(57)【要約】  本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する免疫グロブリンに、およびより特には、ポリペプチドであって、１つ以上のかかる免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなる前記ポリペプチドに、関する。本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）などのかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含む構築物、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよび構築物を調製する方法に；かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現するかまたは発現可能な宿主細胞に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に；特に、本明細書に記載の予防および／または治療目的などの予防および／または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に、関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
2020525410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
ＡＤＡＭＴＳが、ＡＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ１９、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９およびＡＤＡＭＴＳ１５およびＡＤＡＭＴＳ２０からなる群から選択され、最も好ましくはＡＤＡＭＴＳ５である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤが、ＡＤＡＭＴＳ４、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４に結合しない、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤが３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４；および
配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２；および
配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０；および
配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項５】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤが、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで
（ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群から選択され：
（ａ）配列番号２２；および
（ｂ）配列番号２２と１、２、３、４、５または６個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義され：
−位置２において、ＳはＲに変更されており；および／または
−位置３において、ＡはＴに変更されており；および／または
−位置４において、ＶはＦに変更されており；および／または
−位置６において、ＶはＳに変更されており；および／または
−位置７において、ＮはＹに変更されており；および／または
−位置１０において、ＡはＧに変更されており；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３６であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号５４である、
前記ポリペプチド。
【請求項６】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤが、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号３３であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群から選択され：
（ｃ）配列番号５０；および
（ｄ）配列番号５０と１、２、または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義され：
−位置８において、ＭはＩに変更されており；および／または
−位置９において、ＰはＴに変更されており；および／または
−位置１０において、ＹはＦに変更されており；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択され：
（ｅ）配列番号６８；および
（ｆ）配列番号６８と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義される：
−位置５において、ＦはＬに変更されており；および／または
−位置１１において、ＤはＥに変更されている；
前記ポリペプチド。
【請求項７】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤが、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２８であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群から選択され：
（ｃ）配列番号４４；および
（ｄ）配列番号４４と１、２、または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義され：
−位置３において、ＳはＴに変更されており；および／または
−位置４において、ＲはＷに変更されており；および／または
−位置８において、ＴはＩに変更されており；および／または
−位置９において、ＴはＬに変更されており；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群から選択され：
（ｅ）配列番号６２；および
（ｆ）配列番号６２と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、ここでアミノ酸差異は、以下のように定義される：
−位置１において、ＧはＳに変更されており；および／または
−位置１４において、ＤはＥに変更されている；
前記ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、
−ＣＤＲ１は、配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４からなる群から選択され；
−ＣＤＲ２は、配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２からなる群から選択され；および
−ＣＤＲ３は、配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０からなる群から選択される；
前記ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、ＩＳＶＤが、以下からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせを含む：
ＣＤＲ１は配列番号２１であり、ＣＤＲ２は配列番号３７であり、ＣＤＲ３は配列番号５５である；
ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５３であり、ＣＤＲ３は配列番号１１８である；
ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５３であり、ＣＤＲ３は配列番号７１である；
ＣＤＲ１は配列番号２０であり、ＣＤＲ２は配列番号３６であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
ＣＤＲ１は配列番号２２であり、ＣＤＲ２は配列番号３６であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号４０であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号５０であり、ＣＤＲ３は配列番号６８である；
ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号５１であり、ＣＤＲ３は配列番号６９である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４４であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４５であり、ＣＤＲ３は配列番号６３である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号６１である；
ＣＤＲ１は配列番号２４であり、ＣＤＲ２は配列番号３９であり、ＣＤＲ３は配列番号５７である；
ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３８であり、ＣＤＲ３は配列番号５６である；
ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号５９である；
ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１９であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
ＣＤＲ１は配列番号２９であり、ＣＤＲ２は配列番号４６であり、ＣＤＲ３は配列番号６４である；
ＣＤＲ１は配列番号３０であり、ＣＤＲ２は配列番号４７であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である；
ＣＤＲ１は配列番号３１であり、ＣＤＲ２は配列番号４８であり、ＣＤＲ３は配列番号６６である；
ＣＤＲ１は配列番号３２であり、ＣＤＲ２は配列番号４９であり、ＣＤＲ３は配列番号６７である；および
ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号５２であり、ＣＤＲ３は配列番号７０である；
前記ポリペプチド。
【請求項１０】
ＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなるか、または本質的にこれらからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが、配列番号１２９または１３０であるか、または配列番号１２９もしくは１３０と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＤＲ１が配列番号２１であり、ＣＤＲ２が配列番号３７であり、ＣＤＲ３が配列番号５５である、請求項４、８および９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＩＳＶＤが、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、８、１１７、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが、例えばKinExAまたは代替的にGyrolabによって決定される場合、ＫＤが１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍで、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが、例えばヒトFRETアッセイまたはヒトAlphaLISAによって決定される場合、ＩＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を阻害する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが、ＩＣ５０が最大１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍ、５Ｅ−０９Ｍ、または４Ｅ−９Ｍ、３Ｅ−９Ｍ、２Ｅ−９Ｍ、例えば１Ｅ−９Ｍなどで、ＡＤＡＭＴＳ５の（酵素）活性を阻害する、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが、例えば結合ＥＬＩＳＡにより決定される場合、ＥＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５を調節する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートが１Ｅ−０４ｓ−１未満でＡＤＡＭＴＳ５に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ＡＤＡＭＴＳ５が、ヒトＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１４９）、ウシＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５０）、ラットＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５１）、モルモットＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５２）、マウスＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５３）またはカニクイザルＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５４）、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ５、最も好ましくは配列番号１４９である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドが、ＡＤＡＭＴＳ５の活性、例えばプロテアーゼ活性、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンの切断などに、好ましくはアグリカンの切断に、拮抗し；好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカナーゼ活性に拮抗する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカンへの結合を、例えば、FRET、AlphaLISAまたはＥＬＩＳＡによって決定される場合に、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、ブロックする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが、ＡＤＡＭＴＳ５のプロテアーゼ活性を阻害する、例えば、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなど基質の、好ましくはアグリカンの、タンパク質分解を阻害する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、ここで少なくとも１つのＩＳＶＤが、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、好ましくは配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
少なくとも２つのＩＳＶＤが、ＡＤＡＭＴＳに、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
それぞれ個別にＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含む、ポリペプチドであって、ここで
ａ）少なくとも「第１」ＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ５の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造に特異的に結合し；およびここで、
ｂ）少なくとも「第２」ＩＳＶＤは、第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造とはそれぞれ異なる、ＡＤＡＭＴＳ５の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に特異的に結合する；
前記ポリペプチド。
【請求項２６】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する「第１」ＩＳＶＤが、配列番号２、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、８、１１７、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する「第２」ＩＳＶＤが、配列番号１１８または１９である、請求項２５または２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ポリペプチドが、配列番号１２６（クローン１２９ ２Ｆ３−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）および配列番号１２８（クローン１３１ ９Ｄ３−０９３−Ａｌｂ）からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号１２６、１２７、１２８、１３０または１３１に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ＣＤＲ１が配列番号１４６であり、ＣＤＲ２が配列番号１４７であり、およびＣＤＲ３が配列番号１４８である、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、ＡＬＢ８（配列番号１３１）、ＡＬＢ２３（配列番号１３２）、ＡＬＢ１２９（配列番号１３３）、ＡＬＢ１３２（配列番号１３４）、ＡＬＢ１１（配列番号１３５）、ＡＬＢ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ（配列番号１３６）、ＡＬＢ８２（配列番号１３７）、ＡＬＢ８２−Ａ（配列番号１３８）、ＡＬＢ８２−ＡＡ（配列番号１３９）、ＡＬＢ８２−ＡＡＡ（配列番号１４０）、ＡＬＢ８２−Ｇ（配列番号１４１）、ＡＬＢ８２−ＧＧ（配列番号１４２）、ＡＬＢ８２−ＧＧＧ（配列番号１４３）、ＡＬＢ９２（配列番号１４４）、およびＡＬＢ２２３（配列番号１４５）からなる群から選択される、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリペプチドであって、以下：
配列番号１２９（クローン５７７ ２Ｆ３ＳＯ−Ａｌｂ）、
配列番号１３０（クローン５７９ ２Ｆ３ＳＯ−０９３−Ａｌｂ）、
配列番号１２０（クローン４ ２Ａ１２−Ａｌｂ）、
配列番号１２１（クローン５ ２Ｄ７−Ａｌｂ）、
配列番号１２２（クローン６ ２Ｆ３−Ａｌｂ）
配列番号１２３（クローン６９ ０４９−Ａｌｂ）、
配列番号１２４（クローン７０ ９Ｄ３−Ａｌｂ）、
配列番号１２５（クローン７１ ３Ｂ２−Ａｌｂ）、
配列番号１２６（クローン１２９ ２Ｆ３−０９３−Ａｌｂ）、
配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）、および
配列番号１２８（クローン１３１ ９Ｄ３−０９３−Ａｌｂ）
からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項３３】
アグリカンに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤであって、好ましくは配列番号１５６（ナノボディ00745 PEA114F08）および配列番号１５７（ナノボディ00747 PEA604F02）からなる群から選択される前記ＩＳＶＤを、さらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤが、同一でも異なっていてもよい、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤが、配列番号１５６および１５７からなる群から独立して選択される、請求項３４または３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、ヒトアグリカン［配列番号１５５］に特異的に結合する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカンに特異的に結合する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ポリペプチドが、少なくとも７日、例えば１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月間も、滑液（ＳＦ）において３７℃で安定性を有する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
少なくとも２つのＩＳＶＤが、互いに直接連結されているか、またはリンカーを介して連結されている、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
リンカーが、配列番号１５８〜１７４からなる群から選択され、好ましくは配列番号１６９である、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
Ｃ末端伸長をさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
Ｃ末端伸長がＣ末端伸長（Ｘ）ｎであり、式中ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；および各Ｘは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選択される、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
ポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１１６、１１７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９または１３０のいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
例えばＡＤＡＭＴＳ５活性が関与するところの、個体の疾患または障害を処置および／または予防する方法であって、方法が、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを、前記疾患または障害の症状を処置または予防するのに有効な量で前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
疾患または障害が、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
医薬として使用するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
ＡＤＡＭＴＳ５関連疾患、例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーの症状の、処置または予防に使用するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表される少なくとも１つのポリペプチドの、ＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックするか、および／または、少なくとも、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによって、ＡＤＡＭＴＳ５への結合が交差ブロックされている、前記ポリペプチド。
【請求項５１】
ポリペプチドであって、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによるＡＤＡＭＴＳ５への結合を、交差ブロックするか、および／または、少なくとも、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによって、ＡＤＡＭＴＳ５への結合が交差ブロックされており、ここで前記ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ここでＡＤＡＭＴＳ５への結合が、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節する、前記ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する免疫グロブリンに、より特に、１つ以上のかかる免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなるポリペプチド（本明細書ではそれぞれ、「本発明の免疫グロブリン」および「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる）に関する。本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）などのかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含む構築物、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよび構築物を調製する方法に；かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現するかまたは発現可能な宿主細胞に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に；特に、本明細書に記載の予防および／または治療目的などの予防および／または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に、関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
変形性関節症（ＯＡ）は、世界中に及ぶ廃疾の最も一般的な原因の１つである。３，０００万人のアメリカ人がこれに罹患しており、最も一般的な関節障害である。米国人口の２０％以上が、２０２５年までにこれに罹患すると予測されている。この疾患は全身性ではなく、通常は少数の関節に限定されている。しかし、この疾患はすべての関節で、ほとんどの場合は膝、股関節、手、肩、および脊椎で発生する。ＯＡは、慢性的な痛みと障害をもたらす関節軟骨（骨を覆う軟骨）の進行性の侵食によって特徴付けられる。最終的にこの疾患は、関節軟骨の完全な破壊、その下にある骨の硬化、骨棘形成などにつながり、すべて運動の喪失と痛みにつながる。変形性関節症は、関節症状、関節軟骨の欠損に起因する徴候、ならびに骨、腱、および筋肉などを含む隣接組織における変化の組合せを特徴とする、多様な状態群として定義できる。痛みはＯＡの最も顕著な症状であり、多くの場合、患者が医療的援助を求める理由となる。ＯＡに治療法はなく、すなわち現在の処置はＯＡの関節の構造的劣化を抑制しない。疾患管理はせいぜい緩和的な処置に限られ、疾患の進行の根本的な原因にはほとんど対処できない。疾患の開始は多因子性であり得るが、軟骨の破壊は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の制御されないタンパク質分解の結果であると考えられる。関節軟骨の最も豊富なＥＣＭ成分は、コラーゲン（主にコラーゲンＩＩ）およびプロテオグリカン、主にアグリカンである（Kiani et al. 2002 Cell Research 12:19-32）。
【０００３】
アグリカンは、軟骨に耐荷重性を与える水和ゲル構造を提供することにより、関節軟骨の適切な機能において重要である。アグリカンは、軟骨細胞によって発現される大きなマルチモジュラー分子（２３１７アミノ酸）である。そのコアタンパク質は、３つの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）および、グリコサミノグリカン鎖の結合のためのＧ２とＧ３の間の大きな拡張領域で構成されている。この拡張領域は、２つのドメイン、すなわちケラタン硫酸鎖で置換されたドメイン（ＫＳドメイン）とコンドロイチン硫酸鎖で置換されたドメイン（ＣＳドメイン）で構成されている。ＣＳドメインには、１００〜１５０のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合している。アグリカンはヒアルロナンと大きな複合体を形成し、ここでは５０〜１００のアグリカン分子が、Ｇ１ドメインおよびリンクタンパク質を介して１つのヒアルロナン分子と相互作用する。水を吸収すると（ＧＡＧ含有量により）、これらの複合体は圧縮に抵抗する可逆的に変形可能なゲルを形成する。関節軟骨の構造、体液貯留および機能は、アグリカンのマトリックス含有量、および無傷のコアタンパク質に結合したコンドロイチン硫酸の量に関連している。構造的には、ＯＡはアグリカンの分解によって特徴付けられ、ドメインＧ３およびＧ２を徐々に放出し（軟骨の「収縮」をもたらす）、最終的にＧ１ドメインの放出とコラーゲンの分解を引き起こし、軟骨構造を不可逆的に破壊する。ＯＡ病因の最も重要なアグリカン切断部位は、配列ＴＥＧＥ３７３↓３７４ＡＲＧＳに位置する。この切断部位は、アグリカンの球間ドメイン（ＩＧＤ）に位置している。３７４ＡＲＧＳネオエピトープを認識する抗体は、ＡＤＡＭＴＳ４であることが証明されたアグリカナーゼ１およびＡＤＡＭＴＳ５であるアグリカナーゼ２の発見につながった。その後、ＡＤＡＭＴＳ１、−８、−９、−１５、−２０を含む他の関連ＡＤＡＭＴＳ酵素が、アグリカナーゼ活性を有することが示された。ＡＤＡＭＴＳ１６および１８も、弱いアグリカナーゼである。ＡＤＡＭＴＳおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、配列と全体の形状の両方で非常に類似している、アグリカンへの結合部位を共有する（El Bakali et al. 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399）。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）酵素は、組織の形態形成および病理生理学的リモデリングにおいて、また炎症および血管生物学において様々な役割を有する、分泌されるマルチドメインマトリックス関連亜鉛メタロエンドペプチダーゼである（Kelwick et al. 2015 Genome Biology 16:113）。ヒトファミリーには、既知の基質に基づいてサブグループ化できる１９のメンバーが含まれる。アグリカナーゼまたはプロテオグリカナーゼには、ＡＤＡＭＴＳ１、−４、−５、−８、−９、−１５および−２０が含まれ、これらはアグリカン、バーシカン、ブレビカンおよびニューロカンを含むヒアルロナン結合性コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）細胞外タンパク質を切断することができる。ウシのアグリカンの最も好ましい２つの切断部位はＫＥＥＥ１６６７↓１６６８ＧＬＧＳであり、その後にＧＥＬＥ１４８０↓１４８１ＧＲＧＴが続く。その後、ＩＧＤのＮＩＴＥＧＥ３７３↓３７４ＡＲＧＳで切断が起こり（ここではＭＭＰは切断しない）、前述のネオエピトープが放出され、そしてＣＳ−２領域のＴＡＱＥ１７７１↓１７７２ＡＧＥＧおよびＶＳＱＥ１８７１↓１８７２ＬＧＱＲで切断が起こる（Fosang et al. 2008 European Cells and Materials 15:11-26）。これらの切断部位は、ヒト、ウシ、マウス、およびラットで高度に保存されている。
様々な証拠が、ＡＤＡＭＴＳ５が変形性関節症の病因に関与する主要な酵素であることを示している。ＡＤＡＭＴＳ５は、軟骨中に存在する主要アグリカナーゼである。ヒト軟骨外植片および軟骨細胞において、ＡＤＡＭＴＳ５のノックダウンはアグリカン分解を減衰させ、この酵素がヒト組織に関与し得ることを示唆した。この酵素の発現は、インターロイキン１およびオンコスタチンＭなどのサイトカインによって増強され、組織内のアグリカンの分解を引き起こす。ＡＤＡＭＴＳ５によって生成されたアグリカン断片は、ＯＡ患者の滑液および血清から検出される（Germaschewski et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22:690‐697）。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ５は、Ｎ末端のプロテアーゼドメインおよびＣ末端の補助ドメインを含む不活性タンパク質として、最初に合成される。プロテアーゼドメインは、シグナルペプチド、フューリン認識配列を有するプロドメイン、および触媒ドメインで構成されている。プロドメインは、活性酵素を生産するためにプロタンパク質転換酵素によって切断される。ＡＤＡＭＴＳ５はさらに、基質認識に積極的に関与し、その基質に対するプロテイナーゼの親和性を調節する、補助ドメイン（「エキソサイト」）を含んでいる。ＡＤＡＭＴＳ５のディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型様（ＴＳ）リピート、システインリッチドメイン、スペーサー領域、および追加ＴＳモチーフは、潜在的なエキソサイト機能を有する補助ドメインである。システインリッチドメインは、ＡＤＡＭＴＳ５のグリコサミノグリカンへの結合およびドッキングに不可欠であると思われる。ＡＤＡＭＴＳメンバーの最大のばらつきは、これらの補助的なドメインに見出される（Kelwick et al., 2015 Genome Biology 16:113）。
構造的な疾患の進行を阻害し、理想的には症状および／または機能を改善する薬物として定義できる、疾患修飾性抗変形性関節症薬（ＤＭＯＡＤ）が、強く求められている。ＤＭＯＡＤは、高齢人口でのこの慢性疾患において長期間にわたって処方される可能性が高いため、複数の併存疾患および薬物間相互作用の可能性がある対象集団において、優れた安全性データが要求される。
【０００６】
いくつかの製薬会社が、ＡＤＡＭＴＳ５の小分子阻害剤を開発している。これらの化合物のいくつかは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的であると主張されているが、他の化合物は他のＡＤＡＭＴＳメンバー、またはＭＭＰに対してさえも効果を有する。これらの交差阻害は、筋骨格症候群、すなわち広域スペクトル阻害剤によって引き起こされ、関節痛、筋肉痛、関節硬直および腱炎を伴う副作用の原因であると考えられている（Santamaria et al., 2015 Biochem J 471:391-401）。-Wyethアグリカナーゼ阻害剤ＡＧＧ−５２３は、健康な対象およびＯＡ患者の５つの第Ｉ相臨床試験で使用されたが、それ以上には進んでいない。他の低分子ＡＤＡＭＴＳ阻害剤も、潜在的なＤＭＯＡＤとしてさらなる臨床開発に参入していない（Bondeson et al., 2015 Drug Discovery 10:5-14）。実際、ＤＭＯＡＤを具体的に調査した近年の多くの臨床試験にもかかわらず、これまでの所かかる処置は承認されていない（El Bakali et al., 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399）。
【０００７】
抗体（「Ａｂ」）を使用した標的生物療法の成功を考慮して、ＯＡに対して同様の治療戦略を開発することに関心が寄せられた。ＡＤＡＭＴＳ５のスペーサードメインに向けられたRottapharmのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＣＲＢ００１７の研究により、マウスにおいて、このｍＡｂの関節内投与によって、疾患の進行が用量依存的に有意に予防されたことが示された（Chiusaroli et al., 2013 Osteoarthritis Cartilage 21:1807）。全身投与との比較は行われず、ｍＡｂが滑膜腔からどの程度漏出したかは評価されなかった。別の研究では、マウスにｍＡｂ １２Ｆ４を全身投与し、構造的疾患の改善と疼痛関連行動の軽減の両方が実証された（Miller et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35）。しかし、ｍＡｂ １２Ｆ４をカニクイザルに１回投与すると、局所出血、用量依存性の平均動脈圧および心臓コンダクタンス異常（より具体的にはＥＣＧでのＳＴ上昇および心室性不整脈）が引き起こされ、心虚血が単回投与後８か月まで持続することが示された（Larkin et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S483）。これらの副作用により、ｍＡｂ １２Ｆ４のさらなる臨床開発は中止された。
【０００８】
WO2008/074840には、Ablynx NVの名の元で、ＡＤＡＭＴＳ５を含む、Ａディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバーに対するNanobodies（登録商標）の生成について記載されている。
関節への治療的介入は、薬物を関節軟骨に標的化することが困難であるために、さらに妨げられている。関節軟骨は無血管および無リンパ組織であるため、従来の薬物送達経路（経口、静脈内、筋肉内）は、薬物の、受動拡散による滑膜毛細血管から軟骨への経滑膜移行に最終的に依存している。これは、医薬の関節内（ＩＡ）送達の開発を促進した。
一方、治療用タンパク質のＩＡ送達は、関節空間からの急速なクリアランスと軟骨内の保持不足により制限されており、大きな関節に限定されている。関節における薬物の滑膜滞留時間は、多くの場合２４時間未満である（Edwards 2011 Vet J 190:15-21；Larsen et al., 2008 J Pham Sci 97:4622-4654）。ほとんどのＩＡ注射された薬物の急速なクリアランスのため、有効な濃度を維持するには頻繁な注射が必要となる（Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38:349-355）。さらに、治療用タンパク質のＩＡ送達は小さな関節に対しては実際には実行不可能であり、それにより、例えばＯＡの指などの処置が妨げられている。
効果的なＤＭＯＡＤの必要性が残されている。
【発明の概要】
【０００９】
３．発明の概要
本発明は、他の有利な特性に加えて、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較した場合に、改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性（例えば、改善された調製の容易さ、良好な安定性、および／または商品のコスト削減）を有する、ＯＡに対するポリペプチドを提供することを目的とする。特に本発明は、ＡＤＡＭＴＳを阻害し、特にＡＤＡＭＴＳ５を阻害するポリペプチドを提供することを目的とする。
ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭＴＳ、およびＭＭＰはアグリカンへの結合部位を共有しており、これは配列および全体的な形状の両方で非常に類似している。他の様々なＡＤＡＭ（ＴＡＣＥを含む）およびＡＤＡＭＴＳファミリーのメンバーは、正常な生理学において多様な役割を有し、多くの一般的な病理状態、例えば喘息、関節炎、がん、結合組織障害または血栓性血小板減少性紫斑病などに強く関連するため（El Bakali et al.、前掲）、本発明者らは、選択性を保つことの重要性を認識した。ＡＤＡＭＴＳ５活性のみを効果的に抑制するには、触媒ドメインを標的化することが最良の選択肢であると思われた。しかしながら、ＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインは、高度の配列類似性を共有している（上記のEl Bakali et al.を参照）。さらに、様々な種の間の触媒ドメインの高い配列保存が、堅牢な免疫応答に先立つことが判明した。
【００１０】
驚くべきことに、本発明のＩＳＶＤは、一方では選択性を保ちつつ、一方ではＡＤＡＭＴＳ５の（酵素）活性を阻害するという、これら２つの一見相互に排他的な要件を満たした。
本発明の様々な一価のＩＳＶＤは、AlphaLISA酵素アッセイにおいて、従来の二価抗体ｍＡｂ １２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０と等効力であった。これに加えて、本発明のＩＳＶＤはまた、関節を連想させる高またはさらに過剰なアグリカン基質濃度においても、従来の二価抗体ｍＡｂ １２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０と等効力であった。一方、生理的条件にさらに類似したex vivoのウシ外植片アッセイでは、ほとんどの一価ＩＳＶＤがRottapharmの比較物ｍＡｂ １２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０（「１２Ｆ４」）およびｍＡｂ ＣＲＢ００１７よりも、優れたＩＣ５０を示した。ヒトのex vivo外植片アッセイにおいて、本発明のＩＳＶＤは、ＩＣ５０により示されるように、従来技術の従来の抗体ＣＲＢ００１７よりも実質的に優れていた。
安定性、親和性、阻害活性、ならびに免疫原性の最小化などを含む種々の多様な好ましい特徴を考慮してＩＳＶＤをさらに操作した後、これらのＩＳＶＤを次にin vivoで評価した。
【００１１】
本発明のＩＳＶＤの全身投与は、in vivoでのアグリカナーゼ活性の強力な阻害を、カニクイザルで評価されたように実証した。さらにＩＳＶＤは、従来技術の抗体１２Ｆ４とは対照的に、安全に使用できた。また、in vivoマウス内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルにおいて、本発明のＩＳＶＤは、最大５０％の構造的利益を、全身投与による予防的および治療的処置の両方で示した。本発明のＩＳＶＤによる早期の処置は、ラットにおける前十字靱帯切除および内側半月板切除（ＡＣＬＴ＋ｔＭｘ）誘発性ＯＡに、用量依存性の有意かつ重要な症候性利益をもたらした。
【００１２】
ＩＳＶＤは最終的に、関節のＡＤＡＭＴＳ５を阻害することを目的としているため、様々なプロテアーゼを含有する関節の滑液の状態に抵抗する必要がある。上記の好ましい特性の次に、単離されたＩＳＶＤは、滑液中で非常に安定であることが示された。この安定性により、より少ない頻度での投与計画が可能になることが予想される。
したがって本発明は、トロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む、ポリペプチドに関し、ここで好ましくは、前記ＡＤＡＭＴＳは、ＡＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ１９、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９およびＡＤＡＭＴＳ１５およびＡＤＡＭＴＳ２０からなる群から選択され、最も好ましくはＡＤＡＭＴＳ５である。一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、ＡＤＡＭＴＳに、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に結合する前記ＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ４、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４に結合しない。
【００１３】
さらに好ましい側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４；および
配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２；および
配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０；および
配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される。
【００１４】
さらに好ましい側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は、（ａ）配列番号２２；および（ｂ）配列番号２２と１、２、３、４、５または６個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、ここで位置２においてＳはＲに変更されており；位置３においてＡはＴに変更されており；位置４においてＶはＦに変更されており；位置６においてＶはＳに変更されており；位置７においてＮはＹに変更されており；および／または位置１０においてＡはＧに変更されており；（ｉｉ）ＣＤＲ２は配列番号３６であり；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は配列番号５４である。
【００１５】
さらに好ましい側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号３３であり；（ｉｉ）ＣＤＲ２は、（ｃ）配列番号５０；および（ｄ）配列番号５０と１、２、または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、ここで、位置８においてＭはＩに変更されており；位置９においてＰはＴに変更されており；および／または位置１０においてＹはＦに変更されており；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、（ｅ）配列番号６８；および（ｆ）配列番号６８と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、ここで位置５においてＦはＬに変更されており；および／または位置１１においてＤはＥに変更されている。
【００１６】
さらに好ましい側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号２８であり；（ｉｉ）ＣＤＲ２は、（ｃ）配列番号４４；および（ｄ）配列番号４４と１、２、または３個のアミノ酸の差を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、ここで位置３においてＳはＴに変更されており；位置４においてＲはＷに変更されており；位置８においてＴはＩに変更されており；および／または位置９においてＴはＬに変更されており；（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、（ｅ）配列番号６２；および（ｆ）配列番号６２と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、ここで位置１においてＧはＳに変更されており；および／または位置１４においてＤはＥに変更されている。
本発明のすべての側面の好ましい態様において、本明細書の上および下に略述されるように、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、好ましくは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなるか、または本質的にそれらからなる。好ましいフレームワーク配列は、例えば以下の表Ａ−２に開示されており、本発明のＩＳＶＤに使用することができる。好ましくは、表Ａ−２に示されているＣＤＲは、同じＩＳＶＤ構築物のそれぞれのフレームワーク領域と一致している。
【００１７】
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＩＳＶＤは、ＩＳＶＤの群から選択され、ここで：ＣＤＲ１は、配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４からなる群から選択され；ＣＤＲ２は、配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２からなる群から選択され；およびＣＤＲ３は、配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０からなる群から選択される。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＩＳＶＤは、ＩＳＶＤの群から選択され、ここで：
ＣＤＲ１は配列番号２１であり、ＣＤＲ２は配列番号３７であり、ＣＤＲ３は配列番号５５である；
ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５３であり、ＣＤＲ３は配列番号１１８である；
ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５３であり、ＣＤＲ３は配列番号７１である；
ＣＤＲ１は配列番号２０であり、ＣＤＲ２は配列番号３６であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
ＣＤＲ１は配列番号２２であり、ＣＤＲ２は配列番号３６であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号４０であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号５０であり、ＣＤＲ３は配列番号６８である；
ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号５１であり、ＣＤＲ３は配列番号６９である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４４であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４５であり、ＣＤＲ３は配列番号６３である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号６１である；
ＣＤＲ１は配列番号２４であり、ＣＤＲ２は配列番号３９であり、ＣＤＲ３は配列番号５７である；
ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３８であり、ＣＤＲ３は配列番号５６である；
ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号５９である；
ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１９であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
ＣＤＲ１は配列番号２９であり、ＣＤＲ２は配列番号４６であり、ＣＤＲ３は配列番号６４である；
ＣＤＲ１は配列番号３０であり、ＣＤＲ２は配列番号４７であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である；
ＣＤＲ１は配列番号３１であり、ＣＤＲ２は配列番号４８であり、ＣＤＲ３は配列番号６６である；
ＣＤＲ１は配列番号３２であり、ＣＤＲ２は配列番号４９であり、ＣＤＲ３は配列番号６７である；および
ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号５２であり、ＣＤＲ３は配列番号７０である。
【００１８】
さらに好ましい側面において、本発明は、ＣＤＲ１が配列番号２１であり、ＣＤＲ２が配列番号３７であり、ＣＤＲ３が配列番号５５である、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＩＳＶＤは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、８、１１７、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、例えばKinExAまたは代替的にGyrolabによって決定される場合、ＫＤが１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍで、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する。
【００１９】
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、例えばヒトFRETアッセイまたはヒトAlphaLISAによって決定される場合、ＩＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を阻害する。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＩＣ５０が最大１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍ、５Ｅ−０９Ｍ、または４Ｅ−９Ｍ、３Ｅ−９Ｍ、２Ｅ−９Ｍ、例えば１Ｅ−９Ｍなどで、ＡＤＡＭＴＳ５の（酵素）活性を阻害する。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、例えば結合ＥＬＩＳＡにより決定される場合、ＥＣ５０が１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５を調節する。
【００２０】
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートが１Ｅ−０４ｓ−１未満でＡＤＡＭＴＳ５に結合する。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＡＤＡＭＴＳ５は、ヒトＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１４９）、ウシＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５０）、ラットＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５１）、モルモットＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５２）、マウスＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５３）またはカニクイザルＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１５４）、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ５、最も好ましくは配列番号１４９である。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５の活性、例えばプロテアーゼ活性、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンの切断などに、好ましくはアグリカンの切断に、拮抗し；好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカナーゼ活性に拮抗する。
【００２１】
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカンへの結合を、例えば、FRET、AlphaLISAまたはＥＬＩＳＡによって決定される場合に、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、ブロックする。
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５のプロテアーゼ活性を阻害する、例えば、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなど基質の、好ましくはアグリカンの、タンパク質分解を阻害する。
さらに好ましい側面において、本発明は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで少なくとも１つのＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、好ましくは配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択され、ここで好ましくは、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳに、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する。
【００２２】
さらに好ましい側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで、（ａ）少なくとも「第１」ＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ５の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に特異的に結合し；およびここで、（ｂ）少なくとも「第２」ＩＳＶＤは、第１の抗原決定基エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造とはそれぞれ異なる、ＡＤＡＭＴＳ５の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、または立体構造に特異的に結合し、好ましくはここで、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する前記「第１」ＩＳＶＤは、配列番号２、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、８、１１７、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択され、好ましくはここで、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する前記「第２」ＩＳＶＤは、配列番号１１８または１９であり、さらにより好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２６（クローン１２９ ２Ｆ３−０９３−ＡＬＢ）、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）および配列番号１２８（クローン１３１ ９Ｄ３−０９３−Ａｌｂ）からなる群から選択される。
【００２３】
さらに好ましい側面において、本発明は、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、好ましくはここで、前記血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここでＣＤＲ１は配列番号１４６であり；ＣＤＲ２は配列番号１４７であり；およびＣＤＲ３は配列番号１４８であり；さらにより好ましくはここで、前記血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、ＡＬＢ８（配列番号１３１）、ＡＬＢ２３（配列番号１３２）、ＡＬＢ１２９（配列番号１３３）、ＡＬＢ１３２（配列番号１３４）、ＡＬＢ１１（配列番号１３５）、ＡＬＢ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ（配列番号１３６）、ＡＬＢ８２（配列番号１３７）、ＡＬＢ８２−Ａ（配列番号１３８）、ＡＬＢ８２−ＡＡ（配列番号１３９）、ＡＬＢ８２−ＡＡＡ（配列番号１４０）、ＡＬＢ８２−Ｇ（配列番号１４１）、ＡＬＢ８２−ＧＧ（配列番号１４２）、ＡＬＢ８２−ＧＧＧ（配列番号１４３）、ＡＬＢ９２（配列番号１４４）、およびＡＬＢ２２３（配列番号１４５）からなる群から選択され、さらにより好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号１２９（クローン５７７ ２Ｆ３ＳＯ−Ａｌｂ）、配列番号１３０（クローン５７９ ２Ｆ３ＳＯ−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２０（クローン４ ２Ａ１２−Ａｌｂ）、
配列番号１２１（クローン５ ２Ｄ７−Ａｌｂ）、配列番号１２２（クローン６ ２Ｆ３−Ａｌｂ）配列番号１２３（クローン６９ ０４９−Ａｌｂ）、配列番号１２４（クローン７０ ９Ｄ３−Ａｌｂ）、配列番号１２５（クローン７１ ３Ｂ２−Ａｌｂ）、配列番号１２６（クローン１２９ ２Ｆ３−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）、および配列番号１２８（クローン１３１ ９Ｄ３−０９３−Ａｌｂ）からなる群から選択される。
【００２４】
さらに好ましい側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤであって、好ましくは配列番号１５６（ナノボディ00745 PEA114F08）および配列番号１５７（ナノボディ00747 PEA604F02）からなる群から選択される前記ＩＳＶＤをさらに含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
さらに好ましい側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一であっても異なっていてもよく、好ましくはここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、配列番号１５６および１５７からなる群から独立して選択され、さらにより好ましくは、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン［配列番号１５５］に特異的に結合する。好ましくは、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、イヌアグリカン（表２も参照）、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカンに特異的に結合する。好ましくは、前記アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤは、好ましくは、軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。
【００２５】
さらに好ましい側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、少なくとも７日、例えば１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月間も、滑液（ＳＦ）において３７℃で安定性を有する。
さらに好ましい側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、互いに直接連結されるか、リンカーを介して連結され、好ましくは該リンカーは、配列番号１５８〜１７４（すなわち、配列番号１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３および１７４）からなる群から選択され、好ましくは配列番号１６９である。
さらに好ましい側面において、本発明は、Ｃ末端伸長をさらに含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、好ましくはここで、前記Ｃ末端伸長はＣ末端伸長（Ｘ）ｎであり、式中ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；および各Ｘは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選択される。
【００２６】
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１〜１９（すなわち配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９）、１１６〜１１７または１２０〜１３０（すなわち配列番号１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０）のいずれかと、少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する。
さらに好ましい側面において、本発明は、例えばＡＤＡＭＴＳ５活性が関与するところの、個体の疾患または障害を処置および／または予防する方法に関し、該方法は、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを、前記疾患または障害の症状を処置または予防するのに有効な量で前記個体に投与することを含み、好ましくはここで、前記疾患または障害は、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーからなる群から選択される。より好ましくは、前記疾患または障害は関節炎であり、最も好ましくは変形性関節症である。
【００２７】
さらに好ましい側面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
さらに好ましい側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５関連疾患の症状、例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーの症状の、処置または予防に使用するための、本明細書に記載のポリペプチドに関する。より好ましくは、前記疾患は関節炎であり、最も好ましくは変形性関節症である。
【００２８】
さらに好ましい側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表される少なくとも１つのポリペプチドの、ＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックするか、および／または、少なくとも、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによって、ＡＤＡＭＴＳ５への結合が交差ブロックされている。
さらに好ましい側面において、本発明はポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによるＡＤＡＭＴＳ５への結合を、交差ブロックするか、および／または、ＡＤＡＭＴＳ５への結合が、少なくとも、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つにより表されるポリペプチドによって交差ブロックされており、ここで前記ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ここでＡＤＡＭＴＳ５への結合は、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節する。
【００２９】
ポリペプチドおよび組成物の他の側面、利点、用途および使用は、本明細書のさらなる開示から明らかになるであろう。本明細書の本文にわたりいくつかの文書が引用されている。ここに引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のすべては、本発明が先行発明によってかかる開示に先行する権利を与えられない、ということの承認として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
４．図の凡例
【図１】図１は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤが、ＭＭＰ１（Ａ）またはＭＭＰ１４（Ｂ）の活性を阻害しないことを示す図である。
【図２】図２は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤが、ＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害しないことを示す図である。
【図３】図３は、既存の抗体（プレＡｂ）の、健康な対象、変形性関節症の対象、および残留プレＡｂ結合を有するドナーに由来する３つのドナー試料セットからのナノボディ構築物５８１（Ａ）およびナノボディ構築物５７９（Ｂ）への、結合レベルを示す図である。
【図４】図４は、ナノボディ構築物５８１（「C011400581」）が、ヒトＡＤＡＭＴＳ１（Ａ）に結合せず、ヒトＡＤＡＭＴＳ４またはヒトＡＤＡＭＴＳ１５（Ｂ）に結合しないことを示す図である。
【図５】図５は、ヒト外植系における効力を示す図である。７日後の上清中のＧＡＧ蓄積を示す。
【００３１】
【図６】Ａ）ウシ共培養システムにおける上清への、ＧＡＧ放出の時間経過を示す。Ｂ）ＧＡＧ放出の曲線下面積（ＡＵＣ）計算の時間経過（７〜２８日）を示す。反復数ｎ＝４。データは、Box&Whiskers形式で最小から最大まで表示される。Ｃ）データは、パパイン消化後のＧＡＧ含有量［ｎｇ／ｍｇ軟骨］を示す。反復数ｎ＝４。データは、Box&Whiskers形式で最小から最大まで表示される。
【図７】図７は、ｅｘＡＧＮｘ１放出の曲線下面積（ＡＵＣ）計算の時間経過（７〜２８日）を示す。反復数数ｎ＝４。データは、Box&Whiskers形式で最小から最大まで表示される。
【図８】図８は、Ｃ２Ｍ放出の曲線下面積（ＡＵＣ）計算の時間経過（７〜２８日）を示す。反復数ｎ＝４。データは、Box&Whiskers形式で最小から最大まで表示される。
【００３２】
【図９】図９は、Ｃ３Ｍ放出の曲線下面積（ＡＵＣ）計算の時間経過（７〜２８日）を示す。反復数数ｎ＝４。データは、Box&Whiskers形式で最小から最大まで表示される。
【図１０】図１０は、ＮＨＰにおけるアグリカナーゼ活性の阻害を示す。
【図１１】図１１は、軟骨変性の抑制を示す。中央軟骨変性の合計は、ＤＭＭマウスモデルでの予防的（Ａ）および治療的（Ｂ）処置において示される。
【図１２】図１２は、ラット外科手術ＯＡモデルでの症候性挙動を示す。
【図１３】図１３は、内側脛骨軟骨変性の幅を示す。
【図１４】図１４は、抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの、軟骨のex vivo培養（Ａ、Ｂ、Ｃ）および軟骨と滑膜の共培養（Ｄ、Ｅ）における、アグリカナーゼ由来のアグリカンの分解に対する効果を示す。リストされた濃度は、ナノボディの濃度である。統計分析は、通常の一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５の場合に考慮した。
【００３３】
５．詳細な説明
安全で効果的なＯＡ医薬品、特にＤＭＯＡＤの必要性が残されている。これらの医薬は、特に広く適用可能なフォーマットが意図される場合、様々な頻繁に対立する要件に適合する必要がある。そのためこのフォーマットは、好ましくは広範囲の患者に有用であるべきである。フォーマットは好ましくは安全であり、頻繁な投与による感染を誘発しない。加えてフォーマットは、好ましくは患者に優しく、例えばフォーマットは、便利な投与計画および投与経路、例えば、全身投与を許容する。例えば、投与されると、フォーマットは循環から即座に除去されないことが好ましい。ただし、半減期を延長しても、好ましくは標的外の活性や副作用が生じたり、有効性が制限されるべきではない。
本発明は、これらの要件の少なくとも１つを実現する。
従来にはないスクリーニング、特性評価、および組み合わせ戦略に基づいて、本発明者らは驚くべきことに、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）が、in vitroおよびin vivo実験で非常に良好に機能することを観察した。
【００３４】
さらに本発明者らは、ＩＳＶＤを再操作して、ＯＡの改善において比較薬よりもさらに優れた性能を発揮させることができた。また本発明のＩＳＶＤは、先行技術の化合物よりも有意に安全であることが実証された。
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ、特にＡＤＡＭＴＳ５に拮抗するポリペプチドであって、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを含む改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性を有する前記ポリペプチドを提供することを意図する。
したがって、本発明は、（本明細書で定義されるように）ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたおよび／または特異的に結合し得る、ＩＳＶＤおよびポリペプチドに関する。
したがって、本発明は、（本明細書で定義されるように）ＡＤＡＭＴＳに向けられおよび／またはこれに特異的に結合し、その活性を調節するＩＳＶＤおよびポリペプチド、特に、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５への結合は、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節する。
【００３５】
別に示されているか定義されていない限り、使用されるすべての用語は、当業者には明白であろうこの分野でのそれらの通常の意味を有する。例えば、次のような標準的なハンドブックが参照される：Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987)、Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985)、Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981)；Roitt et al. (Immunology (6th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001)、Roitt et al. (Roitt’s Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001)、およびJaneway et al. (Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005)、ならびに本明細書で引用する一般的な背景技術。
【００３６】
別に示されていない限り、特に詳細に説明されていないすべての方法、ステップ、技術、および操作は、それ自体既知の様式で実行でき、また実行されており、これは当業者には明らかであろう。例えば、本明細書で言及される標準ハンドブックおよび一般的な背景技術、ならびにそこに引用されているさらなる参考文献が再び参照され；また、例えば、以下のレビューも参照される：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000)、Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)；これらは、親和性成熟などのタンパク質工学技術、および免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性およびその他の望ましい特性を改善するためのその他の技術について、説明している。
【００３７】
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意すべきである。したがって例えば、１つの「試薬」への言及には、かかる異なる試薬の１つ以上が含まれ、「方法」への言及には、改変され得るかまたは本明細書に記載の方法で置換され得る、当業者に知られている同等のステップおよび方法への言及が含まれる。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、本発明に含まれることが意図されている。
【００３８】
用語「および／または」は、本明細書で使用される場合は常に、「および」、「または」、および「前記用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、おとび最も好ましくは５％以内を意味する。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む」という単語、および「含む」および「含むこと」などの変形は、述べられた整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しない、ということを意味する。本明細書で使用する場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」または「含む（including）」という用語で置き換えることができ、または場合によっては本明細書において、「有する」という用語を使用することもできる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語）は、一般に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列ならびにこれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
アミノ酸配列は、文脈に依存して、単一のアミノ酸または、２つ以上のアミノ酸の分岐していない配列を意味すると解釈される。ヌクレオチド配列は、３つ以上のヌクレオチドの非分岐配列を意味すると解釈される。
【００４０】
アミノ酸は、天然のタンパク質に一般的に見られるＬ−アミノ酸である。アミノ酸残基は、標準の３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示される。例えば、WO 08/020079の４８頁表Ａ−２を参照されたい。Ｄ−アミノ酸を含むこれらのアミノ酸配列は、この定義に含まれることを意図しない。翻訳後修飾されたアミノ酸を含むアミノ酸配列は、この表Ａ−２に示されている記号および、例えばヒドロキシル化またはグリコシル化などの修飾位置を使用して、最初に翻訳されるアミノ酸配列として説明し得るが、しかしこれらの修飾は、アミノ酸配列に明示的に示されてはならない。配列修飾された結合、架橋およびエンドキャップ、非ペプチジル結合などとして発現できるペプチドまたはタンパク質はすべて、当技術分野で知られているように、この定義に含まれる。
【００４１】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質／ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本開示を通して交換可能に使用され、それぞれは本開示の目的に対して同じ意味を有する。各用語は、２つ以上のアミノ酸の直鎖でできた有機化合物を指す。化合物は、１０以上のアミノ酸、２５以上のアミノ酸；５０以上のアミノ酸；１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、さらには３００以上のアミノ酸を有し得る。当業者は、以下を理解するであろう：すなわち、ポリペプチドは一般にタンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、しかしポリペプチドとタンパク質を区別するアミノ酸の数の、当技術分野で認識されているカットオフポイントは存在しないこと；ポリペプチドは、化学合成または組換え法により作成できること；および、タンパク質は一般に、当分野で 知られている組換え方法によりin vitroまたはin vivoで作製されること。慣例により、ポリペプチドの一次構造のアミド結合は、アミノ酸が書かれている順序の通りであり、ここでポリペプチドのアミン末端（Ｎ末端）は常に左側にあり、酸末端（Ｃ末端）は右側にある。
【００４２】
核酸またはアミノ酸配列が、「（本質的に）単離された（形態）（にある）」と見なされるのは、−例えば、それが得られた反応培地または培養培地と比較して−、上記ソースまたは培地と通常関連している少なくとも１つの別の成分から、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分または高分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物または微量成分などから、分離された場合である。特に、核酸またはアミノ酸配列は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、および最大１０００倍またはそれ以上まで精製されている場合に、「（本質的に）単離された」と見なされる。「（本質的に）単離された形態にある」核酸またはアミノ酸は、適切な技術を使用して、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術を使用して決定されるように、好ましくは本質的に均質である。
【００４３】
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を「含む」、または別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から「本質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、最初に言及されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれに組み込まれていることを意味し得るが、より一般的には、これは一般に、最初に言及されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がその配列内に、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれを有する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチそれぞれを含むことを意味し、最初に言及された配列が実際にどのように生成または取得されたか（例えば、本明細書に記載の任意の適切な方法による）には関係しない。非限定的な例により、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン（「ＩＳＶＤ」）を含むと言われる場合、これは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列に組み込まれたことを意味し得るが、より通常には、これは一般に、本発明のポリペプチドがどのように生成または取得されたかに関係なく、本発明のポリペプチドがその配列内に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸またはヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に言及された核酸またはヌクレオチド配列は、これが発現産物（例えばポリペプチド）に発現されるときに、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が前記発現産物の一部を形成している（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及されたより大きな核酸またはヌクレオチド配列と同じリーディングフレームにある）。また、本発明の構築物がポリペプチドまたはＩＳＶＤを含むと言われる場合、これは、前記構築物が、前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤをそれぞれ、少なくとも包含することを意味し得るが、より一般的には、これは、前記構築物が、前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤに加えて、基、残基（例えばアミノ酸残基）、部分および／または結合単位を包含することを意味し、ここで前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤが前記の基、残基（例えば、アミノ酸残基）、部分および／または結合単位にどのように接続されているかには関係せず、および前記構築物がどのように生成または取得されたかにも関係しない。
【００４４】
「本質的に〜からなる」とは、本発明で使用されるＩＳＶＤが、本発明のＩＳＶＤと全く同一であるか、または、本発明の次のようなＩＳＶＤに対応することを意味する：すなわち、限られた数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基など、例えば１〜１０のアミノ酸残基、好ましくは１〜６のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６個のアミノ酸残基を、ＩＳＶＤのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加されて有するＩＳＶＤ。
２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージは、次のように計算することができる：［第２ヌクレオチド配列内の対応する位置のヌクレオチドと同一の、第１ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの数］を、［第１ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの総数］で除算し、［１００％］を掛ける；ここで、第１ヌクレオチド配列と比較した、第２ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換または追加は、単一のヌクレオチド（位置）における違いと見なされる。代替的に、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、NCBI Blast v2.0などの配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、標準設定を用いて計算され得る。配列同一性の程度を決定するための他のいくつかの技術、コンピューターアルゴリズムおよび設定は、例えば、WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185およびGB 2357768に記載されている。通常、上記で概説した計算方法に従って２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列が「第１」ヌクレオチド配列とされ、他のヌクレオチド配列が「第２」ヌクレオチド配列とされる。
【００４５】
２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージ（本明細書では「アミノ酸同一性」とも呼ばれる）は、次のように計算することができる：［第２アミノ酸配列内の対応する位置のアミノ酸残基と同一の、第１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］を掛ける；ここで、第１アミノ酸配列と比較した、第２アミノ酸配列内のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換または追加は、単一のアミノ酸残基（位置）における違い、すなわち本明細書で定義される「アミノ酸差異」と見なされる。代替的に、２つ以上のアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ヌクレオチド配列の配列同一性の程度を決定するための上記のような既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、再度標準設定を用いて計算され得る。通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１」アミノ酸配列とされ、他のアミノ酸配列が「第２」アミノ酸配列とされる。
【００４６】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際に、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるが、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を与えないアミノ酸置換として説明することができる。かかる保存的アミノ酸置換は、当分野において、例えばWO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383およびWO 01/09300からよく知られており；およびかかる置換の（好ましい）種類および／または組み合わせは、WO 04/037999ならびにWO 98/49185およびそこに引用されているさらなる参考文献からの関連する教示に基づいて選択され得る。
【００４７】
かかる保存的置換は、好ましくは、以下のグループ（ａ）〜（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換される置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；（ｂ）極性の負に帯電した残基およびそれらの（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａを、ＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；Ａｓｎを、ＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｎをＡｓｐへ；Ｇｌｙを、ＡｌａまたはＰｒｏへ；Ｈｉｓを、ＡｓｎまたはＧｌｎへ；Ｉｌｅを、ＬｅｕまたはＶａｌへ；Ｌｅｕを、ＩｌｅまたはＶａｌへ；Ｌｙｓを、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕへ；Ｍｅｔを、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅへ；Ｐｈｅを、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；および／またはＰｈｅを、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕへ。
【００４８】
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al. (“Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, 1978)によって開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸変異の頻度の分析、Chou and Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978)によって開発された構造形成可能性の分析、およびEisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984)、Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981)およびGoldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986)によって開発されたタンパク質の疎水性パターンの分析に、基づいてもよい；これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ナノボディの一次、二次および三次構造に関する情報は、本明細書の説明および上記で引用した一般的な背景技術に記載されている。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造は、例えば、Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996)、Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996)およびDecanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999)により与えられている。従来のＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬ界面を形成するいくつかのアミノ酸残基、およびこれらの位置での潜在的なラクダ化置換についてのさらなる情報は、上記の先行技術に見出すことができる。
【００４９】
アミノ酸配列および核酸配列は、それらがその全長にわたって１００％の配列同一性（本明細書で定義されるもの）を有する場合、「完全に同一」と言われる。
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸差異（amino acid difference）」は、第２の配列と比較した、第１の配列の位置にある単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１つ、２つまたはそれ以上のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解されている。より具体的には、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸差異」は、ｂ）、ｄ）またはｆ）で特定されるＣＤＲ配列の位置上の、それぞれａ）、ｃ）またはｅ）のＣＤＲ配列と比較した、単一アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す。ｂ）、ｄ）およびｆ）のＣＤＲ配列は、それぞれａ）、ｃ）またはｅ）のＣＤＲ配列と比較して、１、２、３、４または最大５個のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解される。
【００５０】
「アミノ酸差異」は、任意の１、２、３、４または最大５個の置換、欠失または挿入、またはそれらの任意の組み合わせであることができ、これは、本発明のポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤の特性を改善するか、または、本発明のポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤の所望の特性から、または所望の特性のバランスもしくは組み合わせから、少なくとも過度に低減のないものである。この点において、本発明のポリペプチドなどの本発明で得られたＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、１、２、３、４、または最大５つの置換、欠失、または挿入なしの１つ以上のＣＤＲ配列を含むポリペプチドと比較して、少なくとも、同じ、ほぼ同じ、またはより高い親和性でＡＤＡＭＴＳ５に結合すべきである。親和性は、当分野で 知られている任意の適切な方法により測定され得るが、好ましくは、実施例の節に記載の方法により測定される。
【００５１】
この点において、以下に示されるｂ）、ｄ）および／またはｆ）によるＣＤＲのアミノ酸配列は、それ自体知られているかまたは実施例に記載されているような親和性成熟の１つ以上の技術を使用した親和性成熟を用いた、それぞれａ）、ｃ）および／またはｅ）によるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であってよい。例えば、本発明のポリペプチドの発現に使用される宿主生物に応じて、かかる欠失および／または置換は、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（１つ以上のグリコシル化部位など）が削除されるように設計され得、これは当業者の能力の範囲内であろう（実施例を参照）。
本明細書で使用される「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」または「ファミリー」とは、同一の長さを有するナノボディおよび／またはＶＨＨ配列のグループを指し（すなわち、それらはその配列内に同じ数のアミノ酸を有する）、そのうち、位置８と位置１０６（Kabat番号付けによる）の間のアミノ酸配列は、８９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００５２】
互換的に使用可能な用語「エピトープ」および「抗原決定基」とは高分子の一部を指し、例えば免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明のポリペプチドなどの、抗原結合分子によって、より具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドまたはタンパク質である。エピトープは、免疫グロブリンに対する最小結合部位を定義し、したがって免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
エピトープを認識する抗原結合分子（免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明のポリペプチドなど）の一部は、「パラトープ」と呼ばれる。
特定のエピトープ、抗原またはタンパク質（またはその少なくとも一部、断片またはエピトープ）に対して、「結合」または「特異的に結合」できるか、「親和性を有する」か、および／または「特異性を有する」アミノ酸配列（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、抗体、ポリペプチド、または一般にその抗原結合タンパク質またはポリペプチドまたは断片）は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」または「向けられる」と言われるか、またはかかるエピトープ、抗原またはタンパク質に関する「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原または「抗」タンパク質（例えば、「抗」ＡＤＡＭＴＳ５）であると言われる。
【００５３】
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を示す。親和性は通常、ＫＤ、または解離定数として与えられ、これはモル／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性は会合定数ＫＡとして表すこともでき、これは１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫＤ値に関して表される。ＫＡ＝１／ＫＤの関係を考慮して、分子相互作用の強度をそのＫＤ値によって指定することを用いて、対応するＫＡ値を計算できることは、当業者には明らかである。ＫＤ値はまた、分子相互作用の強度を熱力学的意味でも特徴付けるが、これはＫＤ値が、結合の自由エネルギー（ＤＧ）の変化に、よく知られている関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等価的にＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｌｎは自然対数を表す）によって関連するためである。
重要（例えば特異的）と考えられる生物学的相互作用のＫＤは、通常１０−１２Ｍ（０．００１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、ＫＤは低くなる。
【００５４】
ＫＤは、ｋｏｆｆで表される複合体の解離速度定数と、ｋｏｎで表されるその会合速度との比として表すこともできる（したがってＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフレートｋｏｆｆの単位はｓ−１である（ｓは秒のＳＩ単位表記である）。オンレートｋｏｎの単位はＭ−１ｓ−１である。オンレートは、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用の拡散律速会合速度定数に近づく。オフレートは、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによって、特定の分子相互作用の半減期に関連している。オフレートは、１０−６ｓ−１（複数日数のｔ１／２を有する不可逆的な複合体に近い）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
ＩＳＶＤなどの抗原結合タンパク質の、抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイおよび／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野でそれ自体知られているそれらの様々な変形、ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。
【００５５】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の異なる技術によって測定でき、例えば、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術などであり（例えば、Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）ここで、一方の分子はバイオセンサーチップに固定され、もう一方の分子は、ｋｏｎ、ｋｏｆｆの測定、したがってＫＤ（またはＫＡ）値をもたらすフロー条件下で、固定された分子上を通過する。これは例えば、よく知られているBIACORE（登録商標）機器（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）を使用して実行できる。Kinetic Exclusion Assay（KINEXA（登録商標）機器）（Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43）は、結合パートナーの標識なしで溶液中の結合イベントを測定し、複合体の解離を動力学的に除外することに基づいている。溶液内親和性分析はまた、自動化されたバイオ分析と迅速な試料ターンアラウンドのプラットフォームを提供するGYROLAB（登録商標）イムノアッセイシステム（Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）、またはＥＬＩＳＡを使用して実行することもできる。
【００５６】
また、測定プロセスが、例えばある分子のバイオセンサーのコーティングに関連するアーチファクトにより、意味された分子の固有の結合親和性に何らかの影響を与える場合、測定されたＫＤが見かけのＫＤに対応し得ることも当業者には明らかであろう。また、１つの分子が他の分子に対する複数の認識部位を含む場合、見かけのＫＤを測定してもよい。かかる状況において、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合力の影響を受ける可能性がある。特に、ＫＤの正確な測定は非常に労働集約的である可能性があり、その結果、見かけ上のＫＤ値が、２つの分子の結合強度を評価するためにしばしば決定される。すべての測定が一貫した方法で行われる限り（例えば、アッセイ条件を変更しない限り）、見かけのＫＤ測定を真のＫＤの近似値として使用できるため、本書ではＫＤおよび見かけのＫＤは、同等の重要性または関連性で扱うべきである。
【００５７】
「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなど）分子が結合できる、抗原または抗原決定基の異なる種類の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、例えば、WO 08/020079（参照により本明細書に組み込まれる）の５３〜５６頁に記載されているように、親和性および／または結合力に基づいて決定することができ、ここには、抗原結合分子（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなど）と関連抗原の間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術も記載されている。典型的には、抗原結合タンパク質（本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなど）は、解離定数（ＫＤ）として１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、およびより好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルで、それらの抗原に結合する（すなわち、会合定数（ＫＡ）として１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、およびより好ましくは１０８〜１０１２リットル／モル）。１０−４モル／リットルを超える任意のＫＤ値（または１０４リットル／モル未満の任意のＫＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ＩＳＶＤは、所望の抗原に、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満、例えば１０〜５ｐＭ以下などの親和性で、結合するであろう。WO 08/020079の５３〜５６頁の段落（ｎ）も参照されたい。
【００５８】
ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが、別の（第２）標的または抗原と比較して（第１）標的または抗原に「特異的」であると言われるのは、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが第１の抗原に、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合する場合の親和性よりも、（上記のように、およびＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆレートおよび／またはＫｏｎレートとして適切に表現されて）少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍以上の親和性で結合する場合である。例えば、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドは、第１の標的または抗原に、前記ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合するＫＤよりも少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１、および好ましくは少なくとも１０００分の１、またはさらに小さいＫＤ値で、結合し得る。好ましくは、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが、第１の標的または抗原に対して、第２の標的または抗原と比較して「特異的」である場合、（本明細書で定義されるように）これは前記第１の標的または抗原には向けられるが、前記第２の標的または抗原には向けられない。
【００５９】
抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイおよび／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野で知られているそれらの異なる変形、ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。
親和性を評価するために使用できる好ましいアプローチは、Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19)の２ステップＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）手順である。この方法は、液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体への１つの分子の吸着に関連する、起こりうるアーチファクトを回避する。当業者には明らかなように、解離定数は実際のまたは見かけの解離定数であってよい。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えばWO 08/020079の５３〜５６頁に記載されている技術が含まれる。
【００６０】
最後に、多くの状況において、経験ある科学者はある参照分子に対する結合親和性を決定するのが便利であると判断し得ることに、注意すべきである。例えば、分子ＡとＢの間の結合強度を評価するために、例えばＢに結合することが知られており、かつ発蛍光団または発色団または他の化学成分で好適に標識されている、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）または他のフォーマット（蛍光検出用の発蛍光団、光吸収検出用の発色団、ストレプトアビジン媒介ＥＬＩＳＡ検出用のビオチン）についてのビオチンなどで好適に標識されている、参照分子Ｃを使用し得る。通常、参照分子Ｃを固定濃度に維持し、Ａの濃度をＢの特定の濃度または量に対して変化させる。その結果、Ａの不在下でＣについて測定されたシグナルが半分になるところでのＡの濃度に対応する、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ、および参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知である場合、相互作用Ａ−Ｂの見かけのＫＤは、次の式から得られる：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆである場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに注意。ＩＣ５０の測定が、比較される結合剤について一貫した方法で行われる場合（例えば、ｃｒｅｆを固定するなど）、分子相互作用の強度または安定性の違いを、ＩＣ５０を比較することで評価でき、この測定は、このテキスト全体でＫＤまたは見かけのＫＤに等価であると判断される。である場合
【００６１】
半数阻害濃度（ＩＣ５０）はまた、例えば薬理効果などの生物学的または生化学的機能を阻害することにおける、化合物の有効性の尺度でもある。この定量的尺度は、一定の生物学的プロセス（またはプロセスの成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、侵襲性など）を半分に阻害するために必要な、ポリペプチドまたはＩＳＶＤ（ナノボディなど）の量を示す。言い換えれば、これは物質の最大半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）（５０％ＩＣ、またはＩＣ５０）である。ＩＣ５０値は、本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）などの所定のアンタゴニストについて、アゴニストの最大生物学的応答の半分を阻害するために必要な濃度を決定することにより、計算することができる。薬物のＫＤは、用量反応曲線を作成し、本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）などのアンタゴニストの異なる濃度が、アゴニスト活性を逆転させる効果を調べることにより、決定することができる。
【００６２】
半数効果濃度（ＥＣ５０）という用語は、指定された暴露時間の後、ベースラインと最大の中間の反応を引き起こす化合物の濃度を指す。本文脈において、これは、ポリペプチド、ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）の効力の尺度として使用される。段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。濃度は、モル単位で表されることが好ましい。
生物学的システムにおいて、リガンド濃度のわずかな変化は、典型的には、Ｓ字関数に従った急速な応答の変化をもたらす。リガンド濃度の増加に伴う応答の増加が鈍化し始める変曲点が、ＥＣ５０である。これは、適合線の導出によって数学的に決定できる。推定のためにグラフに依存することは、ほとんどの場合に便利である。ＥＣ５０が実施例の節で提供されている場合、実験は、ＫＤを可能な限り正確に反映するように設計されている。すなわち、ＥＣ５０値はＫＤ値と見なされる。用語「平均ＫＤ」は、少なくとも１回、しかし好ましくは１回より多くの、例えば少なくとも２回の実験で得られた、平均ＫＤ値に関する。「平均」という用語は、数学用語の「平均」（データの合計をデータのアイテムの数で割ったもの）を指す。
【００６３】
これはまた、化合物の阻害（５０％阻害）の尺度であるＩＣ５０にも関連している。競合結合アッセイおよび機能的アンタゴニストアッセイの場合、ＩＣ５０は用量反応曲線の最も一般的な要約測度である。アゴニスト／刺激剤アッセイの場合、最も一般的な要約測度はＥＣ５０である。
阻害定数（Ｋｉ）は、阻害剤がどれだけ強力かを示す指標である；これは、半数阻害をもたらすのに必要な濃度である。実験条件に応じて変化するＩＣ５０とは異なり、Ｋｉは絶対値であり、しばしば薬物の阻害定数と呼ばれる。阻害定数Ｋｉは、次のCheng-Prusoff方程式を使用して計算できる：
【数１】
2020525410.tif 000003
式中、［Ｌ］はリガンドの固定濃度である。
【００６４】
本明細書で使用される、本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの「効力」という用語は、その特定の効果が生じるのに必要な本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの量の関数である。これは、本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤが、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節および／または部分的もしくは完全に阻害する能力を指す。より具体的には、前記ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの、本明細書で定義されるＡＤＡＭＴＳ５活性を低下させるか、または完全に阻害する能力を指す場合がある。したがってこれは、前記ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの、ＡＤＡＭＴＳ５の活性、例えばタンパク質分解などの酵素活性、例えばプロテアーゼ活性および／またはエンドペプチダーゼ活性を、ならびにアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンを含むがこれらに限定されない基質の結合を、好ましくはアグリカンの切断を、阻害する能力を指し得る。前記ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤは、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５のアグリカナーゼ活性に拮抗する。効力は、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている任意の適切なアッセイによって測定され得る。本明細書で使用される「アグリカナーゼ活性」は、アグリカンのタンパク質分解的切断として定義される。
【００６５】
本発明のポリペプチドの「有効性」は、効果自体の最大強度を、飽和ポリペプチド濃度において測定する。有効性は、本発明のポリペプチドから達成可能な最大応答を示す。これは、ポリペプチドが所望の（治療）効果を生み出す能力を指す。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５に、例えばGyrolabまたはKinExAによって決定される場合、ＫＤとして１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍなどで、結合する
【００６６】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えば結合ＥＬＩＳＡによって決定される場合、ＥＣ５０として１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５を調節する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートとして５Ｅ−０４ｓ−１未満、例えば１Ｅ−０４ｓ−１または５Ｅ−０５ｓ−１未満、またはさらに１Ｅ−０５ｓ−１未満で、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばヒトFRETアッセイまたはヒトAlphaLISAによって決定される場合、ＩＣ５０として１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を阻害する。
【００６７】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、ＩＣ５０として最大１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍ、５Ｅ−０９Ｍ、または４Ｅ−９Ｍ、３Ｅ−９Ｍ、２Ｅ−９Ｍ、例えば１Ｅ−９Ｍなどで、ＡＤＡＭＴＳ５の酵素活性を阻害する。
ＩＳＶＤまたはポリペプチドなどのアミノ酸配列が、２つの異なる抗原または抗原決定基（例えば、哺乳類の異なる種からのＡＤＡＭＴＳ５、例えばヒトＡＤＡＭＴＳ５、ウシＡＤＡＭＴＳ５、ラットＡＤＡＭＴＳ５、モルモットＡＤＡＭＴＳ５、マウスＡＤＡＭＴＳ５、またはカニクイザルＡＤＡＭＴＳ５など）に対して「交差反応性である」と言われるのは、これが、これらの異なる抗原または抗原決定基に特異的（本明細書で定義のように）である場合である。ＩＳＶＤまたはポリペプチドは、２つの異なる抗原に対する結合親和性が、２、５、１０、５０、１００倍またはそれ以上に異なる可能性があっても、これらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書で定義されるように）特異的であれば、交差反応性であると考えられることが理解されよう。
【００６８】
ＡＤＡＭＴＳ５は、ＡＤＡＭＴＳ１１、ＡＤＭＰ−２、またはアグリカナーゼ２とも呼ばれる。
ＡＤＡＭＴＳ５の関連する構造情報は、例えば、以下の表１に示すように、UniProtアクセッション番号に見出すことができる（表Ｂを参照）。
表１
【表１】
2020525410.tif 000004
【００６９】
「ヒトＡＤＡＭＴＳ５」とは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＡＤＡＭＴＳ５を指す。一側面において、本発明のポリペプチドは、Human sapiens、Mus musculus、Cavia Porcellus、Bos taurus、Macaca mulattaおよび/またはRattus norvegicusからのＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ５、好ましくは配列番号１４９に特異的に結合する。
用語「（交差）ブロックする」、「（交差）ブロックされた」、「（交差）ブロッキング」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合すること」および「（交差）競合」は本明細書において互換的に使用され、免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤が、他の免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは結合剤の所定の標的への結合を妨害する能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤が標的への別の結合を妨げることができる程度、したがって、本発明に従って交差ブロックすると言うことができるかどうかは、当技術分野で一般的な競合結合アッセイを使用して、例えば、精製されたＩＳＶＤを、競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上に提示されたＩＳＶＤに対してスクリーニングすることによる等で、決定することができる。特に適切な定量的交差ブロッキングアッセイには、ＥＬＩＳＡが含まれる。
【００７０】
標的（交差）ブロックに向けられた免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチド、または他の結合剤が、本明細書で定義されるように（交差）ブロッキングが可能か、競合的に結合するか、または（交差）競合するかを決定するための他の方法は、例えば実施例の節で説明されているような、ＳＰＲベースの「サンドイッチアッセイ」によって評価することができる。他の適切な方法は、例えばXiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91‐98, 2004)、Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118‐125, 2011)に説明されている。
したがって本発明は、本明細書に記載の、例えば配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８（表Ａ−１を参照）で表されるポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えば競合ＥＬＩＳＡによって決定されるように、交差ブロッキングポリペプチドと競合する。
【００７１】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドと競合する、ポリペプチドなどの競合物質を決定する方法に関し、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８のいずれかによって表され、ここで本明細書に記載のポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５への、例えばヒトＡＤＡＭＴＳ５（配列番号１４９）への結合について、ポリペプチドなどの競合物質と競合するか、またはこれを交差ブロックし、ここで、競合物質のＡＤＡＭＴＳ５への結合は、本発明のポリペプチドの存在下において、本発明のポリペプチドの不在下における競合物質のＡＤＡＭＴＳ５への結合と比較して、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば８０％、９０％または１００％、低減される（すなわち、特定のアッセイでは実質的に検出不能）。競合および交差ブロッキングは、例えば競合ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳアッセイなどの当技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。一側面において、本発明は、本発明のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８で表される少なくとも１つのポリペプチドのＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックするか、および／または、そのＡＤＡＭＴＳ５への結合が、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８で表される少なくとも１つのポリペプチドによって、交差ブロックされている。
【００７２】
本発明はまた、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８などの本明細書に記載のポリペプチドと競合する、競合物質に関し、ここで競合物質は、ＡＤＡＭＴＳ５への結合について本明細書に記載のポリペプチドと競合または交差ブロックし、ここで本発明のポリペプチドのＡＤＡＭＴＳ５への結合は、前記競合物質の存在下において、前記競合物質の不在下における本発明のポリペプチドによるＡＤＡＭＴＳ５への結合と比較して、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上、例えば８０％、またはさらにそれ以上、例えば少なくとも９０％または１００％、低減される（すなわち、特定のアッセイでは実質的に検出不能）。一側面において、本発明は、ポリペプチドであって、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８の１つなどの本発明のポリペプチドによるＡＤＡＭＴＳ５への結合を、交差ブロックするか、および／または、ＡＤＡＭＴＳ５への結合が、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８の少なくとも１つなどの本発明のポリペプチドによって、交差ブロックされている、前記ポリペプチドに関し、ここで好ましくは、前記ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、またはＩＳＶＤを含み、かつＡＤＡＭＴＳ５への結合は、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節する。
【００７３】
「ＡＤＡＭＴＳ５活性」および「ＡＤＡＭＴＳ５の活性」（これらの用語は、本明細書では互換的に使用される）には、限定はされないが、タンパク質分解などの酵素活性、例えばプロテアーゼ活性（プロテイナーゼまたはペプチダーゼ活性とも呼ばれる）、およびエンドペプチダーゼ活性、ならびに例えば基質の認識および／または結合などの、エキソサイトによる活性、例えばディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型様（ＴＳ）リピート、システインリッチドメイン、スペーサー領域および／または追加のＴＳモチーフによるもの、が含まれる。ＡＤＡＭＴＳ５活性には、ヒアルロナン結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）細胞外タンパク質などの基質、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、およびビグリカンなどの、結合および／またはタンパク質分解が含まれる。本明細書で使用される場合、タンパク質分解とは、タンパク質の、より小さなポリペプチドまたはアミノ酸への分解であって、ポリペプチド鎖においてアミノ酸を一緒に連結するペプチド結合の加水分解によるものである。
【００７４】
本発明の文脈において、「調節すること」または「調節する」とは、一般に、適切なin vitro、細胞またはin vivoアッセイ（例えば、本明細書で言及されるものなど）を使用して測定される、ＡＤＡＭＴＳ５による活性の変化を意味する。特に、「調節すること」または「調節する」とは、適切なin vitro、細胞またはin vivoアッセイ（例えば、本明細書で言及されるものなど）を使用して測定されるＡＤＡＭＴＳ５の活性を、同じアッセイにおいて、同じ条件下であるが本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチドが存在しない場合のＡＤＡＭＴＳ５の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上、低下または阻害するか、または活性を増加させることを意味し得る。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節し、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５の活性を阻害する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５のプロテアーゼ活性を阻害する、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなどの基質のタンパク質分解を阻害する。
【００７５】
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５の基質への結合、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなどの基質への結合をブロックし、ここで前記基質は、好ましくはアグリカンである。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＥＬＩＳＡで決定される、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカンへの結合を、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、ブロックする。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５の活性に拮抗またはこれを阻害し、例えば（ｉ）プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなどの切断、好ましくはアグリカンの切断；好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカナーゼ活性に、拮抗またはこれを阻害し；（ｉｉ）基質のＡＤＡＭＴＳ５への結合、例えばＡＤＡＭＴＳ５のエキソサイト例えばディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型様（ＴＳ）リピート、システインリッチドメイン、スペーサー領域または追加のＴＳモチーフなどへの結合に、拮抗またはこれを阻害する。
【００７６】
したがって、本発明は、明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５のプロテアーゼ活性を、例えば酵素阻害アッセイまたは実施例の節に記載のような当技術分野で知られている任意の適切な方法で測定した場合に、好ましくは少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、阻害する。
ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭＴＳ、およびＭＭＰは、配列および全体の形状の両方で非常に類似している、アグリカンへの結合部位を共有し、例えばＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインは高度の配列類似性を共有するが、本発明者らは、実施例の節で実証するように、標的特異的なＩＳＶＤを同定することができた。標的特異性はまた、広域スペクトル阻害剤によって引き起こされる副作用である筋骨格症候群を、回避するか、少なくとも制限する。
【００７７】
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤおよびポリペプチドなどのＡＤＡＭＴＳ５結合剤に関し、ここで該ＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＭＭＰ１および／またはＭＭＰ１４（膜型）に結合しない。好ましくは、本発明は、本明細書で定義されるポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ４、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４に結合しない。
特に明記しない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体または従来の４鎖抗体を指すために使用されるかどうかにかかわらず、フルサイズの抗体、その個々の鎖の両方、ならびにそのすべての部分、ドメインまたは断片（それぞれ、抗原結合ドメインまたは断片、例えばＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどを含むが、これらに限定されない）を含む一般用語として使用される。
【００７８】
本明細書で使用される（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは無関係にその三次構造を保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般にドメインはタンパク質の個別の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの機能を失うことなく、他のタンパク質に追加、除去、または転送されることができる。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４鎖抗体または重鎖抗体の鎖など）、またはかかる球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持するという特徴があり、これは、２つのβシートに配置された約７つの逆平行β鎖の２層サンドイッチで構成され、任意に、保存されたジスルフィド結合によって安定化される。
【００７９】
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、これらは当技術分野および本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれる；当該フレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断され、これらは当技術分野および本明細書の以下では、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４のように示され得る。抗原結合部位を保有することにより、抗体に抗原に対する特異性を付与するのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
【００８０】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（本明細書では「ＩＳＶＤ」または「ＩＳＶ」と略す）は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、これは、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上にあり、かつ単一免疫グロブリンドメインによって形成されている分子を定義する。このため免疫グロブリン単一可変ドメインは、「従来の」免疫グロブリンまたはその断片とは別に設定され、ここで２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成する。通常、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して、抗原結合部位を形成する。後者の場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与する、すなわち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与する。
【００８１】
上記の定義を考慮して、従来の４鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など；当技術分野で既知）またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合ＦｖまたはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片、またはかかる従来の４鎖抗体に由来するダイアボディ（すべて当技術分野で知られている）の、抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインと見なされないが、その理由は、これらの場合、抗原の各エピトープへの結合が、通常１つの（単一）免疫グロブリンドメインではなく、一対の（関連する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインなどによって、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに共同して結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬペアによって、生じるからである。
対照的にＩＳＶＤは、追加の免疫グロブリン可変ドメインとペアリングすることなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＩＳＶＤの結合部位は、単一のＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインによって形成される。したがって、ＩＳＶＤの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。
【００８２】
そのため、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）またはその適切な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列またはＶＨＨ配列）またはその適切な断片であってよいが、ただし、単一の抗原結合単位（すなわち機能的抗原結合単位；これは単一の可変ドメインから本質的になり、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して機能性抗原結合単位を形成する必要はない）を形成できる限りにおいてである。
本発明の一態様において、ＩＳＶＤは重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）である；より具体的には、ＩＳＶＤは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００８３】
例えば、ＩＳＶＤは、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」またはｄＡｂ（またはｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸）、またはナノボディ（本明細書で定義され、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、またはそのいずれかの適切な断片であってよい。
特に、ＩＳＶＤは、Nanobody（登録商標）（本明細書で定義）またはその適切な断片であり得る。［注：Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）およびNanoclone（登録商標）は、Ablynx N.Vの登録商標である。］ナノボディの一般的な説明については、以下の詳細な説明、および本明細書で引用した先行技術、例えばWO 08/020079（１６頁）に記載されている。
【００８４】
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても知られる「ＶＨＨドメイン」は、元々「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」の；Hamers-Casterman et al. 1993 Nature 363: 446-448）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記述されてきた。用語「ＶＨＨドメイン」が選択されたのは、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と呼ばれる）から、および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するためである。ＶＨＨおよびナノボディの詳細については、Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)のレビュー、および一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願を参照する： Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079およびWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231およびWO 02/48193； Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016およびWO 03/055527；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のWO 03/050531；National Research Council of Canada によるWO 01/90190；Institute of AntibodiesによるWO 03/025020 (= EP 1433793)；ならびにAblynx N.V.によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787およびWO 06/122825、およびAblynx NVによるさらなる公開された特許出願。これらの出願で言及されたさらなる先行技術、特に国際出願WO 06/040153の４１〜４３頁の参考文献のリストも参照；そのリストおよび参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの参考文献に記載されているように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分ヒト化ナノボディ）は、１つ以上のフレームワーク配列に１つ以上の「ホールマーク残基」が存在することによって、特に特徴付けられる。ナノボディのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分または断片、誘導体または「ナノボディ融合」、多価構築物（リンカー配列の非限定的な例を含む）、およびナノボディの半減期を延ばすための異なる修飾およびその調製を含む、ナノボディのさらなる説明は、例えばWO 08/101985およびWO 08/142164に見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な説明については、本明細書で引用される先行技術、例えばWO 08/020079（１６頁）の記載を参照する。
【００８５】
特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤に存在するフレームワーク配列は、本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤がナノボディであるように、１つ以上のホールマーク残基を含んでもよい（例えば、WO 08/020079（表Ａ−３からＡ−８）に記載のように）。かかるフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）のいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書のさらなる開示から明らかになる（例えば、表Ａ−２を参照）。一般に、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的ヒト化ナノボディ）は、１つ以上のフレームワーク配列における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在によって、特に特徴付けることができる（例えば、WO 08/020079、６１頁２４行目から９８頁３行目にさらに記載されているように）。
【００８６】
より詳細には、本発明は、次の（一般的な）構造を有するアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ＡＤＡＭＴＳ５結合剤を提供する：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ここにおいてＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を指し、および前記免疫グロブリン単一可変ドメインは：
ｉ）配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８（表Ａ−１を参照）のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸の同一性の程度を決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される。この点において表Ａ−２も参照し、この表は、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５または１８の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号７２〜８４）、フレームワーク２配列（配列番号８５〜９４）、フレームワーク３配列（配列番号９５〜１１３）を列挙する；または、
ｉｉ）表Ａ−２に示すフレームワーク配列の組み合わせ；
およびここで：
ｉｉｉ）好ましくは、Kabatの番号付けによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８における１つ以上のアミノ酸残基は、例えばWO 08/020079の表Ａ−３から表Ａ−８に記載されているようなホールマーク残基から選択される。
【００８７】
本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤はまた、すべて「改良された免疫グロブリン可変ドメイン」と題された以下の同時係属米国仮出願に記載された特定の変異／アミノ酸残基を含み得る：２０１４年５月１６日出願のUS 61/994552；２０１４年６月１８日出願のUS 61/014,015；２０１４年８月２１日出願のUS 62/040,167；２０１４年９月８日出願のUS 62/047,560（すべてAblynx N.V.に割り当てられている）。
特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、以下を好適に含有し得る：（ｉ）位置１１２にＫまたはＱ；または（ｉｉ）位置１１のＶと組み合わせた、位置１１０のＫまたはＱ；または（ｉｉｉ）位置８９のＴ；または（ｉｖ）位置８９のＬおよび位置１１０のＫまたはＱ；または（ｖ）位置１１のＶおよび位置８９のＬ；または（ｉ）〜（ｖ）の適切な組み合わせ。
【００８８】
前記同時係属米国仮出願にも記載されているように、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤が、上記（ｉ）から（ｖ）の１つ（またはその適切な組み合わせ）に従った変異を含む場合：
−位置１１のアミノ酸残基は、好ましくはＬ、Ｖ、またはＫから選択される（およびＶが最も好ましい）；および／または
−位置１４のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから適切に選択される；および／または
−位置４１のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから適切に選択される；および／または
−位置８９のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＶまたはＬから適切に選択される；および／または
−位置１０８のアミノ酸残基は、好ましくはＱまたはＬから適切に選択される；および／または
−位置１１０のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから適切に選択される；および／または
−位置１１２のアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから適切に選択される。
【００８９】
前記同時係属米国仮出願で述べたように、前記の変異は、いわゆる「既存の抗体」の、本発明の免疫グロブリンおよび化合物への結合を防止または低減するのに有効である。この目的のために、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤はまた、（任意に前記変異と組み合わせて）Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを含み得る（式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；および各Ｘは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選択される）、例えば、米国仮出願およびWO 12/175741を参照。特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、タンパク質、ポリペプチドまたはこれらを含む他の化合物もしくは構築物のＣ末端を形成する場合、かかるＣ末端伸長を含み得る（例えば、前述の米国仮出願およびWO 12/175741を参照）。
【００９０】
本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、任意の適切な様式で任意の適切な供給源に由来する免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインであり得、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の適切な種由来）または、合成または半合成アミノ酸配列であって、「ヒト化」（本明細書で定義）ナノボディまたはＶＨＨ配列、「ラクダ化」（本明細書で定義）免疫グロブリン配列（および特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）を含むがこれらに限定されないもの、ならびに、親和性成熟（例えば、合成、ランダム、または天然の免疫グロブリン配列から開始）、ＣＤＲグラフト、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組み合わせ、オーバーラッププライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術などの手法によって得られたナノボディ；または、本明細書でさらに説明する前述のいずれかの適切な組み合わせであってよい。また、免疫グロブリンがＶＨＨ配列を含む場合、本明細書でさらに説明するように、前記免疫グロブリンを適切にヒト化して、本発明の１つ以上のさらなる（部分的または完全な）ヒト化免疫グロブリンを提供してもよい。同様に、免疫グロブリンが合成または半合成配列（部分的ヒト化配列など）を含む場合、前記免疫グロブリンを任意にさらに適切にヒト化して、再度、本明細書に記載されるように、再度、１つ以上のさらなる（部分的または完全な）本発明のヒト化免疫グロブリンを提供する。
【００９１】
「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「Domain Antibodies」、および「dAbs」（「Domain Antibodies」および「dAbs」は、GlaxoSmithKlineグループの商標として使用されている）としても知られ、例えば以下に記載されている：EP 0368684、Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989)、Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003)およびWO 03/002609ならびに例えばWO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388；およびDomantis Ltdの他の公開特許出願。ドメイン抗体は本質的に、非ラクダ科哺乳類のＶＨまたはＶＬドメイン、特にヒト４鎖抗体に対応する。エピトープを単一の抗原結合ドメインとして、すなわちＶＬまたはＶＨドメインとそれぞれペアリングせずに結合するために、かかる抗原結合特性の特異的な選択が必要となり、例えばヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリを使用することによる。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様に約１３から約１６ｋＤａの分子量を有し、完全にヒト配列に由来する場合、例えばヒトにおける治療的使用のためにはヒト化を必要としない。
【００９２】
哺乳動物起源ではないために本発明の文脈ではあまり好ましくないが、単一可変ドメインは、ある種のサメに由来し得ることにも留意されたい（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えばWO 05/18629を参照）。
本発明は特にＩＳＶＤに関し、ここで該ＩＳＶＤは、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよびラクダ化ＶＨからなる群から選択される。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)によるＶＨドメインの一般的な番号付けに従って、例えばRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)の図２に示されるように、ラクダのＶＨＨドメインに適用されたものと同様になされる；これらはすべて当技術分野で知られている。ＶＨドメインのアミノ酸残基に番号付けする代替方法は、同様の方法でＶＨＨドメインにも適用することができ、当技術分野で知られている。しかし、本明細書、特許請求の範囲、および図面では、特に明記しない限り、上記のようにＶＨＨドメインに適用されるKabatによる番号付けに従う。
【００９３】
ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当技術分野で周知のように、各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は変化する可能性があり、Kabatの番号付けにより示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合があることに、留意すべきである（すなわち、Kabat番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列で占有されていないか、または実際の配列がKabat番号付けで許容されている数よりも多くのアミノ酸残基を含む場合がある）。これは一般に、Kabatによる番号付けは、実際の配列内のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合と対応しない場合があることを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０、多くの場合１１２〜１１５の範囲にあるだろう。しかし、より小さな配列およびより長い配列もまた、本書に記載の目的に適する可能性があることに注意すべきである。
【００９４】
ＣＤＲに関しては、当技術分野でよく知られているように、Kabatの定義（これは配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている）およびChothiaの定義（これは構造ループ領域の位置に基づいている）などの、ＶＨまたはＶＨＨ断片のＣＤＲを定義および説明するための複数の規則がある。例えば、ウエブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/を参照。本明細書および特許請求の範囲の目的のために、ＣＤＲは、最も好ましくはＡｂｍ定義に基づいて定義され（これは、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づいている）、これはKabat定義とChothia定義の間の最適な妥協案であると考えられている（参照：http://www.bioinf.org.uk/abs/）。本明細書で使用する場合、ＦＲ１はアミノ酸残基を位置１〜２５に含み、ＣＤＲ１はアミノ酸残基を位置２６〜３５含み、ＦＲ２はアミノ酸を位置３６〜４９に含み、ＣＤＲ２はアミノ酸残基を位置５０〜５８に含み、ＦＲ３はアミノ酸残基を位置５９〜９４に含み、ＣＤＲ３はアミノ酸残基を位置９５〜１０２に含み、ＦＲ４はアミノ酸残基を位置１０３〜１１３に含む。
本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒト源、好ましくはラクダ科動物、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。本明細書に記載されるように、それらはヒト化されてもよい。さらにこの用語は、非ラクダ科の供給源、例えばマウスまたはヒトであって、本明細書に記載されるように「ラクダ化」されたものに由来する、ポリペプチドを含む。
【００９５】
したがって、ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤは、ヒト化の対象となる場合がある。特に、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化ＩＳＶＤは、本明細書で一般的に定義されるＩＳＶＤであり得るが、ここで少なくとも１つのアミノ酸残基が（特に、フレームワーク残基の少なくとも１つに）存在し、これはヒト化置換（本明細書で定義のように）であるか、および／またはそれに対応する。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することで確認でき、その後、こうして決定された1つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（またはその組み合わせ）は、前記ＶＨＨ配列に導入され得（本明細書でさらに説明されるように、それ自体既知の任意の様式によって）、得られたヒト化ＶＨＨ配列は、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さおよびレベル、および／またはその他の所望の特性について、試験され得る。このようにして、限られた程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（またはその適切な組み合わせ）が、本明細書の開示に基づき当業者によって決定され得る。また、上記に基づいて、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤ（のフレームワーク領域）は、部分的にヒト化または完全にヒト化されてもよい。
【００９６】
本発明の別の特に好ましいクラスのＩＳＶＤは、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、ただし「ラクダ化」されているアミノ酸配列を有するＩＳＶＤを含み、ここで「ラクダ化」されているとは、すなわち従来の４本鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が、重鎖抗体のＶＨＨドメイン内の対応する位置にある１つ以上のアミノ酸残基で置換されることによる。これは、それ自体既知の様式で実行することができ、当業者には、例えば本明細書の説明に基づいて明らかであろう。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義されるように、ＶＨ−ＶＬ界面を形成するおよび／またはそこに存在するアミノ酸位置、および／または、いわゆるラクダ科のホールマーク残基に、挿入される（例えば、WO 94/04678およびDavies and Riechmann (1994 and 1996)も参照）。好ましくは、ラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインを生成または設計するための出発材料または出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかし、本発明のかかるラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインは、それ自体既知の任意の適切な様式で得ることができ、したがって、天然のＶＨドメインを含むポリペプチドを出発材料として使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されるのではないことに、留意されたい。以下を参照：Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994；Biotechnol. 13: 475-479, 1995；Prot. Eng. 9: 531-537, 1996)およびRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)。
【００９７】
例えば本明細書でさらに説明するように、「ヒト化」および「ラクダ化」は共に、次のように実施することができる：天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインそれぞれをコードするヌクレオチド配列を提供し、次いで、それ自体既知の様式で、前記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変更して、新しいヌクレオチド配列がそれぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」ＩＳＶＤをコードするようにすること。次いでこの核酸をそれ自体既知の様式で発現させて、本発明の所望のＩＳＶＤを提供することができる。代替的に、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列それぞれに基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ＩＳＶＤのアミノ酸配列をそれぞれ設計し、それ自体知られているペプチド合成の技術を使用してde novoで合成することができる。また、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列それぞれに基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ＩＳＶＤをそれぞれコードするヌクレオチド配列を設計し、次に、それ自体既知の核酸合成の技術を使用してde novoで合成することができ、その後、こうして得られた核酸をそれ自体既知の様式で発現させて、本発明の所望のＩＳＶＤを提供することができる。
【００９８】
ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインおよびヒト化ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤはまた、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に１つ以上の変更を導入することで親和性成熟させることができ、この変更は、それぞれの親分子と比較して、そのそれぞれの抗原について得られたＩＳＶＤに改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟ＩＳＶＤ分子は、当技術分野で 知られている方法によって調製することができ、例えば以下に記載されている：Marks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992)、Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994)、Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995)、Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995)、Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995)、Hawkins et al. (J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992)、Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)。
【００９９】
ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ドメイン抗体またはナノボディなどのＩＳＶＤから開始して、ポリペプチドを設計／選択および／または調製するプロセスは、本明細書では前記ＩＳＶＤを「フォーマットする」とも呼ばれる；ポリペプチドの一部を作るＩＳＶＤは、「フォーマットされた」または「そのフォーマットの」ポリペプチドであると言われる。ＩＳＶＤがフォーマットされ得る方法の例およびかかるフォーマットの例は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであろう；かかるフォーマットされた免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる側面を形成する。
好ましいＣＤＲを、表Ａ−２に示す。
【０１００】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４；および
配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２；および
配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０；および
配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される。
【０１０１】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、
（ａ）配列番号２２；および
（ｂ）配列番号２２と１、２、３、４、５または６個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列；
からなる群から選択され、ここで
−位置２においてＳはＲに変更されており；
−位置３においてＡはＴに変更されており；
−位置４においてＶはＦに変更されており；
−位置６においてＶはＳに変更されており；
−位置７においてＮはＹに変更されており；および／または
−位置１０においてＡはＧに変更されており；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は配列番号３６であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は配列番号５４である。
【０１０２】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号３３であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、
（ｃ）配列番号５０；および
（ｄ）配列番号５０と１、２、または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列；
からなる群から選択され、ここで、
−位置８においてＭはＩに変更されており；
−位置９においてＰはＴに変更されており；および／または
−位置１０においてＹはＦに変更されており；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
（ｅ）配列番号６８；および
（ｆ）配列番号６８と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列：
からなる群から選択され、ここで
−位置５においてＦはＬに変更されており；および／または
−位置１１においてＤはＥに変更されている。
【０１０３】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号２８であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、
（ｃ）配列番号４４；および
（ｄ）配列番号４４と１、２、または３個のアミノ酸の差を有するアミノ酸配列；
からなる群から選択され、ここで
−位置３においてＳはＴに変更されており；
−位置４においてＲはＷに変更されており；
−位置８においてＴはＩに変更されており；および／または
−位置９においてＴはＬに変更されており；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
（ｅ）配列番号６２；および
（ｆ）配列番号６２と１または２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列；
からなる群から選択され、ここで
−位置１においてＧはＳに変更されており；および／または
−位置１４においてＤはＥに変更されている。
【０１０４】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
−ＣＤＲ１は、配列番号２１、３５、２０、２２、２５、３３、２８、２４、２３、２６、２７、２９、３０、３１、３２および３４からなる群から選択され；
−ＣＤＲ２は、配列番号３７、５３、３６、４０、５０、５１、４４、４５、４３、３９、３８、４１、１１９、４２、４６、４７、４８、４９および５２からなる群から選択され；および
−ＣＤＲ３は、配列番号５５、１１８、７１、５４、５８、６８、６９、６２、６３、６１、５７、５６、５９、６０、６４、６５、６６、６７および７０からなる群から選択される。
【０１０５】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで該ＩＳＶＤは、ＩＳＶＤの群から選択され、ここで：
ＣＤＲ１は配列番号２１であり、ＣＤＲ２は配列番号３７であり、ＣＤＲ３は配列番号５５である；
ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５３であり、ＣＤＲ３は配列番号１１８である；
ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号５３であり、ＣＤＲ３は配列番号７１である；
ＣＤＲ１は配列番号２０であり、ＣＤＲ２は配列番号３６であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
ＣＤＲ１は配列番号２２であり、ＣＤＲ２は配列番号３６であり、ＣＤＲ３は配列番号５４である；
ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号４０であり、ＣＤＲ３は配列番号５８である；
ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号５０であり、ＣＤＲ３は配列番号６８である；
ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号５１であり、ＣＤＲ３は配列番号６９である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４４であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４５であり、ＣＤＲ３は配列番号６３である；
ＣＤＲ１は配列番号２８であり、ＣＤＲ２は配列番号４３であり、ＣＤＲ３は配列番号６１である；
ＣＤＲ１は配列番号２４であり、ＣＤＲ２は配列番号３９であり、ＣＤＲ３は配列番号５７である；
ＣＤＲ１は配列番号２３であり、ＣＤＲ２は配列番号３８であり、ＣＤＲ３は配列番号５６である；
ＣＤＲ１は配列番号２６であり、ＣＤＲ２は配列番号４１であり、ＣＤＲ３は配列番号５９である；
ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１９であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
ＣＤＲ１は配列番号２７であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、ＣＤＲ３は配列番号６０である；
ＣＤＲ１は配列番号２９であり、ＣＤＲ２は配列番号４６であり、ＣＤＲ３は配列番号６４である；
ＣＤＲ１は配列番号３０であり、ＣＤＲ２は配列番号４７であり、ＣＤＲ３は配列番号６５である；
ＣＤＲ１は配列番号３１であり、ＣＤＲ２は配列番号４８であり、ＣＤＲ３は配列番号６６である；
ＣＤＲ１は配列番号３２であり、ＣＤＲ２は配列番号４９であり、ＣＤＲ３は配列番号６７である；および
ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号５２であり、ＣＤＲ３は配列番号７０である。
【０１０６】
特定の好ましい態様において、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここでＣＤＲ１は配列番号２１であるか、またはそれを含み、ＣＤＲ２は配列番号３７であり、ＣＤＲ３は配列番号５５である。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで該ＩＳＶＤは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、８、１１７、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される。
【０１０７】
限定することなく、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチドの調製のための「ビルディングブロック」として使用でき、これは、ビルディングブロックとして（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ５上の同一または別のエピトープに対して、および／またはＡＤＡＭＴＳ５以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質、または標的に対して）機能することができる、１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを任意に含み得ることが、理解されるであろう。
本発明のポリペプチド（本明細書では「ナノボディ構築物」とも示される）は、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤを含み、例えばＡＤＡＭＴＳ５に結合する２つのＩＳＶＤ、および好ましくはアルブミンに結合するＩＳＶＤを含む。本発明のポリペプチドにおいて、ＩＳＶＤは、直接連結されても、リンカーを介して連結されてもよい。さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端伸長を含む。本明細書で詳述するように、Ｃ末端伸長は、ヒト対象／患者のほとんどの試料中の既存の抗体／因子の結合を、本質的に防止／除去する。Ｃ末端伸長は、最後の（最もＣ末端に位置する）ＩＳＶＤの最後のアミノ酸残基（通常はセリン残基）のＣ末端に存在する。
【０１０８】
以下でさらに詳述するように、ＩＳＶＤは、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインに由来し得るが、しかしＩＳＶＤは、本発明のポリペプチドにおいてＶＨおよびＶＬドメインの相補的な対を形成しないように選択される。ナノボディ、ＶＨＨ、およびヒト化ＶＨＨは、軽鎖を有しない天然のラクダ抗体に由来するという点で珍しく、実際これらのドメインは、ラクダ科の軽鎖と会合して相補的なＶＨＨとＶＬの対を形成することができない。したがって、本発明のポリペプチドは、相補的ＩＳＶＤを含まず、および／または例えば相補的ＶＨ／ＶＬ対などの相補的ＩＳＶＤ対を形成しない。
一般に、単一のビルディングブロック、単一のＩＳＶＤまたは単一のナノボディを含むかまたは本質的にそれらからなるポリペプチドまたは構築物は、本明細書においてそれぞれ「一価」ポリペプチドおよび「一価構築物」と呼ばれる。２つ以上のビルディングブロック（例えばＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドまたは構築物は、本明細書において「多価」ポリペプチドまたは構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドまたは構築物に存在するビルディングブロック／ＩＳＶＤは、本明細書において、「多価フォーマット」であると言及される。例えば、「二価」ポリペプチドは、リンカー配列を介して任意に連結された２つのＩＳＶＤを含み得るが、「三価」ポリペプチドは、２つのリンカー配列を介して任意に連結された３つのＩＳＶＤを含み得；一方、「四価」ポリペプチドは、３つのリンカー配列を介して任意に連結された４つのＩＳＶＤを含み得る、などである。
【０１０９】
多価ポリペプチドにおいて、２つ以上のＩＳＶＤは同一でも異なっていてもよく、同じ抗原または抗原決定基に対して（例えば、エピトープの同一部分またはエピトープの異なる部分に対して）向けられてもよく、または代替的に、異なる抗原または抗原決定基、またはそれらの任意の適切な組み合わせに向けられてもよい。少なくとも２つのビルディングブロック（例えば、ＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドおよび構築物であって、ここで少なくとも１つのビルディングブロックは第１の抗原（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ５）に向けられ、少なくとも１つのビルディングブロックは第２の抗原（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ５とは異なるもの）に向けられるものは、「多重特異性」ポリペプチドおよび構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドおよび構築物に存在するビルディングブロック（例えばＩＳＶＤなど）は、本明細書において「多重特異性フォーマット」とも呼ばれる。したがって、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＡＤＡＭＴＳ５）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤ、および第２の抗原（すなわちＡＤＡＭＴＳ５とは異なる）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであり、一方、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＡＤＡＭＴＳ５）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤ、第２の抗原（すなわちＡＤＡＭＴＳ５とは異なる）に向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤ、および少なくとも第３の抗原（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ５と第２の抗原の両方とは異なる）に向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤを含むポリペプチドである、など。
【０１１０】
一側面において、本発明は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで少なくとも１つのＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、より好ましくは配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される。
一側面において、本発明は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、より好ましくは前記２つのＩＳＶＤの各ＩＳＶＤは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から独立して選択される。
「多重パラトピック」ポリペプチドおよび「多重パラトピック」構築物、例えば「二重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物および「三重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物は、それぞれ異なるパラトープを有する２つ以上のビルディングブロックを含むか、本質的にそれらからなる。
【０１１１】
したがって、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する本発明のＩＳＶＤは、本質的に単離された形態（本明細書で定義）であることができ、または、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する１つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなり得、かつ任意にさらに１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含み得る（すべて任意に１つ以上の適切なリンカーを介して連結される）構築物またはポリペプチドの、一部を形成し得る。本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する本発明の１つ以上のＩＳＶＤ（またはその適切な断片）などの、本発明による少なくとも１つのＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる、ポリペプチドまたは構築物に関する。
本発明の１つ以上のＩＳＶＤは、かかるポリペプチドまたは構築物中のビルディングブロックとして使用され、すべて本明細書に記載される本発明の一価、多価または多重パラトピックポリペプチドまたは構築物を提供する。したがって本発明はまた、本発明の一価ポリペプチドまたはＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる、一価構築物であるポリペプチドに関する。
【０１１２】
したがって本発明は、例えば、本発明の２つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれらからなる二価または三価ポリペプチドまたは構築物などの、多価ポリペプチドまたは多価構築物であるポリペプチドまたは構築物にも関する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多価および多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製については、Conrath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001)、ならびに例えばWO96/34103、WO99/23221およびWO 2010/115998も参照）。
【０１１３】
一側面において、その最も単純な形態において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、およびＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの同一の第２のＩＳＶＤを含む、本発明の二価ポリペプチドまたは構築物であり、ここでナノボディなどの前記第１および前記第２のＩＳＶＤは、リンカー配列（本明細書で定義される）を介して任意に連結されてもよい。別の形態において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの同一の第２のＩＳＶＤ、およびＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの同一の第３のＩＳＶＤを含む、本発明の三価ポリペプチドまたは構築物であり、ここでナノボディなどの前記第１、第２および第３のＩＳＶＤは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して任意に連結され得る。一側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する、２、３または４個のＩＳＶＤ（またはその適切な断片）などの、本発明による少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる、ポリペプチドまたは構築物に関する。２つ以上のＩＳＶＤは、１つ以上のペプチドリンカーを介して任意に連結されてもよい。
【０１１４】
別の側面において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤと、例えばアグリカンなどの第２の抗原に向けられたナノボディなどの第２のＩＳＶＤとを含む、本発明の二重特異性ポリペプチドまたは構築物であり得、ここでナノボディなどの前記第１および第２のＩＳＶＤは、リンカー配列（本明細書で定義される）を介して任意に連結され得る；一方、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物はまた、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、例えばアグリカンなどの第２の抗原に向けられたナノボディなどの第２のＩＳＶＤ、および第３の抗原に向けられたナノボディなどの第３のＩＳＶＤを含む、本発明の三重特異性ポリペプチドまたは構築物であってもよく、ここでナノボディなどの前記第１、第２および第３のＩＳＶＤは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して、任意に連結されていてもよい。
本発明はさらに、ＡＤＡＭＴＳ５、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ５に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤ（またはその適切な断片）、およびアグリカンに結合するＩＳＶＤなどの追加の１つのＩＳＶＤを含むか、または（本質的に）それからなる、多価ポリペプチドに関する。
【０１１５】
本発明による特に好ましい二価、二重特異性ポリペプチドまたは構築物は、本明細書に記載の実施例および表Ａ−１に示すものである（配列番号１２０〜１３０（すなわち、配列番号１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９および１３０）、および最も好ましくは配列番号１２９および１３０を参照）。
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれからなり、ここで該少なくとも２つのＩＳＶＤは同一でも異なっていてもよいが、その少なくとも１つのＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に向けられ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に結合する該ＩＳＶＤは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択される。
【０１１６】
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物に存在する２つ以上のＩＳＶＤは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）からなり得る；それらは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列で構成されていてもよい。好ましい側面において、それらは、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、または「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸）、Nanobody（登録商標）（ＶＨＨを含むがこれに限定されない）、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列；または親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列からなる。２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的または完全にヒト化されたナノボディまたは部分的または完全にヒト化されたＶＨＨからなることができる。
【０１１７】
本発明の一側面において、本発明の多重パラトピック（好ましくは二重パラトピックまたは三重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物に存在する第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ５への結合について互いに（交差）競合せず、したがって、異なるファミリーに属する。したがって本発明は、各ＩＳＶＤが異なるファミリーに属している２つ以上のＩＳＶＤを含む、多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物に関する。一側面において、本発明のこの多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第１のＩＳＶＤは、本発明のこの多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第２のＩＳＶＤのＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックせず、および／または、第１のＩＳＶＤは、第２のＩＳＶＤによってＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックされない。別の側面において、本発明の多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第１のＩＳＶＤは、本発明のこの多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物の第２のＩＳＶＤのＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックし、および／または、第１のＩＳＶＤは、第２のＩＳＶＤによってＡＤＡＭＴＳ５への結合を交差ブロックされる。
【０１１８】
特に好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、３つ以上のＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれからなり、このうち少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられている。ＡＤＡＭＴＳ５に向けられた前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一でも異なっていてもよく、ＡＤＡＭＴＳ５の同じエピトープまたは異なるエピトープに向けられてもよく、同じエピトープビンまたは異なるエピトープビンに属することができ、および／または、ＡＤＡＭＴＳ５の同じドメインまたは異なるドメインに結合できることが、理解されるであろう。
【０１１９】
相対的親和性は、ポリペプチド内のＩＳＶＤの位置に依存し得る。本発明のポリペプチドにおけるＩＳＶＤの順序（配向）は、当業者の必要性に従って選択され得ることが理解されるであろう。個々のＩＳＶＤの順序、およびポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計選択の問題である。リンカーの有無にかかわらず、一部の配向は、他の配向と比較して優先される結合特性を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチドにおける第１のＩＳＶＤ（例：ＩＳＶＤ１）および第２のＩＳＶＤ（例：ＩＳＶＤ２）の順序は、（Ｎ末端からＣ末端へ）：（ｉ）ＩＳＶＤ１（例：ナノボディ１）−［リンカー］−ＩＳＶＤ２（例：ナノボディ２）−［Ｃ末端伸長］；または（ｉｉ）ＩＳＶＤ２（例：ナノボディ２）−［リンカー］−ＩＳＶＤ１（例ナノボディ１）−［Ｃ末端伸長］；（ここで、角括弧内の部分、すなわちリンカーおよびＣ末端伸長は、任意である）。すべての配向が本発明に包含される。所望の結合特性を提供するＩＳＶＤの配向を含むポリペプチドは、例えば実施例の節で例示されるように、日常的なスクリーニングにより容易に同定され得る。好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＡＤＡＭＴＳ５に結合したＩＳＶＤ−［リンカー］−アルブミンまたはアグリカン結合したＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］であり、ここで角括弧内の部分は任意である。
【０１２０】
一側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで、
ａ）少なくとも「第１」ＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ５の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に特異的に結合し、好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する前記「第１」ＩＳＶＤは、配列番号２、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、８、１１７、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から選択され；および
ｂ）少なくとも「第２」ＩＳＶＤは、第１の抗原決定基エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造とはそれぞれ異なる、ＡＤＡＭＴＳ５の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造に特異的に結合し、好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する前記「第２」ＩＳＶＤは、配列番号１１６または１９である。
【０１２１】
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれからなり、ここで、前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一または異なることができ、これらは配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８からなる群から独立して選択される。
さらなる側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられた２つ以上のＩＳＶＤを含む多重パラトピック（好ましくは二重パラトピック）ポリペプチドまたは構築物に関し、該ＩＳＶＤは、配列番号２、１１６、１９、１、３、６、１６、１７、１０、１１、９、５、４、７、１１７、８、１２、１３、１４、１５および１８のいずれか１つによって結合されるのと同じエピトープに結合する。
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１〜１９（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９）、１１６〜１１７または１２０〜１３０（すなわち配列番号１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０）のいずれかと、少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する。
【０１２２】
一側面において、本発明は、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２６（クローン１２９ ２Ｆ３−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）および配列番号１２８（クローン１３１ ９Ｄ３−０９３−Ａｌｂ）からなる群から選択される、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
当該技術は、変形性関節症などの、関節の軟骨に影響を与える障害のためのより効果的な治療を必要としている。特に全身的に投与される場合、ほとんどの薬物の滞留時間は不十分である。本発明者らは、本発明の構築物、ポリペプチドおよびＩＳＶＤなどの治療薬の有効性は、治療薬を、薬物の半減期を延長してその結果薬物の保持を増加させるが、前記治療薬の有効性を邪魔しない部分に結合することにより、顕著に増加させることができるとの仮説をたてた。
【０１２３】
本発明の特定の側面において、本発明の構築物またはポリペプチドは、それのない本発明の対応する構築物またはポリペプチドと比較して、増加した半減期を付与する部分を有し得る。本発明のかかる構築物およびポリペプチドのいくつかの好ましいが非限定的な例は、当業者には、本明細書のさらなる開示に基づいて明らかになり、これは例えば以下を含む：化学修飾されて半減期を増加させた（例えば、ペグ化による）、本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合するための少なくとも１つの追加の結合部位を含む、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤；または、本発明のアミノ酸配列の半減期を延長する少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された、少なくとも１つの本発明のＩＳＶＤを含む本発明のポリペプチド。かかる半減期延長部分またはＩＳＶＤを含む本発明のポリペプチドなどの、本発明の構築物の例は、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者に明らかになるであろう；例としては、限定はされないが、以下のポリペプチドである：本発明の１つ以上のＩＳＶＤが、１つ以上の血清タンパク質またはその断片（（ヒト）血清アルブミンまたはその適切な断片など）に好適に連結したポリペプチド、または、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の結合単位に好適に連結したポリペプチド（血清タンパク質の例としては、例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、または血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）などの血清タンパク質に結合できるナノボディ、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンである；本明細書に記載のさらなる説明および参考文献を参照されたい）；本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（ヒトＦｃなど）またはその適切な部分もしくは断片に連結されているポリペプチド；または、本発明の１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小タンパク質またはペプチドに適切に結合したポリペプチド、例えば、限定はされないが、以下に記載のタンパク質およびペプチド：WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691およびPCT/EP2011/051559。
【０１２４】
一側面において、本発明は、本発明の構築物またはポリペプチドを提供し、ここで前記構築物または前記ポリペプチドはさらに、血清タンパク質結合部分または血清タンパク質を含む。好ましくは、前記血清タンパク質結合部分は、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合する。
一側面において、本発明は、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一般に、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明の構築物またはポリペプチドそれ自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合の半減期よりも長い、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍より長い、半減期を有する。例えば、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体と比較して、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、例えばヒトにおいて、半減期の増加が１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらに２４、４８または７２時間を超え得る。
【０１２５】
本発明の好ましいが非限定的な側面において、本発明の構築物および本発明のポリペプチドは、例えばヒトにおいて、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、さらには２４、４８または７２時間超増加した、血清半減期を有する。
本発明の別の好ましいが非限定的な側面において、本発明のポリペプチドなどの本発明のかかる構築物は、ヒトにおいて少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間またはそれ以上の、血清半減期を示す。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドは、血清半減期として、少なくとも５日（約５〜１０日など）、好ましくは少なくとも９日（約９〜１４日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０〜１５日など）、または少なくとも約１１日（約１１〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２〜１８日またはそれ以上など）、または１４日以上（約１４〜１９日など）を有し得る。
【０１２６】
本発明の特に好ましいが非限定的な側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する１つ以上のビルディングブロックに加えて、血清アルブミンに結合する少なくとも１つのビルディングブロック、例えば、本明細書に記載のヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む、本発明の構築物および本発明のポリペプチドを提供する。好ましくは、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含むか、または本質的にそれらからなり、ここでＣＤＲ１はＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２はＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、およびＣＤＲ３はＧＧＳＬＳＲである。好ましくは、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２またはＡｌｂ２２３からなる群から選択される（表Ｄを参照）。
【０１２７】
一側面において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤおよび血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含み、これらは好ましくは以下からなる群から選択される：配列番号１２９（クローン５７７ ２Ｆ３＊−Ａｌｂ）、配列番号１３０（クローン５７９ ２Ｆ３＊−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２０（クローン４ ２Ａ１２−Ａｌｂ）、配列番号１２１（クローン５ ２Ｄ７−Ａｌｂ）、配列番号１２２（クローン６ ２Ｆ３−Ａｌｂ）、配列番号１２３（クローン６９ ０４９−Ａｌｂ）、配列番号１２４（クローン７０ ９Ｄ３−Ａｌｂ）、配列番号１２５（クローン７１ ３Ｂ２−Ａｌｂ）、配列番号１２６（クローン１２９ ２Ｆ３−０９３−Ａｌｂ）、配列番号１２７（クローン１３０ ０４９−０９３−Ａｌｂ）、および配列番号１２８（クローン１３１ ９Ｄ３−０９３−Ａｌｂ）（表Ａ−１を参照）。
一側面において、本発明は、血清タンパク質結合部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記血清タンパク質結合部分は、非抗体ベースのポリペプチドである。
【０１２８】
当該技術は、変形性関節症などの関節の軟骨に影響を与える障害に対する、より効果的な治療を必要としている。関節内に投与された場合でも、罹患した軟骨を処置するためのほとんどの薬物の滞留時間は不十分である。本発明者らは、本発明の構築物、ポリペプチドおよびＩＳＶＤなどの治療薬の有効性は、治療薬を、関節内に薬物を「固定」しその結果薬物の保持を増加させるが、治療薬の有効性は邪魔しない部分に結合することによって、調節できるとの仮説をたてた（この部分は、本明細書では「軟骨固定タンパク質」または「ＣＡＰ」とも呼ばれる）。この固定の概念は、薬物の有効性を調節するのみでなく、毒性と副作用を減らすことによって罹患した関節の操作上の特異性を調節することができ、それにより、可能性のある有用な薬物の数を増加させた。
【０１２９】
臨床使用のための分子のフォーマットは、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する、ＩＳＶＤなどの１つまたは２つのビルディングブロック、およびかかる保持モードの作用を有する、ＩＳＶＤなどの１つ以上のビルディングブロック、および場合によってはさらなる部分を含むことが予想された。同時係属出願において、かかるフォーマットは、ＡＤＡＭＴＳ５結合と例えば抑制活性などの治療効果の両方、ならびに保持特性を保持することが実証されている。保持モードの作用を有する、ＩＳＶＤなどの１つ以上のビルディングブロックは、例えば以下のようなＡＤＡＭＴＳ５が関与する疾患において保持効果を有する任意のビルディングブロックである（「ＣＡＰビルディングブロック」）：関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチー。
「ＣＡＰビルディングブロック」は、他の例えば治療用のビルディングブロック、例えばＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤなどを、例えば関節などの所望の部位に、誘導、固定、および／または保持するために使用され、ここで前記他の例えば治療用のビルディングブロックは、例えばＡＤＡＭＴＳ５の結合および／または阻害などの、その効果を発揮する。
【０１３０】
本発明者らはさらに、アグリカンに結合するＩＳＶＤなどのアグリカン結合剤は、アグリカンが重度にグリコシル化され、関節の軟骨に影響を及ぼす様々な障害において分解されるにも関わらず、潜在的にかかるアンカーとして機能すると仮定した。さらに、薬剤が臨床に入る前に必要とされる様々な動物モデルでのコストおよび広範な試験を考慮すると、かかるアグリカン結合剤は、優先的に広い交差反応性を有するべきであり、例えば、アグリカン結合剤は、様々な種のアグリカンに結合すべきである。
様々な独創的な免疫化、スクリーニング、および特性評価方法を使用して、本発明者らは、関節内において延長された保持時間および活性を可能にする、優れた選択性、安定性、および特異性を備えた様々なアグリカン結合剤を特定することができた。
一側面において本発明は、関節からの、組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出を低減および／または阻害する方法に関し、前記方法は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、本発明による構築物、または本発明による組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人へ投与することを含む。
【０１３１】
本発明において、用語「流出の低減および／または阻害」は、組成物、ポリペプチドまたは構築物の、関節内から外部への外向きの流れを低減および／または阻害することを意味する。好ましくは、流出は、関節内における前述の組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出であって、同じ条件下であるが本発明のアグリカン結合剤、例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤの存在なしの流出と比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％、またはそれ以上、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％をも、低減および／または阻害される。
ＡＤＡＭＴＳ５が関与する疾患、例えば関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーなどの次に、本発明のアグリカン結合剤はまた、軟骨に影響を与える様々な他の疾患、例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、（例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離）、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎（本明細書では一般に「アグリカン関連疾患」と示される）にも使用できることが予想される。
【０１３２】
上記のＣＡＰビルディングブロック、例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤは、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。好ましい側面において、ＣＡＰビルディングブロックは他の種に対して交差反応性であり、以下の１つ以上に特異的に結合する：ヒトアグリカン（配列番号１５５）、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカン。アグリカンの関連構造情報は、例えば下の表２に示すように、（UniProt）アクセッション番号に記載されている。
好ましいＣＡＰビルディングブロックは、ＩＳＶＤ結合アグリカン、好ましくはヒトアグリカンであり、好ましくは表Ｂに示されるように配列番号１５５で表される。
表２
【表２】
2020525410.tif 000005
【０１３３】
したがって本発明は、少なくとも１つのＣＡＰビルディングブロックをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
したがって本発明は、好ましくは配列番号１５６および１５７で表されるＩＳＶＤから選択される、アグリカンに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一でも異なっていてもよい。
【０１３４】
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、配列番号１５６〜１５７からなる群から独立して選択される。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、配列番号１５６〜１５７によって表される。
ある側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン［配列番号１５５］に特異的に結合する。
【０１３５】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン（配列番号１５５）、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカンに、特異的に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでアグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび構築物は、好ましくは安定であることが理解されるであろう。本発明のポリペプチド、構築物またはＩＳＶＤの安定性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには、（限定はされないが）ポリペプチド、構築物またはＩＳＶＤの活性が測定され、続いて滑液中で所望の期間インキュベートされ、その後活性が再度測定されるアッセイが含まれる。
【０１３６】
一側面において、本発明は、滑液（ＳＦ）中３７℃で、少なくとも７日、例えば少なくとも１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月間も、安定性を有する、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物に関する。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物中のＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤなどの、治療用ビルディングブロックの望ましい活性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。
一側面において、本発明は、少なくとも１つのＩＳＶＤまたはポリペプチド、および１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本明細書に記載の構築物に関する。１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、好ましくは、以下：ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合できる結合単位、Ｆｃ部分、および、血清タンパク質、さらなるアミノ酸残基、例えば毒素、標識、放射性化学物質などのタグまたは他の機能的部分に結合可能な、小タンパク質またはペプチド；からなる群から選択される。
【０１３７】
一態様において、以下で言及されるように、本発明は、半減期延長を付与する部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記部分はＰＥＧである。したがって本発明はまた、ＰＥＧを含む本発明の構築物またはポリペプチドに関する。
さらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させ、変更し、またはその他の影響を与えても与えなくてもよく、本発明のポリペプチドにさらなる機能を加えても加えなくてもよい。例えば、かかるアミノ酸残基は：
ａ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基を、例えば異種宿主細胞または宿主生物での発現の結果として含むことができる；
ｂ）合成時に宿主細胞からのポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列またはリーダー配列を、形成し得る（例えば、本発明のポリペプチドを発現するために使用する宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレ、プロまたはプレプロ形態を提供するため）。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明されているとおりであってよい。通常、かかるリーダー配列はポリペプチドのＮ末端に連結されるが、ただし最も広い意味での本発明はこれに限定されない；
【０１３８】
ｃ）「タグ」、すなわち例えばポリペプチドの精製を可能にするまたは促進するアミノ酸配列または残基を、例えば前記配列または残基に向けられた親和性技術を使用して、形成し得る。その後、前記配列または残基を除去して（例えば、化学的または酵素的切断により）、ポリペプチドを提供することができる（この目的のために、タグは、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列またはポリペプチド配列に任意に連結するか、切断可能なモチーフを含むことができる）。かかる残基のいくつかの好ましいが非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、およびＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡなどのｍｙｃタグである；
ｄ）官能化された、および／または官能基の結合部位として機能することができる、１つ以上のアミノ酸残基であってもよい。適切なアミノ酸残基および官能基は当業者には明らかであり、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書で言及されるアミノ酸残基および官能基が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１３９】
本発明にさらに包含されるのは、本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤを含む構築物であり、これらはさらに他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む。
他の基、残基、部分または結合単位は、例えば化学基、残基、部分であってよく、これらは例えば、それ自体で生物学的および／または薬理学的に活性であってもなくてもよい。例えば、限定されないが、かかる基は、本発明のポリペプチドまたは構築物の「誘導体」を提供するために、本発明の１つ以上のＩＳＶＤまたはポリペプチドに連結され得る。
したがって本発明は、その最も広い意味で、本発明の構築物および／またはポリペプチドの誘導体である、構築物および／またはポリペプチドも含む。かかる誘導体は一般に、本発明の構築物および／またはポリペプチド、および／または本発明のポリペプチドを形成する１つ以上のアミノ酸残基の、修飾によって、および特に化学的および／または生物学的（例えば酵素的）修飾によって、得ることができる。
【０１４０】
かかる修飾の例、ならびにかかる様式で修飾可能なポリペプチド配列内のアミノ酸残基の例（すなわち、タンパク質骨格上であるか、好ましくは側鎖上）、かかる修飾に使用できる方法および技術、およびかかる修飾の潜在的な使用および利点は、当業者には明らかであろう（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013も参照）。
例えば、かかる修飾は、１つ以上の（官能）基、残基または部分の、本発明のポリペプチド内またはこれの上への導入（例えば、共有結合によるかまたは他の適切な様式による）、および特に、本発明の構築物および／またはポリペプチドに１つ以上の所望の特性または機能性を付与する、１つ以上の（官能）基、残基または部分の導入を、含み得る。かかる官能基の例は、当業者には明らかであろう。
【０１４１】
例えば、かかる修飾は、本発明の構築物またはポリペプチドの半減期、溶解度および／または吸収を増加させ、本発明の構築物またはポリペプチドの免疫原性および／または毒性を低減し、本発明の構築物またはポリペプチドの望ましくない副作用を排除または減弱し、および／または本発明の構築物またはポリペプチドに他の有利な特性を付与しおよび／または望ましくない特性を低減する、１つ以上の機能的部分の；または前述の２つ以上の任意の組み合わせの、導入（例えば、共有結合によるか、または他の適切な様式による）を含み得る。かかる機能的部分およびそれらを導入するための技術の例は、当業者には明らかであり、一般に、本明細書の上記で引用した一般的な背景技術で言及されるすべての機能的部分および技術、ならびに医薬品タンパク質の修飾のための、それ自体既知の機能的部分および技術を含むことができる；および特に、抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の修飾については、例えばRemington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)を参照されたい。かかる機能的部分は、例えば、本発明のポリペプチドに直接（例えば共有結合で）、または任意に適切なリンカーまたはスペーサーを介して、連結することができ、これは再度、当業者には明らかであろう。
【０１４２】
１つの具体例は、本発明のポリペプチドまたは構築物が化学的に修飾されてその半減期が増加した（例えば、ペグ化により）、本発明の誘導体ポリペプチドまたは構築物である。これは、医薬タンパク質の半減期の延長および／または免疫原性の低下に、最も広く使用されている手法の１つであり、好適な薬学的に許容し得るポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧ）などの結合を含む。一般に、任意の適切な形態のペグ化、例えば抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖを含むがこれらに限定されない）に対して当技術分野で使用されるペグ化などを、使用することができる；例えば、以下を参照：Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002)、Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003)、Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003)およびWO 04/060965。タンパク質のペグ化のための様々な試薬も市販されており、例えばNektar Therapeutics, USAからである。
【０１４３】
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化が使用される（例えば、Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003を参照）。例えばこの目的のために、ＰＥＧを、本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基に結合させることができ、本発明の構築物またはポリペプチドは、ＰＥＧの結合のために１つ以上のシステイン残基を適切に導入するように修飾され得、または、ＰＥＧの結合のための１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列が、本発明の構築物またはポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合されてもよく、これらはすべて、当業者にそれ自体既知のタンパク質工学の技術を使用するものである。
好ましくは、本発明の構築物またはポリペプチドについては、５０００を超える分子量、例えば１０，０００超および２００，０００未満、例えば１００，０００未満；例えば、２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧが使用される。
【０１４４】
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化を、本発明のポリペプチドの発現に使用される宿主細胞に応じて、通常は同時翻訳および／または翻訳後の修飾の一部として含む。
さらに別の修飾は、本発明のポリペプチドまたは構築物の意図する使用に応じた、１つ以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含み得る。それらを結合、使用および検出するための適切な標識および技術は、当業者には明らかであり、例えば、以下を含むがこれに限定はされない：蛍光標識（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（phthaldehyde）、およびフルオレスカミンおよび１５２Ｅｕなどの蛍光金属、またはランタニド系のその他の金属など）、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識（例えばルミナール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびそのアナログ）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、および７５Ｓｅなど）、金属、金属キレート、または金属カチオン（例えば金属カチオン、例：９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、および６８Ｇａ、またはin vivo、in vitroもしくはin situ診断およびイメージングでの使用に特に適した他の金属または金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ））、ならびに発色団および酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）。他の適切な標識は当業者には明らかであり、例えば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出可能な部分を含む。
【０１４５】
本発明のかかる標識ポリペプチドおよび構築物は、例えば、in vitro、in vivoまたはin situアッセイ（それ自体既知の免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」等を含む）のために、ならびにin vivoの診断およびイメージングを目的として、特定の標識の選択に応じて使用され得る。
当業者には明らかであるように、別の修飾は、例えば上記の金属または金属カチオンの１つをキレート化するためのキレート基の導入を伴い得る。適切なキレート基には、例えば限定するものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれる。
【０１４６】
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合ペアなどの特定の結合ペアの一部である、機能的部分の導入を含んでもよい。かかる機能的部分を使用して、本発明のポリペプチドを、結合ペアの他の半分に結合する別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物に、例えば結合ペアの形成により連結することができる。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドをビオチンにコンジュゲートさせ、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結することができる。例えば、本発明のかかるコンジュゲート構築物またはポリペプチドは、レポーターとして、例えば、検出可能なシグナル発生剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされる診断システムにおいて、使用され得る。かかる結合ペアは、例えば本発明の構築物またはポリペプチドを、薬学的目的に適した担体を含む担体に結合するために使用することもできる。１つの非限定的な例は、Cao and Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000)に記述されたリポソーム製剤である。かかる結合ペアはまた、治療的に活性な薬剤を本発明のポリペプチドに連結するために使用され得る。
【０１４７】
他の可能性のある化学的および酵素的修飾は、当業者には明らかであろう。かかる修飾はまた、研究目的（例えば、機能−活性の関係を研究するため）で導入することもできる。例えばLundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997)を参照する。
好ましくは、構築物、ポリペプチドおよび／または誘導体は、ＡＤＡＭＴＳ５に、本明細書で定義される親和性（本明細書でさらに説明されるように、ＫＤ値（実際または見かけの値）、ＫＡ値（実際または見かけの値）、ｋｏｎレートまたはオンレート、および／またはｋｏｆｆまたはオフレート、あるいは代替的にＩＣ５０値として、適切に測定および／または表示される）で結合する（本発明のポリペプチドについて定義されるように）。
本発明のかかる構築物および／またはポリペプチドならびにその誘導体はまた、本質的に単離された形態（本明細書で定義される）であってもよい。
【０１４８】
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤまたは本発明のポリペプチドを含むかまたは本質的にそれからなり、さらに、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本発明の構築物に関する。
一側面において、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合可能な結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合可能な小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、本発明の構築物に関する。
【０１４９】
本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物において、例えばＩＳＶＤなどの２つ以上のビルディングブロック、および任意に１つ以上の他の基、薬物、薬剤、残基、部分、または結合単位は、互いに直接連結されてもよく（例えば、WO 99/23221に記載されているように）、および／または１つ以上の適切なスペーサーまたはリンカーを介して互いに連結されてもよく、またはそれらの任意の組み合わせである。多価および多重特異性ポリペプチドでの使用に適したスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーまたはスペーサーであり得る。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサーは、薬学的使用を目的とする構築物、タンパク質またはポリペプチドの構築における使用に適している。
【０１５０】
例えば本発明のポリペプチドは、三価、三重特異性ポリペプチドであって、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤなどの１つのビルディングブロック、アルブミンに結合するＩＳＶＤ、および第３のＩＳＶＤなどの潜在的に別のビルディングブロックを含む、前記ポリペプチドであってもよく、ここでＩＳＶＤなどの前記第１、第２および第３のビルディングブロックは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して、任意に連結されてもよい。また本発明は、本発明の構築物またはポリペプチドであって、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する第１のＩＳＶＤ、および場合によりアルブミンに結合する第２のＩＳＶＤ、および／または場合により第３のＩＳＶＤおよび／または場合により第４のＩＳＶＤを含む、前記構築物またはポリペプチドを提供し、ここで前記第１のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第２のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第３のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第４のＩＳＶＤは、リンカー、特に３つのリンカーを介して、連結される。
【０１５１】
いくつかの特に好ましいリンカーには、抗体断片または抗体ドメインを連結するために当技術分野で使用されるリンカーが含まれる。これらには、上記の一般的な背景技術で言及されたリンカー、ならびに例えばダイアボディまたはＳｃＦｖ断片を構築するために当技術分野で使用されるリンカーが含まれる（この点についてはしかし、ダイアボディおよびＳｃＦｖ断片において、使用されるリンカー配列は、適切なＶＨおよびＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することを可能にする長さ、ある程度の柔軟性、および他の特性を有するべきであり、本発明のポリペプチドで使用されるリンカーの長さまたは柔軟性に特に制限はなく、これは、ナノボディなどの各ＩＳＶＤが、それ自体で完全な抗原結合部位を形成するからである）。
【０１５２】
例えばリンカーは、適切なアミノ酸配列であってよく、特に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、例えば１〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例には、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）２タイプのｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えばWO 99/42077に記載されている（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３など、および、本明細書に記載のAblynxによる出願に記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９およびＧＳ７リンカー（例えばWO 06/040153およびWO 06/122825を参照）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体または類似の配列のヒンジ領域など（WO 94/04678に記載されている）が含まれる。好ましいリンカーを、表Ｃに示す。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（ＡＡＡなど）、ならびにリンカーＧＳ３０（WO 06/122825の配列番号８５も参照）およびＧＳ９（WO 06/122825の配列番号８４も参照）である。
他の適切なリンカーは一般に、有機化合物またはポリマー、特に医薬用途のタンパク質での使用に適したものを含む。例えばポリ（エチレングリコール）部分は、抗体ドメインを連結するために使用されている；例えばWO 04/081026を参照。
【０１５３】
使用されるリンカーの長さ、柔軟性の程度、および／または他の特性（ただし通常は、ＳｃＦｖ断片で使用されるリンカーの場合ほど重要ではない）が、本発明のポリペプチドなどの本発明の最終構築物の、ケモカインまたは１つ以上の他の抗原に対する親和性、特異性または結合力を含む特性（これらに限定はされない）にいくらかの影響を及ぼし得ることは、本発明の範囲に包含される。本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用する最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
例えば、ＡＤＡＭＴＳ５および別の標的に向けられた、ビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよび柔軟性は、ポリペプチド中の本発明のＩＳＶＤなどの各ビルディングブロックが、その同族の標的、例えば各標的の抗原決定基に結合することを可能にするようなものであることが好ましい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
【０１５４】
さらに本発明の範囲内であるのは、使用されるリンカーが、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に、１つ以上の他の好ましい特性または機能性を付与し、および／または誘導体の形成および／または官能基の結合のための１つ以上の部位を提供することである（例えば、本発明のＩＳＶＤの誘導体について本明細書に記載のように）。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含むリンカーは改善された親水性を提供できるが、小さなエピトープまたはタグを形成するかまたは含むリンカーは、検出、識別、および／または精製の目的で使用することができる。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定のポリペプチドで使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
【０１５５】
最後に、本発明のポリペプチドなどの構築物に２つ以上のリンカーが使用される場合、これらのリンカーは同一でも異なっていてもよい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の構築物またはポリペプチドで使用する最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
通常、発現および生産を容易にするために、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物は、線状ポリペプチドである。しかし本発明は、その最も広い意味でこれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物が３つ以上のビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディを含む場合、３つ以上の「アーム」を有するリンカーの使用によりそれらを連結することが可能であり、それぞれの「アーム」は、ビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディに連結されて「星形」の構築物を提供する。通常はあまり好ましくはないが、円形の構築物を使用することも可能である。
【０１５６】
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記ＩＳＶＤは互いに直接連結されるか、またはリンカーを介して連結される。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、第１のＩＳＶＤおよび／または第２のＩＳＶＤおよび／またはおそらく血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、リンカーを介して連結されている。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記リンカーは、３Ａ、５ＧＳ、７ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳ、３５ＧＳ、ｐｏｌｙ−Ａ、８ＧＳ、４０ＧＳ、Ｇ１ヒンジ、９ＧＳ−Ｇ１ヒンジ、ラマ上部の長いヒンジ領域、およびＧ３ヒンジ、のリンカーからなる群から選択され、例えば表Ｃ（配列番号１５８〜１７４）に示されている。
【０１５７】
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される。
本発明はさらに、本明細書に記載の構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤ、核酸、宿主細胞、および組成物を調製する方法に関する。
本発明の多価ポリペプチドは一般に、少なくとも本発明のＩＳＶＤおよび／または一価ポリペプチドを、場合により１つ以上の適切なリンカーを介して、１つ以上のさらなるＩＳＶＤに適切に連結するステップを含む方法によって調製することができ、こうして本発明の多価ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、前記核酸を適切な方法で発現するステップ、および発現された本発明のポリペプチドを回収するステップを含む方法によっても、調製することができる。かかる方法は、それ自体既知の様式で実行することができ、これは当業者には、例えば本明細書でさらに説明する方法および技術に基づいて、明らかであろう。
【０１５８】
本発明の多価ポリペプチドを調製する方法は、少なくとも、本発明の２つ以上のＩＳＶＤおよび例えば１つ以上のリンカーを、適切な様式で一緒に連結するステップを含んでもよい。本発明のＩＳＶＤ（およびリンカー）は、当技術分野で知られており本明細書でさらに説明する任意の方法により、結合することができる。好ましい技術には、本発明のＩＳＶＤ（およびリンカー）をコードする核酸配列を連結して、多価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製することが含まれる。アミノ酸または核酸を連結する技術は当業者には明らかであり、標準的なハンドブック、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を再び参照する。
【０１５９】
したがって、本発明は、本発明の多価ポリペプチドの調製における、本発明のＩＳＶＤの使用にも関する。多価ポリペプチドを調製する方法は、本発明のＩＳＶＤを、任意に１つ以上のリンカーを介して、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶＤに連結することを含む。次いで、本発明のＩＳＶＤは、２つ（例えば、二価ポリペプチド中）、３つ（例えば、三価ポリペプチド中）、４つ（例えば、四価中）、またはそれ以上（例えば、多価ポリペプチド中）のビルディングブロックを含む多価ポリペプチドを提供および／または調製する際の、結合ドメインまたはビルディングブロックとして使用される。これに関して、本発明のＩＳＶＤは、２、３、４またはそれ以上のビルディングブロックを含む本発明の二価、三価または四価などの多価ポリペプチドを提供および／または調製する際の、結合ドメインまたは結合単位として、使用することができる。
【０１６０】
したがって、本発明はまた、本発明のＩＳＶＤポリペプチド（本明細書に記載）の、多価ポリペプチドの調製における使用にも関する。多価ポリペプチドの調製方法は、本発明のＩＳＶＤの、任意に１つ以上のリンカーを介した、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶＤへの連結を含む。
本発明のポリペプチドおよび核酸は、本明細書のさらなる説明から当業者に明らかなように、それ自体既知の様式で調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の調製のための、それ自体既知の任意の様式で調製することができる。ポリペプチドおよび核酸を調製するためのいくつかの好ましいが非限定的な方法には、本明細書に記載の方法および技術が含まれる。
【０１６１】
本発明のポリペプチドを生産する方法は、以下のステップを含み得る：本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）の、適切な宿主細胞または宿主生物（本明細書では「本発明の宿主」とも呼ばれる）における、または別の適切な発現系における発現；続いて任意に、こうして得られた本発明のポリペプチドを、単離および／または精製すること。
特に、かかる方法は、以下のステップを含んでもよい：本発明の宿主を、本発明の宿主が本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現および／または生産するような条件下で、培養および／または維持すること；続いて任意に、こうして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または精製すること。
【０１６２】
したがって本発明はまた、本発明のポリペプチド、ＩＳＶＤまたは構築物をコードする核酸またはヌクレオチド配列（「本発明の核酸」とも呼ばれる）にも関する。
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書で定義されるように本質的に単離された形態である。本発明の核酸はまた、発現ベクターなどのベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはＹＡＣ（これもまた本質的に単離された形態であり得る）の形態であっても、その中に存在しても、および／またはベクターの一部であってもよい。したがって本発明はまた、本発明の核酸またはヌクレオチド配列を含む、発現ベクターにも関する。
【０１６３】
本発明の核酸は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドに関する情報に基づいて、それ自体既知の様式で調製または取得でき、および／または適切な天然源から単離できる。また、当業者には明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば本発明のＩＳＶＤをコードする少なくとも２つの核酸、および例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸などを、適切な様式で一緒に連結することができる。本発明の核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、例えば、限定はされないが、以下を含み得る：自動化されたＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（またはその２つ以上の部分）の組み合わせること、切断された発現産物の発現をもたらす変異の導入；１つ以上の制限部位の導入（例えば、適切な制限酵素を使用して、容易に消化および／またはライゲートできるカセットおよび／または領域を作成するため）、および／または１つ以上の「不一致」プライマーを使用した、ＰＣＲ反応による変異の導入。これらおよび他の技術は当業者には明らかであり、再度、標準的なハンドブック、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を参照する。
【０１６４】
好ましいが非限定的な態様において、本発明の遺伝子構築物は以下を含む：
ａ）本発明の少なくとも１つの核酸；
ｂ）１つ以上の調節要素に動作可能に接続されている、例えばプロモーター、および任意に適切なターミネーター；および任意にまた
ｃ）それ自体知られている、遺伝子構築物の１つ以上のさらなる要素；
ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、および「動作可能に接続された」は、当技術分野における通常の意味を有する。
本発明の遺伝子構築物は一般に、本発明のヌクレオチド配列を、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など一般的なハンドブックに記載された技術を使用して、上記の１つ以上のさらなる要素に適切に連結することにより提供され得る。
【０１６５】
本発明の核酸および／または本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞または宿主生物を形質転換するために、すなわち、本発明のポリペプチドの発現および／または生産のために、使用され得る。適切な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核生物または真核生物の細胞または細胞株、または任意の適切な真菌、原核生物または（非ヒト）真核生物ならびに、抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現および生産についてそれ自体既知の宿主細胞または（非ヒト）宿主であることができ、これらは当業者には明らかであろう。上記で引用された一般的な背景技術、ならびに例えば以下も参照される：WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998)；Riechmann and Muyldermans (1999)上記；van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000)；Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003)；Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005)；および、本明細書に引用されているさらなる参考文献。さらに本発明のポリペプチドは、無細胞発現系で発現および／または生産することもでき、かかる系の適切な例は当業者には明らかであろう。本発明の宿主または宿主細胞を形質転換するための適切な技術は、当業者には明らかであり、意図される宿主細胞／宿主生物および使用される遺伝子構築物に依存し得る。再度、上記のハンドブックおよび特許出願を参照する。形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態であり得る）または宿主生物（安定な変異体系統または株の形態であり得る）は、本発明のさらなる側面を形成する。したがって本発明は、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞に関する。好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物は、本発明のポリペプチド（および宿主生物の場合：その少なくとも１つの細胞、部分、組織または臓器において）を発現するか、（少なくとも）（例えば、適切な条件下で）発現可能なものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞または宿主生物のさらなる世代、後代および／または子孫を含み、これらは例えば、細胞分裂または有性生殖または無性生殖により得ることができる。
【０１６６】
本発明のポリペプチドの発現を生成／取得するために、形質転換された宿主細胞または形質転換された宿主生物は、一般に、本発明の（望ましい）ポリペプチドが発現／生産されるような条件において、保たれる、維持される、および／または培養され得る。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用される宿主細胞／宿主生物、ならびに本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節要素に依存する。再度、本発明の遺伝子構築物に関する段落で上述した、ハンドブックおよび特許出願を参照する。
【０１６７】
次いで、本発明のポリペプチドの単離は、宿主細胞／宿主生物および／または前記宿主細胞もしくは宿主生物が培養された培地から、それ自体既知のタンパク質の単離および／または精製技術、例えば（分取）クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術、示差沈殿技術、親和性技術（例えば、本発明のポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用）および／または分取免疫学的技術（すなわち、単離されるポリペプチドに対する抗体を使用）を用いて、行うことができる。
一側面において、本発明は、少なくとも以下のステップを含む、本発明による構築物、ポリペプチドまたはＩＳＶＤを生産する方法に関する：（ａ）適切な宿主細胞または宿主生物または別の適切な発現系において、本発明による核酸配列を発現するステップ；これに続いて任意に（ｂ）本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤを単離および／または精製するステップ。
【０１６８】
一側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸を含む、組成物に関する。
上記のように、安全で効果的なＯＡ医薬品の必要性が残されている。非従来的なスクリーニング、特性評価および組み合わせ戦略に基づいて、本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ５に結合しこれを阻害するＩＳＶＤを特定した。これらのＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、in vitroおよびin vivo実験で非常に優れた性能を発揮した。さらに、本発明のＩＳＶＤは、先行技術の化合物よりも有意に有効であることも実証された。したがって本発明は、ＡＤＡＭＴＳ、特にＡＤＡＭＴＳ５に拮抗するＩＳＶＤおよびポリペプチドであって、先行技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを含む、改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性を有する前記ＩＳＶＤおよびポリペプチドを提供する。さらに、これらのＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、アルブミンに結合するＩＳＶＤに連結されると、対象での保持が増加し、活性を保持しつつ全身投与が可能であった。
【０１６９】
一側面において、本発明は、例えばＡＤＡＭＴＳ５活性が関与する個体の疾患または障害を処置または予防する方法に関し、この方法は、本発明によるＩＳＶＤまたはポリペプチドを、前記疾患または障害の症状を処置または予防するための有効量で、前記個体に投与することを含む。
一側面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明による組成物、本発明によるＩＳＶＤ、本発明によるポリペプチド、および／または本発明による構築物に関する。
別の側面において、本発明は、少なくともＡＤＡＭＴＳ５関連疾患の予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、および／または本明細書に記載の処置方法の１つ以上で使用するための、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物の使用に関する。
【０１７０】
本発明はまた、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物の使用であって、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節すること、例えばアグリカンの分解を抑制することにより予防および／または処置できる少なくとも１つの疾患または障害の、予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
本発明はまた、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／または構築物の使用であって、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／または構築物を患者に投与することにより予防および／または処置することができる少なくとも１つの疾患、障害または状態の予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
【０１７１】
本発明はさらに、少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５関連疾患の予防および／または処置に使用するための、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物および／もしくは構築物、またはそれを含む医薬組成物に関する。
本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、軟骨に影響を与える様々な疾患において、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーおよび非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（本明細書では一般的に「ＡＤＡＭＴＳ５関連疾患」として示される）において、使用可能であることが予想される。
【０１７２】
一側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５関連疾患の症状を処置または予防するのに使用するための、本発明による組成物、ＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物に関し、前記疾患としては例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーおよびＮＡＳＨである。
一側面において、本発明は、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎およびＮＡＳＨを予防または処置するための方法に関し、ここで前記方法は、それを必要とする対象に、少なくとも本発明による組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、または構築物の薬学的活性量を投与することを含む。
【０１７３】
一側面において、本発明は、本発明によるＩＳＶＤ、ポリペプチド、組成物または構築物の使用であって、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーおよびＮＡＳＨを処置または予防するための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
また、アグリカンに結合することにより、本発明の構築物および／またはポリペプチドは、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、例えばＭＭＰ２０などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）だけではなく、アグリカンの分解におけるＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を、低下または阻害し得ることが期待される。
【０１７４】
本発明の文脈において、用語「予防および／または処置」は、疾患の予防および／または処置を含むだけでなく、一般に以下も含む：疾患の発症の予防、疾患の進行の遅延または逆転、疾患の予防または遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の発症の予防または遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の軽減および／または緩和、疾患の重症度および／または持続期間および／またはそれに関連する症状の低減、および／または疾患の重症度および／またはそれに関連する任意の症状のさらなる増加の予防、疾患によって引き起こされる任意の生理学的損傷の予防、軽減、または逆転、および処置される患者に有益な一般的に任意の薬理作用。
【０１７５】
投与計画は、担当医および臨床的要因によって決定される。医療分野でよく知られているように、任意の一患者への投与量は、例えば患者のサイズ、体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、使用されるポリペプチド（抗体を含む）の活性、投与の時間と経路、一般的な健康状態、および他の療法または処置との組み合わせを含む、多くの要因に依存する。タンパク質性の薬学的活性物質は、１用量あたり１ｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在し得る；しかしながら、この例示的な範囲を下回るかまたは上回る用量も想定される。計画が持続注入の場合、１分間に体重１キログラムあたり１ｐｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
【０１７６】
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物は、ＡＤＡＭＴＳ５の生物学的機能を、当技術分野で周知の方法によりアッセイされる場合に、少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、９５％または最大９９％、および最も好ましくは約１００％（本質的に完全に）阻害および／または中和するために、例えば、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０または５０ｐｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
一般に処置計画は、本発明の１つ以上のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／もしくは構築物、またはそれを含む１つ以上の組成物の、１以上の薬学的有効量または用量での投与を含む。投与されるべき特定の量または用量は、臨床医により、再度上記の要因に基づいて決定することができる。本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤの有用な用量は、それらのin vitro活性と動物モデルにおけるin vivo活性とを比較することにより決定することができる。マウスおよび他の動物での有効用量をヒトに外挿する方法は、当技術分野で知られている；例えば、US 4,938,949を参照。
【０１７７】
一般に、処置される特定の疾患、障害または状態、使用される特定の本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物の効力、特定の投与経路および使用される特定の医薬製剤または組成物に応じて、臨床医は適切な投与計画を決定できるであろう。
本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤの、処置における使用に必要とされる量は、選択された特定の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、および／または構築物だけでなく、投与経路、処置される状態の性質、患者の年齢および状態によっても異なり、最終的には担当医または臨床医の裁量に委ねられる。また、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤの用量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片、または臓器に応じて変化する。
【０１７８】
所望の用量は、単回用量で、または適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４またはそれ以上のサブ用量として便利に提示され得る。サブ用量自体は、例えば、いくつかの別個の大まかに間隔を空けた複数の投与にさらに分割されてもよい。
投与計画には、長期にわたる毎日の処置が含まれ得る。「長期」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の期間を意味する。この用量範囲の必要な修正は、本明細書の教示および通常の実験のみを使用して、当業者により決定され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照。投与量は、任意の合併症の場合には、個々の医師が調整することもできる。
【０１７９】
通常、上記の方法において、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物が使用される。しかしながら、本発明の２つ以上のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物を組み合わせて使用することは、本発明の範囲内である。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物は、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物または成分と組み合わせて、すなわち、併用治療計画として使用することができ、これは、相乗効果をもたらすことも、そうでない場合もある。
医薬組成物はまた、少なくとも１つのさらなる活性剤、例えば１つ以上のさらなる抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、タンパク質、核酸、有機および無機分子を含み得る。
【０１８０】
再度、臨床医は、かかるさらなる化合物または成分、ならびに適切な併用処置計画を、上記の要因と自身の専門家の判断に基づき、選択することができる。
特に、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物は、本明細書に引用される疾患、障害および状態の予防および／または処置に使用されるかまたは使用できる、他の薬学的に活性な化合物または成分と、組み合わせて使用することができ、その結果、相乗効果が得られる場合も得られない場合もある。かかる化合物および成分の例、ならびにそれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または組成物は、臨床医には明らかであろう。
【０１８１】
２つ以上の物質または成分が併用処置計画の一部として使用される場合、それらは同じ投与経路または異なる投与経路を介して、本質的に同時にまたは異なる時間に投与され得る（例えば、本質的に同時に、連続的に、または交互の方式に従って）。物質または成分を同じ投与経路を介して同時に投与する場合、それらは、当業者には明らかなように、異なる医薬製剤もしくは組成物、または組み合わせた医薬製剤または組成物の一部として、投与することができる。
【０１８２】
また、２つ以上の活性物質または成分を併用処置計画の一部として使用する場合、物質または成分の各々は、化合物または成分をそれ自体で使用する場合に使用するのと同じ量で、同じ計画に従って投与してもよく、かかる併用は、相乗効果をもたらすこともあり、もたらさないこともある。しかし、２つ以上の活性物質または成分の組み合わせ使用が相乗効果をもたらす場合、投与する物質または成分の１つ、それ以上、またはすべての量を減らすことも可能であり、なおかつ所望の治療効果を達成する。これは例えば、通常の量で使用する場合に、１つ以上の物質または成分の使用に関連する任意の望ましくない副作用を、回避、制限、または軽減するのに役立ち得て、なおかつ所望の医薬または治療効果が得られる。
【０１８３】
本発明に従って使用される処置計画の有効性は、臨床医には明らかであるように、関与する疾患、障害または状態について、それ自体既知の任意の様式で決定しおよび／または従うことができる。臨床医はまた、必要に応じておよびケースバイケースで特定の処置計画を変更または修正して、望ましい治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限、または軽減することができ、および／または、一方では望ましい治療効果を達成し、他方では望ましくない副作用を回避、制限、または軽減することの間の適切なバランスを達成する。
【０１８４】
一般に処置計画は、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持される限り、続けられるであろう。再度、これは臨床医が決定できる。
したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明の少なくとも１つの構築物、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、本発明の少なくとも１つのＩＳＶＤ、または本発明の少なくとも１つの核酸、および少なくとも１つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途に適した）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。特定の側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸、好ましくは配列番号ＯＯＯの少なくとも１つ、および少なくとも１つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途に適したもの）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。
【０１８５】
処置される対象は、任意の温血動物であってもよいが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。獣医用途においては、処置される対象に、商業目的で飼育されているかペットとして飼われている任意の動物が含まれる。当業者には明らかであるように、処置される対象は、特に、本明細書で言及される疾患、障害および状態に苦しんでいるか、またはそのリスクのある人である。したがって、本発明の好ましい側面において、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、医学または診断において使用するためのものである。好ましくは、医薬組成物は、ヒト医学で使用するためのものであるが、獣医学的目的で使用することもできる。
【０１８６】
再度、かかる医薬組成物において、本発明の１つ以上の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物および／もしくは構築物、またはそれをコードするヌクレオチド、および／またはそれを含む医薬組成物は、１つ以上の他の活性成分、例えば本明細書に記載されているものと、適切に組み合わせることができる。
本発明はまた、in vitro（例えば、in vitroまたは細胞アッセイ）またはin vivo（例えば、単一細胞または多細胞生物、および特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば本発明の疾患、障害または状態のリスクがあるか、またはこれに罹患しているヒト）のいずれかで使用するための組成物（例えば、限定されることなく、本明細書にさらに記載の医薬組成物または製剤など）にも関する。
【０１８７】
特に明記しない限り、処置への言及には、確立された症状の処置および予防的処置の両方が含まれることを理解されたい。
一般に、医薬用途では、本発明の構築物、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤは、少なくとも１つの本発明の構築物、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤおよび、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に１つ以上の薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬製剤または組成物として製剤化することができる。非限定的な例として、かかる製剤は、経口投与のため、非経口投与のため（静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入など）、局所投与のため、吸入による投与のために、皮膚パッチ、インプラント、座薬などに適した形態であることができ、ここで非経口投与が好ましい。かかる適切な投与形態−これは投与の様式に応じて固体、半固体または液体であり得る−およびその調製に使用するための方法および担体は、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明される。かかる医薬製剤または組成物は、一般に、本明細書において「医薬組成物」と呼ばれる。
【０１８８】
例示的な賦形剤として、崩壊剤、結合剤、充填剤、および潤滑剤が言及され得る。崩壊剤の例には、寒天、アルギン、炭酸カルシウム、セルロース、コロイド二酸化ケイ素、ゴム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、およびデンプンが含まれる。結合剤の例には、微結晶セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。充填剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、三塩基性硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、セルロース、デキストリン、デキストロース、フルクトース、ラクチトール、ラクトース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、ソルビトール、デンプン、スクロース、糖、およびキシリトールが含まれる。潤滑剤の例には、寒天、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化植物油、酸化マグネシウム、ステアリン酸塩、マンニトール、ポロキサマー、グリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルナトリウム、ソルビトール、およびタルクが含まれる。通常の安定剤、防腐剤、湿潤剤および乳化剤、粘稠性改善剤、風味改善剤、浸透圧を変化させる塩、緩衝物質、可溶化剤、希釈剤、皮膚軟化剤、着色剤、およびマスキング剤、および抗酸化剤が、医薬品アジュバントとして考慮される。
【０１８９】
適切な担体には、限定はされないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが含まれる。
一般に、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤは、それ自体既知の任意の適切な様式で、製剤化および投与することができる。例えば、上記で引用された一般的な背景技術（および特にWO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079）、ならびに標準のハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)、Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２〜２５５頁参照）を参照。
【０１９０】
特定の側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸を含み、さらに少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントを含み、任意に１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬組成物に関する。
本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤは、従来の抗体および抗体断片（ＳｃＦｖおよびダイアボディを含む）および他の薬学的に活性なタンパク質についてのそれ自体既知の任意の様式で、製剤化および投与され得る。かかる製剤およびそれを調製する方法は、当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内、脊髄内、鼻腔内または気管支内投与）、またさらに局所（すなわち、経皮または皮内）投与に好ましく適している製剤を含む。
【０１９１】
非経口投与のための製剤は、例えば、注入または注射に適した滅菌溶液、懸濁液、分散液または乳液であり得る。かかる製剤に適した担体または希釈剤には、例えば、限定はされないが、WO 08/020079の１４３頁に記載されているものが含まれる。通常、水溶液または懸濁液が好ましい。
本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤはまた、遺伝子治療から知られている送達方法を用いて投与することもでき、例えば、その遺伝子治療送達方法に関して参照により組み込まれる米国特許第5,399,346号を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤをコードする遺伝子でトランスフェクトされた一次細胞は、特定の臓器、組織、移植片、腫瘍、または細胞を標的とする組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクトされ得、さらに、細胞内局在発現のためのシグナルおよび安定化配列でトランスフェクトされ得る。
【０１９２】
本発明のさらなる側面によれば、本発明のポリペプチドは、in vivoおよびin vitroでのさらなる用途に使用され得る。例えば本発明のポリペプチドは、診断目的のために、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５の存在を検出および／または定量化するため、および／またはＡＤＡＭＴＳ５を精製するために設計されたアッセイにおいて、使用され得る。ポリペプチドはまた、毒性学、安全性、および投与量の研究を実施するために、特定の疾患の動物モデルで試験され得る。
最後に本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、前記成分をコードする少なくとも１つの核酸配列、本発明のベクターまたはベクターシステム、および／または本発明による宿主細胞を含む、キットに関する。キットは、異なる形態、例えば診断キットとして提供され得ることが企図される。
【０１９３】
本発明を、以下の非限定的な好ましい側面、実施例および図によりさらに説明する。
本出願を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
配列は、明細書の本文および、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５による別個の配列リストに記載されている。特定の番号で指定された配列は、明細書本文と別個の配列リストにおいて同一であるべきである。例として、配列番号１は、明細書本文と別個の配列リストの両方で、同じ配列を定義すべきである。明細書本文と別個の配列リストの配列定義の間に矛盾がある場合（例えば、明細書本文の配列番号１が誤って、別個の配列リストの配列番号２に対応する場合）、本出願における特定の配列への言及、特に特定の態様における言及は、別個の配列リストへの言及ではなく、本出願の本文中の配列への言及として理解されるべきである。言い換えれば、明細書本文と別個の配列リストとの間の、配列定義／指定の矛盾は、別個の配列リストを、明細書、実施例、図、および特許請求の範囲を含む出願の本文に開示されている配列およびそれらの指定に修正することにより、解決される。
【実施例】
【０１９５】
例
例１  組換えＡＤＡＭＴＳ５タンパク質の異なる種からの生成
様々なフォーマットのウシ、ラット、モルモット、マウス、およびカニクイザルの組換えＡＤＡＭＴＳ５タンパク質を、HEK293 Flp-In（商標）発現システムにより、FuGENE（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Promega）を使用して、社内で生成した。トランスフェクションの２日後、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む選択培地を細胞に加えて、安定発現細胞を選択した。
安定発現細胞を拡大した。分泌されたＡＤＡＭＴＳ５を含む馴化培地を、細胞から毎日採取し、HisTrapクロマトグラフィーで精製し、続いて５０ｍＭのHepesバッファー、ｐＨ７．５でバッファー交換した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０１９６】
例２  ＡＤＡＭＴＳ５タンパク質によるラマの免疫化、重鎖のみの抗体断片レパートリーのクローニング、およびファージの調製
２．１  免疫化
獣医学部の倫理委員会（University Ghent, Belgium）の承認後、３頭のラマを、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５タンパク質（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2198-AD）で免疫化した。
【０１９７】
２．２  重鎖のみの抗体断片レパートリーのクローニングおよびファージの調製
最後の免疫原注射に続いて、血液試料を収集した。これらの血液試料から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll-Hypaqueを使用し製造業者の指示（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US）に従って調製した。本質的にWO 05/044858に記載されているようにして、ＰＢＭＣから全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用して、ＶＨＨ／ナノボディをコードするＤＮＡセグメントを増幅した。その後、ファージを標準プロトコルに従って調製し（例えば、先行技術および本明細書で引用したAblynx N.V.の出願を参照）、４℃でのフィルター滅菌後にさらなる使用のために保存した。
【０１９８】
例３  ファージディスプレイを介したヒトＡＤＡＭＴＳ５特異的ＶＨＨの選択
すべてのラマから取得してファージライブラリにクローン化されたＶＨＨレパートリーを使用して、ヒトＡＤＡＭＴＳ５結合ナノボディを選択した。組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５タンパク質（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2198-AD）は、Maxisorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）上、５μｇ／ｍｌで、陰性対照の０μｇ／ｍｌ抗原の隣に固定した。ファージライブラリとのインキュベーションおよび徹底的な洗浄の後、結合したファージをトリプシン（１ｍｇ／ｍＬ）で溶出し、大腸菌細胞の感染に使用した。感染した大腸菌細胞を使用して、次の選択ラウンドのファージを調製するか、または分析用に寒天プレートに播種した。さらに、合成ライブラリは、３つの連続した選択ラウンドで使用した。
すべての選択ラウンドの出力を、濃縮因子について分析した；濃縮因子は、対照と比較した、溶出液に存在するファージ数である。さらなる分析のために、最適な選択条件を選択した。
特定の結合剤の選択出力をスクリーニングするために、単一のコロニーを寒天プレートから選び出し、１ｍＬの９６ディープウェルプレートで増殖させた。ＬａｃＺ制御ＶＨＨ発現は、ＩＰＴＧの添加により誘導した。ペリプラズム抽出物は、標準プロトコルに従って調製した（例えば、先行技術および本明細書で引用したAblynx N.V.の出願を参照）。
【０１９９】
例４  機能的ブロッキングナノボディのためのペリプラズム抽出物のスクリーニング
最初のステップにおいて、ペリプラズム抽出物を、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５への結合について結合ＥＬＩＳＡにより試験した。簡潔に言えば、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2198-AD）を濃度１μｇ／ｍｌで、３８４ウェルMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）に被覆した。ウェルはカゼイン溶液（１％）でブロックした。ペリプラズム抽出物の１０倍希釈液の添加後、ナノボディ結合を、マウス抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰコンジュゲート（Sigma, St. Louis, US）および、基質ｅｓＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメンチルベンジジン）（SDT, Brussels, Belgium）の存在下での続く酵素反応を使用して、検出した。無関係なナノボディ対照の平均シグナルと無関係なナノボディ対照の標準偏差の３倍の合計よりも高い、ＥＬＩＳＡシグナルを示すクローンは、陽性のヒトＡＤＡＭＴＳ５結合ナノボディをコードすると見なされた。
【０２００】
アグリカンのＡＤＡＭＴＳ５媒介性切断を防ぐことができるナノボディを識別するために、クローンを、FRETベースのヒトＡＤＡＭＴＳ５酵素アッセイにおいて、５０ｍＭのHEPES（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．１％ＣＨＡＰＳ、５％グリセロールをアッセイバッファーとして使用して、試験した。簡潔に言えば、ＡＤＡＭＴＳ５結合ナノボディを含むペリプラズム抽出物を、３８４ウェルOptiPlate（PerkinElmer, Waltham, MA, US）中で、２５μＭの消光蛍光ヒトペプチド基質（Abz-TEGEARGSVI-Dap(Dnp)-KK-NH2, Anaspec, Serain Belgium, cat# 60431-1）１０μｌ、および２５ｎＭのヒトＡＤＡＭＴＳ５（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2198-AD）１０μｌを用いて、インキュベートした。ナノボディがＡＤＡＭＴＳ５媒介性切断を防ぐ能力を、Tecan Infinite M1000プレートリーダーで２時間の間、毎分モニタリングした。データはGraphpad Prismソフトウェアで分析した。酵素の進行曲線から、陰性対照の初期速度（ｖ０）、ならびにプレート内のすべてのナノボディクローンの速度（ｖｉ）およびバックグラウンドシグナル（Ｓｂ）を決定した。式１００＊（１−（ｖｉ−Ｓｂ）／（ｖ０−Ｓｂ））を使用して、阻害パーセントを計算した。
【０２０１】
無関係なナノボディを含むペリプラズム抽出物を、陰性対照として使用した。陰性対照のシグナルと比較して蛍光シグナルを５０％以上減少させることができたＡＤＡＭＴＳ５ナノボディを含むペリプラズム抽出物は、阻害性ナノボディと見なされた。続いて、陽性クローンのＤＮＡ配列を決定した。
ペリプラズム抽出物のスクリーニングデータの概要を、表４．１に示す。抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディのアミノ酸配列を、表Ａ−１に示す。
表４．１  抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディを含むペリプラズム抽出物のスクリーニング結果
【表３】
2020525410.tif 000006
【０２０２】
クローニングおよび配列決定の後、ＣＤＲに違いはあるが、類似する結合と阻害特性を示すクローンで構成されている、様々なファミリーが特定された。
クローニングおよび配列決定の後、ナノボディ０２Ａ１２は、クローン０９Ｄ０３のファミリーメンバーとして同定された（表Ａ−１およびＡ−２を参照）。ＣＤＲ領域の配列の多様性は、以下の表４．１Ａ、４．１Ｂ、および４．１Ｃに示されている。クローン０９Ｄ０３のＣＤＲのアミノ酸配列は、ファミリーメンバーのＣＤＲを比較する基準として使用した（ＣＤＲ１はKabat位置２６で始まり、ＣＤＲ１はKabat位置５０で始まり、およびＣＤＲ３はKabat位置９５で始まる）。
表４．１Ａ（０９Ｄ０３ ＣＤＲ１）
【表４】
2020525410.tif 000007
＊１つのクローンにおいて最大６個のＣＤＲ１変異（配列番号２２）
【０２０３】
表４．１Ｂ（０９Ｄ０３ ＣＤＲ２１）
【表５】
2020525410.tif 000008
＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ２変異（配列番号３６）
表４．１Ｃ（０９Ｄ０３ ＣＤＲ３）
【表６】
2020525410.tif 000009
＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ変異（配列番号５４）
【０２０４】
クローンニングおよび配列決定の後、クローン０９Ａ０５はクローン０３Ｂ０２のファミリーメンバーとして同定された（表Ａ−１およびＡ−２を参照）。ＣＤＲ領域の配列の多様性は、以下の表４．１Ｄ、４．１Ｅ、および４．１Ｆに示されている。クローン０３Ｂ０２のＣＤＲのアミノ酸配列は、ファミリーメンバーのＣＤＲを比較する基準として使用した（ＣＤＲ１はKabat位置２６で始まり、ＣＤＲ１はKabat位置５０で始まり、およびＣＤＲ３はKabat位置９５で始まる）。
表４．１Ｄ（０３Ｂ０２ ＣＤＲ１）
【表７】
2020525410.tif 000010
＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ１変異（配列番号３３）
【０２０５】
表４．１Ｅ（０３Ｂ０２ ＣＤＲ２）
【表８】
2020525410.tif 000011
＊１つのクローンにおいて最大３個のＣＤＲ２変異（配列番号５０）
表４．１Ｆ（０３Ｂ０２ ＣＤＲ３）
【表９】
2020525410.tif 000012
＊１つのクローンにおいて最大２個のＣＤＲ変異（配列番号６８）
【０２０６】
クローンニングおよび配列決定の後、クローン０３Ｄ０２および０２Ｃ１０はクローン０３Ｄ０１のファミリーメンバーとして同定された（表Ａ−１およびＡ−２を参照）。ＣＤＲ領域の配列の多様性は、以下の表４．１Ｇ、４．１Ｈ、および４．１Ｉに示されている。クローン０３Ｄ０１のＣＤＲのアミノ酸配列は、ファミリーメンバーのＣＤＲを比較する基準として使用した（ＣＤＲ１はKabat位置２６で始まり、ＣＤＲ１はKabat位置５０で始まり、およびＣＤＲ３はKabat位置９５で始まる）。
表４．１Ｇ（０３Ｄ０１ ＣＤＲ１）
【表１０】
2020525410.tif 000013
＊１つのクローンにおいて最大０個のＣＤＲ１変異（配列番号２８）
【０２０７】
表４．１Ｈ（０３Ｄ０１ ＣＤＲ２）
【表１１】
2020525410.tif 000014
＊１つのクローンにおいて最大３個のＣＤＲ１変異（配列番号４４）
表４．１I（０３Ｄ０１ ＣＤＲ３）
【表１２】
2020525410.tif 000015
＊１つのクローンにおいて最大１個のＣＤＲ変異（配列番号６２）
上記の結果は、結合および阻害特性を保持しつつ、いくつかのアミノ酸の変化が許容されることを示している。特に、ＡＤＡＭＴＳ５への結合は、ＡＤＡＭＴＳ５活性の阻害の予測因子ではない。例えばクローン３Ｆ０４は強力な結合剤であるが、弱い阻害剤である。
【０２０８】
例５  精製された一価ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの特性評価
例４に記載されたスクリーニングから選択されたクローンを、さらに特性評価した。選択されたナノボディの大腸菌（ＴＧ−１）での形質転換の際に、１ｍＭのＩＰＴＧの添加により発現を誘導し、３７℃で４時間継続させた。細胞培養物を回転させた後、ペリプラズム抽出物を、ペレットを凍結融解し続いて遠心分離することにより、調製した。次にこれらの抽出物を、HisTrap FF粗１ｍｌカラム（GE healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom）でＩＭＡＣを介して精製するための出発材料として使用し、続いてZebaスピンカラム（Pierce, Rockford, IL, USA）で脱塩し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの評価により少なくとも９５％純度を得た。
【０２０９】
５．１  ＡＤＡＭＴＳ５ブロッキングナノボディの酵素ＡＤＡＭＴＳ５アッセイにおける評価
ナノボディがアグリカンのＡＤＡＭＴＳ５媒介性切断を防止する能力を、本質的に例４に記載されているように、FRETベースの酵素アッセイで確認した。データはGraphpad Prismソフトウェアで分析した。酵素進行曲線から初期速度を決定し（ｖｉ）、これらの値を阻害剤濃度の関数としてプロットし、ＩＣ５０値を算出した。基本的に、精製されたナノボディを用いたヒトFRETアッセイにより、ペリプラズム抽出物を用いた例４に記載の結果が確認された。ＩＣ５０は１．８Ｅ−０９Ｍ〜３．７Ｅ−０８Ｍの範囲であった。特に、従来のｍＡｂ １２Ｆ４は一価のナノボディよりも、ＩＣ５０が１．０Ｅ−０９Ｍでやや優れていたが、すべてのナノボディが優れた有効性を示した（データは示さず）。
【０２１０】
FRETベースのアッセイの次に、基質としてビオチン化４３マーアグリカンオリゴペプチドを用いた、AlphaLISA（Perkin Elmer, Waltham, MA, US）ベースのヒトＡＤＡＭＴＳ５アッセイを実施した。この基質のＡＤＡＭＴＳ５切断により、ビオチン化ＡＲＧＳＶネオエピトープ産物が放出され、これは、ストレプトアビジン−AlphaScreenドナービーズおよび抗マウスＩｇＧ被覆AlphaLISAアクセプタービーズに捕捉された抗ネオエピトープ（「ＡＲＧＳＶ」）抗体によって検出することができ、レーザー励起時に発光AlphaScreenシグナルの生成がもたらされる。
【０２１１】
ナノボディの阻害能力を決定するために、精製ナノボディの連続希釈液（陽性対照および陰性の無関係ナノボディ対照と共に）を、ヒトＡＤＡＭＴＳ５（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2198-AD）を用いて、３８４ウェルOptiplate（Perkin Elmer, Waltham, MA, US）中、室温で１５分間インキュベートした。ビオチン化４３マーアグリカンオリゴペプチド基質（Biosyntan, Berlin, Germany）を添加し、３７℃で３時間インキュベートした後、反応を停止した。最初の検出ステップは、ネオエピトープ「ＡＲＧＳＶ」に対するアグリカン抗体、マウスＢＣ３ ｍＡｂ（MDBioproducts, Egg, Switzerland）およびストレプトアビジンAlphaScreenドナービーズ（Perkin Elmer）を含む５μｌの検出溶液１の添加により、実施した。室温で１時間インキュベートした後、抗マウスAlphaLISAアクセプタービーズ（Perkin Elmer）を含む５μｌの第２の検出溶液を加えた。プレートを室温で２時間、暗所でインキュベートした。測定は、Envision Multi label Plate reader（Perkin Elmer, Waltham, MA, US）でプレートを読み取って実施した。
【０２１２】
ナノボディの、ＡＤＡＭＴＳ５媒介性の基質の切断を防ぐ能力を決定するために、シグナルの減少をナノボディ濃度の関数で分析し、ＩＣ５０値を算出した。
結果を表５．１にまとめる。
表５．１  ヒトAlphaLISA酵素アッセイにおける、ナノボディおよび参照化合物についてのＡＤＡＭＴＳ５の効力（ＩＣ５０）および阻害パーセント（％）。
【表１３】
2020525410.tif 000016
【０２１３】
AlphaLISAアッセイにおいて、少なくとも３つの１価ナノボディ（２Ｆ０３、１１Ｂ０６、および９Ｄ０３）が従来のｍＡｂ １２Ｆ４と同様のＩＣ５０値を示し、残りはより高い値を示す。しかし、すべてのナノボディはほぼ１００％の阻害を示す。驚くべきことに、ｍＡｂ １２Ｆ０４よりも少なくとも１００倍高いＩＣ５０値を有するナノボディ３Ｂ０３は、依然として１００％の阻害を有する。
【０２１４】
５．２  ＡＤＡＭＴＳ５ブロッキングナノボディのウシ外植片アッセイにおける評価
ナノボディの、ex vivoアッセイ（ここで基質は、生化学アッセイと比較して生理学的条件により近い状態で提示される）における、軟骨の分解をブロックする能力の評価では、ウシ外植片アッセイを実施した。簡潔に言えば、ウシの軟骨外植片（直径４ｍｍ）を牛の膝関節から新たに調製し、ＩＬ−１αの存在下で９６ウェルプレート中でインキュベートして、軟骨の分解を誘導した。軟骨／アグリカン分解の尺度として、５日間のインキュベーション（３７℃、７．５％ＣＯ２）後の上清において、異染性色素１，９ジメチルメチレンブルー（６３３ｎｍでの発光）を介して、ＧＡＧの放出が検出された。コンドロイチン硫酸は、アッセイ標準として含まれた。有効性は、化合物を含まない（０％）およびMSC2310852Aの存在下（１００％の効果）のＩＬ−１α誘導対照により、定義した。
結果を表５．２にまとめる。
【０２１５】
表５．２  ウシ外植片アッセイにおける一価ナノボディのＩＣ５０値。
【表１４】
2020525410.tif 000017
＊結果は、１アッセイ内で同一の外植片および同一の実験ＩＤを用いてのみ、比較可能である。
【０２１６】
５．３  エピトープビニング
ＳＰＲベースの「サンドイッチアッセイ」をBiacore T100機器で実行して、ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディを異なるエピトープビンにグループ化した。この目的のために、各抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディは、ＣＭ５センサーチップに、ＥＤＣおよびＮＨＳ化学を使用したアミンカップリングを介して固定化された。１００ｎＭのＡＤＡＭＴＳ５の捕捉ステップの後、１μＭ濃度の精製ナノボディを、それぞれ１サイクルで再生なしで、表面接触時間１２０秒、流量４５μＬ／分で注入した。曲線をBiacore T100評価ソフトウェアで処理し、捕捉されたＡＤＡＭＴＳ５への追加の結合あり（異なるビン）またはなし（同一のビン）について評価した。
ナノボディは、２つのグループに分類することができた：１つの大きなビン（「ビン１」）は、類似または重複するエピトープを有するすべての阻害性ナノボディを含み、第２のグループは、ＡＤＡＭＴＳ５の異なるエピトープを認識する結合性かつ非機能性ナノボディ３Ｆ０４を含む（「ビン２」）。
表５．３は、試験されたナノボディの結合エピトープをまとめたものである。
表５．３  抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディのエピトープビン
【表１５】
2020525410.tif 000018
【０２１７】
５．４  種の交差反応性
種の交差反応性は、最初にＳＰＲベースのオフレート分析により、Biacore T100機器で評価した。ナノボディは、ヒト、カニクイザル（「カニクイザル（cyno）」）、モルモット、マウス、およびウシのＡＤＡＭＴＳ５への結合について試験した。この目的のために、組換えＡＤＡＭＴＳ５を、ＣＭ５チップ上に、ＥＤＣおよびＮＨＳを使用したアミンカップリングにより固定化した。精製されたナノボディを１００ｎＭの濃度で２分間注入し、４５ｕｌ／分の流速で１５分間解離させた。個々のナノボディのオフレートは、１：１相互作用モデル（ラングミュアモデル）を個々の解離曲線に適合させることにより、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して決定した。参照として、ヒトＡＤＡＭＴＳ５でのオフレートを各実験で決定した。
結果を、表５．４Ａにまとめる。
【０２１８】
表５．４Ａ  一価抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの種交差反応性データの概要
【表１６】
2020525410.tif 000019
【０２１９】
試験した各ナノボディについて、同様のオフレートが試験したすべての種で観察された。
さらに、カニクイザルとモルモットのＡＤＡＭＴＳ５の交差反応性も、AlphaLISAを使用した効力測定により、本質的に例５．１に記載のようにして、ただしビオチン化カニクイザル４３−アグリカンオリゴペプチド基質およびビオチン化モルモット４３−アグリカンオリゴペプチド基質を使用して検討した。ナノボディの、ＡＤＡＭＴＳ５媒介性の基質の切断を防ぐ能力を決定するために、シグナルの減少をナノボディ濃度の関数で分析し、ＩＣ５０値を算出した。
得られた効力を、表５．４Ｂにまとめる。
表５．４Ｂ  一価抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの種交差反応性データの概要
【表１７】
2020525410.tif 000020
【０２２０】
すべてのナノボディおよび対照化合物は、ヒトおよびカニクイザルＡＤＡＭＴＳ５を同様の効力でブロックした。モルモットAlphaLISAでは、最も強力なナノボディは、ヒトAlphaLISAにおけるよりわずかに低い効力を示したが、これはおそらく、酵素濃度の増加によるアッセイ感度の低下の結果であろう。
ナノボディ２Ａ１２、２Ｆ０３、０９３および０４９のラット交差反応性は、ＳＰＲベースの親和性測定により、Biacore T100を使用して評価した。参照のために、ヒトＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性も決定した。このために、ラットおよびヒトＡＤＡＭＴＳ５をＣＭ５チップ上に、ＥＤＣおよびＮＨＳ化学を使用したアミンカップリングにより固定化した。精製されたナノボディを、異なる濃度（１〜１０００ｎＭの間）で２分間注入し、４５μｌ／分の流量で２５分間解離させた。動力学定数は、センサーグラムから、BIAEvaluationソフトウェア（１：１相互作用）を使用して算出した。
【０２２１】
表５．４Ｃに示すように、試験されたすべてのナノボディについて、ヒトＡＤＡＭＴＳ５およびラットＡＤＡＭＴＳ５に対する同様の親和性が得られた。半減期が延長されたナノボディ０６９（下記参照）の親和性は、その一価の対応物（ナノボディ０４９）の親和性に類似しており、ＡＬＢ１１のＣ末端への添加が、親和性に影響を与えないことを示す。半減期が延長された二重パラトピックナノボディ１３０の親和性は、半減期が延長されたナノボディ０６９の親和性と比較して、両方の種で高かった（ヒトＡＤＡＭＴＳ５で１５倍、ラットＡＤＡＭＴＳ５で１０倍）（表５．４Ｃ）。
表５．４Ｃ  ヒトＡＤＡＭＴＳ５およびラットＡＤＡＭＴＳ５への親和性の概要
【表１８】
2020525410.tif 000021
【０２２２】
５．５  ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４活性の阻害
ＡＤＡＭＴＳ５に対するナノボディの選択性を確認するために、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４の酵素活性の阻害を、それぞれの酵素を使用したFRETベースのアッセイで評価した。簡潔に言えば、活性化されたヒトＭＭＰ１またはＭＭＰ１４を、室温で３０分間、ナノボディの希釈系列１０μｌを用いてインキュベートした。インキュベーション後、５μＭまたは２．５μＭの蛍光ペプチド基質（Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2蛍光ＭＭＰ基質（R&D Systems cat #ES001））それぞれを２０μｌ添加した。ナノボディの、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４媒介性の切断を防ぐ能力を、１分ごとに２時間、３７℃で、Tecan Infinite M1000プレートリーダーでモニタリングした。
得られた滴定曲線を、図１に示す。
天然の阻害剤ＴＩＭＰ２およびＴＩＭＰ３は、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４活性を阻害したが、試験したナノボディはいずれも、阻害を示さなかった。
【０２２３】
５．６  ヒトＡＤＡＭＴＳ４活性の阻害
ヒトＡＤＡＭＴＳ４の阻害を評価するために、ヒトＡＤＡＭＴＳ５のAlphaLISAと同様のアッセイを、本質的に例５．１に記載されているようにして、ただしヒトＡＤＡＭＴＳ４（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 4307-AD）を使用して実施した。ナノボディの、ヒトＡＤＡＭＴＳ４媒介性の基質の切断を防ぐ能力を決定するために、シグナルの減少をナノボディ濃度の関数で分析し、ＩＣ５０値を算出した。
結果を図２に示す。
小分子MSC2310852AはヒトＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害したが、試験したナノボディまたはｍＡｂ １２Ｆ４はいずれも、阻害活性を示さなかった（図２参照）。モノクローナル抗体１２Ｆ４（Ｈ４Ｌ０）は、WO 2011/002968において、ＡＤＡＭＴＳ４よりも選択的であると記載されている。
【０２２４】
例６  ナノボディをフォーマットする
６．１  Ｎ−グリコシル化モチーフのノックアウト
ナノボディ１１Ｂ０６（位置Ｎ５２）およびナノボディ３Ｆ０４（位置Ｎ１１０ｆ）に存在するＮ−グリコシル化モチーフを、フォーマットする前にノックアウトした。この部位を、ＮＮＫコドンライブラリを使用してランダム化した。これらの位置はＣＤＲにあるため、モチーフの変異は結合特性に影響を与える可能性がある。したがって、ライブラリの、結合特性に影響を及ぼさない可能な置換についてのスクリーニングを、Biacore T100機器を使用したヒトＡＤＡＭＴＳ５のＳＰＲベースのオフレート分析により、本質的に例５．４に記載されているようにして行った。
驚くべきことに、ナノボディ１１Ｂ０６におけるアミノ酸Ｎ５２のセリンによる置換、およびナノボディ３Ｆ０４におけるアミノ酸Ｎ１００Ｆのグルタミンによる置換は、結合に影響しなかった（データは示さず）。
したがって、さらにフォーマットするためのビルディングブロックとして、ナノボディ０４９（＝１１Ｂ０６（Ｎ５２Ｓ））および０９３（３Ｆ０４（Ｎ１００ＦＱ））を、それぞれナノボディ１１Ｂ０６および３Ｆ０４の代わりに使用した（表Ａ−１を参照）。
【０２２５】
６．２  フォーマットされたナノボディの生成
ヒトＡＤＡＭＴＳ５アグリカナーゼ活性をブロックする半減期延長ナノボディ構築物の生成のために、ナノボディ２Ａ１２、２Ｄ０７、２Ｆ０３、０４９、９Ｄ０３および３Ｂ０２を、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）−ナノボディＡＬＢ１１に融合させた（表６．３を参照）。さらに、ＡＬＢ１１半減期延長構築物を、異なる結合エピトープからの２つのナノボディの組み合わせ（ビン１メンバーとビン２メンバーの組み合わせ）からも生成した。フォーマットされたナノボディ構築物は、Pichia pastorisで発現され、培養培地に分泌され、Poros MabCaptureA Protein Aビーズ（Applied Biosystems, Bleiswijk, Netherlands cat # 4374729）で親和性精製された。ナノボディ構築物の完全性（integrity）が確認された。
【０２２６】
６．３  ＨＳＡの不在下および存在下でのAlphaLISAにおける効力
フォーマットされたナノボディ構築物を、例５．１に記載のように、AlphaLISAで試験した。さらに、ＨＳＡ結合のナノボディの効力に対する影響を、過剰のＨＳＡ（最終濃度４．２μＭ）の存在下で実験を行うことにより検討した。
すべての半減期延長ナノボディ構築物のＩＣ５０値を、表６．３に示す。
表６．３．フォーマットされたナノボディ構築物（＋／−ＨＳＡ）のAlphaLISAで決定された効力
【表１９】
2020525410.tif 000022
ＮＤ＝未決定；０９３＊＝３Ｆ０４（Ｎ１００ｆＱ）；０４９２＊＝１１Ｂ０６（Ｎ５２Ｓ）
結果は、ＡＬＢ１１フォーマットもＨＳＡ結合も、ナノボディ構築物の効力に影響を与えないことを示す。
【０２２７】
６．４  ＨＳＡへの結合
ＡＬＢ１１ナノボディのＨＳＡに対する親和性は、ＳＰＲを介してBiacore T100で決定した。この目的のために、ＨＳＡをＣＭ５チップ上にアミンカップリングにより固定し、本質的に例５．３に記載のように処理した。参照として一価ＡＬＢ１１の親和性も測定し、これは３．２ｎＭであった。
結果を表６．４にまとめる。
表６．４  ＨＬＥナノボディ構築物のＨＳＡに対する親和性
【表２０】
2020525410.tif 000023
ＮＤ＝未決定；＊ＦＮｂ＝機能性ナノボディ；０４９２＊＝１１Ｂ０６（Ｎ５２Ｓ）；０９３３＊＝３Ｆ０４（Ｎ１００ｆＱ）
半減期が延長されたすべてのＡＤＡＭＴＳ５ナノボディ構築物は、類似の親和性を有し（表６．４を参照）、これは一価ＡＬＢ１１のＨＳＡに対する親和性よりも低かった。
【０２２８】
６．５  ヒトＡＤＡＭＴＳ５のKinExAによる親和性決定
フォーマットされたナノボディ構築物０６９（０４９−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１）およびナノボディ構築物１３０（０４９−３５ＧＳ−０９３−ＡＬＢ１１）（表６．５も参照）の親和性を、溶液中で結合平衡除外法により、KinExA3000機器（Sapidyne, Boise, USA）で決定した。この目的のために、ヒトＡＤＡＭＴＳ５を、Darling and Brault (2004 Assay Drug Dev Technol. 2:647-57)で詳細に説明されている製造業者の指示に従って、ＰＭＭＡビーズに結合した。一定濃度のナノボディ構築物（５０ｐＭナノボディ構築物０６９または５ｐＭナノボディ構築物１３０）を、２ｎＭ〜０．２ｐＭの範囲のヒトＡＤＡＭＴＳ５の系列に加え、室温で１６時間、平衡に達するまでインキュベートした。その後、混合物をKinExAのオートサンプラーを介して、ヒトＡＤＡＭＴＳ５にコンジュゲートしたＰＭＭＡビーズを充填したカラムに注入し、ビーズ上の遊離ナノボディ構築物を捕捉し、Alexa647標識ＨＳＡで検出した。遊離ナノボディ構築物の割合を、滴定されたヒトＡＤＡＭＴＳ５の関数としてプロットし、KinExA Proソフトウェアv3.2.6を使用して適合させた。
【０２２９】
結果を表６．５に示す。
表６．５  KinExAを介して決定された、ヒトＡＤＡＭＴＳ５への結合に対する２つのナノボディ構築物の親和性
【表２１】
2020525410.tif 000024
０４９＊＝１１Ｂ０６（Ｎ５２Ｓ）；０９３２＊＝３Ｆ０４（Ｎ１００ｆＱ）
ナノボディ構築物０６９と比較して、ナノボディ構築物１３０で約２０倍高い親和性が観察される。これらのデータは、ナノボディ構築物１３０のヒトＡＤＡＭＴＳ５への強い結合を確認する。
【０２３０】
例７  ナノボディの配列最適化（ＳＯ）
例示のナノボディ２Ｆ０３、ナノボディ０４９（１１Ｂ０６（Ｎ５２Ｓ））およびナノボディ０９３（３Ｆ０４（Ｎ１００ｆＱ））を、配列最適化プロセスに供した。配列最適化は親ナノボディ配列が変異するプロセスであり、このプロセスは、ナノボディのヒト化（ｉ）およびノックアウト翻訳後修飾（ｉｉ）、ならびに潜在的な既存抗体に対するエピトープ（ｉｉｉ）をカバーする。ナノボディＡＬＢ１１も、潜在的な既存抗体に対するエピトープをノックアウトするよう、変異させた。
（ｉ）ヒト化の目的で親ナノボディ配列を変異させ、ヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖細胞系コンセンサス配列とより同一のナノボディ配列を生成する。ナノボディとヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖細胞系コンセンサスとの間で異なるフレームワーク領域における特定のアミノ酸（いわゆるホールマーク残基を除く）は、タンパク質の構造、活性、および安定性が無傷のままであるようにして、ヒトの対応物に変更される。いくつかの特徴的な残基は、ナノボディの安定性、活性、親和性に重要であることが知られているため、これらは変異されない。
【０２３１】
（ｉｉ）ＣＤＲに存在し、翻訳後修飾（ＰＴＭ）に敏感であるという実験的証拠があるアミノ酸は、ＰＴＭ部位は不活性化されるが、タンパク質の構造、活性、および安定性は維持されたままであるように、変更される。
（ｉｉｉ）ナノボディの配列は、タンパク質の構造、活性、および安定性に影響を与えることなく最適化されて、任意の天然に存在する既存の抗体の結合を最小限に抑え、処置により出現する免疫原性反応を引き起こす可能性を低下させる。
配列最適化されフォーマットされたナノボディ構築物５８１およびナノボディ構築物５７９の生成のために、それぞれのビルディングブロックが、３５ＧＳリンカーを介して接続された。これにより、ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）およびナノボディ構築物５７９（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−０９３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）がそれぞれ得られた（表Ａ−１を参照）。構築物は、Pichia Pastorisでタグなしタンパク質として生産され、Protein A親和性クロマトグラフィーによって精製された後、脱塩された。ナノボディ構築物の完全性が確認された。
【０２３２】
７．１  ヒトＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性
ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）の親和性を、KinExAを使用し、例６．５に記載されているようにして、ただし記載のプロトコルにマイナーな適合を入れて決定した。２０ｐＭの固定濃度のナノボディ構築物５８１を、ヒトＡＤＡＭＴＳ５の希釈系列（２０ｎＭ〜０．３２ｐＭの範囲の２．２倍連続希釈および、ＡＤＡＭＴＳ５なしのブランク）と共にインキュベートした。アルブミンの干渉を試験するために、ＨＳＡを、ナノボディ構築物５８１のＫＤの１００倍の濃度で、ヒトＡＤＡＭＴＳ５を使用した選択実験におけるこのプレインキュベーションに添加した。混合物をインキュベートし、KinExAのオートサンプラーを介した、ヒトＡＤＡＭＴＳ５にコンジュゲートしたＰＭＭＡビーズを充填したカラムへの注入の２４時間前に、平衡に達することを可能にした。捕捉されたナノボディ構築物５８１は、ナノボディ構築物５８１を認識するＡＦ６４７標識抗ナノボディツール（Ablynxにより生成）を使用して検出した。
【０２３３】
結果を表７．１に示す。
表７．１  ＨＳＡの有無の場合の、ヒトＡＤＡＭＴＳ５に対するナノボディ構築物５８１の親和性
【表２２】
2020525410.tif 000025
結果は、ナノボディ構築物５８１のヒトＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性が、ＨＳＡなしで３．６５ｐＭ、ＨＳＡありで４．８４ｐＭであることを示す。
【０２３４】
７．２  血清アルブミンに対する親和性
ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）におけるＡＬＢ１１ビルディングブロックの、ヒト、カニクイザル、モルモット、マウス、およびラットの血清アルブミン（ＳＡ）への結合に対する親和性を、ＳＰＲを使用して例５．３に記載のように決定した。
結果を表７．２に示す。
表７．２  ヒト、カニクイザル、モルモット、マウス、およびラットの血清アルブミンへの結合に対する、ナノボディ構築物５８１の親和性（ＫＤ、ｎＭ）
【表２３】
2020525410.tif 000026
＊オフレートは検出限界外：＞５．０Ｅ−０１（１／ｓ）
【０２３５】
７．３  プレＡｂ結合
ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）およびナノボディ構築物５７９（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−０９３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）を、３つの関連ドナー血清試料セット（健康な対象からの試料、ＯＡ試料、および既知の残留プレＡｂが他のナノボディに結合しているバイアスセット試料）からの既存の抗体（プレＡｂ）結合について、ＳＰＲテクノロジーを介してProteOn XPR36機器でスクリーニングした。血液試料は、ＨＳＡに捕捉された抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディ構築物への結合について分析した。既存抗体の結合レベルを、センサーグラムを二重参照した後、レポートポイントを１２５秒（関連付け終了後５秒）に設定して、決定した。分析は、ProteOn manager 3.1（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を使用して実施した。
結果を図３に示す。
両方のナノボディ構築物は、低い残留プレＡｂ結合レベルを有し、ナノボディ構築物５８１は明らかに、最小の残留プレＡｂ結合を示した（図３を参照）。
【０２３６】
７．４  ヒトAlphaLISAにおける機能
AlphaLISAを、ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）でヒトＡＤＡＭＴＳ５を使用して、本質的に例５．１に記載されているように実施した。
結果を表７．４に示す。
表７．４  ナノボディ構築物５８１のAlphaLISAにより決定された効力（ｐＭ）。
【表２４】
2020525410.tif 000027
結果は、ナノボディ構築物５８１の効力が１８８ｐＭであることを示す。
【０２３７】
７．５  樹状細胞Ｔ細胞アッセイにおける免疫原性プロファイリング
相対的な免疫原性を、樹状細胞Ｔ細胞増殖アッセイで決定した。本質的に、ナノボディを、最も豊富なＨＬＡクラスＩＩアレルを含有する５０の健康なドナーの細胞試料に対して試験したが、それは、これらが世界人口の大半を代表するからである。免疫応答の評価を、抗薬物抗体形成の代理マーカーとしてＴ細胞増殖を用いて行った。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を陽性対照として使用した。陽性対照ＫＬＨは、５０人のドナーすべてで陽性反応をもたらした。試験したドナーはすべて、ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）について陽性ではなかった。ナノボディ構築物５７９（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−０９３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）は、３人のドナー（６％）で陽性反応を示した。ブランク条件（培地のみ）では、５０人のドナーのうち２人（４％）が陽性反応を示した。これらの結果を使用して、５０人のドナーのうち３人を超える全体的な応答しきい値を設定し、これは、６％を超える全体的な応答しきい値に対応する。試験したナノボディの全体的な免疫原性ポテンシャルは、有意な陽性反応の割合が６％以下であったため、低いと見なされた（表７．５を参照）。
【０２３８】
表７．５  ＤＣ−Ｔ細胞アッセイで測定された免疫原性プロファイリング結果
【表２５】
2020525410.tif 000028
【０２３９】
７．６  ヒトＡＤＡＭＴＳ１への結合
ヒトＡＤＡＭＴＳ１への結合を、結合ＥＬＩＳＡで試験した（図４ＡＡを参照）。簡潔に言えば、１８．５ｎＭのヒトＡＤＡＭＴＳ１（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2197-AD)）およびヒトＡＤＡＭＴＳ５（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 2198-AD）を、３８４ウェルMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）に被覆した。ウェルをカゼイン溶液（１％）でブロックし、ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）および抗ヒトＡＤＡＭＴＳ１ ｍＡｂ（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # MAB2197）の希釈系列を、両方の被覆されたタンパク質への結合について試験した。ナノボディ構築物５８１（Ablynxにより生成）およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体（Abcam, Cambridge, UK）をそれぞれ認識する、ＨＲＰコンジュゲート抗ナノボディツールでの検出、およびその後の基質ｅｓＴＭＢ（３、３’，５，５’−テトラメンチルベンジジン）（SDT, Brussels, Belgium）の存在下での酵素反応の後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。
用量反応曲線は、ヒトＡＤＡＭＴＳ５ｈのナノボディ構築物５８１およびヒトＡＤＡＭＴＳ１の抗ヒトＡＤＡＭＴＳ１ ｍＡｂについて観察され、ナノボディ構築物５８１が、ヒトＡＤＡＭＴＳ１に結合しないことを示す。
【０２４０】
７．７  ヒトＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ１５への結合
ヒトＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ１５への結合を、結合ＥＬＩＳＡで試験した（図４Ｂを参照）。簡潔に言えば、１μｇ／ｍＬのヒトＡＤＡＭＴＳ４（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 4307-AD）またはヒトＡＤＡＭＴＳ１５（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 5149-AD）を、１μｇ／ｍＬで一晩、９６ウェルMaxisorpＥＬＩＳＡプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）に被覆した。プレートをSuperBlock T20（ＰＢＳ）（Thermo Scientific Pierce; cat # 37516）でブロックした後、ナノボディ構築物５８１（「C011400581」）、または陽性対照抗ＡＤＡＭＴＳ４ ｍＡｂ（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # MAB4307）、または陽性対照抗ＡＤＡＭＴＳ１５ ｍＡｂ（R&D Systems, Minneapolis, US; cat # MAB5149）を、１μＭから開始して被覆プレートに塗布し、室温で１時間インキュベートした。結合したC011400581ナノボディは、ナノボディ構築物５８１（Ablynxによって生成）を認識するビオチン化抗ナノボディツールで検出し、一方陽性対照ｍＡｂは、ビオチン化ヤギ抗マウスｐＡｂ（Jackson Immuno Research; cat # 115-065-062）で検出した。両方のストレプトアビジン−ＨＲＰを、二次検出ツール（Thermo Scientific Pierce; cat # 21126）として使用した。次にプレートを、ｓＴＭＢを添加して視覚化した（SDT, Brussels, Belgium）。すべての希釈および検出ツールは、アッセイ希釈液（＝ＰＢＳ＋１０％Superblock＋０．０５％Tween20）中に調製した。発色反応は、２．５分後に１ＭのＨＣｌを添加することにより停止させた。光学密度を４５０ｎｍで、６２０ｎｍを基準波長として測定した。
【０２４１】
７．８  KinExA親和性決定による種の交差反応性
ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）の、いくつかの種のＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性は、KinExAを使用して例７．１に記載されているように決定した。すべての種について、ヒトＡＤＡＭＴＳ５にコンジュゲートしたＰＭＭＡビーズを調製し、上記のように遊離のナノボディ構築物５８１を捕捉するために使用した。捕捉されたナノボディ構築物５８１は、ナノボディ構築物５８１（Ablynxによって生成）を認識するＡＦ６４７標識抗ナノボディツールを使用して検出した。結果を表７．７に示す。
表７．７  ナノボディ構築物５８１の、カニクイザル、ラット、マウス、ウシのＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性
【表２６】
2020525410.tif 000029
【０２４２】
例８  ヒト外植片アッセイにおける効力
ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）を、軟骨分解をブロックする能力について、ex vivoアッセイで本質的に例５．２に記載されているようにして、ただし今回はヒト外植片アッセイにおいて評価した。簡潔に言えば、ヒト軟骨外植片（直径４ｍｍ）をヒト膝関節から新たに調製し、９６ウェルプレートで、軟骨分解を誘発するために１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１αの存在下でインキュベートした。軟骨／アグリカン分解の尺度として、ＧＡＧの放出を、７日間のインキュベーション（３７℃、７．５％ＣＯ２）後の上清において、異染性色素１，９ジメチルメチレンブルー（６３３ｎｍでの発光）を介して検出した。コンドロイチン硫酸は、アッセイ標準として含まれた。有効性は、ＩＬ−１βおよびＯＳＭ誘導対照により、化合物なしでSC2310852Aの存在下で定義された。ＣＲＢ００１７は、第Ｉ相臨床試験（Rottapharm）で使用される抗ＡＤＡＭＴＳ５ ｍＡｂである。
【０２４３】
結果を、図５および表８にまとめる。
表８
【表２７】
2020525410.tif 000030
ナノボディはヒト外植片アッセイにおいて、高い効力および軟骨の分解（ＧＡＧ損失）の１００％阻害を示す。表８に示すように、ナノボディはウシ外植片アッセイにおいて、ＣＲＢ００１７よりも少なくとも１０倍優れている。
【０２４４】
例９  ウシ共培養モデルにおけるＣ２Ｍ、Ｃ３ＭおよびｅｘＡＧＮＸ１の調節
ナノボディ構築物５８１（図では「５８１」）が、ウシ共培養システムにおける、ＧＡＧの放出および含有量、Ｃ２Ｍ（コラーゲンＩＩ分解のマーカー）、Ｃ３Ｍ（コラーゲンＩＩＩ分解のマーカー）およびｅｘＡＧＮｘ１（ネオエピトープＴＥＧＥを特徴付けるアグリカン分解のマーカー）に及ぼす影響を調査した。この共培養システムでは、ウシの膝からの軟骨外植片を、同一動物の滑膜と共に２８日間インキュベートした。最高のＧＡＧ放出は、培養７日後に検出された（図６Ａ）。ナノボディ構築物５８１は、３つの濃度で試験した：１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ。軟骨外植片を滑膜とインキュベートすると、ＧＡＧ放出が増加した。ナノボディ構築物５８１は、ＧＡＧ放出を阻害した（図６Ｂ）。
【０２４５】
ＧＡＧ放出と共に、軟骨外植片の残りのＧＡＧ含有量の分析（パパイン消化後）は、外植片のみと比較した場合の、外植片と滑膜の共インキュベーション後のＧＡＧ含有量の減少を明らかにした（図６Ｃ）。
ＧＡＧ放出の分析と並行して、アグリカン分解の特異的マーカーとしてのｅｘＡＧＮｘ１の放出を測定した。曲線下面積分析（ＡＵＣ）は、軟骨外植片と滑膜を一緒にインキュベートした場合に、ｅｘＡＧＮｘ１放出の強力な誘導を示した。さらに、ナノボディ構築物５８１は、濃度依存的にｅｘＡＧＮｘ１の放出を阻害し、１００ｎＭの５８１で完全に阻害した（図７）。
【０２４６】
ナノボディ構築物５８１の、共培養システムにおける軟骨のコラーゲンネットワークに対する効果を、Ｃ２ＭをコラーゲンＩＩ分解のマーカーとして測定した。アグリカンネットワークの分解のマーカー（ＧＡＧおよびｅｘＡＧＮｘ１）とは対照的に、Ｃ２Ｍは、１４日目から２１日目の間で増加し始めた。共培養システムにおけるナノボディ構築物５８１のインキュベーションは、Ｃ２Ｍの放出を抑制した（図８）。
滑膜炎症の追加マーカーとして、Ｃ３Ｍ（すなわち、ＩＩＩ型コラーゲン分解マーカー）を決定した。Ｃ３Ｍ放出の時間経過分析は、Ｃ３Ｍが１４日後に増加し始め、２１日目付近でピークに達することを示した。ナノボディ構築物５８１による処置は、Ｃ３Ｍを３つの濃度すべてで阻害した（図９）。
【０２４７】
例１０  ＮＨＰにおけるアグリカナーゼ活性の阻害
ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１；「C011400581」）のin vivoでのアグリカナーゼ活性の阻害能力を、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルであるカニクイザルで評価した。簡単に述べると、ナノボディ構築物５８１を、３匹のオスと３匹のメスのカニクイザルの群に、用量レベル６、３０、または１５０ｍｇ／ｋで４週間、週１回、皮下（ｓ．ｃ．）投与で与えた。併用対照群は、ビヒクルで、すなわち２０ｍＭヒスチジン、８％スクロース、０．０１％Tween20、ｐＨ６．０で処置した。
【０２４８】
アグリカナーゼ活性の阻害は、いくつかの時点で収集された血清試料において、血清中のネオエピトープＡＲＧＳの存在を特徴とするアグリカン分解断片のレベルを決定することにより、測定した。ナノボディ構築物５８１で処置したすべての動物は、同様のプロファイルを示した；すなわち、ＡＲＧＳレベルは最初の投与で減少し、４８時間から１２０時間の間にアッセイの測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）（０．０８ｎＭ）の前後の非常に低いレベルに達した。その後、ＡＲＧＳレベルはＬＬＭＲの前後で持続的な最大の低下を示し、４週間の研究終了までにベースラインに戻らなかった。
結果の概要を図１０に示す。
結論として、ＡＤＡＭＴＳ５特異的ナノボディは、全身投与後に標的に関与し、試験されたすべての用量レベルで、in vivoでＡＲＧＳネオエピトープレベルを強力に調節する。さらに、先行技術のｍＡｂとは対照的に、試験アイテムに関連する病理学的不整脈は観察されなかった。さらに、試験に関連したＳＴ上昇が、試験された用量レベルのいずれかでナノボディで処置された雄および雌のサルで認められたという証拠はなかった。
【０２４９】
例１１  軟骨変性の阻害
ナノボディおよびナノボディ構築物の、in vivoでの軟骨変性を阻害する能力をさらに評価するために、マウスＤＭＭ（内側半月板不安定化）モデルを使用した。簡単に述べると、内側半月板を外科的に不安定化した。例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）を、皮下投与により、ＤＭＭの誘導の３日前（予防的）、またはＤＭＭの誘導の３日後（治療的）に様々な濃度で与えた。８週間の処置後、動物を屠殺し、膝を取り出した。膝をパラフィンブロックに包埋し、切片にし、トルイジンブルーで染色した。続いて切片を、内側軟骨変性の合計を含むいくつかのパラメーターについて採点した。
結果を図１１に示す。
結果は、ＤＭＭマウスモデルにおけるナノボディによる予防的および治療的処置（ｓ．ｃ．）の両方に、最大５０％の構造的利益があることを示している。
【０２５０】
例１２  ラットの外科的ＯＡモデルにおける症候性利益
ナノボディが症候性利益を確立する能力を評価するために、ラットの外科的ＯＡモデルを使用した。簡単に述べると、ラットをＡＣＬｔおよびｔＭｘ手術で処置して、０日目にＯＡを誘導した。ＡＣＬｔおよびｔＭｘ外科的モデル（内側半月板切除で拡大された前十字靭帯切除）において、ナノボディ構築物５８１を３日目から１日おきに皮下投与した。毎週、歩行分析（CatWalk上）による症候性利益、および関節の直径の減少を決定した。
結果を図１２に示す。
【０２５１】
変形性関節症を、成体雄ラット（Lister Hooded；平均体重３４６±２０ｇ）に、右膝関節における前十字靭帯切除（ＡＣＬＴ）＋内側半月板の切除（ｔＭｘ）により誘発した（０日目）。ビヒクルまたは試験アイテム（ｓｃ）による処置は手術後３日目に開始し、２日おきに４２日目まで継続した。健康な対照群には外科的介入はなかったが、投与群と同時点でｓｃでビヒクルを投与した。（Ａ）経時的な歩行障害を、「ビヒクルに対する％利益」として計算した。「健康＋プラセボ」群の平均＝１００％の利益。「ＡＣＬＴ ｔＭｘ＋ビヒクル」群の平均＝０％の利益。（Ｂ）処置開始後の調査されたすべての時点での「ビヒクルに対する利益」の平均。示されているのは、１４〜１５ラット／群の平均±ＳＥＭである。＊＝ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡとダネットを使用して計算。
ナノボディによる早期の処置は、ＡＣＬＴ＋ｔＭｘ誘発ＯＡ中に用量依存的で有意かつ重要な症候性利益をもたらした。
【０２５２】
例１３  カニクイザルにおける毒性研究
カニクイザルにおいて４週間の亜慢性毒性試験を実施して、ナノボディの全身毒性、局所耐容性および安全性薬理学に関する情報を得た。例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）を、皮下投与により、雄３匹と雌３匹のカニクイザル（Macaca fascicularis）の群に、用量６、３０、または１５０ｍｇ／ｋｇで４週間、週に１回背部領域に皮下投与することにより与えた。同時対照群は、ビヒクル、２０ｍＭのヒスチジン、８％スクロース、０．０１％Tween20、ｐＨ６．０で処置した。
試験した用量レベルのいずれにおいても、試験アイテムに関連した局所不耐性の徴候は認められなかった。試験アイテムに関連する影響は、すべての動物における行動、体重、摂餌量、血液学的および生化学的パラメーター、リンパ球タイピング、ＣＲＰレベル、尿検査パラメーター、眼科および聴覚機能、ならびに臓器重量に対して、いずれの用量レベルにおいても認められなかった（データは示さず）。剖検時の肉眼的検査および組織病理学的検査においても、いずれの試験用量レベルで検査した動物のいずれにおいても、試験アイテムでの処置に関連する局所または全身の臓器のいかなる変化も、明らかにされなかった。
【０２５３】
ｍＡｂ １２Ｆ４は、局所的な心内膜出血、可逆性の証拠のない用量依存性の血圧上昇、および心臓コンダクタンス異常（ＳＴ上昇および心室性不整脈）を示したことが報告されているため（Larkin, et al., The highs and lows of translational drug development: Antibody-mediated inhibition of ADAMTS-5 for osteoarthritis disease modification, OARSI conference 2014: Paris；Renninger et al., Identification of Altered Cardiovascular Function Produced by a Novel Biologic Compound in a Stand Alone Safety Pharmacology Primate Study, in SPS meeting, 2013）、ＥＭＫＡシステムを使用した広範な非侵襲的遠隔測定が、動物に対して実施された。
試験アイテムに関連する影響は、いずれの用量レベルのいずれの動物の遠隔測定パラメーター（非侵襲性ＥＭＫＡシステムを使用）にも、認められなかった。特に、病理学的不整脈は観察されず、試験アイテムに関連したＳＴ上昇の証拠も、いずれの試験用量レベルのナノボディで処置された雄および雌のサルにおいて、見いだされなかった（データは示さず）。
これらの研究により、ＡＤＡＭＴＳ５特異的ナノボディは、安全であると見なさすことができることが確認される。
【０２５４】
例１４  in vivoラットＭＭＴモデルのＤＭＯＡＤ研究
本発明のＣＡＰ結合剤に融合したＡＤＡＭＴＳ５阻害剤のin vivo効力を実証するために、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂（Tear）（ＭＭＴ）モデルを使用した。簡単に述べると、抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディを、ＣＡＰ結合剤（ナノボディ構築物C010100954またはナノボディ構築物９５４として示される）に結合させた。ラットの片膝を手術して、ＯＡ様の症状を引き起こした。処置は、手術後３日目にＩＡ注射により開始した。組織病理学を術後４２日目に実施した。中間および最終血清試料を、探索的バイオマーカー分析のために採取した。内側および全体の実質的軟骨変性の幅、ならびに軟骨変性の減少率を決定した。群当たり２０匹の動物を使用した。
【０２５５】
内側脛骨の軟骨下欠損を図１３に示す。
この結果は、軟骨幅が、ＡＤＡＭＴＳ５−ＣＡＰ構築物によって４２日後に、ビヒクルと比較して大幅に減少したことを示す。これらの結果はさらに、以下を示唆する：
（ａ）ＣＡＰ部分は、抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの活性に悪影響を与えない；
（ｂ）ＣＡＰ部分は、抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの保持を可能にする；および
（ｃ）抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディは、ＣＡＰ部分に結合した場合でも、軟骨の幅にプラスの効果がある。
【０２５６】
例１５
方法：４頭の動物からのウシ軟骨外植片（ＢＥＸ）、ならびに８つの外科的に置換された膝関節（ＨＥＸ）および１つの健康なヒト膝関節（ｈＨＥＸ）からのヒト軟骨外植片を、培地のみで（ｗ／ｏ）、炎症誘発性サイトカイン（オンコスタチンＭ［１０ｎｇ／ｍＬ］＋ＴＮＦα［２０ｎｇ／ｍＬ］（Ｏ＋Ｔ））、または、（Ｏ＋Ｔ）と例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）［１μＭ〜１ｎＭ］の存在下で、２１日まで培養した。ウシ（ｂＣＣ）および４つの置換された変形性関節症のヒト膝関節（ｈＣＣ）からの軟骨および滑膜を、ex vivoで最大２８日間、培地のみ（ｗ／ｏ）で、Ｏ＋Ｔ、またはＯ＋Ｔと例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）［１μＭ−０．６ｎＭ］で共培養した。軟骨を、生検パンチャーを使用して等しいサイズの外植片に切断した。滑膜は、同じサイズの外植片（３０ｍｇ［±３ｍｇ］）にメスで切断した。外植片の代謝活性は、アラマーブルーによって評価した。軟骨組織の代謝回転は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、良好に特徴付けられた、馴化培地での分解（ｈｕＡＲＧＳ、ｅｘＡＧＮｘＩ、Ｃ２Ｍ）および形成（ＰｒｏＣ２）のバイオマーカーを測定して評価した。ＰｒｏＣ２およびＣ２Ｍは、それぞれＩＩ型コラーゲンの形成と分解の代謝産物であり、ｅｘＡＧＮｘＩおよびｈｕＡＲＧＳは、ＡＤＡＭＴＳ５分解アグリカンの代謝産物である。平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が報告される。統計分析は、Dunnの多重比較検定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、または正規分布を前提としたダネットの多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡを使用して行った。
【０２５７】
結果：ＢＥＸ、ＨＥＸ、およびｂＣＣの代謝活性は、培養期間全体で安定していたが、ｈＣＣおよびｈＨＥＸの代謝活性は、Ｏ／Ｔ処置条件ではｗ／ｏと比較して１４日目から大幅に低下した。Ｏ＋Ｔで刺激した培養において、ＡＤＡＭＴＳ５分解アグリカンの代謝産物は、ｈｕＡＲＧＳおよびｅｘＡＧＮｘＩがわずかに遅れて増加したｈＨＥＸを除き、培養の最初の週にピークに達した。Ｏ＋ＴによるＩＩ型コラーゲン分解のＣ２Ｍは、１９日後にピークに達した。ＩＩ型コラーゲン形成のＰｒｏ−Ｃ２は、ｗ／ｏ対照と比較して、培養全体を通じて比較的安定したままであった。
【０２５８】
例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）をＯ＋Ｔと組み合わせて処置すると、ｈｕＡＲＧＳを、用量依存的にＢＥＸ（最高用量：Ｏ＋Ｔの８％）、ＨＥＸ（最高用量：Ｏ＋Ｔの４０％）、ｂＣＣ（最高用量：Ｏ＋Ｔの１０％）、ｈＣＣ（最高用量：Ｏ＋Ｔの４０％）、およびｈＨＥＸ（最高用量：Ｏ＋Ｔの２４％）において減少させた（図１４）。ｈｕＡＲＧＳの減少に基づく例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）のＩＣ５０は、ＢＥＸでの３００ｎＭから、＜１５ｎＭのＨＥＸ、ｈＨＥＸ、ｂＣＣおよびｈＣＣの範囲であった（図１４）。
例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）のｅｘＡＧＮｘＩに対する効果は、試験した培養物中のｈｕＡＲＧＳに類似していた。例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）はまた、Ｃ２Ｍ（ＩＩ型コラーゲン分解のマーカー）も有意にかつ用量依存的に低減したが、その効果はアグリカン分解マーカーよりも小さかった。例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）は、試験した条件のいずれにおいても、ＩＩ型コラーゲン形成代謝産物Ｐｒｏ−Ｃ２に影響を示さなかった。
【０２５９】
結論：ここでは、例示的ナノボディ構築物５８１（２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ１１）が、ウシおよびヒトの軟骨のex vivo培養物の前炎症状態における、および軟骨と滑膜の共培養物における、ＡＤＡＭＴＳ５媒介性のアグリカン分解およびＭＭＰ媒介性ＩＩ型コラーゲン分解の用量依存的阻害により、軟骨保護効果があることを示した。２Ｆ３ＳＯ−３５ＧＳリンカー−Ａｌｂ（配列番号１２９）は、本発明の好ましい態様の１つである。
【０２６０】
例１６  本ナノボディ構築物は、先行技術のナノボディよりも優れている
WO 2008/074840には、様々なＡＤＡＭＴＳ５ナノボディが記載されている。本実験では、WO 2008/074840に記載されている２６のナノボディと、例示のナノボディ２Ｆ３ＳＯ（２Ｆ３＊）によって代表される本発明のナノボディとの間で比較が行われた。
すべての構築物を、AlphaLISAアッセイで例５．１に記載されているように試験した。ナノボディ２Ｆ３ＳＯ（２Ｆ３＊）は、C011400581（配列番号１２９）のＡＤＡＭＴＳ５結合一価ビルディングブロックである。陰性対照として、無関係なナノボディIRR00028を使用した。
【０２６１】
最初に、先行技術のナノボディの活性をAlphaLISAで決定した。結果を表１６．１に示す。
表１６．１  AlphaLISAで決定された従来技術のナノボディの活性
【表２８】
2020525410.tif 000031
【０２６２】
結果は、７つのみの先行技術のナノボディがブロッキング活性を有することを示す。残りの先行技術のナノボディは、活性がなかったか、または活性を増強した。
この比較実験の第２段階では、ブロッキングナノボディを、例示の一価ナノボディ２Ｆ３ＳＯ（２Ｆ３＊）に対して比較した。
ナノボディ構築物のＩＣ５０値を、表１６．２に示す。例示の一価ナノボディ２Ｆ３ＳＯ（２Ｆ３＊）との倍率差も、比較を容易にするために示されている。
【０２６３】
表１６．２  AlphaLISAで決定された、ナノボディ２Ｆ３ＳＯ（２Ｆ３＊）に対する従来技術のナノボディ構築物の効力
【表２９】
2020525410.tif 000032
本発明のナノボディ構築物は、先行技術のＡＤＡＭＴＳ５ナノボディよりも優れていると結論付けることができる。
【０２６４】
表Ａ−１：一価および多価の抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディの名称および短い記述（「ＩＤ」）、配列番号（「ＳＥＱ」）およびアミノ酸配列
【表３０−１】
2020525410.tif 000033
【表３０−２】
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【表３０−３】
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＊ＳＯ（配列最適化）バージョン
【０２６５】
表Ａ−２：ＣＤＲおよびフレームワークの配列、および式Ｉで提供される好ましい組み合わせ、すなわちＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（以下の用語「ＩＤ」は、与えられた配列番号を指す）
【表３１−１】
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【表３１−２】
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【０２６６】
表Ｂ：様々なアミノ酸配列：名称および短い記述（「ＩＤ」）、配列番号（「ＳＥＱ」）およびアミノ酸配列（「配列」）
【表３２−１】
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【表３２−２】
2020525410.tif 000039
【０２６７】
表Ｃ：様々なリンカー配列（「ＩＤ」は、本明細書で使用される配列番号を指す）
【表３３】
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【０２６８】
表Ｄ：ＣＤＲ配列を含む、血清アルブミン結合ＩＳＶＤ配列（「ＩＤ」は本明細書で使用される配列番号を指す）
【表３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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