(57)【要約】  本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原、特に線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、新規な二重特異性抗原結合分子、およびこれらの分子を作製する方法、および同分子を使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域
をさらに含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、請求項１または２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３および配列番号１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｃ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｅ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｆ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｈ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｉ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｊ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｋ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｌ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｍ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｎ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｐ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１から７または１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む、請求項１から７または１０または１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｅ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｆ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｈ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｊ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｋ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｌ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１から７または１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、またはＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１から７または１１または１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
Ｆｃ領域がＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項２から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
Ｆｃ領域が、（ｉ）アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラス、または（ｉｉ）アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むマウスＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項２から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと
を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片と
を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、請求項２４に記載の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法。
【請求項２６】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２７】
医薬として使用するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
（ｉ）ＣＤ４０を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、
（ｉｖ）がんを治療する、
（ｖ）がんの進行を遅延させる、
（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、
（ｖｉｉ）感染症を治療する
のに使用するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、または請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
がんの治療に使用するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３１】
がんを有する個体を治療する方法であって、有効量の請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２６に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
【請求項３２】
二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線および／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療に使用するための請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、または請求項２６に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、新規な二重特異性抗原結合分子に関する。特に、これらの二重特異性抗原結合分子は、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域をさらに含む。本発明はさらに、これらの分子を作製する方法および同分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
強力な適応免疫応答の発生中には、複数の分子シグナルが必要とされる。シグナル１は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に提示されるその同族抗原の結合を伴う。シグナル２は、共刺激受容体と、Ｔ細胞とＡＰＣとの間のそれぞれのリガンドのエンゲージメントからなる。最も良く研究され、最も重要な共刺激エフェクターの１つは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーＣＤ４０およびそのリガンドＣＤ４０Ｌである（Ｅｌｇｕｅｔａ  Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２〜７２）。ＣＤ４０を含むＴＮＦＲファミリーのいくつかのメンバーは、初期Ｔ細胞活性化後に、ＡＰＣおよびＴ細胞応答を維持するよう機能するので、免疫系の組織化および機能において中心的役割を有する（Ｗａｔｔｓ  Ｔ．Ｈ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３、２３〜６８）。様々な共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの組み合わせによって、ＡＰＣおよびＴ細胞の活性化および生存を連続的および一過的に調節して、結果としてＡＰＣおよびＴ細胞機能の密な制御を維持しながら、免疫応答を増加させることが可能になる。疾患状態に応じて、共刺激ＴＮＦファミリーメンバーを介した刺激は、疾患を憎悪させるまたは改善することができる。ＴＮＦＲファミリー共刺激因子の活性化または遮断は、がん、感染性疾患、移植および自己免疫を含む複数の分野でのいくつかの治療用途への見込みを示す。
【０００３】
いくつかの共刺激分子の中でも、ＴＮＦＲファミリーメンバーＣＤ４０は、成熟、生存、抗原提示、サイトカイン産生およびＡＰＣの共刺激分子の発現を誘導し、次いでこれらが炎症性サイトカインによる抗原特異的Ｔ細胞応答およびＮＫ細胞活性化を駆動することによって、免疫応答の駆動において重要な役割を果たす。ＣＤ４０は、感染症、腫瘍および自己抗原に対する免疫応答を調節し、その発現がＡＰＣ、例えばＢ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、単球およびマクロファージ、ならびに血小板、および非造血系起源の細胞、例えば筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮および内皮細胞の表面上で実証されている（Ｅｌｇｕｅｔａ  Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２〜１７２）。ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌは、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、血小板、単核球細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞および好塩基球上で発現される（Ｃａｒｂｏｎｅ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９７；１８５（１２）：２０５３〜２０６０またはＥｌｇｕｅｔａ  Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２〜７２）。ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの発現は、種々の免疫刺激シグナルに応じて強力に上方制御され、ＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞との間のＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が、ＡＰＣ活性化および抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加に寄与する（Ｂｅｖａｎ  ＭＪ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；４（８）：５９５〜６０２）。ＣＤ４０アゴニスト抗体を使用することによって、同様の免疫刺激結果が観察された（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨおよびＧｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ．、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１９（５）：１０３５〜１０４３）。
【０００４】
その天然リガンドＣＤ４０Ｌ、ＩＩ型膜貫通タンパク質またはアゴニスト抗体によるＩ型膜貫通受容体ＣＤ４０のエンゲージメントはＣＤ４０クラスター化を促進し、アダプタータンパク質の細胞質受容体ドメインへの動員を誘導する。ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）として知られているこれらのアダプタータンパク質の動員は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ならびにカノニカルおよび非カノニカル核内因子κＢ（ＮＦκＢ）シグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらす（Ｅｌｇｕｅｔａ  Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９；２２９（１）：１５２〜７２）。今度は、これがＡＰＣ成熟および活性化をもたらし、次いで、抗原特異的Ｔ細胞応答を最大化する。近年の研究では、抗腫瘍免疫の利用におけるアゴニストＣＤ４０抗体の２つの異なる作用様式が示されている。適応免疫系の活性化を通した媒介腫瘍細胞殺傷によるその間接的作用様式に加えて、アゴニストＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０発現固形腫瘍細胞のアポトーシスの誘導を通した直接的腫瘍細胞殺傷を誘導することができる（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００；２０（１５）：５５０３〜１５）。腫瘍細胞の直接的ＣＤ４０抗体媒介殺傷は、抗ＣＤ４０抗体を介したＣＤ４０エンゲージメントによって同時に活性化されるＡＰＣによってプロセシングおよび提示され得る腫瘍抗原の源を提供することができ、次いで、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞、内因性ワクチンワクチン接種として知られる仮定された機構を誘導することができる。ＣＤ４０エンゲージメントが効率的な抗がん免疫応答をもたらし得るので、アゴニストＣＤ４０抗体は、単一薬剤として、および化学療法と組み合わせての両方で、種々の前臨床腫瘍モデルで首尾よく使用されている（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨおよびＧｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ．、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１９（５）：１０３５〜４３）。
【０００５】
現在までに、６つのＣＤ４０  ｍＡｂが臨床試験で調査中である：Ｃｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４（ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１３；２：２２９〜４０）、ＡＤＣ１０１３（完全ヒト、ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１抗体；Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ；Ｍａｎｇｓｂｏ  ＳＭ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５年３月１日；２１（５）：１１１５〜２６）、ＡＰＸ−００５（完全ヒト化、ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１  ｍＡｂ；Ａｐｅｘｉｇｅｎ；Ｂｊｏｒｃｋ  Ｐ．ら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；３（補遺２）：１９８頁）、ＳＥＡ−ＣＤ４０（ＣＤ４０アゴニストＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｇａｒｄａｉ  ＳＪ．ら  ＡＡＣＲ  １０６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１５；４月１８〜２２日、要約２４７２）ならびにＲＯ７００９７８９（完全ヒト、ＣＤ４０超アゴニストＩｇＧ２  ｍＡｂ）は、第Ｉ相臨床試験で調査されており、ダセツズマブ（ＣＤ４０部分アゴニストＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｋｈｕｂｃｈａｎｄａｎｉ  Ｓ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００９；１０：５７９〜５８７）は、第ＩＩ相臨床試験で調査されている。これらの試験に適格の患者は固形腫瘍、古典的ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）または緩慢性リンパ腫（濾胞性リンパ腫を含む）を有する。補体媒介細胞傷害（ＣＭＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介したＣＤ４０＋腫瘍細胞のＦｃ依存性細胞傷害から、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するＡＰＣ活性化ならびに腫瘍および腫瘍間質を枯渇させるマクロファージ活性化に及ぶ多様な活性が、これらのＣＤ４０アゴニスト活性について示されている。今までのところ、この観察された不均一性についての決定的な説明はない。しかしながら、近年の研究により、この作用様式多様性が、少なくとも一部は、エピトープ特異性、アイソタイプまたはＦｃ：ＦｃγＲ相互作用における抗ＣＤ４０抗体の差によって説明することができることが示されている。例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のアポトーシス誘導または免疫調節メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように（Ｄａｈａｎ  Ｒ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１６年６月１３日；２９（６）：８２０〜３１；Ｌｉ  Ｆ．およびＲａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１；３３３、１０３０〜１０３４；Ｔｅｎｇ  Ｍ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３、１９１１〜１９２０）、ＣＤ４０アゴニスト抗体はインビボで、標的細胞上においてＦａｂ断片が結合しているＣＤ４０の、標的細胞以外の細胞上においてＦｃ断片が結合しているＦｃγ受容体への架橋が必要であるようである。提案されている機構は、標的細胞上のＣＤ４０膜貫通分子のＦｃγ受容体媒介クラスター化、および強力なインビボ有効性を達成するためのその後の高められたＣＤ４０シグナル伝達を含む。
【０００６】
アゴニストＣＤ４０抗体の臨床開発が、有望な初期結果を提供している。最初の臨床試験で、ＣＰ−８７０，８９３は、進行がんを有する患者における臨床有効性を示した。進行がんを有する２９人の患者のうちの４人が、ＣＰ−８７０，８９３の単一静脈内点滴を受けた後、部分的応答を示した（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００７年３月１日；２５（７）：８７６〜８３）。１年半にわたる９回のその後のＣＰ−８７０，８９３の投与で治療されたこれらの４人の患者のうちの１人は、５年以上完全寛解のままであった。しかしながら、ＣＰ−８７０，８９３の最も一般的な副作用はサイトカイン放出症候群および血栓塞栓性イベントであり、結果として使用した投与スケジュールおよび投与経路では、１４０人超の患者での第Ｉ相臨床試験の統合的データは限られた臨床有効性しか示さず、抗体の局所投与が推奨された（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨ、Ｇｌｅｎｎｉｅ  Ｍ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３、１９（５）、１０３５〜１０４３）。単剤反応の欠如は、一部は広範なＣＤ４０発現によって引き起こされる重篤なオンターゲット／オフ腫瘍効果によって起こり、用量制限毒性（例えば、サイトカイン放出症候群）をもたらす。ＣＤ４０が腫瘍特異的標的によって架橋されるとＡＰＣを特異的に活性化するアゴニストＣＤ４０抗体の開発は、副作用を減少させ、用量制限を減少させ、効率的な長期持続性抗がん免疫を生成する可能性を有する新たな治療選択肢を提供する。
【０００７】
入手可能な前臨床および臨床データは、がんに対する有効な内因性免疫応答を誘導および増強することができるＣＤ４０の有効なアゴニストの高い臨床的必要性が存在することを明確に実証している。しかしながら、これらの効果は細胞の単一型に限定されることも単一機構を介して作用することもほとんど全くなく、細胞間および細胞内シグナル伝達機構を解明するよう設計された研究によって明らかになった複雑性のレベルは増加し続けている。既知のＣＤ４０抗体は、サイトカイン放出症候群および血小板／内皮細胞活性化などの用量制限毒性により比較的低用量でしか投与することができず、標的ＡＰＣ上の経路の不十分な活性化および狭い治療指数をもたらす。よって、単一細胞型に好ましく作用する「標的化」アゴニストの必要性がある。
【０００８】
本発明は、ＣＤ４０および標的細胞抗原に特異的に結合することができる新たな二重特異性抗原結合分子に関する。本発明の抗原結合分子は、腫瘍特異的または腫瘍関連標的に好ましく結合することができる部分と、ＣＤ４０にアゴニスト結合することができる部分を組み合わせ、ＣＤ４０を通したＡＰＣの活性化が標的細胞抗原、例えば腫瘍間質細胞上で発現されるＦＡＰを通した、および潜在的にはまた二次リンパ組織で中程度に発現されるＦＡＰを通した架橋によって提供される。二重特異性抗原結合分子のＦＡＰ依存性架橋は、ＣＤ４０発現細胞の活性化を腫瘍組織および潜在的にはまた腫瘍流入領域リンパ節などの二次リンパ組織に限局する。ＣＤ４０および活性化Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体、例えばＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に特異的に結合することができる二重特異性抗原結合分子と対照的に、ＦＡＰなどの腫瘍標的への標的化によって、主に線維芽細胞が他の組織と比較して上昇したレベルのＦＡＰを発現する腫瘍間質および腫瘍流入領域リンパ節でのＣＤ４０媒介ＡＰＣ活性化が可能になる。よって、本発明の抗原結合分子は、ＣＤ４０受容体を有効に駆動するだけでなく、所望の部位で極めて選択的に駆動し、一方、ＦｃγＲ架橋の必要性を克服し、それによって副作用を減少させることができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分（抗原結合ドメイン）を、標的細胞抗原を標的化する少なくとも１つの抗原結合部位と組み合わせた二重特異性抗原結合分子に関する。これらの二重特異性抗原結合分子は、好ましくは標的細胞抗原に対するその結合能により、標的細胞抗原が発現される部位で共刺激ＣＤ４０受容体を活性化するので、有利である。
【００１０】
一態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１１】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む。さらに特に、安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインは、エフェクター機能を減少させる突然変異を含む。
【００１２】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する。
【００１３】
さらなる態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する。よって、一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１４】
一態様では、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００１６】
特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００１７】
さらなる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００１８】
別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、マウスＣＤ４０に結合し、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００１９】
さらに、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本発明は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１９および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２０、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２１】
なお別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１９および配列番号２６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２６２および配列番号２６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｖ）配列番号２２、配列番号２６４および配列番号２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２２】
さらに、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３および配列番号１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２３】
特に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｃ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｅ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｆ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｈ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｉ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｊ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｋ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｌ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｍ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｎ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｐ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２４】
さらに特に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合が提供される。
【００２５】
さらなる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２６】
特に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｅ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｆ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｈ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｊ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｋ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｌ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２７】
さらに特に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、またはＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２８】
別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００２９】
特に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３０】
さらに、（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３１】
別の態様では、（ｉ）配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号２６、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３２】
一態様では、二重特異性抗原結合分子がヒト化またはキメラ抗体である。さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子がＩｇＧ  Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。特に、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。特定の態様では、Ｆｃ領域が、（ｉ）アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラス、または（ｉｉ）アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むマウスＩｇＧ１サブクラスのものである、二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、Ｆｃ領域は、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【００３３】
別の態様では、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃ領域の第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがホールを含む、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、または（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。さらに特に、Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３４】
さらなる態様では、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３５】
別の態様では、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３６】
特定の態様では、Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインがクロスｆａｂ断片である。よって、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３７】
一態様では、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されているＶＨおよびＶＬと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３８】
別の態様では、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ＶＨ−ＣＬ鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００３９】
なお別の態様では、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４０】
さらに、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている２つのＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４２】
さらなる態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている２つのＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４３】
別の態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４４】
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片または２つのＦａｂ断片が、各々がＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含み、ＶＨ−ＣＬ鎖またはＶＬ−ＣＨ１鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーＦａｂ断片である。
【００４５】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書で前に定義される（ａ）の２つの重鎖の各々が、場合によりペプチドリンカーによって互いに接続されているＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨ−ＣＨ１鎖を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４６】
別の態様では、本発明は、
（ａ）各重鎖が場合によりペプチドリンカーによって互いに接続されているＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨ−ＣＨ１鎖およびＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４７】
別の態様では、
（ａ）各重鎖が場合によりペプチドリンカーによって互いに接続されているＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨ−ＣＨ１鎖およびＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片またはクロスＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４８】
別の態様では、
（ａ）各重鎖が場合によりペプチドリンカーによって互いに接続されているＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨ−ＣＨ１鎖およびＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、前記クロスｆａｂ断片のＶＨ−ＣＬ鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００４９】
なお別の態様では、
（ａ）各重鎖が場合によりペプチドリンカーによって互いに接続されているＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨ−ＣＨ１鎖およびＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、前記クロスｆａｂ断片のＶＬ−ＣＨ１鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００５０】
別の特定の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の１つまたは複数が、１２３位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）および１２４位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のリジン（Ｋ）を含むＣＬドメインと、１４７位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）および２１３位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【００５１】
本発明の別の態様によると、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター、および本発明の単離ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞が真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００５２】
別の態様では、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、上に記載される宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって作製されたＣＤ４０およびＦＡＰに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を包含する。
【００５３】
本発明はさらに、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００５４】
医薬として使用するための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、または二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物も本発明によって包含される。
【００５５】
一態様では、
（ｉ）ＣＤ４０を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、
（ｉｖ）がんを治療する、
（ｖ）がんの進行を遅延させる、
（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、
（ｖｉｉ）感染症を治療する
のに使用するための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物が提供される。
【００５６】
具体的な態様では、がんの治療に使用するための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物が提供される。別の具体的な態様では、本発明は、がんの治療に使用するための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子であって、化学療法剤、放射線および／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するのに使用するための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物が提供される。
【００５７】
さらなる態様では、本発明は、個体の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、有効量の本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を個体に投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体のがんを治療するまたは遅延させる方法であって、有効量の本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。
【００５８】
それを必要とする個体の疾患を治療するための医薬を製造するため、特にがんを治療するための医薬を製造するための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子の使用、ならびに個体の疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の本発明の二重特異性抗原結合分子を含む治療的有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法も提供される。具体的な態様では、疾患が、がんである。上記の態様のいずれにおいても、個体が哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ヒトＣＤ４０およびＦＡＰと特異的に結合する二重特異性抗原結合分子の概略図である。図１Ａは、一方の重鎖のＣ末端におけるＶＨおよび他方の重鎖のＣ末端におけるＶＬを含む１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して四価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール突然変異を表す。図１Ｂは、重鎖のＣ末端においてそれぞれ融合した２個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋２型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して四価およびＦＡＰに対して二価）の概略図を示す。図１Ｃは、一方の重鎖のＣ末端におけるＶＨおよび他方の重鎖のＣ末端におけるＶＬを含む１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた２個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる２＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して二価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール突然変異を表す。図１Ｄは、重鎖のＣ末端においてそれぞれ融合した、２個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた２個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる２＋２型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して二価およびＦＡＰに対して二価）の概略図を示す。図１Ｅは、重鎖の１つのＣ末端において融合した１個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた２個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる２＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して二価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール突然変異を表す。図１Ｆは、１個のＦＡＰ結合アームと組み合わされた１個のＣＤ４０結合アームからなる１＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して一価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール突然変異を表す。
【図２】ＦＡＰ標的化一価または二価型式におけるヒト四価抗ＣＤ４０抗体の、ＦＡＰネガティブ腫瘍細胞（図２Ａ）およびＦＡＰポジティブ腫瘍細胞（図２Ｂ）との結合を示す図である。トランスジェニック改変マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現し、一方、親細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔはｈｕＦＡＰを発現しない。１個かまたは２個のいずれかのＦＡＰ結合部分を有する四価抗ＣＤ４０抗原結合分子のみが、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞と効率的に結合するが、ＦＡＰ非標的化型式は結合しない（図２Ｂ）。二価ＦＡＰコンストラクトは、一価コンストラクトより強く結合する。対照的に、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体のＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞との結合は検出されなかった（図２Ａ）。結合は、二次検出抗体として用いられるフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示されている。ＭＦＩは、フローサイトメトリーにより測定された。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図３Ａ−Ｂ】一価または二価ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞に関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ７０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞への効果は、図３Ａに示されており、一方、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞への効果は図３Ｂに示されている。
【図３Ｃ−Ｄ】一価または二価ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞に関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞への効果は、図３Ｃに示されており、一方、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞への効果は図３Ｄに示されている。
【図３Ｅ−Ｆ】一価または二価ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞に関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８３ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞への効果は、図３Ｅに示されており、一方、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞への効果は図３Ｆに示されている。
【図３Ｇ−Ｈ】一価または二価ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞に関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞への効果は、図３Ｇに示されており、一方、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞への効果は図３Ｈに示されている。
【図４Ａ−Ｂ】２日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズとの２日間のインキュベーション後、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ７０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図４Ｃ−Ｄ】２日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズとの２日間のインキュベーション後、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８３ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図４Ｅ−Ｆ】２日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズとの２日間のインキュベーション後、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図５Ａ−Ｂ】５日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）との５日間のＢ細胞インキュベーション後、ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトは、Ｂ細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６発現のＦＡＰ依存性上方制御を誘導した。ＲＯ７００９７８９または架橋ＳＧＮ−４０により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御はわずかに低かった。ＣＤ７０およびＣＤ８３について、ＦＡＰおよびＣＤ４０を標的化する二重特異性抗体に関して、上方制御を全く観察することができず、または非常に限られた上方制御のみを観察することができたが、一方、ポジティブコントロール抗体は、明らかに、これらのＢ細胞活性化マーカーへの効果を示した。示されている抗体価測定された抗体との５日間のインキュベーション後のＣＤ７０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図５Ｃ−Ｄ】５日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）との５日間のＢ細胞インキュベーション後、ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトは、Ｂ細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６発現のＦＡＰ依存性上方制御を誘導した。ＲＯ７００９７８９または架橋ＳＧＮ−４０により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御はわずかに低かった。ＣＤ７０およびＣＤ８３について、ＦＡＰおよびＣＤ４０を標的化する二重特異性抗体に関して、上方制御を全く観察することができず、または非常に限られた上方制御のみを観察することができたが、一方、ポジティブコントロール抗体は、明らかに、これらのＢ細胞活性化マーカーへの効果を示した。示されている抗体価測定された抗体との５日間のインキュベーション後のＣＤ８０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図５Ｅ−Ｆ】５日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）との５日間のＢ細胞インキュベーション後、ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトは、Ｂ細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６発現のＦＡＰ依存性上方制御を誘導した。ＲＯ７００９７８９または架橋ＳＧＮ−４０により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御はわずかに低かった。ＣＤ７０およびＣＤ８３について、ＦＡＰおよびＣＤ４０を標的化する二重特異性抗体に関して、上方制御を全く観察することができず、または非常に限られた上方制御のみを観察することができたが、一方、ポジティブコントロール抗体は、明らかに、これらのＢ細胞活性化マーカーへの効果を示した。示されている抗体価測定された抗体との５日間のインキュベーション後のＣＤ８３ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図５Ｇ−Ｈ】５日間のインキュベーション後のＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下での一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）との５日間のＢ細胞インキュベーション後、ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトは、Ｂ細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６発現のＦＡＰ依存性上方制御を誘導した。ＲＯ７００９７８９または架橋ＳＧＮ−４０により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御はわずかに低かった。ＣＤ７０およびＣＤ８３について、ＦＡＰおよびＣＤ４０を標的化する二重特異性抗体に関して、上方制御を全く観察することができず、または非常に限られた上方制御のみを観察することができたが、一方、ポジティブコントロール抗体は、明らかに、これらのＢ細胞活性化マーカーへの効果を示した。示されている抗体価測定された抗体との５日間のインキュベーション後のＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図６】５日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化ビーズ（図６Ａ）または非コーティング化ビーズ（図６Ｂ）の存在下での、異なるＦＡＰ標的化および非標的化のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で処理されたヒトＢ細胞のＩＬ−６分泌を示す図である。ＦＡＰの存在下で、一価および二価ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体ＲＯ７００９７８９およびＳＧＮ４０と比較して、類似したＩＬ−６分泌の増加を誘導した。対照的に、非標的化ネガティブコントロール抗体で処理されたＢ細胞は、未処理のＢ細胞と類似した低いＩＬ−６レベルを発現した。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、二重特異性抗原結合分子に関してＩＬ−６産生の増加は検出されなかった。ＥＬＩＳＡにより測定された、示されている抗体価測定された抗体と５日間培養されたヒトＢ細胞の上清におけるＩＬ−６量が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図７Ａ−Ｂ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒト単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、ＤＣ活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８３）の増加を誘導したが、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、活性化マーカー上方制御は検出されなかった。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＣＤ８０およびＣＤ８３の上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。全ての他の試験された抗体と比較して、ＲＯ７０９７８９について、ＤＣ上のＣＤ７０のより高い上方制御が観察された。対照的に、ＣＤ８６発現は、未処理のＤＣと比較して、異なる抗ＣＤ４０抗体とインキュベートされたＤＣにおいて有意には変化しなかった。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ７０ポジティブの活力あるｍｏＤＣの百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図７Ｃ−Ｄ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒト単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、ＤＣ活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８３）の増加を誘導したが、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、活性化マーカー上方制御は検出されなかった。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＣＤ８０およびＣＤ８３の上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。全ての他の試験された抗体と比較して、ＲＯ７０９７８９について、ＤＣ上のＣＤ７０のより高い上方制御が観察された。対照的に、ＣＤ８６発現は、未処理のＤＣと比較して、異なる抗ＣＤ４０抗体とインキュベートされたＤＣにおいて有意には変化しなかった。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８０ポジティブの活力あるｍｏＤＣの百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図７Ｅ−Ｆ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒト単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、ＤＣ活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８３）の増加を誘導したが、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、活性化マーカー上方制御は検出されなかった。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＣＤ８０およびＣＤ８３の上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。全ての他の試験された抗体と比較して、ＲＯ７０９７８９について、ＤＣ上のＣＤ７０のより高い上方制御が観察された。対照的に、ＣＤ８６発現は、未処理のＤＣと比較して、異なる抗ＣＤ４０抗体とインキュベートされたＤＣにおいて有意には変化しなかった。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８３ポジティブの活力あるｍｏＤＣの百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図７Ｇ−Ｈ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒト単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、ＤＣ活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８３）の増加を誘導したが、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、活性化マーカー上方制御は検出されなかった。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＣＤ８０およびＣＤ８３の上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。全ての他の試験された抗体と比較して、ＲＯ７０９７８９について、ＤＣ上のＣＤ７０のより高い上方制御が観察された。対照的に、ＣＤ８６発現は、未処理のＤＣと比較して、異なる抗ＣＤ４０抗体とインキュベートされたＤＣにおいて有意には変化しなかった。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８６ポジティブの活力あるｍｏＤＣの百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図８】８時間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ＦＡＰに対して一価で、かつＣＤ４０に対して二価の二重特異性抗体は、ＦＡＰおよびＣＤ４０に対して二価の二重特異性抗体と類似した、ＳＥＡＰ産生の増加を誘導したが、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＳＥＡＰ産生は検出されなかった。さらに、ＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化抗体によるＳＥＡＰ産生の上方制御が、ＦＡＰの存在下で観察された。しかしながら、ＳＥＡＰ産生はまた、ＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化抗体で処理されたレポーター細胞の上清において、ＦＡＰの非存在下で観察された。ＦＡＰ結合ドメインの代わりに１個または２個のＤＰ４７ドメインを有するヒトＣＤ４０に対して四価のネガティブコントロール抗体は、ＦＡＰの存在下および非存在下で、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞における同等のＳＥＡＰ産生を誘導し、ポジティブコントロール抗体ＳＧＮ−４０＋Ｆ（ａｂ）は、ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ヒトＣＤ４０に対して二価または四価のＦＡＰ標的化二重特異性抗体と比較して、類似したレベルのＳＥＡＰ産生を誘導した。ＳＥＡＰにより加水分解される基質の量と相関する、６５０ｎｍの波長における吸収が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図９Ａ−Ｂ】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化される、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウス（ヒトＣＤ４０およびマウスＣＤ４０の類似した発現パターン）から単離され、低量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされ、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣによりＴ細胞増殖は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖レベルは同等であった。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ２５またはＩＦＮγ産生の有意な上方制御は、異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で予め刺激されたＤＣと共培養されたＴ細胞について、観察されなかった。大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣのみが、未処理の条件と比較して、これらのマーカーの明らかな発現増加を誘導した。示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）、ＩＦＮγ、ＣＤ２５、およびＣＤ４４ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図９Ｃ−Ｄ】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウス（ヒトＣＤ４０およびマウスＣＤ４０の類似した発現パターン）から単離され、低量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされ、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣによりＴ細胞増殖は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖レベルは同等であった。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ２５またはＩＦＮγ産生の有意な上方制御は、異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で予め刺激されたＤＣと共培養されたＴ細胞について、観察されなかった。大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣのみが、未処理の条件と比較して、これらのマーカーの明らかな発現増加を誘導した。示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）、ＩＦＮγ、ＣＤ２５、およびＣＤ４４ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図９Ｅ−Ｆ】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウス（ヒトＣＤ４０およびマウスＣＤ４０の類似した発現パターン）から単離され、低量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされ、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣによりＴ細胞増殖は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖レベルは同等であった。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ２５またはＩＦＮγ産生の有意な上方制御は、異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で予め刺激されたＤＣと共培養されたＴ細胞について、観察されなかった。大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣのみが、未処理の条件と比較して、これらのマーカーの明らかな発現増加を誘導した。示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）、ＩＦＮγ、ＣＤ２５、およびＣＤ４４ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図９Ｇ−Ｈ】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウス（ヒトＣＤ４０およびマウスＣＤ４０の類似した発現パターン）から単離され、低量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされ、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣによりＴ細胞増殖は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖レベルは同等であった。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ２５またはＩＦＮγ産生の有意な上方制御は、異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で予め刺激されたＤＣと共培養されたＴ細胞について、観察されなかった。大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣのみが、未処理の条件と比較して、これらのマーカーの明らかな発現増加を誘導した。示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）、ＩＦＮγ、ＣＤ２５、およびＣＤ４４ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図９Ｉ−Ｊ】ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体活性化ＤＣによりプライミングされたＴ細胞の上清において測定されたＩＬ−２およびＩＬ−１２（ｐ４０）の濃度を示す図である。ＯＴ−１  Ｔ細胞と、低量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされ、かつＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体およびＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣの共培養において、ＦＡＰの非存在下、ＦＡＰ標的化抗体で予め刺激されたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養されたＯＴ−１  Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−２およびＩＬ−１２（ｐ４０）レベルの増加が検出された。さらに、マウス二価ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体は、ヒトの等価の二重特異性抗原結合分子より著しく高いＩＬ−１２（ｐ４０）の分泌を誘導した。ＩＬ−２分泌は、抗ヒトＣＤ４０二重特異性抗原結合分子と抗マウスＣＤ４０二重特異性抗原結合分子の両方とも同じ様な程度で、ＦＡＰ依存性様式で増加した。ＥＬＩＳＡにより測定された、示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養されたマウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の上清におけるＩＬ−２およびＩＬ−１２（ｐ４０）量が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１０】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＯＶＡパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウスから単離され、ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートで処理され、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異性Ｔ細胞の強い増殖、ならびにＣＤ２５およびＣＤ４４発現を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）またはＯＶＡの非存在下（ＤＥＣのみ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣにより、Ｔ細胞増殖および活性化は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖ならびにＣＤ２５およびＣＤ４４発現レベルは同等であった。ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートの代わりに大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣもまた、強いＴ細胞増殖ならびに活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ４４の発現を誘導した。ＯＶＡの存在下または非存在下で、示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１１】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＯＶＡパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウスから単離され、ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートで処理され、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異性Ｔ細胞の強い増殖、ならびにＣＤ２５およびＣＤ４４発現を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）またはＯＶＡの非存在下（ＤＥＣのみ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣにより、Ｔ細胞増殖および活性化は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖ならびにＣＤ２５およびＣＤ４４発現レベルは同等であった。ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートの代わりに大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣもまた、強いＴ細胞増殖ならびに活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ４４の発現を誘導した。ＯＶＡの存在下または非存在下で、示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、ＣＤ２５ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１２】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＯＶＡパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウスから単離され、ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートで処理され、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異性Ｔ細胞の強い増殖、ならびにＣＤ２５およびＣＤ４４発現を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）またはＯＶＡの非存在下（ＤＥＣのみ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣにより、Ｔ細胞増殖および活性化は誘導されなかった。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有するマウスまたはヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖ならびにＣＤ２５およびＣＤ４４発現レベルは同等であった。ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートの代わりに大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣもまた、強いＴ細胞増殖ならびに活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ４４の発現を誘導した。ＯＶＡの存在下または非存在下で、示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、ＣＤ４４ポジティブの活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１３】ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化されたＯＶＡパルス化ＤＣと共培養されたＴ細胞の上清において測定されたＩＦＮγレベルを示す図である。ＦＡＰの存在下で、抗ヒトＣＤ４０ＦＡＰ標的化抗体で処理されたＤＣと共培養されたＴ細胞に関する条件において、ＩＦＮγレベルは上昇した（図１３Ａ）。加えて、ＩＦＮγ分泌は、抗ヒトＣＤ４０二重特異性抗原結合分子と抗マウスＣＤ４０二重特異性抗原結合分子の両方に関して同じような程度で、ＦＡＰ依存性様式で増加した。ＥＬＩＳＡにより測定された、示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の上清におけるＩＦＮγ量が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１４Ａ−Ｂ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化マウス抗ＣＤ４０コンストラクトによるマウスＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズに関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、有意なＢ細胞活性化マーカー上方制御はまた、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体ＦＧＫ４．５で処理されたＢ細胞について観察された。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ７０およびＣＤ８０の増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかった。対照的に、ポジティブコントロール抗体は、ＦＡＰ前処理に関係なく、ＣＤ７０およびＣＤ８０の上方制御を誘導した。ＣＤ８６上方制御は、２個のＦＡＰ結合部分を有する四価抗マウスＣＤ４０抗体に関してＦＡＰ依存性であったが、ＦＡＰ非依存性効果が、１個のみのＦＡＰ結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について観察された。加えて、ＭＨＣ−ＩＩ発現のＦＡＰ非依存性上方制御が、全ての試験された二重特異性抗原結合分子について観察された。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ７０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１４Ｃ−Ｄ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化マウス抗ＣＤ４０コンストラクトによるマウスＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズに関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、有意なＢ細胞活性化マーカー上方制御はまた、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体ＦＧＫ４．５で処理されたＢ細胞について観察された。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ７０およびＣＤ８０の増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかった。対照的に、ポジティブコントロール抗体は、ＦＡＰ前処理に関係なく、ＣＤ７０およびＣＤ８０の上方制御を誘導した。ＣＤ８６上方制御は、２個のＦＡＰ結合部分を有する四価抗マウスＣＤ４０抗体に関してＦＡＰ依存性であったが、ＦＡＰ非依存性効果が、１個のみのＦＡＰ結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について観察された。加えて、ＭＨＣ−ＩＩ発現のＦＡＰ非依存性上方制御が、全ての試験された二重特異性抗原結合分子について観察された。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ８０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１４Ｅ−Ｆ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化マウス抗ＣＤ４０コンストラクトによるマウスＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズに関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、有意なＢ細胞活性化マーカー上方制御はまた、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体ＦＧＫ４．５で処理されたＢ細胞について観察された。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ７０およびＣＤ８０の増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかった。対照的に、ポジティブコントロール抗体は、ＦＡＰ前処理に関係なく、ＣＤ７０およびＣＤ８０の上方制御を誘導した。ＣＤ８６上方制御は、２個のＦＡＰ結合部分を有する四価抗マウスＣＤ４０抗体に関してＦＡＰ依存性であったが、ＦＡＰ非依存性効果が、１個のみのＦＡＰ結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について観察された。加えて、ＭＨＣ−ＩＩ発現のＦＡＰ非依存性上方制御が、全ての試験された二重特異性抗原結合分子について観察された。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１４Ｇ−Ｈ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化マウス抗ＣＤ４０コンストラクトによるマウスＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズに関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現（ＣＤ７０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の増加を誘導した。さらに、有意なＢ細胞活性化マーカー上方制御はまた、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体ＦＧＫ４．５で処理されたＢ細胞について観察された。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ７０およびＣＤ８０の増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察することができなかった。対照的に、ポジティブコントロール抗体は、ＦＡＰ前処理に関係なく、ＣＤ７０およびＣＤ８０の上方制御を誘導した。ＣＤ８６上方制御は、２個のＦＡＰ結合部分を有する四価抗マウスＣＤ４０抗体に関してＦＡＰ依存性であったが、ＦＡＰ非依存性効果が、１個のみのＦＡＰ結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について観察された。加えて、ＭＨＣ−ＩＩ発現のＦＡＰ非依存性上方制御が、全ての試験された二重特異性抗原結合分子について観察された。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＭＨＣＩＩポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１５】ヒトＣＤ４０およびＦＡＰまたはＤＰ４７と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子の概略図である。図１５Ａは、一方の重鎖のＣ末端におけるＶＨおよび他方の重鎖のＣ末端におけるＶＬを含む１個のＤＰ４７結合部分と組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＤＰ４７抗体（ＣＤ４０に対して四価およびＤＰ４７に対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ノブ・イントゥ・ホール突然変異を表す。図１５Ｂは、重鎖のＣ末端においてそれぞれ融合した２個のＤＰ４７結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋２型式での二重特異性ＣＤ４０−ＤＰ４７抗体（ＣＤ４０対して四価およびＤＰ４７に対して二価）の概略図を示す。図１５Ｃは、１個のＦＡＰ結合アームと組み合わされた１個のＣＤ４０結合アームからなる１＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して一価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。図１５Ｄは、２個のＣＤ４０結合アームのうちの１個の一部として１個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた２個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる２＋１型式での例示的な二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体の概略図を示す。図１５Ｅは、重鎖の１つのＣ末端において融合した１個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して四価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。図１５Ｆは、重鎖の１つのＣ末端において融合した１個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体の概略図を示す。ＶＨ２ａおよびＶＬ２ａ  ＣＤ４０結合ドメインは、マウスＳ２Ｃ６  ＣＤ４０結合ドメインの社内でのヒト化から得られた。図１５Ｇは、重鎖の１つのＣ末端において融合した１個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体の概略図を示す。ＶＨ２ｄおよびＶＬ２ａ  ＣＤ４０結合ドメインは、マウスＳ２Ｃ６  ＣＤ４０結合ドメインの社内でのヒト化から得られた。図１５Ｈは、ＶＬ−ＣＨ１鎖がＦｃノブ鎖のＣ末端で融合している、クロスオーバーｆａｂ断片としての１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた２個のＣＤ４０結合部分からなる２＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体の概略図を示す。図１５Ｉは、ＶＨ−ＣＬ鎖がＦｃノブ鎖のＣ末端で融合している、クロスオーバーｆａｂ断片としての１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた２個のＣＤ４０結合部分からなる２＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体の概略図を示す。
【図１６】図１６Ａは、親のマウスＦＧＫ４．５抗体（Ｐ１ＡＤ３４４９）を示す図である。図１６Ｂ〜Ｅは、マウスＣＤ４０およびＦＡＰまたはＤＰ４７と特異的に結合する二重特異性抗原結合分子の概略図である。図１６Ｂは、一方の重鎖のＣ末端におけるＶＨおよび他方の重鎖のＣ末端におけるＶＬを含む１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた４個のマウスＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して四価およびＦＡＰに対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ＦｃにおけるＤＤ／ＫＫ突然変異を表し、Ｆｃ受容体との結合は、Ｄ２７０Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異により阻害される。図１６Ｃは、重鎖のＣ末端においてそれぞれ融合した２個のＦＡＰ結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のマウスＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋２型式での二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体（ＣＤ４０対して四価およびＦＡＰに対して二価）の概略図を示す。Ｆｃ受容体との結合は、Ｄ２７０Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異により阻害される。図１６Ｄは、一方の重鎖のＣ末端におけるＶＨおよび他方の重鎖のＣ末端におけるＶＬを含む１個のＤＰ４７結合部分と組み合わされた４個のマウスＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋１型式での二重特異性ＣＤ４０−ＤＰ４７抗体（ＣＤ４０に対して四価およびＤＰ４７に対して一価）の概略図を示す。黒色の点は、ＦｃにおけるＤＤ／ＫＫ突然変異を表し、Ｆｃ受容体との結合は、Ｄ２７０Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異により阻害される。図１６Ｅは、重鎖のＣ末端においてそれぞれ融合した２個のＤＰ４７結合Ｆａｂドメインと組み合わされた４個のマウスＣＤ４０結合Ｆａｂドメインからなる４＋２型式での二重特異性ＣＤ４０−ＤＰ４７抗体（ＣＤ４０対して四価およびＤＰ４７に対して二価）の概略図を示す。Ｆｃ受容体との結合は、Ｄ２７０Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異により阻害される。
【図１７】ＦＡＰ標的化一価または二価の型式でのヒト四価、二価、または一価抗ＣＤ４０抗体の、ＦＡＰポジティブ腫瘍細胞との結合を示す図である。トランスジェニック改変マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞株は、高レベルのマウス線維芽細胞活性化タンパク質（ｍＦＡＰ）を発現する。全ての描かれたコンストラクトは、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞とのそれらの結合強度（ＥＣ５０値、およびシグナル強度）が様々である。１個かまたは２個のいずれかのＦＡＰ結合部分を有する抗ＣＤ４０抗原結合分子のみが、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞と効率的に結合するが、ＦＡＰ非標的化型式（Ｐ１ＡＤ４５７４およびＰ１ＡＤ４４６５）は結合しない。Ｃ末端ＦＡＰ結合ドメインを有する二価ＦＡＰコンストラクトは、Ｃ末端ＦＡＰ結合ドメインを有する一価コンストラクトより強く結合する。最も強いＦＡＰ結合は、１＋１型式について観察された。二次検出抗体として用いられるフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として、結合が示されている。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定された。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１８】ＦＡＰ標的化一価または二価の型式でのヒト四価、二価、または一価抗ＣＤ４０抗体の、Ｄａｕｄｉ細胞（ヒトＣＤ４０の高い表面発現レベルをもつＢリンパ芽球細胞株）との結合を示す図である。全ての描かれたコンストラクトは、ＣＤ４０と結合するが、ＣＤ４０ポジティブＤａｕｄｉ細胞とのそれらの結合強度（ＥＣ５０値、およびシグナル強度）が様々である。二価抗ＣＤ４０抗体は、四価抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高いＥＣ５０レベルを示し、より高い結合プラトーに達する。最低の結合プラトーと組み合わされた最高のＥＣ５０値は、１＋１型式について観察された。抗ＣＤ４０抗体の細胞表面タンパク質との結合は、ＦＡＣＳ分析を用いて、フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片で検出された。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインは、ブランクコントロールのＭＦＩを引き算することにより補正された。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図１９】２４時間インキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化（図１９Ａ）または非コーティング化（図１９Ｂ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ＦＡＰに対して一価およびＣＤ４０に対して一価または二価の二重特異性抗体は、ＦＡＰおよびＣＤ４０に対して二価の二重特異性抗体と類似した、ＳＥＡＰ産生の増加を誘導したが、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＳＥＡＰ産生は検出されず、または低い産生が検出された。さらに、ＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化抗体によるＳＥＡＰ産生の上方制御は、ＦＡＰの存在下で観察された。しかしながら、ＳＥＡＰ産生はまた、ＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化抗体で処理されたリポーター細胞の上清において、ＦＡＰの非存在下で観察された。ＦＡＰ結合ドメインの代わりに１個のＤＰ４７ドメインを有するヒトＣＤ４０に対して四価のネガティブコントロール抗体は、ＦＡＰの存在下および非存在下でＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞において同等のＳＥＡＰ産生を誘導し、ポジティブコントロール抗体Ｐ１ＡＤ４４７０＋Ｆ（ａｂ）は、ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ヒトＣＤ４０に対して二価または四価のＦＡＰ標的化二重特異性抗体と比較して、類似したレベルのＳＥＡＰ産生を誘導した。ＳＥＡＰにより加水分解される基質の量と相関する、６５０ｎｍの波長における吸収が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下でのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞活性化のＥＣ５０値は、表１１に要約されている。全ての試験された、ＣＤ４０に対して四価の抗体のＥＣ５０値は同等であり、描かれた、ＣＤ４０に対して二価の抗体のＥＣ５０値と比較して低かった。最高のＥＣ５０値は１＋１型式について検出された。
【図２０】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化（図２０Ａ）または非コーティング化（図２０Ｂ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＤａｕｄｉ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズに関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現ＣＤ７０の増加を誘導した。さらに、ＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカー上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御と比較して、高かった。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、描かれた、ＣＤ４０に対して一価または二価のＦＡＰ標的化二重特異性抗体に関して、ＣＤ７０の増加は観察することができず、一方、四価ＣＤ４０結合分子は、ＣＤ７０の上方制御を誘導したが、ＦＡＰの存在下においてより低い程度で誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ７０ポジティブの活力あるＤａｕｄｉ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下での活性化のＥＣ５０値は、表９に要約されている。全ての、ＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化抗体のＥＣ５０値は同等であり、描かれた、ＣＤ４０に対して二価の抗体のＥＣ５０値と比較して低かった。最高のＥＣ５０値は、ポジティブコントロール抗体Ｐ１ＡＤ４４７０および１＋１型式について検出された。
【図２１】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化（図２１Ａ）または非コーティング化（図２１Ｂ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で一価または二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。ＦＡＰコーティング化ビーズに関して、ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、二価ＦＡＰ標的化分子と類似した、Ｂ細胞活性化マーカー発現ＣＤ８６の増加を誘導した。架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御は、わずかに低かった。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、二重特異性抗原結合分子に関して、ＣＤ８６発現の増加は観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は、活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後のＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下での活性化のＥＣ５０値は、表１０に要約されている。全ての、ＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化抗体のＥＣ５０値は同等であり、描かれた、ＣＤ４０に対して二価のＦＡＰ標的化抗体のＥＣ５０値と比較して低かった。最高のＥＣ５０値は、２＋１型式、２＋２型式、および１＋１型式について検出された。
【図２２】ＦＡＰの存在下（図２２Ａ）または非存在下（図２２Ｂ）での、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化される、ＯＶＡパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す図である。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウスから単離され、ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートで処理され、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体、加えてＦＡＰコーティング化ビーズで刺激されたＤＣは、抗原特異性Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣにより、Ｔ細胞増殖および活性化は全くまたはほとんど誘導されなかった。１個、２個、または４個のＣＤ４０結合部分および１個または２個のＦＡＰ結合部分を有するヒト二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖は同等であった。ＤＥＣ２０５−ＯＶＡコンジュゲートの代わりに大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣは、強いＴ細胞増殖を誘導した。ＯＶＡの存在下（図２２Ａおよび２２Ｂ）で、示されている抗体価測定された抗体とプレインキュベートされたｈｕＣＤ４０  ｔｇ  ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ−ｌｏｗ）の活力あるＣＦＳＥ標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図２３Ａ−Ｃ】ＦＡＰ発現マウス結腸腺癌腫瘍細胞株（ＭＣ３８−ＦＡＰ）を注射され、かつＦＧＫ４．５（Ｐ１ＡＤ３４４９）かまたはＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１（Ｐ１ＡＤ４５２０）かまたはビヒクル単独のいずれかで治療されたマウスにおける酵素血清中レベルを示す図である。非標的化ＣＤ４０  ｍＡｂ（ＦＧＫ４．５）で治療されたマウスと対照的に、ＦＡＰ−ＣＤ４０（ＦＧＫ４．５）  ４＋１（すなわち、ＣＤ４０に対して四価およびＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体）での治療は、肝臓傷害を示す血清酵素の増加が観察されなかったので、肝臓傷害を誘導しなかった。これは、アラニンアミノトランスフェラーゼについて図２３Ａにおいて、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）について図２３Ｂにおいて、およびソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）について図２３Ｃにおいて、群あたり３匹の動物について示されている。図２３Ａ〜２３Ｃにおいて、ｙ軸は、１リットルあたりのユニットでの血清酵素レベルを示し、ｘ軸は、ＦＧＫ４．５またはＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１またはビヒクル単独で治療された個々のマウスを示す。
【図２３Ｄ−Ｅ】ＦＡＰ発現マウス結腸腺癌腫瘍細胞株（ＭＣ３８−ＦＡＰ）を注射され、かつＦＧＫ４．５（Ｐ１ＡＤ３４４９）かまたはＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１（Ｐ１ＡＤ４５２０）かまたはビヒクル単独のいずれかで処理されたマウスにおける体重、および脾臓重量を示す図である。親の非標的化ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ３４４９）で治療されたマウスと比較して、ＦＧＫ４．５×ＦＡＰ（Ｐ１ＡＤ４５２０）で治療されたマウスにおいて、体重の減少が観察されず（図２３Ｄ）、脾臓重量のより少ない増加が観察された（図２３Ｅ）。図２３Ｄにおいて、ｙ軸は、ＦＧＫ４．５またはＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１またはビヒクル単独で治療されたマウスのグラムでの体重を示し、ｘ軸は、腫瘍注射後の日数を示す。図２３Ｅは、治療注射から３日後の、ＦＧＫ４．５またはＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１またはビヒクル単独で治療されたマウスの脾臓重量を示す。（（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ検定）。
【図２４】ＦＡＰ発現マウス結腸腺癌腫瘍細胞株（ＭＣ３８−ＦＡＰ）を注射され、かつＦＧＫ４．５（Ｐ１ＡＤ３４４９）かまたはＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１（Ｐ１ＡＤ４５２０）かまたはビヒクル単独のいずれかで処理されたマウスにおけるＤＣ活性化およびＴ細胞増殖を示す図である。治療注射から３日後の腫瘍流入領域リンパ節におけるＤＣ活性化（図２４Ａおよび２４Ｂ）、および治療注射から８日後の腫瘍におけるＴ細胞増殖（図２４Ｃおよび２４Ｄ）が、ビヒクル治療された動物と比較して、ＦＧＫ４．５治療およびＦＧＫ４．５×ＦＡＰ  ４＋１治療動物において有意に増加した。図２４Ａ〜２４Ｄは、腫瘍流入領域リンパ節におけるＤＣのＣＤ８６発現（図２４Ａ）およびＣＤ７０発現（図２４Ｂ）、ならびに治療注射から３日後および８日後、それぞれにおける、腫瘍におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞のＫｉ６７発現（図２４Ｃ）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数（図２４Ｄ）を示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、独立両側Ｓｔｕｄｅｎｔ検定）。
【図２５Ａ−Ｂ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化（図２５Ａ）または非コーティング化（図２５Ｂ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ５１４５）により誘導されたＣＤ７０のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ７０上方制御（図２５Ａ）は、わずかに低かった。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、二重特異性抗原結合分子に関して、ＣＤ７０発現（図２５Ｂ）の増加は観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は、活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ７０ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図２５Ｃ−Ｄ】２日間のインキュベーション後の、ＦＡＰコーティング化（図２５Ｃ）または非コーティング化（図２５Ｄ）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下で二価ＦＡＰ標的化ヒト抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す図である。架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ５１４５）により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御（図２５Ｃ）は、わずかに低かった。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）で、二重特異性抗原結合分子に関して、ＣＤ８６発現（図２５Ｄ）の増加は観察することができなかったが、ポジティブコントロール抗体は、活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率が示されている。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
定義
別途定義のない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を説明する目的で、以下の定義を適用し、適当な場合は、単数形で使用される用語は複数も含み、逆もまた同様である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、広義に、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片およびスキャフォールド抗原結合タンパク質である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」または「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインが、その標的細胞抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインが、結合する実体（例えば、ＣＤ４０アゴニスト）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞または腫瘍間質に向けることができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義される抗体およびその断片を含む。さらに、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば設計された反復タンパク質または設計された反復ドメインに基づく結合ドメインを含む（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号参照）。
【００６３】
抗体またはその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、これと相補的な領域を含む分子の部分を指す。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、例えば、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」がまた、Ｆａｂ断片またはクロスＦａｂ断片であり得る。
【００６４】
本明細書における「抗体」という用語は、広義で使用され、それだけに限らないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに抗体断片を含む種々の抗体構造を包含する。
【００６５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、例えば、一般的に微量に存在する変異体などの、天然に存在するまたはモノクローナル抗体調製物の作製中に生じる突然変異を含む考えられる変異抗体を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である、および／または同じエピトープに結合する。典型的に様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。
【００６６】
「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用される場合、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、その各々が異なる抗原決定基に特異的な２つの抗原結合部位を含む。一定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上で発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子はまた、多重特異性抗体の一部を形成することもできる。
【００６７】
本出願内で使用される「価」という用語は、１つの別個の抗原決定基に特異的な抗原結合分子中の１つの別個の抗原決定基に特異的な指定された数の結合部位の存在を示す。よって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、それぞれ抗原結合分子中の一定の抗原決定基に特異的な２つの結合部位、４つの結合部位および６つの結合部位の存在を示す。本発明の特定の態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子が、一定の抗原決定基について一価であり得る（これらが前記抗原決定基についてただ１つの結合部位を有することを意味する）、またはこれらが、一定の抗原決定基について二価もしくは四価であり得る（これらがそれぞれ前記抗原決定基について２つの結合部位または４つの結合部位を有することを意味する）。
【００６８】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に、天然抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体を指すために使用される。「天然抗体」は、種々の構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合した２つの軽鎖および２つの重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、引き続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、引き続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの型の１つに割り当てられ、そのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられ得る。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの型の１つに割り当てられ得る。
【００６９】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、それだけに限らないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボティ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、クロスＦａｂ断片；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および単一ドメイン抗体が挙げられる。一定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９〜１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有するダイアボティおよび抗体断片は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０、６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９〜１３４（２００３）にも記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。一定の実施形態では、単一ドメイン抗体が、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号参照）。抗体断片は、それだけに限らないが、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク質消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含む種々の技術によって作製され得る。
【００７０】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖および軽鎖可変ドメインならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片をもたらす。よって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬドメインおよび軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片ならびにＶＨドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原組み合わせ部位（２つのＦａｂ断片）およびＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。本発明によると、「Ｆａｂ断片」という用語はまた、以下で定義される「クロスＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」を含む。
【００７１】
「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変領域が交換される、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖、ならびに重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の定常領域が交換されると、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００７２】
「単鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであって、前記抗体ドメインおよび前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうちの１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；前記リンカーが少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸のポリペプチドである、ポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得るだろう（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）。
【００７３】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」または「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうちの１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１およびｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；ＶＨおよびＶＬは一緒になって、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得るだろう（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）。
【００７４】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０個〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで接続された、抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、フレキシビリティのためにグリシンに富むと同時に可溶性のためにセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができる、または逆もまた同様である。このタンパク質は、定常領域を除去し、リンカーを導入したにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６〜９６に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、すなわちＶＬドメインと集合して機能的抗原結合部位となることでき、またはＶＬドメインの特性を有する、すなわちＶＨドメインと集合して機能的抗原結合部位となることでき、それによって全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００７５】
「スキャフォールド抗原結合タンパク質」は、当技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチンおよび設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、抗原結合ドメインのための代替スキャフォールドとして使用されている。例えば、ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：２４５〜２５５（２００９）およびＳｔｕｍｐｐら、Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：６９５〜７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質が、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｙ））、リポカリン（アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ））、プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ））、Ａドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））、血清トランスフェリン（トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖または重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ））、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新抗原受容体βラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγクリスタリンまたはユビキチン（アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリーのタンパク質、ペプチドアプタマーおよびフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与える異種配列で置換され得る。異なる結合特異性を有するよう操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離可変領域とほぼ同じサイズである。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１〜２）、３１〜４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質などの小型疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。これらは、異なる標的抗原に結合するよう操作され得る円錐構造のオープンエンドのいくつかのループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンはサイズが１６０〜１８０個のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７〜３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９���号および米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するよう操作され得る黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来するスキャフォールドである。ドメインは、およそ５８個のアミノ酸の三重らせん束からなる。表面残基のランダム化によってライブラリーが作成されている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４、１７、４５５〜４６２および欧州特許第１６４１８１８号を参照されたい。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。およそ３５個のアミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造を採用している。Ａドメインのファミリーによって示される天然変異のシャフリングによって多様性が生まれる。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２）、１５５６〜１５６１（２００５）およびＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６）、９０９〜９１７（２００７年１月）を参照されたい。トランスフェリンはモノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、ペプチド配列を許容的な表面ループに挿入することによって、様々な標的抗原に結合するよう操作することができる。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例としてはトランスボディが挙げられる。さらなる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４、２４０６６〜２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一アンキリンリピートは２つのαヘリックスおよび１つのβターンからなる３３残基モチーフである。これらは、各リピートの第１のαヘリックスおよびβターン中の残基をランダム化することによって様々な標的抗原に結合するよう操作することができる。モジュールの数を増加させることによって、その結合面を増加させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９〜５０３（２００３）、ＰＮＡＳ  １００（４）、１７００〜１７０５（２００３）およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５〜１０２８（２００７）および米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照されたい。単一ドメイン抗体は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダの抗体重鎖の可変ドメインから誘導された（ナノボディまたはＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）またはサメに由来するＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するよう操作され得るスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。βサンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるようにするように操作することができる。さらなる詳細につ��ては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５〜４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号および米国特許第６８１８４１８号を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的には活性部位で挿入された限定された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３〜７９７（２００５）を参照されたい。マイクロボディは、３〜４個のシステイン架橋を含む、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例としてはＫａｌａｔａＢＩおよびコノトキシンおよびノッチンが挙げられる。微小タンパク質は、微小タンパク質の全体フォールドに影響を及ぼすことなく、最大２５個のアミノ酸を含むよう操作され得るループを有する。操作されたノッチンドメインについてのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
【００７６】
参照分子としての「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイで参照分子とその抗原の結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイで抗原結合分子とその抗原の結合を５０％以上ブロックする。
【００７７】
「抗原結合ドメイン」または「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、これと相補的な領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合し得る。抗原結合ドメインは、例えば、１つまたは複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」および「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の近接する伸長または非近接アミノ酸の様々な領域で構成されるコンフォメーション形状）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウイルス感染細胞の表面上、他の病気にかかった細胞の表面上、免疫細胞の表面上、血清中に遊離で、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出され得る。別途指示がない限り、本明細書中で抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施形態では、抗原がヒトタンパク質である。本明細書で特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」非プロセシングタンパク質ならびに細胞中でのプロセシングから得られた任意のタンパク質型を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を包含する。
【００７９】
「特異的結合」によって、結合が抗原について選択的であり、不要なまたは非特異的相互作用から識別され得ることが意味される。抗原結合分子が特異的抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７、３２３〜３２９（２０００））および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８、２１７〜２２９（２００２））を通して測定することができる。一実施形態では、抗原結合分子が非関連タンパク質に結合する程度が、例えばＳＰＲによって測定すると、抗原結合分子と抗原の結合の約１０％未満である。一定の実施形態では、抗原に結合する分子が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００８０】
「親和性」または「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離速度定数の結合速度定数（それぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）に対する比である解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。よって、等価な親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００８１】
「親和性成熟」抗体は、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）の１つまたは複数の変化を有さない親抗体と比較した、このような変化を有する抗体を指し、このような変化は抗体の抗原に対する親和性の改善をもたらす。
【００８２】
「標的細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞、特にがん細胞または腫瘍間質の細胞などの腫瘍の標的細胞の表面上に提示される抗原決定基を指す。よって、標的細胞抗原は、腫瘍関連抗原である。特に、標的細胞抗原は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１などの活性化Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体を含まない。一定の実施形態では、標的細胞抗原が、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一態様では、腫瘍標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３３からなる群から選択される。特に、腫瘍標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００８３】
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰまたはセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」という用語は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＡＰを指す。この用語は、「全長」非プロセシングＦＡＰならびに細胞中でのプロセシングから得られた任意のＦＡＰ型を包含する。この用語はまた、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子が、ヒト、マウスおよび／またはカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２）またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示される。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸２６位から７６０位まで広がる。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列は配列番号１４２に示される。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号１４３）またはＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示される。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸２６位から７６１位まで広がる。配列番号１４４は、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸を示す。配列番号１４５は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
【００８４】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原結合分子と抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般的に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい。単一ＶＨまたはＶＬドメインが抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００８５】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変である、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、天然四本鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループのアミノ酸残基および／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含み、後者は最高の配列可変性である、および／または抗原認識に関与している。例示的超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）で生じる。（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））。例示的ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５およびＨ３の９５〜１０２で生じる。（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。超可変領域（ＨＶＲ）は相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、本明細において、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して互換的に使用される。この特定の領域は、定義が互いと比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含むＫａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）によって記載されている。それにもかかわらず、いずれかの定義の抗体またはその変異体のＣＤＲの言及への適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図している。上に引用される参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として表Ａで以下に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化するだろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。
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【００８６】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のための番号付けシステムを定義した。当業者であれば、配列自体を超えた実験データに依存することなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを任意の可変領域配列に明白に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号付けシステムを指す。別途断りのない限り、抗体可変領域の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
【００８７】
ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲまたはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜５８およびＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２で生じる。（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）参照）。別途指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメインの他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本発明書では、Ｋａｂａｔら、上記に従って番号付けされる。
【００８８】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）中に以下の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８９】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００９０】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって所有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００９１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。一定の実施形態では、ヒト化抗体が、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合によりヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の型は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、元の抗体のものからさらに修正または変化して本発明による特性をもたらすものである。
【００９２】
「ヒト」抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるまたはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体の配列に相当するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００９３】
本明細書の「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで広がる。一実施形態では、炭水化物鎖が、ＣＨ２ドメインに結合している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインまたは変異ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに対してＣ末端の残基の伸長を含む（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインまたは変異ＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、その他方の鎖に対応する「空洞」（「ホール」）が導入されたＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許第５，８２１，３３３号参照）であり得る。このような変異ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進することができる。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域が、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで広がる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書で別途明示しない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００９４】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９、６１７〜６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８、７〜１５（２００１）に記載されている。一般的に、本方法は、第１のポリペプチドの界面の隆起（「ノブ」）および第２のポリペプチドの界面の対応する空洞（「ホール」）を導入して、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように空洞内に位置することができるようにすることを含む。隆起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。隆起と同一または類似のサイズの代償的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。隆起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変化させることによって、例えば部位特異的突然変異誘発によって、またはペプチド合成によって生成され得る。特定の実施形態では、ノブ修飾が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施形態では、ノブ修正を含むＦｃドメインのサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これらの２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成がもたらされ、よって二量体がさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８、７〜１５（２００１））。
【００９５】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに置換、付加または欠失をもたらすが、免疫グロブリンがエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性など）を媒介する能力を実質的に低下させない変化を有する変異体を含むことを意図している。例えば、１つまたは複数のアミノ酸を、生物学的機能を実質的に喪失することなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。このような変異体は、活性に対する効果が最小となるように当技術分野で公知の一般規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１０（１９９０）参照）。
【００９６】
「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプで変化する、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【００９７】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）の相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した、赤血球および対応する抗体で被覆された種々の他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１〜５２４参照）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプについての特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体についてのＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．およびＫｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７〜４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（１９９４）２５〜３４；ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０〜３４１；およびＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１〜２４８に記載されている。
【００９８】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害性および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体産生の調節を含む多種多様なエフェクター機能を駆動する。ヒトでは、３つのクラスのＦｃγＲが特徴を明らかにされており、以下の通りである：
−  ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性でモノマーＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上で発現される。アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つのＦｃ領域ＩｇＧの修飾は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に代入された２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３〜２６２４）。
−  ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧと中程度〜低い親和性で結合し、広く発現される。この受容体は２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上で見られ、殺傷過程を活性化することができるように思われる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害過程で役割を果たすように思われ、Ｂ細胞、マクロファージおよび肥満細胞および好酸球上で見られる。Ｂ細胞上では、これはさらなる免疫グロブリン産生および例えば、ＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチを抑制するよう機能するように思われる。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを通して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、Ｂ型はＩｇＥと別の受容体の結合を通してこれらの細胞の活性化を抑制するのを助け得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２およびＫ４１４（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つでの突然変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見られる。
−  ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ＩｇＧと中程度〜低い親和性で結合し、２つの型として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球およびいくつかの単球およびＴ細胞上で見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つでの突然変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見られる。
【００９９】
Ｆｃ受容体についてのヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上述の突然変異部位ならびにＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４に記載されている。
【０１００】
「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」という用語は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下での本明細書で報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。抗体がＡＤＣＣを媒介する初期ステップを誘導する能力は、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞、あるいはＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）などのＦｃγ受容体発現細胞への結合を測定することによって調べられる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合が測定される。
【０１０１】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域によるエンゲージメント後に、受容体保有細胞がエフェクター機能を行うよう刺激するシグナル伝達イベントを誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【０１０２】
別途指示がない限り、「ＣＤ４０」という用語は、本明細書で使用される場合、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ４０を指す。この用語は、「全長」非プロセシングＣＤ４０ならびに細胞中でのプロセシングから得られた任意のＣＤ４０型を包含する。この用語はまた、ＣＤ４０の天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を包含する。例示的ヒトＣＤ４０のアミノ酸配列は配列番号１（ＵｎｉｐｒｏｔＰ２５９４２、バージョン２００）に示され、例示的マウスＣＤ４０のアミノ酸配列は配列番号１４６（ＵｎｉｐｒｏｔＰ２７５１２、バージョン１６０）に示される。ＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーに属する５０ｋＤａ細胞表面糖タンパク質である。（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら（１９８９）、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１４０３〜１４１０）。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮、内皮細胞、線維芽細胞および平滑筋細胞を含む、多くの正常および腫瘍細胞型で発現される。ＣＤ４０は、全てのＢリンパ腫および全ての固形腫瘍の７０％で発現され、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦなどの成熟シグナルによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）で上方制御される。ＣＤ４０活性化はまた、単球の機能的樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導し、ＡＰＣ−ＣＤ４０誘導サイトカインを通してＮＫ細胞の細胞溶解活性を増強する。よって、ＣＤ４０は、ＡＰＣの成熟、ヘルパーサイトカインの分泌、共刺激分子の上方制御およびエフェクター機能の増強を誘導することによって、免疫応答の開始および増強において必須の役割を果たす。
【０１０３】
「ＣＤ４０アゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を刺激する任意の部分を含む。ＣＤ４０は、本文脈で使用される場合、好ましくはヒトＣＤ４０を指し、よって、ＣＤ４０アゴニストは、好ましくはヒトＣＤ４０のアゴニストである。典型的には、この部分はアゴニストＣＤ４０抗体または抗体断片である。
【０１０４】
「抗ＣＤ４０抗体」、「抗ＣＤ４０」、「ＣＤ４０抗体」および「ＣＤ４０に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＤ４０の標的化における診断剤および／または治療剤として有用になるように、十分な親和性でＣＤ４０に結合することができる抗体を指す。一態様では、抗ＣＤ４０抗体と非関連非ＣＤ４０タンパク質の結合の程度が、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定すると、抗体とＣＤ４０の結合の約１０％未満である。一定の実施形態では、ＣＤ４０に結合する抗体が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１０５】
「ペプチドリンカー」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であるまたは本明細書に記載される。適切な、非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー（式中、「ｎ」は一般的に１〜１０、典型的には２〜４、特に２の数である）、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号１４７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４８）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１４９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５０）からなる群から選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５１）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１５２）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１５３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１５４）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１５５）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１５６）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１５７）、ＧＧＳＧ（配列番号１５８）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１５９）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１６０）およびＧＧＮＧＳＧ（配列番号１６１）も含む。（Ｇ４Ｓ）（配列番号１４７）、（Ｇ４Ｓ）２またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４８）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１５２）および（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１５３）が特に目的のペプチドリンカーである。
【０１０６】
「アミノ酸」という用語は、本出願で使用される場合、アラニン（３文字表記：ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【０１０７】
「融合した（ｆｕｓｅｄ）」または「接続された（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」とは、成分（例えば、抗体の重鎖およびＦａｂ断片）が、ペプチド結合によって、直接的に、または１つもしくは複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【０１０８】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者が備えている技能の範囲内にある種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較している配列の完全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９で利用者文書でファイリングされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニアから公的に入手可能である、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に使用する状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ，  ｗｉｔｈ，  ｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ）所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して（ｔｏ，  ｗｉｔｈ，  ｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ）一定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現され得る）は、以下の通り計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２による同一の一致としてスコアリングされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるだろう。別途指定のない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されるように得られる。
【０１０９】
一定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましいだろう。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、適切な修飾を、分子をコードするヌクレオチド配列に導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有する限り、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って最終コンストラクトに到達することができる。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲおよびフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換を「好ましい置換」という見出しで表Ｂに提供し、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）に関して以下にさらに記載する。アミノ酸置換を目的の分子に導入し、産物を所望の活性、例えば保持された／改善した抗原結合、減少した免疫原性または改善したＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
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【０１１０】
アミノ酸を共通の側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１１１】
非保存的置換は、これらのクラスのあるもののメンバーと別のクラスの交換を伴う。
【０１１２】
「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、さらなる試験のために選択される得られた変異体（複数可）は、親抗原結合分子に対して一定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）を有する、および／または実質的に保持された親抗原結合分子の一定の生物学的特性を有する。例示的置換変異体は親和性成熟抗体であり、これは簡便には、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して作製され得る。手短に述べれば、１つまたは複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異抗原結合分子をファージ上にディスプレイさせ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。一定の実施形態では、置換、挿入または欠失が、このような変化が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲ中で行ってもよい。突然変異誘発のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５によって記載されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）の残基または群を同定し、中性または負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、抗体と抗原の相互作用が影響を及ぼされるかどうかを決定する。さらなる置換を、初期置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置で導入することができる。あるいはまたはさらに、抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造により抗体と抗原との間の接点を同定する。このような接触残基および隣接残基を、置換のための候補として標的化または排除することができる。変異体をスクリーニングして、所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
【０１１３】
アミノ酸配列挿入は、長さが１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ−および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する本発明の二重特異性抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入変異体には、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドとのＮまたはＣ末端融合体が含まれる。
【０１１４】
一定の実施形態では、本明細書で提供される二重特性抗原結合分子を変化させて、抗体がグリコシル化されている程度を増加または減少させる。分子のグリコシル化変異体は、簡便には１つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるまたは除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、そこに結合している炭水化物を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、一般的にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら  ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６〜３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した種々の炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸ならびにフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、一定の改善した特性を有する変異体を作り出すために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のオリゴ糖を修飾することができる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）または米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。別の態様では、二分オリゴ糖を含む、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の変異体が提供される。このような変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照されたい。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中の少なくとも１個のガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有することができ、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；および国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１１５】
一定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば分子の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様では、置換残基が分子の接触可能部位で生じる。それによると、これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基を抗体の接触可能部位に位置させ、これを使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分またはリンカー−薬物部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作り出すことができる。一定の態様では、以下の残基のいずれか１つまたは複数がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるように作製され得る。
【０１１６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子またはコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用的なホスホジエステル結合または非慣用的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
【０１１７】
「単離」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製（部分的もしくは実質的）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞内に含まれるポリヌクレオチド分子が含まれるが、ポリヌクレオチド分子が、染色体外またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離ＲＮＡ分子には、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物、ならびにプラス鎖およびマイナス鎖型、ならびに二本鎖型が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に産生されたこのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得る、またはこれらを含み得る。
【０１１８】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチド当たり最大５個の点突然変異を含んでもよいことを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％を欠失させるもしくは別のヌクレオチドで置換してもよい、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までのいくつかのヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの変化は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、またはこれらの末端位置間のどこでも、参照配列中の残基の間に個々に散在して、または参照配列内の１つもしくは複数の近接する群で起こり得る。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、慣習的にはポリペプチドについて上に論じられるもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）などの公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。
【０１１９】
「発現カセット」という用語は、標的細胞内での特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを含む、組換え的にまたは合成的に作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットを、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも、転写される核酸配列およびプロモーターを含む。一定の実施形態では、本発明の発現カセットが、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２０】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、それが標的細胞内で動作可能に会合された特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。いったん発現ベクターが標的細胞の内側にくると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞転写および／または翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターが、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【０１２１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、このような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代数にかかわらずこれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでもよい。元の形質転換細胞でスクリーニングまたは選択されるのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために使用され得る任意の型の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞、ほんの少し例を挙げれば、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。
【０１２２】
薬剤の「有効量」は、投与された細胞または組織中で生理的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【０１２３】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば疾患の有害作用を排除させる、減少させる、遅延させる、最小化するまたは予防する。
【０１２４】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、それだけに限らないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。特に、個体または対象はヒトである。
【０１２５】
「薬学的組成物」という用語は、そこに含有される有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
【０１２６】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象にとって非毒性の、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤には、それだけに限らないが、バッファー、安定剤または防腐剤が含まれる。
【０１２７】
「添付文書」という用語は、治療用製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌および／または使用に関する警告についての情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる説明書を指すために使用される。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変形）は、治療している個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、臨床病理学の予防のためまたはその経過中に行うことができる。望ましい治療効果には、それだけに限らないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減弱、転移の予防、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発症を遅延させるまたは疾患の進行を遅延させる。
【０１２９】
「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓もしくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫（上記がんのいずれかの難治性型、または上記がんの１つもしくは複数の組み合わせを含む）などの増殖性疾患を指す。
【０１３０】
「化学療法剤」という用語は、本明細書で使用される場合、がんの治療に有用な化学化合物を指す。一態様では、化学療法剤が代謝拮抗剤である。一態様では、代謝拮抗剤が、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジンおよびゲムシタビンからなる群から選択される。１つの特定の態様では、代謝拮抗剤がカペシタビンまたはゲムシタビンである。別の態様では、代謝拮抗剤がフルオロウラシルである。一態様では、化学療法剤が、微小管形成に影響を及ぼす薬剤である。一態様では、微小管形成に影響を及ぼす薬剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール、エトポシドおよびテニポシドからなる群から選択される。別の態様では、化学療法剤が、シクロホスファミドなどのアルキル化剤である。一態様では、化学療法剤が、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などの細胞傷害性抗生物質である。一態様では、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤がドキソルビシンである。
【０１３１】
本発明の二重特異性抗体
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、およびそれによりおそらく増強した有効性などの特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３２】
例示的二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３３】
特定の態様では、これらの二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０への標的化アゴニスト結合を特徴とする。特に、二重特異性抗原結合分子は、腫瘍関連標的細胞抗原に対して標的化されたＣＤ４０アゴニストである。別の特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、エフェクター機能を減少させる突然変異を含む、安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域を含む。エフェクター機能を減少させるまたは廃止する突然変異を含むＦｃ領域の使用によって、Ｆｃ受容体を介した架橋による非特異的アゴニズムが防止され、ＣＤ４０＋細胞のＡＤＣＣが防止される。
【０１３４】
本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子は、典型的にはがん細胞または腫瘍間質である標的細胞で免疫応答を選択的に誘導するという点で、ＣＤ４０に特異的に結合することができる従来の抗体に優る利点を有する。一態様では、腫瘍関連標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３３からなる群から選択される。
【０１３５】
特定の態様では、腫瘍関連標的細胞抗原がＦＡＰである。
【０１３６】
これらの二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０へのＦＡＰ標的化アゴニスト結合を特徴とする。ＦＡＰ発現細胞の存在下では、二重特異性抗原結合分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、実施例２．１）を活性化する、ヒトＢ細胞（実施例２．１．１および２．１．３）、ヒトＤａｕｄｉ細胞（実施例２．１．２）およびヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ、実施例２．１．４）を活性化することができる。
【０１３７】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１３８】
別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１３９】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含み、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む。
【０１４０】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含み、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む。
【０１４１】
別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４２】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４３】
さらなる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３および配列番号１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４４】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｃ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｅ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｆ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｈ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｉ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｊ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｋ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｌ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｍ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｎ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｐ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４５】
特定の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４６】
なお別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４７】
一態様では、
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｅ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｆ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｈ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｊ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｋ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｌ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４８】
特定の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、またはＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４９】
標的細胞抗原がＦＡＰである二重特異性抗原結合分子
特定の態様では、標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、全体が参照により含まれる国際公開第２０１２／０２００６号に記載されている。特に目的のＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
【０１５０】
一態様では、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５１】
別の態様では、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５２】
特に、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）が（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）が（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む。
【０１５３】
さらなる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５４】
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、またはＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５５】
ＣＤ４０およびＦＡＰに結合する二重特異性抗原結合分子
別の態様では、
（ｉ）配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号２６、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５６】
さらなる態様では、
（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５７】
特定の態様では、
（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）および配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５８】
別の特定の態様では、
（ｉ）配列番号１７９または配列番号１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、および配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５９】
さらなる態様では、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含み、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６０】
さらに、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含み、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６１】
別の態様では、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含み、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６２】
別の態様では、
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含み、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６３】
二重特異性、一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１６４】
特定の態様では、前記分子が、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。一態様では、標的細胞抗原がＦＡＰである。
【０１６５】
一態様では、前記分子が、
（ｉ）配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号２６、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６６】
一態様では、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６７】
別の態様では、前記分子が、
（ｉ）配列番号２５、配列番号３３、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号２６、配列番号３４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６８】
１つの特定の態様では、前記分子が、
（ｉ）配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６９】
特定の態様では、前記分子が、（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）および配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１７０】
別の特定の態様では、前記分子が、（ｉ）配列番号１７９または配列番号１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）および配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１７１】
特定の態様では、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１７２】
ＣＤ４０への結合について二価および標的細胞抗原への結合について一価の二重特異性抗原結合分子（２＋１フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７３】
よって、ＣＤ４０について二価であり、標的細胞抗原について一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１７４】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインであって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインがそれぞれペプチドリンカーを介して２つの重鎖のＣ末端の一方に接続されているＶＨおよびＶＬドメインと
を含む。
【０１７５】
特定の態様では、ペプチドリンカーが、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５２および配列番号１５３から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに特に、ペプチドリンカーは配列番号１５３を含む。
【０１７６】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインであって、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介して重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬドメインと
を含む。
【０１７７】
別の特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインであって、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介してＦｃノブ重鎖のＣ末端に接続されており、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介してＦｃホール重鎖のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬドメインと
を含む。
【０１７８】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインであって、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介してＦｃノブ重鎖のＣ末端に接続されており、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介してＦｃホール重鎖のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬドメインと
を含む。
【０１７９】
一態様では、本発明は、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１８０】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８１】
別の態様では、本発明は、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１８２】
特に、ＶＨドメインは配列番号９または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）であり、ＶＬドメインは配列番号１０または配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）である。さらに特に、ＶＨドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）であり、ＶＬドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）である。
【０１８３】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）各々が配列番号８２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号８８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｂ）各々が配列番号１３３のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号１３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８４】
別の特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片であって、ペプチドリンカーを介して重鎖の一方のＣ末端に接続されているＦａｂ断片と
を含む。
【０１８５】
一態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片であって、（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１８６】
特に、特異的に結合することができるＦａｂ断片はクロスオーバーｆａｂ断片である。
【０１８７】
一態様では、本発明は、各々が配列番号１３７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖と、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８８】
さらなる態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含むＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーｆａｂ断片であって、ＶＨ−ＣＬ鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１８９】
一態様では、ＶＨ−ＣＬ鎖がＦＣノブ重鎖のＣ末端に接続されている。
【０１９０】
別の態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含むＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーｆａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１９１】
一態様では、ＶＬ−ＣＨ１鎖がＦＣノブ重鎖のＣ末端に接続されている。
【０１９２】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）各々が配列番号１６５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号１６８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｂ）各々が配列番号２４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｃ）各々が配列番号２４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｄ）各々が配列番号２４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｅ）各々が配列番号２５６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２５８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９３】
ヘッドトゥーテールフォーマットの二重特異性抗原結合分子（２＋１）
別の態様では、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む重鎖と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＦｃ領域サブユニットを含む重鎖と、
（ｃ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｄ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＬドメインを含む軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１９４】
特に、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、各々が配列番号１６５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１９５】
ＣＤ４０への結合について二価であり、標的細胞抗原への結合について二価である二重特異性抗原結合分子（２＋２フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９６】
よって、ＣＤ４０について二価であり、標的細胞抗原について二価である、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１９７】
一態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、２つのＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１９８】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）各々が配列番号８６のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖、
各々が配列番号８７のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖、および
各々が配列番号９０のアミノ酸配列を含む、２つの重鎖、または
（ｂ）各々が配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖、
各々が配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖、および
各々が配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、２つの重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９９】
ＣＤ４０への結合について四価であり、標的細胞抗原への結合について一価である二重特異性抗原結合分子（４＋１フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２００】
よって、ＣＤ４０について四価であり、標的細胞抗原について一価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２０１】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、その各２つが場合によりペプチドリンカーを介して、重鎖で互いに融合している、二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、ペプチドリンカーが配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。さらに特に、抗原結合分子はそれぞれＶＨＣＨ１−ペプチドリンカー−ＶＨＣＨ１断片を含む２つの重鎖を含む。特定の態様では、ペプチドリンカーが配列番号１４８のアミノ酸配列を有する。
【０２０２】
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインがＶＨおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に接続されており、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に接続されている、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２０３】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）重鎖の各々がＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインに融合したＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインであって、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介して重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬドメインと
を含む。
【０２０４】
特定の態様では、ペプチドリンカーが、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５２および配列番号１５３から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに特に、ペプチドリンカーは配列番号１５３を含む。
【０２０５】
一態様では、
（ａ）各軽鎖が配列番号２６、配列番号３４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）重鎖の各々がＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１およびＦｃ領域サブユニットを含み、両ＶＨドメインが配列番号２５、配列番号３３、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）を含む、２つの重鎖と、
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインであって、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介して重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２０６】
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片と、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨおよびＶＬドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２０７】
特に、ＶＨドメインは配列番号９または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）であり、ＶＬドメインは配列番号１０または配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）である。さらに特に、ＶＨドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）であり、ＶＬドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）である。
【０２０８】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）各々が配列番号８２のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｂ）各々が配列番号１３３のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号１３２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２０９】
別の特定の態様では、本発明は、
（ａ）各々が配列番号９７のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む、マウスＣＤ４０に特異的に結合することができる二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２１０】
一態様では、
（ａ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）重鎖の各々がＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインに融合したＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｃ）（ｂ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２１１】
特に、特異的に結合することができるＦａｂ断片はクロスオーバーｆａｂ断片である。
【０２１２】
一態様では、
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２１３】
特に、特異的に結合することができるＦａｂ断片はクロスオーバーｆａｂ断片である。
【０２１４】
さらなる態様では、
（ａ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖であって、ＶＬが配列番号２６、配列番号３４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）各重鎖がＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１鎖およびＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖であって、両ＶＨドメインが配列番号２５、配列番号３３、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）を含む、２つの重鎖と、
（ｃ）ＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含むＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ断片であって、ＶＨ−ＣＬ鎖が（ｂ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーＦａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２１５】
一態様では、ＶＨ−ＣＬ鎖がＦＣノブ重鎖のＣ末端に接続されている。
【０２１６】
さらなる態様では、
（ａ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖であって、ＶＬが配列番号２６、配列番号３４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、４つの軽鎖と、
（ｂ）各重鎖がＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１鎖およびＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖であって、両ＶＨドメインが配列番号２５、配列番号３３、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）を含む、２つの重鎖と、
（ｃ）ＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含むＦＡＰに特異的に結合することができるクロスオーバーｆａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖が（ｂ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーｆａｂ断片と
を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２１７】
一態様では、ＶＬ−ＣＨ１鎖がＦＣノブ重鎖のＣ末端に接続されている。
【０２１８】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）各々が配列番号１６５のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号１７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｂ）各々が配列番号２４３のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２４５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｃ）各々が配列番号２４３のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２４６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２４７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または
（ｄ）各々が配列番号２４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、配列番号２４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号２５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２１９】
ＣＤ４０への結合について四価であり、標的細胞抗原への結合について二価である二重特異性抗原結合分子（４＋２フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２２０】
よって、ＣＤ４０について四価であり、標的細胞抗原について二価である二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２２１】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つの抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、その各２つが場合によりペプチドリンカーを介して互いに融合している二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、ペプチドリンカーが配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。さらに特に、抗原結合分子はそれぞれＶＨＣＨ１−ペプチドリンカー−ＶＨＣＨ１断片を含む２つの重鎖を含む。特定の態様では、ペプチドリンカーが配列番号１４８のアミノ酸配列を有する。
【０２２２】
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、第１のＦａｂ断片がペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に接続されており、第２のＦａｂ断片がペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に接続されている、二重特異性抗原結合分子が提供される。一態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片が、それぞれＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含むクロスオーバーＦａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖が２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーＦａｂ断片である。
【０２２３】
特定の態様では、本発明は、各々が配列番号８６のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖と、各々が配列番号８７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、配列番号８５のアミノ酸配列を含む２つの重鎖とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２２４】
別の態様では、本発明は、各々が配列番号１００のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖と、各々が配列番号９９のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む２つの重鎖とを含む、マウスＣＤ４０に特異的に結合することができる二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２２５】
Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能を減少させるＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインをさらに含む。
【０２２６】
一定の態様では、１つまたは複数のアミノ酸修飾を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入して、それによってＦｃ領域変異体を作製することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２２７】
Ｆｃドメインは、標的組織中での優れた蓄積に寄与する長い血清半減期および好ましい組織−血液分配比を含む、好ましい薬物動態特性を本発明の二重特異性抗体に付与する。しかしながら、同時に、これは、本発明の二重特異性抗体の、好ましい抗原保有細胞よりもむしろ、Ｆｃ受容体を発現している細胞への望ましくない標的化につながり得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインが、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  ＦｃドメインまたはＩｇＧ４  Ｆｃドメインと比較して、減少したＦｃ受容体に対する結合親和性および／または減少したエフェクター機能を示す。特に、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０２２８】
１つのこのような態様では、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（もしくは天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性、および／または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（もしくは天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、実質的にＦｃ受容体に結合しない、および／またはエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体が活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体が抑制性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が抑制性ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能が、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびサイトカイン分泌の１つまたは複数である。特定の態様では、エフェクター機能がＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインが、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、実質的に類似の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を示す。実質的に類似のＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超、特に約８０％超、さらに特に約９０％超を示す場合に達成される。
【０２２９】
特定の態様では、Ｆｃドメインを、非操作Ｆｃドメインと比較して、減少したＦｃ受容体に対する結合親和性および／または減少したエフェクター機能を有するよう操作する。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインが、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に同じ１つまたは複数のアミノ酸突然変異が存在する。一態様では、アミノ酸突然変異が、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を減少させる。別の態様では、アミノ酸突然変異が、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍減少させる。一態様では、操作Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子が、非操作Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらに特に５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体が抑制性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が抑制性ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体が活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々への結合が減少する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も減少する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性が減少しない。実質的に類似のＦｃＲｎへの結合、すなわち、Ｆｃドメインの前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、Ｆｃドメインの非操作型（または前記Ｆｃドメインの非操作型を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を示す場合に、達成される。Ｆｃドメイン、または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。一定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインを、非操作Ｆｃドメインと比較して、減少したエフェクター機能を有するよう操作する。減少したエフェクター機能には、それだけに限らないが、以下の１つまたは複数が含まれ得る：減少した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、減少した抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、減少した抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、減少したサイトカイン分泌、減少した抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、減少したＮＫ細胞への結合、減少したマクロファージへの結合、減少した単球への結合、減少した多形核細胞への結合、減少したアポトーシスを誘導する直接シグナル伝達、減少した樹状細胞成熟または減少したＴ細胞プライミング。
【０２３０】
減少したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つまたは複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位の２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。改善したまたは減少したＦｃＲｓへの結合を有する一定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４）。
【０２３１】
本発明の一態様では、Ｆｃドメインが、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１およびＰ３２９位でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施形態では、ＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインが、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様では、アミノ酸置換がＰ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換、およびＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓからなる群から選択されるさらなるアミノ酸置換を含む。さらに特定の実施形態では、Ｆｃドメインがアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ＰＣＴ特許出願番号、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消滅させる。前記文献はまた、このような突然変異Ｆｃドメインを調製する方法およびＦｃ受容体結合またはエフェクター機能などのその特性を決定する方法も記載している。このような抗体は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する、または突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）。
【０２３２】
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。さらに具体的な実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。さらに具体的な実施形態では、Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８ＰおよびＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３８、８４〜９１（２０１０）参照）。
【０２３３】
母方ＩｇＧの胎児への移行を担う（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７〜５９３、およびＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９〜２４３４）、増加した半減期および改善した新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を有する抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎの結合を改善する１つまたは複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の１つまたは複数での置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。Ｆｃ領域変異体の他の例に関するＤｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８８）７３８〜７４０；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；および国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
【０２３４】
Ｆｃ受容体との結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装および組換え発現によって得られ得るようなＦｃ受容体を使用したＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができる。適切なこのような結合アッセイは本明細書に記載される。あるいは、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性を、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞などの特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価することができる。ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３、７０５９〜７０６３（１９８６）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２、１４９９〜１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６、１３５１〜１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリーのための非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５、６５２〜６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価することができる。
【０２３５】
以下の節は、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能を減少させるＦｃドメイン修飾を含む本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、ならびに（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン（ＦｃドメインがＦｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む）に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃドメインがエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインがアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０２３６】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方または他方に融合した、異なる抗原結合部位を含み、よって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットが２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え共発現およびその後の二量体化が、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。よって、組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率および純度を改善するために、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに導入することが有利であるだろう。
【０２３７】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。よって、一態様では、前記修飾がＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。
【０２３８】
具体的な態様では、前記修飾が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方の「ノブ」修飾およびＦｃドメインの２つのサブユニットの他方の「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾である。よって、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子であって、ノブ・イントゥ・ホール法により、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２３９】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９、６１７〜６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８、７〜１５（２００１）に記載されている。一般的に、本方法は、第１のポリペプチドの界面の隆起（「ノブ」）および第２のポリペプチドの界面の対応する空洞（「ホール」）を導入して、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように空洞内に位置することができるようにすることを含む。隆起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。隆起と同一または類似のサイズの代償的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。
【０２４０】
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に位置することができる隆起が第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が位置することができる空洞が第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成される。隆起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変化させることによって、例えば部位特異的突然変異誘発またはペプチド合成によって作り出され得る。具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニット中で、さらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
【０２４１】
なおさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット中で、さらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット中で、さらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２個のシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体がさらに安定化される（Ｃａｒｔｅｒ（２００１）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８、７〜１５）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み（ＥＵ番号付け）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２４２】
代替態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの会合を促進する修飾が、例えばＰＣＴ公開、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体形成が静電気的に好ましくなくなるが、ヘテロ二量体化が静電気的に好ましくなるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面の１つまたは複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基による置き換えを伴う。
【０２４３】
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫを有する完全なＣ末端終末であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つまたは２つが除去されている短縮Ｃ末端であり得る。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端が短縮Ｃ末端終末ＰＧである。本明細書で報告される全ての態様の一態様では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体が、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを含む（Ｇ４４６およびＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。本明細書で報告される全ての態様の一実施形態では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体が、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２４４】
Ｆａｂドメインの修飾
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆａｂ断片の一方で、可変ドメインＶＨおよびＶＬ、または定常ドメインＣＨ１およびＣＬが交換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２４５】
１つの結合アーム中にドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬまたはＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７〜１１９１に詳細に記載されている。これらは明らかに、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチによって引き起こされる副産物を減少させる（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）。
【０２４６】
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆａｂ断片の一方で、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。さらに特に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片で、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている。
【０２４７】
特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子であって、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。このような分子は、一価二重特異性抗原結合分子と呼ばれる。
【０２４８】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子であって、前記追加のＦａｂ断片がそれぞれ、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されている、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、追加のＦａｂ断片が、ＶＨドメインが軽鎖の一部となり、ＶＬドメインが重鎖の一部となるように、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、Ｆａｂ断片である。
【０２４９】
よって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子であって、前記標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、ＶＬ−ＣＨ鎖がそれぞれ、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されているクロスオーバーＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を含む。
【０２５０】
別の態様では、正確なペアリングをさらに改善するために、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子が、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は交差または非交差ＣＨ１およびＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つで、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの１つで、１４７位（ＥＵ番号付け）および２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２５１】
本発明の例示的抗体
一態様では、本発明は、ＣＤ４０に特異的に結合する新たな抗体および抗体断片を提供する。これらの抗体は、これらの抗体を標的細胞抗原に特異的に結合することができる別の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子への組込みに特に適したものにする、既知のＣＤ４０抗体と比較して優れた特性を有する。新たな抗体は、多量におよび高い力価で製造可能である、高い熱安定性（凝集温度Ｔａｇｇによって測定される）を示す、または高いヒト性（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）の程度を有するので、ヒトの体内で免疫原性が少ないという点をさらに特徴とする。ヒト生殖系列配列と比較したＶＨおよびＶＬ配列のヒト性の割合は、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，Ｋ．Ｒ．およびＭａｒｔｉｎ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．２００７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００７、３６９、８５２〜８６２に記載される方法によって決定することができる。対応するデータを表２４および表２５に示す。
【０２５２】
一態様では、
（ｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｖｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｖｉｉｉ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｖｉｉｉ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｉｘ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｘ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｘｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｘｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｘｉｉｉ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｘｉｖ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｘｖ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体が提供される。
【０２５３】
別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体と結合について競合する抗体であって、本明細書で前に定義される（ｉ）〜（ｘｖ）の重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬのいずれかを含む抗体が提供される。
【０２５４】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体と結合について競合する抗体であって、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む抗体が提供される。
【０２５５】
さらなる態様では、
（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｖｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、または
（ｖｉｉｉ）配列番号１１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体が提供される。
【０２５６】
別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体と結合について競合する抗体であって、本明細書で前に定義される（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬのいずれかを含む抗体が提供される。
【０２５７】
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体と結合について競合する抗体であって、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む抗体が提供される。特に、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体が提供される。
【０２５８】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子もしくはその断片をコードする単離ポリヌクレオチド、または本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２５９】
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして、または共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段を通して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合して、免疫グロブリンを形成する。
【０２６０】
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドが、本明細書に記載される本発明による二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２６１】
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【０２６２】
一定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸がＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡである、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。
【０２６３】
組換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドが提供される。二重特異性抗原結合分子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために１つまたは複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドを容易に単離し、慣用的な手順を使用して配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であり得る、または核酸断片であり得る。発現ベクターは、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと動作可能に会合した、二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドをクローニングする発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができるが、存在する場合、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一ベクター、または別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば別個の（異なる）ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターは単一コード領域を含み得る、または２つ以上のコード領域を含み得る、例えば本発明のベクターは１つまたは複数のポリペプチドをコードすることができ、これがタンパク質分解切断を介して最終タンパク質に翻訳後にまたは翻訳と同時に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子もしくはそのポリペプチド断片、またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合したまたは融合していない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊エレメントまたはモチーフを含む。動作可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列（複数可）の影響または制御下に置くように１つまたは複数の調節配列と会合している場合である。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害もせず、ＤＮＡ鋳型が転写される能力も妨害しない場合に、２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域およびこれと会合したプロモーターなど）が「動作可能に会合されている」。よって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができる場合に、プロモーター領域はその核酸と動作可能に会合されているだろう。プロモーターは、所定の細胞内でのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと動作可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。
【０２６４】
適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書で開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、それだけに限らないが、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどの脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギαグロブリンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。追加の適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、それだけに限らないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、および／または染色体組込エレメント、例えばレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）もしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴を含み得る。
【０２６５】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域を、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、いったん粗面小胞体を横切る成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的にポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが翻訳ポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌または「成熟」型が産生されることを認識している。一定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、またはポリペプチドと動作可能に会合されたポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。
【０２６６】
後の精製を促進する（例えば、ヒスチジンタグ）または融合タンパク質の標識を助けるために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド内にまたはその末端に含めてもよい。
【０２６７】
本発明のさらなる態様では、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。一定の態様では、本発明の１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチドおよびベクターは、それぞれポリヌクレオチドおよびベクターに関して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込み得る。一態様では、宿主細胞が、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、ベクターで形質転換されているまたはトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質またはその断片を産生するよう操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製するおよびその発現を支持するのに適した宿主細胞は当技術分野で周知である。このような細胞を特定の発現ベクターで必要に応じてトランスフェクトまたは形質導入することができ、多量のベクター含有細胞を播種大規模発酵槽で増殖させて、臨床用途にとって十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞には、原核微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが含まれる。例えば、特にグリコシル化が必要とされない場合、ポリペプチドを細菌中で産生させることができる。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分で単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、そのグリコシル化経路を「ヒト化」して、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす、真菌および酵母株を含む、糸状菌または酵母などの真核微生物がポリペプチドコードベクターに適したクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２、１４０９〜１４１４（２００４）およびＬｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４、２１０〜２１５（２００６）を参照されたい。
【０２６８】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と合わせて使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁で培養するよう適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３６、５９（１９７７）に記載される２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２３、２４３〜２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ３８３、４４〜６８（１９８２）に記載されている）、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７、４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した一定の哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５〜２６８頁（２００３）を参照されたい。宿主細胞には、培養細胞、例えば、ほんの少し例を挙げれば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞が真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を操作して、発現産物が重鎖と軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるように免疫グロブリン鎖の他方も発現するようにすることができる。
【０２６９】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片を作製する方法であって、本明細書で提供される本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養することと、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片を回収することとを含む方法が提供される。
【０２７０】
本明細書に記載されるように調製される本発明の二重特異性分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、部分的には、正味荷電、疎水性、親水性等などの因子に依存し、当業者に明らかであるだろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体または抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡまたはプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に本質的に記載されるように抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子またはその断片の純度を、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む種々の周知の分析法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現される二重特異性抗原結合分子は、還元または非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実証されるように、インタクトであり、適切に組み立てられていることが示された。
【０２７１】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子を、当技術分野で公知の種々のアッセイによって、その結合特性および／または生物活性について特徴を明らかにすることができる。特に、これらを実施例でより詳細に記載されるアッセイによって特徴を明らかにする。
【０２７２】
１．結合アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子と対応する標的発現細胞の結合は、例えばヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を発現するマウス線維芽細胞株およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を使用することによって評価することができる。本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子とＣＤ４０の結合は、実施例４．２．８に記載されるラージ細胞を使用することによって決定することができる。
【０２７３】
２．活性アッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子を生物活性について試験する。生物活性には、二重特異性抗原結合分子の有効性および特異性が含まれ得る。有効性および特異性は、標的抗原の結合でＣＤ４０受容体を通したアゴニストシグナル伝達を示すアッセイによって実証される。さらに、二重特異性抗原結合分子とインキュベートした樹状細胞（ＤＣ）を使用して、インビトロＴ細胞プライミングアッセイを行う。
【０２７４】
薬学的組成物、製剤および投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物が、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物が、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば以下に記載される、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
【０２７５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解または分散された治療的有効量の１種または複数の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的にまたは薬理的に許容される」という句は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって一般的に非毒性である、すなわち、例えば必要に応じてヒトなどの動物に投与した場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の都合の悪い反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本発明による少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子と、場合により追加の有効成分とを含有する薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０によって例示されるように、本開示に照らして当業者に知られているだろう。特に、組成物は凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者に知られるように、任意のおよび全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤およびこれらの組み合わせを含む。
【０２７６】
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内筋肉内、髄腔内または腹腔内注射によって投与するために設計されたものを含む。注射用に、本発明の二重特異性抗原結合分子を、水溶液、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液または生理的食塩水バッファーに製剤化することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。あるいは、二重特異性抗原結合分子は、使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であり得る。滅菌注射液は、必要量の本発明の抗原結合分子を、必要に応じて、種々の以下に列挙される他の成分を含む適切な溶媒に組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成することができる。一般的に、分散液は、種々の滅菌有効成分を、塩基性分散媒および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液、懸濁液またはエマルジョンを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前に滅菌濾過したその液体媒体からの、有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥または凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤はまず、十分な食塩水またはグルコースで注射前に等張性を付与されるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護すべきである。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容される賦形剤には、それだけに限らないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の溶解度を増加させて高度濃���溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液を、適切な油性注射懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはエチルクリート（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）もしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。
【０２７７】
有効成分を、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形物品、例えば膜またはマイクロカプセルの形態である。特定の実施形態では、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはこれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することによって、注射用組成物の延長された吸収をもたらすことができる。
【０２７８】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤にはさらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの間質性薬物分散剤が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む一定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰがコンドロイチナーゼなどの１種または複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２７９】
例示的凍結乾燥抗体製剤は米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸塩バッファーを含む。
【０２８０】
上記組成物に加えて、抗原結合分子をデポー調製物として製剤化してもよい。このような長時間作用性製剤は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。よって、例えば、融合タンパク質を、適切なポリマーもしくは疎水性物質（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化してもよい。
【０２８１】
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、慣用的な混合、溶解、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥方法によって製造され得る。薬学的組成物は、タンパク質の、薬学的に使用することができる調製物への加工を容易にする１種または複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して慣用的な様式で製剤化され得る。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。
【０２８２】
二重特異性抗原結合分子を遊離酸または塩基、中性または塩型の組成物に製剤化してもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸または塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、あるいは例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。薬学的塩は、対応する遊離塩基型よりも水性および他のプロトン性溶媒に可溶性である傾向がある。
【０２８３】
本明細書の組成物はまた、治療している特定の適応症に必要な２種以上の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。このような有効成分は、適切には意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。
【０２８４】
インビボ投与に使用するための製剤は一般的に滅菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
【０２８５】
治療方法および組成物
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれも治療方法に使用され得る。治療方法に使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子を、優れた医療行為に一致した様式で製剤化、服用および投与することができる。本文脈において検討する因子には、治療している特定の障害、治療している特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に知られている他の因子が含まれる。
【０２８６】
一態様では、医薬として使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２８７】
さらなる態様では、（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、（ｖｉｉ）感染症を治療するのに使用するための、本明細書の二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、疾患を治療するのに使用するため、特にがんの治療に使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２８８】
一定の態様では、治療方法に使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用するための、本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子を提供する。一定の態様では、本発明は、治療的有効量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。一定の態様では、治療される疾患が、がんである。治療を必要とする対象、患者または「個体」は、典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０２８９】
一態様では、（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、または（ｖｉｉ）感染症を治療する方法であって、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を、それを必要とする個体に投与することを含む方法が提供される。
【０２９０】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造または調製における本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様では、医薬が、治療的有効量の医薬を、疾患を有する個体に投与することを含む、疾患を治療する方法に使用するためのものである。一定の態様では、治療される疾患が増殖性障害、特にがんである。がんの例としては、それだけに限らないが、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がんおよび腎臓がんが挙げられる。がんの他の例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽腫、肉腫および白血病が挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体を使用して治療することができる他の細胞増殖性障害には、それだけに限らないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌線（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頚部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域および泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん性状態または病変およびがん転移も含まれる。一定の実施形態では、がんが、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頚部がんからなる群から選択される。当業者であれば、多くの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体が治癒を提供することができないが、利益を提供することができることを容易に認識する。いくつかの態様では、ある利益を有する生理的変化も治療的に有益であるとみなされる。よって、いくつかの態様では、生理的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の量が「有効量」または「治療的有効量」とみなされる。
【０２９１】
疾患を予防または治療するため、（単独でまたは１種もしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合）本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、具体的な分子、疾患の重症度および経過、本発明の二重特異性抗原結合分子を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前のまたは同時の治療介入、患者の臨床歴ならびに二重特異性抗原結合分子に対する反応、ならびに担当医の裁量に依存する。投与を担う実務家は、いずれにしても、個々の対象のための組成物中の有効成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。それだけに限らないが、単回投与または種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与およびパルス注入を含む種々の投与スケジュールが本明細書で企図される。
【０２９２】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、適切には一度にまたは一連の治療にわたって患者に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば１回もしくは複数回の別個の投与、または連続注入のいずれにしても、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗原結合分子が、患者に投与するための初期候補投与量となり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上に及び得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、治療が一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持されるだろう。本発明の二重特異性抗原結合分子の１つの例示的投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であるだろう。他の例では、用量が、１投与当たり約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上、およびその中の任意の導出可能な範囲も含み得る。本明細書に列挙される数値から導出可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重等の範囲を投与することができる。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）の１つまたは複数の用量が患者に投与され得る。このような用量は、間欠的に、例えば１週間毎または３週間毎に投与され得る（例えば、患者が約２回〜約２０回、または例えば約６回の融合タンパク質の投与を受けるように）。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が３週間毎に投与される。初期のより高い負荷用量、引き続いて１回または複数回の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有用となり得る。この治療の進行は、慣用的な技術およびアッセイによって容易に監視される。
【０２９３】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、一般的に意図した目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療または予防するために使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与または施用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分当業者の能力の範囲内にある。全身投与については、治療的有効用量を、最初に細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定することができる。次いで、用量を動物モデルに処方して、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。初期投与量は、当技術分野で周知の技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。
【０２９４】
投与量および間隔を個々に調節して、治療効果を維持するのに十分な本発明の二重特異性抗原結合分子の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日に及ぶ。治療的有効血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成され得る。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定され得る。局所投与または選択的取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の有効局所濃度は、血漿濃度に関連し得ない。当業者であれば、不当な実験をすることなく治療的有効局所投与量を最適化することができるだろう。
【０２９５】
本明細書に記載される本発明の二重特異性抗原結合分子の治療的有効用量は一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益を提供する。融合タンパク質の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物試験を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体が高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトへの使用に適した投与量の範囲を製剤化するのに使用することができる。投与量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、種々の因子、例えば使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁、全体が参照により本明細書に組み込まれる、参照）。
【０２９６】
本発明の融合タンパク質で治療される患者の担当医であれば、毒性、臓器機能不全などにより投与をいつどのように終結、中断または調節するか分かるだろう。逆に、担当医であれば、（毒性を排除しながら）臨床反応が十分でない場合に、治療をより高レベルに調節することも分かっているだろう。目的の障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などで変化する。状態の重症度は、例えば、一部は標準的な予後評価方法によって評価され得る。さらに、用量およびもしかすると投与頻度も、個々の患者の年齢、体重および反応によって変化するだろう。
【０２９７】
他の薬剤および治療
本発明の二重特異性抗原結合分子は、治療で１種または複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与され得る。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体の症状または疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療している特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。一定の実施形態では、追加の治療剤が別の抗がん剤、例えば微小管攪乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤または抗血管新生剤である。一定の態様では、追加の治療剤が免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤または細胞増殖抑制剤、細胞アポトーシスの活性化剤、またはアポトーシス誘導剤に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。
【０２９８】
よって、二重特異性抗原結合分子が化学療法剤、放射線および／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療に使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子またはこれらを含む薬学的組成物が提供される。
【０２９９】
このような他の薬剤は、適切には意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害または治療の種類、および上で論じられる他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体は、一般的に同じ投与量および本明細書に記載される投与経路で、または本明細書に記載される投与量の約１〜９９％で、または適切であると経験的／臨床的に決定された任意の投与量および任意の経路によって使用される。
【０３００】
上記のこのような併用療法は、組み合わせ投与（２種以上の治療剤が同じまたは別個の組成物に含まれる）、および別個の投与（この場合、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の投与が、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前、これと同時および／またはこの後に行われ得る）を包含する。
【０３０１】
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防および／または診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に結合したラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独のあるいは状態を治療、予防および／または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針によって穴開け可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の二重特異性抗原結合分子である。
【０３０２】
ラベルまたは添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）組成物を中に含有する第１の容器であって、組成物が本発明の二重特異性抗原結合分子を含む容器と；（ｂ）組成物を中に含有する第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害剤または治療剤を含む容器とを含み得る。本発明の実施形態の製造品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを示す添付文書をさらに含み得る。
【０３０３】
あるいはまたはさらに、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（または第３の）容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業的観点および使用者観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
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【０３０４】
以下の番号付けされたパラグラフ（パラ）は、最初の優先権出願による本発明の態様を記載する：
１．
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む二重特異性抗原結合分子。
２．
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域
をさらに含む、パラ１に記載の二重特異性抗原結合分子。
３．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ１またはパラ２に記載の二重特異性抗原結合分子。
４．標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、パラ１から３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
５．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ１またはパラ２に記載の二重特異性抗原結合分子。
６．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、パラ１から５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
７．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、パラ１から６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
８．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む、パラ１から７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
９．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む、パラ１から７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、パラ１から９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と
を含む、パラ１から８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、パラ１から８または１１のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．（ｉ）配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、ならびに配列番号２６、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む、パラ１から８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．Ｆｃ領域がＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、パラ２から１３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、パラ２から１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．Ｆｃ領域が、（ｉ）アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラス、または（ｉｉ）アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むマウスＩｇＧ１サブクラスのものである、パラ２から１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域の第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、パラ２から１６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃ領域の第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがホールを含む、パラ２から１７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、または
（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、
パラ２から１８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２０．（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと
を含む、パラ１から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２１．（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されているＶＨおよびＶＬと
を含む、パラ１から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２２．（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、２つのＦａｂ断片と
を含む、パラ１から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２３．（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む、パラ１から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２４．（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ接続に結合している、２つのＦａｂ断片と
を含む、パラ１から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２５．
（ａ）各重鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片と
を含む、パラ１から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２６．ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片または２つのＦａｂ断片が、各々がＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含み、ＶＬ−ＣＨ１鎖が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されているクロスオーバーＦａｂ断片である、パラ２２から２５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２７．ＣＤ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片を含む、パラ１から２６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２８．（ａ）の２つの重鎖の各々が、ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨおよび２つのＣＨ１ドメインを含む、パラ２３から２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２９．ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の１つまたは複数が、
１２３位（Ｋａｂｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）および１２４位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のリジン（Ｋ）を含むＣＬドメインと、
１４７位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）および２１３位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインと
を含む、パラ２３から２８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３０．パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
３１．パラ３０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
３２．パラ３０に記載のポリヌクレオチドまたはパラ３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
３３．二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、パラ３２に記載の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法。
３４．パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
３５．医薬として使用するための、パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ３４に記載の薬学的組成物。
３６．
（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、
（ｉｖ）がんを治療する、
（ｖ）がんの進行を遅延させる、
（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、
（ｖｉｉ）感染症を治療する
のに使用するための、パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、またはパラ３４に記載の薬学的組成物。
３７．がんの治療に使用するための、パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ３４に記載の薬学的組成物。
３８．がんを治療するための医薬の製造における、パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ３４に記載の薬学的組成物の使用。
３９．がんを有する個体を治療する方法であって、有効量のパラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ３４に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
４０．細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するのに使用するための、パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ３４に記載の薬学的組成物。
４１．二重特異性抗原結合分子が化学療法剤、放射線および／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療に使用するためのパラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、またはパラ３４に記載の薬学的組成物。
【実施例】
【０３０５】
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供される一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態を行うことができることが理解される。
【０３０６】
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９に記載されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。製造業者の指示に従って分子生物学試薬を使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  番号９１−３２４２に示される。
【０３０７】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を二本鎖配列決定によって決定した。
【０３０８】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって作製した、または自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を、適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接した遺伝子セグメントを標準的クローニング／配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを適切な制限部位を用いて設計して、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。全てのコンストラクトを、真核細胞中で分泌するためのタンパク質を標的化するリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０３０９】
タンパク質精製
タンパク質を、標準的なプロトコルを参照して濾過細胞培養物上清から精製した。手短に述べれば、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で達成し、引き続いて直ちに試料を中和した。凝集タンパク質を、ＰＢＳまたは２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０中、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってモノマー抗体から分離した。モノマー抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要であれば）、冷凍し、−２０℃または−８０℃で保存した。試料の一部を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または質量分析によるその後のタンパク質分析および分析特徴づけに供した。
【０３１０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造業者の指示に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。特に、１０％または４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ泳動バッファー添加剤を含む）またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）泳動バッファーを使用した。
【０３１１】
ＣＥ−ＳＤＳ
二重特異性抗体およびコントロール抗体の純度、抗体完全性、および分子量を、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐテクノロジー（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いるＣＥ−ＳＤＳにより分析した。５μｌのタンパク質溶液を、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを用いて、製造会社の使用説明書に従って、ＣＥ−ＳＤＳ分析用に調製し、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｈｉｐを用いて、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステムで分析した。データを、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸソフトウェア  バージョン３．０．６１８．０を用いて解析した。
【０３１２】
分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。手短に述べれば、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫゲル  Ｇ３０００ＳＷカラムに、またはＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍで２×ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。溶出タンパク質を、ＵＶ吸光度またはピーク面積の積分によって定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１が標準として役立った。
【０３１３】
質量分析
このセクションは、正しい組み立てに重点を置いた、ＶＨ／ＶＬまたはＣＨ／ＣＬ交換（ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多重特異性抗体の特徴づけを記載する。予想される一次構造を、脱グリコシルした無傷のＣｒｏｓｓＭａｂおよび脱グリコシル／ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ、または代替として、脱グリコシル／ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【０３１４】
ＣｒｏｓｓＭａｂを、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓバッファー中、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、３７℃、最長１７時間、Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆで脱グリコシルした。ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡまたはＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ；Ｓｗｅｄｅｎ）消化を、１００μｇ脱グリコシルＣｒｏｓｓＭａｂと共に、そのベンダーにより供給されたバッファーにおいて実施した。質量分析の前に、試料を、セファデックスＧ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣにより脱塩した。全質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ  ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）においてＥＳＩ−ＭＳにより決定した。
【０３１５】
実施例１
ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的化する二重特異性コンストラクトの作製および産生
１．１  ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的化する二重特異性抗原結合分子の作製
抗ＣＤ４０結合体の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡ（ＷＯ２００６／１２８１０３の配列番号１０および配列番号１６）を、適切な発現プラスミドにおいて、ヒトＩｇＧ１の対応する定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでクローニングした。重鎖および軽鎖の発現は、ＭＰＳＶコアプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーエレメントからなるキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動される。発現カセットはまた、そのｃＤＮＡの３’末端に合成ポリＡシグナルを含有する。加えて、プラスミドベクターは、プラスミドのエピソーム維持のための複製開始点（ＥＢＶ  ＯｒｉＰ）を有する。ＣＤ４０  ｍＡｂおよびＦＡＰ  ｍＡｂの可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ、表１および２に示されている。
【０３１６】
異なる二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体は、ＦｃのＣ末端に１個かもしくは２個のいずれかのＦＡＰ結合アームと組み合わされた４個のＣＤ４０結合部分からなる４＋１型式および４＋２型式で、またはＦｃのＣ末端に１個かもしくは２個のいずれかのＦＡＰ結合アームと組み合わされた２個のＣＤ４０結合部分からなる２＋１型式および２＋２型式で調製されている（図１Ａ〜１Ｄ）。ＦＡＰ結合体２８Ｈ１の作製および調製は、参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ２０１２／０２０００６  Ａ２に記載されている。４＋１分子および２＋１分子を作製するために、ノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを用いて、ヘテロ二量体化を達成した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）に導入し、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）に導入した。４＋２分子および２＋２分子において、ＷＯ２０１０／１４５７９２  Ａ１に記載されているようなＣｒｏｓｓＭａｂテクノロジーにより、正しい軽鎖ペアリングが保証された。二重特異性の型式とは無関係に、全ての場合において、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を用いて、ＷＯ２０１２／１３０８３１  Ａ１に記載された方法に従って、Ｆｃγ受容体との結合を抑止した。二重特異性分子の配列は表３および４に示されている。
【０３１７】
ヒト受容体を標的化する分子の他にも、マウス抗原を認識する代替分子を、同じ型式で作製した。これらの場合、４＋１分子のヘテロ二量体化を、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２０１０、１９６３７〜１９６４６により記載された方法に従って、ＦｃにおけるＤＤ／ＫＫ突然変異（第１の重鎖におけるＬｙｓ３９２ＡｓｐおよびＬｙｓ４０９Ａｓｐの導入、ならびに第２の重鎖におけるＧｌｕ３５６ＬｙｓおよびＡｓｐ３９９Ｌｙｓ突然変異の導入）により達成し、一方、Ｆｃ受容体との結合を、Ｂａｕｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）、１８１、６６６４〜９またはＷＯ２０１６／０３０３５０  Ａ１に記載された方法に従って、Ｄ２７０Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異により阻害した。
【０３１８】
全ての遺伝子を、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過的に発現させた。発現ベクターはまた、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）含有宿主細胞中でのエピソーム複製用のｏｒｉＰ領域を含む。
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【０３１９】
１．２  ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的化する二重特異性抗原結合分子の産生
その分子を、懸濁培養で増殖したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてコトランスフェクションするか、または懸濁培養で増殖したＣＨＯ  Ｋ１細胞を哺乳動物発現でｅｖｉＦＥＣＴを用いてコトランスフェクションするかのいずれかにより、産生させた。細胞に、対応する発現ベクターをトランスフェクションした。
【０３２０】
ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における産生では、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２５０ｍｇ／Ｌ  Ｇ４１８を含有するＥｘｃｅｌｌ培養培地において血清を含まずに、懸濁培養した。６００ｍＬ  ｔｕｂｅｓｐｉｎフラスコ（最大許容容量４００ｍＬ）における産生では、６億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションでは、８億個の細胞を、２１０ｘｇで５分間、遠心分離し、上清を、２０ｍＬの予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、２０ｍＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地中に４００μｇ  ＤＮＡの最終量で混合した。１０８０μＬ  ＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍＬ）の添加後、その混合物を、１５秒間、ボルテックスし、その後、室温で１０分間、インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍＬ  ｔｕｂｅｓｐｉｎフラスコへ移し、５％ＣＯ２大気でのインキュベーター内、３７℃で３時間、インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５ｇ／Ｌ  Ｐｅｐｓｏｙ、および１．２５ｍＭ  ＶＰＡを含有する３６０ｍＬ  Ｅｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を、２４時間、培養した。トランスフェクションから１日後、１２％  Ｆｅｅｄ  ７および３ｇ／ｌ  グルコースを加えた。７日後、培養上清を、精製のために、２５００ｘｇで６０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心機）により収集した。その溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを、０．０１％  ｗ／ｖの最終濃度まで加え、４℃で維持した。
【０３２１】
（懸濁培養における無血清増殖に順応した）懸濁培養系のＣＨＯ  Ｋ１細胞における産生では、細胞を、ｅｖｉＧｒｏｗ培地（ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（化学組成既知の動物成分を含まない無血清培地）において増殖させ、ｅｖｉＦｅｃｔ（ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をｅｖｉＭａｋｅ（ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（化学組成既知の動物成分を含まない無血清培地）において３７℃および５％ＣＯ２で７日間、維持した。
【０３２２】
７日後、培養上清を、精製のために、Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０  ＲＣにおいて最大速度で４５分間の遠心分離により収集した。その溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、４℃で維持した。培養培地におけるその分子の濃度を、プロテインＡ−ＨＰＬＣかまたはプロテインＡ−Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）かのいずれかにより決定した。
【０３２３】
分泌タンパク質を、細胞培養物上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィー、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー工程により精製した。アフィニティークロマトグラフィーについて、２５ｍｌ  ２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５と平衡したＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（カラム容積（ＣＶ）＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を負荷した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０ＣＶ  ２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５での洗浄により除去し、標的タンパク質を、６ＣＶ  ２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０において溶出した。タンパク質溶液を、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０の１／１０を加えることにより中和した。２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０と平衡したＨｉＬｏａｄ  ＸＫ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への負荷の前に、標的タンパク質を濃縮および濾過した。精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
【０３２４】
最終精製工程後のその分子の純度および分子量を、還元剤の存在下および非存在下でＣＥ−ＳＤＳにより分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を製造会社の使用説明書に従って用いた。
【０３２５】
その分子の総計含有量を、２５℃で、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７ランニングバッファー中、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
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【０３２６】
１．３  ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的化するさらなる二重特異性抗原結合分子の作製
実施例１．１と同様に、二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体の異なる型のコンストラクトを調製した。例えば、１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた１個のＣＤ４０結合部分からなる二重特異性抗体を調製した（図１５Ａ）。ＷＯ２０１０／１４５７９２  Ａ１に記載されているようなＣｒｏｓｓＭａｂテクノロジーを用いて、正しい軽鎖ペアリングを保証したため、その型式を、１＋１  ｃｒｏｓｓｍａｂと呼ぶ。ＣＤ４０結合ＦａｂがＦＡＰ結合ＦａｂのＮ末端に融合している、「ヘッドトゥーテール」と呼ばれる別の２＋１型式を調製し（図１５Ｂ）、ＦｃのＣ末端におけるいずれか１個のＦＡＰ結合クロスｆａｂを組み合わされた２個のＣＤ４０結合部分からなるさらなる２＋１型式（図１Ｅ）を産生した。さらに、ＦｃのＣ末端における１個のＦＡＰ結合クロスｆａｂと組み合わされた４個のＣＤ４０結合部分からなる４＋１型式（図１５Ｃ）を調製した。全てのこれらのコンストラクトにおいて、抗ＣＤ４０結合体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、ＷＯ２００６／１２８１０３に記載されているようなＣＤ４０結合体に対応する（前記文書の配列番号１０および配列番号１６）。ＦＡＰ結合体２８Ｈ１の作製および調製は、参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ２０１２／０２０００６  Ａ２に記載されている。１＋１、２＋１、および４＋１分子を作製するために、ノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを用いてヘテロ二量体化を達成した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異は、第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）に導入されており、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異は、第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）に導入されている。さらに、ＷＯ２０１０／１４５７９２  Ａ１に記載されているようなＣｒｏｓｓＭａｂテクノロジーは、正しい軽鎖ペアリングを保証した。二重特異性の型式とは無関係に、全ての場合において、ＷＯ２０１２／１３０８３１  Ａ１に記載された方法により、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、２３４Ａ）を用いて、Ｆｃγ受容体との結合を抑止している。二重特異性分子のアミノ酸配列は表６に示されている。
【０３２７】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わされたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの調節下で一過性に発現する。発現ベクターはまた、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）由来核抗原）を含有する宿主細胞におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含有する。
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【０３２８】
二重特異性抗体の発現
４つの異なるペプチド鎖をコードする発現ベクターの、懸濁培養で増殖したＨＥＫ細胞への一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションを、抗体ベクターのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）調製物、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、Ｐｅｉｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）、および無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における１ｍｌあたり１〜２百万個の生細胞の最初の細胞密度を用いて、細胞供給会社の使用説明書に従って実施した。振盪フラスコまたは撹拌発酵槽内での７日間の培養後、細胞培養物上清を、１４０００ｇでの３０分間の遠心分離により採取し、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
【０３２９】
二重特異性抗体の精製
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養物上清から抗体を精製した。簡単に述べれば、滅菌濾過された細胞培養物上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と平衡したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂上に捕捉し、平衡バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０で溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０での中和後、凝集したタンパク質を、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０におけるサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて濃縮し、−８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ−ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、およびエンドトキシン決定による次の特性評価のために用いた。
【０３３０】
１．４  ＣＤ４０およびＦＡＰを標的化する二重特異性コンストラクトの特徴づけ
１．４．１  ヒトまたはマウスＦＡＰ発現マウス線維芽細胞との結合
ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９、またはマウス線維芽細胞活性化タンパク質（ｍＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰクローン２６を用いて、細胞表面ＦＡＰとの結合を試験した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９およびＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰクローン２６を、それぞれ、ｈｕＦＡＰまたはｍＦＡＰを１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択下で発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１をマウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）にトランスフェクションにより作製した。ＦＡＰをトランスフェクションされず、かつＦＡＰを発現しないＮＩＨ／３Ｔ３野生型（ｗｔ）細胞を、ネガティブコントロールとして用いた。
【０３３１】
ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰ、またはＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を追加した１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０−０２５）で培養した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰおよびＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞について、ＦＡＰ発現細胞の選択のために培地へ１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８−０３）を加えた。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、酵素を含まない細胞解離バッファー（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１０１４）を用いることにより、プレートから取り出した。０．３×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰクローン２６、またはＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔを、１×ＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳの２００μｌ中、丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルへ加えた。プレートを、１７００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清を弾き飛ばした。細胞を、４℃冷却ＦＡＣＳバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−４２２２−２６）の２００μＬで１回、洗浄した。示された濃度範囲で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）またはアイソタイプコントロール抗体ＤＰ４７を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷却ＦＡＣＳバッファー中に、全ての試料を再懸濁し（２連で）、４℃で１２０分間、インキュベートした。その後、細胞を、２００μＬ  ４℃冷却ＦＡＣＳバッファーで３回、洗浄した。細胞をさらに、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する４℃冷却二次抗体溶液（二次抗体の１：５０希釈溶液）の２５μＬ／ウェルで染色し、暗闇中、４℃で６０分間、インキュベートした。細胞を、２００μｌ  ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含有する８５μＬ／ウェル  ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、同じ日、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを含む）を用いて捕捉した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を用いて実施した。
【０３３２】
図２Ａ、２Ｂ、および図１７に示されているように、ＦＡＰについて一価または二価の二重特異性抗体は、ヒトおよびマウスＦＡＰ発現標的細胞と結合する。したがって、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗原結合分子だけが、直接的な腫瘍標的化性質を示す。Ｃ末端ＦＡＰ結合ドメインを有する二価ＦＡＰコンストラクトは、一価ＦＡＰ型式に対して二価ＦＡＰ型式における結合活性の増大により説明されるように、Ｃ末端ＦＡＰ結合ドメインを有する一価コンストラクトより強く結合する。最も強いＦＡＰ結合は、１＋１型式（Ｐ１ＡＥ０１９２）について観察された。ＦＡＰ標的化抗体のＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞との結合は検出されなかった。異なる二重特異性抗体について測定された場合のＥＣ５０値は、下記の表７に示されている。
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【０３３３】
１．４．２  ヒトＣＤ４０発現Ｄａｕｄｉ細胞との結合
細胞表面ＣＤ４０との結合を、Ｄａｕｄｉ細胞（高発現レベルのヒトＣＤ４０を有するヒトＢリンパ芽球細胞株）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１３）を用いて試験した。Ｄａｕｄｉ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を追加した１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０−０２５）で培養した。１０％ＦＢＳを含む１×ＤＭＥＭの２００μｌ中の０．３×１０５個のＤａｕｄｉ細胞を、丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルへ加えた。プレートを、１７００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清を弾き飛ばした。細胞を、４℃冷却ＦＡＣＳバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−４２２２−２６）の２００μＬで１回、洗浄した。示された濃度範囲で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）またはアイソタイプコントロール抗体ＤＰ４７を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷却ＦＡＣＳバッファー中に、全ての試料を再懸濁し（２連で）、４℃で１２０分間、インキュベートした。その後、細胞を、２００μＬ  ４℃冷却ＦＡＣＳバッファーで３回、洗浄した。細胞をさらに、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する４℃冷却二次抗体溶液（二次抗体の１：５０希釈溶液）の２５μＬ／ウェルで染色し、暗闇中、４℃で６０分間、インキュベートした。細胞を、２００μｌ  ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含有する８５μＬ／ウェル  ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、同じ日、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを含む）を用いて捕捉した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を用いて実施した。
【０３３４】
図１８に示されているように、全ての描かれたクローンは、ＣＤ４０と結合するが、ＣＤ４０ポジティブＤａｕｄｉ細胞とのそれらの結合強度（ＥＣ５０値およびシグナル強度）が様々である。二価ＣＤ４０型式に対する四価ＣＤ４０型式の、抗体あたりのより多く占有されるＣＤ４０結合部位および結合活性の増大により説明されるように、二価抗ＣＤ４０抗体は、四価抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高いＥＣ５０レベルを示し、より高い結合プラトーに達する。最も低い結合プラトーと組み合わされた最も高いＥＣ５０値が、１＋１型式（Ｐ１ＡＥ０１９２）について観察された。ネガティブコントロール抗体のＤａｕｄｉ細胞との結合は検出されなかった。異なる二重特異性抗体について測定された場合のＥＣ５０値は下記の表８に示されている。
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【０３３５】
実施例２
ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子の機能的性質
２．１  ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子による抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＣＤ４０媒介性活性化
ＣＤ４０の連結は、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）の成熟および活性化を誘導し、これらの細胞型の生存を促進する。ＣＤ４０シグナル伝達により、サイトカイン産生ならびにＢ細胞およびＤＣの表面上での共刺激分子発現が増加する（Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａら、Ａｎｎｕ  ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ、２００４、２２、３０７〜３２８；Ｓ．Ｄａｎｅｓｅら、Ｇｕｔ．  ２００４、５３、１０３５〜１０４３；Ｇ．Ｂｉｓｈｏｐら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．  ２００７、５９７、１３１〜１５１）。
【０３３６】
異なるＦＡＰ依存性抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト性質およびＦＡＰ特異性を試験するために、ヒトバフィーコートから得られたＡＰＣを、ＦＡＰ依存性アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体およびＦＡＰコーティング化ビーズかまたはヒトＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のいずれかとインキュベートした。ＡＰＣ活性化を、ＦＡＣＳにより測定し、細胞の上清を、サイトカインについて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析した。
【０３３７】
２．１．１  抗原の供給源としてＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞を用いる、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞の活性化
ＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、二重特異性抗原結合分子についての抗原の供給源として用いた。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞を、マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）の、ＣＭＶプロモーター下でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドのトランスフェクションにより作製した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞またはＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞を、細胞が増殖するのを防止するために、ＲＳ  ２０００照射器（Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２７Ｇｙで照射した。９６ウェル平底プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２６９６）のウェルあたり、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン  ストレプトマイシン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）、１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０−０２４）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０−０３９）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０−０３５）、および５０μＭ  β−メルカプトエタノール（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３５０−０１０）を供給されたＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）１６４０（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１８７０−０２５）からなるＲ１０培地の１００μｌ中の０．２×１０５個の照射されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、播種した。
【０３３８】
次の日、バフィーコートを、Ｓｔｉｆｔｕｎｇ  Ｚｕｒｃｈｅｒ  Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ  ＳＲＫから入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、５０ｍＬのバフィーコートを、同体積のＰＢＳ（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１００２３）中に希釈した。５０ｍＬポリプロピレン遠心管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）を供給し、そのＬｙｍｐｈｏｒｅｐ（商標）の上に管あたり２５ｍＬのバフィーコート／ＰＢＳ溶液を注意深く層状に重ねた。管を、室温で、２０００ｒｐｍ、２４分間、低加速度、中断なしで遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から収集し、ＰＢＳで３回、洗浄し、１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、細胞を、細胞型および数についてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンターＡｃ・Ｔ（商標）５ｄｉｆｆ  ＯＶ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号６６０５５８０）で分析した。ＰＢＭＣからのＢ細胞単離の前に、ＣＤ１４ポジティブ画分を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０５０−２０１）でのＣＤ１４ポジティブ細胞の磁気標識、およびその後のａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９２−５４５）での単離により除去した。ＣＤ１４ネガティブ画分を、その後の、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂ細胞単離キットＩＩ（カタログ番号１３０−０９１−１５１）およびａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離でのＢ細胞単離に用いた。１×１０５個のＢ細胞を、ウェルあたり５０μｌのＲ１０培地中、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞へ加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体を、５０μｌのＲ１０培地中Ｂ細胞へ、１μｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬまでの範囲の濃度（３×希釈系列）で加えた。ポジティブコントロールとして、ＦＡＰ非依存性アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体ＲＯ７００９７８９（ＩｇＧ２、ＩＮＮ：Ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）およびＳＧＮ−４０（ＩｇＧ１、ＩＮＮ：ダセツズマブ）を用いた。両方の抗体は、ＣＤ４０に対して二価である。ＳＧＮ−４０抗体は生物活性のためにＦｃ受容体架橋を必要とすること（Ｃ．Ｌａｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５、６５、８３３１〜８３３８）（同様に、ＲＯ７００９７８９についても論議中である機構（Ｒ．Ｄａｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１６、２９、１〜１２））が文献に記載されているため、これらの２つの抗体を、Ｂ細胞の添加前に、架橋ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００６−００８）と３０分間、インキュベートした。４８時間後、細胞を、９６ウェル丸底プレートへ移し、ＰＢＳで１回、洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプコントロール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０４００Ｃ）の５０μｌとインキュベートした。４℃での１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物の５０μｌを細胞へ加えた。以下の蛍光標識���体を用いた：抗ヒトＣＤ８３  ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＢ１５ｅ、カタログ番号３０５３２４）、抗ヒトＣＤ８０  ＢＶ６０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＬ３０７．４、カタログ番号５６３３１５）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６−２．６、カタログ番号５５５５５２）、抗ヒトＣＤ１４  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＣＤ１４、カタログ番号３２５６２２）、抗ヒトＣＤ３  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１、カタログ番号３００４３０）、抗ヒトＣＤ７０  ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン１１３−１６、カタログ番号３５５１０４）、抗ヒトＣＤ８６  ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＦＵＮ−１、カタログ番号５６２３９０）、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６−６、カタログ番号５５９８６６）、および抗ヒトＣＤ１９  ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＳＪ２５Ｃ１、カタログ番号５６０１７７）。生細胞と死細胞を区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）を抗体混合物に加えた。４℃での３０分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回、洗浄し、その後、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。同じ日、細胞を、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを含む）を用いて分析した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を用いて実施した。ＣＤ１４およびＣＤ３についてネガティブで、かつＣＤ１９についてポジティブな生細胞（ａｑｕａネガティブ）を、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６発現について分析した。
【０３３９】
図３Ａ〜３Ｈは、ヒトＣＤ４０に対して四価で、かつＦＡＰに対して一価かまたは二価のいずれかの二重特異性抗原結合分子による、Ｂ細胞活性化マーカー、ＣＤ７０（図３Ａおよび３Ｂ）、ＣＤ８０（図３Ｃおよび３Ｄ）、ＣＤ８３（図３Ｅおよび３Ｆ）、およびＣＤ８６（図３Ｇおよび３Ｈ）のＦＡＰ依存性上方制御を示す。ＦＡＰに対して一価の二重特異性抗体は、２個のＦＡＰ結合部分を有する分子と類似した、活性化マーカー発現の増加を誘導した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ＦＡＰ細胞に関して、二重特異性抗原結合分子によるＢ細胞活性化マーカーの上方制御は、ＦＡＰ非依存性ポジティブコントロール抗体により誘導された上方制御に匹敵した。ＦＡＰの存在なし（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｗｔ細胞）で、Ｂ細胞活性化マーカーの増加は、二重特異性抗原結合分子に関して観察されず、一方、ポジティブコントロール抗体は、これらのマーカーの発現の上方制御を誘導した。
【０３４０】
２．１．２  抗原の供給源としてＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を用いた、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＤａｕｄｉ細胞の活性化
９６ウェル平底プレートのウェルあたり１０％ＦＢＳを加えた１×ＤＭＥＭの１００μｌ中の１×１０５個のＤａｕｄｉ細胞を加えた。抗原の供給源としてＦＡＰを発現する細胞を用いる代わりに、ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１１２０５Ｄ）を、製造会社の使用説明書に従って、ビオチン化マウスＦＡＰ（社内で製造）でコーティングし（６．５×１０４個のビーズ：０．０１μｇのタンパク質の結合能）、５０μｌのＲ１０培地において２：１のビーズ：細胞の比でＤａｕｄｉ細胞へ加えた。ＦＡＰ発現細胞の代わりにＦＡＰでコーティングされたビーズの使用は、より安定で、かつ再現性の高い系を提供する。細胞の品質の変動、およびＡＰＣ活性化状態に影響する可能性がある細胞性産物の分泌が、潜在的に結果を歪める因子を表すからである。コントロールとして、非コーティング化ビーズを、Ｄａｕｄｉ細胞に加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体またはポジティブコントロール抗体（セクション２．１．１に記載された）を、５０μｌのＲ１０培地中、Ｄａｕｄｉ細胞へ加えた。２日後、Ｄａｕｄｉ細胞を、２．１．１で特定化された染色および分析手順に従い、ＦＡＣＳにより分析した。
【０３４１】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＢ細胞は、全ての抗体についてＣＤ７０発現の増加を示した（図２０ＡおよびＢ参照）。特定の分子のＥＣ５０値は、下記の表９に要約されている。これらの発現マーカーの上方制御は、異なるＦＡＰ標的化抗体の場合、ＦＡＰに依存し、これらのＦＡＰ依存性抗体により誘導された発現の増加は、架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）により誘導された増加と比較して高かった。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）において、描かれた、ＣＤ４０に対して一価または二価の二重特異性抗体に関して、ＣＤ７０の増加は観察されず、一方、四価ＣＤ４０結合分子は、ＦＡＰ存在下より程度は低いがＣＤ７０の上方制御を誘導した。これはＤａｕｄｉ細胞における四価ＣＤ４０結合体の、低いが、検出可能なＦＡＰ非依存性ＣＤ４０活性化を示している。
2020515276.tif 000055
【０３４２】
２．１．３  抗原の供給源としてＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を用いた、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞の活性化
セクション２．１．１に記載されているように、Ｂ細胞を、バフィーコートから単離し、９６ウェル平底プレートのウェルあたり、１００μｌのＲ１０培地中１×１０５個のＢ細胞を加えた。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１１２０５Ｄ）を、製造会社の使用説明書に従って、ビオチン化ヒトまたはマウスＦＡＰ（社内で製造）でコーティングし（６．５×１０４個のビーズ：０．０１μｇのタンパク質の結合能）、５０μｌのＲ１０培地において２：１のビーズ：細胞の比でＢ細胞へ加えた。コントロールとして、非コーティング化ビーズを、Ｂ細胞に加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体またはポジティブコントロール抗体（セクション２．１．１に記載された）を、５０μｌのＲ１０培地中、Ｂ細胞へ加えた。２日後、Ｂ細胞を、２．１．１で特定化された染色および分析手順に従い、ＦＡＣＳにより分析した。あるいは、Ｂ細胞を、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下で５日間、培養し、ヒトＩＬ−６  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２０６−０５）を用いるＩＬ−６測定のために１１０μｌ上清を採取した。Ｂ細胞は、追加のＢ細胞受容体刺激の必要なしに、ＣＤ４０リガンドでの刺激で、増加した量のＩＬ−６を産生することが知られている（Ｍ．Ｄｕｄｄｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００４、１７２、３４２２〜３４２７）。ＥＬＩＳＡを、製造会社により提供されたプロトコールに記載されているように実施し、ただし、唯一の違いとして、アッセイのあらゆる工程について推奨された量の半分を用いた。Ｂ細胞を、セクション２．１．１で特定化された染色および分析手順に従い、ＦＡＣＳにより分析した。
【０３４３】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＢ細胞は、全ての抗体についてＣＤ７０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６発現の増加を示した（図４Ａ〜４Ｆ、図２１ＡおよびＢ、ならびに図２５Ａ〜Ｄ参照）。特定の分子のＣＤ８６発現の増加に関連したＥＣ５０値は、下記の表１０に要約されている。これらの発現マーカーの上方制御は、異なるＦＡＰ標的化抗体の場合、ＦＡＰに依存し、これらのＦＡＰ依存性抗体により誘導された発現の増加は、架橋ＣＤ４０抗体Ｐ１ＡＤ４４７０により誘導された増加と同等、またはそれよりわずかに低かった。
2020515276.tif 000056
【０３４４】
ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）との５日間のＢ細胞インキュベーション後、ヒトＣＤ４０およびＦＡＰを標的化する抗原結合分子は、Ｂ細胞上のＣＤ８０発現のＦＡＰ依存性上方制御を誘導した。１個かまたは２個のいずれかのＦＡＰ結合部位を有する抗ヒトＣＤ４０抗体により誘導されたＣＤ８０発現のレベルは同等であった。Ｂ細胞のポジティブコントロール抗ＣＤ４０抗体での処理は、類似した程度のＣＤ８０上方制御をもたらした。二重特異性抗原結合分子に関して、ＦＡＰ依存性ＣＤ８６発現の上昇も同様に、検出することができた。この場合もやはり、１個または２個のＦＡＰ結合部位の存在は、この活性化マーカーの発現レベルに大きな差を生じなかった。架橋ＳＧＮ−４０（ダセツズマブ）またはアゴニストＣＤ４０抗体セリクレルマブ（ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）（ＲＯ  ７００９７８９）により誘導されたＣＤ８６のＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されたＣＤ８６上方制御は、わずかに低かった。ＣＤ７０およびＣＤ８３について、ＦＡＰおよびＣＤ４０を標的化する二重特異性抗体に関して、上方制御が全く観察されず、または非常に限られた上方制御のみが観察されたが、ポジティブコントロール抗体は、これらのＢ細胞活性化マーカーへの効果をはっきり示した（図５Ａ〜５Ｈ）。
【０３４５】
図６Ａおよび６Ｂは、異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体のＢ細胞ＩＬ−６産生への効果を示す。ＦＡＰが存在する場合、上清におけるＩＬ−６濃度は、試験された全てのアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体について同じような程度で上昇した（未処理（ＵＴ）条件と比較して約６倍増加）。Ｂ細胞の非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）とのインキュベーションにより、二重特異性抗原結合分子に関して、ＩＬ−６産生の増加は、検出されず、これらの分子のＦＡＰ依存性を実証した。
【０３４６】
２．１．４  抗原の供給源としてヒトＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を用いた、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒト単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）の活性化
ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）密度遠心分離によりバフィーコートから単離した。その後、単球を、２．１．１に記載されているように、ＣＤ１４マイクロビーズおよびａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離を用いて単離した。単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）を発生させるために、３×１０６個の単球を、６ウェルプレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２００６）のウェルあたり１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で播種した。ＤＣ成熟について、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン  ストレプトマイシン、２％（ｖ／ｖ）ヒト血清（５６℃で３０分間、熱失活）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ４５２２、ロット番号ＳＬＢＰ１６８７Ｖ）、２０ｎｇ／ｍＬ新鮮に加えられた組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−０３−２０ＵＧ、ロット番号０８１２３０Ｈ１２１３）、および２０ｎｇ／ｍＬの新鮮に加えられた組換えヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−０４−１００ＵＧ、ロット番号０９１５１４Ｃ３１１６）を追加したＲＰＭＩ  １６４０からなるｍｏＤＣ培地を用いた。５日後、ｍｏＤＣを、６ウェルプレートから、懸濁液および半接着細胞の穏やかな剥離により、採取し、ヒトＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮なｍｏＤＣ培地中に再懸濁した。９６ウェル平底プレートのウェルあたり１００μｌのｍｏＤＣ培地中、２×１０５個のｍｏＤＣを播種した。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、ビオチン化ヒトＦＡＰでコーティングし、５０μｌおいて２：１のビーズ／ＤＣの比で加えた（２．１．３に記載されているように）。コントロールとして、非コーティング化ビーズを、ｍｏＤＣに加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体を、５０μｌ中、１μｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬまでの範囲（３×希釈系列）の濃度でＤＣに加えた。ポジティブのＦＡＰ非依存性コントロールとして、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体ＲＯ７００９７８９および架橋ＣＤ４０抗体を用いた。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）および異なるアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の添加から２日後、ｍｏＤＣ活性化を、ＦＡＣＳにより測定した。ＦＡＣＳ染色を、２．１．１に特定化されているように、抗ヒトＣＤ８６  ＢＶ４２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＦＵＮ−１、カタログ番号５６２４３２）、抗ヒトＣＤ８０  ＢＶ６０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＬ３０７．４、カタログ番号５６３３１５）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６−２．６、カタログ番号５５５５５２）、抗ヒトＣＤ１ｃ  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＦ１０／２１Ａ３、カタログ番号５６５４２４）、抗ヒトＣＤ７０  ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン１１３−１６、カタログ番号３５５１０４）、抗ヒトＣＤ１１ｃ  ＰＥ−ｅＦ６１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３．９、カタログ番号６１−０１１６−４２）、抗ヒトＣＤ８３  ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＢ１５ｅ、カタログ番号５６１１３２）、抗ヒトＣＤ２０９  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＤＣＮ４６、カタログ番号５５１５４５）、抗ヒトＣＤ３  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＯＫＴ３、カタログ番号５６−００３７−４２）、抗ヒトＣＤ１４  ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＭ５Ｅ２、カタログ番号５６１３８４）、および生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）からなる蛍光標識抗体の混合物を用いて実施した。同じ日、細胞を、５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを用いて実施した。単一の生細胞を、ＣＤ３ネガティブおよびＣＤ１４ネガティブの細胞についてゲーティングした。この集団に基づいて、ＣＤ１ｃおよびＣＤ１１ｃポジティブ細胞を、活性化マーカー、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６の発現について分析した。
【０３４７】
全てのアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体について、ｍｏＤＣ上のＣＤ８３の明白かつ類似した上方制御を観察することができた（図７Ｅ〜７Ｆ）。ＦＡＰ依存性抗ＣＤ４０抗体の場合、この上方制御は、ＦＡＰ依存性様式で検出された。ＣＤ４０およびＦＡＰを標的化する二重特異性抗原結合分子に関して、ＣＤ８０発現は、わずかに増加しただけだが、この増加は、ＦＡＰ依存性であり、ＤＣ上のポジティブコントロール抗体ＲＯ７００９７８９により誘導されたＣＤ８０上方制御と匹敵した（図７Ｃおよび７Ｄ）。ＣＤ８６発現は、未処理のＤＣと比較して、異なる抗ＣＤ４０抗体とインキュベートされたＤＣ上で有意には変化しなかったが（図７Ｇおよび７Ｈ）、ＣＤ７０発現は、これらの抗体のアゴニスト効果により上昇した（図７Ａおよび７Ｂ）。この場合もやはり、両方のＦＡＰ依存性抗体は、ＦＡＰが存在した時だけ活性化性質を示し、それらのＣＤ７０への効果は類似した。しかしながら、ＣＤ７０発現が上方制御されたｍｏＤＣの数は、低い範囲にあった（ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１ｃポジティブ細胞の最大８％）。ＲＯ７００９７８９は、この実験設定において、二重特異性分子を比較して、ＤＣ上のＣＤ７０を上方制御する、より高い効力を示した。
【０３４８】
２．１．５  抗原の供給源としてマウスＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を用いた、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞の活性化
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｈｋｂ−ｃｄ４０）を、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子により媒介されるヒトＣＤ４０刺激を分析するためのレポーター細胞株として用いた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞は、ヒトＣＤ４０受容体、および胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のＮＦκＢ誘導性分泌を安定的に発現する。ＣＤ４０Ｌまたはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞上に発現したＣＤ４０受容体との結合が、ＮＦκＢ媒介性ＳＥＡＰ産生をもたらすシグナル伝達カスケードを駆動する。産生されたＳＥＡＰの量は、ＣＤ４０受容体活性化の程度と直接的に相関する。上清における分泌型ＳＥＡＰのレベルは、分光光度計で、６２０〜６５５ｎｍで測定することができる。９６ウェル平底プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２６９６）のウェルあたり、１６０μｌの予熱されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）検出培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｈｂ−ｄｅｔ２）中の０．５×１０５個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞を播種した。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、ビオチン化マウスＦＡＰでコーティングし、２０μｌのＰＢＳにおいて２：１のビーズ：細胞の比で加えた（２．１．３に記載されているように）。コントロールとして、非コーティング化ビーズを、レポーター細胞に加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体を、２０μｌのＰＢＳ中、その細胞に、６．８９ｎＭから０．００３２ｎＭまでの範囲（３×希釈系列）の濃度で加えた。コントロール分子として、ＦＡＰ結合ドメインの代わりに１個または２個のＤＰ４７ドメインを有するヒトＣＤ４０に対して四価の抗体、およびＦＡＰ非依存性架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）を用いた。３７℃での８時間のインキュベーション後、上清におけるＳＥＡＰレベルを、分光光度計により６５０ｎｍで測定した。
【０３４９】
全てのアゴニストＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体について、明白かつ同等のＳＥＡＰ産生が観察された。ヒトＣＤ４０に対して一価または二価のＦＡＰ標的化二重特異性抗体の場合、ＳＥＡＰ産生が、ＦＡＰの存在下でのみ検出された。対照的に、ヒトＣＤ４０に対して四価のＦＡＰ標的化二重特異性抗体で処理されたレポーター細胞は、ＦＡＰ利用可能性とは無関係にＳＥＡＰを分泌した。しかしながら、ＦＡＰの存在下で、これらの抗体で処理されたレポーター細胞の上清において、より高いＳＥＡＰレベルが検出された。さらに、ＦＡＰ結合ドメインの代わりに１個または２個のＤＰ４７ドメインを有するヒトＣＤ４０に対して四価のネガティブコントロール抗体は、ＦＡＰの存在下および非存在下で、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞において同等のＳＥＡＰ産生を誘導した。ポジティブコントロール抗体ＣＤ４０  ＩｇＧ（Ｐ１ＡＤ４４７０）＋Ｆ（ａｂ）は、ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下で、ヒトＣＤ４０に対して二価または四価のＦＡＰ標的化二重特異性抗体と比較して、類似したレベルのＳＥＡＰ産生を誘導した（図８Ａ、８Ｂ、１９ＡおよびＢ）。ＣＤ４０抗体および異なる二重特異性抗体について測定した場合のＥＣ５０値は、下記の表１１に示されている。
2020515276.tif 000057
【０３５０】
２．２  ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子によるＤＣのＣＤ４０媒介性活性化およびその後のＴ細胞のプライミング
ＦＡＰ依存性抗ヒトＣＤ４０抗体により活性化されたＤＣの、Ｔ細胞を効率的にプライミングする能力を実証するために、インビトロＴ細胞プライミングアッセイを確立した。これらのアッセイについて、ヒトＣＤ４０受容体を発現するトランスジェニックマウス（ｈｕＣＤ４０ｔｇマウス）（類似したヒトおよびマウスＣＤ４０受容体発現パターンを有するマウス；Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；Ｔａｃｏｎｉｃにより作製された）の脾臓由来のＤＣを単離し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドかまたはオボアルブミン（ＯＶＡ）のいずれかでパルスし（ＤＥＣ−２０５受容体媒介性抗原取り込み）、異なるアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体とインキュベートした。二重特異性抗原結合分子のＦＡＰ依存性を示すために、ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を介してＦＡＰを供給した。２４時間後、ＣＤ８ポジティブＴ細胞を、ＯＴ１マウス（これらのマウスのＣＤ８ポジティブＴ細胞は、全て、Ｈ２−Ｋｂとの関連において、ＳＩＩＮＦＥＫＬを認識するトランスジェニックＴＣＲを有する；Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｃｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の脾臓から単離し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識し、パルスされたＤＣに加えた。実験の５日目、ＤＣおよびＴ細胞サイトカインを、培養細胞の上清において分析し、Ｔ細胞を、活性化および増殖能力について分析した。
【０３５１】
２．２．１  ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化される、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス化ＤＣを介してのＴ細胞プライミング
ＤＣをｈｕＣＤ４０ｔｇマウスの脾臓から単離した。脾臓ＤＣを単離するために、ｈｕＣＤ４０ｔｇマウス由来の脾臓を、カルシウム２＋（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５−０５）、２５０μｌの１０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１１０８８８６６００１）、および１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ溶液（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５０２５−１５０ＫＵ、ロット番号ＳＬＢＲ０５３５Ｖ）を含む、２．２５ｍＬハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含有する６ウェルプレートの１つのウェルへ入れた。２１Ｇ針（Ｂｒａｕｎ、カタログ番号４６５７５２７）を有する３ｍＬシリンジ（ＢＤ、カタログ番号３０９６５８）を用いて、脾臓を膨らませ、続いて、ハサミの助けを借りて、小片へと裂いた。３７℃での２５分間のインキュベーション後、５０μＬの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、カタログ番号Ａ４８９２．１０００）を加え、その後、３７℃で５分間の２回目のインキュベーション工程を行った。脾細胞および小片の脾臓組織を含有する溶液を、４０μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２３４０）を通して５０ｍＬポリプロピレン遠心管へと濾過した。脾臓組織小片を、３ｍＬシリンジプラグの末端を用いてフィルターを通して砕いた。次の工程において、５０ｍＬ管を、室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、赤血球を溶解させるために、脾細胞へ１ｍＬの１×細胞溶解バッファー（蒸留水で１：１０希釈）（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）を加えた。室温での４分間のインキュベーション後、２０ｍＬのＲ１０を加え、続いて、室温で５分間の１５００ｒｐｍでの遠心分離工程を行った。上清を除去し、脾細胞を、３０ｍＬのＲ１０中に再懸濁し、細胞カウント数および生存率を、自動ＥＶＥ細胞カウンター（ＶＷＲ、カタログ番号７３４−２６７５）で決定した。ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離によりＤＣを単離するために、マウスＣＤ１１ｃ  ＵｌｔｒａＰｕｒｅマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１０８−３３８）を、製造会社の使用説明書に従って用いた。その後、９６ウェル平底プレートのウェルあたり５０μｌのＲ１０中、０．２５×１０５個のＤＣを播種した。その後、ＤＣを、１ｐｇ／ｍＬの準最適濃度でのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（オボアルブミン残基２５７〜２６４）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、カタログ番号ＡＳ−６０１９３−５、ロット番号１３６０６１８）でパルスした。この限定された量の抗原により、異なって活性化されたＤＣのせいでのＴ細胞活性化における変動を検出することが可能になる。追加のＤＣ活性化刺激に依存せずに高いＴ細胞活性化を誘導するためのポジティブコントロールとして、ＳＩＩＮＦＥＫＬを、１ｎｇ／ｍＬの濃度でＤＣに加えた。ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原でパルスされなかったＤＣは、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。ヒトＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を、５０μＬのＲ１０において２：１のビーズ：細胞の比でＤＣに加えた。次の工程において、異な���アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を、５０μＬのＲ１０において１μｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまでの範囲（１０×希釈系列）の濃度で加えた。この実験設定において、２個のＦＡＰ結合部位を含有する二重特異性抗ヒトＣＤ４０抗体を、ＦＡＰ結合ドメインの代わりに２個のＤＰ４７ドメインを有するそれの等価物、ＦＡＰ非依存性ＲＯ７００９７８９および架橋ＳＧＮ−４０、ならびにマウスＣＤ４０に対して四価でかつＦＡＰに対して二価のマウスＦＡＰ依存性二重特異性抗体（２８Ｈ１  ＦＡＰ結合体）と比較した。２４時間後、ＯＴ１マウス由来の脾臓ＣＤ８ポジティブ細胞を単離した。そのように行うために、ＯＴ１マウスの脾臓を、３ｍＬシリンジプラグの末端を用いて４０μｍフィルターを通して砕き５０ｍＬ管に受けた。フィルターをＲ１０で洗浄し、脾細胞を、室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。１ｍＬの１×細胞溶解バッファー（蒸留水で１：１０希釈）を細胞に加え、室温で４分間のインキュベーション後、２０ｍＬのＲ１０を加えた。管を室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てた。脾細胞を、３０ｍＬのＲ１０中に再懸濁し、細胞カウント数および生存率を、自動ＥＶＥ細胞カウンターで決定した。ＣＤ８ポジティブ細胞を、マウスＣＤ８ａ＋  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１０４−０７５）およびａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離を用いて、製造会社の使用説明書に従って、ネガティブ選択方法で単離した。その後、分離後のネガティブ画分に見出されたＣＤ８ポジティブ細胞を、予熱されたＰＢＳで洗浄し、ＥＶＥ細胞カウンターでカウントし、細胞数を、予熱されたＰＢＳ中、２×１０７個の細胞／ｍＬに調整した。１０ｍＭ  ＣＦＳＥ溶液（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４）を、予熱されたＰＢＳ中、５０００倍に希釈し、１：１比でＰＢＳ中に再懸濁された細胞に加えた（ＣＦＳＥ最終濃度１μＭ）。短時間のボルテックス後、細胞を室温で５分間、インキュベートした。４０ｍＬの予熱されたＲ１０培地を細胞に加えることにより、標識反応を停止させた。ＰＢＳでの２回の洗浄工程後、ＣＤ８ポジティブ細胞を、Ｒ１０中に再懸濁し、０．５×１０５個の細胞を、１００μｌ  Ｒ１０において、パルスされたＤＣに加えた。実験の５日目、Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のために、０．５μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬおよび２μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３７．５１、カタログ番号１６−０２８１−８６）で再び刺激した。ＳＩＩＮＦＥＫＬおよび抗ＣＤ２８添加から１時間後、細胞内タンパク質輸送をブロックするために、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）（ＢＤ、カタログ番号５１−２３０１ＫＺ）（１：１０００）を細胞に加えた。もう４時間のインキュベーション工程後、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）に基づいた多重サイトカイン測定のために、１５０μｌの上清を採取した。２３個のサイトカインの１セットを測定するために、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）マウスサイトカインＧｒｐＩパネル２３−Ｐｌｅｘキット（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号Ｍ６０００９ＲＤＰＤ）を、製造会社の使用説明書に従って用いた。Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析について、９６ウェル平底プレート内の細胞を、９６ウェル丸底プレートへ移し、ＰＢＳで１回、洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプコントロールの５０μｌとインキュベートした。４℃での１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中蛍光標識抗体の混合物の５０μｌを細胞に加えた。以下の抗体を用いた：抗マウスＣＤ８６  ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＬ−１、カタログ番号１０５０４３）、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＭ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６２６）、抗マウスＣＤ７０  ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＲ７０、カタログ番号１２−０７０１−８２）、抗マウスＣＤ３  ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５−２Ｃ１１、カタログ番号５６２２８６）、抗マウスＣＤ２５  ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＰＣ６１．５、カタログ番号２５−０２５１−８２）、抗マウスＣＤ１１ｃ  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＬ３、カタログ番号５６１１１９）、抗マウスＣＤ４４  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＩＭ７、カタログ番号５６０５６７）、および抗マウスＣＤ８  ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン５３−６．７、カタログ番号１００７１４）。生細胞と死細胞を区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（商標）を抗体混合物に加えた。細胞を、細胞外染色抗体溶液と４℃で３０分間、インキュベートした。その後、細胞を、ＰＢＳで２回、洗浄し、透過処理し、抗マウスＩＦＮγ  ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＸＭＧ１．２、カタログ番号５０５８３０）をＦｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５５２３−００）と共に用いて、製造会社のプロトコールに従って、ＩＦＮγについて細胞内染色した。細胞を、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、同日、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを用いて実施した。ＣＤ８およびＣＤ３の発現を示した生細胞の集団を、ＣＦＳＥ色素希釈度、ＩＦＮγ産生、ＣＤ４４およびＣＤ２５発現について分析した。
【０３５２】
図９Ａ〜９Ｈは、低量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされ、かつ異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＤＣが、Ｔ細胞増殖を誘導し得ることを示している。ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体の場合、ＦＡＰがアッセイに提供された場合のみ、増殖が誘導される。４個のＣＤ４０結合部分および２個のＦＡＰ結合部分を有する、二重特異性抗原結合分子のマウスまたはヒトバージョンで刺激されたＤＣにより誘導された増殖のレベルは同等であった。これは、ＤＣ上に発現したヒトＣＤ４０受容体の下流シグナル伝達が、ｈｕＣＤ４０ｔｇマウスにおいて損なわれていないことを強く示唆する。異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で刺激されているＤＣと共培養されたＴ細胞について、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ２５、またはＩＦＮγ産生の有意な上方制御は観察されなかった。大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスされたＤＣのみが、未処理の条件と比較して、これらのマーカーの明らかな変化を示した。
【０３５３】
上清におけるサイトカイン濃度測定は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体のＩＬ−２（図９Ｉ）およびＩＬ−１２（ｐ４０）（図９Ｊ）発現への効果を示した。ＦＡＰ依存性ヒト抗ＣＤ４０抗体に関して、ＦＡＰの存在下でのみ、ＩＬ−１２（ｐ４０）レベルの上昇が検出された。しかしながら、マウスの等価の二重特異性抗原結合分子は、ＩＬ−１２（ｐ４０）の顕著により高い分泌を誘導した。ＩＬ−２分泌は、抗ヒトＣＤ４０二重特異性抗原結合分子と抗マウスＣＤ４０二重特異性抗原結合分子の両方に関して、類似した程度で、ＦＡＰ依存様式で、増加した。
【０３５４】
２．２．２  ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化される、ＯＶＡパルス化ＤＣを介してのＴ細胞プライミング
セクション２．２．１に記載されているように、ＤＣを、ｈｕＣＤ４０ｔｇマウスの脾臓から単離し、ＦＡＰコーティング化または非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、および異なるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を脾臓ＤＣに加えた。ＤＣによる取り込みおよびプロセシングを必要としないＳＩＩＮＦＥＫＬでＤＣをパルスする代わりに、ＯＶＡタンパク質を抗原として用いた。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）刺激非依存性様式（追加のＴＬＲ刺激は、ＤＣの高い全体的な活性化をもたらす可能性があり、そのことは、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体での刺激による種々の活性化状態の検出を不可能にする）でのＯＶＡ取り込みを促進するために、ビオチン化抗マウスＤＥＣ２０５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、クローンＮＬＤＣ−１４５、カタログ番号１３０−１０１−８５４）と組み合わせてＯｖａ抗原送達試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９４−６６３）を、製造会社のプロトコールに従って用いた。簡単に述べれば、ＤＣを、ＤＥＣ２０５受容体（ＣＤ８ポジティブのクロス提示ＤＣ上に高度に発現している（Ｍ．Ｌａｈｏｕｄら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００、１２（５）、７３１〜７３５））と結合するビオチン化抗体とインキュベートする。その後、Ｏｖａ送達試薬、ＦＩＴＣに連結された抗ビオチン抗体、およびＯＶＡを細胞に加え、ＯＶＡのＤＥＣ２０５受容体媒介性取り込みをもたらす。ネガティブコントロールを提供するために、ＯＶＡの添加なしに、抗ＤＥＣ２０５抗体でのみＤＣを標識した。次の日、セクション２．２．１に記載されているように、ＣＤ８ポジティブＴ細胞を、ＯＴ１マウスから単離し、ＣＦＳＥ標識し、ＤＣに加えた。実験の５日目、マウスＩＦＮ−γ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ４８５−０５）を用いるＩＦＮγ測定のために、１５０μｌの上清を採取した。ＥＬＩＳＡを、製造会社により提供されたプロトコールに記載されているように、実施した。Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析について、９６ウェル平底プレート内の細胞を、９６ウェル丸底プレートへ移し、ＰＢＳで１回、洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプコントロールの５０μｌとインキュベートした。４℃での１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中蛍光標識抗体の混合物の５０μｌを細胞に加えた。以下の抗体を用いた：抗マウスＣＤ４  ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＫ１．５、カタログ番号１００４３８）、抗マウスＣＤ８６  ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＬ−１、カタログ番号１０５０４３）、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＭ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６２６）、抗マウスＣＤ７０  ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＲ７０、カタログ番号１２−０７０１−８２）、抗マウスＣＤ３  ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５−２Ｃ１１、カタログ番号５６２２８６）、抗マウスＣＤ２５  ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＰＣ６１．５、カタログ番号２５−０２５１−８２）、抗マウスＣＤ１１ｃ  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎ���ｅｓ、クローンＨＬ３、カタログ番号５６１１１９）、抗マウスＣＤ４４  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＩＭ７、カタログ番号５６０５６７）、および抗マウスＣＤ８  ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン５３−６．７、カタログ番号１００７１４）。生細胞と死細胞を区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（商標）を抗体混合物に加えた。細胞を、５０μｌの染色抗体混合物と４℃で３０分間、インキュベートした。その後、細胞を、ＰＢＳで２回、洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを用いて実施した。ＣＤ３ポジティブおよびＣＤ８ポジティブの生存細胞を、ＣＦＳＥシグナル、ＣＤ２５およびＣＤ４４発現について分析した。
【０３５５】
図１０Ａ〜１０Ｃ、１１Ａ〜１１Ｃ、１２Ａ〜１２Ｃ、および２２Ａ〜２２Ｂは、ＯＶＡ送達試薬とインキュベートされ、かつヒトＣＤ４０およびＦＡＰを標的化する二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣが、ＣＤ８ポジティブＯＴ１  Ｔ細胞増殖（図１０Ａ〜１０Ｃおよび２２Ａ〜２２Ｂ）、ならびにＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５（図１１Ａ〜１１Ｃ）およびＣＤ４４（図１２Ａ〜１２Ｃ）の発現を有意に増強し得ることを示している。これらの効果は、ＦＡＰ依存性であった。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡの結果により、ヒト抗ＣＤ４０  ＦＡＰ標的化抗体によるＴ細胞活性化の増強が確認された：ＩＦＮγレベルは、抗ヒトＣＤ４０  ＦＡＰ標的化抗体で処理されたＤＣと共培養されたＴ細胞に関する条件において、上昇した（図１３Ａ〜１３Ｃ）。マウス抗ＣＤ４０  ＦＡＰ標的化抗体の効果は同等であり、ｈｕＣＤ４０ｔｇマウスモデルが、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の効果を測定するための適切な系を提供するという仮説を支持している。
【０３５６】
実施例３
ＦＡＰ標的化抗マウスＣＤ４０結合分子の機能的性質
３．１  ＦＡＰ標的化抗マウスＣＤ４０結合分子によるマウスＢ細胞のＣＤ４０媒介性インビトロ活性化
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の脾臓を、セクション２．２．１に記載されているように、処理した。マウスＢ細胞を、マウスＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９０−８６２）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、脾細胞から単離した。１×１０５個のＢ細胞を、９６ウェル平底プレートのウェルあたり１００μｌ  Ｒ１０において播種した。マウスビオチン化ＦＡＰ（社内製造）でコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（詳細な説明について２．１．３参照）、またはコントロールとしての非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、５０μｌのＲ１０において、２：１のビーズ：細胞の比で加えた。アゴニスト抗マウスＣＤ４０抗体を、５０μｌのＲ１０において、Ｂ細胞に加えた。抗体濃度は、１μｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬまで（３×希釈系列）様々であった。この実験設定において、４個の抗マウスＣＤ４０結合部位および１個かまたは２個のいずれかのＦＡＰ結合部位を有する二重特異性抗原結合分子（抗ヒトＣＤ４０二重特異性抗原結合分子におけるＦＡＰ結合ドメインと等価の２８Ｈ１  ＦＡＰ結合体）を、マウスＣＤ４０に対して二価である、ＦＡＰ非依存性ＦＧＫ４．５抗体（ラットＩｇＧ２ａ、ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＥ００１６−２）と比較した。ＦＧＫ４．５の生物活性は、Ｆｃ受容体架橋に依存し（Ｌ．Ｒｉｃｈｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．  ２０１４、２（１））、それゆえに、ＦＧＫ４．５を、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）架橋抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１２−００５−００３、ロット番号１２３８０１）と、室温で３０分間、プレインキュベートした。４８時間後、Ｂ細胞を、活性化マーカーの発現についてＦＡＣＳにより分析した。この目的のために、Ｂ細胞を９６ウェル平底プレートへ移し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプコントロールの５０μｌとインキュベートした。４℃での１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中蛍光標識抗体の混合物の５０μｌを細胞へ加えた。以下の抗体を用いた：抗マウスＣＤ１９  ＢＶ６０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１Ｄ３、カタログ番号５６３１４８）、抗マウスＣＤ８６  ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＬ−１、カタログ番号１０５０４３）、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＭ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６２６）、抗マウスＣＤ７０  ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＲ７０、カタログ番号１２−０７０１−８２）、抗マウスＣＤ８０  ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１６−１０Ａ１、カタログ番号５６２５０４）、抗マウスＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５−２Ｃ１１、カタログ番号５５２７７４）、抗マウスＮＫ１．１  ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＰＫ１３６、カタログ番号１０８７１４）、抗マウスＣＤ１１ｃ  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＬ３、カタログ番号５６１１１９）、抗マウスＣＤ４５  Ａｌｅｘａ  Ｆ��ｕｏｒ  ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン３０−Ｆ１１、カタログ番号５６−０４５１−８２）、抗マウスＣＤ８  ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン５３−６．７、カタログ番号１００７１４）。生細胞と死細胞を区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（商標）を抗体混合物に加えた。細胞を、染色混合物と４℃で３０分間、インキュベートし、ＰＢＳで２回、洗浄し、その後、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳ分析を、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析し、データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを用いて行った。生存可能な単一細胞を、非Ｂ細胞を排除するために、ＣＤ１１ｃネガティブ、ＣＤ３ネガティブ、およびＮＫ１．１ネガティブ細胞についてゲーティングした。ＣＤ８ネガティブ、ＣＤ１９ポジティブ細胞を、Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６の発現について分析した。
【０３５７】
マウスＢ細胞の、１個かまたは２個のいずれかのＦＡＰ結合部分を有するＦＡＰ標的化抗マウスＣＤ４０抗体とのインキュベーションは、Ｂ細胞活性化マーカーの発現を増加させた。ＣＤ７０発現は、架橋ＦＧＫ４．５抗体での条件と比較して、二重特異性抗原結合分子に関してわずかにのみ増加した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。しかしながら、高レベルのＣＤ７０を発現する細胞の全体的な数は、むしろ低かった。ＣＤ８０発現は、Ｂ細胞の、マウスＣＤ４０およびＦＡＰを標的化する二重特異性分子での処理で、ＦＡＰ依存性様式で上方制御した（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。二重特異性分子は、ＣＤ８０上方制御の場合、二価ＦＡＰ非依存性ＦＧＫ４．５抗体より高い効力を示した。ＣＤ８６発現増加も同様に、試験された全てのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体により誘導され、発現レベルは全ての抗体について同等であった（図１４Ｅおよび１４Ｆ）。ＣＤ８６上方制御は、２個のＦＡＰ結合部分を有する四価抗マウスＣＤ４０抗体に関してＦＡＰ依存性であったが、たった１個のＦＡＰ結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について、ＦＡＰ非依存性効果が観察された。加えて、ＭＨＣ−ＩＩ発現のＦＡＰ非依存性上方制御は、全ての試験された二重特異性抗原結合分子について観察された（図１４Ｇおよび１４Ｈ）。
【０３５８】
３．２  ＦＡＰ標的化抗マウスＣＤ４０結合分子によるマウスＤＣおよびＴ細胞のＣＤ４０媒介性インビボ活性化
マウスＦＡＰ発現を有するマウス結腸腺癌ＭＣ３８＿ＦＡＰトランスフェクタント腫瘍細胞株を、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔ  ＡＧで実施されたインビボ継代から取得し、増殖後、Ｇｌｙｃａｒｔ内の細胞バンクに預けた。ＭＣ３８＿ｍｕＦＡＰ＿ｉｎｖｉｐａ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）、１ｍＭピルビン酸塩、１×ＮＥＡＡ、および６μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭにおいて培養した。細胞を、水飽和雰囲気中、５％ＣＯ２、３７℃で培養し、９５％の生存率でインビトロ継代１４回において、注射した。１００μｌ細胞懸濁液（５０％ＲＰＭＩ培地および５０％ｍａｔｒｉｇｅｌ）中２×１０６個の腫瘍細胞を、皮下注射した。実験の開始時点で週齢８〜９週間の３３匹のＣ５７Ｂｌ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した）を、特定病原体除去の条件下で、１２時間の明期と１２時間の暗期の一日サイクルで、認定ガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、維持した。実験研究プロトコールは、地方自治体により検討されて、認可され（Ｐ２０１１−１２８）、到着後、動物を、新しい環境に慣れるように、および観察のために、１週間、維持した。その後、それらは、識別のために背中の右側の皮下にトランスポンダーを埋め込み、回復のためにもう１週間、維持した。定期的に、連続的な健康モニタリングを実行した。インビボでＣＤ４０のＦＡＰ標的化活性化を研究するために、マウスに、２×１０６個のＭＣ３８−ＦＡＰを研究０日目に皮下注射した。腫瘍が２００ｍｍ３に達したｘ日目において、群あたり９匹のマウスに、２００μＬの異なる化合物を腹腔内に注射した。ビヒクル群におけるマウスに、ヒスチジンバッファーを注射し、治療群の動物に、１０ｍｇ／ｋｇ  ＦＧＫ４．５かまたは１５ｍｇ／ｋｇ  ＦＧＫ４．５  ４＋１のいずれかを注射した。動物を、毎日、臨床症状、および体重減少などの有害作用の検出について管理した。動物についての終了判断基準は、臨床的病気、運動障害、およびみすぼらしい毛衣であった。治療注射後７２時間目および８日目の時点において、腫瘍、脾臓、腫瘍流入領域および腫瘍非流入領域リンパ節を、群あたり３匹のマウスから収集し、フローサイトメトリーにより分析した。加えて、全ての屠殺された動物由来の血清を収集して、肝臓傷害を示す血清酵素を分析した。
【０３５９】
フローサイトメトリー分析について、セクション２．１．１およびセクション３．１、それぞれに記載されているように、全ての収集された器官の単一細胞懸濁液を調製し、蛍光標識抗体で染色した。生細胞と死細胞を区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（商標）を抗体混合物に加えた。細胞を、染色混合物と４℃で３０分間、インキュベートし、ＰＢＳで２回、洗浄し、その後、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳ分析を、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて実施し、データ解析を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを用いて行った。ＤＣを、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩについて高ポジティブで、かつＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ１９についてネガティブな生存可能な単一細胞として同定した。ＣＤ７０およびＣＤ８６発現（どちらもＤＣ活性化マーカー）を、治療注射から３日後、ＤＣ上で分析した。生存可能なＣＤ４５ポジティブ、ＣＤ３ポジティブ、およびＣＤ８ポジティブな単一細胞を、ＣＤ８＋  Ｔ細胞として同定した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、Ｋｉ６７  ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＳｏｌＡ１５、カタログ番号１１−５６９８−８２）発現について分析し、腫瘍におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数を、絶対的細胞カウントビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号０１−１２３４）を用いて決定した。
【０３６０】
図２３Ａ〜２３Ｃに示されているように、３日目、肝細胞傷害を示唆する酵素が、ＣＤ４０の単一腹腔内用量を注射されたマウスにおいて増加したが、ＦＡＰ−ＣＤ４０またはビヒクル単独を注射されたマウスにおいては増加しなかった。加えて、ＦＡＰ−ＣＤ４０  ４＋１またはビヒクル単独を注射されたマウスと比較して、治療から３日後、ＣＤ４０治療マウスの体重が減少し、脾臓の重さが増加し（それぞれ、図２３Ｄおよび２３Ｅ）、親ＣＤ４０抗体で治療された動物と比較して、ＦＡＰ標的化ＣＤ４０抗体で治療された動物における重症度のより低い副作用を示した。ＦＧＫ４．５より低い程度であったが、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体は、ビヒクル治療マウスと比較して、治療から３日後、腫瘍流入領域リンパ節においてＤＣ活性化（ＣＤ８６およびＣＤ７０発現）の有意な増加（図２４Ａおよび２４Ｂ）、および治療から８日後、腫瘍におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖（Ｋｉ６８発現および細胞数）の有意な増加（図２４Ｃおよび２４Ｄ）を誘導した。要約すれば、４＋１型式でＣＤ４０のＦＡＰ依存性活性化を有するＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０分子が、非標的化抗ＣＤ４０親抗体ＦＧＫ４．５と比較して、全身性毒性の低下と共に、腫瘍所有マウスにおいて強力なＤＣおよびＴ細胞活性化を誘導する。
【０３６１】
実施例４
抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の作製および産生
４．１  抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の第１の作製
４．１．１  方法
抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６は、ＷＯ２０００／０７５３４８に開示されており、配列番号１２９のＶＨドメインおよび配列番号１３０のＶＬドメインを有する。その変異体を、以下に記載されているように作製した。抗ＣＤ４０結合体Ｓ２Ｃ６のヒト化工程中の適切なヒトアクセプターフレームワークの同定について、２つの方法の組合せを用いた。一方においては、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを探索し、このフレームワーク上にＣＤＲをグラフトし、どの逆突然変異を構想できるかを評価することによる、古典的手法をとった。より明確には、同定されたフレームワークの親抗体との各アミノ酸の違いを、その結合体の構造的完全性への影響について判断し、親配列への逆突然変異を、適切な場合はいつでも導入した。構造評価を、Ｂｉｏｖｉａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン４．５を用いて実装された社内の抗体構造相同性モデル化ツールで作製された、親抗体とそのヒト化型の両方のＦｖ領域相同性モデルに基づいた。
【０３６２】
他方では、社内開発されたインシリコツールを用いて、ヒト化型のＶＨドメインおよびＶＬドメインのお互いへの配向を予測した（参照により本明細書に組み入れられたＷＯ２０１６０６２７３４参照）。その結果を、親結合体の予測されたＶＨ−ＶＬドメイン配向と比較して、出発抗体と幾何学的に近いフレームワーク組合せについて選択した。理論的根拠は、その２個のドメインのペアリングの破壊的変化をもたらし得るＶＨ−ＶＬ接触面領域における可能性のあるアミノ酸交換を検出することである。
【０３６３】
４．１．２  アクセプターフレームワークの選択およびその適合
アクセプターフレームワークを、下記の表１２に記載されているように選択した：
2020515276.tif 000058
【０３６４】
ＣＤＲ３後のフレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）およびヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ１＊０１（ＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連した部分は、下線で示されている。
【０３６５】
構造的考慮に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親結合体におけるアミノ酸への逆突然変異を、ＶＨ領域の位置Ｈ４８（Ｍ＞Ｉ）およびＨ７１（Ｒ＞Ｖ）ならびにＶＬ領域の位置Ｌ３６（Ｆ＞Ｙ）、Ｌ４６（Ｒ＞Ｌ）、およびＬ８７（Ｙ＞Ｆ）（Ｋａｂａｔ番号付け）に導入した。さらに、ＣＤＲ−Ｈ２における２つの位置を、正突然変異のための有望な候補、すなわち、全体的なヒト特性を増加させるための親結合体からヒトアクセプター生殖系列へのアミノ酸交換として、つまり、Ｈ６０（Ｎ＞Ａ）およびＨ６４（Ｋ＞Ｑ）を同定した。
【０３６６】
推定の開発可能性ホットスポット（アスパラギン脱アミド）に取り組むために、親結合体に関するさらなる変化を、ＶＨにおける位置Ｈ５２ｂ（Ｎ＞Ｑ）およびＨ５４（Ｎ＞Ａ）、ならびにＶＬにおける位置Ｌ２７ｆ（Ｎ＞Ｑ）、Ｌ２８（Ｇ＞Ｐ）、Ｌ２９（Ｎ＞Ｑ）、およびＬ３０（Ｔ＞Ｉ）（Ｋａｂａｔ番号付け）に導入した。
【０３６７】
以下の表１３において、ＶＨ−ＶＬペアリングマトリックスが示されている：
2020515276.tif 000059
【０３６８】
４．１．３  生じたヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン
生じた、ヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨドメインは、下記の表１４に見出すことができ、生じた、ヒト化ＣＤ４０抗体のＶＬドメインは、下記の表１５に列挙されている。
2020515276.tif 000060
2020515276.tif 000061
【０３６９】
Ｓ２Ｃ６変異体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域についてのヒト化アミノ酸配列を、ＤＮＡへ逆翻訳し、生じたｃＤＮＡ（ｃＮＤＡ）を合成し（ＧｅｎＡｒｔ）、その後、エフェクター機能を抑止するＬＡＬＡおよびＰＧ突然変異（ロイシン２３４からアラニンへ、ロイシン２３５からアラニンへ、プロリン３２９からグリシンへ）を有するヒトＩｇＧ１バックボーン／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクターへ、またはヒトＣ−κとの融合タンパク質として軽鎖発現ベクターへクローニングした。その後、ＬＣプラスミドおよびＨＣプラスミドを、ＨＥＫ２９３へコトランスフェクションし、７日後、抗体精製についての標準方法により上清から精製した。
【０３７０】
４．２  抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の第２の作製
４．２．１  方法
実施例４．１についてのように、抗ＣＤ４０結合体Ｓ２Ｃ６のヒト化工程中の適切なヒトアクセプターフレームワークの同定について、２つの方法の組合せを用いた。一方においては、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを探索し、このフレームワーク上にＣＤＲをグラフトし、どの逆突然変異を構想できるかを評価することによる、古典的手法をとった。より明確には、同定されたフレームワークの親抗体との各アミノ酸の違いを、その結合体の構造的完全性への影響について判断し、親配列への逆突然変異を、適切な場合はいつでも導入した。構造評価を、Ｂｉｏｖｉａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン４．５を用いて実装された社内の抗体構造相同性モデル化ツールで作製された、親抗体とそのヒト化型の両方のＦｖ領域相同性モデルに基づいた。
【０３７１】
他方では、社内開発されたインシリコツールを用いて、ヒト化型のＶＨドメインおよびＶＬドメインのお互いへの配向を予測した（参照により本明細書に組み入れられたＷＯ２０１６０６２７３４参照）。その結果を、親結合体の予測されたＶＨ−ＶＬドメイン配向と比較して、出発抗体と幾何学的に近いフレームワーク組合せについて選択した。理論的根拠は、その２個のドメインのペアリングの破壊的変化をもたらし得るＶＨ−ＶＬ接触面領域における可能性のあるアミノ酸交換を検出することである。
【０３７２】
４．２．２  アクセプターフレームワークの選択およびその適合
２つの異なるアクセプターフレームワークを、以下の表１６および表１８に記載されているように選択した。
2020515276.tif 000062
【０３７３】
ＣＤＲ３後のフレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）およびヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連した部分は、太字で示されている。
【０３７４】
構造的考慮に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親結合体におけるアミノ酸への逆突然変異を、ＶＨ領域の位置Ｈ４３（Ｑ＞Ｋ）、Ｈ４４（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ６９（Ｍ＞Ｌ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｖ）、Ｈ７３（Ｔ＞Ｋ）、Ｈ８８（Ｖ＞Ａ）、およびＨ１０５（Ｑ＞Ｈ）、ならびにＶＬ領域の位置Ｌ２（Ｉ＞Ｖ）、Ｌ４（Ｍ＞Ｖ）、Ｌ８７（Ｙ＞Ｆ）、およびＬ１０４（Ｖ＞Ｌ）に導入した。一変異体において、突然変異Ｔ７０Ｓ（ＶＨ）が、この位置におけるわずかにより親水性残基の効果を研究するために含まれた。
【０３７５】
全ての変異体は、推定の開発可能性ホットスポット（アスパラギン脱アミド）に取り組むために、Ｎ５４Ａ突然変異（ＶＨ）を含む。全ての位置は、ＫａｂａｔＥＵ番号付けスキームにおいて与えられている。
【０３７６】
以下の表１７において、ヒト化変異体ＶＨ−ＶＬペアリングマトリックスが示されている：
2020515276.tif 000063
2020515276.tif 000064
【０３７７】
ＣＤＲ３後のフレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）およびヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連した部分は、太字で示されている。
【０３７８】
構造的考慮に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親結合体におけるアミノ酸への逆突然変異を、ＶＨ領域の位置Ｈ４４（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ４９（Ｓ＞Ｇ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｖ）、Ｈ７８（Ｌ＞Ａ）、Ｈ９４（Ｋ＞Ｒ）、およびＨ１０５（Ｑ＞Ｈ）、ならびにＶＬ領域の位置Ｌ４２（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｓ）、およびＬ８７（Ｙ＞Ｆ）に導入した。さらに、ＣＤＲ−Ｈ２における４つの位置を、正突然変異のための有望な候補、すなわち、全体的なヒト特性を増加させるための親結合体からヒトアクセプター生殖系列へのアミノ酸交換として、つまり、Ｈ６０（Ｎ＞Ｇ）、Ｈ６１（Ｑ＞Ｄ）、Ｈ６２（Ｋ＞Ｓ）、およびＨ６３（Ｆ＞Ｖ）を同定した。
【０３７９】
全ての変異体は、推定の開発可能性ホットスポット（アスパラギン脱アミド）に取り組むために、Ｎ５４Ａ突然変異（ＶＨ）を含む。全ての位置は、ＫａｂａｔＥＵ番号付けスキームにおいて与えられている。
【０３８０】
以下の表１９において、ヒト化変異体ＶＨ−ＶＬペアリングマトリックスが示されている：
2020515276.tif 000065
【０３８１】
４．２．３  生じたヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン
生じた、アクセプターフレームワーク１に基づいたヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、下記の表１７に見出すことができ、生じた、アクセプターフレームワーク２に基づいたヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、下記の表１８に列挙されている。
2020515276.tif 000066
2020515276.tif 000067
【０３８２】
４．２．４  ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧ型式における新しいヒト化ＣＤ４０抗体
ＶＨおよびＶＬの新しいヒト化変異体に基づいて、新しいＣＤ４０抗体を、ＷＯ２０１２／１３０８３１  Ａ１に記載された方法に従って、Ｆｃγ受容体との結合を抑止するためにエフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を有するｈｕＩｇＧ１抗体として発現させた。
2020515276.tif 000068
【０３８３】
ヒトＩｇＧ１＿ＬＡＬＡＰＧ抗体としてのヒト化ＣＤ４０抗体の完全長配列は表２０に見出すことができる。
2020515276.tif 000069
2020515276.tif 000070
2020515276.tif 000071
2020515276.tif 000072
2020515276.tif 000073
2020515276.tif 000074
2020515276.tif 000075
2020515276.tif 000076
2020515276.tif 000077
【０３８４】
４．２．５  ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧ型式における新しいヒト化ＣＤ４０抗体の産生
異なるペプチド鎖をコードする発現ベクターの懸濁培養で増殖したＨＥＫ２９３−Ｆ細胞への一過性トランスフェクションにより、抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）へのトランスフェクションを、細胞供給会社の使用説明書に従って、抗体ベクターのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の調製物、Ｆ１７に基づいた培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）、および無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１〜２百万個の生細胞／ｍｌの細胞の初濃度を用いて、実施した。細胞培養物上清を、振盪フラスコまたは撹拌発酵槽における７日間の培養後、１４０００ｇで３０分間での遠心分離により採取し、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
【０３８５】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養物上清から抗体を精製した。簡単に述べれば、滅菌濾過された細胞培養物上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と平衡したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂上に捕捉し、平衡バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０で溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０での中和後、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて、濃縮し、−８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ−ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、およびエンドトキシン決定による、次の特性評価に用いた。
【０３８６】
異なるヒト化ＣＤ４０抗体についての産生収量は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィーを用いる調製用アフィニティークロマトグラフィー後の収量から計算された力価値として表２１に示されている。
【０３８７】
最終精製工程後のその分子の純度および分子量を、還元剤の存在下および非存在下で、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造会社の使用説明書に従って用いた。
【０３８８】
その分子の凝集体含有量を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＮａＮ３、ｐＨ６．７  ランニングバッファーにおいてＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて、２５℃で分析した。
【０３８９】
全ての抗体を直接比較するために、静的光散乱（ＳＬＳ）および印加した温度応力に応じた固有タンパク質蛍光を測定することによって、熱安定性を監視した。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の３０μｇの濾過タンパク質試料を２連でＯｐｔｉｍ  ２機器（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ）に適用した。温度を０．１℃／分で２５℃から８５℃に傾斜して、半径および総散乱強度を回収した。固有タンパク質蛍光を決定するために、試料を２６６ｎｍで励起させ、発光を２７５ｎｍ〜４６０ｎｍで回収した。全ての抗体について、凝集温度（Ｔａｇｇ）は、６４℃から６９℃の間であり、下記の表２４および表２５に提供されている。
【０３９０】
異なるフレームワークを有するヒト化ＣＤ４０抗体についての産生収量は、下記の表２４または表２５に示されている。
2020515276.tif 000078
2020515276.tif 000079
【０３９１】
４．２．６  組換えヒトおよびカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインタンパク質の作製
以下のコンストラクトを、クローニングし、ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションにより発現させた。
１）Ｃ末端Ｈｉｓ−ＡｖｉＴａｇ（商標）タグを有するヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２１〜１９３、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００１２４１）（配列番号２６６）
２）Ｃ末端Ｈｉｓ−ＡｖｉＴａｇ（商標）タグを有する、カニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ４０細胞外ドメイン（アミノ酸２１〜１９３、カニクイザルＣＤ４０細胞外ドメイン配列をＲｏｃｈｅカニクイザルｃＤＮＡデータベース（未公開データ）から取得した）（配列番号２６７）
【０３９２】
結合分析のためのＣＤ４０細胞外ドメイン抗原を、遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により作製し、標準クローニング手順を用いて、固有の制限部位を介してＲｏｃｈｅの社内発現ベクターへクローニングした。全てのコンストラクトのクローニングをシーケンシングにより検証した。全ての抗原は、ＣＭＶプロモーターの調節下で発現した。ＣＤ４０細胞外ドメインコンストラクトの一過性発現では、懸濁培養系のＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）にそれぞれのプラスミドをトランスフェクションした：一般的に、約２×１０６個の細胞／ｍｌにおけるＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の１Ｌに、製造会社の使用説明書に従って、ＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により複合体形成させた合計５００μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を６日間、インキュベートした。その後、細胞を遠心分離により採取し、タンパク質を含有する上清を、０．２２μｍ減圧濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した。Ｈｉｓ−ＡｖｉＴａｇ（商標）タグ付きタンパク質を、完全Ｈｉｓ−Ｔａｇ樹脂（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０での洗浄後、Ｈｉｓ−ＡｖｉＴａｇ（商標）融合タンパク質を、５００ｍＭイミダゾールを追加した洗浄バッファー、ｐＨ７．０を用いて溶出した。凝集したタンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４におけるサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、単量体融合タンパク質から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（１０ＫＤ  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて濃縮し、−８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ−ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、および質量分析による次の特性評価のために用いた。
【０３９３】
ＣＤ４０細胞外ドメインのビオチン化：
Ｃ末端ＡｖｉＴａｇ（商標）を含有するヒトまたはカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインコンストラクトの酵素部位特異的ビオチン化を、製造会社の使用説明書に従ってＢｉｒＡ  ビオチン−タンパク質リガーゼキット（Ａｖｉｄｉｔｙ  ＬＬＣ、ＵＳＡ）を用いることにより実施した。簡単に述べれば、ＢｉｏｍｉｘＡ（１０×濃度：０．５Ｍビシンバッファー、ｐＨ８．３）およびＢｉｏｍｉｘＢ（１０×濃度：１００ｍＭ  ＡＴＰ、１００ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、５００μＭ  ｄ−ビオチン）の１／１０体積をＡｖｉＴａｇ（商標）含有タンパク質に加え、続いて、１０ｎｍｏｌタンパク質あたり２．５μｇ  ＢｉｒＡリガーゼを加えた。その反応混合物を、３０℃で１時間、インキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  ｐｒｅｐａｃｋｅｄ  ＨｉＬｏａｄカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）におけるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【０３９４】
４．２．７  ヒト／カニクイザルＣＤ４０結合表面プラズモン共鳴スペクトロスコピーアッセイ
捕捉システム（１０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２；注文コード：２８９５８３２５；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）の約１２０００レゾナンスユニット（ＲＵ）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給されたアミンカップリングキットを用いることにより、ｐＨ５．０においてＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上にカップリングした。試料とシステムのバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）  ｐＨ７．４であった。フローセルは２５℃に設定され（試料ブロックは１２℃に設定）、ランニングバッファーで２回、プライミングされた。抗体は、５０ｎＭ溶液を５μｌ／分の流量で３０秒間、注射することにより捕捉された。３００ｎＭから開始し、１：３希釈での溶液中様々な濃度でのヒトＣＤ４０細胞外ドメインまたはカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインを、３０μｌ／分の流量で３００秒間、注射することにより会合を測定した。解離相を、試料溶液からランニングバッファーへ切り換えることにより引き起こして、１２００秒間までモニターした。グリシン  ｐＨ２．１溶液での３０μｌ／分の流速、６０秒間の洗浄により表面を再生させた。バルク屈折率差を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた応答を引き算することにより補正した。ブランク注射もまた引き算される（＝二重参照）。見かけのＫＤおよび他の動力学的パラメータの計算について、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを用いた。見かけのＫｄを、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ  Ｂ４０００評価ソフトウェア（バージョン１．１）を用いて計算した。
【０３９５】
４．２．８  ＣＤ４０特異的ヒト化抗体の特徴づけのための細胞結合アッセイ
ＣＤ４０ポジティブ細胞（Ｒａｊｉ細胞）を、トリプシンを用いて培養ボトルから剥離し、Ｃａｓｙ細胞カウンターを用いてカウントした。４℃でのペレット化後、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２．５％  ＦＣＳ）中に再懸濁し、２．０Ｅ＋０６個の細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルＰＰ  Ｖ底プレート（２５μＬ／ウェル＝５．０Ｅ＋０４Ｚｅｌｌｅｎ／ウェル）に分配した。
【０３９６】
ＣＤ４０特異的抗体を、ＦＡＣＳバッファー中２０μｇ／ｍＬに調整し、１０μｇ／ｍＬの最終濃度を生じた。２０μｌを２５μｌ細胞懸濁液へ加え、４℃で１時間、インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーにおいて２回洗浄した。洗浄後、細胞を、二次抗体（＜ｈｕＩｇＧ＞−Ａｌｅｘａ４８８、ｃ＝１０μｇ／ｍＬ）を含有する５０μＬ  ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、４℃で１時間、インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーにおいて２回、洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いる測定のために７０μｌ／ウェル  ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。
【０３９７】
表２６において、ヒト化ＣＤ４０抗体のＣＤ４０発現細胞（Ｒａｊｉ細胞）との親和性（Ｂｉａｃｏｒｅにより測定）および細胞結合が示されている。
2020515276.tif 000080
【０３９８】
４．２．９  ＵＨＲ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析による抗体特徴づけ
試料を、２％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む４０％アセトニトリルを用いるセファデックスＧ２５  ５×２５０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でのＨＰＬＣにより脱塩した。総質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅソース（Ａｄｖｉｏｎ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）におけるＵＨＲ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳにより決定した。データ収集を９００〜４０００ｍ／ｚ（ＩＳＣＩＤ：０．０ｅＶ）において行った。生の質量スペクトルを評価し、社内開発されたソフトウェアツールを用いて個々の相対モル質量へ変換した。
【０３９９】
４．２．１０  抗体の熱安定性評価
試料を、２０ｍＭヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、０．４μｍフィルタープレートを通しての遠心分離により光学３８４ウェルプレートへ移し、パラフィンオイルで覆った。試料を２５℃から８０℃へ０．０５℃／分の率で加熱しながら、流体力学半径を、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ）における動力学的光散乱により繰り返し、測定した。あるいは、試料を１０μＬマイクロキュベットアレイへ移し、それらを２５℃から９０℃へ０．１℃／分の率で加熱しながら、静的光散乱データおよび２６６ｎｍレーザーでの励起による蛍光データをＯｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ  Ｉｎｃ．）で記録した。凝集開始温度は、流体力学半径（ＤＬＳ）または散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始める温度として定義される。融解温度は、蛍光強度対波長を示すグラフにおける屈曲点として定義される。
【０４００】
実施例５
新しいヒト化ＣＤ４０抗体変異体に関する二重特異性コンストラクトの作製および産生
５．１  ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的する二重特異性抗原結合分子の作製
実施例４に記載されているようなＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを、適切な発現プラスミドにおいてヒトＩｇＧ１の対応する重鎖定常または軽鎖定常とインフレームでクローニングした。重鎖および軽鎖の発現は、ＭＰＳＶコアプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーエレメントからなるキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動される。発現カセットはまた、ｃＤＮＡの３’末端に合成ポリＡシグナルを含有する。加えて、プラスミドベクターは、プラスミドのエピソーム維持のための複製開始点（ＥＢＶ  ＯｒｉＰ）を有する。
【０４０１】
実施例１と同様に、異なる二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体を、ＦｃのＣ末端における１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた４個のＣＤ４０結合部分からなる４＋１型式（図１Ａ）で、またはＦｃのＣ末端における１個のＦＡＰ結合部分（図１Ｃおよび１Ｅ）かもしくはＦｃのＣ末端における２個のＦＡＰ結合部分（図１Ｄ）かのいずれかと組み合わされた２個のＣＤ４０結合部分からなる２＋１および２＋２型式で調製する。加えて、１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた１個のＣＤ４０結合部分からなる二重特異性抗体を調製する（図１Ｆ）。ＦＡＰ結合体、２８Ｈ１および４Ｂ９の作製および調製は、参照により本明細書に組み入れられているＷＯ２０１２／０２０００６  Ａ２に記載されている。４＋１分子および２＋１分子を作製するために、ノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを用いて、ヘテロ二量体化を達成する。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）において導入し、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）において導入する。２＋２分子において、ＷＯ２０１０／１４５７９２  Ａ１に記載されているようなＣｒｏｓｓＭａｂテクノロジーにより、正しい軽鎖ペアリングが保証される。二重特異性の型式に関係なく、全ての場合において、ＷＯ２０１２／１３０８３１  Ａ１に記載された方法に従って、Ｆｃγ受容体との結合を抑止するために、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、２３４Ａ）を用いる。二重特異性分子の配列は、表２７に示されている。
【０４０２】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わされたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの調節下で一過性に発現する。発現ベクターは、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）核内抗原）含有宿主細胞におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含有する。
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【０４０３】
実施例４．２に記載されているような新しいヒト化ＣＤ４０抗体変異体に関して、さらなる二重特異性抗体を調製した。そのような二重特異性抗体の特定の配列は、下記の表２８に示されている。特に、異なる二重特異性ＣＤ４０−ＦＡＰ抗体を、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したクロスオーバーｆａｂ断片としての１個のＦＡＰ結合部分と組み合わされた４個のＣＤ４０結合部分からなる４＋１型式（図１５Ｆおよび１５Ｇ）、またはＶＬ−ＣＨ１鎖がＦｃノブ鎖のＣ末端に融合している、クロスオーバーｆａｂ断片としての１個のＦＡＰ結合部分（図１５Ｈ）か、もしくはＶＨ−ＣＬ鎖がＦｃノブ鎖のＣ末端に融合している、クロスオーバーｆａｂ断片としての１個のＦＡＰ結合部分（図１５Ｉ）かのいずれかと組み合わされた２個のＣＤ４０結合部分からなる２＋１型式で調製した。
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【０４０４】
５．２  ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的化する二重特異性抗原結合分子の産生
ＣＤ４０および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的化する二重特異性抗原結合分子を、４つの異なるペプチド鎖をコードする発現ベクターの、懸濁培養で増殖したＨＥＫ細胞への一過性トランスフェクションにより発現させた。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションを、抗体ベクターのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）調製物、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、Ｐｅｉｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）、および無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における１ｍｌあたり１〜２百万個の生存可能な細胞の最初の細胞密度を用いて、細胞供給会社の使用説明書に従って実施した。振盪フラスコまたは撹拌発酵槽内での７日間の培養後、細胞培養物上清を、１４０００ｇでの３０分間の遠心分離により採取し、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
【０４０５】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養物上清から二重特異性抗体を精製した。簡単に述べれば、滅菌濾過された細胞培養物上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と平衡したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂上に捕捉し、平衡バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０で溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０での中和後、凝集したタンパク質を、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０におけるサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、必要に応じて、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて濃縮し、−８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ−ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、およびエンドトキシン決定による次の特性評価のために用いた。
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【０４０６】
５．３  ヒト化ＣＤ４０抗体変異体およびＦＡＰを含む二重特異性抗体の特徴づけ
５．３．１  ヒトまたはマウスＦＡＰ発現マウス線維芽細胞との結合
実施例１．４．１に記載されているように、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９、またはマウス線維芽細胞活性化タンパク質（ｍＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍＦＡＰクローン２６を用いて、細胞表面ＦＡＰとの結合を試験した。ヒト化ＣＤ４０抗体変異体を含む二重特異性抗原結合分子の一部について測定された場合のＥＣ５０値は、表７に示されている。
【０４０７】
５．３．２  ＦＡＰとの結合（表面プラズモン共鳴）
ヒトＦＡＰを結合する二重特異性コンストラクトの能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。全てのＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ）において２５℃、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ））で実施した。
【０４０８】
Ｈｉｓタグ付きヒト二量体ＦＡＰ（組換えＦＡＰ＿ＥＣＤ）を、抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号３４６６０）を固定化したＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、１０ｕＬ／分の流速で６０秒間５００ｎＭ  ｈｕＦＡＰ、２０ｕＬ／分の流速で２０秒間１０ｎＭマウスＦＡＰ、および２０ｕＬ／分の流速で２０秒間１０ｎＭ  ｃｙｎｏＦＡＰの注射により捕捉した。最高１８０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の抗Ｈｉｓ抗体についての固定化レベルを用いた。捕捉工程後、二重特異性抗体およびコントロール分子をすぐに、０．７８〜１００ｎＭの範囲の濃度、３０μＬ／分の流速で２８０秒間、および１８０秒間の解離相で、チップ表面上を通過させた。バルク屈折率差を、ＦＡＰが固定化されていない参照フローセルで得られた応答を引き算することにより補正した。結合活性をＬａｎｇｍｕｉｒ  １：１曲線フィッティングを用いて決定した。二価結合について、同じ１：１フィッティングを用いて、見かけのＫＤ値を導いた。
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【０４０９】
５．３．３  ＣＤ４０との結合（表面プラズモン共鳴）
ヒトＣＤ４０を結合する二重特異性コンストラクトの能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。全てのＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ）において２５℃、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ））で実施した。
【０４１０】
実施例４．２．７に従って、３００ｎＭから開始し、１：３希釈での溶液中様々な濃度でのヒトＣＤ４０細胞外ドメインを、３０μｌ／分の流量で３００秒間、注射することにより会合を測定した。解離相を、試料溶液からランニングバッファーへ切り換えることにより引き起こして、１２００秒間までモニターした。グリシン  ｐＨ２．１溶液での３０μｌ／分の流速、６０秒間の洗浄により表面を再生させた。バルク屈折率差を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた応答を引き算することにより補正した。ブランク注射もまた引き算される（＝二重参照）。見かけのＫＤおよび他の動力学的パラメータの計算について、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを用いた。見かけのＫｄを、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ  Ｂ４０００評価ソフトウェア（バージョン１．１）を用いて計算した。
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【０４１１】
５．３．４  ヒトＣＤ４０発現Ｄａｕｄｉ細胞との結合
実施例１．４．２に記載されているように、細胞表面ＣＤ４０との結合を、Ｄａｕｄｉ細胞（高発現レベルのヒトＣＤ４０を有するヒトＢリンパ芽球細胞株）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１３）を用いて試験した。ヒト化ＣＤ４０抗体変異体を含む二重特異性抗原結合分子の一部について測定された場合の例示的なＥＣ５０値は、表８に示されている。
【０４１２】
５．３．５  ヒト化ＣＤ４０抗体変異体を含む二重特異性抗原結合分子の機能的性質
ヒト化ＣＤ４０抗体変異体を含む二重特異性抗原結合分子の機能的性質を、実施例２に記載された実験に従って分析した。例示的なデータは、前に本明細書に示されているように表９、１０、または１１に提供されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図３Ｇ−Ｈ】
2020515276.tif 000099
【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
2020515276.tif 000101
【図４Ｅ−Ｆ】
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【図５Ａ−Ｂ】
2020515276.tif 000103
【図５Ｃ−Ｄ】
2020515276.tif 000104
【図５Ｅ−Ｆ】
2020515276.tif 000105
【図５Ｇ−Ｈ】
2020515276.tif 000106
【図６】
2020515276.tif 000107
【図７Ａ−Ｂ】
2020515276.tif 000108
【図７Ｃ−Ｄ】
2020515276.tif 000109
【図７Ｅ−Ｆ】
2020515276.tif 000110
【図７Ｇ−Ｈ】
2020515276.tif 000111
【図８】
2020515276.tif 000112
【図９Ａ−Ｂ】
2020515276.tif 000113
【図９Ｃ−Ｄ】
2020515276.tif 000114
【図９Ｅ−Ｆ】
2020515276.tif 000115
【図９Ｇ−Ｈ】
2020515276.tif 000116
【図９Ｉ−Ｊ】
2020515276.tif 000117
【図１０】
2020515276.tif 000118
【図１１】
2020515276.tif 000119
【図１２】
2020515276.tif 000120
【図１３】
2020515276.tif 000121
【図１４Ａ−Ｂ】
2020515276.tif 000122
【図１４Ｃ−Ｄ】
2020515276.tif 000123
【図１４Ｅ−Ｆ】
2020515276.tif 000124
【図１４Ｇ−Ｈ】
2020515276.tif 000125
【図１５】
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【図１６】
2020515276.tif 000127
【図１７】
2020515276.tif 000128
【図１８】
2020515276.tif 000129
【図１９】
2020515276.tif 000130
【図２０】
2020515276.tif 000131
【図２１】
2020515276.tif 000132
【図２２】
2020515276.tif 000133
【図２３Ａ−Ｃ】
2020515276.tif 000134
【図２３Ｄ−Ｅ】
2020515276.tif 000135
【図２４】
2020515276.tif 000136
【図２５Ａ−Ｂ】
2020515276.tif 000137
【図２５Ｃ−Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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