(57)【要約】  インビトロおよびインビボの両方で、体細胞を誘導血管性細胞に直接リプログラミングするための組成物および方法を本明細書に開示する。このような組成物および方法は、血管新生促進療法の発展を含む様々な目的に有用である。
2020511116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする２つ以上の核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記２つ以上の核酸配列が発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクター。
【請求項３】
前記核酸配列のそれぞれが、単一発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項２に記載の非ウイルスベクター。
【請求項４】
前記非ウイルスベクターが、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２ａ、ｐＡｄ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、およびｐＣＤＮＡ３．０の群から選択されるプラスミドを含む、請求項２または３に記載の非ウイルスベクター。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、細胞内送達に適切なリポソーム、微小粒子、またはナノ粒子内に封入される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２もしくは５のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターと、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤とを含む、組成物。
【請求項７】
体細胞を血管性細胞にリプログラミングする方法であって、
（ａ）前記体細胞内に、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質、またはＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１タンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内送達すること、あるいは、
（ｂ）ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質、またはＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１タンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有または発現する細胞から産生された細胞外小胞に前記体細胞を曝露すること、を含む、方法。
【請求項８】
前記タンパク質またはポリヌクレオチドが経時的に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＦＬＩ１タンパク質、またはＦＬＩ１タンパク質をコードする核酸が最初に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＬＩ１タンパク質、またはＦＬＩ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単独で投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＬＩ１タンパク質およびＥＴＶ２、またはＦＬＩ１タンパク質およびＥＴＶ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＬＩ１タンパク質およびＦＯＸＣ２タンパク質、またはＦＬＩ１タンパク質およびＦＯＸＣ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２もしくは５のいずれか一項に記載の非ウイルスベクター、または請求項６に記載の組成物を、前記体細胞内に細胞内送達することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記体細胞が皮膚細胞である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞内送達が三次元ナノチャネルエレクトロポレーションを含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞内送達が組織ナノトランスフェクション装置による送達を含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞内送達が深部局所組織ナノエレクトロインジェクション装置による送達を含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
体細胞を血管性細胞にリプログラミングする方法であって、前記体細胞内にｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を細胞内送達することを含む、方法。
【請求項１９】
前記ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤が、細胞内送達に適切なリポソーム、微小粒子、またはナノ粒子内に封入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞内送達がエレクトロポレーションによるトランスフェクションを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞内送達が三次元ナノチャネルエレクトロポレーションを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内送達が組織ナノトランスフェクション装置による送達を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内送達が深部局所組織ナノエレクトロインジェクション装置による送達を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記体細胞が皮膚細胞である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記体細胞が筋細胞である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年１２月２２日出願の米国特許仮出願第６２／４３８，２６０号、および２０１７年７月８日出願の米国特許仮出願第６２／５３０，１３２号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府支援による研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＥＢ０１７５３９、ＧＭ０７７１８５、ＧＭ１０８０１４、ＮＲ０１５６７６、ＮＳ０９９８６９、およびＴＲ００１０７０、ならびに全米科学財団により授与された認可番号ＥＥＣ−０９１４７９０の下で政府支援を受けてなされたものである。連邦政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生促進細胞療法は、いくつかの虚血性障害の治療のための有望な戦略を提供する。しかし、血管新生促進細胞療法に関する現状の手法は、限られた細胞源／細胞ドナーを含む翻訳上の大きな障害、およびエクスビボでの煩雑かつ危険な細胞前処理工程（例えば、誘導された多能性、増殖、分化）の必要性に直面している。したがって、インビボでの直接的な細胞リプログラミングを介した血管誘導のための組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
インビトロおよびインビボの両方で、体細胞を血管性細胞および／または内皮細胞にリプログラミングするための組成物および方法を本明細書に開示する。一実施形態は、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを開示する。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１タンパク質は、ヒトタンパク質などの哺乳類タンパク質である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１タンパク質は、ほぼ同率で発現される。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１タンパク質は、約１：１：１、２：１：１、１：２：１、１：１：２、２：１：１、２：２：１、２：１：２、１：２：２、３：１：１、１：３：１、１：１：３、３：２：１、１：２：３、１：３：２、２：１：３、２：３：１、３：１：２、２：３：２、３：２：２、２：２：３、３：３：１、３：１：３、１：３：３、３：３：２、３：２：３、または２：３：３の比率（ＥＴＶ２：ＦＯＸＣ２：ＦＬＩ１）で発現される。
【０００７】
また、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする、１つ、２つ、またはそれ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドと、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤とを含む組成物が開示される。
【０００８】
また、本開示のポリヌクレオチドを含有する非ウイルスベクターが開示される。特定の実施形態において、ベクターは、組換え細菌プラスミドである。例えば、いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターはｐＣＤＮＡ３骨格を有する。いくつかの実施形態において、ベクターは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【０００９】
また、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを体細胞内に細胞内送達することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。
【００１０】
別の実施形態は、血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法を開示し、その体細胞内に、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ、２つ、またはそれ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチド、ならびにｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を細胞内送達することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、体細胞内にＦＬＩ１単独をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内送達することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、体細胞内にｍｉＲ−２００ｂ阻害剤単独をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内送達することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、体細胞内にＦＬＩ１およびＥＴＶ２をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内送達することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、体細胞内にＦＬＩ１およびＦＯＸＣ２をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内送達することを含む。
【００１１】
また、皮膚細胞または筋細胞など、しかしそれらに限定されない体細胞を、血管性細胞および／または内皮細胞にリプログラミングする方法も開示し、体細胞内にｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を細胞内送達することを含む。例えば、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤は、核酸配列ＵＡＡＵＡＣＵＧＣＣＵＧＧＵＡＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１）を含む抗ｍｉＲ−２００ｂアンタゴミルであり、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（カタログ番号ＩＨ−３００５８２−０８−０００５）から購入できる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、標的細胞にＥＦＦをトランスフェクトした後、細胞は、トランスフェクトした遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をＥＶ内に充填することができ、それによって他の体細胞で血管内皮を誘導することができる。同様に、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトされた細胞は、ＥＶにおいてその阻害剤部分をエキソサイトーシスする傾向があり、続いて他の体細胞／遠隔の体細胞で血管内皮を誘導するために使用され得る。したがって、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含有または発現する細胞から産生された細胞外小胞と共に体細胞を曝露することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。また、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を含有する細胞から産生された細胞外小胞と共に体細胞を曝露することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。
【００１３】
これらの実施形態において、遺伝子銃、こうした送達に適した微小粒子もしくはナノ粒子、エレクトロポレーションによるトランスフェクション、三次元ナノチャネルエレクトロポレーション、組織ナノトランスフェクション装置、こうした送達に適したリポソーム、または深部局所組織ナノエレクトロインジェクション装置によって、ポリヌクレオチドおよび組成物は、体細胞、またはドナー細胞に、細胞内送達することができる。これらの実施形態の一部において、ポリヌクレオチドは、細菌プラスミドなどの非ウイルスベクター内に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを使うことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター内に組み込むことができる。しかし、他の実施形態において、ポリヌクレオチドはウイルス性に送達されない。
【００１４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−１Ｉ】ＥＦＦ  ＴＮＴが虚血条件下で血管新生の増加および皮膚組織の救済をもたらすことを示す。図１Ａは、組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）によるＥＦＦでのマウス背部皮膚の処理を示す概略図である。図１Ｂは、内皮マーカーＰｅｃａｍ−１およびｖＷＦの発現の増加により明示されるように、血管新生を示す蛍光顕微鏡写真である。図１Ｃは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した背部皮膚におけるＰｅｃａｍ−１（対照に対しておよそ４５０％）およびｖＷＦ（対照、すなわち、未処置の皮膚に対しておよそ２００％）の遺伝子発現解析を示す。図１Ｄは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した領域への灌流の増強を経時的に示す高解像度レーザースペックル画像を示す。図１Ｅは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚（破線）および対照皮膚（実線）の灌流比率を示すグラフである。ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚は、対照皮膚に対する灌流の増強を経時的に示す。図１Ｆは、拍動性挙動を有する表層血管（破線円）の存在を確認するＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚の超音波画像であり、親循環系との吻合が成功したことを示す。図１Ｇは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚と比較して、対照組織の皮弁壊死の増加を示す、単茎皮弁実験の結果を示す。図１Ｈは、皮弁したＥＦＦ  ＴＮＴ皮膚への血流の増加を示す高解像度レーザースペックル画像を示す。図１Ｉは、皮弁壊死の定量化を示すグラフである。ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚は、対照皮膚に対する壊死の低下を示した。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図２Ａ−２Ｉ】ＥＦＦ遺伝子カクテルが、誘導内皮細胞（ｉＥＣ）により早くより効率的な線維芽細胞リプログラミングを促進することを示す。図２Ａは、３Ｄナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）によりＥＦＦをトランスフェクトしているＨＤＡＦ細胞を示す概略図である。図２Ｂは、トランスフェクション７日後の内皮マーカーＰｅｃａｍ−１の強力な発現、ならびに線維芽細胞マーカーＦＳＰの発現低下を示す蛍光顕微鏡写真である。図２Ｃは、２つの異なるトランスフェクション条件：Ｅｔｖ２単独対ＥＦＦの共トランスフェクションに関する内皮マーカーの遺伝子発現分析の結果を示す。この分析は、遺伝子発現において顕著な差を示し、Ｅｔｖ２単独と比較して、ＥＦＦは、トランスフェクション７日後に著しくより強力な内皮遺伝子発現をもたらした。図２Ｄおよび２Ｅは、内皮細胞に相当するマトリゲル中で培養した場合、ＥＦＦをトランスフェクトした細胞が血管様構造を形成することができたことを示す管形成アッセイの結果を示す（ＨＭＥＣ、陽性対照）。他方では、対照ＨＤＡＦ細胞は、マトリゲルで培養した場合、管状構造を形成することができなかった。管長さは、対照細胞では約１００μｍ、ＥＦＦをトランスフェクトした細胞では約４５０μｍ、およびＨＭＥＣ細胞では約３７５μｍであった。図２Ｆは、ＮＥＰによりＥＦＦをトランスフェクトされる（０日目）およびマウスの側腹部に注射される（１日目）ＭＥＦ細胞を示す概略図である。図２Ｇは、非ウイルス性にＥＦＦをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞が、トランスフェクション７日後という早い時期に内皮マーカー発現を表すことを示す蛍光顕微鏡写真である。図２Ｈは、非ウイルス性にＥＦＦをトランスフェクトしたｔｄＴｏｍａｔｏ−ＭＥＦ細胞を示す。トランスフェクションは、ＮＳＧマウスにおける側腹部注射後の血管形成を促進する。図２Ｉは、Ｐｅｃａｍ−１の発現増強を示す蛍光顕微鏡写真である。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図３Ａ−３Ｆ】ＥＦＦ  ＴＮＴが四肢全体を壊死性虚血から救済することを示す。図３Ａは、マウス大腿動脈の結紮および切断（０日目）と、それに続くＥＦＦ  ＴＮＴ（３日目）を示す概略図である。図３Ｂは、わずか数秒続く大腿皮膚の１回限りの処理が、大腿動脈の切断後、肢再灌流の増加をもたらしたことを示すレーザースペックル画像である。図３Ｃは、ＥＦＦ処理後の肢再灌流の増加（実線）対対照（点線）を示すグラフである。灌流は、虚血性対正常／対側肢の比に基づいて計算した。図３Ｄは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した肢と比較してより顕著な組織壊死の徴候を示す対照肢の画像である（１４日目）。図３ＥはＮＭＲスペクトルである。筋肉エネルギーのＮＭＲベースの測定によって、対照と比較して、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した肢についてのＡＴＰおよびＰＣｒレベルの増加を確認した。図３Ｆは、血管新生の増強を示す腓腹筋の免疫蛍光分析である（１４日目）。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図４Ａ−４Ｂ】ＥＦＦ−ＴＮＴは、Ｂａｌｂ／ｃ後肢虚血モデルにおいて壊死肢を救済することを示す。図４Ａは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理後の再灌流の成功を示す、肢のレーザースペックル画像を示す。図４Ｂは、ＴＮＴ処理の有無による虚血肢の肉眼的変化を示す。
【図５Ａ−５Ｅ】ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した背部皮膚から単離された細胞外小胞（ＥＶ）が、虚血肢の再灌流および救済の仲介を手助けする。図５Ａは、損傷／ＥＶ媒介性の救済の概略図である。マウス大腿動脈の結紮および切断（０日目）と、それに続くＥＦＦ  ＴＮＴ処理後（１日目）、ＥＶを大腿骨から単離し（２日目）、次に大腿骨に注射した（３日目）。図５Ｂは、ＥＶ含有量のｑＲＴ−ＰＣＲ特徴付けの結果を示す。遺伝子発現を、対照（未処置）マウスにおける発現と比較して測定した。Ｅｔｖ２は対照に対して約１７５倍のレベルで発現された。Ｆｌｉ１は対照に対して約２５倍のレベルで発現された。Ｆｏｘｃ２は対照に対して約５０倍のレベルで発現された。ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）は、対照に対して約２６倍のレベルで発現された。そしてｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）は、対照に対して約６倍のレベルで発現された。図５Ｃは、肢再灌流の増強および救済を示すレーザースペックル画像を示す。図５Ｄは、ＥＦＦ  ＥＶ注射後の灌流の増加（破線）対対照（点線）を示すグラフである。灌流は、虚血性対正常／対側肢の比に基づいて計算した。図５Ｄは、ＥＶ処置した肢について血管新生の増加を示す腓腹筋の免疫蛍光分析を示す。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図６Ａ−６Ｂ】皮膚のｉＥＣがＣｏｌ１Ａ１を発現する真皮由来のものであることを示す。図６Ａは、Ｃｏｌ１Ａ１−ＧＦＰマウスモデルからのＥＦＦ  ＴＮＴ処置した皮膚切片の蛍光顕微鏡写真を示し、Ｃｏｌ１Ａ１由来の皮膚細胞もまたＰｅｃａｍ−１内皮マーカーを発現することを示す。図６Ｂは、ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＧＦＰトレーサーとＰｅｃａｍ−１の両方に免疫反応性であった細胞要素をＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲでさらに分析した。結果は、このようなダブルポジティブな要素が著しく高い内皮マーカーの遺伝子発現を有したことを示す。Ｐｅｃａｍ−１は対照に対して約５倍のレベルで発現された。ＶＥＧＦＲ２は、対照に対して約１２倍のレベルで発現された。そしてＣｏｌ１Ａ１は対照に対して約１倍のレベルで発現された。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）、＃０．０５＜ｐ＜０．０７（片側ｔ検定）。Ｋ１４−ＣｒｅレポーターおよびＣｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデルを用いた実験によって、リプログラミングした細胞集団は大部分が真皮由来であることを確認した。誘導されたニューロンモデルとは異なり、内皮マーカーを発現するＫ１４由来の細胞の明確な証拠はなかった。ＧＦＰ＋／ＣＤ３１＋細胞要素のＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ測定によって、内皮マーカーの発現増加を確認した。
【図７】皮膚線維芽細胞におけるｍｉＲ−２００ｂの阻害は、ｉＥＣへの直接変換を誘導する。（Ａ）ヒト成体皮膚線維芽細胞（ＨＡＤＦ）におけるＦＩＴＣタグ化ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤のナノエレクトロポレーション送達の概略図および誘導された敷石状内皮細胞（ｉＥＣ）形成を示す代表的画像。陽性対照としてヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を使用した。（Ｂ）対照またはｍｉＲ２００ｂ阻害剤をトランスフェクトしたｉＥＣにおけるＣＤ９０およびＣＤ３１発現のフローサイトメトリー分析。各プロット内の数字（黄色い箱）は、ＣＤ３１＋ＣＤ９０＋移行細胞の割合を示す。（Ｃ）ＣＤ３１＋ＣＤ９０＋（左）またはＶＥＧＦＲ２＋線維芽細胞＋（右）についての二重陽性細胞の定量化をプロットした（ｎ＝３）。値は平均±ｓ．ｄ．で表す。＊は、１日目に対してｐ＜０．００１。（Ｄ）ｃＤＮＡマイクロアレイによる対照またはｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトしたｉＥＣの遺伝子発現プロファイル分析（ｎ＝３）。７日目の対照阻害剤処理したＨＡＤＦと比較した、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤トランスフェクトされたｉＥＣにおける差次的に発現された遺伝子を示す「ヒートマップ」画像によって表されるデータ。赤色は遺伝子が平均よりも高いレベルで発現されることを示し、緑色は遺伝子がより低いレベルで発現されることを示す。（Ｅ）抗ｍｉＲ２００ｂをトランスフェクトしたｉＥＣにおける、Ｃｏｌ１Ａ１およびＦｓｐ−１（線維芽細胞マーカー）、Ｃｄ３１およびＶｅｇｆｒ２（内皮マーカー）、Ｔｉｅ２（動脈マーカー）、Ｃｏｕｐ−ＴＦＩＩ（静脈マーカー）、ならびにＰｒｏｘ１（リンパマーカー）の発現レベルの定量化（ｎ＝３）。遺伝子発現を対応する１８ｓ値に対して正規化し、対照試料の値に対する変化倍数として示す（０日目として）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。対照に対して、＊＊はｐ＜０．０１、＃はｐ＜０．０５。（Ｆ）アセチル化ＬＤＬ（ＡｃＬＤＬ）取り込みの代表的な画像（上）およびｉＥＣによる平均ＡｃＬＤＬ摂取の定量化（下）（ｎ＝３）。スケールバー、５０μｍ。（Ｇ）インビトロマトリゲルプラグアッセイ（ｎ＝３）におけるｉＥＣによる毛細管様構造（上）および管長の定量化（下）を示す代表的な画像。スケールバー、２００μｍ。ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を陽性対照として使用した。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊は対照ｉｎｈに対してｐ＜０．００１。
【図８】ｍｉＲ−２００ｂ阻害によってＦｌｉ−１の発現を脱サイレンシングし、血管新生スイッチを活性化するＥｔｖ２発現を促進する。（Ａ）対照またはｍｉＲ−２００ｂ模倣物をトランスフェクトしたｉＥＣにおいて、野生型Ｆｌｉ−１  ３’ＵＴＲプラスミドまたは変異型Ｆｌｉ−１  ３’ＵＴＲプラスミドのいずれかをトランスフェクトすることよって、ｍｉＲ標的レポータールシフェラーゼアッセイを調べた。結果をレニラルシフェラーゼ活性で正規化した（ｎ＝６）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊は野生型対照模倣体に対してｐ＜０．００１、＊＊は変異型対照模倣体に対してｐ＜０．０１。（Ｂ）ｍｉＲ−２００ｂ模倣物または阻害剤（ｉｎｈ）を送達したｉＥＣのＦＬＩ−１タンパク質レベルのウエスタンブロット分析（左）および定量化（右）。βアクチンは負荷対照として機能する（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊は対照対照ｉｎｈに対してｐ＜０．００１、＊はそれぞれの対照に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）ｍｉＲ−２００ｂ  ｉｎｈもしくはＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡまたは両方でトランスフェクトしたＨＡＤＦ細胞におけるＦＬＩ−１タンパク質レベルを示すウエスタンブロット分析（上）および定量化（下）。βアクチンは負荷対照として機能する（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．として表された。＊ｐ＜０．００１（それぞれの対照に対して、またはｍｉＲ−２００ｂ  ｉｎｈに対して）。（Ｄ）管状の毛細管構造を示すマトリゲルプラグアッセイの代表的な画像（左）、および対照またはＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡの非存在下または存在下で、ｍｉＲ−２００ｂ  ｉｎｈトランスフェクトしたｉＥＣの７日目（右）の管長を定量化した（ｎ＝３）。スケールバー、１００μｍ。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊はそれぞれの対照に対してｐ＜０．００１。（Ｅ）Ｆｌｉ−１サイレンシングまたは過剰発現ＨＡＤＦ細胞におけるＥｔｖ２プロモーターへのＦＬＩ−１結合を示すＣｈＩＰアッセイ。ＩｇＧを陰性対照として用いた（ｎ＝３）。（Ｆ）ｍｉＲ２００ｂ模倣物または阻害剤を共トランスフェクトしたＦｌｉ１サイレンシングしたまたは過剰発現ＨＡＤＦ細胞におけるＧＬＵＣ／ＳＥＡＰ比を計算することによって、Ｅｔｖ２プロモータールシフェラーゼ活性を測定した（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＃はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。（Ｇ）ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤もしくはＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡまたは両方でトランスフェクトしたＨＡＤＦ細胞におけるＥｔｖ２遺伝子発現の定量化（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．として表した。＃はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。
【図９】ｍｉＲ２００ｂの創傷誘導抑制による皮膚線維芽細胞のｉＥＣへのインビボリプログラミング。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮膚に対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡを送達後の、ｍｉＲ−２００ｂ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（左）およびＦＬＩ−１タンパク質発現のウエスタンブロット分析（中央）および定量化（右）ｍＲＮＡ正規化およびβアクチンのために使用される１８ｓは、タンパク質のための負荷対照として機能する（ｎ＝３）。結果は平均±ｓ．ｄ．である。＊＊は対照ＬＮＡに対してｐ＜０．０１。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの創傷縁皮膚組織における創傷後日数のＦＬＩ−１発現（上部）および定量化（下部）を示すウエスタンブロット。βアクチンは負荷対照として機能する（ｎ＝３）。結果は平均±ｓ．ｄ．である。＊＊は皮膚に対してｐ＜０．０１。（Ｃ）ｔｄ−ｔｏｍａｔｏ発現（赤色内因性蛍光）線維芽細胞を示す、Ｆｓｐ１−Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏマウス系統追跡の創傷縁組織の代表的な免疫蛍光画像は、抗ＣＤ３１−ＦＩＴＣ抗体で染色したとき緑色蛍光と一致した。創傷縁皮膚線維芽細胞におけるｔｄ−ｔｏｍａｔｏとＣＤ３１の共局在は、ピアソンの相関係数を計算することによって定量化された（ｎ＝３）。スケールバー、５０μｍ。＊ｐ＜０．００１（Ｄ）ＬＣＭのＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、５日目のＦｓｐ−１（左）およびＣｄ３１（右）の遺伝子発現を示した、無傷皮膚および創傷縁皮膚組織からｔｄＴｏｍａｔｏ＋線維芽細胞を捕捉した（ｎ＝４）。結果は平均±ｓ．ｄ．である。ｎ．ｓ．＝非有意、＊は皮膚に対してｐ＜０．００１。（Ｅ）抗ＣＤ３１−ＦＩＴＣ抗体で染色した場合、ｔｄ−ｔｏｍａｔｏ発現線維芽細胞を示す、Ｆｓｐ１−Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏのバックグラウンドにおけるＳＴＺ誘導された糖尿病マウスの創傷縁組織の代表的な免疫蛍光画像は、緑色蛍光とあまり関係がない。糖尿病性皮膚線維芽細胞におけるｔｄ−ｔｏｍａｔｏとＣＤ３１の共局在は、ピアソンの相関係数を計算することによって定量化された（ｎ＝３）。スケールバー、５０μｍ。＊ｐ＜０．００１
【図１０】ｍｉＲ−２００ｂの阻害が、Ｆｌｉ−１の発現を脱サイレンシングすることによって糖尿病性創傷治癒を改善する。（Ａ）Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ調節した線維芽細胞特異的Ｆｌｉ−１  ｓｈＲＮＡ発現を示す概略図。（Ｂ）創傷縁線維芽細胞におけるＦｌｉ−１の標的ノックダウンのための試験計画の概略図（Ｃ）ＦＳＰ−Ｃｒｅマウスの代表的な免疫蛍光画像。対照ＬＮＡまたは抗ｍｉｒ−２００ｂ−ＬＮＡを、ＬｏｘＰ隣接した対照スクランブルまたはＦｌｉ１  ｓｈＲＮＡ−ＥＧＦＰカセットのレンチウイルス（ＬＶ）注射と共に創傷縁に送達した。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ制御ＲＮＡ干渉により、創傷縁線維芽細胞は緑色蛍光を発現した（左）。（Ｄ）皮膚線維芽細胞（緑色）もＣＤ３１（赤色）内皮マーカー（右側）を発現した共焦点画像の共局在分析を示すグラフ（ｎ＝６）。スケールバー、５０μｍ。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊＊は、対照ＬＮＡ＋対照ｓｈＲＮＡ  ＬＶに対してｐ＜０．０１、＊は、抗ｍｉＲ−２００ｂ  ＬＮＡ＋対照ｓｈＲＮＡ  ＬＶに対してｐ＜０．００１。
【図１１】ｍｉＲ−２００ｂの阻害が、Ｆｌｉ−１の発現を脱サイレンシングすることによって糖尿病性創傷治癒を改善する。（Ａ）非糖尿病性および糖尿病性ヒト対象の創傷縁組織におけるｍｉＲ−２００ｂおよびＦｌｉ−１遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝３）データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊は非糖尿病性対象に対してｐ＜０．００１。（Ｂ）非糖尿病および糖尿病の対象の創傷縁組織におけるより低い（上）およびより高い（下）倍率図で表されるＦＬＩ−１タンパク質の免疫組織化学。スケールバー、２００μｍ。（Ｃ）対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡで処置した糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスの創傷後縁組織のｍｉＲ−２００ｂ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝３）。データ平均±ｓ．ｄ．を表す。対照ＬＮＡに対して、＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１。（Ｄ）ｄｂ／ｄｂマウスの同じ創傷縁組織のＦＬＩ−１タンパク質発現のウエスタンブロット分析（上）および定量化（下）。βアクチンは負荷対照として機能する（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊＊は対照ＬＮＡに対してｐ＜０．０１。（Ｅ）ｄｂ／ｄｂマウスの対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡを送達した創傷縁組織におけるＣＤ３１（赤色）およびＦＳＰ１（緑色）（左側パネル）、ならびにその共局在化分析（右側）を示す代表的な免疫蛍光画像。スケールバー、２００μｍ。＊＊は対照ＬＮＡに対してｐ＜０．０１。（Ｆ）対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡ処理したｄｂ／ｄｂマウスの創傷床における血液灌流を示す代表的な画像（ｎ＝４）。（Ｇ、Ｈ）上記マウスの１０日目の創傷血管構造（ｇ）および創傷閉鎖（ｈ）を示す代表的な画像。（Ｉ）上述のマウスにおける創傷面積の割合を計算することによって創傷閉鎖を測定した。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。対照ＬＮＡに対して、＊はｐ＜０．００１、＃はｐ＜０．０５。（Ｊ）ｄｂ／ｄｂマウスの対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡ送達した創傷縁組織におけるＣＤ３１（赤色）およびＣＤ１０５（緑色）レベルの存在量を示す代表的な免疫蛍光画像。スケールバー、５００μｍ。
【図１２】抗ｍｉＲ２００ｂによって皮膚線維芽細胞を内皮細胞に直接リプログラミング（Ａ）ヒト皮膚におけるｍｉＲ−２００ｂ発現レベルおよび創傷縁皮膚組織（ｎ＝３）値は平均±ｓ．ｄ．を表す。＃は皮膚に対してｐ＜０．０５。（Ｂ）創傷後の表示された日数に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚線維芽細胞が豊富な創傷縁組織のレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）においてＲＴ−ｑＰＣＲによりｍｉＲ−２００ｂ発現差異を分析した。（ｎ＝３）。値は平均±ｓ．ｄ．を表す。皮膚に対して、＃はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。（Ｃ）対照またはｍｉＲ−２００ｂ阻害剤のナノエレクトロトランスフェクション後１、４、７、１０および２８日目にＨＡＤＦ細胞をフローサイトメトリー分析にかけた。ＶＥＧＦＲ２＋線維芽細胞＋発現を有する二重陽性細胞集団のフローサイトメトリーゲーティング（上）および分析（下）の代表的な画像。各プロットに埋め込まれた数（黄色い箱）は、ＶＥＧＦＲ２＋線維芽細胞＋細胞の割合を示す（ｎ＝３）。（Ｄ）７日目の対照またはｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトしたＨＡＤＦ中のＦＳＰ−１（緑色）およびＣＤ３１（赤色）の免疫蛍光細胞染色。ＤＡＰＩを核の対比染色に使用した（ｎ＝３）。スケールバー、１００μｍ。（Ｅ）対照または抗ｍｉＲ２００ｂのマイクロアレイデータの階層的クラスタリングは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ（登録商標））によって生成されたＨＡＤＦをトランスフェクトし、血管新生、血管形成、および血管増殖に関与するいくつかの遺伝子の上方制御（赤）および下方制御（緑）を示した。（Ｆ）ｍｉＲ−２００ｂ誘導内皮細胞は、Ｃｏｌ１Ａ１、Ｆｓｐ−１（線維芽細胞）の発現がより少なく、Ｃｃｌ２（内皮）マーカーの高発現（ｎ＝３）を示した。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＃は対照ｉｎｈに対してｐ＜０．０５。（Ｇ）抗ｍｉＲ２００ｂトランスフェクション後のＨＡＤＦ細胞の多能性因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＮａｎｏｇ）の遺伝子発現分析。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。対照（０日目として）に対して、＃はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、ｎｓ＝非有意。
【図１３】Ｆｌｉ−１のインシリコ分析およびその下流での標的調節（Ａ）ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲＤＢ、ｍｉＲａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ  ａｎｄ  Ｄｉａｎａ−ｍｉｃｒｏＴ  データベースによって予測される、ヒトおよびマウスｍｉＲ−２００ｂそれぞれについての、ヒトおよびマウスＦｌｉ−１の３’ＵＴＲにおける推定結合部位を示すインシリコ試験（Ｂ）対照またはｍｉＲ−２００ｂ模倣物もしくは阻害剤を送達したＨＡＤＦ細胞におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子発現を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊＊はそれぞれの対照に対してｐ＜０．０１。（Ｃ）Ｆｌｉ−１の可能な結合部位を明らかにするＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒデータベースによるＥｔｖ２プロモーター分析。−１３５７／−６４２断片にわたるヒトＥｔｖ２プロモーター領域ＧＸＰ＿２０５４０５２は、６つのＦｌｉ−１（ＥＴＳファミリー転写因子）結合部位を含み、−１８３／−４０にわたる領域ＧＸＰ＿６０３８３３０は、Ｅｔｖ２トランス活性化を担うＦｌｉ−１についての２つの推定結合部位を含む。マウスでは、−５６０／−１５１にわたるＧＸＰ＿３６２３３７９のＥｔｖ２プロモーター領域は、Ｅｔｖ２のトランス活性化を担うＦｌｉ−１についての５つの結合部位を含む。（Ｄ）結合配列と共に、ヒトおよびマウスのＥｔｖ２プロモーター領域上の開始位置および終了位置を有する個々のＦｌｉ−１（ＥＴＳ）結合部位の詳細な説明を示す表。（Ｅ）Ｅｔｖ２サイレンシングした細胞およびＦｌｉ−１過剰発現細胞における初期血管新生マーカー（Ｔｉｅ２、Ｔａｌ１、Ｃｄ３１、およびＶｅｇｆｒ２）の遺伝子発現分析。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。対照細胞に対して、＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１。
【図１４】抗ｍｉＲ２００ｂ−ＬＮＡ送達後の創傷血管新生の増加（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚に対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ２００ｂ−ＬＮＡをトランスフェクションした後の表示された日数に、レーザースペックルで測定された皮膚血液灌流の代表的な画像（ｎ＝３）スケールバー、１０ｍｍ。（Ｂ）ＬＣＭによるＦＳＰｃｒｅ  ｔｄＴｏｍａｔｏ＋線維芽細胞の捕捉前後を示す画像。
【図１５】ｍｉＲ２００ｂ−ＬＮＡ送達後の創傷血管新生の増加は、線維芽細胞特異的なＦｌｉ−１のサイレンシングによって抑制される。（ａ）Ｆｌｉ−１  ｓｈＲＮＡ発現カセットの側面に位置するＬｏｘＰをトランスフェクトされたＨＡＤＦ−Ｃｒｅ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光を示す代表的画像。スケールバー、１００μｍ。（ｂ）４つの異なるＦｌｉ−１  ｓｈＲＮＡベクターが、Ｃｒｅ媒介性ＳＴＯＰカセットの欠失の際に皮膚線維芽細胞において検証された。ｃｒｅリコンビナーゼベクター（ｐＣＳＣｒｅ２、Ｇ．Ｒｙｆｆｅｌからの寄贈、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃３１３０８）および各４つの異なるＦｌｉ−１  ｓｈＲＮＡ発現カセットで共トランスフェクトした細胞におけるＦＬＩ−１タンパク質発現を示すウエスタンブロット。ＣＣ、対照ｓｈＲＮＡ構築物およびＶＣ、レンチウイルスＦｌｉ−１  ｓｈＲＮＡ構築物（ｃ）線維芽細胞特異的Ｆｌｉ−１ノックダウンもまた、Ｆｌｉ−１の免疫染色によって創傷縁組織で確認された。創傷後５日目の皮膚創傷縁組織のＦｌｉ−１陽性染色の代表的な画像。（ｄ）対照またはＦｌｉ−１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子の非存在下または存在下で、対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡで処理したマウスにおける創傷後９日目の創傷部位での血液灌流の代表的な画像。スケールバー、５ｍｍ。（ｅ）上記マウスにおいて創傷灌流を測定した（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。それぞれの対照に対して、＃はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。（ｆ）対照またはＦｌｉ−１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子の非存在下または存在下で、対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂＬＮＡで処理したマウスにおける創傷後９日目の創傷閉鎖の代表的な画像。スケールバー、５ｍｍ。（ｇ）創傷面積の割合を計算することにより、上述のマウスにおいて創傷閉鎖をモニターした（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊＊はそれぞれの対照に対してｐ＜０．０１。（ｈ）創傷上皮化を示すＫ１４の免疫蛍光染色の代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。
【図１６】抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡの投与が、ｄｂ／ｄｂマウスにおける創傷治癒の悪化を弱める。（ａ）非糖尿病性（ｄｂ／＋）マウスおよび糖尿病性（ｄｂ／ｄｂ）マウスにおける血糖レベル（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊はｄｂ／＋に対してｐ＜０．００１。（ｂ）ｄｂ／＋およびｄｂ／ｄｂマウスの無傷の皮膚および創傷の皮膚におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＃は無傷皮膚に対してｐ＜０．０５。（ｃ）４日目の対照ＬＮＡまたは抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡで処理したｄｂ／ｄｂ創傷におけるＥＴＶ２タンパク質レベルの存在量を示すウエスタンブロット（ｎ＝３）。βアクチンは負荷対照として機能する。（ｄ）創傷灌流を上記のマウスで測定した（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。それぞれの対照ＬＮＡに対して、＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１。（ｅ）対照ＬＮＡ創傷と比較した、ｄｂ／ｄｂマウスの抗ｍｉＲ−２００ｂ  ＬＮＡ送達創傷における痂皮の早期脱落を示す痂皮脱離曲線（１０日目）。緑色の線は抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡ処理した創傷を示し、一方、赤色の線は対照ＬＮＡ処理した創傷を示す。（ｆ、ｇ）ｄｂ／ｄｂマウスの対照ＬＮＡおよび抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡ送達された創傷組織におけるＣＤ３１（赤色）およびＣＤ１０５染色の免疫蛍光画像。スケールバー、それぞれ５００ｍｍ（ｆ）および１０００ｍｍ（ｇ）。
【図１７】ＴＮＴは、リプログラミング因子の送達およびトランスフェクション境界を超えた伝播の増強を仲介する。（ａ）剥離した皮膚組織に対するＴＮＴプロセスの概略図。剥離は皮膚表面から死細胞を取り除くのに必要である。正極は皮内に挿入され、負極はカーゴ溶液と接触させる。次いで、パルス電場（２５０Ｖ、１０ｍｓパルス、１０パルス）を電極両端に印加して露出した細胞膜をナノ穿孔して、カーゴを直接サイトゾルに注入する。ナノポアアレイを示すＴＮＴプラットフォーム表面の走査型電子顕微鏡写真（上）。（ｂ）シミュレーション目的の境界条件を示す概略図。ナノチャネルは最も外側の細胞層と直接接触している。（ｃ）ＴＮＴ（実線）対ＢＥＰ（破線）を受けている異なる細胞（すなわち、パネル「ｂ」からの細胞１、３および５）についての穿孔プロファイルのシミュレーション。このプロットは、ＴＮＴが集中的な穿孔をもたらすが、ＢＥＰは広範な穿孔をもたらすことを示す。（ｄ）トランスフェクションの２４時間後のＴＮＴ対ＢＥＰのＡＢＭ発現結果（ｎ＝５）。ＴＮＴは優れたＡＢＭ発現をもたらした。ＡＢＭプラスミドの皮内注射とそれに続くパルス電場を介してＢＥＰを実施した。ＢＥＰ実験のための対照は、電場を用いずにＡＢＭプラスミドの皮内注射を含んだ。標識ＤＮＡおよびＡＢＭ因子でそれぞれＴＮＴ処理した後のマウス皮膚の（ｅ）代表的なＩＶＩＳ蛍光顕微鏡画像および（ｆ）共焦点顕微鏡画像。ＧＦＰはＡｓｃｌ１プラスミドのレポーター遺伝子である。（ｇ）遺伝子発現が表皮トランスフェクション境界を超えて伝播したことを示す、表皮および真皮における遺伝子発現のレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）およびｑＲＴ−ＰＣＲの結果（ｔ＝２４時間）（ｎ＝５〜６）。（ｈ）表皮から真皮へのＥＶ媒介性トランスフェクション増殖の概念を説明する概略図。（ｉ）ＥＶカーゴのｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＢＭ  ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡの有意な負荷を示した（ｎ＝６〜８）。（ｊ）ＥＶがトランスフェクションおよびリプログラミングを増殖するための生存ビヒクルであるかどうかを確認するための実験計画。（ｋ）ＴＮＴ処理した皮膚から単離されたＥＶ（緑色）を自然に内在化したマウス胚性線維芽細胞（赤色）を示す共焦点顕微鏡写真。（ｌ）ＡＢＭトランスフェクト皮膚から単離されたＡＢＭ含有ＥＶへの２４時間の曝露後７日目にｉＮを示すＭＥＦ培養。ＡＢＭトランスフェクション後の皮膚における（ｍ）Ｔｕｊ１および（ｎ）ニューロフィラメント（ＮＦ）発現の増加を示す、免疫染色の結果（４週目）（ｏ）神経細胞クラスター興奮性の結果としての細胞外ニッチのイオン濃度の変化（挿入部位当たりの標準からの平均標準偏差として定量化された）を示す、統計的に代表的な棒グラフとして示された電気生理学的活性（ｎ＝８、ｐ＜０．０５、フィッシャーの正確確率検定）。この平均は、各ＡＢＭマウスまたは対照マウスについて５〜１０回の試験（１試験あたり１００回の連続した離散測定）で計算した。活性は、ベースラインを超えるイオン濃度の変化として定義された（破線、生理食塩水中で測定された実験的ノイズとして確立された）。各バーは、独立したマウスについて集められた結果を示す。＊ｐ＜０．０１（Ｄｕｎｎ’ｓ）、＃���＜０．０１（ＴｕｋｅｙＴｅｓｔ）、＃＃ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図１８】ＥＦＦ  ＴＮＴは虚血条件下での血管新生の増加と皮膚組織の救済をもたらす。（ａ〜ｃ）わずか数秒続く背部皮膚の一回限りの処置は、皮膚組織の血管新生の増加（Ｐｅｃａｍ−１、ｖＷＦ）をもたらした（７日目）（ｎ＝３）。（ｄ、ｅ）高解像度レーザースペックル画像は、経時的にＥＦＦ処理領域への灌流の増強を示した（ｎ＝５）。（ｆ）ＥＦＦ処理された皮膚の超音波画像は、脈動挙動を有する表層血管（破線の円）の存在を確認し、これは親循環系による吻合の成功を示唆する。（ｇ）ＥＦＦ処理皮膚と比較して、対照についての皮弁壊死の増加を示す単茎皮弁実験。（ｈ）ＥＦＦ  ＴＮＴで処理した皮弁した組織への血流の増加を示すレーザースペックル画像。（ｉ）皮弁壊死の定量化（ｎ＝６）。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）、＃＃ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図１９】ＥＦＦ  ＴＮＴが壊死性虚血から四肢全体を救済する。（ａ〜ｃ）わずか数秒続く大腿部皮膚の一回限りの処理は、大腿動脈の切断後、肢再灌流の増加をもたらした。虚血性対正常／対側肢の比に基づいて灌流を計算した（ｎ＝５〜７）。（ｄ）ＥＦＦ処置した肢と比較してより顕著な組織壊死の徴候を示す対照肢（１４日目）。（ｅ）筋肉エネルギーのＮＭＲベースの測定値によって、対照と比較して、ＥＦＦ処理した肢についてのＡＴＰおよびＰＣｒレベルの増加を確認した。（ｆ）血管新生の増強を示す腓腹筋の免疫蛍光分析。＃＃ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図２０】ＴＮＴプラットフォームの製造およびナノチャンネルアレイのシミュレーション。（ａ）両面研磨シリコンウエハ。（ｂ〜ｄ）ナノチャネルのパターン形成およびＤＲＩＥ。（ｅ）エッチングしたナノチャネルの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。（ｆ）マイクロリザーバーの裏面エッチング。（ｇ）ＳＥＭ顕微鏡写真および（ｈ、ｉ）それぞれ異なる条件下でのエッチングプロファイルおよびエッチング速度を示すプロット。（ｊ、ｋ）非対称（すなわちＴ字型）ナノチャネルアレイｖｓ対称（すなわち十字型）アレイの電界分布（ｊ１、ｋ１）および放熱プロファイル（ｊ、ｋ２〜３）を示すシミュレーション結果。バルクエレクトロポレーション（ＢＥＰ）は、インビボでの非ウイルス遺伝子送達のための現在の至適基準である。しかし、ＢＥＰにおける遺伝子の取り込みは非常に確率論的なプロセスであり、これは不均一な電場に影響されているだけでなく、それぞれ１〜３の下流および／またはエンドサイトーシスや拡散などのより受動的な過程によっても影響されている。このように、インビボでより活性かつ決定論的な遺伝子送達を容易にする単純なアプローチが明らかに必要とされている。ここでは、クリーンルームベースの技術（すなわち、投影リソグラフィ、接触フォトリソグラフィ、および深部反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ））を実施して（図２０ａ〜ｉ）、より決定論的な方法で、天然に接近可能な（例えば、皮膚）または外科的に接近可能な（例えば、骨格筋）組織表面への活性非ウイルス遺伝子送達のために、シリコンベースのＴＮＴ装置を製造した。ＴＮＴプラットフォームは、遺伝子カーゴを組織に形質導入するために保持することができるマイクロスケールのリザーバーに相互接続された高並列アレイのクラスター化ナノチャネルから構成された。簡潔に説明すると、まず、投影リソグラフィおよびＤＲＩＥを使用して、厚さ約２００μｍの両面研磨シリコンウエハの表面上に約４００〜５００ｎｍのチャネルのアレイを画定した。シミュレーション試験は、このような非対称Ｔ字型アレイが、より少ない不活性ゾーンを示す非対称のナノチャネルクラスターを有する（図２０ｊ１、ｋ１、赤い星）、より対称性の低いナノ細孔分布と比較して、電界分布と放熱に関する本質的な利点のいくつかを提供すると同時に、ピークと谷の温度を２０〜２５％減少させる（図２０ｊ２〜３、ｋ２〜３）ことを示唆する。次いで、これに続いて、接触リソグラフィベースのパターン形成およびナノチャネルを並置するマイクロリザーバーのアレイのＤＲＩＥ媒介性穿孔が続いた。最後に、プラットフォーム表面を窒化ケイ素の薄い絶縁層で不動態化した。
【図２１】インビボナノチャンネルベースのエレクトロポレーション対バルクエレクトロポレーション（ＢＥＰ）のシミュレーション結果。（ａ）実験設定を説明する概略図。（ｂ、ｃ）２５０Ｖ刺激下での模擬電圧分布。（ｄ〜ｆ）単一細胞バルクエレクトロポレーションのための膜電位差のシミュレーション。（ｇ）ナノチャネルから遠く離れた細胞（細胞２および細胞３）と比較した、ナノチャネルと直接接触している細胞（細胞１）の穿孔プロファイル。（ｈ）ＴＮＴ対ＢＥＰにおける穿孔プロファイル。
【図２２】ＥＶ媒介性細胞リプログラミング。（ａ）実験設定を説明する概略図。ＥＶは、ＡＢＭ  ＴＮＴ処置した背部皮膚から採取された。（ｂ）ＥＶからのＡＢＭコピー数を標準的な手順に従って定量し、（トランスフェクション直後に採取した皮膚組織から）ＴＮＴを通して直接送達された遺伝子コピー数と比較した。簡潔に説明すると、絶対的ｑＰＣＲ定量化を使用して、ＣＴ値を標準曲線に関連付けることによって処理済み試料内の標的遺伝子のコピー数を評価した。標準曲線は、各遺伝子／プラスミドの１０倍連続希釈を利用することによって作成した。予想通り、かなりの量のＡＢＭコピーがＥＶ単離体において検出され、それはＴＮＴを介して直接送達されたより低範囲の遺伝子コピー数内に収まった。（ｃ）ＭＥＦ細胞をインビトロで皮膚由来のＥＶに曝露したさらなる実験によって、ＡＢＭを負荷したＥＶに曝露した場合のｉＮの存在によって証明されるように、そのようなコピー数の大きさが陽性リプログラミングの結果につながることをさらに示された。
【図２３】ＴＮＴ処理した背部皮膚から単離された自己ＡＢＭ負荷ＥＶは、ナイーブマウスに皮内注射される場合、神経栄養様特性を示す。（ａ）実験設定を説明する概略図。ＥＶをＡＢＭ  ＴＮＴ処理した背部皮膚から採取し、ナイーブマウスに注射した。（ｂ）１４日後に採取された組織生検は、制御（未処置）マウスと比較したＴｕｊ１発現の増大を示す。ＡｂＭ負荷したＥＶはＴｕｊ１発現の約２６倍の増加をもたらした。比較すると、ＡＢＭ  ＴＮＴは、Ｔｕｊ１発現の約９４倍の増加をもたらし、これは、ＥＶ媒介性の伝播と組み合わせた直接リプログラミング因子注射の正味の効果を反映する。この場合の対照検体は未処置の皮膚生検である。ｎ＝３＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図２４】ＴＮＴ処理した背部皮膚から単離された自己ＡＢＭ処理したＥＶは、ＭＣＡＯ脳卒中マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）モデルにおける神経栄養様特性を示す。（ａ）実験設定を説明する概略図。ＭＣＡＯ脳卒中を最初に誘導した。これに続いて、ＡＢＭまたは対照ＴＮＴ処理、およびＥＶの頭蓋内注射前に背部皮膚からのＥＶ単離が続く。（ｂ、ｃ）ＥＶ注射のわずか７日後に梗塞体積の有意な減少を示すＭＲＩ画像および定量化。（ｄ）脳室下（ＳＶＺ）領域から梗塞領域に向かって突出するＤＣＸ＋細胞／突起を示す、脳卒中誘発の２１日後の免疫蛍光画像（白い矢印）。対照脳内のＤＣＸ＋細胞は、主にＳＶＺ領域の壁の大部分を覆うことが見出された。このような予備的知見は、ニューロン促進因子を負荷したインビボ由来のＥＶに対する潜在的な治療効果を示唆する。ｎ＝４〜５＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図２５】ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイおよびＩＰＡ（登録商標）分析およびクラスタリングアルゴリズムを用いたインビトロｉＮとインビボｉＮ間の遺伝子発現プロファイルの相同性の同定。インビトロで生成されたｉＮまたはＡＢＭトランスフェクトマウスの皮膚から顕微解剖されたレーザー捕捉（インビボｉＮ）を、マウストのランスクリプトームアレイ（ＭＴＡ  １．０）分析の後、クラスタリングアルゴリズムを用いたデータマイニングに供した。インビトロ由来のｉＮ培養物を、ＡＢＭ６の非ウイルス性のエレクトロポレーションに基づく送達によって得た。インビトロのｉＮ対インビボのｉＮ間の発現パターンの相同性を同定するために、２６２２５の注釈付きプローブセットを、ｋ平均教師なし学習アルゴリズムを使用して１６群にクラスター化した。インビトロでｉＮ対インビボｉＮ群間の発現パターン相同性を示した３５０３個のプローブセットのクラスターを、ＩＰＡ（登録商標）分析および階層的クラスタリングに供した。（ａ）ヒートマップは、未リプログラミングの線維芽細胞群と比較して有意に異なる遺伝子（５２８）を表す。（ｂ）遺伝子発現の誘導を示すＩＰＡ（登録商標）分析。（ｂ）についてのさらなる詳細については、以下の表１および２を参照されたい。マイクロアレイ−ＩＰＡ（登録商標）分析は、脳組織発達に関与する遺伝子の誘導を同定し、インビトロおよびインビボ由来の両方のｉＮ（とりわけ）嗅覚反応に関連する遺伝子の大きなクラスターを含んだ。インビボ群についてより頑強な誘導が見られた。
【図２６】皮膚の電気生理学的活性のインサイチュ測定。（ａ）インビボ活性電位検知プロセスを詳述する情報フロー図。２０秒間にわたる５Ｈｚの酸化還元イベント中の、実験配置ＰＰｙ（ＤＢＳ）作用電極、真皮層におよそ１〜２ｍｍの間隔で挿入され、生理食塩水とイオン的に接続されたＡｇ／ＡｇＣｌ対電極ワイヤから、データ収集（急速な酸化還元イベントを生じさせる入力電位および結果として生じる電流を測定すること）、後処理（作用電極近傍の輸送現象に関与するイオン数を計算すること、および導電性ファラデー材料の電荷方程式を当てはめることによって濃度の時間依存性の変化を導き出すこと、実験バイアスを除去するために時間依存性の全応答をその平均で割ることによってデータセットを正規化すること、および標準偏差を計算して局所細胞の興奮性を定量化すること）、および解釈（正規化されたプロットから結果として生じる偏差がバックグラウンドの電気的ノイズを超えているかどうかを判断して、ＰＰｙ（ＤＢＳ）チップの近くの細胞が興奮性細胞であるかどうかを判断すること）まで。（ｂ）イオン移動率に対する濃度依存性を示す、導電性高分子の近接におけるイオン輸送を表す概念図、ならびに興奮性細胞と非興奮性細胞が周囲の媒体をどのように調節するかの違いを示す概念図。（ｃ）作用電極と対電極／参照電極との間での１秒以上の入力電位（Ｖ）のプロット、同じ１秒間に測定された電流（μＡ）応答から計算された合成電荷（μＣ）、還元イベント中の濃度依存性Ｋ２の値を決定するための適切な電荷方程式、代表的なＡＢＭ処理した（興奮性）試料および対照試料の代表的なＫ２対時間プロット。
【図２７】皮膚のｉＮは表皮及び真皮源に由来する。（ａ）Ｋ１４−Ｃｒｅレポーターマウスモデル、および（ｂ）Ｃｏｌ１Ａ１−ＧＦＰマウスモデルからのＡＢＭ処理した皮膚切片の蛍光顕微鏡写真であり、Ｋ１４、またはＣｏｌ１Ａ１由来（緑色／ＧＦＰ）の皮膚細胞がＴｏｊ１ニューロンマーカーも発現することを示す。Ｔｕｊ１に使用された二次抗体はＣＹ５タグ化されており、放出シグナルは赤色に偽着色された。ｔｄＴｏｍａｔｏバックグラウンドチャネルは、マージされた画像から除外された。スケール＝２０μｍ。（ａ．１、ｂ．１）ＧＦＰトレーサーおよびＴｕｊ１の両方に対して免疫反応性である細胞要素をＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲによってさらに分析した。結果は、そのような二重陽性要素が有意に高いニューロンマーカー遺伝子発現および中等度から著しく減少した皮膚細胞マーカー遺伝子発現を有することを示す。ｎ＝３＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。Ｋ１４−Ｃｒｅレポーターマウスモデルによる系統追跡実験は、ケラチン１４陽性（Ｋ１４＋）細胞が最終的にｔｄＴｏｍａｔｏ発現からｅＧＦＰに切り替わるＲＯＳＡ遺伝子座のｃｒｅ媒介性組換えを受け、新たに誘導されたニューロンが部分的にＫ１４＋皮膚細胞に由来することを確認した。活性なＣｏｌ１Ａ１プロモーターを有する細胞がｅＧＦＰを発現する、Ｃｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデルを用いた実験は、Ｔｕｊ１＋への移行期において真皮からのいくつかのコラーゲン／ｅＧＦＰ＋細胞を示した。これらの細胞における持続的なＣｏｌ１Ａ１／ＧＦＰ活性は、線維芽細胞と誘導されたニューロンとの間の漸進的な表現型シフトを明らかに反映する。ＬＣＭを使用して、ＧＦＰ＋およびＴｕｊ１＋の両方であるトランスジェニックマウスモデルの組織切片から細胞要素の遺伝子発現プロファイルを捕捉かつさらに特徴付けし、それにより、Ｋ１４由来のものであるが今やニューロンマーカーを発現する細胞、またはニューロン運命に移行する活性コラーゲンプロモーター（例えば、線維芽細胞）を有する細胞に対応するだろう。本発明者らの結果は、そのような要素が実際にニューロン促進マーカーの発現増加、およびマーカー起源細胞の発現低下（すなわち、Ｋ１４、Ｃｏｌ１Ａ１）を呈することを示した。
【図２８】ＥＦＦ遺伝子カクテルは、より速くかつより効率的な線維芽細胞の内皮運命（ｉＥＣ）へのリプログラミングを促進する。（ａ）ＨＤＡＦ細胞をＥＦＦで非ウイルス的にトランスフェクトした。（ｂ）内皮マーカーＰｅｃａｍ−１の強力な発現、ならびに線維芽細胞マーカーＦＳＰの発現低下を示す蛍光顕微鏡写真（ｔ＝形質導入後７日）。（ｃ）２つの異なる形質導入条件に対する内皮マーカーの遺伝子発現分析（Ｅｔｖ２単独対ＥＦＦの同時トランスフェクション）。結果は、遺伝子発現における著しい違いを示し、ＥＦＦは、形質導入後７日目に、Ｅｔｖ２単独と比較して有意に強力な内皮遺伝子発現をもたらす（ｄ、ｅ）。内皮細胞に相当するマトリゲル中で培養した場合、ＥＦＦ形質導入細胞が血管様構造を形成することができたことを示す管形成アッセイの結果（ＨＭＥＣ、陽性対照）。一方、対照ＨＤＡＦ細胞は、マトリゲル中で培養した場合、管状構造を形成することができなかった。（ｆ）ＥＦＦトランスフェクション後１、３および７日目の内皮および線維芽細胞マーカー発現のフローサイトメトリーに基づく分析。３日目および７日目までに、集団の約６％および１７％が、対照細胞と比較して、それぞれＰｅｃａｍ−１の発現を示した。そのような動態は、背側皮膚上のＥＦＦ  ＴＮＴ後の灌流の増加について見られたタイムラインと一致する（図１９）。しかしながら、ＥＦＦ  ＴＮＴに応答して増加したインビボ灌流は、必ずしも間質組織の血管組織へのリプログラミングによって完全に促進されるわけではない。既存の血管床のリモデリング／発芽も同様に一因となり得る。（ｇ、ｈ）ＥＦＦで非ウイルス的にトランスフェクトされたＭＥＦ細胞もトランスフェクション７日後という早い時期に内皮マーカーの発現を示す。（ｉ、ｊ）ＥＦＦで非ウイルス的にトランスフェクトされたｔｄＴｏｍａｔｏ−ＭＥＦ細胞は、ＮＳＧマウスへの側腹部注射後の血管形成を抑制した。ｎ＝３〜４。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図２９】内因性Ｆｏｘｃ２発現における差異皮膚における相対的Ｆｏｘｃ２発現は、（ａ）複数の位置または（ｂ）異なるマウス（同じ位置）から生検した。ｎ＝３である。近年のインビトロ試験では、レンチウイルスＥｔｖ２ベクターのゲノム統合によって、高レベルの内在性Ｆｏｘｃ２を有する細胞株で直接的な内皮細胞リプログラミングが誘導され得ることが報告されているにも関わらず、遍在性Ｆｏｘｃ２発現はインビボで有意に変化し（図２５）、それによって、一部の例では、低レベルの内因性Ｆｏｘｃ２発現が、Ｅｔｖ２単独の非ウイルス性エピソーム発現による内皮誘導の成功を妨げ得ることが暗示された。このように、それは、Ｅｔｖ２、Ｆｏｘｃ２、およびＦｌｉ１（ＥＦＦ）に基づく転写因子の新規なカクテルを提示かつ試験した。Ｆｌｉ１は既知のイントロンエンハンサーであり、したがってリプログラミングカクテル１７の有効性を増強する能力を有し得る。
【図３０】ＥＦＦ処理した皮膚は細胞増殖増強の兆候を示す。（ａ）ｒｅｐＴＯＰＴＭ  ｍｉｔｏＩＲＥマウスにおけるＩＶＩＳ発光分析は、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理したマウスの背部皮膚上での増殖活性を確認する（赤い点線）。これらのマウスは、細胞増殖１８中に特異的に誘導されるサイクリンＢ２遺伝子由来の人工プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーターを発現する。（ｂ）増殖マーカー（Ｋｉ６７）と内皮マーカー（Ｐｅｃａｍ−１）との共局在を示す背部皮膚の免疫蛍光分析。
【図３１】皮膚のｉＥＣは、Ｃｏｌ１Ａ１を発現する真皮由来のものである。（ａ）おそらく線維芽細胞から内皮表現型に移行するＰｅｃａｍ１内皮マーカーも発現するＣｏｌ１Ａ１由来の皮膚細胞（緑色）を示す、Ｃｏｌ１Ａ１−ＧＦＰマウスモデルからのＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚切片の蛍光顕微鏡写真。（ｂ）ＧＦＰトレーサーおよびＰｅｃａｍ１の両方に対して免疫反応性である細胞要素をＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲによってさらに分析した。結果は、そのような二重陽性要素が有意に高い内皮マーカー遺伝子発現を有することを示す。ｎ＝３＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）、＃０．０５＜ｐ＜０．０７（片側ｔ検定）。Ｋ１４−ＣｒｅレポーターおよびＣｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデルを用いた実験によって、リプログラミングした細胞集団は大部分が真皮由来であることを確認した。誘導されたニューロンモデルとは異なり、内皮マーカーを発現するＫ１４由来の細胞の明確な証拠はなかった。
【図３２】ＥＦＦ処理した肢における大腿動脈の切断ならびに側副の発生率の増加を確認するＨＲＬＳおよび超音波画像診断。（ａ）ＨＲＬＳ画像は、非虚血対応物と比較して、対照マウスおよびＥＦＦ処理したマウス両方の虚血肢に大腿動脈の不存在を確認する。ＥＦＦ処理した肢から得られる拡散ＬＳ信号（白い矢印）は、おそらく肢再灌流を仲介するより小さな口径の側副血管の存在を示唆する。（ｂ）超音波画像はまた、虚血肢における大腿動脈の不存在を確認し、したがって、肢再灌流は、切断された大腿動脈の修復ではなく、新しい／より小さい側副の発達によって調節される可能性があることをさらに示唆する。
【図３３】ＥＦＦトランスフェクションは、Ｂａｌｂ／ｃ後肢虚血モデルにおいて壊死を予防するのに役立つ。（ａ）ＥＦＦトランスフェクション後の再灌流の成功を示す肢のレーザースペックル画像。（ｂ）ＥＦＦ処理の有無による虚血肢の肉眼的変化。
【図３４】Ｆｓｐ１−Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏマウスモデルを用いて行われた後肢虚血実験は、腓腹筋のＰｅｃａｍ−１＋細胞の一部が、陽性ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターシグナル（白色に示す共局在化）も呈したことを示し、それによって可能な線維芽細胞由来を示唆した（例えば、骨格筋線維芽細胞）。
【図３５】ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した背部皮膚から分離されたＥＶは、虚血肢の再灌流を媒介するのに役立つ。（ａ）損傷／ＥＶ媒介性の再灌流の概略図。（ｂ）ＥＶ含有量のｑＲＴＰＣＲによる特徴付け。これらのＥＶは多細胞組織構造から単離され、したがってそのような倍率変化は、おそらく、ＥＦＦ（および追加因子）カーゴをほとんどあるいは全く運んでいないＥＶと比較的大きなＥＦＦを有するＥＶとの平均値を表す。さらなる実験（図２５）は、そのようなＥＶが遠隔ナイーブ細胞をリプログラミングすることができることを確認した。（ｃ、ｄ）レーザースペックル再灌流分析。（ｅ）対照と比較してＥＦＦ  ＥＶ処理した肢の血管新生の増加を示す腓腹筋の免疫蛍光分析（すなわち、ブランク／モック溶液を用いたＴＮＴ処理した背部皮膚由来のＥＶ）。（ｆ）腓腹筋へのＥＶ注射後の血管マーカーの共発現を示す高倍率顕微鏡写真。このような予備的知見は、内皮促進因子を負荷したインビボ由来のＥＶに対する潜在的に治療的（血管新生促進）効果を示唆する。ｎ＝３＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図３６】ＥＦＦをトランスフェクトした皮膚由来のＥＦＦ含有ＥＶは、ナイーブ細胞のリプログラミングを調節することができる。（ａ）ＥＶを異なる時点でＴＮＴ処理した（ＥＦＦ対対照）背部皮膚から単離し、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔにより分析した。（ｂ）ＥＦＦトランスフェクションはＥＶの放出の増加をもたらした（＞２４時間）（ｎ＝３）。（ｃ）ＭＥＦ細胞をＥＦＦ含有ＥＶに曝露することによって、結果的に対照ＥＶに曝露されたＭＥＦ培養物には見られない個別のＰｅｃａｍ−１＋細胞ポケットが形成された。しかしながら、リプログラミング効率は、ＥＦＦプラスミドの直接ナノチャネルに基づく注射と比較して低いように思われる（図２７）。これは、送達メカニズムの違い（例えば、直接電気注射対エンドサイトーシス／融合）、および／またはインビトロおよびインビボの微小環境間の局所濃度の違いを含む、複数の要因による可能性がある。追加実験は、（ｄ）未損傷組織（すなわち、背部皮膚）にＥＦＦ含有ＥＶを注射することによって、Ｐｅｃａｍ−１およびｖＷＦなどの内皮マーカーを発現する細胞成分が顕著に増加することを示した。（ｅ）しかしながら、レーザースペックル分析は、対照ＥＶと比較して３日後の皮膚灌流のわずかな（約２０％、ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡ）増加を示した（赤色破線）（ｎ＝４）。これらの知見によって、ＥＦＦを含んだＥＶによって提供される刺激が、健康組織／未損傷組織１９における血管恒常性の調節を担う、周知の血管新生抑制メカニズムの作用を克服する可能性が低いと思われることが示唆される。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図３７】ＴＮＴベースのオリゴＲＮＡ送達およびリプログラミングプラスミドＤＮＡに基づくリプログラミングの限界の１つは、挿入突然変異誘発の潜在的なリスクである。リプログラミング遺伝子プラスミドのＴＮＴ媒介性送達後にゲノム統合が起こったかどうかを決定するために、ＴＮＴ処理した皮膚から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲを行い、プラスミド骨格および／またはレポーター遺伝子と一致する配列についてスクリーニングした。（ａ）本発明者らの結果は、ゲノムＤＮＡ中にプラスミド骨格またはレポーターの痕跡を全く示さず、したがって、この場合、挿入／組込みは非常に可能性がないことを示唆した。しかしながら、特にプラスミドの配置が変更されている場合（例えば、異なる骨格、線状対円形の配置など）、これは将来起こることを排除するものではない。これを考慮に入れて、ＲＮＡベースのトランスフェクションを介してＴＮＴプラットフォームを使用して皮膚組織をリプログラミングすることができるかどうかを試験するために実験を行った。（ｂ，ｃ）インビトロ２０で体細胞に多能性を誘導することが過去に報告されているｍｉｃｒｏＲＮＡ３０２／３６７クラスター（すなわち、ｍｉＲＮＡ３０２ａ／ｂ／ｃ＋ｍｉＲＮＡ３６７）を用いたＴＮＴ実験によって、そのようなカクテルのＴＮＴベースの送達が、７日目という早い時期に皮膚に多能性マーカーの顕著な誘導することが示された。スクランブルｍｉＲＮＡでＴＮＴ処理した皮膚組織では、誘導多能性は検出されなかった。
【図３８】異なるＴＮＴ対照を比較する。ＡＢＭ／ＥＦＦ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のブランク溶液、およびＰＢＳ＋偽／空のプラスミド（ＰＢＳ＋ＳＨ）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３〜５）の背部皮膚にＴＮＴを行った。未処理の皮膚を比較目的のために使用した。２４時間後の遺伝子発現分析は、いずれの対照群間（ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ＳＨ、または未処理の皮膚）で有意差（ＡＮＯＶＡ、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）を示さない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
インビトロおよびインビボの両方で、血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングするための組成物および方法を本明細書に開示する。
【００１７】
組成物
ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを開示する。
【００１８】
ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１をコードするアミノ酸配列および核酸配列は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｅｔｓ変異体２（Ｅｔｖ２）の遺伝子ＩＤは、１４００８である。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓフォークヘッドボックスＣ２（Ｆｏｘｃ２）の遺伝子ＩＤは、１４２３４である。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓフレンド白血病組込体１（Ｆｌｉ１）の遺伝子ＩＤは、１４２４７である。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）配列が使用され、本明細書に開示されるが、これらのタンパク質のヒト形態を含む他の哺乳動物形態は当該技術分野で既知であり、本開示の方法にて使用可能である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓアミノ酸配列
ＭＤＬＷＮＷＤＥＡＳＬＱＥＶＰＰＧＤＫＬＴＧＬＧＡＥＦＧＦＹＦＰＥＶＡＬＱＥＤＴＰＩＴＰＭＮＶＥＧＣＷＫＧＦＰＥＬＤＷＮＰＡＬＰＨＥＤＶＰＦＱＡＥＰＶＡＨＰＬＰＷＳＲＤＷＴＤＬＧＣＮＴＳＤＰＷＳＣＡＳＱＴＰＧＰＡＰＰＧＴＳＰＳＰＦＶＧＦＥＧＡＴＧＱＮＰＡＴＳＡＧＧＶＰＳＷＳＨＰＰＡＡＷＳＴＴＳＷＤＣＳＶＧＰＳＧＡＴＹＷＤＮＧＬＧＧＥＡＨＥＤＹＫＭＳＷＧＧＳＡＧＳＤＹＴＴＴＷＮＴＧＬＱＤＣＳＩＰＦＥＧＨＱＳＰＡＦＴＴＰＳＫＳＮＫＱＳＤＲＡＴＬＴＲＹＳＫＴＮＨＲＧＰＩＱＬＷＱＦＬＬＥＬＬＨＤＧＡＲＳＳＣＩＲＷＴＧＮＳＲＥＦＱＬＣＤＰＫＥＶＡＲＬＷＧＥＲＫＲＫＰＧＭＮＹＥＫＬＳＲＧＬＲＹＹＹＲＲＤＩＶＬＫＳＧＧＲＫＹＴＹＲＦＧＧＲＶＰＶＬＡＹＱＤＤＭＧＨＬＰＧＡＥＧＱ（配列番号２）、または、配列番号２に対して、少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２をコードする核酸配列は、核酸配列
ＡＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣＣＧＡＴＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＧＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＡＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＣＧＣＴＡＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧＣＴＧＧＡＣＧＧＧＣＡＡＴＡＧＣＣＧＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＧＴＣＴＡＣＧＴＴＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＣＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＧＧＧＡＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡ（配列番号３）、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３からなる核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＦＯＸＣ２は、アミノ酸配列
ＭＱＡＲＹＳＶＳＤＰＮＡＬＧＶＶＰＹＬＳＥＱＮＹＹＲＡＡＧＳＹＧＧＭＡＳＰＭＧＶＹＳＧＨＰＥＱＹＧＡＧＭＧＲＳＹＡＰＹＨＨＱＰＡＡＰＫＤＬＶＫＰＰＹＳＹＩＡＬＩＴＭＡＩＱＮＡＰＥＫＫＩＴＬＮＧＩＹＱＦＩＭＤＲＦＰＦＹＲＥＮＫＱＧＷＱＮＳＩＲＨＮＬＳＬＮＥＣＦＶＫＶＰＲＤＤＫＫＰＧＫＧＳＹＷＴＬＤＰＤＳＹＮＭＦＥＮＧＳＦＬＲＲＲＲＲＦＫＫＫＤＶＰＫＤＫＥＥＲＡＨＬＫＥＰＰＳＴＴＡＫＧＡＰＴＧＴＰＶＡＤＧＰＫＥＡＥＫＫＶＶＶＫＳＥＡＡＳＰＡＬＰＶＩＴＫＶＥＴＬＳＰＥＧＡＬＱＡＳＰＲＳＡＳＳＴＰＡＧＳＰＤＧＳＬＰＥＨＨＡＡＡＰＮＧＬＰＧＦＳＶＥＴＩＭＴＬＲＴＳＰＰＧＧＤＬＳＰＡＡＡＲＡＧＬＶＶＰＰＬＡＬＰＹＡＡＡＰＰＡＡＹＴＱＰＣＡＱＧＬＥＡＡＧＳＡＧＹＱＣＳＭＲＡＭＳＬＹＴＧＡＥＲＰＡＨＶＣＶＰＰＡＬＤＥＡＬＳＤＨＰＳＧＰＧＳＰＬＧＡＬＮＬＡＡＧＱＥＧＡＬＧＡＳＧＨＨＨＱＨＨＧＨＬＨＰＱＡＰＰＰＡＰＱＰＰＰＡＰＱＰＡＴＱＡＴＳＷＹＬＮＨＧＧＤＬＳＨＬＰＧＨＴＦＡＴＱＱＱＴＦＰＮＶＲＥＭＦＮＳＨＲＬＧＬＤＮＳＳＬＧＥＳＱＶＳＮＡＳＣＱＬＰＹＲＡＴＰＳＬＹＲＨＡＡＰＹＳＹＤＣＴＫＹ（配列番号４）、または配列番号４に対して、少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＦＯＸＣ２をコードする核酸配列は、核酸配列
ＧＡＡＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＧＣＧＴＧＧＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＧＣＣＧＡＴＣＣＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＴＣＧＣＴＣＣＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＧＧＴＡＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＣＧＣＣＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＣＧＣＴＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＣＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＧＧＴＡＧＣＴＧＡＣＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＴＣＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＴＡＡＣＧＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＴＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＣＧＧＧＣＴＡＴＧＡＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＡＣＧＴＧＴＧＣＧＴＴＣＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＣＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＴＴＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＣＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＣＣＴＣＧＧＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＧＡＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＣＴＡＣＧＣＣＧＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＣＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＣＴＣＴＴＡＣＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧＣＡＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＣＴＣＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＡＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＧＧＣＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＣＴＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＧＡＧＴＧＣＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＧＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＧＧＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＴＡＡＧＴＡＴＣＧＧＡＴＡＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号５）、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号５からなる核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＦＬＩ１は、アミノ酸配列
ＭＤＧＴＩＫＥＡＬＳＶＶＳＤＤＱＳＬＦＤＳＡＹＧＡＡＡＨＬＰＫＡＤＭＴＡＳＧＳＰＤＹＧＱＰＨＫＩＮＰＬＰＰＱＱＥＷＩＮＱＰＶＲＶＮＶＫＲＥＹＤＨＭＮＧＳＲＥＳＰＶＤＣＳＶＳＫＣＮＫＬＶＧＧＧＥＡＮＰＭＮＹＮＳＹＭＤＥＫＮＧＰＰＰＰＮＭＴＴＮＥＲＲＶＩＶＰＡＤＰＴＬＷＴＱＥＨＶＲＱＷＬＥＷＡＩＫＥＹＧＬＭＥＩＤＴＳＦＦＱＮＭＤＧＫＥＬＣＫＭＮＫＥＤＦＬＲＡＴＳＡＹＮＴＥＶＬＬＳＨＬＳＹＬＲＥＳＳＬＬＡＹＮＴＴＳＨＴＤＱＳＳＲＬＮＶＫＥＤＰＳＹＤＳＶＲＲＧＡＷＮＮＮＭＮＳＧＬＮＫＳＰＬＬＧＧＳＱＴＭＧＫＮＴＥＱＲＰＱＰＤＰＹＱＩＬＧＰＴＳＳＲＬＡＮＰＧＳＧＱＩＱＬＷＱＦＬＬＥＬＬＳＤＳＡＮＡＳＣＩＴＷＥＧＴＮＧＥＦＫＭＴＤＰＤＥＶＡＲＲＷＧＥＲＫＳＫＰＮＭＮＹＤＫＬＳＲＡＬＲＹＹＹＤＫＮＩＭＴＫＶＨＧＫＲＹＡＹＫＦＤＦＨＧＩＡＱＡＬＱＰＨＰＴＥＴＳＭＹＫＹＰＳＤＩＳＹＭＰＳＹＨＡＨＱＱＫＶＮＦＶＰＳＨＰＳＳＭＰＶＴＳＳＳＦＦＧＡＡＳＱＹＷＴＳＰＴＡＧＩＹＰＮＰＳＶＰＲＨＰＮＴＨＶＰＳＨＬＧＳＹＹ（配列番号６）、または配列番号６に対して、少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＦＬＩ１をコードする核酸配列は、核酸配列ＡＡＡＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＣＧＧＴＴＡＡＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＣＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＣＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＴＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＴＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＡＡＴＡＧＣＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＡＣＧＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＡＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＡＧＡＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＧＡＴＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＴＣＣＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＡＧＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴＡＧＡＡＣＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＡＣＧＡＴＣＡＴＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＧＴＣＴＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＧＴＡＡＡＣＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＴＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＡＣＧＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＧＴＧＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＡＣＡＡＣＧＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡＧＴＴＧＣＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＣＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＧＡＣＣＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７）、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７からなる核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【００２５】
ポリペプチドまたは機能性核酸を発現するために、ヌクレオチドコード配列を適切な発現ベクターに挿入できる。したがって、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクターも開示し、２つ以上の核酸配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、核酸配列は、単一の発現制御配列に作動可能に連結されている。他の実施形態において、核酸配列は、２つ以上の別個の発現制御配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターは、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２１、ｐＡｄ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、およびｐＣＤＮＡ３．０の群から選択されるプラスミドを含む。
【００２６】
遺伝子配列ならびに適切な転写制御要素および翻訳制御要素を含有する発現ベクターを構築する方法は、当技術分野において周知である。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されている。
【００２７】
発現ベクターは、一般に、挿入されたコード配列の翻訳および／または転写のための必要な要素である調節配列を含有する。例えば、コード配列は、好ましくは、所望の遺伝子産物の発現の制御を手助けするプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されている。
【００２８】
「制御要素」または「調節配列」は、ベクターエンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、５’および３’非翻訳領域などであり、転写および翻訳を実行するための宿主細胞タンパク質と相互作用する。このような要素は、その強度および特異性において変化し得る。
【００２９】
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【００３０】
「エンハンサー」とは、一般に、転写開始部位から一定ではない距離で機能し、転写単位に対して５’側または３’側であり得るＤＮＡ配列を指す。さらにまた、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ、コード配列自体の内部にも存在することができるこれらは、通常、１０ｂｐ長〜３００ｂｐ長であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。
【００３１】
「内因性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノムにおいて所与の遺伝子と天然に連結されているものである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が、連結したエンハンサー／プロモーターよって誘導されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子に並列して配置されるものである。
【００３２】
バイオテクノロジーにおいて使用されるプロモーターは、遺伝子発現の制御の意図されたタイプとは異なるタイプのものである。それらは、一般に、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは発生段階特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および合成プロモーターに分類され得る。
【００３３】
構成的プロモーターは、実質的にすべての組織で発現を誘導し、完全ではないとしても、環境要因および発生要因とはほぼ関係ない。その発現は、通常、内因性因子によって条件づけされないので、構成的プロモーターは、通常、種にまたがって、さらには界にまたがって活性である。構成的プロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、およびＣＡＧが挙げられる。
【００３４】
組織特異的または発生段階特異的プロモーターは、特異的な組織（複数可）または特定の発達段階において遺伝子の発現を誘導する。植物について、血管系、光合成組織、塊茎、根、および他の栄養器官、または種子および他の生殖器官において遺伝子発現に影響を及ぼすプロモーター要素は、異種系（例えば、遠縁種またはさらには他の界）に見出すことができるが、最も高い特異性は、一般に、相同性プロモーター（すなわち、同一種、属、または科）を用いて得られる。これは、おそらく転写因子の協調的発現がプロモーターの活性の調節に必要だからである。
【００３５】
誘導性プロモーターの性能は、内因性因子だけでなく、人為的に制御することができる環境条件および外部刺激に条件付けられている。この群の中には、光、酸素レベル、熱、冷気、および創傷などの非生物的因子によって調節されるプロモーターがある。これらの要因のいくつかは実験環境外で制御するのが難しいので、目的の生物で天然には見られない化合物に応答するプロモーターが特に目的とするものである。これらの系列に沿って、他の化合物のうち、抗生物質、銅、アルコール、ステロイド、および除草剤に応答するプロモーターは、他の生物的または非生物的要因とは無関係に、意のままに遺伝子活性の誘導を可能にするように適合および精製されている。
【００３６】
真核生物細胞生物学の研究のために最も一般的に使用される２つの誘導性発現系は、Ｔｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎと命名される。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌に見られる１つのタンパク質である、ＴｅｔＲ（テトラサイクリン抑制因子）を、単純ヘルペスウイルスに見られる別のタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインと融合させることによって作製されるテトラサイクリントランス活性化因子（ｔＴＡ）タンパク質を利用する。得られたｔＴＡタンパク質は特定のＴｅｔＯオペレーター配列でＤＮＡに結合することができる。ほとんどのＴｅｔ−Ｏｆｆシステムでは、そのようなＴｅｔＯ配列のうちのいくつかの反復が、ＣＭＶプロモーターなどの最小プロモーターの上流に配置されている。最小プロモーターを有するいくつかのＴｅｔＯ配列の全体は、その遺伝子またはそのプロモーターの下流の遺伝子の発現増加によって、テトラサイクリントランスアクチベータータンパク質ｔＴＡの結合に応答するので、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）と呼ばれる。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムでは、ＴＲＥ制御遺伝子の発現はテトラサイクリンとその誘導体によって抑制され得る。それらはｔＴＡに結合し、それをＴＲＥ配列に結合できないようにし、それによってＴＲＥ制御遺伝子のトランス活性化を妨げる。Ｔｅｔ−Ｏｎシステムも同様に機能するが、その逆の方法で機能する。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムでは、ｔＴＡは、テトラサイクリンまたはその誘導体の１つ（ドキシサイクリンなど）に結合しない場合に限り、オペレーターに結合することができ、Ｔｅｔ−Ｏｎシステムでは、ｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンにより結合した場合に限り、オペレーターに結合することができる。したがって、系へのドキシサイクリンの導入は遺伝子産物の転写を開始する。Ｔｅｔ−Ｏｎシステムは、応答性が速いため、Ｔｅｔ−Ｏｆｆよりも優先されることがある。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、および／またはＦＬＩ１をコードする核酸配列は、同一の発現制御配列に作動可能に連結されている。あるいは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を用いて、多重遺伝子またはポリシストロニックメッセージを生成することができる。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回して内部部位で翻訳を開始することができる。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写し、それぞれＩＲＥＳで分離してポリシストロニックメッセージを生成することができる。ＩＲＥＳ要素のおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子を、単一プロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させて、単一メッセージを転写することができる。
【００３８】
発現制御配列に作動可能に連結されている、本明細書に開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含有する非ウイルスベクターを開示する。このような非ウイルスベクターの例としては、オリゴヌクレオチド単独、または適切なタンパク質、多糖、もしくは脂質製剤と組み合わせたオリゴヌクレオチド、が挙げられる。非ウイルス方法は、単純な大規模生産および低い宿主免疫原性がちょうど２であるという点で、ウイルス方法を上回る特定の利点を提示する。以前は、遺伝子の低レベルのトランスフェクションおよび発現によって、非ウイルス方法を不利にした。しかしながら、ベクター技術における近年の進歩は、ウイルスのトランスフェクション効率と同様のトランスフェクション効率を有する分子および技術を得た。
【００３９】
好適な非ウイルスベクターの例としては、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２ａ、ｐＡｄ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、およびｐＣＤＮＡ３．０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
また、本開示の組成物および方法で使用のためのｍｉＲ−２００ｂ阻害剤（アンタゴニスト）を開示する。ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、標的ｍｉＲＮＡと共に二本鎖を形成し、ｍｉＲＮＡがその標的ｍＲＮＡに結合することを阻止する。これによって、ｍｉＲＮＡの標的となるｍＲＮＡの翻訳の増加をもたらす。
【００４１】
本開示のｍｉＲＮＡアンタゴニストは、選択されたｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの標的配列にハイブリダイズする、十分に相補的なヌクレオチド配列を含む、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖またはヘアピン構造のオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「部分的に二本鎖」という用語は、相補鎖より少ないヌクレオチドを含有する二本鎖構造を指す。一般に、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドは、７５％未満の二本鎖構造、好ましくは５０％未満、より好ましくは２５％、２０％、または１５％未満の二本鎖構造を有するだろう。
【００４２】
ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、１８〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜８０ヌクレオチド長であり得る。成熟ｍｉＲＮＡは、１９〜３０個のヌクレオチド、好ましくは２１〜２５個のヌクレオチド、特に２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドの長さを有することができる。マイクロＲＮＡ前駆体は、典型的には約７０〜１００ヌクレオチドの長さを有し、ヘアピン立体配座を有する。
【００４３】
ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列を考えると、ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの一部に対して十分に相補的なｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ワトソンクリック塩基対の規則に従って設計することができる。本明細書で使用される場合、「十分に相補的」という用語は、生理学的条件下で、２つの配列の間で二本鎖を形成することができるように２つの配列が十分に相補的であることを意味する。ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ標的配列に対して十分に相補的なｍｉＲＮＡアンタゴニスト配列は、ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列と７０％、８０％、９０％、またはそれ以上同一であり得る。一実施形態において、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡもしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ標的配列に対して相補的ではない１、２、または３以下のヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ標的配列に対して１００％相補的である。
【００４４】
有用なｍｉＲＮＡアンタゴニストとしては、内在性ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。本開示のｍｉＲＮＡアンタゴニストは、好ましくは、約１２〜２５ヌクレオチド、好ましくは約１５〜２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡの標的配列にハイブリダイズする十分に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、相補領域におけるヌクレオチドのミスマッチがある。好ましい実施形態では、相補領域は、１、２、３、４、または５以下のミスマッチを有するだろう。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ヒトｍｉＲＮＡに対して「正確に相補的」である。したがって、一実施形態において、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、正確に相補的な領域においてワトソンクリック塩基対のみでハイブリット形成されるようにｍｉＲＮＡにアニールすることができる。したがって、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、一塩基差を特異的に識別する。この場合、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、正確な相補性が一塩基差の領域において見られる場合、ｍｉＲＮＡ活性のみを阻害する。
【００４７】
一実施形態において、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーまたはそれらの修飾である。ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、天然に生じる核酸塩基、糖、および共有結合性のヌクレオシド間（骨格）連結を含有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００４８】
ｍｉＲＮＡアンタゴニストは修飾塩基を含み得る。アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルは、ＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改良された性質を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成および天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、またはツベルシジン）を用いて調製することができる。あるいは、上記塩基のいずれかの置換または修飾類似体を使用することができる。例としては、２−アミノアデニン、６−メチルならびに他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルならびに他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに２−アミノプロピルアデニンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられるが、これらに限らない。
【００４９】
本開示のｍｉＲＮＡアンタゴニストを修飾して、ヌクレアーゼに対する抵抗性を増強することができる。したがって、本開示のｍｉＲＮＡアンタゴニストは、核酸分解的分解に対して安定化させたヌクレオチド修飾を含むオリゴマーであり得るオリゴマーは、トータルマー、ミキサーマー、ギャップマー、テイルマー、ヘッドマーまたはブロックマーであり得る。「トータルマー」は、天然に存在しないヌクレオチドのみを含む一本鎖オリゴヌクレオチドである。「ギャップマー」という用語は、少なくとも５つの天然に生じるヌクレオチド（すなわち、未修飾核酸）に隣接する修飾された核酸セグメントからなるオリゴヌクレオチドを指す。「ブロックマー」という用語は、少なくとも５つの天然に生じるヌクレオチドの核酸セグメントに隣接する中心的な修飾核酸セグメントを指す。「テイルマー」という用語は、５’末端の少なくとも５つの天然に生じるヌクレオチドに続く３’末端の修飾された核酸セグメントを有するオリゴヌクレオチドを指す。「ヘッドマー」という用語は、５’末端の修飾された核酸セグメントに続く３’末端の少なくとも５つの天然に生じるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを指す。「ミキサー」という用語は、天然に生じるヌクレオチドと天然に生じないヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチドを指す。しかしながら、ギャップマー、テイルマー、ヘッドマー、およびブロックマーとは異なり、ＤＮＡ単位のような５個を超える天然に存在するヌクレオチドの連続した配列は存在しない。
【００５０】
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下の１つ以上を含み得る。（ｉ）１つまたは両方の非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の置換。（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの置換、またはリボース糖のリボース以外の構造との大量置換。（ｉｉｉ）ホスフェート部分の「デホスホ」リンカーによる大量置換。（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換。（ｖ）リボース−ホスフェート骨格の置換または修飾。あるいは（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、または蛍光標識部分などの部分のＲＮＡ３’末端または５’末端への結合。
【００５１】
ｍｉＲＮＡアンタゴニストは修飾された糖類を含有することができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾することができ、またはいくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で置き換えることができる。
【００５２】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ、「ロック」核酸（ＬＮＡ）が含まれ、２’ヒドロキシルは、例えば、メチレン架橋またはエチレン架橋によって、同一リボース糖、アミノ、Ｏ−アミン、およびアミノアルコキシの炭素原子の４’炭素に結合している。メトキシエチル基（ＭＯＥ）のみを含有するオリゴヌクレオチドは、頑強なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに相当するヌクレアーゼ安定性を示す。
【００５３】
「デオキシ」修飾には、水素、ハロ、アミノ、シアノ、メルカプト、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが含まれ、これらは任意に置換されていてもよい。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【００５４】
糖基はまた、リボース中の対応する炭素の立体化学配置とは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含み得る。したがって、修飾ＲＮＡは、糖として、例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。
【００５５】
Ｃ−１’に核酸塩基を欠く「脱塩基」糖も含まれる。これらの脱塩基糖はまた、１つ以上の構成糖原子に修飾をさらに含み得る。
【００５６】
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、２’修飾を１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含むものである。
【００５７】
本開示のｍｉＲＮＡアンタゴニストは、修飾されたホスフェート基を含有することができる。リン酸基は負の荷電種である。電荷は、２つの非結合酸素原子に均等に分布される。しかしながら、リン酸基は、酸素の１つを異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果は、核酸分解的分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。
【００５８】
修飾ホスフェート基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが含まれる。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置換された両方の非結合酸素を有する。ホスホロジチオエート中のリン中心はアキラルであり、これはオリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。ジアステレオマー形成は、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対して様々な耐性を示す調製物をもたらし得る。さらに、キラルリン酸基を含有するＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾ＲＮＡ種に対して低くなり得る。
【００５９】
リン酸基は、リンを含まない連結基で置き換えることができる。リン酸基を置換することができる部分の例には、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが含まれる。好ましい置換はメチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【００６０】
リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣足場もまた構築され得る。例には、モフィリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代替は、ＰＮＡ代替である。
【００６１】
本開示のｍｉＲＮＡアンタゴニストはまた、その３’末端および／または５’末端で修飾され得る。末端修飾はいくつかの理由のために加えることができ、その理由には、活性を調節すること、分解に対する抵抗性を調節すること、または細胞によるｍｉＲＮＡアンタゴニストの取り込みを調節することが含まれる。修飾は、末端リン酸全体もしくはリン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端は、標識部分または保護基などの他の機能的な分子実体に結合することができる。機能性分子実体は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖に結合することができる。スペーサーの末端原子は、リン酸基の結合原子、または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’Ｏ、Ｎ、ＳもしくはＣ基と結合するか、またはそれらを置換することができる。あるいは、スペーサーは、ヌクレオチド代用物の末端原子に結合するかまたはそれを置換することができる。末端修飾の他の例には、染料、挿入剤、架橋剤、ポルフィリン、多環式芳香族炭化水素、人工エンドヌクレアーゼ、親油性担体およびペプチド複合体が含まれる。
【００６２】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡアンタゴニストはアンタゴミルである。アンタゴミルは、例えば、ＳｔｏｆｆｅｌらのＵＳ２００７／０２１３２９２に記載されている特定のクラスのｍｉＲＮＡアンタゴニストである。アンタゴミルは、ＲＮａｓｅ保護のための様々な修飾ならびに組織および細胞取り込みの増強などの薬理学的特性を含むＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴミルは、糖、ホスホロチオエート骨格、および３’末端にコレステロール部分の完全な２’−Ｏ−メチル化を有することによって通常のＲＮＡとは異なる。
【００６３】
アンタゴミルは、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端にホスホロチオエート、少なくとも第１、第２、または第３のヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態において、アンタゴミルは、６つのホスホロチオエート骨格修飾を含有し、２つのホスホロチオエートは５’末端に位置し、４つは３’末端に位置する。ホスホロチオエート修飾は、ＲＮａｓｅ活性に対する保護を提供し、それらの親油性は組織取り込みの増強に寄与する。
【００６４】
アンタゴミルおよび他のｍｉＲＮＡ阻害剤の例は、ＷＯ２００９／０２０７７１、ＷＯ２００８／０９１７０３、ＷＯ２００８／０４６９１１、ＷＯ２００８／０７４３２８、ＷＯ２００７／０９００７３、ＷＯ２００７／０２７７７５、ＷＯ２００７／０２７８９４、ＷＯ２００７／０２１８９６、ＷＯ２００６／０９３５２６、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００７／１１２７５３、ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００５／０２３９８６、またはＷＯ２００５／０１３９０１に記載され、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
カスタムデザインされた抗ｍｉＲ（商標）分子はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。したがって、いくつかの実施形態において、アンタゴミルは、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ａｎｔｉ−ｍｉＲ（商標）阻害剤である。これらの分子は、細胞内の天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡ分子を特異的に阻害するように設計された、化学修飾および最適化された一本鎖核酸である。
【００６６】
カスタムデザインされたＤｈａｒｍａｃｏｎ  ｍｅｒｉｄｉａｎ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡヘアピン阻害剤もＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。これらの阻害剤は化学修飾および二次構造モチーフを含む。例えば、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎらは、ＵＳ２００６／０２２３７７７において、これらの分子の効力を増強する二次構造要素の識別を報告する。具体的には、逆相補コアの領域に隣接する高度に構造化された二本鎖の取り込みは、阻害機能を著しく増大させ、ナノモル以下の濃度でｍｕｌｔｉ−ｍｉＲＮＡ阻害を可能にする。アンタゴミルの設計におけるこのような改善は、本開示の方法にて使用するために企図される。
【００６７】
開示された組成物は薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的にまたは他の点で望ましくない物質、すなわち、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれている薬学的組成物の他の成分のいずれとも有害な方法で相互作用することなく、核酸またはベクターと共に対象に投与され得る物質を意味する。当業者にはよく知られているように、担体は、活性成分のあらゆる分解を最小限に抑え、かつ対象におけるあらゆる有害な副作用を最小限に抑えるように自然に選択されるであろう。
【００６８】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれる）中に存在し得る。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とし得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）、およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」および他の抗体結合リポソーム（結腸癌に対する脂質媒介性薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボでのマウスグリオーマ細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化などのビヒクル。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）、およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与している。これらの受容体はクラスリン被覆ピットにクラスター化し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面に再利用されるか、細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解される。内在化経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の排出、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節など様々な機能を担う。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド結合価、およびリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１０：６、３９９−４０９（１９９１））。
【００６９】
適切な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤中に使用して製剤を等張にする。薬学的に許容される担体の例としては、食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出性製剤が挙げられ、このマトリックスは成形物品、例えばフィルム、リポソーム、または微粒子の形態である。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましくあり得ることは当業者には明らかであろう。
【００７０】
薬学的担体は当業者に既知である。これらは最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、および生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体であろう。組成物は筋肉内投与または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与されるだろう。
【００７１】
薬学的組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などのような１つ以上の活性成分を含み得る。
【００７２】
非経口投与用の調製物には、滅菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、乳液、または懸濁液（食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加剤も存在し得る。
【００７３】
局所投与用製剤は、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および散剤を含み得る。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。
【００７４】
経口投与用の組成物には、粉末剤または顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいことがある。
【００７５】
組成物の一部は、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として潜在的に投与され、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成され得る。
【００７６】
薬学的組成物を含む本明細書に開示された組成物は、局所治療が望ましいのか全身治療が望ましいのかに応じて、および治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与することができる。例えば、本開示の組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮投与され得る。組成物は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮的、体外、眼科的、経膣的、直腸内、鼻腔内、局所的などで投与することができ、局所鼻腔内投与または吸入による投与が含まれる。
【００７７】
方法
また、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを体細胞内に細胞内送達することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。いくつかの実施形態において、核酸配列は非ウイルスベクターに存在する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている。他の実施形態において、核酸は、２つ以上の発現制御配列に作動可能に連結されている。
【００７８】
また、体細胞内に、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ、２つ、またはそれ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチド、ならびにｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を細胞内送達することを含む、血管性細胞および／または内皮細胞に体細胞をリプログラミングする方法を開示する。
【００７９】
また、体細胞内にｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を細胞内送達することを含む、血管性細胞および／または内皮細胞に体細胞をリプログラミングする方法を開示する。
【００８０】
様々な方法が当該技術分野で既知であり、ウイルスおよび非ウイルス媒介手法を含む、細胞への核酸の導入に適している。典型的な非ウイルス媒介手法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介導入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介導入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介導入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、標的細胞にＥＦＦをトランスフェクトした後、細胞は、トランスフェクトした遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をＥＶ内に充填することができ、それによって他の体細胞で血管内皮を誘導することができる。同様に、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトされた細胞は、ＥＶのその阻害剤部分を開口分泌するのに役立ち、続いて、他の体細胞／遠隔の体細胞で血管内皮を誘発するために使用される可能性がある。したがって、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含有または発現する細胞から産生された細胞外小胞と共に体細胞を曝露することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。また、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤を含有する細胞から産生された細胞外小胞と共に体細胞を曝露することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。
【００８２】
したがって、ＥＴＶ２、ＦＯＸＣ２、およびＦＬＩ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含む外因性ポリヌクレオチドを発現または含有する細胞から単離された細胞外小胞（ＥＶ）に体細胞を曝露することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法を開示する。また、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトした細胞から単離された細胞外小胞（ＥＶ）に体細胞を曝露することを含む血管性細胞および／または内皮細胞に、体細胞をリプログラミングする方法も開示する。例えば、いくつかの実施形態において、ドナー細胞を、１つ以上の開示されたポリヌクレオチドまたはｍｉＲ−２００ｂ阻害剤でトランスフェクトし、インビトロで培養した。次いで、ドナー細胞によって分泌されたＥＶを培地から採取することができる。次いで、これらのＥＶを体細胞に投与して、それを血管性細胞および／または内皮細胞にリプログラミングした。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、結合組織または上皮組織からの任意の間質細胞／支持細胞とすることができ、皮膚線維芽細胞、筋線維芽細胞、皮膚上皮、腸上皮、および導管上皮を含むことができる（が、これらに限定されない）。
【００８３】
エキソソームおよび微小胞は、サイズおよび表面タンパク質マーカーを含む、それらの生合成過程および生物物理学的性質に基づいて異なるＥＶである。エキソソームは、サイズが４０〜１５０ｎｍの均質な小粒子であり、通常、エンドサイトーシスの再循環経路から生じる。エンドサイトーシスでは、エンドサイトーシス小胞が細胞膜に形成され、融合して初期エンドソームを形成する。これらは成熟し、腔内小胞が小胞内内腔に出芽する後期エンドソームになる。リソソームと融合する代わりに、これらの多小胞体は細胞膜と直接融合し、エキソソームを細胞外空間に放出する。エキソソーム生合成、タンパク質カーゴ選別、および放出は、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ複合体）ならびにＡｌｉｘおよびＴｓｇ１０１などの他の関連タンパク質を含む。対照的に、微小胞は、細胞膜からの膜小胞の外側への出芽および分裂を通して直接産生され、それゆえ、それらの表面マーカーは、起源の膜の組成に大きく依存する。さらに、それらは、直径が１５０〜１０００ｎｍの範囲の、より大きくより不均一な細胞外小胞の集団を構成する傾向がある。しかしながら、両方のタイプの小胞が、機能的ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびタンパク質をレシピエント細胞に送達することが示されている。
【００８４】
いくつかの実施形態において、遺伝子銃、こうした送達に適した微小粒子もしくはナノ粒子、エレクトロポレーションによるトランスフェクション、三次元ナノチャネルエレクトロポレーション、組織ナノトランスフェクション装置、こうした送達に適したリポソーム、または深部局所組織ナノエレクトロインジェクション装置によって、ポリヌクレオチドおよび組成物は、ＥＶの体細胞、またはドナー細胞に、細胞内送達することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを使うことができる。しかし、他の実施形態において、ポリヌクレオチドはウイルス性に送達されない。
【００８５】
エレクトロポレーションは、細胞膜の透過性を増大させるために細胞に電場を印加し、カーゴ（例えば、リプログラミング因子）を細胞に導入することを可能にする技術である。エレクトロポレーションは、外来ＤＮＡを細胞に導入するための一般的な技術である。
【００８６】
組織ナノトランスフェクションは、配列されたナノチャネルを通して非常に強く集束電場を印加することによって、細胞内へのカーゴ（例えば、リプログラミング因子）を直接的なサイトゾル送達を可能にし、それによって、並置された組織細胞メンバーを良性にナノ穿孔し、細胞内にカーゴを電気泳動により打ち込む。
【００８７】
一実施形態において、本開示の組成物は、体重ｋｇ当たり約０．１ｎｇ〜約１００ｇ、体重ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜約５０ｇ、体重ｋｇ当たり約１００ｎｇ〜約１ｇ、体重ｋｇ当たり約１μｇ〜１００ｍｇ、体重ｋｇ当たり１μｇ〜５０ｍｇ、体重ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、および体重ｋｇ当たり１ｍｇ〜約５０ｍｇの非経口的投与と同等の用量で投与される。あるいは、治療上有効量を得るために投与した本開示の組成物の量は、体重ｋｇ当たり約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、またはそれ以上である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物および方法は、足場構造として機能することができる脈管構造を生成するために使用される。この足場構造を使って、例えば、神経組織の修復に役立つことができる。この応用としては、末梢神経損傷、および外傷性脳損傷または脳卒中などの中枢神経系への病理学的／傷害性損傷を含む。いくつかの実施形態において、作製された血管構造を使用して、複合組織移植、またはいかなる組織移植にも栄養分を与えることができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物および方法は、「望ましくない」組織（例えば、脂肪、傷痕組織）を脈管構造に変換するために使用される。このように新しく形成された脈管構造は、非虚血性条件下で「再吸収する」ことが予想される。
【００９０】
定義
「対象」という用語は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。このため、対象は、ヒトまたは獣医学的患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。
【００９１】
「治療的に有効」という用語は、使用される組成物の量が、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善する充分な量のものを指す。このような改善は、必ずしも排除ではなく、減少または変化のみを要求する。
【００９２】
「薬学的に許容可能な」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、および他の問題または合併症を起こさない、ヒトまたは動物の組織との接触に適した、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。
【００９３】
「担体」という用語は、化合物または組成物と組み合わせて、その意図された使用または目的のために、調製、保存、投与、送達、有効性、選択性、または化合物もしくは組成物の他の任意の特性を補助あるいは円滑化する、化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、かつ対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために、担体を選ぶことができる。
【００９４】
「治療」という用語は、疾患、病態、または障害を治療、改善、安定化、または予防する目的で、患者を医学的に管理することを指す。この用語は、積極的治療、すなわち、特に疾患、病態、または障害の改善を対象とする治療を含み、そしてまた原因治療、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の原因の除去を対象とする治療を含む。さらに、この用語は、緩和治療、すなわち、疾患、病態、または障害の治癒よりも、むしろ症状の緩和のために計画された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の発症を最小化または部分的にもしくは完全に阻害することを対象にした治療、ならびに支持療法、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の改善を対象にした別の特定の治療を補うために用いられる治療を含む。
【００９５】
「阻害する」という用語は、活性、応答、病態、疾患、またはその他の生物学的パラメータの低下を指す。これは、以下に限定されないが、活性、応答、病態、または疾患の完全な消失を含むことができる。これはまた、例えば、天然レベルまたは対照レベルと比較して、活性、応答、病態、または疾患の１０％の低下を含むこともできる。このように、低下は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％であるか、またはその間の任意の量の低下であり得る。
【００９６】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で互いに結合されているアミノ酸、例えばペプチドイソスターなど、を指し、遺伝子をコードする２０個のアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシングなどの自然の過程によって、または当該技術分野において公知の化学修飾技術によって修飾することができる。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、ポリペプチド中のいかなる部位においても起こり得る。同じ種類の修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同じ程度あるいは異なる程度で存在し得る。所与のポリペプチドはまた、多種類の修飾を有することもできる。修飾とは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、共有架橋結合もしくは環状化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システインもしくはピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｒｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびトランスファーＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加（例えばアルギニル化）を含むが、これに限定されない。（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）を参照されたい）
【００９７】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略語、文字、符号、または語のリストを指す。本明細書に使用されるアミノ酸の略語は、従来のアミノ酸の１文字コードであり、以下のように表される：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギンもしくはアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミンもしくはグルタミン酸。
【００９８】
本明細書で使用される「核酸」という語句は、ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはＤＮＡーＲＮＡハイブリッド、一本鎖もしくは二本鎖、センスもしくはアンチセンスであるかに関わらず、ワトソンクリック塩基対合による相補的核酸にハイブリダイズすることのできる、天然に存在するもしくは合成されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、および非リン酸ジエステルヌクレオシド間連結（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル（ｔｈｉｏｄｉｅｓｔｅｒ）連結）も含むことができる。特に、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができるが、限定はされない。
【００９９】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間連結を生成するそのリン酸部分と糖部分とを介して一緒に連結され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の一緒に連結されたヌクレオチドを含有する分子を指すのに時々使用される。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、５価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【０１００】
ヌクレオチド類似体は、塩基部分、糖部分および／またはリン酸部分に対してある種の修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は当技術分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニン、ならびに糖部分またはリン酸部分での修飾が挙げられるだろう。
【０１０１】
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドに類似する機能的特性を有するが、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のようにリン酸部分を含有しない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソンクリックの方法またはフーグスティーンの方法で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して連結される分子である。ヌクレオチド置換体は、適当な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型の構造に適合することができる。
【０１０２】
用語「ベクター」または「構築物」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞内に輸送することができる核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞（例えば、転写調節因子に連結された）によって、発現に適した形態で遺伝子構築物を含有する、任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）を含む。プラスミドは一般にベクター形態で使用されるので、「プラスミド」および「ベクター」は同じ意味で用いられる。さらに、本発明は、同等の機能を担う他のベクターを含むことを意図する。
【０１０３】
「作動可能に連結された」という用語は、核酸と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、転写調節因子へのＤＮＡの作動可能な連結は、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、かつ転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的かつ機能的な関連性を指す。
【０１０４】
本明細書の目的のために、所与の核酸配列Ｄと、所与の核酸配列Ｄとの、または所与の核酸配列Ｄに対する、所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃの配列同一性％（あるいは、所与の配列Ｄと、所与の配列Ｄとの、または所与の配列Ｄに対する、配列同一性％を有しかつ含む、所与の配列Ｃと表現することもできる）は、次式で計算される。
分数Ｗ／Ｚの１００倍
式中、Ｗは、配列アライメントプログラムのＣおよびＤのアライメントによる同一性照合としてスコアされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さに等しくなく、Ｄに対するＣの配列同一性％は、Ｃに対するＤの配列同一性％に等しくないことが理解されよう。当技術分野の技能の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、配列同一性％を決定する目的のためのアライメントを得ることができる。
【０１０５】
「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェンシーな条件下で実質的に相補的な核酸（例えば、ｃ−ｍｅｔ核酸）を認識し、これと物理的に相互作用（すなわち塩基対）し、他の核酸とは実質的に塩基対合しないことを意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」という用語は、プローブ配列および標的配列との間に少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９７％の配列同一性がある場合に、ハイブリダイゼーションが、一般に生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５倍のＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍のデンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、およびサケ精子ＤＮＡなどの２０μｇの変性せん断キャリアＤＮＡを含む溶液中での一晩のインキュベーションと、それに続いて約６５℃の０．１倍のＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を洗浄することである。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）の特に第１１章に例示されている。
【０１０７】
本発明の多くの実施形態を説明してきた。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【０１０８】
実施例１；誘導内皮細胞への体細胞のインビトロリプログラミング
図２に関連して、インビトロでの非ウイルストランスフェクションおよびリプログラミング実験は、１週間未満で、ヒトおよびマウス初代線維芽細胞を誘導内皮細胞に効率的にリプログラミングした、遺伝子Ｅｔｖ２、Ｆｏｘｃ２、およびＦｌｉ１（ＥＦＦ）の共トランスフェクションであることを示した。これらの実験において、ＨＤＡＦ細胞は、非ウイルス性にＥＦＦをトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞の蛍光顕微鏡写真は、内皮マーカーＰｅｃａｍ−１の強力な発現、ならびに線維芽細胞のマーカーＦＳＰの発現低下を示した（ｔ＝トランスフェクション７日後）。２つの異なるトランスフェクション条件（Ｅｔｖ２単独対ＥＦＦの共トランスフェクション）についての内皮マーカーの遺伝子発現解析。結果は、遺伝子発現において顕著な差を示し、Ｅｔｖ２単独と比較して、ＥＦＦは、トランスフェクション後７日目に著しくより強力な内皮遺伝子発現をもたらした。管形成アッセイから得られた結果は、内皮細胞に相当するマトリゲル中で培養した場合、ＥＦＦトランスフェクション細胞が血管様構造を形成することができたことを示した（ＨＭＥＣ、陽性対照）。他方では、対照ＨＤＡＦ細胞は、マトリゲルで培養した場合、管状構造を形成することができなかった。非ウイルス性にＥＦＦをトランスフェクトされたＭＥＦ細胞はまた、トランスフェクション７日後という早い時期に内皮マーカー発現を示した。非ウイルス性にＥＦＦをトランスフェクトされたｔｄＴｏｍａｔｏ−ＭＥＦ細胞は、ＮＳＧマウスの側腹部注射後に血管形成を助長した。これらのデータを以下の表１にさらに要約する。
【表１】
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【０１０９】
実施例２；ＥＦＦ  ＴＮＴが虚血条件下で血管新生の増加および皮膚組織の救済をもたらすことを示す。
図１に関連して、内皮細胞リプログラミングを誘導する誘導するＥＦＦの有効性がインビトロで確立されたら、インビボでのリプログラミング方法を試験した。わずか数秒続く、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮膚の１回限りの処理は、対照皮膚に対するＰｅｃａｍ−１およびｖＷＦの発現における有意な増加により明示されるように、７日目までに皮膚組織の血管新生の増加をもたらした。高解像度レーザースペックル画像は、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した領域への灌流（血流）の増強を経時的に示した。皮膚表面から３ｍｍほどの拍動挙動を有する表層血管（破線円）の存在を確認するＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚の超音波画像であり、親循環系との吻合が成功したことを示す。
【０１１０】
単茎皮弁実験は、ＴＮＴ処理した皮膚と比較して、対照組織について皮弁壊死の増加を示した。レーザースペックル画像は、皮弁したＥＦＦ  ＴＮＴ処理した組織への血流の増加を示した。これらの実験は、ＥＦＦ媒介性皮膚リプログラミングが、虚血性組織の機能性再灌流を引き起こし、ＥＦＦ送達が、虚血条件下で組織壊死に対抗したことを示す。
【０１１１】
実施例３；ＥＦＦ  ＴＮＴが壊死性虚血から四肢全体を救済する。
図３に関連して、さらなる実験が、後肢虚血Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて、ＥＦＦ送達が肢全体の救済をもたらしたことを実証した。わずか数秒続く大腿皮膚の１回限りの処理は、大腿動脈の切断後、肢再灌流の増加をもたらした。灌流は、虚血性対正常／対側肢の比に基づいて計算した。対照肢は、１４日目にＥＦＦ  ＴＮＴ処理した肢と比較して、より顕著な組織壊死の徴候を示した。筋肉エネルギーのＮＭＲベースの測定値によって、対照と比較して、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した肢についてのＡＴＰおよびＰＣｒレベルの増加を確認した。腓腹筋の免疫蛍光分析は、１４日目に血管新生の増強を示した。
【０１１２】
実施例４；ＥＦＦ−ＴＮＴは、Ｂａｌｂ／ｃ後肢虚血モデルにおける壊死肢を救済する。
図４を参照して、損傷誘導性肢虚血からより多くの有害な副作用を経験する傾向を有する、Ｂａｌｂ／ｃマウスでの追加の実験によって、ＥＦＦ処理が良好な肢灌流およびそれに続いて壊死および自然切断からの救済をもたらしたことを示した。肢のレーザースペックル画像は、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理後の再灌流の成功を示した。図４のパネル（ｂ）は、ＴＮＴ処理の有無による虚血肢の肉眼的変化を示す。
【０１１３】
実施例５；ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した背部皮膚から単離された細胞外小胞は、虚血肢の再灌流および救済を仲介するのに役立つ。
図５に関連して、ＰＣＲ分析によって、ＥＦＦ  ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡトランスフェクションに加えて、血管新生促進ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦｍＲＮＡを前負荷したように見える、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した背部皮膚を、細胞外小胞（ＥＶ）が単離したことが明らかとなった。このことは、ＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚由来のＥＶが、標的組織全体にＥＦＦリプログラミングシグナルを伝播するための生存機構を表すだけでなく、トランスフェクション後の最初の数時間以内に血管新生促進シグナルを拡散することによって適所の前条件づけの役割を果たし得ることを示唆している。図５のパネル（ａ）は、損傷／ＥＶ媒介性の救済の概略図を示す。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＥＶ含量を特徴付けた。図５のパネル（ｂ）は、ＥＦＦ処理した皮膚のレーザースペックル再灌流分析を示す。ＥＶ処理した肢についての血管新生の増加を示す腓腹筋の免疫蛍光分析。
【０１１４】
実施例６；Ｃｏｌ１Ａ１を発現する真皮に由来する皮膚内の誘導された内皮細胞
図６に関連して、Ｋ１４−ＣｒｅレポーターおよびＣｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデルを用いた実験によって、リプログラミングした細胞集団は大部分が真皮起源であることを確認した。Ｃｏｌ１Ａ１−ＧＦＰマウスモデルからのＥＦＦ  ＴＮＴ処理した皮膚切片の蛍光顕微鏡写真であり、Ｃｏｌ１Ａ１由来の皮膚細胞（緑色）がまたＰｅｃａｍ−１内皮マーカーも発現することを示した。ＧＦＰトレーサーとＰｅｃａｍ−１の両方に免疫反応性であった細胞要素をＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲでさらに分析した。結果は、このようなダブルポジティブな要素が著しく高い内皮マーカーの遺伝子発現を有することを示す。ＧＦＰ＋／ＣＤ３１＋細胞要素のＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲ測定によって、内皮マーカーの発現増加を確認した。
【０１１５】
方法
ＴＮＴプラットフォームの製造
ＴＮＴ装置は、薄く（約２００μｍ）両面研磨した（１００）シリコンウエハから製造された。簡潔に説明すると、まず、厚さ約１．５μｍのＡＺ５２１４Ｅフォトレジスト層をシリコンウエハ上に約３０００ｒｐｍでスピンコートした。続いて、ＧＣＡ６１００Ｃステッパーを使用して、フォトレジスト上にナノスケール開口部をパターン形成した。１００ｍｍウエハ当たり最大１６ダイのナノスケール開口部アレイをパターン形成した。次いで、そのような開口部をエッチングマスクとして使用して、深反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ  １００  システム）によって、シリコン表面上に約１０μｍの深さのナノチャネルを穿孔した。最適化したエッチング条件には、ＳＦ６ガス：１３秒／１００ｓｃｃｍのガス流／７００ＷのＩＣＰ電力／４０ＷのＲＦ電力／３０ｍＴのＡＰＣ圧力、Ｃ４Ｆ８ガス条件：７秒／１００ｓｃｃｍのガス流／７００ＷのＩＣＰ電力／１０ＷのＲＦ電力／３０ｍＴのＡＰＣ圧力が含まれる。次いで、マイクロスケールのリザーバーを、接触フォトリソグラフィおよびＤＲＩＥを介してウエハの裏側にパターン形成した。最後に、ＴＮＴプラットフォーム表面上に、厚さ約５０ｎｍの窒化ケイ素の絶縁層／保護層を配置した。
【０１１６】
畜産
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した、Ｂ６．１２９（Ｃｇ）−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／ＪマウスをＫ１４ｃｒｅと交配させて、Ｋ１４ｃｒｅ／Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊマウスを作製した。ｐＯＢＣｏｌ３．６ＧＦＰｔｐｚマウスは、Ｔｒａｃｉ  Ｗｉｌｇｕｓ博士（Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から寄贈された。ＲＯＳＡｍＴ／ｍＧマウスの遺伝子型判定ＰＣＲは、プライマーｏＩＭＲ７３１８−ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ（配列番号８）、ｏＩＭＲ７３１９−ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ（配列番号９）、およびｏＩＭＲ７３２０−ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ（配列番号１０）を用いて行ったが、Ｋ−１４  Ｃｒｅ導入遺伝子はプライマーｏＩＭＲ１０８４−ＧＣＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＣ（配列番号１１）、ｏＩＭＲ１０８５−ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＴＴ（配列番号１２）。を用いて確認した。オハイオ州立大学のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されたプロトコルに従って、すべての動物試験を実施した。動物にタグを付け、コンピューターベースのアルゴリズムを用いて無作為にグループ分けした。
【０１１７】
哺乳動物細胞培養およびインビトロリプログラミング
初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＰＣＳ−２０１−０１２）を、線維芽細胞増殖キット−無血清（ＡＴＣＣ  ＰＣＳ  ２０１−０４０）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した線維芽細胞基礎培地中で増殖させた。Ｅ１２．５−Ｅ１４マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。非ウイルス細胞トランスフェクションおよびリプログラミング実験は、過去に報告されているように、３Ｄナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）を介して実施した。簡潔に説明すると、細胞を最初に３ＤＮＥＰ装置上で一晩完全にコンフルエントになるまで増殖させた。続いて、パルス電場を用いて、Ｆｌｉ１：Ｅｔｖ２：Ｆｏｘｃ２の１：１：１混合物からなる細胞中にプラスミドのカクテル（０．０５μｇ／μｌ）を送達した。次いで、細胞をプラスミド送達の２４時間後に回収し、ＥＧＭ−２  ＭＶ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔキット（ＣＣ−４１４７、Ｌｏｎｚａ）を補充したＥＢＭ−２基礎培地（ＣＣ−３１５６、Ｌｏｎｚａ）に入れ、実験／測定用にさらに処理した。Ｅｔｖ２およびＦｌｉ１プラスミドは、
【０１１８】
Ａｎｗａｒｕｌ  Ｆｅｒｄｏｕｓ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｘａｓ）の好意により寄付された。Ｆｏｘｃ２プラスミドは、Ｔｓｕｔｏｍｕ  Ｋｕｍｅ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−ＦＣＶＲＩ，Ｃｈｉｃａｇｏ）のご好意により寄付された。
【０１１９】
インビボリプログラミング
ＴＮＴの２４〜４８時間前に、まず処理対象の領域を麻痺させた。次いで、皮膚を剥離して、死細胞層／ケラチン細胞層を除去して、表皮の有核細胞を曝露した。ＴＮＴ装置を剥離した皮膚表面上に直接配置した。ＥＦＦプラスミドカクテルを０．０５〜０．１μｇ／μｌの濃度でリザーバーに入れた。金被覆電極（すなわちカソード）をプラスミド溶液に浸漬し、一方、２４Ｇ針対電極（すなわちアノード）を皮内に挿入し、ＴＮＴプラットフォーム表面に並置した。次いで、パルス電気刺激（すなわち、振幅２５０Ｖの１０パルスおよび１パルス当たり１０ｍｓの持続時間）を電極両端に印加して、露出した細胞膜をナノ穿孔し、ナノチャネルを通して細胞内にプラスミドカーゴを打ち込んだ。
【０１２０】
後肢虚血手術
片側後肢虚血は閉塞とそれに続く大腿動脈の切断によって誘発された。簡潔に説明すると、８〜１０週齢のマウスを１〜３％イソフルランで麻酔し、加熱したパッド上の実体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＯＰＭＩ）下に仰臥位に置いた。大腿動脈を露出させ、約１ｃｍの切開を通して大腿静脈から分離した。近位端および遠位端の閉塞を７−０絹縫合糸で誘導した後、動脈の完全なトランスフェクションを行った。最後に、ブプレノルフィンの単回用量を皮下投与して痛みを制御した。手術の２時間後にレーザースペックル画像（ＭｏｏｒＬＤＩ−Ｍａｒｋ２）を実施して血流閉塞の成功を確認した。
【０１２１】
細胞外小胞（ＥＶ）の単離
ＥＶを、ＯＣＴブロックで採取し、後で使用するために凍結保存された、直径１２ｍｍの皮膚生検から単離した。簡潔に説明すると、ブロックを解凍し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してＯＣＴを除去した。外科用メスを用いて脂肪組織の除去後に、皮膚組織を約１ｍｍ片に刻んで、ＰＢＳ中でマイクログラインダーを用いてホモジナイズした。３０００ｇで遠心分離した後、Ｅｘｏｑｕｉｃｋキット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：５の比（Ｅｘｏｑｕｉｃｋ：上清）で使用して、上清からＥＶを４℃で１２時間単離した。ＥＶを１５００ｇで３０分間の遠心分離により沈殿させた。次いで、製造業者によって提供された推奨に従って、ｍｉｒＶａｎａキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡをペレットから抽出した。
【０１２２】
ＤＮＡプラスミド調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ、カタログ番号１２１６１、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄカタログ番号７４０４１０）を用いて、ＥＦＦプラスミドを調製した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｅｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から得た。プラスミドＤＮＡ構築物およびそれらの供給源のリストについては、表２を参照されたい。
【表２】
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【０１２３】
レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）および定量的リアルタイムＰＣＲ
ＰＡＬＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｎｒｅｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のレーザー顕微解剖システムを使用してＬＣＭを実施した。形態および／または免疫染色に基づいて同定された組織切片の特定領域を切断し、２０倍接眼レンズで捕捉した。試料を２５μｌの細胞直接溶解抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に放出した。約１，０００，０００μｍ２の組織領域を各キャップに捕捉し、次いで溶解物をさらなる処理のために−８０℃で保存した。ＬＣＭ試料のｑＲＴ−ＰＣＲは製造業者の指示に従って細胞直接溶解緩衝液から実施した。プライマーのリストを表３に提供する。
【表３】
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【０１２４】
免疫組織化学および共焦点顕微鏡
特異的抗体および標準的な手順を用いて、組織免疫染色を実施した。簡潔に説明すると、ＯＣＴ包埋組織を１０μｍの厚さで凍結切片化し、冷アセトンで固定し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、そして特異的抗体と共にインキュベートした（表４）。続いて、蛍光標識した適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識α−モルモット、１：２００、Ａｌｅｘａ４８８標識α−ウサギ、１：２００、Ａｌｅｘａ５６８標識α−ウサギ、１：２００）とのインキュベーションによってシグナルを可視化し、ＤＡＰＩで対比染色した。レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００  ｆｉｌｔｅｒ／ｓｐｅｃｔｒａｌ）で画像を捕捉した。
【０１２５】
ＩＶＩＳ画像
【表４】
2020511116.tif 000006
【０１２６】
動物は、ＦＡＭ−ＤＮＡトランスフェクションの２４時間後に麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ光学画像化システムを用いて画像化された。発光画像とのオーバーレイ画像は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して作製した。
【０１２７】
脳卒中脳の磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）
磁気共鳴血管造影法を用いて、マウスにおける本発明者らのＭＣＡＯモデルを検証し、効果的なＭＣＡＯのために閉鎖栓サイズおよび内頸動脈挿入距離を最適化した。９．４ＴのＭＲＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＭＣＡ再灌流の４８時間後に麻酔をかけたマウスに対してＴ２強調ＭＲＩを実施した。ＭＲ画像は、以下のパラメータを用いた緩和強調の高速取得（ＲＡＲＥ）シーケンスを用いて取得した：視野（ＦＯＶ）３０×３０ｍｍ、取得マトリックス２５６×２５６、ＴＲ３，５００ｍｓ、ＴＥ４６．９２ｍｓ、スライスギャップ１．０ｍｍ、希少因子８、平均数３。ｍｍ当たり８．５ピクセルの解像度。未加工のＭＲ画像を標準ＤＩＣＯＭフォーマットに変換し、処理した。Ｏｓｉｒｉｘ  ｖ３．４を用いた画像の適切なソフトウェアコントラスト強調の後、各冠状脳スライスにおける梗塞領域を描写するために、デジタル面積測定がマスクされた観察者によって行われた。過去に報告されているように、脳切片からの梗塞面積を合計し、切片の厚さを乗じ、浮腫誘発性腫脹について補正して、梗塞体積を決定した（ＫｈａｎｎａＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１３、３３（８）：１１９７−１２０６）。
【０１２８】
筋肉エネルギーの分析
筋肉エネルギーは、ＲＦ送信用の体積コイルおよび受信用の３１Ｐコイルを使用して、９．４Ｔｅｓｌａスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃ）でＮＭＲ分光測定を評価した。特注の１Ｈ／３１Ｐトランシーバーコイルアレイでインビボ画像化を実施した。単一パルス系列を用いてデータを得た。生データをノイズ低減のためにウィンドウ処理し、スペクトル領域にフーリエ変換した。
【０１２９】
血管の超音波ベースの画像および特徴付け
血管形成を超音波画像によって並行モニターした。簡潔に説明すると、Ｖｅｖｏ２１００システム（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＭＳ２５０リニアアレイプローブを用いてＢモードで超音波画像を得た。ドップラーカラーフロー画像をモニターに実装し、収縮期と拡張期下で血流特性を定量化した。
【０１３０】
統計分析
試料をコード化し、データ解析を盲検法で実施した。動物実験では、データは少なくとも３匹の動物の平均±ＳＤとして報告されている。インビトロデータは、３〜６回の実験の平均±ＳＤとして報告されている。すべての統計はＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン１３．０で実施した。
【０１３１】
実施例７；単一のｍｉＲＮＡを標的とすることによる皮膚線維芽細胞の機能的内皮細胞への直接的なインビボリプログラミング
結果
ｍｉＲ−２００ｂ単独の阻害は、培養線維芽細胞を、内皮細胞（ｉＥＣ）を誘導するように変換した。
この一連の調査は、慢性創傷患者の創傷縁でｍｉＲ−２００ｂレベルが皮膚内のそれよりも急激に低いという観察に始まった（図１２Ａ）。マウスにおいて、創傷は、創傷閉鎖後に、創傷形成前の値に反発したｍｉＲ−２００ｂの一過性の阻害を誘導した（図１２Ｂ）。ｍｉＲ−２００ｂのそのような創傷誘導性阻害の重要性を理解するために、抗ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤分子を、ナノチャネルベースのエレクトロポレーションによってヒト成人皮膚線維芽細胞に送達した（Ｂｏｕｋａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。敷石状形態への細胞構造の頑強な表現型の切り替えは、線維芽細胞の内皮細胞への変換を予備的に示唆していることを意味した（図７Ａ）。線維芽細胞におけるｍｉＲ−２００ｂ阻害は、４日目以降、線維芽細胞特異的ＣＤ９０よりも内皮マーカーＣＤ３１を顕著に誘導した。そのような移行は２８日目に最大となる進行性であり（９８．４％）、線維芽細胞における急速な出現および内皮特性の維持を示した（図７Ｂおよび７Ｃ）。この観察は、線維芽細胞ＦＳＰ１＋細胞に対する別の血管新生因子ＶＥＧＦＲ２＋の漸進的出現と一致した（図７Ｃおよび１２Ｃ）。線維芽細胞ＦＳＰ−１の付随的な喪失とカップリングさせた内皮マーカーＣＤ３１の増加は、ｍｉＲ−２００ｂ抑制細胞において明らかであった（図１２Ｄ）。抗ｍｉＲ２００ｂをトランスフェクトした線維芽細胞のトランスクリプトームアレイは、血管新生のＣＣＬ２（Ｓｔａｍａｔｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）およびＣＸＣＬ８（Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）によって表される内皮遺伝子クラスターに対するＣｏｌ１Ａ、ＭＭＰ、ＣＸＣＬ５などの線維芽細胞特異的遺伝子から発現プロファイルのシフトを示した（図７Ｄおよび１２Ｅ〜１２Ｆ）。ｉＥＣの特徴付けは、線維芽細胞（ＣＯＬ１Ａ１およびＦＳＰ１）マーカーの痕跡が残っている動脈（ＰＥＣＡＭ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＴＩＥ２）、静脈（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ）、リンパ管（ＰＲＯＸ１）の特性の共存を明らかにした（図７Ｅ）。ヒト微小血管内皮細胞と同様に、ｍｉＲ−２００ｂ抑制した線維芽細胞において、Ａｃ−ＬＤＬ取り込み（図７Ｆ）およびマトリゲル管形成は高かった（図７Ｇ）。したがって、線維芽細胞は、ｍｉＲ−２００ｂ阻害に応答して内皮細胞の機能的特徴を達成した。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＮａｎｏｇなどの多能性遺伝子は、抗ｍｉＲ−２００ｂトランスフェクションの４日目以降、非常に低いレベルに留まり（図１２Ｇ）、これは線維芽細胞からｉＥＣへの変換が直接的であることを示している。
【０１３２】
Ｆｌｉ−１を脱サイレンシングしたｍｉＲ−２００ｂ阻害
ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、およびＤｉａｎａ−ＭｉｃｒｏＴアルゴリズムを使用したインシリコ試験によって、血管新生転帰を調節し得るｍｉＲ−２００ｂの標的が予測された。フレンド白血病統合体１（Ｆｌｉ−１）転写因子の３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、ｍｉＲ−２００ｂに対する結合部位を含む（図１３Ａ）。ｍｉＲ−２００ｂ模倣物の送達は、Ｆｌｉ−１−３’ＵＴＲレポータールシフェラーゼ活性を有意に抑制した（図８Ａ）。そのような効果は、変異Ｆｌｉ−１３’ＵＴＲを有する細胞において無効にされ（図８Ａ）、Ｆｌｉ−１発現の調節におけるｍｉＲ−２００ｂ結合の特異性の重要性を認識した。したがって、血管発達および血管新生に関与する中心的制御因子である転写因子のＥＴＳファミリーのメンバーであるＦｌｉ−１は、ｍｉＲ−２００ｂによって転写後遺伝子サイレンシングを受ける（Ｍｅａｄｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｄｅ  Ｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。初代ヒト皮膚線維芽細胞においてｍｉＲ−２００ｂがＦｌｉ−１を標的とするという概念に対する直接的な支持は、ｍｉＲ−２００ｂ模倣物または阻害剤を用いた試験において得られた（図１３Ｂ）。ｍｉＲ−２００ｂ模倣物はＦｌｉ−１タンパク質レベルを低下させ、対照的に、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトした線維芽細胞においてＦｌｉ−１タンパク質が誘導された（図８Ｂ）。ｍｉＲ−２００ｂ阻害線維芽細胞によって引き起こされる血管新生転帰におけるＦｌｉ−１の有意性を決定するために、抗ｍｉＲ−２００ｂまたはＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡ単独もしくはそれを組み合わせてのいずれかでトランスフェクトした。ｍｉＲ−２００ｂ単独の阻害はＦｌｉ−１タンパク質の脱サイレンシングにおいて強力であったが、そのような効果はＦｌｉ−１ノックダウンを受けた細胞では鈍かった（図８Ｃ）。これらの知見と一致して、マトリゲルアッセイにおける内皮管長に対するｍｉＲ−２００ｂ阻害の血管新生作用はＦｌｉ−１依存的であることが観察された（図８Ｄ）。
【０１３３】
血管新生スイッチを引き起こしたＥｔｖ２のＦｌｉ−１依存性トランス活性化
ｍｉＲ−２００ｂ阻害によって引き起こされる血管新生の経路において、Ｆｌｉ−１作用の下流の成分は、プロモーター分析のためのＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアを使用して特徴付けられた。Ｅｔｖ２プロモーター領域は、Ｅｔｖ２の活性化に必要な８つの既知のＥＴＳ結合部位を含む（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイは、Ｆｌｉ−１サイレンシングした皮膚線維芽細胞において、Ｅｔｖ２プロモーターへのＦｌｉ−１の結合増強が抑制されたが、Ｆｌｉ−１の強制発現は、Ｆｌｉ−１によるＥｔｖ２プロモーターの占有を改善したことを示した。（図８Ｅ）。これらの結果は、それぞれｍｉＲ−２００ｂ阻害剤もしくは模倣物で処理した、Ｆｌｉ−１サイレンシング細胞またはＦｌｉ−１過剰発現細胞において、Ｅｔｖ２プロモーター−レポーターアッセイを用いて裏付けられた。ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤をトランスフェクトした細胞ではレポーター活性の増加が検出された。Ｆｌｉ１ノックダウンに応答したそのような活性の鈍化は、Ｅｔｖ２トランス活性化におけるＦｌｉ−１の重要性を強調した。一貫して、Ｆｌｉ−１過剰発現細胞におけるＥｔｖ２プロモーター活性の増加は、細胞をｍｉＲ−２００ｂ模倣物およびＦｌｉ−１強制発現ベクターで共トランスフェクトしたときに完全に消失した（図８Ｆ）。ｉＥＣにおけるＦｌｉ−１のサイレンシングまたは脱サイレンシングは、それぞれ、Ｅｔｖ２  ｍＲＮＡ発現を下方制御または上方制御した（図８Ｇ）。したがって、ｍｉＲ−２００ｂ阻害はＦｌｉ−１を脱サイレンシングし、それによって血管新生スイッチを活性化するためにＥｔｖ２を上方制御する（図１３Ｅ）。
【０１３４】
皮膚線維芽細胞の血管性ｉＥＣへの直接的なインビボリプログラミングのための系統追跡の証拠
インビボでの皮膚線維芽細胞のｉＥＣへの直接変換は、免疫が十分なＣ５７ＢＬ／６マウスの無傷皮膚におけるｍｉＲ−２００ｂの阻害によって達成された。皮膚への抗ｍｉＲ２００ｂ−ＬＮＡの局所ナノエレクトロポレーションに基づく送達は、Ｆｌｉ−１を脱サイレンシングした（図９Ａ）。同時に、背部皮膚における血流の改善が観察された。そのような改善は一過性であり、ｍｉＲ−２００ｂ阻害の７日目にピークを示した後、その後の４日間の誘導灌流を低下させた（図１４Ａ）。無傷皮膚において誘発された血管構造の適時の後退を指すこの一連の証拠は、インビボで生じるｉＥＣによる奇形腫形成の可能性に不利になる。適切に灌流されている無傷の健康な皮膚とは異なり、誘導灌流の重要性は血管新生が必要な創傷では異なる（Ｔｏｎｎｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。組織修復の生理学における直接細胞変換の不可欠な役割の概念と一致して、損傷それ自体が創傷縁組織においてｍｉＲ−２００ｂ阻害を引き起こした（図１２Ａ）。そのような阻害は、創傷後７日目および９日目の創傷縁組織におけるＦｌｉ−１発現の付随的増加と関連していた（図９Ｂ）。インビボでの細胞変換の直接的証拠の探索は、Ｆｓｐ１−Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏマウスを用いた系統追跡試験を必要とした（Ｕｂｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。損傷後５日目は、ＣＤ３１＋である線維芽細胞系列の移行細胞の豊富な存在によって特徴付けられた（図９Ｃ）。レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）によって単離された創傷縁線維芽細胞（図１４Ｂ）は、内皮マーカーＣＤ３１の増加と共に弱毒化ＦＳＰ１発現などの移行特性を示した（図９Ｄ）。これは、線維芽細胞が、ｍｉＲ−２００ｂが阻害される損傷部位でｉＥＣに変換されるという直接的証拠を構成する。しかしながら、線維芽細胞から内皮細胞へのそのような損傷誘導性のｍｉＲ−２００ｂ依存性の生理学的変換は、このような血管性細胞変換に対する障壁として糖尿病性病態を認識する糖尿病マウスでは損なわれた（図９Ｅ）。
【０１３５】
ｉＥＣへの生理学的リプログラミングを損なった皮膚線維芽細胞におけるＦｌｉ−１の条件付きインビボノックダウン
損傷部位での線維芽細胞のｉＥＣ変換への変換におけるＦｌｉ−１の有意性を試験するために、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ制御ＲＮＡ干渉を利用してマウスにおける条件付き線維芽細胞特異的遺伝子ノックダウンを得た（Ｈｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｋａｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４年）。線維芽細胞特異的Ｆｌｉ−１は、ＬｏｘＰ隣接Ｆｌｉ−１  ｓｈＲＮＡ発現カセットによってインビボでノックダウンされた（図１０Ａ）。４つのＬｏｘＰ隣接Ｆｌｉ−１  ｓｈＲＮＡ発現カセットを設計し、インビトロでのＦｌｉ−１タンパク質発現の下方制御の効率に基づいており（図１５Ａおよび１５Ｂ）、３つのカセットをプールし、Ｆｓｐ１−Ｃｒｅマウスの創傷縁でのレンチウイルストランスフェクションに使用した。Ｆｌｉ−１  ｓｈＲＮＡベクターの検証は図１５Ｂおよび１５Ｃに報告されている。創傷縁組織における抗ｍｉＲ２００ｂ−ＬＮＡの送達（図１０Ｂ）は、線維芽細胞のｉＥＣへの変換におけるｍｉＲ−２００ｂの役割を支持してＦＳＰ１およびＣＤ３１の共局在化の増加を示した（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。このような共局在化は、Ｆｌｉ−１がｍｉＲ−２００ｂ機能の重要なメディエータとして関与しているＦｌｉ−１の線維芽細胞標的ノックダウンによって著しく鈍かった（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。実際、同じ実験条件下で、皮膚線維芽細胞におけるＦｌｉ−１ノックダウンは、創傷灌流を有意に減衰し（図１５Ｄおよび１５Ｅ）、創傷閉鎖を損なった（図１５Ｆ〜１５Ｈ）。これらの結果は、ｍｉＲ−２００ｂ阻害によって引き起こされる損傷部位の線維芽細胞由来の成熟ｉＥＣが、組織の血管新生に役立つＦｌｉ−１依存性であることを示す。
【０１３６】
局所抗ｍｉＲ−２００ｂ−ＬＮＡは皮膚線維芽細胞のｉＥＣへのインビボ変換により糖尿病性創傷血管新生を救済する
創傷治癒障害は一般的な糖尿病性合併症である（Ｂｒｅｍ  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ、２００７）。非糖尿病患者と比較して、糖尿病患者の創傷縁は、著しく上昇したｍｉＲ−２００ｂの存在量を示したが、Ｆｌｉ−１  ｍＲＮＡレベルは低かった（図１１Ａ）。免疫組織化学試験は、非糖尿病のヒト対象と比較して、糖尿病患者の創傷縁組織においてＦｌｉ−１タンパク質の存在量が乏しいことを明らかにした（図１１Ｂ）。ＩＩ型糖尿病の確立されたモデルであるｄｂ／ｄｂマウスでは、創傷はｍｉＲ−２００ｂ発現を抑制することができなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。ｄｂ／ｄｂマウスの創傷縁に単一の抗ｍｉＲ２００ｂ−ＬＮＡ分子を送達することによる強制的なｍｉＲ−２００ｂ阻害（図１１Ｃ）は、Ｆｌｉ−１（図１１Ｄ）およびその下流のＥｔｖ２タンパク質発現（図１６Ｃ）の有意な増強をもたらし、続いて糖尿病マウスの創傷縁組織にｉＥＣの存在量が出現した（図１１Ｅ）。そのような応答は、改善された創傷灌流および治癒をもたらした（図１１Ｆ〜１１Ｉおよび１６Ｄ〜１６Ｅ）。改善された血管新生はまた、ｄｂ／ｄｂマウスの抗ｍｉＲ２００ｂ処理した創傷縁組織におけるより高い存在量のＣＤ３１＋およびＣＤ１０５＋内皮細胞によっても明らかであった（図１１Ｊおよび１６Ｆ〜１６Ｇ）。要約すると、この研究によって、損傷中に一時的にオフにするとｉＥＣへの直接細胞変換のためのＦｌｉ−１−Ｅｔｖ２軸を誘導する、重要なスイッチとして皮膚線維芽細胞のｍｉＲ−２００ｂを認識する新しいパラダイムが紹介される。
【０１３７】
材料および方法
試薬および抗体すべての組織培養材料は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡまたはＬｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪのいずれかから入手した。ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡヘアピン阻害剤ネガティブコントロール（カタログ番号ＩＮ−００１００５−０１−０５）、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐヘアピン阻害剤（カタログ番号ＩＨ−３００５８２−０８−０００５）、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡを模倣物ネガティブコントロール（カタログ番号ＣＮ−００１０００−０１−０５）、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  マイクロＲＮＡ  ヒトｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ模倣物（カタログ番号Ｃ−３００５８２−０７−００１０）およびＯＮ−ＴＡＲＧＥＴおよびＦＬＩ１  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号Ｌ−００３８９２−００−０００５）は、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯから購入した。ヒトＦｌｉ１−３’ＵＴＲ（カタログ番号ＨｍｉＴ０５６６７３−ＭＴ０５）、対照ベクター（ＣＳ−ＭｍｉＴ０２７１０４−ＭＴ０６−０１）、およびＥｔｖ２のプロモーターレポータークローン（ＮＭ＿０１４２０９）（カタログ番号ＨＰＲＭ１２８９４−ＰＧ０４）をＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。抗体は、ＦＬＩ−１（カタログ番号ａｂ１５２８９）、Ｅｔｖ２（カタログ番号ａｂ１８１８４７）、Ｓ１００Ａ４（別名ＦＳＰ−１）（カタログ番号ａｂ２７９５７）、ＣＤ１０５（カタログ番号ａｂ１０７５９５）、予吸着ヤギ抗ラットＩｇＧＨ＆Ｌ（Ｃｙ５（登録商標））（カタログ番号ａｂ６５６５）をＡｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから購入した。精製ラット抗マウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１としても知られる）（カタログ番号５５０２７４）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）、ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡから入手した。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ヒトＣＤ３１抗体（クローン：ＷＭ５９、カタログ番号３０３１１５）、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＣＤ９０（Ｔｈｙ１）抗体（クローン：５Ｅ１０、カタログ番号３２８１０７）、およびフィコエリトリン（ＰＥ）は抗ヒトＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２）抗体（クローン：７Ｄ４−６、カタログ番号３５９９０３）は、カリフォルニア州サンディエゴのＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。抗線維芽細胞抗体、ヒト（クローン：ＲＥＡ１６５、カタログ番号１３０−１００−１３５）を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから得た。抗マウスβアクチン（カタログ番号Ａ５４４１）、ストレプトゾトシン（カタログ番号Ｓ０１３０）をＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号ＮＡ９３４Ｖ）、抗マウスＩｇＧ（カタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）、およびＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡから入手した。ヒト血漿由来の低密度リポタンパク質、アセチル化、Ａｌｅｘａ  Ｆｌ���ｏｒ（登録商標）５９４共役（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４  ＡｃＬＤＬ）（カタログ番号Ｌ３５３５３）およびＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（カタログ番号Ｃ３０９９）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから購入した。Ｃｕｌｔｒｅｘ  Ｐａｔｈ  Ｃｌｅａｒ還元増殖因子ＢＭＥ（カタログ番号３４３３−００５−０１）はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから、Ｓｅｃｒｅｔｅ−Ｐａｉｒデュアル発光アッセイキット（カタログ番号ＳＰＤＡ−Ｄ０１０）はＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａから、およびＳｉｍｐｌｅＣｈＩＰ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ＩＰキット（アガロースビーズ）（カタログ番号９００４）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡから入手した。Ｕ６  ｓｎＲＮＡプライマー（カタログ番号４４２７９７５、ＩＤ：００１９７３）およびｈｓｐ−ｍｉＲ−２００ｂプライマー（カタログ番号４４２７９７５、ＩＤ：００２２５１）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡから入手した。他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０１３８】
非ウイルスナノエレクトロポレーション装置の製造組織ナノトランスフェクション装置は、標準的なクリーンルーム製造技術を使用して、薄く（約２００μｍ）両面研磨した（１００）シリコンウエハから製造された。簡潔に説明すると、厚さ約１．５μｍのＡＺ５２１４Ｅの層をウエハ表面にスピンコートした。続いて、投影リソグラフィを介してフォトレジスト上にナノ細孔をパターン形成した。次いで、そのような細孔をエッチングマスクとして使用して、ＳＦ６／Ｃ４Ｆ８ガスの組み合わせを使用した深部反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）によって、シリコン表面に深さ約１０μｍのナノチャネルを穿孔した。次いで、ナノチャネルへの流動性アクセスを得るために、接触フォトリソグラフィおよびＤＲＩＥを介して、マイクロスケールのリザーバーをウエハの裏側にエッチングした。最後に、厚さ約５０ｎｍの窒化ケイ素の絶縁層をウエハ表面に配置した。
【０１３９】
細胞培養およびインビトロ非ウイルストランスフェクション初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、カタログ番号ＰＣＳ−２０１−０１２）を、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）溶液（ＧｉｂｃｏＴＭ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号１５１４０１２２）を含有する、線維芽細胞増殖キットを無血清（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＰＣＳ−２０１−０４０）で補った線維芽細胞基礎培地（ＡＴＣＣカタログ番号ＰＣＳ−２０１−０３０）中で、９５％空気および５％ＣＯ２からなる加湿雰囲気下３７℃で、増殖させた。ヒト真皮微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）をＭＣＤＢ−１３１培地（ＧｉｂｃｏＴＭ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３７２−０１９）中で培養した。
【０１４０】
非ウイルス細胞トランスフェクションは、過去に報告されているように（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２、３９９−４０９）、３Ｄナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）によって行った。簡潔に説明すると、細胞を最初に３ＤＮＥＰ装置上で一晩完全にコンフルエントになるまで増殖させた。続いて、パルス電場を用いて、対照またはｍｉＲ２００ｂ阻害剤（５０ｎＭ）を細胞に送達した。次いで、細胞をｍｉＲＮＡ送達の２４時間後に回収し、ＥＧＭ−２  ＭＶ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔキット成分（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−４１４７）を補充したＥＢＭ−２基礎培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３１５６）に入れて、さらなる実験のためにさらに処理した。
【０１４１】
ｍｉＲ阻害剤／模倣物およびｓｉＲＮＡトランスフェクション。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、抗生物質不含の培地中、０．１×１０６細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。トランスフェクション時にコンフルエンスは約７０％に達するだろう。トランスフェクションは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴＴＭ１トランスフェクション試薬（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）およびＯｐｔｉＭＥＭ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いた、ｍｉＲ−２００ｂ阻害剤（１００ｎＭ）もしくはｍｉＲ−２００ｂ模倣物（５０ｎＭ）、またはヒトＦＬＩ−１（１００ｎＭ）のｓｉＲＮＡスマートプールのリポソーム媒介性送達によって達成された。ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質発現の定量化のために、７２時間の対照およびｍｉＲ２００ｂ阻害剤／模倣物または対照およびＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡトランスフェクションの後にサンプルを回収した。
【０１４２】
動物試験およびインビボリプログラミングおよびレンチウイルス送達。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮから入手した。レプチン受容体（Ｌｅｐｒｄｂ）の自然突然変異についてホモ接合型マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、またはストック番号０００６４２）またはそれらのそれぞれの非糖尿病の痩せた対照同腹仔ｍ＋／ｄｂ（週齢８〜１０）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから入手した。ＦＳＰ１−Ｃｒｅマウスを入手した（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９００９５，ＵＳＡ）。ＦＳＰ１−Ｃｒｅマウスを、ｌｏｘＰが導入されたｔｄＴｏｍａｔｏ対立遺伝子を保有するＲ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏマウス（ＪＡＸ）と交配させた。ＦＳＰ１は線維芽細胞において特異的に発現されるので、これらのマウスの子孫（ＦＳＰ１−Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏ）は線維芽細胞において特異的に発現される赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏを有するであろう（Ｕｂｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ；５０ｍｇ／ｋｇ体重、５日間）またはビヒクル、クエン酸緩衝液（０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を腹腔内注射することによってＣ５７ＢＬ／６マウスを糖尿病にし、血糖値をＡｃｃｕ−Ｃｈｅｋ血糖計（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて定期的に評価した。食物摂取および体重も毎日記録した。＞２０ｍｍｏｌ／Ｌより高い血糖値を有するマウスを糖尿病と定義し、実験用に選択した。オハイオ州立大学のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されたプロトコルに従って、すべての動物試験を実施した。動物をタグ付けし、無作為にグループ化した。
【０１４３】
目的の領域の動物の毛皮をトランスフェクションの前にトリミングした。Ｅｘｉｑｏｎ，Ｉｎｃ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡから購入したｍｉＲ−２００ｂのｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐｏｗｅｒ阻害剤（カタログ番号４１０４０４２−１０１）または陰性対照（カタログ番号１９９００６−１０１）を含有する溶液を非ウイルストランスフェクション装置のリザーバーに入れ（１００ｎＭの濃度で）、その後に装置を皮膚と接触させて置いた。金被覆電極（すなわちカソード）をカーゴ溶液に浸漬し、一方、２４Ｇ針対電極（すなわちアノード）を皮内に挿入して、トランスフェクションプラットホームに並置した。次に、パルス電気刺激（すなわち、振幅２５０Ｖの１０パルスおよび１パルス当たり１０ｍｓの持続時間）を電極両端に印加して、皮膚細胞をナノ穿孔し、ナノチャネルを通して阻害剤または対照カーゴを細胞内に打ち込んだ。
【０１４４】
ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（ＬＶ）の送達は皮内注射によって達成された。ｌｏｘｐ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘｐ−センス−ループ−アンチセンス構造およびｓｈＲＮＡスクランブル対照を有するレンチウイルスベクター中のマウスＦｌｉ１のｓｈＲＮＡクローンセット（４つの構築物）をＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａからカスタマイズした。簡潔に説明すると、ＬＶ粒子（３セットのＦｌｉ−１  ｓｈＲＮＡクローン）を、創傷の２日前に創傷縁から１ｍｍ離れた力価１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ（創傷あたり５０μＬ）で皮内注射した。注射手順を創傷日および創傷後３日目に繰り返した。
【０１４５】
創傷モデル正中線から等距離かつ四肢に隣接して、背部皮膚に２つの６ｍｍ生検パンチ切除創傷を作り、収縮を防ぐためにシリコンシートを添えて、それによって創傷を肉芽形成および再上皮化によって治癒させた。創傷処置の間、標準的な推奨に従ってマウスを低用量イソフルラン吸入によって麻酔した。各創傷をデジタル写真撮影し、言及した異なる時点でレーザースペックルにより灌流をチェックした。創傷面積をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分析した。年齢が一致した非創傷動物からの皮膚が対照として使われた。すべての動物実験は、ＯＳＵ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。示された時間に動物を安楽死させ、分析のために創傷縁を回収した。創傷縁採取のために、創傷した皮膚の前縁から１〜１．５ｍｍの組織を創傷全体の周りで切除した。組織を急速凍結し、４％パラホルムアルデヒドまたは最適切断温度（ＯＣＴ）化合物のいずれかに集めた。
【０１４６】
皮膚線維芽細胞のレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）本発明者らのグループによって過去に報告されているように、ＰＡＬＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｎｒｅｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のレーザー顕微解剖システムを使用してレーザー捕捉顕微解剖を行った。真皮線維芽細胞に富む領域の捕捉のために、切片をヘマトキシリンで３０秒間染色し、続いて、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏで洗浄し、エタノール中で脱水した。組織像に基づいて、真皮画分を同定した。ＦＳＰ１−Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏマウスからの線維芽細胞の捕捉のために、続いて、切片をＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏで洗浄し、エタノール中で脱水した。赤色蛍光に基づいて線維芽細胞を同定した。組織切片を典型的に切断し、２０倍の接眼レンズの下で捕捉した。試料を２５μｌの細胞直接溶解抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れた。約１０，００，０００μｍ２の組織領域を各キャップに捕捉し、次いで溶解物をさらなる処理のために−８０℃で保存した。
【０１４７】
ヒト試料。ヒトの皮膚および創傷の生検試料は、それぞれＯＳＵ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＷＣ）で健康な成人ヒト対象または慢性創傷患者から得た。すべてのヒト試験は、オハイオ州立大学（ＯＳＵ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された。ヘルシンキ宣言のプロトコルに従い、患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。
【０１４８】
免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）および共焦点顕微鏡。特異的抗体を用いて創傷試料の凍結切片に対して免疫染色を行った。簡潔に説明すると、ＯＣＴ包埋組織を１０μｍの厚さで凍結切片し、冷アセトンで固定し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、そしてＣＤ３１（１：４００希釈）、ＣＤ１０５（１：４００希釈）、Ｋｅｒａｔｉｎ１４（１：１０００希釈）に対する特異的抗体と共にインキュベートした。免疫細胞化学のために、細胞（０．１×１０６細胞／ウェル）をカバーガラス上に播種し、ＩＣＣ固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ、カタログ番号５５００１０）で固定し、１０％正常ヤギ血清でブロッキングし、ＣＤ３１およびＦＳＰ１に対する一次抗体と共に一晩インキュベートした。続いて、蛍光標識した適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ５６８標識α−ラット、１：２００希釈、Ａｌｅｘａ４８８標識α−ウサギ、１：２００希釈）とのインキュベーションによってシグナルを可視化し、ＤＡＰＩで対比染色した。顕微鏡で画像を捕捉し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ  ４．８ソフトウェア（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析を行った。
【０１４９】
ウエスタンブロット。組織抽出物または細胞溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡ法によって決定し、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、それをＰＶＤＦ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ、カタログ番号ＩＰＶＨ０００１０）に移した。まず、膜を１０％スキムミルク中でブロックし、１：１０００希釈の一次抗体と４０℃で一晩インキュベートし、続いて１：３０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した特異的な二次抗体とインキュベートした。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、シグナルを可視化した。ｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いて個々のバンドについてピクセル濃度測定分析を行った。抗マウスβアクチン（１：１００００希釈）は負荷対照として機能する。
【０１５０】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイム定量的ＰＣＲ。細胞または創傷縁組織試料からのＲＮＡを、製造業者の指示に従ってｍｉＲＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ１５６０）を使用することによって抽出した。ＲＮＡ量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して測定し、ＲＮＡ品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のＲＮＡ６０００  ＮａｎｏＡｓｓａｙを使用してチェックした。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８０８００５１）を用いて、ＲＮＡを逆転写した。遺伝子特異的プライマーを用いたＳＹＢＲ緑色ベースのリアルタイム定量的ＰＣＲ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。最終伸長後、生成物の特異性を確実にするために融解曲線分析を行った。１８ｓを別々の反応で同時に増幅し、Ｃｔ値を補正するために使用した。ｍｉＲＮＡ発現の決定のために、ｍｉＲＮＡに対する特異的ＴａｑＭａｎアッセイおよびＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６６５９６）を使用した後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３０４４３７）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。
【０１５１】
ｍｉＲ標的ルシフェラーゼレポーターアッセイＨＡＤＦ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ／Ｐｌｕｓ試薬を用いて４８時間、１００ｎｇのヒトＦｌｉ１−３’ＵＴＲまたは変異体ベクターでトランスフェクトした。フレンド白血病ウイルス組込体１のレポーター構築物３’ＵＴＲ（ｐＬｕｃ−Ｆｌｉ１−３’ＵＴＲヒトプラスミド）（カタログ番号ＨｍｉＴ０５４４５６−ＭＴ０６）はＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａから入手した。変異構築物については、シード配列領域をナンセンス配列に置き換えた（詳細については、図１６を参照されたい）。ホタルルシフェラーゼをＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、二重シフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、製造元のプロトコルに従って決定した。データの正規化は、レニラプラスミド（１０ｎｇ）で細胞を共トランスフェクトすることによって達成された。データは、ホタル対レニラルシフェラーゼ活性の比（ＦＬ／ＲＬ）として提示されている。
【０１５２】
プロモータールシフェラーゼアッセイＥｔｖ２プロモーター活性化におけるＦｌｉ−１の関与を分析するために、Ｅｔｖ２プロモーターレポータークローンを、ＨＤＡＦ細胞において対照またはｍｉＲ２００ｂ阻害剤もしくは模倣物またはＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡのいずれかと共トランスフェクトした。７２時間のトランスフェクション後、Ｓｅｃｒｅｔｅ−Ｐａｉｒ二重蛍光アッセイキットを使用して、製造業者の指示に従って、細胞培養培地中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）および分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性を分析した。Ｅｔｖ２はＧＬｕｃレポーター遺伝子の発現を制御するが、ＳＥＡＰはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって制御される。ＳＥＡＰ発現を正規化因子（内部標準対照）として使用した。簡潔に説明すると、１０μｌの培地試料を１００μｌのＧＬｕｃアッセイ作業溶液またはＳＥＡＰアッセイ作業溶液と混合し、室温で１分間（ＧＬｕｃ）または５分間（ＳＥＡＰ）インキュベートし、続いてルミノメーターで発光を測定した。ＳＥＡＰに対するＧＬｕｃの発光強度の比（ＲＬＵ、相対光単位）を各試料について計算した。
【０１５３】
フローサイトメトリー対照またはｍｉＲ２００ｂ阻害剤をトランスフェクトしたＨＤＡＦ細胞上のＣＤ３１およびＣＤ９０またはＶＥＧＦＲ２および線維芽細胞タンパク質の発現をフローサイトメトリー（ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター）によって評価した。簡潔に説明すると、トランスフェクションの１、４、７、１０、および２８日後にＨＤＡＦ細胞（１×１０６）を回収し、ＰＢＳ含有２％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁し、次いで、ＣＤ９０およびＣＤ３１またはＶＥＧＦＲ２および線維芽細胞タンパク質に対して蛍光標識抗体（１試験あたり５μｌ）で、室温で３０分間、染色した。データはＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２．１）を用いて分析した。
【０１５４】
ＬＤＬ取り込みアッセイ。ＨＤＡＦ細胞を対照またはｍｉＲ２００ｂ阻害剤のいずれかでトランスフェクトし、７日目に、細胞をＤＭＥＭ中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識Ａｃ−ＬＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。ＨＤＭＥＣを陽性対照細胞として使用した。インキュベーション終了時に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。Ａｃ−ＬＤＬの取り込みは、Ａｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ  ４．８ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して蛍光顕微鏡法によって分析した。
【０１５５】
インビトロ血管新生アッセイインビトロでの血管新生は、過去に報告されているように（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、マトリゲル上での管形成能力によって評価された。簡潔に説明すると、ＨＡＤＦ細胞を対照またはｍｉＲ２００ｂ阻害剤でトランスフェクトし、トランスフェクション後７日目に、細胞をマトリゲルでプレコートした４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播種した。ＨＭＥＣを陽性対照細胞として使用した。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ４．８ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、８時間の細胞播種後の管長を測定することによって血管新生特性を評価した。
【０１５６】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイは、異なる処理条件においてＥｔｖ２プロモーターへのＦｌｉ−１の結合を評価するために、製造業者の指示に従って行った。簡潔に説明すると、対照またはＦｌｉ−１  ｓｉＲＮＡおよび対照またはＦｌｉ−１強制発現ベクターでトランスフェクトしたＨＡＤＦ細胞を１％ホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定し、次いでグリシンを添加することにより停止させた。細胞を核調製のために処理し、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  Ｎｕｃｌｅａｓｅと共にインキュベートした核をペレット化して、１５０〜９００ｂｐの平均断片サイズを有するクロマチン試料を作製した。酵素消化を０．５ＭのＥＤＴＡの添加により停止させ、次いで、試料を氷上で超音波処理し、４℃で１０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。試料をＦｌｉ−１抗体または対照正常ウサギＩｇＧと共に４℃で一晩、回転板上でインキュベートした。抗体−クロマチン複合体をプロテインＧ−アガロースビーズでペレット化し、免疫沈降したＤＮＡを溶出して精製した。次に、Ｅｔｖ２遺伝子のプロモーター領域を標的とするプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ヒトＥｔｖ２プロモーター配列の増幅に使用したプライマーは、５’−ＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣ−３’（順方向）および５’−ＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧ−３’（逆方向）の生成物長２１４ｂｐであった。ＰＣＲ生成物を臭化エチジウム染色１．５％アガロースゲルで泳動し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いてＢｉｏ−Ｒａｄゲルドキュメンテーションシステムにより画像を捕捉した。
【０１５７】
統計分析試料をコード化し、データ解析を盲検法で実施した。有意差を決定するためにスチューデントのｔ検定（両側）を使用した。複数のグループ間の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて試験した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意と見なした。
【０１５８】
実施例８；局所組織ナノトランスフェクションは、非ウイルス性間質のリプログラミングと救済を仲介する
細胞療法はいくつかの条件に対する有望な戦略を表すが、現在のアプローチは、限られた細胞供給源および煩雑な前処理工程（例えば、単離、誘導多能性）の必要性を含む主要な翻訳障害に直面している（ＲｏｓｏｖａＩ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８、２６（８）：２１７３−２１８２、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２０１２，２２４（２）：４４０−４４５、Ｌｏｓｏｒｄｏ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４，１０９（２２）：２６９２−２６９７、ＬｅｅＡＳ，ｅｔ  ａｌ．ＮａｔＭｅｄ２０１３，１９（８）：９９８−１００４、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１２，３０（９）：８４９−８５７、Ｌｅｄｕｃ  ＰＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７，２（１）：３−７）。インビボ細胞リプログラミングは、容易に入手可能な細胞源（例えば、線維芽細胞）を利用し、エクスビボ前処理の必要性を回避することによって、より効果的な細胞ベースの治療を可能にする可能性を有する（ＨｅｉｎｒｉｃｈＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１５，１７（３）：２０４−２１１、Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４，１１（１０）：１００６−１００８）。しかしながら、既存のリプログラミング方法論は、注意をはらんでおり、ウイルストランスフェクションに対する強い依存度を含む（ＧｒａｎｄｅＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１３、４：２３７３、Ｍｏｒｉｔａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ２０１５，１１２（１）：１６０−１６５）。さらに、カプシドサイズの制限および／または現状のアプローチの確率的性質（ウイルス性および非ウイルス性）はさらなる制限を課し、したがってより安全でより決定論的なインビボリプログラミング方法の必要性を強調している（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６，１２（２）：３９９−４０９、Ｍａｒｘ  Ｖ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ２０１６，１３（１）：３７−４０）。それぞれ確立されたおよび新しく開発された誘導性ニューロンおよび内皮のリプログラミングモデルで検証されたナノチャネル化装置を介して、局所的に組織をリプログラミングするために新規でありながら実施が簡単な非ウイルスアプローチを開示する。このアプローチの簡潔さおよび有用性は、損傷誘導性虚血の２つのマウスモデルを使用して壊死組織および四肢全体を救済することによって実証される。
【０１５９】
材料および方法
ＴＮＴプラットフォームの製造
ＴＮＴ装置を、薄く（約２００μｍ）両面研磨した（１００）シリコンウエハから製造した（図２０）。簡潔に説明すると、まず、厚さ約１．５μｍのＡＺ５２１４Ｅフォトレジスト層をシリコンウエハ上に約３０００ｒｐｍでスピンコートした。続いて、ＧＣＡ６１００Ｃステッパーを使用して、フォトレジスト上にナノスケール開口部をパターン形成した。１００ｍｍウエハ当たり最大１６ダイのナノスケール開口部アレイをパターン形成した。次いで、そのような開口部をエッチングマスクとして使用して、深反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ  １００  システム）によって、シリコン表面上に約１０μｍの深さのナノチャネルを穿孔した。最適化したエッチング条件には、ＳＦ６ガス：１３秒／１００ｓｃｃｍのガス流／７００ＷのＩＣＰ電力／４０ＷのＲＦ電力／３０ｍＴのＡＰＣ圧力、Ｃ４Ｆ８ガス条件：７秒／１００ｓｃｃｍのガス流／７００ＷのＩＣＰ電力／１０ＷのＲＦ電力／３０ｍＴのＡＰＣ圧力が含まれる。次いで、マイクロスケールのリザーバーを、接触フォトリソグラフィおよびＤＲＩＥを介してウエハの裏側にパターン形成した。最後に、ＴＮＴプラットフォーム表面上に、厚さ約５０ｎｍの窒化ケイ素の絶縁層／保護層を配置した。
【０１６０】
畜産
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した、Ｂ６．１２９（Ｃｇ）−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／ＪマウスをＫ１４ｃｒｅと交配させて、Ｋ１４ｃｒｅ／Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊマウスを作製した。ｐＯＢＣｏｌ３．６ＧＦＰｔｐｚマウスは、Ｔｒａｃｉ  Ｗｉｌｇｕｓ博士（Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から贈与された。ｒｅｐＴＯＰＴＭ  ｍｉｔｏＩＲＥマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｆｓｐ１−Ｃｒｅマウスを入手した（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ）。Ｆｓｐ１−ＣｒｅマウスをＢ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交配させて、線維芽細胞に特異的なｔｄＴｏｍａｔｏ発現を有するマウスを作製した。研究の時点ではすべてのマウスは雄性であり、８〜１２週齢であった。ＲＯＳＡｍＴ／ｍＧマウスの遺伝子型判定ＰＣＲは、プライマーｏＩＭＲ７３１８−ＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴ、ｏＩＭＲ７３１９−ＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＴＡ、およびｏＩＭＲ７３２０−ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴを用いて行い、Ｋ−１４Ｃｒｅ導入遺伝子は、プライマーｏＩＭＲ１０８４−ＧＣＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣ、ｏＩＭＲ１０８５−ＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴを用いて行った。Ｆｓｐ１−Ｃｒｅマウスの遺伝子型判定ＰＣＲは、順方向−ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＴＣＴ、逆方向−ＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣ（野生型、生成物長さ＝３２４ｂｐ）、および順方向−ＧＣＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣ、逆方向−ＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴ（ＣＲＥ導入遺伝子、生成物長さ＝１００ｂｐ）のプライマーを用いて行い、ｔｄ  ｔｏｍａｔｏについては、順方向−ＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡ、逆方向−ＣＣＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣ（野生型、生成物長さ＝１９６ｂｐ）、および順方向−ＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＣ、逆方向−ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧ（変異型、生成物長さ＝２９７ｂｐ）のプライマーを用いて行った。オハイオ州立大学のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されたプロトコルに従って、すべての動物試験を実施した。試料サイズを事前に決定するために統計的方法は使用されなかった。検出力分析は、この試験に必須ではない。動物にタグを付け、コンピューターベースのアルゴリズムを用いて無作為にグループ分けした。（ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇ）
【０１６１】
哺乳動物細胞培養およびインビトロリプログラミング
マイコプラズマ不含かつ認証された、初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＰＣＳ−２０１−０１２）を、ＡＴＣＣから直接購入した。さらなる細胞株認証／試験は行われなかった。これらの細胞を、線維芽細胞増殖キット無血清（ＡＴＣＣ  ＰＣＳ  ２０１−０４０）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した線維芽細胞基礎培地中で増殖させた。Ｅ１２．５−Ｅ１４マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。非ウイルス細胞トランスフェクションおよびリプログラミング実験は、過去に報告されているように１１、３Ｄナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）を介して実施した。簡潔に説明すると、細胞を最初に３ＤＮＥＰ装置上で一晩完全にコンフルエントになるまで増殖させた。続いて、パルス電場を用いて、Ｆｌｉ１：Ｅｔｖ２：Ｆｏｘｃ２の１：１：１混合物からなる細胞中にプラスミドのカクテル（０．０５μｇ／μｌ）を送達した。次いで、細胞をプラスミド送達の２４時間後に回収し、ＥＧＭ−２  ＭＶ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔキット（ＣＣ−４１４７、Ｌｏｎｚａ）を補充したＥＢＭ−２基礎培地（ＣＣ−３１５６、Ｌｏｎｚａ）に入れ、実験／測定用にさらに処理した。Ｅｔｖ２およびＦｌｉ１プラスミドを入手した（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｘａｓ）。Ｆｏｘｃ２プラスミドは、Ｔｓｕｔｏｍｕ  Ｋｕｍｅ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−ＦＣＶＲＩ，Ｃｈｉｃａｇｏ）のご好意により寄付された。
【０１６２】
インビボリプログラミング
ＴＮＴの２４〜４８時間前に、まず処理対象の領域を麻痺させた。次いで、皮膚を剥離して、死細胞層／ケラチン細胞層を除去して、表皮の有核細胞を曝露した。ＴＮＴ装置を剥離した皮膚表面上に直接配置した。ＡＢＭまたはＥＦＦプラスミドカクテルを０．０５〜０．１μｇ／μｌの濃度でリザーバーに入れた。金被覆電極（すなわちカソード）をプラスミド溶液に浸漬し、一方、２４Ｇ針対電極（すなわちアノード）を皮内に挿入し、ＴＮＴプラットフォーム表面に並置した。次いで、パルス電気刺激（すなわち、振幅２５０Ｖの１０パルスおよび１パルス当たり１０ｍｓの持続時間）を電極両端に印加して、露出した細胞膜をナノ穿孔し、ナノチャネルを通して細胞内にプラスミドカーゴを打ち込んだ。ＡＢＭプラスミドは、過去に報告されているように１１、２：１：１のモル比で混合した。特に指定しない限り、対照検体は、ブランク、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／疑似プラスミド溶液を用いたＴＮＴ処理を含んだ（図３８）。
【０１６３】
電気生理学的活性測定
細胞外記録の一般的原理を用いて、皮膚における電気生理学的活性を検出した。クロノアンペロメトリー測定を、鎮静マウスの皮膚上の２つの小さな切開を通してニューロンの興奮性を検出するために、ＰＰｙベースのプローブを使用して実施した。
【０１６４】
ＭＣＡＯ脳卒中手術および解析
一過性限局性脳虚血はマウスにおいて中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により誘導され、過去に報告されているように、腔内フィラメント挿入技術を使用することにより達成された（Ｋｈａｎｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１３、３３（８）：１１９７−１２０６）。浮腫を補正した後、対側半球の割合として梗塞サイズを決定するためにＭＲＩ画像を使用した。
【０１６５】
虚血性皮膚皮弁
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮膚上に、２０ｍｍ×１０ｍｍの大きさの単茎（すなわち、ランダムパターン）虚血皮弁を作製した。簡潔に説明すると、８〜１０週齢のマウスを１〜３％イソフルランで麻酔した。背側を麻痺させ、洗浄し、ベタジンで滅菌した。２０ｍｍ長の全層性平行切開を１０ｍｍ離すことによって、マウスの背部皮膚上に単茎皮弁を作製した。皮の底部は、自由に垂れ下がる皮弁を作るために切断された。皮弁縁を焼灼した。０．５ｍｍシリコンシートを皮弁の下に置き、次に５−０エチコン絹縫合糸で隣接する皮膚に縫合した。最後に、ブプレノルフィンの単回用量を皮下投与して痛みを制御した。手術の２時間後にレーザースペックル画像（Ｐｅｒｉｍｅｄ）を実施して血流閉塞の成功を確認した。ＴＮＴベースのトランスフェクションは、皮膚皮弁の２４時間前に行った。
【０１６６】
後肢虚血手術
片側後肢虚血は、閉塞およびその後の大腿動脈の切断とそれに続く切断によって誘発された（Ｌｉｍｂｏｕｒｇ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ２００９、４（１２）：１７３７−１７４６）。簡潔に説明すると、８〜１０週齢のマウスを１〜３％イソフルランで麻酔し、加熱したパッド上の実体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＯＰＭＩ）下に仰臥位に置いた。大腿動脈を露出させ、約１ｃｍの切開を通して大腿静脈から分離した。近位端および遠位端の閉塞を７−０絹縫合糸で誘導した後、動脈の完全な処置を行った。最後に、ブプレノルフィンの単回用量を皮下投与して痛みを制御した。手術の２時間後にレーザースペックル画像（ＭｏｏｒＬＤＩ−Ｍａｒｋ２）を実施して血流閉塞の成功を確認した。
【０１６７】
細胞外小胞（ＥＶ）の単離
ＥＶを、ＯＣＴブロックで採取し、後で使用するために凍結保存されていた、直径１２ｍｍの皮膚生検から単離した。簡潔に説明すると、ブロックを解凍し、ＰＢＳで洗浄してＯＣＴを除去した。外科用メスを用いて脂肪組織の除去後に、皮膚組織を約１ｍｍ片に刻んで、ＰＢＳ中でマイクログラインダーを用いてホモジナイズした。３０００ｇで遠心分離した後、Ｅｘｏｑｕｉｃｋキット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：５の比（Ｅｘｏｑｕｉｃｋ：上清）で使用して、上清からＥＶを４℃で１２時間単離した。ＥＶを１５００ｇで３０分間の遠心分離により沈殿させた。次いで、製造業者によって提供された推奨に従って、ｍｉｒｖａｎａキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡをペレットから抽出した。
【０１６８】
ＤＮＡプラスミド調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ、カタログ番号１２１６１、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄカタログ番号７４０４１０）を用いてプラスミドを調製した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｅｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から得た。
【０１６９】
レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）および定量的リアルタイムＰＣＲ
ＬＣＭは、ＰＡＬＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのレーザー顕微解剖システムを使用して実施した。形態および／または免疫染色に基づいて同定された組織切片の特定領域を切断し、２０倍接眼レンズで捕捉した。試料を２５μｌの細胞直接溶解抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に放出した。約１，０００，０００μｍ２の組織領域を各キャップに捕捉し、次いで溶解物をさらなる処理のために−８０℃で保存した。ＬＣＭ試料のｑＲＴ−ＰＣＲは製造業者の指示に従って細胞直接溶解緩衝液から実施した。
【０１７０】
免疫組織化学および共焦点顕微鏡
特異的抗体および標準的な手順を用いて、組織免疫染色を実施した。簡潔に説明すると、ＯＣＴ包埋組織を１０μｍの厚さで凍結切片化し、冷アセトンで固定し、１０％正常ヤギ血清でブロッキングし、そして特異的抗体と共にインキュベートした。続いて、蛍光標識した適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識α−モルモット、１：２００、Ａｌｅｘａ４８８標識α−ウサギ、１：２００、Ａｌｅｘａ５６８標識α−ウサギ、１：２００）とのインキュベーションによってシグナルを可視化し、ＤＡＰＩで対比染色した。血管のレクチンベースの可視化は、組織の３０分前にＦＩＴＣ標識レクチンを尾静脈注射によって行った。レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００  ｆｉｌｔｅｒ／ｓｐｅｃｔｒａｌ）で画像を捕捉した。
【０１７１】
ＩＶＩＳ画像
動物をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ光学イメージングシステムを用いて麻酔下で画像化した。画像化の５〜１０分前に、ｒｅｐＴＯＰＴＭ  ｍｉｔｏＩＲＥマウスに基質ルシフェリン（カブトムシルシフェリンのカリウム塩、Ｐｒｏｍｅｇａ）を１００ｍｇ／ｋｇの用量で予め注射した。発光画像とのオーバーレイ画像は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して作製した。
【０１７２】
脳卒中脳の磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）
磁気共鳴血管造影法を用いて、マウスにおける本発明者らのＭＣＡＯモデルを検証し、効果的なＭＣＡＯのために閉鎖栓サイズおよび内頸動脈挿入距離を最適化した。９．４ＴのＭＲＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＭＣＡ再灌流の４８時間後に麻酔をかけたマウスに対してＴ２強調ＭＲＩを実施した。ＭＲ画像は、以下のパラメータを用いた緩和強調の高速取得（ＲＡＲＥ）シーケンスを用いて取得した：視野（ＦＯＶ）３０×３０ｍｍ、取得マトリックス２５６×２５６、ＴＲ３，５００ｍｓ、ＴＥ４６．９２ｍｓ、スライスギャップ１．０ｍｍ、希少因子８、平均数３。１ｍｍ当たり８．５ピクセルの解像度。未加工のＭＲ画像を標準ＤＩＣＯＭフォーマットに変換し、処理した。Ｏｓｉｒｉｘ  ｖ３．４を用いた画像の適切なソフトウェアコントラスト強調の後、各冠状脳スライスにおける梗塞領域を描写するために、デジタル面積測定はマスクされた観察者によって行われた。過去に報告されているように、脳切片からの梗塞面積を合計し、切片の厚さを乗じ、浮腫誘発性腫脹について補正して、梗塞体積を決定した（ＫｈａｎｎａＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１３，３３（８）：１１９７−１２０６）。
【０１７３】
筋肉エネルギーの分析
筋肉エネルギーは、ＲＦ送信用の体積コイルおよび受信用の３１Ｐコイルを使用して、９．４Ｔｅｓｌａスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃ）でＮＭＲ分光測定を評価した（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ＧＢ，ｅｔ  ａｌ．ＭＡＧＭＡ  ２０１５，２８（５）：４９３−５０１）。特注の１Ｈ／３１Ｐトランシーバーコイルアレイでインビボ画像化を実施した。単一パルス系列を用いてデータを得た。生データをノイズ低減のためにウィンドウ処理し、スペクトル領域にフーリエ変換した。
【０１７４】
血管の超音波ベースの画像および特徴付け
血管形成を超音波画像によって並行モニターした。簡潔に説明すると、Ｖｅｖｏ  ２１００システム（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｂ−ｍｏｄｅに関する超音波画像を、ＭＳ２５０直線配列プローブを用いて得た。（Ｇｎｙａｗａｌｉ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１０９（４１））。ドップラーカラーフロー画像をモニターに実装し、収縮期と拡張期下で血流特性を定量化した。
【０１７５】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイおよびＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ（ＩＰＡ）（登録商標）分析。
ＬＣＭを使用して、ＡＢＭトランスフェクトマウス皮膚からインビボ由来ｉＮについて濃縮した組織単離物を調製した（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７，１０４（３６）：１４４７２−１４４７７、Ｒｉｎｋ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１０，３０（７）：１２７５−１２８７）。単離した組織を、ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）からの溶解緩衝液中で処理した。ＲＮＡ抽出、標的標識化、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）、およびデータ分析は、過去に報告されているように実施した（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７，１０４（３６）：１４４７２−１４４７７、Ｒｉｎｋ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１０，３０（７）：１２７５−１２８７、ＲｏｙＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８，３４（２）：１６２−１８４）。試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅトランスクリプトームアレイ１．０（ＭＴＡ１．０）とハイブリダイズさせた。アレイを洗浄し、オハイオ州立大学の施設のＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で、前述のとおりスキャンした（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７，１０４（３６）：１４４７２−１４４７７、ＲｏｙＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８，３４（２）：１６２−１８４）。発現データは、シリーズアクセッション番号ＧＳＥ９２４１３でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）に提出されている。ＲＭＡ１６を用いて生データを正規化し、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳａｎｔａＣｌａｒａＣＡ）を用いて分析した。ｄＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して、データのさらなる処理を実施した（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７，１０４（３６）：１４４７２−１４４７７、ＲｏｙＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８，３４（２）：１６２−１８４）。群にわたる類似の遺伝子の機能注解は、ＩＰＡ（登録商標）分析を用いて行われた。表５および図６を参照されたい。
【表５】
2020511116.tif 000007
【表６】
2020511116.tif 000008
【０１７６】
統計分析
試料をコード化し、データ収集を盲検様式で実施した。データは、３〜８つの生物学的複製物の平均±標準誤差として報告されている。失敗したトランスフェクション（例えば、皮膚とナノチャネルとの間の接触不良、またはナノチャネルの目詰まりなどに起因する）は、分析から除外した。再現性を確認するために実験を少なくとも２回繰り返した。群間比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。統計的差異は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン１３．０を用いて、必要に応じてパラメトリック／ノンパラメトリック検定によって決定した。
【０１７７】
データ利用可能性
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現データはＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓからアクセスできる。妥当な要求があれば、追加のデータは対応する作成者から入手可能である。
【０１７８】
皮膚における電気生理学的活性のインサイチュ測定。
インビボで誘導されたニューロンの固有の興奮性を検出することに努力が集中され、この目的を達成するために細胞外記録の一般原則が使用された。しかし、細胞外記録のために使用される従来の電気生理学的技術は、マウスから組織を解剖して切り離し、形態学的に誘導されたニューロンを同定し、次いで目的の細胞に近接して細胞外電極を配置する必要があるため、実行するのが困難だった。パッチクランプ法または従来の電気生理学的測定を実施することの前述の複雑さを克服するために、細胞外空間に配置された導電性ポリマー電極のクロノアンペロメトリー測定を使用して、ニューロンの興奮性を検出した。ポリマーへのおよびポリマーからの電荷の侵入および放出の伝達関数を測定データに適用し、導電性ポリマーの二重層およびファラデー反応に対応する極および残基を計算する。伝達関数分析から計算された残基は、Ｖｅｎｕｇｏｐａｌら（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｔｅｌ  Ｍａｔ  Ｓｙｓｔ  Ｓｔｒ２０１６，２７（１２）：１７０２−１７０９）に説明されているように、ポリマーに隣接したカチオン濃度の変化に対応する。図２５に示すように、マウスのＡＢＭ処理した領域に導電性ポリマー電極を配置することによって、ニューロンの興奮性を示す、ファラデー反応に対応する残基への経時変化を観察した。
【０１７９】
酸化還元系導電性高分子カチオンセンサー操作の物理
ドデシルベンゼンスルホン酸（ＰＰｙ（ＤＢＳ））を添加したポリピロールは、電位の発生時にカチオンを局所媒体と交換する導電性ポリマーである。カチオン侵入率は、適用された電位の機能、ポリマー幾何学、ポリマーの現状、および電解質の濃度である。（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ２０１４，２０１（０）：２９３−２９９）この濃度依存性は、５〜１００ｍＭ１１の範囲にわたってＮａＣｌ濃度と直線関係を有することが実証されているカチオンセンサーの作成を可能にする。さらに、ＰＰｙ（ＤＢＳ）センサーは、それらの機能に障害を与えたり影響を与えたりすることなく、生物学的物質の局所カチオン濃度を決定することができる無毒性かつ酸化還元メディエータフリーシステムである。それゆえ、中規模のＰＰｙ（ＤＢＳ）センサーは真皮層内に存在できるプローブに製造され、インサイチュのカチオン濃度を測定する。
【０１８０】
ＰＰｙ（ＤＢＳ）膜の単一の酸化還元スイッチ（酸化還元イベント）は、ファラデーおよび二重層ベースのイオン輸送の両方を引き起こす。時間依存性イオン輸送速度論は、下式で記述される。式中、ｋ１値およびτ１値は、電気二重層を形成するイオンの総数および速度に対応し、ｋ２値およびτ２値は、ポリマーに介入するイオンの総数および割合に対応する。これに基づいて、二重層コンデンサの効果を無視することができ、カチオン濃度に対する高感度なパラメータとしてｋ２値を残した（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｔｅｌ  Ｍａｔ  Ｓｙｓｔ  Ｓｔｒ２０１６、２７（１２）：１７０２−１７０９）。
【数１】
2020511116.tif 000009
【０１８１】
陽イオン濃度の経時変化を捉えるために、ＰＰｙ（ＤＢＳ）の複数の酸化還元サイクルが必要とされる。スイッチングの周波数は、目的のシステム内の濃度変化率の推定に基づいて選択されなければならない。この場合、電気生理学的活性率は未知であったので、酸化還元周波数は５Ｈｚとなるように選択された。この周波数では、各還元サイクルの時間は、システムが定常状態に達するのに必要な時間（ポリマーの厚さおよび電解質濃度に基づいて２．５〜１０秒）よりもかなり短い（Ｎｏｒｔｈｃｕｔｔ  ＲＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ２０１６、１８（２６）：１７３６６−１７３７２）。これにより、ポリマーは各酸化還元状態の間で一定の流量で作動し、ポリマーが０．１秒以内に許容できるイオンの総数に起因してｋ２が変化する状態を作り出す。それゆえ、測定されたｋ２は局部カチオン濃度に比例する。経時的なｋ２の変化のモニタリングは、局所細胞の興奮性による陽イオン濃度の変化を直接測定する。
【０１８２】
ＰＰｙ（ＤＢＳ）微小電極の製造
白金ワイヤ（直径０．０２５ｍｍ、純度９９．９％の硬さ、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，ＵＳＡ）を石英毛管（７５×１ｍｍ、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を通して挿入して、２ｍｍの突起を形成した。突出端部をエポキシで封止し、作用電極（ＷＥ）として１ｍｍ露出白金線を残した。銀ワイヤ（直径０．５ｍｍ、純度９９．９％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を同様に処理して、１ｍｍの突出部を有する参照電極（ＲＥ）を形成した。挿入前に、銀ワイヤを次亜塩素酸ナトリウム溶液（１０〜１５％塩素）中に２０分間浸漬してＡｇ／ＡｇＣｌ層を形成した。電解重合溶液（０．２ｍＭピロール、９８％純度および０．１ｍＭドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈか）を形成し、３０分間沈降させた。電解重合セルは、Ｐｔワイヤ、Ａｇ／ＡｇＣｌ、および白金ワイヤ対極（ＣＥ）から構成されていた。サイクリックボルタンメトリー実験（ＣＶ）を行って、電気化学的接続性、ピロール活性、およびポリマー成長領域を検証した。続いて、クロノアンペロメトリー実験（ＣＡ）を、１１８．５μＣの電荷が蓄積されるまで０．５２Ｖの電位（ＣＶに基づいて）をかけて行い、０．１５Ｃｃｍ−２の電荷密度を有するＰＰｙ（ＤＢＳ）膜を作製した。その後、ＰＰｙ（ＤＢＳ）チップを脱イオン水ですすぎ洗いし、窒素流下で乾燥させた。
【０１８３】
ＰＰｙ（ＤＢＳ）微小電極の平衡化とキャリブレーション。Ｎ２流下で乾燥した後、ＰＰｙ（ＤＢＳ）センサーを生理的条件（脱イオン水中の１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と同様の保存溶液中で平衡化した。これは、１０サイクルにわたるＣＶによって行われ、サイクルに対して冗長な電流応答を確実にし、カチオン侵入に対するＰＰｙ（ＤＢＳ）チップの感度を高めた。
【０１８４】
神経細胞の興奮性の検出のためのプロトコルマウスをＡＢＭまたは対照として分類し、測定前に鎮静させた。２つの１ｍｍ穿孔を真皮層に（３〜５ｍｍ離れて）作った。表皮全体にわたって電気伝導性を確保するために、孔の間に０．９％の生理学的ＮａＣｌ溶液を注入した。次いで、１ｍｍの各プローブが表皮層に露出されるように、ナノポジショナー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてＰＰｙ（ＤＢＳ）プローブおよびＡｇ／ＡｇＣｌプローブを注射部位に挿入した。次いで、サイクリックボルタモグラムを記録して、電気化学的接続性を確実にし、系中のノイズを特徴付けた。その後、２０秒の間に１００回の酸化還元サイクルが完了するまで、０．１秒毎に還元電位と酸化電位とをスイッチングすることによって一連のクロノアンペロメトリー測定を行った。印加された還元電位および酸化電位は、ＣＶ中に観察された酸化還元ピーク（還元ピークより０．２Ｖ小さく、酸化ピークより０．２Ｖ大きい）に基づいて選択された。酸化還元スイッチングの前後に５秒間の平衡化（０Ｖ印加）ＣＡを行った。反応が試験間で同様になるまでＣＡプロセスを５〜１０回繰り返し、これは定常状態の挙動を示す。１つの挿入部位と複数の挿入部位で複数の試験が記録された。これは、挿入部位が任意に作られたので、神経細胞活性を捕捉する可能性を高めるために行われた。
【０１８５】
濃度変動に対するセンサー応答のベースライン特性センサーに対する環境ノイズの影響をさらに理解するために、１０ｍＬ容器中の０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて、サイクリックボルタンモメトリーおよびクロノアンペロメトリー測定を（上記の方法を用いて）行った。この実験は、システムの固有ノイズが特徴付けられるベースライン測定基準を確立するために用いられた。これを用いてＡＢＭマウスまたは対照マウスの「活性」を定義した。これによると、３％±の偏差が「興奮性」細胞の証拠であると考えられた。一過性を排除するために、測定の最初の２５サイクルを無視した。残りの７５回の酸化還元サイクルのうち、イオン放出を無視しながらイオンの進入の影響を捕捉するために、還元サイクルのみを検討した。最初のセクションで説明したモデルを使用して、２項指数関数をデータに適合させ、ｋ２値を得た。電極間にかなりのずれがあるだけでなく、時間に依存する偏りがあることがわかった。その結果、ｋ２値をそれらの平均で割って、五次多項式フィットを差し引くことによってｋ２値を正規化した。この方法を使用することによって、使用される電極とは無関係に、比較のための客観的基礎が得られた。
【０１８６】
結果
インビボでの核リプログラミングにおける近年の進歩は、「部位」、患者特異的な細胞に基づく治療法の発展の可能性を切り開いた。ナノチャネル化装置によってリプログラミング因子を局所的かつ制御可能に組織に送達するために、新規であるが実施が容易な非ウイルスアプローチを開発した（図１７）。そのような組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）アプローチは、配列されたナノチャネルを通して非常に強く集中した電場を印加することによってリプログラミング因子の直接的な細胞質ゾル送達を可能にし（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６，１２（２）：３９９−４０９、Ｂｏｕｋａｎｙ  ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１，６（１１）：７４７−７５４）、それは、並置組織細胞膜を無害にナノ穿孔し、リプログラミング因子を細胞内に電気泳動により打ち込む（図１７ａ〜ｄ）。ＴＮＴシステム製造過程およびシミュレーション結果に関する詳細な情報は、図２０および図２１に見出すことができる。遺伝子送達が本質的に非常に確率論的であり、有害な副作用（例えば、炎症反応、細胞死）をもたらし得る現在のインビボトランスフェクション技術（例えば、ウイルス、従来の組織バルクエレクトロポレーションまたはＢＥＰ）とは対照的に（Ｓｅｎ  ＣＫ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１５、１８５（１０）：２６２９〜２６４０）、ナノチャネルベースのトランスフェクションは、単一細胞レベルでのより集中的（図１７ｂ、ｃ）かつ十分な（図１７ｄ）リプログラミング因子送達を可能にする。したがって、これを決定論的インビボ遺伝子トランスフェクションおよびリプログラミングのための強力なツールにしている（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６、１２（２）：３９９−４０９、Ｂｏｕｋａｎｙ  ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１，６（１１）：７４７−７５４）。
【０１８７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対するＦＡＭ標識ＤＮＡを用いた実験は、ＴＮＴが迅速（＜１秒）かつ非侵襲的／局所的様式で、カーゴを皮膚に送達できることを立証した（図１７ｅ）。次に、リプログラミング因子のＴＮＴベースの局所送達が皮膚リプログラミングの成功をもたらすことができるかどうかを、Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）の過剰発現がインビトロで線維芽細胞を誘導ニューロン（ｉＮ）に直接リプログラミングすることが知られている頑強なモデルを用いて試験した（Ｇａｌｌｅｇｏ−ＰｅｒｅｚＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６，１２（２）：３９９−４０９、ＶｉｅｒｂｕｃｈｅｎＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６３（７２８４）：１０３５−１０４１）。他の妥当なメカニズム（Ｄａｖｉｓ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８，９（６）：４３１−４３６）の中でも、ＴＮＴはリプログラミング因子の局所送達に使用できるだけでなく（図１７ｆ）、標的遺伝子ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡに富む細胞外小胞（ＥＶ）の派遣を介して（図１７ｈ、ｉ）（Ｖａｌａｄｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７，９（６）：６５４−６５９）、初期のトランスフェクション境界（すなわち表皮）を超えたリプログラミング刺激の伝播（すなわち表皮から真皮）をもたらす協調的応答を調整することもできる（図１７ｇ〜ｉ）。ＴＮＴ処理した皮膚から単離されたＡＢＭ負荷したＥＶにナイーブ細胞を曝露することによって（図１７ｊ−１）、これらのＥＶが遠隔細胞によって自発的に内在化され、リプログラミングを引き起こし得ることが立証された（図１７ｋ、ｌおよび２２）。さらに、遺伝子発現分析は、皮内ＡＢＭ  ＥＶ注射が、Ｔｕｊ１発現の増加によって証明されるように、ニューロン誘導と一致する皮膚の変化を引き起こすことを示した（図２３）。皮膚由来のＡＢＭ６７負荷ＥＶの神経栄養効果は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）脳卒中マウスモデルにおいてさらに確認された（図２４）（Ｋｈａｎｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１３，３３（８）：１１９７−１２０６）。
【０１８８】
皮膚細胞リプログラミングの成功は免疫蛍光法によって検証され、それはＴｕｊ１およびニューロフィラメントの発現の経時的な増加を示した（図１７ｍ、ｎ）。インビトロおよびインビボ由来のｉＮを比較する全ゲノムトランスクリプトームアレイ分析を介してさらなる特徴付けを行った（図２５）。ニューロンの興奮性を示す電気生理学的活性は、新規ポリピロール（ＰＰｙ）ベースのバイオセンシングプラットフォーム（図２６）を介して、約５０％のＡＢＭトランスフェクトマウス（図１７ｏ）において首尾よく検出およびモニターされた（インサイチュ）（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｔｅｌ  Ｍａｔ  Ｓｙｓｔ  Ｓｔｒ  ２０１６、２７（１２）：１７０２−１７０９）。対照マウスのいずれにもこのような活性は検出されなかった。Ｋ１４−Ｃｒｅレポーターマウスモデルを用いた系統追跡実験により、新たに誘導されたニューロンは部分的にＫ１４＋皮膚細胞に由来することが証明された（図２７）。毛嚢もまた一貫して顕著なＴｕｊ１免疫反応性を示し、これは濾胞細胞が再プログラミング過程に参加し得ることを示唆している（Ｈｕｎｔ  ＤＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８，２６（１）：１６３−１７２、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０１２，１３２（６）：１７２５−１７２７）。Ｃｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデル（図２７）を用いた追加実験では、活性なＣｏｌ１Ａ１プロモーターを有する細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）がｅＧＦＰを発現し、Ｔｕｊ１＋への移行期に真皮にいくつかのコラーゲン／ｅＧＦＰ＋が存在することを示し、それによって皮膚内のリプログラミングされた細胞の線維芽細胞由来が示唆された。
【０１８９】
ケーススタディとしてｉＮを使用したインビボでのリプログラミングの成功についてＴＮＴプラットフォームを検証したので、皮膚細胞を誘導された内皮細胞（ｉＥＣ）にリプログラミングすることができる、堅牢で単純な非ウイルス方法論を開発した。この目的のために、過去の報告と比較して（Ｍｏｒｉｔａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１５，１１２（１）：１６０−１６５）、体細胞のｉＥＣへのより迅速で効果的なリプログラミングを促進するために、一連のリプログラミング因子、Ｅｔｖ２、Ｆｏｘｃ２、およびＦｌｉ１（ＥＦＦ）を同定および検証した（インビトロで）（図２８および２９）。インビトロの非ウイルストランスフェクションおよびリプログラミング実験（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６，１２（２）：３９９−４０９）は、ＥＦＦがヒトおよびマウスの初代線維芽細胞を迅速（１週間未満）かつ効率的にｉＥＣにリプログラミングできることを示した。（図２８）。
【０１９０】
直接的な内皮細胞リプログラミングを誘導するＥＦＦの有効性がインビトロで確立した後、このパラダイムをインビボで試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮膚へのこれら３つの遺伝子の共トランスフェクションは、増殖活性の増強（図３０）に加えて、対照皮膚（図１８ａ〜ｃ）と比較して、Ｐｅｃａｍ−１およびｖＷＦ発現の有意な増加によって証明されるように、１週間以内に著しい間質のリプログラミングをもたらした。Ｋ１４−ＣｒｅレポーターおよびＣｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデルを用いた実験によって、リプログラミングした細胞集団は大部分が真皮由来であることが証明された（図３１）。背部皮膚の高解像度レーザースペックル（ＨＲＬＳ）画像は、ＥＦＦのＴＮＴベースの送達が３日以内に治療領域への血流を増強することを示した（図１８ｄ、ｅ）。超音波画像は、皮膚の表面からわずか３ｍｍ離れた予想外の拍動性血流を検出し（図１８ｆ、右）、局所機能性皮膚動脈を有する新たに形成された血管吻合の成功を実証した。対照マウスでは、血管は典型的には皮膚表面付近では検出されなかったことに留意されたい（図１８ｆ、左）。
【０１９１】
血管内皮を誘導するためのＥＦＦカクテルの頑強性がインビトロおよびインビボの両方で実証された後、ＥＦＦ  ＴＮＴ媒介性局所皮膚リプログラミングが虚血組織の機能的再潅流をもたらし得るかどうかを調べるために実験を行った。この概念をまず、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全層性２×１ｃｍ２の単茎背部皮膚皮弁で試験した。これにより、皮弁した組織への血液供給は頭側アタッチメントからのみもたらされた（図１８ｇ）。ＥＦＦ処理後のレーザースペックルモニタリングは、対照皮弁と比較してより高い血液灌流を示した（図２ｈ）。予想通り、対照皮弁は組織壊死の有意な徴候を示した（図１８ｇ−上、ｉ）。そのような組織損傷はＥＦＦトランスフェクションに応答して有意に制限された。したがって、ＴＮＴ媒介性ＥＦＦ送達およびその後の間質のリプログラミングは、虚血条件下で組織壊死を効果的に打ち消した。
【０１９２】
最後に、ＴＮＴベースのＥＦＦの送達が四肢全体の救済をもたらすことができるかどうかを検証するために、ＴＮＴを後肢虚血Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルで試験した（図１９ａ）。大腿動脈を切断した３日後に、大腿内皮に対してＥＦＦ  ＴＮＴを実施した。レーザースペックルモニタリングは、手術直後に肢への血流の有意な減少を記録した（図１９ｂ）。対照の虚血肢と比較して、ＥＦＦ処置した肢はＴＮＴ後７日目という早い時期に灌流の改善を示した（図１９ｂ、ｃ）。ＨＲＬＳ画像は、対照と比較してＥＦＦ処置した肢における小さい側副の発生率の増加を示した（図３２）。肉眼的分析は、ＥＦＦ処置したものと比較して、対照肢においてより顕著な組織壊死の徴候を示した（図１９ｄ）。損傷誘発性の虚血肢２３、２４から、より有害な副作用を経験する傾向にあるＢａｌｂ／ｃマウスでの追加実験は、ＥＦＦトランスフェクションもまた、肢灌流の成功をもたらし、壊死および自己切断の発生率を最小限に抑えることを示した（図３３）。核磁気共鳴画像法（ＮＭＲ）による筋肉エネルギー試験は、対照と比較してＥＦＦ処理した肢におけるＡＴＰおよびホスホクレアチン（ＰＣｒ）のレベルの増加を示した（図１９ｅ）。免疫蛍光分析は、処理領域をはるかに超えて著しい血行再建を明らかにした。血管新生は、腓腹筋のような肢内のより遠位の位置でも誘導された（図１９ｆ、３４）。そのような反応の根底にあるメカニズムはさらに解明されなければならないが、ＥＦＦ処理した背部皮膚から単離された自己由来ＥＶは、後肢虚血マウスモデルにおいて腓腹筋に直接注射されると血管形成を誘発する可能性があることが示された（図３５）。並行インビトロ実験は、そのようなＥＶがナイーブ細胞においてリプログラミングを誘導できることを証明した（図３６）。したがって、ＥＦＦ処理した組織から送り出されたＥＶが、ｉＥＣ促進リプログラミングシグナルの伝播のメディエータとしての役割を果たすことが提示された。ＰＣＲ分析によって、形質導入されたＥＦＦ  ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡに加えて、これらのＥＶもまた血管新生促進ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ  ｍＲＮＡを前負荷しているように見えることが明らかにされた（図３５）。このことは、ＥＦＦ処理した皮膚由来のＥＶが、標的組織全体にＥＦＦリプログラミングシグナルを伝播するための生存機構を表すだけでなく、トランスフェクション後の最初の数時間以内に血管新生促進シグナルを拡散することによって適所の前条件づけの役割を果たし得ることを示唆している。
【０１９３】
したがって、ＴＮＴを使用して、迅速で非常に効果的かつ非侵襲的な方法で、リプログラミング因子を皮膚に送達することができる。そのようなＴＮＴ送達は、確立されかつ新しく開発されたｉＮおよびｉＥＣそれぞれのリプログラミングモデルで実証されるように、仕立てられた皮膚組織リプログラミングをもたらす。ＴＮＴ誘導した皮膚由来のｉＥＣは、親循環系とうまく吻合した血管ネットワークを急速に形成し、損傷誘導性虚血の２つのマウスモデルにおいて組織および肢灌流を回復した。ＴＮＴベースの組織リプログラミングは、患者自身の組織を免疫学的に調査された豊富なバイオリアクターとして使用することを最終的に可能にし、回収時に、局所的に／部位で、または遠位で病態を解決できる自己細胞を産生する可能性を有する。わずか数秒続く局所的な一回限りの処理を通して強力で好ましい生物学的応答を引き出して伝播する、ＴＮＴアプローチを実装するこの簡単さはまた、オリゴＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ）媒介性リプログラミング（図３７）（Ａｎｏｋｙｅ−ＤａｎｓｏＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２０１１、８（４）：３７６−３８８）、遺伝子調節、編集などを含む、プラスミドＤＮＡベースのリプログラミング戦略を超えた応用を見出す可能性がある。
【０１９４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本開示の発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての刊行物、ならびにそれらが引用される対象となる資料は、参照により明確に組み込まれる。
【０１９５】
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認めるか、または確認することができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020511116.tif 000011
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2020511116.tif 000064
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
2020511116.tif 000071
【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
2020511116.tif 000075
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
2020511116.tif 000095
【図１５Ｈ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ−１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ−２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２０Ｊ】
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【図２０Ｋ】
2020511116.tif 000139
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ−２１Ｃ】
2020511116.tif 000141
【図２１Ｄ−２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
2020511116.tif 000155
【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2020511116.tif 000158
【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ−２７ａ．１】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
2020511116.tif 000163
【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
2020511116.tif 000165
【図２８Ｅ】
2020511116.tif 000166
【図２８Ｆ】
2020511116.tif 000167
【図２８Ｇ】
2020511116.tif 000168
【図２８Ｈ】
2020511116.tif 000169
【図２８Ｉ】
2020511116.tif 000170
【図２８Ｊ】
2020511116.tif 000171
【図２９Ａ】
2020511116.tif 000172
【図２９Ｂ】
2020511116.tif 000173
【図３０Ａ】
2020511116.tif 000174
【図３０Ｂ】
2020511116.tif 000175
【図３１Ａ−３１Ｂ】
2020511116.tif 000176
【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
2020511116.tif 000180
【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
2020511116.tif 000183
【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
2020511116.tif 000185
【図３５Ｅ】
2020511116.tif 000186
【図３５Ｆ】
2020511116.tif 000187
【図３６Ａ】
2020511116.tif 000188
【図３６Ｂ】
2020511116.tif 000189
【図３６Ｃ】
2020511116.tif 000190
【図３６Ｄ】
2020511116.tif 000191
【図３６Ｅ】
2020511116.tif 000192
【図３７Ａ】
2020511116.tif 000193
【図３７Ｂ】
2020511116.tif 000194
【図３７Ｃ】
2020511116.tif 000195
【図３８】
2020511116.tif 000196
【配列表】
2020511116000001.app
【国際調査報告】
2020511116.tif 000197
2020511116.tif 000198
2020511116.tif 000199
2020511116.tif 000200