(57)【要約】  オートファジーは、典型的には、飢餓により活性化され、細胞及び生物がエネルギー貯蔵を動員することを可能にする。オートファジーの薬理学的モジュレーションは、治療可能性に相当することが公知である。本明細書では、本発明者らは、非従来型のオートファジー依存的な方法で細胞から放出されるタンパク質、すなわちジアゼパム結合インヒビター（ＤＢＩ）が、オートファジーをレギュレーションすることを報告する。特に、本発明者らは、ＤＢＩがオートファジーを阻害し、マウスへのリコンビナントＤＢＩの供給が解糖を増強し、脂質生成を増強し、脂肪酸酸化を阻害したことを実証する。本発明者らは、モノクローナル抗体によるＤＢＩの中和と、自己抗体を誘発する免疫原性ＤＢＩ誘導体による能動免疫とがオートファジーを誘導し、飢餓誘導性体重減少を増加させ、再給餌による食物摂取を減少させ、高カロリー食に応じた体重増加を減少させる代謝変化をもたらすことを示す。したがって、本発明は、ＤＢＩの活性又は発現のモジュレーションに基づいてオートファジーをモジュレーションするための方法及び医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体におけるオートファジーを阻害する方法であって、ＤＢＩの活性又は発現を促進する治療有効量の薬剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が低体重である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が消耗障害を患っている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、食欲不振悪液質、高齢食欲不振、神経性食欲不振、ガンに関連する悪液質、ＡＩＤＳに関連する悪液質、心不全に関連する悪液質、嚢胞性線維症に関連する悪液質、関節リウマチに関連する悪液質、腎疾患に関連する悪液質、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する悪液質、ＡＬＳに関連する悪液質、腎不全に関連する悪液質又は関連悪液質、並びに異常な食欲、体脂肪、エネルギーバランス及び／又は意図的ではない体重減少に関連する他の障害を患っている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、ガン疾患、神経変性疾患、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患からなる群より選択される疾患を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＢＩの活性を促進する前記薬剤が、ｉ）配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉ）配列番号１の１７位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１の３３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｖ）配列番号１の４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＤＢＩの発現を促進する前記薬剤が、請求項６の前記ポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＢＩの活性を促進する前記薬剤が、ＤＢＩの活性を模倣する小有機分子又はペプチド模倣物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
それを必要とする被験体におけるオートファジーを刺激する方法であって、ＤＢＩの活性又は発現を阻害する治療有効量の薬剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記被験体が過体重である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が肥満を患っている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が２型糖尿病又はメタボリックシンドロームを患っている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体が、ガン、神経変性疾患、感染性疾患、肺気腫といった肺疾患、嚢胞性線維症、肝疾患、膵炎又はタンパク質症を患っている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＢＩの活性又は発現を阻害する治療有効量の前記薬剤及び治療有効量の化学療法剤を、ガンを患っている前記被験体に投与することを含み、前記化学療法剤の前に、ＤＢＩの活性又は発現を阻害する前記薬剤を投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＢＩの活性を阻害する前記薬剤が、ＤＢＩに対する抗体又はアプタマーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列からなるフラグメントに対するものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、モノクローナルキメラ抗体、モノクローナルヒト化抗体又はモノクローナルヒト抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＢＩの発現を阻害する前記薬剤が、ｓｉＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムといった発現の阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＢＩの活性を阻害する前記薬剤が、前記被験体に投与された場合に、ＤＢＩに対する自己抗体の中和を誘発するために適切なワクチン組成物からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ワクチン組成物が、ｉ）配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉ）配列番号１の１７位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１の３３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｖ）配列番号１の４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる抗原を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、前記ワクチンに対する強力な免疫反応を誘発するために一般に十分に外来性である担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ワクチン組成物がアジュバントを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
オートファジーをモジュレーションするために適切な化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）候補化合物を提供すること、ｉｉ）前記候補化合物がＤＢＩの活性又は発現をモジュレーションすることができるかを決定すること、及びｉｉｉ）ＤＢＩの活性又は発現をモジュレーションすることができる前記候補化合物をポジティブ選択することを含む、方法。
【請求項２５】
被験体が体重モジュレーションのリスクがあるかを決定する方法であって、ｉ）前記被験体から得られた血液サンプル中のＤＢＩのレベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）において決定した前記レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）において決定した前記レベルと前記所定の基準値との間の差が決定された場合、前記被験体が体重モジュレーションのリスクがあると結論することを含む、方法。
【請求項２６】
それを必要とする被験体における非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を処置する方法であって、ＤＢＩの活性又は発現を阻害する治療有効量の薬剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、オートファジーをモジュレーションするための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
オートファジー（「自食」）は、細胞生物学における微妙に制御されているが最も壮観な現象の１つであり、細胞質構造のターンオーバーを促進し、栄養不足を含む変化するストレス条件への細胞の適応を可能にすることにより、細胞及び生物の恒常性の維持において重要な役割を果たす（１、２）。いくつかのリーダーレスタンパク質（これは、ゴルジを回避する非従来型経路を介してのみ放出され得る）の細胞分泌は、オートファジーと強く関連する（３〜７）。１つのこのようなタンパク質は、ジアゼパム結合タンパク質（ＤＢＩ）又はアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）結合タンパク質（ＡＣＢＰ）として公知の系統発生学的に古い因子である（３、４）。ヒト又はマウスＤＢＩは、すなわち、細胞内（それが長鎖アシルＣｏＡ分子に結合する場所）ではＡＣＢＰとして、及び細胞外（タンパク質全体又はその分解生成物であるトリアコンタテトラニューロペプチド［ＴＴＮ、残基１７〜５０］及びオクタデカニューロプチド［ＯＤＮ、残基３３〜５０］が、γ−アミノ酪酸タイプＡレセプターＧＡＢＡＡＲのベンゾジアゼピン結合部位と相互作用し、ＧＴＰタンパク質共役レセプターＧＰＣＲとしてその活性をモジュレーションし得る場所）ではＤＢＩとして、２つの全く異なる機能を有する８７アミノ酸の小さなタンパク質（１０kDa）である（８〜１０）。ＤＢＩ及びそのタンパク質分解フラグメントはまた、末梢型ベンゾジアゼピンレセプター（ＰＢＲ）（１１〜１３）及び未だ同定されていないＧＰＣＲ（ＯＤＮ−ＧＰＣＲ）（１４〜１７）に結合する。しかしながら、オートファジーのフィードバックレギュレーションにおけるＤＢＩ分泌の役割は調査されていない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、オートファジーをモジュレーションするための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲により定義される。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
発明の詳細な説明：
オートファジーは、典型的には、飢餓により活性化され、細胞及び生物がエネルギー貯蔵を動員することを可能にする。本明細書では、本発明者らは、非従来型のオートファジー非依存的な方法で細胞から放出されるタンパク質、すなわちアシル補酵素Ａ結合タンパク質（ＡＣＢＰ）としても公知のジアゼパム結合インヒビター（ＤＢＩ）が、３つのレベルでオートファジーをレギュレーションすることを報告する。第１に、オートファジーはＤＢＩ分泌を引き起こし、細胞からこのオートファジー促進因子を枯渇させる（オートクリンレギュレーション）。第２に、オートファジーは、細胞外空間におけるＤＢＩの蓄積を引き起こし、ＤＢＩが他の細胞に対して作用してオートファジーを阻害することを可能にする（パラクリンレギュレーション）。第３に、循環ＤＢＩは摂食行動を刺激するので、オートファジー誘導の主な原因を除去する（エンドクリンレギュレーション）。ヒトでは、血漿ＤＢＩレベルは肥満で増加する。マウスへのリコンビナントＤＢＩの追加供給は、解糖を増強し、脂質生成を増強し、脂肪酸酸化を阻害した。本発明者らはまた、自己抗体を誘発する免疫原性ＤＢＩ誘導体により、ＤＢＩを中和するための３つの戦略、すなわち、誘導性全身ノックアウト、受動免疫及び能動免疫を設計した。これらの戦略は、飢餓誘導性体重減少を増加させ、再給餌による食物摂取を減少させる代謝変化を促す。
【０００５】
一般的な定義：
本明細書で使用される場合、「被験体」、「個体」又は「患者」という用語は互換的に使用され、診断、処置又は治療が望まれる任意の被験体、特にヒトを指す。他の被験体としては、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられ得る。いくつかの好ましい実施態様では、被験体はヒトである。
【０００６】
「オートファジー」という用語はマクロオートファジーを指し、特に指定がない限り、細胞自身の成分；例えば、長寿命タンパク質、タンパク質凝集体、細胞小器官、細胞膜、細胞小器官膜及び他の細胞成分の分解を伴う異化プロセスである。オートファジーの機構は、（ｉ）細胞のターゲット領域周囲の膜の形成、細胞質の残りの部分から内容物の分離、（ｉｉ）その結果として生じた小胞とリソソームとの融合、及びその後の小胞内容物の分解を含み得る。オートファジーという用語はまた、飢餓細胞が不要なプロセスからより重要なプロセスに栄養分を再配分する機構の１つを指し得る。また、例えば、オートファジーはいくつかの疾患の進行を阻害し得、細胞内病原体による感染に対する保護的な役割を果たし得る。オートファジーの急性、断続的又は連続的な刺激は、動脈硬化、心不全、ガン及び神経変性を含む老化及び加齢関連疾患を遅延させ得る。オートファジーの刺激はまた、高脂肪若しくは高糖質の食事又は高塩により誘導される体重増加、肥満、メタボリックシンドローム、高血圧及び糖尿病を減少させ得る。
【０００７】
本明細書で使用される場合、「ボディマスインデックス」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、身長（メートル単位）の平方当たりの体重（kg/m2）として計算される比を指す。ＢＭＩは、個体の体重が、彼又は彼女の身長の人にとって正常な又は望ましいものからどれだけ離れているかを評価する簡単な手段を提供する。ＢＭＩカテゴリの一般的な定義は、以下のとおりである：飢餓：１５kg/m2未満のＢＭＩ；低体重−１８．５kg/m2未満のＢＭＩ；理想−１８．５〜２５kg/m2のＢＭＩ；過体重−２５〜３０kg/m2のＢＭＩ；肥満−３０〜４０kg/m2のＢＭＩ；病的肥満−４０kg/m2を超えるＢＭＩ。簡単であるが、人の体重特性を特性評価するＢＭＩ法は、常に正しいとは限らない。例えば、ＢＭＩは、フレームサイズ、筋肉質又は個体の骨、軟骨及び水分量の様々な割合の要因を考慮しない。したがって、体脂肪量の実際のレベルに関するＢＭＩの精度は、フィットネスレベル、筋肉量、骨構造、性別及び民族性などの要因により歪められ得る。また、低身長の人及び高齢者は、より低いＢＭＩ値を有する傾向がある。しかしながら、熟練者、例えば医師は、任意の所定の個体のＢＭＩ評価を行う場合に、これらの要因を考慮することができるであろうと考えられる。
【０００８】
本明細書で使用される場合、「ガン」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、限定されないが、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む。ガンという用語は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患を含む。「ガン」という用語は、原発性ガン及び転移性ガンの両方をさらに包含する。本発明の方法及び組成物により処置され得るガンの例としては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮に由来するガン細胞が挙げられる。加えて、ガンは、限定されないが、特に以下の組織型、悪性新生物；ガン腫、未分化ガン；巨細胞ガン及び紡錘形細胞ガン；小細胞ガン；乳頭ガン；扁平上皮ガン；リンパ上皮ガン；基底細胞ガン；石灰化上皮ガン；移行上皮ガン；乳頭状移行上皮ガン；腺ガン；悪性ガストリノーマ；胆管細胞ガン；肝細胞ガン；混合型肝細胞ガン及び胆管細胞ガン；索状腺ガン；腺様嚢胞ガン；腺腫様ポリープの腺ガン；家族性大腸ポリポーシス腺ガン；固形ガン；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺ガン；乳頭状腺ガン；色素嫌性ガン；好酸性ガン；好酸性腺ガン；好塩基性ガン；明細胞腺ガン；顆粒細胞ガン；濾胞腺ガン；乳頭状濾胞腺ガン；非被包性硬化性ガン；副腎皮質ガン；子宮内膜ガン；皮膚付属器ガン；アポクリン腺ガン；皮脂腺ガン；耳垢腺ガン；粘表皮ガン；嚢胞腺ガン；乳頭状嚢胞腺ガン；乳頭状漿液嚢胞腺ガン；粘液性嚢胞腺ガン；粘液性腺ガン；印環細胞ガン；浸潤性乳管ガン；髄様ガン；小葉ガン；炎症性ガン；乳房ページェット病；腺房細胞ガン；腺扁平上皮ガン；扁平上皮異形成を伴う腺ガン；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性芽細胞腫；セルトリ細胞腫；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫；悪性パラガングリオーマ；悪性乳房外パラガングリオーマ；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑内の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；繊維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；悪性混合腫瘍；ミューラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；ガン肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性ガン腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛ガン；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞性リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；他の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫及び有毛細胞性白血病であり得る。
【０００９】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、コードアミノ酸及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。この用語は、限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する又は有しない異種及び相同シグナル配列との融合物；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；などを含む融合タンパク質を含む。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「ＤＢＩ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＢＩ遺伝子（遺伝子ＩＤ：１６２２）によりコードされるジアゼパム結合インヒビターであるアシルＣｏＡ結合タンパク質を指す。この用語は、ＥＰ；ＡＣＢＰ；ＡＣＢＤ１；及びＣＣＫ−ＲＰとしても公知である。例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＮＩ参照配列ＮＰ＿００１０７３３３１．１（配列番号１）（アシルＣｏＡ結合タンパク質アイソフォーム１）により表される。例示的なヒト核酸配列は、ＮＣＮＩ参照配列ＮＭ＿００１０７９８６２．２（配列番号２）（アシルＣｏＡ結合タンパク質アイソフォーム１）により表される。
【表１】
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【００１１】
本明細書で使用される場合、「ＤＢＩ活性」という用語は、とりわけ、オートファジーの阻害、低血糖の誘導、食物摂取の刺激、体重増加の刺激、脂肪酸酸化の減少、グルコース輸送体のアップレギュレーション、ＰＰＡＲＧのアップレギュレーション、グルコース取り込みの刺激、解糖の刺激又は脂質生成の刺激を含むＤＩＢの任意の生物学的活性を指す。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患するリスクがあるか又は疾患に罹患していると疑われる患者、並びに病気であるか又は疾患若しくは病状を患っていると診断された患者の処置を含む、予防的又は予防処置並びに治癒的な又は疾患改変的な処置を指し、臨床的再発の抑制を含む。障害若しくは再発性障害の１つ以上の症候を予防し、治癒し、その発症を遅延させ、その重症度を減少させ、若しくは改善するために、又はこのような処置の非存在下で予想されるよりも被験体の生存を延長するために、処置は、医学的障害を有するか又は最終的に障害を獲得し得る被験体に投与され得る。「治療レジメン」は、病気の処置のパターン、例えば治療中に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に、高レベルの薬物を患者に提供することである。導入レジメンは、維持レジメン中に医師が用いるであろうよりも高用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る「ローディングレジメン」を（部分的に又は全体的に）用い得る。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中の患者の維持のために、例えば、長期間（数カ月間又は数年間）にわたって患者を寛解状態に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、持続的治療（例えば、薬物を定期的な間隔、例えば毎週、毎月、毎年などで投与すること）又は間欠的治療（例えば、断続的処置、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の所定基準［例えば、疾患徴候など］を満たした際の処置）を用い得る。
【００１３】
「治療有効量」は、治療効果を達成するための本発明の薬剤の十分な量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医により決定されると理解されよう。任意の特定の被験体のための特定の治療有効用量レベルは、処置されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般健康、性別及び食事；投与時間、投与経路及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の類似要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当技術分野の技術の範囲内である。しかしながら、製品の１日投与量は、０．０１〜４，０００mg／成人／日の広範囲で変動し得る。典型的には、組成物は、処置すべき被験体への投与量の対症調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、５００及び１０００mgの有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約１０００mgの有効成分を含有する。有効量の薬物は、通常、１日当たり０．０００２mg/kg〜約５０mg/kg体重、とりわけ１日当たり約０．００１mg/kg〜１０mg/kg体重の投与量レベルで供給される。
【００１４】
オートファジーを阻害する方法：
したがって、本発明の第１の目的は、それを必要とする被験体におけるオートファジーを阻害する方法であって、ＤＢＩの活性又は発現を促進する治療有効量の薬剤を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施態様では、オートファジーを阻害する本発明の方法は、食欲及びその結果として体重増加を刺激するために特に適切である。特に、本発明の方法はまた、グルコース取り込み及び脂質生成を促進するために特に適切である。したがって、本発明の方法は、本明細書に後述される様々な疾患の処置に特に適切である。
【００１６】
したがって、いくつかの実施態様では、被験体は低体重である。本明細書における場合、「低体重」という用語は、１８．５未満のボディマスインデックスを有する被験体を指す。
【００１７】
低体重は、いくつかの原因、例えば急速な代謝、粗末な／不十分な食事又は飢餓（栄養失調）、腸機能不全による吸収不良、内分泌障害、例えばＩ型糖尿病、精神的問題（例えば、神経性食欲不振、身体醜形障害、ストレス及び不安）並びに慢性病及び老化による体重減少によるものであり得る。一般に、低体重の根本的な原因自体を処置しなければならないが、低体重も健康被害であり得るので、このようなものそれ自体を処置しなければならない。実際、低体重を患っている人は、一般に、肉体的スタミナ不良、弱い免疫系を有し、骨粗鬆症、心臓病及び血管疾患などの疾患を発症するより高いリスクがある。加えて、女性では、低体重は、性成熟の遅延、遅延無月経又は妊娠中の合併症につながり得る。
【００１８】
いくつかの実施態様では、被験体は消耗障害を患っている。本明細書で使用される場合、「消耗障害」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、限定されないが、食欲不振悪液質、高齢食欲不振、神経性食欲不振、ガンに関連する悪液質、ＡＩＤＳに関連する悪液質、心不全に関連する悪液質、嚢胞性線維症に関連する悪液質、関節リウマチに関連する悪液質、腎疾患に関連する悪液質、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する悪液質、ＡＬＳに関連する悪液質、腎不全に関連する悪液質又は関連悪液質、並びに異常な食欲、体脂肪、エネルギーバランス及び／又は意図的ではない体重減少に関連する他の障害を含む。
【００１９】
いくつかの実施態様では、被験体は「悪液質」を患っている。本明細書で使用される場合、「悪液質」という用語は、体脂肪及び筋肉量の喪失を伴う身体的消耗の症状に使用される。一般に、悪液質は、ガン、必要な免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、心臓病、感染性疾患、ショック、火傷、エンドトキシン血症、臓器炎症、手術、糖尿病、コラーゲン病などの症状、放射線療法及び化学療法に関連し得るか、又はそれらによるものであり得る。これらの疾患の多くでは、悪液質は、罹患率又は死亡率に有意に寄与し得る。悪液質状態を発症しやすい別の特定の群の個体群は、例えば、胃ガン及び潰瘍の患者で実践され得る胃切除術を受けた個体である。
【００２０】
いくつかの実施態様では、被験体は食欲不振を患っている。本明細書で使用される場合、「食欲不振」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、食欲の顕著な減少又は全面的な食物嫌悪を特徴とする摂食障害を指す。いくつかの実施態様では、被験体は神経性食欲不振を患っている。一般に、神経性食欲不振を患っている被験体は、１７．５kg/m2未満のＢＭＩを有する。
【００２１】
したがって、本発明は、１つ以上の消耗障害、例えば食欲不振悪液質、高齢食欲不振、神経性食欲不振、ガンに関連する悪液質、ＡＩＤＳに関連する悪液質、心不全に関連する悪液質、嚢胞性線維症に関連する悪液質、関節リウマチに関連する悪液質、腎疾患に関連する悪液質、ＣＯＰＤに関連する悪液質、ＡＬＳに関連する悪液質、腎不全に関連する悪液質若しくは関連悪液質又は股関節骨折を示す患者を処置し、重症患者の死亡率及び罹患率を減少させる方法であって、このような処置を必要とする患者に、ＤＢＩの活性又は発現を促進する治療有効な薬剤を投与することを含む方法に関する。
【００２２】
いくつかの実施態様では、被験体は、ガン疾患、神経変性疾患、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患からなる群より選択される疾患を患っている。
【００２３】
いくつかの実施態様では、被験体はガンを患っている。特に、オートファジーは腫瘍の進行に不可欠であるように思われ、代謝要件の増加のためのビルディングブロック及びエネルギーを腫瘍に提供する。ＤＢＩの活性又は発現を促進する薬剤を単独で又は化学療法薬と組み合わせて投与することによる腫瘍の代謝環境のモジュレーションは、基本的な及び飢餓誘導性のオートファジーの抑制につながり、死に対して腫瘍細胞を感受性にし得る。したがって、ＤＢＩの活性又は発現を促進する本発明の薬剤は、進行性ガンの処置に適切であろう。いくつかの実施態様では、ガンはオートファジーコンピテントガンである。本明細書で使用される場合、「オートファジーコンピテントガン」という用語は、オートファジーが起こり得るガンを示す。いくつかの実施態様では、ＡＴＧ５又はＡＴＧ７欠損は検出されない。本発明の文脈では、「ＡＴＧ５又はＡＴＧ７欠損」という用語は、被験体の腫瘍細胞又はその一部が、ＡＴＧ５又はＡＴＧ７機能不全、ＡＴＧ５又はＡＴＧ７遺伝子の低発現又はヌル発現を有することを示す。前記欠損は、典型的には、プレＡＲＮｍがＮＭＤ（非感覚媒介性崩壊）系により分解されるようなＡＴＧ５又はＡＴＧ７遺伝子の突然変異に起因し得る。前記欠損はまた、典型的には、タンパク質がミスフォールディングされてプロテアソームを介して分解されるような突然変異に起因し得る。前記欠損はまた、タンパク質の機能不全につながる機能喪失突然変異に起因し得る。前記欠損はまた、被験体の細胞において遺伝子が低発現されるような遺伝子発現のエピジェネティックコントロール（例えば、メチル化）に起因し得る。前記欠損はまた、特定のシグナリング経路により誘導されるＡＴＧ５又はＡＴＧ７遺伝子の抑制に起因し得る。前記欠損はまた、ＡＴＧ５又はＡＴＧ７遺伝子の発現をコントロールするヌクレオチド配列の突然変異に起因し得る。
【００２４】
いくつかの実施態様では、被験体は、オートファジーの阻害が適切である神経変性疾患を患っている。典型的には、被験体は筋萎縮性側索硬化症を患っている。本明細書で使用される場合、「筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）」という用語は、古典的（シャルコー）ＡＬＳの名称で公知の神経変性症候群のスペクトル、ルー・ゲーリック病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、球麻痺発症型ＡＬＳ、脊髄発症型ＡＬＳ及び多系統病変を伴うＡＬＳを含む(Wijesekera LC and Leigh PN. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet)。
【００２５】
いくつかの実施態様では、被験体はサルコペニアを患っている。本明細書で使用される場合、「サルコペニア」という用語は、老化により引き起こされる骨格筋量の漸進的減少を意味し、これは、筋肉強度の減少を直接的に引き起こし、様々な身体機能の低下及び障害をもたらし得る。
【００２６】
ＤＢＩの活性又は発現を促進する薬剤：
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性を促進する薬剤は、配列番号１の配列又はそのフラグメントと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドである。
【００２７】
本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９又は１００％の同一性を有することを意味する。配列の同一性は、同一性（又は類似性又は相同性）の割合の観点から頻繁に測定される；割合が高いほど、２つの配列はより類似する。比較のための配列アラインメント方法は当技術分野で周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992;及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994)に記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994には、配列アラインメント方法及び相同性計算の詳細な検討が示されている。例として、アライメントツールＡＬＩＧＮ(Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989)又はＬＦＡＳＴＡ(Pearson and Lipman, 1988)は、配列比較を実施するために使用され得る(Internet Program（登録商標）1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, fasta20u63 version 2.0u63, release date December 1996)。ＡＬＩＧＮは配列全体を互いに比較し、ＬＦＡＳＴＡは局所的な類似性の領域を比較する。これらのアライメントツール及びそれらの各チュートリアルは、例えば、ＮＣＳＡウェブサイトのインターネットで入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較では、デフォルトパラメータ（ギャップ存在コスト１１、残基ごとのギャップコスト１）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ２配列関数が用いられ得る。より短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアライメントする場合、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用してアラインメントを実施すべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である；Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997;及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照のこと。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、ポリペプチド（すなわち、配列番号１）の一次構造の物理的に隣接する部分を指す。いくつかの実施態様では、フラグメントは、配列番号１の少なくとも８個の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、フラグメントは、８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；３１；３２；３３；３４；３５；３６；３７；３８；３９；４０；４１；４２；４３；４４；４５；４６；４７；４８；４９；５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６；５７；５８；５９；６０；６１；６２；６３；６４；６５；６６；６７；６８；６９；７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１：８２；８３；８４；８５；又は８６個の連続アミノ酸を含む。本発明によれば、フラグメントは、ＤＢＩの活性を保持するものとする。
【００２９】
いくつかの実施態様では、フラグメントは、１７位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列からなる（すなわち、トリアコンタテトラニューロペプチド又はＴＴＮ）。
【００３０】
いくつかの実施態様では、フラグメントは、３３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列からなる（すなわち、オクタデカニューロプチド又はＯＤＮ）。
【００３１】
いくつかの実施態様では、フラグメントは、４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列からなる（すなわち、オクタペプチド又はＯＰ）。
【００３２】
したがって、いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性を促進する薬剤は、
−配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
−配列番号１の１７位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
−配列番号１の３３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
−配列番号１の４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列
を含むポリペプチドからなる。
【００３３】
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの異種ポリペプチドに融合されて、融合タンパク質を形成する。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは直接的に又はスペーサーを介して、そのＣ末端において異種ポリペプチドのＮ末端に融合されるか、又はそのＮ末端において異種ポリペプチドのＣ末端に融合される。本明細書で使用される場合、「直接的に」という用語は、本発明のポリペプチドの末端（Ｎ又はＣ末端）の（最初又は最後の）アミノ酸が、異種ポリペプチドの末端（Ｎ又はＣ末端）において（最初又は最後の）アミノ酸に融合されることを意味する。換言すれば、この実施態様では、前記ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸は、共有結合により、前記異種ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸に直接的に連結されるか、又は前記ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸は、共有結合により、前記異種ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸に直接的に連結される。本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、本発明のポリペプチドを異種ポリペプチドに連結する少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。このようなスペーサーは、立体障害を防止するために有用であり得る。典型的には、スペーサーは、２，３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；又は２０個のアミノ酸を含む。
【００３４】
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドはシグナル配列に融合される。シグナル配列は、分泌タンパク質又は目的の他のタンパク質の分泌及び単離を促進するために使用され得る。シグナル配列は、典型的には、１つ以上の切断事象における分泌中に成熟タンパク質から一般に切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含有する。
【００３５】
いくつかの実施態様では、本発明の融合タンパク質はイムノアドヘシンである。本明細書で使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、本発明のポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様分子を表す。構造的には、イムノアドヘシンは、本発明のポリペプチドと免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得る。免疫グロブリン配列は、典型的には、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）であるが、必ずしもそうではない。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有益な化学的及び生物学的特性の多くを保有し得る。イムノアドヘシンは、所望の特異性を有するヒトタンパク質配列であって、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結されたヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性は、完全にヒト成分を使用して達成され得る。このようなイムノアドヘシンは、患者に対して最小限に免疫原性であり、慢性使用又は反復使用に安全である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域はネイティブ配列Ｆｃ領域である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は変異体Ｆｃ領域である。さらに別の実施態様では、Ｆｃ領域は機能的Ｆｃ領域である。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで及ぶと定義される。イムノアドヘシンの接着部分及び免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーにより連結され得る。免疫グロブリン配列は、典型的には、免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうではない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ、しかし典型的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得られ得る。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチド及びイムノアドヘシンの免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーにより連結される。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、本発明のポリペプチド及び免疫グロブリン配列部分を連結する少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。このようなリンカーは、立体障害を防止するために有用であり得る。いくつかの実施態様では、リンカーは、４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個のアミノ酸残基を有する。しかしながら、上限は重要ではないが、例えばこのようなポリペプチドの生物医薬品生産に関する利便性の理由により選択される。リンカー配列は、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列であり得る。治療目的で使用される場合、リンカーは、好ましくは、イムノアドヘシンが投与される被験体において非免疫原性である。リンカー配列の１つの有用なグループは、国際公開公報第９６／３４１０３号及び国際公開公報第９４／０４６７８号に記載されている重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列である。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、当技術分野でそれ自体が公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的、生物学的、遺伝的又は酵素的技術の単独又は組み合わせにより生産される。例えば、所望の配列のアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、アミノ酸配列の生産のための標準的な技術により、前記ポリペプチドを容易に生産し得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは市販のペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, California製のもの）を使用して、製造業者の指示にしたがって合成され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、当技術分野で現在周知のリコンビナントＤＮＡ技術により合成され得る。例えば、これらのフラグメントは、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、所望のポリペプチドを発現する適切な真核生物又は原核生物宿主にこのようなベクターを導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、その後、周知の技術を使用してそれらを単離し得る。
【００３７】
いくつかの実施態様では、本発明の治療方法において使用される本発明のポリペプチドは、それらの治療有効性を改善するために改変され得ることが企図される。治療化合物のこのような改変は、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、又は生体内分布を改変するために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、生体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルとの組み合わせにより有意に減少され得る。薬物のバイアビリティを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーが、生体内分布を改変し、細胞取り込み様式を改善し、生理学的障壁を通る透過性を変化させ；体からのクリアランス率を改変することが示されている。ターゲティング効果又は徐放効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度な生体適合性及び改変容易性を考慮して、薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームへの付着は、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基を通して、及び他の化学的方法を介して活性剤にカップリングされ得る；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２つの活性剤に制限される。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合特性を保持する新規生体材料であって、しかし、１分子当たり多数の付着点のさらなる利点を有し（より大きな薬物ローディングを提供する）、様々な用途に適するように合成的に設計され得る新規生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーが探索された。
【００３８】
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの発現を促進する薬剤は、上記ポリペプチドをコードする核酸分子である。本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。しかしながら、この用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体、例えば限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン及び２，６−ジアミノプリンのいずれかを含む配列を取り込む。
【００３９】
いくつかの実施態様では、核酸分子は、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列を含む。本発明によれば、第２の核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する第１の核酸配列は、第１の配列が、第２の核酸配列と５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６；５７；５８；５９；６０；６１；６２；６３；６４；６５；６６；６７；６８；６９；７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。
【００４０】
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターに含められる。典型的には、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス又は感染性ウイルスであるウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、ベクターはＡＡＶベクターである。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」という用語は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びそれらの突然変異形態を含むアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、全体又は一部が欠失したＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上、好ましくはｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を有し得るが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持し得る。遺伝子を宿主ゲノムに統合し、大量の外来遺伝物質を移入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングされる能力により、レトロウイルスは、遺伝子送達ベクターとして選択され得る。レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列に代えて目的の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損性のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲ及び／又はパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含有するリコンビナントプラスミドを（例えば、リン酸カルシウム沈殿により）この細胞株に導入すると、パッケージング配列は、リコンビナントプラスミドのＲＮＡ転写産物がウイルス粒子にパッケージングされることを可能にし、次いで、これが培養培地に分泌される。次いで、リコンビナントレトロウイルスを含有する培地を収集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入に使用する。レトロウイルスベクターは、様々な細胞型に感染することができる。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含有する。複雑性の増大は、潜在的感染の過程で、ウイルスがそのライフサイクルをモジュレーションすることを可能にする。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することにより生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆを欠失させて、ベクターを生物学的に安全にする。レンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号及び米国特許第５，９９４，１３６号（これらは両方とも、参照により本明細書に組み入れられる）。一般に、ベクターはプラスミド系又はウイルス系であり、選択のために、及び宿主細胞への核酸の移入のために、外来核酸を組み込むための必須配列を有するように構成されている。目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子も当技術分野で公知である。したがって、関連遺伝子を選択ベクターにクローニングし、次いで、目的のターゲット細胞をトランスフォーメーションするために使用する。非分裂細胞に感染することができるリコンビナントレンチウイルスが米国特許第５，９９４，１３６号（これは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されており、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ並びにｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上のベクターで適切な宿主細胞がトランスフェクションされている。これには、パッケージング細胞を生産するために、ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードする核酸を提供し得る第１のベクターと、ウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供し得る別のベクターが記載されている。異種遺伝子を提供するベクターをそのパッケージング細胞に導入することにより、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が得られる。ｅｎｖは、好ましくは、ヒト及び他の種の細胞のトランスダクションを可能にする両指向性エンベロープタンパク質である。典型的には、本発明の核酸分子又はベクターは、「コントロール配列」（これは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを総称して指す）を含む。これらは共同して、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供する。適切な宿主細胞において、選択コード配列が複製、転写及び翻訳されることができる限り、これらのコントロール配列の全てが常に存在する必要はない。別の核酸配列は、「プロモーター」配列（これは、調節配列がＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）コード配列の転写を開始させることができる遺伝子由来であるＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すためにその通常の意味で使用される）である。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（この場合、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）、「抑制性プロモーター」（この場合、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）及び「構成的プロモーター」を含み得る。
【００４１】
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性を促進する薬剤は、ＤＢＩの活性を模倣する有機小分子又はペプチド模倣物である。本明細書で使用される場合、「有機小分子」という用語は、医薬品で一般に使用される有機分子と同程度のサイズの分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を含まない。好ましい有機小分子は、最大約５０００Da、より好ましくは最大２０００Da、最も好ましくは最大約１０００Daのサイズの範囲である。本明細書で使用される場合、「ペプチド模倣物」という用語は、その必須要素（ファーマコフォア）が３Ｄ空間で天然ペプチド又はタンパク質を模倣する任意の分子であって、生物学的ターゲットと相互作用して同じ生物学的効果をもたらす能力を保持する任意の分子を指すために使用される。ペプチド模倣物は、既存のペプチドを改変することにより、又はペプチドを模倣する類似システム、例えばペプトイド及びβ−ペプチドを設計することにより典型的に得られ得るペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様鎖を含む。アプローチにかかわらず、変化された化学構造は、例えば、安定性又は生物活性が増加又は減少するという点で、分子特性を有利に調整するように設計される。したがって、改変は、限定されないが、変化された骨格及び非天然アミノ酸の組み込みを含む天然に存在しないペプチドの変化を伴う。本明細書で使用される場合、「アミノ酸模倣物」という用語は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有する化合物であって、しかし、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００４２】
オートファジーを刺激する方法：
したがって、本発明の第１の目的は、それを必要とする被験体におけるオートファジーを刺激する方法であって、ＤＢＩの活性又は発現を阻害する治療有効量の薬剤を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【００４３】
いくつかの実施態様では、オートファジーを刺激する本発明の方法は、食欲を抑制しその結果として体重を減少させるために特に適切である。前記方法はまた、特に血糖及び脂肪生成を減少させるためのものである。したがって、本発明の方法は、本明細書に後述される様々な疾患の処置において特に適切である。
【００４４】
いくつかの実施態様では、被験体は過体重である。特に、被験体は肥満である。肥満は、他の点では健康な被験体が３０kg/m2以上のＢＭＩを有する症状、又は少なくとも１つの共存症を有する被験体が２７kg/m2以上のＢＭＩを有する症状を指す。「肥満被験体」は、他の点では健康な被験体であって、３０kg/m2以上のＢＭＩを有する被験体であるか、又は少なくとも１つの共存症を有する被験体であって、２７kg/m2以上のＢＭＩを有する被験体である。「肥満のリスクがある被験体」は、他の点では健康な被験体であって、２５kg/m2〜３０kg/m2未満のＢＭＩを有する被験体であるか、又は少なくとも１つの共存症を有する被験体であって、２５kg/m2〜３０kg/m2未満のＢＭＩを有する被験体である。アジア系の人々では、肥満に関連するリスクの増加は、より低いＢＭＩで生じ得る。日本を含むアジア及びアジア太平洋諸国では、「肥満」は、被験体が２５kg/m2以上のＢＭＩを有する症状を指す。これらの国における「肥満被験体」は、体重減少を必要とするか又は体重減少により改善される少なくとも１つの肥満誘導性又は肥満関連共存症を有する被験体であって、２５kg/m2以上のＢＭＩを有する被験体を指す。これらの国では、「肥満のリスクがある被験体」は、２３kg/m2超〜２５kg/m2未満のＢＭＩを有する者である。
【００４５】
いくつかの実施態様では、被験体は２型糖尿病を患っている。本明細書で使用される場合、「２型糖尿病」又は「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。２型糖尿病は、多くの場合、インスリンのレベルが正常であるか又は上昇さえもする場合に発生し、組織がインスリンに適切に応答することができないことに起因すると思われる。２型糖尿病患者のほとんどは肥満である。
【００４６】
いくつかの実施態様では、被験体はメタボリックシンドロームを患っている。本明細書で使用される場合、「メタボリックシンドローム」という用語は、腹部肥満、高グリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール、高血圧及び空腹時高血漿グルコースの３つ以上を有することを特徴とする被験体を指す。これらの症候の基準は、the third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel in Detection, Evaluation and Treatment of High blood Cholesterol in Adults (Ford, E S. et al. 2002)で定義されている。
【００４７】
いくつかの実施態様では、被験体はガンを患っている。基礎となる機構は未だ特性評価されていないが、化学療法前飢餓（オートファジーを全身的に誘導することができる最も強力なオートファジー誘導生理学的刺激）は処置有効性を有意に増加させ、腫瘍成長を制限することが示されている。さらに、ＰＩ３Ｋ過剰活性化を有する腫瘍は食事制限に対して耐性であることが実証されているが、これは、化学増感プロセスにおけるオートファジーの重要な役割を示唆している。本発明は、本発明の薬剤の定時投与に基づいて、より低侵襲で同等に有効な処置につながり得る。したがって、本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、治療有効量の本発明の薬剤及び治療有効量の化学療法剤を前記被験体に投与することを含み、前記化学療法剤の前に本発明の薬剤を投与する方法に関する。いくつかの実施態様では、本発明の薬剤は、化学療法剤の投与の１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；３１；３２；３３；３４；３５；３６；３７；３８；３９；４０；４１；４２；４３；４４；４５；４６；４７；４８；４９；５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６時間前に投与される。化学療法剤としては、限定されないが、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロスレアス；抗生物質、例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンω１Ｉ；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素蛋白エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチ��マイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメ��ルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施態様では、被験体は神経変性疾患を患っている。神経変性疾患の例としては、限定されないが、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレクサンダー病、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、毛細血管拡張性運動失調、バッテン病（シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても公知である）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳運動失調３型）、ＭＥＬＡＳ−ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中、多系統萎縮症、多発性硬化症、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリザウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄小脳運動失調（様々な特徴を有する複数のタイプ）、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー病、脊髄癆、テイ・サックス病及び毒性脳症が挙げられる。好ましい神経変性疾患としては、アルツハイマー病が挙げられる。神経変性疾患（すなわち、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病）は、一連の異なる年齢依存的又は遺伝依存的な病状であり、ミスフォールディングされたタンパク質の凝集体の蓄積の結果としての進行性神経細胞死、損傷オルガネラ、細胞クリアランス機構の機能障害を特徴とする。オートファジーは、潜在的に有害な凝集傾向の長寿命タンパク質の分解及び損傷オルガネラのリサイクルに特化した生理学的機構であり、それは、神経細胞死に対する保護因子として考えられている。本発明の文脈では、本発明の薬剤による患者の処置は、細胞クリアランス機能の改善及び異なる疾患の症候の改善をもたらし得る。例えば、ハンチントン病は、その神経内凝集をもたらすハンチンチンタンパク質のポリグルタミン尾部の漸進的なエクスパンションを特徴とする病状である。ハンチンチンは、オートファジー経路の特定のターゲットであることが実証されており、本発明の薬剤の投与による基礎オートファジーの増加は、神経細胞死の割合を減少させ得る。よく知られたパーキンソン病の２つの形態では、ＰＩＮＫ１及びＰＡＲＫ２をコードする２つの遺伝子の劣性突然変異であって、マイトファジーに関与する劣性突然変異は、この疾患の病因を部分的に説明し、患者を本発明の薬剤による処置に適切なものにし得る。同様に、オートファジー誘導は、おそらくはオートファジー系の飽和により、パーキンソン病の散発性形態の病因の原因となるアルファシヌクレイン凝集体（レビー小体）の除去に寄与し得る。
【００４９】
いくつかの実施態様では、被験体は感染性疾患を患っている。オートファジープロセスは、微生物に対する多面的防御に積極的に関与し、分解リソソームへの微生物の選択的送達（異種食作用と称されるプロセス）を介して、又はエンドリソソーム区画への微生物核酸の送達（先天性免疫及び適応免疫のその後の活性化を伴う）を介して、それらの排除に寄与する。臨床関連病原体は、in vitroで異物貪食により分解される；これらの中には、グループＡ  Streptococcus pyogenes、Mycobacterium tuberculosis、Shigella flexneri、Salmonella enterica、Listeria monocytogenesなどの細菌；単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）などのウイルス及びトキソプラズマ原虫などの寄生虫がある。また、in vivoにおける証拠により、オートファジー遺伝子は、L. monocytogenes、M. tuberculosis、S. enterica、T. gondii、ＨＳＶ１を含む多数の病原体に対する保護的な役割を有することが示された。赤痢菌及びサルモネラ菌のような病原体により媒介される感染症はアミノ酸の飢餓反応をトリガーし、最終的には、オートファジーを介したこれらの病原体の排除につながることが最近示されている。ここでは、細菌及びウイルス感染に対するオートファジー促進及び抗微生物応答をトリガーするための本発明の薬剤の使用が適切であり得る。
【００５０】
いくつかの実施態様では、被験体は肺気腫を患っている。α１−アンチトリプシンタンパク質の突然変異は、肺気腫（突然変異体タンパク質の凝集形態の蓄積を特徴とする疾患）を引き起こす。他のタンパク質症に関して、本発明の薬剤（例えば、ＨＣ、ＵＫ−５０９９）の投与によるオートファジー誘導は、症候を改善し得る。
【００５１】
いくつかの実施態様では、被験体は嚢胞性線維症を患っている。最近の前臨床研究では、突然変異体ＣＴＦＲの凝集体のクリアランス障害による嚢胞性線維症の病原性が、機能不全性アグリファジーの結果であることが見出された。本発明の薬剤の投与により媒介されるオートファジーの誘導は、適切な戦略に相当し得る。
【００５２】
いくつかの実施態様では、被験体は肝疾患を患っている。in vivoにおけるオートファジーの潜在的な影響は肝臓研究から発見されたが、これは、オートファジーが、肝臓の生理学において果たす重要な役割を強調している。
【００５３】
したがって、本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体における非アルコール性脂肪肝疾患を処置する方法であって、ＤＢＩの活性又は発現を阻害する治療有効量の薬剤を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「非アルコール性脂肪肝疾患」又は「ＮＡＦＬＤ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、過剰なアルコール使用によるものではなく、脂肪が肝臓に沈着した場合に生じる脂肪肝の１つの原因を指す。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、特に肥満及び糖尿病患者で、最も再発性で重度の病状の１つに相当するが、特定の治療はまだ利用可能ではない。ＮＡＦＬＤは、アルコール消費の二次的な結果としてではなく、肝臓における脂肪の蓄積として定義される。本発明の薬剤のオートファジー促進能力は、異なる原因によるＮＡＦＬＤの治療として使用され得る：ＴＧ液滴の選択的分解（脂肪貪食）、脂肪生成経路の抑制（すなわち、ＢＴＣによるミトコンドリアからのクエン酸塩輸出の阻害）。逆に、オートファジーインデューサーであるペルヘキシリンは、ＡＬＤにおいて適応的かつ保護的な役割を果たし、エタノール中毒後の肝細胞保護を与え、脂肪細胞分化を阻害し得る。
【００５５】
ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）に分類され得る。非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）はＮＡＦＬＤの一種であり、脂肪が肝細胞に蓄積する症状である。ＮＡＦＬは、肝硬変に進行する最小リスクを有する。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）はＮＡＦＬＤのより極端な形態であり、原因不明の肝臓の線維症及び肝硬変の主な原因とみなされる。ＮＡＳＨの主な特徴は、炎症及び損傷に加えて、肝臓における脂肪である。ＮＡＳＨは重度であり得、線維症及び肝硬変につながり得るが、この場合、肝臓は回復不能に損傷して瘢痕化し、もはや適切に機能することができない。ＮＡＦＬＤを有する患者のほとんどは、症候をほとんど有しないか又は全く有しない。患者は、疲労、倦怠感及び鈍い右上腹部不快感を訴え得る。軽度の黄疸が認められ得るが、これはまれである。したがって、ＮＡＦＬＤの合併症は、典型的には、肝線維症及びその後の肝硬変を含む。肝線維症は、正常肝臓のものと定性的に区別され得る細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする。無検査のままであれば、肝線維症は、（被包化小結節の存在により定義される）肝硬変、肝臓及び臓器の不全並びに死に進行する。
【００５６】
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性又は発現を阻害する薬剤は、ＮＡＳＨの処置に特に適切である。
【００５７】
いくつかの実施態様では、被験体は、最終的には腺房細胞の大規模な壊死性細胞死に至る膵外分泌腺の炎症性疾患である膵炎を患っている。この病状を促進する機構は依然として不明であるが、この病理学的プロセスでは、オートファジーが損なわれているという考えについて一致している。腺房細胞は、主にリソソームタンパク質（すなわち、ＬＡＭＰ２）の枯渇のために、オートファゴリソソームになることができない大きなオートファゴソームを特徴とする。さらに、Ｉｋｋαの喪失はオートファジーフラックスを阻害し、ｐ６２陽性タンパク質凝集体の形成を促進して、疾患の開始に寄与することが最近示されている。加えて、疾患の急性期では、「ザイモファジー」と称される選択的オートファジープロセスは、有害な活性化チモーゲン顆粒の分解による腺房細胞の死を防止する。ヒドロキシクエン酸などの本発明の薬剤は、ザイモファジーを誘導する能力について試験され得る。また、これらの薬剤は単独で、又はリソソームターゲット療法と組み合わせて、正常なオートファジーフラックスを回復することにより、疾患の症候を改善するために適切である。
【００５８】
いくつかの実施態様では、被験体はタンパク質症を患っている。本発明の薬剤の使用によるオートファジーの誘導は、タンパク質症の処置に特に適切であり得る。タンパク質症の例としては、限定されないが、アルツハイマー病、脳βアミロイド血管障害、網膜神経節細胞の変性、プリオン病（例えば、牛海綿状脳症、クル病、クロイツフェルト・ヤコブ病、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症）、タウオパチー（例えば、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症）、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（アイスランド型）、ＣＡＤＡＳＩＬ、アレクサンダー病、セルピン病、家族性アミロイドニューロパシー、老人性全身性アミロイドーシス、セルピン病、ＡＬアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、２型糖尿病、大動脈内側アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス、フィンランド型家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎／ミオパチー、白内障、甲状腺髄様ガン、心房アミロイドーシス、下垂体プロラクチノーマ、遺伝性格子状角膜異栄養症、皮膚苔癬アミロイドーシス、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス、肺胞蛋白症、アミロイド産生性歯原性腫瘍、精嚢アミロイドーシス、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症及び重病ミオパチーが挙げられる。
【００５９】
ＤＢＩの活性又は発現を阻害する薬剤：
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性を阻害する薬剤は、ＤＢＩに対する抗体である。
【００６０】
したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、抗原結合ドメインを含む抗体フラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線形抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ、トリボディ（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合物、それぞれ二重特異性又は三重特異性）；ｓｃ−ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー、Ｔ細胞を引き付けるｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（小さな免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小さなモジュラー免疫医薬品」ｓｃＦｖ−Ｆｃダイマー；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「デュアルアフィニティリターゲティング」）；１つ以上のＣＤＲを含む小さな抗体模倣物などを含む。様々な抗体系構築物及びフラグメントを調製及び使用するための技術は、当技術分野で周知である（Kabat et al., 1991（これは、参照により本明細書に具体的に組み入れられる）を参照のこと）。特に、ダイアボディは、欧州特許出願公開第４０４，０９７号及び国際公開公報第９３／１１１６１号にさらに記載されているのに対して、線状抗体は、Zapata et al. (1995)にさらに記載されている。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成され得る。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’フラグメントを生成し得る。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成につながり得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント及び他のフラグメントもまた、リコンビナント技術により合成され得るか、又は化学的に合成され得る。抗体フラグメントを生産するための技術は周知であり、当技術分野で説明されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001; Reiter et al., 1996;及びYoung et al., 1995にはそれぞれ、有効な抗体フラグメントの生産がさらに記載されており、それを可能にする。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は一本鎖抗体である。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、軽鎖を生来的に欠くラクダ科動物に見られ得るタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体は、「nanobody（登録商標）」とも称される。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明については、上記で引用されている先行技術並びに欧州特許出願公開第０３６８６８４号、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490;及び国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号も参照のこと。天然抗体では、２つの重鎖はジスルフィド結合により互���に連結されており、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。ラムダ（１）及びカッパ（ｋ）の２つのタイプの軽鎖がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ。各鎖は、異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）の２つのドメインを含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨと総称されるＣＨＩ、ＣＨ２及びＣＨ３）の４つのドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合及びＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する残基で構成される。時には、非超可変領域若しくはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が抗体結合部位に関与し得るか、又は全体のドメイン構造に影響を与え、したがって結合部位に影響を与え得る。相補性決定領域又はＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖Ｖ領域及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。抗体可変ドメインの残基は、Kabat et alにより考案されたシステムにしたがって慣習的にナンバリングされる。このシステムは、Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (hereafter “Kabat et al.”)に記載されている。本明細書では、このナンバリングシステムが使用される。Kabat残基指定は、配列番号の配列におけるアミノ酸残基の直線的なナンバリングと常に直接的に対応するわけではない。実際の線状アミノ酸配列は、フレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、基本的な可変ドメイン構造の構造成分の短縮又はそれへの挿入に対応する厳密なKabatナンバリングよりも少ない又は多いアミノ酸を含有し得る。残基の正確なKabatナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と、「標準的な」Kabatナンバリング配列とのアラインメントにより、所定の抗体について決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Kabatナンバリングシステムにしたがって、残基３１〜３５Ｂ（Ｈ−ＣＤＲ１）、残基５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）及び残基９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Kabatナンバリングシステムにしたがって、残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、残基５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）及び残基８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）に位置する。
【００６１】
いくつかの実施態様では、抗体は、４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列からなるフラグメント（すなわち、オクタペプチド又はＯＰ）に対するものである。
【００６２】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、典型的にはキメラマウス／ヒト抗体である。「キメラ抗体」という用語は、非ヒト動物由来の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインとを含むモノクローナル抗体を指す。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物が使用され得る。特に、前記マウス／ヒトキメラ抗体は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖を含み得る。
【００６３】
いくつかの実施態様では、抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、大部分又は全部が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置き換えられた抗体を表す。ヒト化の方法としては、限定されないが、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号及び米国特許第５，８５９，２０５号（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施態様では、抗体は完全ヒト抗体である。完全ヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分について、トランスジェニックマウスを免疫することにより調製され得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５９８，３６９号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第６，１５０，５８４号及びそれらで引用されている参考文献（これらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【００６５】
いくつかの実施態様では、抗体は中和抗体である。本明細書で使用される場合、「中和抗体」という用語は、ＤＢＩの活性を完全に阻害し、減少させる抗体である。抗体が中和抗体であるかは、実施例に記載されているin vitroアッセイにより決定され得る。典型的には、本発明の中和抗体は、ＤＢＩの活性を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％阻害する。
【００６６】
いくつかの実施態様では、本発明の中和抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を媒介しないので、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない。いくつかの実施態様では、中和抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することができるＦｃドメインを含まない。いくつかの実施態様では、中和抗体は、Ｆｃドメインを欠く（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを欠く）か、又はＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、中和抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体フラグメント、又は複数の異なる抗体フラグメントを含む多重特異性抗体からなるか、又はそれを含む。いくつかの実施態様では、中和抗体は毒性部分に連結されていない。いくつかの実施態様では、抗体がＣ２ｑ結合を変化させ、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少させ若しくは無効化するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。このアプローチは、ldusogieらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００６７】
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性を阻害する薬剤は、ＤＢＩに対するアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点において抗体の代替物に相当する分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、事実上任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの試験管内選択法（ＳＥＬＥＸ法）により単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により取得可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、ユニークな配列の最終的に化学的改変された線形オリゴマーである。ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質、例えばE. coliチオレドキシンＡによりディスプレイされるコンフォメーション的に拘束された抗体可変領域からなる(Colas et al., 1996)。
【００６８】
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの発現を阻害する薬剤は、発現のインヒビターである。「発現のインヒビター」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。本発明の好ましい実施態様では、遺伝子発現の前記インヒビターは、ｓｉＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【００６９】
いくつかの実施態様では、発現のインヒビターはｓｉＲＮＡである。低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において使用するための発現のインヒビターとして機能し得る。ＤＢＩ遺伝子発現は、ＤＢＩ遺伝子発現が特異的に阻害されるように、患者又は細胞を低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させることにより減少され得る（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。
【００７０】
いくつかの実施態様では、発現のインヒビターはエンドヌクレアーゼである。「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。デオキシリボヌクレアーゼＩなどのいくつかは、ＤＮＡを比較的非特異的に（配列に関係なく）切断するが、制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素と典型的に称される多くは、非常に特異的なヌクレオチド配列においてのみ切断する。エンドヌクレアーゼベースのゲノム不活性化の背後にある機構は、一般に、ＤＮＡ一本鎖又は二本鎖切断の最初の工程を必要とし、次いで、ＤＮＡ修復のための２つの異なる細胞機構であって、ＤＮＡ不活性化に活用され得る細胞機構をトリガーし得る：エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度の相同性修復（ＨＤＲ）。特定の実施態様では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓである。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、塩基配列の短い繰り返しを含有する原核生物ＤＮＡのセグメントである、関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートを指す。いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌由来のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、米国特許第８６９７３５９号及び米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号に記載されている。いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、Zetsche et al. (“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13)においてProvotella及びＦrancisella 1（Ｃｐｆ１）からより最近特性評価されたＣＲＩＳＰＲであるＣＲＥＴＰＲ−Ｃｐｆ１である。
【００７１】
いくつかの実施態様では、発現のインヒビターはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、その通常の転写方向に対して逆のオリゴヌクレオチド配列であって、したがって、宿主細胞内において発現されるターゲット遺伝子ｍＲＮＡ分子に相補的なＲＮＡ転写産物（例えば、それは、ワトソン・クリック塩基ペア形成を介してターゲット遺伝子ｍＲＮＡ分子にハイブリダイゼーションし得る）を発現するオリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンス鎖は、ターゲット遺伝子の発現を妨げることができる限り、多くの異なる方法で構築され得る。例えば、アンチセンス鎖は、その相補体（例えば、アンチセンス及びセンス遺伝子によりコードされるＲＮＡは相補的であり得る）の転写を可能にするために、その通常の転写方向に対してターゲット遺伝子のコード領域（又はその一部）を逆にすることにより構築され得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、ターゲット遺伝子と同じイントロン又はエキソンパターンを有する必要はなく、ターゲット遺伝子の非コードセグメントは、コードセグメントと同様にターゲット遺伝子発現のアンチセンス抑制の達成において同等に有効であり得る。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖であり得る３’−５’又は５’−３’方向の核酸配列を指す。本発明の文脈で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特にＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。本発明によれば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＢＩをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号２）をターゲティングし、細胞におけるＤＢＩの量を減少させることができる。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡを「ターゲティングする」オリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドを指す。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡの配列の領域に少なくとも部分的に相補的な、好ましくは完全に相補的な配列を含み、前記相補性は、細胞内条件下で特異的結合をもたらすために十分である。当業者には直ちに明らかであるように、第２の配列に「完全に相補的」な配列は、ＤＮＡ分子の形態又はＲＮＡ分子の形態のいずれかにある第２の配列の逆相補体カウンターパートを意味する。１つ以上のミスマッチがある場合、配列は、第２の配列に「部分的に相補的」である。ＤＢＩをコードするｍＲＮＡをターゲティングする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、バイオインフォマティクスツールを使用して、基礎として前記ｍＲＮＡの配列を使用することにより設計され得る。例えば、配列番号２の配列は、ＤＢＩをコードするｍＲＮＡをターゲティングする核酸を設計するための基礎として使用され得る。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、例えばガン細胞におけるＤＢＩの量を減少させることができる。オリゴヌクレオチドが、細胞におけるＤＢＩの量を減少させることができるかを決定するための方法は、当業者に公知である。これは、例えば、ウエスタンブロットによりＤＢＩタンパク質発現を分析することにより、並びに試験すべきアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下でＤＢＩタンパク質発現を比較することにより行われ得る。いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜５０ヌクレオチド、例えば１２〜３５ヌクレオチド、１２〜３０、１２〜２５、１２〜２２、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２２、１８〜２２又は約１９、２０又は２１ヌクレオチドの長さを有する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２のｍＲＮＡに相補的な配列の１２〜５０個の連続ヌクレオチド、例えば１２〜３５、１２〜３０、１２〜２５、１２〜２２、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２２、１８〜２２又は約１９、２０又は２１個の連続ヌクレオチドを含み得るか、又はそれらからなり得る。いくつかの実施態様では、in vivoにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性及び／又は治療効率を増加させるために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに改変され、好ましくは化学的に改変される。特に、本発明の文脈で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチドを含み得る。化学的改変は、３つの異なる部位で起こり得る：（ｉ）リン酸基、（ｉｉ）糖部分及び／又は（ｉｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの骨格構造全体。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対する増加した耐性を有するホスホロチオエート誘導体（硫黄原子による非架橋ホスホリル酸素原子の置き換え）として用いられ得る。２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）改変（例えば、ISIS Pharmaceuticalsにより販売されている改変骨格）も有効である。加えて又はあるいは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全に、部分的に又は組み合わせて、糖の２’位において置換、特に以下の化学的改変を有する誘導体である改変ヌクレオチドを含み得る：Ｏ−メチル基（２’−Ｏ−Ｍｅ）置換、２−メトキシエチル基（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、フルオロ基（２’−フルオロ）置換、クロロ基（２’−Ｃｌ）置換、ブロモ基（２’−Ｂｒ）置換、シアニド基（２’−ＣＮ）置換、トリフルオロメチル基（２’−ＣＦ３）置換、ＯＣＦ３基（２’−ＯＣＦ３）置換、ＯＣＮ基（２’−ＯＣＮ）置換、Ｏ−アルキル基（２’−Ｏ−アルキル）置換、Ｓ−アルキル基（２’−Ｓ−アルキル）置換、Ｎ−アルキル基（２’−Ｎ−アルキル（2'-N-akyl））置換、Ｏ−アルケニル基（２’−Ｏ−アルケニル）置換、Ｓ−アルケニル基（２’−Ｓ−アルケニル）置換、Ｎ−アルケニル基（２’−Ｎ−アルケニル）置換、ＳＯＣＨ３基（２’−ＳＯＣＨ３）置換、ＳＯ２ＣＨ３基（２’−ＳＯ２ＣＨ３）置換、ＯＮＯ２基（２’−ＯＮＯ２）置換、ＮＯ２基（２’−ＮＯ２）置換、Ｎ３基（２’−Ｎ３）置換及び／又はＮＨ２基（２’−ＮＨ２）置換。加えて又はあるいは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボースの２’酸素と４’炭素との間に共有結合的架橋を形成してそれを３’末端構成に固定するロックド核酸（ＬＮＡ）を生産するためにリボース部分が使用されている完全改変又は部分改変ヌクレオチドを含み得る。これらの構築物は、生物学的培地中で極めて安定であり、ＲＮａｓｅＨを活性化し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡと緊密なハイブリッドを形成することができる。したがって、好ましい実施態様では、本発明の文脈で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、２’−ＯＭｅ類似体、２’−ホスホロチオエート類似体、２’−フルオロ類似体、２’−Ｃｌ類似体、２’−Ｂｒ類似体、２’−ＣＮ類似体、２’−ＣＦ３類似体、２’−ＯＣＦ３類似体、２’−ＯＣＮ類似体、２’−Ｏ−アルキル類似体、２’−Ｓ−アルキル類似体、２’−Ｎ−アルキル類似体、２’−Ｏ−アルケニル類似体、２’−Ｓ−アルケニル類似体、２’−Ｎ−アルケニル類似体、２’−ＳＯＣＨ３類似体、２’−ＳＯ２ＣＨ３類似体、２’−ＯＮＯ２類似体、２’−ＮＯ２類似体、２’−Ｎ３類似体、２’−ＮＨ２類似体及びそれらの組み合わせからなる群より選択される改変ヌクレオチドを含む。より好ましくは、改変ヌクレオチドは、ＬＮＡ、２’−ＯＭｅ類似体、２’−ホスホロチオエート類似体及び２’−フルオロ類似体からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、アンチセンスはトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスである。「トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）」という用語は、(Ittig D, et al., Nucleic Acids Res, 2004, 32:346-353; Ittig D, et al., Prague, Academy of Sciences of the Czech Republic. 1:21-26 (Coll. Symp. Series, Hocec, M., 2005); Ivanova et al., Oligonucleotides 2007, 17:54-65; Renneberg D, et al., Nucleic Acids Res, 2002, 15 30:2751-2757; Renneberg D, et al., Chembiochem, 2004, 5:1114-1118;及びRenneberg D, et al., JACS, 2002, 124:5993-6002)のように骨格のコンフォメーションのフレキシビリティを制限し、ねじれ角γの骨格形状を最適化するように、シクロプロパン環の導入により各ヌクレオチドが改変された拘束オリゴデオキシリボヌクレオチド類似体のクラスを指す。詳細には、構造的剛性のさらなる増強のためにシクロプロパンユニットが縮合されたヌクレオシドの中心Ｃ（３’）とＣ（５’）との間のさらなるエチレン架橋により、ｔｃ−ＤＮＡはＤＮＡと構造的に異なる。例えば、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの例については、国際公開公報第２０１０１１５９９３号を参照のこと。トリシクロＤＮＡ化学の利点は、その骨格の構造特性が、相補的ヌクレオチド配列との高い親和性及び高特異的なハイブリダイゼーションを保持しながら、ＡＯＮの長さの減少を可能にすることである。予想外のことに、筋肉内適用を使用したin vivo状況では、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド技術に必要な投与量の少なくとも１０倍未満のマイクログラム投与量で、ｔｃ−ＤＮＡ  ＡＯＮを有利に使用し得る。加えて、ｔｃ−ＤＮＡは完全な活性を保持し、アンチセンスの長さが短い。したがって、例えば、１３〜１５ヌクレオチドのｔｃ−ＤＮＡ  ＡＯＮは、本開示により例示されるex vivo及びin vivo用途において非常に有効である。
【００７２】
いくつかの実施態様では、ＤＢＩの活性を阻害する薬剤は、被験体に投与される場合に、ＤＢＩに対する中和自己抗体を誘発するために適切なワクチン組成物からなる。本発明の目的では、「ワクチン組成物」という用語は、免疫系反応を誘導するためにヒト又は動物に投与され得る組成物を意味することを意図する；この免疫系反応は、ＤＢＩに対する抗体の産生をもたらし得る。典型的には、ワクチン組成物は、ＤＢＩ由来の少なくとも１つの抗原を含む。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によりプロセシング及びディスプレイされる場合、抗体又はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）により特異的に結合されることができる分子を指す。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープを包含する。加えて、抗原は、免疫系により認識されることができ、並びに／又は液性免疫反応及び／若しくは細胞性免疫反応を誘導して、Ｂ及び／若しくはＴリンパ球の活性化をもたらすことができる。抗原は、１つ以上のエピトープ又は抗原部位（Ｂ及びＴエピトープ）を有し得る。いくつかの実施態様では、抗原は、配列番号１の配列又はそのフラグメント（例えば、エピトープ）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる。いくつかの実施態様では、抗原は、ｉ）配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉ）配列番号１の１７位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号１の３３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｖ）配列番号１の４３位のアミノ酸残基から５０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、ワクチンに対する強力な免疫反応を誘発するために一般に十分に外来性である担体タンパク質にコンジュゲートされる。例示的な担体タンパク質は、本質的に高い免疫原性である。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は両方とも、動物を用いて実験する場合のコンジュゲートワクチンの開発において担体として一般的に使用されており、本明細書では担体タンパク質として企図される。治療用コンジュゲートワクチンの調製において使用されているタンパク質としては、限定されないが、多くの病原菌の毒素及びそれらのトキソイドが挙げられる。適切な担体分子は多数であり、限定されないが、細菌毒素又は生成物、例えばコレラ毒素Ｂ−（ＣＴＢ）、ジフテリア毒素、破傷風トキソイド、及び百日咳毒素及び糸状血球凝集素、志賀毒素、シュードモナス外毒素；レクチン、例えばリシンＢサブユニット、アブリン及びスイートピーレクチン；サブウイルス、例えばレトロウイルス核タンパク質（レトロＮＰ）、狂犬病リボ核タンパク質（狂犬病ＲＮＰ）、植物ウイルス（例えば、ＴＭＶ、ササゲ及びカリフラワーモザイクウイルス）、水疱性口内炎ウイルス−ヌクレオカプシドタンパク質（ＶＳＶ−Ｎ）、ポックスウイルスベクター及びセムリキ森林ウイルスベクター；人工ビヒクル、例えば多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）、ミクロスフェア；酵母ウイルス様粒子（ＶＬＰ）；マラリアタンパク質抗原；並びに他のもの、例えばタンパク質及びペプチド並びに上記の任意の改変物、誘導体又は類似物が挙げられる。他の有用な担体としては、粘膜応答を増強する能力を有するもの、より具体的にはＬＴＢファミリーの細菌毒素、レトロウイルス核タンパク質（レトロＮＰ）、狂犬病リボ核タンパク質（狂犬病ＲＮＰ）、水疱性口内炎ウイルス−ヌクレオカプシドタンパク質（ＶＳＶ−Ｎ）及びリコンビナントｐｏｘウイルスサブユニットが挙げられる。
【００７３】
いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物はアジュバントを含む。「アジュバント」という用語は、単独で投与されると有意な活性を欠くが、別の治療剤の活性を増強し得る化合物であり得る。いくつかの実施態様では、アジュバントは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）であるか、又は他の油系アジュバントは、３０〜７０％、好ましくは４０〜６０％、より好ましくは４５〜５５％の重量比（w/w）で存在する。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニストからなる群より選択される少なくとも１つのＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）アゴニストを含む。他のアジュバントとしては、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。特定の一実施態様では、アジュバントは、アジュバント特性を有するエマルジョンである。このようなエマルジョンとしては、水中油型エマルジョンが挙げられる。フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）は、このようなアジュバントの１つである。別の適切な水中油型エマルジョンは、スクアレンを含有するMF59（商標）アジュバント、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Tween（商標）80界面活性剤としても公知）及びソルビタントリオレエートである。スクアレンは、サメ肝油から元々得られた天然有機化合物であるが、アマランス種子、米ぬか、小麦胚芽及びオリーブを含む植物起源（主に植物油）からも入手可能である。他の適切なアジュバントは、Montanide（商標）ISA 50V（これは鉱油系アジュバントである）; Montanide（商標）ISA 206;及びMontanide（商標）IMS 1312を含むMontanide（商標）アジュバント(Seppic Inc., Fairfield N.J.)である。鉱油はコアジュバント中に存在し得るが、いくつかの実施態様では、本明細書に記載される組成物の油成分は全て、代謝可能な油である。
【００７４】
医薬組成物：
ＤＢＩの活性又は発現をモジュレーションする（すなわち、促進又は阻害する）薬剤は、医薬組成物の形態で被験体に投与される。典型的には、治療用組成物を形成するために、本発明の薬剤は、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わされ得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳動物に、特に必要に応じてヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の又は他の望まれない反応を生成しない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤助剤を指す。経口投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、局所投与又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は単独で、又は別の有効成分と組み合わせて、従来の医薬支持体との混合物として、単位投与形態で被験体に投与され得る。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、粉末剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は溶液などの経口経路形態、舌下及び口腔内投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。典型的には、医薬組成物は、注射されることができる製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは特に、等張性滅菌生理食塩水溶液（一ナトリウム若しくは二ナトリウムのリン酸塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムの塩化物など、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて、滅菌水又は生理食塩水の添加により注射液の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、前記形態は滅菌されてなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保全されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中、並びに油中で調製され得る。保存及び使用の通常の条件下では、微生物の成長を防止するために、これらの調製剤は保存剤を含有する。本発明の薬剤は、中性又は塩形態の組成物に製剤化され得る。（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）薬学的に許容し得る塩は、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸と、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第２鉄の水酸化物などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来するものであり得る。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒度の保持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの場合に応じて、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物で使用することによりもたらされ得る。滅菌注射液は、必要に応じて前掲のいくつかの他の成分と共に適切な溶媒中に、必要量の活性化合物を取り込ませ、その後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、基本分散媒体及び前掲のものからの他の必要成分を含有する滅菌のビヒクル中に、様々な滅菌された有効成分を取り込ませることにより調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。直接注射のためのより濃縮された又は高度に濃縮された溶液の調製も企図され、この場合、極めて迅速な浸透をもたらして、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達するために、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。製剤化により、溶液は、投与製剤に適合する方法で、治療上有効である量で投与されるであろう。製剤は、上記注射液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いられ得る。水溶液による非経口投与のために、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースで液体希釈剤は等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者には公知であるであろう。投与量の変動は、処置されている被験体の状態に応じて必ず生じるであろう。投与責任者は、いずれにせよ、個々の被験体のための適切な用量を決定するであろう。
【００７５】
スクリーニング方法：
本発明のさらなる目的は、オートファジーをモジュレーションするために適切な化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）候補化合物を提供すること、ｉｉ）前記候補化合物がＤＢＩの活性又は発現をモジュレーションすることができるかを決定すること、及びｉｉｉ）ＤＢＩの活性又は発現をモジュレーションすることができる前記候補化合物をポジティブ選択することを含む方法に関する。
【００７６】
本発明の一実施態様によれば、候補化合物は、以前に合成された化合物のライブラリー、又は構造がデータベースで決定される化合物のライブラリー、又はde novo合成された化合物のライブラリー、又は天然化合物から選択され得る。候補化合物は、（ａ）タンパク質又はペプチド、（ｂ）核酸、及び（ｃ）有機又は化学化合物（天然又は非天然）の群から選択され得る。実例として、事前選択された候補核酸のライブラリーは、米国特許第５，４７５，０９６号及び米国特許第５，２７０，１６３号の文献に記載されているように、ＳＥＬＥＸ法を実施することにより得られ得る。いくつかの実施態様では、候補化合物は、ＤＢＩ由来のペプチド又はＤＢＩのペプチド模倣物である。
【００７７】
候補化合物がＤＢＩの活性又は発現をモジュレーションし得るかの試験は、当技術分野で公知のアッセイを使用するか、又はそれをルーチンに改変することにより決定され得る。例えば、前記方法は、ＤＢＩを発現する細胞を候補化合物と接触させ、ＤＢＩ媒介活性を測定し、細胞応答を標準的な細胞応答と比較することを含み得る。典型的には、標準的な細胞応答は、候補化合物の非存在下で測定される。標準に対する細胞応答の減少は、候補化合物がＤＢＩの活性を阻害することができることを示す。反対に、標準に対する細胞応答の増加は、候補化合物がＤＢＩの活性を促進することができることを示す。いくつかの実施態様では、本発明は、ＤＢＩのレセプターに特異的に結合するリガンドを同定するための方法を提供する。例えば、膜又はその調製物などの細胞区画は、ＤＢＩのレセプターに結合する分子を発現する細胞から調製され得る。遺伝子の発現を決定する方法も当技術分野で周知であり、典型的には、レポーターアッセイ（例えば、ＤＢＩ遺伝子のプロモーター下で核酸分子を発現する細胞、又は検出可能部分で標識された形態のＤＢＩを発現する細胞）又は核酸レベルの発現を決定するための任意のアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）である。
【００７８】
いくつかの実施態様では、ポジティブ選択された候補化合物は、オートファジーに対するその特性をさらにアッセイすることを考慮して、（例えば、実施例に記載されているような内因性蛍光バイオセンサー又は外因性蛍光プローブによる）さらなる選択工程に供され得る。いくつかの実施態様では、ポジティブ選択された候補化合物は、異なるin vitro又はin vivoアッセイにおいてその特性をさらにアッセイすることを考慮して、さらなる選択工程に供され得る。例えば、選択化合物は、血糖をモジュレーションし、食物摂取をモジュレーションし、体重の増減をモジュレーションし、脂肪酸酸化をモジュレーションし、グルコース輸送体（例えば、ＧＬＵＴ−１又はＧＬＵＴ−４）の膜発現をモジュレーションし、ＰＰＡＲＧの発現をモジュレーションし、グルコース取り込み（例えば、非放射性又は放射性グルコース同位体の取り込み）をモジュレーションし、解糖をモジュレーションし、又は脂質生成をモジュレーションするその能力についてアッセイされる。このようなアッセイは、典型的には、実施例に記載されている。
【００７９】
バイオマーカー：
本発明のさらなる目的は、被験体が体重モジュレーションのリスクがあるかを決定する方法であって、ｉ）前記被験体から得られた血液サンプル中のＤＢＩのレベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）において決定した前記レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）において決定した前記レベルと前記所定の基準値との間の差が決定された場合、前記被験体が体重モジュレーションのリスクがあると結論することを含む方法に関する。
【００８０】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、工程ｉ）において決定したレベルが所定の基準値よりも高い場合に、被験体が体重増加のリスクがあるかを決定するために特に適切である。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、工程ｉ）において決定したレベルが所定の基準値よりも低い場合に、被験体が体重減少のリスクがあるかを決定するために特に適切である。
【００８１】
本発明の方法は、体重増加又は体重減少をモジュレーションするために適切な食事又は薬物で被験体が応答を達成するかを決定するために特に適切である。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、再発のリスクを決定するために特に適切である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「血液サンプル」という用語は、ＤＢＩを含有する患者由来の任意の血液サンプルを意味する。いくつかの実施態様では、血液サンプルは、ＤＢＩを含有しやすい血清又は血漿サンプルである。
【００８３】
例えば、サンプル中のタンパク質のレベルを決定するための任意の従来の方法によりレベルが決定される場合、使用可能である。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、血液サンプルを、血液サンプル中に存在しやすいタンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体であり得る。別の実施態様では、結合パートナーはアプタマーであり得る。本発明のポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、公知の方法にしたがって、例えば、とりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスから選択される宿主動物に適切な抗原又はエピトープを投与することにより生じ得る。当技術分野で公知の様々なアジュバントは、抗体産生を増強するために使用され得る。本発明の実施において有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、培養液中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離され得る。生産及び分離のための技術としては、限定されないが、ハイブリドーマ技術が挙げられる。いくつかの実施態様では、結合パートナーはアプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識の点において抗体の代替物に相当する分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、事実上任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列である。本発明の結合パートナー、例えば抗体又はアプタマーは、検出可能な分子又は物質、例えば蛍光分子、放射性分子又は当技術分野で公知の任意の他の標識で標識され得る。シグナルを一般に（直接的又は間接的に）提供する標識は、当技術分野で公知である。本明細書で使用される場合、抗体に関する「標識された」という用語は、検出可能な物質、例えば放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体又はアプタマーにカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体又はアプタマーの直接的な標識、及び検出可能な物質を用いた反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを意図する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野で公知の任意の方法により、放射性分子で標識され得る。上述のアッセイは、一般に、固体支持体への結合パートナー（すなわち、抗体又はアプタマー）の結合を伴う。本発明の実施において使用され得る固体支持体としては、基材、例えばニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェル形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどが挙げられる。バイオマーカータンパク質のレベルは、イムノアッセイ、例えば競合、直接反応又はサンドイッチ型アッセイを含む標準的な免疫診断技術を使用して測定され得る。このようなアッセイとしては、限定されないが、凝集試験；酵素標識及び媒介性免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降が挙げられる。より具体的には、例えば、前記バイオマーカータンパク質を認識する抗体のセットでマイクロタイタープレートのウェルをコーティングするＥＬＩＳＡ法を使用し得る。次いで、前記バイオマーカータンパク質を含有する又は含有すると疑われる血液サンプルをコーティングウェルに添加する。抗体−抗原複合体の形成を可能にするために十分なインキュベーション期間後、プレートを洗浄して未結合部分を除去し、検出可能に標識された二次結合分子を添加し得る。二次結合分子を任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出する。いくつかの実施態様では、イムノアッセイは、タンパク質に対する特異性を有する２つの抗体の使用を伴い得る。典型的には、タンパク質を「検出」するために一次抗体が使用され、タンパク質を「捕捉」するために二次抗体が使用される。いくつかの実施態様では、前記方法は、ｉ）タンパク質に特異的な一定量の第１の抗体でコーティングされた固体支持体を提供すること、ｉｉ）サンプルを固体支持体と接触させること、ｉｉｉ）及び、標識にコンジュゲートされた一定量の第２の抗体を添加することにより達成される。標識に特異的に結合した結合パートナーの量の測定は、サンプル中に存在するタンパク質の量を明らかにする。典型的には、一次抗体は、二次抗体との相互作用を妨げないエピトープに対するものである。典型的には、（非イオン性界面活性剤を含む又は含まない任意の適切なバッファー、例えばＰＢＳによる）洗浄工程は、工程ｉｉ）及びｉｉｉ）の後に実施される。典型的には、ＢＳＡ若しくはミルク及び／又は血清（ヤギ又はウシ）を含有するバッファーを用いて、ブロッキング工程を実施して、タンパク質の非特異的結合を遮断する。（イムノアッセイベースの方法を用いた又は用いない）バイオマーカータンパク質のレベルの測定はまた、化合物の分離：化合物の分子量に基づく遠心分離；質量及び電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；並びに使用される特定の固相に対する化合物の親和性に基づく固相親和性を含み得る。分離されたら、前記バイオマーカータンパク質は、その化合物について公知の「分離プロファイル」、例えば保持時間に基づいて同定され、標準的な技術を使用して測定され得る。あるいは、目的のタンパク質（例えば、ＤＢＩ）は、例えば、質量分析計により検出及び測定され得る。
【００８４】
いくつかの実施態様では、所定の基準値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者に認識されているように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。例えば、適切に保存された過去の患者サンプル中のＤＢＩの発現レベルの遡及的測定は、所定の基準値の確立に使用され得る。いくつかの実施態様では、所定の基準値は、実質的に健康である（すなわち、上記で定義される正常ＢＭＩ）１つ以上の被験体由来のコントロールサンプル中のＤＢＩのレベルに由来する。所定の基準値は、試験の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床転帰）にしたがって最適な感度及び特異度を得るために決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（したがって閾値）は、実験データに基づいて受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、参照群におけるマーカーのレベルを決定した後、試験すべきサンプル中のマーカーの測定したレベルの統計処理のためにアルゴリズム分析を使用し、サンプル分類について有意性を有する分類標準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名称は、受信者操作特性曲線としても公知の受信者動作特性曲線である。それは、臨床的生化学診断試験のために主に使用される。ＲＯＣ曲線は、真の陽性率（感度）及び偽陽性率（１−特異度）という連続変数を反映する総合指標である。それは、画像合成方法を用いて感度と特異度との間の関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の正常結果と異常結果との間の境界値）を連続変数として設定して、一連の感度の値及び特異度の値を計算する。次いで、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断精度は高い。ＲＯＣ曲線上で座標図の左上端に最も近い点が、高感度値及び高特異度値を併せもつ臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０〜０．５である。ＡＵＣ＞０．５である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果はより良好になる。ＡＵＣが０．５〜０．７である場合、精度は低い。ＡＵＣが０．７〜０．９である場合、精度は中等度である。ＡＵＣが０．９よりも高い場合、精度は極めて高い。このアルゴリズム法は、好ましくはコンピューターを用いて行われる。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステム、例えばＭｅｄＣａｌｃ  ９．２．０．１医学統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ  ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ  ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ−ＲＯＣ．ＳＡＳ、ＧＢ  ＳＴＡＴ  ＶＩ０．０  (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., USA)は、ＲＯＣ曲線を描くために使用され得る。
【００８５】
以下の図及び実施例により、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ヒト及びマウスにおけるオートファジーに対するＤＢＩ及びＤＢＩ阻害の効果。（Ａ〜Ｄ）。培養細胞におけるオートファジーに対する細胞外ＤＢＩの効果。Ｈ４−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞を、（場合により熱不活性化した）中和ＤＢＩ抗体の存在下で６時間培養し、最後の２時間はＢＡＦＡ１の非存在下又は存在下で培養した（Ａ）。あるいは、ＷＴ  Ｈ４細胞を同様の条件で培養し、続いて、オートファジー関連ＬＣ３−ＩＩを検出した（Ｂ）。Ｈ４−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞（Ｃ）又はＷＴ  Ｈ４細胞（Ｄ）を、ＢＡＦＡ１あり又はなしでリコンビナント（ｒｅｃ．）ＤＢＩタンパク質と共に培養し、オートファジーを測定した。アイソタイプ又は未処置コントロールと比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。（Ｅ、Ｆ）。マウスにおけるオートファジーに対する細胞外ＤＢＩの効果。中和ＤＢＩ特異的抗体をマウスに腹腔内注射し（Ｅ）、又はｒｅｃＤＢＩを静脈内注射した（Ｆ）。処置の４時間後、マウスをロイペプチンで処置し、２時間後に肝臓を回収し、イムノブロットによりオートファジー関連パラメータ（ＬＣ３−ＩＩの増加、ＳＱＳＴＭ１の減少）をモニタリングした（ｎ＝マウス３匹／群）。
【図２】食欲不振又は肥満を有する患者における血漿ＤＢＩ濃度。神経性食欲不振（Ａ）、肥満（Ｂ）又は肥満手術前若しくはその１年後の肥満（Ｃ）を有する患者のコホートにおいて、年齢及び性別一致正常体重コントロール（Ａ、Ｂ）と比較して、血漿ＤＢＩを測定した。結果は平均±ＳＥＭである。＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。結果は、１群当たり５匹のマウスの平均である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。完全なデータは表Ｓ１に示されている。
【図３】ＤＢＩの解糖及び食欲促進効果。（Ａ〜Ｃ）。ＤＢＩコードベクターの流体力学的注射。マウス（ｎ＝５／群）は、ベクターのみ、又はマウスＤｂｉ  ｃＤＮＡを発現する構築物の静脈内注射を受け、血糖（Ａ）、食物摂取（Ｂ）又は体重増加（Ｃ）を経時的にモニタリングした。結果は平均±ＳＥＭである。ベクターのみのコントロールとの比較で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ〜Ｈ）。全身代謝に対するリコンビナント（ｒｅｃ．）ＤＢＩタンパク質の効果。ビヒクルのみ又はｒｅｃ．ＤＢＩ又はあるいはＤＢＩ由来ペプチドＴＴＮ若しくはＯＤＮをマウス（ｎ＝５／群）に静脈内注射し、指定の時点において、血糖（Ｄ）、食物摂取（Ｅ、Ｆ）及び体重増加（Ｇ）を測定した。あるいは、矢印により示されているようにｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質を投与し、呼吸計により脂肪酸酸化を２４時間にわたって測定した（Ｈ）。ビヒクルコントロールとの比較で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】特定の抗体による細胞外ＤＢＩ中和の食欲減退効果。（Ａ〜Ｄ）。グルコース及び摂食行動に対するＤＢＩ中和の効果。モノクローナル抗ＤＢＩ（抗ＤＢＩ  ｍＡｂ  ７Ａ）（Ａ）又はポリクローナル抗ＤＢＩ（抗ＤＢＩ、ａｂ１６８７１）（Ｃ）及びアイソタイプコントロール抗体の腹腔内注射の３０分後、給餌又は未給餌（２４時間）マウス（ｎ＝５／群）において、血漿グルコースレベルを測定した。再給餌後の食物摂取を経時的にモニタリングした（Ｂ、Ｄ）。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、アイソタイプコントロールと比較した抗ＤＢＩ効果を示し、＄Ｐ＜０．０５、＄＄＄Ｐ＜０．００１は、コントロール未給餌マウスと比較した未給餌マウスにおける抗ＤＢＩ効果を表す。
【図５】ＤＢＩ中和は、肝臓における脂質生成の全体的抑制を誘導する。イムノブロッティングにより、様々な肝タンパク質の発現に対するＤＢＩ中和の効果を測定し、各レーンは１匹のマウスを表す（Ａ）。定量的結果（Ｂ）は平均±ＳＥＭ（Ｎ＝５）である。アイソタイプを受けた給餌マウスとの比較で、＊ｐ＜０．０５。
【図６】ＤＢＩに対する自己免疫の食欲減退効果。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のみ、又はｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質（ＫＬＨ−ＤＢＩ）にコンジュゲートされたＫＬＨをマウスに注射した。ＤＢＩに対するＩｇＧ自己抗体を生じているマウスを、ＫＬＨのみで免疫したコントロールと比較して、飢餓条件における体重減少（動物５匹／群）（Ａ）、２４時間の飢餓後の食物摂取（Ｂ）をモニタリングし、通常食（Ｃ）又は高脂肪食（Ｄ）のマウス（７〜８匹／群）の累積体重増加を測定した。ＤＢＩ特異的自己抗体の効果について、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【実施例】
【００８７】
材料及び方法
化学物質、細胞株及び培養条件。
特に指定がない限り、細胞培養のための培地及びサプリメントはGibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)から購入し、プラスチックはCorning B.V. Life Sciences (Schiphol-Rijk, The Netherlands)から購入し、化学物質はSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)から購入した。全ての細胞株を、１０％ウシ胎仔血清、１００mg/Lピルビン酸ナトリウム、１０mM ＨＥＰＥＳバッファー、１００単位/mLペニシリンＧナトリウム及び１００μg/mL硫酸ストレプトマイシンを含有する培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。加えて、ヒト子宮頸ガンＨｅＬａ細胞及びヒト脳神経膠腫Ｈ４細胞並びにそれらのＧＦＰ−ＬＣ３発現誘導体の場合には、細胞型特異的培養条件はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。ヒト肝細胞ガンＨｅｐＧ２細胞の場合には、最小必須培地イーグル（ＥＭＥＭ）を上記のように補充し、２mMグルタミン及び１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を加えた。細胞を、６ウェルプレート、９４ウェルプレートに播種し、２４時間成長させてから、指定の期間にわたって単独で及び／又は５０nMバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１、Tocris）、１００nMラパマイシン（Ｒａｐａ）、ＤＢＩに対する抗体（ａｎｔｉＤＢＩ）、リコンビナントタンパク質ＤＢＩ（ｒｅｃＤＢＩ）と組み合わせて処理した。血清及び栄養枯渇（ＮＦ）では、細胞を、無血清ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で培養した。
【００８８】
ヒト細胞培養におけるプラスミドトランスフェクション及びＲＮＡ干渉。ＤＢＩ  ｃＤＮＡをコードするプラスミドは、OriGene (Rockville, MD, USA)から入手した。AttracteneR試薬(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて一過性プラスミドトランスフェクションを実施し、特に指示がない限り、トランスフェクションの２４時間後に細胞を分析した。細胞を、６ウェルプレート又は９６ウェルプレート中で培養し、５０％コンフルエンスでトランスフェクションした。ＤＢＩ及びＴＳＰＯに対して特異的な１００nMのｓｉＲＮＡ(Qiagen)の存在下で、RNAi MaxTMトランスフェクション試薬(Invitrogen, Eugene, USA)によりｓｉＲＮＡをリバーストランスフェクションし、スクランブルｓｉＲＮＡをコントロールとして使用した。イムノブロットにより、ｓｉＲＮＡ媒介性タンパク質ダウンレギュレーションをコントロールした。
【００８９】
免疫蛍光。細胞を、４％ＰＦＡで、室温で１５分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理した。非特異的結合部位をＰＢＳ中５％ウシ血清でブロッキングし、続いて、一次抗体で、４℃で一晩染色した。ＤＢＩの検出(Santa Cruz)のために、細胞を染色した。適切なAlexaFluor（商標）コンジュゲート(Molecular Probes-Invitrogen)を、一次抗体に結合させた。核をHoechst 33342（１０μg/ml）で標識した。それぞれDC300Fカメラ及びLSM 510顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)又はLeica SPE共焦点顕微鏡を備えるIRE2顕微鏡(Leica Microsystems)により、標準及び共焦点蛍光顕微鏡評価（４０倍）を実施した。ドット平均面積の定量に関して、４０倍対物レンズを使用して、共焦点顕微鏡により画像をキャプチャした。取得した画像を８ビットバイナリファイルに変換し、各画像における４ピクセルを超える面積を有する個々のＧＦＰ−ＬＣ３点の面積を、ImageJソフトウェア(NIH)により計算した。各実験を少なくとも３回行い、１条件当たり４０〜５０個の細胞を定量した。
【００９０】
自動顕微鏡検査。ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＨ４、ＨｅｐＧ２又はＨｅＬａ細胞を、刺激の２４時間前に、９６ウェルイメージングプレート(BD Falcon, Sparks, USA)に播種した。細胞を指定の薬剤で４〜６時間処理した。続いて、細胞を４％ＰＦＡで固定し、１０μM Hoechst 33342で対比染色した。ロボット化Twister IIプレートハンドラー(Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA)に結合した４０倍対物レンズ(Olympus, Center Valley, USA)を備えるBD経路855自動顕微鏡(BD Imaging Systems, San Jose, USA)を使用して、画像を取得した。BD Attovisionソフトウェア(BD Imaging Systems)により、細胞質におけるＧＦＰ−ＬＣ３点の存在について、画像を分析した。製造業者の標準的な手順にしたがって、細胞表面をセグメント化し、細胞質領域及び核領域に分割した。RB 2x2及びMarr-Hildrethアルゴリズムを使用して、細胞質ＧＦＰ−ＧＡＬＴ、ＧＦＰ−ＬＣ３、ＲＦＰ−ＦＹＶＥ、ＧＦＰ−ＧＡＬＴ−ＲＦＰ−ＬＣ３、ＧＦＰ−ＲＦＰ−ＬＣ３陽性ドットを認識した。Rソフトウェア(http://www.r-project.org/)により、統計分析を実行した。
【００９１】
イムノブロッティング。イムノブロッティングでは、タンパク質 ２５μgを４−１２％ビス−トリスアクリルアミド(Invitrogen)又は１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャストゲル(Biorad, Hercules, USA)で分離し、Immobilon（商標）膜(Millipore Corporation, Billerica, USA)に電気転写した。次いで、目的のタンパク質の分子量にしたがって、膜を異なる部分にスライスして、同じ実験内で異なる抗原の同時検出を可能にした。５％脱脂粉乳（ＴＢＳ中ｗ：ｖ）を補充した０．０５％Tween20（ＴＢＳ中ｖ：ｖ）で膜を１時間インキュベーションし、続いて、ＤＢＩ（ＸＸＸ）、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)、ＬＣ３、ＦＡＳＮ、ｐ−ｐ７０ｓ６ｋ、ｐ７０ｓ６ｋ、ｐ−ＳＲＥＢＰ、ＳＲＥＢＰ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＴＳＰＯ、ＰＰＡＲＧ (Cell Signalling, Danvers, MA, USA)に特異的な一次抗体と共に一晩インキュベーションすることにより、非特異的結合部位飽和した。適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体(Southern Biotech, Birmingham, USA)＋SuperSignal West Pico化学発光基質(Thermo Scientific-Pierce)を用いて、現像を実施した。抗グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ抗体（ＧＡＰＤＨ；Chemicon International, Temecula, USA）又は抗アクチン(Abcam, Cambridge, MA, USA)を使用して、レーンの均等なローディングをコントロールした。
【００９２】
マウス実験及び組織処理。野生型（ＷＴ）であるＣ５７ＢＬ／６マウス(Charles River Laboratory, Lentilly, France)、ＧＦＰ−ＬＣ３−トランスジェニック（Prof. N. Mizushimaの寄贈）、Ｂｅｃｌｉｎ＋／−Ｃ５７ＢＬ／６（Dr. B. Levineの寄贈）、Ａｍｂｒａｇｔ／ｇｔ（Dr. P. Boyaの寄贈）、Ａｔｇ４ｂ−／−（Dr. C. Lopez-Otinの寄贈）を繁殖させ、FELASA、及びAnimal Experimental Ethics Committee Guidelines (CE n. 26: 2012-65, 2012-67; Val de Marne, France) の両方にしたがって維持した。マウスを、１２時間明暗周期の温度コントロール環境で飼育し、自由に食物及び水又は高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた。マウスを２４〜４８時間の飢餓に供し、又はＤＢＩ、ＤＢＩ由来ペプチド若しくはＤＢＩ特異的抗体を腹腔内注射若しくは静脈内注射し、１時間〜６時間後に屠殺した。抽出後、組織を液体窒素で直ぐ凍結し、１５０mM ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０mM ＥＤＴＡ及びComplete（登録商標）プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Applied Science)を含有する２０mMトリスバッファー（ｐＨ７．４）中で、Precellys 24組織ホモジネーター(Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France)を使用して、２サイクルにわたって５，５００rpmで２０秒間ホモジナイズした。次いで、組織抽出物を１２，０００ｇ、４℃で遠心分離し、上清を収集した。ビシンコニン酸技術(BCAタンパク質アッセイキット、Pierce Biotechnology, Rockford, IL)により、上清中のタンパク質濃度を評価した。
【００９３】
ＤＢＩ検出：in vivo処理後、１５０００rpmで３０分間の遠心分離により、血液収集チューブから血漿を回収し、製造業者が指示するようにDBI ELISA (Mybiosource MBS2025156)を使用して、血漿中のＤＢＩの量を決定した。in vitro実験では、刺激の２４時間前に、Ｈ４、ＨｅｐＧ２又はＨｅＬａ細胞を９６ウェルイメージングプレート(BD Falcon, Sparks, USA)に播種した。細胞を指定の薬剤で指定時間処理し、上清を収集し、DBI ELISA (Abnova KA0532 DBI (Human) ELISA)を使用して上清中のＤＢＩの量を決定した。
【００９４】
免疫。Harlan France (Gannat, France)から入手した６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾基底部を、ミョウバン沈殿ＫＬＨ(Calbiochem, La Jolla, CA)１００μgを含む平衡塩溶液１００μlで皮下免疫した。ＤＢＩをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に架橋することにより、ＤＢＩ−ＫＬＨを製造した。ＤＢＩ自己抗体を発現するトランスジェニックマウスは、Montanide ISA51vgアジュバントで乳化した生理食塩水ＫＬＨ−ＤＢＩのいずれかの筋肉内注射を受けた（３０  ｇ、３０  ｇ、３０  ｇ、１０  ｇを４週間にわたって週１回）。ＫＬＨ−ＤＢＩコンジュゲートの生成のために、マウスＤＢＩを１：２０のモル比で混合し、０．２５％最終（v/v）グルタルアルデヒドに徐々に調整した。グリシン溶液の添加により、反応を停止させた。限外濾過(Millipore; Billerica, Massachusetts, USA)の後、ホルムアルデヒド溶液を０．２％最終（v/v）まで添加した。グリシン溶液の添加により反応を停止させ、続いて、７０mMリン酸バッファー（ｐＨ７．８）と共に１００kDa膜を使用して限外濾過した。ＤＢＩ−ＫＬＨを４℃で保存した。ＫＬＨの非存在下で架橋反応を行い、最終膜の分子量カットオフが１０kDaである以外は同じ方法で、コントロール抗原として機能するＩＦＮｇｆを製造した。ブラッドフォードアッセイにより、タンパク質濃度を決定した。
【００９５】
線虫系統：本発明者らは、C.elegans系統を維持するための標準的な手順に従った。全ての実験について、飼育温度を２０℃に設定した。本発明者らは、オートファジーの評価のために、ＤＡ２１２３：ＷＴ；Ｉｓ［ｐｌｇｇ−１ＧＦＰ：：ＬＧＧ−１＋ｒｏｌ−６（ｓｕ１００６）］、ＭＡＨ１４：ｄａｆ−２（ｅ１３７０）；［ｐｌｇｇ−１ＧＦＰ：：ＬＧＧ−１＋ｒｏｌ−６（ｓｕ１００６）］及びＭＡＨ２８：ａａｋ−２（ｏｋ５２４）；［ｐｌｇｇ−１ＧＦＰ：：ＬＧＧ−１＋ｒｏｌ−６（ｓｕ１００６）］を使用した（４０、４１）。第１の系統をＳＶ６２：ａｃｂｐ−１（ｓｖ６２）Ｉ及びクワドループルＦＥ００１７：ａｃｂｐ−１（ｓｖ６２）Ｉ；ａｃｂｐ−６（ｔｍ２９９５）ＩＩ；ａｃｂｐ−４（ｔｍ２８９６）ＩＩＩ；ａｃｂｐ−３（ｓｖ７３）Ｘ系統（４２）と交配させて、ａｃｂｐファミリー遺伝子の枯渇時のオートファジーをモニタリングした。咽頭ポンピングの測定では、減少した咽頭ポンピングの遺伝モデルであるＤＡ４６５：ｅａｔ−２（ａｄ４６５）ＩＩと組み合わせて、ＳＶ６２及びＦＥ００１７系統を使用した。
【００９６】
C.elegansにおけるオートファジー測定：記載されているように（４３）、オートファジーを測定した。簡潔に言えば、各遺伝的背景の十分に給餌した成虫 １０匹を、ＮＧＭ又はＲＮＡｉプレート上で産卵させた。４時間後、両親を除去し、プレートを２０℃に置いた。２日後、同調動物を収集し、１０mMレバミソールで麻酔し、顕微鏡検査のためにスライド上にマウントした。Ｌ３−Ｌ４幼虫期の下皮シーム細胞において、ＧＦＰ：：ＬＧＧ−１陽性オートファジー斑点の数を測定した（４４）。記載されているように（４５）、咽頭ポンピングを測定した。自由運動動物のグラインダー運動を実体顕微鏡で測定した。各個体について３回の独立した測定を実施し、動物１匹当たりの平均ポンプ数を記録した。細菌を欠くＮＧＭプレートに動物を２４時間置くことにより、飢餓を達成した。観察の３０分前に、動物を放置してＯＰ５０播種プレート上で回復させた。
【００９７】
マウス脳の免疫組織化学。マウスをペントバルビタール(Nembutal, Abbott Laboratories, Chicago, IL; 80 mg/kg腹腔内)で深麻酔し、リン酸バッファー（ＰＢ；０．１Ｍ）、続いて４％パラホルムアルデヒド（０．１M ＰＢ中）で経心臓的に灌流した。脳を摘出し、同じ固定液で２時間後固定し、２０％スクロース溶液（０．１M ＰＢ中）で４８時間凍結保護し、ＣＯ２で瞬間凍結した。冠状切片（２０μm）をクライオスタット(CM 3050 Leica, Nussloch, Germany)で切断した。視床下部切片を３つの別々の系列で収集し、顕微鏡スライドガラス(SuperFrost Plus, Faust, Schaffhausen, Switzerland)上に解凍マウントした。室温で風乾し、ＰＢＳで再水和した後、切片をブロッキング溶液中で２時間インキュベーションした（１．５％ウサギ正常血清＋アビジン；Vector Laboratories, Burlingame, CA）。一次抗体（ポリクローナルヤギ抗ｃ−Ｆｏｓ、Santa Cruz、１：１０，０００＋ビオチン、Vector Laboratories）を４℃で４８時間適用した。ＰＢＳで洗浄することにより未結合抗体を除去してから、切片を二次抗体（ビオチン化ウサギ抗ヤギ、Vectastain-Elite ABC Kit, Vector Laboratories；１：２００）と共に室温で２時間インキュベーションした。ＡＢＣ溶液(Vectastain-Elite ABC Kit, Vector Laboratories)中でインキュベーションした後、ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）を色素原として使用した［０．０２％Ｈ２Ｏ２及び着色強化のために０．０８％ＮｉＣｌ２（×６  Ｈ２Ｏ）、０．０１％ＣｏＣｌ２（×６  Ｈ２Ｏ）を含むＰＢＳ中０．０４％］。最後に、切片を段階的なアルコールで脱水し、キシレンでクリーニングし、Entellan (Merck, Darmstadt, Germany)でカバースリップした。
【００９８】
酵母オートファジー測定：ＥＧＦＰ−Ａｔｇ８融合タンパク質を発現する細胞の蛍光顕微鏡検査を使用してＡｔｇ８ｐの液胞局在性により、又は公開されている方法にしたがってＢＹ４７４１野生型若しくはｄｂｉ１トランスフォーメーション細胞を使用してアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性により、オートファジーをモニタリングした。
【００９９】
結果及び考察：
オートファジー（「自食」）は、細胞生物学における微妙にレギュレーションされているが最も壮観な現象の１つであり、細胞質構造のターンオーバーを促進し、栄養不足を含む変化するストレス条件への細胞の適応を可能にすることにより、細胞及び生物の恒常性の維持において重要な役割を果たす（１、２）。いくつかのリーダーレスタンパク質（これは、ゴルジを回避する非従来型経路を介してのみ放出され得る）の細胞分泌は、オートファジーと強く関連する（３〜７）。１つのこのようなタンパク質は、ジアゼパム結合タンパク質（ＤＢＩ）又はアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）結合タンパク質（ＡＣＢＰ）として公知の系統発生学的に古い因子である（３、４）。ヒト又はマウスＤＢＩは、すなわち、細胞内（それが長鎖アシルＣｏＡ分子に結合する場所）ではＡＣＢＰとして、及び細胞外（タンパク質全体又はその分解生成物であるトリアコンタテトラニューロペプチド［ＴＴＮ、残基１７〜５０］及びオクタデカニューロプチド［ＯＤＮ、残基３３〜５０］が、γ−アミノ酪酸タイプＡレセプターＧＡＢＡＡＲのベンゾジアゼピン結合部位と相互作用し、ＧＴＰタンパク質共役レセプターＧＰＣＲとしてその活性をモジュレーションし得る場所）ではＤＢＩとして、２つの全く異なる機能を有する８７アミノ酸の小さなタンパク質（１０kDa）である（８〜１０）。ＤＢＩ及びそのタンパク質分解フラグメントはまた、末梢型ベンゾジアゼピンレセプター（ＰＢＲ）（１１〜１３）及び未だ同定されていないＧＰＣＲ（ＯＤＮ−ＧＰＣＲ）（１４〜１７）に結合する。今回、本発明者らは、ＤＢＩ分泌がオートファジーのフィードバックレギュレーションに関与し得るかという問題に取り組んだ。
【０１００】
無栄養（ＮＦ）で培養し、又はラパマイシン（ＲＡＰＡ）（オートファジー刺激条件）で処理したヒト細胞株は、バフィロマイシンＡ１（ＢＡＦＡ１）、クロロキン及びヒドロキシクロロキンなどのリソソームインヒビターの添加により、並びに必須オートファジー遺伝子／タンパク質ＡＴＧ５の欠失により抑制され得る細胞内ＤＢＩ発現の減少を示す（データは示さず）。ベースライン条件の培養上清では、可溶性ＤＢＩを検出することができたが、ＮＦ培養では、ＢＡＦＡ１を添加するか又はＡＴＧ５を除去しない限り増加した（データは示さず）。同様に、体のほとんどの細胞においてオートファジーを誘導することが公知の条件（１８）である２４時間の飢餓に供したオートファジーコンピテント野生型（ＷＴ）マウス由来のいくつかの器官では、ＤＢＩの細胞内含有量は減少した（しかし、オートファジー欠損Ｂｅｃｎ１＋／−由来のものではそうではなかった）（データは示さず）。同時に、飢餓後、ＷＴ由来の血漿では、ＤＢＩレベルは増加したが、部分的オートファジー欠損Ｂｅｃｎ１＋／−、Ａｔｇ４ｂ−／−及びＡｍｂｒａ１ｇｔ／ｇｔマウス由来の血漿では増加しなかった（データは示さず）。これらの結果は、in vivoにおけるオートファジー誘導が、細胞外区画への細胞内ＤＢＩの放出を引き起こすことを裏付けている。
【０１０１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＤＢＩの枯渇は、培養ヒト細胞におけるＮＦ性刺激オートファジーを減少させたが（データは示さず）、その過剰発現はオートファジーフラックスを刺激した（データは示さず）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）にカップリングした微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ軽鎖３Ｂ（ＬＣ３）のオートファゴソームへの再分布を追跡することにより、及びその電気泳動移動度の増加を引き起こすＬＣ３脂質化を測定することにより、オートファジーをモニタリングしたところ、この結果が得られた（データは示さず）。同時に、ＭＴＯＲ基質ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の増加により示されるように、ＤＢＩのサイレンシングは、オートファジーのネガティブレギュレーターである機械的ラパマイシンターゲット（ＭＴＯＲ）のキナーゼ活性を増加させた（データは示さず）。したがって、後期エンドソーム／リソソームアダプターＭＡＰＫ及びＭＴＯＲアクティベーター５（ＬＡＭＴＯＲ５）との直接的な分子相互作用を通じてＭＴＯＲ経路と交差し得る細胞内ＤＢＩ（１９）は、ｍＴＯＲをネガティブにレギュレーションし、オートファジーをポジティブに制御する。細胞由来のＤＢＩのオートファジー依存性枯渇は、オートクリンフィードバックループを活性化し得、これがオートファジープロセスの自己制限をもたらす。
【０１０２】
ＤＢＩオルソログをコードする酵母（Saccharomyces cerevisiae）ａｃｂ１遺伝子のノックアウトはＮＦ誘導性オートファジーを阻害したが（データは示さず）、線虫（Caenorhabditis elegans）ａｃｂｐ−１遺伝子のノックアウトは単独で、又は（この種には存在するが哺乳動物には存在しない）そのホモログのいくつかと一緒にオートファジーを刺激した（データは示さず）。この矛盾は、単細胞対多細胞の状況では、この系統発生学的に古いタンパク質が異なるオートファジー調節機能を有し得ることを示唆している。実際、依然としてＤＢＩを発現する少数の細胞と混合した培養ヒト細胞の大部分においてＤＢＩをｓｉＲＮＡ枯渇させた場合（これは、これらの細胞におけるオートファジーを阻害する。データは示さず）、この操作は、後者におけるオートファジーを増強した（データは示さず）。同様に、培養培地中の細胞外ＤＢＩを中和する抗体の添加はオートファジーフラックスを刺激したが（図１Ａ、Ｂ）、リコンビナント（ｒｅｃ）ＤＢＩタンパク質（又はそのフラグメントＴＴＮ及びＯＤＮ）の添加は、培養ヒト細胞におけるＮＦ誘導性オートファジーを阻害した（図１Ｃ〜Ｄ）。同様に、マウスへの特定の抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射による細胞外ＤＢＩの中和は、様々な器官におけるオートファジーを誘導したが（図１Ｅ）、ｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質の全身静脈内（ｉ．ｖ．）又は腹腔内投与は、飢餓誘導性オートファジーを阻害した（図１Ｆ）。これらの結果は、（細胞内ＤＢＩがオートファジーを刺激するという事実とは対照的に）細胞外ＤＢＩがオートファジーを抑制することを示しており、これは、細胞からのオートファジー誘導性ＤＢＩ放出がパラクリンフィードバックループに関与し得ることを意味する。
【０１０３】
神経性食欲不振を有する患者 ５２人のコホートでは、正常なボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する年齢及び性別一致コントロールと比較して、血漿ＤＢＩ濃度が異常に低かったが（図２Ａ）、これは、食欲不振患者 ２４人に関する以前の報告（２０）を裏付けている。さらに重要なことに、肥満個体では、ＤＢＩ濃度が異常に高く（及び肥満手術後に減少し）、高い循環インスリンレベルと相関している（図２Ｂ、Ｃ）。同様に、（レプチンレセプターの欠損を有する）遺伝的肥満Ｏｂ／Ｏｂマウスは、増強した循環ＤＢＩレベルを示した（データは示さず）。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＤＢＩが一般的な代謝を制御するかを調査した。このため、ｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質及び抗ＤＢＩ抗体をそれぞれ給餌マウス及び飢餓マウスに注射し、２時間後、それらの器官を質量分析メタボロミクス分析に供した。ｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質は低血糖を引き起こした。逆に、ＤＢＩ中和は飢餓誘導性低血糖を回復させ、ケトン体２−ヒドロキシ酪酸の血漿レベルの飢餓誘導性増加をさらに悪化させた（データは示さず）。したがって、本発明者らは、グルコース及び脂肪酸代謝との関連における体重コントロールに対するＤＢＩの効果を調査することを決定した。
【０１０４】
ＤＢＩをコードするｃＤＮＡの流体力学的注射（ＤＢＩの肝臓発現を増加させる手順）は、低血糖、食物摂取の増加をもたらし、体重増加を引き起こした（図３Ａ〜Ｃ）。同様に、ｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質（又はそのペプチドフラグメントＴＴＮ又はＯＤＮ）の全身（腹腔内又は静脈内）注射は、低血糖、食物摂取の増加及び体重増加の３つを刺激した（図３Ｄ〜Ｇ）。同時に、ｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質は、呼吸計により決定した場合、全身レベルで脂肪酸酸化を減少させた（図１Ｈ）。ＤＢＩタンパク質が食欲促進効果を有するという知見は、脳へのＤＢＩフラグメントの投与が食欲減退性であることを示す以前の報告（２１、２２）とは対照的である。したがって、腹腔内経路又は静脈内経路を介して注射したｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質は、中枢神経効果ではなく末梢神経効果を介して作用する可能性がある。実際、ｒｅｃ．ＤＢＩの全身投与は、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ１）及びペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターガンマ−γ（ＰＰＡＲＧ）（これは、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳＮ）を介して脂質生成をアップレギュレーションする）の肝臓アップレギュレーションを急速に（３０分）引き起こした（データは示さず）。したがって、ｒｅｃ．ＤＢＩは、グルコースから内臓脂肪への１４Ｃ原子の取り込みを増強した（データは示さず）。また、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞に添加した場合、ｒｅｃ．ＤＢＩは、基礎解糖及び最大解糖の両方を刺激した（データは示さず）。グルコースの腹腔内注射によるＤＢＩ誘導性低血糖の回復は過食症を予防した（データは示さず）。したがって、ＤＢＩは、グルコース取り込み、解糖及び脂質生成を促進し、最終的には、摂食応答をトリガーする低血糖を引き起こす。
【０１０５】
ｒｅｃ．ＤＢＩタンパク質の食欲促進効果を考慮して、本発明者らは、内因性ＤＢＩの枯渇又は中和が食欲減退性であるかを調査した。構成的Ｄｂｉノックアウト（Ｄｂｉ−／−）を有するマウスは死亡するか（２３）、又は表皮バリア機能を含む複数の欠陥により影響を受けるか（２４〜３３）のいずれかであり、ＤＢＩの細胞内機能及び細胞外機能を区別するために明らかに使用することができない。本発明者らは、（ｆｌｏｘ化Ｄｂｉのタモキシフェン（Ｔａｍ）誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性切除を使用して）タモキシフェン注射によりＤｂｉをコンディショナルノックアウトし得るマウスを作成した（データは示さず）。ＤＢＩのＴａｍ誘導性全身ノックアウトは、通常食を給餌した成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの一部を殺し（データは示さず）、高脂肪食（ＨＦＤ）のマウスの生存を損なわず（データは示さず）、飢餓誘導死に対してマウスをさらに感受性にした（データは示さず）。ＤＢＩ枯渇マウスでは、飢餓により誘導される体重減少は増加したが（データは示さず）、グルコースレベルは正常血糖の範囲内に維持されていた（データは示さず）。細胞外ＤＢＩのみを中和するために、本発明者らは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ７Ａ、ＩｇＧ）を生成した。異なる抗ＤＢＩ抗体の全身（腹腔内）注射は、給餌マウス及び飢餓マウスにおける血漿グルコースレベルを増加させ（図４Ａ、Ｃ）、飢餓後食物摂取を減少させた（図４Ｂ、Ｄ）。ＤＢＩを中和するいくつかの市販のポリクローナル抗体を用いたところ、非常に似た結果が得られた（データは示さず）。全身ＤＢＩノックアウトとは対照的に、ｍＡｂ  ７Ａ及びポリクローナル抗体は、飢餓マウスにおいてさえ致死を引き起こした。ベースライン（データは示さず）及び飢餓条件（データは示さず）の両方において、ＤＢＩの遮断は全身の脂肪酸酸化を阻害した。ＤＢＩ中和により誘導される高血糖にもかかわらず、飢餓マウスは、血漿インスリンレベル、Ｃペプチド及び胃阻害性ペプチド（ＧＩＰ）の減少を示した（データは示さず）。
【０１０６】
肝臓では、ＤＢＩの中和は、脂質生成の抑制に応じて、ステロール調節要素結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）の阻害的リン酸化を引き起こしたので、ＰＰＡＲＧ及びＦＡＳＮの発現を減少させた（図５）。したがって、ＤＢＩの中和は、肥満原性高脂肪食との関連で肝脂肪症を軽減する。
【０１０７】
次に、本発明者らは、強力なアジュバントと一緒にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップリングしたＤＢＩでマウスを免疫することにより、ＤＢＩに対する自己寛容を破壊して中和自己抗体の産生を誘導する可能性を調査した（３４）。循環中のＤＢＩを永続的に中和する自己抗体の急増（データは示さず）は、代謝に対して大きな影響を有していたが、（全身ノックアウトについて記録されているように）致死効果を伴わず、飢餓中の体重減少の増強（図６Ａ）及び飢餓後再摂食の減少（図６Ｂ）をもたらした。また、通常食又はＨＦＤを給餌したマウスにおいて通常見られる体重増加は、ＤＢＩに対する自己免疫により減少した（図６Ｃ、Ｄ）。ＨＦＤ給餌マウスでは、ＤＢＩに対する免疫は、肝臓脂質生成刺激因子（ＦＡＳＮ）をダウンレギュレーションし、肝臓カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ１。これは脂肪酸取り込みに必要である）を増加させ、肝臓におけるカルニチン脂肪酸エーテルを増大させ、肝脂肪症を抑制し、複数の遊離脂肪酸の高脂血症を軽減し、白色脂肪組織の量を減少させて褐色脂肪の脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）をアップレギュレーションした（データは示さず）。
【０１０８】
飢餓マウス及びＤＢＩ中和に供したマウス由来の異なる組織のメタボロミクス比較により、肝臓及び筋肉（示さず）よりも、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）（データは示さず）及び血漿（データは示さず）の強い類似性が明らかになった。代謝に対するＤＢＩ中和の効果は（中枢神経系外の）末梢効果によるはずであるが、転写因子ｃ−Ｆｏｓのリン酸化を評価することにより決定した場合、抗体媒介性ＤＢＩ遮断は、食欲促進性の外側視床下部領域（ＬＨ）のニューロンを阻害し、食欲減退性の腹内側核（ＶＭＮ）のニューロンを活性化した（データは示さず）。全体として、これらの結果は、ＤＢＩに対する受動免疫及び能動免疫が両方とも強力な抗肥満効果を発揮することを示している。
【０１０９】
本発明者らのデータは、飢餓誘導性オートファジーが３つのレベルのＤＢＩ媒介性フィードバックレギュレーションに供されるというモデルを示している。オートファジーはＤＢＩ分泌を引き起こし、このオートファジー促進因子を細胞から枯渇させ（オートクリンレギュレーション）、次いで、細胞外空間に蓄積するＤＢＩが他の細胞に作用して、オートファジーを阻害する（パラクリンレギュレーション）。加えて、循環ＤＢＩは摂食行動を刺激するので、栄養摂取を増加させ、オートファジー誘導の主な原因を除去する（エンドクリンレギュレーション）。１つ又は複数のＤＢＩオルソログの枯渇に供したC.elegansは咽頭ポンピングの減少を示したので（データは示さず）、この後者の効果は、系統発生的に保存されているように思われる。したがって、ＤＢＩは、栄養枯渇がオートファジーの誘導を介して摂食行動を刺激する原始反射に関与する可能性がある。
【０１１０】
そのオートファジー阻害効果に加えて、細胞外ＤＢＩは、全身代謝に対する強力なモジュレーション効果を有する。神経性食欲不振を有する青年では、循環ＤＢＩレベルが低い。これは、マウスにおいて観察されるＤＢＩレベルの短期的な飢餓誘導性増加とは対照的である。この矛盾の理由は依然として理解困難である。しかしながら、ＤＢＩコード遺伝子の欠失又はＤＢＩタンパク質の中和は、マウスに対して食欲減退効果を有し、飢餓後の食物摂取を減少させたので、（おそらくは転写レベルでＤＢＩ発現を決定するセットポイントの長期再調整に起因する）ＤＢＩレベルの食欲不振関連減少（３５）がこの表現型の原因であり得ると推測することは魅力的である。全く対照的に、リコンビナントタンパク質（又はその活性ペプチドフラグメント）の全身注射による細胞外ＤＢＩの提供は、肝細胞へのグルコース取り込みのアップレギュレーション並びに解糖及び脂質生成の増加に続いて、低血糖を促すことにより、食物摂取を刺激した。実際、病的肥満を有する患者又はマウスは、ＤＢＩの血漿レベルの増加を示した。ＤＢＩ発現のこの増加の理由は依然として不明である。肥満はオートファジー阻害に関連するが（３６、３７）、これは、オートファジーフラックスの変化が循環ＤＢＩの増大を説明し得ないことを意味する。逆に、ＤＢＩの肥満関連上昇はオートファジー阻害に寄与し得、そしてこれが体重減少を和らげて体重増加を促す（３８、３９）。また、ＤＢＩの欠失又は中和が食欲を抑制し、体重増加を減少させ、ＨＦＤ誘導性脂肪症及び肝脂肪症を鈍らせ得るという観察により示されるように、細胞外ＤＢＩレベルの上昇は、食欲促進反応及び脂肪生成反応を促す。ＤＢＩの中和は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を注射することにより、及び自己抗体の誘導により達成され得る。長期ＤＢＩ遮断から有害副作用が除かれ、所望の治療目標を構成する場合、この後者の戦略は、病的肥満の予防又は処置に特に有用であり得る。
【０１１１】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する最新技術を説明する。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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