(57)【要約】  対象において治療細胞を移植する方法、および対象に移植する前に対象に移植する膵島細胞を調製する方法が本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に治療細胞を移植する方法であって、
ａ．前記治療細胞を、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて治療細胞混合物を作製すること、
ｂ．前記治療細胞混合物を前記対象の器官の表面に適用すること、
ｃ．前記細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を、前記治療細胞混合物を覆って前記器官の前記表面に適用すること、
ｄ．前記細胞マトリックス対の前記第１の要素の供給源を、前記治療細胞混合物を覆って前記器官の前記表面に適用し、これにより治療細胞足場を形成することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療細胞が治療作用物質を産生し、分泌する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記治療作用物質が、ペプチド、血液因子、ホルモン、増殖因子、またはサイトカインである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が前記治療作用物質の欠乏症を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記治療作用物質がインスリンまたはインスリン類似体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療細胞が、膵島細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、またはインスリンもしくはインスリン類似体を産生し、分泌するように遺伝子改変された細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞マトリックス対がトロンビンおよびフィブリノゲンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞マトリックス対の前記第１の要素の前記供給源が血漿である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血漿が前記対象に対して自己である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象から血漿を採取することを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象から血漿を採取する前に、前記対象に、ω−３脂肪酸、抗炎症薬、免疫調節分子、増殖因子、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を投与することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血漿が、多血小板血漿（ＰＲＰ）、抗炎症因子、血管新生促進因子、増殖因子、またはこれらの組み合わせを豊富に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞マトリックス対の前記第２の要素の前記供給源が、組換えヒトトロンビンである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の要素がトロンビンであり、前記第２の要素の前記供給源が血漿である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記器官が中皮性の器官である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記中皮性の器官が腹膜である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記中皮性の器官が、肝臓、膵臓、または消化管の器官である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記中皮性の器官が網である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
腹腔鏡下で前記網の軸に沿って前記治療細胞混合物を層状にすることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記軸に沿って前記網の反対側を折り畳んで前記網の前記治療細胞足場を包むことを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療細胞を血漿と組み合わせて治療細胞混合物を形成すること、前記治療細胞混合物を前記対象の前記網の前記表面に適用すること、トロンビンを、前記治療細胞混合物を覆って適用すること、および血漿を前記治療細胞混合物および前記トロンビンを覆って適用することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が代謝疾患に罹患している、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝疾患が糖尿病または肥満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｉ型糖尿病が重篤な低血糖を伴って生じる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が、外因性インスリン治療により代謝疾患を治療されている、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療細胞が前記対象に移植された後にインスリン治療を中止することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、前記膵島細胞を内皮由来エキソソームまたは内皮細胞と共に培養することを含む方法。
【請求項３１】
前記内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であるか、または前記内皮由来のエキソソームがＨＵＶＥＣ由来のエンドソームである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記膵島細胞がヒト膵島細胞である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
約１０００〜５０００個の膵島細胞が、ｍｌ当たり約１０４〜約１０６個の内皮細胞または約１０１０〜約１０１５個のエキソソームと共に培養される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記膵島細胞を内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞と共に少なくとも約２４〜約４８時間培養することを含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記膵島細胞を内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞と共に少なくとも約３〜６日間培養することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記膵島細胞を内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞と共に少なくとも約１〜約２週間培養することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、前記膵島細胞を前記対象に移植する前に、前記膵島細胞を内皮由来のエキソソームの内容物と共に培養することを含む方法。
【請求項３８】
対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、前記膵島細胞を前記対象に移植する前に、前記膵島細胞を、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ラミニン、コラーゲン、インスリン増殖因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ−２）、ＣＤ４０、ＩＧＦＢＰ−１、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦα、ｃＩＡＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＮＦβ、ＣｙｔｏＣ、ＩＧＦＢＰ−４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ｂａｄ、ＩＧＦ−１  ｓＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、ＨＳＰ６０、ｐ２７、カスパーゼ８、ＩＧＦ−２、またはこれらの組み合わせと共に培養することを含む方法。
【請求項３９】
対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、前記膵島細胞を、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来のエキソソームまたはＭＳＣと共に培養することを含む方法。
【請求項４０】
前記ＭＳＣが脂肪由来のＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＳＣがＣＤ１４６を発現する、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＭＳＣが炎症制御因子によって刺激される、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記膵島細胞をＭＳＣ由来のエキソソームまたはＭＳＣと共に少なくとも約２４〜約４８時間培養することを含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記膵島細胞をＭＳＣ由来のエキソソームまたはＭＳＣと共に少なくとも約３〜６日間培養することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、前記膵島細胞を前記対象に移植する前に、前記膵島細胞をＭＳＣ由来のエキソソームの内容物と共に培養することを含む方法。
【請求項４６】
対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、前記膵島細胞を前記対象に移植する前に、前記膵島細胞を、ＩＧＦＢ−１、ＩＧＦＢ−２、ＩＧＦＢ−３、ＩＧＦＢ−４、ＩＧＦＢ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、エオタキシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮγ、ＣＣＬ１、ＭＣＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、またはこれらの組み合わせと共に培養することを含む方法。
【請求項４７】
膵島細胞を対象に移植する方法であって、
ａ．請求項３０〜４６のいずれか一項に記載の方法により前記膵島細胞を調製すること
ｂ．工程（ａ）で調製された膵島細胞を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて、治療細胞混合物を作製すること
ｃ．前記治療細胞混合物を前記対象の器官の表面に適用すること、および
ｄ．前記細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を、前記治療細胞混合物を覆って前記器官の前記表面に適用し、これにより、治療細胞足場を形成すること、を含む方法。
【請求項４８】
膵島細胞を対象に移植する方法であって、
ａ．膵島細胞を支持細胞組成物および細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて、治療細胞混合物を作製すること、
ｂ．前記治療細胞混合物を前記対象の器官の表面に適用すること、および
ｃ．前記細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を、前記治療細胞混合物を覆って前記器官の前記表面に適用し、治療細胞足場を形成すること、を含む方法。
【請求項４９】
前記支持細胞組成物が内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記支持細胞組成物が、免疫調節細胞、幹細胞、微細化された脂肪細胞クラスター、骨髄由来単核細胞、脂肪由来間質血管細胞群の細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、造血前駆細胞、単球、白血球、線維芽細網間質細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む脂肪組織部分、またはこれらの細胞混合物を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫調節細胞がＴｒｅｇ細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記幹細胞が、ＭＳＣ、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、内皮前駆細胞、またはこれらの細胞混合物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
血漿を、前記治療細胞混合物を覆って前記器官の前記表面に適用する工程を更に含む、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記トロンビンを適用した後に血漿を前記器官の前記表面に適用する工程を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療細胞が、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、ナノカプセル化、またはコンフォーマルコーティングされている、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療細胞が前記支持細胞組成物と共にカプセル化されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療細胞が前記支持細胞組成物とは別にカプセル化されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法により前記対象に細胞を移植する工程を含む、糖尿病を有する対象の外因性インスリン要求性（ＥＩＲ）を低減する方法。
【請求項５９】
正常血糖を回復させる必要がある対象において正常血糖を回復させる方法であって、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法により前記対象に細胞を移植する工程を含む方法。
【請求項６０】
対象においてインスリン離脱を引き起こすかまたはインスリン抵抗性を低減する方法であって、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法により前記対象に細胞を移植する工程を含む方法。
【請求項６１】
対象において体重減少を引き起こす方法であって、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法により前記対象に細胞を移植する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２５日に出願の米国仮出願第６２／４７６，７４２号の優先権を主張し、それはその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
肝内膵島移植は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および無自覚性低血糖を有するか、または手術に起因する糖尿病（膵切除）を有する患者の治療を目指す膵島移植臨床試験のための最も信頼できる移植方法である（１）。肝内膵島移植は、インスリンを離脱していない場合であっても、ヘモグロビン１ｃの正常化、血糖管理の改善、および重篤な低血糖事象の消失をもたらした（２）。臨床試験において肝内膵島移植の何年も後に進行性の移植片機能不全が観察され、多くの場合、外因性インスリンの再導入を必要とした。長期の肝内膵島機能不全は、前臨床モデルでも観察された（３）。即時型血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の活性化および肝内膵島による塞栓形成後の移植片微小環境における低酸素が、機能損傷および移植された膵島の大部分の喪失に寄与する（４〜７）。更に、経口投与された薬物の肝初回通過により肝内膵島がより高濃度の糖尿病誘発性の免疫抑制剤に曝露される。この状況における他の潜在的な困難にする要因としては、肝実質における島周囲脂肪の蓄積（微小脂肪変性）が挙げられる（８〜１３）。更に、ＩＢＭＩＲに加えて、消化管を通して吸収されたエンドトキシンおよび他の炎症誘発性薬剤への肝内膵島の慢性曝露は、急性および慢性拒絶エピソードのより高い発症率に関連することが知られている適応免疫応答を引き起こし得るだけでなく、場合によってはＴ１Ｄを有する移植された対象において自己免疫の再発を促進する（２）。
【０００３】
膵島移植のための肝臓外の部位を開発する最終目的は、膵内分泌部からの分泌物の生理的門脈ドレナージを提供する能力だけでなく、レシピエントの慢性的な免疫抑制の必要性を回避することができる成功裡の生物学的置換戦略の開発のために移植片微小環境の操作を可能にすることである（１４、１５）。このような部位の理想的な特徴としては、比較的大容量の組織（例えば、低純度またはカプセル化されたインスリン産生細胞製剤）を収容し、侵襲性が最小限の移植手順を可能にし、非侵襲性の縦断的なモニタリング、および移植片生検および／または回収のためのアクセス、ならびに門脈系を通した生理的静脈ドレナージを可能にするのに十分な空間を含む（１４，１５）。報告によれば更なる利点は、大循環により還流される器官に対して門脈により還流される器官での、膵臓移植片のより低い拒絶率に関連した門脈系を通して送達される抗原の免疫調節効果（門脈寛容）である（１６）。
【０００４】
上記を考慮すると、膵島移植の改善された方法が当該技術分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
治療細胞を移植する方法が、有利には、Ｉ型糖尿病などの代謝疾患の長期治療をもたらすことができることを実証するデータが本明細書において提供される。このようなデータにより、本明細書に記載の方法の実施によって、正常血糖の長期回復および低血糖エピソードなしに外因性インスリン治療から離脱することをヒト対象で成功裡に達成することができることが裏付けられる。また本明細書において提供されるデータは、本開示の方法により調製される治療細胞がグルコース刺激性インスリン分泌の増加をもたらすことを実証し、対象の代謝疾患を治療する安全な手段を提供するのに更に役立つ。
【０００６】
本開示は、対象に治療細胞を移植する方法を提供する。代表的実施形態では、治療細胞は、治療作用物質（例えば、インスリン）を産生し、分泌する。代表的実施形態では、本発明の対象に治療細胞を移植する方法は、治療細胞を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて治療細胞混合物を作製すること、当該治療細胞混合物を対象の器官の表面に適用すること、当該細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を当該治療細胞混合物を覆って当該器官の当該表面に適用すること、および当該細胞マトリックス対の当該第１の要素の供給源を当該治療細胞混合物を覆って当該器官の当該表面に適用し、これにより、治療細胞足場を形成することを含む。
【０００７】
また本開示は、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法も提供する。例示的な態様では、本発明の方法は、膵島細胞を内皮由来エキソソームまたは内皮細胞と共に培養することを含む。
【０００８】
本開示は、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法を更に提供する。代表的実施形態では、本発明の方法は、膵島細胞を対象に移植する前に膵島細胞を内皮由来エキソソームの内容物と共に培養することを含む。したがって、代表的な例では、本発明の方法は、膵島細胞を対象に移植する前に膵島細胞を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ラミニン、コラーゲン、インスリン増殖因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ−２）、ＣＤ４０、ＩＧＦＢＰ−１、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦα、ｃＩＡＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＮＦβ、ＣｙｔｏＣ、ＩＧＦＢＰ−４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ｂａｄ、ＩＧＦ−１  ｓＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、ＨＳＰ６０、ｐ２７、カスパーゼ８、ＩＧＦ−２、またはこれらの組み合わせと共に培養することを含む、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法である。
【０００９】
更に、対象の膵島細胞を含む組成物であって、当該膵島細胞が本明細書において開示される方法によって生成される組成物が提供される。また本開示は、本明細書において開示される方法によって生成される膵島細胞を移植する方法を提供する。
【００１０】
本開示は、膵島細胞を支持細胞組成物および細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて治療細胞混合物を作製すること、当該治療細胞混合物を対象の器官の表面に適用すること、および当該細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を当該治療細胞混合物を覆って当該器官の当該表面に適用し、これにより治療細胞足場を形成することを含む、対象に膵島細胞を移植する更に別の方法を提供する。代表的な例では、本発明の方法は、上記細胞マトリックス対の上記第１の要素の供給源を上記治療細胞混合物を覆って上記器官の上記表面に適用することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】生物学的足場内の網内膵島移植を実証する。Ａ：移植処置の模式図Ｂ：ラットでの処置Ｃ：ＮＨＰでの処置正中開腹（ｂ１）後、網を穏やかに露出させて、広げる（ｂ２およびｃ１）。自己血漿中に再懸濁した膵島移植片（ｃ２）を、網上に穏やかに分散させる（ｂ３およびｃ３）。組換えヒトトロンビンを大網表面の膵島上へと添加してゲル形成を引き起こし（ｃ４）、次いで、網を折り畳んで移植片の血管が分布する網への接触を増やす（ｂ４およびｃ５）。移植片除去時に移植片領域をより容易に確認するために、非吸収性の縫合糸によりＮＨＰにおける移植片の外縁部を縫合した（ｃ５）。
【図２】生物学的足場のインビトロでの走査型電子顕微鏡写真を示す。Ａ：血漿／トロンビン混合物。フィブリンは、重合した複雑な三次元網目構造を形成する（棒＝５μｍ）。Ｂ：培養培地中の未処理のヒト膵島細胞の表面（棒＝５０μｍ）。Ｃ：生物学的足場内に埋め込まれたヒト膵島重合したフィブリンは、膵島表面周囲に相似マトリックスを形成する（棒＝５０μｍ）。
【図３】生物学的足場へと移植された網内膵島が糖尿病ラットにおいて正常血糖を回復させることを実証する。Ａ：糖尿病の迅速な回復およびＰＯＤ７４（ｎ＝１）または２４０（ｎ＝４）での網の移植片除去後の高血糖（矢じり）を示す、３，０００ＩＥＱ（１７，３３８±８８１ＩＥＱ／ｋｇ）が網上に移植された糖尿病ラットにおける非絶食時血糖値（ｎ＝７；１７３．４±９１ｇ体重）。Ｂ：移植の２ヵ月後に選択された動物（ｎ＝３）において実行されたＩＶＧＴＴの間の無処置の動物（ｎ＝３）と比較した血糖プロフィール。示される値は、平均±ＳＤである。挿入図は、各群の曲線下面積（ＡＵＣ）（ｍｇ×分×ｄＬ−１）を示す。Ｃ：移植された動物（ｎ＝５）において移植の１１週間後（●）および２６週間後（○）に実行されたＯＧＴＴの間の血糖プロフィール。挿入図は、グルコース負荷の間のＡＵＣ（ｍｇ×分×ｄＬ−１）を示す。Ｄ−Ｇ：網内膵島移植片の代表的な組織病理学的パターン。切片は、ＰＯＤ７６に外植された網内膵島移植片から得た。Ｄ：ヘマトキシリン−エオシン染色。Ｅ：マッソン三重染色。ＦおよびＧ：抗インスリン（ＩＮＳ）（赤色蛍光）、抗ＧＣＧ抗体（緑色蛍光）（Ｆ）、抗ＳＭＡ（緑色蛍光）（Ｇ）および核色素のＤＡＰＩ（青色蛍光）で染色された切片の免疫蛍光顕微鏡検査。ボックスは、左パネルでより高い倍率で示される移植片領域を示す。ｗｋ、週。
【図４】肝内膵島および生物学的足場へと移植された網内膵島の同等の機能を実証する。同一のバッチ単離分からの膵島を用いて網内の生物学的足場内に（Ａ）（●、ｎ＝７）または肝臓へと（門脈を介して）（Ｂ）（○、ｎ＝５）１，３００ＩＥＱ（〜８，２００ＩＥＱ／ｋｇ体重）の臨床的に関連する同系膵島塊を移植された糖尿病ラットにおける非絶食時血糖値。上記群は糖尿病の回復について同じ経時変化を有し、移植８０日後での網内生物学的足場の除去は、高血糖の再発（Ａの矢じり）をもたらした。全ての移植された動物において移植の５週間後（Ｃ）または１１週間後（Ｄ）に実行されたＯＧＴＴの間の血糖プロフィール。挿入図は、各群についてのグルコース負荷の間のＡＵＣ（ｍｇ×分×ｄＬ−１）を示す（ｗｋ、週）。
【図５】網内生物学的足場および肝内同系膵島のラットレシピエントの血清中の検出されたバイオマーカーを実証する。同系ドナーラット膵島の同一バッチからの１，３００ＩＥＱのアリコートが、網内の生物学的足場（網［○］）または肝内部位（肝臓［●］）内に並行して移植された。血液試料は、循環血液中のバイオマーカーレベルを検出するために留置ＪＶＣから回収した。示されるデータは、平均±ＳＥＭ（時点当たりｎ＝４〜７）である。ＡおよびＢ：移植１時間後に評価された代謝マーカー。Ａ：μｇ／ｍＬでのインスリン（＊Ｐ＝０．０１８）。Ｂ：μｇ／ｍＬでのＣ−ペプチド。以下の炎症マーカーを移植２４時間後に評価した：ｐｇ／ｍＬ（Ｃ）でのＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ｐｇ／ｍＬ（Ｄ）でのＩＬ−６、（Ｅ）ｐｇ／ｍＬでのレプチン（＊Ｐ＝０．０１３）、μｇ／ｍＬでのハプトグロビン（Ｆ）、および（Ｇ）μｇ／ｍＬでのα２−マクログロブリン（＊＊Ｐ＜０．０３）。炎症バイオマーカーであるＭＣＰ−１／ＣＣＬ２（図５Ｃ）およびＩＬ−６（図５Ｄ）は、２４時間時点で実験群間で同等の増加を示し、両方の群において移植７２時間後に検出不可能な値を示した（示さず）。レプチンレベルは、肝内群のレシピエントにおいて２４時間で網内群と比較して有意に高かった（それぞれ、６３３±３１に対して４８３±３５ｐｇ／ｍＬ；Ｐ＝０．０１３）（図５Ｅ）。急性期タンパク質であるハプトグロビンのレベルは、両方の群（図５Ｆ）において同等であったが、α２−マクログロブリンのレベルは、２４時間で網内群に対して肝内膵島レシピエントで有意に高かった（１５５±２６ｐｇ／ｍＬに対して２８０±５８；片側ｔ検定：Ｐ＜０．０３）（図５Ｇ）。
【図６】高純度および低純度の膵島の糖尿病ラットへの網内移植を実証する。Ａ：＞９５％の純度（ｎ＝３）（１６７．３±１．５ｇ体重［１１，８５３±１０９ＩＥＱ／ｋｇ］）、または３０％の純度（ｎ＝３）（１７０．３±１０．５ｇ体重［１１，７７１±７２５ＩＥＱ／ｋｇ］）を有する臨床的に関連する２，０００ＩＥＱの同系膵島塊を網上に移植された糖尿病ラットにおける非絶食時血糖値。移植の＞１００日後での網移植片の除去（矢じり）は、高血糖の再発をもたらした。Ｂ：移植７０日後に高純度および低純度の膵島調製物を移植された動物において実行された経口ブドウ糖負荷試験の間の血糖プロフィール。
【図７】網内の生物学的足場が全身免疫抑制下の糖尿病ラットにおいて同種異系膵島の生着を補助することを実証する。抗リンパ球血清（−３日目に、０．５ｍＬを腹腔内投与）によるリンパ球枯渇の誘導およびミコフェノール酸（ＭＰＡ）（０〜１４日目は２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、次いで、２０日目まで１日おきに投与量の１／４の割合で漸減）およびＣＴＬＡ４Ｉｇ（０、２、４、６、８および１０日目ならびにその後週１回、１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与；アバタセプト）による維持からなる臨床的に関連する免疫抑制剤のプロトコール下で、雌の糖尿病Ｌｅｗｉｓラット（ＲＴ１ｌ）（ｎ＝４）が３，０００ＩＥＱのＷＦラット膵島（ＲＴ１ｕ）を網内生物学的足場に移植される、完全ＭＨＣ不一致の同種異系ラットの移植組合せ（矢印）。経過観察の間の各動物の非絶食時血糖値を示す。移植片拒絶は、高血糖状態の再発として定義された。各シンボルは、個々の動物を示す。
【図８】糖尿病の非ヒト霊長類における同種異系網内膵島移植を実証する。糖尿病カニクイザルは、臨床的に関連する免疫抑制治療に乗じて９，３４７ＩＥＱ／ｋｇの同種異系膵島を網に移植された。Ａ：外因性インスリン要求性（ＥＩＲ）（ＩＵ／ｋｇ／ｄａｙ）、ＦＢＧ（ｍｇ／ｄＬ）、およびＰＢＧ。Ｂ：経過観察期間にわたって上記動物において測定された空腹時Ｃ−ペプチド（ｎｇ／ｍＬ）レベル。Ｃ−Ｇ：移植後４９日目での網内膵島移植片の組織病理学的パターン。Ｃ：ヘマトキシリン−エオシン染色。Ｄ：インスリン（ＩＮＳ）（赤色）、ＧＣＧ（緑色）、および核色素（ＤＡＰＩ）（青色）に対する免疫反応性の評価のための免疫蛍光顕微鏡検査。Ｅ：インスリン（赤色）およびＣＤ３＋Ｔ細胞（ＣＤ３）（青緑色）についての免疫蛍光法。ＦおよびＧ：島内の新生血管形成。Ｆ：インスリン（赤色）、血管構造（ＳＭＡ）（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光法。Ｇ：インスリン（赤色）、内皮細胞（ｖＷＦ）（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光顕微鏡検査。
【図９】Ａ：時間の関数としての組織液グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。Ｂ：移植後の時間（日）の関数としての平均毛細血管血糖（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１０】（Ａ）ナノ粒子トラッキング解析および（Ｂ）透過型電子顕微鏡による内皮細胞由来のエキソソームの特徴付けを実証する。ＨＵＶＥＣ由来エキソソームとのインキュベーション後の（Ｃ）レシピエント細胞ＭＩＮ６細胞または（Ｄ）ヒト膵島でのＨＵＶＥＣ由来のエキソソーム（赤色に染色されるＲＮＡカーゴ）取り込みの免疫蛍光顕微鏡検査による検出。
【図１１】膵島細胞の形態を実証する。（Ａ）ヒト膵島は、単独で標準的な培養条件で１週間培養されたか、またはＨＵＶＥＣ細胞またはＨＵＶＥＣ由来のエキソソームと共培養された。（Ｂ）ヒト膵島対照の培養（７日目）、ＨＵＶＥＣと共培養した膵島（７日目）、およびＨＵＶＥＣ由来エキソソームと共培養した膵島（７日目）における１週間後の詳細な画像。画像は、３人の無関係のドナーからのヒト膵島を培養することによって観察される膵島の形態を代表する。１０ｘ倍率。
【図１２】膵島機能を実証する。（Ａ）対照膵島およびＨＵＶＥＣまたはＨＵＶＥＣ由来のエキソソームで処理された膵島におけるインスリン（赤色）、グルカゴン（緑色）およびＤＡＰＩ（４０、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；青色）について免疫蛍光染色の代表的画像。３２ｘ倍率。（Ｂ−Ｃ）２．２または１６．６ｍｍｏｌ／ｌのグルコースに曝露されたヒト膵島、ヒト膵島＋ＨＵＶＥＣ、およびヒト膵島＋ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームのグルコース刺激性インスリン放出アッセイ。培地中に放出されたインスリンのレベルが測定された。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤである（＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊ｐ＜０．０５；ｎｓ（有意でない））。
【図１３Ａ−Ｃ】ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のヒトアポトーシスプロテオームプロフィールアレイの定量分析を実証する。ＨＵＶＥＣ（Ａ）およびＨＵＶＥＣ由来エキソソーム（Ｂ）についてのアレイにおけるアポトーシスタンパク質の発現の代表的画像を示す。Ｒａｙ  Ｂｉｏ  Ｈｕｍａｎアポトーシスアレイキット上でスポットされる正確なタンパク質抗体を示すテンプレート（Ｃ）。
【図１３Ｄ】結果を棒グラフ（Ｄ）として示し、データをアレイに特異的な陽性対照に標準化し、次いで、ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームをＨＵＶＥＣと比較して平均的な倍率変化を確認した。シグナル強度における任意の≧１．５倍の増加または≦０．６５倍の減少を発現の有意な差とみなした。
【図１４】（ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、（ｉｉ）ＭＳＣに由来するエキソソーム、もしくは（ｉｉｉ）ＭＳＣ条件培地、または対照と共培養した膵島細胞の刺激指数のグラフである。
【図１５Ａ−Ｂ】低用量または高用量のＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃによる刺激によりＡＤ−ＭＳＣによって発現された様々な炎症制御因子および増殖因子の濃度を示す一連のグラフである。
【図１５Ｃ】低用量または高用量のＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃによる刺激によりＡＤ−ＭＳＣによって発現された様々な炎症制御因子および増殖因子の濃度を示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、その必要がある対象に治療細胞を移植する方法を提供する。代表的実施形態では、本発明の方法は、治療細胞を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて治療細胞混合物を作製すること、当該治療細胞混合物を対象の器官の表面に適用すること、当該細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を当該治療細胞混合物を覆って当該器官の当該表面に適用すること、および当該細胞マトリックス対の当該第１の要素の供給源を当該治療細胞混合物を覆って当該器官の当該表面に適用し、これにより、治療細胞足場を形成することを含む。
【００１３】
治療細胞および治療作用物質
本明細書で使用する場合、用語「治療細胞」は、細胞が移植された対象に疾患、障害、もしくは医学的状態、またはそれらの症状の治療または処理を提供する細胞を指す。「移植する」は、対象の体に挿入するか、埋め込むか、接合するかまたは、配置することを意味する。治療細胞は、任意の真核生物（例えば、動物、哺乳動物、ヒト）、任意の種類の組織（例えば、肺、脳、心臓、皮膚、内皮、幹、免疫、血液、骨など）に由来し得、任意の発生段階（例えば、胚、成体）のものであり得る。
【００１４】
本開示の方法の代表的実施形態では、治療細胞は、治療作用物質を産生し、分泌する。本明細書において意図される治療作用物質の例としては、天然酵素、天然の供給源に由来するタンパク質、組換えタンパク質、天然ペプチド、合成ペプチド、環状ペプチド、抗体、受容体アゴニスト、細胞毒薬物、免疫グロブリン、β−アドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、冠血管拡張薬、強心配糖体、抗不整脈薬、心臓交感神経作動薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、利尿薬、変力物質、コレステロールおよびトリグリセリド低下薬、胆汁酸隔離剤、フィブラート、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ナイアシン誘導体、抗アドレナリン作動薬、αアドレナリン作動性遮断薬、中枢性抗アドレナリン作動薬、血管拡張薬、カリウム保持性利尿薬、チアジドおよび関連薬、ンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、末梢血管拡張薬、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗生物質、レチノイド、インスリンおよび類似体、αグルコシダーゼ阻害薬、ビグアニド、メグリチニド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、アンドロゲン、プロゲストーゲン、骨代謝制御因子、下垂体前葉ホルモン、視床下部ホルモン、下垂体後葉ホルモン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト、排卵促進薬、選択的エストロゲン受容体調節薬、抗甲状腺薬、甲状腺ホルモン、膨張性下剤、緩下剤、嬬動抑制薬、細菌叢修飾因子、腸内吸着剤、腸内抗感染薬、抗食欲減退薬、抗悪液質薬、抗過食薬、食欲抑制薬、抗肥満薬．制酸薬、上部消化管薬、抗コリン作用薬、アミノサリチル酸誘導体、生体応答調節因子、コルチコステロイド、抗痙攣薬、５−ＨＴ４部分アゴニスト、抗ヒスタミン薬、カンナビノイド、ドーパミン拮抗薬、セロトニン拮抗薬、細胞保護薬、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト、粘膜保護薬、プロトンポンプ阻害薬、ピロリ菌根絶治療薬、赤血球産生刺激薬、造血薬、貧血因子、ヘパリン、抗線維素溶解薬、止血薬、血液凝固因子、アデノシン二リン酸阻害薬、糖タンパク質受容体阻害薬、フィブリノゲン−血小板結合阻害薬、トロンボキサンＡ２阻害薬、プラスミノゲン活性化因子、抗血栓薬、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、コルチコステロイド、選択的免疫抑制剤、抗真菌薬、エイズ関連感染症、サイトメガロウイルス、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬、ヌクレオシド類縁体逆転写酵素阻害薬、プロテアーゼ阻害剤、貧血、カポジ肉腫、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、マクロライド、オキサゾリジノンエステル、ペニシリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、トリメトプリムおよび誘導体、テトラサイクリン、駆虫薬、殺アメーバ薬、ビグアニド、キナアルカロイド、葉酸拮抗薬、キノリン誘導体、ニューモシスチス・カリニ治療薬、ヒドラジド、イミダゾール、トリアゾール、ニトロイミダゾール、環状アミン、ノイラミニダーゼ阻害薬、ヌクレオシド、リン吸着薬、コリンエステラーゼ阻害薬、補助治療薬、バルビツール酸および誘導体、ベンゾジアゼピン、γアミノ酪酸誘導体、ヒダントイン誘導体、イミノスチルベン誘導体、スクシンイミド誘導体、鎮痙薬、���角アルカロイド、抗片頭痛薬、生体応答調節因子、カルバミン酸エステル、三環式誘導体、脱分極薬、非脱分極性薬、神経筋麻痺薬、中枢神経系興奮薬、ドーパミン作動薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、ＣＯＭＴ阻害薬、アルキルスルホネート、エチレンイミン、イミダゾテトラジン、ナイトロジェンマスタード類似体、ニトロソ尿素、白金含有化合物、代謝拮抗薬、プリン類似体、ピリミジン類似体、尿素誘導体、アントラサイクリン、アクチノマイシンド、カンプトセシン誘導体、エピポドフィロトキシン、タキサン、ビンカアルカロイドおよび類似体、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、非ステロイド性アロマターゼ阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬抗悪性腫瘍薬、アザスピロデカンジオン誘導体、抗不安薬、興奮薬、モノアミン再取り込み阻害薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、抗うつ薬、ベンズイソオキサゾール誘導体、ブチロフェノン誘導体、ジベンゾジアゼピン誘導体、ジベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルブチルピペリジン誘導体、フェノサイアジン、チエノベンゾジアゼピン誘導体、チオキサンテン誘導体、アレルゲンエキス、非ステロイド薬、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、キサンチン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタグランジン、肺表面活性剤、粘液溶解薬、細胞分裂阻止性物質、尿酸排泄薬、キサンチンオキシダーゼ阻害薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、メテナミン塩、ニトロフラン誘導体、キノロン、平滑筋弛緩薬、副交感神経作動薬、ハロゲン化炭化水素、アミノ安息香酸のエステル、アミド（例えば、リドカイン、塩酸アルチカインまたは塩酸ブピバカイン）、解熱薬、催眠薬および鎮静薬、シクロピロロン、ピラゾロピリミジン、非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、ｐ−アミノフェノール誘導体、アルコールデヒドロゲナーゼ阻害薬、ヘパリン拮抗薬、吸着薬、催吐薬、オピオイド拮抗薬、コリンエステラーゼ賦活薬、ニコチン代替治療薬、ビタミンＡ類似体および拮抗薬、カルニチン類似体および拮抗薬、ビタミンＣ類似体および拮抗薬、ビタミンＤ類似体および拮抗薬、ビタミンＥ類似体および拮抗薬、ビタミンＫ類似体および拮抗薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
治療作用物質は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチンを含むがこられに限定されないペプチド、血液因子、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子であり得る。本明細書における使用のための追加の増殖因子としては、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体αサブユニット、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在性トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体、ならびにキメラタンパク質およびその生物学的または免疫学的に活性な断片が挙げられる。代表的な態様では、治療作用物質は、インスリンまたはインスリン類似体である。本明細書で使用する場合、用語「インスリン類似体」は、インスリンの作用を模倣するように設計されている非天然分子を意味する。代表的な態様では、インスリン類似体は、構造的にインスリンと類似している。代表的な態様では、インスリン類似体は、���効型インスリン類似体、持効型インスリン類似体またはインスリン類似体の前混合物である。このようなインスリン類似体は、当技術分野において公知であり、例えば、Ａｓｐａｒｔ、Ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ、Ｌｙｓｐｒｏ、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、ＮｏｖｏＲａｐｉｄ（登録商標）、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）、Ｔｒｅｓｉｂａ、Ｈｕｍａｌｏｇ  Ｍｉｘ  ２５（登録商標）、Ｈｕｍａｌｏｇ  Ｍｉｘ  ５０（登録商標）、およびＮｏｖｏＭｉｘ  ３０（登録商標）を含む。インスリン類似体は、融合インスリン類似体（例えば、Ａｌｂｕｌｉｎ）であってもよい。例えば、Ｄｕｔｔａｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（１）：２５１−２５８（２００５）を参照のこと。
【００１６】
代表的な態様では、治療細胞は、膵島細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、ならびにインスリンまたはインスリン類似体を産生し、分泌するように改変された細胞である。インスリンまたはインスリン類似体を産生し、分泌するように改変された細胞は、当技術分野において公知である。例えば、ＷＯ２０１６／１７９１０６、ＣＮ１０２０５１３７２、ＣＮ１６６８３２４、ＣＮ１０１１６０３９０、ＵＳ２００４０１９１９０１、ＣＮ１０１７２４６０２、ＵＳ７０５６７３４、ＵＳ２０１４０２３４２６９、ＵＳ２００６０２８１１７４、ＵＳ２０１４０２５６０４３、ＣＮ１０１４３２４２５、ＵＳ２０１４０２４２０３８を参照のこと。代表的な態様では、治療細胞は、ｉＰＳＣから生成される膵島細胞である。例えば、Ｍｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ（Ｍａｒ  ２０１７）；ｄｏｉ  １０．１００２／ｔｅｒｍ．２２２８、Ｙａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ９（２）：１６８ー１７９（２０１７）、Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １４（１）：３４１  （２０１６）、Ｒａｊａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｐ．２５４５９、およびＥｎｄｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｄｅｃ  ２０１６）；ｄｏｉ：１０．１００２ｊｃｐ．２５７２１を参照のこと。
【００１７】
代表的な態様では、治療細胞は、膵島細胞である。代表的な例では、膵島細胞は、ヒト膵島細胞、所望により、本開示の方法の対象と同種異系のヒト膵島細胞である。一部の態様では、膵島細胞は、ヒト死体または他のヒトドナーから単離される。ヒト死体からこのような細胞を単離する方法は、当該技術分野において記載されている。Ｈａｌｂｅｒｓｔａｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １００１：２２７−２５９（２０１３）を参照のこと。代表的な態様では、膵島細胞は、Ｒａｎｕｎｃｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ９（３）：４０９ー４１４（２０００）、Ｄｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １３（３）：２０４ー２１４（２００６）に記載のものなどの非ヒト膵島細胞である。
【００１８】
一部の例では、膵島細胞は膵島の一部であり、したがって、本開示の対象に治療細胞を移植する方法は、膵島を移植する方法を包含する。一部の態様では、本発明の方法は、膵島を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて膵島混合物を作製すること、当該膵島混合物を対象の器官の表面に適用すること、当該細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を当該膵島混合物を覆って当該器官の当該表面に適用すること、および当該細胞マトリックス対の第１の要素の供給源を当該膵島混合物を覆って当該器官の当該表面に適用して、これにより、治療細胞足場を形成することを含む。
【００１９】
一部の態様では、治療細胞は、細胞クラスターの一部である。代表的な態様では、治療細胞は、膵島細胞クラスター、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）クラスター、胚性幹細胞クラスター、ならびにインスリンまたはインスリン類似体を産生し、分泌するように改変された細胞のクラスターである。
【００２０】
細胞マトリックス対
本明細書で使用する場合、用語「細胞マトリックス対」は、細胞に支持体を提供する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に関与する一対の分子（例えば、第１の要素および第２の要素）を指す。細胞マトリックス対は、例えば、プロテオグリカン非プロテオグリカン多糖類、およびタンパク質を含む、ＥＣＭの成分を含んでいてもよい。細胞マトリックス対は、例えば、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ））ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、またはこれらの前駆体形態を含んでいてもよい。代表的な態様では、細胞マトリックス対は、フィブロネクチンおよびコラーゲンを含む。代表的な態様では、細胞マトリックス対は、ラミニンおよびコラーゲンまたはナイドジェンを含む。代表的な態様では、細胞マトリックス対は、トロンビンおよびフィブリノゲンを含む。
【００２１】
本開示の方法の代表的実施形態では、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源は、治療細胞混合物を作製するために治療細胞と組み合わされる。代表的な態様では、細胞マトリックス対の第１の要素はフィブロネクチンであり、フィブロネクチンの供給源は血漿である。代表的な態様では、血漿は、本発明の方法の対象に対して自己である。この点に関しては、一部の態様では、本発明の方法は、治療細胞を対象の器官の表面に適用する前に対象から血漿を採取することを含む。血漿を採取することを含むこのような方法は、本明細書において更に記載される。「追加の工程」を参照のこと。代表的な態様では、細胞マトリックス対の第２の要素の供給源は組換えヒトトロンビンであり、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源は血漿である。
【００２２】
移植部位
本開示の方法に関して、治療細胞は、対象へと特定の部位、すなわち移植部位に移植される。代表的な態様では、治療細胞は、例えば、治療細胞混合物の一部として移植部位に適用される。各種の実施形態では、移植部位は、器官である。例えば、代表的な態様では、治療細胞は、例えば、治療細胞混合物の一部として対象の器官の表面に適用される。代表的な例では、器官は中皮性の器官であり、例えば、中皮組織を含む。代表的な態様では、中皮性の器官は、腹膜を含むかまたは、腹膜である。代表的実施形態では、器官は、肝臓、膵臓または消化管の器官（例えば、食道、咽頭、口腔、胃、網、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（例えば、盲腸、大腸）、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、膵臓、唾液腺、リップ、歯、舌または喉頭蓋）である。代表的な態様では、器官または移植部位は、胃粘膜下組織、尿生殖路、筋肉、骨髄、腎臓（例えば、腎臓被膜）、前眼房、精巣または胸腺である。
【００２３】
代表的な例では、治療細胞は、例えば、治療細胞混合物の一部として，網（例えば、大網または小網）の表面に適用される。網は、門脈系へと流入する豊富な毛細管組織を含む２層の中皮シートからなる。網は、動かすのが容易であり、膵島移植片を収容するのに十分な大きさである（ヒトにおいて３００〜１，５００ｃｍ２の表面積）。代表的な態様では、本発明の方法は、腹腔鏡下で治療細胞混合物を網の軸に沿って層状に重ねることを含む。本明細書で使用する場合、用語「腹腔鏡下で」は、腹部の器官を見るため、または外科的処置を可能にするために光ファイバー機器が腹壁を通して挿入される外科的処置を指す。代表的な態様では、本発明の方法は、軸に沿って網の反対側を折り畳んで網の治療細胞足場を包むことを更に含む。本開示の方法の代表的実施形態では、当該方法は、治療細胞を血漿と組み合わせて治療細胞混合物を形成すること、当該治療細胞混合物を対象の網の表面に適用すること、トロンビンを当該治療細胞混合物を覆って適用すること、および血漿を当該治療細胞混合物および当該トロンビンを覆って適用することを含む。
【００２４】
対象
代表的実施形態では、本開示の方法の対象は、マウスおよびハムスターなどのげっ歯目の哺乳動物、およびウサギなどのウサギ目の哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物、ネコ科の動物（ネコ）およびイヌ科の動物（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物、ウシ科の動物（ウシ）およびイノシシ科の動物（ブタ）を含む偶蹄目の哺乳動物、またはウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物である。一部の態様では、哺乳動物は、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ目またはＳｉｍｏｉｄ目（サル）に属するか、または真猿亜目（ヒトおよび類人猿）に属する。代表的な態様では、哺乳動物は、ヒトである。
【００２５】
代表的な例では、哺乳動物は、移植される治療細胞によって提供される治療作用物質の欠乏症を有するヒトである。代表的な態様では、治療細胞は、インスリンまたはその類似体を産生し、分泌する。代表的な態様では、対象は、代謝疾患、例えば、糖尿病または肥満に罹患している。代表的な例では、糖尿病はＩ型糖尿病であり、特定の態様では、Ｉ型糖尿病は重篤な低血糖を伴って生じる。代表的な態様では、対象は、外因性インスリン治療により代謝疾患を治療されている。代表的な態様では、対象は、治療細胞の移植前に、外因性インスリン治療により代謝疾患を治療されていた対象である。代表的な例では、移植された治療細胞は、移植後に外因性インスリン治療を止めることができるように、必要とされるインスリンを提供する。したがって、一部の態様では、本開示の方法は、治療細胞を対象に移植した後、外因性インスリン治療を中止すること含む。
【００２６】
支持細胞組成物
代表的実施形態では、本開示の方法は膵島細胞を対象に移植する方法であって、治療細胞、例えば、膵島細胞および支持細胞組成物を同時投与することを含む方法である。代表的な態様では、治療細胞、例えば、膵島細胞および支持細胞組成物は、対象に移植する前に混合されるか、または組み合わせられ、次いで、混合物は同時に移植される。代表的な態様では、治療細胞、例えば、膵島細胞および支持細胞組成物は、対象に逐次的に移植される。例えば、治療細胞（例えば、膵島細胞）は、支持細胞組成物の移植前に移植されるか、または治療細胞（例えば、膵島細胞）は、支持細胞組成物の移植後に移植される。
【００２７】
代表的な態様では、治療細胞、例えば、膵島細胞は、移植前に支持細胞組成物と混合され、本発明の方法は、細胞の混合物を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせて治療細胞混合物を作製することを更に含む。本発明の方法は、治療細胞混合物を対象の器官の表面に適用すること、および細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を、治療細胞混合物を覆って器官の表面に適用して、これにより治療細胞足場を形成することを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源を、治療細胞混合物を覆って器官の表面に適用することを更に含む。代表的な例では、細胞マトリックス対の第１の要素はフィブロネクチンであり、フィブロネクチンの供給源は血漿、例えば、自己血漿である。代表的な態様では、細胞マトリックス対の第２の要素はトロンビンであり、トロンビンの供給源は組換えヒトトロンビンである。代表的な態様では、本発明の方法は、血漿を、治療細胞混合物を覆って器官の表面に適用すること、例えば、トロンビンを適用した後に血漿を器官の表面に適用することを更に含む。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「支持細胞組成物」は、治療細胞、例えば、膵島細胞の生存率および／または機能を支持する細胞を含む組成物を指す。代表的な態様では、支持細胞組成物は、対象への治療細胞、例えば、膵島細胞の全生着に役立つ。代表的な態様では、支持細胞組成物は、治療細胞、例えば、膵島細胞を対象からの除去から保護するのを支援するか、または治療細胞、例えば、膵島細胞を免疫応答から保護する。代表的な態様では、支持細胞組成物は、細胞の酸素化および／または血管化を増加させることによって、または細胞に必要とされる栄養分へのアクセスを増やすことによって治療細胞、例えば、膵島細胞の生存率および／または生存を増加させる。代表的な態様では、支持細胞組成物は、治療細胞（例えば、膵島細胞）による治療作用物質（例えば、インスリン）の産生および／または分泌を増加させるか、または維持する。代表的な態様では、支持細胞組成物は、内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞を含む。追加の態様または代替的態様では、支持細胞組成物は、免疫調節細胞、幹細胞、微細化された脂肪細胞クラスター、骨髄由来単核細胞、脂肪由来間質血管細胞群の細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、造血前駆細胞、単球、白血球、線維芽細網間質細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む脂肪組織部分、またはこれらの細胞混合物を含む。追加の態様または代替的態様では、支持細胞組成物は、免疫調節細胞、幹細胞、微細化された脂肪細胞クラスター、骨髄由来単核細胞、脂肪由来間質血管細胞群の細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、造血前駆細胞、単球、白血球、線維芽細網間質細胞、またはＭＳＣのうちの任意の１つ以上に由来するエキソソームを含む。代表的な態様では、免疫調節細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。代表的な態様では、幹細胞は、ＭＳＣ、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞（例えば、ＡＤ−ＭＳＣ）、内皮前駆細胞、またはこれらの細胞混合物である。
【００２９】
代表的な態様では、支持細胞組成物は、ＭＳＣまたはＭＳＣに由来するエキソソームを含む。代表的な態様では、ＭＳＣは、脂肪由来のＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）である。代表的な態様では、ＭＳＣは、ＣＤ１４６の細胞表面発現について陽性である。代表的な態様では、膵島細胞を対象に移植する方法は、ＣＤ１４６を発現するＭＳＣを事前選択することを含む。代表的な態様では、膵島細胞を対象に移植する方法は、ＣＤ１４６発現を誘導する条件下でＭＳＣを培養することを含む。代表的な例では、本発明の方法は、ＩＦＮγまたはＴＮＦαの存在下でＭＳＣを培養してＣＤ１４６を発現するＭＳＣ集団を得ることを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、ＭＳＣを約５ｎｇ〜約１００ｎｇのＩＦＮγまたはＴＮＦαと共に約１〜７日間培養すること、ＣＤ１４６の発現について陽性のＭＳＣを精製すること、および次いで、対象に膵島細胞と共に精製されたＣＤ１４６＋ＭＳＣを同時投与することを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、ＭＳＣを約５ｎｇ〜約５０ｎｇのＩＦＮγまたはＴＮＦαと共に約２〜３日間培養することを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、ＭＳＣを約５ｎｇ〜約２５ｎｇ（例えば、約８ｎｇ〜約１５ｎｇ、約１０ｎｇ）のＩＦＮγまたはＴＮＦαと共に約２日間培養することを含む。
【００３０】
代表的な態様では、支持細胞組成物は、異なる細胞種を含む不均一細胞集団を含む。例えば、代表的な態様では、骨髄由来単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）、およびＭＳＣが内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、周皮細胞、造血前駆細胞、単球および白血球と混合されている、脂肪組織由来の間質血管細胞群を含む支持細胞組成物。また例えば、支持細胞組成物は、微細化された脂肪または微細化された脂肪細胞クラスターを含み得る。代表的な例では、支持細胞組成物は、取り入れ間質細胞およびＭＳＣを有する微小破砕脂肪組織を含む。代表的な態様では、支持細胞組成物は、脂肪組織を洗浄し、乳化し、リンスするＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）技術により生成される精製された脂肪組織を含む。得られた画分は、約０．３〜約０．８ｍｍの脂肪クラスターを含む。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）により生成された画分は、間質血管成分内の周皮細胞を含み得る。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）技術、これにより生成される脂肪画分、およびその種々の適用がＴｒｅｍｏｌａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２：３０４ー３１２（２０１６）に記載されている。
【００３１】
代表的な態様では、支持細胞組成物は、実質上同じ細胞種を含む均一な細胞集団を含む。例えば、代表的な態様では、支持細胞組成物は、ＢＭ−ＭＮＣまたは脂肪組織幹細胞（ＡＤＳＣ）から培養により増殖させた成体幹細胞を含む。また例えば、支持細胞組成物は、線維芽細網間質細胞、例えば、リンパ節または膵臓から単離された線維芽細網間質細胞を含み得る。
【００３２】
代表的な態様では、支持細胞組成物は、増強された免疫調節性特性を有する事前選択された成体幹細胞、例えば、細胞表面マーカーＣＤ１４６の陽性発現を有する成体幹細胞を含む。
【００３３】
標的化分子
代表的実施形態では、本開示の方法は、対象に移植する前に膵島細胞を標的化分子と組み合わせて治療細胞混合物を作製することを含む、膵島細胞を対象に移植する方法である。代表的な態様では、膵島細胞は、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と更に組み合わせられる。代表的な態様では、膵島細胞は、支持細胞組成物と更に組み合わせられる。本発明の方法は、治療細胞混合物を対象の器官の表面に適用すること、および細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を、治療細胞混合物を覆って器官の表面に適用して、これにより治療細胞足場を形成することを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源を、治療細胞混合物を覆って器官の表面に適用することを更に含む。代表的な例では、細胞マトリックス対の第１の要素はフィブロネクチンであり、フィブロネクチンの供給源は血漿、例えば、自己血漿である。代表的な態様では、細胞マトリックス対の第２の要素はトロンビンであり、トロンビンの供給源は組換えヒトトロンビンである。代表的な態様では、本発明の方法は、血漿を、治療細胞混合物を覆って器官の表面に適用すること、例えば、トロンビンを適用した後に血漿を器官の表面に適用することを更に含む。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「標的化分子」は、結合パートナーを特異的に認識し、結合する分子または薬剤を指し、したがって、標的化分子は化合物の標的、すなわち膵島細胞への送達を導く。標的化分子としては、抗体および抗原、ビオチンおよびストレプトアビジン、リガンドおよび受容体などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な態様では、標的化分子を膵島細胞に直接的に接着させる。他の態様では、標的化分子を膵島細胞に間接的に接着させる。一部の態様では、標的化分子は、膵島細胞と共にカプセル化されている。
【００３５】
カプセル化
代表的な態様では、本開示の方法の治療細胞は、カプセル化されていないか、または「裸」である。他の代表的な例では、治療細胞は、カプセル化されているか、またはコーティングを含む。代表的な態様では、治療細胞は、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、ナノカプセル化、またはコンフォーマルコーティングされている。治療細胞、例えば、膵島細胞をカプセル化およびコンフォーマルコーティングする方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１４７４８３号、Ｔｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（９）：（２０１５）、Ｔｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１１（２９）：１０５１４ー１０５１９（２０１４）、Ｓｃｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６７ー６８：６５ー７３（２０１４）、Ｂａｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ  １１（５）：３８４ー３９１（２０１１）を参照のこと。
【００３６】
代表的な態様では、治療細胞は、支持細胞組成物と共にカプセル化されている。代表的な態様では、治療細胞は、支持細胞組成物とは別にカプセル化されている。代表的な態様では、治療細胞は、標的化分子と共にカプセル化されている。代表的な態様では、治療細胞は、標的化分子とは別にカプセル化されている。膵島細胞をカプセル化する方法および膵島細胞をコンフォーマルコーティングする方法は、当該技術分野において記載されている。例えば、ＷＯ２０１００７８２０２、前出のＴｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）を参照のこと。
【００３７】
代表的な態様では、治療細胞（例えば、膵島細胞）は、（ｉ）アルギン酸塩−［ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）−Ｘ１］ｎおよび（ｉｉ）多官能性ＰＡＧ−Ｘ２を反応させて共有結合を形成することによって形成される、共有結合により安定化されたコーティング内にカプセル化されており、ここで、ｎは０より大きい整数であり、Ｘ１およびＸ２のうちの第１のものはＮ３であり、Ｘ１およびＸ２のうちの第２のものは、
【化１】
2020515544.tif 000002
［式中、Ｒ１＝ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２
【化２】
2020515544.tif 000003
であるかまたは、Ｒ２＝Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ３、ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＮＯ２でありＲ３＝ＯＣＨ３、ＣＨ３、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＮＯ２である］からなる群から選択される。
【００３８】
代表的な態様では、共有結合により安定化されたコーティングは、複数の単層を含む。代表的な態様では、複数の単層は、アルギン酸塩−［ＰＡＧ−Ｘ１］ｎ反応生成物の単層と多官能性ＰＡＧ−Ｘ２反応生成物の単層とを交互に繰り返す。代表的な例では、多官能性ＰＡＧ−Ｘ２は、少なくとも３つのＰＡＧ−Ｘ２アームを有するマルチアームＰＡＧ−Ｘ２を含む。代表的な態様では、アルギン酸塩−［ポリエチレングリコール（ＰＡＧ）−Ｘ１］ｎ分子、多官能性ＰＡＧ−Ｘ２分子、または両方は、追加の末端配位子（Ｘ３）を含む。一部の態様では、追加の末端配位子（Ｘ３）は、タンパク質、画像化標識、ナノ粒子、バイオポリマー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡまたはＤＮＡの断片からなる群から選択される。
【００３９】
代表的な態様では、治療細胞（例えば、膵島細胞）は、コーティング材料によってコンフォーマルコーティングされている。代表的な例では、治療細胞（例えば、膵島細胞）は、ａ）油相内での水相のドリッピングからジェッティングへの移行および流れの伸長を可能にするコーティング装置内で同心油相内に水相を注入すること、ｂ）治療細胞（例えば、膵島細胞）およびコーティング材料を水相に添加することによってコンフォーマルコーティングされ、コーティング材料の重合が水相噴流の粒子への崩壊の下流で発生し、これにより、治療細胞（例えば、膵島細胞）のコーティング材料によるコンフォーマルコーティングをもたらす。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０１４７４８３号を参照のこと。
【００４０】
代表的な態様では、治療細胞をコンフォーマルコーティングする方法は、ｃ）コーティング装置の流出物を回収すること、ｄ）油相からコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を精製すること、ｅ）膵島細胞を含まないコーティング材料からコンフォーマルコーティングされた膵島細胞を分離すること、またはｆ）これらの組み合わせを含む。代表的な態様では、油相からコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を精製する工程は、ａ）コーティング装置流出物を遠心分離してコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料から油相を分離する工程、およびｂ）所望により、コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料から油相が完全に除去されるまでヘキサン抽出を実行する工程を含む。代表的な態様では、膵島細胞を含まないコーティング材料からコンフォーマルコーティングされた膵島細胞を分離する工程は、勾配遠心分離によって、または重力によるコーティングされたクラスターの沈降によって実行される。代表的な態様では、９５％を超えるコンフォーマルコーティングされた膵島細胞が、膵島細胞を含まないコーティング材料から精製される。
【００４１】
代表的な態様では、コーティング材料としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。代表的な態様では、水相は、約７５，０００個の膵島細胞／ｍｌを含み、更に、ａ）ｐＨ６〜７の無血清培地中の約１０％のＰＥＧ、約２％のプルロニックＦ６８、および約０．６２％ｗ／ｖのＤＴＴ、ｂ）ｐＨ６〜７のＨＢＳＳ中の約５％のＰＥＧ、約１％のプルロニックＦ６８、および０．３１％ｗ／ｖのＤＴＴ、ｃ）ｐＨ６〜７のＣａ２＋およびＭｇ２＋のないＨＢＳＳ中の約５％のＰＥＧ、約１％のプルロニックＦ６８、約０．８％の中粘度Ｇ群アルギン酸塩、および約０．３１％ｗ／ｖのＤＴＴ、またはｄ）ｐＨ６〜７のＣａ２＋およびＭｇ２＋のないＨＢＳＳ中の約５％のＰＥＧ、約０．８％の中粘度Ｇ群アルギン酸塩、および約０．３１％ｗ／ｖのＤＴＴを含む。代表的な例では、油相は、約１０％のＳｐａｎ８０と共にポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含み、ここで当該油相は、所望により約０．０２または約０．２％のトリエタノールアミンを更に含む。
【００４２】
代表的な態様では、コーティング装置は、流れ集束領域および流れ集束領域下流の流路を含むフローチャンバーを含み、ここで当該フローチャンバーは以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：ａ）流れ集束領域の内部流路の直径がその長さに沿って１０ｄ〜ｄに制限され、ここでｄは約１ｍｍである、ｂ）流れ集束領域の集束角度が約６０度である、ｃ）流れ集束領域下流の流路が直径約１ｍｍである、およびｄ）先端が集束領域の約０．５ｍｍ上流に制限される針またはカテーテルを通して水相がフローチャンバーに注入される。
【００４３】
代表的な態様では、膵島細胞をコンフォーマルコーティングするために使用されるプロセスは、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：ａ）油相速度と水相速度の比が約３５０である、ｂ）油相の粘度と水相の粘度の比が３．５、１３、または１３０である、ｃ）水相が最初は約５０μｌ／分で油相に注入されて、次いで、約１０μｌ／分まで減少させられる一方で、油相は約３．５ｍｌ／ｍｉｎに維持される、およびｄ）水相の注入前に、空気が油相に注入される。
【００４４】
代表的な態様では、水相は、ｐＨ６〜７のＣａ２＋およびＭｇ２＋のないＨＢＳＳ中の５％のＰＥＧ、０．８％のＭＶＧ、７５，０００個の膵島細胞／ｍｌおよび０．３１％ｗ／ｖのＤＴＴを含み、ここで油相は、１０％のＳｐａｎ８０と共にＰＰＧを含み、当該油相は、所望により０．０２または０．２％のトリエタノールアミンを含み、上記コーティング装置は、６０度の集束角度および直径約１ｍｍである流れ集束領域下流の流路を有し、内径が１０ｍｍ〜１ｍｍに減少される流路を有する流れ集束領域を含むフローチャンバーを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、以下の工程を含む：ａ）油相をフローチャンバーに適用する工程、ｂ）所望により、先端が集束領域基部の０．５ｍｍ上流に配置されるカテーテルを通してフローチャンバーに空気を注入する工程、およびｃ）空気（存在する場合）および水相を当該カテーテルを通してフローチャンバーに注入する工程であって、水相と油相間の表面張力により噴射水を分裂させてコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を含むマイクロリットル液滴が生じるように、水相が最初は５０μｌ／分で注入されて、次いで、１０μｌ／分まで減少させられる一方で、油相は約３．５ｍｌ／分に維持される工程。代表的な態様では、膵島細胞をコンフォーマルコーティングするために使用される方法は、以下の工程を更に含む：ｄ）フローチャンバーから流出物を回収する工程、ｅ）流出物を遠心分離して油相からコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を分離する工程、ｆ）コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料から油相上清を除去する工程、ｇ）コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料をヘキサンを含む組成物中に再懸濁する工程、ｈ）工程ｇ）の混合物を遠心分離してヘキサンからコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を分離する工程、ｉ）ヘキサン上清を除去する工程、ｊ）コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料をヘキサンおよび緩衝液（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）を含む組成物中に再懸濁する工程、ｋ）工程ｊ）の混合物を遠心分離してヘキサンおよび緩衝液（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）からコンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を分離する工程、ｌ）ヘキサン／緩衝液上清を除去する工程、およびｍ）コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含有する緩衝液中に再懸濁する工程。代表的な態様では、本発明の方法は、以下の工程を更に含む：ｎ）コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を分離することができる密度勾配を形成するための溶液を層状にする工程、ｏ）コンフォーマルコーティングされた膵島細胞および膵島細胞を含まないコーティング材料を当該密度勾配に適用する工程、ｐ）当該密度勾配を遠心分離して膵島細胞を含まないコーティング材料から��ンフォーマルコーティングされた膵島細胞を分離する工程、およびｑ）膵島細胞を含まないコーティング材料を含有する上清を除去する工程。
【００４５】
代表的な態様では、膵島細胞周囲のコンフォーマルコーティングは、１０〜２０μｍの範囲の厚さである。代表的な態様では、コーティング装置に導入される９０％を超える膵島細胞が、コンフォーマルコーティングされる。
【００４６】
追加の工程
本開示の方法に関して、本発明の方法は、追加の工程を含んでいてもよい。例えば、対象に治療細胞を移植する方法は、本発明の方法の記載した工程（複数可）のうちの１つ以上を繰り返すことを含んでいてもよい。したがって、代表的な態様では、本発明の方法は、治療細胞を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源と組み合わせることによって作製される治療細胞混合物の治療細胞を対象の器官の表面に適用する工程を繰り返すことを含む。代表的な態様では、本発明の方法は、治療細胞混合物を６〜１２ヵ月毎に、または対象の血中グルコース、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨＡ１Ｃ）レベル、Ｃペプチドレベル、ＨＯＭＡインデックスもしくはＢＥＴＡスコア、および／または低血糖エピソードの頻度に基づき必要に応じて再適用する工程を含む。あるいは、または、更に、本発明の方法は、細胞マトリックス対の第２の要素の、または第１の要素の供給源を適用する工程を繰り返すことを含んでいてもよい。
【００４７】
細胞マトリックス対の第１の要素または第２の要素が血漿タンパク質であり、その供給源は血漿である代表的実施形態では、対象に治療細胞を移植する方法は、対象から血漿を採取する工程を更に含む。この点に関しては、血漿は、治療細胞を受容する対象に対して自己である。代表的な態様では、血漿は、調整血漿である。ある種の態様では、本発明の方法は、対象から血漿を採取する前に、ω−３脂肪酸、抗炎症薬、免疫調節分子、増殖因子、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を対象に投与し、続いて対象から血漿を採取する工程を更に含む。代表的な例では、血漿は、処理された血漿である。ある種の態様では、血漿は１つ以上の特徴、または血漿中に存在する特定のタンパク質または分子の発現が強化されているか、または血漿はある種のタンパク質または分子を除去するように処理されている。代表的な態様では、血漿は、多血小板血漿（ＰＲＰ）、抗炎症因子、血管新生促進因子、増殖因子、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上が濃縮されるように処理されている。
【００４８】
治療細胞を移植する方法は、治療細胞混合物の適用の前または後において、または両方で更に他の工程を含み得る。代表的な態様では、本開示の治療細胞を移植する方法は、対象の外因性インスリンおよび／または他の抗糖尿病薬の摂取量を減少させる工程を含む。代表的な態様では、本発明の方法は、例えば、治療作用物質をコードする核酸を含むベクターにより細胞を遺伝子操作することによって治療細胞を作製する工程を更に含む。代表的な態様では、本発明の方法は、遺伝子操作された細胞を培養する工程を更に含む。代表的実施形態では、治療細胞を移植する方法は、内皮由来のエキソソームもしくは内皮細胞またはこのようなエキソソームの内容物の存在下で細胞を培養することによって治療細胞を作製する工程を含む。したがって、本開示は、対象に移植する治療細胞を作製するための１つ以上の工程を含む細胞を移植する方法を提供する。
【００４９】
膵島を調製する方法
本開示は、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法を提供する。代表的実施形態では、本発明の方法は、膵島細胞を内皮由来のエキソソームもしくは内皮細胞（ＥＣ）または内皮由来のエキソソームの内容物と共に培養する工程を含む。代表的な態様では、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であるか、または内皮由来のエキソソームはＨＵＶＥＣ由来のエンドソームである。代表的な態様では、膵島細胞は、ヒト膵島細胞である。代表的な例では、約１００〜５００個の膵島細胞は、ｍｌ当たり約１０４〜約１０６個のＥＣ、または約１０１０〜約１０１５個のＥＣ由来のエキソソームと共に培養される。代表的な態様では、約１０００〜１０，０００個（例えば、１０００〜５０００個）の膵島細胞は、ｍｌ当たり約１０４〜約１０６個の内皮細胞、または約１０１０〜約１０１５個のエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約１００ＩＥＱ〜約１０００ＩＥＱの膵島細胞は、約１００個のＥＣ〜約１０００個のＥＣ、または約１〜約１００ｕｇ／ｍｌのＥＣ由来のエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約２５０ＩＥＱ〜約７５０ＩＥＱの膵島細胞は、約２５０個のＥＣ〜約７５０個のＥＣ、または約５〜約５０ｕｇ／ｍｌのＥＣ由来のエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約４００〜約６００ＩＥＱの膵島細胞は、約４００個のＥＣ〜約６００個のＥＣ、または約５〜約１５ｕｇ／ｍｌのＥＣ由来のエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約５００ＩＥＱの膵島細胞は、約５００個のＥＣまたは約１０ｕｇ／ｍｌのＥＣ由来のエキソソームと共に培養される。一部の態様では、膵島細胞を調整する方法は、膵島細胞を内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞と共に少なくとも約２４〜約４８時間培養する工程を含む。所望により、本発明の方法は、膵島細胞を内皮由来のエキソソームまたは内皮細胞と共に少なくとも約３〜６日間または少なくとも約１〜約２週間培養する工程を含む。
【００５０】
代表的実施形態では、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法は、膵島細胞を対象に移植する前に膵島細胞を内皮由来のエキソソームの内容物と共に培養する工程を含む。代表的な態様では、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法は、膵島細胞を対象に移植する前に、膵島細胞を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ラミニン、コラーゲン、インスリン増殖因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ−２）、ＣＤ４０、ＩＧＦＢＰ−１、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦα、ｃＩＡＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＮＦβ、ＣｙｔｏＣ、ＩＧＦＢＰ−４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ｂａｄ、ＩＧＦ−１  ｓＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、ＨＳＰ６０、ｐ２７、カスパーゼ８、ＩＧＦ−２、またはこれらの組み合わせと共に培養する工程を含む。
【００５１】
本開示は、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法であって、膵島細胞をＭＳＣ由来のエキソソームもしくはＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエキソソームの内容物と共に培養する工程を含む方法も提供する。代表的な態様では、ＭＳＣは、脂肪由来のＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）である。代表的な態様では、ＭＳＣは、ＣＤ１４６の発現について陽性である。代表的な態様では、膵島細胞は、ヒト膵島細胞である。代表的な例では、約１００〜５００個の膵島細胞は、ｍｌ当たり約１０４〜約１０６個のＭＳＣまたは約１０１０〜約１０１５個のエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約１００ＩＥＱ〜約１０００ＩＥＱの膵島細胞は、約１００個のＭＳＣ〜約１０００個のＭＳＣまたは約１〜約１００ｕｇ／ｍｌのエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約２５０ＩＥＱ〜約７５０ＩＥＱの膵島細胞は、約２５０個のＭＳＣ〜約７５０個のＭＳＣまたは約５〜約５０ｕｇ／ｍｌのエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約４００〜約６００ＩＥＱの膵島細胞は、約４００個のＭＳＣ〜約６００個のＭＳＣまたは約５〜約１５ｕｇ／ｍｌのエキソソームと共に培養される。代表的な例では、約５００ＩＥＱの膵島細胞は、約５００個のＭＳＣまたは約１０ｕｇ／ｍｌのエキソソームと共に培養される。一部の態様では、膵島細胞を調整する方法は、膵島細胞をＭＳＣ由来のエキソソームまたはＭＳＣと共に少なくとも約２４〜約４８時間培養する工程を含む。所望により、本発明の方法は、膵島細胞をＭＳＣ由来のエキソソームまたはＭＳＣと共に少なくとも約３〜６日間または少なくとも約１〜約２週間培養する工程を含む。
【００５２】
代表的な態様では、ＭＳＣは、細胞表面マーカーの発現について事前選択される。代表的な例では、細胞表面マーカーは、ＣＤ１４６である。代表的な態様では、対象に移植するための膵島を調製する方法は、ＣＤ１４６発現を誘導する条件下でＭＳＣを培養する工程を含む。代表的な例では、本発明の方法は、ＩＦＮγまたはＴＮＦαの存在下でＭＳＣを培養してＣＤ１４６を発現するＭＳＣ集団を得る工程を含む。代表的な態様では、本発明の方法は、ＭＳＣを約５ｎｇ〜約１００ｎｇのＩＦＮγまたはＴＮＦαと共に約１〜７日間培養する工程、ＣＤ１４６の発現について陽性のＭＳＣを精製する工程、および次いで、対象に膵島細胞と共に精製されたＣＤ１４６＋ＭＳＣを同時投与する工程を含む。代表的な態様では、本発明の方法は、ＭＳＣを約５ｎｇ〜約５０ｎｇのＩＦＮγまたはＴＮＦαと共に約２〜３日間培養する工程を含む。代表的な態様では、本発明の方法は、ＭＳＣを約５ｎｇ〜約２５ｎｇ（例えば、約８ｎｇ〜約１５ｎｇ、約１０ｎｇ）のＩＦＮγまたはＴＮＦαと共に約２日間培養する工程を含む。
【００５３】
代表的実施形態では、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法は、膵島細胞を対象に移植する前にＭＳＣ由来のエキソソームの内容物を有する膵島細胞を培養する工程を含む。代表的な態様では、対象に移植するための膵島細胞を調製する方法は、膵島細胞を対象に移植する前に膵島細胞をＩＧＦＢ−１、ＩＧＦＢ−２、ＩＧＦＢ−３、ＩＧＦＢ−４、ＩＧＦＢ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、エオタキシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮγ、ＣＣＬ１、ＭＣＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、またはこれらの組み合わせと共に培養する工程を含む。
【００５４】
各種の態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞を調製する方法により膵島細胞を調製する工程、工程（ａ）で調製された膵島細胞を細胞マトリックス対の第１の要素の供給源を組み合わせて治療細胞混合物を作製する工程、当該治療細胞混合物を対象の器官の表面に適用する工程、および当該細胞マトリックス対の第２の要素の供給源を当該治療細胞混合物を覆って当該器官の当該表面に適用する工程であって、これにより治療細胞足場を形成する工程を含む膵島細胞を対象に移植する方法を提供する。
【００５５】
組成物
本開示は、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源、細胞マトリックス対の第２の要素、および支持細胞組成物のうちの１つ以上と組み合わされた治療細胞を含む組成物を更に提供する。代表的な態様では、組成物は、細胞マトリックス対の第１の要素の供給源、細胞マトリックス対の第２の要素、および支持細胞組成物、ならびに薬理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤のうちの１つ以上と組み合わされた治療細胞を含む医薬組成物である。代表的な態様では、医薬組成物は無菌であり、対象（例えば、ヒト対象）への投与に好適である。代表的な態様では、１つ以上の成分は、本明細書に記載されるようにカプセル化またはコンフォーマルコーティングされている。代表的な態様では、治療細胞は、支持細胞組成物と共にカプセル化またはコンフォーマルコーティングされているか、またはカプセル化またはコンフォーマルコーティングされていてもいなくてもよい支持細胞組成物とは別にカプセル化またはコンフォーマルコーティングされている。代表的な態様では、支持細胞組成物は、ＭＳＣもしくは内皮細胞、および／またはＭＳＣもしくは内皮細胞に由来するエキソソームを含む。
【００５６】
関連する実施形態では、膵島細胞を調製する方法によって調製された組成物もまた提供される。代表的な例では、組成物は、膵島細胞およびＭＳＣ、内皮細胞またはそれらに由来するエキソソームを含む。所望により、組成物は、約１００〜５００個の膵島細胞、および約１０４〜約１０６個のＭＳＣもしくは内皮細胞またはｍｌ当たり約１０１０〜約１０１５個のエキソソームを含む。代表的な態様では、組成物は、膵島細胞およびＭＳＣまたは内皮細胞に由来するエキソソームの内容物を含む。代表的な態様では、組成物は、膵島細胞および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ラミニン、コラーゲン、インスリン増殖因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ−２）、ＣＤ４０、ＩＧＦＢＰ−１、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦα、ｃＩＡＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＮＦβ、ＣｙｔｏＣ、ＩＧＦＢＰ−４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ｂａｄ、ＩＧＦ−１  ｓＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、ＨＳＰ６０、ｐ２７、カスパーゼ８およびＩＧＦ−２のうちの１つ以上を含む。代表的な態様では、組成物は、膵島細胞およびＩＧＦＢ−１、ＩＧＦＢ−２、ＩＧＦＢ−３、ＩＧＦＢ−４、ＩＧＦＢ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、エオタキシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮγ、ＣＣＬ１、ＭＣＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【００５７】
使用方法
本明細書で初めて提供される情報に基づいて、本開示の方法は、治療作用物質、例えば、インスリンが対象において欠乏している疾患または医学的状態の治療に有用であると考えられる。したがって、本開示は、患者の疾患または医学的状態を治療または防止する方法を提供し、ここで、当該疾患または医学的状態は、インスリンまたはインスリン機能の欠如が当該医学的状態の疾患の発症および／または進行に関連する医学的状態の疾患である。本発明の方法は、本明細書に記載の治療細胞を移植する方法により、対象に治療細胞（例えば、膵島細胞）を疾患または医学的状態を治療または防止するのに効果的な量で移植する工程を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、疾患または医学的状態は、代謝症候群である。代謝症候群Ｘ、インスリン抵抗性症候群、またはリーベンス（Ｒｅａｖｅｎ´ｓ）症候群としても公知の代謝症候群は、５千万人を越える米国人が患っている病気である。代謝症候群は、典型的に以下の危険因子のうちの少なくとも３つ以上の集合によって特徴付けられる：（１）腹部肥満（腹部および腹部周囲の過剰な脂肪組織）、（２）アテローム性異常脂血症（動脈壁におけるプラークの蓄積を促進する、高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロールおよび高ＬＤＬコレステロール症を含む高脂血症）、（３）高血圧、（４）インスリン抵抗性または耐糖能障害、（５）血栓形成促進状態（例えば、血中の高フィブリノゲンまたはプラスミノゲン活性化因子阻害物質−１）、および（６）炎症誘発性状態（例えば、血中の高Ｃ反応性タンパク質）。他の危険因子としては、老化、ホルモンの不均衡および遺伝的素因が含まれ得る。
【００５９】
代謝症候群は、血管プラークの蓄積に関連する冠動脈性心疾患および他の疾患、例えば脳卒中およびアテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）とも呼ばれる末梢血管疾患のリスクの増加と関連している。代謝症候群を有する患者は、その初期段階におけるインスリン抵抗性状態から、ＡＳＣＶＤのリスクが更に増加する完全なＩＩ型糖尿病へと進行し得る。特定の理論に拘束されるものではないが、インスリン抵抗性、代謝症候群および血管疾患の間の関係には、インスリン刺激性血管拡張の障害、増強された酸化ストレスに起因するＮＯ利用能のインスリン抵抗性に関連する減少、およびアディポネクチンなどの脂肪細胞由来のホルモンの異常を含む１つ以上の同時発生的な発症機序が含まれ得る（Ｌｔｅｉｆ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０（ｓｕｐｐｌ．Ｂ）：６６Ｂー７６Ｂ（２００４））。
【００６０】
２００１  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ（ＡＴＰ  ＩＩＩ）によれば、同一個人における以下の特色のうちのいずれか３つが代謝症候群の基準を満たしている：（ａ）腹部肥満（男性で１０２ｃｍを超え、女性で８８ｃｍを超える腹囲）、（２）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）、（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性で４０ｍｇ／ｄｌ以下および女性で５０ｍｇ／ｄｌ以下）、（ｄ）血圧（１３０／８５以上）、および（ｅ）空腹時血糖（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、以下の基準のうちの少なくとも２つと共に、高いインスリンレベル（高い空腹時血糖または高い食後血糖単独）を持つ個人は、代謝症候群の基準を満たしている：（ａ）腹部肥満（０．９を超えるウエスト対ヒップ比、少なくとも３０ｋｇ／ｍ２の肥満指数、または３７インチを超えるのウエスト測定値）、（ｂ）少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌのトリグリセリドレベル、または３５ｍｇ／ｄｌ未満のＨＤＬコレステロールを示すコレステロールパネル、（ｃ）１４０／９０以上の血圧、または高血圧の治療を受けている。  （Ｍａｔｈｕｒ，Ｒｕｃｈｉ，“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”ｅｄ．Ｓｈｉｅｌ，Ｊｒ．，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．，ＭｅｄｉｃｉｎｅＮｅｔ．ｃｏｍ，Ｍａｙ  １１，２００９）。
【００６１】
本明細書における目的について、ある個人が２００１  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ＰａｎｅｌまたはＷＨＯにより示された基準の一方または両方を満たす場合、その個人は代謝症候群に悩まされているものと考えられる。
【００６２】
特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載の治療細胞を移植する方法は、代謝症候群を治療するのに有用である。したがって、本開示は、対象における代謝症候群を予防もしくは治療する方法、または代謝症候群の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の危険因子を減らす方法であって、本明細書に記載の方法により対象に治療細胞を代謝症候群またはその危険因子を治療または防止するのに効果的な量で移植する工程を含む方法を提供する。
【００６３】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、高血糖の医学的状態を治療する。代表的な態様では、高血糖の医学的状態は、インスリン依存性またはインスリン非依存性の糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または妊娠性糖尿病である。一部の態様では、本発明の方法は、腎障害、網膜症および血管疾患を含む１つ以上の糖尿病の合併症を減らすことによって、高血糖の医学的状態を治療する。
【００６４】
本開示は、糖尿病を有する対象の外因性インスリン要求性（ＥＩＲ）を低減する方法であって、本明細書に記載の任意の治療細胞を移植する方法により当該対象に細胞を移植する工程を含む方法を提供する。
【００６５】
また本開示は、正常血糖を回復させる必要がある対象において正常血糖を回復させる方法であって、本明細書に記載の任意の治療細胞を移植する方法により当該対象に細胞を移植する工程を含む方法を提供する。
【００６６】
本開示は、対象におけるインスリン離脱またはインスリン抵抗性の低下を引き起こす方法であって、本明細書に記載の任意の治療細胞を移植する方法により当該対象に細胞を移植する工程を含む方法を更に提供する。
【００６７】
一部の態様では、疾患または医学的状態は、肥満である。一部の態様では、肥満は、薬剤誘発性肥満である。一部の態様では、本発明の方法は、患者において体重増加を防止するか、または減少させること、または体重減少を増加させることによって肥満を治療する。幾つかの態様では、本発明の方法は、食欲を低下させること、食物摂取を減少させること、患者の脂肪レベルを低下させること、または胃腸系を通した食物移動の速度を低下させることによって肥満を治療する。
【００６８】
肥満は他の疾患の発症または進行に関連するため、肥満を治療する方法は、血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、糖尿病タイプＩＩの発症、高脂血症および筋骨格疾患を含む、肥満に関連する合併症を減らす方法において更に有用である。したがって、本開示はこれらの肥満に関連する合併症を治療または防止する方法を提供する。
【００６９】
更に本開示は、対象において体重減少を引き起こす方法であって、先行請求項のいずれか一項に記載の方法により対象に細胞を移植する工程を含む方法を提供する。
【００７０】
以下の実施例は、単に本発明を例示するためだけに提供され、その範囲を如何様にも限定するためではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１
この実施例は、実施例２の実験において使用される材料および方法を記載する。
【００７２】
動物
実験動物による研究は、マイアミ大学（ＵＭ）動物実験委員会により承認され、監視された実験計画の下で実施された。動物は、獣医学部で飼育された。膵島ドナー（＞２５０ｇの雄）としてＬｅｗｉｓ（ＭＨＣ、ラットハプロタイプ：ＲＴ１ｌ）ラットおよびＷｉｓｔａｒ  Ｆｕｒｔｈ（ＷＦ）（ＲＴ１ｕ）ラット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｒｌａｎ．ｃｏｍ）、ならびにレシピエント（１７０〜２００ｇの雌）としてＬｅｗｉｓラットが使用された。特定の実験については頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）留置ラットを購入した。げっ歯動物は、オートクレーブ処理した水および食餌を自由に摂取できるマイクロアイソレーターケージで飼育した。ドナーおよびレシピエントのカニクイザル（それぞれ、７．９２および３．５８歳）は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｅｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ホームステッド、フロリダ）から得られ、特定病原体を持たなかった。ペアで飼育されたサルは、自由に水を与えられ、１日２回給餌された（２４）。ＵＭは、国立衛生研究所実験動物福祉部門による２００２年４月１２日発効の動物福祉保証番号Ａ−３２２４−０１を保有し、国際実験動物ケア評価認証協会によって認定されている。
【００７３】
糖尿病誘発および代謝モニタリング
糖尿病は、ラットにおいてはストレプトゾトシンの６０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与（２〜３日間隔で２回の注射、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（２５）、およびＮＨＰにおいては１００ｍｇ／ｋｇの静脈内投与（Ｔｅｖａｐｈａｒｍ．ｃｏｍ）（７、２２）によって誘発された。
【００７４】
尾穿刺により得た全血試料で≧３００ｍｇ／ｄＬの非絶食時血糖値（ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ血糖測定器［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃａｎ．ｃｏｍ］）を有するげっ歯類がレシピエントとして使用された。移植片の機能は、＜２００ｍｇ／ｄＬの非絶食時血糖として定義された。移植後の選択された時点でげっ歯動物におけるブドウ糖負荷試験を実施して移植片の能力を評価した（２５）。一晩の絶食後、グルコースを経口（経口ブドウ糖負荷試験［ＯＧＴＴ］、２．５ｇ／ｋｇ）または静脈内（静脈内ブドウ糖負荷試験［ＩＶＧＴＴ］、０．５ｇ／ｋｇ）ボーラス投与し、血糖値を携帯型血糖測定器によってモニタリングした。グルコースの曲線下面積（ＡＵＣ）を、以前に記載したように算出した（２６）。同種異系膵島移植片の場合、非絶食時高血糖状態の再発が移植片拒絶の徴候とみなされた。
【００７５】
ＮＨＰにおいて、糖尿病は、＜０．２ｎｇ／ｍＬの空腹時Ｃ−ペプチドレベルおよびストレプトゾトシン投与の４週間後に実施したグルカゴン負荷に対する陰性応答（＜０．３ｎｇ／ｍＬの刺激性Ｃ−ペプチド）として定義された（７、２２）。血糖値は、ヒールティック（Ｈｅｅｌ−ｓｔｉｃｋ）により毎日２〜３回モニタリングされた（ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ）。ストレプトゾトシン後かつ移植前での１５０〜２５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖（ＦＢＧ）および食後血漿血糖（ＰＢＧ）レベルを目標として、インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｌｌｙ．ｃｏｍ］またはＨｕｍｕｌｉｎ  Ｒ  ｐｌｕｓ  Ｌａｎｔｕｓ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｏｆｉ．ｕｓ］）を、必要に応じて個別的にスライディングスケールに基づいて皮下投与した。血漿Ｃ−ペプチドレベルは、Ｃｏｂａｓ分析装置（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｒｏｃｈｅ．ｃｏｍ）を使用して電気化学発光免疫測定法により評価した。
【００７６】
血漿採取
静脈穿刺により得た血液は、３．２％クエン酸ナトリウムを含有する微量遠心チューブに回収した。室温にて１，４５５ｇで１０分間遠心分離した後に血漿を得て、アリコートを−８０℃で保存し、使用する前に解凍した。
【００７７】
膵島単離および移植片調製
膵島は、ラット（ＤＲＩ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｅ）（２７）、ＮＨＰ（２２）およびヒト（ＤＲＩ  ｃＧＭＰ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（１、２８〜３０）について糖尿病研究所（ＤＲＩ）で標準化されたプロトコールを使用した酵素消化、続いて密度勾配での精製により得た。
【００７８】
網内生着および機能に対する調製された膵島の純度の程度の効果を評価するために、Ｌｅｗｉｓラットの膵島を標準的な技術（２７）を使用して単離および精製し、ジチゾン染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１、２）により評価した場合に＞９５％の純度（純粋な画分）を得た。膵島精製後の外分泌組織クラスター（最も純度が低い画分）を含有する膵臓スラリーを培養下で維持し、膵島量（ＩＥＱ）（２）を決定するために使用されるアルゴリズムによって計数した。移植前に、最終的な純粋な膵島生成物のアリコートを外分泌膵臓組織と混合して３０％純度の膵島細胞生成物（３：７ｖ／ｖ、膵島対外分泌組織）を得た。
【００７９】
膵島移植
全身麻酔下の胸骨下正中小開腹手術は、殺菌した領域上に平らに広げられた網を露出させることを可能にした（図１）。本発明者らは、以前にＮＨＰにおける同様の網内フラップ移植術を報告している（２２）。
【００８０】
ｒｈＴ（Ｒｅｃｏｔｈｒｏｍ、全米医薬品コード第２８４００号［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ］）を、げっ歯動物についてキットに含まれる０．９％ＮａＣｌによって、またはＮＨＰ実験においてはＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含むダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ］）により戻した。ｒｈＴの最終アリコート（１，０００ＩＵ／ｍＬ）を−２０℃で保した。
【００８１】
膵島を含む生物学的足場の生体内原位置での作製による移植手順を、図１に要約する。げっ歯動物実験について、膵島アリコートを遠心分離（１分、２００ｇ）し、上清を捨て、膵島を同系（自家）血漿中に再懸濁した。更に遠心分離した後、大部分の余分な血漿を除去し、膵島／血漿のスラリーを精密注射器（ｈａｍｉｌｔｏｎｃｏｍｐａｎｙ．ｃｏｍ）で回収した。同様に、ＮＨＰの場合は、膵島を微量遠心チューブに回収し、短時間遠心し、ドナー血漿（−１日目に得て、４℃で保存）中で二回洗浄し、手術室へ運んだ。余分な血漿を、マイクロピペット（Ｐ１０００）を使用して膵島／血漿の回収前に除去した。両方の種において、膵島／血漿スラリーを網の表面上に穏やかに分散させ（図１Ａ、ｂ２、およびｃ３）、次いでｒｈＴを移植片上に穏やかに滴下し（図１Ａ、ｃ４）、膵島を即時にゲル化させ、網表面に付着させた。網を穏やかに２つに折り畳んで、移植片との接触および移植片の封じ込めを増加させた（図１Ａ、ｂ３、ｂ４、およびｃ５）。ＮＨＰにおいて、取り出し時の参照として非吸収性の縫合糸により移植片領域外側の網を縫合した（図１、ｃ５）。げっ歯動物実験において、折り畳まれた網に対して、何も使用しないか、縫合するか、または血漿：ｒｈＴ混合物（１０：１のｖ／ｖ）が使用された。腹膜腔に網を再配置した後に、腹壁筋および皮膚を縫合した。
【００８２】
膵島調製物のばらつきによる潜在的交絡効果（３１）を回避するために、移植部位または移植片純度の比較を目的とするラット実験については、大量の一回の単離分からの等しい数の同系膵島を糖尿病レシピエントへと生物学的足場または肝臓に並行して移植した（２５）。選択されたラットにおいて、長期の経過観察後に移植片を含む網を除去する生存手術を実施して高血糖へと即座に戻るのを確認し、これにより、本来の膵内分泌部の機能が残存している可能性を除外した。
【００８３】
免疫抑制
臨床的に関連する免疫抑制剤が、ラットおよびＮＨＰ同種異系移植モデルにおいて使用された（３２〜３５）。ラットは、Ｓａｆｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（３５）から改変して、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（ＣＤ１５２）−免疫グロブリン融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）（０、２、４、６、８および１０日目ならびにその後毎週に１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与；アバタセプト［Ｏｒｅｎｃｉａ］［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｓ．ｃｏｍ］）と組み合わせて、抗リンパ球血清（−３日目に０．５ｍＬを腹腔内投与［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｕｒａｔｅ．ｃｏｍ．ｇｒ］）およびミコフェノール酸（移植日に開始して２週間２０ｍｇ／ｋｇ／日で、次いで、２０日目まで１日おきに投与量の１／４の割合で漸減して投与；マイフォーティック［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖａｒｔｉｓ．ｃｏｍ］）（３６）による誘導処理を受けた。ＮＨＰは、抗胸腺細胞（ウサギ）グロブリン（移植から−１、０、２および４日目に１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与；サイモグロブリン；Ｓａｎｏｆｉ）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（０、４、１４、２８、５６および７５日目に２０ｍｇ／ｋｇで、ならびにその後月１回、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与；ベラタセプト［Ｎｕｌｏｊｉｘ］［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｓ．ｃｏｍ］）、およびシロリムス（２日目から毎日、８〜１２ｎｇ／ｍＬのトラフレベルを目標として投与；ラパマイシン［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｃｌａｂｓ．ｃｏｍ］）を投与された。
【００８４】
バイオマーカー
血液試料は、ベースライン時および移植後の選択された時点以後に留置ＪＶＣから回収した。インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、インターロイキン（ＩＬ）−６およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）（以前はＭＣＰ−１）を、市販のマルチプレックスキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）を使用して測定し、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムで分析した。ラット急性期タンパク質α２−マクログロブリンおよびハプトグロビンのレベルを、特異的なＥＬＩＳＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ）を使用して、動態マイクロプレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ）で測定した。
【００８５】
組織病理学
組織切片（厚さ４μｍ）を、移植片の形態学的評価のためにヘマトキシリン・エオジンで染色した。マッソン三重染色（Ｃｈｒｏｍａｖｉｅｗ、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ［ｈｔｔｐｓ：／／ｖｗｒ．ｃｏｍ］）を選択された移植片に対して行い、コラーゲン（青染色）または筋線維および細胞質（赤染色）を明らかにした（２５）。特異的抗体を使用して免疫蛍光法を実施し、インスリン（１：１００；モルモット抗インスリン［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｋｏ．ｃｏｍ］）、グルカゴン（ＧＣＧ）（１：１００；ウサギ抗グルカゴン［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｇｅｎｅｘ．ｃｏｍ］）、内皮（１：２０；ウサギ抗ＣＤ３１［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ］または１：５０；フォンビルブラント因子［ｖＷＦ］、ウサギ抗ｖＷｆ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ］）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）（１：５０；ウサギ抗ＳＭＡ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ］）、およびＴ細胞（１：１００；ＣＤ３、ウサギポリクローナル抗ヒト［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｍａｒｑｕｅ．ｃｏｍ］）を検出した。使用された二次抗体は、ヤギ抗モルモットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（１：２００）およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ］）であった。デジタル画像は、ＤＲＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙのＳＰ５倒立型共焦点顕微鏡（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｉｃａ．ｃｏｍ）を使用して得た。
【００８６】
走査型電子顕微鏡
ヒト血漿は、同意したボランティア（ＩＲＢ２００９１１３８）から得た。ヒト膵島およびヒト膵島を含有または非含有の血漿／トロンビン凝塊を、ＰＢＳ（０．１３７ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４および０．００２７ｍｏｌ／ＬのＫＣｌ（ｐＨ７．４））中２％のグルタルアルデヒドで≧３時間固定し、固定液中に４℃で保存した。３回の洗浄後、試料はＰＢＳ中１％の四酸化オスミウムで後固定し、エタノールで脱水し、ヘキサメチルジシラザンで乾燥させ、プラスチック計量ボートに分散させ、一晩ガス抜きした。調製物を、穏やかに押すことによって粘着性カーボンタブで覆われたアルミニウムスタブに付着させ、次いで、プラズマスパッタコーターで２０ｎｍ厚のパラジウム層によりコーティングし、ＵＭ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙで電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥＩ  ＸＬ−３０）を使用して撮像した。
【００８７】
統計解析
データは、Ｅｘｃｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａｐｌｏｔ．ｃｏｍ）およびＰｒｉｓｍ６（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して解析された。シャピロ−ウィルク検定を使用してパラメトリックなデータ分布を評価した。対応のないｔ検定を実行して実験群を比較した。示される値は、表示される場合を除いて平均±ＳＥＭである。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意であるとみなした。
【００８８】
実施例２
この実施例は、非ヒト対象に細胞を移植する方法を実証する。
【００８９】
膵島移植は、β細胞機能を維持するかまたは回復させるための治療選択肢である。本発明者らの研究は、膵島の肝臓外移植のための臨床応用可能なプロトコールを開発することを目的とした。生体内原位置に生成された接着性、吸収性の血漿トロンビン生物学的足場を使用して網上に移植された膵島の能力が、糖尿病ラットおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおいて評価された。生物学的足場内の網内膵島の生着が、島内の豊富な血管網の再構築を伴う改善された代謝機能および膵島細胞構造の維持の達成によって両方の種において確認された。長期の非絶食時正常血糖および十分なグルコースクリアランス（負荷試験）が、ラットの肝内部位および網内部位の両方で達成された。網内移植レシピエントは、膵島の有害ストレス（例えば、急性血清インスリン）および炎症（例えば、レプチンおよびα２−マクログロブリン）の低レベルの血清バイオマーカーを示した。重要なことに、低純度、（３０：７０％の内分泌：外分泌）同系ラット膵島調製物は、網内での生物学的足場移植後の純粋な（＞９５％内分泌）調製物と同等の機能を示した。更に、生物学的足場は、免疫抑制レシピエントにおいて同種異系膵島生着を維持した。
【００９０】
生物学的足場の極微構造
走査型電子顕微鏡は、ヒト血漿中のｒｈＴにより引き起こされた反応によって得られた複雑なフィブリン線維網を明らかにした（図２Ａ）。ヒト膵島細胞表面は、超顕微法によって滑らかにみえた（図２Ｂ）。インビトロでヒト血漿をｒｈＴおよびヒト膵島と混合することによって引き起こされる凝塊は、新たに形成された生物学的足場内に膵島構造を閉じ込めている相似三次元フィブリンマトリックスの発生をもたらした（図２Ｃ）。本発明者らは、移植された膵島周囲の微細な接着性フィブリン足場を生じさせる血漿／トロンビン反応の誘導は、膵島移植片の網の表面への接着を促進するのに有用であり、これにより膵島のペレット化を防ぎ、したがって、生着、新血管新生および膵島の生存を補助すると推論した。
【００９１】
生物学的足場に移植された網内膵島は糖尿病ラットにおいて正常血糖を回復させる
同系ラット膵島移植モデルが使用された。３，０００ＩＥＱのストレプトゾトシン糖尿病レシピエントが肝臓内移植または肝臓外移植後に糖尿病の回復を経験することが以前に証明された（２５）。１７，３３８±８８１ＩＥＱ／ｋｇの網内移植後、全ての動物（ｎ＝７；１７３．４±９１ｇ体重）は、２日以内に正常血糖を達成し、正常血糖を経過観察期間（図３Ａ）の間維持し、＞２００日目でさえ維持した。２匹の動物が、移植後７６日目に移植片を含む網の除去を受け、１匹は手術後に死亡し、もう１匹はすぐに高血糖になった（図３Ａ）。残りのレシピエントは、移植後＞２００日間、経過観察した。膵島移植の２ヵ月後に選択された動物において実施されたＩＶＧＴＴは、移植された膵島は、グルコースをボーラス投与され後に無処置の動物のそれと同等の様式で７５分以内にグルコースを除去したことを示した（ｎ＝３／群；無処置のラットにおける１７，８５１±８１０ｍｇの×分×ｄＬ−１に対する網内膵島生物学的足場レシピエントにおける１６，２７６±８５７ｍｇの×分×ｄＬ−１のＡＵＣ）（図３Ｂ）。更に、移植の１１および２６週間後に移植された動物において実施されたＯＧＴＴは、両方の時点での同等のグルコースクリアランスを確認した（ｎ＝５；１１週目での１９，５４２±１，７３５ｍｇ×分×ｄＬ−１および２６週目の２０，７３５±７８５ｍｇ×分×ｄＬ−１のＡＵＣ）（図３Ｃ）。外植された移植片の組織病理学は、良く保存された膵島細胞構造（図３Ｄ−Ｇ）、強いインスリン免疫染色および豊富な移植片内血管化（例えば、ＳＭＡ）を示し、全ての特徴は、十分な生着と矛盾せず、インビボでの機能的データを補強した。
【００９２】
生物学的足場に移植された肝内および網内膵島の同等の機能
網内の生物学的足場内に移植された同系膵島の性能を、肝内移植片の性能と比較した。同一バッチの膵島からの１，３００ＩＥＱ（〜８，２００ＩＥＱ／ｋｇの体重［「臨床的に関連する」腫瘤］）のアリコートが、網内の生物学的足場内（ｎ＝７；１６０．３±６．４ｇ体重［８，１２２±３３４ＩＥＱ／ｋｇ］）（図４Ａ）に、または肝内部位（ｎ＝５；１５５．４±７．３ｇ体重［８，３８０±３９６ＩＥＱ／ｋｇ］）（図４Ｂ）に並行して移植された。両方の群において全てのレシピエントは、１週間以内に正常血糖を達成し、８２日（〜１２数週間）の経過観察期間の間、良好な代謝制御を維持した。網の移植片除去は、高血糖の即座の再発をもたらした（ｎ＝４）（図４Ａ）。移植の５週間後（図４Ｃ）および１１週間後（図４Ｄ）でのＯＧＴＴは、両方の移植部位において同等の代謝機能を示した（それぞれ、網内生物学的足場レシピエントまたは肝内膵島レシピエントについて５週目のＡＵＣは１８，３９３±５７１および１８，０３６±５９８．５ｍｇ×分×ｄＬ−１であり、１１週目のＡＵＣは２１，９８７±２，５８０および２１，１４９±１，４５６ｍｇ×分×ｄＬ−１）（図４ＣおよびＤ）。
【００９３】
生物学的足場内の網内膵島のレシピエントにおける低レベルのストレス関連バイオマーカー
移植処置によって誘発される膵島の有害ストレスおよび炎症に関連する選択されたバイオマーカーが、評価された。血液試料を、移植後の異なる時点でＪＶＣから回収した。有害ストレスを与えられた膵島細胞（５，３７，３８）からのインスリンのダンピングの結果であり得るインスリンおよびＣ−ペプチドレベルの急上昇が、両方の実験群において移植の１時間後に観察された。インスリンピークは、網内の群と比較して肝内の群において有意に高く（それぞれ、１．４０５±０．３５２μｇ／ｍＬに対して２．８４１±０．３３８；Ｐ＝０．０１８）（図５Ａ）、その後の時点では両方の群において同等レベルであった（データ非表示）。Ｃ−ペプチドレベルでは、統計学的有意差が観察されなかった（それぞれ、２．５６５±０．２５に対して２．９４１±０．３０３μｇ／ｍＬ）（図５Ｂ）。
【００９４】
網内生物学的足場は低純度の膵島調製物の十分な生着を提供する
臨床でのヒト膵島調製物は、通常、移植組織の最終容量を増加させる異なる程度の不純物（例えば、外分泌組織）を含有する。本発明者らは、網内生物学的足場が臨床的に関連する低純度の膵島調製物の移植に適切かどうか評価した。純度＞９５％（ｎ＝３；１６７．３±１．５ｇ体重［１１，８５３±１０９ＩＥＱ／ｋｇ］）、または純度３０％（ｎ＝３；１７０．３±１０．５ｇ体重［１１，７７１±７２５ＩＥＱ／ｋｇ］）の同系膵島調製物からの２，０００ＩＥＱの移植は、全てのレシピエントラットの急速な糖尿病の回復（５日以内）をもたらした（図６Ａ）。全ての動物は、経過観察期間を通して安定した正常血糖を維持し、ＯＧＴＴにおいて同等のグルコースクリアランスを示した（ＡＵＣ：それぞれ、純度９０および３０％調製物のレシピエントについて１７，７７６±１，６８７および１９，７３４±１，９９７ｍｇ×分×ｄＬ−１）（図６Ｂ）。移植片を含む網の外科的除去を、移植の＞１００日後に実施した。純度３０％膵島のレシピエントのうちの１匹は手術後に死亡したが、両方の群において全ての他の動物は、高血糖の迅速な再発を示し、移植片依存的な正常血糖が確認された。
【００９５】
網内生物学的足場は、免疫抑制レシピエントにおいて同種異系膵島の十分な生着を提供する
臨床的に関連する全身免疫抑制処理（３２〜３５）下での網内生物学的足場の膵島生着補助に対する適合性が、完全ＭＨＣ不一致の同種異系ラットの移植組み合わせにおいて評価された。３，０００ＩＥＱのＷＦ膵島（ＲＴ１ｕ）の糖尿病Ｌｅｗｉｓラット（ＲＴ１ｌ）レシピエントは、４匹全てが、使用された一過性の全身免疫抑制プロトコール下で５日以内に正常血糖を達成し、移植片拒絶が高血糖状態の再発と同時に起きた移植の５週間後まで移植片の機能を維持した（図７）。
【００９６】
生物学的足場内の網内膵島移植片は前臨床モデルにおいて生着する
同種異系膵島移植の臨床的に関連する前臨床モデルにおける生物学的足場の効果を、糖尿病カニクイザルで調べた。移植前は、上記動物は、＜０．０５ｎｇ／ｍＬの血漿Ｃ−ペプチドと共に４〜５ＩＵ／ｋｇ／日までの外因性インスリンを必要とする（図８）。〜９，３４７ＩＥＱ／ｋｇに相当する４８，７００ＩＥＱの膵島塊（〜１５０μＬの総膵島移植片容量）を移植した。移植処置および手術後の臨床転帰には問題がなく、手術からの標準的な回復を示した。移植後の最初の数週後に、ＦＢＧおよびＰＢＧの改善が観察され、外因性インスリンの漸減を必要とした（図８Ａ）。陽性の空腹時Ｃ−ペプチドレベル（図８Ｂ）が、移植直後および経過観察を通して観察された。その後に上記動物は、生着部位とは無関係な技術的合併症のために、手術の４９日後（ＰＯＤ）に息を引き取った。外植された移植片の組織病理学的評価は、内分泌マーカーであるインスリンおよびグルカゴンについての免疫反応性（図８Ｄ）、ある程度の島周囲のリンパ球浸潤（ＣＤ３）（図８Ｅ）、ならびに島内部および外部の豊富な血管構造（ＳＭＡ［図８Ｆ］およびｖＷＦ［図８Ｇ］）を有する良く保存された膵島の形態（図８Ｃ）を実証した。
【００９７】
実施例３
この実施例は、例示的なヒト対象に細胞を移植する方法を実証する。
【００９８】
膵島移植は、１型糖尿病を有する患者の正常血糖を回復させ、重篤な低血糖をなくすことができる。１膵島移植を肝内配置によって実施する場合、制限事項としては、限られた移植片組織容量、配置による出血、移植後の高濃度の免疫抑制薬への曝露、および即時の血液媒介性炎症応答の誘発が挙げられる。２網は、膵島移植のための密に血管形成した表面を提供し、門脈系へと流入し、容易に利用可能である。３、４
【００９９】
無自覚性低血糖および重篤な低血糖のエピソードを合併した、１型糖尿病の２５年の病歴を持つ４３歳の女性の症例（体重５３．４Ｋｇ；ＢＭＩ  ２１．５Ｋｇ／ｍ２；インスリン１日量３２．９１±１．２８単位／日）を本明細書に掲示する。刺激性Ｃ−ペプチドレベルは＜０．３ｎｇ／ｍＬ（＜０．１ｎｍｏｌ／Ｌ）であり、ＨｂＡ１ｃは６．８％であった。患者は、網上への膵島移植を受けた（ＮＣＴ０２２１３００３）。１人の死亡したドナーに由来する６０２，３９５膵島量（１膵島量＝１５０μｍの膵島直径）（６．５ｍＬの包装された総組織容量）を自己血漿（１：２の比率）と混合し、腹腔鏡下で網上へと重ねた。組換えトロンビン（２０ｍＬ；Ｒｅｃｏｔｈｒｏｍ（登録商標）、１０００単位／ｍＬ）を、膵島を覆って重ねた。実施例１および２に記載の方法と異なり、トロンビンが膵島を覆って重ねられた後に自己血漿の更なる層が重ねられて分解可能な生物学的足場が生成された。誘導は抗胸腺細胞グロブリンおよびエタナーセプトを含み、維持免疫抑制はミコフェノール酸ナトリウムおよびタクロリムスから構成された。タクロリムスは、脱毛により移植の８ヵ月後にシロリムスに切り替えられた。外科合併症は、観察されなかった。
【０１００】
インスリンは、移植の１７日後に中断された。毛細血管血糖、連続グルコースモニタリング、混合食負荷試験、ＨＯＭＡインデックスおよびＢＥＴＡスコアを、図９および表１に示す。５
【表１】
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【０１０１】
１２ヵ月目では、９０分グルコースは、２６６ｍｇ／ｄＬ（１４．６ｍｍｏｌ／ｌ）であり、３００分での１３０ｍｇ／ｄＬ（７．１ｍｍｏｌ／ｌ）へと減少した。連続グルコースモニタリングでの７日間の平均グルコースは、１０９±１５ｍｇ／ｄｌであり（６．０±０．８ｍｍｏｌ／ｌ；ｎ＝１８７６）、ＨｂＡ１ｃは６．０％、β−スコアは７、ＢＥＴＡ−２スコアは１０であった。インスリン分泌は時間の経過と共に減衰し、グルコース濃度が増加したが、これらは亜糖尿病の範囲内にとどまった。患者は現在定期的に運動し、低炭水化物食を続けており、おそらくこのことが彼女の血糖安定性に寄与している。
【０１０２】
この患者において、網上への膵島移植は、正常血糖およびインスリン離脱を回復させた。インスリン感受性の増加を伴う１２ヵ月目での機能低下が観察され、これはタクロリムスのシロリムスへの切替えに起因すると本発明者らは考えている。患者は、現在外因性インスリンなしで安定した血糖管理を有し、低血糖エピソードは起きていない。
【０１０３】
材料および方法
１型糖尿病発症の病歴
本明細書で報告される患者は、彼女が前月にわたって多飲、多尿、多食および約１０ポンドの意図しない体重減少を呈した後、１７歳で１型糖尿病の診断を受けた。彼女は、疾患発症時に８００ｍｇ／ｄＬの範囲のグルコース濃度を有していたことを思い出したが、ＨｂＡ１ｃレベルを思い出せなかったか、または糖尿病ケトアシドーシスの診断を確認することができなかった。患者がその時に海外に居住していたため、彼女の最初の診断に関連する医療記録は利用できない。彼女は、直ちにインスリン治療を開始した。
【０１０４】
移植前評価
膵島移植のスクリーニング評価時に、２８日間のグルコース−インスリン記録から得られたインスリン要求性は、３３．３０±１．７６単位／日であった。患者は無自覚性低血糖と一致する６のＣｌａｒｋｅスコアを有した１。彼女は、重篤な低血糖（すなわち、補助を必要とする）を移植の前年の間に１ヵ月につき少なくとも１回経験しており、グルカゴン投与を必要とする、意識喪失に付随する３回のエピソードを経験した。
【０１０５】
移植前評価には、対応する２９８ｍｇ／ｄＬ（１６．３９ｍｍｏｌ／ｌ）のグルコースを伴う、＜０．１ｎｇ／ｍＬ（＜０．０３ｎｍｏｌ／Ｌ）の空腹時Ｃ−ペプチドおよび０．１５ｎｇ／ｍＬ（０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ）の９０分Ｃ−ペプチド（混合食負荷試験の２時間後）が見られる。本発明者らは、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ抗原−２（ＩＡ−２）、Ｚｉｎｃ輸送タンパク質８（ＺｎＴ８）およびインスリンに対する糖尿病に関連する自己抗体の存在を評価した。インスリン抗体アッセイを除いて、全ての自己抗体レベルは、試験試料ならびに陽性対照および陰性対照試料のカウント数毎分から算出されたインデックスとして表現される。正常値上限は、ＲＯＣ（受信者動作曲線）を使用して算出された。患者の結果は、ＩＡ−２（２３．３のインデックス［正常カットオフ６．４］）およびＺｎＴ８（７．９のインデックス［正常カットオフ３．３５］）自己抗体について陽性だったが、ＧＡＤ６５およびインスリン自己抗体については陰性であった。移植５ヵ月前の追跡調査訪問時は、２８日のグルコース−インスリン記録からのインスリン要求性は、３２．９１±１．２８単位／日であった。
【０１０６】
膵島移植後の体重減少
膵島移植後、８．２Ｋｇの段階的な体重減少が、移植後６ヵ月で観察された。彼女の体重は、栄養評価およびバランスの取れた食事の再開後、４５．５Ｋｇで安定し、横ばいになった。膵島移植後の体重減少は、予想外ではなく、以前に報告されていた。２可能性のある原因としては、インスリン要求性の最適化（すなわち、外因性インスリン投与の離脱および生理的内因性インスリンの送達）および低血糖の解決に一部起因する炭水化物摂取の減少が挙げられる。
【０１０７】
インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ）インデックス
ＨＯＭＡインデックス３を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｔｕ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍａｃａｌｃｕｌａｔｏｒのオンラインで利用できるＨＯＭＡ２計算機（バージョン２．２．３（著作権）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｕｎｉｔ、オックスフォード大学）を使用して、インスリン感受性の変化およびβ細胞機能を長期的にモニタリングするために算出した。
【０１０８】
ＨＯＭＡ２−ＩＲ（インスリン抵抗性）は、時間の経過と共に減衰した。ＨＯＭＡ２−％Ｂ（１３−細胞機能）は、ＭＭＴＴの間に観察された代謝応答と一致して、６ヵ月で改善した。ＨＯＭＡ２−％Ｂの減衰が１２ヵ月目に観察され、これはＨＯＭＡ−２％Ｓ（インスリン感受性）の段階的増加を伴った。
【０１０９】
ＢＥＴＡスコア
確認された１３−スコア４およびＢＥＴＡ−２スコア５を、膵島移植後のβ細胞機能の総合的指標として利用した。
【０１１０】
６ヵ月目で彼女は、全体的として優れた移植片の機能を示す８のβ−スコアを有した一方で、インスリン離脱に関連する１５のＢＥＴＡ−２スコアは、この値が耐糖能障害にも関連し、上記患者が１６５ｍｇ／ｄＬの９０分グルコース（図９、パネルＣ）を有したため、血糖管理に関して更なる情報を提供した。
【０１１１】
１２ヵ月目にβ−スコアは、７（依然としてインスリン離脱および全体的として良好な移植片の機能に関連する値）に減少した。注目すべきことに、ＢＥＴＡ−２スコアは、１０（一般に、インスリン離脱の喪失に関連する値）に、著しく減少した。上記患者は混合食負荷試験に対する減少したインスリン分泌応答を有したが、７日間の連続グルコースモニタリングによって評価された彼女の全体としての血糖管理は、１０９±１５ｍｇ／ｄＬ（７３〜１５１ｍｇ／ｄＬの範囲、ｎ＝１８７６）であり、インスリン治療の再導入を必要としなかった。上記患者は、定期的に主にエアロビック運動をして運動を継続しており、健康な低炭水化物食を続けている。本発明者らは、これらの要因がおそらく彼女の安定した血糖管理に寄与していると推測する。
【０１１２】
実施例４
この実施例は、膵島を調製する例示的な方法を実証する。
【０１１３】
ランゲルハンス島においてインスリン産生細胞の破壊は、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の進行の間に発生し、グルコースホメオスタシスの喪失をもたらす。Ｔ１ＤＭを治療するためのヒト膵島の移植は、細胞療法に現在使用されている唯一の細胞供給源である。Ｔ１ＤＭを有するレシピエントにおける膵島移植は、血糖管理を改善し、高血糖を制御するための外因性インスリン注射剤の必要性を低下させるか、またはなくし、重篤な低血糖エピソードを防止し、正常に近いＨｂＡ１ｃレベルを維持する。しかし、移植の有効性は、移植前の膵島生存率および機能の喪失、または移植後の膵島の拒絶もしくは移植片の機能の喪失により制限されてきた。移植前の膵島生存率の向上および長期機能の改善は、臨床的成果を改善し得る。この研究の目的は、インビトロでの内皮細胞および内皮由来のエキソソームの膵島機能および生存率に対する明白な効果を解明することであった。内皮細胞または内皮由来エキソソームと膵島の共培養は、膵島の完全性、形態を維持し、膵島の機能を延長することができた。これらの結果は、内皮由来のエキソソームをヒト膵島の移植前培養物の最適化のための無細胞治療として使用して潜在的にヒト膵島の機能および臨床的成果を延長することができることを実証する。
【０１１４】
膵臓全体または精製された膵島細胞の移植は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有する患者のインスリン分泌を回復させる治療選択肢と考えられる  １。膵島移植は、Ｔ１Ｄを有するレシピエントにおいて血糖管理を改善し、糖尿病を制御するためのインスリン注射の必要性を低下させるか、またはなくす一方で、重篤な低血糖エピソードを防止し、正常に近いＨｂＡ１ｃレベルを維持することを示した２、３。しかし、膵島移植の有効性は制限されてきた。したがって、膵島移植片の移植後の結果における成功率改善の大きな必要性が存在する４。制限事項の１つとして、移植前の２〜３日のインビトロ培養におけるヒト膵島生存率および機能の喪失が挙げられる５。インビトロ培養が品質維持を実行し、移植前に膵島が産物放出基準を満たすのを確実にするために必要とされるため、培養の間、膵島の生存および全体的な質を最適化することは重要である６。
【０１１５】
糖尿病治療のための膵島移植を改善するために、膵島を間葉系幹細胞または内皮細胞などの異なる細胞種と共に共培養することができる７１２。実際、内皮細胞と共に膵島を培養することは、膵島の生存および機能を改善し、移植の成功を改善し得る７、１３。また、ＶＥＧＦまたはヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ｈＩＬ−１Ｒａ）などの内皮細胞により分泌される特定の因子、膵島の生存を延長することができ得る３、１４、１５。同様に、マイクロ小胞などの内皮細胞により放出される他のパラクリン因子は、β細胞機能を改善することができるようである１６、１７。この研究の目的は、移植前培養における内皮細胞および特に内皮由来のエキソソームのヒト膵島の生存および機能を維持および改善する能力を更に調べることであった。
【０１１６】
結果
内皮細胞および内皮細胞由来エキソソームの特徴付け
ＨＵＶＥＣ１８を含むほとんど全ての細胞は、種々の重要な生理作用を有する異なる種類の膜マイクロ小胞およびナノ小胞を放出する。マイクロ小胞は、主にそれらのサイズおよび生成機序においてナノ小胞と異なる。マイクロ小胞は、分断または出芽によって細胞膜から放出され、サイズは通常０．２μｍより大きく、マイクロパーティクルまたはエクトソームと称されてきた。対照的にエキソソームを含むナノ小胞は、直径３０〜１００ｎｍの間であり、エンドサイトーシス起源を特徴とし、多胞体（ＭＶＢ）または後期エンドソームの周辺膜の逆の出芽によって形成される。異なる種類の細胞外小胞のタンパク質内容物は、一般に、親細胞のそれを反映する。またＥＶは、タンパク質およびＲＮＡを含む特定の分子を豊富に含む。ここで本発明者らは、ＨＵＶＥＣによって産生されるナノ小胞を、そのサイズおよびタンパク質内容物のために、エキソソームと称する（下記参照）。
【０１１７】
ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームが膵島の生存および機能に対する効果を有したかどうかを決定するために、ＨＵＶＥＣ細胞を培養し、ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームを超遠心分離法によって条件培地から調製した。位相差顕微鏡によりＨＵＶＥＣが分析され、大きな核を有する典型的な玉石型の形態が示された。エキソソームを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を特徴付けした。ＮＴＡ（図１０Ａ）により、観察された粒子サイズおよびサイズ分布が確認され、ＨＵＶＥＣエキソソームの大きさは、９６ｎｍであると推定された。エキソソームのＴＥＭ分析は、ＮＴＡデータと一貫して、特徴的な杯状形態（図１０Ｂ）を有するサイズが≦１００ｎｍの小胞を示した。重要なことに、Ｅｘｏ−Ｒｅｄ（赤染色）によって標識されるＲＮＡカーゴを有するエキソソームのＭＩＮ６細胞またはヒト膵島との２〜４時間の共インキュベーションは、標的細胞によるエキソソームＲＮＡの取り込みを実証した（図１０Ｃおよび１Ｄ）。
【０１１８】
膵島の形態
ヒト膵島形態の保持が島機能の予測の重要なパラメーターであることが知られている１９、２０。糖尿病の進行と同様に膵島移植の失敗に伴う、膵島形態の破壊および島機能の喪失が証明されてきた２１。ヒト膵島形態は、位相差顕微鏡によって、単離後に線維芽細胞の単一の層からなるカプセルによって囲まれている、内分泌細胞の直径約５０〜２５０μｍの小さな分散した黄金色のクラスター様構造として観察することができる。しかし、膵島は培養下で１週間の間に形態学的変化を示す。単独で培養される場合、膵島は三次元のクラスター形態を段階的に失い、二次元の構造になる。これは、それらを囲む膜の喪失に関連する（図１１）。無処理の膵島では、クラスター様構造の数が減少し、より不規則で平坦な断片化された膵島が見出される（図１１Ａ、ａ；図１２Ａ）。しかし、ＨＵＶＥＣまたはＨＵＶＥＣ由来のエキソソームで処理された膵島では、クラスター様形態が維持され、膵島外に見出される遊走細胞が少ない（図１１Ａ、ｂおよびｃ、図１２Ａ）。
【０１１９】
膵島の機能
高グルコース（１６．６ｍＭ）に対して低グルコース（２．２ｍＭ）培地中に放出される細胞インスリンの百分率を比較することにより、島機能をグルコース刺激性インスリン分泌によって評価した（図１２Ｂ〜Ｃ）。標準条件で１週間間培養された膵島は、培養０日目の膵島と比較して刺激指数の有意な減少を示した（ｐ値＜０．０００１）。０日目の標準的な培養群と比較して、ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームと共培養された膵島にはシミュレーションインデックスに差がなく、ＨＵＶＥＣと共培養された膵島には刺激指数のわずかな改善（ｐ値＜０．０５）があった。培養７日後において無処理の膵島と比較して多量のグルコース依存性インスリン分泌が、ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームで処理された膵島で生じた（ｐ＜０．００５；図１２Ｃ）。
【０１２０】
内皮細胞および内皮細胞由来のエキソソームのヒトアポトーシスタンパク質アレイ。
【０１２１】
ＨＵＶＥＣまたはＨＵＶＥＣ由来のエキソソームがインビトロで島機能を増強できることが証明されたため、本発明者らは、細胞またはエキソソームが、島機能を増強し、ヒト膵島に保護を提供することができる抗アポトーシスタンパク質を伝達することができるかどうかを更に検討した。ヒトアポトーシス関連タンパク質アレイを実施して細胞およびエキソソーム中のアポトーシス関連タンパク質の存在を半定量的に検出した。代表的なアレイのデータを図１３に示す。デンシトメトリーによるタンパク質シグナルの定量化は、インスリン様増殖因子結合タンパク質２を示した。
【０１２２】
ＩＧＦＢＰ２は、エキソソームにおいて細胞におけるレベルに対して１．８倍増加した。対照的に、ｂｃｌ−ｗ（ＢＣＬ２様２）は、０．６４倍に減少し、ＢＩＤ（ＢＨ３共役ドメインデスアゴニスト）は、０．５５倍に減少し、ｓＴＮＦＲＩ（可溶性腫瘍壊死因子受容体１）は、０．５３倍に減少した（図１３Ｄ）。
【０１２３】
考察
移植前のインビトロ培養期間における膵島細胞の生存および生存率を改善する切迫した必要性が存在する。この研究の目的は、培養ヒト膵島の機能を維持し、増強する内皮細胞の能力を調べることであった。ここで、本発明者らは、ヒト内皮細胞由来のエキソソームが内皮細胞と膵島の間の相互作用を促進することを証明した。更に、本発明者らは、ヒト内皮細胞によって放出されるエキソソームが、エキソソームによって保有されるＲＮＡカーゴのヒト膵島細胞への伝達および内部移行を仲介することを証明した。更にグルコース刺激性インスリン分泌は、内皮由来のエキソソームと共に１週間培養された膵島群において、標準条件下で培養されたものと比較して０．５倍高い刺激指数（ｐ値＜０，００５）を示した。総合すると、これらの結果は、ヒト膵島へと内部移行されて島機能を保持する内皮由来のエキソソームの能力を実証する。
【０１２４】
長期培養における膵島の維持は、移植する膵島の品質維持および輸送を行うために必要とされ、膵島の断片化、膵島塊の喪失、および細胞生存率減少に関連することが示されてきた４、２２。移植前に培養された膵島の質の改善は、膵島移植の成功および臨床的成果を改善するはずである。本発明者らの結果は、内皮細胞および特に内皮細胞エキソソームは、培養下の膵島の生存および機能を改善するだけでなく、生体内での正常な膵β細胞機能に寄与することもできることを示唆した７、１３、２３〜２６。内皮細胞は、例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ラミニン、コラーゲン等の膵島の機能に影響を及ぼす分子を分泌するパラクリン効果による膵島微小環境における明白な効果を有する。また生体内での膵島に対する同様の明白な効果が、内皮細胞エキソソームによって仲介され得る。
【０１２５】
近年、エキソソームは、様々な生理学的または病態生理学的条件における、タンパク質、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡの伝達により細胞間の情報交換を仲介する可能性のある候補として出現した１７、２８、２９。この研究において、内皮細胞は、超遠心分離によって単離することができ、３０〜１００ｎｍの間のサイズおよび杯状形態を含むエキソソームの典型的特徴を示すエキソソームを放出することが観察された。更に、内皮由来のエキソソームは、その標識されたＲＮＡカーゴを膵島に伝達し、これにより、両方の細胞種間の生物情報の伝達を媒介することが実証された。更に、共培養群の膵島の形態は完全性の維持を示したが、標準的な培養条件においては不規則な構造を有するより破壊された膵島が存在した。また、形態を維持することに加えて、内皮細胞によって放出されるエキソソームは、１週間の培養下で、標準条件で培養された膵島と比較してβ膵島細胞によるグルコース刺激性インスリン分泌を増加させる能力を示した。ＨＵＶＥＣおよびＨＵＶＥＣ由来のエキソソームのヒトアポトーシスアレイによる発現が異なるタンパク質の分析は、抗糖尿病効果３０に関連するＩＧＦＢＰ２などの細胞代謝過程の正の調節に関与するタンパク質、ならびに新生血管形成および虚血状態の改善３１に関与するタンパク質のエキソソームにおけるレベルの増加を示した。対照的に、下方制御されたタンパク質は、ミトコンドリア機能および細胞死で関係付けられるｂｃｌ−ｗ生存促進性タンパク質３２、ＦＡＳ依存的ヒト膵島細胞死に関係付けられるＢＩＤ３３など、外因性アポトーシスシグナル伝達経路と関連し、細胞死経路に関連するＳＴＮＦＲＩ３４は減少した。抗体アレイによる本発明者らの発見は、内皮細胞によって放出されるエキソソームが、ＨＵＶＥＣ由来のエキソソームのより高い治療効果を説明し得るレベルで抗アポトーシスタンパク質を放出し、かつ／または抗アポトーシスタンパク質の発現を下方制御することを示した。
【０１２６】
まとめると、本明細書に記載される発見は、内皮細胞とヒト膵島間の新規の機序のパラクリン情報交換を強調し、糖尿病治療における島機能の改善におけるエキソソームの新規の機能を同定する。エキソソームのパラクリン効果は、それが移植前に島機能を改善する新規の無細胞治療として使用することができることを示唆する。
【０１２７】
実施例５
この例は、実施例４に記載の研究に利用された材料および方法を示す。
【０１２８】
倫理規定
この研究は、ヘルシンキ宣言に示された原則に則って実施された。脳死臓器提供者からの膵臓は、連邦ガイドライン則って様々な臓器調達機関から得た。器官は、マイアミ大学糖尿病研究所のｃＧＭＰ施設にて、マイアミ大学のヒト対象研究局により発行された、亡くなったドナーからの膵島細胞の単離は、ヒト対象研究にあたらないことを述べる免除証書の下で膵島の単離のために処理された。
【０１２９】
膵島単離および培養
３人の無関係のドナーから単離された膵島が、研究に使用された。表２に膵島ドナーの特徴をまとめる。ヒト膵臓に由来する膵島は、マイアミ大学ミラー医学部の糖尿病研究所のｃＧＭＰヒト膵島細胞処理施設で単離された。ヒト膵島は、補足されたＣＭＲＬ−１０６６培地（Ｇｉｂｃｏ）中で２２℃および５％ＣＯ２にて一晩培養された。
【表２】
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【０１３０】
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ）ＨＵＶＥＣは、ＬＳＧＳ（製品番号Ｓ−００３−１０、ロット番号１５４１７２５、Ｇｉｂｃｏ）および１％抗生物質を補足した２００ＰＲＦ  Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、継代数４〜５の間で使用した。
【０１３１】
膵臓βＭＩＮ６細胞（Ｄｒ．Ｂｕｃｈｗａｌｄ（糖尿病研究所、マイアミ、フロリダ州）より譲り受けた）を、２５ｍＭのグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃にて培養した。
【０１３２】
ＩｎｃｕＣｙｔｅリアルタイムイメージングアッセイ
ヒト膵島共培養プレートを、合計１週間毎日１０×倍率でウェル１つ当たり１６視野を撮像するリアルタイムイメージングのためにＩｎｃｕＣｙｔｅ（ＥＳＳＥＮ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ）に挿入した。データは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５ソフトウェアを使用して分析した。全てのＩｎｃｕＣｙｔｅによる実験は、三度繰り返して実施した。
【０１３３】
エキソソーム除去培地の調製およびエキソソーム単離
全ての栄養分を補足した培地を、４℃にて１１０，０００×ｇで１６〜１８時間遠心分離し、次いで、上清を０．２２μｍのフィルターを通して滅菌ボトルに濾過した。培地を４℃で最長４週間保存した。ＨＵＶＥＣ細胞を、それらが８０％のコンフルエンスに達するまで、通常条件下で増殖させた。培養培地を除去して、同程度の容量のエキソソーム産生培地と入れ替えた。細胞を４８時間インキュベーターに戻した。
【０１３４】
エキソソームを、以前に記述されているように超遠心分離によって単離した３５。培地を、４℃にて３００ｘｇで１０分間、２０００ｘｇで１０分間、および１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。次いで、上清を、４℃にて１００，０００×ｇで７０分間遠心分離した。各チューブのペレットを、１ｍｌのリン酸塩類緩衝液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、最後に試料を４℃にて１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、エキソソームのペレットを２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１３５】
透過型電子顕微鏡
精製したエキソソームを、ＰＢＳ中１％のグルタルアルデヒドにより固定した。リンス後、懸濁液の２０ｍＬ液滴をフォルムバール／炭素被覆グリッド上に載せ、３％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸水溶液で１分間ネガティブ染色し、Ｔｅｃｎａｉ  Ｓｐｉｒｉｔ  Ｇ−２装置（ＦＥＩ、アイントホーヴェン、オランダ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察した。
【０１３６】
ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）
エキソソーム調製物を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００およびＮａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＴＡ２．３  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ、およびＭａｌｖｅｒｎ、イギリス）によって解析して粒子数およびサイズ分布を得た。少なくとも３回の分析を、各個別の試料について実行した。
【０１３７】
共培養
ＨＵＶＥＣ細胞を、培養プレートから酵素により剥離し、計数し、１ｍＬの総容積中約３００個のヒト膵島と共に２４ウェル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加えた（０．１×１０６の細胞）。同じ方法論で、エキソソームの添加（１，２９ｘ１０１２粒子／ｍｌ）について実施した。対照には、単独で培養された膵島およびＨＵＶＥＣが含まれた。
【０１３８】
エキソソームの標識化およびエキソソーム取り込みのライブイメージング
エキソソームＲＮＡカーゴを、製造者のプロトコールにしたがってＥｘｏ−Ｒｅｄ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により標識した。要約すると、エキソソームペレットを１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、１０μｌのＥｘｏ−Ｒｅｄ染色液と混合し、３７℃にて１０分間インキュベートし、次いで、１００μｌのＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ試薬を添加して反応を停止させた。標識されたエキソソームを４℃にて３０分間インキュベートした。最後にエキソソームを１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ヒト膵島およびＭＩＮ６細胞をガラス底皿で増殖させ、標識されたエキソソームを添加し、１時間インキュベートした。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で直ちに細胞を画像化した。
【０１３９】
免疫蛍光染色
細胞を、０．５ｍｌ／ウェルの４％パラホルムアルデヒドを添加することによって室温にて２０分間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１ＭのＰＢＳ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で２０分間透過処理した。細胞をＰＢＳで再びリンスした。０．１ＭのＰＢＳ中に希釈された１０％正常ロバ血清および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でブロッキングを行った。一次抗体混合物とのインキュベーションを４℃にて一晩行い、続いて、二次抗体とのインキュベーションを室温にて１時間行った。以下の一次抗体が使用された。１：２５０の抗インスリン（Ａ０５６４、Ｄａｋｏ）および抗グルカゴン（Ａ０５６５、Ｄａｋｏ）、ソマトスタチン（ＤＡＫＯ、Ａ０５６６）。Ａｌｅｘａ５６８（Ａ１１０７５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  ４８８（Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａ  ６４７（Ａ３１５７３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合された適切な二次抗体が、５００倍希釈で使用された。一次および二次抗体の両方を、ブロッキングバッファーで希釈した。核は、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。
【０１４０】
グルコース刺激性インスリン分泌アッセイ（ＧＳＩＳ）
静置インキュベーションアッセイを使用して、膵島対照およびＨＵＶＥＣまたはＨＵＶＥＣ由来のエキソソームと共培養された膵島におけるグルコース応答性を決定した。膵島は、４連で配置した。膵島、膵島−ＨＵＶＥＣ共培養物、および膵島−ＨＵＶＥＣ由来のエキソソーム共培養物を、０．１％ｗｔ／ｖｏｌのＢＳＡ、２６ｍＭの炭酸水素ナトリウムおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する低グルコース（２．２ｍＭ）に改変したクレブス緩衝液中で細胞をインキュベートすることによって平衡化した。次いで、低グルコース（２．２ｍＭ）、高グルコース（１６．６ｍＭ）、および低グルコース（２．２ｍＭ）緩衝液中での１時間のインキュベーションを順次実施した。培地の試料を、プレインキュベーション後の各１時間の終了後に回収し、膵島を沈降させ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、ノースカロライナ州）を使用してインスリン濃度が定量化するまで、各ウェルから回収された条件培地を−８０℃にて凍結させた。
【０１４１】
ヒトアポトーシス関連タンパク質アレイ
ＨＵＶＥＣ細胞およびＨＵＶＥＣ由来のエキソソームを、ヒトアポトーシス抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を製造者の使用説明書にしたがって使用して解析した。要約すると、最初にメンブレンを室温にて３０分間ブロッキングし、次いで細胞またはエキソソームに由来するタンパク質１ｍｌ（２，０００μｇ／ｍＬ）を添加し、一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄し、１ｍｌのビオチン結合一次抗体を添加し、室温にて２時間インキュベートした。次いで、メンブレンを洗浄し、ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンと共に室温にて２時間インキュベートし、再び洗浄した。最後に、メンブレンを検出緩衝液と共に１分間インキュベートし、その後、シグナルをＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｅ  ＦＥ０５０６イメージングシステム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて検出した。タンパク質の相対的な発現レベルをシグナル強度を比較することによって得た。しかし、アポトーシス抗体アレイは半定量的な方法であり、濃度について直接的な結論を導くことはできない。アレイメンブレン上での陽性対照のシグナル強度を１００として設定し、比較されている異なるメンブレンからの結果を標準化するために使用した。試料中のタンパク質の相対的な発現レベルを、ＨＵＶＥＣ細胞とＨＵＶＥＣ由来のエキソソームとの間で比較した。シグナル強度における任意の≧１．５倍の増加または≦０．６５倍の減少を、製造者の使用説明書にしたがって有意であるとみなした。
【０１４２】
統計
全ての実験手順を、平均±ＳＤとして表現する。統計解析として、分散が有意に異なる場合に適用されたウェルチ補正を伴う対応のないスチューデントｔ検定が実行された。全ての対象における個々のサイトカイン濃度を二連で検出したヒトアポトーシス関連タンパク質アレイの統計解析を実行した。
【０１４３】
実施例６
この実施例は、膵島細胞を移植する必要がある対象に移植する前に膵島細胞を調製する例示的な方法を実証する。
【０１４４】
ヒト膵島細胞を、（ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、（ｉｉ）ＭＳＣに由来するエキソソーム、もしくは（ｉｉｉ）ＭＳＣ条件培地、または対照と４８時間共培養した。約５００ＩＥＱの膵島細胞を、約５００個のＭＳＣまたは約１０ｕｇ／ｍｌのエキソソームと共に培養した。
【０１４５】
膵島をグルコース刺激性インスリン分泌（３ｍＭ〜１１ｍＭのグルコース刺激）について分析することにより共培養の効果を評価した。図１４は、各培養物の刺激指数のグラフである。図１４に示すように、グルコース刺激性インスリン分泌は、膵島がＭＳＣまたはＭＳＣに由来するエキソソームと共培養された場合に対照と比較して増加した。ＭＳＣ条件培地と共培養された膵島のグルコース刺激性インスリン分泌は、対照のそれと同様であった。
【０１４６】
また、膵島のタンパク質発現を分析すること、および４群の細胞培養物間でタンパク質発現プロフィールを比較することによって共培養の効果を評価した。膵島のＭＳＣまたはＭＳＣに由来するエキソソームとの共培養は、炎症性分子および免疫調節分子の発現増加を引き起こした。例えば、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）、ならびにＣＸＣＬ３（ＭＩＰ２ｂ、ＧＲＯｇまたはＧＲＯ３としても公知）の発現は、膵島をＭＳＣと共培養することによって対照の膵島培養物と比較して増加した。
【０１４７】
この実施例は、膵島をＭＳＣまたはＭＳＣに由来するエキソソームと共培養することが膵島の機能を増強することを証明する。
【０１４８】
実施例７
この実施例は、膵島細胞を移植する必要がある対象に移植する前に膵島細胞を調製する例示的な方法を実証する。
【０１４９】
ＡＤ−ＭＳＣを様々な薬剤によって刺激し、次いで、刺激されたＡＤ−ＭＳＣによって分泌されたエキソソームの分子プロフィールに基づいて異なる表現型に分けた。一例では、ＡＤ−ＭＳＣを、１０ｎｇのＴＮＦαまたは１０ｎｇのＩＦＮγにより培養下で約４８時間刺激した。別の例では、ＡＤ−ＭＳＣを、より少量のこれらの分子（１０ｐｇのＴＮＦαまたは１０ｐｇのＩＦＮγ）により培養下で約４８時間刺激した。他の刺激剤としては、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）（５０μｇ／ｍｌ）およびリポ多糖体（ＬＰＳ）（１μｇ／ｍｌ）が挙げられる。ＡＤ−ＭＳＣの刺激されなかった対照群は、同様に維持された。
【０１５０】
細胞を、フローサイトメトリーまたは他の技術によって分子発現プロフィールについて分析した。例えば、刺激された各ＡＤ−ＭＳＣ群および刺激されなかった対照群のタンパク質発現プロフィールを決定した。このようなアッセイの結果は、様々な刺激剤がＡＤ−ＭＳＣに異なる分子発現プロフィールを有させることを実証した。また、ＡＤ−ＭＳＣに由来するエキソソームの発現プロフィールは、刺激剤または刺激の欠如により異なっていた。例えば、細胞表面マーカーであるＣＤ１４６の発現は、より多量のＴＮＦαまたはＩＦＮγにより刺激された場合に、より少量（１０ｐｇ）の同じサイトカインと比較して有意に増加した。また、より多量のＴＮＦαまたはＩＦＮγ（１０ｎｇ）により刺激された場合に、特定の増殖因子（例えば、ＩＧＦＢ−１、ＩＧＦＢ−２、ＩＧＦＢ−３、ＩＧＦＢ−４、ＩＧＦＢ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１  ＳＲ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ  Ｒ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、およびＶＥＧＦ）、および特定の炎症制御因子（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、エオタキシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮγ、ＣＣＬ１、ＭＣＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦα）の発現が増加した。図１５を参照のこと。
【０１５１】
この例は、膵島と同時移植するためのＭＳＣを調製する方法を実証する。
【０１５２】
参考文献
以下の参考文献は、背景技術ならびに実施例１および２において引用される。
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１６．Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｄｒａｉｎａｇｅ  ｏｖｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｖｅｎｏｕｓ  ｄｒａｉｎａｇｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２００１；２３４：６８９−６９６
１７．Ｐｌａｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｏｍｅｎｔｕｍ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２０００；６：１６９−１７６
１８．Ｃｈａｆｆａｎｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｍｅｎｔａｌ  ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｓｕｒｇ  Ｒａｄｉｏｌ  Ａｎａｔ  ２００５；２７：２８７−２９１ｐｍｉｄ：１６２３７４８７ＯｐｅｎＵｒｌＣｒｏｓｓＲｅｆＭｅｄｌｉｎｅ
１９．Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｏｍｅｎｔｕｍ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ  ｃａｓｔｓ．Ａｃｔａ  Ａｎａｔ（Ｂａｓｅｌ）  １９９１；１４０：１４６−１４９ｐｍｉｄ：１８６７０５６ＯｐｅｎＵｒｌＣｒｏｓｓＲｅｆＭｅｄｌｉｎｅ
２０．Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ−ｏｍｅｎｔａｌ  ｐｏｕｃｈ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｐｏｒｔａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  １９９５；２７：３２３６
２１．Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９８；４７：１０２０−１０２６
２２．Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ｏｍｅｎｔａｌ  ｐｏｕｃｈ  ｏｎ  ａ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００９；９：９１−１０４
２３．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ２０１０；２５：２０３−２１０ｐｍｉｄ：２０１１９５７１ＯｐｅｎＵｒｌＣｒｏｓｓＲｅｆＭｅｄｌｉｎｅ
２４．Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｙｅ  ａｓ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ａ  ｂａｂｏｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２０１１；５４：１１２１−１１２６
２５．Ｐｉｌｅｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｂｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００６；８１：１３１８−１３２４
２６．Ｉｃｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍａｘｉｍｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００５；５：２１−３０
２７．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃｏｌｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１２；２１：１３４９−１３６０
２８．Ｒｉｃｏｒｄｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９８８；３７：４１３−４２０
２９．Ｒｉｃｏｒｄｉ，Ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｂｒａｖｅ  ｎｅｗ  ｗｏｒｌｄ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００３；５２：１５９５−１６０３
３０．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ（ＰＨＰＩ）  ｍａｓｔｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｔｃｈ  ｒｅｃｏｒｄ  −  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．ＣｅｌｌＲ４  ２０１４；２：ｅ８９１
３１．Ｐｉｌｅｇｇｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｏｌｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００９；８７：１４４２−１４５０
３２．Ｐｏｓｓｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｆｒｅｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｒ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１０；９０：１５９５−１６０１
３３．Ｖｅｒｇａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ａｂｒｏｇａｔｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１０；５９：２２５３−２２６４
３４．Ｂａｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＴＬＡ４Ｉｇ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ４０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ３Ａ８．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１２；１２：１９１８−１９２３
３５．Ｓａｆｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｐｉｓｃｉｎｅ（ｔｉｌａｐｉａ）  ｉｓｌｅｔｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ＮＯＤ  ａｎｄ  ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１４；２１：１２７−１３９
３６．Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｍｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｉｓｌｅｔ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｂｉｏｈｙｂｒｉｄ  ｄｅｖｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１０；１０：７６−７７
３７．Ｆａｒａｄｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｖａｌｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐｅｒｉｏｄ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ  ｉｓｌｅｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ２００５；３７：３４３３−３４３４
３８．Ｂｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ａｆｔｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００６；６：１７０４−１７１１
３９．Ｙａｓｕｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｅｗ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−−ａ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ−ｏｍｅｎｔａｌ  ｐｏｕｃｈ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９８３；３６：１８１−１８２
４０．Ｓｉｍｅｏｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｉｇ．Ａｕｓｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  １９８６；６４：３７−４１
４１．Ａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｏｍｅｎｔａｌ  ｐｏｕｃｈ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  １９９２；２４：２７８９
４２．Ａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｍｅｎｔａｌ  ｐｏｕｃｈ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｏｕｔｂｒｅｄ  ｄｏｇｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９３；５６：５２４−５２９
４３．Ｊａｃｏｂｓ−Ｔｕｌｌｅｎｅｅｒｓ−Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｎｕｄｅ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｂｅｔｔｅｒ  ｉｎ  ｏｍｅｎｔｕｍ  ｔｈａｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｔｙ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２０１０；５３：１６９０−１６９９
４４．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｍｅｎｔｕｍ  ｉｓ  ｂｅｔｔｅｒ  ｓｉｔｅ  ｔｈａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  β−ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１３；９６：１０２６−１０３３
４５．Ｐｅｄｒａｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＰＤＭＳ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１３；２２：１１２３−１１３５
４６．Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ：ａｎ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ．Ｊ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｅｄ  ２０１０；１：１３５−１４２
４７．Ｈｅｆｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｌ−ｕｐ：ａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｉｓｌｅｔ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ２０１０；１６１：１３４−１３８ｐｍｉｄ：１９３９４６４９ＯｐｅｎＵｒｌＣｒｏｓｓＲｅｆＭｅｄｌｉｎｅ
４８．Ｃｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｏｍｐ  Ｍｅｄ  ２００９；５９：５１７−５２６
４９．Ｐｒｏｃａｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；５：１４３
５０．Ｏｚｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｏｏｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｅｌａｇａｔｒａｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００２；５１：１７７９−１７８４ｐｍｉｄ：１２０３１９６５ＯｐｅｎＵｒｌＡｂｓｔｒａｃｔ／ＦＲＥＥ  Ｆｕｌｌ  Ｔｅｘｔ
５１．Ｉｃｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００８；８８：１１６７−１１７７
５２．Ｒｉｃｏｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｎｔｌｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  １９９５；２７：３３８２
５３．Ｓｔｒｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｄｍｏｎｔｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００４；５３：３１０７−３１１４
５４．Ｃｈｉｎｎａｋｏｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｔａｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｅｃｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ：ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ，ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２０１４；２６０：５６−６４
５５．Ｋａｋａｂａｄｚｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｍａｓｓ  ｏｆ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１３；１３：２５５０−２５５７
【０１５３】
以下の参考文献は、実施例３において引用される。
１．Ｈｅｒｉｎｇ  ＢＪ，Ｃｌａｒｋｅ  ＷＲ，Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＮＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  ３  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２０１６；３９：１２３０−４０．
２．Ｃａｎｔａｒｅｌｌｉ  Ｅ，Ｐｉｅｍｏｎｔｉ  Ｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔｓ．Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ  ２０１１；１１：３６４−７４．
３．Ｂｅｒｍａｎ  ＤＭ，Ｏ’Ｎｅｉｌ  ＪＪ，Ｃｏｆｆｅｙ  ＬＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ｏｍｅｎｔａｌ  ｐｏｕｃｈ  ｏｎ  ａ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００９；９：９１−１０４．
４．Ｂｅｒｍａｎ  ＤＭ，Ｍｏｌａｎｏ  ＲＤ，Ｆｏｔｉｎｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ：Ｉｎｔｒａｏｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１６；６５：１３５０−６１．
５．Ｆｏｒｂｅｓ  Ｓ，Ｏｒａｍ  ＲＡ，Ｓｍｉｔｈ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＥＴＡ−２  Ｓｃｏｒｅ：Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌ  ｔｏ  Ｅｓｔｉｍａｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｆａｓｔｉｎｇ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１６；１６：２７０４−１３．
【０１５４】
以下の参考文献は、実施例３の補足情報において引用される。
１．Ｃｌａｒｋｅ  ＷＬ，Ｃｏｘ  ＤＪ，Ｇｏｎｄｅｒ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＬＡ，Ｊｕｌｉａｎ  Ｄ，Ｓｃｈｌｕｎｄｔ  Ｄ，Ｐｏｌｏｎｓｋｙ  Ｗ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｗａｒｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ＩＤＤＭ．Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １９９５；１８：５１７−２２．
２．Ｐｏｇｇｉｏｌｉ  Ｒ，Ｅｎｆｉｅｌｄ  Ｇ，Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００８；８５：５０１−６．
３．Ｗａｌｌａｃｅ  ＴＭ，Ｌｅｖｙ  ＪＣ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＲ．Ｕｓｅ  ａｎｄ  ａｂｕｓｅ  ｏｆ  ＨＯＭＡ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００４；２７：１４８７−９５．
４．Ｒｙａｎ  ＥＡ，Ｐａｔｙ  ＢＷ，Ｓｅｎｉｏｒ  ＰＡ，Ｌａｋｅｙ  ＪＲ，Ｂｉｇａｍ  Ｄ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＡＭ．Ｂｅｔａ−ｓｃｏｒｅ：ａｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００５；２８：３４３７．
５．Ｆｏｒｂｅｓ  Ｓ，Ｏｒａｍ  ＲＡ，Ｓｍｉｔｈ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＥＴＡ−２  Ｓｃｏｒｅ：Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌ  ｔｏ  Ｅｓｔｉｍａｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｆａｓｔｉｎｇ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１６；１６：２７０４−１３．
【０１５５】
以下の参考文献は、実施例４および５において引用される。
１．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｄａｖｉｓ，Ｃ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｊ．，Ｓｔｒａｔｔａ，Ｒ．＆  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｃａｒｅ  ２３，１１２−１１６（２０００）．
２．Ｐｉｅｍｏｎｔｉ  Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｐ．Ａ．２５  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｉｃｏｒｄｉ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｓｌｅｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．ＣｅｌｌＲ４  ２０１３；１（１）：ｅ１２８．
３．Ｔｈａｒａｖａｎｉｊ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｈｅａｌｔｈ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８６，１１６１−１１６７，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＴＰ．０ｂ０１３ｅ３１８１８ａ７ｆ４５（２００８）．
４．Ｋｉｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｓｌｅｔ  ｌｏｓｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２１，１０２９−１０３５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４３２−２２７７．２００８．００７１９．ｘ（２００８）．
５．Ｉｈｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ａｎｓｉｔｅ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｈｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２２，２０７２１６，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４３２−２２７７．２００８．００７６９．ｘ（２００９）．
６．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ（ＰＨＰＩ）  Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂａｔｃｈ  Ｒｅｃｏｒｄ  −  Ａ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．ＣｅｌｌＲ４  ２０１４；２（２）：ｅ８９１．
７．Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｓｌｅｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｔ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ４１，４３０２−４３０６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｒａｎｓｐｒｏｃｅｅｄ．２００９．０９．０７１（２００９）．
８．Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏａｔｉｎｇ，Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，ｅ５６６９６，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５６６９６（２０１３）．
９．Ｓｏｒｄｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｐｐｅａｒｉｎｇ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｒｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｓｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２８，１４０−１５１，ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．２５９（２０１０）．
１０．Ｙａｍａｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８７，６６７−６７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｓ．２０１３．１０．０３１（２０１４）．
１１．Ｂｈａｎｇ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔｕａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｆｉｂｒｉｎ  ｇｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４，７２４７−７２５６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３．０６．０１８（２０１３）．
１２．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｉｓｌｅｔｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｉｓｌｅｔ  ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７，２３９３−２４０１，ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｂ０７−０９８１（２００８）．
１３．Ｐａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．［Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｉｓｌｅｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ］．Ｚｈｏｎｇ  ｎａｎ  ｄａ  ｘｕｅ  ｘｕｅ  ｂａｏ．Ｙｉ  ｘｕｅ  ｂａｎ  ＝  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｏｕｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３９，１２９−１３５，ｄｏｉ：１０．１１８１７／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２−７３４７．２０１４．０２．００４（２０１４）．
１４．Ｎａｒａｎｇ，Ａ．Ｓ．，Ｓａｂｅｋ，Ｏ．，Ｇａｂｅｒ，Ａ．Ｏ．＆  Ｍａｈａｔｏ，Ｒ．Ｉ．Ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３，１９７０−１９８２，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−００６−９０６５−７（２００６）．
１５．Ｐａｇｅｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｅ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｆｌａｔｔ，Ｐ．Ｒ．＆  Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｒ．Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｌｏｎａｌ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｏｂｅｓｉｔｙ  ＆  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １３，６６２−６６８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４６３−１３２６．２０１１．０１３９２．ｘ（２０１１）．
１６．Ｃａｎｔａｌｕｐｐｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２１，１３０５−１３２０，ｄｏｉ：１０．３７２７／０９６３６８９１１Ｘ６２７５３４（２０１２）．
１７．Ｆｉｇｌｉｏｌｉｎｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，ｅ１０２５２１，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０２５２１（２０１４）．
１８．Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｌ．＆  Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２，５６９−５７９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ８５５（２００２）．
１９．Ｃａｂｒｅｒａ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｙｔｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｈａｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，２３３４−２３３９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１０７９０１０３（２００６）．
２０．Ｍｏｒｉｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ：ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎａｔｏｍｙ  ２０９，３８１−３９２，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４６９−７５８０．２００６．００６２０．ｘ（２００６）．
２１．Ｒａｃｋｈａｍ，Ｃ．Ｌ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｍ．＆  Ｋｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｉｓ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，ｅ５７８４４，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５７８４４（２０１３）．
２２．Ｏｌｓｓｏｎ  Ｒ，Ｃ．Ｐ．Ｂｅｔｔｅｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｉｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８（２００５）．
２３．Ｒａｃｋｈａｍ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｉｓｌｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １５，４４９−４５９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｙｔ．２０１２．１１．００８（２０１３）．
２４．Ｋａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｓｌｅｔ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｒａｐｉｄ  ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６１，８６６−８７６，ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｂ１０−１４９２（２０１２）．
２５．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ａ．，Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｌ．＆  Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｉｓｌｅｔ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４７，２３１５−２３２４，ｄｏｉ：１０．１２１０／ｅｎ．２００５−０９９７（２００６）．
２６．Ｑｕａｒａｎｔａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，ｅ９４７８３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９４７８３（２０１４）．
２７．Ｃａｏ，Ｚ．＆  Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｏｌｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａ−ｉｓｌｅｔ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ６１，６４７−６５４（２０１４）．
２８．Ｖａｌａｄｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，６５４−６５９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ１５９６（２００７）．
２９．Ｇｕａｙ，Ｃ．，Ｍｅｎｏｕｄ，Ｖ．，Ｒｏｍｅ，Ｓ．＆  Ｒｅｇａｚｚｉ，Ｒ．Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ：ＣＣＳ  １３，１７，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９６４−０１５−００９７−７（２０１５）．
３０．Ｈｅｄｂａｃｋｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＧＦＢＰ２，ａ  Ｌｅｐｔｉｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ（ｖｏｌ  ６，ｐｇ  １１，２０１０）．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １１，２３９−２３９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｍｅｔ．２０１０．０２．０１０（２０１０）．
３１．Ｆｅｎｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５７，４２６−４３４，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３１−０１５−０５８９−３（２０１５）．
３２．Ｓｏｒｉａ，Ｂ．＆  Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｂ．Ｒ．Ｄｕａｌ  Ｔｒａｄｅ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  Ｂｃｌ−ｘＬ  ｉｎ  ｉｓｌｅｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：ｂａｌａｎｃｉｎｇ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２，１８−２１，ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｂ１２−１０２３（２０１３）．
３３．Ｊｏｇｌｅｋａｒ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｋｉｌｌｅｄ  ｂｙ  ＢＩＤ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＦＡＳ  ｌｉｇａｎｄ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０４９５−０１６−１２１２−ｙ（２０１６）．
３４．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＮＩＴ−１  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０，３２１９−３２２７，ｄｏｉ：１０．１２１０／ｅｎｄｏ．１４０．７．６８７３（１９９９）．
３５．Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆  Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ／  ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  ｂｏａｒｄ，Ｊｕａｎ  Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ．．．［ｅｔ  ａｌ．］  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｕｎｉｔ  ３  ２２，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ０３２２ｓ３０（２００６）．
【０１５６】
本明細書において援用される、刊行物、特許出願および特許を含む、全ての参考文献は、各々の参考文献が参照により組み入れられるように個々にかつ具体的に示されかつその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参考として本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
本開示を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに同様の指示物は、本明細書に別の記述がなければ、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」は、別途注記のない限り、開放型専門用語として解釈されるべきである（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）。
【０１５８】
本明細書において特に指定のない限り、本明細書中の値の範囲の記載は、その範囲および各端点に入る各々の別個の値を個々に指す略記方法として役立つことを意図したものであるにすぎず、各々の別個の値および各端点は、それが本明細書中に個々に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において特に指定のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。特に要求されない限り、本明細書中に提供されるあらゆる例、または例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本開示をより上手く説明することを意図したものにすぎず、本開示の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書における言語は、本開示の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１６０】
本開示を実施するための発明者に知られている最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本開示が実施されることを意図する。したがって、本開示は、適用法で許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変および同等物を含む。更に、本明細書において特に指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組み合わせが本開示に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【国際調査報告】
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