(57)【要約】  本発明は、赤血球系前駆体をインビトロにおいて作製するためのプロセスに関し、該プロセスは、遺伝子組み換えされた又は遺伝子組み換えされていない造血幹細胞を、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーを含む合成細胞培地に接触させることを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球系前駆体を作製するためのインビトロのプロセスであって、オートファジーインデューサー及びグルココルチコイドホルモンを含む細胞培地に造血幹細胞を接触させることを含む、プロセス。
【請求項２】
前記オートファジーインデューサーは、低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ−２８）、ＳＭＥＲ−１０、及びＳＭＥＲ−１８、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記オートファジーインデューサーはＳＭＥＲ−２８である、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記グルココルチコイドホルモンは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、コルチバゾール、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記グルココルチコイドホルモンは、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びデキサメタゾンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記グルココルチコイドホルモンはデキサメタゾンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記培地は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）経路アクチベーター、好ましくはプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＩＳ）インヒビター、より好ましくはジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記造血幹細胞は、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞（ＥＳ）若しくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）の分化によって得られる、又は、患者の血液サンプルから、臍帯血若しくは胎盤血から、若しくは骨髄サンプルから単離される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記造血幹細胞はヒト造血幹細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記造血幹細胞は、特に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＨＴＥＲＴ）、ＢリンフォーマＭｏ−ＭＬＶインサーションリージョン１ホモログ（B lymphoma Mo-MLVinsertion region 1 homolog、ＢＭＩ１）、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢからなる群より選択される１つ以上の遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記造血幹細胞はＨＴＥＲＴ遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記造血幹細胞はＢＭＩ１遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記造血幹細胞はＨＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＨＴＥＲＴ）、ＢリンフォーマＭｏ−ＭＬＶインサーションリージョン１ホモログ（ＢＭＩ１）、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢからなる群より選択される１つ以上の遺伝子は、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下におかれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記造血幹細胞は、
−  １つ以上のコア赤血球ネットワーク（core erythroidnetwork、ＣＥＮ）経路転写因子、好ましくはＬＩＭドメインオンリー２（LIM domain only 2、ＬＭＯ２）、及び／又は、
−  １つ以上のＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子、好ましくはＢ細胞リンフォーマ−エクストララージ（B-celllymphoma-extra large、ＢＣＬ−ＸＬ）、を過剰発現するようにさらに遺伝子組み換えされる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記造血幹細胞は、ＢＣＬ−ＸＬ遺伝子を過剰発現するようにさらに遺伝子組み換えされる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記造血幹細胞は、ＬＭＯ２遺伝子を過剰発現するようにさらに遺伝子組み換えされる、請求項１０〜１４及び１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記ＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子、好ましくはＢＣＬ−ＸＬは、１つ以上の構成的プロモーターの制御下におかれる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記コア赤血球ネットワーク（ＣＥＮ）経路転写因子遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子、好ましくはＬＩＭドメインオンリー２（ＬＭＯ２）は、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下におかれる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記造血幹細胞は不死化されている及び／又は自殺遺伝子を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記培地は、造血幹細胞の栄養要件に適応させ、特に造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させた培地である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記細胞は、前記培地において、少なくとも２０日間、好ましくは少なくとも４０日間、より好ましくは少なくとも６０日間培養される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２３】
赤血球系前駆体を作製及び／又は増幅するための、請求項１〜７及び２１のいずれか１項に記載の細胞培地の使用。
【請求項２４】
請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えされた造血幹細胞。
【請求項２５】
赤血球系前駆体及び／又は赤血球をインビトロにおいて作製するための、請求項２４に記載の造血幹細胞の使用。
【請求項２６】
赤血球を作製するためのインビトロのプロセスであって、
−  請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロセスによる赤血球系前駆体の作製、及び
−  前記赤血球系前駆体の成熟の誘導、及び、
−  任意的に、得られた前記赤血球の回収を含む、プロセス。
【請求項２７】
前記赤血球系前駆体の成熟は、前記前駆体を赤血球分化培地において培養することによって誘導される、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させるとともに、グルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、及びオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ−２８、及び任意的にＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含む、細胞培地。
【請求項２９】
−  ０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭの濃度のグルココルチコイドホルモン、及び／又は、
−  ２μＭ〜３０μＭの濃度のオートファジーインデューサー、及び／又は、
−  ７５μＭ〜３５０μＭの濃度のＨＩＦ経路アクチベーターを含む、請求項２８に記載の細胞培地。
【請求項３０】
前記オートファジーインデューサーは、低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ−２８）、ＳＭＥＲ−１０、及びＳＭＥＲ−１８、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２８又は２９に記載の細胞培地。
【請求項３１】
前記オートファジーインデューサーはＳＭＥＲ−２８である、請求項２８又は２９に記載の細胞培地。
【請求項３２】
前記グルココルチコイドホルモンは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、コルチバゾール、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より選択される、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項３３】
前記グルココルチコイドホルモンは、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びデキサメタゾンからなる群より選択される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項３４】
前記グルココルチコイドホルモンはデキサメタゾンである、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項３５】
前記培地は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）経路アクチベーター、好ましくはプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＩＳ）インヒビター、より好ましくはジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）をさらに含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項３６】
（ｉ）トランスフェリン、（ｉｉ）インスリン、（ｉｉｉ）ヘパリン、及び（ｉｖ）血清、血漿、血清プール、又は血小板ライセート、好ましくは血小板ライセートをさらに含む、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項３７】
幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＥＰＯ、任意的にＩＬ−３をさらに含む、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項３８】
赤血球系前駆体を作製及び／又は増幅するための、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の細胞培地の使用。
【請求項３９】
赤血球系前駆体及び／又は赤血球を作製するためのキットであって、
−  請求項１〜７、２１、及び２８〜３７のいずれか１項に記載の細胞培地、
−  請求項２４に記載の遺伝子組み換えされた造血幹細胞、及び、
−  任意的に、そうしたキットを使用するための指示を含む指導書を含む、キット。
【請求項４０】
赤血球系前駆体及び／又は赤血球を作製するための、請求項３９に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に該当する。より具体的には、本発明は赤血球系前駆体及び赤血球を作製するための新規のプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織への酸素常時供給を維持することは、多くの生体、特にヒトの生存に不可欠である。体内で血流を介して酸素を運搬するのは赤血球である。この輸送は、酸素に結合可能な赤血球に特異的なタンパク質のヘモグロビンによって行われる。赤血球が組織に達すると、酸素は毛細血管壁を介して拡散する。ゆえに、赤血球の役割は不可欠である。
【０００３】
赤血球輸注は、緊急の場合（出血）及び病気（血液疾患、がんなど）の場合に必要である。２０１６年には、輸血の要求にこたえるため、世界で１００万を超える血液バッグが集められ分配された。これらの５０パーセントが、世界人口の１５％に相当するのみである先進国に分配されている。開発途上国における輸血の問題は、輸血の供給と安全性とに関与し、先進国ではこれらの問題は良好に管理されている。しかしながら、慢性的な輸血に関連する免疫学的合併症（同種免疫）は、患者の将来に関わるような輸血効果の停滞をもたらし得る。
【０００４】
現在のところ、輸血はドナーからの血液に限られている。
【０００５】
成人では、赤血球産生又は赤血球生成はいわゆる造血髄にて行われ、これは扁平骨で長骨の端部に存在する。骨髄では、造血幹細胞と呼ばれる複能性幹細胞が、連続的に種々のタイプの赤血球系前駆体（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球）に分化する。赤芽球が骨髄を出ると、その核を失って網赤血球となり、そして成熟赤血球となる。
【０００６】
赤血球をインビトロにおいて産生させる造血幹細胞用の分化培地は既知である。しかしながら、現行のプロセスは、大規模産生において、産生量を著しく制限する赤血球成熟への早すぎる進行、正常に脱核ステップを行うことができない細胞への分化などの重大な欠点がある（Akimov S et al.,2005, Stem cells, 23(9): 1423-1433; Hirose SI et al., 2013, Stem Cell Reports,1(6): 499-508; Huang X, 2013, Mol. Ther., 22(2): 451-463）。そして、他のプロセスでは、フィーダー細胞とともに共培養が使用され（Kurita R et al.,2013, PloS One, 8(3): e59890）、これは実施が複雑であるとともに費用がかかるものである。
【０００７】
赤血球のインビトロにおける産生のための新規のプロセスの開発は、供給の要求を満たし、起こり得る伝染リスクを退け、免疫学的合併症を回避することができると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書に記載の本発明は、なかでも、これらの要求を満たすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、デキサメタゾン、低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ２８）、及び任意的にジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）を含む培地における造血幹細胞の培養が、これらの幹細胞を赤血球系前駆体に分化するだけでなく、この前駆体が最終的に赤血球に分化する能力を保ちながら、この前駆体の個体群を著しく増幅させる。こうして得られた赤血球系前駆体は、培養物において維持され、成熟脱核細胞、すなわち赤血球へと分化するその能力を失うことなく６０日を超える間増幅することができる。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、赤血球系前駆体を作製するためのインビトロのプロセスに関し、該プロセスは、好ましくは造血幹細胞の栄養要件に適応させ、特に造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させるとともに、グルココルチコイドホルモン、及びオートファジーインデューサーを含む細胞培地に、造血幹細胞を接触させることを含む。
【００１１】
好ましくは、グルココルチコイドホルモンは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、コルチバゾール、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より選択される。より特に好ましくは、グルココルチコイドホルモンは、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びデキサメタゾンからなる群から選択される。最も特に好ましくは、グルココルチコイドホルモンはデキサメタゾンである。
【００１２】
好ましくは、オートファジーインデューサーは、低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ−２８）、ＳＭＥＲ−１０、及びＳＭＥＲ−１８、並びにそれらの組合せからなる群より選択される。より特に好ましくは、オートファジーインデューサーは低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ−２８）である。
【００１３】
特定の実施形態において、培地はまた、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）経路アクチベーター、好ましくはプロリルヒドロキシラーゼインヒビター、より好ましくはジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）を含む。
【００１４】
造血幹細胞は、好ましくは、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞（ＥＳ）若しくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）の分化によって得られる、又は、動員有り又は無しで患者の臍帯血若しくは胎盤の血液サンプルから、若しくは骨髄サンプル若しくは採取物から単離される。好ましくは、造血幹細胞はヒト造血幹細胞である。
【００１５】
造血幹細胞は、特に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＨＴＥＲＴ）、ＢリンフォーマＭｏ−ＭＬＶインサーションリージョン１ホモログ（B lymphoma Mo-MLVinsertion region 1 homolog、ＢＭＩ１）、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢからなる群より選択される１つ以上の遺伝子を過剰発現するように、遺伝子組み換えされていてもよい。好ましくは、造血幹細胞は、ＨＴＥＲＴ遺伝子を過剰発現する、又はＢＭＩ１遺伝子を過剰発現するために遺伝子組み換えされていてもよい。また、造血幹細胞は、ＨＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を過剰発現するために組み換えされていてもよい。
【００１６】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＨＴＥＲＴ）、ＢリンフォーマＭｏ−ＭＬＶインサーションリージョン１ホモログ（ＢＭＩ１）、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢからなる群より選択される１つ以上の遺伝子は、好ましくは、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下におかれる。
【００１７】
また、これらの造血幹細胞は、
−  １つ以上のコア赤血球ネットワーク（core erythroidnetwork、ＣＥＮ）経路転写因子、好ましくはＬＩＭドメインオンリー２（LIM domain only 2、ＬＭＯ２）、及び／又は、
−  １つ以上のＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子、好ましくはＢ細胞リンフォーマ−エクストララージ（B-celllymphoma-extra large、ＢＣＬ−ＸＬ）、を過剰発現するように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００１８】
好ましくは、造血幹細胞は、ＢＣＬ−ＸＬ遺伝子を過剰発現する、又はＬＭＯ２遺伝子を過剰発現するために遺伝子組み換えされていてもよい。
【００１９】
ＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子は、好ましくは、１つ以上の構成的プロモーターの制御下におかれる。
【００２０】
コア赤血球ネットワーク（ＣＥＮ）経路転写因子遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子は、好ましくは、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下におかれる。
【００２１】
また、これらの造血幹細胞は不死化細胞であってもよい。
【００２２】
好ましくは、細胞は、本発明の培地において、少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも４０日間、特に好ましくは少なくとも６０日間培養される。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、赤血球系前駆体の作製及び／又は増幅のための本発明にかかる細胞培地の使用にさらに関する。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、上述のような遺伝子組み換えされた造血幹細胞、並びに赤血球系前駆体及び／又は赤血球をインビトロにおいて作製するためのこれらの造血幹細胞の使用に関する。
【００２５】
第４の態様において、本発明は、赤血球を作製するためのインビトロのプロセスに関し、該プロセスは、
−  本発明のプロセスによる赤血球系前駆体の作製、及び
−  赤血球系前駆体の成熟の誘導、及び
−  任意的に、得られた赤血球の回収を含む。
【００２６】
好ましくは、赤血球系前駆体の成熟は、赤血球分化培地において赤血球系前駆体を培養することによって誘導される。
【００２７】
他の態様において、本発明は、造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させるとともに、グルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、及びオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ−２８、及び任意的にＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含む細胞培地にさらに関する。
【００２８】
好ましくは、培地は、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭの濃度のグルココルチコイドホルモン、及び／又は２μＭ〜３０μＭの濃度のオートファジーインデューサー、及び／又は７５μＭ〜３５０μＭの濃度のＨＩＦ経路アクチベーターを含む。
【００２９】
オートファジーインデューサーは、好ましくは、低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ−２８）、ＳＭＥＲ−１０、及びＳＭＥＲ−１８、並びにそれらの組合せからなる群より選択され、より特に好ましくはＳＭＥＲ−２８である。
【００３０】
グルココルチコイドホルモンは、好ましくは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、コルチバゾール、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より選択され、より特に好ましくは、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びデキサメタゾンからなる群より選択され、最も特に好ましくはデキサメタゾンである。
【００３１】
培地はまた、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）経路アクチベーターは、好ましくはプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＩＳ）インヒビター、より好ましくはジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）である。
【００３２】
また、培地は、（ｉ）トランスフェリン、（ｉｉ）インスリン、（ｉｉｉ）ヘパリン、及び（ｉｖ）血清、血漿、血清プール、又は血小板ライセート、好ましくは血小板ライセート、並びに任意的に幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＥＰＯ、及び／又はＩＬ−３も含むことができる。
【００３３】
本発明は、赤血球系前駆体を作製する及び／又は増幅するための本発明にかかる細胞培地の使用にさらに関する。
【００３４】
第５の態様において、本発明は、赤血球系前駆体及び／又は赤血球の作製のためのキットにさらに関し、該キットは、
−  本発明にかかる培地、及び／又は
−  本発明にかかる遺伝子組み換えされた造血幹細胞、及び
−  任意的に、そうしたキットを使用するための指示を含む指導書を含む。
【００３５】
そして、第６の態様において、本発明は、赤血球系前駆体及び／又は赤血球を作製するための本発明にかかるキットの使用にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、種々の培養プロトコルにおける１４日目の表面マーカーＣＤ１１７及びＣＤ２３５ａの発現プロファイルを示す。Ａはプロトコル４、Ｂはプロトコル３、Ｃはプロトコル１、Ｄはプロトコル２である。
【図２】図２は、種々の培養プロトコルにおける、ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、及びＬＭＯ２を過剰発現するように遺伝子組み換えされた細胞の２４日目の表面マーカーＣＤ１１７及びＣＤ２３５ａの発現プロファイルを示す。Ａはプロトコル４、Ｂはプロトコル１、Ｃはプロトコル２である。
【図３】図３は、種々の培養プロトコルにおける、ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ−ＸＬを過剰発現するように遺伝子組み換えされた細胞の２４日目の表面マーカーＣＤ１１７及びＣＤ２３５ａの発現プロファイルを示す。Ａはプロトコル４、Ｂはプロトコル１、Ｃはプロトコル２である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明者らは、オートファジーインデューサー、すなわち低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ２８）、及びグルココルチコイドホルモン、すなわちデキサメタゾンを含む培地における造血幹細胞培養が、デキサメタゾンのみを添加したコントロールの培地と比較して赤血球系前駆体作製を著しく増大させることを示した。こうして得られた赤血球系前駆体は、培養物において維持され、６０日を超える間増幅することができる。また、発明者らは、これらの赤血球系前駆体が効果的に赤血球に分化可能であることを示した。
【００３８】
このインビトロの培養プロセスは、簡単で経済的であるという利点を有するだけでなく、赤血球系前駆体、そして赤血球の産業的大規模産生への道を開くものである。これにより、輸血する患者の安全性を最適化しながら血液不足又は輸血効果停滞のリスクを減らす。
【００３９】
このように、第１の態様において、本願は、赤血球系前駆体を作製するためのインビトロのプロセスに関し、該プロセスは、オートファジーインデューサー及びグルココルチコイドホルモンを含む培地に造血幹細胞を接触させることを含む。このプロセスの目的は、造血幹細胞の赤血球系前駆体への分化を誘導し、その後に赤血球へと分化するこの前駆体の能力を維持しながら、この前駆体個体群を増幅、すなわち増殖させることである。ゆえに、本発明におけるプロセスは、赤血球系前駆体の作製及び増幅のためのプロセスである。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「赤血球系前駆体」という用語は、赤血球生成時に造血幹細胞の分化によって得られる前駆体細胞を指す。これらの前駆体細胞は、分裂して後に脱核により赤血球へと分化する能力を有する有核細胞である。赤血球系前駆体は、好ましくは、マーカーであるＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ７１、及びＣＸＣＲ４の発現によって特徴づけられるバースト形成単位Ｅ（ＢＦＵ−Ｅ）、マーカーであるＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ３６、及びＣＤ７１の発現によって特徴づけられるコロニー形成単位−Ｅ（ＣＦＵ−Ｅ）、マーカーであるＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ３６、及びＣＤ２３５ａの発現によって特徴づけられる前赤芽球、マーカーであるＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ３６、及びＣＤ２３５ａの発現によって特徴づけられる好塩基性赤芽球、及びマーカーであるＣＤ３６、ＣＤ７１、及びＣＤ２３５ａの発現によって特徴づけられる多染性赤芽球、並びにそれらの混合物から選択される。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」という用語は、白血球、赤血球、及び血小板などの血球及び免疫細胞に分化可能な複能性幹細胞を指す。造血幹細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、及び／又はＣＤ３４抗原を発現する。好ましくは、造血幹細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ３４抗原、任意的にＣＤ１３３抗原を発現する。
【００４２】
好ましい実施形態において、ＨＳＣはヒトＨＳＣである。
【００４３】
これらのＨＳＣは、種々の由来から、当業者に周知の方法により得られる。特に、ＨＳＣは、例えば、特定の膜受容体の存在（例えばＣＤ４５、及び／又はＣＤ４５）に対する免疫磁気システム又はスクリーニングシステムを使用して、骨髄、細胞吸着、全血、又は臍帯血（若しくは胎盤血）から単離することができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「細胞吸着」という用語は、アフェレーシスによるＨＳＣの血液からの除去を指す。アフェレーシスは、体外血液循環によって特定の血液成分を採取する技術である。採取される成分は遠心分離及び抽出によって分離される一方、採取されない成分はドナー又は患者に再注入される（治療的アフェレーシス）。
【００４５】
また、ＨＳＣは、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞、好ましくは誘導多能性幹細胞の分化によって得られる。多能性幹細胞をＨＳＣに分化させる技術は当業者に周知である。いくつかのプロトコル、特に、胚様体の中間段階とＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、及びＢＭＰ−４のサイトカインの組合せとによる１７日間の分化からなるＬｅｎｇｅｒｋｅ  Ｃ等によるプロトコル(2009, Ann N YAcad Sci, 1176:219-27)の記載がある。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊由来で、生殖系列細胞を含む身体のあらゆる組織の形成をもたらす（中胚葉、内胚葉、外胚葉）能力を有する細胞を指す。胚性幹細胞の多能性は、転写因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧなどのマーカー、及びＳＳＥＡ３／４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１などの表面マーカーの存在により評価することができる。胚性幹細胞は、例えばＣｈｕｎｇ等によって記載される技術（Cell Stem Cell,2008, 2(2): 113-117）を使用して、由来する胚を破壊することなく得られる。特定の実施形態において、法的又は倫理的な理由から、胚性幹細胞は非ヒト胚性幹細胞である。他の特定の実施形態において、本発明で使用される胚性幹細胞は、好ましくは由来する胚を破壊することなく得られるヒト胚性幹細胞である。使用される胚は、好ましくは、現行法に従って規制において及び倫理的な承認を得た後の、不妊治療時に得られた余剰の胚である。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳ）という用語は、分化体細胞の遺伝子リプログラミングによって得られるとともに、部分的に胚性幹細胞と類似する自己複製性及び多能性の形態及び潜在力を有する多能性幹細胞を指す。これらの細胞は、特に、アルカリホスファターゼ染色及びタンパク質ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＳＳＥＡ３／４の発現を含む多能性マーカーに対して陽性である。誘導多能性幹細胞を得るプロセスは、当業者に周知であり、特にＹｕ等（Science, 2007,318 (5858): 1917-1920）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ等（Cell, 2007, 131(5): 861-872）、及びＮａｋａｇａｗａ等（Nat Biotechnol,2008, 26(1): 101-106）による文献に記載されている。
【００４８】
また、本発明におけるプロセスで使用されるＨＳＣは、その赤血球生成に関わる能力及び／又はその増幅能力を増大させるように遺伝子組み換えされたＨＳＣであり得る。このように、特定の実施形態において、本発明におけるプロセスは、その赤血球生成に関わる能力及び／又はその増幅能力を増大させるようにＨＳＣの遺伝子組換えを含み得る。これらの細胞を遺伝子組み換えする方法は当業者に周知であり、例えばレトロウイルス若しくはレンチウイルスによって導入遺伝子を細胞ゲノムに導入すること、遺伝子若しくはタンパク質導入の任意の他の形態に関与する。
【００４９】
実施形態において、これらのＨＳＣの増幅能力は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＨＴＥＲＴ）、ＢリンフォーマＭｏ−ＭＬＶインサーションリージョン１ホモログ（ＢＭＩ１）、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢからなる群より選択される１つ以上の遺伝子を過剰発現することで向上する。
【００５０】
特定の実施形態において、ＨＳＣはＨＴＥＲＴを過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００５１】
他の特定の実施形態において、ＨＳＣは、ＨＴＥＲＴと、ＢリンフォーマＭｏ−ＭＬＶインサーションリージョン１ホモログ（ＢＭＩ１）、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢからなる群より選択される１つ以上の遺伝子とを過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００５２】
好ましい実施形態において、ＨＳＣは、ＨＴＥＲＴ及び／又はＢＭＩ１、好ましくはＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００５３】
赤血球生成経路に関わるＨＳＣの能力は、ＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路、及び／又はコア赤血球ネットワーク（ＣＥＮ）経路に関与する１つ以上の遺伝子を過剰発現することで向上させることができる。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「ＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路」という用語は、主要なタンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）、及びＢ細胞リンフォーマ−エクストララージ（ＢＣＬ−ＸＬ）である細胞シグナル経路を指す。ＥＰＯは赤血球生成に必須であり、赤血球関与及び細胞生存を高める。ＥＰＯをその膜受容体に結合させることでＥＰＯ−Ｒを二量体化させ、これは、活性化されたときＪＡＫ２を誘導する。そして、ＪＡＫ２は、ＥＰＯ−Ｒの細胞質側末端におけるチロシン残基をリン酸化する。これらのリン酸化チロシンは、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含むタンパク質との相互作用を可能にし、これが種々のシグナル経路の活性化につながり、主要なものはＳＴＡＴ５経路である。ＳＴＡＴ５は、まず二量体化されて、リン酸化され、これにより、細胞増殖及び赤血球分化に関与する遺伝子を含む種々の遺伝子の転写を活性化させる核への移行を行う。
【００５５】
実施形態において、ＨＳＣは、ＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５Ｐ／ＢＣＬ−ＸＬ経路の１つ以上の遺伝子、好ましくはＥＰＯ−Ｒ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５Ｐ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−２をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００５６】
特定の実施形態において、ＨＳＣはＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「ＣＥＮ経路」という用語は、赤血球のアイデンティティーを確立する又は維持するために必須の転写因子の群を指す。
【００５８】
実施形態において、ＨＳＣは、１つ以上のＣＥＮ経路遺伝子、好ましくは、ＧＡＴＡ１（ＤＮＡ配列「ＧＡＴＡ」に結合するジンクフィンガータンパク質ファミリーに属する転写因子）、ＴＡＬ  ｂＨＬＨ転写因子１（ＴＡＬ１）、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）、ＬＩＭドメインバインディング１（ＬＤＢ１）、ＬＩＭドメインオンリー２（ＬＭＯ２）、及び幹細胞白血病（ＳＣＬ）をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００５９】
特定の実施形態において、ＨＳＣはＬＭＯ２をコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明におけるプロセスに使用されるＨＳＣは、
（ｉ）  ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の遺伝子、好ましくはＨＴＥＲＴ及び／又はＢＭＩ１、より特に好ましくはＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１、並びに
（ｉｉ）  好ましくはＥＰＯ−Ｒ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−２をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、１つ以上のＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子、より特に好ましくはＢＣＬ−ＸＬ、並びに／又は、
（ｉｉｉ）  好ましくはＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、ＫＬＦ１、ＬＤＢ１、ＬＭＯ２、及びＳＣＬをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＣＥＮ経路遺伝子、より特に好ましくはＬＭＯ２、を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００６１】
他の特定の実施形態において、本発明におけるプロセスに使用されるＨＳＣは、
（ｉ）  ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の遺伝子、好ましくはＨＴＥＲＴ及び／又はＢＭＩ１、より特に好ましくはＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１、並びに
（ｉｉ）  好ましくはＥＰＯ−Ｒ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５Ｐ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−２をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、１つ以上のＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子、より特に好ましくはＢＣＬ−ＸＬ、並びに、
（ｉｉｉ）  好ましくはＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、ＫＬＦ１、ＬＤＢ１、ＬＭＯ２、及びＳＣＬをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＣＥＮ経路遺伝子、より特に好ましくはＬＭＯ２、を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００６２】
好ましい実施形態において、ＨＳＣは、
（ｉ）  ＨＴＥＲＴをコードする遺伝子、及び任意的にＢＭＩ１をコードする遺伝子、並びに
（ｉｉ）  ＬＭＯ２をコードする遺伝子及び／又はＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子、好ましくＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子、を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００６３】
特に、ＨＳＣは、ＨＴＥＲＴをコードする遺伝子及びＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子、及び任意的にＢＭＩ１をコードする遺伝子、を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００６４】
他の好ましい実施形態において、ＨＳＣは、
（ｉ）  ＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１をコードする遺伝子、並びに
（ｉｉ）  ＬＭＯ２をコードする遺伝子及び／又はＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子、を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００６５】
特に、ＨＳＣは、
（ｉ）  ＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１をコードする遺伝子、並びにＬＭＯ２をコードする遺伝子、又は
（ｉ）  ＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１をコードする遺伝子、並びにＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子、を過剰発現するように遺伝子組み換えすることができる。
【００６６】
本明細書で使用するとき、「過剰発現」、「過剰発現する」、又は「過剰発現すること」という用語は、非遺伝子組換え細胞における遺伝子の発現レベルより高い、遺伝子組換え細胞における同じ遺伝子の発現レベルを指す。細胞が遺伝子組換え前に目的の遺伝子を発現しないが、遺伝子組換え後に発現するとき、この用語は、「発現」、「発現する」、又は「発現すること」に置き換えられ得る。
【００６７】
ＨＳＣにおける遺伝子の過剰発現は、当業者に既知の任意の方法によって、特に、過剰発現される１つ以上の遺伝子を含む核酸、過剰発現される遺伝子の１つをそれぞれが含むいくつかの核酸をＨＳＣに導入することによって、得ることができる。このように、１つ以上の核酸は同じ構築物又は個別の構築物に構成することができる。１つ以上の核酸は、当業者に既知の任意の方法によって、特に、ウイルス形質導入、微量注入法、遺伝子導入、エレクトロポレーション、及び遺伝子銃によって、ＨＳＣに導入することができる。
【００６８】
本明細書で使用するとき、「構築物」という用語は発現カセット又は発現ベクターを指す。
【００６９】
発現カセットにおいて、過剰発現される１つ以上の遺伝子は、その発現に必要な配列に作動可能に連結される。特に、過剰発現される１つ以上の遺伝子は、ＨＳＣにおいてそれらを発現させるプロモーターの制御下にあるとよい。一般的に、発現カセットは、転写を開始させるプロモーター、１つ以上の遺伝子、及び転写ターミネーターを含む、又はそれらからなる。「作動可能に連結される」という文言は、コード配列の発現が転写プロモーターの制御下にあるようにエレメントが組み合わせられていることを示す。典型的には、プロモーターの配列は、１つ以上の目的の遺伝子の上流（５´）に配置される。スペーサー配列は、コードするタンパク質の翻訳による発現を妨げないならば、調節因子と遺伝子との間に存在することができる。また、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された配列を活性化させる少なくとも１つの「エンハンサー」を含むことができる。
【００７０】
発現ベクターは、１つ以上の核酸又は記載されるような発現カセットを含む。この発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、該細胞において目的の核酸を発現させるために使用可能である。ベクターは、当業者に周知の従来の分子生物学的技術によって構築することができる。
【００７１】
有利には、発現ベクターは、目的の核酸を発現させる調節因子を含む。これらの因子は、例えば転写プロモーター、転写アクチベーター、ターミネーター配列、開始コドン及び終止コドンを含むことができる。これらの因子を選択する方法は当業者に周知である。
【００７２】
ベクターは、環状又は線状、一本鎖又は二本鎖であってもよい。これは、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体から有利に選択される。好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。
【００７３】
過剰発現される１つ以上の遺伝子は、同じ核酸に存在していなくても、同一又は異なる構成的プロモーター又は誘導的プロモーターの制御下におくことができる。
【００７４】
ＨＳＣは、一時的に又は安定的に形質転換／遺伝子導入することができ、１つ以上の核酸、カセット、又はベクターはエピソームとして細胞に含まれる、又はＨＳＣゲノムに組み込むことができる。これらは、同一又は別個の領域において真核生物細胞ゲノムに挿入することができる。
【００７５】
目的の遺伝子の安定的又は一時的な発現を可能にする当業者に周知の数多くの技術が存在する。特に、目的の遺伝子は、標的発現系、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するノックイン技術を使用して細胞のゲノムに組み込むことができる（例えばPlatt et al.Cell. 2014 Oct 9; 159(2):440-55又はLo et al. Biotechniques. 2017 Apr 1; 62(4):165-174を参照）。１つ以上の目的の遺伝子の単一コピーが所定の座位で細胞ゲノムに挿入可能なこの技術は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする遺伝子及び１つ以上の遺伝子が挿入される座位に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の連携的発現を可能にする１つ以上のベクターの遺伝子導入に基づくものである。該１つ以上の目的の遺伝子又は該１つ以上の目的の遺伝子を含むカセットは、Ｃａｓ９によって生じた切断の修復の結果として、挿入される。
【００７６】
本願で使用するとき、「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」という用語は、Ｃａｓ９と相互作用して標的染色体領域にガイドすることができるＲＮＡ分子を指す。
【００７７】
核ｇＲＮＡは、
−  標的染色体領域と相補的であり、内在性ＣＲＩＳＰＲ系のｃｒＲＮＡを模倣する、ｇＲＮＡの５´末端における第１領域（通常「ＳＤＳ」領域として呼称される）、及び
−  トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と内在性ＣＲＩＳＰＲ系ｃｒＲＮＡとの間の塩基対相互作用を模倣し、３´末端における実質的に一本鎖の配列により二本鎖ステムループ構造を有する、ｇＲＮＡの３´末端における第２領域（通常「ハンドル」領域として既知である）、の２つの領域を含むことができる。この第２領域はｇＲＮＡ−Ｃａｓ９結合に必須である。
【００７８】
目的の遺伝子又は１つ以上の目的の遺伝子を含むカセットは、ｇＲＮＡが標的とする切断部位の相同配列に隣接し、相同組換えによる切断修復によって遺伝子又はカセットを挿入することができる。
【００７９】
構成的発現を可能にするプロモーターの例は、ｐＥＦ１αロング、ｐＣＭＶ、及びｐＣＡＧを含むがこれらに限らない。
【００８０】
本発明において使用可能な誘導的発現系は、Ｔｅｔ−Ｏｎ系であり、これは、大腸菌のテトラサイクリン制御因子（ＴｅｔＲ）タンパク質をヘルペスウイルスのＶＰ１６タンパク質の活性ドメインに融合させて作製されたテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）の使用に基づくものである。ｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンと結合される場合のみ、特定のＴｅｔＯオペレート配列におけるＤＮＡに結合することができる。複数のＴｅｔＯ繰り返し配列がＥＦ１αロングプロモーターなどのプロモーターの制御下におかれる。プロモーターに結合したＴｅｔＯ配列は、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と呼ばれ、プロモーターの制御下にある遺伝子の発現を増大させることでテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）結合に応答する。
【００８１】
複数の遺伝子が過剰発現されると、同じプロモーター又は複数のプロモーターの制御下におかれ得る。
【００８２】
特定の実施形態において、ＨＳＣは、ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の遺伝子、好ましくはＨＴＥＲＴ及び／又はＢＭＩ１、より特に好ましくはＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１を過剰発現するように遺伝子組み換えされ、この遺伝子又はこれらの遺伝子は１つ以上の誘導的プロモーターの制御下におかれる。
【００８３】
特定の実施形態において、ＨＳＣは、好ましくはＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、ＫＬＦ１、ＬＤＢ１、ＬＭＯ２、及びＳＣＬをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＣＥＮ経路遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされ、この遺伝子又はこれらの遺伝子は１つ以上の誘導的プロモーターの制御下におかれる。
【００８４】
特定の実施形態において、ＨＳＣは、好ましくはＥＰＯ−Ｒ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５Ｐ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−２をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、より特に好ましくはＢＣＬ−ＸＬである、１つ以上のＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされ、この遺伝子又はこれらの遺伝子は１つ以上の構成的プロモーターの制御下におかれる。
【００８５】
好ましい実施形態において、ＨＳＣは、誘導的プロモーターの制御下においてＨＴＥＲＴをコードする遺伝子、及び構成的プロモーターの制御下においてＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００８６】
他の好ましい実施形態において、ＨＳＣは、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下においてＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、及びＬＭＯ２をコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００８７】
他の好ましい実施形態において、ＨＳＣは、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下においてＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１をコードする遺伝子、及び１つ以上の構成的プロモーターの制御下においてＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【００８８】
あるいは、又は上述の遺伝子組換えに加え、本発明におけるプロセスに使用されるＨＳＣはまた、誘導的プロモーターの制御下において例えばＨＳＶ−ＴＫ遺伝子又はＣａｓｐ９遺伝子などの自殺遺伝子を含むように遺伝子組み換えすることができる。本明細書で使用するとき、「自殺遺伝子」という用語は、対象の自殺遺伝子に対応して、さらなる分子（薬剤又は他のもの）の存在の有無で、これを発現する分裂可能細胞の死をもたらす任意の遺伝子を指す。一例として、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子又はＣａｓｐ９遺伝子を発現する細胞の細胞死は、それぞれガンシクロビル又はＡＰ１００３を添加することでなされる。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明におけるプロセスに使用されるＨＳＣは不死化ＨＳＣである。これらの不死化細胞は、上述のようにさらに遺伝子組み換えすることができる。
【００９０】
不死化ＨＳＣは、悪性細胞から株化された不死化細胞株から得られる。
【００９１】
好ましくは、不死化ＨＳＣは、例えばｉＰＳから（Kurita et al.PLoS ONE, 2013, 8, e59890）、臍帯血細胞から（Kurita et al. supra; Huang, X. et al. Mol. Ther.2014, 22, 451-463）、胚性幹細胞から（Hirose, S. et al.Stem Cell Rep. 2013, 1, 499-508）、又は骨髄から単離されたＨＳＣから、細胞吸着から、若しくは末梢血全血から（Trakarnsanga etal., 2017, Nature Communications, Vol. 8, 14750）など、非悪性細胞から株化された不死化細胞株から得られる。
【００９２】
ＨＳＣは、当業者に既知の任意の技術によって、特にヒトパピローマウイルス１６型発がん遺伝子Ｅ６及びＥ７（ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７）を有するレンチウイルスベクターでの形質導入によって（Akimov et al.Stem Cells. 2005 Oct; 23(9): 1423-1433; Trakarnsanga et al. supra）、不死化可能である。任意的に、ＨＳＣはまた、ＨＴＥＲＴをコードする遺伝子を有するレンチウイルスで形質導入することができる（Akimov et al., supra）。
【００９３】
好ましい実施形態において、本発明におけるプロセスに使用される不死化ＨＳＣは、赤血球系前駆体の成熟脱核赤血球への成熟誘導後に死滅させるこができる自殺遺伝子を含む。
【００９４】
本発明におけるプロセスは、上述のＨＳＣを、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーに、より好ましくは造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させるとともにグルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーを含む培地に、接触させることを含む。
【００９５】
本明細書で使用するとき、「オートファジー」、「自己融解」又は「自己貪食」という用語は同等であり、互換的に使用可能である。オートファジーは、それ自体のリソソームによる細胞における細胞質の一部の分解を指す。
【００９６】
オートファジーは、特定のタンパク質（ウイルス性、異常なものなど等）を及び損傷した小器官を排除するために利用される生理学的なプロセスである。また、このプロセスは、細胞内病原体を排除することに関わり得る。いくつかのシグナル経路は、栄養欠乏から微生物浸入まで、様々なタイプの細胞ストレスを検出し、オートファジーを調節するように集中する。本明細書で使用するとき、「オートファジーインデューサー」という用語は、細胞においてオートファジーを誘導可能な分子を指す。
【００９７】
特に、オートファジーインデューサーは、メトホルミン、ラパマイシン、ペリホシン、エベロリムス、レスベラトロール、若しくはタモキシフェンなどのｍＴＯＲ経路インヒビター、化合物ＭＧ−１３２（２６Ｓプロテアソームインヒビター）、化合物ＳＡＨＡ（全ヒストンデアセチラーゼインヒビター）、トリコスタチンＡ、若しくはバルプロ酸などの自己貪食空胞形成アクチベーター、又はＳＭＥＲ−２８、ＳＭＥＲ−１０、若しくはＳＭＥＲ１８などのｍＴＯＲ経路と無関係に作用する低分子であってもよい。
【００９８】
特定の実施形態において、オートファジーインデューサーは、好ましくは低分子エンハンサーのラパマイシン−２８（ＳＭＥＲ−２８）、ＳＭＥＲ−１０、及びＳＭＥＲ１８、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、ｍＴＯＲ経路と無関係に作用するインデューサーである。
【００９９】
好ましい実施形態において、オートファジーインデューサーはＳＭＥＲ−２８である。
【０１００】
本明細書で使用するとき、「グルココルチコイドホルモン」、「グルココルチコイド」、「コルチコステロイド」、又は「コルチコイド」という用語は同等であり、互換的に使用可能である。これらの用語は、プレグナン核を有し、タンパク質及び炭水化物の代謝に作用する、天然又は合成のステロイドホルモンを指す。
【０１０１】
実施形態において、グルココルチコイドホルモンは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、コルチバゾール、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より選択される。
【０１０２】
特定の実施形態において、グルココルチコイドホルモンは、好ましくはプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、コルチバゾール、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より選択される、合成ホルモンである。
【０１０３】
好ましい実施形態において、グルココルチコイドホルモンは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、並びにそれらの誘導体、及び混合物からなる群より、好ましくは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾンからなる群より選択される。
【０１０４】
特に好ましい実施形態において、グルココルチコイドホルモンはデキサメタゾンである。
【０１０５】
特定の実施形態において、オートファジーインデューサーは、ＳＭＥＲ−２８、ＳＭＥＲ１０、及びＳＭＥＲ１８からなる群より選択され、好ましくはＳＭＥＲ−２８であり、グルココルチコイドホルモンは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾンからなる群より選択され、好ましくはデキサメタゾンである。
【０１０６】
特に特定の実施形態において、オートファジーインデューサーはＳＭＥＲ−２８であり、グルココルチコイドホルモンはデキサメタゾンである。
【０１０７】
任意的に、ＨＳＣはまた、ＨＩＦ経路のアクチベーターと接触させることができる。本明細書で使用するとき、「ＨＩＦ経路」という用語は、ＥＰＯ分泌を促進してＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路を活性化する低酸素誘導因子（ＨＩＦ）によって開始されるシグナル経路を指す。
【０１０８】
好ましくは、本発明におけるＨＩＦ経路アクチベーターはプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＩＳ）インヒビターである。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、「プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＩＳ）」及び「プロコラーゲン−プロリンジオキシゲナーゼ」という用語は同等であり、互換的に使用可能である。プロリルヒドロキシラーゼは、ＨＩＦのプロリル残基におけるＨＩＦの水酸化酵素である。水酸化されると、ＨＩＦは阻害される。ゆえに、特定のプロリルヒドロキシラーゼのインヒビターは、プロリルヒドロキシラーゼを阻害してＨＩＦ経路を活性化させ、これがＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路を活性化させることができる分子である。
【０１１０】
好ましくは、プロリンヒドロキシラーゼインヒビターは、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）、Ｎ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、ＦＧ−４３８３、Ｆ−００４１、ＦＧ−２２１６、ＦＧ−４５９２、Ｓ９５６７１１、エチル−３、４ジヒドロキシ−ベンゾアト（ＥＤＨＢ）、ＴＭ６０８９、ＴＭ６５５、ＴＭ６００８、８−ヒドロキシキノリン、及びそれらの誘導体からなる群より選択される。
【０１１１】
最も特に好ましくは、ＨＩＦ経路アクチベーターはＤＭＯＧである。
【０１１２】
本発明におけるプロセスの実施時に、ＨＳＣは、造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させた培地において培養される。好ましくは幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及び脂肪を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジーズ）又はＳｔｅｍＭＡＣＳ  ＨＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  ＸＦ、ヒト（インビトロジェン）など、ＨＳＣの栄養要求に適応させた数多くの培地が当業者に知られており、市販されている。
【０１１３】
好ましくは、ＨＳＣは、２００〜１００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは５００〜２０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは約１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で培養される。
【０１１４】
好ましくは培地を約３日毎に変えて、細胞が約４００００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度を超えないようにする。
【０１１５】
ＨＳＣは、培養の第１日目、又は培養の数日後、例えば１０〜１５日後に、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーに接触させることができる。
【０１１６】
好ましくは、ＨＳＣは、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーにともに接触させる。
【０１１７】
あるいは、ＨＳＣは、まずグルココルチコイドホルモンに接触させ、そしてオートファジーインデューサーに接触させることができ、又はその逆でもよい。第２化合物の添加は、例えば、第１化合物との接触の数時間後に行うことができる。
【０１１８】
好ましくは、ＨＳＣは、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーにともに接触させる。より特に好ましくは、ＨＳＣは、培養の第１日目からグルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーにともに接触させる。
【０１１９】
接触は、ＨＳＣ培地にグルココルチコイドホルモン及び／又はオートファジーインデューサーを添加すること、又はＨＳＣをグルココルチコイドホルモン及び／又はオートファジーインデューサーを含む培地に配置することで行うことができる。
【０１２０】
グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーの濃度は、培養又は接触において、一定である又は変化させることができる。
【０１２１】
好ましくは、培地がグルココルチコイドホルモンを含むとき、これは、０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜１ｍＭ、より好ましくは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭ、特に好ましくは０．０２ｍＭ〜０．１ｍＭの濃度で存在する。
【０１２２】
特定の実施形態において、培地がグルココルチコイドホルモンを含むとき、これは約０．１ｍＭの濃度で存在する。
【０１２３】
好ましくは、培地がオートファジーインデューサーを含むとき、これは、０．１μＭ〜１００μＭ、好ましくは０．５μＭ〜５０μＭ、より好ましくは１μＭ〜３０μＭ、特に好ましくは２μＭ〜３０μＭの濃度で培地に存在する。あるいは、培地がオートファジーインデューサーを含むとき、これは１０μＭ〜３０μＭの濃度で培地に存在することができる。
【０１２４】
特定の実施形態において、培地がオートファジーインデューサーを含むとき、これは約２μＭの濃度で培地に存在する。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、「約」という用語は、特定値の±５％、好ましくは特定値の±２％である値の範囲を指す。例として、「約２０」は、２０±５％、又は１９〜２１を含む。
【０１２６】
同様に、ＨＳＣがＨＩＦ経路アクチベーターの存在下におかれる実施形態において、アクチベーターの濃度は、培養又は接触において、一定である又は変化させることができる。
【０１２７】
好ましくは、培地がＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含むとき、これは、１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは１０μＭ〜５００μＭ、より好ましくは５０μＭ〜４００μＭ、特に好ましくは７５μＭ〜３５０μＭの濃度で培地に存在する。
【０１２８】
特定の実施形態において、ＨＳＣは、培養の１０〜１５日後、グルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、及びオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ２８の存在下におかれる。好ましくは、この実施形態において、グルココルチコイドホルモンの濃度は、０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭであり、より特に好ましくは０．０２ｍＭ〜０．１ｍＭであり、オートファジーインデューサーの濃度は１０μＭ〜３０μＭである。
【０１２９】
他の特定の実施形態において、ＨＳＣは、培養の第１日目、又は培養の１０日前から、グルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、及びオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ２８の存在下におかれる。好ましくは、この実施形態において、グルココルチコイドホルモンの濃度は、０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭであり、好ましくは約０．１ｍＭであり、オートファジーインデューサーの濃度は２μＭ〜３０μＭであり、好ましくは約２μＭである。
【０１３０】
ＨＳＣは、好ましくは、少なくとも１０日間、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサー、及び任意的にＨＩＦ経路アクチベーターを含む培地において維持される。より特に好ましくは、ＨＳＣは、少なくとも２０、３０、４０、５０、又は６０日間、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーを含む培地において維持される。
【０１３１】
このステップ時に、細胞培養物はＨＳＣだけでなく赤血球系前駆体も含むということが理解される。
【０１３２】
発明者らは、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーを含む培地の使用が、最終的な赤血球分化の経路に関わらない赤血球系前駆体の作製を著しく増幅させた、ということを示した。このように、本発明のプロセスにおいて、ＨＳＣは、少なくとも６０、７０、８０、９０、又は１００日間、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーを含む培地において培養することができる。好ましくは、ＨＳＣは、最大７０、８０、９０、又は１００日間、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーを含む培地において培養される。
【０１３３】
ＨＳＣ培養の期間、並びにグルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサー、及び任意的にＨＩＦ経路アクチベーターとの接触時間は、細胞個体群に存在する赤血球系前駆体の比率を評価することで当業者によって容易に決定可能である。好ましくは、ＨＳＣは、少なくとも９０％の赤血球系前駆体、好ましくは少なくとも９５％の赤血球系前駆体、より好ましくは少なくとも９９％の赤血球系前駆体を含む個体群が得られるまで、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーに接触させる。
【０１３４】
培養は、成熟赤血球の成熟マーカーが現れるまで維持することができる。好ましくは、培養は、細胞が増幅されなくなる、及び／又は、その１０％未満、好ましくは５％未満が膜受容体ＣＤ１１７を発現するとき、停止される。あるいは、培養は、培養物において細胞の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が多染性赤芽球段階に達する、又はさらに分化の進行段階にあるとき、停止させることができる。
【０１３５】
特定の実施形態において、プロセスは、培地がグルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサー、及び任意的にＨＩＦ経路アクチベーターを含む培養期と、培地がグルココルチコイドホルモン、オートファジーインデューサー、及び／又はＨＩＦ経路アクチベーターを含まない培養期とを交互にすることを含むことができる。
【０１３６】
グルココルチコイドホルモン、オートファジーインデューサー、及びＨＩＦ経路アクチベーターは、ともに又は連続的に培地に添加する又は培地から取り除くことができる。
【０１３７】
培地の組成を変える技術は当業者に周知である。特に、分子の添加又はその濃度の増大は既存の培地に直接的に行うことができ、分子の除去又はその濃度の減少は細胞の遠心分離及び新しい培地への再懸濁によって、又は培地の希釈によって行うことができる。
【０１３８】
本発明におけるプロセスは、得られた赤血球系前駆体を回収するステップをさらに含むことができる。このステップは、当業者に既知の任意の技術によって、特に培地の遠心分離及び除去によって行うことができる。また、本発明のプロセスは、細胞選別ステップ、特にマーカーＣＤ１１７の発現に基づく細胞選択ステップを含むことができる。ＣＤ１１７＋細胞は赤血球系前駆細胞の増幅を延長させるために選択することができる。一方、ＣＤ１１７−細胞は赤血球を作製するために選択することができる。
【０１３９】
また、本発明におけるプロセスは、得られた／回収された赤血球系前駆体を洗浄するステップを含むことができる。このステップは、当業者に既知の任意の技術によって、特に連続する遠心分離及び再懸濁のステップによって行うことができる。
【０１４０】
特定の態様において、本発明はまた、本発明のプロセスによって得られた赤血球系前駆体の個体群に関する。
【０１４１】
他の態様において、本発明はまた、赤血球作製のための、本発明のプロセスによって得られた赤血球系前駆体の使用に関する。
【０１４２】
本明細書で使用するとき、「赤血球（red blood cell）」、「成熟赤血球（mature red bloodcell）」、「赤血球（red blood cell）」、「赤血球（red corpuscle）」、「赤血球（erythrocyte）」、及び「成熟赤血球（matureerythrocyte）」という用語は同等であり、互換的に使用可能である。「赤血球（erythrocyte）」という用語は、赤血球成熟に特有のマーカーを有する脱核細胞を指す。これらは、特にグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）を発現するが、マーカーＣＤ３６を発現しない。
【０１４３】
このように、本発明は、赤血球を作製するためのインビトロのプロセスに関し、該プロセスは、
−  上述の本発明のプロセスによる赤血球系前駆体の作製、及び
−  赤血球系前駆体の成熟の誘導、を含む。
【０１４４】
本発明における赤血球系前駆体を作製するためのプロセスに関する上述の実施形態は、この態様においても考慮される。
【０１４５】
赤血球系前駆体の成熟は、ＣＤ２３５ａなどの赤血球成熟マーカーの発現及び脱核によるものを含むことができる。
【０１４６】
また、本発明のプロセスは、細胞選別ステップ、特にＣＤ１１７−細胞選択ステップを含むことができる。
【０１４７】
前駆体の成熟は、当業者に既知の任意の方法によって誘導することができる。特に、成熟は、赤血球分化培地、例えばエリスロポエチン及び任意的にＳＭＥＲ２８を添加した培地にて赤血球系前駆体を培養することで誘導することができる。好ましくは、成熟は、幹細胞因子（ＳＣＦ）又はデキサメタゾンを含まず、エリスロポエチン（約２．５ＩＵ／ｍＬ）及び任意的にＳＭＥＲ２８（約２．５μＭ）を添加した培地にて赤血球系前駆体を培養することで誘導される。あるいは、成熟は、無血清培地に細胞を配置することで誘導される。好ましくは、前駆体成熟は、例えば培養物において５，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える、高細胞濃度で誘導される。
【０１４８】
実施形態において、本発明における赤血球を作製するためのプロセスは、有核細胞を排除するステップをさらに含む。このステップにより、成熟赤血球のみを含む均質な個体群が得られる。
【０１４９】
本発明における赤血球系前駆体を作製するためのプロセスに使用されるＨＳＣが誘導的自殺遺伝子を含む特定の実施形態において、この有核細胞を排除するステップは、この自殺遺伝子の発現を誘導することで行うことができる。
【０１５０】
赤血球を作製するためのプロセスは、得られた赤血球を回収するステップをさらに含むことができる。このステップは、当業者に既知の任意の技術によって、特に、培地の濾過、遠心分離及び除去によって行うことができる。
【０１５１】
また、本発明におけるプロセスは、得られた／回収された赤血球を洗浄するステップを含むことができる。このステップは、当業者に既知の任意の技術によって、特に連続する濾過、遠心分離及び再懸濁のステップによって行うことができる。
【０１５２】
他の態様において、本発明はまた、本発明のプロセスによって得られた赤血球の個体群に関する。
【０１５３】
他の態様において、本発明はまた、本発明のプロセスによって得られた赤血球系前駆体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１５４】
また、本発明は、造血グラフトとして使用するための、本発明における赤血球系前駆体、又は本発明における赤血球系前駆体を含む医薬組成物に関する。本明細書で使用するとき、「造血グラフト」という用語は、対象の骨髄に投与するために用いられるとともに赤血球を作製することができる一式の細胞を指す。
【０１５５】
また、本発明は、貧血症の処置に使用するための、本発明における赤血球系前駆体、又は本発明における赤血球系前駆体を含む医薬組成物に関する。
【０１５６】
本明細書で使用するとき、「貧血症」という用語は、異常に低レベルの健康な赤血球によって特徴づけられる異常な血球数、及び対象の年齢に対して正常値より低い循環ヘモグロビンの減少を指す。一例として、貧血症は、一般的に、男性では１３ｇ／ｄＬ未満、女性では１２ｇ／ｄＬ未満、子供では１１ｇ／ｄＬ未満、及び新生児では１４ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルによって特徴づけられる。
【０１５７】
貧血症には、様々な複数の原因があり得る。貧血症の例は、出血に関連する貧血症（例えば外傷又は手術による出血）、薬剤処置（例えば化学療法）又は毒性物質への暴露（例えば脂肪分解剤、酸化剤、鉛、毒液、若しくは毒物）により誘発された貧血症、赤血球膜の遺伝性障害による溶血性貧血症（例えば遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、若しくは遺伝性熱変形赤血球症）、赤血球膜の後天性障害による溶血性貧血症（例えば発作性夜間ヘモグロビン尿症若しくは有棘赤血球増加症）、自己免疫性溶血性貧血症（例えば輸血事故）、感染因子による貧血症（例えばマラリア、バベシア若しくはバルトネラ感染、トリパノソーマ症、内臓リーシュマニア症、敗血症、若しくはＣＭＶ感染）、遺伝性又は後天性鉄芽球性貧血、骨髄不全による貧血症（例えば骨髄抑制、ビタミンＢ１２欠乏、脊髄形成異常症、若しくは悪性血液疾患（malignanthematopathy）による骨髄疾患侵入（白血病、リンパ腫、転移））、又は鎌状赤血球症若しくはサラセミア症候群に関与する貧血症を含むが、これらに限定されない。好ましくは、貧血症は、鎌状赤血球症又はサラセミア症候群に関連するものである。
【０１５８】
本発明は、貧血症に罹患する患者を処置するための方法に関し、該方法は、本発明のプロセスによって得られた赤血球系前駆体の治療有効量、又は本発明において得られた赤血球系前駆体を含む医薬組成物を、該患者に投与することを含む。
【０１５９】
また、本発明は、貧血症を処置する薬剤の、特に生物学的薬剤の調製のための、本発明において得られた赤血球系前駆体、又は該前駆体を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１６０】
本明細書で使用するとき、「生物学的薬剤」という用語は、活性物質が生物学的由来のものによって産生される又は生物学的由来のものから抽出される医薬品を指す。
【０１６１】
好ましくは、この態様において、赤血球系前駆体は非遺伝子組換えＨＳＣから得られる。
【０１６２】
本明細書で使用するとき、「対象」及び「患者」という用語は同等であり、互換的に使用可能である。これらの用語は、好ましくは、動物、特に哺乳動物、最も特に好ましくはヒト、特に胎児、新生児、子供、１０代の子供、成人、又は高齢者を指す。本明細書で使用するとき、「胎児」という用語は妊娠８週を超える子宮内発育段階を指し、「新生児」という用語は１２か月齢以下のヒトを指し、「子供」という用語は１〜１２歳のヒトを指し、「成人」という用語は１２〜６０歳のヒトを指し、「高齢者」という用語は６０歳以上のヒトを指す。
【０１６３】
患者は、好ましくは、輸血障害のある、多回輸血した、又は希な血液群を有する、患者である。好ましい実施形態において、この患者は、貧血症、特に鎌状赤血球症又はサラセミア症候群に関連する貧血症に罹患している。
【０１６４】
本明細書で使用するとき、「輸血障害」という用語は、有効ではない、及び／又は患者に病理学的合併症を誘発する輸血を指す。
【０１６５】
赤血球濃縮物（ＲＣＣ）の輸注の２４時間後、輸注効率が８０％未満であるとき、赤血球輸注は有効ではないと考えられる。
【０１６６】
赤血球輸注効率（ＥＴＥ）は以下の式によって計算される。
【数１】
2020525031.tif 000002
【０１６７】
輸注されるＨＢの最小量は４０ｇであり、観察される平均は５０ｇである。ＴＢＶは全血液量を指す。
【０１６８】
輸血障害に関連する病理学的合併症は、数年後に発生し得るとともに患者の将来の輸血ができなくなる免疫性輸血（輸血同種免疫）の結果によるものであり得る。実際に、新しく輸血するとき、以前の免疫化が直接的な溶血の危機をまねく（抗体が十分な力価で存在する場合）か、又は、遅延性の溶血を引き起こす（抗体が低力価で存在する、又は新しく輸血するとき血清学的に検出不可能ですらある場合）ことがある。
【０１６９】
本明細書に使用するとき、「多回輸血」という用語は、複数の輸血を受けた患者、及び／又は既に輸血をして他にも輸血を受ける患者を指す。
【０１７０】
本明細書に使用するとき、「希な血液群」という用語は、仏国及び／若しくは欧州及び／若しくは世界人口における頻度が１／２５０未満の血液群、並びに／又はその血液群を保有する患者がＯ型で輸血できない血液群を指す。希な血液は供給が困難である。
【０１７１】
獣医学的用途の分野において、本発明の対象は、非ヒト動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、げっ歯動物、非ヒト霊長類、及び家禽類からなる群より選択される好ましくはペット又は家畜であってもよい。
【０１７２】
本明細書に使用するとき、「処置」という用語は、症状の改善若しくは排除、疾患進行の遅延、疾患進行の停止、又は疾患の排除を目的とした任意の行為を指す。この用語は、より具体的に、好ましくは対象の年齢に対する正常値に達するような、健康な赤血球及び循環ヘモグロビンのレベルの増加を指す。この用語は、予防的処置及び根治的処置の両方を含む。本明細書で使用するとき「治療有効量」という用語は、病態の少なくとも１つの症状における作用を奏するために、より具体的には処置する対象における健康な赤血球及び循環ヘモグロビンのレベルを増加させるために、十分な量を指す。
【０１７３】
本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される担体」及び「薬学的に許容されるサポート」という用語は同等であり、医薬組成物に存在する有効成分以外の任意の物質を指す。この添加は、特に、細胞の特性を変えることなく細胞の保存及び投与を容易にするために用いられる。本発明における赤血球又は赤血球前駆体を含む組成物の製剤化に使用される薬学的に許容される担体は、例えば、生理食塩水、ヒト血清アルブミン添加ＰＢＳ溶液、及びそれらの混合物からなる群より選択することができる、又は赤血球及び／若しくは前駆体の保存に適する容積モル浸透圧濃度を有するとともに好ましくは対象に直接投与可能な任意の他の生理食塩水溶液であってもよい。また、赤血球を含む組成物の製剤化において、生理食塩水−アデニン−グルコース−マンニトール（ＳＡＧＭ）剤は、単独の、又は上述の他の薬学的に許容される担体と組み合わせて、薬学的に許容される担体として使用することができる。
【０１７４】
好ましくは、前駆体又はグラフト投与は、患者の骨髄にて又は静脈内注射によって行われる。
【０１７５】
好ましい実施形態において、赤血球系前駆体を作製するために使用される造血幹細胞は、ドナーのサンプル由来、又はドナーから得た細胞由来であり、赤血球系前駆体はレシピエントである患者に移植するために用いられる。ドナー及びレシピエントは、同じ個体（自家グラフト）又は異なる個体（同種間グラフト）であってもよい。好ましくは、ドナーとレシピエントとは同じ個体である。
【０１７６】
他の態様において、本発明は、本発明のプロセスによって得られた赤血球と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物又は薬剤、特に生物学的薬剤に関する。
【０１７７】
また、本発明は、貧血症に罹患する、すなわち赤血球の供給を必要とする患者の輸血のための、本発明のプロセスによって得られた赤血球、又は本発明において得られた赤血球を含む医薬組成物に関する。
【０１７８】
また、本発明は、貧血症に罹患する、すなわち赤血球の供給を必要とする患者を処置するための方法に関し、該方法は、本発明のプロセスによって得られた赤血球の治療有効量、又は本発明における赤血球を含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１７９】
また、本発明は、貧血症の処置に使用するための、本発明のプロセスによって得られた赤血球、又は本発明において得られた赤血球を含む医薬組成物に関する。
【０１８０】
好ましくは、貧血症は、鎌状赤血球症又はサラセミア症候群に関連する貧血症である。
【０１８１】
好ましくは、患者は輸血障害がある、多回輸血されている、又は希な血液型である。
【０１８２】
個別化医療の文脈において、投与される又は患者に投与される赤血球は、赤血球作製のためのインビトロのプロセスにおいて得られ、該プロセスは、
−  該患者のサンプルからＨＳＣを得ること、
−  本発明のプロセスにおいて該ＨＳＣから赤血球系前駆体を得ること、及び
−  本発明のプロセスにおいて該赤血球系前駆体から赤血球を得ること、を含む。
【０１８３】
ＨＳＣは、患者の血液又は骨髄のサンプルから得られる。あるいは、ＨＳＣは、患者から得た分化体細胞の遺伝子リプログラミングによって得られるｉＰＳＣから取得される。
【０１８４】
ＨＳＣは、任意的に上述のように遺伝子組み換えすることができる。
【０１８５】
他の態様において、本発明は、
（ｉ）  ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、ｃ−ＭＹＣ、ｌ−ＭＹＣ、及びＭＹＢをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の遺伝子、好ましくはＨＴＥＲＴ及び／又はＢＭＩ１、より特に好ましくはＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１、並びに
（ｉｉ）  好ましくはＥＰＯ−Ｒ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５Ｐ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−２をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される、１つ以上のＥＰＯ−Ｒ／ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５／ＢＣＬ−ＸＬ経路遺伝子、より特に好ましくはＢＣＬ−ＸＬ、並びに／又は、
（ｉｉｉ）  好ましくはＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、ＫＬＦ１、ＬＤＢ１、ＬＭＯ２、及びＳＣＬをコードする遺伝子、並びにそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＣＥＮ経路遺伝子、より特に好ましくはＬＭＯ２、を過剰発現するように遺伝子組み換えされたＨＳＣにさらに関する。
【０１８６】
赤血球系前駆体を作製するためのプロセスに使用されるＨＳＣに関わる実施形態は、この態様においても考慮される。
【０１８７】
好ましい実施形態において、ＨＳＣは、誘導的プロモーターの制御下においてＨＴＥＲＴをコードする遺伝子、及び構成的プロモーターの制御下においてＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【０１８８】
他の好ましい実施形態において、ＨＳＣは、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下においてＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、及びＬＭＯ２をコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【０１８９】
他の好ましい実施形態では、ＨＳＣは、１つ以上の誘導的プロモーターの制御下においてＨＴＥＲＴ及びＢＭＩ１をコードする遺伝子、及び構成的プロモーターの制御下においてＢＣＬ−ＸＬをコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子組み換えされる。
【０１９０】
また、遺伝子組換えＨＳＣは上述のような自殺遺伝子を含む、又は不死化させることができる。
【０１９１】
また、本発明は、特に上述の本発明のプロセスにおいて、好ましくはインビトロで赤血球系前駆体及び／又は赤血球を作製するための本発明における遺伝子組換えＨＳＣの使用に関する。
【０１９２】
さらに他の態様において、本発明は、ＨＳＣの栄養要件に適応させ、特に造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させるとともに、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサー、及び任意的にＨＩＤ経路アクチベーターを含む細胞培地に関する。
【０１９３】
赤血球系前駆体を作製するためのプロセスに使用される、グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサー、及び任意的にＨＩＤ経路アクチベーターを含む培地に関する実施形態は、この態様においても考慮される。
【０１９４】
グルココルチコイドホルモン及びオートファジーインデューサーは本発明におけるプロセスについて上述のとおりである。好ましくは、グルココルチコイドホルモンはデキサメタゾンであり、及び／又はオートファジーインデューサーはＳＭＥＲ２８であり、及び／又はＨＩＦ経路アクチベーターはＤＭＯＧである。
【０１９５】
造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させた細胞培地のベースは、ＨＳＣ及び／又は赤血球系前駆体の要求を満たすように当業者に既知の任意のベースであってもよい。
【０１９６】
本明細書で使用するとき、「増殖」という用語は細胞の増殖を指す。「分化」という用語は、培養細胞による、初期に培地への播種に使用された細胞には存在しなかった特徴の取得を指す。この場合、この用語は、赤血球系前駆体の特徴の取得を指す。ゆえに、造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させた培地は、ＨＳＣの赤血球系前駆体への分化、並びにＨＳＣ及び赤血球系前駆体の増殖を可能にする培地である。この用語は、本明細書において赤血球系前駆体が赤血球となるとともに特に細胞の脱核に関与するプロセスを規定する「成熟」と混同しないようにすべきである。ゆえに、造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させた培地は、好ましくはこの成熟を誘発する任意の化合物を含まない。
【０１９７】
細胞培地のベースは、インスリン、トランスフェリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヘパリン、ＩＬ−３、ＥＰＯ、増殖因子、並びに／又は血清、血漿、血小板ライセート、及び／若しくは血清プールを添加した、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）又はＨＳＣの栄養要求に適応させた同等の培地（例えばＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジーズ）又はＳｔｅｍＭＡＣＳ  ＨＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  ＸＦ、ヒト（インビトロジェン））を含むことができる。培地に添加する化合物は、好ましくは組換え又は精製技術によって得られたヒト化合物である。これらの種々の化合物の濃度は、供給者の推奨又は技術常識に基づいて当業者によって容易に決定される。
【０１９８】
本明細書で使用するとき、「血清プール」という用語は、ウイルス減弱性のヒトＡＢ血漿の混合物（１００を超える異なる血漿の混合物であることが多い）を指す。これを行うために、輸血センターからのＡＢ血漿を混合し、ウイルス減弱し、そして分取りする。そして、血清プールは新しいものが使用されるか、又は凍結することができる。
【０１９９】
本明細書で使用するとき、「血小板ライセート」という用語は、血小板濃縮物の溶解から得られる増殖因子が豊富である生成物を指す。これを行うために、輸血センターからの血小板濃縮物を混合後、溶解することができる。当業者に周知の種々の溶解方法が存在し、特に超音波溶解、溶媒及び／若しくは界面活性剤の使用、又は冷凍融解が存在する。血小板濃縮物は好ましくは冷凍融解によって溶解される。冷凍融解は、血小板を破壊させて、それらが含む増殖因子を血漿内に放出する、通常は２つのサイクルの凍結／回答サイクルからなる。任意的に、溶解の後、遠心分離及び／又は濾過を行うことができる。そして、血小板ライセートは新しいものが使用されるか、又は凍結することができる。
【０２００】
好ましくは、本発明における培地のベースは、
−  約２００μｇ／ｍＬ〜約４００μｇ／ｍＬ、好ましくは約３００μｇ／ｍＬ〜約３５０μｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約３３０μｇ／ｍＬの濃度のトランスフェリン、好ましくはヒトトランスフェリン、並びに／又は、
−  約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約１０μｇ／ｍＬの濃度のインスリン、好ましくはヒトインスリン、並びに／又は、
−  約１％〜約１０％、好ましくは約３％〜約７％の濃度、より好ましくは約５％の濃度の血清、血漿、若しくは血清プール、好ましくはヒトのもの、及び／若しくは約０．０５％〜約０．５％、好ましくは約０．１％〜約０．５％の濃度、より好ましくは約０．３％の濃度の血小板ライセート、好ましくはヒト由来のもの、並びに／又は、
−  約０．５Ｕ／ｍＬ〜約１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１Ｕ／ｍＬ〜約５Ｕ／ｍＬの濃度、より好ましくは約３Ｕ／ｍＬの濃度のヘパリン、好ましくはヒトヘパリン、を添加した上述のようなＩＭＤＭ又は同等の培地である。
【０２０１】
任意的に、特に造血株細胞の増殖及び／又は分化に適応させた培地では、培地はまた、
−  約１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約３ｎｇ／ｍＬ〜約７ｎｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−３、好ましくはヒトＩＬ−３、
−  約１０ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦ、好ましくはヒトのもの、及び／又は
−  約０．５ＩＵ／ｍＬ〜約１０ＩＵ／ｍＬ、好ましくは約１ＩＵ／ｍＬ〜約５ＩＵ／ｍＬの濃度、より好ましくは約２ＩＵ／ｍＬの濃度のＥＰＯ、好ましくはヒトのもの、を添加することができる。
【０２０２】
特定の実施形態において、本発明における培地のベースは、好ましくは上述のようなＩＭＤＭ又は同等の培地であり、トランスフェリン、インスリン、ヘパリン、及び、血清、血漿、血清プール、又は血小板ライセート、好ましくはトランスフェリン、インスリン、ヘパリン、及び、血清プール、又は血小板ライセート、より特に好ましくは、トランスフェリン、インスリン、ヘパリン、及び血小板ライセートを含む。これらの化合物は、好ましくは上述のような濃度で使用される。
【０２０３】
好ましい実施形態において、この培地は、好ましくは上述のような濃度の、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びＥＰＯをさらに含む。
【０２０４】
あるいは、この培地は、好ましくは上述のような濃度の、ＳＣＦ及びＥＰＯを含むことができる。
【０２０５】
特定の実施形態において、本発明における培地のベースは、
−  ３００μｇ／ｍＬ〜３５０μｇ／ｍＬの濃度のトランスフェリン、好ましくはヒトトランスフェリン、
−  ５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの濃度のインスリン、好ましくはヒトインスリン、
−  ３％〜７％の濃度の血清、血漿、若しくは血清プール、好ましくはヒトのもの、及び／又は０．１％〜０．５％の濃度の血小板ライセート、好ましくはヒト由来のもの、並びに、
−  １Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度のヘパリン、好ましくはヒトヘパリン、
並びに任意的に、
−  ３ｎｇ／ｍＬ〜７ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−３、好ましくはヒトＩＬ−３、
−  ５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦ、好ましくはヒトのもの、及び／又は
−  １ＩＵ／ｍＬ〜５ＩＵ／ｍＬの濃度のＥＰＯ、好ましくはヒトのもの、を含む。
【０２０６】
本発明における培地は、このベースに加えて、（ｉ）オートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ−２８、（ｉｉ）グルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、及び任意的に（ｉｉｉ）ＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含む。
【０２０７】
特定の実施形態において、本発明における培地は、このベースに加えて、
−  ０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．００２ｍＭ〜１ｍＭ、より好ましくは０．００５ｍＭ〜０．５ｍＭ、特に好ましくは０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭの濃度のグルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、及び、
−  ０．１μＭ〜１００μＭ、好ましくは０．５μＭ〜５０μＭ、より好ましくは１μＭ〜３０μＭ、特に好ましくは２μＭ〜３０μＭの濃度のオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ−２８、及び、
−  任意的に、１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは１０μＭ〜５００μＭ、より好ましくは５０μＭ〜４００μＭ、特に好ましくは７５μＭ〜３５０μＭの濃度のＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含む。
【０２０８】
特定の実施形態において、本発明における培地は、０．００５ｍＭ〜０．５ｍＭのグルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、０．５μＭ〜５０μＭのオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ−２８、及び任意的に５０μＭ〜４００μＭのＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含む。
【０２０９】
他の実施形態において、本発明における培地は、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭのグルココルチコイドホルモン、好ましくはデキサメタゾン、２μＭ〜３０μＭのオートファジーインデューサー、好ましくはＳＭＥＲ−２８、及び任意的に７５μＭ〜３５０μＭのＨＩＦ経路アクチベーター、好ましくはＤＭＯＧを含む。
【０２１０】
好ましくは、本発明における培地は、非ヒト由来の血清（例えばウシ胎仔血清）、トロンボポエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ−６、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＦＬＴ−リガンド、及び／又はヒドロコルチゾンを含まない。
【０２１１】
また、本発明は、特に上述の本発明のプロセスにおける、より具体的にはＨＳＣの赤血球系前駆体への分化を促進、及び／又は赤血球系前駆体を増幅するように、赤血球系前駆体を作製及び／若しくは増幅する、並びに／又は赤血球を作製するための本発明における上述のような細胞培地の使用に関する。
【０２１２】
他の態様において、本発明はキットにさらに関し、該キットは、
−  本発明における細胞培地、及び／又は
−  本発明における遺伝子組換えＨＳＣ若しくは本発明における遺伝子組換えＨＳＣを得るための遺伝子構築物、及び
−  任意的に、そうしたキットを使用するための指示を含む指導書を含む。
【０２１３】
また、本発明は、特に上述の本発明のプロセスにおいて、赤血球系前駆体及び／又は赤血球を作製するための本発明におけるキットの使用に関する。
【０２１４】
刊行物の記事若しくは要約、公開特許出願、登録特許、又は他の任意の引用例を含む、本願に記載のすべての引用例は、引用例に記載のあらゆる結果、表、図面、及び文言を含んで、言及することで本明細書に全体的に援用される。
【０２１５】
「含む」、「有する」、「包含する」、及び「からなる」という用語は、異なる意味を有するが、本発明の記載において相互置換可能である。
【０２１６】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の例示的で非限定的な実施例を閲覧することでより明らかになる。
【実施例】
【０２１７】
［実施例１：臍帯血及び細胞吸着由来ＨＳＣからの赤血球系前駆体の増幅］
〔材料と方法〕
＜使用培地＞
トランスフェリン（３３０μｇ／ｍＬ）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、５％ＡＢ血清プール（ＥＦＳ）、及びヘパリン（３Ｕ／ｍＬ）を添加したＩＭＤＭ（バイオクロム）を使用した。０日目から７日目まで、培地にＩＬ−３（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＥＰＯ（２ＩＵ／ｍＬ）を添加した。７日目から赤芽球前駆体の増幅終了まで、培地にＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＥＰＯ（２ＩＵ／ｍＬ）を添加した。
【０２１８】
＜ＨＳＣ＞
ミルテニーより提供されるプロトコルに従ってＣＤ３４＋ビーズを使用して磁気分離後に、ＨＳＣを取得した（ミルテニーバイオテックのCD34 MicroBeadKit, human参照）。
【０２１９】
＜細胞メンテナンス＞
０日目に、細胞を１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播種し、４日目に、細胞を新しい培地に１／５希釈し、７日目に、細胞を洗浄して、新しい培地に１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養した。１１日目に、細胞を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、新しい培地に播種した。１４日目に、細胞を新しい培地に３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで再播種した。１８日目に、細胞を０．５百万／ｍＬに希釈した。２１日目以降、細胞を各メンテナンス日（すなわち週２回）において計画的に百万／ｍＬに戻した。
【０２２０】
＜培養プロトコル＞
プロトコル１：０日目から１１日目まで、細胞を基本培地にて培養する。１１日目に、使用する培地に２５３．９μＭのＤＭＯＧを添加する。１４日目に、３３３μＭのＤＭＯＧ、０．０２ｍＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）、及び３０μＭのＳＭＥＲ２８を使用する培地に添加する。１８日目に使用する培地に、０．０９ｍＭのＤＥＸ及び２０．１μＭのＳＭＥＲ２８を添加する。２１日目に、０．１０ｍＭのＤＥＸ及び２４．５μＭのＳＭＥＲ２８を、使用する培地に添加し、０．１０ｍＭのＤＥＸ及び１７．４μＭのＳＭＥＲ２８を２５日目のものに添加した。最後に、２８日目から、培地に０．１０ｍＭのＤＥＸ及び１３．８μＭのＳＭＥＲ２８を計画的に添加した。
【０２２１】
プロトコル２：０日目から培養終了まで、培地に０．１ｍＭのＤＥＸ及び２．２７μＭのＳＭＥＲ２８を添加する。
【０２２２】
プロトコル３：０日目から培養終了まで、培地に０．１ｍＭのＤＥＸを添加する。
【０２２３】
プロトコル４：このプロトコルはコントロールプロトコルであり、任意の因子を添加せずに基本培地で行われた。
【０２２４】
＜フローサイトメトリー＞
１００，０００細胞のサンプルを採取、洗浄して、供給者の指示に従ってＣＤ２３５ａ及びＣＤ１１７抗体に暴露させる。室温及び暗所において３０分後、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。そして、細胞をサイトメトリー解析に対して準備状態になる。
【０２２５】
ＣＤ２３５ａ抗体は、成熟赤血球関与を示すグリコホリンＡを特異的に認識する。
【０２２６】
ＣＤ１１７抗体は、細胞の未熟性、系統、及び自己複製能力を示す受容体ｃ-キット（すなわち幹細胞因子受容体）を特異的に認識する。
【０２２７】
＜細胞カウント＞
細胞をトリパンブルー溶液において１／１０に希釈し、必要なら細胞死亡率を評価できるようにする。
【０２２８】
〔結果〕
【表１】
2020525031.tif 000003
表１は、種々のプロトコルによる培養後の細胞カウントを示す。
プロトコル１及び２では、赤芽球が対数増幅された。また、プロトコル１及び２で得られた増幅は、デキサメタゾン単独で得られたものより実質的に大きい（表１参照）。また、プロトコル１及び２が細胞吸着又は臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞から赤血球系前駆体を増幅させるということは注目すべきである。
【０２２９】
Ｃ-キットマーカーは、この条件で、コントロール条件よりも長く持続する（図１参照）。この膜マーカーは細胞の若さ及び増殖能力を示す。
【０２３０】
この作業は、本発明の培地におけるヒト造血幹細胞の培養により、
−  全赤血球関与の細胞、
−  赤血球系前駆体の対数的濃縮及び増幅、を得ることができるということを示した。
【０２３１】
特に、増幅を最大７８日持続させることができる。
【０２３２】
［実施例２：ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１を誘導的に過剰発現し、ＢＣＬ−ＸＬを構成的に過剰発現する、又は、ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１、及びＬＭＯ２を誘導的に過剰発現する、細胞吸着由来の改変ＨＳＣからの赤血球系前駆体の増幅］
〔材料と方法〕
＜使用培地＞
トランスフェリン（３３０μｇ／ｍＬ）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、５％ＡＢ血清プール（ＥＦＳ）、及びヘパリン（３Ｕ／ｍＬ）を添加したＩＭＤＭ（バイオクロム）を使用した。０日目から７日目まで、培地にＩＬ−３（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＥＰＯ（２ＩＵ／ｍＬ）を添加した。７日目から赤芽球前駆体の増幅終了まで、培地にＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＥＰＯ（２ＩＵ／ｍＬ）を添加した。
【０２３３】
＜ＨＳＣ＞
ミルテニーＣＤ３４＋ビーズを使用して磁気分離後に、ＨＳＣを細胞吸着から取得した。
【０２３４】
＜細胞メンテナンス＞
０日目に、ＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１レンチウイルス上清及びＢＣＬ−ＸＬレトロウイルス上清、又はＨＴＥＲＴ、ＢＭＩ１レンチウイルス上清及ＬＭＯ２レンチウイルス上清で２つの連続感染のため、細胞を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播種し、３日目に、細胞を３回洗浄し、１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で再播種し、４日目に、細胞を新しい培地において１／５に希釈した。  ７日目に、細胞を洗浄し、新しい培地において１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養した。１１日目に、細胞を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、新しい培地に播種した。１４日目に、細胞を新しい培地に３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで再播種した。１８日目に、細胞を０．５百万／ｍＬに希釈した。２１日目以降、細胞を各メンテナンス日（すなわち週２回）において計画的に百万／ｍＬに戻した。
【０２３５】
＜培養プロトコル＞
プロトコル１：０日目から１１日目まで、細胞を基本培地にて培養する。１１日目に、使用する培地に２５３．９μＭのＤＭＯＧを添加する。１４日目に、３３３μＭのＤＭＯＧ、０．０２ｍＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）、及び３０μＭのＳＭＥＲ２８を使用する培地に添加する。１８日目に使用する培地に、０．０９ｍＭのＤＥＸ及び２０．１μＭのＳＭＥＲ２８を添加する。２１日目に、０．１０ｍＭのＤＥＸ及び２４．５μＭのＳＭＥＲ２８を、使用する培地に添加し、０．１０ｍＭのＤＥＸ及び１７．４μＭのＳＭＥＲ２８を２５日目に添加した。最後に、２８日目から、培地に０．１０ｍＭのＤＥＸ及び１３．８μＭのＳＭＥＲ２８を計画的に添加した。
【０２３６】
プロトコル２：０日目から培養終了まで、培地に０．１ｍＭのＤＥＸ及び２．２７μＭのＳＭＥＲ２８を添加する。
【０２３７】
プロトコル３：０日目から培養終了まで、培地に０．１ｍＭのＤＥＸを添加する。
【０２３８】
プロトコル４：このプロトコルはコントロールプロトコルであり、任意の因子を添加せずに基本培地で行われた。
【０２３９】
〔結果〕
【表２】
2020525031.tif 000004
表２は、種々のプロトコルによる培養後６５日目の細胞カウントを示す。
プロトコル１及び２では、両方の改変ＨＳＣモデルで赤芽球が対数増幅される（表２参照）。また、プロトコル１及び２で得られた増幅は、デキサメタゾン単独で得られたものより実質的に大きい。
【０２４０】
Ｃ-キットマーカーは、この条件で、コントロールよりも長く持続する。この膜マーカーは細胞の若さ及び増殖能力を示す（図２及び図３参照）。プロトコル２では、両方のタイプの改変ＨＳＣで増幅が優れている。
【０２４１】
これらの増幅は、改変細胞が（臍帯血のＣＤ３４＋と比較して）その小さい増幅率で知られる細胞吸着由来のＣＤ３４＋細胞であることから、格別なものである。
【０２４２】
これらの改変細胞プロトコルにより、細胞吸着由来のＣＤ３４＋細胞は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞より大きい増幅能力を得る。
【図１】
2020525031.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2020525031.tif 000009
2020525031.tif 000010
2020525031.tif 000011
2020525031.tif 000012
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