ｍｇのＨＢＰＬ）をポリカーボネートカラム（１．０ｘ１２ｃｍ）に注ぎ、７５０ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、７５０ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、ｐＨ９．２に調整した。カラムをｐＨ７．５の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで平衡化した。調製されたハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）を含むアフィニティーカラムを４℃で保存した。
【０１８１】
実施例１３：神経変性疾患の患者の血液からの異なるサブタイプの循環ｃｆＤＮＡの分離
神経変性障害の患者からの循環ｃｆＤＮＡは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、神経細胞死を誘発する可能性がある。デオキシリボヌクレアーゼ酵素を使用すると、この作用を取り除くことができる。国際公開第２０１６／１９０７８０号を参照のこと。神経細胞死に対する異なるサブタイプの循環ｃｆＤＮＡの影響を調べて、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびにｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡのすべてからの血液の浄化が神経細胞死を防ぐことができるか否かを確認するために、以下の実験を行った。
【０１８２】
神経細胞培養のために、胎生（ｅ）１５〜１７日のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの胚から大脳皮質を取り出した。細針を使用して皮質外植体を約２００〜４００μｍ２の切片に切り、製造元の指示に従ってＰａｐａｉｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて分散させ、氷冷最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）においてさらに維持した。最初にポリ−Ｄ−リジン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）、続いてラミニン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）でコーティングした１３ｍｍ径のガラス製カバースリップ上にニューロンを播き、１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中において、加湿８％ＣＯ２（ｖ／ｖ）雰囲気下において３７℃で２４〜４８時間培養した。
【０１８３】
最初の培養期間の後、細胞培養培地を以下の血漿サンプルのうちの１つで２倍（ｖ／ｖ）に希釈し、さらに２４時間培養した：（ａ）２０歳の健康なドナーの血漿、（ｂ）急速に進行したアルツハイマー病（ＡＤ）の患者の血漿、（ｃ）５μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（ＰＵｌｍｏｚｙｍｅ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で６時間処理した同じＡＤ患者の血漿、（ｄ）レクチンアフィニティーカラムおよび抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラム（実施例２に記載のように調製、すなわち抗ヒストンＨ２Ａ抗体を含むアフィニティーマトリックスおよびガランサス・ニバリス（スノードロップ）のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）の両方を通過させた後の同じＡＤ患者の血漿、および（ｅ）ヒストンＨ１．３アフィニティーカラム（実施例１に記載のようにマトリックスを調製、すなわち、ヒストンＨ１．３を結合させたセルロースビーズのアフィニティーマトリックス）を通過させた後の同じＡＤ患者の血漿；０．８ｘ９ｃｍポリカーボネートカラムに装填（カラム体積の８０％まで）し、対応するカラムを通過する血漿サンプルの体積は約２．０ｍＬであった。
【０１８４】
細胞培養実験で使用された血漿サンプルからの循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルを図５に示す。
【０１８５】
健康なドナーの血漿では、モノヌクレオソームの形態の限られた量のヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡのみが検出された。ＡＤ患者の血漿では、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の高レベルのヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡが検出された。ＡＤ患者の血漿をＤＮａｓｅ  Ｉ酵素で処理すると、オリゴヌクレオソームおよびモノヌクレオソーム画分中のＤＮＡ含有量が減少したが、サブヌクレオソーム画分（〜１４７塩基対未満の長さ）におけるＤＮＡは顕著に増加した。レクチンアフィニティーカラムおよび抗ヒストンＨ２Ａ抗体アフィニティーカラムで浄化したＡＤ患者の血漿は、ヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡを含まず、サブヌクレオソーム（すなわち、非結合）ｃｆＤＮＡのみを含んでいた。ヒストンＨ１．３アフィニティーカラム（単一ステップとして）で処理されたＡＤ患者の血漿は、循環ｃｆＤＮＡを含んでいなかった。
【０１８６】
アポトーシス細胞死マーカーのカスパーゼ３の誘導を、血漿サンプルへの２４時間の暴露後に培養分散皮質ニューロンで測定した。細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定し、ＰＢＳで１：５００に希釈した抗切断カスパーゼ３抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ））と共に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中のヤギ抗ウサギポリクローナルＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間インキュベートし、その後に洗浄および計数した。
【表５】
2020534028.tif 000006
【０１８７】
結果を表５に示す。したがって、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡおよび非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡからの血液の浄化は、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡおよびエキソソーム結合ｃｆＤＮＡからの単純な浄化よりも実質的に高い程度で神経細胞死を防ぎ、さらにはおそらくＤＮＡ酵素分解の副産物の放出またはＤＮａｓｅ  Ｉに対する循環ｃｆＤＮＡの感度の低さのため、ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素による血漿中の循環ｃｆＤＮＡの切断よりもさえ良好に神経細胞死を防ぐ。
【０１８８】
実施例１４：内因性デオキシリボヌクレアーゼの再活性化
デオキシリボヌクレアーゼ酵素（ＤＮａｓｅ）は、循環中の高分子量ＤＮＡの分解を担う主要な酵素である。多数の研究により、デオキシリボヌクレアーゼ活性が、がん、転移がん、自己免疫疾患、敗血症、不妊などの、血液中の循環ｃｆＤＮＡの上昇を伴う特定の状態で抑制されることが示されている（Tamkovich SN, Circulating DNA and DNase activity in human blood. Ann N Y Acad Sci. 2006 Sep; 1075:191-6; Martinez-Valle, DNase 1 activity in patients with systemic lupus erythematosus: relationship with epidemiological, clinical, immunological and therapeutical features. Lupus. 2009 Apr; 18(5): 418-23; EP20070827224; Travis J Gould, Cellular and Biochemical Properties of Cell-Free DNA: A Prognostic Marker In Severe Sepsis Patients, Blood 2011,118:2169）。
【０１８９】
ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびにｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡの減少が血漿中のＤＮａｓｅ  Ｉ活性にどのように影響するかを評価するために、以下の実験を実施した。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ(Goldshtein, H. et al., A rapid direct fluorescent assay for cell-free DNA quantification in biological fluids, Annals of Clinical Biochemistry, Vol 46, Issue 6, pp. 488-494）に記載の方法を用いて、血漿中のｃｆＤＮＡを測定した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最初にジメチルスルホキシドで１：１０００に希釈し、次にリン酸緩衝生理食塩水で１：８に希釈した。１０μLの血漿サンプルを９６ウェルプレートに添加した。４０μＬの希釈Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄを各ウェルに加え（最終希釈１：１０，０００）、９６ウェル蛍光計で５３５ｎｍの発光波長と４８５ｎｍの励起波長で蛍光を測定した。
【０１９０】
ＤＮａｓｅ  Ｉウェスタンブロットは、血漿サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）ブロッティング膜に転写し、ヤギ抗ヒトＤＮａｓｅ  Ｉ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とインキュベートして行った。ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧとのインキュベーション後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して結合を可視化した。
【０１９１】
血清デオキシリボヌクレアーゼ活性は、製造元のプロトコルに従ってＯＲＧ５９０（Ｏｒｇｅｎｔｅｃ）を使用して測定した。検出は、６２０ｎｍの補正波長を用いて４５０ｎｍでマイクロプレート光度計（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＦＣ）を使用して行った。
【０１９２】
乳がんで、肺、肝臓および縦隔に多発性転移を有する（Ｔ４Ｎ３Ｍ１）５６歳の女性患者から血液を採取した。５ｍＬの血漿アリコートを、０．５ｍＬのヒストンＨ１．３アフィニティーマトリックスを含む１ｍＬのポリカーボネートカラム（０．５ｘ５ｃｍ）を通す複数回のランにかけた：各カラムランの後に、循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイルの評価、ＤＮａｓｅウェスタンブロット、ならびにデオキシリボヌクレアーゼ活性および循環細胞外ＤＮＡ含有量の定量を行った。結果を図６に要約する。
【０１９３】
循環ｃｆＤＮＡプロファイルの電気泳動評価では、カラムランの回数の増加とともに、すべての画分の含有量の連続的な減少が示された。その観察は、血漿中の循環ｃｆＤＮＡの直接定量によって追認された。ウェスタンブロットにより検出される同程度の量のＤＮａｓｅ  Ｉ酵素が患者血漿中に最初に存在していた。しかしながら、ＤＮａｓｅ  Ｉの酵素活性は大きく抑制されており、循環ｃｆＤＮＡの量が約１／２に減少した４カラムランの後でのみ有意になった。
【０１９４】
したがって、前記哺乳動物におけるｃｆＤＮＡの全体的な循環レベルが少なくとも５０％低下する本発明によるアフェレシスは、内在性ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の活性を再活性化させる可能性があり、これは循環ｃｆＤＮＡレベルの低下を必要とする患者に有益である。
【０１９５】
約５０００ｎｇ／ｍＬの循環ｃｆＤＮＡの最高報告レベル（一部の進行がん、敗血症患者、および外傷患者で報告されている）に基づき、３０ｍｇの結合能力を有するアフィニティーカラムまたはアフィニティーカラムの組合せは、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびにｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡのすべてからの患者血漿のほぼ完全な浄化をもたらすことができる。
【０１９６】
実施例１５：抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＡＭ）を含むアフィニティーカラムの調製
M. J. Losman, Monoclonal autoantibodies to subnucleosomes from a MRL/Mp (-)+/+ mouse. Oligoclonality of the antibody response and recognition of a determinant composed of histones H2A, H2B, and DNA. J Immunol March 1, 1992, 148 (5) 1561-1569)に記載の方法に従い、ＭＲＬ／Ｍｐ（−）＋／＋マウスを使用して、マウスモノクローナルヌクレオソーム特異的抗体を調製した。ここでＡＮ−１およびＡＮ−４４と称される調製されたモノクローナル（ＩｇＧ）抗体（Ｍａｂｓ）は、ヌクレオソームに選択的に結合するがコアヒストンやＤＮＡなどのヌクレオソームの成分には結合しないそれらの能力に基づき選択された（Kees Kramers, Specificity of monoclonal anti-nucleosome auto-antibodies derived from lupus mice, Journal of Autoimmunity, V. 9, Issue 6, 1996, P. 723-729）。ヌクレオソーム、ならびにヌクレオソームのヒストンおよび非ヒストン成分に対するＡＮ−１およびＡＮ−４４の相対的親和性を以下の表６に要約する。
【表６】
2020534028.tif 000007
【０１９７】
ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をあらかじめパックした１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラムをアフィニティーマトリックス／カートリッジの調製に使用した。製造元の手順に従って２００μｇのＡＮ−１をＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた。
【０１９８】
上記の表に示された親和性データに基づき、ＡＮＡＭがヌクレオソーム結合循環ｃｆＤＮＡのみに結合し、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡには結合しないことは明らかである。
【０１９９】
したがって、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡの結合を確保するために、動物実験では２つの連続したカラムを用いた。抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を含む１つのカラムは、この実施例で上述したように調製した。ポリアミドアミンデンドリマーアフィニティーマトリックスを含む第２のカラムは、実施例４に記載のように調製した。
【０２００】
実施例１６：アフェレシス処置
全身麻酔下（キシラジン０．８ｍｇおよびケタミン４ｍｇの腹腔内注射）で実験ラットの大腿静脈および頸静脈に慢性静脈カテーテルを挿入した。試験中、カテーテルをヘパリン添加生理食塩水で週３回フラッシュした。各アフェレシス処置の前に、ヘパリンのボーラス投与（９０ＩＵ／１００ｇ体重（ｂ．ｗ．））を行った。体外システムをヘパリン添加生理食塩水で完全に満たし、その後、カテーテルの末端を体外システムに接続した。
【０２０１】
動物アフェレシス実験のために、本明細書に記載のアフィニティーカラムに、これら調製されたアフィニティーカラムを体外／アフェレシスシステムの第２（血漿）の回路にさらに組み込むための入口と出口が取り付けられた。
【０２０２】
システムの第１の回路では、血漿分離器（Ｓａｘｏｎｉａ  ｍｅｄｉｃａｌ，Ｒａｄｅｂｅｒｇ，ドイツ）を介して動物（大腿静脈）からポンプ（ロータリーペリスターミニポンプ（Ｒｏｔａｒｙ  ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｍｉｎｉ−ｐｕｍｐ），Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で血液が送り出され、そして静脈カテーテルによって動物に戻された。分離された血漿は、（第２のロータリーペリスターミニポンプを介して）第２の回路に入り、本明細書に記載のアフェレシス処置の具体例に従い１つまたは複数のアフィニティカートリッジを通過した。
【０２０３】
システムの第１の回路では、血漿分離器（Ｓａｘｏｎｉａ  ｍｅｄｉｃａｌ，Ｒａｄｅｂｅｒｇ，ドイツ）を介して動物（大腿静脈）からポンプ（ロータリーペリスターミニポンプ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で血液が送り出され、そして頸静脈に挿入された静脈カテーテルによって動物に戻された。分離された血漿は、（第２のロータリーペリスターミニポンプに支援されて）第２の回路に入り、（本明細書に記載のアフェレシス処置の具体例に従い）アフィニティカートリッジを通過し、頸静脈に挿入されたカテーテルに接続されたポリマーラインを介して動物の体に戻された。
【０２０４】
実施例１７：敗血症および敗血症性腎損傷のアフェレシス治療
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）の方法による古典的な敗血症誘発モデルを確立した。体重３５０〜４００ｇの雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを使用した。動物をペントバルビタールナトリウムで麻酔した（５０ｍｇ/ｋｇ腹腔内投与）。
【０２０５】
約１．５ｃｍの腹部正中切開を行った。盲腸腸間膜を切開して盲腸を露出させた。次に、腸の連続性が維持されるように、盲腸を末端と回盲弁の間で結紮した。次に、結紮の中央部分での２１ゲージの針を用いた単一の貫通穿刺により盲腸に穴を開けた。結んだ部分を軽く押して、少量の糞便が腸の表面に押し出されるようにした。盲腸を腹腔に戻した。筋肉層には吸収性縫合糸を用い、皮膚には外科用ステープルを用いて、外科創傷を層ごとに縫合した。手術後、ラットに１０ｍＬ／ｋｇの温かい注射用０．９％塩化ナトリウムを注射し、回復後、処置によって動物をランダムに３つの群（群１〜３；各群６匹）に分けた。
【０２０６】
実施例１６に記載のようにアフェレシス治療を実行した。アフェレシス処置を２回実行した：１日目（ＣＬＰ後２４時間）および３日目（ＣＬＰ後７２時間）。６匹のラットは、実施例１５で指定されたように調製された抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を含むカラム／カートリッジを使用したアフェレシス処置を受け、６匹のラットは、実施例４で指定されたように調製されたＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）を含むカラム／カートリッジを使用したアフェレシス処置を受けた。６匹のラット（陰性対照群）は、対応する量の未修飾支持体を装填したカートリッジを用いたアフェレシス処置を受けた。各アフェレシス処置の前に、血清クレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルをＲｏｃｈｅ  Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ  Ｐｌｕｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定することにより、急性腎障害（腎機能）のレベルを評価した。従来のＴＨＰ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｈｅａｔ−Ｐｈｅｎｏｌ）法（Breitbach et al., PLoS ONE, 2014, 9(3):e87838）を用いて、１００μＬの血漿サンプルから循環ｃｆＤＮＡを抽出した。製造元の指示に従って、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オランダ）でＤＮＡを定量し、ｃｆＤＮＡの変化を、ベースラインすなわち最初のアフェレシス処置前のレベルに対する、ＤＮＡレベルの割合（％）として表した。陰性対照群のために、対応する量の非修飾支持体（Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ｂｅａｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＭＴ  ５００、粒径１００〜２５０μｍ、Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ、チェコ共和国、９８％エタノールおよび再蒸留水で２回洗浄）を含むカラム／カートリッジを調製した。生存率（ＣＬＰの１２０時間後）を、敗血症の治療効果の主要パラメータとして想定した。動物の割り当ておよび結果を以下の表７に示す。
【表７】
2020534028.tif 000008
【０２０７】
結果は、ＰＤＡＭアフェレシスデバイスが、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびに非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを捕捉でき、より優れた治療効果をもたらし、敗血症および敗血症性腎臓損傷における循環ｃｆＤＮＡのレベルをより効果的に低下させたことを示す。
【０２０８】
実施例１８：化学療法関連毒性徴候のアフェレシス治療
１８匹の体重３００〜３５０ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｓｄ）ラットを、実施例１６に記載のようにアフェレシス処置のために準備し、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｓ．ｒ．Ｌ．．）を１０ｍｇ/ｋｇ用量で単回静脈内ボーラス注射を行った。アフェレシス処置は、パクリタキセル注射の４時間後に開始し、１２時間継続した；６匹のラットは、抗ヌクレオソーム抗体アフィニティーマトリックス（ＡＮＡＭ）を含むカラム／カートリッジを使用したアフェレシス処置を受け、６匹のラットは、ハイパーブランチポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）を含むカラム／カートリッジを使用したアフェレシス処置を受けた。６匹のラット（陰性対照）は、対応する量の未修飾支持体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）を装填したカートリッジを使用したアフェレシス処置を受けた。
【０２０９】
実施例１７に記載のように循環ｃｆＤＮＡレベルを定量し、示した（ｃｆＤＮＡは、ベースラインに対するＤＮＡレベルの割合（％）として表した）。生存率（ボーラス投与の２４時間後）を、治療効果の主要パラメータとして想定した。動物の割り当ておよび結果を以下の表８に示す。
【表８】
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【０２１０】
結果は、ＰＬＬＡＭアフェレシスデバイスが、ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびに非結合ｃｆＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を含む実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡを捕捉でき、より優れた保護／治療効果をもたらし、化学療法薬で毒された動物における循環ｃｆＤＮＡのレベルをより効果的に低下させたことを示す。
【０２１１】
実施例１９：ヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソーム結合ＤＮＡを捕捉する１つのカートリッジと、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡを捕捉する別のカートリッジとを用いた血漿ｃｆＤＮＡの浄化／アフェレシス
血漿ｃｆＤＮＡレベルの測定のために、修正ＨＴＰ法（Xue, X., et al. Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum, Clinica Chimica Acta, V.404 (2009), pp. 100-104）を用いて５００μＬの血漿サンプルからｃｆＤＮＡを抽出し、製造元の指示に従ってＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オランダ）を使用してそれを定量した。
【０２１２】
ｃｆＤＮＡがＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによりサンプル中に検出されなかった場合は、本明細書において上述した方法で、アガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動によってサンプル中のｃｆＤＮＡの不在をさらに確認した。
【０２１３】
アフェレシス／浄化処置のために、血漿サンプルを対応するアフィニティーカラムに徐々に添加して通過させた。
【０２１４】
６７歳の敗血症性ショック患者から得た２．０ｍＬの血漿サンプルを、ＡＮＡＭアフィニティーカラムを通して浄化した。ＡＮＡＭアフィニティーカラム（ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡを捕捉する）は、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（実施例１５に記載）に基づき調製し、レクチンアフィニティーカラム（エキソソーム結合ｃｆＤＮＡを捕捉する）は、実施例２（ガランサス・ニバリス［スノードロップ］のレクチンを含むアフィニティーマトリックス）に記載のように調製した。
【０２１５】
患者の血漿中の最初のｃｆＤＮＡレベルは１１５０ｎｇ／ｍＬであり、アガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動により実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡの顕著な存在が可視化された（図７、レーンＡを参照）。ＡＮＡＭアフィニティーカラムとレクチンアフィニティーカラムの組合せを通す１回目のランの後の血漿中のｃｆＤＮＡのレベルは、３５０ｎｇ／ｍＬに低下した。部分的に浄化された患者血漿を、新鮮なＡＮＡＭアフィニティーカラムとレクチンアフィニティーカラムの同じ組合せを通す２回目のランにさらにかけた。２回目のランの後の血漿中のｃｆＤＮＡのレベルは変化しないままであり、蛍光ＤＮＡ色素染色を用いたアガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動により可視化される目に見える量の７５０ｋＤａまでの分子量を有する非ヌクレオソーム起源のｃｆＤＮＡを有していた（図７、レーンＣを参照）。
【０２１６】
この実験により、ＡＮＡＭアフィニティーカラムおよびレクチンアフィニティーカラムがｃｆＤＮＡから患者血漿を完全に浄化できないのは、ＡＭＡＭアフィニティーカラムとレクチンアフィニティーカラムの組合せの全体的な結合能力ではなく、患者血漿から非ヌクレオソームまたは非エキソソーム起源のｃｆＤＮＡを捕捉できないことに関連していることが明らかとなった。これを確認するために、実施例７に記載のように調製した抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム（高親和性マウスモノクローナルＩｇＭ抗−ｄｓ＋ｓｓＤＮＡを結合させたアガロースのマトリックス）を通してサンプルをさらに浄化した。１回の浄化の実行後、患者血漿中のｃｆＤＮＡのレベルは、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで測定して検出不能となった。この結果は、アガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動後に目に見えるＤＮＡ物質が不在であることによってさらに確認された。
【０２１７】
したがって、１つのカラム／カートリッジがヌクレオソーム結合ＤＮＡおよびエキソソーム結合ＤＮＡを捕捉し、別のカラム／カートリッジがｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む非結合ｃｆＤＮＡを捕捉する２つの連続アフィニティーカラム／カートリッジの使用は、すべてのタイプの循環ｃｆＤＮＡからの患者血液の浄化／アフェレシスに非常に有効である。
【０２１８】
同じ患者からの別の２ｍＬの血漿サンプルを、ＤＮＡインターカレーターアフィニティーカラム（実施例８に記載のように調製、すなわち、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２と結合させたセルロースビーズ）および抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラム（実施例７に記載のように調製、すなわち、高親和性マウスモノクローナルＩｇＭ抗ＤＮＡ抗体と結合させたアガロースのマトリックス）により浄化した。ＤＮＡインターカレーターアフィニティーカラムと抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラムの組合せを通す１回目のランの後の血漿中のｃｆＤＮＡレベルは４７５ｎｇ／ｍＬに低下し、様々な起源のｃｆＤＮＡがアガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動によって視覚化された（図７、レーンＢ）。この部分的に浄化された患者の血漿を、新鮮なＤＮＡインターカレーターアフィニティーカラムと抗ＤＮＡ抗体アフィニティーカラムの同じ組合せを通す２回目のランにさらにかけた。患者血漿での２回目のランの後の血漿中のｃｆＤＮＡレベルは、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで測定して検出不能となった。この結果は、蛍光ＤＮＡ色素染色を用いたアガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動後に目に見えるＤＮＡ物質が不在であることによってさらに確認された。
【０２１９】
したがって、本発明に従い、実質的にすべてのタイプのｃｆＤＮＡ（ヌクレオソーム結合ｃｆＤＮＡ、エキソソーム結合ｃｆＤＮＡ、ならびに非結合ｃｆＤＮＡ［ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む］を含む）に結合するマトリックスを含むカラム／カートリッジの組合せを使用することにより、著しく大量のｃｆＤＮＡの捕捉が可能となる。
【０２２０】
実施例２０：急性膵炎のラットの血液からｃｆＤＮＡを除去するための門脈からの血漿の浄化／アフェレシス
実験では、２５０〜３５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット６匹を使用した。すべての外科的処置は、０．８ｍｇのキシラジンと４ｍｇのケタミンの腹腔内注射による全身麻酔下において加熱手術台で行われた。
【０２２１】
急性膵炎は次のように誘発した。開腹術中に、ファーター乳頭部に２４Ｇ  Ａｂｂｏｃａｔｈ（登録商標）−Ｔ静脈内注入カニューレを使用して経十二指腸カニューレを挿入した。グリシルグリシン−ＮａＯＨバッファー溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０、３７℃）中の滅菌グリコデオキシコール酸０．５ｍＬの圧力モニター注入の前に、総胆管をクランプし、胆汁と膵液をカニューレから排出させた。注入直後に、クランプを外すことにより、肝十二指腸間の胆汁の流れを回復させた。８．０ポリプロン漿膜縫合糸を使用して、十二指腸の穿刺穴を注意深く閉じた。
【０２２２】
ラット１、２および３において腹部を閉じた後、実施例１６に記載のように、慢性静脈カテーテルを大腿静脈および頸静脈に挿入した。
【０２２３】
ラット４、５、および６には、Ｓｔｒｕｂｂｅ（Strubbe J.H. et al, Hepatic-portal and cardiac infusion of CCK-8 and glucagon induce different effects on feeding. Physiol Behav 46: 643-646, 1989）に記載されているように、肝臓の８ｍｍ尾側の肝門脈に門脈カテーテルを埋め込んだ。
【０２２４】
実施例４に記載のように調製されかつポリプロピレン入口および出口を備えたＰＤＡＭアフィニティーカートリッジを使用して、実施例１６に記載のようにアフェレシス処置を実行した。１日目〜３日目の間、毎日アフェレシス処置を実行し、各アフェレシス処置の時間は１２時間であった。
【０２２５】
生存率（膵炎の誘発から９６時間後）を治療効果の主要パラメータとして想定した。ラットのｃｆＤＮＡおよび細菌起源のｃｆＤＮＡ（すなわち、細菌負荷）の定量化のために、製造元の指示に従ってＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、２００μＬのラット血漿サンプルから総ｃｆＤＮＡを単離した。生存率（膵炎の誘発から９６時間後）を治療効果の主要パラメータとして想定した。ラットのｃｆＤＮＡおよび細菌起源のｃｆＤＮＡ（すなわち、細菌負荷）の定量化のために、製造元の指示に従ってＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、２００μＬのラット血漿サンプルから総ｃｆＤＮＡを単離した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元のプロトコルに従って使用して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により血漿サンプルのｃｆＤＮＡ濃度を測定した。細菌由来のｃｆＤＮＡの定量化のために、細菌１６ＳｒＤＮＡの保存領域用に特異的プライマーおよびプローブを設計した：フォワードプライマー：５’−ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴ−３’、およびプローブ：（６−ＦＡＭ）−５’−ＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ−３’−（ＴＡＭＲＡ）（参照: Mangala, A.; Nadkarni, A. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology, 2002, vol. 148, pp.257-266）。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙラットβ−アクチンＲｎ００６６７８６９＿ｍ１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をラットゲノムｃｆＤＮＡの増幅に使用した。
【０２２６】
生存／転帰、ならびに頸静脈から採取した血漿中のラットβ−アクチン遺伝子および細菌１６ＳｒＤＮＡの各ＰＣＲの結果（Ｃｔ、すなわち閾値サイクル値）を表９に示す。
【表９】
2020534028.tif 000010
【０２２７】
結果は、アフェレシスのために血液を門脈から本発明によるアフェレシスデバイスに迂回／取り出すことにより、（大腿静脈、すなわち非局所静脈からの血液の迂回と比較して）急性膵炎のラットにおいて、より高い生存およびより効果的なｃｆＤＮＡ（細菌起源のｃｆＤＮＡを含む）からの血液の浄化がもたらされることを示す。
【０２２８】
したがって、ｃｆＤＮＡの放出の原因となる病理学的プロセス（腫瘍成長、敗血症性または無菌性炎症、細菌ＤＮＡ放出）が、主に門脈によって排出される区域／領域（食道、胃、腸、脾臓、膵臓、胆嚢、腹腔）を起源とする臨床環境では、アフェレシス処置のために門脈から血液を迂回させることが有益となり得る。
【０２２９】
実施例２１：ヒストンＨ１アフィニティーマトリックス、ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス、およびポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）による患者血漿からのｃｆＤＮＡ除去の比較
ポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）は、実施例１２で指定されたように作成した。ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）は、実施例４で指定されたように作成した。ヒストンＨ１アフィニティーマトリックスは、実施例１で指定されたように作成した。
【０２３０】
ｃｆＤＮＡ富化モデル血漿は、健康なボランティアの血漿とマーカーＤＮＡ（１ｋｂｐ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合して１０μｇ／ｍＬの最終ｃｆＤＮＡ濃度にすることにより作成した。人工的な１ｋｂプラスＤＮＡラダーで富化されたモデル血漿に関するポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）、ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）、およびヒストンＨ１アフィニティーマトリックスの吸着能力を、アフィニティーマトリックス：血漿比１：５（１００μＬのアフィニティーマトリックスを５００μＬのモデル血漿と混合した）でゆっくりと回転させながら３７℃で１時間、体積吸着法（volume adsorption method）により試験した。エタノールアミンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを対照として使用した。インキュベーション前およびアフィニティーマトリックスの沈降時に、Ｅ−Ｇｅｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎシステムを使用して１％アガロースゲル電気泳動により血漿サンプルを分析した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｕａｇｅｎを使用してｃｆＤＮＡを患者血漿から抽出し、Ｑｕｂｉｔ  ３．０蛍光光度計で定量した。同じアフィニティーマトリックスを、歯原性関連敗血症と診断された患者の血漿と、１：１０のアフィニティーマトリックス：血漿比（アフィニティーマトリックス１００μＬを患者血漿１ｍＬと混合した）で、同じインキュベーション条件を用いてインキュベートした。１時間で、遠心分離によりアフィニティーマトリックスを除去した。インキュベーション前およびアフィニティーマトリックスの沈降時に、Ｅ−Ｇｅｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎシステムを使用して１％アガロースゲル電気泳動により血漿サンプルを分析した。エタノールアミンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを対照として使用した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｕａｇｅｎを使用してｃｆＤＮＡを患者血漿から抽出し、Ｑｕｂｉｔ  ３．０蛍光光度計で定量した。ｃｆＤＮＡの定量化データを以下の表１０に示す。
【表１０】
2020534028.tif 000011
【０２３１】
ポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）、ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）、およびヒストンＨ１アフィニティーマトリックスは、ｃｆＤＮＡ富化モデル血漿からモデルｃｆＤＮＡを除去する同等の能力を有するが、ヒストンＨ１アフィニティーマトリックスは患者血漿からｃｆＤＮＡを除去するのに有意に優れているように見える。この発見は、サンプルの電気泳動分析によって確認された（図８および９を参照）。
【０２３２】
ポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）、ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）、およびヒストンＨ１アフィニティーマトリックスを使用した体積吸着試験は、最低限のｃｆＤＮＡ含有量を有するほぼ同じ電気泳動写真をもたらした。
【０２３３】
ポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックス（ＰＬＬＡＭ）、ＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックス（ＰＤＡＭ）、およびヒストンＨ１アフィニティーマトリックスを使用した体積吸着試験は、ヒストンＨ１アフィニティーマトリックスとのインキュベーション後は最低限のｃｆＤＮＡ含有量を有するが、ポリ−Ｌ−リジンアフィニティーマトリックスおよびＰＡＭＡＭデンドリマーアフィニティーマトリックスとのインキュベーション後は有意なｃｆＤＮＡ含有量を有する、異なる電気泳動写真をもたらした。
【０２３４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。さらに、すべての値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。
【０２３５】
特許、特許出願、刊行物、製品説明、およびプロトコルが本出願全体を通して引用されており、それらの開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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