(57)【要約】  本発明は、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）由来の酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ、ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現させる組換え大腸菌を利用して、ダイゼインまたはゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）から、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）を選択的および効率的に合成する方法に関するものである。  また、前記微生物菌株と５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを発現する生変換組成物は、抗酸化剤、抗がん剤などに使用することができ、更年期疾患の予防または治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌。
【請求項２】
請求項１の組換え大腸菌を利用して、基質であるダイゼインからエクオールを合成する方法。
【請求項３】
請求項１の組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成する方法。
【請求項４】
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、前記４つの酵素のうちテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を残りの３つの酵素に比べて５倍以上過発現する組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法。
【請求項５】
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）を発現する組換え大腸菌と、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌とを利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法。
【請求項６】
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）およびジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現しない組換え大腸菌を利用して、基質であるダイゼインからジヒドロエクオールを選択的に合成する方法。
【請求項７】
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）およびジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現しない組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成する方法。
【請求項８】
請求項４または請求項５において、前記５‐ヒドロキシ‐エクオールは、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２〜請求項７のいずれか一項において、前記組換え大腸菌が全細胞触媒として利用される方法。
【請求項１０】
請求項２〜請求項７のいずれか一項において、好気性条件で進行されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２〜請求項７のいずれか一項において、０．２〜１ｍｍｏｌ／Ｌの基質を使用して合成する方法。
【請求項１２】
請求項２〜請求項７のいずれか一項において、基質転換率が９５％以上であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項２〜請求項７のいずれか一項において、反応系に水溶性高分子をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３において、前記水溶性高分子が食品添加用水溶性高分子であって、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドンであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項３または請求項７による方法で合成される５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール。
【請求項１６】
下記化学式で表される５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール。
【化１】
2020508671.tif 000003
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクオール誘導体を生産する組換え大腸菌およびこれを利用したエクオール誘導体の合成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内微生物のうち一部の嫌気性微生物は、ヒトがマメ科植物を通じて摂取したイソフラボンを代謝してエクオールへと生変換することが知られている。これまでに発見されたエクオール合成微生物はすべてバクテリアであり、代表的に、スラッキア属（Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．）、エガセラ属（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）、アドレクルーツィア属（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｉｚｉａ  ｓｐ．）のように、大部分がコリオバクテリア属に属しており、例外的に、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来も存在する。
【０００３】
前記のような腸内微生物の酵素反応により作られたエクオールは、Ｓ構造の光学異性体のみ合成され、これは、ヒトの人体に吸収されて植物性エストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）効果を示すことが知られている。したがって、エクオールを絶えず摂取する場合、乳がんの誘発といった従来の更年期症状治療剤の副作用なしに、女性の更年期症状、特に、骨粗しょう症の発病および症状が緩和されることが証明された。このような効果は、エクオールの分子構造がヒトのエストロゲンと類似性を有し、エストロゲン受容体αとβのうちαへの選択性が高いためである。それだけでなく、（Ｓ）‐エクオールは、心血管系疾患を予防し、前立腺がんを緩和させる効果も明らかにされている（非特許文献１）。エクオールの類似体である５‐ヒドロキシ‐エクオールは、イソフラボンであるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）から由来した物質で、エクオールに比べて明らかにされた生物学的効能は相対的に少ないものの、エクオールよりも優れた抗酸化性を示す植物性エストロゲンであることが報告されている（非特許文献２）。また、ジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）は、前立腺がんと卵巣がん細胞の成長を阻害するという報告があり、臨床第２期試験の結果、化学抗がん剤に耐性が生じた卵巣がんの抑制に効果があることが報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
しかし、腸内微生物を利用するエクオール合成のための多様な努力と研究とは異なり、５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成の努力は制限的であった。ただ、エクオールを生合成するいくつかの腸内微生物が５‐ヒドロキシ‐エクオールを合成できることが、以下のように報告されている。ラットの腸で同定したコリオバクテリアＳｔｒａｉｎ  Ｍｔ１Ｂ８とヒトの大便で同定したスラッキア・イソフラボニコンバーテンスを利用して、ゲニステインがジヒドロゲニステインを経て５‐ヒドロキシ‐エクオールへと生合成されることが明らかとされた（非特許文献４）。しかし、このような菌株を利用した５‐ヒドロキシエクオールの生産は、微生物を嫌気条件で生長させることに対する制限点があり、微生物の接種後、最少１５時間後から５‐ヒドロキシ‐エクオールが生産され、生産性が低く、標準物質の不在による正確な最終収率予測が難しいという限界点が存在する。
【０００５】
イソフラボンの一つであるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）は、微生物Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｍｔ１Ｂ８（１６）、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）（１７）、ｓｔｒａｉｎ  ＡＵＨ‐ＪＬＣ１５９によって、５‐ヒドロキシ‐エクオールへと生転換されることが報告されたことがあるが、反応および培養時間が２〜３日と長く、嫌気性反応条件を要求し、基質であるゲニステインの量が０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上である場合、転換率が８０％以下に低下する問題点が存在する（特許文献１）。
【０００６】
合成された５‐ヒドロキシ‐エクオールは、ＤＰＰＨラジカル捕捉効果が（Ｓ）‐エクオールの２０倍であり、Ｃ・エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）の寿命とストレス抵抗性を増加させることが証明されている（非特許文献５）。しかし、５‐ヒドロキシ‐エクオールのその他の生理的活性は明らかにされていない。
【０００７】
最近、ラクトコッカスおよびスラッキア属のバクテリアから、イソフラボンダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）をエクオールに変換させる役割をする４つの酵素が、２０１３年、Ａｎｎｅｔｔ  Ｂｒａｕｎｅグループによって初めて同定された（非特許文献６）。前記酵素は、３つの還元酵素と、１つの異性化酵素で構成されており、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許公報第１０３２７５８８４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＲｅｖｉｅｗｓ，６９（８），４３２‐４４８，２０１１
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２３（６），３７８‐３８４，２０１４
【非特許文献３】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２１（４），６３３‐６３９，２０１１
【非特許文献４】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４，４８４７（２００８）／Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７５，１７４０（２００９）
【非特許文献５】Ｃｏｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２３（６）：３７８‐３８４，２０１４
【非特許文献６】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７９（１１），３４９４，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つを発現する組換え大腸菌を提供することである。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、新規な化合物である５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを提供することであり、これに対する合成方法は皆無であった。
【００１２】
そこで、本発明の他の目的は、前記組換え大腸菌を利用して、ダイゼインまたはゲニステインから、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成する方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つのうち２つまたは３つの酵素を組み合わせて発現する組換え大腸菌を利用して、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的および効率的に合成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明者らは、ヒトの腸内微生物であるスラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）由来のダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌および前記４つの酵素のうち２つまたは３つの酵素を組み合わせて発現する組換え大腸菌を製造した。
【００１５】
また、本発明の組換え大腸菌は、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）からエクオール（ｅｑｕｏｌ）またはジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）を生変換する全細胞触媒（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）として利用され得、ゲニステインを５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに選択的に生転換する全細胞触媒として利用され得る。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、好気性条件で基質の濃度約０．２〜約１ｍｍｏｌ／Ｌにおいて９５％の基質転換率で、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを生合成することができる。
【００１７】
また、本発明は、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。
【００１８】
また、本発明は、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの選択的合成を、好気性条件において数時間単位で遂行可能であるため、生産費用の節減および生産物による高付加価値の獲得が可能であり、効率的な大量生産を通じて、食品、医薬品などの多様な応用先への活用が可能である。
【００１９】
また、本発明の組換え大腸菌を全細胞触媒として利用する反応系への追加的な酸化還元酵素に適用する場合、多様なヒドロキシ‐イソフラボノイドを合成することができることから、研究的に価値が高い。
【００２０】
また、本発明によって合成された化合物は、更年期疾患の予防および治療に使用され得、前立腺がん、卵巣がんの治療のための抗がん剤として用いられ得る。また、化粧品または食品添加物の形態で抗酸化剤として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、初期ダイゼインの濃度による（Ｓ）‐エクオールの収率を示した図表である。
【図２】図２は、４つの酵素をすべて発現する組換え大腸菌を利用した、エクオール（ｅｑｕｏｌ）、ジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）合成反応の模式図である。
【図３】図３は、図２の合成反応において、反応時間によるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、ＧＳＮ）、ジヒドロゲニステイン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、ＤＨＧ）、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ、５ＯＨ‐ＥＱ）、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ、５‐ＯＨ‐ＤＥＱ）の反応系内濃度（μＭ）を示す。
【図４】図４は、２つの酵素を発現する組換え大腸菌１および２を利用して区画化された合成反応の模式図である。
【図５】図５は、図４の合成反応において、反応時間による、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，ＧＳＮ）、ジヒドロゲニステイン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，ＤＨＧ）、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ，５ＯＨ‐ＥＱ）、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ，５‐ＯＨ‐ＤＥＱ）の反応系内濃度（μＭ）を示す。
【図６】図６は、図２および図４にて言及した組換え大腸菌の細胞抽出物におけるタンパク質の量をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで示したものである。
【図７】図７は、２１０〜３２０ｎｍの波長範囲において、円二色性分散系を利用して楕円率を測定した図表である。
【図８】図８は、２つまたは３つの酵素を発現する組換え大腸菌を利用しての、反応時間によるジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）の反応系内濃度（μＭ）を示す。
【図９】図９は、初期ゲニステインの濃度による基質転換率および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの収率を示した図表である。
【図１０】図１０の（イ）は、５‐ヒドロキシ‐エクオールのＥＩ‐ＭＳで分析した質量スペクトルと分子構造であり、（ロ）は、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの質量スペクトルと分子構造である。
【図１１】図１１は、水溶性高分子であるポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、以下、ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、以下、ＰＶＰ）を添加した反応液における（Ｓ）‐エクオールの反応系内濃度を時間により示した図表である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明において使用される用語は、当業界において通常的に使用されるものであって、当業者であればその意味を誰でも理解することができるものであるが、本明細書において簡略に説明すると次のとおりである：
【００２３】
（１）発現：組換え遺伝子を含むベクターを含む微生物において組換えタンパク質を生産することを意味する。
【００２４】
（２）ベクター：一本鎖、二本鎖、円形または超らせんＤＮＡまたはＲＮＡからなるポリヌクレオチドを意味する。ベクターは、組換えタンパク質を生産することができるように、適切な距離に作動的に連結されている複製オリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結などから構成されている。発現する組換えタンパク質にコーディングする遺伝子を核酸カセットの位置に挿入する。
【００２５】
（３）細胞抽出物：組換えタンパク質が発現された微生物を破砕した後、遠心分離器で固形細胞残渣を除去した後の上澄み液を意味する。本発明においては、ダイゼイン還元酵素、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素、ジヒドロダイゼイン還元酵素、テトラヒドロダイゼイン還元酵素のうち一部または全部が発現された微生物抽出物を意味する。
【００２６】
（４）全細胞反応：特定の酵素を含む細胞を破砕して細胞抽出物を利用したり、または、酵素を分離精製せずに完全な細胞全体を利用した反応を意味する。
【００２７】
本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌に関するものである。
【００２８】
本発明においては、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）由来のダイゼイン還元酵素、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素、ジヒドロダイゼイン還元酵素、テトラヒドロダイゼイン還元酵素に該当するＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を通じて増幅させた後、ｐＲＳＦＤｕｅｔまたはｐＣＤＦＤｕｅｔベクターにそれぞれ入れ、これをＥ．ｃｏｌｉにおいてｈｉｓ‐ｔａｇ（６  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）のように発現した。
【００２９】
前記組換え大腸菌は、基質であるダイゼインからエクオールまたはジヒドロエクオールを合成するにあたって利用され得る。
【００３０】
また、前記組換え大腸菌は、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成するにあたって利用され得る。
【００３１】
前記エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成方法は、（Ｓ）‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールを合成するにあたって利用され得る。
【００３２】
より具体的に、前記組換え大腸菌は、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）からエクオール（ｅｑｕｏｌ）およびジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）を生変換する全細胞触媒（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）として利用され得、また、ゲニステインを５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｒｏｅｑｕｏｌ）に生転換する全細胞触媒として利用され得る。
【００３３】
本発明の組換え大腸菌を全細胞触媒として利用するエクオール合成反応には、還元剤を添加して生成物の酸化を抑制し、還元剤としては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、Ｌ‐アスコルビン酸、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）などを使用することができる。添加した還元剤の濃度は、初期基質濃度の約１０〜約１００倍が好ましい。反応液には、ｐＨ緩衝作用のためにリン酸カリウム緩衝液が含まれ、リン酸カリウムの濃度は、約５０〜約４００ｍＭが好ましい。反応温度は、約１８〜約３７℃が好ましく、約２５〜約３０℃がより好ましい。反応液のｐＨは約５〜約１０が好ましく、約６〜約９がより好ましく、約７〜約８がさらに好ましい。反応器の攪拌速度は、約５０〜約４００ｒｐｍが好ましく、約８０〜約２５０ｒｐｍがより好ましく、約１００〜約２００ｒｐｍがさらに好ましい。
【００３４】
前記エクオール合成反応器内の炭素供給源としては、グルコースおよびグリセロールを使用することができ、グルコースまたはグリセロールの濃度は、約１〜約５（ｗ／ｖ）％が好ましく、約１．５〜約４（ｗ／ｖ）％がより好ましく、約２〜約３（ｗ／ｖ）％がさらに好ましい。本発明の組換え微生物の濃度は、光学密度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、以下、Ｏ．Ｄ．）約１〜１００が好ましく、約５〜約５０がより好ましく、約１０〜約３０がさらに好ましい。
【００３５】
前記エクオール合成反応系の基質としては、合成しようとするイソフラバン（ｉｓｏｆｌａｖａｎ）またはイソフラベン（ｉｓｏｆｌａｖｅｎｅ）の種類に応じて、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、オルト‐ヒドロキシ‐ダイゼイン（ｏｒｔｈｏ‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄａｉｄｚｅｉｎ）、オルト‐ヒドロキシ‐ゲニステイン（ｏｒｔｈｏ‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）などを使用することができる。
【００３６】
前記基質の反応液に対する溶解度を向上させるために、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、および、β‐シクロデキストリン（β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、メチル‐β‐シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、２‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（２‐（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）などを利用することができる。
【００３７】
図１は、初期ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）の濃度による（Ｓ）‐エクオールの収率を示した図表であり、図１に示されているように、初期ダイゼインの濃度が増加するほど（Ｓ）‐エクオールの収率（％）は減少するが、生産される（Ｓ）‐エクオール（ｍＭ）は増加する傾向を示す。
【００３８】
図２は、ダイゼインおよびゲニステインからダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ：ＤＤＲＣ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＤＲ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＨＤＲ）を発現する組換え大腸菌を利用した、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール合成反応の模式図である。
【００３９】
前記図２に示されているように、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）は、ダイゼイン還元酵素（ＤＺＮＲ）によって（Ｒ）‐ジヒドロダイゼインに転換され、これは、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ＤＤＲＣ）によって（Ｓ）‐ジヒドロダイゼインに転換される。（Ｓ）‐ジヒドロダイゼインは、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ＤＨＤＲ）によって（３Ｓ，４Ｒ）‐トランス‐テトラヒドロダイゼインに転換され、これは、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ＴＨＤＲ）によってエクオールに転換されたり、脱水によってジヒドロエクオールに転換される。
【００４０】
また、前記図２に示されているように、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）は、ダイゼイン還元酵素（ＤＺＮＲ）によって（Ｒ）‐ジヒドロゲニステインに転換され、これは、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ＤＤＲＣ）によって（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインに転換される。（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインは、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ＤＨＤＲ）によって（３Ｓ，４Ｒ）‐トランス‐テトラヒドロゲニステインに転換され、これは、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ＴＨＤＲ）によって５‐ヒドロキシ‐エクオールに転換されたり、脱水によって５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに転換される。
【００４１】
本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、前記４つの酵素のうちテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が、残りの３つの酵素に比べて５倍以上過発現された組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法に関するものである。
【００４２】
具体的に、テトラヒドロダイゼイン還元酵素が、残りの３つの酵素に比べて５倍以上、好ましくは１０倍以上過発現された組換え大腸菌を利用すると、５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成することができる。
【００４３】
これは、図２に示されているように、テトラヒドロダイゼイン還元酵素の発現量を増加させると、テトラヒドロゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを合成する速度が増加して、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの生成が競争的に阻害されるためである。
【００４４】
前記組換え大腸菌の発現方法およびこれを利用した５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成方法は、前述した、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つをすべて発現する組換え大腸菌の製造方法およびこれを利用したエクオールの合成方法と同一である。
【００４５】
図６は、図２および図４にて言及した組換え大腸菌の細胞抽出物におけるタンパク質の量をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで示したものであり、４つの酵素の発現量において、４つの組換え酵素を一つの大腸菌で発現したときよりも、ダイゼイン還元酵素とジヒドロダイゼインラセミ化酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌およびジヒドロダイゼイン還元酵素とテトラヒドロダイゼイン還元酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌において、酵素の発現量が増加した。図６において、１：ＤＤＤＴは、図２において言及した４つの組換え酵素を一つの大腸菌で発現したときの場合であり、２：ＤＤは、図４においてダイゼイン還元酵素とジヒドロダイゼインラセミ化酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌の細胞抽出物に該当し、３：ＤＴは、図４においてジヒドロダイゼイン還元酵素とテトラヒドロダイゼイン還元酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌の細胞抽出物に該当する。
【００４６】
図５は、反応時間による、ゲニステイン、ジヒドロゲニステイン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、５‐ヒドロキシ‐エクオールの反応系内濃度（μＭ）を示し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素の発現量が、残りの３つの酵素に比べて５倍以上増加した組換え大腸菌を発現したシステム（図６の２および３）を利用すると、４つの酵素をすべて発現した組換え大腸菌に関する図２に比べて、５‐ヒドロキシ‐エクオールの収率および生産性と５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに対する５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択性が増大し得ることを示している。
【００４７】
また、本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）を発現する組換え大腸菌１と、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌２を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法に関するものである。
【００４８】
前記組換え大腸菌１および２を全細胞触媒として混合する生転換反応系により、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成することができる。
【００４９】
本発明の組換え大腸菌１および２の発現方法およびこれを利用した５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成方法は、前述した、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つをすべて発現する組換え酵素の発現方法およびこれを利用したエクオールの合成方法と同一である。
【００５０】
前記組換え大腸菌１および２の混合反応系は、５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択的生産だけでなく、エクオール、６‐メトキシ‐エクオール（６‐Ｍｅｔｈｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）、および多様なヒドロキシ‐エクオール（Ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）などの生産に適用することができる。
【００５１】
図４は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ：ＤＤＲＣ）を一つのベクターで発現する組換え大腸菌と、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＤＲ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＨＤＲ）を一つのベクターで発現する他の組換え大腸菌とに反応が区画化された全細胞反応系を示す。
【００５２】
前記図４によれば、前記組換え大腸菌１によってゲニステインが（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインに転換され、（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインは、前記組換え大腸菌２によって５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールに転換されるため、組換え大腸菌１および２によってゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成することができることを示す。
【００５３】
異なる組換え大腸菌により反応が区画化された全細胞反応系は、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールの生産性および最終収率が向上するという点で有利であり、副産物である５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの生成を減らすことにより、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールの選択性が増加するという点で優れる。
【００５４】
前記５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法は、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールを選択的に合成することができる。
【００５５】
具体的に、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が５倍以上過発現された組換え大腸菌、または前記組換え大腸菌１および２を利用して、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールを選択的に合成することができる。
【００５６】
これと関連して、図７は、前記組換え大腸菌を利用して合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールの光学構造を知るために、２１０〜３２０ｎｍの波長範囲において、円二色性分散系を利用して楕円率を測定した図表であり、本発明の組換え大腸菌により生合成された５‐ヒドロキシ‐エクオールは、３番の炭素においてＳ‐形態を有することを確認することができる。
【００５７】
さらに、本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）およびジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現しない組換え大腸菌を利用して、基質であるダイゼインからジヒドロエクオールを選択的に合成する方法に関するものである。
【００５８】
具体的に、前記組換え大腸菌を全細胞触媒として利用して、ダイゼインからジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。
【００５９】
前記ジヒドロエクオールを合成する反応液にホウ酸を添加すると、（３Ｓ，４Ｒ）‐トランス‐テトラヒドロダイゼインの脱水反応を促進するため、ジヒドロエクオールを高い収率で合成することができる。添加されるホウ酸の量は、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭが好ましい。
【００６０】
また、本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ）およびジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現しない組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成する方法に関するものである。
【００６１】
具体的に、前記組換え大腸菌を全細胞触媒として利用して、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。
【００６２】
前記発明の組換え大腸菌の発現方法およびこれを利用したジヒドロエクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、上述した、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つをすべて発現する組換え酵素の発現方法およびこれを利用したエクオールの合成方法と同一である。
【００６３】
図８は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＤＲ）を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ＤＨＤＲ）と、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ、ＤＤＲＣ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＤＲ）を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ ＤＤＲＣ ＋ＤＨＤＲ）とを利用して、ダイゼインに対し全細胞反応を行ったときの、反応時間によるジヒドロエクオールの反応系内濃度を示した図表である。図８に示されているように、前記組換え大腸菌を利用して、ダイゼインからジヒドロエクオールをエクオールの生成なしに選択的に合成することができ、３つの酵素を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ ＤＤＲＣ ＋ＤＨＤＲ）を利用した場合、２つの酵素を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ＤＨＤＲ）よりも生成されるジヒドロエクオールの濃度が高い。
【００６４】
図９は、ダイゼイン還元酵素、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素、ジヒドロダイゼイン還元酵素を発現する組換え大腸菌を利用して、ゲニステインに対し全細胞反応を行ったときの、初期ゲニステインの濃度による基質転換率および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの収率を示した図表であり、図９に示されているように、前記組換え大腸菌を利用して、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。
【００６５】
本発明の組換え大腸菌は、全細胞触媒として利用され得る。全細胞触媒は、多くの生触媒反応に利用されており、常温常圧の温和な条件で反応を進行させ、反応特異性に優れるという長所がある。補酵素が必ず必要であったり、複数段階の反応を伴う工程、あるいは精製時に酵素の活性が顕著に減少する場合などにおいては、全細胞を利用して生触媒工程を遂行することがより有利である。また、反応終了後、生成物の精製の際にも、全細胞として利用された組換え大腸菌を、遠心分離器を利用して選択的に分離することができるため有利である。
【００６６】
前記合成されたエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、好気性条件で進行され得るため、嫌気性条件でエクオールを合成する従来技術に比べ、温和な条件でエクオールを合成することができる。したがって、本発明の合成方法は、従来技術において嫌気性条件を提供するために使用していた装置や技術を必要としない。
【００６７】
前記合成されたエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、約０．２〜約５ｍｍｏｌ／Ｌの基質を使用することができる。
【００６８】
基質であるダイゼインまたはゲニステインの濃度が０．２ｍｍｏｌ／Ｌ未満である場合には、合成されるエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの量が十分でなかったり、または精製費用も高くなり得、５ｍｍｏｌ／Ｌを超過する場合には、基質の転換率が減少して、追加の精製費用が発生し得る。
【００６９】
好ましくは、基質の濃度が約０．２〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、基質の濃度が約０．８〜約１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７０】
ただし、反応系に水溶性高分子をさらに含む場合には、基質の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌを超えても、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを高い収率で合成することができるため、基質の濃度は約３〜５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００７１】
前記エクオールまたはジヒドロエクオールの合成方法は、ダイゼインの転換率が９５％以上であり、前記５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、ゲニステインの転換率が９５％以上である。
【００７２】
前記転換率は、（減少した基質の濃度／初期の基質の濃度）×１００（％）を示す。
【００７３】
また、本発明の合成方法は、基質の濃度が０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上においても、基質の転換率が９５％以上であり得る。
【００７４】
図３および図５は、反応時間による、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，ＧＳＮ）、ジヒドロゲニステイン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，ＤＨＧ）、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５ＯＨ‐ＥＱ）の反応系内濃度（μＭ）を示し、反応時間１０時間だけで、基質の転換率は９５％以上であることが示されている。
【００７５】
前記エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、反応系に水溶性高分子をさらに含むことができる。また、前記水溶性高分子は、食品添加用水溶性高分子を使用することができる。
【００７６】
水溶性高分子としては、たとえば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、および、β‐シクロデキストリン（β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、メチル‐β‐シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、２‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（２‐（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）などを利用することができる。好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンを利用することができる。
【００７７】
反応系に水溶性高分子をさらに含むことにより、反応系内の基質の溶解度が増加するため、製造されるエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの最終収率が増加し得る。
【００７８】
図１１は、実施例１の反応液に、水溶性高分子であるポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドンをさらに添加した反応液における（Ｓ）‐エクオールの反応系内濃度を時間により示した図表である。図１１に示されているように、反応液にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）をさらに含む場合には、５ｍｍｏｌ／Ｌの基質を使用してもエクオールを高い収率で合成することができる。
【００７９】
また、本発明は、前記言及した本発明の合成方法により製造される、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに関するものである。
【００８０】
特に、本発明の合成方法により製造される５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールは、従来知られていなかった新規な化合物であって、下記化学式で表すことができる。
【００８１】
【化１】
2020508671.tif 000002
【００８２】
本発明は、好気性条件における基質の高い転換率により（Ｓ）‐エクオールを合成することができ、合成されたエクオールはエストロゲンと類似した分子構造を有するため、乳がんの誘発といった従来の更年期症状治療剤の副作用なしに、女性の更年期症状、特に、骨粗しょう症の発病および症状を緩和させることができ、心血管系疾患を予防し、前立腺がんを緩和させることができる。
【００８３】
また、本発明において合成されたジヒドロエクオールは、前立腺がん、卵巣がんの治療のための抗がん剤として用いられ得る。
【００８４】
また、本発明は、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの選択的合成を、好気性条件において数時間単位で遂行可能であるため、生産費用の節減および生産物による高付加価値の獲得が可能であり、効率的な大量生産を通じて、食品、医薬品などの多様な応用先への活用が可能である。
【００８５】
また、本発明の組換え大腸菌を全細胞触媒として利用する反応系への追加的な酸化還元酵素に適用する場合、多様なヒドロキシ‐イソフラボノイドを合成することができることから、研究的に価値が高い。
【００８６】
具体的に、酸化還元酵素として、チロシナーゼ、シトクロムＰ４５０またはフラビンモノオキシゲナーゼなどを使用することができ、３’‐ヒドロキシ‐エクオール、６‐ヒドロキシ‐エクオール、８‐ヒドロキシ‐エクオール、６，３’‐ジヒドロキシ‐エクオールといったヒドロキシ‐イソフラボノイドを合成することができる。
【００８７】
また、本発明により合成された５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールは、更年期疾患の予防および治療に使用され得、前立腺がん、卵巣がんの治療のための抗がん剤として用いられ得る。また、化粧品または食品添加物の形態で抗酸化剤として使用され得る。
【００８８】
以下、本発明の具体的な方法を実施例として詳細に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８９】
組換え大腸菌の製造方法
【００９０】
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒａｃｅｍａｓｅ：ＤＤＲＣ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＤＲ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＨＤＲ）に該当するＤＮＡ配列を、ＰＣＲを通じて増幅させた後、ｐＲＳＦＤｕｅｔまたはｐＣＤＦＤｕｅｔベクターにそれぞれ入れ、これをＥ．ｃｏｌｉにおいてｈｉｓ‐ｔａｇ（６  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）のように発現した。
【００９１】
具体的に、前記酵素の塩基配列が挿入されたｐｌａｓｍｉｄをＢＬ２１  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌに形質転換後、それぞれｐｌａｓｍｉｄに合った抗生剤を含むＬＢ固体培地において３７℃の培養器で１２時間培養した。一つのコロニーを、抗生剤を含む３ｍＬ  ＬＢ液体培地に接種し、１２時間の間、３７℃の培養器で２００ｒｐｍの速度で培養した。この培養液の２ｖ％（１ｍＬ）を、５０ｍＬの抗生剤を含む新しいＬＢ液体培地に接種した。培養液のＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達すると、０．１ｍＭのＩＰＴＧと０．１ｍＭのＭｎＳＯ４を入れ、１８℃の培養器において２００ｒｐｍで１８時間、タンパク質の発現を誘導した。１８時間後、細胞は４０００ｒｐｍで遠心分離し、２５ｍＬのＰＢＳで洗浄して準備した。
【００９２】
本発明の組換え大腸菌を利用した、全細胞反応系におけるエクオールの生産方法（反応法１）
【００９３】
反応器として１０〜１０００ｍｌのガラス器具を利用し、反応器に下記の濃度の組換え大腸菌および基質を供給する。
【００９４】
反応には、還元剤としてＬ‐アスコルビン酸を初期基質濃度１０倍で添加し、反応液にはｐＨ緩衝作用のために濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液が含まれ、反応温度は３０℃である。反応液のｐＨは８であり、反応器の攪拌速度は１５０ｒｐｍである。本発明の反応器内の炭素供給源としてはグルコースまたはグリセロールを利用し、グルコースまたはグリセロールの濃度は２（ｗ／ｖ）％であり、組換え微生物の濃度はＯ．Ｄ．１０またはＯ．Ｄ．２０である。
【実施例】
【００９５】
［実施例１］：エクオールの変換に関与する４つの酵素をすべて発現する組換え大腸菌を利用しての、ダイゼインから（Ｓ）‐エクオールの合成
【００９６】
０．２〜５ｍＭのダイゼインを、Ｏ．Ｄ．１０の前記４つの酵素を発現する組換え大腸菌を利用して、反応法１のとおりに反応を進行させた。基質、中間体、生成物は、４倍数以上のエチルアセテート（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、以下、ＥＡ）で抽出し、遠心減圧器を利用して溶媒を除去した後、一定量のメタノールに再溶解して、高性能‐液体クロマトグラフィーで物質の反応性と濃度を確認した。図１に示されている（Ｓ）‐エクオールの収率のとおり、０．２ｍＭでは９５％以上、０．４、０．６ｍＭでは８０％以上、２ｍＭでは５０％以上、５ｍＭでは２０％以上の収率を確認することができた。
【００９７】
［実施例２］：エクオールの変換に関与する４つの酵素をすべて発現する組換え大腸菌を利用しての、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成
【００９８】
５００μＭのゲニステイン（図２．ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）を、Ｏ．Ｄ．１０の前記４つの酵素を発現する組換え大腸菌を利用して、反応法１のとおりに反応を進行させた。基質、中間体、生成物は、４倍数以上のエチルアセテート（ＥＡ）で抽出し、遠心減圧器を利用して溶媒を除去した後、一定量のメタノールに再溶解して、高性能‐液体クロマトグラフィーで物質の反応性と濃度を確認した。反応６時間で、５００μＭのゲニステインは９９％以上転換され、５‐ヒドロキシ‐エクオール９７ｍｇ／Ｌ、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール２２ｍｇ／Ｌが生成されることを確認した。
【００９９】
前記のような組成を通じて、１ｍＭのゲニステインを、反応法１を通じた反応を進行させ、図３から確認できるように、反応時間１０時間だけで基質転換率は９５％以上、５‐ヒドロキシ‐エクオール１９９ｍｇ／Ｌ、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール６３ｍｇ／Ｌを生産することができた。
【０１００】
［実施例３］：区画化された反応系を利用した、５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択的合成
【０１０１】
図４の模式図のように、ダイゼイン還元酵素とジヒドロダイゼインラセミ化酵素を発現する組換え大腸菌１と、ジヒドロダイゼイン還元酵素とテトラヒドロダイゼイン還元酵素を発現する組換え大腸菌２とを全細胞触媒として混合する生転換反応系を構築した。１ｍＭのゲニステインを、反応法１に従って反応を進行させた場合、図５のように、反応時間による基質、生成物の濃度を液体クロマトグラフィーで確認した。本反応系は、反応時間６時間だけで、基質転換率は９９％以上、５‐ヒドロキシ‐エクオール２３１ｍｇ／Ｌ、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール１２ｍｇ／Ｌを生産した。生産結果を、実施例１の結果と比較した場合、５‐ヒドロキシ‐エクオールの生産性は１．６倍増加し、５‐ヒドロキシ‐エクオールの濃度／５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの濃度で定義される５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択性は５倍増加した。
【０１０２】
また、４つの酵素の発現量を比較するために、実施例２における組換え大腸菌ならびに実施例３における組換え大腸菌１および２の細胞抽出物を、超音波処理により破砕して準備し、細胞抽出物は、３０分間、１３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した後、上澄み液を得て、図６のとおり、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分析した。
【０１０３】
分析の結果、４つの酵素の発現量において、実施例２で使用した大腸菌よりも、実施例３で使用した２つの組換え大腸菌においてすべて増加した。そのうち、テトラヒドロダイゼイン還元酵素の発現量が顕著に増加し、実施例１の大腸菌破砕液と対比して２０倍以上増加し、残りの３つの酵素の発現量に比べて５倍以上過発現された。
【０１０４】
［実施例４］：５‐ヒドロキシ‐エクオールの光学異性体の分析
【０１０５】
本発明の組換え大腸菌で合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールの光学構造を決定するために、円二色性分散スペクトル分析を進行させた。測定波長範囲は２１０〜３２０ｎｍであり、円二色性分散計ＣｈｉｒａｓｃａｎＴＭ  ｐｌｕｓ  ＣＤ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＵＫ）を利用した。試料を、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、純粋なメタノールに溶かした後、測定した。
【０１０６】
測定結果は、図７にグラフで示し、２３８ｎｍにおいて高い大きさの陰性のコットン（ｃｏｔｔｏｎ）効果を示し、２７０ｎｍにおいて高い大きさの陽性のコットン効果を示した。したがって、本発明の組換え大腸菌により生合成された５‐ヒドロキシエクオールは３番の炭素においてＳ‐形態を有することを確認することができた。
【０１０７】
［実施例５］：ジヒドロエクオールの選択的合成
【０１０８】
ジヒドロエクオールを生合成するために、実施例１の組換え大腸菌においてテトラヒドロダイゼイン還元酵素が欠損し、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素を含むか（ＤＺＮＲ＋ＤＤＲＣ＋ＤＨＤＲ、以下、ＤＤＤ菌株）、または含まない組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ＤＨＤＲ、以下、ＤＤ菌株）を作製した。前記大腸菌を利用して、反応法１に従ってダイゼインを基質とする反応を進行させ、さらに反応液にホウ酸２００ｍＭを添加した。その結果、エクオールを生成することなく、ジヒドロエクオールのみが生成されることを確認し（図８）、具体的に、初期ダイゼインの濃度を０．５ｍＭとして生転換反応を開始して２時間反応させた場合、ＤＤ菌株においては２８μＭ、ＤＤＤ菌株においては６０μＭのジヒドロエクオールが合成された。
【０１０９】
［実施例６］：５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの選択的合成
【０１１０】
５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを生合成するために、実施例２の組換え大腸菌においてテトラヒドロダイゼイン還元酵素がプラスミドから欠損した組換え大腸菌を作製した。前記大腸菌を利用して、反応法１に従ってゲニステインを基質とする反応を進行させ、５‐ヒドロキシ‐エクオールを生成することなく、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールのみ生成されることを確認した（図９）。初期ゲニステインの濃度を０．２、０．４、０．６、１．０ｍＭとして生転換反応を開始して３６時間反応させた場合、ゲニステインの転換率は、０．６ｍＭ以下では９９％以上であり、１．０ｍＭで９７％であった。５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの転換収率は、それぞれ４４、３５、２７、３９％であった。
【０１１１】
［実施例７］：５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの質量分析
【０１１２】
実施例３と６において合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを、ガスクロマトグラフィー‐質量分析器（ＧＣ‐ＭＳ）を通じて同定し、その結果は図１０に明示した。
【０１１３】
前記組換え微生物で合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロ‐エクオールをＥＩ‐ＭＳで分析した。ＥＩ‐ＭＳは、Ｔｈｅｒｍｏ社のＴＲＡＣＥ  ＧＣ  Ｕｌｔｒａ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ／ＩＴＱ１１００を利用した。陽性モードで無極性のキャピラリーカラム（ＴＲ‐５  ｍｓ）を利用し、ヘリウムガス流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、ｉｎｌｅｔ、ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌｉｎｅ、ｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅの温度はそれぞれ２５０、２７５、２３０℃とした。ガスクロマトグラフのオーブン温度は、６５℃で５分間維持した後、３℃／ｍｉｎの速度で２５０℃まで増加する。イオン化電圧は７０ｅＶであり、測定質量範囲は５０〜６００ａｍｕであった。
【０１１４】
ＥＩ‐ＭＳ分析の結果は、以前に報告されたＤＨＤのスペクトルと同一であるものと示された（Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．Ｎａｉｒ．Ｊ．Ｎａｔｒ．Ｐｒｏｃ．５８：１８９２‐１８９６，１９９５；Ｗａｈａｌａ，Ｋ．，Ａ．Ｓａｌａｋｋａ，ａｎｄ  Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１７：２９３‐２９，１９９８）。合成された化合物のＥＩ‐ＭＳは、予想のとおり、ｍ／ｚ２５６においてＣ１５Ｈ１２Ｏ４（ＤＨＤ）と一致する［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークを示した。合成された化合物の他のイオンピークは、１３７（１００）、１２０（５２）、９１（３６）、６５（１６）であった。
【０１１５】
［実施例８］：水溶性高分子をさらに含む反応系におけるエクオールの合成
【０１１６】
ダイゼインの反応液に対する溶解度を向上させるために、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下、ＤＭＳＯ）を含み、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）をさらに含むこと以外には、実施例１と同一に反応を進行させた。
【０１１７】
具体的に、ダイゼイン５ｍＭにおけるエクオールの収率を増加させるために、水溶性高分子ＰＥＧまたはＰＶＰ５％（ｗ／ｖ）をさらに含む反応器において反応を進行させ、ＰＶＰを添加した反応の場合、反応時間１２時間だけで５ｍＭのエクオールが合成され（収率９９％以上、１．１６ｇ／Ｌ）、ＰＥＧを添加した反応の場合、反応時間２４時間だけで３．７ｍＭのエクオールが合成された（収率７４％以上、０．９ｇ／Ｌ）。
【０１１８】
前記実施例１および２によれば、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つを発現する組換え大腸菌により、好気性条件において、数時間内に、高収率で、ダイゼインから（Ｓ）‐エクオールを合成したり、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成することができた。
【０１１９】
前記実施例３、５および６においては、酵素４つの酵素のうち２つまたは３つの酵素を組み合わせた組換え大腸菌を利用して、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールをそれぞれ選択的に合成することができた。
【０１２０】
また、前記実施例４および７を通じて、実施例２、３および６による組換え大腸菌が５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成することを確認することができた。
【０１２１】
また、前記実施例８においては、反応系に水溶性高分子をさらに含むことにより、水溶性高分子を含んでいない反応系（実施例１）に比べて、エクオールの収率に優れることを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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