(57)【要約】  対象の皮膚から生体物質を収集および／または検出するための方法およびキットが本明細書に提供される。対象の標的皮膚部位の生物学的特性を判定するための方法およびキットも本明細書に提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の皮膚から生体物質を収集するための非侵襲的な方法であって、
（ａ）標的皮膚部位からの生体物質の第１のセットが粘着テープの第１のセットに接着できるように、対象の前記標的皮膚部位を前記粘着テープの前記第１のセットの各々と順々に接触させることと、
（ｂ）（ａ）の後に、標的皮膚部位からの生体物質の第２のセットが粘着テープの第２のセットに接着できるように、前記対象の同じ標的皮膚部位を前記粘着テープの前記第２のセットの各々と順々に接触させることと、を含み、
前記第１のセットおよび前記第２のセットの前記粘着テープの各々が、基材へ結合した水溶性接着層を含む、非侵襲的方法。
【請求項２】
（ｃ）（ｂ）の後に、標的皮膚部位からの生体物質の第３のセットが粘着テープの第３のセットに接着できるように、前記対象の同じ標的皮膚部位を前記粘着テープの前記第３のセットの各々と順々に接触させることをさらに含み、前記第３のセットの前記粘着テープの各々が、基材へ結合した水溶性接着層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘着テープの前記第１のセット、前記粘着テープの前記第２のセット、および／または前記粘着テープの前記第３のセットが、２〜５個のテープを各々含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記基材が水溶性基材である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性基材がセルロースを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶性接着層が水溶性ポリマーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶性ポリマーが水溶性アクリルポリマーを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のセット、前記第２のセット、および前記第３のセットの前記粘着テープが同じテープである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、アトピー性皮膚炎に罹患しているヒト対象である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が未成年または成人である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的部位が病変部位である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的部位が非病変部位である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体物質の前記第１のセットが、前記対象の角質層からの生体物質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体物質の前記第１のセットにおける微生物生体物質の存在を判定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記判定するステップが、細菌、ウイルス、および／または真菌からの生体物質の存在を分析することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体物質が、細胞、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記判定するステップが、前記生体物質の前記第１のセットから単離された微生物細胞を培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記判定するステップが、前記生体物質の前記第１のセットからの微生物核酸を増幅させることと、増幅した前記核酸を分析することとを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体物質の前記第２のセットおよび／または前記生体物質の前記第３のセットが、前記対象の角質層の下の表皮層からの生体物質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体物質の前記第２のセットおよび／または前記第３のセットからの宿主生体物質の存在を判定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記判定するステップが、ケラチノサイトからの生体物質の存在を分析することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体物質が、細胞、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記判定するステップが、前記生体物質の前記第２のセットおよび／または第３のセットにおける宿主核酸を増幅させることと、増幅した前記核酸を分析することとを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体物質の前記第１のセット、第２のセット、および／または第３のセットからの脂質を分析することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触させるステップ（ｂ）が、前記接触させるステップ（ａ）の直後に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触させるステップ（ｃ）が前記接触させるステップ（ｂ）の直後に実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
対象の標的皮膚部位の生体物質特性を判定するための方法であって、
（ａ１）対象の標的皮膚部位からの生体物質の第１のセットを含む、粘着テープの第１のセットを提供することと、
（ａ２）前記生体物質の前記第１のセットのからの少なくとも１種類の微生物生体物質の存在を分析することと、
（ｂ１）前記対象の前記標的皮膚部位からの生体物質の第２のセットを含む、粘着テープの第２のセットを提供することであって、前記生体物質の前記第２のセットが、前記生体物質の前記第１のセットの収集後に収集される、提供することと、
（ｂ２）前記生体物質の前記第２のセットからの少なくとも１種類の宿主生体物質の存在を分析することと、を含み、
前記第１のセットおよび前記第２のセットの前記粘着テープの各々が、基材へ結合した水溶性接着層を含む、方法。
【請求項２８】
（ｃ１）前記対象の前記標的皮膚部位からの前記生体物質の第３のセットを含む、前記粘着テープの第３のセットを提供することであって、前記生体物質の前記第３のセットが、前記生体物質の前記第２のセットの収集後に収集される、提供することと、
（ｃ２）前記生体物質の前記第３のセットからの少なくとも１種類の宿主生体物質の存在を分析することであって、前記第３のセットの前記粘着テープの各々が、基材へ結合した水溶性接着層を含む、分析することと、をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記粘着テープの前記第１のセット、前記粘着テープの前記第２のセット、および／または前記粘着テープの前記第３のセットが、２〜５個のテープを各々含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記基材が水溶性基材である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記水溶性基材がセルロースを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記水溶性接着層が水溶性ポリマーを含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記水溶性ポリマーが水溶性アクリルポリマーを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のセット、前記第２のセット、および前記第３のセットの前記粘着テープが同じテープである、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体物質の前記第１のセットにおける前記微生物生体物質が、細菌、ウイルス、および／または真菌からのものである、請求項２７〜３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物生体物質が、微生物細胞、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記粘着テープの前記第１のセットからの前記少なくとも１種類の微生物生体物質を抽出することをさらに含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記分析するステップ（ａ２）が、前記生体物質の前記第１のセットからの微生物核酸を増幅させることと、増幅した前記核酸を分析することとを含む、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体物質の前記第１のセットからの微生物細胞を培養することをさらに含む、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体物質の前記第２および／または第３のセットにおける前記宿主生体物質が、ケラチノサイトの生体物質を含む、請求項２７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主生体物質が、細胞、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記粘着テープの前記第２のセットおよび／または前記粘着テープの前記第３のセットからの前記少なくとも１種類の宿主生体物質を抽出することをさらに含む、請求項２７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記分析するステップ（ｂ２）および／または（ｃ２）が、前記生体物質の前記第２のセットおよび／または第３のセットにおける宿主核酸を増幅させることと、増幅した前記核酸を分析することとを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記生体物質の前記第１のセット、第２のセット、および／または第３のセットからの脂質を分析することをさらに含む、請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象の前記標的皮膚部位について判定された前記生体物質特性に基づいて、前記対象の皮膚容態を評価することをさらに含む、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、アトピー性皮膚炎に罹患しているヒト対象である、請求項２７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が未成年または成人である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的皮膚部位が病変部位である、請求項２７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記標的皮膚部位が非病変部位である、請求項２７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
対象の皮膚容態を評価するためのキットであって、
（ａ）水溶性テープへ接着した生体物質を抽出するための１種類以上の試薬と、
（ｂ）微生物生体物質および／または宿主生体物質の存在を判定するための１種類以上の検出薬と、を含む、キット。
【請求項５１】
（ｃ）複数の水溶性テープをさらに含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
（ｂ）における前記１種類以上の検出薬が、微生物培養培地、微生物を検出するための薬剤、宿主生体物質を検出するための薬剤、またはこれらの組み合わせを含む、請求項５０または５１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容がすべて参照により本明細書で援用される２０１７年３月３日出願の米国仮出願番号第６２／４６６，６６７号の、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約番号ＮＩＨ  ＮＩＡＩＤ  ２Ｕ１９ＡＩ０７０２３５、およびＮＩＨ  ＮＩＡＩＤ  Ｔ３２ＡＩ６０５１５の下での米国政府の支援で行われた。米国政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚試料は、皮膚疾患の分子レベルの基礎を研究するために使用することができる。しかしながら、アトピー性皮膚炎などの多くの複雑な皮膚疾患の理解および最適な管理は、診断を支援することができおよび／または適切な処置戦略の選択を誘導することができる皮膚容態の臨床的に有用な生体マーカーを開発するために皮膚試料を収集するための信頼できかつ非侵襲的な方法がないことによって制限されてきた。
【０００４】
皮膚生検は、診断目的のための一般的な臨床ツールであるが、例えば、本来侵襲的な手順と関係する危険性、局所麻酔の必要性、所要時間、および訓練された担当者の必要性を含む多くの因子により、生体マーカーの判定および／または研究において個体（皮膚疾患に罹患しているかまたは罹患していない）での使用に実行可能ではないことがある。これらの危険性は、ほかに当該手順を受ける理由がない対象（例えば、皮膚疾患に罹患していない対象）においてはさらに正当性が低い。
【０００５】
侵襲性が最小限である皮膚収集のためのいくつかの方法は、過去何年にもわたって出現してきた。このような法の例としては、例えば、Ｑチップまたはガーゼを用いた試料採取、削皮技術、逆イオン導入法、および超音波系の方法が挙げられる。皮膚表面と表皮において誘導される経路との間の生物学的接続が、臨床的に関連性のある皮膚生体マーカーを判定して皮膚疾患の分子レベルの理解を得るよう研究されることができるように、皮膚表面を皮膚表面の下の層と同時に試料採取することができるであろう非侵襲的な方法を開発するための必要性がなおもある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、皮膚試料を収集するための頑強で低コストの方法および侵襲性が最小限である方法の開発に少なくとも一部基づいている。本明細書に説明する方法は、同じ皮膚部位における皮膚試料の連続的な収集のための複数の水溶性接着テープの使用を包含する。予期せぬことに、本明細書に説明する方法は、皮膚表面と表皮に誘導される経路との間の生物学的接続を研究することができるように、皮膚表面をその下にある層と同時に試料採取することを可能にする。例えば、本方法は、単一の皮膚部位からの種々の生体物質、例えば、ミクロビオーム、表皮ＤＮＡ、表皮ＲＮＡおよび表皮脂質の同時収集を可能にし、これらは個々にまたは一緒に使用されて、ケラチノサイトにおける疾患の分子レベルのシグネチャ（例えば、エピジェネティクス、トランスクリプトミクス、および遺伝学的性質）を検討することができる。この皮膚表面と皮膚表面の下にある表皮層（複数可）の同時試料採取は、皮膚表面と表皮に誘導される分子経路との間の接続／関連性の識別を容易にし、例えば、ケラチノサイトにおける疾患の分子レベルのシグネチャを識別すること、および／または皮膚容態のホリスティック分析を提供することにおいて有用となり得る。本明細書に説明する方法は、１）麻酔の必要なく非侵襲的、２）容易に行える、３）迅速、４）信頼できかつ一貫性がある、５）費用効果が高い、６）大きなコホートにおいて収集の必要性を満たすために規模拡大可能、および７）後で加工するために試料を保存することができる、という利点を少なくとも有する。
【０００７】
したがって、本開示の一態様は、対象の皮膚から生体物質を収集するための非侵襲的な方法を特徴とする。本方法は、（ａ）対象の標的皮膚部位を第１のセットの接着テープの各々と順々に接触させて、標的皮膚部位からの第１のセットの生体物質を第１のセットの接着テープへ接着させることと、（ｂ）（ａ）の後、対象の同じ標的皮膚部位を第２のセットの接着テープの各々と順々に接触させて、標的皮膚部位からの第２のセットの生体物質を第２のセットの接着テープへ接着させることと、を含み、第１のセットおよび第２のセットにおける接着テープの各々は、基材へ結合した水溶性接着剤を含む。いくつかの実施形態において、接触させること（ｂ）は、接触させるステップ（ａ）の直後に実施される。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｃ）（ｂ）の後に、対象の同じ標的皮膚部位を第３のセットの接着テープの各々と順々に接触させて、標的皮膚部位からの第３のセットの生体物質を第３のセットの接着テープへ接着させることをさらに含んでもよく、第３のセットにおける接着テープの各々は、基材へ結合した水溶性接着剤を含む。
【０００８】
別の態様において、本開示は、対象の標的皮膚部位の生体物質特性を判定するための方法を提供する。本方法は、（ａ１）対象の標的皮膚部位からの第１のセット生体物質を含む第１のセットの接着テープを提供することと、（ａ２）第１のセットの生体物質からの少なくとも１種類の微生物生体物質の存在を分析することと、（ｂ１）対象の標的皮膚部位からの第２のセットの生体物質を含む第２のセットの接着テープを提供することであって、第２のセットの生体物質が、第１のセットの生体物質の収集後に収集される、提供することと、（ｂ２）第２のセットの生体物質からの少なくとも１種類の宿主生体物質の存在を分析することと、を含み、第１のセットおよび第２のセットにおける接着テープの各々は、基材へ結合した水溶性接着剤を含む。いくつかの実施形態において、接触させること（ｂ１）は、接触させるステップ（ａ１）の直後に実施される。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｃ１）対象の標的皮膚部位からの第３のセットの生体物質を含む第３のセットの接着テープを提供することであって、第３のセットの生体物質が第２のセットの生体物質の収集後に収集される、提供することと、（ｃ２）第３のセットの生体物質からの少なくとも１種類の宿主生体物質の存在を分析することをさらに含んでもよく、第３のセットにおける接着テープの各々が基材へ結合した水溶性接着層を含む。
【０００９】
本明細書に説明する方法を包含する種々の態様のいくつかの実施形態において、各セットの接着テープ（例えば、第１のセット、第２のセット、および／または第３のセット）は独立して、２〜５のテープを含むことができる。
【００１０】
各セットにおける接着テープは、同じテープまたは異なるテープを含むことができる。各セットにおける接着テープは、基材へ結合した水溶性接着剤を含む。いくつかの実施形態において、基材は、水溶性である固体基材である。例えば、水溶性固体基材は、セルロースを含んでもよい。いくつかの実施形態において、水溶性接着剤は、水溶性ポリマー、例えば、以下に限定するわけではないが水溶性アクリルポリマーを含んでもよい。
【００１１】
接着テープは、いかなる年齢の対象へも適用することができる。例えば、接着テープは、皮膚の疾患または障害（例えば、アトピー性皮膚炎）に罹患しているいかなる年齢の対象へも適用することができる。いくつかの実施形態において、対象は未成年であることができる。いくつかの実施形態において、対象は成人であることができる。
【００１２】
接着テープは、対象の皮膚の上の標的皮膚部位のいずれへも、例えば、皮膚容態の分析が必要とされる皮膚部位へ適用することができる。例えば、標的皮膚部位は、くるぶし、腕（例えば、上腕または前腕）、耳の後ろ、指間、首の後ろ、背中または腰、脚、ウエストであってもよい。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は前腕である。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は、毛髪が実質的にない。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は、病変部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は、非病変部位であってもよい。
【００１３】
各セットの接着テープは、対象の標的皮膚部位からの生体物質のセットを収集する。例えば、第１のセットの生体物質は、対象の角質層からの生体物質を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のセットの生体物質における微生物生体物質の存在は、判定することができる。例えば、第１のセットの生体物質において収集される細菌、ウイルス、酵母、および／または真菌からの生体物質（例えば、細胞、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子など）の存在は分析することができる。いくつかの実施形態において、第１のセットの生体物質から単離された微生物細胞は、例えば、増殖のために培養することへ供されることができる。いくつかの実施形態において、第１のセットの生体物質からの微生物核酸を増幅させることができ、増幅した核酸を分析することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、第２および／または第３のセットの生体物質は、対象の角質層の下の表皮層からの生体物質を含むことができる。いくつかの実施形態において、第２および／または第３のセットの生体物質からの宿主生体物質の存在を判定することができる。例えば、第２および／または第３のセットの生体物質において収集されるケラチノサイトからの生体物質（例えば、細胞、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子など）の存在を分析することができる。いくつかの実施形態において、第２および／または第３のセットの生体物質からのケラチノサイト核酸を増幅させることができ、増幅した核酸を分析することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１、第２、および第３のセットのうちのいずれか１つの生体物質を分析して、少なくとも１種類以上の脂質の存在を判定することができる。
【００１６】
また本開示の範囲内にあるのは、対象の皮膚容態を評価するためのキットである。例えば、一態様において、本キットは、（ａ）水溶性接着テープへ接着した生体物質を抽出するための１種類以上の試薬と、（ｂ）微生物生体物質および／または宿主生体物質の存在を判定するための１種類以上の検出薬とを含む。いくつかの実施形態において、本キットは、複数の水溶性接着テープをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、本キットにおいて提供される検出薬（複数可）は、微生物培養培地、微生物を検出するための薬剤、宿主生体物質を検出するための薬剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【００１７】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明において明らかにする。本開示の他の特長または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、また添付の特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれており、当該態様は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせたこれらの図面のうちの１つ以上に対する参照により、より良好に理解されることができる。
【００１９】
【図１】ミクロビオーム、ＤＮＡ、およびＲＮＡ分析のために、皮膚から生体物質を収集するための例示的な非侵襲的な方法を示す概略図である。
【図２】図１に示されるような方法により収集および単離されたＲＮＡの２つの代表的な試料（試料Ａおよび試料Ｂ）の電気泳動図を示す。これらの電気泳動図は、強い１８ｓおよび２８ｓピークを示す（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）。計算機により発生させたＲＮＡアガロースゲル電気泳動法は、強いバンドを示し、分解を示していない。
【図３】ＧＡＰＤＨ、ケラチン１、およびＳ１００Ａ８の発現に対する陽性対照（ＨＢＥＣ細胞）の定量的ＰＣＲ増幅プロットと比較して、２つの代表的な試料（試料Ａ、試料Ｂ）の定量的ＰＣＲ増幅プロットを示す（左側のパネル）。試料Ａ、試料Ｂおよび陽性対照からのＰＣＲ産物のＳＹＢＲグリーン融解曲線は、重なった単一の曲線を示す（右側のパネル）。
【図４】定量的ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す写真を含んでいる。試料は三つ組で陽性（＋）対照と共に泳動されている。期待されるアンプリコンの大きさ：ＧＡＰＤＨ（１８４ｂｐ）、ケラチン１（１２８ｂｐ）、Ｓ１００Ａ８（１０４ｂｐ）。陽性対照と類似の明確なバンドは、ＧＡＰＤＨ、ケラチン１、およびＳ１００Ａ８の試料中に存在する。Ｓ１００Ａ８中の試料１は、おそらくプライマー二量体化でほとんど増幅しなかった。
【図５】テープ剥離法を用いて皮膚からミクロビオーム、表皮ＤＮＡおよび表皮ＲＮＡの分析のために生体物質を収集する例示的なスキームを示す図式である。
【図６Ａ−６Ｂ】健常対照およびアトピー性皮膚炎患者からの本明細書に説明するようなテープストリップ収集がメタゲノミクスショットガン配列決定および分析のための高品質細菌ＤＮＡを提供することを示すバブルプロットである。図６Ａは、健常成人対照（ｎ＝１２）から採取した単一のテープストリップの代表的なバブルプロットを示す。図６Ｂは、アトピー性皮膚炎患者（ｎ＝１２）の非病変部位および病変部位から採取した単一のテープストリップの代表的なバブルプロットを示す。ライブラリの調製および配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５５０配列決定装置を用いて実施し、Ｔａｂｌｅａｕを分析に用いた。バブルプロットにおける個々の円の数は種の多様性を表し、バブルの大きさは量を示す。テープストリップ法は、ライブラリの調製、配列決定、およびメタゲノム解析のために十分量の高品質細菌ＤＮＡを提供する。
【図７Ａ−７Ｂ】健常対照由来のテープストリップ収集（例えば、本明細書に説明するような）が、下流のピロシーケンス法のために良質のＤＮＡを提供することを示す図式である。ＤＮＡのメチル化のレベルにアクセスするために、ＤＮＡを個々のテープから抽出した後、関心対象の領域の重亜硫酸塩処理およびＰＣＲ増幅を行った。２名の対象のメチル化レベルにアクセスし、１つは０％メチル化を示した（図７Ａ、配列番号１）のに対し、もう１つは７５％メチル化を示した（図７Ｂ、配列番号２）。
【図８】Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す増幅プロットである。テープ１０の三つ組を各遺伝子と共に示す：ロリクリン（ＬＯＲ）、フィラグリン（ＦＬＧ）、ＧＡＰＤＨ、およびケラチン１４（ＫＲＴ１４）。
【図９】接着テープ（例えば、本明細書に説明するような）から皮膚試料採取が下流遺伝子発現分析のための十分なＲＮＡを提供することを示す図式である。テープ８〜１１の増幅周期ヒートマップは、高レベルの皮膚マーカーＦＬＧ、ＬＯＲおよびＫＲＴ１４を含む。陰性対照（すなわち、テンプレートなし、ＲＴなし、および水）においては有意な発現は観られなかった。ＨａＣａｔとは、陽性対照として使用されるヒトケラチノサイト細胞株である。
【図１０】本明細書に説明するような例示的なテープ剥離法を用いて収集したミクロビオームＤＮＡの１セットの電気泳動を示す。テープストリップ法は、下流の適用のために高品質ＤＮＡを提供する。ＡＴＩ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、２００塩基対と６００塩基対の間に高品質ＤＮＡフラグメントを実証する。
【図１１】異なる材料の接着テープを用いて収集されたＲＮＡからのＦＬＧ発現（ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化）の定量的な結果を示す図式である。水溶性接着テープ（Ｓｍａｒｔｓｏｌｖｅ（登録商標））は、他の水不溶性接着テープ（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（登録商標）、ＢａｎｄＡｉｄ（登録商標）、およびＴｒａｎｓｐｏｒｅ（登録商標））よりも高いＲＮＡ収量を示す。
【図１２】本明細書に説明する方法を用いてアトピー性皮膚炎未成年（例えば、１〜２歳）の皮膚から得られたメタゲノミクスミクロビオームデータを示す図式である。大量の細菌属由来の微生物ＤＮＡを、本明細書に説明する方法を用いて検出した。
【図１３Ａ−１３Ｃ】約１８３名のアトピー性皮膚炎未成年の病変皮膚部位および非病変皮膚部位におけるフィラグリン（ＦＬＧ）（図１３Ａ）、Ｓ１００Ａ８（図１３Ｂ）、およびＳ１００Ａ９（図１３Ｃ）の相対的な発現レベルに対応する宿主ＲＮＡ／ＤＮＡ定量的ＰＣＲデータを示すプロットグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
例えば、皮膚科学的疾患についての生体マーカー同定のために、ならびに機序、エピジェネティクス、およびゲノムの研究のために、皮膚から生体物質を収集するための迅速かつ信頼可能であり、侵襲性が最小限であるツール／方法を欠いている。皮膚生検は、通常使用されてはいるが、高度に訓練された医療従事者を必要とし、侵襲性であり、時間がかかり、大コホートにおける収集にとって実用的ではない。したがって、皮膚ミクロビオームおよび宿主生体物質（例えば、ケラチノサイト生体物質）を評価するための生体物質の同時収集のための費用効果のある、侵襲性が最小の、信頼可能な、感度の高い、かつ規模拡大可能なツールキットおよび／または方法を開発する必要性がある。
【００２１】
本開示は、皮膚試料を収集するための頑強で、費用効果のある、かつ侵襲性が最小限の方法の開発に少なくとも一部基づいている。本明細書に説明する方法は、同じ皮膚部位における皮膚試料の連続的収集のための複数の水溶性接着テープの使用を包含する。予期せぬことに、本明細書に説明する方法は、皮膚表面と表皮において誘導される細胞レベル／分子レベルの経路との間に生物学的接続が調査され得るように、皮膚表面の下の表皮層と同時の皮膚表面の試料採取を可能にする。例えば、本方法は、皮膚中に存在する少量の核酸を有することが既知であるアトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者の単一の皮膚部位からの少なくとも微生物核酸およびケラチノサイト核酸の同時収集を許容する。さらに、水不溶性接着テープを用いることと比較すると、水溶性接着テープの使用は皮膚部位から収集された生体物質（例えば、核酸）の収量を有意に改善することが示された。したがって、本明細書に説明する方法は、ケラチノサイトにおける疾患の分子レベルのシグネチャ（例えば、エピジェネティクス、トランスクリプトミクス、および遺伝学的性質）を検討もしくは同定するために、および／または皮膚容態のホリスティック分析を提供するために個々にまたは一緒に使用することができる、単一の皮膚部位からの種々の生体物質、例えば、ミクロビオーム、表皮ＤＮＡ、表皮ＲＮＡおよび表皮脂質の同時収集を有効に許容する。本明細書に説明する方法は、少なくとも以下の利点を有する：１）非侵襲的でありかつ麻酔の必要性がないこと、２）実施するのが容易であること、３）迅速であること、４）信頼可能かつ一貫性があること、５）費用効果があること、６）大コホートにおける収集の必要性を満たすよう規模拡大可能であること、および７）後で加工するために試料を保存することができること。
【００２２】
したがって、同じ皮膚部位で皮膚試料を連続的に（順々に）収集するための複数の水溶性接着テープを用いて、対象の皮膚から生体物質を収集および／または検出するための方法およびキットが本明細書に説明される。いくつかの実施形態において、第１のいくつかの接着テープ（第１のセット）によって収集される皮膚試料は、微生物生体物質（複数可）の存在を分析するために使用することができるのに対し、その後のテープ（第２のセットおよび場合により第３のセット）によって収集される皮膚試料は、皮膚表面の下の表皮層からの宿主生体物質（複数可）を分析するために使用することができる。本明細書に説明する方法およびキットは、ミクロビオームと皮膚表面との間の分子レベルの／生物学的な接続／相関および皮膚表面の下の表皮層（複数可）において誘導される細胞レベル／分子レベルの経路が探索および調査されることができるよう、同じ標的皮膚部位における皮膚ミクロビオームおよび宿主ケラチノサイト関連生体物質（例えば、核酸）の評価を可能にすることができる。
【００２３】
いくつかの態様において、本開示は、対象の皮膚から生体物質を収集するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）対象の標的皮膚部位を第１のセットの接着テープの各々と順々に接触させて、標的皮膚部位からの第１のセットの生体物質を第１のセットの接着テープに接着させることと、（ｂ）（ａ）の後、対象の同じ標的皮膚部位を第２のセットの標的皮膚部位の各々と順々に接触させて、標的皮膚部位からの第２のセットの生体物質を第２のセットの接着テープへ接着させることと、を含み、第１のセットおよび第２のセットにおける接着テープの各々は、基材へ装着された水溶性接着層を含む。
【００２４】
他の態様において、本開示は、対象の標的皮膚部位の生体物質特性を判定するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ１）対象の標的皮膚部位からの第１のセットの生体物質を含む第１のセットの接着テープを提供することと、（ａ２）第１のセットの生体物質からの少なくとも１種類の微生物生体物質の存在を分析することと、（ｂ１）対象の標的皮膚部位からの第２のセットの生体物質を含む第２のセットの接着テープを提供することであって、第２のセットの生体物質が、第１のセットの生体物質の収集後に収集される、提供することと、（ｂ２）第２のセットの生体物質からの少なくとも１種類の宿主生体物質の存在を分析することと、を含み、第１のセットおよび第２のセットにおける接着テープの各々は、基材へ装着された水溶性接着層を含む。
【００２５】
本明細書に説明する方法のうちのいずれかにおいて、第３のセットの接着テープは、対象の同じ標的皮膚部位からの第３のセットの生体物質を収集するために提供または使用することができ、第３のセットの接着テープは、第２のセットの接着テープが適用されかつ標的皮膚部位から除去された後に適用される。次に、第３のセットからの少なくとも１種類の生体物質を分析することができる。必要な場合、追加のセット（複数可）の接着テープを第３のセットの接着テープの後に提供または使用して、対象の同じ標的皮膚部位からの追加のセットの生体物質を収集することができる。
【００２６】
Ｉ．標的皮膚部位からの生体物質を収集するための水溶性接着テープ
本明細書に説明する方法のいずれかにおいて皮膚試料を収集するために使用される各セット（例えば、第１のセット、第２のセット、および／または第３のセット）における接着テープは、水溶性でもあり得る固体基材へ装着された水溶性接着剤を含む水溶性接着テープである。いくつかの実施形態において、各セットにおける接着テープは同じテープであり得る。いくつかの実施形態において、各セットにおける接着テープは、収集されることになっている生体物質の種類に応じて異なり得る。
【００２７】
水溶性接着剤は、水中でおよび／または水性緩衝溶液中で溶解可能である。水性緩衝溶液は、緩衝液（例えば、トリスまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンだがこれらに限定されない）、ポリオール（例えば、グリセロールまたはチオグリセロールのようなその誘導体）、および／またはタンパク質変性剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアナートだがこれらに限定されない）を含むことができる。いくつかの実施形態において、接着剤は、中性ｐＨ、例えば、ｐＨ６、ｐＨ７、もしくはｐＨ８、および／または４℃〜２５℃もしくは４℃〜１０℃の温度の水中でまたは水性緩衝溶液中で溶解可能である。一実施形態において、接着剤は、４℃〜１０℃の温度でグアニジチオシアナートと、トリス（ｐＨ７〜８）と、１−チオグリセロールとを含む水性緩衝溶液中で溶解可能である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、水溶性接着剤は、水溶性ポリマー接着剤を含む。このような水溶性ポリマー接着剤の例としては、アクリルポリマー（例えば、アクリル酸ポリマーまたはアクリル酸エステル／アクリル酸コポリマーだがこれらに限定されない）、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、セルロースエーテル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリ丼、グルチン接着剤、デンプン接着剤、カゼイン接着剤、およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、水溶性接着層は、水溶性アクリルポリマー（例えば、アクリル酸ポリマーまたはアクリル酸エステル／アクリル酸コポリマーだがこれらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態において、水溶性接着剤は、感圧性ポリマー接着剤を含む。いくつかの実施形態において、接着層は、ゴム製接着剤を含んでいない。
【００２９】
水溶性接着層は、固体基材、例えば、固体支持体へ装着されている。固体支持体は典型的には、テープをしなやかにまたは可撓性にさせておき、例えば、テープは容易に折れ曲がったり成形したりする。テープの厚さは変えることができるが、ただし、テープがしなやかなままであることを条件とする。いくつかの実施形態において、固体基材は、水溶性固体基材、例えば、先に説明した水溶性接着剤のものと類似の条件において溶解可能である水溶性固体基材である。いくつかの実施形態において、水溶性固体基材はセルロースを含む。例示的な水溶性固体基材は木材繊維系固体基材である。
【００３０】
いかなる大きさおよび／または形状の接着テープも使用することができる。例えば、接着テープは、円形のディスク、正方形、または任意の他の形状へと作製することができる。接着テープは、０．５平方インチ〜４平方インチ、または１平方インチ〜２平方インチの表面積を有することができる。接着テープの大きさおよび形状は、接着テープが適用される標的部位の大きさおよび／または位置に応じて変えることができる。
【００３１】
各セットにおける接着テープの数は、いくつかの因子、例えば、皮膚の容態、接着テープの大きさおよび／または接着性、標的皮膚部位に存在する生体物質の量、ならびにこれらのいずれかの組み合わせに応じて変えることができる。例えば、いくつかの実施形態において、第１のセット、第２のセット、第３のセット、および任意の追加のセットの接着テープは、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれより多数のテープを含む少なくとも２以上のテープを各々独立して含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のセット、第２のセット、第３のセット、および任意の追加のセットの接着テープは、２〜１０のテープ、２〜８のテープ、２〜７のテープ、２〜６のテープ、２〜５のテープ、２〜４のテープ、３〜６のテープ、３〜５のテープ、または３〜４のテープを各々独立して含むことができる。例としてに過ぎないが、接着テープが１平方インチの表面積を有するいくつかの実施形態において、第１のセット、第２のセット、第３のセット、および任意の追加のセットの接着テープは、２〜５のテープを各々独立して含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、第１のセットの接着テープは、３のテープを含んでもよいのに対し、第２のセットおよび第３のセットの接着テープは、４のテープを各々含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１のセットの接着テープは７のテープを含んでもよいのに対し、第２のセットの接着テープは、４日間を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１のセットの接着テープは３のテープを含んでもよいのに対し、第２のセットの接着テープは８のテープを含んでもよい。
【００３２】
ＩＩ．水溶性接着テープを用いた皮膚部位からの生体物質の収集
生体物質は、対象の標的皮膚部位を一連の接着テープと接触させること、すなわち、標的皮膚部位を先行する接着テープの除去後に接着テープと接着させることによって、対象の標的皮膚部位から収集される。生体物質が収集される標的皮膚部位は、対象の皮膚上のいかなるところであってもよい。例えば、標的皮膚部位は、くるぶし、腕（例えば、上腕または前腕）、耳の後ろ、指間、首の後ろ、背中または腰、脚、またはウエストであってもよい。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は前腕である。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は、毛髪が実質的にない。
【００３３】
標的皮膚部位は、病変部位または非病変部位であり得る。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は、皮膚病変、例えば、創傷、斑（ｐｌａｑｕｅ）（例えば、例えば、平らな、持ち上がった斑（ｐａｔｃｈ）、またはうろこ状の斑（ｐａｔｃｈ）を皮膚または皮膚への損傷に含み得る。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は皮膚病変を含んでいなくてもよい。
【００３４】
標的皮膚部位は、あらゆる大きさであることができ、当業者は、例えば、標的皮膚部位における皮膚の容態および／またはある特定の生物学的分子の量に基づいて、皮膚試料採取の大きさを判定することができるであろうことは理解される。いくつかの実施形態において、標的皮膚部位は、０．５平方インチ〜４平方インチ、または１平方インチ〜２平方インチの表面積を有してもよい。
【００３５】
本明細書に説明する接着テープは、分析される皮膚から生体物質を必要とするいかなる対象へも適用することができる。いくつかの実施形態において、接着テープは、皮膚の疾患または障害に罹患しているまたは罹患していない哺乳類、例えば、ヒト対象へ適用することができる。いくつかの実施形態において、対象は、皮膚の疾患または障害に罹患している、罹患している疑いのある、またはそれらの危険にあるヒト対象であり得る。例えば、皮膚障害は、乾癬、皮膚炎、皮膚感染症、アレルギー反応、蕁麻疹、脂漏、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、化膿性汗腺炎、アレルギー性紫斑病、ばら色粃糠疹、疱疹状皮膚炎、結節性紅斑、多形紅斑、紅斑性狼瘡、打撲傷、日光角化症、ケロイド、脂肪腫、脂腺嚢胞、糸状線維腫、眼瞼黄色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、またはカポジ肉腫であり得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、生体物質が収集される対象は、炎症性皮膚疾患または炎症性皮膚障害に罹患している、罹患している疑いのある、またはそれらの危険にあるヒト対象であり得る。炎症性皮膚疾患または炎症性皮膚障害の例としては、ざ瘡、酒さ、乾癬、アトピー性皮膚炎（湿疹）、脂漏性皮膚炎、および接触皮膚炎、せつ、癰、天疱瘡、蜂窩織炎、グロヴァー病、化膿性汗腺炎、ならびに扁平苔癬が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、生体物質が収集される対象は、アトピー性皮膚炎に罹患している、罹患していることが疑われる、またはその危険にあるヒト対象であり得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、生体物質が収集される対象は、皮膚症状を有する全身性疾患に罹患しているヒト対象であり得る。皮膚症状を有する例示的な全身性疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、生体物質が収集される対象は、例えば、６か月齢〜１８歳を含む１８歳以下の未成年であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、１〜２歳の未成年であり得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、生体物質が収集される対象は、１９〜８０歳を含むような１８歳超の成人であり得る。いくつかの実施形態において、対象は１９〜７０歳であり得る。いくつかの実施形態において、生体物質が収集される対象は、６６〜８０歳のような６５歳超の高齢者であり得る。
【００４０】
概して、複数の接着テープは、生体物質を収集するために圧力と共に標的皮膚部位へ適用される。圧力は、かなりの時間、例えば、１秒間〜５分間、典型的には１０秒間〜４５秒間適用することができる。いくつかの実施形態において、接着テープは、標的皮膚部位へ１５〜２０秒間適用した後に除去または剥離される。皮膚部位へ適用される圧力の量および剥離時間の長さを変えて、特定の適用のための理想の圧力および時間を同定することができることは理解されるであろう。概して、圧力は皮膚の上にある接着テープを手動で押下することによって適用されるが、鋭くない平らな対象のような対象を使用して、皮膚へテープを適用するのを支援して、皮膚から生体物質を収集することができる。いくつかの実施形態において、セットにおける各接着テープは、標的皮膚部位へ１回以上、例えば、２回、３回、またはそれより多数回適用することができる。言い換えれば、いくつかの実施形態において、新鮮な接着テープは標的皮膚部位における各適用において使用され、または補油的皮膚部位は、同じ接着テープを用いて２回以上剥離することができる。いくつかの実施形態において、第１のセットの各々における接着テープの各々は、標的皮膚部位へ１回のみ適用される。いくつかの実施形態において、第２および／または第３のセットの各々における接着テープの各々は、同じ標的皮膚部位へ少なくとも２回以上適用することができる。
【００４１】
使用する接着テープの可撓性、しなやかさ、および組成、テープが除去される前に皮膚へ接着させられている時間、皮膚へ適用する際にテープへ適用する力、分析される生体物質の量、皮膚の容態、ならびに患者間の変異性のような因子は、典型的には、十分な生体物質が標的皮膚部位から収集されることを保証するために、特定のテープ剥離法に有用なプロトコルに関して判断することが考慮に入れられる。いくつかの実施形態において、テープが皮膚に適用される際にテープへ適用される圧力のレベルおよび持続時間は、軽度以下の一過性の紅斑がテープの適用および除去後に対象において生じることがあるように決定される。したがって、テープ収集法は、非侵襲的または侵襲性が最小限であるとみなされる。
【００４２】
接着テープが標的皮膚部位から収集された後、生体物質が接着した接着テープは、分析されることになっている生体物質が安定のままである適切な条件下で保存される。例えば、いくつかの実施形態において、収集された接着テープは、４℃〜１０℃の温度で保存される。いくつかの実施形態において、収集された接着テープは、分析されることになっている生体物質の安定性および完全性を維持し、かつ接着テープの水溶性接着材料を溶解して、接着した生体物質を放出する試薬の中で保存される。例としてに過ぎないが、接着テープがその後の下流の核酸分析のために収集されるいくつかの実施形態において、このような接着テープは、水性緩衝溶液中で、例えば、中性ｐＨ、例えば、ｐＨ６、ｐＨ７、またはｐＨ８で保存することができ、水性緩衝溶液は、緩衝液（トリスまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンだがこれらに限定されない）、ポリオール（例えば、グリセロールまたはチオグリセロールのようなその誘導体）、および／またはタンパク質変性剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアナートだがこれに限定されない）を含むことができる。例示的な緩衝液は、グアニジンチオシアナートと、トリス（ｐＨ７〜８）と、１−チオグリセロールと、を含む、水性緩衝溶液である。
【００４３】
接着テープが細胞培養のために収集されるいくつかの実施形態において、接着テープは、細胞培養培地中で保存することができるか、および／または室温で保存することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、接着テープから抽出される生体物質は、後の使用のために瞬時凍結して−８０℃で保存することができる。典型的には、このことは、液体窒素またはドライアイスを用いるスナップ凍結によって実施することができる。
【００４５】
ＩＩＩ．水溶性接着テープから収集された生体物質を分析する方法
標的皮膚部位から収集された生体物質は、標的皮膚部位からの細胞および／またはその細胞構成要素を含み得る。細胞は、生細胞および／または死細胞（その断片を含む）を含み得る。細胞は、対象の皮膚表面からの微生物細胞（例えば、細菌、真菌、酵母、および／またはウイルスだがこれらに限定されない）および／または対象の宿主皮膚細胞（例えば、ケラチノサイトおよび他の皮膚細胞）を含み得る。
【００４６】
細胞構成要素は、例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、およびこれらのうちのいずれかの組み合わせを含むがそれらに限定されない、細胞に由来する物質である。核酸は概して、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む）を含む。核酸は二本鎖または一本鎖であり得る。ポリペプチドは、例えば、タンパク質およびペプチドを含む、アミノ酸残基のポリマーである。ポリペプチドの例としては、成長因子、酵素、代謝産物、サイトカイン、およびペプチド系毒素が挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、コレステロール、遊離脂肪酸、細胞性脂質（例えば、形質膜および他の小器官の構成要素）、炭水化物結合脂質（糖脂質）、タンパク質の翻訳後脂質化（例えば、パルミトイル化またはファルネイスル化（ｆａｒｎｅｙｓｌａｔｉｏｎ））、スフィンゴ脂質シグナル伝達分子、エンドカンナビノディス（ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｄｉｓ）、セラミド、および生理活性リゾリン脂質、ならびにこれらのいずれかの組み合わせを含む。小分子は、有機小分子であり、典型的には５ｋＤａ未満の分子量を有し、その例としては、微生物細胞によって産生される毒素、ケモカイン、および／または代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「第１のセットの生体物質」は、対象の標的皮膚部位を本明細書に説明する第１のセットの接着テープの各々と接触させることによって得られ、それにより第１のセットの生体物質は、第１のセットの接着テープに接着する。第１のセットの接着テープは、標的皮膚部位と最初に接触させられる複数の水溶性接着テープ（例えば、２〜８、２〜７、２〜６、または２〜５）である。
【００４８】
「第２のセットの生体物質」は、第１のセットの接着テープの適用および除去後に、対象の同じ標的皮膚部位を本明細書に説明する第２のセットの接着テープの各々と接触させることによって得られ、それにより第２のセットの生体物質は、第２のセットの接着テープに接着する。第２のセットの接着テープは、第１のセットの接着テープの直後に標的皮膚部位と接触させられる複数の水溶性接着テープ（例えば、２〜８、２〜７、２〜６、または２〜５）である。
【００４９】
「第３のセットの生体物質」は、第２のセットの接着テープの適用および除去後に、対象の同じ標的皮膚部位を本明細書に説明する第３のセットの接着テープの各々と接触させることによって得られ、それにより第３のセットの生体物質は、第３のセットの接着テープに接着する。第３のセットの接着テープは、第２のセットの接着テープの直後に標的皮膚部位と接触させられる複数の水溶性接着テープ（例えば、２〜８、２〜７、２〜６、または２〜５）である。
【００５０】
各セットの生体物質は、複数の生物学的分子を含み、（例えば、種類および／または量において）異なる組成を含有し得る。いくつかの実施形態において、第１のセットおよび第２のセット（および／または第３のセット）の生体物質は、少なくとも１種類の生体物質において異なっている。例えば、微生物細胞（例えば、細菌、真菌、酵母、および／またはウイルスだがこれらに限定されない）またはこれらの細胞構成要素（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子（代謝産物））は、第２のセットおよび／または第３のセットにおけるレベルよりも実質的に高いレベルで第１のセットに存在し、いくつかの場合において、第２のセットおよび／または第３のセットは、微生物細胞が存在しないことがある。別の例において、ケラチノサイトまたはその細胞構成要素（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子（代謝産物））は、第１のセットにおけるレベルよりも実質的に大きなレベルで第２のセットおよび／または第３のセットに存在し、いくつかの場合において、第２のセットおよび／または第３のセットは、このようなケラチノサイトまたはその細胞構成要素が存在しないことがある。本明細書で使用する場合、「実質的に大きな」または「実質的に高い」という用語は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、またはそれより高い上昇を含む、少なくとも３０％以上の上昇を指す。いくつかの実施形態において、微生物細胞（例えば、細菌、真菌、および／またはウイルスだがこれらに限定されない）またはこれらの細胞構成要素（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子（代謝産物））は、例えば、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより高いレベルを含む、少なくとも５０％以上、第１のセットにおけるレベルよりも大きなレベルで、第２のセットにおよび／または第３のセットに存在する。いくつかの実施形態において、第２のセットの生体物質は、微生物細胞を含んでいないことがある。いくつかの実施形態において、ケラチノサイトまたはその細胞構成要素（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子（代謝産物））は、例えば、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより高いレベルを含む、少なくとも５０％以上、第１のセットにおけるレベルよりも大きなレベルで、第２のセットにおよび／または第３のセットに存在する。いくつかの実施形態において、第１のセットの生体物質が死ケラチノサイト（例えば、核を有さないケラチノサイト）を含むことがあるが、第１のセットの生体物質は、生ケラチノサイトを含んでいない。
【００５１】
いくつかの実施形態において、第１のセットの生体物質は、対象の角質層からの生体物質を含む。角質層からの物質は、角質層の表面からのおよび／または角質層内の物質を含むことができる。角質層は、表皮の最外層であり、死皮膚細胞から構成される。環境と皮膚の下層との間の強固な遮蔽を提供することによって、その真下にある生細胞を保護する。角質層は、連続的に脱落する死ケラチノサイトの１０〜３０の薄い層でできている。角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）は、「角質層（ｈｏｒｎｙ  ｌａｙｅｒ）」としても既知であり、その細胞が動物の角に似て強固であるからである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、第１のセットの生体物質は、対象の角質層からの少なくとも１種類の微生物生体物質を含む。微生物生体物質は、第１のセットの生体物質から抽出または単離されてもよい。微生物生体物質の非限定例としては、微生物細胞（例えば、細菌、真菌、ウイルス、および酵母）およびその細胞構成要素（例えば、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子など）が挙げられる。いくつかの実施形態において、微生物細胞は、第１のセットの生体物質から単離され、例えば、薬剤スクリーニングのために培養および増殖され、微生物細胞の抗生物質耐性を判定し、および／または微生物細胞に対する有効な抗生物質を判定することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、微生物核酸は、第１のセットの生体物質から抽出され、例えば、微生物細胞を同定することができる。いくつかの実施形態において、微生物核酸は、例えば、検出および／または分析される前に、ポリメラーゼ連鎖反応によって、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって増幅され得る。いくつかの実施形態において、微生物ＤＮＡは、第１のセットの生体物質から抽出され、ショットガンメタゲノム配列決定によって分析されることができる。ショットガンメタゲノム配列決定は、所与の試料中に存在するすべての微生物におけるすべての遺伝子の包括的な試料採取を許容する。したがって、微生物種の多様性および微生物の量は、第１のセットの生体物質から抽出される微生物核酸に基づいて評価することができる。例えば、図６Ａおよび図６Ｂは、微生物種の多様性が健常対照およびアトピー性皮膚炎に罹患している対象から収集された第１のセットの生体物質において検出されたことを示す。図１２に示すように、非常に多数の微生物種が、本明細書に説明する方法を用いてアトピー性皮膚炎の未成年（例えば、１〜２歳）の皮膚から得ることができ、この種には、例えば、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、サリニバクター（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プスエドキサニトモナス（Ｐｓｕｅｄｏｘａｎｉｔｈｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エンヒドロバクター（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エシェンキア（Ｅｓｃｈｅｎｃｈｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロダノバクター（Ｒｈｏｄａｎｏｂａｃｔｅｒ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）、およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物核酸は、１６ＳｒＲＮＡ配列決定によって分析することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、第２のセット、第３のセット、および／または任意の追加のセットの生体物質は、宿主生体物質を含む。宿主生体物質とは、生体物質が得られる対象の「自己」物質である。宿主生体物質は、生体物質が得られる対象の角質層の下の表皮層のいずれかに由来し得る。例えば、宿主生体物質は、対象の透明層、顆粒層、および／または有棘層に由来し得る。いくつかの実施形態において、宿主生体物質は、例えば、当該生体物質が得られる対象の角質層の下の表皮層のうちのいずれかからのケラチノサイトおよびその細胞構成要素（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、および小分子を含む）を含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、宿主生体物質の存在は、第２および／または第３のセットの生体物質から判定することができる。例えば、ケラチノサイトからの生体物質（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、および小分子などを含む）の存在を分析することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、宿主生体物質は、ケラチノサイト核酸を含む。核酸を分析するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、第２および／または第３のセットの生体物質からのケラチノサイト核酸は、検出および／または分析に先立って増幅することができる。生体物質からの核酸は、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって分析することができる。例えば、核酸は、ブロット分析手順、例えば、ノザンブロット手順による分析に先立って増幅することができる。ブロット分析手順のために、ポリヌクレオチドは、ゲル上で分離された後、関心対象の配列と相補的なポリヌクレオチドを用いて探査される。例えば、ＲＮＡは、ニトロセルロースへ転移されたゲル上で分離され、関心対象の遺伝子（例えば、皮膚生体マーカーおよび／または皮膚の疾患もしくは障害と関係する生体マーカー）のうちの１つと相補的なＤＮＡを用いて探査される。相補的なプローブは、放射性標識、化学標識することなどができる。いくつかの実施形態において、核酸は、大きさ分別によって検出および／または分析することができる。核酸を大きさ分別する方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）を含むゲル電気泳動法などによって、当業者に周知である。核酸を大きさ分別することは、当業者に公知のクロマトグラフィー法によっても達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡに基づいて、関心対象の遺伝子（複数可）（例えば、皮膚生体マーカーおよび／または皮膚の疾患もしくは障害と関係する生体マーカー）の発現のために増幅および分析することができる。増幅反応における可変性を説明するために、標的核酸分子および対照核酸分子（例えば、ＧＡＰＤＨのようなハウスキーピング遺伝子）の発現レベルを比較して、相対的な発現レベルを得ることができる。いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子（複数可）（例えば、皮膚生体マーカーおよび／または皮膚の疾患もしくは障害と関係する生体マーカー）の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、核酸を配列決定することによって分析することができる。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸マイクロアレイによって分析することができる。いくつかの実施形態において、アトピー性皮膚炎関連遺伝子、例えば、Ｓ１００Ａ８およびＫＩＦ３Ａ、またはＧｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ”（２０１５）ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  １０（１２）：ｅ０１４４３１６において説明されるようないずれかの他のシグネチャ遺伝子は、第２のセットおよび／または第３のセットの生体物質から検出および／または分析することができる。いくつかの実施形態において、第２のセットの生体物質からのゲノムＤＮＡは、配列決定によって検出または分析することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、宿主生体物質は、１種類以上の遺伝子（例えば、皮膚の疾患または障害、例えばアトピー性皮膚炎と関係するポリペプチドをコードする遺伝子）のポリペプチド産物を含むことができる。ポリペプチドを検出および分析するための方法は、例えば、イムノアッセイまたはマイクロアッセイによって、当該技術分野で既知である。例えば、いくつかの実施形態において、例えば、Ｔｈ２仲介因子であるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−１３、ＣＣＬ２（単球走化性タンパク質１）、ＣＣＬ２２（マクロファージ由来ケモカイン）、およびＣＣＬ１７［胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）］、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−１０、急性相タンパク質血清アミロイドＡ、Ｃ反応性タンパク質、ならびに血管接着分子１、ＣＣＬ１７、ＩＬ−８を含むがこれらに限定されない、アトピー性皮膚炎に関与する免疫調節分子は、第２および／または第３のセットの生体物質から検出および／または分析することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、異なる生体物質は、異なる分析のために、第１のセット、第２のセット、および第３のセットの生体物質の各々から抽出してもよい。例えば、微生物生体物質（例えば、微生物核酸）は、微生物種の多様性および／または各種の量の分析のために、第１のセットの生体物質から抽出することができる。宿主生体物質（例えば、表皮生体物質）は、第２および／または第３のセットの生体物質から抽出してもよい。例えば、第２のセットの生体物質からの宿主表皮ゲノムＤＮＡは、関心対象のある特定の遺伝子（複数可）（例えば、ケラチノサイト特異的マーカーおよび／または皮膚の疾患もしくは障害と関係するマーカー）について、例えば、ゲノム評価および／またはエピジェネティクス評価のために分析することができる。第３のセットの生体物質からの宿主表皮ＲＮＡは、関心対象のある特定の遺伝子（複数可）（例えば、ケラチノサイト特異的マーカーおよび／または皮膚の疾患もしくは障害と関係するマーカー）の発現レベルについて分析することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、宿主脂質（すなわち、生体物質が得られる対象の「自己」皮膚脂質）は、脂質が各対象に由来するであろう深度差があり得る、接着テープから収集されたいずれかのセット（例えば、第１のセット、第２のセット、第３のセット、および／または任意の追加のセット）の生体物質から抽出することができる。宿主脂質は、角質層または角質層の下の表皮層に由来し得る。いくつかの実施形態において、第２のセットの生体物質は、宿主脂質について分析され得る。分析されることになっている宿主脂質の例としては、コレステロール、遊離脂肪酸、スフィンゴ脂質シグナル伝達分子、内在性カンナビノイド、セラミド、および／または生理活性リゾリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リピドミクスを分析するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、多重構成要素脂質液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）／ＭＳ分析および／または高性能薄層クロマトグラフィーを実施して、皮膚の脂質組成を分析することができる。このような脂質分析を使用して、脂質含有量が異常であるかどうか、およびこのことが皮膚の容態または疾患にどのように関するかを判定することができる。いくつかの実施形態において、１種類以上の脂質は、診断用または予防用生体マーカーとして使用して、湿疹に罹患している、または罹患していることが疑われる、または湿疹についてのおよび喘息の偶発的な発症についての危険性のある対象（例えば、未成年）を同定することができる。いくつかの実施形態において、１種類以上の脂質は、処置用生体マーカーとして使用して、対象が、例えば、局所セラミドまたは他の局所薬を含む処置に応答性があるかどうかを判定することができる。いくつかの実施形態において、脂質情報を使用して、皮膚における脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）がケラチノサイトにおける免疫応答にどの世に影響するのかを判定することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、微生物生体物質（例えば、微生物核酸のような本明細書に説明するような生体物質）を含んでいる第１のセットの生体物質は、７つの水溶性接着テープ（テープ１〜７、例えば、本明細書に説明するようなテープ）を含む第１のセットの接着テープによって提供されるのに対し、宿主生体物質（例えば、表皮ＲＮＡのような本明細書に説明するような宿主生体物質）を含んでいる第２のセットの生体物質は、４つの水溶性接着テープ（テープ８〜１１、例えば、本明細書に説明するようなテープ）を含む第２のセットの接着テープによって提供される。いくつかの実施形態において、微生物生体物質（例えば、微生物核酸のような本明細書に説明されるような生体物質）を含んでいる第１のセットの生体物質は、３つの水溶性接着テープ（テープ１〜３、例えば、本明細書に説明するようなテープ）を含む第１のセットの接着テープによって提供されるのに対し、宿主生体物質（例えば、表皮ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのような本明細書に説明するような宿主生体物質）を含んでいる第２のセットの生体物質は、８つの水溶性接着テープ（テープ４〜１１、本明細書に説明するようなテープ）を含む第２のセットの接着テープによって提供される。いくつかの実施形態において、微生物生体物質（例えば、微生物核酸のような本明細書に説明するような生体物質）を含んでいる第１のセットの生体物質は、３つの水溶性接着テープ（テープ１〜３、例えば、本明細書に説明するようなテープ）を含む第１のセットの接着テープによって提供されるのに対し、宿主生体物質（例えば、表皮ＤＮＡのような本明細書に説明するような宿主生体物質）を含んでいる第２のセットの生体物質は、３つの水溶性接着テープ（テープ４〜７、例えば、本明細書に説明するようなテープ）を含む第２のセットの接着テープによって提供され、宿主生体物質（例えば、表皮ＲＮＡのような本明細書に説明するような宿主生体物質）を含んでいる第３のセットの生体物質は、３つの水溶性接着テープ（テープ８〜１１、例えば、本明細書に説明するようなテープ）を含む第３のセットの接着テープによって提供される。
【００６１】
各セットの生体物質からの分析を組み合わせて、生体物質が収集された標的皮膚部位の生体物質特性を判定することができる。したがって、生体物質が収集された対象の皮膚の容態は、適宜評価することができる。いくつかの実施形態において、皮膚の容態は、療法の効能を監視するために、および／または適切な処置投与計画を決定するために、処置の前後で評価することができる。例えば、対象がアトピー性皮膚炎に罹患しているいくつかの実施形態において、対象の皮膚部位（例えば、罹患した皮膚部位）の生体物質特性を処置の前後で判定して、療法の効能を監視しおよび／または適切な処置投与計画を決定することができる。いくつかの実施形態において、対象は、参照生体物質特性（例えば、皮膚の疾患または障害に罹患していない対象から得られた生体物質特性）と比較して、判定された生体物質特性に基づいて、皮膚の疾患または障害について診断されることができる。
【００６２】
ＩＶ．対象の皮膚の容態を評価するためのキット
本開示の別の態様は、対象の皮膚の容態を評価するためのキットに関する。したがって、いくつかの実施形態において、このようなキットは、（ａ）水溶性接着テープへ接着した生体物質を抽出するための１種類以上の試薬と、（ｂ）微生物生体物質および／または宿主生体物質の存在を判定するための１種類以上の検出薬とを含むことができる。
【００６３】
水溶性接着テープに接着した生体物質を抽出するための試薬には水溶性接着テープを溶解する薬剤が含まれていてもよい。このような試薬は、分析されることになっている生体物質の少なくとも１つを安定させる薬剤も含んでもよい。例えば、例示的な試薬は、緩衝剤（例えば、トリスまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンだがこれらに限定されない）、ポリオール（例えば、グリセロールまたはチオグリセロールのようなその誘導体）、および／またはタンパク質変性剤（例えば、グアニジニウムチオシアナートだがこれに限定されない）を含むことができる。いくつかの実施形態において、試薬は、グアニジンチオシアナートと、トリス（ｐＨ７〜８）と、１−チオグリセロールとを含んでいる水性緩衝溶液であってもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態において、キットは、生体物質の混合物から標的生体物質を単離および／または精製するための薬剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、標的微生物生体物質および／または宿主生体物質を単離および／または精製するための薬剤を含むことができる。このような薬剤には、微生物核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、宿主表皮ＤＮＡ、宿主表皮ＲＮＡ、宿主表皮脂質、およびこれらのいずれかの組み合わせを単離および／または精製するための薬剤を含むことができるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）微生物核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ゲノムＤＮＡを単離および／または精製するための薬剤とを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）微生物核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ＲＮＡを単離および／または精製するための薬剤とを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）微生物核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮脂質を単離および／または精製するための薬剤とを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）微生物核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ゲノムＤＮＡを単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉｉ）表皮ＲＮＡを単離および／または精製するための薬剤とを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）微生物核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ゲノムＤＮＡを単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｉｉ）表皮ＲＮＡを単離および／または精製するための薬剤と、（ｉｖ）表皮脂質を単離および／または精製するための薬剤とを含むことができる。これらの生体物質を単離および／または精製するための試薬および材料は、当該技術分野で既知であり、市販されている。例としてに過ぎないが、表皮ＲＮＡを単離および／または精製するための薬剤には、溶解緩衝液、トリゾール、クロロホルム、イソプロパノール、ＤＮアーゼ、清浄化カラム、およびこれらのいずれかの組み合わせを含んでもよいが、それらに限定されない。
【００６５】
いくつかの実施形態において、キットにおいて提供される検出薬（複数可）は、微生物培養培地（例えば、液体培地またはアガーのような固体培地）、微生物を検出するための薬剤、宿主生体物質を検出するための薬剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。薬剤は微生物を検出中であり、および／または宿主生体物質は、検出されることになっている生体分子の種類によって変えることができる。例えば、微生物および／または宿主生体物質から核酸を検出するための薬剤は、例えば、関心対象の遺伝子の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブと、増幅薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼとを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨだがこれに限定されない）、ケラチノサイト特異的遺伝子（例えば、ケラチン１だがこれに限定されない）、および／または皮膚疾患関連遺伝子を増幅および／または検出するために設計されていてもよい。例えば、キットを使用してアトピー性皮膚炎に罹患している、罹患している疑いのある、またはその危険にある対象の皮膚の容態を評価するいくつかの実施形態において、キットは、アトピー性皮膚炎関連遺伝子（Ｓ１００Ａ８およびＫＩＦ３Ａだがこれらに限定されない）についてのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含むことができる。
【００６６】
微生物および／または宿主生体物質からのポリペプチドを検出するための薬剤には、分析されることになっている具体的なタンパク質またはペプチドに対する捕捉抗体、検出抗体（例えば、標識した抗体）、ブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン）、およびこれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。例えば、キットを用いてアトピー性皮膚炎に罹患している、罹患している疑いのある、またはその危険にある対象の皮膚の容態を評価するいくつかの実施形態において、キットは、アトピー性皮膚炎関連タンパク質またはペプチド（例えば、本明細書に説明するような免疫調節分子のような、アトピー性皮膚炎と関係する免疫調節分子だがこれに限定されない）に対する捕捉抗体を含むことができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、キットにおいて提供される検出薬は、（ｉ）例えば、メタゲノムショットガン配列決定のために、または１６ＳｒＲＮＡ配列決定のために微生物ＤＮＡライブラリを調製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ＤＮＡの存在を検出するための薬剤（例えば、重亜硫酸塩ピロシーケンスのための重亜硫酸ナトリウム）とを含むことができる。いくつかの実施形態において、検出薬は、（ｉ）例えば、メタゲノムショットガン配列決定のために、または１６ＳｒＲＮＡ配列決定のために微生物ＤＮＡライブラリを調製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ＲＮＡの存在を検出するための薬剤（例えば、逆転写酵素反応を実施するための薬剤ならびに関心対象の遺伝子（複数可）を増幅および／または検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ）とを含むことができる。いくつかの実施形態において、検出薬は、（ｉ）例えば、メタゲノムショットガン配列決定のために、または１６ＳｒＲＮＡ配列決定のために微生物ＤＮＡライブラリを調製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮脂質の存在を検出するための薬剤とを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットにおいて提供される検出薬は、（ｉ）例えば、メタゲノムショットガン配列決定のために、または１６ＳｒＲＮＡ配列決定のために、微生物ＤＮＡライブラリを調製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ＤＮＡの存在を検出するための薬剤（例えば、重亜硫酸塩ピロシーケンスのための重亜硫酸ナトリウム）と、（ｉｉｉ）表皮ＲＮＡの存在を検出するための薬剤（例えば、逆転写酵素反応を実施するための薬剤ならびに関心対象の遺伝子（複数可）の発現を増幅および／または検出するためオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ）と、を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットにおいて提供される検出薬は、（ｉ）例えば、メタゲノムショットガン配列決定のために、または１６ＳｒＲＮＡ配列決定のために、微生物ＤＮＡライブラリを調製するための薬剤と、（ｉｉ）表皮ＤＮＡの存在を検出するための薬剤（例えば、重亜硫酸塩ピロシーケンスのための重亜硫酸ナトリウム）と、（ｉｉｉ）表皮ＲＮＡの存在を検出するための薬剤（例えば、逆転写酵素反応を実施するための薬剤ならびに関心対象の遺伝子（複数可）の発現を増幅および／または検出するためオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ）と、（ｉｖ）表皮脂質の存在を検出するための薬剤とを含むことができる。これらの生体物質を検出するための試薬および材料は、当該技術分野で既知であり、市販されている。
【００６８】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に説明するテープのような複数（例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、またはそれより多数）の水溶性接着テープをさらに含むことができる。水溶性接着テープは、基材へ装着された水溶性接着剤を含む、本明細書に説明する接着テープである。いくつかの実施形態において、水溶性世着テープは個々に包装されることができる。いくつかの実施形態において、複数の接着テープは、複数の部分セットへと包装されることができ、各部分セットは、２〜５の接着テープを含んでもよい。いくつかの実施形態において、複数の水溶性接着テープは、ロールへと包装されてもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に説明する方法のいずれかに従った使用のための説明書をさらに含むことができる。説明書は、水溶性接着テープを用いた生体物質の収集の方法、および／または水溶性接着テープから収集された生体物質を分析する方法の説明を含むことができる。
【００７０】
本明細書に説明するキットにおいて供給される説明書は、
包装挿入物（例えば、キットの中に含まれる紙シート）の上に典型的に記載された説明書であるが、機械可読説明書（例えば、磁気記憶ディスクまたは光記憶ディスクの上に担持された説明書）も承認可能である。いくつかの実施形態において、ラベルまたは包装挿入物は、キットが具体的な皮膚の疾患または障害、例えば、アトピー性皮膚炎に罹患している、罹患している危険性のある、またはその危険にある対象についての皮膚生体物質特性を取得するために使用されることを示すことができる。いくつかの実施形態において、キットは、皮膚の疾患または容態、例えば、アトピー性皮膚炎に罹患していない対象についての参照生体物質特性、例えば、参照皮膚生体物質特性を比較のためにさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ラベルまたは包装挿入物は、キットが、例えば、本明細書に説明するような特定の対照群における使用に適していることを示すことができる。説明書は、本明細書に説明する方法のいずれかを実行するために提供されることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、キットは、接着テープを標的皮膚部位へ適用し、標的皮膚部位から接着テープを除去するための適用ツールをさらに含むことができる。このような適用ツールはピンセットであってもよい。
【００７２】
キットは、緩衝液および解釈情報のような追加の構成要素を場合により提供することができる。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器と関係するラベルまたは包装挿入物（複数可）とを含む。
【００７３】
さらなる労力なく、当業者は、先の説明に基づいて、本開示をそのもっとも完全な程度まで利用することができると考えられる。以下の具体的な実施形態はそれゆえ、単に説明するものとして解釈されることになっており、本開示の残部をどのようにも制限するものではない。本明細書に引用される公表物はすべて、本明細書で参照される目的または発明の対象についての参照によって援用される。
【実施例】
【００７４】
実施例１：皮膚からのＲＮＡ収集の非侵襲法の開発
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）の理解は、皮膚からの試料の収集のための信頼できる非侵襲的な方法がないことによって限られている。テープ収穫法は、皮膚の最外層を形成する生物学的試料（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）を抽出する方法として実施される非侵襲的な手順であるが、ＡＤを研究するために用いられてはいない。
【００７５】
角質層は、表皮の最外層であり、感染、脱水、化学的および機械的ストレスからの下層組織への保護を提供する。しかしながら、ケラチンで満たされ死んで平らになった無核細胞からなる（およびほとんどないしまったくＲＮＡがない）。ＲＮＡについての試料採取は、角質層の下の皮膚の収集を必要とする。いくつかの変数は、試料収集に影響する可能性がある。これには、例えば、除去するのが困難な環境におけるＲＮアーゼの存在、連続的なテープストリップの大きさおよび数（表皮への深度に対する代理）、ならびに単離技術を含むが、これらに限定されない。それゆえ、十分な量および純度のＲＮＡが下流の適用における使用のために取得することができるよう、皮膚からのＲＮＡ収集のための非侵襲的なテープ剥離法を開発する必要がある。
【００７６】
例示的な方法
図１は、標的皮膚部位の生体物質特性を判定する非侵襲的な方法の例示的なスキームを示す図式である。
【００７７】
収集
分析のための生体物質を収集するために、１１の１平方インチの水溶性接着ストリップ（ＳｍａｒｔＳｏｌｖｅ（登録商標）、Ｂｏｗｌｉｎｇ  Ｇｒｅｅｎ，ＯＨ）を同じ標的皮膚部位（例えば、前腕前側上）で連続して検査対象へ適用した。ストリップ１〜７をミクロビオームおよびＤＮＡの単離のために貯留したのに対し、ストリップ８〜１１をＲＮＡ単離に使用した。
【００７８】
いくつかの実施形態において、生体物質を病変および／または非病変皮膚部位から収集することができる。
【００７９】
ＲＮＡ単離
テープを４ｍＬのトライゾール試薬へ入れ、瞬時凍結／解凍した。崩壊したテープを遠心分離によって沈降させた。６００μＬのクロロホルムを添加し、ＲＮＡ抽出を実施した。次いで、イソプロパノール沈殿を実施し、ペレットをエタノールで洗浄した。次に、試料をＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ清浄化カラム、次いでカラム上で実施されるＤＮＡｓｅ  Ｉ消化（Ｑｉａｇｅｎ）が続いた。
【００８０】
品質管理
試料の収量（濃度および品質）をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって確認した。試料をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。定量的ＰＣＲは、Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎプロトコルを備えたＳＹＢＲＧｒｅｅｎを用いるＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６を用いて実施した。皮膚の生体マーカーおよび／または皮膚疾患と関係する生体マーカー（例えば、ＧＡＰＤＨ、ケラチン１およびＳ１００ＡＢ）の遺伝子発現を測定した。ＲＴ非テンプレートおよび陽性対照（ＲＮＡはＨＢＥＣ細胞株を形成する）を各遺伝子についての品質管理に利用した。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ融解曲線およびアガロースゲル電気泳動法を利用して、増幅産物を確認した。いくつかの実施形態において、Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブを使用して感度および特異性を改善することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子の発現分析は、異なるレベルのテープストリップ（例えば、ストリップ８対１１）対単細胞対同じ個体由来のプールされた試料で実施することができる。
【００８２】
結果
図２は、図１に示すような方法によって収集および単離されたＲＮＡの２つの代表的な試料（試料Ａおよび試料Ｂ）の電気泳動図を示す。電気泳動図は、強い１８ｓおよび２８ｓのピークを示す（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）。コンピュータ生成ＲＮＡアガロースゲル電気泳動は、強いバンドかつ分解なしを示す（図２を参照されたい）。
【００８３】
図３（左側のパネル）は、ＧＡＰＤＨ、ケラチン１、およびＳ１００Ａ８の定量的ＰＣＲ増幅プロットとの比較における２つの代表的な試料（試料Ａ、試料Ｂ）の定量的ＰＣＲ増幅プロットを示す。図３（右側のパネル）は、試料Ａ、試料Ｂおよび陽性対照からのＰＣＲ産物のＳＹＢＲｇｒｅｅｎ融解曲線が重なった単一の曲線を示すことを示す。
【００８４】
図４は、定量的ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す写真を含んでいる。試料は、三つ組で陽性（＋）対照と共に泳動されている。期待されるアンプリコンの大きさ：ＧＡＰＤＨ（１８４ｂｐ）、ケラチン１（１２８ｂｐ）、Ｓ１００Ａ８（１０４ｂｐ）。陽性対照と類似の明確なバンドは、ＧＡＰＤＨ、ケラチン１、およびＳ１００Ａ８の試料において存在する。Ｓ１００Ａ８における試料１は、おそらくプライマーの二量体化のため、ほとんど増幅されていなかった。
【００８５】
本結果は、テープ剥離法が検査対象において十分耐容性があったことを示す。気付いた唯一の反応は、本手順の直後に皮膚のテーピング部位における軽度で一過性の紅斑であった。テープストリップの大きさを大きくした（例えば、１平方インチのより大きなテープストリップ）結果、１／２平方インチのより小さなテープストリップと比較して、ＤＮＡ／ＲＮＡ収量が改善し、一貫性が生じた。ナノドロップデータは、２６０／２８０比で測定されたＲＮＡ試料が１．６〜１．９の間の値を有したことを示す。ＲＮＡ収量における実質的な増加は、１１番目よりも後のテープストリップにおいてみられなかった。いくつかの実施形態において、単一のカラムに基づいた単離は単独で結果的にカラムの目詰まりを生じる可能性がある。したがって、これらの実施形態において、複数のステップの単離を適用することができる。
【００８６】
結論
テープ剥離法は、皮膚からの生体物質の収集のための非侵襲的かつ十分に耐容性のある方法である。テープストリップ収集は結果的に、定量的ＲＴ−ＰＣＲにおける使用に十分なＲＮＡ収量を生じる。例えば、さらに少量のＲＮＡ量の増幅が可能である。
【００８７】
実施例２：未成年からのケラチノサイトＲＮＡおよびＤＮＡの試料の収集のための迅速な信頼できる方法
アトピー性皮膚炎とは、アトピーの共通した顕在化であるが、ヒトに基づいた研究は、遺伝子、ゲノム、および機序の研究に使用することができる皮膚からの生物学的試料の収集のための信頼できる非侵襲定な方法がないことによって限られている。この理解における間隙は、皮膚上皮を対象とする新規の療法を隠ぺいしてきた。したがって、アトピー性皮膚炎に罹患している未成年の病変皮膚および非病変皮膚からのＲＮＡの収集に関する非侵襲的で、信頼でき、かつ感度のある方法を開発する必要性がある。本発明者らは、皮膚を対象とするゲノム、エピジェネティクス、およびミクロビオームの生体マーカーおよび療法の開発のために、ケラチノサイトからのＲＮＡおよびＤＮＡを信頼可能に高品質で収集する未成年からの皮膚の非侵襲的な試料採取のためのテープを基にした方法を開発してきた。このアプローチは、未成年の皮膚を研究および試料採取し、新たな疾患生体マーカーを同定および追跡し、新たな治療開発を可能にするよう広範に利用することができる。このテープ法は、細菌、タンパク質、および代謝産物の収集へも適用可能である。
【００８８】
方法
水溶性テープを利用して、対象の同じ標的皮膚部位からのストリップの連続的な接着および除去を用いて非病変皮膚から試料を収集した。例えば、ストリップ１〜３は、ミクロビオーム分析およびゲノム分析のために、ストリップ４〜１１は、宿主ＲＮＡ／ＤＮＡ分析のために保存した。方法のパラメータには、例えば、（１）テープおよび接着種類、（２）テープの大きさ、（３）連続的なテープ試料の数（真皮への貫通についての代理）ならびに（４）精製技術を含む。ＲＮＡ／ＤＮＡ収率（量および質）をＮａｎｏｄｒｏｐおよびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて概算した。利用可能性は、ＲＴ−定量的ＰＣＲを通じてゲージをとり、ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）、ケラチノサイト特異的マーカー（例えば、ケラチン１）、およびアトピー関連遺伝子（例えば、Ｓ１００Ａ８、およびＫＩＦ３Ａ）の発現を定量化した。皮膚試料採取の非侵襲性は、検査対象の皮膚の発疹の様相または不快感によって評価した。
【００８９】
結果
テープ剥離法は、十分耐容性があった。水溶性のテープは、水不溶性テープ（例えば、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（登録商標））よりも高いＲＮＡ／ＤＮＡ収率および一貫した結果を生じた。より大きなテープは結果的に、改善された収率を生じたが、いくつかの場合においてはあまり一貫していない結果を生じた。追加的な連続したテープ試料は、収率および一貫性を改善した。沈殿ステップを用いたトライゾールを通じての精製に続くカラムに基づく清浄化は、トライゾールまたはカラムに基づくプロトコル単独の使用と比較して、一貫性を改善した。ＲＴ−定量的ＰＣＲは、ＧＡＰＤＨの高いレベルの発現、Ｓ１００Ａ８およびケラチン１の中間的なレベル、ならびにＫＩＦ３Ａの低レベルの発現を示した。
【００９０】
これらの結果は、テープに基づいた方法がアトピー性皮膚炎に罹患している未成年からの皮膚の非侵襲的な試料採取のために使用することができることを示す。この方法は、高品質のＲＮＡを生じ、ゲノムおよびエピジェネティクスの研究を可能にし、例えば、皮膚障害に罹患している成人および未成年へ広範に適用することができる。さらに、本明細書に説明する方法を使用して、皮膚表面からの微生物の分析物、例えば、細菌、タンパク質、および代謝産物、ならびに皮膚表面の下の表皮層からの宿主分析物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および代謝産物）を同時に収集することができる。
【００９１】
実施例３：表皮およびミクロビオームの核酸の同時評価のための侵襲性が最小限の方法
皮膚科学的疾患の研究には、生体マーカーの同定のために、ならびに機序の、エピジェネティクスの、およびゲノムの研究のために皮膚試料を収集する迅速かつ信頼できる侵襲性が最小限のツールがない。皮膚生検は、高度に訓練された医療従事者を必要とし、侵襲的で時間がかかり、大コホートにおける収集には実用的ではない。したがって、皮膚ミクロビオームおよびケラチノサイトの核酸を評価するための生体物質の同時収集のための肥厚効果のある、侵襲性が最小限の、信頼できる、感度のある、および規模拡大可能なツールキットおよび／または方法を開発する必要性がある。
【００９２】
結果
方法および耐容性の一般的な説明
１１の１平方インチの水溶性接着テープのストリップを用いて、各対象の同じ標的皮膚部位からのストリップの連続的な接着および除去を用いて、患者から表皮試料を収集した。連続的なストリップを同時の皮膚表面ミクロビオーム特徴づけ、ならびに下にあるケラチノサイトのエピジェネティクスの遺伝子レベルの研究、および遺伝子発現分析に利用した。
【００９３】
ツールキットおよび／または方法は、１平方インチ（１ｉｎ×１ｉｎ）片の水溶性接着テープ（ＳｍａｒｔＳｏｌｖｅ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔａｐｅ，Ｂｏｗｌｉｎｇ  Ｇｒｅｅｎ，ＯＨ）（図５を参照されたい）の適用および除去を連続的に利用して、皮膚を試料採取した。テープの無菌性を定量的ＰＣＲおよび培養法を用いて確認し、微生物の混入の証拠はなかった。本方法は、アトピー性皮膚炎に罹患している２００名を超える未成年において病変皮膚部位および非病変皮膚部位の両方から十分耐容性があった。気付いた唯一の反応は、本手順の直後の皮膚テーピング部位における軽度の一過性の紅斑であった。第１の３つのストリップ（ストリップ１〜３）を微生物核酸の単離に、次いでメタゲノム配列決定によるミクロビオーム解析に使用した。その次の３つのストリップ（ストリップ４〜７）をゲノムおよびエピジェネティクスの研究のための宿主表皮ゲノムＤＮＡの単離に利用した。最後の３つのストリップ（ストリップ８〜１１）は、遺伝子発現の定量化のための宿主表皮ＲＮＡの単離に使用した。
【００９４】
ミクロビオームの試料採取は有効であり、接触によるアガープレート収集に匹敵する
第１の３つのテープ（以下の方法の節を参照されたい）からの微生物ＤＮＡの精製後、バイオアナライザー（電気泳動図）を使用してＤＮＡの完全性を確認し（図１０を参照されたい）、次にショットガンメタゲノミクス配列決定を実施した（図６Ａ〜図６Ｂを参照されたい）。
【００９５】
エピジェネティクス分析のためにテープから単離された表皮ゲノムＤＮＡの使用
エピジェネティクスの研究のためにテープストリップ４〜７から単離されたＤＮＡの適切性を重亜硫酸塩ピロシーケンスによって検査した。このＤＮＡをＱｕｂｉｔ蛍光測定に基づいて０．８〜１ｎｇ／ｕｌの範囲の収量のカラムに基づく市販のキットを用いて単離した。溶離したＤＮＡを重亜硫酸塩処理し、関心対象の領域についてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、ピロシーケンスを受け、ピログラムは、非メチル化ＤＮＡおよびメチル化ＤＮＡの両方の検出を確認した（図７Ａ〜図７Ｂを参照されたい）。
【００９６】
表皮試料採取は、定量的ＲＴ−ＰＣＲのための良好な品質のＲＮＡを生じる
テープストリップＲＮＡを、テープ残渣のより良好な除去のための溶媒に基づくおよびカラムに基づくアプローチを用いて単離した。相補的ＤＮＡ鎖を下流の定量的ＲＴ−ＰＣＲについて生成して、皮膚マーカーを評価した。グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、フィラグリン（ＦＬＧ）、ロリクリン（ＬＯＲ）およびケラチン１４（ＫＲＴ１４）、クラウジン１（ＣＬＤ１）、カドヘリン（ＣＤＨ）、Ｓ１００Ａ８ならびにＳ１００Ａ９を含むいくつかの遺伝子を、少量から多量の範囲で査定した。試料を三つ組で泳動したとき、増幅成功率（ＦＬＧおよびＬＯＲのデータに基づく）はおよそ９０％であった。フィラグリンおよびロリクリンは、高度に発現することが認められた（中間の３０周期におけるＣＴ、図８および図９）。下部に表される遺伝子（Ｓ１００Ａ８遺伝子およびＳ１００Ａ９遺伝子のような）は、より低い発現レベルを有していた（上位３０周期から下位４０周期までにおけるＣＴ。
【００９７】
考察
説明したツールキット／方法は、同じ皮膚部位から皮膚微生物試料および宿主表皮試料（例えば、ケラチノサイト核酸単離用）を収集するための効率的で低コストの、侵襲性が最小限の方法である。試料は、皮膚由来の判定のために、ならびにケラチノサイトトランスクリプトミクス、遺伝学、およびエピジェネノミクスのためにうまく使用することができる。この技術を使用して、皮膚疾患の分子レベルの土台を探索し、治療介入のための標的を同定することができる。本技術を使用して、すべての異なる年齢および生活環において皮膚疾患の臨床的に有用な生体マーカー、および皮膚疾患の重症度、バリアの機能不全、生理学的性質の生体マーカーを同定し、診断を支援し、および最適な処置の選択を誘導することもできる。本技術は、大コホートにおける研究設定および臨床点の両方における広範な種々の皮膚科学的容態へ容易に適用することができる。
【００９８】
本データは、本明細書に説明するツールキットおよび／または方法が、下層のケラチノサイトの皮膚由来の、ならびに遺伝子分析、トランスクリプトーム分析およびエピゲノム分析を描写するためのメタゲノミクスに使用することができる試料を生じることを明確に実証している。テープは、リピドミクスおよびメタボロミクスにも利用することができる。試料の収集および加工は、ツールキットを実施するのを容易にする、高価ではなくいつでも在庫がある、かつ容易に取得可能な製品、試薬および機器を使用することができる。さらなる利点は、応用訓練をしていない研究者または臨床家によって容易に実施することができる点を含み、このことは、麻酔なしで患者によって十分に耐容される。このことは、皮膚生検の典型的な収集方法と対比すると、有意な利点である。本明細書に説明する方法は、研究／個人の必要性を満たすよう容易に修正および規模変更することができる。新たな技術および下流の応用が生まれるにつれ、本ツールキットは、これらの新たな技術を組み込むのにさらに適応させることができる。
【００９９】
要約すると、本ツールキット／方法、具体的にはテープ試料採取法および加工は、信頼でき、再現可能であり、かつ従来の接触によるプレート培養法を用いて得られた結果に近似したミクロビオーム分析を可能にした。表皮皮膚収集は、ケラチノサイトのＤＮＡおよびＲＮＡを生じ、このことは、ピロシーケンス、トランスクリプトミクス、およびリアルタイムＰＣＲのような下流の応用における使用に十分な質および量であることが実証された。
【０１００】
収集源が皮膚表面および／または表皮の上層からの細胞（例えば、皮膚上に存在するヌクレアーゼを含む）を含むので、核酸の完全性が生検からの試料の完全性とあまり一致していないかもしれないことは特筆される。試料の化学的混入を最小限にするために、複数のステップの精製を実施して、テープ基材および接着残渣を除去することができる。複数のテープストリップを単一の個体から収集すると、成功率は集約的に、テープストリップのうちの１つから得られたＲＮＡからの定量的ＲＴ−ＰＣＲについて１００％に近い。少量の試料のため、複数のステップを踏まえて、混入の危険性を低減させるべきであり、例えば、以下の方法の節を参照されたい。
【０１０１】
アトピー性皮膚炎に罹患している対象における本明細書に説明する試料収集法の使用
本明細書に説明する方法を使用して、未成年におけるアトピー性皮膚炎から喘息への進行の機序（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｔｏ  Ａｓｔｈｍａ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ（Ｍ−ＰＡＡＣＨ））コホートにおけるアトピー性皮膚炎の分子シグネチャを探索した。本研究において、病変性および非病変性の両方の湿疹性皮膚を、本明細書に説明するツールキット／方法を用いて小児患者から試料採取して、皮膚ミクロビオーム、表皮エピジェネティクスおよび遺伝子発現の相互作用を検討した。２００名を超える患者から４，０００を超えるテープストリップをうまく収集した。
【０１０２】
図１２は、本明細書に説明する方法を用いてアトピー性皮膚炎の未成年（例えば、１〜２歳）の皮膚から得られたメタゲノミクスミクロビオームデータを示す図式である。多数の細菌属からの微生物ＤＮＡを、本明細書に説明する方法を用いて検出し、これらの例としては、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、サリニバクター（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プスエドキサニトモナス（Ｐｓｕｅｄｏｘａｎｉｔｈｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エンヒドロバクター（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エシェンキア（Ｅｓｃｈｅｎｃｈｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロダノバクター（Ｒｈｏｄａｎｏｂａｃｔｅｒ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）、およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａが）挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０３】
図１３Ａ〜図１３Ｃは、アトピー性皮膚炎の約１８３名の未成年の病変性および非病変性皮膚部位におけるフィラグリン（ＦＬＧ）（図１３Ａ）、Ｓ１００Ａ８（図１３Ｂ）、およびＳ１００Ａ９（図１３Ｃ）の発現レベルに対応する宿主ＲＮＡ／ＤＮＡ定量的ＰＣＲデータを示すプロットグラフである。
【０１０４】
例示的な追加の応用
先に説明したアトピー性皮膚炎に加えて、本明細書に説明する方法を使用して、他の皮膚科学的疾患または全身性疾患の皮膚症状の他のマーカーを探索することができる。さらに、テープは、リピドミクス、プロテオミクス、およびメタボロミクスの分析に利用することができる。本明細書に説明する方法を使用して、疾患の分子レベルの土台をより良好に理解したり、治療介入および薬剤開発のための新たな標的を同定したりすることができる。本明細書に説明する方法を使用して、疾患の臨床的に関連性のある生体マーカーを同定することもでき、すなわち、診断、疾患の重症度を支援し、自然歴を予測し、または最良の処置戦略を選択するのを助けることもできる。さらに、本明細書に説明する方法は、単独で、または皮膚、血液もしくは他の生体試料からの疾患から同定された生体マーカーと共に、診断目的のための臨床的なポイントオブケアにおいて利用することができる。例えば、多くの発疹の原因の診断は概して、本明細書に説明する方法／キットを用いて分子レベルの診断を行うことによって回避され得る皮膚生検を必要とする。本明細書に説明する方法／キットは、地域の診療所、診察室、緊急ケアセンター、または病院において実施することができる。
【０１０５】
結論として、皮膚からの生体物質の侵襲性が最小限の収集のための、例えば、皮膚疾患またはさらには皮膚症状を有する全身性疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのような）の診断および管理のための臨床上および研究上の設定における使用のための方法およびキットが本明細書に提示される。
【０１０６】
方法
皮膚からの生体物質の収集
＊緩衝液および緩衝液を含有するチューブを４℃で維持する。このことは、緩衝液および細胞が下流の核酸抽出にとって実行可能なままであることを保証する。
１．手を洗い、手袋をはめる。
２．参加者の皮膚部位を好ましくは毛髪を咲けて同定する。第１のストリップを、接着側を下にして部位へと置く。部位を強調因子（ペン／マーカーを使用することができる）で強調する。
−肢から収集する場合、突っ張っている参加者の肢が快適となるよう考慮する。試料採取は長くなる可能性がある。
−強調した部位は、同じ位置からの連続的な収集を容易にする。
３．手袋をはめた手／指で、皮膚上のテープストリップを穏やかに１５〜２０秒間マッサージする。
−ストリップができるだけ部位の表面積のほとんどへ接着することを確実にする。テープのマッサージは、激しくすべきだが、参加者に痛くないようにすべきである
４．テープを皮膚から滅菌したカモノハシ型ピンセットで除去する。
５．粘着性のある側をチューブの内側へ維持しながら、滅菌したピンセットまたはグローブをはめた手でストリップを折りたたむ。１．５ｍｌチューブの中にストリップを注意深く入れ、これを氷上に置く。ピンセットを用いて、粘着性のある側に触れるのを回避する。
−テープ８〜１１を２回テープ処理する。皮膚上にテープストリップを置き、これを１５〜２０秒間こすった後、９０度曲げて同じ領域を再度テープ処理する。皮膚をさらに１５〜２０秒間マッサージした後、テープをカモノハシ型ピンセットで注意深く除去する。
−テープを入れた後、テープが完全に緩衝液中に浸漬することができるように、チューブを転倒させる。
６．それに続く部位でテープの収集を繰り返す。
７．すべてのテープを氷上へ移動させる
８．ＲＮＡテープを１０〜２５秒間ボルテックスする
−ボルテックスすることで、テープが破壊されるのを支援し、溶解がより直ちに改善され、ＲＮアーゼから保護されることになる。
９．４２℃のヒートブロックまたはビーズを充填した水浴にすべてのチューブを３０分間置く。
−熱は、緩衝液中に収集したいかなるタンパク質も変性させるのを支援し、核酸抽出において役立つことになっている。
１０．ヒートブロックの後、直ちに取り外して、ドライアイス中に置く（５分間）か、ドライアイス＋エタノール中で瞬間凍結させる。その後、すべてのテープを−８０℃で保存する。
【０１０７】
単離および精製
微生物ＤＮＡ
１．単一のテープストリップ試料からＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｋｉｔ（登録商標）を用いてＤＮＡ抽出を実施した。
２．チューブをボルテックスし、６５℃で４５分間インキュベートして、テープの破壊を支援する。
３．１３，０００×ｇで３０分間遠心分離する。
４．上清を清潔なチューブへと移す。
５．ステップ３およびステップ４を繰り返す。
６．６００ｕｌの核溶解溶液を上清へ添加し、８０℃で５分間インキュベートする。
７．試料を室温へと冷却させ、３ｕｌのＲＮアーゼを添加した後、３７℃で３０分間インキュベートする。
８．２００ｕｌのタンパク質沈殿溶液を添加し、ボルテックスし、これを氷上で５分間置く。
９．３分間遠心分離し、６００ｕＬの室温のイソプロパノールを含有するチューブの中へと上清を移す。
１０．試料を混合し、１３０００〜１６０００×ｇで２分間遠心分離して、ＤＮＡをペレットにする。
１１．上清を除去し、ＤＮＡを６００ｕｌの７０％エタノールで洗浄する。
１２．１３０００〜１６０００×ｇで２分間遠心分離する。
１３．エタノールを除去し、ペレットを１０〜１５分間風乾させる。
１４．ＤＮＡを５０ｕＬのＤＮＡ再水和溶液中で再懸濁し、６５℃で１時間または４℃で一晩インキュベートする。
１５．テープの残渣はしばしば溶液中に残っているので、再水和したＤＮＡの最終スピンは、混入しているペレットを除去するために必要である。一度遠心分離したら、細菌ゲノムＤＮＡを含有する上清を除去し、下流の応用のために保存する。
【０１０８】
表皮ゲノムＤＮＡ
１．チューブを氷上で解凍する。
２．熱ブロックを７０℃に設定する。
３．緩衝液ＭＢＬを５５℃に加温する。
４．個々のテープをＱＩＡｍｐ  ＢＩＯｓｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ＤＮＡキットと共に提供されるビーズチューブの中へと移す。
５．４５０μｌの溶液ＭＢＬをペレットに添加し、ピペット処理によって再懸濁する。
６．１０秒間ボルテックスして混合し、７０℃のヒートブロックの中に１５分間置く。
７．テープをＢｅａｄ  Ｒｕｐｔｏｒで１分間ばらばらにする。
８．ＰｏｗｅｒＢｅａｄ  Ｔｕｂｅを１０，０００×ｇで３分間遠心分離して、細片をペレットにする。
９．上清を新たな２ｍｌ収集チューブ（提供される）に移す。
１０．１００μｌの溶液ＩＲＳを添加し、ボルテックスして混合する。
１１．室温で５分間インキュベートする。
１２．１０，０００×ｇで１分間遠心分離して、細片をペレットにする。
１３．上清を新たな２ｍｌ収集チューブ（提供される）に移す。
１４．１ｍｌの溶液ＢＢを添加する。ピペット処理またはパルスボルテックスして、混合する。
１５．簡単に遠心分離して蓋の最上部からいかなる液体も収集する。
１６．６００μｌの可溶化液をＭＢスピンカラムに搭載し、１０，０００×ｇで１分間遠心分離する。
１７．フロースルーを廃棄し、ＭＢスピンカラムを２ｍｌの収集チューブへと入れ戻す。すべての可溶化液がＭＢスピンカラムへ搭載されるまで、このステップを繰り返す。
１８．ＭＢスピンカラムを新たな２ｍｌ収集チューブ（提供される）へ移し、５００μｌの溶液ＣＢを添加することによって洗浄する。
１９．１０，０００×ｇで１分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、ＭＢスピンカラムを２ｍｌの収集チューブに入れ戻す。
２０．さらに５００μｌの溶液ＣＢで洗浄し、１０，０００×ｇで１分間スピンさせる。フロースルーを廃棄し、ＭＢスピンカラムを２ｍｌ収集チューブへ入れ戻す。
２１．１３，０００×ｇで２分間遠心分離して、ＭＢスピンカラム膜を乾燥させる。
２２．ＭＢスピンカラムを新たな２ｍｌ収集チューブ（提供される）へ移す。
２３．５０μｌの溶液ＥＢを膜の中心へ直接添加することによって溶離する。ＭＢスピンカラムを室温で最長５分間静置させておいて、溶離を最大限にする。
２４．１０，０００×ｇで１分間遠心分離する。
２５．ＭＢスピンカラムを廃棄し、ゲノムＤＮＡを含有する２ｍｌ収集チューブに蓋をする。
２６．１３，０００×ｒｐｍで３分間遠心分離して、上清を新たなチューブへ移す。
２７．ＤＮＡは、挿入色素キット（Ｑｕｂｉｔなど）を用いて定量化することができる。分光光度法は、有用であるとはこれまでのところ示されてはいない。
【０１０９】
表皮ＲＮＡ
１．チューブを氷上で解凍する
２．テープをＢｅａｄ  Ｒｕｐｔｏｒで３０秒間、＊＊＊設定を用いてばらばらにする。
３．チューブを４℃、２０，０００ｒｐｍ（できるだけ高く）で３０分間遠心分離して、テープを沈降させる。
４．上清（５００ｕＬ）を直ちに取り出し、新たなチューブへと入れる。
５．５００ｕｌの上清を同じ容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールと混合する。
６．１５秒間ボルテックスする。
７．卓上遠心機で１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
８．最上層を新たなチューブへと収集し、４００ｕｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加する。
９．１５秒間ボルテックスする。
１０．１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
１１．最上層を新たなチューブに収集し、３００ｕｌのクロロホルムを添加する。
１２．１５秒間ボルテックスする。
１３．１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
１４．最上層を新たなチューブへ収集し、１００ｕｌのイソプロパノールを添加することによって、技術マニュアルからのＰＲＯＭＥＧＡキットの説明書１５に従う．
１５．５秒間ボルテックスする。
１６．可溶化液をミニカラムへ移し、１４，０００ｇで３０秒間遠心分離する。
１７．フロースルーを廃棄し、ミニカラムを収集チューブへと入れ戻す。
１８．５００μｌのＲＮＡ洗浄溶液をミニカラムへと添加する。
１９．１４，０００ｇで３０秒間遠心分離する。
２０．収集チューブを空にする。
２１．滅菌チューブの中で、２４ｕｌのＹｅｌｌｏｗ  Ｃｏｒｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、３ｕｌのＭｎＣｌ２および３ｕｌのＤＮアーゼＩ（試料当たり）を組み合わせることによって、ＤＮアーゼＩインキュベーション混合物を調製する。緩徐なピペット処理によって混合する。
２２．３０μｌのＤＮアーゼＩインキュベーション混合物をカラムの内側の膜へ直接適用する。
２３．室温で１５分間インキュベートする。
２４．２００μｌのカラム洗浄溶液をミニカラムへ添加する。
２５．１４，０００×ｇで３０秒間遠心分離する。収集チューブを空にする必要はない。
２６．５００μｌのＲＮＡ洗浄溶液を添加する。
２７．１４，０００×ｇで３０秒間遠心分離する。
２８．収集チューブを廃棄し、ミニカラムを新たな収集チューブへと入れる。
２９．３００μｌのＲＮＡ洗浄溶液を添加する。
３０．高速で２分間遠心分離する。
３１．ミニカラムを収集チューブから溶離チューブへと移し、６０ｕｌのヌクレアーゼ非含有水を膜へ添加する。
３２．これを１分間静置させておく。
３３．４℃、１４，０００×ｇで１分間遠心分離する。カラムを取り出して廃棄する。精製されたＲＮＡを含有する溶離チューブに蓋をする。
３４．４℃、１３，０００×ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を新たなチューブへ移す。
３５．ＲＮＡは、挿入色素キット（Ｑｕｂｉｔなど）を用いて定量化することができる。分光光度法は、有用であることがこれまでのところ示されていない。
【０１１０】
少量のＤＮＡおよびＲＮＡ試料を取り扱うことに関するガイダンス
空気媒介の接触混入は、試料の取り扱い中に回避することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出ステップ中の混入の危険性の一部は、ヒトＰＣＲアンプリコンに由来する。したがって、危険を低減させるために、単離および増幅ステップは別個の部屋で実施することができる。例えば、ＰＣＲ部屋は、溶媒およびキットを基にしたＲＮＡ抽出、ならびに増幅前のステップのために別個のステーションを専用の装置（ボルテックス、遠心分離機、およびピペット）と共に装備されるよう創出することができる。その上、完全な滅菌環境を確保するために、これらのステーションは、紫外光およびＨＥＰＡフィルタが装備されることもできる。試薬と試料との間の交差混入は、単回使用の一定分量のプライマー、水、および試薬を用いることによって低減することができる。希釈した遺伝子発現Ｔａｑｍａｎプローブおよびピロシーケンスプライマーセットは、別個の−２０℃ユニットの中で保存することができる。ＤＮＡ抽出および重亜硫酸塩転化処理は、別個の部屋の中で実施することができ、そこではゲノムＤＮＡのみが取り扱われ、ＰＣＲ産物は許容されていない。いずれかのＰＣＲ産物が取り扱われて、例えば、アガロースゲルの中で可視化されることになっている場合、交差混入を回避するために別個の実験台領域において実施することができる。
【０１１１】
品質管理のために、適切な陽性対照および陰性対照を使用する。例えば、対照は、ＰＣＲ陰性対照（水のみ／ｃＤＮＡテンプレート対照なし）、逆転写酵素陰性対照（水のみ／ＲＮＡなし）およびＲＴ酵素陰性対照なし、ならびに適切な陽性対照（培養されたヒトケラチノサイト、ＨａＣａｔ）を含むことができる。
【０１１２】
下流の応用法
ショットガンメタゲノム配列決定
ＤＮＡの濃度をＱｕｂｉｔ（登録商標）を用いて測定した。増幅したライブラリ生成は、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ（登録商標）アダプタを用いて実施し、配列決定を実施して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００（登録商標）を用いて試料当たり２．５Ｇ塩基対の深度まで１５０ｂｐのＤＮＡ対形成末端リードを取得した。生の配列リードを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプログラムｂｃｌ２ｆａｓｔｑを用いて脱複合体化した。次に、生のリードをフィルタ処理し、プログラムＳｉｃｋｌｅを用いて品質管理のためにトリミングした１６。トリミングしたリードを、Ｋｒａｋｅｎを用いてカスタム微生物ゲノムデータベースへと整列させた１７。ｋマーの長さ３２の実際の配列リードマッチをＫｒａｋｅｎにおいて使用して、最小の共通祖先にリードを割り当てた。試料のうちでマッピングされた総リードの最小数に対する計数データの標準化を、ＲにおけるＶｅｇａｎパッケージによる希薄化を用いて実施して、属および種の両方のレベルにおける相対量を付与した１８。主成分分析は、Ｒにおけるａｄｅ４およびＶｅｇａｎパッケージを用いて、標準化された種の量のデータから算出されたＥｕｃｌｉｄｉａｎ差異マトリックスに関して実施した。機械学習アルゴリズムであるＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔを用いて、ＲパッケージランダムＦｏｒｅｓｔおよびＢｏｒｕｔａを用いる患者コホートを区別する鍵となる種を同定した１９、２０。
【０１１３】
重亜硫酸塩ピロシーケンス
ＤＮＡｍ測定のために、２０ｕｌのテープゲノムＤＮＡを一晩の重亜硫酸ナトリウム処理へ供し、製造元の仕様書によってＥＺ  ＤＮＡメチル化−Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。ピロシーケンスは、製造元の説明書に従って、ＰｙｒｏＭａｒｋ真空プレップワークステーションおよびＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ９６ＭＤ機器（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にＰｙｒｏ  Ｇｏｌｄ試薬を用いて実施した。生成したピログラムは、Ｐｙｒｏ  Ｑ−ＣｐＧメチル化分析ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて自動分析した。
【０１１４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
１６ｕｌのＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との逆転写酵素反応を実施した。陰性対照試料および陽性対照試料をこの時点で創出した。反応物を１０倍希釈し、６．７５ｕｌを各ＰＣＲ反応に使用した。製造元の説明書に従って、ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）、ＦＬＧ（Ｈｓ００８５６９２７＿ｇ１）、ＬＯＲ（Ｈｓ０１８９４９６２＿ｓ１）およびＫＲＴ１４（Ｈｓ００２６５０３３＿ｍ１）についてのＴａｑｍａｎプローブを使用した。
【０１１５】
材料：
収集
・Ｓｍａｒｔｓｏｌｖｅ，Ｂｏｗｌｉｎｇ  Ｇｒｅｅｎ，ＯＨ；１ｉｎ．×３０ｙｄロール（カタログ番号ＩＴ１１２０２１Ｓ）
・ＢＬ＋ＴＧ緩衝液（４Ｍグアニジンチオシアナート、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、２％１−チオグリセロール）
【０１１６】
ＤＮＡ単離
・ＱＩＡａｍｐ  ＢｉＯｓｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ＤＮＡキット（カタログ番号１２２４０−５０）
・ＺｙｍｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼプレミックス（カタログ番号Ｅ２００４）
・ＥＺ  ＤＮＡ  メチル化−Ｇｏｌｄキット（カタログ番号Ｄ５００６）
【０１１７】
ＲＮＡの単離
・フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（カタログ番号ＡＭ９７２２）
・Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ細胞ミニプレップシステム（カタログ番号Ｚ６０１２）
【０１１８】
遺伝子発現
・ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ  ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号１１７５６５００）
・ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）
・ＦＬＧ（Ｈｓ００８５６９２７＿ｇ１）
・ＬＯＲ（Ｈｓ０１８９４９６２＿ｓ１）
・ＫＲＴ１４（Ｈｓ００２６５０３３＿ｍ１）
・Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（カタログ番号４４４４９６３）
【０１１９】
実施例４：方法の開発において試験された収集技術／材料の比較
侵襲性が最小限の皮膚収集のためのいくつかの方法は、過去何年にもわたって出現してきた１〜３。皮膚からの核酸、タンパク質および間質液の収集については、方法は剥削技術４、皮膚テープ４〜１１またはシアノアクリラート剥離、逆イオン泳動４、および超音波に基づく方法１２を含む。同様に、皮膚をＱチップ、ガーゼまたは皮膚テープで試料採取することはこれまで、ミクロビオームを試料採取するための信頼できる方法である。
【０１２０】
異なる種類のストリップ（水溶性ストリップ対水不溶性ストリップ）をＤＮＡ／ＲＮＡ単離について検査し、収量を比較した（表１を参照されたい）。Ｓｍａｒｔｓｏｌｖｅテープは水溶性であるのに対し、他のテープであるＴｅｇａｄｅｒｍ包帯、Ｔｒａｎｓｐｏｒｅ手術用テープ、Ｂｌｅｎｄｅｒｍ手術用テープ、Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  Ｂｒｕｓｈ、Ｓｈｅｅｒ包帯、および繊維状包帯はすべて水不溶性である。侵襲性が最小限の収集技術を評価するために使用する臨界点を表２に示す。
【０１２１】
図１１は、異なる材料の接着テープを用いて皮膚から収集したＲＮＡからのＦＬＧ発現（ＧＡＰＤＨの発現に対して標準化）の定量的な結果を示す。水溶性接着テープ（Ｓｍａｒｔｓｏｌｖｅ（登録商標））は、他の水不溶性接着テープ（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（登録商標）、ＢａｎｄＡｉｄ（登録商標）、およびＴｒａｎｓｐｏｒｅ（登録商標））よりも高いＲＮＡ収量を示す。
【表１】
2020508689.tif 000003
【表２】
2020508689.tif 000004
【０１２２】
参考文献
１  Ｂａｒａｓｈ，Ｍ．，Ｒｅｓｈｅｆ，Ａ．＆Ｂｒａｕｎｅｒ，Ｐ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔａｐｅ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｃｒｉｍｅ  ｓｃｅｎｅ  ｉｔｅｍｓ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  ５５，１０５８−１０６４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５５６−４０２９．２０１０．０１４１６．ｘ（２０１０）。
２  Ｋｏｐｋａ，Ｊ．，Ｌｅｄｅｒ，Ｍ．，Ｊａｕｒｅｇｕｉｂｅｒｒｙ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｒｅｍ，Ｇ．＆Ｂｏｓｅｌｌｉ，Ｇ．Ｏ．Ｎｅｗ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｏｎ  ａ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｓｅｌｆ−ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ｓｅａｌ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌａｔｅｎｔ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  ５６，１２３５−１２４０，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５５６−４０２９．２０１１．０１８５３．ｘ（２０１１）。
３  Ｐａｌｉｗａｌ，Ｓ．，Ｏｇｕｒａ，Ｍ．＆Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．Ｒａｐｉｄ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｖｉａ  Ｓｋｉｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１２５５−１２６３，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−０１０−００８１−２（２０１０）。
４  Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．＆Ｍａｉｂａｃｈ，Ｈ．Ｉ．Ｗｈｙ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｋｉｎ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ？Ａ  ｂｒｉｇｈｔ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｏｃｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ３０，１−６，ｄｏｉ：１０．３１０９／１５５６９５２７．２０１０．５１７２３０（２０１１）。
５  Ｂｅｎｓｏｎ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｓｓａｇｅｓ  ｉｎ  ｌｅｓｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｌｅｓｉｏｎａｌ  ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ｓｋｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔａｐｅ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １２６，２２３４−２２４１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｊｉｄ．５７００４１２（２００６）。
６  Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｌｏｔｖｅｄ，Ｈ．Ｃ．，Ｋｒｏｇｆｅｌｔ，Ｋ．Ａ．＆Ａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｔａｐｅ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｃｏｒｎｅｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６，８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１９９１８（２０１６）。
７  Ｅｍｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ  ａ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，１２，ｄｏｉ：１０．１１８６／２００１−１３２６−２−１２（２０１３）。
８  Ｍｏｒｈｅｎｎ，Ｖ．Ｂ．，Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｙ．＆Ｒｈｅｉｎｓ，Ｌ．Ａ．Ａ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ４１，６８７−６９２（１９９９）。
９  Ｗａｃｈｓｍａｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １６４，７９７−８０６，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１３３．２０１１．１０２３９．ｘ（２０１１）。
１０  Ｗｏｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ＲＮＡ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔａｐｅ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｓｋｉｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １２３，１５９−１６７，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．００２２−２０２Ｘ．２００４．２２７２９．ｘ（２００４）。
１１  Ｗｏｎｇ，Ｒ．，Ｔｒａｎ，Ｖ．，Ｔａｌｗａｌｋｅｒ，Ｓ．＆Ｂｅｎｓｏｎ，Ｎ．Ｒ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔａｐｅ  ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４，８１−９２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｄｅｒｍｓｃｉ．２００６．０８．００７（２００６）。
１２  Ｌｅｃｏｍｔｅ，Ｍ．Ｍ．Ｊ．，Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｋａｙ，Ｄ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎｓ，Ｊ．Ｌ．＆Ｉｎｇｒａｍ，Ｊ．Ｒ．Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳｏｎｏＰｒｅｐ（Ｒ）ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｓｋｉｎ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｉｓ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓｋｉｎ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９，２７−３４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１６００−０８４６．２０１２．００６４１．ｘ（２０１３）。
１３  Ｈａｒｄｅｒ，Ｊ．＆Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．ＲＮａｓｅ  ７，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，４６７７９−４６７８４，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ２０７５８７２００  （２００２）。
１４  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＤＮａｓｅ  ２  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ＤＮＡ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ１７５８１，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１７５８１（２０１１）。
１５  Ｐｒｏｍｅｇａ．ｉｎ  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｅｂｓｉｔｅ（２０１２）。
１６  Ｊｏｓｈｉ，Ｎ．Ｓｉｃｋｌｅ：Ａ  ｓｌｉｄｉｎｇ−ｗｉｎｄｏｗ，ａｄａｐｔｉｖｅ，ｑｕａｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ＦａｓｔＱ  ｆｉｌｅｓ．（２０１１）。
１７  Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｅ．＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｋｒａｋｅｎ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘａｃｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，Ｒ４６，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２０１４−１５−３−ｒ４６（２０１４）。
１８  Ｏｋｓａｎｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ｖｅｇａｎ：Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３−０．（２０１５）。
１９  Ｌｉａｗ，Ａ．＆Ｗｉｅｎｅｒ，Ｍ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ．Ｒ  Ｎｅｗｓ  ２，１８−２２（２００２）。
２０  Ｋｕｒｓａ，Ｍ．Ｂ．＆Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｗ．Ｒ．Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｂｏｒｕｔａ  Ｐａｃｋａｇｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３６（２０１０）。
【０１２３】
他の実施形態
本明細書において開示される特長はすべて、いかなる組み合わせにおいても組み合わせることができる。本明細書において開示される各特長は、同じ、等価の、または類似の目的を提供する代替的な特長によって置き換えることができる。したがって、別段に明白に記載されていない限り、開示された各特長は、等価のまたは類似の特長の一般的なシリーズの例に過ぎない。
【０１２４】
先の説明から、当業者は、本開示の必須の特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に当てはめるために、本開示の種々の変更および修正をなすことができる。したがって、他の実施形態は、特許請求の範囲内でもある。
【０１２５】
等価物
いくつかの本発明の実施形態を本明細書において説明および解説してきたが、当業者は、本明細書に説明する機能を実施し、ならびに／または結果および／もしくは利点のうちの１つ以上を取得するための種々の他の手段ならびに／または構造を容易に想定するであろうし、このような変更および／または修正の各々は、本明細書に説明する本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書で説明するパラメータ、寸法、材料、および／または構造がすべて例示的であるよう意図されており、本発明の教示が使用される具体的な１つのまたは複数の応用によるであろうことを容易に認識するであろう。当業者は、本明細書に説明する具体的な本発明の実施形態に対する多くの等価物を、単に決まり切った実験を用いて認識するであろうし、または確認することができるであろう。それゆえ、先の実施形態が例としてに過ぎないが提示されており、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明の実施形態が具体的に説明および特許請求された以外に実施され得ることは理解されることになっている。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に説明する各個々の特長、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられる。さらに、このような特長、システム、物品、材料、キット、および／または方法のうちの２つ以上のいずれかの組み合わせは、このような特長、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に不一致ではない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０１２６】
すべての定義は、本明細書で定義および使用する場合、辞書汀な定義、参照により援用される文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味を管理すると理解されるべきである。
【０１２７】
本明細書に開示される参考文献、特許および特許出願はすべて、各々が引用される発明の対象に関して参照により援用され、いくつかの場合、本文書の完全性を包含することができる。
【０１２８】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、別段に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【０１２９】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合の句「および／または」は、そのように協同する要素、すなわち、いくつかの場合において共同で存在し、他の場合において別個に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味するものと理解されるべきである。「および／または」で列挙される複数の要素は、同じ様式、すなわち、そのように協同する要素の「１つ以上」で解釈されるべきである。他の要素は、具体的に同定される要素に関していようと関していまいと、「および／または」の節によって具体的に同定される要素以外を場合により表し得る。したがって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」に対する参照は、「を含んでいる」のような開放末端の言語と共に使用するとき、一実施形態においてはＡのみを指すことができ（場合により、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態において、Ｂのみを指すことができ（場合によりＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態において、ＡおよびＢの両方を指すことができる（場合により、他の要素を含む）などである。
【０１３０】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「または」は、先に定義した「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包含されているものと解釈されなければならず、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つの包含だけでなく、１つを超える包含も、および場合により、追加の列挙されていない項目も含むものと解釈されなければならない。「たった１つの」または「実際に１つの」または、特許請求の範囲において使用するとき、「からなる」のような対照的に明確に示される用語のみが要素の数またはリストのうちの実際に１つの要素の包含を指すであろう。概して、本明細書で使用する場合の「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちのたった１つ」、または「のうちの実際に１つ」など、排他的な点によって先行されるとき、排他的な代替物（すなわち、「１つまたはもう１つだが両方ではない」）を示すものと解釈されるのみでなければならない。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用するとき、特許法の分野において使用される通常の意味を有さなければならない。
【０１３１】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、１つ以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という句は、要素のリストにおける要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するよう理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙されるありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストにおける要素のいかなる組み合わせも除外しない。この定義は、「少なくとも１つ」という句が具体的に同定される要素に関していようといまいと指す要素のリスト内で具体的に同定される要素以外に要素が場合により存在し得ることも許容する。したがって、非限定例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または等価に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または等価に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、１つよりも多いＡを場合により含み、Ｂは存在しない（および場合によりＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態において、１つよりも多いＢを場合により含み、Ａは存在しない（および場合によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、さらに別の実施形態において、１つよりも多いＡを場合により含む少なくとも１つのＡと、１つよりも多いＢを場合により含む少なくとも１つのＢ（および場合により他の要素を含む）を指すことができるなどである。
【０１３２】
対照的に別段に明確に示されない限り、１つよりも多いステップまたは行為を含む本明細書で特許請求されるいずれかの方法において、本方法のステップまたは行為の順序が本方法のステップまたは行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
【図１】
2020508689.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020508689.tif 000011
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2020508689.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
2020508689.tif 000016
【図１０−２】
2020508689.tif 000017
【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
2020508689.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
2020508689.tif 000025
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020508689.tif 000027
【図１３Ｃ】
2020508689.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月6日(2019.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020508689000001.app
【国際調査報告】
2020508689.tif 000029
2020508689.tif 000030