(57)【要約】  野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼもしくはその発現コンストラクトと比較してより高い特異性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントと、ｔＲＮＡ−ｇＲＮＡ融合体もしくはリボザイム−ｇＲＮＡ融合体のコード配列を含む発現コンストラクトとを含む、またはＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントのコード配列およびｔＲＮＡ−ｇＲＮＡもしくはリボザイム−ｇＲＮＡのコード配列を双方とも含む発現コンストラクトを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムが提供される。高い効率および高い特異性を有するゲノム編集システムを導入することによって細胞を遺伝子改変するための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のｉ）〜ｉｉｉ）、すなわち
ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、およびｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも１つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
前記ガイドＲＮＡの５’末端は、前記ｔＲＮＡの３’末端へ連結されており、
前記融合体は、細胞内で転写されたのち、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを前記５’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する、ゲノム編集システム。
【請求項２】
次のｉ）〜ｉｉｉ）、すなわち
ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも１つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
前記ガイドＲＮＡの５’末端は、第一のリボザイムの３’末端へ連結されており、
前記第一のリボザイムは、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端で前記融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを前記５’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する、ゲノム編集システム。
【請求項３】
改変されることになっているｔＲＮＡおよび細胞が、同じ種に由来する、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記ｔＲＮＡが、配列番号１において示される配列によってコードされる、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが配列番号２のバリアントであり、かつ配列番号２の位置８５５におけるアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がＫ８５５Ａである、請求項１または２記載のシステム。
【請求項６】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが配列番号２のバリアントであり、かつ配列番号２の位置８１０、１００３および１０６０においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がＫ８１０Ａ、Ｋ１００３ＡおよびＲ１０６０Ａである、請求項１または２記載のシステム。
【請求項７】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが配列番号２のバリアントであり、かつ配列番号２の位置８４８、１００３および１０６０においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がＫ８４８Ａ、Ｋ１００３ＡおよびＲ１０６０Ａである、請求項１または２記載のシステム。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが配列番号２のバリアントであり、かつ配列番号２の位置６１１、６９５および９２６においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がＲ６１１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａである、請求項１または２記載のシステム。
【請求項９】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが配列番号２のバリアントであり、かつ配列番号２の位置４９７、６１１、６９５および９２６においてアミノ酸置換を含み、例えば、前記アミノ酸置換がＮ４９７Ａ、Ｒ６１１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａである、請求項１または２記載のシステム。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが配列番号４、配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載のシステム。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードする前記ヌクレオチド配列が、改変されることになっている前記細胞が由来する生体についてコドンが最適化されている、請求項１または２記載のシステム。
【請求項１２】
前記ガイドＲＮＡが一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１または２記載のシステム。
【請求項１３】
細胞を遺伝子改変するための方法であって、請求項１から１２までのいずれか１項記載のシステムを前記細胞へ導入し、かつそれにより前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントが前記ガイドＲＮＡによって前記細胞の前記ゲノム内の前記標的配列へ定方向化され、かつ前記標的配列中の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を結果的に生じることを含む、方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびにイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）などの単子葉類および双子葉類を含む植物に由来する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記システムが、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームトランスフェクション、微量注射、ウイルス感染（バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルスなど）、微粒子銃、ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換およびアグロバクテリウム仲介形質転換から選択される方法によって前記細胞内へと導入される、請求項１３または１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関する。特に、本発明は、高い効率および高い特異性を有するゲノム編集方法に関する。より具体的には、本発明は、高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントによって生体のゲノム内の標的配列の部位特異的改変の効率を高めるための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
クラスター化して規則的に間を挿んだ短い回文構造状反復およびＣＲＩＳＰＲ関連システム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）は、ゲノム編集のための最も人気のあるツールである。このシステムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡの誘導の下で特異的ＤＮＡ配列を開裂させ、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）の細胞内修復機序を活性化させて、特異的ＤＮＡ配列が修復過程の間に編集されるように、細胞内ＤＮＡ損傷を修復することができる。現に、最も普遍的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムの欠点の１つが、その低い特異性およびオフターゲット効果であり、これらが、このゲノム編集システムの適用を大いに制限している。
【０００３】
効率的で高特異性のゲノム編集を可能にする方法およびツールが、当技術分野においてなおも必要とされている。
【０００４】
発明の概要
一態様において、本発明は、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、当該ゲノム編集システムは、次のｉ）〜ｉｉｉ）、すなわち
ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、およびｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも１つを含み、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドＲＮＡの５’末端は、ｔＲＮＡの３’末端へ連結されており、
融合体は、細胞内で転写された後、ガイドＲＮＡの５’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを５’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
【０００５】
第二の態様において、本発明は、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、当該ゲノム編集システムは、次のｉ）〜ｉｉｉ）、すなわち
ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも１つを含み、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドＲＮＡの５’末端は、第一のリボザイムの３’末端へ連結されており、
第一のリボザイムは、ガイドＲＮＡの５’末端で融合体を開裂させるよう設計されており、それにより余分なヌクレオチドを５’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
【０００６】
第三の態様において、本発明は、本発明のゲノム編集システムを細胞内へと導入し、それによりＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントがガイドＲＮＡによって細胞のゲノム内の標的配列へと定方向化され、かつ標的配列中の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を結果的に生じることを含む、細胞を遺伝子改変するための方法を提供する。
【０００７】
第四の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製された遺伝子改変細胞を含む、遺伝子改変生体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、Ｕ３またはＵ６を使用した場合に、異なる５’末端ヌクレオチドを有する標的配列についてｓｇＲＮＡを設計するための戦略を示す。Ａ：ｔＲＮＡとの融合によって、ｓｇＲＮＡは、標的配列の５’末端ヌクレオチドを考慮することなく設計されることができる。Ｂ：ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ融合体の正確な開裂。
【図２】図２は、クラス（１）の標的に関するＷＴ  ＳｐＣａｓ９（野生型ＳｐＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率を示す。
【図３】図３は、クラス（２）の標的に関するＷＴ  ＳｐＣａｓ９（野生型ＳｐＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率を示す。
【図４】図４は、Ｕ６プロモーターを使用した場合に、ｓｇＲＮＡの５’末端にある追加ヌクレオチドが編集効率に影響することを示す。
【図５】図５は、ＯｓＭＫＫ４遺伝子座に対して、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡによって編集効率を改善でき、かつｓｇＲＮＡと比較して高い特異性を維持できることを示す。
【図６】図６は、ＯｓＣＤＫＢ２遺伝子座に対して、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡの使用によって、高い特異性を維持しつつも、編集効率を野生型ＳｐＣａｓ９のレベルまで高めることができることを示す。
【図７】図７は、ｇＲＮＡと標的配列との間のミスマッチに対するＣａｓ９バリアントの編集特異性を示す。
【図８】図８は、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡによって、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率がヒト細胞内の野生型ＳｐＣａｓ９の編集効率まで改善されたことを示す。
【図９】図９は、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ融合体発現のためのｐＵＣ５７−Ｕ３−ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡベクターの配列構造を示す。
【０００９】
発明の詳細な説明
１．定義
本発明において、別段の記載がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を指す。また、タンパク質およびヌクレオチドの化学、分子生物学、細胞および組織の培養、微生物学、免疫学に関する本明細書で使用する用語および実験手順はすべて、当技術分野で一般的に使用される用語および従来の方法に属する。例えば、本明細書で使用する標準的なＤＮＡ組換えおよび分子クローン化技術は、当業者に周知であり、次の参考文献、すなわちＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９において詳細に説明されている。その一方で、本発明をより良好に理解するために、関連用語についての定義および説明を以下に提供する。
【００１０】
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」および「Ｃａｓ９」は、本明細書で互換的に使用することができ、Ｃａｓ９タンパク質およびそのフラグメント（Ｃａｓ９の活性のあるＤＮＡ開裂ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質など）を含む、ＲＮＡ定方向化ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化して規則的に間を挿んだ短い回文構造状反復およびその関連システム）ゲノム編集システムの構成要素であり、ＤＮＡ標的配列を標的としかつ開裂させ、ガイドＲＮＡの誘導の下でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する。
【００１１】
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書において互換的に使用することができ、典型的には、部分的な相補対を通じて複合体を形成するｃｒＲＮＡ分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ分子から構成され、ｃｒＲＮＡは、ハイブリッド形成のための標的配列と十分に相補的であり、かつＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）を定方向化させて標的配列へ特異的に結合する、配列を含む。しかしながら、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの双方の特徴を含む一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計できることは、当技術分野で公知である。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「ｔＲＮＡ」および「転移ＲＮＡ」という用語は、アミノ酸を保有しかつ輸送する機能を有する小分子ＲＮＡを指すために互換的に使用される。ｔＲＮＡ分子は通常、クローバー状へと折りたたまれる約７０〜９０のヌクレオチドの短鎖からなる。真核生物において、ゲノム内のｔＲＮＡ遺伝子はｔＲＮＡ前駆体へと転写され、このｔＲＮＡ前駆体が次に、ＲＮアーゼＰおよびＲＮアーゼＺによる５’および３’の追加の配列の切除後に成熟ｔＲＮＡへと加工される。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「リボザイム」という用語は、トランスリン酸エステル結合加水分解反応およびホスホジエステル結合加水分解反応を触媒することによってＲＮＡの開裂および加工に関与する触媒機能を有するＲＮＡ分子を指す。
【００１４】
本明細書で使用する「ゲノム」は、核内に存在する染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えば、ミトコンドリア、プラスチド）中に存在する小器官ＤＮＡも包含する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「生体」には、ゲノム編集に適したいかなる生体も含まれる。例示的な生体としては、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの家禽類、イネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などの単子葉類および双子葉類を含む植物、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１６】
「遺伝子改変生体」または「遺伝子改変細胞」は、そのゲノム内に外来性ポリヌクレオチドまたは改変された遺伝子もしくは発現制御配列を含有する生体または細胞を意味する。例えば、外来性ポリヌクレオチドは、生体または細胞のゲノム内へと安定して組み込まれ、かつ連続した世代について遺伝する。外来性ポリヌクレオチドは、ゲノム単独内へとまたは組換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込まれることができる。改変された遺伝子または発現制御配列とは、単一のまたは複数のデオキシヌクレオチドの置換、欠失および付加を含む、生体または細胞のゲノム内の配列である。
【００１７】
配列に関して「外来性の」という用語は、外来種から生じる配列、または同じ種からの場合には、人間による計画的な介在による組成物および／もしくはゲノムの遺伝子座においてその天然形態から実質的に改変された配列を意味する。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸フラグメント」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を場合により含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指すために互換的に使用される。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸塩形態で認められる）は、次のように一文字表記によって称される。すなわち、「Ａ」はアデニル酸塩またはデオキシアデニル酸塩であり（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡについて）、「Ｃ」はシチジル酸塩またはデオキシシチジル酸塩であり、「Ｇ」はグアニル酸塩またはデオキシグアニル酸塩であり、「Ｕ」はウリジル酸塩であり、「Ｔ」はデオキシチミジル酸塩であり、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）であり、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）であり、「Ｋ」はＧまたはＴであり、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴであり、「Ｉ」はイノシンであり、かつ「Ｎ」は何らかのヌクレオチドである。
【００１９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」は、アミノ酸残基からなるポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然のアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、および「タンパク質」という用語には改変体も含まれ、これには、グリコシル化、脂質結合、硫化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「発現コンストラクト」とは、組換えベクターなど、生体内での関心対象のヌクレオチド配列の発現に適したベクターを指す。「発現」とは、機能的産物の生成を指す。例えば、ヌクレオチド配列の発現とは、ヌクレオチド配列の転写（転写によるｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡの生成など）、および／またはＲＮＡからタンパク質前駆体もしくは成熟タンパク質への翻訳を指すことができる。
【００２１】
本発明の「発現コンストラクト」とは、線形核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクター、またはいくつかの実施形態においては、翻訳可能なＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であることができる。
【００２２】
本発明の「発現コンストラクト」とは、異なる源に由来する関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ源に由来するが天然において通常認められるものとは異なる様式で配置される関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２３】
「調節配列」または「調節エレメント」は互換的に使用され、コード配列の上流（５’非コード配列）に、コード配列内に、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連コード配列の転写、ＲＮＡ加工もしくはＲＮＡ安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含むことができるが、これらに限定されない。
【００２４】
「プロモーター」は、別の核酸フラグメントの転写を制御できる核酸フラグメントを指す。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターとは、細胞由来の如何にかかわらず、細胞内での遺伝子の転写を制御できるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターまたは発生過程で調節されるプロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。
【００２５】
「構成的プロモーター」とは、たいていの細胞型におけるたいていの状況において遺伝子の発現を生じることができるプロモーターを指す。「組織特異的プロモーター」および「組織に好ましいプロモーター」は、互換的に使用されており、１つの組織内または器官内で主として発現するが、必ずしも当該組織内または器官内でばかりではなく、１つの特定の細胞または細胞型においても発現できるプロモーターを指す。「発生過程で調節されるプロモーター」は、その活性が発生事象によって決定されるプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」は、内在性刺激または外来性刺激（環境、ホルモン、または化学シグナルなど）に応じて、当該プロモーターへ作動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、調節エレメント（例えば、プロモーター配列、転写終結配列などだがこれらに限定されない）が核酸配列（コード配列またはオープンリーディングフレームなど）と会合し、それによりヌクレオチド配列の転写が転写調節エレメントによって制御されかつ調節されることを意味する。調節エレメント領域を核酸分子へ作動可能に連結するための技術は、当技術分野で公知である。
【００２７】
生体内への核酸分子（例えば、プラスミド、線形核酸フラグメント、ＲＮＡなど）またはタンパク質の「導入」は、当該核酸またはタンパク質が生体の細胞内で機能するよう、当該細胞を形質転換するために使用されることを意味する。本発明で使用する場合、「形質転換」は、安定した形質転換および一過性の形質転換の双方を含む。「安定した形質転換」は、結果として外来遺伝子の安定した遺伝を生じる、ゲノム内への外来ヌクレオチド配列の導入を指す。いったん安定して形質転換されると、外来核酸配列は、生体およびその連続した世代のいずれかのゲノム内へと安定して組み込まれる。「一過性の形質転換」は、外来遺伝子の安定した遺伝なくその機能を実行する、細胞内への核酸分子またはタンパク質の導入を指す。一過性の形質転換において、外来核酸配列は、ゲノム内へと組み込まれることはない。
２．高い効率および高い特異性を有するゲノム編集システム
Ｆｅｎｇ  ＺｈａｎｇらのＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントｅＳｐＣａｓ９（１．０）（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）、およびＪ．Ｋｅｉｔｈ  Ｊｏｕｎｇらによって開発されたＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）は、ゲノム編集におけるオフターゲット率を有意に低減させることができ、したがって高い特異性を有する。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、これら３つのＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントが、高い特異性を有するものの、野生型Ｃａｓ９と比較して非常により低い遺伝子編集効率を有することを発見した。
【００２８】
本発明者らは驚くべきことに、ガイドＲＮＡの５’末端をｔＲＮＡへ融合させることによって、高い特異性を維持しつつ、高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントの編集効率を野生型レベルに高めることさえ可能であることを発見した。
【００２９】
いかなる理論による制限をも意図するものではないが、高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントの編集効率の低減は、ガイドＲＮＡの転写が正確に開始されることができるか否かに関連すると考えられている。当技術分野において、ガイドＲＮＡを生体内で生成するために通常使用されるプロモーターとしては、例えば、その転写がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって駆動されるＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＵ３ｓｎＲＮＡプロモーターが挙げられる。Ｕ６プロモーターは、Ｇにおける転写を開始するために必要とし、したがって、Ａ、ＣまたはＴの第一のヌクレオチドを有する標的配列について、追加のＧは、転写されるとｓｇＲＮＡの５’末端に存在することになる。Ｕ３プロモーターは、Ａにおける転写を開始し、したがって、Ｇ、ＣまたはＴの第一のヌクレオチドを有する標的配列について、追加のＡは、転写されるとｓｇＲＮＡの５’末端に存在することになる。本発明者らは、追加のヌクレオチドがｓｇＲＮＡの５’末端に存在する場合に、高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントの編集効率が低減することを発見した。ｔＲＮＡを正確に加工する（ｔＲＮＡ前駆体の５’および３’の追加的な配列を正確に除去して成熟ｔＲＮＡを形成する）機序によるｔＲＮＡとの融合転写によって、追加のヌクレオチドを５’末端に有さないｓｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターまたはＵ３プロモーターを用いる場合でさえ、標的配列の第一のヌクレオチドの型を考慮する必要なく、容易に得ることができる。それにより、高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントの編集効率を改善でき、標的配列の選択可能な範囲を拡大することができる。加えて、いかなる理論による制限をも意図するものではないが、ｔＲＮＡとの融合によって、ｓｇＲＮＡの発現レベルを高めることができ、このことも、高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントの編集効率の改善に寄与し得る。
【００３０】
それゆえ、本発明は、次のｉ）〜ｉｉｉ）、すなわち
ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、およびｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも１つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有し、
ガイドＲＮＡの５’末端は、ｔＲＮＡの３’末端へ連結されており、
融合体は、細胞内で転写された後にガイドＲＮＡの５’末端で開裂し、それにより余分なヌクレオチドを５’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する、ゲノム編集システムを提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、改変されることになっているｔＲＮＡおよび細胞は、同種由来である。
【００３２】
いくつかの具体的な実施形態において、ｔＲＮＡは、次の配列、すなわちａａｃａａａｇｃａｃｃａｇｔｇｇｔｃｔａｇｔｇｇｔａｇａａｔａｇｔａｃｃｃｔｇｃｃａｃｇｇｔａｃａｇａｃｃｃｇｇｇｔｔｃｇａｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｇｔｇｃａ（配列番号１）によってコードされる。
【００３３】
ｔＲＮＡ−ガイドＲＮＡ融合体の設計は、当業者の技術の内である。例えば、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｍａｒ  １７，２０１５；  ｖｏｌ．１１２，ｎｏ．１１，３５７０〜３５７５を参照することができる。
【００３４】
本発明は、ガイドＲＮＡとリボザイムとの融合体も考慮する。高特異性Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントの編集効率がｓｇＲＮＡの正確な転写開始に関するという、本発明において発見されたことに基づいて、特異的な部位におけるＲＮＡを切断するリボザイムの能力を用いることによって、高い特異性を維持しながら編集効率を改善するよう、ＲＮＡとリボザイムとの融合体の合理的な設計によって、５’末端における追加のヌクレオチドなしでｓｇＲＮＡを生成することができる。
【００３５】
それゆえ、本発明は、次のｉ）〜ｉｉｉ）、すなわち
ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント、およびリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、ならびに
ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列とリボザイム−ガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
から選択される少なくとも１つを含む、細胞のゲノム内の標的配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集システムであって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有しており、
ガイドＲＮＡの５’末端は、第一のリボザイムの３’末端へ連結されており、
第一のリボザイムは、ガイドＲＮＡの５’末端で融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを５’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する、ゲノム編集システムも提供する。
【００３６】
一実施形態において、ガイドＲＮＡの３’末端は、第二のリボザイムの５’末端へ連結されており、第二のリボザイムは、ガイドＲＮＡの３’末端で融合体を開裂させるよう設計され、それにより余分なヌクレオチドを３’末端に保有していないガイドＲＮＡを形成する。
【００３７】
第一のリボザイムまたは第二のリボザイムの設計は、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩＰＢ，Ａｐｒ，２０１４；  Ｖｏｌ  ５６，Ｉｓｓｕｅ  ４，３４３〜３４９を参照することができる。
【００３８】
１つの具体的な実施形態において、第一のリボザイムは、次の配列、すなわち５’−（Ｎ）６ＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＣＴＣＧＴＣ−３’（配列番号１２）によってコードされ、ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴから独立して選択され、かつ（Ｎ）６は、ガイドＲＮＡの５’末端で最初の６個のヌクレオチドとは逆相補的な配列を指す。１つの具体的な実施形態において、第二のリボザイムは、次の配列、すなわち５’−ＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１３）によってコードされる。
【００３９】
野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してより高い特異性を有する、本発明におけるＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、種々の種のＣａｓ９に、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９、ヌクレオチド配列を配列番号２に示し、アミノ酸配列を配列番号３に示す）に由来することができる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、配列番号２の位置８５５においてアミノ酸置換を含む、配列番号２のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、位置８５５におけるアミノ酸置換はＫ８５５Ａである。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、配列番号２の位置８１０、１００３および１０６０におけるアミノ酸置換を含む、配列番号２のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３ＡおよびＲ１０６０Ａである。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、配列番号２の位置８４８、１００３および１０６０におけるアミノ酸置換を含む、配列番号２のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３ＡおよびＲ１０６０Ａである。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、配列番号２の位置６１１、６９５および９２６におけるアミノ酸置換を含む、配列番号２のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、Ｒ６１１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａである。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、配列番号２の位置４９７、６１１、６９５および９２６におけるアミノ酸置換を含む、配列番号２のバリアントである。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸置換はそれぞれ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６１１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａである。
【００４５】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、配列番号４（ｅＳｐＣａｓ９（１．０））、配列番号５（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））または配列番号６（ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１）において示されるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。概して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントにおける１つ以上のＮＬＳは、細胞の核内でのＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントの、ゲノム編集機能のために十分な量の蓄積を駆動するのに十分な強度を有するべきである。概して、核局在化活性の強度は、ＮＬＳの数および位置、ならびにＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントにおいて使用する１つ以上の具体的なＮＬＳ、またはこれらの組み合わせによって決まる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントのＮＬＳは、Ｎ末端および／またはＣ末端に位置することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、Ｎ末端にまたはＮ末端の近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、Ｃ末端にまたはＣ末端の近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、Ｎ末端にある１つ以上のＮＬＳおよびＣ末端にある１つ以上のＮＬＳなど、ＮＬＳの組み合わせを含む。１つを超えるＮＬＳがある場合、各ＮＬＳは、他のＮＬＳとは独立しているものとして選択することができる。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、２つのＮＬＳを含み、例えば、この２つのＮＬＳはそれぞれ、Ｎ末端およびＣ末端に位置する。
【００４８】
概して、ＮＬＳは、タンパク質の表面上に曝露した正に帯電しているリジンまたはアルギニンからなる１つ以上の短い配列からなるが、他の型のＮＬＳも当技術分野で公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、ＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣ−３’）、ＰＫＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’またはＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴ）、またはＳＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’）が挙げられる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントのＮ末端は、ＰＫＫＫＲＫＶによって示されるアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントのＣ末端は、ＳＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶによって示されるアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。
【００５０】
加えて、本発明のＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、編集されることになっているＤＮＡの位置によって、細胞質局在化配列、染色質局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、およびこれらに類するものなど、他の局在化配列も含むことができる。
【００５１】
標的細胞における有効な発現を得るために、本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列は、ゲノム編集されることになっている細胞が由来する生体に対してコドンが最適化されている。
【００５２】
コドンの最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または約１超、２超、３超、４超、５超、１０超、１５超、２０超、２５超、５０超、またはそれより多数のコドン）を、関心対象の宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、当該宿主細胞における発現の亢進のために核酸配列を改変する過程を指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンのバイアス（生体間でのコドンの使用の差）はしばしば、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関しており、このことは順に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性、および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性によると考えられている。細胞内での選択されたｔＲＮＡの優性は一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子を、コドンの最適化に基づく所与の生体における最適な遺伝子発現のために調製することができる。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／において入手可能な「コドン使用データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法において応用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：  ２９２（２０００）を参照されたい。
【００５３】
本発明のシステムによってゲノム編集されることができる細胞が由来する生体には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびに単子葉類および双子葉類、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を含む植物、ならびにこれらに類するものが含まれるが、それらに限定されない。
【００５４】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするコドンの最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号７（ｅＳｐＣａｓ９（１．０））、配列番号８（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））または配列番号９（ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１）に示されるとおりである。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡとは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。所与の標的配列による適切なｓｇＲＮＡを構築する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅｘａｐｌｏｉｄ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，９４７〜９５１（２０１４）、Ｓｈａｎ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，６８６〜６８８（２０１３）、Ｌｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４１，６３〜６８（２０１４）を参照されたい。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列、および／またはガイドＲＮＡ融合体をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターなどの発現調節エレメントへ作動可能に連結されている。
【００５７】
本発明において使用することができるプロモーターの例としては、ポリメラーゼ（ｐｏｌ）Ｉプロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ｐｏｌＩプロモーターの例としては、ニワトリＲＮＡｐｏｌＩプロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長鎖末端リピート（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）最初期プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターが挙げられる。メタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用することができる。プロモーターの他の例としては、Ｔ７バクテリオファージプロモーター、Ｔ３バクテリオファージプロモーター、β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびＳｐ６バクテリオファージプロモーターなどが挙げられる。植物に使用した場合に、使用することができるプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、コムギＵ６プロモーター、イネＵ３プロモーター、トウモロコシＵ３プロモーターおよびイネアクチンプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
３．細胞を遺伝子改変するための方法
別の態様において、本発明は、本発明のゲノム編集システムを細胞へ導入し、それによりＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントがガイドＲＮＡによって細胞のゲノム内標的配列を標的とし、結果的に標的配列における１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を生じる、細胞を遺伝子改変するための方法を提供する。
【００５８】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ複合体によって認識されかつ標的とされることができる標的配列の設計は、当業者の技術の内である。概して、標的配列とは、ガイドＲＮＡにおいて含まれる約２０個のヌクレオチドのリーダー配列と相補的な配列であり、その３’末端は、プロトスペーサー付近のモチーフ（ＰＡＭ）ＮＧＧのすぐ近くにある。
【００５９】
例えば、本発明のいくつかの実施形態において、標的配列は、構造：５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’を有し、ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴから独立して選択され、Ｘは１４≦Ｘ≦３０の整数であり、ＮＸはＸ個の連続したヌクレオチドを表し、かつＮＧＧはＰＡＭ配列である。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｘは２０である。
【００６０】
本発明において、改変されることになっている標的配列は、ゲノム内のいかなるところへも、例えば、タンパク質コード遺伝子などの機能的遺伝子内に位置することができ、または例えば、プロモーター領域もしくはエンハンサー領域などの遺伝子発現調節領域の中に位置することができ、それにより当該遺伝子の機能的改変を達成することができ、または遺伝子発現の改変を達成することができる。
【００６１】
細胞の標的配列における置換、欠失および／または付加は、Ｔ７ＥＩ、ＰＣＲ／ＲＥまたは配列決定法によって検出することができ、例えば、Ｓｈａｎ，Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｊ．＆  Ｇａｏ，Ｃ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  ｗｈｅａｔ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．９，２３９５〜２４１０（２０１４）を参照されたい。
【００６２】
本発明の方法において、ゲノム編集システムは、当業者に周知の種々の方法を用いて細胞内へと導入することができる。
【００６３】
本発明のゲノム編集システムを細胞内へと導入するための方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームトランスフェクション、微量注射、ウイルス感染（バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルスなど）、微粒子銃、ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換またはアグロバクテリウム仲介形質転換が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明の方法を用いたゲノム編集へ供することができる細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびにイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）などの単子葉類および双子葉類を含む植物などに由来することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は試験管内で実施される。例えば、細胞は単離された細胞である。いくつかの他の実施形態において、本発明の方法は、生体内で実施することができる。例えば、細胞は生体内の細胞であり、本発明のシステムは、例えばウイルス仲介法を用いることによって、当該細胞内へと生体内導入することができる。いくつかの実施形態において、細胞は生殖細胞である。いくつかの実施において、細胞は体細胞である。
【００６６】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製された遺伝子改変細胞を含む遺伝子改変生体をさらに提供する。
【００６７】
生体には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびネコなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類、ならびにイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）などの単子葉類および双子葉類を含む植物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
実施例
材料および方法
二成分発現ベクターｐＪＩＴ１６３−ＳｐＣａｓ９、ｐＪＩＴ１６３−ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｐＪＩＴ１６３−ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびｐＪＩＴ１６３−ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の構築
ＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の配列をイネについてコドンの最適化を行った。ＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、ｐＪＩＴ１６３−ＳｐＣａｓ９プラスミド（配列番号１０）をテンプレートとして用いるＦａｓｔ  ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｒａｎｓＧｅｎ）を用いる部位特異的変異誘発によって得た。
【００６９】
ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築
本実験において使用されるｓｇＲＮＡ標的配列を次のとおり表１に示す。
【００７０】
【表１】
2020508046.tif 000002
【００７１】
ｓｇＲＮＡ発現ベクターであるｐＯｓＵ３−ＣＤＫＢ２−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−ＭＫＫ４−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−Ａ１−ｓｇＲＮＡ、ならびにｐＯｓＵ３−Ａ２−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−Ａ３−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−Ａ４−ｓｇＲＮＡおよびｐＯｓＵ３−ＰＤＳ−ｓｇＲＮＡを、先に説明されているｐＯｓＵ３−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ５３０６３）に基づいて構築する（Ｓｈａｎ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，６８６〜６８８，２０１３）。
【００７２】
ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築
ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ発現ベクターを、ｐＵＣ５７−Ｕ３−ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡベクター（配列番号１１、図６）に基づいて構築する。ＢｓａＩを用いたｐＵＣ５７−Ｕ３−ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡの消化後に線形ベクターを得、対応する順方向オリゴおよび逆方向オリゴをアニーリングし、線形ベクターへと結合し、その後の工程は、ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築と同様である。
【００７３】
【表２】
2020508046.tif 000003
【００７４】
プロトプラストアッセイ
イネ品種日本晴を本研究に使用する。プロトプラスト形質転換は、以下に説明するとおり実施する。形質転換は、ＰＥＧ仲介トランスフェクションによって、各プラスミド１０μｇを用いて行う。プロトプラストを４８時間後に収集し、ＤＮＡをＰＣＲ−ＲＥアッセイのために抽出した。
【００７５】
イネプロトプラストの調製および形質転換
１）播種の葉鞘をプロトプラスト単離に使用し、鋭利な刃で幅約０．５ｍｍへと切断した。
【００７６】
２）切断直後、０．６Ｍマンニトール溶液中に移し、暗所で１０分間置いた。
【００７７】
３）マンニトール溶液を濾過によって除去し、生成物を酵素分解溶液中へと移し、３０分間真空排気した。
【００７８】
４）酵素分解を暗所で５〜６時間、緩徐に振盪しながら実施した（脱色振盪器、速度１０）。
【００７９】
５）酵素分解の完了後、等容積のＷ５を添加し、１０秒間水平振盪してプロトプラストを放出させた。
【００８０】
６）プロトプラストを５０ｍｌの丸底遠心チューブ内へと４０μｍのナイロン膜で濾過し、Ｗ５溶液で洗浄した。
【００８１】
７）２５０ｇの横形遠心分離を３分間行って、プロトプラストを沈殿させ、上清を廃棄した。
【００８２】
８）１０ｍｌのＷ５を添加することによってプロトプラストを再懸濁し、次いで２５０ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【００８３】
９）適量のＭＭＧ溶液を添加してプロトプラストを２×１０６／ｍｌの濃度まで再懸濁した。
【００８４】
注：上記の工程は、すべて室温で行った。
【００８５】
１０）１０〜２０μｇのプラスミド、２００μｌのプロトプラスト（約４×１０５個の細胞）、および２２０μｌの新鮮なＰＥＧ溶液を２ｍｌの遠心チューブに入れ、混合し、かつ室温で暗所で１０〜２０分間置いて、形質転換を誘導した。
【００８６】
１１）形質転換の完了後、８８０μｌのＷ５溶液を緩徐に添加し、チューブを混合のために緩徐に転倒混和し、２５０ｇの横形遠心分離を３分間行い、上清を廃棄した。
【００８７】
１２）生成物を２ｍｌのＷＩ溶液中に再懸濁し、６ウェルプレートへ移し、室温（または２５℃）で暗所で培養した。プロトプラストゲノムＤＮＡ抽出のために、生成物は４８時間培養する必要がある。
【００８８】
ディープシーケンシングによる変異同定
ディープシーケンシング分析は、Ｌｉａｎｇ，Ｚ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｏ，Ｑ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｒａｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８，１４２６１を参照して実施する。
【００８９】
実施例１：標的部位に対するＷＴ  ＳｐＣａｓ９およびそのバリアントの編集能力の比較
ＷＴ  ＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１をそれぞれ一過性発現ベクターｐＪＩＴ１６３内に構築し、ＷＴ  ＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の発現をトウモロコシユビキチン遺伝子プロモーターによって駆動する。ｓｇＲＮＡをｐＯｓＵ３−ｓｇＲＮＡベクター内に構築し、ｓｇＲＮＡの発現をＯｓＵ３プロモーターによって駆動する。イネプロトプラストを形質転換し、プロトプラストＤＮＡをＰＣＲ−ＲＥ分析のために抽出し、変異効率を査定した。５つの標的部位（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４およびＰＤＳ）（図２および図３を参照されたい）を選択して、野生型ＳｐＣａｓ９ならびにｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集能力の違いを比較する。
【００９０】
ＯｓＵ３プロモーターは、ヌクレオチドＡで転写を開始しなければならず、それゆえ、標的部位についてのｓｇＲＮＡ発現ベクターの設計を、次のように２つの条件に分けることができる。
【００９１】
（１）所望のｓｇＲＮＡ標的配列（２０ｂｐ）の５’末端における第一のヌクレオチドが、Ｇ／Ｔ／Ｃのいずれか１つである場合、Ｕ３プロモーターはＡで転写を開始するので、転写されたｓｇＲＮＡの５’末端へ追加のＡが付加され、さらに、転写されたｓｇＲＮＡは、標的配列と完全にマッチすることができない。ｓｇＲＮＡ発現ベクターは、図１においてＵ３＋ＡＮ２０として構築することができるのに対し、Ｎ２０は標的配列であり、Ａは５’末端における追加のヌクレオチドである。
【００９２】
（２）所望のｓｇＲＮＡ標的配列（２０ｂｐ）の５’末端における第一のヌクレオチドがＡである場合、転写を開始するためにＵ３プロモーターによって使用されることができ、それゆえ、追加のヌクレオチドは、転写されたｓｇＲＮＡの５’末端には存在しない。ｓｇＲＮＡ発現ベクターは、図１においてＵ３＋ＡＮ１９として構築することができるのに対し、ＡＮ１９は標的配列である。
【００９３】
選択された標的部位Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＰＤＳはクラス（１）の標的部位に属し、標的部位Ａ４はクラス（２）の標的部位に属する。
【００９４】
本実験結果は、クラス（１）の標的部位に対するｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率が極度に低いことを示す。ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率とＷＴ  ＳｐＣａｓ９の編集効率との違いは、クラス（２）の標的部位に対しては有意ではない。このことは、転写から結果として生じるｓｇＲＮＡの５’末端における追加のヌクレオチドが、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率を低減させることができることを示す。
【００９５】
ＯｓＵ３プロモーターと同様に、トウモロコシＵ６プロモーター（ＴａＵ６）は、ヌクレオチドＧで転写を開始しなければならず、それゆえ、標的部位に対するｓｇＲＮＡ発現ベクターの設計を、次のように２つの条件に分けることができる。
【００９６】
（１）所望のｓｇＲＮＡ標的配列（２０ｂｐ）の５’末端における第一のヌクレオチドがＡ／Ｔ／Ｃのいずれか１つである場合、Ｕ６プロモーターがＧで転写を開始するので、転写されたｓｇＲＮＡの５’末端に追加のＧが付加され、さらに、転写されたｓｇＲＮＡは、標的配列と完全にマッチすることができない。
【００９７】
（２）所望のｓｇＲＮＡ標的配列（２０ｂｐ）の５’末端における第一のヌクレオチドがＧである場合、転写を開始するためにＵ６プロモーターによって使用されることができ、それゆえ、追加のヌクレオチドは、転写されたｓｇＲＮＡの５’末端に存在しない。
【００９８】
ＯｓＰＤＳ標的部位は、クラス（２）の標的部位に属する。ＴａＵ６プロモーターを使用して、ＯｓＰＤＳ標的部位に対するＧＮ１９ｓｇＲＮＡおよびＧＮ２０ｓｇＲＮＡの転写を駆動し、ここで、ＧＮ２０は、クラス（１）の標的部位を、すなわちｓｇＲＮＡの５’末端における追加のＧで模倣することができる。
【００９９】
【表３】
2020508046.tif 000004
【０１００】
本結果は、ｓｇＲＮＡの５’末端における１つの追加のＧが、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率を有意に低減させることを示す（図２）。
【０１０１】
実施例２：ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ融合によるＣａｓ９バリアントの編集効率の上昇
実施例１の結果によると、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率に影響する重要な因子は、ｓｇＲＮＡが正確に開始されているか否かである。
【０１０２】
先行報告によると、ｔＲＮＡとｓｇＲＮＡの５’末端との融合は、ｓｇＲＮＡの発現を上方調節し、結果的にｓｇＲＮＡの５’末端における正確な開裂を生じ、それによりｓｇＲＮＡの５’末端における追加のヌクレオチドを回避する（Ｘｉｅ  Ｋ，Ｍｉｎｋｅｎｂｅｒｇ  Ｂ，Ｙａｎｇ  Ｙ．Ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔＲＮＡ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５  Ｍａｒ  １７；  １１２（１１）：  ３５７０〜３５７５．ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１４２０２９４１１２．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｍａｒ  ２を参照されたい）。
【０１０３】
実施例１における各標的部位に対するｓｇＲＮＡをｔＲＮＡと融合させて、ＯｓＵ３プロモーターの制御下で発現させた。実施例１における方法によって、ｓｇＲＮＡの替わりにｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを用いて、実験を実施した。図２に示すように、標的部位Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＰＤＳに対して、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率は、ｓｇＲＮＡの替わりにｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを用いると有意に上昇する。
【０１０４】
実施例３：Ｃａｓ９バリアントの編集特異性へのｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ融合体の影響
３．１  イネＯｓＭＫＫ４標的部位
イネ遺伝子ＭＫＫ４における標的部位ＧＡＣＧＴＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧを選択して、ｓｇＲＮＡおよびｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを設計した。この標的部位は、図５に示すような２つの可能なオフターゲット部位を有する。ｓｇＲＮＡまたはｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを発現させるためのベクター、ならびにＷＴＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を発現させるためのベクターをそれぞれ、イネプロトプラスト内へと同時形質転換した。形質転換の２日後、プロトプラストＤＮＡを抽出し、標的部位およびオフターゲット部位のゲノムフラグメントを、特異的プライマーによって増幅した。この３つの部位の変異率を、第二世代配列決定技術を用いて分析した。
【０１０５】
本実験結果を図５に示す。
【０１０６】
ｓｇＲＮＡを使用すると、ＷＴＳｐＣａｓ９と比較して、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、極度に低いオフターゲット効果を有するが、有意により低い編集効率を有する。
【０１０７】
ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを使用すると、各群の編集効率は上昇したが、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は比較的高い特異性を維持できる。特にＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に対しては、極度に低レベルの変異のみを２つのオフターゲット部位について双方とも検出することができる。それゆえ、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡとＳｐＣａｓ９−ＨＦ１との組み合わせは、高い効率および高い特異性を有するゲノム編集に特に適している。
【０１０８】
３．２  イネＯｓＣＤＫＢ２標的部位
イネ遺伝子ＯｓＣＤＫＢ２における標的部位ＡＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＴＡＣＧＧＧを選択して、ｓｇＲＮＡを設計した。この標的部位は、図６に示すように３つの可能なオフターゲット部位を有する。ｓｇＲＮＡまたはｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを発現させるためのベクターならびにＷＴＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を発現させるためのベクターをそれぞれ、イネプロトプラスト内へと同時形質転換した。形質転換の２日後、プロトプラストＤＮＡを抽出し、特異的プライマーを使用することによって標的部位およびオフターゲット部位のゲノムフラグメントを増幅した。この４つの部位の変異率をディープシーケンシングによって分析した。
【０１０９】
本実験結果を図６に示す。標的部位に対するｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率は、ｓｇＲＮＡの替わりにｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを用いることによって有効に上昇する。特に、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率は、野生型のレベルまで復元させることができ、高い特異性を維持できる。この標的配列はＡで開始するので、ＡによってＵ３プロモーターが転写を正確に開始することができ、編集効率の上昇が、ｔＲＮＡとの融合体によるｓｇＲＮＡの発現レベルの上昇から結果的に生じるのかもしれない。
【０１１０】
実施例４：ｇＲＮＡと標的配列とのミスマッチに対するＣａｓ９バリアントの編集特異性
イネ遺伝子ＭＫＫ４における標的部位ＧＡＣＧＴＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧについてｓｇＲＮＡを設計するとき、２つの隣接した塩基のミスマッチを人工的に導入した（プリンに対してはプリン、かつピリミジンに対してはピリミジン）。ｓｇＲＮＡがこの標的部位と完全にマッチすることができない条件下での編集を検出した。編集を検出することができる場合、オフターゲットとしてみなす。本実験は、実施例３．１における実験と同様の方法で実施した。
【０１１１】
本実験結果を図７に示した。ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡを使用した場合に、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡと標的配列とのミスマッチ（特に、いずれかの末端に対してより近いミスマッチ）に対してより高い感受性を示した。
【０１１２】
実施例５：ヒト胚性腎２９３細胞におけるＣａｓ９バリアントの編集効率および編集特異性
ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子内の標的配列ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＧに対してｓｇＲＮＡを設計した。Ｕ６：ｓｇＲＮＡ−ＧＮ１９およびＵ６：ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ−Ｎ２０は、Ｕ６プロモーターで転写されたｓｇＲＮＡが長さ２０ｎｔであり、かつ標的配列と完全にマッチすることを表し、Ｕ６：ｓｇＲＮＡ−ＧＮ２０は、Ｕ６プロモーターで転写されたｓｇＲＮＡが長さ２１ｎｔであり、かつ追加のＧを５’末端に含有することを表す。
【０１１３】
Ｔ７Ｅ１アッセイの結果は、異なる戦略で転写されたｓｇＲＮＡを使用したとき、ＷＴ  Ｃａｓ９が同様の編集効率を呈することを示す（図８）。しかしながら、ｓｇＲＮＡが追加のヌクレオチドを５’末端に含有するとき、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率は、有意に低減した。さらに、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ融合体を用いることによって、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の編集効率は、ＷＴ  Ｃａｓ９の編集効率までまたはそれより高くにさえ上昇した。
【０１１４】
編集特異性に関して、ＷＴ  Ｃａｓ９は、オフターゲット１およびオフターゲット２の両部位においてオフターゲット編集を結果的に生じた。ｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、ｔＲＮＡ−ｓｇＲＮＡ融合体を使用したとき、オフターゲット編集を結果的に生じなかった。
【０１１５】
【表４】
2020508046.tif 000005
【図１】
2020508046.tif 000006
【図２】
2020508046.tif 000007
【図３】
2020508046.tif 000008
【図４】
2020508046.tif 000009
【図５】
2020508046.tif 000010
【図６】
2020508046.tif 000011
【図７】
2020508046.tif 000012
【図８】
2020508046.tif 000013
【図９】
2020508046.tif 000014
【配列表】
2020508046000001.app
【国際調査報告】
2020508046.tif 000015
2020508046.tif 000016
2020508046.tif 000017
2020508046.tif 000018