(57)【要約】  グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ）から単離したスクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）を提供し、変異体、およびホモファルネソールをアンブロキサンへと生体触媒的に変換するＧ．モルビフェル（Ｇ．ｍｏｒｂｉｆｅｒ）ＳＨＣを使用する方法も提供する。
2020508651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）をコードする核酸分子を含む組換えベクターであって、前記スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）のアミノ酸配列が、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、組換えベクター。
【請求項２】
前記ＳＨＣが、配列番号２に対して、４５位、４６位、５４位、８６位、１３９位、１４２位、１７８位、１８４位、１９４位、２３９位、２７８位、３２６位、３３５位、３８６位、４５５位、４６０位、６０３位、６２３位、６２４位、６５６位、６５８位またはこれらの組合せにおいてアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４】
配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を含み、かつ配列番号２に対して、４５位、４６位、５４位、８６位、１３９位、１４２位、１７８位、１８４位、１９４位、２３９位、２７８位、３２６位、３３５位、３８６位、４５５位、４６０位、６０３位、６２３位、６２４位、６５６位、６５８位またはこれらの組合せにおいてアミノ酸置換を含む、組換えスクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）。
【請求項５】
アンブロキサン（ambroxan）を生成する方法であって、
（ａ）スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）を発現している組換え宿主細胞へとホモファルネソールを提供することであって、前記スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）のアミノ酸配列が、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であることと、
（ｂ）前記ＳＨＣによって生成されたアンブロキサンを収集することと、
を含む、方法。
【請求項６】
前記ホモファルネソールが、可溶化剤の存在下で提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶化剤が、非イオン性界面活性剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ホモファルネソールが、（３Ｅ，７Ｅ）ホモファルネソールを含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン骨格を有する化合物は、芳香化学物質として非常に経済的に重要である。これらの中で、アンブロキサン（ambroxan）として公知の（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−ドデカヒドロ−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フランは、芳香組成物のベースノートを提供するために特に重要である。元来、マッコウクジラの竜涎香から得られ、合成法がアンブロキサンの生成のために開発されてきた。１つのアプローチにおいて、クラリセージ（クラリセージ（Ｓａｌｖｉａ  ｓｃｌａｒｅａ））の構成物であるスクラレオールが、出発材料として使用される。例えば、クロム酸、過マンガン酸塩、Ｈ２Ｏ２またはオゾンによるスクラレオールの酸化的分解は、スクラレオリドを提供し、これは、例えば、ＬｉＡｌＨ４またはＮａＢＨ４を使用してそれに続いて還元され、アンブロクス−１，４−ジオールが得られる。代わりに、スクラレオリドは、ハイホジーマ・ロセオニガー（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ  ｒｏｓｅｏｎｉｇｅｒ）を使用して生体内変化によってスクラレオールから調製することができる（欧州特許第０２０４００９号明細書）。最終的に、アンブロクス−１，４−ジオールは、一連の化学プロセスにおいて環化されて、化合物アンブロキサン（（−）−２）が得られる。アンブロキサンのラセミ化合物であるｒａｃ−２の調製は、とりわけ、ホモファルネシル酸および４−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エニル）ブタン−２−オンを介して達成されてきた。
【０００２】
別のアプローチにおいて、アンブロキサンは、スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ；スキーム１）を使用して生体触媒的に調製される（Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  ３６７：７２３）。
【０００３】
【化１】
2020508651.tif 000003
【０００４】
ＳＨＣはホパンへのスクアレンの環化を天然に触媒する一方、アンブロキサンの触媒作用は、０．０２ｍＵ／ｍｇのタンパク質の特異的活性を伴う二次反応である。アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（以前はバチルス・アシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ））、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）およびブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からのＳＨＣは、それらの天然基質（例えば、スクアレン）ならびに非天然基質（例えば、ホモファルネソールおよびシトラール）に関して精製および特性決定されてきた。例えば、国際公開第２０１０／１３９７１９号パンフレット、国際公開第２０１２／０６６０５９号パンフレット、特開２００９０６０７９９号公報、およびＳｅｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ８４：７２−７７を参照されたい。さらに、国際公開第２０１６／１７００９９号パンフレットは、記載されたアンブロキサンへのＥ，Ｅ−ホモファルネソールの変換の改善された割合を伴うＳＨＣ変異体について記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、スクアレンホペンシクラーゼ（ＧＨＣ）をコードする核酸分子を担持する組換えベクターを提供し、スクアレンホペンシクラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。一部の実施形態では、ＳＨＣは、配列番号２に対して、４５位、４６位、５４位、８６位、１３９位、１４２位、１７８位、１８４位、１９４位、２３９位、２７８位、３２６位、３３５位、３８６位、４５５位、４６０位、６０３位、６２３位、６２４位、６５６位、６５８位またはこれらの組合せにおいてアミノ酸置換を有する。組換えベクターを担持する組換え宿主細胞をまた提供し、ＳＨＣを発現している組換え宿主細胞にホモファルネソールを提供し（ＳＨＣのアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である）、ＳＨＣによって生成されるアンブロキサンを収集することによる、アンブロキサンを生成するための方法も提供する。方法の一部の実施形態によると、ホモファルネソールは、可溶化剤、例えば、非イオン性界面活性剤の存在下で提供される。方法の他の実施形態によると、ホモファルネソールは、（３Ｅ，７Ｅ）ホモファルネソールを含む。本発明は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ配列番号２に対して、４５位、４６位、５４位、８６位、１３９位、１４２位、１７８位、１８４位、１９４位、２３９位、２７８位、３２６位、３３５位、３８６位、４５５位、４６０位、６０３位、６２３位、６２４位、６５６位、６５８位またはこれらの組合せにおいてアミノ酸置換を含む組換えＳＨＣポリペプチドをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ）スクアレンホペンシクラーゼ（ＧｍＳＨＣ）と、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＺｍＳＨＣ）、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）（ＢｓｐＳＨＣ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（ＲｐＳＨＣ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＳｃＳＨＣ）、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）（ＢａｍＳＨＣ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（ＢａｎＳＨＣ）およびＡ．アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（ＡａＳＨＣ）からのＳＨＣ酵素との、アミノ酸配列の比較を提供する。下線を引いた残基は、コア配列Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｒｐ（配列番号３）を表し、ボールド体の残基は、Ａｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ（配列番号４）活性部位モチーフを表す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ）スクアレンホペンシクラーゼ（ＧｍＳＨＣ）と、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＺｍＳＨＣ）、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）（ＢｓｐＳＨＣ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（ＲｐＳＨＣ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＳｃＳＨＣ）、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）（ＢａｍＳＨＣ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（ＢａｎＳＨＣ）およびＡ．アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（ＡａＳＨＣ）からのＳＨＣ酵素との、アミノ酸配列の比較を提供する。下線を引いた残基は、コア配列Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｒｐ（配列番号３）を表し、ボールド体の残基は、Ａｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ（配列番号４）活性部位モチーフを表す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ）スクアレンホペンシクラーゼ（ＧｍＳＨＣ）と、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＺｍＳＨＣ）、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）（ＢｓｐＳＨＣ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（ＲｐＳＨＣ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＳｃＳＨＣ）、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）（ＢａｍＳＨＣ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（ＢａｎＳＨＣ）およびＡ．アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（ＡａＳＨＣ）からのＳＨＣ酵素との、アミノ酸配列の比較を提供する。下線を引いた残基は、コア配列Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｒｐ（配列番号３）を表し、ボールド体の残基は、Ａｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ（配列番号４）活性部位モチーフを表す。
【図２】１５ｍｇ／ｍＬのホモファルネソールを伴う３７℃での６時間および２０時間のインキュベーションに続く、変異体ＧｍＳＨＣ酵素によって生成されたアンブロキサンのピーク面積％を示す。破線は、野生型ＳＨＣによるアンブロキサンの生成を示す。
【図３】２５％の酵素添加での５０ｍｇ／ｍＬのホモファルネソールを伴う３７℃での６時間および２０時間のインキュベーションに続く、変異体ＧｍＳＨＣ酵素によるアンブロキサン生成物ピーク面積％を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）、またはより好ましくは、グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ）から単離したホモファルネソール−アンブロキサンシクラーゼ（ＨＡＣ）、およびアンブロキサンへとホモファルネソールを生体触媒的に変換するためのＧ．モルビフェル（Ｇ．ｍｏｒｂｉｆｅｒ）ＳＨＣ（ＧｍＳＨＣ）を使用する方法を提供する。ＧｍＳＨＣのヌクレオチド配列は、配列番号１において提供する。ＧｍＳＨＣのアミノ酸配列（配列番号２）は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＷＰ＿０４０５０７４８５およびＥＨＨ６９６９１で利用可能である。ＧｍＳＨＣアミノ酸配列と、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、Ｒ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、Ｓ．セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｂ．アンビファリア（Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ）、Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびＡ．アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）からのＳＨＣアミノ酸配列とのアラインメント（図１Ａ〜図１Ｃ）は、３７％〜７６％の範囲のアミノ酸配列同一性を示す（表１）。
【０００８】
【表１】
2020508651.tif 000004
【０００９】
ＧｍＳＨＣは、コア配列Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｒｐ（配列番号３）（Ｒｅｉｐｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１５５−１６１）、およびＳＨＣ活性部位と相関するＡｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ（配列番号４）モチーフを含有する（Ｗｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１８１１−５）。図１Ａ〜図１Ｃを参照されたい。本明細書において提示するデータは、ＧｍＳＨＣ酵素が、異種宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されているとき、ホモファルネソールをアンブロキサンへと容易に変換することができることを示す。したがって、ＧｍＳＨＣ酵素、およびその誘導体は、ホモファルネソールを供給原料または出発材料として使用してアンブロキサンを調製する方法において有用である。
【００１０】
本明細書において使用する場合、用語「アンブロキサン（ambroxan）」は、（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−ドデカヒドロ−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フランを指し、これはＡＭＢＲＯＸ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ）、Ａｍｂｒｏｘａｎ（Ｈｅｎｋｅｌ）、ＡＭＢＲＯＦＩＸ（Ｇｉｖａｕｄａｎ）、ＡＭＢＥＲＬＹＮ（Ｑｕｅｓｔ）、ＣＥＴＡＬＯＸ  Ｌａｅｖｏ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ）、ＡＭＢＥＲＭＯＲ（Ａｒｏｍｏｒ）および／またはＮｏｒａｍｂｒｅｎｏｌｉｄｅ  Ｅｔｈｅｒ（Ｐａｃｉｆｉｃ）として商業的に公知である。アンブロキサンの望ましい感覚に関する利益は、（＋）エナンチオマーよりむしろ（−）立体異性体に由来する。（−）立体異性体の香りは、ムスク様、ウッディー系（woody）、暖かい感じ（warm）または琥珀系（ambery）として説明され、一方、（＋）エナンチオマーは、相対的に弱い香りの様子（odor note）を有する。このように、（−）−アンブロキサンが富んだ材料は、本発明の１つの特徴である。
【００１１】
本明細書に記載のように、（−）−アンブロキサンは、ホモファルネソールから合成することができる（スキーム１）。ホモファルネソールの４つの公知の異性体、（３Ｚ，７Ｚ、すなわち、ＺＺ）、（３Ｅ，７Ｚ、すなわち、ＥＺ）、（３Ｚ，７Ｅ、すなわち、ＺＥ）および（３Ｅ，７Ｅ、すなわち、ＥＥ）異性体が存在する。Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（（１９８６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  ３６７：７２３）によると、（−）−アンブロキサンは、ＥＥホモファルネソールから主に得られる。米国特許出願公開第２０１２／０１３５４７７号明細書は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＳＨＣ酵素が、ＺＥホモファルネソールを（−）−アンブロキサンへと変換することができることを示す。しかし、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  （（２０１１）Ｃｈｅｍｉｅ  Ｕｎｓｅｒｅｒ  Ｚｅｉｔ  ４５：３７４−３８８）は、ＺＥホモファルネソールが、９ｂ−ｅｐｉ−アンブロキサンにのみ変換され、（−）−アンブロキサンには変換されないことを示す。したがって、本発明のホモファルネソール供給原料／出発材料は、単一の異性体であるか、またはホモファルネソールの２種もしくはそれより多い異性体の混合物である。一部の実施形態では、ホモファルネソール出発材料は、４つの異性体ＥＥ：ＥＺ：ＺＺ：ＺＥの混合物である。他の実施形態では、ホモファルネソール出発材料は、ＺＥ：ＥＥ、ＺＥ：ＥＺまたはＥＥ：ＥＺの混合物である。ＥＥ：ＥＺの混合物の使用を含めた実施形態では、好ましくは、ＥＥ：ＥＺの重量比は、９９：１〜約５０：５０の範囲である。より特定すると、ホモファルネソール出発材料は、８０：２０または７０：３０のＥＥ：ＥＺ重量比を有する。特定の実施形態では、ホモファルネソール出発材料は、＞９０の（３Ｅ，７Ｅ）ホモファルネソールを有する。ホモファルネソールの例示的なＥＥ：ＥＺ立体異性混合物は、３５８２６−６７−６のＣＡＳ番号を有する。
【００１２】
好ましくは、（−）−アンブロキサンの調製において使用される出発材料は、立体異性的に純粋な（３Ｅ，７Ｅ）ホモファルネソール（ＥＥＨ）である。ＥＥＨを調製する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｄｏｄｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：２７９４；Ｂａｒｒｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６１：２２１５；Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１２１５；国際公開第９２／０６０６３号パンフレットおよび米国特許第９，４９３，３８５号明細書によって記載されている。
【００１３】
本明細書において使用する場合、「ＧｍＳＨＣ」は、グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ）から単離したスクアレンホペンシクラーゼを指す。特に、「変異体」または「誘導体」によって修飾されていないとき、「ＧｍＳＨＣ」は、配列番号２によるアミノ酸配列を有する野生型タンパク質を指す。比較すると、「変異体ＧｍＳＨＣ」、「ＧｍＳＨＣ変異体」または「ＧｍＳＨＣ誘導体」は、配列番号２による参照（もしくは野生型）ＧｍＳＨＣ配列のアミノ酸配列と比較して変化している、修飾または変異アミノ酸配列を指す。一実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、その基質（例えば、ホモファルネソール、特に、ＥＥＨ）についての酵素の活性を修飾（例えば、増加）する少なくとも１つの変更を有する。別の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、異種宿主細胞における酵素の安定性、局在化、または発現を修飾する少なくとも１つの変更を有する。
【００１４】
本明細書において使用する場合、用語「アミノ酸変更」は、１つもしくは複数のアミノ酸残基の挿入、１つもしくは複数のアミノ酸残基の欠失、または参照アミノ酸配列（例えば、配列番号２の野生型アミノ酸配列）のアミノ酸配列に対して１つもしくは複数の異なるアミノ酸による１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換（保存的もしくは非保存的であり得る）を意味する。アミノ酸変更は、ＧｍＳＨＣ誘導体アミノ酸配列のアミノ酸配列と参照ＧｍＳＨＣのアミノ酸配列の比較によって容易に同定することができる。
【００１５】
保存的アミノ酸置換は、例えば、関連するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行い得る。２０個の天然アミノ酸は、下記の６つの標準的なアミノ酸基へとグループ化することができる：（１）疎水性−Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性−Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性−Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。したがって、本明細書において使用する場合、用語「保存的置換」は、上記で示した６つの標準的なアミノ酸基の同じ群内に列挙した別のアミノ酸による、アミノ酸の交換を意味する。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、このように修飾されたポリペプチドにおいて１つの負の電荷を保持する。さらに、グリシンおよびプロリンは、アルファ−ヘリックスを中断させるそれらの能力に基づいて、互いに置換し得る。上記の６つの群内のいくつかの好ましい保存的置換は、下記の部分群内の交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ；（ｉｉ）ＳｅｒおよびＴｈｒ；（ｉｉｉ）ＡｓｎおよびＧｉｎ：（ｉｖ）ＬｙｓおよびＡｒｇ；ならびに（ｖ）ＴｙｒおよびＰｈｅ。公知の遺伝コード、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を所与として、熟練した科学者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【００１６】
本明細書において使用する場合、「非保存的置換」または「非保存的アミノ酸交換」は、上記で示したような６つの標準的なアミノ酸基（１）〜（６）の異なる群において列挙した別のアミノ酸による、アミノ酸の交換として定義される。典型的には、本開示のＧｍＳＨＣ誘導体は、野生型ＧｍＳＨＣの生物学的機能を変化させる非保存的置換を使用して調製される。
【００１７】
様々な実施形態では、アミノ酸変更、またはアミノ酸変更の組合せは、アミノ酸変更、またはアミノ酸変更の組合せを有さない野生型ＧｍＳＨＣと比較して、ホモファルネソールをアンブロキサンへと変換するためのＧｍＳＨＣ誘導体の活性を増進する。タンパク質モデリングを使用して、ＧｍＳＨＣ参照配列においてこのような置換、欠失、または挿入をガイドし得る。例えば、ＧｍＳＨＣアミノ酸配列の構造モデルは、Ａ．アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＳＨＣについての座標を使用して生じさせ得る。このような相同性モデルは、アンブロキサンへとホモファルネソールを変換するためのＧｍＳＨＣ酵素の改善、例えば、参照野生型酵素よりホモファルネソール基質と接触させることによるアンブロキサンのより多い生成を誘導するのに有用である。
【００１８】
ＧｍＳＨＣ誘導体酵素をもたらす、ＧｍＳＨＣ配列へとこのような変化を導入するために使用し得るアミノ酸変更、例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発、宿主細胞のトランスフェクション、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を含めた組換え遺伝子技術の公知のプロトコルを使用して導入し得る。次いで、誘導体は、ＧｍＳＨＣ機能的活性についてスクリーニングすることができる。
【００１９】
ＧｍＳＨＣ誘導体は、配列番号２による参照（もしくは野生型）ＧｍＳＨＣ配列のアミノ酸配列に対して、約１〜約４５個のアミノ酸変更、約１〜約４０個のアミノ酸変更、約１〜約３５個のアミノ酸変更、約１〜約３０個のアミノ酸変更、約１〜約２５個のアミノ酸変更、約１〜約２０個のアミノ酸変更、約１〜約１５個のアミノ酸変更、約１〜約１０個のアミノ酸変更、または約１〜約５個のアミノ酸変更を有し得る。
【００２０】
代わりに、ＧｍＳＨＣ誘導体は、配列番号２による参照（もしくは野生型）ＧｍＳＨＣ配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも５個または少なくとも１０個のアミノ酸変更を有することができるが、約２０個以下または３０個以下のアミノ酸変更である。様々な実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、参照ＧｍＳＨＣに対して、約１個のアミノ酸変更、約２個のアミノ酸変更、約３個のアミノ酸変更、約４個のアミノ酸変更、約５個のアミノ酸変更、約６個のアミノ酸変更、約７個のアミノ酸変更、約８個のアミノ酸変更、約９個のアミノ酸変更、約１０個のアミノ酸変更、約１５個のアミノ酸変更、約２０個のアミノ酸変更、約２５個のアミノ酸変更、約３０個のアミノ酸変更、約３５個のアミノ酸変更、約４０個のアミノ酸変更、約４５個のアミノ酸変更、または約５０個のアミノ酸変更を有し得る。
【００２１】
これらのまたは他の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、参照ＧｍＳＨＣ（配列番号２）と少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する。
【００２２】
一部の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、配列番号２に対して、４５位、４６位、５４位、８６位、１３９位、１４２位、１７８位、１８４位、１９４位、２３９位、２７８位、３２６位、３３５位、３８６位、４５５位、４６０位、６０３位、６２３位、６２４位、６５６位または６５８位の１つもしくは複数においてアミノ酸変更を含む。一部の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、下記のアミノ酸置換の１つもしくは複数を有する。配列番号２に対してＶ４５Ｘ、Ｅ４６Ｘ、Ｑ５４Ｘ、Ｓ８６Ｘ、Ｆ１３９Ｘ、Ｙ１４２Ｘ、Ｑ１７８Ｘ、Ｍ１８４Ｘ、Ｒ１９４Ｘ、Ｇ２３９Ｘ、Ｉ２７８Ｘ、Ｔ３２６Ｘ、Ｌ３３５Ｘ、Ｅ３８６Ｘ、Ｉ４５５Ｘ、Ｆ４６０Ｘ、Ｑ６０３Ｘ、Ｇ６２３Ｘ、Ｆ６２４Ｘ、Ｌ６５６ＸまたはＹ６５８Ｘ、ここで：
Ｖ４５ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹであり；
Ｅ４６ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｑ５４ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｓ８６ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｆ１３９ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｙ１４２ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷであり；
Ｑ１７８ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｍ１８４ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｒ１９４ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｇ２３９ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｉ２７８ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｔ３２６ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｌ３３５ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｅ３８６ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｉ４５５ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｆ４６０ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｑ６０３Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｇ６２３ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｆ６２４ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｌ６５６ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；
Ｙ６５８ＸにおけるＸは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷである。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、配列番号２に対して、下記のアミノ酸置換Ｖ４５Ｉ、Ｖ４５Ｑ、Ｖ４５Ｌ、Ｅ４６Ｈ、Ｅ４６Ｑ、Ｑ５４Ｅ、Ｓ８６Ａ、Ｆ１３９Ｌ、Ｙ１４２Ｒ、Ｑ１７８Ｅ、Ｍ１８４Ａ、Ｍ１８４Ｌ、Ｍ１８４Ｉ、Ｍ１８４Ｖ、Ｒ１９４Ｑ、Ｇ２３９Ｖ、Ｉ２７８Ｖ、Ｔ３２６Ｓ、Ｌ３３５Ｆ、Ｅ３８６Ｑ、Ｉ４５５Ｔ、Ｆ４６０Ａ、Ｑ６０３Ｈ、Ｇ６２３Ａ、Ｇ６２３Ｖ、Ｆ６２４Ｙ、Ｆ６２４Ａ、Ｌ６５６ＥおよびＹ６５８Ｆの１つまたは組合せを有する。他の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、表２において提示したような配列番号２に対する置換の組合せ、または任意のこれらの組合せを有する。
【００２４】
【表２】
2020508651.tif 000005
【００２５】
Ａ．アシドカルダリウス（Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＳＨＣ（ＡａｃＳＨＣ）における、ＧｍＳＨＣのＦ１３９Ｌ、Ｙ１４２、Ｉ４５５、Ｇ２３９およびＦ６２４に対応するアミノ酸の位置におけるアミノ酸置換は、アンブロキサンへのＥＥＨの変換に関してＡａｃＳＨＣ酵素の活性を増加させることが示されてきた。国際公開第２０１６／１７００９９号パンフレットを参照されたい。さらに、ＡａｃＳＨＣのＦ６０１は、原核生物および真核生物のＳＨＣ種の間で、高度に保存されたアミノ酸残基として同定されてきた。ＡａｃＳＨＣ誘導体Ｆ６０１Ｙは、オキシドスクアレン基質（スクアレンではない）について非常に増加したＶｍａｘを示すことが報告されてきた。しかし、Ｆ６０１Ｙは、スクアレンが使用されるとき、野生型ＡａｃＳＨＣに対して、親和性（すなわち、より高いＫＭ）における減少および触媒効率／活性（Ｋｃａｔ／ＫＭ）における減少を示す。Ｈｏｓｈｉｎｏ  ＆  Ｓａｔｏ（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（４）：２９１−３０１を参照されたい。特に、ＧｍＳＨＣにおけるＦ６０１Ｙと同等であるＳＨＣ誘導体は、Ｆ６２４Ｙである。
【００２６】
したがって、本発明のある特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、配列番号２に対して、Ｖ４５Ｉ、Ｖ４５Ｑ、Ｖ４５Ｌ、Ｅ４６Ｈ、Ｅ４６Ｑ、Ｓ８６Ａ、Ｆ１３９Ｌ、Ｑ１７８Ｅ、Ｍ１８４Ａ、Ｍ１８４Ｌ、Ｍ１８４Ｉ、Ｍ１８４Ｖ、Ｒ１９４Ｑ、Ｇ２３９Ｖ、Ｉ２７８Ｖ、Ｔ３２６Ｓ、Ｌ３３５Ｆ、Ｅ３８６Ｑ、Ｉ４５５Ｔ、Ｆ４６０Ａ、Ｑ６０３Ｈ、Ｇ６２３Ａ、Ｇ６２３Ｖ、Ｌ６５６ＥおよびＹ６５８Ｆの少なくとも１つもしくは複数と組み合わせた、少なくとも置換Ｑ５４Ｅ、Ｆ６２４ＹまたはＹ１４２Ｒを有する。特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、表２において一覧表示した変異の組合せを有する。一部の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、配列番号２による野生型／参照アミノ酸配列と比較して、４つまでの変異を有するアミノ酸配列を有する修飾されたＧｍＳＨＣポリペプチドであり、配列番号２に対して、少なくとも置換Ｑ５４Ｅ、Ｆ６２４ＹまたはＹ１４２Ｒを含む。
【００２７】
ＳＨＣ活性を決定および定量化するためのアッセイは本明細書に記載されており、当技術分野において公知である。例示として、ＧｍＳＨＣおよび／またはＧｍＳＨＣ誘導体活性は、精製したＧｍＳＨＣ酵素、またはＧｍＳＨＣ酵素を生成している宿主細胞もしくは完全組換え宿主生物からの抽出物を、適当な基質と共に適当な条件下でインキュベートし、反応生成物の分析（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）またはＨＰＬＣ分析による）を行うことによって決定することができる。ＧｍＳＨＣ酵素活性アッセイおよび反応生成物の分析についてのさらなる詳細は、実施例において提供する。これらのアッセイは、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））においてＧｍＳＨＣを生成することを含む。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「活性」は、基質と反応して、標的生成物を提供する酵素の能力を意味する。活性は、時間に応じた、標的生成物の増加、基質（もしくは出発材料）の減少によって、またはこれらのパラメータの組合せによって、活性試験として公知であるものにおいて決定することができる。本開示のＧｍＳＨＣは、ホモファルネソールをアンブロキサンへと生物変換するその能力によって特性決定される。
【００２９】
ＧｍＳＨＣ誘導体の使用を対象とする実施形態では、好ましくは、ＧｍＳＨＣ誘導体は、参照ＧｍＳＨＣタンパク質より良好な標的収率を示す。用語「標的収率」は、１グラムの供給原料当たりの回復可能な生成物のグラムを指す（これはモル変換割合パーセントとして計算することができる）。さらに、ＧｍＳＨＣ誘導体は、参照ＧｍＳＨＣタンパク質に対する、修飾された（例えば、増加した）標的生成能力を示すことができる。用語「標的生成能力」は、１時間の生物変換時間（すなわち、基質が加えられた後の時間）当たりの１リットルの発酵能力当たりのグラムでの回復可能な標的生成物の量を指す。さらに、ＧｍＳＨＣ誘導体は、参照ＧｍＳＨＣタンパク質と比較した、修正された標的収率因子を示すことができる。用語「標的収率因子」は、反応媒体中の得られた生成物濃度、およびＧｍＳＨＣ誘導体（例えば、精製したＧｍＳＨＣ酵素、またはＧｍＳＨＣ酵素を発現している組換え宿主細胞からの抽出物）の濃度の間の比を指す。ある特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣ誘導体は、参照ＧｍＳＨＣタンパク質（例えば、配列番号２）に対して、酵素活性（例えば、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換）における、少なくとも２倍、３倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍の増加を示す。
【００３０】
本明細書において開示されているＧｍＳＨＣタンパク質の機能的ホモログはまた、本発明の範囲内に含まれる。「機能的ホモログ」は、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、かつ参照ポリペプチドの生化学的機能または生理機能の１つもしくは複数を実行するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に生じたポリペプチドでよく、配列類似性は、収束進化または分岐進化事象により得る。したがって、機能的ホモログは、文献において、ホモログ、またはオーソログ、またはパラログとして示されることがある。天然に生じた機能的ホモログの変異体、例えば、野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドは、それら自体が機能的ホモログであり得る。機能的ホモログはまた、ポリペプチドについてのコード配列の部位特異的突然変異誘発を介して、または異なる天然に生じたポリペプチドについてのコード配列からのドメインを合わせること（「ドメインスワッピング」）によって生じさせることができる。所望の様式で、ＧｍＳＨＣ酵素の特異的活性を増加させるか、基質特異性を変化させるか、発現レベルを変化させるか、または細胞内位置を変化させるために使用することができる、本明細書に記載されているＧｍＳＨＣ酵素の機能的ホモログを得るための技術は公知であり、とりわけ、定向進化技術、部位特異的突然変異誘発技術およびランダム突然変異誘発技術を含む。
【００３１】
望ましくは、ＧｍＳＨＣ酵素および機能的ホモログは、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有する。好ましくは、機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ超のアミノ酸残基の連続した広がりに亘って示した配列同一性を示す。
【００３２】
ＧｍＳＨＣ発現、ならびにアンブロキサンの生成および単離を促進するために、ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体は、組換え宿主細胞において発現している。「遺伝子改変宿主細胞」または「トランスジェニック細胞」とまた称される用語「組換え宿主」は、異種核酸を含む宿主細胞を示すか、またはそのゲノムは、少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列によって増強されてきた。本開示の宿主細胞は、核酸分子、またはＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体をコードする核酸分子を含有するベクターと共に遺伝子操作し得る。
【００３３】
用語「核酸分子」は、本明細書において使用する場合、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡでよい本開示のポリヌクレオチドを指し、二本鎖または一本鎖、センスおよび／またはアンチセンス鎖でよい。用語「核酸分子」は特に、本明細書において使用する場合、ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体、例えば、配列番号１をコードするポリヌクレオチド（例えば、完全長ヌクレオチド配列、またはその断片もしくは部分として）に適用される。この用語はまた、ｃＤＮＡ；フランキング遺伝子の少なくとも１つを欠いているゲノム断片；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成され、かつフランキング遺伝子の少なくとも１つを欠いているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの断片；フランキング遺伝子の少なくとも１つを欠いている制限酵素断片；および天然に生じたものでないタンパク質、例えば、融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。融合タンパク質は、１つもしくは複数のアミノ酸を、通常タンパク質のＮ末端において、しかしまたＣ末端において、タンパク質（例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ）に加えることができるか、またはタンパク質の領域内で融合される。このような融合タンパク質、またはこのようなタンパク質をコードする融合ベクターは典型的には、（ｉ）組換えタンパク質の生成における増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度における増加；および／または（ｉｉｉ）アフィニティー精製のためのリガンドを提供することによる組換えタンパク質の精製における補助を提供する。ある特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体は、組換え宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体の発現および／または活性を支援するリーダー配列を含む。
【００３４】
用語「核酸分子」はまた、特定の組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞）における発現に適したコドン最適化配列を含む。用語「コドン最適化」は、コドンの１つもしくは複数、または好ましくは、かなりの数を、細菌宿主細胞遺伝子においてより頻繁に使用されるコドンに置換することによって、原核生物または真核生物宿主細胞、特に、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞における発現に適合させたタンパク質コード配列を意味する。これに関しては、参照配列番号１をコードするヌクレオチド配列、および全てのその変異体／誘導体は、ソース（例えば、ＧｍＳＨＣ）において見出されたような本来のものであり得るか、またはヌクレオチド配列は、選択した宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドンを最適化することができる。
【００３５】
用語「単離されたＤＮＡ」は、本明細書において使用する場合、自然源（例えば、グルコノバクター・モルビフェル（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｏｒｂｉｆｅｒ））から単離された核酸もしくはポリヌクレオチド、または組換えＤＮＡ技術によって生成された核酸もしくはポリヌクレオチド、例えば、宿主細胞中に任意選択で組み込まれている宿主細胞とは異種のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築体を指す。キメラのヌクレオチド配列は、組換え分子として特に生成し得る。酵素に関して、用語「組換え」は、組換えＤＮＡ技術によって生成された、すなわち、所望の酵素をコードする外来ＤＮＡ構築体によって形質転換された細胞から生成された酵素を指す。用語「組換え」は特に、クロスオーバーまたは遺伝子モザイクを達成する組換えを伴うかまたは伴わない、このようなポリヌクレオチドまたはその部分を一緒に合わせる、ポリヌクレオチドのアセンブリーに適用される。例えば、これは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合させて、機能の所望の組合せを生じさせるために行われる。本明細書に記載されているポリペプチドをコードする組換え核酸分子は、ポリペプチドを発現させるのに適した１つもしくは複数の調節領域へとセンス配向で作動可能に連結しているそのポリペプチドについてのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロニックｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現させることができるため、複数のポリペプチドは、必要に応じてそれらの微生物についての単一の調節領域の制御下で発現させることができる。
【００３６】
調節領域は配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように、調節領域およびコード配列が配置されているとき、コード配列および調節領域は、動作可能に連結されていると考えられる。転写／翻訳調節エレメントには、これらに限定されないが、当業者には公知であり、かつ遺伝子発現を推進またはその他の点で制御する、誘導性および非誘導性、構成的、細胞周期を制御する、代謝的に制御する、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサーおよび他のエレメントが含まれる。このような調節エレメントには、これらに限定されないが、調節エレメント、例えば、ＣＵＰ−１プロモーター；例えば、ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆ系において用いられているようなｔｅｔリプレッサー；ｌａｃ系、およびｔｒｐ系調節エレメントが含まれる。例として、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、１００μＭ〜１．０ｍＭの濃度範囲で遺伝子発現の有効な誘導物質である。この化合物は、ｌａｃオペロンの転写を誘発するラクトース代謝物であるアロラクトースの分子模倣物であり、したがって、遺伝子がｌａｃオペレーターの制御下であるとき、これは遺伝子発現を誘導するために使用される。遺伝子発現を誘発する調節エレメントの別の例は、ラクトースである。
【００３７】
本開示の核酸分子はまた、さらなるポリペプチド配列、例えば、マーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードする雑種遺伝子の部分を形成することができる。マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（ベータ−ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）を含む。本開示の実施と関連する標準的な手順の多くと同様に、さらなる有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能を果たすことができるさらなる配列について当業者は承知している。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、発現および任意選択の精製のためにベクター中に挿入し得る、上記の野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体をコードする組換え核酸分子を提供する。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。通常、ＤＮＡ組換え技術に適した発現ベクターは、典型的には、プラスミドタイプのものである。発現ベクターは、本明細書に記載のような野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体をコードする組換え核酸分子、およびポリペプチドを発現させるのに適した必要な調節領域を含む。このようなベクターは、宿主細胞中に天然に存在しない核酸分子、通常、ＲＮＡへと転写されるかまたはタンパク質へと翻訳され（「発現され」）ない核酸分子、および宿主細胞中へと導入することを望む他の遺伝子または核酸分子を含む。典型的には、本明細書に記載されている組換え宿主細胞のゲノムは、１つもしくは複数の組換え核酸分子の安定な導入によって増強されることを認識されたい。しかし、自律的または複製プラスミドまたはベクターはまた、本開示の範囲内で使用することができる。さらに、本開示は、低コピー数、例えば、単一のコピー、または高コピー数のプラスミドまたはベクターを使用して実施することができる。ある特定の実施形態では、本開示のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工細菌染色体もしくは人工酵母染色体、ノックアウトもしくはノックイン構築体、直鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、メガプラスミドの形態で生成された合成核酸分子もしくはカセット、合成もしくは人工染色体、例えば、植物、細菌、哺乳動物または酵母の人工染色体である。
【００３９】
本発明によれば、組換え核酸分子によってコードされるＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体は、ベクターの導入によって、細胞内で構成的または誘導的に発現している。微生物細胞は、標準的な形質転換術を使用したＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体をコードするベクターで形質転換される。適切な実施形態では、複製開始点を提供するＤＮＡは、ベクター中に含まれる。複製開始点は、当業者が適切に選択し得る。配列が既に複製自体の起点として動作可能である遺伝子またはゲノムを提示する場合、遺伝子の性質によって、追加の複製開始点は必要とし得ない。
【００４０】
本発明の文脈では、外来または異種ＤＮＡが細胞内に導入されたとき、微生物細胞（例えば、細菌または酵母の細胞）は形質転換される。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム中に統合され、すなわち、共有結合的に連結されていてもよいか、または連結されていなくてもよい。原核生物、および酵母において、例えば、形質転換ＤＮＡは、エピソームのエレメント、例えば、プラスミド上に維持し得る。真核細胞に関して、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされたＤＮＡが染色体中に統合されているものであり、その結果、トランスフェクトされたＤＮＡは染色体複製によって娘細胞によって遺伝される。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含めた細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力によって決定される。
【００４１】
本開示の目的のために使用し得る宿主細胞には、これらに限定されないが、原核細胞、例えば、本開示のＧｍＳＨＣ核酸分子を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌人工染色体、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換することができる、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；例えば、本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換することができる、単純な真核細胞、例えば、酵母（例えば、サッカロマイセス属およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス昆虫細胞発現系）；ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＣＨＯおよびＪｕｒｋａｔ）、ならびに植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコ）が含まれる。宿主細胞、および本開示の核酸分子を導入するために使用されるそれぞれのベクターによって、核酸分子は、例えば、染色体もしくはミトコンドリアＤＮＡに統合されるか、または染色体外に、例えば、エピソームに維持することができるか、または細胞が一過性にのみ担持することができる。
【００４２】
真核細胞に関連する実施形態では、好ましくは、細胞は、真菌、哺乳動物または植物の細胞である。適切な真核細胞は、例えば、これらに限定されないが、哺乳動物細胞、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）およびアスペルギルス属）、または昆虫細胞（Ｓｆ９を含めた）、両生類細胞（メラノフォア細胞を含めた）、または線虫属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）（エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を含めた）の細胞を含めた虫細胞を含む。適切な哺乳動物細胞は、例えば、これらに限定されないが、ＣＯＳ細胞（Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７を含めた）、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、または他のトランスフェクト可能な真核細胞系を含む。
【００４３】
原核生物に関連する実施形態では、好ましくは、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、またはストレプトマイセス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）である。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、産業および監督機関によって組換えタンパク質発現に適したものとして認識されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞である（これらに限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２宿主細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１宿主細胞を含めた）。ある特定の実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について利用可能な変異体、プラスミドのライブラリー、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報が存在し、生成物収率を増進するための様々なモジュールの合理的な設計を可能とする。したがって、ある特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体コード配列をコードする核酸分子を発現している組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ホモファルネソールをアンブロキサンへと変換するために提供される。
【００４４】
本開示によって使用する別の好ましい宿主細胞は、合成生物学において広範に使用されている出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。このように、組換え宿主細胞は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について利用可能な変異体、プラスミドのライブラリー、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報が存在し、生成物収率を増進するための様々なモジュールの合理的な設計を可能とする。さらに、組換え出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物を作製するための方法は公知である。したがって、ある特定の実施形態では、ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体コード配列をコードする核酸分子を発現している組換え出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ホモファルネソールをアンブロキサンへと変換するために提供される。
【００４５】
細胞の培養は、通常の様式で行われる。培養培地は、炭素源、少なくとも１つの窒素源および無機塩を含有し、ビタミンをこれに加える。この培地の構成物は、当該の宿主細胞の種を培養するために従来使用されるものでよい。本明細書に記載の方法において有用な炭素源は、組換え宿主細胞によって代謝されて、アンブロキサンの成長および／または生成を促進することができる任意の分子を含む。適切な炭素源の例には、これらに限定されないが、（例えば、糖蜜において見出されるような）スクロース、フルクトース、キシロース、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオースまたは他のグルコース含有ポリマーが含まれる。
【００４６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いる実施形態では、確定した最少培地、例えば、Ｍ９Ａを、細胞培養のために使用し得る。Ｍ９Ａ培地の構成要素は、１４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのグルコースおよび１．２５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む。本開示の別の実施形態では、栄養素に富んだ培地、例えば、ＬＢを使用する。ＬＢ培地の構成要素は、１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌを含む。無機培地およびＭ９無機培地の他の例は、例えば、米国特許第６，５２４，８３１号明細書および米国特許出願公開第２００３／００９２１４３号明細書において開示されている。
【００４７】
酵母を宿主として用いる実施形態では、例えば、炭素源、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースが適している。炭素源は、培養期間に亘って宿主生物に提供することができるか、または代わりに、生物は、ある期間、別のエネルギー源、例えば、タンパク質の存在下で成長し、次いで、フェドバッチ相の間のみ、炭素の源を提供されることができる。
【００４８】
本開示の方法において使用するための組換え宿主細胞の適合性は、周知の方法を使用した単純な試験手順によって決定し得る。例えば、試験される宿主細胞は、微生物の繁殖のために一般に使用されるｐＨ、温度および通気条件下で、富栄養培地（例えば、ＬＢ培地、Ｂａｃｔｏ−トリプトン酵母抽出物培地、栄養素培地など）において繁殖し得る。組換え宿主細胞が生物変換の所望の生成物を生成すると同定されると、生成物は典型的には、生成宿主細胞系によって、適切な発現系および発酵、例えば、細胞培養物中の微生物生成によって大規模に生成される。
【００４９】
組換え宿主細胞は、バッチ、フェドバッチまたは連続的プロセスまたはこれらの組合せにおいて成長し得る。本明細書において使用する場合、用語「バッチ培養」は、培養培地が培養の間に加えられも回収もされない培養法である。比較すると、用語「フェドバッチ」は、培養培地が培養の間に加えられるが、回収されない培養法を意味する。典型的には、組換え宿主細胞は、培養系において成長し、ここで、組換え宿主細胞は、発酵槽中で確定した温度にて適切な栄養素源、例えば、炭素源の存在下で、所望の期間成長し、ホモファルネソールをアンブロキサンに生物変換し、かつ所望の量の（−）−アンブロキサンを含めたアンブロキサンを生成するのに十分な酵素を生成する。組換え宿主細胞は、任意の適切な様式で、例えば、バッチ培養またはフェドバッチ培養によって培養し得る。しかし、しばしば、より高い累積的生成物力価は、連続的プロセス、例えば、生成物除去、基質供給、およびバイオマス添加または（部分的）交換を実行することによって達成することができる。
【００５０】
本開示の一実施形態は、培養系において野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している組換え宿主細胞を提供し、ホモファルネソールを培養系（例えば、供給による）へと提供し、組換え宿主細胞によって生成されたＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を使用してホモファルネソールをアンブロキサンへと変換し、アンブロキサンを収集し、アンブロキサン（特に、（−）−アンブロキサン）を任意選択で単離することによる、組換え宿主細胞においてアンブロキサンを生成する方法を提供する。一部の実施形態では、組換え宿主細胞はまた、ＧｍＳＨＣの発現、またはアンブロキサンを作製するための生物変換経路を増進する役割を果たす他の核酸分子を発現している。
【００５１】
本開示の別の実施形態は、培養系において野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している組換え宿主細胞を提供し、ホモファルネソールを培養系へと提供し、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換を促進するのに適した可溶化剤の存在下でホモファルネソール（例えば、ＥＥＨ）を培養系に供給し、アンブロキサンを収集し、アンブロキサン（特に、（−）−アンブロキサン）を任意選択で単離することによる、組換え宿主細胞においてアンブロキサンを生成する方法を提供する。一部の実施形態では、変換は、可溶化剤、特に、非イオン性界面活性剤または洗剤、例えば、ＴＷＥＥＮ８０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００などを、反応混合物に加えることによって増進される。
【００５２】
組換え宿主細胞は、それに続く生物変換ステップのために、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している細胞を適切な量で提供するために多くの方法で培養し得る。生物変換ステップに適用可能な宿主細胞は広範に変化するため（例えば、真菌、細菌、昆虫、哺乳動物および植物の細胞）、培養条件は、当然ながら、それぞれの種の特定の必要条件に調節され、これらの条件は周知であり、実証されている。組換え宿主細胞を成長させるための当該技術分野で公知の方法のいずれかを使用して、本開示のそれに続く生物変換ステップにおいて使用される細胞を生成し得る。典型的には、細胞は特定の密度（光学密度（ＯＤ）として測定可能）へと成長して、生物変換反応のための十分なバイオマスが生成される。
【００５３】
選択される培養条件は、得られる細胞の量（バイオマス）、およびどのようにバイオマスが生体触媒（すなわち、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を含有する細胞または細胞画分）となるかに影響を与えることができる。一部の実施形態では、生体触媒は、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している組換え全細胞である。他の実施形態では、生体触媒は、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している、組換え全細胞懸濁液または固定化細胞である。他の実施形態では、生体触媒は、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している組換え宿主細胞から調製される膜画分または液体画分である。野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を生成する組換え全細胞は、発酵槽（生物変換反応のための）から回収した全細胞、または発酵槽（これは次いでワンポット反応において使用される）中の細胞を含む。野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を生成する組換え全細胞は、損なわれていない組換え全細胞および／または細胞デブリを含むことができる。どちらにしても、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体は、基質（例えば、ホモファルネソール）を受け、かつ／または相互作用するために、膜（例えば、細胞膜）と何らかの方法で会合しており、この膜（例えば、細胞膜）は、全細胞（例えば、組換え全細胞）の部分であり得るか、または全細胞（例えば、組換え全細胞）を含み得る。野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体はまた、固定化形態（例えば、酵素担体と関連している）でよく、これによって、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体が基質（例えば、ホモファルネソール）と相互作用することが可能となる。野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体はまた、可溶性形態で使用し得る。
【００５４】
一実施形態では、生体触媒は、（十分なバイオマスを生じさせるのに）十分な量で生成され、生物変換ステップの前に収集および洗浄（および任意選択で貯蔵（例えば、凍結または凍結乾燥））される。さらなる実施形態では、細胞は、（十分な生体触媒を生じさせるのに）十分な量で生成され、次いで、生物変換反応のために生体触媒を収集および洗浄する必要なく、反応条件を調節する。このワンステップ（もしくは「ワンポット」）方法は、コストを低減させる一方で、プロセスを単純化するため、有利である。細胞を成長させるために使用される培養培地はまた、生物変換反応における使用に適しているが、ただし、反応条件は調節され、生物変換反応を促進する。
【００５５】
細胞を成長させるための最適ｐＨは、６．０〜７．０の範囲である。生物変換反応のための最適ｐＨは、生物変換反応において使用されるＳＨＣ酵素、例えば、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体によって決まり得る。ｐＨは、当業者には周知の技術を使用してレギュレートされる。
【００５６】
用語「混合物」または「反応混合物」は、本開示において、用語「培地」と互換的に使用し得る（特に、これが「ワンポット」反応と関連するように）一方、十分なバイオマスを生じさせるように細胞を成長させることは、細胞培養物／発酵培地を必要とするが、反応緩衝液は適切なｐＨで十分であるため、培地は生物変換ステップのために必要とされないことに留意すべきである。
【００５７】
本開示の生物変換方法は、時間、温度、ｐＨおよび可溶化剤の条件下で行われ、アンブロキサンへのホモファルネソール供給原料の変換をもたらす。反応混合物のｐＨは、ＧｍＳＨＣ誘導体酵素について４〜８、好ましくは、５〜６．５、より好ましくは、４．８〜６．０の範囲であり、および野生型ＧｍＳＨＣ酵素について約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲であり得、反応混合物へと緩衝液を添加することによって維持することができる。使用される緩衝液は、クエン酸、リン酸、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、またはＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液である。好ましい温度は、約１５℃〜約４５℃、好ましくは、約２０℃〜約４０℃である。温度は、生物変換プロセスの間に一定に保つことができるか、または変更することができる。
【００５８】
可溶化剤、例えば、界面活性剤、洗剤、溶解度増強剤、水混和性有機溶媒などの使用は、生物変換反応を改善させることが示されてきた。本明細書において使用する場合、用語「界面活性剤」は、２つの液体の間または液体および固体の間の表面張力（もしくは界面張力）を低下させる構成要素を意味する。界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、および分散剤として作用し得る。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または両性もしくは双性イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の例には、これらに限定されないが、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート８０）、およびＴＷＥＥＮ２０（ポリソルベート２０）が含まれる。例示的なアニオン性界面活性剤には、これらに限定されないが、タウロデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）が含まれる。本明細書において提示する結果が示すように、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００は、特に有用な可溶化剤である。したがって、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００ならびに他の界面活性剤、例えば、ＳＤＳおよびＴＷＥＥＮ２０を使用して、ホモファルネソールからアンブロキサンへの生物変換反応のために速度および収率を増加させることができる。可溶化剤は、反応物中の約０．００５％〜０．４８％、またはより好ましくは、反応混合物中の約０．０５〜５％の濃度範囲で含むことができる。
【００５９】
本発明の方法によると、アンブロキサンは、それにホモファルネソール基質を加える生体触媒を使用して生成される。公知の手段（例えば、蠕動ポンプ、注入シリンジなど）を使用した供給によって、基質を加えることが可能である。ホモファルネソールは油溶性化合物であり、油フォーマットで提供される。生体触媒（微生物細胞、例えば、損なわれていない組換え全細胞および／または細胞デブリおよび／または固定化酵素）が水相中に存在することを考えれば、ホモファルネソールを生物変換反応混合物に加えるとき、生物変換反応は三相系（水相、固相および油相を含めた）として見なし得る。可溶化剤が存在するときでさえ、これはまた当てはまり得る。
【００６０】
一部の実施形態は完全な無傷の細胞または細胞抽出物の使用を含む一方、他の実施形態は、アンブロキサンへのホモファルネソールの生物変換のための、遊離の任意選択で精製したもしくは部分的に精製したＧｍＳＨＣ酵素、または固定化されたＧｍＳＨＣ酵素の使用を含む。この点において、可溶性野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体が生体触媒として使用されるとき、これは二相系と考えられる。
【００６１】
存在するホモファルネソール異性体の数は、反応のスピードに影響を与え得る。ＳＨＣ誘導体酵素は、ホモファルネソール異性体の複合混合物（例えば、ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺ）からのＥ，Ｅ−ホモファルネソールを（−）−アンブロキサンへと生物変換することができることが示されてきた（国際公開第２０１６／１７００９９号パンフレットを参照されたい）。しかし、ホモファルネソール異性体の複合混合物を使用してより低い変換割合が典型的には観察され、ＥＥＨ以外のホモファルネソール異性体が、ＳＨＣ誘導体酵素へのアクセスについてＥＥＨと競合し得、したがって、（−）−アンブロキサンへのＥＥＨの変換のための拮抗阻害剤として作用し得、かつ／またはまた代替の基質として作用し得るという考え方とこれは一致する。したがって、本方法は好ましくは、２〜４つの異性体、好ましくは、２つの異性体の立体異性混合物から構成されるホモファルネソール基質の存在下で行われる。一部の実施形態では、ホモファルネソールの２つの異性体のみを、反応混合物に加える。ある特定の実施形態では、ホモファルネソール基質は、ＥＥ：ＥＺ立体異性混合物から構成される。他の実施形態では、立体異性的に純粋なＥ，Ｅ−ホモファルネソールを、反応混合物に加える。
【００６２】
本発明の方法によって生成されるアンブロキサンは、例えば、蒸気抽出／蒸留または非水混和性溶媒（水相中にある生体触媒から反応生成物および未反応の基質を分離する）を使用した有機溶媒抽出、それに続くその後の溶媒の蒸発によって回収して、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）分析によって決定するように粗反応生成物を得てもよい。蒸気抽出／蒸留および有機溶媒抽出方法は、当業者には公知である。例示として、このように得られたアンブロキサンは、有機溶媒、例えば、非水混和性溶媒（例えば、トルエン）を使用して全反応混合物から抽出し得る。代わりに、このように得られたアンブロキサンは、水混和性溶媒（例えば、エタノール）または非水混和性溶媒（例えば、トルエン）を使用して反応混合物の固相（例えば、遠心分離または濾過によって得られる）から抽出し得る。さらなる例として、アンブロキサンは、結晶として固相中で、もしくはアモルファス形態で存在し、また濾過を用いて、残った固相（細胞材料もしくはその細片）および液相から分離することができる。さらなる例として、アンブロキサンの融点を超える温度（概ね７５℃）にて、アンブロキサンは、水相の上部上で油層を形成し得、ここで、油層を取り出し、回収することができる。油層が取り出された後のアンブロキサンの完全な回収を確実にするために、有機溶媒を、バイオマス中またはバイオマス上またはバイオマス周囲に含有される残留するアンブロキサンを抽出するために、結晶として水相に加え得る。有機層は、油層と合わせることができ、その後、全体をさらに処理して、アンブロキサンを単離および精製する。アンブロキサンは、さらに選択的に結晶化して、最終生成物からの副生成物（すなわち、（−）−アンブロキサン以外の異性体）および未反応のホモファルネソール基質を除去し得る。用語「選択的結晶化」は、それによって（−）−アンブロキサンが溶媒から結晶化することをもたらし、一方、残った異性体は、結晶化溶媒中で溶解されたままである工程ステップを指す。一部の実施形態では、単離された結晶性材料は、（−）−アンブロキサン生成物のみを含有する。他の実施形態では、単離された結晶性材料は、他の異性体を含有し、ここで前記異性体は、嗅覚の容認できる量でのみ存在する。
【００６３】
（−）−アンブロキサンの抽出および／または選択的結晶化における使用に適した適切な水混和性および非水混和性の有機溶媒の例には、これらに限定されないが、脂肪族炭化水素、好ましくは、５〜８個の炭素原子を有するもの、例えば、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンまたはシクロオクタン；ハロゲン化脂肪族炭化水素、好ましくは、１個もしくは２個の炭素原子を有するもの、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタンまたはテトラクロロエタン；芳香族炭化水素、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンまたはジクロロベンゼン；脂肪族非環式および環式エーテルまたはアルコール、好ましくは、４〜８個の炭素原子を有するもの、例えば、エタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン；またはエステル、例えば、酢酸エチルまたはｎ−ブチルアセテートまたはケトン、例えば、メチルイソブチルケトンまたはジオキサン、またはこれらの混合物が含まれる。特に好ましくは使用される溶媒は、上記のヘプタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、第三級ブチルメチルエーテルおよびｉＢＭＥとしてまた公知である）、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、酢酸エチルおよび／またはこれらの混合物である。好ましくは、水混和性溶媒、例えば、エタノールは、反応混合物の固相からの（−）−アンブロキサンの抽出のために使用される。エタノールの使用は、取り扱うことが容易であり、無毒性であり、環境に優しいため、有利である。
【００６４】
ある特定の実施形態では、最終生成物は、単離した（−）−アンブロキサンである。用語「単離されている」は、（−）−アンブロキサンに関連して使用されるように、生物変換生成物に付随する構成要素から分離または精製されている生物変換生成物を指す。そこから実体が天然に由来するソースとは異なる細胞系において生成される実体は、実体がそれに天然に付随する構成要素を必然的に含有しないため、「単離されている」。単離または純度の程度は、任意の適当な方法、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ＨＰＬＣまたはＮＭＲ分析によって測定することができる。一部の実施形態では、最終生成物（（−）−アンブロキサン）は、均一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または８９．５％純度または９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％純度へと単離および精製される。
【００６５】
最終（−）−アンブロキサン生成物の嗅覚的純度は、水中の１０％エタノール抽出物を使用するか、または結晶性材料を試験することによって決定し得る。最終（−）−アンブロキサン生成物は、（−）−アンブロキサン生成物の市販の参照に対してその嗅覚的純度、質およびその感覚プロファイルについて試験し得る。（−）−アンブロキサン材料はまた、材料がその感覚受容性プロファイルに関して規格に合致するかを決定するために、専門家が適用研究において試験することができる。
【００６６】
ＧｍＳＨＣ酵素の活性は、モルパーセントでの反応率（生成物の量／（生成物の量＋残った出発材料の量））×１００）によって定義される。好ましくは、野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体酵素の存在下で、または野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体を発現している組換え宿主細胞の存在下での（−）−アンブロキサンへのＥＥＨの生物変換は、モルパーセントで示し、用いられるＥＥＨのモルに基づいて、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００の（−）−アンブロキサンの収率を実現する。特に好ましくは、収率は、５〜１００、１０〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、特に、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００である。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、収率および／または反応率は、例えば、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３６時間または４８時間の確定した期間に亘り決定し、この間に、ＥＥＨは、本開示によって野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体酵素をコードする核酸分子を担持する組換え宿主細胞によって（−）−アンブロキサンへと変換される。さらなる実施形態では、反応は、例えば、２５℃、３０℃、４０℃、５０℃または６０℃の確定した条件下で行われる。
【００６８】
野生型ＧｍＳＨＣもしくはＧｍＳＨＣ誘導体酵素をコードする核酸分子を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え型菌株においてホモファルネソールから（−）−アンブロキサンを作製するための生物変換プロセスは、（−）−アンブロキサン生成のための低コストで産業上経済的なプロセスを提供することができる。
【００６９】
望ましくは、生成された（−）−アンブロキサンの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２０，０００ｍｇ／Ｌ（２０ｇ／Ｌ）もしくはより高く、例えば、約２０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌまたは１００〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは、約１２５ｇ／Ｌまたは１５０ｇ／Ｌの範囲である。
【００７０】
（−）−アンブロキサンについての様々な用途には、これらに限定されないが、高級香料または消費者製品、例えば、本質的に全ての製品を含めた、布帛ケア、トイレタリー、美容およびクリーニング製品が含まれ、ここで、これらに限定されないが、ＡＭＢＲＯＸ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ）、Ａｍｂｒｏｘａｎ（Ｈｅｎｋｅｌ）ＡＭＢＲＯＦＩＸ（Ｇｉｖａｕｄａｎ）、ＡＭＢＥＲＬＹＮ（Ｑｕｅｓｔ）、ＣＥＴＡＬＯＸ  Ｌａｅｖｏ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ）、ＡＭＢＥＲＭＯＲ（Ａｒｏｍｏｒ）および／またはＮｏｒａｍｂｒｅｎｏｌｉｄｅ  Ｅｔｈｅｒ（Ｐａｃｉｆｉｃ）製品を含めた現在利用可能なアンブロキサン成分が商業的に使用される。（−）−アンブロキサンの選択的結晶化は、未反応のホモファルネソール基質の存在、およびまた（−）−アンブロキサンと他の検出可能な異性体の比によって影響を受け得る。たとえ（−）−アンブロキサンへのホモファルネソール基質の１０％のみの変換が得られても、（−）−アンブロキサンの選択的結晶化は依然可能である。
【００７１】
下記の非限定的実施例を提供して、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００７２】
実施例１：ＰｅｌＢリーダー配列の挿入
ＧｍＳＨＣの酵素活性を増加させる１つのアプローチとして、ｐｅｌＢリーダー配列を、ＧｍＳＨＣをコードする核酸を含有するｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクター中に挿入した。ｐｅｌＢリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチドを、ｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクター中への挿入のためにＮｃｏＩおよびＮｄｅＩ適合性末端と共に調製した。ｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクターをＮｃｏＩおよびＮｄｅＩで消化し、ｐｅｌＢリーダー配列のオリゴヌクレオチドを伴う一晩の連結反応において使用した。連結反応物を精製し、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換において使用した。このように得られた形質転換体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のランダム標本を、相補性オリゴヌクレオチドプライマー「ｐｅｌＢ−ＳＨＣ−Ｆｗ」および「ｐＥＴ−ＸｈｏＩ−Ｒｅｖ」を伴うコロニーＰＣＲによってアセスメントし、連結反応が成功したかどうかを決定した。クローンは、正確なサイズの挿入断片を含有すると同定された。それに続くＤＮＡ配列分析によって、ｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクターへのｐｅｌＢリーダー配列の挿入を確認した。
【００７３】
実施例２：ＰｅｌＢ−ＧｍＳＨＣ融合タンパク質の発現分析
ｐｅｌＢ−ＧｍＳＨＣクローンを含有するプラスミドを使用して、融合タンパク質の発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。形質転換に続いて、単一のコロニークローンを単離し、１０ｍＬのＬＢ培地＋カナマイシンを播種するために使用した。１０ｍＬの培養物を、２００ｒｐｍで一晩振盪しながら３７℃にてインキュベートした。一晩培養物を使用して、１ＬのＬＢ培地＋カナマイシンを含有するフラスコを播種し、これを、誘導の前に６時間、振盪しながら３７℃にて２００ｒｐｍでインキュベートした。タンパク質発現の誘導は、１ｍＬのＩＰＴＧ（１Ｍ）を加えることによって開始させた。誘導に続いて、インキュベーター温度を２５℃に低下させ、培養物を振盪しながら２００ｒｐｍで一晩静置した。一定分量（１．５ｍＬ）の２５℃の一晩培養物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析のために取り出し、残りの培養物は、さらなる処理のために遠心分離によって収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、正確なサイズのｐｅｌＢ−ＧｍＳＨＣ融合タンパク質が発現したことが観察された。
【００７４】
実施例３：全細胞スクリーニングアッセイ
ｐｅｌＢリーダー配列を含め、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞周辺腔中へのＧｍＳＨＣ酵素の輸送を促進し、それによって、細胞を取り巻く環境において、ＧｍＳＨＣ酵素を基質にとってより利用可能であるようにした。このように、スクリーニングアッセイを行い、ＧｍＳＨＣと比較するように、ｐｅｌＢ−ＧｍＳＨＣを含有する全細胞懸濁液によってアンブロキサンへのホモファルネソールの変換を分析した。反応物は、全細胞、１００μｌのクエン酸ナトリウム（１Ｍ）、ｐＨ４．９、可溶化緩衝液（０．０５ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、０．０１ＭのＭｇＣｌ２、１％ｖ／ｖ  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）中の１００μｌのホモファルネソール（１００ｍＭ）、および８００μｌの可溶化緩衝液を含んだ。反応物を３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートし、試料を１６時間および８０時間後に取り出した。ＧＣ分析の前に、試料を２容のｎ−ヘプタンで抽出した。１ｍｇの全細胞当たりの平均変換面積％を計算した。結果によれば、野生型ＧｍＳＨＣ細胞懸濁液は、１時間当たり１ｍｇの全細胞当たり平均０．０３３面積％を実現した一方、ｐｅｌＢ−ＧｍＳＨＣ細胞懸濁液は、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換をもたらさなかったことが示された。したがって、ｐｅｌＢリーダー配列は、ＧｍＳＨＣの活性に悪影響を与えたようであった。
【００７５】
ＳＨＣ酵素は補助因子非依存性であるため、ＧｍＳＨＣは、反応後に活性を保持し得ることが仮定された。活性が保持されるかどうかを決定するために、上記の１６時間の時点からの細胞を取り出し、０．５ｍＬの新鮮な反応混合物に再懸濁させた。次いで、これらの「二次通過」反応物を、３７℃、２００ｒｐｍにて概ね６４時間インキュベートした。６４時間後、反応物をＧＣ分析のために２容のｎ−ヘプタンで抽出した。「初回通過」および「二次通過」の比較は、新鮮な反応混合物への反復曝露に続いて活性の最小の分解を示した（二次通過において０．０３７％に対して初回通過において０．０３３％）。したがって、これらのデータは、全細胞を再使用／リサイクルして、反復変換を行うことをできることを示し、プロセスの全体的なコストを最小化することが有利であると証明し得る。
【００７６】
実施例４：発酵におけるアンブロキサンへのホモファルネソールの変換
上記で示したように、ＧｍＳＨＣを発現している全細胞は、ホモファルネソールをアンブロキサンへと生物変換した。したがって、発酵における変換が達成することができるかを決定した。野生型ＧｍＳＨＣまたはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＳＨＣ（ＲｐＳＨＣ；国際公開第２０１０／１３９７１９号パンフレット）を発現している細胞を、下記の様式で成長および発現させた。一晩、ＧｍＳＨＣおよびＲｐＳＨＣをコードする核酸を担持する細胞の１０ｍＬの（ＬＢ培地＋カナマイシン、３７℃、２００ＲＰＭ）開始培養物を使用して、１ＬのＬＢ培地＋カナマイシンを播種した。１Ｌの培養物を３７℃、２００ｒｐｍにて概ね４時間インキュベートした。それに続いて、１ｍＬのＩＰＴＧ（１Ｍ）を、培養物に加えて、ＳＨＣタンパク質発現を誘発し、培養物のインキュベーション温度を一晩のインキュベーションのために２５℃に低減させた。
【００７７】
ＧｍＳＨＣおよびＲｐＳＨＣの発現を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を細胞培養物上で行った。一定分量（１．５ｍＬ）の一晩培養物を取り出し、１４，５００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを２００μＬのＳＤＳ添加緩衝液に再懸濁させた。次いで、再懸濁した細胞を９５℃に５分間加熱した。１４，５００ｒｐｍでの１０秒間の短時間の遠心分離に続いて、添加緩衝液中のＳＨＣの試料を、プレキャスト４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェル中に入れた。この分析の結果は、ＧｍＳＨＣおよびＲｐＳＨＣの両方が発現したことを示した。
【００７８】
ＧｍＳＨＣおよびＲｐＳＨＣの発現の確認に続いて、表３において提供したように二重反復反応物を調製した。
【００７９】
【表３】
2020508651.tif 000006
【００８０】
反応物を調製し、３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。１６時間のインキュベーションの後に試料を取り出し、ＧＣ分析のために２容のｎ−ヘプタンで抽出した。４０時間後、残った反応混合物を遠心し、細胞をペレット化し、ＧＣ分析のために上清を２容のｎ−ヘプタンで抽出した。１時間当たりの変換面積％の平均を、表４において提示する。
【００８１】
【表４】
2020508651.tif 000007
【００８２】
表４において提示した結果は、細胞培養培地中のＳＨＣによるアンブロキサンへのホモファルネソールの変換を示す。結果はまた、タウロデオキシコール酸中のエマルジョンよりも、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００中のホモファルネソールがアンブロキサンへとより容易に変換されたことを示す。
【００８３】
実施例５：ＧｍＳＨＣ誘導体の合理的な設計
ホモロジーモデリング。ホモロジーモデリングを使用して、ＧｍＳＨＣの三次元構造を構築した。使用したテンプレートは結晶１ＧＳＺ（Ｌｅｎｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：６３９−４５）および３ＳＱＣ（Ｗｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１７５−８７）であったが、これらはＧｍＳＨＣ配列の９５％と４４％および４３％の配列同一性を共有する。
【００８４】
分子ドッキング。次いで、ホモファルネソールの基底状態の表示を、ＧｍＳＨＣ構造の活性中心にドッキングした。これは、第１のプロトン供与体のプロトン化した酸素原子の中心にある３Ｄグリッドボックスを定義することによって達成された。このグリッドボックスは、活性中心ポケット領域を同定し、ここで、基質立体構造は分子ドッキングの実行の間に標本抽出する。次いで、Ｌａｍａｒｃｋｉａｎ遺伝子アルゴリズム（ＬＧＡ；Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１９：１６３９−６２；Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．３０：２７８５−９１）を使用して分子ドッキングを行った。系毎に全部で１０００ＬＧＡの実行を行った。集団は３００であり、ＧＡエリーティズム＝１であり、世代の最大数は２７０００であり、エネルギー評価の最大数は２５０００００であった。したがって、それぞれのＬＧＡの実行について、第一世代は３００のランダムな基質立体構造の集団で開始した。現在の集団における最良の基質立体構造は、自動的に次世代まで生き残る（ＧＡエリーティズム＝１）。したがって、次世代集団は、前の世代からの最も適切な基質立体構造および別の２９９の立体構造から始まる。最大世代数またはエネルギー評価に達するとき、ＬＧＡの実行は停止する。それぞれのＬＧＡの実行について、１つの基質立体構造を得た。次いで、基質立体構造を、エネルギーおよび最小２乗偏差にしたがってソートした。最良の構造は、最も低い平均結合エネルギーを伴う最も集合したクラスターの最も低い結合エネルギー構造に対応した。
【００８５】
ＳＨＣ構造分析および触媒機序。ＳＨＣは、二量体の３Ｄアレンジメントを採択する内在性モノトピック膜タンパク質である。各モノマーは、２つの高度に安定なα／α−バレルドメインを構築する多数のα−ヘリックスを密接に接続する（Ｗｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１７５−８７）、８つのＱＷモチーフによって特性決定される（Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４０７−１１）。活性中心空洞は２つのα／α−バレルドメイン内に埋没され、内側の疎水性チャネルを通してそのアクセスは可能である。ＡａＳＨＣについて、チャネルおよび活性中心空洞は、基質認識に関与している、残基Ｆ１６６、Ｖ１７４、Ｆ４３４、およびＣ４３５によって構成される狭い狭窄部によって分離している（Ｌｅｎｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：６３９−４５）。ＧｍＳＨＣについて、これらの残基は、Ｆ１７６、Ｍ１８４、Ｆ４５７およびＣ４５８に対応する。他に示さない限り、ＧｍＳＨＣに関して提供されるアミノ酸残基の位置は、配列番号２を基準にしている。活性中心空洞の上部において、保存ＤＸＤＤモチーフを構成する残基（Ｗｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１７５−８７）が観察される。これらの残基の１つは、第１のプロトン供与体であるＤ３９６であり、これは二重結合２および３へとプロトンを供与することによって環化を開始させる（スキーム２）。ＧｍＳＨＣにおいて、Ｄ３９６の酸素原子は、二重結合２、３の炭素３から４．６Åである。
【００８６】
【化２】
2020508651.tif 000008
【００８７】
ＤＸＤＤモチーフの後に、強力なカチオン−π相互作用によってカチオン性中間体を安定化させることに関与しているトリプトファンおよびフェニルアラニン残基が続く（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  （１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１６３−１６８）。空洞の底には最後のプロトン受容体であるグルタメート残基があり、これはヒドロキシル基からのプロトンを受け、第３の環の閉鎖および生成物であるアンブロクスの形成をもたらし得る。ＧｍＳＨＣの構造分析は、この酵素が、２つの可能な最後のプロトン受容体を有することを示す。しかし、ドッキング結果によると、ＧｍＳＨＣのＥ３８６は、最後のプロトン受容体である可能性が高い。ホモファルネソールヒドロキシル酸素およびＥ３８６の間の距離は、単に３．５Åである。明らかに、最後のプロトン受容体のこの配置は、この酵素の触媒有効性において重要な役割を果たしている。
【００８８】
分子モデルを使用して、カチオン性中間体および他の主要な触媒残基の安定化に関与しているカチオン−パイ相互作用を確立するＧｍＳＨＣ残基を決定した。特に、重要な触媒残基は、他のＳＨＣ酵素と共に保存されている。主な差異は、ａ）ＧｍＳＨＣ活性中心が、残基４５であり；ｂ）ＧｍＳＨＣ残基１８４が、残基１７６、４５７および４５８と一緒に、基質選択性と関連する、疎水性チャネルおよび活性中心空洞の間の狭い狭窄部に関与しており；ｃ）ＱＷモチーフのパターンがいくらか異なることを含む。
【００８９】
構造的ホットスポット。分子モデリングおよび分子ドッキング結果に基づいて、下記の構造的ホットスポットを同定した：残基Ｖ４５、Ｅ４６、Ｑ５４、Ｆ１７６、Ｍ１８４、Ｆ４５７、Ｃ４５８、Ｗ１７９、Ｉ２７８、Ｑ２７９、Ｔ３２６、Ｆ３８５、Ｅ３８６、Ｄ３９７、Ｆ４４３、Ｆ４６０、Ｆ６２４、Ｆ６５４およびＬ６５６。
【００９０】
特異性決定位置および保存残基。特異性決定位置は、どの残基が所与の触媒特異性を共有するファミリーのタンパク質の部分群内で協調的に進化したかを示す。このように、これはタンパク質の同じファミリー内で生物学的機能の多様性を獲得することと関連する進化過程を追跡することを可能とする。特異性決定位置は、Ｘｄｅｔのアルゴリズムを使用して１０００の相同配列を含有する複数の配列アラインメントから計算した。ＧｍＳＨＣの特異性決定位置は、Ｙ１１３、Ｖ１３８、Ｒ１４１、Ｆ１７１、Ｅ２２５、Ｅ２２６、Ｄ２２７、Ｑ３２４、Ｇ３８１、Ｉ４５５、Ｈ４７４、Ｌ４７６、Ｓ５５９、Ａ５６８、Ｌ６５６およびＥ６７９である。
【００９１】
ＧｍＳＨＣの進化。アンブロクスへのホモファルネソールの触媒的変換を改善するために、ＧｍＳＨＣを修飾して、（１）ミカエリスメンテン複合体を改善し；（２）構造的および共進化ホットスポットに基づいて、カルボカチオン中間体のカチオン−π安定化を増加させることができる変異を導入し；（３）５環天然基質であるスクアレンの触媒作用にのみ不可欠である残基を変異させることによって触媒の空洞を開口し；（４）生成物形成を促進するために最後のプロトン受容体を補助する残基を変異させ；（５）活性中心を変化させ；（６）疎水性チャネルおよび活性中心空洞の間の狭い狭窄部に関与する残基を変異させ；（７）ＱＷモチーフを増加させた。
【００９２】
ミカエリスメンテン複合体を改善し、かつカルボカチオン中間体のカチオン−π安定化を増加させるように設計されたＧｍＳＨＣ変異体は、分子ドッキングを使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで試験した。この分析の結果を、表５において提示する。
【００９３】
【表５】
2020508651.tif 000009
【００９４】
【表６】
2020508651.tif 000010
【００９５】
上記で示した修飾のそれぞれに取り組むさらなる変異を、表６において一覧表示する。
【００９６】
【表７】
2020508651.tif 000011
【００９７】
【表８】
2020508651.tif 000012
【００９８】
【表９】
2020508651.tif 000013
【００９９】
ＳＨＣ変異体酵素発現。表６の野生型およびＧｍＳＨＣ変異体を、ｐＥＴ２８ａ（＋）中に個々にクローン化した。これらのＤＮＡ構築体をＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換し、カナマイシンを含有する寒天プレート上に播種した。これらを、３７℃にて一晩インキュベートした。単一の細菌のコロニーを採取し、９６ウェルプレート中の５００μＬのＬＢ＋カナマイシンを播種するために使用した。このプレートを、撹拌しながら３７℃にて一晩インキュベートした。これらの初代培養（１０μＬ）を５０ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブ中の１０ｍＬのＬＢ＋カナマイシンを播種するために使用し、これをそれに続いて３７℃にて１８０ｒｐｍで約７時間インキュベートした。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘発した。インキュベーター温度を２５℃に低下させ、培養物を１８０ｒｐｍで一晩さらにインキュベートした。翌日、培養物を４０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、上清を廃棄した。反応アッセイにおける使用の前に、細胞ペレットを２ラウンドの凍結／解凍に曝露させた。
【０１００】
細胞ペレット（１μＬ）をニトロセルロース膜上へとスポッティングし、３０分間空気乾燥させた。膜を、穏やかに撹拌しながら５％粉乳中に室温にて１時間配置した。次いで、膜をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３×５分すすいだ。抗ヒスチジン抗体溶液（１０，０００倍希釈）を加え、振盪しながら室温にて１時間インキュベートした。ブロットをそれに続いてＰＢＳ中で３×５分洗浄した。展開溶液（１０ｍＬのＰＢＳ中の６ｍｇのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および５μＬの３０％Ｈ２Ｏ２）を、ブロットに加えた。展開すると、展開溶液を直ちに除去し、ブロットを水ですすいだ。
【０１０１】
この分析の結果は、１ｍＭのＩＰＴＧの添加に続いて、全ての構築体が２５℃にてＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現したことを示した。酵素の発現および処理に続いて、ドットブロットを行って、特定の変異の導入がタンパク質発現を変化させたかを評価した。特に、ＧｍＳＨＣ変異体の大部分は、野生型ＧｍＳＨＣ構築体と同様のレベルの発現を示した。
【０１０２】
ＳＨＣ変異体スクリーニング反応。クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．３（等容量の１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．９および０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を調製した。次いで、タウロデオキシコール酸（ホモファルネソール基質に関して２％ｗ／ｗ）を、クエン酸ナトリウム緩衝液に加えた。それに続いて、ホモファルネソール（３ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは１５ｍｇ／ｍＬ）を、緩衝液に加えた。このように得られたエマルジョンを２つの９６ウェルプレート中に移し、加えられるホモファルネソール濃度によって様々な期間（すなわち、３ｍｇ／ｍＬのホモファルネソール、１６時間のインキュベーション；１０ｍｇ／ｍＬのホモファルネソール、６時間および２４時間のインキュベーション；１５ｍｇ／ｍＬのホモファルネソール、４時間および２０時間のインキュベーション）、撹拌しながら３７℃にてインキュベートした。研究が進行するにつれ、ホモファルネソール濃度は増加し、インキュベーション期間は減少し、調査した変異体の間のＳＨＣ活性におけるより明白な差異が可能となった。反応を停止させ、生成物を抽出するために、２容のヘプタンを、各ウェルに加えた。次いで、徹底的に混合するため撹拌しながら、プレートを３７℃にて３０分間インキュベートした。プレートを１０分間４０００ｒｐｍにて遠心し、細胞材料をペレット化した。次いで、上部の有機層を取り出し、クリーンなガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアル中に入れた。
【０１０３】
ＧＣ分析方法。ＧＣ分析方法を使用して、出発材料、およびスクリーニング反応において使用される生成物のそれぞれを検出した。生じた試料の容量によって、４．５分のみの実行時間を伴う速い方法を開発した。ＧＣ分析条件を、表７において提示する。
【０１０４】
【表１０】
2020508651.tif 000014
【０１０５】
３ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬ両方のホモファルネソールの添加に続くＳＨＣ変異体反応試料の分析は、いくつかのＳＨＣ変異体／誘導体が、野生型酵素と比較して、改善された活性を示したことを示した。特に目的の変異体を、表８において一覧表示する。
【０１０６】
【表１１】
2020508651.tif 000015
【０１０７】
結果によれば、酵素の多くが、アンブロキサンを生じさせるために使用されるホモファルネソール異性体の完全な消費に達したことが示された。このように、さらなる分析を行い、１つもしくは複数の最適なＳＨＣ酵素を同定した。特に、基質添加を１５ｍｇ／ｍＬに増加させ、インキュベーションは限定された期間（すなわち、４時間および２０時間）の間進行させた。表９において示すように、野生型ＳＨＣ酵素より高い活性を示した複数の変異体酵素が存在した。特に、Ｆ６２４Ｙ  ＳＨＣ変異体は、４時間後に最も高い活性を示し、一方、Ｅ４６Ｑ  ＳＨＣ変異体は、２０時間後に最も高い活性を示した。特に、活性中心へのアクセスを与える疎水性チャネルを変化させることによって酵素特異性に影響を与えるように設計された、１８４位において変異（Ｍ１８４Ｌ、Ｍ１８４Ｖ、Ｍ１８４ＩおよびＭ１８４Ａ）を有する酵素のそれぞれは、より長いインキュベーション期間に続いて活性の増加を示した。
【０１０８】
【表１２】
2020508651.tif 000016
【０１０９】
ホモファルネス酸からのスクラレオリド生成について、アンブロキサンに加えて、変異体をまた試験した。この分析は、Ｇ６２３Ｖ、Ｉ２７８Ｖ、Ｌ３３５ＦおよびＱ５４Ｅ変異体が、野生型ＧｍＳＨＣと比較して、スクラレオリド生成の増加を示したことを示した（表１０）。
【０１１０】
【表１３】
2020508651.tif 000017
【０１１１】
４時間のインキュベーションの後で、７つのみの変異体は、野生型ＳＨＣ（破線より上の全てのバー）より高いアンブロキサン生成を示した一方、１５の変異体は、２０時間のインキュベーションに続いてより高い活性を示したことを図２は示す（図２）。特に、Ｖ４５Ｌ＋Ｔ３２６Ｓ、Ｆ６２４Ｙ、Ｅ４６Ｑ、Ｍ１８４Ｌ、Ｍ１８４Ｖ、Ｍ１８４ＩおよびＱ１７８Ｅ変異体は、両方の時点において増加した活性を示した。これらの７つの変異体に加えて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分析は、Ｇ６２３Ａ、Ｑ５４Ｅ、Ｒ１９４ＱおよびＭ１８４Ａ変異体がまた目的のものであったことを示した。したがって、ＧｍＳＨＣ酵素の活性を増加させる相加効果または相乗効果を示す組合せ変異体を提供する（表１１）。
【０１１２】
【表１４】
2020508651.tif 000018
【０１１３】
選択した組合せ変異体を５０ｍｇ／ｍＬのホモファルネソールと共に２０時間インキュベートしたとき、変異体のそれぞれは、野生型ＧｍＳＨＣと比較して活性の増加を示したことが見出された（表１２）。組合せ変異体が２５％の酵素添加で５０ｍｇ／ｍＬのホモファルネソールと共に６時間または２０時間インキュベートしたとき、同様の結果が観察された（図３）。
【０１１４】
【表１５】
2020508651.tif 000019
【０１１５】
実施例６：ＧｍＳＨＣ誘導体の要約
ＳＨＣは、二量体の３Ｄアレンジメントを採択する内在性モノトピック膜タンパク質である。各モノマーは、２つの高度に安定なα／α−バレルドメインを構築する多数のα−ヘリックスを密接に接続するＱＷモチーフによって特性決定される（Ｗｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１７５−８７）。活性中心空洞は２つのα／α−バレルドメイン内に埋没され、酵素の膜浸漬領域（membrane-immersed region）であることが示唆される内側の疎水性チャネルを通してそのアクセスは可能である（Ｌｅｎｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：６３９−４５）。チャネルおよび活性中心空洞は、基質認識に関与している狭い狭窄部によって分離されている（Ｌｅｎｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：６３９−４５）。ＧｍＳＨＣについて、これらの残基は、Ｐｈｅ１７６、Ｍｅｔ１８４、Ｐｈｅ４５７およびＣｙｓ４５８に対応する。保存ＤＸＤＤモチーフを構成する残基（Ｗｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１７５−８７）は、活性中心空洞の上部において見出される。それらの残基の１つは、第１のプロトン供与体であるＡｓｐ３９６であり、これは二重結合Ｃ２＝Ｃ３へとプロトンを供与することによってホモファルネソールの環化を開始させる。ＤＸＤＤモチーフの後に、強力なカチオン−π相互作用によってカチオン性中間体を安定化させることに関与しているトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン残基が続く（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  （１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１６３−８）。空洞の底上には、最後のプロトン受容体である負に帯電している残基があり、これはヒドロキシル基からプロトンを受け、それによって、第３の環の閉環およびアンブロキサンの形成がもたらされる。
【０１１６】
アンブロキサンへのホモファルネソールの変換を改善させるために、ＧｍＳＨＣは、配列番号２の４５位、４６位、５４位、１７８位、１８４位、１９４位、２４７位、２７８位、３２６位、３８６位、３３５位、４６０位、６２３位および６２４位における残基の１つもしくは複数において変異させた。
【０１１７】
４５位および３２６位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび分子ドッキング計算によると、残基Ｖ４５およびＴ３２６は、基質ヒドロキシル基の近くに置かれる。基質との分子間相互作用を増加させるために、ＧｍＳＨＣ４５位は、グルタミン、ロイシンまたはイソロイシンに変異させ、３２６位は、セリンに変異させる。これらの変異の両方の組合せ（Ｖ４５Ｌ＋Ｔ３２６Ｓ）は、１５ｇ／Ｌのホモファルネソールを伴う２０時間のインキュベーションの後でアンブロキサン生成における１．４倍の増加を示した。
【０１１８】
４６位、５４位および３８６位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび分子ドッキング計算によると、残基Ｅ４６またはＥ３８６は、最後のプロトン受容体として機能し、基質ヒドロキシル基からプロトンを受ける。ＡａＳＨＣ（Ｒｅｉｎｈｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：１２１−６）およびＧｍＳＨＣ相同性モデルの間の構造的アラインメントは、ＧｍＳＨＣのＱ５４が、この酵素の最後のプロトン受容体であるＡａＳＨＣの残基Ｅ４５と重ねられることを示す（Ｄａｎｇ  ＆  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ  （２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：６４３−９）。したがって、ＧｍＳＨＣの残基５４はグルタミン酸（glutamate）に変異し、保存ＤＸＤＤモチーフと関連する電荷ネットワーク上に悪影響を有することなしに、この位置における最後のプロトン受容体を組み込んだ。残基４６はグルタミン、アラニンまたはヒスチジンに変異し、一方、残基３８６はグルタミンに変異し、最後のプロトン受容体の位置を変化させた。野生型酵素と比較したとき、Ｅ３８６位において変異を有する変異体は、酵素活性に対して効果は有さなかった。しかし、Ｅ４６位およびＱ５４位における変異は両方とも、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換における増加を示した。１５ｇ／Ｌのホモファルネソールの２０時間のインキュベーションの後、Ｅ４６ＱおよびＥ４６Ｈ変異体はそれぞれ、活性における１．８倍および１．２倍の改善を示し、一方では、Ｑ５４Ｅ変異体は、野生型酵素と比較して、活性における１．４倍の改善を示した。
【０１１９】
１７８位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび相同ヒトラノステロールシンターゼの間の構造的アラインメント（Ｔｈｏｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１１８−２２）は、ＧｍＳＨＣのＱ１７８が、この酵素の最後のプロトン受容体であるヒトラノステロールシンターゼの残基Ｈ２３２と重ねられることを示す。したがって、ＧｍＳＨＣの残基１７８は、グルタミン酸に変異され、この位置における最後のプロトン受容体を組み込んだ。この変異の導入は、野生型酵素と比較して、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換を１．４倍増加させた。
【０１２０】
１８４位。残基Ｍ１８４は、基質認識に関与している狭い狭窄部中に配置される（Ｌｅｎｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：６３９−４５）。このように、基質認識を変化させるために、ＧｍＳＨＣのＭ１８４は、非極性アミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびアラニンに変異した。この位置を変異させることによって、メチオニン酸化現象も防止され、これは基質認識に悪影響を与えることができた。Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａのいずれかの１つへのＭ１８４の変異は、活性の増加をもたらしたことが観察された。特に、Ｍ１８４Ｉ変異体は、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換における１．７倍の改善を伴って、最も大きな増加を示した。
【０１２１】
１９４位。ＱＷモチーフはα−ヘリックスをしっかりと接続し、２つのα／α−バレルの構築に寄与する。これらの高度に安定なα／α−バレルは、高度にエネルギー発生性の触媒反応と関連するエネルギー放出に対して酵素を保護する。ＧｍＳＨＣの相同性モデルによると、残基Ｒ１９４は、残基Ｗ１５２近くに配置される。したがって、新規なＱＷモチーフをＷ１５２と共に導入するために、残基１９４をグルタミンに変異させ、それによって、酵素の構造的安定性を増加させた。実験的に、この変異は、アンブロキサンへのホモファルネソールの変換における１．３倍の改善を伴って、変換における改善を示した。
【０１２２】
２４７位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルによれば、残基Ｐ２４７は、酵素の膜浸漬領域であることが示唆されるチャネル入口におけるループに配置される。残基Ｐ２４７は非プロリン残基に変異し、この領域におけるチャネルの動力学が変化した。組合せ変異体、Ｖ４５Ｌ＋Ｔ３２６Ｓ＋Ｍ１８４Ｉ＋Ｒ１９４Ｑにおいて試験したとき、４０％の酵素添加で５０ｇ／Ｌのホモファルネソールと共にインキュベートしたとき、変換における２．７倍の改善が観察された。
【０１２３】
２７８位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび分子ドッキング計算によれば、残基Ｉ２７８は基質ヒドロキシル基の真下に配置される。残基Ｉ２７８がバリンに変異するとき、分子ドッキング計算は、基質Ｃ２＝Ｃ３二重結合を第１のプロトン供与体であるＤ３９６の近くに配置することによって活性中心内の基質配置が改善することを示す。残基Ｉ２７８の変異は、ホモファルネソール変換において改善を示さなかった。しかし、酵素がホモファルネス酸と共にインキュベートされたとき、スクラレオリドへの酸の変換は、野生型酵素と比較したとき、１０ｇ／Ｌの基質添加および１００％の酵素添加にて試験したとき２倍の改善を示した。
【０１２４】
３３５位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび分子ドッキング計算によれば、残基Ｌ３３５は、第１のプロトン供与体である残基Ｄ３９６の近くに配置され、フェニルアラニンに変異されたとき、これは基質カチオン性中間体との強力なカチオン−π相互作用を導入することができる。この位置における変異は、スクラレオリドへのホモファルネス酸の変換に関して１．８倍の改善を実現した。
【０１２５】
４６０位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルによれば、ＧｍＳＨＣの残基Ｆ４６０は、基質認識に関与している狭い狭窄部の隣の活性中心空洞における残基である（Ｌｅｎｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：６３９−４５）。残基Ｆ４６０はアラニンに変異し、活性中心空洞への基質のアクセスを増加させた。その結果、この変異は、１５ｇ／Ｌの基質添加でホモファルネソールと反応したとき、１．３倍の改善を示した。
【０１２６】
６２３位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび分子ドッキング計算によれば、残基Ｇ６２３は、基質のヒドロキシル基近くに位置する。したがって、残基Ｇ６２３はアラニンまたはバリンに変異し、基質との分子間相互作用を増加させた。Ｇ６２３Ａ変異体は、１５ｇ／Ｌのホモファルネソールの存在下でアンブロキサン生成における１．６倍の改善を示した一方、Ｇ６２３Ｖ変異体は、スクラレオリドへのホモファルネス酸の変換において１．９倍の増加を示した。
【０１２７】
６２４位。ＧｍＳＨＣ相同性モデルおよび分子ドッキング計算によれば、残基Ｆ６２４は、強力なカチオン−π相互作用を確立し、カチオン性中間体を安定化させる。したがって、残基Ｆ６２４はチロシンまたはトリプトファンに変異し、基質カチオン性中間体とのさらにより強力なカチオン−π相互作用が導入された。この位置がトリプトファンに変化したとき、ホモファルネソールからのアンブロキサンの生成における１．４５倍の改善が得られた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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