(57)【要約】  本発明は、異化嫌気性解糖の最終生成物としての乳酸、及び同化中性脂質合成の最終生成物としての中性脂質という２のマーカーの新規な組み合わせ適用に基づいて、腫瘍細胞での（再）分化を誘導する薬剤の同定のための試験を備える。上記セルベースシステムが、さらに、少なくとも７日間の長期にわたって有効なハイスループットスクリーニングを可能にする新規な液体処理手順と、新たな生存率試験とによって特徴付けられる。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の未分化又は脱分化細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物を同定する方法であって、
ａ）複数の脱分化／又は未分化腫瘍細胞からなる細胞培養サンプルを提供するステップとｂ）目的の上記化合物を上記細胞培養サンプルと接触させるステップと、
ｃ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第１マーカーの乳酸の相対濃度を測定するステップと、
ｄ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第２マーカーの複数の中性脂質の相対濃度を測定するステップと
を備え、
ここにおいて、ステップｃ）及びｄ）は、必要に応じて逆の順序で実行され得る方法。
【請求項２】
上記細胞培養サンプルの無脂質又は脂質減少培養によって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
好気的条件下で上記細胞培養サンプルを培養することによって特徴付けられる請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
下記ステップ
ｅ）遠心分離後の吸光度の定量による複数の生存接着細胞の量を決定するステップ、及び／又は
ｆ）バックグラウンドレベルへの完全なシグナル減少の間で、上記複数の細胞におけるアポトーシスの完全な誘導を測定するステップ
をさらに含む上記発明されたプロセスによって特徴付けられる請求項１、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生存率試験としての利用、及び／又はアポトーシスのための試験としての利用のためのものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インスリンの存在下で上記細胞培養サンプルを培養することによって特徴付けられる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
インスリン受容体アイソタイプＢの陰性／若しくは低発現であるか、又はインスリンの存在下対非存在下での複数の分化細胞よりも高いインスリン受容体アイソタイプＡ／Ｂの発現比を有する（腫瘍）細胞培養サンプルを培養することによって特徴付けられる請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
機能的インスリン受容体サブタイプＢ発現、及び相対的に高いサブタイプＢ発現にそれぞれ向かうサブタイプＡのＢに対する比率の分析を可能にする上記細胞の代謝の同化的変化の方向に向かう、インスリンの上記存在対非存在下での１又は両方の上記マーカー（複数の場合がある）の変化によって特徴付けられる請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プロラクチンの存在対非存在下で、プロラクチン受容体に対して陰性又は不十分に発現する乳房細胞培養サンプルを培養することによって特徴付けられる請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記機能的プロラクチン受容体発現の分析を可能にする上記細胞の代謝の同化的変化の方向に向かう、プロラクチンの存在対非存在下での１又は両方の上記マーカーの変化によって特徴付けられる請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロタイタープレートに上記細胞培養サンプルを供給することによって特徴付けられる請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記マイクロタイタープレートをシールする気体透過性箔によって特徴付けられる請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
光学フェノールレッド吸収のｐＨ依存性変化を測定することによって、適切なＣＯ２雰囲気でインキュベートされた重炭酸塩緩衝細胞培養培地中の乳酸濃度の定量によって特徴付けられる請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程１ｄ）におけるマーカーのさらなる培養又は測定のための新たな培地の添加前に、遠心分離による上記細胞培養サンプルからの単一／複数の培地及び／又は洗浄緩衝液の除去によって特徴付けられる請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
部分デバイス（Ａ）及び（Ｂ）を介して培地及び／又は洗浄緩衝液の単一／複数の変更を実行することによって特徴付けられる請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
複数の未分化又は脱分化細胞、特に複数の腫瘍細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物の同定のための複数のマーカーの乳酸及び複数の中性脂質の組み合わされた使用によって特徴付けられる請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
光学フェノールレッド吸収のｐＨ依存性変化の測定による、及び適切な中性脂質染色（蛍光）色素（例えばＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３）を使用した中性脂質の定量による、適切な一定のＣＯ２雰囲気でインキュベートされた重炭酸塩緩衝細胞培養培地中の乳酸濃度の定量によって特徴付けられる請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
複数の未分化又は脱分化細胞、特に複数の腫瘍細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物の同定のための複数のマーカーの乳酸及び複数の中性脂質の使用であって、ここにおいて、上記複数のマーカーが組み合わされて使用される使用。
【請求項１９】
遠心分離によって複数の細胞から複数の液体を除去するための容器（部分デバイス（Ａ））であって、
４の側壁（ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２）であって、長方形形状が得られるように２の対向する側壁が同じ長さ（ｌａ、ｌｂ）を有する４の側壁と、
平らな底部（ｃ）であって、接続領域の全てにわたって上記複数の側壁のそれぞれと防液方式で接続されている底部（ｃ）と、
上記容器の内側に向けられた突出部（ｄａ、ｄｂ）を有する上記複数の側壁のそれぞれと、
それぞれの側壁の上面における上記側壁の長さｌａの中間に位置される複数の凹部（ｅ１、ｅ２）を有し、互いに対向している４つの側壁のうちの２と
を備える容器。
【請求項２０】
遠心分離による液体の添加を可能にする複数の細胞を培養するためのマイクロタイタープレート（部分デバイス（Ｂ））であって、上記プレートが表面（１）及び複数のウェル（２）を備え、上記複数のウェルが上記底部（３）に向かって先細りであり、この底部（３）に開口部、特に円形の開口部が存在するマイクロタイタープレート。
【請求項２１】
上記開口部の直径が、上記複数のウェルのそれぞれの内部の液体の表面張力に比例し、重力よりも強い力の影響下でのみ液体が逃げるように調整される請求項２０に記載のマイクロタイタープレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の同定のための試験を備え、この薬剤は、異化嫌気性解糖の最終生成物としての乳酸、及び同化中性脂質合成の最終生成物としての複数の中性脂質の２のマーカーの新規な組み合わせ適用に基づいて、腫瘍細胞での（再）分化を誘導する。上記セルベースシステムは、さらに、少なくとも７日間の長期にわたって有効なハイスループットスクリーニングを可能にする新規な液体処理手順と、新規な生存率試験とによって特徴付けられる。
【背景技術】
【０００２】
マイクロタイタープレートへの培地の添加及び除去は、それぞれ、遠心分離、及び新たに開発された複数の容器に基づく新たなシステムを介して実行され得る。細胞生存率は、非侵襲的に、マーカーフリーに、及び費用中立に、物理的に吸収を介する遠心分離後に、生存接着細胞の細胞接着の基準によって、初めて独創的に測定され得る。細胞接着の低下は、プログラムされた細胞死に特異的であるため、細胞生存率を測定するための本発明の方法は、アポトーシス対ネクローシスの検出のために初めて具体的に使用され得る。この方法は、特にハイスループットスクリーニングに適する。脱分化及び未分化細胞は、それぞれ複数の腫瘍疾患の重要な病態生理学的特徴を表す。
【０００３】
悪性腫瘍疾患は、世界中の主要な健康問題を代表し、先進国では心血管疾患に続く主要な健康問題である。「ドイツ癌学会（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｋｒｅｂｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）」の情報によれば、ドイツ国内だけで毎年約５０万人が癌によって病気になっている。ほとんどの癌疾患は年齢が上がると発生するため、人口動態の変化により発生率のさらなる増加が予想される。専門家は、癌の症例が２０５０年まで最大で３０％増加すると見積もっている。集中的な研究努力及び新たな分子生物学的発見にもかかわらず、多くの悪性腫瘍の予後はほとんど改善されていないばかりである。ほとんど治療不可能な腫瘍実体の治療オプションを成功させるための医学的ニーズが高いため、新たな薬剤の必要性は非常に高い。ほとんどの場合、実際のガイドラインでは化学療法による治療が推奨されているが、これは、腫瘍特異的な治療を許容せず、患者に多くの副作用をもたらす。
【０００４】
現代の抗癌剤の開発は、高い特異性と抗腫瘍効果とを伴う低毒性の薬剤を目指す。そのような抗癌剤の１種は、複数の分化誘導剤であり、これは、異なる形態の急性白血病の治療に良く適用される。これらの薬物は、他の複数の効果の中でも、細胞腫瘍防御メカニズムを活性化することができ、アポトーシス又は効率的な抗原提示を介したプログラム細胞死といった高い細胞分化状態とも相関する。これらの薬剤は、現在の抗腫瘍療法を改善する高い可能性を有する。しかし、複数の固形腫瘍では、（再）分化のブロックにつながるメカニズムは、これまでほとんど理解されていないばかりである。新たな分子生物学的研究は、エピジェネティックな発現パターンにより、これらの腫瘍がそれぞれより分化した腫瘍とより分化していない腫瘍とに分けられ得ることを示唆する。これらのうち、より分化した複数の腫瘍は、予後がより良好である。遺伝的変異とは逆に、エピジェネティックな複数の変化は可逆的であるため、特定の複数の分化誘導剤も複数の固形腫瘍の治療を改善する可能性がある。これに関連して、複数の分化誘導剤が、複数の腫瘍幹細胞と呼ばれる高い腫瘍形成性の腫瘍亜集団を、より攻撃性の低いより分化した複数の腫瘍細胞に発達させ得ることは、特に興味深い。
【０００５】
図１は、複数の腫瘍幹細胞の発生及び腫瘍形成性のスキームを示す。高い幹細胞特性を有するこれらの細胞は、おそらく多くの腫瘍の悪性度を規定する。それらの発生（上方の矢印）は、これまで完全には理解されておらず、おそらく非常に異種である。一方、腫瘍発生の文脈において、それらは「起源の細胞」として議論され、それは腫瘍の異質な複数の細胞形態の発達を引き起こす細胞であると予想される。一方、それらは、おそらく化学療法下で特に発生する低い幹細胞性を有する複数の腫瘍細胞から発生し、治療の成功を決定することについても議論されている。複数の分化誘導剤は、腫瘍幹細胞の幹細胞性を低下させ、それを悪性度の低い、より分化した腫瘍細胞に発達させることが知られている（下方の矢印）。腫瘍細胞のより低い幹細胞性は、細胞腫瘍防御メカニズムの増加（上記参照）、治療抵抗性の発生の減少、及び治療後のより低い再発リスクに関連する。
【０００６】
細胞遺伝子の発現パターンを大きく変化させ、異なる細胞分化ブロック（例えば、ヒストン脱アセチル化阻害剤）を標的とする効力を有する公知の複数の薬剤を用いた最初の複数の研究は、エピジェネティックに作用する複数の薬剤の適用が乳癌、膵臓癌、肺癌等の複数の固形腫瘍の治療を改善する効力も有することを示唆する。しかし、これまで、まれにしか理解されていない病態生理による可能性が高い分化を誘発することにより、複数の固形腫瘍の治療のために特別に開発された抗癌剤は、医薬品市場で入手できない。複数の固形腫瘍の分化のブロックにつながる病態生理学的メカニズムに特異的に対処する薬剤が、特に不足している。
【０００７】
白血病又は神経芽細胞腫の複数の（再）分化薬剤の同定のために開発された現在のハイスループットスクリーニングシステムは、複数の分化細胞で高度に発現されると報告されている異なる複数の遺伝子の発現プロファイルを扱っている。しかし、複数の固形腫瘍における遺伝子発現プロファイルの異質性が高いため、この方法は低い特異性と偽陽性結果の高い比率とに関連付けられる。これらの特性を低減するために、これらのシステムには、大量の遺伝子の並行分析が必要とされ、このため、ハイスループットスクリーニングでの効率的かつ広範な適用が断念される。あるいは、ハイコンテントイメージングにより複数の形態変化及び／又は規定された複数のタンパク質マーカーを分析する、利用可能な複数の試験システムがある。しかし、これらのシステムは、複雑でコストがかかり、膨大なデータ量の効率的な分析のために非常に高いロジスティックス作業及び高いコンピュータ出力が必要である。従って、これらのシステムは、効率的で幅広い高スループットアプリケーションに使用することができない。
【０００８】
現在、腫瘍細胞の分化を誘導し、複数の腫瘍特異的分化ブロックを克服する複数の薬剤を同定する方法が必要とされている。この方法は、高い特異性によって特徴付けられるべきである。さらに、偽陰性の結果の量も同様に低いことが好ましいはずである。加えて、そのシステムは、大量の様々な物質が短時間で調査され得ることを意味するハイスループット試験のために可能であるべきである。これに関連して、財務コストも１つの関連する要素を示す。そのシステムは、経済的に価格設定されるべきである。これは、新たな複数の化合物のハイスループットスクリーニングに必須の細胞生存率試験を含み、コスト削減の方法で一次試験に最適に実装される。腫瘍、細胞分化を誘発し、腫瘍特異的分化ブロックを克服する複数の薬剤の同定の場合、アポトーシスにより生存能力が廃止された細胞を定量することは、特に興味深い。アポトーシスを介したプログラム細胞死の能力は、複数の分化細胞の特徴とみなされており、複数の腫瘍細胞におけるエピジェネティックな（再）プログラミングを介して誘導され得る（ＥＬ−Ｍｅｔｗａｌｌｙ，ＴＨ＆Ｐｏｕｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａ  ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ（２００７））。ハイスループットスクリーニングアプリケーションでの複数のアポトーシス細胞の有効な定量化は、並外れて複雑であり、高い経済的コストに結びつく（Ｈｓｕ，ＫＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｏｒ（ＮＩＡＤＳ）ｏｎ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＨＤＡＣＩ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．（２０１８）．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１９０２０４５２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＥＬ−Ｍｅｔｗａｌｌｙ，ＴＨ＆Ｐｏｕｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａ  ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ（２００７））
【非特許文献２】Ｈｓｕ，ＫＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｏｒ（ＮＩＡＤＳ）ｏｎ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＨＤＡＣＩ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．（２０１８）．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１９０２０４５２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、ここでは、腫瘍細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物の有効な同定が乳酸及び中性脂質の新規な組み合わせの定量によって可能とされ得ることが、示され得る。腫瘍形成のモデルに応じて、それは、再分化（クローン進化モデル）又は分化（腫瘍幹細胞モデル）と呼ばれる。本発明のプロセスは、上述の用語から独立して、腫瘍（幹）細胞のより悪性度の低い（より分化した）腫瘍細胞又は細胞への形質転換を誘導することができるような複数の化合物を含む。
【００１１】
さらに、驚くべきことに、上記発明されたプロセスでは、特に高スループット形式で実行される場合、使用されるマイクロプレートの複数のウェル（例えば、最大１５３６のウェル形式）から種々の液体（例えば、細胞懸濁液、培地、バッファ（緩衝液）、試薬等）の追加及び除去が、部分的な複数のデバイス（Ａ）及び（Ｂ）で構成される新たに開発されたデバイスを使用して、（ａ）穏やかな、（ｂ）同時の、（ｃ）均一な、（ｄ）バブルフリー（無気泡）の、（ｅ）完全な、（ｆ）無菌の、（ｇ）効率的な、（ｈ）コストに中立な方式で、単純な遠心分離によって実行され得ることが明らかとなった。このデバイスは、市販の手動ピペットで使用されることができ、必ずしもマルチチャンネルピペット又は複雑なロボットシステムを必要としない。遠心分離を除き、全ての作業は、市販の細胞培養ベンチを使用して、無菌条件下で実行され得る。
【００１２】
最後に、遠心分離後に基準細胞の接着を介してマイクロタイタープレートで接着的に成長する細胞の細胞生存率を、吸光度測定によって物理的かつ無標識で測定する新たな方法を開発することが可能となった。開発された方法は、目的の複数の細胞のアポトーシスの完全な誘導を、コストに中立で迅速かつ有効な方式で測定するために初めて使用されることができ、同時に高スループットシステムに適用され得る。
【００１３】
第１実施形態では、本発明の根底にある目的が、複数の未分化又は脱分化細胞、特に複数の腫瘍細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物を同定する方法によって解決され、この方法は、以下を備える。
ａ）複数の脱分化／又は未分化腫瘍細胞からなる細胞培養サンプルを準備するステップ。
ｂ）目的の上記化合物を上記細胞培養サンプルに接触させるステップ。
ｃ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第１マーカーの乳酸の相対濃度を測定するステップ。
ｄ）次いで、未処理細胞と比較して、第２マーカーの複数の中性脂質の相対濃度を測定するステップ。
ここにおいて、ステップｃ）及びｄ）は、必要に応じて逆の順序で実行され得る。
【００１４】
上記複数の結果の複合分析に続く乳酸及び複数の中性脂質の測定により、上記発明されたプロセスは、新規化合物が細胞内での（再）分化を誘導することができるかどうかの評価を初めて可能とし、従って、複数の腫瘍疾患の治療処置に使用され得る。
【００１５】
本発明について、複数の腫瘍細胞は、複数のいわゆる腫瘍幹細胞を含む。複数の未処理細胞は、目的の上記化合物で処理されていない複数の細胞として定義され、上記化合物と物理的に接触しなかったことを意味する。選択された複数の遺伝子発現プロファイルについて、複数の固形腫瘍の非常に高いエピジェネティックな異質性のため、個々に選択された複数の遺伝子の検査は、目的の上記腫瘍の（再）分化を不十分にしか規定しないことが考慮されるべきである。複数の分化細胞において強化又は減少された方法で発生することが知られている複数の代謝プロセスは、複数の腫瘍細胞で変化された異質性が少なく、腫瘍細胞の（再）分化においてより保存的に分化細胞代謝プロファイルに向かって変化する。従って、検出のためのハイスループットシステムを使用して、腫瘍細胞の代謝を分化細胞の代謝への方向に変更すると、複数の変性腫瘍細胞の（再）分化が、特異的に、少ない偽陽性で示されることが示され得た。
【００１６】
本発明は、マーカーの乳酸及びマーカーの複数の中性脂質を組み合わせた定量が、特に複数の同化及び脂質減少細胞培養条件下で、複数の固形腫瘍中で（再）分化する複数の化合物を特異的に同定するための使用され得ることを、初めて示す。両方のマーカーが互いに独立して細胞分化のための特性として説明された場合でも、組み合わされたアプリケーションのみが、特に複数の腫瘍細胞における（再）分化の有効な測定を可能にする。
【００１７】
最近の複数の調査は、好気的条件下、すなわちワールブルク効果として知られる現象で複数の腫瘍細胞が嫌気性解糖を行う前の仮定と比較して、複数の腫瘍細胞が悪性度を低下させることなく、ベータ酸化及び減少された嫌気性解糖を介して、増加したエネルギー需要を柔軟にカバーし得るということを示唆する（Ｐｏｒｐｏｒａｔｏ，Ｐ．Ｅ．，Ｆｉｌｉｇｅｄｄｕ，Ｎ．，Ｐｅｄｒｏ，ＪＭＢ−Ｓ．，Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．＆Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（２０１７）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１７．１５５）。ベータ酸化を介してカバーするエネルギーの場合、脂肪滴に取り込まれた複数の中性脂質は、腫瘍細胞のエネルギー需要のためのエネルギー源として機能する（Ｃａｂｏｄｅｖｉｌｌａ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ−ｆｕｅｌｅｄ  β−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．ｍ１１３．４６６６５６）。よって、乳酸の単独測定は、複数の腫瘍細胞での（再）分化の測定に適した基準ではないが、複数の未処理細胞に対する細胞内中性脂質濃度の追加的な増加と組み合わされた場合にのみ、（再）分化に外挿するために十分に使用され得る。
【００１８】
さらに、例えば解糖を阻害するのみの複数の化合物は、本発明では除外され得る。
【００１９】
従って、両方のマーカーの新規な組み合わせは、上記記載された試験方法に不可欠である。最も強力な同化ホルモンであるインスリンの添加が、複数の非腫瘍細胞におけるインスリンのために説明されるような同化代謝の方向に、本来的に、複数の（再）分化腫瘍細胞での両方のマーカーの変化を増幅することが初めて示され得た。よって、複数の細胞の培養中及び本発明の工程ｂ）中にインスリンが存在することが、好ましい。
【００２０】
これに関連して、同化ホルモンの同化効果が、記載される上記両方のマーカーによる（再）分化の検出を改善するために、今回、初めて効率的に使用され得る。これは、対応するホルモン受容体が、目的の上記（腫瘍）細胞の（再）分化細胞で発現されるのみである場合に、特に独創的に当てはまる。これは、分化した乳房上皮細胞と比較して、プロラクチン受容体が陰性であるか又は発現が少ないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を伴って、初めて利用されることが公知である（Ｌｏｐｅｚ−Ｏｚｕｎａ，Ｖ．Ｍ．，Ｈａｃｈｉｍ，Ｉ．Ｙ．，Ｈａｃｈｉｍ  Ｍ．Ｙ．，Ｌｅｂｒｕｎ，Ｊ．Ｊ．＆Ａｌｉ，Ｓ．Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｐｒｏ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１６））。それにより、同化作用性プロラクチンの添加は、（再）分化細胞における同化代謝の方向に、言及された複数のマーカーの変化を誘発するのみである。ホルモンを含む／含まない標的化インキュベーションを介した、使用される複数のマーカーの乳酸及び中性脂質の定量の組み合わせにおいて、ホルモン受容体結合の強い生理学的特異性によって、プロラクチン受容体発現の分析のための検出方法を生理的受容体活性化の結果として達成することが、初めて可能である。さらに、受容体結合後の下流シグナル伝達カスケードの分析がカバーされ得る。結果として、生理学的に機能的な受容体の発現に関する結論が引き出され得る。同様に、インスリン受容体Ｂの機能的発現と、サブタイプＡ及びＢ比とのそれぞれは、インスリンを伴う／伴わない標的インキュベーションによって分析されることができ、その理由は、複数の非分化細胞で主に発現されるアイソフォームＡと比較して、主に複数の分化細胞で発現するアイソフォームＢのみの特定の受容体活性化は、複数の（再）分化細胞の同化代謝の方向に、言及した複数のマーカーの変化を誘発するからである。
【００２１】
特に複数の低分化腫瘍細胞として、例えば複数のトリプルネガティブ乳癌細胞は、主に複数の細胞外供給源から複数の中性脂質を受け取る（Ａｎｔａｌｉｓ，ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．エストロゲン受容体陰性基底様乳癌細胞でのＡＣＡＴ１の高発現は、ＬＤＬ誘発性増殖と関連する．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．（２０１０）．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０５４９−００９−０５９４−８）ため、脂質を含まないか、又は脂質細胞の複数の培養条件が低いことが、複数の腫瘍細胞での（再）分化につながる複数の中性脂質の増加に有利であるということが、初めて示され得た。複数の分化細胞は、嫌気性条件下で代謝プロセスを嫌気性解糖に切り替えることができるため、（再）分化の結果としての乳酸産生の増加を測定するために複数の好気性培養条件が適用されることが、確認されなければならない。
【００２２】
両方のマーカーが、例えば代謝物濃度と相関する酵素活性を介して直接又は間接に定量され得る。上記発明された表現型の方法は、これまで未知の複数の標的構造の実装を可能にし、これは、革新的な複数の医薬品の開発にとって重要な技術的利点を表す。
【００２３】
上記発明されたプロセスによれば、乳酸及び複数の中性脂質は、ハイスループット試験システムにおける（再）分化を誘導する複数の化合物を同定するための複数のマーカーとして、初めて使用される。そうすることで、上記試験システムは、複数の腫瘍以外の複数の病気にも拡張されることができ、その病態生理は、細胞の脱分化又は分化の阻害が重要な役割を果たすことを示唆する。これは、いくつか例を挙げると、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）を含む肝炎等の慢性炎症性疾患の場合があり得る。さらなる例は、関節症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又は種々の筋障害のような変性疾患、及び、アミロイドーシス又はリピドーシスのような種々の代謝疾患である。
【００２４】
病態生理学的プロセスの研究に加えて、上記試験システムは、健康な複数の幹細胞の生理学的分化を分析するために使用され得る。この場合、試験システムと健康な複数の幹細胞とを組み合わせることで、健康な組織に生理学的分化を特異的に誘導する複数の化合物が同定され得た。これは、例えばＩＲＤＳ（新生児呼吸窮迫症候群）の治療のための役割を果たし得る。
【００２５】
さらに、健康な複数の幹細胞を使用すると、複数の化合物の疾患特異的効果が示されることができ、これは、病態生理学的分化ブロックの特定のターゲティング及び／又は除去を意味する。このようにして、分化の誘導が期待されない健康な複数の幹細胞に対する化合物の効果を除外することが可能である。
【００２６】
従って、上述の試験方法によって同定される複数の固形腫瘍での（再）分化を誘導する複数の薬物候補が、上述の適用における更なる治療可能性のために調査されることも可能となった。
【００２７】
複数の幹細胞の生理学的分化の間に、エネルギー生成で使用するための嫌気性解糖の減少と酸化的リン酸化の増加とが生じる。このプロセスは、細胞の異化の不可欠な部分を表す。特に好気的条件下では、酸化的リン酸化によるエネルギー生成が、複数の分化細胞において優勢である。対照的に、好気性条件下での嫌気性解糖の増加は、膨大な数の腫瘍細胞内で説明される。
【００２８】
上記発明されたプロセスでは、好気性条件下での嫌気性解糖の減少が、（ハイスループット）スクリーニングシステム内の複数の固形腫瘍細胞での（再）分化を同定するための代謝指標として初めて使用される。嫌気性解糖の定量は、乳酸濃度の測定により可能とされる。乳酸の生成は、インジケータを介した間接的な濃度測定を可能にするｐＨ値の変化によって測定され得る。ｐＨの変化は、重炭酸塩緩衝細胞培養培地を使用した嫌気性乳酸生産に、優先的かつ革新的に言及し得る。液体中の溶存ＣＯ２濃度を測定する、インキュベータによって提供されるＣＯ２雰囲気の一定の高いＣＯ２分圧によって、エネルギー貯蔵の好気的分解によって生成された比較的低いＣＯ２の量は、平衡（ＣＯ２（液体）とＣＯ２（気体）との間の）に進み、培地のｐＨ変化をもたらさない。よって、ｐＨ変化は、細胞内のＣＯ２産生による影響をほとんど受けず、非重炭酸塩緩衝培地と比較して、重炭酸塩緩衝培地で培養される嫌気性乳酸産生とより適切に相関する（適切なＣＯ２雰囲気、例えば１、５〜２、２％重炭酸塩で５〜１０％ＣＯ２でインキュベートされる）。
【００２９】
あるいは、好ましくは、上記複数の細胞によって産生される乳酸の量は、市販の複数の試験システムによって酵素的に測定されることもできる。あるいは、好ましくは、細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性が、マーカーの乳酸を定量するために分析され得る。細胞内ＬＤＨの活性は、嫌気性解糖及び乳酸の形成とも相関する。
【００３０】
さらに、そして驚くべきことに、特に複数の同化細胞培養条件下（例えば、インスリンの存在下）で、乳酸に加えて複数の中性脂質の貯蔵が、複数の固形腫瘍の（再）分化の検証のための適切な第２マーカーを表すことが明らかとなった。この検証は、適切な複数の蛍光リガンドを使用してなされ得る。例えば、非極性構造が複数の中性脂質に特異的に結合する市販のリガンドＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３を用いてなされる。特に、上記発明されたプロセスが好ましくは脂質が枯渇した、又は脂質が減少した培地で行われるように、無脂質又は低脂質培地では、上記重要性が特に顕著である。脂質枯渇培地と脂質減少培地の両方は、製造者によって提供されるタンパク質、成長因子、及び脂質を含まない、市販の化学的に規定された基礎培地に基づく。それぞれの細胞株に応じて、脂質源が追加されないか（脂質枯渇培地）、又は基礎培地に規定濃度の脂質源が補充される（脂質減少培地）。
【００３１】
上記発明されたプロセスは、わずかなサンプルで実行され得る。しかし、このプロセスは、種々のマイクロタイタープレートを同時に処理するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）システムとしても実行され得る。ハイスループットスクリーニングは、シマンスキらによって既に詳述されるように規定される（Ａｄａｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔ；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ２０１２，１３，４２７−４５２．）。上記発明されたプロセスは、低スループットスクリーニングから超ハイスループットスクリーニングまで、表２に記載される全てのスクリーニングモードに適する。しかし、上記発明されたプロセスは、ハイスループットスクリーニング又は超ハイスループットスクリーニングさえ、初めて提供する。
【００３２】
上記発明されたプロセスの実行は、特に好ましくは、マイクロタイタープレートで行われる。適切なマイクロタイタープレートの使用は、ＨＴＳシステムとして導入されるプロセスの実装を可能とする。よって、例えば、３８４のウェルマイクロタイタープレートを使用して、短時間で３８４のサンプルが一度に分析され得る。
【００３３】
状況に応じて、他の複数の形式のマイクロタイタープレートが当然に使用され得る。上記複数のマイクロタイタープレートのサイズは、両方のマーカーの濃度を分析する可能性によって制限される。分析が短時間で実行される光学分光法で行われる限り、化合物のより迅速な同定を可能にするハイスループットスクリーニングが実行され得る。同様に、異なる複数の細胞培養サンプルが、化合物の同定に関して調査されることができ、それにより、例えば、複数の細胞培養サンプルは、異なる複数の腫瘍細胞からなる。従って、上記発明されたプロセスは、複数の化合物の同定だけでなく、他の複数の腫瘍実体における効果について公知の腫瘍において公知の効果を有する複数の化合物の検証も可能にする。
【００３４】
好ましくは、マイクロタイタープレートは、上記発明されたプロセスの間、気体透過性のシーリング箔でシールされる。これにより、液体、固体、又は気体の複数の不純物が個々のサンプルに浸透することを防ぎ、拡散による均一なガス交換を可能にする。
【００３５】
上記発明されたプロセスのために、細胞培養プローブが提供されなければならない。このプローブは、追加された化合物に反応すべき複数の腫瘍細胞で構成される。続いて、細胞培養が続く間に上記化合物が添加される。この目的のために、一般的に使用される培地、又は複数のバッファコンポーネント（緩衝液成分）の追加が必要とされる。特に好ましい実施形態では、培地又はバッファコンポーネントの追加及び除去は、本発明の部分デバイス（Ａ）及び／又は（Ｂ）によってなされる。
【００３６】
上記発明されたプロセスの好ましい実施形態は、以下のステップを含む。
【００３７】
ａ）複数の脱分化又は未分化腫瘍細胞からなる細胞培養サンプルを準備するステップ。
ｂ）目的の上記化合物を細胞培養サンプルと接触させるステップ。
ｃ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第１マーカーの乳酸の相対濃度を測定するステップ。
ｄ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第２マーカーの複数の中性脂質の相対濃度を測定するステップ。
【００３８】
ここにおいて、ステップｃ）及びｄ）は、必要に応じて逆の順序で実行されてもよく、ここにおいて、培地及び／若しくは複数のバッファコンポーネントの追加は部分デバイス（Ｂ）によってなされ、並びに／又は、培地及び／若しくは複数のバッファコンポーネントの削除は部分デバイス（Ａ）によってなされる。
【００３９】
部分デバイス（Ａ）及び部分デバイス（Ｂ）が図に示される。図２〜７は、部分デバイス（Ａ）を示し、図８〜１１は、部分デバイス（Ｂ）を示す。これら図は、様々な図を示す、すなわち、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、腫瘍幹細胞の発生及び腫瘍形成性のスキームを示す。
【図２】図２は、部分デバイス（Ａ）の上面図である。
【図３】図３は、部分デバイス（Ａ）の側面図である（長辺側）。
【図４】図４は、部分デバイス（Ａ）の側面図である（横側）。
【図５】図５は、部分デバイス（Ａ）の底面図である。
【図６】図６は、マイクロタイタープレートのための接触面、及びマイクロタイタープレートの簡単な取り外しのための凹みを示す部分デバイス（Ａ）の斜視図である。
【図７】図７は、角から視た部分デバイス（Ａ）の斜視図である。
【図８】図８は、部分デバイス（Ｂ）の上面図である。
【図９】図９は、部分デバイス（Ｂ）の側面図である（長辺側）。
【図１０】図１０は、部分デバイス（Ｂ）の側面図である（横側）。
【図１１】図１１は、角から視た部分デバイス（Ｂ）の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
よって、本発明は、更なる実施形態において、遠心分離を介して細胞から複数の液体を除去するための容器（部分デバイス（Ａ））を指し、以下を含むことを特徴とする。
４の側壁（ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２）であって、ここにおいて、長方形が得られるように２の対向する側壁が同じ長さ（ｌａ、ｌｂ）を有する４の側壁。
平らな底部（ｃ）であって、接続領域の全てにわたって上記複数の側壁のそれぞれと防液方式で接続される底部（ｃ）。
上記容器の内側に向けられた突出部（ｄａ、ｄｂ）を有する上記複数の側壁のそれぞれ。
互いに対向する上記４の側壁のうちの２であって、上記それぞれの側壁の上面に上記側壁の長さｌａの中間に位置される凹部（ｅ１、ｅ２）を有する４の側壁のうちの２。
【００４２】
更なる実施形態において、本発明は、細胞を培養するために遠心分離による液体の添加を可能にするマイクロタイタープレート（部分装置（Ｂ））を開示し、上記プレートが、表面（１）及び複数のウェル（２）を備え、上記複数のウェルが、開口部、特に円形の開口部が存在する上記底部（３）に向かって先細りにされる。上記マイクロタイタープレートの上記底部（３）の開口部が、上記開口部の直径が上記複数のウェルのそれぞれの内部の液体の表面張力に比例し、かつ、液体が重力よりも強い力の影響下でのみ逃れるように調整される。
【００４３】
上記部分デバイス（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法と共に以下に説明される。
【００４４】
本発明では、ステップｃ）及びｄ）で言及される複数のマーカーを決定するために、上記複数の細胞培養サンプルが洗浄されることができ、及び／又は１又は複数の培地交換が行われ得る。例えば、このステップは、公知の複数のピペッティング方法を使用して行われ得る。発明的に好ましくは、このステップが遠心分離によって行われることである。
【００４５】
液体を吸引する一般的な複数の（マルチ）ピペッティングシステムと比較して、上記発明されたプロセスは、費用対効果の高い短時間の遠心分離によって、複数の化合物又は複数の蛍光リガンドを添加する前に、マイクロタイタープレートの単一の複数のウェルから血清含有培地又は低血清培地若しくは無血清培地を除去することが好ましい。
【００４６】
従って、一般的に入手可能な複数の遠心分離器の複数のハンガーで使用するための容器（部分装置（Ａ））が開発された。複数のマイクロタイタープレートが、上記容器に、上記複数のウェルの開口部を下向きにして上記容器の内腔に向くよう組み込まれ、これにより、上記複数のマイクロタイタープレートが上記容器の複数の容器壁に固定される。その結果、単一の複数のウェルからの複数の液体が、同時に上記容器によって提供される空洞に除去され得る（図２〜７、部分装置（Ａ））。これが、単一の複数のウェルからの上記複数の液体の効率的な、穏やかな、無菌かつ完全な除去を可能とし、これと比較して、複数の液体を除去するために吸引を使用する公知のピペッティング方法では、多くの場合、接着して成長している複数の細胞が消失する結果となる、及び／又は、上記ウェル内に持続的に液体が残留することにつながる。必要に応じて、部分デバイス（Ａ）が、種々の複数のピペッティングロボットと一緒に設置され得る。
【００４７】
複数の接着成長細胞に基づく複数の細胞培養技術を使用した複数のアッセイでは、数秒間の遠心分離（例えば１００〜３００×ｇ）後に上記培地が完全に除去され、回収されることができ、これにより、複数のマイクロプレートウェルに液体残留物（残留量）が残らない。よって、洗浄ステップの効率的な削減及び／又は防止がさらに可能とされ、複数の試験期間がより短くなり、複数の洗浄溶液の量がより少なくなる。続く複数の細胞培養試験での細胞／細胞株の生存率の低下は、観察され得なかった。
【００４８】
培地の効率的な除去及び洗浄ステップの防止が、複数のセルベースアッセイの堅牢性を大幅に増加させる。さらに、種々の吸引アタッチメントを使用することと比較して、部分デバイス（Ａ）及び遠心分離による上清の効率的な除去は、洗浄ステップの削減／防止にもつながり、残留物のない効率的な液体除去を可能にし、複数の非セルベースアッセイシステム（例えば、ＥＬＩＳＡベースアッセイ）における複数の人工産物の発生を防ぐ。
【００４９】
従来、マイクロタイタープレートの全てのウェルへの培地又は液体の同時添加は、複数のマルチチャネルロボットヘッド（例えば、９６〜１５３６チャンネル）を介して実現され得る。代替的に、これが、特別に設計されたマイクロタイタープレートと組み合わされて、一般に入手可能な複数のマルチ／シングルチャンネルピペット又は複数のシングル／マルチチャンネルロボットヘッド（例えば、１〜１６チャンネル）を使用して行われ得ることが、初めて示され得た（図８〜１１、部分デバイス（Ｂ））。
【００５０】
最初のステップでは、（例えば、円形の）開口部が組み込まれた底部に向かってわずかに先細りの複数のウェルで構成される上記特別に設計されたマイクロタイタープレートが、添加される上記複数の液体を添加するために使用される。単一の各ウェルに個別に液体が充填され得る。表面張力により、上記複数の液体は、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りである上記単一の複数のウェルの底部の例えば円形の上記開口部を通って流れないであろう。ここで、上記キリ穴の直径は、上記液体の表面張力に調整されなければならない。例えば洗剤の存在による低い表面張力は、より小さな直径を必要とする。より高い表面張力を有する複数の液体は、より大きな直径を可能にする。あるいは、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りにされる複数のウェルから構成さされるマイクロタイタープレートの充填は、マイクロタイタープレートを上記液体に完全に浸すことにより、一段階で行われる。
【００５１】
第２ステップでは、上記底部の（例えば円形の）開口部に向かってわずかに先細りの複数のウェルから構成され、市販のマイクロタイタープレートに移すべき液体で満たされたマイクロタイタープレートが、マイクロタイタープレート上に適切にセットされ、これにより、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りの複数のウェルは、市販のマイクロタイタープレートの複数のウェルの上記複数の壁又は上記複数のウェル内の複数の液体と接触しない。無菌状態で液体を移動させるために、フィッティングカバーの蓋（ぴったり覆う蓋）が部分デバイス（ｂ）に追加される。これで、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りの複数のウェルから構成されるマイクロタイタープレートから市販のマイクロタイターへの遠心分離プレートを介した複数の液体の移動が、行なわれ得る。そうすることで、複数の液体は、自動的に、加えられる回転速度とは無関係に、可能な限り低い圧力で、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りであるマイクロタイタープレートの複数のウェルから、市販のマイクロタイタープレートの複数のウェルに押し出される。このプロセスが遠心分離器の加えられる回転速度から独立している理由は、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りの複数のウェル内に上記液体を保持する表面張力よりも半径方向の力が強くなる瞬間に、上記液体が上記市販のマイクロタイタープレートの複数のウェルに移動されるからである。回転速度の更なる増加は、上記底部の開口部に向かってわずかに先細りであるマイクロタイタープレートの複数のウェルから、接着によって残った複数の液体残留物の全ての移動につながる。これにより、穴あきマイクロタイタープレートが、間に必要とされる洗浄ステップを必要とすることなく、更なる適用に使用され得る。
【００５２】
要するに、市販の細胞培養遠心分離器を用い、加えられる回転速度をゼロから最大３００×ｇまで増加して部分デバイス（Ｂ）を使用することによって、単一の複数の液体が、マイクロタイタープレートの単一の複数のウェル内に、標的化され、穏やかに、同時に、均一に、完全に、及びコスト効率の高い方法で移動され得る。
【００５３】
さらに、遠心分離、及び上述の部分デバイス（Ａ）を使用して、接着成長する複数の細胞のための新たなコスト効率の高い生存率試験が、複数のマイクロタイタープレートを使用する細胞培養の分野に統合され得ることが示された。
【００５４】
上記発明されたプロセスの好ましい実施形態は、下記ステップをさらに含む。
【００５５】
ｅ）遠心分離後の吸光度の定量により、複数の接着成長細胞の細胞生存率を測定するステップ。
ｆ）バックグラウンドレベルへの完全なシグナル減少の間での、上記複数の細胞におけるアポトーシスの完全な誘導を測定するステップ。
【００５６】
要するに、本発明のプロセスの好ましい実施形態は、以下のステップを含む。
【００５７】
ａ）複数の脱分化又は未分化腫瘍細胞からなる細胞培養サンプルを準備するステップ。
ｂ）目的の上記化合物を上記細胞培養サンプルと接触させるステップ。
ｃ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第１マーカーの乳酸の相対濃度を測定するステップ。
ｄ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第２マーカーの複数の中性脂質の相対濃度を測定するステップ。
【００５８】
ここにおいて、ステップｃ）及びｄ）は、必要に応じて逆の順序で実行されてもよい。
【００５９】
ｅ）遠心分離後の吸光度の定量により、複数の接着成長細胞の細胞生存率を測定するステップ。
ｆ）バックグラウンドレベルへの完全なシグナル減少の間での、上記複数の細胞におけるアポトーシスの完全な誘導を測定するステップ。
【００６０】
特に好ましいプロセスは、下記ステップを含む。
【００６１】
ａ）複数の脱分化又は未分化腫瘍細胞からなる細胞培養サンプルを準備するステップ。
ｂ）目的の上記化合物を上記細胞培養サンプルと接触させるステップ。
ｃ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第１マーカーの乳酸の相対濃度を測定するステップ。
ｄ）次いで、複数の未処理細胞と比較して、第２マーカーの複数の中性脂質の相対濃度を測定するステップ。
【００６２】
ここにおいて、ステップｃ）及びｄ）は、必要に応じて逆の順序で実行されてもよい。
【００６３】
ｅ）遠心分離後の吸光度の定量により、複数の接着成長細胞の細胞生存率を測定するステップ。
ｆ）バックグラウンドレベルへの完全なシグナル減少の間での、上記複数の細胞におけるアポトーシスの完全な誘導を測定するステップ。
【００６４】
ここにおいて、培地及び／若しくは複数のバッファコンポーネントの追加が、部分デバイス（Ｂ）を介して行われ、並びに／又は、培地及び／若しくは複数のバッファコンポーネントの削除が、部分デバイス（Ａ）を介して行われる。
【００６５】
驚くべきことに、遠心分離、及び上述の部分デバイス（Ａ）を使用して、複数の接着成長細胞の新たなコスト効率の高い生存率試験が、マイクロタイタープレートを使用する細胞培養の分野に統合され得ることが明らかになった。
【００６６】
これにより、複数の接着成長細胞の細胞生存率は、市販の複数のマイクロタイタープレート（例えば、プラスチック表面に変化のないポリスチレンのウェル底部）での吸光度の非侵襲的物理的測定によって測定される生存率基準細胞接着によって測定され得る。
これが、複数の生存細胞の量に対するマイクロタイタープレートごとの明確な測定値の有効な、迅速な、非侵襲的な、及びラベルフリーの正規化を可能にする。
【００６７】
複数の生体細胞のラベルフリーな定量は、細胞の複数のヌクレオチド及び／又は複数の芳香族アミノ酸の特性によって、２６０ｎｍから２８０ｎｍの吸収最大で光を生理学的に吸収するために実行され得る（吸収最大ＤＮＡ／ＲＮＡ：２６０ｎｍ、吸収最大タンパク質：２８０ｎｍ）。複数のタンパク質の測定の場合、これは、初めて可能とされる可能性があり、その理由は、部分的デバイス（Ａ）を介した遠心分離による培地の完全な除去により、複数のタンパク質又は複数の緩衝液成分といった複数の培地成分からマイクロタイタープレートの複数のウェルがフリーになり、さもなければ、測定に影響を及ぼし得るからである。光吸収の代替として、光拡散又は細胞自己蛍光が定量され得る。さらに、測定前に上記複数の細胞と相互作用するか、又は上記複数の細胞に取り込まれる発蛍光団又は発色団を使用する方法が使用されることができ、この場合、残存する複数の生存細胞の量が、バックグラウンド信号に関して定量され得る。代わりに、残存している複数の生存細胞の数は、（高含有量）顕微鏡検査によって測定され得る。この方法は、エンドポイント測定として実行されることができ、又は、設定された培地の変更、及び培地の添加前／除去後の測定によって、規定された速度論で実行され得る。接触阻害によって細胞成長が低下される密度よりも大幅に低い密度で複数の細胞が播種される場合、増殖の測定のための複数の速度論的試験も実行され得る。
【００６８】
この非侵襲的でラベルフリーな方法では、細胞の溶解は行われないため、複数の生存細胞は、更なる研究に直接利用され得る。上記記載された本方法は、複数の毒性試験、及び複数の免疫毒性アッセイのために使用され得る。後者の場合、複数の非接着免疫細胞は、遠心分離によって除去され、従って、吸光度測定を妨害しない。
【００６９】
複数の壊死細胞と比較して、細胞接着の喪失は、複数のアポトーシス細胞に特徴的である結果、複数のプラスチック表面への接着の減少をもたらすため（Ｋｗｏｎ，Ｈ．−Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｊ．−Ｈ．，Ｓｈｉｎ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｊ．−Ｈ．＆Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｎａｎｏ−ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１５６２３）、遠心分離後のバックグラウンドレベルへの光吸収の減少に相関する方法が、目的の上記化合物で予め処理された複数の細胞でのアポトーシスの完全な誘導を伴って開発された。それにより、非／低接着性の複数の細胞は、遠心分離によって生成される半径方向の力を介して除去され、その結果、検査されるべき上記複数のマイクロプレートウェルの光学吸収がより低下する。本来的に接着性の複数の細胞の完全な剥離は、アポトーシスによって誘発された細胞接着の終了後の複数の細胞の不可逆的な剥離によって測定される任意の時点での全ての細胞において、アポトーシスの誘発と相関する。同じことが、複数のアポトーシス小胞、すなわち細胞剥離後に生じるアポトーシスにおける後期の段階にも適用される。本方法は、特に高スループットのアプリケーションにおいて、複雑な速度論のため、変量を測定することが困難であるアポトーシスを測定するための、新たな、非常に効率的な、非侵襲的な、ラベルフリーな、有効な、及び一般的なアポトーシスマーカーの独立した方法を提供する。
【００７０】
遠心分離後のバックグラウンドレベルでの複数の吸光度の測定は、測定の時点とは独立して、アポトーシスの絶対誘導が、それぞれのマイクロプレートウェル（複数の場合もあり）内の目的の複数の細胞で生じたことを示す。複数の細胞がアポトーシスを起こす能力は、（再）分化の特有の特徴を表すため（ＥＬ−Ｍｅｔｗａｌｌｙ，ＴＨ＆Ｐｏｕｒ，ＰＭ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａ  ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ（２００７））、特に速度論及び／又は複数の段階希釈を伴ったアポトーシスの定量は、例えば複数の分化誘導物質を同定するために、上述の乳酸及び／又は複数の中性脂質という複数のマーカーと非常に良く組み合わされ得る。よって、効果的で時間的に同等の代謝モニタリングが複数の試験に統合され得る。
【００７１】
ステップｅ）と比較して、本方法は、エンドポイント測定として実行されることができ、又は、設定された培地の複数の変更、及び培地の添加前／除去後の複数の測定によって規定される速度論で実行され得る。細胞増殖による複数の影響を減少するためには、細胞密度、及び複数の細胞培養技術が全ての細胞株に対して個別に選択されなければならない（アプリケーション例を参照）。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の根底にある課題が、腫瘍細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物を同定するための複数のマーカーの乳酸及び複数の中性脂質の利用によって解決される。上記複数のマーカーの検出に関しては、上記発明されたプロセスを参照する。
【００７３】
従って、本発明の方法は、好ましい実施形態において、複数の未分化又は脱分化細胞、特に複数の腫瘍細胞での（再）分化を誘導する複数の化合物の同定のための複数のマーカーの乳酸及び中性脂質の組み合わされた使用によって特徴付けられる。特に好ましくは、光学フェノールレッド吸収のｐＨ依存性の変化の測定による、及び適切な中性脂質染色（蛍光）色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３）を使用した複数の中性脂質の定量による乳酸濃度の定量化（適切な一定のＣＯ２雰囲気でインキュベートされた重炭酸塩緩衝細胞培養培地）によって特徴付けられる。
【００７４】
以下の応用例は、本発明の基礎をなす複数の作業を非限定的な方法でさらに説明する。
【実施例】
【００７５】
例
均質で融合性の細胞層を準備するために、複数の細胞（細胞株：Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＡＮＣ−１）が３８４のウェルマイクロタイタープレートに規定の密度で播種され、２４時間培養された。上記複数の細胞の密度は、成長停止によって細胞増殖を減少させる方法で選択される。次のステップでは、上記培地が遠心分離によって交換され、目的の上記化合物が添加される。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の場合、酪酸ナトリウムが添加され、Ａ５４９細胞の場合、酪酸ナトリウム及びデキサメタゾン（ＤＭ）が添加された。酪酸ナトリウムの分化誘導効果（Ａ５４９の場合のＤＭを含む）は公知である。
【００７６】
一部の複数の細胞株は、細胞株に依存する時間として２４時間の最初のインキュベーション後に、無血清培地に変更する必要があり得る。その後にのみ、目的の上記化合物の追加が行われる。上記化合物のインキュベーション時間は、選択される腫瘍モデルに依存し、個別に調整されなければならない。必要に応じて、例えば２４時間から１６８時間までのインキュベーション時間で、目的の上記化合物を任意に繰り返し添加することにより、１／複数の培地交換が、それぞれの細胞株に応じて行われる。
【００７７】
目的の上記化合物のインキュベーション時間が終了すると（細胞株に応じて約４８時間から１６８時間まで）、上清中の乳酸濃度が測定される。従って、上記サンプルのｐＨ値の変化は、フェノールレッドを指標として使用して測定され、乳酸濃度と関連付けられる。この目的のために、マイクロタイタープレートが、融合性の細胞層を通して分析される。
【００７８】
続いて、培地を完全に除去するために、遠心分離による培地交換が行われた。残存する培地は、次の第２マーカーの複数の中性脂質の測定に悪影響を与える可能性がある。
【００７９】
培地を完全に交換した後、蛍光リガンドＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３が添加され、遠心分離による色素含有培地の除去の後、１時間インキュベートされた。複数の中性脂質の濃度は、蛍光測定によって測定された。
【００８０】
（再）分化を誘導する複数の物質は、第１マーカーの乳酸の減少、及び第２マーカーの複数の中性脂質の増加につながった。両方のマーカーを肯定的な方法で分析するために、第１マーカーは、数学的に複数の正の値に変換される。このことは、第１マーカーの複数の高い値が第１マーカーの高い減少を意味する。複数の未処理細胞の平均値と比較して、種々の化合物が、（再）分化誘導能力に関して検査、分析、評価され得る。
【００８１】
両方のマーカーの測定に直接続いて、接着細胞の細胞生存率が、マイクロプレートリーダーでの吸光度測定によって測定される。それによって、上記測定の実行は、以前に行われた測定から独立しており、以前に添加された複数の蛍光リガンドによってさらに影響を受けることがない。
【図１】
2020525036.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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