(57)【要約】  融合タンパク質はナノケージ単量体、および前記ナノケージ単量体に連結された抗体またはそのフラグメントを含み、前記抗体またはそのフラグメントは結合対の第１の成分を含み、そこで複数の前記融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の前記抗体またはそのフラグメントが前記ナノケージの外面を装飾し、それにより、前記結合対の第１の成分が、結合対の第２の成分と相互作用するために露出されているものとする。
2020534861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノケージ単量体、および
前記ナノケージ単量体に連結された抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であって、
前記抗体またはそのフラグメントは結合対の第１の成分を含み、
複数の前記融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の前記抗体またはそのフラグメントが前記ナノケージの外面を装飾し、それにより、前記結合対の第１の成分が、前記結合対の第２の成分と相互作用するために露出されているものとする、融合タンパク質。
【請求項２】
前記結合対の第１の成分が抗体またはそのフラグメントのＦｃ部分であり、前記結合対の第２の成分がＦｃ受容体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記結合対の第１の成分が抗原結合エピトープであり、前記結合対の第２の成分が抗原である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ナノケージが約３個〜約１００個のナノケージ単量体、例えば２４個または６０個の単量体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ナノケージ単量体が、フェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ボールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらのフラグメント、およびそれらのバリアントから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ナノケージ単量体と前記抗体またはそのフラグメントとの間にリンカーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが柔軟性であるかまたは剛性であり、約１個〜約３０個のアミノ酸残基を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーが約８個〜約１６個のアミノ酸残基を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記リンカーがＧＧＳリピートを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記リンカーが４つのＧＧＳリピートを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗原をさらに含む、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗原がリピートドメインを含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記抗原がマラリア抗原である、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗原がマラリアＣＳＰタンパク質のフラグメントである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原が前記マラリアＣＳＰタンパク質のＮＡＮＰリピートドメインのフラグメントである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記抗原が５．５  ＮＡＮＰリピートを含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記抗原がＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記抗体またはそのフラグメントがリピートドメインに特異的である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記抗体またはそのフラグメントがマラリア抗原に特異的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記抗体またはそのフラグメントがマラリアＣＳＰタンパク質に特異的である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントが、前記マラリアＣＳＰタンパク質のＮＡＮＰリピートドメインに特異的である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記抗体またはそのフラグメントが、次の配列：
【数１】
2020534861.tif 000023
に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列またはそのフラグメントを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記抗体またはそのフラグメントが次の配列：
【数２】
2020534861.tif 000024
を含む、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記抗体またはそのフラグメントが配列：
【数３】
2020534861.tif 000025
からなる、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記抗体またはそのフラグメントが腫瘍抗原に特異的である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記抗体またはそのフラグメントが自己抗原に特異的である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記抗体またはそのフラグメントが、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、またはＣＤ２０に特異的である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記抗体またはそのフラグメントが標的臓器に特異的である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記抗体またはそのフラグメントがＦａｂフラグメントの重鎖および／または軽鎖を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記抗体またはそのフラグメントがＦｃフラグメントを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
前記抗体またはそのフラグメントがｓｃＦｖを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
Ｆａｂ軽鎖および／または重鎖をさらに含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
別個に生成されたＦａｂ軽鎖および／またはＦａｂ重鎖と会合している、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
検出可能な部分をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記検出可能な部分が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビンに基づく蛍光タンパク質である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むナノケージ。
【請求項３７】
各ナノケージ単量体が、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、請求項３６に記載のナノケージ。
【請求項３８】
前記ナノケージ単量体の約２０％〜約８０％が請求項１〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、請求項３６に記載のナノケージ。
【請求項３９】
前記ナノケージが多価である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のナノケージ。
【請求項４０】
医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のナノケージ。
【請求項４１】
前記カーゴ分子がタンパク質であり、前記カーゴ分子が前記ナノケージに内包されるように前記融合タンパク質に融合されている、請求項４０に記載のナノケージ。
【請求項４２】
前記カーゴ分子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビンに基づく蛍光タンパク質である、請求項４１に記載のナノケージ。
【請求項４３】
前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に融合されておらず、前記ナノケージに内包されている、請求項４２に記載のナノケージ。
【請求項４４】
前記カーゴ分子が内部に含まれることによりＴ細胞エピトープを提供するが、場合によってはＢ細胞エピトープを提供しないこともある、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のナノケージ。
【請求項４５】
前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に融合されており、内部に含まれることによりＴ細胞エピトープを提供するが、場合によってはＢ細胞エピトープを提供しないこともある、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のナノケージ。
【請求項４６】
前記カーゴ分子が小分子、放射性同位体、または磁性粒子である、請求項４３に記載のナノケージ。
【請求項４７】
前記表面に抗原をさらに含む、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載のナノケージ。
【請求項４８】
前記抗原が、ナノケージ単量体との融合タンパク質として発現される、請求項４７に記載のナノケージ。
【請求項４９】
請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のナノケージを含むワクチン。
【請求項５０】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコード化する核酸分子。
【請求項５１】
請求項５０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載のベクターを含み、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を生産する宿主細胞。
【請求項５３】
請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のナノケージまたは請求項５９に記載のワクチンを投与することを含む、対象に免疫を付与する方法。
【請求項５４】
請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のナノケージまたは請求項４９に記載のワクチンを投与することを含む、疾患または状態を処置および／または予防する方法。
【請求項５５】
前記疾患または状態が、がん、ＨＩＶ、マラリア、または自己免疫疾患である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
診断的イメージング方法であって、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のナノケージを対象、組織、または試料に投与すること、および前記対象、組織、または試料をイメージングすることを含み、前記ナノケージが、蛍光タンパク質または磁気イメージング部分などの診断標識を含むものとする、方法。
【請求項５７】
ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡなどにおける研究ツールとしての、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項３６〜４８のいずれか一項に記載のナノケージの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子に関する。特に、本発明は、ナノ粒子サブユニット融合タンパク質、ナノ粒子を含むワクチン、ならびに関連する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、様々な学問分野の進歩に貢献している。ナノ粒子を使用すると、標的を絞った送達が可能になる；また、規則正しいマイクロアレイの設計、徐放性、および触媒プロセスのためにケージ化された微小環境が可能である。
【０００３】
ナノ粒子は、多糖類、リポソーム、または無機ナノ材料など、様々な材料から合成することができる。しかしながら、これらの送達プラットフォームは、過酷な製造条件によるタンパク質の活性低下、望ましくない分解産物および低カプセル化効率など、生体分子を融合する際の重要な制限と関連している。不適切な条件または製剤は、構造に壊滅的な影響を与える可能性があるため、所望の機能を阻害する可能性がある。例えば、三量体ｇｐ１２０糖タンパク質（最も重度にグリコシル化された既知の糖タンパク質）および抗体ドメインには、最適な活性を得るための厳密な緩衝液範囲がある。
【０００４】
タンパク質ナノ粒子は、上記技術にとって魅力的な代替品である；それらの構成単位はアミノ酸であり、遺伝子工学は組成、分子量および機能の絶妙な制御を可能にする。高感度の準安定タンパク質を含むナノ粒子の製造には、タンパク質の自己集合が最適な方法である。実際、自己集合したナノ粒子は、生理的条件下で非共有結合的相互作用により形成され、均一であり、対称的なことも多いナノカプセルの生成を確実なものにし得る。自己集合性タンパク質ナノ粒子は、追加の機能を伝達するためにすべて微調整することができる３つの異なる表面：外部表面、内部表面およびサブユニット間表面を有する。
【０００５】
ペプチドの自己集合性タンパク質への融合に関する多数の報告が存在する。チタンまたは金結合ペプチドを使用して、これらの金属にナノ粒子を選択的に付着させることができる。しかしながら、生物学的相互作用は三次および四次の構造を必要とすることが多く、したがって折り畳まれたタンパク質は一般にペプチドよりも拡張された機能を付与する。さらに、ヒトタンパク質の５０％はグリコシル化されていると推定されており、これらの翻訳後修飾は、タンパク質構造の維持において重要な役割を演じ、安定性を伝達し、機能を提供するものである。糖タンパク質とタンパク質ナノ粒子の遺伝子融合については、わずか数例しか存在しない。
【０００６】
ワクチンで使用するための抗原で表面が装飾されたナノケージは、例えば、米国特許第８，５４６，３３７号、米国特許出願公開第２０１５／０１１０８２５号、国際特許出願公開第２０１６／１０９７９２号、Ｋａｎｅｋｉｙｏら（Ｎａｔｕｒｅ（ネイチャー）、２０１３、４９９：１０２−１０６）、およびＳｌｉｅｐｅｎら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ（レトロバイロロジー）、２０１５、１２：８２）によって記載されている。以前に、本発明者らは、多量体（６０量体）提示のために自己集合性ルマジンシンターゼタンパク質の外部にカーゴを遺伝子融合することが可能であることを示した（Ｊａｒｄｉｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）、２０１３年５月１０日；３４０（６１３３）：７１１−６）。
【０００７】
国際特許出願公開第２０１０／０２２２５０１号は、ナノ粒子の表面から突出する有機基に抗体などの部分を付着させることができる複合ナノ粒子の製造方法を記載している。
【０００８】
Ｃｈｏｅら（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（マテリアルズ）２０１６、９（１２）：９９４）は、Ｆｃ受容体の抗体への結合を模倣するスマート生体材料を使用して、抗体を単離および標的指向化するいくつかの方法の総括を提供する。Ｆｃ結合ペプチドは、例えば、ナノ材料上に抗体を局在化し、血清中のタンパク質の半減期を延長するために適用される。この総括では、Ｆｃ結合ペプチドの最近の開発を提示し、その結合特性と多様な適用性について検討する。
【０００９】
Ｋｈｏｓｈｎｅｊａｄら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（バイオコンジュゲート・ケミストリー）、２０１６、２７（３）：６２８−６３７）は、ＩＣＡＭ−１およびＰＥＣＡＭ−１またはそれらの単鎖抗原結合フラグメント（ｓｃＦｖ）に対するモノクローナル抗体がフェリチンナノ粒子にコンジュゲートされた研究について記述している。フェリチンナノ粒子は、２０ｎｍのサイズ範囲の担体で内皮接着分子を標的とするプラットフォームを提供する可能性があることが示唆されている。
【００１０】
Ｋａｎｇら（多機能、ハイブリッドおよびナノマテリアルに関する第４回国際会議（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，Ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、ポスタープログラム、２０１５年、Ｐ１．０４８）は、トラスツズマブとヒトフェリチンのｓｃＦｖバリアントのキメラタンパク質ナノケージについて記載している。
【００１１】
Ｃａｒｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．（サイエンス）、１９９２、２５６（５０５３）：１０５−７）は、抗原と同時にＣＤ１９を取り込むと、その抗原に対するＢ細胞応答が高まることを示している。
【００１２】
公衆に有用な代替品を提供する生成物、組成物および／または方法の開発が要望される。
【発明の概要】
【００１３】
一実施態様によると、
ナノケージ単量体、および
前記ナノケージ単量体に連結された抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であって、
前記抗体またはそのフラグメントは結合対の第１の成分を含み、
複数の前記融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の前記抗体またはそのフラグメントが前記ナノケージの外面を装飾し、それにより、前記結合対の第１の成分が、前記結合対の第２の成分と相互作用するために露出されているものとする、融合タンパク質。
【００１４】
一実施態様において、前記結合対の第１の成分は抗体またはそのフラグメントのＦｃ部分であり、前記結合対の第２の成分はＦｃ受容体である。
【００１５】
一実施態様において、前記結合対の第１の成分は抗原結合エピトープであり、前記結合対の第２の成分は抗原である。
【００１６】
一実施態様において、前記ナノケージは、約３〜約１００のナノケージ単量体、例えば２４の単量体または６０の単量体を含む。
【００１７】
一実施態様において、前記ナノケージ単量体は、フェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ボールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらのフラグメント、およびそれらのバリアントから選択される。
【００１８】
一実施態様において、前記融合タンパク質は、前記ナノケージ単量体と前記抗体またはそのフラグメントとの間にリンカーをさらに含む。
【００１９】
一実施態様において、前記リンカーは柔軟性があるかまたは剛性であり、約１〜約３０個のアミノ酸残基を含む。
【００２０】
一実施態様において、前記リンカーは約８〜約１６個のアミノ酸残基を含む。
【００２１】
一実施態様において、前記リンカーはＧＧＳリピートを含む。
【００２２】
一実施態様において、前記リンカーは４つのＧＧＳリピートを含む。
【００２３】
一実施態様において、前記融合タンパク質は前記抗原をさらに含む。
【００２４】
一実施態様において、前記抗原はリピートドメインを含む。
【００２５】
一実施態様において、前記抗原はマラリア抗原である。
【００２６】
一実施態様において、前記抗原はマラリアＣＳＰタンパク質のフラグメントである。
【００２７】
一実施態様において、前記抗原は前記マラリアＣＳＰタンパク質のＮＡＮＰリピートドメインのフラグメントである。
【００２８】
一実施態様において、前記抗原は５．５ＮＡＮＰリピートを含む。
【００２９】
一実施態様において、前記抗原はＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰである。
【００３０】
一実施態様において、前記融合タンパク質はＦｃドメインである。
【００３１】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントはリピートドメインに特異的である。
【００３２】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントはマラリア抗原に特異的である。
【００３３】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントはマラリアＣＳＰタンパク質に特異的である。
【００３４】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは、マラリアＣＳＰタンパク質のＮＡＮＰリピートドメインに特異的である。
【００３５】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは、次の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列またはそのフラグメントを含む：
【化１】
2020534861.tif 000003
【００３６】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは次の配列を含む：
【化２】
2020534861.tif 000004
【００３７】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは次の配列からなる：
【化３】
2020534861.tif 000005
【００３８】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは腫瘍抗原に特異的である。
【００３９】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは自己抗原に特異的である。
【００４０】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、またはＣＤ２０に特異的である。
【００４１】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは標的臓器に特異的である。
【００４２】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントは、Ｆａｂフラグメントの重鎖および／または軽鎖を含む。
【００４３】
一実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントはｓｃＦｖを含む。
【００４４】
一実施態様において、前記融合タンパク質は、Ｆａｂ軽鎖および／またはＦａｂ重鎖をさらに含む。
【００４５】
一実施態様において、前記融合タンパク質は、別個に生成されたＦａｂ軽鎖および／またはＦａｂ重鎖と会合している。
【００４６】
一実施態様において、前記融合タンパク質は検出可能な部分をさらに含む。
【００４７】
一実施態様において、前記検出可能な部分は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビンに基づく蛍光タンパク質である。
【００４８】
一実施態様によれば、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むナノケージが提供される。
【００４９】
一実施態様において、各ナノケージ単量体は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【００５０】
一実施態様では、ナノケージ単量体の約２０％から約８０％が本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【００５１】
一実施態様において、前記ナノケージは多価である。
【００５２】
一実施態様において、前記ナノケージは、医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持している。
【００５３】
一実施態様において、前記カーゴ分子はタンパク質であり、前記カーゴ分子が前記ナノケージに内包されるように前記融合タンパク質に融合されている。
【００５４】
一実施態様において、前記カーゴ分子は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビンに基づく蛍光タンパク質である。
【００５５】
一実施態様において、前記カーゴ分子は前記融合タンパク質に融合されておらず、前記ナノケージに内包されている。
【００５６】
一実施態様において、前記カーゴ分子は内部に含まれることによりＴ細胞エピトープを提供するが、場合によってはＢ細胞エピトープを提供しないこともある。
【００５７】
一実施態様において、前記カーゴ分子は前記融合タンパク質に融合されており、内部に含まれることによりＴ細胞エピトープを提供するが、場合によってはＢ細胞エピトープを提供しないこともある。
【００５８】
一実施態様において、前記カーゴ分子は小分子、放射性同位体、または磁性粒子である。
【００５９】
一実施態様において、前記融合タンパク質は、表面に抗原をさらに含む。
【００６０】
一実施態様において、前記抗原はナノケージ単量体との融合タンパク質として発現される。
【００６１】
一実施態様によれば、本明細書に記載のナノケージを含むワクチンが提供される。
【００６２】
一実施態様によれば、本明細書に記載の融合タンパク質をコード化する核酸分子が提供される。
【００６３】
一実施態様によれば、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターが提供される。
【００６４】
一実施態様によれば、本明細書に記載のｃのベクターを含み、本明細書に記載の融合タンパク質を産生する宿主細胞が提供される。
【００６５】
一実施態様によれば、本明細書に記載のナノケージまたは本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、対象を免疫化する方法が提供される。
【００６６】
一実施態様によれば、本明細書に記載のナノケージまたは本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、疾患または状態を処置および／または予防する方法が提供される。
【００６７】
一実施態様において、前記疾患または状態は、がん、ＨＩＶ、マラリア、または自己免疫疾患である。
【００６８】
一実施態様によれば、診断的イメージング方法であって、本明細書に記載のナノケージを対象、組織、または試料に投与すること、および前記対象、組織、または試料をイメージングすることを含み、前記ナノケージが、蛍光タンパク質または磁気イメージング部分などの診断標識を含むものとする方法が提供される。
【００６９】
一実施態様によれば、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡなどの研究ツールとしての、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のナノケージの使用が提供される。
【００７０】
本発明の新規特徴は、以下の本発明の詳細な説明を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の詳細な説明および提示された特定の例は、本発明のある特定の実施態様を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正は、後述の本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から当業者にとって明らかなものとなるため、例示のみを目的としていることを理解されたい。
【００７１】
本発明は、図面を参照した上で以下の説明からさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、本明細書に記載のヒトフェリチン（図１Ａ）またはアキフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ルマジンシンターゼ（図１Ｂ）の自然発生する自己集合ナノ粒子バックボーンを示す；図１Ｃは、１つのプラスミドのトランスフェクションのみを必要とする単鎖Ｆａｂ−フェリチンナノ粒子を生成するための概略図を示す。
【図２】図２は、本発明のフェリチン（図２Ａ）ナノ粒子またはルマジンシンターゼ（図２Ｂ）ナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂを生成するために使用される構築物の概略図を示す。図２Ｃは、本明細書に記載の抗体発現ナノ粒子の概略図を示す。
【図３】図３は、アフィニティクロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定された図２Ａおよび２Ｂの方法に従って生成されたフェリチン（図３Ａ）ナノ粒子またはルマジンシンターゼ（図３Ｂ）ナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂの純度を表すデータを示す。
【図４】図４は、本明細書に記載のフェリチン（図４Ａ）ナノ粒子またはルマジンシンターゼ（図４Ｂ）ナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂの電子顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、ナノ粒子バックボーンを伴わない抗体Ｆａｂに対するＣＤ２２の結合親和性（図５Ａ）、本明細書に記載のフェリチンナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂに対するＣＤ２２の結合親和性（図５Ｂ）またはルマジンシンターゼナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂに対するＣＤ２２の結合親和性（図５Ｃ）を表すデータを示す。
【図６】図６は、フェリチンナノ粒子単独でのエンドサイトーシスの非存在下の場合（図６Ｃ）と比較した、フェリチンナノ粒子を発現する２つの異なる抗体Ｆａｂの受容体介在エンドサイトーシスを立証するデータを示す（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【図７】図７は、本明細書に記載のフェリチンナノ粒子の蛍光能力を表すデータを示す。
【図８】図８は、ＣＳＰ  ＮＡＮＰリピートドメイン抗原と２つのＦａｂ抗体フラグメントとの間の相互作用の結晶構造を示す。
【図９】図９は、ＣＳＰ  ＮＡＮＰリピートドメイン抗原、Ｆａｂ抗体フラグメント、およびＢ細胞間の相互作用の模式的なモデリングを示す。
【図１０】図１０は、様々な長さのリンカーでＦａｂ重鎖に融合したＣＳＰ  ＮＡＮＰリピートドメイン抗原を含む融合タンパク質の配列を示す。
【図１１】図１１は、図１０の融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー精製のデータを示す。
【図１２】図１２は、図１０の融合タンパク質に対応するが、ＣＳＰ  ＮＡＮＰリピートドメインおよびリンカーを欠く野生型抗体のサイズ排除クロマトグラフィー精製からのデータを示す。
【図１３】図１３は、野生型抗体による結合と比較した図１０の融合タンパク質のＣＳＰ結合速度論を示す。
【図１４】図１４は、図１０の融合タンパク質に対する野生型抗体の結合親和性を示す。
【図１５】図１５は、図１０の融合タンパク質に対する野生型抗体の結合親和性を示す。
【図１６】図１６は、図１０の融合タンパク質に対する野生型抗体の結合親和性を示す。
【図１７】図１７は、野生型抗体と図１０の融合タンパク質との間の相互作用の概略図を示す。
【図１８】図１８は、野生型抗体と融合タンパク質の相互作用についての絶対質量を決定するための多角度光散乱と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーからのデータおよび本明細書に記載されている融合タンパク質に特異的なＩｇＭ受容体を発現するＢ細胞の相互作用を表す概略図を示す。
【図１９】図１９は、ワクチンプラットフォームとしてα−ＣＤ１９刺激Ｆａｂと抗原を共提示するように設計されたナノ粒子を示す。
【図２０】図２０は、刺激抗体と抗原とを共提示するようにナノ粒子を設計できることを示す。
【図２１】図２１は、二重特異性ナノ粒子が十分に折り畳まれており、高密度のＦａｂおよび抗原を提示していることを示す。
【図２２】図２２は、二重特異性ナノ粒子が、予想どおりに機能性があり、結合することを示す。
【図２３】図２３は、自己アジュバントナノ粒子が、対照との比較においてＣａ２＋依存性Ｂ細胞活性化を促進できることを示す。
【図２４】図２４は、単鎖Ｆｃナノ粒子の折りたたみ、集合、および溶出データを示す。
【図２５】図２５は、高親和性ヒトＰｆＣＳＰ  ＮＡＮＰ抗体の親和性成熟を示す。（Ａ）選択された（標識された）ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗ＰｆＣＳＰ抗体（緑色）および非ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗ＰｆＣＳＰ抗体（灰色）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）親和性およびＳＨＭ（９）。（Ｂ〜Ｄ）元の抗体および変異抗体。［（Ｂ）および（Ｃ）］ＰｆＣＳＰ  ＥＬＩＳＡ反応性。（Ｄ）２〜４回の独立した実験からの平均（バー）Ｐｆ肝細胞横断阻害（記号）。＊＊スチューデントの両側ｔ検定にて有意（α＝０．０１）。（Ｅ）ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５抗体におけるサイレント（灰色）および置換（赤色）ＳＨＭ（バー）（ｎ＝６３）。（Ｆ）ベースライン（ベース）モデルと比較した、観測された（ｏｂｓ）アミノ酸使用（２２、２３）。（ＧおよびＨ）独立したＮＡＮＰ３  ＳＰＲ親和性測定値（ドット）および平均値（線）。＊＊ボンフェローニ多重比較検定では有意（α＝０．０１）および非有意（ｎｓ）。（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）、少なくとも２つの独立した実験の１つの表示。
【図２６】図２６は、親和性成熟が同型リピート結合を推進することを示す。（Ａ〜Ｈ）１２１０  Ｆａｂ／ＮＡＮＰ５共結晶構造。（Ａ）４つのＮＡＮＰ結合Ｆａｂの重ね合わせ。（Ｂ）抗原−抗体相互作用の表面表示。（Ｃ）１２１０によるコアエピトープ認識の詳細。黒のダッシュはＨ結合を示す。（Ｄ）ＮＡＮＰ５と複合体を形成した２つの１２１０Ｆａｂ。［（Ｅ）および（Ｆ）］Ｆａｂ−Ｂ（Ｅ）およびＦａｂ−Ａ（Ｆ）の表面表示。同型相互作用に関与する残基は濃い灰色である。［（Ｇ）および（Ｈ）］同型相互作用の詳細。親和性成熟残基は赤で標識されている。（Ｉ）等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって測定された平均値±ＳＥＭ  ＫＤ。ドットは、少なくとも３つの独立した実験からの測定値を表す。片側マン・ホイットニー検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｊ）１２１０Ｆａｂ−ＰｆＣＳＰ複合体についての多角度光散乱と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ）。赤い線は、２つの測定値からの平均±ＳＤモル質量を示す。（Ｋ）１２１０Ｆａｂ−ＰｆＣＳＰ複合体の２Ｄクラス平均。赤い矢印は個々のＦａｂを示し、赤い線は結晶構造で観察された結合角を示す（Ｄ）。スケールバー、１０ｎｍ。
【図２７】図２７は、抗体１２１０によるＮＡＮＰ５リピート結合を示す。Ａ、１２１０−ＮＡＮＰ５結晶構造の非対称単位において４つの１２１０Ｆａｂが２つのＮＡＮＰ５ペプチドに結合している。Ｂ、５８０（ティール；（１０））、６６３（緑；（１０））、１２１０（黄）および非リガンドペプチド（紫；（１２））構造のＮＰＮＡケイデンスの重ね合わせ。フィー（Φ）角およびプシー（Ψ）角の標準偏差が示されている。Ｃ、ＮＡＮＰ３ペプチドとの複合体におけるＨ．２１４０／Ｌ．１２１０キメラＦａｂとの１２１０−ＮＡＮＰ５の重ね合わせ。１２１０結合ＮＡＮＰ５ペプチドは黄色に着色され、キメラＦａｂおよびＮＡＮＰ３結合ペプチドは灰色に着色されている。
【図２８】図２８は、抗原結合に対する残基Ｈ．Ｙ５２ＡおよびＨ．Ｙ５８のアラニン交換の効果を示す。抗体１２１０、２１４０、２２１９ならびにＨ．Ｙ５２ＡおよびＨ．Ｙ５８の位置がアラニン交換されたそれぞれの変異体のＰｆＣＳＰおよびＮＡＮＰ５  ＥＬＩＳＡ反応性。３つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図２９】図２９は、１２１０−ＮＡＮＰ５の結晶構造を示す。Ａ、１２１０とＮＡＮＰ５の詳細な相互作用。分子間Ｈ結合は黒色の破線で、分子内Ｈ結合は赤色で色付けされている。Ｂ、２つの１２１０Ｆａｂに結合したＮＡＮＰ５ペプチドについての１．０σに輪郭を合わせた不偏電子密度省略マップ（黒メッシュ）。Ｃ、ＳＥＣ／ＭＡＬＳで調べた１２１０−ＮＡＮＰ５の溶出プロファイル。赤い水平線は、ＮＡＮＰ５に結合した２つの１２１０Ｆａｂの計算されたモル質量に対応する。Ｄ、ＳＥＣ／ＭＡＬＳによって調査された完全長ＰｆＣＳＰの溶出プロファイル。赤い水平線は、溶出抗原の計算されたモル質量に対応する。
【図３０】図３０は、ＮＡＮＰリピートペプチドへの１２１０結合の等温滴定熱量測定を示す。Ａ、Ｂ、ＮＡＮＰ５（Ａ）およびＮＡＮＰ３（Ｂ）への１２１０、１２１０＿ＮＳ、１２１０＿ＹＹ、および１２１０＿ＧＬの結合の代表的な生ＩＴＣデータ（上部パネル）および適合した結合曲線（下部パネル）が示されている。Ｃ、（Ａ）および（Ｂ）で観察されたこれらの相互作用について測定された結合熱力学値の概要。少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭが報告されている。
【図３１】図３１は、１２１０および１２１０＿ＹＹのＰｆＣＳＰへの結合力を示す。代表的なバイオレイヤー干渉センサーグラム（緑）、１：１モデルの最適な適合（黒）、および（Ａ）１２１０ＩｇＧおよび（Ｂ）１２１０＿ＹＹ  ＩｇＧの完全長ＰｆＣＳＰへの結合についての結合力の計算値。
【図３２】図３２は、Ｂ細胞の活性化と寄生虫の抑制を示す。（Ａ〜Ｄ）１２１０およびバリアントのＮＡＮＰ５誘導カルシウムシグナル伝達。［（Ａ）および（Ｂ）］少なくとも６つの代表的な実験のうちの１つについての１μｇ／ｍＬ  ＮＡＮＰ５に対する、反応速度論と活性化細胞のパーセント（Ａ）、およびシグナル強度の中央値のオーバーレイ（Ｂ）。［（Ｃ）および（Ｄ）］１μｇ／ｍＬ（Ｃ）（ｎ＝６または７）ＮＡＮＰ５および０．１μｇ／ｍＬ（Ｄ）（ｎ＝３）ＮＡＮＰ５後の活性化細胞のパーセントおよび活性化時間の中央値。記号は独立した実験を示し、線とエラーバーは平均値±標準偏差を示す。＊＊ボンフェローニ多重比較検定について有意（α＝０．０１）および非有意（ｎｓ）。（ＥおよびＦ）寄生虫抑制。（Ｅ）示されたＮＡＮＰ３親和性を有する１２１０（黒色）抗体および２１６３（茶色）抗体についての少なくとも３回の独立した実験の平均値±ＳＤ  ＩＣ５０値。信頼区間が大幅に重複しているため、ＩＣ５０値間に有意差は無い。（Ｆ）Ｐｂ‐ＰｆＣＳＰスポロゾイトを皮下注射する２４時間前に、３０μｇまたは１００μｇの１２１０またはバリアントによる受動免疫を行った後の無寄生虫マウス。データは、１群につき５匹のマウスを使用した１回（１００μｇ）または２回（３０μｇ）の独立した実験を示す。１２１０バリアントについての生存に有意差は無い（マンテルコックス検定）。
【図３３】図３３は、Ｐｆ肝細胞横断の抗体介在阻害を示す。Ａ、Ｂ、１２１０（Ａ）、２１６３（Ｂ）、および示されたバリアントについてのＰｆ肝細胞横断阻害。ＩＣ５０値（ｇ／ｍＬ）およびヒル（Ｈｉｌｌ）係数（ｎ）値とそれらの標準偏差を、各プロットの上に示す。Ｃ、１２１０（黒色）および２１６３（茶色）、ならびに（ＡおよびＢ）に示すそれぞれのバリアントについてのＮＡＮＰ３親和性およびヒル係数。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３４】図３４は、ＩＧＨＶ３−２３でコード化されたＰｆＣＳＰ  ＮＡＮＰ抗体の抗同型親和性成熟を示す。（Ａ）すべてのＶＨ３−２３／Ｖκ１−５抗ＰｆＣＳＰ抗体（緑色）および非ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５抗ＰｆＣＳＰ抗体（灰色）のうちの１４５０のＳＰＲ親和性およびＳＨＭ（９）。（Ｂ）ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５抗体におけるサイレント（灰色）および置換（赤色）ＳＨＭ（バー）（ｎ＝１００）。（Ｃ〜Ｅ）Ｆａｂ１４５０−ＮＡＮＰ５共結晶構造。頭−頭結合モード（Ｃ）、Ｆａｂ−Ｆａｂ（Ｄ）、およびＦａｂ−ＮＡＮＰ５（Ｅ）の相互作用。黒のダッシュはＨ結合を示す。親和性成熟残基は、ＳＨＭ  ａａ使用スキームに従って色付けされ、赤で標識されている。ベースライン（ベース）モデルと比較している観測された（ｏｂｓ）アミノ酸使用（２２、２３）。（Ｆ）総メモリーＢ細胞（１８）およびＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉＣＤ３８ｈｉ形質芽球（ＰＢ）およびＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＰｆＣＳＰ反応性メモリーＢ細胞（ＣＳＰｍｅｍ）におけるＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗体またはＶＨ３−２３／Ｖκ１−５抗体（８、９）。ドットは、ｎ＝１５００配列のサブサンプルを表す。ボックスプロットは、分布の中央値、標準偏差、最大値と最小値を示す。＊＊＊両側スチューデントｔ検定で有意（α＝０．００１）。（Ｇ）クローン的に拡大した場合対シングレットをプールした場合のＰＢおよびＣＳＰｍｅｍ間におけるＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗体およびＶＨ３−２３／Ｖκ１−５抗体の頻度（９）。
【図３５】図３５は、抗体１４５０および５８０−ｇｌによるＮＡＮＰ５リピート結合を示す。Ａ、ＮＡＮＰ５に結合した１４５０および５８０−ｇｌ（ＰＤＢ  ６ＡＺＭ、（１０））パラトープの表面を表したもの。Ｂ、１４５０とＮＡＮＰ５の詳細な相互作用。分子間Ｈ結合は黒色の破線で、分子内Ｈ結合は赤色で色付けされている。
【図３６】図３６は、１２１０とＲＴＳ，Ｓワクチン誘導ＮＡＮＰ抗体３１１（ＩＧＨＶ３−３３およびＩＧＬＶ１−４０によってコード化される）の構造比較を示す。最小限のＮＰＮＡＮＰＮＡＮＡリピートエピトープの認識について、同様の抗原結合立体配座が観察される。１２１０における抗同型変異Ｈ．Ｎ５６＿Ｋと同様に、３１１はＨ．Ｎ５６＿Ｒを有しており、これは抗同型親和性成熟も受けている可能性があることを示唆している。Ａ、１２１０ＩｇＫ鎖はティール色、１２１０  ＩｇＨ鎖は緑色で示されている。Ｂ、３１１Ｉｇλ鎖は茶色で、３１１ＩｇＨ鎖は紫色で示されている。ＮＡＮＰリピート抗原はピンク色で示されている。変異した残基は黄色に色付けされている。Ｈ．３１、Ｈ．５０、およびＨ．５６の位置におけるＡＡ交換が強調表示されている。Ｃ、Ｄ、１２１０（Ｃ）と３１１（Ｄ）の隣接するリピートエピトープに結合するＦａｂ間における同型ＨＣＤＲ２相互作用の詳細な表示。Ｄについては、３１１−ＮＡＮＰ複合体の構造が複製され、１２１０＿ＮＡＮＰ５複合体のＦａｂ−ＡとＦａｂ−Ｂの両方に構造的に整列した。親和性成熟残基Ｈ．Ｋ５６（Ｃ、１２１０Ｆａｂ）およびＨ．Ｒ５６（Ｄ、３１１Ｆａｂ、（１１））は赤色で標識されている。
【図３７】図３７は、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−３０−５の遺伝子頻度を示す。末梢血単核細胞のゲノム配列決定により決定されるＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−３０−５生殖細胞系遺伝子セグメントの頻度（８、９）。表１に示すように、ＣＤＲ２配列に基づいて、それぞれの生殖細胞系遺伝子に配列を割り当てた。
【図３８】図３８は、マラリアワクチン抗原（ＣＳＰ−ＮＡＮＰ５．５−リンカー抗体）が完全長ＰｆＣＳＰ抗原を認識できるＩｇＧ力価を引き出すことを示す。
【図３９】図３９は、図２５の免疫から誘発された抗ＰｆＣＳＰ血清の活性／機能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
定義
別に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、１９９４年にオックスフォード大学プレスによって発行された、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ（ジーンズ）Ｖ（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により１９９４年に発行された、Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学辞典）（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．により１９９５年に発行されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（分子生物学および生物工学：包括的デスクリファレンス）（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に記載されている。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料はすべて本発明の試験の実施に使用することができるが、典型的な材料および方法は本明細書に記載されている。本発明についての説明および請求において、以下の用語が使用される。
【００７４】
また、本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書では多くの特許出願、特許、および出版物を参照することにより、記載されている実施態様の理解が促進される。これらの参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本出願の範囲を理解する上で、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ（前記の）」は、１つまたは複数のエレメントがあることを意味するものとする。さらに、本明細書で使用される「含んでいる」という用語およびその派生語は、述べられた特徴、エレメント、構成要素、群、整数、および／または段階の存在を明記しているが、記載されていない他の特徴、エレメント、構成要素、群、整数、および／または段階の存在を除外するものではない開放形式の用語であることを意図する。上記はまた、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの派生語などの類似の意味を持つ語にも適用される。
【００７６】
また、ある特定の構成要素を「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として記載されている実施態様はすべて、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」こともあり得、この「〜からなる」は、閉鎖的または制限的な意味を有し、「〜から本質的になる」は、明記された構成要素を含んでいるが、不純物として存在する材料、該構成要素を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する避けられない材料、および本発明の技術的効果を達成する以外の目的で追加された構成要素を除く他の構成要素を除外することを意味するものと理解されよう。例えば、「本質的に〜からなる」という句を使用して定義される組成物は、既知の許容される添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを含む。典型的には、一セットの構成要素から本質的になる組成物は、５重量％未満、典型的には３重量％未満、より典型的には１重量％未満、さらにより典型的には０．１重量％未満の割合で非特定成分（複数可）を含むことになる。
【００７７】
本明細書において含まれるものとして定義された構成要素はいかなるものであっても、但し書きまたは否定的限定により、特許請求された発明から明確に除外されることもあり得ることが理解されよう。
【００７８】
さらに、本明細書に記載されているすべての範囲には、明確に記述されているかどうかにかかわらず、該範囲の末端と中間範囲の点もすべて含まれる。
【００７９】
本明細書で使用される「実質的に」、「約」および「およそ」などの度合を示す用語は、最終結果が大幅に変更されないように修飾された用語の妥当な量の逸脱を意味する。これらの度合を示す用語は、この偏差が修飾する単語の意味を否定するものではない場合、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００８０】
さらに、核酸またはポリペプチドに与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために提供されていることは言うまでもない。本開示の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用することはできるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」の語と同義である。「または」という単語は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、「および」を含むものとする。
【００８１】
用語「タンパク質ナノ粒子」および「ナノケージ」は、本明細書では互換的に使用され、マルチサブユニットの、タンパク質ベースの多面体形状の構造を指す。サブユニットまたはナノケージ単量体は、それぞれタンパク質またはポリペプチド（例えば、グリコシル化ポリペプチド）により構成され、また場合によっては単一または複数の、以下の特徴あるもの：核酸、補欠分子族、有機化合物および無機化合物で構成されることもある。タンパク質ナノ粒子の非限定的な例には、フェリチンナノ粒子（例えば、Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．（インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・サイエンシーズ）、１２：５４０６−５４２１、２０１１を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）、エンカプスリンナノ粒子（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ，ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ネイチャー・ストラクチュラル・アンド・モレキュラー・バイオロジー）、１５：９３９−９４７、２００８参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ（ＳＯＲ）ナノ粒子（例えば、Ｕｒｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）、３１１：９９６−１０００、２００６を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）、ルマジンシンターゼナノ粒子（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー）、３０６：１０９９−１１１４、２００１を参照）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼナノ粒子（例えば、Ｉｚａｒｄら、ＰＮＡＳ（米国科学アカデミー紀要）９６：１２４０−１２４５、１９９９を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。フェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれ、いくつかの場合では２４、６０、２４、６０、および６０のタンパク質サブユニットからなる球状タンパク質複合体に自己集合する単量体タンパク質である。カルボキシソーム、ボールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２ＰおよびＭＳ２コートタンパク質もまた、本明細書での使用が想定されるナノケージを生成する。さらに、完全にまたは部分的に合成された自己集合単量体も、本明細書での使用が想定される。
【００８２】
「ワクチン」は、対象において予防的または治療的免疫応答を誘導する医薬組成物である。場合によっては、免疫反応は防御免疫反応である。典型的には、ワクチンは、病原体、例えばウイルス病原体の抗原、または病的状態と相関する細胞成分に対する抗原特異的免疫応答を誘導する。ワクチンには、ポリヌクレオチド（開示された抗原をコード化する核酸など）、ペプチドまたはポリペプチド（開示された抗原など）、ウイルス、細胞または１つもしくは複数の細胞成分が含まれ得る。１つの具体的な非限定的な例において、ワクチンは、マラリア感染に随伴する症状の重症度を軽減し、および／または対照と比較して寄生虫保有量を低減する免疫応答を誘導する。別の非限定的な例では、ワクチンは、対照と比較してマラリア感染を低減および／または予防する免疫応答を誘導する。
【００８３】
本明細書で使用される「免疫グロブリン」（Ｉｇ）としても当該技術分野で呼ばれる用語「抗体」は、対合した重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖から構築されたタンパク質を指し；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、およびＩｇＭなど、様々なＩｇアイソタイプが存在する。抗体は、ヒト、マウス、ラット、サル、ラマ、またはサメを含む任意の種に由来し得ることが理解されよう。抗体が正しく折り畳まれるとき、各鎖は、さらなる直鎖ポリペプチド配列によって結合された若干の異なる球状ドメインに折り畳まれる。例えば、免疫グロブリン軽鎖は可変（ＶＬ）ドメインおよび定常（ＣＬ）ドメインに折り畳まれ、重鎖は可変（ＶＨ）ドメインおよび３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインに折り畳まれる。重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の相互作用により、抗原結合領域（Ｆｖ）が形成される。各ドメインは、当業者によく知られた十分に確立された構造を有する。
【００８４】
軽鎖および重鎖の可変領域は、標的抗原の結合に関与しているため、抗体間でかなりの配列多様性を示す可能性がある。定常領域は配列多様性が少なく、若干の天然タンパク質との結合に関与しており、重要な免疫学的事象を誘発する。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがって、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列の可変性の大部分は、可変重鎖と軽鎖ごとに３つずつ、すなわち６つの超可変領域で発生する；超可変領域は結合して抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合と認識に寄与する。抗原に対する抗体の特異性と親和性は、超可変領域の構造、ならびに抗原に提示する表面のサイズ、形状、および化学的性質によって決まる。
【００８５】
本明細書で言及される「抗体フラグメント」には、当技術分野で既知のあらゆる適切な抗原結合抗体フラグメントが含まれ得る。抗体フラグメントは、天然に存在する抗体フラグメントであってもよく、または天然に存在する抗体を操作することにより、または組換え法を使用することにより得られることもある。例えば、抗体フラグメントには、限定されるわけではないが、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーで連結されたＶＬとＶＨからなる分子）、Ｆｃ、単鎖Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；単一のＶＬまたはＶＨで構成されるフラグメント）、およびこれらのいずれかの多価を提示するものが含まれ得る。
【００８６】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語はまた、該抗体をコード化するＤＮＡ分子であって抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子、または該抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成される抗体を意味すると解釈されるべきであり、前記ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能であり周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られた。
【００８７】
「エピトープ」という用語は、抗原決定基を指す。エピトープは、抗原性である、すなわち特異的な免疫応答を誘発する分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、例えばポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは通常、変性溶媒にさらされたときに保持されるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは通常、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３個、より通常は少なくとも５個、約９個、約１１個、または約８個〜約１２個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体配座を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における方法）、Ｖｏｌ．６６、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（エピトープマッピングプロトコル）を参照。
【００８８】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、特定の免疫学的適格細胞の活性化、またはその両方が含まれ得る。当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる高分子が抗原としての役割を果たすことができることを理解するはずである。さらに、抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者であれば、したがって、免疫応答を誘発するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば、本明細書で使用されているところの用語「抗原」をコード化することになると理解するはずである。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコード化される必要はないことを理解するはずである。本明細書に記載の実施態様は、２つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列を様々な組み合わせで配置して所望の免疫応答を誘発できることは即明らかである。さらに、当業者であれば、抗原が「遺伝子」によってコード化される必要はまったくないことを理解するはずである。抗原を合成できること、または生物学的試料から誘導できることは即明らかである。かかる生物学的試料には、組織試料、細胞、または生体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８９】
したがって、本明細書に記載の組成物は、例えばウイルス、細菌、真菌または寄生虫による感染、がん、および自己免疫障害などの様々な疾患状態に対する脊椎動物対象の保護または処置に適している可能性がある。これらの特定の疾患状態は例としてのみ言及されており、限定することを意図していないことを認識されたい。
【００９０】
本明細書に記載の組成物と組み合わせて有用な適切な抗原には、本明細書で定義される任意の抗原が含まれる。抗原は市販されているか、または当業者はそれらを生成することができる。抗原は、改変された生きた微生物もしくは死滅した微生物、または腫瘍細胞、合成生成物、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、多糖類もしくは類似の生成物、またはアレルゲンを含むがこれらに限定されない微生物または他の細胞から精製された天然産物であり得る。抗原性部分はまた、タンパク質、ペプチド、多糖類または類似の生成物のサブユニットであり得る。抗原はまた、遺伝的抗原、すなわち、免疫応答を引き起こすＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００９１】
使用できる抗原の代表例には、予防用または治療用ワクチンおよびアレルゲンで使用される可能性のある自己免疫疾患、ホルモン、または腫瘍抗原に加えて、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、および他の感染源に由来する天然、組換えまたは合成の生成物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一実施形態では、抗原は、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）などの様々なウイルスからのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。国際出願ＵＳ２００６／４０８６２、国際出願ＵＳ２００４／０２２００１、米国特許出願第１１／５８２，５４０号、米国特許出願第６０／７９９，３４３号、米国特許出願第６０／８１７，４０２号、米国特許出願第６０／８５９，２４０号参照、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、抗原はキメラＶＬＰを含む。「キメラＶＬＰ」とは、少なくとも２つの異なる供給源（生物）由来のタンパク質またはその一部を含むＶＬＰを指す。通常、１つのタンパク質は、宿主細胞からのＶＬＰの形成を推進することができるウイルスに由来する。したがって、一実施形態では、前記キメラＶＬＰはＲＳＶ  Ｍタンパク質を含む。別の実施形態では、前記キメラＶＬＰはＮＤＶ  Ｍタンパク質を含む。別の実施形態では、前記キメラＶＬＰはインフルエンザウイルスＭタンパク質を含む。
【００９２】
ウイルス産物または細菌産物は、酵素切断により生物が産生する成分であり得るか、または当業者に周知の組換えＤＮＡ技術により生成された生物の成分であり得る。
【００９３】
抗原のいくつかの特定の例は、肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ３、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス１、２、６および７、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹、乳頭腫ウイルス、エプスタインバーウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス（ハンタウイルスなど）、コクサキエウイルス、ピコマウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パポバウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス（複数のタイプ）、アデノウイルス（複数のタイプ）、パラインフルエンザウイルス（複数のタイプ）、鳥インフルエンザまたはパンデミックインフルエンザ（様々なタイプ）、季節性インフルエンザ、輸送熱ウイルス、西部および東部馬脳脊髄炎、日本Ｂ型脳脊髄炎、ロシア春夏脳脊髄炎、豚コレラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鶏痘、狂犬病、ネコおよびイヌジステンパーなどのウイルス、遅脳ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポキシウイルス科（天然痘またはワクシニアなど）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）によって引き起こされるウイルス感染に由来する抗原である。これらのファミリーに属するウイルスは、関節炎、細気管支炎、脳炎、眼感染症（結膜炎、角膜炎など）、慢性疲労症候群、Ｂ型日本脳炎、ジュニン、チクングニア、リフトバレー熱、黄熱、髄膜炎、日和見感染症（エイズなど）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、風邪、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例、カポジ、いぼ）、およびウイルス血症などの様々な病気や症状を引き起こす可能性があるが、これらに限定されるわけではない。
【００９４】
抗原はまた、細菌や真菌の感染症に由来する場合もあり、例えば：結核やハンセン病を引き起こすマイコバクテリア、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｃｉ）、好気性グラム陰性菌（ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｉ）、マイコプラズマに起因する感染症、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）およびクラミジア門（ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、ボルデテラ・パーツシス（百日咳菌、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）および黄疸出血病レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）に由来する抗原がある。特定の実施形態は、サルモネラ・パラチフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、パラチフス菌）ＡおよびＢ、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ジフテリア菌）、クロストリジウム・テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、破傷風菌）、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、フェセリ菌（Ｃ．ｆｅｓｅｒｉ）および他のガス壊疽菌、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｐ．ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ・マルトサイダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギチジス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（ナイセリア・ゴノロエエ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、放線菌）（例、ノカルジア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ））、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス科（例、バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｓｉｓ）炭疽菌）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（例、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ））、ブラストマイコシス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンジダ、カンピロバクター、クラミジア、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、コリネバクテリウム（例えば、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ））、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）および腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（例えば、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ））、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、チフス菌）、サルモネラ・エンテリチジス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、腸炎菌）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ���ａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ、赤痢菌））、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、マイコプラズマ、マイコバクテリウム（例、マイコバクテリウムレプラエおよびマイコバクテリウムツベルクローシス）、ビブリオ（例、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、リケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、例、トレポネマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ））、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ならびにＡ群、Ｂ群、およびＣ群連鎖球菌）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｓ）、トレポネマ・ポリドゥム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｏｌｌｉｄｕｍ）など；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐ、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌ．ｖｉｖａｘ）など）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ）、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、パスツレラヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、コリネバクテリウムジフセリエトキソイド（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ  ｔｏｘｏｉｄ）、髄膜炎菌多糖類（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ、百日咳菌）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ））多糖類、破傷風菌トキソイド、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、ウシ結核菌）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の死滅細胞を含む。
【００９５】
抗原はまた、寄生性マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、住血吸虫症、フィラリア症マラリア、アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外寄生虫、ジアルジア、蠕虫病、タイレリア症、トリコモナスおよび胞子虫類（例、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｒａｘ）、プラスモジウム・ファキパリウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｋｉｐａｒｉｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ））に由来するものであり得る。これらの寄生虫は、疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（赤痢、ジアルジア症など）、肝疾患、肺疾患、日和見感染症（ＡＩＤＳ関連など）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラズマ症を含む様々な疾患や症状を引き起こす可能性があるが、これらに限定されるわけではない。
【００９６】
本明細書に記載の組成物での使用に適した腫瘍関連抗原には、単一の腫瘍タイプを示し得る、いくつかのタイプの腫瘍間で共有され得る、および／または正常細胞と比較して腫瘍細胞で排他的に発現または過剰発現され得る変異分子および非変異分子の両方が含まれる。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質およびムチンの発現の腫瘍特異的パターンも立証されている。対象のがんワクチンで使用するための例示的な腫瘍関連抗原には、がん遺伝子のタンパク質産物、腫瘍抑制遺伝子、および腫瘍細胞に特有の変異または再配列を有する他の遺伝子、再活性化胚遺伝子産物、がん胎児性抗原、組織特異的（ただし腫瘍特異的ではない）分化抗原、成長因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来ウイルスタンパク質、ならびに若干の他の自己タンパク質が含まれる。腫瘍関連抗原の特定の実施形態には、例えば、Ｒａｓ  ｐ２１がん原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３およびＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＢＣＲ−ａｂ１がん遺伝子のタンパク質産物、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、およびベータカテニンなどの変異抗原；ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２およびＫＳＡなどの過剰発現抗原、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などのがん胎児性抗原；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などの自己抗原、およびＭａｒｔ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２などのメラニン細胞分化抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２などの前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、ＧＡＧＥ  １、ＧＡＧＥ  ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥなどの再活性化胚遺伝子産物、ならびにＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１などの他のがん精巣抗原；Ｍｕｃ−１やＭｕｃ−２などのムチン；ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３などのガングリオシド、中性糖脂質、およびＬｅｗｉｓ（ｙ）やｇｌｏｂｏ−Ｈなどの糖タンパク質；ならびにＴｎ、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原（ＴＦ）、ｓＴｎなどの糖タンパク質が含まれる。また、本明細書において腫瘍関連抗原として含まれるのは、全細胞および腫瘍細胞溶解物ならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対する使用のためのＢリンパ球のモノクローナル増殖で発現される免疫グロブリンイディオタイプである。腫瘍関連抗原およびそれらのそれぞれの腫瘍細胞標的には、例えば、がん腫の抗原としてのサイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８および１９が含まれる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ヒト胎児抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６およびＴ１６も既知のがん抗原である。デスミンと筋肉特異的アクチンは筋原性肉腫の抗原である。胎盤アルカリホスファターゼ、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、およびアルファフェトプロテイ��は、栄養芽細胞腫瘍および胚細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異抗原は、前立腺がんの抗原、結腸腺がんのがん胎児性抗原である。ＨＭＢ−４５は黒色腫の抗原である。子宮頸がんでは、有用な抗原がヒト乳頭腫ウイルスによってコード化される可能性がある。クロマグラニンＡとシナプトフィシンは、神経内分泌腫瘍と神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に興味深いのは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する攻撃的な腫瘍である。かかる壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞の抗原の豊富な供給源であり、したがって、対象の治療については、従来の化学療法および／または放射線療法と併せて有利な用途が見出される可能性がある。抗原は、あらゆる腫瘍または悪性細胞株に由来し得る。
【００９７】
抗原は、アレルギーを引き起こす一般的なアレルゲンに由来する場合もある。アレルゲンには、植物材料、金属、化粧品または洗剤の成分、ラテックスなど、様々な人工資源または天然資源に由来する有機または無機の材料が含まれる。本明細書に記載の組成物および方法で使用するための適切なアレルゲンのクラスには、花粉、動物のフケ、草、カビ、ほこり、抗生物質、刺咬昆虫の毒、および様々な環境的（化学物質および金属を含む）薬物および食物アレルゲンが含まれるが、これらに限定されない。一般的な木のアレルゲンには、ハコヤナギ、ポプラ（ｐｏｐｕｌａｒ）、トネリコ、カバノキ、メープル、オーク、ニレ、ヒッコリー、およびペカンの木からの花粉が含まれる；一般的な植物のアレルゲンには、ライ麦、ブタクサ、オオバコ、スイバドックおよびブタクサからのアレルゲンが含まれる；植物接触アレルゲンには、毒オーク、ツタウルシおよびイラクサ由来のものが含まれる；一般的な草のアレルゲンには、ティモシー、ジョンソン、バミューダ、ウシノケグサおよびブルーグラスのアレルゲンが含まれる；一般的なアレルゲンはまた、カビや菌類、例えばアルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ホルモデンドラム（Ｈｏｒｍｏｄｅｎｄｒｕｍ）、アスペルギルス、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）および好熱性放線菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）からも入手できる；ペニシリンとテトラサイクリンは一般的な抗生物質アレルゲンである；表皮アレルゲンは、ハウスダストまたはオーガニックダスト（通常は菌類起源）、イエダニ（デルマルファゴイデス・プテロシナイシス（ｄｅｒｍａｌｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｓｉｎｙｓｓｉｓ））などの昆虫、または羽、猫や犬のフケなどの動物源から入手できる；一般的な食物アレルゲンには、牛乳とチーズ（乳製品）、卵、小麦、ナッツ（ピーナッツなど）、魚介類（甲殻類など）、エンドウ豆、豆、グルテンのアレルゲンが含まれる；一般的な環境アレルゲンには、金属（ニッケルおよび金）、化学物質（ホルムアルデヒド、トリニトロフェノールおよびターペンチン）、ラテックス、ゴム、繊維（綿または羊毛）、黄麻布、染毛剤、化粧品、洗剤および香水アレルゲンが含まれる；一般的な薬物アレルゲンには、局所麻酔薬とサリチル酸アレルゲンが含まれる；抗生物質アレルゲンには、ペニシリンおよびスルホンアミドアレルゲンが含まれる；一般的な昆虫のアレルゲンには、蜂、スズメバチおよびアリの毒、およびゴキブリのキノコ体傘部（ｃａｌｙｘ）のアレルゲンが含まれる。特に十分に特性確認されたアレルゲンには、Ｄｅｒ  ｐＩアレルゲンの主要エピトープおよび潜在エピトープ（Ｈｏｙｎｅら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（イムノロジー）８３、１９０−１９５）、蜂毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）（Ａｋｄｉｓら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション）９８、１６７６−１６８３）、カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １（Ｂａｕｅｒら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イム��ロジー）１０７、５３６−５４１）、および多エピトープ組換え草アレルゲンｒＫＢＧ８．３（Ｃａｏら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（イムノロジー）９０、４６−５１）があるが、これらに限定されるわけではない。これらおよび他の適切なアレルゲンは市販されており、および／または既知の技術に従って抽出物として容易に調製することができる。
【００９８】
抗原は、精製抗原形態でもまたは部分精製抗原形態でもよく、上記の抗原、抗原性ペプチド、当技術分野において既知で利用可能なタンパク質、および慣用的技術を使用して同定できる他のタンパク質のいずれかに由来し得る。抗原は、典型的には、その毒性または猛毒特性が低減または破壊され、適切なものに導入されると、特定の微生物、抗原の調製に使用される微生物の抽出物または生成物に対して免疫応答を誘導する形態をとることになり、またはアレルゲンの場合、特定のアレルゲンによるアレルギーの症状を緩和するのに役立つことになる。抗原は、単独で、または組み合わせて使用することができる；例えば、複数の細菌抗原、複数のウイルス抗原、複数の細菌抗原、複数の寄生虫抗原、複数の細菌性、ウイルス性のトキソイド、複数の腫瘍抗原、複数のアレルゲンまたは前述の生成物のいずれかの組み合わせをアジュバント組成物と組み合わせることにより、多価抗原性組成物および／またはワクチンを作り出すことができる。本明細書に記載の組成物において、抗原は、組成物の小胞構造成分に捕捉、吸着、または混合された抗原であってもよい。
【００９９】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物と共に使用するのに適した抗原には、免疫原性が低い抗原、例えばマラリア抗原、デング抗原およびＨＩＶ抗原、またはパンデミック疾患に対する免疫を付与することを意図した抗原、例えばインフルエンザ抗原が含まれる。
【０１００】
「コード化する」とは、特定されたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または特定されたアミノ酸配列およびそれから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により細胞または他の生物学的系でタンパク質が産生される場合、遺伝子はタンパク質をコード化している。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコーディング鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写用の鋳型として使用される非コーディング鎖は両方とも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質またはその他の生成物をコード化しているということができる。
【０１０１】
本明細書で使用される「発現」という用語は、そのプロモータによって推進される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
【０１０２】
「単離された」とは、自然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その自然状態の共存材料から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
【０１０３】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列」には、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコード化するすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコード化するフレーズヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列が何らかのバージョンでイントロンを含み得る程度までイントロンを含み得る。
【０１０４】
本明細書で使用される「調整する」という用語は、処置または化合物の非存在下での対象の応答レベルと比較した、および／または他の点では同一だが未処置である対象の応答レベルと比較した対象の応答レベルの検出可能な増加または減少を調節することを意味する。この用語は、本来のシグナルまたは応答を摂動すること、および／または影響を与えることにより、対象、典型的にはヒトにおける有益な治療応答を調節することを含む。
【０１０５】
「機能し得るように連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能し得るように連結されている。例えば、プロモータがコーディング配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモータはコーディング配列に機能し得るように連結されている。一般に、機能し得るように連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要に応じて同じ読み枠内にある２つのタンパク質コーディング領域を結合させる。
【０１０６】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内の注射または注入技術が含まれる。
【０１０７】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは交換可能である。当業者であれば、核酸がポリヌクレオチドであり、単量体の「ヌクレオチド」に加水分解できるという一般的な知識を有するはずである。単量体のヌクレオチドは加水分解されてヌクレオシドになり得る。本明細書で使用されるポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲなどを用いた、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングなど、および合成手段を含むがこれらに限定されない、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０８】
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質またはペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれていなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限は無い。ポリペプチドには、ペプチド結合により互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用する場合、この用語は、例えば当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖、および当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、多くのタイプが存在する。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１０９】
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識することもまたは結合することもない抗体を意味する。例えば、１つの種に由来する抗原に特異的に結合する抗体が、１つ以上の種に由来するその抗原に結合する場合もある。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体が特異的であるものとしての抗体の分類を変えることはない。別の例では、ある抗原に特異的に結合する抗体が、該抗原の異なる対立遺伝子型にも結合することがある。しかしながら、かかる交差反応性自体が、特異的であるものとしての抗体の分類を変更することはない。場合によっては、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」を、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することにより、該相互作用が該化学種上の特定構造（例、抗原決定基またはエピトープ）の存在に左右されること；例えば、抗体は一般的にタンパク質ではなく、ある特定のタンパク質構造を認識して結合することを意味することができる。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」と抗体を含む反応におけるエピトープＡ（または遊離の非標識Ａ）を含む分子の存在は、抗体に結合した標識Ａの量を減少させることになる。
【０１１０】
「治療有効量」、「有効量」または「十分な量」という用語は、哺乳動物、例えばヒトを含む対象に投与された場合、所望の結果を達成するのに十分な量、例えば防御免疫応答を誘発するのに有効な量を意味する。本明細書に記載の化合物の有効量は、対象の免疫原、年齢、性別、および体重などの要因によって異なり得る。当業者に理解されているように、最適な治療応答を実現するために、投薬または処置計画を調整してもよい。例えば、本明細書に記載の治療有効量の融合タンパク質の投与は、実施態様において、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などの病原体に対する免疫を高めるのに十分である。他の実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質の治療有効量の投与は、がん、ＨＩＶ、マラリア、または自己免疫疾患などの疾患または状態を処置するのに十分である。さらに他の実施態様において、本明細書に記載の治療有効量の融合タンパク質の投与は、ワクチンの有効性を高めるアジュバントとして作用するのに十分である。
【０１１１】
さらに、治療的有効量での対象の処置計画は、単回投与で構成されてもよく、あるいは一連の適用を含んでもよい。処置期間の長さは、免疫原、対象の年齢、薬剤の濃度、薬剤に対する患者の応答性、またはそれらの組み合わせなどの様々な要因によって異なる。また、処置に使用される薬剤の有効投与量は、特定の処置計画の過程で増加または減少する場合があることも理解されよう。投与量の変化が生じ、当技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって明らかになる可能性がある。本明細書に記載の融合タンパク質は、実施態様において、マラリア、ＨＩＶまたはがんなどの問題の疾患または障害に対する慣用的治療法による処置の前、最中または後に投与されることがある。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質については、がんを処置するための免疫療法と組み合わせた特定の用途が見出される可能性がある。
【０１１２】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞には、一次対象細胞とその子孫が含まれる。
【０１１３】
本明細書で使用される「転写制御下」または「機能し得るように連結された」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモータがポリヌクレオチドに対して正しい位置および配向にあることを意味する。
【０１１４】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる物質の組成物である。直鎖ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物界の任意の構成員、典型的には哺乳動物を指す。「哺乳動物（哺乳類）」という用語は、ヒト、その他の高等霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの家畜および農場の動物、および動物園、スポーツ、または愛玩用の動物を含む哺乳類に分類されるあらゆる動物を指す。通常、哺乳類はヒトである。
【０１１６】
１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（並行）投与および任意の順序での連続投与が含まれる。
【０１１７】
「医薬的に許容し得る」という用語は、化合物または化合物の組み合わせが医薬用の製剤の残りの成分と適合性があること、および米国食品医薬品局によって公布されたものを含む確立された政府基準に従ってヒトに投与することが一般に安全であることを意味する。
【０１１８】
「医薬的に許容し得る担体」という用語には、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および／または吸収遅延剤などが含まれるが、これらに限定されない。医薬的に許容し得る担体の使用は周知である。
【０１１９】
「アジュバント」という用語は、ワクチン中に存在し、ワクチン中に存在する抗原に対する免疫応答を強化する化合物または混合物を指す。例えば、アジュバントは、本明細書で検討されているワクチンに存在するポリペプチド、または本明細書で検討されているその免疫原性フラグメントもしくはバリアントに対する免疫応答を増強することもある。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポーとして、また免疫応答を非特異的に強化するリンパ系活性化因子としての役割を果たすこともある。使用され得るアジュバントの例には、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ／合成トレハロースジコリノミコラート、例えばＧＳＫ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手可能）が含まれる。別の適切なアジュバントは、免疫刺激性アジュバントＡＳ０２１／ＡＳ０２（ＧＳＫ）である。これらの免疫刺激アジュバントは、強いＴ細胞応答を与えるように製剤化されており、ＱＳ−２１、キライ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｙ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニン、ＴＬ４リガンド、モノホスホリルリピドＡを脂質またはリポソームの担体中に一緒に含む。他のアジュバントには、非イオン性ブロックコポリマーアジュバント（例えば、ＣＲＬ  １００５）、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＩＰＯ．ｓｕｂ．４）、Ｒ−８４８（Ｔｈ１様アジュバント）、イミキモド、ＰＡＭ３ＣＹＳ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ロキソリビン、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、コレラ毒素由来抗原（例、ＣＴＡ  １−ＤＤ）、リポ多糖アジュバント、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、水中の油または炭化水素エマルジョン（例：Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓから入手可能なＭＦ５９またはモンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ  ７２０）、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
「バリアント」は、比較配列内の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾および／または置換により、比較基準配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性な融合タンパク質、抗体、またはそのフラグメントである。バリアントは一般に、比較配列との配列同一性が１００％未満である。しかしながら、通常、生物学的に活性なバリアントは、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性など、比較配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有することになる。バリアントには、比較基準配列の生物活性のある程度のレベルを保持する少なくとも１０個のアミノ酸のペプチドフラグメントが含まれる。またバリアントには、比較配列のＮ末端もしくはＣ末端に、または比較配列内に１つ以上のアミノ酸残基が付加されているポリペプチドも含まれる。またバリアントには、いくつかのアミノ酸残基が欠失し、場合によっては１つ以上のアミノ酸残基により置換されていてもよいポリペプチドも含まれる。バリアントはまた、例えば、天然に存在するアミノ酸以外の部分で置換することにより、またはアミノ酸残基を修飾して天然に存在しないアミノ酸を生成することにより、共有結合的に修飾されることもある。
【０１２１】
「アミノ酸配列同一性パーセント」は、本明細書では、配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後における、配列同一性の一部として保存的置換を考慮に入れていない、本発明のポリペプチドなどの興味の対象である配列内の残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。候補配列へのＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部伸長、欠失または挿入のいずれも、配列の同一性または相同性に影響すると解釈されるものではない。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、「ＢＬＡＳＴ」など、当技術分野で周知である。
【０１２２】
本明細書における目的のための「活性の」または「活性」は、本明細書に記載の融合タンパク質の生物学的活性および／または免疫学的活性を指し、「生物学的」活性は、融合タンパク質によって引き起こされる生物学的機能（阻害性または刺激性）を指す。
【０１２３】
本明細書に記載の融合タンパク質は、修飾を含み得る。かかる修飾には、抗マラリア剤またはアジュバントなどのエフェクター分子へのコンジュゲーションが含まれるが、これに限定されない。修飾にはさらに、検出可能なレポーター部分へのコンジュゲーションが含まれるが、これに限定されない。半減期を延長する修飾（例：ペグ化）も含まれる。タンパク質および非タンパク質の薬剤は、当該分野で既知の方法により融合タンパク質にコンジュゲーションされ得る。コンジュゲーション法には、直接結合、共有結合したリンカーを介した結合、および特異的結合対メンバー（例、アビジン−ビオチン）が含まれる。かかる方法には、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（キャンサー・リサーチ）５０、６６００−６６０７（１９９０）によって記載された方法、ならびにＡｍｏｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（アドバンシーズ・イン・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー）３０３、７９−９０（１９９１）およびＫｉｓｅｌｅｖａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（モレキュラー・バイオロジー）（ＵＳＳＲ）２５、５０８−５１４（１９９１）によって記載された方法が含まれ、これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
融合タンパク質
本明細書に記載されているのは、融合タンパク質である。融合タンパク質は、ナノケージ単量体およびナノケージ単量体に結合した抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントは抗原結合エピトープを含む。複数の融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の抗体またはそのフラグメントがナノケージの外表面を装飾し、それにより抗原結合エピトープが抗原との相互作用のために露出される。
【０１２５】
他の実施態様において、融合タンパク質は、ナノケージ単量体およびナノケージ単量体に結合した抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントは、抗体またはそのフラグメントのＦｃ部分を含む。複数の融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の抗体またはそのフラグメントがナノケージの外面を装飾し、それにより抗体またはそのフラグメントのＦｃ部分がＦｃ受容体と相互作用するために露出される。
【０１２６】
典型的な実施態様において、ナノケージは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、または９８〜約４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、または１００のナノケージ単量体、例えば２４単量体または６０単量体など、約３〜約１００のナノケージ単量体を含む。ナノケージ単量体は、天然、合成、または部分合成の任意の既知ナノケージ単量体であってもよく、実施態様では、フェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ボールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、そのフラグメント、およびそのバリアントから選択される。図１Ａおよび１Ｂは、自己集合ナノケージの画像を示す。
【０１２７】
特定の実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、ナノケージ単量体と抗体またはそのフラグメントとの間にリンカーを含む。このリンカーにより、タンパク質が発現されると、ナノケージ単量体と抗体またはそのフラグメントの両方が、自己集合と抗体機能に有利な立体配座をとることができる。リンカーは、柔軟性があっても剛性でもよい。
【０１２８】
リンカーは一般に、融合タンパク質にある程度の柔軟性を与えるのに十分な長さではあるが、リンカーの長さはナノケージ単量体と抗体の配列および融合タンパク質の三次元立体配座に応じて変わることが理解されよう。したがって、リンカーは、典型的には、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９〜約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のアミノ酸残基、例えば８、１０、または１２のアミノ酸残基などの約８〜約１６のアミノ酸残基など、約１から約３０のアミノ酸残基である。
【０１２９】
リンカーは、抗体の抗原結合部位への抗原の結合を妨げることのないものであればいかなるアミノ酸配列のものであってもよい。典型的な一例では、リンカーはＧＧＳリピートを含み、より典型的には、リンカーは、約４のＧＧＳリピートなど、約２、３、４、５、または６のＧＧＳリピートを含む。
【０１３０】
典型的には、抗体はＦａｂフラグメントの重鎖および／または軽鎖を含むが、上記抗体の１つなどの任意の抗体またはそのフラグメントを本明細書に記載の融合タンパク質に使用し得ることが理解されよう。他の典型的な実施態様において、抗体またはそのフラグメントはｓｃＦｖまたはｓｃＦｃを含む。
【０１３１】
特定の実施態様において、融合タンパク質は抗原をさらに含むことがある。そのような実施態様は、米国特許出願第＿＿＿＿＿＿（Ｊｕｌｉｅｎら、本明細書と同時に提出、整理番号３２０６−５００５）に明記されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、かかる実施態様では、抗原は少なくとも第１および第２の抗体結合エピトープ；ならびに少なくとも第１の抗原エピトープに特異的な抗体またはそのフラグメントを有する。抗体またはそのフラグメントの第１の抗原エピトープへの結合は、抗原結合部分に結合するための第２の抗原エピトープを提示し、および／または第１の抗体結合エピトープは抗体またはそのフラグメントに結合し、前記結合は抗体またはそのフラグメントの状況において前記第２の抗体結合エピトープを提示する。
【０１３２】
実施態様では、抗原は典型的にはリピートドメインを含む。これにより、単一体に２つの同一の抗体結合エピトープを含めることが容易になる。もちろん、抗原は、上記のように、異なる抗体結合エピトープを有することがあり、その場合、リピートドメインは適切ではない。関連実施態様において、抗体はリピートドメインに特異的である。
【０１３３】
典型的な実施態様において、抗原はマラリアＣＳＰタンパク質のフラグメントなどのマラリア抗原である。より典型的には、抗原はマラリアＣＳＰタンパク質のＮＡＮＰリピートドメインのフラグメントであり、５．５のＮＡＮＰリピートを含む。典型的な実施態様において、抗原はＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰである。関連する実施態様において、抗体はマラリアＣＳＰタンパク質などのマラリア抗原に特異的であり、より典型的には、マラリアＣＳＰタンパク質のＮＡＮＰリピートドメインに特異的である。
【０１３４】
マラリアＣＳＰタンパク質が、ＮＰＤＰ、ＮＶＤＰ、およびＮＡＮＡを含め、ＮＡＮＰ以外に、またはＮＡＮＰに加えて、他の繰り返しアミノ酸を有する可能性があることは言うまでもない。これらは、単独で、またはＮＡＮＰの有無にかかわらず組み合わせた形で繰り返されて、抗原または抗原の一部を形成することもあり、明確にするために、ＮＡＮＰが存在しない場合でも「ＮＡＮＰリピートドメイン」という語句に含まれるものとする。Ｎ末端ドメインと中央リピート領域との間の接合部でのＮＰＤＰモチーフのユニークな位置は、ほぼすべてのＰｆ分離株で保存されている（＞９９．８％）（Ｋｉｓａｌｕら、２０１８）。対照的に、ＮＡＮＰ−ＮＶＤＰ交互配列は一般にＮＰＤＰモチーフの直後に位置するが、ＮＡＮＰモチーフは４０回超も繰り返され得、長さはＰｆ野生分離株間で大きく異なり得る。そのため、リピート・ターゲティングｍＡｂは、単一のＰｆＣＳＰ分子内であっても、エピトープの多くのコピーに結合することが示されている。ｍＡｂのＭＧＧ４およびＣＩＳ４３は、ＮＰＤＰ、ＮＶＤＰ、およびＮＡＮＰに無差別に結合するが、特異的繰り返しモチーフに対する独特の優先傾向も示す。重要なことに、記載されているｍＡｂは、ＮＰＤＰモチーフ（接合エピトープと呼ばれる、ＫＱＰＡＤＧＮＰＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮ）に関与する能力を有しており、これは、Ｐｆスポロゾイトを阻害する効力を高める可能性がある。ｍＡｂのＭＧＧ４およびＣＩＳ４３のパラトープは、繰り返しモチーフ内のある特定のアミノ酸の互換性に対応する能力を有する（ＮＰＤＰ対ＮＶＤＰ対ＮＡＮＰ）。
【０１３５】
典型的には、抗体またはそのフラグメントは、配列：
【数４】
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に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列またはそのフラグメント、例えば、上記配列に対して、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列、例えば１００％配列同一性を含むか、またはそれからなる配列を含む。
【０１３６】
他の実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、エプラツズマブまたはデニンツズマブなどの抗ＣＤ２２抗体または抗ＣＤ１９抗体である。特定の実施態様において、抗原は、別個のサブユニット融合タンパク質として、または他の既知の方法によってナノケージの表面に結合した形で、ナノケージの表面に共提示されることもある。抗原および抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメントを共提示することにより、抗原に特異的に結合したアジュバント効果が提供される。抗ＣＤ１９と共提示されている抗原は、ナノ粒子表面に直接的または間接的に結合され得、上記の抗体またはそのフラグメントの状況で提示され得ることが特に考えられる。
【０１３７】
他の実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、上記で列挙したものなどの任意の抗原に指向され得る。典型的には、抗原は、がんまたはＡ型、Ｂ型、Ｃ型の肝炎、ＨＩＶ、マイコバクテリア、マラリア病原体、ＳＡＲＳ病原体、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルスなどの感染源、またはクラミジアやマイコバクテリアなどの細菌性病原体、または共動員および細胞傷害性殺傷のための自己反応性Ｂ細胞または任意のＴ細胞に由来する。
【０１３８】
一般に、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｆａｂ軽鎖および／または重鎖と関連しており、これらは融合タンパク質とは別個にまたは連続して生成され得る。
【０１３９】
あるいは、本明細書に記載の融合タンパク質については、治療薬または診断薬としての用途が見出され得る。したがって、実施態様における抗体またはそのフラグメントは、例えば、腫瘍抗原または自己抗原に特異的であり得る。
【０１４０】
実質的に同一の配列は、１つ以上の保存的アミノ酸変異を含み得る。参照配列に対する１つ以上の保存的アミノ酸変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的、または機能的特性の実質的な変化を伴わない変異体ペプチドを生成する可能性があることは当技術分野で知られている；そのような場合、参照配列と変異体配列は「実質的に同一」のポリペプチドとみなされる。保存的アミノ酸変異には、アミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれ得る；保存的アミノ酸置換は、本明細書において、類似の化学的性質（例えば、サイズ、電荷、または極性）を有する別のアミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換として定義される。
【０１４１】
非限定的な例では、保存的変異はアミノ酸置換であり得る。かかる保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、または酸性のアミノ酸で同じ群の別のものを置換してもよい。「塩基性アミノ酸」という用語は、生理的ｐＨで典型的には正に帯電している、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびリシン（ＬｙｓまたはＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（別名「極性アミノ酸」）という用語は、生理的ｐＨでは非荷電状態であるが、２つの原子によって共有される電子対がその一方の原子の方により近く引き寄せられている少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸には、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）が含まれる。「疎水性アミノ酸」（別名「非極性アミノ酸」）という用語は、アイゼンバーグ（１９８４）の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従ってゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸には、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、およびグリシン（ＧｌｙまたはＧ）がある。
【０１４２】
「酸性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで典型的には負に帯電している、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸には、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、およびアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）が含まれる。
【０１４３】
配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用される；これは、残基の位置間における最大の対応を得るように２つの配列を整列させたときに同じ残基のパーセントを計算することによって決定される。任意の既知の方法を使用して配列同一性を計算することもある；例えば、コンピュータのソフトウェアを使用して配列同一性を計算できる。限定することを望むものではないが、配列同一性は、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（およびｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／にある）によって維持されるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、Ｂｌａｓｔ−Ｎ、またはＦＡＳＴＡ−Ｎなどのソフトウェア、または当技術分野で知られている他の適切なソフトウェアにより計算することができる。
【０１４４】
本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも８５％同一であり得る；別の例では、実質的に同一の配列は、アミノ酸レベルで本明細書に記載の配列に対し少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一であり得る。特定の実施態様において、実質的に同一の配列は、参照配列の活性および特異性を保持している。非限定的な実施形態では、配列同一性の違いは、複数の場合もある保存的アミノ酸変異によるものであり得る。
【０１４５】
本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、それらの発現、検出または精製の助けとなる追加の配列を含んでいてもよい。当業者に知られているそのような配列またはタグを使用することができる。例えば、限定することを望むものではないが、融合タンパク質は、ターゲティングまたはシグナル配列（例えば、限定されないがｏｍｐＡ）、検出タグを含み得、具体例としてのタグカセットはＳｔｒｅｐタグまたはその任意のバリアントを含む；例えば、米国特許第７，９８１，６３２号参照、Ｈｉｓタグ、配列モチーフＤＹＫＤＤＤＤＫを有するＦｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタマートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １を参照、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｖ５タグ、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、チオレドキシンタグ、またはそれらの任意の組み合わせ；精製タグ（例えば、限定されるわけではないが、Ｈｉｓ５またはＨｉｓ６）、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１４６】
別の例では、追加の配列は、国際公開第９５／０４０６９号のＣｒｏｎａｎらまたは国際公開第２００４／０７６６７０号のＶｏｇｅｓらによって記載されているものなどのビオチン認識部位であり得る。また、当業者に知られているように、リンカー配列は、追加の配列またはタグと組み合わせて使用されてもよい。
【０１４７】
より具体的には、タグカセットは、高い親和性または結合力で抗体に特異的に結合することができる細胞外成分を含んでもよい。単鎖融合タンパク質構造内で、タグカセットは、（ａ）コネクター領域に対しアミノ末端直近に位置し得るか、（ｂ）リンカーモジュールの間に挟まれて連結する形をとり得るか、（ｃ）結合ドメインに対しカルボキシ末端直近に位置し得るか、（ｄ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とエフェクタードメインの間に挟まれて連結する形を取りうるか、（ｅ）結合ドメインのサブユニットの間に挟まれて連結する形を取りうるか、または（ｆ）単鎖融合タンパク質のアミノ末端に位置し得る。特定の実施形態では、１つ以上の接合アミノ酸は、タグカセットと疎水性部分との間に配置されてそれらを連結するか、タグカセットとコネクター領域の間に配置されてそれらを連結するか、タグカセットとリンカーモジュールの間に配置されてそれらを連結するか、またはタグカセットと結合ドメインとの間に配置されてそれらを連結してもよい。
【０１４８】
また、本明細書には、様々な方法論を使用して表面に固定化された単離もしくは精製された融合タンパク質、ポリペプチド、またはそのフラグメントも含まれる；例えば、限定することを望むものではないが、ポリペプチドは、Ｈｉｓタグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着などを介して表面に結合またはカップリングされてもよい。固体表面は、任意の適切な表面、例えば、限定されるわけではないが、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、膜、ビーズ（磁気ベースまたはセファロースベースのビーズまたはその他クロマトグラフィー樹脂）、ガラス、フィルム、またはその他の有用な表面であり得る。
【０１４９】
他の実施態様において、融合タンパク質はカーゴ分子に結合され得る；融合タンパク質は、カーゴ分子を所望の部位に送達し得、当技術分野で知られている任意の方法（組換え技術、化学的コンジュゲーション、キレート化など）を使用してカーゴ分子に結合され得る。カーゴ分子は、治療薬または診断薬などの任意のタイプの分子であり得る。例えば、いかなる方法でも限定することを望むものではないが、治療薬は放射性免疫療法に使用されることもある放射性同位体；免疫毒素などの毒素；免疫サイトカインなどのサイトカイン；細胞毒素；アポトーシス誘導剤；酵素；免疫療法用の抗がん抗体；または当技術分野で知られている任意の他の適切な治療分子であってもよい。他方、診断薬には、放射性同位体、ガドリニウムまたは酸化鉄などの常磁性標識、発蛍光団、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素または染料（Ｃｙ３、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、またはＤｙｌｉｇｈｔ８００など）、検出可能なタンパク質ベースの分子に融合した親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、またはイメージング法で検出され得るその他の任意の適切な薬剤が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。特定の非限定的な例において、融合タンパク質は、ＦＩＴＣなどの蛍光剤に結合されてもよく、または強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）に遺伝子融合されてもよい。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、カーゴ分子はタンパク質であり、カーゴ分子がナノケージに内包されるように融合タンパク質に融合される。他の実施態様において、カーゴ分子は融合タンパク質に融合されておらず、ナノケージに内包されている。カーゴ分子は通常、タンパク質、小分子、放射性同位元素、または磁性粒子である。
【０１５１】
本明細書に記載の融合タンパク質は、それらの標的に特異的に結合する。本明細書に記載の抗体またはフラグメントの、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す抗体特異性は、親和性および／または結合力に基づいて決定することができる。親和性は、抗原と抗体との解離の平衡定数（ＫＤ）で表され、抗原決定基（エピトープ）と抗体結合部位との結合強度を測定する。結合力とは、抗体とその抗原との結合強度の尺度である。抗体は、典型的には１０−５〜１０−１１  ＭのＫＤで結合する。１０−４Ｍを超えるＫＤはいずれも、一般に非特異的結合を示すと考えられる。ＫＤの値が小さくなると、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度は強くなる。実施態様において、本明細書に記載の抗体は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、または１０−９Ｍ未満のＫＤを有する。
【０１５２】
また、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含むナノケージも本明細書に記載されている。ナノケージは、複数の同一の融合タンパク質、複数の異なる融合タンパク質（したがって多価である）、融合タンパク質と野生型タンパク質の組み合わせ、およびそれらの任意の組み合わせから自己集合し得ることは言うまでもない。例えば、ナノケージは、免疫療法のための少なくとも１つの抗がん抗体と組み合わせて、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質で装飾されていてもよい。典型的な実施態様において、ナノケージ単量体の約２０％〜約８０％が本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【０１５３】
また、本明細書に記載の融合タンパク質およびポリペプチドをコード化する核酸分子、ならびに核酸分子を含むベクターおよびベクターを含む宿主細胞も本明細書に記載される。
【０１５４】
本明細書に記載の融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドには、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列と実質的に同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。「実質的に同じ」核酸配列は、本明細書では、２つの配列を（適切なヌクレオチドの挿入または欠失により）最適な形で整列させ、比較して２つの配列間のヌクレオチドの正確な一致を決定したときに、別の核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性を有する配列として定義される。
【０１５５】
抗体のフラグメントをコード化するＤＮＡの適切な供給源には、完全長抗体を発現するハイブリドーマや脾臓細胞などの細胞が含まれる。フラグメントは、抗体等価物としてそれ自体で使用されてもよいし、上記のように等価物に組み換えられてもよい。このセクションで説明するＤＮＡの欠失と組換えは、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（抗体の機能的等価物）というタイトルのセクションで上記に列挙された公開特許出願に記載されている方法などの既知の方法および／または下記に記載されているものなどの他の標準的な組換えＤＮＡ技術によって実行され得る。ＤＮＡの別の供給源は、当技術分野で知られているように、ファージディスプレイライブラリーから産生された単鎖抗体である。
【０１５６】
さらに、発現配列、プロモータおよびエンハンサー配列に機能し得るように結合された前述のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。限定されるわけではないが酵母および哺乳類細胞培養系を含む、細菌および真核生物系などの、原核生物における抗体ポリペプチドの効率的な合成のための様々な発現ベクターが開発されている。本発明のベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。
【０１５７】
任意の適切な発現ベクターを使用することができる。例えば、原核生物クローニングベクターには、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭ、およびＲＰ４などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドが含まれる。また、原核生物ベクターには、Ｍｌ３などのファージＤＮＡの誘導体や他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージも含まれる。酵母で有用なベクターの一例は、２μプラスミドである。哺乳類細胞での発現に適したベクターには、ＳＶ−４０のよく知られた誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス由来のＤＮＡ配列、上記のものなど、機能性哺乳類ベクターの組み合わせに由来するシャトルベクター、および機能性プラスミドおよびファージＤＮＡがある。
【０１５８】
追加の真核生物発現ベクターが当技術分野で知られている（例、Ｐ  Ｊ．ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ．Ｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ（ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス）、１：３２７−３４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー）、１：８５４−８６４（１９８１）；ＫａｕｆｉｎａｎｎおよびＳｈａｒｐ、“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ”（モジュラージヒドロ葉酸レダクターゼ相補的ＤＮＡ遺伝子でコトランスフェクトされた配列の増幅と発現）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー）、１５９：６０１−６２１（１９８２）；ＫａｕｆｈｉａｎｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー）、１５９：６０１−６６４（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ”（チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるヒト免疫インターフェロンＤＮＡ遺伝子の産物の発現と特性評価）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（米国科学アカデミー紀要）、８０：４６５４−４６５９（１９８３）；ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（米国科学アカデミー紀要）、７７：４２１６−４２２０、（１９８０）、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５９】
発現ベクターは、典型的には、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに機能し得るように結合されている少なくとも１つの発現制御配列を含む。クローン化されたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するために、制御配列がベクターに挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要なオペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖系プロモータ、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモータ、酵母酸性ホスファターゼのプロモータ、例えばＰｈｏ５、酵母アルファ接合因子のプロモータ、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およびサルウイルスに由来するプロモータ、例えば初期および後期プロモータまたはＳＶ４０、および原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列である。
【０１６０】
本明細書には、前述の発現ベクターを含む組換え宿主細胞も記載されている。本明細書に記載の融合タンパク質は、ハイブリドーマ以外の細胞株で発現させることができる。本発明のポリペプチドをコード化する配列を含む核酸は、適切な哺乳類宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【０１６１】
特に優先性の高い細胞株は、高レベルの発現、興味の対象であるタンパク質の構成的発現、および宿主タンパク質からの最小限の混入に基づいて選択される。発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当技術分野で周知であり、限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびその他多くの細胞など、多くの不死化細胞株を含む。適切なさらなる真核細胞には、酵母および他の真菌が含まれる。有用な原核生物宿主には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＧ−９３６、大腸菌ＨＢ  １０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｘ２２８２、大腸菌ＤＨＩ、および大腸菌ＭＲＣ１などの大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）がある。
【０１６２】
これらの本組換え宿主細胞は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養し、宿主細胞または宿主細胞を取り囲む培地からポリペプチドを精製することにより融合タンパク質を製造するために使用され得る。組換え宿主細胞における分泌のための発現されたポリペプチドのターゲティングは、興味の対象である抗体をコード化する遺伝子の５’末端にシグナルまたは分泌リーダーペプチドをコード化する配列を挿入することにより促進され得る（Ｓｈｏｋｒｉら、（２００３）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー）６０（６）：６５４−６６４、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（プロテイン・エンジニアリング）、１０：１−６（１９９７）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）、１４：４６８３−４６９０（１９８６）参照、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。これらの分泌リーダーペプチドエレメントは、原核生物配列または真核生物配列のいずれかに由来し得る。したがって好適には、宿主細胞の細胞質ゾルからのポリペプチドの移動および培地への分泌を指令するために、ポリペプチドのＮ末端に連結されたアミノ酸である分泌リーダーペプチドが使用される。
【０１６３】
本明細書に記載の融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基に融合させることができる。そのようなアミノ酸残基は、例えば、単離を促進するペプチドタグであり得る。特定の臓器または組織への抗体のホーミングのための他のアミノ酸残基も考えられる。
【０１６４】
ＨＣフェリチンとＬＣの同時トランスフェクションにより、Ｆａｂナノケージを生成できることは言うまでもない。別法として、図１Ｃに示すように、１つのプラスミドのトランスフェクションのみを必要とする単鎖Ｆａｂ−フェリチンナノケージを使用することができる。これは、ＬＣとＨＣとの間における異なる長さのリンカー、例えば６０または７０のアミノ酸で行うことができる。単鎖Ｆａｂを使用すると、重鎖と軽鎖が対になることが確保され得る。タグ（例：Ｆｌａｇ、ＨＡ、ｍｙｃ、Ｈｉｓ６ｘ、Ｓｔｒｅｐなど）も、上記の精製を容易にするために、構築物のＮ末端またはリンカー内に追加することができる。さらに、タグ系を使用することにより、異なるＦａｂ−ナノ粒子プラスミドを同時トランスフェクトしたときに、連続／追加的アフィニティクロマトグラフィー段階を使用して、同じナノ粒子上に多くの異なるＦａｂが存在することを確認できる。これにより、ナノ粒子に多重特異性が提供される。プロテアーゼ部位（ＴＥＶ、３Ｃなど）を挿入して、必要に応じて、発現および／または精製後にリンカーとタグを切断することができる。かかる構築物の一例は、抗ＨＩＶ広域中和性Ｆａｂ  １０Ｅ８についてのものである：
【化５】
2020534861.tif 000007
【０１６５】
別の実施態様では、本明細書に記載の融合タンパク質の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物、典型的には若齢、若年、または新生児哺乳動物に投与することにより対象にワクチン接種する方法が本明細書に記載されている。治療有効な、とは、問題の抗原に対する防御免疫応答を提供するなど、所望の治療効果を生み出すのに有効な量を意味する。
【０１６６】
本明細書に記載の融合タンパク質およびワクチンを投与するために、任意の適切な方法または経路を使用することができる。投与経路には、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が含まれる。
【０１６７】
本明細書に記載の融合タンパク質が、予防または処置の目的で哺乳動物で使用される場合、医薬的に許容し得る担体をさらに含む組成物の形態で投与されることは言うまでもない。適切な医薬的に許容し得る担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、およびそれらの組み合わせが含まれる。医薬的に許容し得る担体は、結合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を高める湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝液などの少量の補助物質をさらに含んでいてもよい。注射の組成物は、当技術分野で周知のように、哺乳動物への投与後に有効成分の迅速、持続的または遅延放出を実現するように製剤化され得る。
【０１６８】
ヒト抗体は、ヒトへの投与に特に有用であるが、他の哺乳類にも投与され得る。本明細書で使用される「哺乳動物（哺乳類）」という用語は、ヒト、実験動物、飼いならされたペットおよび農場の動物を含むことを意図しているが、これらに限定されない。
【０１６９】
また、本明細書に記載の融合タンパク質の治療的または予防的有効量を含むワクチン接種用キットも本明細書に含まれる。キットは、例えば任意の適切なアジュバントをさらに含むことができる。キットには説明書が含まれている場合がある。
【０１７０】
上記の開示は、本発明を全般的に説明している。以下の特定の例を参照すると、より完全な理解が得られる。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に指定がない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、決して以下の例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含するものと解釈されるべきである。
【０１７１】
以下の例には、ベクターおよびプラスミドの構築、かかるベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコード化する遺伝子の挿入、または宿主細胞へのプラスミドの導入に使用されるものなど、従来の方法の詳細な説明は含まれない。かかる方法は、当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを含む多数の刊行物に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
さらに説明しなくても、当業者であれば、前述の説明および以下の実例となる例を使用して、本発明の化合物を製造および利用し、特許請求の方法を実施できるはずであると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の典型的な実施態様を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りを限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７３】
例１：本発明のナノ粒子の構築物設計、クローニング、発現および精製
構築物設計およびクローニング
ヒトフェリチンＬ鎖のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０２７９２）を得、１２アミノ酸のＧＧＳ４ｘリンカーをＮ末端およびＣ末端に付加した。Ｎ末端リンカーの上流に、ＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩアフィニティタグを付加してアフィニティ精製を促進し、ＡｆｌＩＩ制限部位およびＸｂａＩ制限部位を付加して下流のクローニングを促進した。さらに、ＮｈｅＩ制限部位およびＫｐｎＩ制限部位をＣ末端リンカーに対し下流に付加した（図２Ａ）。同様に、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ルマジンシンターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９Ｘ２Ｅ５）のアミノ酸配列を得、Ｎ末端およびＣ末端のＧＧＳ４ｘリンカーを隣接させた。ＡｇｅＩ制限部位およびＮｈｅＩ制限部位をこの構築物のＮ末端に付加し、ＡｆｌＩＩ部位およびＸｂａＩ部位をＣ末端に付加した後、Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩを付加した（図２Ｂ）。両方の構築物を、ヒト発現のためにコドン最適化し、合成し、ｐＨＬｓｅｃ発現ベクターにクローニングした。エプラツズマブＦａｂの重鎖（エプラツズマブＨＣ）またはデニンツズマブＦａｂの重鎖（デニンツズマブＨＣ）を、フェリチン（図２Ａ）構築物およびルマジンシンターゼ（図２Ｂ）構築物のＮ末端に上記の制限部位を使用してクローニングした。さらに、ＮｈｅＩ制限部位およびＫｐｎＩ制限部位を使用して、ｅＧＦＰおよびｉＬＯＶをフェリチンのＣ末端にクローニングした。
【０１７４】
ナノ粒子の発現および精製
Ｆａｂ  ＨＣナノ粒子構築物、Ｆａｂ  ＬＣおよび非コンジュゲートナノ粒子（Ｆａｂは例としてデニンツズマブまたはエプラツズマブであり、ナノ粒子はフェリチン（図２Ａ）またはルマジンシンターゼ（図２Ｂ）である）を、一時的にＨＥＫ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞に１：１：１の比率で同時トランスフェクトした。細胞を２００  ｍＬの培養液に０．８  ｘ  １０６細胞ｍＬ−１で分割した。５０μｇのＤＮＡをろ過し、トランスフェクション試薬ＦｅｃｔｏＰＲＯ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）と１：１の比率で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ：ＦｅｃｔｏＰＲＯ溶液を細胞に直接添加し、細胞をＭｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）中３７℃、１８０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で６〜７日間インキュベートした。
【０１７５】
６，３７１ｘｇで２０分間の遠心分離により細胞を採取し、上清を保持し、０．２２μｍのＳｔｅｒｉｔｏｐフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してろ過した。上清をＳｔｒｅｐＴｒａｐアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に４ｍＬ／分で通過させた。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ９．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する前に、カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ９．０、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。溶出したナノ粒子を含む画分をプールし、濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ９．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中０．５ｍＬ／分でＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅサイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離して、サイズの均一性を達成した。フェリチン（図３Ａ）ナノ粒子およびルマジンシンターゼ（図３Ｂ）ナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂの純度を示すデータを、溶出プロファイル（上）およびウェスタンブロット（下）によって示す。
【０１７６】
同じプロトコルを使用して、フェリチン−ＧＦＰ／ｉＬＯＶ粒子を生産したが、例外として、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にフェリチン−ＧＦＰ／ｉＬＯＶ構築物のみをトランスフェクトした。
【０１７７】
例２：フェリチンナノ粒子およびルマジンシンターゼナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂのネガティブ染色電子顕微鏡法
本発明のフェリチン（図４Ａ）ナノ粒子およびルマジンシンターゼ（図４Ｂ）ナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂの電子顕微鏡写真の作成について説明する。精製されたナノ粒子を、２％ギ酸ウラニルで染色した。２０〜５０枚の画像からなるデータセットを、２００ｋＶで動作する電界放出ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０電子顕微鏡と３０ｅ−Å−２の電子線照射により手動で収集した。Ｏｒｉｕｓ電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｇａｔａｎ  Ｉｎｃ．）を使用して画像を３４，４８３×の較正倍率で取得し、その結果、標本でのピクセルサイズは２．６１Åになり、約０．７５〜２μｍのデフォーカス範囲が使用された。ＥＭＡＮ２を使用して、合計約１，０００枚の粒子画像を手動で選択した。粒子画像の２Ｄ分類は、５０クラスが許可されて実行された。
【０１７８】
例３：フェリチンナノ粒子およびルマジンシンターゼナノ粒子を発現する抗体Ｆａｂの結合親和性
エプラツズマブＦａｂ（図５Ａ）、エプラツズマブ−フェリチン（図５Ｂ）およびエプラツズマブ−ルマジンシンターゼ（図５Ｃ）のＣＤ２２への結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６  ＢＬＩシステム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定した。Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーを１ｘカイネティクスバッファー（１Ｘ  ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、０．００２％Ｔｗｅｅｎ、０．０１％ＢＳＡ）で水和し、２５ｎｇ／μＬのＣＤ２２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２０２７３）を１，０００ｒｐｍで３００秒間ロードした。次に、バイオセンサーを、１ｘカイネティクスバッファーを含むウェルに６０秒間ベースラインまで移入した後、Ｆａｂ／ナノ粒子の連続希釈液を含むウェルに移した。その後、１８０秒会合段階の後に、１ｘカイネティクス中における１８０秒解離段階が続いた。分析は、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて１：１の適合モデルで実行された。
【０１７９】
例４：Ｆａｂナノ粒子を発現する抗体の受容体介在エンドサイトーシス
抗体−フェリチン（図６Ａおよび６Ｂ）またはフェリチン単独（図６Ｃ）のナノ粒子（０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍＬ）を、１時間Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７（４ｍｇ／ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により１０：１ｖ／ｖの比率で標識した。次に、ナノ粒子を２Ｌの１ｘ  ＰＢＳで８時間透析し、透析緩衝液を３回交換した。５μｇ／ｍＬの透析標識ナノ粒子を使用して、５分間、１０分間または３０分間、ヒトＢｊａｂ細胞（１ｘ１０６細胞／ｍＬ）を処理した。所望のインターナリゼーション時間の後、細胞を３回洗浄し、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩチャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に分注した。６３ｘ油浸対物レンズとＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を装備したＷａｖｅＦＸ−ＸＩ回転ディスク共焦点顕微鏡（Ｑｕｏｒｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して画像を捉えた。細胞の中心面の画像を取得し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して画像を処理および解析した。
【０１８０】
例５。蛍光タンパク質の内部コンジュゲーションにより、ナノ粒子を蛍光性にすることができる
クローニング、発現、精製およびＥＭは上記と同様である。さらに、ＮｈｅＩ制限部位およびＫｐｎＩ制限部位を使用して、ｅＧＦＰおよびｉＬＯＶをフェリチンのＣ末端にクローニングした。フェリチン−ＧＦＰ／ｉＬＯＶ粒子の生成に関しては、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にフェリチン−ＧＦＰ／ｉＬＯＶ構築物のみをトランスフェクトしたことを除き、プロトコルは上記と同様である。染色は、例２で上述した要領で行われた。フェリチン−ＧＦＰ／ｉＬＯＶナノ粒子の蛍光を、３６５ｎｍの波長でトランスイルミネータにより測定した（図７）。
【０１８１】
例６：ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−リンカー−１２１０融合タンパク質の発現および精製
融合タンパク質を以下の要領で構築および精製した。まず初めに、５．５ｘ  ＣＳＰ  ＮＰＮＡリピートと、それに続く８、１０、または１２残基のフレキシブルＧＧＳリンカーを、ｐｃＤＮＡ３．４  ＴＯＰＯ発現ベクターにおける１２１０−ＨＣ−Ｆａｂ配列のＮ末端にクローニングした。ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−８ｘ−１２１０  Ｆａｂ（図１０Ａ）、ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−１０ｘ−１２１０  Ｆａｂ（図１０Ｂ）およびＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−１２ｘ−１２１０  Ｆａｂ（図１０Ｃ）を、ＦｅｃｔｏＰＲＯ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）トランスフェクション試薬を使用し、ｐｃＤＮＡ３．４  ＴＯＰＯ発現ベクターでの１２１０−ＬＣ遺伝子（図１０Ｄ）による同時トランスフェクションによりＨＥＫ２９３Ｆ細胞において一時的に発現させることにより製造した。精製は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により行われた。Ｆａｂを、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、図１１および図１２参照）。
【０１８２】
例７：融合タンパク質はＣＳＰに結合しないが、野生型抗体によって認識および結合される
ＣＳＰへの結合の測定を、次の要領で実施した。ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−リンカー−１２１０  ＦａｂがＣＳＰを認識できるかどうか、またはＣＳＰ結合部位がＮＰＮＡ５．５によって閉塞されているかどうかを判断するために、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）実験を実施した（図１３）。組換えＣＳＰをカイネティクスバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．００２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＮＴＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。カイネティクスバッファーにリガンドをロードして安定したベースラインを確立した後、バイオセンサーを、１２１０  Ｆａｂ、ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−８ｘ−１２１０  Ｆａｂ、ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−１０ｘ−１２１０  Ｆａｂ、およびＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−１２ｘ−１２１０  Ｆａｂを含むウェルに浸漬した。その後、解離速度をモニターするために、カイネティクスバッファーにチップを浸漬した。
【０１８３】
融合タンパク質に対する野生型抗体の結合親和性の測定を、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を使用して以下の要領で実施した。熱量測定滴定実験は、Ａｕｔｏ−ｉＴＣ２００  ＭｉｃｒｏＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＭｉｃｒｏＣａｌ）を使用して２５℃で行った。タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ８．０に対して４℃で一晩透析した。熱量測定セル内のＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−８ｘ−１２１０  Ｆａｂ、ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−１０ｘ−１２１０  ＦａｂおよびＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−１２ｘ−１２１０  Ｆａｂ（１０μＭ）を、２．５μｌの１５回の連続注入で１２１０  Ｆａｂ（９２μＭ）により滴定した。Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０の１：１結合モデルに従って実験データを分析し、図１４〜図１６に示した。
【０１８４】
例８：サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
抗体−融合タンパク質相互作用の絶対質量の測定を、以下の要領で実施した。ＩＴＣから回収された１２１０  Ｆａｂ／ＣＳＰ−ＮＰＮＡ５．５−リンカー−１２１０  Ｆａｂ共複合体を、次の較正済検出システム：（ｉ）ＭｉｎｉＤａｗｎ  Ｔｒｅｏｓ  ＭＡＬＳ検出器（Ｗｙａｔｔ）；（ｉｉ）準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ）；および（ｉｉｉ）Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒｅＸ屈折率（ＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ）を備えたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にインラインで結合されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。データ処理を、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ）を使用して実行し、図１８Ａに示す。
【０１８５】
例９。抗体発現Ｆａｂナノ粒子は、抗原と共提示されるとＢ細胞の活性化を促進する
ＢＧ５０５  Ｅｎｖ  ＳＯＳＩＰ三量体を、ＡｇｅＩ制限部位およびＸｂａＩ制限部位を使用してフェリチンのＮ末端にクローニングした。ｅＯＤ−ＧＴ６のアミノ酸配列を得、ルマジンシンターゼのＣ末端に付加し、ＧＧＳ４ｘリンカーとＮｈｅＩ制限部位により分離させた。Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩを構築物のＣ末端に付加して、アフィニティ精製を促進した。構築物全体を哺乳類発現用にコドン最適化し、合成し、制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩを使用してｐＨＬｓｅｃ発現ベクターにクローニングした（図１９）。Ｆａｂ  ＨＣナノ粒子、Ｆａｂ  ＬＣおよび抗原ナノ粒子（Ｆａｂはデニンツズマブであり、抗原はＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰまたはｅＯＤＧＴ６であり、ナノ粒子はフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれかである）を、上記前例で説明した要領で、一時的にＨＥＫ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に同時トランスフェクトし、上記と同じプロトコルを使用して精製したが、ただしＢＧ５０５含有ナノ粒子も、５００ｍＭ塩化ナトリウム洗浄と１  Ｍα−メチルマンノシド溶出を使用してスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  Ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン（ＧＮＬ）アガロース親和性によって精製した。ネガティブ染色電子顕微鏡法は、前の例での説明と同様であった。バイオレイヤー干渉法は、前の例での説明と同様であり、ＣＤ１９ｍＶｅｎｕｓおよびＶＲＣ０１  Ｆａｂを、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーおよび抗ヒトＦａｂバイオセンサーにコーティングされたリガンドとして使用して、デニンツズマブナノ粒子およびＢＧ５０５／ｅＯＤＧＴ６−ナノ粒子への結合をそれぞれ検出した。カルシウムフラックスアッセイ（図２３）については、Ｂｊａｂ細胞（１ｘ１０６細胞）を、ＨＢＳＳ中で１μＭのＦｌｕｏ−４染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。細胞を５ｍＬの１Ｘ  ＰＢＳで２回洗浄し、氷上で５００μｌのＲＰＭＩに再懸濁した。取得前に、細胞を３７℃浴中で５分間温め、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓ  Ｃｅｌｌ  ＡｎａｌｙｚｅｒのＦＩＴＣチャネルで３０秒間高値で取得し、ベースラインを確立した。次に、示された量のナノ粒子を細胞に加えて素早く混合し、その後データを５〜１０分間、またはシグナルがベースラインに戻るまで取得した。ＦｌｏｗＪｏでデータを分析して平均強度を確立し、それを経時的にプロットした。
【０１８６】
例１０：単鎖Ｆｃナノ粒子の設計
単鎖Ｆｃナノ粒子を、次の配列を使用して設計した。配列中、太字はＦｃドメインを示し、通常のフォントはリンカーを示し、下線はフェリチンを示す：
【化６】
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【０１８７】
プロテインＡカラムに結合する能力によって示されるように、抗体のＦｃドメインは正しく折りたたまれている。図２４に示すように、低ｐＨまたは３  Ｍ  ＭｇＣｌ２により溶出することができる。サイズ排除クロマトグラフィーでの単分散ピークが示すように、単鎖Ｆｃナノ粒子は正しく組み立てられている。
【０１８８】
例４：抗同型親和性成熟により、反復エピトープに対するヒトＢ細胞応答は改善される
概要
親和性成熟により、病原体の侵入から保護するために、抗原結合特性が改善された体細胞変異抗体バリアントを発現するＢ細胞が選択される。本発明者らは、マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）に対する防御抗体を発現するヒトＢ細胞のクローン選択と親和性成熟の根底にある分子メカニズムを究明した。ＰｆＣＳＰの反復性により、２つのＰｆＣＳＰリピート結合モノクローナル抗体間の直接的な同型相互作用が促進され、それによって抗原親和性とＢ細胞活性化が改善されることを分子詳細で示す。これらのデータは、ヒトにおいて寄生虫曝露を繰り返した後、同型抗体の相互作用を伝達する体細胞変異の強力な選択についての機構的な説明を提供する。本発明者らの発見は、ＰｆＣＳＰおよびおそらくは他の反復抗原に対する抗体応答を改善するための抗原介在親和性成熟の異なる方式を示している。
【０１８９】
材料および方法
ジェノタイピング
この研究は、テュービンゲン（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ）大学の医学部および大学クリニックの倫理委員会によって承認され、医薬品の臨床試験の実施の基準およびヘルシンキ宣言の原則を厳守した。試料を入手した臨床試験は、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２１１５５１６およびＥｕｄｒａＣＴデータベースの番号２０１３−００３９００−３８の下で登録され、ＦＤＡ  ＩＮＤ  １５８６２の下、Ｐａｕｌ−Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ポール・エールリッヒ研究所）の承認を受けて実施された（８、９）。ゲノムＤＮＡを全血から抽出した。ＩＧＨＶ３遺伝子ファミリーセグメントを、バーコードプライマーを使用して増幅させた。アンプリコンをプールし、ＴｒｕＳｅｑ  ＰＣＲフリーライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定用に調製した。３００〜３００  ｂｐのペアエンドプロトコルを使用して、ＭｉＳｅｑシーケンサーで配列決定を実行した。配列決定リードを、ＰａｎｄａＳｅｑ（２４）を使用して組み立て、バーコード識別によりドナーに割り当てた。
【０１９０】
部位特異的変異導入
抗体コード化プラスミドでの部位特異的変異導入を、Ｑ５部位特異的変異導入キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。
【０１９１】
抗体およびＦａｂの製造
ＩｇＧ産生については、ＩＧＨ可変領域およびＩＧＫ可変領域を、以前に説明したように、それぞれヒトＩＧＫ定常領域およびＩＧＧ１定常領域の上流の発現ベクターにクローニングした（２５）。組換えモノクローナル抗体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発現させ、プロテインＧセファロース（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製抗体の抗体濃度を前述のようにＥＬＩＳＡで測定した（９、１０）。ＦａｂをＩｇＧのパパイン消化により生成し、プロテインＡクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＩＴＣ研究では、ＩＧＨ可変領域およびＩＧＫ可変領域を、それぞれヒトＩＧＫ定常領域およびＣＨ１定常領域のすぐ上流にあるｐｃＤＮＡ３．４  ＴＯＰＯ発現ベクターにクローニングした。Ｆａｂを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一時的に発現させ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
【０１９２】
抗原製造
ＥＬＩＳＡを、以前に記載されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＮ末端が切断された形でＮＡＮＰ５（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＮＡＮＰ３（ＰＳＬ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）またはＰｆＣＳＰに対して実施した（１０、２６）。ＢＬＩ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ、および単一粒子ネガティブ染色ＥＭについては、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞での一時的発現のために、完全長ＰｆＣＳＰ（ＮＦ５４株）をｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯにクローニングした。ＰｆＣＳＰを、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉ／ＮＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
【０１９３】
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴測定を、シリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にドッキングされたＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行した。ｐＨ  ７．４の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ミリモルのＨＥＰＥＳを、記載されているように（９）ランニングバッファーとして使用した。アミンカップリングベースのヒト抗体捕捉キットを使用して、抗ヒトＩｇＧ抗体をチップに固定した。等しい濃度のサンプル抗体とアイソタイプ対照が、それぞれサンプルフローセルとリファレンスフローセルで捕捉された。フローセルを安定させるために、ランニングバッファーを１０μＬ／分の速度で２０分間注入した。ランニングバッファー中の０．０１５μＭ、０．０９μＭ、０．５５μＭ、３．３μＭ、および２０μＭのＮＡＮＰ３を３０μＬ／分の速度で注入した。フローセルを３  Ｍ  ＭｇＣｌ２で再生させた。データを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００ソフトウェアＶ２．０を使用した定常状態速度論解析により適合させた。
【０１９４】
結晶化と構造決定
精製１２１０  ＦａｂおよびキメラＨ．２１４０／Ｋ．１２１０  Ｆａｂを、１２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化試験前に１：５モル比でＮＡＮＰ５（１０ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＮＰ３（１０ｍｇ／ｍＬ）によりそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。精製１４５０  ＦａｂとＮＡＮＰ５を３：１のモル比で混合し、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により過剰の１４５０  Ｆａｂを除いて精製した。次いで、精製１４５０−ＮＡＮＰ５を、結晶化試験の前に６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１２１０−ＮＡＮＰ５共結晶は２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ３３５０および０．２  Ｍクエン酸ナトリウム中で成長し、１５％（ｗ／ｖ）エチレングリコールで凍結保護された。ＮＡＮＰ３と複合体を形成したキメラＨ．２１４０／Ｋ．１２１０  Ｆａｂの共結晶は、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．６  Ｍ塩化ナトリウム、および０．１  Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ  ６．５中で成長し、１５％（ｗ／ｖ）グリセロールで凍結保護された。１４５０−ＮＡＮＰ５共結晶は、２２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ３３５０および０．２  Ｍクエン酸水素二アンモニウム中で成長し、１５％（ｗ／ｖ）エチレングリコールで凍結保護された。データを、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＣＬＳ）の０８ＩＤ−１ビームラインまたはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）の２３−ＩＤビームラインで収集し、ＸＤＳを使用して処理およびスケーリングした（２７）。Ｐｈａｓｅｒを使用した分子置換によって、構造を決定した（２８）。ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（２９）を使用して構造の精密化を行い、Ｃｏｏｔ（３０）を使用して精密化の反復を行った。ソフトウェアはＳＢＧｒｉｄを介してアクセスされた（３１）。
【０１９５】
等温滴定熱量測定
熱量測定滴定実験を、Ａｕｔｏ−ｉＴＣ２００機器（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して２５℃で行った。タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０および１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して４℃で一晩透析した。ＮＡＮＰ５ペプチドおよびＮＡＮＰ３ペプチドを透析緩衝液で２〜３μＭに希釈し、熱量測定セルに加え、２．５μｌの１５回の連続注入で１２１０、１２１０＿ＧＬ、１２１０  Ｈ．Ｄ１００Ｙｍｕｔ＿Ｋ．Ｎ９２Ｙｍｕｔ（１２１０＿ＹＹ）Ｆａｂ、および１２１０＿Ｈ．Ｋ５６＿Ｎｒｅｖ＿Ｋ．Ｎ９３＿Ｓｒｅｖ（１２１０＿ＮＳ）Ｆａｂ（１００μＭ）により滴定した。実験を少なくとも３回実施し、平均値と平均値の標準誤差を記録した（図３０）。Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０を使用して、１：１結合モデルに従って実験データを分析した。Ｐｒｉｓｍでの片側マン・ホイットニー検定を使用して、統計解析を実行した。
【０１９６】
バイオレイヤー干渉結合試験
ＢＬＩ（Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）実験を実施して、完全長ＰｆＣＳＰに対する１２１０および１２１０＿ＹＹ  ＩｇＧの結合力を測定した。完全長ＰｆＣＳＰをカイネティクスバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、および０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｎｉ／ＮＴＡ（ＮＴＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。カイネティクスバッファーにリガンドをロードして安定したベースラインを確立した後、ＩｇＧの２倍希釈系列を含むウェルにバイオセンサーを浸漬した。その後、解離速度をモニターするために、カイネティクスバッファーにチップを浸漬した。ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ分析ソフトウェア９．０を使用して速度論データを分析し、曲線を１：１結合モデルに適合させた。
【０１９７】
サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ）
ＮＡＮＰ５ペプチドと３倍モル過剰の１２１０  Ｆａｂとで複合体を形成させ、次の較正済検出システム：（ｉ）ＭｉｎｉＤａｗｎ  Ｔｒｅｏｓ  ＭＡＬＳ検出器（Ｗｙａｔｔ）；（ｉｉ）準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ）；および（ｉｉｉ）Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒｅＸ屈折率（ＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ）を備えたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にインラインで結合されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。３３０マイクログラムの完全長ＰｆＣＳＰを、上記検出システムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＨＰＬＣとインラインで結合されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。完全長ＰｆＣＳＰ（５μＭ）と２０倍モル過剰の１２１０  Ｆａｂ（１００μＭ）とで複合体を形成させ、１００μＬまたは４００μＬを、上記の検出システムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＨＰＬＣとインラインで結合されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ）を使用して、データ処理を実行した。
【０１９８】
ネガティブ染色透過電子顕微鏡
４００メッシュのＣｕグリッドをコロイドン（ｃｏｌｌｏｉｄｏｎ）でコーティングし、炭素の薄い連続層をグリッド上に蒸着させた。カーボングリッドを、標準プロトコルに従ってグロー放電させた。完全長ＰｆＣＳＰと複合体を形成した１２１０  Ｆａｂの３μＬの液滴を、グロー放電カーボングリッドに塗布した。２０秒後、グリッドをブロットし、３μＬの１％（ｗ／ｖ）ギ酸ウラニル溶液を、中間でブロットして、５秒間と最終１８秒間の２ロットについて３回加えた。２００  ｋＶで稼働するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  ２０でデータを収集した。デフォーカス値が１〜３μｍである１２０枚の画像が収集された。最初に、Ｒｅｌｉｏｎ  ２．０（３２）で合計１０８０枚の粒子画像を手動で選択し、１０のクラスを許可して粒子画像の２Ｄ分類を実行した。それに続いて、９４７枚の粒子画像を含む最高の６つの２Ｄクラスを使用して、１２０枚の顕微鏡写真から１３，１４６枚の粒子画像を自動選択し、５０クラスを許可して２Ｄ分類を実行した。
【０１９９】
ＴＫＯ−ＥＳＴ細胞のレトロウイルス形質導入
内因性ＢＣＲ発現を欠いている、トリプルＲａｇ２、λ５、およびＳＬＰ−６５  ＴＫＯ−ＥＳＴ欠損マウスのプレＢ細胞を、レトロウイルス形質導入によりＩｇ重鎖および軽鎖の遺伝子で再構成した（３３）。ウイルス粒子の生成のために、完全なＩＧＨＭおよびＩＧＫ可変領域をコード化する構築物を、ｐＭＩＺＣＣおよびｐＭＩＺＹＮベクターバックボーンにクローニングした（３４）。１ウェルあたり１．８  ｘ  １０５のＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏウイルスパッケージング細胞を、完全イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、０．５ｍＬβ−メルカプトエタノール、およびペニシリン／ストレプトマイシン含有）中の６ウェル培養プレートに播種した。２４時間後、３μｌのＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を使用して１００μｌの純ＩＭＤＭ中、０．５μｇの重鎖および０．５μｇの軽鎖プラスミドを細胞にトランスフェクトし、３７℃および８％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。上清を採取し、０．４５μｍフィルターを使用してウイルス粒子を精製した。１μｌ／ｍＬのポリブレンをウイルス粒子懸濁液に加えた。並行して、２  ｘ  １０５ＴＫＯ−ＥＳＴ細胞を１．５  ｍＬチューブに移し入れ、遠心分離した（３６６ｘｇ、４℃、５分）。上清を捨て、細胞ペレットを８００μｌのウイルス粒子懸濁液に再懸濁した。ＴＫＯ−ＥＳＴ細胞に対し、３６６ｘｇおよび３７℃でスピン形質導入を行った。３時間後、培地を、ＩＬ−７を補充した新鮮な完全なＩＭＤＭと交換し、細胞を６ウェルプレートに播種した。
【０２００】
Ｃａ２＋フラックス測定
Ｃａ２＋ｆｌｕｘを（３３）に記載されているように測定した。ウイルス形質導入後、１×１０６ＴＫＯ−ＥＳＴ細胞にカルシウム感受性染料Ｉｎｄｏ−１  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を３７℃で４５分間ロードした。Ｉｎｄｏ−１染色溶液を、２５μｌのＩｎｄｏ−１ストック溶液（２５μｌのＤＭＳＯで５０μｇのＩｎｄｏ−１を希釈して調製）と２５μｌのプルロン酸Ｆ−１２７および１１３μｌのＦＣＳを混合することにより調製し、インキュベートした。（５分、暗所、ＲＴ）。Ｉｎｄｏロード細胞を５ｍＬの１％ＦＣＳ  ＩＭＤＭで洗浄し、５００μｌの１％ＦＣＳ  ＩＭＤＭに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブに移した。各試料を、測定前にホットプレート上３７℃で１０分間個別に予熱した。Ｃａ  ２＋フラックスのベースラインをＬＳＲサイトメータで３０秒間記録した後、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ、最終濃度：２μＭ）を含む抗原溶液５μｌを添加し、抗原に応答したＣａ  ２＋フラックスを６分間記録した。異なる細胞株における表面Ｉｇ発現は、抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＫの蛍光標識抗体の結合によりＦＡＣＳで測定したとき同低度であった。４−ＯＨＴおよびα−Ｉｇκ抗体（１μｇ／ｍＬ）で刺激すると、すべての細胞株の同等の機能が確認された。
【０２０１】
Ｐｆ横断アッセイ
Ｐｆ横断アッセイを、記載されているように（９、１０）９６ウェルプレート形式で実行した。簡単に述べると、雌のアノフェレス・コルッツィ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｃｏｌｕｚｚｉｉ）の蚊の唾液腺から得られた７５，０００  Ｐｆのスポロゾイトを、異なる濃度のモノクローナル抗体と３０分間プレインキュベートした後、０．５ｍｇ／ｍＬデキストラン／ローダミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の存在下でＨＣ−０４ヒト肝細胞とインキュベートした。未処理のスポロゾイトとデキストラン／ローダミンのみをそれぞれ陽性対照として使用し、実験のバックグラウンドシグナルを決定した。１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した後、デキストラン陽性（すなわち、横断した細胞）のパーセンテージをＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータを使用して測定した。バックグラウンドシグナルを、すべての測定値から差し引いた。横断阻害を、未処理のスポロゾイトで観察された横断速度に基づいて測定した。各抗体についてのデータを、少なくとも３つの独立した実験からプールし、３パラメトリックＨｉｌｌ関数を使用して滴定曲線を適合させた。
【０２０２】
マウスへの免疫付与と感染
すべての動物実験は、ドイツのベルリンにあるＬＡＧｅＳｏ（Ｈ００２７／１２）によって承認された。免疫付与と感染を、以前に説明されているように実行した（９、１０）。簡単に述べると、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（１群あたり５匹）に対し、１００μｌのＰＢＳ中の１００μｇまたは３０μｇのモノクローナルヒト抗ＰｆＣＳＰ抗体またはアイソタイプ対照（ｍＧＯ５３（３５））による腹腔内での受動免疫を行った。受動免疫の２４時間後、マウスに対し、５，０００のＰｆＣＳＰトランスジェニックネズミマラリア原虫（プラスモジウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ））（Ｐｂ‐ＰｆＣＳＰ）（１０）スポロゾイトを尾根に皮下注射して感染させた。感染後３日目から１２日目まで、ギムザ染色された血液塗抹標本を毎日分析した。寄生虫陽性であると公表するために、少なくとも１００個の顕微鏡視野をカウントした。
【０２０３】
結果および考察
ヒトマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｆ）のスポロゾイトは、免疫優性中央ＮＡＮＰリピート領域を伴う表面タンパク質のスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）を発現する（１〜３）。動物モデルがＰｆ感染から防御される場合、該リピートに対する抗体が介在することがあり得る（４〜６）。しかしながら、抗ＮＡＮＰ抗体介在による防御は、ワクチン接種では容易に達成されない。したがって、防御的ＰｆＣＳＰ  ＮＡＮＰ抗体の誘導は、前赤血球ワクチン開発の主要な目標である（７）。本発明者らは、最近、クロロキンによる予防下における生きたＰｆスポロゾイトへの繰り返し曝露後のＰｆナイーブボランティアにおける抗ＮＡＮＰ  ＰｆＣＳＰメモリーＢ細胞応答が、８−アミノ酸（ａａ）長の免疫グロブリン（Ｉｇ）κ相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＫＣＤＲ３：８）を有する強力なＰｆ抑制性のＩＧＨＶ３−３３およびＩＧＫＶ１−５コード化生殖細胞系抗体のクローン選択および拡大によって主に成熟することを示した（８、９）。
【０２０４】
ここでは本発明者らは、ＮＡＮＰ五量体ペプチド（ＮＡＮＰ５）に対して１０−６〜１０−９Ｍの親和性が報告されている５つの代表的な生殖細胞系または低変異抗体を分析した（図２５Ａおよび表１）（９）。元のＩｇＶκ１−５がＶκ２−２８で置き換えられたとき、または天然Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）が９アミノ酸長ＫＣＤＲ３を伴うＶκ１−５軽鎖と対合したとき、抗原結合は抑止されることから（図２５Ｂ）、抗原認識におけるこれらの特異的なＩｇ遺伝子の特徴の重要性が実証された。
【表１】
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【０２０５】
すべてのＶＨ３−３３／Ｖｋ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗体は、ＩＧＨＶ３−３３＊０１対立遺伝子によってコード化された（９）。ＩＧＨＶ３−３３＊０１は、セリンやアルギニンではなくトリプトファンを厳密にコード化するＩｇＨ  ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）２の５２位が、他の点で非常に類似した３つの遺伝子セグメント（ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３０−３、およびＩＧＨＶ３−３０−５）とは異なる（表２および表３）。抗体２１４０におけるＨ．Ｗ５２＿Ａ変異体、およびＩＧＨＶ３−３０＊０２およびＩＧＨＶ３−３０−５＊０２対立遺伝子を模倣する二重変異体（Ｈ．Ｗ５２＿Ｒ、Ｈ．Ｖ５０＿Ｆ）を含む、選択された抗体のＨ．Ｗ５２＿ＳおよびＨ．Ｗ５２＿Ｒ変異体はすべて、インビトロ寄生虫阻害活性の低下に関連するＰｆＣＳＰ反復反応性の低下を示した（図２５、ＣおよびＤ）。
【表２】
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【表３】
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【０２０６】
ＮＡＮＰ反応性ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８  Ｂ細胞の大部分は、ＨＣＤＲ１（Ｈ．Ｓ３１）およびＨＣＤＲ２（Ｈ．Ｖ５０、Ｈ．Ｎ５６）、ならびにＫＣＤＲ３（Ｋ．Ｓ９３）での置換変異を強力に選択したクローン拡大および体細胞超変異（ＳＨＭ）多様化細胞クラスターに属しており、これはおそらく親和性成熟の結果であると考えられた（図２５、ＥおよびＦ）（９）。生殖細胞系抗体２１６３および低変異抗体１２１０について示されているように、Ｈ．Ｖ５０位およびより少ない程度ではあるがＨ．Ｓ３１位での欠損突然変異（ｍｕｔ）または復帰（ｒｅｖ）の導入により、最小ＮＡＮＰ３ペプチド（１０、１１）への結合におけるある役割が明らかになった（図２５、ＧおよびＨ、および表４）。対照的に、Ｈ．Ｎ５６位およびＫ．Ｓ９３位での交換は、単独（１２１０＿Ｈ．Ｋ５６＿Ｎｒｅｖ、１２１０＿Ｋ．Ｎ９３＿Ｓｒｅｖ、２１６３＿Ｈ．Ｎ５６＿Ｋｍｕｔ）でも、組み合わせ（１２１０＿ＮＳ、２１６３＿ＫＮ）の場合でも、有意な効果を示さなかった（図２５、ＧおよびＨ、および表４）。したがって、リピートへの親和性成熟により、ＶＨ３−３３／ＶＫ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗ＮＡＮＰ抗体の４つの特徴的な置換変異のうち２つだけの強い選択が説明された。
【表４】
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【０２０７】
次に、本発明者らは、ＮＡＮＰ５との１２１０抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）の共結晶構造を決定した（図２６、図２７Ａ、および表５〜７）。ＮＡＮＰコアエピトープは、ＩｇＨ  ２１４０／Ｉｇκ１２１０キメラ抗体に結合されたＮＡＮＰに類似した、以前の観察結果と一致する、タイプＩβターンと伸長立体配座（図２６、ＡおよびＣ、図２７Ｂ）を含んでいた（図２７Ｃおよび表５および８）（１０−１４）。ＫＣＤＲ３における主鎖原子は、該リピートとのＨ結合に介在するように最適な形で配置されており、８アミノ酸長のＫＣＤＲ３の強力な選択の一因であると考えられる（図２６、ＢおよびＣ、表３、６、および１１）。ＶＨ３−３３生殖細胞系残基は、抗原接触の大部分、特にＨ．Ｖ５０およびＨ．Ｗ５２（ＩＧＨＶ３−３３対立遺伝子によってユニーク形式でコード化される残基）、ならびにＨＣＤＲ２のＨ．Ｙ５２ＡおよびＨ．Ｙ５８に介在していた（表６および図２８）（１５）。Ｈ．Ｖ５０およびＨ．Ｓ３１での親和性成熟は、該リピートとのファンデルワールス相互作用の強化によって説明され得る（図２６Ｃ）。
【表５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表７】
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【表８】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表１０】
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【表１１】
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【０２０８】
特に、本発明者らの結晶構造はまた、２つの１２１０  Ｆａｂ（１２１０  Ｆａｂ−ＡおよびＦａｂ−Ｂと呼ばれる）が１３３°の角度での頭−頭立体配置で１つのＮＡＮＰ５ペプチドに結合することも明らかにした（図２６Ｄおよび図２９）。この独特な結合モードにより、２つのＦａｂ間で２６３Å２の埋没表面積（ＢＳＡ）が得られ、Ｆａｂとリピート間でさらに約１２０Å２のＢＳＡが得られる６つの同型抗体−抗体Ｈ結合が生じた（図２６、ＥおよびＦ、および表６、７、および１１）。２つの高度に選択された変異、Ｈ．Ｎ５６＿ＫおよびＫ．Ｓ９３＿Ｎ（図２５、ＥおよびＦ）は、反対側のＦａｂでＨ．Ｙ５２ＡおよびＨ．Ｓ９９とＨ結合を形成し、それによって頭−頭立体配置を安定化した（図２６、ＧおよびＨ）。８アミノ酸長のＫＣＤＲ３が反対側の１２１０分子のＨＣＤＲ３と最適な形で接触していることから、ＫＣＤＲ３の長さ制限についての別の説明が提供された。
【０２０９】
同型相互作用を調べるため、次に本発明者らは、１２１０、１２１０＿ＮＳ（同型結合に関与する選択された変異を欠く）、１２１０  Ｈ．Ｄ１００＿Ｙｍｕｔ／Ｋ．Ｎ９２＿Ｙｍｕｔｍｕｔａｎｔ（１２１０＿ＹＹ、立体的な衝突により頭−頭結合を破壊するように設計された）、および１２１０生殖細胞系列（１２１０＿ＧＬ）についてＮＡＮＰ５およびＮＡＮＰ３へのＦａｂ親和性を測定した（図２６Ｉおよび図３０）。１２１０と比較して、１２１０＿ＹＹおよび１２１０＿ＮＳは、ＮＡＮＰ３に対してではなくＮＡＮＰ５に対する親和性が有意に弱いが、１２１０＿ＧＬの場合両方のペプチドの結合が著しく悪化していた（図２６Ｉおよび図３０）（１６）。これらのデータは、１２１０のみが高親和性の同型の頭−頭結合立体配置で該リピートを効率的に認識したことを示唆している。３８のＮＡＮＰリピートを有する完全長ＰｆＣＳＰの分析により、この仮説が確認された。約１２個の１２１０  ＦａｂがＰｆＣＳＰに結合し、１２１０  Ｆａｂ−ＮＡＮＰ５結晶構造に類似した頭−頭結合立体配置でＮＡＮＰリピートを認識した（図２６、ＪおよびＫ、および図２９Ｄ）（１１、１７）。さらに、同型抗体相互作用に関与する能力が制限されている１２１０＿ＹＹは、１２１０よりも完全長ＰｆＣＳＰへの結合親和性が低いことを示した（図３１）。したがって、親和性成熟により、同型の抗体相互作用を改善する変異が選択され、それにより間接的にＰｆＣＳＰのＮＡＮＰ結合が増加する。
【０２１０】
細胞レベルでのＳＨＭの選択をよりよく理解するために、本発明者らは、１２１０またはバリアントＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するトランスジェニックＢ細胞株のＮＡＮＰ５に応答したＢ細胞活性化の程度を測定した（図３２、Ａ〜Ｄ）。ＢＣＲシグナル伝達は、１２１０と比較して１２１０＿ＧＬを発現する細胞では遅れていた。この効果は、１２１０＿ＹＹ変異細胞でさらに顕著であった。予想どおり、特に低い抗原濃度では、高いリピート親和性を有する１２１０＿Ｖ５０Ｉｍｕｔは１２１０よりも強いシグナルを伝達したが、１２１０＿ＮＳは有意差を示さなかった（図３２Ｄ）。したがって、直接的なＮＡＮＰ結合と同型抗体相互作用の両方によって、Ｂ細胞の活性化が促進される。ＮＡＮＰ３親和性の２ｌｏｇ差異（図２５、ＧおよびＨ）およびこれらの抗体が同型相互作用に関与する様々な可能性にもかかわらず、すべてがインビトロでＰｆスポロゾイトを阻害する同様の能力を示した（図３２Ｅおよび図３３）。同様に、すべての抗体は、おそらく強力な結合力効果により、マウスでの受動免疫後の血液段階の寄生虫の発生から同様のレベルの用量依存的防御を付与した（図３２Ｆ）。これらのデータにより、可溶性抗体としての防御効果とは関係無く、親和性成熟による抗同型抗体変異体の強力なインビボ選択の機構的説明が得られる。
【０２１１】
ＶＨ３抗体は、抗ＰｆＣＳＰメモリー応答に多大な影響を及ぼす（９、１１、１４）。ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８に加えて、本発明者らは、選択時に高度に変異した親和性成熟ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５ＮＡＮＰ反応性メモリーＢ細胞抗体のクラスターを観察した（図３４、ＡおよびＢ）（９）。代表的なＶＨ３−２３／Ｖκ１−５抗体である１４５０のＮＡＮＰ５結合モードは１２１０とは異なるが、これもまた、ＨＣＤＲ３が直接並置され、親和性が成熟したＫ．Ｎ３０残基がＦａｂ−ＡとＦａｂ−Ｂの間にＨ結合を形成している、頭−頭立体配置であるＮＡＮＰ５を認識した（図３４、ＣからＥ、図３５、ＡおよびＢ、表５、９、および１０）。ＶＨ３−２３／Ｖｋ１−５抗体クラスターの配列解析により、抗体−抗原相互作用、抗体−抗体接触に直接関与する、またはＮＡＮＰエピトープ認識に最適な１４５０パラトープ立体配座に有利なアミノ酸交換の濃縮が確認された（図３４Ｂ）。
【０２１２】
マラリア未経験者のＰｆＳＰＺ−ＣＶａｃ免疫付与後、ＰｆＣＳＰ反応性メモリーＢ細胞の約１５％が、ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８またはＶＨ３−２３／Ｖκ１−５の配列特性を示した（図３４Ｆ）（１８）。さらに、これらの細胞は、非拡大集団と比較して、拡大された抗ＰｆＣＳＰメモリーＢ細胞プールで強く濃縮されていた（図３４Ｇ）。したがって、低変異高親和性ＶＨ３−３３抗体と他の遺伝子の組み合わせを使用した低親和性抗体の両方で、Ｐｆスポロゾイト曝露を繰り返した後、抗同型の親和性成熟が観察される（９）。この現象はまた、ＲＴＳ、Ｓマラリアワクチン接種によって誘発されるＢ細胞応答でも発生する可能性がある（図３６）（１１）。
【０２１３】
したがって、従来の抗体−抗原親和性成熟に加えて、抗同型親和性成熟により、ヒトにおけるＰｆＣＳＰ反応性Ｂ細胞の強力なクローン拡大と競合的選択が促進される。親和性成熟がない場合でも、ＶＨ３−３３／Ｖκ１−５／ＫＣＤＲ３：８抗体は中程度以上の強力なＮＡＮＰ結合剤であり、強力なＰｆ阻害剤である。これは、ＨＣＤＲ２のＨ．Ｗ５２に大きく依存している。ＩＧＨＶ３−３３はＩＧＨ遺伝子座の構造多型の領域に位置するため、特にＰｆ流行地域では、ハプロタイプ頻度により、予防接種時の防御的体液性抗ＰｆＣＳＰリピート応答の効率的な誘導が決定される可能性がある（１９）。事実、本発明者らの研究での１人のドナーはＩＧＨＶ３−３３陰性であった（図３７）。本発明者らは、反復抗原（マラリアなど）が２つの抗体を近接させて結合を最適化し、同型相互作用により表面免疫グロブリン分子のクラスター化を促進する場合、抗同型親和性成熟はＢ細胞応答の一般化可能な特性であり得ると提案している（２０、２１）。
【０２１４】
参考文献
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７．Ｅ．Ｍ．Ｒｉｌｅｙ、Ｖ．Ａ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ：Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．（マラリアの免疫メカニズム：ワクチン開発における新しい洞察）。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（ネイチャー・メディシン）１９、１６８−１７８（２０１３）。
８．Ｂ．Ｍｏｒｄｍｕｌｌｅｒ、Ｇ．Ｓｕｒａｔ、Ｈ．Ｌａｇｌｅｒ、Ｓ．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ、Ａ．Ｓ．Ｉｓｈｉｚｕｋａ、Ａ．Ｌａｌｒｅｍｒｕａｔａ、Ｍ．Ｇｍｅｉｎｅｒ、Ｊ．Ｊ．Ｃａｍｐｏ、Ｍ．Ｅｓｅｎ、Ａ．Ｊ．Ｒｕｂｅｎ、Ｊ．Ｈｅｌｄ、Ｃ．Ｌ．Ｃａｌｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｍｅｎｇｕｅ、Ｔ．Ｇｅｂｒｕ、Ｊ．Ｉｂａｎｅｚ、Ｍ．Ｓｕｌｙｏｋ、Ｅ．Ｒ．Ｊａｍｅｓ、Ｐ．Ｆ．Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ、Ｋ．Ｃ．Ｎａｔａｓｈａ、Ａ．Ｍａｎｏｊ、Ｔ．Ｍｕｒｓｈｅｄｋａｒ、Ａ．Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａ、Ａ．Ｇ．Ｅａｐｐｅｎ、Ｔ．Ｌｉ、Ｒ．Ｅ．Ｓｔａｆｆｏｒｄ、Ｍ．Ｌｉ、Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｒ．Ａ．Ｓｅｄｅｒ、Ｔ．Ｌ．Ｒｉｃｈｉｅ、Ｂ．Ｋ．Ｌ．Ｓｉｍ、Ｓ．Ｌ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｐ．Ｇ．Ｋｒｅｍｓｎｅｒ、Ｓｔｅｒｉｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｂｙ  ｃｈｅｍｏａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＰｆＳＰＺ  ｖａｃｃｉｎｅ．（化学弱毒化ＰｆＳＰＺワクチンによるヒトマラリアに対する無菌防御）。Ｎａｔｕｒｅ（ネイチャー）５４２、４４５−４４９（２０１７）。
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１０．Ｇ．Ｔｒｉｌｌｅｒ、Ｓ．Ｗ．Ｓｃａｌｌｙ、Ｇ．Ｃｏｓｔａ、Ｍ．Ｐｉｓｓａｒｅｖ、Ｃ．Ｋｒｅｓｃｈｅｌ、Ａ．Ｂｏｓｃｈ、Ｅ．Ｍａｒｏｉｓ、Ｂ．Ｋ．Ｓａｃｋ、Ｒ．Ｍｕｒｕｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｓａｌｍａｎ、Ｃ．Ｊ．Ｊａｎｓｅ、Ｓ．Ｍ．Ｋｈａｎ、Ｓ．Ｈ．Ｉ．Ｋａｐｐｅ、Ａ．Ａ．Ａ．Ａｄｅｇｎｉｋａ、Ｂ．Ｍｏｒｄｍｕｌｌｅｒ、Ｅ．Ａ．Ｌｅｖａｓｈｉｎａ、Ｊ．−Ｐ．Ｊｕｌｉｅｎ、Ｈ．Ｗａｒｄｅｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒａｌ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍａｌａｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．（自然の寄生虫曝露は防御的なヒト抗マラリア抗体を誘導する）。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（免疫）４７、１１９７−１２０９．ｅ１０（２０１７）。
１１．Ｄ．Ｏｙｅｎ、Ｊ．Ｌ．Ｔｏｒｒｅｓ、Ｕ．Ｗｉｌｌｅ−Ｒｅｅｃｅ、Ｃ．Ｆ．Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ、Ｄ．Ｅｍｅｒｌｉｎｇ、Ｊ．Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ、Ｗ．Ｖｏｌｋｍｕｔｈ、Ｙ．Ｆｌｏｒｅｓ−Ｇａｒｃｉａ、Ｆ．Ｚａｖａｌａ、Ａ．Ｂ．Ｗａｒｄ、Ｃ．Ｒ．Ｋｉｎｇ、Ｉ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＡＮＰ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．（熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質におけるＮＡＮＰリピートの抗体認識についての構造的基礎）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（米国科学アカデミー紀要）１１４、Ｅ１０４３８−Ｅ１０４４５（２０１７）。
１２．Ａ．Ｇｈａｓｐａｒｉａｎ、Ｋ．Ｍｏｅｈｌｅ、Ａ．Ｌｉｎｄｅｎ、Ｊ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ＮＰＮＡｒｅｐｅａｔ  ｍｏｔｉｆ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ．（マラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質からのＮＰＮＡリピートモチーフの結晶構造）。Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（ケミカル・コミュニケーションズ）１４、１７４−１７６（２００６）。
１３．Ｎ．Ｋ．Ｋｉｓａｌｕ、Ａ．Ｈ．Ｉｄｒｉｓ、Ｃ．Ｗｅｉｄｌｅ、Ｙ．Ｆｌｏｒｅｓ−Ｇａｒｃｉａ、Ｂ．Ｊ．Ｆｌｙｎｎ、Ｂ．Ｋ．Ｓａｃｋ、Ｓ．Ｍｕｒｐｈｙ、Ａ．Ｓｃｈｏｎ、Ｅ．Ｆｒｅｉｒｅ、Ｊ．Ｒ．Ｆｒａｎｃｉｃａ、Ａ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｓ．Ｍａｒｃｈ、Ｈ．−Ｘ．Ｌｉａｏ、Ｂ．Ｆ．Ｈａｙｎｅｓ、Ｋ．Ｗｉｅｈｅ、Ａ．Ｍ．Ｔｒａｍａ、Ｋ．Ｏ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｍ．Ａ．Ｇｌａｄｄｅｎ、Ａ．Ｍｏｎｒｏｅ、Ｍ．Ｂｏｎｓｉｇｎｏｒｉ、Ｍ．Ｋａｎｅｋｉｙｏ、Ａ．Ｋ．Ｗｈｅａｔｌｅｙ、Ａ．Ｂ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ、Ｓ．Ｋ．Ｆａｒｎｅｙ、Ｇ．−Ｙ．Ｃｈｕａｎｇ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｎ．Ｋｃ、Ｓ．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ、Ｐ．Ｄ．Ｋｗｏｎｇ、Ｐ．Ｓｉｎｎｉｓ、Ｓ．Ｎ．Ｂｈａｔｉａ、Ｓ．Ｈ．Ｉ．Ｋａｐｐｅ、Ｂ．Ｋ．Ｌ．Ｓｉｍ、Ｓ．Ｌ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｆ．Ｚａｖａｌａ、Ｍ．Ｐａｎｃｅｒａ、Ｒ．Ａ．Ｓｅｄｅｒ、Ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐａｒａｓｉｔｅ．（ヒトモノクローナル抗体は、寄生虫の新たな脆弱性部位を標的にすることによりマラリア感染を予防する）。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（ネイチャー・メディシン）２４、４０８−４１６（２０１８）。
１４．Ｊ．Ｔａｎ、Ｂ．Ｋ．Ｓａｃｋ、Ｄ．Ｏｙｅｎ、Ｉ．Ｚｅｎｋｌｕｓｅｎ、Ｌ．Ｐｉｃｃｏｌｉ、Ｓ．Ｂａｒｂｉｅｒｉ、Ｍ．Ｆｏｇｌｉｅｒｉｎｉ、Ｃ．Ｓ．Ｆｒｅｇｎｉ、Ｊ．Ｍａｒｃａｎｄａｌｌｉ、Ｓ．Ｊｏｎｇｏ、Ｓ．Ａｂｄｕｌｌａ、Ｌ．Ｐｅｒｅｚ、Ｇ．Ｃｏｒｒａｄｉｎ、Ｌ．Ｖａｒａｎｉ、Ｆ．Ｓａｌｌｕｓｔｏ、Ｂ．Ｋ．Ｌ．Ｓｉｍ、Ｓ．Ｌ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｓ．Ｈ．Ｉ．Ｋａｐｐｅ、Ｃ．Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｉ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ａ  ｐｕｂｌｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｔｈａｔ  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｕａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．（ポロゾイト周囲タンパク質への二重の結合を通じてマラリア感染を強力に阻害するパブリック抗体系列）。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（ネイチャー・メディシン）２４、４０１−４０７（２０１８）。
１５．反復反応性についてのＨ．Ｙ５２ＡおよびＨ．Ｙ５８の重要性は、抗体１２１０、２１４０、および２２１９のアラニン変異によって確認された（図２９）。
１６．すべての抗体は、それぞれ約２および約１の結合化学量論でＮＡＮＰ５およびＮＡＮＰ３を認識し、より短いＮＡＮＰ３ではなくＮＡＮＰ５が２つのＦａｂの結合を可能にすることを実証した。
１７．Ｃ．Ｒ．Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈ．Ｊ．Ｓｕｔｔｏｎ、Ｊ．Ａ．Ｋａｃｚｍａｒｓｋｉ、Ｈ．Ａ．ＭｃＮａｍａｒａ、Ｂ．Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｊ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｙ．Ｃａｉ、Ｊ．Ｎ．Ｄｕｐｓ、Ｎ．Ｊ．Ｄ’Ａｒｃｙ、Ｍ．Ｓｉｎｇｈ、Ａ．Ｃｈｕａｈ、Ｔ．Ｓ．Ｐｅａｔ、Ｃ．Ｊ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉ．Ａ．Ｃｏｃｋｂｕｒｎ、Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍ  ａ  ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．（マラリア原虫に対するＴ依存性Ｂ細胞応答は、スポロゾイト周囲タンパク質と高結合力多価複合体を形成する抗体を誘導する）。ＰＬＯＳＰａｔｈｏｇ．（ＰＬＯＳパソジェンズ）１３、ｅ１００６４６９（２０１７）。
１８．Ｂ．Ｊ．ＤｅＫｏｓｋｙ、Ｔ．Ｋｏｊｉｍａ、Ａ．Ｒｏｄｉｎ、Ｗ．Ｃｈａｒａｂ、Ｇ．Ｃ．Ｉｐｐｏｌｉｔｏ、Ａ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｇ．Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、Ｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｅａｖｙ−ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．（ヒト対合重鎖および軽鎖抗体レパートリーの徹底的な測定と分析）。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（ネイチャー・メディシン）２１、８６−９１（２０１５）。
１９．Ｃ．Ｔ．Ｗａｔｓｏｎ、Ｋ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ、Ｒ．Ｌ．Ｗａｒｒｅｎ、Ｍ．Ｍａｌｉｇ、Ｊ．Ｓｃｈｅｉｎ、Ａ．Ｊ．Ｗｉｌｌｓｅｙ、Ｊ．Ｂ．Ｊｏｙ、Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ、Ｔ．Ａ．Ｇｒａｖｅｓ、Ｒ．Ｋ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｒ．Ａ．Ｈｏｌｔ、Ｅ．Ｅ．Ｅｉｃｈｌｅｒ、Ｆ．Ｂｒｅｄｅｎ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ，ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｌｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．（ヒト免疫グロブリン重鎖の可変性、多様性、結合遺伝子の完全ハプロタイプ配列、および対立遺伝子およびコピー数の変動の特性確認）。Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス）９２、５３０−５４６（２０１３）。
２０．Ｔ．Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｄ．Ｌａｉ、Ｉ．Ｓ．Ｄｅｍｅｎｔｉｅｖａ、Ｓ．Ｐ．Ｍｏｎｔａｎｏ、Ｋ．Ｋｕｒｏｓａｗａ、Ｙ．Ｚｈｅｎｇ、Ｌ．Ｒ．Ａｋｉｎ、Ｋ．Ｍ．Ｓｗｉｓｔ−Ｒｏｓｏｗｓｋａ、Ａ．Ｔ．Ｇｒｚｙｂｏｗｓｋｉ、Ａ．Ｋｏｉｄｅ、Ｋ．Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ、Ｂ．Ｄ．Ｓｔｒａｈｌ、Ｎ．Ｌ．Ｋｅｌｌｅｈｅｒ、Ａ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ、Ｓ．Ｋｏｉｄｅ、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｌａｓｐｉｎｇ  ｂｙ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．（ヒストンのメチル化に非常に特異的な抗体の２つの抗原結合部位による抗原クラスピング）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（米国科学アカデミー紀要）１１３、２０９２−２０９７（２０１６）。
２１．Ｈ．Ｍ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｓ．Ｄ．Ｎｏｆａｌ、Ｅ．Ｊ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ａ．Ｒ．Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（マラリア原虫タンパク質の反復配列）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（欧州微生物学会連合マイクロバイオロジー・レビューズ）４１、９２３−９４０（２０１７）。
２２．Ｇ．Ｙａａｒｉ、Ｊ．Ａ．Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ、Ｍ．Ｕｄｕｍａｎ、Ｄ．Ｇａｄａｌａ−Ｍａｒｉａ、Ｎ．Ｇｕｐｔａ、Ｊ．Ｎ．Ｈ．Ｓｔｅｒｎ、Ｋ．Ｃ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｄ．Ａ．Ｈａｆｌｅｒ、Ｕ．Ｌａｓｅｒｓｏｎ、Ｆ．Ｖｉｇｎｅａｕｌｔ、Ｓ．Ｈ．Ｋｌｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．（ハイスループット免疫グロブリン配列決定データからの同義変異に基づく体細胞超変異標的化と置換のモデル）。Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（フロンティアズ・イン・イムノロジー）４、３５８（２０１３）。
２３．Ｎ．Ｔ．Ｇｕｐｔａ、Ｊ．Ａ．Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ、Ｍ．Ｕｄｕｍａｎ、Ｄ．Ｇａｄａｌａ−Ｍａｒｉａ、Ｇ．Ｙａａｒｉ、Ｓ．Ｈ．Ｋｌｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｃｈａｎｇｅ−Ｏ：Ａ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．（Ｃｈａｎｇｅ−Ｏ：大規模なＢ細胞免疫グロブリンレパートリー配列決定データを分析するためのツールキット）。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（バイオインフォマティクス）３１、３３５６−３３５８（２０１５）。
２４．Ａ．Ｐ．Ｍａｓｅｌｌａ，Ａ．Ｋ．Ｂａｒｔｒａｍ，Ｊ．Ｍ．Ｔｒｕｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｄ．Ｎｅｕｆｅｌｄ、ＰＡＮＤＡｓｅｑ：Ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．（ＰＡＮＤＡｓｅｑ：イルミナシーケンス用のペアエンドアセンブラー）。ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＢＭＣバイオインフォマティクス）１３、３１（２０１２）。
２５．Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒ、Ｅ．Ｍｅｆｆｒｅ、Ｓ．Ｙｕｒａｓｏｖ、Ｍ．Ｔｓｕｉｊｉ、Ｍ．Ｃ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｈ．Ｗａｒｄｅｍａｎｎ、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．（単一細胞ＲＴ−ＰＣＲおよび発現ベクタークローニングによる単一ヒトＢ細胞からのモノクローナル抗体の効率的な生成）。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ）３２９、１１２−１２４（２００８）。
２６．Ｋ．Ｔｅｗａｒｉ、Ｂ．Ｊ．Ｆｌｙｎｎ、Ｓ．Ｂ．Ｂｏｓｃａｒｄｉｎ、Ｋ．Ｋａｓｔｅｎｍｕｅｌｌｅｒ、Ａ．Ｍ．Ｓａｌａｚａｒ，Ｃ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖ．Ｓｏｕｎｄａｒａｐａｎｄｉａｎ，Ａ．Ａｈｕｍａｄａ，Ｔ．Ｋｅｌｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ａ．Ｓｅｄｅｒ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳＰ）ａｎｄ  αＤＥＣ−ＣＳＰ  ｉｎ  ｎｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、非ヒト霊長類における熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）およびαＤＥＣ−ＣＳＰに対する抗体および多機能ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の効果的なアジュバントである）。Ｖａｃｃｉｎｅ（ワクチン）２８、７２５６−７２６６（２０１０）。
２７．Ｗ．Ｋａｂｓｃｈ、ＸＤＳ。Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ（アクタ・クリスタログラフィカ・セクションＤ）６６、１２５−１３２（２０１０）。
２８．Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ，Ｒ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｐ．Ｄ．Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．Ｗｉｎｎ，Ｌ．Ｃ．Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｒ．Ｊ．Ｒｅａｄ，Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．（Ｐｈａｓｅｒ結晶学ソフトウェア）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．（ジャーナル・オブ・アプライド・クリスタログラフィー）４０、６５８−６７４（２００７）。
２９．Ｐ．Ｄ．Ａｄａｍｓ、Ｐ．Ｖ．Ａｆｏｎｉｎｅ、Ｇ．Ｂｕｎｋｏｃｚｉ、Ｖ．Ｂ．Ｃｈｅｎ、Ｉ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｅｃｈｏｌｓ、Ｊ．Ｊ．Ｈｅａｄｄ、Ｌ．−Ｗ．Ｈｕｎｇ、Ｇ．Ｊ．Ｋａｐｒａｌ、Ｒ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ、Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ、Ｎ．Ｗ．Ｍｏｒｉａｒｔｙ、Ｒ．Ｏｅｆｆｎｅｒ、Ｒ．Ｊ．Ｒｅａｄ、Ｄ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．Ｓ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｔ．Ｃ．Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．Ｈ．Ｚｗａｒｔ、ＰＨＥＮＩＸ：Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．（ＰＨＥＮＩＸ：高分子構造ソリューションのための包括的なＰｙｔｈｏｎベースのシステム）。ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ（アクタ・クリスタログラフィカ・セクションＤ）６６、２１３−２２１（２０１０）。
３０．Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙ、Ｂ．Ｌｏｈｋａｍｐ、Ｗ．Ｇ．Ｓｃｏｔｔ、Ｋ．Ｃｏｗｔａｎ、Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．（Ｃｏｏｔの特徴および開発）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ（アクタ・クリスタログラフィカ・セクションＤ）６６、４８６−５０１（２０１０）。
３１．Ａ．Ｍｏｒｉｎ、Ｂ．Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ、Ｊ．Ｋｅｙ、Ｐ．Ｃ．Ｓａｎｓｃｈａｇｒｉｎ、Ｍ．Ａ．Ｔｉｍｏｎｙ、Ｍ．Ｏｔｔａｖｉａｎｏ、Ｐ．Ｓｌｉｚ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．（共同研究はソフトウェアを最大限に活用する）。Ｅｌｉｆｅ（イーライフ）２、ｅ０１４５６（２０１３）。
３２．Ｓ．Ｈ．Ｗ．Ｓｃｈｅｒｅｓ、Ａ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｖｉｅｗ  ｏｎ  ｃｒｙｏ−ＥＭ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．（クライオＥＭ構造決定に関するベイズ流見解）。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー）４１５、４０６−４１８（２０１２）。
３３．Ｓ．Ｍｅｉｘｌｓｐｅｒｇｅｒ、Ｆ．Ｋｏｈｌｅｒ、Ｔ．Ｗｏｓｓｎｉｎｇ、Ｍ．Ｒｅｐｐｅｌ、Ｍ．Ｍｕｓｃｈｅｎ、Ｈ．Ｊｕｍａａ、Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（従来の軽鎖はＢ細胞受容体の自律シグナル伝達能力を阻害する）。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（免疫）２６、３２３−３３３（２００７）。
３４．Ｆ．Ｋｏｈｌｅｒ，Ｅ．Ｈｕｇ，Ｃ．Ｅｓｃｈｂａｃｈ，Ｓ．Ｍｅｉｘｌｓｐｅｒｇｅｒ，Ｅ．Ｈｏｂｅｉｋａ，Ｊ．Ｋｏｆｅｒ，Ｈ．Ｗａｒｄｅｍａｎｎ，Ｈ．Ｊｕｍａａ，Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｉｍｉｃ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐｒｅ−Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．（自己反応性Ｂ細胞受容体は、自律的なプレＢ細胞受容体シグナル伝達を模倣し、初期Ｂ細胞の増殖を誘導する）。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（免疫）２９、９１２−９２１（２００８）。
３５．Ｈ．Ｗａｒｄｅｍａｎｎ、Ｓ．Ｙｕｒａｓｏｖ、Ａ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｊ．Ｗ．Ｙｏｕｎｇ、Ｅ．Ｍｅｆｆｒｅ、Ｍ．Ｃ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅａｒｌｙ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．（初期ヒトＢ細胞前駆体による優勢な自己抗体産生）。Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）３０１、１３７４−１３７７（２００３）
【０２１５】
例５：免疫付与実験
図３８は、マラリアワクチン抗原（ＣＳＰ−ＮＡＮＰ５．５−リンカー抗体）が完全長ＰｆＣＳＰ抗原を認識できるＩｇＧ力価を引き出すことを示す。予想どおり、応答はブースト可能で、３回の投与で増加する。これら２つの例において、マラリアワクチンは２つの異なるナノ粒子に表示され、一方は他方よりも強い免疫応答をもたらす。図３９は、図３８における免疫付与から誘発された抗ＰｆＣＳＰ血清の活性／機能を示す。これは、スポロゾイト横断阻害アッセイで測定される。所定の血清希釈度で、ナノ粒子上でのマラリアワクチンの提示方法に応じて、阻害活性は５０％〜８０％の間で変化する。これらの結果は、１）本明細書に記載のマラリアワクチンが抗マラリア免疫応答を誘導すること、および２）得られた免疫血清がスポロゾイトに対する阻害能力を有することを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２１６】
配列表１  ＜２２３＞抗原
配列表２  ＜２２３＞抗体
配列表３  ＜２２３＞エピトープ
配列表４  ＜２２３＞Ｆｌａｇタグ
配列表５  ＜２２３＞抗体
配列表６  ＜２２３＞ナノ粒子
配列表７〜２５  ＜２２３＞抗体
【図１】
2020534861.tif 000026
【図２】
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【図３】
2020534861.tif 000028
【図４】
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【図５】
2020534861.tif 000030
【図６】
2020534861.tif 000031
【図７】
2020534861.tif 000032
【図８】
2020534861.tif 000033
【図９】
2020534861.tif 000034
【図１０】
2020534861.tif 000035
【図１１】
2020534861.tif 000036
【図１２】
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【図１３】
2020534861.tif 000038
【図１４】
2020534861.tif 000039
【図１５】
2020534861.tif 000040
【図１６】
2020534861.tif 000041
【図１７】
2020534861.tif 000042
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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