(57)【要約】  本発明は、治療用タンパク質の凍結乾燥医薬配合物を製造するプロセスであって、（ａ）バルク量の治療用タンパク質の配合物を提供することと、（ｂ）上記のバルク配合物中における治療用タンパク質の濃度を測定することと、（ｃ）上記のバルク配合物中のタンパク質の充填重量を調整してタンパク質の固定用量を得ることと、（ｄ）タンパク質の充填重量が調整された配合物を凍結乾燥して容器内に最終配合物を得ることと、を含み、固定容量を用いて再構成した後の生成物の濃度が所定の許容可能な範囲内にある、プロセスに関する。プロセスは、低タンパク質濃度の配合物（例えば、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ）に特に好適である。
2020534255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質の凍結乾燥医薬配合物を製造するプロセスであって、
ａ．バルク量の前記治療用タンパク質の配合物を提供することと、
ｂ．バルク配合物中における前記治療用タンパク質の濃度を測定することと、
ｃ．前記バルク配合物中の前記タンパク質の充填重量を調整して、前記タンパク質の固定用量を得ることと、
ｄ．前記タンパク質の充填重量が調整された配合物を凍結乾燥して、容器内に最終配合物を得ることと
を含み、
固定容量を用いて再構成した後の生成物の濃度が、所定の許容可能な範囲内にある、プロセス。
【請求項２】
前記タンパク質の調整された充填重量が、式：
【数１】
2020534255.tif 000025
に従って計算される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記最終配合物中の前記タンパク質の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記治療用タンパク質は、ロミプロスチム、ブリナツモマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ＡＭＧ７０１、及びＡＭＧ３３０から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記治療用タンパク質はロミプロスチムであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記最終配合物は、約ｐＨ５．０で、約１０ｍＭのヒスチジン、約４％ｗ／ｖのマンニトール、約２％ｗ／ｖのスクロース、及び約０．００４％のポリソルベート２０中において、約０．５ｍｇ／ｍＬのロミプロスチムを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記治療用タンパク質はブリナツモマブであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約５５μｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記配合物は、約ｐＨ７．０で、約２５ｍＭのクエン酸一水和物、約１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約２００ｍＭのＬ−リジン塩酸塩、及び約０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０中において、約５５μｇ／ｍＬのブリナツモマブを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記治療用タンパク質はインフリキシマブであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約２０±１．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記最終配合物は、約ｐＨ７．２で、約２０±１．５ｍｇ／ｍＬのインフリキシマブ、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記治療用タンパク質はトラスツズマブであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約２１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記最終配合物は、約ｐＨ６．１で、約２１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、約０．３０３ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン、約０．４７０ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、約１９．１ｍｇ／ｍＬのα，α−トレハロース二水和物、及び０．０８４０ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記治療用タンパク質はＡＭＧ７０１であり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記最終配合物は、約ｐＨ４．２で、約１ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ７０１、約１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、約９．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１に記載のプロセス。；
【請求項１５】
前記治療用タンパク質はＡＭＧ３３０であり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記最終配合物は、約ｐＨ６．１で、約０．５ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ３３０、約１０ｍＭのリン酸カリウム、約８．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、約１．０％（ｗ／ｖ）のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ）、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記最終配合物中の前記タンパク質の濃度は、約２５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記治療用タンパク質は二重特異性一本鎖抗体コンストラクトである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記治療用タンパク質は、ＡＭＧ７０１及びＡＭＧ３３０から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物薬剤に関し、具体的には、治療用タンパク質、その使用方法、その医薬配合物、及び医薬配合物を製造するプロセスに関する。具体的には、本発明は、凍結乾燥医薬配合物を製造するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
過去１０年間で、技術の進歩により、薬学的用途の多種多様な活性分子を生成することが可能となった。生物学的な作用機序の理解の本質が進歩したことにより、これらの分子を、少量の生成物が効果を有する特定の属性のために設計することが可能となった。
【０００３】
これらの分子は、従来の有機及び無機薬品と比較してより大きく、且つ／又はより複雑となり得るため（すなわち、複雑な三次元構造に加えて複数の官能基を有する）、こうした生成物の配合物は特別な課題を呈する。生成物の生物学的活性を維持するために、配合物は、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の立体配座完全性を無傷で保存し、同時にタンパク質の複数の官能基を分解から守る必要がある。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち、結合形成又は切断して新しい化学物質をもたらすことによるタンパク質の修飾を伴う任意のプロセス）又は物理的不安定性（すなわち、タンパク質の高次構造における変化）を伴い得る。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、β脱離、又はジスルフィド交換によってもたらされ得る。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿、又は吸着によってもたらされ得る。３つの最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質の凝集、脱アミド化、及び酸化である。Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０（４）：３０７−３７７。
【０００４】
これらの設計された分子は、その合成的性質に起因して、一般的に凍結乾燥（フリーズドライ）されており、改善された貯蔵安定性を提供し得ることを示す。フリーズドライは、タンパク質を保存するために一般的に用いられる技法であり、対象となるタンパク質調製物から水を除去する役割を果たす。フリーズドライ、又は凍結乾燥は、乾燥される対象の材料が最初に凍結され、続いて氷又は凍結溶媒が真空環境下で昇華されることにより除去されるプロセスである。フリーズドライプロセス中の安定性を強化するため、且つ／又は貯蔵時の凍結乾燥生成物の安定性を向上させるために、凍結乾燥前の配合物に賦形剤が含まれてもよい。Ｐｉｋａｌ，Ｍ．（１９９０），Ｂｉｏｐｈａｒｍ．３（９）２６−３０及びＡｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（３）：２８５−２９１。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特異的な生物学的標的を有する設計分子、及び結果として生じる生成物の必要用量は、製造プロセスに新たな課題をもたらす。現行技術は、生成物を目標の濃度に配合し、続いて定められた容量で容器に充填する単純なプロセスを伴う。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、凍結乾燥製剤を生成するプロセスに関する。具体的に、本発明は、必要な量の生成物を、配合することと、充填することと、使用のために固定容量の希釈剤を用いて凍結乾燥生成物を再構成した後でその存在を保証することと、に関する。
【０００７】
本発明によれば、治療用タンパク質の凍結乾燥医薬配合物を製造するプロセスであって、
（ａ）バルク量の治療用タンパク質の配合物を提供することと、
（ｂ）上記バルク配合物中における治療用タンパク質の濃度を測定することと、
（ｃ）上記バルク配合物中のタンパク質の充填重量を調整してタンパク質の固定用量を得ることと、
（ｄ）タンパク質の充填重量が調整された配合物を凍結乾燥して容器内に最終配合物を得ることと、を含み、
固定容量を用いて再構成した後の生成物の濃度が所定の許容可能な範囲内にある、プロセスが提供される。
【０００８】
上記のプロセスでは、最終配合物中のタンパク質濃度は、約２０又は２５ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約１８ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、及び約２１ｍｇ／ｍＬが最も好ましい。本発明のプロセスに好ましい治療用タンパク質は、ロミプロスチム、ブリナツモマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ＡＭＧ７０１、及びＡＭＧ３３０である。ＡＭＧ７０１及びＡＭＧ３３０は、二重特異性一本鎖抗体コンストラクトであり、その他の二重特異性一本鎖抗体コンストラクト（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）も、本発明のプロセスにおける好ましい治療用タンパク質である。配合物中に存在する好ましい医薬品賦形剤は糖類を含み、トレハロース、スクロース、及びいずれかの水和物が最も好ましい。好ましい医薬品賦形剤は緩衝剤を更に含み、ヒスチジン、クエン酸一水和物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、及びグルタミン酸が好ましい。好ましい賦形剤は界面活性剤を更に含み、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０が最も好ましい。本発明のプロセスに従って用いられる好ましい賦形剤及び治療用タンパク質を表１に示し、それぞれのおおよその好ましい濃度を各タンパク質及び賦形剤の下に列挙する。
【０００９】
【表１】
2020534255.tif 000003
【００１０】
更に、本発明に従い、配合物は本明細書の以下に記載されるその他の賦形剤を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】配合物及び充填重量が、典型的な制御戦略に従っている、低用量生成物向けの例示的な設計空間を示す応答表面マップである。灰色の空間は、方法／再構成のばらつきが、不適合のタンパク質濃度の結果を有する可能性を５０％超で有する場所を表す。大きな四角形は、配合物開発のための現在の作動範囲を示す。小さな長方形は、有効作動範囲を示す。
【図２】バルク濃度及び充填容量に加えてオスモル濃度が考慮される、低用量生成物向けの例示的な設計空間を示す応答表面マップである。薄灰色の領域は、方法／再構成のばらつきによって不適合のタンパク質濃度の結果が生じる可能性を５０％超で有する、段階付けされた（ｓｔｅｐｐｅｄ−ｉｎ）製剤濃度規格値を示す。濃灰色の領域は、オスモル濃度の規格値を示す。長方形は、充填重量（ｘ軸）及び配合バルク濃度（ｙ軸）の設計空間範囲である、工程内制御（ＩＰＣ）／アラートリミット作動範囲（ＡＬＯＲ）を示す。
【図３】実行可能であるがフォールトトレラントではない充填重量及び配合物制御戦略の例を示す応答表面マップである。曲線及び両方向矢印は、起こり得る充填目標の誤差を示す。薄灰色の領域は、段階付けされた製剤濃度の規格値を表し、薄灰色の領域は、方法／再構成のばらつきによって不適合のタンパク質濃度の結果が生じる可能性を５０％超で有する場所を示す。濃灰色の領域は、オスモル濃度の規格値を定める。長方形はＩＰＣ／ＡＬＯＲを示す。
【図４】期待される低い配合バルク及び低い充填重量を伴う、範囲端部の制御に困難を有する充填重量及び配合物制御戦略の例を示す応答表面マップである。左側の曲線及び両方向矢印は、低い充填容量で起こり得る充填目標の誤差を示す。右側の曲線及び両方向矢印は、高い充填容量で起こり得る充填目標の誤差を示す。薄灰色の領域は、段階付けされた製剤濃度の規格値を表し、薄灰色の領域は、方法／再構成のばらつきによって不適合のタンパク質濃度の結果が生じる可能性を５０％超で有する場所を示す。濃灰色の領域は、オスモル濃度の規格値を定める。長方形はＩＰＣ／ＡＬＯＲを示す。
【図５】バルク配合の結果を用い、続いてバイアル中の総生成物用量目標（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ）に基づいて充填重量の設定点を調整して、実行可能且つフォールトトレラントな凍結乾燥薬剤プロセスをもたらす組み合わせ戦略の例を示す応答表面マップである。曲線及び両方向矢印は、起こり得る充填目標の誤差を示す。薄灰色の領域は、図１〜４にある段階付けされた製剤濃度の規格値を定める。濃灰色の領域は、オスモル濃度の規格値を定める。菱形はＩＰＣ／ＡＬＯＲを示し、ＩＰＣ／ＡＬＯＲ内の最大充填容量でのオスモル濃度規格値によって切り取られている。
【図６】下記の実施例１に従って決定される、規格化された充填重量対再構成後の生成物タンパク質濃度を示す。
【図７】下記の実施例１に従って決定される、規格化された充填重量対オスモル濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
用語の定義
以下の記述では、多くの用語が広く用いられている。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００１３】
特に明記しない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１つ又は２つ以上を意味する。更に、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００１４】
本明細書で使用する時、「医薬配合物」又は「配合物」とは、（ｉ）それを必要とする患者への非経口投与（静脈内、筋肉内、皮下、噴霧、肺内、鼻腔内、又は髄腔内投与を含むがこれらに限定されない）に好適な、生物学的に活性なタンパク質などの薬学的に活性な薬物と、（ｉｉ）連邦医薬局（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）又は他の外国内当局によって安全とみなされる１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、及びその他の添加剤と、の無菌組成物である。医薬配合物としては、直接投与可能な液体（例えば水性）溶液、及び投与前に希釈剤を添加することによって溶液中に再構成することが可能な凍結乾燥粉末が挙げられる。しかしながら、用語「医薬配合物」は、患者への局所投与用組成物、経口摂取用組成物、及び非経口栄養補給用組成物を明確に除外する。
【００１５】
本明細書で使用する時、「貯蔵寿命」とは、医薬配合物が特定の保存条件（例えば２〜８℃）で保存される場合に、医薬配合物中の活性成分（例えば抗体）の分解が最小限（例えば約５％〜１０％以下の分解）である保存期間を意味する。分解を評価するための技法は、医薬配合物中のタンパク質の正体に応じて変わる。例示的な手法としては、例えば凝集を検出するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ、例えば、タンパク質断片化を検出する逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、例えばタンパク質の電荷の変化を検出するイオン交換−ＨＰＬＣ、並びに質量分析法、蛍光分光法、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）、及びタンパク質の立体配座変化を検出するラマン分光法が挙げられる。これらの手法は全て、医薬配合物中のタンパク質の分解を評価し、その配合物の貯蔵寿命を決定するために、単独で又は組み合わせで使用することができる。本発明の医薬配合物は、２〜８℃で保存した場合、２年間にわたって分解（例えば、断片化、凝集又はアンフォールディング）の増加が約５〜１０％を超えないことが好ましい。
【００１６】
本明細書で使用する場合、生物学的に活性なタンパク質の「安定な」配合物とは、（ｉ）対照配合サンプルと比較して、２〜８℃で少なくとも２年間保存した際に、少なくとも２０％の凝集の減少及び／若しくは生物学的活性の損失の減少、又は（ｉｉ）熱ストレス条件下（例えば２５℃で１〜１２週間、４０℃で１〜１２週間、５２℃で７〜８日など）で、凝集の減少及び／若しくは生物学的活性の損失の減少のいずれかを示す配合物である。一実施形態では、配合物中のタンパク質がその物理的安定性、化学的安定性、及び／又は生物学的活性を保持していれば、配合物は安定であると見なされる。
【００１７】
タンパク質は、色彩及び／若しくは透明度を目視検査して、又は濁度若しくは凝集体形成などに関する紫外線散乱若しくはサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）若しくは電気泳動法により測定して、例えば凝集、沈殿、及び／又は変性の様子を示していない場合は、配合物中で「その物理的安定性を保持している」と言うことができる。
【００１８】
タンパク質は、例えば、所与の時点における化学的安定性の結果、結合形成又は切断によるタンパク質の修飾から新たな化学物質が生じない場合は、配合物中で「その化学的安定性を保持している」と言うことができる。更なる実施形態では、化学的安定性は、タンパク質の化学変化形態を検出及び定量化することによって評価することができる。化学変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィを用いて評価可能なサイズ変更（例えばクリッピング）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を伴い得る。その他の種類の化学変化としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィによって評価可能な荷電変化（例えば脱アミド化の結果生じる）が挙げられる。酸化は、別の一般的に見られる化学修飾である。
【００１９】
タンパク質は、非修飾タンパク質と比較して、例えば、配合タンパク質（例えば抗体）の生物学的活性の割合が、対照溶液と比較したアッセイ（例えば抗原結合アッセイ）で測定して、約５０％〜約２００％、約６０％〜約１７０％、約７０％〜約１５０％、約８０％〜約１２５％、又は約９０％〜約１１０％のいずれかである場合は、医薬配合物中で「その生物学的活性を保持している」と言うことができる。更なる実施形態では、タンパク質は、例えば、限定するものではないが、所与の時点におけるタンパク質の生物学的活性が少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％である場合は、医薬配合物中で「その生物学的活性を保持している」と言うことができる。
【００２０】
本明細書で使用する時、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、配合物及び方法が列挙された要素を含むが、その他の列挙されていない要素を除外しないことを意味することが意図される。用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、配合物及び方法が列挙される要素を含むと定義するように用いられる場合、配合物及び／又は方法の基本的性質を変更させる列挙されていない要素は除外するが、その他の列挙されていない要素は除外しない。そのため、本明細書で定義される要素から本質的になる配合物は、任意の分離及び精製方法からの混入物質、又は薬学的に許容される担体（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、防腐剤などといった微量のその他の要素を排除しないが、例えば、追加の不特定のアミノ酸などは除外する。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」は、配合物及び方法を定義するために用いられる場合、微量を超えるその他の成分、及び本明細書に記載される組成物を投与するための実質的な方法工程を除外する。これらの接続句の各々によって定義される実施形態は、本開示及び本明細書で具現化される本発明の範囲内である。
【００２１】
本明細書中で使用する時、用語「単離された」は、その天然環境の成分から識別され、分離及び／又は回収されたタンパク質（例えば抗体）を指す。その天然環境の混入成分は、タンパク質の診断的又は治療的使用を妨害する物質であり、これとしては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、タンパク質は、（１）ローリー法により測定して抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を十分に得られる程度まで、或いは（３）クマシーブルー、又は好ましくは銀染色を用いて、還元条件下又は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製される。単離されたタンパク質は、組換え細胞内にインサイチュのタンパク質を含むが、これは、そのタンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないためである。しかし、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００２２】
本発明は、抗体などの治療用タンパク質の医薬配合物のためのプロセスに関する。「抗体」（Ａｂ）及び同義語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に対し結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によっては低いレベルで、また骨髄腫によっては高いレベルで産生される。したがって、本明細書で使用する時、用語「抗体」又は「抗体ペプチド」は無傷な抗体、抗体誘導体、抗体類似体、遺伝子組み換え抗体、検出可能な標識を有する抗体、本明細書中に開示される抗体と特異的結合を競合する抗体、又は無傷な抗体と特異的結合を競合するその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体）を指し、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二重特異性抗体を含む。特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、例えば、組換えＤＮＡ技術によって作製される。さらなる実施形態では、抗原結合フラグメントは、無傷の抗体の酵素的又は化学的切断によって作製される。抗原結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用する時、用語「無傷な抗体」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体を指す。したがって、この用語は、限定するものではないが、完全ヒト抗体、遺伝子組み換え抗体、二重特異性抗体、及び抗体誘導体を含むが、但しこうした抗体が２つの重鎖及び２つの軽鎖を含んだことを条件とする。
【００２４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する時、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限らない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それを生成する方法を指すものではない。
【００２５】
本発明に従って配合されたモノクローナル抗体及び抗体コンストラクトは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方で、鎖の残部が、所望の生物学的活性を示す限りではあるが、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を明確に含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。本明細書において興味の対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界サル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリミタイズド（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体が挙げられる。キメラ抗体を作製するための様々な方法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８１６，３９７号明細書、Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．の欧州特許第０１７１４９６号明細書、欧州特許第０１７３４９４号明細書、及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
【００２６】
本発明に従って配合されたモノクローナル抗体及び抗体コンストラクトは、「ヒト」又は「完全ヒト」と称される抗体を明確に含む。「ヒト抗体」及び「完全ヒト抗体」という用語はそれぞれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した動物から単離された抗体を含む、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有し、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体、例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）抗体、及びＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によって米国特許第５，９３９，５９８号明細書で説明される抗体を指す。
【００２７】
用語「遺伝子組み換え抗体」は、アミノ酸配列が天然抗体の配列から変更された抗体を意味する。抗体の生成における組換えＤＮＡ技術の関連性のために、天然の抗体に見出されるアミノ酸の配列に限定される必要はなく、抗体は、所望の特性を得るために再設計することができる。多くの可能なバリエーションがあり、その範囲は、たった１個又は数個のアミノ酸への変化から、例えば可変領域及び／又は定常領域の完全な再設計にまで及ぶ。定常領域の変化は、一般に、補体の結合、膜との相互作用、及び他のエフェクター機能、並びに製造性及び粘度などの特性を改善又は変更するために行われる。可変領域における変更は、抗原結合特性を改善するために行われる。
【００２８】
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００２９】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖と、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成し得るように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域のより多くを含む１本の重鎖とを含む。
【００３０】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖と、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖とを含む。
【００３１】
用語「Ｆｖフラグメント」及び「一本鎖抗体」は、重鎖及び軽鎖の両方の抗体可変領域を含むが、定常領域は欠くポリペプチドを指す。抗体全体と同様に、これは特異的抗原に選択的に結合することができる。わずか約２５ｋＤａの分子量のＦｖフラグメントは、２本の重タンパク質鎖及び２本の軽鎖から構成される通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１本の軽鎖及び半分の重鎖）よりもさらに小さい。
【００３２】
「単一ドメイン抗体」は、単一ドメインＦｖ単位、例えば、ＶＨ又はＶＬからなる抗体フラグメントである。抗体全体と同様に、それは特異的抗原に選択的に結合することができる。わずか１２〜１５ｋＤａの分子量の単一ドメイン抗体は、２本の重タンパク質鎖及び２本の軽鎖から構成される通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１本の軽鎖及び半分の重鎖）及び一本鎖可変フラグメント（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、軽鎖由来の１つ及び重鎖由来の１つ）よりもさらに小さい。第１の単一ドメイン抗体を、ラクダ科の動物に見出される重鎖抗体から遺伝子工学により操作した。単一ドメイン抗体に関する研究のほとんどは、現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖に由来するナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
【００３３】
本明細書で使用する時、用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを指し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインは、１つの抗原又は標的（例えばＣＤ３）に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的（例えばＢＣＭＡ；例えばＣＤ３３）に結合する。したがって、本発明による抗体コンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を備える。本発明の用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。
【００３４】
本発明による抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、それらは、天然に存在せず、且つそれらは、天然に存在する産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体コンストラクト又は免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。二重特異性抗体コンストラクトは、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照されたい。
【００３５】
本発明の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及びもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を含む。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、それがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。ペプチドリンカーは、他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体コンストラクトに結合するためにも使用され得る。
【００３６】
リンカーが使用される場合、このリンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立してその異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列からなることが好ましい。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、Ｇｌｙに富んだリンカーが好ましい。上記の「ペプチドリンカー」に関して特に好ましい「単一」のアミノ酸はＧｌｙである。したがって、上記のペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ここで、ｘは、１又はより大きい整数（例えば、２又は３）である。好ましいリンカーは、配列番号１〜９に示されている。二次構造の促進の欠如を含む上記のペプチドリンカーの特徴は当技術分野で既知であり、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２９，２１−３０）、及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。上記のドメインの相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子操作によって提供することができる。融合され作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【００３７】
特に好ましい実施形態によれば、且つ付属の実施例に記載されるように、本発明のＡＭＧ７０１及びＡＭＧ３３０抗体コンストラクトはそれぞれ、「二重特異性一本鎖抗体コンストラクト」であり、より好ましくは、二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が一価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてこれらが作製されることを可能にする、本明細書で上述した合成リンカーによって結合することができる（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来技術を用いて得られ、且つそのフラグメントは、完全又は全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常、約１０〜約２５アミノ酸、好ましくは約１５〜２０アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシン及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００３８】
二重特異性一本鎖分子は、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の作製に関して説明される技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）は、選出された標的を特異的に認識する一本鎖抗体コンストラクトを作製するように適合させることができる。
【００３９】
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性一本鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖ又はｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書の上記に記載されるリンカーを用いて）連結することにより作り出すことができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｕｌｙ  １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９０（１４）：６４４４−８を参照されたい）。
【００４０】
本明細書で上述したように、本発明は、抗体コンストラクトが、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、これらのフォーマットのうちのいずれかのダイアボディ及びオリゴマーからなる群から選択されるフォーマットである好ましい実施形態を提供する。
【００４１】
本発明の抗体コンストラクトの別の好ましい実施形態によれば、標的抗原ＣＤ３及びＣＤ３３又はＢＣＭＡのいずれかに結合する結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、上述のペプチドリンカーを介して直接結合するのではなく、結合ドメインはダイアボディに関して説明した二重特異性分子の形成に起因して形成される。したがって、ＣＤ３結合ドメインのＶＨ鎖はこうしたペプチドリンカーを介してＣＤ３３又はＢＣＭＡ結合ドメインのＶＬに融合されてもよく、同時にＣＤ３結合ドメインのＶＨ鎖はこうしたペプチドリンカーを介してＣＤ３３又はＢＣＭＡ結合ドメインのＶＬに融合される。
【００４２】
本明細書では、用語「アミノ末端」並びに「カルボキシル末端」並びにこれらの短縮形である「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、ポリペプチド内の位置を表すように用いられる。その状況が可能である場合、これらの用語は、近接していること又は相対位置を示すために、ポリペプチドの特定の配列又は部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するとは限らない。
【００４３】
本明細書で使用する時、用語「アミノ酸」は、Ｄ又はＬ光学異性体のＮ−アセチル類縁体（例えばＮ−アセチルアルギニン）を含むがこれに限定されないグリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方、並びにアミノ酸類縁体及びペプチド模倣薬を含む、天然及び／又は非天然若しくは合成のアミノ酸のいずれかを指す。一部の態様では、用語「アミノ酸」は単量体アミノ酸を指す。
【００４４】
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法及びそれらの手法は、当該技術分野で周知されており、且つ一般的に使用されるものである。別段の記載がない限り、本発明の方法及び技法は、一般に、当該技術分野で周知される従来法に従って実施され、また、本明細書全体を通して引用され論じられる一般的な参考文献及びより特定性の高い参考文献に記載されるとおりである。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９０），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。いずれの酵素反応及び精製手法も、製造者の説明に従って実施されるか、当該技術分野において一般に達成されるように実施されるか、又は本明細書で説明されるとおりに実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される専門用語、並びにそれらの実験室的な手順及び手法は、当該技術分野で周知され、且つ一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、配合、及び送達、並びに患者の治療に標準的な手法が使用され得る。
【００４５】
中間配合濃度の使用
タンパク質配合物の目標は、高純度の組み換えタンパク質溶液（原薬）を安定した有効な生物薬剤学的剤形に変換することである。Ｋａｍｅｒｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），６３（１３）：１１１８−５９（参照により組み込まれる）。配合前特性決定（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）と称される場合もある第１工程は、タンパク質の物理化学的性質及び不安定性経路を決定することを含み、これにより、様々な賦形剤を含有する配合物の設計が、所定の貯蔵条件下でタンパク質の安定性を確保することが可能となる。同時に、配合条件下（例えば賦形剤の存在下）でタンパク質の物理化学的完全性及び生物学的活性を監視するための分析手法を、これらのパラメータにおける任意の変化に対する許容可能な限度を定める規格値と共に開発する必要がある。続いて、様々な医薬品賦形剤の標的レベルを用いた様々なタンパク質濃度における特定の配合物を、貯蔵寿命にわたる安定性、可溶性、及び等張性を保証するために実験的に試験する。更に、タンパク質−賦形剤混合物を貯蔵し、患者又は医療専門家による非経口投与を容易にするための一次容器を選択する（例えばバイアル瓶、カートリッジ、又は予充填シリンジ）。生物薬剤学的薬又はワクチン剤形全体（タンパク質、賦形剤、一次容器、及び送達装置）が、無菌条件下での商業生産を可能にするためのスケーラビリティと、ヒトに使用するための生物薬剤学的剤形の生産及び試験のための規制指導の全てに適合することと、の両方のために設計されなければならない。
【００４６】
配合物の開発は、一般には、生物物理学的スクリーニング戦略全体を通して正しいｐＨ及び緩衝系を特定することから開始する。ｐＨを安定化させるために緩衝剤がタンパク質溶液に添加されると、タンパク質の安定性は特有の狭いｐＨ範囲の特性と一般に連関しているため、これにより、続いてタンパク質が安定化される。Ｑｕａｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ：Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｒｎｓ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，ｐｐ．９４−１１３中のＧａｒｉｄｅｌ  ａｎｄ  Ｂａｓｓａｒａｂ（２００９），“Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ”を参照されたい（これは参照により組み込まれる）。続いて、安定剤（例えば糖類）、充填剤（例えばマンニトール）、及び界面活性剤（例えばポリソルベート２０）などのその他の配合物賦形剤を緩衝タンパク質溶液に添加する。凍結乾燥配合物の場合、こうした液状配合混合物を続いて凍結乾燥させる。
【００４７】
その他の製剤プロセスにおける凍結乾燥においては、重要な制御は、必要な用量を患者に送達する治療用タンパク質の充填重量である。高濃度生成物の場合、配合段階での生成物濃度の制御、それに続く充填プロセスの一部としての充填重量制御の単純な戦略が適切である。しかしながら、マイクログラム、又は更にはミリグラム単位の非常に低い用量の生成物を送達する場合、用量送達を保証するためのこの単純な戦略は、患者が必要な用量を受け得ることを保証する点で問題を生じ始める。関連する懸念は、製品ラベルが容器内の製品を反映しない場合があること、及び、投薬のために物質を取り出すのが困難となる場合があることである。したがって、凍結乾燥医薬配合物中の治療用タンパク質の充填重量に対するより優れた制御を提供するプロセスに対する必要性が存在する。
【００４８】
上述したように、高濃度の治療用タンパク質の場合は、配合段階での生成物濃度の制御、それに続く充填プロセスの一部としての充填重量制御の単純な戦略が適切であるが、低濃度の場合に問題を生じる場合がある。充填重量及び配合標的が制御されている場合の低用量生成物の充填重量制御のための設計空間は、個別に高いばらつきを示し、製品が出荷時規格（ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を満たさない大きな可能性を有する。製造のばらつきに起因して、プロセスの規模、及び製造設備に固有のばらつきのために配合バルクの正確な制御を達成することができない。もう１つの問題は、高いばらつきは凍結乾燥生成物に固有であることであり、これは、生成物が再構成される必要があり、これもまた可変のプロセスであるためである。
【００４９】
典型的な制御戦略（図１に示す）は、不適合のタンパク質濃度の結果を有する可能性を５０％超で有する。図１では、凍結乾燥均質性データの観察される全体的なばらつきは０．０１ｍｇ／ｍＬである。最低能力を保証するため、平均作動範囲を、３×０．０１＝０．０３ｍｇ／ｍＬだけ「段階付けされた」規格値範囲に対応するように制約する必要がある。白色の空間内を標的とするプロセスは、バッチあたりの規格値外（ＯＯＳ）バイアル瓶が０．１％未満の品質を有する。対照的に、影付き領域内を標的にするプロセスは、より高いＯＯＳ率を有する。図１から分かるように、現在の作動範囲（大きな正方形）は所望の配合物の不適合境界（ｅｄｇｅｓ  ｏｆ  ｆａｉｌｕｒｅ）を含む。しかしながら、有効作動範囲（図１のより小さな長方形）は、配合のばらつき及び充填剤重量制御の両方の一部として達成され得るよりも厳しい充填許容範囲を必要とする。
【００５０】
したがって、その他の生成物品質属性（例えばオスモル濃度、ｐＨ）及びタンパク質濃度を考慮する必要もあるプロセスは、標準的方法では生産又は実行可能でない場合がある。図２は、オスモル濃度規格値が考慮されている例示的な設計空間を示す。灰色の着色は、ＩＰＣ／アラートリミット作動範囲内にある広範な不適合条件を示す。
【００５１】
標準的方法はまた、実行可能であるがフォールトトレラントではない充填重量及び配合物制御戦略をもたらし得る（図３を参照）。図１にあるとおり、ＩＰＣ／ＡＬＯＲは、製剤濃度規格値を満たさない領域を含む。製剤濃度規格値を満たす領域（ＩＰＣ／ＡＬＯＲ内の白色領域）内では、充填目標における誤差の余地はほとんど存在しない。したがって、図３に示すように、標準的方法は、実行可能であるが十分なフォールトトレランスのない、範囲端部の制御に困難を伴うプロセスをもたらし得る。
【００５２】
充填容量の増加は、適切なフォールトトレランスを備えた実行可能な配合物を生成するのに十分なプロセスのばらつきを有さない場合がある。図４は充填容量が増加した応答表面マップである。充填目標範囲はＩＰＣ／ＡＬＯＲ及び生成物規格値内に置かれ得るが、フォールトトレランスは不完全なままであり得る。配合バルク濃度の許容範囲を超えた充填重量範囲は、フォールトトレランスが不十分である。
【００５３】
配合バルクの結果を用いて、続いて治療用タンパク質の充填重量を調整する場合、作動範囲は、実行可能且つ十分にフォールトトレラントな配合物を実現できるだけ十分に変更してよい。図５に示すように、修正された作動範囲（ＩＰＣ／ＡＬＯＲ）によって、期待される充填目標範囲が、十分に濃度及びオスモル濃度規格値内に収まることが可能となる。このようにして、充填目標範囲を、十分なフォールトトレランスを有する濃度及びその他の規格値内に提供することができる。
【００５４】
今日までに、この技法は、ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））低用量ＳＫＵ、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））、インフリキシマブ、及びトラスツズマブ向けの低用量在庫管理単位（ＳＫＵ）に用いられてきた。この技法の使用に関する詳細は、下記の実施例に記載されている。
【００５５】
賦形剤一般
配合物の１つの問題は、製造、輸送、及び貯蔵のストレスに耐えて生成物を安定化させることであり、これは特定の配合物賦形剤によって達成され得る。一般には、賦形剤は、様々な化学的及び物理的ストレスに耐えてタンパク質を安定化させるその機序に基づいて分類することができる。一部の賦形剤は、特定のストレスの効果を緩和するか、或いは特定のタンパク質の特定の感受性を調節する。その他の賦形剤は、タンパク質の物理的安定性及び共有結合安定性に対してより一般的な効果を有する。
【００５６】
液状及び凍結乾燥タンパク質配合物の一般的な賦形剤を表２に示す（Ｋａｍｅｒｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．６３（１３）：１１１８−５９を参照されたい）。
【００５７】
【表２】
2020534255.tif 000004
【００５８】
【表３】
2020534255.tif 000005
【００５９】
【表４】
2020534255.tif 000006
【００６０】
その他の賦形剤は当該技術分野で既知であり、参照により本明細書に組み込まれるＰｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，５２：２３８−３１１に見出すことができる。
【００６１】
本明細書に提供される教示及び指示を鑑みれば、当業者であれば、本発明の生物薬剤学的配合物を得るために、どの量又は範囲の賦形剤を任意の特定の配合物に含めてよいかを理解するであろう。例えば、本発明の生物薬剤学的配合物に含めるべき塩の量及び種類は、最終溶液の所望のオスモル濃度（すなわち等張性、低張性、又は高張性）、並びに配合物に含められるべきその他の成分の量及びオスモル濃度に基づいて選択され得る。同様に、配合物に含められるポリオール又は糖の種類を参照した例証によれば、こうした賦形剤の量はそのオスモル濃度に依存する。
【００６２】
当業者は、生物薬剤の安定性の保持を促進する本発明の生物薬剤学的配合物を得るために、どの量又は範囲の賦形剤を任意の特定の配合物に含めてよいか決定することができる。例えば、本発明の生物薬剤学的配合物に含めるべき塩の量及び種類は、最終溶液の所望のオスモル濃度（すなわち等張性、低張性、又は高張性）、並びに配合物に含められるべきその他の成分の量及びオスモル濃度に基づいて選択され得る。同様に、配合物に含められるポリオール又は糖の種類を参照した例証によれば、こうした賦形剤の量はそのオスモル濃度に依存する。
【００６３】
例えば、約５％（重量／容量）のソルビトールが等張性を得ることができる一方で、スクロース賦形剤が等張性を得るには約９％（重量／容量）必要である。本発明の生物薬剤学的配合物に含むことのできる１つ以上の賦形剤の量又は濃度の範囲の選択を、塩、ポリオール、及び糖を参照することによって上記で例示した。しかしながら、当業者であれば、本明細書で説明され、特定の賦形剤を参照することによって更に例示された考察は、例えば塩、アミノ酸、他の等張化剤、界面活性剤、安定剤、充填剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、抗酸化剤、金属イオン、キレート剤、及び／又は防腐剤などのあらゆる種類及び組み合わせの賦形剤に等しく適用可能であることを理解するであろう。
【００６４】
更に、配合物中に特定の賦形剤が、例えばパーセント（％）重量／体積で報告される場合、当業者は、その賦形剤の等価のモル濃度も検討されることを認識するであろう。
【００６５】
当業者は、上記の賦形剤の濃度が、特定の配合物内で相互依存性を共有することを認識するであろう。一例として、例えばタンパク質／ペプチド濃度が高い場合、又は、安定化剤の濃度が高い場合、充填剤の濃度は低下され得る。更に、当業者は、充填剤を含まない特定の配合物の等張性を維持するために、安定化剤の濃度が、しかるべく調整されてよい（すなわち、「等張化（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ）」量の安定剤が用いられる）ことを認識するだろう。
【００６６】
緩衝剤
溶液のｐＨは、タンパク質のアミノ酸残基の化学的完全性（例えば、Ａｓｎの脱アミド化及びＭｅｔの酸化）及びその高次構造の維持に影響を及ぼす。したがって、当業者は緩衝剤を用いて、溶液のｐＨを制御し、またタンパク質の安定性を最適化する。タンパク質薬物の最大限の安定性は、通常狭いｐＨ範囲内にある。この目的にはいくつかのアプローチ（例えば加速安定性研究及び熱量測定スクリーニング研究）が有用である（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１６）：５２４１−７）。配合物が完成したら、製剤は、その貯蔵寿命を通して、所定の規格内で製造及び維持しなければならない。従って、配合物中のｐＨを制御するために、緩衝剤はほぼ常に使用される。
【００６７】
有機酸、リン酸塩及びトリスは、タンパク質配合物中の緩衝剤として通常使用されてきた（表３を参照されたい）。緩衝種の緩衝能はｐＨがｐＫａと等しいときに最大になり、ｐＨがこの値から増加又は低下すると低下する。緩衝能の９０パーセントはそのｐＫａの１ｐＨ単位内に存在する。緩衝能はまた、緩衝剤濃度が増加すると比例して増加する。
【００６８】
【表５】
2020534255.tif 000007
【００６９】
上記に加えて、一部の治療用タンパク質は、薬学的に適切な濃度で自己緩衝性となり得る。こうしたタンパク質の配合物は、従来の緩衝剤を全く含まなくてもよい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１２／００２８８７７号明細書を参照されたい。
【００７０】
糖及び炭水化物
糖は、液状配合物及び凍結乾燥配合物の両方でタンパク質を安定化するために頻繁に用いられる。スクロース及びトレハロースなどの二糖は、液体状態での高濃度における選択的水和により、また固体状態でのタンパク質との特異的相互作用及び粘性ガラス状マトリックスの形成により、タンパク質を安定化させると考えられる。糖分子は、モノクローナル抗体溶液の粘度を増加させ得るが、これは選択的水和機構によるものと推定される。ソルビトールなどの糖アルコールは、溶液中及び凍結乾燥状態のタンパク質を安定化させ得る。マンニトールは、凍結乾燥配合物中の充填剤として用いられることが多い。ラクトースは、タンパク質の吸引配合物の担体分子として用いられる。シクロデキストリン誘導体は、抗体、ワクチン抗原、増殖因子としてのかかるより小さなタンパク質、インターロイキン−２、及びインスリンの液状配合物中のタンパク質を安定化させることができる。
【００７１】
安定剤及び充填剤
充填剤は、生成物のエレガンスを向上させ、且つブローアウトを防ぐために凍結乾燥配合物中で典型的に用いられる。配合物中の条件は、一般に、充填剤が凍結した非晶相から結晶化して（凍結する間、又はＴｇ’を超えてアニーリングする間のいずれかで）ケーキ構造及びバルクを付与するように設計される。マンニトール及びグリシンは、一般的に用いられる充填剤の例である。
【００７２】
安定剤としては、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、及びガラス形成剤としての役割を果たし得る化合物の部類が挙げられる。凍結保護剤は、凍結中の又は低温で凍結状態のタンパク質を安定化させるように作用する（Ｐ．Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｄ．，Ｇｏｏｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，（１９９７））。凍結乾燥保護剤は、フリーズドライの脱水段階中にタンパク質の天然様立体配座特性を保存することによって、タンパク質をフリーズドライされた固形剤形で安定化させる。ガラス状態特性は、温度の関数としてのこれらの緩和特性に応じて、「頑丈」又は「脆弱」に分類されている。安定性を与えるためには、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、及びガラス形成剤が、タンパク質と同じ相に留まることが重要である。糖、ポリマー、及びポリオールはこのカテゴリに入り、場合によっては３つの役割の全てを果たすことができる。
【００７３】
ポリオールは、糖（例えば、マンニトール、スクロース、ソルビトール）、及び他の多価アルコール（例えば、グリセロール及びプロピレングリコール）を含む賦形剤の一部類を包含する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーはこのカテゴリに含まれる。ポリオールは、液状及び凍結乾燥非経口タンパク質配合物の両方において、安定化賦形剤及び／又は等張化剤として一般的に使用される。ホフマイスターシリーズの場合、ポリオールはコスモトロピック（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｉｃ）であり、タンパク質表面から選択的に排除される。ポリオールは、タンパク質を物理的分解経路及び化学的分解経路の両方から保護することができる。選択的に排除された共溶媒はタンパク質の界面における溶媒の有効表面張力を増加させるため、エネルギー的に最も好ましいタンパク質の立体配座は最小の表面積を有するものである。
【００７４】
マンニトールは、フリーズドライ中に非晶質タンパク質相から結晶化してケーキに構造的安定性を与えるため、凍結乾燥配合物において一般的な充填剤である（例えばＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）−Ｌｙｏ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））。これは、一般に、スクロースなどの凍結保護剤及び／又は凍結乾燥保護剤と組み合わせて使用される。マンニトールは凍結条件下で結晶化する傾向があるため、ソルビトール及びスクロースが、輸送中に又は製造前にバルクを凍結させる際に遭遇する凍結融解のストレスから生成物を保護するための、液状配合物中の好ましい等張化剤／安定剤である。ソルビトール及びスクロースは、結晶化に対する抵抗性がはるかに大きく、従って、タンパク質から相分離する可能性がより低い。マンニトールは、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）、Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）、及びＲｅｂｉｆ（登録商標）などのいくつかの市販液状配合物において等張化量で用いられている一方で、これらの薬物の製品ラベルに「凍結禁止」と警告が記載されていることに注目することは興味深い。グルコース及びラクトースなどの（遊離アルデヒド又はケトン基を含有する）還元糖は、タンパク質の表面リジン及びアルギニン残基と反応し、アルデヒドと第一級アミンとのメイラード反応を介してタンパク質の表面リジン及びアルギニン残基を糖化し得るため、使用を避けるべきである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｈｒｕｎｇ，４６（２）：５８−６３（２００２）；Ｈｕｍｅｎｙ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５０（７）：２１５３−６０（２００２））。スクロースは、酸性条件下で、フルクトース及びグルコースへと加水分解し得（Ｋａｕｔｚ  Ｃ．Ｆ．ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ａ．Ｌ．，ＪＡＣＳ，５０（４）１０２２−３０（１９２８））、その結果、糖化を引き起こし得る。
【００７５】
本発明の組成物の特定の実施形態では、凍結乾燥に誘起される又は貯蔵に誘起される凝集及び化学的分解を防止又は低減するために安定剤（又は安定剤の組み合わせ）が凍結乾燥配合物に添加される。再構成時の濁った又は不透明な溶液は、タンパク質が沈殿したことを示す。用語「安定剤」は、水性及び固体状態での、凝集又はその他の物理的分解及び化学的分解（例えば、自己分解、脱アミド化、酸化など）を防ぐことができる賦形剤を意味する。医薬組成物中で従来使用される安定剤としては、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニンＨＣＬ、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ−メチルピロリデン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｅｎｅ）、セルロース及びヒアルロン酸などの多糖を含むポリヒドロキシ化合物、塩化ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ７４：２２５）。
【００７６】
オスモライト
タンパク質配合物の賦形剤として一般的に用いられるオスモライトを表２に列記する。自然界で一般的に見いだされる、賦形剤として有用となり得るその他のオスモライトとしては、タウリン、ベタイン、トリメチルアミン、Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）、コリン−Ｏ−スルフェート、及びサルコシンが挙げられる。
【００７７】
タンパク質及びポリマー
タンパク質系の賦形剤は、特に、タンパク質系賦形剤の存在下でタンパク質系薬剤又はワクチンの安定性を監視するための分析方法の開発において、配合物に複雑性を付与する。ポリマーは、凍結乾燥タンパク質配合物における賦形剤（例えば充填剤）として評価されてきた。タンパク質が乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーと共に配合される、タンパク質薬物及びワクチンの制御放出配合物が研究されている。多くの更なる水溶性ポリマー（例えばヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））が、タンパク質薬物の局所配合物のために用いられてきた。
【００７８】
ＰＥＧは、２つの異なる温度依存性機構によってタンパク質を安定化させることができる。これは、低温ではタンパク質表面から選択的に排除されるが、高温では、その両親媒性のためにタンパク質のアンフォールド形態と相互作用することが示されている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（１９８７），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６（２４）：７８１３−９）。これは、低温では、選択的排除によってタンパク質を保護することができるが、高温では、恐らくアンフォールドされた分子間の生産的衝突の数を低減することによりタンパク質を保護することができる。ＰＥＧは凍結保護剤でもあり、組み換え抗血友病因子の凍結乾燥配合物であるＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）において使用されてきた。
【００７９】
酸化防止剤
多くの異なる原因がタンパク質残基を酸化させ得る。酸化性タンパク質の損傷は、大気の酸素、温度、光曝露、及び化学的汚染などの要因を含む製造プロセス及び生成物の貯蔵を慎重に管理することによって最小化することができる。こうした管理が不適当である場合は、酸化防止賦形剤を配合物に含めることができる。
【００８０】
最も一般的に使用される医薬用酸化防止賦形剤は、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、又はキレート剤である。治療用タンパク質配合物中の抗酸化剤は水溶性でなければならず、生成物の貯蔵寿命全体を通して活性を維持しなければならない。還元剤及び酸素／フリーラジカルスカベンジャーは、溶液中の活性酸素種を切断することによって機能する。キレート剤（例えばＥＤＴＡ）は、フリーラジカル形成を促進する微量金属不純物を結合することによって効果を発揮し得る。例えば、酸性線維芽細胞増殖因子の液状配合物中では、ＥＤＴＡが金属イオンによって触媒されるシステイン残基の酸化を阻害する。ＥＤＴＡは、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）及びＯｎｔａｋ（登録商標）などの市販製品に使用されている。
【００８１】
金属イオン
一般に、遷移金属イオンはタンパク質中で物理的及び化学的分解反応を触媒し得るため、タンパク質配合物中の遷移金属イオンは望ましくない。しかしながら、特定の金属イオンがタンパク質に対する補因子として機能する場合は、それが配合物中に含められる。金属イオンが配位錯体を形成する場合、これはタンパク質の懸濁液配合物（例えばインスリンの亜鉛懸濁液）中でも用いられ得る。アスパラギン酸がイソアスパラギン酸に異性化することを阻害するためのマグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）の使用が提案されている（国際公開第２００４／０３９３３７号パンフレット）。
【００８２】
金属イオンは、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（ｒｈＤＮａｓｅ、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））の配合物中で安定性及び／又は増加した活性を付与することが見いだされている。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、特異的結合部位を通じて、酵素の安定性を増加させた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８８（４）：４７７−８２）。実際に、ＥＧＴＡによって溶液からカルシウムイオンを除去することで、脱アミド化及び凝集の増加が生じた。しかしながら、この効果は、Ｃａ＋２イオンでのみ観察され、その他の二価のカチオン（Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２）は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させることが観察された。
【００８３】
同様の効果が、第ＶＩＩＩ因子の配合において観察された。Ｃａ＋２及びＳｒ＋２イオンはタンパク質を安定化させた一方で、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２、及びＦｅ＋２などのその他のものはこれを不安定化させた（Ｆａｔｏｕｒｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１５５，１２１−１３１）。第ＶＩＩＩ因子を用いた別の研究では、Ａｌ＋３イオンの存在下で凝集速度の顕著な増加が観察された（Ｄｅｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３（１０）：２５４９−５７）。著者らは、緩衝剤塩のような他の賦形剤にはＡｌ＋３イオンが混入していることが多いことを指摘しており、配合製品中で適切な品質の賦形剤を使用することの必要性を例示している。Ａ型肝炎及びポリオなどの生きている又は死んでいる弱毒化されたピコルナウイルスを含有するワクチンは、マグネシウムによって立体配座的に安定化される。カルシウム、マグネシウム、及び亜鉛などの金属イオンは水溶液中のオキシトシンの安定性を改善する。インスリンは亜鉛に結合して、結晶形態の二量体及び六量体の形成をもたらすことができ、これにより、様々なインビボ放出プロファイルを有する様々な配合物の調製が可能となる。六量体インスリン配合物の化学及び熱安定性は、様々な濃度の亜鉛及びフェノールの存在下で変化する。
【００８４】
特異的リガンド
タンパク質治療薬の立体配座安定性を改善するための１つのアプローチは、タンパク質固有のリガンド結合部位を利用することである。例えば、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）は、その酵素活性のために二価金属イオンを必要とするだけではなく、これは、カルシウムイオンの存在下で改善された立体配座安定性を有する。酸性及び塩基性の両方の線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）の創傷治癒を促進する能力が臨床的に評価されたが、両方のタンパク質が、細胞表面上の強い負電荷を持つプロテオグリカンと自然に結合する。様々なその他の強い負電荷を持つ化合物もａＦＧＦに結合し、タンパク質のポリアニオン結合部位との相互作用によってａＦＧＦを劇的に安定化させる。
【００８５】
界面活性剤
タンパク質分子は、表面と相互作用する高い傾向を有すため、空気−液体、バイアル−液体、及び液体−液体（シリコーン油）界面で吸着及び変性を起こしやすい。この分解経路は、タンパク質濃度に逆依存し、可溶性及び不溶性のタンパク質凝集体、又は表面への吸着による溶液からのタンパク質の喪失をもたらす。容器表面吸着に加えて、表面誘起分解は、搬送及び取り扱い中に経験されるような物理的攪拌によって悪化する。
【００８６】
界面活性剤は、表面誘起分解を防ぐために、タンパク質配合物中で一般的に使用される。界面活性剤は、界面位置に関してタンパク質に打ち勝つ能力を有する両親媒性の分子である。界面活性剤分子の疎水性部分は界面位置（例えば、空気／液体）を占めるのに対し、分子の親水性部分はバルク溶媒の方向に配向された状態を保つ。十分な濃度（典型的には、洗剤の臨界ミセル濃度付近）において、界面活性剤分子の表面層は、タンパク質分子が界面において吸着するのを防ぐ役割を果たす。これにより、表面誘起分解は最小化される。
【００８７】
最も一般的に用いられる界面活性剤は、ソルビタンポリエトキシレート、すなわちポリソルベート２０及びポリソルベート８０（例えば、製剤のＡｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）中）の非イオン性脂肪酸エステルである。２つは、分子Ｃ−１２及びＣ−１８にそれぞれ疎水性特性を付与する脂肪族鎖の長さのみが異なる。ポリソルベート８０は、ポリソルベート２０よりも界面活性が高く、且つより低い臨界ミセル濃度を有する。ポリソルベート２０及びポリソルベート８０の両方が、攪拌誘起凝集から保護することが示されている。ポリソルベート２０及びポリソルベート８０はまた、凍結、凍結乾燥、及び再構成によって誘起されるストレスからも保護する。ポリソルベート２０及び８０の両方が、タンパク質を酸化させ得る過酸化物を含み得、これら自体が酸化又は加水分解のいずれかによって分解して、タンパク質の安定性に様々な影響を及ぼし得る。配合物中のポリソルベート２０又は８０の濃度を制御することも、膜ろ過中のその複雑な挙動のために困難であり得る（特にポリソルベートが溶液中でミセルを形成する濃度において）。界面活性剤ポロキサマー１８８も、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（登録商標）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）及びＯｖｉｄｒｅｌ（登録商標）などのいくつかの市販液体製品中に使用されてきた。一般的に、非イオン性界面活性剤は、主に疎水性表面（例えば空気−水界面）に関してタンパク質分子に打ち勝ち、それによってタンパク質がこれらの疎水界面においてアンフォールドするのを防ぐことによってタンパク質を安定化させるものと考えられる。非イオン性界面活性剤はまた、処理中に存在するその他の疎水性表面にタンパク質分子が吸着するのを阻止することができる。更に非イオン性界面活性剤は、タンパク質分子中の疎水性領域と直接相互作用することができる。モノクローナル抗体は、緩衝剤のみと比較して、ポリソルベート２０の臨界ミセル濃度に影響を与え得る。
【００８８】
洗剤はまた、タンパク質の熱力学的配座安定性にも影響を及ぼし得る。ここでも、所定の賦形剤の効果は、タンパク質特異的である。例えば、ポリソルベートは、一部のタンパク質の安定性を低下させ、その他の安定性を向上させることが示されている。洗剤のタンパク質不安定化は、部分的又は全体的にアンフォールドしたタンパク質状態との特異的な結合に関与し得る洗剤分子の疎水性尾部の点で理にかなっている。これらの種類の相互作用は、より拡張したタンパク質状態への配座平衡の移行を引き起こし得る（すなわち、結合するポリソルベートを補完してタンパク質分子の疎水性部分の露出を増加させる）。或いは、タンパク質の天然状態がいくつかの疎水性表面を示す場合、天然状態に結合する洗剤はその立体配座を安定化させ得る。
【００８９】
ポリソルベートの別の側面は、これらが本質的に酸化分解を起こしやすい点である。これらは、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を原材料として含有する場合が多い。安定剤の添加から生じる酸化損傷の可能性のために、最低有効濃度の賦形剤が配合物中に使用されるべきであるという点が強調される。界面活性剤の場合、所定のタンパク質の有効濃度は、安定化機構によって決まる。界面活性剤の安定化機構が表面変性の防止に関連する場合、有効濃度は洗剤の臨界ミセル濃度付近になることが想定されている。反対に、安定化機構が特異的なタンパク質−洗剤相互作用と関連する場合、有効な界面活性剤濃度は、タンパク質濃度及び相互作用の化学量論に関連する（Ｒａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１５９−７５）。
【００９０】
また、凍結及び乾燥中の表面関連凝集現象を防止するために、界面活性剤を適量で添加してもよい（Ｃｈａｎｇ（１９９６），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：１３２５）。例示的な界面活性剤としては、天然のアミノ酸に由来する界面活性剤を含む、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、及び両性界面活性剤が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、並びにグリコデオキシコール酸ナトリウム塩が挙げられるがこれらに限定されない。カチオン性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムが挙げられるがこれらに限定されない。双性イオン性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−１０、及びＳＢ３−１２が挙げられるがこれらに限定されない。非イオン性界面活性剤としては、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＴＷＥＥＮ−２０、及びＴＷＥＥＮ−８０が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、界面活性剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、４０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５、及び８０、大豆レシチン及び他のリン脂質、例えばＤＯＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ、及びＤＯＰＧ、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
【００９１】
塩
塩は、配合物のイオン強度を増加させるために添加される場合が多く、これは、タンパク質の溶解度、物理的安定性、及び等張性に重要であり得る。塩は、様々な様式でタンパク質の物理的安定性に影響を与え得る。イオンは、タンパク質表面上の荷電した残基に結合することによって、タンパク質の天然状態を安定化させ得る。或いは、これらはタンパク質骨格に沿ったペプチド基（−ＣＯＮＨ−）に結合することによって、変性状態を安定化させることができる。塩はまた、タンパク質分子内の残基間の反発性の静電相互作用を遮蔽することによって、タンパク質の未変性立体配座を安定化させることもできる。タンパク質配合物中の電解質は、タンパク質の凝集及び不溶性をもたらし得るタンパク質分子間の誘引性の静電相互作用を遮蔽することもできる。
【００９２】
タンパク質の安定性及び溶解性に対する塩の効果は、イオン種の特性によって大幅に変動する。ホフマイスターシリーズは、電解質がタンパク質を沈殿させる能力に基づいて、電解質を順位付けする方法として、１８８０年代に考案された（Ｃａｃａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３０（３）：２４１−２７７）。この報告では、ホフマイスターシリーズは、イオン性及び非イオン性共溶質によるタンパク質安定化効果の規模を表すために用いられる。表Ｃでは、溶液状態のタンパク質に対する共溶質の一般的効果に関連して、共溶質が安定化（コスモトロピック）から不安定化（カオトロピック）まで順番に記載されている。一般的に、アニオン間の効果の差は、カチオンに関して観察されるものよりはるかに大きく、両種とも、非経口配合物中で許容され得るよりも高い濃度で効果が最も明白になる。「塩析」と称されるプロセスによって、タンパク質を溶液から沈殿させるために、高濃度のコスモトロープ（例えば、＞１モルの硫酸アンモニウム）が一般に使用され、コスモトロープは、タンパク質表面から選択的に排除され、その天然の（折り畳まれた）立体配座にあるタンパク質の溶解性を低下させる。塩の除去又は希釈は、タンパク質を溶液に復活させる。用語「塩溶」とは、タンパク質骨格のペプチド結合を溶媒和させることによって、タンパク質の溶解性を向上させる不安定化イオン（例えば、グアニジン及び塩化物など）の使用を指す。カオトロープの漸増濃度は、ペプチド鎖の溶解度が増加するにつれて、タンパク質の変性（アンフォールド）状態の立体配座を好む。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスターシリーズでのイオンの位置が定義される。
【００９３】
【表６】
2020534255.tif 000008
【００９４】
非経口配合物中での等張性を維持するために、塩濃度は、一価イオンの組み合わせに対して一般に１５０ｍＭ未満に限定される。この濃度範囲では、塩安定化の機構は、おそらく、静電的な反発性分子内力又は誘因性の分子間力のスクリーニング（デバイ・ヒュッケルスクリーニング）によるものである。興味深いことに、カオトロピック塩は、この機構によって、タンパク質構造を安定化する上で類似濃度のコスモトロープよりも効果的であることが示されている。カオトロピックアニオンはコスモトロピックイオンよりも強く結合するものと考えられている。共有結合性のタンパク質分解の場合、デバイ・ヒュッケル理論によって、この機構に対するイオン強度の効果が異なることが予想される。したがって、塩化ナトリウムによるタンパク質安定化の公表された報告には、塩化ナトリウムが共有結合性分解を加速したという報告が添付されている。塩がタンパク質の安定性に影響を与える機構はタンパク質特異的であり、溶液ｐＨの関数として著しく変動し得る。タンパク質薬物の送達を可能とする上で有用であり得る賦形剤の例は、いくつかの高濃度抗体配合物の賦形剤である。過去数年にわたり、こうした配合物の粘度を低下させる上で塩が有効であることが示されてきた（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，２００６），Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，９４（９）：１９２８−４０，ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，９５（１）：２３４−５）。
【００９５】
防腐剤
防腐剤は、同じ容器からの２回以上の取り出しを伴う複数回使用非経口配合物を開発する際に必要となる。その主な機能は、製剤の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。防腐剤は長い使用の歴史を有するが、防腐剤を含むタンパク質配合物の開発は困難であり得る。防腐剤は、ほぼ常に、タンパク質に対する不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質配合物における使用を制限する主要な要因となっている（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９４（２）：３８２−９６）。ベンジルアルコールもまた、濃度、温度、及び時間依存的な様式で、タンパク質の構造及び安定性に影響を及ぼすことが示されている。これらの不安定化効果のために、多くの凍結乾燥タンパク質配合物が、投与前にタンパク質と接触する時間を最小化するために、ベンジルアルコールを含む希釈剤で再構成される。
【００９６】
ほとんどのタンパク質薬物は、単回使用のためにのみ配合されている。しかしながら、複数回用量配合物が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。防腐処理された配合物の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。少なくとも４種の、ｈＧＨの防腐処理された配合物を含有するこうしたペンデバイスが現在入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（液体）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（登録商標）（液体）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバカートリッジ）はフェノールを含有し、一方でＳｏｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）はｍ−クレゾールを配合している。
【００９７】
防腐処理された剤形の配合物開発中に、いくつかの態様を考慮する必要がある。製剤中の効果的な防腐剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の防腐剤を、タンパク質の安定性を損なうことなく抗微生物効果を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。例えば、３つの防腐剤が、インターロイキン−１受容体（Ｉ型）に対する液体配合物の開発において、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて成功裏にスクリーニングされた。防腐剤は、市販されている製品中で一般に使用されている濃度での安定性に対する影響に基づいて、順位付けされた（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５（２）：２００−８）。
【００９８】
予想され得るように、防腐剤を含有する液体配合物の開発は凍結乾燥配合物よりも困難である。フリーズドライ生成物は、防腐剤なしで凍結乾燥され、使用時に希釈剤を含有する防腐剤で再構成することができる。これにより防腐剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性リスクが大幅に最小化される。液体配合物の場合、防腐剤の有効性及び安定性は、製品の貯蔵寿命全体（通常は約１８〜２４か月）にわたって維持されなければならない。注意すべき重要な点としては、防腐剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終配合物において実証される必要がある。
【００９９】
一部の防腐剤は、注射部位反応を引き起こす場合があり、これは、防腐剤を選択する場合に検討する必要のあるもう１つの要因である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）中の防腐剤及び緩衝剤の評価に焦点を当てた臨床試験において、ｍ−クレゾールを含有する配合物と比べて、フェノール及びベンジルアルコールを含有する配合物中では、疼痛の知覚がより低いことが観察された（Ｋａｐｐｅｌｇａａｒｄ（２００４），Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．６２  Ｓｕｐｐｌ  ３：９８−１０３）。興味深いことに、一般的に使用される防腐剤のうち、ベンジルアルコールは麻酔特性を有する（Ｍｉｎｏｇｕｅ  ａｎｄ  Ｓｕｎ（２００５），Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．１００（３）：６８３−６）。
【実施例】
【０１００】
本明細書において議論及び引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。
【０１０１】
当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１０２】
実施例１：
この実験は、充填重量目標を調節することにより、それぞれの再構成された製剤用にタンパク質濃度の標的を正確に合わせることができることを実証する。
【０１０３】
材料
・  ｐＨ５でマンニトール、スクロース、Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０を含有する緩衝剤
・  容器バイアル、３ｃｃ、Ｉ型ガラス、未処理、ストッパを用いた１３ｍｍ仕上げ、１３ｍｍ、４４３２／５０  Ｖ−５０、
・  ロミプロスチム濾過精製バルク
【０１０４】
方法
１．  必要な量の希釈緩衝剤を用いて薬物を標的の生成物配合（０．５ｍｇ／ｍＬ）に希釈する。
２．  ０．２２μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルタを用いて配合溶液を濾過する。
３．  バイアル及びストッパ：３ｃｃバイアルが洗浄され脱パイロジェン処理されていることを確実にする。
４．  十分な数量のバイアルを、それぞれの充填重量目標；０．３０７、０．３２２、０．３４２、０．３５７、０．３７３ｇまで満たす。
５．  バイアルを栓で部分的に塞ぎ、凍結乾燥機内に配置する。
６．  適切な凍結、真空を伴い、一次及び二次乾燥、続いてストッパリング、及び封止されたバイアル中の凍結乾燥生成物の取り出しを伴う、必要な凍結乾燥サイクルを実施する。
７．  生成物を、０．３２ｍＬの定められた再構成容量の注入用水を用いて再構成する。
８．  紫外線（ＵＶ）吸収を用いてバイアル中に得られたタンパク質の濃度を測定する。吸光度は、特定の波長の光が検体を通過する際に吸収される量として定められる。吸光度単位とは、分子、その濃度、及び検体の経路長に固有の吸光度の関数である。タンパク質分子中の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、２６０〜２９０ｎｍのＵＶ範囲中の光を吸収する。この範囲のＵＶ吸光は、溶液中のタンパク質の存在を測定するために通常用いられる。
９．  氷点降下法を用いて生成物のオスモル濃度を測定する。
１０．  分析を実施して、タンパク質及びオスモル濃度の両方に対する調整された充填重量目標の効果を判定する。
【０１０５】
【表７】
2020534255.tif 000009
【０１０６】
図６に示す０．９９６４のＲ２によって示されるとおり、再構成されたタンパク質濃度と充填容量との間に強い線形関係が観察された。この線形関係は、以下に示すタンパク質のマスバランスに基づき理論的に説明することができる。
Ｃ再構成＊Ｖ再構成＝（Ｃ配合−Ｃ喪失）＊Ｖ充填［方程式１］
【数１】
2020534255.tif 000010
【０１０７】
Ｃ再構成が再構成後のタンパク質濃度である場合、Ｖ再構成は再構成後の生成物容量であり、Ｃ配合は配合バルクタンパク質の濃度であり、Ｃ喪失はフィルタ及び容器に結合したことによるタンパク質の喪失であり、Ｖ充填は各バイアル中の充填容量である。配合バルク濃度、タンパク質結合喪失、及び再構成容量が所定の実施で一定であるため、再構成後のタンパク質濃度は、方程式２に示されるように充填容量に比例している。
【０１０８】
パイロット規模の実験では、表６に示すとおり、各充填条件での１０個の複製を用いて最終再構成製剤（ＤＰ）のタンパク質濃度のばらつきを測定した。したがって、観察されたばらつきは、生成物の再構成に付随するばらつきを含む、プロセス及び分析両方のばらつきを表す。
【０１０９】
【表８】
2020534255.tif 000011
【０１１０】
オスモル濃度に対する充填重量の影響（再構成ＤＰ）
再構成後の最終製剤のオスモル濃度を、５種類の充填重量目標で充填されたバイアルのオスモル濃度に関して試験した。充填前及び再構成後のオスモル濃度の結果を表７にまとめる。０．３４１グラムの目標充填重量での結果に基づくと、オスモル濃度は充填及び再構成後で変化せず、これは、測定可能量の賦形剤が喪失しなかったことを示す。再構成容量が一定に保たれている場合、より高い充填容量ではオスモル濃度はわずかに上昇し、より低い充填容量ではわずかに低下する。
【０１１１】
【表９】
2020534255.tif 000012
【０１１２】
図７に示すように、充填重量／容量（０．３４１ｇの目標に基づき正規化された）が、生成物のオスモル濃度（目標充填重量での３１３ｍＯｓｍ／ｋｇの目標オスモル濃度に基づいて正規化された）に対してプロットされる場合、線形関係が判明した。この線形関係は、オスモル濃度の定義、及びその緩衝剤成分濃度との関係によって説明することができる。
【０１１３】
オスモル濃度は溶質濃度の尺度であり、溶媒１キログラム当たりのオスモル（Ｏｓｍ）の数として定義される（オスモル／ｋｇ又はＯｓｍ／ｋｇ）。モル濃度（モル／Ｌ）とは異なり、オスモル濃度は、溶質のモルではなく溶質粒子（解離イオンなど）のモルを測定する。溶液のオスモル濃度は、以下の式に従って計算することができる。
オスモル濃度（ｏｓｍ／ｋｇ）＝密度＊ΣφｉｎｉＣｉ［方程式３］
式中、φは浸透係数であり、ｎは分子が解離する粒子（例えばイオン）の数であり、Ｃは溶質のモル濃度（モル／Ｌ）である。
【０１１４】
充填重量（又は容量）が目標容量よりも１０％高い場合、配合物中の各賦形剤種の濃度は、一定容量に再構成した時に１０％増加する。方程式３に示されるように、既知の配合物中でφｉ及びｎｉが一定であるため、各種の濃度における１０％の増加は、オスモル濃度の１０％の増加をもたらす。同様に、充填容量の１０％の減少は、賦形剤濃度の１０％の減少、及びその結果としてオスモル濃度の１０％の減少をもたらす。
【０１１５】
実施例２
タンパク質のブリナツモマブは、ｐＨ７．０で、２００ｍＭのＬ−リジン−ＨＣｌ、２５ｍＭのクエン酸、１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース二水和物、０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０に配合された５５μｇ／ｍＬを有する。配合タンパク質の許容可能範囲を濾過バルク段階で測定する。４８．０μｇ／ｍＬ〜６５．０μｇ／ｍＬの範囲のバルク濃度を用いる。測定されたタンパク質濃度に基づいて、３ｍＬの水で再構成した時に１２．５ｍｃｇ／ｍＬの再構成製剤を目標とする目標充填重量を計算する。
Ｃ再構成＊Ｖ再構成＝（Ｃ配合−Ｃ喪失）＊Ｖ充填
式中、
Ｃ再構成＊Ｖ再構成＝目標タンパク質含量再構成である。
【０１１６】
続いて目標タンパク質含量を生成物密度で乗算し、測定された薬剤濃度（必要に応じて結合による喪失で調整される）で除算して、目標充填重量を決定してよい。
【０１１７】
目標充填重量は、以下の式に従い、対応する充填重量範囲（０．６３４〜０．８５８ｇｍ）を用いて計算し、
【数２】
2020534255.tif 000013
式中、ＤＳは原薬を指すと当業者には一般に理解される。より一般的に表すと、
【数３】
2020534255.tif 000014
である。
【０１１８】
実施例３
インフリキシマブ製剤は２０±１．５ｍｇ／ｍＬのインフリキシマブを有し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を配合し、１０ｍＬの注入用水を用いた再構成後にｐＨ７．２である。
【０１１９】
目標充填重量は、以下の式に従い、対応する充填重量範囲（４．８５〜５．６３ｇｍ）を用いて計算する。
【０１２０】
目標充填重量の計算
【数４】
2020534255.tif 000015
【０１２１】
実施例４
トラスツズマブは２１ｍｇ／ｍＬを有し、ｐＨ６．１で、０．３０３ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン、０．４７０ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、１９．１ｍｇ／ｍＬのα，α−トレハロース二水和物、０．０８４０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を配合する。目標充填重量を、以下の式に従い、製品引渡要件に基づく様々な充填重量範囲を用いて計算する。充填重量目標は３．１〜２１．２ｇｍの範囲である（それぞれの提示物（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に応じて変化する）。この生成物は複数の組成を有し、プールされた原薬の濃度は２１ｍｇ／ｍＬである。
【０１２２】
この実施例４及び後続の実施例の各製剤ロットの目標充填重量を、以下の情報を用いて計算する。
【数５】
2020534255.tif 000016
【０１２３】
一例として、
【数６】
2020534255.tif 000017
である。
【０１２４】
別の一例として、
【数７】
2020534255.tif 000018
である。
【０１２５】
更なる例として、
【数８】
2020534255.tif 000019
である。
【０１２６】
実施例５
ＡＭＧ７０１は、一本鎖の可変ドメイン二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ（登録商標））抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体コンストラクトである（ＮＣＩ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ及びその他の参考文献を参照されたい）。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有するＡＭＧ７０１を、ｐＨ４．２で、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、９．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０と配合した。目標充填重量を、以下の式に従い、製品引渡要件に基づく様々な充填重量範囲を用いて計算する。ＡＭＧ７０１は３つの提示物を有し、第１の提示物の充填重量目標範囲は０．４７〜０．５７ｇｍであり、第２の提示物では１．６０〜１．９６ｇｍであり、第３の提示物では３．２８〜４．０１ｇｍである。
【０１２７】
第１の提示物の場合：
【数９】
2020534255.tif 000020
【０１２８】
第２の提示物の場合：
【数１０】
2020534255.tif 000021
【０１２９】
第３の提示物の場合：
【数１１】
2020534255.tif 000022
【０１３０】
実施例６
ＡＭＧ３３０は、抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３の一本鎖可変ドメイン二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ（登録商標））である（ＮＣＩ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ及びその他の参考文献を参照されたい）。０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有するＡＭＧ３００を、ｐＨ６．１で、１０ｍＭのリン酸カリウム、８．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、１．０％（ｗ／ｖ）のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ）、０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０と配合した。目標充填重量を、以下の式に従い、製品引渡要件に基づく様々な充填重量範囲を用いて計算する。充填重量目標は１．２〜１．５ｇｍの範囲である。目標充填重量は次のように計算する。
【数１２】
2020534255.tif 000023
【０１３１】
一般に、本方法論は、再構成後の生成物が確実に所要の濃度であるように、生成物の目標量が容器内で求められる場合に用いることができる。この結果は、再構成生成物の容量の量を測定することによって達成される：例えば、１ｍｇ／ｍＬの所望の濃度の治療用タンパク質を含む１ｍＬ容量は、１ｍｇの所要のタンパク質含量の合計量をもたらす。
目標タンパク質含量［ｍｇ］＝（タンパク質濃度［ｍｇ／ｍＬ］×再構成容量［ｍＬ］）
【０１３２】
続いて目標タンパク質含量を用いて、以下の式に基づき目標充填重量を計算する。工程内の、又は測定された薬剤濃度は、典型的には、任意のプロセスのばらつきを補うために、配合プロセスの一部として測定される。場合によっては、目標タンパク質含量の調整を行い、結合による生成物の喪失を補う。充填重量の正確なターゲティングを確実にするためには測定された薬剤濃度の信頼性が必要である。
【数１３】
2020534255.tif 000024
【０１３３】
工程内濃縮及び再構成生成物の両方のための治療薬は、１ミリリットル（ｍＬ）当たりマイクログラム（ｍｃｇ又はμｇ）台から１ミリリットル（ｍＬ）当たりミリグラム（ｍｇ）台の範囲であり得るため、これは特定の実施例である。
【０１３４】
上述したオスモル濃度の検証が必要である（実験的発見に基づく）。容器に充填される活性薬剤の所要の量を達成して、再構成生成物が、生成物（活性薬剤又はタンパク質）濃度、のみならずオスモル濃度の規格限界の両方を満たすことを保証するために、充填重量目標と組み合わせて、許容される測定された薬剤濃度の制限が定められる。
【０１３５】
本明細書において議論及び引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。
【０１３６】
当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
2020534255.tif 000026
【図２】
2020534255.tif 000027
【図３】
2020534255.tif 000028
【図４】
2020534255.tif 000029
【図５】
2020534255.tif 000030
【図６】
2020534255.tif 000031
【図７】
2020534255.tif 000032
【配列表】
2020534255000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月14日(2020.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
リンカーが使用される場合、このリンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立してその異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列からなることが好ましい。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、Ｇｌｙに富んだリンカーが好ましい。上記の「ペプチドリンカー」に関して特に好ましい「単一」のアミノ酸はＧｌｙである。したがって、上記のペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ここで、ｘは、１又はより大きい整数（例えば、２又は３）である。二次構造の促進の欠如を含む上記のペプチドリンカーの特徴は当技術分野で既知であり、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２９，２１−３０）、及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。上記のドメインの相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子操作によって提供することができる。融合され作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質の凍結乾燥医薬配合物を製造するプロセスであって、
ａ．バルク量の前記治療用タンパク質の配合物を提供することと、
ｂ．バルク配合物中における前記治療用タンパク質の濃度を測定することと、
ｃ．前記バルク配合物中の前記タンパク質の充填重量を調整して、前記タンパク質の固定用量を得ることと、
ｄ．前記タンパク質の充填重量が調整された配合物を凍結乾燥して、容器内に最終配合物を得ることと
を含み、
固定容量を用いて再構成した後の生成物の濃度が、所定の許容可能な範囲内にあり、前記タンパク質の調整された充填重量が、式：
【数１】
2020534255.tif 000033
に従って計算される、プロセス。
【請求項２】
前記最終配合物中の前記タンパク質の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記治療用タンパク質は、ロミプロスチム、ブリナツモマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ＡＭＧ７０１、及びＡＭＧ３３０から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記治療用タンパク質はロミプロスチムであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記最終配合物は、約ｐＨ５．０で、約１０ｍＭのヒスチジン、約４％ｗ／ｖのマンニトール、約２％ｗ／ｖのスクロース、及び約０．００４％のポリソルベート２０中において、約０．５ｍｇ／ｍＬのロミプロスチムを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記治療用タンパク質はブリナツモマブであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約５５μｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記配合物は、約ｐＨ７．０で、約２５ｍＭのクエン酸一水和物、約１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約２００ｍＭのＬ−リジン塩酸塩、及び約０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０中において、約５５μｇ／ｍＬのブリナツモマブを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記治療用タンパク質はインフリキシマブであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約２０±１．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記最終配合物は、約ｐＨ７．２で、約２０±１．５ｍｇ／ｍＬのインフリキシマブ、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記治療用タンパク質はトラスツズマブであり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約２１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記最終配合物は、約ｐＨ６．１で、約２１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、約０．３０３ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン、約０．４７０ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、約１９．１ｍｇ／ｍＬのα，α−トレハロース二水和物、及び０．０８４０ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記治療用タンパク質はＡＭＧ７０１であり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記最終配合物は、約ｐＨ４．２で、約１ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ７０１、約１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、約９．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記治療用タンパク質はＡＭＧ３３０であり、前記最終配合物中の前記治療用タンパク質の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記最終配合物は、約ｐＨ６．１で、約０．５ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ３３０、約１０ｍＭのリン酸カリウム、約８．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、約１．０％（ｗ／ｖ）のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ）、及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記最終配合物中の前記タンパク質の濃度は、約２５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記治療用タンパク質は二重特異性一本鎖抗体コンストラクトである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記治療用タンパク質は、ＡＭＧ７０１及びＡＭＧ３３０から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【国際調査報告】
2020534255.tif 000034
2020534255.tif 000035
2020534255.tif 000036