(57)【要約】植物における異種ヌクレオチド配列の発現を調節する組成物及び方法が提供される。組成物は、形態形成遺伝子に作動可能に連結された組織優先的プロモーターを含む。また、形態形成遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示のプロモーター配列を用いて植物に異種ヌクレオチド配列を発現させる方法が提供される。形態形成遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含み、さらに目的の異種ヌクレオチド配列を含むＤＮＡコンストラクトもまた提供される。
2020536515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、このヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；
（ｂ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；
（ｃ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；
（ｄ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の断片又は改変体（ここで、前記ヌクレオチド配列の前記断片又は改変体は、植物細胞において転写を開始する）；又は
（ｅ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチド（ここで、前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも１００の連続するヌクレオチドは、植物細胞において転写を開始する）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する組織優先的プロモーターを含む形態形成遺伝子カセットを含む核酸分子であって、
前記（ａ）〜（ｅ）の組織優先的プロモーターは形態形成遺伝子に作動可能に連結されている核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の形態形成遺伝子カセットを含む発現カセット。
【請求項３】
請求項２に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の発現カセットを含む植物細胞。
【請求項５】
前記植物細胞は、単子葉植物、双子葉植物、又は裸子植物由来のものである、請求項４に記載の植物細胞。
【請求項６】
前記単子葉植物、前記双子葉植物、又は前記裸子植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群から選択される、請求項５に記載の植物細胞。
【請求項７】
前記形態形成遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項４に記載の植物細胞。
【請求項８】
前記形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、請求項４に記載の植物細胞。
【請求項９】
前記発現カセットは、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットをさらに含む、請求項４に記載の植物細胞。
【請求項１０】
前記発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、前記部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、請求項９に記載の植物細胞。
【請求項１１】
前記構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、請求項１０に記載の植物細胞。
【請求項１２】
前記発現カセットの形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットは前記植物細胞において一時的に発現し、前記発現カセットの形質遺伝子カセットは前記植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項１１に記載の植物細胞。
【請求項１３】
前記発現カセットの形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットは前記植物細胞から切り出され、前記発現カセットの形質遺伝子カセットは前記植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項１１に記載の植物細胞。
【請求項１４】
請求項２に記載の発現カセットを含む植物。
【請求項１５】
前記植物は、単子葉植物、双子葉植物、又は裸子植物である、請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
前記単子葉植物、前記双子葉植物、又は前記裸子植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、又はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の植物。
【請求項１７】
前記形態形成遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１４に記載の植物。
【請求項１８】
前記形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、請求項１４に記載の植物。
【請求項１９】
前記発現カセットは、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットをさらに含む、請求項１４に記載の植物。
【請求項２０】
前記発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、前記部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
前記構成的プロモーター、前記誘導性プロモーター、前記組織特異的プロモーター、又は前記発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、請求項２０に記載の植物。
【請求項２２】
前記発現カセットの形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットは前記植物において一時的に発現し、前記発現カセットの形質遺伝子カセットは前記植物のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の植物の種子であって、前記発現カセットの形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項２４】
前記発現カセットの形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットは前記植物から切り出され、前記発現カセットの形質遺伝子カセットは前記植物のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項２１に記載の植物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の植物の種子であって、前記発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項２６】
植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチドを有し、前記転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている発現カセット。
【請求項２７】
植物又は植物細胞において転写を開始することができる機能的断片又は改変体を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記機能的断片又は改変体は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列に由来し、前記転写を開始することができる機能的断片又は改変体は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている発現カセット。
【請求項２８】
植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、前記転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている発現カセット。
【請求項２９】
植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセット。
【請求項３０】
植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択され、前記転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセット。
【請求項３１】
トランスジェニック植物を作製する方法であって、
植物細胞を、（ａ）
（ｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、このヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｉｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｖ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；又は
（ｖ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記（ｉ）〜（ｖ）のヌクレオチド配列は形態形成遺伝子に作動可能に連結している組織優先的プロモーターカセット、並びに、（ｂ）栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする目的の異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットを含む組換え発現カセットで形質転換することと；
前記組換え発現カセットを有するトランスジェニック植物細胞を選択することと；
前記トランスジェニック植物を前記トランスジェニック植物細胞から再生することと
を含む方法。
【請求項３２】
前記植物細胞は単子葉植物、双子葉植物、及び裸子植物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記単子葉植物、前記双子葉植物、又は前記裸子植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記形態形成遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、前記部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記構成的プロモーター、前記誘導性プロモーター、前記組織特異的プロモーター、又は前記発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換え発現カセットから前記組織優先的プロモーターカセット及び前記部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法によって作製されるトランスジェニック植物。
【請求項４０】
請求項３９に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項４１】
前記組織優先的プロモーターカセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、前記形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のＴ−ＤＮＡ及び前記第２のＴ−ＤＮＡは、前記植物細胞の形質転換するための同じ菌株に存在する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項４５】
請求項４４に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項４６】
前記第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、前記第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、前記第１の菌株及び前記第２の菌株は前記植物細胞を形質転換するための比率で混合される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項４９】
請求項４８に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項５０】
体細胞胚成熟効率の改善方法であって、
植物細胞を、（ａ）
（ｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、このヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｉｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｖ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｖ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列は形態形成遺伝子に作動可能に連結している組織優先的プロモーターカセット、並びに、（ｂ）栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする目的の異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットを含む組換え発現カセットで形質転換することと；
前記組換え発現カセットを有するトランスジェニック植物細胞を選択することと；
前記トランスジェニック植物を前記トランスジェニック植物細胞から再生することとを含み、前記組換え発現カセットは、前記組換え発現カセットを含まないトランスジェニック植物細胞と比較して、体細胞胚成熟効率の改善をもたらす、方法。
【請求項５１】
前記植物細胞は単子葉植物、双子葉植物、及び裸子植物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記単子葉植物、前記双子葉植物、又は前記裸子植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記形態形成遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、前記部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記構成的プロモーター、前記誘導性プロモーター、前記組織特異的プロモーター、又は前記発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組換え発現カセットから前記組織優先的プロモーターカセット及び前記部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項５９】
請求項５８に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項６０】
前記組織優先的プロモーターカセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、前記形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１のＴ−ＤＮＡ及び前記第２のＴ−ＤＮＡは、前記植物細胞の形質転換するための同じ菌株に存在する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項６４】
請求項６３に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項６５】
前記第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、前記第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、前記第１の菌株及び前記第２の菌株は前記植物細胞を形質転換するための比率で混合される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項６８】
請求項６７に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項６９】
トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、
双子葉植物細胞又は裸子植物細胞を、（ａ）
（ｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、このヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｉｉ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、前記植物細胞において転写を開始する）；
（ｉｖ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体（ここで、前記断片若しくは改変体は、前記植物細胞において転写を開始する）；又は
（ｖ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片（ここで、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１００ｂｐの断片は、前記植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記植物細胞において転写を開始する前記（ｉ）〜（ｖ）のヌクレオチド配列はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している組織優先的プロモーターカセット、並びに、（ｂ）栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする目的の異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットを含む組換え発現カセットで形質転換することと；
形質転換された各細胞において前記組換え発現カセットを発現させて、体細胞胚又はシュートを形成することと；
前記体細胞胚を発芽させるか、又は前記シュートを培養して、前記トランスジェニック双子葉植物又は前記トランスジェニック裸子植物を形成することとを含み、前記トランスジェニック双子葉植物又は前記トランスジェニック裸子植物は前記目的の異種ポリヌクレオチドを含む方法。
【請求項７０】
前記体細胞胚又は前記シュートは、前記双子葉植物細胞又は前記裸子植物細胞の形質転換の開始後約２１〜約２８日以内に形成される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記裸子植物細胞は、マツ及びダグラスファーからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記双子葉植物細胞は、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、亜麻、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、メロン、又はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、前記部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記構成的プロモーター、前記誘導性プロモーター、前記組織特異的プロモーター、又は前記発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記組換え発現カセットから前記組織優先的プロモーターカセット及び前記部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項７９】
請求項７８に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項８０】
前記組織優先的プロモーターカセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、前記形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１のＴ−ＤＮＡ及び前記第２のＴ−ＤＮＡは、前記植物細胞の形質転換するための同じ菌株に存在する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
請求項８２に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項８４】
請求項８３に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項８５】
前記第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、前記第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、前記第１の菌株及び前記第２の菌株は前記植物細胞を形質転換するための比率で混合される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
請求項８６に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項８８】
請求項８６に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項８９】
トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、
（ａ）双子葉植物又は裸子植物の外植片の細胞を、目的の異種遺伝子を含む形質遺伝子カセットと、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む形態形成遺伝子カセットとを含む組換え発現カセットで形質転換すること；
（ｂ）形質転換された各細胞において前記（ａ）の組換え発現カセットを発現させて、体細胞胚又はシュートを形成すること；及び
（ｃ）前記体細胞胚を発芽させるか、又は前記シュートを培養して、前記トランスジェニック双子葉植物又は前記トランスジェニック裸子植物を形成することを含む方法。
【請求項９０】
前記体細胞胚又は前記シュートは、前記細胞の形質転換の開始後約２１〜約２８日以内に形成される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記双子葉植物又は前記裸子植物は、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、亜麻、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、メロン、又はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記構成的プロモーター、前記誘導性プロモーター、前記組織特異的プロモーター、又は前記発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、ＬＥＡ−Ｄ３４、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体、又は配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記目的の異種遺伝子は、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする、請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
前記組換え発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、前記部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、請求項８９に記載の方法。
【請求項９８】
前記構成的プロモーター、前記誘導性プロモーター、前記組織特異的プロモーター、又は前記発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記組換え発現カセットから前記形態形成遺伝子カセット及び前記部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
請求項９９に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項１０２】
前記形態形成遺伝子カセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、前記形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１のＴ−ＤＮＡ及び前記第２のＴ−ＤＮＡは、前記双子葉植物細胞の形質転換するための同じ菌株に存在する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項１０６】
請求項１０５に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項１０７】
前記第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、前記第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、前記第１の菌株及び前記第２の菌株は前記植物細胞を形質転換するための比率で混合される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１のＴ−ＤＮＡを前記第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
請求項１０８に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【請求項１１０】
請求項１０９に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記組換え発現カセットの前記形質遺伝子カセットを含む種子。
【請求項１１１】
発芽には、前記体細胞胚又はシュートを成熟培地又は発芽培地に移して、前記トランスジェニック植物を形成することが含まれる、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は植物分子生物学の分野に関し、より詳しくは、植物における遺伝子発現の調節に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５６２，６６３号に基づく優先権を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１８年８月２９日作成の２０１８０８２９＿７４５３ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５のファイル名を備え、９９５，５５６バイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
植物宿主の異種ＤＮＡ配列の発現は、植物宿主内で機能する作動可能に連結しているプロモーター、例えばプロモーターの存在に依存している。プロモーター配列の選択は、異種ＤＮＡ配列が生物内で何時何処で発現するかを決定するであろう。特定の組織又は器官での発現が望まれる場合、組織優先的プロモーターを使用し得る。刺激に反応した遺伝子発現が望まれる場合、誘導性プロモーターが調節エレメントとして選択される。対照的に、植物の細胞全体で継続的な発現が望まれる場合、構成的プロモーターが使用される。トランスジェニック植物の異種ヌクレオチド配列の発現レベルを変えるために、コアプロモーター配列の上流及び／又は下流の付加的調節配列を、形質転換ベクターの発現コンストラクトに含有させることができる。
【０００５】
植物の特定の組織又は器官のＤＮＡ配列を発現させることが望ましい場合がよくある。例えば、細胞の増殖を促進する、形態形成遺伝子に作動可能に連結している組織優先的プロモーターの使用は、形質転換プロセスにおけるトランスジェニックイベントの効率的な回収に有用である。そのような組織優先的プロモーターはまた、植物の収穫量や病原体に対する耐性を増強するため、所望の植物組織において形質遺伝子及び／又は病原体耐性タンパク質を発現させるのに有用である。或いは、所望の表現型を得るため、植物組織で天然ＤＮＡ配列の発現を阻害することが望ましい場合もあろう。この場合、そのような阻害は、アンチセンス配列の発現が、天然ＤＮＡ配列のｍＲＮＡの翻訳を妨げるＲＮＡの転写産物を産生するように、アンチセンスヌクレオチド配列に作動可能に連結した組織優先型プロモーターを含む植物の形質転換によって行われ得るであろう。
【０００６】
さらに、例えば細胞分化又は細胞伸長などの、特定の成長又は発達段階にある植物組織でＤＮＡ配列を発現させることが望ましいこともあり得る。そのようなＤＮＡ配列は、植物の成長プロセスを促進又は阻害し、それによって植物の成長速度又は構造に影響を及ぼすために使用され得る。
【０００７】
したがって、組織優先的プロモーター、特に形態形成遺伝子を含む成長促進遺伝子の発現を制御する調節エレメントとして機能し得るプロモーターを単離し特徴付ける必要がある。そのようなプロモーターはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換直後のインビトロでの成長及び形態形成を促進する遺伝子の強力な爆発的発現をもたらすが、その後は、異所性過剰発現が異常な成長及び発達を引き起こす植物組織において減少し、実質的に「オフ」となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
植物の遺伝子発現を調節するための組成物及び方法が提供される。より詳しくは、本開示のプロモーターは、植物組織の表皮Ｌ１（外層）における組織優先的発現を付与する。本開示の特定の態様は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の断片又は改変体（ここで、ヌクレオチド配列の断片又は改変体は、植物細胞において転写を開始する）；並びに、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチド（ここで、ヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチドは、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する組織優先的プロモーターを含む形態形成遺伝子カセットを含む核酸分子であって、組織優先的プロモーターは形態形成遺伝子に作動可能に連結されている核酸分子を含む。形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットもまた含まれる。形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含むベクターもまた含まれる。
【０００９】
さらに、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対し少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の断片又は改変体（ここで、ヌクレオチド配列の断片又は改変体は、植物細胞において転写を開始する）；並びに、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチド（ここで、ヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチドは、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する組織優先的プロモーターを含む形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞及び植物であって、組織優先的プロモーターは形態形成遺伝子に作動可能に連結されている植物細胞及び植物が提供される。形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞及び植物には、単子葉植物、双子葉植物、及び裸子植物が含まれる。形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞及び植物には、以下に限定されないが、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む、単子葉植物、双子葉植物、及び裸子植物が含まれる。本開示はまた、形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞又は植物であって、形態形成遺伝子カセットの形態形成遺伝子は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、植物細胞又は植物を提供する。また、形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞又は植物であって、形態形成遺伝子カセットの形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、植物細胞又は植物が提供される。
【００１０】
本開示はまた、形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞及び植物であって、発現カセットは、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットをさらに含む、植物細胞及び植物を提供する。本開示はまた、形態形成遺伝子カセットを含む発現カセットを含む植物細胞及び植物であって、発現カセットは、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセット、及びＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、植物細胞及び植物を提供する。また、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターが提供される。また、植物細胞及び植物であって、発現カセットの形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットは植物細胞及び植物において一時的に発現し、発現カセットの形質遺伝子カセットは植物細胞及び植物のゲノムに安定的に組み込まれる、植物細胞及び植物が提供される。また、植物細胞及び植物であって、発現カセットの形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットは植物細胞及び植物から切り出され、発現カセットの形質遺伝子カセットは植物細胞及び植物のゲノムに安定的に組み込まれる、植物細胞及び植物が提供される。発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、植物の種子も提供される。
【００１１】
本開示はさらに、植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチドを有し、転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセットを提供する。
【００１２】
また、植物又は植物細胞において転写を開始することができる機能的断片又は改変体を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、機能的断片又は改変体は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列に由来し、転写を開始することができる機能的断片又は改変体は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセットが提供される。
【００１３】
本開示はまた、植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセットを提供する。
【００１４】
また、植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセットが提供される。
【００１５】
植物又は植物細胞において転写を開始することができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つからなる群から選択され、転写を開始することができるヌクレオチド配列は、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、発現カセットもまた提供される。
【００１６】
また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、（ａ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列の断片若しくは改変体は、植物細胞において転写を開始する）；又は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、組織優先的プロモーターカセット、並びに（ｂ）栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする目的の異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することと；組換え発現カセットを有するトランスジェニック植物細胞を選択することと；トランスジェニック植物をトランスジェニック植物細胞から再生することとを含む、方法が提供される。
【００１７】
本開示のトランスジェニック植物を作製する方法に有用な単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、及び裸子植物細胞もまた提供される。本開示の方法に有用な植物細胞には、以下に限定されないが、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む、単子葉植物、双子葉植物、及び裸子植物が含まれる。
【００１８】
本開示はまた、植物細胞を作製する方法であって、本明細書中に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、形態形成遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、方法を提供する。また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、方法が提供される。
【００１９】
また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、組換え発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、方法が提供される。また、トランスジェニック植物を作製するための方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、方法が提供される。
【００２０】
また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、組換え発現カセットから組織優先的プロモーターカセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、方法が提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック植物もまた提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック植物から作製される組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む種子もまた提供される。
【００２１】
また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、組織優先的プロモーターカセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、方法が提供される。また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡ及び第２のＴ−ＤＮＡは、植物細胞を形質転換するための同じ菌株に存在する、方法が提供される。また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子もまた提供される。
【００２２】
また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、第１の菌株及び第２の菌株は植物細胞を形質転換するための比率で混合される、方法が提供される。また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのように作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子も提供される。
【００２３】
トランスジェニック植物を作製する方法であって、（ａ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一性であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列の断片若しくは改変体は、植物細胞において転写を開始する）；又は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は形態形成遺伝子に作動可能に連結されている、組織優先的プロモーターカセット、並びに（ｂ）栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする目的の異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することと；組換え発現カセットを有するトランスジェニック植物細胞を選択することと；トランスジェニック植物をトランスジェニック植物細胞から再生することとを含み、組換え発現カセットは、組換え発現カセットを含まないトランスジェニック植物細胞と比較して、体細胞胚成熟効率の改善をもたらす、方法。
【００２４】
また、本開示の体細胞胚成熟効率を改善する方法において有用な単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、及び裸子植物細胞が提供される。本開示の方法に有用な植物細胞には、以下に限定されないが、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む、単子葉植物、双子葉植物、及び裸子植物が含まれる。
【００２５】
本開示はまた、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、本明細書中に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、形態形成遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードし、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、方法を提供する。また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、形態形成遺伝子は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、方法が提供される。
【００２６】
また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、組換え発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、方法が提供される。また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、方法が提供される。
【００２７】
また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、組織優先的プロモーターカセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを組換え発現カセットから切り出すことをさらに含む、方法が提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック植物もまた提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック植物から作製される組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む種子もまた提供される。
【００２８】
また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、組織優先的プロモーターカセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、方法が提供される。また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡ及び第２のＴ−ＤＮＡは、植物細胞を形質転換するための同じ菌株に存在する、方法が提供される。また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子も提供される。
【００２９】
また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、第２のＴ−ＤＮＡが第２の菌株に存在し、第１の菌株及び第２の菌株は植物細胞を形質転換するための比率で混合される、方法が提供される。また、体細胞胚成熟効率を改善する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子も提供される。
【００３０】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、（ａ）配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列の断片若しくは改変体は、植物細胞において転写を開始する）；又は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、この植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、組織優先的プロモーターカセット、並びに（ｂ）栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする目的の異種ポリヌクレオチドを含む形質遺伝子カセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することと；形質転換された各植物細胞を発現させて体細胞胚又はシュートを形成させることと；体細胞胚を発芽させるか又はシュートを培養して、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を形成させること（ここで、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物は目的の異種ポリヌクレオチドを含む）とを含む、方法が提供される。本開示の方法はまた、双子葉植物細胞又は裸子植物細胞の形質転換の開始後約２１〜約２８日以内の体細胞胚又はシュート形成を提供する。
【００３１】
本開示のトランスジェニック植物を作製する方法において有用な裸子植物細胞もまた提供される。以下に限定されないが、マツ及びダグラスファーを含む本開示の方法に有用な裸子植物細胞もまた提供される。また、本開示のトランスジェニック植物を作製する方法において有用な双子葉植物細胞もまた提供される。以下に限定されないが、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、亜麻、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、メロン、又はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む本開示の方法に有用な双子葉植物細胞もまた提供される。
【００３２】
本開示はまた、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、双子葉植物細胞又は裸子植物細胞を、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで形質転換することを含み、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、方法を提供する。また、トランスジェニック植物を作製する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで植物細胞を形質転換することを含み、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードする、方法が提供される。
【００３３】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセットを含む組換え発現カセットで双子葉植物細胞又は裸子植物細胞を形質転換することを含み、組換え発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、本明細書に開示される組織優先的プロモーターカセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを含む組換え発現カセットで双子葉植物又は裸子植物を形質転換することを含み、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、方法が提供される。
【００３４】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、組換え発現カセットから組織優先的プロモーターカセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、方法が提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物もまた提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物から作製される組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む種子もまた提供される。
【００３５】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、組織優先的プロモーターカセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡ及び第２のＴ−ＤＮＡは、植物細胞を形質転換するための同じ菌株に存在する、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子もまた提供される。
【００３６】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、第１の菌株及び第２の菌株は双子葉植物細胞又は裸子植物細胞を形質転換するための比率で混合される、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子もまた提供される。
【００３７】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、（ａ）双子葉植物又は裸子植物の外植片の細胞を、目的の異種遺伝子を含む形質発現カセットと、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む形態形成遺伝子カセットとを含む組換え発現カセットで形質転換すること；（ｂ）形質転換された各細胞において（ａ）の組換え発現カセットを発現させて、体細胞胚又はシュートを形成すること；及び（ｃ）体細胞胚を発芽させるか、又はシュートを培養して、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を形成することを含む、方法が提供される。本開示の方法はまた、双子葉植物細胞又は裸子植物細胞の形質転換の開始後約２１〜約２８日以内の体細胞胚又はシュート形成を提供する。
【００３８】
また、本開示のトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法に有用な双子葉植物細胞、及び裸子植物細胞が提供される。本開示の方法に有用な植物細胞には、以下に限定されないが、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、亜麻、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、メロン、又はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む、双子葉植物及び裸子植物が含まれる。
【００３９】
本開示はまた、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる、方法を提供する。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する遺伝子産物をコードするヌクレオチドによってコードされる、方法が提供される。
【００４０】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、ＬＥＡ−Ｄ３４、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体、又は配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片からなる群から選択される、方法が提供される。
【００４１】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、目的の異種ポリヌクレオチドは、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する遺伝子産物をコードする、方法が提供される。
【００４２】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、組換え発現カセットは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２、Ｂ３、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３からなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む部位特異的リコンビナーゼカセットをさらに含み、部位特異的リコンビナーゼは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結されている、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）、若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４からなる群から選択される、方法が提供される。
【００４３】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、組換え発現カセットから形態形成遺伝子カセット及び部位特異的リコンビナーゼカセットを切り出すことをさらに含む、方法が提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物もまた提供される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物から作製される組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む種子もまた提供される。
【００４４】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、形態形成遺伝子カセットは第１のＴ−ＤＮＡを含み、形質遺伝子カセットは第２のＴ−ＤＮＡを含む、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡ及び第２のＴ−ＤＮＡは、植物細胞を形質転換するための同じ菌株に存在する、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック双子葉植物及びトランスジェニック裸子植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック双子葉植物及びトランスジェニック裸子植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子もまた提供される。
【００４５】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡは第１の菌株に存在し、第２のＴ−ＤＮＡは第２の菌株に存在し、第１の菌株及び第２の菌株は植物細胞を形質転換するための比率で混合される、方法が提供される。また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を作製する方法であって、第１のＴ−ＤＮＡを第２のＴ−ＤＮＡから分離することをさらに含む、方法が提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック植物もまた提供される。そのようにして作製されたトランスジェニック双子葉植物及びトランスジェニック裸子植物の種子であって、組換え発現カセットの形質遺伝子カセットを含む、種子もまた提供される。
【００４６】
また、トランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック双子葉植物を作製する方法であって、発芽は、体細胞胚又はシュートを成熟培地又は発芽培地に移すこと、及びトランスジェニック双子葉植物又はトランスジェニック裸子植物を形成することを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ＷＵＳ発現（ＨＢＳ２（ＰＨＰ８０７３４；配列番号１１３）、ＨＢＳ３（ＰＨＰ８１３４３；配列番号１１６）、ＬＴＰ３（ＰＨＰ８０７３０；配列番号１１２）、ＭＡＴＥ１（ＰＨＰ８０７３６；配列番号１１４）及びＮＥＤ１（ＰＨＰ８１０６０；配列番号１１５））を駆動するプロモーターＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ２（ＨＢＳ２；配列番号１０８）、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３（ＨＢＳ３；配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３（ＬＴＰ３；配列番号１２４）、ＧＭ−ＭＡＴＥ１（ＭＡＴＥ１；配列番号１０９）、ＧＭ−ＮＥＤ１（ＮＥＤ１；配列番号１１０）、並びにＴＡＧ−ＲＦＰ対照（ＷＵＳ遺伝子なし）（ＰＨＰ８０７２８；配列番号１１１）の体細胞胚成熟効率の中央値を示す。
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃの写真は、白色光下で撮影した。図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆの写真は、トランスジェニックイベントを示すために、蛍光灯下で撮影した。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆの写真は同時に撮影した（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染の５〜６週間後）。図２Ａ及び図２Ｄに示す体細胞胚、ＴＡＧ−ＲＦＰ対照処理（対照ＴＡＧ−ＲＦＰ；ＰＨＰ８０７２８；配列番号１１１）は小さく十分に発育していない。図２Ｂ及び図２Ｅに示す体細胞胚、ＬＴＰ３  ＰＲＯ：：ＷＵＳ（ＰＨＰ８０７３０；配列番号１１２）処理は、ＴＡＧ−ＲＦＰ対照処理より約２倍大きい。図２Ｃ及び図２Ｆに示す体細胞胚、ＨＢＳ３  ＰＲＯ：：ＷＵＳ（ＰＨＰ８１３４３；配列番号１１６）処理は、ＴＡＧ−ＲＦＰ対照処理よりも約５倍大きい。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、ＧＭ−ＨＢＳ３  ＰＲＯ：：ＷＵＳイベントの正常な発育及び結実を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下に、添付の図面を参照しながら本明細書中の開示をより詳しく説明するが、図面は可能な態様のいくつかを示すものであって全部ではない。実際、開示は、多くの異なる形態で具体化可能であり、本明細書中に記載した態様に限られると解釈すべきではなく、むしろ、これらの態様は、本開示が適用法的要件を満たすために提供される。
【００４９】
本明細書に開示する多くの変更及び他の態様は、本開示の組成物及び方法が関連する分野の当業者であって、以下の説明や添付の図面に提示された教示を利用できる者であれば、思い付くであろう。したがって、開示が、本明細書に開示した特定の態様に限定されるべきではなく、また、変更やその他の態様が添付の請求項の範囲に含まれることを意図していることは理解されるべきである。本明細書中には特定の用語が使用されるが、それらは、一般的且つ記述的意味でのみ使用されものであって、限定を目的として使用されるものではない。
【００５０】
また、本明細書に使用される専門用語は、単に特定の態様を説明するためのものであって、限定を目的とするものではないことも理解されるべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用する用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」態様が含まれ得る。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示の組成物及び方法が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。この後に続く本明細書及び特許請求の範囲においては、本明細書で定義する多くの用語について言及するであろう。
【００５１】
再生可能な植物構造体は、限定はされないが、シュート分裂組織、シュート、体細胞胚、胚発生カルス、体細胞分裂組織、及び／又は器官形成カルスなどの、完全に機能する稔性植物を形成することができる多細胞構造体と定義される。
【００５２】
体細胞胚は、球形の移行期にある胚の形成、胚軸及び胚盤の形成、並びに脂質及びデンプンの蓄積を含む、接合胚の発達に類似した発達段階を経て成長する多細胞構造体と定義される。接合胚から生じる単一の体細胞胚は発芽して、本来単細胞から生じ得る非キメラ植物体を作製する。
【００５３】
胚発生カルスは、成熟稔性植物に再生することができる増殖性の一次及び二次体細胞胚を包んでいる未分化の、又は部分的に未分化の細胞の脆い、又は脆くない混合物と定義される。
【００５４】
体細胞分裂組織は、葉原基が隣接し、維管束始原細胞によって包まれた、地上生育植物を生じさせる未分化の頂端ドームを有するとされる、種子由来の胚の一部である頂端分裂組織に類似した多細胞構造体と定義される。そのような体細胞分裂組織は、単一の分裂組織、又は融合した分裂組織の集まりを形成することができる。
【００５５】
器官形成カルスは、限定はされないが、頂端分裂組織、根分裂組織、葉及び根などの分化した成長する植物構造体のコンパクトな混合物と定義される。
【００５６】
発芽とは、小植物体を形成する再生可能な構造体の成長をいい、小植物体は成長を続けて植物を作る。
【００５７】
トランスジェニック植物は、導入遺伝子を含む成熟した稔性植物と定義される。
【００５８】
本開示は、形態形成遺伝子に作動可能に連結された組織優先的プロモーターを含む核酸分子に関する組成物及び方法、並びにそれらの使用方法に関する。本開示の核酸分子組成物は、形態形成遺伝子に作動可能に連結された、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３（配列番号１）、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３（トランケート型）（配列番号２）、ＡＴ−ＭＬ１（配列番号３）、ＧＭ−ＭＬ１−Ｌｉｋｅ（配列番号４）、ＧＭ−ＭＬ１−Ｌｉｋｅ（トランケート型）（配列番号５）、ＺＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３（配列番号６）、ＯＳ−ＨＢＳＴＡＲＴ３（配列番号７）、ＡＴ−ＰＤＦ１  Ｐ２（配列番号８）、ＧＭ−ＰＤＦ１（配列番号９）、ＧＭ−ＰＤＦ１（トランケート型）（配列番号１０）、ＳＢ−ＰＤＦ１（配列番号１１）、ＯＳ−ＰＤＦ１（配列番号１２）、ＯＳ−ＰＤＦ１（トランケート型）（配列番号１３）、ＰＴ−ＰＤＦ１（配列番号１４）、ＰＴ−ＰＤＦ１（トランケート型）（配列番号１５）、ＳＩ−ＰＤＦ１（配列番号１６）、ＳＩ−ＰＤＦ１（トランケート型）（配列番号１７）、ＡＴ−ＰＤＦ２（配列番号１８）、ＧＭ−ＰＤＦ２（配列番号１９）、ＧＭ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号２０）、ＺＭ−ＧＬ１（配列番号２１）、ＡＴ−ＰＤＦ２ａ（配列番号２２）、ＡＴ−ＰＤＦ２ａ（トランケート型）（配列番号２３）、ＧＭ−ＰＤＦ２ａ（配列番号２４）、ＧＭ−ＰＤＦ２ａ（トランケート型）（配列番号２５）、ＯＳ−ＰＤＦ２（配列番号２６）、ＯＳ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号２７）、ＰＴ−ＰＤＦ２（配列番号２８）、ＰＴ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号２９）、ＶＶ−ＰＤＦ２（配列番号３０）、ＶＶ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号３１）、ＺＭ−ＰＤＦ２（配列番号３２）、ＳＩ−ＰＤＦ２（配列番号３３）、ＳＩ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号３４）、ＶＶ−ＰＤＦ２ａ（配列番号３５）、ＰＴ−ＰＤＦ２ａ（配列番号３６）、ＰＴ−ＰＤＦ２ａ（トランケート型）（配列番号３７）、ＭＴ−ＰＤＦ２（配列番号３８）、ＭＴ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号３９）、ＡＴ−ＨＤＧ２（配列番号４０）、ＧＭ−ＨＤＧ２（配列番号４１）、ＧＭ−ＨＤＧ２（トランケート型）（配列番号４２）、ＳＢ−ＨＤＧ２（配列番号４３）、ＳＢ−ＨＤＧ２（トランケート型）（配列番号４４）、ＡＴ−ＣＥＲ６（配列番号４５）、ＡＴ−ＣＥＲ６０（配列番号４６）、ＡＴ−ＣＥＲ６０（トランケート型）（配列番号４７）、ＧＭ−ＣＥＲ６（配列番号４８）、ＧＭ−ＣＥＲ６（トランケート型）（配列番号４９）、ＰＴ−ＣＥＲ６（配列番号５０）、ＰＴ−ＣＥＲ６（トランケート型）（配列番号５１）、ＶＶ−ＣＥＲ６（配列番号５２）、ＶＶ−ＣＥＲ６（トランケート型）（配列番号５３）、ＳＢ−ＣＥＲ６（配列番号５４）、ＺＭ−ＣＥＲ６（配列番号５５）、ＳＩ−ＣＥＲ６（配列番号５６）、ＳＩ−ＣＥＲ６（トランケート型）（配列番号５７）、ＯＳ−ＣＥＲ６（配列番号５８）、ＯＳ−ＣＥＲ６（トランケート型）（配列番号５９）、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ２（配列番号１０８）、ＧＭ−ＭＡＴＥ１（配列番号１０９）、ＧＭ−ＮＥＤ１（配列番号１１０）、ＧＭ−ＬＴＰ３（配列番号１２４）、ＡＴ−ＭＬ１（トランケート型）���配列番号１２５）、ＡＴ−ＣＥＲ６（トランケート型１）（配列番号１２６）、ＡＴ−ＰＤＦ１（トランケート型）（配列番号１４９）、ＡＴ−ＰＤＦ２（トランケート型）（配列番号１５０）、ＡＴ−ＨＤＧ２（トランケート型）（配列番号１５１）、ＡＴ−ＡＮＬ２（配列番号１５２）、及びＡＴ−ＣＥＲ６（トランケート型２）（配列番号１８９）として知られる組織優先的プロモーターのヌクレオチド配列を含む。本開示は、形態形成遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９に記載のヌクレオチド配列、並びにそれらの断片及び改変体の少なくとも１つを含む核酸分子を提供する。本組成物は、形態形成遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９に記載のヌクレオチド配列番号に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、発現カセット、ＤＮＡコンストラクト、及びベクターをさらに含む。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「本明細書に開示される組織優先的プロモーター」という用語は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対し少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の断片又は改変体（ここで、断片又は改変体は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチド（ここで、ヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチドは、植物細胞において転写を開始する）；並びに、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００ｂｐの断片（ここで、ヌクレオチド配列の少なくとも１００ｂｐの断片は、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「形態形成遺伝子」は、異所的に発現した場合に、植物を作製することができる体細胞から発生した構造体の形成を刺激する遺伝子を意味する。より正確には、形態形成遺伝子の異所性発現が、植物を作製することができる体細胞胚又はシュート分裂組織などの器官形成構造体のデノボ形成を刺激する。この刺激によるデノボ形成は、形態形成遺伝子が発現した細胞、又は隣接細胞で起こる。形態形成遺伝子は、他の遺伝子の発現を調節する転写因子、又は植物組織中のホルモン濃度に影響する遺伝子であり得、これらはいずれも形態形成変化を刺激することができる。形態形成遺伝子は、植物のゲノムに安定に組み込んだり、一時的に発現させたりすることができる。本開示の組織優先的プロモーターは、ＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子（ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５、又はＷＯＸ９）などの、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せに関与する形態形成遺伝子を発現させるために使用される。米国特許第７，３４８，４６８号明細書及び同第７，２５６，３２２号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書及び同第２００７／０２７１６２８号明細書；Ｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：８７−９６；及びＭａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：８０５−８１５；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒａａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：２４８；Ｄｏｌｚｂｌａｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １９：１０２８−３９を参照されたい。ＷＵＳ／ＷＯＸの調節は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、再生、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュートの分化及び／若しくは発達、又はそれらの組合せを含む植物及び／又は植物組織表現型を調節すると考えられる。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳの発現は栄養組織に幹細胞を誘導することができ、これは体細胞胚に分化することができる（Ｚｕｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３０：３４９−３５９）。この点に関して、ＭＹＢ１１８遺伝子（米国特許第７，１４８，４０２号明細書を参照）、ＭＹＢ１１５遺伝子（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２４−２３５を参照）、ＢＡＢＹＢＯＯＭ遺伝子（ＢＢＭ；Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ１４：１７３７−１７４９を参照）、又はＣＬＡＶＡＴＡ遺伝子（例えば、米国特許第７，１７９，９６３号明細書を参照）もまた興味深い。
【００６１】
本開示に有用な形態形成遺伝子には、当該技術分野において知られるＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子及び本明細書に開示される遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。形態形成遺伝子には、ＡＴ−ＷＵＳ（配列番号６０）、ＬＪ−Ｗ（配列番号６２）、ＧＭ−Ｗ（配列番号６４）、ＣＳ−ＷＵＳ（配列番号６６）、ＣＲ−ＷＵＳ（配列番号６８）、ＡＡ−ＷＵＳ（配列番号７０）、ＲＳ−ＷＵＳ（配列番号７２）、ＢＮ−ＷＵＳ（配列番号７４）、ＢＯ−ＷＵ（配列番号７６）、ＨＡ−ＷＵＳ（配列番号７８）、ＰＴ−ＷＵＳ（配列番号８０）、ＶＶ−ＷＵＳ（配列番号８２）、ＡＴ−ＷＵＳ（ダイズ最適化）（配列番号８４）、ＬＪ−ＷＵＳ（ダイズ最適化）（配列番号８６）、ＭＴ−ＷＵＳ（ダイズ最適化）（配列番号８８）、ＰＹ−ＷＵＳ（ダイズ最適化）（配列番号９０）、ＰＶ−ＷＵＳ（ダイズ最適化）（配列番号９２）、ＺＭ−ＷＵＳ１（配列番号９４）、ＺＭ−ＷＵＳ２（配列番号９６）、ＺＭ−ＷＵＳ３（配列番号９８）、ＺＭ−ＷＯＸ２Ａ（配列番号１００）、ＺＭ−ＷＯＸ４（配列番号１０２）、ＺＭ−ＷＯＸ５Ａ（配列番号１０４）、ＺＭ−ＷＯＸ９（配列番号１０６）、ＧＧ−ＷＵＳ（配列番号１２７）、ＭＤ−ＷＵＳ（配列番号１２９）、ＭＥ−ＷＵＳ（配列番号１３１）、ＫＦ−ＷＵＳ（配列番号１３３）、ＧＨ−ＷＵＳ（配列番号１３５）、ＺＯＳＭＡ−ＷＵＳ（配列番号１３７）、ＡＭＢＴＲ−ＷＵＳ（配列番号１３９）、ＡＣ−ＷＵＳ（配列番号１４１）、ＡＨ−ＷＵＳ（配列番号１４３）、ＣＵＣＳＡ−ＷＵＳ（配列番号１４５）、及びＰＩＮＴＡ−ＷＵＳ（配列番号１４７）を含む本明細書に開示されるＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書に開示されるＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子は、ＡＴ−ＷＵＳ（配列番号６１）、ＬＪ−Ｗ（配列番号６３）、ＧＭ−Ｗ（配列番号６５）、ＣＳ−ＷＵＳ（配列番号６７）、ＣＲ−ＷＵＳ（配列番号６９）、ＡＡ−ＷＵＳ（配列番号７１）、ＲＳ−ＷＵＳ（配列番号７３）、ＢＮ−ＷＵＳ（配列番号７５）、ＢＯ−ＷＵ（配列番号７７）、ＨＡ−ＷＵＳ（配列番号７９）、ＰＴ−ＷＵＳ（配列番号８１）、ＶＶ−ＷＵＳ（配列番号８３）、ＡＴ−ＷＵＳ（配列番号８５）、ＬＪ−ＷＵＳ（配列番号８７）、ＭＴ−ＷＵＳ（配列番号８９）、ＰＹ−ＷＵＳ（配列番号９１）、ＰＶ−ＷＵＳ（配列番号９３）、ＺＭ−ＷＵＳ１（配列番号９５）、ＺＭ−ＷＵＳ２（配列番号９７）、ＺＭ−ＷＵＳ３（配列番号９９）、ＺＭ−ＷＯＸ２Ａ（配列番号１０１）、ＺＭ−ＷＯＸ４（配列番号１０３）、ＺＭ−ＷＯＸ５Ａ（配列番号１０５）、ＺＭ−ＷＯＸ９（配列番号１０７）、ＧＧ−ＷＵＳ（配列番号１２８）、ＭＤ−ＷＵＳ（配列番号１３０）、ＭＥ−ＷＵＳ（配列番号１３２）、ＫＦ−ＷＵＳ（配列番号１３４）、ＧＨ−ＷＵＳ（配列番号１３６）、ＺＯＳＭＡ−ＷＵＳ（配列番号１３８）、ＡＭＢＴＲ−ＷＵＳ（配列番号１３０）、ＡＣ−ＷＵＳ（配列番号１４２）、ＡＨ−ＷＵＳ（配列番号１４４）、ＣＵＣＳＡ−ＷＵＳ（配列番号１４６）、及びＰＩＮＴＡ−ＷＵＳ（配列番号１４８）を含むＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする。
【００６３】
本明細書に開示されるＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子はＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする遺伝子を含み、このＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、若しくは１４８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、若しくは１４７いずれかのヌクレオチド配列によってコードされる。
【００６４】
本開示に有用な他の形態形成遺伝子には、ＬＥＣ１（Ｌｏｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９３：１１９５−１２０５）、ＬＥＣ２（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＮＡＳ  １０５：３１５１−３１５６；Ｂｅｌｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ  １１３：５４３−５５３）、ＫＮ１／ＳＴＭ（Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７：７８７−７９５）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＩＰＴ遺伝子（Ｅｂｉｎｕｍａ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｍｉｎｅ，２００１，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ−Ｐｌａｎｔ  ３７：１０３−１１３）、ＭＯＮＯＰＴＥＲＯＳ−ＤＥＬＴＡ（Ｃｋｕｒｓｈｕｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．２０４：５５６−５６６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＶ−６ｂ遺伝子（Ｗａｂｉｋｏ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｍｕｒａ  １９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：９３９−９５１）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＡ−ｈ及びＩＡＡ−ｍ遺伝子の組み合わせ（Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２０：９２３−９２８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＳＥＲＫ遺伝子（Ｈｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７：８０３−８１６）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｏｐｓｉｓ）ＡＧＬ１５遺伝子（Ｈａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：６５３−６６３）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「転写因子」は、プロモーターのＤＮＡ配列に結合し、発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることによって、特異的遺伝子の転写速度を制御するタンパク質を意味する。形態形成遺伝子でもある転写因子の例には、ＡＰ２／ＥＲＥＢＰファミリー（ＢＢＭ（ＯＤＰ２）を含む）のメンバー、多血症及びアインテグメンタサブファミリー、ＬＥＣ１及びＨＡＰ３などのＣＡＡＴボックス結合タンパク質、並びにＭＹＢ、ｂＨＬＨ、ＮＡＣ、ＭＡＤＳ、ｂＺＩＰ及びＷＲＫＹファミリーのメンバーが含まれる。
【００６６】
一態様では、組換え発現カセット又はコンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。種々の態様においては、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換の開始後約２１〜約２８日の間に起こる。
【００６７】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、部位特異的リコンビナーゼによる切除を標的となり得る。したがって、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換後の所望の時点での切除によって制御され得る。部位特異的リコンビナーゼが、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を制御するために使用される場合、発現コンストラクトは切除されるべきポリヌクレオチド配列に隣接する適切な部位特異的切除部位（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼが利用される場合、Ｃｒｅ  ｌｏｘ部位）を含むと理解される。部位特異的リコンビナーゼが、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトに共に位置する必要はない。しかし、一態様では、発現コンストラクトは、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００６８】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を制御するために使用される部位特異的リコンビナーゼは、種々の好適な部位特異的リコンビナーゼから選択することができる。例えば、種々の態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、ＦＬＰｅ、ＫＤ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ラムダＩｎｔ、ファイＣ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｂ２（Ｎｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．３４  ｐｐ１４１９８−１４２０３）、Ｂ３（Ｎｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．３４  ｐｐ１４１９８−１４２０３）、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、又はＵ１５３である。部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドであり得る。不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｇ１７Ａ）〜ＣＲＥ又はＥＳＲ（Ｇ１７Ａ）〜ＣＲＥであり得る。
【００６９】
一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発生調節プロモーターに作動可能に連結している。好適な構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、及び発生調節プロモーターとしては、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２（Ｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：８４９−８６０及び米国特許第５５２５７１６号明細書）、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ、７ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、又はＬＥＡ−Ｄ３４が挙げられる。
【００７０】
一態様では、部位特異的リコンビナーゼに作動可能に連結している化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。化学誘導性プロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）、エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）、又はクロルスルフロンリプレッサー（ＣＲ）により抑制することができ、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンド又はスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。リプレッサーはＴＥＴＲであり得、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリン又はアンヒドロテトラサイクリンである  （Ｇａｔｚ，Ｃ．，Ｆｒｏｈｂｅｒｇ，Ｃ．ａｎｄ  Ｗｅｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．（１９９２）Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＣａＭＶ  ３５Ｓ  
ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，３９７−４０４）。或いは、リプレッサーはＥＳＲであり得、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、又はハロスルフロンである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０２８７９３６号明細書）。
【００７１】
一態様では、発現コンストラクトが部位特異的リコンビナーゼ切除部位を含む場合、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、オーキシン誘導性プロモーター、発達的調節プロモーター、組織特異的プロモーター、又は構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。これに関連して有用な、例示的なオーキシン誘導性プロモーター、発達的調節プロモーター、組織特異的プロモーター、及び構成的プロモーターとしては、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、ＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）、ＡＸＩＧ１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３８，５９３号明細書）、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、ＡＴ−ＨＳＰ８１１（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９（２）：３８３−３９０）、ＡＴ−ＨＳＰ８１１Ｌ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９（２）：３８３−３９０）、ＧＭ−ＨＳＰ１７３Ｂ（Ｓｃｈｏｅｆｆｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３（１１）：２４９１−２４９７）、テトラサイクリン、エタメツルフロン（ｅｔｈａｍｅｔｈｓｕｌｆｕｒｏｎ）若しくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーター、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＳＤＲ、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、ＬＥＡ−Ｄ３４、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体、又は配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片が挙げられる。
【００７２】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の適切な発現期間は、以下に限定されないが、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの断片若しくは改変体、又は配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの少なくとも１００ｂｐの断片を含む、本明細書に開示の組織優先的プロモーターを使用することによって達成することができる。形態形成遺伝子カセット及び形質遺伝子カセットを用いてトランスジェニック植物を作製する場合、形質遺伝子のみを含むトランスジェニック植物を提供するために、共形質転換植物において形質遺伝子座から形態形成遺伝子座を分離する能力を有することが望ましい。これは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の２つのＴ−ＤＮＡを有するバイナリーシステムを用いて達成することができ、この一般的なテーマには２つのバリエーションがある（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照）。例えば、第１の２つのＴ−ＤＮＡを有するベクターでは、形態形成遺伝子及び除草剤選択（すなわち、ＨＲＡ）のための発現カセットが第１のＴ−ＤＮＡ内に含まれ、形質遺伝子カセットが第２のＴ−ＤＮＡ内に含まれる。ここで、両Ｔ−ＤＮＡは単一のバイナリーベクター上に存在する。２つのＴ−ＤＮＡを有するプラスミドを含むアグロバクテリウムによって植物細胞が形質転換されると、形質転換細胞は高い割合で、異なるゲノム上の位置（たとえば、異なる染色体上）に組み込まれた両Ｔ−ＤＮＡを含む。第２の方法では、例えば、それぞれ２つのＴ−ＤＮＡのうちの１つ（形態形成遺伝子Ｔ−ＤＮＡと形質遺伝子Ｔ−ＤＮＡのいずれか）を含む２つのアグロバクテリア株をある比率で混合し、その混合物を形質転換に用いる。この混合アグロバクテリウム法による形質転換では、回収されたトランスジェニックイベントが両方のＴ−ＤＮＡを（多くの場合、別々のゲノム位置に）含むことが高頻度で観察されている。作製されたトランスジェニックイベントの大半で２つのＴ−ＤＮＡ遺伝子座が独立に分離し、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子座が互いに分離した子孫Ｔ１植物を容易に特定でき、形質遺伝子を含み、形態形成遺伝子／除草剤遺伝子を持たない子孫種子が回収されることが、両方の同時形質転換法で観察されている。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １１（４）：３８１−９６を参照されたい。
【００７３】
本明細書で提供される方法では、目的のヌクレオチド配列が組み込まれた再生可能な植物細胞を作製するために、細菌媒介及び／又は微粒子銃媒介遺伝子導入を使用している。本開示の方法において有用な菌株としては、非武装化アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、又はリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌が含まれるが、これらに限定されない。一態様では、異なる菌株は、（ｉ）非武装化アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、（ｉｉ）非武装化アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌、並びに（ｉｉｉ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌及びオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌から選択される。
【００７４】
本方法において有用な非武装化アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）としては、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４、及びＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本方法において有用なオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌株としては、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｂ−６７０７８、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・オリザエ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクトラム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７、オクロバクテリウム・ペコリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｐｅｃｏｒｉｓ）、オクロバクテリウム・シセリＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ、オクロバクテリウム・ガリニファエシス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｇａｌｌｉｎｉｆａｅｃｉｓ）、オクロバクトラム・グリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ガングゾウエンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ハエマトフィルム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｍ）、オクロバクテリウム・インターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム・ルピニ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ）、オクロバクテリウム・ピツイトスム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｉｔｕｉｔｏｓｕｍ）、オクロバクテリウム・シュードインターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム・シュードグリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・リゾスファエラエ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、オクロバクテリウム・チオフェニボランス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｈｉｏｐｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）及びオクロバクトラム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本方法に有用なリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌株としては、リゾビウム・ラシタナム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｓｉｔａｎｕｍ）、リゾビウム・リゾゲンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｂｉ）、リゾビウム・マルチホスピティウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｈｏｓｐｉｔｉｕｍ）、リゾビウム・トロピシー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）、リゾビウム・ミルオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｉｌｕｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ．ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）Ｍａｄｉｓｏｎ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２３７０、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２４０８、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２６６８、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２３７０Ｇ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２３７０ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２０４８Ｇ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２０４８ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．Ｐｈａｓｅｏｌｉ）２６６８Ｇ、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）２６６８ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＲＬ５４２Ｃ、リゾビウム・エトリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ）ＵＳＤＡ９０３２、リゾビウム・エトリー・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉｂｖ．Ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・エンドフィティクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・ティベティクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｉｂｅｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・エトリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・ピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｐｉｓｉ）、リゾビウム・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・ファバエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆａｂａｅ）、リゾビウム・ハイナネンセ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｈａｉｎａｎｅｎｓｅ）、アルスロバクター・ビスコーズス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、リゾビウム・アラミ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ａｌａｍｉｉ）、リゾビウム・メソシニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｓｉｎｉｃｕｍ）、リゾビウム・スラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｕｌｌａｅ）、リゾビウム・インディゴフフェラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｅ）、リゾビウム・ガリカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、リゾビウム・ヤンリンゲンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｙａｎｇｌｉｎｇｅｎｓｅ）、リゾビウム・モンゴレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、リゾニウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾビウム・ロエセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｅｓｓｅｎｓｅ）、リゾビウム・ツボネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｕｂｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・セルロシリティクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・ソリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｏｌｉ）、ネオリゾビウム・ガレガエ（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇａｌｅｇａｅ）、ネオリゾビウム・ビグナエ（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｇｎａｅ）、ネオリゾビウム・フアウトレンス（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｈｕａｕｔｌｅｎｓｅ）、ネオリゾビウム・アルカリソリ（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ａｌｋａｌｉｓｏｌｉ）、アウレイモナス・アルタミレンシエ（Ａｕｒｅｉｍｏｎａｓａｌｔａｍｉｒｅｎｓｉｓ）、アウレイモナス・フリジダクアエ（Ａｕｒｅｉｍｏｎａｓ  ｆｒｉｇｉｄａｑｕａｅ）、アウレイモナス・ウレイリティカ（Ａｕｒｅｉｍｏｎａｓ  ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アウランティモナス・コラリシダ（Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒａｌｉｃｉｄａ）、フルビマリナ・ペラギ（Ｆｕｌｖｉｍａｒｉｎａ  ｐｅｌａｇｉ）、マルテレラ・メディテラネア（Ｍａｒｔｅｌｅｌｌａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、アゾリゾビウム・ウンディコーラ（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｕｎｄｉｃｏｌａ）、アロリゾビウム・ウィティス（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）、アロリゾビウム・ボルボリ（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｂｏｒｂｏｒ）、ベイジェリンキア・フルミネンシス（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｆｌｕｍｉｎｅｎｓｉｓ）、アグロバクテイルム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテイルム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・セレニティレデゥセンスコリグ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ｃｏｒｒｉｇ）、リゾビウム・ロセッテイフォルマンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒｏｓｅｔｔｉｆｏｒｍａｎｓ）、リゾビウム・ダエジェオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・アグレガツム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、パラリゾビウム・カプスラツム（Ｐａｒａｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、パラリゾビウム・ジャルディニィイ（Ｐａｒａｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇｉａｒｄｉｎｉｉ）、エンシフェル・メキシカヌス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｍｅｘｉｃａｎｕｓ）、エンシフェル・テランガエ（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｔｅｒａｎｇａｅ）、エンシフェル・サエリ（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｓａｈｅｌｉ）、エンシフェル・コスティエンシス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｋ���ｓｔｉｅｎｓｉｓ）、エンシフェル・クメロウィアエ（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｋｕｍｍｅｒｏｗｉａｅ）、エンシフェル・フレディイ（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｆｒｅｄｉｉ）、シノリゾビウム・アメリカヌム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、エンシフェル・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｒｂｏｒｉｓ）、エンシフェル・ガラマンティクス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｇａｒａｍａｎｔｉｃｕｓ）、エンシフェル・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、エンシフェル・ヌミディクス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｎｕｍｉｄｉｃｕｓ）、エンシフェル・アダエレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＳＤ６３０、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＵＳＤＡ１００２、シノリゾビウム・フレディイ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＵＳＤＡ２０５、シノリゾビウム・フレディイ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＳＦ５４２Ｇ、シノリゾビウム・フレディイ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＳＦ４４０４、及びシノリゾビウム・フレディイ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＳＭ５４２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，３６５，８５９号明細書を参照されたい。
【００７７】
一態様では、第１の菌株及び第２の菌株は５０：５０の比で存在する。一態様では、第１の菌株及び第２の菌株は２５：７５の比で存在する。一態様では、第１の菌株及び第２の菌株は１０：９０の比で存在する。一態様では、第１の菌株及び第２の菌株は５：９５の比で存在する。一態様では、第１の菌株及び第２の菌株は１：９９の比で存在する。一態様では、第１の菌株と第２の菌株は異なる菌株である。
【００７８】
本開示のプロモーターには、植物において転写を開始させるヌクレオチド配列が含まれる。特定の態様では、プロモーターは、組織優先的に転写を開始させる。本開示のコンストラクトは、形態形成遺伝子に作動可能に連結された、本明細書中に開示される組織優先的プロモーターを含む。
【００７９】
本明細書に開示される組織優先的プロモーターはまた、目的の植物における異種ポリヌクレオチド又は目的のポリヌクレオチドのその後の発現のための発現カセット又はベクターの構築において、又は他のプロモーターを単離するためのプローブとして使用される。本開示は、形態形成遺伝子に作動可能に連結された配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに記載のプロモーターヌクレオチド配列を含み、任意選択によりさらに異種ポリヌクレオチド又は目的のポリヌクレオチドを含む、単離されたＤＮＡコンストラクトを提供する。
【００８０】
本開示の態様は、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つ（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対し少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、ヌクレオチド配列は、植物細胞において転写を開始する）；配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の断片又は改変体（ここで、断片又は改変体は、植物細胞において転写を開始する）；並びに、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチド（ここで、ヌクレオチド配列の少なくとも１００の連続するヌクレオチドは、植物細胞において転写を開始する）；並びに、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのヌクレオチド配列の少なくとも１００ｂｐの断片（ここで、ヌクレオチド配列の少なくとも１００ｂｐの断片は、植物細胞において転写を開始する）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有し、形態形成遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターを含み、且つ任意選択によりさらに異種ポリヌクレオチド又は目的のポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。また、核酸を含むプロモーターを含む発現カセット、発現カセットを含むベクター、及び発現カセットを含む植物細胞も具体化されている。さらなる態様は、単子葉又は双子葉の植物細胞であるか単子葉又は双子葉の植物であるかにかかわらず、発現カセットが一時的に発現するか、又は植物細胞又は植物のゲノムに安定に組み込まれている植物細胞又は植物、並びに単子葉又は双子葉の植物であるか、単子葉又は双子葉の植物であるか、単子葉又は双子葉の植物細胞であるか、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む植物であるかにかかわらず、本明細書に記載の発現カセットを含む植物細胞又は植物を含む。
【００８１】
また、植物のゲノムに安定に組み込まれた本明細書に記載の発現カセットを有する植物、この植物の種子であって、そのような発現カセットを含む種子も具体化されている。さらに、異種ポリヌクレオチド又は目的ポリヌクレオチドの遺伝子又は遺伝子産物が、栄養増強、収量増加、非生物的ストレス耐性、干ばつ耐性、寒冷耐性、除草剤耐性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素使用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、又は代謝経路を変更する能力を付与する植物も具体化されている。異種ポリヌクレオチド又は目的ポリヌクレオチドの発現が前記植物の表現型を変化させる植物もまた具体化されている。また、プロモーター活性を有する機能的断片であって、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に由来し、形態形成遺伝子に作動可能に連結されている断片を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットも具体化されている。
【００８２】
本開示は、単離された、又は実質的に精製された核酸組成物を包含する。「単離された」又は「精製された」核酸分子、或いはその生物活性部分は、組換え技術によって生成されたときには、他の細胞物質も培地も実質的に含んでおらず、また、化学的に合成された場合には、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含んでいない。「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接している配列（タンパク質コード配列を含む）（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を実質的に有していない。例えば、各種態様においては、単離された核酸分子が含有する、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸分子に隣接しているヌクレオチド配列は、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満であり得る。本開示の配列は、それぞれの転写開始部位に隣接している５’末端側非翻訳領域から単離することができる。
【００８３】
本開示のプロモーターヌクレオチド配列の断片及び改変体もまた、本開示に包含されている。配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つのプロモーター配列の断片及び改変体は、本開示のＤＮＡコンストラクトにおいて使用され得る。本明細書で使用する場合、用語「断片」は、核酸配列の一部を指す。プロモーターの断片は、構成的方法で転写を駆動するなどの、転写開始の生物学的活性を保持している。或いは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、必ずしも生物学的活性を保持していないことがある。本明細書に開示されるプロモーターのヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０、１９７５、２０００、２０２５、２０５０、２０７５、２１００、２１２５、２１５０、２１７５、２２００、２２２５、２２５０、２２７５、２３００、２３２５、２３５０、２３７５、２４００、２４２５、２４５０、２４７５、２５００、２５２５、２５５０、２５７５、２６００、２６２５、２６５０、２６７５、２７００、２７２５、２７５０、２７７５、２８００、２８２５、２８５０、２８７５、２９００、２９２５、２９５０、２９７５、３０００、３０２５、３０５０、３０７５、３１００、３１２５、３１５０、３１７５、３２００、３２２５、３２５０、３２７５、３３００、３３２５、３３５０、３３７５、３４００、３４２５、３４５０、３４７５、３５００、３５２５、３５５０、３５７５、３６００、３６２５、３６５０、３６７５、３７００、３７２５、３７５０、３７７５、３８００、３８２５、３８５０、３８７５、３９００、３９２５、３９５０、３９７５、４０００、４０２５、４０５０、４０７５、４１００、４１２５、４１５０、４１７５、４２００、４２２５、４２５０、４２７５、４３００、４３２５、４３５０、４３７５、４４００、４４２５、４４５０、４４７５、４５００、４５２５、４５５０、４５７５、４６００、４６２５、４６５０、４６７５、４７００、４７２５、４７５０、４７７５、４８００、４８２５、４８５０、４８７５、４９００、４９２５、４９５０、４９７５、５０００、５０２５、５０５０、５０７５、５１００、５１２５、５１５０、５１７５、５２００、５２２５、５２５０、５２７５、５３００、５３２５、５３５０、５３７５、５４００、５４２５、５４５０、５４７５、５５００、５５２５、５５５０、５５７５、５６００、５６２５、５６５０、５６７５、５７００、５７２５、５７５０、５７７５、５８００、５８２５、５８５０、５８７５、５９００、５９２５、５９５０、５９７５、６０００、６０２５、６０５０、６０７５、６１００、６１２５、６１５０、６１７５、６２００、又は６２２５のヌクレオチドから、配列番号１〜５９、１０８〜１１０、１２４〜１２６、１４９〜１５２、及び１８９の少なくとも１つの完全長までの範囲であり得る。プロモーターの生物活性部分は、本開示のプロモーター配列の一部を単離し、その部分のプロモーター活性を評価することによって調製することができる。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「改変体」は、本明細書に開示のプロモーターと実質的類似性を有する配列を意味する。改変体は、天然のポリヌクレオチドの１つ以上の内部部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失及び／若しくは付加、並びに／又は天然のポリヌクレオチドの１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用する場合、「天然の」ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列では、天然に存在する改変体は、よく知られた分子生物学的手法、例えば、ポリヌクレアーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や、本明細書で概説しているようなハイブリダイゼーション法を用いて同定することができる。
【００８５】
改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的変異誘発などを使用して生成されたものなど、合成的に作られたヌクレオチド配列を含む。一般に、本明細書に開示のヌクレオチド配列の改変体は、本明細書の他の箇所に記載の配列アライメントプログラム（デフォルトパラメーターを使用）で測定したとき、そのヌクレオチド配列に対し少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有するであろう。本明細書に開示のヌクレオチド配列の生物学的に活性な改変体もまた包含される。生物学的に活性な改変体としては、例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を有する、本明細書に開示のヌクレオチド配列の天然のプロモーター配列が挙げられる。プロモーターの活性は、ノーザンブロット解析、転写融合体で行うレポーター活性測定などの手法を用いて測定することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。或いは、プロモーターの断片又は改変体の制御下で生成される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などのレポーター遺伝子のレベルを測定することができる。例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９６９−９７３、米国特許第６，０７２，０５０号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｎａｇａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（１）：８７−９０を参照されたい。改変体ヌクレオチド配列にはまた、ＤＮＡシャフリングなどの変異組換え誘導法により生成される配列も包含される。そのような方法では、プロモーター用の１つ以上の異なるヌクレオチド配列が、新しいプロモーターを作り出すために操作され得る。このようにして、実質的な配列同一性を有し、インビトロ又はインビボで相同的に組換えることができる配列領域を含む関連配列のポリヌクレオチドの集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリーが作られる。このようなＤＮＡシャフリングのための戦略は当該技術分野で知られている。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１、Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９  ３９１、Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８、Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９、Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１並びに米国特許第５，��０５，７９３号明細書及び同第５，８３７，４５８号明細書（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８６】
変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は当該技術分野で知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号明細書、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びこれらに引用されている参考文献（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８７】
本開示のヌクレオチド配列は、他の生物、特には他の植物、より特には他の単子葉植物又は双子葉植物から対応する配列を単離するために使用することができる。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法は、本明細書に記載の配列に対する配列相同性に基づいてそのような配列を同定するのに使用することができる。本明細書に記載の全配列又はそれらの断片に対する配列同一性に基づいて単離された配列は、本開示に包含される。
【００８８】
ＰＣＲ法では、任意の目的の植物から抽出したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計する方法及びＰＣＲクローニングの方法は当該技術分野では一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。知られているＰＣＲ方法としては、限定はされないが、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【００８９】
ハイブリダイゼーション手法では、既知のヌクレオチド配列の全て又は一部を、選択した生物からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片の集団（すなわち、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリー）に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用する。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又は他のオリゴヌクレオチドであり得、３２Ｐなどの検出用基又は他の検出用マーカーで標識することができる。このように、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本開示のプロモーターをベースとする合成オリゴヌクレオチドを標識化することにより作製することができる。ハイブリダイゼーション用プローブの調製方法、及びゲノムライブラリーの構築方法は、当該技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に開示されている。
【００９０】
例えば、本明細書に開示の全プロモーター配列、又はその１つ以上の部分を、対応するプロモーター配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用することができる。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを行うために、そのようなプローブは、プロモーター配列に特有で、長さが一般に少なくとも約１０ヌクレオチド長又は少なくとも約２０ヌクレオチド長の配列を含む。そのようなプローブは、ＰＣＲにより選択された植物からの対応するプロモーター配列を増幅するために使用することができる。この手法は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために、又は生物中のコード配列の存在を決定する診断アッセイとして使用することができる。ハイブリダイゼーション手法には、プレーティングしたＤＮＡライブラリー（プラーク又はコロニー、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照）のハイブリダイゼーションスクリーニングが含まれる。
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブが他の配列よりその標的配列により検出できる程度に（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件を意味するものである。ストリンジェントな条件は、配列依存性があり、環境によって異なるであろう。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシー条件を制御することによって、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。或いは、ストリンジェンシー条件は、低い程度の類似性が検出されるように配列内での一部のミスマッチを許容するように調整することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブの長さは約１０００ヌクレオチド未満、最適には５００ヌクレオチド未満である。
【００９１】
通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、通常約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は、他の塩）で、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合に少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）の場合に少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加により形成することができる。低ストリンジェントな条件の例としては、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液によるハイブリダイゼーション、及び５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェントな条件の例としては、３７℃で、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェントな条件の例としては、３７℃で、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び６０〜６５℃で少なくとも３０分間、０．１×ＳＳＣにおける最終洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーションの時間は、概ね約２４時間未満であり、通常約４〜約１２時間である。洗浄時間は、少なくとも平衡に達することができるだけの時間であろう。
【００９２】
特異性は、通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、熱融点（Ｔｍ）はＭｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３８：２６７  ２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％形態）−５００／Ｌ（式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％形態はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである）から概算することができる。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズするときの（所定のイオン強度及びｐＨ下での）温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄の条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整し得る。例えば、９０％の同一性を有する配列を得たい場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列及びその相補配列についてのＴｍより約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍより１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ、中程度のストリンジェントな条件は、Ｔｍより６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍより１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができる。当業者であれば、この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄の組成物、並びに所望のＴｍを使用して、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に説明されていることを理解するであろう。所望のミスマッチの程度が４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）もまた参照されたい。したがって、プロモーター活性を有し、且つ本明細書に開示されるプロモーター配列又はその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された配列は、本開示に包含される。
【００９３】
一般に、プロモーター活性を有し、且つ本明細書に開示されるプロモーター配列にハイブリダイズする配列は、開示される配列と、少なくとも４０％〜５０％相同であり、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％〜９８％以上相同である。すなわち、配列の配列類似性は、少なくとも約４０％〜５０％、約６０％〜７０％、及び約８０％、８５％、９０％、９５％〜９８％の配列類似性を共有する範囲にわたり得る。
【００９４】
以下の用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド間の配列の関係性を記載するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「参照配列」は、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット又はその全体、例えば、完全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列の断片、或いは完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列であり得る。
【００９６】
本明細書で使用する場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続した特定の断片をいい、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続したヌクレオチド長であり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００又はそれ以上であり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことに起因する参照配列に対する高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが通常導入され、適合した数から減算されることを理解している。
【００９７】
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野においてよく知られている。したがって、任意の２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ、ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８のアルゴリズム、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２：２６４（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７におけるように改変）のアルゴリズムであり、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーションは、配列同一性を決定するための配列の比較に利用され得る。このようなインプリメンテーションとしては、限定はされないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）、並びにＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標），Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメーターを使用して実行し得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４、Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｃｏｒｐｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０、Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５、及びＰｅａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）によく説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）（前出）のアルゴリズムに基づいている。ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティが、アミノ酸配列を比較する場合に、ＡＬＩＧＮプログラムで使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）（前出）のアルゴリズムに基づいている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行し、本開示のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行し、本開示のタンパク質又はポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）を利用することができる。或いは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）を使用して、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）（前出）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ、タンパク質に対するＢＬＡＳＴＸ）を使用し得る。国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイト、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アライメントはまた、目視によって手動的に実行し得る。
【００９９】
別段の記載がない限り、本明細書に示されている配列同一性／類似性値は、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０により、以下のパラメータを用いて得られた値である：ヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ・ウエイト（ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ）５０、レングス・ウエイト（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ）３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリクスを使用；アミノ酸配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ・ウエイト（ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ）８、レングス・ウエイト（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ）２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用；又はそれらと等価の任意のプログラム。本明細書で使用する場合、「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって作製されるその対応するアライメントと比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致、及び同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを作製する、任意の配列比較プログラムである。
【０１００】
ＧＡＰプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（前出）を使用して、マッチ数を最大化しギャップ数を最小化する２つの完全な配列のアライメントを見出す。ＧＡＰは全ての可能なアライメント及びギャップ位置を考慮し、マッチした塩基の最大数と最小のギャップ数を有するアライメント作製する。これにより、マッチした塩基の単位におけるギャップクリエーションペナルティ及びギャップ伸長ペナルティの提示が可能になる。ＧＡＰは、挿入される各ギャップにマッチするギャップクリエーションペナルティ数を得る必要がある。ゼロより大きいギャップ伸長ペナルティを選択するなら、ＧＡＰはさらに、挿入される各ギャップに対し、ギャップ伸長ペナルティのギャップ倍長の長さを得る必要がある。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）のＶｅｒｓｉｏｎ  １０におけるデフォルトのギャップクリエーションペナルティ値及びギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ８及び２である。ヌクレオチド配列では、デフォルトギャップクリエーションペナルティは５０であり、一方、デフォルトギャップ伸長ペナルティは３である。ギャップクリエーションペナルティ及びギャップ伸長ペナルティは、０〜２００からなる整数の群から選択される整数で表すことができる。したがって、例えば、ギャップクリエーションペナルティ及びギャップ伸長ペナルティは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又はそれ以上であり得る。
【０１０１】
ＧＡＰは、最良のアライメントファミリーの１メンバーを示す。このファミリーには多くのメンバーが存在し得るが、より良好なクオリティを有するメンバーは他に存在しない。ＧＡＰは、整列のための４つの性能指数を表示する：クオリティ、率（Ｒａｔｉｏ）、同一性及び類似性。クオリティは、配列をアラインするために最大化された量である。率（Ｒａｔｉｏ）は、クオリティを短い断片中の塩基数で除したものである。同一性パーセントは、実際に一致している記号のパーセントである。類似性パーセントは、類似している記号のパーセントである。ギャップに向かい合っている記号は無視する。１対の記号のスコアリングマトリクス値が類似性閾値の０．５０より大きいか又は等しいとき、類似性のスコアが付けられる。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）のＶｅｒｓｉｏｎ  １０において使用されるスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１０２】
２つの核酸配列又はポリペプチド配列と関連する「配列同一性」又は「同一性」は、本明細書で使用する場合、ある特定の比較ウィンドウに最大の対応でアラインしたときに同じである２つの配列の残基をいう。配列同一性のパーセンテージをタンパク質に関して使用する場合、同一でない残基位置がしばしば保存的アミノ酸置換により異なることが認識される。ここで、アミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、それゆえ、分子の機能特性は変化しない。保存的置換で配列が異なる場合、置換の保存的性質を補正するために、配列同一性パーセントを高める方向に調節してもよい。そのような保存的置換によって相異する配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。このような調節を行う方法は、当業者にはよく知られている。典型的には、これには、保存的置換を、完全ミスマッチとしてではなく部分的ミスマッチとして採点し、それにより、配列同一性パーセントを高める方法が含まれる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、非保存的置換に０のスコアを与える場合、保存的置換には０と１との間のスコアを与える。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）において実行されるように算出される。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、二つの配列の最適なアライメントについて、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定してマッチ位置数を得、そのマッチ位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０１０４】
ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを使用するアライメントプログラムを使用して参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者であれば、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることは認識していよう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、及び少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【０１０５】
ヌクレオチド配列が実質的に同一である別の指標は、二つの分子が、ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズするか否かである。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列のＴｍよりも約５℃低く選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、Ｔｍより約１℃〜約２０℃低い範囲の温度を包含し、本明細書中の他で限定されているように、所望するストリンジェンシーの程度により変わる。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて作製される場合に、起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一である１つの指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと、免疫学的に交差反応性である場合である。
【０１０６】
本明細書に開示される組織優先的プロモーター、並びにその改変体及び断片は、植物の遺伝子操作、例えば、形質転換植物又はトランスジェニック植物の作製において、目的の表現型を発現させるのに有用である。本明細書で使用する場合、「形質転換植物」及び「トランスジェニック植物」という用語は、そのゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが何世代にもわたって伝えられるように、トランスジェニック又は形質転換植物のゲノムに安定に組み込まれる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに単独で、又は組換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込むことができる。本明細書で使用する場合、用語「トランスジェニックの」には、異種核酸の存在によってその表現型が改変されたあらゆる細胞、細胞系、組織、植物部又は植物体が、それらの最初に改変されたトランスジェニック体も、その最初のトランスジェニック体から有性交配又は無性繁殖によって作られたものも、含まれることは理解されるべきである。
【０１０７】
トランスジェニック「イベント」は、目的の遺伝子を含む核酸発現カセットなどの異種ＤＮＡコンストラクトで植物細胞を形質転換し、植物体のゲノムへ導入遺伝子を挿入することによって植物体集団を再生し、そして、特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられた植物体を選択することによって作製される。イベントは、挿入遺伝子の発現によって、表現型で特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは植物体の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」はまた、形質転換体と他の植物との間の有性交配によって作製された子孫をいい、その子孫は異種ＤＮＡを含む。
【０１０８】
用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子、及びこれらの子孫を指す。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子由来の細胞が挙げられる。
【０１０９】
植物部としては、以下に限定されないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、及び様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織）を含む分化組織及び未分化組織が挙げられる。植物組織は、植物にあっても、植物の器官、組織、若しくは細胞培養物にあってもよい。
【０１１０】
本開示はまた、本明細書に開示した方法又は組成物のいずれかから得られる植物も含む。本開示はまた、本明細書に開示した方法又は組成物のいずれかによって得られる植物由来の種子を含む。「植物」という用語は、全植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、植物組織、植物細胞、植物部、種子、珠芽、胚、及び、それらの子孫を指す。植物細胞は分化又は未分化であり得る（例えば、カルス、未分化カルス、未熟胚及び成熟胚、未熟接合胚、未熟子葉、胚軸、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉、葉細胞、根細胞、師管細胞、及び花粉）。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、外植片、未熟胚、胚、接合胚、体細胞胚、胚発生カルス、分裂組織、体細胞分裂組織、器官形成カルス、プロトプラスト、成熟穂生成種子由来胚、葉基、成熟植物由来葉、葉頂、未熟花序、房、未熟穂、シルク、子葉、未熟子葉、胚軸、分裂組織領域、カルス組織、葉由来細胞、葉由来細胞、茎由来細胞、根由来細胞、シュート由来細胞、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子由来の細胞が挙げられる。植物部としては、以下に限定されないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、及び様々な形態の培養物中の細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織）を含む分化組織及び未分化組織が挙げられる。植物組織は、植物にあっても、植物の器官、組織、若しくは細胞培養物にあってもよい。穀粒は、それらの種の栽培又は繁殖と異なる目的で栽培業者が作製する成熟種子を意味するものとする。再生植物の子孫、改変体及び変異体もまた、これらの子孫、改変体及び変異体が導入されたポリヌクレオチドを含むなら、本開示の範囲に含まれる
【０１１１】
本開示は、以下に限定されないが、トウモロコシ、アルファルファ、ソルガム、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む任意の植物種の形質転換に使用することができる。単子葉植物としては、以下に限定されないが、オオムギ、トウモロコシ（トウモロコシ）、キビ（例えば、トウジンビエ（トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）））、オートムギ、イネ、ライムギ、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、ライコムギ、又はコムギ、或いは、葉及び茎作物、例えば、以下に限定されないが、竹、マーラム、アシ、ライグラス、サトウキビ；芝、観賞用草本、並びにスイッチグラス及び芝草などの他の草が挙げられる。或いは、本開示において使用される双子葉植物としては、以下に限定されないが、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、エンドウ、クローバー、アルファルファ、ソラマメ、トマト、ラッカセイ、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、又はワタが挙げられる。
【０１１２】
高等植物、例えば、被子植物類（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）及び裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）を本開示に使用することができる。本開示に有用な好適な植物種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）及びブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。
【０１１３】
トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）及びトウモロコシ属（Ｚｅａ）に属する植物が本開示の方法に使用され得る。
【０１１４】
農業、園芸、（液体燃料分子及び他の化学物質の作製のための）バイオマス作製、及び／又は林業にとって重要又は興味深い植物が、本開示の方法において使用され得る。非限定的な例としては、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ジャイアントミスカンサス）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ、エネルギー用サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ワタ（カイトウメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ケブカワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、アンドロポゴン・ゲラルディー（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（クサヨシ）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（ギョウギシバ）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（オニウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ、Ｅ．グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）（及び、「ウログランディス」として知られるそのハイブリッド）、Ｅ．グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、Ｅ．カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、Ｅ．テレティコルニス（Ｅ．ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉ）、Ｅ．ビミナリス（Ｅ．ｖｉｍｉｎａｌｉｓ）、Ｅ．ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｅ．サリグナ（Ｅ．ｓａｌｉｇｎａ）及びＥ．ウロフィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）を含む）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（コムギ属（ｔｒｉｔｉｃｕｍ）−コムギ×ライムギ）、竹、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ヤトロファ属（ｊａｔｒｏｐｈａ））、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（亜麻）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（レタス）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（サヤインゲン）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ��（ライマメ）、レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種（エンドウマメ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ．ナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、Ｂ．ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ココア）、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ）（トウガラシ及びピーマン）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）（ラッカセイ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）（サツマイモ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）（ココナツ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）種（カンキツ類の木）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（アボカド）、イチジク（イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ））、グアバ（グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）（パパイヤ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）（カシュー）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）（マカダミア）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）（アーモンド）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（タマネギ）、マスクメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（マスクメロン）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、カンタロープ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）（カンタロープ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）（スクワシュ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（スクワシュ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、クラスタマメ（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ）（グアーマメ）、イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）（イナゴマメ）、フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）（フェヌグリーク）、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）（リョクトウ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ササゲ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）（ソラマメ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（ヒヨコマメ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）（レンズマメ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、オニゲシ（Ｐ���ｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、キジュ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）、キナノキ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、カリフォルニアバイケイソウ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ．）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａｓｉｎｉｃａ）種、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ）（トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、サンギナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、コシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ｒｕｂｂｅｒ）、オランダハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、コショウハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）（ベニノキ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種（アザレア）、アザレア（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）（アザレア）、ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）（ハイビスカス）、チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）種（チューリップ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種（ラッパズイセン）、ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）（ペチュニア）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、キク、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、シロバナルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ルピナス）、ユニオラ・パニクラタ（Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（ヤマナラシ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（メープル）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（オオムギ）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）（オオアワガエリ）、及び球果植物（ｃｏｎｉｆｅｒｓ）が挙げられる。
【０１１５】
本開示においては球果植物を使用することができ、球果植物としては、例えば、テーダマツ（テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ））、及びモントレーパイン（ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ））などのマツ；ダグラスファー（ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；カナダツガ（カナダツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；アメリカツガ（アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ））；マウンテンヘムロック（マウンテンヘムロック（Ｔｓｕｇａ  ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ））；アメリカカラマツ又はカラマツ（ラリックス・オキシデンタリス（Ｌａｒｉｘ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））；ベイトウヒ（カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ））；セコイア（セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ））及びバルサムモミ（バルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ））などのトゥルーモミ；並びにベイスギ（ベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ））及びイエローシーダー（イエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））などのシーダーが挙げられる。
【０１１６】
本開示においては芝草を使用することができ、芝草としては、以下に限定されないが、スズメノカタビラ（スズメノカタビラ（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ））、ネズミムギ（ネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））、カナダブルーグラス（コイチゴツナギ（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））、コロニアルベントグラス（イトコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓｔｅｎｕｉｓ））、クリーピングベントグラス（コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、クレステッドホイートグラス（アグロピロン・デセルトルム（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ））、フェアウェイホイートグラス（アグロピロン・クリスタツム（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｃｒｉｓｔａｔｕｍ））、ハードフェスク（フェストゥカ・ロンギホリア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ））、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））、オーチャードグラス（カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、ペレニアルライグラス（ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））、レッドフェスク（オオウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ））、レッドトップ（コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓａｌｂａ））、ラフブルーグラス（オオスズメノカタビラ（Ｐｏａｔｒｉｖｉａｌｉｓ））、ウシノケグサ（ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ））、スムーズブロムグラス（コスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ））、オオアワガエリ（オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））、ベルベットベントグラス（ヒメヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ））、ウィーピングアルカリグラス（アレチタチドジョウツナギ（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ  ｄｉｓｔａｎｓ））、ヒメカモジグサ（アグロピロン・スミチイ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｍｉｔｈｉｉ））、セントオーガスチングラス（イヌシバ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ））、ノシバ（シバ属（Ｚｏｙｓｉａ）種）、バヒアグラス（アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ））、カーペットグラス（ホソバツルメヒシバ（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ））、センチビードグラス（チャボウシノシッペイ（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ））、キクユグラス（キクユグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｉｎｕｍ））、シーショアパスパラム（サワスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ））、ブルーグラマ（ブルーグラマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ））、バッファローグラス（バッファローグラス（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ））、アゼガヤモドキ（アゼガヤモドキ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ））が挙げられる。
【０１１７】
特定の態様において、本開示の植物は、作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、ソルガム、コムギ、キビ、タバコなど）である。本開示において有用な他の植物としては、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、及びメロンが挙げられる。
【０１１８】
本開示のプロモーター配列によって発現するさらなる異種コード配列、異種ポリヌクレオチド、及び目的のポリヌクレオチドは、植物の表現型を変化させるために使用され得る。目的の表現型の様々な変化としては、植物における遺伝子発現の改変、植物の病原体又は昆虫に対する防御機構の改変、植物の除草剤に対する耐性の増大、環境ストレスに応答する植物の発達の改変、塩、温度（高温及び低温）、乾燥に対する植物の応答の調節などが挙げられる。これらの結果は、適切な遺伝子産物を含む目的の異種ヌクレオチド配列の発現によって得ることができる。特定の態様では、目的の異種ヌクレオチド配列は、その発現レベルが植物体又は植物部で増大する内因性の植物配列である。結果は、１つ以上の内因性遺伝子産物、特に、ホルモン、レセプター、シグナル伝達分子、酵素、トランスポーター又は補因子の発現の改変を提供することによって、或いは、植物の栄養摂取に影響を及ぼすことによって得ることができる。本明細書に開示されるプロモーターによって提供される組織優先的発現は、遺伝子産物発現を変えることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。特定の態様では、発現パターンが組織優先的であるので、発現パターンは様々なタイプのスクリーニングに有用である。
【０１１９】
本開示の目的のヌクレオチド配列の一般的な種類としては、例えば、ジンクフィンガーなどの情報に関与する遺伝子、キナーゼなどの伝達に関与する遺伝子、及び熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関与する遺伝子が挙げられる。導入遺伝子のより具体的な種類としては、例えば、農学上の重要な形質、昆虫抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、環境ストレス抵抗性（寒冷、塩、乾燥などに対する耐性の変化）及び穀粒特性をコードする遺伝子が挙げられる。導入遺伝子のさらに他の種類としては、植物及びその他の真核生物、並びに原核生物由来の、酵素、補因子及びホルモンなどの外因性産物の発現を誘発する遺伝子が挙げられる。目的のいかなる遺伝子もポリヌクレオチドも本開示のプロモーターに作動可能に連結し、植物で発現し得ることは認識されている。
【０１２０】
多くの目的遺伝子が本開示のプロモーターに作動可能に連結し、植物で発現することができ、例えば、ＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子は昆虫抵抗性が積み重ねられ、それはまた１つ以上のさらなる入力形質（例えば、除草剤抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス抵抗性、ストレス耐性、病害抵抗性性、雄性不稔性、茎強度など）又は出力形質（例えば、収量増加、デンプンの改質、油プロファイルの改善、バランスのとれたアミノ酸、高リシン若しくはメチオニン、消化性の向上、繊維品質の改善、乾燥抵抗性、栄養増強など）が積み重ねられ得る。
【０１２１】
本開示のプロモーターは穀物の品質に影響を及ぼす農学的に重要な形質、例えば、油の濃度（オレイン酸の含量の増加）及び種類、飽和及び不飽和、必須アミノ酸の品質及び量、リシン及び硫黄の濃度の増加、セルロース濃度、並びにデンプン及びタンパク質含量に作動可能に連結され得る。本開示のプロモーターは、トウモロコシにおいて、ホルドチオニンタンパク質の改変を提供する遺伝子に作動可能に連結され得、これは米国特許第５，９９０，３８９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書、及び同第５，７０３，０４９号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示のプロモーターが作動可能に連結され得る遺伝子の別の例は、１９９６年３月２０日出願の米国特許第５，８５０，０１６号明細書に記載されているダイズ２Ｓアルブミン、及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６５：９９−１０６に記載されているオオムギ由来のキモトリプシン阻害剤によってコードされるリシン及び／又は硫黄に富む種子タンパク質である（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２２】
本開示のプロモーターは、ルートワーム、ヨトウムシ、ヨーロッパマツマダラメイガなどの大きな収率ドラッグを有する害虫に対する抵抗性をコードする昆虫抵抗性遺伝子に作動可能に連結することができる。このような遺伝子としては、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書、同第５，７４７，４５０号明細書、同第５，７３６，５１４号明細書、同第５，７２３，７５６号明細書、同第５，５９３，８８１号明細書、及びＧｅｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））などが挙げられる。本開示のプロモーターに作動可能に連結することができる病害抵抗性形質をコードする遺伝子としては、例えば、フモニシン解毒する遺伝子などの解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）、非病原性（ａｖｒ）及び病害抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２、及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）が挙げられる（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２３】
本開示のプロモーターに作動可能に連結することができる除草剤抵抗性形質としては、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素系除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、そのような抵抗性に導く変異、特にＳ４及び／又はＨｒａ変異を含むアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノトリシン若しくはバスタに対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子及びＧＡＴ遺伝子；例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書及び国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照）、或いは当該技術分野で知られる他のそのような遺伝子が挙げられる。ｂａｒ遺伝子は除草剤のバスタに対する抵抗性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質のカナマイシン及びジェネティシンに対する抵抗性をコードし、ＡＬＳ−遺伝子変異体は除草剤のクロルスルフロンに対する抵抗性をコードしており、そのいずれもが本開示のプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０１２４】
グリホサート抵抗性は、変異５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート合成酵素（ＥＰＳＰ）及び本開示のプロモーターに作動可能に連結することができるａｒｏＡ遺伝子によって付与される。例えば、Ｓｈａｈ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。これには、グリホサート抵抗性を付与し得るＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列が開示されている。Ｂａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，の米国特許第５，６２７，０６１号明細書にもまた、本開示のプロモーターに作動可能に連結され得るＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子が記載されている。米国特許第６，２４８，８７６Ｂ１号明細書、同第６，０４０，４９７号明細書、同第５，８０４，４２５号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書、同第５，１４５，７８３号明細書、同第４，９７１，９０８号明細書、同第５，３１２，９１０号明細書、同第５，１８８，６４２号明細書、同第４，９４０，８３５号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４Ｂ１号明細書、同第６，１３０，３６６号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第４，５３５，０６０号明細書、同第４，７６９，０６１号明細書、同第５，６３３，４４８号明細書、同第５，５１０，４７１号明細書、米国再発行特許第３６，４４９号明細書、米国再発行特許第３７，２８７Ｅ号明細書、及び米国特許第５，４９１，２８８号明細書、並びに国際公開第９７／０４１０３号パンフレット、国際公開第９７／０４１１４号パンフレット、国際公開第００／６６７４６号パンフレット、国際公開第０１／６６７０４号パンフレット、国際公開第００／６６７４７号パンフレット、及び国際公開第００／６６７４８号パンフレット（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。グリホサート抵抗性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書、及び同第５，４６３，１７５号明細書（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳しく記載されているように、グリホサート酸化還元酵素をコードする本開示のプロモーターに作動可能に連結され得る遺伝子を発現する植物に付与される。グリホサート抵抗性はまた、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする本開示のプロモーターに作動可能に連結され得る遺伝子の過剰発現によって植物に付与され得る。例えば、米国特許出願第１１／４０５，８４５号明細書及び同第１０／４２７，６９２号明細書（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２５】
本開示のプロモーターに作動可能に連結された不稔遺伝子もまた、ＤＮＡコンストラクト中にコードされ得、物理的雄穂除去の代替を提供し得る。そのような方法に使用される遺伝子の例としては、雄性組織優先的遺伝子、及び米国特許第５，５８３，２１０号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＱＭなどの雄性不稔性表現型を有する遺伝子が挙げられる。本開示のプロモーターに作動可能に連結され得るその他の遺伝子としては、キナーゼ、及び雄性又は雌性の配偶体形成に毒性のある化合物をコードするものを含む。
【０１２６】
例えば、エタノール作製のためのデンプンを増加させる、又はタンパク質の発現を提供するなどの商業的形質もまた、本開示のプロモーターに作動可能に連結された１つ又は複数の遺伝子上にコードされ得る。形質転換植物の別の重要な商業利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているようなポリマー及びバイオプラスチックの生成である。本開示のプロモーターに作動可能に連結し得る、β−ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシブチレート合成酵素）、及びアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）などの遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。
【０１２７】
本開示のプロモーターに作動可能に連結し得る、他の利用可能な遺伝子及びそれらの関連する表現型の例としては、ウイルス外皮タンパク質及び／若しくはＲＮＡをコードする遺伝子、又はウイルス抵抗性を付与する他のウイルス若しくは植物遺伝子、真菌抵抗性を付与する遺伝子、収穫量増大を促進する遺伝子、並びに、寒冷、乾燥によって生ずる脱水、熱及び塩分などのストレス、有毒な金属若しくは微量元素などに対する抵抗性を与える遺伝子が挙げられる。
【０１２８】
実例として、以下は、本開示のプロモーター配列に作動可能に連結することができる他の遺伝子の種類の例の一覧であるが、これらに限定することを意図するものではない。
【０１２９】
１．昆虫又は病害に対する抵抗性を付与し、且つコードする導入遺伝子：
（Ａ）植物の病害抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の病害抵抗性遺伝子（Ｒ）産物と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子産物との間の特異的相互作用によってしばしば活性化される。特定の病原体種に抵抗性を示す植物を設計するために、植物種をクローン化された抵抗性遺伝子で形質転換することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍａｔｏ  Ｃｆ−９  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（ｔｏｍａｔｏ  Ｐｔｏ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＳＰ２  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ）；ＭｃＤｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｗｏｆｆｅｎｄｅｎ，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（４）：１７８−８３及びＴｏｙｏｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１１（６）：５６７−８２を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。病害抵抗性植物は、野生型植物と比較して病原体に対する抵抗性がより大きいものである。
（Ｂ）バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体、又はそれをモデルとした合成ポリペプチド。例えば、Ｇｅｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９を参照されたい。これには、Ｂｔデルタ−エンドトキシン遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列が開示されている。さらに、デルタ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号４００９８、６７１３６、３１９９５及び３１９９８で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入することができる。遺伝子操作されるバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）導入遺伝子の他の例は、以下の特許及び特許出願に記載されており、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる：米国特許番号第５，１８８，９６０明細書、同第５，６８９，０５２号明細書、同第５，８８０，２７５号明細書、国際公開第９１／１４７７８号パンフレット、国際公開第９９／３１２４８号パンフレット、国際公開第０１／１２７３１号パンフレット、国際公開第９９／２４５８１号パンフレット、国際公開第９７／４０１６２号パンフレット、並びに米国特許出願第１０／０３２，７１７号明細書、同第１０／４１４，６３７号明細書、及び同第１０／６０６，３２０号明細書。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｃ）エクジステロイド及び幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモン若しくはフェロモン、その改変体、それに基づく模倣体、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト。例えば、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、すなわち幼若ホルモンの付活性化剤のバキュロウイルス発現に関するＨａｍｍｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８による開示を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｄ）発現すると、その作用を受けた害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（発現クローニングは昆虫利尿ホルモン受容体のＤＮＡコードを得る）、Ｐｒａｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（アロスタチンがディプロプテラ・プンクタータ（Ｄｉｐｌｏｐｔｅｒａ  ｐｕｎｔａｔａ）で特定されている）、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３０（１）：３３−５４；Ｚｊａｗｉｏｎｙ，（２００４）Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  ６７（２）：３００−３１０。Ｃａｒｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｉ−ｄｅ−Ｓａ，（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４０（１１）：１５１５−１５３９、Ｕｓｓｕｆ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｓｃｉ．８０（７）：８４７−８５３、及びＶａｓｃｏｎｃｅｌｏｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｉｒａ，（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４４（４）：３８５−４０３の開示を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｏｍａｌｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２６６，３１７号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。これには、昆虫特異的毒素をコードする遺伝子が開示されている。
（Ｅ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体、又は殺虫活性を有する他の非タンパク質分子の超集積に関与する酵素。
（Ｆ）生物活性分子の改変、例えば翻訳後の改変などに関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ（天然であるか合成であるかを問わない）。例えば、Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．の名前によるＰＣＴ出願の国際公開第９３／０２１９７号パンフレットを参照されたい。これには、カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。キチナーゼをコードする配列を含むＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣからアクセッション番号３９６３７及び６７１５２で入手することができる。Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（これには、タバコ鉤虫キチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が教示されている）、及びＫａｗａｌｌｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（これには、パセリのｕｂｉ４−２ポリウビキチン遺伝子が提示されている）米国特許出願第１０／３８９，４３２号明細書、同第１０／６９２，３６７号明細書、及び米国特許第６，５６３，０２０号明細書も参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｇ）シグナル伝達を刺激する分子。例えば、リョクトウのカルモジュリンのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を記載のＢｏｔｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７による開示、及びトウモロコシのカルモジュリンのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提示しているＧｒｉｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｈ）疎水性モーメントペプチド。ＰＣＴ出願の国際公開第９５／１６７７６号パンフレット及び米国特許第５，５８０，８５２号明細書（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体の開示）、並びにＰＣＴ出願の国際公開第９５／１８８５５号パンフレット及び米国特許第５，６０７，９１４号明細書（病害抵抗性を付与する合成抗微生物ペプチドを教示）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｉ）膜透過酵素、チャネルフォーマー又はチャネルブロッカー。例えば、トランスジェニックタバコ植物にシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に対する抵抗性を付与するセクロピン−ベータ溶解ペプチド類似体の異種発現を記載のＪａｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８９：４３を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｊ）ウイルス侵入性タンパク質又はそれから誘導される複合毒素。例えば、形質転換植物細胞中のウイルス外皮タンパク質の蓄積は、外皮タンパク質遺伝子が由来するウイルス及び関連ウイルスによって引き起こされるウイルスの感染及び／又は病気の進行に対する耐性を付与する。Ｂｅａｃｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。外皮タンパク質が介在する、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、及びタバコモザイクウイルスに対する耐性が、形質転換植物に付与された（同文献）。
（Ｋ）昆虫特異的抗体又はそれから誘導される抗毒素。したがって、例えば、昆虫の消化管の重要な代謝機能を標的とした抗体は、その作用を受けた酵素を不活性化し、昆虫を死滅させるであろう。Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ♯４９７，ＳＥＶＥＮＴＨ  ＩＮＴ’Ｌ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＬＡＮＴ−ＭＩＣＲＯＢＥ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，１９９４）（一本鎖抗体断片の生成による、トランスジェニックタバコの酵素不活性化）を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｌ）ウイルス特異的抗体。例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９を参照されたい。この文献には、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物がウイルスの攻撃から保護されることが示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｍ）病原体又は寄生生物により天然に産生する発達阻害タンパク質。したがって、例えば、真菌エンド−アルファ−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−アルファ−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成及び植物の養分放出を促進する。Ｌａｍｂ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び特徴付けは、Ｔｏｕｂａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７に記載されている。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｎ）植物により天然に産生される発達阻害タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物体が、真菌性の病気に対し高い抵抗性を有することを示した。
（Ｏ）全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）応答に関与する遺伝子及び／又は病因関連遺伝子。Ｂｒｉｇｇｓ，（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（２）：１２８−１３１，Ｐｉｅｔｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｌｏｏｎ，（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．７（４）：４５６−６４、及びＳｏｍｓｓｉｃｈ，（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３（７）：８１５−６。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｐ）抗真菌遺伝子（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，（１９９３）Ｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０１：７０９−７１２、及びＰａｒｉｊｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔａ１８３：２５８−２６４、及びＢｕｓｈｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７−１４９）。また、米国特許出願第０９／９５０，９３３号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｑ）フモニシン、ビューベリシン、モニリホルミン及びゼアラレノン、並びにそれらの構造的に関連する誘導体などに対する解毒遺伝子。例えば、米国特許第５，７９２，９３１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｒ）シスタチン、及びシステインプロテイナーゼ阻害剤。米国特許出願第１０／９４７，９７９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｓ）デフェンシン遺伝子。国際公開第０３／０００８６３号パンフレット及び米国特許出願第１０／１７８，２１３号明細書（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｔ）線虫に対する耐性を付与する遺伝子。国際公開第０３／０３３６５１号パンフレット、及びＵｒｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔａ  ２０４：４７２−４７９，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．２（４）：３２７−３１（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｕ）真菌コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｏｌａ）によって引き起こされる炭疽病による茎腐病に対する耐性を付与する、ｒｃｇ１などの遺伝子。Ｊｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ｍｅａｎｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ  Ｓｔａｌｋ  Ｒｏｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｉｚｅ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）８９：４１３−４１８、及び米国仮特許出願第６０／６７５，６６４号明細書（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３０】
２．除草剤に対する抵抗性を付与する導入遺伝子、例えば：
（Ａ）イミダゾリノン又はスルホニル尿素などの、成長点又は分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーの遺伝子の例は、例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１及びＭｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９にそれぞれ記載されているような変異ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。また、米国特許第５，６０５，０１１号明細書、同第５，０１３，６５９号明細書、同第５，１４１，８７０号明細書、同第５，７６７，３６１号明細書、同第５，７３１，１８０号明細書、同第５，３０４，７３２号明細書、同第４，７６１，３７３号明細書、同第５，３３１，１０７号明細書、同第５，９２８，９３７号明細書、及び同第５，３７８，８２４号明細書、並びに国際公開第９６／３３２７０号パンフレットも参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｂ）グリホサート（それぞれ変異５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート合成酵素（ＥＰＳＰ）遺伝子及びａｒｏＡ遺伝子により耐性が付与される）、並びに、グルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子及びストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子）並びにピリジノキシプロピオン酸又はフェノキシプロピオン酸及びシクロスヘキソン（ｃｙｃｌｏｓｈｅｘｏｎ）（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）などの他のホスホノ化合物。例えば、Ｓｈａｈ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。これには、グリホサート抵抗性を付与し得るＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列が開示されている。Ｂａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６２７，０６１号明細書にもまた、ＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子が記載されている。米国特許第６，５６６，５８７号明細書、同第６，３３８，９６１号明細書，同第６，２４８，８７６Ｂ１号明細書、同第６，０４０，４９７号明細書、同第５，８０４，４２５号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書、同第５，１４５，７８３号明細書、同第４，９７１，９０８号明細書、同第５，３１２，９１０号明細書、同第５，１８８，６４２号明細書、同第４，９４０，８３５号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４Ｂ１号明細書、同第６，１３０，３６６号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第４，５３５，０６０号明細書、同第４，７６９，０６１号明細書、同第５，６３３，４４８号明細書、同第５，５１０，４７１号明細書、米国再発行特許第３６，４４９号明細書、米国再発行特許第３７，２８７Ｅ号明細書、及び米国特許第５，４９１，２８８号明細書、並びに国際公開の欧州特許第１１７３５８０号明細書、国際公開第０１／６６７０４号パンフレット、欧州特許第１１７３５８１号明細書、及び欧州特許第１１７３５８２号明細書（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。グリホサート抵抗性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書及び同第５，４６３，１７５号明細書（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳しく記載されているグリホサート酸化還元酵素をコードする遺伝子を発現する植物にも付与される。グリホサート抵抗性はさらに、グリホサートＮアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現により植物に付与することができる。例えば、米国特許出願第１１／４０５，８４５号明細書、同第１０／４２７，６９２号明細書、及びＰＣＴ出願のＵＳ０１／４６２２７号明細書を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号３９２５６で得ることができ、その変異遺伝子のヌクレオチド配列はＣｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号明細書に開示されている。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｕｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．の欧州特許出願第０  ３３３  ０３３号明細書、及びＧｏｏｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，９７５，３７４号明細書（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．の欧州特許第０  ２４２  ２４６号明細書及び同第０  ２４２  ２３６号明細書、並びにＤｅ  Ｇｒｅｅｆ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示されており、そこには、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製について記載されている。また、米国特許第５，９６９，２１３号明細書、同第５，４８９，５２０号明細書、同第５，５５０，３１８号明細書、同第５，８７４，２６５号明細書、同第５，９１９，６７５号明細書、同第５，５６１，２３６号明細書、同第５，６４８，４７７号明細書、同第５，６４６，０２４号明細書、同第６，１７７，６１６Ｂ１号明細書、及び同第５，８７９，９０３号明細書も参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。フェノキシプロプリオン酸及びシクロスヘキソン（ｃｙｃｌｏｓｈｅｘｏｎｅ）（例えば、セトキシジム及びハロキシホップ）に対する抵抗性を付与する遺伝子の例は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２及びＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。
（Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡ遺伝子及びｇｓ＋遺伝子）及びベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）などの、光合成を阻害する除草剤。Ｐｒｚｉｂｉｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の形質転換が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はＳｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、Ｈａｙｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３によって記載されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｄ）アセトヒドロキシ酸合成酵素は、この酵素を発現する植物を様々な種類の除草剤に対して抵抗性を有する植物とすることが見出され、各種の植物に導入されている（例えば、Ｈａｔｔｏｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４６：４１９（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。除草剤に対する抵抗性を付与する他の遺伝子としては、ラットシトクロームＰ４５０７Ａ１、及び酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０酸化還元酵素のキメラタンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６（１）：１７−２３）、グルタチオン還元酵素及びスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子（Ａｏｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３６：１６８７）、及び様々なホスホトランスフェラーゼの遺伝子（Ｄａｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：６１９）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｅ）プロトポルフィリノーゲン酸化酵素（ｐｒｏｔｏｘ）は、葉緑素の生成に必要であり、葉緑素はあらゆる植物の生存に必要である。ｐｒｏｔｏｘ酵素は、様々な除草化合物の標的として働く。これらの除草剤はまた、存在する異なる種類の植物全ての成長を阻害し、それら全体を破壊する。これらの除草剤に対し抵抗性を有する改変ｐｒｏｔｏｘ活性を含む植物の成長は、米国特許第６，２８８，３０６Ｂ１号明細書、同第６，２８２，８３７Ｂ１号明細書、及び同第５，７６７，３７３号明細書、並びに国際公開第０１／１２８２５号パンフレットに記載されている。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
３．穀物特性の改変又は改変に寄与する導入遺伝子、例えば：
（Ａ）例えば、以下による脂肪酸の改変：
（１）植物のステアリン酸含有量を増大させるステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素の下方制御。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２４及び国際公開第９９／６４５７９号パンフレット（トウモロコシの脂質プロファイルを改変する不飽和化酵素の遺伝子）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（２）ＦＡＤ−２遺伝子の改変によるオレイン酸の増大及び／又はＦＡＤ−３遺伝子の改変によるリノレン酸の低減（米国特許第６，０６３，９４７号明細書、同第６，３２３，３９２号明細書、同第６，３７２，９６５号明細書、及び国際公開第９３／１１２４５号パンフレットを参照されたい（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
（３）国際公開第０１／１２８００号パンフレット（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような共役リノレン酸又はリノール酸含有量の改変。
（４）ＬＥＣ１、ＡＧＰ、Ｄｅｋ１、Ｓｕｐｅｒａｌ１、ｍｉ１ｐｓ、ｌｐａ１、ｌｐａ３、ｈｐｔ又はｈｇｇｔなどの種々のｌｐａ遺伝子。例えば、国際公開第０２／４２４２４号パンフレット、国際公開第９８／２２６０４号パンフレット、国際公開第０３／０１１０１５号パンフレット、米国特許第６，４２３，８８６号明細書、米国特許第６，１９７，５６１号明細書、米国特許第６，８２５，３９７号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、同第２００３／０２０４８７０号明細書、国際公開第０２／０５７４３９号パンフレット、国際公開第０３／０１１０１５号パンフレット、及びＲｉｖｅｒａ−Ｍａｄｒｉｄ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：５６２０−５６２４を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｂ）例えば、以下によるリン含有量の改変：
（１）フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を増強し、形質転換した植物により多くの遊離リン酸を加えることになろう。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２７：８７を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（２）フィターゼ含有量を減少させる遺伝子の上方制御。トウモロコシでは、これは、例えば、Ｒａｂｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３に記載されるように、低濃度のフィチン酸で特徴付けられるトウモロコシ変異体で同定されるＬＰＡアレルなどの１つ以上のアレルと関連するＤＮＡをクローニングし、その後、再導入することによって、且つ／又は国際公開第０２／０５９３２４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／０００９０１１号明細書、国際公開第０３／０２７２４３号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、国際公開第９９／０５２９８号パンフレット、米国特許第６，１９７，５６１号明細書、米国特許第６，２９１，２２４号明細書、米国特許第６，３９１，３４８号明細書、国際公開第２００２／０５９３２４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、国際公開第９８／４５４４８号パンフレット、国際公開第９９／５５８８２号パンフレット、国際公開第０１／０４１４７号パンフレットに記載されるように、イノシトールキナーゼ活性を変えることによって行い得るであろう。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｃ）例えば、デンプンの分枝パターンに作用する酵素の遺伝子、又はＮＴＲ及び／若しくはＴＲＸなどのチオレドキシンを改変する遺伝子を変えること（米国特許第６，５３１，６４８号明細書を参照されたい（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、並びに／又はｃｓ２７若しくはＴＵＳＣ２７若しくはｅｎ２７などのガンマゼインノックアウト若しくは変異体（米国特許第６，８５８，７７８号、米国特許出願公開第２００５／０１６０４８８号及び同第２００５／０２０４４１８号を参照されたい（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））によって得られる炭水化物の改変。Ｓｈｉｒｏｚａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）のフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２００：２２０（バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の作製）、Ｅｌｌｉｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓφｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（オオムギアルファ−アミラーゼ遺伝子の部位特異的変異誘発）、及びＦｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）、国際公開第９９／１０４９８号パンフレット（ＵＤＰ−Ｄ−キシロース４−エピメラーゼ、Ｆｒａｇｉｌｅ１及び２、Ｒｅｆ１、ＨＣＨＬ、Ｃ４Ｈの修飾による消化性及び／又はデンプン抽出の改善）、米国特許第６，２３２，５２９号明細書（デンプンレベル（ＡＧＰ）の改変による高油料種子の作製方法）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。上記の脂肪酸修飾遺伝子を使用して、デンプンと油の経路の相互関係によってデンプン含有量及び／又は組成に影響を及ぼすこともできる。
（Ｄ）トコフェロール又はトコトリエノールの改変などの、抗酸化物質の含有量又は組成の改変。例えば、米国特許第６，７８７，６８３号明細書、米国特許出願公開第２００４／００３４８８６号明細書、及び国際公開第００／６８３９３号パンフレット（フィチルプレニルトランスフェラーゼ（ｐｐｔ）の改変による抗酸化物質レベルの操作を含む）、国際公開第０３／０８２８９９号パンフレット（ホモゲンチシン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｇｇｔ）の改変による）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（Ｅ）種子の必須アミノ酸の改変。例えば、米国特許第６，１２７，６００号明細書（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させる方法）、米国特許第６，０８０，９１３号明細書（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させるバイナリ方法）、米国特許第５，９９０，３８９号明細書（高リシン）、国際公開第９９／４０２０９号パンフレット（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第９９／２９８８２号パンフレット（タンパク質のアミノ酸の改変方法）、米国特許第５，８５０，０１６号明細書（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第９８／２０１３３号パンフレット（必須アミノ酸レベルを高めたタンパク質）、米国特許第５，８８５，８０２号明細書（高メチオニン）、米国特許第５，８８５，８０１号明細書（高トレオニン）、米国特許第６，６６４，４４５号明細書（植物アミノ酸生合成酵素）、米国特許第６，４５９，０１９号明細書（リシン及びトレオニンの増加）、米国特許第６，４４１，２７４号明細書（植物トリプトファン合成酵素ベータサブユニット）、米国特許第６，３４６，４０３号明細書（メチオニン代謝酵素）、米国特許第５，９３９，５９９号明細書（高硫黄）、米国特許第５，９１２，４１４号明細書（メチオニンの増加）、国際公開第９８／５６９３５号パンフレット（植物アミノ酸生合成酵素）、国際公開第９８／４５４５８号パンフレット（より高い割合で必須アミノ酸を含む改変種子タンパク質）、国際公開第９８／４２８３１号パンフレット（リシンの増加）、米国特許第５，６３３，４３６号明細書（含硫アミノ酸含有量の増加）、米国特許第５，５５９，２２３号明細書（植物の栄養価を改善するためにプログラム可能なレベルの必須アミノ酸を含有する、定義済み構造を持つ合成貯蔵タンパク質）、国際公開第９６／０１９０５号パンフレット（トレオニンを増加）、国際公開第９５／１５３９２号パンフレット（リシンの増加）、米国特許出願公開第２００３／０１６３８３８号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１５００１４号明細書、米国特許出願公開第２００４／００６８７６７号明細書、米国特許第  ６，８０３，４９８号明細書、国際公開第０１／７９５１６号パンフレット及び国際公開第００／０９７０６号パンフレット（ＣｅｓＡ：セルロース合成酵素）、米国特許第６，１９４，６３８号明細書（ヘミセルロース）、米国特許第６，３９９，８５９号明細書及び米国特許出願公開第２００４／００２５２０３号明細書（ＵＤＰＧｄＨ）、米国特許第６，１９４，６３８号明細書（ＲＧＰ）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
４．部位特異的ＤＮＡ組み込みのための部位を作製する遺伝子
これには、ＦＬＰ／ＦＲＴ系に使用可能なＦＲＴ及び／又はＣｒｅ／Ｌｏｘｐ系に使用可能なＬｏｘ部位の導入が含まれる。例えば、Ｌｙｚｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２１：９２５−９３２、及び国際公開第９９／２５８２１号パンフレットを参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。使用可能な他の系としては、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（Ｍａｅｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｖｉｃｋｉ  Ｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｃｈ．１１８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ（Ｅｎｏｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、及びｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系（Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
５．非生物的ストレス耐性（限定はされないが、開花、雄穂及び種子の発達、窒素利用効率の増強、窒素反応性の改変、乾燥抵抗性又は乾燥耐性、寒冷抵抗性又は耐寒性、及び塩抵抗性又は耐塩性を含む）に影響を及ぼし、ストレス下で収穫量を増大させる遺伝子。例えば、国際公開第００／７３４７５号パンフレット（リンゴ酸の改変によって水使用効率が改変される）；米国特許第５，８９２，００９号明細書、米国特許第５，９６５，７０５号明細書、米国特許第５，９２９，３０５号明細書、米国特許第５，８９１，８５９号明細書、米国特許第６，４１７，４２８号明細書、米国特許第６，６６４，４４６号明細書、米国特許第６，７０６，８６６号明細書、米国特許第６，７１７，０３４号明細書、国際公開第２０００／０６００８９号パンフレット、国際公開第２００１／０２６４５９号パンフレット、国際公開第２００１／０３５７２５号パンフレット、国際公開第２００１／０３４７２６号パンフレット、国際公開第２００１／０３５７２７号パンフレット、国際公開第２００１／０３６４４４号パンフレット、国際公開第２００１／０３６５９７号パンフレット、国際公開第２００１／０３６５９８号パンフレット、国際公開第２００２／０１５６７５号パンフレット、国際公開第２００２／０１７４３０号パンフレット、国際公開第２００２／０７７１８５号パンフレット、国際公開第２００２／０７９４０３号パンフレット、国際公開第２００３／０１３２２７号パンフレット、国際公開第２００３／０１３２２８号パンフレット、国際公開第２００３／０１４３２７号パンフレット、国際公開第２００４／０３１３４９号パンフレット、国際公開第２００４／０７６６３８号パンフレット、国際公開第９８／０９５２１号パンフレット及び国際公開第９９／３８９７７号パンフレット（凍結、高塩分及び乾燥という植物に対する負の効果を緩和し、植物表現型に他の正の効果を付与するのに有効な、ＣＢＦ遺伝子及び転写因子などの遺伝子を記載している）；米国特許出願公開第２００４／０１４８６５４号明細書及び国際公開０１／３６５９６号パンフレット（植物中のアブシジン酸が改変され、それにより、収穫量の増加及び／又は非生物的ストレスに対する耐性の増大など、植物の表現型が改善される）；国際公開第２０００／００６３４１号パンフレット、国際公開第０４／０９０１４３号パンフレット、米国特許出願第１０／８１７４８３号明細書及び米国特許第６，９９２，２３７号明細書（サイトカイニン発現が改変され、それにより、乾燥耐性などのストレス耐性が増大し、且つ／又は収穫量が増加した植物が得られる）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、国際公開第０２／０２７７６号パンフレット、国際公開第２００３／０５２０６３号パンフレット、特開２００２−２８１９７５号公報、米国特許第６，０８４，１５３号明細書、国際公開第０１／６４８９８号パンフレット、米国特許第６，１７７，２７５号明細書及び米国特許第６，１０７，５４７号明細書（窒素利用の増強及び窒素反応性の改変）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エチレンの改変については、米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１６６１９７号明細書及び国際公開第２０００／３２７６１号パンフレットを参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非生物的ストレスの植物転写因子又は転写調節因子については、例えば、米国特許出願公開第２００４／００９８７６４号明細書又は米国特許出願公開第２００４／００７８８５２号明細書を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
６．収穫量、開花、植物成長及び／若しくは植物構造などの植物の成長及び農業形質に影響を及ぼす他の遺伝子及び転写因子を、植物に導入又は移入することができる。例えば、国際公開第９７／４９８１１号パンフレット（ＬＨＹ）、国際公開第９８／５６９１８号パンフレット（ＥＳＤ４）、国際公開第９７／１０３３９号パンフレット及び米国特許第６，５７３，４３０号明細書（ＴＦＬ）、米国特許第６，７１３，６６３号明細書（ＦＴ）、国際公開第９６／１４４１４号パンフレット（ＣＯＮ）、国際公開第９６／３８５６０号パンフレット、国際公開第０１／２１８２２号パンフレット（ＶＲＮ１）、国際公開第００／４４９１８号パンフレット（ＶＲＮ２）、国際公開第９９／４９０６４号パンフレット（ＧＩ）、国際公開第００／４６３５８号パンフレット（ＦＲＩ）、国際公開第９７／２９１２３号パンフレット、米国特許第６，７９４，５６０号明細書、米国特許第６，３０７，１２６号明細書（ＧＡＩ）、国際公開第９９／０９１７４号パンフレット（Ｄ８及びＲｈｔ）、並びに国際公開第２００４／０７６６３８号パンフレット及び国際公開第２００４／０３１３４９号パンフレット（転写因子）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
本明細書に開示される、プロモーター配列に作動可能に連結している異種ヌクレオチド配列、及びそれに関連する生物活性断片及び改変体は、標的遺伝子のアンチセンス配列であり得る。用語「アンチセンスＤＮＡヌクレオチド配列」は、そのヌクレオチド配列の５’から３’という通常の方向に対し、その逆方向の配列を意味するものである。植物細胞に送達されると、アンチセンスＤＮＡ配列の発現は、標的遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の正常な発現を妨げる。アンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の転写によって生じた内因性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的でハイブリダイズすることができるＲＮＡ転写産物をコードする。この場合、標的遺伝子によってコードされる天然タンパク質の産生が阻害され、所望の表現型応答を得る。アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を妨げるなら、改変されていてもよい。このように、対応するアンチセンス配列に対し７０％、８０％、８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用し得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド若しくはそれ以上からなる配列を使用し得る。したがって、本明細書に開示のプロモーター配列は、アンチセンスＤＮＡ配列に作動可能に連結して、植物中の天然タンパク質の発現を抑制又は阻害することができる。
【０１３６】
「ＲＮＡｉ」は遺伝子発現を抑制する一連の関連手法を指す（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。他の名称で呼ばれる旧手法は、今日、同じメカニズムに依っていると考えられるが、文献では異なる名称が付されている。これらには、「アンチセンス阻害」、すなわち標的タンパク質の発現を抑制し得るアンチセンスＲＮＡ転写産物の産生、及び、同一又は類似性の高い外来性又は内因性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す「コサプレッション」又は「センスサプレッション」が含まれる（米国特許第５，２３１，０２０号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。このような手法は、１本はサイレンシングする標的遺伝子の相補的な二本鎖ＲＮＡの蓄積を生じるコンストラクトの使用に依存している。本開示のプロモーター配列を使用して、マイクロＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ干渉を起こすコンストラクトの発現を駆動することができる。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」又は「転写開始領域」は、通常、ＴＡＴＡボックス又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導して特定のコード配列に適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始させることができるＤＮＡ配列を含むＤＮＡの調節領域を意味する。プロモーターは、ＴＡＴＡボックスの上流若しくは５’に一般的に位置する他の認識配列、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導してＲＮＡ合成を開始させることができるＤＮＡ配列（転写開始速度に影響を及ぼす上流プロモーターエレメントと呼ばれる）をさらに含み得る。本明細書に開示のプロモーター領域のヌクレオチド配列が特定されたことが認められており、本明細書で特定された特定のプロモーター領域の上流の５’側の非翻訳領域におけるさらなるプロモーターを単離し特定するのはこの分野における最新技術である。さらにキメラプロモーターが提供され得る。このようなキメラは、異種の転写調節領域の断片及び／又は改変体に融合したプロモーター配列の部分を含む。したがって、本明細書に開示のプロモーター領域は、コード配列、エンハンサーなどの組織及び一時的な発現の原因であるものなどの上流プロモーターを含み得る。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、用語「調節エレメント」はまた、通常、常にではないが、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は特定の部位で転写を開始するのに必要な他の因子を認識することによって、コード領域の発現を制御する配列を含む、構造遺伝子のコード配列の上流（５’）側のＤＮＡ配列を指す。ＲＮＡポリメラーゼ又は特定の部位で確実に開始させる他の転写因子を認識する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与しているコアプロモーターエレメント、及び遺伝子の発現を変化させる他の制御エレメントを含む。イントロン、又はコード領域配列も３’側に位置しているヌクレオチド配列もまた、目的のコード領域の発現の調節に寄与し得ることは理解されるべきである。好適なイントロンの例としては、限定はされないが、トウモロコシＩＶＳ６イントロン、又はトウモロコシアクチンイントロンが挙げられる。調節エレメントはまた、転写開始部位の下流（３’）側、転写領域内、又はそれらの両方に位置するエレメントを含み得る。本開示との関連では、転写後の調節エレメントとして、転写開始の後に活性なエレメント、例えば、翻訳エンハンサー及び転写エンハンサー、翻訳リプレッサー及び転写リプレッサー、並びにｍＲＮＡ安定性決定因子が挙げられる。
【０１３９】
本開示のプロモーター又はその改変体若しくは断片は、異種調節エレメントの活性を調節するために、異種調節エレメント又はプロモーターに作動可能に連結し得る。そうした調節には、異種調節エレメントの転写活性の増強若しくは抑制、転写後イベントの調節、又は異種調節エレメントの転写活性の増強若しくは抑制及び転写後イベントの調節が含まれる。例えば、本開示の１つ以上のプロモーター又はその断片は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター若しくは組織特異的プロモーター又はそれらの断片を作動可能に連結して、植物細胞中の所望の組織内のそのようなプロモーターの活性を調節することができる。
【０１４０】
本開示のプロモーター配列又はその改変体若しくは断片は、形態形成遺伝子及び／又は目的の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結される場合、植物のＬ１組織における形態形成遺伝子及び／又は異種ヌクレオチド配列の安定な又は一過性の発現を駆動し得る。
【０１４１】
「異種ヌクレオチド配列」、「目的の異種ポリヌクレオチド」、又は「異種ポリヌクレオチド」は、本開示全体を通して使用される場合、天然には本開示のプロモーター配列と共に存在しないか、又はそれに作動可能に連結されない配列である。このヌクレオチド配列はプロモーター配列に対し異種であるが、宿主植物に対しては、同種の、又は天然の、又は異種の、又は外来のものであり得る。同様に、プロモーター配列は、宿主植物及び／又は目的のポリヌクレオチドに対して、同種の、又は天然の、又は異種の、又は外来のものであり得る。
【０１４２】
本開示の単離されたプロモーター配列は、一定範囲の発現レベルを有する異種ヌクレオチド配列を提供するように、改変することができる。したがって、全プロモーター領域より少ない領域を使用することができ、目的のヌクレオチド配列の発現を駆動する能力を保持することができる。プロモーター配列の部分を欠失させる方法とは異なる方法で、ｍＲＮＡの発現レベルを変えることができることは認識されている。例えば、トランケーションの過程で除かれるネガティブ調節エレメント（リプレッサーで）があるなら、ｍＲＮＡの発現レベルを低下させることができ、或いは、プロモーター欠失の結果として、発現を増大させることができる。一般に、単離されたプロモーター配列の少なくとも約２０個のヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の発現を駆動するために使用されるであろう。
【０１４３】
転写レベルを高めるために、エンハンサーを本開示のプロモーター領域と組み合わせて使用し得ることがわかった。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは当該技術分野で知られており、ＳＶ４０エンハンサー領域、３５Ｓエンハンサーエレメントなどが挙げられる。いくつかのエンハンサーはまた、通常のプロモーター発現パターンを、例えば、プロモーターを構成的に発現させることによって変えることが知られている（エンハンサーがなければその同じプロモーターが１つ又は少数の特定の組織でのみ発現する場合）。
【０１４４】
本開示の単離されたプロモーター配列の改変は、異種ヌクレオチド配列の一定の範囲の発現を提供し得る。したがって、それらは弱プロモーター又は強プロモーターに改変され得る。一般に、「弱プロモーター」は、コード配列の発現を低レベルで駆動するプロモーターを意味する。「低レベル」の発現とは、約１／１０，０００〜約１／１００，０００〜約１／５００，０００の転写レベルで発現することを意味するものである。逆に、強プロモーターは、高レベル、すなわち約１／１０〜約１／１００〜約１／１，０００の転写レベルでコード配列の発現を駆動する。
【０１４５】
本開示のプロモーターを天然のコード配列と共に使用して、発現を増加又は低減し、それにより形質転換植物の表現型を変化させ得ることがわかった。本明細書に開示のヌクレオチド配列（表１を参照）、並びにその改変体及び断片は、任意の植物の遺伝子操作において有用である。調節配列は、その発現が制御されて所望の表現型応答を獲得する異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結しているなら、本態様において有用である。用語「作動可能に連結している」は、異種ヌクレオチド配列の転写又は翻訳が、プロモーター配列の影響下にあることを意味する。このように、本開示のプロモーターのヌクレオチド配列は、目的の植物における発現のために、より特には植物の生殖組織における発現のために、目的の異種ヌクレオチド配列と共に発現カセットに提供され得る。
【０１４６】
本開示の一態様においては、発現カセットは、形態形成遺伝子及び／又は異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本開示のプロモーターヌクレオチド配列又はその改変体若しくは断片の１つを含む転写開始領域を含む。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にヌクレオチド配列を挿入するための複数の制限酵素認識部位を有し得る。
発現カセットはさらに、選択マーカー遺伝子及び３’終端領域を含み得る。
【０１４７】
発現カセットは、転写の５’〜３’方向に、宿主生物において機能する、転写開始領域（すなわち、本開示のプロモーター、又はその改変体若しくは断片）、翻訳開始領域、目的の異種ヌクレオチド配列、翻訳終端領域、及び、場合により転写終端領域を含み得る。調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域及び翻訳終端領域）、及び／又は本態様のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対し、又は相互に天然／類似であり得る。或いは、調節領域及び／又は本態様のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対し、又は相互に異種であり得る。本明細書で使用する場合、配列に関連した「異種の」は、外来種を起源とする配列であるか、又は同一種からのものであれば、組成及び／又はゲノム遺伝子座が意図的な人的介入によって天然の形態から実質的に改変されている配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動に可能に連結したプロモーターは、そのポリヌクレオチドが由来する種と異なる種からのものであるか、又は、同一／類似種からのものであれば、一方若しくは両方が元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されており、或いは、プロモーターが、作動可能に連結しているポリヌクレオチドに対し天然のプロモーターではない。
【０１４８】
終端領域は転写開始領域と同じ由来であっても、作動可能に連結した目的のＤＮＡ配列と同じ由来であっても、宿主植物と同じ由来であっても、他のソース由来（すなわち、プロモーター、発現するＤＮＡ配列、宿主植物、又はこれらの任意の組み合わせに対し外来若しくは異種）であってもよい。適切な終端領域は、オクトピン合成酵素終端領域及びノパリン合成酵素終端領域など、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４、Ｓａｎｆａｃｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９、Ｍｏｇｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２、Ｍｕｎｒｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８、Ｂａｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３、及びＪｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
本開示の配列を含む発現カセットはまた、生物に同時形質転換される遺伝子、異種ヌクレオチド配列、目的の異種ポリヌクレオチド、又は異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの追加のヌクレオチド配列を含み得る。或いは、そのような追加配列を他の発現カセットに供してもよい。
【０１５０】
必要に応じて、発現が本開示の組織優先的プロモーター配列の制御下にあるヌクレオチド配列、及び任意の追加ヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現を増加させるために最適化することができる。すなわち、発現を改善するために、これらのヌクレオチド配列を、植物に好適なコドンを用いて合成することができる。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書、及びＭｕｒｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
細胞宿主中で遺伝子の発現を亢進させるために、追加的に配列を改変することが知られている。このような改変には、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン−イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列、及び遺伝子の発現に有害であり得る他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。宿主細胞において発現した既知の遺伝子を参考にして算出される、異種ヌクレオチド配列のＧ−Ｃ含量を、所与の細胞宿主の平均レベルに調節することができる。可能であれば、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるよう配列を改変する。
【０１５２】
発現カセットはさらに、５’リーダー配列を含むことができる。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するよう作用し得る。翻訳リーダーはこの分野では知られており、限定はされないが、以下のものが挙げられる：ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）、ポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）リーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ））（Ａｌｌｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ  Ｄｗａｒｆ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ））；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルス（ａｌｆａｌｆａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）の外皮タンパク質ｍＲＮＡ（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）由来の非翻訳リーダー（Ｊｏｂｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）、タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）リーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，  ｐａｇｅｓ  ２３７−２５６）、及びトウモロコシクロロティックモトルウイルス（ｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）リーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８４：９６５−９６８もまた参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｍＲＮＡ安定性を高めることが知られている方法では、例えば、トウモロコシユビキチンイントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｉｌ，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：２１３−２１８、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６７５−６８９）又はトウモロコシＡｄｈＩイントロン（Ｋｙｏｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８、Ｋｙｏｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３５３−３５７）などが使用され得る。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
本態様のＤＮＡコンストラクトはまた、必要に応じて、さらなるエンハンサー、翻訳エンハンサー若しくは転写エンハンサーを含み得る。これらのエンハンサー領域は、当業者にはよく知られており、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含み得る。開始コドンは、全配列の翻訳を確かにするため、コード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。翻訳調節シグナルと開始コドンは、天然及び合成双方の様々な起源に由来するものであってよい。翻訳開始領域は、転写開始領域のソース又は構造遺伝子から提供され得る。配列はまた、遺伝子発現のために選択された調節エレメントに由来してもよく、特に、ｍＲＮＡの翻訳を増大させるように改変してもよい。転写レベルを高めるために、エンハンサーを本態様のプロモーター領域と組み合わせて利用し得ることがわかった。エンハンサーは当該技術分野で知られており、ＳＶ４０エンハンサー領域、３５Ｓエンハンサーエレメントなどが挙げられる。
【０１５４】
発現カセットの調製には、各種ＤＮＡ断片が、適当な配向で、必要ならば、適当なリーディングフレームにおけるＤＮＡ配列を提供するように操作され得る。この終わり近くに、アダプター又はリンカーがＤＮＡ断片の結合に使用され得、或いは、適当な制限酵素認識部位、不要なＤＮＡの除去、制限酵素認識部位の除去などを提供するための他の操作が行われ得る。この目的のために、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジション及びトランスバージョンが行われ得る。
【０１５５】
レポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子もまた本開示の発現カセットに含まれ得る。この技術分野で知られている好適なレポーター遺伝子の例は、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｅｌｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ｐｐ．１−３３、ＤｅＷｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７；Ｇｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２５１７−２５２２、Ｋａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：６５０−６５５、及びＣｈｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：３２５−３３０に見出すことができる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
形質転換された細胞又は組織を選択するための選択マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与する遺伝子を挙げることができる。好適な選択マーカー遺伝子の例としては、以下に限定されないが、クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９２）、メトトレキサートに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３；Ｍｅｉｊｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７−８２０）、ヒグロマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｗａｌｄｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３−１０８、及びＺｈｉｊｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１０８：２１９−２２７）；ストレプトマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６−９１）、スペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：１３１−１３７）、ブレオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｉｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１−１７６）、スルホンアミドに対する耐性をコードする遺伝子（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７−３６）、ブロモキシニルに対する耐性をコードする遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９−４２３）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（Ｓｈａｗ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１並びに米国特許出願第１０／００４，３５７号明細書及び同第１０／４２７，６９２号明細書）、ホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子（ＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３−２５１８）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
トランスジェニックイベントの回収において有用性を提供し得る他の遺伝子としては、以下に限定はされないが、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Ｃｈａｌｆｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２）、ルシフェラーゼ（Ｒｉｇｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（１９）：８１１５及びＬｕｅｈｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３９７−４１４）、及びアントシアニン産生をコードするトウモロコシ遺伝子（Ｌｕｄｗｉｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：４４９）などの例が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
本開示のプロモーター配列を含む発現カセットは、形態形成遺伝子に作動可能に連結され、場合によりさらに異種ヌクレオチド配列、目的の異種ポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチドヌクレオチド、又は目的の配列に作動可能に連結され、任意の植物を形質転換するために使用することができる。このようにして、遺伝子組換えが行われた植物体、植物細胞、植物組織、種子、根などを得ることができる。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、ヌクレオチドコンストラクト、例えば、発現カセット又はコンストラクトを宿主細胞に導入するためのプラスミド、コスミド又はバクテリオファージなどのＤＮＡ分子を指す。クローニングベクターは、通常、外来ＤＮＡ配列を特定可能な方法で、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに挿入することができる１つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、クローニングベクターで形質転換された細胞の識別及び選択に使用するのに好適なマーカー遺伝子とを含む。マーカー遺伝子としては、通常、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性又はアンピシリン耐性を与える遺伝子が挙げられる。
【０１６０】
本開示の方法は、植物にポリペプチド又はポリヌクレオチドを導入することを含む。本明細書で使用する場合、「導入する」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に、その配列が植物細胞の内部に侵入する方法で送ることを意味する。本開示の方法は、植物に配列を導入する特定の方法に依存することはなく、植物の少なくとも１つの細胞の内部にポリヌクレオチド又はポリペプチドを単に侵入させるだけである。ポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に導入する方法は、当該技術分野で知られており、限定はされないが、安定な形質転換方法、一過性形質転換方法、及びウイルス媒介方法が挙げられる。
【０１６１】
「安定な形質転換」とは、植物に導入されるヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受け継がれ得る形質転換をいう。「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが植物に導入されるが植物のゲノムに組み込まれないか、又はポリペプチドが植物に導入されることを意味する。
【０１６２】
形質転換プロトコール、及びヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコールは、形質転換の標的の植物又は植物細胞の種類により、すなわち単子葉植物であるか双子葉植物であるかにより変わり得る。ヌクレオチド配列を植物細胞に導入し、続いて植物ゲノムに挿入する好適な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５６３，０５５号明細書、及びＺｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，９８１，８４０号明細書）、遺伝子直接導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、弾道粒子加速（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、同第５，８７９，９１８号明細書、同第５，８８６，２４４号明細書、同第５，９３２，７８２号明細書、Ｔｏｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．、（１９９５）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）、ＭｃＣａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照）、及びＬｅｃ１形質転換（国際公開第００／２８０５８号パンフレット）が挙げられる。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７、Ｓａｎｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）、ＭｃＣａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）、Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）、Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）、Ｄａｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）、米国特許第５，２４０，８５５号明細書、同第５，３２２，７８３号明細書、及び同第５，３２４，６４６号明細書、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）、Ｆｒｏｍｍ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）、Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４、米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀草類）、Ｂｙｔｅｂｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））；Ｄｅ  Ｗｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８、及びＫａｅｐｐｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）、Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５、及びＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ，（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：７４５−７５０（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるトウモロコシ）も参照されたい。これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。迅速な植物形質転換のための方法及び組成物はまた、米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。植物形質転換に有用なベクターは、米国特許出願第１５／７６５，５２１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１６３】
特定の態様では、本開示のプロモーター配列を含むＤＮＡコンストラクトは、様々な一過性形質転換法を用いて植物に供することができる。このような一過性形質転換法としては、限定はされないが、ウイルスベクター系、及びＤＮＡのその後の脱離が起こらないような方法でのポリヌクレオチドの沈澱が挙げられる。したがって、粒子結合ＤＮＡからの転写は起こり得るが、脱離してゲノムに組み込まれる頻度は非常に小さい。このような方法としては、ポリエチルイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３１４３）でコーティングした粒子の使用が挙げられる。
【０１６４】
他の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、植物をウイルス又はウイルス性核酸と接触させることにより、植物に導入することができる。一般に、このような方法は、本開示のヌクレオチドコンストラクトをウイルス性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に組み込むことを含む。ウイルス性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチドを植物に導入し、それによりコードされるタンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書、同第５，３１６，９３１号明細書、及びＰｏｒｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２０９−２２１を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
植物ゲノムの特定の位置でポリヌクレオチドをターゲッティングにより挿入する方法は当該技術分野で知られている。一態様では、ゲノムの所望の位置でのポリヌクレオチドの挿入は、部位特異的組換えシステムを用いて行うことができる。例えば、国際公開第９９／２５８２１号パンフレット、国際公開第９９／２５８５４号パンフレット、国際公開第９９／２５８４０号パンフレット、国際公開第９９／２５８５５号パンフレット及び国際公開第９９／２５８５３号パンフレットを参照されたい。これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。簡単に言えば、本開示のポリヌクレオチドは、２つの非同一性組換え部位で挟まれている導入カセットに含まれ得る。導入カセットは、導入カセットの部位に対応する２つの非同一性組換え部位で挟まれている標的部位がそのゲノムに安定に組み込まれた植物に導入される。適切なリコンビナーゼが提供され、導入カセットが標的部位に組み込まれる。目的のポリヌクレオチドは、それによって植物ゲノムの特定の染色体上の位置に組み込まれる。
【０１６６】
形質転換された細胞は、従来の方法で植物体に成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。その後、これらの植物を成長させ、同じ形質転換種又は異なる種と授粉させ、それにより得られた、所望の表現型の特性を発現した子孫を確認することができる。所望の表現型特性の発現が安定して維持され、受け継がれるのを確実にするため、２世代以上生育させ、その後、所望の表現型特質の発現が達成されたことを確実にするため、種子を収穫することができる。このように、本開示は、ゲノムに安定に組み込まれた、本開示のヌクレオチドコンストラクト、例えば本開示の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」ともいう）を提供する。
【０１６７】
植物組織から植物を再生する様々な方法がある。再生の特定の方法は、出発植物組織と再生する特定の植物種に依るであろう。単一植物プロトプラスト形質転換体又は種々の形質転換された外植片からの植物の再生、発達及び培養は、当該技術分野でよく知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、（１９８８）Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。この再生及び育成プロセスには、通常、形質転換細胞を選択し、それらの個別の細胞を、胚の通常発生段階から小植物を根付かせる段階まで育成する工程を含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生される。得られる根付いたトランスジェニックシュートはその後、土壌などの適切な植物育成培地に植え付ける。好ましくは、再生植物を自家授粉させて同型のトランスジェニック植物を提供する。さもなければ、再生植物から得た花粉を、農学的に重要な系の種子から育った植物と交雑させる。逆に、これらの重要な系の植物の花粉を、再生植物への授粉に使用する。所望のポリヌクレオチドを含む本態様のトランスジェニック植物は、当業者によく知られた方法で栽培される。
【０１６８】
本態様は、植物内での発現の調節する化合物のスクリーニングのための組成物を提供する。ベクター、細胞及び植物は、本明細書に開示の調節配列のアゴニスト及びアンタゴニストのための候補分子のスクリーニングに使用することができる。例えば、レポーター遺伝子は、調節配列に作動可能に連結し、植物において導入遺伝子として発現することができる。試験する化合物が加えられ、レポーター遺伝子の発現が測定され、プロモーター活性に対する効果が決定される。
【０１６９】
一態様において、本開示の方法及び組成物は、体細胞胚へ、体細胞胚由来の植物ゲノム中の改変に特異的な部位を標的とするのに有用なポリヌクレオチドを、高効率且つ高速で導入するのに使用することができる。本開示の方法及び組成物によって導入することができる部位特異的改変としては、部位特異的改変を導入する任意の方法によるもの、例えば、限定はされないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチドの使用（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書）、又は、ＴＡＬＥＮ、マガヌクレオチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓなどの二本鎖切断技術によるものが挙げられる。例えば、植物若しくは植物細胞のゲノム中の標的配列のゲノム改変のために、植物を選択するために、塩基又は配列を欠失させるために、遺伝子編集のために、そして目的ポリヌクレオチドを植物若しくは植物細胞のゲノムに挿入するために、本開示の方法及び組成物を使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを植物細胞又は植物へ導入することができる。したがって、本開示の方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと共に使用して、植物体、植物細胞又は種子のゲノム中の標的部位及び目的ヌクレオチドを修飾又は改変するのに有効なシステムな提供することができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、この植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは植物ゲノムに結合し、ゲノム標的配列に二本鎖切断を引き起こすことができる。
【０１７０】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、植物体、植物細胞又は種子のゲノム中の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。さらに、細胞のゲノム中の標的部位の改変、細胞のゲノム中のヌクレオチドの編集に有効なシステムを提供するために、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法及び組成物を提供する。ゲノム標的部位が特定されたなら、様々な方法を用いて、様々な目的ポリヌクレオチドを含むように標的部位をさらに改変することができる。本発明の組成物及び方法を使用して、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列の編集を行うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを導入することができる。編集されるべきヌクレオチド配列（目的ヌクレオチド配列）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識される標的部位中にあっても標的部位外にあってもよい。
【０１７１】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）（ＳＰＩＤＲ―スペーサー散在型ダイレクトリピートとしても知られる）は、最近記載されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短く且つ高度に保存されたＤＮＡリピート（通常２４〜４０ｂｐ、１〜１４０回の繰り返し―ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）から構成され、部分的に回文を形成している。反復配列（通常、種に固有である）間は一定の長さの可変配列（通常、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に依り２０〜５８）がスペーサーとして存在している（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。
【０１７２】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は最初にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において見出された（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３；Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６）。同様の間隔短配列リピートが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で特定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はリピートの構造により他のＳＳＲと異なり、短等間隔リピート（ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と呼ばれていた（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．６：２３−３３、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。リピートは、クラスターの形態で生じる短いエレメントであり、常に一定の長さの可変配列により等しい間隔をおいて存在している（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。
【０１７３】
Ｃａｓ遺伝子としては、一般にフランキングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合して、関連して、又は近接若しくは隣接して存在する遺伝子が挙げられる。用語「Ｃａｓ遺伝子」及び「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書では互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的レビューは、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に記載されている。
【０１７４】
４つの当初記載された遺伝子ファミリーに加え、さらに４１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。この文献には、ＣＲＩＳＰＲシステムが、異なるリピート配列パターン、遺伝子群、及び種の範囲を有する、異なる分類に属することが示されている。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣａｓ遺伝子の数は、種によって変わり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質と関連しており、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ標的配列へ二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」には、ＤＮＡ標的部位に二本鎖切断を導入することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチドとの複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位の極めて近くでＤＮＡ二本鎖をほどき、ガイドヌクレオチドによる標的配列の認識時に両方のＤＮＡ鎖を切断するが、それは、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端で適切に配向している場合に限られる（２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの図２Ａ及び図２Ｂを参照）。
【０１７５】
一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、以下に限定されないが、２００７年３月１日に公開され、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレットの配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５及び５１８に記載のＣａｓ９遺伝子である。別の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物、トウモロコシ又はダイズ最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、以下に限定されないが、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの図１Ａに示されたものである。別の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域上流のＳＶ４０核標的シグナル、及びＣａｓコドン領域下流の二分ＶｉｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７４４２−６）に作動可能に連結している。
【０１７６】
一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの、配列番号１、１２４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、１９３、若しくは配列番号５のヌクレオチド２０３７〜６３２９、又はその機能的断片若しくは改変体からなるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子である。
【０１７７】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して、用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」及び「機能的に等価な断片」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの一部又はサブ配列を指す。
【０１７８】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して、用語「機能的改変体」、「機能的に等価である改変体」及び「機能的に等価な改変体」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの改変体を指す。断片及び改変体は、部位特異的変異誘発法及び合成構築法などの方法により得ることができる。
【０１７９】
一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｎ（１２−３０）ＮＧＧ型のゲノム配列を認識することができる、植物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子であり、原則として標的とし得る。
【０１８０】
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷させずに特定部位でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、これらはさらに亜型を含む。Ｉ型及びＩＩＩ型系においては、メチラーゼ活性及び制限活性の両活性が単一複合体内に含まれる。エンドヌクレアーゼはまた、ホーミングヌクレアーゼ（ＨＥアーゼ）としても知られるメガヌクレアーゼを含み、この酵素は、制限エンドヌクレアーゼのように、特定の認識部位に結合し切断するが、メガヌクレアーゼの認識部位は通常長く、約１８ｂｐ以上である（２０１２年３月２２日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１号明細書）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフを基に４つのファミリー、すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈ−Ｎ−Ｈファミリー、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーに分類されている。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びリン酸ジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、その長い認識部位と、そのＤＮＡ基質の配列多型性を許容していることで知られている。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、それぞれ独立ＯＲＦ、イントロンおよびインテインによってコードされる酵素に対して付される接頭辞のＦ−、Ｉ−又はＰＩ−で特徴付けられる。遺伝子組換えプロセスの１つの工程は、認識部位又はその近傍でのポリヌクレオチドの切断を含む。この切断活性は、二本鎖の切断に使用され得る。部位特異的リコンビナーゼ及びその認識部位のレビューには、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ５：５２１−７、及びＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７を参照されたい。いくつかの例では、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリー又はリゾルバーゼファミリーからのものである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、植物又は他の有機体のゲノム中の特定の標的配列での二本鎖切断に使用することができる配列特異的ヌクレアーゼの新しい分類である（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び二本鎖切断誘発物質ドメインからなる人工の二本鎖切断誘発物質である。認識部位特異性は、通常、例えばＣ２Ｈ２構造を有する２つ、３つ若しくは４つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガードメインによって与えられるが、他のジンクフィンガー構造は知られており、工学的に作り出されている。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドを設計するために適用できる。ＺＦＮとしては、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合した人工ＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、ＦｏｋｌなどのＭｓ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインが挙げられる。さらなる機能性は、ジンクフィンガー結合ドメイン、例えば、転写活性因子ドメイン、転写抑制因子ドメイン及びメチラーゼに融合することができる。いくつかの例では、切断活性にヌクレアーゼドメインの二量体化が要求される。各ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡの３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、ヌクレアーゼの二量体化要件で、９個の連続するヌクレオチドからなる配列を認識し、２組のジンクフィンガートリプレットが、１８個のヌクレオチドからなる認識配列に結合するために使用される。
【０１８１】
細菌及び古細菌は、短鎖ＲＮＡを使用して外来核酸を分解する、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させた（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的へガイドするのにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）は、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖に相補的な領域と、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を有する塩基対とを含む。
【０１８２】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドヌクレオチド」は、２つのＲＮＡ分子、可変ターゲティングドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成的融合に関連している。一態様では、ガイドヌクレオチドは、１２〜３０ヌクレオチド配列からなる可変ターゲティングドメインと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し得るＲＮＡ断片とを含む。
【０１８３】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連している。このガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であってよい。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合、又は連結修飾を含むことができ、この連結修飾としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、又は環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるが、これらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドもまた、「ガイドヌクレオチド」と称される。
【０１８４】
ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。この二本鎖分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の個別の分子を含む。この２個の個別の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であってよい。一態様では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌及び古細菌中で天然に存在するｃＲＮＡの断片を含む可能性がある。一態様では、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中及び古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又はそれ以上のヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。
【０１８５】
一態様においては、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、「ｔｒａｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。一態様では、ＲＮＡ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
【０１８６】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む一本鎖分子であってもよい。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。一本鎖ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列及びｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、「一本鎖ガイドヌクレオチド」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、「一本鎖ガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「一本鎖ガイドヌクレオチド−ＤＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称することができる。本開示の一態様においては、一本鎖ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ又はｃＲＮＡ断片、及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して一本鎖ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、一本鎖ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１８７】
用語「可変ターゲティングドメイン」又は「ＶＴドメイン」は本明細書においては互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性％は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり得る。一態様では、可変ターゲティングドメインは１２〜３０ヌクレオチドからなる連続ストレッチを含む。可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０１８８】
ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」又は「ＣＥＲドメイン」は本明細書においては互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に記載する改変を参照されたい）、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０１８９】
一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。一態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチドであり得る。別の態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
【０１９０】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変又は配列、トラッキングが生じる改変又は配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変又は配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更又は調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用又はタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、及び細胞透過性の増大の群から選択される。
【０１９１】
一態様では、ガイドヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼとは、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を導入するのを可能にする複合体を形成することができる。
【０１９２】
本開示の一態様では、可変標的ドメインの長さは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり得る。
【０１９３】
本開示の一態様において、ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ（又はｃＲＮＡ断片）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（又はｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。ガイドヌクレオチドは、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、限定はされないが、粒子衝撃法又は局所的適用法により植物体又は植物細胞に直接導入することができる。
【０１９４】
一態様では、ガイドヌクレオチドは、植物細胞中でガイドヌクレオチドを転写することができる、植物特異的プロモーターに作動可能に連結した、対応するガイドＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を導入することによって、間接的に導入することができる。用語「対応するガイドＤＮＡ」には、ＲＮＡ分子の各「Ｕ」が「Ｔ」に置き替えられている以外はＲＮＡ分子と同じＤＮＡ分子が含まれる。
【０１９５】
一態様では、ガイドヌクレオチドは、粒子衝撃法により、又は、植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結した、対応するガイドＤＮＡを含む組換えＤＮＡコンストラクトをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換するための本開示の方法及び組成物によって導入される。
【０１９６】
一態様では、ＲＮＡ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対してガイドヌクレオチドを使用する利点の１つは、融合ガイドヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１９７】
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」及び「ゲノム標的遺伝子座」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって植物細胞ゲノムで二本鎖切断が誘発される、植物細胞ゲノム中のポリヌクレオチド配列（葉緑体ＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡを含む）を指す。標的部位は植物ゲノム中の内因性部位であり得、或いは、標的部位は植物体に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、或いは標的部位は天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、用語「内因性標的配列」及び「天然標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物ゲノムに対して内因性又は天然性のものであり、且つ植物ゲノム中の標的配列の内在性又は天然の位置に存在する標的配列を指す。一態様では、標的部位は、ＤＮＡ認識部位、又は特異的に認識し、且つ／若しくは、ＬＩＧ３−４エンドヌクレアーゼ（米国特許出願公開第２００９／０１３３１５２Ａ１号明細書（２００９年５月２１日公開））、若しくはＭＳ２６＋＋メガヌクレアーゼ（２０１２年６月１９日出願の米国特許出願第１３／５２６９１２号明細書）などの二本鎖切断誘発物質によって結合する標的部位に類似する部位であり得る。
【０１９９】
「人工標的部位」又は「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物のゲノム中に導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、植物ゲノム中の内因性標的配列又は天然標的配列と配列が同じであり得、しかし、植物ゲノム中の異なる場所（すなわち、非内因性又は非天然の場所）に存在し得る。
【０２００】
「改変標的部位」、「改変標的配列」、「変更標的部位」及び「変更標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、非改変標的配列を比較したとき、少なくとも１つの改変を含む本明細書に開示の標的部位を指す。そのような「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【０２０１】
配列番号１〜１８９の概要を表１に示す。
【０２０２】
【表１】
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【０２０３】
【表２】
2020536515.tif 000004
【０２０４】
【表３】
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【０２０５】
【表４】
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【０２０６】
【表５】
2020536515.tif 000007
【０２０７】
【表６】
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【０２０８】
【表７】
2020536515.tif 000009
【０２０９】
【表８】
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【０２１０】
【表９】
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【０２１１】
【表１０】
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【０２１２】
【表１１】
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【０２１３】
【表１２】
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【０２１４】
【表１３】
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【０２１５】
【表１４】
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【０２１６】
【表１５】
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【０２１７】
【表１６】
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【０２１８】
【表１７】
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【０２１９】
以下の実施例は、実例として提供するものであって、限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２２０】
本開示の態様を以下の実施例においてさらに明確にするが、実施例中、特に明記しない限り、部及びパーセンテージは重量基準であり、度はセ氏である。これらの実施例は本開示の態様を示すが、単に例証として示すものである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、これらの態様の必須の特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、それらに様々な変更及び修正を加えて、様々な用途及び条件に適合させることができる。したがって、本明細書に示され記載されているものに加えて、これらの態様の様々な変更は、当業者には、前述の記載から明らかであろう。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０２２１】
実施例１．植物材料及び培地組成
本方法では、懸濁培養、未熟子葉、成熟子葉、分割種子、胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、及び葉を含む広範な組織又は外植片型使用することができる。ダイズ形質転換、組織培養、及び再生に使用される種々の培地組成を表２に概説する。この表において、培地Ｍ１は、これが形質転換のための出発物質である場合、懸濁培養の開始のために使用される。培地Ｍ２及びＭ３は、上に列挙した外植片の全範囲のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換に有用な代表的な共培養培地を示す。培地Ｍ４は選択に有用であり（適切な選択剤と共に）、Ｍ５は体細胞胚成熟に使用され、培地Ｍ６は発芽に使用されてＴ０小植物体を作出する。
【０２２２】
【表１８】
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【０２２３】
【表１９】
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【０２２４】
共培養の１〜５日後、組織を、選択なしでＭ３培地で１週間培養し（回復期間）、次いで、選択に移行する。選択では、安定な形質転換体の選択のために抗生物質又は除草剤をＭ３培地に添加する。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に対するカウンターセレクションを開始するために、３００ｍｇ／ｌのＴｉｍｅｎｔｉｎ（登録商標）（クラブラン酸カリウムと混合した無菌チカルシリン二ナトリウム、ＰｌａｎｔＭｅｄｉａ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）も添加し、選択剤及びＴｉｍｅｎｔｉｎ（登録商標）の両方を、選択期間を通して培地中に維持する（合計８週間まで）。選択培地は毎週交換する。選択培地で６〜８週間後、形質転換された組織は、漂白された（又は壊死した）、不健康な組織のバックグラウンドに対して緑色組織として見えるようになる。これらの組織片をさらに４〜８週間培養する。
【０２２５】
次いで、緑色の健康な体細胞胚を、１００ｍｇ／ＬのＴｉｍｅｎｔｉｎ（登録商標）を含むＭ５培地に移す。Ｍ５培地で合計４週間、成熟させた後、成熟体細胞胚を、滅菌した空のペトリ皿に入れ、ＭｉｃｒｏｐｏｒｅＴＭテープ（３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ、ＵＳＡ）で密封するか、又はプラスチックボックス（ファイバーテープなし）に入れ、室温で４〜７日間置く。
【０２２６】
乾燥した胚をＭ６培地に植え、２６℃、１８時間の光周期、６０〜１００μＥ／ｍ２／ｓの照度で発芽させる。発芽培地で４〜６週間後、小植物体を湿らせたＪｉｆｆｙ−７ピートペレット（Ｊｉｆｆｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ、Ｓｈｉｐｐａｇａｎ、Ｃａｎａｄａ）に移し、以下の条件下、すなわち、６０〜１００μＥ／ｍ２／ｓ、２６℃／２４℃の昼／夜の温度で１６時間の光周期で、Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーター中で順応するまで、透明なプラスチックトレーボックス中に封入したままにする。最後に、硬化した小植物体を、湿らせたＳｕｎＧｒｏ  ７０２を含有する２ガロンのポットに植え、温室内で成熟し、種子を持つまで成長させる。
【０２２７】
実施例２．ダイズの形質転換
ダイズでは、粒子衝撃法の標準プロトコール（Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ，１９９１，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ  ２７：１７５−１８２）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１６：１８５５２−１８５４３、米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、又はオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換（米国特許出願公開第２０１８／０２１６１２３号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））が本開示の方法と共に使用することができる。
【０２２８】
実施例３．ＷＵＳ発現を制御するＧＭ−ＬＴＰ３プロモーターはダイズ形質転換を改善する
発現カセットＧＭ−ＬＴＰ３  ＰＲＯ：：ＡＴ−ＷＵＳ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＵＢＱイントロン１：：ＴＡＧ−ＲＦＰ：：ＵＢＱ３  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＳＡＭＳ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＳＡＭＳ  イントロン１：：ＧＭ−ＨＲＡ：：ＧＭ−ＡＬＳ  ＴＥＲＭ（ＰＨＰ８０７３０；配列番号１１２）を有するＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＡＧＬ１を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒ大豆品種ＰＨＹ２１を形質転換した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄し、過剰の細菌を除いた。９日後、組織を体細胞胚成熟培地に移し、２２日後にトランスジェニック体細胞胚はドライダウンの準備が整った。この時点で、十分に形成された成熟体細胞胚は、ＲＦＰフィルターを備えた落射蛍光実体顕微鏡下で赤色の蛍光を発した。成長した体細胞胚は、機能的であり発芽して温室で健康な植物体に育った。この急速な、体細胞胚の生成方法、及び発芽させて植物体を形成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から２ヵ月に短縮された。
【０２２９】
実施例４．ＷＵＳ発現を制御するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターはダイズの形質転換成熟効率を改善する
形質転換が困難なダイズ品種では、ダイズ形質転換過程で形成される形質転換体細胞胚の多くが適切に成熟しないことが一般的に観察される。体細胞胚が最終的に成熟しないと、発芽頻度が大幅に減少して、温室で生き残るトランスジェニック小植物体が形成される。ＷＵＳ発現を駆動するプロモーター（ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３（配列番号１２４）、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ２（配列番号１０８）、ＧＭ−ＭＡＴＥ１（配列番号１０９）、ＧＭ−ＮＥＤ１（配列番号１１０））を試験して、ダイズ形質転換成熟効率に及ぼすそれらの影響を決定した。ＷＵＳ発現（ＰＨＰ８１３４３；配列番号１１６）を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）は、体細胞胚成熟の効率を大幅に改善し、ＴＡＧ−ＲＦＰ対照（ＰＨＰ８０７２８；配列番号１１１）の中央値８％未満から５０％超まで成熟効率を増加させた。図１を参照されたい。これは、発芽してトランスジェニックＴ０植物体を形成することができるトランスジェニック成熟体細胞胚の頻度の増加に直接つながった。図３Ａ及び３Ｂを参照されたい。
【０２３０】
ＷＵＳの発現を駆動する他のプロモーターの使用では、中間の成熟効率が得られ、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ２（ＰＨＰ８０７３４；配列番号１１３）、ＧＭ−ＬＴＰ３（ＰＨＰ８０７３０；配列番号１１２）、ＧＭ−ＭＡＴＥ１（ＰＨＰ８０７３６；配列番号１１４）又はＧＭ−ＮＥＤ１（ＰＨＰ８１０６０；配列番号１１５）プロモーターの中央値レベルはそれぞれ１３％、３３％、１３％、及び１５％であった。図１を参照されたい。ＴＡＧ−ＲＦＰ対照処理（ＰＨＰ８０７２８；配列番号１１１）では、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染の５〜６週後の体細胞胚は小さく生育不足であったが、ＧＭ−ＬＴＰ３  ＰＲＯ：：ＷＵＳ（ＰＨＰ８０７３０；配列番号１１２）処理、及びＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３  ＰＲＯ：：ＷＵＳ（ＰＨＰ８１３４３；配列番号１１６）処理における体細胞胚はそれぞれ約２〜５倍大きかった。図２Ａ〜２Ｆを参照されたい。  
【０２３１】
実施例５．形態形成遺伝子の発現を制御するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター又はＧＭ−ＬＴＰ３プロモーターは形質転換を改善する
蛍光マーカーを含む発現カセットにおけるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＬＥＣ１、ＬＥＣ２、ＫＮ１、ＳＴＭ、又はＬＥＣ１様（Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１５，５−１８）遺伝子の発現を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３プロモーター（配列番号１２４）、又は本明細書に開示の他のプロモーターの使用により、体細胞胚形成の頻度及びトランスジェニックＴ０植物体の回収が増加することが見出される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒ大豆品種ＰＨＹ２１の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を形質転換する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄し、過剰の細菌を除く。約９日後、組織は体細胞胚成熟培地に移され、約２２日後にトランスジェニック体細胞胚はドライダウンの準備が整うと予想される。この時点で、十分に形成された成熟体細胞胚は、適切なフィルターを備えた落射蛍光実体顕微鏡下で蛍光を発する。成長した体細胞胚は、機能的であり発芽して温室で健康な植物体に育つ。この急速な、体細胞胚の生成方法、及び発芽させて植物体を形成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から約２〜３ヵ月に短縮されると予想される。
【０２３２】
実施例６．アグロバクテリウムＩＰＴ遺伝子の発現を制御するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３又はＧＭ−ＬＴＰ３プロモーターの使用は直接的シュート形成を促進し、形質転換を改善する
蛍光マーカーを含む発現カセットにおけるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＰＴ遺伝子の発現を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３プロモーター（配列番号１２４）、又は本明細書に開示の他のプロモーターの使用により、多数のシュート形成の頻度及びトランスジェニックＴ０植物体の回収が増加することが見出される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒ大豆品種ＰＨＹ２１の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を形質転換する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄して過剰の細菌を除去し、多数のシュート増殖を促進する培地に移す。９日後、組織はシュートの発達に有利な培地に移され、２２日後にトランスジェニックシュートが、発根を促進する培地に移されると予想される。この時点で、初期小植物体は、適切なフィルターを有する落射蛍光立体顕微鏡下で蛍光を発する。機能性小植物体は急速に発達し、温室内で成長し続け、健康な植物体を作出する。この急速な、トランスジェニック植物を直接生成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から約２〜３ヵ月に短縮されると予想される。
【０２３３】
実施例７．シロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ）モノプテロス−デルタ遺伝子の発現を制御するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター又はＧＭ−ＬＴＰ３プロモーターはシュート形成を直接刺激し、形質転換を改善する
蛍光マーカーを含む発現カセットにおけるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）モノプテロス−デルタ遺伝子の発現を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３プロモーター（配列番号１２４）、又は本明細書中に開示の他のプロモーターの使用により、多数のシュート形成の頻度及びトランスジェニックＴ０植物体の回収が増加することが見出される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒ大豆品種ＰＨＹ２１の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を形質転換する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄して過剰の細菌を除去し、多数のシュート増殖を促進する培地に移す。９日後、組織はシュートの発達に有利な培地に移され、２２日後にトランスジェニックシュートが、発根を促進する培地に移されると予想される。この時点で、初期小植物体は、適切なフィルターを有する落射蛍光立体顕微鏡下で蛍光を発する。機能性小植物体は急速に発達し、温室内で成長し続け、健康な植物体を作出する。この急速な、トランスジェニック植物を直接生成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から約２〜３ヵ月に短縮されると予想される。
【０２３４】
実施例８．成長促進遺伝子の発現を制御するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター又はＧＭ−ＬＴＰ３プロモーターは形質転換を改善する
蛍光マーカーを含む発現カセットにおけるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＶ−６Ｂ遺伝子、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＡ−ｈ遺伝子、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＡ−ｍ遺伝子、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＳＥＲＫ又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＧＬ１５遺伝子の発現を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３プロモーター（配列番号１２４）、又は本明細書に開示の他のプロモーターの使用により、体細胞胚形成の頻度及びトランスジェニックＴ０植物体の回収が増加することが見出される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒ大豆品種ＰＨＹ２１の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を形質転換する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄し、過剰の細菌を除く。９日後、組織は体細胞胚成熟培地に移され、２２日後にトランスジェニック体細胞胚はドライダウンの準備が整うと予想される。この時点で、十分に形成された成熟体細胞胚は、適切なフィルターを備えた落射蛍光実体顕微鏡下で蛍光を発する。成長した体細胞胚は、機能的であり発芽して温室で健康な植物体に育つ。この急速な、体細胞胚の生成方法、及び発芽させて植物体を形成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から約２〜３ヵ月に短縮されると予想される。
【０２３５】
実施例９．ウイルスエンハンサーエレメントの、ＷＵＳの発現を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターとの併用は、ダイズ形質転換をさらに改善する
ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３プロモーター（配列番号１２４）、又は本明細書に開示の他のプロモーターの単独使用と比較して、蛍光マーカーを含む発現カセットにおけるＷＵＳ発現を駆動するＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）、ＧＭ−ＬＴＰ３プロモーター（配列番号１２４）、又は本明細書に開示の他のプロモーターに隣接した３５Ｓエンハンサーなどのウイルスエンハンサーエレメントの使用により、体細胞胚形成の頻度及び体細胞胚成熟の頻度がさらに増加し、トランスジェニックＴ０植物の回収の全体的な増加がもたらされる。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒ大豆品種ＰＨＹ２１の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を形質転換する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄し、過剰の細菌を除く。９日後、組織を体細胞胚成熟培地に移し、２２日後にトランスジェニック体細胞胚はドライダウンの準備が整う。この時点で、十分に形成された成熟体細胞胚は、適切なフィルターを備えた落射蛍光実体顕微鏡下で蛍光を発する。成長した体細胞胚は、機能的であり発芽して温室で健康な植物体に育つ。この急速な、体細胞胚の生成方法、及び発芽させて植物体を形成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から約２〜３ヵ月に短縮される。
【０２３６】
他のエンハンサーエレメントが同様の方法で試験され、そしてまた、ＧＭ−ＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーター（配列番号１）の単独使用と比較して、形質転換の増加が生ずることが示される。  このようなエンハンサーとしては、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）３５Ｓ及びミラビリスモザイクウイルス（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）２ｘＭＭＶなどのウイルスエンハンサー、並びに内因性植物エンハンサーエレメントが挙げられる。
【０２３７】
実施例１０．シロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログはダイズにおいて体細胞胚の形成を促進する働きをする
以下の処理を比較した。パーティクルガン法による形質転換処理では、全てが  ＧＭ−ＥＦ１Ａ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＥＦ１Ａ  イントロン１：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＳＡＭＳ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＳＡＭＳ  イントロン１：：ＧＭ−ＡＬＳ：：ＧＭ−ＡＬＳ  ＴＥＲＭを有するプラスミドＱＣ３１８（配列番号１１７）を含んだ。処理は、１）対照（追加遺伝子なし）、２）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するｐＶＥＲ９６６２（配列番号１１８）、３）ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＧＭＷＵＳ（配列番号１１９）、４）メディカゴ・トルンキュラータ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＭＴＷＵＳ（配列番号１２０）、５）ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＬＪＷＵＳ（配列番号１２１）、６）インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＰＶＷＵＳ（配列番号１２２）、及び７）ペチュニアＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＰＹＷＵＳ（配列番号１２３）を含んだ。
【０２３８】
未熟子葉を種子から単離し、２週間前培養し、次いで、パーティクルガン法で形質転換し、２つのプラスミドの混合物を共導入し、第１のものは、ＷＵＳオルソログの各々のｃＤＮＡ配列の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯからなる発現カセット（ｐＶＥＲ９６６２（配列番号１１８）、ＵＢＩＧＭＷＵＳ（配列番号１１９）、ＵＢＩＭＴＷＵＳ（配列番号１２０）、ＵＢＩＬＪＷＵＳ（配列番号１２１）、ＵＢＩＰＶＷＵＳ（配列番号１２２）、及びＵＢＩＰＹＷＵＳ（配列番号１２３））と、ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷの発現カセット（ＱＣ３１８（配列番号１１７））とを含んだ。外植片を２週間培養した。２週間後に、蛍光を発する球状体細胞胚の数を計数し、各処理について表にした。
【０２３９】
パーティクルガン法による形質転換の２週間後、衝撃された対照子葉では蛍光を発する球状体細胞胚はほとんど観察されなかったが、他の全ての処理（ＡＴ−ＵＢＩプロモーターによって駆動される異なる双子葉植物種由来のＷＵＳ遺伝子を含有）では衝撃された子葉で多くの蛍光を発する体細胞胚が観察された。
【０２４０】
実施例１１．シロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログはアブラナ属（ＢＲＡＳＳＩＣＡ）において体細胞胚の形成を促進する働きをする
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログによる形質転換のために、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を単離する。以下の処理を比較する。パーティクルガン法による形質転換処理では、全てが  ＧＭ−ＥＦ１Ａ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＥＦ１Ａ  イントロン１：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＳＡＭＳ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＳＡＭＳ  イントロン１：：ＧＭ−ＡＬＳ：：ＧＭ−ＡＬＳ  ＴＥＲＭを有するプラスミドＱＣ３１８（配列番号１１７）を含む。処理は、１）対照（追加遺伝子なし）、２）ｐＶＥＲ９６６２（配列番号１１８）、３）ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＧＭＷＵＳ（（配列番号１１９）、４）メディカゴ・トルンキュラータ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＭＴＷＵＳ（配列番号１２０）、５）ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＬＪＷＵＳ（配列番号１２１）、６）インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＰＶＷＵＳ（配列番号１２２）、及び７）ペチュニアＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＰＹＷＵＳ（配列番号１２３）が含まれた。
【０２４１】
パーティクルガン法による形質転換のために、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を単離し、２つのプラスミドの混合物を共導入し、第１のものは、ＷＵＳオルソログの各々のｃＤＮＡ配列の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯからなる発現カセット（ｐＶＥＲ９６６２（配列番号１１８）、ＵＢＩＧＭＷＵＳ（配列番号１１９）、ＵＢＩＭＴＷＵＳ（配列番号１２０）、ＵＢＩＬＪＷＵＳ（配列番号１２１）、ＵＢＩＰＶＷＵＳ（配列番号１２２）、及びＵＢＩＰＹＷＵＳ（配列番号１２３））と、ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷの発現カセット（ＱＣ３１８（配列番号１１７））とを含む。外植片を２週間培養する。２週間後に、蛍光を発する球状体細胞胚の数を計数し、各処理について表にする。
【０２４２】
パーティクルガン法による形質転換の２週間後、衝撃された対照外植片型、例えばアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織では、蛍光を発する球状体細胞胚はほとんど観察されないが、他の全ての処理（ＡＴ−ＵＢＩプロモーターによって駆動される異なる双子葉植物種由来のＷＵＳ遺伝子を含有）では、衝撃された外植片型、例えばアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織では、多数の蛍光を発する球状体細胞胚が観察される。
【０２４３】
実施例１２．シロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログはヒマワリにおいて体細胞胚の形成を促進する働きをする
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログによる形質転換のために、ヒマワリの未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を単離する。以下の処理を比較する。パーティクルガン法による形質転換処理では、全てが  ＧＭ−ＥＦ１Ａ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＥＦ１Ａ  イントロン１：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＳＡＭＳ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＳＡＭＳ  イントロン１：：ＧＭ−ＡＬＳ：：ＧＭ−ＡＬＳ  ＴＥＲＭを有するプラスミドＱＣ３１８（配列番号１１７）を含む。処理は、１）対照（追加遺伝子なし）、２）ｐＶＥＲ９６６２（配列番号１１８）、３）  ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＧＭＷＵＳ（配列番号１１９）、４）メディカゴ・トルンキュラータ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＭＴＷＵＳ（配列番号１２０）、５）ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＬＪＷＵＳ（配列番号１２１）、６）インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＰＶＷＵＳ（配列番号１２２）、及び７）ペチュニアＷＵＳ遺伝子の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯを有するＵＢＩＰＹＷＵＳ（配列番号１２３）が含まれた。
【０２４４】
パーティクルガン法による形質転換のために、ヒマワリの未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織を含む種々の外植片型を単離し、２つのプラスミドの混合物を共導入し、第１のものは、ＷＵＳオルソログの各々のｃＤＮＡ配列の発現を駆動するＡＴ−ＵＢＩ  ＰＲＯからなる発現カセット（ｐＶＥＲ９６６２（配列番号１１８）、ＵＢＩＧＭＷＵＳ（配列番号１１９）、ＵＢＩＭＴＷＵＳ（配列番号１２０）、ＵＢＩＬＪＷＵＳ（配列番号１２１）、ＵＢＩＰＶＷＵＳ（配列番号１２２）、及びＵＢＩＰＹＷＵＳ（配列番号１２３））と、ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷの発現カセット（ＱＣ３１８（配列番号１１７））とを含む。外植片を２週間培養する。２週間後に、蛍光を発する球状体細胞胚の数を計数し、各処理について表にする。
【０２４５】
パーティクルガン法による形質転換の２週間後、衝撃された対照外植片型、例えばヒマワリの未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織では、蛍光を発する球状体細胞胚はほとんど観察されないが、他の全ての処理（ＡＴ−ＵＢＩプロモーターによって駆動される異なる双子葉植物種由来のＷＵＳ遺伝子を含有）では、衝撃された外植片型、例えばヒマワリの未熟子葉、分割種子、単離された胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｅｓ）、成熟子葉節、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、上胚軸、又は葉の組織では、多数の蛍光を発する球状体細胞胚が観察される。
【０２４６】
実施例１３．シロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログはアブラナ属（ＢＲＡＳＳＩＣＡ）形態形成成長を促進する
１２の異なる双子葉植物種、２つの裸子植物種、及び１つの単子葉植物種由来のＷＵＳ遺伝子について、スペクチノマイシン含有培地による選択下での、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）におけるトランスジェニック緑色シュート応答の成長を促進する能力を評価することにより、有効性を試験した。ＷＵＳ発現カセットを含む全ての処理で、コンストラクトに用いられたＷＵＳ遺伝子を除いてＴ−ＤＮＡの構成は同一であった。このＴ−ＤＮＡ構成は、ボールド体のイタリック体で示す可変のＷＵＳ遺伝子を含む、ＲＢ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＵＢＱ  ５ＵＴＲ：：ＧＭ−ＵＢＱ  イントロン１：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ１  Ｎ１：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＡＴ−ＵＢＩＱ１０  ＰＲＯ：：ＡＴ−ＵＢＩＱ１０  ５ＵＴＲ：：ＡＴ−ＵＢＩＱ１０  イントロン１：：ＣＴＰ：：ＳＰＣＮ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭ＋ＬＢであった。
【０２４７】
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の種子の表面を５０％Ｃｌｏｒｏｘ溶液で滅菌し、ＭＳ基礎塩及びビタミンを含有する固体培地で発芽させた。実生を１０〜１４日間、光中、２８℃で成長させ、胚軸を子葉から切り離した。胚軸外植片を、２００ｍＭアセトシリンゴンを含む１０ｍｌの２０Ａ培地（表３）を含む１００×２５ｍｍペトリ皿に移し、次いで、長さ３〜５ｍｍの切片にスライスした。スライス後、上記の発現カセットを含む４０μｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）溶液（アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−５５０ｎＭで光学濃度０．５０）を皿に加え、胚軸／アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）混合物を含むペトリ皿をシェーカープラットフォーム上に置き、１０分間軽く撹拌した。１０分間やさしく撹拌した後、皿を薄暗い光の中に移し、３日間、２１℃で共培養した。
【０２４８】
共培養後、胚軸外植片をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）溶液から取り出し、滅菌濾紙上で軽くふき取った後、７０Ａ選択培地（表３）（１０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含む）に置き、明るい室内（２６℃及び明るい光）に移動させた。外植片を２週間、７０Ａ選択培地に置いた後、２回目の７０Ａ選択に移した（或いは、２回目の選択では、外植片を２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含む７０Ｂ培地（表３）に移した）。２回目の選択後、外植片を７０Ｃシュート伸長培地（表３）に２〜３週間移し、明るい室内に戻した。次いで、シュートを９０Ａ発根培地（表３）に移した後、温室内の土壌に移した。
【０２４９】
【表２０】
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【０２５０】
表４に示すように、異なる種由来のＷＵＳ遺伝子は、キャノーラにおけるトランスジェニック緑色シュートの成長応答を促進した。このシュート発達の促進とスペクチノマイシン耐性シュートの回復能力は、ＷＵＳ遺伝子の供給源に応じて変化した。このトランスジェニックシュートを促進するレベルは、キュウリでは陰性対照処理よりわずかに高いだけであったが、他の種由来のＷＵＳ遺伝子では、グネモン（Ｇｎｅｔｕｍ  ｇｎｅｍｏｎ）（裸子植物）の９５％まで様々であり、ブドウ、セキショウモ（単子葉植物）、カランコエ属（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ）、ペチュニア、リンゴ、ヒマワリ、キャッサバ、及びグネツム属（Ｇｎｅｔｕｍ）由来のＷＵＳ遺伝子について７０％を超える応答が観察された。
【０２５１】
【表２１】
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【０２５２】
実施例１４．ヒマワリＷＵＳオルソログの発現を制御するＨＤ−ＺＩＰ  ＩＶ転写因子ファミリー由来のプロモーターの使用によりアブラナ属（ＢＲＡＳＳＩＣＡ）の形態形成成長が促進される
ヒマワリ（ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ））由来のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳ遺伝子のオルソログの発現を駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）プロモーターについて、スペクチノマイシン含有培地による選択下での、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）におけるトランスジェニック緑色シュート応答の成長を促進する能力を評価することにより、有効性を試験した。全ての処理で、ボールド体のイタリック体で示す可変プロモーターＨＤ−ＺＩＰ  ＩＶ  ＰＲＯを含む、３つの発現カセットＲＢ＋ＨＤ−ＺＩＰ  ＩＶ  ＰＲＯ：：ＨＡ−ＷＵＳ：：ＯＳ：−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＧＭ−ＵＢＱ  ５ＵＴＲ：：ＧＭ−ＵＢＱ  イントロン１：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ１  Ｎ１：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＡＴ−ＵＢＩＱ１０  ＰＲＯ：：ＡＴ−ＵＢＩＱ１０  ５ＵＴＲ：：ＡＴ−ＵＢＩＱ１０  イントロン１：：ＳＰＣＮ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭ＋ＬＢを含むＴ−ＤＮＡを使用した。
【０２５３】
試験したプロモーターはシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来であり、原表皮因子（Ｐｒｏｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｆａｃｔｏｒ）１（ＰＤＦ１、配列番号１４９）、原表皮因子（Ｐｒｏｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｆａｃｔｏｒ）２（ＰＤＦ２、配列番号１５０）、グレイブラス（Ｇｌａｂｒｏｕｓ）２（ＨＤＧ２、配列番号１５１）、分裂組織レイヤ（Ｍｅｒｉｓｔｅｍ  Ｌａｙｅｒ）１（ＭＬ１、配列番号１２５）、エセリフェルム（Ｅｃｅｒｉｆｅｒｕｍ）６（ＣＥＲ６、配列番号１２６）、及びアントシアンレス（ＡＮＬ１、配列番号１５２）を含んだ。これらのプロモーターを含むプラスミドのＴ−ＤＮＡ構成は、それぞれ表１のＲＶ０２７３４３、ＲＶ０２７３４４、ＲＶ０２７３４０、ＲＶ０２７３４２、ＲＶ０２７３３８、及びＲＶ０２７３３７（これらは、それぞれ配列番号１７５、１６９、１７３、１７４、１７２、及び１７１に対応する）に示される。これらのプロモーターを、陽性対照としてＣａＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ（Ｔ−ＤＮＡ情報については、ＲＶ０２１０９０、配列番号１５３を参照）と、また、陰性対照としてＷＵＳ発現カセットを含まないＴ−ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ情報については、ＲＶ０２６５３２、配列番号１７０を参照）と比較した。
【０２５４】
アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子の表面滅菌、実生を生成するための発芽、胚軸外植片の作製、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−による形質転換、組織培養、及びスペクチノマイシンを使用する選択は全て、実施例１３に記載のように行った。
【０２５５】
結果は０〜１０のスケールで示し、ゼロ（０）は陰性対照の応答を超える応答はなく、１０（１０）はＣａＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯで観察される強力な形態形成応答促進に一致する。試験した種々のプロモーターでは、ＰＤＦ１  ＰＲＯで観察された応答は５であり、ＰＤＦ２  ＰＲＯでは応答は２．３であり、ＨＤＧ２  ＰＲＯでは応答は２．２であり、ＭＬ１では応答は２であり、ＣＥＲ６  ＰＲＯでは応答は２であり、ＡＮＬ１  ＰＲＯについては応答は２であった。ＣａＭＶ３５ＳプロモーターはＷＵＳの発現を駆動する際には好ましくない可能性がある強力な構成的プロモーターであるが、強力な初期の発現はＴ−ＤＮＡの組み込み直後は有益であり（シュート形成を急速に促進するため）、植物体全体における強力な発現は形態学的異常及び不稔性をもたらす。試験したＨＤ−ＺＩＰ  ＩＶプロモーターは発達中の胚及び分裂組織のＬ１（表皮）層で発現したが、それ以外は植物体全体では発現しない。したがって、植物の発育及び生殖部分が発達するにつれてＷＵＳ発現のダウンレギュレーションを伴うＴ−ＤＮＡ送達後のシュート形成の正の成長促進は、所望の結果であり、達成された。シュート形成のこの急速な成長促進は、試験したＨＤ−ＺＩＰ  ＩＶプロモーターの全てで実証された。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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