(57)【要約】本発明は、特定のサイズ以下の細胞または細胞群を含む骨関節炎の予防または治療用の薬学的組成物、細胞治療剤製造用キットおよび骨関節炎治療剤の製造方法に関するものである。本発明の有効成分である選別された特定のサイズ以下のＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞および形質転換していない哺乳類細胞の混合細胞は、軟骨細胞相互間の凝集を最小限に抑え、治療効果も有益である。また、選別された特定のサイズ以下の混合細胞が患者に投与される場合、患者コンプライアンスを向上させることができ、治療剤の生産施設または病院での品質管理が容易である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換した哺乳類細胞集団を含む骨関節炎の予防または治療用の薬学的組成物であって、前記集団に含まれる細胞または細胞群は、２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有するものである、薬学的組成物。
【請求項２】
前記形質転換した哺乳類細胞集団は、追加的に放射線照射（irradiate）したものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記組成物は、前記形質転換していない哺乳類細胞集団のほか、形質転換していない哺乳類細胞集団をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物は、「形質転換していない哺乳類細胞集団」対「形質転換した哺乳類細胞集団」が、細胞数を基準に１〜１０対１の割合で混合されたものである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記哺乳類細胞は、軟骨細胞または軟骨前駆細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記哺乳類細胞は、ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換したものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞集団を含む、細胞治療剤製造用キットであって、
前記集団に含まれる細胞または細胞群は、２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有するものである、キット。
【請求項９】
前記キットは、前記形質転換していない哺乳類細胞集団のほか、形質転換していない哺乳類細胞集団をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットは、「形質転換していない哺乳類細胞集団」対「形質転換した哺乳類細胞集団」が、細胞数を基準に１〜１０対１の割合で混合されたものである、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
次のステップを含む骨関節炎治療剤を製造する方法：
（１）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞集団および形質転換していない哺乳類細胞集団をそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）のＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団の中で２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する細胞または細胞群と、形質転換していない哺乳類細胞集団の中で３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する細胞または細胞群をそれぞれ選別するステップと、
（３）前記ステップ（２）のそれぞれ選別された細胞集団を分離されたバイアル内にそれぞれ充填するステップと、
（４）前記ステップ（３）のバイアル内にそれぞれの細胞集団を混合するステップ。
【請求項１３】
前記ステップ（４）の混合は、前記ステップ（２）の形質転換した哺乳類細胞集団と形質転換していない哺乳類細胞集団が、細胞数を基準に１〜１０対１の割合で混合されるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（１）のＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団は、追加的に放射線照射（irradiate）したものである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨関節炎の予防または治療用の薬学的組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性関節炎とも呼ばれる骨関節炎は、軟骨の損傷または退行性変化により、関節をなす骨、軟骨及び靭帯などに損傷が起こり、炎症と痛みが生じる慢性疾患である。骨関節炎は指、膝（膝関節）、尻（股関節）、腰（腰椎関節）、首（頸椎の関節）などの体中のほぼすべての関節で発症する。骨関節炎は、その発生が年齢と関連し、関節の過度の使用や老化による軟骨の摩耗により発生するものと考えられてきた。しかし、最近、骨関節炎の発生機序と軟骨細胞の様々な刺激に対する反応が知られるにつれて、単純に老化と関連する避けることができない現象ではなく、軟骨細胞の代謝バランスの異常などの様々な原因による関節の損傷と、これにより、様々な全身的因子と局所的因子が相互に作用して発生する関節疾患として理解されている。
【０００３】
骨関節炎の主な症状は、反復的な痛み、関節の強直感、機動力の低下および機能喪失である。臨床的な経過は、通常、徐々に進行していく。ある程度病気が進行するにつれて、関節軟骨の消失と変性によって関節面が不規則になると、痛みの程度が増強し、漸進的な運動障害のために日常生活に大きな支障をきたすことになる。また、関節の変形も起こる。
【０００４】
軟骨の成長に関連する調節因子（modulator）及び生化学的因子（biochemical factor）を標的とした研究が進行中である。これらの因子は、骨形成の効果的な刺激因子であるＢＭＰ（bone morphogenic protein）、及び細胞成長と細胞外基質（extracellular matrix、ＥＣＭ）の形成を刺激するＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）を含む。
【０００５】
特に、ＴＧＦ−βは、プロテオグリカン（proteoglycan）の合成、軟骨細胞の生長及び組織再生に関与することが知られている。また、ＴＧＦ−βは、免疫抑制および抗炎症機能を有することが知られている。ＥＧＦ（epidermal growth factor）、ＩＧＦ−Ｉ（insulin-like growth factor I）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）のような他の成長因子もまた軟骨の再生を刺激するが、これらの成長因子は、軟骨の損傷に効果を示さなかった。
【０００６】
前記のような成長因子は、投与において、濃度、放出速度および伝達方法などの決定に困難がある。研究者らは、動物実験で証明された結果に基づいて、これらの因子をリポソームを介して、または培地に溶解して伝達しようとする努力を継続的に行ってきた。しかし、これらの因子の人間への適用は、大きく進んでいない状況である。
【０００７】
遺伝的に変形された軟骨細胞の利用は、細胞媒介遺伝子治療法と組み合わせて軟骨の再生を成功的に導いた非常に新規な技術である（Lee KHらHum Gene Ther 2001;12：1805-1813、SUN U. SONGらTissue Engineering 2005;11：1516-1526）。この方法は、ＴＧＦ−β遺伝子を有するレトロウイルスベクターで形質導入（transduction）された同種（allogeneic）ヒト軟骨細胞と同種正常軟骨細胞とを混合して使用する。この方法は、外科的方法を最小限に抑えるとともに、軟骨の再生を誘導することができる。
【０００８】
成熟した軟骨細胞は球形の形状を有し、ＩＩ型膠原線維（Type II collagen）と非常に大きな分子量の凝縮プロテオグリカン（proteoglycan）、非膠原繊維（non-collagenous fiber）を合成する。
【０００９】
骨関節炎において、関節の損傷を軟骨細胞を移植して治療しようとする努力が継続的に行われている。特に軟骨損傷に対する組織工学的な支持体として軟骨細胞を用いようとする技術が公開されている。韓国特許公開第１０−２０１５−００１４３６９号では、軟骨細胞または軟骨分化能を有する細胞をＶ字底プレート（deep well plate）に分注し、遠心分離した後、３次元培養して玉状の軟骨細胞治療剤を製造する技術を開示している。前記文献では、玉状の軟骨組織が欠損部位を埋めることにより、軟骨損傷部位の形状および厚さに関係なく、欠損部位を修復できることを開示している。
【００１０】
また、米国特許公開第２００５−０１５２８８２号では、１〜２７ｍｍ３の直径を有する粒子（particle）状の軟骨とマトリックスとの組み合わせを含む軟骨の成長促進用組成物を開示している。
【００１１】
また、米国特許公開第２０１６−００３８５４４号では、骨関節炎での軟骨を代替するための軟骨類似組織を製造するために、高密度の軟骨細胞前駆体（chondroblast）集団を形成する。
【００１２】
前記のように、これまで知られている軟骨細胞を用いた治療用組成物のほとんどは、小さく作った組織や高密度集団などの塊を用いるのが一般的であり、組織や細胞塊が排除された軟骨細胞組成物の治療効果については知られていない。一方、生物学的製剤の場合には、非常に小さな差が全く異なる結果を示し得る。このため、塊を形成しない軟骨細胞が治療効果を示すことができるかについては、事実上まだ証明されていない状況である。
【００１３】
また、実質的に患者に適用可能なレベルに有効性が確保された細胞治療剤を提供するためには、どのような大きさと種類の細胞が必要とされるかについて特定および選別する必要性が依然として残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このような状況の下で、本発明者らは、特定の疾患、特に骨関節炎に対する細胞治療剤を開発するために鋭意努力した。その結果、目的の遺伝子、例えばＴＧＦ−βを発現するように形質転換した細胞および形質転換していない正常細胞のそれぞれが特定のサイズを有するように選別することが、軟骨細胞相互間の凝集を最小限に抑えつつ、有効な治療効果を示すことを確認した。
【００１５】
また、選別された特定のサイズ以下の混合細胞を患者に投与した場合、優れた治療効果を維持しながらも患者コンプライアンスを向上することができ、実際患者に投薬するための治療剤の生産施設または病院での品質管理が容易なことを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、骨関節炎の予防または治療用の薬学的組成物を提供することにある。
【００１７】
また、本発明の他の目的は、細胞治療剤製造用キットを提供することにある。
【００１８】
さらに、本発明のまた他の目的は、骨関節炎治療剤を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２０】
本発明の一態様によると、本発明は、形質転換した哺乳類細胞集団を含む骨関節炎の予防または治療用の薬学的組成物であって、前記集団に含まれる細胞または細胞群は、２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する薬学的組成物を提供する。
【００２１】
本発明の最大の特徴は、目的の遺伝子［例えば、ＴＧＦ−βのＴＧＦ−β１］で形質転換した哺乳類細胞（細胞群または細胞集団）を特定する基準として、粒子のサイズ、例えば２００μｍ未満のＤ９０粒子径を基準に選別して、前記細胞の治療学的有効性を確認することにより、細胞治療剤の組成物として用いることにある。
【００２２】
本発明で使用される用語「形質転換」は、形質導入または形質感染と同じ意味で混用される。
【００２３】
本発明の組成物の有効成分である前記哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、単一の細胞または細胞が結合している形態と定義される。
【００２４】
本発明で哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群の分類基準は、粒子のサイズ、特に粒子径サイズ分布のＤｘである。
【００２５】
本明細書で前記哺乳類細胞集団の基準を示すときに使用する用語「粒子径サイズ分布のＤｘ」は、分布のｘ番目の百分位を示す。本発明において、例えばＤ９０は９０番目の百分位を示し、Ｄ９０は、Ｄ（０．９０）又はＤ［０．９］、或いはそれと類似した表現で記載してもよい。中央粒子サイズおよびＤｘにおいて、大文字Ｄ又は小文字ｄは相互交換してもよく、同じ意味を持つ。
【００２６】
前記形質転換した哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有することが好ましい。前記形質転換した哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群の粒子径は、例えば、１μｍ〜１９９μｍ、１μｍ〜１５０μｍ、１μｍ〜１００μｍ、１μｍ〜９０μｍ、１μｍ〜８０μｍ、１μｍ〜７０μｍ、１μｍ〜６０μｍ、１μｍ〜５０μｍまたは１μｍ〜４０μｍであってもよい。
【００２７】
一方、２００μｍ以上のＤ９０粒子径を有する形質転換した哺乳類細胞集団の場合は、不規則で大きな塊がなくならずにそのまま残存し、骨関節炎治療用の薬学的組成物に適用するには適していない。
【００２８】
本発明において、形質転換した哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、好ましくは、ＴＧＦ−βを発現する細胞または細胞群であり、最も好ましくはＴＧＦ−β１を発現する細胞または細胞群である。本発明によると、前記細胞集団は、不活性化されることが好ましい。
【００２９】
前記不活性化は、放射線照射（irradiate）によるものであり、前記放射線照射は、ガンマ線、Ｘ線または電子線であってもよい。
【００３０】
また、本発明の好ましい実施形態によると、前記細胞集団は、形質転換していない哺乳類細胞集団と混合して投与することができる。
【００３１】
前記形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有することが好ましい。前記形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、例えば、１μｍ〜２９９μｍ、１μｍ〜２４０μｍ、１μｍ〜２３０μｍ、１μｍ〜２２０μｍ、１μｍ〜２１０μｍ、１μｍ〜２００μｍ、１μｍ〜１９０μｍ、１μｍ〜１８０μｍ、１μｍ〜１７０μｍ、１μｍ〜１６０μｍ、１μｍ〜１５０μｍ、１μｍ〜１４０μｍ、１μｍ〜１３０μｍ、１μｍ〜１２０μｍ 、１μｍ〜１１０μｍ、１μｍ〜１００μｍ、１μｍ〜９０μｍ、１μｍ〜８０μｍ、１μｍ〜７０μｍ、１μｍ〜６０μｍ、１μｍ〜５０μｍまたは１μｍ〜４０μｍであってもよい。
【００３２】
一方、３００μｍ以上のＤ９０粒子径を有する形質転換していない哺乳類細胞集団の場合は、不規則で大きな塊がなくならずにそのまま残存し、骨関節炎治療用の薬学的組成物に適用するには適していない。
【００３３】
本発明の一具現例では、ＴＧＦ−βを発現するように形質転換した細胞および形質転換していない哺乳類細胞のそれぞれが特定のサイズを有するように分離することが、軟骨細胞相互間の凝集を最小限に抑え、治療効果にも有益であることを確認した。また、選別された特定のサイズ以下の細胞を患者に投与する場合、患者コンプライアンスを向上させることができ、治療剤の生産施設または病院での品質管理が容易である。
【００３４】
また、一具現例では、ＴＧＦ−βを発現する軟骨細胞および形質転換していない哺乳類細胞である正常細胞を、ろ過などにより特定のサイズの細胞または細胞群からなるように選別することが、細胞間の凝集を抑制できることを確認した。
【００３５】
つまり、形質転換した哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群のＤ９０値が２００μｍ未満、例えば１００μｍであり、形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群のＤ９０値が３００μｍ未満、例えば２００μｍである場合、細胞間の凝集が効果的に抑制される。
【００３６】
また、前記特定のサイズの細胞または細胞群は、単一細胞状態、コロニー状態、クラスタ状態、又はこれらが混合された状態であってもよい。
【００３７】
本発明の好ましい具現例によると、前記「形質転換していない哺乳類細胞集団」対「形質転換した哺乳類細胞集団」の割合は、細胞数を基準として０.１〜１０対１であり、より好ましくは１〜１０対１であり、さらに好ましくは１〜３対１であってもよく、最も好ましくは３対１であってもよい。
【００３８】
本発明で哺乳類細胞は、軟骨細胞または軟骨前駆細胞であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用される用語「軟骨細胞」とは、細胞が脱分化または再分化するかに関係なく、分離された軟骨細胞集団を意味する。数時間かけて試験管培養を行った後、軟骨細胞は、繊維芽細胞のような他の細胞型に脱分化することが観察された。しかし、誘導を行う場合には、これらの細胞は、軟骨細胞に再分化することができる。本発明の目的において「軟骨細胞」は、時間の経過につれて脱分化する軟骨細胞を任意に含む、本来の出発軟骨細胞培養物を含むサンプルを意味する。
【００４０】
本発明で軟骨細胞は、同種細胞であることが好ましい。本発明は、単一型の細胞だけでなく、結合組織細胞の混合された培養物でも実施できることをよく理解するであろう。結合組織細胞は、化合物または放射能で処理して、細胞が目的の遺伝子、好ましくはＴＧＦ−βを安定に発現するようにすることをよく理解するであろう。好ましくは、結合組織細胞は、これを注射した宿主有機体において免疫反応を起こさない。これに関し、細胞媒介された遺伝子治療または体細胞治療の場合には、自己細胞だけでなく、同種細胞を使用することもできる。
【００４１】
また、前記哺乳類細胞は、ヒト由来であってもよい。
【００４２】
本明細書で用語「予防」は、疾患または疾病を保有していると診断されたことはないが、この疾患または疾病にかかりやすい傾向がある動物、例えば哺乳類で疾患または疾病の発生を抑制することを意味する。
【００４３】
本明細書で用語「治療」は、（ｉ）疾患または疾病の発展の抑制、（ｉｉ）疾患または疾病の軽減、および（ｉｉｉ）疾患または疾病の除去を意味する。好ましくは、前記治療しようとする疾患または疾病は骨関節炎である。
【００４４】
また、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬剤学的に許容される適切な担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences（19th ed.，1995）に詳細に記載されている。
【００４６】
本発明の薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化の方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって様々な方法で処方することができる。
【００４７】
一方、本発明の薬学的組成物の投与量は、好ましくは１回あたり１．０ｘ１０６〜３ｘ１０７個の細胞である。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与することができ、非経口投与する場合には、関節腔内、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、関節腔部位に注入することができる。本発明の薬学的組成物は、適用される疾患の種類に応じて投与経路を決定することが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物に含まれる有効成分の濃度は、治療目的、患者の状態、必要期間、疾患の重度などを考慮して決定し、特定の範囲の濃度に限定されない。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に従って、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造するか、または多容量容器内に入れて製造することができる。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００５１】
また、本発明の他の態様によると、本発明は、ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団を含む、骨関節炎の治療または予防のための細胞治療剤製造用キットを提供する。前記集団に含まれる細胞または細胞群は、２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有することが好ましい。
【００５２】
前記キットは、形質転換していない哺乳類細胞集団をさらに含むことができる。前記形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有することが好ましい。
【００５３】
前記キットには、前記細胞治療剤として、前記哺乳類細胞集団のみならず、当該分野で一般的に使用されるツール、試薬などを含むことができる。
【００５４】
前記ツールまたは試薬の一例としては、適切な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、発色団（chromophores）、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられるが、これらに限定されない。標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定できる基質および反応停止剤を含むことができる。担体には、可溶性担体、不溶性担体がある。可溶性担体の一例としては、当該分野で公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばＰＢＳがあり、不溶性担体の一例としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロースおよびそれらの組み合わせであってもよい。
【００５５】
本発明の他の態様によると、本発明は、次のステップを含む骨関節炎治療剤を製造する方法を提供する：
（１）ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団および形質転換していない哺乳類細胞集団をそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）のＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団の中で２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する細胞または細胞群、および形質転換していない哺乳類細胞集団の中で３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する細胞または細胞群をそれぞれ選別するステップと、
（３）前記ステップ（２）のそれぞれ選別された細胞集団を、分離されたバイアル内にそれぞれ充填するステップと、
（４）前記ステップ（３）のバイアル内にそれぞれの細胞集団を混合するステップ。
【００５６】
すなわち、前記骨関節炎治療剤は、ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団と形質転換していない哺乳類細胞集団を混合して投与することができ、ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有し、前記形質転換していない哺乳類細胞集団に含まれる細胞または細胞群は、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有することが好ましい。
【００５７】
前記選別は、物理的、化学的または電子的な選別であってもよい。物理的選別には、一定のサイズのメッシュ（mesh）を使用するか、或いはセルストレーナーまたはフィルタを使用する方法を用いることができる。また、この物理的選別のほか、細胞の蛍光、磁気、電荷などを用いる細胞選別方法を応用することができ、これらに限定されない。
【００５８】
本発明のキットおよび治療剤の製造方法は、前述の構成を含むので、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【発明の効果】
【００５９】
本発明の組成物の有効成分である選別された特定のサイズ以下のＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞および形質転換していない哺乳類細胞の混合細胞組成物は、細胞塊を内包していないながらも有効に優れた治療効果を示すので、医薬品の品質管理の側面から見て、不純物と容易に区別することができ、治療剤の生産施設や病院で管理しやすい利点がある。また、選別された細胞は、軟骨細胞相互間の追加凝集を示さず、保管にも有益である。さらに、選別された特定のサイズ以下の混合細胞を患者に投与する場合、患者コンプライアンスを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、軟骨細胞のセルストレーナー（Cell strainer）を通過前後のバイアルを示す。
【図２ａ】図２ａは、形質転換していない細胞のセルストレーナーを通過前後の顕微鏡観察結果を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、形質転換した細胞のセルストレーナーを通過前後の顕微鏡観察結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、形質転換していない細胞のセルストレーナーを通過前及び通過後における、時間経過による顕微鏡観察結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、形質転換した細胞のセルストレーナーを通過前及び通過後における、時間経過による顕微鏡観察結果を示す。
【図４ａ】図４ａは、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルに選別された混合細胞を処理したときのフォンフレイフィラメントテストの結果を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルに選別された混合細胞を処理したときのフォンフレイフィラメント結果をＡＵＣ（area under the curve）で表すものである。
【図５】図５は、ＭＩＡ骨関節炎動物モデルに選別された混合細胞を処理したときのＨ＆Ｅ染色軟骨組織の分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げて説明する。本発明による実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲が後述する実施例に限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６２】
実施例１．細胞治療剤の用意
本発明で用いられる細胞治療剤は、ＴＧＦ−β１（NCBI Reference Sequence：NM_000660.6）を発現するように形質転換した細胞集団（第１集団；以下、「ＴＣ」）と、前記遺伝子で形質転換していない正常な細胞集団（第２集団；以下、「ＨＣ」）とを含む混合細胞である。
【００６３】
前記ＴＣは、ＴＧＦ−β１のｃＤＮＡを公知の方法により細胞に注入して製造することができる。例えば、ＴＧＦ−β１のｃＤＮＡを、アンピシリン、ネオマイシンなどの抵抗遺伝子を有する公知のベクター［例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐＣＩ（アンピシリン抵抗遺伝子を含有）］に含ませて、ＴＧＦ−β１のｃＤＮＡを含むベクターを製造した後、軟骨細胞にリン酸カルシウム（calcium phosphate）方法またはリポペクチン（lipofectin）方法などの公知の方法で注入することにより製造できる。又は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどの遺伝子伝達体を使用して製造することもできる。
【００６４】
前記ＨＣ及びＴＣは、ヒト由来の細胞であって、ＨＣは正常軟骨細胞であり、ＴＣはＴＧＦ−β１が分泌されるように形質転換された細胞である。ＨＣ及びＴＣの作製方法は、［Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２ Ｆｅｂ；１４（２）：２４７−２５６］、並びに米国特許第７，００５，１２７号および米国特許第７，２８２，２００号に開示されている。
【００６５】
前記ＨＣ及びＴＣの混合比は、細胞数を基準に３：１の割合で混合して以下の実施例に適用した。
【００６６】
作製されたＴＣ及びＨＣは、それぞれバイアルに充填した後、凍結し、混合細胞治療剤としての使用のために準備・保管した。このとき、ＴＣは凍結前または凍結後、放射線照射により不活性化した。
【００６７】
実施例２．有効性を有する細胞の種類の選別
本発明者らは、前記実施例１で用意した細胞治療剤である混合細胞の細胞凝集の種類およびサイズによる有効性を確認しようとした。
【００６８】
そのために、セルストレーナー（cell strainer）をポア（pore）のサイズ別に用意し、ろ過した後、ＨＣ細胞及びＴＣ細胞の凝集現象の有無を確認する一連のＱＣ（quality control）を行った。
【００６９】
２−１．ＨＣ細胞におけるセルストレーナーのポアサイズによる細胞凝集現象の確認
本発明者らは、ＨＣ細胞を培養して細胞浮遊液を集めた。一部の細胞に対しては、セルストレーナーを適用せずにバイアルに細胞を充填して異物検査を行った。残りの細胞浮遊液に対しては、２００及び３００μｍポアサイズのセルストレーナーで細胞をろ過した後、セルストレーナーの適用後の異物検査を行った。
【００７０】
その結果は、表１に示す通りである。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
つまり、ＨＣ細胞におけるセルストレーナーのポアサイズによる細胞凝集現象の有無を確認するために、細胞塊を完全に除去する方法で、セルストレーナーを用いて細胞浮遊物を通過させた後、細胞塊の減少有無を確認した。ＨＣ細胞の場合、２００μｍセルストレーナーを通過した細胞は、図１に示すように、細胞塊がすべて濾過され、充電後の異物検査で適合判定を受けた。
【００７３】
また、図２ａに示すように、２００μｍセルストレーナーの適用後は、細胞塊がなくなることが顕微鏡で観察された。
【００７４】
これに対して、３００μｍセルストレーナーを適用した後は、図１に示すように、不規則で大きな塊がなくならずにそのまま残存することが肉眼で確認された。
【００７５】
これらのことから、ＨＣ細胞の場合には、３００μｍセルストレーナーを通過することができる３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する細胞、特に２００μｍ以下のＤ９０粒子径を有する細胞が適切であることがわかる。
【００７６】
２−２．ＴＣ細胞におけるセルストレーナーのポアサイズによる細胞凝集現象の確認
本発明者らは、ＴＣ細胞を培養して細胞浮遊液を集め、一部の細胞に対しては、セルストレーナーを適用せずにバイアルに細胞を充填して異物検査を行った。残りの細胞浮遊液に対しては、７０、１００及び２００μｍポアサイズのセルストレーナーで細胞をろ過した後、セルストレーナーの適用後の異物検査を行った。
【００７７】
その結果は、表２に示す通りである。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
つまり、ＴＣ細胞におけるセルストレーナーのポアサイズによる細胞凝集現象の有無を確認するために、細胞塊を完全に除去する方法で、セルストレーナーを用いて細胞浮遊物を通過させた後、細胞塊の減少有無を確認した。ＴＣ細胞の場合、７０μｍ及び１００μｍセルストレーナーを通過した細胞は、図１に示すように、細胞塊がすべて濾過され、充電後の異物検査を通過した。
【００８０】
また、図２ｂに示すように、１００μｍセルストレーナーの適用後は、細胞塊がなくなることが顕微鏡でも観察された。
【００８１】
これに対して、２００μｍセルストレーナーを適用した後は、図１に示すように、不規則で大きな塊がなくならずにそのまま残存することが肉眼で確認された。
【００８２】
これらのことから、ＴＣ細胞の場合には、２００μｍセルストレーナーを通過することができる２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有する細胞、特に１００μｍ以下のＤ９０粒子径を有する細胞が適切であることがわかる。
【００８３】
実施例３．ストレーナーの適用が追加的な凝集を防止できるかどうかの確認
本発明者らは、前記実施例２で用意したセルストレーナーを通過する前後の細胞において、時間が経過するにつれて細胞凝集の種類およびサイズに変化がないかどうか、およびストレーナーの適用が追加的な凝集の防止にも役立つかどうかを確認しようとした。
【００８４】
そのために、セルストレーナー（cell strainer）をポア（pore）サイズ別に用意し、ろ過した後、常温でバイアルを放置し、ＨＣ細胞及びＴＣ細胞の凝集現象が時間の経過により変化するかを確認した。
【００８５】
３−１．ＨＣ細胞におけるセルストレーナーの適用後の時間による細胞凝集現象の確認
本発明者らは、ＨＣ細胞を培養して細胞浮遊液を集めた。一部の細胞に対しては、セルストレーナーを適用せずにバイアルに細胞を充填し、時間の経過による細胞凝集現象を確認した。残りの細胞浮遊液に対しては、２００μｍポアサイズのセルストレーナーで細胞をろ過した後、バイアルに細胞を充填し、時間の経過による細胞凝集現象を確認した。
【００８６】
ＨＣ細胞のセルストレーナーのポアサイズによる細胞凝集現象の有無を確認するために、細胞塊を完全に除去する方法で、セルストレーナーを用いて細胞浮遊物を通過させた後、細胞塊の減少有無を確認した。
【００８７】
その結果、図３ａに示すように、０時間に２００μｍセルストレーナーを適用した後は、細胞塊がなくなることが顕微鏡で観察された。また、３時間経過後も細胞塊がこれ以上生じないことを顕微鏡で観察した。
【００８８】
これに対して、セルストレーナーを適用していない場合には、不規則で大きな塊がなくならずにそのまま残存することが顕微鏡で観察され、これは時間が経ってもそのまま残存することを確認することができた。
【００８９】
３−２．ＴＣ細胞におけるセルストレーナーの適用後の時間による細胞凝集現象の確認
本発明者らは、ＴＣ細胞を培養して細胞浮遊液を集めた。一部の細胞に対しては、セルストレーナーを適用せずにバイアルに細胞を充填し、時間の経過による細胞凝集現象を確認した。残りの細胞浮遊液に対しては、１００μｍポアサイズのセルストレーナーで細胞をろ過した後、バイアルに細胞を充填し、時間の経過による細胞凝集現象を確認した。
【００９０】
ＴＣ細胞におけるセルストレーナーのポアサイズによる細胞凝集現象の有無を確認するために、細胞塊を完全に除去する方法で、セルストレーナーを用いて細胞浮遊物を通過させた後、細胞塊の減少有無を確認した。
【００９１】
その結果、図３ｂに示すように、０時間に１００μｍセルストレーナーを適用した後は、細胞塊がなくなることが顕微鏡でも観察された。また、３時間が経っても細胞塊がこれ以上生じないことを顕微鏡で観察した。
【００９２】
これに対して、セルストレーナーを適用していない場合には、図３ｂに示すように、不規則で大きな塊がなくならずにそのまま残存することが顕微鏡で観察された。これは時間が経ってもそのまま残存することを確認することができた。
【００９３】
実施例４．ＭＩＡ骨関節炎モデルにおける選別された混合細胞処理による骨関節炎の治療効果の確認
４−１．痛み緩和効果の確認
本発明者らは、ＭＩＡ投与で骨関節炎を誘発させたラット動物モデルに、前記実施例２で確認された特定のサイズ以下の細胞に選別された混合細胞、すなわち、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有するＨＣ細胞と２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有するＴＣ細胞とが３：１の割合で混合された混合細胞を投与したときの陣痛効果を比較し、本発明の混合細胞治療剤の有効性を確認しようとした。
【００９４】
すなわち、本発明者らは、選別された混合細胞の治療効果を確認するために、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルを作成した後、選別された混合細胞を処理して痛みの変化を観察した。
【００９５】
まず、動物モデルの作成には、６週齢の雄ラット（Spargue-Dawley、200〜225g、Nara-Biotec社、大韓民国）を使用した。動物実験は、コーロン生命科学社（大韓民国）の実験動物運営委員会（IACUC No. KLS IACUC 2013-04）の承認下で獣医的管理の下で行った。
【００９６】
関節炎を誘導するために、６０ｍｇ／ｍＬの濃度のＭＩＡ（monosodium iodoacetate、Sigma、USA）溶液５０μｌを３１Ｇ注射器を使用してラットの左膝の関節腔内に投与した。
【００９７】
ＭＩＡ投与２週間後、骨関節炎が誘発された個体を対象に対照物質（ＣＳ−１０）と混合細胞をそれぞれ左膝の関節腔内に投与した。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
その後、フォンフレイフィラメント（von Frey filament）テストを測定した。前記テストでは、１９８０年Ｄｉｘｏｎ（Chaplan SR et al.，Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw，Journal of Neuroscience Methods，1994，53：55-63；及び、Dixon WJ，Efficient analysis of experimental observations，Annual Reviews Pharmacology and Toxicology，1980，20：441-62）が確立した５０％ｕｐ＆ｄｏｗｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法を使用した。Ｎ値がそれぞれ０．４、０．６、１、２、４、６、８、１５ｇｒａｍ（ｇ）である９つのフィラメントを用いて痛みの反応を調査し、定められたパターンに従って閾値（threshold）を計算した。
【０１００】
混合細胞および対照物質を投与してから一定時間（０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日）が経過した後、フォンフレイフィラメントテスト値を測定した。
【０１０１】
その結果、図４ａ及び４ｂに示すように、混合細胞を投与後、一定期間（０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日）が経過した後のフォンフレイフィラメント測定値は、対照群であるＣＳ−１０投与群に比べて混合細胞投与群で統計的に有意な鎮痛効果が示されることを確認した（ｐ＜０．０５）。フォンフレイフィラメント結果を、性能の評価指標として使用される曲線下面積ＡＵＣ値で表示した場合にも、対照群であるＣＳ−１０投与群に比べて混合細胞投与群で統計的に有意な結果を確認した（ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
４−２．軟骨構造改善効果の確認
本発明者らは、ＭＩＡ投与で骨関節炎を誘発させたラット動物モデルに、対照群（vehicle）と、前記実施例２のように特定のサイズ以下の細胞に選別された混合細胞の投与群の軟骨構造改善効果を比較して、混合細胞治療剤の有効性を確認しようとした。
【０１０３】
そのために、本発明者らは、前記実施例４−１と同様にして用意した動物モデルを実験実行５６日後に犠牲にして、Ｈ＆Ｅ染色組織の分析を行った。
【０１０４】
その結果、図５に示すように、対照群（vehicle）であるＣＳ−１０投与群では、軟骨構造の改善が観察されないのに対して、混合細胞（mixed cell）投与群では、軟骨構造の改善が観察されることを確認した。
【０１０５】
結論として、本発明に基づいて選別された、３００μｍ未満のＤ９０粒子径を有するＨＣ細胞と２００μｍ未満のＤ９０粒子径を有するＴＣ細胞とが３：１の割合で混合された混合細胞は、塊状の細胞がない状態でも優れた痛みの緩和及び軟骨生成の効果を示すので、優れた骨関節炎治療剤として用いることができる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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