(57)【要約】本開示は、テモゾロミド薬剤耐性神経膠腫の治療における２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）の使用を記述する。２，４−ｄｓ−ＰＢＮは、神経膠腫の出現、再発、拡散、成長、転移、もしくは血管新生を低下させて、かつ、テモゾロミド耐性の発生を阻害するために、テモゾロミドを含む、他の化学療法及び放射線療法並びに手術と組み合わせて用いてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるテモゾロミド耐性神経膠腫の治療方法であって、前記神経膠腫の血管新生、成長または拡散を阻害するのに有効な用量の２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
のちの２，４−ｄｓ−ＰＢＮの血液脳関門の通過を必要とする経路を通じて、投与を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記経路が、経腸、静脈内、または動脈内である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、再発性または転移性神経膠腫を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、以前に一つまたは複数の抗神経膠腫療法に失敗している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効用量が、１日に体重１ｋｇあたり約５〜約１５０ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記経腸投与を食物成分の栄養補充物を通じて行う、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記経腸投与を丸剤または液剤の形態で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
二次抗神経膠腫療法をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記二次抗神経膠腫療法が、放射線、手術、または化学療法、例えば、テモゾロミド、ロムスチン、ビンクリスチン、マチュレーン、ＰＣＶ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及び／またはＤＦＭＯである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記二次抗神経膠腫薬剤が、テモゾロミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
テモゾロミドの有効用量が、テモゾロミドの標準単剤療法用量未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
有効量が、与える食事の約０．００５ｗ／ｗ％〜約０．１ｗ／ｗ％である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経膠腫が、星状細胞腫、乏突起膠腫、または多形神経膠芽腫、あるいは前述のいずれかのＴＧＦ−β１発現形態、ＭＧＭＴ発現形態及び／またはＡＰＧＮ発現形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮによる処置前及び処置後に、リポ多糖結合タンパク質の発現を測定することによって治療効果を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）神経膠腫を有する対象を特定すること、及び
（ｂ）前記神経膠腫においてテモゾロミド耐性の発生を阻害するのに有効な用量の
（ｉ）２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）、及び
（ｉｉ）テモゾロミド
を前記対象に投与することを含む、前記対象における神経膠腫テモゾロミド耐性の発生を阻害するための方法。
【請求項１７】
のちの２，４−ｄｓ−ＰＢＮの血液脳関門の通過を必要とする経路を通じて、投与を行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記経路が、経腸、静脈内、または動脈内である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記有効用量が、１日に体重１ｋｇあたり約５〜約１５０ｍｇである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記経腸投与を食物成分の栄養補充物を通じて行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記経腸投与を丸剤または液剤の形態で行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効量が、与える食事の約０．００５ｗ／ｗ％〜約０．１ｗ／ｗ％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経膠腫が、星状細胞腫、乏突起膠腫、多形神経膠芽腫、または前述のいずれかのＴＧＦ−β１発現形態もしくはＭＧＭＴ発現形態である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
二次抗神経膠腫療法をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記二次抗神経膠腫療法が、放射線、手術、または化学療法、例えば、テモゾロミド、ロムスチン、ビンクリスチン、マチュレーン、ＰＣＶ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及び／またはＤＦＭＯである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記二次抗神経膠腫薬剤が、テモゾロミドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
テモゾロミドの有効用量が、テモゾロミドの標準単剤療法用量未満である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮによる処置前及び処置後に、リポ多糖結合タンパク質の発現を測定することによって効果を評価することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）神経膠腫を有する対象を特定すること、及び
（ｂ）前記神経膠腫の再発を阻害するのに有効な用量の
（ｉ）２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）、及び
（ｉｉ）テモゾロミド
を前記対象に投与することを含む、神経膠腫再発を阻害するための方法。
【請求項３０】
のちの２，４−ｄｓ−ＰＢＮの血液脳関門の通過を必要とする経路を通じて、投与を行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記経路が、経腸、静脈内、または動脈内である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経膠腫が、星状細胞腫、乏突起膠腫、多形神経膠芽腫、または前述のいずれかのＴＧＦ−β１発現形態もしくはＭＧＭＴ発現形態である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効用量が、１日に体重１ｋｇあたり約５〜約１５０ｍｇである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
神経膠腫の出現を阻害する第二の薬剤を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記二次抗神経膠腫療法が、放射線、手術、または化学療法、例えば、テモゾロミド、ロムスチン、ビンクリスチン、マチュレーン、ＰＣＶ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及び／またはＤＦＭＯである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記二次抗神経膠腫薬剤が、テモゾロミドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
テモゾロミドの有効用量が、テモゾロミドの標準単剤療法用量未満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象における神経膠腫形成をスクリーニングすることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
ＬＢＰの発現を評価することをさらに含み、
未処置対照と比較したＬＢＰレベルの低下が、予後の改善を示す、請求項１、１６または２９に記載の方法。
【請求項４０】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮによる処置前及び処置後に、リポ多糖結合タンパク質の発現を測定することによって効果を評価することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）対象から試料を得ること；及び
（ｂ）前記試料中のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）レベルを評価すること
を含み、
比較正常対照試料からのものより高いＬＢＰレベルが、前記対象における膠芽腫の存在を示す、前記膠芽腫の検出方法。
【請求項４２】
ＬＢＰレベルを評価することが、免疫学的評価または核酸評価を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
免疫学的評価が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
核酸評価が、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングまたはマイクロアレイを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、全血、血清、血漿または尿である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）対象から試料を得ること；
（ｂ）前記試料中のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）レベルを評価すること；及び
（ｃ）第二の時点で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すこと、
を含み、
工程（ｂ）と比較して工程（ｃ）でより高いＬＢＰレベルは、前記対象における膠芽腫の進行を示す、膠芽腫進行の監視方法。
【請求項４７】
ＬＢＰレベルを評価することが、免疫学的評価または核酸評価を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
免疫学的評価が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
核酸評価が、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングまたはマイクロアレイを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料が、全血、血清、血漿または尿である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）対象から試料を得ること；
（ｂ）前記試料中のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）レベルを評価すること；
（ｃ）低、中、及び／または高グレードの膠芽腫に対して、工程（ｂ）のＬＢＰレベルを対照試料と比較すること、及び
（ｄ）前記対象における前記膠芽腫にグレードを割り当てること
を含む、膠芽腫の病期診断方法。
【請求項５２】
ＬＢＰレベルを評価することが、免疫学的評価または核酸評価を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
免疫学的評価が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
核酸評価が、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングまたはマイクロアレイを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料が、腫瘍試料、全血、血清、血漿または尿である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）標的化剤に連結した治療剤を対象に投与することを含む、膠芽腫を有する対象の治療方法。
【請求項５７】
前記ＬＢＰ標的化剤が、抗体、ＳｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２またはペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療剤が、化学療法剤、放射線治療剤、免疫療法剤または生物剤である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記化学療法剤が、テモゾロミドまたは２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記膠芽腫が、薬物耐性である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記膠芽腫が、テモゾロミド耐性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記膠芽腫が、テモゾロミド及び／または２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）で以前に治療されている、請求項５６または６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記膠芽腫が、再発性及び／または転移性である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療剤のＬＢＰへの連結が、切断可能である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者または前記膠芽腫におけるＬＢＰ発現を評価することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）リポ多糖結合タンパク質に連結したイメージング剤を対象に投与すること；及び
（ｂ）前記対象における膠芽腫部位イメージング
を含む、対象における膠芽腫境界の特定方法。
【請求項６７】
ＥＬＴＤ１、Ｓｌｉｔ−３またはＳｐｏｎｄｉｎ−１に連結したイメージング剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記イメージング剤が、色素、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、ＭＲＩ標識または近赤外標識である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
イメージング後に前記膠芽腫を切除することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
切除後に前記膠芽腫部位を再イメージングすることをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）対象から組織試料を得ること；
（ｂ）前記組織試料を、リポ多糖結合タンパク質に連結した標識と接触させること；及び
（ｃ）前記組織試料に結合した前記標識−ＬＢＰ複合体を検出すること
を含む、前記対象由来の組織試料中の膠芽腫細胞の特定方法。
【請求項７２】
前記組織試料を、前記対象に連結した標識、ＥＬＴＤ１、Ｓｌｉｔ−３またはＳｐｏｎｄｉｎ−１に連結したイメージング剤と接触させることをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記標識が、色素、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、ＭＲＩ標識または近赤外標識である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記組織試料が、固定されていない新鮮な生検試料である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記組織試料が、固定された生検試料である、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年９月２０日提出の米国特許仮出願第６２／５６１，００２号の優先権を主張し、この仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
１．分野
本開示は、概して、腫瘍学及び化学療法の分野に関する。特に、薬剤耐性神経膠腫を治療するための２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
神経膠腫は、脳の正常な「神経膠」細胞及び／またはそれらの前駆細胞から生じる多様な脳腫瘍群である。神経膠腫に対する生存の最も重要な決定因子は、神経膠腫の「グレード」である。生存の二次決定因子は、診断時の年齢、パフォーマンスステータス、及び手術の範囲である。低グレード神経膠腫の患者は、一般に生存期間が長い遷延性の自然歴を有するが、高グレード神経膠腫の患者は、成功裏に治療するのがはるかに難しく、生存期間が短い。全ての神経膠腫は、主に神経膠腫の位置及びサイズに関連する特定の徴候並びに症状を有する。
【０００４】
例えば、側頭葉神経膠腫は、発作、言語障害及び／または記憶喪失を引き起こす可能性がある。前頭葉神経膠腫は、発作、行動変化、体の反対側の腕もしくは脚の虚弱、及び／または言語障害を引き起こす可能性がある。後頭神経膠腫は、失明を引き起こす可能性がある。頭頂神経膠腫は、空間識消失、体の反対側の感覚低下、及び／または一度はよく知っていた物もしくは人の認識不能を引き起こす可能性がある。
【０００５】
星状細胞腫は、星状細胞と呼ばれる脳細胞またはそれらの前駆細胞から生じる神経膠腫瘍である。星状細胞は、神経機能を支持する中枢神経系の細胞である。星状細胞腫は、悪性度増大を示す組織学的特徴によって星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、または多形神経膠芽腫に等級づけすることができる。退形成性星状細胞腫及び多形神経膠芽腫は、高グレードの神経膠腫であると考えられるが、星状細胞腫は、低グレードの神経膠腫であると考えられる。高グレード腫瘍は急速に成長し、容易に脳に浸潤して拡散する。低グレード星状細胞腫も脳に浸潤し得るが、通常はより局在化し、長期間かけてゆっくり成長する。高グレード腫瘍は、はるかに進行性で、非常に強力な治療を必要とする。小児の星状細胞腫瘍の大部分は低グレードであるが、成人の大部分は高グレードである。星状細胞腫は、脳及び脊髄のどこにでも発生する可能性があるが、大部分は、大脳半球に位置する。
【０００６】
乏突起膠腫も神経膠腫である。これらは乏突起膠細胞及び／またはそれらの前駆細胞から生じる。正常な乏突起膠細胞は、脳及び脊髄の神経軸索を覆い、神経に電気インパルスをより効率的に伝導させる脂肪物質である、ミエリンを提供する。乏突起膠腫は、低グレード乏突起膠腫（進行性が低い）及び退形成性乏突起膠腫（より進行性）に分類される。純粋な乏突起膠腫よりも一般的なものは、星状細胞腫と乏突起膠腫との混合物である低グレードで退形成性の腫瘍（「乏突起星状細胞腫」）である。
【０００７】
退形成性乏突起膠腫及び混合乏突起星状細胞腫は、星状細胞腫よりも細胞毒性化学療法に対する感受性が高い。ＰＣＶ（プロカルバジン（マチュレーン）、ＣＣＮＵ（ロムスチン）、ビンクリスチン）化学療法に対する反応率が高いことで、この療法の使用はこれらの腫瘍に対するケアの標準ではないとしても、少なくとも非常に一般的な治療となっている。低グレード乏突起膠腫も化学療法に対して感受性で、低グレード腫瘍がそれまでの外科／放射線療法にもかかわらず成長を始めた場合には、ＰＣＶを用いることができる。
【０００８】
潜在的な抗神経膠腫薬としてのフェニル−ｔｅｒｔ−ブチル−ニトロン（ＰＢＮ）の有効性は、ラットＣ６神経膠腫移植モデルの前処置において示されている（Ｄｏｂｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。未処置ラットからのＭＲＩ結果は、Ｃ６神経膠腫の拡散的な侵襲性を示し、そのうちのいくつかは、血管新生と関連していた。前処置としてのＰＢＮ投与により、成長速度の低下及び腫瘍退縮、並びに血管新生の防止を明らかに誘発されることが分かった。しかしながら、ＰＢＮの後処置は、前処置（腫瘍の８０％超の成長が低下した）と比較して、腫瘍退縮に対する効果が低下した（約５０％の腫瘍の腫瘍成長が低下した）。ＭＲＩ知見は、組織学及び血管新生マーカー免疫染色評価からのものに匹敵した。
【０００９】
より最近の研究では、発明者は、ＰＢＮの構造類似体である２，４−ｄｓ−ＰＢＮが、腫瘍体積を減少させ、腫瘍成長速度を遅らせたことを示した。２，４−ｄｓ−ＰＢＮ後処置も生存率の増加に著しく効果的であった。ＰＢＮのスルホン化誘導体が血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過できることは知られていなかったため、この結果は予想外で驚くべきことであった。ＰＢＮである親ニトロンは、ＢＢＢを容易に貫通することが予め分かっている（Ｗａｎｇ  ＆  Ｓｈｕａｉｂ、２００７）。２，４−ジスルホニルＰＢＮ（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）は、親化合物のＰＢＮと構造的に関連するが、それをはるかに水溶性にさせる２個のスルホニル基を含む。水溶性が増加した結果として、２，４−ジスルホニルＰＢＮは、ＰＢＮと比較して、ＢＢＢを容易に通過するとは最初は考えられていなかった（Ｗａｎｇ  ＆  Ｓｈｕａｉｂ、２００７）。しかしながら、発明者は、２，４−ジスルホニルＰＢＮがＢＢＢを容易に通過できることを実証した（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。理想的には、抗神経膠腫療法として使用される薬物は、ＢＢＢの内皮ジャンクションを通過して、腫瘍細胞の大部分に到達する必要があるが（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、悪性神経膠腫は、可溶性因子を分泌することでタイトジャンクションを積極的に劣化させる能力を獲得しており、最終的には侵入した脳組織内のＢＢＢの破壊をもたらすことが可能である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。具体的には、２，４−ジスルホニルＰＢＮは、神経膠腫組織に対する単剤療法として有意な薬効を示した。
【発明の概要】
【００１０】
概要
従って、本開示に従い、テモゾロミド耐性神経膠腫の血管新生、成長または拡散を阻害するのに有効な用量の２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）を、対象に投与することを含む、対象の前記神経膠腫を治療する方法が提供される。のちの２，４−ｄｓ−ＰＢＮの血液脳関門の通過を必要とする経路（経腸、静脈内、または動脈内など）を通じて、投与を行ってもよい。
【００１１】
対象は、再発性もしくは転移性神経膠腫を有していてもよく、及び／または以前に一つまたは複数の抗神経膠腫療法に失敗していてもよい。２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効用量は、１日に体重１ｋｇあたり約５〜約１５０ｍｇであり得る。経腸投与は、食物成分の食事補充を通じてであり得、経腸投与は、丸剤または液剤の形態であり得る。対象は、ヒトであり得る。
【００１２】
方法は、放射線、手術、または化学療法、例えば、テモゾロミド、ロムスチン、ビンクリスチン、マチュレーン、ＰＣＶ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及び／またはＤＦＭＯなどの二次抗神経膠腫療法をさらに含み得る。二次抗神経膠腫薬剤は、テモゾロミドであり得、テモゾロミドの有効用量は、テモゾロミドの標準単剤療法用量未満であり得る。
【００１３】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効量は、与える食事の約０．００５ｗ／ｗ％〜約０．１ｗ／ｗ％であり得る。神経膠腫は、星状細胞腫、乏突起膠腫、または多形神経膠芽腫、あるいは前述のいずれかのＴＧＦ−β１発現形態、ＭＧＭＴ発現形態及び／またはＡＰＧＮ発現形態であり得る。
【００１４】
方法は、２，４−ｄｓ−ＰＢＮによる処置前及び処置後に、リポ多糖結合タンパク質の発現を測定することによって治療効果を評価することをさらに含み得る。方法は、ＬＢＰの発現を評価することをさらに含み得、未処置対照と比較したＬＢＰレベルの低下は、予後の改善を示す。
【００１５】
別の実施形態では、（ａ）神経膠腫を有する対象を特定すること、及び（ｂ）前記神経膠腫においてテモゾロミド耐性の発生を阻害するのに有効な用量の（ｉ）２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）、及び（ｉｉ）テモゾロミドを前記対象に投与することを含む、前記対象における神経膠腫テモゾロミド耐性の発生の阻害方法が提供される。のちの２，４−ｄｓ−ＰＢＮの血液脳関門の通過を必要とする経路（経腸、静脈内、または動脈内など）を通じて、投与を行ってもよい。
【００１６】
対象は、再発性または転移性神経膠腫を有してもよく、及び／または以前に一つまたは複数の抗神経膠腫療法に失敗していてもよい。２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効用量は、１日に体重１ｋｇあたり約５〜約１５０ｍｇであり得る。経腸投与は、食物成分の栄養補充物を通じてでもよく、または経腸投与は、丸剤または液剤の形態でもよい。対象は、ヒトであり得る。
【００１７】
方法は、放射線、外科手術、または化学療法、例えば、テモゾロミド、ロムスチン、ビンクリスチン、マチュレーン、ＰＣＶ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及び／またはＤＦＭＯなどの、二次抗神経膠腫療法をさらに含み得る。二次抗神経膠腫薬剤は、テモゾロミドであり得、テモゾロミドの有効用量は、テモゾロミドの標準単剤療法用量未満であり得る。
【００１８】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効量は、与える食事の約０．００５ｗ／ｗ％〜約０．１ｗ／ｗ％であり得る。神経膠腫は、星状細胞腫、乏突起膠腫、または多形神経膠芽腫、あるいは前述のいずれかのＴＧＦ−β１発現形態、ＭＧＭＴ発現形態及び／またはＡＰＧＮ発現形態であり得る。方法は、ＬＢＰの発現を評価することをさらに含み得、未処置対照と比較したＬＢＰレベルの低下は、予後の改善を示す。
【００１９】
さらに別の実施形態では、（ａ）神経膠腫を有する対象を特定すること、及び（ｂ）前記神経膠腫の再発を阻害するのに有効な用量の（ｉ）２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）、及び（ｉｉ）テモゾロミドを前記対象に投与することを含む、神経膠腫再発の阻害方法が提供される。のちの２，４−ｄｓ−ＰＢＮの血液脳関門の通過を必要とする経路（経腸、静脈内、または動脈内など）を通じて、投与を行ってもよい。
【００２０】
対象は、再発性または転移性神経膠腫を有してもよく、及び／または以前に一つまたは複数の抗神経膠腫療法に失敗していてもよい。２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効用量は、１日に体重１ｋｇあたり約５〜約１５０ｍｇであり得る。経腸投与は、食物成分の栄養補充物を通じてでもよく、または経腸投与は、丸剤または液剤の形態でもよい。対象は、ヒトであり得る。
【００２１】
方法は、放射線、外科手術、または化学療法、例えば、テモゾロミド、ロムスチン、ビンクリスチン、マチュレーン、ＰＣＶ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及び／またはＤＦＭＯ、など、の二次抗神経膠腫療法をさらに含み得る。二次抗神経膠腫薬剤は、テモゾロミドであり得、テモゾロミドの有効用量は、テモゾロミドの標準単剤療法用量未満であり得る。
【００２２】
２，４−ｄｓ−ＰＢＮの有効量は、与える食事の約０．００５ｗ／ｗ％〜約０．１ｗ／ｗ％であり得る。神経膠腫は、星状細胞腫、乏突起膠腫、または多形神経膠芽腫、あるいは前述のいずれかのＴＧＦ−β１発現形態、ＭＧＭＴ発現形態及び／またはＡＰＧＮ発現形態であり得る。方法は、前記対象における神経膠腫形成をスクリーニングすることをさらに含み得る。方法は、２，４−ｄｓ−ＰＢＮによる処置前及び処置後に、リポ多糖結合タンパク質の発現を測定することによって治療効果を評価することをさらに含み得る。方法は、ＬＢＰの発現を評価することをさらに含み得、未処置対照と比較したＬＢＰレベルの低下は、予後の改善を示す。
【００２３】
さらに別の実施形態では、（ａ）対象から試料を得ること；及び（ｂ）前記試料中のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）レベルを評価することを含み、比較正常対照試料からのものより高いＬＢＰレベルが、前記対象における膠芽腫の存在を示す、膠芽腫の検出方法が提供される。ＬＢＰレベルを評価することは、免疫学的評価または核酸評価、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学から選択される免疫学的評価、またはＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングまたはマイクロアレイから選択される核酸評価を含み得る。試料は、全血、血清、血漿または尿であり得る。
【００２４】
さらなる実施形態は、（ａ）対象から試料を得ること；（ｂ）前記試料中のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）レベルを評価すること；及び（ｃ）第二の時点で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことを含み、工程（ｂ）と比較して工程（ｃ）でより高いＬＢＰレベルは、前記対象における膠芽腫の進行を示す、膠芽腫進行の監視方法を含む。ＬＢＰレベルを評価することは、免疫学的評価または核酸評価、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学から選択される免疫学的評価、またはＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングまたはマイクロアレイから選択される核酸評価を含み得る。試料は、全血、血清、血漿または尿であり得る。
【００２５】
さらに別の実施形態は、（ａ）対象から試料を得ること；（ｂ）前記試料中のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）レベルを評価すること；（ｃ）低、中、及び／または高グレードの膠芽腫に対して、工程（ｂ）のＬＢＰレベルを対照試料と比較すること、及び（ｄ）前記対象における前記膠芽腫にグレードを割り当てることを含む、膠芽腫の病期診断方法を含む。ＬＢＰレベルを評価することは、免疫学的評価または核酸評価、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学から選択される免疫学的評価、またはＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングまたはマイクロアレイから選択される核酸評価を含み得る。試料は、全血、血清、血漿または尿であり得る。
【００２６】
追加の実施形態は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）標的化剤に連結した治療剤を前記対象に投与することを含む、膠芽腫を有する対象の治療方法を含む。ＬＢＰ標的化剤は、抗体、ＳｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２またはペプチドであり得る。治療剤は、化学療法剤、放射線治療剤、免疫療法剤または生物剤であり得る。化学療法剤は、テモゾロミドまたは２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）であり得る。膠芽腫は、薬物耐性、例えば、テモゾロミド耐性であり得る。膠芽腫は、テモゾロミド及び／または２，４−ジスルホニルフェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）で以前に治療されていてもよい。膠芽腫は、再発性及び／または転移性であり得る。治療剤のＬＢＰへの連結は、切断可能であり得る。方法は、前記患者または前記膠芽腫におけるＬＢＰ発現を評価することをさらに含み得る。
【００２７】
さらに追加の実施形態は、（ａ）リポ多糖結合タンパク質に連結したイメージング剤を前記対象に投与すること；及び（ｂ）前記対象における膠芽腫部位イメージングを含む、対象における膠芽腫境界の特定方法を含む。方法は、ＥＬＴＤ１、Ｓｌｉｔ−３またはＳｐｏｎｄｉｎ−１に連結したイメージング剤を前記対象に投与することをさらに含み得る。イメージング剤は、色素、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、ＭＲＩ標識または近赤外標識であり得る。方法は、イメージング後に前記膠芽腫を切除することをさらに含み、切除後に前記膠芽腫部位を再イメージングすることを任意にさらに含み得る。
【００２８】
さらに別の実施形態は、（ａ）対象から組織試料を得ること；（ｂ）前記組織試料を、リポ多糖結合タンパク質に連結した標識と接触させること；及び（ｃ）前記組織試料に結合した前記標識−ＬＢＰ複合体を検出することを含む、前記対象由来の組織試料中の膠芽腫細胞の特定方法を含む。方法は、前記組織試料を、前記対象に連結した標識、ＥＬＴＤ１、Ｓｌｉｔ−３またはＳｐｏｎｄｉｎ−１に連結したイメージング剤と接触させることをさらに含み得る。標識は、色素、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、ＭＲＩ標識または近赤外標識であり得る。組織試料は、固定されていない新鮮な生検試料であり得る。組織試料は、固定された生検試料であり得る。
【００２９】
本明細書に記載のいかなる方法または組成物も、本明細書に記載のいかなる他の方法または組成物に関して実行できることが企図される。
【００３０】
特許請求の範囲及び／または明細書において「一つの（ａ）」または「一つの（ａｎ）」なる用語が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる用語と組み合わせて用いられる場合、その使用は、「一」を意味し得るが、「一つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも一つ」、及び「一つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
【００３１】
本明細書において論じるいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法または組成物に関しても実行することができ、逆もまた同じであることが企図される。さらに、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００３２】
本出願の全体を通して、「約」なる用語は、値がその値を決めるために用いるデバイス、方法に対する誤差の固有の変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いる。
【００３３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの含むの任意の形）、「有する（ｈａｖｅ）」（並びに「ｈａｓ」及び「ｈａｖｉｎｇ」などの有するの任意の形）、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」（並びに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」などの含むの任意の形）、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」（並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などの含むの任意の形）なる用語は、制限のない連結動詞である。その結果、一つまたは複数の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」デバイスまたは方法は、それらの一つまたは複数の要素を有するが、それらの一つまたは複数の要素または段階だけを有することに限定されない。同様に、一つまたは複数の特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」デバイスまたは方法の要素は、それらの一つまたは複数の特徴を有するが、それらの一つまたは複数の特徴だけを有することに限定されない。
【００３４】
下記の図面は、本明細書の一部をなし、本発明のある特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面の一つまたは複数を、本明細書に示す具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、よりよく理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】未処置、及びＴＭＺ−、ＯＫＮ−００７、及びＯＫＮ−００７とＴＭＺで併用処置したＧ５５神経膠腫担持マウスの動物生存率のカプラン−マイヤー曲線。
【図２】腫瘍（＞５ｍｍ３）のＭＲＩ検出後の１９〜２２日目に得たインビボ腫瘍体積（ｍｍ３）。
【図３】処置群（ＴＭＺ、ＯＫＮ−００７（ＯＫＮ）、ＯＫＮ−００７とＴＭＺ併用（Ｃｏｍｂ）、または未処置（ＵＴ）ごとの中腫瘍領域における腫瘍（最大腫瘍）を示すＭＲ画像。
【図４】処置群（ＵＴ、ＴＭＺ、ＯＫＮまたは併用治療）ごとの最後のＭＲＩ時点で得られた腫瘍体積。
【図５Ａ】処置群ごとの、複数の時点で得られた腫瘍体積（平均±Ｓ．Ｄ．）（ＵＴ：一点鎖線の黒い白丸；ＴＭＺ：破線の青い白四角；ＯＫＮ：点線の緑の上向きの白三角；併用：実線の赤い下向きの黒三角）。治療ウィンドウは、腫瘍が、最大で≧５０日間、≧１０ｍｍ３であった場合に開始した。
【図５Ｂ】ＵＴ、ＴＭＺ、ＯＫＮ、または併用処置したＧ５５神経膠腫担持マウスにおける、正規化（対側または正常な脳組織に正規化）ｒＣＢＦ値の変化（腫瘍検出後２１〜２２日目の腫瘍のｒＣＢＦマイナス初期腫瘍検出時のｒＣＢＦ）。
【図６】ＵＴ、ＴＭＺ、ＯＫＮ、または併用処置したＧ５５神経膠腫担持マウスから得られた腫瘍組織溶解物中の、ＥＬＩＳＡから測定したエクスビボＬＢＰレベル。
【図７】ＵＴ、ＴＭＺ、ＯＫＮ、または併用処置したＧ５５神経膠腫担持マウスから得られた血清中の、ＥＬＩＳＡから測定したエクスビボＬＢＰレベル。
【図８】ＯＫＮ−００７を併用した、ＴＭＺ耐性（Ｔ９８Ｇ、Ｇ５５）及びＴＭＺ感受性（Ｕ２５１）ＧＢＭ細胞株のインビトロＩＣ５０評価。
【図９】神経膠腫担持ラット腫瘍中のＬＢＰに対するＯＫＮ−００７効果。Ｆ９８神経膠腫担持動物由来の組織溶解物で行ったＬＢＰのＥＬＩＳＡ評価は、ＯＫＮ−００７による治療中に発現差を示した。腫瘍担持動物におけるＬＢＰレベルは、非腫瘍対照群と比較して有意に上昇し、ＯＫＮ−００７処置は、非腫瘍対照に近いＬＢＰレベルをもたらした。
【図１０】神経膠腫担持ラット血清中のＬＢＰに対するＯＫＮ−００７効果。図９からの同じ動物由来の血清を用いたＬＢＰのＥＬＩＳＡ評価により、ＬＰＢが、神経膠腫におけるＯＫＮ−００７の治療結果を予測することができる血清バイオマーカーとして機能することができることが確認された。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃ：腫瘍グレードによるＬＢＰレベル。ＬＢＰレベルは、低グレードの神経膠腫として分類された腫瘍と比較して、高グレードのヒト患者神経膠腫で上昇する。高グレードの神経膠腫：多形神経膠芽腫（図１１Ａ）、及び低グレードの星状細胞腫（図１１Ｂ）におけるＬＢＰの代表的な免疫組織化学染色。（図１１Ｃ）高グレード（ＧＢＭ−膠芽腫、ＡＡ−退形成性星状細胞腫、ＡＯ−退形成性乏突起膠腫；９４人の患者の組織試料）及び低グレード（ＬＧＡ−低グレードの星状細胞腫、オリゴ良性乏突起膠腫；４５人の患者の組織試料）ヒト神経膠腫におけるＬＢＰ発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）スコア平均。グレード基準：０：ＩＨＣ染色の検出が、０％；１：０〜＜２５％；２：２５〜＜５０％；３：５０〜＜７５％；４：７５〜１００％。
【図１２】ＯＫＮ有効性に対するマーカーとしてのＬＢＰ。処置群ごとに、研究の終わりに、血液及び腫瘍組織試料からＥＬＩＳＡによってＬＢＰレベルを評価した。全ての治療は、Ｇ５５神経膠腫を有するＵＴマウスと比較して、血液中のＬＢＰを有意に減少させることが分かった。ＯＫＮ及び併用療法は、Ｇ５５神経膠腫を有するＵＴマウスと比較して、腫瘍組織中のＬＢＰを有意に減少させることが分かった。腫瘍組織または血液中で、ＯＫＮまたは併用療法のＬＢＰレベルに対する差はないように見えた。
【図１３】図１３Ａ〜Ｂ：（図１３Ａ）未処置（ＵＴ）、及びＴＭＺ−、ＯＫＮ−００７、及びＯＫＮ−００７とＴＭＺで併用処置したＧ５５神経膠腫担持マウスの動物生存率のカプラン−マイヤー曲線。全ての処置群は、ＵＴ  Ｇ５５−神経膠腫担持マウスと比較して、有意に高い生存率（ｐ＜０．０５またはそれ以上）を有することが分かった。併用処置群は、ＴＭＺ処置群よりも有意に高い生存率（ｐ＜０．０１）を有することが分かった。（図１３Ｂ）腫瘍（＞５ｍｍ３）のＭＲＩ検出後の１９〜２２日目に得たインビボ腫瘍体積（ｍｍ３）。全ての処置群は、ＵＴ群と比較して、有意に低い腫瘍体積（ｐ＜０．０１またはそれ以上）を有することが分かった。
【図１４】図１４Ａｉ〜Ｄｉｉｉ：腫瘍検出後１９〜２２日目の（図１４Ａ）未処置（ＵＴ）、または各処置群（図１４Ｂ）ＴＭＺ、（図１４Ｃ）ＯＫＮ−００７（ＯＫＮ）、または（図１４Ｄ）ＯＫＮ−００７とＴＭＺ併用（Ｃｏｍｂ）の中腫瘍領域における腫瘍（最大腫瘍）を示す代表的なＭＲ画像。「ｉ」と標識された画像の場合、腫瘍を薄い線で強調して、腫瘍境界を示す。パネル「ｉｉ」または「ｉｉｉ」の画像は、処置群Ａ〜Ｄの他の例であり、ＵＴ群の一貫性または処置群の変動性のいずれかを示す。この時点範囲での治療後に、ＯＫＮ−００７−または併用療法群の図１４Ｃｉｉｉまたは図１４Ｄｉｉｉにおいて検出可能な腫瘍は存在しなかった。
【図１５】図１５Ａｉ〜Ｅ：（図１５Ａ）ＵＴ、（図１５Ｂ）ＴＭＺ、（図１５Ｃ）ＯＫＮ、または（図１５Ｄ）併用処置したＧ５５神経膠腫担持マウスの、正規化（対側または正常な脳組織に正規化）ｒＣＢＦ値の、灌流ＭＲＩによって示される血管変化［腫瘍検出後２１〜２２日目の腫瘍のｒＣＢＦ（相対的な脳血流）マイナス初期腫瘍検出時のｒＣＢＦ］。「ｉ」と標識された画像の上パネルは、処置群ごとの代表的なＴ２−重み付けされた形態学的ＭＲ画像である一方、「ｉｉ」と標識された画像は、処置群ごとの代表的な灌流マップである。（図１５Ｅ）ＵＴ及びＴＭＺ−、ＯＫＮ−、または併用療法処置したＧ５５神経膠腫担持マウスにおける、正規化ｒＣＢＦの変化の定量的評価。全ての処置群は、ＵＴ群と比較して、正規化ｒＣＢＦの変化が有意に低かった（ｐ＜０．０５またはそれ以上）。
【図１６】ＴＭＺ＋ＯＫＮをＴＭＺのみの処置群と比較した場合の、ＬＮ１８  ＧＢＭ細胞中の遺伝子発現比。
【図１７】ＴＭＺ＋ＯＫＮをＴＭＺのみの処置群と比較した場合の、ＬＮ２２９  ＧＢＭ細胞中の遺伝子発現比。
【図１８】後処置の２２、２８及び４６時間での、未処置（ＵＴ）、またはＯＫＮ−００７（ＯＫＮ）、ＴＭＺ、またはＯＫＮ＋ＴＭＺの療法のいずれかで処置した、ラミニン被覆したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）マイクロチャネル中のＧ５５  ＧＢＭ細胞の遊走速度。ＵＴ細胞と、２２及び２８時間でのＯＫＮまたはＯＫＮ＋ＴＭＺで処置した細胞、及び４６時間での全ての処置群との間に有意差があった（＊）。２２及び２８時間でのＴＭＺ群とＯＫＮ＋ＴＭＺ群との間に有意差があった（†）。＊（†）ｐ＜０．０５、＊＊（††）ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１９】ネットワーク経路の概略図における、未処置群（ｎ＝４）と比較した処置群（ｎ＝４）のダウンレギュレート遺伝子（緑色；＞２倍率変化）を示す、ＯＫＮ−００７処置及び未処置ラットＦ９８神経膠腫担持腫瘍由来のｍＲＮＡ試料のマイクロアレイ解析。影響を及ぼした主要なダウンレギュレート遺伝子経路には、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦＢＢ、Ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＮＦκＢ、いくつかのＭＭＰ（特に、ＭＭＰ１２）、ＤＣＮ（デコリン）、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＬＵＭ、ＬＢＰ（リポ多糖結合タンパク質）、及びいくつかのコラーゲンが含まれる。
【図２０】ラットＦ９８処置神経膠腫対未処置腫瘍における、ＯＫＮ−００７による５７個のダウンレギュレート遺伝子のマスターレギュレーターとしてのＴＧＦβ１（Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＩＰＡ）。ＯＫＮ−００７は、コラーゲン、ＭＭＰ１２（組織改造）、ＳＥＲＰＩＮＢ２（セリンペプチダーゼ阻害剤）、ＩＧＦＢＰ５（インシュリン様成長因子結合タンパク質）を含む５７個の遺伝子をダウンレギュレートする。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃ：（図２１Ａ）未処置または（図２１Ｂ）ＯＫＮ−００７処置のいずれかにおけるラットＦ９８同所腫瘍（中腫瘍領域）のＴＧＦβ１  ＩＨＣ。（図２１Ｃ）Ｆ９８腫瘍組織溶解物からの未処置（ＵＴ）またはＯＫＮ−００７（ＯＫＮ）処置におけるＥＬＩＳＡ  ＴＧＦβ１タンパク質レベル（ｐｇ／ｍＬ）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
例示的な態様の説明
多形神経膠芽腫と診断される患者の予後は、早期かつ正確な診断が困難で、かつ、現在有効な治療化合物が無いために非常に悪い。加えて、薬物に最初のうちは感受性のある神経膠腫は、時間とともに耐性を持つようになり得ることで、この非常に致死的な形態の癌を治療するためのさらなる難題を提示する。
【００３７】
上記のように、２，４−ｄｓ−ＰＢＮ、ＰＢＮの構造類似体は、神経膠腫を有する動物の腫瘍体積を減少させ、腫瘍成長速度を遅延させることができ、かつ生存率を有意に増加させることもできた。しかしながら、２，４−ｄｓ−ＰＢＮが、神経膠腫細胞におけるテモゾロミド（ＴＭＺ）耐性の防止及び克服を含む、ＴＭＺに基づく治療の結果に良い影響を及ぼすことができるかどうかは不明である。ＴＭＺ治療の標準治療状況、及びＴＭＺ耐性の有病率を考えれば、そのような恩恵は、ＴＭＺによる治療を受けている患者にとってかなり重要であろう。
【００３８】
従って、本発明者は、ＴＭＺ耐性及び併用療法の文脈における２，４−ｄｓ−ＰＢＮの効果を見ようとした。インビトロ細胞データは、２，４−ｄｓ−ＰＢＮが、ＴＭＺで処置したＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞の細胞生存を有意に減少させることを明確に示している。インビボデータは、２，４−ｄｓ−ＰＢＮとＴＭＺの併用治療が、ＴＭＺ耐性神経膠腫異種移植ヌードマウスモデルにおける動物生存率を有意に増加させ、腫瘍体積を減少させることを明確に示す。これらの予想外の結果は、神経膠腫の強力な新しい治療計画として、２，４−ｄｓ−ＰＢＮとＴＭＺの併用を指している。
【００３９】
本開示のこれら及び他の態様を以下に詳細に記述する。
【００４０】
２．退形成性神経膠腫層
Ａ．臨床上の特徴
退形成性神経膠腫は、中グレードの浸潤性神経膠腫で、低度（限局性で成長が遅い）から多形神経膠芽腫（成長が速く、侵襲性が高い）の間に分類される。退形成性星状細胞腫（ＡＡ）は、星状細胞と呼ばれる脳細胞及び／またはそれらの前駆細胞から生じる腫瘍である。星状細胞は、中枢神経系の支持細胞である。小児の星状細胞腫瘍の大部分は、低グレードであるが、成人の大部分は、高グレードである。これらの腫瘍は、脳及び脊髄のどこにでも発生する可能性がある。
【００４１】
乏突起膠腫は、乏突起膠細胞及び／またはそれらの前駆細胞に由来する神経膠腫である。乏突起膠細胞は、脳内の有髄ニューロンの構造及び機能において役割を有する。退形成性乏突起膠腫（ＡＯ）は、乏突起膠腫よりも進行性であるが、退形成性星状細胞腫よりも化学療法に対する感受性が高い。ＰＣＶ（プロカルバジン、ＣＣＮＵ、ビンクリスチン）化学療法の使用に対する反応率が高いことで、放射線療法の前、放射線照射後、及び／または腫瘍再発及び進行時のＰＣＶ化学療法の使用は一般的となっている。別の神経膠腫は、乏突起膠腫と星状細胞腫の両方の腫瘍型の組織学的混合物として現れ、乏突起星状細胞腫と呼ばれる。乏突起星状細胞腫は、低グレードであり得るが、混合乏突起星状細胞腫の大部分は、退形成性乏突起星状細胞腫（ＡＯＡ）である。
【００４２】
最後の神経膠腫サブグループは、上衣腫である。悪性上衣腫の一つのサブタイプは、退形成性上衣腫（ＡＥ）であり；これらの腫瘍は、脳室と呼ばれる脳脊髄液通路を内張りする上衣細胞及び／またはそれらの前駆細胞から生じる。これらの腫瘍は、テント上（頭の上部）またはテント下（頭の背部）のいずれかとして分類される。
【００４３】
神経膠腫により生じる臨床上の特徴及び症状は、腫瘍の位置及び患者の年齢に依存する。神経膠腫の最も一般的な位置は、成人では大脳半球で、小児では小脳、脳幹、視床下部、及び視床である。脊髄神経膠腫は、脳の神経膠腫よりもはるかに少ない。これらの腫瘍を有する患者は、脳または脊髄内の位置に応じて変動する症状を示す。頭痛、発作、悪心及び嘔吐、四肢虚弱、一側性感覚変化、人格変化、並びに歩行不安定の症状を呈し得る。
【００４４】
Ｂ．分類
退形成性星状細胞腫。退形成性星状細胞腫の組織学的特徴は、低グレード星状細胞腫のものと類似であるが、これらの特徴はより多く、誇張されている。これらの腫瘍は、ＷＨＯグレードＩＩＩである（Ｋｌｅｉｈｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ及びＣａｖｅｎｅｅ、２０００）。細胞性は、核及び細胞多形性と同様、より高まっている。これらの特徴は極度で、背中合わせの細胞及び奇異で過染色性の核を伴い得る。細胞質は乏しく、核の分裂形成及び拡大が退形成を示している。ほとんどの退形成性星状細胞腫で有糸分裂活性が容易に認められるが、不可解なことに大円形細胞を伴う領域にはないこともある。
【００４５】
このグレードの退形成性の範囲は広く、低い細胞性及びわずかな有糸分裂の形態を伴う多形性を示す例もあれば、高度に細胞性かつ多形性で、頻繁に有糸分裂し、膠芽腫の組織学的診断に必要とされる壊死だけを欠いている例もある。このため、挙動のより客観的指標を持つことは有用であり、予後をより正確に予測しようとして細胞増殖のいくつかのマーカーが用いられてきた。この分野で最も用いられたマーカーは、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）及びＫｉ−６７の抗体であった（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＢｒｄＵの細胞取り込みは、細胞周期のＤＮＡ合成期の特異的マーカーであるが、Ｋｉ−６７抗体は、Ｇ０以外の細胞周期の全ての期に存在する抗原を標識する。いずれの抗体もパラフィン包埋組織切片における免疫組織化学的染色により同定することができる。一般論として、退形成性星状細胞腫に対する高い標識速度は、予後不良に関連している（Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌａｍｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００４６】
多形神経膠芽腫。膠芽腫は、多形神経膠芽腫としても知られており、悪性度が最も高いグレードであるＷＨＯグレードＩＶの神経膠腫である（Ｋｌｅｉｈｕｅｓ及びＣａｖｅｎｅｅ、２０００）。これは、頭蓋内腫瘍の１５％から２３％、星状細胞腫の約５０％〜６０％を占める。神経膠線維酸性タンパク質は、細胞質中で同定することができるため、ほとんどの例は、一般に星状細胞から生じると考えられる。しかしながら、いくつかの例は明らかに、乏突起膠細胞などの他の膠細胞系統から生じる。膠芽腫は、最も高頻度に生じる星状細胞腫である。剖検及び連続生検により、いくつかの星状細胞腫は、低グレードから退形成性星状細胞腫、神経膠腫への変換により、複数の悪性グレードを通して進行することが明らかにされている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。しかし、膠芽腫のいくつかの例は、それ以外は健常な患者で急速に発生するようで、小さい時に認められるため、この種の膠芽腫は、悪性度の低いグレードを通らずに星状細胞前駆細胞の悪性変換から直接生じることもあると考えられる（Ｋｌｅｉｈｕｅｓ及びＯｈｇａｋｉ、１９９７；１９９９）。
【００４７】
腫瘍壊死は、膠芽腫を退形成性星状細胞腫から区別する特有の肉眼的特徴である（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；１９９１）。特徴的で診断的な別の鏡検上の特徴は、腫瘍内の増殖性血管変化の存在である。これらの変化は、内皮細胞（血管内皮過形成または増殖）または血管壁自体の細胞（血管壁細胞増殖）で起こる可能性がある。両タイプの変化は、共に微小血管増殖と考えられることもある。膠芽腫の細胞性は、通常は非常に高い。個々の細胞は小さく、核：細胞質の比が高いこともあれば、非常に大きく、奇異で、多量の好酸性細胞質を伴うこともある。これらの同じ小細胞は、腫瘍壊死領域の周りに列を成して凝縮し、特有の偽柵構造を形成すると考えられる。膠芽腫腫瘍は、脳に広範囲に浸潤する傾向を有し、遠隔部位にまで拡散して、多巣性神経膠腫の外観を呈する。一部の例は、真に多巣性である（すなわち、複数の原発部位に同時に生じる）が、これらの多巣性腫瘍の多くは、剖検で全脳を検査すると組織学的連結を示す。
【００４８】
乏突起膠腫。星状細胞腫と同様、乏突起膠腫は、それらの推定起始細胞の組織像に類似している。これらは主に白質でも生じるが、同様の悪性グレードの星状細胞腫よりも大脳皮質に浸潤する傾向がある。星状細胞腫と同様、乏突起膠腫に対して組織学的悪性度の等級づけスキームが用いられてきたが、これらは、星状細胞腫に対して用いられるものと比べて、予後との相関性が低い（Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｂｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄａｕｍａｓ−Ｄｕｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。乏突起膠腫を等級づけるために用いられる組織学的特徴の多くは、星状細胞腫に対して用いられるものと類似している。すなわち、細胞性、多形性、有糸分裂活性、血管変化、及び壊死である。低グレード乏突起膠腫は、小嚢腫を有することがある。全ての組織学的グレードの乏突起膠腫は、容易に皮質に浸潤し、軟膜下領域、ニューロン周囲、及び血管周囲に新生物細胞のクラスターを形成する傾向がある。一般に、乏突起膠腫の細胞は丸く、規則的な核と、細胞質を明確にするはっきりした細胞質の辺縁を有する。別のかなり特有で、診断上有用な特徴は、腫瘍を別々の小葉に分けることができる「金網（ｃｈｉｃｋｅｎ−ｗｉｒｅ）」血管と呼ばれる乏突起膠腫の血管パターンである。退形成が増大するとともに、乏突起膠腫は、高度に細胞性及び多形性となり、壊死の存在を伴う多形性膠芽腫の外観に近づくことがある。これらを退形成性乏突起膠腫と分類することは正しいが、いかなる高グレード膠細胞新生物でもいったん壊死が認められれば、膠芽腫という用語を用いる者もある。退形成性乏突起膠腫を星状細胞膠芽腫から分離するための一つの根拠は、前者ではこの最も高い悪性グレードでも予後がわずかに良いことである。乏突起膠腫においてＭＩＢ−１標識指数が＞３％〜５％の場合、予後不良が予想されると報告している著者もある（Ｈｅｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｋｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｄｅｈｇｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００４９】
乏突起星状細胞腫。ほとんどではないとしても、多くの乏突起膠腫は、星状細胞腫の局所的または密接な細胞混合物を伴って発生する。混合神経膠腫の診断のために、それぞれの比率が重要であるが、厳密な数値に関しては意見が分かれている；通常は、混合神経膠腫と診断するために１０％から２５％の範囲の少数要素を含む混合物を用いる。乏突起星状細胞腫及び退形成性乏突起星状細胞腫は、それぞれＷＨＯグレードＩＩまたはグレードＩＩＩに対応する（Ｋｌｅｉｈｕｅｓ及びＣａｖｅｎｅｅ、２０００）。退形成の組織学的特徴は、いずれの成分にも存在することがあり、予後に悪い影響をおよぼすことになる。そのような特徴には、顕著な細胞性多形、高い細胞性、及び高い有糸分裂速度が含まれる。微小血管増殖及び壊死も見られることがある。予後及び治療への反応が乏突起膠と星状細胞成分との比率に依存すると示されてはいない（Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）が、逆説的に、星状細胞成分よりも乏突起膠成分のＢｒｄＵ  ＬＩによって生存が予測され（Ｗａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、はるかに進んだ腫瘍進行は、星状細胞成分によって支配される。
【００５０】
３．フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）及びテモゾロミド（ＴＭＺ）
Ａ．ＰＢＮ
化合物フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）は、１９５０年代に初めて合成されたが、１９６８年に化学反応中にフリーラジカルを捕捉して安定化させる上で非常に有用であることが明らかとなり、従ってスピントラップと命名された（Ｊａｎｚｅｎ、１９７１）。ＰＢＮはスピントラップの原型であるが、いくつかの他のニトロンが合成され、化学反応中にフリーラジカルを捕捉し、特徴づけるのに有用であることが明らかにされている。これらのスピントラップは、最初は化学反応において用いられたが、１９７０年代半ばに生化学及び生物系においてフリーラジカルを捕捉するために用いられ始めた（Ｐｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）。薬物動態研究により、ＰＢＮは容易かつ速やかに全ての組織にほとんど均等に分布し、ラットで約１３２分の半減期を有し、大部分が尿中に排出されることが判明した。行われた代謝研究は比較的少ないが、肝臓で化合物の環ヒドロキシル化（主にパラ位）が起こることが知られている。
【００５１】
Ｎｏｖｅｌｌｉは、実験動物を敗血症性ショックから保護するためにＰＢＮを用いることができることを最初に示し（Ｎｏｖｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、事実これは後に他のグループにより確認された（Ｐｏｇｒｅｂｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ＰＢＮの使用及び薬理学的物質としての誘導体化は、ＰＢＮが実験的脳卒中モデルにおいて神経保護活性を有することを示した１９８８年の発見（Ｆｌｏｙｄ、１９９０；Ｆｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）後に始まった。これらの結果は繰り返され、拡大された（Ｃｌｏｕｇｈ−Ｈｅｌｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｆｏｌｂｅｒｇｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐａｈｌｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。他の発明者らは、ＰＢＮ及び誘導体の神経保護に関する広範な薬理学調査の結果をまとめている（Ｆｌｏｙｄ、１９９７；Ｈｅｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。神経変性疾患に加えて、ＰＢＮは、糖尿病及び多くの他の状態を含む、ＲＯＳ仲介性プロセスに関与する他の病的状態において保護することが明らかにされている。なぜＰＢＮ及びその誘導体のいくつかが実験的卒中及びいくつかの他の神経変性モデルにおいて非常に神経保護的であるかのメカニズムの基礎は、まだ完全には解明されていない。しかしながら、その作用がフリーラジカルを捕捉するその能力によって単純に説明し得ないことは明らかである。
【００５２】
ＰＢＮの一般式は、
2020534322.tif 000002
であり、
式中：
Ｘは、フェニルまたは
2020534322.tif 000003
であり、
Ｒは、Ｈ、
2020534322.tif 000004
であり、
及びｎは、１〜５の整数であり；または
2020534322.tif 000005
Ｙは、一つまたは複数の位置でヒドロキシル化またはアセチル化することができるｔｅｒｔ−ブチル基；フェニル；または
2020534322.tif 000006
であり、
式中、Ｗは、
2020534322.tif 000007
またはＺであり；Ｚは、Ｃ１〜Ｃ５の直鎖もしくは分枝アルキル基である。
【００５３】
Ｂ．癌におけるＰＢＮ
米国特許第５，５６９，９０２号（参照により本明細書に組み入れられる）は、癌の治療のためのニトロンフリーラジカル捕捉剤の使用を記載している。具体的には、ＰＢＮ及び関連化合物が抗癌食の調製及びそのような補助食の調製において有用であると記載されている。ニトロンの施与を受けて有益であると考えられる対象には下記が含まれる：（１）事前腫瘍研究を受けて、腫瘍が存在する可能性が高いと示されたことがあるもの、（２）非常に強力な発癌環境に曝露され、腫瘍進行の確率が高いもの、及び（３）遺伝的素因によって腫瘍発生の見込みが高くなっているもの。
【００５４】
米国特許公開第２００７／００３２４５３号（参照により本明細書に組み入れられる）は、ＭＲＩ技術を用いて、抗炎症性フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）の神経膠腫に対する効果を記載している。ＰＢＮ自体は、腫瘍の移植前、移植時、または移植後のいずれかで対象に提供した場合、腫瘍の発生を制御することができた。従って、ＰＢＮ及び関連するニトロンフリーラジカル捕捉剤を神経膠腫の治療剤として用いることが提唱された。
【００５５】
Ｃ．２，４−ジスルホニルフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ｄｓ−ＰＢＮ）
米国特許第５，４８８，１４５号（参照により本明細書に組み入れられる）は、２，４−ジスルホニルフェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン及びその薬学的に許容される塩を記載している。これらの物質は、脳卒中において起こるような急性中枢神経系酸化にかかっている患者に、または進行性中枢神経系機能喪失として現われ得る段階的中枢神経系酸化にかかっている患者の、経口または静脈内投与に対して有用な医薬品として記載された。
2020534322.tif 000008
【００５６】
２つのスルホネート基を有する２，４−ジスルホニルＰＢＮは、水に対する溶解性の改善を示すことが予想されたが、その疎油的な（ｌｉｐｏｐｈｏｂｉｃ）特性のために、血液／脳関門を越えて輸送されにくいことを示すこともまた予想された。しかしながら、本発明の化合物を製造し、インビボで研究すると、本発明の化合物は、ＰＢＮと比較して予期しない薬効の増大を示した。この薬効の増大は、ＰＢＮと比較して効力の増大と共に生じた。この効力及び薬効の著しい増大とは全く対照的に、ＰＢＮと比較して著しいかつ非常に大きな毒性の減少があった。
【００５７】
これらの結果は予想されなかった。なぜなら、特定の定義された化合物の一群内における構造／活性の関係の一般文献においては、治療的効力は、代表的には、毒性と共に共変化するからである。従って、大部分の関連化合物は、治療的効力対毒性の比を維持している。対照的に、密接に関連するアナログに対してその効力が増大し、かつその毒性が減少した場合、本発明の化合物は、この予想される関係から逸脱する。
【００５８】
従って、一態様では、本発明は、ＰＢＮ−ジスルホニル化合物及びその薬学的に許容される塩を提供する。第２の態様では、本発明は、活性成分として、この化合物またはその塩を有する、静脈内及び経口投与可能な薬学的組成物を提供する。
【００５９】
２，４−ｄｓ  ＰＢＮは、高いｐＨでは、イオン化した塩の形態で存在し得る：
2020534322.tif 000009
または
2020534322.tif 000010
ここで、Ｘは、薬学的に許容されるカチオンである。最も一般的には、このカチオンは、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのような一価の物質であるが、これはまた、多価のみ、または薬学的に許容される一価のアニオンと組み合わせた多価カチオン、例えば、クロライド、ブロマイド、ヨーダイド、ヒドロキシル、ニトレート、スルホネート、アセテート、タルトレート、オキサレート、スクシネート、パルモエートなどのアニオンとのカルシウム；このようなアニオンとのマグネシウム；このようなアニオンとの亜鉛などでもあり得る。これらの多価カチオンと一価アニオンとの組み合わせが、構造式中に示される場合、本明細書中では、一価アニオンは、「Ｙ」と特定される。
【００６０】
これらの物質の中で、遊離酸及びナトリウム単塩、カリウム単塩またはアンモニウム単塩が最も好ましく、カルシウム塩及びマグネシウム塩もまた、上記単塩より幾分よくないが、好ましい。
【００６１】
２，４−ｄｓ  ＰＢＮは、２工程の反応系列により調製され得る。第１工程においては、市販のｔｅｒｔ−ブチルニトレート（２−メチル−２−ニトロプロパン）を、活性化亜鉛／酢酸触媒またはアルミニウム／水銀アマルガム触媒のような適切な触媒を用いて、対応するｎ−ヒドロキシルアミンに変換する。この反応は、０．５〜１２時間、特に、約２〜６時間ぐらいで、約１５〜１００℃の温度にて、液体反応媒質（例えば、亜鉛触媒の場合、アルコール／水混合液、またはアルミニウムアマルガム触媒の場合、エーテル／水混合液）中で行われ得る。
【００６２】
第２工程においては、新たに形成されたヒドロキシルアミンを、４−ホルミル−１，３−ベンゼンジスルホン酸と、代表的にはアミンをわずかに過剰に用いて反応させる。この反応は、同様の温度条件で行われ得る。この反応は、一般に、１０〜２４時間で完了する。
【００６３】
このように形成される生成物は、遊離酸であり、８９ｇ／モルの分子量により特徴付けられる。この生成物は、白色粉末状物質であり、加熱すると分解する。この生成物は、１ｇ／ｍｌより大きい水溶解性を示すこと、及びＤ２Ｏ中での１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが、８．０４８ｐｐｍ（ｄｄ，８．４，１．７Ｈｚ）；８．８３６ｐｐｍ（ｄ，８．４Ｈｚ）；８．８３９ｐｐｍ（ｄ，１．７Ｈｚ）；８．７７４ｐｐｍ（ｓ）に表れることにより特徴付けられる。
【００６４】
水性媒質に溶かした遊離酸を２当量の適切な塩基（例えば、カリウム塩についてはＫＯＨなど）と混合することにより、様々な塩が容易に形成され得る。
【００６５】
一つの合成は、Ｒ．Ｈ．Ｈｉｎｔｏｎ及びＥ．Ｇ．Ｊａｎｚｅｎ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ  ｈｅｍ．５７：２６４６−２６５１，１９９２）による研究に基づく。これは、アルデヒドとヒドロキシルアミンとの縮合を包含する。ヒドロキシルアミンは、不安定であり、活性化亜鉛触媒を用いて、使用する日に新しく調製される。合成は、以下の通りである。
【００６６】
（表１）必須の化学物質
１．９５％エタノール
２．２−メチル−２−ニトロプロパン
３．亜鉛末
４．氷酢酸
５．ジエチルエーテル
６．飽和塩化ナトリウム
７．硫酸マグネシウム、無水固形物
８．４−ホルミル−１，３−ベンゼンスルホン酸（分子量３１０．２１ｇ／モル）、二ナトリウム塩、水和物
９．メタノール
１０．ジクロロメタン
【００６７】
（表２）Ｎ−ｔ−ブチルヒドロキシルアミンの調製
１．５００ｍL用の３つ口丸底フラスコに、磁気撹拌子、温度計アダプター、温度計、及び滴下漏斗を取り付ける。
２．９５％エタノール（３５０ｍL）をフラスコに加え、氷浴中で１０℃まで冷却した。
３．２−メチル−２−ニトロプロパン（６．１８ｇ、０．０６０モル）、及び亜鉛末（５．８９ｇ、０．０９０モル）を一度に加えた。
４．氷酢酸（１０．８ｇ、０．１８０モル）を滴下漏斗に入れ、激しく撹拌しながら、温度を１５℃未満に維持するような速度で滴下した。
５．氷浴を外し、混合物を３時間室温で撹拌した。
６．溶媒を混合物から除去して、ｔ−ブチルヒドロキシルアミン、酢酸亜鉛及び水が残った。
７．ジクロロメタン（５０ｍL）を加え、混合物をブフナー漏斗を通して濾過した。
８．濾紙上に残った硫酸亜鉛ケーキを２×２５ｍLのジクロロメタンで洗浄した。
９．水を分液漏斗中で濾液から分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。
１０．硫酸マグネシウムをひだ付き（ｆｌｕｔｅｄ）濾紙を通して濾過することにより除去し、次いでジクロロメタンをロータリーエバポレーションにより除去した。
１１．生成物（収率１００％＝５．３４グラム）（粘性液）を、以下で使用するためにメタノール（５０ｍL）に溶解した。
【００６８】
（表３）２，４−ジスルホニルフェニル−Ｎ−ｔ−ブチルニトロンの調製
１．２５０ｍL用の３つ口丸底フラスコに、撹拌子、ガス分散チューブ、滴下漏斗、及び氷水の再循環により冷却されるフリードリッヒ冷却器を備え付けた。
２．フラスコに、２００ｍLのメタノール、４−ホルミル−１，３−ベンゼンジスルホン酸（９．３１ｇ、３０ミリモル）及びＮ−ｔ−ブチルヒドロキシルアミン（Ａの部で得た２５ｍLのメタノール溶液、理論上３０ミリモル）を加えた。
３．反応物を撹拌して窒素で泡立てさせながら、反応物を加熱用マントルで加熱して還流した。
４．混合物を２時間還流した。
５．上で得たヒドロキシルアミンの残りを加えた。
６．窒素で泡立てさせながら、少なくとも１８時間（ただし、２４時間以下）還流を続けた。
７．熱い反応混合物をブフナー漏斗で濾過し、固体を熱メタノールで洗浄した。
８．メタノールをロータリーエバポレーションにより除去して、黄色で粘性のある油状物を得た。
９．熱い１：１のエタノール：アセトン（２００ｍＬ）を加え、混合物を加熱して油状物を溶解させた。
１０．溶液を冷却して、生成物を結晶化させた。
１１．生成物をブフナー漏斗上で集め、真空下で一晩乾燥した。
１２．この反応は、代表的には、７５％収率の白色粉末を与える。
【００６９】
合成の他の方法は、従来技術でも開示されている。
【００７０】
Ｄ．テモゾロミド
テモゾロミド（ＴＭＺ；ブランド名Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）及びＴｅｍｏｄａｌ（登録商標）及びＴｅｍｃａｄ（登録商標））は、経口化学療法薬である。テモゾロミドは、いくつかの脳癌の治療として；星状細胞腫の二次治療として、及び多形神経膠芽腫の一次治療として使用されるアルキル化剤である。ＴＭＺは、アルキル化剤であるダカルバジンのプロドラッグ及びイミダゾテトラジン誘導体である。その承認適用には、ニトロソウレア−及びプロカルバジン−難治性退形成性星状細胞腫、及び新たに診断された多形神経膠芽腫が含まれる。ＴＭＺは、１９９９年８月から米国で、２０００年代初期から他の国々で入手可能になっている。
【００７１】
ＴＭＺからの最も一般的な副作用は、骨髄抑制である。テモゾロミドに関連する最も一般的な非血液学的副作用は、悪心及び嘔吐であり、これらは、自然に治るかまたは標準制吐療法で容易に制御される。これらの後者の効果は、通常、軽度から中等度（グレード１〜２）である。重度の悪心及び嘔吐の発生率は、各々約４％である。重度の嘔吐の既往または経歴を有する患者は、テモゾロミド治療を開始する前に制吐療法を必要とし得る。テモゾロミドは、絶食状態で、食事の少なくとも１時間前に投与すべきである。制吐療法は、テモゾロミドの投与前または投与後に投与してもよい。テモゾロミドは、その成分またはダカルバジンに対して過敏症な患者では禁忌である。テモゾロミドの使用は、重度の骨髄抑制を有する患者には推奨されない。テモゾロミドの標準経口用量は、１日あたり１５０ｍｇ／ｍ２で、維持のために１日あたり２００ｍｇ／ｍ２に増加される。低レベルは、標準用量以下であり、例えば、１２５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、または５０ｍｇ／ｍ２であろう。
【００７２】
テモゾロミドは、遺伝毒性、催奇形性及び胎児毒性であり、妊娠中に使用すべきではない。授乳中の女性は、母乳への分泌のリスクがあるため、薬物を受けながらの授乳を中止すべきである。ある研究では、付随する妊孕性温存対策をせずにテモゾロミドを服用した女性は、晩年における妊娠率が下がることを示したが、テモゾロミドが女性不妊のリスクをもたらすという仮説における統計的有意性は、研究が少なすぎて示されなかった。男性患者では、テモゾロミドは、遺伝毒性効果を有し得る。男性は、治療中または治療後最長で６ヵ月間は子供をもうけないことが勧められ、かつ、テモゾロミド治療による不可逆的な不妊の可能性があるため、治療前に精子を凍結保存する助言を求めることが勧められる。非常にまれであるが、テモゾロミドは、急性呼吸不全または肝損傷を引き起こし得る。
【００７３】
テモゾロミドの治療的利益は、ＤＮＡをアルキル化／メチル化する能力に依存し、ＤＮＡのアルキル化／メチル化は、最も頻繁に、グアニン残基のＮ−７またはＯ−６の位置に生じる。このメチル化はＤＮＡを傷つけ、腫瘍細胞の死を引き起こす。しかしながら、いくつかの腫瘍細胞は、Ｏ−６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子によってヒトでコードされたタンパク質であるＯ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を発現することによって、この種のＤＮＡ損傷を修復することが可能であり、それゆえテモゾロミドの治療効力を減少しかねない。いくつかの腫瘍では、ＭＧＭＴ遺伝子の後成的なサイレンシングは、この酵素の合成を防ぎ、結果的にこのような腫瘍は、テモゾロミドによる死滅に対してより敏感になる。反対に、脳腫瘍におけるＡＧＴタンパク質の存在は、テモゾロミドへの乏しい反応を予測し、これらの患者は、テモゾロミドによる化学療法からほとんど利益を受けない。
【００７４】
試験室研究及び臨床研究は、テモゾロミドを他の薬理学剤と併用することによって、テモゾロミドの抗癌効力を増加させる可能性について調査した。例えば、臨床研究は、クロロキンの追加が神経膠腫患者の治療に有益であり得ることを示した。試験室研究は、緑茶の成分である没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）を追加した場合に、テモゾロミドが脳腫瘍細胞をより効率的に殺傷することを見つけたが；しかしながら、この効果の有効性は、脳腫瘍患者においてまだ確認されていない。前臨床研究は、テモゾロミドと放射線療法を併用した場合の新規の酸素拡散増強化合物トランスクロセチン酸ナトリウム（ＴＳＣ）の使用における調査について２０１０年に報告し、臨床研究は、２０１５年８月の時点で進行中であった。
【００７５】
上述のアプローチは、テモゾロミドと他の薬剤の組み合わせが治療結果を改善し得るかどうかについて調査した一方、テモゾロミド分子自体を変化させることでその活性を増すことができるかどうかについて研究する努力も始まっている。１つのそのようなアプローチは、ペリリルアルコール（脳癌患者における治療活性が実証された天然化合物）をテモゾロミド分子に恒久的に縮合させた。得られた新規化合物（ＮＥＯ２１２またはＴＭＺ−ＰＯＨと呼ばれる）は、その２つの親分子、テモゾロミド及びペリリルアルコールのいずれかのものよりも有意に大きい抗癌活性が判明した。２０１６年の時点で、ＮＥＯ２１２は、ヒトで研究されていないが、神経膠腫、黒色腫、及びトリプルネガティブ乳癌の脳転移の動物モデルにおいて優れた癌治療活性を示した。
【００７６】
ＭＧＭＴ遺伝子を発現する腫瘍細胞は、テモゾロミドの効果に対して、より耐性があるため、研究者らは、ＡＧＴ阻害剤であるＯ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）の包含が、この耐性を克服し、薬物の治療効果を改善することができたがどうかを調査した。実験室では、この組み合わせは、インビトロの腫瘍細胞培養及びインビボの動物モデル中のテモゾロミド活性の増加を確かに示した。しかしながら、脳腫瘍患者の最近完了したフェーズＩＩ臨床研究は、入り交じった結果を生じた；テモゾロミド耐性退形成性神経膠腫を有する患者にＯ６−ＢＧ及びテモゾロミドを与えた場合に治療活性のいくらかの改善があった一方、テモゾロミド耐性退形成性神経膠腫を有する患者におけるテモゾロミド感受性の有意な回復はないようであった。
【００７７】
４．併用治療
一実施形態では、２，４−ｄｓ−ＰＢＮ療法（ＴＭＺを任意に含む）を、放射線、ＰＣＶ、ＤＦＭＯ、ＣＣＮＵまたはＢＣＮＵなどの別の神経膠腫療法との組み合わせで用いてもよい。これらの組成物は、細胞を死滅させる、または細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供される。このプロセスは、細胞を薬剤に同時に接触させることを含み得る。これは、細胞を両方の薬剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と接触させることにより、または一方の組成物は２，４−ｄｓ−ＰＢＮを含み、他方は第二の薬剤を含む、二つの別々の組成物もしくは製剤と同時に細胞を接触させることにより達成され得る。
【００７８】
あるいは、２，４−ｄｓ−ＰＢＮ療法を、他の薬剤治療の前または後に、数分から数週間の間隔で行ってもよい。他の薬剤及び２，４−ｄｓ−ＰＢＮを、細胞、組織または生物に別々に適用する実施形態では、一般にこれらの薬剤が細胞に対して有利に組み合わせた効果を発揮することができるよう、それぞれの送達時の間にあまり時間が経過しないよう確認することになる。そのような場合、細胞を両方の様式と互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に接触させることができることが企図される。しかしながら、いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過している場合、治療期間を大幅に延長することが望ましいこともある。
【００７９】
各薬剤の複数回投与が企図される。例えば、２，４−ｄｓ−ＰＢＮ療法（ＴＭＺまたは他のＡＧＴ阻害剤を任意に含む）が「Ａ」であり、第二の薬剤または療法が「Ｂ」である場合、下記が企図される。
2020534322.tif 000011
【００８０】
患者を、腫瘍とは無関係と考えられる神経学的変化について評価し、ＮＣＩ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（神経毒性）を用いて等級づけることになる。基準の聴力研究の他に、神経学的検査によって聴力損失または聴力損失進行の徴候を有する患者に対し、聴器毒性に関する繰り返し聴力研究を医師の自由裁量で行う。加えて、血球数算定を隔週で行い、血清クレアチニン、アルカリ性ホスファターゼ、ビリルビン及びアラニンアミノトランスフェラーゼ研究を各周期の前に行う。用量は、主に好中球及び血小板数（ビンクリスチン、ロムスチン及びマチュレーン）または聴器毒性（ＤＦＭＯ）に基づき、治療経過中に変更してもよい。時として、下痢のためにＤＦＭＯの用量低下が必要となる。
【００８１】
Ａ．ＰＣＶ
ＰＣＶは、次の三つの異なる薬剤を用いる薬物併用療法である：ヒドラジン誘導体であるマチュレーン、ニトロソウレアであるロムスチン、及びチューブリン相互作用剤であるビンクリスチン。これは、多くの臨床研究で、特に発明者によって、高グレード神経膠腫及び髄芽腫腫瘍に対するその効果を評価する際に用いられている。ＰＣＶで観察される主な副作用は、用量を制限する骨髄毒性であった。ＰＣＶの各成分を以下に記載する。
【００８２】
本発明は、両方ともニトロソウレアであるため、ＣＣＮＵ（ロムスチン）ではなくＢＣＮＵの使用を含み得ることに留意すべきである。ビンクリスチンは通常、ＰＣＶの組み合わせにおける最も活性の低い薬物と考えられるため、ビンクリスチンなしでＣＣＮＵとプロカルバジンまたはＢＣＮＵとプロカルバジンを用いることができることも企図される。
【００８３】
ヒドラジンとニトロソウレアはいずれもアルキル化剤である。グループとして、アルキル化剤は、細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質分子、並びに、より小さいアミノ酸、グルタチオン及び類似の化学物質との共有結合による化学付加物を形成する。一般に、これらのアルキル化剤は、核酸、タンパク質、アミノ酸、またはグルタチオンにおけるアミノ、カルボキシル、ホスフェート、スルフヒドリル基などの、細胞成分中の求核原子と反応する。癌療法におけるこれらのアルキル化剤のメカニズム及び役割はあまり理解されていない。ヒドラジン及びニトロソウレアに加えて、アルキル化剤には下記が含まれる：ダカラブジン及びテモゾロミドなどのトリアゼン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホネートエステル；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシン及びアルトレテミンなどの生体内還元アルキレーター。これらの化合物のいずれかを本発明の化合物との組み合わせで、一緒にまたは個別に用いてもよい。
【００８４】
ｉ．ヒドラジン及びトリアゼン誘導体
ヒドラジン及びトリアゼン誘導体は自然に分解するか、または代謝されてＤＮＡをアルキル化するアルキルカルボニウムイオンを生じる点で、ニトロソウレアと類似である。このクラスの化合物には、マチュレーン、ダカルバジン及びテモゾロミドが含まれる。
【００８５】
マチュレーン中の活性成分は、塩酸プロカルバジン（Ｎ−イソプロプル−アルファ−（２−メチルヒドラジノ）−ｐ−トルアミド一塩酸塩）である。これは、Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。これは、１９６９年にホジキン病の治療用に認可された。典型的形状は、プロカルバジンを塩酸塩で５０ｍｇ含む経口カプセル剤である。用量は、プロカルバジンが他の抗癌薬との併用薬物として用いられるか、または単一の治療剤として用いられるかに応じて変動する。単剤のためにＰＤＲによって示唆される指針は、１００ｍｇを１日２回１４日間である。
【００８６】
マチュレーンの厳密な作用機作は不明である。薬物がタンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡ合成の阻害により作用するとのいくつかの証拠がある。これは、主に肝臓及び腎臓で代謝され、自己酸化されて過酸化水素の放出を伴ってアゾ誘導体になると思われる。アゾ誘導体は、ヒドラゾンへと異性体化し、加水分解の後、ベンジルアルデヒド誘導体とメチルヒドラジンとに分裂する。メチルヒドラジンは、ＣＯ２及びＣＨ４と、おそらくはヒドラジンにさらに分解する一方で、アルデヒドは、酸化されて酸になり、尿中に排出される。
【００８７】
マチュレーンは、モナミンオキシダーゼ阻害活性（ＭＡＯＩ）を示し、従って高チアミン含量を含む食物を制限する食事療法に従うべきである。治療中に避けるべき薬物には、抗ヒスタミン剤、交感神経興奮剤、バルビツレート、麻酔薬、降圧剤またはフェノチアジン、及びエチルアルコールが含まれる。自然熟成チーズ、チョコレート、ナッツ、及びバナナなどの一部の食品は、理論的には一部の患者で高血圧性合併症を引き起こす可能性があるため、これらもプロカルバジン中は避けるべきである。また、マチュレーンを腎及び／または肝機能不全を有する患者で用いると、許容されない毒性が起こることがある。感覚異常、神経障害または錯乱；好中球減少（絶対好中球数が１５００／ｕｌ未満）、血小板減少（血小板が１００，０００／ｕｌ未満）、過敏性反応、口腔周囲の潰瘍形成または持続性疼痛点、下痢または軟便、出血または出血傾向などの中枢神経系の徴候または症状の事象においては、治療を短縮してもよい。
【００８８】
有害であるが、予想される反応には、白血球減少、好中球減少、貧血、及び血小板減少が含まれる。よく報告される急性副作用は、投与中または投与直後の悪心及び嘔吐である。
【００８９】
ｉｉ．ニトロソウレア
ニトロソウレアは、治療用アルキル化剤の一群である。このクラスの化合物には、ロムスチン、カルムスチン、セムスチン、ステプトゾシン、及びニムスチンが含まれる。
【００９０】
（ａ）ロムスチン
ロムスチンは、ＣＣＮＵとしても知られる合成アルキル化剤で、１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソウレアなる化学名を有する。これは、１９７７年に脳腫瘍及びホジキン病の治療用に認可された。これは、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから経口カプセル剤として、１０ｍｇ、４０ｍｇ及び１００ｍｇの剤形で入手可能である。用量は、ロムスチンが単剤として用いられるか、または他の化学療法剤に加えての併用で用いられるかに応じて変動してもよい。過去に未治療の患者における単剤として、ＰＤＲによって推奨される用量は、１回経口用量として１３０ｍｇを６週間に１回である。ロムスチンは、血液脳関門を通過する。
【００９１】
ＣＣＮＵは、ＤＮＡ及びＲＮＡをアルキル化すると考えられる。これは、他のニトロソウレア及び全てではないがいくつかのアルキル化剤と交差耐性である。これは、タンパク質中のアミノ酸のカルバモイル化により、いくつかの主要な酵素プロセスも阻害することができる。
【００９２】
最も一般的で重度の毒性副作用は、血小板減少及び白血球減少を引き起こす骨髄抑制で、これは、出血及び感染に寄与し得る。骨髄毒性は蓄積性であり、従って以前の用量に由来する底血算値に基づき、用量調節を考慮しなければならない。
【００９３】
（ｂ）カルムスチン
カルムスチンは、ＢＣＮＵとしても知られ、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソウレアなる化学名を有するニトロソウレアアルキル化剤で、ＦＤＡにより１９７７年に認可された。カルムスチンは、原発性脳腫瘍の治療用に長年用いられており、神経膠腫の治療に用いられている。カルムスチンは、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから、ｉ．ｖ．注射による送達用の１０ｍｇカルムスチン及び３ｍｌ滅菌希釈剤のバイアルを含むパッケージで入手可能である。単剤として、カルムスチンは、約１５０〜２００ｍｇ／ｍ２を６週間に１回投与する。併用療法では、カルムスチンは、ロムスチンと類似の用量で投与してもよい。送達の代替様式は、腫瘍部位に直接埋め込んだウェーファー（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）Ｗａｆｅｒ）によるものである。
【００９４】
可能性のある副作用には、骨髄抑制、貧血、下痢、低白血球及び血小板数、肺毒性並びに嚥下困難が含まれる。
【００９５】
ｉｉｉ．チューブリン相互作用剤
チューブリン相互作用剤は、重合して細胞微小管を形成するタンパク質であるチューブリンの特定の部位に結合することにより細胞分裂を妨害する。微小管は、重要な細胞構造単位である。相互作用剤がタンパク質上に結合すると、細胞は、適切に微小管を形成することができない。チューブリン相互作用剤には、いずれもアルカロイドであるビンクリスチン及びビンブラスチン、並びにパクリタキセル及びドセタキセルなどのタキサンが含まれる。
【００９６】
ビンクリスチンは、Ｏｎｃｏｖｉｎ（商標）としてＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙから、また硫酸ビンクリスチンとしてＦａｕｌｄｉｎｇから入手可能である。同様にビンカロイコブラスチンと呼ばれるのは、一般的な顕花草本、ツルニチニチソウから得たアルカロイドの塩である、２２−オキソ−、硫酸塩（１：１）（塩）である。これは、静脈内注射により送達する。これは、１９６３年にユーイング肉腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、ホジキン病及び白血病用に認可された。
【００９７】
作用機作は調査中である；しかしながら、分裂細胞の中期での停止をきたす、紡錘体における微小管形成の阻害が関与することが示されている。肝臓は、主要な排出臓器である。ビンクリスチンの静脈内用量のほとんどは速やかに組織結合した後、胆汁中に排出される。ビンクリスチンは、血液脳関門を通過しないと考えられる。
【００９８】
ビンクリスチンは、抗発作薬の血中レベルを低下させ、発作活性を高めると報告されている。最も一般的な有害反応は、脱毛である。白血球減少、神経炎性疼痛及び便秘が起こるが、通常は７日未満である。
【００９９】
Ｂ．ＤＦＭＯ
多くの高増殖型の癌は、腫瘍組織並びに癌を有する哺乳動物の血液及び尿中のポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、及びスペルミンのレベル上昇に関連する。研究により、これは、律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によるポリアミン合成増大に関連し得ることが示されている。ポリアミン合成の経路は、Ｌ−オルニチンにより始まる。この天然アミノ酸は、通常はタンパク質に取り込まれないが、アルギニンをオルニチンと尿素に代謝する尿素回路の一部である。オルニチンは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によりプトレシンとＣＯ２に変換され、ポリアミン生成における律速段階であると考えられる。Ｓ−アデノシルメチオニンから供与されたプロピルアミンの付加により、プトレシンはスペルミジンに変換される。次いで、スペルミジンは、ここでもＳ−アデノシルメチオニンの脱炭酸に関連して、スペルミンシンセターゼによりスペルミンに変換される。プトレシン、スペルミジン及びスペルミンは、哺乳動物組織における三つの主要なポリアミンである。ポリアミンは、動物組織及び微生物で見いだされ、細胞成長及び増殖において重要な役割を果たすことが知られている。細胞成長及び増殖におけるポリアミンの役割の厳密なメカニズムは不明であるが、ポリアミンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質合成などの高分子プロセスを促進することができると思われる。ポリアミンレベルは、精巣、腹側前立腺、及び胸腺、乾癬皮膚病巣、並びに急速な成長過程にある他の細胞中で高いことが公知である。
【０１００】
腫瘍組織の急速な増殖は、ポリアミンレベルの異常な上昇により示されることも周知である。従って、ポリアミンは、腫瘍成長の維持においても重要な役割を果たすと考えられる。従って、ＤＦＭＯなどのＯＤＣ阻害剤は、ポリアミンの生成を阻止し、それにより腫瘍組織の増殖及び転移を減速する、妨害する、または停止することによりそれらの治療効果を発揮すると考えられる。
【０１０１】
ＤＦＭＯ（α−ジフルオロメチルオルニチン、エフロールニチン、Ｏｒｎｉｄｙｌ（登録商標））は、アミノ酸Ｌ−オルニチンの構造類縁体で、化学式Ｃ６Ｈ１２Ｎ２Ｏ２Ｆ２を有する。ＤＦＭＯは、本発明の方法においてＤ−及びＬ−鏡像異性体のラセミ（５０／５０）混合物として、またはＬ−異性体に対してＤ−異性体が多い、例えば、Ｌ−異性体に対して７０重量％、８０重量％、９０重量％もしくはそれ以上のＤ−異性体を含む、Ｄ−及びＬ−異性体の混合物として用いることができる。用いるＤＦＭＯは、実質的にＬ−鏡像異性体を含まなくてもよい。
【０１０２】
ＤＦＭＯの用量を制限する毒性作用は、患者の約５０％に起こる血小板減少（血中の血小板が異常に少ない）、白血球減少（白血球が異常に少ない）、または貧血である。この毒性作用は、比較的無害かつ可逆性であり、薬物停止後に消失する。
【０１０３】
急速に増殖している腫瘍組織の成長速度制御に対するＯＤＣ阻害剤の効果が、標準的な動物腫瘍モデルで評価されている。例えば、ＤＦＭＯの抗腫瘍効果は、以下の動物腫瘍モデルで示されている：マウスのＬ１２１０白血病、Ｂａｌｂ／ＣマウスのＥＭＴ６腫瘍、ラットの７，１２−ジメチルベンズアントラセン誘導性（ＤＭＢＡ誘導性）乳房腫瘍及びＢｕｆｆａｌｏラットのＤＦＭＯ  Ｍｏｒｒｉｓ  ７２８８Ｃまたは５１２３肝癌。加えて、様々な細胞毒性物質と併用してのＤＦＭＯの抗腫瘍効果が以下のとおりに示されている：（ａ）マウスのＬ１２１０白血病、ＢｕｆｆａｌｏラットのＭｏｒｒｉｓ  ７２８８Ｃ肝癌、及びマウスのＥＭＴ６腫瘍におけるビンデシンまたはアドリアマイシンとの併用、（ｂ）マウスのＬ１２１０白血病におけるシトシンアラビノシドとの併用、（ｃ）マウスのＬ１２１０白血病におけるメトトレキセートとの併用、（ｄ）マウスのＥＭＴ６腫瘍及びマウスのＤＭＢＡ誘導性腫瘍におけるシクロホスファミドとの併用、（ｅ）マウス神経膠腫２６脳腫瘍におけるＢＣＮＵとの併用、及び（ｆ）マウスのＬ１２１０白血病、ＢｕｆｆａｌｏラットのＭｏｒｒｉｓ  ７２８８Ｃ肝癌、マウスのＰ３８８リンパ球性白血病、及びマウスのＳ−１８０肉腫におけるＭＧＢＧとの併用。
【０１０４】
ＤＦＭＯは、腫瘍のプトレシン生合成を効果的に阻止することができるが、その結果としての抗腫瘍効果は、細胞毒性ではなく細胞分裂停止である。例えば、ＤＦＭＯは、ＭＣＡ肉腫の成長速度を低下させるが、腫瘍退縮は起こさない。この知見は、ＤＦＭＯが細胞分裂抑制剤であることを示した他の研究者の報告と一致している。しかしながら、研究から、ＤＦＭＯ剤には、ＤＦＭＯを組み込む併用化学療法の今後の開発を可能にする、重要な役割が存在し得ることが明らかである。
【０１０５】
米国特許第４，９２５，８３５号に記載のとおり、ＤＦＭＯは、実際ＯＤＣ活性を不可逆的に阻害するが、インビボでＤＦＭＯ処理した細胞は、外因性プトレシンの取り込みを著しく高めるため、様々な新形成の治療において用いるための治療用ＯＤＣ阻害剤としてのＤＦＭＯの当初の見込みは、幾分薄くなっている。細胞の細胞間輸送メカニズムは、細胞外環境からプトレシンを移入することにより、ＤＦＭＯによるＯＤＣ活性損傷を「巧みに回避」する。従って、インビボでのＤＦＭＯの効果は、インビトロよりもはるかに低い。従って、ＤＦＭＯ処理は、細胞内プトレシン新生を効果的に阻害するが、同時に細胞外プトレシンの取り込みを高め、それによりそのＯＤＣ阻害作用を相殺することになる。
【０１０６】
この問題は、プトレシンがグレープフルーツ果汁（約４００ｐｐｍのプトレシンを含む）などの多くの一般的食品中に存在するという事実によって倍加される。これにより、プトレシンを含まない栄養的に十分な食事を患者に提供することは実質的に不可能となる。従って、ＤＦＭＯ処理細胞は、細胞分裂を支持するために十分な量の細胞外プトレシンを移入することができる。
【０１０７】
ＤＦＭＯをヒト患者に対してより許容されるようにする戦略が、米国特許第４，８５９，４５２号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。ＤＦＭＯ誘導性毒性の低下を助けるための、必須アミノ酸をアルギニンまたはオルニチンのいずれかとの組み合わせで含むＤＦＭＯの製剤が記載されている。
【０１０８】
Ｃ．Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ阻害剤
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）は、テモゾロミドなどの阻害薬の標的である。他のＡＧＴ阻害剤も、本開示の方法に従って、有用であると証明され得る。
【０１０９】
Ｄ．放射線
ＤＮＡ損傷を引き起こし、癌療法に大々的に用いられており、γ線として一般に知られているもの、Ｘ線、及び／または放射性同位体の腫瘍細胞に向けた送達を含む因子。マイクロ波及びＵＶ照射などのＤＮＡ損傷因子の他の形態も企図される。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の組立及び維持に対し広範囲の損傷を与えると考えられる。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる１日線量５０〜２００レントゲンから１回線量２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射性同位体の線量範囲は多様で、同位体の半減期、放出される放射線の強度及びタイプ、並びに新生細胞による取り込みに依存する。細胞に適用する場合の「接触（した）」及び「曝露（された）」なる用語は、本明細書において治療的作成物及び化学療法もしくは放射線療法剤を標的細胞に送達する、または標的細胞の直接近位に置くプロセスを記載するために用いる。細胞死滅または停止を達成するために、両方の薬剤を、細胞を死滅させる、または細胞分裂を防止するのに有効な組み合わせ量で細胞に送達する。
【０１１０】
Ｅ．手術
癌を有する人の約６０％は、何らかのタイプの手術を受けることになり、これには、予防的、診断的または病期決定、治癒的及び待機的手術が含まれる。癌治療としての治癒的手術を、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法などの他の治療法と組み合わせて用いてもよい。治癒的手術には、癌性組織の全てまたは一部を、物理的に除去、摘出、及び／または破壊する切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を意味する。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、冷凍外科術、電気外科術、及び鏡検制御手術（モース氏手術）が含まれる。本発明を表在性癌、前癌、または正常組織の付帯的量の除去と組み合わせて用いることができることがさらに企図される。
【０１１１】
５．リポ多糖結合タンパク質
Ａ．ＬＢＰ
リポ多糖結合タンパク質は、ＬＢＰ遺伝子によってコードされる、ヒト中のタンパク質である。ＬＢＰは、細菌性リポ多糖（またはＬＰＳ）に結合して、ＣＤ１４及びＴＬＲ４と呼ばれる重要な細胞表面パターン認識受容体にＬＰＳを提示することによって免疫応答を惹起する、可溶性急性期タンパク質である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、グラム陰性細菌感染に対する急性期免疫反応に関与する。グラム陰性菌は、その外細胞壁に、糖脂質、リポ多糖（ＬＰＳ）を含む。殺菌性透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）と一緒に、このコードされたタンパク質は、ＬＰＳに結合し、ＣＤ１４受容体と相互作用し、おそらくはＬＰＳ依存性単球応答の調節に役割を果たす。マウスの研究は、このコードされたタンパク質がＬＰＳに対する急速な急性期反応には必要であるが、循環からのＬＰＳクリアランスには必要ないことを示唆している。このタンパク質は、ＢＰＩ、血漿コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）、及びリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）を含む、構造的かつ機能的に関連するタンパク質のファミリーの一部である。この遺伝子は、ＢＰＩ遺伝子のすぐ下流の第２０染色体上に見られる。リポ多糖結合タンパク質は、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び補助受容体ＭＤ−２と相互作用することが示されている。
【０１１２】
Ｂ．ＬＢＰ複合体及びイメージング
本発明者らによって本明細書で最初に報告されたように、ＬＢＰレベルは、低グレードの神経膠腫として分類された腫瘍と比較して、高グレードのヒト患者神経膠腫で上昇する。従って、本明細書で開示される診断方法に従って使用されるＬＢＰ複合体は、蛍光標識、放射性標識及びイメージング剤に連結したＬＢＰの診断複合体が含まれる。これらの複合体は、対象に投与することができ、体内、特に、神経膠腫部位での存在は、ハンドヘルド蛍光スキャナー、近赤外スキャナー、ＭＲＩデバイス、及びＰＥＴスキャナーを用いて決定することができる。このアプローチは、治療の効果を監視するために使用することもでき、ＬＢＰレベルの低下は、治療的利益を示す。
【０１１３】
６．薬学的製剤
本発明は、多くの組成物を開示しており、これらを、本発明のある特定の態様において動物に投与する。例えば、２，４−ｄｓ−ＰＢＮ、並びに様々な二次的化学療法剤は、投与用に製剤される。臨床適用が企図される場合、これらの化合物の薬学的組成物及び所期の用途に適した剤形の組成物を調製することが必要となる。一般に、これは発熱物質、並びにヒトまたは動物に有害である可能性のある他の不純物を基本的に含まない組成物の調製を必要とする。
【０１１４】
薬剤を患者に導入するのに適したものとするため、一般には適当な塩及び緩衝剤を用いることが望まれる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒質に溶解または分散した薬剤の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」なる語句は、動物またはヒトに投与した場合に、有害、アレルギー性、または他の都合の悪い反応を生じない分子実体または組成物を意味する。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」には、任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒質及び物質の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または物質が本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除き、治療的組成物におけるその使用が企図される。他の抗癌剤などの補足的活性成分も組成物に組み込むことができる。
【０１１５】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性成分の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合した水中で調製することができる。分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、その混合物及び油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。静脈内媒体は、液体及び栄養補充物を含む。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスが含まれる。薬剤中の様々な成分のｐＨ及び厳密な濃度を周知のパラメーターにより調節する。
【０１１６】
薬剤の有効量は、所期のゴールに基づいて決定される。「単位用量」なる用語は、対象において用いるのに適した物理的に分離している単位であって、それぞれその投与、すなわち適当な経路及び治療法に関連して所望の反応を生じるよう計算された、あらかじめ決められた量の治療組成物を含む単位を意味する。治療数及び単位用量の両方に従って投与する量は、治療する対象、対象の状態、及び望まれる保護に依存する。治療組成物の正確な量は、医師の判断にも依存し、各個人に特有である。
【０１１７】
Ａ．腸内投与
本発明の活性化合物は、腸内投与用に、例えば、経口投与用に都合よく製剤することができる。薬学的剤形は、ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコール；並びに錠剤、丸剤及びカプセル剤を含む摂取組成物の即時調製用の滅菌粉末を含み得る。また、本発明の薬剤は、食品添加物の形で提供し、毎日の食事プログラムに組み込むことができることも企図される。これらの全ての剤形は、一般に製造及び保存条件下で無菌かつ安定であるように選択される。
【０１１８】
活性化合物は、中性または塩の形の組成物に製剤してもよい。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第２鉄などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【０１１９】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物、及び植物油を含む溶媒または分散媒でもあってもよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は要求される粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと思われる。注射用組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用により行うことができる。
【０１２０】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適当な溶媒中に、必要に応じて前述の様々な他の成分と共に組み込み、続いてろ過滅菌することにより調製する。一般に分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本の分散媒と前述のものから必要とされる他の成分とを含む滅菌媒体中に組み込むことにより調製する。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉末の場合、特定の調製法は、活性成分及び任意の追加の必要成分の粉末を、あらかじめ滅菌ろ過したその溶液から生じる、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１２１】
Ｂ．他の投与経路
腸内投与用に製剤した化合物に加えて、静脈内または筋肉内注射などの非経口製剤も構想される。投与は、鼻、口腔、直腸、膣または局所であり得る。あるいは、投与は、皮内、皮下、または腹腔内注射であり得る。同様に企図されるのは、カテーテルを介した持続灌流である。そのような組成物は、通常は前述の薬学的に許容される組成物として投与することになる。
【実施例】
【０１２２】
７．実施例
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示する技術は、本発明の実施においてうまく機能するように発明者が見いだした技術であり、従ってその実施のために好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更をなすことができ、それでもなお本発明の精神及び範囲から逸脱することなく類似または同様の結果が得られることを理解すべきである。
【０１２３】
実施例１−導入及び研究設計
ヌードマウス中の同所性Ｇ５５ヒトＧＢＭ異種移植は、本発明者が既出の刊行物で使用し、本発明者のグループで使用し続ける、確立されたＧＢＭモデルである。このモデルは、非常に侵襲性の強いＧＢＭを模倣する。このモデルに関して、本発明者は、未処置動物並びにＴＭＺ処置動物の動物生存率、腫瘍体積及び血管灌流データの以前のデータを有した。本発明者は、Ｇ５５細胞がＴＭＺ耐性を持つことを示す予備データも持っていたため、この知見は、ＴＭＺ耐性の理想的な異種移植モデルとしてこれらの細胞の使用をさらに支持するものである。
【０１２４】
本発明者は、４つの処置群で研究を行った。２つの群に関して、本発明者は、１群あたり最低５匹の動物を必要とした。これらは、ＯＫＮのみの群、及びＯＫＮ＋ＴＭＺ群であった。他の２つの群（未処置及びＴＭＺのみ）に関して、本発明者は、各々５匹の群を作製するための既存のデータを含め、実施した研究で２つの未処置及び２つのＴＭＺを含めた。
【０１２５】
本発明者は、ＭＲＩを使用して腫瘍体積を得て、これを使用して治療応答を評価した。本発明者はまた、血管灌流データを得て、腫瘍血管系に対する治療効果を評価した。腫瘍血管灌流速度（相対的な脳血流またはｒＣＢＦとして測定）は、灌流画像から計算する。腫瘍血管灌流速度は、血管新生によって乱れた血管により未処置腫瘍で減少する。正規化されたｒＣＢＦの差から、これは、ｒｃＢＦの実質的な変化をもたらすであろう。抗癌治療を介した腫瘍血管灌流速度の回復は、抗血管新生効果を示し得る。正規化されたｒＣＢＦの変化から、これは、治療効果が腫瘍血管に影響を及ぼす場合には、ｒＣＢＦに比較的小さな差をもたらすであろう。本発明者はまた、動物生存率を評価した。ＭＲＩ研究に関して、本発明者は、ＭＲＩによる腫瘍成長及び血管の変化を評価するために、未処置群については最低でも３つの時点が必要であり、処置動物については少なくとも５つの時点が必要であることを最初に示した一方、実際に、本発明者は、積極的な治療応答により、未処置マウスについて少なくとも５つの時点、及び処置マウスについて１０を上回る時点を得た。
【０１２６】
本発明者はまた、ラットＦ９８神経膠腫担持ラットの腫瘍（ＥＬＩＳＡによって評価）、及びＧＢＭヒト組織試料（免疫組織化学によって評価）中で上昇する、潜在的なバイオマーカーのＬＢＰ（リポ多糖結合タンパク質）を発見した。このバイオマーカーは、ラットＦ９８神経膠腫モデルからのマイクロアレイデータから発見され、ここで、未処置腫瘍は高レベルのＬＢＰを有し、ＯＫＮ−００７処置では、ＬＢＰの遺伝子発現が２倍超減少した。また、ラットＦ９８神経膠腫モデルでは、ＯＫＮ−００７は、未処置腫瘍担持動物と比較した場合、腫瘍組織（ｐ＜０．０００１）及び血清（ｐ＜０．００１）の両方におけるＬＢＰタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡによって評価）を有意に減少させることが分かった。本発明者は、ＬＢＰのＥＬＩＳＡキットを使用して、未処置またはＴＭＺ、ＯＫＮ−００７またはＴＭＺ＋ＯＫＮ−００７で処置のいずれかの腫瘍組織及び血清の両方において双方のＧ５５腫瘍担持マウスにおける有効性マーカーとしてバイオマーカーを評価した。
【０１２７】
実施例２−方法
細胞培養。Ｇ５５細胞は、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｅ．Ｓｕｇｈｒｕｅ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）から得た。Ｇ５５細胞は、１０％コスミック仔ウシ血清（ＣＣＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で培養した。
【０１２８】
マウス及び処置。動物研究は、ＯＭＲＦ  ＩＡＣＵＣ（研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会）の方針に従って実施し、ＮＩＨガイドラインに従うものである。２ヵ月齢の雄ヌードマウス（Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス；Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、１％アガロース溶液の４μＬ細胞培地中に懸濁したヒトＧ５５異種移植細胞（１×１０７）／ｍＬを脳内に移植した。腫瘍が１０〜１５ｍｍ３（ＭＲＩを介して決定）に到達すると、ＯＫＮ−００７（１５０ｍｇ／ｋｇ；絶えず飲み水を介して）またはＴＭＺ（３０ｍｇ／ｋｇ；３日ごとの強制飼養を介して）で３日ごとにマウスを処置した。ＴＭＺは、滅菌生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ及び５％ソルトール−１５で溶解した。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３に到達するまで、または、腫瘍（＞５ｍｍ３）をＭＲＩで検出した後に合計で最長６０日間、マウスを処置した。
【０１２９】
ＭＲＩ。ＭＲＩ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏ−ｓｐｅｃ  ７．０  Ｔｅｓｌａ／３０−ｃｍ水平ボア磁気撮像システムで行った。１．５〜２．５％イソフルラン及び０．８Ｌ／分のＯ２を用いて動物を固定化し、信号伝送用の７２−ｍｍの直角位相体積コイルに置いた。表面マウスヘッドコイルは、信号受信に使用した。Ｔ２強調画像を得て、腫瘍体積は、ＭＲＩデータセットから計算した。
【０１３０】
灌流イメージング。腫瘍毛細管に関連する微小血管の変化を評価するために、灌流イメージング法である動脈スピン標識法（ＡＳＬ）を使用した。腫瘍が最も大きい断面である前後軸の点に位置する脳の単一軸のスライスで、灌流マップを得た。５つの関心領域（ＲＯＩ）の輪郭を腫瘍の周りに手作業で描き、適切なＲＯＩを、比較のために脳の対側からも撮影した。ｒＣＢＦ値の差を計算するため、後期（未処置マウスに対して細胞の脳内移植後１８〜２６日目）及び早期（細胞移植後１０〜１３日目）の腫瘍ステージで腫瘍のｒＣＢＦ値を得て、対応する動物の対側脳領域におけるｒＣＢＦ値に正規化した。
【０１３１】
リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）ＥＬＩＳＡアッセイ。ＬＢＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ；ＡＢＩＮ３７０８０８）は、血清、血漿及び組織試料中のマウスＬＢＰレベルに特異的である。これは、マイクロプレートリーダーを読み取って、４５０／６２０ｎｍの吸光度を測定する比色アッセイである。ＬＢＰ濃度は、標準曲線から計算し、適切な希釈係数を乗じた。
【０１３２】
統計解析。生存率曲線は、カプラン−マイヤー曲線を用いて解析した。腫瘍体積、正規化ｒＣＢＦの変化、及びＬＢＰレベルを２元配置分散分析によって比較して、多重比較を行った。データは、平均±ＳＤとして表され、＊０．０５、＊＊０．０１、＊＊＊０．００１、及び＊＊＊＊０．０００１のいずれかのＰ値は、統計的に有意であると見なした。
【０１３３】
実施例３−結果
動物生存率（図１を参照）。動物生存率データは、併用療法（ＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ）処置マウスの６０％が、腫瘍の検出後に６０日生き残り、５０日を超えて処置されたことを示した。ＯＫＮ−００７処置マウスの１匹（処置マウスの２０％）もまた、腫瘍の検出後に６０日生存した。統計解析は、全ての処置マウス（ＯＫＮ−００７のみ、ＴＭＺのみ、または併用療法のいずれか）が、未処置（ＵＴ）Ｇ５５神経膠腫担持マウスと比較した場合、生存率が有意に増加したことが分かったことを示した。併用療法マウスが、ＴＭＺ処置マウスよりも有意に長い生存率であったことも分かった。ＯＫＮ−００７処置マウスと併用療法マウスとの間に有意性はなかった。動物群の数がより多い場合には、ｐ値がこれらの２つの群の間で０．０７であったため、ＯＫＮ−００７処置マウスと併用療法マウスとの間で有意差を得ることができたであろう。
【０１３４】
腫瘍体積（図２〜４を参照）。ＵＴマウスを安楽死させた時と同じ時点で、すなわち、腫瘍体積が１５０ｍｍ３以上に到達した時（腫瘍の検出後の１９〜２２日目に）と同じ時点で、並びに処置群ごとの最後の時点で腫瘍体積を比較した。腫瘍の検出後の１９〜２２日目に、ＴＭＺ、ＯＫＮ−００７、または併用療法のいずれかで処置したマウスは全て、ＵＴマウスと比較した場合、腫瘍体積が有意に減少したことが分かった（図２）。処置マウスが１匹も腫瘍体積において互いに有意に異ならないことが分かったが、しかしながら、併用療法は、ＴＭＺ−またはＯＫＮ−００７処置マウスのいずれかと比較した場合、腫瘍体積が最も小さかった。試料サイズが小さいため（ｎ＝５）、動物の数が多い場合には、処置群間の有意差があるかもしれない。ＴＭＺ群は、ばらつきが大きく、発明者によって実施した２つの他の研究でも観察された。腫瘍（中腫瘍領域）を示す代表的なＭＲ画像もまた、調査した処置群ごとに示す（図３）。処置群ごとの最後の時点で、ＴＭＺ群及び併用療法群の腫瘍体積は、ＵＴマウスと比較した場合、有意に小さいことが分かった（図４）。ＯＫＮ−００７処置群のばらつきが大きいため、未処置マウス、または他の処置群（ＴＭＺのみ、または併用療法）のいずれかと比較した場合、腫瘍体積に有意差はなかった。複数の時点で得られた腫瘍体積を、以下のグラフに示す（図５Ａ）。治療ウィンドウが示され、ここで、腫瘍が≧１０ｍｍ３に到達すると、腫瘍を処置する。
【０１３５】
腫瘍血管灌流量（正規化されたｒＣＢＦの差）（図５Ｂを参照）。正規化された腫瘍ｒＣＢＦの差は、ＵＴマウスと比較して、全ての処置マウスで有意に減少することが分かった。１群あたりの動物の数が少ないため、処置群間の有意差はなかった、しかしながら、併用療法及びＯＫＮ−００７−処置群の両方は、ＴＭＺ処置と比較して、腫瘍においてより正規化された灌流量を有するようであった。代表的な形態学的ＭＲ画像及びそれらの対応する灌流マップを処置群ごとに示す。
【０１３６】
ＬＢＰ  ＥＬＩＳＡアッセイ（図６及び７を参照）。ＯＫＮ−００７処置マウスまたは併用療法マウスのＬＢＰレベルは、ＵＴマウスと比較して、腫瘍組織中で有意に低かった（図６）。腫瘍組織では、ＴＭＺ処置群のＬＢＰレベルは、ＵＴマウス腫瘍と有意に異なるか分からなかった。腫瘍ＬＢＰレベルにおいて、ＯＫＮ−００７処置群と併用療法との間に有意差はなかった。効果は、ＯＫＮ−００７の効果が主に寄与した可能性がある。血清ＬＢＰレベルは、ＵＴマウス試料と比較して、全ての処置群において有意に低いことが分かり、一般的な治療応答を示した（図７）。
【０１３７】
ＯＫＮ−００７を併用したＴＭＺ耐性及びＴＭＺ感受性ＧＢＭ細胞株のインビトロＩＣ５０評価（図８）。ＯＫＮ−００７は、膠芽腫（ＧＢＭ）前臨床モデルにおいて抗腫瘍活性を有することが本発明者らによって予め示されている。インビトロデータは、ＯＫＮ−００７が、ＴＭＺ（テモゾロミド）耐性ＧＢＭ細胞株（Ｔ９８Ｇ及びＧ５５）を一緒に組み合わせる場合に、それらを減少させ得ることを示す。
【０１３８】
リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）。ＯＫＮ−００７の作用機序を評価する詳細な研究中、転写マイクロアレイを使用して、ラットＦ９８神経膠腫モデルにおけるＯＫＮ−００７処置と関連する特異的な遺伝的変化を解明した。ＬＢＰは、（未処置と比較して）ＯＫＮ処置ラットＦ９８神経膠腫でダウンレギュレートされ、ＴＧＦ−β１と関連する。２７年前に発見され、ＬＰＳに結合する能力にちなんで命名されたＬＰＢ（リポ多糖結合タンパク質）は、感染を阻止するために必要であり、自然免疫及び適応免疫に関与する。ＬＢＰの主な作用機序は、いまだ明らかではない。
【０１３９】
ＬＰＢに対するＯＫＮ−００７効果（図９及び１０）。未処置（腫瘍）及びＯＫＮ−００７処置（ＯＫＮ処置腫瘍）Ｆ９８神経膠腫担持ラットの腫瘍組織中のタンパク質ＬＢＰレベルを図９に示す。正常な脳組織は、未処置（対照）及びＯＫＮ−００７処置（対照＋ＯＫＮ）ラットから得た。未処置と比較して、ＯＫＮ−００７処置神経膠腫中のＬＢＰレベルは有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。対照組織（未処置または処置）も有意に低かった（ｐ＜０．０００１）
【０１４０】
未処置（腫瘍）及びＯＫＮ−００７処置（ＯＫＮ処置）Ｆ９８神経膠腫ラットの血清中のタンパク質ＬＢＰレベルを図１０に示す。正常なラット（対照）からの血清も得た。ＬＢＰの血清レベルは、未処置腫瘍担持ラットと比較してＯＫＮ処置Ｆ９８神経膠腫担持ラット（ｐ＜０．００１）で、正常なラット対未処置腫瘍担持（ｐ＜０．０００１）で、または正常なラット対ＯＫＮ−００７処置神経膠腫担持ラット（ｐ＜０．０５）で有意に低かった。
【０１４１】
高グレード神経膠腫中のＬＢＰの免疫組織化学レベル（図１１Ａ）は、低グレード神経膠腫（図１１Ｂ）と比較して、高グレード神経膠腫中のＬＢＰ（図１１Ｃ）の有意な増加を示す。ＬＢＰは、未処置腫瘍と比較して、腫瘍組織（左グラフ）及び血清（右グラフ）中のヌードマウスのＧ５５ヒトＧＢＭＶ異種移植において、ＯＫＮ−００７またはＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ併用処置によって有意に低下することが分かった。図１２。
【０１４２】
結論
併用療法（ＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ）は、動物生存率の増加、腫瘍体積の減少、ｒＣＢＦ変化の減少、並びに腫瘍組織及び血清の両方におけるＬＢＰレベルの減少において全体的に好ましい応答をするようであった。動物の数の増加は、３つの処置群（ＴＭＺのみ、ＯＫＮ−００７のみ、及び併用療法）と比較した場合、動物生存率、腫瘍体積、及びｒＣＢＦの変化に有意差を示す可能性がある。別のＴＭＺ耐性モデル（別のＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞株の異種移植モデル、またはＴＭＺ処置に失敗した患者からのＧＢＭ細胞を用いた患者由来異種移植モデルのいずれか）における研究を実施することも有利であろう。結論として、ＯＫＮ−００７及びＴＭＺの併用治療が、ＴＭＺまたはＯＫＮ−００７単一治療のいずれかと比較して、全体的な改善を示し、臨床調査を考慮すべきであることをデータは支持している。しかしながら、刊行物に関する他の癌研究者らを納得させるために、動物の数の増加は、おそらく、別の異種移植モデルを用いて、全体的な結果を強化するであろう。
【０１４３】
実施例４−物質及び方法
インビボ研究
マウス及び処置。動物研究は、ＯＭＲＦ  ＩＡＣＵＣ（研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会）の方針に従って実施し、ＮＩＨガイドラインに従うものである。Ｆ９８ラット神経膠腫細胞移植モデルの場合、Ｆ９８細胞（１０−μｌ体積中で１０５個）を、合計で１５匹のＦｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラット（雄２００〜２５０ｇｍ）において定位装置（２ｍｍ側方及び２ｍｍ前頭からブレグマ、３ｍｍの深さで）で脳内に移植した。腫瘍が１０〜２０ｍｍ３体積に到達すると（ＭＲＩによって決定されるように）、動物を２つの群に分割した：ＯＫＮ−００７処置（ｎ＝８）及び未処置（ＵＴ）（ｎ＝７）群。腫瘍が２００〜２５０ｍｍ３体積に到達するまで、または合計で４〜６週間、ラットを処置した。Ｇ５５  ＧＢＭ細胞移植モデルの場合、２ヵ月齢の雄ヌードマウス（Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス；Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、１％アガロース溶液の４μＬ細胞培地中に懸濁したヒトＧ５５異種移植細胞（１×１０６）／ｍＬを脳内に移植した。腫瘍が１０〜１５ｍｍ３（ＭＲＩを介して決定）に到達すると、飲み水中のＯＫＮ−００７（２０ｇマウスに対して１５０ｍｇ／ｋｇ；０．２０％ｗ／ｖ）またはＴＭＺ（３０ｍｇ／ｋｇ）で３日ごとにマウスを処置した。ＯＫＮ−００７を水中に溶解し、２日ごとに作製した。水筒を秤量し、マウス１匹あたりで消費されたＯＫＮ−００７の量を決定した。これらのマウスにおけるＯＫＮ−００７の液体取り込みの体積において著しい逸脱は観察されなかった。ＯＫＮ−００７の平均取り込みは、おおよそ１４０〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日／マウスであった。ＴＭＺは、滅菌生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ及び５％ソルトール−１５で溶解し、強制飼養を介して投与した。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３に到達するまで、または合計で４〜６週間、マウスを処置した。全ての群を層別にして、処置開始前に腫瘍サイズが確実に類似するようにした。
【０１４４】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）。ＭＲＩ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏ−ｓｐｅｃ  ７．０  Ｔｅｓｌａ／３０−ｃｍ水平ボア磁気撮像システムで行った。１．５〜２．５％イソフルラン及び０．８Ｌ／分のＯ２を用いて動物を固定化し、信号伝送用の７２−ｍｍ直交体積コイルに置き、表面ラットヘッドまたはマウスヘッドコイルのいずれかを信号受信に使用した。Ｔ２−重み付けされた形態学的イメージングを、スライス厚：０．５ｍｍ、ＦＯＶ：ラットに対して４×５ｃｍ２またはマウスに対して２×２ｃｍ２、適切な面内解像度：ラットに対して１５０μｍ及びマウスに対して８０μｍ、反復時間（ＴＲ）：３０００ｍｓ及びエコー時間（ＴＥ）：６３ｍｓ、総獲得時間：１３分で得た。Ａｍｉｒａ  ｖ５．６．０（ＦＥＩ）を用いて、３Ｄ  ＭＲＩスライスをレンダリングしたＭＲＩデータセットから腫瘍体積を計算した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１４５】
灌流イメージング。腫瘍毛細管に関連する微小血管の変化を評価するために、灌流イメージング法である動脈スピン標識法（ＡＳＬ）を上述のように使用した（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。腫瘍が最も大きい断面である前後軸の点に位置する脳の単一軸のスライスで灌流マップを得た。５つの関心領域（ＲＯＩ）の輪郭を腫瘍の周りに手作業で描き、適切なＲＯＩを、比較のために脳の対側からも撮影した。ｒＣＢＦ値の差を計算するため、後期（未処置マウスに対して細胞の脳内移植後１８〜２６日目）及び早期（細胞移植後１０〜１３日目）の腫瘍ステージで腫瘍のｒＣＢＦ値を得て、対応する動物の対側脳領域におけるｒＣＢＦ値に正規化した。腫瘍体積は、形態学的画像データセットから転置した。
【０１４６】
ＲＮＡ単離及び調製。ラットＦ９８神経膠腫研究では、全てのラットを最後のＭＲＩ検査後に安楽死させた。各動物の脳を除去し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃の冷凍庫で保存した。全ての処置群からの全ての腫瘍組織由来の総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、分光測光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で定量化した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１４７】
マイクロアレイ解析。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ増幅キットを用いて、ｃＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を上述のように標識した（Ｇｒｉｆｆｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。４×４の処置／未処置試料を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＲａＧｅｎｅ−１＿０−ｓｔ−ｖ１マイクロアレイを用いてプロファイルした。エクソン−レベル−集計測定値を分位数標準化し、偽発見率（ＦＤＲ）：＜４０％、及び倍率変化：＜１．５で、マイクロアレイ（ＳＡＭ、［ＰＭＩＤ：１１３０９４９９］）の有意性分析を用いて、差次的発現を研究した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ）を用いて、機能的強化解析を行った。
【０１４８】
組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）。全てのラットを最後のＭＲＩ検査後に安楽死させた。灌流固定（１０％中性緩衝ホルマリンを尾静脈注射を介して投与した）を麻酔（イソフルラン）マウスに使用して、各動物の全脳を除去し、１０％中性緩衝ホルマリンにさらに保存して、規定通りに処理した。パラフィン包埋組織を５μｍの切片に切り分け、ｓｕｐｅｒ  ｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ（登録商標）ガラススライド上に載置し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡検査で調べた。免疫組織化学（ＩＨＣ）を行い、組織試料を抗ＴＧＦβ１抗体（ウサギ抗ＴＧＦβ１、カタログ番号２５０８７６、１  ｍｇ／ｍＬ、ＡＢＢＩＯＴＥＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色することによってＴＧＦβ１レベルを確立した。ＴＧＦβ１  ＩＨＣについては、切片を、炊飯器で２０分間、抗原賦活液（クエン酸緩衝液、ｐＨ６、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）中でインキュベートした後、脱イオン水で２０分間冷却した。
【０１４９】
統計解析。生存率曲線は、カプラン−マイヤー曲線を用いて解析した。腫瘍体積、正規化ｒＣＢＦの変化、及び腫瘍血液量を２元配置分散分析によって解析、比較して、多重比較を行った。データは、平均±ＳＤとして表され、＊０．０５、＊＊０．０１、＊＊＊０．００１、及び＊＊＊＊０．０００１のいずれかのＰ値は、統計的に有意であると見なした。マイクロアレイデータについては、遺伝子ごとのランダム分散ｔ統計値を使用した（Ｗｒｉｇｈｔ及びＳｉｍｏｎ、２００３）。
【０１５０】
インビトロ研究
細胞及び培地。ほとんどのＧＢＭ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た（Ｕ−１３８−ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−ＨＴＢ−１６）膠芽腫；ＬＮ−１８−ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２６１０）膠芽腫；ＬＮ−２２９−ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２６１１）膠芽腫；及び  Ｔ−９８Ｇ−ＡＴＣＣ−（ＣＲＬ−１６９０）。Ｕ−２５１  ＧＢＭ細胞は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た（Ｎ＃０９０６３００１：Ｕ−３７３  ＭＧ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１７）としても以前に知られる）。Ｇ５５細胞は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の居住者であったＭｉｃｈａｅｌ  Ｓｕｇｈｒｕｅ博士から得た（元々は、細胞を特徴付けたＣ．Ｄａｖｉｄ  Ｊａｍｅｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，ＵＣＳＦ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た）。
【０１５１】
細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｃｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で、標準加湿インキュベーター内で、３７℃、５％  ＣＯ２にて培養した。
【０１５２】
ＩＣ５０濃度−ＴＭＺ感受性判断用のプロトコル。６つの神経膠腫細胞株のＴＭＺに対する感受性は、未処置対照と比較して、５０％成長阻害に必要な濃度（ＩＣ５０；ＧＩ５０としても知られる）から評価した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。簡単に言えば、細胞を、２４ウェル平底プレート中に１×１０４個の細胞／ウェルで播き、培地で２４時間インキュベートした。その後、細胞を培地で２回洗浄し、０．１〜１，０００μＭのＴＭＺを含む新鮮な培地（対照）または培地でさらにインキュベートした。成長培地を＋／−ＴＭＺと共に含む各プレートにおいて、１ｍＭのＯＫＮを含む培地を持つプレートが１つあった。様々な濃度のＴＭＺに７２時間暴露した後、細胞をトリプシン処理で分離し、その数を数えた。実験は、各濃度で少なくとも４回繰り返した。
【０１５３】
ＲＮＡ調製。実験的に測定された発現パターンにおいて人工供給源からの寄与を回避するため、各細胞株を４個の独立した培養で増殖させ、全プロセスを、各培養から抽出したｍＲＮＡで独立して実行した。
【０１５４】
細胞株ＬＮ−１８及びＬＮ−２２９に、４群（細胞、細胞とＴＭＺ、細胞とＴＭＺ−ＯＫＮ併用療法、細胞とＯＫＮ）の遺伝子発現プロファイルの評価を施した。抽出した総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、分光測光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で定量化した。
【０１５５】
ＨＩＦ−１ａ、ＭＰＧ及びＭＧＭＴのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量化。全ての処理による全ての細胞株からの総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、分光測光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で定量化した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
【０１５６】
標的遺伝子ｍＲＮＡを増幅し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステムで測定した。遺伝子発現は、ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。ＰＣＲ生成物の濃度に比例する蛍光シグナルは、各サイクルの終わりに測定し、コンピュータースクリーン上に直ちに表示して、ＰＣＲのリアルタイムモニタリングを可能にした。反応物は、固定数のサイクル後に蓄積したＰＣＲ生成物の量ではなく、ＰＣＲ生成物の増幅を最初に検出したサイクル中のポイントで特徴付けた。テンプレートの開始量が高いほど、蛍光の有意な増加がより早く観察される。閾値サイクルは、蛍光が、ベースラインを上回る固定閾値を超える分画サイクル数として定義される。蛍光データをサイクル閾値測定値に変換し、マイクロソフトエクセルにエクスポートした。グリセルアルデヒド−３−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ発現レベルは、定量内部対照として使用した。正確な定量化のため、各試料のｍＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を用いて正規化した。
【０１５７】
全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。使用したプライマーは、
2020534322.tif 000012
であった。ＭＧＭＴの場合には、
2020534322.tif 000013
を使用して、ＭＰＧの６０３−ｂｐ転写物を増幅した［９］。
【０１５８】
ＨＩＦ−１ａ、ＭＰＧ及びＭＧＭＴのＥＬＩＳＡ。タンパク質発現は、４つ全ての処置群（細胞のみ、細胞とＴＭＺ、細胞とＯＫＮ、細胞とＯＫＮ及びＴＭＺ併用）の６つ全ての神経膠腫細胞株で評価した。細胞を溶解して、アッセイした。簡単に言えば、細胞を冷却ＰＢＳで穏やかに洗浄した後、トリプシンで分離し、１，０００×ｇで５分間遠心分離によって回収した。その後、細胞を冷却ＰＢＳ中で３回洗浄した後、新鮮な溶解バッファー中に懸濁させた。溶解物を１，５００×ｇで１０分間２〜８℃で遠心分離し、細胞残屑を除去した。
【０１５９】
アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡの原理に基づく。供給されたマイクロタイタープレートの各ウェルを標的特異的捕捉抗体でプレコートした。標準または試料をウェルに加え、標的抗原を捕捉抗体に結合させる。非結合標準または試料を洗い流す。その後、ビオチン結合検出抗体を加え、捕捉抗原に結合させる。非結合検出抗体を洗い流す。その後、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体を加え、ビオチンに結合させる。非結合アビジン−ＨＲＰ複合体を洗い流す。その後、ＴＭＢ基質を加え、ＨＲＰ酵素と反応させて、発色をもたらす。硫酸停止液を加えて、発色反応を停止させた後、ウェルの光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍ±２ｎｍの波長で測定する。その後、その抗原濃度を決定するために、未知の試料のＯＤを、既知の抗原濃度を用いて生成したＯＤ標準曲線と比較することができる。
【０１６０】
その後、群間を比較するために、ＥＬＩＳＡから決定した抗原濃度を、各細胞溶解物の総タンパク質濃度に対して正規化した。Ｎ−メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＰＧ）及び低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１α）のＥＬＩＳＡキットは、ＣＬＯＵＤ−ＣＬＯＮＥ  ＣＯＲＰ．（ＣＣＣ）から購入し、ヒトＭＧＭＴのＥＬＩＳＡキットは、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【０１６１】
ＲＮＡシークエンシング。ＲＮＡシークエンシング分析の前に、品質管理対策を実施した。ＲＮＡの濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計による蛍光分析を介して確認した。ＲＮＡの全体的な品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ機器を用いて確認した。最初のＱＣ工程後、製造者プロトコルに従って、Ｌｅｘｏｇｅｎ  Ｑｕａｎｔｓｅｑ  ＦＷＤライブラリー調製キットを用いて、シークエンシングライブラリーを生成した。簡単に言えば、第一ストランドｃＤＮＡは、５’−標識 ポリ−Ｔオリゴマープライマーを用いて生成した。ＲＮａｓｅ消化後、第二ストランドｃＤＮＡは、５’−標識ランダムプライマーを用いて生成した。追加のプライマーによる次のＰＣＲ工程は、完全なアダプターシーケンスを初期５’標識に加え、試料の逆多重化のための一意のインデックスを加え、ライブラリーを増幅した。試料ごとの最終ライブラリーの適切なサイズ及び量に関して、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ上でアッセイした。その後、蛍光分析を介して確認したように、これらのライブラリーを等モル量でプールした。最終プールは、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０機器上のｑＰＣＲを用いて、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー定量試薬により絶対定量した。シークエンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｓｅｑ  ５００機器で行い、高出力ケミストリー及び７５ｂｐシングルエンド読み取りを行った。
【０１６２】
生のシークエンシングファイルは、ポリＡ尾部のｂｂｄｕｋ（Ｋｍｅｒｓを用いた汚染除去）（Ｂｕｓｈｎｅｌｌ，２０１４）トリミング、及びアダプターシーケンスで処理した。Ｆａｓｔｑｃ（Ａｎｄｒｅｗｓ，２０１０）及びｍｕｌｔｉＱＣ（Ｅｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）を使用して、得られたｆａｓｔｑファイルの品質をチェックした。３３〜３６の高品質スコア（ｐｈｒｅｄスコア）が、全ての試料に存在し、各々は、９３０万＋／−１３０万の読み取りであった。その後、各パッケージからのロバスト応答を分析するために、ＧＲＣｈ３８ゲノムに対してＴｏｐｈａｔ２（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）と一列に整列させた、分類されたｂａｍファイルを、並列で２つの別々のパイプラインで提供した。計数及び示差遺伝子発現は、‘ＧｅｎｏｍｉｃＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ’ｆｕｎｃｔｉｏｎ‘ｓｕｍｍａｒｉｚｅＯｖｅｒｌａｐｓ’及び負の二項一般化線形モデリングパッケージＤＥＳｅｑ２を用いて、Ｒで得られた（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１６３】
細胞遊走。遊走研究については、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）マイクロチャネルを内部に備える６ウェルチャンバーの各ウェルを、１０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆した。Ｇ５５細胞を１００μｌ中で播種（５０×１０３個）し、各ウェルに２ｍｌの培地を補充した。チャンバーを、予定した時点まで、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。いくつかのチャンバーを、ＯＫＮ−００７、ＴＭＺ、またはＴＭＺと併用したＯＫＮ−００７（ＯＫＮ−００７及びＴＭＺの両方、並びに２つを併用した場合、１μＬ／ｍＬの培地）で処理し、処置群ごとに、１つのウェルを対照として未処置のままにした。マイクロチャネル内の細胞の画像は、１０×のオリンパスＣＫ４０倒立顕微鏡（日本）を用いて撮影し、遊走した同じ細胞の距離を、播種後の２２時間、２８時間、及び４６時間で測定し、細胞遊走速度（μｍ／ｈ）を計算した。各処理を少なくとも３回繰り返し、データを平均±Ｓ．Ｄとして示す。
【０１６４】
統計解析。ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子及びＥＬＩＳＡタンパク質レベル、及び細胞遊走を２元配置分散分析によって解析、比較して、多重比較を行った。ＲＮＡシークエンシングデータは、ＤＥＳｅｑ２が提供したＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  ＦＤＲ値からのＦＤＲ＜０．０５を用いて分析した（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。データは、平均±ＳＤとして表され、＊０．０５、＊＊０．０１、＊＊＊０．００１、及び＊＊＊＊０．０００１のいずれかのＰ値は、統計的に有意であると見なした。
【０１６５】
実施例５−結果
インビボＧ５５同所異種移植ＧＢＭモデル。動物生存率データは、併用療法（ＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ）処置マウスの６０％が、腫瘍の検出後に６０日生き残り、５０日を超えて処置されたことを示した（図１３Ａ）。ＯＫＮ−００７処置マウスの１匹（処置マウスの２０％）もまた、腫瘍の検出後に６０日生存した。統計解析は、全ての処置マウス（ＯＫＮ−００７のみ、ＴＭＺのみ、または併用療法のいずれか）が、未処置（ＵＴ）Ｇ５５神経膠腫担持マウスと比較した場合、生存率が有意に減少したことが分かったことを示した。併用療法マウスが、ＴＭＺ処置マウスよりも有意に長い生存率であったことも分かった。ＯＫＮ−００７処置マウスと併用療法マウスとの間に有意性はなかった。
【０１６６】
ＵＴマウスを安楽死させた時と同じ時点で、すなわち、腫瘍体積が１５０ｍｍ３以上に到達した時（腫瘍の検出後の１９〜２２日目に）と同じ時点で、並びに処置群ごとの最後の時点で腫瘍体積を比較した。腫瘍の検出後の１９〜２２日目に、ＴＭＺ、ＯＫＮ−００７、または併用療法のいずれかで処置したマウスは全て、ＵＴマウスと比較した場合、腫瘍体積が有意に減少したことを分かった（図１３Ｂ）。処置マウスが１匹も腫瘍体積において互いに有意に異ならないことが分かったが、しかしながら、併用療法は、ＴＭＺ−またはＯＫＮ−００７処置マウスのいずれかと比較した場合、腫瘍体積平均が最も小さかった。腫瘍（中腫瘍領域）を示す代表的なＭＲ画像もまた、調査した処置群ごとに示す（図１４）。
【０１６７】
正規化された腫瘍ｒＣＢＦの差は、ＵＴマウスと比較して、全ての処置マウスで有意に減少することが分かった（図１５Ｅ）。１群あたりの動物の数が少ないため、処置群間の有意差はなかった、しかしながら、併用療法及びＯＫＮ−００７−処置群の両方は、ＴＭＺ処置と比較して、腫瘍においてより正規化された灌流量を有するようであった。代表的な形態学的ＭＲ画像（図１５−Ｄｉ）及びそれらの対応する灌流マップ（図１５Ａ〜Ｄｉｉ）を処置群ごとに示す。
【０１６８】
インビトロＧＢＭ細胞研究。インビトロＧＢＭ細胞成長曲線に由来。ほとんどの細胞が１００μＭ以下のＴＭＺ濃度で５０％超殺傷されるＴＭＺ感受性細胞（Ｕ２５１、ＬＮ２２９）から確立した（表４）。ＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞（Ｔ９８、ＬＮ１８、Ｕ１３８、Ｇ５５）に関して、併用療法の効果は、１００μＭ未満のＴＭＺ濃度で実質的であった。併用療法の効果は、有意であった。
【０１６９】
（表４）ＴＭＺのみ（０、０．１、１、１０、１００または１０００μＭ）またはＯＫＮ（１ｍＭ）を併用したＴＭＺのいずれかで処置したヒトＧＢＭ細胞のＩＣ５０値
2020534322.tif 000014
【０１７０】
１ｍＭ  ＯＫＮの濃度は、いくつかの細胞（ＬＮ２２９、Ｕ１３８、Ｇ５５）に対して２ｍＭ濃度と比較して、細胞生存率の低下に同様に効果的であることが分かった。他の細胞（Ｕ２５１、Ｔ９８、ＬＮ１８）では、２ｍＭ  ＯＫＮは、１ｍＭ濃度と比較して、細胞生存率の低下に僅かにより効果的であることが分かった。
【０１７１】
ＨＩＦ−１α、ＭＧＭＴ及びＭＰＧ。ＲＴ−ＰＣＲ（表５）は、ＨＩＦ−１α遺伝子発現比が、全てのＴＭＺ処置及びＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ処理細胞中で増加したことを示した。ＯＫＮ−００７は、遺伝子発現比を減少させたＴ９８細胞を除いて、全ての細胞中でＨＩＦ−１α遺伝子発現比を増加させた。ＭＧＭＴ遺伝子発現比は、ＴＭＺまたはＯＫＮ−００７のいずれかで処置されたＬＮ１８細胞中で減少する。ＯＫＮ−００７は、Ｔ９８細胞中でＭＧＭＴ遺伝子発現比を減少させた。ＭＧＭＴ遺伝子発現比は、ＴＭＺ、ＯＫＮ−００７または併用処置のいずれかの後に、Ｕ２５１細胞中で増加する。ＭＧＭＴ遺伝子発現比は、ＬＮ１８併用処置で僅かに増加する。ＭＰＧ遺伝子発現比は、ＴＭＺ処置後にほとんどの細胞で、ＯＫＮ−００７処置Ｇ５５及びＵ１３８細胞で、及びＯＫＮ−００７＋ＴＭＺで併用処置したＧ５５、ＬＮ１８及びＵ１３８細胞中で増加した。ＯＫＮ−００７処置したＬＮ１８、Ｔ９８、Ｕ２５１及びＬＮ２２９細胞、及びＯＫＮ−００７＋ＴＭＺで処置したＴ９８及びＬＮ２２９細胞において、ＭＰＧ遺伝子発現比の減少があった。
【０１７２】
（表５）ＴＭＺ、ＯＫＮまたは併用ＯＫＮ＋ＴＭＺのいずれかで処置した、または未処置（ＵＴ）のＴＭＺ耐性及びＴＭＺ感受性ヒトＧＢＭ細胞における、ＨＩＦ−１α、ＭＧＭＴ及びＭＰＧのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現比
2020534322.tif 000015
細胞処置群ごとにＮ＝２。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡで確立されたタンパク質レベル（表６）は、ＨＩＦ−１αが、ＴＭＺまたは併用療法で処置したほとんどの細胞中で上昇したことを示した。ＯＫＮ−００７は、Ｕ１３８細胞中で僅かにＨＩＦ−１αレベルが減少した一方、全ての他の細胞では、このタンパク質は、この処置群で僅かに上昇した。ＭＧＭＴは、ＴＭＺまたは併用療法で処置したＧ５５、Ｔ９８及びＵ２５１細胞中で上昇した。ＯＫＮ−００７は、Ｇ５５及びＬＮ１８細胞中でＭＧＭＴを僅かに減少させた。ＭＰＧは、ＴＭＺまたはＴＭＺと組み合わせたＯＫＮ−００７で処置したＵ２５１細胞で主に上昇のみがみられた。ＯＫＮ−００７は、ＬＮ２２９細胞中でＭＰＧレベルを減少させた。
【０１７４】
（表６）ＴＭＺ、ＯＫＮまたは併用ＯＫＮ＋ＴＭＺのいずれかで処置した、または未処置（ＵＴ）のＴＭＺ耐性及びＴＭＺ感受性ヒトＧＢＭ細胞における、ＨＩＦ−１α、ＭＧＭＴ及びＭＰＧのＥＬＩＳＡタンパク質レベル（ｎｇ／ｍｇ細胞溶解物）変化
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細胞処置群ごとにＮ＝４。
【０１７５】
ＲＮＡシークエンシングデータ。図１７は、ＬＮ１８細胞が、３７個のアップレギュレート遺伝子を有し、３個の遺伝子が、ＴＭＺのみの群と比較して、ＴＭＺ＋ＯＫＮ群でダウンレギュレートしたことを示す。試料２５に関して、遺伝子は、この列で全てアップレギュレートされるようである。これは、他の併用ＯＫＮ＋ＴＭＺ  ＬＮ１８試料とは異なる閾値で設定されるようである。閾値が低下する場合には、パターンは、２６または２８列（他のＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ併用処置ＬＮ１８細胞）のものと同様になる。
【０１７６】
図１６は、ＬＮ１８細胞が、３７個のアップレギュレート遺伝子を有し、３個の遺伝子が、ＴＭＺのみの群と比較して、ＴＭＺ＋ＯＫＮ群でダウンレギュレートしたことを示す。試料２５に関して、遺伝子は、この列で全てアップレギュレートされるようである。これは、他の併用ＯＫＮ＋ＴＭＺ  ＬＮ１８試料とは異なる閾値で設定されるようである。閾値が低下する場合には、パターンは、２６または２８列（他のＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ併用処置ＬＮ１８細胞）のものと同様になる。図１７は、ＬＮ２２９細胞が、２１個のアップレギュレート遺伝子を有し、１９個の遺伝子が、ＴＭＺのみの群と比較して、ＴＭＺ＋ＯＫＮ群でダウンレギュレートしたことを示す。
【０１７７】
インビトロ細胞遊走研究。Ｇ５５  ＧＢＭ細胞遊走研究は、ＯＫＮ処理細胞の細胞遊走速度が、未処置（ＵＴ）細胞と比較して、処置後２２時間及び４６時間で有意に減少したことを示した。ＴＭＺで処置した細胞は、ＵＴ細胞と比較して、処置後２８時間及び４６時間で有意に減少したことが分かった。ＯＫＮ＋ＴＭＺ併用処置は、ＴＭＺのみと比較して、処置後２２時間及び２８時間で細胞遊走を有意に減少させたことも分かった。
【０１７８】
ＵＴまたはＯＫＮ−００７で処置したラットＦ９８神経膠腫からのマイクロアレイデータ。マイクロアレイ解析は、ＯＫＮ処置後に遺伝子の顕著なダウンレギュレーションを特定した。３８４個の遺伝子が、有意にダウンレギュレートされた少なくとも１つのエクソンを有する一方、３個のみが、アップレギュレートされた（データ不図示）。パスウェイ解析は、ＯＫＮ処置Ｆ９８腫瘍が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と関連するいくつかの遺伝子（例えば、コラーゲン及びＭＭＰ遺伝子）をダウンレギュレートし、それらが全て、ＴＧＦβ１に連結していたことを示した。
【０１７９】
ＲＴ−ＰＣＲは、いくつかのＥＣＭ遺伝子が、ＵＴ  Ｆ９８腫瘍と比較して、ＯＫＮ処置でダウンレギュレートされたことを確認することができた（表７）。
【０１８０】
（表７）遺伝子発現が２、５、または１０倍以上に変化した、Ｆ９８未処置及びＯＫＮ−００７処置腫瘍から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
2020534322.tif 000017
【０１８１】
上流調整因子分析は、最も有意に阻害された上流調整因子としてＴＧＦβ１を特定し、これは、５７個のダウンレギュレート遺伝子を制御した（図２０）。ＴＧＦβ１は、それ自体ほぼ２倍にダウンレギュレートされた。
【０１８２】
免疫組織化学は、ＴＧＦβ１タンパク質レベルが、ＵＴ腫瘍と比較して、ＯＫＮ処置Ｆ９８神経膠腫で実質的に低下したことを示した（図２１Ａ〜Ｂ）。ＥＬＩＳＡを用いて、ＴＧＦβ１タンパク質レベルの減少も確認され、ＵＴ腫瘍と比較して、ＯＫＮ処置Ｆ９８神経膠腫におけるＴＧＦβ１タンパク質発現レベルの有意の減少（ｐ＜０．００１）が示された（図２１Ｃ）。
【０１８３】
実施例６−考察
本発明者らは、ＴＭＺと組み合わせた場合、ＯＫＮ−００７が、ＴＭＺ感受性ＧＢＭ細胞におけるＴＭＺの効果を増強し、並びにＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞をＴＭＺに対してより感受性にさせて、及び／または腫瘍細胞成長に対するＯＫＮ−００７の効果を増強できることを確立できた。本発明者らは、ＯＫＮ−００７それ自体が、ＴＧＦ−β１を介して、細胞外マトリックスと関連するいくつかの遺伝子をダウンレギュレートし、細胞遊走に対して効果的になることもできることを確立できた。本発明者らは、ＯＫＮ−００７が、細胞増殖を効果的に阻害し、両方とも血管新生と関連するＨＩＦ−１α及びＶＥＧＦＲ２を減少させ、及びアポトーシスを増加させることができることを以前に発見している。
【０１８４】
ＯＫＮ−００７をＴＭＺと組み合わせる場合、組み合わせは、ＴＭＺ感受性及びＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞の両方に対してインビトロで効果的で、腫瘍体積を相乗的に減少させ、並びにＧ５５同所異種移植ＧＢＭモデルにおける動物生存率及び正常な血管新生をインビボで増加させることができる。
【０１８５】
最近調査された他のＴＭＺ併用療法には、ヘッジホッグシグナル伝達と関連し、かつ、神経膠腫様幹細胞（Ｕ８７−ＭＧ、Ｔ９８Ｇ）に特異的に影響を及ぼすＧＬＩ１のサイレンシング（Ｍｅｌａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）；アルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォーム３Ａ１（ＡＬＤＨ３Ａ１）発現をダウンレギュレートするＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害（Ｓｕｗａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）；ｍｉＲ−５１９ａ模倣体の使用（ここで、ｍｉＲ−５１９ａは、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）介在性オートファジーを標的化して、ＴＭＺ誘導性オートファジー（Ｕ８７−ＭＧ／ＴＭＺ）を促進することで、腫瘍抑制因子として機能する）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）；ＧＢＭ細胞をＴＭＺに対して感受性にさせるためのＰＩ３Ｋの阻害（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）；ＴＭＺ感受性を増強するためのＳＯＸ９／ＣＡ９（炭酸脱水酵素９）介在性発がん経路の阻害（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）；及びポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ナノキャリア構築物の葉酸共役トリブロック共重合体（Ｆａ−ＰＥＧ−ＰＥＩ−ＰＣＬ、Ｆａ−ＰＥＣ）を用いて、ＢＣＬ−２遺伝子を標的化するＴＭＺ及びｓｉＲＮＡの共送達（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）が含まれる。ＴＭＺと組み合わせた全ての療法のいずれかを使用して、ＴＭＺの効果を増強する、及び／またはＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞に影響を及ぼす。
【０１８６】
研究のＩＣ５０成分に関して、全細胞に対して、ＯＫＮ−００７は、ＴＭＺ  ＩＣ５０濃度の低下に実質的な効果を有したため、ＧＢＭ細胞は全て、ＴＭＺ感受性（または、すでにそうであった場合には、よりＴＭＺ感受性）になった。Ｇ５５細胞によるＴＭＺ耐性の評価に関して注意すべき点がある。本発明者らは、低継代Ｇ５５細胞株が実際にＴＭＺ耐性である一方、高継代Ｇ５５（３０回を超える継代）がＴＭＺ感受性になり得ること確立した。インビボＧ５５異種移植データに関して、本発明者らは、低継代Ｇ５５細胞株（１０回未満の継代）を使用し、これは、本発明者らのインビトロ研究で使用したものと同様の継代であった。
【０１８７】
様々な濃度のＯＫＮ−００７から、１ｍＭ濃度のＯＫＮが、いくつかの細胞株（例えば、ＬＮ２２９、Ｕ１３８、Ｇ５５）の２ｍＭ濃度と比較して、細胞生存率の低下に同様に効果的であった一方、他の細胞株（例えば、Ｕ２５１、Ｔ９８、ＬＮ１８）に関して、２ｍＭ  ＯＫＮは、１ｍＭ濃度と比較して、細胞生存率の低下に僅かにより効果的であったと結論付けた。
【０１８８】
タンパク質レベルは、ＴＭＺが、全ての細胞中でＨＩＦ−１αを上昇させ、ほとんどの細胞（ＬＮ２２９を除く）中でＭＧＭＴを上昇させ、Ｔ９８及びＵ２５１細胞中のみでＭＰＧを上昇させることを示すようである。ほとんどの細胞に対するＯＫＮ−００７は、（未処置細胞と比較して）ＨＩＦ−１αタンパク質に影響を与えないようであり、ＯＫＮ−００７はそれ自体、（未処置細胞と比較して；ＬＮ１８を除く）ＭＧＭＴのタンパク質レベルに影響を与えないようであり、及びＭＰＧは、ＯＫＮ処置のみによってＴ９８細胞中でまだ上昇する。興味深いことに、ＨＩＦ−１ａは、Ｕ２５１、Ｕ１３８、及びＴ９８細胞中でＴＭＺによって誘発された後、ＯＫＮ−００７によって減少した。併用ＴＭＺ＋ＯＫＮは、（Ｕ１３８細胞を除いて）ＨＩＦ−１αを上昇させ続けるようであり、ＭＧＭＴタンパク質レベルは、ＴＭＺ＋ＯＫＮ併用処置で実質的に変化せず、及びＭＰＧは、ＴＭＺ＋ＯＫＮ併用処置によりＵ２５１細胞中でまだ上昇する一方、他の細胞は、（ＴＭＺ、ＯＫＮまたはＴＭＺ＋ＯＫＮ併用処置のいずれかから）実質的に影響を受けない。具体的には、Ｕ２５１、Ｔ９８、及びＧ５５細胞中で、ＭＧＭＴのレベルは、ＴＭＺにより増加したが、ＯＫＮ−００７の処置は、ＭＧＭＴの発現を阻害しなかった。
【０１８９】
遺伝子レベルで、ＴＭＺ処理細胞に関して、ＨＩＦ−１α遺伝子発現比は、（未処置細胞と比較して）全ての細胞で増加する。ＴＭＺ＋ＯＫＮ併用処置は、いくつかの細胞（例えば、ＬＮ２２９、ＬＮ１８、Ｕ１３８及びＧ５５）中で、ＴＭＺのみよりもＨＩＦ−１α遺伝子発現比の増加をもたらすが、全体的に、併用療法によるＨＩＦ−１αに対する任意の大幅な減少効果はないようである。Ｔ９８中で併用療法によるＨＩＦ−１α遺伝子発現の低下が注目されるが、有意ではなかった。ＯＫＮのみは、未処置細胞と比較して、Ｔ９８  ＧＢＭ細胞中のＨＩＦ−１α遺伝子発現比のみを減少させるようである。Ｕ１３８及びＵ２５１に対するＯＫＮ処置のＨＩＦ−１α遺伝子発現比は、（未処置細胞と比較して）まだ増加するようである。タンパク質レベルとは異なり、ＯＫＮ−００７によるＨＩＦ−１αの減少は、遺伝子レベルではない。Ｔ９８細胞中でのみＯＫＮ−００７の減少効果があった。ＨＩＦ−１α遺伝子発現比は、細胞中の正常酸素状態と比較して、腫瘍（インビボ）中などのより低酸素の環境で異なり得る。
【０１９０】
３つのみの細胞株（Ｕ２５１、Ｔ９８、ＬＮ１８）中で、ＴＭＺのみまたはＴＭＺ＋ＯＫＮ併用に対するＭＧＭＴ遺伝子発現比の僅かな増加のみがあり、これは検出可能なレベルであった。ＯＫＮ処置のみで、Ｕ２５１細胞中でＭＧＭＴ遺伝子発現比を僅かに増加させたが、（未処置細胞と比較して）ＬＮ１８及びＴ９８細胞中でＭＧＭＴ遺伝子発現比を逆に減少させた。ＯＫＮに関して、これらの結果は、ＯＫＮのみで、ＭＧＭＴ遺伝子発現を減少させて、ＧＢＭ細胞に対する耐性を低下させることができることを示し得る。
【０１９１】
ＴＭＺ処置細胞中のＭＰＧ遺伝子発現比は、（タンパク質レベルとは異なり）３つの細胞株（Ｇ５５、ＬＮ１８及びＵ１３８）中で２倍超に上昇した。併用療法により、４つの細胞株（Ｇ５５、ＬＮ２２９、ＬＮ１８及びＵ１３８）中で、（未処置細胞と比較して）ＭＰＧ遺伝子発現比が上昇した。興味深いことに、ＯＫＮ処置のみは、（未処置細胞と比較して）２つの細胞株（Ｇ５５及びＵ１３８）のＭＰＧ遺伝子発現比を上昇させ続け、２つの他の細胞株（ＬＮ１８、Ｔ９８）のＭＰＧ遺伝子発現比をいくらか減少させた。ＯＫＮ−００７によるＭＧＴの減少は観察されなかった。
【０１９２】
ＬＮ１８  ＧＢＭ細胞のＲＮＡシークエンシングデータから、興味深いアップレギュレート遺伝子は、ＲＮＦ１４９（ｐ５３応答を増幅し、細胞周期を停止させるストレスセンサー遺伝子）、ＩＤＯ−１（ヒト神経膠腫に関与する）、及びＳＬＣ１４ａ２（ＳＴＡＴ３の活性化を負に調節するｍＴＯＲＣ２（ＵＴ２）の上流の内因性膜貫通タンパク質）である。興味深いダウンレギュレート遺伝子には、ＳＵＭＯ２（脳虚血及び低酸素症などの状態におけるＳＵＭＯの過剰発現は、細胞生存率を増加させることができた一方、ＳＵＭＯ発現のノックダウンは、細胞に毒性であることが証明され；耐性神経膠腫細胞中で、ＴＧＦβ１と関連する）（Ｙｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ／Ｈ１．２（ヒストンＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃのノックダウンは、高グルコース誘発炎症及び細胞毒性を阻害する）、及びＰＦＮ１（プロファイリング−１リン酸化は、ヒト神経膠腫における腫瘍攻撃性と関連する）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が含まれる。
【０１９３】
ＬＮ２２９細胞のＲＮＡシークエンシングデータから、興味深いダウンレギュレート遺伝子は、ＥＧＲ１（腫瘍がＥＲ陽性及びＨＥＲ２陽性である患者の無病生存期間の減少と関連する；ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路は、薬物耐性に非常に関連する）、ＸＩＳＴ（生存率低下及び予後不良と関連するレベルの増加）、及びＰＲＫＤＣ（乳癌患者における化学療法抵抗性の予後バイオマーカー）である。興味深いアップレギュレート遺伝子には、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（炎症の重要な負の調節因子）、ＲＮ７ＳＫ（潜在的な抗増殖及び腫瘍抑制機能）、ＳＵＮ−２、及びＫＬＨＬ２１が含まれる。
【０１９４】
さらなるバイオインフォマティクス分析から、ＦＯＳは、最もロバストなダウンレギュレーションを有し、これは、全ての細胞株、及び全ての治療条件ＴＭＺ、ＯＫＮ、及びＴＭＺ＋ＯＫＮにわたって、並びにデータを各治療条件に分けるかまたは細胞株を分ける場合に、ＯＫＮ効果として観察することができる。ＦＯＳは、細胞生存率を減少させて、かつ、放射線を介して、膠芽腫をＤＮＡ損傷に感受性にさせるのに十分であることも観察されているため、これは同様に、ＴＭＺがＤＮＡ損傷を引き起こすことに役立ち得る可能性がある（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１９５】
ＭＧＭＴは、しかしながら、ＬＮ２２９の条件の多くで有意に変化せず、ｌｏｇ２倍率変化は、約３であり、ｐ値は、約０．０５７であった。
【０１９６】
ＴＭＺ耐性と関連し得、ＯＫＮ＋ＴＭＺ併用処置が影響を及ぼし得る他のＭＯＡには、ＴＧＦ−β１（Ｙｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、及びまた恐らくは、Ａｋｔ（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、及びマクロファージ（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）が含まれる。ＯＫＮで処置したＦ９８ラット神経膠腫の本発明者らのマイクロアレイ評価では、ＴＧＦ−β１は、ＴＧＦ−β１に一般的に連結する５７個の遺伝子をダウンレギュレートすることによって、ＯＫＮ有効性に対するＭＯＡに大きな役割を果たした。恐らく、ＯＫＮ＋ＴＭＺ併用処置において、ＯＫＮは、ＴＧＦ−β１に影響を及ぼし、ＴＭＺ耐性細胞への応答を誘発する。
【０１９７】
ＯＫＮ−００７処置対未処置ラットＦ９８神経膠腫ＲＮＡのマイクロアレイ分析から、ダウンレギュレート遺伝子は、インテグリン及びコラーゲンファミリーのメンバーを主に含み、細胞外マトリックス１及び細胞接着で強化されることが確立された。ＯＫＮ−００７で処置した腫瘍組織の細胞生存率は減少した一方、細胞死は、ＡＮＧＰＴ２、ＤＬＬ４、ＨＰＸ、ＩＧＦ１及びＴＧＦＢ１遺伝子のダウンレギュレーションを介して増加した。「血管新生」は、ＯＫＮ−００７処置試料中でも減少した。いくつかの免疫応答遺伝子は、特にダウンレギュレートされ、ＬＢＰ（リポ多糖結合タンパク質）は、最もダウンレギュレートされた。
【０１９８】
最後のエクソンがダウンレギュレートされたＴＧＦＢ１は、５７個の遺伝子のマスターレギュレーターであった。それは、上述のほぼ全てのプロセスに関与し、そのようなものは、ＯＫＮ−００７によってダウンレギュレートされた主要な上流調整因子として考えられ得る。
【０１９９】
インテグリン及びコラーゲンに加えて、細胞外マトリックス糖タンパク質の注目すべき群があり、例えば、ルミカン（ＬＵＭ）、フィブリリン１及び５（ＦＢＮ１）、ラミニン（ＬＡＭＡ２）である。それらの全てはダウンレギュレートされるが、しかしながら、マトリックスメタロペプチダーゼ３（ＭＭＰ３）、全ての上述のタンパク質を分解する酵素、ＡＤＡＭＴＳ９及びＰＲＳＳ２、他のペプチダーゼもダウンレギュレートされる。悪性腫瘍の血管内皮細胞で発現されるが、正常な血管では発現されないＣＤ２４８は、ダウンレギュレートされる。これは、細胞外マトリックス維持及び再構築が、未処置神経膠腫試料中で活性であり、ＯＫＮ−００７処置によって正常化されることを示唆している。
【０２００】
他の機能の中で細胞接着及び遊走を調節する、ＴＧＦＢ１及びＴＧＦベータタンパク質のメンバーであるＬＴＢＰ２（潜在型形質転換成長因子ベータ結合タンパク質）もまた、ダウンレギュレートされる。同様に、ＰＯＳＴＮ（ペリオスチン）及びＬＵＭ（ルミカン）などの他の細胞接着関連分子もダウンレギュレートされる。Ｆ１１ｒ（Ｆ１１受容体）、免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子メンバー（細胞接着、細胞−細胞相互作用、及びタイトジャンクションの形成に重要な調節因子である）もまた、ダウンレギュレートされる。まとめると、細胞接着がダウンレギュレートされることが暗示される。
【０２０１】
ＬＢＰ（リポ多糖結合タンパク質）は、最も強くダウンレギュレートされた免疫関連遺伝子であり、そのエクソンの大部分は、ダウンレギュレートされる。この遺伝子は、グラム陰性８細菌感染に対する急性期免疫反応に関与する。ＤＭＢＴ１（悪性脳腫瘍１で欠失）は、腫瘍細胞と免疫系の相互作用に役割を果たす。サイトカイン受容体ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ６及びＩＬ３１ＡＲとヘテロ二量体化するオンコスタチンＭ受容体（ＯＳＭＲ）、インターフェロン（アルファ、ベータ、及びオメガ）受容体１（ＩＦＮＡＲ１）、及びＦ１１受容体は、全てダウンレギュレートされる。
【０２０２】
全体として、ダウンレギュレート遺伝子によって過剰呈示されるプロセスは、異常調節される未処置の神経膠腫試料とは対照的に、正常な状態に戻されるように思われる。例えば、単一エクソンＣＤ２４８遺伝子は、悪性腫瘍（及びこの研究から未処置神経膠腫試料）で高発現される。ＣＤ２４８は、ＯＫＮ−００７処置試料でダウンレギュレートされ、腫瘍細胞が正常な状態に逆転されることを示唆している。
【０２０３】
神経膠腫は、侵襲性の高い腫瘍であるため、本発明者らはまた、マイクロ流体チャンバーを使用して、ＯＫＮ−００７が、細胞増殖、血管新生の増加及びアポトーシスの増加に役割を果たすだけでなく（Ｔｏｗｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、神経膠腫細胞遊走／浸潤の阻害にも役割を果たす（Ｓｚｏｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）かどうかを確認した。本発明者らは、ＯＫＮ−００７が、遊走速度を有意に低下させたことを示した。神経膠腫細胞浸潤は、神経膠腫細胞と、異なる下流遊走経路を刺激するフィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、テネイシン−Ｃ及びフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス成分との相互作用に依存する（Ｄｅｍｕｔｈ  ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｓ，２００４）。
【０２０４】
ＴＧＦ−β１は、ＴＭＺ耐性に主な役割を果たすため（Ｙｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、ＯＫＮ−００７は、ＴＧＦ−β１を標的化することによって、ＴＭＺ耐性に実際に影響している可能性がある。ＬＮ１８  ＲＮＡシークエンシングデータにおける追加のサポートデータは、ＴＧＦ−β１  ＴＭＺ耐性と関連するＳＵＭＯ２が、（ＴＭＺのみと比較して）ＯＫＮをＴＭＺと組み合わせる場合にノックダウンされることも示す。
【０２０５】
インビトロＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ併用処置研究に基づいて、今後の研究について、以下のバイオマーカー、ＨＩＦ−１α、ＴＧＦβ１、ｃ−ＦＯＳ、ＰＦＮ−１、ＳＵＭＯ２は全て、ＴＭＺと組み合わせた場合に、ＯＫＮ−００７が、ＴＭＺ耐性に相乗的に影響を与え得る役割に関与し得る、潜在的に重要な分子成分であるとして、さらに追及する必要がある。
【０２０６】
Ｕ２５１及びＵ８７細胞株に関する先行研究では、組織培養から生成した遺伝子発現プロファイルが、皮下（ｓ．ｃ．）移植した腫瘍から生成したものと有意に異なり、これは、大脳内（ｉ．ｃ．）で増殖させたものと有意に異なったことに留意すべきである。ｉ．ｃ．遺伝子発現プロファイルと、ｓ．ｃ．異種移植から生成したものとの間の不均衡は、インビボの成長環境が遺伝子発現を改変する一方、同所性の成長条件が、異なるセットの改変を誘発することを示唆する（Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これは、適切なモデルを用いて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を正しく表することの重要性を暗示する。
【０２０７】
結論として、ＯＫＮ−００７は、細胞外マトリックス及び細胞浸潤と関連する重要な遺伝子のダウンレギュレーションを介して腫瘍原性ＴＧＦβ１経路を標的化することによってそのままで有効になる得るだけでなく、ＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞／組織に対する効果も誘発し得る、興味深い抗神経膠腫剤である。ＯＫＮ−００７＋ＴＭＺ併用処置と関連するＭＯＡは、ＨＩＦ−１α、ＭＧＭＴまたはＭＰＧにいずれかを介して発生するようではない。ＯＫＮ−００７自体は、これらの遺伝子のいくつか、及びＧＢＭ細胞のいくつかのタンパク質を減少させたが、大部分のＧＢＭ細胞は、ＯＫＮ−００７または併用処置群の両方で、影響を受けないまたはレベルが上昇した、のいずれかであった。ＲＮＡシークエンシング分析は、ＴＭＺと組み合わせた場合に、ＯＫＮ−００７が、ＴＭＺ耐性にどのように役割を果たし得るのかに関する他に考えられるＭＯＡにいくつかの洞察を提供し、これらは、さらに追及する必要があろう。ＯＫＮ−００７とＴＭＺの併用は、ＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞が増殖することを防ぎ、恐らくは、ＴＭＺの効果を拡張し得る有望な治療戦略のようである。
【０２０８】
本明細書に開示し、特許請求する組成物及び方法は全て、本開示に照らせば過度の実験を行うことなく調製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者であれば、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び方法並びに方法の段階または一連の段階において変更を適用することができることが明らかであると思われる。より具体的には、化学及び生理学両方の面で関連するある特定の物質を本明細書に記載の物質と置き換えてもよく、同じまたは類似の結果が得られることが明らかであると思われる。そのような当業者には明らかな類似の置換及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると思われる。
【０２０９】
引用文献
以下の引用文献は、それらが本明細書に示すものの補助となる例示的方法または他の詳細を提供する程度に、特に参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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