(57)【要約】【課題】  膵損傷治療用医薬品の調製における医薬組成物の用途を提供することを課題とする。【解決手段】  膵損傷治療用医薬品の調製における医薬組成物の用途であって、医薬組成物は、前処理された脂肪幹細胞と、エステルカテキンと、を含み、前記前処理された脂肪幹細胞がエステルカテキンで脂肪幹細胞と共培養したものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物は、前処理された脂肪幹細胞と、エステルカテキンと、を含み、前記前処理された脂肪幹細胞がエステルカテキンで脂肪幹細胞と共培養したものであることを特徴とする、膵損傷治療用医薬品の調製における医薬組成物の用途。
【請求項２】
前記膵損傷が、糖尿病又は高血糖症を引き起こすことを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項３】
前記膵損傷の部位は、膵臓β細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項４】
前記前処理された脂肪幹細胞は、前記エステルカテキンで２時間前処理されることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項５】
前記前処理された脂肪幹細胞のエステルカテキンの濃度は、５〜２５μMであることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項６】
前記前処理された脂肪幹細胞のエステルカテキンの濃度は、２０μＭ未満であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項７】
高グルコース環境で前記前処理された脂肪幹細胞は、前処理されていない脂肪幹細胞に比べると、より高い生存率を有し、前記高グルコース環境とはグルコース濃度が２２ｍＭ〜４４ｍＭであり、３３ｍＭが主なもので、より高い生存率が８０％〜１００％であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項８】
前記前処理された脂肪幹細胞は、前処理されていない脂肪幹細胞に比べると、膵損傷部位におけるサバイビン関連タンパク質の発現量をアップレギュレートさせることができ、前記サバイビン関連タンパク質がｐ−ＩＧＦ１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−Ｂａｄ及びＢｃｌ−ｘＬを含み、アップレギュレート割合が５０％〜１００％であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項９】
前記前処理された脂肪幹細胞は、前処理されていない脂肪幹細胞に比べると、膵損傷部位におけるＳｉｒｔ１経路関連タンパク質の発現量をアップレギュレートさせることができ、前記Ｓｉｒｔ１経路関連タンパク質がｐ−ＡＭＰＫ及びＳｉｒｔ１を含み、アップレギュレート割合が５０％〜１００％であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項１０】
前記前処理された脂肪幹細胞は、前処理されていない脂肪幹細胞に比べると、膵損傷部位における細胞アポトーシス経路関連タンパク質の発現量をダウンレギュレートさせることができ、前記細胞アポトーシス経路関連のタンパク質がＦＡＤＤ、Ｃａｓｐａｓｅ  ８、Ｂａｘ、シトクロム  Ｃ及びＣａｓｐａｓｅ  ３を含み、ダウンレギュレート割合が４０％〜８０％であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【請求項１１】
前記前処理された脂肪幹細胞は、前処理されていない脂肪幹細胞に比べると、膵損傷部位における線維化関連タンパク質をダウンレギュレートさせることができ、線維化関連タンパクがＴＧＦβであり、ダウンレギュレート割合が４０％〜８０％であることを特徴とする、請求項１に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵損傷を修復するための医薬組成物およびその使用方法を提供し、膵損傷を修復するための前記医薬組成物がエピガロカテキンガレート（EGCG）で前処理された脂肪幹細胞を含む。前記エピガロカテキンガレート（EGCG）の前処理を経た脂肪幹細胞の損傷組織修復能力が大幅に向上された。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断は、臨床的の空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄｌ以上および糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ値６．５％以上であり、高血糖の原因が血液中のグルコースの代謝メカニズムが問題になっていた。膵臓から分泌されるインスリンは、血液中のグルコースを代謝する最も重要なタンパク質であるため、高血糖の原因も体内のインスリン分泌が問題になっていた。
【０００３】
１型糖尿病は、インスリン分泌量が不十分であるため、少量のインスリンで血中の大量のグルコースを代謝できないため、血中に高濃度のグルコースが蓄積され、高血糖が形成される。１型糖尿病の主な原因は、インスリン分泌の不足であるため、１型糖尿病の原因のほとんどが膵臓機能の障害である。１型糖尿病を引き起こす多くの要因があり、例えば膵臓細胞死を引き起こす自己免疫疾患、膵臓機能の低下を示す遺伝的問題、膵臓機能を損なうウイルス感染などの多くの要因が膵臓機能の障害を生じてインスリン分泌量の不足に至る。膵臓のβ細胞は、インスリンを産生する膵島上の機械とみられ、マウスでの以前の研究において、損傷した膵臓β細胞を修復できた場合、インスリンの量も増加し、血糖値が正常に戻ることが示されていた。
【０００４】
１型糖尿病の現在の管理には、インスリン投与および膵臓移植に加えて、生活習慣の見直し（定期的な運動、低カロリー・低脂肪の食事、体重コントロールなど）および薬物療法が含まれる。前記方法に加えて、幹細胞を移植することによって（通じて）糖尿病治療の目的を達成できるかもしれないと言及した文献報告書もある。しかし、これまで幹細胞移植による糖尿病の治療の多くが基礎医学研究の文献で報告されてきたが、臨床的には、幹細胞移植による糖尿病の治療に関する文献が比較的少ない。
【０００５】
またいくつかの研究は、高グルコース環境下で幹細胞を傷つけ、幹細胞の移動または修復能力を低下させ、さらに幹細胞の内部酸化圧を高める可能性があることが指摘されている。言い換えれば、如何にして幹細胞を高グルコース環境などの成長に適さない環境で生存し続けられ、膵臓などといった損傷した臓器を効果的に修復できるかが重要な課題である。
【０００６】
これに鑑み、如何にして前記幹細胞を細胞生長に不利な環境、例えば高グルコースや高酸化ストレスなどの微小環境で生き残るか、かつ生体の損傷した臓器をさらに効果的に改善および治療でき、従来技術の欠如を解決するかは、当業者が解決する必要のある喫緊の課題となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来の問題点に鑑みてなされたもので、膵損傷治療用医薬品の調製における医薬組成物の用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、膵損傷治療用医薬品の調製における医薬組成物の応用を提供し、前記医薬組成物は幹細胞およびエステルカテキン（Ｃａｔｅｃｈｉｎ）を含む。
【０００９】
好ましくは、前記幹細胞は、成体幹細胞である。
【００１０】
好ましくは、前記成体幹細胞は、脂肪幹細胞である。
【００１１】
好ましくは、前記カテキンは、エステルカテキン、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）内の１種類或いは複数種類である。
【００１２】
好ましくは、前記エステルカテキンは、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含む。
【００１３】
好ましくは、前記脂肪幹細胞は、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）で２時間前処理される。
【００１４】
好ましくは、前処理された脂肪幹細胞のエステルカテキンの濃度は、２０μＭ未満である。
【００１５】
好ましくは、前処理された脂肪幹細胞のエステルカテキンの濃度は、５〜１５μｇ／ｍＬである。
【００１６】
好ましくは、１×１０５〜１×１０７個の幹細胞は、静注を通じて体内に投与される。
【００１７】
この発明の概要は、本発明内容の完全な概要ではなく、本発明の実施例の重要／キーとなるコンポーネントを示すこと、または本発明の範囲を画定することを意図するものではない。以下の実施形態を参照した後、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者は、本発明の基本的な精神および他の発明の目的、ならびに本発明で講じられる技術的手段および実施態様を容易に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】幹細胞表面マーカーによって分析された幹細胞の特性を示す図である。
【図１Ｂ】幹細胞の分化能によって分析された幹細胞の特性を示す図である。
【図２】幹細胞の高グルコース環境下での（ａ）細胞生存率の分析の結果を示すグラフ、（ｂ）サバイビンタンパク質発現量の解析の結果を示すグラフである。
【図３】幹細胞治療前後の実験動物の血糖値の分析結果を示すグラフである。
【図４】実験動物における膵臓組織の生存に関連するタンパク質発現量の解析、ウェスタンブロット解析の結果を示すグラフである。
【図５】実験動物における膵臓組織の生存に関連するタンパク質発現量の解析、定量グラフである。
【図６】実験動物の膵臓組織におけるSirt1経路関連タンパク質発現量の解析、ウェスタンブロット解析の結果を示すグラフである。
【図７】実験動物の膵臓組織におけるSirt1経路関連タンパク質発現量の解析、定量グラフである。
【図８】実験動物の膵臓組織におけるアポトーシス経路関連タンパク質発現量の解析、ウェスタンブロット解析結果を示すグラフである。
【図９】実験動物の膵臓組織におけるアポトーシス経路関連タンパク質発現量の解析、ウェスタンブロット解析結果を示すグラフである。
【図１０】実験動物の膵臓組織におけるアポトーシス経路関連タンパク質発現量の解析、定量グラフである。
【図１１】実験動物の膵臓組織におけるアポトーシス経路関連タンパク質表現量の解析、定量グラフである。
【図１２】実験動物の膵臓組織切片の分析、ＨＥ染色による膵島組織のサイズの分析結果を示すグラフである。
【図１３】実験動物の膵臓組織切片の分析、膵島組織サイズの分析、定量グラフである。
【図１４】実験動物の膵臓組織切片の分析、マッソントリクローム染色による膵臓組織の線維化の程度の分析結果を示すグラフである。
【図１５】実験動物の膵臓組織切片の分析、ウェスタンブロット法による膵臓組織の線維化の関連タンパク質発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の説明をより詳細かつ完全にするために、以下、本発明の実施態様および具体的実施例を詳細に説明する。ただし、これは本発明の具体的実施例を実施または使用する唯一の形態ではない。実施形態は、複数の具体的実施例の特徴およびこれらの具体的実施例を構築および操作するための方法ステップとそれらの順序を含む。しかし、他の具体的実施例を使用して、同一または均等の機能およびステップ・順序を達成することもできる。
【００２０】
本発明は、膵損傷を治療するための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、エステルカテキンで前処理された幹細胞を含み、幹細胞の分化能を高める効果を有し得る。
【００２１】
以下の実施例は例示的な説明であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２２】
＜動物実験デザイン＞
１．８ヶ月齢のＷｉｓｔａｒ系統雄ラット（楽思科社から購入）を４つの群に分け、以下の表１に示されるように、それぞれが正常群（Ｓｈａｍ）、ＳＴＺ（ストレプトゾトシン、５５ｍｇ／ｋｇ）誘発糖尿病群（ＤＭ）、糖尿病と脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）による糖尿病治療群（ＤＭ＋ＡＤＳＣ）および糖尿病とエステルカテキン（ＥＧＣＧ）の前処理を経た自家脂肪幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）である。ラットは、日中１２時間、夜間１２時間のサイクルで動物室において飼育され、飼育期間中自由に給餌および飲水させる。２匹のラットを動物用ケージに収容し、飼育期間中は２日ごとに動物の下敷きを交換した。糖尿病群ラットの血糖が２００ｍｇ／ｄｌに上昇すると、糖尿病とみなされ、糖尿病群は、１か月後に自家幹細胞移植で治療されました。自家幹細胞の再注入は、各ラットの尾静脈あたり１×１０５〜１×１０７個の幹細胞の注入であった。
【００２３】
動物実験群
【００２４】
【表１】
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【００２５】
２．グルコース分析
ラットのグルコーステストは、空腹時の尾静脈血を用いてアキュチェックアクティブ血糖計（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ  Ａｃｔｉｖｅ）で検出した。
【実施例２】
【００２６】
＜ラット脂肪幹細胞の抽出と実験＞
１．脂肪幹細胞の抽出
８ヶ月齢のＷｉｓｔａｒ系統の雄ラットの腹部脂肪を外科手術で取り出し、脂肪を適切なサイズにカットした後、抗生物質を含む生理食塩水で脂肪を洗浄し、洗浄した脂肪組織をコラゲナーゼタイプＩＩ（０．０１％）含有生理食塩水に入れ、３７℃の水浴上で約１時間加熱撹拌し、３０００ｒｐｍ室温で１０分間程度遠心した。下層の沈殿物を取り出した後、細胞培養皿を用いて細胞を培養した。
【００２７】
２．幹細胞の特性解析
動物の自家幹細胞移植の治療前に、移植された細胞が幹細胞かどうかを決定する必要がある。幹細胞を決定するための解析方法には２種類ある。１つ目は、フローサイトメトリーによる幹細胞膜の陽性マーカー（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ）と陰性マーカー（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ）の解析であり、幹細胞の特性は陽性マーカーの発現量が高いほど、陰性マーカーの発現量が低いことである。２つ目は、幹細胞は他の異なる細胞タイプに分化する能力があるかどうかを観察するための分化実験です。図１（Ａ）から、細胞集団により解析される陽性マーカーＣＤ９０の発現量が９６．６％であり、陰性マーカーＣＤ４５の発現量が１％であることが分かる。また図1（B）は、この細胞集団が脂肪細胞に分化する能力があることを示している。上記をまとめると、この細胞集団が幹細胞の特性を持っていることが分かる。
【実施例３】
【００２８】
＜細胞生存分析＞
細胞を２４ウェルディッシュ（２４ウェルプレート）で培養し、細胞を薬物で処理した後、培養液を除去し、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（リン酸緩衝液）で洗い流し（３回）、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを含む培養液を交換し、３〜４時間程度培養した後、培養液を除去してＰＢＳ緩衝液で洗い流し、ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ（（イソプロパノール）１ｍｌを加えて紫色のｆｏｒｍａｚａｎ（ホルマザン）結晶を溶解し、５分後ＯＤ５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２９】
高グルコース環境刺激下での幹細胞の生存率を図２（ａ）に示し、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ群）（ＡＤＳＣ）と比較して、高グルコース環境下での幹細胞（ＨＧ＋ＡＤＳＣ）の生存率は、５６±４％（ｐ＜０．００１）であった。幹細胞をＥＧＣＧで前処理してから高グルコース（ＨＧ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）で刺激した場合、生存率が６８±５％であり、これはＨＧ  ＋ＡＤＳＣ群（ＨＧ＋Ｅ−ＡＤＳＣ＞ＨＧ＋ＡＤＳＣ，ｐ＜０．０５）よりも有意に高かった。
【実施例４】
【００３０】
＜タンパク質濃度の測定＞
タンパク質は、ブラッドフォードプロテインアッセイ法を使用して定量化された。原理は、タンパク質がクＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０（クマシーブリリアントブルＧ−２５０）と青色の複合体を形成でき、青色が濃いほどタンパク質含有量が高くなることである。この試験方法では、まず５分の１の体積のＢｒａｄｆｏｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｙｅ（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質色素）に一連の既知濃度のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加え、波長５９５ｎｍにおける可視光吸光度(ＯＤ値)を標準曲線とし、さらに同じ方法でサンプルのＯＤ値を測定すると、標準曲線に従ってサンプルのタンパク質濃度を得ることができる。
【実施例５】
【００３１】
＜グルコース分析＞
ラットのグルコーステストは、空腹時の尾静脈血を用いてアキュチェックアクティブ血糖計（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ  Ａｃｔｉｖｅ）で検出した。
【００３２】
幹細胞治療前後の各群の実験動物の血糖値の変化
図３は、幹細胞治療前後の実験動物の血糖値を分析した結果を示すグラフ。図からも分かるように、正常群（Ｓｈａｍ）、糖尿病群（ＤＭ）、幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋ＡＤＳＣ）、ＥＧＣＧの前処理を経た幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）の血糖値は、それぞれ１０３±１０、５４０±５０、５０４±２３、４１２±２８ｍｇ／ｄｌであり、ＤＭ群の血糖値は、Ｓｈａｍ群（ＤＭ＞Ｓｈａｍ、ｐ＜０．００１）よりも有意に高く、ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ群がＤＭ群及びＤＭ＋ＡＤＳＣ群よりも有意に低かった。（ＤＭ＞ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ、ｐ＜０．０１；ＤＭ＋ＡＤＳＣ＞ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ、ｐ＜０．０１）。
【実施例６】
【００３３】
＜ウェスタンブロット法＞
サンプルタンパク質４０ｕｇを取り、ＰＢＳ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＢＳ溶液と５×ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ（トレーサー染料）を加え、よく混ぜて１０分間煮沸してから、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を行う。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の上部ゲルは３．７５％のＳｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ（濃縮ゲル）であり、下部ゲルが５％および１２％のＳｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｇｅｌ（分離ゲル）であった。調製したゲル板を電気泳動装置にセットし、電気泳動槽を電気泳動緩衝液で満たし、処理したタンパク質サンプル溶液をゲル板に形成されたＵ字型溝に加え、７５ボルトで電気泳動を行った。電気泳動が終了した後、タンパク質の移行を行い、ゲルを取り出して湿潤したワットマン３Ｍのろ紙に均等に広げた。このとき、ゲルを予めメタノールに浸したＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（膜）で覆い、次に湿潤した３Ｍのろ紙で覆い、気泡をガラス棒で静かに追い出し、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｈｏｌｄｅｒ（トランスファーホルダー）に入れてから、これをＥｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔａｎｋ（転写緩衝液付きの電気的転写槽）に入れ、４℃で１００ボルトの電圧移行を行い、１時間の電気的移行後、ＰＶＤＦ膜を取り出し、５％（ｗ／ｖ）の脱脂乳（ｎｏｎ−ｆａｔ  ｍｉｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ）含有ＰＢＳsolution（ＰＢＳ溶液）に浸し、室温で１時間振盪した。ＰＶＤＦ膜を４℃の冷蔵庫に入れて一次抗体と一晩反応させ、その後、Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（洗浄液）で２回洗い、毎回１０分間洗い、最後に洗った後、それを捨てる。次に、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＲＰ標識二次抗体）と２時間反応させた後、ＰＶＤＦ膜を同じ方法で洗う。最後に、ＰＶＤＦ膜を４ｍｌの基質溶液（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、基質バッファー）に浸して呈色反応を行った。
【００３４】
図２（ｂ）は、幹細胞が高グルコース環境にある場合のサバイビン関連タンパク質ｐ−Ａｋｔ発現量は、ＡＤＳＣに比べると、高グルコース環境において幹細胞の生存のタンパク質ｐ−Ａｋｔ発現量（ＨＧ＋ＡＤＳＣ＜ＡＤＳＣ）を有意にダウンレギュレートさせ；対照的に、ＥＧＣＧで前処理された幹細胞の高グルコース環境（ＨＧ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）におけるサバイビン関連タンパク質ｐ−Ａｋｔ発現量は、ＨＧ＋ＡＤＳＣ群よりも有意に高かった。
【００３５】
図４乃至図５は、実験動物の膵臓組織のサバイビン関連タンパク質発現量の分析の結果を示すグラフであり、図からも分かるように、正常群（Ｓｈａｍ）と比較すると、ｐ−ＩＧＦ１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−Ｂａｄ及びＢｃｌ−ｘＬを含み、糖尿病群（ＤＭ）が動物の膵臓組織のサバイビン関連タンパク質発現量をダウンレギュレートさせ、対照的に、幹細胞移植による治療後（ＤＭ＋ＡＤＳＣ及びＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）のサバイビン関連タンパク質発現量が回復する傾向を見せた。ＥＧＣＧの前処理を経た幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）のサバイビン関連タンパク質発現量のアップレギュレートは、最も顕著であった。
【００３６】
図６乃至図７からも分かるように、正常群（Ｓｈａｍ）と比較すると、糖尿病群（ＤＭ）は、ｐ−ＡＭＰＫ及びＳｉｒｔ１を含み、動物の膵臓組織におけるＳｉｒｔ１経路関連タンパク質発現量をダウンレギュレートさせ、対照的に幹細胞移植で治療した後（ＤＭ＋ＡＤＳＣ及びＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）、Ｓｉｒｔ１路径関連タンパク質発現量が回復する傾向を見せ、ＥＧＣＧの前処理を経た幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）のサバイビン関連タンパク質発現量のアップレギュレートが最も顕著であった。
【００３７】
図８乃至図１１からも分かるように、正常群（Ｓｈａｍ）と比較すると、糖尿病群（ＤＭ）は、動物膵臓組織細胞におけるアポトーシス経路関連タンパク質発現量をアップレギュレートさせることができる。対照的に、幹細胞移植で治療した後（ＤＭ＋ＡＤＳＣ及びＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）、細胞のアポトーシス経路関連タンパク質発現量が減少の傾向を見せ、EＧＣＧの前処理を経た幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）のサバイビン関連タンパク質発現量のアップレギュレートが最も顕著であった。
【実施例７】
【００３８】
＜切片染色＞
１．ラットの屠殺後、膵臓組織を取り出し、ホルマリン液に浸し組織を固定化し、その後エタノールで脱水し、膵臓組織をパラフィンで包埋し、組織切片を０．２μｍで作製する。ＨＥ染色（ヘマトキシリン−エオシン染色）について、組織切片をエタノールとホルマリンで脱ロウ、固定化した後、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ及びｅｏｓｉｎ染色（ヘマトキシリン−エオシン染色）で観察するだけでよい。マッソントリクローム染色について、組織切片をエタノールとホルマリンで脱ロウ、固定化した後、組織を次の染色液で染色するだけでよい。Ｂｏｕｉｎ染色液の場合は１５分、Ｗｅｉｇｅｒ染色液の場合が１０分、Ｂｅｉｂｒｉｃｈ染色液の場合が５分間、ＰＰＡ染色液の場合が１０分間、アニリンブルー染色液の場合が５分間であった。
【００３９】
２．実験動物の膵臓組織切片の分析
図１２乃至図１３は、動物の膵臓組織のＨＥ染色、観察した膵島組織の直径の大きさ及びその直径の定量グラフである。図から分かるように、正常群（Ｓｈａｍ）、糖尿病群（ＤＭ）、幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋ＡＤＳＣ）、ＥＧＣＧの前処理を経た幹細胞による糖尿病治療群（ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ）の膵島組織の直径の大きさは、１８±０．２、１４．１±０．２、１５．１±０．５、１６．２±０．４μｍであり、ＤＭ群の膵島組織の直径の大きさがＳｈａｍの直径よりも著しく小さく（ＤＭ＜Ｓｈａｍ、ｐ＜０．００１）、幹細胞治療後に膵島組織の直径の大きさが著しく増加（ＤＭ＋ＡＤＳＣ＞ＤＭ、ｐ＜０．０５；ＤＭ＋Ｅ−ＡＣＳＣ＞ＤＭ、ｐ＜０．０１）し、ＥＧＣＧの前処理を経た幹細胞による治療効果はが純粋な幹細胞による治療よりも優れていた（ＤＭ＋ＡＤＳＣ＜ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ、ｐ＜０．０５）。
【００４０】
３．実験動物の膵臓組織切片の線維化の分析
図１４は、マッソントリクローム染色の動物の膵臓組織像であり、膵島組織の線維化の程度を観察すると、図からも分かるように、正常群（Ｓｈａｍ群）と比較すると、糖尿病群（ＤＭ群）に青いコラーゲン染色部位が多いことが重度の線維化を示している。対照的に、幹細胞による治療群のＤＭ＋ＡＤＳＣ及びＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣに青いコラーゲン染色部位が比較的少なく、特に、ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ群の改善が顕著であった。図１５は、動物の膵臓組織の線維化関連タンパク質発現量の解析の結果を示すグラフであり、Ｓｈａｍ群と比較すると、ＤＭ群のＴＧＦβタンパク質発現量が有意に増加し；対照的に、幹細胞治療群のＤＭ＋ＡＤＳＣ及びＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣのＴＧＦβタンパク質発現量が著しく減少し、特に、ＤＭ＋Ｅ−ＡＤＳＣ群の改善が顕著であった。
【００４１】
４．統計分析
各検体／サンプルの分析結果は、３回以上の実験データに基づいて分析され、ＡＮＯＶＡ分析方式で統計した。ｐ＜０．０５は有意差を示す。
【００４２】
実験結果からも分かるように、糖尿病ラットは、幹細胞療法により血糖値を下げるという目的を達成できる。その作用メカニズムは、膵臓組織のサバイビン関連タンパク質をアップレギュレートさせ、Ｓｉｒｔ１経路関連タンパク質をアップレギュレートさせ、アポトーシス経路関連タンパク質の発現をダウンレギュレートさせることにより、膵臓の膵島組織サイズを回復させ、したがって膵臓の機能を正常に回復させて血糖値を下げる。同時に、幹細胞療法の使用は、膵臓組織の線維化関連タンパク質の発現量をダウンレギュレートさせ、膵臓組織の線維化の程度を軽減させるため、間接的に膵臓機能を回復させる。
【００４３】
さらに、エステルカテキン（ＥＧＣＧ）で前処理された幹細胞（Ｅ−ＡＤＳＣ）は、未処理の幹細胞（ＡＤＳＣ）よりも膵臓組織の保護に優れている。原因を究明すると、細胞実験において、高グルコース環境では、幹細胞のサバイビン関連タンパク質ｐ−Ａｋｔがダウンレギュレートし、高グルコース環境での幹細胞の生存率が低下することが分かった。対照的に、ＥＧＣＧでの前処理後、幹細胞のｐ−Ａｋｔは、アップレギュレートし、高グルコース環境での幹細胞の生存率が増加した。この実験の結果は、幹細胞を糖尿病動物に移植する際、糖尿病による高グルコース環境により、幹細胞のサバイビン関連タンパク質ｐ−Ａｋｔがダウンレギュレートしたため、糖尿病動物体内における幹細胞の生存率を低下させ、相対的治療はあまり効果的ではなかった。糖尿病動物への移植前に幹細胞をＥＧＣＧで前処理すると、そのｐ−Ａｋｔサバイビンタンパク質がアップレギュレートし、糖尿病によって引き起こされる高グルコース環境と戦う幹細胞の能力を向上（ＥＧＣＧで前処理された幹細胞は、高グルコース環境によりアポトーシスを引き起こすのは簡単ではない）させ、糖尿病動物体内に生存している幹細胞が多くなり、当然膵臓組織を保護（修復）する機能がより良くなる。
【００４４】
実験の結論は、次の幾つかの重点に帰納でき、つまり（１）ＥＧＣＧ前処理は幹細胞が高グルコース環境と戦う能力をアップレギュレートし；（２）ＥＧＣＧで処理された幹細胞が損傷した膵臓組織を修復する能力及び血糖を下げる能力は、未処理の幹細胞よりも優れ；（３）ＥＧＣＧで処理された幹細胞の損傷した膵臓組織を修復する能力は、膵臓組織内のサバイビン関連タンパク質をアップレギュレートさせ、Ｓｉｒｔ１経路関連タンパク質をアップレギュレートさせ、アポトーシス関連タンパク質をダウンレギュレートさせ、線維症関連タンパク質をダウンレギュレートさせることによるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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