(57)【要約】本発明は、造血幹細胞の増殖に有効であるＭＥＩＳタンパク質を阻害する組成物に関する。本発明は、細胞膜を容易に通過することができ、細胞内でその活性を発揮し、ならびに濃度依存的にＭＥＩＳ活性を阻害することができる製剤を提供する。さらに、本発明は、マウス、ヒト臍帯血、およびヒト骨髄ＨＳＣのエクスビボ増殖を含み得る。さらに、本発明のインビボ適用は、骨髄および末梢血における造血幹細胞の増殖を引き起こす。【選択図】図１
2020500185.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された細胞、培地、増殖因子、およびＭＥＩＳｉ阻害因子を含むことを特徴とする、ＭＥＩＳタンパク質を阻害する組み合わせ医薬。
【請求項２】
前記細胞が、マウス骨髄、ヒト骨髄、およびヒト臍帯血から単離されたことを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項３】
前記培地が、７．２のｐＨ値を有し、ウシ血清アルブミン、組み換えインスリン、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール、およびＩＭＤＭ培地を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項４】
前記増殖因子が、造血幹細胞因子ＳＣＦ、胎児肝臓チロシンキナーゼ−３リガンドＦｌｔ３Ｌ、およびスロンボポイエチンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬。
【請求項５】
ＭＥＩＳｉ−１の化学式が、４−［２−（ベンジルアミノ）−２−オキソエトキシ］−Ｎ−（２，３−ジメチルフェニル）ベンズアミドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬。
【請求項６】
ＭＥＩＳｉ−２の化学式が、４−ヒドロキシ−Ｎ’−［（Ｚ）−（２−オキソナフタレン−１−イリデン）メチル］ベンゾヒドラジドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬。
【請求項７】
成人組織および胚性細胞から得られた造血幹細胞、常在の心筋幹細胞、および心筋細胞の増殖を可能とすることを特徴とする、ＭＥＩＳタンパク質を阻害する組み合わせ医薬。
【請求項８】
骨髄移植前の単核細胞のエクスビボ増殖および線維芽細胞、軟骨、内皮、角膜縁、および間葉系幹細胞のエクスビボ増殖を可能とすることを特徴とする、ＭＥＩＳタンパク質を阻害する組み合わせ医薬。
【請求項９】
癌および癌幹細胞におけるＭＥＩＳ阻害に用いられることを特徴とする、ＭＥＩＳタンパク質を阻害する組み合わせ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖に有効であるＭＥＩＳタンパク質を阻害する組み合わせ医薬に関連する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の最も顕著な特徴は、自己複製能と複数タイプの細胞に分化する能力である。これらの能力により、ＨＳＣは、将来的に体の造血活性に必要とされる再生能を維持しつつも全てのタイプの血液細胞に形質転換することができる。ＨＳＣは、それらの自己複製能により、血液病の治療のためのＨＳＣ移植に頻繁に用いられている。しかしながら、適切なドナーがこれらの移植のために見つかったとしても、臍帯血などの供給源から取得された同種異系間のＨＳＣ数は、有効な移植に十分ではない。それゆえ、ＨＳＣのエクスビボ増殖のための研究はこのような治療適用に必要である。さらに、造血細胞において、遺伝子調節技術後、これらの細胞の単一細胞の選別および増殖が必要とされている。
【０００３】
ある文献の適用では、マウスにおけるＨＳＣサイレンシング遺伝子の欠失がＨＳＣの増殖を誘発することが観察されている。ＭＥＩＳ１タンパク質は、これらの標的の最も注目されているものの１つであり、幹細胞増殖技術における治療上の標的とされている。
【０００４】
ＭＥＩＳタンパク質（ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２およびＭＥＩＳ３）は、様々なドメインから構成されている。Ｐｂｘ１ドメインは、ＭＥＩＳ１とＰｂｘ１タンパク質との相互作用および共活性化に有効である。このドメインは、ＭＥＩＳ１タンパク質のＮ末端のアミノ酸６９〜１９４に局在する。別の重要なドメインは、一般にアミノ酸３３５〜３９０を包含するＣ末端を含むトランス活性化ドメインである。別の重要なドメインは、これらのタンパク質が後に名付けられるホメオボックスドメイン（ホメオドメインとも称される）である。このドメインの大きさは、ＭＥＩＳ１タンパク質で約６２アミノ酸であり、アミノ酸２７２〜３３６を含む。ＤＮＡのＭＥＩＳ１タンパク質のＭＥＩＳ１特異的ヌクレオチド配列は、ＴＧＡＣＡＧに結合することを可能にする。この結合ドメインは、ＭＥＩＳタンパク質（すなわち、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２およびＭＥＩＳ３タンパク質）において保護され、同一であるタンパク質配列を有する。ＭＥＩＳタンパク質がＤＮＡにこのドメインを介して結合し、ＭＥＩＳ１特異的ＤＮＡ結合ヌクレオチド配列を有するという事実は、ホメオドメインを阻害因子実験のための最良の標的とするものである。
【０００５】
ＭＥＩＳタンパク質（ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２およびＭＥＩＳ３）は、ＴＡＬＥクラスホメオドメインを含むホメオボックスタンパク質ファミリーに属する。ホメオボックスタンパク質は、核タンパク質であり、それらは、主に転写因子として機能する。ＭＥＩＳ１タンパク質はまた、心臓再生における心筋細胞サイクルを阻害する特徴を有する。
【０００６】
米国特許文献第ＵＳ２０１５０３５３８９０号は、胚性造血幹細胞の増殖およびそれを必要とする患者への造血機能の提供に必要とされるキット、組成物および方法に関する。
【０００７】
欧州特許文献第ＥＰ２２３６１３１号は、サーチュイン脱アセチル化酵素タンパク質の活性を調節するための方法および組成物を開示する。
【０００８】
国際特許文献第ＷＯ２０１５１４８７１６号は、ヒト造血細胞／前駆細胞のエクスビボ増殖のために得られた方法および組成物を開示する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目的は、造血幹細胞の増殖に有効なＭＥＩＳタンパク質（ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２およびＭＥＩＳ３）を阻害する組み合わせ医薬を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、細胞膜を容易に通過することができ、細胞におけるその活性を達成する組み合わせ医薬を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、濃度依存的にＭＥＩＳタンパク質の活性を阻害する組み合わせ医薬を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、マウス造血幹細胞のエクスビボ増殖を誘導する組み合わせ医薬を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ヒト臍帯血造血幹細胞のエクスビボ増殖を誘導する組み合わせ医薬を提供することである。医薬
【００１４】
本発明の別の目的は、ヒト骨髄および末梢造血幹細胞のエクスビボ増殖を誘導する組み合わせ医薬を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、造血細胞における遺伝子調節後に造血幹細胞の増殖を誘導する組み合わせ医薬を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、インビボ前臨床試験においてＭＥＩＳ阻害を行うことによって造血幹細胞の増殖を高める組み合わせ医薬を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ｐ２１、Ｈｉｆｌａ、Ｈｉｆ２ａ遺伝子発現を低下させる組み合わせ医薬を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、ＧＥＭＭ（顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）造血幹細胞コロニー数を５倍以上増加させる組み合わせ医薬を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、赤血球前駆細胞の数を増加させる組み合わせ医薬を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる別の目的は、ＭＥＩＳタンパク質の転写活性を阻害する組み合わせ医薬を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＭＥＩＳｉ−１によるｐ２１−ルシフェラーゼ活性の阻害の図である。
【図２】図２は、ＭＥＩＳｉ−２によるｐ２１−ルシフェラーゼ活性の阻害の図である。
【図３】図３は、ＭＥＩＳ１経路（ｐ２１、Ｈｉｆ１ａ、Ｈｉｆ２ａ）におけるＭＥＩＳ阻害因子（ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２）の効果のリアルタイムＰＣＲ分析の図である。
【図４】図４は、Ｌ９２９（マウス線維芽）細胞株に適用されたＭＥＩＳ阻害因子（ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２）の細胞毒性分析の図である。
【図５】図５は、用量依存的マウス造血細胞増殖に対する投与７日後のＭＥＩＳ阻害因子の効果の図である。
【図６】図６は、ヒト造血細胞増殖に対するＭＥＩＳ阻害因子の効果の細胞計数結果のフロー分析の図である。（Ａ）ＣＤ３４＋、（Ｂ）ＣＤ１３３＋、（Ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋、（Ｄ）ＡＬＤＨｂｒ抗体
【図７】図７は、ＭＥＩＳｉ−１を適用したＬｉｎ−幹細胞および前駆細胞（骨髄から単離し、磁気分離の結果として取得）、およびＭＥＩＳｉ−１でそれらの増殖７日後のＬＳＫフロー分析の図である。
【図８】図８は、ＭＥＩＳｉ−２を適用したＬｉｎ−幹細胞および前駆細胞（骨髄から単離し、磁気分離の結果として取得）、およびＭＥＩＳｉ−１でそれらの増殖７日後のＬＳＫフロー分析の図である。
【図９】図９は、ＣＦＵ実験によるマウスＨＳＣのインビトロ機能的増殖および形成される異なるコロニーの比率を示す。
【図１０】図１０は、ＭＥＩＳ阻害因子ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳＩ−２のマウスへの皮下注射１０日後の下記細胞のインビボ機能的増殖のフロー分析を示す;  （Ａ）ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−低ＨＳＣ。  （Ｂ）ＬＳＫＣＤ３４低ＨＳＣ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＥＩＳタンパク質を阻害する小分子から構成される組み合わせ医薬であり、前記分子はまた、エクスビボおよびインビボＨＳＣ増殖に有効である。
【００２３】
本発明の組み合わせ医薬を構成するＭＥＩＳタンパク質であるＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２およびＭＥＩＳ３タンパク質は、幹細胞移植に必要とされる幹細胞の増殖技術に多大な貢献をしてきた。
【００２４】
＊本明細書に開示され、本発明を構成する阻害因子は、「ＭＥＩＳｉ−１」と略称され、ＭＥＩＳ阻害因子−１を意味するものとする
【００２５】
＊ＭＥＩＳｉ−２は、ＭＥＩＳ阻害因子−２を意味する。本発明の目的を達成するために開発されている「ＭＥＩＳタンパク質を阻害する組み合わせ」に関する図が添付されて供される。
図１は、ＭＥＩＳｉ−１によるｐ２１−ルシフェラーゼ活性の阻害の図である。
図２は、ＭＥＩＳｉ−２によるｐ２１−ルシフェラーゼ活性の阻害の図である。
図３は、ＭＥＩＳ１経路（ｐ２１、Ｈｉｆ１ａ、Ｈｉｆ２ａ）におけるＭＥＩＳ阻害因子（ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２）の効果のリアルタイムＰＣＲ分析の図である。
図４は、Ｌ９２９（マウス線維芽）細胞株に適用されたＭＥＩＳ阻害因子（ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２）の細胞毒性分析の図である。
図５は、用量依存的マウス造血細胞増殖に対する投与７日後のＭＥＩＳ阻害因子の効果の図である。
図６は、ヒト造血細胞増殖に対するＭＥＩＳ阻害因子の効果の細胞計数結果のフロー分析の図である。
（Ａ）ＣＤ３４＋、（Ｂ）ＣＤ１３３＋、（Ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋、（Ｄ）ＡＬＤＨｂｒ抗体
図７は、ＭＥＩＳｉ−１を適用したＬｉｎ−幹細胞および前駆細胞（骨髄から単離し、磁気分離の結果として取得）、およびＭＥＩＳｉ−１でそれらの増殖７日後のＬＳＫフロー分析の図である。
図８は、ＭＥＩＳｉ−２を適用したＬｉｎ−幹細胞および前駆細胞（骨髄から単離し、磁気分離の結果として取得）、およびＭＥＩＳｉ−１でそれらの増殖７日後のＬＳＫフロー分析の図である。
図９は、ＣＦＵ実験によるマウスＨＳＣのインビトロ機能的増殖および形成される異なるコロニーの比率を示す。
図１０は、ＭＥＩＳ阻害因子ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳＩ−２のマウスへの皮下注射１０日後の下記細胞のインビボ機能的増殖のフロー分析を示す;
（Ａ）ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８低ＨＳＣ。
（Ｂ）ＬＳＫＣＤ３４低ＨＳＣ。
【００２６】
インシリコ、インビトロおよびインビボ実験により、ＭＥＩＳタンパク質（ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＭＥＩＳ３）を阻害する製剤が得られる。
【実施例】
【００２７】
実験研究
本発明の組成物には、
−ＭＥＩＳｉ阻害因子、
−単離の結果として得られる細胞、
−培地、
−増殖因子
が含まれる。
【００２８】
ＭＥＩＳｉ阻害因子は、ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２から構成される。よって、４−［２−（ベンジルアミノ）−２−オキソエトキシ］−Ｎ−（２，３−ジメチルフェニル）ベンズアミド（３８８．４９ｇ／ｍｏｌの分子量）を基準としてＭＥＩＳｉ−１阻害因子についてモル濃度を算出した。
【００２９】
有効な用量は、用量依存的インビトロ実験により１μＭであると決定した。
【００３０】
４−ヒドロキシ−Ｎ’−［（Ｚ）−（２−オキソナフタレン−１−イリデン）メチル］ベンゾヒドラジド（３０６．３２ｇ／ｍｏｌの分子量）を基準としてＭＥＩＳｉ−２阻害因子についてモル濃度を算出した。
【００３１】
有効な用量は、用量依存的インビトロ実験により１μＭであると決定した。
【００３２】
細胞は、マウス骨髄、ヒト骨髄、およびヒト臍帯血から取得した。これらの細胞を、血清を含まない培養培地であるステムスパン培地中でインキュベートした。
【００３３】
ステムスパン培地を培地として使用し、この培地は、ウシ血清アルブミン、組み換えインスリン、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および栄養補給したＩＭＤＭ培地を含有する。この培地のｐＨ値は７．２である。ステムスパン培地は、各培養前に新たに調製し、増殖因子を付加する。
【００３４】
用いられる増殖因子は、ＳＣＦ（造血幹細胞因子）、Ｆｌｔ３Ｌ（胎児肝臓チロシンキナーゼ−３リガンド）、およびＴＰＯ（スロンボポイエチン）である。
【００３５】
特性実験
上記に記載の内容によって得られた本発明の組み合わせにおいて、単離の結果として得られた細胞を、幹細胞増殖因子を含む培地中に撒種し、ＭＥＩＳｉ−１またはＭＥＩＳ２で処理した。次いで、３７℃にて５％ ＣＯ２および通常のＯ２レベルで約１週間から１０日間インキュベートした後、細胞の増殖を、遺伝子調節技術を必要とすることなく試験した。この増殖の結果として、著しい増殖が観察され、これらの結果はフローサイトメトリー分析によって支持された。
【００３６】
下記の特性実験をＭＥＩＳ阻害因子について行った；
１−インシリコ薬物スクリーニング
２−インビトロルシフェラーゼアッセイ
３−ＰＣＲ経路分析
４−エクスビボＨＳＣ増殖試験
５−インビボＨＳＣ増殖、および
６−細胞毒性分析
【００３７】
１−ＭＥＩＳホメオドメインに対するインシリコ薬物スクリーニング
ＭＥＩＳに対するインシリコ薬物スクリーニングを行うために、ホメオドメインを、標的ＤＮＡと相互作用するアミノ酸について解析した。
【００３８】
ＭＥＩＳホメオドメインがＴＧＡＣＡＧヌクレオチドに結合するために介するアミノ酸を決定するために２つの異なる経路を調べる：
ａ）ＭＥＩＳのホメオドメインにおけるホモログ／保護アミノ酸ドメインおよびそれが属するＴＡＬＥタンパク質、ならびにＤＮＡに結合するための保護アミノ酸を解析した。
ｂ）Ｐｂｘ１は、ＭＥＩＳと同一ファミリーに属するタンパク質である。Ｐｂｘ１ホメオドメインの結晶構造を調べ；三次構造比較は、ＭＥＩＳホメオドメインの結晶構造を用いてこの構造について行い；次いでＭＥＩＳホメオドメインタンパク質がＤＮＡと結合する可能性のあるアミノ酸を解析した。
−続いて、グリッドボックス（gridbox）がＤＮＡに結合するために必須であるＭＥＩＳホメオドメインアミノ酸の周辺で見出され、バーチャル阻害剤スクリーニング（virtual inhibitor screening）を行った。
−ＰｕｂＣｈｅｍおよびＺＩＮＣデータベースから１００万個の小分子の三次構造を取得した。１００万個の分子の自動化スクリーニングは、ＡｕｔｏＤｏｃｋＶｉｎａ １．１．２およびＰａＤＥＬ−ＡＤＶプログラムを用いることによって実施し、可能性のある相互作用部分を解析した。
表１：ＭＥＩＳｉ阻害因子のホメオドメイン結合エネルギーの値（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）
【表１】
2020500185.tif 000003
【００３９】
さらに、実施した試験を他のＴＡＬＥホメオドメインと比較し、その結合エネルギーを調べ、それによりＭＥＩＳ特異的阻害因子を決定した（表１）。
【００４０】
２−インビトロルシフェラーゼレポーターアッセイによるＭＥＩＳ１阻害因子の決定
ＭＥＩＳ阻害因子は、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行うことにより試験した。ＭＥＩＳタンパク質は、漸増用量のｐ２１プロモーターを含有するルシフェラーゼレポーターを活性化することが観察された。ＭＥＩＳ１によって活性化されるｐ２１遺伝子プロモーターを含むｐＧＬ２ベクターを、ルシフェラーゼアッセイで用いた。それゆえ、０．８μｇのｐ２１−ｐＧＬ２、４００ｎｇのＭＥＩＳ１発現ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６−ＭＥＩＳ１（Ｏｐｅｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、および０．２μｇのｐＣＭＶ−ＬａｃＺ（内部コントロール）ベクターをＣＯＳ細胞に一緒にトランスフェクトさせた。４時間後、該細胞をプロトタイプＭＥＩＳ阻害因子（０．１、１、および１０μＭ濃度）で処理した。６ウェルプレートおよびリポフェクタミンをトランスフェクションに用いた。４８時間後、該細胞を溶解し、試料を収集し、ルシフェラーゼ活性を調べた。このためにＰｒｏｍｅｇａのレポーターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム）を用いた。ルシフェラーゼ測定は、β−ｇａｌ測定により標準化した（測定は４２０ｎｍで行った）。Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂ ｓｙｓｔｅｍ Ｌｕｍｉｎｏ ｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ装置をルシフェラーゼ測定に用いた。これらの実験の結果として、ＭＥＩＳホメオドメインを標的とし、他のＴＡＬＥホメオドメインと比較して行ったインシリコ実験により、ＭＥＩＳ特異的なヒットを調べることができた（実験結果（ＥＲ）：ＥＲ−Ａ）。
【００４１】
３−リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＭＥＩＳ阻害因子実験
ＨＳＣは、各阻害因子について調製し（６ウェルで３回）、ＤＭＳＯを含有する細胞シリーズを対照群として用いた。各可能性のある小分子について、アッセイを０．１、１、および１０μＭの濃度で行い；該細胞をトリプシン処理し、３日後に回収し、ＲＮＡ単離を行うまでトリゾール中で保存した。ＲＮＡ抽出をＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニキットおよびプロトコルを用いて行った。ｃＤＮＡは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴシステムを用いることにより２μｇのＲＮＡから合成した。アッセイは、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置で実施した。ＧＡＰＤＨをコントロール遺伝子として用い、遺伝子発現をｄｄＣＴ法により標準化するために用いた。ＭＥＩＳ１によって活性化されることが知られているｐ２１、Ｈｉｆ−１アルファ（Ｈｉｆ−１α）、Ｈｉｆ−２アルファ（Ｈｉｆ−２α）遺伝子発現のレベルを調べ、ＤＭＳＯ対照群によって調節した（図３）（ＥＲ：Ｂ）。
【００４２】
４−エクスビボＨＳＣ増殖におけるＭＥＩＳ阻害因子の効果の決定
マウスからの骨髄の単離およびＨＳＣ精製を行った。このために、８〜１２週齢のマウスをイソフルランで安楽死させ、骨髄細胞を大腿骨および脛骨から取得した。簡単に説明すると、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ｃ−Ｋｉｔ＋、ＣＤ３４低細胞（長期ＨＳＣ）は、ビオチンを有する細胞株混合物（抗ＣＤ３、抗ＣＤ５、抗Ｂ２２０、抗Ｍａｃ−１、抗Ｇｒ１、抗Ｔｅｒ１１９；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、続いてストレプタビジン−ＰＥ／Ｃｙ５．５、抗Ｓｃａ−１−ＦＩＴＣ、抗ＫＩＴ−ＡＰＣ、および抗ＣＤ３４−ＰＥ染色で染色することによって取得した。ＳＣＦ培地として公知のＨＳＣ培地を単離された骨髄細胞の培養に用いた。ＳＣＦ培地は、１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を加えた血清を含まないステムスパン培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から構成される。
【００４３】
ＨＳＣ出現頻度と数：
骨髄から取得したＬｉｎ−細胞をＭＥＩＳ阻害因子またはＤＭＳＯを含む細胞培養中で１０日間処理し、次いで造血細胞の数（図４）とＨＳＣの割合（図５および６）を調べた。ＨＳＣ数を調べるために、関連する表面抗原（Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ｃ−Ｋｉｔ＋、ＣＤ３４−）を上記の実験と同様に蛍光色素を抱合した抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した（ＥＲ：Ｃ）。
【００４４】
ＨＳＣのインビトロ機能的増殖および増加したコロニー数：
細胞培養７日後、ＭＥＩＳ阻害因子またはＤＭＳＯで処理したＨＣＳ数を調べた。ＤＭＳＯは対照群である。２０００個の細胞を適切な半流動寒天培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ、Ｍ３４３４、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養し、１０〜１４日後、コロニー数を調べ、コロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵアッセイ）を算出した。ＣＦＵアッセイとともに、ＨＳＣのインビトロ機能増殖、ならびに生じた異なるコロニーの顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球（ＧＥＭＭ）、顆粒球単球（ＧＭ）、およびＢＦＵ−Ｅ比を示した（図７）（ＥＲ：Ｄ）。
【００４５】
ヒトＨＳＣ増殖：
骨髄または臍帯血から得た細胞をＰｅｒｃｏｌｌで分離し、単核細胞を得た。それらを、ＨＳＣ培地を含有するチューブに移した。ＳＣＦ培地として公知のＨＳＣ培地を、単離した骨髄および臍帯血ＨＳＣの培養に用いた。ＳＣＦ培地は、ヒトサイトカイン混合物（ステムスパン（登録商標）ＣＣ１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０２６９０）および１％のＰＳＡ（１０．０００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１０．０００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２４００６２）を含む血清フリーのステムスパン培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から構成される。ＨＳＣ精製後、ＨＳＣを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３７９９）に１ウェルあたり２００〜３００個のＨＳＣで撒種し；次いで最大２００μｌのＭＥＩＳ阻害因子（ＳＣＦ培地中で混合）を各細胞に加え、それらを３７℃にて５％ ＣＯ２および通常のＯ２レベルで７〜１０日間インキュベートした。次いで、ＨＳＣおよび他の造血前駆細胞の数および割合（頻度）を調べた。結果をＤＭＳＯで処理した対照群と比較した（ＥＲ：Ｅ）。
【００４６】
５−ＭＥＩＳ阻害因子によるＨＳＣのインビボ増殖
小分子を用いることによるＨＳＣのエクスビボ増殖の代わりに、ＭＥＩＳ阻害因子をインビボＨＳＣ増殖に直接用いることも可能であることが示された。注入するＭＥＩＳ阻害因子を０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。有効なインキュベーションを確実なものとするために、前記阻害因子を３つの異なる用量でマウスに投与し；投与１０日後、マウスの骨髄から得られたＨＳＣの量を調べた（図９）（ＥＲ：Ｆ）。
【００４７】
６−ＭＥＩＳ阻害因子の細胞毒性分析
Ｌ９２９マウス線維芽細胞株をＭＥＩＳ阻害因子の細胞毒性分析に用いた。該細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３７９９）に１ウェルあたり２０００個の細胞で撒種した。撒種翌日に、該細胞を、各ウェルに最大２００μｌのＤＭＥＭ培地中に混合したＭＥＩＳ１阻害因子１（ＭＥＩＳｉ−１）およびＭＥＩＳ１阻害因子２（ＭＥＩＳｉ−２）による０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの最終濃度を用いて、勾配濃度法により異なる用量で処理し、３７℃にて５％ ＣＯ２および通常のＯ２レベルでインキュベートした。インキュベーション４日後、１０μｌのＷＳＴ１細胞増殖溶液（Ｂｏｓｔｅｒ、ＡＲ１１５９）を加え、４時間のインキュベーション後、吸光度の測定をＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂ ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ（ＥＲ−Ｇ）により４５０ｎｍで行った。
【００４８】
実験結果
実験結果を（ＥＲ）と略記し、関連する結果を下記に記載する。
Ａ−インビボルシフェラーゼ実験を用いて、ＭＥＩＳ阻害因子−１（ＭＥＩＳｉ−１）およびＭＥＩＳ阻害因子−２（ＭＥＩＳｉ−２）と称するＭＥＩＳ阻害因子を最初に調べた。これらの阻害因子（ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２）は、ｐ２１−Ｌｕｃ ＭＥＩＳレポーターを濃度依存的に阻害する（図１および図２）。
Ｂ−ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２（開発されたＭＥＩＳ阻害因子である）は、ＭＥＩＳ１経路におけるｐ２１、Ｈｉｆ−１アルファ（Ｈｉｆ−１α）、Ｈｉｆ−２アルファ（Ｈｉｆ−２α）遺伝子の発現を減少させることが知見された（図３）。
Ｃ−１０日後のＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２で処理した造血細胞数を調べると、２．５倍までの用量依存的増加を測定した（図４）。ＭＥＩＳｉ−１による処理では、ＨＳＣ数において１０倍までの増加が見られた（図５）。この増加は用量に依存する（図５）。さらに、ＭＥＩＳｉ−２で処理したＬｉｎ−細胞では、ＨＳＣ数において３倍までの増加が見られた（図６）。
Ｄ−ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの増加数から、ＭＥＩＳ阻害因子の適用がＨＳＣ数を増加させることが見られた（図７）。ＭＥＩＳ阻害因子は、有効にＨＳＣの機能的に増加させることができる。
Ｅ−全ての結果を解析すると、ＭＥＩＳ阻害因子がヒトＨＳＣの機能的なエクスビボ増殖を引き起こすことが観察される（図８）。ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２を用いた場合、ヒト造血細胞培養におけるＣＤ３４＋ＨＳＣ数（図８Ａ）、ＣＤ１３３＋ＨＳＣ数（図８Ｂ）、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３ ＨＳＣ数（図８Ｃ）、およびＡＬＤＨＢｒ ＨＳＣ数（図８Ｄ）は、ＤＭＳＯ対照群と比較して２倍増加した。
Ｆ−ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２をインビボで用いた場合、マウス骨髄におけるＨＳＣ数（図９Ａ、ＬＳＫＣＤ３４低細胞）および血液におけるＨＳＣ数（図９Ｂ、ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８細胞）の持続的な増加が示された。つまり、ＭＥＩＳ阻害因子がマウスおよびヒトＨＳＣの機能的なエクスビボ増殖を実現することが観察された（図５−８）。
Ｇ−得られた結果において、ＭＥＩＳ阻害因子ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２は、０．１、１、および１０μＭの用量で細胞毒性を有しないことが観察された（図１０）。
【００４９】
結果として、ＭＥＩＳ阻害因子を実施した実験において初めて調べた。インシリコ実験は、ＭＥＩＳホメオドメインを標的とし、他のＴＡＬＥホメオドメインと比較して行い、ＭＥＩＳ特異的なヒットを調べることを可能とした（表１）。
【００５０】
これらの阻害因子は
ｐ２１−Ｌｕｃ ＭＥＩＳレポーターを阻害する（図１および図２）
ＭＥＩＳ１経路における遺伝子発現を減少させる（図３）
ＭＥＩＳ阻害因子は、マウスおよびヒト機能ＨＳＣのエクスビボ増殖を引き起こす（図４、５、６、７、８）。
【００５１】
ＭＥＩＳｉ−１およびＭＥＩＳｉ−２をインビボで用いた場合、骨髄および末梢血におけるＨＳＣ数が増加したことが示された（図９）
【００５２】
ＭＥＩＳ阻害因子１（ＭＥＩＳｉ−１）およびＭＥＩＳ阻害因子２（ＭＥＩＳｉ−２）は細胞毒性を有しないことを確認した（図１０）
【００５３】
本発明の出願
本発明は、臍帯幹細胞およびヒト骨髄幹細胞のインビトロおよびエクスビボ増殖を実現する。さらに、本発明により；単一細胞の増殖が、遺伝子調節後の単一造血幹細胞の選別後に活性化され、成人組織および胚性細胞から得られた造血幹細胞の増殖を可能とする。さらに；常在の心筋幹細胞および心筋細胞の増殖；単核細胞の骨髄移植前のエクスビボ増殖；線維芽細胞、軟骨、内皮、角膜縁、および間葉系幹細胞のエクスビボ増殖；ＭＥＩＳ遺伝子ファミリーを高度に発現する癌および癌幹細胞におけるＭＥＩＳ阻害が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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