(57)【要約】  本出願は、エクスビボであろうとインビボであろうと、ＡＮＧＰＴＬ３に関連する１つ以上の状態を有する患者を治療するための材料および方法を提供する。さらに、本出願は、ゲノム編集により細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を編集および／または調節するための材料および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）修飾細胞の集団を産生するための方法であって、細胞に（ａ）ＡＮＧＰＴＬ３ゲノム遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡをコードする核酸、および（ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入することと、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含む細胞の集団を産生することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％が、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記集団の前記細胞の５０％〜７０％が、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記集団の細胞によって分泌されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が、対照と比較して少なくとも２倍低減される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記集団の細胞によって分泌されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が、対照と比較して少なくとも５倍低減される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対照が、未修飾細胞の集団および／または前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡを受容しなかった細胞の集団である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ３  Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、配列番号１〜配列番号６２０から選択される配列を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｇＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｇＲＮＡが、前記ＡＮＧＰＴＬ３ゲノム遺伝子座の調節エレメントを標的とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｇＲＮＡが、ヒトおよびカニクイザルに対して交差反応性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｇＲＮＡが、化学修飾されたｇＲＮＡである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学修飾されたｇＲＮＡが、前記ｇＲＮＡの３′末端および５′末端にホスホロチオエート化２′−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｇＲＮＡが、表７から選択されたスペーサー配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｇＲＮＡが、ＣＡＡＡＧＡＣＣＵＵＣＵＣＣＡＧＡＣＣＧ（配列番号１７０７１）、ＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７０６９）、およびＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＣＡ（配列番号１７０７０）から選択されたスペーサー配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｇＲＮＡが、前記スペーサー配列ＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７０６９）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として配合される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）および／または（ｂ）の前記核酸が、ウイルスベクター、任意にアデノ随伴ウイルスベクター上に存在する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）の前記ｇＲＮＡもしくは前記ｇＲＮＡをコードする核酸、および／または（ｂ）の前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼもしくは前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に配合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、肝細胞を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞の集団が、ＡＮＧＰＴＬ３関連の状態を有する対象に存在する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７０６９）およびＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＣＡ（配列番号１７０７０）から選択されたスペーサー配列を含む、交差反応性ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または交差反応性ｇＲＮＡをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下、２０１７年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４６１，８２９号、２０１７年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／５２６，５６２号、および２０１７年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，８３２号の利益を主張し、それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。Ｃ１５４２７０００１ＷＯ００−ＳＥＱＬＩＳＴ−ＨＪＤ．ｔｘｔという名前の配列表ファイルは、２０１７年１０月２７日に作成され、サイズは１３．２ＭＢである。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、いくつかの態様では、遺伝子編集の分野、例えば、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の改変に関する。
【背景技術】
【０００４】
ゲノム編集とは、生物の遺伝情報（ゲノム）の標的化した特定の修飾のための戦略および技法を指す。ゲノム編集は、特にヒトの健康の分野で幅広い応用が可能なため、非常に活発な研究分野である。例えば、ゲノム編集を使用して、有害な突然変異を持つ遺伝子を改変（例えば、修正もしくはノックアウト）するか、または遺伝子の機能を調べることができる。導入遺伝子を生細胞に挿入するために開発された初期の技術は、ゲノムへの新しい配列の挿入のランダムな性質によってしばしば制限されていた。ゲノムへのランダムな挿入は、隣接する遺伝子の正常な調節を混乱させ、深刻な望ましくない効果をもたらす場合がある。さらに、ランダムインテグレーション技術は、配列が２つの異なる細胞の同じ場所に挿入される保証がないため、再現性がほとんどない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のような転写活性化因子、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、およびＭｅｇａ  ＴＡＬなどの最近のゲノム編集戦略により、ＤＮＡの特定の領域を修飾することができ、それにより、初期技術と比較して改変の精度を高める。これらの新しいプラットフォームは、はるかに高い再現性を提供するが、依然として制限がある。
【０００５】
遺伝的障害に取り組んでいる世界中の研究者および医療専門家の努力にもかかわらず、またゲノム編集アプローチの見込みにもかかわらず、ＡＮＧＰＴＬ３関連の適応症に関係する安全かつ効果的な治療法を開発する必要性が依然として残っている。
【０００６】
ゲノム編集ツールを使用して、単一の治療でＡＮＧＰＴＬ３関連の障害または状態に対処できるゲノムの永続的変更を行うことにより、結果として生じる治療法は、ある特定のＡＮＧＰＴＬ３関連の適応症および／または疾患を完全に治療することができる。
【発明の概要】
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子を修飾するための非常に効率的な遺伝子編集方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書の遺伝子編集方法は、集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％を修飾するために使用することができる。驚くべきことに、これらの修飾された細胞集団の細胞は、いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分泌の５倍（またはそれ以上）の低減を示す。したがって、これらの方法は、異脂肪血症などのＡＮＧＰＴＬ３関連の適応症を治療するために特に有用であり得る。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、動物モデルからヒトへの実験データのより正確な外挿を可能にする種間（交差反応性）遺伝子編集システムを使用する。
【０００８】
いくつかの態様では、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）修飾細胞の集団を産生するための方法が本明細書で提供され、この方法は、細胞に（ａ）ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座（例えば、配列番号５３０４）を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡを（例えば、交差反応性ｇＲＮＡとして）コードする核酸、および（ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸を導入することと、ＡＮＧＰＴＬ３ゲノム遺伝子座の修飾（例えば、挿入、欠失、または少なくとも１つのヌクレオチド突然変異）を含む細胞の集団を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＡＮＰＴＬ３ゲノム遺伝子座内（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内、例えば染色体１：６２，５９７，４８６〜１：６２，６０６，３０４）の配列に相補的な（２０ｂｐ）スペーサー配列を含む。挿入は、少なくとも１つのヌクレオチドの導入であり、欠失は、少なくとも１つのヌクレオチドの除去であり、突然変異は、少なくとも１つのヌクレオチドの変化である（例えば、Ｃなどの１つのヌクレオチドからＡなどの別のヌクレオチドへ）。
【０００９】
いくつかの実施形態では、集団の細胞の少なくとも５０％は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾（例えば、挿入、欠失、または少なくとも１つのヌクレオチド突然変異）を含む。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、ＡＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、集団の細胞の５０％〜１００％は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含む。例えば、集団の細胞の５０％〜６０％、５０％〜６５％、５０％〜７０％、５０％〜７５％、５０％〜８０％、５０％〜８５％、５０％〜９０％、または５０％〜９５％は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、集団の細胞の５０％〜７０％は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の修飾を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、集団の細胞によって分泌されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、対照と比較して少なくとも２倍低減される。例えば、集団の細胞によって分泌されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、対照と比較して少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍低減され得る。いくつかの実施形態では、集団の細胞によって分泌されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、対照と比較して少なくとも５倍低減される。いくつかの実施形態では、集団の細胞によって分泌されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、対照と比較して２倍〜５倍低減される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、対照は、未修飾細胞の集団および／またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡを受容しなかった細胞の集団である。いくつかの実施形態では、対照は、非ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡを受容する細胞の集団である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。他のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ３  Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（標的配列（ｃｒＲＮＡ配列）およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ補充配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む）である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３ゲノム遺伝子座の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の調節エレメント）を標的とする。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヒトおよびカニクイザルに対して交差反応性である（例えば、ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域に相補的であり、カニクイザルのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域に相補的である）。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されたｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３′末端および５′末端にホスホロチオエート化２′−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３′末端にホスホロチオエート化された２′−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５′末端にホスホロチオエート化された２′−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３′末端および／または３つの５′末端にホスホロチオエート化２′−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ＣＡＡＡＧＡＣＣＵＵＣＵＣＣＡＧＡＣＣＧ（配列番号１７０７１）、ＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７０６９）、およびＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＣＡ（配列番号１７０７０）から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７０６９）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＣＡ（配列番号１７０７０）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ＣＡＡＡＧＡＣＣＵＵＣＵＣＣＡＧＡＣＣＧ（配列番号１７０７１）を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＡＮＧＰＴＬ３関連の状態を有する対象に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３関連の状態は、脂質異常症（異常な量の脂質（例えば、トリグリセリド、コレステロール、および／または脂肪リン脂質））である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として配合（事前に複合）される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、（ａ）および／または（ｂ）の核酸は、ウイルスベクター、任意にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター上に存在する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、（ａ）のｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸、および／または（ｂ）のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼもしくはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に配合される。
【００２３】
またいくつかの態様では、ＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７０６９）およびＧＧＣＣＵＣＣＵＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＣＡ（配列番号１７０７０）から選択されたスペーサー配列を含む、交差反応性ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または交差反応性ｇＲＮＡをコードする核酸が本明細書に提供される。
【００２４】
したがって、いくつかの態様では、ゲノム編集、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産物の発現または機能を低減もしくは排除することによって、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子、またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近くに少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、または突然変異を導入することによって、ゲノムに永続的な変化をもたらすための細胞性、エクスビボ、およびインビボの方法が本明細書に提供され、これは、脂質異常などのＡＮＧＰＴＬ３関連の状態または障害を治療するために使用され得る。また本明細書では、そのような方法を実施するための成分および組成物、ならびにベクターも提供される。
【００２５】
また本明細書では、ゲノム編集により細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための方法であって、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を細胞に導入して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くに少なくとも１つのヌクレオチドの１つ以上の永続的な挿入、欠失、または突然変異をもたらす、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３調節エレメント内またはその近くにもたらし、それによりＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産物の発現または機能を低減または排除するステップを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３ゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡもまた細胞に導入される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本明細書で開示および説明される材料および方法の様々な態様は、添付の図面を参照することにより、よりよく理解することができる。
【００２７】
【図１Ａ】タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの描写である。
【図１Ｂ】タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの別の描写である。
【図２】ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９によるｇＲＮＡの切断効率を表すグラフである。
【図３】ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９によるｇＲＮＡの切断効率を表すグラフである。
【図４】ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９によるｇＲＮＡの切断効率を表すグラフである。
【図５Ａ】初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｇＲＮＡの切断効率の描写である。
【図５Ｂ】カニクイザルから単離された初代肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｇＲＮＡの切断効率の描写である。
【図６Ａ】初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｇＲＮＡの切断効率の描写である。
【図６Ｂ】初代ヒト肝細胞のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分泌に対するｇＲＮＡによる遺伝子編集の効果を説明する。
【図７Ａ】は、初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｇＲＮＡの切断効率の描写である。
【図７Ｂ】初代ヒト肝細胞のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分泌に対するｇＲＮＡによる遺伝子編集の効果を説明する。
【図８】サル肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分泌に対するｇＲＮＡによる遺伝子編集の効果を説明する。
【００２８】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜６２０は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ配列である。
【００２９】
配列番号６２１〜６３１は、意図的に空白である。
【００３０】
配列番号６３２〜４，７１５は、マイクロＲＮＡ配列である。
【００３１】
配列番号４，７１６〜４，７３３は、意図的に空白である。
【００３２】
配列番号４，７３４〜５，３０２は、ＡＡＶ血清型配列である。
【００３３】
配列番号５，３０３は、ＡＮＧＰＴＬ３ヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号５，３０４は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の上流および／または下流に５キロ塩基対を含む遺伝子配列である。
【００３５】
配列番号５，３０５〜５，３９８は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで標的とするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【００３６】
配列番号５，３９９〜５，５９５は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで標的とするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【００３７】
配列番号５，５９６〜６，０７９は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで標的とするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【００３８】
配列番号６，０８０〜６，６３３は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで標的とするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【００３９】
配列番号６，６３４〜１０，１７１は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで標的とするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【００４０】
配列番号１０，１７２〜１７，０１８は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  Ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで標的とするための２２ｂｐスペーサー配列である。
【００４１】
配列番号１７，０１９〜１７，０４８は、意図的に空白である。
【００４２】
配列番号１７，０４９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのサンプルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【００４３】
配列番号１７，０５０〜１７，０５２は、サンプルｓｇＲＮＡ配列を示す。
【００４４】
配列番号１７，０５４〜１７，０５７は、サンプルガイド標的配列を示す。
【００４５】
配列番号１７，０５９〜１７，０６６は、サンプルｓｇＲＮＡ配列を示す。
【００４６】
配列番号１７，０５３および１７，０６７は、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖内のヌクレオチドの例示的な不対領域である。
【００４７】
配列番号１７，０６８〜１７，０７１は、ＡＮＧＰＴＬ３  ｇＲＮＡスペーサー配列の例である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
Ｉ．序論
ゲノム編集
本開示は、生物の遺伝情報（ゲノム）の標的化した特定の改変のための戦略および技法を提供する。本明細書で使用される場合、「改変」または「遺伝情報の改変」という用語は、細胞のゲノム中のあらゆる変更を指す。遺伝的障害の治療の文脈では、改変には、挿入、欠失、および修正が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「挿入」という用語は、ＤＮＡ配列における１つ以上のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、数個のヌクレオチドの小さな挿入から、ｃＤＮＡまたは遺伝子などの大きなセグメントの挿入に及び得る。「欠失」という用語は、ＤＮＡ配列中の１つ以上のヌクレオチドの喪失もしくは除去、または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。場合によっては、欠失には、例えば、数個のヌクレオチドの喪失、エクソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の配列全体が含まれ得る。場合によっては、遺伝子の欠失は、遺伝子またはその遺伝子産物の機能または発現の排除または低減を指す。これは、遺伝子内または遺伝子の近くの配列の欠失だけでなく、遺伝子の発現を妨害する他の事象（例えば、挿入、ナンセンス突然変異）からも起こり得る。本明細書で使用される「修正」という用語は、挿入、欠失、または置換によるかどうかにかかわらず、細胞内のゲノムの１つ以上のヌクレオチドの変更を指す。そのような修正は、修正されたゲノム部位に対して、構造であろうと機能であろうと、より好ましい遺伝子型または表現型の結果をもたらし得る。「修正」の１つの非限定的な例には、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の構造または機能を回復する野生型配列への変異体または欠陥配列の修正が含まれる。突然変異の性質に応じて、本明細書で開示される様々な戦略を介して修正が達成され得る。１つの非限定的な例では、ミスセンス突然変異は、突然変異を含む領域をその野生型の対応物と置き換えることにより修正され得る。別の例として、余分な配列を除去することにより、遺伝子の重複突然変異（例えば、繰り返しの拡大）を修正することができる。
【００４９】
いくつかの態様では、改変にはまた、遺伝子のノックイン、ノックアウト、またはノックダウンが含まれてもよい。本明細書で使用される場合、「ノックイン」という用語は、ゲノムへのＤＮＡ配列またはその断片の付加を指す。ノックインされるそのようなＤＮＡ配列には、遺伝子全体または複数の遺伝子が含まれてもよく、遺伝子または前述の任意の部分または断片に関連する調節配列が含まれてもよい。例えば、野生型タンパク質をコードするｃＤＮＡを、変異体遺伝子を運ぶ細胞のゲノムに挿入することができる。ノックイン戦略は、欠陥遺伝子の全部または一部を置き換える必要はない。場合によっては、ノックイン戦略は、既存の配列を提供された配列で置換すること、例えば、突然変異体対立遺伝子を野生型コピーで置換することをさらに含み得る。一方、「ノックアウト」という用語は、遺伝子の排除または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子の一部を無関係な配列で置き換えることにより、遺伝子をノックアウトしてもよい。最後に、本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の発現の低減を指す。遺伝子のノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が弱められるか、タンパク質レベルが低減または排除される場合がある。
【００５０】
ゲノム編集とは、一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは正確なまたは所定の方法で修飾するプロセスを指す。本明細書に記載のゲノム編集方法の例には、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノムの正確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断し、それによりゲノム内の特定の位置で一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を作成する方法が含まれる。そのような切断は、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１（２），１２１−３１（２０１５）で最近レビューされたように、相同性指向修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの自然な内因性細胞プロセスであり得、それにより定期的に修復される。これら２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替経路のファミリーで構成されている。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接結合し、時にはヌクレオチド配列の喪失または付加を伴い、遺伝子発現を破壊または増強する場合がある。ＨＤＲは、定義されたＤＮＡ配列をブレークポイントに挿入するためのテンプレートとして、相同配列またはドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内因性ゲノムに存在し得る。あるいは、ドナーは、ヌクレアーゼ切断された遺伝子座と高い相同領域を有するが、追加の配列または切断された標的遺伝子座に組み込まれ得る欠失を含む配列変化を含むこともできる、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外因性核酸であり得る。第３の修復機序は、「代替ＮＨＥＪ」とも呼ばれるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり得、遺伝的結果は、小さな欠失および挿入が切断部位で起こり得るＮＨＥＪと同様である。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を利用して、より好ましいＤＮＡ末端結合修復の結果を推進することができ、最近の報告では、このプロセスの分子機序がさらに解明された。例えば、Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，１７４−７６（２０１５）、Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）、Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，２５４−５７（２０１５）、Ｃｅｃｃａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５２８，２５８−６２（２０１５）を参照されたい。場合によっては、ＤＮＡ切断部位の潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能であり得る。
【００５１】
これらのゲノム編集機序のそれぞれを使用して、所望のゲノム改変を作成することができる。ゲノム編集プロセスのステップは、１つまたは２つのＤＮＡ切断を作成することができ、後者は、意図した突然変異部位の近くの標的遺伝子座で、二本鎖切断または２つの一本鎖切断としてである。これは、本明細書に記載および図示されるように、部位特異的ポリペプチドの使用によって達成され得る。
【００５２】
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化した規則的な配置の短い回文配列反復）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノムに見ることができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ウイルスおよびファージなどの外来侵入物から原核生物を守るのに役立つ免疫系の一種として機能する製品をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には３つの段階、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新しい配列の統合、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来侵入核酸のサイレンシングがある。５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＵ、タイプＶ）が特定された。
【００５３】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座には、「反復」と呼ばれる短い反復配列が多数含まれている。発現されると、反復は、二次構造（例えば、ヘアピン）を形成し、かつ／または非構造化一本鎖配列を含むことができる。繰り返しは、通常クラスターで発生し、種間で頻繁に分岐する。反復は、「スペーサー」と呼ばれる固有の介在配列で規則的に配置され、反復−スペーサー−反復遺伝子座アーキテクチャをもたらす。スペーサーは、既知の外来侵入物配列と同一であるか、または高い相同性を有する。スペーサー−反復ユニットは、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）コードし、これはスペーサー−反復ユニットの成熟形態に処理される。ｃｒＲＮＡは、標的核酸の標的化に関与する「種」またはスペーサー配列を含む（原核生物の天然に発生する形態では、スペーサー配列は、外来侵入物核酸を標的とする）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５′または３′末端に位置する。
【００５４】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物のｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同の二次および／または三次構造を含む。
【００５５】
タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステム
自然界におけるタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムでのｃｒＲＮＡの生合成は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムの非限定的な例を図１Ａおよび１Ｂに示す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮａｓｅＩＩＩによって修飾され、次いでｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイのｃｒＲＮＡ反復にハイブリダイズされ得る。内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを動員して、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断することができる。切断されたｃｒＲＮＡをエキソリボヌクレアーゼトリミングに供して、成熟ｃｒＲＮＡ形態を産生することができる（例えば、５′トリミング）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズしたままであり得、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズできる標的核酸に複合体を導くことができる。ｃｒＲＮＡの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断のためにＣａｓ９を活性化することができる。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムの標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる。自然界では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の標的核酸への結合を促進するために不可欠である。タイプＩＩシステム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）は、タイプＩＩ−Ａ（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ−Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）にさらに細分される。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＲＮＡでプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多くの例および適用を提供する。
【００５６】
タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲシステム
タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩＩシステムといくつかの重要な違いがある。例えば、Ｃｐｆ１は、タイプＩＩシステムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに、成熟ｃｒＲＮＡに処理され得る。タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲアレイは、長さ４２〜４４ヌクレオチドの短い成熟ｃｒＲＮＡに処理することができ、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの直接反復で始まり、２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、タイプＩＩシステムの成熟ｃｒＲＮＡは、２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、約２２ヌクレオチドの直接反復が続く。また、Ｃｐｆ１は、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用することができ、それによりＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、タイプＩＩシステムの標的ＤＮＡに続くＧリッチＰＡＭとは対照的に、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率的に切断する。したがって、タイプＶシステムは、ＰＡＭから離れたポイントで切断するが、タイプＩＩシステムは、ＰＡＭに隣接するポイントで切断する。さらに、タイプＩＩシステムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５′オーバーハングで互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。タイプＩＩシステムは、鈍い二本鎖切断によって切断する。タイプＩＩシステムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含むが、タイプＩＩシステムとは対照的に、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いている。
【００５７】
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドには、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７−２５９０（２０１４）に公開されているＣａｓ９ポリペプチドが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、大幅に書き換えられている。Ｆｏｎｆａｒａらはまた、様々な種からのＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列を提供する（配列番号１〜６２０も参照）。
【００５８】
ＩＩ．組成物および方法
本明細書では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を欠失または突然変異させることにより、ゲノム編集ツールを使用してゲノムに永続的な変化をもたらすための、細胞性のエクスビボおよびインビボ方法が提供される。そのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列のゲノム遺伝子座内またはその近くで永続的に編集する。このようにして、本開示に記載される例は、（患者の生涯にわたって潜在的な治療法を提供するのではなく）単一の治療でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を低減または排除するのに役立ち得る。
【００５９】
部位特異的ポリペプチド（エンドヌクレアーゼ、酵素）
部位特異的ポリペプチドは、ゲノム編集でＤＮＡを切断するために使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド、またはポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして細胞または患者に投与することができる。配列番号１〜６２０に列記されているか、または本明細書に開示される酵素またはオルソログのいずれも、本明細書の方法に利用することができる。
【００６０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することができ、次にポリペプチドが向けられる標的ＤＮＡの部位を特定する。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムでは、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼであり得る。
【００６１】
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含み得る。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して一緒に結合することができる。例えば、リンカーは、柔軟なリンカーを含み得る。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０以上のアミノ酸の長さを含み得る。
【００６２】
天然に発生する野生型Ｃａｓ９酵素は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインとＲｕｖＣドメインの２つのヌクレアーゼドメインを含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」という用語は、天然に発生するＣａｓ９および組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。
【００６３】
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様折り畳みを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行β鎖と１つのαらせんを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の一方の鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）を切断することができる。
【００６４】
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＨ様折り畳みを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用することを含む、様々な核酸ベースの機能に関与する。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のαらせんに囲まれた５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。
【００６５】
部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復（ＨＤＲ）またはＮＨＥＪまたは代替の非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。これにより、切断部位の標的核酸に小さな欠失または挿入（インデル）が生じることがあり、遺伝子発現の破壊または改変をもたらし得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレートまたはドナーが利用可能な場合に発生し得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列と相同である配列を含み得る。姉妹染色分体は、細胞によって修復テンプレートとして使用され得る。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復テンプレートは、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給され得る。外因性ドナーテンプレートを用いて、追加の核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（単一もしくは複数の塩基変化もしくは欠失など）を隣接する相同領域の間に導入して、追加または改変された核酸配列も標的遺伝子座に組み込まれるようにすることができる。ＭＭＥＪは、小さな欠失および挿入が切断部位で発生し得るという点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝的結果をもたらす可能性がある。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を促進することができる。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域の潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能であり得る。
【００６６】
したがって、場合によっては、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入することができる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書において「ドナーポリヌクレオチド」（またはドナーもしくはドナー配列）と呼ばれる。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位で天然に発生しない配列であり得る。
【００６７】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、改変、統合、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座、および／または遺伝子突然変異につながり得る。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非天然核酸をゲノムＤＮＡに統合するプロセスは、ゲノム編集の例である。
【００６８】
部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、ＵＳ２０１４／００６８７９７、配列番号８またはＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３９（２１）」９２７５−９２８２（２０１１）］および様々な他の部位特異的ポリペプチドに対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。
【００６９】
部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含み得る。野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する突然変異を含み得る。野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有し得る。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を持たない可能性がある。部位特異的ポリペプチドが実質的な核酸切断活性を持たない修飾形態である場合、本明細書では「酵素的に不活性」と呼ばれる。
【００７０】
部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、標的核酸上で一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導できるような突然変異を含むことができる（例えば、二本鎖標的核酸の糖リン酸骨格のうちの１つのみを切断することにより）。いくつかの態様では、突然変異は、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、上記のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらし得る。いくつかの態様では、突然変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらし得る。突然変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断する能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらし得る。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６などの野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ポリペプチドの残基は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するように突然変異する。突然変異させる残基は、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ポリペプチドの残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６に対応し得る（例えば、配列および／または構造的アラインメントにより決定される）。突然変異の非限定的な例には、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａが含まれる。当業者は、アラニン置換以外の突然変異が適切であり得ることを認識するであろう。
【００７１】
いくつかの態様では、Ｄ１０Ａ突然変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｈ８４０Ａ突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｎ８５４Ａ突然変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｎ８５６Ａ突然変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。
【００７２】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体、例えばＣａｓ９を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を高めることができる。野生型Ｃａｓ９は、通常、標的配列（内因性ゲノム遺伝子座など）の特定の約２０ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計された単一ガイドＲＮＡによってガイドされる。しかしながら、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間でいくつかのミスマッチが許容され、標的部位での必要な相同の長さを、例えばわずか１３ｎｔの相同性に効果的に低減することができ、それによりオフ標的切断としても知られる、標的ゲノムの他の場所におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合および二本鎖核酸切断の可能性の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ異形は、それぞれ１本の鎖のみを切断するため、二本鎖切断を作成するために、一対のニッカーゼが標的核酸に近接して反対側の鎖に結合し、それにより一対のニックを作成する必要があり、これは二本鎖切断と同等である。これには、２つの別個のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに１つずつ）が、標的核酸に近接して反対側の鎖に結合する必要がある。この要件により、二本鎖切断に必要な相同の最小長が本質的に２倍になり、それにより二本鎖切断事象がゲノムの他の場所で起こる可能性を低減し、２つのガイドＲＮＡ部位は（存在する場合）、二本鎖切断の形成を可能にするために、互いに十分に接近する可能性は低い。当該技術分野で説明されているように、ニッカーゼを使用して、ＨＤＲ対ＮＨＥＪを促進することもできる。ＨＤＲを使用して、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用によって、選択した変化をゲノムの標的部位に導入することができる。
【００７３】
企図される突然変異には、置換、付加、および欠失、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。突然変異は、突然変異したアミノ酸をアラニンに変換する。突然変異は、突然変異したアミノ酸を別のアミノ酸に変換する（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）。突然変異は、突然変異したアミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。突然変異は、突然変異したアミノ酸をアミノ酸模倣物（例えば、リン模倣物）に変換する。突然変異は、保存的突然変異であり得る。例えば、突然変異は、突然変異したアミノ酸を、突然変異したアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、立体配座、および／または回転異性体に似たアミノ酸に変換する（例えば、システイン／セリン突然変異、リジン／アスパラギン突然変異、ヒスチジン／フェニルアラニン突然変異）。突然変異は、リーディングフレームのシフトおよび／または未成熟終止コドンの作成を引き起こす可能性がある。突然変異は、１つ以上の遺伝子の発現に影響を与える遺伝子または遺伝子座の調節領域に変化を引き起こす可能性がある。
【００７４】
部位特異的ポリペプチド（例えば、異形、突然変異、酵素的に不活性および／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的とすることができる。部位特異的ポリペプチド（例えば、異形、突然変異、酵素的に不活性および／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、ＤＮＡを標的とすることができる。部位特異的ポリペプチド（例えば、異形、突然変異、酵素的に不活性および／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、ＲＮＡを標的とすることができる。
【００７５】
部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非天然配列を含むことができる（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。
【００７６】
部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み得る。
【００７７】
部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み得る。
【００７８】
部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメインを含むことができ、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
【００７９】
部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および非天然配列（例えば、核局在化シグナル）または部位特異的ポリペプチドを非天然配列に結合するリンカーを含み得る。
【００８０】
部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み得、部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する核酸切断ドメインの一方または両方に突然変異を含む。
【００８１】
部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み得、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが、アスパラギン酸１０の突然変異を含み、かつ／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つが、ヒスチジン８４０の突然変異を含み得、その突然変異は、ヌクレアーゼドメイン（複数可）の切断活性を少なくとも５０％低減する。
【００８２】
１つ以上の部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノムの特定の遺伝子座で一緒に１つの二本鎖切断をもたらす２つのニッカーゼを含み得るか、またはゲノム内の特定の遺伝子座で２つの二本鎖切断を引き起こし得る。あるいは、１つの部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の遺伝子座で１つの二本鎖切断をもたらし得るか、または引き起こし得る。
【００８３】
他の細菌株由来のＣａｓ９オルソログの非限定例には、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ  ＭＢＩＣ１１０１７、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ５５０１、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３２７０、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＬＡＡ１、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  ４４６、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ  ＫＣ４、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  ｓｔｒ．Ｐａｒａｃａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ８００５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  １２４４２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＭＬＳ１０、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿１＿４７、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ  ＤＳＭ  ６７２５、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ  ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ  ＭＰ１０４Ｃ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ＿１０８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈａｇｅ  ｃ−ｓｔ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ３  ｓｔｒ．Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｂａ４  ｓｔｒ．６５７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＱＣＤ−６３ｑ４２、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ  ８５０１、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ５１１４２、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＣＣＹ０１１０、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７４２４、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７８２２、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ  ２５５−１５、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ  ＡＴＣＣ  ２９３２８、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ  ＤＳＭ  ４４９６３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＰＢ２００３／０４４−Ｔ３−４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  １１７４１、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ８１０６、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＥＬＢ１７、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ  Ｚ−７３０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｈａｇｅ  Ｍａ−ＬＭＭ０１、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＩＥＳ−８４３、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＡＴＣＣ  ２３１３４、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ  ＰＣＣ  ７４２０、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ  Ｎｃ４、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ  ＣＣＹ９４１４、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６５０６、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ＿ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ＿ＳＩ、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＳＪ９５、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＪ２、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＪＳ６６６、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ  ＴＡＣ１２５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５４８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５４８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０２１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７３３５、およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ  ＴＣＦ５２Ｂ（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．，２０１３、１０（５）：７２６−７３７）において同定されたＣａｓタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
Ｃａｓ９オルソログに加えて、不活性なｄＣａｓ９の融合タンパク質などの他のＣａｓ９異形、および異なる機能を有するエフェクタードメインは、遺伝子調節のプラットフォームとして役立ち得る。前述の酵素のいずれも、本開示において有用であり得る。
【００８５】
本開示において利用され得るエンドヌクレアーゼのさらなる例は、配列番号１〜６２０に示されている。これらのタンパク質は、使用前に修飾され得るか、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡなどの核酸配列、または本明細書に教示されるプラスミドもしくはＡＡＶベクターなどのベクター構築物内でコードされ得る。さらに、それらはコドン最適化されてもよい。
【００８６】
配列番号１〜６２０は、エンドヌクレアーゼ配列の非網羅的なリストを開示している。
【００８７】
ゲノム標的化核酸
本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、少なくとも目的の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とを含み得る。タイプＩＩシステムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。タイプＩＩガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。タイプＶガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合することができ、それによりガイドＲＮＡおよび部位特異的ポリペプチドが複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を配向することができる。
【００８８】
例示的なガイドＲＮＡには、ゲノム位置がＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリに基づく、スペーサー配列１５〜２００塩基が含まれる。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、染色体１：６２，５９７，４８６〜６２，６０６，３０４（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ−ＧＲＣｈ３８）に位置し得る。
【００８９】
例示的なガイドＲＮＡには、配列番号５，３０５〜１７，０１８に提示されるＤＮＡ配列のＲＮＡバージョンに基づくスペーサー配列が含まれる。当業者によって理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計することができる。例えば、スペーサー配列のそれぞれ、例えば、配列番号５，３０５〜１７，０１８に提示されるＤＮＡ配列のＲＮＡバージョンは、単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡとともに）に入れることができる。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）ａｎｄ  Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）を参照されたい。
【００９０】
ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。
【００９１】
二重分子ガイドＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含み得る。第１の鎖は、５′から３′方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含み得る。
【００９２】
タイプＩＩシステムの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５′から３′方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含み得る。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡに追加機能（例えば、安定性）を提供する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を結合させて、ヘアピン構造を形成することができる。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを含み得る。
【００９３】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５′末端に２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５′末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５′末端に２０ヌクレオチド超のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５′末端に１７〜３０ヌクレオチドの可変長スペーサー配列を含み得る（表１を参照）。
【００９４】
ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号１７，０５１のように、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端にウラシルを含まない場合がある。ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号１７，０５２のように、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に１ウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に２ウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に３ウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に４ウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に５ウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に６ウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に７ウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３′末端に８ウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
【００９５】
ｓｇＲＮＡは、未修飾または修飾であり得る。例えば、修飾ｓｇＲＮＡは、１つ以上の２′−Ｏ−メチルおよび／または２′−Ｏ−メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【表１】
2020508056.tif 000002
【００９６】
タイプＶシステムの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５′から３′方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびスペーサー配列を含み得る。
【００９７】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡは、以下に示され、当該技術分野で説明されるように、化学的手段により容易に合成できる。化学合成手順は、継続的に拡大しているが、高性能液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチドの長さが１００ヌクレオチド程度を超えて大幅に増加するため、より困難になる傾向がある。より長いＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒に結紮される２つ以上の分子を産生することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。種々のタイプのＲＮＡ修飾は、化学合成および／またはＲＮＡの酵素的生成中または後に導入することができ、例えば、安定性を高める修飾は、当該技術分野で説明されるように、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を強化する。
【００９８】
スペーサー伸長配列
ゲノム標的化核酸のいくつかの実施例では、スペーサー伸長配列は、活性を修飾し、安定性を提供し、かつ／またはゲノム標的化核酸の修飾のための位置を提供することができる。スペーサー伸長配列は、オンターゲットまたはオフターゲットの活性または特異性を修飾することができる。いくつかの実施例では、スペーサー伸長配列が提供され得る。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００以上のヌクレオチド以上の長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００以上のヌクレオチド未満の長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、長さが１０ヌクレオチド未満であり得る。スペーサー伸長配列は、長さが１０〜３０ヌクレオチドであり得る。スペーサー伸長配列は、長さが３０〜７０ヌクレオチドであり得る。
【００９９】
スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含み得る。この部分は、核酸を標的化する核酸の安定性を減少または増加させることができる。この部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）であり得る。この部分は、真核細胞で機能することができる。この部分は、原核細胞で機能することができる。この部分は、真核細胞および原核細胞の両方で機能することができる。適切な部分の非限定的な例には、５′キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７  Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による規制された安定性および／または規制されたアクセシビリティを可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的する配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を促進する部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾もしくは配列が含まれる。
【０１００】
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して、配列特異的な方法で標的核酸と相互作用することができる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて異なり得る。
【０１０１】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、システムで使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５′に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計され得る。スペーサーは、標的配列と完全に一致する場合もあれば、ミスマッチを有する場合もある。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡで認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸において、配列５′−ＮＲＧ−３′を含むＰＡＭを認識し、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化された標的核酸の３′のすぐ近くである。
【０１０２】
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を含み得る。標的核酸は、２０ヌクレオチド超を含み得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５′のすぐ近くに２０塩基を含み得る。例えば、５′−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ−３′（配列番号１７０４９）を含む配列において、標的核酸は、Ｎに対応する配列を含むことができ、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＰＡＭである。この標的核酸配列は、しばしばＰＡＭ鎖と呼ばれ、相補的な核酸配列は、しばしば非ＰＡＭ鎖と呼ばれる。当業者は、スペーサー配列が標的核酸の非ＰＡＭ鎖にハイブリダイズすることを認識するであろう（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１０３】
標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有し得る。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔであり得る。いくつかの実施例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施例では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施例では、スペーサーは、１８ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施例では、スペーサーは、２２ヌクレオチドを含み得る。
【０１０４】
いくつかの実施例では、標的核酸のスペーサー配列と非ＰＡＭ鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。いくつかの実施例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％である。いくつかの実施例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの隣接する５′末端ヌクレオチドにわたって１００％である。スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列および標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチドだけ異なっていてもよく、これは１つまたは複数のバルジと考えられ得る。
【０１０５】
スペーサー配列は、コンピュータープログラムを使用して設計または選択され得る。コンピュータープログラムは、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一または類似しているが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として１つ以上のスポットで異なる配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用し得る。
【０１０６】
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列
いくつかの態様では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
【０１０７】
いくつかの態様では、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、細胞内の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズできるヌクレオチドを含む。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、二重鎖、すなわち、塩基対の二本鎖構造を形成することができる。一緒に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの態様では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含む。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含み得る。
【０１０８】
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。いくつかの態様では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さである。
【０１０９】
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。
【０１１０】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列であり得る。
【０１１１】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含むことができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、二重鎖、すなわち、塩基対の二本鎖構造を形成する。一緒に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズすることができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補性であり得る。
【０１１２】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチドの長さであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＪｉｎｅｋらに記載されているｔｒａｃｒＲＮＡ  ｎｔ２３〜４８から構成され得る。
【０１１３】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野生型、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であり得る。
【０１１４】
最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重らせんを構成することができる。最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを含むことができる。
【０１１５】
二重鎖は、ミスマッチを含むことができる（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、または５つのミスマッチを含むことができる。二重鎖は、最大で約１、２、３、４、または５つのミスマッチを含むことができる。二重鎖は、２つまでのミスマッチを含むことができる。
【０１１６】
バルジ
場合によっては、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に「バルジ」が存在し得る。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの不対領域である。バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与し得る。バルジは、二重鎖の片側に、不対５′−ｒｒｒｎ−３′（配列番号１７，０５３）（ｒは、任意のプリンであり、ｎは、反対の鎖上のヌクレオチドとウォブル対を形成することができるヌクレオチドを含む）、および二重鎖の反対側に不対ヌクレオチド領域を含み得る。二本鎖の両側の不対ヌクレオチドの数は、異なり得る。
【０１１７】
一実施例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の不対プリン（例えば、アデニン）を含むことができる。いくつかの実施例では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の不対５′−ＡＡＧｎ−３′（配列番号１７，０６７）を含むことができ、ｎは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上のヌクレオチドとウォブル対を形成することができるヌクレオチドを含む。
【０１１８】
二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５個以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、最大で１、２、３、４、または５個以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、１つの不対ヌクレオチドを含むことができる。
【０１１９】
二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖の第２の側のバルジ（例えば、二重鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの不対ヌクレオチドを含むことができる。
【０１２０】
バルジは、少なくとも１つのウォブル対を含むことができる。いくつかの実施例では、バルジは、最大で１つのウォブル対を含むことができる。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含むことができる。
【０１２１】
ヘアピン
様々な例では、１つ以上のヘアピンを３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３′に位置し得る。
【０１２２】
ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖の最後のヌクレオチド対から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上のヌクレオチドの３′から開始し得る。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖の最後のヌクレオチド対の最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドの３′から開始し得る。
【０１２３】
ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上の連続したヌクレオチドを含むことができる。ヘアピンは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５以上の連続したヌクレオチドを含むことができる。
【０１２４】
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を含むことができる。
【０１２５】
ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、ヘアピン内のヌクレオチド、一緒にハイブリダイズしたもの）を含むことができる。例えば、ヘアピンは、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖中のＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを含むことができる。
【０１２６】
ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用することができる。
【０１２７】
いくつかの実施例では、２つ以上のヘアピンがあり、他の実施例では、３つ以上のヘアピンがある。
【０１２８】
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【０１２９】
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有し得る。
【０１３０】
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であり得る。
【０１３１】
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上の二重化領域（例えば、ヘアピン、ハイブリッド化領域）を含むことができる。３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重化領域を含むことができる。
【０１３２】
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含むことができる。３′ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上のヌクレオチドを含むことができる。３′ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを含むことができる。ステムループ構造は、機能的部分を含むことができる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含むことができる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を含むことができる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を含むことができる。
【０１３３】
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピンは、Ｐドメインを含むことができる。いくつかの実施例では、Ｐドメインは、ヘアピンに二本鎖領域を含むことができる。
【０１３４】
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、単一分子ガイドまたは二重分子ガイドの文脈にあるかどうかに関係なく提供される場合がある。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０〜約５０００以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００未満、またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの長さであり得る。
【０１３５】
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含むことができる。機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含むことができる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有し得る。機能的部分は、真核細胞で機能することができる。機能的部分は、原核細胞で機能することができる。機能的部分は、真核細胞と原核細胞の両方で機能することができる。
【０１３６】
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能的部分の非限定的な例には、３′ポリ−アデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による規制された安定性および／または規制されたアクセシビリティを可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を促進する部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾もしくは配列が含まれる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１つ以上の親和性タグを含むことができる。
【０１３７】
単一分子ガイドリンカー配列
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。上記のＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）では、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドであり得る。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００以上のヌクレオチドであり得る。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００以上のヌクレオチドであり得る。
【０１３８】
リンカーは、様々な配列のいずれかを含むことができるが、いくつかの実施例では、リンカーは、ガイドＲＮＡの他の部分と広範な相同領域を有する配列を含まないため、ガイドの他の機能領域を干渉し得る分子内結合を引き起こす場合がある。上記のＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）では、単純な４ヌクレオチド配列−ＧＡＡＡ−が使用されたが、より長い配列を含む多数の他の配列も同様に使用することができる。
【０１３９】
リンカー配列は、機能的部分を含むことができる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む１つ以上の特徴を含むことができる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を含むことができる。いくつかの実施例では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を含むことができる。
【０１４０】
核酸修飾（化学的および構造的修飾）
いくつかの態様では、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、本明細書でさらに説明され、当該技術分野で知られているように、例えば、活性、安定性または特異性を高める、送達を変える、宿主細胞における先天性免疫応答を減らす、または他の増強のために、個々にまたは組み合わせて使用することができる１つ以上の修飾を含むことができる。
【０１４１】
ある特定の例では、修飾ポリヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用することができ、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは２分子ガイドのいずれか）および／または細胞に導入されたＣａｓ９もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下で説明および図示されるように修飾され得る。そのような修飾ポリヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用して、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集することができる。
【０１４２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムをそのような用途の非限定的な例として使用すると、ガイドＲＮＡの修飾を使用して、ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を強化することができ、単一分子ガイドまたは二重分子、およびＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替として、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動力学を強化するために使用することができ、これは、例えば、オンターゲット活性を強化するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替として、他の（オフターゲット）部位での効果と比較して、特異性、例えば、オンターゲット部位でのゲノム編集の相対速度を高めるために使用することもできる。
【０１４３】
修飾はまた、または代替として、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する抵抗性を高めることによって、ガイドＲＮＡの安定性を高め、それにより細胞内での半減期を増加させるために使用することができる。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されたガイドＲＮＡの半減期を増加させることを使用して、ガイドＲＮＡおよびコードされたＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞内に共存する時間を増加させることができるため、ガイドＲＮＡの半減期を増加させる修飾は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される態様において特に有用であり得る。
【０１４４】
修飾はまた、または代替として、細胞に導入されたＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるために使用することができる。下記および当該技術分野で説明するように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈で十分に特徴付けられているそのような応答は、ＲＮＡの半減期の低減および／またはサイトカインまたは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。
【０１４５】
限定されないが、（例えば、細胞内に存在するＲＮａｓｅによる分解を増加させることによって）ＲＮＡの安定性を高める修飾、結果として生じる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を強化する修飾、および／または細胞に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾を含む、１種以上の修飾はまた、細胞に導入されたエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して行うことができる。
【０１４６】
前述のものおよび他のものなどの修飾の組み合わせも同様に使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の場合、１種以上の修飾をガイドＲＮＡ（上記に例示したものを含む）に対して行うことができ、かつ／または１種以上の修飾を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記に例示したものを含む）に対して行うことができる。
【０１４７】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡは、以下に示され、当該技術分野で説明されるように、化学的手段により容易に合成することができ、多くの修飾が容易に組み込まれるようにする。化学合成手順は、継続的に拡大しているが、高性能液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチドの長さが１００ヌクレオチド程度を超えて大幅に増加するため、より困難になる傾向がある。より長い化学修飾ＲＮＡを生成するために使用され得る１つのアプローチは、２つ以上の分子を生成し、それらを一緒に結紮することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。酵素的に産生されたＲＮＡで使用するために入手可能な修飾の種類は少ないが、例えば、安定性を高め、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または下記および当該技術分野でさらに説明されるように、他の属性を強化するために使用され得る修飾が依然として存在する。
【０１４８】
様々な種類の修飾、特により小さな化学合成ＲＮＡで頻繁に使用される修飾の例として、修飾は、糖の２′位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、いくつかの態様では、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２′−フルオロ修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施例では、ＲＮＡ修飾には、ピリミジン、脱塩基残基、またはＲＮＡの３′末端の逆塩基のリボースに対する２′−フルオロ、２′−アミノ、または２′−Ｏ−メチル修飾が含まれる。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドに日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２′−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【０１４９】
多くのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれているオリゴヌクレオチドを、天然のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されている。これらの修飾オリゴは、未修飾オリゴヌクレオチドよりも長い時間無傷で生存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を含むものが含まれる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特にＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格を有するものであり、天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ、アミド骨格［Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６−３７４（１９９５）を参照］、モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格として表される（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられ、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７を参照）。リン含有結合には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３′アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３′−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３′−５′結合を有するボラノホスフェート、これらの２′−５′結合した類似体、ならびに反転極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が結合されている、３′−５′と５′−３′または２′−５′と５′−２′）が含まれるが、これらに限定されない。米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号を参照さ��たい。
【０１５０】
モルホリノ系オリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）、Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３０，Ｉｓｓｕｅ３，（２００１）、Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）、Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６−２２０（２０００）、Ｌａｃｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１−９５９６（２０００）、および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。
【０１５１】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５−８６０２（２０００）に記載されている。
【０１５２】
リン原子を内部に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有するもの、シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２構成部品が混合しているものを含む。米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５、同第５，１８５，４４４、同第５，２１４，１３４、同第５，２１６，１４１、同第５，２３５，０３３、同第５，２６４，５６２、同第５，２６４，５６４、同第５，４０５，９３８、同第５，４３４，２５７、同第５，４６６，６７７、同第５，４７０，９６７、同第５，４８９，６７７、同第５，５４１，３０７、同第５，５６１，２２５、同第５，５９６，０８６、同第５，６０２，２４０、同第５，６１０，２８９、同第５，６０２，２４０、同第５，６０８，０４６、同第５，６１０，２８９、同第５，６１８，７０４、同第５，６２３，０７０、同第５，６６３，３１２、同第５，６３３，３６０、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号を参照されたい。
【０１５３】
１つ以上の置換糖部分、例えば、以下のうちの１つもまた、２′位に含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドおよび同様の特性を有する他の置換基の薬力学的特性を改善するための基。いくつかの態様では、修飾は、２′−Ｏ−（２′メトキシエチル）としても知られる、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３を含む（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）。他の修飾は、２′−メトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ３）、２′−プロポキシ（２′−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）および２′−フルオロ（２′−Ｆ）を含む。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３  ′末端ヌクレオチド上の糖の３′位および５′末端ヌクレオチドの５′位で行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有していてもよい。
【０１５４】
いくつかの実施例では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格は、新規の基で置き換えることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、例えば、アミノエチルグリシン骨格などの骨格を含むアミドで置き換えることができる。核酸塩基を保持し、直接または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合することができる。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）に見ることができる。
【０１５５】
ガイドＲＮＡは、追加としてまたは代替として、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含むこともできる。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、天然核酸に稀にまたは一時的にしか見られない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２′デオキシシトシンとも呼ばれ、当該技術分野ではしばしば５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５−７７（１９８０）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当該技術分野で知られている「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンもまた含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性が０．６〜１．２℃向上することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の態様である。
【０１５６】
修飾された核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルとアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（疑似−ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルクアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含み得る。
【０１５７】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、′Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ′，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ′，１９９１，３０，ｐａｇｅ  ６１３により開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ′，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示されるものを含み得る。これらのある特定の核酸塩基は、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃向上させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ，′Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ′，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、さらにより具体的には２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合の塩基置換の態様である。修飾された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、および同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第５，７６３，５８８号、同第５，８３０，６５３号、同第６，００５，０９６号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。
【０１５８】
したがって、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡとエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれる非天然の糖、リン酸、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチドのすべての位置を均一に修飾する必要はなく、実際、前述の修飾のうちの複数を単一のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。
【０１５９】
エンドヌクレアーゼをコードするガイドＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを強化する１つ以上の部分または共役体に化学結合することができる。そのような部分は、コレステロール部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）］、コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０（１９９４）］、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９（１９９２）およびＭａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０（１９９３）］、チオコールエステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５３３−５３８（１９９２）］、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０（１９９０）およびＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４（１９９３）］、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）およびＳｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３７７７−３７８３（１９９０）］、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３（１９９５）］、アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４  （１９９５）］、パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７（１９９５）］、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７（１９９６）］などの脂質部分を含むが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４��７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９、９２８号、および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
【０１６０】
糖および他の部分を使用して、カチオン性ポリソームおよびリポソームなどのヌクレオチドを含むタンパク質および複合体を特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞向けの伝達は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介され得る。例えば、Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．２１（１０）：１０２５−３０（２０１４）を参照されたい。当該技術分野で既知であり、定期的に開発されている他のシステムを使用して、本事例で使用する生体分子および／またはその複合体を目的の特定の標的細胞に標的化することができる。
【０１６１】
これらの標的化部分または共役体は、一次または二次ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した共役基を含み得る。本開示の共役基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬力学的特性を高める基が含まれる。典型的な共役基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本開示の文脈において、薬力学的特性を強化する基には、取り込みを改善し、分解に対する耐性を強化し、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本開示の文脈において、薬力学的特性を強化する基には、本開示の化合物の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。代表的な共役基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号（ＷＯ１９９３／００７８８３として公開）、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。共役部分には、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【０１６２】
化学合成の影響を受けにくく、通常は酵素的合成によって産生されるより長いポリヌクレオチドもまた、様々な手段によって修飾され得る。そのような修飾には、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、分子の５′または３′末端での特定の配列または他の部分の組み込み、および他の修飾が含まれ得る。例として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、長さがおよそ４ｋｂであり、インビトロ転写により合成することができる。ｍＲＮＡの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を高めるために（例えば、細胞での分解に対する耐性を高めることによって）適用するか、またはＲＮＡが細胞でしばしば観察される先天性免疫応答を誘発する傾向を低減した後、外因性ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするようなより長いＲＮＡを導入するために適用され得る。
【０１６３】
多くのそのような修飾、例えば、ポリＡテール、５′キャップ類似体（例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾された５′もしくは３′非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾された塩基の使用（例えば、擬似−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５′−トリホスフェート（５−メチル−ＣＴＰ）もしくはＮ６−メチル−ＡＴＰなど）の使用、または５′末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処置は、当該技術分野において説明されている。これらおよび他の修飾は、当該技術分野で知られており、ＲＮＡの新しい修飾が定期的に開発されている。
【０１６４】
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＡｘｏＬａｂｓ，Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、およびその他多くを含む、修飾ＲＮＡの多数の商業的サプライヤーが存在する。ＴｒｉＬｉｎｋに記載されているように、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増加、翻訳の増加、または先天性免疫受容体と転写ＲＮＡとの相互作用の低減などの望ましい特性を付与することができる。５−メチルシチジン−５′−トリホスフェート（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、擬似−ＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰはまた、下記で参照されるＫｏｒｍａｎｎらおよびＷａｒｒｅｎらによる刊行物において説明されるように、培養物中および生体内で先天性免疫刺激を低減する一方で、翻訳を強化することが示されている。
【０１６５】
インビボで送達される化学修飾されたｍＲＮＡを使用して、改善された治療効果を達成できることが示されている。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，１５４−１５７（２０１１）を参照されたい。そのような修飾を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を高め、かつ／またはその免疫原性を低減することができる。擬似−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、および５−メチル−Ｃなどの化学修飾を使用して、ウリジンおよびシチジン残基の４分の１だけを２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃはそれぞれ、マウスのｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介認識の有意な減少をもたらした。先天性免疫系の活性化を低減させることにより、これらの修飾を使用して、インビボでのｍＲＮＡの安定性と寿命を効果的に高めることができる。例えば、上記のＫｏｒｍａｎｎらを参照されたい。
【０１６６】
また、先天性抗ウイルス応答をバイパスするように設計された修飾を組み込んだ合成メッセンジャーＲＮＡを繰り返し投与すると、分化したヒト細胞を多能性に再プログラムできることが示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照されたい。一次再プログラミングタンパク質として作用するこのような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラミングする効率的な手段であり得る。このような細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれ、５−メチル−ＣＴＰ、疑似−ＵＴＰ、およびアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込んだ酵素合成ＲＮＡを使用して、細胞の抗ウイルスを効果的に回避できることがわかった。例えば、上記のＷａｒｒｅｎらを参照されたい。
【０１６７】
当該技術分野に記載されたポリヌクレオチドの他の修飾には、例えば、ポリＡテールの使用、５′キャップ類似体の付加（ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）、５′または３′非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、または５′末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処置が含まれ、新しいアプローチが定期的に開発されている。
【０１６８】
本明細書で使用するための修飾ＲＮＡの生成に適用可能な多くの組成物および技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾に関連して開発されてきた。  ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介した遺伝子サイレンシングへの影響が一般に一過性であり、反復投与を必要とし得るため、インビボで特定の課題を提示する。さらに、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、多くの場合、ウイルス感染の副産物であるｄｓＲＮＡを検出し、中和するために進化した免疫応答を有する。したがって、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）などの哺乳動物酵素、およびｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介することができる潜在的にレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにそのような分子に応答してサイトカインの誘導を引き起こすことができるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３など）が存在する。例えば、Ａｎｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０−４６８（２０１３）、Ｋａｎａｓｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０（３）：５１３−５２４（２０１２）、Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪ．６（９）：１１３０−４６（２０１１）、Ｊｕｄｇｅ  ａｎｄ  ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９（２）：１１１−２４（２００８）によるレビュー、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
【０１６９】
本明細書に記載されるように、ＲＮＡの安定性を高め、先天性免疫応答を低減し、かつ／またはヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利点を達成するために、多種多様な修飾が開発および適用されている。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７−９６（２０１１）、Ｇａｇｌｉｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８−９５（２０１０）、Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８−６７（２０１０）、Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｕｎｉｔ  １６．３（２００９）、Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８（４）：３０５−１９（２００８）、Ｆｕｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ  ２２（３）：２０５−２１０（２０１２）、Ｂｒｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３：１５４（２０１２）によるレビューを参照されたい。
【０１７０】
上記のように、修飾ＲＮＡの多くの商業的サプライヤーがあり、その多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された修飾に特化している。文献で報告されている様々な発見に基づいて、様々なアプローチが提供されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １１：１２５−１４０（２０１２）によって報告されているように、非架橋酸素の硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）への置換が、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために広く使用されていることに注目している。リボースの２′位の修飾は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を向上させる一方で、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を高めることが報告されており、これはまた、免疫活性からの保護を提供することも示されている。中程度のＰＳ骨格修飾と小さな良好な耐容性の２′置換（２′−Ｏ−メチル、２′−フルオロ、２′−ハイドロ）の組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８（２００４）によって報告されたインビボでの適用のための安定性の高いｓｉＲＮＡと関連付けられており、２′−Ｏ−メチル修飾は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９：１９１−２０２（２００９）によって報告された安定性の改善に効果的であると報告されている。先天性免疫応答の誘導の低下に関して、特定の配列を２′−Ｏ−メチル、２′−フルオロ、２′−ハイドロで修飾すると、一般にサイレンシング活性を維持しながら、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を低減することが報告されている。例えば、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４−５０５（２００６）、およびＣｅｋａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０−１０８（２００７）を参照されたい。２−チオウラシル、擬似ウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、およびＮ６−メチルアデノシンなどの追加の修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限に抑えることが示されている。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−１７５（２００５）を参照されたい。
【０１７１】
当該技術分野において知られ、市販されているように、本明細書で使用するために、例えば、コレステロール、トコフェロールおよび葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーを含む細胞による送達および／または取り込みを増強することができるＲＮＡなどのポリヌクレオチドに多くの共役体を適用することができる。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１−８０９（２０１３）によるレビューおよびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
【０１７２】
コドン最適化
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含む細胞での発現について、当該技術分野で標準的な方法に従ってコドン最適化することができる。例えば、意図された標的核酸がヒト細胞にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドを産生するための使用が企図される。
【０１７３】
ゲノム標的化核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
【０１７４】
リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）
部位特異的ポリペプチドおよびゲノム標的化核酸はそれぞれ、細胞または患者に別々に投与することができる。一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合することができる。次いで、事前に複合された材料を、細胞または患者に投与することができる。このような事前に複合された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。ＲＮＰの部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）によってＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に隣接することができる。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端に位置する１つのＮＬＳとＣ末端に位置する第２のＮＬＳの２つのＮＬＳに隣接することができる。ＮＬＳは、ＳＶ４０  ＮＬＳなどの当該技術分野で知られている任意のＮＬＳであり得る。ＲＮＰのゲノム標的化核酸と部位特異的ポリペプチドとの重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰでのｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は、１：１であり得る。
【０１７５】
核酸をコードするシステム構成要素
本開示は、本開示のゲノム標的化核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実施するのに必要な任意の核酸もしくはタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【０１７６】
本開示のゲノム標的化核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実施するのに必要な任意の核酸もしくはタンパク質分子をコードする核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含み得る。
【０１７７】
「ベクター」という用語は、結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントが結紮され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加の核酸セグメントをウイルスゲノムに結紮することができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。
【０１７８】
いくつかの実施例では、ベクターは、それらが動作可能に結合されている核酸の発現を指示することができる可能性がある。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」、またはより単純に「発現ベクター」と呼ばれ、同等の機能を果たす。
【０１７９】
「動作可能に結合された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節配列（複数可）に結合されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、およびある特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者は、発現ベクターの設計が、標的細胞の選択、所望の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを理解するであろう。
【０１８０】
企図される発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、ならびに他の組換えベクターが含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞について企図される他のベクターには、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合する限り、他のベクターを使用することができる。
【０１８１】
いくつかの実施例では、ベクターは、１つ以上の転写および／または翻訳制御要素を含むことができる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的かつ誘導性のプロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、多数の適切な転写および翻訳制御要素のいずれかを発現ベクターで使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の構成要素または他の要素のいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターであり得る。
【０１８２】
適切な真核生物プロモーター（すなわち、真核生物細胞で機能するプロモーター）の非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子−１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉに融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物に由来するものが含まれる。
【０１８３】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含む、低分子ＲＮＡの発現には、例えばＵ６およびＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。そのようなプロモーターの使用を強化するための説明およびパラメータは、当該技術分野で知られており、追加の情報およびアプローチが定期的に説明されている。例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。
【０１８４】
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位と転写ターミネーターを含むこともできる。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列も含み得る。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合され、したがって融合タンパク質をもたらす非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１８５】
プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）であり得る。場合によっては、プロモーターは、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得る。
【０１８６】
本開示のゲノム標的化核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のために送達ビヒクルの表面または表面上にパッケージ化され得る。企図される送達媒体には、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で説明されているように、様々な標的化部分を使用して、そのようなビヒクルと所望の細胞型または位置との優先的相互作用を強化することができる。
【０１８７】
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって起こり得る。
【０１８８】
治療的アプローチ
本明細書では、脂質異常症の患者を治療するための方法が提供される。そのような方法の態様は、エクスビボの細胞ベースの治療法である。例えば、患者の肝臓の生検が行われる。次いで、肝臓特異的前駆細胞または初代肝細胞が、生検材料から単離される。次に、これらの前駆細胞または初代肝細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して修正される。最後に、前駆細胞または初代肝細胞が患者に移植される。任意のソースまたはタイプの細胞を、前駆細胞として使用することができる。
【０１８９】
そのような方法の別の態様は、エクスビボの細胞ベースの治療法である。例えば、患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成することができる。次いで、これらのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して編集することができる。次に、ゲノム編集されたｉＰＳＣを他の細胞に分化することができる。最後に、分化した細胞を患者に移植する。
【０１９０】
そのような方法のさらに別の態様は、エクスビボの細胞ベースの治療法である。例えば、間葉系幹細胞を患者から単離することができ、これは患者の骨髄または末梢血から単離することができる。次に、これらの間葉系幹細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して編集することができる。次に、ゲノム編集された間葉系幹細胞は、あらゆるタイプの細胞、例えば肝細胞に分化することができる。最後に、分化した細胞、例えば肝細胞を患者に移植する。
【０１９１】
エクスビボ細胞療法アプローチの１つの利点は、投与前に治療薬の包括的な分析を実施できることである。ヌクレアーゼベースの治療法は、ある程度のオフターゲット効果を有し得る。エクスビボで遺伝子編集を行うと、移植前に編集された細胞集団を特徴付けることができる。本開示は、編集された細胞の全ゲノムを配列決定して、もしあれば、オフターゲット効果が患者への最小リスクに関連するゲノム位置にあり得ることを保証することを含む。さらに、移植前に、クローン集団を含む特定の細胞集団を単離することができる。
【０１９２】
エクスビボ細胞療法の別の利点は、他の主要な細胞源と比較したｉＰＳＣの遺伝子修飾に関するものである。ｉＰＳＣは豊富であり、細胞ベースの治療法に必要な多数の細胞の入手をより容易にする。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を行うための理想的な細胞型である。これにより、生存率が低下する危険を冒すことなく、正しいゲノム修飾のスクリーニングが可能になる。対照的に、肝細胞などの他の初代細胞は、数回の継代でのみ生存可能であり、クローン的に拡大することは困難である。したがって、脂質異常症の治療のためのｉＰＳＣの操作ははるかに容易になり得、所望の遺伝子修飾を行うために必要な時間を短縮することができる。
【０１９３】
方法には、インビボベースの治療法も含まれ得る。患者の細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して編集される。
【０１９４】
ある特定の細胞は、エクスビボでの治療および治療法のための魅力的な標的を提示するが、送達における効力の増加は、そのような細胞への直接的なインビボ送達を可能にし得る。理想的には、標的化および編集は、関連細胞に向けられる。ある特定の細胞および／または発生段階でのみ活性なプロモーターを使用することにより、他の細胞の切断を防ぐこともできる。追加のプロモーターは、誘導可能であるため、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合、一時的に制御することができる。送達されたＲＮＡおよびタンパク質が細胞内に留まる時間もまた、半減期を変更するために追加された治療またはドメインを使用して調整することができる。インビボ治療は、多くの治療ステップを排除するが、送達速度を低くするには、編集速度を高くする必要があり得る。インビボ治療は、エクスビボ治療および生着による問題と損失を排除することができる。
【０１９５】
インビボ遺伝子療法の利点は、治療的産生および投与の容易さであり得る。同じ治療アプローチおよび治療法は、複数の患者、例えば同じまたは類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する多くの患者を治療するために使用される可能性を有する。対照的に、エクスビボ細胞療法では、通常、患者自身の細胞を使用する必要があり、それらの細胞は単離され、操作され、同じ患者に戻される。
【０１９６】
また本明細書では、ゲノム編集により細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための細胞法も提供される。例えば、細胞は、患者または動物から単離することができる。次いで、細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して編集することができる。
【０１９７】
本明細書で提供される方法は、細胞性またはエクスビボまたはインビボの方法に関係なく、１つ以上の挿入、欠失、または突然変異を、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くに導入することによって、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を低減（ノックダウン）または排除（ノックアウト）することを伴い得る。
【０１９８】
例えば、ノックダウンまたはノックアウト戦略は、不正確なＮＨＥＪ修復経路のために生じるランダムな挿入または欠失（インデル）を導入することによって、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のリーディングフレームを破壊することを伴い得る。これは、１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）を有する目的の遺伝子に、または２つ以上の一本鎖切断もしくは二本鎖切断を、２つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つ以上のｓｇＲＮＡを有する目的の遺伝子に誘導することによって達成することができる。このアプローチは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｓｇＲＮＡの開発および最適化を必要とし得る。
【０１９９】
あるいは、ノックダウンまたはノックアウト戦略はまた、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くに１つ以上のセグメントの欠失を伴い得る。この欠失戦略には、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くの２つの異なる部位と１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに結合できるｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）の少なくとも一対が必要である。２つのｇＲＮＡで構成されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、所望の位置で２つの二本鎖切断を誘導する。切断後、平滑末端またはオーバーハングの有無にかかわらず、２つの末端はＮＨＥＪによって接合され得、介在セグメントの欠失をもたらす。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部での挿入、欠失、または突然変異をもたらし得る。
【０２００】
上記のゲノム編集戦略に加えて、別の戦略は、調節配列の編集によってＡＮＧＰＴＬ３の発現、機能、または活性を調節することを伴う。
【０２０１】
上記の編集オプションに加えて、Ｃａｓ９または類似のタンパク質を使用して、編集のために特定され得る同じ標的部位、またはエフェクタードメインの範囲内の追加の標的部位に、エフェクタードメインを標的することができる。一連のクロマチン修飾酵素、メチラーゼ、またはデメチラーゼを使用して、標的遺伝子の発現を変更することができる。１つの可能性は、突然変異が望ましくない活性をもたらす場合、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を低下させることである。これらのタイプの後成的制御には、特にそれらが可能なオフターゲット効果に制限されるため、いくつかの利点がある。
【０２０２】
コーディングおよびスプライシング配列に加えて、多くのタイプのゲノム標的部位が存在し得る。
【０２０３】
転写および翻訳の調節は、細胞タンパク質またはヌクレオチドと相互作用する部位の多くの異なるクラスに関係している。多くの場合、転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合部位は、部位の役割を研究するために突然変異または欠失のために標的され得るが、それらはまた、遺伝子発現を変更するために標的にすることもできる。ＮＨＥＪに接合する非相同末端を介して、または相同性修復（ＨＤＲ）による直接ゲノム編集によって、部位を付加することができる。ゲノム配列の使用の増加、ＲＮＡ発現、および転写因子結合のゲノム全体の研究により、部位が発生的または一時的な遺伝子調節にどのようにつながるかを特定する能力が向上した。これらの制御システムは直接的であり得るか、または複数のエンハンサーからの活性の統合を必要とし得る広範な協調的規制を伴い得る。転写因子は、通常、６〜１２ｂｐ長の縮退ＤＮＡ配列に結合する。個々の部位によって提供される低レベルの特異性は、複雑な相互作用および規則が、結合および機能的結果に関与していることを示唆する。縮退の少ない結合部位は、より簡単な調節手段を提供することができる。人工転写因子は、ゲノム内の類似配列が少なく、オフターゲット切断の可能性が低い長い配列を指定するように設計することができる。これらのタイプの結合部位はいずれも、遺伝子の調節または発現の変化を可能にするために、突然変異、欠失、または作成することができる（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。
【０２０４】
これらの特徴を持つ別のクラスの遺伝子調節領域は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後の遺伝子調節において重要な役割を果たす非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、すべての哺乳類タンパク質をコードする遺伝子の３０％の発現を調節することができる。二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）による特異的かつ強力な遺伝子サイレンシングに加え、さらに小さな非コーディングＲＮＡが発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。遺伝子サイレンシングに重要な非コーディングＲＮＡの最大クラスは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡは、最初に長いＲＮＡ転写産物として転写され、これは、別個の転写ユニット、タンパク質イントロンの一部、または他の転写産物であり得る。長い転写産物は、不完全に塩基対合したヘアピン構造を含む、初代ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａが関与する核内のタンパク質複合体であるマイクロプロセッサーによって、１つ以上のより短い前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に切断され得る。
【０２０５】
Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、２−ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する、長さ約７０ヌクレオチドの短いステムループであり、成熟した１９〜２５ヌクレオチドｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖にエクスポートされる。塩基対安定性が低いｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の上に負荷され得る。パッセンジャー鎖（＊でマークされる）は機能し得るが、通常は劣化する。成熟したｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを、主に３′非翻訳領域（ＵＴＲ）内に見られる標的ｍＲＮＡの部分相補配列モチーフにつなぎ、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ  １３６，２１５−２３３（２００９）、Ｓａｊ，Ａ．＆Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２１，５０４−５１０（２０１１））。
【０２０６】
ｍｉＲＮＡは、開発、分化、細胞周期、および成長制御において、また哺乳動物および他の多細胞生物の実質的にすべての生物学的経路において重要であり得る。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期の制御、アポトーシスおよび幹細胞の分化、造血、低酸素、筋肉の発達、神経新生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルス複製、および免疫応答にも関与する。
【０２０７】
単一のｍｉＲＮＡは、数百の異なるｍＲＮＡ転写産物を標的とすることができるが、個々のｍｉＲＮＡ転写産物は、多くの異なるｍｉＲＮＡによって標的され得る。ｍｉＲＢａｓｅの最新リリース（ｖ．２１）では、２８６４５超のｍｉｃｒｏＲＮＡに注釈が付けられている。いくつかのｍｉＲＮＡは、複数の遺伝子座によってコードされ、そのうちのいくつかは、タンデムに同時転写されたクラスターから発現され得る。この機能により、複数の経路とフィードバック制御とを備えた複雑な調節ネットワークが可能になる。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバックおよび調節回路の不可欠な部分であり得、タンパク質の産生を制限内に保つことで遺伝子発現の調節に役立ち得る（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｈ．＆Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２４，１３３９−１３４４（２０１０）、Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２７，１−６（２０１４））。
【０２０８】
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する多くのヒト疾患でも重要であり得る。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調する。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究は、ｍｉＲＮＡを免疫応答の調節と関連付けている（Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７，３７６−３８１（２００７））。
【０２０９】
ｍｉＲＮＡはまた、癌との強いつながりがあり、様々な種類の癌で役割を果たすことができる。ｍｉＲＮＡは、多くの腫瘍で下方調節されることがわかっている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期制御およびＤＮＡ損傷応答などの主要な癌関連経路の調節に重要であり得るため、診断に使用することができ、臨床的に標的とすることができる。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、血管新生のバランスを微妙に調節することができ、それによりすべてのｍｉｃｒｏＲＮＡを枯渇させる実験により、腫瘍血管新生が抑制される（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２８，１０５４−１０６７（２０１４））。
【０２１０】
タンパク質をコードする遺伝子について示されているように、ｍｉＲＮＡ遺伝子は、癌とともに発生する後成的変化の影響も受け得る。多くのｍｉＲＮＡ遺伝子座は、ＣｐＧアイランドに関連付けられ、ＤＮＡメチル化による調節の機会を増やす（Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．，Ｓｔｒｅｓｅｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｂ．＆Ｌｙｋｏ，Ｆ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６，１００１−１００５（２００７））。ほとんどの研究では、クロマチンリモデリング薬による治療を使用して、後成的にサイレンシングされたｍｉＲＮＡを明らかにしている。
【０２１１】
ＲＮＡサイレンシングにおける役割に加えて、ｍｉＲＮＡは翻訳を活性化することもできる（Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２７，１−６（２０１４））。ｍｉＲＮＡ部位をノックアウトすると、標的遺伝子の発現の減少につながる場合があるが、これらの部位を導入すると発現が増加する場合がある。
【０２１２】
個々のｍｉＲＮＡは、シード配列（ｍｉｃｒｏＲＮＡの塩基２〜８）を突然変異させることによって最も効果的にノックアウトすることができ、これは、結合特異性にとって重要であり得る。この領域での切断と、それに続くＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合をブロックすることにより、ｍｉＲＮＡ機能を効果的に無効にし得る。ｍｉＲＮＡは、パリンドローム配列に隣接する特別なループ領域の特定の標的化によっても阻害され得る。触媒的に不活性なＣａｓ９を使用して、ｓｈＲＮＡ発現を阻害することもできる（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ４，３９４３（２０１４））。ｍｉＲＮＡの標的化に加えて、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防ぐために、結合部位を標的化および突然変異させることもできる。
【０２１３】
本開示によれば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはそれらの結合部位のうちのいずれかを、本開示の組成物に組み込むことができる。
【０２１４】
組成物は、限定されないが、配列番号６３２〜４，７１５に列記されたｍｉｃｒｏＲＮＡのうちのいずれかの配列、配列番号６３２〜４，７１５に列記されたｍｉｃｒｏＲＮＡの逆相補体、または配列番号６３２〜４，７１５に列記されているｍｉｃｒｏＲＮＡのうちのいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡアンチシード領域を含む領域を有し得る。
【０２１５】
本開示の組成物は、１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、またはｍｉｃｒｏＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国特許公開第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されているものなどの任意の既知のｍｉｃｒｏＲＮＡに対応し得る。非限定的な実施形態として、ヒトゲノムにおける既知のｍｉｃｒｏＲＮＡ、それらの配列、およびそれらの結合部位配列は、配列番号６３２〜４，７１５に列記されている。
【０２１６】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「シード」配列、すなわち、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの位置２〜８の領域の配列を含み、その配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。ｍｉｃｒｏＲＮＡシードは、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの態様では、ｍｉｃｒｏＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含むことができ、対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補部位は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ位置１とは反対のアデニン（Ａ）に隣接している。いくつかの態様では、ｍｉｃｒｏＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含むことができ、対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補部位は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ位置１とは反対のアデニン（Ａ）に隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照されたい。ｍｉｃｒｏＲＮＡシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。
【０２１７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンと生物学における役割の同定が報告されている（Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３）。
【０２１８】
例えば、組成物が肝臓に送達されることを意図していないが、最終的に肝臓に存在する場合、肝臓で豊富なｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つ以上の標的部位がその標的配列をコードするポリヌクレオチドに組み込まれる場合、送達された配列の発現を阻害し得る。異なるｍｉｃｒｏＲＮＡの１つ以上の結合部位の導入を操作して、寿命、安定性、およびタンパク質の翻訳をさらに減少させることができ、したがって攻撃に耐えられる追加の層を提供する。
【０２１９】
本明細書で使用される場合、「ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位」という用語は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位もしくはｍｉｃｒｏＲＮＡ認識部位、またはｍｉｃｒｏＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従い得るか、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ部位における、もしくはそれに隣接した標的配列との、ｍｉｃｒｏＲＮＡとの安定した会合を反映し得ることを理解されたい。
【０２２０】
逆に、本開示の組成物の目的のために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために、それらが天然に発生する配列から操作（すなわち、除去）することができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位を除去して、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。
【０２２１】
具体的には、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）で差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫反応、炎症、ならびに遺伝子療法および組織／臓器移植後の望ましくない免疫反応に関与している。免疫細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、およびアポトーシスの多くの側面も調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は、もっぱら免疫細胞において発現し、特に骨髄樹状細胞で豊富である。本開示のポリペプチドの３′−ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を導入すると、ｍｉＲ−１４２媒介ｍＲＮＡ分解により抗原提示細胞の遺伝子発現を選択的に抑制することができ、プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それにより遺伝子送達後の抗原媒介免疫応答を防ぐ（Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１を参照）。
【０２２２】
一実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現することが知られているｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチドに組み込んで、ｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解によりＡＰＣにおけるポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介免疫応答を緩和するが、ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡが発現しない非免疫細胞で維持される。
【０２２３】
様々な癌細胞／組織および他の疾患におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの差次的発現をプロファイルするために、多くのｍｉｃｒｏＲＮＡ発現研究が実施されており、当該技術分野で説明されている。いくつかのｍｉｃｒｏＲＮＡは、ある特定の癌細胞で異常に過剰発現され、他の癌細胞は、過少発現される。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）、癌幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）、膵臓癌および疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）、喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）、前立腺癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４）、肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）、肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）、結腸直腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）、癌陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）、鼻咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）、慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）、甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）、卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）、乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）において差次的に発現される。
【０２２４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列ならびに標的組織および／または細胞の非限定的な例は、配列番号６３２〜４，７１５に記載されている。
【０２２５】
ゲノム操作戦略
いくつかの態様では、本開示の方法は、対立遺伝子の一方または両方の編集を伴い得る。対立遺伝子（複数可）を修正するための遺伝子編集には、標的遺伝子または遺伝子産物を永続的に改変するという利点がある。
【０２２６】
本開示のエクスビボ方法のステップは、ゲノム操作を使用して患者から単離された肝細胞を編集することを含み得る。あるいは、本開示のエクスビボ方法のステップは、患者特異的ｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞を編集することを含み得る。同様に、本開示のインビボ方法のステップは、ゲノム操作を使用して異脂肪血症患者の細胞を編集することを含む。同様に、本開示の細胞法のステップは、ゲノム操作によりヒト細胞のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集することを含み得る。
【０２２７】
脂質異常症患者は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に異なる突然変異を示す場合がある。本開示の方法では、任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができ、各ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、疾患特異的であってもなくてもよい独自の関連ＰＡＭを有する。
【０２２８】
例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、不正確なＮＨＥＪ修復経路により生じるランダムな挿入または欠失（インデル）を導入することによって破壊または排除され得る。標的領域は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のコード配列（すなわち、エクソン）であり得る。ヌクレオチドを遺伝子のコード配列に挿入させるか、または欠失させると、通常の３文字のコドンパターンが乱れる「フレームシフト」を引き起こす場合がある。このようにして、遺伝子発現、ひいてはタンパク質産生を低減または排除することができる。このアプローチはまた、配列の改変がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を妨げる可能性があるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン、イントロン：エクソン接合部、または調節ＤＮＡ要素を標的とするために使用することもできる。
【０２２９】
別の例として、ＮＨＥＪを使用して、遺伝子内またはその近くのセグメントを、直接または複数の位置を標的とする１つのｇＲＮＡまたは複数のｇＲＮＡによる切断によりスプライスドナーまたはアクセプター部位を改変することのいずれかによって欠失させることもできる。これは、小さなランダムインデルが標的遺伝子をノックアウトするのに非効率的である場合に役立ち得る。このタイプの欠失には、ガイド鎖の対が使用されている。
【０２３０】
ドナーが存在しない場合、ＤＮＡ末端が接合部でほとんどまたはまったく塩基対合せずに接合される、いくつかの非相同修復経路を使用して、ＤＮＡ切断からの末端または異なる切断からの末端を接合することができる。標準的なＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ−ＮＨＥＪなどの同様の修復機序がある。２つの切断がある場合、介在するセグメントを欠失または反転させることができる。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部での挿入、欠失、または突然変異をもたらし得る。
【０２３１】
ＮＨＥＪはまた、相同性に依存しない標的統合につながり得る。例えば、ドナープラスミド上のヌクレアーゼ標的部位の包含は、ドナーと染色体の両方のインビボでのヌクレアーゼ切断後の染色体二本鎖切断への導入遺伝子の組み込みを促進することができる（Ｃｒｉｓｔｅａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１３  Ｍａｒ；１１０（３）：８７１−８０）。ＮＨＥＪを使用して、ヌクレアーゼ切断後に１５ｋｂの誘導性遺伝子発現カセットをヒト細胞株の定義された遺伝子座に挿入した。（例えば、Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２３，５３９−５４６（２０１３）、Ｃｒｉｓｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２０１３，８７１−８０，１０．１００２／ｂｉｔ．２４７３３を参照）。組み込まれた配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のリーディングフレームを破壊するか、または遺伝子の構造を改変することができる。
【０２３２】
さらなる代替法として、相同性指向修復（ＨＤＲ）を使用して、遺伝子をノックアウトするか、または遺伝子機能を改変することもできる。ＨＤＲは、本質的に、ＤＳＢ修復時にテンプレートとして提供された相同ＤＮＡ配列を使用するエラーのない機序である。ＨＤＲの割合は、突然変異と切断部位との間の距離の関数であるため、重複するまたは最も近い標的部位を選択することが重要である。テンプレートには、相同領域に挟まれた余分な配列を含めることができるか、またはゲノム配列とは異なる配列を含めることができるため、配列編集が可能である。
【０２３３】
例えば、ＨＤＲノックアウト戦略には、遺伝子に挿入するか、または遺伝子の一部を非機能的もしくは無関係な配列で置き換えることにより、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の構造または機能を破壊することが含まれ得る。これは、細胞性ＤＳＢ応答をＨＤＲに向けるために外因的に導入されたドナーＤＮＡテンプレートの存在下で、１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）を有する目的の遺伝子に、または２つ以上の一本鎖切断もしくは二本鎖切断を、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つ以上のｇＲＮＡを有する目的の遺伝子に誘導することによって達成することができる（ドナーＤＮＡテンプレートは、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド、長い一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり得る）。このアプローチでは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡ分子の開発と最適化を必要とし得る。
【０２３４】
相同性指向修復は、ＤＳＢを修復するための細胞機序である。最も一般的な形態は、相同的組換えである。一本鎖アニーリングおよび代替ＨＤＲを含む、ＨＤＲには追加の経路がある。ゲノム操作ツールにより、研究者は、細胞の相同的組換え経路を操作して、ゲノムに対する部位特異的修飾を作成することができる。トランスで提供される合成ドナー分子を使用して、細胞が二本鎖切断を修復できることがわかっている。したがって、特定の突然変異の近くに二本鎖切断を導入し、適切なドナーを提供することにより、ゲノムに標的を絞った変更を加えることができる。特異的切断により、ＨＤＲの割合は、相同性ドナーのみを受けた１０６個の細胞中の１個の割合よりも１，０００倍以上増加する。特定のヌクレオチドでの相同性指向修復（ＨＤＲ）の割合は、切断部位までの距離の関数であるため、重複するまたは最も近い標的部位を選択することが重要である。遺伝子編集は、原位置で編集するとゲノムの残りの部分が影響を受けないままであるため、遺伝子の付加よりも利点がある。
【０２３５】
ＨＤＲによる編集のために提供されるドナーは著しく異なるが、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするために、小さなまたは大きな隣接している相同性アームを有する、意図した配列を含むことができる。導入された遺伝的変化に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下、またはプロモーター、ｃＤＮＡなどを含むことができるマルチキロベースカセットと同じ大きさであり得る。一本鎖および二本鎖の両方のオリゴヌクレオチドドナーが使用されている。これらのオリゴヌクレオチドは、サイズが１００ｎｔ未満から数ｋｂを超えるが、より長いｓｓＤＮＡを生成して使用することもできる。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、およびミニサークルなどの二本鎖ドナーを使用することができる。一般に、個々のドナーのパッケージングの制限は５ｋｂ未満であるが、ＡＡＶベクターは、ドナーテンプレートの送達の非常に効果的な手段であり得ることがわかっている。ドナーの活発な転写によりＨＤＲが３倍増加し、プロモーターを含めると変換が増加し得ることを示す。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現とＨＤＲを減少させた。
【０２３６】
Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、１つまたは他のヌクレアーゼドメインが不活性化され、１本のＤＮＡ鎖のみが切断されるニッカーゼ変異体が存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから、または標的領域に隣接するニッカーゼの対を使用して指向され得る。ドナーは、一本鎖、ニック、またはｄｓＤＮＡであり得る。
【０２３７】
ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼとともに、または様々な異なる方法によって、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、またはウイルス形質導入によって独立して供給され得る。ＨＤＲに対するドナーの可用性を高めるために、一連のテザリングオプションが提案されている。例には、ドナーをヌクレアーゼに結合する、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に結合する、またはＤＮＡ末端の結合もしくは修復に関与するタンパク質に結合することが含まれる。
【０２３８】
修復経路の選択は、細胞周期に影響する条件などの多くの培養条件、またはＤＮＡ修復と関連タンパク質の標的化によって導かれ得る。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＤＮＡリガーゼＩＶなどの主要なＮＨＥＪ分子を抑制することができる。
【０２３９】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲの両方を使用する部位特異的遺伝子挿入が行われた。組合せアプローチは、恐らくはイントロン／エクソン境界を含む、ある特定の設定で適用される場合がある。ＮＨＥＪは、イントロンでの結紮に効果的であることを証明することができるが、エラーのないＨＤＲは、コード領域においてより適している可能性がある。
【０２４０】
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、表３に示されるように、多くのエクソンを含んでいる。リーディングフレームを破壊し、最終的にＡＮＧＰＴＬ３タンパク質活性を排除する１つ以上の挿入または欠失を作成するために、これらのエクソンまたは近くのイントロンのうちのいずれか１つ以上を標的とすることができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、この方法は、望ましくない配列に隣接する位置で遺伝子を２回切断することによって欠失を行う、ｇＲＮＡ対を提供することができる。この配列は、１つ以上のエクソン、イントロン、イントロン：エクソン接合部、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。切断は、それぞれがゲノムにＤＳＢを作製する一対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、またはゲノムにＤＳＢを一緒に作製する複数のニッカーゼによって達成することができる。
【０２４２】
あるいは、この方法は、１つのｇＲＮＡを提供して、コーディング配列またはスプライシング配列内で１つの二本鎖切断を行うことができる。二本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはゲノム内でＤＳＢを一緒に作製する複数のニッカーゼによって作製することができる。
【０２４３】
スプライシングドナーおよびアクセプターは、一般に、隣接するイントロンから１００塩基対以内にある。いくつかの実施例では、方法は、目的の各エクソン／イントロン接合部に関しておよそ＋／−１００〜３１００ｂｐを切断するｇＲＮＡを提供することができる。
【０２４４】
ゲノム編集戦略のうちのいずれについても、遺伝子編集は、配列決定またはＰＣＲ分析によって確認することができる。
【０２４５】
標的配列の選択
本明細書でさらに説明および例示されるように、編集のために選択されたエンドヌクレアーゼ系に部分的に依存する、特定の参照遺伝子座に対する５′境界および／または３′境界の位置のシフトを使用して、遺伝子編集の特定の適用を促進または強化することができる。
【０２４６】
そのような標的配列選択の最初の非限定的な例では、多くのエンドヌクレアーゼ系には、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩまたはタイプＶエンドヌクレアーゼの場合に、ＤＮＡ切断部位に隣接した特定の位置でのＰＡＭ配列モチーフの要件など、切断の潜在的な標的部位の初期選択を導くことができる規則または基準がある。
【０２４７】
標的配列の選択または最適化の別の非限定的な例では、標的配列および遺伝子編集エンドヌクレアーゼの特定の組み合わせのオフターゲット活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で生じるＤＳＢの頻度）を、オンターゲット活性の頻度に対して評価することができる。場合によっては、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比較して選択的な利点を有し得る。選択的利点の例示的であるが非限定的な例には、複製率の向上、持続性、ある特定の条件に対する耐性、生着の成功率の向上または患者への導入後のインビボでの持続性などの属性の獲得、およびそのような細胞の数または生存率の維持または増加に関連する他の属性が含まれる。他の場合には、正しく編集された細胞を特定、分類、または他の方法で選択するために使用される１つ以上のスクリーニング方法により、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞を適切に選択することができる。選択的利点と有向選択方法の両方が、改変に関連する表現型を利用することができる。場合によっては、意図した細胞集団を選択または精製するために使用される新しい表現型を作成する第２の修飾を作成するために、細胞を２回以上編集することができる。そのような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーに第２のｇＲＮＡを付加することで作成され得る。場合によっては、ｃＤＮＡおよび選択可能なマーカーを含むＤＮＡ断片を使用して、所望される遺伝子座で細胞を正しく編集することができる。
【０２４８】
特定の場合に任意の選択的利点が適用可能であるか、または任意の有向選択が適用されるかに関係なく、標的配列の選択はまた、適用の有効性を高め、かつ／または所望の標的以外の部位での望ましくない改変の可能性を低減するために、オフターゲット頻度の考慮によって導かれ得る。本明細書および当該技術分野でさらに説明および例示されるように、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似性および非類似性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む多くの要因によって影響を受ける可能性がある。オフターゲット活性の予測を支援する生物情報学的ツールを利用することができ、また頻繁に、そのようなツールを使用して、オフターゲット活性の最も可能性の高い部位を特定することもでき、次いで、実験設定で評価して、オンターゲット活性に対するオフターゲットの相対頻度を評価することができ、それにより高い相対オンターゲット活性を有する配列の選択を可能にする。そのような技法の例示的な例が本明細書で提供され、他のものは当該技術分野で知られている。
【０２４９】
標的配列の選択の別の態様は、相同的組換え事象に関する。相同領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え事象の焦点として機能し得る。そのような組換え事象は、染色体および他のＤＮＡ配列の通常の複製過程で、またＤＮＡ配列が合成されている他の時点で、例えば、通常の細胞複製サイクル中に規則的に起こるが、様々な事象の発生（ＵＶ光および他のＤＮＡ切断の誘導物質など）またはある特定の薬剤の存在（様々な化学的誘導物質など）によって強化され得る、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合に発生する。そのような誘導物質の多くは、ＤＳＢをゲノム内で無差別に発生させ、ＤＳＢは、正常細胞で定期的に誘導および修復することができる。修復中、元の配列は、完全に忠実に再構築することができるが、場合によっては、小さな挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）が、ＤＳＢ部位で導入される。
【０２５０】
本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置でＤＳＢを特異的に誘導することもでき、これを使用して選択された染色体位置で有向または選好的遺伝子修飾事象を引き起こすことができる。相同配列がＤＮＡ修復（および複製）の文脈で組換えの対象となる傾向は、多くの状況で利用することができ、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集系の１つの適用の基礎となっており、相同性指向修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用により提供される目的の配列を所望の染色体位置に挿入する。
【０２５１】
わずか１０以下の塩基対を含み得る「マイクロホモロジー」の小さな領域であり得る、特定の配列間の相同領域を使用して、所望の欠失を引き起こすこともできる。例えば、単一のＤＳＢを、近くの配列でマイクロホモロジーを示す部位に導入することができる。そのようなＤＳＢの通常の修復過程において、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび付随する細胞修復プロセスによって促進される組換えの結果としての介在配列の欠失である。
【０２５２】
しかしながら、状況によっては、相同領域内で標的配列を選択すると、遺伝子融合（欠失がコード領域にある場合）を含む、はるかに大きな欠失が生じる可能性もあり、特定の状況では望ましい場合とそうでない場合がある。
【０２５３】
本明細書で提供される例は、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質活性の低下または排除をもたらす挿入、欠失、または突然変異を誘導するように設計されたＤＳＢの作成のための様々な標的領域の選択、ならびにオンターゲット事象に対してオフターゲット事象を最小化するように設計されている、そのような領域内の特定の標的配列の選択をさらに説明する。
【０２５４】
ヒト細胞
本明細書において説明および例示されるように、異脂肪血症またはＡＮＧＰＴＬ３に関連する任意の障害を改善するために、遺伝子編集の主要な標的は、ヒト細胞である。例えば、エクスビボ方法では、ヒト細胞は体細胞であり得、記載された技法を使用して修飾された後、分化細胞、例えば肝細胞または前駆細胞を生じさせることができる。例えば、インビボ方法では、ヒト細胞は、肝細胞、腎細胞、または他の影響を受けた器官からの細胞であり得る。
【０２５５】
必要な患者に由来する、したがって既に完全に一致している自己細胞で遺伝子編集を行うことにより、患者に安全に再導入され得る細胞を生成し、患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態の改善に効果的となる、細胞集団を効果的に生じさせることが可能である。
【０２５６】
幹細胞は、増殖とより多くの前駆細胞の発生の両方が可能であり、これらは順に分化したまたは分化可能な娘細胞を発生させることができる多数の母細胞を生成する能力を有する。娘細胞自体は、親の発生能を有する１つ以上の細胞を保持しながら、増殖し、後に１つ以上の成熟細胞型に分化する子孫を産生するように誘導することができる。次いで、「幹細胞」という用語は、特定の状況下でより特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、ある特定の状況下で実質的に分化することなく増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様では、前駆細胞または幹細胞という用語は、胚細胞および組織の進行性の多様化において起こるように、分化によって、例えば、完全に個々の特性を獲得することによって、その子孫（子孫）がしばしば異なる方向に特化する、一般化された母細胞を指す。細胞分化は、通常、多くの細胞分裂を通じて発生する複雑なプロセスである。分化した細胞は、それ自体が多能性細胞などに由来する、多能性細胞に由来し得る。これらの多能性細胞はそれぞれ、幹細胞と見なされる場合があるが、それぞれが生じる可能性のある細胞型の範囲は、かなり異なる場合がある。いくつかの分化した細胞はまた、より大きな発生能の細胞を生じさせる能力も持している。そのような能力は自然であり得るか、または様々な要因による治療で人為的に誘導され得る。多くの生物学的な例では、幹細胞はまた、複数の別個の細胞型の子孫を産生することができるため、「多能性」であり得るが、これは「幹細胞性」には必要ない。
【０２５７】
自己再生は、幹細胞の別の重要な態様であり得る。理論的には、２つの主要な機序のいずれかによって自己再生が発生し得る。幹細胞は、非対称に分裂する可能性があり、一方の娘は幹の状態を保持し、もう一方の娘はいくつかの別個の他の特定機能と表現型を発現し得る。あるいは、集団内の幹細胞のうちのいくつかは、２つの幹に対称的に分裂できるため、集団内の一部の幹細胞は全体として維持されるが、集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じる。一般的に、「前駆細胞」は、より原始的な（すなわち、完全に分化した細胞よりも発達経路または進行に沿った初期段階にある）細胞表現型を有する。多くの場合、前駆細胞はまた、有意なまたは非常に高い増殖能も持する。前駆細胞は、発生経路および細胞が発生および分化する環境に応じて、複数の別個の分化細胞型または単一の分化細胞型を生じさせることができる。
【０２５８】
細胞個体発生の文脈では、「分化した」または「分化する」という形容詞は、相対的な用語である。「分化細胞」は、比較対象の細胞よりも発生経路をさらに進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系列制限前駆細胞（筋細胞前駆細胞など）に分化することができ、これは順に、経路をさらに進んだ他の種類の前駆体細胞（筋細胞前駆体など）に、次いで筋細胞などの、ある特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していてもしていなくてもよい最終段階の分化細胞に分化し得る。
【０２５９】
誘導多能性幹細胞
本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣを使用する利点は、細胞が、前駆細胞が投与されるのと同じ対象に由来し得ることである。すなわち、体細胞は、対象から得られ、誘導多能性幹細胞に再プログラムされ、次いで対象に投与される前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化され得る。前駆細胞は本質的に自己起源に由来するため、生着拒絶またはアレルギー反応のリスクは、別の対象または対象群由来の細胞を使用する場合に比べて低減され得る。さらに、ｉＰＳＣを使用すると、胚源から取得した細胞の必要性がなくなる。したがって、一態様では、開示された方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
【０２６０】
分化は、一般に生理学的な状況では不可逆的であるが、体細胞をｉＰＳＣに再プログラムするためのいくつかの方法が最近開発された。例示的な方法は、当業者に知られており、下記で簡単に説明する。
【０２６１】
「再プログラミング」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を改変または反転させるプロセスを指す。別の言い方をすれば、再プログラミングとは、細胞の分化をより未分化またはより原始的な細胞型に逆行させるプロセスを指す。多くの初代細胞を培養すると、完全に分化した特性のいくらかの喪失につながり得ること留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるそのような細胞を単に培養しても、これらの細胞は分化していない細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にはならない。分化細胞の多能性への移行には、培養中の分化特性の部分的な喪失につながる刺激を超えた再プログラミング刺激が必要である。再プログラムされた細胞はまた、一般に培養中の限られた数の分裂の能力しか持たない初代細胞の親と比較して、成長能力を喪失することなく長期継代する能力の特徴を有している。
【０２６２】
再プログラムされる細胞は、再プログラミングの前に部分的または末端的のいずれかに分化させることができる。再プログラミングは、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の多能性状態または多分化能状態への完全な反転を包含し得る。再プログラミングは、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態から未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全または部分的な反転を包含し得る。再プログラミングは、細胞による特定の遺伝子の発現をもたらす可能性があり、その発現は、再プログラミングにさらに寄与する。本明細書に記載のある特定の例では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラミングは、分化細胞を未分化状態（例えば、未分化細胞）にみなすことができる。得られた細胞は、「再プログラムされた細胞」または「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と呼ばれる。
【０２６３】
再プログラミングは、細胞分化中に発生する、核酸修飾の少なくとも一部の遺伝的パターン（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、後成的変化、ゲノム刷り込みなどの改変（例えば、反転）に関係し得る。再プログラミングは、既に多能性である細胞の既存の未分化状態を単に維持すること、または既に多分化能細胞である細胞（例えば、筋原性幹細胞）の既存の完全に分化していない状態を維持することとは異なる。本明細書に記載の組成物および方法は、いくつかの実施例ではそのような目的に使用することもできるが、再プログラミングはまた、既に多能性または多分化能である細胞の自己再生または増殖の促進とは異なる。
【０２６４】
当該技術分野では、体細胞から多能性幹細胞を生成するために使用できる多くの方法が知られている。体細胞を多能性表現型に再プログラムするそのような方法は、本明細書に記載の方法での使用に適しているだろう。
【０２６５】
転写因子の定義された組み合わせを使用して多能性細胞を生成するための再プログラミング方法論が記載されている。マウスの体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの直接形質導入により、発生能が拡大したＥＳ細胞様細胞に変換することができる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−７６（２００６）を参照されたい。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路と後成的なランドスケープの多くを復元するため、ＥＳ細胞に似ている。さらに、マウスｉＰＳＣは、多能性のすべての標準アッセイ、具体的には、３つの胚葉の細胞型へのインビトロ分化、奇形腫形成、キメラへの寄与、生殖系列伝達［例えば、Ｍａｈｅｒａｌｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．３（６）：５９５−６０５（２００８）］、および四倍体補完を満たす。
【０２６６】
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入法を使用して取得することができ、転写因子トリオ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧは、多能性を支配する転写因子のコアセットとして確立されている。例えば、Ｂｕｄｎｉａｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｇｅｐｓｔｅｉｎ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．３（４）：４４８−５７（２０１４）、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ３：１−６  ｓｃｔｍ．２０１４−０１２１（２０１４）、Ｆｏｃｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：ｅ２１１（２０１４）、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。ｉＰＳＣの産生は、歴史的にウイルスベクターを使用して、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を成体の体細胞に導入することによって達成することができる。
【０２６７】
ｉＰＳＣは、成体幹細胞または体性幹細胞と同様に、最終分化した体細胞から生成または誘導することができる。すなわち、再プログラミングによって、非多能性前駆細胞を多能性または多分化能にすることができる。そのような場合、最終分化細胞を再プログラムするのに必要な数の再プログラミング因子を含める必要はない場合がある。さらに、再プログラミング因子の非ウイルス性導入によって、例えば、タンパク質自体の導入によって、または再プログラミング因子をコードする核酸の導入によって、または翻訳時に再プログラミング因子を産生するメッセンジャーＲＮＡの導入によって、再プログラミングを誘導することができる（例えば、Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０））。再プログラミングは、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１とも呼ばれる）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、およびＬＩＮ２８を含む、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組み合わせを導入することによって達成することができる。本明細書に記載の方法および組成物を使用する再プログラミングは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、およびＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１つ以上を体細胞に導入することをさらに含み得る。本明細書に記載の方法および組成物は、再プログラミングのためにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、およびＫｌｆ４のそれぞれの１つ以上を導入することをさらに含み得る。上記のように、再プログラミングに使用される正確な方法は、本明細書に記載の方法および構成にとって必ずしも重要ではない。しかしながら、再プログラムされた細胞から分化した細胞が、例えば、ヒトの治療法に使用される場合、一態様では、再プログラミングは、ゲノムを改変する方法によって影響を受けない。したがって、そのような例では、例えば、ウイルスまたはプラスミドベクターを使用せずに、再プログラミングを達成することができる。
【０２６８】
開始細胞の集団に由来する再プログラミングの効率（つまり、再プログラムされた細胞の数）は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：５２５−５２８（２００８）、Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（７）：７９５−７９７（２００８）、およびＭａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：１３２−１３５（２００８）に示されているように、様々な薬剤、例えば小分子の付加によって強化することができる。したがって、誘導された多能性幹細胞産生の効率または速度を高める薬剤または薬剤の組み合わせは、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの産生に使用することができる。再プログラミング効率を高める薬剤のいくつかの非限定的な例には、中でも可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５′−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）が含まれる。
【０２６９】
再プログラミング促進剤の他の非限定的な例には、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、デプデシン（例えば、（−）−デプデシン）、ＨＣトキシン、ヌルスクリプト（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ、３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニル酪酸（例えば、フェニル酪酸ナトリウム）およびバルプロ酸（（ＶＰ  Ａ）および他の短鎖脂肪酸）、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、ピバロイルオキシメチルブチレート（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としても知られる）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）およびＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、ツバシン、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロン酸ヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９、１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１およびＣＨＡＰ５０が含まれる。他の再プログラミング促進剤には、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒的に不活性な形態）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤、およびＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が含まれる。そのような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ  Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【０２７０】
本明細書に記載の方法で使用するための多能性幹細胞の誘導を確認するために、幹細胞マーカーの発現について単離されたクローンを試験することができる。体細胞に由来する細胞におけるそのような発現は、細胞を誘導多能性幹細胞として識別する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、およびＮａｔｌを含む非限定的な群から選択することができる。ある場合には、例えば、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞が、多能性として識別される。そのようなマーカーの発現を検出するための方法には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびコードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法、例えばウエスタンブロットまたはフローサイトメトリー分析が含まれ得る。検出には、ＲＴ−ＰＣＲだけでなく、タンパク質マーカーの検出も含まれ得る。細胞内マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ、または免疫細胞化学などのタンパク質検出法によって最もよく識別され得るが、細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によって容易に識別される。
【０２７１】
単離された細胞の多能性幹細胞特性は、ｉＰＳＣが３つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力を評価する試験によって確認され得る。一例として、ヌードマウスの奇形腫形成を使用して、単離されたクローンの多能性を評価することができる。細胞をヌードマウスに導入し、細胞から生じる腫瘍に対して組織学および／または免疫組織化学を行うことができる。例えば、３つの胚葉すべてからの細胞を含む腫瘍の成長は、細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。
【０２７２】
肝細胞
いくつかの態様では、本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、肝細胞である。肝細胞は、肝臓の主要な実質組織の細胞である。肝細胞は、肝臓の質量の７０〜８５％を占める。これらの細胞は、タンパク質合成、タンパク質貯蔵、炭水化物の変換、コレステロール、胆汁塩、およびリン脂質の合成、外因性および内因性物質の解毒、修飾、および排泄、ならびに胆汁の形成および分泌の開始に関与している。
【０２７３】
患者特異的ｉＰＳＣの作成
本開示のエクスビボ方法の１つのステップは、１つの患者特異的ｉＰＳ細胞、複数の患者特異的ｉＰＳ細胞、または患者特異的ｉＰＳ細胞株を作成することを含み得る。Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ  ２００６、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７に記載されているように、患者特異的ｉＰＳ細胞を作成するための多くの確立された方法が、当該技術分野において存在する。例えば、作成ステップは、ａ）患者から皮膚細胞または線維芽細胞などの体細胞を単離することと、ｂ）細胞を多能性幹細胞に誘導するために、多能性関連遺伝子のセットを体細胞に導入することと、を含み得る。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ−ＭＹＣ、ｎ−ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択される１つ以上の遺伝子であり得る。
【０２７４】
患者の肝臓または骨髄の生検または穿刺の実施
生検または穿刺液は、身体から採取した組織または体液の試料である。多くの異なる種類の生検または穿刺液が存在する。それらのほとんどすべては、鋭いツールを使用して少量の組織を除去することを伴う。生検が皮膚または他の敏感な領域にある場合、麻痺薬を最初に適用することができる。生検または穿刺は、当該技術分野で既知の方法のうちのいずれかに従って実施され得る。例えば、生検では、腹部の皮膚から肝臓に針を刺し込み、肝組織を捕捉する。例えば、骨髄穿刺では、大きな針を使用して骨盤骨に入り、骨髄を採取する。
【０２７５】
肝臓特異的前駆細胞または初代肝細胞の単離
肝臓特異的前駆細胞および初代肝細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って単離され得る。例えば、ヒト肝細胞は、新鮮な手術標本から単離される。健康な肝組織は、コラゲナーゼ消化により肝細胞を単離するために使用される。得られた細胞懸濁液を、１００ｍｍナイロンメッシュで濾過し、５０ｇで５分間遠心分離して沈殿させ、再懸濁し、冷洗浄液で２〜３回洗浄する。ヒト肝幹細胞は、新鮮な肝標本から得られた肝細胞の厳しい条件下で培養することにより得られる。コラーゲンでコーティングしたプレートに播種された肝細胞を２週間培養する。２週間後、生き残った細胞を取り除き、幹細胞マーカーの発現を特徴付ける（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ２００６；２４：２８４０−２８５０）。
【０２７６】
間葉系幹細胞の単離
間葉系幹細胞は、患者の骨髄または末梢血などから、当該技術分野で知られている任意の方法に従って単離することができる。例えば、骨髄穿刺液は、ヘパリンを含む注射器に集めることができる。細胞を洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌで遠心分離することができる。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）で培養することができる（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ  ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ  ＡＭ，Ｂｅｃｋ  ＳＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８４：１４３−１４７）。
【０２７７】
遺伝子組換え細胞
「遺伝子組換え細胞」という用語は、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を使用）により導入された少なくとも１つの遺伝子組換えを含む細胞を指す。本明細書のいくつかのエクスビボの例では、遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換え前駆細胞であり得る。本明細書のいくつかのインビボの例では、遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換え肝細胞であり得る。外因性ゲノム標的化核酸および／またはゲノム標的化核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子組換え細胞が、本明細書で企図される。
【０２７８】
「対照処理された集団」という用語は、ゲノム編集構成要素の付加を除き、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、培養密度、フラスコサイズ、ｐＨなどで処理された細胞の集団を説明する。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはタンパク質の発現または活性の転写を測定するか（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のウエスタンブロット分析）、またはＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡを定量化することができる。
【０２７９】
「単離された細胞」という用語は、最初に発見された生物から除去された細胞、またはそのような細胞の子孫を指す。任意に、細胞は、例えば、定義された条件下または他の細胞の存在下で、インビトロで培養することができる。任意に、細胞は、後で第２の生物に導入されるか、またはそれ（またはそれが由来する細胞）が単離された生物に再導入され得る。
【０２８０】
単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、混合または不均一な細胞集団から除去および分離された細胞集団を指す。場合によっては、単離された集団は、細胞が単離または濃縮された異種集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団であり得る。場合によっては、単離された集団は、ヒト前駆細胞およびヒト前駆細胞が由来する細胞を含む細胞の異種集団と比較して、ヒト前駆細胞の単離された集団、例えば、ヒト前駆細胞の実質的に純粋な集団であり得る。
【０２８１】
特定の細胞集団に関して「実質的に強化された」という用語は、例えば、脂質異常症を改善するためのそのような細胞の所望のレベルに応じて、特定の細胞型の発生が既存または参照レベルに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍以上増加する細胞集団を指す。
【０２８２】
特定の細胞集団に関して「実質的に濃縮された」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％以上である細胞の集団を指す。
【０２８３】
特定の細胞集団に関して「実質的に濃縮された」または「実質的に純粋な」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。すなわち、前駆細胞の集団に関して「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書における用語で定義される前駆細胞ではない細胞の約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満を含有する細胞の集団を指す。
【０２８４】
ゲノム編集されたｉＰＳＣの他の細胞型への分化
本開示のエクスビボ方法の別のステップは、ゲノム編集されたｉＰＳＣを肝細胞に分化させることを含み得る。分化ステップは、当該技術分野で知られている任意の方法に従って実行することができる。例えば、ｈｉＰＳＣは、アクチビンおよびＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む様々な治療を使用して、胚体内胚葉に分化する。胚体内胚葉は、さらに肝細胞に分化し、治療には、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ，Ｄｅｘａｍｅｔａｓｏｎなど（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ，ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ；２０１０；２８：６７４−６８６，Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ  ２０１３；２：４０９−４１９）が含まれる。
【０２８５】
ゲノム編集された間葉系幹細胞の肝細胞への分化
本開示のエクスビボ方法の別のステップは、ゲノム編集された間葉系幹細胞を肝細胞に分化させることを含み得る。分化ステップは、当該技術分野で知られている任意の方法に従って実行することができる。例えば、ｈＭＳＣは、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、胆汁酸を含む様々な因子およびホルモンで治療される（Ｓａｗｉｔｚａ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５；５：１３３２０）。
【０２８６】
患者への細胞の移植
本開示のエクスビボ方法の別のステップは、肝細胞を患者に移植することを含み得る。この移植ステップは、当該技術分野で知られている任意の移植方法を使用して達成することができる。例えば、遺伝子組換え細胞は、患者の血液に直接注入することができるか、または他の方法で患者に投与されてもよい。
【０２８７】
本開示のエクスビボ方法の別のステップは、前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植することを含む。この移植ステップは、当該技術分野で知られている任意の移植方法を使用して達成することができる。例えば、遺伝子組換え細胞は、患者の肝臓に直接注入することができるか、または他の方法で患者に投与されてもよい。
【０２８８】
ＩＩＩ．製剤および送達
薬学的に許容される担体
本明細書で企図される対象に前駆細胞を投与するエクスビボの方法は、前駆細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
【０２８９】
治療用組成物は、細胞組成物とともに生理学的に許容される担体、および任意に活性成分として内部に溶解または分散した本明細書に記載の少なくとも１つの追加の生物活性剤を含むことができる。場合によっては、治療用組成物は、望まない限り、治療目的で哺乳動物またはヒトの患者に投与される場合、実質的に免疫原性ではない。
【０２９０】
一般に、本明細書に記載の前駆細胞は、薬学的に許容される担体を含む懸濁液として投与され得る。当業者は、細胞組成物に使用される薬学的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存率を実質的に干渉する量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、防腐剤、または他の薬剤を含まないことを認識するであろう。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持することを可能にする浸透圧緩衝液、および任意に、投与時に細胞生存率を維持するか、または生着を増強する栄養素を含むことができる。そのような製剤および懸濁液は、当業者に既知であり、かつ／または日常的な実験を使用して、本明細書に記載されるように前駆細胞との使用に適合させることができる。
【０２９１】
乳化手順が細胞の生存率に悪影響を与えない限り、細胞組成物を乳化またはリポソーム組成物として提示することもできる。細胞および任意の他の活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に記載の治療方法での使用に適した量で混合することができる。
【０２９２】
細胞組成物に含まれる追加の薬剤は、その中に成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０２９３】
生理学的に許容される担体は、当該技術分野で周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水に加えて材料を含まないか、または生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、もしくはリン酸緩衝食塩水などの両方を含む滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、複数の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質などの塩を含むことができる。液体組成物はまた、水に加えて、および水の排除に加えて、液相を含むことができる。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水油エマルジョンである。特定の障害または状態の治療に有効な細胞組成物で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性質に依存する可能性があり、標準的な臨床技法によって決定され得る。
【０２９４】
ガイドＲＮＡ製剤
本開示のガイドＲＮＡは、特定の投与様式および剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、製剤および投与経路に応じて、生理学的に適合するｐＨを達成するように製剤化することができ、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１、約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲であり得る。場合によっては、ｐＨを約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調整することができる。場合によっては、組成物は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに含むことができる。任意に、組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含むことができるか、または細菌増殖の治療または予防に有用な第２の活性成分を含むことができるか（例えば、限定されないが、抗細菌剤または抗菌剤）、または本開示の試薬の組み合わせを含むことができる。
【０２９５】
適切な賦形剤には、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子などの、大きくゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子が含まれる。他の例示的な賦形剤には、抗酸化剤（例えば、限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、限定されないが、油、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが含まれ得る。
【０２９６】
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当該技術分野で既知のウイルスまたは非ウイルス送達媒体によって送達され得る。あるいは、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）は、電気穿孔または脂質ナノ粒子など、当該技術分野で知られているウイルスまたは非ウイルス送達媒体によって送達することができる。さらなる代替態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で、または１つ以上のガイドＲＮＡと、または１つ以上のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを事前に複合してのいずれかで送達され得る。
【０２９７】
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正荷電ペプチド、低分子ＲＮＡ共役体、アプタマーＲＮＡキメラ、ＲＮＡ融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達媒体によって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７−１１３３（２０１１）（他のポリヌクレオチドの送達にも有用なｓｉＲＮＡの非ウイルス性送達ビヒクルに焦点を当てている）に記載されている。
【０２９８】
本開示のポリヌクレオチドについて、製剤は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号に教示されているもののうちのいずれかから選択することができる。
【０２９９】
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞または患者に送達され得る。
【０３００】
ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子は、サイズが１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍの範囲であってもよい。
【０３０１】
ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、または中性脂質から作製され得る。融合性リン脂質ＤＯＰＥまたは膜成分コレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性とナノ粒子の安定性を高めるための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含まれる場合がある。カチオン性脂質の限界には、安定性が低く、クリアランスが速いことによる有効性の低下、ならびに炎症反応または抗炎症反応の生成が含まれる。
【０３０２】
ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質と親水性脂質の両方で構成されてもよい。
【０３０３】
当該技術分野で知られている任意の脂質または脂質の組み合わせを使用して、ＬＮＰを産生することができる。ＬＮＰを産生するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。
【０３０４】
脂質を任意のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを産生することができる。さらに、ポリヌクレオチド（複数可）を脂質（複数可）と広範囲のモル比で組み合わせてＬＮＰを産生することができる。
【０３０５】
前述のように、部位特異的ポリペプチドおよびゲノム標的化核酸はそれぞれ、細胞または患者に別々に投与することができる。一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合することができる。次いで、事前に複合された材料を、細胞または患者に投与することができる。このような事前に複合された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
【０３０６】
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡと特定の相互作用を形成することができる。この特性は、多くの生物学的プロセスで活用されているが、核酸が豊富な細胞環境での無差別な相互作用のリスクも伴う。この問題に対する１つの解決策は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成であり、この場合、ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼと事前に複合される。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡの分解からの保護である。
【０３０７】
ＲＮＰのエンドヌクレアーゼは、修飾または未修飾であり得る。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾または未修飾であり得る。当該技術分野では、多くの修飾が知られており、使用することができる。
【０３０８】
エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡは、一般に１：１のモル比で組み合わせることができる。あるいは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、一般に１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかしながら、広範囲のモル比を使用して、ＲＮＰを産生することができる。
【０３０９】
ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）
組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達に使用することができる。送達されるポリヌクレオチドを含む、パッケージ化されるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、またｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよく、本明細書に記載のＡＡＶ血清型を含むが、それらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。
【０３１０】
ＡＡＶ血清型
本開示の組成物をコードするポリヌクレオチド、例えば、本開示のエンドヌクレアーゼ、ドナー配列、またはＲＮＡガイド分子をパッケージングするＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含むか、またはそれに由来し得る。本開示によれば、ＡＡＶ粒子は、以下の血清型のうちのいずれかから選択される血清型、およびその異形を利用するか、またはそれに基づいてもよく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／Ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／Ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／Ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／Ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／Ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／Ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／Ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／Ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／Ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／Ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／Ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／Ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／Ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／Ｈｕ．６１、ＡＡＶ１−７／ＲＨ．４８、ＡＡＶ１−８／ＲＨ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２−１５／ＲＨ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２−３／ＲＨ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２−４／ＲＨ．５０、ＡＡＶ２−５／ＲＨ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ−２−ｐＲＥ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／Ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／Ｈｕ．９、ＡＡＶ３−１１／ＲＨ．５３、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ３３．１２／Ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／Ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／Ｈｕ．１６、ＡＡＶ３−９／ＲＨ．５２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−１９／ＲＨ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３Ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５Ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−ＡＡ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／Ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／Ｈｕ．２９、ＡＡＶ４−８／Ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−８／ＲＨ．６４、ＡＡＶ４−９／ＲＨ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／Ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／Ｈｕ．１９、ＡＡＶ５−２２／ＲＨ．５８、ＡＡＶ５−３／ＲＨ．５７、ＡＡＶ５４．１／Ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／Ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／Ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／Ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／Ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／Ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／Ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−８Ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣＨ．５、ＡＡＶＣＨ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．２、ＡＡＶＣｙ．３、ＡＡＶＣｙ．４、ＡＡＶＣｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶＣｙ．６、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ−Ｈ、ＡＡＶＨ−１／Ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ−５／Ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＨＥ１．１、ＡＡＶＨＥＲ１．１４、ＡＡＶＨＥＲ１．１６、ＡＡＶＨＥＲ１．１８、ＡＡＶＨＥＲ１．２３、ＡＡＶＨＥＲ１．３５、ＡＡＶＨＥＲ１．３６、ＡＡＶＨＥＲ１．５、ＡＡＶＨＥＲ１．７、ＡＡＶＨＥＲ１．８、ＡＡＶＨＥＲ２．１６、ＡＡＶＨＥＲ２．２９、ＡＡＶＨＥＲ２．３０、ＡＡＶＨＥＲ２．３１、ＡＡＶＨＥＲ２．３６、ＡＡＶＨＥＲ２．４、ＡＡＶＨＥＲ３．１、ＡＡＶＨｕ．１、ＡＡＶＨｕ．１０、ＡＡＶＨｕ．１１、ＡＡＶＨｕ．１１、ＡＡＶＨｕ．１２、ＡＡＶＨｕ．１３、ＡＡＶＨｕ．１４／９、ＡＡＶＨｕ．１５、ＡＡＶＨｕ．１６、ＡＡＶＨｕ．１７、ＡＡＶＨｕ．１８、ＡＡＶＨｕ．１９、ＡＡＶＨｕ．２、ＡＡＶＨｕ．２０、ＡＡＶＨｕ．２１、ＡＡＶＨｕ．２２、ＡＡＶＨｕ．２３．２、ＡＡＶＨｕ．２４、ＡＡＶＨｕ．２５、ＡＡＶＨｕ．２７、ＡＡＶＨｕ．２８、ＡＡＶＨｕ．２９、ＡＡＶＨｕ．２９Ｒ、ＡＡＶＨｕ．３、ＡＡＶＨｕ．３１、ＡＡＶＨｕ．３２、ＡＡＶＨｕ．３４、ＡＡＶＨｕ．３５、ＡＡＶＨｕ．３７、ＡＡＶＨｕ．３９、ＡＡＶＨｕ．４、ＡＡＶＨｕ．４０、ＡＡＶＨｕ．４１、ＡＡＶＨｕ．４２、ＡＡＶＨｕ．４３、ＡＡＶＨｕ．４４、ＡＡＶＨｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶＨｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶＨｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶＨｕ．４５、ＡＡＶＨｕ．４６、ＡＡＶＨｕ．４７、ＡＡＶＨｕ．４８、ＡＡＶＨｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶＨｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶＨｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶＨｕ．４９、ＡＡＶＨｕ．５、ＡＡＶＨｕ．５１、ＡＡＶＨｕ．５２、ＡＡＶＨｕ．５３、ＡＡＶＨｕ．５４、ＡＡＶＨｕ．５５、ＡＡＶＨｕ．５６、ＡＡＶＨｕ．５７、ＡＡＶＨｕ．５８、ＡＡＶＨｕ．６、ＡＡＶＨｕ．６０、ＡＡＶＨｕ．６１、ＡＡＶＨｕ．６３、ＡＡＶＨｕ．６４、ＡＡＶＨｕ．６６、ＡＡＶＨｕ．６７、ＡＡＶＨｕ．７、ＡＡＶＨｕ．８、ＡＡＶＨｕ．９、ＡＡＶＨｕ．ｔ  １９、ＡＡＶＬＧ−１０／ＲＨ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ＲＨ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／Ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ−９／Ｈｕ．３９、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１−８／ＲＨ．４３、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．���、ＡＡＶＲＨ．１０、ＡＡＶＲＨ．１２、ＡＡＶＲＨ．１３、ＡＡＶＲＨ．１３Ｒ、ＡＡＶＲＨ．１４、ＡＡＶＲＨ．１７、ＡＡＶＲＨ．１８、ＡＡＶＲＨ．１９、ＡＡＶＲＨ．２、ＡＡＶＲＨ．２０、ＡＡＶＲＨ．２１、ＡＡＶＲＨ．２２、ＡＡＶＲＨ．２３、ＡＡＶＲＨ．２４、ＡＡＶＲＨ．２５、ＡＡＶＲＨ．２Ｒ、ＡＡＶＲＨ．３１、ＡＡＶＲＨ．３２、ＡＡＶＲＨ．３３、ＡＡＶＲＨ．３４、ＡＡＶＲＨ．３５、ＡＡＶＲＨ．３６、ＡＡＶＲＨ．３７、ＡＡＶＲＨ．３７Ｒ２、ＡＡＶＲＨ．３８、ＡＡＶＲＨ．３９、ＡＡＶＲＨ．４０、ＡＡＶＲＨ．４３、ＡＡＶＲＨ．４４、ＡＡＶＲＨ．４５、ＡＡＶＲＨ．４６、ＡＡＶＲＨ．４７、ＡＡＶＲＨ．４８、ＡＡＶＲＨ．４８、ＡＡＶＲＨ．４８．１、ＡＡＶＲＨ．４８．１．２、ＡＡＶＲＨ．４８．２、ＡＡＶＲＨ．４９、ＡＡＶＲＨ．５０、ＡＡＶＲＨ．５１、ＡＡＶＲＨ．５２、ＡＡＶＲＨ．５３、ＡＡＶＲＨ．５４、ＡＡＶＲＨ．５５、ＡＡＶＲＨ．５６、ＡＡＶＲＨ．５７、ＡＡＶＲＨ．５８、ＡＡＶＲＨ．５９、ＡＡＶＲＨ．６０、ＡＡＶＲＨ．６１、ＡＡＶＲＨ．６２、ＡＡＶＲＨ．６４、ＡＡＶＲＨ．６４Ｒ１、ＡＡＶＲＨ．６４Ｒ２、ＡＡＶＲＨ．６５、ＡＡＶＲＨ．６７、ＡＡＶＲＨ．６８、ＡＡＶＲＨ．６９、ＡＡＶＲＨ．７０、ＡＡＶＲＨ．７２、ＡＡＶＲＨ．７３、ＡＡＶＲＨ．７４、ＡＡＶＲＨ．８、ＡＡＶＲＨ．８Ｒ、ＡＡＶＲＨ８Ｒ、ＡＡＶＲＨ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶＲＨ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、日本人ＡＡＶ  １０、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ  １０、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−１、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−２、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−３、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−７、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １０−２、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １０−６、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １０−８、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−１０、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−３、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−１、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−２、および／またはＡＡＶ  ＳＭ  １０−８が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１１】
いくつかの態様では、ＡＡＶ血清型は、限定されないが、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４などの、Ｎ  Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（６）：１０７０−１０７８（２０１１））によって記載されるＡＡＶ９配列の突然変異であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１２】
いくつかの態様では、ＡＡＶ血清型は、限定されないが、ＡＡＶ３Ｂ（ＵＳ６１５６３０３の配列番号１および１０）、ＡＡＶ６（ＵＳ６１５６３０３の配列番号２、７、および１１）、ＡＡＶ２（ＵＳ６１５６３０３の配列番号３および８）、ＡＡＶ３Ａ（ＵＳ６１５６３０３の配列番号４および９）などの米国特許第６１５６３０３号に記載される配列、またはその誘導体であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１３】
いくつかの態様では、血清型は、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２（１２）：５８８７−５９１１（２００８）によって記載されているように、ＡＡＶＤＪまたはＡＡＶＤＪ８（もしくはＡＡＶ−ＤＪ８）などのその異形であってもよい。ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために２つ以上の突然変異を含む場合がある。非限定的な例として、米国特許第７，５８８，７７２号に配列番号１として記載されているＡＡＶ−ＤＪ配列には、２つの突然変異（１）Ｒ５８７Ｑ（アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）に変更される）および（２）Ｒ５９０Ｔ（アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）に変更される）が含まれ得る。別の非限定的な例として、３つの突然変異（１）Ｋ４０６Ｒ（アミノ酸４０６におけるリジン（Ｋ、Ｌｙｓ）が、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）に変更される）、（２）Ｒ５８７Ｑ（アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）に変更される）、および（３）Ｒ５９０Ｔ（アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）に変更される）を含み得る。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、限定されないが、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５／１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ  ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５／１２１５０１の配列番号８）、「日本人ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５／１２１５０１の配列番号９）などの、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１２１５０１号に記載されているような配列、またはその異形であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１５】
本開示によれば、ＡＡＶカプシド血清型の選択または使用は、様々な種に由来し得る。一実施例では、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であり得る。ＡＡＡＶ血清型は、限定されないが、ＡＡＡＶ（ＵＳ９，２３８，８００の配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、および１４）などの、米国特許第９２３８８００号に記載されているような配列、またはその異形であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１６】
一実施例では、ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であり得る。ＢＡＡＶ血清型は、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ９１９３７６９の配列番号１および６）などの、米国特許第９，１９３，７６９号に記載されているような配列、またはその異形であり得るか、またはそれを有し得る。ＢＡＡＶ血清型は、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号５および６）などの、米国特許第７４２７３９６号に記載されるような配列、またはその異形であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１７】
一実施例では、ＡＡＶは、ヤギＡＡＶであり得る。ヤギＡＡＶ血清型は、限定されないが、ヤギＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号３）などの、米国特許第７４２７３９６号に記載されているような配列、またはその異形であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１８】
他の例では、ＡＡＶは、２つ以上の親血清型からのハイブリッドＡＡＶとして操作されてもよい。一実施例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９からの配列を含むＡＡＶ２Ｇ９であり得る。ＡＡＶ２Ｇ９  ＡＡＶ血清型は、米国特許公開第ＵＳ２０１６／００１７００５号に記載されているような配列であり得るか、またはそれを有し得る。
【０３１９】
一実施例では、ＡＡＶは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（６）：１０７０−１０７８（２０１１）に記載されているように、アミノ酸３９０〜６２７（ＶＰ１番号付け）に突然変異を有するＡＡＶ９カプシドライブラリーによって生成された血清型であり得る。血清型および対応するヌクレオチドアミノ酸およびアミノ酸置換基は、限定されないが、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ、Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８ＡおよびＴ１４３６Ｘ、Ｖ４７３ＤおよびＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ、Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０ＣおよびＡ１６１７Ｔ、Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ、Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ；Ｇ４���１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）、およびＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であり得る。
【０３２０】
一実施例では、ＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む血清型であり得る。非限定的な例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ８であり得る。
【０３２１】
一実施例では、ＡＡＶは、Ｄｅｖｅｒｍａｎ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３４（２）：２０４−２０９に記載されるようなＰＨＰ．ＡまたはＰＨＰ．Ｂなどの異形であり得る。
【０３２２】
一実施例では、ＡＡＶは、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に見られるもののうちのいずれかから選択される血清型であり得る。
【０３２３】
一実施例では、ＡＡＶは、配列番号４，７３４〜５，３０２に記載されるような配列、断片、または異形によってコードされ得る。
【０３２４】
ｒＡＡＶ産生の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）においてレビューされている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４−１２５０、Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４−１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
【０３２５】
ＡＡＶベクターの血清型は、標的細胞型に適合させることができる。例えば、以下の例示的な細胞型は、中でも示されたＡＡＶ血清型によって形質導入され得る。
【表２】
2020508056.tif 000003
【０３２６】
アデノ関連ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターには、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２７】
いくつかの態様では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の１つまたは２つの遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡは、それぞれ別々に脂質ナノ粒子に製剤化され得るか、またはすべて１つの脂質ナノ粒子に共製剤化される。
【０３２８】
いくつかの態様では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化することができ、ｓｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターで送達され得る。
【０３２９】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達するオプションが利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現され得るか、またはＲＮＡとして送達することもできる。ＲＮＡを化学的に修飾して、その半減期を改変もしくは改善し得るか、または免疫応答の可能性もしくは程度を低減することができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達前にｇＲＮＡと複合することができる。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９の分割バージョンおよびＣａｓ９の小さなオーソログは、ＨＤＲのドナーと同様にＡＡＶにパッケージ化され得る。これらの各成分を送達できる一連の非ウイルス性送達方法も存在するか、または非ウイルス性およびウイルス性の方法を組み合わせて用いることもできる。例えば、ナノ粒子を使用してタンパク質とガイドＲＮＡを送達することができる一方で、ＡＡＶを使用してドナーＤＮＡを送達することができる。
【０３３０】
ＩＶ．服用量および投与
「投与する」、「導入する」、および「移植する」という用語は、所望の効果（複数可）がもたらされるように、損傷または修復部位などの所望の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、前駆細胞の対象への配置の文脈で互換的に使用される。細胞、例えば、前駆細胞、またはそれらの分化した子孫は、移植された細胞または細胞の成分の少なくとも一部が生存している対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間の短期間、例えば、２４時間、数日、数年もの長期間、またはさらには患者の寿命であり得る。例えば、本明細書に記載のいくつかの態様では、有効量の肝前駆細胞は、腹腔内または静脈内経路などの全身投与経路を介して投与される。
【０３３１】
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または治療法が望まれる任意の対象を指す。いくつかの態様では、対象は哺乳動物である。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【０３３２】
予防的に提供される場合、本明細書に記載の前駆細胞は、脂質異常症の任意の症状の前に対象に投与することができる。したがって、前駆細胞集団の予防的投与は、脂質異常症の予防に役立つ。
【０３３３】
本明細書に記載の方法に従って投与される前駆細胞集団は、１人以上のドナーから得られた同種前駆細胞を含むことができる。そのような前駆細胞は、任意の細胞または組織起源、例えば、肝臓、筋肉、心臓などのものであり得る。「同種」とは、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一ではない、同じ種の１人以上のドナーから得られた前駆体を含む、前駆細胞または生体試料を指す。例えば、対象に投与される肝前駆細胞集団は、１人以上の無関係のドナー対象、または１人以上の同一でない兄弟姉妹に由来し得る。場合によっては、遺伝的に同一の動物または一卵性双生児から得られたものなど、同系前駆細胞集団を使用することができる。前駆細胞は、自己細胞であり得る。すなわち、前駆細胞は、対象から取得または単離され、同じ対象に投与される。すなわち、ドナーとレシピエントは同じである。
【０３３４】
「有効量」という用語は、異脂肪血症の少なくとも１つ以上の兆候または症状を予防または緩和するために必要な前駆細胞集団またはその子孫の量を指し、所望の効果を提供する、例えば、異脂肪血症を有する対象を治療するのに十分な量の組成物に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、脂質異常症を患っているか、またはリスクのある典型的な対象に投与したときに特定の効果を促進するのに十分な前駆細胞または前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量には、疾患の症状の発症を予防または遅延させ、疾患の症状の経過を変更する（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）のに十分な量も含まれるか、または疾患の症状を反転させる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、通常の実験を使用して当業者によって決定され得ることが理解される。
【０３３５】
本明細書に記載の様々な態様で使用するために、有効量の前駆細胞は、少なくとも１０２前駆細胞、少なくとも５  ×１０２前駆細胞、少なくとも１０３前駆細胞、少なくとも５×１０３前駆細胞、少なくとも１０４前駆細胞、少なくとも５×１０４前駆細胞、少なくとも１０５前駆細胞、少なくとも２×１０５前駆細胞、少なくとも３×１０５前駆細胞、少なくとも４×１０５前駆細胞、少なくとも５×１０５前駆細胞、少なくとも６×１０５前駆細胞、少なくとも７×１０５前駆細胞、少なくとも８×１０５前駆細胞、少なくとも９×１０５前駆細胞、少なくとも１×１０６前駆細胞、少なくとも２×１０６前駆細胞、少なくとも３×１０６前駆細胞、少なくとも４×１０６前駆細胞、少なくとも５×１０６前駆細胞、少なくとも６×１０６前駆細胞、少なくとも７×１０６前駆細胞、少なくとも８×１０６前駆細胞、少なくとも９×１０６前駆細胞、またはその倍数を含む。前駆細胞は、１人以上のドナーに由来し得るか、または自己起源から得ることができる。本明細書に記載のいくつかの実施例では、前駆細胞は、それを必要とする対象への投与の前に培養で増殖させることができる。
【０３３６】
ＡＮＧＰＴＬ３関連障害を有する患者の細胞で発現されるＡＮＧＰＴＬ３のレベルのわずかで漸進的な減少は、疾患の１つ以上の症状の改善、長期生存の増加、および／または他の治療に関連する副作用の軽減に有益であり得る。そのような細胞をヒト患者に投与すると、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルを低下させる前駆細胞の存在は有益である。場合によっては、対象の効果的な治療により、治療対象の全ＡＮＧＰＴＬ３と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３レベルが少なくとも約３％、５％、または７％低下する。いくつかの実施例では、ＡＮＧＰＴＬ３の低減は、ＡＮＧＰＴＬ３全体の少なくとも約１０％になる。いくつかの実施例では、ＡＮＧＰＴＬ３の低減は、ＡＮＧＰＴＬ３全体の少なくとも約２０％〜３０％になる。同様に、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルが大幅に低減した細胞の比較的限られた亜集団の導入は、状況によっては正常化された細胞が罹患細胞と比較して選択的な利点があるため、様々な患者にとって有益であり得る。しかしながら、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルが低減した前駆細胞の適度なレベルでさえ、患者の脂質異常症の１つ以上の態様を改善するために有益であり得る。いくつかの実施例では、肝前駆細胞が投与される患者におけるそのような細胞の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上は、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルを低下させている。
【０３３７】
「投与される」とは、所望の部位での細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象への前駆細胞組成物の送達を指す。細胞組成物は、対象における効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、すなわち、投与は、対象の所望の位置への送達をもたらし、送達される組成物の少なくとも一部、すなわち少なくとも１×１０４細胞が、一定期間にわたって所望の位置に送達される。
【０３３８】
本方法の一態様では、薬学的組成物は、限定されないが、経腸（腸内）、胃腸内、硬膜外（硬膜内）、経口（口経由）、経皮、硬膜周囲、脳内（大脳内）、脳室内（大脳室内）、皮膚上（皮膚への適用）、皮内、（皮膚自体へ）、皮下（皮膚下）、鼻腔内投与（鼻から）、静脈内（静脈中）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈中）、筋肉内（筋肉中）、心臓内（心臓中）、骨内注入（骨髄中）、髄腔内（脊柱管中）、腹腔内（腹腔中への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、海綿体内注射（病的腔中）、腔内（陰茎の基部中）、膣内投与、子宮内、羊膜外イオティック投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、通気（鼻息）、舌下、唇下、浣腸、点眼薬（結膜上）、点耳、耳介（耳内または耳経由）、頬（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯科（１つまたは複数の歯）、電気浸透、子宮頸部内、内腔、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹部内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内）、尾内（馬尾内）、大槽内（大槽大槽内）、角膜内（角膜内）、歯科角膜内（ｄｅｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｃｏｒｎａｌ）、冠動脈内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎海綿体の拡張可能な空間内）、椎間板内（椎間板内）、管内（腺の管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内または硬膜下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（小腸の遠位部内）、病変内（局所病変内または局所病変に直接導入）、管腔内（チューブの内腔内）、リンパ管内（リンパ内）、髄内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、心筋内（心筋内）、眼内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺またはその気管支内）、鼻腔内（鼻腔または眼窩周囲洞内）、脊髄内（脊柱内）、滑液嚢内（関節の滑膜腔内）、腱内（腱内）、精巣内（睾丸内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液内）、胸腔内（胸郭内）、管内（器官の尿細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳内）、血管内（１つまたは複数の血管内）、心室内（心室内）、イオン導入（可溶性塩のイオンが体の組織に移動する電流による）、灌注（開放創または体腔を浸すかまたは洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻から胃へ）、閉塞性包帯法（局所的経路投与は、その後、領域を閉塞する包帯剤で覆われる）、眼科（外眼へ）、口腔咽頭（口と咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身効果のために経口または鼻から吸入することにより気道内）、球後（脳橋の後ろまたは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通過または通過）、気管（気管壁を通過）、経鼓膜（鼓膜全体または鼓膜腔を介して）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、尾ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスおよび脊髄などの経路を介して投与され得る。
【０３３９】
投与方法には、注射、注入、点滴、および／または摂取が含まれる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、経路は静脈内である。細胞の送達のために、注射または注入による投与を行うことができる。
【０３４０】
細胞は、全身投与することができる。「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」、および「末梢投与される」という語句は、標的部位、組織、または器官への直接以外の前駆細胞集団の投与を指し、代わりにそれが入る、対象の循環系であり、したがって代謝および他の同様のプロセスの影響を受ける。
【０３４１】
脂質異常症の治療のための組成物を含む治療の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、ＡＮＧＰＴＬ３のレベルのうちの１つまたはすべての兆候または症状が有益な方法で変更された（例えば、少なくとも１０％減少した）場合、または他の臨床的に認められた症状または疾患のマーカーが改善または改良される場合、治療は「効果的な治療」と見なされる。有効性はまた、入院または医学的介入の必要性（例えば、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）によって評価されるように、個人が悪化しないことによって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／または本明細書に記載されている。治療には、個体または動物の疾患の任意の治療（いくつかの非限定的な例にはヒトまたは哺乳動物が含まれる）が含まれ、（１）疾患を抑制すること、例えば、症状の進行を停止もしくは遅延させること、または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすこと、および（３）症状の発生の可能性を防止または低減することを含む。
【０３４２】
本開示による治療は、個体におけるＡＮＧＰＴＬ３の量を減少または変更することにより、脂質異常症に関連する１つ以上の症状を改善することができる。
【０３４３】
Ｖ．アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の特徴および性質
ＡＮＧＰＴＬ３は、限定されないが、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、心血管疾患、冠状動脈性心疾患、糖尿病、糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、脂肪肝、高インスリン症、高脂血症、高トリグリセリド血症、低ベータリポタンパク質血症、炎症、インスリン抵抗性、代謝性疾患、肥満、口の悪性新生物、脂質代謝障害、口唇および口腔癌、脂質異常症、メタボリックシンドロームＸ、低トリグリセリド血症、オピッツ三角頭蓋症候群、虚血性脳卒中、高トリグリセリド血症、低ベータリポタンパク質血症（家族性２）、家族性低ベータリポタンパク質血症、および虚血性脳血管障害などの疾患および障害に関連している。本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用してＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集することは、本明細書に記載の疾患および障害の症状を治療、予防、および／または緩和するために使用することができる。
【０３４４】
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、ヒトの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルの決定要因である、アンジオポエチン様３タンパク質をコードする。血漿トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールと正の相関がある。ＡＮＧＰＴＬ３の活性は、主に肝臓で発現している。ＡＮＧＰＴＬ３は、脂質異常症に関連している。脂質異常症は、動脈血栓（アテローム性動脈硬化症）の発生に寄与する、血中の脂質レベルの上昇を特徴とする遺伝性疾患である。これらの脂質には、血漿コレステロール、トリグリセリド、または高密度リポタンパク質が含まれる。脂質異常症は、心臓発作、脳卒中、または他の循環の懸念のリスクを高める。現在の管理には、運動や食事の修正などのライフスタイルの変更、およびスタチンなどの脂質低下薬の使用が含まれる。非スタチン脂質低下薬には、胆汁酸封鎖剤、コレステロール吸収阻害剤、ホモ接合型家族性高コレステロール血症薬、フィブラート系薬剤、ニコチン酸、オメガ−３脂肪酸、および／または併用製品が含まれる。治療オプションは通常、特定の脂質異常に依存するが、異なる脂質異常がしばしば共存する。食事の変更を実施するのが難しく、脂質低下療法の効果が証明されていないため、子供の治療はより困難である。
【０３４５】
ＡＮＧＰＴＬ３はまた、低ベータリポタンパク質血症を引き起こすことが知られている。低ベータリポタンパク質血症は、世界中で１０００人に１人〜３０００人に１人の割合で発症する遺伝性疾患（常染色体劣性）である。低ベータリポタンパク質血症の一般的な症状には、５パーセンタイル以下のＬＤＬコレステロールまたはアポリポタンパク質Ｂの血漿濃度が含まれ、身体が脂肪を吸収および輸送する能力を損ない、網膜変性、神経障害、凝固障害、または脂肪肝と呼ばれる肝臓の異常な脂肪蓄積につながり得る。重篤な患者では、脂肪肝は慢性肝疾患（肝硬変）に進行する場合がある。低ベータリポタンパク質血症の現在の治療には、脂肪吸収を改善するために長鎖脂肪酸を１日あたり１５グラムに厳しく制限することが含まれる。低ベータリポタンパク質血症の乳児では、中鎖トリグリセリドの短時間の補充が効果的であり得るが、肝臓毒性を避けるために量を厳密に監視しなければならない。低ベータリポタンパク質血症を治療する別の選択肢は、神経学的合併症を防ぐために高用量のビタミンＥを投与することである。あるいは、プロトロンビン時間の上昇がビタミンＫの枯渇を示唆している場合、ビタミンＡ（１０，０００〜２５，０００ＩＵ／日）の補充が効果的であり得る。
【０３４６】
一実施例では、本明細書に記載の組成物および方法の標的組織は、肝組織である。
【０３４７】
一実施例では、遺伝子は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）であり、アンジオポエチン５、ＡＮＧＰＴ５、ＡＮＧ−５、アンジオポエチン様タンパク質３、アンジオポエチン−５、ＦＨＢＬ２、およびＡＮＬ３と呼ばれる場合もある。ＡＮＧＰＴＬ３の細胞遺伝学的位置は、１ｐ３１．３であり、ゲノム座標は、位置６２，５９７，４８７〜６２，６０６，１５９のフォワード鎖の染色体１上にある。ＡＮＧＰＴＬ３のヌクレオチド配列は、配列番号５３０３として示されている。ＵＳＰ１は、フォワード鎖上のＡＮＧＰＴＬ３の上流の遺伝子であり、ＡＴＧ４Ｃは、フォワード鎖上のＡＮＧＰＴＬ３の下流の遺伝子である。ＤＯＣＫ７は、ＡＮＧＰＴＬ３の反対側の逆鎖に位置する遺伝子である。ＡＮＧＰＴＬ３のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤは２７３２９、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤはＱ９Ｙ５Ｃ１、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤはＥＮＳＧ０００００１３２８５５である。ＡＮＧＰＴＬ３は、２ＳＮＰ、９イントロン、および１２エクソンを有する。Ｅｎｓｅｍｂｌからのエクソン識別子、およびイントロンとエクソンの開始／停止部位を表３に示す。
【表３】
2020508056.tif 000004
【０３４８】
表４は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースに基づいたＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のすべての転写に関する情報を提供する。表４には、Ｅｎｓｅｍｂｌからの転写ＩＤとその転写に対応するＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ、Ｅｎｓｅｍｂｌからの翻訳ＩＤ、タンパク質に対応するＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ、Ｅｎｓｅｍｂｌによって分類された転写配列のバイオタイプ、および表３の情報に基づいた転写のエクソンとイントロンが提供される。
【表４】
2020508056.tif 000005
【０３４９】
ＡＮＧＰＴＬ３には２つのＳＮＰがあり、このＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＵｎｉＰｒｏｔ  ＶＡＲ番号は、ＶＡＲ＿０４９０７１およびＶＡＲ＿０６７２８３である。
【０３５０】
一実施例では、本開示で使用されるガイドＲＮＡは、表５に列記される少なくとも１つの２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的核酸配列を含み得る。表５には、遺伝子の遺伝子記号と配列識別子（遺伝子配列番号）、標的遺伝子の上流および／または下流に１〜５キロ塩基対を含む遺伝子配列（拡張遺伝子配列番号）、および２０ｎｔの標的核酸配列（２０ｎｔの標的配列配列番号）が提供される。それぞれの標的遺伝子を列記する配列には、遺伝子を標的とする鎖（配列リストでは（＋）鎖または（−）鎖で示される）、関連するＰＡＭタイプおよびＰＡＭ配列が２０ｎｔの標的核酸配列（配列番号５３０５〜１７０１８）のそれぞれについて記載されている。当該技術分野では、「Ｔ」が「Ｕ」であるスペーサー配列は、表５に列記された２０ｎｔの配列に対応するＲＮＡ配列であり得ることが理解される。
【表５】
2020508056.tif 000006
【０３５１】
一実施例では、本開示で使用されるガイドＲＮＡは、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、限定されないが、配列番号５３０５〜１７０１８のうちのいずれかなどの、２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的配列に対応するＲＮＡ配列であり得る、少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。
【０３５２】
一実施例では、本開示で使用されるガイドＲＮＡは、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、限定されないが、配列番号５３０５〜１７０１８のうちのいずれかなどの、２０ｎｔ配列に対応するＲＮＡ配列であり得る、少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。
【０３５３】
一実施例では、ガイドＲＮＡは、限定されないが、ＮＡＡＡＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＮＧＨＴＴ、ＮＲＧ、またはＹＴＮなどの、ＰＡＭタイプに関連する２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的核酸配列を含み得る。非限定的な例として、特定の標的遺伝子および特定のＰＡＭタイプの２０ｎｔ標的核酸配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、表６の２０ｎｔ核酸配列のうちのいずれか１つに対応するＲＮＡ配列であり得る。
【表６】
2020508056.tif 000007
【０３５４】
一実施例では、ガイドＲＮＡは、ＹＴＮ  ＰＡＭタイプに関連する２２ヌクレオチド（ｎｔ）標的核酸配列を含み得る。非限定的な例として、特定の標的遺伝子の２２ｎｔ標的核酸配列は、２０ｎｔコア配列を含むことができ、２０ｎｔコア配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、配列番号１０１７２〜１７０１８に対応するＲＮＡ配列であり得る。別の非限定的な例として、特定の標的遺伝子の２２ｎｔ標的核酸配列は、コア配列を含むことができ、このコア配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、配列番号１０１７２〜１７０１８のうちのいずれかに対応するＲＮＡ配列の断片、セグメント、または領域であり得る。
【０３５５】
ＶＩ．他の治療的アプローチ
遺伝子編集は、特定の配列を標的とするように操作されたヌクレアーゼを使用して実施することができる。これまでに、４つの主要なタイプのヌクレアーゼがある：メガヌクレアーゼとその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクターヌクレアーゼのような転写活性化因子（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステム。特にＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性は、タンパク質とＤＮＡの相互作用によるものであり、ＲＮＡとＤＮＡの相互作用は主にＣａｓ９を導くため、ヌクレアーゼプラットフォームは、設計の難易度、標的密度、および作用モードが異なる。
【０３５６】
本開示の方法では、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかしながら、治療標的部位などの本明細書に記載の教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬなどの他の形態のエンドヌクレアーゼに適用することができるか、またはヌクレアーゼの組み合わせを使用できる。しかしながら、本開示の教示をそのようなエンドヌクレアーゼに適用するために、とりわけ、特定の標的部位に向けられたタンパク質を操作する必要があるだろう。
【０３５７】
追加の結合ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合して、特異性を高めることができる。これらの構築物の標的部位は、特定されたｇＲＮＡ指定部位にマッピングされるが、ジンクフィンガードメインなどの追加の結合モチーフを必要とする。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼをＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに融合することができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を高め、切断を提供する。同様に、不活化または死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は切断ドメインに融合でき、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位および融合ＤＮＡ結合ドメインの隣接結合部位を必要とする。これには、追加の結合部位なしで結合を減少させるために、触媒の不活性化に加えて、ｄＣａｓ９のタンパク質工学がいくらか必要になるであろう。
【０３５８】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、タイプＩＩエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインにリンクされた操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインで構成されるモジュール式タンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてのみ機能するため、ＺＦＮの一対は、触媒活性ＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするために、対向するＤＮＡ鎖上の同種の標的「ハーフサイト」配列に、正確な間隔で結合するように操作する必要がある。それ自体は配列特異性を持たないＦｏｋＩドメインの二量体化により、ゲノム編集の開始ステップとして、ＺＦＮハーフサイト間にＤＮＡ二本鎖切断が生成される。
【０３５９】
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常、豊富なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２アーキテクチャの３〜６個のジンクフィンガーで構成され、各フィンガーは主に標的ＤＮＡ配列の１本の鎖のヌクレオチドのトリプレットを認識するが、第４のヌクレオチドとの鎖間相互作用もまた重要である。ＤＮＡとの重要な接触を行う位置でのフィンガーのアミノ酸の改変は、特定のフィンガーの配列特異性を改変する。したがって、４本指のジンクフィンガータンパク質は、１２ｂｐ標的配列を選択的に認識し、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット選好の複合体であるが、トリプレット選好は、隣接するフィンガーによって異なる程度で影響され得る。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを修正することによって、それらをほぼすべてのゲノムアドレスに容易に再標的することができるが、これを良好に行うにはかなりの専門知識が必要である。ＺＦＮのほとんどの適用では、４〜６フィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ１２〜１８ｂｐを認識する。したがって、ＺＦＮの一対は、通常、ハーフサイト間の典型的な５〜７ｂｐスペーサーを含まない、２４〜３６ｂｐの結合標的配列を認識するであろう。結合部位は、１５〜１７ｂｐを含むより大きなスペーサーでさらに分離され得る。この長さの標的配列は、設計プロセス中に反復配列または遺伝子ホモログが除外されると仮定すると、ヒトゲノムにおいて固有である可能性がある。それにもかかわらず、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ相互作用は、特異性が絶対的ではないため、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として、またはＺＦＮの一方または他方のホモ二量体としてのいずれかで、オフ標的結合および切断イベントが発生する。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化接触面を操作して、それら自体ではなく、互いにのみ二量体化し得る、絶対ヘテロ二量体異形とも呼ばれる「プラス」および「マイナス」異形を作成することにより効果的に排除された。絶対ヘテロ二量体を強制すると、ホモ二量体の形成が防止される。これにより、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩ異形を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性が大幅に向上した。
【０３６０】
様々なＺＦＮベースのシステムが、当該技術分野で説明されており、その修正が定期的に報告されており、多くの参考文献がＺＦＮの設計を導くために使用される規則およびパラメータを説明している。例えば、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６）：２７５８−６３（１９９９）、Ｄｒｅｉｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３０３（４）：４８９−５０２（２０００）、Ｌｉｕ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７（６）：３８５０−６（２００２）、Ｄｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（４２）：３５５８８−９７（２００５）、およびＤｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６−７８（２００１）を参照されたい。
【０３６１】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに結合されているモジュラーヌクレアーゼの別の形式を表し、一対のＴＡＬＥＮが連携して、標的ＤＮＡ切断を実現する。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質と、関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインは、植物細菌病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種に本来記載されているＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸反復のタンデムアレイで構成され、各反復は、典型的に最大２０ｂｐ長であり、標的配列全長が最大４０ｂｐである、標的ＤＮＡ配列中の単一の塩基対を認識する。各反復のヌクレオチド特異性は、反復変数二残基（ＲＶＤ）によって決定され、これは、位置１２および１３に２つのアミノ酸のみを含む。塩基のグアニン、アデニン、シトシン、およびチミンは、主に４つのＲＶＤ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、およびＡｓｎ−Ｇｌｙによってそれぞれ認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに簡単な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼ設計に関して後者を超える利点を表す。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮは、オフ標的活性を低減するためにＦｏｋＩドメインの絶対ヘテロ二量体異形の使用からも恩恵を受けている。
【０３６２】
触媒機能が無効になっている、ＦｏｋＩドメインの追加の異形が作成されている。ＴＡＬＥＮ一対またはＺＦＮ一対のいずれかの半分に不活性なＦｏｋＩドメインが含まれている場合、ＤＳＢではなく、標的部位で一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが発生する。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの１つが不活性化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」変異体の使用に匹敵する。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動することができるが、ＤＳＢよりも効率が低くなる。主な利点は、ＮＨＥＪを介した誤修復の傾向があるＤＳＢとは異なり、オフターゲットのニックが迅速かつ正確に修復されることである。
【０３６３】
様々なＴＡＬＥＮベースのシステムが当該技術分野で説明されており、その修正が定期的に報告されている。例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０９−１２（２００９）、Ｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５（６０６９）：７１６−９（２０１２）、およびＭｏｓｃｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照されたい。「ゴールデンゲート」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用は、複数のグループによって説明されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（１４）：６３１５−２５（２０１１）、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４１（６）：３３９−４７，Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｍａｙ  １７（２０１４）、およびＣｅｒｍａｋ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１２３９：１３３−５９（２０１５）を参照されたい。
【０３６４】
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、多くの場合、ゲノムで固有の部位において、高い特異性でＤＮＡを切断する配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、および広範囲の宿主（真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、およびファージを含む）に由来するＶｓｒ様を含む構造によって分類される、少なくとも６つの既知のＨＥファミリーがある。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集の最初のステップとして標的遺伝子座にＤＳＢを作成することができる。さらに、一部の天然および操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きな標的配列とそれらが提供する特異性により、ＨＥは部位特異的ＤＳＢを作成する魅力的な候補になった。
【０３６５】
様々なＨＥベースのシステムが当該技術分野で説明されており、その修正が定期的に報告されている。例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２４（８）：６６３−８０（２０１４），Ｂｅｌｆｏｒｔ  ａｎｄ  Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１１２３：１−２６（２０１４）、Ｈａｆｅｚ  ａｎｄ  Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ  ５５（８）：５５３−６９（２０１２）によるレビュー、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
【０３６６】
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合および特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を利用して、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび触媒活性ＨＥの融合を使用する。例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ４２：２５９１−２６０１（２０１４）、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇ３  ４：１１５５−６５（２０１４）、およびＢｏｉｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１−９６（２０１５）を参照されたい。
【０３６７】
さらなる変化において、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）とＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基板上で約３０ｂｐ離れて位置付けられ、互換性のない粘着末端を有する２つのＤＳＢを生成する。例えば、Ｗｏｌｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ４２，８８１６−２９（２０１４）を参照されたい。既存のヌクレアーゼベースのアプローチの他の組み合わせが進化し、本明細書に記載の標的ゲノム修飾を達成するのに役立つと予想される。
【０３６８】
ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的かつ機能的な特性を組み合わせることにより、固有の欠陥のいくつかを潜在的に克服することができるゲノム編集へのさらなるアプローチが提供される。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、典型的に、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作成する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとワトソン・クリック塩基対合を行うガイドＲＮＡの２０または２４ヌクレオチド配列（さらに、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、隣接したＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭ配列における追加の２塩基）によって駆動される。そのような配列は、ヒトゲノムにおいて固有であるのに十分な長さであるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に標的配列の５′半分でかなりの混乱が許容されることがあり、特異性を促進する塩基の数を効果的に低減する。これに対する解決策の１つは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合機能のみを保持するＣａｓ９またはＣｐｆ１触媒機能を完全に不活性化し、代わりにＦｏｋＩドメインを不活性化したＣａｓ９に融合することである。例えば、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３２：５６９−７６（２０１４）、およびＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７−８２（２０１４）を参照されたい。ＦｏｋＩは、触媒的に活性化するために二量体化しなければならないため、２つのＦｏｋＩ融合体を近接させて二量体を形成し、ＤＮＡを切断するには２つのガイドＲＮＡが必要である。これにより、複合された標的部位の塩基数が本質的に２倍になり、それによりＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる標的化の厳密性が高まる。
【０３６９】
さらなる例として、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＩ−ＴｅｖＩなどの触媒活性ＨＥへの融合は、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合および特異性、ならびにＩ−ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を利用し、オフターゲット切断がさらに低減され得ると期待される。
【０３７０】
ＶＩＩ．キット
本開示は、本明細書に記載の方法を実行するためのキットを提供する。キットは、ゲノム標的化核酸、ゲノム標的化核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または本明細書に記載の方法の態様を実行するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質分子のうちの１つ以上、あるいはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０３７１】
キットは、（１）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに（３）ベクター（複数可）またはポリペプチドの再構成および／または希釈のための試薬を含むことができる。
【０３７２】
キットは、（１）（ｉ）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに（２）ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むことができる。
【０３７３】
上記のキットのいずれにおいても、キットは、単一分子ガイドのゲノム標的化核酸を含むことができる。上記のキットのいずれにおいても、キットは、二重分子ゲノム標的化核酸を含むことができる。上記のキットのいずれにおいても、キットは、２つ以上の二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含むことができる。キットは、核酸標的化核酸をコードするベクターを含むことができる。
【０３７４】
上記のキットのいずれにおいても、キットは、所望の遺伝子修飾をもたらすために挿入されるポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【０３７５】
キットの構成要素は、別々の容器に入れるか、または単一の容器にまとめることもできる。
【０３７６】
上記の任意のキットは、１種以上の追加の試薬をさらに含むことができ、そのような追加の試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロ産生のための試薬、配列決定のためのアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液などであり得る。キットはまた、エンドヌクレアーゼによるオンターゲット結合もしくはＤＮＡの切断を促進または増強するため、または標的化の特異性を改善するために使用できる１つ以上の成分を含むこともできる。
【０３７７】
上述の構成要素に加えて、キットは、キットの構成要素を使用して方法を実施するための指示書をさらに含むことができる。この方法を実施するための指示書は、適切な記録媒体に記録され得る。例えば、指示書は、紙またはプラスチック等の基材に印刷することができる。指示書は、添付文書として、キットの容器またはその構成要素のラベル等（すなわち、包装または分包装に関連する）に存在し得る。指示書は、適切なコンピューター読み取り可能な記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在し得る。場合によって、実際の指示書はキットに存在しないが、リモートソースから（例えば、インターネット経由で）指示書を取得するための手段を提供することができる。この場合の例は、指示書を見ることができる、および／または指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を入手するためのこの手段は、適切な基材に記録することができる。
【０３７８】
ＶＩＩＩ．特定の方法および組成物
したがって、本開示は、特に、本開示による以下の非限定的な方法に関し、第１の方法、方法１では、本開示は、ゲノム編集による細胞内のアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の編集方法を提供し、本方法は、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くに少なくとも１つのヌクレオチドの１つ以上の永続的な挿入、欠失、または突然変異をもたらす、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３調節エレメント内またはその近くに導入し、それによりＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産生物の発現または機能を低減または排除するステップを含む。
【０３７９】
別の方法、方法２では、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態または障害を有する患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、患者から肝細胞を単離するステップと、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子または肝細胞のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで編集するステップと、ゲノム編集された肝細胞を患者に移植するステップと、を含む。
【０３８０】
別の方法、方法３では、本開示は、方法２の方法を提供し、ここで、編集ステップは、肝細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くに少なくとも１つのヌクレオチドの１つ以上の永続的な挿入、欠失、または突然変異をもたらす、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３調節エレメント内またはその近くにもたらし、それによりＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
【０３８１】
別の方法、方法４では、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態または障害を有する患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、患者特異的な誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成するステップと、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはｉＰＳＣのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで編集するステップと、ゲノム編集されたｉＰＳＣを肝細胞に分化するステップと、肝細胞を患者に移植するステップと、を含む。
【０３８２】
別の方法、方法５では、本開示は、方法４の方法を提供し、ここで、編集ステップは、ｉＰＳＣに１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くで少なくとも１つのヌクレオチドの１つ以上の永続的な挿入、欠失、または突然変異をもたらす、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３調節エレメント内またはその近くにもたらし、それによりＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
【０３８３】
別の方法、方法６では、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３関連状態または障害を有する患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、間葉系幹細胞を患者から単離するステップと、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子または間葉系幹細胞のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近くで編集するステップと、ゲノム編集された間葉系幹細胞を肝細胞に分化するステップと、肝細胞を患者に移植するステップと、を含む。
【０３８４】
別の方法、方法７では、本開示は、方法６の方法を提供し、ここで、編集ステップは、間葉系幹細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くに少なくとも１つのヌクレオチドの１つ以上の永続的な挿入、欠失、または突然変異をもたらす、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３調節エレメント内またはその近くにもたらし、それによりＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
【０３８５】
別の方法、方法８では、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害を有する患者を治療するためのインビボ方法を提供し、本方法は、患者の細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するステップを含む。
【０３８６】
別の方法、方法９では、本開示は方法８の方法を提供し、ここで、編集ステップは、細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはその近くに少なくとも１つのヌクレオチドの１つ以上の永続的な挿入、欠失、または突然変異をもたらす、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３調節エレメント内またはその近くにもたらし、それによりＡＮＧＰＴＬ３遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
【０３８７】
別の方法、方法１０では、本開示は、方法８または９のいずれかの方法を提供し、ここで、細胞は、肝細胞である。
【０３８８】
別の方法、方法１１では、本開示は、方法１０の方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、局所注射、全身注入、またはそれらの組み合わせによって肝細胞に送達される。
【０３８９】
別の方法、方法１２では、本開示は、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の連続ゲノム配列を改変する方法を提供し、本方法は、細胞を１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させて、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことを含む。
【０３９０】
別の方法、方法１３では、本開示は、方法１２の方法を提供し、ここで、連続したゲノム配列の改変は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の１つ以上のエクソンで発生する。
【０３９１】
別の方法、方法１４では、本開示は、方法１〜１３のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、配列番号１〜６２０に列記されたもののうちのいずれか、および配列番号１〜６２０に列記されたもののうちのいずれかと少なくとも７０％の相同性を有する異形から選択される。
【０３９２】
別の方法、方法１５では、本開示は、方法１４の方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つ以上のタンパク質またはポリペプチドである。
【０３９３】
別の方法、方法１６では、本開示は、方法１４の方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドである。
【０３９４】
別の方法、方法１７では、本開示は、方法１６の方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【０３９５】
別の方法、方法１８では、本開示は、方法１７の方法を提供し、ここで、１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）は、１つ以上の化学修飾されたＲＮＡである。
【０３９６】
別の方法、方法１９では、本開示は、方法１８の方法を提供し、ここで、１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）は、コード領域内で化学修飾される。
【０３９７】
別の方法、方法２０では、本開示は、方法１６〜１９のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）は、コドン最適化されている。
【０３９８】
別の方法、方法２１では、本開示は、方法１〜２０のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、この方法は、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含む。
【０３９９】
別の方法、方法２２では、本開示は、方法２１の方法を提供し、ここで、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のコード配列のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む。
【０４００】
別の方法、方法２３では、本開示は、方法２１の方法を提供し、ここで、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の調節エレメントをコードする他の配列に隣接する配列に相補的なスペーサー配列を含む。
【０４０１】
別の方法、方法２４では、本開示は、方法２１〜２３のうちのいずれかの方法を提供し、ここで、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。
【０４０２】
別の方法、方法２５では、本開示は、方法２１〜２４のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと事前に複合されている。
【０４０３】
別の方法、方法２６では、本開示は、方法２５の方法を提供し、ここで、事前複合は、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡの、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼへの共有結合を伴う。
【０４０４】
別の方法、方法２７では、本開示は、方法１４〜２６のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に配合される。
【０４０５】
別の方法、方法２８では、本開示は、方法２１〜２７のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子中に配合される。
【０４０６】
別の方法、方法２９では、本開示は、方法１２または２１〜２３のうちのいずれか１つの方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、ＡＡＶベクター粒子中でコードされ、ＡＡＶベクター血清型は、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列記されたものから選択される。
【０４０７】
別の方法、方法３０では、本開示は、方法２１〜２３のうちのいずれかの方法を提供し、ここで、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、ＡＡＶベクター粒子中でコードされ、ＡＡＶベクター血清型は、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列記されたものから選択される。
【０４０８】
別の方法、方法３１では、本開示は、方法２１〜２３のうちのいずれかの方法を提供し、ここで、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子にコードされ、ＡＡＶベクター血清型は、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列記されたものから選択される。
【０４０９】
本開示はまた、配列番号５３０５〜１７０１８のうちのいずれかに対応するＲＮＡ配列である少なくともスペーサー配列を含む単一分子ガイドＲＮＡを含む組成物、組成物１も提供する。
【０４１０】
別の組成物、組成物２では、本開示は、組成物１の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、単一分子ガイドＲＮＡは、スペーサー伸長領域をさらに含む。
【０４１１】
別の組成物、組成物３では、本開示は、組成物１の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、単一分子ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域をさらに含む。
【０４１２】
別の組成物、組成物４では、本開示は、組成物１〜３の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、単一分子ガイドＲＮＡは、化学修飾されている。
【０４１３】
別の組成物、組成物５では、本開示は、組成物１〜４の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、単一分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼと事前に複合されている。
【０４１４】
別の組成物、組成物６では、本開示は、組成物５の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。
【０４１５】
別の組成物、組成物７では、本開示は、組成物６の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ３  Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１、ならびにこれらの酵素と少なくとも７０％の相同性を有する異形から選択される。
【０４１６】
別の組成物、組成物８では、本開示は、組成物７の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
【０４１７】
別の組成物、組成物９では、本開示は、組成物８の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つのＮＬＳは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのアミノ末端の５０アミノ酸またはその内部にあり、および／または少なくとも１つのＮＬＳは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのカルボキシ末端の５０アミノ酸またはその内部にある。
【０４１８】
別の組成物、組成物１０では、本開示は、組成物９の単一分子ガイドＲＮＡを提供し、ここで、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、真核細胞での発現に最適化されたコドンである。
【０４１９】
別の組成物、組成物１１では、本開示は、組成物１〜３の単一分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ提供する。
【０４２０】
別の組成物、組成物１２では、本開示は、組成物８〜１０のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをコードするＤＮＡを提供する。
【０４２１】
別の組成物、組成物１３では、本開示は、組成物１１または１２のＤＮＡを含むベクターを提供する。
【０４２２】
別の組成物、組成物１４では、本開示は、組成物１３のベクターを提供し、ここで、ベクターは、プラスミドである。
【０４２３】
別の組成物、組成物１５では、本開示は、組成物１３のベクターを提供し、ここで、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子であり、ＡＡＶベクター血清型は、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列記されているものから選択される。
【０４２４】
ＩＸ．定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に必須であるが、必須であるかどうかにかかわらず、不特定の要素の包含に対して開かれている組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用される。
【０４２５】
「から本質的になる」という用語は、特定の態様に必要な要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的かつ新規または機能的特徴（複数可）に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を可能にする。
【０４２６】
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指し、態様のその説明に列挙されていないいかなる要素をも除外する。
【０４２７】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。
【０４２８】
本明細書に提示される特定の数値の前には、「約」という用語が付いている。「約」という用語は、列挙された数値の±１０％以内の数値を意味する。
【０４２９】
数値の範囲が本明細書で提示される場合、範囲の下限と上限の間の各介入値、範囲の上限と下限である値、およびその範囲とともに記載されたすべての値は、本開示に包含される。範囲の下限および上限内のすべての可能な下位範囲も、本開示により企図されている。
【０４３０】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、下記の付随する説明に記載されている。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用することができるが、好ましい材料および方法をここで説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明から明らかになるであろう。説明において、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、単数形は複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が優先する。
【０４３１】
本明細書で列挙される任意の数値範囲は、列挙された範囲内に含まれる同じ数値精度の（すなわち、指定された数字の数が同じである）すべての部分範囲を記述する。例えば、「１．０〜１０．０」の列挙された範囲は、「２．４〜７．６」の範囲は、明細書の本文に明示的に列挙されていないとしても、例えば「２．４〜７．６」などの、列挙される最小値１．０と列挙された最大値１０．０との間のすべての部分範囲を示す。したがって、出願人は、本明細書で明示的に列挙された範囲内に含まれる同じ数値精度の任意の部分範囲を明示的に列挙するために、特許請求の範囲を含む本明細書を修正する権利を留保する。このような範囲はすべて、本明細書に本質的に記載されており、そのような部分範囲を明示的に列挙する修正は、書面による説明、説明の十分性、および米国特許法第１１２（ａ）条および第１２３条（２）ＥＰＣの要件を含む、追加事項要件に準拠する。また、明示的に指定されているか、または別途文脈で必要とされていない限り、本明細書で説明されているすべての数値パラメータ（例えば、値、範囲、量、パーセンテージなどを表すもの）は、「約」という言葉が数値の前に明示的に現れていない場合でも、「約」という言葉が前置されているかのように読むことができる。さらに、本明細書で説明されている数値パラメータは、報告された有効桁数、数値精度に照らして、および通常の四捨五入手法を適用することによって解釈する必要がある。また、本明細書に記載の数値パラメータは、パラメータの数値を決定するために使用される基礎となる測定技法の固有の変動特性を必然的に保有することも理解される。
【０４３２】
本開示の１つ以上の態様の詳細は、下記の付随する説明に記載されている。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用することができるが、好ましい材料および方法をここで説明する。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明から明らかとなるであろう。説明において、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、単数形は複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が優先する。
【０４３３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。
【０４３４】
Ｘ．実施例
本発明は、本開示の例示的で非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。
【０４３５】
実施例は、ＡＮＧＰＬＴ３遺伝子の永続的な欠失または突然変異をもたらすＡＮＧＰＴＬ３遺伝子において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の活性を低減または排除する、本明細書で「ゲノム修飾」と呼ばれる定義された治療的ゲノム欠失、挿入、または置換を作成するための例示的なゲノム編集技法としてのＣＲＩＳＰＲシステムの使用について説明する。定義された治療的修正の導入は、本明細書で説明および例示されるように、脂質異常症の潜在的な改善のための新規な治療戦略を表す。
【０４３６】
実施例１−ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域は、標的部位について走査される。配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について、各領域を走査する。次いで、配列表の配列番号６，６３４〜１０，１７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ  ２０ｂｐスペーサー配列が同定される。
【０４３７】
実施例２−ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域は、標的部位について走査される。配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について、各領域を走査する。次いで、配列表の配列番号５，５９６〜６，０７９〜１０，１７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ  ２０ｂｐスペーサー配列を同定する。
【０４３８】
実施例３−ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域は、標的部位について走査される。配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について、各領域を走査する。次いで、配列表の配列番号５，３９９〜５，５９５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ  ２０ｂｐスペーサー配列を同定する。
【０４３９】
実施例４−ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域は、標的部位について走査される。配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について、各領域を走査する。次いで、配列表の配列番号５，３０５〜５，３９８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ  ２０ｂｐスペーサー配列を同定する。
【０４４０】
実施例５−ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域は、標的部位について走査される。配列ＮＮＮＮＧＡＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について、各領域を走査する。次いで、配列表の配列番号６，０８０〜６，６３３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ  ２０ｂｐスペーサー配列を同定する。
【０４４１】
実施例６−ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域は、標的部位について走査される。配列ＴＴＮまたはＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について、各領域を走査する。次いで、配列表の配列番号１０，１７２〜１７，０１８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ  ２２ｂｐスペーサー配列を同定する。
【０４４２】
実施例７−ガイド鎖のバイオインフォマティクス分析
次いで、候補ガイドは、オンターゲット部位およびオフターゲット部位の両方で理論的な結合と実験的に評価された活動の両方を含む単一プロセスまたはマルチステッププロセスでスクリーニングおよび選択された。例として、意図されるもの以外の染色体位置の効果の可能性を評価するために、特定のオンターゲット部位、例えばＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内の部位を、隣接するＰＡＭと一致させる配列を有する候補ガイドを、下記でより詳細に説明および例示されるように、オフターゲット結合を評価するために利用可能な様々なバイオインフォマティクスツールのうちの１つ以上を使用して、同様の配列を有するオフターゲット部位を切断する能力について評価した。
【０４４３】
次に、オフターゲット活性の可能性が比較的低いと予測される候補を、実験的に評価して、様々な部位でのオンターゲット活性、次いでオフターゲット活性を測定した。好ましいガイドは、選択された遺伝子座での望ましいレベルの遺伝子編集を達成するのに十分高いオンターゲット活性と、他の染色体遺伝子座での改変の可能性を低減する比較的低いオフターゲット活性と、を有する。オンターゲット活性とオフターゲット活性との比率は、多くの場合、ガイドの「特異性」と呼ばれる。
【０４４４】
予測されるオフターゲット活性の初期スクリーニングには、最も可能性の高いオフターゲット部位を予測するために使用できる既知の公開されたバイオインフォマティクスツールがいくつかあり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼシステムの標的部位への結合は、相補配列間のワトソン・クリック塩基対合によって駆動されるため、非類似性の程度（したがって、オフターゲット結合の可能性の低下）は、本質的に、一次配列の相違：ミスマッチとバルジ、すなわち、非相補的な塩基に変化する塩基、および標的部位に対する潜在的なオフターゲット部位の挿入または欠失に関する。ＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、および欠失を伴うＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位）（ｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕでウェブ上で入手可能）と呼ばれる例示的なバイオインフォマティクスツールは、このような類似性をコンパイルする。他のバイオインフォマティクスツールには、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤおよびＣＣＴｏｐが含まれるが、これらに限定されない。
【０４４５】
バイオインフォマティクスは、突然変異と染色体再編成の有害な影響を低減するために、オフターゲット切断を最小限に抑えるために使用される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に関する研究は、特にＰＡＭ領域から遠い位置での塩基対ミスマッチおよび／またはバルジを伴うＤＮＡ配列へのガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションによる高いオフターゲット活性の可能性を示唆した。したがって、塩基対のミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間に挿入および／または欠失を有する潜在的なオフターゲット部位を特定できるバイオインフォマティクスツールを有することが重要である。オフターゲット予測アルゴリズムＣＣＴｏｐに基づくバイオインフォマティクスツールを使用して、ＣＲＩＳＰＲのオフターゲット部位の可能性があるゲノムを検索した（ＣＣＴｏｐは、ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／でウェブ上で入手可能である）。ＣＯＳＭＩＤ出力は、ミスマッチの数と場所に基づいて、潜在的なオフターゲット部位のリストをランク付けし、標的部位のより多くの情報に基づいた選択を可能にし、オフターゲット切断の可能性が高い部位の使用を回避する。
【０４４６】
ある領域のｇＲＮＡ標的化部位の推定されたオンターゲット活性および／またはオフターゲット活性を評価する追加のバイオインフォマティクスパイプラインが採用されている。活動を予測するために使用できる他の機能には、問題の細胞型、ＤＮＡアクセシビリティ、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、および他のＣＨＩＰ配列データに関する情報が含まれる。ｇＲＮＡの対の相対的な位置と方向、ローカル配列の特徴、およびマイクロホモロジーなど、編集の効率を予測する追加の要因を検討する。
【０４４７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位の初期評価およびスクリーニングは、ＡＮＧＰＴＬ３〜２００ｂｐ  ５′上流配列、エクソン１〜６（７エクソンのうち）およびイントロン１〜６の領域に焦点を合わせた。完全なイントロン配列を評価した。またはエクソン−イントロン接合部に近い約１００〜３００ｂｐの配列を、大きなイントロンについて評価した。エクソン配列内のｇＲＮＡを使用して、タンパク質配列の変化および／またはタンパク質の切断によりタンパク質の機能の喪失につながるインデルを作成することができる。５′ＵＴＲ配列のｇＲＮＡを単独で、またはエクソン内のｇＲＮＡと組み合わせてのいずれかで使用して、翻訳開始部位を除去し、タンパク質合成を防ぐことができる。イントロンのｇＲＮＡを単独で、またはエクソン内のｇＲＮＡと組み合わせて使用して、スプライスドナーおよびアクセプター部位を除去し、切断されたタンパク質の産生とその結果としての機能喪失を引き起こし得る。
【０４４８】
初期のバイオインフォマティクス分析により、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするおよそ２０３のガイドが特定された。このガイドのサブセットをさらに分析した。予測されるオフターゲット部位（１つまたは２つのミスマッチ）を有するガイドは排除され、０．０００２を超えるマイナー対立遺伝子頻度を有するＳＮＰと重複するガイドも排除された。また、Ａｎｇｐｔｌ３配列内の位置に基づいて、スクリーニングのためにｇＲＮＡに優先順位を付けた。５′エクソンを標的とするｇＲＮＡが優先された。この分析により、インビトロ転写ベースのガイドスクリーニングプロトコルのガイドに優先順位を付けた１９２のガイドのプールが残った（表７）。
【０４４９】
実施例８−オンターゲット活性の細胞内の優先ガイドの試験
同種のＤＮＡ標的領域を編集できるｇＲＮＡの大きなスペクトルを特定するために、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーンを実施した。関連するゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用した分析のために提出した。結果のｇＲＮＡのリストは、配列の固有性に基づいて約２００ｇＲＮＡのリストに絞り込まれ（ゲノム内のどこかに完全な一致を有しないｇＲＮＡのみをスクリーニングした）、予測されるオフターゲットは最小限であった。このｇＲＮＡのセットは、インビトロで転写され、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを使用して、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、ＴＩＤＥ分析を使用して切断効率を評価した（図２〜４）。
【０４５０】
ＨＥＫ細胞でスクリーニングされた１９２個のガイドの中から、編集効率が高く、ＣＣＴｏｐオフターゲットスコアが低いガイドを特定した（表７および図２〜４）。
【０４５１】
次に、有意な活性を持つｇＲＮＡを培養細胞中で追跡して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の改変を測定した（例１１〜１３）。特に、以下で説明するインビトロ編集実験のために、ヒトＡＮＧＰＴＬ３配列と、ヒトおよびサル（交差反応性）ＡＮＧＰＴＬ３（利用可能なカニクイザルおよびアカゲザルＡＮＧＰＴＬ３配列と１００％一致）の両方を標的とする２つのｇＲＮＡを特異的に標的とする２つのガイドを選択した（例えば、表８を参照）。オフオフターゲット事象を再び追従することができる。様々な細胞にトランスフェクトし、遺伝子編集のレベルおよび可能なオフターゲット事象を測定することができる。これらの実験は、ヌクレアーゼおよびドナーの設計および送達の最適化を可能にする。
【表７−１】
2020508056.tif 000008
【表７−２】
2020508056.tif 000009
【表７−３】
2020508056.tif 000010
【表７−４】
2020508056.tif 000011
【表７−５】
2020508056.tif 000012
【表７−６】
2020508056.tif 000013
【０４５２】
実施例１０−初代肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｇＲＮＡの交差反応活性
本実施例は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むリポフェクタミントランスフェクション複合体によるノックアウト後、カニクイザルおよびヒトドナーから単離された初代肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｇＲＮＡの効率的な交差反応活性を示す。
【０４５３】
ヒトおよびカニクイザルから単離された初代肝細胞（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、コンフルエントな単層に播種し、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡでトランスフェクトした。ＡＸＯＬａｂｓによって合成されたＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｇＲＮＡは、以下のフォーマットを使用して化学修飾した。ｎ＊ｎ＊ｎ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣａａｃｕｕＧＡＡＡａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕ＊ｕ＊ｕ＊Ｕ、ここで
大文字：未修飾ヌクレオチド、小文字：２′−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチド、ｎまたはＮ：任意のヌクレオチド、＊：ホスホロチオエート結合（配列番号１７，０５８）。修飾されたｇＲＮＡを表８に示す。
【０４５４】
手短に言えば、細胞を０．３５×１０６細胞／ウェルで２４ウェルのＩ型コラーゲンでコーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉマルチウェルプレート、カタログ番号３５６４０８）のコンフルエントな単層に播種し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養プレート培地（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ｚ９９０００３）において５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。ｇＲＮＡをＣａｓ９  ｍＲＮＡと複合して播種した３〜５時間後に、肝細胞単層をトランスフェクトした。ヒト肝細胞を、ヒト特異的ｇＲＮＡまたは種交差反応性ｇＲＮＡのいずれかでトランスフェクトし、サル肝細胞を種交差反応性ｇＲＮＡでトランスフェクトした。ｇＲＮＡのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ００３）を使用して、製造業者のプロトコルに従い、２００ｎｇの最終ｇＲＮＡ量で行った。
【０４５５】
「ＭＯＣＫ」試料を生成するために、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含まないＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘでも肝細胞をトランスフェクトした。さらに、肝細胞の種ごとに既知の編集効率範囲で一貫して活性であることが知られているＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ対照で肝細胞をトランスフェクトした（例えば、ヒト肝細胞のＣ３  ｇＲＮＡまたはサル肝細胞のＰＣＳＫ９  ｇＲＮＡ）。細胞は、トランスフェクションの１６時間後に新鮮なＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養培地の培地交換を受け、ｇＲＮＡ−リポフェクタミン複合体で４８時間インキュベートし、その時点で製造元のプロトコルに従い、それらをｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧｅｍ）に溶解した。
【０４５６】
肝細胞をＣａｓ９およびＡＮＧＰＴＬ３  ｇＲＮＡでトランスフェクトし、モックトランスフェクタント（対照群）を、分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）分析によって分析した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＥＫ，Ｃｈｅｎ  Ｔ，Ａｍｅｎｄｏｌａ  Ｍ，ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｓｅｌ  Ｂ．Ｅａｓｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｃｅ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｄｅｃ  １６；４２（２２）：ｅ１６８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６）。簡単に言うと、ゲノムＤＮＡがＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲキットを使用したＰＣＲのテンプレートとして使用された。
【０４５７】
ＰＣＲアンプリコンは、ＡｘｙＰｒｅｐ  Ｍａｇ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して精製した。アンプリコンは、分解アルゴリズムを使用して配列決定および分析した。ｇＲＮＡ活性は、非標的鎖上のＳ．ｐｙ．Ｃａｓ９の予測切断部位に隣接した（すなわち、ＰＡＭ（ＮＧＧ）の上流のヌクレオチド−４とヌクレオチド−３の間）、および標的鎖上のＰＡＭ相補配列（ＣＣＮ）の下流の３ヌクレオチドと４ヌクレオチドとの間に様々なインデル（１〜５０ｎｔの挿入、または１〜５０ｎｔの欠失）を持つ対立遺伝子の比として測定した。
【０４５８】
ＴＩＤＥ分析は、ＡＮＧＰＴＬ３  ｇＲＮＡ  ＥＸ２、Ｔ６、およびＴ９がヒト肝細胞で約５０％〜６０％のＩｎＤｅｌを誘導し、ＥＸ１  ｇＲＮＡが平均で２０％未満の効率を誘導したことを示した（図５Ａを参照）。交差反応性ガイドＴ６およびＴ９は、活性であり、サル肝細胞で遺伝子編集を誘導した。ｇＲＮＡ  Ｔ６の編集効率は最高であり、サル肝細胞のＩｎＤｅｌは６０％を超えていた（図５Ｂを参照）。
【表８】
2020508056.tif 000014
【０４５９】
実施例１１−遺伝子編集された初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分泌
本実施例は、Ｔ６  ｇＲＮＡによる効率的な遺伝子編集と、初代ヒト肝細胞における分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の低減との相関関係を示す。
【０４６０】
初代ヒト肝細胞（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．３５ｘ１０６細胞／ウェルで２４ウェルのＩ型コラーゲンでコーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ、カタログ番号３５６４０８）のコンフルエントな単層に播種し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養プレート培地（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ｚ９９０００３）において５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。肝細胞単層を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと複合して、ＡＮＧＰＴＬ３  Ｔ６  ｇＲＮＡまたはＣ３  ｇＲＮＡ（ヒトＣ３を効率的にノックアウトするが、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集しない非関連ｇＲＮＡ）のいずれかを播種した３〜５時間後にトランスフェクトした。ｇＲＮＡのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して、製造元のプロトコルに従い、２００ｎｇの最終ｇＲＮＡ量で行った。「ＭＯＣＫ」試料を生成するために、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含まないＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘでも肝細胞をトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの１６時間後に新鮮なＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養培地の培地交換を受けた。試料を、ｇＲＮＡ−リポフェクタミン複合体とともに４８時間インキュベートし、その時点で上清をヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分析用に収集し、製造元のプロトコルに従って細胞をｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧｅｍ）に溶解した。
【０４６１】
Ｃａｓ９およびＴ６  ｇＲＮＡ、またはＣａｓ９およびＣ３  ｇＲＮＡでトランスフェクトした肝細胞、ならびに「ＭＯＣＫ」トランスフェクタント（対照群）を、ＴＩＤＥによって分析した。ＴＩＤＥ分析は、ＡＮＧＰＴＬ３がＴ６  ｇＲＮＡ（ＩｎＤｅｌ約６０％）によって編集されたことを示した（図６Ａ）。同様に、Ｃ３  ｇＲＮＡは、ヒトＣ３遺伝子を効率的に編集し、同じヒトドナーでのＩｎＤｅｌ頻度は約５５％であった（図６Ａ）。
【０４６２】
ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３８２９）を使用して、遺伝子編集試料から収集した上清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の濃度を検出した。結果は、Ｔ６  ｇＲＮＡによるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集において約６０％の効率を有する初代肝細胞の上清が、１ｎｇ／ｍＬ未満のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を含み、対照群と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの有意な低減を示す（図６Ｂ）。対照群「ＭＯＣＫ」およびＣ３は、それぞれ約２．８ｎｇ／ｍｌ（図６Ｂ）および約２．６ｎｇ／ｍＬ（図６Ｂ）のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の同様のレベルを示した。本研究は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の効果的な編集が、初代肝細胞における分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の機能的低減をもたらしたことを示している。
【０４６３】
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質ノックダウンの検出ウィンドウを増やすために、共培養した初代ヒト肝細胞を培養し、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９でトランスフェクトした。
【０４６４】
初代ヒト肝細胞（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、単離されたマウス３Ｔ３線維芽細胞の存在下（ＳＮ  Ｂｈａｔｉａ，ＵＪ  Ｂａｌｉｓ，ＭＬ  Ｙａｒｍｕｓｈ，Ｍ  Ｔｏｎｅｒ．″Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ″Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３（１４），１８８３−１９００，ＳＮ  Ｂｈａｔｉａ，ＭＬ  Ｙａｒｍｕｓｈ，Ｍ  Ｔｏｎｅｒ．″Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ３Ｔ３  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ″Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４（２），１８９−１９９）、共培養フォーマットで、２４ウェルのＩ型コラーゲンでコーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ，Ｃａｔ＃３５６４０８）中で培養し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養プレート培地（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ｚ９９０００３）において５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。肝細胞共培養物を、培養開始の２４時間後にｇＲＮＡ（表８）およびＣａｓ９  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ｇＲＮＡのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して、製造元のプロトコルに従い、２００ｎｇの最終ｇＲＮＡ量で行った。肝細胞はまた、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションｇＲＮＡ−リポフェクタミン複合体の６時間後および２４時間毎に合計１０日間、新鮮なＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培地の培地交換を受けた。
【０４６５】
Ｃａｓ９およびＴ６  ｇＲＮＡ、またはＣａｓ９およびＣ３  ｇＲＮＡでトランスフェクトした共培養初代肝細胞、ならびに「ＭＯＣＫ」トランスフェクタント（対照群）を、ＴＩＤＥによって分析した。ＴＩＤＥ分析は、ＡＮＧＰＴＬ３がＴ６  ｇＲＮＡ（ＩｎＤｅｌ約６０％）によって編集されたことを示した（図７Ａ）。同様に、Ｃ３  ｇＲＮＡは、ヒトＣ３遺伝子を効率的に編集し、同じヒトドナーでのＩｎＤｅｌ頻度は約５２％であった（図７Ａ）。これらのデータは、単一培養および共培養フォーマットの初代ヒト肝細胞の一貫した編集プロファイルを示している。
【０４６６】
ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ３８２９）を使用して、遺伝子編集試料から収集した上清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の濃度を検出した。結果は、Ｔ６  ｇＲＮＡによるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集において約６０％の効率を有する初代肝細胞の上清が、約１ｎｇ／ｍＬのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を含み、対照群と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの有意な低減を示す（図７Ｂ）。対照群「ＭＯＣＫ」およびＣ３は、それぞれ約２９ｎｇ／ｍＬおよび約３１ｎｇ／ｍＬのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の同様のレベルを示した。共培養した初代肝細胞は、単培養肝細胞と比較して、５倍高いレベルのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を分泌し、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の破壊により分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が確実に低減することを示した。
【０４６７】
実施例１２−遺伝子編集された初代サル肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分泌
本実施例は、Ｔ６  ｇＲＮＡによる効率的な遺伝子編集と、初代サル肝細胞における分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の低減との相関関係を示す。
【０４６８】
初代サル肝細胞（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．３５ｘ１０６細胞／ウェルで２４ウェルのＩ型コラーゲンでコーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ、カタログ番号３５６４０８）のコンフルエントな単層に播種し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養プレート培地（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ｚ９９０００３）において５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。肝細胞単層を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと複合して、ＡＮＧＰＴＬ３  Ｔ６  ｇＲＮＡまたはＰＣＳＫ９  ｇＲＮＡ（サルゲノム中のＰＣＳＫ９遺伝子を効率的にノックアウトするが、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集しない非関連ｇＲＮＡ）のいずれかを播種した３〜５時間後にトランスフェクトした。ｇＲＮＡのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して、製造元のプロトコルに従い、２００ｎｇの最終ｇＲＮＡ量で行った。「ＭＯＣＫ」試料を生成するために、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含まないＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘでも肝細胞をトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの１６時間後に新鮮なＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養培地の培地交換を受けた。試料を、ｇＲＮＡ−リポフェクタミン複合体とともに４８時間インキュベートし、その時点で上清をヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質分析用に収集し、製造元のプロトコルに従って細胞をｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧｅｍ）に溶解した。
【０４６９】
Ｃａｓ９およびＴ６  ｇＲＮＡ、Ｔ９  ｇＲＮＡ、またはＰＣＳＫ９  ｇＲＮＡでトランスフェクトしたサル肝細胞、ならびに「ＭＯＣＫ」トランスフェクタント（対照群）を、ＴＩＤＥによって分析した。ＴＩＤＥ分析は、ＡＮＧＰＴＬ３がＴ６  ｇＲＮＡ（ＩｎＤｅｌ約６７％）およびＴ９  ｇＲＮＡ（ＩｎＤｅｌ約２９％）によって編集されたことを示した（図５Ｂ）。同様に、ＰＣＳＫ９  ｇＲＮＡは、サルＰＣＳＫ９遺伝子を効率的に編集し、同じサルドナーでのＩｎＤｅｌ頻度は約４１％であった（図５Ｂ）。
【０４７０】
サルＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（サルＡＮＧＰＴＬ３  ＥＬＩＳＡキット、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏ、カタログ番号ＬＳ＿Ｆ３８５１８）を使用して、遺伝子編集試料から収集した上清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の濃度を検出した。結果は、Ｔ６  ｇＲＮＡによるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集において約６７％の効率を有する初代肝細胞の上清が、１ｎｇ／ｍＬ未満のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を含み、対照群と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの有意な低減を示す（図８）。対照群「ＭＯＣＫ」およびＣ３は、それぞれ約３ｎｇ／ｍＬおよび約２．５ｎｇ／ｍＬのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の同様のレベルを示した。本研究は、交差反応性ｇＲＮＡ、Ｔ６によるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の効果的な編集が、初代サル肝細胞における分泌されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の機能的低減をもたらしたことを示している。
【０４７１】
実施例１３−関連する動物モデルでのインビボ試験
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ガイドの組み合わせを評価した後、リード製剤を動物モデルにおいてインビボで試験する。
【０４７２】
初代ヒト肝細胞、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの複合体のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の欠失の効率が高い異種間ＡＮＧＰＴＬ３  ｇＲＮＡの組み合わせは、送達のために脂質ナノ粒子中に配合される。
【０４７３】
カニクイザルは、ＡＮＧＰＴＬ３阻害のためのモノクローナル抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチド療法の両方で前臨床データが取得されているため、大型動物モデルとして使用される。これらの治療法は、現在、家族性高コレステロール血症患者におけるＡＮＧＰＴＬ３阻害とトリグリセリド、ＬＤＬコレステロール、およびＨＤＬコレステロールの低減との相関を評価するための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を完了している。
【０４７４】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびＴ６  ｇＲＮＡと複合した脂質ナノ粒子をサルに注入し、全血試料は、投与後１日目および１４日間にわたって３日毎に毎時収集する。投与前のベースライン全血採取も行われる。対照群には、生理食塩水を注入した動物が含まれる。
【０４７５】
体重は、研究を通してモニターされ、血漿および血清試料は、サイトカインおよび補体活性化（炎症反応）および臨床脂質パネル（総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ−Ｃ、およびトリグリセリド）についてモニターされる。１４日間の完了時に、肝組織を収集し、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の遺伝子編集について評価する。
【０４７６】
肝組織は、対照および投与動物の両方からホモジナイズされ、有効なＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集の証拠のためにＴＩＤＥ分析によって分析される。
【０４７７】
研究期間中のＴＩＤＥ分析と脂質化学の結果は、ＩｎＤｅｌ頻度とコレステロールレベルの修正との相関関係をもたらし、主要な生物学的マーカーであるＬＤＬ−Ｃの低減に重点が置かれる。
【０４７８】
上記のように、ヒト細胞での培養により、ヒトの標的と背景のヒトゲノムの直接試験も可能になる。
【０４７９】
さらに、マウスモデルにおける修飾マウスまたはヒト肝細胞の生着により、前臨床の有効性と安全性の評価を観察することができる。修飾された細胞は、生着後数ヶ月で観察できる。
【０４８０】
実施例１４−オフターゲット活性についての細胞内の優先ガイドの試験
上記実施例のＩＶＴスクリーニングから最高のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡは、他の方法に加えて、ハイブリッドキャプチャアッセイ、ＧＵＩＤＥ  Ｓｅｑ、および全ゲノム配列決定を使用して、オフターゲット活性について試験される。
【０４８１】
ＸＩ．同等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されているものである。
【０４８２】
グループの１つ以上のメンバーを含む「または」メンバー間の特許請求の範囲または説明は、反対のことが示されない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、所与の製品またはプロセスに１つ、複数、またはすべてのグループメンバーが存在する、採用される、または他の方法で関連する場合、満たされていると見なされる。本開示は、グループの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、用いられる、または他の方法で関連する実施形態を含む。本開示は、所与の製品またはプロセスに複数の、またはグループ全体のメンバーが存在する、用いられる、または他の方法で関連する実施形態を含む。
【０４８３】
加えて、先行技術に含まれる本開示の特定の実施形態は、特許請求の範囲のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていなくても、除外することができる。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療または活性成分、任意の製造方法、任意の使用方法など）は、理由の如何を問わず、先行技術の存在に関連しているか否かにかかわらず、１つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。
【０４８４】
使用された言葉は限定ではなく説明の言葉であり、そのより広い態様における本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範疇内で変更がなされ得ることを理解されたい。
【０４８５】
本開示は、いくつかの説明された実施形態に関してある程度詳細に説明されたが、そのような詳細または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきではないが、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって、本開示の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲に対する参照と解釈されるべきである。
【０４８６】
実施例に関する注記
本開示は、本開示の様々な態様および／またはその潜在的な用途を例示する目的で様々な特定の態様の説明を提供するが、当業者が変形および修正を想到することが理解される。したがって、本明細書に記載の１つまたは複数の発明は、少なくとも特許請求の範囲と同じくらい広く、本明細書で提供される特定の例示的な態様によってより狭く定義されるものではないことを理解されたい。
【０４８７】
本明細書で特定される任意の特許、出版物、または他の開示資料は、特に明記しない限り、組み込まれた資料が、本明細書に明示的に記載される既存の説明、定義、ステートメント、または他の開示資料と明示的に矛盾しない範囲でのみ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのため、必要な範囲で、本明細書に記載される明示的な開示は、参照により組み込まれた任意の矛盾する資料に優先する。参照により本明細書に組み込まれると言われているが、本明細書に記載されている既存の定義、ステートメント、または他の開示資料と矛盾する任意の資料またはその一部は、その組み込まれた資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲でのみ組み込まれる。出願人は、参照により本明細書に組み込まれる任意の主題またはその一部を明示的に列挙するために、本明細書を修正する権利を留保する。
【図１Ａ】
2020508056.tif 000015
【図１Ｂ】
2020508056.tif 000016
【図２】
2020508056.tif 000017
【図３】
2020508056.tif 000018
【図４】
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【図５Ａ】
2020508056.tif 000020
【図５Ｂ】
2020508056.tif 000021
【図６Ａ】
2020508056.tif 000022
【図６Ｂ】
2020508056.tif 000023
【図７Ａ】
2020508056.tif 000024
【図７Ｂ】
2020508056.tif 000025
【図８】
2020508056.tif 000026
【配列表】
2020508056000001.app
【国際調査報告】
2020508056.tif 000027
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2020508056.tif 000029
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