(57)【要約】本開示は、標的ウイルス核酸の切断に使用するためのガイドＲＮＡを提供する。本開示は、ＨＰＶ感染症の処置のための、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ならびに特定の配列および修飾を有するガイドＲＮＡを含み、いずれのＲＮＡもナノ粒子によってカプセル化されている組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、感染組織への局所または局部送達のための担体製剤中に懸濁され得る脂質ナノ粒子にパッケージングされている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡはまた、感染細胞へのＲＮＡの送達および感染細胞内での滞留を促進する修飾ヌクレオチドなどの特色も含む。
2020515258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス核酸における標的と相補的なターゲティング領域を有するガイドＲＮＡ核酸分子を含む、合成ガイドＲＮＡ。
【請求項２】
前記ウイルス核酸が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸である、請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３】
前記ＨＰＶ核酸がＨＰＶ１６核酸である、請求項２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項４】
配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含む、請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６を含む、請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項７】
配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項８】
前記ターゲティング領域が、配列番号３９または配列番号４０を含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９】
前記標的が、配列番号６４または配列番号６５を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０】
配列番号８０を含む、請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ＨＰＶ核酸がＨＰＶ１８核酸である、請求項２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２】
配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つを含む、請求項１１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１３】
配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１４】
配列番号３１、３３、３５、または３７を含む、請求項１１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１５】
配列番号３１、３３、３５、または３７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１６】
前記ウイルス核酸が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸である、請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１７】
配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つを含む、請求項１６に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１８】
配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１６に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１９】
配列番号４１、４３、または４５を含む、請求項１６に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２０】
配列番号４１、４３、または４５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１６に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２１】
１つまたは複数の修飾塩基を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２２】
２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２３】
各々が２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；および２’−Ｏ−メチルアデノシンからなる群から選択される複数の修飾塩基を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２４】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、修飾塩基を有するヌクレオチドにさらによって置換されており、各修飾塩基が、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２５】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドの少なくとも約２０％が、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２６】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドの少なくとも約２０％が、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基をさらに含む、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２７】
２つのヌクレオシド間にホスホロチオエート結合を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２８】
前記ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内に１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項２９】
前記ガイドＲＮＡにおける前記ヌクレオシド間結合のうちの１つまたは複数が、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３０】
前記ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内の前記ヌクレオシド間結合のうちの１つまたは複数が、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３１】
架橋型核酸（ＢＮＡ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３２】
ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３３】
配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３４】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、架橋型核酸（ＢＮＡ）を有するヌクレオチドによってさらに置換されている、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３５】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、ロックド核酸（ＬＮＡ）を有するヌクレオチドによってさらに置換されている、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３６】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を有するヌクレオチドによってさらに置換されている、請求項６、７、１４、１５、１９、または２０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３７】
前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、（ａ）各修飾塩基が２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、または２’−Ｏ−メチルアデノシンである修飾塩基；（ｂ）リボース糖に２’−Ｏ−メチル基；（ｃ）２つのヌクレオシド間のホスホロチオエート結合；（ｄ）ＬＮＡ、ＢＮＡ、もしくはＣＲＮ；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せを有するヌクレオチドによってさらに置換されている、請求項６または７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項４０】
ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ；
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ；
カチオン性脂質を含み、前記ｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡをカプセル化している複数のナノ粒子；
ならびに担体製剤
を含む組成物。
【請求項４１】
前記担体製剤が、前記脂質ナノ粒子を安定化し、組織滞留および組織浸透を促進することによって局所または局部送達を増強する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ガイドＲＮＡが、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを含む、請求項４０または請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ガイドＲＮＡが、請求項２〜１５のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物が１種より多くのガイドＲＮＡを含み、前記１種より多くのガイドＲＮＡが、異なるポリヌクレオチド配列、修飾、または両方を有する、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
異なるポリヌクレオチド配列を有するガイドＲＮＡ分子を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ガイドＲＮＡの異なる種が、同じウイルス核酸の異なる標的に結合する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ガイドＲＮＡの異なる種が、異なるウイルス核酸の標的に結合する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ナノ粒子がＰＥＧ化されている、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記複数のナノ粒子が前記担体製剤内に分散され、前記担体製剤が、担体液体、油、またはゲルを含む、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記Ｃａｓ９が、野生型Ｃａｓ９と比較して１〜２５個の間のアミノ酸置換を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記アミノ酸置換のうちの１つまたは複数が、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、Ｋ１００３、またはＲ１０６０である、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記Ｃａｓ９が、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、およびＲ１０６０Ａを含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ｍＲＮＡのコード配列が、複数の５−メチルシチジンを含む、請求項４０〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ｍＲＮＡのコード配列が、複数のシュードウリジンまたは５メトキシ−ウリジンを含む、請求項４０〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；
前記ガイドＲＮＡが、（ａ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つ、または（ｂ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含み；
前記複数のナノ粒子が、前記担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含み；
前記複数のナノ粒子が、前記担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；
前記ガイドＲＮＡが、（ａ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つ、または（ｂ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含み；
前記複数のナノ粒子が、前記担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つを含み；
前記複数のナノ粒子が、前記担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；
前記ガイドＲＮＡが、（ａ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つ、または（ｂ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含み；
前記複数のナノ粒子が、前記担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；
前記ガイドＲＮＡが、配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つを含み；
前記複数のナノ粒子が、前記担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項６４】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、３７、４１、４３、４５、７４、７５、または７６を含み、前記ガイドＲＮＡの複数の前記ヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基が、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号４１、４３、４５、７４、７５、または７６を含み、前記ガイドＲＮＡの複数の前記ヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基が、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項６７】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓエンドヌクレアーゼを含むリボヌクレオタンパク質。
【請求項６８】
前記ガイドＲＮＡが、請求項２〜１５のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを含む、請求項６７に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項６９】
前記ガイドＲＮＡが、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを含む、請求項６７または請求項６８に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項７０】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項７１】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つを含む、請求項６７に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項７２】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つを含む、請求項６７に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項７３】
前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項７４】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、（ａ）配列番号６１、６２、６３、もしくは８４に記載のアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、もしくは７８に記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載のリボヌクレオタンパク質。
【請求項７５】
請求項６７〜７４のいずれか一項に記載のリボヌクレオタンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７６】
対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に請求項１〜３７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡの治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項７７】
対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に請求項３８に記載のＤＮＡ分子の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項７８】
対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に請求項３９に記載のベクターの治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項７９】
対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に請求項４０〜６６のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項８０】
対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載のリボヌクレオタンパク質、または請求項７５に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項８１】
前記対象がヒトである、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症を処置する方法であって、それを必要とする患者の感染部位に、請求項４０〜６１および６４〜６５のいずれかに記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項８３】
前記患者がＨＰＶ感染症を有し、ＨＰＶ陽性軽度もしくは高度前がん病変、ＨＰＶ陽性扁平上皮内癌、またはＨＰＶ陽性浸潤がんと診断されている、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ウイルス感染症を処置するための組成物であって、
配列番号６３に対して、アミノ酸１４９〜１６５；アミノ酸２３５〜２４９；アミノ酸５６６〜５８０；アミノ酸７２１〜７３５；アミノ酸８８０〜８９４；アミノ酸９５２〜９６６；およびアミノ酸１３１２〜１３２６からなる群から選択されるものの中で１つまたは複数の置換を有する、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、または前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む組成物。
【請求項８５】
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）、またはヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）、およびヒトポリオーマウイルス（ＢＫ、ＪＣ、またはメルケル細胞、ＭＣＶ）からなる群から選択されるウイルスからのウイルス標的に対して特異的である１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
ＥＢＶ、ＨＰＶ、およびＨＢＶからなる群から選択されるウイルスからのウイルス標的に対して特異的である１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８７】
前記１つまたは複数の置換が、配列番号６３に対して、Ｒ１５２、Ｉ１５４、Ａ１５７、Ｆ２３８、Ｎ２４０、Ａ２４３、Ｆ５６９、Ｋ５７１、Ｃ５７４、Ｗ８８３、Ｑ８８５、Ｎ８８８、Ｖ９５５、Ｌ１３１５、およびＮ１３１７から選択される位置であり、各々がＫ、Ｖ、Ｓ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｔ、およびＮのうちの１つに置換されている、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
前記１つまたは複数の置換が、配列番号６３に対して、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑから選択される、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記置換が、配列番号６３に対して、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑのうちの少なくとも６つを含む、請求項８４〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９０】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが配列番号６２を含む、または前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号５５、５６、５７、５８、６１、７６、６８、６９、および７０からなる群から選択される配列を含む、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドをｍＲＮＡの形態で含む、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記ガイドＲＮＡがＨＰＶを標的とする、請求項８４〜９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１〜３８および７１〜７３からなる群から選択される配列を含む、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、６６、７１、７２、および７３からなる群から選択される配列を含む、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、７４、７５、および７６からなる群から選択される配列を含み、前記ガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、修飾塩基を有する複数のヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基が、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジンからなる群から選択される、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９７】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、または前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドが、リポソームまたは脂質ナノ粒子にパッケージングされている、請求項８４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをリポソームに包まれた活性なＲＮＰとして含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
前記ポリヌクレオチドを脂質ナノ粒子にカプセル化されたｍＲＮＡとして含む、請求項９７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する声明
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、それにより参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、９３０２８５＿４２１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは１４５ＫＢであり、２０１８年３月２８日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出されている。
【０００２】
本開示は、ウイルス処置組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルス感染症は、世界全体の疾患および死亡の重要な原因である。例えば、子宮頸がんは、ある特定のタイプのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症によって引き起こされる。２つのＨＰＶタイプ（１６および１８）が、子宮頸がんおよび前がん子宮頸部病変の７０％を引き起こす。ＨＰＶはまた、頭頸部（中咽頭）、肛門、外陰部、膣、および陰茎のがんにも関連している。世界保健機関によれば、２０１２年におよそ２７０，０００人の女性が子宮頸がんのために死亡した。世界全体で、子宮頸がんは、女性で４番目に多いがんであり、２０１２年における新たな症例は推定で５３０，０００例であり、全ての女性のがんによる死亡の７．５％となっている。
【０００４】
ＨＰＶは、集合的にパピローマウイルスとして公知のＤＮＡウイルスのファミリーであるパピローマウイルス科のメンバーである。パピローマウイルスは、体表面組織の基底層で複製する。パピローマウイルスは、無エンベロープであり、このことは、ウイルスの外殻またはカプシドが脂質膜によって覆われていないことを意味している。Ｌ１として知られる単一のウイルスタンパク質は、５５〜６０ナノメートルのカプシドを形成する。ほとんどの無エンベロープウイルスと同様に、カプシドは、幾何学的に規則正しく、正二十面体の対称性を表す。ＨＰＶゲノムは、長さ約８，０００塩基対の二本鎖環状ＤＮＡ分子である。これは、ゲノムウイルスＤＮＡをパッケージングする細胞ヒストンタンパク質と共にＬｌシェル内にパッケージングされている。
【０００５】
Ｌ１コートタンパク質に基づくＨＰＶのワクチンが存在する。しかし、それらのワクチンは、ウイルスに曝露する前に投与しなければならない。ワクチンは、ＨＰＶ感染症またはＨＰＶ関連疾患、例えばがんを処置することはできず、ＨＰＶ感染症の公知の治療法はない。
【０００６】
重要な健康上の意義を有する別のウイルスは、Ｂ型肝炎である。世界保健機関は、２億５７００万人の人が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症に罹っていると推定している。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、肝臓を攻撃し、急性および慢性疾患の両方を引き起こし得る。ＨＢＶは、長さが約３ｋｂｐのゲノムを有し、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を含有する部分的二本鎖のＤＮＡウイルスである（SeegerおよびMason、Virology、４７９〜４８０巻：６７２〜６８６頁、２０１５年）。標的細胞に入ると、ＤＮＡは、核において共有結合的に閉環した環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）へと変換され、これは次いでウイルスｍＲＮＡ合成の鋳型を形成する（SeegerおよびMason、Virology、４７９〜４８０巻：６７２〜６８６頁、２０１５年）。
ＨＰＶまたはＨＢＶによる感染症などのウイルス感染症を予防および処置する治療アプローチがなおも必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】SeegerおよびMason、Virology、４７９〜４８０巻：６７２〜６８６頁、２０１５年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、ウイルス核酸、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはＨＢＶ核酸を標的とするガイドＲＮＡを提供する。追加の態様では、本開示は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、およびウイルス核酸を標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはそのようなＣａｓエンドヌクレアーゼおよび／もしくはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＢＶまたはＨＰＶ感染症などのウイルス感染症の処置のための、（ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および（ｂ）１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、特定の配列および修飾を含んでもよく、ナノ粒子によってカプセル化されていてもよい。
【０００９】
一部の実施形態では、組成物は、ウイルス標的、例えばエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）、またはヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）に対して特異的である１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、組成物は、修飾ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ならびにエピソーム形態でおよび／または宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれて存在する完全長および部分的断片を含むＨＰＶゲノムに対してＣａｓエンドヌクレアーゼをターゲティングする１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、その部位がヒトゲノムでも出現しない、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のゲノム内の部位と相補的であるターゲティング領域を含む。
【００１１】
別の実施形態では、組成物は、修飾ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ならびにＨＢＶゲノムに対してＣａｓエンドヌクレアーゼをターゲティングする１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、感染細胞へのＲＮＡの送達および感染細胞内での滞留を促進する修飾ヌクレオチドなどの特色を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡにおける修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡ安定性を改善する、免疫原性を低減する、またはエンドヌクレアーゼ活性の特異性を改善するように機能し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、リボース環に１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチル基、ヌクレオチド間の１つもしくは複数のホスホロチオエート結合、または両方などの、特にエクソヌクレアーゼ消化に対して保護することができるガイドＲＮＡの５’および３’末端に対して近位に位置する特色を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ウイルス標的に対する結合を安定化し、非ウイルス標的（例えば、ヒトＤＮＡ）に対する結合を低減し、またはエンドヌクレアーゼ活性の特異性を増強し得る、１つまたは複数のロックド核酸、架橋型核酸、または配座制限（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）核酸を、例えばターゲティング領域内に、必要に応じて含み得る。さらなる実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９と比較して、特異性を増強し、およびオフターゲット活性を減少させ得る（例えば、ガイドＲＮＡ標的の外部の位置で標的ＤＮＡとの相互作用を不安定にすることによって）変異を含んでもよい。なおさらなる実施形態では、ＲＮＡは、患者による免疫応答を最小限にし得るシュードウリジンまたは５−メチル−シトシンなどの修飾を含んでもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、好ましくはプログラム可能なヌクレアーゼ、例えばＣａｓエンドヌクレアーゼまたは修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、野生型バージョンと比較して、免疫原性が減少するように修飾されている修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする。コードされる修飾ヌクレアーゼは、野生型と比較して、Ｔ細胞エピトープ内に１つまたは複数の置換を含み得る。特に、治療タンパク質をｍＲＮＡとして送達する場合、免疫応答を回避するために治療剤を修飾することは難題である。修飾ヌクレオチド配列を使用することによって、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されると、結果として得られたタンパク質は、野生型と比較して、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発しない代替または修飾エピトープを有し得る。本開示は、１つまたは複数の予想されるＴ細胞エピトープが、野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して免疫応答を回避または減少させる置換を有する、修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質配列を含む。修飾Ｔ細胞エピトープを有する修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、ＤＮＡベクターにおいて、タンパク質形態（例えば、抗ウイルスガイドＲＮＡと複合体を形成した修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する活性なリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）として）で、または標的細胞内で翻訳されるｍＲＮＡとしてコードされた細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、例えば１つまたは複数のガイドＲＮＡと共にｍＲＮＡ形態で送達される。
【００１４】
一実施形態では、Ｃａｓ９コードｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、固体ナノ粒子、またはリポソームにパッケージングされている。そのような実施形態では、ＲＮＡカプセル化ナノ粒子を、感染組織への局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、粘膜、または局部（ｌｏｃａｌ）送達のために製剤化することができ、これによって全身送達および循環が回避され、このようにしてＣａｓエンドヌクレアーゼの薬物曝露、オフターゲット活性、および免疫原性が最小限となる。一実施形態では、ＲＮＡは、例えば、リン酸骨格の電荷の均衡を保ち、ＲＮＡの組織を通しておよび細胞中への浸透、ならびに細胞内での放出を促進するカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子にパッケージングされている。Ｃａｓ９コードｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化している脂質ナノ粒子を、組織滞留亢進剤または増粘剤、例えばヒドロキシエチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースなどを含み得る、適したゲルまたは懸濁液、例えば水性懸濁液を含有する局所用製剤でさらに提供され得る。本明細書において企図されるＬＮＰ製剤は、ＬＮＰ安定性を増強するための１つまたは複数の賦形剤、例えば、スクロースまたはマンニトールなどを含み得る。同様に、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤が局所送達のために調製される場合、製剤は、組織浸透を亢進するための賦形剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、エタノール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、スクロースエステル、またはＮ−メチルピロリドンなどを含み得る。ある特定の実施形態では、本説明に従うＬＮＰ製剤は、基底上皮へのＲＮＡ送達を増強するデバイス、例えば、マイクロニードルアレイなどによって投与され得る。
【００１５】
具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、ＨＰＶ感染症に関連する高度前がん性病変などの感染部位の局所または局部に適用される。そのような実施形態では、ＬＮＰによってカプセル化されたガイドＲＮＡは、細胞内に放出され、ＬＮＰによってカプセル化されたｍＲＮＡは、放出され、細胞のリボソームによって翻訳されて、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを産生する。本組成物および製剤の文脈において使用するためのＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、リンカー配列、ならびに最適な核局在化のために設計された１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端および／またはＣ末端に含み得る。翻訳後、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、提供されたガイドＲＮＡ（単数または複数）と複合体を形成して、活性なＲＮＰを形成する。ＲＮＰは、核へと移行し、ガイドＲＮＡの相補的部分とウイルスゲノム内の標的との間の配列特異的相互作用によって、ウイルスゲノムに結合する。ウイルス標的に結合すると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼはウイルスゲノムを切断する。結果として生じたウイルスＤＮＡ断片は、細胞経路によって分解または修復され、それによって感染症を取り除くまたは妨害し得る。
【００１６】
一態様では、本開示は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ；配列番号１〜３８、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つに記載の核酸配列を含むガイドＲＮＡ、またはその修飾塩基を有するバージョン；カチオン性脂質を含み、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化している複数のナノ粒子（すなわち、「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」）；ならびに担体製剤を含む組成物を提供する。具体的な実施形態では、担体製剤は、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化しているＬＮＰを安定化する１つまたは複数の構成成分を含み得る。さらなる実施形態では、担体製剤は、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化しているＬＮＰを安定化する１つまたは複数の構成成分、ならびに組織滞留および／または組織浸透を促進することによって局所または局部送達を増強する１つまたは複数の構成成分を含み得る。脂質ナノ粒子に使用されるカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含み得る。ある特定の実施形態では、複数のＬＮＰは、担体製剤内に分散されている固体脂質ナノ粒子であり、担体製剤は、担体液体、油、またはゲルを含む。本明細書に記載される組成物に含まれるＬＮＰは、ＰＥＧ化されてもよい。さらなる実施形態では、ＬＮＰにカプセル化されたｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、または５８を含み；ＬＮＰにカプセル化されたガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７を含み；複数のＬＮＰは、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【００１７】
一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９と比較して、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、Ｋ１００３、およびＲ１０６０からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも１つの多様性を必要に応じて含むＣａｓ９であり得る。例えば、Ｃａｓ９は、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、およびＲ１０６０Ａを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのコード配列は、複数の５−メチルシチジンを含む。ｍＲＮＡのコード配列は、複数のシュードウリジンまたは５メトキシ−ウリジンを含み得る。
【００１８】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号６３に対して、アミノ酸１４９〜１６５；アミノ酸２３５〜２４９；アミノ酸５６６〜５８０；アミノ酸７２１〜７３５；アミノ酸８８０〜８９４；アミノ酸９５２〜９６６；またはアミノ酸１３１２〜１３２６内に１つまたは複数の置換（例えば、１〜２５個の間）を有する、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の置換は、配列番号６３に対して、Ｒ１５２、Ｉ１５４、Ａ１５７、Ｆ２３８、Ｎ２４０、Ａ２４３、Ｆ５６９、Ｋ５７１、Ｃ５７４、Ｗ８８３、Ｑ８８５、Ｎ８８８、Ｖ９５５、Ｌ１３１５、およびＮ１３１７から選択される位置であり、各々は、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｔ、またはＮのうちの１つに置換されている。
【００１９】
一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化シグナルを含み得る。
【００２０】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）；２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％の間）の修飾塩基を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド間に１〜９個の間のホスホロチオエート結合を含む。ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの架橋型核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および／または配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含み得る。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３９または配列番号４０に記載の核酸配列を含むターゲティング領域を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のうちの１つであり、必要に応じて各々が２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）；２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのヌクレオチドの約２０〜１００％は、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、必要に応じてヌクレオチドの約２０〜１００％が、リボース糖にメチルまたは２’−Ｏ−メチル基などの修飾を有する、配列番号４１、４３、および４５のうちの１つであり、好ましくは各々が２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）；２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％）の修飾塩基を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、４５からなる群から選択される配列を含み、さらにガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基を含む。
【００２３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症を処置する方法もまた、本明細書に提供する。そのような方法の実施形態は、それを必要とする患者の感染部位に、本明細書に記載される組成物の有効量を投与するステップを含む。患者は、ＨＰＶ感染症を有していてもよく、またはＨＰＶ陽性軽度もしくは高度前がん病変、ＨＰＶ陽性扁平上皮内癌、もしくはＨＰＶ陽性浸潤がんと診断されている。
【００２４】
ある特定の態様では、本発明は、ウイルス感染症を処置するための本明細書に開示の組成物を提供する。組成物は好ましくは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）、およびヒトポリオーマウイルス（ＢＫ、ＪＣ、またはメルケル細胞、ＭＣＶ）からなる群から選択されるウイルスからのウイルス標的に対して特異的である１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＥＢＶ、ＨＰＶ、またはＨＢＶに対して特異的である。
【００２５】
特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含み、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６０および６７〜７８のうちの１つを含む。一実施形態では、組成物は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをｍＲＮＡの形態で含む。ガイドＲＮＡは、ＨＰＶを標的とし、例えば配列番号１〜３８および７１〜７６からなる群から選択される配列を含み得る。好ましくは、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群から選択される配列を含み、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％）の修飾塩基を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、７１、７２、７３、７４、７５、または７６を含む。好ましくは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、リポソームまたは脂質ナノ粒子にパッケージングされている。例えば、一部の実施形態では、組成物は、ＬＮＰもしくはリポソームに包まれた活性なＲＮＰとしてＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、または組成物は、固体脂質ナノ粒子にカプセル化されたｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の置換は、配列番号６３に対して、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑから選択される。必要に応じて、置換は、配列番号６３に対して、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑのうちの６〜１５個を含む。
【００２６】
別の実施形態では、本説明に従う組成物は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ；ＨＰＶゲノムにおける標的と相補的な部分を有するガイドＲＮＡであって、必要に応じて修飾塩基を有する配列番号１〜３８、７１〜７６、および７９〜８３からなる一覧から選択される配列を含むガイドＲＮＡ；カチオン性脂質を含み、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化している複数の固体脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）；ならびに担体製剤を含む。ある特定のそのような実施形態では、担体製剤は、脂質ナノ粒子を安定化させ、組織滞留を促進することによって局所もしくは局部送達を増強する、および／または組織浸透を促進することによって局所もしくは局部送達を増強する１つまたは複数の構成成分を含み得る。ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、７４、７５、および７６のうちの１つであってもよく、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％）の修飾塩基を含んでもよい。必要に応じて、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。好ましくは、ガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基を含む。ｍＲＮＡのコード配列は、複数のシュードウリジンまたは５メトキシ−ウリジンを含み得る。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド間に１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含んでもよい。
【００２７】
具体的な実施形態では、担体は、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、スクロース、マンニトール、ラウリル硫酸ナトリウム、エタノール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、スクロースエステル、またはＮ−メチルピロリドンから選択される１つまたは複数の賦形剤を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較して、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、Ｋ１００３、Ｒ１０６０からなる群から選択されるアミノ酸に対して１〜７個の間の多様性を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの架橋型核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および／または配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含む。必要に応じて、ガイドＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも約２０％は、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含む。ＬＮＰはＰＥＧ化されてもよい。Ｃａｓ９は、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、およびＲ１０６０Ａを含み得る。カチオン性脂質は、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含み得る。必要に応じて、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、および５８からなる群から選択される配列を含み、ガイドＲＮＡは、好ましくは複数（例えば、２０〜１００％）の修飾塩基を有する配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、７４、７５、および７６からなる群から選択される配列を含む。
【００２９】
本明細書に記載される組成物の実施形態は、ウイルス感染症を処置するために有用である。そのような実施形態では、組成物は、配列番号６３に対して、アミノ酸１４９〜１６５；アミノ酸２３５〜２４９；アミノ酸５６６〜５８０；アミノ酸７２１〜７３５；アミノ酸８８０〜８９４；アミノ酸９５２〜９６６；またはアミノ酸１３１２〜１３２６からなる群から選択されるアミノ酸内に１〜２５個の置換を有する、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにＥＢＶ、ＨＰＶ、およびＨＢＶからなる群から選択されるウイルスからのウイルス標的に対して特異的である１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。好ましくは、組成物は、脂質ナノ粒子にカプセル化されたｍＲＮＡとしてのポリヌクレオチドを含む。置換は、配列番号６３に対して、各々がＫ、Ｖ、Ｓ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｔ、およびＮのうちの１つに必要に応じて置換されている、Ｒ１５２、Ｉ１５４、Ａ１５７、Ｆ２３８、Ｎ２４０、Ａ２４３、Ｆ５６９、Ｋ５７１、Ｃ５７４、Ｗ８８３、Ｑ８８５、Ｎ８８８、Ｖ９５５、Ｌ１３１５、およびＮ１３１７から選択される位置であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号６２を含んでもよく、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５、５６、５７、５８、および６１からなる群から選択される配列を含んでもよい。好ましくは、組成物は、ｍＲＮＡの形態のＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＨＰＶを標的とする。ガイドＲＮＡは、必要に応じて約２０〜１００％の塩基が修飾されている、配列番号１〜３８、７１〜７６、および７９〜８３からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、必要に応じて、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％）の修飾塩基を含む、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、７４、７５、および７６からなる群から選択される配列を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、７１〜７３、および７９〜８３からなる群から選択される配列を含む。Ｃａｓ９では、置換は、配列番号６３に対して、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑを含み得る。好ましくは、置換は、配列番号６３に対して、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑのうちの少なくとも６個を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ１１３をコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ１２１を含む組成物１０１を示す。ガイドＲＮＡ１２１は、ウイルスゲノムにおける標的核酸と相補的であるターゲティング領域１２７を含む。１つまたは複数のナノ粒子１０５（カチオン性脂質１０７を含む）は、ｍＲＮＡ１１３およびガイドＲＮＡ１２１をカプセル化している。ナノ粒子１０５は、水、水溶液、またはゲルなどの担体製剤１３５によって必要に応じて運ばれる。担体製剤１３５は、１つまたは複数の賦形剤１３６を必要に応じて含む。
【００３２】
【図２】図２は、ある特定の実施形態に従うｍＲＮＡ１１３を示す。ｍＲＮＡ１１３は、５’キャップ２０５、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）２１１、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２１５、３’ＵＴＲ２２１、およびポリＡテール２２７（例えば、１２０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。
【００３３】
【図３】図３は、ターゲティング領域１２７を示す、ガイドＲＮＡ１２１と複合体を形成したＣａｓエンドヌクレアーゼ３０７を含むリボヌクレオタンパク質（「ＲＮＰ」）を示す。
【００３４】
【図４】図４は、本開示の核酸分子、例えばｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化するために使用され得るリポソーム４０１を示す。
【００３５】
【図５】図５は、ＨＰＶ感染症を処置する方法５０１を図示する。
【００３６】
【図６】図６は、ＨＰＶゲノムのマップである。
【００３７】
【図７】図７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼアッセイの結果を示す。上のパネルは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性切断を、ＤＮＡ断片を挿入するためにどのように使用することができるかについての概念図を示す。下のパネルは、挿入されたＤＮＡ断片のＰＣＲ検出によるＣＲＩＳＰＲ媒介性切断の検出を示す。Ａ＝ＨＰＶガイドＲＮＡ１．１．１（配列番号２）；Ｂ＝ＨＰＶガイドＲＮＡ  Ｅ６−２（配列番号８１）；Ｃ＝ＨＰＶガイドＲＮＡ  Ｅ７−１（配列番号８２）。
【００３８】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物が、ウイルスＤＮＡを低減させ、ウイルス細胞を殺滅することができることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。（Ａ）ウイルスＤＮＡレベルは、非特異的ガイドＲＮＡを提供された細胞と比較して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを提供された細胞では低い。（Ｂ）細胞死は、非特異的ガイドＲＮＡを提供されたＨＰＶ１６＋細胞と比較して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを提供されたＨＰＶ１６＋細胞では多かった（左）。細胞死は、ＨＰＶ１６−２９３細胞ではかなり少なく、ＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを提供された細胞と、非特異的ガイドＲＮＡを提供された細胞との間でより類似であった（右）。
【図８Ｂ】同上。
【００３９】
【図９】図９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ＨＰＶ１６＋がん細胞を殺滅し得ることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。細胞傷害性は、非特異的ガイドＲＮＡを与えた細胞と比較して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを与えた細胞では大きかった。細胞の殺滅は、処置後数日間増加する（左）、およびＣａｓ９  ｍＲＮＡの量の増加と共に増加する（右）傾向があった。
【００４０】
【図１０】図１０は、ＨＰＶ感染症の処置のための医薬を作製する方法１００１を図示する。
【００４１】
【図１１】図１１は、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ技術（Tsaiら、Nature  Biotechnology、３３巻：１８７〜１９７頁、２０１５年を参照されたい）に基づく組成物の特異性を確認する戦略を図示する。
【００４２】
【図１２】図１２は、ＨＰＶ１６ゲノム（配列番号６４および６５）の部分のターゲティングにおけるＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡの異なる用量で検出された特異性を示す。
【００４３】
【図１３】図１３は、ＨＰＶ１６ガイドＲＮＡ１．１．１（Ａ、丸）（配列番号２）、１．１．３（Ｂ、四角）（配列番号４）、およびＥ６−１  ＢＮＡ／ＬＮＡ（Ｃ、菱形）（配列番号８３）に対応するＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを投与したＣａｓエンドヌクレアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ切断効率の測定結果を示す。
【００４４】
【図１４】図１４は、ＨＰＶ１６ガイドＲＮＡ１．１．１（Ａ）（配列番号２）、１．１．３（Ｂ）（配列番号４）、およびＥ６−１  ＢＮＡ／ＬＮＡ（Ｃ）（配列番号８３）に対応するＨＰＶガイドＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断特異性を示す。
【００４５】
【図１５】図１５は、ｍＲＮＡが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、ｍＲＮＡ−ＬＮＰの組織浸透の成功を示す。
【００４６】
【図１６−１】図１６は、例示的なＣａｓ９ヌクレオチド（ｍＲＮＡ）配列を示す。配列番号５４〜６０および６７〜７０に関して、以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ｃｍ＝２’−Ｏ−メチルシチジン；ｇｍ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｕｍ＝２’−Ｏ−メチルウリジン；ａｍ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｍ５ｃ＝５−メチルシチジン；ｐ＝シュードウリジン；ｎ＝任意のヌクレオチド；ｎ＊＝ホスホロチオエート結合；＋ｎ＝ロックド核酸または架橋型核酸；（ｍｏ５ｕ）＝５メトキシウリジン。配列番号７７に関して、以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ヌクレオチドの前の「ｍ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基修飾を示す；ヌクレオチドの後の「＊」は、ホスホロチオエート結合骨格修飾を示す；ヌクレオチドの前の「＋」は、ロックド核酸または架橋型核酸を示す；「Ｙ」は、シュードウリジンを示す；「ｍ５ｃ」は、５−メチルシトシンを示す。配列番号７８に関して、以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：Ｏ＝５−メトキシウリジン。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【図１６−５】同上。
【図１６−６】同上。
【図１６−７】同上。
【図１６−８】同上。
【図１６−９】同上。
【図１６−１０】同上。
【図１６−１１】同上。
【図１６−１２】同上。
【図１６−１３】同上。
【図１６−１４】同上。
【図１６−１５】同上。
【図１６−１６】同上。
【図１６−１７】同上。
【図１６−１８】同上。
【図１６−１９】同上。
【図１６−２０】同上。
【図１６−２１】同上。
【図１６−２２】同上。
【図１６−２３】同上。
【図１６−２４】同上。
【図１６−２５】同上。
【図１６−２６】同上。
【図１６−２７】同上。
【図１６−２８】同上。
【図１６−２９】同上。
【図１６−３０】同上。
【図１６−３１】同上。
【図１６−３２】同上。
【図１６−３３】同上。
【図１６−３４】同上。
【００４７】
【図１７−１】図１７は、例示的なＣａｓ９タンパク質配列を示す。以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ｃｍ＝２’−Ｏ−メチルシチジン；ｇｍ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｕｍ＝２’−Ｏ−メチルウリジン；ａｍ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｍ５ｃ＝５−メチルシチジン；ｐ＝シュードウリジン；ｎ＝任意のヌクレオチド；ｎ＊＝ホスホロチオエート結合；＋ｎ＝ロックド核酸または架橋型核酸；（ｍｏ５ｕ）＝５メトキシウリジン。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【００４８】
【図１８−１】図１８は、ＨＰＶ１６を標的とするための例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。配列番号１〜３０および７１〜７６に関して、以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ｃｍ＝２’−Ｏ−メチルシチジン；ｇｍ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｕｍ＝２’−Ｏ−メチルウリジン；ａｍ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｍ５ｃ＝５−メチルシチジン；ｐ＝シュードウリジン；ｎ＝任意のヌクレオチド；ｎ＊＝ホスホロチオエート結合；＋ｎ＝ロックド核酸または架橋型核酸；（ｍｏ５ｕ）＝５メトキシウリジン。配列番号７９〜８３に関して、以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ヌクレオチドの前の「ｍ」は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基修飾を示す；ｎ＊＝ホスホロチオエート結合；＋ｎ＝ロックド核酸または架橋型核酸。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【００４９】
【図１９】図１９は、ＨＰＶ１８を標的とするための例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ｃｍ＝２’−Ｏ−メチルシチジン；ｇｍ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｕｍ＝２’−Ｏ−メチルウリジン；ａｍ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｍ５ｃ＝５−メチルシチジン；ｐ＝シュードウリジン；ｎ＝任意のヌクレオチド；ｎ＊＝ホスホロチオエート結合；＋ｎ＝ロックド核酸または架橋型核酸；（ｍｏ５ｕ）＝５メトキシウリジン。
【００５０】
【図２０】図２０は、ＨＢＶを標的とするための例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ｃｍ＝２’−Ｏ−メチルシチジン；ｇｍ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｕｍ＝２’−Ｏ−メチルウリジン；ａｍ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｍ５ｃ＝５−メチルシチジン；ｐ＝シュードウリジン；ｎ＝任意のヌクレオチド；ｎ＊＝ホスホロチオエート結合；＋ｎ＝ロックド核酸または架橋型核酸；（ｍｏ５ｕ）＝５メトキシウリジン。
【００５１】
【図２１】図２１は、ＥＢＶを標的とするガイドＲＮＡに関するＥＢＶゲノム内の例示的な標的配列を示す。
【００５２】
【図２２】図２２は、例示的な標的配列を示す。以下の記号を使用して、配列の特色を例証する：ｎ＝任意のヌクレオチド。
【００５３】
【図２３】図２３は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ＋ＨＰＶ１６  Ｅ７ガイドＲＮＡ組成物の特異性を示す。
【００５４】
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｃは、配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）修飾ＨＰＶ１６  Ｅ７  ｇＲＮＡ（配列番号７９）によるＣａｓ９特異性の増強を示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
ある特定の態様では、本開示は、ＨＰＶまたはＨＢＶ核酸などのウイルス核酸における標的と相補的であるガイドＲＮＡ配列を提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、様々な修飾、例えば２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、ロックドもしくは架橋型ヌクレオチド、または２つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と共に使用して、標的核酸を切断することができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子をさらに含む組成物中で細胞または組織に送達される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部として細胞または組織に送達される。
【００５６】
ある特定の態様では、本開示は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、およびウイルス核酸を標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡ、またはそのようなＣａｓエンドヌクレアーゼおよび／もしくはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＰＶまたはＨＢＶ感染症などのウイルス感染症の処置のための、（ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および（ｂ）１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００５７】
ある特定の態様では、本開示は、ウイルス感染症を予防または処置する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡを含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００５８】
用語集
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することは、本開示の理解にとって有用であり得る。本明細書で使用される場合、ある特定の用語は、以下の定義された意味を有する。特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００５９】
文脈上それ以外であることを必要とする場合を除き、本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、範囲を定めない包括的な意味、すなわち、「含むがそれらに限定されない」として解釈すべきである。「からなる」は、本明細書に開示される他の成分の微量より多くの要素および実質的な方法のステップを除外することを意味するものとする。用語「本質的にからなる」は、特許請求の範囲を、明記された材料もしくはステップ、または特許請求される本発明の基本的特徴に実質的に影響を及ぼさない材料もしくはステップに制限する。例えば、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製法からの微量の混入物および薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存剤などを除外しない。同様に、タンパク質が、タンパク質の長さの多くて２０％に寄与するが、タンパク質の活性に実質的に影響を及ぼさない（例えば、タンパク質の活性を５０％以下変更する）追加のアミノ酸を含む場合、タンパク質は、特定のアミノ酸配列から本質的になる。移行句の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００６０】
本明細書を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特色、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体の様々な場所での「一実施形態では」または「実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴を、１つまたは複数の実施形態において任意の適した様式で組み合わせてもよい。
【００６１】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかにそれ以外であることを指示していない限り、複数形を含む。例えば、用語「１つの細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。同様に、本明細書に記載される医薬の処置または調製のための「１つの組成物」の使用は、文脈上明らかにそれ以外であることを指示していない限り、そのような処置または調製のため本発明の１つまたは複数の組成物を使用することを企図する。
【００６２】
代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物の１つまたは代替物の任意の組合せを意味すると理解すべきである。例えば、「核酸分子またはペプチド」は、核酸分子もしくはペプチドのいずれか、またはその両方を指す。
【００６３】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、状況のその後に記載される事象が起こっても起こらなくてもよいこと、記載が、前記事象または状況が起こる場合と、起こらない場合を含むことを意味する。
【００６４】
本明細書において配列を記載する場合に使用される「複数の」は、少なくとも２つと起こり得る全ての間を意味する。例証するために、配列番号１は、１０２ヌクレオチド長であり、１８個のシトシンを含む。配列番号１における複数の塩基が修飾されると述べることは、２〜１０２個の間の塩基が修飾されることを意味する。配列番号１が複数の５−メチル−シトシン修飾を含有すると述べることは、２〜１８個の間のシトシンが５’メチル基を有することを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」は一般的に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量の誤差の許容可能な程度を指す。典型的に、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０％、１０％、または５％以内であり得る。あるいは、および特に生物系では、用語「約」および「およそ」は、１桁内の、潜在的に所与の値の５倍または２倍以内である値を意味し得る。明示していない場合、用語「約」および「およそ」は、値に等しい、またはその値の２０％以内を意味する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、数的な量は、報告される有効数字の数に反映される程度に正確である。例えば、０．１という値は、０．０５〜０．１４を意味すると理解される。別の例として、値０．１〜０．２の間隔は、０．０５〜０．２４の範囲を含む。このように、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜２．４ｍｇ／ｍＬの濃度範囲を意味する。
【００６７】
本説明では、任意の濃度範囲、パーセンテージの範囲、比の範囲、または整数範囲は、特に示されていない場合、引用された範囲内の任意の整数の値、および適切であればその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解すべきである。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され、一般的にペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸のポリマーを指す。これは任意の長さのポリマーであり得、線形、分岐、または環状であり得る。アミノ酸は、天然に存在しても、天然に存在しなくてもよく、または変更されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へのアセンブリーも含み得る。この用語はまた、天然のまたは人工的に変更されたアミノ酸ポリマーも含む。そのような変更は、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは変更を含む。この定義はまた、例えばアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸を含む）の１つまたは２つまたはそれより多くのアナログを含むポリペプチド、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）、および当技術分野で公知の他の変更も含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「機能的に等価なペプチド」は、構造（配列）に関して異なり得るが、当初のペプチドと同じまたは類似であるペプチドを指す。機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、交換されるアミノ酸の特性の検討に基づいて、タンパク質構造の変化が操作され得る組換えＤＮＡ技術の適用を介して作成してもよい。当業者は、変異誘発技術の適用を通して設計した変化を導入してもよい。
【００７０】
「シグナルペプチド」はまた、「シグナル配列」、「リーダー配列」、「リーダーペプチド」、「局在化シグナル」、または「局在化配列」とも呼ばれ、分泌経路へと運命付けられる新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド（通常、長さ１５〜３０アミノ酸）である。シグナルペプチドは典型的に、Ｎ末端で親水性の一連の短い正に帯電したアミノ酸、５〜１５残基の中央の疎水性ドメイン、およびシグナルペプチダーゼの切断部位を有するＣ末端領域を含む。真核生物では、シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質の小胞体への転位を促し、そこでタンパク質がシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟タンパク質を作成し、次いでタンパク質はその適切な行き先へと進行する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成された断片、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、またはエクソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片のうちのいずれかを指す。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲによって産生される。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）、または両方の組合せである単量体で構成され得る。修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドが、野生型または当初のまたは比較ヌクレオチド分子とは、例えば糖部分（例えば、２’−Ｏ−メチル化）、ピリミジンもしくはプリン塩基部分（例えば、メチル化）、またはヌクレオチド間の連結（例えば、ホスホロチオエート連結）の置き換えまたは修飾において異なる、「修飾」を有するまたは「修飾する」ことができる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような連結のアナログによって連結することができる。ホスホジエステル連結のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなどが挙げられる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００７２】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これは、コード領域の前および後の領域「リーダーおよびトレーラー」ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００７３】
用語「単離された」は、材料がその当初の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在する核酸またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系で同時に存在する材料の一部または全てから分離されている同じ核酸またはポリペプチドは、単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部であり得、および／またはそのような核酸もしくはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であり得るが、そのようなベクターまたは組成物が核酸またはポリペプチドの天然の環境の一部ではないという点で、なおも単離され得る。
【００７４】
明細書で使用される場合、用語「組換え」は、外因性の核酸分子の導入によって修飾されている細胞、微生物、核酸分子、もしくはベクターを指すか、または内因性の核酸分子もしくは遺伝子の発現が制御され、調節解除され、または構成的であるように変更されており、そのような変更もしくは修飾が遺伝子操作によって導入され得る細胞もしくは微生物を指す。遺伝的変更は、例えば、１つもしくは複数のタンパク質もしくは酵素をコードする核酸分子（発現制御エレメント、例えばプロモーターを含み得る）を導入する修飾、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、もしくは細胞の遺伝物質の他の機能的破壊もしくはそれへの機能的付加を含み得る。
【００７５】
本明細書に使用する場合、「変異」は、参照または野生型の核酸分子またはポリペプチド分子とそれぞれ比較した場合の核酸分子またはポリペプチド分子の配列の変化を指す。変異は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む、いくつかの異なるタイプの配列の変化をもたらし得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「保存的変異」または「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換を指す。例示的な保存的置換は、当技術分野で周知である（例えば、Lehninger、Biochemistry、第２版；Worth  Publishers,  Inc.  NY,  NY、７１〜７７頁、１９７５年；Lewin、Genes  IV、Oxford  University  Press、NYおよびCell  Press、Cambridge、MA、８頁、１９９０年を参照されたい）。
【００７７】
本明細書で使用される「配列同一性」または「パーセント同一性」は、２つまたはそれより多くの配列のアライメントを最適にするために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、別の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における核酸またはアミノ酸残基と同一である、１つの配列における核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージを指す（すなわち、％の同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列同一性の値のパーセンテージは、Altschulら（１９９７年）、「Gapped  BLAST  and  PSI-BLAST:  a  new  generation  of  protein  database  search  programs」、Nucleic  Acids  Res.２５巻：３３８９〜３４０２頁によって定義されるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ  ２．０ソフトウェアを使用して、デフォルト値に設定したパラメーターによって生成することができる。
【００７８】
追加の定義は、本開示を通して記載する。
【００７９】
ガイドＲＮＡ分子
本明細書に使用される場合、「ガイドＲＮＡ」は、共に機能して、エンドヌクレアーゼと共に活性なリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成するトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の両方を含むこと、または単一のガイドＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡとして公知の単一分子バージョンを指す。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオタンパク質」または「ＲＮＰ」は、ガイドＲＮＡのＣａｓエンドヌクレアーゼとの会合によって形成されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質複合体を指す。ＲＮＰは、ガイドＲＮＡとエンドヌクレアーゼとの天然の会合の結果としてｉｎ  ｖｉｖｏで形成することができるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルして、エレクトロポレーションもしくはトランスフェクション技術を使用して細胞に直接送達することができる。
【００８０】
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ形態で存在する。
【００８１】
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、修飾ヌクレオチドの形態での１つもしくは複数の修飾、または標準的なリン酸骨格結合に対する修飾を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、その部位がヒトゲノムにおいても出現しないウイルスのゲノム内の部位と相補的であるターゲティング領域またはターゲティング部分を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＨＰＶゲノム内の標的に対して特異的にハイブリダイズするターゲティング領域を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの感染細胞への送達および感染細胞内での滞留を促進する修飾ヌクレオチドなどの特色を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡにおける修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡ安定性を改善する、免疫原性を低減する、またはエンドヌクレアーゼ活性の特異性を改善するように機能し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、リボース環に１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチル基、ヌクレオチド間の１つもしくは複数のホスホロチオエート結合、または両方などの特色を含み得る。そのような修飾は、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの５’および３’末端の近位に位置し得、エクソヌクレアーゼ消化に対して保護し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ウイルス標的に対する結合を安定化し、非ウイルス標的（例えば、ヒトＤＮＡ）に対する結合を低減し、またはエンドヌクレアーゼ活性の特異性を増強し得る、１つまたは複数のロックド核酸、架橋型核酸、または配座制限核酸を、例えばターゲティング領域内に、必要に応じて含み得る。なおさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは、患者による免疫応答を最小限にし得るシュードウリジンまたは５−メチル−シトシンなどの修飾を含み得る。
【００８４】
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（「ｃｍ」）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（「ｇｍ」）；２’−Ｏ−メチルウリジン（「ｕｍ」）；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（「ｆｍ」）；および２’−Ｏ−メチルアデノシン（「ａｍ」）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％の間）の修飾塩基を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド間に１〜９個の間のホスホロチオエート結合を含む。さらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの架橋型核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および／または配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含み得る。
【００８５】
図３は、ターゲティング領域１２７を示す、ガイドＲＮＡ１２１を含むＲＮＰ３０１を示す。Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを送達する組成物に関して（図１を参照されたい）、組成物１０１を細胞に送達すると、ｍＲＮＡは、翻訳されてＣａｓ９タンパク質３０７を形成し、これはガイドＲＮＡ１２１と複合体を形成して、描写される酵素的に活性なＲＮＰ３０１を形成する。他の実施形態では、ＲＮＰ３０１は、細胞に直接送達される。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１は、必要に応じて１つまたは複数の修飾を有する、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちの１つを含む。ある特定の他の実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１は、必要に応じて１つまたは複数の修飾を有する、配列番号３１〜３８のうちの１つを含む。修飾は、例えばヌクレオチドのリボース環に２’−Ｏ−メチル基、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、またはロックド核酸もしくは架橋型核酸を含み得る。それ以外であると明記している場合を除き、ＲＮＡは、好ましくは標準的なリボヌクレオチドを含む。
【００８６】
ガイドＲＮＡ１２１は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含み得る。２’−Ｏ−メチルオリゴ修飾は、ＲＮＡアナログが一般的な塩基加水分解およびヌクレアーゼから保護すること、ならびに付加毎に二重鎖のＴｍが１〜４℃増加することを特徴とし得る。２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの立体配置は、ＲＮＡのようなＡ型であり、ＤＮＡのようなＢ型ではないことが見出され得る。一方の形態から他方の形態への移行を行うために必要なのは、これらの１組の連続した修飾だけであり得る。２’Ｏ−メチル基の別の利点は、ヌクレアーゼ活性からのＲＮＡ分子の安定化を含む。２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能である。一実施形態では、組成物１０１を細胞に送達する場合にエクソヌクレアーゼ活性から保護するために、１〜約１０個の間の、好ましくは約５個の２’−Ｏ−メチル基を、ガイドＲＮＡ１２１の５’および３’末端の両方で最初の５、または６、または７塩基内に含める。ガイドＲＮＡ１２１はまた、ロックド核酸および架橋型核酸の両方を含む、配座制限核酸（ＣＲＮ）も含み得る。
【００８７】
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、しばしばインアクセシブル（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）ＲＮＡと呼ばれる、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分の架橋によって修飾される。架橋は、リボースを、しばしばＡ型二重鎖で見出される３’−ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）立体配座で「ロック」する。望ましければ、ＬＮＡヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合し、ワトソン−クリック塩基対形成規則に従ってＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることができる。そのようなオリゴマーは、化学合成され、Ｑｉａｇｅｎの会社であるＥｘｉｑｏｎ（Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。
【００８８】
架橋型核酸（ＢＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。それらは、時に、制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）またはインアクセシブルＲＮＡ分子とも呼ばれる。ＢＮＡ単量体は、「固定された」Ｃ３’−ｅｎｄｏ糖パッカリングを伴う５員環、６員環、または７員環架橋型構造を含有し得る。架橋は、リボースの２’，４’位で合成的に取り込まれて、２’，４’−ＢＮＡ単量体が得られる。単量体は、標準的なホスホロアミド化学を使用して、オリゴヌクレオチドポリマー構造に取り込むことができる。ＢＮＡは、結合親和性および安定性が増加した、構造的に堅固なオリゴヌクレオチドである。ＢＮＡは、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）から入手可能である。
【００８９】
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＨＰＶゲノム、例えばＨＰＶ１６ゲノム、ＨＰＶ１８ゲノム、ＨＰＶ６ゲノム、またはＨＰＶ１１ゲノムなどを標的とする。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、７４、７５、または７６に記載される核酸配列を含み、必要に応じて、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）；および２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基によってさらに置換されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの約２０〜１００％のヌクレオチドが、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２、３、４、６〜１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３２、３４、３６、３８、または７１〜７３に記載の核酸配列を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、必要に応じて、約２０〜１００％のヌクレオチドがリボース糖にメチルまたは２’−Ｏ−メチル基などの修飾を有する、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、３７、４１、４３、および４５のうちの１つであり、好ましくは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）、および２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）からなる群から選択される複数（例えば、約２０〜１００％）の修飾塩基を含む。好ましくは、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、４５からなる群から選択される配列を含み、必要に応じて、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）；および２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基によってさらに置換されている。
【００９１】
一実施形態では、組成物１０１は、（ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、または活性なＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｂ）ウイルス標的、例えばエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）、またはヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）に対して特異的である１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。
【００９２】
本明細書に記載される組成物１０１の実施形態は、ＨＰＶ感染症の処置のために提供され得る。そのような実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１は、配列番号３９または配列番号４０を含むターゲティング領域１２７を含み得る。ＨＰＶ感染症の処置のために提供される組成物に含まれるガイドＲＮＡ１２１は、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、または３７のうちの１つまたは複数を含んでもよく、必要に応じて、１０個またはそれより多くの２’−Ｏ−メチルウリジンを含んでもよい。例えば、ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１の少なくとも約２０％のヌクレオチドは、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＨＰＶ１６に対して使用するための第１のガイドＲＮＡを含み得る。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、３７、４１、４３、４５のうちの１つを含み、必要に応じて、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基を含む。例えば、ガイドＲＮＡは、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４２、４４、および４６のうちの１つであり得る。
【００９４】
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＨＰＶを標的とし、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のうちの１つを含み、必要に応じて、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される１つまたは複数の修飾塩基を含む。例えば、ガイドＲＮＡは、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８のうちの１つであり得る。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡはＨＢＶを標的とし、配列番号４１、４３、または４５のうちの１つを含み、さらに必要に応じて、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）；および２’−Ｏ−メチルアデノシン（ａｍ）からなる群から選択される１つまたは複数の修飾塩基を含む。例えば、ガイドＲＮＡは、配列番号４２、４４、または４６のうちの１つであり得る。
【００９６】
他の実施形態では、ガイドＲＮＡはＥＢＶを標的とし、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、および５３のうちの１つと実質的に相補的なターゲティング領域を含み、好ましくは各々が２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される複数の修飾塩基を含む。配列番号４７は、ＥＢＶゲノムにおける第１の標的である。配列番号４８は、ＥＢＶゲノムにおける第２の標的である。配列番号４９は、ＥＢＶゲノムにおける第３の標的である。配列番号５０は、ＥＢＶゲノムにおける第４の標的である。配列番号５１は、ＥＢＶゲノムにおける第５の標的である。配列番号５２は、ＥＢＶゲノムにおける第６の標的である。配列番号５３は、ＥＢＶゲノムにおける第７の標的である。必要に応じて、配列番号４７〜５３のいずれかを標的とするガイドＲＮＡは、本明細書におけるガイドＲＮＡに関連して記載される修飾のいずれかを含んでもよく、好ましくは、各々が、ガイドＲＮＡ内の末端の７〜１０ヌクレオチド内に、２’−Ｏ−メチルシチジン（ｃｍ）；２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｇｍ）；２’−Ｏ−メチルウリジン（ｕｍ）；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（ｆｍ）からなる群から選択される少なくとも３つの修飾塩基を含む。
【００９７】
一実施形態では、本開示は、ウイルス核酸における標的と相補的なターゲティング領域を有するガイドＲＮＡ核酸分子を含む合成ガイドＲＮＡを提供する。一実施形態では、ウイルス核酸は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸である。別の実施形態では、ウイルス核酸は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸である。
【００９８】
一実施形態では、本開示は、ＨＰＶ１６核酸における標的と相補的なターゲティング領域を有するガイドＲＮＡ核酸分子を含み、（ａ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つ；または（ｂ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、合成ガイドＲＮＡを提供する。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６を含む。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング領域は、配列番号３９または配列番号４０を含む。なおさらなる実施形態では、ウイルス核酸における標的は、配列番号６４または配列番号６５を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号８０を含む。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾塩基を含んでもよい。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンを含んでもよい。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；および２’−Ｏ−メチルアデノシンからなる群から選択される複数の修飾塩基を含んでもよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６を含み、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基は、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも約２０％は、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、２つのヌクレオシド間にホスホロチオエート結合を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々で末端の１０ヌクレオチド内に１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６を含み、ガイドＲＮＡにおける１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６を含み、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている。これらの実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは架橋型核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含んでもよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、７４、７５、または７６を含み、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を有するヌクレオチドによってさらに置換されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、（ａ）各修飾塩基が、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルアデノシンである修飾塩基；（ｂ）リボース糖の２’−Ｏ−メチル基；（ｃ）２つのヌクレオシド間のホスホロチオエート結合；（ｄ）ＬＮＡ、ＢＮＡ、もしくはＣＲＮ；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ、を有するヌクレオチドによってさらに置換されている。
【００９９】
一実施形態では、本開示は、ＨＰＶ１８核酸における標的と相補的なターゲティング領域を有するガイドＲＮＡ核酸分子を含み、（ａ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つ；または（ｂ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、合成ガイドＲＮＡを提供する。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つを含む。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、３５、または３７を含む。なおさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、３５、または３７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾塩基を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンを含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；および２’−Ｏ−メチルアデノシンからなる群から選択される複数の修飾塩基を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、３５、または３７を含み、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基は、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも約２０％は、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、２つのヌクレオシド間にホスホロチオエート結合を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内に１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、３５、または３７を含み、ガイドＲＮＡにおける１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、３５、または３７を含み、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている。これらの実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、架橋型核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、３５、または３７を含み、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を有するヌクレオチドによってさらに置換されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、（ａ）各修飾塩基が２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルアデノシンである修飾塩基；（ｂ）リボース糖の２’−Ｏ−メチル基；（ｃ）２つのヌクレオシド間のホスホロチオエート結合；（ｄ）ＬＮＡ、ＢＮＡ、もしくはＣＲＮ；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せを有するヌクレオチドによってさらに置換されている。
【０１００】
一実施形態では、本開示は、ＨＢＶ核酸における標的と相補的なターゲティング領域を有するガイドＲＮＡ核酸分子を含み、（ａ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つ；または（ｂ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、合成ガイドＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、または４５を含む。さらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、または４５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾塩基を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンを含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、各々が２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；および２’−Ｏ−メチルアデノシンからなる群から選択される複数の修飾塩基を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、または４５を含み、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基は、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも約２０％は、リボース糖に２’−Ｏ−メチル基を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、２つのヌクレオシド間にホスホロチオエート結合を含み得る。上記の実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内に１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、または４５を含み、ガイドＲＮＡにおける１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、または４５を含み、ガイドＲＮＡの５’末端および３’末端の各々の１０末端ヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合によってさらに置換されている。これらの実施形態のいずれかでは、ガイドＲＮＡは、架橋型核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、または４５を含み、ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）を有するヌクレオチドによってさらに置換されている。一部の実施形態では、ＨＢＶ核酸を標的とするガイドＲＮＡのヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、（ａ）各修飾塩基が２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルアデノシンである修飾塩基；（ｂ）リボース糖に２’−Ｏ−メチル基；（ｃ）２つのヌクレオシド間のホスホロチオエート結合；（ｄ）ＬＮＡ、ＢＮＡ、もしくはＣＲＮ；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せを有するヌクレオチドによってさらに置換されている。
【０１０１】
一部の態様では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子が提供される。そのようなＤＮＡ分子を含むベクターも同様に企図される。
【０１０２】
本開示の例示的なガイドＲＮＡ配列を、ＨＰＶ１６のターゲティングに関して図１８に、ＨＰＶ１８のターゲティングに関して図１９に、およびＨＢＶのターゲティングに関して図２０に示す。加えて、図２１および２２は、例示的な標的配列を示す。
【０１０３】
Ｃａｓ９分子および核酸
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ関連細菌エンドヌクレアーゼファミリーの任意のメンバーを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば配列番号５４に記載の核酸分子によってコードされる、および／または配列番号６３もしくは８４に記載のアミノ酸配列を含むものである。他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、修飾Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、修飾Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、野生型分子と比較して修飾されている。例えば、Ｃａｓ９を、免疫原性が減少するように修飾（例えば、野生型と比較してＴ細胞エピトープ内に１つまたは複数の置換を含むように修飾）してもよい。特に、治療タンパク質をｍＲＮＡとして送達する場合、免疫応答を回避するために治療剤を修飾することは難題である。修飾ヌクレオチド配列を使用することによって、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されると、結果として得られたタンパク質は、野生型と比較して、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発しない代替または修飾エピトープを有することができる。本開示は、一部の実施形態では、１つまたは複数の予想されるＴ細胞エピトープが、野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して免疫応答を回避または減少させる置換を有する、修飾Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質配列を提供する。一実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９と比較して、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、Ｋ１００３、およびＲ１０６０のうちの１つまたは複数を含む、少なくとも１つのアミノ酸多様性を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、またはＲ１０６０Ａを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡのコード配列は、複数の５−メチルシチジンを含む。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡのコード配列は、複数のシュードウリジンまたは５メトキシ−ウリジンを含む。
【０１０５】
以下により詳細に考察するように、ｍＲＮＡ１１３は、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＡｍｐＴｅｃ  ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの企業により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって製造することができる。ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写製造は、典型的にはＲＮＡポリメラーゼおよびＮＴＰのミックスを有する緩衝液中で二本鎖ＤＮＡ鋳型を使用する。ポリメラーゼは、ｍＲＮＡ１１３を合成する。次いで、ＤＮＡを酵素的に分解する。ｍＲＮＡ１１３を、ポリメラーゼ、遊離のＮＴＰ、および分解したＤＮＡから精製する。
【０１０６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、タンパク質形態で（例えば、抗ウイルスガイドＲＮＡと複合体を形成した修飾Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有する活性なＲＮＰとして）、または標的細胞内で翻訳されるｍＲＮＡとして、ＤＮＡベクターにコードされた細胞に送達される。一実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のガイドＲＮＡと共にｍＲＮＡ形態で送達される。
【０１０７】
図２は、ある特定の実施形態に従うｍＲＮＡ１１３を示す。ｍＲＮＡ１１３は、５’キャップ２０５、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）２１１（例えば、ベータ−グロビン配列に由来し得るなど）、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２１５、３’ＵＴＲ２２１（例えば、ベータ−グロビン配列に由来する）、およびポリＡテール２２７（例えば、１２０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。ＯＲＦ２１５は、開始コドン（ＡＵＧ、コザック配列の一部）で始まり、終止コドン（ＵＡＧ）で終わる。ｍＲＮＡ１１３は、３’ＵＴＲを含み、これは翻訳の終止を支持する。ｍＲＮＡ１１３はまた、約８０〜１２０塩基のポリ（Ａ）テールを含み、これは、翻訳因子の結合を支持し、ｍＲＮＡ１１３を安定化し、ｍＲＮＡ分解を防止する。
【０１０８】
一部の実施形態では、５’キャップ２０５に関して、７−メチル−グアノシンは、５’−５’三リン酸架橋を介して第１の５’ヌクレオチドに連結している。追加のメチル基の数に応じて、これは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２と呼ばれ得る。一部の実施形態では、以下に記載されるように産生されたｍＲＮＡは、全てがキャップされるわけではなく、すなわち産生されたｍＲＮＡ分子の１００％が５’キャップを有するわけではない。５’ＵＴＲ２１１は、リボソーム結合および翻訳因子結合のための部位を提供する。５’ＵＴＲ２１１は、ｍＲＮＡ１１３の発現レベルに影響を及ぼす。発現は、ＯＲＦ２１５の配列のその対応するアミノ酸配列への翻訳を含む。ＯＲＦ２１５は、Ｃａｓ９などのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、必要に応じて哺乳動物発現に関してコドン最適化される。５’キャップ２０５は、Ｃａｐ０またはＣａｐ１、５’−５’三リン酸架橋を介して第１の５’ヌクレオチドに連結された７−メチルグアノシンを含み得る。コザック配列は、５’ＵＴＲ２１１の３’末端およびＯＲＦ２１５の５’末端にわたり、翻訳開始領域として働く。一部の実施形態では、ＯＲＦは、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０のうちの１つを含み、ガイドＲＮＡの複数のヌクレオチドは、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基は、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである。一部の実施形態では、ＯＲＦは、標準的なＲＮＡヌクレオチド配列と比較して１つまたは複数の修飾を含む。一部の実施形態では、ＯＲＦは、配列番号５６、５７、もしくは５８、または遺伝子コードの縮重により同じアミノ酸配列をコードし、配列番号５６、５７、もしくは５８と少なくとも約８５％の同一性を有し、複数のシュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシチジン残基を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＯＲＦ２１５は、配列番号５６〜６０のうちの１つによって記載されるＣａｓ９バリアント、または機能的に等価なペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＲＦ２１５は、配列番号６７〜７０、７７、および７８のうちの１つによって記載されるＣａｓ９バリアントまたは機能的に等価なペプチドをコードする。ｍＲＮＡ１１３のＯＲＦ２１５を、特定の生物に関してコドン最適化してもよい。
【０１０９】
当業者は、遺伝子コードの縮重のために、配列番号５４〜６０、６７〜７０、７７、および７８のある特定の予想可能な多様性が、各々に関してそれぞれの機能的等価物を提供することを理解するであろう。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子のＤＮＡセンスを参照すると、ＯＲＦの一部は、ＭＰＱをコードするＣＡＡ  ＣＣＴ  ＣＡＡを含み得る。しかし、プロリン（Ｐ）は、任意の塩基がゆらぎ位置にある場合、リボソームによって組み込まれ、そのためプロリンのコドンはＣＣＮとして表すことができる。グルタミン（Ｑ）は、ゆらぎ塩基がプリンである場合に組み込まれ、このようにＱコドンを、ＣＡＲ（当業者は、ＮおよびＲがそれぞれ、任意の塩基およびプリンに関するＩＵＰＡＣ多義性コードであることを認識する）として表すことができる（この場合も、ＤＮＡセンスにおいて）。標準的なコドンチャートおよび遺伝子コードの理解を使用して、配列番号５４〜６０のうちの１つに対して約８５％もの低い同一性を有するが、それでもなお配列番号５４〜６０によってそれぞれコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードする配列を生成することが可能である。そのため、ｍＲＮＡ１１３のＯＲＦ２１５は、配列番号５４〜６０のうちの１つ、または配列番号５４〜６０のうちの１つに対して８５％〜１００％の間の同一性を有する配列を含み得る（２つの配列を整列させ、［（マッチした塩基／総塩基）×１００］を計算することによって決定）と理解される。しかし、配列番号５４〜６０に対して１００％の同一性を有するまたはそれに近い配列（例えば、９５％〜１００％の間の同一性を有する配列）は、コドン最適化、および例えばＧＣ含有量またはＲＮＡ二次構造の回避のために最も好ましい場合がある。
【０１１０】
一実施形態では、ｍＲＮＡ１１３は、Ｃａｓ９のバージョンなどのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする。一実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）であり、配列番号５４を含むｍＲＮＡによってコードされる。
【０１１１】
さらなる実施形態では、ｍＲＮＡ１１３は、修飾Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、
ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体は、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列（ＳｐＣａｓ９によって認識される）２１〜２４および隣接する２０ｂｐプロトスペーサー配列（ｓｇＲＮＡの５’末端と相補的である）で構成される標的部位を切断する。ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体は、４つのＳｐＣａｓ９残基（Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６）によって作製される直接の水素結合を含む、標的ＤＮＡ鎖のリン酸骨格に対するいくつかのＳｐＣａｓ９媒介性ＤＮＡ接触部分を含むことが構造研究によって示唆されている。それらの残基の１つ、複数、または全てのアラニン置換は、ＳｐＣａｓ９のオンターゲット切断効率を低減させない。３置換バリアント（Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）および４置換バリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）が良好な活性を示すことが示されている。４置換バリアントは、高忠実度バリアント＃１に関してＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、別名ＨＦ  Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９と称されている。オフターゲット活性を、シークエンシング（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）法によって可能となる二本鎖切断のゲノムワイドなバイアスのない同定を使用して評価してもよい。参照により組み込まれている、Tsai、２０１５年、GUIDE-seq  enables  genome-wide  profiling  of  off-target  cleavage  by  CRISPR-Cas  nucleases、Nat  Biotechnol、３３巻：１８７〜１９７頁を参照されたい。追加のＤ１１３５Ｅ置換を有するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２と称される）は、研究において野生型ＳｐＣａｓ９の７０％またはそれより高い活性を保持し、組成物１０１内に含めてもよい。加えて、追加のＬ１６９ＡまたはＹ４５０Ａ置換（その側鎖がそのＰＡＭ近位末端の標的ＤＮＡとの非特異的疎水性相互作用を媒介すると考えられている位置）を有するバリアントを含めてもよい。参照により組み込まれている、Kleinstiver、２０１６年、High-fidelity  CRISPR-Cas9  variants  with  undetectable  genome-wide  off  targets、Nature、５２９巻（７５８７号）：４９０〜４９５頁を参照されたい。
【０１１２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較して、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、Ｋ１００３、またはＲ１０６０のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つのアミノ酸多様性を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、およびＲ１０６０Ａのうちの１つ、２つ、または３つ全てを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号５９に記載のｍＲＮＡ配列、例えば、配列番号５９と等価であり、配列番号５９によって定義されるＨＦ  Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および高忠実度バリアント＃１によってコードされる。別の実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号５９に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するｍＲＮＡ配列によってコードされる。
【０１１３】
特異性が増強された修飾ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の特異性増強バージョン（例えば、ｅＳｐ（１．１）Ｃａｓ９；配列番号６０）を、本明細書の実施形態において使用してもよい。一部の実施形態では、ｅＳｐ（１．１）をコードするｍＲＮＡは、好ましくは５’キャップ、５’ＵＴＲ、コザック配列、ＯＲＦ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む。
【０１１４】
Slaymakerらは、Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断が、ＤＮＡ鎖分離に依存し得ることを報告している。参照により組み込まれている、Slaymaker、２０１６年、Rationally  designed  Cas9  nucleases  with  improved  specificity、Science、３５１巻（６２６８号）：８４〜８８頁を参照されたい。ヌクレアーゼ活性は、鎖分離によって活性化され、しかもＣａｓ９のヘリカーゼ活性を減弱させることによって、ｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチが、オフターゲット部位での切断活性を低減させ得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の結晶構造は、ＳｐＣａｓ９におけるＨＮＨ、ＲｕｖＣ、およびＰＡＭ−相互作用ドメインの間に、正に帯電した溝が位置することを示しており、これは標的ＤＮＡの非標的鎖の安定化に関与している可能性が高い。その非標的鎖の溝において正に帯電した残基を中和すると、非標的鎖の結合を弱め、標的と非標的ＤＮＡ鎖の間の再ハイブリダイゼーションを促進し、それによって、ＲＮＡガイドと標的ＤＮＡ鎖の間のよりストリンジェントなワトソン−クリック塩基対形成を必要とする場合がある。その溝内での５個の置換は、オンターゲット切断効率を維持しながら、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してオフターゲット部位での活性を低減させ得る。高い効率（野生型レベルのオンターゲットｉｎｄｅｌ形成レベル）および特異性（ＥＭＸ（１）およびＶＥＧＦＡ（１）オフターゲットでの検出可能なｉｎｄｅｌ形成はない）の両方を有するバリアントには：ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）［ｅＳｐＣａｓ９（１．０）とも呼ばれる］、およびＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）［ｅＳｐＣａｓ９（１．１）とも呼ばれる］が挙げられる。一部の実施形態は、組成物１０１中にｍＲＮＡ１１３によってコードされるｅＳｐＣａｓ９（１．０）または（１．１）を含む。
【０１１５】
実施形態のいずれかでは、ｍＲＮＡ１１３は、５−メチルシチジン（ｍ５ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、または両方のうちの１つまたは複数を含んでもよい。修飾ヌクレオシドは、生得の免疫活性化を低減させ、ｍＲＮＡの翻訳を増加させ得る。非修飾ｍＲＮＡは、望ましくないサイトカイン分泌を誘導し得る。大量のＲＮＡは、ファージＲＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写または固相化学合成によって調製され得る。シュードウリジン（Ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）（ＴｒｉＬｉｎｋ）の三リン酸誘導体を使用して、修飾ヌクレオシドを含有するＲＮＡを生成してもよい。ＲＮＡに修飾ヌクレオチドが取り込まれると、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）などのＲＮＡセンサーを活性化するその能力を低減させ得る。修飾ヌクレオチドは、好ましくはシュードウリジン−（Ψ）、または５−メチルシチジン−（ｍ５Ｃ）、５−メトキシ−ウリジン、およびΨ−（ｍ５Ｃ／Ψ）ヌクレオシド修飾を含む。一部の実施形態では、ｍ５Ｃ／Ψヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、最少量のＲＮＡセンサー活性化および最高レベルの翻訳を生じる。ＨＰＬＣ精製によって、Ψまたはｍ５Ｃ／Ψヌクレオシドを含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡからｄｓＲＮＡおよび他の混入物を除去すると、高レベルで翻訳されるＲＮＡを生じる。参照により組み込まれている、Kariko、２０１１年、Generating  the  optimal  mRNA  for  therapy:HPLC  purification  eliminates  immune  activation  and  improves  translation  of  nucleoside-modified,  protein-encoding  mRNA、Nucleic  Acids  Res、３９巻（２１号）：ｅ１４２頁を参照されたい。
【０１１６】
ｍＲＮＡは、例えば、３０、５１、または１２０ヌクレオチド長のポリ（Ａ）テールを含有するように転写され得る。ポリ（Ａ）テールを、転写の際に鋳型依存的に付加してもよく、および／または転写後に酵素的に付加してもよい。例えば転写後、追加のポリ（Ａ）テールを、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼによって付加してもよい。ＲＮＡを、例えば２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを含むおよび含まないｍ７Ｇキャッピングキット（ＳｃｒｉｐｔＣａｐ、ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）によってキャップして、Ｃａｐ１またはＣａｐ０を得てもよい。キャッピングを、例えばＴｒｉＬｉｎｋのＣｌｅａｎＣａｐまたはＡｍｐＴｅｃの酵素的キャッピングを使用して行い、Ｃａｐ１を得てもよい。
【０１１７】
治療タンパク質の免疫原性は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を介して、繰り返し曝露後の免疫に基づくクリアランスを通して治療剤の半減期を低下させることによって、治療剤の有効性を低減させ得る。ＡＤＡを低減させる戦略には：免疫抑制、患者の寛容化（用量、経路、および補助製剤）、およびタンパク質内の高度免疫原性Ｔ細胞エピトープの修飾が挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９の免疫原性Ｔ細胞エピトープに対する修飾を含む。
【０１１８】
ｍＲＮＡに基づく治療剤の場合、タンパク質の合成による方向付けられた翻訳後化学修飾、例えばＰＥＧ化は、可能ではない。しかし、予想されるＴ細胞エピトープ内の重要なアミノ酸を変更して、免疫原性およびＡＤＡを低減させることは可能である。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング操作を用いて、タンパク質内のＭＨＣ  ＩＩ拘束免疫原性ペプチドを予想してもよい。本開示の一部の実施形態は、野生型ヌクレアーゼ配列と比較してＴ細胞エピトープが修飾されているヌクレアーゼ配列を含む。ヌクレアーゼエピトープＴ細胞エピトープにおける修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏの薬物特性を改善し、ＡＤＡを低減させ、繰り返し投与を容易にし得る。免疫原性を低減させる別の方法は、分解ペプチドをＣａｓ９またはｓｇＲＮＡにコンジュゲートすることによって薬物曝露を低減させ、ＣＲＩＳＰＲ構成要素の半減期を低減させることである。
【０１１９】
一実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号６３に記載の野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９アミノ酸配列を含む。
【０１２０】
一実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｎ末端およびＣ末端核局在化配列（ＮＬＳ）を含む野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９アミノ酸配列、例えば配列番号６１を含む。さらなる実施形態では、異なるＮＬＳおよびリンカー配列を有する追加のＣａｓ９タンパク質バリアントを、同じｍＲＮＡ分子内に含めてもよく、例えば、ｍＲＮＡは、配列番号５６〜５８のうちの１つ、ならびに配列番号６１に記載のアミノ酸配列をコードする任意のｍＲＮＡを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、１つより多くのＣａｓ９、例えば、配列番号５４〜６０、６７〜７０、７７、および７８のうちの１つより多くをコードし得る。
【０１２１】
一実施形態では、１つまたは複数のＣａｓ９バリアントは、配列番号６１と比較して増強された核局在化を有し、結果としてより高いエンドヌクレアーゼ活性、より高い効力をもたらし、より低い薬物レベルの投与を可能にする。それらの利点は、免疫原性の低減、ならびに薬物製造のより低いコストに寄与し得る。
【０１２２】
一実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、低減されたＡＤＡおよび必要に応じた末端ＮＬＳ配列を有するバリアントＣａｓ９である。例えば、一実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号６２のものなどの修飾ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いる：
【化１】
2020515258.tif 000003
【０１２３】
配列番号６２は、低減されたＡＤＡを有するように操作されたＮ末端およびＣ末端ＮＬＳを有するＳｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質配列を提供する。予想されるＭＨＣ  ＩＩエピトープ（以下および実施例１を参照されたい）を下線で示す。各エピトープ内の太字のアミノ酸は、ＡＤＡリスクを低減させる置換を示す。
【０１２４】
このように、本発明の一部の実施形態は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の潜在的ＭＨＣ  ＩＩ拘束ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープの変異誘発を含む。予想ツールを使用して、タンパク質配列におけるＭＨＣ  ＩＩ  Ｔ細胞エピトープを予想してもよい。適した予想ツールには、例えば、ＳＹＦＰＥＴＨＩ、ＩＥＤＢ（以下の多様性：推奨される、コンセンサス、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＮＮ＿ａｌｉｇｎ、ＳＭＭ＿ａｌｌｉｇｎ、コンビナトリアルライブラリー、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏを含む）、ＲＡＮＫＰＥＰ、ＰｒｏＰｒｅｄ、ＭＵＬＴＩＰＲＥＤ２、ＭＨＣＩＩＰｒｅｄ、ＭＨＣ２ＳＫｐａｎ、およびＮｅｔＭＨＣＩＩが挙げられる。一部の実施形態では、配列番号６２は、以下の７つの潜在的Ｔ細胞エピトープを含有する：エピトープ１はアミノ酸１６５〜１８１を含む；エピトープ２はアミノ酸２５１〜２６５を含む；エピトープ３はアミノ酸５８２〜５９６を含む；エピトープ４はアミノ酸７３７〜７５１を含む；エピトープ５はアミノ酸８９６〜９１０を含む；エピトープ６はアミノ酸９６８〜９８２を含む；およびエピトープ７はアミノ酸１３２８〜１３４２を含む。引き続き配列番号６２に関連して、一部の実施形態では、各エピトープは、以下の小配列を有し得る（配列番号６２に関連して）：エピトープ１では、小領域ｌａ（アミノ酸１６８〜１７６）または小領域ｌｂ（アミノ酸１７０〜１７８）が特に重要であり得る；エピトープ２では、小領域２ａはアミノ酸２５５〜２６３である；エピトープ３では、小領域３ａはアミノ酸５８６〜５９４である；エピトープ４では、小領域４ａはアミノ酸７４１〜７４９を含む；エピトープ５では、小領域５ａはアミノ酸９００〜９０８を含む；エピトープ６では、小領域６ａはアミノ酸９７２〜９８０を含む；エピトープ７では、小領域７ａはアミノ酸１３３２〜１３４０を含む。Ｃａｓ９の上記のエピトープおよび小領域は、それらが高度に免疫原性であり得る推定のエピトープを表すことから特に重要である。一実施形態では、エピトープ１〜３における多くの（例えば、少なくとも半分の）または実質的に全ての残基を、アラニンに変異させる（および変異は、Ｃａｓ９構造／機能を妨害しない）。一実施形態では、（配列番号６３に関連して）：Ｗ８８３、Ｑ８８５、Ｎ８８８、Ｖ９５５、Ｌ１３１５、およびＮ１３１７から選択される１つまたは複数を含む、エピトープ５〜７内のある特定の明記された残基を変異させる。帯電した残基をアラニンに変異させることは、核酸に直接接触する近傍の残基の局部静電気および位置決めに影響を及ぼし得る。
【０１２５】
本開示の例示的なＣａｓ９核酸配列を図１６に示し、本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質配列を図１７に示す。
【０１２６】
組成物
ある特定の態様では、本開示は、ウイルス核酸を標的とするＣａｓエンドヌクレアーゼおよびウイルス核酸を標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはそのようなＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび／もしくはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ウイルス感染症、例えばＨＢＶまたはＨＰＶ感染症の処置のための、（ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および（ｂ）１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の他の実施形態では、組成物は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含み、ＲＮＰは、ガイドＲＮＰと複合体を形成した、またはガイドＲＮＰと会合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。上記の実施形態のいずれかでは、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、特定の配列および修飾を含んでもよく、ナノ粒子によってカプセル化されていてもよい。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＨＢＶまたはＨＰＶ核酸を標的とする。
【０１２７】
一部の実施形態では、組成物は、修飾ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡならびにＨＰＶまたはＨＢＶゲノムに対してＣａｓエンドヌクレアーゼをターゲティングする１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。それらのＲＮＡは、脂質ナノ粒子、固体ナノ粒子、またはリポソームにパッケージングされている。ＲＮＡカプセル化ナノ粒子は、感染組織への局所、粘膜、または局部送達のために最適に製剤化され、全身送達および循環を回避し、このようにしてＣａｓエンドヌクレアーゼの薬物曝露、オフターゲット活性、および免疫原性を最小限にする。一部の実施形態では、ナノ粒子は、基底上皮へのＲＮＡ送達を増強するために、例えば、マイクロニードルアレイなどのデバイスによって投与される。
【０１２８】
ｍＲＮＡは、好ましくは、プログラム可能なヌクレアーゼ、例えばＣａｓエンドヌクレアーゼまたは修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは修飾エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたは修飾Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、野生型バージョンと比較して、免疫原性が減少するように修飾されている修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする。コードされる修飾ヌクレアーゼは、野生型と比較して、Ｔ細胞エピトープ内に１つまたは複数の置換を含み得る。特に、治療タンパク質がｍＲＮＡとして送達される場合、免疫応答を回避するために治療剤を修飾することは難題である。修飾ヌクレオチド配列を使用することによって、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されると、結果として得られたタンパク質は、野生型と比較して、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発しない代替または修飾エピトープを有することができる。本発明は、１つまたは複数の予想されるＴ細胞エピトープが野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して免疫応答を回避または減少させる置換を有する、修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質配列を含む。修飾Ｔ細胞エピトープを有する修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、タンパク質形態で（例えば、抗ウイルスガイドＲＮＡと複合体を形成した修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する活性なリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）として）、または標的細胞内で翻訳されるｍＲＮＡとして、ＤＮＡベクターにコードされた細胞に送達され得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、例えば１つまたは複数のガイドＲＮＡと共にｍＲＮＡ形態で送達される。
【０１２９】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、その部位がヒトゲノムにおいても出現しない、ウイルスゲノム、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＢＶ、またはＥＢＶのゲノム内の部位と相補的であるターゲティング領域を含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの感染細胞への送達を促進する、および感染細胞内での滞留を促進する修飾ヌクレオチドなどの特色を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡにおける修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡ安定性を改善する、免疫原性を低減する、またはエンドヌクレアーゼ活性の特異性を改善するように機能し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、リボース環に１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチル基、ヌクレオチド間の１つもしくは複数のホスホロチオエート結合、または両方などの、特に、エクソヌクレアーゼ消化に対して保護し得るガイドＲＮＡの５’および３’末端に対して近位に位置する特色を含むことができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的に対する結合を安定化し、非ウイルス標的（例えば、ヒトＤＮＡ）に対する結合を低減し、またはエンドヌクレアーゼ活性の特異性を増強し得る、１つまたは複数のロックド核酸、架橋型核酸、または配座制限核酸を、例えばターゲティング領域内に、必要に応じて含み得る。さらなる実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９と比較して、特異性を増強し、およびオフターゲット活性を減少させ得る（例えば、ガイドＲＮＡ標的の外部の位置で標的ＤＮＡとの相互作用を不安定にすることによって）変異を含み得る。なおさらなる実施形態では、ＲＮＡは、患者による免疫応答を最小限にし得るシュードウリジンまたは５−メチル−シトシンなどの修飾を含み得る。
【０１３１】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、例えば、リン酸骨格の電荷の均衡を保ち、ＲＮＡの組織を通しておよび細胞中への浸透、ならびに細胞内への放出を促進するカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子にパッケージングされている。脂質ナノ粒子は、組織滞留亢進剤または増粘剤、例えばヒドロキシエチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースなどを含み得る、適したゲルまたは懸濁液、例えば水性懸濁液を含有する局所用製剤中でさらに提供され得る。製剤は、ＬＮＰ安定性を増強するための賦形剤、例えばスクロースまたはマンニトールなどを含み得る。製剤は、組織浸透を亢進するための賦形剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、エタノール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、スクロースエステル、またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）などを含み得る。製剤化されたナノ粒子は、基底上皮へのＲＮＡ送達を増強するためのデバイス、例えば、マイクロニードルアレイなどによって投与され得る。
【０１３２】
一部の実施形態では、組成物は、ＨＰＶ感染症に関連する高度前がん病変などの感染部位の局所または局部に適用される。ＲＮＡは、細胞内に放出され、ｍＲＮＡは、細胞のリボソームによって翻訳されて、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを産生する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、リンカー配列、および最適な核局在化のために設計された１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端および／またはＣ末端に含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、提供されたガイドＲＮＡ（単数または複数）と複合体を形成して、活性なＲＮＰを形成する。ＲＮＰは、核へと移行し、ガイドＲＮＡの相補的部分とウイルスゲノム内の標的との間の配列特異的相互作用により、ウイルスゲノムに結合する。ウイルス標的に結合すると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムを切断する。結果として生じたウイルスＤＮＡ断片は、細胞経路によって分解または修復され、それによって感染症を取り除くまたは妨害し得る。
【０１３３】
図１は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ１１３およびガイドＲＮＡ１２１を含む、本開示の例示的な組成物１０１を示す。１つまたは複数のナノ粒子１０５（カチオン性脂質１０７を含む）は、ｍＲＮＡ１１３およびガイドＲＮＡ１２１をカプセル化している。以下により詳細に記載するように、ガイドＲＮＡ１２１は、標的核酸と相補的であるターゲティング領域１２７を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１は、配列番号１〜３８、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含み、ターゲティング領域１２７は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のゲノムにおける標的核酸と相補的である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１は、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含み、ターゲティング領域１２７は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のゲノムにおける標的核酸と相補的である。ナノ粒子１０５は、担体製剤１３５、例えば水、水溶液、またはゲルによって必要に応じて運ばれる。担体製剤１３５は、賦形剤１３６、例えばラウリル硫酸ナトリウム、エタノール、ジエエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、スクロースエステル、またはＮ−メチルピロリドンのうちの１つまたは複数を必要に応じて含む。本明細書では、ｍＲＮＡ１１３、ガイドＲＮＡ１２１、ナノ粒子１０５、および担体製剤１３５、ならびに感染症を処置する方法、および医薬を作製する方法を記載する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、または５８に記載の核酸を含み；ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、７４、７５、および７６に記載の核酸を含み；Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、複数のナノ粒子内にカプセル化されており、複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１３５】
本開示の態様は、ウイルス感染症の処置に使用するための組成物および方法を提供する。一実施形態では、組成物は、アミノ酸１４９〜１６５（別名、エピトープ１）；アミノ酸２３５〜２４９（別名、エピトープ２）；アミノ酸５６６〜５８０（別名、エピトープ３）；アミノ酸７２１〜７３５（別名、エピトープ４）；アミノ酸８８０〜８９４（別名、エピトープ５）；アミノ酸９５２〜９６６（別名、エピトープ６）；またはアミノ酸１３１２〜１３２６（別名、エピトープ７）の一部（配列番号６３に対して）内に１つまたは複数の置換を有する、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のＮＬＳ（例えば、いずれかの末端で）を含んでもよく、一部の実施形態では、配列番号６２によって表され、それらの同じ７個のエピトープは、配列番号６２に関連して以下の通りである：エピトープ１はアミノ酸１６５〜１８１を含む；エピトープ２はアミノ酸２５１〜２６５を含む；エピトープ３はアミノ酸５８２〜５９６を含む；エピトープ４はアミノ酸７３７〜７５１を含む；エピトープ５はアミノ酸８９６〜９１０を含む；エピトープ６はアミノ酸９６８〜９８２を含む；およびエピトープ７はアミノ酸１３２８〜１３４２を含む。引き続き配列番号６２に関連して、それらの１つまたは複数の置換は、特にアミノ酸１６８〜１７６；アミノ酸１７０〜１７８；アミノ酸２５５〜２６３；アミノ酸５８６〜５９４；アミノ酸７４１〜７４９；アミノ酸９００〜９０８；アミノ酸９７２〜９８０；およびアミノ酸１３３２〜１３４０のうちの１つまたは複数内に位置してもよい。１つまたは複数の置換は、配列番号６３に対して、Ｒ１５２、Ｉ１５４、Ａ１５７、Ｆ２３８、Ｎ２４０、Ａ２４３、Ｆ５６９、Ｋ５７１、Ｃ５７４、Ｗ８８３、Ｑ８８５、Ｎ８８８、Ｖ９５５、Ｌ１３１５、およびＮ１３１７であってもよく、各々は、Ａ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｔ、Ｎのうちの１つへの置換であってもよい。一実施形態では、置換は、Ｒ１５２Ｋ、Ｉ１５４Ｖ、Ａ１５７Ｓ、Ｆ２３８Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４３Ｓ、Ｆ５６９Ｌ、Ｋ５７１Ｒ、Ｃ５７４Ｅ、Ｗ８８３Ｔ、Ｑ８８５Ｎ、Ｎ８８８Ｑ、Ｖ９５５Ｉ、Ｌ１３１５Ｉ、およびＮ１３１７Ｑのうちのいずれか、ならびに必要に応じて少なくとも約５個または８個を含む。
【０１３６】
複数のガイドＲＮＡを含む組成物
一部の実施形態では、組成物は、１種より多くのガイドＲＮＡを含み、１種より多くのガイドＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列、修飾、または両方を有する。一実施形態では、異なる種のガイドＲＮＡ分子は、異なるポリヌクレオチド配列を有する。さらなる実施形態では、異なる種のガイドＲＮＡは、同じウイルス核酸の異なる標的に結合する。なおさらなる実施形態では、異なる種のガイドＲＮＡは、異なるウイルス核酸の標的に結合する。
【０１３７】
例えば、一部の実施形態では、組成物は、１種より多くのガイドＲＮＡを含み、第１のガイドＲＮＡは、好ましくはある特定の修飾を有する、ＵＧＣＡＡＵＧＵＵＵ  ＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣ  ＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣ  ＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ  ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ  ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣ  ＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵ  ＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵ  ＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ  ＵＵ（配列番号１）を含む。例えば、第１のガイドＲＮＡ内において、５’末端の最初の３ヌクレオチドは各々、リボース環に２’−Ｏ−メチル基を含む。同様に、３’末端の最後の３ヌクレオチドは各々、リボース環に２’−Ｏ−メチル基を含む。加えて、最初の３つおよび最後の３つのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート結合を含み（配列は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵを使用する標準的なＲＮＡ命名法（大文字または小文字）を使用して示す）、標準的な塩基および／または骨格からのいかなる多様性も、適切な添え書きによって記載する。例えば、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ１２１（例えば、配列番号１〜３８、７１〜７６、および７９〜８３のうちの１つ）は、１つまたは複数のホスホロチオエート結合をさらに含む。
【０１３８】
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、オリゴのリン酸骨格において非架橋酸素を硫黄原子に置換する。この修飾は、好ましくは、ヌクレアーゼ分解からヌクレオチド間連結を保護するために含まれる。ホスホロチオエート結合は、エクソヌクレアーゼ分解を阻害するために、オリゴの５’末端、３’末端、または両方で最後の３〜５ヌクレオチドの間に導入することができる。ホスホロチオエート結合をオリゴ全体に含めることは、同様にエンドヌクレアーゼによる攻撃を低減するために役立つ。ＰＳ結合を有するオリゴは、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に発注することができる。参照により組み込まれている、Wan、Synthesis,  biophysical  properties  and  biological  activity  of  second  generation  antisense  oligonucleotides  containing  chiral  phosphorothioate  linkages、Nucleic  Acids  Res、４２巻：１３４５６〜１３４５８頁、２０１４年を参照されたい。
【０１３９】
本発明の組成物は、ＨＰＶ１６に対して使用するために第２のガイドＲＮＡを含み得る。第２のガイドＲＮＡは、必要に応じて、第１のガイドＲＮＡに関して記載されるそれらの同じ修飾のいずれかと共に、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、３７、７４、７５、または７６のうちの１つを含む。第２のガイドＲＮＡもまた、好ましくは生得の免疫応答を低減させるために１０個またはそれより多くの２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。
【０１４０】
本発明の組成物は、第３のガイドＲＮＡを含み得る。第３のガイドＲＮＡは、必要に応じて、第１のガイドＲＮＡおよび必要に応じて第２のガイドＲＮＡに関して記載されるそれらの同じ修飾のいずれかを有する、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、または３７のうちの１つを含む。第３のガイドＲＮＡは、少なくとも１つの架橋型核酸（ＢＮＡ）を含む。ある特定の実施形態では、第３のガイドＲＮＡは、特異性を増加させるためにＤＮＡ結合領域における特定の部位でロックド核酸または架橋型核酸を含む。
【０１４１】
本発明の組成物は、ＨＰＶ１８を処置するために第４のガイドＲＮＡを含み得る。第４のガイドＲＮＡは、配列番号３１、３３、および３５のうちの１つ、ならびに必要に応じて記載される修飾のいずれかを含み、好ましくは５’末端の最初の３ヌクレオチドは各々、リボース環に２’−Ｏ−メチル基を含む。同様に、３’末端の最後の３ヌクレオチドは各々、リボース環に２’−Ｏ−メチル基を含む。加えて、最初の３つおよび最後の３つのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート結合を含む。第４のガイドＲＮＡは、１０個またはそれより多くの２’−Ｏ−メチルウリジンを必要に応じて含み得る。第４のガイドＲＮＡは、好ましくはターゲティング領域内に、１つまたは複数の配座制限ヌクレオチド（例えば、ＢＮＡまたはＬＮＡ）を必要に応じて含み得る。
【０１４２】
例示的な組成物
一実施形態では、本開示は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ；本明細書に記載されるガイドＲＮＡ；カチオン性脂質を含み、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化している複数のナノ粒子；ならびに担体製剤を含む組成物を提供する。さらなる実施形態では、担体製剤は、脂質ナノ粒子を安定化させ、組織滞留および組織浸透を促進することによって局所または局部送達を増強する。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含む。
【０１４３】
さらなる実施形態では、組成物は、１種より多くのガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡの種は、異なるポリヌクレオチド配列、修飾、または両方を有する。特定の実施形態では、組成物は、異なるポリヌクレオチド配列を有するガイドＲＮＡ分子を含み、異なる種のガイドＲＮＡは、同じウイルス核酸の異なる標的、または異なるウイルス核酸の標的に結合する。
【０１４４】
上記の実施形態のいずれかでは、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含み得る。特定の実施形態では、ナノ粒子はＰＥＧ化される。さらなる実施形態では、複数のナノ粒子は、担体製剤内に分散され、担体製剤は、担体液体、油、またはゲルを含む。
【０１４５】
上記の組成物のいずれかでは、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９であり得、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較して１〜２５個の間のアミノ酸置換を必要に応じて含み得る。例示的なアミノ酸置換は、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、Ｋ１００３、またはＲ１０６０、ならびにＫ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、およびＲ１０６０Ａを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのコード配列は、複数の５−メチルシチジン、シュードウリジン、または５メトキシ−ウリジンを含む。
【０１４６】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；ガイドＲＮＡは、（ａ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つ、または（ｂ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み；複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１４７】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；ガイドＲＮＡは、配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つを含み；複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１４８】
なおさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；ガイドＲＮＡは、（ａ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つ、または（ｂ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み；複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１４９】
なおさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；ガイドＲＮＡは、配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つを含み；複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１５０】
なおさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；ガイドＲＮＡは、（ａ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つ、または（ｂ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み；複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１５１】
なおさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、または７８を含み；ガイドＲＮＡは、配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つを含み；複数のナノ粒子は、担体製剤によって提供される担体液体、油、またはゲル内に分散されている。
【０１５２】
上記の例では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含み得る。
【０１５３】
上記の例では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、３７、４１、４３、４５、７４、７５、または７６を含んでもよく、ガイドＲＮＡの複数のヌクレオチドは、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基は、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである。
【０１５４】
上記の例では、ガイドＲＮＡは、配列番号４１、４３、４５、７４、７５、または７６を含んでもよく、ガイドＲＮＡの複数のヌクレオチドは、修飾塩基を有するヌクレオチドによってさらに置換されており、各修飾塩基は、２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；または２’−Ｏ−メチルアデノシンである。
【０１５５】
リボヌクレオタンパク質および関連組成物もまた、本開示の範囲内にある。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、（ａ）配列番号１〜３０、７１〜７６、および７９〜８３のうちのいずれか１つ；（ｂ）配列番号３１〜３８のうちのいずれか１つ；または（ｃ）配列番号４１〜４６および６６のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９であり、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、（ａ）配列番号６１、６２、６３、もしくは８４に記載のアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６７、６８、６９、７０、７７、もしくは７８に記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。リボヌクレオタンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた、本開示によって企図される。
【０１５６】
ナノ粒子
一部の実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡおよびＣａｓ  ｍＲＮＡは、リン酸骨格の電荷の均衡を保ち、ＲＮＡの、組織を通した細胞中への浸透、ならびに細胞内への放出を促進する、例えばカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子にパッケージングされている。脂質ナノ粒子は、組織滞留亢進剤または増粘剤、例えば、ヒドロキシエチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースなどを含み得る、適したゲルまたは懸濁液、例えば水性懸濁液を含有する局所用製剤中でさらに提供され得る。製剤は、例えばスクロースまたはマンニトールなどのＬＮＰ安定性を増強するための賦形剤を含み得る。製剤は、組織浸透を亢進するための賦形剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、エタノール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、スクロースエステル、またはＮ−メチルピロリドンなどを含み得る。製剤化されたナノ粒子は、基底上皮へのＲＮＡ送達を増強するためのデバイス、例えばマイクロニードルアレイなどによって投与され得る。
【０１５７】
好ましくは、ウイルス感染症を処置する組成物および方法では、組成物は、リポソームまたは脂質ナノ粒子を介して送達される、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。本開示の実施形態はまた、リポソームに包まれた活性なＲＮＰ、または脂質ナノ粒子にカプセル化されたポリヌクレオチドも含む。リポソームまたはナノ粒子はさらに、以下に記載される懸濁液またはゲルなどの適した担体中に提供されてもよい。本発明の方法は、これらの組成物を感染部位に、好ましくは非全身性に送達するステップを含む。これらの態様では、組成物および方法は、感染組織におけるヌクレアーゼの送達または発現によって、そうでなければ開始される免疫応答を減弱させるために、予想されるＴ細胞エピトープが野生型と比較して修飾されている修飾Ｃａｓエンドヌクレアーゼを用いる。
【０１５８】
カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）を含み得る。好ましくは、複数のナノ粒子は、担体製剤内に分散している固体脂質ナノ粒子であり、担体製剤は、担体液体、油、またはゲルを含む。ナノ粒子はＰＥＧ化されてもよい。
【０１５９】
一実施形態では、組成物１０１は、カチオン性脂質１０７を含む複数のナノ粒子１０５を含む。ナノ粒子１０５は、ｍＲＮＡ１１３およびガイドＲＮＡ１２１をカプセル化している。任意の適したナノ粒子を含めてもよい。ナノ粒子１０５は、図１に示される固体脂質ナノ粒子であり得る。加えてまたはあるいは、アニオン性核酸と相互作用してリポプレックスを形成する複数のカチオン性表面基により、リポソームを使用してｍＲＮＡ１１３およびガイドＲＮＡ１２１を送達してもよい。
【０１６０】
図４は、ｍＲＮＡ１１３およびガイドＲＮＡ１２１をカプセル化するために使用され得る例示的なリポソーム４０１を示す。固体脂質ナノ粒子またはリポソームのいずれの型も、少なくとも１つのカチオン性脂質を含む。
【０１６１】
一般的に、カチオン性脂質は、頭部基の構造に基づいて３つの主要なカテゴリーに分類される：一価の脂質、例えばＮ（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；多価脂質、例えばジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；ならびにカチオン性脂質誘導体、例えば３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）。疎水性鎖は、異なる特色を有するナノ粒子を提供する。ミリストイル（Ｃ１４）鎖は、Ｃ１６およびＣ１８鎖と比較してトランスフェクションに関して最適であることが見出され得る。より長い鎖は、相転移温度を増加させ、脂質膜の流動性を低減させ、これらは脂質膜融合にとって望ましくない場合がある。同様に、かなり高い脂質流動性を有する不飽和アルキル鎖は、飽和アルキル鎖脂質と比較してより高いトランスフェクション効率をもたらし得る。
【０１６２】
カチオン性脂質をベクターとして使用して、静電気的相互作用を通してアニオン性核酸を濃縮および送達してもよい。カチオン性脂質と核酸の比を調整することによって、過剰なカチオン性コーティングは、ベクターの、負に帯電した細胞表面およびエンドソーム膜との結合を助けて、核酸の細胞質送達を助け得る。カチオン性脂質頭部基と核酸の骨格との間の静電気的相互作用は、カチオン性リポソームにおけるｍＲＮＡ１２１およびガイドＲＮＡ１１３のカプセル化を推進する。調製方法を以下に記載する。必要に応じて、ナノ粒子１０５はＰＥＧ化される。
【０１６３】
ＬＮＰは、典型的に直径５０〜２００ｎｍの範囲のサイズ、好ましくは６０〜１２０ｎｍの範囲のサイズであり得、必要に応じて、タンパク質結合および望まれない取り込みを最小限にするためにＰＥＧなどの中性ポリマーの表面コーティングを含んでもよい。ナノ粒子１０５は、水、水性溶液、懸濁液、またはゲルなどの担体１３５によって必要に応じて運ばれる。例えば、ＬＮＰを、懸濁液またはゲルなどの局所送達のための製剤または調製物に含めてもよい。そのような製剤は、脂肪酸、界面活性剤、エステル、アルコール、ポリアルコール、ピロリドン、アミン、アミド、スルホキシド、テルペン、アルカン、およびリン脂質などの化学エンハンサー（上皮または角質層の高次構造を乱すことによって局所の薬物浸透を亢進するために）を含んでもよい。
【０１６４】
ＬＮＰの使用は、ペイロードＲＮＡの溶解度を増強し、透過・滞留亢進（ＥＰＲ）効果により、持続的で制御された放出を提供し、より高濃度のＲＮＡを標的エリアに送達し得る。脂質に基づくナノ粒子（リポソームおよび固体−脂質ナノ粒子）を使用してもよい。
【０１６５】
ナノ粒子の局所薬物送達は、標的部位に対して直接治療作用を提供し、潜在的に望まれない全身副作用を低減させ得る。ナノ粒子を、例えば溶液／液体製剤、乾燥製剤、または粘性製剤（すなわち、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤）として、臨床において局所使用のために製剤化することができる多様な方式が存在する。ナノ粒子を懸濁するために使用される媒体は、生体適合性であり、かつ経皮吸収を促進するために使用されなければならない。懸濁媒体はまた、ナノ粒子からの薬物の放出動態も変更させ得る。参照により組み込まれている、Goyal、２０１６年、Nanoparticles  and  nanofibers  for  topical  drug  delivery、J  Control  Release、２４０巻：７７〜９２頁を参照されたい。
【０１６６】
媒体は、角質層などの障壁への浸透を助け得る。例えば、角質層が、遊離のステロール、遊離の脂肪酸、トリグリセリド、およびセラミドの複層マトリクスに埋め込まれた角質細胞を含む場合、皮膚浸透亢進剤は、ＲＮＡの浸透を増加させ得る。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、ＬＮＰを、緩衝液に懸濁する。緩衝液は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）などの浸透亢進剤を含んでもよい。ＳＬＳは、表皮脂質の流動性を増加させることによって、皮膚への浸透を亢進するアニオン性界面活性剤である。適用部位の下の脂質流動性の増加によって、ＳＬＳを、最適に拡散させることができる。このように、ＳＬＳは、経皮送達を増加させることなく、表皮内薬物送達を増加させることができる。方法は、必要に応じて約１〜１０重量／重量％のＳＬＳ、すなわち約３５〜２５０ｍＭ  ＳＬＳを含むｐＨ＝６の２００ｍＭリン酸緩衝液などの緩衝液の使用を含み得る。参照により組み込まれている、Piret、２０００年、Sodium  Lauryl  Sulfate  Increases  the  Efficacy  of  a  Topical  Formulation  of  Foscarnet  against  Herpes  Simplex  Virus  Type  1  Cutaneous  Lesions  in  Mice、Antimic  Ag  Chemother、４４巻（９号）：２２６３〜２２７０頁を参照されたい。
【０１６８】
脂質ナノ粒子は、必要に応じて、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーゲルなどのゲル（必要に応じてＳＬＳを含む）を介して送達され得る。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポリマーブロックの長さをカスタマイズできることから、わずかに異なる特性を有する多くの異なるポロキサマーが存在する。一般的な用語「ポロキサマー」に関して、これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマー）の後に３つの数字が続くことによって命名され：最初の２つの数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の数字×１０はポリオキシエチレンの含有パーセンテージを与える（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７＝４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および７０％のポリオキシエチレン含有量を有するポロキサマー）。ＰｌｕｒｏｎｉｃおよびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ商標に関して、これらのコポリマーの符号化は、室温でその物理形態を定義する文字で始まり（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））、その後に２つまたは３つの数字が続く。数字表記での最初の数字（３桁の数の場合は２つの数字）に３００を乗じると、疎水性物質のおおよその分子重量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレンの含有パーセンテージを与える（例えば、Ｌ６１は、１，８００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量、および１０％のポリオキシエチレン含有量を示す）。
【０１６９】
脂質ナノ粒子を、凍結乾燥してもよい（例えば、凍結保護剤としてデキストロース（５％ｗ／ｖ）を使用して）。ＬＮＰは、水性懸濁剤中または例えばレシチンを含む乳剤中に保持してもよい。
【０１７０】
処置方法
本開示の別の態様は、ウイルス感染症を処置するための本明細書に記載されるガイドＲＮＡおよび関連組成物の使用である。例えば、一実施形態では、対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、対象にガイドＲＮＡ、ＤＮＡ、ベクター、またはＣａｓ９−ガイドＲＮＡ組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７１】
一部の実施形態では、本開示は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症を処置する方法を提供する。一部のＨＰＶタイプは、がんへと変化し得る異常な成長である前がん病変、またはがんを引き起こし得る。ある特定のＨＰＶタイプは、膣、陰茎、肛門の内部および外部、または頭頸部の一部のエリアを含む、性器および他のエリアに感染する。「高リスク」ＨＰＶは、がんを引き起こす可能性がより高いＨＰＶのタイプである。そのような感染症は、正常な細胞を、前がん病変またはがんへとトランスフォームする。ＨＰＶに関連するがんには、子宮頸がん、口腔がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、および陰茎がんが挙げられる。
【０１７２】
ＨＰＶに関連する子宮頸がんのうち、約７０％が、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８によって引き起こされる。ＨＰＶによる子宮頸がんは、前がん子宮頸部病変として現れ得る。前がん子宮頸部病変はまた、上皮内病変とも呼ばれ、最終的に子宮頸がんへと発達し得る子宮頸部の細胞の異常である。子宮頸部細胞には主に２つのタイプ、扁平上皮細胞と腺細胞があり、異常はいずれのタイプにも起こり得る。前がん子宮頸部病変の最も一般的なタイプには：異型扁平上皮細胞（子宮頸部の扁平上皮細胞の異常）；扁平上皮内病変（軽度または高度のいずれかとして分類され、高度病変は子宮頸がんに進行する可能性がより高い）；および異型腺細胞（子宮頸部上部エリアまたは子宮内の起こり得る前がん病変）が挙げられる。推奨される行動はＨＰＶ検査を含み得る。試験結果陽性の場合、病変を処置してＨＰＶウイルスを取り除いてもよい。全て参照により組み込まれている、Senapati、２０１６年、Molecular  mechanisms  of  HPV  mediated  neoplastic  progression、Infect  Agent  Cancer、１１巻：５９  eCollection；Ghittoni、２０１５年、Role  of  human  papillomavirus  in  carcinogenesis、Ecancermedicalscience、９巻：５２６頁；およびWorld  Health  Organization、２０１３年、WHO  Guidelines  for  screening  and  treatment  of  precancerous  lesions  for  cervical  cancer  prevention、WHO、Genevaを参照されたい。
【０１７３】
一部の実施形態では、組成物を、ＨＰＶ感染症に関連する高度前がん病変などの感染部位の局所または局部に適用する。ＲＮＡが細胞内に放出され、ｍＲＮＡが細胞のリボソームによって翻訳されて、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを産生する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、リンカー配列、ならびに最適な核局在化のために設計された１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端および／またはＣ末端に含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、提供されたガイドＲＮＡ（単数または複数）と複合体を形成して、活性なリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成する。ＲＮＰは核へと移行し、ガイドＲＮＡの相補的部分と、ウイルスゲノム内の標的との間の配列特異的相互作用により、ウイルスゲノムに結合する。ウイルス標的に結合すると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムを切断する。結果として生じたウイルスＤＮＡ断片は細胞経路によって分解または修復され、それによって感染症を取り除くまたは妨害し得る。
【０１７４】
図５は、ＨＰＶ感染症を処置する方法５０１を図示する。方法５０１は、本明細書に記載される実施形態に従って組成物１０１を用意するステップ５０５を含む。組成物１０１の有効量を、それを必要とする患者の感染部位に組成物の有効量を投与する５０９。組成物１０１は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ１１３、および配列番号１〜３８、７１〜７６、または７９〜８３からなる一覧から選択される配列を含むガイドＲＮＡ１２１を含む。複数のナノ粒子１０５は、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化している。最も好ましくは、組成物１０１は、非経口投与または局所投与され５０９、全身循環を回避する。例えば、組成物１０１を感染部位の表面に直接適用しても、感染部位に注射してもよい。そのような手段によって、方法５０１を使用して、扁平上皮癌病変、例えば高度前がんＨＰＶ病変などの感染部位を処置してもよい。方法５０１を使用して、がん、例えば子宮頸がん、肛門がん、口腔がん、陰茎がん、または膣がんの発生を予防してもよい。好ましくは、方法を使用して、子宮頸がんを予防する。配列番号１〜３８、７１〜７６、または７９〜８３からなる一覧から選択される配列を含むガイドＲＮＡ１２１は、好ましくは、ＨＰＶゲノムにおける領域と実質的に相補的なターゲティング領域１２７を含む。ある特定の実施形態では、ＨＰＶのＥ６および／またはＥ７遺伝子が標的とされる。一実施形態では、対象におけるＨＰＶ感染症を処置する方法であって、配列番号８０を含むガイドＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７５】
図６は、ＨＰＶ遺伝子におけるＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７遺伝子のマップである。ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７遺伝子は、抗ウイルス処置においてプログラム可能なヌクレアーゼを使用して標的として使用してもよい。Ｅ６およびＥ７タンパク質は発癌性であり得ることから、ヌクレアーゼによる破壊に関してそのそれぞれの遺伝子を標的とすることは貴重であり得る。ガイドＲＮＡを設計するために、各遺伝子を、ヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、Ｃａｓ９の５’−ＮＧＧ−３’）に関して走査する。遺伝子内で見出された各候補ＰＡＭに関して、ＰＡＭに隣接する２０ヌクレオチドを読み出し、ヒトゲノムと比較する。その２０ヌクレオチド＋ＰＡＭがヒトゲノム内である特定の基準にマッチしない場合には、その２０ヌクレオチド＋ＰＡＭをターゲティング配列として使用することができる。マッチ基準は、完全ではないマッチを必要条件としてもよい。一実施形態では、ターゲティング配列は、≧７０％マッチする一連の２３ヌクレオチドがヒトゲノム内に存在しない、２０ヌクレオチド＋ＰＡＭ（例えば、Ｃａｓ９に関して２３ヌクレオチド）である。一実施形態では、ターゲティング配列は、ＰＡＭが後に続く一連の２０ヌクレオチドがヒトゲノム内に存在せず、ヒトゲノムの２０ヌクレオチドが、ターゲティング配列の２０ヌクレオチドと≧７０％マッチする、２０ヌクレオチド＋ＰＡＭである（例えば、Ｃａｓ９がヌクレアーゼである場合、ＰＡＭが後に続く１４個またはそれより多くのマッチ塩基を有するヒトゲノムの一連の２０ヌクレオチドがあれば、所与のターゲティング配列の使用を除外する）。
【０１７６】
医薬を作製する方法
本発明の態様は、ウイルス感染症の処置のための医薬を作製する方法を提供する。
【０１７７】
図１０は、ＨＰＶ感染症の処置のための医薬（例えば、組成物１０１）を作製する方法１００１を図示する。方法１００１は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを調製するステップ１００５；配列番号１〜３８、７１〜７６、または７９〜８３からなる一覧から選択される配列を含む１つまたは複数のガイドＲＮＡを調製するステップ１００９；ならびにカチオン性脂質を含む複数のナノ粒子にｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化するステップ１０１３を含む。ナノ粒子を、薬学的に許容される担体、例えば、ゲルまたは懸濁液、例えば水性懸濁液に導入１０１９してもよい。
【０１７８】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、必要に応じて１つまたは複数の修飾を有する、配列番号１、５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、４、および３７のうちの１つから選択される配列を含む。ガイドＲＮＡは、好ましくは固相合成によって合成される。固相合成は、全ての試薬および溶媒がその中を自由に通過することができるカラムにおいてフィルター間に保持され得る固体支持体上で実施される。固相合成によって、大過剰の液相試薬を使用して、反応が迅速に完了するように推進することができる。不純物および過剰の試薬を洗い流し、精製は必要ではない。プロセスを自動化してもよく、コンピューター制御された固相合成装置上で自動化しやすい。固体支持体（別名、樹脂）は、オリゴヌクレオチドが結合する、典型的に直径５０〜２００μｍの不溶性粒子である。適した支持体には、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）およびポリスチレンが挙げられる。
【０１７９】
固体支持体は典型的に、樹脂１グラムあたりヌクレオシド２０〜３０μｍｏｌのローディングによって製造される。例えば、Ｈ−ホスホネートおよびホスホトリエステル法、ならびにＫｈｏｒａｎａのホスホジエステルアプローチを含む、任意の適した方法を使用してもよい。一部の実施形態では、固相技術および自動化を使用するホスホロアミダイト法を使用する。
【０１８０】
ホスホロアミダイトオリゴ合成は、３’から５’方向に、合成サイクルあたり１ヌクレオチドが付加されて進行する。合成のために使用される構築ブロックは、一般的に「単量体」と呼ばれ、これは活性化ＲＮＡヌクレオシド（ホスホロアミダイト）である。ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を使用して、ヌクレオシドの５’末端を保護し、β−シアノエチル基は、３’亜リン酸塩部分を保護し、同様に、複素環ヌクレオ塩基において反応性の一級アミンを保護するように作用する追加の基を含んでもよい。保護基は、合成の間に分岐形成または他の望ましくない副反応が起こるのを防止するように選択される。オリゴヌクレオチドは、固体支持体上で合成される。典型的に、支持体は、コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレン、または膜を充填した小さいカラムである。オリゴヌクレオチドは通常、３’から５’へと合成される。合成は、最初の支持体結合、保護ヌクレオチドがロードされた反応カラムを合成装置のカラムホルダーに付加することによって始まる。第１のヌクレオチド構築ブロックまたは単量体は通常、長鎖アルキルアミン−コントロールドポアガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）に固定される。オリゴヌクレオチド合成に対するホスホロアミダイトアプローチは、固体支持体、通常コントロールドポアガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレンにおいて４ステップで進行する。合成は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解したジクロロ酢酸（ＤＣＡ）による短時間の処置による５’−トリチル基の切断によって開始される。次に、テトラゾールによって活性化した単量体を、利用可能な５’−ヒドロキシルにカップリングし、亜リン酸塩連結を得る。ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ溶液を使用するヨウ素での処置によるその後の亜リン酸塩酸化によってリン酸骨格を生じる。無水酢酸によるキャッピングステップは、望ましくない不全配列を終止させ、オリゴヌクレオチド合成サイクルを完了する。いずれも参照により組み込まれている、McBride、１９８３年、An  investigation  of  several  deoxynucleoside  phosphoramidites  useful  for  synthesizing  deoxyoligonucleotides、Tetrahedron  Lett、２４巻：２４５〜２４８頁、１９８３年；およびKosuri、２０１４年、Large-scale  de  novo  DNA  synthesis:technologies  and  applications、Nat  Meth、１１巻：４９９〜５０７頁を参照されたい。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを合成することによって調製される。任意の適した合成方法を使用してもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって作製する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、プロモーターを含有する精製した線形ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含む緩衝液系、ならびに適切なファージＲＮＡポリメラーゼを使用する。ＤＮＡ鋳型は好ましくは、ファージポリメラーゼが結合するための二本鎖プロモーターを含む。鋳型は、クローニングによって操作されるプラスミド構築物、ＲＮＡ前駆体からの第１鎖および第２鎖合成によって生成されたｃＤＮＡ鋳型、またはＰＣＲによってもしくは化学合成オリゴヌクレオチドのアニーリングによって生成された線形鋳型を含み得る。鋳型は（例えば、直線化した）プラスミドであり得る。多くのプラスミドは、ファージポリメラーゼプロモーターを含む。任意の適したプロモーターを使用してもよく、例えば、３つの一般的なポリメラーゼ、ＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３のうちのいずれかのプロモーターを使用してもよい。
【０１８２】
一部の実施形態（ＴｒｉＬｉｎｋ）では、直線化したプラスミド鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡから離れると転写が停止する「ランオフ転写」のためである。プラスミドは、およそポリ（Ａ）８０テールをコードする。プロセスは、メチル化５’キャップ（「Ｃａｐ１」）を、同時転写的に付加する。このプロセスは、ＴｒｉＬｉｎｋによる商標名ＣｌｅａｎＣａｐによって提供される。プロセスは、正常または修飾ＮＴＰ（５ｍＣ、５−メトキシ−ウリジン（５ｍｏＵ））を任意の比で使用することができる。転写反応後、ｍＲＮＡをホスファターゼ処置して、キャップのないｍＲＮＡから任意の５’三リン酸を除去する。ＨＰＬＣは、最終ｍＲＮＡ産物を精製する。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、ＰＣＲプライマーを使用して、プラスミドのｍＲＮＡコード領域のみから二本鎖ＤＮＡ鋳型を増幅する。１つのＰＣＲプライマーは、プラスミドにおいてポリ（Ａ）テールが失われる問題を防止するためにポリ（Ａ）１２０テールを含有する。このプロセスは、正常または修飾ＮＴＰ（５ｍＣ、Ψ）を任意の比で使用することができ、同時転写的にまたは転写後および酵素的にキャッピングを行うことができる。転写後、ｍＲＮＡをホスファターゼ処置して、キャップのないｍＲＮＡから任意の５’三リン酸を除去する。ｍＲＮＡを、スピンカラムを介して精製して、ｄｓＲＮＡを除去する。このプロセスは、Ａｍｐ−Ｔｅｃによって提供される。
【０１８４】
一般的に、転写鋳型のためのプラスミドベクターを、制限酵素消化によって直線化してもよい。転写がＤＮＡ鋳型の末端まで進行することから、直線化によって、規定の長さおよび配列のＲＮＡ転写物が確実に生成される。ＰＣＲ産物はまた、転写のための鋳型としても機能することができる。フォワードまたはリバースＰＣＲプライマーのいずれかの５’末端にプロモーター配列を含めることによって、プロモーターをＰＣＲ産物に付加することができる。
【０１８５】
次いで、鋳型ＤＮＡを、リボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）の存在下で、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡファージポリメラーゼによって転写する。ポリメラーゼは、鋳型鎖を横切り、ＤＮＡとの塩基対形成を使用して、相補的ＲＮＡ鎖（チミンの代わりにウラシルを使用して）を合成する。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型鎖の３’→５’末端へと移動して、５’→３’方向にＲＮＡ分子を産生する。参照により組み込まれている、Jani、２０１２年、In  vitro  Transcription  and  Capping  of  Gaussia  Luciferase  mRNA  Followed  by  HeLa  Cell  Transfection、J  Vis  Exp、６１巻：３７０２頁を参照されたい。
【０１８６】
カチオン性脂質を含む複数のナノ粒子におけるｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡのカプセル化は、任意の適した方法によって進行してもよい。調製方法は、カチオン性リポソームおよびｍＲＮＡを溶液中で直接混合するステップ、または溶液中のｍＲＮＡによる薄層脂質膜の再水和を含んでもよい。水溶液中にカチオン性脂質／ｍＲＮＡ複合体を分散すると、依然としてカチオン性リポソームと呼ばれる場合もあるが、より正確にはリポプレックスと呼ばれる不均一な複合体をもたらすことが多い。リポプレックスは、投入量の最大９０％の核酸の積み荷をカプセル化することができる。参照により組み込まれている、Wang、２０１５年、Delivery  of  oligonucleotides  with  lipid  nanoparticles、Adv  Drug  Deliv  Rev、８７巻：６８〜８０頁を参照されたい。
【０１８７】
一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡ（例えば、約６０μｇ／反応の収率でＴ７ポリメラーゼに基づくＩＶＴキットにより調製）は、予め形成されたＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）／コレステロール（１：１モル比）リポソームと静電気的に相互作用する。カチオン性脂質頭部基と核酸の骨格との間の静電気的相互作用は、カチオン性リポソームにおけるｍＲＮＡのカプセル化を推進する。これは、自己アセンブルする、リポソームに基づくコア膜ナノ粒子製剤を生じる。静電気的相互作用は、コア構造上での脂質二重層の崩壊を誘導することによって自己アセンブリーを促進し、コア／膜構造を有する球状で固体のリポソームナノ粒子をもたらす。参照により組み込まれている、Wang、２０１３年、Systematic  delivery  of  modified  mRNA  encoding  herpes  simplex  virus  1  thymidine  kinase  for  targeted  cancer  gene  therapy、Mol  Ther、２１巻（２号）：３５８〜３６７頁を参照されたい。
【０１８８】
調製方法は、カチオン性リポソームおよびＲＮＡを溶液中で直接混合するステップ、または溶液中のＲＮＡによる薄層脂質膜の再水和を含み得る。水溶液中にカチオン性脂質／ＲＮＡ複合体を分散すると、依然としてカチオン性リポソーム、別名リポプレックスと呼ばれる場合もある不均一な複合体をもたらし得る。リポプレックスは、投入量の最大９０％の核酸の積み荷をカプセル化することができる。参照により組み込まれている、Wang、２０１５年、Delivery  of  oligonucleotides  with  lipid  nanoparticles、Adv  Drug  Deliv  Rev、８７巻：６８〜８０頁を参照されたい。
【０１８９】
一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡ（例えば、約６０μｇ／反応の収率でＴ７ポリメラーゼに基づくＩＶＴキットにより調製）は、予め形成されたＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）／コレステロール（１：１モル比）リポソームと静電気的に相互作用する。これは、自己アセンブリーする、リポソームに基づくコア膜ナノ粒子製剤を生じる。静電気的相互作用は、コア構造上での脂質二重層の崩壊を誘導することによって自己アセンブリーを促進し、コア／膜構造を有する球状で固体のリポソームナノ粒子をもたらす。参照により組み込まれている、Wang、２０１３年、Systematic  delivery  of  modified  mRNA  encoding  herpes  simplex  virus  1  thymidine  kinase  for  targeted  cancer  gene  therapy、Mol  Ther、２１巻（２号）：３５８〜３６７頁を参照されたい。このように、一部の実施形態では、ナノ粒子は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）をさらに含む。ナノ粒子は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含んでもよい。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、ＨＰＬＣ精製１−メチルシュードウリジン含有ｍＲＮＡを、自己アセンブリープロセスを使用してＬＮＰにカプセル化してもよい。ＬＮＰは、イオン化可能な脂質Ｌ３１９、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧをモル比５５：１０：３２．５：２．５（Ｌ３１９：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）で使用して調製する。脂質窒素のｓｉＲＮＡリン酸塩に対する比３でｍＲＮＡを導入し、これは総脂質のｍＲＮＡに対する重量比約１０：１に対応する。自然発生小胞形成プロセスを使用して、ＬＮＰを調製する。ｍＲＮＡを１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液、ｐＨ４中で約１ｍｇ／ｍｌに希釈する。脂質を溶解し、エタノール中で適切な比で混合する。シリンジポンプを使用して、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液をそれぞれ、１５および５ｍｌ／分で送達する。ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液を含有するシリンジを、ＰＥＥＫ高速液体クロマトグラフィー管材料（ｓｉＲＮＡ溶液に関して内径０．０２および脂質溶液に関して内径０．０１）を有するユニオンコネクター（０．０５抜き穴、＃Ｐ−７２８；ＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）に接続する。ある長さのＰＥＥＫ高速液体クロマトグラフィー管材料（内径０．０４）を、ユニオンコネクターの出口に接続し、収集チューブにつなぐ。次いで、エタノールを除去し、外部緩衝液を、透析またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってリン酸緩衝食塩水（１５５ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣ１、３ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）に交換する。最後に、ＬＮＰを、０．２μｍ滅菌フィルターを通して濾過する。ＬＮＰは、好ましくは、カプセル化されたＲＮＡの総脂質に対する比約０．０５（重量／重量）および直径約８０ｎｍのイオン化可能なカチオン性脂質／ホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−脂質（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ／ｍｏｌ）を含有する。ｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、１μｇ／μｌのｍＲＮＡ濃度で、−８０℃で保存され得る。参照により組み込まれている、Maier、２０１３年、Biodegradable  lipids  enabling  rapidly  eliminating  lipid  nanoparticles  for  systemic  delivery  of  RNAi  therapeutics、Mol  Ther、２１巻（８号）：１５７０〜１５７８頁を参照されたい。背景に関しては、全て参照により組み込まれている、ＷＯ２０１６／０８９４３３Ａｌ、ＷＯ２０１５／００６７４７Ａ２、ＷＯ２０１４／０９３９２４Ａｌ、およびＷＯ２０１３／０５２５２３Ａｌを参照されたい。
【０１９１】
図１１は、ＲＮＰの特異性を確認する戦略を示す。ＣＲＩＳＰＲ構成要素を、二本鎖オリゴ−デオキシヌクレオシド（ｄｓＯＤＮ）と共に標的細胞にエレクトロポレートする。細胞をＲＮＰと共にインキュベートし、Ｃａｓ９によって導入された切断がｄｓＯＤＮを捕捉する。１日後、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、アダプターを付加するステップを含む試料調製に供して、シークエンシングライブラリーを作成する。シークエンシングを使用して、捕捉されたｄｓＯＤＮを同定する。
【０１９２】
このように、シークエンシング（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）法によって可能となる二本鎖切断のゲノムワイドなバイアスのない同定によって、オフターゲット活性を評価してもよい。参照により組み込まれている、Tsai、２０１５年、GUIDE-seq  enables  genome-wide  profiling  of  off-target  cleavage  by  CRISPR-Cas  nucleases、Nat  Biotechnol、３３巻：１８７〜１９７頁を参照されたい。Tsai、２０１５年のそれらのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法を使用して、組成物１０１のオフターゲット効果を決定した。しかし、そのような手段では、組成物１０１は、許容可能な低いオフターゲット効果および高いオンターゲット特異性を有することが示され得る。
【０１９３】
開示のｍＲＮＡおよび送達法を介しての良好なオンターゲット特異性に加えて、開示される組成物および特に脂質ナノ粒子にカプセル化されたｍＲＮＡは、標的組織および細胞への良好な浸透ならびに標的組織および細胞内での良好な放出を示し、ｍＲＮＡの放出は、例えば活性なタンパク質への翻訳を通して発現を可能にする。
【実施例】
【０１９４】
（実施例１）
修飾Ｔ細胞エピトープを有するバリアントＣａｓ９タンパク質
エピトープ解析を、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９アミノ酸配列、配列番号６３について実施した。ＳＹＦＰＥＴＨＩ、ＩＥＤＢ（デフォルトの設定、コンセンサス、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＮＮ＿ａｌｉｇｎ、ＳＭＭ＿ａｌｌｉｇｎ、コンビナトリアルライブラリー、およびＳｔｕｒｎｉｏｌｏによって完了した解析）、ＲＡＮＫＰＥＰ、ＰｒｏＰｒｅｄ、ＭＵＬＴＩＰＲＥＤ２、ＭＨＣＩＩＰｒｅｄ、ＭＨＣ２ＳＫｐａｎ、およびＮｅｔＭＨＣＩＩを含む、複数のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予想ツールを使用して、変異誘発に関するＨＬＡ−ＤＲＢ１の潜在的ＭＨＣ  ＩＩ拘束ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを同定した。
【０１９５】
７つのエピトープが、配列番号６３に関して予想された：エピトープ１（アミノ酸１４９〜１６５を含む）；エピトープ２（アミノ酸２３５〜２４９を含む）；エピトープ３（アミノ酸５６６〜５８０を含む）；エピトープ４（アミノ酸７２１〜７３５を含む）；エピトープ５（８８０〜８９４を含む）；エピトープ６（アミノ酸９５２〜９６６を含む）；およびエピトープ７はアミノ酸（１３１２〜１３２６）を含む。
【０１９６】
それらの同じ７つのエピトープは、配列番号６２に関連して以下の通りである：エピトープ１はアミノ酸１６５〜１８１を含む；エピトープ２はアミノ酸２５１〜２６５を含む；エピトープ３はアミノ酸５８２〜５９６を含む；エピトープ４はアミノ酸７３７〜７５１を含む；エピトープ５はアミノ酸８９６〜９１０を含む；エピトープ６はアミノ酸９６８〜９８２を含む；およびエピトープ７はアミノ酸１３２８〜１３４２を含む。
【０１９７】
引き続き配列番号６２に関連して、各エピトープは、以下のような小配列を有し得る（配列番号６２に関連して）：エピトープ１では、小領域ｌａ（アミノ酸１６８〜１７６）または小領域ｌｂ（アミノ酸１７０〜１７８）が特に重要であり得る；エピトープ２では、小領域２ａはアミノ酸２５５〜２６３である；エピトープ３では、小領域３ａはアミノ酸５８６〜５９４である；エピトープ４では、小領域４ａはアミノ酸７４１〜７４９を含む；エピトープ５では、小領域５ａはアミノ酸９００〜９０８を含む；エピトープ６では、小領域６ａはアミノ酸９７２〜９８０を含む；エピトープ７では、小領域７ａはアミノ酸１３３２〜１３４０を含む。Ｃａｓ９の上記のエピトープおよび小領域は、それらが高度に免疫原性であり得る潜在的エピトープとして同定されたことから特に重要である。
【０１９８】
エピトープの変異性を解析するために、各エピトープを、ａｐｏ−Ｃａｓ９  ３Ｄ結晶構造データ、ｓｇＲＮＡ結合Ｃａｓ９構造、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ｄｓＤＮＡ構造に関して調べて、各エピトープにおける際立って重要な残基の重要性を決定する。例えば、構造または機能に影響を及ぼす可能性なしに、エピトープ上の電荷の問題を低減するために、ほとんどの残基をアラニンに変異させることができることが見出され得る。同様に、アラニンである残基をセリンに保存的に変異させることができることも見出され得る。
【０１９９】
（実施例２）
ＨＰＶ１６を標的とするＣａｓ９組成物
遺伝子コードｍＲＮＡ  ＤＮＡを、Ｔ７ファージポリメラーゼによる転写のために用意し、ガイドＲＮＡを、ホスホロアミダイト合成によって合成した。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験として、Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、および標的ＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエンドヌクレアーゼアッセイのために混合およびインキュベートした。図７に示すように、消化したＤＮＡのＤＮＡゲル電気泳動によって、高いエンドヌクレアーゼ活性が明らかとなった。４つのレーンは、Ｅ６〜Ｅ７領域のＰＣＲアンプリコン、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＰ処置アンプリコンの産物の結果を示す。レーン２〜４は各々、対照と比較して差を示す。レーン３は、別個の質量の３つの断片へのＨＰＶゲノムＤＮＡの切断を示す。ｇＲＮＡは、Ｅ６またはＥ７遺伝子内でマッチするように設計されていることから、これらのデータは、対応するタンパク質の発現が、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ媒介性切断によって停止し得ることを示唆する。
【０２０１】
図８は、Ｃａｓ９（配列番号５４）およびガイドＲＮＡ（配列番号２）の送達（エレクトロポレーションによる）がＳｉＨａ細胞においてＨＰＶゲノムのコピー数を低減させることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。（Ａ）ウイルスＤＮＡレベルは、非特異的ガイドＲＮＡを提供された細胞と比較してＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを提供された細胞では低かった。（Ｂ）細胞死は、非特異的ガイドＲＮＡを提供されたＨＰＶ１６＋細胞（左）と比較してＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡを提供されたＨＰＶ１６＋  ＳｉＨａ細胞では多かった。細胞死は、ＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡおよびまたは非特異的ガイドＲＮＡを提供されたかにかかわらず、ＨＰＶ１６陰性２９３細胞（右）ではかなり低かった。
【０２０２】
図９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＰＶ１６＋  ＳｉＨａがん細胞を殺滅できることを示す。細胞傷害性は、非特異的ガイドＲＮＡを受けた細胞と比較して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（配列番号５４）およびＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡ（配列番号２）をエレクトロポレートされた細胞では大きかった。細胞の殺滅は、処置後数日間増加する傾向があり（左）、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの量が増加すると共に増加する傾向があった（右）。
【０２０３】
（実施例３）
ＨＰＶ１６を標的とするＣａｓ９組成物
図１２は、ＨＰＶ１６ゲノム（配列番号６４および６５）の部分のターゲティングにおける、実施例５に記載されるＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによって異なる用量で検出されたガイドＲＮＡの特異性を示す。配列番号６４または配列番号６５が標的とされる場合、特異性は９９．９％〜１００％である。
【０２０４】
図１３は、セルフリーＤＮＡ切断アッセイを使用して、ＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡ１．１．１（配列番号２）（丸）；１．１．３（配列番号４）（四角）、およびＥ６−１  ＢＮＡ／ＬＮＡ（配列番号８３）（菱形）に関するＣａｓエンドヌクレアーゼのオンターゲット（左）およびオフターゲット（右）ＤＮＡ切断効率の測定結果を示す。Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡをプレインキュベートして、リボヌクレオタンパク質複合体を形成する。次いで、ｇＲＮＡ標的配列を含有する二本鎖ＤＮＡを付加し、ＣＲＩＳＰＲ複合体にＤＮＡを短期間切断させた後、反応をクエンチした。切断および非切断ＤＮＡ産物を、キャピラリーゲル電気泳動によって分離し、定量する。
【０２０５】
プロトスペーサーにおけるＢＮＡ／ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、オフターゲットＤＮＡに対する活性を低減させるが、オンターゲットＤＮＡに対する活性を維持する。
【０２０６】
図１４は、ＨＰＶターゲティングガイドＲＮＡ１．１．１（配列番号２）（Ａ）、１．１．３（配列番号４）（Ｂ）、およびＥ６−１  ＢＮＡ／ＬＮＡ（配列番号８３）（Ｃ）のＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによる細胞内ＤＮＡ切断特異性を示す。結果は、少なくとも１つの配座制限ヌクレオチド、例えばロックド核酸または架橋型核酸残基を含めることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断特異性を大幅に改善できることを示す。
【０２０７】
（実施例４）
ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の組織浸透
図１５は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の組織浸透の成功を示す。ＬＮＰカプセル化ｍＲＮＡの子宮頸部上皮ＰＢＳへの膣内送達後のマウス子宮頸部からの切片の顕微鏡写真を陰性対照として使用した。Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔは、市販のトランスフェクション試薬である。ＬＮＰ  １Ａは、脂質ナノ粒子にカプセル化されたＧＦＰ  ｍＲＮＡであった。ＬＮＰ  １Ｂは、脂質の異なる組成物（ＭＣ３）で構成される別の脂質ナノ粒子にカプセル化されたＧＦＰ  ｍＲＮＡであった。ｍＲＮＡはＧＦＰをコードし、このようにＧＦＰは、ＬＮＰ送達ｍＲＮＡから翻訳された活性な、発現されたタンパク質を示す。矢印は、ＰＢＳまたはＴｕｒｂｏｆｅｃｔに関するよりも大きい蛍光が、ＬＮＰ  １ＡおよびＬＮＰ  １Ｂに関して明白である領域を示す。結果は、ＬＮＰ  １ＡおよびＬＮＰ  １Ｂが、子宮頸部上皮における発現されたタンパク質の広範な分布をもたらすことを示す。
【０２０８】
（実施例５）
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ＋ＨＰＶ１６  Ｅ７  ｇＲＮＡの特異性
ＨＰＶ１６ターゲティングガイドＲＮＡのオンターゲットおよびオフターゲット活性を、バイアスのないディープシークエンシングＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ法によって測定した。ＤＮＡ二本鎖切断のバイアスのない同定を、Ｇｕｉｄｅ  Ｓｅｑによって決定し、Nat  Biotechnol.２０１５年２月；３３巻（２号）：１８７〜１９７頁、doe:10.1038/nbt.3117に記載されるように実施した。
【０２０９】
簡単に説明すると、細胞に、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（配列番号６８、または高忠実度Ｃａｓ９バリアントをコードする配列、配列番号５９および配列番号６０）、ガイドＲＮＡ（配列番号６）、およびＤＮＡ二本鎖切断を組み込む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を同時トランスフェクトした。図７は、ｄｓＯＤＮの取り込みの成功を示す。上のパネルは、ゲノムＤＮＡ（斜線の棒）へのｄｓＯＤＮ（白い棒）取り込みの略図である。下のパネルは、２つの異なるＰＣＲ反応およびその対応するゲル電気泳動の画像を示し、３５ｂｐ  ｄｓＯＤＮのＳｉＨａゲノムＤＮＡへの取り込みを示す。ＣＲＩＳＰＲ処置およびｄｓＯＤＮ組み込み後、ゲノムＤＮＡを、単離し、超音波処理によって剪断し、次いでアダプターを剪断ＤＮＡにライゲートした。ｄｓＯＤＮ特異的増幅およびシークエンシングを、ＭｉＳｅｑ次世代シークエンシング機器において実施した。配列のプロセシングは、https://github.com/aryeelab/guideseqに記載されているように実施した。特異性は、オンターゲット「リード」のパーセンテージとして（すなわち、オンターゲットリードの数をリード総数で除算して１００を乗算することによって）計算した。
【０２１０】
図２３に示すように、配列番号６８に対応するＣａｓ９  ｍＲＮＡを、ＨＰＶ１６＋  ＳｉＨａ細胞においてｇＲＮＡ（配列番号６）と共に使用する場合（上の表）、標的配列切断は、非常に特異的であり、オフターゲット効果を示さず、オンターゲット切断は、９９％を超える割合であった。オフターゲットリードは、同じＲＮＡを使用して２つのＨＰＶ１６陰性細胞株（Ｃ３３ａ、２９３Ｔ）では検出されなかった。オンターゲット切断の割合は、高忠実度Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ配列を同じｇＲＮＡ（配列番号６）と共に送達すると（下の表）、さらに高かった（１００％はオンターゲットであった）。
【０２１１】
（実施例６）
配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）修飾ＨＰＶ１６  Ｅ７  ｇＲＮＡによる増強されたＣａｓ９特異性
配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）修飾ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドと比較して非ワトソンクリック塩基対を作製する場合のトレランスが低減されている。したがって、ＣＲＮ修飾を、ｇＲＮＡのターゲティング領域に追加し、それらが非修飾ヌクレオチドと比較して高いオンターゲット活性、ならびに予想されるオフターゲットＤＮＡ部位で増加した特異性を保持しているか否かを確認するために試験した。
【０２１２】
ＨＰＶ１６のターゲティングにおけるＣＲＮ修飾ガイドＲＮＡの有効性を、セルフリー切断アッセイを使用して評価した。Ｅ７遺伝子標的またはＨＰＶ１６ガイド１．２の公知の潜在的オフターゲット部位のいずれかを含有する２ｋｂの二本鎖ＤＮＡを、Ｃａｓ９タンパク質（配列番号６１）、および修飾されていないか（配列番号６）または特に選択された位置（配列番号７９）でプロトスペーサーにＢＮＡもしくはＬＮＡ修飾のいずれかを含有するガイドＲＮＡからなる予め形成されたリボヌクレオタンパク質と共にインキュベートした。対照として使用するガイドＲＮＡは、ＥＢＶゲノム（配列番号４７）を標的とするガイドＲＮＡであった。切断された標的ＤＮＡの量を、切断および非切断ＤＮＡの産生をキャピラリーゲル電気泳動によって分離することによって決定した。図２４Ａに示すように、ＲＮＰを、ＢＮＡまたはＬＮＡ修飾ガイドＲＮＡと共に形成する場合、オフターゲットＤＮＡに対する活性は、非修飾ガイドＲＮＡと共に形成したＲＮＰと比較して低減される。
【０２１３】
標的の完全性を評価するために、ＲＮＡを、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）を介してＨＰＶ１６＋ＳｉＨａ細胞に送達した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２によって２４時間インキュベートした。次いで、総ゲノムＤＮＡを回収し、特異的プローブを使用して、Ｅ７遺伝子標的およびハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＡを定量的に増幅した。各試料を、ＰＰＩＡの量に対して正規化した。図２４Ｂに示すように、ＣＲＮ修飾ガイドＲＮＡは、細胞においてＨＰＶ１６  Ｅ７に対して非修飾ガイドＲＮＡとほぼ同程度に効率的に機能し、低減されたオフターゲット活性が単に全体的な活性の低減によるものではないことを示す。
【０２１４】
Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ組成物がウイルス細胞を殺滅する能力を、ＳｉＨａ殺滅アッセイを使用して評価した（図２４Ｃ）。ＲＮＡを、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）を介してＨＰＶ１６＋ＳｉＨａ細胞に送達した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２によって８日間インキュベートした後、細胞を採取してフローサイトメトリーによって計数した。８日目での生存細胞の相対的分画を図２４Ｃに示し、緩衝液のみでヌクレオフェクトした細胞に対して正規化した。ＣＲＮ修飾ガイドＲＮＡは、ＳｉＨａ殺滅アッセイにおいて非修飾ガイドＲＮＡとほぼ同程度に効率的に機能する。
【０２１５】
２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，６４３号および２０１７年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５０７，９６３号を含む、本明細書において参照される、および／または出願データシートにおいて列挙されるすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出願は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。多様な特許、出願および公開の概念に適用するのに必要な場合、実施形態の態様は改変することができ、さらなる実施形態が提供される。
【０２１６】
本発明の具体的な実施形態を説明し記載してきたが、上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それらに様々な変化を行うことができることは、容易に認識されるであろう。これらおよび他の変化を、上で詳述した記載に照らして実施形態に行うことができる。
【０２１７】
一般的に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定すると解釈してはならず、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の完全な範囲と共に起こり得る全ての実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１６−９】
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【図１６−１０】
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【図１６−１１】
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【図１６−１２】
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【図１６−１３】
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【図１６−１４】
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【図１６−１５】
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【図１６−１６】
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【図１６−１７】
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【図１６−１８】
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【図１６−１９】
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【図１６−２０】
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【図１６−２１】
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【図１６−２２】
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【図１６−２３】
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【図１６−２４】
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【図１６−２５】
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【図１６−２６】
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【図１６−２７】
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【図１６−２８】
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【図１６−２９】
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【図１６−３０】
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【図１６−３１】
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【図１６−３２】
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【図１６−３３】
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【図１６−３４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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