(57)【要約】抗体分子およびＴＣＲ分子などのポリペプチド、ならびにそれを作製する方法が開示される。そのポリペプチドは、障害を処置し、防止し、および／または診断するために使用することができる。この開示は、少なくとも部分的に、本明細書に開示された構造的または機能的特性の１つまたは複数を含む結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子）を提供する。ある実施形態では、その結合ポリペプチドのライブラリー、そのポリペプチドまたはライブラリーを作製するための方法、その結合ポリペプチドをコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、組成物（例えば、薬学的組成物）、キット、および容器を作製するための方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、重鎖（ＨＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、軽鎖（ＬＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）前記ＨＣストランドを前記ＬＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
【請求項２】
前記ＨＣエレメントが、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＣエレメントが、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列が、発現した時、前記ＨＣエレメントおよび前記ＬＣエレメントが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップが、以下：
ａ）以下：
（ｉ）前記細胞由来の前記ＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
（ｉｉ）前記細胞由来の前記ＬＣＶＲをコードし、捕捉支持体を生成する第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、
と結合した捕捉支持体を獲得するステップ、ならびに
ｂ）前記第１および前記第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、前記隔離された産生反応部位を維持して、以下：
前記細胞由来の前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および
前記細胞由来の前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップ
を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉支持体が、ビーズ、およびｃＤＮＡと結合する部分を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記隔離された産生反応部位が、前記第１および前記第２のｍＲＮＡから、前記細胞の前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメント、をコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および前記細胞の前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび前記第２のｄｓ  ｃＤＮＡが、プライマーの存在下で増幅され、前記プライマーの少なくとも１つが、第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間のヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾がＤＮＡ合成を低下させる、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド修飾が、２個の隣接したヌクレオチド間のスペーサーの挿入、またはリボースへの修飾を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーの少なくとも１つのプライマーが、リン酸化されており、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハングおよび平滑末端を含み、かつ前記ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが５’オーバーハングおよび平滑末端を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが、共有結合性に連結されて一本鎖核酸配列を生じ、前記ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結され、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、前記ＨＣストランドと前記ＬＣストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして連結部位において二重鎖領域を形成する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記スプリントオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ合成を阻害する修飾を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップであって、
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）前記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび前記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位を獲得するステップ；ならびに
ｂ）前記細胞の溶解、ならびに前記捕捉支持体を、前記第１のｍＲＮＡおよび前記第２のｍＲＮＡと結合させて、前記ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、前記隔離された細胞反応部位を維持するステップ
を含み、前記隔離された細胞反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ
をさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で、前記隔離された細胞反応部位から、前記ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を放出させるステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸配列を増幅するステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸配列を発現して、前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメント、および前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドを抗原と接触させ、前記ポリペプチドが前記抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項１〜２３のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、ステップ
を含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＨＣエレメントおよびＬＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
【請求項２５】
前記ライブラリーが、以下：
ａ）前記複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む、
ｂ）前記複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む、
ｃ）前記ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、固有メンバーである、または
ｄ）前記ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、固有メンバーである、
の特性のうちの１つ、２つ、３つまたは全てを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法により作製されたライブラリー。
【請求項２７】
前記ライブラリーがディスプレイライブラリーである、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２８】
ａ）請求項２６または２７に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドを抗原に接触させるステップ、および前記抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメントをコードするセグメントを含むα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、α鎖（ＡＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメントをコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、β鎖（ＢＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＡＣストランドをＢＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＢＣＶＲまたはＡＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
【請求項３１】
前記核酸配列が、発現した時、前記ＡＣエレメントおよび前記ＢＣエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＡＣＶＲおよび前記ＢＣＶＲがマッチしている、ステップ
を含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＡＣエレメントおよびＢＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法により作製されたライブラリー。
【請求項３５】
ａ）請求項３４に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
【請求項３６】
ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメントをコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、γ鎖（ＧＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメントをコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、δ鎖（ＤＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＧＣストランドをＤＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＤＣＶＲまたはＧＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
【請求項３７】
前記核酸配列が、発現した時、前記ＧＣエレメントおよび前記ＤＣエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＧＣＶＲおよび前記ＤＣＶＲがマッチしている、ステップ
を含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＧＣエレメントおよびＤＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法により作製されたライブラリー。
【請求項４１】
ａ）請求項４０に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
【請求項４２】
ａ）細胞由来のＨＣＶＲの重鎖（ＨＣ）エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；ならびに
ｂ）前記細胞由来のＬＣＶＲの軽鎖（ＬＣ）エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド、
ｃ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間のヌクレオチド修飾を含むプライマーであって、前記ヌクレオチド修飾がＤＮＡ合成を低下させる、プライマー
を含む、隔離された産生反応部位であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしており、かつ前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、隔離された産生反応部位。
【請求項４３】
前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、請求項４２に記載の隔離された産生反応部位。
【請求項４４】
第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間に位置したスペーサーを含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造または二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記スペーサーが可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
ａ）細胞由来のＨＣＶＲの重鎖（ＨＣ）エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；
ｂ）前記細胞由来のＬＣＶＲの軽鎖（ＬＣ）エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド；ならびに
ｃ）前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして、連結の部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチド
を含む、隔離された連結反応部位であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしており、前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが共有結合性に連結され、前記隔離された連結反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、隔離された連結反応部位。
【請求項４７】
リガーゼをさらに含む、請求項４６に記載の隔離された連結反応部位。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年１２月２３日に出願された米国仮出願第６２／４３８，７１２号の利益を主張する。上記出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体療法は、疾患関連生物学的分子と特異的に相互作用する能力があるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む免疫療法の一クラスである。ここ数年、治療抗体がターゲティングしうる疾患分野は、かなり拡大しており、いくつかのモノクローナル抗体および抗体誘導体生成物が、米国および多くの他の国において治療的使用に認可されている。モノクローナル抗体療法は、現在、様々な疾患または状態を処置するために使用され、または調べられており、その疾患または状態には、例えば、感染性疾患、がん、免疫疾患、臓器移植、循環器疾患、および代謝性疾患が含まれる。
【０００３】
様々な生物学的機能をモジュレートすることにおけるモノクローナル抗体および抗体誘導体生成物の能力を考慮すれば、障害を処置し、防止し、および診断するのに適した抗体の作出のための新しい手法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この開示は、少なくとも部分的に、本明細書に開示された構造的または機能的特性の１つまたは複数を含む結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子）を提供する。ある実施形態では、その結合ポリペプチドのライブラリー、そのポリペプチドまたはライブラリーを作製するための方法、その結合ポリペプチドをコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、組成物（例えば、薬学的組成物）、キット、および容器を作製するための方法もまた、提供される。本明細書に開示されたポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、本明細書に開示された障害および状態などの障害を処置し、防止し、および／または診断するために、（単独で、または他の作用物質もしくは治療モダリティーと組み合わせて）使用することができる。
【０００５】
ある局面では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、重鎖（ＨＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、軽鎖（ＬＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＨＣストランドをＬＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞、例えば、異なるＢ細胞）由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法を特徴とする。
【０００６】
ある実施形態では、ＨＣエレメントは、ＨＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、ＬＣエレメントは、ＬＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる。
【０００７】
ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、かつＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。
【０００８】
ある実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、例えば、ヒトＢ細胞である。ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞またはトリ細胞である。
【０００９】
ある実施形態では、核酸配列が、発現した時、ＨＣエレメントおよびＬＣエレメント（例えば、ＨＣＶＲＳおよびＬＣＶＲＳ）が機能性抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはｓｃＦａｂを形成するように、構成される。ある実施形態では、抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖが、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である。
【００１０】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップは、以下：
ａ）以下：（ｉ）細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および（ｉｉ）上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：上記細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップを含む。
【００１１】
ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【００１２】
ある実施形態では、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【００１３】
ある実施形態では、ＨＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＬＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＨＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＬＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＨＣストランドとＬＣストランドの両方がセンス鎖である。ある実施形態では、ＨＣストランドとＬＣストランドの両方がアンチセンス鎖である。
【００１４】
ある実施形態では、捕捉支持体は、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＨＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＬＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。ある実施形態では、例えば同様のレベルの各ＤＮＡ分子型を捕捉するのに都合良い条件を生じることを促進するために、ＨＣストランドと結合する部分は、ＬＣストランドと結合する部分と異なる。ある実施形態では、ＨＣストランドと結合する部分は、ＬＣストランドと結合する部分と同一である。
【００１５】
ある実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている。
【００１６】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下：第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および細胞のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む。
【００１７】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。
【００１８】
ある実施形態では、細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される。ある実施形態では、細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドは、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される。
【００１９】
ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる。
【００２０】
ある実施形態では、増幅は、３０サイクルまたはそれ未満、例えば、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、１５サイクルもしくはそれ未満、１４サイクルもしくはそれ未満、１３サイクルもしくはそれ未満、１２サイクルもしくはそれ未満、１１サイクルもしくはそれ未満、１０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む。
【００２１】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、例えばＨＣＶＲＳおよび／またはＬＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する。
【００２２】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。ある実施形態では、増幅は、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。
【００２３】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない。
【００２４】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ伸長を低下させる（例えば、ブロックする）任意の化学的実体が、本明細書に記載された方法に従って使用することができると考えられる。
【００２５】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である。ある実施形態では、スペーサーは可撓性スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーは炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多い）脱塩基ヌクレオチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーはＰＥＧスペーサーである。ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである。
【００２６】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーの内部に、または３’末端に位置する。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）第３のメンバー（例えば、本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む）を含む。
【００２７】
ある実施形態では、第１のメンバーは、第２のメンバーとアニールする能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは、同じプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子内ハイブリダイゼーションを通して、アニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。別の実施形態では、第１のメンバーは、異なるプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子間ハイブリダイゼーションを通して、アニールまたはハイブリダイズして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、修飾プライマーが形成し、支持体（例えば、ビーズ）捕捉に対する競合の低下（例えば、防止）を促進することができる、少なくとも２つの二次構造があると考えられる。例えば、二次構造は、（同じプライマー内での）分子内ハイブリダイゼーションにより形成されるヘアピン様構造であり得、または二次構造は、（２つの異なるプライマー間の）分子間ハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖構造であり得る。
【００２８】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＨＣＶＲＳおよび／またはＬＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【００２９】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む。ある実施形態では、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーは、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、可撓性（例えば、グリシンにより促進される）および親水性の一般的性質をもつ任意の配列は、本明細書に記載された方法に従って、有効に働き得ると考えられる。例示的なリンカーは、一般的に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａの１つまたは複数が過剰出現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し、および疎水性残基、例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅの１つまたは複数が過少出現（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し得る。プライマーの長さは、様々であり得、例えば、３〜５０個のアミノ酸残基（例えば、５〜４５個、１０〜４０個、１５〜３５個、２０〜３０個、１０〜２０個、１０〜３０個、２０〜４０個、または３０〜４０個のアミノ酸残基）である。ある実施形態では、リンカー配列は、（（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ））ｎ（式中、ｍ＝３、４、５、またはそれより大きい、およびｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。
【００３０】
ある実施形態では、プライマーは、本明細書に、例えば、実施例に、記載されたプライマーである。
【００３１】
ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーにおける溶液中で起こる。ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、支持体（例えば、ビーズ）上で起こらない。例えば、逆転写、増幅、またはその両方は、液滴内の溶液中で起こり得る。
【００３２】
ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する。
【００３３】
ある実施形態では、ＨＣストランドおよびＬＣストランドは、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＨＣストランドおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＬＣストランドは、共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＨＣストランドは、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＬＣストランドがＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる。
【００３４】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー、または隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【００３５】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、ＨＣストランドおよびＬＣストランドは、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【００３６】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、以下：（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＨＣストランドおよびＬＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９５℃で）、加熱するステップ；（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＨＣストランドおよびＬＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、５０〜６５℃で）、冷却するステップ；（ｃ）ＨＣストランドおよびＬＣストランドのライゲーション（例えば、ＨＣストランドとＬＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４５〜６５℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクル、４５サイクル、５０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップを含む。
【００３７】
ある実施形態では、ＨＣストランドおよびＬＣストランドは、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、ＨＣストランドとＬＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む。ある実施形態では、修飾は、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【００３８】
ある実施形態では、共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＨＣおよびＬＣストランドに相補的なストランドは、増幅により産生される。
【００３９】
ある実施形態では、方法、例えば、共有結合性の連結のステップは、オーバーラップ伸長によるスプライシングまたはオーバーハング伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲとしても公知のオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）のステップを含まない。
【００４０】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む。
【００４１】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップは、ａ）ｉ）細胞；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびにｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップを含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【００４２】
ある実施形態では、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーは、溶解試薬、例えば、洗剤を含む。ある実施形態では、細胞は、熱または酵素により溶解される。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む。
【００４３】
ある実施形態では、方法は、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、放出ステップは、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。
【００４４】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体は、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される。
【００４５】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから核酸配列を放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、核酸配列を増幅するステップをさらに含む。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、例えば、核酸が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから放出された後、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で起こる。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーで起こる。
【００４６】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む。
【００４７】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む。ある実施形態では、ベクターは、核酸配列内に含まれない追加のＨＣエレメントまたはＬＣエレメントを供給する。ある実施形態では、ベクターは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、またはその両方を供給する。ある実施形態では、方法は、ベクターを発現するステップをさらに含む。
【００４８】
ある実施形態では、方法は、核酸配列を発現して、ＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップをさらに含む。ある実施形態では、ＬＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＨＣエレメントのＮ末端側にある。ある実施形態では、ＨＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＬＣエレメントのＣ末端側にある。
【００４９】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を結合するかどうかを、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより、決定するステップをさらに含む。
【００５０】
ある局面では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）重鎖（ＨＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；および
ｉｉ）軽鎖（ＬＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得し、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；ならびに
ｅ）ＨＣストランドをＬＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含む、方法を特徴とする。
【００５１】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
【００５２】
ある局面では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）を含む、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、上記細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＨＣストランド）の、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＬＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＨＣストランドおよびＬＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された連結反応部位）、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＨＣおよびＬＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法を特徴とする。
【００５３】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法を特徴とし、方法は、
【００５４】
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしており、本明細書に記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＨＣエレメントおよびＬＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する。
【００５５】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。
【００５６】
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＨＣエレメントおよびＬＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、本明細書に記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、もしくは１０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、もしくは１０８〜１０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）を含む、
ライブラリーを特徴とする。
【００５７】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳ、およびＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはｓｃＦａｂを形成するように、構成される。
【００５８】
ある実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、複数個のメンバーのそれぞれはさらに、ディスプレイ実体の表面上のメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする。ある実施形態では、ライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは酵母ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは哺乳動物ディスプレイライブラリーである。
【００５９】
ある態様では、本開示は、ａ）本明細書に記載されたライブラリーを、例えば、本明細書に記載された方法により、獲得するステップ；およびｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチド（例えば、ＨＣエレメントおよびＬＣエレメントを含むポリペプチド）を作製する方法を特徴とする。
【００６０】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収する（例えば、単離し、または精製する）ステップをさらに含む。
【００６１】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された産生反応部位（例えば、ＨＣＶＲをコードする核酸、およびＬＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている）である、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを特徴とする。
【００６２】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【００６３】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下の１つ、２つ、または全部を含む：（ｉ）ＨＣおよびＬＣのＶ遺伝子配列に特異的な１つもしくは複数のプライマー；（ｉｉ）ＨＣ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｃＤＮＡ上へ導入されたオーバーハングに特異的な１つもしくは複数のプライマー；または（ｉｉｉ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含む、１つもしくは複数のプライマーであって、前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマーの前記第２のメンバーとアニールする能力、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む構造を形成する能力がある。
【００６４】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含まない。別の実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【００６５】
ある態様では、本開示は、（例えば、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法のための、）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含み、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールする能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドを特徴とする。
【００６６】
ある実施形態では、第１のメンバーおよび第２のメンバーは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、第２のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。
【００６７】
ある実施形態では、スペーサーは、本明細書に記載されたスペーサー、例えば、可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである。
【００６８】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。
【００６９】
ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＨＣＶＲＳおよび／またはＬＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【００７０】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された連結反応部位（例えば、ＨＣＶＲをコードする核酸、およびＬＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている）である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを特徴とする。
【００７１】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【００７２】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＨＣストランドとＬＣストランドの接合部を含む配列またはその相補的配列にハイブリダイズして、ライゲーションの部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されたスプリントオリゴヌクレオチド）を含む。
【００７３】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【００７４】
ある局面では、本開示は、ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：  
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、α鎖可変領域配列（ＡＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、α鎖（ＡＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、β鎖可変領域配列（ＢＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むβ鎖ｄｓ  ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、β鎖（ＢＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１のストランドを第２のストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞、例えば、異なるＴ細胞）由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＡＣＶＲのＡＣエレメントおよびＢＣＶＲのＢＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法を特徴とする。
【００７５】
ある実施形態では、ＡＣエレメントは、ＡＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、ＢＣエレメントは、ＢＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる。
【００７６】
ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、かつＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。
【００７７】
ある実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ヒトＴ細胞である。ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞またはトリ細胞である。
【００７８】
ある実施形態では、核酸配列が、発現した時、ＡＣエレメントおよびＢＣエレメント（例えば、ＡＣＶＲＳおよびＢＣＶＲＳ）が機能性抗原結合分子、例えば、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖の単一鎖または複合体を形成するように、構成される。ある実施形態では、抗原結合分子、例えば、ＴＣＲ  α鎖および／またはβ鎖が、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である。
【００７９】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップは、以下：
ａ）以下：（ｉ）細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および（ｉｉ）上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：上記細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップを含む。
【００８０】
ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【００８１】
ある実施形態では、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【００８２】
ある実施形態では、ＡＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＢＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＡＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＢＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＡＣストランドとＢＣストランドの両方がセンス鎖である。ある実施形態では、ＡＣストランドとＢＣストランドの両方がアンチセンス鎖である。
【００８３】
ある実施形態では、捕捉支持体は、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＡＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＢＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。ある実施形態では、例えば同様のレベルの各ＤＮＡ分子型を捕捉するのに都合良い条件を生じることを促進するために、ＡＣストランドと結合する部分は、ＢＣストランドと結合する部分と異なる。ある実施形態では、ＡＣストランドと結合する部分は、ＢＣストランドと結合する部分と同一である。
【００８４】
ある実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている。
【００８５】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下：第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｃＤＮＡ、および細胞のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む。
【００８６】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。
【００８７】
ある実施形態では、細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される。ある実施形態では、細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドは、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される。
【００８８】
ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる。
【００８９】
ある実施形態では、増幅は、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、１５サイクルもしくはそれ未満、１４サイクルもしくはそれ未満、１３サイクルもしくはそれ未満、１２サイクルもしくはそれ未満、１１サイクルもしくはそれ未満、１０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む。
【００９０】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、例えばＡＣＶＲＳおよび／またはＢＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する。
【００９１】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。ある実施形態では、増幅は、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。
【００９２】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない。
【００９３】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ伸長を低下させる（例えば、ブロックする）任意の化学的実体が、本明細書に記載された方法に従って使用することができると考えられる。
【００９４】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である。ある実施形態では、スペーサーは可撓性スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーは炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多い）脱塩基ヌクレオチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーはＰＥＧスペーサーである。ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである。
【００９５】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーの内部に、または３’末端に位置する。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）第３のメンバー（例えば、本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む）を含む。
【００９６】
ある実施形態では、第１のメンバーは、第２のメンバーとアニールする能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは、同じプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子内ハイブリダイゼーションを通して、アニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。別の実施形態では、第１のメンバーは、異なるプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子間ハイブリダイゼーションを通して、アニールまたはハイブリダイズして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、修飾プライマーが形成し、支持体（例えば、ビーズ）捕捉に対する競合の低下（例えば、防止）を促進することができる、少なくとも２つの二次構造があると考えられる。例えば、二次構造は、（同じプライマー内での）分子内ハイブリダイゼーションにより形成されるヘアピン様構造であり得、または二次構造は、（２つの異なるプライマー間の）分子間ハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖構造であり得る。
【００９７】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＡＣＶＲＳおよび／またはＢＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【００９８】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む。ある実施形態では、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーは、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、可撓性（例えば、グリシンにより促進される）および親水性の一般的性質をもつ任意の配列は、本明細書に記載された方法に従って、有効に働き得ると考えられる。例示的なリンカーは、一般的に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａの１つまたは複数が過剰出現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し、および疎水性残基、例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅの１つまたは複数が過少出現（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し得る。プライマーの長さは、様々であり得、例えば、３〜５０個のアミノ酸残基（例えば、５〜４５個、１０〜４０個、１５〜３５個、２０〜３０個、１０〜２０個、１０〜３０個、２０〜４０個、または３０〜４０個のアミノ酸残基）である。ある実施形態では、リンカー配列は、（（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ））ｎ（式中、ｍ＝３、４、５、またはそれより大きい、およびｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。
【００９９】
ある実施形態では、プライマーは、本明細書に、例えば、実施例に、記載されたプライマーである。
【０１００】
ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーにおける溶液中で起こる。ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、支持体（例えば、ビーズ）上で起こらない。例えば、逆転写、増幅、またはその両方は、液滴内の溶液中で起こり得る。
【０１０１】
ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する。
【０１０２】
ある実施形態では、ＡＣストランドおよびＢＣストランドは、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＡＣおよびＢＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＡＣストランドおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＢＣストランドは、共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＡＣおよびＢＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＡＣストランドは、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＢＣストランドがＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる。
【０１０３】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー、または隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【０１０４】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、ＡＣストランドおよびＢＣストランドは、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【０１０５】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、以下：（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＡＣストランドおよびＢＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９５℃で）、加熱するステップ；（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＡＣストランドおよびＢＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、５０〜６５℃で）、冷却するステップ；（ｃ）ＡＣストランドおよびＢＣストランドのライゲーション（例えば、ＡＣストランドとＢＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４５〜６５℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクル、４５サイクル、５０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップを含む。
【０１０６】
ある実施形態では、ＡＣストランドおよびＢＣストランドは、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、ＡＣストランドとＢＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む。ある実施形態では、修飾は、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【０１０７】
ある実施形態では、共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＡＣおよびＢＣストランドに相補的なストランドは、増幅により産生される。
【０１０８】
ある実施形態では、方法、例えば、共有結合性の連結のステップは、オーバーラップ伸長によるスプライシングまたはオーバーハング伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲとしても公知のオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）のステップを含まない。
【０１０９】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む。
【０１１０】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップは、ａ）ｉ）細胞；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびにｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップを含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０１１１】
ある実施形態では、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーは、溶解試薬、例えば、洗剤を含む。ある実施形態では、細胞は、熱または酵素により溶解される。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む。
【０１１２】
ある実施形態では、方法は、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、放出ステップは、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。
【０１１３】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体は、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される。
【０１１４】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから核酸配列を放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、核酸配列を増幅するステップをさらに含む。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、例えば、核酸が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから放出された後、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で起こる。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーで起こる。
【０１１５】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む。
【０１１６】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む。ある実施形態では、ベクターは、核酸配列内に含まれない追加のＡＣエレメントまたはＢＣエレメントを供給する。ある実施形態では、方法は、ベクターを発現するステップをさらに含む。
【０１１７】
ある実施形態では、方法は、核酸配列を発現して、ＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップをさらに含む。ある実施形態では、ＢＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＡＣエレメントのＮ末端側にある。ある実施形態では、ＡＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＢＣエレメントのＣ末端側にある。
【０１１８】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を結合するかどうかを、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより、決定するステップをさらに含む。
【０１１９】
あるる実施形態では、本開示は、ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のＴＣＲα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のＴＣＲβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）ＴＣＲα鎖（ＡＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＴＣＲα鎖可変領域配列（ＡＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＴＣＲα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＡＣストランド；および
ｉｉ）ＴＣＲβ鎖（ＢＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＴＣＲβ鎖可変領域配列（ＢＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＴＣＲβ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＢＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得し、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；ならびに
ｅ）ＡＣストランドをＢＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含む、方法を特徴とする。
【０１２０】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
【０１２１】
ある局面では、本開示は、ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のＴＣＲα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のＴＣＲβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）を含む、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、上記細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＡＣストランド）の、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＢＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＡＣストランドおよびＢＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された連結反応部位）、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＡＣおよびＢＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法を特徴とする。
【０１２２】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
【０１２３】
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法を特徴とし、方法は、
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のＴＣＲα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のＴＣＲβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしており、本明細書に記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＡＣエレメントおよびＢＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する。
【０１２４】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。
【０１２５】
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＡＣエレメントおよびＢＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、本明細書に記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、もしくは１０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、もしくは１０８〜１０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）を含む、
ライブラリーを特徴とする。
【０１２６】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳ、およびＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖の単一鎖または複合体を形成するように、構成される。
【０１２７】
ある実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、複数個のメンバーのそれぞれはさらに、ディスプレイ実体の表面上のメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする。ある実施形態では、ライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは酵母ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは哺乳動物ディスプレイライブラリーである。
【０１２８】
ある態様では、本開示は、ａ）本明細書に記載されたライブラリーを、例えば、本明細書に記載された方法により、獲得するステップ；およびｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチド（例えば、ＡＣエレメントおよびＢＣエレメントを含むポリペプチド）を作製する方法を特徴とする。
【０１２９】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収する（例えば、単離し、または精製する）ステップをさらに含む。
【０１３０】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された産生反応部位（例えば、ＡＣＶＲをコードする核酸、およびＢＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＡＣＶＲおよび前記ＢＣＶＲがマッチしている）である、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを特徴とする。
【０１３１】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０１３２】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下の１つ、２つ、または全部を含む：（ｉ）ＡＣおよびＢＣのＶ遺伝子配列に特異的な１つもしくは複数のプライマー；（ｉｉ）ＡＣ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｃＤＮＡ上へ導入されたオーバーハングに特異的な１つもしくは複数のプライマー；または（ｉｉｉ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含む、１つもしくは複数のプライマーであって、前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマーの前記第２のメンバーとアニールする能力、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む構造を形成する能力がある。
【０１３３】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含まない。別の実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【０１３４】
ある態様では、本開示は、（例えば、ＡＣＶＲのＡＣエレメントおよびＢＣＶＲのＢＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＡＣＶＲおよび前記ＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法のための、）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含み、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールする能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドを特徴とする。
【０１３５】
ある実施形態では、第１のメンバーおよび第２のメンバーは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、第２のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。
【０１３６】
ある実施形態では、スペーサーは、本明細書に記載されたスペーサー、例えば、可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである。
【０１３７】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。
【０１３８】
ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＡＣＶＲＳおよび／またはＢＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【０１３９】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された連結反応部位（例えば、ＡＣＶＲをコードする核酸、およびＢＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＡＣＶＲおよび前記ＢＣＶＲがマッチしている）である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを特徴とする。
【０１４０】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０１４１】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＡＣストランドとＢＣストランドの接合部を含む配列またはその相補的配列にハイブリダイズして、ライゲーションの部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されたスプリントオリゴヌクレオチド）を含む。
【０１４２】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【０１４３】
ある局面では、本開示は、ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、γ鎖可変領域配列（ＧＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、γ鎖（ＧＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、δ鎖可変領域配列（ＤＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むδ鎖ｄｓ  ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、δ鎖（ＤＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１のストランドを第２のストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞、例えば、異なるＴ細胞）由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＧＣＶＲのＧＣエレメントおよびＤＣＶＲのＤＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法を特徴とする。
【０１４４】
ある実施形態では、ＧＣエレメントは、ＧＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、ＤＣエレメントは、ＤＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる。
【０１４５】
ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、かつＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。
【０１４６】
ある実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ヒトＴ細胞である。ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞またはトリ細胞である。
【０１４７】
ある実施形態では、核酸配列が、発現した時、ＧＣエレメントおよびＤＣエレメント（例えば、ＧＣＶＲＳおよびＤＣＶＲＳ）が機能性抗原結合分子、例えば、ＴＣＲγ鎖およびδ鎖の単一鎖または複合体を形成するように、構成される。ある実施形態では、抗原結合分子、例えば、ＴＣＲγ鎖および／またはδ鎖が、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である。
【０１４８】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップは、以下：
ａ）以下：（ｉ）細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および（ｉｉ）上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：上記細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップを含む。
【０１４９】
ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【０１５０】
ある実施形態では、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【０１５１】
ある実施形態では、ＧＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＤＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＧＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＤＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＧＣストランドとＤＣストランドの両方がセンス鎖である。ある実施形態では、ＧＣストランドとＤＣストランドの両方がアンチセンス鎖である。
【０１５２】
ある実施形態では、捕捉支持体は、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＧＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＤＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。ある実施形態では、例えば同様のレベルの各ＤＮＡ分子型を捕捉するのに都合良い条件を生じることを促進するために、ＧＣストランドと結合する部分は、ＤＣストランドと結合する部分と異なる。ある実施形態では、ＧＣストランドと結合する部分は、ＤＣストランドと結合する部分と同一である。
【０１５３】
ある実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている。
【０１５４】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下：第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および細胞のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む。
【０１５５】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。
【０１５６】
ある実施形態では、細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される。ある実施形態では、細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドは、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される。
【０１５７】
ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる。
【０１５８】
ある実施形態では、増幅は、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、１５サイクルもしくはそれ未満、１４サイクルもしくはそれ未満、１３サイクルもしくはそれ未満、１２サイクルもしくはそれ未満、１１サイクルもしくはそれ未満、１０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む。
【０１５９】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、例えばＧＣＶＲＳおよび／またはＤＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する。
【０１６０】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。ある実施形態では、増幅は、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。
【０１６１】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない。
【０１６２】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ伸長を低下させる（例えば、ブロックする）任意の化学的実体が、本明細書に記載された方法に従って使用することができると考えられる。
【０１６３】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である。ある実施形態では、スペーサーは可撓性スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーは炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多い）脱塩基ヌクレオチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーはＰＥＧスペーサーである。ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである。
【０１６４】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーの内部に、または３’末端に位置する。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）第３のメンバー（例えば、本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む）を含む。
【０１６５】
ある実施形態では、第１のメンバーは、第２のメンバーとアニールする能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは、同じプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子内ハイブリダイゼーションを通して、アニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。別の実施形態では、第１のメンバーは、異なるプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子間ハイブリダイゼーションを通して、アニールまたはハイブリダイズして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、修飾プライマーが形成し、支持体（例えば、ビーズ）捕捉に対する競合の低下（例えば、防止）を促進することができる、少なくとも２つの二次構造があると考えられる。例えば、二次構造は、（同じプライマー内での）分子内ハイブリダイゼーションにより形成されるヘアピン様構造であり得、または二次構造は、（２つの異なるプライマー間の）分子間ハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖構造であり得る。
【０１６６】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＧＣＶＲＳおよび／またはＤＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【０１６７】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む。ある実施形態では、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーは、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、可撓性（例えば、グリシンにより促進される）および親水性の一般的性質をもつ任意の配列は、本明細書に記載された方法に従って、有効に働き得ると考えられる。例示的なリンカーは、一般的に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａの１つまたは複数が過剰出現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し、および疎水性残基、例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅの１つまたは複数が過少出現（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し得る。プライマーの長さは、様々であり得、例えば、３〜５０個のアミノ酸残基（例えば、５〜４５個、１０〜４０個、１５〜３５個、２０〜３０個、１０〜２０個、１０〜３０個、２０〜４０個、または３０〜４０個のアミノ酸残基）である。ある実施形態では、リンカー配列は、（（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ））ｎ（式中、ｍ＝３、４、５、またはそれより大きい、およびｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。
【０１６８】
ある実施形態では、プライマーは、本明細書に、例えば、実施例に、記載されたプライマーである。
【０１６９】
ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーにおける溶液中で起こる。ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、支持体（例えば、ビーズ）上で起こらない。例えば、逆転写、増幅、またはその両方は、液滴内の溶液中で起こり得る。
【０１７０】
ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する。
【０１７１】
ある実施形態では、ＧＣストランドおよびＤＣストランドは、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＧＣおよびＤＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＧＣストランドおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＤＣストランドは、共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＧＣおよびＤＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＧＣストランドは、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＤＣストランドがＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる。
【０１７２】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー、または隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【０１７３】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、ＧＣストランドおよびＤＣストランドは、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【０１７４】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、以下：（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＧＣストランドおよびＤＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９５℃で）、加熱するステップ；（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＧＣストランドおよびＤＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、５０〜６５℃で）、冷却するステップ；（ｃ）ＧＣストランドおよびＤＣストランドのライゲーション（例えば、ＧＣストランドとＤＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４５〜６５℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクル、４５サイクル、５０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップを含む。
【０１７５】
ある実施形態では、ＧＣストランドおよびＤＣストランドは、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、ＧＣストランドとＤＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む。ある実施形態では、修飾は、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【０１７６】
ある実施形態では、共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＧＣおよびＤＣストランドに相補的なストランドは、増幅により産生される。
【０１７７】
ある実施形態では、方法、例えば、共有結合性の連結のステップは、オーバーラップ伸長によるスプライシングまたはオーバーハング伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲとしても公知のオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）のステップを含まない。
【０１７８】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む。
【０１７９】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップは、ａ）ｉ）細胞；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびにｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップを含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０１８０】
ある実施形態では、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーは、溶解試薬、例えば、洗剤を含む。ある実施形態では、細胞は、熱または酵素により溶解される。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む。
【０１８１】
ある実施形態では、方法は、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、放出ステップは、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。
【０１８２】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体は、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される。
【０１８３】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから核酸配列を放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、核酸配列を増幅するステップをさらに含む。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、例えば、核酸が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから放出された後、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で起こる。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーで起こる。
【０１８４】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む。
【０１８５】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む。ある実施形態では、ベクターは、核酸配列内に含まれない追加のＧＣエレメントまたはＤＣエレメントを供給する。ある実施形態では、方法は、ベクターを発現するステップをさらに含む。
【０１８６】
ある実施形態では、方法は、核酸配列を発現して、ＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップをさらに含む。ある実施形態では、ＤＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＧＣエレメントのＮ末端側にある。ある実施形態では、ＧＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＤＣエレメントのＣ末端側にある。
【０１８７】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を結合するかどうかを、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより、決定するステップをさらに含む。
【０１８８】
あるる実施形態では、本開示は、ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のＴＣＲγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のＴＣＲδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）ＴＣＲγ鎖（ＧＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＴＣＲγ鎖可変領域配列（ＧＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＴＣＲγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＧＣストランド；および
ｉｉ）ＴＣＲδ鎖（ＤＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＴＣＲδ鎖可変領域配列（ＤＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＴＣＲδ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＤＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得し、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；ならびに
ｅ）ＧＣストランドをＤＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含む、方法を特徴とする。
【０１８９】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
【０１９０】
ある局面では、本開示は、ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のＴＣＲγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のＴＣＲδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）を含む、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、上記細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＧＣストランド）の、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＤＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＧＣストランドおよびＤＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された連結反応部位）、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＧＣおよびＤＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法を特徴とする。
【０１９１】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法を特徴とし、方法は、
【０１９２】
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のＴＣＲγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のＴＣＲδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしており、本明細書に記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＧＣエレメントおよびＤＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する。
【０１９３】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。
【０１９４】
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＧＣエレメントおよびＤＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、本明細書に記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、もしくは１０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、もしくは１０８〜１０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数を含む、
ライブラリーを特徴とする。
【０１９５】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳ、およびＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、ＴＣＲγ鎖およびδ鎖の単一鎖または複合体を形成するように、構成される。
【０１９６】
ある実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、複数個のメンバーのそれぞれはさらに、ディスプレイ実体の表面上のメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする。ある実施形態では、ライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは酵母ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは哺乳動物ディスプレイライブラリーである。
【０１９７】
ある態様では、本開示は、ａ）本明細書に記載されたライブラリーを、例えば、本明細書に記載された方法により、獲得するステップ；およびｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチド（例えば、ＧＣエレメントおよびＤＣエレメントを含むポリペプチド）を作製する方法を特徴とする。
【０１９８】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収する（例えば、単離し、または精製する）ステップをさらに含む。
【０１９９】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された産生反応部位（例えば、ＧＣＶＲをコードする核酸、およびＤＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＧＣＶＲおよび前記ＤＣＶＲがマッチしている）である、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを特徴とする。
【０２００】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０２０１】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下の１つ、２つ、または全部を含む：（ｉ）ＧＣおよびＤＣのＶ遺伝子配列に特異的な１つもしくは複数のプライマー；（ｉｉ）ＧＣ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｃＤＮＡ上へ導入されたオーバーハングに特異的な１つもしくは複数のプライマー；または（ｉｉｉ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含む、１つもしくは複数のプライマーであって、前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマーの前記第２のメンバーとアニールする能力、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む構造を形成する能力がある。
【０２０２】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含まない。別の実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【０２０３】
ある態様では、本開示は、（例えば、ＧＣＶＲのＧＣエレメントおよびＤＣＶＲのＤＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＧＣＶＲおよび前記ＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法のための、）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含み、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールする能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドを特徴とする。
【０２０４】
ある実施形態では、第１のメンバーおよび第２のメンバーは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、第２のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。
【０２０５】
ある実施形態では、スペーサーは、本明細書に記載されたスペーサー、例えば、可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである。
【０２０６】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。
【０２０７】
ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＧＣＶＲＳおよび／またはＤＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【０２０８】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された連結反応部位（例えば、ＧＣＶＲをコードする核酸、およびＤＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＧＣＶＲおよび前記ＤＣＶＲがマッチしている）である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを特徴とする。
【０２０９】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０２１０】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＧＣストランドとＤＣストランドの接合部を含む配列またはその相補的配列にハイブリダイズして、ライゲーションの部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されたスプリントオリゴヌクレオチド）を含む。
【０２１１】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】図１は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチした核酸配列を作製するいくつかの方法を描示する図である。Ａ１、Ｂ１およびＣ２のボックスは、隔離された反応部位、特に隔離された細胞反応部位において起こるステップを指し示す。Ｃ３、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５およびＤ６のボックスは、隔離された反応部位、特に隔離された産生反応部位において起こるステップを指し示す。Ｅ１、Ｅ２およびＥ３のボックスは、隔離された反応部位、特に隔離された連結反応部位において起こるステップを指し示す。Ｃ１のボックスは、隔離された反応部位において必ずしも起きないステップを指し示す。本文で論じられるように、隔離された反応部位は、ミスマッチのＨＣおよびＬＣエレメントを生じる核酸を含まない。
【０２１３】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチした核酸を作製する例示的な方法を示す一連の略図である。図２Ａでは、細胞（例えばＢ細胞などの免疫細胞）を溶解させ、ＨＣＶＲおよびマッチしたＬＣＶＲをコードするｍＲＮＡをビーズに捕捉させる。図２Ｂでは、捕捉されたｍＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換させ、その後ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ）により増幅して、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ｃＤＮＡのマッチした対を含むｃＤＮＡビーズを生じさせる。自己アニーリング性プライマー（例えば、第１のメンバー、および第１のメンバーにハイブリダイズする能力がある第２のメンバーを含み、第１および第２のメンバーがスペーサー、例えばＰＥＧスペーサーにより分離されており、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ配列にハイブリダイズする能力がある配列をさらに含むプライマー）を、逆転写反応および／またはＤＮＡポリメラーゼ増幅に使用することができる。図２Ｃでは、ＬＣＶＲまたはＨＣＶＲ配列の各末端（例えば、ＬＣＶＲの３’末端およびＨＣＶＲの５’末端）にハイブリダイズする能力がある配列を含むスプリントオリゴを使用し、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲのマッチした対を結合させるリガーゼサイクリング反応を使用して、マッチしたＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ  ｃＤＮＡ産物を融合させることができる。図２Ｄでは、融合したＬＣＶＲ／ＨＣＶＲ産物を、例えばＰＣＲにより増幅させることができる。
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図２Ｄ】同上
【０２１４】
【図３】図３は、ＴａｑリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定性リガーゼ（Ａｍｐ；Ｌｕｃｉｇｅｎ）が、ＶＨおよびＶＬ産物を効率的に連結させる能力があったことを示すポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）画像である。
【０２１５】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、抗体４Ｇ２および９Ｅ１０のそれぞれについての、天然で対形成する、連結されたＶＨ＋ＶＬ産物が、リガーゼサイクリングによりうまく産生されたことを示すゲル電気泳動画像である。図４Ａでは、リガーゼサイクリング産物の変性ＰＡＧＥにより、リガーゼを含む反応で、４Ｇ２および９Ｅ１０のそれぞれについての連結されたＶＨ＋ＶＬ産物、ならびに個々のＶＨおよびＶＬポリヌクレオチドが生じたことが示された。リガーゼを欠く反応では、連結されたＶＨ＋ＶＬ産物は検出されなかった。図４Ｂでは、バルクＰＣＲ再増幅産物のアガロースゲル電気泳動により、４Ｇ２および９Ｅ１０についてのＶＨ−ＶＬ連結されたポリヌクレオチドがＰＣＲ反応において混合されても、天然の対形成が保持されたことが示された。
【０２１６】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、自己アニーリング性プライマーを使用しての効率的かつ特異的なＰＣＲ産物捕捉を示すグラフおよび略図である。図５Ａでは、（１）スペーサーを含み、ビーズ上のオリゴに相補的な５’配列およびＶＬ鋳型配列に相補的な３’配列を有するＶＬプライマー、（２）スペーサーを欠き、ビーズ上のオリゴに相補的な５’配列およびＶＬ鋳型配列に相補的な３’配列を有するＶＬプライマー、（３）ビーズ上のオリゴに相補的な５’配列およびＶＬ鋳型配列に相補的な３’配列を欠くＶＬプライマー、ならびに（４）（１）と類似したデザインを有するが、ＶＨ鋳型に相補的な配列を有する３’末端（ＤＮＡポリメラーゼ伸長のため）を有するＶＨプライマーを含む一連のフォワードＰＣＲプライマーデザインを、ＰＣＲ産物を捕捉する能力について試験した。図５Ｂでは、スペーサーを含むＶＬプライマーを、ＶＬオリゴ、ＶＨオリゴ、およびＶＨ＋ＶＬオリゴの効率的かつ特異的なＰＣＲ捕捉に使用した。残りのプライマーのうち、ＶＨプライマーのみがオリゴのいずれか（特にＶＨオリゴおよびＶＨ＋ＶＬオリゴ）を捕捉する能力があった。
【０２１７】
【図６】図６は、天然で対形成するＶＨ−ＶＬ産物が、４Ｇ２抗体を発現する細胞から得られた核酸から、滴中で産生されうることを示すアガロースゲル電気泳動画像である。ＮＴＣ＝液滴ワークフロー全体が実施されたが細胞が含まれていなかった試料；ＰＣＲ  ＮＴＣ＝鋳型なし対照。
【０２１８】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、自己アニーリング性プライマー（図７Ａ）は、未使用のプライマーレベルが高い時にＰＣＲ産物捕捉の競合を防止することができるが、非自己アニーリング性プライマー（図７Ｂ）は、未使用のプライマーレベルが低い時しかそれができないことを示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０２１９】
標的分子または細胞、例えば、ヒトタンパク質または細胞と、高親和性および高特異性で結合するポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体分子）が本明細書に開示される。ある実施形態では、そのポリペプチドは結合ポリペプチドである。ある実施形態では、結合ポリペプチドは、抗体分子である。ある実施形態では、結合ポリペプチドはＴＣＲ分子（例えば、可溶性ＴＣＲ分子）である。ある実施形態では、そのポリペプチドのライブラリー、そのポリペプチドまたはライブラリーを作製するための方法、そのポリペプチドをコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および組成物（例えば、薬学的組成物）、キット、容器もまた提供される。本明細書に記載された方法は、天然でマッチし、または対形成される２つまたはそれより多い鎖を含有する機能性ポリペプチドを作製または選択するのに有用である。本明細書に開示されたポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体分子）は、本明細書に開示された障害および状態などの障害を処置し、防止し、および／または診断するために（単独で、または他の作用物質または治療モダリティと組み合わせて）使用することができる。
【０２２０】
理論に縛られることを望まないが、本明細書に記載された方法は、例えば、何百万個というＢ細胞／プラズマ細胞抗体のハイスループットの表現型（例えば、結合性）スクリーニング、および異なる種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリが挙げられるが、それらに限定されない）に由来したＢ細胞からの抗体発見を促進することができると考えられる。例えば、唯一の必要条件は、その種由来のＶＨおよびＶＬ配列を適切に増幅するためのプライマーの知識であり得る。
【０２２１】
本明細書に記載されたワークフローは、いかなる種における使用にも適するので、各種が抗原に対して異なる型の結合ポリペプチド（例えば、抗体）を発生するため、このワークフローは、（免疫化／ワクチン接種後の）標的抗原に対する多様な結合ポリペプチド（例えば、抗体）を発見する能力を有意に向上させることができる。（例えば、標的エピトープに対する）免疫寛容問題は、標的抗原を欠き、または標的抗原との有意なアミノ酸の違いを有する種（例えば、ニワトリは、ヒトまたはマウスがヒト抗原／エピトープに対する寛容を有するより、ヒト抗原／エピトープに対して寛容が低下している）を使用することにより、よりうまく克服することができる。
【０２２２】
本明細書に記載された方法は、頑丈であり、かつ再成長することができる酵母において、抗体レパートリーの「表現型コピー」を作製することを促進することができる。感受性が高く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで長く生存せず、かつ厳しい抗体／ＢＣＲ結合特徴づけを生きのびることができない初代Ｂ細胞を使用する場合と違って、これは、抗体レパートリーの厳しく、かつ繰り返される試験を促進する。
【０２２３】
液滴において、天然で対形成するＶＨ−ＶＬ配列を作製するための他の方法は、そのＤＮＡを連結するためにＤＮＡポリメラーゼでのオーバーラップ伸長（ＰＣＲ）によるスプライシングを使用することができ、それは特異性に関する限界があり得、不正確な連結による多岐にわたるサイズの不均一な産物を生じ得る。本明細書に記載されたライゲーション方法は、そのような問題を被らない。
【０２２４】
さらに、オーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシングを使用する液滴方法には、滴内で融合していない任意のＰＣＲ産物が、ＶＨとＶＬの間の共通の追加配列により、非滴ＰＣＲ増幅中に融合される可能性を有するという固有の限界がある。滴の外側で起こる融合は、鎖が区画化されていないため、非天然の対形成をもたらす。本明細書に記載された例示的なライゲーションワークフローについて、ＶＨおよびＶＬに共通配列を付加する必要がなく、したがって、この問題が発生しない。
【０２２５】
そのようなＰＣＲ増幅は、いくつかの配列が他のものより効率的に増幅するため、多岐にわたる配列の有意に偏った出現をもたらし得、そのことは、ＰＣＲ中に生じる指数関数的増幅後、著しい違いをもたらし得る。本明細書に記載されたワークフローは、ＰＣＲ産物をビーズ上に捕捉させることにより、この問題を低減する。例えば、細胞のＶＨおよびＶＬ配列は、非常に良く、または不十分に増幅された場合には、同様の量の産物が、ビーズ上に捕捉されるだろう。それにより、このステップを省き、かつオーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシングにより連結を実施する方法と比べて、最終ライブラリーにおける抗体配列の出現がより一様になる。
【０２２６】
定義
「ＨＣ可変領域」は、その用語が本明細書で使用される場合、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびに重鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含むポリペプチドを指す。
【０２２７】
「ＬＣ可変領域」は、その用語が本明細書で使用される場合、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびに軽鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含むポリペプチドを指す。
【０２２８】
「重鎖可変領域配列」または「ＨＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、抗原の結合を可能にするのに、重鎖ＣＤＲ由来の十分な配列、および重鎖ＦＷ領域由来の十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＨＣＶＲＳは、軽鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。ある実施形態では、ＨＣＶＲＳは、抗原の結合を可能にするのに、重鎖ＣＤＲ１、２、および３由来の十分な配列、ならびに重鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、重鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。ある実施形態では、ＨＣＶＲＳは、軽鎖可変領域と複合体形成するのに、かつ抗原の結合を可能にするのに、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびに重鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、重鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。
【０２２９】
「軽鎖可変領域配列」または「ＬＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、抗原の結合を可能にするのに、軽鎖ＣＤＲ由来の十分な配列、および軽鎖ＦＷ領域由来の十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＬＣＶＲＳは、重鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。ある実施形態では、ＬＣＶＲＳは、抗原の結合を可能にするのに、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３由来の十分な配列、ならびに軽鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、軽鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。ある実施形態では、ＬＣＶＲＳは、重鎖可変領域と複合体形成するのに、かつ抗原の結合を可能にするのに、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびに軽鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、軽鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。
【０２３０】
ＬＣまたはＨＣ可変領域の「エレメント」は、その用語が本明細書で使用される場合、少なくとも１個のアミノ酸をコードする配列を指す。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲを含む。ある実施形態では、エレメントはＦＷ領域を含む。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲおよびＦＷ領域を含む。ある実施形態では、エレメントは、ＨＣＶＲＳまたはＬＣＶＲＳを含む。ある実施形態では、エレメントは、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアミノ酸残基を含む。
【０２３１】
「マイクロチャンバー」は、その用語が本明細書で使用される場合、形成の際に、それが、単一細胞、または単一細胞由来の内容物を含有するような大きさにされている、例えば、十分に小さい、コンパートメントを指す。ある実施形態では、マイクロチャンバーは、それが含有する細胞の１０倍〜１０，０００倍である体積を有する。ある実施形態では、マイクロチャンバーは２０ｐＬの体積を有する。ある実施形態では、マイクロチャンバーは、１００ｎＬの最大寸法を有する。ある実施形態では、マイクロチャンバーは、液体の液滴を含む。実施形態では、マイクロチャンバーは、非混和性媒体、例えば、気体または第２の液体中に配置された第１の液体の液滴を含む。ある実施形態では、マイクロチャンバーは、非混和性の第２の液体、例えば、フッ素化油の中に第１の液体を分散させることにより形成された、第１の液体、例えば、溶解緩衝液またはＰＣＲ反応緩衝液の液滴を含む。ある実施形態では、マイクロチャンバーは、支持体、およびその支持体以外の物質、例えば、溶液を含む。ある実施形態では、液滴は、支持体（例えば、捕捉支持体、例えば、ビーズ）、およびその支持体以外の物質、例えば、溶液を含む。
【０２３２】
「獲得すること」は、その用語が本明細書で使用される場合、実体、例えば、物理的実体またはデータの所有または提供を指す。物理的実体を獲得することは、物理的実体を作製または製造すること（直接的に獲得すること）、加えて、物理的実体を別の関係者または供給源から受け取ること（間接的に獲得すること）を含む。データまたは値を獲得することは、そのデータまたは値を作成すること（直接的に獲得すること）、加えて、データまたは値を別の関係者または供給源から受け取ること（間接的に獲得すること）を含む。
【０２３３】
「マッチした」は、その用語が重鎖可変領域と軽鎖可変領域に関して本明細書で使用される場合、それらが同じ細胞由来であることを意味する。軽鎖可変領域のエレメントおよび重鎖可変領域のエレメントに関して、それは、そのエレメントが由来している軽鎖可変領域と重鎖可変領域が同じ細胞由来であることを意味する。
【０２３４】
「隔離された反応部位」は、その用語が本明細書で使用される場合、第１の担持させた捕捉支持体と第２の担持させた捕捉支持体の間での、または一般的に、別の細胞のＨＣもしくはＬＣ（またはα鎖もしくはβ鎖、またはγ鎖もしくはδ鎖）をコードする核酸からの、十分な分離を可能にし、その結果、前記第１の担持させた捕捉支持体には、別の細胞由来のＨＣまたはＬＣ（またはα鎖もしくはβ鎖、またはγ鎖もしくはδ鎖）をコードする核酸が混入していない、部位、例えば、支持体上の場所、マイクロチャンバー、または支持体上のウェルを指す。ある実施形態では、隔離された反応部位は、第１のｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体と第２のｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体の間での、または一般的に、別の細胞のＬＣもしくはＨＣをコードする核酸からの、十分な分離を提供し、その結果、前記第１のｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体には、別の細胞由来のＨＣまたはＬＣ（またはα鎖もしくはβ鎖、またはγ鎖もしくはδ鎖）をコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡが混入していない。ある実施形態では、隔離された反応部位は、第１のｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体と第２のｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体の間での、または一般的に、別の細胞のＨＣもしくはＬＣ（またはα鎖もしくはβ鎖、またはγ鎖もしくはδ鎖）をコードする核酸からの、十分な分離を提供し、その結果、前記第１のｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体には、別の細胞由来のＨＣまたはＬＣ（またはα鎖もしくはβ鎖、またはγ鎖もしくはδ鎖）をコードする核酸、例えば、ｃＤＮＡが混入していない。分離は、例えば、支持体上の隔離された反応部位間の十分な距離により；隔離された反応部位が流体接続されていないように構成することにより；または、体積もしくはチャンバーと環境との間の非混和性バリアの形成により、提供され得る。ある実施形態では、隔離された反応部位は、支持体、およびその支持体以外の物質、例えば、溶液を含む。
【０２３５】
「相補的な」は、その用語が本明細書で使用される場合、ワトソン・クリック対形成を形成することができる配列を指す。第１の配列が、第２の配列に相補的である場合、それは、その第２の配列全体と、またはその第２の配列の全部に満たない部分と、相補的であり得る。
【０２３６】
「ディスプレイ実体」は、その用語が本明細書で使用される場合、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む実体、例えば、ファージまたは細胞、例えば、酵母細胞を指す。
【０２３７】
「ＡＣ可変領域」は、その用語が本明細書で使用される場合、ＴＣＲα鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにα鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含むポリペプチドを指す。
【０２３８】
「ＢＣ可変領域」は、その用語が本明細書で使用される場合、β鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにβ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含むポリペプチドを指す。
【０２３９】
「ＧＣ可変領域」は、その用語が本明細書で使用される場合、ＴＣＲγ鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにγ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含むポリペプチドを指す。
【０２４０】
「ＤＣ可変領域」は、その用語が本明細書で使用される場合、δ鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにδ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含むポリペプチドを指す。
【０２４１】
「α鎖可変領域配列」または「ＡＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、抗原の結合を可能にするのに、α鎖ＣＤＲ由来の十分な配列、およびα鎖ＦＷ領域由来の十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＡＣＶＲＳは、β鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。ある実施形態では、ＡＣＶＲＳは、抗原の結合を可能にするのに、α鎖ＣＤＲ１、２、および３由来の十分な配列、ならびにα鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、α鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。ある実施形態では、ＡＣＶＲＳは、β鎖可変領域と複合体形成するのに、かつ抗原の結合を可能にするのに、α鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにα鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、α鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。
【０２４２】
「β鎖可変領域配列」または「ＢＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、抗原の結合を可能にするのに、β鎖ＣＤＲ由来の十分な配列、およびβ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＢＣＶＲＳは、α鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。ある実施形態では、ＢＣＶＲＳは、抗原の結合を可能にするのに、β鎖ＣＤＲ１、２、および３由来の十分な配列、ならびにβ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、β鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。ある実施形態では、ＢＣＶＲＳは、α鎖可変領域と複合体形成するのに、かつ抗原の結合を可能にするのに、β鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにβ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、β鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。
【０２４３】
「γ鎖可変領域配列」または「ＧＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、抗原の結合を可能にするのに、γ鎖ＣＤＲ由来の十分な配列、およびγ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＧＣＶＲＳは、δ鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。ある実施形態では、ＧＣＶＲＳは、抗原の結合を可能にするのに、γ鎖ＣＤＲ１、２、および３由来の十分な配列、ならびにγ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、γ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。ある実施形態では、ＧＣＶＲＳは、δ鎖可変領域と複合体形成するのに、かつ抗原の結合を可能にするのに、γ鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにγ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、γ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。
【０２４４】
「δ鎖可変領域配列」または「ＤＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、抗原の結合を可能にするのに、δ鎖ＣＤＲ由来の十分な配列、およびδ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＤＣＶＲＳは、γ鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。ある実施形態では、ＤＣＶＲＳは、抗原の結合を可能にするのに、δ鎖ＣＤＲ１、２、および３由来の十分な配列、ならびにδ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、δ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。ある実施形態では、ＤＣＶＲＳは、α鎖可変領域と複合体形成するのに、かつ抗原の結合を可能にするのに、δ鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびにδ鎖ＦＷ領域由来の十分な配列、例えば、δ鎖ＦＷ領域１、２、３、および４を含む。
【０２４５】
α鎖またはβ鎖可変領域の「エレメント」は、その用語が本明細書で使用される場合、少なくとも１個のアミノ酸をコードする配列を指す。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲを含む。ある実施形態では、エレメントはＦＷ領域を含む。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲおよびＦＷ領域を含む。ある実施形態では、エレメントは、ＡＣＶＲＳまたはＢＣＶＲＳを含む。ある実施形態では、エレメントは、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアミノ酸残基を含む。
【０２４６】
γ鎖またはδ鎖可変領域の「エレメント」は、その用語が本明細書で使用される場合、少なくとも１個のアミノ酸をコードする配列を指す。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲを含む。ある実施形態では、エレメントはＦＷ領域を含む。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲおよびＦＷ領域を含む。ある実施形態では、エレメントは、ＧＣＶＲＳまたはＤＣＶＲＳを含む。ある実施形態では、エレメントは、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアミノ酸残基を含む。
【０２４７】
「マッチした」は、その用語がα鎖可変領域とβ鎖可変領域に関して本明細書で使用される場合、それらが同じ細胞由来であることを意味する。α鎖可変領域のエレメントおよびβ鎖可変領域のエレメントに関して、それは、そのエレメントが由来しているα鎖可変領域とβ鎖可変領域が同じ細胞由来であることを意味する。
【０２４８】
「マッチした」は、その用語がγ鎖可変領域とδ鎖可変領域に関して本明細書で使用される場合、それらが同じ細胞由来であることを意味する。γ鎖可変領域のエレメントおよびδ鎖可変領域のエレメントに関して、それは、そのエレメントが由来しているγ鎖可変領域とγ鎖可変領域が同じ細胞由来であることを意味する。
【０２４９】
本明細書で使用される冠詞である「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」とは、１つまたは１つを超える（例えば、少なくとも１つの）、冠詞の文法的目的語を指す。
【０２５０】
文脈によりそうでないことが明らかに指し示されない限りにおいて、本明細書では、「または」という用語は、「および／または」という用語を意味するように使用され、互換的に使用される。
【０２５１】
「約」および「およそ」とは一般に、測定値の性質または精度を踏まえ、測定される数量について許容可能な程度の誤差を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の、２０パーセント（％）以内、典型的に、１０％以内であり、より典型的には、５％以内である。
【０２５２】
本明細書で開示される組成物および方法は、指定された配列、またはこれらと実質的に同一もしくは同様な配列、例えば、指定された配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、またはこれを超えて同一な配列を有するポリペプチドおよび核酸を包含する。
【０２５３】
本明細書のアミノ酸配列の文脈では、「実質的に同一な」という用語は、第１のアミノ酸配列と、第２のアミノ酸配列とが、共通の構造的ドメインおよび／または共通の機能的な活性を有しうるよう、ｉ）第２のアミノ酸配列内の、アラインメントされたアミノ酸残基と同一であるか、またはｉｉ）これらのアミノ酸残基の保存的置換である、十分な数または最小数のアミノ酸残基を含有する、第１のアミノ酸を指すように使用される。例えば、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列との少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通構造ドメインを含むアミノ酸配列。
【０２５４】
本明細書のヌクレオチド配列の文脈では、「実質的に同一な」という用語は、第１のクレオチド配列と、第２のクレオチド配列とが、共通の機能的な活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的なポリペプチド活性をコードするよう、第２の核酸配列内の、アラインメントされたヌクレオチドと同一な、十分な数または最小数のヌクレオチドを含有する、第１の核酸配列を指すように使用される。例えば、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列との少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【０２５５】
「機能的改変体」という用語は、天然に存在する配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一なヌクレオチド配列によりコードされ、天然に存在する配列の、１つまたは複数の活性を有することが可能であるポリペプチドを指す。
【０２５６】
配列の間の相同性または配列同一性（本明細書では、用語は互換的に使用される）の計算は、以下の通りに実施する。
【０２５７】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較を目的として、配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方またはその両方に、ギャップを導入することができ、非相同配列は、比較を目的とする場合、無視することができる）。典型的な実施形態では、比較を目的としてアラインメントされる基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、５０％、６０％、例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されていれば、分子は、この位置において同一である。
【０２５８】
２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れるときに、配列により共有される、同一な位置の数の関数である。
【０２５９】
２つの配列の間の配列の比較、および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。一部の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４４〜４５３頁）によるアルゴリズムを使用して決定する。ある特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）内のＧＡＰプログラムを使用して決定する。１つの適切なパラメータのセット（そうでないことが指定されない限りにおいて、使用すべきパラメータのセット）は、ギャップペナルティーを１２とし、ギャップ伸長ペナルティーを４とし、フレームシフトギャップペナルティーを５とする、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリクスである。
【０２６０】
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、Ｅ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９年）、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁）によるアルゴリズムを使用して決定することができる。
【０２６１】
本明細書で記載される核酸配列およびタンパク質配列を、公開データベースに照らした検索を実施する「クエリー配列」として使用して、例えば、他のファミリーメンバーまたは類縁の配列を同定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜１０頁による、ＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、本明細書で記載される核酸と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本明細書で記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップ付きアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁において記載されている、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【０２６２】
本明細書で使用される「低度のストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、高度のストリンジェンシー条件、または極めて高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件について記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、参照により組み込まれる、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６において見出すことができる。この参考文献には、水性法および非水性法が記載されており、いずれも使用することができる。本明細書で言及される、具体的なハイブリダイゼーション条件は、以下の通り：１）６倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃における、低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件に続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、少なくとも５０℃で２回の洗浄（低度のストリンジェンシー条件のために、洗浄温度を５５℃へと上昇させることができる）；２）６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃における、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件に続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６０℃で１回または複数回の洗浄；３）６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃における、高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件に続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃で１回または複数回の洗浄であり、４）極めて高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、６５℃の、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、１％のＳＤＳ中、６５℃で１回または複数回の洗浄であることが好ましい。極めて高度のストリンジェンシー条件４）が、適切な条件であり、そうでないことが指定されない限りにおいて、使用すべき条件である。
【０２６３】
本明細書で記載される分子は、それらの機能に対して、実質的な影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換または非本質的アミノ酸置換を有しうることが理解される。
【０２６４】
「アミノ酸」という用語は、天然または合成であれ、アミノ官能基および酸官能基の両方を含み、天然に存在するアミノ酸のポリマー内に含まれることが可能な、全ての分子を包含することを意図する。例示的なアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸；それらの類似体、誘導体、および同類；改変体の側鎖を有するアミノ酸類似体；ならびに前出のうちのいずれかの、全ての立体異性体を含む。本明細書で使用された「アミノ酸」という用語は、Ｄ光学異性体またはＬ光学異性体の両方と、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）とを含む。
【０２６５】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえたアミノ酸置換である。当技術分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。
【０２６６】
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」（単鎖の場合）という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように、互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含む場合があり、非アミノ酸により中断される場合がある。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識化構成要素とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。ポリペプチドは、天然の供給源から単離することもでき、組換え法により、真核宿主または原核宿主から生成することもでき、合成手順の生成物の場合もある。ある実施形態では、ポリペプチドは、抗体分子である。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＣＲ分子、例えば、可溶性ＴＣＲ分子である。
【０２６７】
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または  「ポリヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、一本鎖は、コード鎖の場合もあり、非コード（アンチセンス）鎖の場合もある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾ヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどにより、重合の後でさらに修飾することもできる。核酸は、組換えポリヌクレオチドの場合もあり、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドの場合もあり、これらは、天然には存在しないか、または非天然の配置で、別のポリヌクレオチドへと連結される。
【０２６８】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、その元の環境または天然環境（例えば、天然に存在する場合は、天然環境）から取り出された材料を指す。例えば、生きている動物において存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、人為的介入により、天然系に共存する材料の一部または全部から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であることが可能であり、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部でありうるが、このようなベクターまたは組成物が、それが天然で見出される環境の一部ではないという点で、依然として単離されている。
【０２６９】
本明細書で使用される、例えば、本明細書に記載される障害「を処置する」という用語は、ある実施形態では、障害、例えば、本明細書に記載される障害を有し、かつ／または障害、例えば、本明細書に記載される障害の症状を経験する被験体（例えば、ヒト）が、抗体分子を投与した場合に、抗体分子を投与しなかった場合より重症度が軽い症状を患い、かつ／またはより急速に回復することを意味する。処置は、例えば、障害の影響もしくは症状、特徴、および／または原因の、１つまたは複数の顕在化を、部分的に、または完全に、緩和する場合もあり、好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）場合もあり、和らげる場合もあり、阻害する場合もあり、これらの重症度を低減し、かつ／またはこれらの発生率を低減し、必要に応じて、これらの発症を遅延させる場合もある。ある実施形態では、処置は、障害のある特定の徴候を呈さない被験体の処置、ならびに／または障害の早期の徴候だけを呈する被験体の処置である。ある実施形態では、処置は、障害の、１つまたは複数の確立した徴候を呈する被験体の処置である。ある実施形態では、処置は、障害を患うと診断された被験体の処置である。
【０２７０】
本明細書で使用される、例えば、障害「を防止する」という用語は、被験体が、ポリペプチド（例えば、抗体分子）を受容すれば、被験体（例えば、ヒト）が、障害を有する可能性が低いことを意味する。
【０２７１】
本明細書では、組成物および方法の多様な態様を、下記でさらに詳細に記載する。さらなる定義は、明細書を通して明示される。
【０２７２】
結合ポリペプチドのライブラリー
結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体分子のライブラリー（例えば、ディスプレイライブラリー）、および結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体分子のライブラリーを作製する方法が本明細書に開示される。
【０２７３】
ある実施形態では、本明細書に記載された方法は、２つのＤＮＡ断片、例えば、抗体重鎖可変領域（またはその一部分）と抗体軽鎖可変領域（またはその一部分）、ＴＣＲα鎖（またはその一部分）とＴＣＲβ鎖（またはその一部分）、またはＴＣＲγ鎖（またはその一部分）とＴＣＲδ鎖（またはその一部分）をコードする配列を、リガーゼ媒介性アプローチを使用して、連結する。
【０２７４】
例えば、抗体は、２つの型のポリペプチド鎖、軽鎖と重鎖で構成され、それらのそれぞれは、別個のｍＲＮＡ分子から翻訳される。Ｂ細胞から特定の抗体（またはＢ細胞受容体）の機能ユニットをコピーするために、その特定の重鎖およびそれの同族の軽鎖の知識が維持されなければならない。これは、典型的には、個々のクローンがマイクロウェルプレートのウェル内にあるという方法を使用して実施され、そのことが、クローンを分離された状態にさせておき、したがって、その結果の重鎖配列および軽鎖配列は、対形成されることがわかっている。そのようなクローニングプロセスは、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートに適合するＢ細胞数へ十分、拡大する。しかしながら、ヒトおよび動物におけるＢ細胞レパートリーは、約１０６〜１０１１個のＢ細胞の範囲であり得、それらの多くは異なるクローン（すなわち、異なるＢＣＲまたは抗体）である。したがって、（１）鎖の天然の対形成を保持し、かつ（２）そのような多数の固有のクローンの機能照合を可能にする、何百万個〜何十億個というＢ細胞のコピーを、効率的な様式で作製し得る必要性がある。そのような方法は、様々な方法により機能的に照合することができる抗体のレパートリーの再生可能なコピーを作製することを促進し得る。
【０２７５】
ある実施形態では、本明細書に記載された方法は、以下の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、または全部）を使用する：（１）液滴（ｐＬ〜ｎＬの体積の滴）内の個々の細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）の小型化された区画化、（２）溶解し、かつ２つの鎖（例えば、抗体ＶＨとＶＬ、ＴＣＲα鎖とβ鎖、またはＴＣＲγ鎖とδ鎖）をＰＣＲ増幅すること、（３）天然の鎖対形成が保持されるように前記２つの鎖を特異的に連結し、しかも、熱安定性リガーゼがその連結を触媒すること、および（４）酵母またはファージディスプレイなどの表面ディスプレイテクノロジーによりクローンのハイスループットの表現型照合を可能にする様式で、前記連結されたＤＮＡを増幅すること。
【０２７６】
本明細書に記載された方法は、発現した場合、機能性ポリペプチド、例えば、機能性抗原結合ポリペプチドをコードする、核酸配列を生じ得る。例えば、ＨＣエレメントとＬＣエレメント（またはＡＣエレメントとＢＣエレメント、またはＧＣエレメントとＤＣエレメント）は、頭から頭へ、または尾から尾への配向では構成されない。ある実施形態では、ＨＣエレメントとＬＣエレメント（またはＡＣエレメントとＢＣエレメント、またはＧＣエレメントとＤＣエレメント）は、頭から尾への配向で構成される。例えば、ＬＣエレメント（またはＬＣＶＲＳ）のＣ末端が、ＨＣエレメント（またはＨＣＶＲＳ）のＮ末端と、直接的または間接的に、連結され、またはＨＣエレメント（またはＨＣＶＲＳ）のＣ末端が、ＬＣエレメント（またはＬＣＶＲＳ）のＣ末端と、直接的または間接的に、連結される。
【０２７７】
例示的なワークフロー
細胞（例えば、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）は、個々に、滴中にカプセル化される。滴において、細胞は溶解され、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドを含有するビーズ上へ捕捉される。ビーズは、天然の対形成情報（例えば、２つの鎖、例えば、単一Ｂ細胞における重鎖と軽鎖；単一Ｔ細胞におけるα鎖とβ鎖；または単一Ｔ細胞におけるγ鎖とδ鎖の間の天然の対形成）を維持することを容易にする。次に、そのｍＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡへ逆転写される。逆転写は、溶解滴内で、滴の外側で、またはその後の滴（「ＰＣＲ」滴）中で、実施され得る。捕捉されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを有するビーズは、最初の滴から回収される。その後、ビーズは、新しい滴中にカプセル化され、その新しい滴において、核酸が、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡが鋳型である場合）かまたはＰＣＲ（ｃＤＮＡが鋳型である場合）のいずれかにより増幅される。２つの鎖をコードするｃＤＮＡは、滴において増幅される。増幅された産物は、特異的な相補的核酸ハイブリダイゼーションによりビーズ上へ捕捉されて戻る。捕捉された産物を有するビーズは、滴から回収され、その後、新しい滴中にカプセル化される。滴において、熱安定性リガーゼを使用して、一方の鎖（例えば、ＶＨ）をコードする増幅産物は、他方の鎖（例えば、ＶＬ）をコードする増幅産物と連結される。あるアプローチ（「付着性産物を連結すること」）において、付着性（または「粘着末端」）ＰＣＲ産物が生成され、ハイブリダイズした付着性ＰＣＲ産物の共有結合性ライゲーションが、熱安定性リガーゼにより実施される。別のアプローチ（「リガーゼサイクリング反応」）において、付着性ＰＣＲ産物は産生されない。むしろ、滴において、ＤＮＡは、熱安定性リガーゼおよびスプリント（または架橋）オリゴヌクレオチドの使用により、互いに連結される。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、本明細書に記載された方法は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ方法により引き起こされる意図されない融合の可能性を低下させ、または排除すると考えられる（Ｔｕｒｃｈａｎｉｎｏｖａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１３年；４３巻（９号）：２５０７〜２５１５頁）。天然で対形成する鎖を表す、ライゲーションされた産物はさらに増幅されて、酵母またはファージにおけるなどのディスプレイライブラリーを生じるのに十分な材料を生成する。ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、または完全長ＩｇＧなどの形式における、天然で対形成する鎖（例えば、抗体重鎖と軽鎖、ＴＣＲα鎖とβ鎖、またはＴＣＲγ鎖とδ鎖）をコードする増幅産物は、酵母またはファージディスプレイなどの適切な発現またはディスプレイビヒクルへ導入される。例えば、１０４個より多く、かつ１０９個またはそれより多い数までを有する、構築されたライブラリーは、確立された方法を使用して、所望の結合および／または他の表現型性質について迅速に照合することができる。
【０２７８】
リガーゼの適切な基質である付着性ＰＣＲ産物の作製
ある実施形態では、リガーゼの適切な基質である付着末端を有する増幅（例えば、ＰＣＲ）産物が生成される。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ伸長を、例えば、化学修飾された（例えば、損傷された）ヌクレオチドもしくは塩基、または増幅に使用されるプライマーへの他の変化の使用を通して、限定された位置で中途で終結させることができると考えられる。これらの化学修飾されたヌクレオチドまたは塩基（または他のプライマー変化）は、その後、増幅産物の１つの鎖へ組み込まれる。ＤＮＡポリメラーゼは、修飾ヌクレオチドを含有する鋳型鎖を読み通す時、それは、読み通すことができないため、修飾ヌクレオチドにおいて（またはその近くで）伸長を中途で停止する。この修飾による早期ポリメラーゼ終結は、付着末端を有する増幅産物の産生をもたらし得る。その増幅産物は、（類似の様式で産生され得る）相補性付着末端を有する別の増幅産物と効率的にハイブリダイズ（またはアニール）することができる。例えば、それぞれ相補性付着末端を有する、１つの鎖（例えば、ＶＨ）をコードするＰＣＲ産物および別の鎖（例えば、ＶＬ）をコードするＰＣＲ産物は、お互いに高効率でハイブリダイズ（またはアニール）することができる。次に、ＤＮＡポリメラーゼと共に液滴中に（例えば、熱サイクリングを通じて）存在する熱安定性リガーゼは、ハイブリダイズした（またはアニールした）ＤＮＡ分子のライゲーション（共有結合性連結）を触媒する。
【０２７９】
ある実施形態では、天然対形成情報は、増幅およびライゲーション中、維持される。ある実施形態では、増幅とライゲーションの両方は、同じ滴において、例えば、滴を破壊することなく、起こる。ある実施形態では、リガーゼは、９５℃またはそれより高く（例えば、９６℃もしくはそれより高く、９７℃もしくはそれより高く、または９８℃もしくはそれより高く）において、１回または複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、またはそれより多く）の熱サイクル中、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。ある実施形態では、リガーゼは、９５℃またはそれより高く（例えば、９６℃もしくはそれより高く、９７℃もしくはそれより高く、または９８℃もしくはそれより高く）において、少なくとも５分間（例えば、少なくとも１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４５分間、または６０分間）、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。ある実施形態では、リガーゼは、９５℃またはそれより高く（例えば、９６℃もしくはそれより高く、９７℃もしくはそれより高く、または９８℃もしくはそれより高く）において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を可能にする緩衝液条件下、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。
【０２８０】
ある実施形態では、修飾は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害またはブロックし、かつ依然としてライゲーションのための基質であり続ける。ある実施形態では、修飾は、増幅産物のリガーゼへの結合を阻害または阻止しない。ある実施形態では、修飾は、ホスホジエステル結合の形成を阻害または阻止しない。ある実施形態では、修飾は、大きくかさ高い化学基を含まない。例示的な修飾には、リボース２’−Ｃ（２位炭素）修飾（例えば、ＯＨ（すなわち、リボヌクレオチドであって、デオキシリボヌクレオチドではない）、Ｏ−メチル（Ｏ−ＣＨ３）、またはアミン（ＮＨ２））；リボース４’−Ｃ（４位炭素）修飾；塩基修飾（例えば、非天然塩基、ウラシル、またはその他）；脱塩基部位（例えば、ＡＰ部位または脱ピリミジン／脱プリン）；またはスタガード型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）プライマー（例えば、異なる長さのオーバーハング）が挙げられるが、それらに限定されない。ある実施形態では、修飾はウラシルを含み、ウラシルにより阻害されるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ）が増幅に使用される。
【０２８１】
滴中での付着末端ＰＣＲ−ライゲーション実験を実施するための例示的なステップが下記に示されている。
【０２８２】
細胞カプセル化
細胞は、個々に液滴中にカプセル化することができる。ある実施形態では、細胞は免疫細胞である。ある実施形態では、細胞はＢ細胞である。ある実施形態では、細胞はＴ細胞である。ある実施形態では、細胞は抗体産生細胞である。ある実施形態では、細胞は、単離された細胞または精製された細胞である。ある実施形態では、細胞は、被験体、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはニワトリから得られる。
【０２８３】
ある実施形態では、液滴の体積は、１０ｐＬから１００ｎＬまで、例えば、１０ｐＬから１００ｐＬまで、１０ｐＬから１０００ｐＬまで、１０ｐＬから１０ｎＬまで、１０ｎＬから１００ｎＬまで、１０００ｐＬから１００ｎＬまで、１００ｐＬから１００ｎＬまで、１００ｐＬから１０ｎＬまで、１００ｐＬから１０００ｐＬまで、１０００ｐＬから１０ｎＬまで、または１００ｐＬから１０００ｐＬまでである。ある実施形態では、液滴の体積は、１００ｐＬから１０００ｐＬまでである。
【０２８４】
ある実施形態では、液滴は油中水型液滴である。ある実施形態では、液滴は、担体（例えば、油）相、例えば、約１％  フッ素系界面活性剤（ｆｌｕｏｒｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ（商標）ＨＦＥ−７５００を含む担体相中に存在する。
【０２８５】
液滴は、例えば、マイクロ流体チップ（例えば、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ製２Ｒ  １００μｍ）を使用して、シリンジまたは圧力ポンプにより制御される流体相の流れで形成することができる。ある実施形態では、液滴の水相は、緩衝液、細胞溶解を助ける試薬、およびビーズを含む。ある実施形態では、緩衝液は、ｐＨ  ７．５のＴｒｉｓを含む。ある実施形態では、細胞溶解を助ける試薬は洗剤を含む。細胞溶解を助けるために使用することができる例示的な洗剤には、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、ＩＧＥＰＡＬ、またはラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）が挙げられるが、それらに限定されない。ある実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。ある実施形態では、ビーズは、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、重鎖または軽鎖をコードするｍＲＮＡ）とアニールするためのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）とカップリングしている。
【０２８６】
ある実施形態では、液滴は、カプセル化後、１個以下の細胞を含有する。ある実施形態では、液滴は複数個のビーズを含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり１個以下の細胞を含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり少なくとも１個のビーズを含有する。典型的には、滴の占有は、液滴当たり１個以下の細胞、および液滴当たり少なくとも１個のビーズである。
【０２８７】
細胞溶解
カプセル化後、液滴は、細胞溶解を促進するためにインキュベートすることができる。ある実施形態では、（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）の存在下で、ビーズにより効率的に捕捉できるようにｍＲＮＡ二次構造を低減させるため、かつ／または溶解効率を向上させるために加熱される。ある実施形態では、エマルジョンは、４０℃から８０℃の間、例えば、４０℃から６０℃の間、５０℃から７０℃の間、または６０℃から８０℃の間の温度、例えば、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、または８０℃においてインキュベートされる。ある実施形態では、エマルジョンは、５〜６０分間、例えば、１０〜４５分間、１５〜３０分間、５〜３０分間、または３０〜５０分間、インキュベートされる。ある実施形態では、細胞は熱により溶解される。ある実施形態では、細胞は酵素により溶解される。典型的には、細胞が溶解された後、ｍＲＮＡが放出され、ビーズ上のオリゴヌクレオチドへアニールすることによりビーズ上に捕捉される。
【０２８８】
ビーズ回収
（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、滴不安定化試薬、例えば、パーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）を使用して破壊することができる。ある実施形態では、ビーズ含有水相が回収される。ある実施形態では、ビーズは磁気ビーズであり、磁石を使用して単離される。ある実施形態では、ビーズは、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５）において、洗浄され、再懸濁される。
【０２８９】
逆転写
逆転写は、標準方法を使用して実施することができる。ある実施形態では、逆転写は、非エマルジョン反応において実施される。ある実施形態では、逆転写は、エマルジョン反応において実施される。ある実施形態では、捕捉されたｍＲＮＡを有するビーズは、緩衝液−酵素混合物（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）において再懸濁され、逆転写を促進するために３５℃〜４５℃（例えば、４０℃）で１０〜６０分間（例えば、１５分間）、インキュベートされる。ある実施形態では、ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドは、第１のストランドｃＤＮＡの合成のためのプライマーとして使用される。ある実施形態では、ビーズは、逆転写後、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５）で洗浄される。
【０２９０】
ビーズカプセル化
ビーズは、個々に液滴中にカプセル化することができる。ある実施形態では、液滴の体積は、５ｐＬから５００ｐＬまで、例えば、５ｐＬから４００ｐＬまで、５ｐＬから３００ｐＬまで、５ｐＬから２００ｐＬまで、５ｐＬから１００ｐＬまで、５ｐＬから５０ｐＬまで、５ｐＬから２５ｐＬまで、４００ｐＬから５００ｐＬまで、３００ｐＬから５００ｐＬまで、２００ｐＬから５００ｐＬまで、１００ｐＬから５００ｐＬまで、５０ｐＬから５００ｐＬまで、２５ｐＬから５００ｐＬまで、１０ｐＬから５００ｐＬまで、１０ｐＬから４００ｐＬまで、２５ｐＬから３００ｐＬまで、５０ｐＬから２００ｐＬまで、または１０ｐＬから５０ｐＬまでである。ある実施形態では、液滴の体積は、１０ｐＬから５０ｐＬまでである。
【０２９１】
ある実施形態では、液滴は油中水型液滴である。ある実施形態では、液滴は、担体（例えば、油）相、例えば、約１％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ（商標）ＨＦＥ−７５００を含む担体相中に存在する。
【０２９２】
ある実施形態では、液滴は、カプセル化後、１個のビーズを含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり１個以下のビーズを含有する。
【０２９３】
ＰＣＲライゲーション反応
ある実施形態では、ＰＣＲライゲーション反応が実施される。ある実施形態では、ＰＣＲライゲーション反応は、抗体重鎖可変領域（またはその一部分）および抗体軽鎖可変領域（またはその一部分）をコードするヌクレオチド配列を含むライゲーションされた産物（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を生成する。ある実施形態では、ＰＣＲライゲーション反応は、ＴＣＲα鎖（またはその一部分）およびＴＣＲβ鎖（またはその一部分）をコードするヌクレオチド配列を含むライゲーションされた産物（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を生成する。ある実施形態では、ＰＣＲライゲーション反応は、ＴＣＲγ鎖（またはその一部分）およびＴＣＲδ鎖（またはその一部分）をコードするヌクレオチド配列を含むライゲーションされた産物（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を生成する。ある実施形態では、ＰＣＲライゲーション反応は、ｃＤＮＡとカップリングしているビーズ、ＤＮＡポリメラーゼ、（例えば、前記ｃＤＮＡの増幅のための）オリゴヌクレオチド、リガーゼ（例えば、熱安定性リガーゼ）、および緩衝液を含む液滴において、実施される。
【０２９４】
その反応に使用することができる例示的なＤＮＡポリメラーゼには、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２９５】
ある実施形態では、ライゲーション産物はｓｃＦｖ、ＦａｂまたはｓｃＦａｂカセットを含有する。ある実施形態では、カセット（例えば、ｓｃＦｖカセット）は、ＶＬ−リンカー−ＶＨとして構築される。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、その順序は、発現または機能へ有意な影響を及ぼすことなく、ＶＨ−リンカー−ＶＬへ切り換えることができると考えられる。ある実施形態では、カセット（例えば、ｓｃＦｖ）カセットは、ＶＨ−リンカー−ＶＬとして構築される。ある実施形態では、カセットは、定常領域配列（例えば、ＣＨ１ドメインおよび／またはＣＬドメイン）、例えば、ＶＬ−ＣＬとカップリングしたＶＨ−ＣＨ１を含む。
【０２９６】
同様に、ライゲーション産物は、α鎖−リンカー−β鎖もしくはβ鎖−リンカー−α鎖、またはγ鎖−リンカー−δ鎖もしくはδ鎖−リンカー−γ鎖として構築されたカセットを含有し得る。
【０２９７】
ある実施形態では、ＶＬ配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、ＶＨ配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０２９８】
ある実施形態では、ＶＨ配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、ＶＬ配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０２９９】
同様に、ある実施形態では、α鎖（またはγ鎖）配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、β鎖（またはδ鎖）配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０３００】
同様に、ある実施形態では、β鎖（またはδ鎖）配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、α鎖（またはγ鎖）配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０３０１】
前記反応に使用することができる例示的なリガーゼ（例えば、熱安定性リガーゼ）には、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）熱安定性ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｃ  ＤＮＡリガーゼ、Ｒｍａ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡリガーゼ、またはＴｔｈ  ＤＮＡリガーゼが挙げられるが、それらに限定されない。  
【０３０２】
ある実施形態では、緩衝液は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性とリガーゼ酵素活性の両方を支持する。
【０３０３】
ある実施形態では、熱サイクリングは、エマルジョンを用いて（例えば、ＰＣＲチューブにおいて）実施される。ある実施形態では、熱サイクリングは、以下の条件を使用して実施される：９５〜９８℃で３０秒間〜２分間の最初の変性；以下の１０〜３０サイクル：９５〜９８℃で１０〜３０秒間の変性、５０〜６０℃で１０〜３０秒間のプライマーアニーリング、７２℃で３０秒間のポリメラーゼ伸長、および４５〜５５℃で３分間の粘着産物アニーリングおよびライゲーション。反応は４℃で保持され得る。
【０３０４】
水性部の回収
（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、滴不安定化試薬、例えば、パーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）を使用して破壊することができる。ある実施形態では、水性部（例えば、連結産物、および必要に応じて、非連結産物を含有する）が回収される。ある実施形態では、ビーズは捨てられる。
【０３０５】
連結産物の精製
連結産物（例えば、天然で連結されるＶＬ−リンカー−ＶＨを表す）は、非連結産物（例えば、非連結ＶＨおよびＶＬ）から精製することができる。ライゲーション産物は、非ライゲーション産物からサイズ分離により分離される。例えば、変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、または変性ＨＰＬＣ−ＳＥＣを使用することができる。連結産物（約８００〜９００ｂｐ）は、非連結産物（約３５０〜５００ｂｐ）から単離される。変性ＰＡＧＥ精製について、ライゲーションされたバンドが、ゲルから切り出され、ゲルスライスからＤＮＡを抽出するために電気溶出（ｅｌｅｃｒｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）が実施される（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｅｌｕｔｏｒ）。
【０３０６】
精製された連結産物の増幅
精製された連結産物は、例えば、ＰＣＲにより増幅することができる。例えば、精製された連結産物は、ＤＮＡ含有修飾ヌクレオチドを穏和に読み通す条件下でのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を使用するＰＣＲにより増幅される。
【０３０７】
最終ＰＣＲ産物は、標準方法（例えば、発現ベクターでのエレクトロポレーション）を使用して、酵母へ導入されて、生物学的供給源に由来した天然で対形成するライブラリーを生じることができる。
【０３０８】
リガーゼサイクリング
ある実施形態では、異なる鎖（例えば、ＶＨおよびＶＬ）は、粘着末端産物を直接、お互いにアニールすることを促進するだろう、両方の鎖に共通したＤＮＡ配列を組み込むように増幅されない。ある実施形態では、架橋（またはスプリント）オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの増幅後であるが、熱安定性リガーゼの存在下で、含まれる。架橋オリゴヌクレオチドは、リガーゼの基質となるように、２つの鎖をお互いに直接隣接させて架橋することを促進し得る。次に、リガーゼは、ＤＮＡの鎖の間の共有結合形成を触媒する。この機構は、各鎖において、両方の鎖に共通した配列（例えば、ＶＨとＶＬの両方における共通配列を有するオーバーハングＤＮＡ）の組込みをもたらさないので、オーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシングの機会はない。
【０３０９】
このアプローチのステップは、一般的に、エマルジョンＰＣＲステップから始まることを除いて、上記と同じである。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は滴において実施され得る。プライマーは、オーバーハング配列を付加することができるが、一般的に、（上記のストラテジーと違って）付加される、両方の鎖（例えば、ＶＬおよびＶＨ）への共通配列はない。滴におけるビーズは、それのコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドにより、それぞれが特異的なオーバーハング配列を有する、２つの鎖のｄｓＤＮＡ産物（例えば、ＶＨおよびＶＬ）で満たされ、または飽和する。滴は破壊され、ビーズに連結もアニールもされていないあらゆるＰＣＲ産物が洗い流される。２つの鎖（例えば、ＶＨおよびＶＬ）のｄｓＤＮＡを含有するビーズは、熱安定性リガーゼおよびスプリントオリゴヌクレオチドの存在下で、新しい滴中にカプセル化される。このエマルジョン形式において、熱サイクリングが実施され、それは、３−ＤＮＡ片複合体の形成を促進する。この複合体は、リガーゼの基質であり、リガーゼは、共有結合形成を触媒して、２つの鎖を連結する。ある実施形態では、熱サイクリングは、全ての「トップストランド」ＤＮＡの連結された産物への変換を、１つの基質により律速されるまで、助ける。別の実施形態では、両方のストランドがライゲーションされる。例えば、いったん「トップストランド」がライゲーションされたならば、それは、反対のストランドについての「スプリント」として働くことができ、それをリガーゼは基質として認識するだろう。理論に縛られることを望まないが、この様相は、特に、反応を効率的にさせ、すなわち、最初のライゲーションされた産物が、より多くの鋳型（スプリント）として働いて、さらにより多い追加のライゲーションされた産物を生成することができると考えられる。滴は破壊され、ライゲーションされた産物は、標準ＰＣＲ手段により増幅される。
【０３１０】
リガーゼサイクリング実験を実施するための例示的なステップが下記に示されている。
【０３１１】
細胞カプセル化
細胞は、個々に液滴中にカプセル化することができる。ある実施形態では、細胞は免疫細胞である。ある実施形態では、細胞はＢ細胞である。ある実施形態では、細胞はＴ細胞である。ある実施形態では、細胞は抗体産生細胞である。ある実施形態では、細胞は、単離された細胞または精製された細胞である。ある実施形態では、細胞は、被験体、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはニワトリから得られる。
【０３１２】
ある実施形態では、液滴の体積は、１０ｐＬから１００ｎＬまで、例えば、１０ｐＬから１００ｐＬまで、１０ｐＬから１０００ｐＬまで、１０ｐＬから１０ｎＬまで、１０ｎＬから１００ｎＬまで、１０００ｐＬから１００ｎＬまで、１００ｐＬから１００ｎＬまで、１００ｐＬから１０ｎＬまで、１００ｐＬから１０００ｐＬまで、１０００ｐＬから１０ｎＬまで、または１００ｐＬから１０００ｐＬまでである。ある実施形態では、液滴の体積は、１００ｐＬから１０００ｐＬまでである。
【０３１３】
ある実施形態では、液滴は油中水型液滴である。ある実施形態では、液滴は、担体（例えば、油）相、例えば、約１％  フッ素系界面活性剤（ｆｌｕｏｒｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ（商標）ＨＦＥ−７５００を含む担体相中に存在する。
【０３１４】
液滴は、例えば、マイクロ流体チップ（例えば、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ製２Ｒ  １００μｍ）を使用して、シリンジまたは圧力ポンプにより制御される流体相の流れで形成することができる。ある実施形態では、液滴の水相は、緩衝液、細胞溶解を助ける試薬、およびビーズを含む。ある実施形態では、緩衝液は、ｐＨ  ７．５のＴｒｉｓを含む。ある実施形態では、細胞溶解を助ける試薬は洗剤を含む。細胞溶解を助けるために使用することができる例示的な洗剤には、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、ＩＧＥＰＡＬ、またはラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）が挙げられるが、それらに限定されない。ある実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。ある実施形態では、ビーズは、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、重鎖または軽鎖をコードするｍＲＮＡ）とアニールするためのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）とカップリングしている。
【０３１５】
ある実施形態では、液滴は、カプセル化後、１個以下の細胞を含有する。ある実施形態では、液滴は複数個のビーズを含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり１個以下の細胞を含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり少なくとも１個のビーズを含有する。典型的には、滴の占有は、液滴当たり１個以下の細胞、および液滴当たり少なくとも１個のビーズである。
【０３１６】
細胞溶解
カプセル化後、液滴は、細胞溶解を促進するためにインキュベートすることができる。ある実施形態では、（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）の存在下で、溶解効率を向上させるために加熱される。ある実施形態では、エマルジョンは、４０℃から８０℃の間、例えば、４０℃から６０℃の間、５０℃から７０℃の間、または６０℃から８０℃の間の温度、例えば、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、または８０℃においてインキュベートされる。ある実施形態では、エマルジョンは、５〜６０分間、例えば、１０〜４５分間、１５〜３０分間、５〜３０分間、または３０〜５０分間、インキュベートされる。ある実施形態では、細胞は熱により溶解される。ある実施形態では、細胞は酵素により溶解される。典型的には、細胞が溶解された後、ｍＲＮＡが放出され、ビーズ上のオリゴヌクレオチドへアニールすることによりビーズ上に捕捉される。
【０３１７】
ビーズ回収
（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、滴不安定化試薬、例えば、パーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）を使用して破壊することができる。ある実施形態では、ビーズ含有水相が回収される。ある実施形態では、ビーズは磁気ビーズであり、磁石を使用して単離される。ある実施形態では、ビーズは、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５）において、洗浄され、再懸濁される。ある実施形態では、ビーズは、ｍＲＮＡのビーズからの解離を低下させるために、冷たい状態で保持される。
【０３１８】
逆転写
逆転写は、標準方法を使用して実施することができる。ある実施形態では、逆転写は、非エマルジョン反応において実施される。ある実施形態では、逆転写は、エマルジョン反応において実施される。典型的な実施形態では、逆転写ステップは、ＰＣＲ滴内で実施される。例えば、ｍＲＮＡビーズが、ｃＤＮＡ形成およびｄｓＤＮＡ増幅を促進するための逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの両方と共に滴中にカプセル化される。ある実施形態では、捕捉されたｍＲＮＡを有するビーズは、緩衝液−酵素混合物（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）において再懸濁され、逆転写を促進するために３５℃〜４５℃（例えば、４０℃）で１０〜６０分間（例えば、１５分間）、インキュベートされる。ある実施形態では、ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドは、第１のストランドｃＤＮＡの合成のためのプライマーとして使用される。ある実施形態では、ビーズは、逆転写後、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５）で洗浄される。
【０３１９】
ＰＣＲのためのビーズカプセル化
ビーズは、個々に液滴中にカプセル化することができる。ある実施形態では、液滴の体積は、５ｐＬから５００ｐＬまで、例えば、５ｐＬから４００ｐＬまで、５ｐＬから３００ｐＬまで、５ｐＬから２００ｐＬまで、５ｐＬから１００ｐＬまで、５ｐＬから５０ｐＬまで、５ｐＬから２５ｐＬまで、４００ｐＬから５００ｐＬまで、３００ｐＬから５００ｐＬまで、２００ｐＬから５００ｐＬまで、１００ｐＬから５００ｐＬまで、５０ｐＬから５００ｐＬまで、２５ｐＬから５００ｐＬまで、１０ｐＬから５００ｐＬまで、１０ｐＬから４００ｐＬまで、２５ｐＬから３００ｐＬまで、５０ｐＬから２００ｐＬまで、または１０ｐＬから５０ｐＬまでである。ある実施形態では、液滴の体積は、１０ｐＬから５０ｐＬまでである。
【０３２０】
ある実施形態では、液滴は油中水型液滴である。ある実施形態では、液滴は、担体（例えば、油）相、例えば、約１％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ（商標）ＨＦＥ−７５００を含む担体相中に存在する。
【０３２１】
ある実施形態では、液滴は、カプセル化後、１個のビーズを含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり１個以下のビーズを含有する。
【０３２２】
ＰＣＲ反応
ある実施形態では、ＰＣＲ反応が実施される。ある実施形態では、ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡとカップリングしているビーズ、ＤＮＡポリメラーゼ、（例えば、前記ｃＤＮＡの増幅のための）オリゴヌクレオチド、および緩衝液を含む液滴において実施される。
【０３２３】
その反応に使用することができる例示的なＤＮＡポリメラーゼには、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。
【０３２４】
ある実施形態では、ＰＣＲ産物はｓｃＦｖカセットを含有する。ある実施形態では、ｓｃＦｖカセットは、ＶＬ−リンカー−ＶＨとして構築される。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、その順序は、発現または機能へ有意な影響を及ぼすことなく、ＶＨ−リンカー−ＶＬへ切り換えることができると考えられる。ある実施形態では、ｓｃＦｖカセットは、ＶＨ−リンカー−ＶＬとして構築される。
【０３２５】
同様に、ＰＣＲ産物は、α鎖−リンカー−β鎖もしくはβ鎖−リンカー−α鎖、またはγ鎖−リンカー−δ鎖もしくはδ鎖−リンカー−γ鎖として構築されたカセットを含有し得る。
【０３２６】
ある実施形態では、本明細書に記載された標的可変領域配列のためのプライマーは、（例えば、５’から３’へ）以下を含有することができる：捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である第１の配列、スペーサー（例えば、本明細書に記載されたスペーサー、例えば、ＰＥＧスペーサー）、前記第１の配列の少なくとも一部分に相補的である配列、ユニバーサルプライミング配列、および標的可変領域配列に相補的な配列。
【０３２７】
ある実施形態では、ＶＬ配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、ＶＨ配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０３２８】
ある実施形態では、ＶＨ配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、ＶＬ配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０３２９】
同様に、ある実施形態では、α鎖（またはγ鎖）配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、β鎖（またはδ鎖）配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０３３０】
同様に、ある実施形態では、β鎖（またはδ鎖）配列のためのリバースプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。ある実施形態では、α鎖（またはγ鎖）配列のためのフォワードプライマーは、以下の１つ、２つ、または全部を含有する：（ａ）リンカー配列をコードするオーバーハング配列、（ｂ）例えば前記オーバーハングにおける、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）；または（ｃ）５’−ホスフェート。
【０３３１】
ある実施形態では、熱サイクリングは、エマルジョンを用いて（例えば、ＰＣＲチューブにおいて）実施される。ある実施形態では、熱サイクリングは、以下の条件を使用して実施される：９５〜９８℃で３０秒間〜２分間の最初の変性；以下の１０〜３０サイクル：９５〜９８℃で１０〜３０秒間の変性、５０〜６０℃で１０〜３０秒間のプライマーアニーリング、および７２℃で３０秒間のポリメラーゼ伸長。ある実施形態では、ＰＣＲ産物のビーズへの捕捉を促進するために反応をゆっくり冷却させる。反応は４℃で保持され得る。
【０３３２】
ビーズ回収
（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、滴不安定化試薬、例えば、パーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）を使用して破壊することができる。ある実施形態では、ビーズ含有水相が回収される。ある実施形態では、ビーズは磁気ビーズであり、磁石を使用して単離される。ある実施形態では、ビーズは、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５）において、洗浄され、再懸濁される。
【０３３３】
リガーゼサイクリングのためのビーズカプセル化
ビーズは、個々に液滴中にカプセル化することができる。ある実施形態では、液滴の体積は、５ｐＬから５００ｐＬまで、例えば、５ｐＬから４００ｐＬまで、５ｐＬから３００ｐＬまで、５ｐＬから２００ｐＬまで、５ｐＬから１００ｐＬまで、５ｐＬから５０ｐＬまで、５ｐＬから２５ｐＬまで、４００ｐＬから５００ｐＬまで、３００ｐＬから５００ｐＬまで、２００ｐＬから５００ｐＬまで、１００ｐＬから５００ｐＬまで、５０ｐＬから５００ｐＬまで、２５ｐＬから５００ｐＬまで、１０ｐＬから５００ｐＬまで、１０ｐＬから４００ｐＬまで、２５ｐＬから３００ｐＬまで、５０ｐＬから２００ｐＬまで、または１０ｐＬから５０ｐＬまでである。ある実施形態では、液滴の体積は、１０ｐＬから５０ｐＬまでである。
【０３３４】
ある実施形態では、液滴は油中水型液滴である。ある実施形態では、液滴は、担体（例えば、油）相、例えば、約１％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ（商標）ＨＦＥ−７５００を含む担体相中に存在する。
【０３３５】
ある実施形態では、液滴は、カプセル化後、１個のビーズを含有する。ある実施形態では、複数個のビーズが得られ、その複数個のうちの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、液滴当たり１個以下のビーズを含有する。
【０３３６】
リガーゼサイクリング反応
ある実施形態では、リガーゼサイクリング反応が実施される。ある実施形態では、リガーゼサイクリング反応は、ＰＣＲ産物とカップリングしているビーズ、スプリントオリゴヌクレオチド（例えば、１つのストランド（例えば、「トップ」ＶＬストランド）の３’末端および別のストランド（例えば、「トップ」ＶＨストランド）の５’末端に相補的であり、かつそれらにアニールする）、熱安定性リガーゼ、およびリガーゼ酵素活性を支持する１つまたは複数の反応成分（例えば、ＮＡＤ）を含む液滴において実施される。
【０３３７】
前記反応に使用することができる例示的なリガーゼ（例えば、熱安定性リガーゼ）には、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）熱安定性ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｃ  ＤＮＡリガーゼ、Ｒｍａ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡリガーゼ、またはＴｔｈ  ＤＮＡリガーゼが挙げられるが、それらに限定されない。
【０３３８】
ある実施形態では、熱サイクリングは、エマルジョンを用いて（例えば、ＰＣＲチューブにおいて）実施される。ある実施形態では、熱サイクリングは、以下の条件を使用して実施される：以下の３〜１５サイクル：９０〜９５℃で３０秒間の変性、ならびに５０〜６０℃で１〜３分間のアニーリングおよびライゲーション。反応は４℃で保持され得る。
【０３３９】
水性部の回収
（例えば、合一した異なる溶液相を含有する）エマルジョンは、滴不安定化試薬、例えば、パーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）を使用して破壊することができる。ある実施形態では、水性部（例えば、連結産物、および必要に応じて、非連結産物を含有する）が回収される。ある実施形態では、ビーズは捨てられる。
【０３４０】
連結産物の精製
連結産物（例えば、天然で連結されるＶＬ−リンカー−ＶＨを表す）は、非連結産物（例えば、非連結ＶＨおよびＶＬ）から精製することができる。ライゲーション産物は、非ライゲーション産物からサイズ分離により分離される。例えば、変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、変性ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、アガロースゲル電気泳動、またはＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用することができる。連結産物（約８００〜９００ｂｐ）は、非連結産物（約３５０〜５００ｂｐ）から単離される。変性ＰＡＧＥ精製について、ライゲーションされたバンドが、ゲルから切り出され、ゲルスライスからＤＮＡを抽出するために電気溶出（ｅｌｅｃｒｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）が実施される（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｅｌｕｔｏｒ）。
【０３４１】
精製された連結産物の増幅
精製された連結産物は、例えば、ＰＣＲにより増幅することができる。例えば、精製された連結産物は、そのライゲーションされた産物の外側末端をアニールするオリゴヌクレオチドを用いた、標準条件下でのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を使用するＰＣＲにより増幅される。
【０３４２】
最終ＰＣＲ産物は、標準方法（例えば、発現ベクターでのエレクトロポレーション）を使用して、酵母または哺乳動物細胞へ導入されて、生物学的供給源に由来した天然で対形成するライブラリーを生じることができる。
【０３４３】
抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸を作製する方法における例示的なステップは、図２Ａ〜２Ｄに示されている。
【０３４４】
追加の例示的方法
ある態様では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法を特徴とし、前記方法は、図１のステップ：Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、およびＤ１を実行し、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製することを含む。
【０３４５】
ある態様では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法を特徴とし、前記方法は、図１のステップ：Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ２、およびＥ１を実行し、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製することを含む。
【０３４６】
ある態様では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法を特徴とし、前記方法は、図１のステップ：Ａ１、Ｂ１、Ｃ２、およびＤ３を実行し、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製することを含む。
【０３４７】
ある態様では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法を特徴とし、前記方法は、図１のステップ：Ａ１、Ｂ１、Ｃ２、Ｄ４、およびＥ２を実行し、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製することを含む。
【０３４８】
ある態様では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法を特徴とし、前記方法は、図１のステップ：Ａ１、Ｂ１、Ｃ３、およびＤ５を実行し、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製することを含む。
【０３４９】
ある態様では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法を特徴とし、前記方法は、図１のステップ：Ａ１、Ｂ１、Ｃ３、Ｄ６およびＥ３を実行し、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製することを含む。
【０３５０】
前述の例示的な方法において、ｃＤＮＡは、典型的には、このワークフロー概念において支持体（例えば、ビーズ）上に捕捉されない。例えば、ｍＲＮＡは、支持体（例えば、ビーズ）から解離し、その後、ｃＤＮＡが、隔離された反応部位（例えば、マイクロチャンバー）、例えば、滴における溶液中で作製され、その後、ＰＣＲ産物が、隔離された反応部位（例えば、マイクロチャンバー）、例えば、滴における溶液中で鋳型としてのｃＤＮＡから作製される。ある実施形態では、方法は、ＲＴ−ＰＣＲ反応を含み、両方の酵素ステップが滴における溶液中で起こる。前述の例示的な方法において、増幅産物は、典型的には、支持体（例えば、ビーズ）上に捕捉され、そのことは、対形成された産物を、次の隔離された反応部位（例えば、マイクロチャンバー）、例えば、次の滴へ移すのを容易にすることができる。
【０３５１】
抗体分子
抗体分子および抗体分子のライブラリーが本明細書に開示されている。ある実施形態では、抗体分子または抗体分子のライブラリーは、本明細書に記載された方法により作製される。
【０３５２】
本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖、または少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むその断片を指す。「抗体分子」という用語は、例えば、全長の成熟抗体、および抗体の抗原結合性断片を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書では、ＶＨと略記する）と、軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書では、ＶＬと略記する）とを含みうる。別の例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列と、２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列とを含み、これにより、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）（Ｄａｂ）（二価および二特異性）、およびキメラ（例えば、ヒト化）抗体（これらは、全抗体または組換えＤＮＡ技術を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成された抗体の修飾により生成され得る）など、２つの抗原結合性部位を形成する。これらの機能的な抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むがこれらに限定されない、任意のクラスの抗体、および任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）の抗体に由来しうる。抗体分子は、モノクローナル抗体分子の場合もあり、ポリクローナル抗体分子の場合もある。抗体分子はまた、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作出された抗体でもありうる。抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有しうる。抗体分子はまた、例えば、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖から選択される軽鎖も有しうる。本明細書では、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語を、「抗体」という用語と互換的に使用する。
【０３５３】
抗原結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ダイアボディー（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ科動物可変ドメインまたはラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照されたい）；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知である、いくつかの従来の技法を含む、任意の適する方法を使用して得ることができ、断片も、有用性について、無傷抗体と同じ形でスクリーニングすることができる。
【０３５４】
「抗体」という用語は、無傷分子のほか、その機能的断片も含む。抗体の定常領域を変更して、例えば、変異させて、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増大または減少させる）ことができる。
【０３５５】
抗体分子は、単鎖抗体でありうる。単鎖抗体（ｓｃＦＶ）は、操作することができる（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ，  Ｄ．ら（１９９９年）、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８８０巻：２６３〜８０頁；およびＲｅｉｔｅｒ，  Ｙ．（１９９６年）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２巻：２４５〜５２頁を参照されたい）。単鎖抗体を、二量体化または多量体化させて、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を作出することができる。
【０３５６】
本明細書で開示される抗体分子はまた、単一ドメイン抗体でもありうる。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が、単一ドメインポリペプチドの部分である抗体を含みうる。例は、天然で軽鎖を欠く抗体である重鎖抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作抗体、および抗体に由来する足場以外の単一ドメイン足場を含むがこれらに限定されない。単一ドメイン抗体は、任意の当該分野による単一ドメイン抗体、または任意の将来的な単一ドメイン抗体でありうる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来しうる。一部の態様に従い、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として公知である、天然に存在する単一ドメイン抗体である。このような単一ドメイン抗体については、例えば、ＷＯ９４／０４６７８において開示されている。明確さの理由で述べると、本明細書では、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体に由来する、この可変ドメインは、従来の４鎖免疫グロブリンのＶＨから識別される、ＶＨＨまたはナノボディーとして公知である。このようなＶＨＨ分子は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコにおいて惹起される抗体に由来しうる。Ｃａｍｅｌｉｄａｅ以外の他の種も、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体を産生することが可能であり、このようなＶＨＨもまた想定される。
【０３５７】
ＶＨ領域およびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲまたはＦＷ）と称する、より保存的な領域を分散させた、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称する超可変性領域へと細分することができる。本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変領域内のアミノ酸配列であって、抗原特異性および結合アフィニティーを付与するアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される「フレームワーク」、「ＦＷ」、および「ＦＲ」という用語は、互換的に使用される。
【０３５８】
フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲については、多数の方法により正確に規定されている（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号；Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．ら（１９８７年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅにより使用されるＡｂＭによる定義を参照されたい）。一般に、例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｄｕｅｂｅｌ，  Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい。ある実施形態では、以下の定義：重鎖可変ドメインのＣＤＲ１についてのＡｂＭによる定義と、他のＣＤＲについてのＫａｂａｔによる定義とを使用する。ある実施形態では、全てのＣＤＲについて、Ｋａｂａｔによる定義を使用する。加えて、ＫａｂａｔによるＣＤＲまたはＡｂＭによるＣＤＲに関して記載される実施形態はまた、Ｃｈｏｔｈｉａによる超可変ループを使用して実行することもできる。各ＶＨおよび各ＶＬは、典型的に、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲと、４つのＦＲとを含む。
【０３５９】
本明細書で使用される「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成しうるアミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含みうる。例えば、配列は、１つ、２つ、またはこれを超えるＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸を含む場合もあり、これらを含まない場合もあり、タンパク質構造の形成と適合性である、他の変更を含む場合もある。
【０３６０】
「抗原結合性領域」という用語は、抗原またはそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含む抗体分子の部分を指す。タンパク質（またはタンパク質模倣体）に関して、抗原結合性領域は、典型的に、抗原に結合する界面を形成する、１つまたは複数のループ（少なくとも、例えば、４つのアミノ酸またはアミノ酸模倣体による）を含む。典型的に、抗体分子の抗原結合性領域は、少なくとも１つもしくは２つのＣＤＲおよび／または超可変性ループ、またはより典型的に少なくとも３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲおよび／または超可変性ループを含む。
【０３６１】
本明細書では、「競合する」または「交差競合する」という用語は、別の抗体分子の、標的への結合に干渉する抗体分子の能力を指すように、互換的に使用される。結合への干渉は、直接的な場合もあり、間接的な場合（例えば、抗体分子または標的のアロステリックモジュレーションを介する）もある。抗体分子が、別の抗体分子の、標的への結合に干渉することが可能な程度と、したがって、抗体分子が、競合すると言いうるのかどうかとは、競合結合アッセイ、例えば、ＦＡＣＳアッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはＢＩＡＣＯＲＥアッセイを使用して決定することができる。ある実施形態では、競合結合アッセイは、定量的競合アッセイである。ある実施形態では、第１の抗体分子の標的への結合が、競合結合アッセイ（例えば、本明細書に記載の競合アッセイ）において１０％またはそれより多く、例えば、２０％またはそれより多く、３０％またはそれより多く、４０％またはそれより多く、５０％またはそれより多く、５５％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、６５％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、７５％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、８５％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多くだけ低減される場合に、第１の抗体分子は、第２の抗体分子と標的に対する結合について競合するという。
【０３６２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術により作製することもでき、ハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、組換え法）により作製することもできる。
【０３６３】
「事実上のヒト」タンパク質とは、中和抗体応答、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を惹起しないタンパク質である。ＨＡＭＡは、多数の状況において、例えば、例えば、慢性疾患状態または再発性疾患状態の処置において、抗体分子を反復的に投与する場合に問題となりうる。ＨＡＭＡ応答は、血清からの抗体のクリアランスの増大のために（例えば、Ｓａｌｅｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２巻：１８０〜１９０頁（１９９０年）を参照されたい）、また、潜在的なアレルギー性反応のためにも（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、５巻：５１１７〜５１２３頁（１９８６年）を参照されたい）、反復抗体投与を、潜在的に無効としうる。
【０３６４】
抗体分子は、ポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体の場合もある。一部の実施形態では、抗体を、組換えにより生成する、例えば、任意の適切なファージディスプレイ法またはコンビナトリアル法により生成することができる。
【０３６５】
抗体を作製するための種々のファージディスプレイ法およびコンビナトリアル法が当該技術分野において公知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、国際公開ＷＯ  ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、国際公開ＷＯ  ９１／１７２７１；  Ｗｉｎｔｅｒら、国際公開ＷＯ  ９２／２０７９１；  Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際公開ＷＯ  ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際公開ＷＯ  ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、国際公開ＷＯ  ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、国際公開ＷＯ  ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら、（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら、（１９９２）  Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら、（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓら、（１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；  Ｇｒａｍら、（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら、（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓら、（１９９１）  ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に記載されている通りであり、これらの全ての内容は本明細書に参考として援用される）。
【０３６６】
ある実施形態では、抗体分子は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を産生するように遺伝子操作されたマウスにおいて作られる抗体）、または非ヒト抗体、例えば、齧歯類（マウスまたはラット）抗体、ヤギ抗体、霊長類（例えば、サル）抗体、ラクダ抗体である。ある実施形態では、非ヒト抗体は、齧歯類抗体（マウス抗体またはラット抗体）である。当技術分野では、齧歯類抗体を生成する方法が公知である。
【０３６７】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを使用して作出することができる。目的の抗原で免疫化された、これらのトランスジェニックマウスに由来する脾臓細胞を使用して、ヒトタンパク質に由来するエピトープに対して特異的なアフィニティーを伴う、ヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生成することができる（例えば、Ｗｏｏｄら、国際公開ＷＯ  ９１／００９０６，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、国際公開ＷＯ  ９１／１０７４１；  Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際公開ＷＯ  ９２／０３９１８；Ｋａｙら、国際公開９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｌ．ら、１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．ら、１９９４  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６を参照）。
【０３６８】
抗体は、可変領域またはその部分、例えば、ＣＤＲを、非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて作出した抗体でありうる。キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体は、本発明の範囲内にある。非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて作出し、次いで、ヒトにおける抗原性を減少させるように、例えば、可変領域のフレームワーク内または定常領域内で修飾した抗体も、本発明の範囲内にある。
【０３６９】
キメラ抗体は任意の好適な組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。いくつかが、当技術分野で公知である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願１８４，１８７；  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．、欧州特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際公開ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら、（１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）；Ｌｉｕら、（１９８７）  ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら、１９８７，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら、（１９８７）  ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７，  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら、（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら、１９８８，  Ｊ．  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１５５３−１５５９を参照）。
【０３７０】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、少なくとも１つまたは２つであるが、一般に３つ全てのレシピエントＣＤＲ（免疫グロブリンの重鎖およびまたは軽鎖の）を、ドナーＣＤＲで置きかえる。抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも１つの部分で置きかえる場合もあり、ＣＤＲの一部だけを、非ヒトＣＤＲで置きかえる場合もある。抗原へのヒト化抗体の結合に要求される数のＣＤＲを置きかえることだけが必要である。ある実施形態では、ドナーは、齧歯類抗体、例えば、ラット抗体またはマウス抗体であり、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであろう。典型的に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンを、「ドナー」と呼び、フレームワークを提供する免疫グロブリンを、「アクセプター」と呼ぶ。一部の実施形態では、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば、齧歯類）免疫グロブリンである。アクセプターフレームワークは、典型的に、天然に存在する（例えば、ヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワーク、またはこれと、約８５％もしくはこれを超えて、例えば、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一な配列である。
【０３７１】
本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、類縁配列のファミリー内で、最も高頻度で生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８７年を参照されたい）。タンパク質のファミリー内では、コンセンサス配列内の各位置は、ファミリー内のこの位置において最も高頻度で生じるアミノ酸で占有される。２つのアミノ酸が、同等に高頻度で生じる場合、いずれも、コンセンサス配列内に含まれうる。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列内のフレームワーク領域を指す。
【０３７２】
抗体は任意の好適な方法によってヒト化することができ、いくつかのそのような方法が、当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７，  Ｏｉら、１９８６，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４およびＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号を参照、これらの全ての内容は本明細書に参考として援用される）。
【０３７３】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、免疫グロブリン鎖のうちの、１つ、２つ、または全てのＣＤＲを、置きかえうる、ＣＤＲグラフティングまたはＣＤＲ置換により生成することができる。例えば、それらの全ての内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５５２〜５２５頁；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４頁；Ｂｅｉｄｌｅｒら、１９８８年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１巻：４０５３〜４０６０頁；Ｗｉｎｔｅｒ、ＵＳ５，２２５，５３９を参照されたい。Ｗｉｎｔｅｒは、ヒト化抗体を調製するのに使用しうる、ＣＤＲグラフティング法について記載している（その内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ、ＵＳ５，２２５，５３９である、１９８７年３月２６日に出願された、英国特許出願第ＧＢ２１８８６３８Ａ号）。
【０３７４】
また、特異的なアミノ酸を、置換するか、欠失させるか、または付加したヒト化抗体も提示される。ドナーに由来するアミノ酸を選択するための基準については、例えば、その内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、ＵＳ５，５８５，０８９、例えば、ＵＳ５，５８５，０８９の１２〜１６段において記載されている。抗体をヒト化する他の技法については、１９９２年１２月２３日に公表された、Ｐａｄｌａｎら、ＥＰ５１９５９６Ａ１において記載されている。
【０３７５】
ある実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａ）、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体分子は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域を変更して、例えば、変異させて、抗体分子の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、および／または補体機能のうちの１または複数を増大または減少させる）ことができる。ある実施形態では、抗体分子は、エフェクター機能を有し、補体に結合しうる。別の実施形態では、抗体分子は、エフェクター細胞を動員したり、補体に結合したりしない。ある特定の実施形態では、抗体分子は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低減されているか、またはこの能力を有さない。例えば、抗体分子は、Ｆｃ受容体への結合を支援しない、アイソタイプもしくは亜型、断片、または他の改変体でありうる、例えば、抗体分子は、Ｆｃ受容体結合性領域を、変異または欠失させている。
【０３７６】
ある実施形態では、抗体分子の定常領域を変更する。当技術分野では、抗体定常領域を変更するための方法が公知である。機能を変更した、例えば、細胞上のＦｃＲ、または補体のＣ１成分など、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを変更した抗体分子は、抗体の定常部分内の、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なる残基で置きかえることにより生成することができる（例えば、それらの全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ３８８，１５１Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたい）。また、Ｓ２２８Ｐ（ＥＵ命名法；Ｋａｂａｔ命名法では、Ｓ２４１Ｐ）など、ヒトＩｇＧ４内の抗体構造を安定化させるアミノ酸変異も想定される。マウスまたは他の種の免疫グロブリンへと適用されれば、これらの機能を低減するか、または消失させる、同様の種類の変更も記載されうるであろう。
【０３７７】
ある実施形態では、抗体分子内のアミノ酸だけが、正準のアミノ酸である。ある実施形態では、抗体分子は、天然に存在するアミノ酸；それらの類似体、誘導体、および同類；改変体の側鎖を有するアミノ酸類似体；および／または前出のうちのいずれかの、全ての立体異性体を含む。抗体分子は、アミノ酸のＤ光学異性体またはＬ光学異性体と、ペプチド模倣体とを含みうる。
【０３７８】
本明細書で記載される抗体分子のポリペプチドは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含む場合があり、非アミノ酸により中断される場合がある。抗体分子はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識化構成要素とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作により修飾することもできる。ポリペプチドは、天然の供給源から単離することもでき、組換え法により、真核宿主または原核宿主から生成することもでき、合成手順の生成物の場合もある。
【０３７９】
本明細書で記載される抗体分子は、非コンジュゲート形態において単独で使用することもでき、物質、例えば、毒素もしくは部分（例えば、治療薬；放射線を放出する化合物；植物起源、真菌起源、もしくは細菌起源の分子；または生物学的タンパク質（例えば、タンパク質毒素）もしくは生物学的粒子（例えば、例えば、ウイルスコートタンパク質を介する、組換えウイルス粒子）に結合させることもできる。例えば、抗体分子は、α放射体、β放射体、もしくはγ放射体、またはβおよびγの放射体などの放射性同位元素とカップリングさせることができる。
【０３８０】
抗体分子は、誘導体化することもでき、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）へと連結することもできる。本明細書で使用される「誘導体化」抗体分子とは、修飾抗体分子である。誘導体化法は、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、毒素、酵素、またはビオチンなどのアフィニティーリガンドの付加を含むがこれらに限定されない。したがって、抗体分子は、免疫接着分子を含む、本明細書で記載される抗体の誘導体化形態、および他の形の修飾形態を含むことを意図する。例えば、抗体分子は、別の抗体（例えば、二特異性抗体またはダイアボディー）、検出可能な作用物質、毒素、医薬、および／または抗体もしくは抗体部分の、別の分子（ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介しうるタンパク質もしくはペプチドなど、１つまたは複数の他の分子実体へと機能的に連結する（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、または他の形で）ことができる。
【０３８１】
一部の種類の誘導体化抗体分子は、２つまたはこれを超える抗体（同じ種類、または、例えば、二特異性抗体を創出するように、異なる種類）を架橋することにより生成される。適切な架橋剤は、ヘテロ二官能性の架橋剤であって、適切なスペーサーで隔てられた、２つの顕著に異なる反応性基を有する架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性の架橋剤（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）を含む。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから市販されている。
【０３８２】
抗体分子を誘導体化させうる（または標識化しうる）、有用な検出可能な作用物質は、蛍光化合物、多様な酵素、補欠分子族、発光材料、生物発光材料、蛍光放出性金属原子、例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、および他のランタニド、ならびに放射性材料（下記で記載する）を含む。例示的な蛍光性の検出可能な作用物質は、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどを含む。抗体はまた、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素によっても誘導体化させることができる。抗体を、検出可能な酵素で誘導体化させる場合、検出可能な酵素は、酵素が、検出可能な反応生成物を生成させるのに使用する、さらなる試薬を添加することにより検出することができる。例えば、検出可能な作用物質である、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、検出可能である、有色の反応生成物をもたらす。抗体分子はまた、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）によっても誘導体化させることができる。例えば、抗体を、ビオチンで誘導体化させ、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的測定を介して検出することができる。適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；発光材料の例は、ルミノールを含み、生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む。
【０３８３】
標識化抗体分子は、（ｉ）所定の抗原を、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準法により単離すること；（ｉｉ）タンパク質の存在度および発現パターンについて評価するために、所定の抗原を検出する（例えば、細胞溶解物中または細胞上清中で）こと；（ｉｉｉ）組織内のタンパク質レベルを、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定する臨床試験手順の一部としてモニタリングすることを含む、多数の文脈で、例えば、診断に使用することもでき、かつ／または実験に使用することもできる。
【０３８４】
抗体分子は、別の分子実体、典型的に、標識剤もしくは標識部分または治療剤もしくは治療部分（例えば、抗微生物剤もしくは抗微生物部分（例えば、抗菌剤もしくは抗菌部分、または殺菌剤もしくは殺菌部分）、免疫調節剤もしくは免疫調節部分、免疫刺激剤もしくは免疫刺激剤部分、細胞傷害剤もしくは細胞傷害部分、または細胞増殖抑制剤もしくは細胞増殖抑制部分）とコンジュゲートさせることができる。放射性同位元素は、診断的適用において使用することもでき、治療的適用において使用することもできる。抗体分子とカップリングさせうる放射性同位元素は、α放射体、β放射体、もしくはγ放射体、またはβおよびγの放射体を含むがこれらに限定されない。このような放射性同位元素は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、クロム（５１Ｃｒ）、塩素（３６Ｃｌ）、コバルト（５７Ｃｏまたは５８Ｃｏ）、鉄（５９Ｆｅ）、セレン（７５Ｓｅ）、またはガリウム（６７Ｇａ）を含むがこれらに限定されない。治療剤として有用な放射性同位元素は、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、およびロジウム（１８８Ｒｈ）を含む。例えば、診断法における使用のための標識として有用な放射性同位元素は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、炭素（１４Ｃ）、およびトリチウム（３Ｈ）、または上記で列挙した治療用同位元素のうちの１または複数を含む。
【０３８５】
本開示は、放射性標識化抗体分子と、抗体分子を標識化する方法とを提示する。ある実施形態では、抗体分子を標識化する方法が開示される。方法は、抗体分子を、キレート剤と接触させて、これにより、コンジュゲート抗体を生成するステップを含む。コンジュゲート抗体を、放射性同位元素、例えば、１１１インジウム、９０イットリウム、および１７７ルテチウムで放射性標識化して、これにより、標識化抗体分子を生成する。
【０３８６】
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される抗体分子を作製する方法を提示する。方法は、抗原またはその断片を提供するステップと；抗原に特異的に結合する抗体分子を得るステップと；抗原および／または抗原を発現する生物の活性をモジュレートすることにおける、抗体分子の有効性を評価するステップとを含む。方法は、その誘導体（例えば、ヒト化抗体分子）を含む抗体分子を、被験体、例えば、ヒトへと投与するステップをさらに含みうる。
【０３８７】
本開示は、上記の抗体分子をコードする単離核酸分子、ベクター、およびこれらの宿主細胞を提示する。核酸分子は、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含むがこれらに限定されない。
【０３８８】
他の結合ポリペプチド
本明細書における開示は、抗体分子に限定されることを意図するものではない。本明細書に記載された方法は、（例えば、少なくとも２つの対形成される、またはマッチした鎖を有する）２つまたはそれより多い鎖を有する任意の結合ポリペプチドに幅広く適用できる。
【０３８９】
ある実施形態では、結合分子は、Ｘ鎖可変領域およびＹ鎖可変領域を含む。例えば、本明細書における態様、実施形態、および定義のいずれかにおいて、抗体重鎖（または可変領域）は、Ｘ鎖（または可変領域）に置き換えることができ、抗体軽鎖（または可変領域）は、Ｙ鎖（または可変領域）に置き換えることができる。
【０３９０】
ある態様において、本開示は、抗体Ｘ鎖可変領域（ＸＣＶＲ）のＸ鎖エレメント（ＸＣエレメント）および抗体Ｙ鎖可変領域（ＹＣＶＲ）のＹ鎖エレメント（ＹＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＸＣＶＲおよびＹＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＸＣＶＲのＸＣエレメント、例えば、Ｘ鎖可変領域配列（ＸＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＸ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、Ｘ鎖（ＸＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＹＣＶＲのＹＣエレメント、例えば、Ｙ鎖可変領域配列（ＹＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＹ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、Ｙ鎖（ＹＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＸＣストランドをＹＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＹＣＶＲまたはＸＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＸＣＶＲのＸＣエレメントおよびＹＣＶＲのＹＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＸＣＶＲおよびＹＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法を特徴とする。
【０３９１】
「マッチした」は、その用語がＸ鎖可変領域とＹ鎖可変領域に関して本明細書で使用される場合、それらが同じ細胞由来であることを意味する。ある実施形態において、Ｘ鎖可変領域およびＹ鎖可変領域は、多価タンパク質または多価タンパク質の一部を形成し得る。Ｘ鎖可変領域のエレメントおよびＹ鎖可変領域のエレメントに関して、それは、そのエレメントが由来しているＸ鎖可変領域とＹ鎖可変領域が同じ細胞由来であることを意味する。
【０３９２】
「Ｘ鎖可変領域配列」または「ＸＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、他のポリペプチド（例えば、抗原）の結合を可能にするのに十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＸＣＶＲＳは、Ｙ鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。「Ｙ鎖可変領域配列」または「ＹＣＶＲＳ」は、その用語が本明細書で使用される場合、他のポリペプチド（例えば、抗原）の結合を可能にするのに十分な配列を含むポリペプチドを指す。実施形態では、ＹＣＶＲＳは、Ｘ鎖可変領域と組み立てられ、かつ、例えば、抗原を結合することができる。
【０３９３】
ＹＣまたはＸＣ可変領域の「エレメント」は、その用語が本明細書で使用される場合、少なくとも１個のアミノ酸をコードする配列を指す。ある実施形態では、エレメントはＣＤＲを含む。ある実施形態では、エレメントはＦＷ領域を含む。
【０３９４】
ある実施形態では、ＸＣエレメントは、ＸＣＶＲＳを含み、またはそれからなる。ある実施形態では、ＹＣエレメントは、ＹＣＶＲＳを含み、またはそれからなる。
【０３９５】
ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＸＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＸＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、かつＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含む。
【０３９６】
ある実施形態では、細胞は免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、例えば、ヒトＢ細胞である。ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞またはトリ細胞である。
【０３９７】
ある実施形態では、核酸配列が、発現した時、ＸＣエレメントおよびＹＣエレメント（例えば、ＸＣＶＲＳおよびＹＣＶＲＳ）が機能性抗原結合分子、例えば、ＸＣおよびＹＣの単一鎖または複合体を形成するように、構成される。ある実施形態では、抗原結合分子が、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である。
【０３９８】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップは、以下：
ａ）以下：（ｉ）細胞由来のＸＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および（ｉｉ）上記細胞由来のＹＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：上記細胞由来のＸＣＶＲのＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および上記細胞由来のＹＣＶＲのＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップを含む。
【０３９９】
ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第１のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【０４００】
ある実施形態では、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である。例えば、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なり、ならびに／またはＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖は、第２のｄｓ  ｃＤＮＡのアンチセンス鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、もしくはそれと１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、もしくは５０ヌクレオチド以下、異なる。
【０４０１】
ある実施形態では、ＸＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＹＣストランドはセンス鎖である。ある実施形態では、ＸＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＹＣストランドはアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＸＣストランドとＹＣストランドの両方がセンス鎖である。ある実施形態では、ＸＣストランドとＹＣストランドの両方がアンチセンス鎖である。
【０４０２】
ある実施形態では、捕捉支持体は、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＸＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＹＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。ある実施形態では、例えば同様のレベルの各ＤＮＡ分子型を捕捉するのに都合良い条件を生じることを促進するために、ＸＣストランドと結合する部分は、ＹＣストランドと結合する部分と異なる。ある実施形態では、ＸＣストランドと結合する部分は、ＹＣストランドと結合する部分と同一である。
【０４０３】
ある実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている。
【０４０４】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下：第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＸＣＶＲのＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｃＤＮＡ、および細胞のＹＣＶＲのＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む。
【０４０５】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む。
【０４０６】
ある実施形態では、細胞由来のＸＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される。ある実施形態では、細胞由来のＹＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドは、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される。
【０４０７】
ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる。ある実施形態では、逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる。
【０４０８】
ある実施形態では、増幅は、３０サイクルまたはそれ未満、例えば、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、１５サイクルもしくはそれ未満、１４サイクルもしくはそれ未満、１３サイクルもしくはそれ未満、１２サイクルもしくはそれ未満、１１サイクルもしくはそれ未満、１０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む。
【０４０９】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、例えばＸＣＶＲＳおよび／またはＹＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する。
【０４１０】
ある実施形態では、逆転写および／または増幅は、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。ある実施形態では、増幅は、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない。
【０４１１】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない。
【０４１２】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ伸長を低下させる（例えば、ブロックする）任意の化学的実体が、本明細書に記載された方法に従って使用することができると考えられる。
【０４１３】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である。ある実施形態では、スペーサーは可撓性スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーは炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多い）脱塩基ヌクレオチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーである。ある実施形態では、スペーサーはＰＥＧスペーサーである。ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである。
【０４１４】
ある実施形態では、ヌクレオチド修飾は、プライマーの内部に、または３’末端に位置する。ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）第３のメンバー（例えば、本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む）を含む。
【０４１５】
ある実施形態では、第１のメンバーは、第２のメンバーとアニールする能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは、同じプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子内ハイブリダイゼーションを通して、アニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二Ｘ鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。別の実施形態では、第１のメンバーは、異なるプライマー内の第２のメンバーと、例えば、分子間ハイブリダイゼーションを通して、アニールまたはハイブリダイズして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、修飾プライマーが形成し、支持体（例えば、ビーズ）捕捉に対する競合の低下（例えば、防止）を促進することができる、少なくとも２つの二次構造があると考えられる。例えば、二次構造は、（同じプライマー内での）分子内ハイブリダイゼーションにより形成されるヘアピン様構造であり得、または二次構造は、（２つの異なるプライマー間の）分子間ハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖構造であり得る。
【０４１６】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＸＣＶＲＳおよび／またはＹＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【０４１７】
ある実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む。ある実施形態では、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーは、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、可撓性（例えば、グリシンにより促進される）および親水性の一般的性質をもつ任意の配列は、本明細書に記載された方法に従って、有効に働き得ると考えられる。例示的なリンカーは、一般的に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａの１つまたは複数が過剰出現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し、および疎水性残基、例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅの１つまたは複数が過少出現（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）し得る。プライマーの長さは、様々であり得、例えば、３〜５０個のアミノ酸残基（例えば、５〜４５個、１０〜４０個、１５〜３５個、２０〜３０個、１０〜２０個、１０〜３０個、２０〜４０個、または３０〜４０個のアミノ酸残基）である。ある実施形態では、リンカー配列は、（（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ））ｎ（式中、ｍ＝３、４、５、またはそれより大きい、およびｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる。
【０４１８】
ある実施形態では、プライマーは、本明細書に、例えば、実施例に、記載されたプライマーである。
【０４１９】
ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーにおける溶液中で起こる。ある実施形態では、逆転写、増幅、またはその両方は、支持体（例えば、ビーズ）上で起こらない。例えば、逆転写、増幅、またはその両方は、液滴内の溶液中で起こり得る。
【０４２０】
ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む。ある実施形態では、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む。ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡは、粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する。
【０４２１】
ある実施形態では、ＸＣストランドおよびＹＣストランドは、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＸＣおよびＹＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＸＣストランドおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＹＣストランドは、共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＸＣおよびＹＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である。ある実施形態では、ＸＣストランドは、ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＹＣストランドがＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる。
【０４２２】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー、または隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＸＣストランドおよびＹＣストランド、またはＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、ＸＣストランドおよびＹＣストランド、またはＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【０４２３】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、ＸＣストランドおよびＹＣストランドは、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＸＣストランドおよびＹＣストランド、またはＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む。ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＸＣストランドおよびＹＣストランド、またはＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む。ある実施形態では、酵素は、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである。ある実施形態では、共有結合性連結は、リガーゼ熱サイクリングを含む。
【０４２４】
ある実施形態では、共有結合性連結、例えば、ライゲーションは、以下：（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＸＣストランドおよびＹＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９５℃で）、加熱するステップ；（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＸＣストランドおよびＹＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、５０〜６５℃で）、冷却するステップ；（ｃ）ＸＣストランドおよびＹＣストランドのライゲーション（例えば、ＸＣストランドとＹＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４５〜６５℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクル、４５サイクル、５０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップを含む。
【０４２５】
ある実施形態では、ＸＣストランドおよびＹＣストランドは、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、ＸＣストランドとＹＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する。ある実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む。ある実施形態では、修飾は、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【０４２６】
ある実施形態では、共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＸＣおよびＹＣストランドに相補的なストランドは、増幅により産生される。
【０４２７】
ある実施形態では、方法、例えば、共有結合性の連結のステップは、オーバーラップ伸長によるスプライシングまたはオーバーハング伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲとしても公知のオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）のステップを含まない。
【０４２８】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む。
【０４２９】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップは、ａ）ｉ）細胞；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＸＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＹＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびにｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップを含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＸＣＶＲまたはＹＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０４３０】
ある実施形態では、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーは、溶解試薬、例えば、洗剤を含む。ある実施形態では、細胞は、熱または酵素により溶解される。ある実施形態では、捕捉支持体は、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む。
【０４３１】
ある実施形態では、方法は、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、放出ステップは、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。
【０４３２】
ある実施形態では、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体は、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される。
【０４３３】
ある実施形態では、方法は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから核酸配列を放出させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、核酸配列を増幅するステップをさらに含む。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、例えば、核酸が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーから放出された後、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で起こる。ある実施形態では、核酸配列の増幅は、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーで起こる。
【０４３４】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む。
【０４３５】
ある実施形態では、方法は、核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む。ある実施形態では、ベクターは、核酸配列内に含まれない追加のＸＣエレメントまたはＹＣエレメントを供給する。ある実施形態では、ベクターは、ＸＣ  ＣＤＲ１、ＸＣ  ＣＤＲ２、またはその両方を供給する。ある実施形態では、方法は、ベクターを発現するステップをさらに含む。
【０４３６】
ある実施形態では、方法は、核酸配列を発現して、ＸＣＶＲのＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＹＣＶＲのＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップをさらに含む。ある実施形態では、ＹＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＸＣエレメントのＮ末端側にある。ある実施形態では、ＸＣエレメントは、ポリペプチドにおいてＹＣエレメントのＣ末端側にある。
【０４３７】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を結合するかどうかを、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより、決定するステップをさらに含む。
【０４３８】
ある局面では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＸＣＶＲ）のＸ鎖エレメント（ＸＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＹＣＶＲ）のＹ鎖エレメント（ＹＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＸＣＶＲおよびＹＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＸＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＹＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＸＣＶＲまたはＹＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）由来のＸ鎖（ＸＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＸＣＶＲのＸＣエレメント、例えば、Ｘ鎖可変領域配列（ＸＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＸ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＸＣストランド；および
ｉｉ）由来のＹ鎖（ＹＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＹＣＶＲのＹＣエレメント、例えば、Ｙ鎖可変領域配列（ＹＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むＹ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＹＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得し、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＹＣＶＲまたはＸＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；ならびに
ｅ）ＸＣストランドをＹＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含む、方法を特徴とする。
【０４３９】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｅ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
【０４４０】
ある局面では、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＸＣＶＲ）のＸ鎖エレメント（ＸＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＹＣＶＲ）のＹ鎖エレメント（ＹＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＸＣＶＲおよびＹＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）；ならびにｉｉ）上記細胞由来のＸＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＹＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体（例えば、本明細書に記載される捕捉支持体）を含む、隔離された細胞反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された細胞反応部位）、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＸＣＶＲまたはＹＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、細胞由来のＸＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および細胞由来のＹＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された産生反応部位）、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞（例えば、異なる細胞）由来のＹＣＶＲまたはＸＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、上記細胞由来のＸＣＶＲのＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および上記細胞由来のＹＣＶＲのＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＸＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＸＣストランド）の、ＹＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＹＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＸＣストランドおよびＹＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位（例えば、本明細書に記載される隔離された連結反応部位）、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＸＣおよびＹＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法を特徴とする。
【０４４１】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または全部）は、本明細書に記載された方法に従って実施される。ある実施形態では、ステップａ）〜ｆ）のそれぞれは、本明細書に記載された方法に従って実施される。
【０４４２】
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法を特徴とし、方法は、
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、Ｘ鎖可変領域（ＸＣＶＲ）のＸ鎖エレメント（ＸＣエレメント）およびＹ鎖可変領域（ＹＣＶＲ）のＹ鎖エレメント（ＹＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＸＣＶＲおよびＹＣＶＲがマッチしており、本明細書に記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＸＣエレメントおよびＹＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する。
【０４４３】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、複数個の固有メンバーは、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、（マッチしたＸＣエレメント配列およびＹＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。ある実施形態では、ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＸＣエレメント配列およびＹＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである。
【０４４４】
ある局面では、本開示は、複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＸＣエレメントおよびＹＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、本明細書に記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、もしくは１０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、もしくは１０８〜１０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％が、（マッチしたＸＣエレメント配列およびＹＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＸＣエレメント配列およびＹＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）を含む、
ライブラリーを特徴とする。
【０４４５】
ある実施形態では、複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＸＣエレメント、例えば、ＸＣＶＲＳ、およびＹＣエレメント、例えば、ＹＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖを形成するように、構成される。
【０４４６】
ある実施形態では、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、複数個のメンバーのそれぞれはさらに、ディスプレイ実体の表面上のメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする。ある実施形態では、ライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは酵母ディスプレイライブラリーである。ある実施形態では、ライブラリーは哺乳動物ディスプレイライブラリーである。
【０４４７】
ある態様では、本開示は、ａ）本明細書に記載されたライブラリーを、例えば、本明細書に記載された方法により、獲得するステップ；およびｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチド（例えば、ＸＣエレメントおよびＹＣエレメントを含むポリペプチド）を作製する方法を特徴とする。
【０４４８】
ある実施形態では、方法は、前記ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収する（例えば、単離し、または精製する）ステップをさらに含む。
【０４４９】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された産生反応部位（例えば、ＸＣＶＲをコードする核酸、およびＹＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＸＣＶＲおよび前記ＹＣＶＲがマッチしている）である、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを特徴とする。
【０４５０】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＸＣＶＲまたはＹＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０４５１】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、以下の１つ、２つ、または全部を含む：（ｉ）ＸＣおよびＹＣのＶ遺伝子配列に特異的な１つもしくは複数のプライマー；（ｉｉ）ＸＣ  ｃＤＮＡおよびＹＣ  ｃＤＮＡ上へ導入されたオーバーハングに特異的な１つもしくは複数のプライマー；または（ｉｉｉ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含む、１つもしくは複数のプライマーであって、前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマーの前記第２のメンバーとアニールする能力、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む構造を形成する能力がある。
【０４５２】
ある実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含まない。別の実施形態では、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【０４５３】
ある態様では、本開示は、（例えば、ＸＣＶＲのＸＣエレメントおよびＹＣＶＲのＹＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、前記ＸＣＶＲおよび前記ＹＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法のための、）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間に位置するヌクレオチド修飾を含む第３のメンバー（例えば、スペーサー）を含み、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールする能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドを特徴とする。
【０４５４】
ある実施形態では、第１のメンバーおよび第２のメンバーは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある。ある実施形態では、第１のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、第２のメンバーは５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である。
【０４５５】
ある実施形態では、スペーサーは、本明細書に記載されたスペーサー、例えば、可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである。
【０４５６】
ある実施形態では、第１のメンバーは、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む。
【０４５７】
ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＸＣＶＲＳおよび／またはＹＣＶＲＳに相補的な配列の１つ、２つ、または全部を含む。ある実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と同一、または実質的に同一である。別の実施形態では、ユニバーサルプライミング配列は、第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列と異なる。ある実施形態では、第２のメンバーは、（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む。
【０４５８】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載された隔離された連結反応部位（例えば、ＸＣＶＲをコードする核酸、およびＹＣＶＲをコードする核酸を含み、前記ＸＣＶＲおよび前記ＹＣＶＲがマッチしている）である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを特徴とする。
【０４５９】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、異なる細胞由来のＸＣＶＲまたはＹＣＶＲをコードする核酸を含まない。
【０４６０】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、ＸＣストランドとＹＣストランドの接合部を含む配列またはその相補的配列にハイブリダイズして、ライゲーションの部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されたスプリントオリゴヌクレオチド）を含む。
【０４６１】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
【０４６２】
Ｔ細胞受容体分子
本明細書における開示は、抗体分子に限定されることを意図するものではない。ある実施形態では、結合分子はＴＣＲ分子、例えば、可溶性ＴＣＲ分子である。ある実施形態では、結合分子は、ＴＣＲα鎖可変領域およびＴＣＲβ鎖可変領域を含む。ある実施形態では、結合分子は、ＴＣＲγ鎖可変領域およびＴＣＲδ鎖可変領域を含む。例えば、本明細書における態様、実施形態、および定義のいずれかにおいて、抗体重鎖（または可変領域）は、ＴＣＲα鎖（または可変領域）に置き換えることができ、抗体軽鎖（または可変領域）は、ＴＣＲβ鎖（または可変領域）に置き換えることができる；または抗体重鎖（または可変領域）は、ＴＣＲγ鎖（または可変領域）に置き換えることができ、抗体軽鎖（または可変領域）は、ＴＣＲδ鎖（または可変領域）に置き換えることができる。
【０４６３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子およびＴＣＲ分子のライブラリーが本明細書で開示されている。ある実施形態では、ＴＣＲ分子、またはＴＣＲ分子のライブラリーは、本明細書に記載された方法により作製される。
【０４６４】
本明細書で使用される「ＴＣＲ分子」（「Ｔ細胞受容体分子」または「Ｔ細胞受容体分子」としても公知）という用語は、タンパク質、例えば、ＴＣＲ鎖、または少なくとも１つのＴＣＲ可変ドメイン配列を含むその断片を指す。「ＴＣＲ分子」という用語は、例えば、全長の成熟ＴＣＲ、およびＴＣＲの抗原結合性断片を含む。例えば、ＴＣＲ分子は、α鎖可変ドメイン配列およびβ鎖可変ドメイン配列を含み得る。別の例において、ＴＣＲ分子は、γ鎖可変ドメイン配列およびδ鎖可変ドメイン配列を含み得る。ある実施形態では、ＴＣＲ分子は可溶性ＴＣＲ分子である。
【０４６５】
Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞の表面上に見出すことができ、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとしての抗原の断片を認識することに関与する。ＴＣＲは、典型的には、２つの異なるタンパク質鎖を含む。ヒトにおいて、Ｔ細胞の約９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによりコードされる）を含み、Ｔ細胞の約５％においては、ＴＣＲは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによりコードされる）を含む。この比率は、個体発生中、および疾患状態（例えば、白血病）において、変化し得る。ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合した時、Ｔリンパ球は、シグナル伝達、例えば、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子、および活性化された、または遊離した転写因子により媒介される一連の生化学的事象を通して活性化される。
【０４６６】
例えば、天然に存在するＴＣＲは、典型的には、例えば、インバリアントなＣＤ３鎖分子との複合体の部分として発現した高可変性アルファ（α）およびベータ（β）鎖を含む、ジスルフィド連結された膜アンカー型ヘテロ二量体タンパク質である。この受容体を発現するＴ細胞は、α：β（またはαβ）Ｔ細胞と呼ばれることがあるが、少数のＴ細胞は、可変性ガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖により形成される、別の受容体を発現し、γδＴ細胞と呼ばれることがある。
【０４６７】
ＴＣＲの各鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域を含み得る。定常領域は、細胞膜の近位にあり、その後に、膜貫通領域、および短い細胞質テールが続き、一方、可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体と結合することができる。
【０４６８】
ＴＣＲα鎖またはβ鎖の可変ドメインは、それぞれ３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し得る。β鎖上の超可変性の追加の区域（ＨＶ４）もまた存在し得、それは、典型的には、抗原と接触せず、ＣＤＲとみなされない。これらの可変ドメインにおける残基は、ＴＣＲの２つの領域において、α鎖とβ鎖の界面に、およびＣＤ３シグナル伝達複合体の近くにあるβ鎖フレームワーク領域に位置する。理論に縛られることを望まないが、ある実施形態では、ＣＤＲ３が、プロセシングされた抗原を認識することに関与する主要なＣＤＲであると考えられる。アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することができ、β鎖のＣＤＲ１は、そのペプチドのＣ末端部分と相互作用することができる。ＣＤＲ２はＭＨＣを認識し得る。β鎖のＣＤＲ４は、一般的に、抗原認識に関与するとは考えられておらず、スーパー抗原と相互作用する可能性がある。
【０４６９】
ＴＣＲの定常ドメインは、例えば、２つの鎖の間の連結を、例えばジスルフィド結合を通して形成する短い接続配列を含む。
【０４７０】
ＴＣＲ多様性の発生は、体細胞Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによる個々の体細胞Ｔ細胞におけるＤＮＡをコードするセグメントの遺伝子組換えから主に生じる。各組換えＴＣＲは、例えばαβＴ細胞の場合α鎖とβ鎖、またはγδＴ細胞の場合、γ鎖とδ鎖により形成される、抗原結合部位の構造により決定される固有の抗原特異性を有し得る。例えば、ＴＣＲα鎖およびγ鎖は、ＶＪ組換えにより生成され得、β鎖およびδ鎖は、ＶＤＪ組換えにより生成され得る。これらの特異的な領域（例えば、α鎖またはγ鎖についてのＶおよびＪ；β鎖またはδ鎖についてのＶ、Ｄ、およびＪ）の交差は、ペプチド／ＭＨＣ認識にとって典型的には重要であるＣＤＲ３領域に対応する。
【０４７１】
ＴＣＲ受容体は、可変ＴＣＲ鎖の複合体（例えば、３つの二量体シグナル伝達モジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε、およびＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／ηとのα鎖およびβ鎖）を形成し得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞と、抗原提示細胞  −  ＡＰＣ（ＭＨＣクラスＩＩ）または任意の他の細胞型（ＭＨＣクラスＩ）との間の物理的接触中に特定のペプチド／ＭＨＣ複合体を認識するクローンＴＣＲを発現することができる。Ｔ細胞複合体からのシグナルは、特定の共受容体によるＭＨＣ分子の同時結合により増強され得る。例えば、ヘルパーＴ細胞および制御性Ｔ細胞において、共受容体は、ＭＨＣクラスＩＩに特異的であるＣＤ４であり、細胞傷害性Ｔ細胞において、共受容体は、ＭＨＣクラスＩに特異的であるＣＤ８である。
【０４７２】
「ＴＣＲ」という用語は、無傷分子のほか、その機能的断片も含む。ＴＣＲ断片は、当業者に公知である、いくつかの従来の技法を含む、任意の適する方法を使用して得ることができ、断片も、有用性について、ＴＣＲ抗体と同じ形でスクリーニングすることができる。ＴＣＲの定常領域は、変化して、例えば、変異して、ＴＣＲの性質を改変することができる。
【０４７３】
ＴＣＲ分子は、単鎖ＴＣＲでありうる。単鎖ＴＣＲを、二量体化または多量体化させて、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価ＴＣＲを作出することができる。
【０４７４】
本明細書で開示されるＴＣＲ分子はまた、単一ドメインＴＣＲでもありうる。単一ドメインＴＣＲは、その相補性決定領域が、単一ドメインポリペプチドの部分であるＴＣＲを含みうる。例は、天然でα、β、γまたはδ鎖を欠くＴＣＲであるα、β、γまたはδ重鎖ＴＣＲ、従来の２鎖ＴＣＲに由来する単一ドメインＴＣＲ、操作ＴＣＲ、およびＴＣＲに由来する足場以外の単一ドメイン足場を含むがこれらに限定されない。単一ドメインＴＣＲは、任意の当該分野による単一ドメインＴＣＲ、または任意の将来的な単一ドメインＴＣＲでありうる。単一ドメインＴＣＲは、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来しうる。
【０４７５】
可変領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲまたはＦＷ）と称する、より保存的な領域を分散させた、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称する超可変性領域へと細分することができる。本明細書でＴＣＲ分子の文脈において使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、ＴＣＲ可変領域内のアミノ酸配列であって、抗原特異性および結合アフィニティーを付与するアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される「フレームワーク」、「ＦＷ」、および「ＦＲ」という用語は、互換的に使用される。
【０４７６】
本明細書で使用される「ＴＣＲ可変ドメイン配列」とは、ＴＣＲ可変ドメインの構造を形成しうるアミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含みうる。例えば、配列は、１つ、２つ、またはこれを超えるＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸を含む場合もあり、これらを含まない場合もあり、タンパク質構造の形成と適合性である、他の変更を含む場合もある。
【０４７７】
「抗原結合性領域」という用語は、抗原またはそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含むＴＣＲ分子の部分を指す。タンパク質（またはタンパク質模倣体）に関して、抗原結合性領域は、典型的に、抗原に結合する界面を形成する、１つまたは複数のループ（少なくとも、例えば、４つのアミノ酸またはアミノ酸模倣体による）を含む。典型的に、ＴＣＲ分子の抗原結合性領域は、少なくとも１つもしくは２つのＣＤＲおよび／または超可変性ループ、またはより典型的に少なくとも３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲおよび／または超可変性ループを含む。
【０４７８】
本明細書では、「競合する」または「交差競合する」という用語は、別のＴＣＲ分子の、標的への結合に干渉するＴＣＲ分子の能力を指すように、互換的に使用される。結合への干渉は、直接的な場合もあり、間接的な場合（例えば、ＴＣＲ分子または標的のアロステリックモジュレーションを介する）もある。ＴＣＲ分子が、別のＴＣＲ分子の、標的への結合に干渉することが可能な程度と、したがって、ＴＣＲ分子が、競合すると言いうるのかどうかとは、競合結合アッセイ、例えば、ＦＡＣＳアッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはＢＩＡＣＯＲＥアッセイを使用して決定することができる。ある実施形態では、競合結合アッセイは、定量的競合アッセイである。ある実施形態では、第１の抗体分子の標的への結合が、競合結合アッセイ（例えば、本明細書に記載の競合アッセイ）において１０％またはそれより多く、例えば、２０％またはそれより多く、３０％またはそれより多く、４０％またはそれより多く、５０％またはそれより多く、５５％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、６５％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、７５％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、８５％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多くだけ低減される場合に、第１のＴＣＲ分子は、第２のＴＣＲ分子と標的に対する結合について競合するという。
【０４７９】
ＴＣＲは、ポリクローナルの場合もあり、モノクローナル抗体の場合もある。一部の実施形態では、ＴＣＲを、組換えにより生成する、例えば、任意の適切なファージディスプレイ法またはコンビナトリアル法により生成することができる。ファージディスプレイ法およびコンビナトリアル法は、当該技術分野において公知である。
【０４８０】
ある実施形態では、ＴＣＲ分子は、完全ヒトＴＣＲ（例えば、ヒトＴＣＲ配列に由来するＴＣＲを産生するように遺伝子操作されたマウスにおいて作られるＴＣＲ）、または非ヒトＴＣＲ、例えば、齧歯類（マウスまたはラット）ＴＣＲ、ヤギＴＣＲ、霊長類（例えば、サル）ＴＣＲ、ラクダＴＣＲである。ある実施形態では、非ヒトＴＣＲは、齧歯類ＴＣＲ（マウスＴＣＲまたはラットＴＣＲ）である。例えば、ヒトＴＣＲは、マウス系ではなく、ヒトＴＣＲ遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを使用して作出することができる。
【０４８１】
ＴＣＲは、可変領域またはその部分、例えば、ＣＤＲを、非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて作出したＴＣＲでありうる。キメラＴＣＲ、ＣＤＲグラフトＴＣＲ、およびヒト化ＴＣＲは、本発明の範囲内にある。非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて作出し、次いで、ヒトにおける抗原性を減少させるように、例えば、可変領域のフレームワーク内または定常領域内で修飾したＴＣＲも、本発明の範囲内にある。
【０４８２】
キメラＴＣＲは任意の好適な組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
【０４８３】
ヒト化ＴＣＲまたはＣＤＲグラフトＴＣＲは、少なくとも１つまたは２つであるが、一般に３つ全てのレシピエントＣＤＲ（ＴＣ鎖の）を、ドナーＣＤＲで置きかえる。ＴＣＲは、非ヒトＣＤＲの少なくとも１つの部分で置きかえる場合もあり、ＣＤＲの一部だけを、非ヒトＣＤＲで置きかえる場合もある。抗原へのヒト化ＴＣＲの結合に要求される数のＣＤＲを置きかえることだけが必要である。ある実施形態では、ドナーは、齧歯類抗体、例えば、ラットＴＣＲまたはマウスＴＣＲであり、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであろう。典型的に、ＣＤＲを提供するＴＣＲを、「ドナー」と呼び、フレームワークを提供するＴＣＲを、「アクセプター」と呼ぶ。一部の実施形態では、ドナーＴＣＲは、非ヒト（例えば、齧歯類）ＴＣＲである。アクセプターフレームワークは、典型的に、天然に存在する（例えば、ヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワーク、またはこれと、約８５％もしくはこれを超えて、例えば、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一な配列である。
【０４８４】
本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、類縁配列のファミリー内で、最も高頻度で生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８７年を参照されたい）。タンパク質のファミリー内では、コンセンサス配列内の各位置は、ファミリー内のこの位置において最も高頻度で生じるアミノ酸で占有される。２つのアミノ酸が、同等に高頻度で生じる場合、いずれも、コンセンサス配列内に含まれうる。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサスＴＣＲ配列内のフレームワーク領域を指す。
【０４８５】
ＴＣＲは任意の好適な方法によってヒト化することができる。ヒト化ＴＣＲまたはＣＤＲグラフトＴＣＲは、免疫グロブリン鎖のうちの、１つ、２つ、または全てのＣＤＲを、置きかえうる、ＣＤＲグラフティングまたはＣＤＲ置換により生成することができる。また、特異的なアミノ酸を、置換するか、欠失させるか、または付加したヒト化ＴＣＲも提示される。
【０４８６】
ある実施形態ではＴＣＲ分子は、定常領域を有する。定常領域を変更して、例えば、変異させて、ＴＣＲ分子の特性を修飾することができる。ある実施形態では、ＴＣＲ分子の定常領域を変更する。当技術分野では、定常領域を変更するための方法が公知である。
【０４８７】
ある実施形態では、ＴＣＲ分子におけるアミノ酸だけが、正準のアミノ酸である。ある実施形態では、ＴＣＲ分子は、天然に存在するアミノ酸；それらの類似体、誘導体、および同類；改変体の側鎖を有するアミノ酸類似体；および／または前出のうちのいずれかの全ての立体異性体を含む。ＴＣＲ分子は、アミノ酸のＤ光学異性体またはＬ光学異性体と、ペプチド模倣体とを含みうる。
【０４８８】
本明細書で記載されるＴＣＲ分子のポリペプチドは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含む場合があり、非アミノ酸により中断される場合がある。ＴＣＲ分子はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識化構成要素とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作により修飾することもできる。ポリペプチドは、天然の供給源から単離することもでき、組換え法により、真核宿主または原核宿主から生成することもでき、合成手順の生成物の場合もある。
【０４８９】
本明細書で記載されるＴＣＲ分子は、非コンジュゲート形態において単独で使用することもでき、物質、例えば、毒素もしくは部分（例えば、治療薬；放射線を放出する化合物；植物起源、真菌起源、もしくは細菌起源の分子；または生物学的タンパク質（例えば、タンパク質毒素）もしくは生物学的粒子（例えば、例えば、ウイルスコートタンパク質を介する、組換えウイルス粒子）に結合させることもできる。例えば、ＴＣＲ分子は、α放射体、β放射体、もしくはγ放射体、またはβおよびγの放射体などの放射性同位元素とカップリングさせることができる。
【０４９０】
ＴＣＲ分子は、誘導体化することもでき、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）へと連結することもできる。本明細書で使用される「誘導体化」ＴＣＲ分子とは、修飾ＴＣＲ分子である。誘導体化法は、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、毒素、酵素、またはビオチンなどのアフィニティーリガンドの付加を含むがこれらに限定されない。したがって、ＴＣＲ分子は、免疫接着分子を含む、本明細書で記載される抗体の誘導体化形態、および他の形の修飾形態を含むことを意図する。例えば、ＴＣＲ分子は、別のＴＣＲ（例えば、二特異性ＴＣＲ）、検出可能な作用物質、毒素、医薬、および／またはＴＣＲもしくはＴＣＲ部分の、別の分子（ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介しうるタンパク質もしくはペプチドなど、１つまたは複数の他の分子実体へと機能的に連結する（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、または他の形で）ことができる。
【０４９１】
一部の種類の誘導体化ＴＣＲ分子は、２つまたはこれを超えるＴＣＲ（同じ種類、または、例えば、二特異性ＴＣＲを創出するように、異なる種類）を架橋することにより生成される。適切な架橋剤は、ヘテロ二官能性の架橋剤であって、適切なスペーサーで隔てられた、２つの顕著に異なる反応性基を有する架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性の架橋剤（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）を含む。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから市販されている。
【０４９２】
ＴＣＲ分子を誘導体化させうる（または標識化しうる）、有用な検出可能な作用物質は、蛍光化合物、多様な酵素、補欠分子族、発光材料、生物発光材料、蛍光放出性金属原子、例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、および他のランタニド、ならびに放射性材料（下記で記載する）を含む。例示的な蛍光性の検出可能な作用物質は、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどを含む。ＴＣＲはまた、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素によっても誘導体化させることができる。ＴＣＲを、検出可能な酵素で誘導体化させる場合、検出可能な酵素は、酵素が、検出可能な反応生成物を生成させるのに使用する、さらなる試薬を添加することにより検出することができる。例えば、検出可能な作用物質である、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、検出可能である、有色の反応生成物をもたらす。ＴＣＲ分子はまた、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）によっても誘導体化させることができる。例えば、ＴＣＲを、ビオチンで誘導体化させ、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的測定を介して検出することができる。適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；発光材料の例は、ルミノールを含み、生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む。
【０４９３】
標識化ＴＣＲ分子は、（ｉ）所定の抗原を、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準法により単離すること；（ｉｉ）タンパク質の存在度および発現パターンについて評価するために、所定の抗原を検出する（例えば、細胞溶解物中または細胞上清中で）こと；（ｉｉｉ）組織内のタンパク質レベルを、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定する臨床試験手順の一部としてモニタリングすることを含む、多数の文脈で、例えば、診断に使用することもでき、かつ／または実験に使用することもできる。
【０４９４】
ＴＣＲ分子は、別の分子実体、典型的に、標識剤もしくは標識部分または治療剤もしくは治療部分（例えば、抗微生物剤もしくは抗微生物部分（例えば、抗菌剤もしくは抗菌部分、または殺菌剤もしくは殺菌部分）、免疫調節剤もしくは免疫調節部分、免疫刺激剤もしくは免疫刺激剤部分、細胞傷害剤もしくは細胞傷害部分、または細胞増殖抑制剤もしくは細胞増殖抑制部分）とコンジュゲートさせることができる。放射性同位元素は、診断的適用において使用することもでき、治療的適用において使用することもできる。抗体分子とカップリングさせうる放射性同位元素は、α放射体、β放射体、もしくはγ放射体、またはβおよびγの放射体を含むがこれらに限定されない。このような放射性同位元素は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、クロム（５１Ｃｒ）、塩素（３６Ｃｌ）、コバルト（５７Ｃｏまたは５８Ｃｏ）、鉄（５９Ｆｅ）、セレン（７５Ｓｅ）、またはガリウム（６７Ｇａ）を含むがこれらに限定されない。治療剤として有用な放射性同位元素は、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、およびロジウム（１８８Ｒｈ）を含む。例えば、診断法における使用のための標識として有用な放射性同位元素は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、炭素（１４Ｃ）、およびトリチウム（３Ｈ）、または上記で列挙した治療用同位元素のうちの１または複数を含む。
【０４９５】
本開示は、放射性標識化ＴＣＲ分子と、ＴＣＲ分子を標識化する方法とを提示する。ある実施形態では、ＴＣＲ分子を標識化する方法が開示される。方法は、ＴＣＲ分子を、キレート剤と接触させて、これにより、コンジュゲート抗体を生成するステップを含む。コンジュゲート抗体を、放射性同位元素、例えば、１１１インジウム、９０イットリウム、および１７７ルテチウムで放射性標識化して、これにより、標識化ＴＣＲ分子を生成する。
【０４９６】
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示されるＴＣＲ分子を作製する方法を提示する。方法は、抗原またはその断片を提供するステップと；抗原に特異的に結合するＴＣＲ分子を得るステップと；抗原および／または抗原を発現する生物の活性をモジュレートすることにおける、ＴＣＲ分子の有効性を評価するステップとを含む。方法は、その誘導体（例えば、ヒト化ＴＣＲ分子）を含むＴＣＲ分子を、被験体、例えば、ヒトへと投与するステップをさらに含みうる。
【０４９７】
この開示は、上記のＴＣＲ分子をコードする単離核酸分子、そのベクターおよび宿主細胞を提供する。その核酸分子には、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡが含まれるが、それらに限定されない。
【０４９８】
動物モデル
本明細書で記載されるペプチド（例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を、例えば、多様な動物モデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価することができる。例えば、動物モデルは、本明細書に記載された結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の、標的分子または細胞の生物学的機能をモジュレートすることにおける有効性を試験するために使用することができる。別の例として、動物モデルはまた、本明細書に記載された結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の、本明細書に記載された障害を処置し、防止し、または診断することにおける有効性を試験するために使用することができる。動物モデルはまた、例えば、副作用について調べ、結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の濃度を、ｉｎ  ｓｉｔｕで測定し、標的分子の機能と本明細書に記載される障害との相関を裏付けるのにも使用することができる。
【０４９９】
本明細書で記載される他の障害のための例示的な動物モデルはまた、当該技術分野において公知である。本明細書で記載される結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を評価するために使用しうる、例示的な動物の種類は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびサルを含むがこれらに限定されない。
【０５００】
薬学的組成物およびキット
一部の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化される、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を含む組成物、例えば、薬学的に許容される組成物を提示する。
【０５０１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。担体は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適しうる。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における結合ポリペプチドのうち約５％未満、例えば、約４％、３％、２％または１％未満が凝集物として存在する。別の実施形態では、薬学的組成物における結合ポリペプチドのうち少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％またはそれより多くが単量体として存在する。一部の実施形態では、凝集物または単量体のレベルを、クロマトグラフィー、例えば、高速サイズ除外クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により決定する。
【０５０２】
本明細書で明示される組成物は、様々な形態でありうる。これらは、例えば、溶液（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散物または懸濁物、リポソーム、および坐剤など、液体剤形、半固体剤形、および固体剤形を含む。適切な形態は、投与および治療適用の意図される方式に依存する。典型的な適切な組成物は、注射用溶液または注入用溶液の形態でありうる。１つの適切な投与方式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）投与方式である。ある実施形態では、結合ポリペプチドを、静脈内注入または静脈内注射により投与する。別の実施形態では、結合ポリペプチドを、筋内注射または皮下注射により投与する。
【０５０３】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、通例、注射による、腸内投与および局所投与以外の投与方式を意味し、限定せずに述べると、静脈内注射および静脈内注入、筋内注射および筋内注入、動脈内注射および動脈内注入、髄腔内注射および髄腔内注入、関節包内注射および関節包内注入、眼窩内注射および眼窩内注入、心内注射および心内注入、皮内注射および皮内注入、腹腔内注射および腹腔内注入、経気管注射および経気管注入、皮下注射および皮下注入、表皮下注射および表皮下注入、関節内注射および関節内注入、被膜下注射および被膜下注入、くも膜下注射およびくも膜下注入、脊髄内注射および脊髄内注入、硬膜外注射および硬膜外注入ならびに胸骨内注射および胸骨内注入を含む。
【０５０４】
治療用組成物は、滅菌であるものとし、製造条件下および保管条件下で安定であるものとすることが典型的である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、または高い結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の濃度に適する、他の秩序化構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、要求に応じて、上記で数え上げた成分のうちの１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に、要求される量で、活性化合物（例えば、結合ポリペプチド）を組み込むことに続く、濾過滅菌により調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本分散媒と、上記で数え上げた成分に由来する要求される他の成分とを含有する滅菌ビヒクルへと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、有効成分に、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液に由来する、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動度は、例えば、レシチンなど、コーティングの使用により維持することができ、分散物の場合は、要求される粒子サイズの維持により維持することができ、界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
【０５０５】
本明細書に記載される結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、様々な方法により投与することができる。当技術分野では、いくつかの方法が公知であり、多くの治療適用、予防適用、または診断適用に適切な投与経路／投与方式は、静脈内注射または静脈内注入である。例えば、結合ポリペプチドは、約１〜１００ｍｇ／ｍ２、好ましくは、約５〜５０ｍｇ／ｍ２、約７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に達し、より好ましくは、約１０ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、１０ｍｇ／分未満；好ましくは、５ｍｇ／分未満であるかまたはこれと等しい速度での静脈内注入により投与することができる。当業者により察知される通り、投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変動するであろう。ある特定の実施形態では、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、化合物を、急速な放出に対して保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許になっているか、または、一般に、当業者に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【０５０６】
ある特定の実施形態では、結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、例えば、不活性の希釈剤または同化可能な可食性担体と共に、経口投与することができる。結合ポリペプチド（および、所望される場合、他の成分）はまた、硬質シェルまたは軟質シェルのゼラチンカプセルへと封入することもでき、錠剤へと圧縮することもでき、被験体の食餌へと直接組み込むこともできる。治療的経口投与のために、結合ポリペプチドは、賦形剤と共に組み込み、摂取可能な錠剤、口腔用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、ウェハーなどの形態で使用することができる。結合ポリペプチド（例えば、抗体分子）を、非経口投与以外で投与するために、化合物をコーティングするか、または化合物を、その不活化を防止する材料と共に共投与することが必要でありうる。治療用組成物、予防用組成物、または診断用組成物はまた、医療デバイスにより投与することもでき、当技術分野では、いくつかが公知である。
【０５０７】
投薬レジメンは、所望される応答（例えば、治療的応答、予防的応答、または診断的応答）をもたらすように調整される。例えば、単回のボーラスを投与することもでき、いくつかに分けた用量を、ある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要求により示されるように用量を比例して低減するか、または増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、単位剤形（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）で製剤化することが、とりわけ有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、処置される被験体のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位であって、各単位が、要求される医薬担体を随伴させて、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定数量の活性化合物を含有する単位を指す。単位剤形についての仕様は、（ａ）抗体分子の固有の特徴、および、達成される、特定の治療効果、予防効果、または診断上の効果、ならびに（ｂ）当技術分野における固有の限界であって、個体における感受性の処置のために、このような結合ポリペプチドを化合させる限界により決定され、かつ、これに直接左右される。
【０５０８】
結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の治療有効量、予防有効量、または診断有効量についての、例示的で非限定的な範囲は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約約１〜３０、１〜１５、１〜１０、１〜５、５〜１０、または１〜３ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇである。結合ポリペプチドは、約１〜１００ｍｇ／ｍ２、例えば、約５〜５０ｍｇ／ｍ２、約７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に達し、例えば、約１０ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、１０ｍｇ／分未満；例えば、５ｍｇ／分未満であるかまたはこれと等しい速度での静脈内注入により投与することができる。投与量値は、緩和される状態の種類および重症度と共に変動しうることに注目すべきである。任意の特定の被験体のために、具体的な投薬レジメンを、ある期間にわたり、個別の必要、および組成物を投与するまたは組成物の投与を管理する人物の職業的判断に従い調整すべきであり、本明細書で明示される投与量範囲は、例示的なものであるに過ぎず、特許請求される組成物についての範囲または実施を限定することを意図するものではないことをさらに理解されたい。
【０５０９】
本明細書の薬学的組成物は、「治療有効量」、「予防有効量」、または「診断有効量」の、本明細書に記載される結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を含みうる。
【０５１０】
「治療有効量」とは、所望される治療結果を達成するのに必要な投与量で、これに必要な期間にわたる有効量を指す。結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体部分が、個体において所望される応答を誘発する能力などの因子に従い変動しうる。治療有効量はまた、抗体分子の任意の毒性作用または有害作用を、治療的に有益な効果が凌駕するときの量でもある。
【０５１１】
「治療有効投与量」は、典型的に、測定可能なパラメータを、非処置被験体と比べて、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％阻害する。測定可能なパラメータは、例えば、血尿、有色の尿、泡沫状尿、疼痛、手および足における腫脹（浮腫）、または高血圧でありうる。結合ポリペプチド（例えば、抗体分子）が、測定可能なパラメータを阻害する能力を、本明細書に記載される障害の処置、または防止における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。代替的に、組成物のこの特性を、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）が、標的分子または細胞の生物学的機能をモジュレートする能力について検討することにより評価することができる。
【０５１２】
「予防有効量」とは、所望される予防結果を達成するのに必要な投与量で、これに必要な期間にわたる有効量を指す。予防用量は、被験体において、疾患の前または疾患の早期に使用されるので、予防有効量は、治療有効量未満となることが典型的であろう。
【０５１３】
「診断有効量」とは、所望される診断結果を達成するのに必要な投与量で、これに必要な期間にわたる有効量を指す。診断有効量とは、障害、例えば、本明細書に記載される障害を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて診断しうる量であることが典型的である。
【０５１４】
また、本明細書で記載される結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を含むキットも、本開示の範囲内にある。キットは、使用のための指示；他の試薬、例えば、標識、治療剤、または抗体分子をキレート化するか、または抗体分子を、標識もしくは治療剤もしくは放射性組成物へと他の形でカップリングするのに有用な薬剤；結合ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を、投与用に調製するためのデバイスまたは他の材料；薬学的に許容される担体；および被験体への投与のためのデバイスまたは他の材料を含む、１つまたは複数の他の要素を含みうる。
【０５１５】
核酸
本開示はまた、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴ細胞受容体分子））をコードするヌクレオチド配列を含む核酸も特徴とする。
【０５１６】
ある実施形態では、核酸は、本明細書に記載されたポリペプチド（抗体分子またはＴＣＲ分子）の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする、またはそれと実質的に相同なヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一な、および／または本明細書に記載されたストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力がある配列）を有するヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、またはこれと実質的に相同なヌクレオチド配列（例えば、これと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一であり、および／または本明細書で記載されるストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）をさらに含む。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またＴＣＲ分子）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、またはこれと実質的に相同なヌクレオチド配列（例えば、これと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一であり、および／または本明細書で記載されるストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）をさらに含む。
【０５１７】
ある実施形態では、核酸は、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の重鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列、またはこれと実質的に相同なヌクレオチド配列（例えば、これと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一であり、および／または本明細書で記載されるストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）をさらに含みうる。別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列、またはこれと実質的に相同なヌクレオチド配列（例えば、これと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一であり、および／または本明細書で記載されるストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）をさらに含む。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）の重鎖および軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列、またはこれと実質的に相同なヌクレオチド配列（例えば、これと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一であり、および／または本明細書で記載されるストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）を含む。
【０５１８】
ある実施形態では、核酸は、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の部分を含む。その部分は、例えば、可変領域（例えば、ＶＨまたはＶＬ）；１、２、もしくは３個、もしくはそれより多い（例えば、４、５、または６個の）ＣＤＲ；または１、２、３、もしくは４個、もしくはそれより多いフレームワーク領域、必要に応じて、定常領域またはＦｃ領域をコードしうる。
【０５１９】
本明細書で開示される核酸は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、一本鎖は、コード鎖の場合もあり、非コード（アンチセンス）鎖の場合もある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾ヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどにより、重合の後でさらに修飾することもできる。核酸は、組換えポリヌクレオチドの場合もあり、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドの場合もあり、これらは、天然には存在しないか、または非天然の配置で、別のポリヌクレオチドへと連結される。
【０５２０】
一部の態様では、適用は、本明細書で記載される核酸を含有する、宿主細胞およびベクターを特徴とする。核酸は、下記でより詳細に記載される通り、同じ宿主細胞内または別個の宿主細胞内に存在する、単一のベクターで存在する場合もあり、別個のベクターで存在する場合もある。
【０５２１】
ベクター
本開示は、本明細書に記載されているような、ポリペプチド（例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを特色とする。
【０５２２】
ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むがこれらに限定されない。
【０５２３】
多数のベクター系を利用することができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなど、動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを用いる。ベクターの別のクラスは、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、およびフラビウイルスなど、ＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡエレメントを用いる。
【０５２４】
加えて、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする、１つまたは複数のマーカーを導入することにより、ＤＮＡをそれらの染色体へと安定的に組み込んだ細胞を選択することもできる。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対する原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性などをもたらしうる。選択用マーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列へと直接連結することもでき、共形質転換により、同じ細胞へと導入することもできる。ｍＲＮＡの最適な合成のためには、さらなるエレメントもまた必要とされうる。これらのエレメントは、スプライスシグナルのほか、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルも含みうる。
【０５２５】
発現のために、発現ベクターまたはＤＮＡ配列を含有する構築物を調製したら、発現ベクターを、適切な宿主細胞へとトランスフェクトまたは導入することができる。例えば、プロトブラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、レトロウイルスによる形質導入、ウイルスによるトランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション、または他の従来の技法など、多様な技法を利用して、これを達成することができる。プロトブラスト融合の場合、細胞を、培地中で増殖させ、適切な活性についてスクリーニングする。
【０５２６】
当業者には、結果として得られるトランスフェクトされた細胞を培養し、産生されたポリペプチド（例えば、抗体分子）を回収するための方法および条件が公知であり、本記載に基づき利用される、具体的な発現ベクターおよび哺乳動物の宿主細胞に応じて、変動させるか、または最適化することができる。
【０５２７】
細胞
本開示はまた、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）をコードする核酸を含む宿主細胞も提示する。ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、本明細書に記載された方法に従って操作することができる。例えば、宿主細胞は、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、本明細書に記載される抗体分子またはＴＣＲ分子）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこれと実質的に相同な配列（例えば、これと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはこれを超えて同一であり、および／または本明細書で記載されるストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）、または前記核酸のうちの１つの部分を含みうる。
【０５２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）をコードする核酸を含むように、宿主細胞を遺伝子操作する。
【０５２９】
ある特定の実施形態では、発現カセットを使用することにより、宿主細胞を遺伝子操作する。「発現カセット」という語句は、このような配列と適合性の宿主における遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能なヌクレオチド配列を指す。このようなカセットは、プロモーター、イントロンを伴うかまたは伴わないオープンリーディングフレーム、および終結シグナルを含みうる。例えば、誘導的プロモーターなど、発現を実施するのに必要または有用な、さらなる因子もまた使用することができる。
【０５３０】
本開示はまた、本明細書で記載されるベクターを含む宿主細胞も提示する。
【０５３１】
細胞は、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞でありうるがこれらに限定されない。適切な真核細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、およびＭＤＣＫＩＩ細胞を含むがこれらに限定されない。適切な昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞を含むがこれらに限定されない。
【０５３２】
ポリペプチドの使用
本明細書で開示されるポリペプチド（例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）のほか、本明細書で開示される薬学的組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、治療的、予防的、および／または診断的有用性を有する。
【０５３３】
ある実施形態では、ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、標的分子（例えば、タンパク質）または細胞の１つまたは複数の生物学的活性をモジュレート（例えば、低減（例えば、阻害、遮断または中和））するか、または増大（例えば、活性化、開始（ｉｎｉｔｉａｔｅ）または増強）する。例えば、これらのポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、標的分子または細胞の１つまたは複数の生物学的活性をモジュレートするために、培養物中の細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで、または被験体、例えばヒト被験体に、例えばｉｎ  ｖｉｖｏで、投与され得る。さらに、ある態様では、本開示は、障害が処置、予防または診断されるように、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を被験体に投与するステップを含む、被験体において障害、例えば、本明細書で記載される障害を処置、予防または診断する方法を提示する。例えば、本開示は、障害、例えば、標的分子または細胞に関連する障害（例えば、本明細書に記載される障害）を処置、予防または診断するために、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を、培養物中の細胞と、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させるステップ、または本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を、被験体に、例えばｉｎ  ｖｉｖｏで投与するステップを含む方法を提示する。
【０５３４】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。一部の実施形態では、被験体は、ヒト被験体、例えば、本明細書で記載される障害を有する、または本明細書で記載される障害を有する危険性があるヒト患者である。「非ヒト動物」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長動物を含む。ある実施形態では、被験体はヒトである。本明細書で記載される方法および組成物は、本明細書で記載される障害を有するヒト患者を処置するために適切である。本明細書で記載される障害を有する患者は、本明細書で記載される障害を発症しているが、（少なくとも一時的に）無症候性である患者、本明細書で記載される障害の症状を示した患者、または本明細書で記載される障害と関連するかもしくは付随する障害を有する患者を含む。
【０５３５】
障害を処置または防止する方法
本明細書に記載されたポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、障害または状態を処置または防止するために使用することができる。ある実施形態では、ポリペプチドは、障害または状態を処置または防止するのに望ましくありうる、最適な、または改善された半減期を有する。理論により束縛されることを望まないが、ある実施形態では、本明細書に記載されたポリペプチド（例えば、最適な、または改善された半減期を有するポリペプチド）は、同じ、または類似した結合アフィニティーおよび／または特異性を有する別のポリペプチド（例えば、最適な、または改善された半減期を有さず、または有するように操作されていないポリペプチド）を凌ぐ１つまたは複数の利点を提供しうると考えられる。これらの利点には、増加した治療的もしくは防止的有効性、低減した投与量レジメン、または改善した薬物動態学的特性が含まうるが、それらに限定されない。ある実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載された変異型Ｆｃ領域を含む。
【０５３６】
本明細書に記載されたポリペプチドにより処置または防止することができる例示的な障害または状態には、がん（例えば、固形腫瘍または血液がん）、感染性疾患（例えば、細菌感染症またはウイルス感染症）、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、炎症性障害、代謝性障害（例えば、糖尿病）、心血管障害、臓器移植拒絶が含まれるが、それらに限定されない。
【０５３７】
がん
本明細書で記載されるポリペプチによって処置または予防され得る例示的ながんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫または骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫または上衣腫）、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（例えば、消化管カルチノイド腫瘍）、心（心臓）腫瘍、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、リンパ腫、子宮頸がん、胆管細胞癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、眼がん（例えば、眼球内黒色腫または網膜芽細胞腫）、ファロピウス管がん、骨の線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ／ｓｔｏｍａｃｈ）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（例えば、中枢神経系腫瘍、頭蓋外腫瘍、性腺外腫瘍、卵巣がんまたは精巣がん）、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（例えば、腎細胞がんまたはウィルムス腫瘍）、ランゲルハンス細胞組織球症（ＬＣＨ）、喉頭がん、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはヘアリーセル白血病）、口唇および口腔（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）がん、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、エイズ関連、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫（例えば、眼球内（眼）黒色腫）、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口のがん（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、慢性骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔（ｏｒａｌ）がん、口唇および口腔（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）がん、中咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん（例えば、上皮卵巣がんまたは生殖細胞卵巣腫瘍）、膵がん、膵神経内分泌腫瘍（膵島腫瘍）、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、��膜肺芽腫（ｐｌｅｕｒｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｂｌａｓｔｏｍａ）、腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫または子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌または非黒色腫皮膚がん）、小腸がん、扁平上皮癌、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜子宮がん、腟がん、外陰部がん、またはそれらの転移性病変を含むがこれらに限定されない。
【０５３８】
本明細書に記載されたポリペプチドにより処置または防止することができる例示的な感染性疾患には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ感染症、放線菌症、アフリカ睡眠病（アフリカントリパノソーマ症）、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、アメーバ症、アナプラズマ症、住血線虫症、アニサキス症、炭疽、ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ感染症、アルゼンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス感染症、バベシア症、ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ感染症、細菌性肺炎、細菌性腟炎、バクテロイデス感染症、バランチジウム症、バルトネラ症、バイリスアスカリス感染症、ＢＫウイルス感染症、黒色砂毛症、ブラストシスティス症、ブラストミセス症、ボリビア出血熱、ボツリヌス中毒（および乳児ボツリヌス中毒）、ブラジル出血熱、ブルセラ症、腺ペスト、バークホルデリア感染症、ブルーリ潰瘍、ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ感染症（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓおよびｓａｐｏｖｉｒｕｓ）、カンピロバクター症、カンジダ症（モニリア症；鵞口瘡）、毛細虫症、カリオン病、ネコ引っ掻き病、蜂巣炎、シャーガス病（アメリカトリパノソーマ症）、軟性下疳、水痘、チクングンヤ熱、クラミジア感染症、ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症（台湾急性呼吸器因子またはｔｗａｒ）、コレラ、黒色分芽菌症、ツボカビ症、肝吸虫症、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ大腸炎、コクシジオイデス症、コロラドダニ熱（ＣＴＦ）、感冒（急性ウイルス性鼻咽喉炎；急性コリーザ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ）、シクロスポラ症、嚢虫症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ感染症、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、メジナ虫症、エボラ出血熱、エキノコックス症、エーリキア症、蟯虫症（蟯虫感染症）、エンテロコッカス感染症、エンテロウイルス感染症、発疹チフス、伝染性紅斑（第五病）、突発性発疹（第六病）、肝蛭症、肥大吸虫症、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、フィラリア症、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる食中毒、自由生活アメーバ性感染症、フゾバクテリウム感染症、ガス壊疽（クロストリジウム性筋壊死）、ジオトリクム症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、ジアルジア症、鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径肉芽腫（鼠径リンパ肉芽腫症）、Ａ群連鎖球菌感染症、Ｂ群連鎖球菌感染症、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染症、手足口病（ＨＦＭＤ）、Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ性肺感染症（ＨＰＳ）、ハートランドウイルス病、ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、単純ヘルペス、ヒストプラスマ症、鉤虫感染症、ヒトボカウイルス感染症、ヒトｅｗｉｎｇｉｉエーリキア症、ヒト顆粒球アナプラズマ症（ＨＧＡ）、ヒトメタニューモウイルス感染症、ヒト単球エーリキア症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、ヒトパラインフルエンザウイルス感染���、膜様条虫症、エプスタイン・バーウイルス伝染性単核球症（Ｍｏｎｏ）、インフルエンザ（ｆｌｕ）、イソスポーラ症、川崎病、角膜炎、ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ感染症、クールー、ラッサ熱、レジオネラ症（レジオネラ病）、レジオネラ症（ポンティアック熱）、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病（ライムボレリア症）、リンパ管フィラリア（象皮症）、リンパ性脈絡髄膜炎、マラリア、マールブルグ出血熱（ＭＨＦ）、麻疹、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、類鼻疽（ウィットモア病）、髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、横川吸虫症、微胞子虫症、伝染性軟属腫（ＭＣ）、サル痘、流行性耳下腺炎、発疹熱（地方性発疹チフス）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ肺炎、菌腫（曖昧性除去）、ハエ幼虫症、新生児結膜炎（新生児眼炎）、（新）異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ、ｎｖＣＪＤ）、ノカルジア症、オンコセルカ症（河川盲目症）、オピストルキス症、パラコクシジオイデス症（南アメリカブラストミセス症）、肺吸虫症、パスツレラ症、アタマジラミ寄生症（アタマジラミ）、コロモジラミ寄生症（コロモジラミ）、ケジラミ症（毛ジラミ（ｐｕｂｉｃ  ｌｉｃｅ）、ケジラミ（ｃｒａｂ  ｌｉｃｅ））、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））、ペスト、肺炎球菌感染症、ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ肺炎（ＰＣＰ）、肺炎、灰白髄炎、プレボテラ感染症、一次アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）、進行性多巣性白質脳症、オウム病、Ｑ熱、狂犬病、回帰熱、ＲＳウイルス感染症、リノスポリジウム症、ライノウイルス感染症、リケッチア感染症、リケッチア痘症、リフトバレー熱（ＲＶＦ）、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）、疥癬、住血吸虫症、敗血症、細菌性赤痢（ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）（細菌性赤痢（Ｂａｃｉｌｌａｒｙ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ））、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）（帯状疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ））、天然痘（痘瘡）、スポロトリコーシス、ブドウ球菌食中毒、ブドウ球菌感染症、糞線虫症、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、条虫症、テタヌス（開口障害）、白癬性毛瘡（かみそり負け）、頭部白癬（頭皮の白癬）、体部白癬（身体の白癬）、股部白癬（いんきんたむし）、手白癬（手の白癬）、黒癬、足白癬（アスリートフット）、爪白癬（爪真菌症）、癜風（なまず）、トキソカラ症（眼幼虫移行症（ＯＬＭ））、トキソカラ症（内臓幼虫移行症（ＶＬＭ））、トラコーマ、トキソプラズマ症、旋毛虫症、トリコモナス症、鞭虫症（鞭虫感染症）、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ感染症、渓谷熱、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ感染症、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ腸炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル熱、白色砂毛（ｗｈｉｔｅ  ｐｉｅｄｒａ）（白色砂毛（Ｔｉｎｅａ  ｂｌａｎｃａ））、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症、エルシニア感染症、黄熱病、ジカ熱、または接合菌症が含まれるが、それらに限定されない。
【０５３９】
本明細書に記載されたポリペプチドにより処置または防止することができる例示的な免疫障害または状態には、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、軸索型＆神経細胞型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、ベーチェット病、類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多病巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹もしくは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、低ガンマグロブリン血症（ｈｙｐｏｇａｍｍａｌｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連した小児自己免疫性神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、毛様体扁平部炎（末梢性ぶどう膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群（多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性ガンマグロブリン血症、皮膚の変化）、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ（ＲＡ）、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ���、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トローザ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑症、またはウェゲナー肉芽腫症（多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））が含まれるが、それらに限定されない。
【０５４０】
本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、患者が回復するまで、患者の全身における、ポリペプチドの治療有効レベルを保つ頻度で投与することが典型的である。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約１つ、２つ、５つ、１０、２０、３０、または４０の、ポリペプチドが、各標的分子または細胞に結合するのに十分な血清濃度を達成する頻度で投与することができる。ある実施形態では、ポリペプチドを、１、２、３、４、５、６、または７日ごと、１、２、３、４、５、または６週ごと、または１、２、３、４、５、または６か月ごとに投与する。
【０５４１】
当技術分野では、多様なポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）を投与する方法が公知であり、下記でも記載される。使用されるポリペプチドの、適切な投与量は、被験体の年齢および体重と、使用される特定の薬物とに依存するであろう。
【０５４２】
ポリペプチドは、それら自体で使用することもでき、第２の薬剤、例えば、抗菌剤、毒素、またはタンパク質、例えば、第２のポリペプチドへとコンジュゲートさせることもできる。この方法は、単独であるか、または第２の薬剤へとコンジュゲートさせた、ポリペプチドを、このような処置を要求する被験体に投与するステップを含む。ポリペプチドを使用して、様々な治療剤、例えば、毒素、またはこれらの混合物を送達することができる。
【０５４３】
組み合わせ療法
ポリペプチド（例えば、抗体分子またはＴＣＲ分子）は、他の治療と組み合わせて使用することができる。例えば、組み合わせ療法は、１つまたは複数のさらなる治療剤、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数のさらなる治療剤と共に共製剤化され、かつ／または共投与される、ポリペプチドを含みうる。他の実施形態では、ポリペプチドを、他の治療的処置モダリティー、例えば、本明細書に記載の他の治療的処置モダリティーと組み合わせて投与する。有利には、このような組み合わせ療法は、投与される治療剤の低投与量を用い、これにより、多様な単剤療法と関連する、可能な毒性または合併症を回避しうる。
【０５４４】
本明細書で使用される「組み合わせで」投与されるとは、２つの（またはこれを超える）異なる処置を、障害への被験体の罹患の前に、またはこの経過中に、被験体に送達することを意味する。ある実施形態では、２つまたはこれを超える処置を、予防的に、例えば、被験体が、障害を有するか、または障害を伴うと診断される前に送達する。別の実施形態では、２つまたはこれを超える処置を、被験体が、障害を発症したか、またはこれを伴うと診断された後で送達する。一部の実施形態では、重複がなされるように、１つの処置の送達は、第２の処置の送達が始まるときに、依然として行われている。本明細書では、場合によって、これを、「同時的送達」または「共時的送達」と称する。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の一部の実施形態では、処置は、投与の組み合わせのために、より有効である。例えば、第２の処置を第１の処置の非存在下で投与した場合にみられるものより、第２の処置はより有効である、例えば、より少量の第２の処置により同等の効果が見られるか、もしくは第２の処置が症状を、より大きな程度低減するか、または第１の処置について同様の状況が見られる。一部の実施形態では、送達は、障害と関連する症状または他のパラメータの低減が、他の処置の非存在下で送達された１つの処置により観察される低減を超えるような送達である。２つの処置の効果は、部分的に相加的な場合もあり、完全に相加的な場合もあり、相加性を超える場合もある。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２の処置が送達されるときに、なおも検出可能であるような送達でありうる。
【０５４５】
ある実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載された障害を処置または防止するために、第２の治療（例えば、追加の作用物質）と組み合わせて投与される。ある実施形態では、追加の作用物質は、第２のポリペプチド（例えば、抗体分子）、例えば、第１のポリペプチド（例えば、抗体分子）とは異なるポリペプチド（例えば、抗体分子）である。組み合わせて使用することができる例示的なポリペプチド（例えば、抗体分子）には、本明細書に記載されたポリペプチド（例えば、抗体分子）の任意の組み合わせが含まれるが、それに限定されない。別の実施形態では、追加の作用物質は、ポリペプチド（例えば、抗体分子）以外である。例えば、追加の作用物質は、小分子または核酸分子でありうる。さらに別の実施形態では、第２の治療は、手術、放射線療法、細胞療法（例えば、幹細胞療法）、または臓器もしくは組織移植から選択される。
【０５４６】
ある実施形態では、第２の治療は、以下のうちの１つまたは複数から選択される治療を含む：アンドロゲン補充療法、抗ホルモン療法、抗血清療法、自己免疫増強療法、生物療法、血液照射療法、近接照射療法、心臓再同期療法（ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、細胞療法、細胞移入療法、キレート療法、化学療法、金療法、コバルト療法、寒冷圧迫療法（ｃｏｌｄ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、寒冷療法、電気痙攣療法、電磁療法（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、電子線治療（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、電気療法、酵素補充療法、エピジェネティック療法（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、エストロゲン補充療法、体外衝撃波療法、高速中性子療法、フッ化物療法、遺伝子治療、温熱療法（ｈｅａｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）、蠕虫療法、ホルモン療法、ホルモン補充療法、宿主調節療法（ｈｏｓｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｔｈｅｒａｐｙ）、高圧酸素療法、温熱療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｔｈｅｒａｐｙ）、免疫抑制療法、免疫療法、術中電子線照射療法（ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、術中照射治療、逆さま療法（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、レーザー療法、光療法、リチウム療法、低レベルレーザー療法、磁気療法（ｍａｇｎｅｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）、磁気共鳴療法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）、医療ガス療法（ｍｅｄｉｃａｌ  ｇａｓ  ｔｈｅｒａｐｙ）、医学的栄養療法（ｍｅｄｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、分子シャペロン療法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）、分子療法、モノクローナル抗体療法、マイナスイオン療法（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｉｒ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、中性子捕獲療法、中性子療法、経口補水療法、浸透圧療法、酸素療法、オゾン療法、緩和療法、粒子療法、ファージ療法、音素神経学的低クロム療法（ｐｈｏｎｅｍｉｃ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒａｐｙ）、光線力学的療法、光線療法、光熱療法（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）、理学療法、増殖療法、タンパク質療法、陽子線療法（ｐｒｏｔｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、パルス電磁場療法（ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）、ＰＵＶＡ療法、放射線療法、補水療法、呼吸療法、サルベージ療法、血清療法、幹細胞療法、定位照射療法、標的化療法、温熱療法（ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、ＴＫ細胞療法、寛容原性療法（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、経皮持続酸素療法、紫外線療法、またはウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）。
【０５４７】
他の障害を処置または防止するために、本明細書に記載されたポリペプチドまたは組成物と組み合わせて使用することができる例示的な治療は、本明細書における「障害を処置または防止する方法」のセクションにも記載されている。
【０５４８】
診断法
一部の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、生検または体液（例えば、血液、尿または脳脊髄液）試料中など、生物学的試料中）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、被験体におけるｉｎ  ｖｉｖｏイメージング）において、標的分子（例えば、タンパク質）または細胞の存在を検出するための診断法を提示する。方法は、（ｉ）試料を、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、本明細書で記載される抗体分子）と接触させるか、または被験体に、ポリペプチド（例えば、抗体分子）を投与するステップと；（必要に応じて）（ｉｉ）基準試料、例えば、対照試料（例えば、生検または体液（例えば、血液、尿または脳脊髄液）試料など、対照の生物学的試料）または対照の被験体を、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、本明細書で記載される抗体分子）と接触させるステップと；（ｉｉｉ）ポリペプチド（例えば、抗体分子）と、試料もしくは被験体、または対照試料もしくは対照の被験体中の標的分子または細胞との間の複合体の形成を検出するステップとを含み、ここで試料または被験体における複合体の形成の、対照試料または対照の被験体と比べた変化、例えば、統計学的に有意な変化が、試料中の標的分子または細胞の存在を指し示す。ポリペプチド（例えば、抗体分子）は、結合した抗体または結合しなかったポリペプチド（例えば、抗体分子）の検出を容易とするように、検出可能な物質で、直接的に標識することもでき、間接的に標識することもできる。適切な、検出可能な物質は、本明細書に記載するような、多様な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、および放射性材料を含む。
【０５４９】
細菌を検出するために使用される試料を指す場合の「試料」という用語は、細胞試料、細胞溶解物試料、タンパク質試料、もしくは細胞の膜抽出物試料、血液、尿またはＣＳＦなどの体液試料、または生検などの組織試料を含むがこれらに限定されない。
【０５５０】
ポリペプチド（例えば、抗体分子）と、標的分子または細胞との複合体の形成は、標的分子または細胞に結合したポリペプチド（例えば、抗体分子）、またはこれらに結合しなかったポリペプチド（例えば、抗体分子）を測定するか、または可視化することにより検出することができる。任意の適切な検出アッセイを使用することができ、従来の検出アッセイは、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイまたは免疫組織化学を含む。ポリペプチドの標識化に対する代替法として、検出可能な物質で標識化した標準物質と、標識化しないポリペプチドとを用いる競合免疫アッセイにより、試料中の標的分子または細胞の存在を、アッセイすることができる。このアッセイでは、生物学的試料と、標識化した標準物質と、ポリペプチドとを組み合わせ、非標識化結合分子に結合した標識化標準物質の量を決定する。試料中の標的分子または細胞の量は、ポリペプチド（例えば、抗体分子）に結合した標識化標準物質の量と反比例する。
【０５５１】
本明細書に記載されたポリペプチド（例えば、抗体分子）は、本明細書に記載されたポリペプチドにより処置または防止することができる障害を診断するために使用することができる。本明細書に記載された検出または診断方法は、本明細書に記載された障害を処置または防止するために本明細書に記載された他の方法と組み合わせて使用することができる。
【０５５２】
追加の実施形態は、下記の番号付けされた項において記載されている。
１．抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、重鎖（ＨＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、軽鎖（ＬＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＨＣストランドをＬＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＨＣＶＲのＨＣエレメントおよびＬＣＶＲのＬＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法。
２．ＨＣエレメントがＨＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる、項１に記載の方法。
３．ＬＣエレメントがＬＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる、項１または２に記載の方法。
４．核酸配列が、発現した時、ＨＣＶＲＳおよびＬＣＶＲＳが機能性抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖを形成するように、構成される、項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖが、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である、項４に記載の方法。
６．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップが、以下：
ａ）以下：
（ｉ）細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
（ｉｉ）上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、
と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：
上記細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および
上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップ
を含む、項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である、項６に記載の方法。
８．ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である、項６または７に記載の方法。
９．捕捉支持体が、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む、項６〜８のいずれかに記載の方法。
１０．捕捉支持体が、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＨＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＬＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、項６〜９のいずれかに記載の方法。
１１．第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている、項６〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、以下：
第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および細胞のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物
を含む、項６〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む、項６〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む、項６〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される、項６〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される、項６〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる、項１５または１６に記載の方法。
１８．逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる、項１５または１６に記載の方法。
１９．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる、項１５または１６に記載の方法。
２０．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる、項１５または１６に記載の方法。
２１．逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる、項１５または１６に記載の方法。
２２．増幅が、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、１５サイクルもしくはそれ未満、１４サイクルもしくはそれ未満、１３サイクルもしくはそれ未満、１２サイクルもしくはそれ未満、１１サイクルもしくはそれ未満、１０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む、項６〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．逆転写および／または増幅が、例えばＨＣＶＲＳおよび／またはＬＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する、項６〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．増幅が、ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない、項６〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．増幅が、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない、項６〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．少なくとも１つのプライマーが、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む、項２５に記載の方法。
２７．少なくとも１つのプライマーが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない、項２５または２６に記載の方法。
２８．ヌクレオチド修飾が、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する、項２６または２７に記載の方法。
２９．ヌクレオチド修飾が、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である、項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．スペーサーが、可撓性スペーサー、炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、またはそれより多い）の脱塩基ヌクレオチド、またはＰＥＧスペーサーである、項２９に記載の方法。
３１．ヌクレオチド修飾が、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである、項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
３２．ヌクレオチド修飾が、プライマーの内部に、または３’末端に位置する、項２６〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む、項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の第２のメンバーとアニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む、（分子内ハイブリダイゼーションによる）ヘアピン構造または（分子間ハイブリダイゼーションによる）二本鎖構造を形成する能力がある、項３３に記載の方法。
３５．第１のメンバーが、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む、項３３または３４に記載の方法。
３６．第２のメンバーが、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＨＣＶＲＳおよび／またはＬＣＶＲＳに相補的な配列
の１つ、２つ、または全部を含み、必要に応じて、第２のメンバーが（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む、項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．少なくとも１つのプライマーが、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、項２３〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーが、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている、項３７に記載の方法。
３９．リンカー配列が、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる、項３７または３８に記載の方法。
４０．ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む、項１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む、項１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む、項１〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む、項１〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する、項１〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．ＨＣストランドおよびＬＣストランドが、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項１〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＨＣストランドおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＬＣストランドが共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項１〜４４のいずれかに記載の方法。
４７．ＨＣストランドがＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＬＣストランドがＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる、項１〜４４のいずれかに記載の方法。
４８．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる、項１〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む、項４８に記載の方法。
５０．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む、項４８または４９に記載の方法。
５１．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる、項１〜４７のいずれかに記載の方法。
５２．ＨＣストランドおよびＬＣストランドが、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる、項５１に記載の方法。
５３．隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーが、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む、項５１または５２に記載の方法。
５４．隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーが、ＨＣストランドおよびＬＣストランド、またはＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む、項５１〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．酵素が、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである、項５０または５４に記載の方法。
５６．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、以下：
（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＨＣストランドおよびＬＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９５℃で）、加熱するステップ；
（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＨＣストランドおよびＬＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、５０〜６５℃で）、冷却するステップ；
（ｃ）ＨＣストランドおよびＬＣストランドのライゲーション（例えば、ＨＣストランドとＬＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４５〜６５℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクル、４５サイクル、５０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップ
を含む、項５１〜５５のいずれかに記載の方法。
５７．ＨＣストランドおよびＬＣストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる、項１〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．スプリントオリゴヌクレオチドが、ＨＣストランドとＬＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する、項５７に記載の方法。
５９．スプリントオリゴヌクレオチドが、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む、項５７または５８に記載の方法。
６０．修飾が、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある、項５９に記載の方法。
６１．共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＨＣおよびＬＣストランドに相補的なストランドが増幅により産生される、項１〜６０のいずれかに記載の方法。
６２．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む、項１〜６１のいずれかに記載の方法。
６３．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップが、
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップ
を含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、項６２に記載の方法。
６４．隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、溶解試薬、例えば、洗剤を含む、項６３に記載の方法。
６５．細胞が熱または酵素により溶解される、項６３または６４に記載の方法。
６６．捕捉支持体が、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む、項６３〜６５のいずれかに記載の方法。
６７．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む、項６２〜６６のいずれかに記載の方法。
６８．放出ステップが、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される、項６７に記載の方法。
６９．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される、項６２〜６８に記載の方法。
７０．核酸配列を産生マイクロチャンバーから放出させるステップを含む、項１〜６９のいずれかに記載の方法。
７１．核酸配列を増幅するステップをさらに含む、項１〜７０のいずれかに記載の方法。
７２．核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップを含む、項１〜７１のいずれかに記載の方法。
７３．核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップを含む、項１〜７２のいずれかに記載の方法。
７４．ベクターが、核酸配列に含まれない追加のＨＣエレメントまたはＬＣエレメントを供給する、項７３に記載の方法。
７５．ベクターが、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、またはその両方を供給する、項７３または７４に記載の方法。
７６．ベクターを発現するステップを含む、項７３〜７５のいずれかに記載の方法。
７７．核酸配列を発現して、ＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、項１〜７６のいずれかに記載の方法。
７８．ＬＣエレメントが、ポリペプチドにおいてＨＣエレメントのＮ末端側にある、項７７に記載の方法。
７９．ＨＣエレメントが、ポリペプチドにおいてＬＣエレメントのＣ末端側にある、項７７に記載の方法。
８０．ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む、項７７〜７９のいずれかに記載の方法。
８１．ポリペプチドが抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、項７７〜８０のいずれかに記載の方法。
８２．細胞が免疫細胞、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞、例えば、ヒトＢ細胞またはＴ細胞である、項１〜８１のいずれかに記載の方法。
８３．細胞が哺乳動物細胞またはトリ細胞である、項１〜８２のいずれかに記載の方法。
８４．抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）ステップｂ）由来の重鎖（ＨＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；および
ｉｉ）ステップｂ）由来の軽鎖（ＬＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｅ）ＨＣストランドをＬＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、方法。
８５．抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、
細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）
を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、
上記細胞由来のＨＣＶＲのＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および
上記細胞由来のＬＣＶＲのＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＨＣストランド）の、ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＬＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＨＣストランドおよびＬＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＨＣおよびＬＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法。
８６．複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしており、項１〜８５のいずれかに記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＨＣエレメントおよびＬＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する、方法。
８７．複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む、項８６に記載の方法。
８８．複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む、項８６または８７に記載の方法。
８９．ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、項８６〜８８のいずれかに記載の方法。
９０．ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、項８６〜８９のいずれかに記載の方法。
９１．複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＨＣエレメントおよびＬＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、項１〜８５のいずれかに記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、もしくは１０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、もしくは１０８〜１０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＨＣエレメント配列およびＬＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）を含む、
ライブラリー。
９２．複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＨＣエレメント、例えば、ＨＣＶＲＳ、およびＬＣエレメント、例えば、ＬＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、ｓｃＦｖを形成するように、構成される、項９１に記載のライブラリー。
９３．ライブラリーがディスプレイライブラリーである、項９１〜９２のいずれかに記載のライブラリー。
９４．複数個のメンバーのそれぞれが、ディスプレイ実体の表面上でのメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする、項９１〜９３のいずれかに記載のライブラリー。
９５．ライブラリーがファージディスプレイライブラリーである、項９１〜９４のいずれかに記載のライブラリー。
９６．ライブラリーが酵母ディスプレイライブラリーである、項９１〜９４のいずれかに記載のライブラリー。
９７．ライブラリーが哺乳動物ディスプレイライブラリーである、項９１〜９４のいずれかに記載のライブラリー。
９８．ａ）項９１〜９７のいずれかに記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
９９．ポリペプチドを抗原に接触させるステップをさらに含む、項９８に記載の方法。
１００．抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、項９８または９９に記載の方法。
１０１．ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、α鎖可変領域配列（ＡＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、α鎖（ＡＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、β鎖可変領域配列（ＢＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、β鎖（ＢＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＡＣストランドをＢＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＢＣＶＲまたはＡＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＡＣＶＲのＡＣエレメントおよびＢＣＶＲのＢＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法。
１０２．ＡＣエレメントがＡＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる、項１０１に記載の方法。
１０３．ＢＣエレメントがＢＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる、項１０１または１０２に記載の方法。
１０４．核酸配列が、発現した時、ＡＣＶＲＳおよびＢＣＶＲＳが機能性抗原結合分子、例えば、単鎖ＴＣＲ分子を形成するように、構成される、項１０１〜１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．抗原結合分子が、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である、項１０４に記載の方法。
１０６．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップが、以下：
ａ）以下：
（ｉ）細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
（ｉｉ）上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、
と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：
上記細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および
上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップ
を含む、項１０１〜１０５のいずれかに記載の方法。
１０７．ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である、項１０６に記載の方法。
１０８．ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である、項１０６または１０７に記載の方法。
１０９．捕捉支持体が、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む、項１０６〜１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．捕捉支持体が、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＡＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＢＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、項１０６〜１０９のいずれかに記載の方法。
１１１．第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている、項１０６〜１１０のいずれかに記載の方法。
１１２．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、以下：
第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および細胞のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物
を含む、項１０６〜１１１のいずれかに記載の方法。
１１３．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む、項１０６〜１１２のいずれかに記載の方法。
１１４．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む、項１０６〜１１３のいずれかに記載の方法。
１１５．細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される、項１０６〜１１４のいずれかに記載の方法。
１１６．細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される、項１０６〜１１５のいずれかに記載の方法。
１１７．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる、項１１５または１１６に記載の方法。
１１８．逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる、項１１５または１１６に記載の方法。
１１９．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる、項１１５または１１６に記載の方法。
１２０．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる、項１１５または１１６に記載の方法。
１２１．逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる、項１１５または１１６に記載の方法。
１２２．増幅が、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、１５サイクルもしくはそれ未満、１４サイクルもしくはそれ未満、１３サイクルもしくはそれ未満、１２サイクルもしくはそれ未満、１１サイクルもしくはそれ未満、１０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む、項１０６〜１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．逆転写および／または増幅が、例えばＡＣＶＲＳおよび／またはＢＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する、項１０６〜１２２のいずれかに記載の方法。
１２４．増幅が、ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない、項１０６〜１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．増幅が、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない、項１０６〜１２４のいずれかに記載の方法。
１２６．少なくとも１つのプライマーが、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む、項１２５に記載の方法。
１２７．少なくとも１つのプライマーが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない、項１２５または１２６に記載の方法。
１２８．ヌクレオチド修飾が、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する、項１２６または１２７に記載の方法。
１２９．ヌクレオチド修飾が、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である、項１２６〜１２８のいずれかに記載の方法。
１３０．スペーサーが、可撓性スペーサー、炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、またはそれより多い）の脱塩基ヌクレオチド、またはＰＥＧスペーサーである、項１２９に記載の方法。
１３１．ヌクレオチド修飾が、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである、項１２６〜１２８のいずれかに記載の方法。
１３２．ヌクレオチド修飾が、プライマーの内部に、または３’末端に位置する、項１２６〜１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む、項１２３〜１３２のいずれかに記載の方法。
１３４．第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の第２のメンバーとアニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む、（分子内ハイブリダイゼーションによる）ヘアピン構造または（分子間ハイブリダイゼーションによる）二本鎖構造を形成する能力がある、項１３３に記載の方法。
１３５．第１のメンバーが、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む、項１３３または１３４に記載の方法。
１３６．第２のメンバーが、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＡＣＶＲＳおよび／またはＢＣＶＲＳに相補的な配列
の１つ、２つ、または全部を含み、必要に応じて、第２のメンバーが（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む、項１３３〜１３５のいずれかに記載の方法。
１３７．少なくとも１つのプライマーが、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、項１２３〜１３６のいずれかに記載の方法。
１３８．リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーが、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている、項１３７に記載の方法。
１３９．リンカー配列が、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる、項１３７または１３８に記載の方法。
１４０．ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む、項１０１〜１３９のいずれかに記載の方法。
１４１．ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む、項１０１〜１４０のいずれかに記載の方法。
１４２．ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む、項１０１〜１４１のいずれかに記載の方法。
１４３．ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む、項１０１〜１４２のいずれかに記載の方法。
１４４．ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する、項１０１〜１４３のいずれかに記載の方法。
１４５．ＡＣストランドおよびＢＣストランドが、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＡＣおよびＢＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項１０１〜１４４のいずれかに記載の方法。
１４６．ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＡＣストランドおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＢＣストランドが共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＡＣおよびＢＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項１０１〜１４４のいずれかに記載の方法。
１４７．ＡＣストランドがＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＢＣストランドがＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる、項１０１〜１４４のいずれかに記載の方法。
１４８．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる、項１０１〜１４７のいずれかに記載の方法。
１４９．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む、項１４８に記載の方法。
１５０．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む、項１４８または１４９に記載の方法。
１５１．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる、項１０１〜１４７のいずれかに記載の方法。
１５２．ＡＣストランドおよびＢＣストランドが、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる、項１５１に記載の方法。
１５３．隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーが、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む、項１５１または１５２に記載の方法。
１５４．隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーが、ＡＣストランドおよびＢＣストランド、またはＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む、項１５１〜１５３のいずれかに記載の方法。
１５５．酵素が、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである、項１５０または１５４に記載の方法。
１５６．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、以下：
（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＡＣストランドおよびＢＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９５℃で）、加熱するステップ；
（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＡＣストランドおよびＢＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、５０〜６５℃で）、冷却するステップ；
（ｃ）ＡＣストランドおよびＢＣストランドのライゲーション（例えば、ＡＣストランドとＢＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４５〜６５℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクル、４５サイクル、５０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップ
を含む、項１５１〜１５５のいずれかに記載の方法。
１５７．ＡＣストランドおよびＢＣストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる、項１０１〜１５６のいずれかに記載の方法。
１５８．スプリントオリゴヌクレオチドが、ＡＣストランドとＢＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する、項１５７に記載の方法。
１５９．スプリントオリゴヌクレオチドが、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む、項１５７または１５８に記載の方法。
１６０．修飾が、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある、項１５９に記載の方法。
１６１．共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＡＣおよびＢＣストランドに相補的なストランドが増幅により産生される、項１０１〜１６０のいずれかに記載の方法。
１６２．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む、項１０１〜１６１のいずれかに記載の方法。
１６３．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップが、
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップ
を含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、項１６２に記載の方法。
１６４．隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、溶解試薬、例えば、洗剤を含む、項１６３に記載の方法。
１６５．細胞が熱または酵素により溶解される、項１６３または１６４に記載の方法。
１６６．捕捉支持体が、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む、項１６３〜１６５のいずれかに記載の方法。
１６７．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む、項１６２〜１６６のいずれかに記載の方法。
１６８．放出ステップが、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される、項１６７に記載の方法。
１６９．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される、項１６２〜１６８に記載の方法。
１７０．核酸配列を産生マイクロチャンバーから放出させるステップを含む、項１０１〜１６９のいずれかに記載の方法。
１７１．核酸配列を増幅するステップをさらに含む、項１０１〜１７０のいずれかに記載の方法。
１７２．核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップを含む、項１０１〜１７１のいずれかに記載の方法。
１７３．核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップを含む、項１０１〜７２のいずれかに記載の方法。
１７４．ベクターが、核酸配列に含まれない追加のＡＣエレメントまたはＢＣエレメントを供給する、項１７３に記載の方法。
１７５．ベクターが、ＡＣ  ＣＤＲ１、ＡＣ  ＣＤＲ２、またはその両方を供給する、項１７３または１７４に記載の方法。
１７６．ベクターを発現するステップを含む、項１７３〜１７５のいずれかに記載の方法。
１７７．核酸配列を発現して、ＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、項１０１〜１７６のいずれかに記載の方法。
１７８．ＢＣエレメントが、ポリペプチドにおいてＡＣエレメントのＮ末端側にある、項１７７に記載の方法。
１７９．ＡＣエレメントが、ポリペプチドにおいてＢＣエレメントのＣ末端側にある、項１７７に記載の方法。
１８０．ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む、項１７７〜１７９のいずれかに記載の方法。
１８１．ポリペプチドが抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、項１７７〜１８０のいずれかに記載の方法。
１８２．細胞が免疫細胞、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞、例えば、ヒトＢ細胞またはＴ細胞である、項１０１〜１８１のいずれかに記載の方法。
１８３．細胞が哺乳動物細胞またはトリ細胞である、項１０１〜１８２のいずれかに記載の方法。
１８４．ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）ステップｂ）由来のα鎖（ＡＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、α鎖可変領域配列（ＡＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＡＣストランド；および
ｉｉ）ステップｂ）由来のβ鎖（ＢＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、β鎖可変領域配列（ＢＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＢＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｅ）ＡＣストランドをＢＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＢＣＶＲまたはＡＣＶＲをコードする核酸を含まない、方法。
１８５．ＴＣＲα鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＡＣＶＲまたはＢＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、
細胞由来のＡＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
細胞由来のＢＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）
を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＢＣＶＲまたはＡＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、
上記細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および
上記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＡＣストランド）の、ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＢＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＡＣストランドおよびＢＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＡＣおよびＢＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法。
１８６．複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしており、項１０１〜１８５のいずれかに記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＡＣエレメントおよびＢＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する、方法。
１８７．複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む、項１８６に記載の方法。
１８８．複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む、項１８６または１８７に記載の方法。
１８９．ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、項１８６〜１８８のいずれかに記載の方法。
１９０．ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、項１８６〜１８９のいずれかに記載の方法。
１９１．複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＡＣエレメントおよびＢＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、項１０１〜１８５のいずれかに記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、もしくは１０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、もしくは１０８〜１０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＡＣエレメント配列およびＢＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）を含む、
ライブラリー。
１９２．複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＡＣエレメント、例えば、ＡＣＶＲＳ、およびＢＣエレメント、例えば、ＢＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、単鎖ＴＣＲを形成するように、構成される、項１９１に記載のライブラリー。
１９３．ライブラリーがディスプレイライブラリーである、項１９１〜１９２のいずれかに記載のライブラリー。
１９４．複数個のメンバーのそれぞれが、ディスプレイ実体の表面上でのメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする、項１９１〜１９３のいずれかに記載のライブラリー。
１９５．ライブラリーがファージディスプレイライブラリーである、項１９１〜１９４のいずれかに記載のライブラリー。
１９６．ライブラリーが酵母ディスプレイライブラリーである、項１９１〜１９４のいずれかに記載のライブラリー。
１９７．ライブラリーが哺乳動物ディスプレイライブラリーである、項１９１〜１９４のいずれかに記載のライブラリー。
１９８．ａ）項１９１〜１９７のいずれかに記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
１９９．ポリペプチドを抗原に接触させるステップをさらに含む、項１９８に記載の方法。
２００．抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、項１９８または１９９に記載の方法。
２０１．ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、γ鎖可変領域配列（ＧＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、γ鎖（ＧＣ）ストランド；および
ｉｉ）上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、δ鎖可変領域配列（ＤＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、δ鎖（ＤＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＧＣストランドをＤＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＤＣＶＲまたはＧＣＶＲをコードする核酸を含まず、それにより、ＧＣＶＲのＧＣエレメントおよびＤＣＶＲのＤＣエレメントをコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する、方法。
２０２．ＧＣエレメントがＧＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる、項２０１に記載の方法。
２０３．ＤＣエレメントがＤＣＶＲＳまたはその機能性断片（例えば、その抗原結合断片）を含み、またはそれからなる、項２０１または２０２に記載の方法。
２０４．核酸配列が、発現した時、ＧＣＶＲＳおよびＤＣＶＲＳが機能性抗原結合分子、例えば、単鎖ＴＣＲ分子を形成するように、構成される、項２０１〜２０３のいずれかに記載の方法。
２０５．抗原結合分子が、例えば、本明細書に記載された方法またはアッセイにより決定される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である、項２０４に記載の方法。
２０６．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップが、以下：
ａ）以下：
（ｉ）細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
（ｉｉ）上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランド
を含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、
と結合した捕捉支持体（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）を獲得するステップ、ならびに
ｂ）第１および第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持して、以下：
上記細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および
上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップ
を含む、項２０１〜２０５のいずれかに記載の方法。
２０７．ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが第１のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である、項２０６に記載の方法。
２０８．ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが第２のｄｓ  ｃＤＮＡと同一、または実質的に同一である、項２０６または２０７に記載の方法。
２０９．捕捉支持体が、ビーズ、例えば、磁気ビーズを含む、項２０６〜２０８のいずれかに記載の方法。
２１０．捕捉支持体が、ｃＤＮＡと結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、（ｉ）ＧＣストランドと結合する部分；（ｉｉ）ＤＣストランドと結合する部分；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、項２０６〜２０９のいずれかに記載の方法。
２１１．第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体上に配置されている、項２０６〜２２０のいずれかに記載の方法。
２１２．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、以下：
第１および第２のｍＲＮＡから（例えば、第１および第２のｍＲＮＡが、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体から溶液へ放出された後）、細胞のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および細胞のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物
を含む、項２０６〜２１１のいずれかに記載の方法。
２１３．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、第１のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む、項２０６〜２１２のいずれかに記載の方法。
２１４．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、第２のｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介するプライマーを含む、項２０６〜２１３のいずれかに記載の方法。
２１５．細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第１のｍＲＮＡの逆転写により生成される、項２０６〜２１４のいずれかに記載の方法。
２１６．細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡストランドが、第２のｍＲＮＡの逆転写により生成される、項２０６〜２１５のいずれかに記載の方法。
２１７．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー内で起こる、項２１５または２１６に記載の方法。
２１８．逆転写が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバー内で起こる、項２１５または２１６に記載の方法。
２１９．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、または隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる、項２１５または２１６に記載の方法。
２２０．逆転写が、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーの外側で、および隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーの外側で、起こる、項２１５または２１６に記載の方法。
２２１．逆転写が、隔離された反応部位の外側で、例えば、マイクロチャンバーの外側で、起こる、項２１５または２１６に記載の方法。
２２２．増幅が、２０サイクルまたはそれ未満、例えば、２５サイクルもしくはそれ未満、２４サイクルもしくはそれ未満、２３サイクルもしくはそれ未満、２２サイクルもしくはそれ未満、２１サイクルもしくはそれ未満、２０サイクルもしくはそれ未満、９サイクルもしくはそれ未満、８サイクルもしくはそれ未満、７サイクルもしくはそれ未満、６サイクルもしくはそれ未満、または５サイクルもしくはそれ未満を含む、項２０６〜２２１のいずれかに記載の方法。
２２３．逆転写および／または増幅が、例えばＧＣＶＲＳおよび／またはＤＣＶＲＳに特異的な配列を含む、１つまたは複数のプライマーを使用する、項２０６〜２２２のいずれかに記載の方法。
２２４．増幅が、ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップ含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない、項２０６〜２２３のいずれかに記載の方法。
２２５．増幅が、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの産生を媒介する２つまたはそれより多いプライマーを使用するステップを含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含み、少なくとも１つのプライマーがヌクレオチド修飾を含まない、項２０６〜２２４のいずれかに記載の方法。
２２６．少なくとも１つのプライマーが、例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含む、項２２５に記載の方法。
２２７．少なくとも１つのプライマーが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を、例えば、低下させる、例えば、阻害する、ヌクレオチド修飾を含まない、項２２５または２２６に記載の方法。
２２８．ヌクレオチド修飾が、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを伸長することを阻害する、項２２６または２２７に記載の方法。
２２９．ヌクレオチド修飾が、プライマーへの、例えば、プライマーにおける２個の隣接したヌクレオチド間での、スペーサーの挿入である、項２２６〜２２８のいずれかに記載の方法。
２３０．スペーサーが、可撓性スペーサー、炭素スペーサー（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝３、４、５、またはそれより大きい）、２個もしくはそれより多い（例えば、３個、４個、５個、またはそれより多い）の脱塩基ヌクレオチド、またはＰＥＧスペーサーである、項２２９に記載の方法。
２３１．ヌクレオチド修飾が、例えばリボースへの、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＨ、２’−ＮＨ２、またはウラシルである、項２２６〜２２８のいずれかに記載の方法。
２３２．ヌクレオチド修飾が、プライマーの内部に、または３’末端に位置する、項２２６〜２３１のいずれかに記載の方法。
２３３．少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１のメンバー；（ｉｉ）第２のメンバー；および必要に応じて、（ｉｉｉ）本明細書に記載された、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置する、ヌクレオチド修飾を含む、項２２３〜２３２のいずれかに記載の方法。
２３４．第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の第２のメンバーとアニールして、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む、（分子内ハイブリダイゼーションによる）ヘアピン構造または（分子間ハイブリダイゼーションによる）二本鎖構造を形成する能力がある、項２３３に記載の方法。
２３５．第１のメンバーが、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む、項２３３または２３４に記載の方法。
２３６．第２のメンバーが、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＧＣＶＲＳおよび／またはＤＣＶＲＳに相補的な配列
の１つ、２つ、または全部を含み、必要に応じて、第２のメンバーが（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む、項２３３〜２３５のいずれかに記載の方法。
２３７．少なくとも１つのプライマーが、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、項２２３〜２３６のいずれかに記載の方法。
２３８．リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含むプライマーが、リン酸化、例えば、５’リン酸化されている、項２３７に記載の方法。
２３９．リンカー配列が、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、５、またはそれより大きい）を含み、またはそれからなる、項２３７または２３８に記載の方法。
２４０．ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む、項２０１〜２３９のいずれかに記載の方法。
２４１．ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む、項２０１〜２４０のいずれかに記載の方法。
２４２．ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハング、例えば、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある５’オーバーハングを含む、項２０１〜２４１のいずれかに記載の方法。
２４３．ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、平滑末端、例えば、５’ホスフェートを含む平滑末端を含む、項２０１〜２４２のいずれかに記載の方法。
２４４．ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが粘着末端を含み、例えば、両方が５’オーバーハングを有する、項２０１〜２４３のいずれかに記載の方法。
２４５．ＧＣストランドおよびＤＣストランドが、共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、一本鎖核酸配列を生じ、ＧＣおよびＤＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項２０１〜２４４のいずれかに記載の方法。
２４６．ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＧＣストランドおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡの変性ＤＣストランドが共有結合性に連結され、例えば、ライゲーションされ、ＧＣおよびＤＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項２０１〜２４５のいずれかに記載の方法。
２４７．ＧＣストランドがＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、かつＤＣストランドがＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ内に存在し、ならびにＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが共有結合性に連結されて、例えば、ライゲーションされて、例えば、二本鎖核酸配列を生じる、項２０１〜２４５のいずれかに記載の方法。
２４８．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位において起こる、項２０１〜２４７のいずれかに記載の方法。
２４９．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む、項２４８に記載の方法。
２５０．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む、項２４８または２４９に記載の方法。
２５１．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、隔離された産生反応部位とは異なる部位において起こる、例えば、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる、項２０１〜２４７のいずれかに記載の方法。
２５２．ＧＣストランドおよびＤＣストランドが、隔離された産生部位から隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーへ移され、共有結合性連結が、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーにおいて起こる、項２５１に記載の方法。
２５３．隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーが、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションする能力がある試薬を含む、項２５１または２５２に記載の方法。
２５４．隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーが、ＧＣストランドおよびＤＣストランド、またはＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡおよびＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡを共有結合性にカップリングする酵素を含む、項２５１〜２５３のいずれかに記載の方法。
２５５．酵素が、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼである、項２５０または２５４に記載の方法。
２５６．共有結合性連結、例えば、ライゲーションが、以下：
（ａ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＧＣストランドおよびＤＣストランドの変性を可能にする条件下で（例えば、９６℃で）、加熱するステップ；
（ｂ）隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを、ＧＣストランドおよびＤＣストランドへのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、６０〜６６℃で）、冷却するステップ；
（ｃ）ＧＣストランドおよびＤＣストランドのライゲーション（例えば、ＧＣストランドとＤＣストランドの間のホスホジエステル結合の形成）を可能にする条件下で（例えば、４６〜６６℃で）、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを維持するステップ；ならびに
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を逐次的に、２サイクル、６サイクル、２０サイクル、２６サイクル、２０サイクル、２６サイクル、３０サイクル、３６サイクル、４０サイクル、４６サイクル、６０サイクル、またはそれより多くのサイクル、繰り返すステップ
を含む、項２５１〜２５５のいずれかに記載の方法。
２５７．ＧＣストランドおよびＤＣストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結される、例えば、ライゲーションされる、項２０１〜２５６のいずれかに記載の方法。
２５８．スプリントオリゴヌクレオチドが、ＧＣストランドとＤＣストランドの接合部を含む配列、またはその相補的配列にハイブリダイズし、ライゲーション部位において二重鎖領域を形成する、項２５７に記載の方法。
２５９．スプリントオリゴヌクレオチドが、例えばＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡ合成を阻害する修飾（例えば、ＮＨ２基）を含む、項２５７または２５８に記載の方法。
２６０．修飾が、スプリントオリゴヌクレオチドの３’末端にある、項２５９に記載の方法。
２６１．共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＧＣおよびＤＣストランドに相補的なストランドが増幅により産生される、項２０１〜２６０のいずれかに記載の方法。
２６２．隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップをさらに含む、項２０１〜２６１のいずれかに記載の方法。
２６３．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップが、
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体を、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡと結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップ
を含み、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、項２６２に記載の方法。
２６４．隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、溶解試薬、例えば、洗剤を含む、項２６３に記載の方法。
２６５．細胞が熱または酵素により溶解される、項２６３または２６４に記載の方法。
２６６．捕捉支持体が、ｍＲＮＡ、例えば、オリゴ（ｄＴ）を結合する部分（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む、項２６３〜２６５のいずれかに記載の方法。
２６７．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから放出させるステップをさらに含む、項２６２〜２６６のいずれかに記載の方法。
２６８．放出ステップが、例えば、非捕捉ｍＲＮＡの交差結合を低下させるために、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で実施される、項２６７に記載の方法。
２６９．ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体が、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーから、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーへ移される、項２６２〜２６８に記載の方法。
２７０．核酸配列を産生マイクロチャンバーから放出させるステップを含む、項２０１〜２６９のいずれかに記載の方法。
２７１．核酸配列を増幅するステップをさらに含む、項２０１〜２７０のいずれかに記載の方法。
２７２．核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップを含む、項２０１〜２７１のいずれかに記載の方法。
２７３．核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップを含む、項２０１〜２７２のいずれかに記載の方法。
２７４．ベクターが、核酸配列に含まれない追加のＧＣエレメントまたはＤＣエレメントを供給する、項２７３に記載の方法。
２７５．ベクターが、ＧＣ  ＣＤＲ１、ＧＣ  ＣＤＲ２、またはその両方を供給する、項２７３または２７４に記載の方法。
２７６．ベクターを発現するステップを含む、項２７３〜２７５のいずれかに記載の方法。
２７７．核酸配列を発現して、ＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、項２０１〜２７６のいずれかに記載の方法。
２７８．ＤＣエレメントが、ポリペプチドにおいてＧＣエレメントのＮ末端側にある、項２７７に記載の方法。
２７９．ＧＣエレメントが、ポリペプチドにおいてＤＣエレメントのＣ末端側にある、項２７７に記載の方法。
２８０．ポリペプチドを抗原と接触させるステップをさらに含む、項２７７〜２７９のいずれかに記載の方法。
２８１．ポリペプチドが抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、項２７７〜２８０のいずれかに記載の方法。
２８２．細胞が免疫細胞、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞、例えば、ヒトＢ細胞またはＴ細胞である、項２０１〜２８１のいずれかに記載の方法。
２８３．細胞が哺乳動物細胞またはトリ細胞である、項２０１〜２８２のいずれかに記載の方法。
２８４．ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、以下：
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡを生成する反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物とｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップ（これは、例えば、隔離された細胞反応部位において、隔離された産生反応部位において、またはいずれにおいてでもなく、例えば、隔離された反応部位においてではなく、起こり得る）；
ｄ）ｉ）ステップｂ）由来のγ鎖（ＧＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、γ鎖可変領域配列（ＧＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＧＣストランド；および
ｉｉ）ステップｂ）由来のδ鎖（ＤＣ）ストランドであって、上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、δ鎖可変領域配列（ＤＣＶＲＳ）をコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＤＣストランド
を含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｅ）ＧＣストランドをＤＣストランドへ共有結合性に連結する、例えば、ライゲーションするステップ
を含み、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＤＣＶＲまたはＧＣＶＲをコードする核酸を含まない、方法。
２８５．ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）上記細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび上記細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを獲得するステップ；  
ｂ）細胞の溶解、ならびに捕捉支持体に、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーを維持するステップであって、隔離された細胞反応部位、例えば、細胞隔離マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＧＣＶＲまたはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｃ）担持されたｍＲＮＡを鋳型として使用して、
細胞由来のＧＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
細胞由来のＤＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡを担持させた捕捉支持体）
を産生する、反応混合物、例えば、逆転写酵素を含む反応混合物と、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を接触させるステップを含む、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを獲得するステップであって、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーが、上記細胞以外の細胞由来のＤＣＶＲまたはＧＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ；
ｄ）第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび第２のｄｓ  ｃＤＮＡを増幅して、
上記細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ；および
上記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む複数個のＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生することを可能にする条件下で、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバーを維持するステップ；
ｅ）ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＧＣストランド）の、ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡのストランド（ＤＣストランド）への共有結合性連結、例えば、ライゲーションを含み、ＧＣストランドおよびＤＣストランドがどちらもセンス鎖またはアンチセンス鎖である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーを獲得するステップ；ならびに
ｆ）共有結合性に連結された、例えば、ライゲーションされた、ＧＣおよびＤＣストランドを増幅するステップ
を含む、方法。
２８６．複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含み、かつＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしており、項２０１〜２８５のいずれかに記載の方法により作製される、ステップ
を含み、複数個の固有核酸配列のそれぞれが、異なる固有の細胞由来のＧＣエレメントおよびＤＣエレメントを含み、それにより、複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する、方法。
２８７．複数個の固有メンバーが、少なくとも２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、または２０９個の固有メンバーを含む、項８６に記載の方法。
２８８．複数個の固有メンバーが、２０４〜２０９個、２０４〜２０８個、２０４〜２０７個、２０４〜２０６個、２０４〜２０５個、２０８〜２０９個、２０７〜２０９個、２０６〜２０９個、２０５〜２０９個、２０５〜２０８個、２０６〜２０７個、２０４〜２０５個、２０５〜２０６個、２０６〜２０７個、２０７〜２０８個、または２０８〜２０９個の固有メンバーを含む、項２８６または２８７に記載の方法。
２８９．ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または２００％が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、項２８６〜２８８のいずれかに記載の方法。
２９０．ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、２５％未満、２０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、項２８６〜２８９のいずれかに記載の方法。
２９１．複数個の固有メンバーを含むライブラリーであって、
ｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、ＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含み、各固有メンバーにおけるＧＣエレメントおよびＤＣエレメントがマッチしている；
ｉｉ）複数個の固有メンバーのそれぞれが、異なる固有細胞由来の、ＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳをコードするセグメント、およびＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳをコードするセグメントを含む；および
ｉｉｉ）ライブラリーが、以下：
ａ）ライブラリーが、項２０１〜２８５のいずれかに記載の方法により作製される；
ｂ）複数個の固有メンバーが、少なくとも２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、もしくは２０９個の固有核酸配列を含む；
ｃ）複数個の固有メンバーが、２０４〜２０９個、２０４〜２０８個、２０４〜２０７個、２０４〜２０６個、２０４〜２０５個、２０８〜２０９個、２０７〜２０９個、２０６〜２０９個、２０５〜２０９個、２０５〜２０８個、２０６〜２０７個、２０４〜２０５個、２０５〜２０６個、２０６〜２０７個、２０７〜２０８個、もしくは２０８〜２０９個の固有メンバーを含む；
ｄ）ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは２００％が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである；または
ｅ）ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、２５％未満、２０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、（マッチしたＧＣエレメント配列およびＤＣエレメント配列をコードする）固有メンバーである、
の性質の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全部）を含む、
ライブラリー。
２９２．複数個の固有メンバーのそれぞれが、発現した時、ＧＣエレメント、例えば、ＧＣＶＲＳ、およびＤＣエレメント、例えば、ＤＣＶＲＳが、機能性抗原結合分子、例えば、単鎖ＴＣＲを形成するように、構成される、項２９１に記載のライブラリー。
２９３．ライブラリーがディスプレイライブラリーである、項２９１〜２９２のいずれかに記載のライブラリー。
２９４．複数個のメンバーのそれぞれが、ディスプレイ実体の表面上でのメンバーのディスプレイを生じるポリペプチドをさらにコードする、項２９１〜２９３のいずれかに記載のライブラリー。
２９５．ライブラリーがファージディスプレイライブラリーである、項２９１〜２９４のいずれかに記載のライブラリー。
２９６．ライブラリーが酵母ディスプレイライブラリーである、項２９１〜２９４のいずれかに記載のライブラリー。
２９７．ライブラリーが哺乳動物ディスプレイライブラリーである、項２９１〜２９４のいずれかに記載のライブラリー。
２９８．ａ）項２９１〜２９７のいずれかに記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
２９９．ポリペプチドを抗原に接触させるステップをさらに含む、項２９８に記載の方法。
３００．抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、項２９８または２９９に記載の方法。
３０１．項１〜８５、１０１〜１８５、または２０１〜２８５のいずれかに記載された隔離された産生反応部位である、隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー。
３０２．上記細胞以外の細胞由来の（ｉ）ＨＣＶＲもしくはＬＣＶＲ、（ｉｉ）ＡＣＶＲもしくはＢＣＶＲ、または（ｉｉｉ）ＧＣＶＲもしくはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、項３０１に記載の隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー。
３０３．以下：
（ｉ）（ａ）ＨＣおよびＬＣ、（ｂ）α鎖およびβ鎖、または（ｃ）γ鎖およびδ鎖のＶ遺伝子配列に特異的な１つまたは複数のプライマー；
（ｉｉ）（ａ）ＨＣ  ｃＤＮＡおよびＬＣ  ｃＤＮＡ、（ｂ）α鎖ｃＤＮＡおよびβ鎖ｃＤＮＡ、または（ｃ）γ鎖ｃＤＮＡおよびδ鎖ｃＤＮＡ上に導入されたオーバーハングに特異的な１つまたは複数のプライマー；
（ｉｉｉ）第１のメンバー、第２のメンバー、および第１のメンバーと第２のメンバーの間に位置する、ヌクレオチド修飾（例えば、スペーサー）を含む、１つまたは複数のプライマーであって、第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマーの第２のメンバーとアニールする能力、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む、（分子内ハイブリダイゼーションによる）ヘアピン構造または（分子間ハイブリダイゼーションによる）二本鎖構造を形成する能力がある、プライマー
の１つ、２つ、または全部を含む、項３０１または３０２に記載の隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー。
３０４．核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含まない、項３０１〜３０３のいずれかに記載の隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー。
３０５．核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む、項３０１〜３０３のいずれかに記載の隔離された産生反応部位、例えば、産生マイクロチャンバー。
３０６．第１のメンバー、第２のメンバー、および第１のメンバーと第２のメンバーの間に位置する、ヌクレオチド修飾（例えば、スペーサー）を含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの第２のメンバーとアニールする能力、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む、（分子内ハイブリダイゼーションによる）ヘアピン構造または（分子間ハイブリダイゼーションによる）二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチド。
３０７．第１および第２のメンバーが、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成する能力がある、項３０６に記載のオリゴヌクレオチド。
３０８．第１のメンバーが、５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である、項３０６または３０７に記載のオリゴヌクレオチド。
３０９．第２のメンバーが、５〜４０ヌクレオチド長、例えば、５〜１０ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、３０〜４０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１５〜２５ヌクレオチド長である、項３０６〜３０８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
３１０．スペーサーが可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである、項３０６〜３０９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
３１１．第１のメンバーが、捕捉支持体に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を含む、項３０６〜３１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
３１２．第２のメンバーが、（例えば、５’から３’へ）以下：（ｉ）第１のメンバーの少なくとも一部分に相補的である配列；（ｉｉ）（例えば、ＰＣＲ増幅または次世代シーケンシングのための）ユニバーサルプライミング配列；ならびに（ｉｉｉ）標的配列、例えば、ＧＣＶＲＳおよび／またはＤＣＶＲＳに相補的な配列
の１つ、２つ、または全部を含み、必要に応じて、第２のメンバーが（例えば、酵母または哺乳動物細胞における）相同組換えのための配列を含む、項３０６〜３１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
３１３．項５１〜８３、８５、１５１〜１８３、１８５、２５１〜２８３、または２８５のいずれかに記載された隔離された連結反応部位である、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバー。
３１４．上記細胞以外の細胞由来の（ｉ）ＨＣＶＲもしくはＬＣＶＲ、（ｉｉ）ＡＣＶＲもしくはＢＣＶＲ、または（ｉｉｉ）ＧＣＶＲもしくはＤＣＶＲをコードする核酸を含まない、項３１３に記載の隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバー。
３１５．（ｉ）ＨＣストランドとＬＣストランド、（ｉｉ）ＡＣストランドとＢＣストランド、または（ｉｉｉ）ＧＣストランドとＤＣストランドの接合部を含む配列またはその相補的配列にハイブリダイズして、ライゲーションの部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチドを含む、項３１３または３１４に記載の隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバー。
３１６．核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む、項３１３〜３１５のいずれかに記載の隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバー。
３１７．例えば連結ステップにおいて、オーバーラップ伸長によるスプライシングまたはオーバーハング伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲとしても公知のオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８８年；１６巻（１５号）：７３５１〜６７頁）のステップを含まない、項１〜３００のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０５５３】
（実施例１）
滴中での付着末端ＰＣＲ−ライゲーション
Ｂ細胞を液滴中にカプセル化した。Ｂ細胞を液滴中にカプセル化し、液滴の体積は１０ｐＬ〜１００ｎＬ、典型的には約１００〜１０００ｐＬの範囲であった。Ｂ細胞の供給源には、例えば、マウス、ヒト、ラット、ウサギ、またはニワトリが含まれていてよい。担体（油）相は、約１％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ  ＨＦＥ−７５００から構成されていた。液滴を、マイクロ流体チップ（例えばＤｏｌｏｍｉｔｅ製２Ｒ  １００μｍ）により、シリンジまたは圧力ポンプによりコントロールされた流体相の流れで形成させた。液滴の水相は、緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）、細胞溶解を助けるための洗剤、ならびに重鎖および軽鎖ｍＲＮＡにアニールするためのオリゴヌクレオチド（プライマー）を含む磁気ビーズから構成されていた。滴の占有は、液滴当たり１個以下の細胞、かつ液滴当たり少なくとも１個のビーズであるべきである。
【０５５４】
細胞溶解を容易とするため、液滴をインキュベートした。特定の洗剤（例えばＴｗｅｅｎ２０）の存在下での溶解効率を改善するため、エマルジョンを加熱した。例えば、エマルジョンを４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、または８０℃の温度までおよそ５〜６０分間加熱することができる。細胞が溶解された後、ｍＲＮＡが放出され、ビーズ上のオリゴヌクレオチドにアニールすることによりビーズに捕捉された。
【０５５５】
エマルジョンを破壊し、ビーズを回収した。ＰＦＯ（パーフルオロオクタノール）などの滴不安定化試薬を使用してエマルジョン（または合一した異なる溶液相）を破壊した。ビーズを含む水相を回収した。磁石を使用してビーズを単離した。ビーズを緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）で洗浄し、再懸濁した。
【０５５６】
逆転写（ＲＴ）を実施して、（非エマルジョン反応において）ｃＤＮＡ−ビーズを生じさせた。ＲＴ（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）を容易とするため、緩衝液−酵素混合物でビーズを再懸濁した。ＲＴを容易とするため、反応を４０℃で１５分間インキュベートした。ビーズを緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。
【０５５７】
回収されたビーズを、ＰＣＲ−ライゲーション反応のためにカプセル化することができる。体積約５ｐＬ〜５００ｐＬ、最も一般的には約１０〜５０ｐＬの範囲の液滴を使用することができる。担体（油）相は、約２％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３Ｍ  ＨＦＥ−７５００から構成されていてよい。滴を、ｃＤＮＡを有するビーズ；ＰＣＲ試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む）；ＶＨおよびＶＬ配列の増幅を可能にするオリゴヌクレオチド；熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）熱安定性ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｃ  ＤＮＡリガーゼ、Ｒｍａ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡリガーゼ、またはＴｔｈ  ＤＮＡリガーゼ）；および最適化された緩衝液条件（ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼの酵素活性両方を支持するのに適合していること）とともにカプセル化することができる。
【０５５８】
チューブで試験されたように、ｓｃＦｖカセットをＶＬ−リンカー−ＶＨとして構築した。順序は、機能にも性能にも顕著な影響を与えることなく入れ替えることができる（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）。ＶＬ配列のリバースプライマーは、リンカー配列をコードし、修飾型ヌクレオチドを少なくとも１つ（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）有するオーバーハング配列を含みうる。ＶＬリバースプライマーは、５’−ホスフェート（リガーゼの基質となるのに必要）も含みうる。ＶＨ配列のフォワードプライマーは、リンカー配列をコードし、修飾型ヌクレオチドを少なくとも１つ（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を有する３個の連続したヌクレオチド）有するオーバーハング配列を含みうる。ＶＨフォワードプライマーは、５’−ホスフェート（リガーゼの基質となるのに必要）も含みうる。滴の占有は、滴当たり１個以下のビーズであるべきである。
【０５５９】
エマルジョンを用いて熱サイクリングを実施することができる。作出されたエマルジョンをＰＣＲチューブに移すことができる。以下の条件を使用して熱サイクリングを実施することができる：最初の変性を９５〜９８℃で３０秒〜２分間；変性を９５〜９８℃で１０〜３０秒間、プライマーアニーリングを５０〜６０℃で１０〜３０秒間、ポリメラーゼ伸長を７２℃で３０秒間、ならびに付着性産物アニーリングおよびライゲーションを４５〜５５℃で３分間、を１０〜３０サイクル。反応は４℃で維持されうる。
【０５６０】
エマルジョンを破壊し、連結された（および連結されていない）産物を含む部分を回収した。ＰＦＯ（パーフルオロオクタノール）などの滴不安定化試薬を使用してエマルジョンを破壊することができる。水相を回収し、ビーズを捨てることができる。
【０５６１】
チューブで試験されたように、連結された産物（天然で連結されるＶＬ−リンカー−ＶＨを表す）を、連結されていないＶＨおよびＶＬ産物から精製した。サイズ分離により、ライゲーションされた産物を、ライゲーションされていない産物から分離した。例えば、変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）または変性ＨＰＬＣ−ＳＥＣを使用することができる。連結産物（約８００〜９００ｂｐ）を、非連結産物（約３５０〜５００ｂｐ）から単離した。変性ＰＡＧＥ精製では、ライゲーションされたバンドをゲルから切り出し、電気溶出を実施してゲルスライスからＤＮＡを抽出した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｅｌｕｔｏｒ）。
【０５６２】
精製された連結産物をＰＣＲにより増幅することができる。修飾型ヌクレオチドを含むＤＮＡを適度に読み通すことができるポリメラーゼ／条件、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを使用することができる。
【０５６３】
最終ＰＣＲ産物を、標準的な方法（例えば、発現ベクターを用いてのエレクトロポレーション）を使用して酵母に導入し、生物学的供給源に由来する天然で対形成するライブラリーを生じさせることができる。
【０５６４】
（実施例２）
リガーゼサイクリング手法
Ｂ細胞を液滴中にカプセル化した。Ｂ細胞を液滴中にカプセル化し、液滴の体積は１０ｐＬ〜１００ｎＬ、典型的には約１００〜１０００ｐＬの範囲であった。Ｂ細胞の供給源には、例えば、マウス、ヒト、ラット、ウサギ、またはニワトリが含まれていてよい。担体（油）相は、約１％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する３Ｍ  ＨＦＥ−７５００から構成されていた。液滴を、マイクロ流体チップ（例えば、Ｄｏｌｏｍｉｔｅの２Ｒ  １００μｍ）により、シリンジまたは圧力ポンプによりコントロールされた流体相の流れで形成させた。液滴の水相は、緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）、細胞溶解を助けるための洗剤、ならびに重鎖および軽鎖ｍＲＮＡにアニールするためのオリゴヌクレオチド（プライマー）を含む磁気ビーズから構成されていた。滴の占有は、液滴当たり１個以下の細胞、かつ液滴当たり少なくとも１個のビーズであるべきである。
【０５６５】
細胞溶解を容易とするため、液滴をインキュベートした。特定の洗剤（例えばＴｗｅｅｎ２０）の存在下での溶解効率を改善するため、エマルジョンを加熱した。例えば、エマルジョンを４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、または８０℃の温度までおよそ５〜６０分間加熱することができる。細胞が溶解された後、ｍＲＮＡが放出され、ビーズ上のオリゴヌクレオチドにアニールすることによりビーズに捕捉された。
【０５６６】
エマルジョンを破壊し、ビーズを回収した。ＰＦＯ（パーフルオロオクタノール）などの滴不安定化試薬を使用してエマルジョン（または合一した異なる溶液相）を破壊した。ビーズを含む水相を回収した。磁石を使用してビーズを単離した。ビーズを緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）で洗浄し、再懸濁した。
【０５６７】
逆転写（ＲＴ）を実施して、（非エマルジョン反応において）ｃＤＮＡ−ビーズを生じさせることができる。ＲＴ（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）を容易とするため、緩衝液−酵素混合物でビーズを再懸濁することができる。ＲＴを容易とするため、反応を４０℃で１５分間インキュベートすることができる。ビーズを緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）で１回洗浄することができる。
【０５６８】
回収されたビーズを、ＰＣＲ反応のためにカプセル化することができる。体積約５ｐＬ〜５００ｐＬ、最も一般的には約１０〜５０ｐＬの範囲の液滴を使用することができる。担体（油）相は、約２％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３Ｍ  ＨＦＥ−７５００から構成されていてよい。滴は、ｃＤＮＡを含むビーズ（一部のビーズは「空」であってよく、これは問題ではない）；ＰＣＲ試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む）；ＶＨおよびＶＬ配列の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドとともにカプセル化されうる。
【０５６９】
ｓｃＦｖカセットをＶＬ−リンカー−ＶＨとして構築することができる。順序は、機能にも性能にも顕著な影響を与えることなく入れ替えることができる（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）。ＶＬリバースおよびＶＨフォワードプライマーは、リンカーをコードするオーバーハング配列を含みうる。ＶＨリバースプライマーは、５’−ホスフェートを有しうる。滴の占有は、滴当たり１個以下のビーズであるべきである。
【０５７０】
エマルジョンを用いて熱サイクリングを実施することができる。作出されたエマルジョンをＰＣＲチューブに移すことができる。標準的なＰＣＲ条件を使用して熱サイクリングを実施することができる：最初の変性を９５〜９８℃で３０秒〜２分間；変性を９５〜９８℃で１０〜３０秒間、プライマーアニーリングを５０〜６０℃で１０〜３０秒間、ポリメラーゼ伸長を７２℃で３０秒間、を１０〜３０サイクル。反応は４℃で維持されうる。
【０５７１】
エマルジョンを破壊し、ビーズを回収することができる。ＰＦＯ（パーフルオロオクタノール）などの滴不安定化試薬を使用してエマルジョン（または合一した異なる溶液相）を破壊することができる。ビーズを含む水相を回収することができる。磁石を使用してビーズを単離することができる。ビーズを洗浄して、ビーズに捕捉されなかったＰＣＲ産物を除去することができる。ビーズを緩衝液（例えばトリス、ｐＨ７．５）で再懸濁することができる。
【０５７２】
回収されたビーズを、リガーゼサイクリング反応のためにカプセル化することができる。体積約５ｐＬ〜５００ｐＬ、最も一般的には約１０〜５０ｐＬの範囲の液滴を使用することができる。担体（油）相は、約２％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３Ｍ  ＨＦＥ−７５００から構成されていてよい。滴は、「トップ」ＶＬストランドの３’末端および「トップ」ＶＨストランドの５’末端に相補的であり、これらにアニールするスティント（ｓｔｉｎｔ）オリゴヌクレオチド；熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）熱安定性ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｃ  ＤＮＡリガーゼ、Ｒｍａ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡリガーゼ、またはＴｔｈ  ＤＮＡリガーゼ）；リガーゼ酵素活性を支持するのに必要な反応構成要素（例えばＮＡＤ）とともにカプセル化されうる。占有は、滴当たり１個以下のビーズであるべきである。
【０５７３】
エマルジョンを用いて熱サイクリングを実施することができる。作出されたエマルジョンをＰＣＲチューブに移すことができる。標準的な条件を使用して熱サイクリングを実施することができる：変性：９０〜９５℃で３０秒間、アニーリングおよびライゲーションを５０〜６０℃で１〜３分間、を３〜１５サイクル。反応は４℃で維持されうる。
【０５７４】
エマルジョンを破壊し、連結産物を含む水性部分を回収することができる。ＰＦＯ（パーフルオロオクタノール）などの滴不安定化試薬を使用してエマルジョン（または合一した異なる溶液相）を破壊することができる。水相を回収し、ビーズを捨てることができる。
【０５７５】
精製された連結産物をＰＣＲにより増幅することができる。連結されたＶＬ−リンカー−ＶＨのライゲーションされた断片の外側末端をアニールするオリゴヌクレオチドを用いて標準的な条件を使用することができる。
【０５７６】
最終ＰＣＲ産物を酵母に導入し、生物学的供給源に由来する天然で対形成するライブラリーを生じさせることができる。
【０５７７】
（実施例３）
リガーゼサイクリング反応
この実施例では、ＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物を、熱安定性リガーゼおよびスプリントオリゴを使用して共有結合性に連結させた。
【０５７８】
ハイブリドーマクローン（ＡＴＣＣ、ＨＢ−１１２、「４Ｇ２」）由来のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および製造業者が推奨する条件に従って単離されたＲＮＡを使用してｃＤＮＡを作出した。使用されたプライマーは、重鎖および軽鎖の定常領域を対象としていた：マウスＩｇＧ＿ＣＨ１＿ｒｅｖ（５’−ＣＨＧＡＴＧＧＧＧＳＴＧＴＹＧＴＴＫＴＲＧＣ（配列番号１））およびマウスカッパ＿Ｒｅｖ（５’−ＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号２））。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード、例えば、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｓ＝ＧまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴにより定義される。
【表１】
2020511117.tif 000002
【０５７９】
構成要素を混合し、６５℃まで５分間加熱し、次いで氷上で少なくとも１分間インキュベートした。次いで以下の構成要素を添加した：
【表２】
2020511117.tif 000003
【０５８０】
構成要素を混合し、次いで５５℃で１０分間インキュベートした。次いで８０℃で１０分間インキュベートすることにより反応を不活性化した。ｃＤＮＡ産物をＰＣＲのための鋳型として使用し、ＶＨおよびＶＬ産物を別々に作出した。使用されたプライマーは以下を含んでいた：
４Ｇ２  ＶＬ＿Ｆｗｄ
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号３）
マウスカッパ＿Ｒｅｖ−Ｐｈｏｓ
５’−／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）
４Ｇ２  ＶＨ＿Ｆｗｄ−Ｐｈｏｓ
５’−／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ（配列番号５）
マウスＩｇＧ＿ＣＨ１＿ｒｅｖ
５’−ＣＨＧＡＴＧＧＧＧＳＴＧＴＹＧＴＴＫＴＲＧＣ（配列番号１）
ＰＣＲ反応はそれぞれ以下を含んでいた：
【表３】
2020511117.tif 000004
次いで熱サイクリングを以下の通り実施した：
【表４】
2020511117.tif 000005
【０５８１】
ＡＭＰｕｒｅビーズを使用してＰＣＲ産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物をＮａｎｏｄｒｏｐにより定量化した。リガーゼサイクリング反応を、ＶＨ産物、ＶＬ産物、およびスプリントオリゴのモル比１：１：１を達成するように、２５μｌ反応において設定した。使用されたスプリントオリゴは以下の配列を有していた：
５’−ＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＴＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧ／３ＡｍＭＯ／（配列番号６）。
各リガーゼサイクリング反応は以下を含んでいた：
【表５】
2020511117.tif 000006
【０５８２】
リガーゼサイクリング反応を変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により解析した。Ｔａｑリガーゼに加えて、さらなる熱安定性リガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（Ａｍｐ）、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を評価した。
【０５８３】
図３に示すように、ＴａｑリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定性リガーゼを使用すると、ＶＨおよびＶＬ産物の効率的な連結が観察された。
【０５８４】
（実施例４）
連結産物のバルク再増幅中の天然の対形成の保持
エマルジョンＯＥ−ＰＣＲワークフローにより、オーバーラップ伸長によるスプライシングを容易とするための配列を必ず共有するＶＨおよびＶＬ産物が生じる。このようなワークフローでは、滴中ではともにスプライシングされない保持されたあらゆるＶＨ／ＶＬ産物が、産物のバルク（非エマルジョン）ＰＣＲ増幅中にスプライシングされうる。全ての細胞産物（例えば、多くのクローン／固有の配列）が混合されているとこのようなスプライシングがバルク相中に発生するため、ランダムな（非天然の）対形成が発生する可能性があった（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１３年；４３巻（９号）：２５０７〜１５頁を参照のこと）。このワークフローは、これの発生を低下させるだけでなく完全に防止するストラテジーから恩恵を受けることとなる。ＶＨおよびＶＬ産物が任意の共通の配列を共有しない方法が本明細書に記載されており、ゆえにこのワークフローは、バルク再増幅ステップ中にＯＥ−ＰＣＲによる偶発的なスプライシングに感受性ではない。
【０５８５】
これを実証するため、連結されたＶＨ−ＶＬ産物を互いにサイズが異なる２つのハイブリドーマクローンから作出した。ゆえに天然の対形成  対  非天然の対形成について、産物のサイズにより評価することができた。ハイブリドーマ４Ｇ２由来のＶＨおよびＶＬ産物は実施例３に記載されているように作出した。ハイブリドーマ９Ｅ１０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７２９）「ミニ」ＶＨおよびＶＬ産物は、同じＲＴプライマーおよび以下のＰＣＲプライマーを使用して同様に産生した：
９Ｅ１０ミニ＿ＶＬ＿Ｆｗｄ
５’−ＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号７）
マウスカッパ＿Ｒｅｖ−Ｐｈｏｓ
５’−／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）
９Ｅ１０＿ＶＨ＿Ｆｗｄ
５’−／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧ（配列番号８）
９Ｅ１０ミニ＿ＶＨ＿Ｒｅｖ
５’−ＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＡＣＧＡＣＴＡＣＣＡＡＴＧ（配列番号９）
【０５８６】
産生された４Ｇ２  ＶＨおよびＶＬ産物は、それぞれ４００ｂｐおよび３７８ｂｐのサイズであった。産生されたミニ９Ｅ１０  ＶＨおよびＶＬ産物は、それぞれ２０３ｂｐおよび１６８ｂｐのサイズであった。ＡＭＰｕｒｅビーズを使用してＰＣＲ産物を精製した。
【０５８７】
次いで産物に、実施例３に記載されているように、２０サイクルの熱サイクリングを使用してリガーゼサイクリング反応を行った。４Ｇ２および９Ｅ１０  ＶＨ−ＶＬ産物を、液滴中で（個々のコンパートメント中で）天然で連結される産物の作出をシミュレートした別々のチューブにおいてライゲーションした。産物を変性ＰＡＧＥにより解析した。４Ｇ２  ＶＨ−ＶＬおよび９Ｅ１０  ＶＨ−ＶＬの天然で連結される産物は、それぞれ７７８ｂｐおよび３７１ｂｐのサイズに相当した。２０サイクルのリガーゼサイクリングを使用して、ライゲーションされた両産物ならびにライゲーションされていないＶＨおよびＶＬ  ＤＮＡを含む産物を生じさせた。図４Ａに示すように、天然で連結されるＶＨ−ＶＬ産物が６Ｇ２および９Ｅ１０の両方について作出された。
【０５８８】
ライゲーション産物をＡＭＰｕｒｅビーズにより精製し、次いで合わせて、連結産物のＰＣＲ再増幅のための鋳型として使用した。このステップは、滴中でＶＨ−ＶＬの連結を実施した後の産物回収、その後の連結されたＶＨ−ＶＬのＰＣＲ再増幅をシミュレートしていた。これにより、ＰＣＲにおける鋳型として、ライゲーションされていないＶＨおよびＶＬ  ＤＮＡを有することで、ＰＣＲによるバルク再増幅中にＤＮＡが一緒に連結される機会がもたらされた。ＤＮＡが個々のクローンごとに区画化されていなかったため、バルク相において発生した任意の連結により非天然の対形成がもたらされる。
ＰＣＲ再増幅を下記の通り実施した。連結産物を増幅するために使用された「外側」プライマーは以下の通りである：
９Ｅ１０ミニ＿ＶＬ＿Ｆｗｄ
５’−ＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号７）
４Ｇ２  ＶＬ＿Ｆｗｄ
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号３）
９Ｅ１０ミニ＿ＶＨ＿Ｒｅｖ
５’−ＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＡＣＧＡＣＴＡＣＣＡＡＴＧ（配列番号９）
マウスＩｇＧ＿ＣＨ１＿ｒｅｖ
５’−ＣＨＧＡＴＧＧＧＧＳＴＧＴＹＧＴＴＫＴＲＧＣ（配列番号１）
ＰＣＲ反応はそれぞれ以下を含んでいた：
【表６】
2020511117.tif 000007
次いで熱サイクリングを以下の通り実施した：
【表７】
2020511117.tif 000008
【０５８９】
最後に、アガロースゲル電気泳動により産物を解析した。非天然で連結される産物はその中間体サイズにより容易に同定可能であった。特に、４Ｇ２−ＶＬ／９Ｅ１０−ミニ−ＶＨおよび９Ｅ１０−ミニ−ＶＬ／４Ｇ２  ＶＨの連結された産物は、それぞれ５８１ｂｐおよび５６８ｂｐのサイズに相当する。図４Ｂに示すように、バルク再増幅中に混合したときに天然の対形成の保持が観察された（レーン５）。
【０５９０】
（実施例５）
ＰＣＲ産物のビーズへの捕捉を容易とするためのオリゴデザイン
液滴中でのＲＴ−ＰＣＲ（例えば上記のような）後に、ＰＣＲ産物を滴内でビーズに捕捉させ、ＶＨおよびＶＬ産物の天然のマッチングを保持することができる。ｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物のビーズへの効率的な捕捉を容易とするため、定義されたｓｓＤＮＡを末端に有する産物を作出するストラテジーを考案した。このｓｓＤＮＡの配列は、ビーズにコンジュゲートしたオリゴの配列に相補的である。したがって、これらの配列の相補性により、ｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物の特異的かつ効率的な捕捉が容易となる。
【０５９１】
４Ｇ２  ｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を、以下のプライマーおよびＱ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを使用して産生した。リバースプライマーは、ビーズでのＰＣＲ産物の特異的な検出を容易とするための５’−ビオチン部分を含む。ＰＣＲストラテジーは以下の通りであった：
【表８】
2020511117.tif 000009
【０５９２】
以下のプライマーを使用した：
４Ｇ２  ＶＬ  Ｆｗｄ  ＋ＰＥＧ
５’−ＴＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＧＣ／ｉＳｐ１８／ＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１０）
４Ｇ２  ＶＬ  Ｆｗｄ  −ＰＥＧ
５’−  ＴＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＧＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１１）
４Ｇ２  ＶＬ  Ｆｗｄ  Ｎｏ＿５’
５’−ＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１２）
Ｍｕｓ  Ｋａｐ  Ｒｅｖビオチン
５’−／５ビオチンＴＥＧ／ＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号１３）
Ｍｕｓ  ＩｇＧ−ＨＣ  Ｒｅｖ  ＋ＰＥＧ
５’−ＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣ／ｉＳｐ１８／ＣＧＴＧＡＣＡＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＨＧＡＴＧＧＧＧＳＴＧＴＹＧＴＴＫＴＲＧＣ（配列番号１４）
４Ｇ２  ＶＨ  Ｆｗｄビオチン
５’−／５ビオチンＴＥＧ／ＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ（配列番号１５）
【０５９３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析し、ＡＭＰｕｒｅビーズにより精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより定量化した。
【０５９４】
アミン標識された捕捉オリゴを、標準的な方法を使用してカルボキシル化ビーズ（ＣＯＭＰＥＬ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にコンジュゲートさせた。上記のＰＣＲプライマーにおけるＰＥＧスペーサーの５’側の配列に相補的な配列を有する以下のオリゴを、ビーズへのコンジュゲーションに使用した。ビーズをＶＬオリゴのみ、ＶＨオリゴのみ、または両オリゴにコンジュゲートさせた。
ＶＬ捕捉
５’−ＧＣＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１６）
ＶＨ捕捉
５’−ＧＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１７）
【０５９５】
ＰＣＲ産物を捕捉するため、以下の反応を設定した。精製されたＰＣＲ産物を０．５×ＳＳＣ緩衝液で希釈し、最終体積２５μｌ中ＤＮＡ２５０ｎｇを達成した。オリゴとコンジュゲートしたビーズを０．５×ＳＳＣで洗浄し、次いでビーズ４００，０００個を希釈された各ＰＣＲ産物と混合した。ビーズ−ＰＣＲ産物混合物をピペットにより混合してビーズを懸濁し、次いでチューブをサーモサイクラーに入れて以下のプログラムを実行した：
【表９】
2020511117.tif 000010
試料は以下の通りであった：
【表１０】
2020511117.tif 000011
【０５９６】
温度インキュベーション後、試料を磁石に当ててチューブ側面にビーズを収集した。上清を除去し、ビーズを０．５×ＳＳＣ緩衝液で洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０００に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７  ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）５０μｌを用いて、捕捉されたＰＣＲ産物について各試料をプローブした。室温で２５分間混合しながらインキュベートした後、チューブを磁石に当て、上清を除去し、ビーズをＰＢＳ緩衝液で洗浄した。ビーズをＰＢＳ５０μｌに再懸濁し、次いでフローサイトメトリーにより解析した。
【０５９７】
図５Ａ〜５Ｂに示すように、結果から、ＰＣＲプライマーにおけるＰＥＧスペーサー、およびビーズにコンジュゲートした適切な相補的オリゴ（例えば試料（１）のように）についての要件を用いるこの方法による、効率的かつ特異的なＰＣＲ産物捕捉が裏付けられる。
【０５９８】
（実施例６）
リガーゼサイクリングによる、滴中での、天然で対形成するＶＨ−ＶＬ産物の作出
この実施例では、抗体４Ｇ２のＶＨおよびＶＬ配列を発現する細胞を溶解させ、溶解物由来のｍＲＮＡを使用して、リガーゼサイクリングにより天然で対形成するＶＨ−ＶＬ産物を作出した。
細胞溶解緩衝液を以下の通り調製した：
２０％Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００  ３００μｌ
２０％サルコシル  １０μｌ
５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ４０μｌ
２ＭトリスｐＨ７．５  １００μｌ
水  ３５０μｌ
１００％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ  ２００μｌ
カルボキシル化ＣＯＭＰＥＬ磁気ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ）を、以下のアミン修飾型オリゴとコンジュゲートさせた：
ＶＬ捕捉
５’−ＧＣＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１６）
ＶＨ捕捉
５’−ＧＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１７）
Ｍｕｓ＿ＩｇＧ＿ＣＨ１＿ｍＲＮＡ捕捉
５’−ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＫＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１８）
Ｍｕｓ＿Ｋａｐ＿ｍＲＮＡ捕捉
５’−ＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１９）
【０５９９】
ｍＲＮＡ捕捉（例えば、ＶＨおよび／またはＶＬをコードするｍＲＮＡの捕捉）にオリゴ（ｄＴ）も使用可能である。
【０６００】
使用される滴サイズで滴当たり約２．５個のビーズのカプセル化を容易とする密度２×１０７ビーズ／ｍｌで、ビーズを溶解緩衝液に懸濁した。
【０６０１】
４Ｇ２マウスハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび２４％Ｏｐｔｉｐｒｅｐを含むＰＢＳで密度２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。この密度により、滴２つ当たりおよそ１個の細胞での滴へのカプセル化が容易となる。滴に細胞およびビーズをともにカプセル化するため、２試薬１００μｍ直径親フッ素性マイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を、３つのＭｉｔｏｓ  Ｐ−Ｐｕｍｐ圧力ポンプ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）によりコントロールされた溶液の流れで使用した。マイクロ流体チップは、水溶液用の２つのインプットチャネル、およびフルオロカーボン油用の２つのインプットチャネルを含んでいた。細胞およびビーズをそれぞれ速度１０μｌ／分で流動させ、フッ素化油（１％  フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＨＦＥ−７５００）を５５μｌ／分で流動させた。これらの流量により、体積およそ５００ｐｌの液滴が生じた。エマルジョンを１時間収集した。
【０６０２】
ビーズへのｍＲＮＡ捕捉を容易とするため、エマルジョン（細胞および細胞なし対照）を４５℃のヒートブロックに２０分間適用した。次いでエマルジョンおよびビーズを、ビーズからのｍＲＮＡの解離を低下させるため４℃で維持し取り扱った。過剰量の油をシリンジにより除去し、ＲＮＡｓｅ阻害剤（１：１００）を含む氷冷６×ＳＳＣ緩衝液５ｍｌをエマルジョンに添加した。滴の合一を誘導するため、ＰＦＯ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノール）をエマルジョンに添加した（１００μＬ）。反転によって試料を完全に混合し、その後５００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。水相をピペットにより混合し、収集し、次いで新たなチューブに移した。チューブを磁石に当てた後、ＲＮａｓｅ阻害剤（１：１００）を含む氷冷緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）５００μｌで、ビーズ（ハイブリダイズしたｍＲＮＡを有する）を２回洗浄した。次いで、ＲＮａｓｅ阻害剤（１：１００）を含む氷冷緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）５００μｌでビーズを懸濁した。
【０６０３】
第２のエマルジョンをｍＲＮＡビーズおよびＲＴ−ＰＣＲ混合物で調製した。ＲＴ−ＰＣＲビーズ緩衝液（２×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（ＯｎｅＴａｑ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＥＢ）１００μｌ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ７０μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤４μｌ、予め混合された２５μＭプライマー６．４μｌ、および水３２μｌ）でｍＲＮＡビーズを懸濁した。使用されたプライマーは以下であった：
４Ｇ２  ＶＬ  Ｆｗｄ  ＋ＰＥＧ
５’−ＴＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＧＣ／ｉＳｐ１８／ＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１０）
Ｍｕｓ  ＩｇＧ−ＨＣ  Ｒｅｖ  ＋ＰＥＧ
５’−ＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣ／ｉＳｐ１８／ＣＧＴＧＡＣＡＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＨＧＡＴＧＧＧＧＳＴＧＴＹＧＴＴＫＴＲＧＣ（配列番号１４）
マウスカッパ＿Ｒｅｖ−Ｐｈｏｓ
５’−／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）
４Ｇ２  ＶＨ  Ｆｗｄ−Ｐｈｏｓ
５’−／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ（配列番号５）
【０６０４】
別に、酵素混合物を調製した（２×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液４００μｌ、ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液で１．３３倍に希釈した酵素４３μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤１６μｌ、および水３４１μｌ）。
【０６０５】
ビーズおよび酵素混合物をそれぞれ２．５μｌ／分および７．５μｌ／分で、ならびに油（２％  フッ素系界面活性剤を含むＨＦＥ７５００）を３５μｌ／分でともに流動させることにより、ＲＴ−ＰＣＲ用のエマルジョンを作出した。２試薬３０μｍ直径親フッ素性マイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を圧力ポンプとともに使用して液滴を作出した。これらの条件下で、体積およそ１５〜３５ｐｌの液滴を、滴５つ当たり１個未満のビーズのビーズ占有で形成させた。ビーズが全てカプセル化されるまで（約３０〜６０分間）滴を作出した。次いで、サーモサイクラーにおいて以下のプログラムで熱サイクリングするため、エマルジョンをＰＣＲチューブにアリコートに分けた：
【表１１】
2020511117.tif 000012
【０６０６】
熱サイクリングを行ったエマルジョンを１本のチューブに合わせた。過剰量の油を、シリンジを使用して底部から除去した。滴を破壊するためＰＦＯ１００μｌを添加し、その後混合して２０００×ｇで２分間遠心分離した。次いで水相をピペットにより混合し（ビーズを懸濁させるため）、新たなチューブに移した。ビーズは捕捉されたＰＣＲ産物を含んでいた。チューブを磁石に当て、上清を除去した。ビーズを氷冷０．５×ＳＳＣ緩衝液５００μｌで穏やかに洗浄した。ビーズを再度磁石に当て、上清を除去し、次いで氷冷０．５×ＳＳＣ緩衝液１００μｌで再懸濁した。
【０６０７】
次いで、ＶＨおよびＶＬ産物を共有結合性に連結させるためのリガーゼサイクリングエマルジョン用に試料を調製した。ビーズ溶液（１０×Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ緩衝液（ＮＥＢ）２０μｌ、６０％スクロース１１７μｌ、および水６３μｌ）でビーズを懸濁した。Ｔａｑリガーゼ混合物を調製した（１０×Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ緩衝液８０μｌ、Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ４２μｌ、スプリントオリゴ（０．１μＭ）１３μｌ、および水６６５μｌ）。使用されたスプリントオリゴは、
【０６０８】
５’−ＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＴＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧ／３ＡｍＭＯ／（配列番号６）であった。
【０６０９】
ビーズ溶液を２μｌ／分で、酵素混合物を６μｌ／分で、油（２％  フッ素系界面活性剤を含むＨＦＥ７５００）を３５μｌ／分で流動させることによりエマルジョンを作出した。２試薬３０μｍ直径親フッ素性マイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を圧力ポンプとともに使用して、液滴を作出した。これらの条件下で、体積およそ１５〜３５ｐｌの液滴を、滴５つ当たり１個未満のビーズのビーズ占有で形成させた。ビーズが全てカプセル化されるまで（約３０〜６０分間）滴を作出した。次いで、サーモサイクラーにおいて以下のプログラムを使用して熱サイクリングするため、エマルジョンをＰＣＲチューブにアリコートに分けた：
【表１２】
2020511117.tif 000013
【０６１０】
熱サイクリングを行ったエマルジョンを１本のチューブに合わせた。過剰量の油を、シリンジを使用して底部から除去した。滴を破壊するためＰＦＯ１００μｌを添加し、その後混合して２０００×ｇで２分間遠心分離した。次いで水相をピペットにより混合し（ビーズを懸濁させるため）、ＰＣＲチューブに移した（チューブ当たり５０μｌ）。次いで、ビーズにハイブリダイズしたライゲーションされたＰＣＲ産物の解離を容易とするため、試料を８０℃に予め加熱したサーモサイクラーにかけた。ビーズを沈殿させた後、上清を除去して新たなチューブに移した。次いでＡＭＰｕｒｅビーズを使用して産物を精製した。
【０６１１】
次いでライゲーションされた産物を、以下のプライマーを使用するＰＣＲによりチューブ内で再増幅させた：
４Ｇ２−ＶＬ−Ｆｗｄ−Ｒｅａｍｐ  ５’−ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号２３）
４Ｇ２−ＶＨ−Ｒｅｖ−Ｒｅａｍｐ  ５’−ＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡ（配列番号２４）
【表１３】
2020511117.tif 000014
熱サイクリングを以下の通り実施した：
【表１４】
2020511117.tif 000015
【０６１２】
アガロースゲル電気泳動により再増幅産物を解析した。図６に示すように、４Ｇ２細胞試料は連結されたＶＨ−ＶＬ  ＤＮＡの意図された産物を生じたが、陰性対照試料は産物を全く生じなかった。
【０６１３】
例えば天然で対形成するＶＬおよびＶＨをインタクトなオープンリーディングフレーム間の可撓性リンカー配列とともに含む最終ＰＣＲ産物を、酵母表面発現ベクターにクローニングし、標準的な方法を使用して酵母に形質転換させ、天然で対形成する酵母ディスプレイライブラリーを生じることができると考えられる。例えば、各末端にさらなる５０ｂｐをＰＣＲにより組み込むことができる。これらの５０ｂｐは酵母発現ベクターにおける適切な配列にマッチし、インサートＰＣＲ産物（例えば天然で連結されるＶＬ−ＶＨを含む）および直鎖状酵母発現ベクターの酵母の同時形質転換に続く、酵母における相同組換えによるクローニングを容易とする。
【０６１４】
（実施例７）
プライマーとのＰＣＲ産物捕捉の競合を防止するための自己アニーリング性プライマー
ビーズへのＰＣＲ産物捕捉は、ＰＥＧなどのスペーサーの組み込みによりＰＣＲ産物の末端に粘着末端（ｓｓＤＮＡ）を作出することによって容易となった。これらのｓｓＤＮＡ部分はビーズにコンジュゲートしたオリゴに対し配列相補性を有しており、それにより特異的なハイブリダイゼーションが容易となった。ＰＣＲ産物中のこれらの配列は、増幅プライマーに含めることで組み込まれた。ＰＣＲプライマーはＰＣＲ産物のｓｓＤＮＡ末端と同じ配列を有していたため、これらも特異的なハイブリダイゼーションによりビーズに捕捉されうる。このようなプライマー捕捉は必ずＰＣＲ産物捕捉と競合することとなる。
【０６１５】
ＰＣＲによる抗体レパートリーの増幅には、典型的には様々な抗体遺伝子配列を増幅するための数多くのＰＣＲプライマーが必要である。例えば、ヒトおよびマウスレパートリーのＶおよびＪ領域を認識するプライマーセットは、重鎖および軽鎖のＶ領域を対象とする約１５〜２０のプライマーから構成されることが多い。数多くのプライマーが必要であることから、ビーズへのＰＣＲ産物の捕捉に対するプライマーの競合効果を悪化させる状況がもたらされる。マルチプレックスＰＣＲシナリオでは、所与の滴（コンパートメント）においては、単一のプライマー（または限られた数）が、滴中で標的抗体配列に対し相補性を有しうる。残りのレパートリープライマーは標的配列にマッチしないこととなる。これらのマッチしないプライマーはＰＣＲ中にアンプリコンに組み込まれず、したがって、ＰＣＲ産物捕捉について有効に競合する状態となっている。この限界に取り組むため、滴内の未使用のＰＣＲプライマーが捕捉についてＰＣＲ産物と競合する能力を緩和するデザインを作出した。ＰＣＲ産物捕捉は、例えば、未使用のプライマーの、アンプリコンを作出するプライマーに対するモル比１５：１の条件下で達成可能である。
【０６１６】
上記のように、カルボキシル化磁気ビーズを以下のアミン修飾型オリゴとコンジュゲートさせた。
ＶＬ＿捕捉
ＧＣＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１６）
ＶＨ＿捕捉
ＧＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１７）
Ｍｕｓ＿ＩｇＧ＿ＣＨ１＿ｍＲＮＡ＿ｃａｐｔ
ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＫＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１８）
Ｍｕｓ＿Ｋａｐ＿ｍＲＮＡ＿ｃａｐｔ
ＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／３ＡｍＭＯ／（配列番号１９）
【０６１７】
以下のオリゴを使用して、４Ｇ２ハイブリドーマに対応するＶＬ配列を増幅するようにＲＴ−ＰＣＲ反応を設定した。これらのオリゴは、自己アニーリング性配列を有しないデザイン（非ＳＡ）および自己アニーリング性配列を有するデザイン（ＳＡ）を表す。さらに、５’−末端に自己アニーリング性配列を有するが、４Ｇ２  ＶＬまたはＶＨ  ｍＲＮＡ配列にマッチしない３’−末端配列を有するオリゴ（ミスマッチ）を、マルチプレックスレパートリープライマーと類似した、ＰＣＲ中に消費されない例示的なＰＣＲプライマーとして含めた。ビーズ上で捕捉されたＰＣＲ産物の検出を容易とするため、リバースプライマーをビオチン化した。
【化１】
2020511117.tif 000016
【０６１８】
下線は自己アニーリング性（相補的）配列を示す。
【表１５】
2020511117.tif 000017
【表１６】
2020511117.tif 000018
【０６１９】
フォワード自己アニーリング性プライマー（４Ｇ２＿ＶＬ＿Ｆｗｄ＿ＳＡ）とともに使用される、競合するミスマッチオリゴの濃度については、以下の条件を使用した：
【表１７】
2020511117.tif 000019
【０６２０】
Ｆｗｄ非自己アニーリング性プライマー（４Ｇ２＿ＶＬ＿Ｆｗｄ＿非ＳＡ）とともに使用される、競合するミスマッチオリゴの濃度については、以下の条件を使用した：
【表１８】
2020511117.tif 000020
【０６２１】
以下のプログラムを用いて試料に熱サイクリングを行った：
【表１９】
2020511117.tif 000021
【０６２２】
熱サイクリング後、試料をピペッティングにより穏やかに混合し、ビーズを懸濁した。次いで、ビーズへのＰＣＲ産物捕捉を容易とするため、以下のプログラムで試料をサーモサイクラーに入れた：
【表２０】
2020511117.tif 000022
【０６２３】
捕捉手順の後、チューブを磁石に当てて上清を回収した。上清をアガロースゲル電気泳動により解析し、ＰＣＲ産物の作出の成功を確認した。捕捉されたＰＣＲ産物を有するビーズを、ビーズを分離するため磁石を使用して、氷冷ＰＢＳＡ（１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ）１００μｌで３回洗浄した。次いで各試料を、ＰＢＳＡ中の１：５００  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７  ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ）１００μｌとともに、回転させながら４℃で、光から離して４５分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを氷冷ＰＢＳＡ１００μｌで３回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを氷冷ＰＢＳＡ１００μｌで再懸濁し、ＡｌｅｘａＧｌｕｏ６４７蛍光シグナルについてフローサイトメーターで解析した。
【０６２４】
平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各試料について決定した。ミスマッチオリゴの非存在に対応するＭＦＩと比較したＭＦＩの百分率として、試料データをプロットした。図７Ａ〜７Ｂに示すように、自己アニーリング性プライマーのみが、ミスマッチプライマーオリゴの、マッチしたプライマーオリゴに対する比が高い時にＰＣＲ産物捕捉の競合を防止する能力があった。これらの結果は、特に自己アニーリング性プライマーデザインにより、未使用のプライマーが１５倍多い条件−例えば複数抗体レパートリー条件をシミュレートする条件下で、ＰＣＲ産物が効率的に捕捉されうることを示している。
【０６２５】
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および受託番号は、各個別の刊行物または特許が、参照により組み込まれることが、具体的、かつ、個別に指し示された場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０６２６】
均等物
本発明の具体的な実施形態について論じてきたが、上記の明細書は、例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書および下記の特許請求の範囲を検討すれば、当業者には、本発明の多くの変化形が明らかとなるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を、それらの均等物の全範囲と共に参照し、本明細書を、このような変化形と共に参照することにより決定されるものとする。
【図１】
2020511117.tif 000023
【図２Ａ】
2020511117.tif 000024
【図２Ｂ】
2020511117.tif 000025
【図２Ｃ】
2020511117.tif 000026
【図２Ｄ】
2020511117.tif 000027
【図３】
2020511117.tif 000028
【図４】
2020511117.tif 000029
【図５】
2020511117.tif 000030
【図６】
2020511117.tif 000031
【図７】
2020511117.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月4日(2019.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020511117000001.app
【国際調査報告】
2020511117.tif 000033
2020511117.tif 000034
2020511117.tif 000035
2020511117.tif 000036
2020511117.tif 000037
2020511117.tif 000038
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