(57)【要約】  細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。本発明のシステムは、ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびにｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、第１のポリヌクレオチドが、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードすること、第２のポリヌクレオチドが、スペーサーをコードすること、第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、および第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすることを特徴とする。このような細胞を作製する方法、このような細胞を使用した治療方法も提供する。
2020500563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムであって、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記転写活性化因子がHEA3またはHEA4である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記HEA3が、野生型HEA3転写因子のバリアントである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記HEA4が、野生型HEA4転写因子のバリアントである、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記HEA3が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインが、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む、請求項２または３に記載のシステム。
【請求項６】
前記HEA3が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインが、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む、請求項２または３に記載のシステム。
【請求項７】
前記HEA4が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインが、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む、請求項２または４に記載のシステム。
【請求項８】
前記HEA4が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインが、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む、請求項２、４または７に記載のシステム。
【請求項９】
前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントが、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記野生型HEA3転写因子のバリアントが、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２、３、５、６および９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記野生型HEA3転写因子のバリアントが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる、請求項２、３、５、６、９および１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記野生型HEA4転写因子のバリアントが、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２、４および７〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記野生型HEA4転写因子のバリアントが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる、請求項２、４、７〜９および１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記薬物が、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
第１のプロモーターが、配列番号２３に示される核酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、前記キメラ抗原受容体の発現が、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって、前記キメラ抗原受容体の発現が誘導される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記副作用が、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記シグナル伝達ドメインが、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
第２のプロモーターが誘導型プロモーターである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
第２のプロモーターが構成的プロモーターである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
第２のプロモーターがＥＦ１αｐである、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記転写活性化因子が、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
前記転写活性化因子が、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
第１の核酸が第１のベクターをさらに含み、第２の核酸が第２のベクターをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
第１のベクターと第２のベクターが、単一のウイルスベクターにパッケージされている、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
第１の核酸が、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３０】
第２の核酸が、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３１】
前記選択マーカーが、EGFRtおよび／またはHER2tである、請求項２９または３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記選択マーカーが薬物耐性を付与する、請求項２９または３０に記載のシステム。
【請求項３３】
第１の核酸が、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記自己切断ペプチドが、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体と比べて増強されるように前記スペーサーが最適化されている、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３６】
第１の核酸が、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーが、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記ＤＮＡスペーサーが、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記ＤＮＡスペーサーが、配列番号１２０に示される配列を含む、請求項３６または３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記ＤＮＡスペーサーが、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む、請求項３６または３７に記載のシステム。
【請求項４０】
前記ＤＮＡスペーサーが、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４１】
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムであって、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステム。
【請求項４２】
前記転写活性化因子がHEA3またはHEA4である、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記HEA3が、野生型HEA3転写因子のバリアントである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記HEA4が、野生型HEA4転写因子のバリアントである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
前記HEA3が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインが、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む、請求項４２または４３に記載のシステム。
【請求項４６】
前記HEA3が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインが、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む、請求項４２または４３に記載のシステム。
【請求項４７】
前記HEA4が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインが、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む、請求項４２または４４に記載のシステム。
【請求項４８】
前記HEA4が、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインが、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む、請求項４２または４４に記載のシステム。
【請求項４９】
前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントが、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記野生型HEA3転写因子のバリアントが、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４２、４３、４５、４６または４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記野生型HEA3転写因子のバリアントが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる、請求項４２、４３、４５、４６、４９または５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記野生型HEA4転写因子のバリアントが、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４２および４７〜４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記野生型HEA4転写因子のバリアントが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる、請求項４２、４７〜４９および５２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記転写制御因子が、HEA3キメラ転写因子のバリアントであり、該バリアントが、薬物への選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含む、請求項２〜３、５、６、９〜１１、１４〜４０、４２、４３、４５、４６および４９〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５５】
前記薬物が、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である、請求項４１〜５４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５６】
少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、前記キメラ抗原受容体の発現量が、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる、請求項４１〜５４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５７】
０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって、前記キメラ抗原受容体の発現が誘導される、請求項４１〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５８】
野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
前記副作用が、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である、請求項５８に記載のシステム。
【請求項６０】
第２の核酸が、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されていてもよいポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、
前記リガンド結合ドメインが、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、または標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子であり、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する、
請求項１〜５９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６１】
アポトーシスを制御する前記ポリペプチドがサバイビンである、請求項４１〜６０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６２】
前記サバイビンが、配列番号１２４に示される配列によってコードされる、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記サバイビンが、配列番号１２３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６１または６２に記載のシステム。
【請求項６４】
第１のプロモーターが、第２のプロモーターとは逆向きである、請求項１〜６３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６５】
前記リガンド結合ドメインが、結合性断片などの抗体断片である、請求項１〜６４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６６】
前記リガンド結合ドメインが一本鎖可変断片である、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
前記腫瘍特異的分子が、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４１および６３〜６６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６８】
前記ウイルス特異的分子が、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である、請求項１〜４１および６３〜６６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６９】
前記リガンド結合ドメインが、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する、請求項６５または６６に記載のシステム。
【請求項７０】
前記スペーサーが、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む、請求項１〜６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７１】
第１の核酸が、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーが、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項４１〜７０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７２】
前記ＤＮＡスペーサーが、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７３】
前記ＤＮＡスペーサーが、配列番号１２０に示される配列を含む、請求項７１または７２に記載のシステム。
【請求項７４】
前記ＤＮＡスペーサーが、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７５】
前記ＤＮＡスペーサーが、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７６】
第１の核酸が第１のベクターをさらに含み、第２の核酸が第２のベクターをさらに含む、請求項４１〜７５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７７】
第１のベクターと第２のベクターが、単一のウイルスベクターにパッケージされている、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである、請求項７７に記載のシステム。
【請求項７９】
請求項１〜３５および５４〜６８のいずれか１項に記載のシステムに含まれる第１の核酸、または請求項４１〜７８のいずれか１項に記載のシステムに含まれる第２の核酸によってコードされるキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８０】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載のシステムを含む、哺乳動物細胞などの宿主細胞。
【請求項８１】
Ｔ細胞前駆細胞である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
前記Ｔ細胞前駆細胞が造血幹細胞である、請求項８１に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８４】
ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８５】
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞を薬学的に許容される賦形剤中に含む組成物。
【請求項８６】
請求項８１に記載の宿主細胞と請求項８２に記載の宿主細胞とを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
請求項８１または８２に記載の宿主細胞と請求項８３または８４に記載の宿主細胞とを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８８】
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞をインビトロで作製する方法であって、
ａ）請求項１〜７８のいずれか１項に記載のシステムを提供すること；および
ｂ）単離されたＴリンパ球集団に前記システムを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させること
を含む方法。
【請求項８９】
前記Ｔリンパ球が増殖培養されたものであり、抗CD3および／または抗CD28と少なくとも１種の恒常性サイトカインとの存在下において、細胞移入としての使用に十分な数に達するまで前記Ｔリンパ球を培養することをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記単離されたＴリンパ球集団がＴ細胞前駆細胞を含む、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｔ細胞前駆細胞が造血幹細胞である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記リンパ球が、CD8+またはCD4+である、請求項８８〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、または請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項９４】
前記疾患が、がんまたはウイルス疾患である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記対象が、抗がん療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記対象が、抗ウイルス療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項９３〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む、請求項９３〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の細胞、または請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品の投与前、投与中または投与後に、別の抗がん療法または抗ウイルス療法を前記対象に提供することをさらに含む、請求項９３〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の細胞、または請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を養子細胞移入によって前記対象に投与する、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
別の形態の抗がん療法または抗ウイルス療法で前記対象を処置した後に、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を該対象に投与する、請求項９３〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
哺乳動物細胞などの宿主細胞において導入遺伝子の発現を誘導する薬物、またはがんもしくはウイルス感染症の治療用組成物を投与することをさらに含む、請求項９３〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記薬物が、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、フルベストラントおよび／もしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記タモキシフェンが、１０ｍｇ／回、１１ｍｇ／回、１２ｍｇ／回、１３ｍｇ／回、１４ｍｇ／回、１５ｍｇ／回、１６ｍｇ／回、１７ｍｇ／回、１８ｍｇ／回、１９ｍｇ／回もしくは２０ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記フルベストラントが、２５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、３５０ｍｇ／回、４００ｍｇ／回、４５０ｍｇ／回もしくは５００ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
血清中の薬物濃度が３０ｎＭ、４０ｎＭもしくは５０ｎＭまたはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度となる用量範囲で前記CMP8が投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である、請求項９４〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記固形腫瘍が、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
がんまたはウイルス感染症の治療のための、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞または請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品と該宿主細胞中または該組成物中の導入遺伝子の発現を誘導する薬物との組み合わせの使用。
【請求項１０９】
前記薬物が、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、フルベストラントおよび／もしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１０】
前記タモキシフェンが、１０ｍｇ／回、１１ｍｇ／回、１２ｍｇ／回、１３ｍｇ／回、１４ｍｇ／回、１５ｍｇ／回、１６ｍｇ／回、１７ｍｇ／回、１８ｍｇ／回、１９ｍｇ／回もしくは２０ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される、請求項１０９に記載の使用。
【請求項１１１】
前記フルベストラントが、２５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、３５０ｍｇ／回、４００ｍｇ／回、４５０ｍｇ／回もしくは５００ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される、請求項１０９に記載の使用。
【請求項１１２】
血清中の薬物濃度が３０ｎＭ、４０ｎＭもしくは５０ｎＭまたはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度となる用量範囲で前記CMP8が投与される、請求項１０９に記載の使用。
【請求項１１３】
前記がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である、請求項１０８〜１１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１４】
前記固形腫瘍が、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１５】
がんまたはウイルス感染症を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞または請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を前記対象に投与すること、および
前記組成物中または前記宿主細胞中の導入遺伝子の発現を誘導する薬物を投与すること
を含む方法。
【請求項１１６】
前記がんが、固形腫瘍および血液悪性腫瘍から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記固形腫瘍が、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の宿主細胞または請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品の、医薬品としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願の参照による引用
本出願は、2016年12月12日に出願された米国仮特許出願第62/433,183号に基づく優先権を主張するものである。この出願に開示されている内容は、参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される。
【０００２】
配列、配列表またはコンピュータープログラムにより作成した配列に関する情報
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI.118WO.txtのファイル名で2017年12月6日に作成された297kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される。
【０００３】
細胞（たとえば哺乳動物細胞）において薬物の制御による導入遺伝子の発現を促進する遺伝子システムに関する実施形態を開示する。また、本開示は、哺乳動物細胞などの遺伝子組み換え細胞における導入遺伝子の発現の制御に有用な野生型HEA3キメラ転写因子バリアントおよび野生型HEA4キメラ転写因子バリアントの特定に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子移入によりヒトＴリンパ球を遺伝子組換えすることによって、腫瘍細胞上に発現される表面分子に特異的なキメラ抗原受容体（CAR）を発現させることができる。この目的に有用な遺伝子導入法としては、キメラ抗原受容体をコードするウイルスベクターを使用した様々な種類のウイルス形質導入法が挙げられる。キメラ抗原受容体を発現した細胞を患者に養子移入することにより、がんおよび感染症を治療することができる。キメラ抗原受容体は合成受容体である。このような合成受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを含み、該細胞外リガンド結合ドメインとしては、たとえば、細胞内シグナル伝達部分（CD3ζ単独、または１種以上の共刺激ドメインと組み合わせられたCD3ζ）に連結されたモノクローナル抗体一本鎖可変断片（scFv）が挙げられる。キメラ受容体の設計に関する研究は、正常組織に対して重大な毒性を引き起こすことなく、悪性細胞を標的とすることが可能なscFvおよびその他のリガンド結合因子を決定すること、およびＴ細胞のエフェクター機能を活性化することが可能な、細胞内シグナル伝達モジュールの最適な構成を決定することに焦点が当てられている。キメラ抗原受容体の発現を促進する別の遺伝子システムが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様は、細胞において薬物の制御による導入遺伝子の発現を促進する遺伝子システムに関する。一実施形態において、制御された導入遺伝子の発現は細胞を標的とし、たとえば、養子免疫療法における使用を目的として設計されたリンパ球（好ましくはヒトリンパ球）を標的とする。このシステムは、キメラ抗原受容体（CAR）をリダイレクトした養子療法を使用するため、安全性が厳密に保たれており、さらに、インビボでのCARの発現を臨床医がリアルタイムで制御することを可能にするという治療目的を損なうことがない。薬物応答性に基づいてCARの発現の転写制御が可能となるようにベクターを遺伝子組換えし、臨床医により処方された薬物で刺激することによって、インビボでCARの活性およびその他の細胞メディエーターの活性を「オン」または「オフ」に切り替えることができ、その結果、臨床的に許容可能な薬物動態、組織分布、および細胞外間隙とリンパ球の細胞質の間での分配を達成することができる。ベクタープラットフォームとしては、アデノウイルスやレンチウイルスの遺伝子に加えて、ミニサークルまたはpiggyBacトランスポゾンをコードする遺伝子も挙げることができる。本明細書において提供する遺伝子システムは、薬物で制御される導入遺伝子の発現を提供し、薬物の非存在下で導入遺伝子を機能的に「オフ」の状態とし、かつ薬物の存在下で導入遺伝子を機能的に「オン」の状態とすることができる。
【０００６】
このようなアプローチの１つにおいて、タモキシフェンという薬物が利用される。タモキシフェンは、エストロゲンのアンタゴニスト／部分アゴニストであり、FDA認可薬物として市販されている。タモキシフェンは経口投与され、長期間にわたって連日投与することができる。タモキシフェンは、安全性が証明されており、薬物動態プロファイルが好適であり、組織分布が良好であり、細胞外間隙と細胞質の間での分配係数が低い。また、本明細書に記載のアプローチにおいて有用な他の薬物は、安全性が証明されていること、薬物動態プロファイルが好適であること、組織分布が良好であること、細胞外間隙と細胞質の間での分配係数が低いこと、および／または毒性が低いことを目安に選択することができる。
【０００７】
しかしながら、タモキシフェンは、たとえば、白内障、生理不順、便秘、下痢、浮腫（むくみ）、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐、体重減少などのいくつかの副作用を呈することがある。したがって、一部の患者では、低い血漿中タモキシフェン濃度において、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子を「オン」の状態にする必要がある。
【０００８】
本開示の一態様は、転写因子の特性を制御するために転写活性化因子に加えることができる変更に関し、たとえば、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン内の１個以上のアミノ酸に変更を加えることによって、前記転写因子のエストロゲン類似体に対する親和性を向上させることができ、かつp65トランス活性化ドメイン内および／またはRelA（p65）トランス活性化ドメイン内の１個以上のアミノ酸に変更を加えることによって薬物に応答した転写活性を向上させることができるが、これらに限定されない。RelA内の変異は、薬物に応答した転写活性を向上させるが、薬物と受容体の結合には影響を及ぼさない。薬物と受容体の結合は、ER-LBD内の変異の影響のみを受ける。いくつかの実施形態において、本発明のシステムは合成転写制御因子を使用し、該合成転写制御因子が、タモキシフェンの存在下において導入遺伝子の上流の合成プロモーターに結合し、発現を誘導する。このタモキシフェン制御性転写因子（「TamR-tf」あるいは「HEA3/HEA4転写因子」とも呼ばれる）は、ヒト由来サブユニットを含むキメラ転写因子であり、肝細胞核因子１−α（HNF-1α）のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインが、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来のタモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインにインフレームで融合されており、このタモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインがさらにNF-κBのp65活性化ドメイン（p65）に融合されている。HEA4は、ヒト由来サブユニットを含むキメラ転写因子であり、肝細胞核因子１−α（HNF-1α）のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインが、３個の点突然変異（G400V、M543A、L544A）を含むエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来タモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインにインフレームで融合されており、このタモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインがさらにNF-κBのp65活性化ドメイン（p65）に融合されており、前記点突然変異は、エストラジオールとの結合を阻害するが、タモキシフェン代謝産物やその他のエストロゲン類似体との結合を可能とするものである。代表的なアミノ酸配列を配列番号１に示す（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号１は、ER-LBD内に１個の点突然変異を含み、この点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、タモキシフェン代謝産物である4-OHT、フルベストラントおよびその他のエストロゲン類似体に対するナノレベルでの特異性を付与する。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来の前記タモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインは、TamR-tfの２８２〜５９５番目のアミノ酸からなる配列であり、５���１番目に変異（G521R）を有し、薬物と受容体の結合に影響を与える。NF-κBのp65活性化ドメイン（p65）は、配列番号１の５９６〜８６２番目のアミノ酸からなる配列である（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。
【０００９】
タモキシフェンの非存在下では、細胞質内の熱ショックタンパク質９０（HSP90）がタモキシフェン結合活性部位に結合することによって、TamR-tfが核内から排除されるため、導入遺伝子の発現は「オフ」の状態となる。細胞質内にナノモル濃度のタモキシフェンが存在すると、ER-LBDへの結合に対してHSP90と活発に競合することによってこれを阻害し、TamR-tfの核内への転座が生じる。核内への転座が起こると、TamR-tfは、自体の特異的結合部位である合成プロモーター（たとえば、配列番号２３（tagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaagagctcagggtatataatg）に示される核酸配列からなる7xHBD/mE1B）と結合することが容易となる。タモキシフェンの存在下では、TamR-tfが7xHBD/mE1Bプロモーターに結合することによって導入遺伝子の発現が「オン」の状態になる。いくつかの実施形態において、この転写制御因子は、導入遺伝子の発現を様々なレベルで制御できるように改変することができる。TamR-tfのリガンド結合ドメイン内のアミノ酸を置換することによって、タモキシフェンおよびその代謝産物に対する選択的応答が可能となり、薬物と受容体の結合に影響を与えることができる。４−ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）は、TamR-tf活性に関して薬理学的活性が最も高い代謝物であり、内因性エストロゲンと相互作用を起こさない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、野生型HEA3バリアントおよび野生型HEA4バリアントは、ヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメインが置換されていることから、薬物に対する感受性が増強されていることが特定されている。RelA（p65）トランス活性化ドメインにおける変異は、薬物または薬物リガンドに応答した転写活性を増強させる。いくつかの実施形態において、このような高親和性形態は、4-OHTおよびその他のエストロゲン類似体（たとえばフルベストラント）に対する選択的結合性を付与することができるように、ヒトエストロゲン受容体においてアミノ酸置換を行うことによって作製される。このような変更は、たとえば、リン酸化模倣およびアセチル化模倣としての機能を果たすことが可能な、HEA3 RelAドメインおよびHEA4 RelAドメインにおけるアミノ酸置換と組み合わせた場合、このアミノ酸置換と協調して、薬物活性化因子に応答した導入遺伝子の発現を向上させることができる。また、リガンドの非存在下における「オフ」状態のストリンジェンシーに悪影響を与えることなく、活性化作用を持つエストロゲン類似体薬物の投与に対する導入遺伝子発現の感受性およびその発現量を劇的に向上させることが可能な、３個すべての修飾を有するバリアントの好ましい一形態も本明細書において述べる。別の一態様では、HEA3は、RelA内の変異ではなく、ER-LBD内における変異（L384M、M421G、G521R）を有しているため、薬物であるCMP8に対して応答性を備える。RelAにおける変異は、薬物に対する特異性に影響を及ぼさない場合がある。また、RelAにおける変異によって、転写活性が向上する場合がある。転写活性が向上したこのようなHEA3キメラ転写因子およびHEA4キメラ転写因子を利用することによって、無毒な低用量のタモキシフェン、フルベストラントまたはCMP8で容易に到達可能な体内薬物濃度に応答できるように、この制御システムを改変することができる。
【００１１】
第１の態様において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、ポリペプチドスペーサー、好ましくは最適化されたスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子と比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異によって、薬物と受容体の結合が影響を受ける。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、野生型HEA3を使用したシステムと比較して所定の濃度における転写発現を増強させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。いくつかの実施形態において、前記無毒な薬物用量において、野生型HEA3キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して薬物副作用が低減、排除または予防される。いくつかの実施形態において、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。いくつかの実施形態において、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である��いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子よりも高くなる。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。いくつかの実施形態において、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。いくつかの実施形態において、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、または標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、結合断片などの抗体断片である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、および／またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡス���ーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。
【００１２】
第２の態様において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量の前記薬物に応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3と比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3キメラ転写因子または前記HEA4キメラ転写因子は、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３および／または配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および／または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子よりも高くなる。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。いくつかの実施形態において、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。いくつかの実施形態において、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、結合断片などの抗体断片である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発��を向上させる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
第３の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムの第１の核酸および／または第２の核酸によってコードされるキメラ受容体ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、ポリペプチドスペーサー、好ましくは最適化されたスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および／または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および／または配列番号１��に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細��においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、または標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
第４の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号��７および／または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、Ｔ細胞前駆細胞などの哺乳動物細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
第５の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を薬学的に許容される賦形剤中に含む組成物を提供する。また、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む、哺乳動物細胞などの宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該細胞はＴ細胞前駆細胞であり、これは造血幹細胞であってもよい。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
第６の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞をインビトロで作製する方法を提供する。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、または標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、結合断片などの抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、Ｔ細胞前駆細胞などの哺乳動物細胞である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる宿主細胞をインビトロで作製する前記方法は、ａ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを提供すること；およびｂ）単離されたＴリンパ球集団に前記システムを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させることを含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔリンパ球は増殖培養されたものであり、前記方法は、抗CD3および／または抗CD28と少なくとも１種の恒常性サイトカインとの存在下において、細胞移入としての使用に十分な数に達するまで前記Ｔリンパ球を培養することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記単離されたＴリンパ球集団はＴ細胞前駆細胞を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記リンパ球はCD8+またはCD4+である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
第７の態様において、疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において疾患を治療、抑制または緩和する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を、薬学的に許容される賦形剤中に含む。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、結合断片などの抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記疾患は、がんまたはウイルス疾患である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記対象は、抗がん療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記対象は、抗ウイルス療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む。
前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、本明細書において提供される実施形態のいずれか１つに記載の細胞、または本明細書において提供される実施形態のいずれか１つに記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品の投与前、投与中または投与後に、別の抗がん療法または抗ウイルス療法を前記対象に提供することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記細胞または前記少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品は、養子細胞移入によって前記対象に投与する。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、別の形態の抗がん療法または抗ウイルス療法で前記対象を処置した後に、前記宿主細胞、または前記少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を前記対象に投与する。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、がんまたはウイルス感染症の治療のために、前記宿主細胞または前記組成物中の導入遺伝子の発現を誘導する薬物を投与することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、フルベストラントおよび／もしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記タモキシフェンは、１０ｍｇ／回、１１ｍｇ／回、１２ｍｇ／回、１３ｍｇ／回、１４ｍｇ／回、１５ｍｇ／回、１６ｍｇ／回、１７ｍｇ／回、１８ｍｇ／回、１９ｍｇ／回もしくは２０ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記フルベストラントは、２５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、３５０ｍｇ／回、４００ｍｇ／回、４５０ｍｇ／回もしくは５００ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記CMP8は、血清中の薬物濃度が３０ｎＭ、４０ｎＭもしくは５０ｎＭまたはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度となる用量範囲で投与される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記がんは、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記固形腫瘍は、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
第８の態様において、疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において疾患を治療、抑制または緩和する方法を提供する。該方法は、本明細書において提供される実施形態のいずれか１つに記載の、哺乳動物細胞などの宿主細胞、または本明細書において提供される実施形態のいずれか１つに記載の少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を、薬学的に許容される賦形剤中に含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該細胞はＴ細胞前駆細胞であり、これは造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記疾患は、がんまたはウイルス疾患である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記対象は、抗がん療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記対象は、抗ウイルス療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である。
前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞、または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品の投与前、投与中または投与後に、別の抗がん療法または抗ウイルス療法を前記対象に提供することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる細胞、または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品は、養子細胞移入によって前記対象に投与する。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる宿主細胞、または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品は、別の形態の抗がん療法または抗ウイルス療法で前記対象を処置した後に該対象に投与する。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、がんまたはウイルス感染症の治療のために、前記宿主細胞または前記組成物中の導入遺伝子の発現を誘導する薬物を投与することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、フルベストラントおよび／もしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記タモキシフェンは、１０ｍｇ／回、１１ｍｇ／回、１２ｍｇ／回、１３ｍｇ／回、１４ｍｇ／回、１５ｍｇ／回、１６ｍｇ／回、１７ｍｇ／回、１８ｍｇ／回、１９ｍｇ／回もしくは２０ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記フルベストラントは、２５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、３５０ｍｇ／回、４００ｍｇ／回、４５０ｍｇ／回もしくは５００ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記CMP8は、血清中の薬物濃度が３０ｎＭ、４０ｎＭもしくは５０ｎＭまたはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度となる用量範囲で投与される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記がんは、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記固形腫瘍は、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３��示されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
第９の態様において、がんまたはウイルス感染症の治療のための、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる哺乳動物細胞などの宿主細胞または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品と該宿主細胞中または該組成物中の導入遺伝子の発現を誘導する薬物との組み合わせの使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を、薬学的に許容される賦形剤中に含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、哺乳動物細胞などの該宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。前記使用の実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、フルベストラントおよび／もしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記使用の実施形態のいくつかにおいて、前記タモキシフェンは、１０ｍｇ／回、１１ｍｇ／回、１２ｍｇ／回、１３ｍｇ／回、１４ｍｇ／回、１５ｍｇ／回、１６ｍｇ／回、１７ｍｇ／回、１８ｍｇ／回、１９ｍｇ／回もしくは２０ｍｇ／回の用量��囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される。前記使用の実施形態のいくつかにおいて、前記フルベストラントは、２５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、３５０ｍｇ／回、４００ｍｇ／回、４５０ｍｇ／回もしくは５００ｍｇ／回の用量範囲、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の用量で投与される。前記使用の実施形態のいくつかにおいて、前記CMP8は、血清中の薬物濃度が３０ｎＭ、４０ｎＭもしくは５０ｎＭまたはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度となる用量範囲で投与される。前記使用の実施形態のいくつかにおいて、前記がんは、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である。前記使用の実施形態のいくつかにおいて、前記固形腫瘍は、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
第１０の態様において、がんまたはウイルス感染症を有する対象において細胞免疫療法を行う方法を提供する。該方法は、本明細書において提供される実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞、または本明細書において提供される実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品を前記対象に投与すること、および前記組成物中または前記宿主細胞中の導入遺伝子の発現を誘導する薬物を投与することを含む。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を、薬学的に許容される賦形剤中に含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該細胞はＴ細胞前駆細胞であり、これは造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記がんは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍から選択される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記固形腫瘍は、乳がん、脳腫瘍、肺がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
第１１の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる宿主細胞または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる少なくとも１種の組成物もしくは組み合わせ製品の、医薬品としての使用を提供する。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を、薬学的に許容される賦形剤中に含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少な��とも１つ以上の核酸配列によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ以上を含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つ以上によってコードされる。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。細胞においてキメラ��原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とする。
Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を増強させる少なくとも１個の変異を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能な前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、��列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。���明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。哺乳動物細胞などの前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。前記宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である宿主細胞を含み、さらに、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である別の宿主細胞を含む。前記組成物の実施形態のいくつかにおいて、該組成物は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球であるか、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である宿主細胞と、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である別の宿主細胞とを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCまたはVAR2CSAに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは配列番号１２４に示される配列によってコー��される。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ−１Ｆ】HEA3の（低親和性）単一変異RelAバリアントとHEA4の（高親和性）単一変異RelAバリアントを示し、これらのバリアントを細胞に形質導入し、4-OHTを投与した場合の応答を示す。薬物により構成的発現を誘導可能な転写因子と、（図１Ａ）HEA3単一変異RelAバリアントまたは（図１Ｂ）HEA4単一変異RelAバリアント（RelAタンパク質ドメイン上の位置でS536EまたはK310Qであり、これらは、HEA3およびHEA4においてS846EおよびK621Qにそれぞれ相当する）と、ZsGreen蛍光レポーターとが組み込まれたデュアルパッケージングレンチウイルス構築物の概要を図に示す。500nM 4-OHTの存在下において24時間培養した後の、（図１Ｃ）HEA3 RelAバリアントまたは（図１Ｄ）HEA4 RelAバリアントを発現するJurkat細胞におけるZsGreenレポーターの発現を示す。（図１Ｅ）HEA3 RelAバリアント発現Jurkat細胞または（図１Ｆ）HEA4 RelAバリアント発現Jurkat細胞におけるEGFRt+ZsGreen+細胞の割合（％）およびZsGreen蛍光強度の中央値として、4-OHTに対する用量反応性を示す。
【００２３】
【図２Ａ−２Ｅ】HEA4（高親和性）二重変異RelAバリアントおよびCMP8応答性HEA3 RelAバリアントを示し、これらのバリアントを細胞に形質導入し、4-OHTまたはCMP8を投与した場合の応答を示す。薬物により構成的発現を誘導可能な転写因子と、（図２Ａ）HEA4二重変異RelAバリアント（RelAタンパク質ドメイン上の位置でS536E/K310Qであり、これらは、HEA3およびHEA4においてS846EおよびK621Qにそれぞれ相当する）または（図２Ｂ）CMP8応答性HEA3単一変異RelAバリアント（S563E）と、ZsGreen蛍光レポーターとが組み込まれたデュアルパッケージングレンチウイルス構築物の概要を図に示す。500nM 4-OHTまたは500nM CMP8の存在下において24時間培養した後の、（図２Ｃ）HEA4二重変異RelAバリアントまたは（図２Ｄ）CMP8応答性HEA3 RelAバリアントを発現するJurkat細胞におけるZsGreenレポーターの発現を示す。（図２Ｅ）HEA4二重変異RelAバリアント発現Jurkat細胞または（図２Ｆ）CMP8応答性HEA3単一変異RelAバリアント発現Jurkat細胞におけるEGFRt+ZsGreen+細胞の割合（％）およびZsGreen蛍光強度の中央値として、4-OHTおよびCMP8に対する用量反応性を示す。
【００２４】
【図３Ａ−３Ｃ】薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と誘導型蛍光レポーターeGFP:fflucをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物を細胞に形質導入した結果を示す。図３Ａは、薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と誘導型蛍光レポーターeGFP:fflucをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物をCD4 Ｔ細胞およびCD8 Ｔ細胞に形質導入したことを示す。形質導入したCD4 Ｔ細胞およびCD8 Ｔ細胞を精製して増殖させた後、抗p65抗体を用いてウエスタンブロットを行い（図３Ｂ）、キメラ転写因子の発現を確認した。（図３Ｃ）フローサイトメトリーによって、ソーティングした細胞におけるEGFRtの発現を確認し、リガンドを誘導しない条件下でeGFPの発現漏れを調べた。
【００２５】
【図４Ａ−４Ｂ】薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と誘導型蛍光レポーターeGFP:fflucをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物を示し、このレンチウイルス構築物を細胞に形質導入した結果を示す。（図４Ａ）薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と誘導型蛍光レポーターeGFP:fflucをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物をCD4 Ｔ細胞およびCD8 Ｔ細胞に形質導入したことを示す。形質導入CD4 Ｔ細胞および形質導入CD8 Ｔ細胞を精製し増殖させた後、（図４Ｂ）0nM、30nMまたは500nMの4-OHTを添加して、抗CD3／抗CD28マイクロビーズ（ビーズ：細胞＝２：１）またはPMA（2μM）／イオノマイシン（20ng/mL）の存在下または非存在下において、これらのＴ細胞を24時間インキュベートした。次いで、eGFPの発現をフローサイトメトリーで定量した。
【００２６】
【図５Ａ−５Ｅ】薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と誘導型蛍光レポーターeGFP:fflucをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物を示し、このレンチウイルス構築物を細胞に形質導入した結果を示す。（図５Ａ）薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と誘導型蛍光レポーターeGFP:fflucをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物をCD4 Ｔ細胞およびCD8 Ｔ細胞に形質導入したことを示す。形質導入CD4 Ｔ細胞および形質導入CD8 Ｔ細胞を精製し増殖させた後、濃度を漸増しながら4-OHTを添加して、抗CD3／抗CD28マイクロビーズ（ビーズ：細胞＝２：１）またはPMA（2μM）／イオノマイシン（20ng/mL）の存在下または非存在下において、これらのＴ細胞を24時間インキュベートした。eGFPの発現をフローサイトメトリーで定量した。4-OHTで24時間処理した後の、（図５Ｂ）EGFRt+eGFP+CD4 Ｔ細胞および（図５Ｃ）EGFRt+eGFP+CD8 Ｔ細胞の割合（％）ならびに（図５Ｄ）CD4 Ｔ細胞および（図５Ｅ）CD8 Ｔ細胞におけるeGFP発現のMFIを示す。
【００２７】
【図６Ａ−６Ｄ】レンチウイルス構築物で形質導入した細胞の結果を示す。薬物により制御される転写因子（HEA4（p65/S536E/K310Q））と、切断可能な２Ａリンカーを介してHer2tGに連結された誘導型の（図６Ａ）キメラサイトカイン受容体（CCR（CD122））または（図６Ｂ）サバイビンとをコードするデュアルパッケージングレンチウイルス構築物を感染させてJurkat細胞を形質導入した。500nM 4-OHTで24時間処理した後の（図６Ｃ）CCR（CD122）および（図６Ｄ）サバイビンの発現を、Her2tGのアップレギュレーションにより調べた。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下の説明において、各用語は本明細書において一般的な通常の意味を有する。当業者であれば、本明細書全体を通して使用されている各用語を理解できるであろう。
【００２９】
本明細書において「約」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、測定値について述べる場合に使用してもよく、所定値から±２０％または±１０％の変動、より好ましくは±５％の変動、さらにより好ましくは±１％の変動、さらにより好ましくは±０．１％の変動を意味してもよい。
【００３０】
本明細書において「抗原」すなわち「Ａｇ」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、免疫応答を惹起する分子が挙げられるが、これに限定されない。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫担当細胞の活性化、またはこれらの両方に関与していてもよい。組換え技術により抗原を作製、合成および産生できること、または生体試料から抗原を得ることができることは容易に理解される。このような生体試料として、組織試料、腫瘍試料、細胞または体液（たとえば血液、血漿または腹水）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、キメラ抗原受容体によって認識されるリガンドは、免疫応答を惹起することができる抗原である。
【００３１】
本明細書において「抗腫瘍効果」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移巣の減少、余命の延長、またはがん状態と関連した様々な生理学的症状の減少によって示される生物学的効果が挙げられるが、これらに限定されない。また、「抗腫瘍効果」は再発の減少または再発までの時間の延長によって示すこともできる。
【００３２】
本明細書において「キメラ受容体」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、前記疾患または障害に関連する分子と結合する抗体配列またはその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインが、スペーサードメインを介して、Ｔ細胞受容体またはその他の受容体の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）に連結された合成設計受容体が挙げられるが、これに限定されない。キメラ受容体は、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、およびキメラ抗原受容体（CAR）とも呼ぶことができる。このようなCARは、免疫受容体を発現する細胞に任意の特異性を移植することができる遺伝子組換え受容体である。研究者によっては、キメラ抗原受容体（CAR）は、抗体または抗体断片、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであると理解されている。本明細書に記載のCARは、様々な構成要素またはドメイン（たとえばエピトープ結合領域（たとえば抗体断片、scFvまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）が遺伝子組換えされており、この遺伝子組換えによって驚くべき効果が得られたことから、各エレメントに注目した場合、本明細書全体においてCARの構成要素をそれぞれ別個のものとして明確に区別できることが多い。CARに含まれる様々なエレメントは様々なバリエーションを有することから、たとえば、このようなバリエーションによって、特定のエピトープまたは抗原に対する結合親和性が増強される。
【００３３】
本明細書において「一本鎖可変断片（scFv）」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、１０〜２５個のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドで連結された免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいてもよい融合タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。リンカーは、通常、柔軟性を持つようにグリシンに富んでいるとともに、溶解性を持つようにセリンまたはトレオニンに富んでおり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端を連結することができ、あるいは、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端を連結することができる。scFvは、定常領域が除去されており、リンカーが導入されているにも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性が保持されている。scFvは抗原に特異的である場合がある。本明細書において「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を惹起する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫担当細胞の活性化、またはこれらの両方に関与していてもよい。抗原は、組換え技術により作製、合成および産生することができ、あるいは生体試料から得ることもできる。このような生体試料として、組織試料、腫瘍試料、細胞または体液（たとえば血液、血漿または腹水）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において提供されるCARの実施形態のいくつかにおいて、該CARは、抗体断片、scFvまたはこれらの一部、たとえばCDRドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。この特定のscFvは、huCD19 scFv（G01S）と呼ばれ、配列番号４０によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaggtgcagctggtcgaatccggaggaggactggtccagcccggccggagcctgagactgagctgtgccgcttccggattcacttttgacgattacgcaatgcattgggtgaggcaggcccctggcaaggggctggaatgggtctccggaatctcttggaacagtgggcgcattggatatgccgattctgtgaagggccgattcactatctctcgggacaacgctaaaaatagtctgtttctgcagatgaattccctgcgcgccgaggataccgccgtgtactattgcgcccgagaccagggctaccactactatgatagcgccgaacatgcattcgacatttggggacagggaactgtggtcaccgtgagctccggaggaggaggaagcggaggaggagggtccggaggcgggggatcacagagcgcactgacccagccacggagcgtgagcggatttcctgggcagtctgtcaccattagttgcacaggcaccacatcagacgatgtgagctggtaccagcagcacccagggaaggctccccagctgatgctgtatgacgtgtccaaaagaccttctggcgtcccacataggtttagtggaagccggagcggccgggcagccagtctgatcatttcagggctgcagacagaggacgaagctgattatttctgttctagttacgcaggcagatataactctgtgctgtttggcgggggaacaaagctgactgtcctg）。いくつかの実施形態において、前記CARはscFvを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、CD20（CD20（Leu16））の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４４に示される配列によってコードされる（atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagctatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaaattacatggactggtaccagaagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagttttaatccacccacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggtgcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctggacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaaaggcaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggactattactgtgcaagatctaattattacggtagtagctactggttcttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca）。いくつかの実施形態において、前記CD20（Leu16）scFvは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む（METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、CD22（m971）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD22に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgattatgcagtatctgtgaaaagtcgaataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagagaagtgactggggatctcgaggatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcctcaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagtctccatcgtccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagccagaccatttggagctacttaaattggtatcagcagagaccagggaaagcccctaacctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcaggggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaagctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtatccctcagacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaact）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、CD22（m971）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。B7-H3受容体は、様々ながん細胞上に発現されることが知られている。このようながん細胞として、胃がん細胞、卵巣がん細胞および／または非小細胞肺がん細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記CARは、がんおよび／または炎症の治療または緩和において使用される。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４８に示される配列によってコードされる（atgctgcgtcggcggggcagccctggcatgggtgtgcatgtgggtgcagccctgggagcactgtggttctgcctcacaggagccctggaggtccaggtccctgaagacccagtggtggcactggtgggcaccgatgccaccctgtgctgctccttctcccctgagcctggcttcagcctggcacagctcaacctcatctggcagctgacagataccaaacagctggtgcacagctttgctgagggccaggaccagggcagcgcctatgccaaccgcacggccctcttcccggacctgctggcacagggcaacgcatccctgaggctgcagcgcgtgcgtgtggcggacgagggcagcttcacctgcttcgtgagcatccgggatttcggcagcgctgccgtcagcctgcaggtggccgctccctactcgaagcccagcatgaccctggagcccaacaaggacctgcggccaggggacacggtgaccatcacgtgctccagctaccagggctaccctgaggctgaggtgttctggcaggatgggcagggtgtgcccctgactggcaacgtgaccacgtcgcagatggccaacgagcagggcttgtttgatgtgcacagcatcctgcgggtggtgctgggtgcaaatggcacctacagctgcctggtgcgcaaccccgtgctgcagcaggatgcgcacagctctgtcaccatcacagggcagcctatgacattccccccagaggccctgtgggtgaccgtggggctgtctgtctgtctcattgcactgctggtggccctggctttcgtgtgctggagaaagatcaaacagagctgtgaggaggagaatgcaggagctgaggaccaggatggggagggagaaggctccaagacagccctgcagcctctgaaacactctgacagcaaagaagatgatggacaagaaatagcc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含む（MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５４に示される核酸配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccacaccctgctttcctgctgatccctgatgtgcagctgcaggaatcaggcccaagcctggtcaaaccctcccagtctctgagtctgacctgtacagtgactgggtactccatcacatctgatttcgcatggaactggattaggcagtttccaggcaataagctggagtggatgggctacatctcatatagcgggaacactcgctataatcccagtctgaaatcacggatcagcattactagagacaccagcaagaaccagttctttctgcagctgaattccgtgaccattgaggataccgccacatactattgcgtcacagctggcagaggctttccatactggggacagggcacactggtgactgtcagcgccggctccacctctgggagtggaaaacctggctccggggaaggatctacaaagggagacatcctgatgactcagtccccaagctccatgtcagtgagcctgggcgacaccgtctctattacatgtcactctagtcaggatatcaacagtaatattggctggctgcagcagcgacccggcaagtctttcaaagggctgatctatcatggaactaacctggacgatgaagtgcctagcagattttccggctctgggagtggagctgattacagtctgaccatttcaagcctggagtcagaagacttcgcagattactattgcgtccagtatgcccagttcccctggacttttggcgggggaaccaagctggagatcaaacgg）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVQLQESGPSLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGNTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTIEDTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSAGSTSGSGKPGSGEGSTKGDILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHSSQDINSNIGWLQQRPGKSFKGLIYHGTNLDDEVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIKR）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctataccatgtcttgggtgcgacaggcccctggacaagcgcttgagtggatgggaaccattagtagtcgtggtacttacacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaagctatctttactcactggggccgtggcaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcaaggcgagtcaggacattaataactatcacagctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatcgtgcaaacagattggtcgatggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtatggaacagattttaccctcacaattaataacatagaatctgaggatgctgcatattacttctgtctgaaatataatgtgtttccgtacacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSRGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTHWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYHSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYNVFPYTFGQGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctataccatgtcttgggtgcgacaggcccctggacaagcgcttgagtggatgggaaccattagtagtggtggtacttacacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaagctatctttacttactggggccgtggcaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcaaggcgagtcaggacattaataactatttaagctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatcgtgcaaacagattggtagatggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtatggaacagattttaccctcacaattaataacatagaatctgaggatgctgcatattacttctgtctgaaatatgatgtgtttccgtacacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaagcgtgctgacacagcctagctccgtgtctgccgcccctggccagaaagtgaccatcagctgtagcggcagcaccagcaacatcggcaacaactacgtgtcctggtatcagcagcaccccggcaaggcccccaagctgatgatctacgacgtgtccaagcggcccagcggcgtgcccgatagattttccggcagcaagagcggcaacagcgccagcctggatatcagcggcctgcagtctgaggacgaggccgactactattgcgccgcctgggacgatagcctgagcgagttcctgtttggcaccggcaccaagctgacagtgctgggcggaggcggaggatctggcggcggaggaagtggcggagggggatctcaggtgcagctggtggaaagcggcggcaacctggtgcagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcggcagcttcagcatgagctgggtgcgccaggctcctgggggaggactggaatgggtggcaggactgagcgccagaagcagcctgacccactacgccgatagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcgtgtacctgcagatgaacagcctgcgggtggaagataccgccgtgtactactgcgccagacggtcctacgacagcagcggctactggggccacttctacagctacatggacgtgtggggccagggcaccctcgtgacagtgtct）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPSVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、GD2（hu3F8）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaagcatcgtgatgacccagacccccaagttcctgctggtgagcgccggcgacagggtgaccatcacctgcaaggccagccagagcgtgagcaacgacgtgacctggtaccagcagaaggccggccagagccccaagctgctgatctacagcgccagcaacaggtacagcggcgtgcccgacaggttcaccggcagcggctacggcaccgccttcaccttcaccatcagcaccgtgcaggccgaggacctggccgtgtacttctgccagcaggactacagcagcttcggcggcggcaccaagctggagatcaagagg）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、GD2（hu3F8）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVTWYQQKAGQSPKLLIYSASNRYSGVPDRFTGSGYGTAFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSFGGGTKLEIKR）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、Her2（ハーセプチン）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６４に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttctcgcttctctggttccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggatccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagt）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、Her2（ハーセプチン）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13R2a（hu08）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６６に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtccccctcttctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtaaggccagtcaggatgtaggtactgctgtagcctggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctgctgatctactcggcatcctaccggtccactggcgtgccttccagattctccggctctggctctggcaccgatttcaccctgaccatctcctccctccagcctgaggatttcgccacctactactgccagcaccattatagtgctccgtggacgtttggcggcggaacaaaggtggagatcaagggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaggtgcagctggtggagtctggcggcggactggtgcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcctccggcttcaccttcagtaggaatggcatgtcttgggtgaggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtggccaccgttagtagtggtggtagttacatctactatgcagacagtgtgaaggggcggttcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtacctccagatgaactccctgagggccgaggataccgccgtgtactactgtgc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaggtgcagctggtggagtctggcggcggactggtgcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcctccggcttcaccttcagtaggaatggcatgtcttgggtgaggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtggccaccgttagtagtggtggtagttacatctactatgcagacagtgtgaaggggcggttcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtacctccagatgaactccctgagggccgaggataccgccgtgtactactgtgccagacaagggactacggcactagctacgaggttcttcgatgtctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctctggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgacatccagatgacccagtccccctcttctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtaaggccagtcaggatgtaggtactgctgtagcctggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctgctgatctactcggcatcctaccggtccactggcgtgccttccagattctccggctctggctctggcaccgatttcaccctgaccatctcctccctccagcctgaggatttcgccacctactactgccagcaccattatagtgctccgtggacgtttggcggcggaacaaaggtggagatcaaggaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaagaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７４に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggtacctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttcgcgagggacggttcaa）。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRF）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcaatctcttgcagatctagtcagagccttctaaaaaataatggaaacacctttttacattggtacctgcagaagtcaggccagtctccaaagctccttatctacaaagtttccaaccgactttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacatatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattccgtacacattcggaggggggaccaagctcgagctgaaacgaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtgctgcctggggattctctgagactctcctgtgcaacttctgagttcaccttcactgattactacatgacttgggtccgccagcctccaagaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacagagctaatggttacacaacagagtacaatccatctgtgaagggtcggttcaccatttccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagaactgaggacagtgccacttattactgtgcaagagtctctaactgggcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQPPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、ROR1（R12）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７８に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggaacagctcgtcgaaagcggcggcagactggtgacacctggcggcagcctgaccctgagctgcaaggccagcggcttcgacttcagcgcctactacatgagctgggtccgccaggcccctggcaagggactggaatggatcgccaccatctaccccagcagcggcaagacctactacgccacctgggtgaacggacggttcaccatctccagcgacaacgcccagaacaccgtggacctgcagatgaacagcctgacagccgccgaccgggccacctacttttgcgccagagacagctacgccgacgacggcgccctgttcaacatctggggccctggcaccctggtgacaatctctagcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgagctggtgctgacccagagcccctctgtgtctgctgccctgggaagccctgccaagatcacctgtaccctgagcagcgcccacaagaccgacaccatcgactggtatcagcagctgcagggcgaggcccccagatacctgatgcaggtgcagagcgacggcagctacaccaagaggccaggcgtgcccgaccggttcagcggatctagctctggcgccgaccgctacctgatcatccccagcgtgcaggccgatgacgaggccgattactactgtggcgccgactacatcggcggctacgtgttcggcggaggcacccagctgaccgtgaccggc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む（ROR1（R12）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca）。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD33に特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８２に示される配列によってコードされる（CD33（h2H12）VlVh scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VlVh scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８４に示される核酸配列によってコードされる（メソテリン（P4）scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaattctaggatcc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含む（メソテリン（P4）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８６に示される核酸配列によってコードされる（VAR2CSA（ID1-DBL2Xb）scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaagtctcacgaatgggtataagtgcgacaaatgcaaatcaggcacatcccggtccaaaaaaaaatggatctggaaaaagagcagcgggaatgaggagggcctgcaggaagaatacgctaacacaatcggactgccccctcgaactcaatctctgtaccttgggaacttgcctaaactggaaaacgtctgtgaagacgtcaaggacataaacttcgatacgaaagagaagttcctggctggatgccttatcgtgagctttcacgagggaaagaatctgaagaaaaggtacccacagaataaaaactctggcaataaagagaatttgtgcaaggccctggagtactcttttgcggactatggcgatctcataaagggcacaagcatctgggataatgagtataccaaggatctggagctgaatctgcagaataactttgggaaattgtttgggaagtatattaaaaaaaataataccgccgagcaggacacatcctactcttccctcgacgagctgcgggagtcatggtggaacaccaacaaaaagtatatctggacggcaatgaaacatggcgcggaaatgaatatcaccacttgtaatgcagacggctctgtcaccgggtccggttcttcttgcgatgatataccaaccatcgatttgattccgcagtatctgagatttctccaagagtgggtggaaaatttttgcgagcagaggcaagctaaggtcaaggacgtgatcaccaattgtaaaagttgcaaagaatcagggaacaagtgcaaaaccgagtgtaagacgaagtgcaaggacgaatgcgagaaatataaaaaattcatcgaggcttgtggaacagccgggggtgggattgggaccgcaggcagcccatggagcaagcggtgggaccaaatctataaacgatacagcaagcacatcgaagatgccaagcggaaccgcaaagctggcacaaaaaactgtgggactagcagcacgactaatgccgcggcaagcactgatgaaaataaatgcgtgcaaagtgacatcgactctttcttcaaacacctgatcgatatcggtcttactacgccaagcagctacctcagtaatgttctggatgataatatttgtggggcggacaaagcaccttggactacctacaccacctataccacaacagagaagtgtaataaagagagagacaaatcaaagtctcagagctctgatacactggtcgttgtgaatgtgccaagccctttggggaatacgccctacagatataaatac）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含む（VAR2CSA（ID1-DBL2Xb）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPSLTNGYKCDKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLVVVNVPSPLGNTPYRYKY）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５７】
「スペーサー」は「リンカー」とも呼ばれ、この用語は、本明細書において一般的な通常の意味を有し、たとえば、軽鎖と重鎖の間に位置する残基が挙げられるが、これに限定されない。スペーサーは10〜20アミノ酸長であってもよい（たとえば、少なくとも10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長もしくはこれら以上、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さであってもよい）。柔軟なスペーサーは、scFvドメインを様々な方向に向けさせることができるため、抗原結合特異性を最適化することができる。scFvドメインよりも前にシグナルペプチドを配置することができ、これによって、産生されたタンパク質を小胞体へと誘導して表面発現させ、この結果、切断を起こすことができる。また、柔軟なスペーサーは、scFvドメインを様々な方向に向けさせることができることから、抗原への結合を容易にすることができる。scFvドメインの特異的結合を可能とする良好なスペーサーは、経験則に基づいて決定することができ、scFvの抗原認識ドメインに左右される。いくつかの実施形態において、リンカーは、標的細胞に対するscFvドメインの結合が向上するように最適化されたスペーサー長を有しており、これによって細胞傷害性が増強されうる。いくつかの実施形態において、scFvドメインと膜貫通ドメインの間のリンカーすなわちスペーサーの長さは、25〜55アミノ酸長であってもよい（たとえば、25アミノ酸長、26アミノ酸長、27アミノ酸長、28アミノ酸長、29アミノ酸長、30アミノ酸長、31アミノ酸長、32アミノ酸長、33アミノ酸長、34アミノ酸長、35アミノ酸長、36アミノ酸長、37アミノ酸長、38アミノ酸長、39アミノ酸長、40アミノ酸長、41アミノ酸長、42アミノ酸長、43アミノ酸長、44アミノ酸長、45アミノ酸長、46アミノ酸長、47アミノ酸長、48アミノ酸長、49アミノ酸長、50アミノ酸長、51アミノ酸長、52アミノ酸長、53アミノ酸長、54アミノ酸長もしくは55アミノ酸長、もしくはこれら以上、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さであってもよい）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０２に示される核酸配列によってコードされる（IgG4ヒンジのヌクレオチド配列：gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4ヒンジのアミノ酸配列：ESKYGPPCPPCP）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０４に示される核酸配列によってコードされる（IgG4-CH2（L235D、N297Q）のヌクレオチド配列：gcccccgagttcgacggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttccagagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaag）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4-CH2（L235D、N297Q）のアミノ酸配列：APEFDGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０６に示される核酸配列によってコードされる（IgG4-CH3のヌクレオチド配列：ggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaag）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4 CH3のアミノ酸配列：GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０８に示される核酸配列によってコードされる（CD8ヒンジ／膜貫通ドメインのヌクレオチド配列：gaatctaagtacggaccggccaagcctaccaccacccctgcccctagacctccaacacccgccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgaggcccgaggcttgtagaccagctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacatgtggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcacc）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を含む（CD8ヒンジ／膜貫通ドメインのアミノ酸配列：ESKYGPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５８】
本明細書において「膜貫通ドメイン」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、タンパク質の膜貫通領域が挙げられるが、これに限定されない。膜貫通ドメインは、単一のαヘリックス、膜貫通型βバレル、βヘリックスまたはその他の構造であってもよい。本発明の実施形態のいくつかにおいて、前記膜貫通ドメインはCD28tmを含む。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号１１０に示される配列によってコードされる（CD28の膜貫通ドメインのヌクレオチド配列：atgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtg）。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を含む（CD28の膜貫通ドメインのアミノ酸配列：MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV）。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号１１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号１１２に示される配列によってコードされる（CD8ヒンジ／膜貫通ドメインのヌクレオチド配列：gaatctaagtacggaccggccaagcctaccaccacccctgcccctagacctccaacacccgccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgaggcccgaggcttgtagaccagctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacatgtggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcacc）。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を含む（CD8ヒンジ／膜貫通ドメインのアミノ酸配列：ESKYGPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT）。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号１１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００５９】
本明細書において「キメラサイトカイン受容体」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ケモカインまたはその一部のアミノ酸配列を有し、別のタンパク質と融合されたタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。
【００６０】
本明細書において「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、TCR/CD3複合体のCD3ζ鎖などによって提供される一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などの（ただしこれらに限定されない）Ｔ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分が挙げられるが、これに限定されない。共刺激ドメインとして、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原−１（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3などの分子全体、またはCD83と特異的に結合するリガンド全体、またはこれらの一部が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、他の細胞内メディエーターと相互作用することによって、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などの細胞応答を媒介する細胞内シグナル伝達ドメインである。本明細書に記載のシグナル伝達ドメインの実施形態のいくつかにおいて、該シグナル伝達ドメインは、CD3ζ細胞内ドメイン、CD28細胞内ドメイン、および／または4-1BBを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１４に示される核酸配列によってコードされる（CD3ζのヌクレオチド配列：cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg）。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１５に示されるアミノ酸配列を含む（CD3ζのアミノ酸配列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR）。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１６に示される核酸配列によってコードされる（4-1BBのヌクレオチド配列：aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg）。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を含む（4-1BBのアミノ酸配列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL）。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１８に示される配列によってコードされる（CD28の細胞内ドメインのヌクレオチド配列：cgcagcaagcggagcagaggcggccacagcgactacatgaacatgacccctagacggcctggccccaccagaaagcactaccagccctacgcccctccccgggactttgccgcctacagaagc）。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含む（CD28の細胞内ドメインのアミノ酸配列：RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS）。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００６１】
本明細書において「核酸」または「核酸分子」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られる断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られる断片などが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
【００６２】
本明細書において「ＤＮＡスペーサー」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヌクレオチドを含むスペーサーが挙げられるが、これに限定されない。ＤＮＡスペーサーは、たとえば、プロモーターと、該プロモーターの制御下にある発現対象の遺伝子の間に位置していてもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。本明細書において「コードする」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成するためのテンプレートとして機能する特性が挙げられるが、これに限定されない。したがって、特定の遺伝子に対応するｍＲＮＡが転写および翻訳されて、細胞またはその他の生物系においてタンパク質が産生された場合、その遺伝子はこのタンパク質をコードすると言える。「ポリペプチドをコードする核酸配列」としては、同じアミノ酸配列をコードするあらゆる縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【００６３】
「サバイビン」は、baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5（BIRC5）としても知られている。本明細書において「サバイビン」という用語は、一般的な通常の意味を有し、アポトーシスファミリー阻害薬のメンバーであるタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【００６４】
本明細書において「条件的」または「誘導可能」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、誘導因子の存在下で遺伝子を発現させるが、誘導因子の非存在下では実質的に遺伝子を発現させないプロモーターなどの核酸構築物が挙げられるが、これに限定されない。
【００６５】
本明細書において「構成的」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、継続的に産生されるポリペプチドを構成的に発現させるプロモーターなどの核酸構築物が挙げられるが、これに限定されない。
【００６６】
本明細書において「特異的」または「特異性」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、結合パートナーに対するリガンドの特性、またはリガンドに対する結合パートナーの特性を指してもよく、たとえば、相補的形状、静電結合に関与する特異性および疎水性結合に関与する特異性が挙げられるが、これらに限定されない。結合に関与する特異性としては、立体特異性、領域選択性、および化学選択性が挙げられる。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体をコードする核酸を作製する方法であって、所望または選択されたリガンドに特異的に結合するキメラ抗原受容体をコードする核酸を作製する方法を提供する。
【００６７】
本明細書において「TamR-tf」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、タモキシフェンにより制御される転写因子が挙げられるが、これに限定されない。タモキシフェンより制御される転写因子しては、野生型HEA3、野生型HEA4、変異型HEA3、変異型HEA4および／またはRelAバリアントを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書において「HEA3」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヒト由来サブユニットを含むキメラ転写因子であって、肝細胞核因子１−α（HNF-1α）のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインが、１個のアミノ酸置換（G521R）を含むエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来タモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインにインフレームで融合され、このタモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインがさらにNF-κBのp65活性化ドメイン（p65）に融合されており、前記アミノ酸置換が、エストラジオールの結合を抑制するが、エストロゲン類似体に対してはナノモルレベルでの感受性を付与することを特徴とするキメラ転写因子が挙げられるが、これに限定されない。
【００６９】
HEA3は、Roscilliら（Molecular Therapy, Vol. 6, Issue 5,pp. 653-663 (2002)）によって、新規な４−ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）依存性制御因子として報告されており、マウス骨格筋において遺伝子発現を長期にわたって制御することが示されている（Roscilli et al.；参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００７０】
本明細書において「HEA4」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヒト由来サブユニットを含むキメラ転写因子であって、肝細胞核因子１−α（HNF-1α）のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインが、３個のアミノ酸置換（G400V、M543A、L544A）を含むエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来タモキシフェン特異的リガンド結合ドメインにインフレームで融合され、このタモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインがさらにNF-κBのp65活性化ドメイン（p65）に融合されており、前記アミノ酸置換が、エストラジオールの結合を抑制するが、エストロゲン類似体に対してはナノモルレベルでの感受性を付与することを特徴とするキメラ転写因子が挙げられるが、これに限定されない。
【００７１】
本明細書において「制御」または「調節」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、生物学的プロセスを制御すること、または生物学的プロセス、生物学的経路、細胞プロセスもしくは細胞経路を改変もしくは制御することが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書において「細胞傷害性Ｔリンパ球」（CTL）という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、表面上にCD8を発現するＴリンパ球（たとえばCD8+Ｔ細胞）が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、そのような細胞は、抗原を経験したことのある「メモリー」Ｔ細胞（TM細胞）であることが好ましい。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される実施形態によるシステムを含む宿主細胞はCTL細胞である。
【００７３】
本明細書において「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「TCM」）という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、抗原を経験したCTLであり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にCD62L、CCR-7、および／またはCD45ROを発現するが、CD45RAは発現していないか、CD45RAの発現が低下しているCTLが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO、および／またはCD95の発現が陽性であるが、CD54RAの発現が低下していることがある。本明細書において「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「TEM」）は、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面上にCD62Lを発現していないか、CD62Lの発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較して、CD45RAを発現していないか、CD45RAの発現が低下しているＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、CD62Lおよび／またはCCR7の発現が陰性であり、CD28および／またはCD45RAの発現が陽性または陰性である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される実施形態によるシステムを含む宿主細胞はTCM細胞である。本明細書において提供される宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はセントラルメモリーＴ細胞である。
【００７４】
本明細書において「ナイーブ」Ｔ細胞という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、抗原を経験していないＴリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、CD62Lおよび／またはCD45RAを発現しており、CD45ROを発現していないＴリンパ球が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、CD62L、CCR7、CD28、CD127、および／またはCD45RAが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される実施形態によるシステムを含む宿主細胞はナイーブＴ細胞である。
【００７５】
本明細書において「エフェクター」Ｔ細胞または「TE」Ｔ細胞という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、CD62L、CCR7、および／もしくはCD28を発現していないか、またはCD62L、CCR7、および／もしくはCD28の発現が低下しており、かつグランザイムＢ陽性および／またはパーフォリンが陽性であるＴリンパ球が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される実施形態によるシステムを含む宿主細胞はエフェクターＴ細胞である。
【００７６】
本明細書において「濃縮された」および「除去された」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、混合物中の特定の種類の細胞の量を指す場合に使用され、「濃縮される」種類の細胞の数を増加させる方法もしくは工程、または「除去する」細胞の数を減少させる方法もしくは工程で処理された細胞混合物が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、濃縮工程で処理する細胞の由来に応じ、混合物または組成物中において「濃縮された」細胞が（細胞数）全体の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくはそれ以上を占めていてもよく、かつ／または「除去された」細胞が（細胞数）全体の４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％もしくはそれ以下を占めていてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる宿主細胞をインビトロで作製する方法を提供する。このインビトロにおける方法は、ａ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを提供すること；およびｂ）単離されたＴリンパ球集団に前記システムを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させることを含む。各Ｔリンパ球集団を増殖させるこの方法は、Ｔリンパ球集団を濃縮する方法である。
【００７７】
本明細書において「エピトープ」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、抗体、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含む免疫系によって認識される抗原または分子の一部が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープは、通常、少なくとも７個のアミノ酸を有し、線状であってもよく、高次構造を有していてもよい。本発明の実施形態のいくつかにおいて、抗体またはリガンド結合ドメインは、特定のエピトープに結合するように最適化することができる。当業者であれば、結合を最適化する技術を容易に理解できるであろう。たとえば、リガンド結合モチーフは、結合親和性および／またはエピトープの認識が向上するように、点突然変異によって最適化することができる。
【００７８】
本明細書において「単離された」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある他の成分から同定、分離かつ／または回収された様々なポリペプチドまたは核酸が挙げられるが、これらに限定されない。単離されたポリペプチドまたは核酸は、これらが本来関連する他の成分を全く含まないことが好ましい。単離されたポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある不純物は、通常、該ポリペプチドまたは核酸の診断用途または治療用途を妨害する物質であり、たとえば、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性の溶質または非タンパク質性の溶質が挙げられる。「単離された」という用語は、細胞の亜集団の単離について述べる場合にも使用することができ、たとえば、特定の用途のための細胞を作製する方法におけるCD4+Ｔリンパ球亜集団および／またはCD8+Ｔリンパ球亜集団の単離について述べる場合にも使用することができる。
【００７９】
本明細書において「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、リンパ球を活性化する分子（本明細書ではキメラ受容体分子）の１つ以上のドメイン全体またはその一部が挙げられるが、これらに限定されない。このような分子の細胞内ドメインは、細胞メディエーターと相互作用することによってシグナルを媒介し、増殖、分化、活性化、およびその他のエフェクター機能をもたらす。いくつかの実施形態において、このような分子として、CD28、CD3、もしくは4-1BBの全体もしくはその一部、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８０】
本明細書において「リガンド」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、別の物質と特異的に結合して複合体を形成する物質が挙げられるが、これに限定されない。リガンドとしては、抗原上のエピトープ、受容体に結合する分子、基質、阻害物質、ホルモン、および／または活性化物質が挙げられる。本明細書において「リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合する物質またはその一部を指す。リガンド結合ドメインとしては、抗体の抗原結合部分、受容体の細胞外ドメイン、および／または酵素の活性部位が挙げられる。本明細書において「作動可能に連結される」は、制御配列と異種核酸配列の間の機能的な連結を指し、これによって該異種核酸配列の発現が可能となる。たとえば、第１の核酸配列と第２の核酸配列が、機能的に関連して配置されている場合、該第１の核酸配列と該第２の核酸配列は、作動可能に連結されていると言える。たとえば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、該プロモーターは該コード配列に作動可能に連結されていると言える。通常、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質のコード領域を連結することが必要とされる場合、これらは同じリーディングフレーム内に存在する。
【００８１】
本明細書において「腫瘍特異的分子」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、腫瘍によって発現され、腫瘍に典型的な抗原、タンパク質または分子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、またはこれらの組み合わせである。
【００８２】
本明細書において「ウイルス分子」または「ウイルス特異的分子」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ウイルスのＲＮＡもしくはＤＮＡによってコードされるタンパク質、またはウイルス感染に応答して細胞によって発現される分子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。
【００８３】
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド配列における「アミノ酸配列同一性（％）」は、リガンド結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および／またはリンパ球活性化ドメインの候補配列中のアミノ酸残基が、それぞれの参照配列中のアミノ酸残基と一致しているパーセンテージとして定義される。このアミノ酸配列同一性は、配列同一性（％）の最大値を算出するため、配列をアラインし、必要に応じてギャップを挿入した後に算出されたものであり、保存的置換は配列同一性の一部として考慮していない。アミノ酸配列同一性（％）を決定するためのアラインメントは、当技術分野の範囲に含まれる様々な方法で行うことができ、たとえば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、Megalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピュータソフトウェアを使用して行うことができる。当業者であれば、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができ、このようなパラメータとしては、比較される複数の配列の全長にわたってアラインメントを最大とするのに必要な任意のアルゴリズムが挙げられる。たとえば、WU-BLAST-2コンピュータープログラム［Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)（参照により本明細書に援用される）］を用いてアミノ酸配列同一性（％）を算出するには、いくつかの検索パラメータを用いるが、それらのほとんどはデフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されないパラメータ（すなわち調整可能なパラメータ）は、overlap span=1、overlap fraction=0.125、word threshold (T) =11およびscoring matrix=BLOSUM62に設定される。アミノ酸配列同一性（％）は、（ａ）参照キメラ受容体配列のポリペプチドアミノ酸配列のすべてまたは各配列と比較対象の目的のアミノ酸配列との間で一致したアミノ酸残基の数をWU-BLAST-2で決定し、次いで（ｂ）目的のポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割ることによって決定される。いくつかの実施形態において、アミノ酸の配列同一性（％）または核酸の配列同一性（％）は、コンピュータソフトウェアによって決定される。
【００８４】
「実質的に精製された」は、目的の分子以外の他の分子や他の細胞が全体の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下しか存在しないことを指す。また、「実質的に精製された細胞」は、天然の状態において通常関連する他の種類の細胞から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。
【００８５】
正常細胞上の腫瘍抗原またはその他の分子の存在について述べる際に使用される「実質的に存在しない」という用語は、腫瘍抗原またはその他の分子を有する正常細胞のパーセンテージおよび／または正常細胞上の腫瘍抗原の密度を指す。いくつかの実施形態において、「実質的に存在しない」は、腫瘍抗原またはその他の分子が、腫瘍細胞またはその他の病変細胞と比較して、正常細胞の５０％未満にしか見られず、かつ／または正常細胞上のその密度が５０％未満であることを意味する。
【００８６】
本明細書において「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、任意の哺乳動物から得られたＴ細胞が挙げられ、サル、イヌおよび／またはヒトなどの霊長類から得られたＴ細胞であることが好ましいが、これらに限定されない。本明細書において提供される宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞はレシピエント対象と同種（同種であるが異なるドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞は自己由来である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は同系である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。
【００８７】
本明細書において「ベクター」または「構築物」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、様々な制御因子を含む細胞中に異種核酸を導入して、該細胞において該異種核酸を発現させるために使用される核酸が挙げられるが、これに限定されない。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母、トランスポゾンおよびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母、トランスポゾン、またはウイルスゲノムである。いくつかの実施形態において、前記トランスポゾンは、PiggyBacトランスポゾンである。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸および／または第２の核酸は、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。
【００８８】
本明細書において「導入遺伝子」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ある生物から別の生物に自然に移入された遺伝子もしくは遺伝物質、または遺伝子工学的手法によって、ある生物から別の生物に移入された遺伝子または遺伝物質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、細胞において導入遺伝子の発現を誘導可能な方法であって、
ａ）導入遺伝子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞を調節するタンパク質をコードする。
【００８９】
ウイルスベクターを使用して、遺伝物質を細胞内に送達することができる。ベクターの送達は、形質導入によって行うことができ、この技術は当業者に公知である。本発明の実施形態のいくつかにおいて、核酸を細胞に導入するために使用されるベクターは、アデノウイルス系ベクターまたはレンチウイルス系ベクターである。
【００９０】
本明細書において「ミニサークル」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、原核生物のベクター部分から切り出された環状の小さなプラスミド誘導体が挙げられるが、これに限定されない。ミニサークルは、発現ベクターとして機能することができ、哺乳動物細胞を遺伝子操作するための遺伝子導入担体として使用されている。ミニサークルは、細菌性ＤＮＡ配列を含んでいないことから、異物として認識される可能性が少なく、破壊されにくいという利点を有する。したがって、一般的な導入遺伝子の送達方法では、外来ＤＮＡを含むプラスミドが使用される。ミニサークルのサイズが小さいほどクローニング能力が向上し、ミニサークルを細胞に送達することが容易になる。本発明をなんら限定するものではないが、ミニサークルの作製は２工程で行うことができ、元となるプラスミド（真核生物由来のインサートを含む細菌性プラスミド）を大腸菌において作製する工程と、この工程の終了後、該大腸菌内において部位特異的リコンビナーゼを誘導する工程とを含んでいてもよい。これらの工程の後、前記インサートの両端に位置する２つのリコンビナーゼ標的配列を利用して、原核生物ベクターに由来する部分を切り取り、得られたミニサークル（レシピエント細胞を非常に有効に遺伝子組換えできる媒体）およびミニプラスミドをキャピラリーゲル電気泳動（CGE）により回収する。
【００９１】
精製されたミニサークルは、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは当業者に知られているその他の方法により、レシピエント細胞に移入可能である。従来のミニサークルは複製起点を欠いているため、標的細胞内で自己複製できず、コードされた遺伝子は細胞が分裂すると消失する（このことは、持続性発現を必要とする用途であるか、あるいは一過性発現を必要とする用途であるかによって、有利とも不利ともなりうる）。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、および該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークルである。
【００９２】
Sleeping Beauty（SB）やPiggyBacなどのトランスポゾンシステムを含むプラスミドは、ウイルスを使用せずに遺伝子をＴ細胞に安定に導入するためアプローチを提供する。近年、PiggyBacシステムを使用して複数のトランスポゾンを送達することによって、複数の目的の導入遺伝子を発現する安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞が作製された。哺乳動物細胞における使用を当初の目的としてIvicsおよび共同研究者らによって再び使われ始めたSBシステムは、Ｔ細胞免疫療法の臨床試験において遺伝子送達法として使用されてきた。SBを使用した遺伝子組み込みは、転写単位およびそれらの制御配列に対する選択性が、γ−レトロウイルスやレンチウイルスベクターよりも弱く、したがって、これらのウイルスよりも安全であると考えられる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、Sleeping Beautyシステムを含むミニサークルによる遺伝子組換えが想定される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、PiggyBacシステムを含むミニサークルによる遺伝子組換えが想定される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、Sleeping Beautyシステムを含むミニサークルによる遺伝子組換えが想定される。
【００９３】
本明細書において「アポトーシス」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、多細胞生物において起こりうるプログラム細胞死（PCD）のプロセスが挙げられるが、これに限定されない。生化学的事象によって、特徴的な細胞変化（形態変化）および細胞死が引き起こされる。このような変化としては、ブレブ形成、細胞収縮、核断片化、クロマチン凝集、および染色体のＤＮＡ断片化が挙げられる。アポトーシスにおいては、細胞がストレスに反応して細胞内アポトーシスシグナル伝達を開始し、これによって細胞の自殺が引き起こされる。グルココルチコイドの核受容体への結合、熱、放射線、栄養不足、ウイルス感染、低酸素状態、および、たとえば細胞膜の損傷などによる細胞内カルシウム濃度の増加はいずれも細胞に損傷を与え、細胞内アポトーシスシグナルの放出を誘起しうる。ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼなどの細胞内成分のいくつかもアポトーシスの制御を補助しうる。
【００９４】
酵素によって細胞死が実際に起こるには、アポトーシスシグナルの誘導によって制御タンパク質がアポトーシス経路を開始する必要がある。アポトーシスシグナルは、このようなプロセスにより細胞死を引き起こすが、細胞死が必要でなくなった場合は、このプロセスは停止する。アポトーシスにはいくつかのタンパク質が関与しているが、主に２種の制御方法が同定されている。一つは、ミトコンドリアの機能を標的とする方法であり、もう一つは、アダプタータンパク質を介してアポトーシス機構にアポトーシスシグナルを直接的に伝達する方法である。いくつかの毒素研究において、アポトーシスを開始させるための別の外因性経路が同定されており、薬物の活性により細胞内カルシウム濃度を増加させることによって、カルシウム結合プロテアーゼであるカルパインを介してアポトーシスが起こる。
【００９５】
アポトーシスは、様々な因子によって制御されうる。これらの因子として、IL-2を発現可能な遺伝子、IL-7を発現可能な遺伝子、IL-15を発現可能な遺伝子、ケモカイン受容体を発現可能な遺伝子、Bcl2を発現可能な遺伝子、CA-Aktを発現可能な遺伝子、dn-TGFβRIIIを発現可能な遺伝子、dn-SHP1/2を発現可能な遺伝子、および／またはPD-1 CD28キメラを発現可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。IL-15は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化および増殖を制御する。齧歯類のリンパ球において、IL-15は、アポトーシスの阻害因子であるBCL2L1/BCL-X(L)を誘導することによって、アポトーシスを抑制することが示された。同様に、セリアック病患者において、IL-15はBcl-2および／またはBCL-xLを誘導することによって、Ｔリンパ球のアポトーシスを抑制する。ヒトではBCL2遺伝子によってコードされるBcl-2（Ｂ細胞リンパ腫２）は、制御タンパク質であるBcl-2ファミリーのメンバーとして最初に見出されたタンパク質であり、Bcl-2ファミリーは、細胞死（アポトーシス）の誘導（プロアポトーシス）または抑制（抗アポトーシス）によって細胞死（アポトーシス）を制御する。特に、Bcl-2は重要な抗アポトーシスタンパク質として考えられており、がん遺伝子として分類されている。Aktとしても知られているプロテインキナーゼＢ（PKB）は、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写、細胞遊走などの様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしているセリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼである。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムであって、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量の前記薬物に応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、アポトーシスの制御またはチェックポイントシグナル伝達の制御を担う前記ポリペプチドは、IL-2、IL-7、IL-15、ケモカイン受容体、Bcl2、CA-Akt、dn-TGFβRIII、dn-SHP1/2またはPD-1-CD28キメラを含む。
【００９６】
本明細書において「チェックポイントシグナル伝達」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、特定の移行点における細胞周期の遮断、および／または細胞周期イベントが正確な順序で起こるようにするための各周期における監視が挙げられるが、これらに限定されない。チェックポイントシグナル伝達は、活性化することもできる。たとえば、チェックポイントシグナル伝達はＤＮＡの損傷によって誘導され、その損傷が修復されるまで細胞周期は進行しない（ただし、チェックポイントシグナル伝達の機能はこれに限定されない）。「細胞周期チェックポイント」は、真核細胞において細胞を適切に分裂させる制御機構である。それぞれの細胞周期では細胞の状態が評価され、各チェックポイントにおいて細胞周期が停止されうるが、細胞の状態が良好である場合は細胞周期が次々に進行する。現在、３種のチェックポイントが知られており、制限チェックポイントまたは開始チェックポイントとしても知られているG1チェックポイント；G2/Mチェックポイント；およびスピンドルチェックポイントとしても知られている中期チェックポイントがある。ストレスを受けた後に細胞周期の移行を制限し、かつ／または細胞死を誘導する生化学的経路は、細胞周期チェックポイントとして知られている。これらのチェックポイントは、ＤＮＡの複製、修復、および分裂の正確性を維持する。チェックポイントシグナル伝達を制御することができるポリペプチドとしては、p53、p107、p130、および転写抑制因子Rbが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記ポリペプチドは、p53、p107、p130または転写抑制因子Rbを含む。
【００９７】
本明細書において「負のチェックポイント制御因子」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、腫瘍を効果的に攻撃するＴ細胞応答を制限することができる因子が挙げられるが、これに限定されない。「負のチェックポイント制御因子」は、「負のチェックポイントシグナル伝達」とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記ポリペプチドは、PD-1、VISTA、LAG-3またはTIM3を含む負のチェックポイント制御因子である。いくつかの実施形態において、前記システムは、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であるか、または野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上している。
【００９８】
別の例においては、シグナル伝達経路の上流において増殖抑制刺激を媒介する細胞周期阻害因子であるCip/Kipファミリーに属するサイクリン-CDK阻害因子p21Cip1、p27Kip1およびp57Kip2が、細胞周期の制御以外の機能も備えた多機能タンパク質として見出されている。Cip/Kipタンパク質は、細胞周期の制御に加えて、アポトーシス、転写制御、細胞の運命決定、細胞遊走、および細胞骨格動態において重要な役割を果たしうる。複雑なリン酸化ネットワークがCip/Kipタンパク質の細胞内局在、タンパク質−タンパク相互作用および安定性を様々に変化させることによって、Cip/Kipタンパク質の機能を調節している。このような機能は、胚発生から腫瘍抑制にまで及ぶプロセスにおいて、正常細胞の維持および組織のホメオスタシスの維持に不可欠である。いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムの実施形態のいくつかにおいて、前記ポリペプチドはチェックポイントシグナル伝達を調節する。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記ポリペプチドは、負のチェックポイント制御因子を抑制する。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【００９９】
本明細書において「Ｔ細胞前駆細胞」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、胸腺へと遊走して、Ｔ細胞前駆細胞となることができ、Ｔ細胞受容体を発現していないリンパ球前駆細胞が挙げられるが、これに限定されない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に移行し、細胞分裂により増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。最も初期の胸腺細胞はCD4もCD8も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（CD4-CD8-）細胞に分類される。これらは成長により発達し、ダブルポジティブ胸腺細胞（CD4+CD8+）となり、最終的にシングルポジティブ（CD4+CD8-またはCD4-CD8+）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。
【０１００】
胸腺細胞の約９８％は、胸腺での発達過程においてポジティブ選択およびネガティブ選択により選抜されずに死滅し、残りの２％が生存して胸腺を去り、成熟した免疫担当Ｔ細胞になる。
【０１０１】
Ｔ細胞前駆細胞は、ダブルネガティブ（DN）段階においては主に機能的β鎖を産生し、ダブルポジティブ（DP）段階では主に機能的α鎖を産生し、その結果、最終的に機能性αβ Ｔ細胞受容体を産生する。４つのDN段階（DN1、DN2、DN3およびDN4）を経て胸腺細胞が発達するに従って、Ｔ細胞はインバリアントα鎖を発現するが、β鎖の遺伝子は再編成される。再編成されたβ鎖がインバリアントα鎖と対を為すことに成功した場合、β鎖の再編成を止めるシグナルが産生され（さらに、もう一方のアレルが抑制され）、細胞の増殖が起こる。これらのシグナルが産生されるには、この前駆TCRが細胞表面上に発現されていなければならないが、これらのシグナル自体は前駆TCRに結合するリガンドに依存する。このように発達した胸腺細胞はその後、CD4およびCD8の両方を発現し、α鎖が選択されるダブルポジティブ（DP）段階を経る。再編成β鎖がシグナル伝達を全くもたらさない場合（たとえば、インバリアントα鎖との対合ができなかった結果）、この細胞は無視され（シグナル伝達を受けることなく）、死滅すると考えられている。
【０１０２】
本明細書において「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、リンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、NK細胞など）などの骨髄系細胞に分化することができる前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。HSCは３種の幹細胞が存在する異種細胞集団であり、これらの幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞との比率（L/M）により区別される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む宿主細胞を提供する。本明細書において提供される宿主細胞の実施形態のいくつかにおいて、該宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１０３】
本開示は、導入遺伝子の発現のための誘導可能な因子、および導入遺伝子の発現のための構成的因子を有するシステムを提供する。このシステムは、形質導入された細胞に機能的特性を付与するための１つ以上の導入遺伝子の発現が制御されるように調整することができる。
【０１０４】
Ｔ細胞（CAR-T）養子療法（キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞）は、臨床試験において強力な抗腫瘍活性が示されているものの、顕著な毒性も認められている。たとえば、移植細胞により誘導されたサイトカインストーム（サイトカイン放出症候群）、腫瘍崩壊症候群（TLS）、および慢性的なＢ細胞の減少が起こることがあり、これらはいずれも構成的に発現されたCARが非制御下にその機能を発揮していることに起因する。そのような毒性によって、患者の一部では、CAR-Ｔ細胞を用いた養子療法の適用範囲が制限されることがある。導入遺伝子により改変した養子Ｔ細胞免疫療法を用いた臨床試験では、導入遺伝子を構成的に発現することができるＴ細胞が検討されており、このような導入遺伝子は常に「オン」の状態であり、導入遺伝子に関連する副作用の大部分に寄与している。たとえば、自殺遺伝子を使用したCAR-Ｔ細胞の排除などによるCAR-Ｔ細胞の排除方法によって、そのような毒性を低減することができるが、このアプローチは、抗腫瘍活性が十分に発揮される前にこれを低減させてしまう恐れがあり、治療有効性にもかなりの影響を与えうる。
【０１０５】
小分子により導入遺伝子の発現を制御する現在の技術は、マクロライド系抗生物質、エクジソン、ラパマイシン類似体などの様々な薬物による効果に依存するものである。しかし、このような薬物は、毒性のオフターゲット効果、望ましくない生体内分布および薬物動態プロファイル、狭い作動域、ならびに／またはFDA認可の市販医薬品であることによる入手制限などによって使用が制限されうる。さらに、このようなシステムの多くは、異種部分から構築されたキメラ転写制御因子を使用するため、このシステムをヒトの治療に使用すると、免疫性の合併症が引き起こされる。
【０１０６】
小分子によって制御される導入遺伝子の発現は、生体臨床医学、特にCAR Ｔ細胞免疫療法において非常に需要の高い技術である。これと競合するシステムでは、一般に、異種ドメインから構成されたキメラ転写因子と現在FDA未認可の誘導薬物が使用されている。
【０１０７】
したがって、キメラ抗原受容体の発現を誘導する薬物の有害な副作用を最小限に抑えつつ、インビボにおける生存および有効性が向上された細胞集団および治療活性に重要なキメラ受容体の発現を制御する方法を特定することが必要とされている。さらに、治療活性の向上、インビボでの生存および／もしくは有効性の向上、ならびに／または有害な副作用の最小化を目的として、細胞療法において使用される細胞を調節するための発現システムおよび方法も必要とされており、この発現システムおよび方法は、たとえば、前記細胞において発現されるCARなどの組換え抗原受容体および／またはその他の分子の発現を調節するための発現システムおよび方法であってもよい。本明細書では、驚くべきことに、有害な副作用を最小限に抑えることができ、かつインビボにおいて生存および治療有効性を向上させることができる方法について述べる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターの制御下にある導入遺伝子を提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体（CAR）をコードする。前記誘導型プロモーターは、細胞においてCARの発現を停止させること、および時間が経過してから（たとえば再発した場合などに）該細胞を再活性化することを可能とする能力を提供する。また、CAR Ｔ細胞において発現のオンとオフを周期的に切り替えることによって、Ｔ細胞受容体の持続的な刺激による疲弊および／またはアナジーを最小限に抑えることができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、遺伝子は、前記誘導型プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記遺伝子はキメラサイトカイン受容体をコードする。
【０１１０】
さらに、ベクターを設計することによって、形質導入細胞の１つ以上の機能持性を増強することができるさらなる導入遺伝子を導入することができ、これによって、形質導入細胞の抗腫瘍作用、生存および増殖などを増強することができる。いくつかの実施形態において、この導入遺伝子は誘導型プロモーターの制御下にある。このような導入遺伝子としては、生存および増殖を促進する遺伝子、アポトーシスを阻害する遺伝子、ならびにチェックポイントシグナル伝達を制御する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。このような遺伝子として、IL-2をコードする遺伝子、IL-15をコードする遺伝子、ケモカイン受容体をコードする遺伝子、Bcl2をコードする遺伝子、CA-Aktをコードする遺伝子、dn-TGFβRIIIをコードする遺伝子、dn-SHP1/2をコードする遺伝子、および／またはPD-1-CD28キメラをコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、IL-2をコードする遺伝子、IL-7をコードする遺伝子、IL-15をコードする遺伝子、ケモカイン受容体をコードする遺伝子、Bcl2をコードする遺伝子、キメラサイトカイン受容体をコードする遺伝子、CA-Aktをコードする遺伝子、dn-TGFβRIIIをコードする遺伝子、dn-SHP1/2をコードする遺伝子、および／またはPD-1-CD28キメラをコードする遺伝子である。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記遺伝子は、負のチェックポイント制御因子を抑制するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子は、前記誘導型プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号８８に示される核酸配列を含む（CCR（CD122）のヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacggaggcggtgggagcggaggcggtgggagcatgacaattctaggtacaacttttggcatggttttttctttacttcaagtcgtttctggagaaagtggctatgctcaaaatggagacttggaagatgcagaactggatgactactcattctcatgctatagccagttggaagtgaatggatcgcagcactcactgacctgtgcttttgaggacccagatgtcaacatcaccaatctggaatttgaaatatgtggggccctcgtggaggtaaagtgcctgaatttcaggaaactacaagagatatatttcatcgagacaaagaaattcttactgattggaaagagcaatatatgtgtgaaggttggagaaaagagtctaacctgcaaaaaaatagacctaaccactatagttaaacctgaggctccttttgacctgagtgtcatctatcgggaaggagccaatgactttgtggtgacatttaatacatcacacttgcaaaagaagtatgtaaaagttttaatgcacgatgtagcttaccgccaggaaaaggatgaaaacaaatggacgcatgtgaatttatccagcacaaaactgacactcctgcagagaaagctccaaccggcagcaatgtatgagattaaagttcgatccatccctgatcactattttaaaggcttctggagtgaatggagtccaagttattacttcagaactccagagatcaataatagctcaggggagatggatcctatcttactaaccatcagcattttgagttttttctctgtcgctctgttggtcatcttggcctgtgtgttatggaactgcaggaacaccgggccatggctgaagaaggtcctgaagtgtaacaccccagacccctcgaagttcttttcccagctgagctcagagcatggaggagacgtccagaagtggctctcttcgcccttcccctcatcgtccttcagccctggcggcctggcacctgagatctcgccactagaagtgctggagagggacaaggtgacgcagctgctcctgcagcaggacaaggtgcctgagcccgcatccttaagcagcaaccactcgctgaccagctgcttcaccaaccagggttacttcttcttccacctcccggatgccttggagatagaggcctgccaggtgtactttacttacgacccctactcagaggaagaccctgatgagggtgtggccggggcacccacagggtcttccccccaacccctgcagcctctgtcaggggaggacgacgcctactgcaccttcccctccagggatgacctgctgctcttctcccccagtctcctcggtggccccagccccccaagcactgcccctgggggcagtggggccggtgaagagaggatgcccccttctttgcaagaaagagtccccagagactgggacccccagcccctggggcctcccaccccaggagtcccagacctggtggattttcagccaccccctgagctggtgctgcgagaggctggggaggaggtccctgacgctggccccagggagggagtcagtttcccctggtccaggcctcctgggcagggggagttcagggcccttaatgctcgcctgcccctgaacactgatgcctacttgtccctccaagaactccagggtcaggacccaactcacttggtg）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号８９に示されるアミノ酸配列をコードする（CCR（CD122）のアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHGGGGSGGGGSMTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVIYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号９０に示される核酸配列を含む（PD1ECD-IFNαのヌクレオチド配列：atgcagatccctcaggccccttggcctgtcgtgtgggctgtgctgcagctgggatggcggcctggctggtttctggacagccccgacagaccctggaacccccctacattttcccctgccctgctggtcgtgaccgagggcgacaatgccaccttcacctgtagcttcagcaacaccagcgagagcttcgtgctgaactggtacagaatgagccccagcaaccagaccgacaagctggccgccttccccgaggatagatctcagcccggccaggactgccggttcagagtgacccagctgcccaacggccgggacttccacatgtctgtcgtgcgggccagacggaacgacagcggcacatatctgtgcggcgccatcagcctggcccccaaggcccagatcaaagagagcctgagagccgagctgagagtgaccgagagaagggccgaagtgcctaccgcccaccctagcccatctccaagacctgccggccagttccagacactcgtgggcggaggatgcgacctgcctcagacacacagcctgggcagcagacggaccctgatgctgctggcccagatgcggaagatcagcctgttcagctgcctgaaggaccggcacgacttcggcttccctcaggaagagttcggcaaccagtttcagaaggccgagacaatccccgtgctgcacgagatgatccagcagatcttcaacctgttctccaccaaggacagcagcgccgcctgggacgagacactgctggacaagttctacaccgagctgtaccagcagctgaatgacctggaagcctgcgtgatccagggcgtgggcgtgacagagacacccctgatgaaggaagatagcatcctggccgtgcgcaagtacttccagcggatcaccctgtacctgaaagagaagaagtacagcccctgcgcctgggaggtcgtgcgcgccgagatcatgagaagcttcagcctgagcaccaacctgcaggaaagcctgcggagcaaagaa）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９１に示されるアミノ酸配列をコードする（PD1ECD-IFNαのアミノ酸配列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVGGGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号９２に示される核酸配列を含む（STAT5aのヌクレオチド配列：atggcgggctggatccaggcccagcagctgcagggagacgcgctgcgccagatgcaggtgctgtacggccagcacttccccatcgaggtccggcactacttggcccagtggattgagagccagccatgggatgccattgacttggacaatccccaggacagagcccaagccacccagctcctggagggcctggtgcaggagctgcagaagaaggcggagcaccaggtgggggaagatgggtttttactgaagatcaagctggggcactacgccacgcagctccagaaaacatatgaccgctgccccctggagctggtccgctgcatccggcacattctgtacaatgaacagaggctggtccgagaagccaacaattgcagctctccggctgggatcctggttgacgccatgtcccagaagcaccttcagatcaaccagacatttgaggagctgcgactggtcacgcaggacacagagaatgagctgaagaaactgcagcagactcaggagtacttcatcatccagtaccaggagagcctgaggatccaagctcagtttgcccagctggcccagctgagcccccaggagcgtctgagccgggagacggccctccagcagaagcaggtgtctctggaggcctggttgcagcgtgaggcacagacactgcagcagtaccgcgtggagctggccgagaagcaccagaagaccctgcagctgctgcggaagcagcagaccatcatcctggatgacgagctgatccagtggaagcggcggcagcagctggccgggaacggcgggccccccgagggcagcctggacgtgctacagtcctggtgtgagaagttggccgagatcatctggcagaaccggcagcagatccgcagggctgagcacctctgccagcagctgcccatccccggcccagtggaggagatgctggccgaggtcaacgccaccatcacggacattatctcagccctggtgaccagcacattcatcattgagaagcagcctcctcaggtcctgaagacccagaccaagtttgcagccaccgtacgcctgctggtgggcgggaagctgaacgtgcacatgaatcccccccaggtgaaggccaccatcatcagtgagcagcaggccaagtctctgcttaaaaatgagaacacccgcaacgagtgcagtggtgagatcctgaacaactgctgcgtgatggagtaccaccaagccacgggcaccctcagtgcccacttcaggaacatgtcactgaagaggatcaagcgtgctgaccggcggggtgcagagtccgtgacagaggagaagttcacagtcctgtttgagtctcagttcagtgttggcagcaatgagcttgtgttccaggtgaagactctgtccctacctgtggttgtcatcgtccacggcagccaggaccacaatgccacggctactgtgctgtgggacaatgcctttgctgagccgggcagggtgccatttgccgtgcctgacaaagtgctgtggccgcagctgtgtgaggcgctcaacatgaaattcaaggccgaagtgcagagcaaccggggcctgaccaaggagaacctcgtgttcctggcgcagaaactgttcaacaacagcagcagccacctggaggactacagtggcctgtccgtgtcctggtcccagttcaacagggagaacttgccgggctggaactacaccttctggcagtggtttgacggggtgatggaggtgttgaagaagcaccacaagccccactggaatgatggggccatcctaggttttgtgaataagcaacaggcccacgacctgctcatcaacaagcccgacgggaccttcttgttgcgctttagtgactcagaaatcgggggcatcaccatcgcctggaagtttgattccccggaacgcaacctgtggaacctgaaaccattcaccacgcgggatttctccatcaggtccctggctgaccggctgggggacctgagctatctcatctatgtgtttcctgaccgccccaaggatgaggtcttctccaagtactacactcctgtgctggctaaagctgttgatggatatgtgaaaccacagatcaagcaagtggtccctgagtttgtgaatgcatctgcagatgctgggggcagcagcgccacgtacatggaccaggccccctccccagctgtgtgcccccaggctccctataacatgtacccacagaaccctgaccatgtactcgatcaggatggagaattcgacctggatgagaccatggatgtggccaggcacgtggaggaactcttacgccgaccaatggacagtcttgactcccgcctctcgccccctgccggtcttttcacctctgccagaggctccctctca）。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９３に示されるアミノ酸配列をコードする（STAT5aのアミノ酸配列：MAGWIQAQQLQGDALRQMQVLYGQHFPIEVRHYLAQWIESQPWDAIDLDNPQDRAQATQLLEGLVQELQKKAEHQVGEDGFLLKIKLGHYATQLQKTYDRCPLELVRCIRHILYNEQRLVREANNCSSPAGILVDAMSQKHLQINQTFEELRLVTQDTENELKKLQQTQEYFIIQYQESLRIQAQFAQLAQLSPQERLSRETALQQKQVSLEAWLQREAQTLQQYRVELAEKHQKTLQLLRKQQTIILDDELIQWKRRQQLAGNGGPPEGSLDVLQSWCEKLAEIIWQNRQQIRRAEHLCQQLPIPGPVEEMLAEVNATITDIISALVTSTFIIEKQPPQVLKTQTKFAATVRLLVGGKLNVHMNPPQVKATIISEQQAKSLLKNENTRNECSGEILNNCCVMEYHQATGTLSAHFRNMSLKRIKRADRRGAESVTEEKFTVLFESQFSVGSNELVFQVKTLSLPVVVIVHGSQDHNATATVLWDNAFAEPGRVPFAVPDKVLWPQLCEALNMKFKAEVQSNRGLTKENLVFLAQKLFNNSSSHLEDYSGLSVSWSQFNRENLPGWNYTFWQWFDGVMEVLKKHHKPHWNDGAILGFVNKQQAHDLLINKPDGTFLLRFSDSEIGGITIAWKFDSPERNLWNLKPFTTRDFSIRSLADRLGDLSYLIYVFPDRPKDEVFSKYYTPVLAKAVDGYVKPQIKQVVPEFVNASADAGGSSATYMDQAPSPAVCPQAPYNMYPQNPDHVLDQDGEFDLDETMDVARHVEELLRRPMDSLDSRLSPPAGLFTSARGSLS）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号９４に示される核酸配列を含む（構成的に活性なSTAT5aのヌクレオチド配列：atggcgggctggatccaggcccagcagctgcagggagacgcgctgcgccagatgcaggtgctgtacggccagcacttccccatcgaggtccggcactacttggcccagtggattgagagccagccatgggatgccattgacttggacaatccccaggacagagcccaagccacccagctcctggagggcctggtgcaggagctgcagaagaaggcggagcaccaggtgggggaagatgggtttttactgaagatcaagctggggcactacgccacgcagctccagaaaacatatgaccgctgccccctggagctggtccgctgcatccggcacattctgtacaatgaacagaggctggtccgagaagccaacaattgcagctctccggctgggatcctggttgacgccatgtcccagaagcaccttcagatcaaccagacatttgaggagctgcgactggtcacgcaggacacagagaatgagctgaagaaactgcagcagactcaggagtacttcatcatccagtaccaggagagcctgaggatccaagctcagtttgcccagctggcccagctgagcccccaggagcgtctgagccgggagacggccctccagcagaagcaggtgtctctggaggcctggttgcagcgtgaggcacagacactgcagcagtaccgcgtggagctggccgagaagcaccagaagaccctgcagctgctgcggaagcagcagaccatcatcctggatgacgagctgatccagtggaagcggcggcagcagctggccgggaacggcgggccccccgagggcagcctggacgtgctacagtcctggtgtgagaagttggccgagatcatctggcagaaccggcagcagatccgcagggctgagcgcctctgccagcagctgcccatccccggcccagtggaggagatgctggccgaggtcaacgccaccatcacggacattatctcagccctggtgaccagcacattcatcattgagaagcagcctcctcaggtcctgaagacccagaccaagtttgcagccaccgtacgcctgctggtgggcgggaagctgaacgtgcacatgaatcccccccaggtgaaggccaccatcatcagtgagcagcaggccaagtctctgcttaaaaatgagaacacccgcaacgagtgcagtggtgagatcctgaacaactgctgcgtgatggagtaccaccaagccacgggcaccctcagtgcccacttcaggaacatgtcactgaagaggatcaagcgtgctgaccggcggggtgcagagtccgtgacagaggagaagttcacagtcctgtttgagtctcagttcagtgttggcagcaatgagcttgtgttccaggtgaagactctgtccctacctgtggttgtcatcgtccacggcagccaggaccacaatgccacggctactgtgctgtgggacaatgcctttgctgagccgggcagggtgccatttgccgtgcctgacaaagtgctgtggccgcagctgtgtgaggcgctcaacatgaaattcaaggccgaagtgcagagcaaccggggcctgaccaaggagaacctcgtgttcctggcgcagaaactgttcaacaacagcagcagccacctggaggactacagtggcctgtccgtgtcctggtcccagttcaacagggagaacttgccgggctggaactacaccttctggcagtggtttgacggggtgatggaggtgttgaagaagcaccacaagccccactggaatgatggggccatcctaggttttgtgaataagcaacaggcccacgacctgctcatcaacaagcccgacgggaccttcttgttgcgctttagtgactcagaaatcgggggcatcaccatcgcctggaagtttgattccccggaacgcaacctgtggaacctgaaaccattcaccacgcgggatttctccatcaggtccctggctgaccggctgggggacctgagctatctcatctatgtgtttcctgaccgccccaaggatgaggtcttctccaagtactacactcctgtgctggctaaagctgttgatggatatgtgaaaccacagatcaagcaagtggtccctgagtttgtgaatgcatttgcagatgctgggggcagcagcgccacgtacatggaccaggccccctccccagctgtgtgcccccaggctccctataacatgtacccacagaaccctgaccatgtactcgatcaggatggagaattcgacctggatgagaccatggatgtggccaggcacgtggaggaactcttacgccgaccaatggacagtcttgactcccgcctctcgccccctgccggtcttttcacctctgccagaggctccctctca）。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９５に示されるアミノ酸配列をコードする（構成的に活性なSTAT5aのアミノ酸配列：MAGWIQAQQLQGDALRQMQVLYGQHFPIEVRHYLAQWIESQPWDAIDLDNPQDRAQATQLLEGLVQELQKKAEHQVGEDGFLLKIKLGHYATQLQKTYDRCPLELVRCIRHILYNEQRLVREANNCSSPAGILVDAMSQKHLQINQTFEELRLVTQDTENELKKLQQTQEYFIIQYQESLRIQAQFAQLAQLSPQERLSRETALQQKQVSLEAWLQREAQTLQQYRVELAEKHQKTLQLLRKQQTIILDDELIQWKRRQQLAGNGGPPEGSLDVLQSWCEKLAEIIWQNRQQIRRAERLCQQLPIPGPVEEMLAEVNATITDIISALVTSTFIIEKQPPQVLKTQTKFAATVRLLVGGKLNVHMNPPQVKATIISEQQAKSLLKNENTRNECSGEILNNCCVMEYHQATGTLSAHFRNMSLKRIKRADRRGAESVTEEKFTVLFESQFSVGSNELVFQVKTLSLPVVVIVHGSQDHNATATVLWDNAFAEPGRVPFAVPDKVLWPQLCEALNMKFKAEVQSNRGLTKENLVFLAQKLFNNSSSHLEDYSGLSVSWSQFNRENLPGWNYTFWQWFDGVMEVLKKHHKPHWNDGAILGFVNKQQAHDLLINKPDGTFLLRFSDSEIGGITIAWKFDSPERNLWNLKPFTTRDFSIRSLADRLGDLSYLIYVFPDRPKDEVFSKYYTPVLAKAVDGYVKPQIKQVVPEFVNAFADAGGSSATYMDQAPSPAVCPQAPYNMYPQNPDHVLDQDGEFDLDETMDVARHVEELLRRPMDSLDSRLSPPAGLFTSARGSLS）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号９６に示される核酸配列を含む（ドミナントネガティブTGFbRIIのヌクレオチド配列：atgggtcgggggctgctcaggggcctgtggccgctgcacatcgtcctgtggacgcgtatcgccagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggaaaaaaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaagtgacaggcatcagcctcctgccaccactgggagttgccatatctgtcatcatcatcttctactgctaccgcgttaaccggcagcagaagctgagttcaacctgggaaaccggcaagacgcggaagctcatggagttcagcgagcactgtgccatcatcctggaagatgaccgctctgacatcagctccacgtgtgccaacaacatcaaccacaacacagagctgctgcccattgagctggacaccctggtggggaaaggtcgctttgctgaggtctataaggccaagctgaagcagaacacttcagagcagtttgagacagtggcagtcaagatcttt）。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９７に示されるアミノ酸配列をコードする（ドミナントネガティブTGFbRIIのアミノ酸配列：MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIF）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号９８に示される核酸配列を含む（ドミナントネガティブSHP1のヌクレオチド配列：atggtgaggtggtttcaccgagacctcagtgggctggatgcagagaccctgctcaagggccgaggtgtccacggtagcttcctggctcggcccagtcgcaagaaccagggtgacttctcgctctccgtcagggtgggggatcaggtgacccatattcggatccagaactcaggggatttctatgacctgtatggaggggagaagtttgcgactctgacagagctggtggagtactacactcagcagcagggtgtcctgcaggaccgcgacggcaccatcatccacctcaagtacccgctgaactgctccgatcccactagtgagaggtggtaccatggccacatgtctggcgggcaggcagagacgctgctgcaggccaagggcgagccctggacgtttcttgtgcgtgagagcctcagccagcctggagacttcgtgctttctgtgctcagtgaccagcccaaggctggcccaggctccccgctcagggtcacccacatcaaggtcatgtgcgagggtggacgctacacagtgggtggtttggagaccttcgacagcctcacggacctggtggagcatttcaagaagacggggattgaggaggcctcaggcgcctttgtctacctgcggcagccgtactatgccacgagggtgaatgcggctgacattgagaaccgagtgttggaactgaacaagaagcaggagtccgaggatacagccaaggctggcttctgggaggagtttgagagtttgcagaagcaggaggtgaagaacttgcaccagcgtctggaagggcagcggccagagaacaagggcaagaaccgctacaagaacattctcccctttgaccacagccgagtgatcctgcagggacgggacagtaacatccccgggtccgactacatcaatgccaactacatcaagaaccagctgctaggccctgatgagaacgctaagacctacatcgccagccagggctgtctggaggccacggtcaatgacttctggcagatggcgtggcaggagaacagccgtgtcatcgtcatgaccacccgagaggtggagaaaggccggaacaaatgcgtcccatactggcccgaggtgggcatgcagcgtgcttatgggccctactctgtgaccaactgcggggagcatgacacaaccgaatacaaactccgtaccttacaggtctccccgctggacaatggagacctgattcgggagatctggcattaccagtacctgagctggcccgaccatggggtccccagtgagcctgggggtgtcctcagcttcctggaccagatcaaccagcggcaggaaagtctgcctcacgcagggcccatcatcgtgcactccagcgccggcatcggccgcacaggcaccatcattgtcatcgacatgctcatggagaacatctccaccaagggcctggactgtgacattgacatccagaagaccatccagatggtgcgggcgcagcgctcgggcatggtgcagacggaggcgcagtacaagttcatctacgtggccatcgcccagttcattgaaaccactaagaagaagctggaggtcctgcagtcgcagaagggccaggagtcggagtacgggaacatcacctatcccccagccatgaagaatgcccatgccaaggcctcccgcacctcgtccaaacacaaggaggatgtgtatgagaacctgcacactaagaacaagagggaggagaaagtgaagaagcagcggtcagcagacaaggagaagagcaagggttccctcaagaggaagtga）。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９９に示されるアミノ酸配列をコードする（ドミナントネガティブSHP1のアミノ酸配列：MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFATLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTIIHLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYYATRVNAADIENRVLELNKKQESEDTAKAGFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHSSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKLEVLQSQKGQESEYGNITYPPAMKNAHAKASRTSSKHKEDVYENLHTKNKREEKVKKQRSADKEKSKGSLKRK）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号９９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号１００に示される核酸配列を含む（PD1TM-MyD88のヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggcggaggagtgggagtcgtgggcggactgctgggatctctggtgctgctcgtgtgggtgctggccgtgattggcggaggaatggctgctggcggacctggcgctggatctgctgctcctgtgtctagcaccagcagcctgcctctggccgccctgaatatgagagtgcggcggagactgagcctgttcctgaacgtgcggacacaggtggccgccgattggacagctctggccgaggaaatggacttcgagtacctggaaatccggcagctggaaacccaggccgaccctacaggacgcctgctggatgcttggcagggcagaccaggcgcttctgtggggagactgctggaactgctgaccaagctgggccgggacgacgtgctgctggaactgggccctagcatcgaagaggactgccagaagtacatcctgaagcagcagcaggaagaggccgagaagcctctgcaggtggcagccgtggatagcagcgtgccaagaacagctgagctggccggaatcaccaccctggacgatcctctgggccacatgcccgagagattcgacgccttcatctgctactgccccagcgacatccagttcgtgcaggaaatgatcagacagctggaacagaccaactaccggctgaagctgtgcgtgtccgaccgggatgtgctgcctggcacctgtgtgtggtctatcgccagcgagctgatcgagaagcggtgcagacggatggtcgtggtggtgtccgacgactacctgcagtccaaagagtgcgacttccagaccaagttcgccctgagcctgagccctggcgcccaccagaagagactgatccccatcaagtacaaggccatgaagaaagagttccccagcatcctgcggttcatcaccgtgtgcgactacaccaacccctgcaccaagtcctggttctggaccagactggccaaggccctgtctctgcct）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記遺伝子は、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列をコードする（PD1TM-MyD88のアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGGGVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVIGGGMAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDIQFVQEMIRQLEQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDDYLQSKECDFQTKFALSLSPGAHQKRLIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTRLAKALSL）。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記配列は、配列番号１０１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【０１２１】
本開示は、第１の核酸および第２の核酸を含むシステム、ならびにこれらの核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。第１の核酸および第２の核酸はそれぞれいくつかのモジュール部分を含み、これらのモジュール部分は切断して別のモジュール部分と置換することができ、このようにして特定の標的細胞に対して前記システムをカスタマイズすることができる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、必要に応じて遺伝子（たとえばキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド）の発現のオンとオフを切り替えて発現制御を行う誘導型プロモーターを含み、前記システムは、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であるか、または野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上している。別の実施形態において、第２の核酸は、転写活性化因子を発現させるための構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、前記遺伝子は、（単一のプラスミドによってコードされた）キメラ抗原受容体および転写活性化因子をコードする。
【０１２２】
誘導システム
本開示は、哺乳動物細胞などの細胞における導入遺伝子の発現制御に有用なシステムを提供する。このような導入遺伝子としては、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子、親和性成熟を経たＴ細胞受容体をコードする遺伝子、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子、ケモカイン受容体をコードする遺伝子、キメラケモカイン受容体をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、アポトーシスを抑制する遺伝子、および／またはチェックポイントシグナル伝達を調節する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記ポリペプチドは、負のチェックポイント制御因子を抑制する。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、前記核酸の構成要素を容易に置換できる様々なモジュール部分を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、哺乳動物細胞などの細胞において導入遺伝子の発現を制御することができ、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であるか、または野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上している。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体、親和性成熟を経たＴ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ケモカイン受容体、キメラケモカイン受容体、サイトカイン、アポトーシスを制御する遺伝子、および／またはチェックポイントシグナル伝達を調節する遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記遺伝子は、負のチェックポイント制御因子を抑制するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムであって、
第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的抗原を標的分子とするリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、最適化されていてもよいポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で述べるように、発現ベクターは第１の核酸および／または第２の核酸を含む。前記キメラ受容体をコードする核酸全体またはその一部によってコードされるポリペプチドはいずれも本発明に包含される。
【０１２５】
別の実施形態において、第１の核酸は、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含み、該第１核酸は、細胞の生存および増殖を促進する遺伝子、アポトーシスを制御する遺伝子、ならびに／またはチェックポイントシグナル伝達を調節する遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。このような遺伝子として、IL-2をコードする遺伝子、IL-7をコードする遺伝子、IL-15をコードする遺伝子、ケモカイン受容体をコードする遺伝子、キメラケモカイン受容体をコードする遺伝子、Bcl2をコードする遺伝子、CA-Aktをコードする遺伝子、dn-TGFβRIIIをコードする遺伝子、dn-SHP1/2をコードする遺伝子および／またはPD-1-CD28キメラをコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記遺伝子は、負のチェックポイント制御因子を抑制するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。
【０１２７】
誘導型プロモーター
本発明のシステムは、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含む第１の核酸を含む。誘導型プロモーターを利用することによって、導入遺伝子の発現のオンとオフとを切り替えることができ、その結果、毒性による副作用を回避することができ、かつ／または寛解期には細胞を休止させることができる。誘導型プロモーターを利用したシステムは、Ｔ細胞の機能を向上させる遺伝子を「オン」の状態にすることにより抗腫瘍作用を向上させることを別の目的とする。誘導型プロモーターを利用したシステムはいくつか知られているが、このようなシステムは、毒性のオフターゲット効果、望ましくない生体内分布および薬物動態プロファイル、狭い作動域、ならびに／またはFDA認可の市販医薬品であることによる入手制限によって限定的にしか臨床適用できない。さらに、このようなシステムの多くは、異種部分から構築されたキメラ転写制御因子を使用しているため、このシステムをヒトの治療に使用すると、免疫性の合併症が引き起こされる。
いくつかの実施形態において、第１の核酸は、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、ならびに
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすることを特徴とする。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、薬物によって誘導することができる。前記薬物は、安全性が証明されていること、薬物動態プロファイルが好適であること、組織分布が良好であること、細胞外間隙と細胞質の間の分配係数が低いこと、免疫原性が低いこと、毒性が低いこと、および／またはリンパ球における発現性が高いことを目安に選択される。特定の一実施形態において、選択される薬物は、FDAに認可されており、導入遺伝子をリンパ球において発現することができ、望ましくない他の遺伝子の発現を活性化させず、かつ、異種部分を含有しないプロモーターを誘導することができる。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物と相互作用する転写活性化因子によって活性化される。前記転写活性化因子は、薬物の存在下において活性化されるか、あるいは薬物の存在下において、誘導型プロモーターに結合し、これを活性化することができる。
【０１２９】
別の薬物の具体例として、転写活性化因子のエストロゲン受容体リガンド結合ドメインに結合する薬物が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記薬物としては、タモキシフェン、その代謝産物および類似体、ならびにそれらの薬学的に許容される塩および／または水和物もしくは溶媒和物が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記薬物として、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8が挙げられる。
【０１３０】
本明細書に記載のアプローチのいくつかにおいて有用なタモキシフェン（CAS RN：10540-29-1）は、２−（４−（（１Ｚ）−１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エタンアミン、または（Ｚ）−２−（ｐ−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（IUPAC）としても知られており、分子式はC26H29NOで示され、その分子量（M.W.）は371.52g/molである。タモキシフェンは、組織特異的活性を有する選択的エストロゲン受容体モジュレーターである。タモキシフェンは、乳房組織において抗エストロゲン薬（阻害薬）として作用するが、子宮内膜においては、コレステロールの代謝、骨密度、および細胞増殖を促進するエストロゲン（刺激薬）として作用する。タモキシフェンは、薬学的に許容される塩として経口投与されることが多い。たとえば、タモキシフェンクエン酸塩（RN 54965-24-1、M.W.563.643）は、転移性乳がんの治療に適応されており、乳房切除および腋窩リンパ節郭清ならびに乳房への放射線照射を行った女性の乳がんの治療において補助薬として使用されている。また、タモキシフェンクエン酸塩は、乳がんを発症する危険性の高い女性における乳がん罹患率の低減にも適応されている。
【０１３１】
本明細書に記載のアプローチのいくつかにおいて有用な、ラット、マウス、およびヒトの乳がん患者におけるタモキシフェンの代謝産物として、Robinson et al. （Metabolites, pharmacodynamics, and pharmacokinetics of tamoxifen in rats and mice compared to the breast cancer patient. Drug Metab Dispos January 1991 19:36-43；この文献はその全体が参照によって本明細書に援用される）に開示されているものが挙げられ、主なものとして、Ｎ−デスメチルタモキシフェン（RN 31750-48-8、M.W.357.494）および４−ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）（RN 68392-35-8、M.W.387.52、アフィモキシフェン）が挙げられる。本明細書に記載のアプローチのいくつかにおいて有用な、チトクロムP-450による分解によって得られる別の代謝産物として、Crewe et al.（Metabolism of Tamoxifen by recombinant human cytochrome P-450 enzymes: Formation of the 4-hydroxy, 4'-hydroxy and N-desmethyl metabolites and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen, Drug Metab Dispos, 30(8): 869-874, 2002, FIG. 1；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されているｃｉｓ−４−ヒドロキシタモキシフェン（RN 174592、M.W.387.52；アフィモキシフェン、Ｅ異性体）、および４’−ヒドロキシタモキシフェン（（Ｚ）−４−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）−１−フェニルブタ−１−エン−２−イル）フェノール）が挙げられる。
【０１３２】
本明細書に記載のアプローチのいくつかにおいて有用な、タモキシフェンとの類似の構造を有する化合物としては、ｃｉｓ−タモキシフェン（RN 13002-65-8、M.W. 371.521）、４−メチルタモキシフェン（RN 73717-95-5、M.W. 385.548）、Ｎ−デスメチルタモキシフェン（RN 31750-48-8、M.W. 357.494）、（Ｚ）−デスエチルメチルタモキシフェン（RN 15917-50-7、M.W. 357.494）、（Ｅ）−デスエチルメチルタモキシフェン（RN 31750-45-5、M.W. 357.494）、トランス−４−ヒドロキシタモキシフェン（RN 68047-06-3、M.W. 387.52）、アフィモキシフェン（RN 68392-35-8、M.W. 387.52、４−ヒドロキシタモキシフェン）、アフィモキシフェン、Ｅ異性体（RN 174592-47-3、M.W. 387.52）、４−クロロタモキシフェン（RN 77588-46-6、M.W. 405.966）、４−フルオロタモキシフェン（RN 73617-96-6、M.W. 389.511）、トレミフェン（RN 89778-26-7、M.W. 405.966）、デスエチルタモキシフェン（RN 19957-51-8、M.W. 343.47）、（Ｅ）−デスエチルタモキシフェン（RN 97151-10-5、M.W. 343.47）、（Ｚ）−デスエチルタモキシフェン（RN 97151-11-6、M.W. 343.47）、ミプロキシフェン（RN 129612-87-9、M.W. 429.6）、２−（ｐ−（β−エチル−α−フェニルスチリル）フェノキシ）トリエチルアミン（RN 749-86-0、M.W. 399.575）、ドロロキシフェン（RN 82413-20-5、M.W. 387.52）、４−ヨード−タモキシフェン（RN 116057-68-2、M.W. 497.413）、ジヒドロタモキシフェン（RN 109640-20-2、M.W. 373.537）、（Ｅ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（４−（１−（２−メチルフェニル）−２−フェニル−１−ブテニル）フェノキシ）エタンアミン（RN 97150-96-4、M.W. 385.548）、および４−ヒドロキシトレミフェン（RN 110503-62-3、M.W. 421.965）；ならびに／またはこれらの薬学的に許容される塩および／もしくは水和物もしくは溶媒和物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本明細書に記載のアプローチのいくつかにおいて有用な、タモキシフェンのクエン酸塩、またはタモキシフェンと類似の構造を有する化合物のクエン酸塩としては、たとえば、タモキシフェンクエン酸塩（RN 54965-24-1、M.W. 563.64）、２−（ｐ−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミンクエン酸塩（RN 7244-97-5、563.64）、（Ｅ）−タモキシフェンクエン酸塩（RN 76487-65-5、M.W. 563.64）、トレミフェンクエン酸塩（RN 89778-27-8、M.W. 598.088）、ドロロキシフェンクエン酸塩（RN 97752-20-0、M.W. 579.64）、２−（ｐ−（１，２−ビス（ｐ−メトキシフェニル）−１−ブテニル）フェノキシ）トリエチルアミンクエン酸塩（RN 42920-39-8、M.W. 651.748）、２−（４−（１，２−ジフェニルエテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−エタンアミン２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸塩（RN 40297-42-5、M.W. 563.643）、２−（ｐ−（α−フェニルスチリル）フェノキシ）トリエチルアミンクエン酸塩（RN 102433-95-4、M.W. 563.64）、２−（ｐ−（２−（ｐ−メトキシフェニル）−１−フェニル−１−ブテニル）フェノキシ）トリエチルアミンクエン酸塩（1：1）（RN 42824-34-0、M.W. 637.72）、２−（ｐ−（１−（ｐ−メトキシフェニル）−２−フェニルプロペニル）フェノキシ）トリエチルアミンクエン酸塩（RN 13554-24-0、M.W. 607.696）、２−（ｐ−（α−（ｐ−メトキシフェニル）スチリル）フェノキシ）トリエチルアミンクエン酸塩一水和物（RN 13542-71-7、M.W. 593.669）、２−（ｐ−（ｐ−メトキシ−α−フェニルフェネチル）フェノキシ）トリエチルアミンクエン酸塩（RN 16421-72-0、M.W. 595.685）、α−（ｐ−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）−β−エチル−ｐ−メトキシ−α−フェニルフェネチルアルコールクエン酸塩（1：1）（RN 35263-93-5、M.W. 639.737）、１−（ｐ−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）−２−（ｐ−メトキシフェニル）−１−フェニルエタノールクエン酸塩（M.W. 611.68）、α−ｐ−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）−β−エチル−α−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−ｐ−メトキシフェネチルアルコールクエン酸塩（RN 35263-96-8、M.W. 655.737）、および／または２−（ｐ−（ｐ−メトキシ−α−メチルフェネチル）フェノキシ）−トリエチルアミンクエン酸塩（RN 15624-34-7、M.W. 533.614）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、発現の誘導に有効な前記薬物の量は、導入遺伝子の発現量が、発現が誘導されていない場合の発現量および／または基底レベルの発現量を上回るような量である。いくつかの実施形態において、前記薬物の有効量は、該薬物の公知の投与量および薬物動態プロファイルを利用することによって容易に決定することができる。本明細書において提供されるシステムにおいて、該システムは、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、基底レベルでの活性が低い。レンチウイルスベクターを用いる場合、発現が誘導されていない細胞における基底レベルでの活性は、細胞において遺伝子の発現が誘導された場合の２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％もしくはこれ以下、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の基底活性レベルである。基底レベルでの活性は、フローサイトメトリーを用いて、導入遺伝子（たとえばマーカー遺伝子）の発現量を誘導因子（たとえば薬物）の非存在下において測定することによって決定することができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターが発現されると、発現が誘導されていない場合や基底レベルでの活性と比べて高い活性を誘導することができる。いくつかの実施形態において、発現が誘導された場合の活性レベルは、発現が誘導されていない場合の２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターの制御下にある導入遺伝子は、トランス活性化因子の非存在下において、１０日未満、８日未満、６日未満、４日未満、２日未満または１日未満でオフの状態となるが、０日ではオフの状態とはならない。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、基底レベルでの活性が低く、高レベルの発現が誘導され、かつ／または短期間でオンとオフとを切り替えることができるように、誘導型プロモーターを設計かつ／または遺伝子操作してもよい。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、7xHBD/mE1bプロモーターである。前記プロモーターの代表的な配列を配列番号２３に示す（配列番号２３：tagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaagagctcagggtatataatg）。たとえば、7xHBD/mE1bプロモーターにおいて、転写活性化因子の結合を増強する変異を導入することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、前記システムは合成転写活性化因子を使用し、該合成転写活性化因子は、前記薬物（たとえばタモキシフェン）の存在下において、導入遺伝子の上流の合成プロモーターに結合し、発現を誘導する。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子はHEA3である。代表的なアミノ酸配列を配列番号１に示す（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号１をコードする核酸配列を含む核酸を含む。前記エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来の前記タモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインは、前記TamR-tfの２８２〜５９５番目のアミノ酸からなる配列であり、５２１番目に変異を有する。NF-κBのp65活性化ドメイン（p65またはTAD）は、５９６〜８６２番目のアミノ酸からなる配列である。配列番号１は、ER-LBD内に１個の点突然変異を含み、この点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、4-OHT、フルベストラントおよびその他のエストロゲン類似体に対するナノレベルでの特異性を付与する。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、タモキシフェン代謝産物である４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントおよびその他のエストロゲン類似体に対するナノレベルでの特異性を付与する少なくとも１個の点突然変異を含む。いくつかの実施形態において、前記１個の点突然変異は、野生型HEA3配列の５２１番目に位置する。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号１は、ER-LBD内に１個の点突然変異を含み、この点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、4-OHT、フルベストラントおよびその他のエストロゲン類似体に対するナノレベルでの特異性を付与する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、転写活性を向上させる少なくとも１個の点突然変異をp65ドメイン内に含む。いくつかの実施形態において、この点突然変異は、野生型HEA3配列の８４６番目に位置する（RelAタンパク質の５３６番目に位置し、これはHEA3の８４６番目に相当する）。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号２で示される配列を含む（配列番号２：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号２をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号２は、HEA3のp65ドメイン内に、転写活性を向上させる点突然変異を含み、この配列をHEA3（p65/S536E）と呼ぶ。RelAタンパク質におけるp65/S536Eの位置は、野生型HEA3および野生型HEA4の８４６番目に相当する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、転写活性を向上させる少なくとも１個の点突然変異をp65ドメイン内に含む。いくつかの実施形態において、この点突然変異は、野生型のHEA3配列の６２１番目に位置する（これはWT RelAタンパク質の３１０番目である）。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含む（配列番号３：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号３をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号３は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（K310Q（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/K310Q）と呼ぶ。K310Qは、RelAの３１０番目に相当する。したがって、この位置は、WT HEA3およびWT HEA4の６２１番目に相当する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、CMP8および４−ヒドロキシタモキシフェンに対するナノレベルでの感受性を付与する少なくとも３個の点突然変異をエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン内に含む。いくつかの実施形態において、これらの点突然変異は、野生型HEA3配列の３８４番目、４２１番目および５２１番目に位置する。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号８で示される配列を含む（配列番号８：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号８をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号８は、３個の点突然変異（L384M、M421G、G521R）をER-LBD内に含むHEA3配列を含み、これらの点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、CMP8および４−ヒドロキシタモキシフェンに対するナノレベルでの感受性を付与する。この配列をCMP8-HEA3と呼ぶ。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、CMP8応答性HEA3転写因子である。いくつかの実施形態において、前記CMP8応答性HEA3転写因子は、転写活性を向上させる少なくとも１個の点突然変異をp65ドメイン内に含む。いくつかの実施形態において、この点突然変異は、前記CMP8応答性HEA3配列の８４６番目に位置する（RelAタンパク質の５３６番目に位置し、これはHEA3の８４６番目に相当する）。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号９で示される配列を含む（配列番号９：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号９をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号９は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（S536E）をp65ドメイン内に含むCMP8-HEA3配列である。この配列をCMP8-HEA3（p65/S536E（RelAタンパク質上の位置）；これはHEA3の８４６番目に相当する）と呼ぶ。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、CMP8応答性HEA3転写因子である。いくつかの実施形態において、前記CMP8応答性HEA3転写因子は、転写活性を向上させる少なくとも１個の点突然変異をp65ドメイン内に含む。いくつかの実施形態において、この点突然変異は、RelAタンパク質配列の３１０番目に位置し、これは、野生型HEA3タンパク質および野生型HEA4タンパク質の６２１番目に相当する。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号１０で示される配列を含む（配列番号１０：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号１０をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号１０は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（K310Q（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むCMP8-HEA3配列である。この配列をCMP8-HEA3（p65/K310Q）と呼ぶ。RelAタンパク質の３１０番目は、野生型HEA3および野生型HEA4の６２１番目に相当する。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、CMP8応答性HEA3転写因子である。いくつかの実施形態において、前記CMP8応答性HEA3転写因子は、転写活性を向上させる少なくとも２個の点突然変異をp65ドメイン内に含む。いくつかの実施形態において、この点突然変異は、野生型HEA3配列の６２１番目に位置する（RelAタンパク質における３１０番目は、野生型HEA3の６２１番目に相当する）。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号１１で示される配列を含む（配列番号１１：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号１１をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号１１は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536EはRelAタンパク質における位置であり、これらは、HEA3およびHEA4において６２１番目（RelAタンパク質のK310A）および８４６番目（RelAタンパク質のS536E）に相当する）をp65ドメイン内に含むCMP8-HEA3配列を含む。この配列をCMP8-HEA3（p65/S536E/K310Q（RelAタンパク質上の位置）（これらは、HEA3およびHEA4において６２１番目および８４６番目に相当する））と呼ぶ。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、前記システムは合成転写活性化因子を使用し、該合成転写活性化因子は、前記薬物の存在下において、導入遺伝子の上流の合成プロモーターに結合し、発現を誘導する。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子はHEA4である。HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびp65ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、HNF1α DNA結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、HEA4は、少なくとも３個の点突然変異をER-LBD内に含み、これらの点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、野生型のHEA3と比較して、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントおよびエストロゲン類似体に対してより高い感受性を付与する。いくつかの実施形態において、これら３個の点突然変異は、HEA4転写因子において４００番目、５４３番目および５４４番目に位置する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも３個の変異を含むHEA4のアミノ酸配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号４：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号４をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号４は、３個の点突然変異（G400V、M543A、L544A）をER-LBD内に含む野生型HEA4配列を含み、これらの点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、野生型のHEA3と比較して、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントおよびエストロゲン類似体に対してより高い感受性を付与する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、前記HEA4転写因子は、少なくとも１個の点突然変異を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異は、p65ドメイン内にあり、転写活性を向上させる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異は、野生型HEA4転写因子の８４６番目に位置する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異を含むHEA4のアミノ酸配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号５：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号５をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号５は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（S536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA4配列を含む。この配列をHEA4（p65/S536E）と呼ぶ。前記変異S536Eは、WT RelAの５３６番目の変異に相当する。この位置は、HEA3の８４６番目に相当する。前記変異K310Qは、WT RelAの３１０番目の変異に相当する。この位置は、HEA3の６２１番目に相当する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、前記HEA4転写因子は、少なくとも１個の点突然変異を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異は、p65ドメイン内にあり、転写活性を向上させる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異は、HEA4転写因子の６２１番目に位置する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１個の変異を含むHEA4のアミノ酸配列は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号６：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号６をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号６は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（K310Q（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA4配列を含む。この配列をHEA4（p65/K310Q）と呼ぶ。K310Qは、RelAにおける位置であり、これは、WT HEA4の６２１番目に相当する。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、前記HEA4転写因子は、少なくとも２個の点突然変異を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも２個の変異は、p65ドメイン内にあり、転写活性を向上させる。いくつかの実施形態において、前記少なくとも２個の変異は、HEA4転写因子の８４６番目と６２１番目に位置する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも２個の変異を含むHEA4のアミノ酸配列は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号７：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。いくつかの実施形態は、配列番号７をコードする核酸配列を含む核酸を含む。配列番号７は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA4配列を含む。この配列をHEA4（p65/S536E/K310Q（RelAタンパク質上の位置））と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA4において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA4において８４６番目に相当する。
【０１５０】
別のキメラ転写因子も本明細書において想定される。いくつかの実施形態において、前記HEA4転写因子は、HNF1αと、HEA4に含まれるものと同じものであるER-LBDと、p65活性化ドメインのヌクレオチド配列の代わりにVP64活性化ドメインとを含み（本明細書においてHEA4（VP64）と呼ぶ）、このHEA4（VP64）は、配列番号２４によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggacgctctggacgacttcgaccttgacatgttgggttccgacgcgctggatgattttgatttggacatgctgggaagcgacgcactggatgactttgatctcgatatgctcggctctgacgcattggacgacttcgacttggatatgctgggttct；HEA4（VP64））。いくつかの実施形態において、HEA4（VP64）は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGS）。いくつかの実施形態は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ転写因子はHEA4（VP64）であり、配列番号２４によってコードされる。いくつかの実施形態において、HEA4（VP64）は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、別のHEA4は、HNF1αと、HEA4に含まれるものと同じものであるER-LBDと、p65活性化ドメインの代わりにHSF1活性化ドメインとを含む。HEA4（HSF-1）は、HNF1αと、HEA4に含まれるものと同じものであるER-LBDと、p65活性化ドメインの代わりにHSF1活性化ドメインとを含み、このHEA4（HSF-1）は、配列番号２６によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggaaaagtgcctcagcgtagcctgcctggacaagaatgagctcagtgaccacttggatgctatggactccaacctggataacctgcagaccatgctgagcagccacggcttcagcgtggacaccagtgccctgctggacctgttcagcccctcggtgaccgtgcccgacatgagcctgcctgaccttgacagcagcctggccagtatccaagagctcctgtctccccaggagccccccaggcctcccgaggcagagaacagcagcccggattcagggaagcagctggtgcactacacagcgcagccgctgttcctgctggaccccggctccgtggacaccgggagcaacgacctgccggtgctgtttgagctgggagagggctcctacttctccgaaggggacggcttcgccgaggaccccaccatctccctgctgacaggctcggagcctcccaaagccaaggaccccactgtctcc）。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ転写因子はHEA4（HSF-1）であり、配列番号２６によってコードされる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ転写因子はHEA4（HSF-1）であり、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEKCLSVACLDKNELSDHLDAMDSNLDNLQTMLSSHGFSVDTSALLDLFSPSVTVPDMSLPDLDSSLASIQELLSPQEPPRPPEAENSSPDSGKQLVHYTAQPLFLLDPGSVDTGSNDLPVLFELGEGSYFSEGDGFAEDPTISLLTGSEPPKAKDPTVS）。いくつかの実施形態は、配列番号２７をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５２】
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ転写因子はHEA4（Arnt）である。HEA4（Arnt）は、HNF1αと、HEA4に含まれるものと同じものであるER-LBDと、p65活性化ドメインのアミノ酸配列の代わりにArnt活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、HEA4（Arnt）は、配列番号２８に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtgcctgaggtcttccaggagatgctgtccatgctgggagatcagagcaacagctacaacaatgaagaattccctgatctaactatgtttccccccttttcagaa）。いくつかの実施形態において、HEA4（Arnt）は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVPEVFQEMLSMLGDQSNSYNNEEFPDLTMFPPFSE）。いくつかの実施形態は、配列番号２９をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５３】
本明細書において「選択マーカーカセット」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、人為的な選択を行うための特性を付与する「選択マーカー」をコードする遺伝子であり、ベクターまたは細胞に導入されるものについて述べるために使用してもよい。選択マーカーカセットは、スクリーニング可能なマーカーであってもよく、このような選択マーカーカセットを使用することによって、研究者が望ましい細胞と望ましくない細胞とを区別すること、または特定の種類の細胞を濃縮することが可能となる。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは選択マーカーカセットを含む。本明細書に記載の選択マーカーカセットは、目的のタンパク質を有するタンパク質または細胞を選択または追跡するために使用されるタンパク質（選択マーカー）をコードする。本明細書に記載の実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質は、フローサイトメトリーなどの実験において選択することができるマーカー配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記マーカーはHer2tGタンパク質である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３０に示されるEGFRtのヌクレオチド配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgtga）。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３１に示されるEGFRtのアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM）。いくつかの実施形態は、配列番号３１をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３２に示されるHer2tのヌクレオチド配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccatgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggaggctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaagggctgccccgccgagcagagagccagccctctgacgtccatcatctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatctga）。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３３に示されるHer2tのアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILI）。いくつかの実施形態は、配列番号３３をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３４に示されるHer2tＧのヌクレオチド配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccatgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggaggctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaagggctgccccgccgagcagagagccagcccgttaacgggtggaggcagcggaggtggctccatcatctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatctga）。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３５に示されるHer2tＧのアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTGGGSGGGSIISAVVGILLVVVLGVVFGILI）。いくつかの実施形態は、配列番号３５をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３６に示されるCD19tのヌクレオチド配列によってコードされる（atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataa）。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３７に示されるCD19tのアミノ酸配列を含む（MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKR）。いくつかの実施形態は、配列番号３７をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３８に示されるDHFRdmのヌクレオチド配列によってコードされる（atggttggttcgctaaactgcatcgtcgctgtgtcccagaacatgggcatcggcaagaacggggacttcccctggccaccgctcaggaatgaatccagatatttccagagaatgaccacaacctcttcagtagaaggtaaacagaatctggtgattatgggtaagaagacctggttctccattcctgagaagaatcgacctttaaagggtagaattaatttagttctcagcagagaactcaaggaacctccacaaggagctcattttctttccagaagtctagatgatgccttaaaacttactgaacaaccagaattagcaaataaagtagacatggtctggatagttggtggcagttctgtttataaggaagccatgaatcacccaggccatcttaaactatttgtgacaaggatcatgcaagactttgaaagtgacacgttttttccagaaattgatttggagaaatataaacttctgccagaatacccaggtgttctctctgatgtccaggaggagaaaggcattaagtacaaatttgaagtatatgagaagaatgat）。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、配列番号３９に示されるDHFRdmのアミノ酸配列を含む（VGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNESRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND）。いくつかの実施形態は、配列番号３９をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムであって、
ａ）第１のポリヌクレオチド、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターをコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導できること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは配列番号２３の核酸配列を含む（配列番号２３：tagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaatagttaataatctacaagagctcagggtatataatg）。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、第１の核酸および第２の核酸はベクターを含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、選択マーカーをコードする核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態において、発現を誘導可能なシステムであって、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていることを特徴とするシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも３個の変異を含み、該HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、前記薬物リガンドに応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。ER-LBDに含まれる変異は、薬物と受容体の結合に影響を与える。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、HNF1α DNA結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含み、該HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、HNF1α DNA結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、HEA3と比較して薬物に対する感受性を向上させる３個の変異をER-LBD内に含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号１は、ER-LBD内に１個の点突然変異を含み、この点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、4-OHT、フルベストラントおよびその他のエストロゲン類似体に対するナノレベルでの特異性を付与する。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号２：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。配列番号２は、HEA3のp65ドメイン内に、転写活性を向上させる点突然変異を含み、この配列をHEA3と呼ぶ（p65/S536E（RelAタンパク質上の位置））。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号３：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号３は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（K310Q（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/K310Q）と呼ぶ。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記���生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される少なくとも１つ以上の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号８：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号８は、３個の点突然変異（L384M、M421G、G521R）をER-LBD内に含むHEA3配列を含み、これらの点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、CMP8および４−ヒドロキシタモキシフェンに対するナノレベルでの感受性を付与する。この配列をCMP8-HEA3と呼ぶ。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号９：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。配列番号９は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（S536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むCMP8-HEA3配列である。この配列をCMP8-HEA3（p65/S536E（RelAタンパク質上の位置））と呼ぶ。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号１０：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号１０は、転写活性を向上させる１個の点突然変異（K310Q（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むCMP8-HEA3配列である。この配列をCMP8-HEA3（p65/K310Q（RelAタンパク質上の位置））と呼ぶ。
いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む（配列番号１１：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWMEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGGVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。配列番号１１は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むCMP8-HEA3配列を含む。この配列をCMP8-HEA3（p65/S536E/K310Q（RelAタンパク質上の位置））と呼ぶ。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記ポリペプチドは、負のチェックポイント制御因子を抑制する。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは抗体断片であり、好ましくはその結合断片である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記システムは合成転写活性化因子を使用し、該合成転写活性化因子は、薬物の存在下において、導入遺伝子の上流の合成プロモーターに結合し、発現を誘導する。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子はHEA3である。いくつかの実施形態において、前記薬物はタモキシフェンである。いくつかの実施形態において、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。
【０１６０】
転写因子の特性を向上させるために、前記転写活性化因子にさらに変更を加えてもよく、たとえば、前記エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン内の１個以上のアミノ酸に変更を加えてもよく、かつ／または前記p65トランス活性化ドメイン内の１個以上のアミノ酸に変更を加えてもよいが、変更はこれらに限定されない。前記エストロゲン受容体の結合ドメインのアミノ酸に変更を加えることによって、前記転写活性化因子に対する前記薬物の結合の特異性と感受性をさらに高めることができる。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、少なくとも３個の点突然変異を含む。たとえば、４００番目、５４３番目および５４４番目のアミノ酸に変異を導入することができる。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4は、配列番号４に示される配列を含む（配列番号４：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号４は、３個の点突然変異（G400V、M543A、L544A）をER-LBD内に含む野生型HEA4配列を含み、これらの点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、野生型のHEA3と比較して、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントおよびエストロゲン類似体に対してより高い感受性を付与する。配列に変更が加えられた前記転写活性化因子は、野生型HEA3と比較して、タモキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントおよびエストロゲン類似体に対する親和性が増加している。前記p65トランス活性化ドメイン内のアミノ酸に変更を加えると、形質導入された細胞を活性化させることなく、導入遺伝子の発現を増加させることができる（配列番号５および配列番号６）。
【０１６１】
タモキシフェンの非存在下では、細胞質内の熱ショックタンパク質９０（HSP90）がタモキシフェン結合活性部位に結合することによって、TamR-tfが核内から排除されるため、導入遺伝子の発現は「オフ」の状態となる。細胞質内にナノモル濃度のタモキシフェンが存在すると、ER-LBDへの結合に対してHSP90と活発に競合してこれを阻害し、TamR-tfの核内への転座が生じる。核内への転座が起こると、TamR-tfは、自体の特異的結合部位である合成プロモーターと結合することが容易となる。タモキシフェンの存在下では、TamR-tfが7xHBD/mE1Bプロモーターに結合することによって導入遺伝子の発現が「オン」の状態になる。いくつかの実施形態において、この転写制御因子は、導入遺伝子の発現を様々なレベルで制御できるように改変することができる。TamR-tf（HEA3）のリガンド結合ドメイン内のアミノ酸を置換することによって、タモキシフェンおよびその代謝産物に対する選択的応答が可能となる。４−ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）は、TamR-tf（HEA3）活性に関して薬理学的活性が最も高い代謝物であり、内在性エストロゲンと相互作用を起こさない。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムであって、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、選択的かつ高い感受性で薬物リガンドへの結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、HNF1α DNA結合ドメインをさらに含む。ER-LBDに含まれる変異は、薬物と受容体の結合に影響を与える。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、選択的かつ高い感受性で薬物リガンドへの結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、HNF1α DNA結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、HEA3と比較して薬物に対する感受性を向上させる３個の変異をER-LBD内に含む。ER-LBDに含まれる変異は、薬物と受容体の結合に影響を与える。いくつかの実施形態において、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3転写因子は、配列番号１２に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１２：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttctccagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１３に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１３：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcc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いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１９に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１９：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggatggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcggcgtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttctccagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号２０に示される核酸配列によってコードされる（配列番号２０：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggatggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcggcgtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacga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いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号２２に示される核酸配列によってコードされる（配列番号２２：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggatggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcggcgtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示される少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１５：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttctccagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１６に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１６：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。
いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１７に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１７：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttctccagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。
いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる（配列番号１８：atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccgtgaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagggaatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgaggctgccgatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、レンチウイルス構築物および／またはリンパ球において機能する。
【０１６４】
キメラ抗原受容体
哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能な、薬物リガンドに対する感受性が向上したシステムであって、
薬物により誘導可能な第１のプロモーター；
第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とするシステムを提供する。
別の実施形態において、キメラ抗原受容体をコードする別のポリヌクレオチドは、構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。
【０１６５】
リガンド結合ドメイン
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍、ウイルス分子、または標的細胞集団もしくは選択された細胞集団に発現されるその他の分子に特異的に結合し、ヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインとしては、受容体またはその一部、小さいペプチド、ペプチドミメティック、基質、およびサイトカインなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその断片であり、その結合断片であることが好ましく、これらはヒト化されていてもよい。抗体または抗体断片をコードする核酸配列は容易に決定することができる。特定の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、CD19に特異的に結合するscFvをコードする。別の特定の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、HER2、CE7、hB7H3、またはEGFRに特異的に結合する一本鎖Fvをコードし、前記ポリヌクレオチドはヒト化された該一本鎖Fvをコードしてもよい。これらの抗体およびその結合ドメインの配列は、当業者に知られており、当業者によって容易に決定される。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCまたはVAR2CSAに特異的に結合する単一のscFvをコードする。
【０１６６】
腫瘍抗原は、免疫応答を誘導する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明のリガンド結合ドメインは、治療されるがんの種類に応じて選択され、腫瘍抗原またはその他の腫瘍細胞表面分子を標的とすることができる。対象から得られた腫瘍試料は、特定のバイオマーカーまたは細胞表面マーカーの存在について特性評価することができる。たとえば、対象から得られた乳がん細胞は、Her2Neu、エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体のそれぞれについて陽性または陰性であり得る。個々の対象の腫瘍細胞上に見出される腫瘍抗原または細胞表面分子が選択される。腫瘍抗原および細胞表面分子は、当技術分野においてよく知られており、たとえば、癌胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、CE7、hB7H3、ROR1、メソテリン、c-Met、GD-2および／またはMAGE A3 TCRが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記腫瘍抗原または前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、および／またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、腫瘍細胞上に存在する細胞表面分子であり、正常組織上に実質的に存在しないか、または重要でない正常組織にその発現が制限されている。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、前記標的は、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、GD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAである。
【０１６８】
一実施形態において、腫瘍上の前記標的分子は、悪性腫瘍と関連する１つ以上のエピトープを含む。悪性腫瘍は、Ｔ細胞受容体またはキメラ受容体によって認識される標的抗原として機能することができるタンパク質を多数発現している。その他の標的分子としては、細胞の形質転換に関連する分子群に属するものが挙げられ、たとえばがん遺伝子HER-2/Neu/ErbB2が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記腫瘍抗原は、同じ種類の組織に由来する対照細胞と比較して、腫瘍細胞上に選択的に発現または過剰発現される。別の実施形態において、前記腫瘍抗原は細胞表面ポリペプチドである。
【０１６９】
キメラ受容体の標的となりうる腫瘍細胞表面分子が特定された後、この標的分子のエピトープを選択し、その特性を評価する。腫瘍細胞表面分子に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ法、ヒト抗体もしくはヒト化抗体を作製する方法、またはヒト抗体を産生するように遺伝子組換えされたトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物を用いる方法を使用して作製することができる。部分的に合成した抗体または全合成抗体のファージディスプレイライブラリが入手可能であり、このライブラリから、標的分子に結合することができる抗体またはその断片をスクリーニングすることができる。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリも入手可能である。いくつかの実施形態において、抗体は、腫瘍細胞表面分子に特異的に結合し、ウシ血清アルブミンやその他の無関係な抗原などの非特異的成分とは交差反応を起こさない。前記抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が特定された後、これらの配列を単離し、かつ／または配列決定することができる。
【０１７０】
抗体または抗原結合断片としては抗体全体またはその一部が挙げられ、該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、および線状抗体が挙げられる。本明細書において「抗体断片」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、全長抗体の一部、好ましくは全長抗体の抗原結合領域または可変領域を指すために使用してもよく、これらの抗体断片は容易に作製することができる。抗体断片としては、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片およびFv断片；diabody；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記抗体断片は、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片もしくはFv断片；diabody；線状抗体；一本鎖抗体分子；または抗体断片から形成された多重特異性抗体である。前記抗体または抗体断片はいずれもヒト化することができ、本明細書に記載の組成物および方法とともに使用することができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、特定の腫瘍細胞表面分子に結合する様々な抗体を多数単離することができ、これらの特性を評価することができる。いくつかの実施形態において、前記抗体は、標的分子のエピトープに対する特異性に基づいて特性が評価される。また、場合によっては、エピトープに対する抗体の親和性に基づいて、同じエピトープに結合する抗体を選択することができる。いくつかの実施形態において、抗体は少なくとも１ｍＭの親和性を有し、５０ｎＭ未満の親和性を有することが好ましい。いくつかの実施形態において、前記抗体は、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、もしくは１ｍＭの親和性を有するか、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の親和性を有する。いくつかの実施形態において、別の抗体よりもエピトープに対する親和性が高い抗体が選択される。たとえば、同じエピトープに結合する対照の抗体よりも、親和性が少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、もしくは少なくとも５０倍高い抗体、または対照の抗体よりも、これらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の倍率分だけ親和性が高い抗体が選択される。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、標的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CE7、hB7H3、EGFR、CD123、CS-1、ROR1、メソテリン、Her2、c-Met、PSMA、GD-2、MAGE A3 TCR、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、これらの標的分子に特異的な前記抗体またはその結合断片は、ヒト化されている。
【０１７３】
特定の実施形態において、前記標的抗原は、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EphA2、IL13Ra2、oaGD2、GD2、CD33、メソテリン、ROR-1および／またはVAR2CSAである。CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EphA2、IL13Ra2、oaGD2、GD2、CD33、メソテリン、ROR-1および／またはVAR2CSAのそれぞれに特異的な抗体は当業者に多数知られており、その配列、エピトープ結合性および親和性は容易に評価することができる。また、本開示は、抗CD19 scFv、抗CD20 scFv、抗CD22 scFv、抗EGFRvIII scFv、抗EphA2 scFv、抗IL13Ra2 scFv、抗oaGD2 scFv、抗GD2 scFv、抗CD33 scFv、抗メソテリン scFv、抗ROR-1 scFvおよび／または抗VAR2CSA scFvの可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する可変領域を包含する。
【０１７４】
本明細書において「ヒト化抗体」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性が高まるように改変されたタンパク質配列を含む非ヒト種由来抗体を指すために使用してもよい。ヒトに投与する目的で構築されたモノクローナル抗体（たとえば、抗がん薬として構築された抗体）を「ヒト化」してもよい。非ヒト免疫系（たとえばマウスの免疫系）を利用して特定の抗体を構築する方法では、抗体をヒト化することが望ましい場合がある。このような方法で作製された抗体のタンパク質配列は、ヒトにおいて天然に産生される同種抗体のタンパク質配列とは部分的に異なるため、ヒト患者に投与した場合に免疫原性を発揮する可能性がある。ヒト化抗体は、ヒト抗体に対するタンパク質配列の類似性がキメラ抗体よりも高められており、かつキメラ抗体が含むことのできる非ヒトタンパク質配列よりも長い非ヒトタンパク質配列を含むことができるという点でキメラ抗体とは異なる。ヒト化抗体の誘導体は、ヒト化抗体に由来する抗体または配列のセグメントであってもよい。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、ヒト化抗体またはその一部を含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、scFvを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはヒト化されたscFvである。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、CD19、CD22、CD20、B7H3受容体、L1CAM、EGFR、EGFRVIII、EphA2、FITC（E2）、GD2、Her2、IL13R2a（hu08）VlVh、IL13Ra2、IL13Ra2、oaGD2、ROR1、CD33、メソテリンおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、異種生物（たとえば齧歯類）に由来するモノクローナル抗体の免疫原性を低減するために、抗体をヒト化することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその断片とヒト免疫系との相互作用を向上させるために、ヒト化を行うことが望ましい場合がある。ハイブリドーマ技術の発展に伴って開発された異種抗体の多くはヒトに対して免疫原性が高いため、臨床適用が制限される場合があり、これは特に、繰り返し投与を行う必要がある場合に顕著である。さらに、このような異種抗体は体内循環から速やかに排除される可能性があるとともに、全身性の炎症作用を引き起こす恐れもある。したがって、いくつかの実施形態において、これらの状況を回避するためにヒト化を行うことが望ましい。抗体をヒト化する技術は当業者に知られている。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、そのコード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、該ポリヌクレオチドを切断して、別の抗原に対するリガンド結合ドメインをコードする別のポリヌクレオチドまたは別の結合特性を有するリガンド結合ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。たとえば、制限部位NheIをリーダー配列の上流にコードし、かつヒンジ領域内の３’末端にRsrIIを配置することよって、キメラ受容体ベクター内に所望のscFvをサブクローニングすることが可能となる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞（たとえばヒト細胞）における発現のためにコドン最適化されている。所望のベクターの制限部位へのサブクローニングは、当業者によく知られている技術の１つである。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドである。CD8αなどの他のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用することもできる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドはCD8αをコードする。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。哺乳類細胞（たとえばヒト細胞）において前記キメラ抗原受容体の発現を可能とするプロモーターが選択される。特定の一実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。
【０１８０】
スペーサー
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含む。通常、スペーサー領域は、前記キメラ受容体のリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、前記リガンド結合ドメインに柔軟性を持たせ、かつリンパ球において高レベル発現を可能とする。たとえば、229アミノ酸長のスペーサードメインを有するCD19特異的キメラ受容体の抗腫瘍活性は、改変IgG4ヒンジのみからなる短いスペーサー領域を有するCD19特異的キメラ受容体の抗腫瘍活性よりも低かった。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、少なくとも10〜229アミノ酸長、10〜200アミノ酸長、10〜175アミノ酸長、10〜150アミノ酸長、10〜125アミノ酸長、10〜100アミノ酸長、10〜75アミノ酸長、10〜50アミノ酸長、10〜40アミノ酸長、10〜30アミノ酸長、10〜20アミノ酸長、もしくは10〜15アミノ酸長であるか、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、１アミノ酸長または２アミノ酸長よりも長く、かつ12アミノ酸長以下、119アミノ酸長以下、または229アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、免疫グロブリン分子のヒンジ領域に由来する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、またはヒトIgG4に由来するヒンジ領域全体またはその一部を含み、1個以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記ヒンジ領域の一部は、重鎖可変領域とコアとの間に存在するアッパーヒンジ領域のアミノ酸配列と、ポリプロリン領域を含むコアヒンジ領域のアミノ酸配列とを含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、12個以下のアミノ酸を有し、かつIgG4のヒンジ領域配列の全体もしくはその一部またはそのバリアントを含む。中程度の長さのスペーサー領域は、119個以下のアミノ酸を有し、かつIgG4のヒンジ領域配列の全体もしくはその一部またはそのバリアントと、CH3領域の全体もしくはその一部またはそのバリアントとを含む。長いスペーサーは、１個〜229個のアミノ酸を有し、かつIgG4のヒンジ領域配列の全体もしくはその一部またはそのバリアントと、CH2領域の全体もしくはその一部またはそのバリアントと、CH3領域の全体もしくはその一部またはそのバリアントとを含む。いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長もしくは12アミノ酸長、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、中程度の長さのスペーサー領域は、13アミノ酸長、20アミノ酸長、30アミノ酸長、40アミノ酸長、50アミノ酸長、60アミノ酸長、70アミノ酸長、80アミノ酸長、90アミノ酸長、100アミノ酸長、110アミノ酸長もしくは119アミノ酸長、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、120アミノ酸長、130アミノ酸長、140アミノ酸長、150アミノ酸長、160アミノ酸長、170アミノ酸長、180アミノ酸長、190アミノ酸長、200アミノ酸長、210アミノ酸長もしくは219アミノ酸長、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲内の長さを有する。
【０１８４】
スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、膜貫通領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、そのコード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、該ポリヌクレオチドを切断して、別のスペーサー領域をコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞（たとえばヒト細胞）における発現のためにコドン最適化されている。
【０１８５】
一実施形態において、前記スペーサー領域は、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4に由来するヒンジ領域配列もしくはその一部、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4に由来するヒンジ領域配列とCH2領域の全体もしくはその一部もしくはそのバリアントとの組み合わせ、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4に由来するヒンジ領域配列とCH3領域の全体もしくはその一部もしくはそのバリアントとの組み合わせ、またはIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4に由来するヒンジ領域配列とCH2領域の全体もしくはその一部もしくはそのバリアントおよび／もしくはCH3領域の全体もしくはその一部もしくはそのバリアントとの組み合わせである。いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、1アミノ酸長もしくは2アミノ酸長を超え、かつ12アミノ酸長以下の改変IgG4ヒンジ配列であり；中程度の長さの配列は、1アミノ酸長もしくは2アミノ酸長を超え、かつ119アミノ酸長以下の、CH3配列を含むIgG4ヒンジ配列であり；または1アミノ酸長もしくは2アミノ酸長を超え、かつ229アミノ酸長以下の、CH2領域およびCH3領域を含むIgG4ヒンジ配列である。
【０１８６】
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該膜貫通ドメインは、前記キメラ受容体を膜につなぎ止める役割を果たす。
【０１８７】
一実施形態において、前記キメラ受容体のドメインのうちの１つと天然の状態で会合する膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、前記キメラ受容体のドメインが、同じまたは異なる表面膜タンパク質に由来する膜貫通ドメインに結合することを回避できるような膜貫通ドメインを選択してもよく、あるいはこのような回避が可能なアミノ酸置換によって膜貫通ドメインを改変してもよく、これによって、前記受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。
【０１８８】
前記膜貫通ドメインは、天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然由来のものである場合、前記膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質に由来するものであってもよく、膜貫通型タンパク質に由来するものであってもよい。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137および／またはCD154の膜貫通領域を少なくとも含む。
【０１９０】
膜貫通ドメインは、合成されたものであってもよく、天然の膜貫通ドメインのバリアントであってもよい。いくつかの実施形態において、合成膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインのバリアントは、主として疎水性残基、たとえば、ロイシンおよびバリンを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１１０〜１１３に示される膜貫通ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性、またはこれらの値のいずれか２つにより定義される範囲内のアミノ酸配列同一性を有してもいてもよい。膜貫通ドメインのバリアントは、Kyte Doolittle法により算出された疎水性スコアが少なくとも５０であることが好ましい。
【０１９１】
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、細胞内シグナル伝達領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、そのコード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、膜貫通ドメインをコードする該ポリヌクレオチドを切断して、別の膜貫通ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞（たとえばヒト細胞）における発現のためにコドン最適化されている。
【０１９２】
細胞内シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該細胞内シグナル伝達ドメインが存在することによって、前記キメラ受容体を発現する形質導入細胞が腫瘍細胞上に発現されたリガンドに結合すると、該形質導入細胞の１つの機能が活性化される。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記形質導入細胞の少なくとも１つの機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインの一部および／またはそのバリアントである。
【０１９３】
本開示のキメラ受容体に用いられる細胞内シグナル伝達ドメインとしては、CD3ζ鎖の細胞内配列、および／またはキメラ受容体が結合するとこれと協同してシグナル伝達を開始する補助受容体の細胞内配列、これらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能を有する任意の合成配列が挙げられる。Ｔ細胞の活性化は、２種類の細胞内シグナル伝達配列によって媒介されると考えられている。一つは、抗原依存性一次活性化を開始して、Ｔ細胞受容体様シグナルを提供する細胞内シグナル伝達配列（一次細胞内シグナル伝達配列）であり、もう一つは、抗原非依存性に二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供する細胞内シグナル伝達配列（二次細胞内シグナル伝達配列）である。刺激性に作用する一次細胞内シグナル伝達配列は、受容体チロシン活性化モチーフすなわちITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。本明細書に記載の実施形態との使用に適した、一次細胞内シグナル伝達配列を含むITAMとしては、CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、および／またはCD66dに由来するものが挙げられる。
【０１９４】
好ましい一実施形態において、前記キメラ受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを単独で含むように、あるいはCD3ζシグナル伝達ドメインと１種以上の所望のその他の細胞内ドメインとを含むように設計することができる。たとえば、前記キメラ受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ鎖と共刺激シグナル伝達領域を含んでいてもよい。
【０１９５】
前記共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の前記細胞内ドメインを含むキメラ受容体の一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の応答に必要とされる抗原受容体やそのリガンド以外の細胞表面分子である。本明細書に記載の実施形態における使用に適したそのような分子としては、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、リンパ球機能関連抗原−１（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびζ鎖関連プロテインキナーゼ（ZAP70）、ならびに／またはCD83と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１９６】
前記キメラ受容体に含まれる複数の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または所定の順序で互いに連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、これらの細胞内シグナル伝達配列は、短いオリゴペプチドリンカーまたは短いポリペプチドリンカーによって連結されていてもよく、これらのリンカーは２〜１０アミノ酸長であることが好ましく、たとえば、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長または１０アミノ酸長である。一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントと、CD28のシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントとを含む。別の一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントと、4-1BBのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントとを含む。さらに別の一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントと、CD28のシグナル伝達ドメインの全体もしくは一部またはそのバリアントと、4-1BBのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントとを含む。特定の一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、CD3ζのバリアントと4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインの一部とを含む。
【０１９７】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、CD3ζドメインの一部に連結された4-1BBの細胞内ドメインを含む。別の一実施形態において、4-1BB細胞内ドメインおよびCD28細胞内ドメインは、CD3ζドメインの一部に連結されている。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号１１４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号１１６に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号１１８に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号１１５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内ドメインは、配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、そのコード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする該ポリヌクレオチドを切断して、別の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。
【０２００】
マーカー配列
いくつかの実施形態において、前記システムは、誘導型プロモーターの制御下に１種以上のマーカー配列をさらに含む。マーカー配列によって、形質導入細胞の選択および／または形質導入細胞の特定が可能となる。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列を使用して、形質導入細胞の選択および／または形質導入細胞の特定を行う。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は、リンカー配列をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記リンカー配列は切断可能なリンカー配列である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、たとえばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａなどの２Ａリンカーである。いくつかの実施形態において、前記リンカーは切断可能なＴ２Ａリンカーである。
【０２０１】
複数種のマーカー配列を使用することができる。通常、マーカー配列は、形質導入細胞の選択および／または検出を可能にする機能特性を有する。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は、ヒトリンパ球の形質導入に適合している。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は、形質導入細胞の選択および／または検出を可能にする。
【０２０２】
前記ポジティブ選択マーカーは、宿主細胞に導入される遺伝子であって、導入された該遺伝子を持つ宿主細胞のポジティブ選択を可能にする表現型を優位に発現する遺伝子であってもよい。このようなタイプの遺伝子は当技術分野において公知であり、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質であるG418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、メトトレキサートに対する耐性を付与する、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子の二重変異体（DHFR dm）などが挙げられる。形質導入細胞は、これらの薬剤の存在下での培養において生存することができ、次いで選択される。
【０２０３】
一実施形態において、第１の核酸は、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の一実施形態において、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体（EGFRt）である。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は末端切断型Her2配列（Her2t）である。本開示で示した実施形態において使用することができる選択マーカー配列を以下に示す。
選択マーカー配列
EGFRtヌクレオチド配列：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgtga（配列番号３０）；
EGFRtアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM（配列番号３１）；
Her2tヌクレオチド配列：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccatgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggaggctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaagggctgccccgccgagcagagagccagccctctgacgtccatcatctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatctga（配列番号３２）；
Her2tアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILI（配列番号３３）；
Her2tGヌクレオチド配列：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccatgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggaggctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaagggctgccccgccgagcagagagccagcccgttaacgggtggaggcagcggaggtggctccatcatctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatctga（配列番号３４）；
Her2tGアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTGGGSGGGSIISAVVGILLVVVLGVVFGILI（配列番号３５）；
CD19tヌクレオチド配列：
Atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataa（配列番号３６）；
CD19tアミノ酸配列：
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKR（配列番号３７）；
DHFRdmヌクレオチド配列：
Atggttggttcgctaaactgcatcgtcgctgtgtcccagaacatgggcatcggcaagaacggggacttcccctggccaccgctcaggaatgaatccagatatttccagagaatgaccacaacctcttcagtagaaggtaaacagaatctggtgattatgggtaagaagacctggttctccattcctgagaagaatcgacctttaaagggtagaattaatttagttctcagcagagaactcaaggaacctccacaaggagctcattttctttccagaagtctagatgatgccttaaaacttactgaacaaccagaattagcaaataaagtagacatggtctggatagttggtggcagttctgtttataaggaagccatgaatcacccaggccatcttaaactatttgtgacaaggatcatgcaagactttgaaagtgacacgttttttccagaaattgatttggagaaatataaacttctgccagaatacccaggtgttctctctgatgtccaggaggagaaaggcattaagtacaaatttgaagtatatgagaagaatgat（配列番号３８）；および
DHFRdmアミノ酸配列：
VGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNESRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND（配列番号３９）。
DNAスペーサー配列：
Gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc（配列番号１２０）。
このDNAスペーサー配列は、7xHBD/mE1B_DNAスペーサーと呼んでもよい。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、４６塩基対のＤＮＡスペーサー配列は、7xHBD/mE1Bプロモーターと誘導型導入遺伝子の間に位置していてもよい。配列番号１２０を含むＤＮＡスペーサーによって、導入遺伝子の発現が向上する。本発明の実施形態のいくつかにおいて、プロモーターと導入遺伝子の間にＤＮＡスペーサーを含むベクター構築物は、同じプロモーターと同じ導入遺伝子の間にＤＮＡスペーサーを有していないベクターよりも導入遺伝子の転写が増加することが示された。本発明の実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、同じプロモーターと同じ導入遺伝子の間にＤＮＡスペーサーを有していないベクターよりも導入遺伝子の発現が向上していた。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、mE1Bプロモーターと導入遺伝子の間に位置する。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、前記マーカー配列をコードする前記ポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、たとえばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなどの２Ａリンカーである。
【０２０６】
マーカー配列をコードするポリヌクレオチドは、そのアミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、マーカー配列をコードする前記ポリヌクレオチドは、そのコード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、マーカー配列をコードする該ポリヌクレオチドを切断して、別のマーカー配列をコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、マーカー配列をコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における発現、好ましくはヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、２種以上のマーカー配列を用いることができる。いくつかの実施形態において、第１のマーカー配列は、構成的プロモーターの制御下にあり、形質導入された細胞が導入遺伝子を発現していることの指標となる。別の実施形態において、第２のマーカー配列は、誘導型プロモーターの制御下にあり、導入遺伝子の発現が誘導されたことの指標となる。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある前記マーカーを使用して、誘導型プロモーターの制御下におけるマーカー配列の発現が他の細胞よりも低い細胞を選択することによって、非誘導状態での発現量または基底レベルでの発現量が他の細胞よりも大幅に低い細胞を選択し、選択した細胞を増殖させてさらなる用途に使用することができる。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞を調節するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。
【０２０８】
誘導型プロモーターの制御下のその他の遺伝子部分
いくつかの実施形態において、第１の核酸は、誘導型プロモーターの制御下に、生存および増殖を促進する遺伝子、アポトーシスを阻害する遺伝子、および／または負のチェックポイントシグナル伝達を抑制する遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。このような遺伝子として、IL-2をコードする遺伝子、IL-7をコードする遺伝子、IL-15をコードする遺伝子、ケモカイン受容体をコードする遺伝子、Bcl2をコードする遺伝子、CA-Aktをコードする遺伝子、dn-TGFβRIIIをコードする遺伝子、dn-SHP1/2をコードする遺伝子、PD-1-IFNαキメラをコードする遺伝子および／またはPD-1-CD28キメラをコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子も、本明細書に記載の誘導型プロモーターの制御下に置かれる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子は、IL-2、IL-7、IL-15、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、Bcl2、CA-Akt、dn-TGFβRII、dn-SHP1/2、PD-1-IFNαキメラおよび／またはPD-1-CD28キメラをコードする。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記遺伝子は、負のチェックポイント制御因子を抑制するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、第１の核酸は、サイトカイン、ケモカイン受容体またはキメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された第１の誘導型プロモーターを含む。走化性サイトカインとも呼ばれるケモカインは、リンパ球の交通を制御する構造的に関連したタンパク質の一群である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは恒常性ケモカインまたは炎症性ケモカインである。ケモカイン受容体としては、CCR2、CCR7またはCCR15が挙げられる。サイトカインとしては、IL-2、IL-12、IL-7および／またはIl-15などのインターロイキン、インターフェロン−δなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子、およびTLR4アゴニストが挙げられる。キメラサイトカイン受容体として、CCR（CD122）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、前記ケモカイン受容体は、CCR2、CCR7、および／またはCCR15を含む。いくつかの実施形態において、前記ケモカイン受容体は、CCR2、CCR7またはCCR15を含む。いくつかの実施形態において、前記サイトカインはインターロイキンを含み、該インターロイキンは、IL-2、IL-12およびIL-7および／もしくはIL-15、またはインターフェロンであり、該インターフェロンは、インターフェロン−δ、腫瘍壊死因子またはTLR4アゴニストを含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、第１の核酸は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結された第１の誘導型プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、第１の核酸は、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結された第１の誘導型プロモーターを含む。このような遺伝子としては、dn-TGFβRII、dn-SHP1/2、PD-1-IFNαキメラおよび／またはPD-1-CD28キメラが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、dn-TGFβRII、dn-SHP1/2、PD-1-IFNαキメラおよび／またはPD-1-CD28キメラである。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節する前記ポリペプチドは、負のチェックポイント制御因子を抑制する。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【０２１２】
誘導型プロモーターの制御下に置かれる核酸の数は特に限定されず、このような核酸として、キメラ抗原受容体をコードする核酸、マーカー配列をコードする核酸、サイトカインをコードする核酸、ケモカインをコードする核酸、アポトーシスの阻害因子をコードする核酸、および／または負のチェックポイントシグナル伝達の阻害因子をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、十分な発現量で各核酸を発現させるために、１つ以上の誘導型プロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下にある遺伝子（たとえばサイトカイン）と、構成的プロモーターの制御下にあるキメラ抗原受容体を含む構築物とを使用して別の構築物を作製することができる。このようにして作製された構築物は、たとえばキメラ抗原受容体を発現するリンパ球などの形質導入された細胞の生存と増殖の向上に有用である。
【０２１３】
本明細書において提供されるシステムにおいて、該システムは、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能である。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。
【０２１５】
構成的プロモーター系
別の実施形態において、本発明のシステムは、転写活性化因子に連結された構成的プロモーターまたは第２の誘導型プロモーターを含む第２の核酸を含む。別の実施形態において、本発明のシステムは、転写活性化因子に連結されたプロモーターを含む第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターとしては、ＥＦ１αプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターは除外される。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、マーカーまたは本明細書に記載のキメラ抗原受容体をコードする１つ以上ポリヌクレオチドに連結されていてもよい。
【０２１６】
構成的プロモーター
構成的プロモーターは、自体の制御下で遺伝子の連続的な発現を可能とする。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターは、レンチウイルス構築物および／またはリンパ球において遺伝子の発現を可能とするプロモーターである。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターは、植物やウイルスなどの異種生物に由来するものではない。
【０２１７】
特定の一実施形態において、構成的プロモーターとして、ＥＦ１αプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、および／またはクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターは除外される。
【０２１８】
転写活性化因子
いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、転写活性化因子に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、誘導因子（たとえば薬物）の存在下で、誘導型プロモーターを活性化する。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターは、転写活性化因子の存在下で誘導される。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は薬物の存在下で誘導型プロモーターに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子はTamR-tf（HEA3またはHEA4）である。転写活性化因子の改変は、前記薬物、前記プロモーターまたはこれらの両方に対する該転写活性化因子の結合力に影響を与えうるアミノ酸配列において行うことができる。たとえば、ERリガンド結合ドメインの結合性は、転写活性化因子に対する薬物の結合に影響を及ぼすと考えられる。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、前記システムは合成転写活性化因子を使用し、該合成転写活性化因子は、前記薬物（たとえばタモキシフェン）の存在下において、導入遺伝子の上流の合成プロモーターに結合し、発現を誘導する。いくつかの実施形態において、前記合成転写活性化因子は、野生型「TamR-tf」HEA3転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記合成転写活性化因子は、野生型「TamR-tf」HEA4転写因子のバリアントである。代表的なアミノ酸配列を配列番号１に示す（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。前記エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）由来の前記タモキシフェン特異的変異リガンド結合ドメインは、前記HEA3の２８２〜５９５番目のアミノ酸からなる配列であり、５２１番目に変異を有する（配列番号１：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。NF-κBのp65活性化ドメイン（p65またはTAD）は、５９６〜８６２番目のアミノ酸からなる配列である。配列番号１は、ER-LBD内に１個の点突然変異を含み、この点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、4-OHT、フルベストラントおよびその他のエストロゲン類似体に対するナノレベルでの特異性を付与する。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。
【０２２１】
転写因子の特性を向上させるために、前記転写活性化因子にさらに変更を加えてもよく、たとえば、前記エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン内の１個以上のアミノ酸に変更を加えてもよく、かつ／または前記p65トランス活性化ドメイン内の１個以上のアミノ酸に変更を加えてもよいが、変更はこれらに限定されない。前記エストロゲン受容体の結合ドメインのアミノ酸に変更を加えることによって、前記転写活性化因子に対する前記薬物の結合の特異性と感受性をさらに高めることができる。変異は、たとえば、配列番号４の４００番目のアミノ酸、５４３番目のアミノ酸および５４４番目のアミノ酸に導入される。（配列番号４：MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPVKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEAADAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS）。配列番号４は、３個の点突然変異（G400V、M543A、L544A）をER-LBD内に含む野生型HEA4配列を含み、これらの点突然変異は、内因性エストロゲンへの結合を抑制するが、野生型のHEA3と比較して、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントおよびエストロゲン類似体に対してより高い感受性を付与する。改変された配列を有する前記転写活性化因子は、タモキシフェンまたは4-OHTに対する親和性が増加している。前記p65トランス活性化ドメイン内のアミノ酸に変更を加えると、形質導入された細胞を活性化させることなく、導入遺伝子の発現を増加させることができる。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞を調節するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。
【０２２２】
マーカー
いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。このようなマーカーポリペプチドは本明細書に記載されており、EGFRt、Her2tおよび／またはDHFRdmが挙げられる。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、前記マーカーは、配列番号３０、３２、３４、３６または３８に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、配列番号３１、３３、３５、３７または３９に示されるアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、リガンドに特異的なリガンド結合ドメイン、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記リガンドは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現されているその他の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導することができる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。
【０２２５】
ベクター
形質導入および導入遺伝子の発現を効率的に行うことができる様々なベクターの組み合わせを構築することができる。いくつかの実施形態において、前記ベクターはデュアルパッケージングウイルスベクターまたは単一の（オールインワン）ウイルスベクターである。別の実施形態において、前記ベクターとして、ウイルスベクターとプラスミドベクターの組み合わせが挙げられる。別のウイルスベクターとしては、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、プラスミドベクターまたはウイルスベクターは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含む第１の核酸を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターまたはウイルスベクターは、細胞の生存または増殖を向上させる遺伝子、アポトーシスを制御する遺伝子、および／またはチェックポイントシグナル伝達を調節する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節することによって、負のチェックポイント制御因子が抑制される。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。前記ポリヌクレオチドは、サイトカイン、キメラサイトカイン受容体またはケモカイン受容体をコードする。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターまたはウイルスベクターは、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含む第１の核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は、ヒトリンパ球の形質導入に適合している。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は、形質導入細胞の選択および／または検出を可能にする。いくつかの実施形態において、前記マーカーは遺伝子であり、該遺伝子として、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質であるG418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子の変異体（DHFRdm）、ピューロマイシンに対する耐性を付与するpac遺伝子、ゼオシンを不活化するSh ble遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）、および／または多剤耐性（MDR）遺伝子などが挙げられる。第１の核酸は、いずれも誘導型プロモーターの制御下にある様々なポリヌクレオチド配列を多数含むことができる。たとえば、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはサイトカインもしくはケモカイン受容体をコードするポリヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子は、前記誘導型プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、前記遺伝子はキメラサイトカイン受容体をコードする。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、薬物に結合して誘導型プロモーターの発現を活性化する転写活性化因子をコードする核酸配列に連結された構成的プロモーターを含む第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターを有するレンチウイルスベクターは、マーカー遺伝子、PiggyBacトランスポゼース、および／またはキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列をさらに含んでいてもよい。この核酸の各構成要素は、Ｔ２Ａ自己切断配列などの配列を介して互いに隔てられていてもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸の各構成要素は、自己切断配列を介して互いに隔てられている。いくつかの実施形態において、前記自己切断配列は２Ａリンカーである。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａである。
【０２２８】
別の実施形態において、異種（前記ベクター、たとえばレンチウイルスベクターに対して異種）の核酸配列は、ベクター中にパッケージされうる他の遺伝子部分の量によって制限される。いくつかの実施形態において、構築物は、前記ウイルスベクターに対して異種の遺伝子を少なくとも２つ含む。いくつかの実施形態において、前記構築物に含まれる、前記ウイルスベクターに対して異種の遺伝子は４つ以下である。前記ウイルスベクター中にパッケージすることが可能な、該ベクターに対して異種の遺伝子の数は、１種以上の導入遺伝子の発現を検出すること、および細胞の少なくとも１０％に形質導入することが可能であり、かつ／または細胞の少なくとも１０％において該導入遺伝子の発現が検出可能なベクター構築物を選択することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞を調節するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスはデュアルパッケージングされたウイルスである。デュアルパッケージングされたウイルスは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導型プロモーターを含む少なくとも１つの条件的構築物を含む。この条件的構築物は、マーカー遺伝子、サイトカインをコードする核酸、キメラサイトカイン受容体をコードする核酸、およびケモカイン受容体をコードする核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、デュアルパッケージングされたレンチウイルスは、構成的プロモーターを含む構成的構築物を含む。一実施形態において、前記構成的構築物は、誘導型プロモーターの転写活性化因子に連結された構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記構成的構築物は、マーカー遺伝子、および／またはサイトカインもしくはケモカインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。２つの構築物を含むシステムの実施形態のいくつかにおいて、各構築物は、別々のウイルスベクターにパッケージされおり、これらのウイルスベクターを混合して使用することによって細胞集団に形質導入することができる。
【０２３０】
構成的構築物および条件的構築物がいずれもマーカー遺伝子を含んでいる場合、各構築物中のマーカー遺伝子は同じものまたは互いに異なるものである。いくつかの実施形態において、構成的構築物および条件的構築物がいずれも、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含んでいる場合、該キメラ抗原受容体は、同じ抗原を標的とするが、異なるリガンド結合ドメインを含んでいてもよく、あるいは、同じ抗原を標的とするが、エピトープは異なっていてもよく、あるいは異なる抗原を標的としてもよい。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、前記ベクターはミニサークルである。ミニサークルは、細菌プラスミドのＤＮＡ骨格を含んでいない環状の発現カセットとして作製されたエピソーマルＤＮＡベクターである。ミニサークルは分子サイズが小さいため、より効率的な形質移入が可能であり、さらに、数日間しか機能しない標準的なプラスミドベクターと比較して数週間にわたる持続発現が可能である。いくつかの実施形態において、ミニサークルは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された、薬物によって誘導可能なプロモーターを含んでいる。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、ケモカイン受容体、マーカー遺伝子および／またはサイトカインに連結することができる。１つ以上のミニサークルを使用することができる。いくつかの実施形態において、ミニサークルは、第１のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含み、別のミニサークルは、第１のキメラ抗原受容体とは異なる第２のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含み、かつ／または、さらに別のミニサークルは、ケモカイン受容体、キメラ抗原受容体およびマーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含む。これらの構築物の各構成要素は、自己切断Ｔ２Ａ配列をコードする核酸などの核酸を介して隔てられている。いくつかの実施形態において、前記構築物の各構成要素は、自己切断Ｔ２Ａ配列をコードする核酸などの核酸を介して隔てられている。いくつかの実施形態において、各ミニサークルに含まれているキメラ抗原受容体は互いに異なるものであり、たとえば、スペーサーの長さ、スペーサーの配列、細胞内シグナル伝達ドメイン、および／またはマーカー配列が異なっているが、相違点はこれらに限定されない。前記ミニサークルベクターは、前記誘導型プロモーターの転写活性化因子をコードする構成的レンチウイルスベクターとともに使用することができる。いくつかの実施形態において、前記ミニサークルベクターは、前記誘導型プロモーターの転写活性化因子をコードする構成的レンチウイルスベクターとともに使用する。本明細書において提供されるシステムにおいて、該システムは、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能である。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、PiggyBacトランスポゾンである。PiggyBac（PB）トランスポゾンは、「カット＆ペースト」機構を介してベクターと染色体との間を効率的に転移する転移性遺伝因子である。転移に際して、PBトランスポゼースは、トランスポゾンベクターの両端に位置するトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、ITRに挟まれた配列を元の部位から効率的に移動させて染色体のTTAA部位に効率的に組み込む。PiggyBacトランスポゾンシステムの強力な活性によって、PBベクターの２つのITRに挟まれた目的の遺伝子を標的ゲノムへと容易に移動させることができる。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、PBは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された、薬物によって誘導可能なプロモーターを含んでいる。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、ケモカイン受容体、マーカー遺伝子および／またはサイトカインに連結することができる。１つ以上のPBトランスポゾンを使用することができる。いくつかの実施形態において、PBは、第１のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含み、別のPBは、第１のキメラ抗原受容体とは異なる第２のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含み、かつ／または、さらに別のPBは、ケモカイン受容体、キメラ抗原受容体およびマーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドに連結された誘導型プロモーターを含む。これらの構築物の各構成要素は、自己切断Ｔ２Ａ配列をコードする核酸などの核酸を介して隔てられている。いくつかの実施形態において、各PBに含まれているキメラ抗原受容体は互いに異なるものであり、たとえば、スペーサーの長さ、スペーサーの配列、細胞内シグナル伝達ドメイン、および／またはマーカー配列が異なっているが、相違点はこれらに限定されない。前記PBは、前記誘導型プロモーターの転写活性化因子をコードする構成的レンチウイルスベクター、および構成的プロモーターに連結されたPiggyBacトランスポゼースを含む構成的ベクターとともに使用することができる。
【０２３４】
いくつかの実施形態は、
キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
誘導可能なプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２の構成的または誘導型プロモーターを含む第２の核酸に関し、
第１の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
前記キメラ抗原受容体が、リガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現されるその他の分子であること、ならびに
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導することができることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、第１の核酸と第２の核酸は、単一のレンチウイルスベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。いくつかの実施形態において、第１の核酸はマーカー遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、第１のキメラ抗原受容体とは異なる第２のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。第１のキメラ抗原受容体と第２のキメラ抗原受容体は互いに異なるものであってもよく、リガンド結合ドメイン、標的抗原、標的抗原のエピトープ、スペーサードメインの長さ、スペーサードメインの配列（短い配列、中程度の配列または長い配列）、および細胞内シグナル伝達ドメインが異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、単一のレンチウイルス構築物において第１の核酸と第２の核酸は、ゲノムのインスレーターの核酸配列を介して隔てられていてもよく、該インスレーターは、たとえば、ウニのインスレーターのクロマチンドメインであってもよい。別の実施形態において、第１の核酸の前記誘導型プロモーターは、第２の核酸の前記構成的プロモーターとは逆向きである。これらのベクターのうち１種以上を組み合わせて使用することによって、標的細胞の形質導入を行い、キメラ抗原受容体の発現を誘導することができる。
【０２３５】
宿主細胞および組成物：Ｔリンパ球集団
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のベクターおよび／または構築物を含む遺伝子組換え宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD4+Ｔリンパ球および／またはCD8+Ｔリンパ球である。
【０２３６】
Ｔリンパ球は、公知の技術によって回収することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような、抗体との親和性結合などの公知の技術によって濃縮または除去することができる。濃縮工程および／または除去工程を行った後、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法によって所望のＴリンパ球をインビトロで増殖させることができる。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は患者から得られた自己Ｔ細胞である。
【０２３７】
たとえば、所望のＴ細胞集団またはＴ細胞亜集団は、増殖前のＴリンパ球集団をインビトロの培地に添加し、次いで、非分裂末梢血単核細胞（PBMC）などのフィーダー細胞を該培地に添加し（たとえば、添加後の細胞集団において、増殖培養開始時の最初の集団中の各Ｔリンパ球１個あたり、少なくとも５個、１０個、２０個、または４０個またはそれ以上のPBMCフィーダー細胞が含まれるような比率になるようにフィーダー細胞を加える）、該培地を（たとえばＴ細胞数を十分に増加させることができる時間にわたって）インキュベートすることによって増殖させることができる。前記非分裂フィーダー細胞は、γ線が照射されたPBMCフィーダー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞分裂を防ぐため、3000〜3600radのγ線を前記PBMCに照射する。いくつかの実施形態において、前記PBMCの細胞分裂を防ぐため、3000rad、3100rad、3200rad、3300rad、3400rad、3500rad、もしくは3600radのγ線、またはこれらのエンドポイント値のいずれか２つの間の任意の放射線値のγ線を前記PBMCに照射する。Ｔ細胞またはフィーダー細胞を培地に添加する順序は必要に応じて入れ替えてもよい。通常、Ｔリンパ球の増殖に適した温度などの条件下で培養物をインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度は、たとえば、通常、少なくとも２５℃であり、少なくとも３０℃が好ましく、３７℃がより好ましい。いくつかの実施形態において、ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度は、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３６℃、もしくは３７℃、またはこれらのエンドポイント値のいずれか２つによって定義される範囲内のその他の温度である。
【０２３８】
増殖させたＴリンパ球としては、ヒト腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的であってもよいCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）およびCD4+ヘルパーＴリンパ球が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記細胞としてはＴ細胞前駆細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、前記増殖方法は、EBVで形質転換された非分裂リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダー細胞として加えることをさらに含んでいてもよい。6000〜10,000radのγ線をLCLに照射してもよい。いくつかの実施形態において、6000rad、6500rad、7000rad、7500rad、8000rad、8500rad、9000rad、9500rad、もしくは10,000radのγ線、またはこれらのエンドポイント値のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の放射線量のγ線を前記LCLに照射する。前記LCLフィーダー細胞は任意の適切な量で提供することができ、たとえば、LCLフィーダー細胞と増殖開始時のＴリンパ球の比率は少なくとも１０：１であってもよい。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、前記増殖方法は、（たとえば、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を培地に加えることをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記増殖方法は、IL-2、IL-7および／またはIL-15を培地に加えることをさらに含んでもよい（IL-2の濃度は、たとえば、少なくとも１０単位／ｍｌである）。
【０２４１】
Ｔリンパ球を単離し、増殖を行う前または増殖を行った後に、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれ、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソーティングすることができる。
【０２４２】
CD8+細胞は、標準的な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態において、CD8+細胞は、ナイーブCD8+細胞、セントラルメモリーCD8+細胞およびエフェクターメモリーCD8+細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を特定することによって、これらのCD8+細胞にさらにソーティングされる。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、CD8+末梢血リンパ球由来のCD62L+サブセットおよびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体で染色した後に、CD62L-CD8+画分およびCD62L+CD8+画分にソーティングされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーTCMの表現型マーカーの発現は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および／またはCD127を含み、グランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+および／またはCD8+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターTEは、CD62L、CCR7、CD28、および／またはCD127が陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンが陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Tリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127および／またはCD45RAが挙げられる。
【０２４３】
CD4+ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞にソーティングされる。CD4+リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブCD4+Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+および／またはCD4+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L+および／またはCD45RO+である。いくつかの実施形態において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L-および／またはCD45RO-である。
【０２４４】
細胞または細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうかは、該表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体による染色を使用したフローサイトメトリーによって判定することができる。細胞集団において特定のマーカーが陰性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で強く染まる細胞集団が存在しないことを指し、陽性は、アイソタイプコントロールよりも特異的抗体で均一に染まる細胞集団が存在することを指す。いくつかの実施形態において、１種以上のマーカーの発現の減少は、対照の細胞集団と比較して、平均蛍光強度の低下が1 log10であること、および／またはマーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも２０％に低下すること、細胞全体の少なくとも２５％に低下すること、細胞全体の少なくとも３０％に低下すること、細胞全体の少なくとも３５％に低下すること、細胞全体の少なくとも４０％に低下すること、細胞全体の少なくとも４５％に低下すること、細胞全体の少なくとも５０％に低下すること、細胞全体の少なくとも５５％に低下すること、細胞全体の少なくとも６０％に低下すること、細胞全体の少なくとも６５％に低下すること、細胞全体の少なくとも７０％に低下すること、細胞全体の少なくとも７５％に低下すること、細胞全体の少なくとも８０％に低下すること、細胞全体の少なくとも８５％に低下すること、細胞全体の少なくとも９０％に低下すること、細胞全体の少なくとも９５％に低下すること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％に低下すること、もしくは２０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージに低下することを指す。いくつかの実施形態において、細胞集団が１種以上のマーカーについて陽性であることは、対照の細胞集団と比較して、マーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも５０％であること、細胞全体の少なくとも５５％であること、細胞全体の少なくとも６０％であること、細胞全体の少なくとも６５％であること、細胞全体の少なくとも７０％であること、細胞全体の少なくとも７５％であること、細胞全体の少なくとも８０％であること、細胞全体の少なくとも８５％であること、細胞全体の少なくとも９０％であること、細胞全体の少なくとも９５％であること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％であること、または５０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージであることを指す。
【０２４５】
細胞または細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうかは、該表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体による染色を使用したフローサイトメトリーによって判定することができる。細胞集団において特定のマーカーが陰性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で強く染まる細胞集団が存在しないことを指し、陽性は、アイソタイプコントロールよりも特異的抗体で均一に染まる細胞集団が存在することを指す。いくつかの実施形態において、１種以上のマーカーの発現の減少は、対照の細胞集団と比較して、平均蛍光強度の低下が1 log10であること、および／またはマーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも２０％に低下すること、細胞全体の少なくとも２５％に低下すること、細胞全体の少なくとも３０％に低下すること、細胞全体の少なくとも３５％に低下すること、細胞全体の少なくとも４０％に低下すること、細胞全体の少なくとも４５％に低下すること、細胞全体の少なくとも５０％に低下すること、細胞全体の少なくとも５５％に低下すること、細胞全体の少なくとも６０％に低下すること、細胞全体の少なくとも６５％に低下すること、細胞全体の少なくとも７０％に低下すること、細胞全体の少なくとも７５％に低下すること、細胞全体の少なくとも８０％に低下すること、細胞全体の少なくとも８５％に低下すること、細胞全体の少なくとも９０％に低下すること、細胞全体の少なくとも９５％に低下すること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％に低下すること、もしくは２０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージに低下することを指す。いくつかの実施形態において、１種以上のマーカーの発現の増加は、蛍光強度の平均値もしくは中央値が増加すること、および／または細胞集団において１つのマーカーまたは任意のマーカーが陽性である細胞の数が増加することを指し、たとえば、対照の細胞集団と比較して、特定の細胞集団におけるマーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも５０％であること、細胞全体の少なくとも５５％であること、細胞全体の少なくとも６０％であること、細胞全体の少なくとも６５％であること、細胞全体の少なくとも７０％であること、細胞全体の少なくとも７５％であること、細胞全体の少なくとも８０％であること、細胞全体の少なくとも８５％であること、細胞全体の少なくとも９０％であること、細胞全体の少なくとも９５％であること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％であること、または５０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージであることを指す。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、抗原特異的なCD4+集団およびCD8+集団は、ナイーブＴリンパ球または抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。たとえば、サイトメガロウイルス抗原に対して特異的なＴ細胞株またはＴ細胞クローンは、サイトメガロウイルスに感染した対象からＴ細胞を単離し、インビトロにおいてサイトメガロウイルス抗原で該細胞を刺激することによって作製することができる。ナイーブＴ細胞を使用することもできる。Ｔ細胞応答を誘導するための標的として使用するための、腫瘍細胞に由来する抗原の数は特に限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の養子細胞免疫療法用組成物は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、乳がん、または黒色腫を含む疾患または障害の治療に有用である。
【０２４７】
Ｔリンパ球集団の改変
いくつかの実施形態において、本開示による免疫療法に使用するための前記Ｔ細胞に機能性遺伝子を導入することが望ましい場合がある。たとえば、単一の遺伝子または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、体内に移入されたＴ細胞の生存および／または機能を向上させることができ、それによって治療法の有効性を改善することができる。あるいは、単一または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、インビボで生存および／または遊走するＴ細胞を選択および／または評価することが可能な遺伝子マーカーを提供することができる。あるいは、単一または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、たとえば、Ｔ細胞において前記導入遺伝子の発現を制御することができ、それによって免疫療法の安全性を改善することができる。これらは、本開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術に従って行うことができる。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の、薬物で誘導可能なキメラ受容体をコードするベクターを使用してＴ細胞を改変する。いくつかの実施形態において、薬物で誘導可能な導入遺伝子をコードするベクターを使用してＴ細胞を改変する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞を調節するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下でキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を改変する。別の実施形態において、誘導型プロモーターの制御下に、サイトカイン、キメラサイトカイン受容体、ケモカイン受容体、アポトーシスを制御する遺伝子、またはチェックポイントシグナル伝達を調節する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を改変する。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、処置を受けるべき対象から得られ、別の実施形態においては、前記リンパ球は同種ヒトドナー、好ましくは健常ヒトドナーから得られる。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節することによって、負のチェックポイント制御因子を抑制する。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【０２４９】
キメラ受容体は、たとえば抗体分子などに由来する抗原結合断片または抗体可変ドメインを利用することによって、任意の細胞表面マーカーに対する特異性を持つように構築することができる。前記抗原結合分子は、１種以上の細胞シグナル伝達モジュールに連結することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞シグナル伝達モジュールとしては、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および／またはCD28膜貫通ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、EGFRtなどの形質導入マーカーをさらに含んでいてもよい。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、CD4+Ｔリンパ球集団および／またはCD8+Ｔリンパ球集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。いくつかの実施形態において、これらの細胞集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体のリガンド結合ドメインは、腫瘍細胞上または感染細胞上の同じリガンドに特異的に結合するか、または異なる抗原もしくは異なるエピトープに特異的に結合する。前記細胞シグナル伝達モジュールもそれぞれ異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記CD8+細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと、前記CD4+ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは同一のものである。別の実施形態では、前記CD8+細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと、前記CD4+ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは異なるものである。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、本明細書に述べるように、CD4 Ｔリンパ球またはCD8 Ｔリンパ球はそれぞれ、形質導入を行う前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソーティングすることができる。いくつかの実施形態において、CD4 Ｔリンパ球またはCD8 Ｔリンパ球はそれぞれ、形質導入を行った後に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソーティングすることができる。
【０２５２】
本明細書で述べるように、いくつかの実施形態において、ナイーブCD4+細胞は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+および／またはCD4+Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L陽性および／またはCD45RO陽性である。いくつかの実施形態において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L陰性および／またはCD45RO陽性である。これらの集団はそれぞれ独立してキメラ受容体で改変することができる。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、本明細書で述べるように、メモリーＴ細胞は、CD8+末梢血リンパ球由来のCD62L+サブセットおよびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体で染色した後に、CD62L-CD8+画分およびCD62L+CD8+画分にソーティングされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞（TCM）の表現型マーカーの発現は、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および／またはCD127を含み、グランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+および／またはCD8+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞（TE）は、CD62L、CCR7、CD28、および／またはCD127が陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンは陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、CD8+、CD62L+、CD45RO+、CCR7+、CD28+、CD127+、および／またはCD45RO+によって特徴付けられる。これらの集団はそれぞれ独立してキメラ受容体で改変することができる。
【０２５４】
遺伝子送達のための組換え感染性ウイルス粒子を利用した様々な形質導入技術が開発されてきた。このような形質導入技術は、現時点において、本発明のＴリンパ球を形質導入するためのアプローチとして好ましい。この形質導入技術に通常使用されるウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルスベクター、および／またはレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。このように、遺伝子導入方法および発現方法としては様々なものが存在するが、このような方法は、哺乳動物細胞に遺伝物質を導入して発現させることを本質的な機能とする。前記形質導入技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球に形質導入することを目的として使用され、このような形質導入技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、組換えアデノウイルスによる感染、アデノ随伴ウイルスによる感染、およびレトロウイルスベクターによる感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球の形質導入は、エレクトロポレーションおよびレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染によって成功を収めている。
【０２５５】
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、真核細胞への遺伝子導入を非常に効率的に行うことができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。
【０２５６】
刺激因子（たとえばリンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現は、治療を受ける個体に対して毒性がある場合がある。したがって、本発明のＴ細胞に、インビボでのネガティブ選択に対する感受性を付与する遺伝子セグメントも本発明の範囲に含まれる。本明細書において「ネガティブ選択」という用語は、一般的な通常の意味を有し、たとえば、インビボにおける個体の状態を変化させることによって該個体に注入した細胞を排除することを指すために使用してもよい。ネガティブ選択が可能な表現型は、投与される薬剤（たとえば化合物）に対する感受性を付与する遺伝子を挿入することによって発現される。ネガティブ選択可能な遺伝子は当技術分野において知られており、たとえば、ガンシクロビルに対する感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子、細胞由来ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞由来アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼなどが挙げられる。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、ネガティブ選択可能な表現型を有する細胞をインビトロで選択することを可能とするポジティブマーカーをＴ細胞に導入すると有用な場合がある。前記ポジティブ選択マーカーは、宿主細胞に導入される遺伝子であって、導入された該遺伝子を持つ宿主細胞のポジティブ選択を可能にする表現型を優位に発現する遺伝子であってもよい。このようなタイプの遺伝子は当技術分野において公知であり、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質であるG418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の二重変異体（DHFRdm）、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）、および／または多剤耐性（MDR）遺伝子などが挙げられる。
【０２５８】
Ｔリンパ球に形質を導入するために、当技術分野において公知の様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体をコードする発現ベクターを使用して、CD4+細胞およびCD8+細胞をそれぞれ別々に改変し、定義された集団を形成させることができる。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、構成的プロモーターの制御下でポリヌクレオチドを含むベクター、および誘導型プロモーターの制御下でサイトカインまたはケモカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを使用して別々に改変することができる。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、前述したように、さらに、ナイーブ細胞亜集団、セントラルメモリー細胞亜集団、およびエフェクター細胞亜集団のそれぞれに固有の細胞表面抗原でソーティングすることによって、これらの亜集団にソーティングされる。また、CD4+細胞集団およびCD8+細胞集団は、サイトカインプロファイルまたは増殖活動に基づいて選択することができる。たとえば、抗原で刺激した後の、IL-2、IL-4、IL-10、TNFα、および／またはIFNγなどのサイトカインの産生が、偽形質導入細胞や形質導入CD8+細胞よりも増強されているCD4+Ｔリンパ球を選択することができる。別の実施形態において、IL-2および／またはTNFαの産生が増強されたナイーブCD4+Ｔ細胞またはセントラルメモリーCD4+Ｔ細胞が選択される。同様に、偽形質導入CD8+細胞よりもIFNγの産生が増強されたCD8+細胞が選択される。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性を示すCD4+細胞およびCD8+細胞が選択される。いくつかの実施形態において、CD4+細胞は、CD8+細胞よりも低い細胞傷害性を示すと予想される。好ましい一実施形態において、特定の種類のがんについて確立された動物モデルを使用して、インビボにおいて腫瘍細胞を殺傷する能力を発揮する形質導入リンパ球（たとえばCD8+セントラルメモリー細胞）が選択される。
【０２６２】
さらに別の実施形態において、特定の種類のがんについて確立された動物モデルを使用して、インビボにおいて持続可能な形質導入キメラ受容体発現Ｔ細胞が選択される。いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域を有する形質導入キメラ受容体CD8+セントラルメモリー細胞は、動物モデルに導入後、３日間以上、１０日間以上、２０日間以上、３０日間以上、４０日間以上、または５０日間以上にわたってインビボで持続可能であったことが示された。
【０２６３】
本開示は、本発明の組成物においてCD4+Ｔ細胞とCD8+Ｔ細胞の組み合わせを使用することを包含する。一実施形態において、キメラ受容体が形質導入されたCD4+細胞の組み合わせは、同じリガンドに特異的である形質導入キメラ受容体発現CD8+細胞と組み合わせてもよく、あるいは異なる腫瘍リガンドに特異的であるCD8+Ｔ細胞と組み合わせてもよい。別の実施形態において、キメラ受容体が形質導入されたCD8+細胞は、腫瘍上に発現された別のリガンドに特異的なキメラ受容体形質導入CD4+細胞と組み合わせる。さらに別の実施形態において、キメラ受容体で改変されたCD4+細胞とキメラ受容体で改変されたCD8+細胞とを組み合わせる。いくつかの実施形態において、CD8+細胞とCD4+細胞は、様々な比率で組み合わせることができ、たとえば、CD8+とCD4+を１：１の比率で組み合わせることができ、CD8+とCD4+を１０：１の比率で組み合わせることができ、CD8+とCD4+を１００：１の比率で組み合わせることができ、またはこれらの比率のいずれかによって定義される範囲内の比率でCD8+とCD4+とを組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、組み合わせた細胞集団は、インビトロおよび／またはインビボにおいて細胞増殖を試験し、細胞の増殖が得られる細胞比率を選択する。
【０２６４】
キメラ受容体を有する細胞を得るための形質導入を行った後および／またはキメラ受容体を有する細胞を選択した後、得られた各細胞集団は、ヒト対象への少なくとも１回の注入に十分な数に達するまでインビトロにおいて増殖させることが好ましく、少なくとも１回の注入に十分な細胞数としては、通常、約１０４個／ｋｇ〜１０９個／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記形質導入細胞は、抗原を有する細胞、抗CD3、抗CD28、およびIL-2、IL-7、IL-15もしくはIL-21、またはそれらの任意の組み合わせの存在下で培養される。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボにおいてサイトカイン刺激、抗原または腫瘍標的に応答して増殖するCD4+細胞およびCD8+細胞が選択される。たとえば、抗CD3および／または抗CD28で刺激した際に、活発に増殖する形質導入CD4+細胞または形質導入CD8+細胞が選択される。いくつかの実施形態において、誘導型プロモーターの制御下および導入遺伝子の誘導因子（たとえば薬物）の存在下において形質導入細胞を刺激すると、導入遺伝子の発現が増強される。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞を調節するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。
【０２６６】
CD4+細胞の亜集団とCD8+細胞の亜集団とを組み合わせてもよい。特定の一実施形態において、改変されたナイーブCD4+細胞または改変されたセントラルメモリーCD4+細胞と、改変されたセントラルメモリーCD8+Ｔ細胞とを組み合わせることによって、抗原を有する細胞（たとえば腫瘍細胞）に対して相乗的な細胞傷害作用を提供する。
【０２６７】
組成物
本発明の開示は、本明細書に記載の遺伝子組換えＴリンパ球製剤を含む養子細胞免疫療法用組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記Ｔリンパ球製剤は、キメラ受容体を有するCD4+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書で述べるように、薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下に、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、スペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体またはその他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、養子細胞免疫療法用組成物は、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的CD8+細胞傷害性Ｔリンパ球製剤をさらに含み、該細胞傷害性Ｔリンパ球製剤は、細胞性免疫応答を提供し、キメラ受容体を有するCD8+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書で述べるように、薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下に、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外一本鎖抗体、スペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の、前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞集団は、インビボにおいて少なくとも３日以上にわたって持続することができる。別の一実施形態において、各細胞集団は互いに組み合わせて、あるいは別の種類の細胞と組み合わせることによって組成物を提供することができる。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の機能を調節する遺伝子を発現することができる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン受容体、およびＴ細胞の機能を調節することができるタンパク質をコードする。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、前記ヘルパーCD4+Ｔリンパ球は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞またはバルクCD4+Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記ヘルパーCD4+リンパ球は、ナイーブCD4+Ｔ細胞であり、該ナイーブCD4+Ｔ細胞は、CD45RO-Ｔ細胞、CD45RA+Ｔ細胞、および／またはCD62L+CD4+Ｔ細胞を含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞および／またはバルクCD8+Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+Ｔ細胞、CD62L+Ｔ細胞および／またはCD8+Ｔ細胞を含む。さらに別の実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記CD4+ヘルパーＴリンパ球はナイーブCD4+Ｔ細胞またはセントラルメモリーCD4+Ｔ細胞である。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、前記組成物はＴ細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、第１の宿主細胞と第２の宿主細胞とを含み、該第１の宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球であり、前記第２の宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。
【０２７１】
方法
本開示は、養子免疫療法用組成物の製造方法、および疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行うための、該組成物の使用、または疾患または障害を有する対象において組成物を使用して細胞免疫療法を行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物の製造方法は、改変されたナイーブCD4+Ｔヘルパー細胞またはセントラルメモリーCD4+Ｔヘルパー細胞を得ることを含み、該改変されたヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するCD4+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書で述べるように、誘導型プロモーターの制御下に、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。別の実施形態において、CD4+細胞は、誘導型プロモーターの制御下にサイトカイン受容体またはケモカイン受容体を有する。CD4+細胞は、誘導型プロモーターの制御下にその他の遺伝子（アポトーシスを制御する遺伝子、細胞外環境を変更する遺伝子など）をさらに有していてもよい。
【０２７２】
別の一実施形態において、前記方法は、改変されたCD8+セントラルメモリーＴ細胞を得ることをさらに含み、該改変されたセントラルメモリーCD8 Ｔリンパ球製剤は、キメラ受容体を有するCD8+細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書で述べるように、誘導型プロモーターの制御下に、リガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該リガンド結合ドメインがリガンドに特異的であること、前記リガンドが、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、または標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子であること、ならびに前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導することができることを特徴とする。別の実施形態では、CD8+細胞は、誘導型プロモーターの制御下にサイトカイン受容体またはケモカイン受容体を有する。
【０２７３】
前記改変されたCD4+Ｔ細胞および前記改変されたCD8+細胞傷害性Ｔ細胞において、薬物によって誘導可能なプロモーターは、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。いくつかの実施形態において、特定の細胞集団において、キメラ抗原受容体に連結されたプロモーターは構成的プロモーターであり、別の集団において、キメラ抗原受容体に連結されたプロモーターは誘導型プロモーターである。たとえば、改変されたCD4+Ｔ細胞は、構成的プロモーターの制御下に、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有し、これに対して、CD8+細胞傷害性Ｔ細胞集団中に含まれるCD8+細胞は、誘導型プロモーターの制御下に、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有する。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターによって制御される遺伝子は、サイトカインをコードする遺伝子、ケモカイン受容体をコードする遺伝子およびアポトーシス制御因子をコードする遺伝子である。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドは、CD4+細胞集団とCD8+細胞集団とで異なる。これらの２種の構築物の差異としては、抗原またはエピトープに対するリガンド結合ドメインの特異性または親和性、スペーサー領域の長さおよび配列、ならびに細胞内シグナル伝達部分が挙げられる。
【０２７５】
キメラ受容体で改変されたCD4+細胞およびCD8+細胞の調製は、本明細書において説明されている。抗原特異的Ｔリンパ球は、疾患または障害を有する患者から得ることができ、あるいはインビトロにおいて抗原の存在下でＴリンパ球を刺激することによっても調製することができる。抗原特異性によって選択されなかったCD4+Ｔリンパ球亜集団および／またはCD8+Ｔリンパ球亜集団も、本明細書に記載の方法で単離することができ、前記製造方法に組み込むことができる。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、このような細胞集団の組み合わせは、細胞表面マーカーの均一性について評価することができ、すなわち少なくとも２世代にわたる増殖において均一な細胞分化状態を有することができるかどうかを評価することができる。品質管理は、前記標的リガンドを発現する細胞株を、キメラ受容体により改変されたＴ細胞およびキメラ抗原受容体の発現を誘導する薬物とともに共培養し、該誘導因子の存在下において、当技術分野で公知の細胞傷害アッセイ、増殖アッセイ、またはサイトカイン産生アッセイを使用して、該キメラ受容体により改変されたＴ細胞が該細胞株を認識するかどうかを確認することによって実施することができる。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の細胞分化状態および細胞表面マーカーは、フローサイトメトリーによって測定することができる。いくつかの実施形態において、前記CD8+細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、CD3、CD8、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4、CD45ROおよび／またはCD45RAを含む。いくつかの実施形態において、前記CD4+細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、CD3、CD4、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4、CD45ROおよび／またはCD45RAを含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキメラ受容体により改変された前記Ｔ細胞は、インビボにおいて少なくとも３日間または少なくとも１０日間にわたって持続することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキメラ受容体により改変された前記Ｔ細胞は、CFSE色素希釈による測定によれば、インビボにおいて少なくとも２世代または少なくとも３世代にわたって増殖することができる。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の増殖および持続性は、前記疾患または障害の動物モデルに前記細胞を投与し、移入された細胞の持続能力および／または増殖能力を測定することによって決定することができる。別の実施形態において、増殖および活性化は、抗原を有する細胞を使用して複数回にわたって活性化することによって、インビトロで試験することができる。
【０２７８】
また、本開示は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下において本明細書に記載のキメラ受容体を発現するリンパ球を含む組成物を投与すること、および前記薬物を投与することを含む方法を提供する。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、前記薬物は、本明細書で述べるように、タモキシフェン、ならびにそのバリアント、誘導体、薬学的に許容される塩、溶媒和物および水和物である。いくつかの実施形態において、前記薬物は、前記組成物の投与前、投与と同時、または投与後の任意の時間点において送達される。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、前記薬物は前記組成物とともに投与され、前記組成物による毒性が見られた場合、前記薬物の投与は毒性が低減するまで中止される。毒性による症状が軽減した後、前記薬物の投与を再開する。いくつかの実施形態において、毒性による症状が軽減した後に前記薬物の投与を再開してもよい。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、前記薬物は前記組成物とともに投与されるが、対象において腫瘍体積の減少またはがん細胞数の減少が見られた場合は、前記遺伝子組換え細胞を休ませるのに適切な期間にわたって前記薬物の投与を中止し、前記遺伝子組換え細胞の活性が見られない場合は、がんは寛解しており、該遺伝子組換え細胞は必要とされない。
【０２８２】
別の実施形態において、本発明の方法は、
細胞性免疫応答を提供する遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤、および／または腫瘍の直接認識を誘導するとともに、前記遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤の、細胞性免疫応答を媒介する能力を向上させる遺伝子組換えヘルパーＴリンパ球製剤を対象に投与すること、ならびに
誘導型プロモーターを誘導する薬物を投与することを含み、
前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するCD8+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書で述べるように、薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下に、リガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、
前記リガンド結合ドメインが、リガンドに特異的であること、
前記リガンドが、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現されるその他の分子であること、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導することができること、
前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するCD4+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書で述べるように、構成的プロモーターまたは薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下に、リガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、
前記リガンド結合ドメインが、リガンドに特異的であること、
前記リガンドが、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、または標的細胞集団に発現されるその他の分子であること、ならびに
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導することができることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記薬物の投与は、前記組成物または前記宿主細胞の投与後に行い、前記組成物または前記宿主細胞の投与から１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、４週間もしくは２ヶ月が経過した後、またはこれらの時間点のいずれか２つの間にある任意の時間が経過した後に行う。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記システムは、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能である。
【０２８３】
別の実施形態において、本発明の方法は、
細胞性免疫応答を提供する遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤、および／または腫瘍の直接認識を誘導するとともに、前記遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤の、細胞性免疫応答を媒介する能力を向上させる遺伝子組換えヘルパーＴリンパ球製剤を対象に投与すること、ならびに
誘導型プロモーターを誘導する薬物を投与することを含み、
前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するCD8+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書で述べるように、構成的プロモーターの制御下に、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、ならびに
前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するCD4+Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書で述べるように、構成的プロモーターまたは薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下に、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍特異的分子は、腫瘍の表面分子である。
【０２８４】
別の実施形態において、本発明の方法は、
細胞性免疫応答を提供する遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤、および／または腫瘍の直接認識を誘導するとともに、前記遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤の、細胞性免疫応答を媒介する能力を向上させる遺伝子組換えヘルパーＴリンパ球製剤を対象に投与すること、ならびに
誘導型プロモーターを誘導する薬物を投与することを含み、
前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤がCD8+Ｔ細胞を含み、該CD8+Ｔ細胞が、本明細書で述べるように、誘導型プロモーターの制御下において、サイトカイン、ケモカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、および／またはチェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチドを発現すること、ならびに
前記ヘルパーＴリンパ球製剤がCD4+Ｔ細胞を含み、該CD4+Ｔ細胞が、本明細書で述べるように、構成的プロモーターまたは薬物によって誘導可能なプロモーターの制御下において、サイトカイン、ケモカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、および／またはチェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチドを発現することを特徴とする。
いくつかの実施形態において、１つ以上の前記細胞集団は、構成的プロモーターの制御下でキメラ抗原受容体を発現する。いくつかの実施形態において、チェックポイントシグナル伝達を調節することによって、負のチェックポイント制御因子を抑制する。いくつかの実施形態において、前記負のチェックポイント制御因子は、PD-1、VISTA、LAG-3および／またはTIM3を含む。
【０２８５】
発現の誘導に有効な薬物の量は、本明細書に記載の形質導入細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％においてキメラ抗原受容体を誘導することができる薬物量、またはこれらのパーセント値のいずれかで定義される範囲内の任意の数の形質導入細胞においてキメラ抗原受容体を誘導することができる薬物量である。本明細書において提供される方法において、前記システムは、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能である。
【０２８６】
別の一実施形態は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、前記対象の生体試料を分析して、前記疾患または障害に関連する標的分子の存在を検出すること、本明細書に記載の養子免疫療法用組成物を投与すること、および前記誘導型プロモーターを誘導する薬物を投与することを含み、前記キメラ受容体が、前記標的分子に特異的に結合することを特徴とする方法に関する。
【０２８７】
本明細書に記載の実施形態に従って治療が可能な対象は、通常、ヒトまたはその他の霊長類である対象であり、たとえば、獣医学の対象となるサルおよび類人猿である。対象は雄性でも雌性でもよく、任意の適切な年齢であってもよく、たとえば、幼児、幼年者、若年者、成人、および高齢者の対象が挙げられる。
【０２８８】
本発明の方法は、たとえば、血液悪性腫瘍、黒色腫、乳がん、脳腫瘍、その他の上皮悪性腫瘍または固形腫瘍の治療または抑制に有用である。いくつかの実施形態において、これらの疾患または障害と関連する分子は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、Her2、EGFR、CE7、hB7H3、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、またはＢ型肝炎表面抗原である。
【０２８９】
本明細書に記載の方法を用いて処置することができる対象としては、がんを有すると特定または選択された対象が挙げられ、該がんとしては、大腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、骨がん、および脳腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。がん患者の特定および／または選択は、臨床的評価または診断的評価によって行うことができる。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態が適用される腫瘍関連抗原または腫瘍関連分子は、黒色腫、乳がん、脳腫瘍、扁平上皮腫、大腸がん、白血病、骨髄腫、および／または前立腺がんに関連する抗原である。別の実施形態において、前記腫瘍関連分子は、遺伝子組換えキメラ受容体を発現する遺伝子組換えＴ細胞で標的化することができる。前記がんとしては、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、脳腫瘍、前立腺がん、および／または白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
前述のように製造された細胞は、本発明の開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において使用することができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、前記細胞の製剤化は、まず該細胞を培地から回収し、次いで該細胞を洗浄し、投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容され得る」担体）中において該細胞を治療有効量まで濃縮することによって行われる。適切な注入用培地は、任意の等張性培地製剤であってもよく、典型的には、生理食塩水、Normosol R（アボット）もしくはPlasma-Lyte A（バクスター）、５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲル液を使用することができる。前記注入用培地には、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清、またはその他のヒト血清成分を添加してもよい。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、組成物中の細胞の治療有効量または抑制有効量は、形質導入されたCD4細胞もしくはCD8細胞の量、または少なくとも２つの細胞サブセット（たとえば、CD8+セントラルメモリーＴ細胞の１つのサブセットとCD4+ヘルパーＴ細胞の１つのサブセット）の量を指す。より典型的には、１０２個を超えかつ１０６個以下、１０８個以下または１０９個以下の細胞であり、たとえば１０８個または１０９個の細胞であってもよく、１０１０個を超える数の細胞であってもよい。細胞の数は、前記組成物の最終的な用途や、該組成物に含まれる細胞の種類などによって決定される。たとえば、特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合、前記集団を占める該細胞の割合は７０％を超え、通常、８０％を超え、８５％を超え、あるいは前記集団全体の９０〜９５％を占める。本明細書に記載の使用において、前記細胞製剤の量は通常１Ｌ以下であり、５００ｍｌ以下であってもよく、さらには２５０ｍｌ以下もしくは１００ｍｌ以下であってもよく、これらの量のいずれか２つによって定義される範囲内の量であってもよい。したがって、前記所望の細胞の密度は、通常、１０４個／ｍｌよりも大きく、通常１０７個／ｍｌよりも大きく、通常１０８個／ｍｌ以上である。臨床的意義のあるこのような数の免疫細胞は、複数回の注入に分割して投与してもよく、その累積投与量は１０６個、１０７個、１０８個、１０８個、１０９個、１０１０個、もしくは１０１１個、もしくはこれらの細胞数以上、またはこれらのエンドポイントのいずれか２つで定義される範囲内の任意の細胞数に相当する。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、本発明のリンパ球は、個体に免疫を付与するために使用することができる。本明細書において「免疫」という用語は、一般的な通常の意味を有し、病原体の感染もしくは腫瘍に対する応答、またはリンパ球反応の標的となる応答に伴う１つ以上の身体症状を軽減することを意味するために使用してもよい。前記細胞の投与量は、通常、病原体に対する免疫を備える正常個体の体内に存在する細胞数の範囲内である。したがって、細胞は、通常、注入によって投与され、１回の注入あたり２個以上から少なくとも１０６個〜３×１０１０個までの範囲の数の細胞が投与され、少なくとも１０７個〜１０９個の細胞を注入することが好ましい。前記Ｔ細胞は、単回の注入によって、または特定の期間における複数回の注入によって投与することができる。しかしながら、個体によって反応性が異なると予想されるため、注入する細胞の種類および細胞の量、ならびに注入の回数、および複数回の注入を実施する期間は主治医によって決定され、日常的な検査によっても決定することができる。十分な量のＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の作製は、本明細書に例示したような、本発明による迅速な増殖方法を用いて容易に行うことができる。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、特定または選択された対象（たとえば、黒色腫、乳がん、脳腫瘍、扁平上皮腫、大腸がん、白血病、骨髄腫、および／もしくは前立腺がんを有することが特定または選択された対象）に静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄内投与、リンパ節内投与、かつ／または脳脊髄液内投与される。いくつかの実施形態において、キメラ受容体により遺伝子組換えされた前記組成物は、腫瘍部位に送達される。あるいは、本明細書に記載の組成物は、本発明の細胞を腫瘍または免疫コンパートメントに標的化させるとともに、肺などの部位を避けることが可能な化合物と組み合わせることができる。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、化学療法剤および／または免疫抑制剤とともに投与される。別の一実施形態においては、まず、本発明の免疫細胞以外の免疫細胞を抑制または殺傷する化学療法剤を患者に投与してから、本明細書に記載の組成物を投与する。場合によっては、化学療法を完全に省いてもよい。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、腫瘍量が減少するまで、本明細書に記載の改変Ｔ細胞と前記誘導因子（たとえば誘導を行うことの可能な薬物）とを組み合わせて投与することを含む。腫瘍量が減少すれば、誘導薬物の投与を中止して、キメラ抗原受容体の発現をオフに切り換え、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の数を減少させてもよい。別の実施形態において、腫瘍増殖の再発または増強が生じた場合に、別の時間点において前記誘導薬物を投与して、キメラ抗原受容体の発現をオンに切り換えてもよい。
【０２９７】
別の実施形態において、前記細胞の持続的な刺激によるアナジーまたは応答不能状態を回避するため、前記誘導薬物を数日間、数週間または数ケ月間にわたって投与してから、数日間、数週間、または数ケ月間にわたって投与を中止し、その後、数日間、数週間、または数ケ月間にわたって再投与することによって、前記キメラ抗原受容体の発現を周期的に切り替えてもよい。
【０２９８】
さらなる実施形態
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子はキメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。いくつかの実施形態において、アポトーシスを制御する前記ポリペプチドはサバイビンである。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む。
前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、導入遺伝子をコードすること、
前記導入遺伝子が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
また、前記システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、���００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み���該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、scFVを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示���れる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08） VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaagaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７４に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggtacctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttcgcgagggacggttcaa）。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRF）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcaatctcttgcagatctagtcagagccttctaaaaaataatggaaacacctttttacattggtacctgcagaagtcaggccagtctccaaagctccttatctacaaagtttccaaccgactttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacatatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattccgtacacattcggaggggggaccaagctcgagctgaaacgaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtgctgcctggggattctctgagactctcctgtgcaacttctgagttcaccttcactgattactacatgacttgggtccgccagcctccaagaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacagagctaatggttacacaacagagtacaatccatctgtgaagggtcggttcaccatttccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagaactgaggacagtgccacttattactgtgcaagagtctctaactgggcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca）。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQPPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、ROR1（R12）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７８に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggaacagctcgtcgaaagcggcggcagactggtgacacctggcggcagcctgaccctgagctgcaaggccagcggcttcgacttcagcgcctactacatgagctgggtccgccaggcccctggcaagggactggaatggatcgccaccatctaccccagcagcggcaagacctactacgccacctgggtgaacggacggttcaccatctccagcgacaacgcccagaacaccgtggacctgcagatgaacagcctgacagccgccgaccgggccacctacttttgcgccagagacagctacgccgacgacggcgccctgttcaacatctggggccctggcaccctggtgacaatctctagcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgagctggtgctgacccagagcccctctgtgtctgctgccctgggaagccctgccaagatcacctgtaccctgagcagcgcccacaagaccgacaccatcgactggtatcagcagctgcagggcgaggcccccagatacctgatgcaggtgcagagcgacggcagctacaccaagaggccaggcgtgcccgaccggttcagcggatctagctctggcgccgaccgctacctgatcatccccagcgtgcaggccgatgacgaggccgattactactgtggcgccgactacatcggcggctacgtgttcggcggaggcacccagctgaccgtgaccggc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む（ROR1（R12）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのヌクレオチド配列（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca））。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD33に特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８２に示される配列によってコードされる（CD33（h2H12）VlVh scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VlVh scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８６に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０２に示される核酸配列によってコードされる（IgG4ヒンジのヌクレオチド配列：gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4ヒンジのアミノ酸配列：ESKYGPPCPPCP）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原��容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。いくつかの実施形態において、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。いくつかの実施形態において、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性���たはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。
【０３００】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペー���ーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、scFVを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示���れる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaagaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７４に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggtacctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttcgcgagggacggttcaa）。
いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRF）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcaatctcttgcagatctagtcagagccttctaaaaaataatggaaacacctttttacattggtacctgcagaagtcaggccagtctccaaagctccttatctacaaagtttccaaccgactttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacatatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattccgtacacattcggaggggggaccaagctcgagctgaaacgaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtgctgcctggggattctctgagactctcctgtgcaacttctgagttcaccttcactgattactacatgacttgggtccgccagcctccaagaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacagagctaatggttacacaacagagtacaatccatctgtgaagggtcggttcaccatttccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagaactgaggacagtgccacttattactgtgcaagagtctctaactgggcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQPPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、ROR1（R12）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７８に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggaacagctcgtcgaaagcggcggcagactggtgacacctggcggcagcctgaccctgagctgcaaggccagcggcttcgacttcagcgcctactacatgagctgggtccgccaggcccctggcaagggactggaatggatcgccaccatctaccccagcagcggcaagacctactacgccacctgggtgaacggacggttcaccatctccagcgacaacgcccagaacaccgtggacctgcagatgaacagcctgacagccgccgaccgggccacctacttttgcgccagagacagctacgccgacgacggcgccctgttcaacatctggggccctggcaccctggtgacaatctctagcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgagctggtgctgacccagagcccctctgtgtctgctgccctgggaagccctgccaagatcacctgtaccctgagcagcgcccacaagaccgacaccatcgactggtatcagcagctgcagggcgaggcccccagatacctgatgcaggtgcagagcgacggcagctacaccaagaggccaggcgtgcccgaccggttcagcggatctagctctggcgccgaccgctacctgatcatccccagcgtgcaggccgatgacgaggccgattactactgtggcgccgactacatcggcggctacgtgttcggcggaggcacccagctgaccgtgaccggc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む（ROR1（R12） scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのヌクレオチド配列（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca））。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD33に特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８２に示される配列によってコードされる（CD33（h2H12）VlVh scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VlVh scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの��施形態において、前記scFvは、配列番号８６に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０２に示される核酸配列によってコードされる（IgG4ヒンジのヌクレオチド配列：gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4ヒンジのアミノ酸配列：ESKYGPPCPPCP）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。いくつかの実施形態において、細胞において導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺
伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【０３０１】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載のシステムの第１の核酸または本発明の実施形態のいずれか１つに記載のシステムの第２の核酸によってコードされるキメラ受容体ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の選択された分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、���００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み���該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCまたはVAR2CSAに特異的に結合する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、���列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、scFVを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示���れる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaagaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７４に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggtacctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttcgcgagggacggttcaa）。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRF）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6) VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcaatctcttgcagatctagtcagagccttctaaaaaataatggaaacacctttttacattggtacctgcagaagtcaggccagtctccaaagctccttatctacaaagtttccaaccgactttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacatatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattccgtacacattcggaggggggaccaagctcgagctgaaacgaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtgctgcctggggattctctgagactctcctgtgcaacttctgagttcaccttcactgattactacatgacttgggtccgccagcctccaagaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacagagctaatggttacacaacagagtacaatccatctgtgaagggtcggttcaccatttccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagaactgaggacagtgccacttattactgtgcaagagtctctaactgggcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQ
PPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、ROR1（R12）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７８に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggaacagctcgtcgaaagcggcggcagactggtgacacctggcggcagcctgaccctgagctgcaaggccagcggcttcgacttcagcgcctactacatgagctgggtccgccaggcccctggcaagggactggaatggatcgccaccatctaccccagcagcggcaagacctactacgccacctgggtgaacggacggttcaccatctccagcgacaacgcccagaacaccgtggacctgcagatgaacagcctgacagccgccgaccgggccacctacttttgcgccagagacagctacgccgacgacggcgccctgttcaacatctggggccctggcaccctggtgacaatctctagcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgagctggtgctgacccagagcccctctgtgtctgctgccctgggaagccctgccaagatcacctgtaccctgagcagcgcccacaagaccgacaccatcgactggtatcagcagctgcagggcgaggcccccagatacctgatgcaggtgcagagcgacggcagctacaccaagaggccaggcgtgcccgaccggttcagcggatctagctctggcgccgaccgctacctgatcatccccagcgtgcaggccgatgacgaggccgattactactgtggcgccgactacatcggcggctacgtgttcggcggaggcacccagctgaccgtgaccggc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む（ROR1（R12）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのヌクレオチド配列（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca））。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD33に特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８２に示される配列によってコードされる（CD33（h2H12）VlVh scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VlVh scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８６に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０２に示される核酸配列によってコードされる（IgG4ヒンジのヌクレオチド配列：gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4ヒンジのアミノ酸配列：ESKYGPPCPPCP）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む、哺乳動物細胞などの宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞において導入遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）導入遺伝子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、���００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサー���さらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCまたはVAR2CSAに特異的に結合する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、���列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、scFVを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示���れる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaagaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７４に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggtacctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttcgcgagggacggttcaa）。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRF）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcaatctcttgcagatctagtcagagccttctaaaaaataatggaaacacctttttacattggtacctgcagaagtcaggccagtctccaaagctccttatctacaaagtttccaaccgactttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacatatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattccgtacacattcggaggggggaccaagctcgagctgaaacgaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtgctgcctggggattctctgagactctcctgtgcaacttctgagttcaccttcactgattactacatgacttgggtccgccagcctccaagaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacagagctaatggttacacaacagagtacaatccatctgtgaagggtcggttcaccatttccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagaactgaggacagtgccacttattactgtgcaagagtctctaactgggcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca）。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQPPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSS）。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、ROR1（R12）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７８に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggaacagctcgtcgaaagcggcggcagactggtgacacctggcggcagcctgaccctgagctgcaaggccagcggcttcgacttcagcgcctactacatgagctgggtccgccaggcccctggcaagggactggaatggatcgccaccatctaccccagcagcggcaagacctactacgccacctgggtgaacggacggttcaccatctccagcgacaacgcccagaacaccgtggacctgcagatgaacagcctgacagccgccgaccgggccacctacttttgcgccagagacagctacgccgacgacggcgccctgttcaacatctggggccctggcaccctggtgacaatctctagcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgagctggtgctgacccagagcccctctgtgtctgctgccctgggaagccctgccaagatcacctgtaccctgagcagcgcccacaagaccgacaccatcgactggtatcagcagctgcagggcgaggcccccagatacctgatgcaggtgcagagcgacggcagctacaccaagaggccaggcgtgcccgaccggttcagcggatctagctctggcgccgaccgctacctgatcatccccagcgtgcaggccgatgacgaggccgattactactgtggcgccgactacatcggcggctacgtgttcggcggaggcacccagctgaccgtgaccggc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む（ROR1（R12）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのヌクレオチド配列（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca））。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD33に特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８２に示される配列によってコードされる（CD33（h2H12）VlVh scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VlVh scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８６に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０２に示される核酸配列によってコードされる（IgG4ヒンジのヌクレオチド配列：gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4ヒンジのアミノ酸配列：ESKYGPPCPPCP）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる、哺乳動物細胞などの宿主細胞を薬学的に許容される賦形剤中に含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの前記宿主細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、���００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサー���さらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されていてもよいポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、結合断片などの抗体断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCまたはVAR2CSAに特異的に結合する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて���前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるヘルパーCD4+Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記組成物は宿主細胞を含み、該宿主細胞は、Ｔ細胞前駆細胞および別の宿主細胞であり、該別の宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記組成物は宿主細胞を含み、該宿主細胞は、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞と、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球、またはナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞から選択されるCD4+Ｔ細胞である宿主細胞とである。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、scFVを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示���れる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttaccaaatatggcgtgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatgggtggcggtgaaatgggcgggcggcagcaccgattataacagcgcgctgatgagccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatcatcgcgatgcgatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcctgagcgtgagcagcacctatctgcattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatagcaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccatcagtatcatcgcagcccgctgacctttggcggcggcaccaaagtggaaattaaagaatctaagta）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu07）VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGVHWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７４に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggtacctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttcgcgagggacggttcaa）。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、抗IL13Ra2（IL13 zetakine）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその一部もしくはscFvは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRF）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７６に示される配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcaatctcttgcagatctagtcagagccttctaaaaaataatggaaacacctttttacattggtacctgcagaagtcaggccagtctccaaagctccttatctacaaagtttccaaccgactttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacatatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattccgtacacattcggaggggggaccaagctcgagctgaaacgaggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtgctgcctggggattctctgagactctcctgtgcaacttctgagttcaccttcactgattactacatgacttgggtccgccagcctccaagaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacagagctaatggttacacaacagagtacaatccatctgtgaagggtcggttcaccatttccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagaactgaggacagtgccacttattactgtgcaagagtctctaactgggcctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca）。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、oaGD2（8B6）VlVh scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQPPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、ROR1（R12）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７８に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggaacagctcgtcgaaagcggcggcagactggtgacacctggcggcagcctgaccctgagctgcaaggccagcggcttcgacttcagcgcctactacatgagctgggtccgccaggcccctggcaagggactggaatggatcgccaccatctaccccagcagcggcaagacctactacgccacctgggtgaacggacggttcaccatctccagcgacaacgcccagaacaccgtggacctgcagatgaacagcctgacagccgccgaccgggccacctacttttgcgccagagacagctacgccgacgacggcgccctgttcaacatctggggccctggcaccctggtgacaatctctagcggcggaggcggatctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgagctggtgctgacccagagcccctctgtgtctgctgccctgggaagccctgccaagatcacctgtaccctgagcagcgcccacaagaccgacaccatcgactggtatcagcagctgcagggcgaggcccccagatacctgatgcaggtgcagagcgacggcagctacaccaagaggccaggcgtgcccgaccggttcagcggatctagctctggcgccgaccgctacctgatcatccccagcgtgcaggccgatgacgaggccgattactactgtggcgccgactacatcggcggctacgtgttcggcggaggcacccagctgaccgtgaccggc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む（ROR1（R12）scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのヌクレオチド配列（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaatataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctggatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca））。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD33に特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VhVl scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８２に示される配列によってコードされる（CD33（h2H12）VlVh scFvのヌクレオチド配列：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtcccatcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttggaggagggaccaaggtggagatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含む（CD33（h2H12）VlVh scFvのアミノ酸配列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８６に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０２に示される核酸配列によってコードされる（IgG4ヒンジのヌクレオチド配列：gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む（IgG4ヒンジのアミノ酸配列：ESKYGPPCPPCP）。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１０４に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡスペーサーは、前記誘導型プロモーターと前記導入遺伝子の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む（配列番号１２０：gctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccacc）。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、HEA3は２個のアミノ酸変異を含み、該HEA3の配列は、配列番号１２２に示される配列によってコードされる（atggtgtccaagctgtcccagctgcagacagaactgctggcagcactgctggaaagcggcctgagcaaagaggccctgattcaggcactcggcgaacctggaccttatctgctcgctggcgaaggccctctggataagggcgagagctgtggcggaggaagaggagagctggccgagctgcctaacggcctgggcgagacaagaggcagcgaggacgagacagacgacgacggcgaggacttcaccccccccatcctgaaagagctggaaaacctgagccccgaggaagccgcccaccagaaagccgtggtggagacactgctgcaggaagatccctggcgggtcgccaagatggtcaagagctacctgcagcagcacaacatcccccagcgggaggtggtggacaccaccggcctgaaccagagccacctgagccagcacctgaacaagggcacccccatgaaaacccagaagagagccgccctgtacacttggtacgtgcggaagcagagagaggtggcccagcagtttacacacgccggccagggcggcctgatcgaggaacctaccggcgacgagctgcccaccaagaagggcagacggaaccggtttaagtggggccctgcatctcagcagatcctgttccaggcctacgagcggcagaagaaccccagcaaagaggaacgggagacactggtggaagagtgcaaccgggccgagtgcatccagagaggcgtgagcccttctcaggctcagggcctcggcagcaatctggtcaccgaagtgcgggtgtacaattggttcgccaaccggcggaaagaggaagccttccggcacaagctgtctgctggcgatatgagagccgccaacctgtggcccagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaacagcctggccctgagcctgaccgccgatcagatggtgtccgctctgctggacgccgagccccctatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggagctggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggacctgaccctgcacgaccaggtccacctgctggaatgtgcctggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggagaagcatggaacaccccggcaagctgctgttcgcccccaacctgctcctggaccggaaccagggaaagtgcgtggagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaggaattcgtgtgcctgaagtccatcatcctgctgaacagcggcgtgtacaccttcctgtcatccaccctgaagtccctggaagagaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatccacctgatggccaaggctggcctgacactccagcagcagcaccagagactggcccagctgctgctgatcctgagccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacacctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctgtacgacctgctgctcgagatgctggatgcccacagactgcacgcccctacaagcagaggcggagccagcgtggaggaaaccgaccagtctcacctggccaccgccggcagcacaagcagccacagcctgcagaagtactacatcaccggcgaggccgagggattccctgccaccgtggagttccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattccagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgatcccagacccccccctagaagaatcgccgtgcccagcagatctagcgccagcgtgcccaagcctgccccccagccctaccctttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggcacctgctccacctcaggtgctgcctcaggcccctgctccagccccagcccctgccatggtgtctgcactggcccaggctccagctcctgtgcctgtgctggcccctggacctcctcaggctgtggcccctcctgcccctaaacctacccaggccggggagggaacactgtctgaggccctgctgcagctccagttcgacgacgaggatctgggagcactgctgggcaatagcaccgaccccgccgtgtttaccgacctggcctccgtggacaacagcgagttccagcagctcctcaaccagggcatccctgtcgccccacacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcaccagactggtcacaggcgcccagaggcctccagatccagcaccagctccactgggagcccctggcctgcctaatgggctgctgtctggcgacgaggacttcgagagcattgccgacatggacttcagcgccctgctgtcccagatcagcagc）。いくつかの実施形態において、前記HEA3は、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む（MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEGFPATVEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFQSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFESIADMDFSALLSQISS）。この配列は、転写活性を向上させる２個の点突然変異（K310QおよびS536E（RelAタンパク質上の位置））をp65ドメイン内に含むHEA3配列を含む。この配列をHEA3（p65/S536E/K310Q）と呼ぶ。RelA上のK310Qは、HEA3において６２１番目に相当し、S536Eは、HEA3において８４６番目に相当する。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記導入遺伝子は、アポトーシスを制御するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、Bcl2および／またはCA-Aktが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドはBcl2またはCA-Aktである。いくつかの実施形態において、アポトーシスを抑制する遺伝子として、たとえば、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、サバイビン、Bcl2、CA-Aktおよび／またはドミナントネガティブ（dn）カスパーゼ３である。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２４に示される配列によってコードされる（Atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgtgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcaatggat）。いくつかの実施形態において、サバイビンは、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む（MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETVKKVRRAIEQLAAMD）。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる宿主細胞をインビトロで作製する方法を提供する。該方法は、ａ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるシステムを提供すること；およびｂ）単離されたＴリンパ球集団に前記システムを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させることを含む。いくつかの実施形態において、前記Ｔリンパ球は増殖培養されたものであり、前記方法は、抗CD3および／または抗CD28と少なくとも１種の恒常性サイトカインとの存在下において、細胞移入としての使用に十分な数に達するまで前記Ｔリンパ球を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記単離されたＴリンパ球集団はＴ細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記リンパ球はCD8+またはCD4+である。
いくつかの実施形態において、前記システムは、哺乳動物細胞などの細胞においてキメラ抗原受容体の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；ならびに
ｂ）薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードすること、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的分子、ウイルス特異的分子、および標的細胞集団に発現されるその他の分子からなる群から選択されるリガンドに特異的なリガンド結合ドメインを含むこと、
前記リガンドが、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導すること、
第２のポリヌクレオチドが、スペーサー、好ましくは最適化されたポリペプチドスペーサーをコードすること、
第３のポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインをコードすること、
第４のポリヌクレオチドが、細胞内シグナル伝達ドメインをコードすること、ならびに
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で誘導可能であること、
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは配列番号２３に示される核酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、たとえば、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、���００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記シグナル伝達ドメインは、CD28ドメイン、4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、誘導型プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２のプロモーターは、ＥＦ１αｐである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１〜１１に示されるアミノ酸配列および配列番号１２１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、配列番号１２〜２２に示される核酸配列および配列番号１２２に示される核酸配列のうちの少なくとも１つによってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、選択マーカーをコードする第５のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、選択マーカーをコードする第６のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーはEGFRtおよび／またはHER2tである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記選択マーカーは薬物耐性を付与する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第７のポリヌクレオチドをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドを含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されるように最適化されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサー���さらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。
いくつかの実施形態において、前記システムは、Ｔ細胞の機能を制御する遺伝子の発現を誘導可能なシステムである。該システムは、
ａ）第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１の核酸；および
ｂ）第３の核酸に作動可能に連結された第２の核酸を含み、
第１の核酸が、薬物により誘導可能な第１のプロモーターを含むこと、
第１のポリヌクレオチドが、サイトカイン、ケモカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、アポトーシスを制御するポリペプチド、細胞外環境を調節するポリペプチド、チェックポイントシグナル伝達を調節するポリペプチド、増殖を制御するマイクロＲＮＡ産物、生存を制御するマイクロＲＮＡ産物、または細胞溶解能を制御するマイクロＲＮＡ産物をコードすること、
第２の核酸が、第２のプロモーターを含むこと、
第３の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターの転写活性化因子をコードすること、および
前記システムが、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子を利用した類似のシステムよりも少ない薬物量で応答するように構成されていること、または
前記システムが、野生型HEA3を利用したシステムと比較して、所定の薬物濃度における転写発現が向上していることを特徴とする。
前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写活性化因子は、HEA3またはHEA4である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、野生型HEA3転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、野生型HEA4転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該エストロゲン受容体リガンド結合ドメインは、薬物リガンドへの選択的結合を可能とする少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA4は、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ER-LBD）およびRelA（p65）トランス活性化ドメインを含み、該RelA（p65）トランス活性化ドメインは、薬物に応答した転写活性を向上させる少なくとも１個の変異を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記HEA3キメラ転写因子のバリアントまたは前記HEA4キメラ転写因子のバリアントは、薬物リガンドに応答した転写活性を向上させるp65リン酸化模倣アミノ酸置換および／またはp65アセチル化模倣アミノ酸置換を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１〜３、配列番号８〜１１および／または配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA3転写因子のバリアントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号１２２に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号４〜７に示されるアミノ酸配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記野生型HEA4転写因子のバリアントは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８に示される核酸配列によってコードされる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記転写制御因子は、前記薬物に対する選択的結合を可能とするアミノ酸置換を含むHEA3キメラ転写因子のバリアントである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記薬物は、タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物、４−ヒドロキシタモキシフェン、フルベストラントもしくはその他のエストロゲン類似体、またはCMP8である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現量は、少なくとも４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭもしくは５００ｎＭの薬物濃度、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記薬物の誘導によって、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子よりも高くなる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ抗原受容体の発現は、０ｎＭを超え１０ｎＭ未満の無毒な薬物用量の前記薬物によって誘導される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、野生型HEA3キメラ転写因子または野生型HEA4キメラ転写因子の発現を誘導するための用量と比較して、前記無毒な薬物用量において薬物副作用が低減、排除または予防される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記副作用は、白内障、便秘、下痢、浮腫、疲労、体液貯留、紅潮、頭痛、ほてり、高血圧、筋肉痛、悪心、息切れ、嘔吐または体重減少である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第２の核酸は、リガンド結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団に発現される別の分子であり、前記リガンドは、リンパ球による認識、調節、抑制および／または排除を誘導する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは逆向きである。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変断片である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記腫瘍特異的分子は、CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、メソテリン、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3 TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルス特異的分子は、HIVエンベロープタンパク質、HIVエンベロープタンパク質複合体、Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質、Hbc抗原タンパク質、HIV-1 GP120タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス早期抗原タンパク質である。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記リガンド結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、EGFRvIII、EGFR、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、Her2、B7H3、CD33、メソテリン、ROR-1、FITCおよび／またはVAR2CSAに特異的に結合する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記スペーサーは、IgG4、IgG4-CH2（L235D、N297Q）またはIgG4-CH3を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は、ＤＮＡスペーサーをさらに含み、該ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、第１のプロモーターと、前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドとの間に位置する。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペー���ーは、配列番号１２０に示される配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、配列番号１２０と９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性（％）を有する配列を含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ＤＮＡスペーサーは、前記キメラ抗原受容体の遺伝子発現を向上させる。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１の核酸は第１のベクターをさらに含み、第２の核酸は第２のベクターをさらに含む。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一のウイルスベクターにパッケージされている。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、scFVを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、huCD19 scFv（G01S）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、muCD19（FMC63）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはCD19に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４２に示される配列によってコードされる（Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3（hBRCA84D）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7-H3受容体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAMのCE7エピトープに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５０に示される配列によってコードされる（atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccccaggtgcagctgcagcagcctggcgccgagctggtgaagccaggcgccagcgtgaagctgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccggctactggatgcactgggtgaagcagagacccggccacggcctggaatggatcggcgagatcaaccccagcaacggccggaccaactacaacgagcggttcaagagcaaggccaccctgaccgtggacaagagcagcaccaccgccttcatgcagctgtccggcctgaccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgccagggactactacggcaccagctacaacttcgactactggggccagggcaccacactgaccgtgagcagcggcggagggggctctggcggcggaggatctgggggagggggcagcgacatccagatgacccagagcagcagcagcttcagcgtgagcctgggcgaccgggtgaccatcacctgtaaggccaacgaggacatcaacaaccggctggcctggtatcagcagacccccggcaacagccccaggctgctgatcagcggcgccaccaacctggtgaccggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaaggactacaccctgaccatcacaagcctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggtccacccccttcaccttcggcagcggcaccgagctggaaatcaaa）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、L1CAM（CE7）scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMHWVKQRPGHGLEWIGEINPSNGRTNYNERFKSKATLTVDKSSTTAFMQLSGLTSEDSAVYFCARDYYGTSYNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKANEDINNRLAWYQQTPGNSPRLLISGATNLVTGVPSRFSGSGSGKDYTLTITSLQAEDFATYYCQQYWSTPFTFGSGTELEIK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR（セツキシマブ）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる（atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacaggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgcacc）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFR scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRT）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EGFRVIII（806）scFvのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvはEGFRに特異的である。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EphA2（2A4）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５６に示���れる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、EpHA2（4H5）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、FITC（E2）scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６０に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2（hu08）VhVl scFvのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記scFvは、IL13Ra2 hu08 VhVl scFvのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む（MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIKESK）。いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号６９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒袼畨㜰볯嚉噬⁨捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯邼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慧慴瑴慣慧杴捡捣条条捣杣条慣捧瑣慧捧捧慧捧瑧杧捧慧捴捧瑧慧捣瑡慴捣杴慣捣捧慧捧瑣慧捧瑧慧捧条慣捣慴捴杴慣瑴杧慴捴条慣慧慡捣杧捧慡条杣捣慧慡瑣捧杴瑡瑴瑡条慣捣条慣捡瑣杧杣条杣捧瑧捧杣条捣捧瑴慴捧杧慣捧杧慣捧杧慣捣慧瑴瑴捡捣杴捡慣瑴条慣捧瑣捧条捣杧慡慧瑴瑴捧慧捣慴瑴瑡杴捣瑡慣瑧瑡慣捴捧条捣杣瑣慧捣瑴杴捧杧杣捧捡慣慡瑧杧慡瑡慴慡杧杴瑧杧杴瑧捴杴捧杧杣捧杧瑣捣杧杴瑧杧杴瑧捴杴慡瑧捧条瑣杧杴慧慡捧杧杣捧杧捣杴瑧捧条捣杧捧杧慣捧瑣捧捧瑣慧捧杴杣杣捧慧捧杧瑣瑴捡瑣瑴捡慣慡慴杴捧瑧捧瑡杴杧杴杣捣条捧捧杣杧慣慡杧捣杴慧瑡杧瑧杧杣瑧慧慡杴杧杣杧杣捧条慣捣慧瑴瑡慡慣捧捧捧杴瑡慧捧杣瑣瑴捡慣瑴条捣捧慧慴捡捧慧慡慡慣捧瑣瑧瑡瑣捧条瑡慧捡条捣杴杣杣杣慧条瑡捡杣杣瑧瑧瑡慴瑴捧捧捧捧慧捴瑡杣杣瑡捧慧杴慧瑴瑡杴杧捧慣杧捧捡捣杴瑧慧捣瑧慧捧条杣慡捴慴条慴볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒袼畨㜰볯嚉器⁬捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉䥄䵑兔偓卓卌十䝖剄呖呉呃十卌卖呓䱙坈兙䭑䝐䅋䭐䱌奉呓乓䅌䝓偖剓卆升升呇䙄䱔䥔卓兌䕐䙄呁奙䡃契剈偓呌䝆䝇䭔䕖䭉䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䕓兖噌卅䝇䱇兖䝐升剌卌䅃十䙇䙔䭔䝙䡖噗兒偁䭇䱇坅䅖䭖䅗䝇呓奄华䱁卍䙒䥔剓乄䭁华奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剁䡄䑒䵁奄䝗䝑䱔呖卖䕓䭓볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯醼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃���馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䦁ㅌ刳㉡볯梈ふ覼桖汖猠䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捴捴瑣杧杴捡慡捧瑣捴杴瑣瑣瑧慧瑧慴捣捡捡捣条慣瑴捣捴瑣慧捴捣条慡瑧捧条瑣杧杴慧慡捧杧杣捧杧捣杴瑧捧条捣杧捧杧慣捧瑣捧捧瑣慧捧杴杣杣捧慧捧杧瑣瑴捡瑣瑴捡慣慡慴杴捧瑧捧瑡杴杧杴杣捣条捧捧杣杧慣慡杧捣杴慧瑡杧瑧杧杣瑧慧慡杴杧杣杧杣捧条慣捣慧瑴瑡慡慣捧捧捧杴瑡慧捧杣瑣瑴捡慣瑴条捣捧慧慴捡捧慧慡慡慣捧瑣瑧瑡瑣捧条瑡慧捡条捣杴杣杣杣慧条瑡捡杣杣瑧瑧瑡慴瑴捧捧捧捧慧捴瑡杣杣瑡捧慧杴慧瑴瑡杴杧捧慣杧捧捡捣杴瑧慧捣瑧慧捧条杣瑧杧杴瑧杧瑴瑣杧杣捧杧杣捧捴杣瑧杧杴瑧杧瑴瑣慧慴瑴慣慧杴捡捣条条捣杣条慣捧瑣慧捧捧慧捧瑧杧捧慧捴捧瑧慧捣瑡慴捣杴慣捣捧慧捧瑣慧捧瑧慧捧条慣捣慴捴杴慣瑴杧慴捴条慣慧慡捣杧捧慡条杣捣慧慡瑣捧杴瑡瑴瑡条慣捣条慣捡瑣杧杣条杣捧瑧捧杣条捣捧瑴慴捧杧慣捧杧慣捧杧慣捣慧瑴瑴捡捣杴捡慣瑴条慣捧瑣捧条捣杧慡慧瑴瑴捧慧捣慴瑴瑡杴捣瑡慣瑧瑡慣捴捧条捣杣瑣慧捣瑴杴捧杧杣捧捡慣慡瑧杧慡瑡慴慡慧瑡瑣慡瑧覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䦁ㅌ刳㉡볯梈ふ覼桖汖猠䙣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌䕐兖噌卅䝇䱇兖䝐升剌卌䅃十䙇䙔䭔䝙䡖噗兒偁䭇䱇坅䅖䭖䅗䝇呓奄华䱁卍䙒䥔剓乄䭁华奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剁䡄䑒䵁奄䝗䝑䱔呖卖䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䥄䵑兔偓卓卌十䝖剄呖呉呃十卌卖呓䱙坈兙䭑䝐䅋䭐䱌奉呓乓䅌䝓偖剓卆升升呇䙄䱔䥔卓兌䕐䙄呁奙䡃契剈偓呌䝆䝇䭔䕖䭉卅覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風諦鎽臣龁臣鶁臣肸菩节臣辁臣环䙣꾁胣鞊䱉㌱慒袼䱉㌱稠瑥歡湩覼臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風諦鎽臣龁臣鶁臣肸菩节臣辁臣环䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捴捴瑣杧杴捡慡捧瑣捴杴瑣瑣瑧慧瑧慴捣捡捡捣条慣瑴捣捴瑣慧捴捣条捧捣杴杴捣捴捣捴慴慣捧捣捴条瑧捡瑣慣瑴慧杧条瑣杧捴慡慣捴捡捣条慡捣条慡杧瑣捣捧捴杴慣瑡杧慣捧瑡杧慴杴慧捧瑡慣捡瑣慧慣捧杴捧瑡瑧捡杴杴慣捧捣杴慧瑡捣瑣慧捴慡杣杴捴条捧杴慣瑧捧慣捴慧慧条捡捣条条慧杴瑣慧捧杧瑡捴杴捣杣慣慣条瑧瑣慣捧杴杧慣瑧瑴捴慣捧瑴捧瑡瑧捣慧慧慣捣慡慡捴慧杧杴捧捣条瑴杴慴慡杧捡瑣捧捴瑴捡瑡瑴慡条慡捡瑴瑴捴捧慧杧慧杣瑧捴慡볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風諦鎽臣龁臣鶁臣肸菩节臣辁臣环䙣꾁胣鞊䱉㌱慒袼䱉㌱稠瑥歡湩���臣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鞊뷤뺁臣꾁臣꺁룤ꢃ苣鞁臣꾁捳癆臣膀藩鞈闧랏볯閼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌䝐噐偐呓䱁奒䥌䕅噌䥎兔兎䅋䱐乃升噍南义呌䝁奍䅃䱁卅䥌噎䝓千䥁䭅兔䵒卌䙇偃䭈卖䝁䙑卓䡌剖呄䥋噅允噆䑋䱌䡌䭌䱋剆䝅䙒볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯閼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣澁䝡㉄볯㢈㙂볯嚉噬⁨捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯隼臣몤臣貂苣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慧杴瑴瑧慧杴捡捣慡捡捴慣瑣瑣捣瑣捧瑣瑧慣瑧瑣杴慧慧捴慡捧瑣慣瑡瑣瑣杴慣慧捴慴瑧慣慧捧瑣捴慴慡慡瑡慡杴慧慡慣捣瑴瑴慴慣瑴杧慴捣杴慣慧条捴条捧慣瑧瑣捣慡条瑣捣瑴瑡瑣捡慡条瑴捴慣捡杣捡瑴捴杴杧瑧捣慣慧慣杧瑴慣瑧杧慣瑧杧瑡慣杧慧慣慴瑴捴捡捡捴慡慧捴条慣慧瑧杧条捧杴条慧捴杴杧条瑴慴瑴捴杴瑣瑣慣慡瑧捡捡瑡瑡捴杣慴慣慣瑴杣慧杧杧杧捡慣条瑣杣条瑣慧慡杣条捧杧条杧杧瑣瑣杧杣捧杧条慧捴杴杧杧条杧杧慣捧慧杧杴慡捡杴瑧杧条捴杴慧杧条捧瑴杧杴瑣捧瑣杧杧瑡捴捴杴条捡捴捴瑣瑧捧慡瑣捴杴条瑴慣捣瑴慣瑣慧瑴捡慴慣杴捡瑴杧瑧捣捧慣捧瑣捣慡慧慡杧慣瑣杴条杴瑧杴杧瑴瑴瑡慴慧慡慣慧捧慴瑡杧瑴捡捡慡慣慧瑧捡慡捴慣捴杴杴慡杧瑧杣瑧捴捡慣瑴捴慣慧慧慴瑡捴捣慡条慣捴瑣瑣瑡瑣捴慡瑡慧捡捡捣杴条慡瑣慧杧捡条杴捣捡瑴瑡慴瑣瑧捧慡慧瑧瑣瑣慡瑣杧捧瑣瑴慧瑣捡杴杧捧慣条捧捡慣瑣瑣慣慣瑧瑣捣捴覼胣㲂牢ਾ臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀慯䑇袼䈸覼汖桖猠䙣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鞼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌䑐噖呍呑䱐䱓噐䱓䑇䅑䥓䍓卒兓䱓䭌乎乇䙔䡌套兌卋兇偓䱋䥌䭙卖剎卌噇䑐䙒䝓䝓䝓奔呆䭌卉噒䅅䑅䝌奖䍆兓呓䥈奐䙔䝇呇䱋䱅剋䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䕓䭖噌卅䝇䱇䱖䝐卄剌卌䅃協䙅䙔䑔奙呍噗兒偐䭒䱁坅䝌䥆乒䅒䝎呙䕔乙卐䭖則呆卉䑒华卑䱉䱙䵑呎剌䕔卄呁奙䅃噒乓䅗䑆坙兇呇䱔噔卓볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鞼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣㲂牢ਾ臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀佒ㅒ볯劈㈱볯玉䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捧杴瑣杧杴捡慡捧瑣捧杴瑣瑧捧慧捧杴捣捣捡捣杣捣瑴捴杴瑣慧捴捣捣条慧捡条瑣杣捴慧慡捧杧杣捧条捡杴瑧慧慣捣杴捧杧慣捧瑣慧捣瑣慧捧杴慣条捧慣捧杧瑣捴慧瑣捴条杣捣慴瑣捡���慧捧杴杧捴杣捣条捧捣瑣杧慣条杧捡杴慧瑡杧瑡杣捣捡慣捴慴捣捣条慣捧杧慣条捡瑣捡慴杣捣捡瑣杧瑧慧捡杧捡杧瑴慣捣瑡瑣捣条杣捡慡杣捣慣慧捡捡杣杴慧捣杴慣慧杴慡慣捧瑣慧慣捧杣捣慧捣杧捧慣捣慴瑣瑴杴杣捣条条捡条瑣捡捧杣捡慧杣捧捧捣杴瑴慣捡瑡瑣杧杧捣瑣杧慣捣瑣杧杴捡慡捴捴慴捧杧杣慧杧杣慧捴杴瑧杧杣慧杧慡瑧杧杣捧杧条慧捴杴条瑣杧杴瑣慧捣慣慧捧捣瑣瑣瑧瑧瑣捧杴捣瑣杧慧条捣瑣捧慣条瑡慣捣杴慴捣瑣慧捧条杣捣慣慣条捡杣捡捡慣捴慧瑣杧慴捴条慣捧杴慣杧捧慧杧捣捣慣慧慴捣杴瑡捧条瑧捧条条杣捡杧慣捧慴慣捣慡慧杧捣条捧瑧捧捣慧捣杧瑴慣捧杧瑡瑣条瑣瑣杧杣捣慧捣捧慴捣杴瑡慣捴捣慣捧瑧捧条捧杣瑡慧杣条捧杣瑡慴瑣捡杴杴捧捧杣捡慴慣捴杧杣捧慴杣杴瑴杣捧杧条捧捡捣条瑣慧捣瑧慧捣杧覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼佒ㅒ볯劈㈱볯玉䙣꺁苣龃菣뢅藩鞈볯䶚䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌児充噌卅䝇䱒呖䝐升呌卌䭃十䙇䙄䅓奙卍噗兒偁䭇䱇坅䅉䥔偙卓䭇奔䅙坔乖則呆卉䑓䅎乑噔䱄䵑华呌䅁剄呁䙙䅃䑒奓䑁䝄䱁乆坉假呇噌䥔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䕓噌呌卑卐卖䅁䝌偓䭁呉呃卌䅓䭈䑔䥔坄兙䱑䝑䅅剐䱙免兖䑓升呙剋䝐偖剄卆升卓䅇剄䱙䥉卐兖䑁䕄䑁奙䝃䑁䥙䝇噙䝆䝇兔呌呖覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯邼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䎈㍄袼㉨ㅈ覼桖汖猠䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯憈杴瑣捴捴瑣杧杴捡慡捧瑣捴杴瑣瑣瑧慧瑧慴捣捡捡捣条慣瑴捣捴瑣慧捴捣捡条瑧捴条瑣杧杴慣瑧瑣杧条瑣慧杧杴慡慧条捣杴杧捧瑣慣瑧慧条瑧瑣捣杴慣条捧瑴瑣杧瑴捡捡瑣瑴捡慣瑡慴杴瑡瑡慡瑡杴杧杴条捡条捧捣瑣杧捡慡杧捧瑴慧瑧杧瑡杴慧杴慧瑴慴捴瑣杧条瑡杧慴瑧捡慣慡慴慴瑡慧慧慡瑴慣条捧慣条捧慴捣瑣慧慣捧杴捡捡瑡捣捡慣捧捡条捣慴慣杴慧捧杴条慧捧瑣慧慧捴杴瑡慧慣慣捧杴杴慴瑴捡杴杴瑣捴杴慧慴杴慡慧杴瑣瑡杧捡慴瑣杧杧捧慡杧慧捣捡条捴捡条捴捴瑣慣볯覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁䑃㌳臣릉闧蒚臣芁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯醼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩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慡杧捧慧杧杴慡捧杴慣杧慡条杣捧捣杴捧瑣杧杴捧捣捣条捣条条捣杴条杣杴捡瑣捧捡杣杴条杣捧瑧慧捧瑣捧捣慧瑣捡杧杣���条瑣杧瑡捣杧慣捧捣捣慣杧慡杧捧瑣杧慡杴捧杴杧杣杴瑡瑣杧杧慣捧慧慧捣捡瑣捡慴慣捡条杣捣瑣慧条条捣杧瑣慧捣瑡慣捴慡杧捡慡慣捧慡慧捧慣杧杴瑴捣杴慡慧杴慡慣捧瑣捧条捡杣捡慧慣捣捧慣捴慴瑣捡杴杣捣慡捧捡慴瑣捡慴杣捧杧慣捧慴杣捣瑡杧捡慴瑣杧杧捣条杧慣捣条杣杴捡杣杴条慣捧볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌䑐光呍呑協䱓䅓䱓䑇噒䥔䍓䅒兓䥄䭓䱙坎兙䭑䑐呇䭖䱌奉呈剓䡌䝓偖剓卆升升呇奄䱓䥔乓䕌䕑䥄呁䙙元䝑呎偌呙䝆䝇䭔䕌呉升協升䭇䝐䝓䝅呓䝋噅䱋䕑䝓䝐噌偁兓䱓噓䍔噔䝓卖偌奄噇坓剉偑剐䝋䕌䱗噇坉升呅奔乙䅓䭌剓呌䥉䑋华卋噑䱆䵋华兌䑔呄䥁奙䅃䡋奙䝙升䅙䑍坙兇呇噓噔卓볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䊁䠷袼䉨䍒㡁䐴볯玉䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀㝂䠭鞏껥鎽臣릉闧蒚臣邵郥馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀ㅌ䅃袼䕃覼捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䲁䌱䵁臣䎮㝅苣钃菣벃菣ꮁ觧낕髧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥閼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捧杴瑣杧杴捡慣捧瑣捧杴瑣瑧捧慧捧杴捣捣捡捣杣捣瑴捴杴瑣慧捴捣捣条瑧捧条瑣捧条慣捧瑣杧杣捣慧捧杴瑧慧条捣条捧捧慣捧瑧慧条瑣瑧捣杴慣条捧慣捧杧瑣捡捡瑣捴捡杣捧慴瑣杧瑡捧捡杴杧杴慡捧条条捡捣杧捣捡杧捣杴慧瑡杧瑡杣捧慧慧捴慡捣捣条慣捡杧捣杧捡慣捡慴慣捡慧捧杧瑴慣条条慣条捧慣捣瑣慧捣瑧杧捡慡慧捧条慣捣捡杣捣瑴慣杴慣捧杴捴杣捧瑣慧捣条杣条慧慣捧捧杣杴慴瑣捴杴杣捣条杧捡慴瑣捡杧慣捣条瑣捡慡瑣捴慧瑣捡杴杧捧慣杧捧捡慣慣瑣慧捣瑧慧捧条杣捧杧条杧杧瑣瑣杧杣捧杧条慧捴杴杧杧条杧杧慣捧慧慣捴慣慧杴捡捣条条慣捧条慣捧瑴慣捧瑧慧捧瑣杧捧慧捣杧瑧慧捣瑡慣捣杴慴条捧慣捡慧杧捡瑡慣捡慡捣杧瑣杧捣杴瑧瑡慣捧条捡捣捣杧慣捡条捣捣条捧杴瑣慧捴条杣捧捧慣捣慡捣杴瑧慧捣杧杣杴捣慣捧杣瑧瑴条杣捧条杣捧捴杣捧慡杧捡慴慣捣瑣慧捣瑡慣慣条捣杴慣杧捣慧杧捡瑴杣捣捡瑣捡慴瑣捧慣捧条慴瑣杧捴慣捣捣瑣捴捡瑣捴杧慣捧杧慣捣慧捧杴慧慡捴慡覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䲁䌱䵁볯䎈㝅볯玉䙣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯醼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌児兖兌偑䅇䱅䭖䝐十䭖卌䭃十奇䙔䝔坙䡍噗克偒䡇䱇坅䝉䥅偎乓則乔乙剅䭆䭓呁呌䑖卋呓䅔䵆䱑䝓呌䕓卄噁䙙䅃䑒奙呇奓䙎奄䝗䝑呔呌卖䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䥄䵑兔卓卓卆卖䝌剄呖呉䭃乁䑅义剎䅌套兑偔乇偓䱒䥌䝓呁䱎呖噇卐䙒䝓䝓䝓䑋呙呌呉䱓䅑䑅䅆奔䍙兑坙呓䙐䙔升呇䱅䥅覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥���붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥閼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䝅剆볯뮂菣궂苣麃菣覼捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣䖯䙇ꮁ觧낕髧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥閼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捴捴瑣杧杴捡慡捧瑣捴杴瑣瑣瑧慧瑧慴捣捡捡捣条慣瑴捣捴瑣慧捴捣捡条瑧捧条瑣慧慡慣慧捧杧捣杣杧捣杴瑧捧条捣慧捧慣慧捧瑣慧捧瑡慴捣杴慣捣瑧慧捧杧瑣瑴条捣杴捡慣捡慴杴捧瑧捧瑡杴杧杴杣捣条条捣杣杧慣慡杧捣杴慧瑡杧瑣杧捧瑧慧瑴杴慧捧杧杣捧慡慣捣慧瑴瑡慡慣捣捣瑧瑴捡慣捧杣捣杴条慣瑴慡慣慡慧慴捡条慣慡条捣条瑧瑧瑴瑴慴慡瑡慧捡条捣杴慣慧捧慡杣瑡捡杣杣瑡瑴瑡慴瑴捧捧捧捧捧捧杴捡瑣瑡慴杴瑡慴杴慡瑴杴杣慴瑴杧杧捣条杧慣捣瑣杧杴捡杣杴条杣杣杧杣捧杧杣捧条杣捧杧杣捧杧慣捧杧杣捧杧杣捧条杣瑡瑡捴杴瑣慧捣慣慧捧捣杧杴瑡捴杴条杣杴条捣杣杧杣慡杣杣杴条瑣瑴条瑣捧杣杣杣条捣条条慣瑴杧慣捣慡慣瑴慣瑴杧慴捴条慣捧捧捡慣捡杧慣捧捣捧捧瑣捧杴瑡慴慡慴杴杣条杣慡条慣瑴条杣捧瑡捴杣条捣捧瑴慴捧杧慣捧杧慣捧杧慣捣慧瑴瑴捡捣杴条慣瑴慡慣捧瑧杧慡条杣慡慧慴瑴捧杧瑡慴瑴瑡杴捣条慣慧捡慡慣捡杴捧杣捡慣捣瑴杴捧捧杧捧捡慣慡瑣杧慡瑣慧慡杣慣捣볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䝅剆猠䙣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌児兖䭌卑假䱇兖卐卑卌呉呃卖䙇䱓乔䝙䡖噗兒偓䭇䱇坅䝌䥖南䝇呎奄呎䙐協䱒䥓䭎乄䭓兓䙖䭆乍䱓卑䑎䅔奉䍙剁䱁奔䑙䕙䅆坙兇呇噌噔䅓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䑓䱉呌卑噐䱉噓偓䕇噒䙓䍓䅒兓䥓呇䥎坈兙剑乔升剐䱌䭉䅙䕓䥓䝓偉剓卆升升呇䙄䱔䥓华䕖䕓䥄䑁奙元乑乎偗呔䝆䝁䭔䕌䭌呒볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䖁䙇噒䥉袼〸覼捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁䝅剆臣릉闧蒚臣芁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀灅䅨袼䄲覼捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯隼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀灅䅈袼䠴覼捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯颼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣���뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䥆䍔볯䖈覼捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯邼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒袼畨㠰볯嚉器⁬捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯颼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒′畨㠰嘠器⁬捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥隼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉噅䱑䕖䝓䝇噌偑䝇䱓䱒䍓䅁䝓呆卆乒䵇坓剖䅑䝐䝋䕌噗呁卖䝓升䥙奙䑁噓䝋䙒䥔剓乄䭁华奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剁䝑呔䱁呁䙒䑆坖兇呇噌噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䑓光呍卑卐䱓䅓噓䑇噒䥔䍔䅋兓噄呇噁坁兙䭑䝐䅋䭐䱌奉䅓奓卒䝔偖剓卆升升呇䙄䱔䥔卓兌䕐䙄呁奙元䡈卙偁呗䝆䝇䭔䕖䭉卅覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥隼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒袼畨㜰볯嚉噬⁨捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯邼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慧慴瑴慣慧杴捡捣条条捣杣条慣捧瑣慧捧捧慧捧瑧杧捧慧捴捧瑧慧捣瑡慴捣杴慣捣捧慧捧瑣慧捧瑧慧捧条慣捣慴捴杴慣瑴杧慴捴条慣慧慡捣杧捧慡条杣捣慧慡瑣捧杴瑡瑴瑡条慣捣条慣捡瑣杧杣条杣捧瑧捧杣条捣捧瑴慴捧杧慣捧杧慣捧杧慣捣慧瑴瑴捡捣杴捡慣瑴条慣捧瑣捧条捣杧慡慧瑴瑴捧慧捣慴瑴瑡杴捣瑡慣瑧瑡慣捴捧条捣杣瑣慧捣瑴杴捧杧杣捧捡慣慡瑧杧慡瑡慴慡杧杴瑧杧杴瑧捴杴捧杧杣捧杧瑣捣杧杴瑧杧杴瑧捴杴慡瑧捧条瑣杧杴慧慡捧杧杣捧杧捣杴瑧捧条捣杧捧杧慣捧瑣捧捧瑣慧捧杴杣杣捧慧捧杧瑣瑴捡瑣瑴捡慣慡慴杴捧瑧捧瑡杴杧杴杣捣条捧捧杣杧慣慡杧捣杴慧瑡杧瑧杧杣瑧慧慡杴杧杣杧杣捧条慣捣慧瑴瑡慡慣捧捧捧杴瑡慧捧杣瑣瑴捡慣瑴条捣捧慧慴捡捧慧慡慡慣捧瑣瑧瑡瑣捧条瑡慧捡条捣杴杣杣杣慧条瑡捡杣杣瑧瑧瑡慴瑴捧捧捧捧慧捴瑡杣杣瑡捧慧杴慧瑴瑡杴杧捧慣杧捧捡捣杴瑧慧捣瑧慧捧条杣慡捴慴条慴볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒袼畨㜰볯嚉器⁬捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉䥄䵑兔偓卓卌十䝖剄呖呉呃十卌卖呓䱙坈兙䭑䝐䅋䭐䱌奉呓乓䅌䝓偖剓卆升升呇䙄䱔䥔卓兌䕐䙄呁奙䡃契剈偓呌䝆䝇䭔䕖䭉䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䕓兖噌���䝇䱇兖䝐升剌卌䅃十䙇䙔䭔䝙䡖噗兒偁䭇䱇坅䅖䭖䅗䝇呓奄华䱁卍䙒䥔剓乄䭁华奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剁䡄䑒䵁奄䝗䝑䱔呖卖䕓䭓볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯醼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䦁ㅌ刳㉡볯梈ふ覼桖汖猠䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捴捴瑣杧杴捡慡捧瑣捴杴瑣瑣瑧慧瑧慴捣捡捡捣条慣瑴捣捴瑣慧捴捣条慡瑧捧条瑣杧杴慧慡捧杧杣捧杧捣杴瑧捧条捣杧捧杧慣捧瑣捧捧瑣慧捧杴杣杣捧慧捧杧瑣瑴捡瑣瑴捡慣慡慴杴捧瑧捧瑡杴杧杴杣捣条捧捧杣杧慣慡杧捣杴慧瑡杧瑧杧杣瑧慧慡杴杧杣杧杣捧条慣捣慧瑴瑡慡慣捧捧捧杴瑡慧捧杣瑣瑴捡慣瑴条捣捧慧慴捡捧慧慡慡慣捧瑣瑧瑡瑣捧条瑡慧捡条捣杴杣杣杣慧条瑡捡杣杣瑧瑧瑡慴瑴捧捧捧捧慧捴瑡杣杣瑡捧慧杴慧瑴瑡杴杧捧慣杧捧捡捣杴瑧慧捣瑧慧捧条杣瑧杧杴瑧杧瑴瑣杧杣捧杧杣捧捴杣瑧杧杴瑧杧瑴瑣慧慴瑴慣慧杴捡捣条条捣杣条慣捧瑣慧捧捧慧捧瑧杧捧慧捴捧瑧慧捣瑡慴捣杴慣捣捧慧捧瑣慧捧瑧慧捧条慣捣慴捴杴慣瑴杧慴捴条慣慧慡捣杧捧慡条杣捣慧慡瑣捧杴瑡瑴瑡条慣捣条慣捡瑣杧杣条杣捧瑧捧杣条捣捧瑴慴捧杧慣捧杧慣捧杧慣捣慧瑴瑴捡捣杴捡慣瑴条慣捧瑣捧条捣杧慡慧瑴瑴捧慧捣慴瑴瑡杴捣瑡慣瑧瑡慣捴捧条捣杣瑣慧捣瑴杴捧杧杣捧捡慣慡瑧杧慡瑡慴慡慧瑡瑣慡瑧覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣䦁ㅌ刳㉡볯梈ふ覼桖汖猠䙣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䶈䱌噌協䱌䍌䱅䡐䅐䱆䥌䕐兖噌卅䝇䱇兖䝐升剌卌䅃十䙇䙔䭔䝙䡖噗兒偁䭇䱇坅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条杧慣捣捣慣杴慡慡捣慣慧条条条捣捧捣杴慴慣瑣杴瑧捡瑧捧杧慡捧条条条条瑧杧捣慣捧条瑴慴慣慣杣捣杧捣条杧杣捧瑣慧捴慧杧慡捣慴捣杧杣捡慧捧杴捣慣捣慡慧条杧慣慧杣慧捡杣瑧瑴慡瑧杧杧捣瑣捧瑡瑣慣捧条瑡捣杴瑴捣条捧瑣捡慧捧杧慣慧条慡捣捣条慣慡慧杧慡杣杧条捡捡杴瑧杧慡慧瑧捧慡捣杧捧杣条杴慣捴慣慧慧杧杣杴条捣瑣捴捴条捧捴条杧捣捴杧慣捧慡捴杴瑧慣捣慧条杴杣杧杴慴慣瑡杴瑧捴捧慣捡杣捧杧慡条条慧条捣瑴捣杧慣慣条瑣瑧瑣捧杴捧慧慴杴条条捣捧慣捡瑣瑧杧捣慣捧捣捣杴瑡慧捴慡捧杧条慣条慡慧捡条捣杴捧捣杴条捣杴捡杣捣慧捴条瑡杧杴捴杣瑣瑣捧杴慧杣捣慧捧捣捣慴捴瑣瑧捡条杣条慴杣捡捣慣捣条捡捣瑴慣捧慧杧捣条慣杴瑡杧捧瑣捧杴捡慣捡瑣杧捣慧捣杧慧捧杴瑧捧捡瑡慧捴慡瑣杧捧慣条杣杧杴捣杣捧瑴杣杴慧捣杴捡捣杴慣杣捡慣杧捴慣捣杴瑣杧慡杴杴捣杴捧杴慧慡捴瑣慧杴瑡杣捧瑣杣杴杴慧慧条慣杴慧捡捡捣杣捧慡捧杴瑣瑧捴捧捣捣慡捣杴瑣捣杴慧捣杧慡捣条杧慡条杴杣杴慧杧捧瑡杧杴慧慧捴瑴杣捡瑡捧杴瑣杧捣捡瑣捣条捣杧瑴捣杧瑡慧杴慡捣杴慣杧捧慧杧慡瑴杣杴杴捣杴慡瑧捣瑡慣捴瑣捧杴慡慣捧杧杣杴慴慣捣瑴捣杴捴瑡捣捡捣杴慡瑧捣瑣杧慡慧慧条慧捣捡瑡捣捡杣杧杴瑣杧捡慡慧捴捡杣捡捡捣杴瑡捣捡瑣慧杴捧慣条捧杴捧瑣慧慣瑣捣条慣捧条慣捣条条捡杴捧捣条瑣捧杴瑣慧捴瑣慧捧慣慣捴杣捧捡瑡慧捧慡慣条杣慧杴慧捡捡瑣瑧捡条慣杴慡瑧捧慡慧捡瑧杧杴捣捣杴慴杣捡瑣捧杴瑣杣条瑡捧杴慧杴捣慣慣慧瑣捧捡捧捣瑣捡慡捧条条捧杧条捣条杣杴慧杧慡捡杣捡慣瑧瑣慣捣杴捧慣捣捧杣捧条慣慣条慣捧慣慣捧瑣捧条慡瑧捡慴慣捴捡杣捧慧杧捣慧杧慧瑴捣瑣捧慣捣瑧杧条瑴捣条慴捣杴捣杣捡捡杣捡慧捣杧慣捣杧瑡杣条慧慡条杣慧条杣慧捣慴杣条捡瑡捴慣慧捧瑡慣杴慡慧条捴捣捣瑴慣捧杧捣捣捡杣瑡捣慣慧捣捣捣捣慴慧条慡捴捧杣杴捣慣捧条瑡瑣条杣捣条杣杴捣慣条捣杴捣捣捣条捣瑣捡捣瑴捴捡慣捧条捣杴条慣捣瑡慣捡慴杣捡慧瑧捴捣慴捣瑡杧杴瑴捣捣条杣捧慣慧捴捴捴条捧瑣瑣捧捴杴捧捡瑣捧捴慣捣捴条瑧捧杴捣捴条捧捣瑣捧捴慣捧捣慣捧捣瑣捧慣杴瑧瑧瑣捧捡杴捧捣条捧捴慣捧捴瑣瑧捧瑣瑧捧杴捧捣瑣杧捡瑣捣捴条捧杴杴捧捣瑣捣杴捣捣慴慡捣慴捣慣杧捣杧杧条杧慡慣瑣瑧瑣慧杧捣瑣捧杴慣捧捴慣瑧捴慧杣捡慧杧瑡瑣杧慧捧捡杴瑣杧捧慡慴捧捡杣捡捣杣捣瑧瑧瑴捡杣捡瑣杧捣捴杣杴慧慣捡条杣条瑴捣条慣捧捴瑣慣捡慣杧捧瑡捣瑣瑧杣捣捣捡捡捡慣捣慧捧捣瑡捧杴瑡杧慡慴捣捣慧���捣瑡慣捣条捡杴瑧慣慣杧杣捣慣慧杧捣捴慣慧捴慣捧捡慣捧捴慣瑣杧慧捧捣瑣杧捣杴捣慴瑡杧捧杴瑣瑧瑣杧杣捡慧杧捡瑴杣条条慣瑴捧杣捡瑡杧捡瑴慣捧捧捣杴瑣瑧捣慣慧捴条慣捧볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風䕈㍁臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼噍䭓卌䱑呑䱅䅌䱁䕌䝓卌䕋䱁光䱁䕇䝐奐䱌䝁䝅䱐䭄䕇䍓䝇則䕇䅌䱅乐䱇䕇剔升䑅呅䑄䝄䑅呆偐䱉䕋䕌䱎偓䕅䅁先䅋噖呅䱌䕑偄剗䅖䵋䭖奓兌䡑䥎児䕒噖呄䝔乌卑䱈兓䱈䭎呇䵐呋䭑䅒䱁呙套剖克䕒䅖兑呆䅈兇䝇䥌䕅呐䑇䱅呐䭋則乒䙒坋假十兑䱉兆奁剅䭑偎䭓䕅䕒䱔䕖䍅剎䕁䥃剑噇偓兓允䱇升䱎呖噅噒乙䙗乁剒䕋䅅剆䭈卌䝁䵄䅒乁坌卐䱐䥍剋䭓之䱓䱁䱓䅔兄噍䅓䱌䅄偅䥐奌䕓䑙呐偒卆䅅䵓䝍䱌乔䅌剄䱅䡖䥍坎䭁噒䝐噆䱄䱔䑈噑䱈䕌䅃䱗䥅䵌䝉噌剗䵓䡅䝐䱋䙌偁䱎䱌剄兎䭇噃䝅噍䥅䑆䱍䅌協剓剆䵍䱎䝑䕅噆䱃卋䥉䱌华噇呙䱆卓䱔卋䕌䭅䡄䡉噒䑌䥋䑔䱔䡉䵌䭁䝁呌兌兑先䱒允䱌䥌卌䥈䡒卍䭎䵒䡅奌䵓䍋之噖䱐䑙䱌䕌䱍䅄剈䡌偁協䝒䅇噓䕅䑔卑䱈呁䝁呓卓午兌奋䥙䝔䅅䝅偆呁䕖兆䱙䑐䑔剄剈䕉䭅䭒呒䕙䙔卑䵉䭋偓卆假䑔剐偐剐䥒噁卐卒䅓噓䭐䅐児奐䙐協䱓呓义䑙䙅呐噍偆䝓䥑兓十䱁偁偁児䱖児偁偁偁偁䵁卖䱁允偁偁偖䱖偁假児噁偁䅐䭐呐䅑䕇呇卌䅅䱌䱑䙑䑄䑅䝌䱁䝌华䑔䅐䙖䑔䅌噓乄䕓兆䱑乌䝑偉䅖䡐呔偅䱍䕍偙䅅呉䱒呖䅇剑偐偄偁偁䝌偁䱇乐䱇卌䑇䑅䕆䥓䑁䑍卆䱁卌䥑卓볯芀臣꺁藩鞈臣膀믨馆듦Ꞁ苣醐룤閁臣讂볯讀臣릂ꫧ뚄ꓥ낕볯䮈ㄳ儰臣袂臣厳㌵䔶볯劈汥뾂菣醃苣ꪳ룤꺁뷤꺽볯覼苣炒㔶菣ꆃ苣뎃蛥ꮁ郥肂䕈㍁藩鞈苣ꮐ苣芀臣꺁藩鞈苣䢒䅅袼㙰⼵㕓㘳⽅㍋〱覼臣벑臣芀敒䅬룤꺁㍋〱꾁胣䢁䅅ꮁ臣蒁臣隼볯醼闧꺛臣뢛뷥鞁胣厁㌵䔶臣膀䕈㍁臣誁臣ꚁ볯钼볯ꪕ鯧ꮁ鯧鎽臣讂胣㲂牢ਾ臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀듧麃臣誁臣ꚁ苣ꆃ菣鞊軥鞏껥鎽臣몙迧銂ꫨ躰迥붃臣랂苣蚃菣銂迦鮾臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨躰藥몁볤邭臣膀苣鶃菣벃苣릂苣뚈뻥馁苣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣鶃菣벃苣릂苣醊裥馁苣몁볤邭臣鞁臣膀臣ꢁ臣낁胣䊁汣誁苣뎁볯뺁臣꾁䅃䄭瑫臣馌臣覂苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鶃菣骃菣膃菣꾁捂㉬臣龁臣䎯ⵁ歁ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꊂ菣袃菣랂苣銂諦뚈臣讂臩鶼귥ꢁ臣ꚁ胣龁臣袁臣膀苣邃苣鎃菣膀捂㉬胣䎁ⵁ歁誁苣뎁볯뺁臣꾁菣龃菣뎃菣趃苣蚃苣隃볯撈覼苣릂菣벃苣鎼臣馌臣覂苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鶃菣骃菣膃菣꾁胣떂菣ꒂ菣뎃胣䊁汣膀䅃䄭瑫臣袂臣込臣龁臣覃菣誃菣袃菣겂菣ꎂ菣袼湤볯ꮂ苣醃菣벂볯ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣떂菣ꒂ菣뎃臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯䆈杴杧杴捣捣慧杣瑴捧捣捣杴捣杴捧条捣瑣瑴瑣慣条慧捣捡杣慣捴捴慴慣瑴慣条慡瑣杧捣瑣捴瑴杧条���瑣捧捧瑣捧捡捣杣慧捧杧瑡杧捣慧杧瑣杧瑣捴瑡捣捡杴捣捣捡杴条慡杣条捣条捡瑴杧捣慣瑧瑧瑴瑣捴杴瑣捴慡杧条瑣杧慡杧瑣杧慧捧慣慧杴捡慧捣捣瑡条条慧捡瑡慡慡条慣瑴杣捴杣瑧杴杣瑣瑴捣瑴捴杴捴慡慧条慣瑧瑴慧条慡瑴慡捣瑣杴瑧慧瑡瑴瑴慧慡瑣杧捡条条慡条条捣慡慧捡慡慡瑴捧慡条慧慡捣慡慣瑡慡慧条慡条慡瑴杴条慧慡瑣瑧慧条慡条杴杣捣瑧捧慣捴慧捧条瑣杧瑣捧慡杴慧覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣떂菣ꒂ菣뎃臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꞁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䝍偁䱔偐坁偑䱆䑋剈卉䙔之偗䱆䝅䅃呃䕐䵒䕁䝁䥆䍈呐久偅䱄允䙃䍆䭆䱅䝅䕗䑐䑄䥐䕅䭈䡋卓䍇䙁卌䭖克䕆䱅䱔䕇䱆䱋剄剅䭁䭎䅉䕋乔䭎䭋䙅䕅噔䭋剖䅒䕉䱑䅁䑍볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣貁苣뺁臣꾁苣ꒂ菣릂蓦鎟韧銂鳦馁苣뺯뇨ꮁ臣蒁臣내菨超雧芙돦銂ꇨ蚁雦閳苣邏뻤馁苣芀ꧨ릖돦꾁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣龮雦ꊽ藦꺁臣骁苣讁볯ꒁ臣袂苣뾮룤내菨袼臣ꢁ臣낁鏥뎹该ꦉ듧麃볯뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣風볨꺁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣醼臣ꮁ苣讂냥ꪁ臣ꢁ苣醼꣧꺁뗧邈觧节臣辁臣蒵臣袐苣鮁ꏨ膓苣趉꣨뺯뇨ꮁ諦躸臣讂臣ꢁ胣誁苣뎁觥風뗧邈觧궸臣龁臣趉꣨뾮룤내菨袼臣ꢁ臣낁鏥뎹该ꦉ듧麃볯궸臣躰藥몁볤邭臣몙迧銂ꫨ躰臣讂雨ꦉ苣閊룤馁苣鎁臣銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣몓매開觧내菨ꪁ臣꺁觥風껥뮸듧麃臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣醼臣ꮁ苣讂苣릂菣ꂃ苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣릂菣ꂃ臣膀鏥뎹该ꦉ듧麃臣ꦁ臣내菨ꮁ臣蒁臣궂菣ꦃ諦龎迥릮뷤꺁駧뺏苣颪냥꾏菨ꪁ苣릂菣ꂃ臣芁苣芀ꧨ랂苣蚃菣꾁胣㲁牢ਾ뷯覼곧醼臣鶃菣貃苣것苣膃菣膀곧銼臣鶃菣貃苣것苣膃菣膀곧鎼臣鶃菣貃苣것苣膃菣誁苣뎁곧钼臣鶃菣貃苣것苣膃菣ꮁ뷤開迥붃臣ꎀ뗧閁苣龁곧醼臣뢠藩鮼臣覂臣ꮁ戼㹲芽볯겖觧ꮁ苣ꎁ臣颪냥꾏菨ꪁ곧醼臣鞃菣ꊃ菣뾂菣꺁믨馆듦Ꞁ賥ꂛ귥銂苣벃菣馁苣뢠藩ꮁ뷤開迥붃臣ꎀ뗧閁苣龁곧銼臣鞃菣ꊃ菣뾂菣銂郥肂곧銼臣뢠藩銂郥뾁胣㲁牢ਾ†곧醼臣뢠藩貁胣겖觧ꮁ苣誂ꫨ躰迥붃臣견볯꺁菣궃菣벃苣벃苣ꮐ苣鎁臣膀戼㹲 견볯꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀苣ꆃ菣鞊軥鞏껥鎽苣뎂菣覃臣讂臣ꢁ胣㲁牢ਾ†觥風苣ꆃ菣鞊軥鞏껥鎽臣膀藨趘觧낕髧蚈귥膀苣ꒂ菣릂裥邭胣誁苣뎁꣦蒚듧麃鯩ꎛ臣몙迧閁苣讂臣꺁믤꺁裥邭臣覂臣讂뻧讁苣뢁諦閁苣讂菣겂菣覃臣릉闧蒚臣ꪃ苣뎃菣邵郥覃菣ꒂ菣銂郥肂臣ꢁ胣㲁牢ਾ†觥風菣겂菣覃臣膀菣뎃菣莐臣袂苣趪귨膀ꫨ肯胣醊裥誁苣뎁볯뺁臣꾁軦꒙苣颪냥馁苣鎁臣膀戼㹲 ���견볯꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀苣骃菣떂菣膀ꗥ뺁臣辁臣肜臩隌臣貂臣鶃菣骃菣膃菣릂菣벃苣벃苣뎂菣覃臣讂臣ꢁ胣㲁牢ਾ†곧鎼臣鶃菣貃苣것苣膃菣貁胣鲆단骀菣ꆃ苣뎃苣뎂菣覃臣讂臣ꢁ胣㲁牢ਾ†곧钼臣鶃菣貃苣것苣膃菣貁胣내菨薆苣낂菣ꮃ볤钁菣ꆃ苣뎃苣뎂菣覃臣讂臣ꢁ胣ꪁ苣뎁臣㲫牢ਾ†觥風苣릂菣ꂃ臣膀蟩龔黥䢋䅅궂菣ꦃ믨馆鯥邭苣ꦈ铧鞁臣麡볤꺁苣릂菣ꂃ苣誂苣醰臣蒁雨ꦉ蟩ꞁꫨ躰迥붃臣芁苣鎁臣膀戼㹲 趉꣨랂苣蚃菣貁胣躇铧讞䕈㍁苣ꦈ铧鞁臣랂苣蚃菣ꢁ꿦莼臣ꚁ胣肉껥꺁雨ꦉ뿦ꚺ臣誁臣讂믨馆駧뺏臣醐룤鞁臣蒁苣鎁臣膀臣龁臣㲯牢ਾ†觥風苣릂菣ꂃ臣膀蟩龔黥䢋䅅銂裥ꢔ臣龁苣릂菣ꂃ臣钯볨鞁臣膀触骮臣겖觧莿뫥ꮁ臣醁苣ꊻ蛥몙迧貁郥誸臣ꚁ臣讂臣ꢁ苣릉뻥ꢁ臣讂胣㲂牢ਾ†觥風苣릂菣ꂃ臣龮雦ꊽ藦꺁臣辁臣讁臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊻ蛥뮴胦隌鯥邭臣膀䕈㍁臣龁臣䢯䅅ꞁ臣讂胣趉꣨랂苣蚃菣꺁껥붖뷥讅臣蒁臣ꒁ臣ꮁ臣蒁臣膀觥風䕈㍁臣膀蟩龔黥䢋䅅ꊻ蛥ꂛ귥꺁菣ꪃ苣뎃菣ꞁ臣讂胣趉꣨랂苣蚃菣꺁껥붖뷥讅臣蒁臣ꒁ臣ꮁ臣蒁臣膀觥風䕈㑁臣膀蟩龔黥䢋䅅ꊻ蛥ꂛ귥꺁菣ꪃ苣뎃菣ꞁ臣讂胣趉꣨랂苣蚃菣꺁껥붖뷥讅臣蒁臣ꒁ臣ꮁ臣蒁臣膀觥風䕈㍁臣膀苣릂菣궃苣뎃迥릮뷤ꪃ苣뎃菣邵郥覃菣ꒂ菣袼剅䰭䑂볯誁苣뎁敒䅬볯炈㔶볯袃菣뎃苣뮴胦隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ臣膀ꧨꢂ苣袃菣늂菣鞏껥鎽菣겂菣覃뗧袐菣ꆃ苣뎃臣膀雨ꦉ菣겂菣覃臣꺁臩麊髧邵郥銂迥붃臣馁苣醰臣辁臣节볯讀臣覤闧銂郥肂胣趉꣨랂苣蚃菣꺁껥붖뷥讅臣蒁臣ꒁ臣ꮁ臣蒁臣膀觥風䕈㍁臣膀苣릂菣궃苣뎃迥릮뷤ꪃ苣뎃菣邵郥覃菣ꒂ菣袼剅䰭䑂볯誁苣뎁敒䅬볯炈㔶볯袃菣뎃苣뮴胦隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ臣膀ꧨ劲汥袼㙰覼菣ꦃ菣릂듦Ꞁ賥覃菣ꒂ菣꾁胣겖觧ꮁ뿥钭臣龁믨馆듦Ꞁ苣醐룤閁臣讂냥ꪁ臣ꢁ苣醼胥꺁ꓥ낕苣ꮐ苣芀觥風苣릂菣ꂃ臣龮雦ꊽ藦꺁臣辁臣讁臣誁臣ꚁ胣趉꣨䢘䅅꾁胣ꢂ苣袃菣늂菣鞏껥鎽菣겂菣覃뗧袐菣ꆃ苣뎃볯䖈ⵒ䉌覼臣袂臣劳汥袼㙰覼菣ꦃ菣릂듦Ꞁ賥覃菣ꒂ菣銂郥뾁胣늩苣릂菣궃苣뎃迥릮뷤ꪃ苣뎃菣邵郥覃菣ꒂ菣꾁胣겖觧ꪃ苣뎃菣뢁臣뢁諦蒚뗧袐苣꾏菨ꢁ臣讂냥ꪁ臣ꢁ苣醼胥꺁ꓥ낕苣ꮐ苣芀觥風苣릂菣ꂃ臣龮雦ꊽ藦꺁臣辁臣讁臣誁臣ꚁ胣趉꣨䢘䅅꾁胣ꢂ苣袃菣늂菣鞏껥鎽菣겂菣覃뗧袐菣ꆃ苣뎃볯䖈ⵒ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瑣捧条瑡慧捡条捣杴捡条捣捧杣捡杣杧捣捡瑣捡瑴瑴捧捧慣慧慧慣捧慴杣捣慧杣捡杧杣捣瑣瑧捴慡慣捴杴杧捧捣杴捧捡捣杴瑧慧慣瑡瑣瑣条杣捧杧条捧杧瑡瑣杧杴捧杧条慧条杴捧杧杣慧杧瑡瑣慧捧杴瑧捧杴捡捣条条捣捣捴杴杴捴杴瑣捧捣杴杧慡捧捣杴捣慡慧捴捡瑣瑧捡捣杴条慣捧捧捣捡慡慧捣慧慣捣瑡杣捡杴瑧瑡慣捧条瑣捧条杧杣条捧捣捣条瑡捡瑣慧杴慣杧杴慣慧捧慧杣���条瑣捡捡慣条条捧慣杧杣杴捣杣捡杣瑧捴条杣慧捴慴捧捴杴捧捧杣捡杣瑣捡瑣慧捴瑡捣捣条杣杴慣杧捣慧杴捡慧杧捣慧瑴捡慴瑣瑧杧杣捣慧瑣捡瑡杣捧杧瑣捡瑧瑧捴杧杣慧杧慣捣慣捧杴捡杣杴捡杣捧볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯馼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯劈剏袼ㅒ覼捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥骼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉䕑䱑䕖䝓則噌偔䝇䱓䱔䍓䅋䝓䑆卆奁䵙坓剖䅑䝐䝋䕌䥗呁奉卐䝓呋奙呁噗䝎䙒䥔卓乄允呎䑖兌乍䱓䅔䑁䅒奔䍆剁卄䅙䑄䅇䙌䥎䝗䝐䱔呖卉䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䱅䱖兔偓噓䅓䱁升䅐䥋䍔䱔卓䡁呋呄䑉套兑兌䕇偁奒䵌噑卑䝄奓䭔偒噇䑐䙒䝓卓䝓䑁奒䥌偉噓䅑䑄䅅奄䍙䅇奄䝉奇䙖䝇呇䱑噔䝔볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯馼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉器⁬捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥袼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慣杧瑴慣捧杴瑧捧条捴杴慧捧杴条瑧慧条慡捧瑣杧杧捣捴条杴慡杧捴捴瑣捧慡杧瑣捴杴瑧慴慣捣瑴慴捣慡瑴瑡慧慴慴慡瑴杧瑧慧慧慣杧捣捣杴慧慣条杧瑣杴条杴慧瑴杧瑡杧瑡瑴瑡捣杴慧慧杴瑧条慴捣慡瑡瑡慡杴条慡瑡捴慡杧捣慡杧瑣捡捣杴捡条瑣慧慣慣捴慣捣条慣慣捧瑣捡瑡杧条瑣慧杧条捣杴条瑡瑣慧杴捡捡条瑣瑧瑧瑡慴瑣瑧捧瑴瑣杧瑡瑡慧条瑡捧慴杴慧瑣捡杴杧杧慣条杧捡慣慣瑧慣慣瑧瑣捣捴覼볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣䎯㍄ꮁ觧낕髧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉器⁬捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥骼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉噑䱑兖䝓䕁䭖偋䅇噓噋䍓䅋䝓呙呆奎䥄坎剖䅑䝐䝑䕌䥗均奉䝐䝄呓奋䕎䙋䅋䅋䱔䅔呄呓呓奁䕍剌䱓卒䑄䅔奖䍙十奇䑅䵁奄䝗䝑呔呖卖覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯銼臣몤臣貂苣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉噬⁨捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥骼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慧慣捴慣慧杴捡捣条捴捴慣捴瑣慣瑣瑧瑣捧瑡瑣瑧条慧慧慣慧瑧慣捣瑡慣瑡杴慴条捧慴瑧慣杧捡瑡慴瑡条瑣瑡瑴慧捧杴瑧瑴慣捧条慡捡慣杧慧慡捧捣瑣慡慧捣瑣慧捴慴慴慧捧慡瑡条瑡杴瑧条瑡杧杧捴捣瑡慣条瑧捴捴杴捧条杴慧捴杴杧慣条瑡慴慴瑣瑣慣捣瑡慣捧条捣杴慣捧瑣慧条瑡瑴杴慣捡瑴瑡慴瑣捧瑴捧条慴杴瑡慧瑧瑴捣捴捴捡瑡瑴杧条慧杧慧捣慡杧杴慧慧捴慡覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉噬⁨捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥骼䱍䱌���䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉䥄䵑兔偓卓卌十䝖剄呖义䭃十䑑义奓卌䙗兑偋䭇偁呋䥌剙乁䱒䑖噇卐䙒䝓䝓䝓䑑呙呌卉䱓偑䑅䅆奔䍙兌䑙䙅䱐䙔䝇呇噋䥅覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯钼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯隼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鞼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯邼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯䦈䝧銃菣뢂臣貃苣것苣膃菣超裥骼慧慧捧慡瑧捡杧捡杣捣瑣捧捣捣瑣杴捣瑣볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣骃菣떂菣꾁胣超裥ꪕ迥醼볯鎼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䦈䝧銃菣뢂臣ꊂ菣躃藩超裥骼卅奋假䍐偐偃볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣骃菣떂菣꾁胣超裥ꪕ迥醼볯鎼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯邼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ苣骃菣떂菣꾁胣趉꣨颪냥讞菣궃菣벃苣벃臣趉꣨躰藥몁볤邭臣鎖臣趽뷧馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風볯꺼볯릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈苣ꮐ苣袼藩鞈闧랏볯銼볯骼捧慴捧瑧瑴慡捡瑴慡捧瑴杧慴捣慧捧捴杧瑡捣捧慣捣볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風볯꺼볯릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꢁ볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯节臣辁臣颼볯薼臣超裥貐룤Ꞁ臣龁臣鎁苣覂臣낕胥꺁臣骁苣讁볯ꒁ臣袂臣ꚁ껥ꦾ臣貂苣蒯鯥薆臣超裥貐룤Ꞁ볯薼볯銂鳦馁苣超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣䢁䅅꾁볯讀臣ꊂ菣躃藩覤闧銂郥뾁胣늩䕈㍁臣超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯銼臣몤臣貂苣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼瑡杧杴捴慣条瑣瑧捣慣捧杴慣慧慣慧捡杴瑣杧慣捧捡杴瑣杧慡条杣捧瑣慧捧慡条条捧捣杴瑡捴条捧捡捴杧杣慡捣杴慧捣瑴瑡瑣捧捴捧杴捧慧条捧捣捴杴慧慴条杧杣条条瑣瑧杧杣慧杧慡慧杧条条瑣杧捣慧捧杴捣慴捡杧捣杴杧杣条捡慡慧杧慣捧慧杧捡慧慧慣慧杣捡慧杣捧慧杧捡瑴慣捣捣捣捣瑡捣杴慡条条瑣杧慡慡捣杴条捣捣慧杧慡捧杣捣慣捣条慡条捣瑧杧杴慧慧慣瑣捧杴慣杧慡慧捴捣杴捧杧瑧杣捣慡慧杴瑧慣条条瑣捡瑣捧条慣捧捡慡慣捴捣捣条杣杧���瑧杧杴慧慣捣捡杣捧瑣慧捡慣慧捧慣捣杴条捣条慣捣杴慡慣条杧慣捣捣慣杴慡慡捣慣慧条条条捣捧捣杴慴慣瑣杴瑧捡瑧捧杧慡捧条条条条瑧杧捣慣捧条瑴慴慣慣杣捣杧捣条杧杣捧瑣慧捴慧杧慡捣慴捣杧杣捡慧捧杴捣慣捣慡慧条杧慣慧杣慧捡杣瑧瑴慡瑧杧杧捣瑣捧瑡瑣慣捧条瑡捣杴瑴捣条捧瑣捡慧捧杧慣慧条慡捣捣条慣慡慧杧慡杣杧条捡捡杴瑧杧慡慧瑧捧慡捣杧捧杣条杴慣捴慣慧慧杧杣杴条捣瑣捴捴条捧捴条杧捣捴杧慣捧慡捴杴瑧慣捣慧条杴杣杧杴慴慣瑡杴瑧捴捧慣捡杣捧杧慡条条慧条捣瑴捣杧慣慣条瑣瑧瑣捧杴捧慧慴杴条条捣捧慣捡瑣瑧杧捣慣捧捣捣杴瑡慧捴慡捧杧条慣条慡慧捡条捣杴捧捣杴条捣杴捡杣捣慧捴条瑡杧杴捴杣瑣瑣捧杴慧杣捣慧捧捣捣慴捴瑣瑧捡条杣条慴杣捡捣慣捣条捡捣瑴慣捧慧杧捣条慣杴瑡杧捧瑣捧杴捡慣捡瑣杧捣慧捣杧慧捧杴瑧捧捡瑡慧捴慡瑣杧捧慣条杣杧杴捣杣捧瑴杣杴慧捣杴捡捣杴慣杣捡慣杧捴慣捣杴瑣杧慡杴杴捣杴捧杴慧慡捴瑣慧杴瑡杣捧瑣杣杴杴慧慧条慣杴慧捡捡捣杣捧慡捧杴瑣瑧捴捧捣捣慡捣杴瑣捣杴慧捣杧慡捣条杧慡条杴杣杴慧杧捧瑡杧杴慧慧捴瑴杣捡瑡捧杴瑣杧捣捡瑣捣条捣杧瑴捣杧瑡慧杴慡捣杴慣杧捧慧杧慡瑴杣杴杴捣杴慡瑧捣瑡慣捴瑣捧杴慡慣捧杧杣杴慴慣捣瑴捣杴捴瑡捣捡捣杴慡瑧捣瑣杧慡慧慧条慧捣捡瑡捣捡杣杧杴瑣杧捡慡慧捴捡杣捡捡捣杴瑡捣捡瑣慧杴捧慣条捧杴捧瑣慧慣瑣捣条慣捧条慣捣条条捡杴捧捣条瑣捧杴瑣慧捴瑣慧捧慣慣捴杣捧捡瑡慧捧慡慣条杣慧杴慧捡捡瑣瑧捡条慣杴慡瑧捧慡慧捡瑧杧杴捣捣杴慴杣捡瑣捧杴瑣杣条瑡捧杴慧杴捣慣慣慧瑣捧捡捧捣瑣捡慡捧条条捧杧条捣条杣杴慧杧慡捡杣捡慣瑧瑣慣捣杴捧慣捣捧杣捧条慣慣条慣捧慣慣捧瑣捧条慡瑧捡慴慣捴捡杣捧慧杧捣慧杧慧瑴捣瑣捧慣捣瑧杧条瑴捣条慴捣杴捣杣捡捡杣捡慧捣杧慣捣杧瑡杣条慧慡条杣慧条杣慧捣慴杣条捡瑡捴慣慧捧瑡慣杴慡慧条捴捣捣瑴慣捧杧捣捣捡杣瑡捣慣慧捣捣捣捣慴慧条慡捴捧杣杴捣慣捧条瑡瑣条杣捣条杣杴捣慣条捣杴捣捣捣条捣瑣捡捣瑴捴捡慣捧条捣杴条慣捣瑡慣捡慴杣捡慧瑧捴捣慴捣瑡杧杴瑴捣捣条杣捧慣慧捴捴捴条捧瑣瑣捧捴杴捧捡瑣捧捴慣捣捴条瑧捧杴捣捴条捧捣瑣捧捴慣捧捣慣捧捣瑣捧慣杴瑧瑧瑣捧捡杴捧捣条捧捴慣捧捴瑣瑧捧瑣瑧捧杴捧捣瑣杧捡瑣捣捴条捧杴杴捧捣瑣捣杴捣捣慴慡捣慴捣慣杧捣杧杧条杧慡慣瑣瑧瑣慧杧捣瑣捧杴慣捧捴慣瑧捴慧杣捡慧杧瑡瑣杧慧捧捡杴瑣杧捧慡慴捧捡杣捡捣杣捣瑧瑧瑴捡杣捡瑣杧捣捴杣杴慧慣捡条杣条瑴捣条慣捧捴瑣慣捡慣杧捧瑡捣瑣瑧杣捣捣捡捡捡慣捣慧捧捣瑡捧杴瑡杧慡慴捣捣慧杧捣瑡慣捣条捡杴瑧慣慣杧杣捣慣慧杧捣捴慣慧捴慣捧捡慣捧捴慣瑣杧慧捧捣瑣杧捣杴捣慴瑡杧捧杴瑣瑧瑣杧杣捡慧杧捡瑴杣条条慣瑴捧杣捡瑡杧捡瑴慣捧捧捣杴瑣瑧捣慣慧捴条慣捧볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風䕈㍁臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼噍䭓卌䱑呑䱅䅌䱁䕌䝓卌䕋䱁光䱁䕇䝐奐䱌䝁䝅䱐䭄䕇䍓䝇則䕇䅌䱅乐䱇䕇剔升䑅呅䑄䝄䑅呆偐䱉䕋䕌䱎偓䕅䅁先䅋噖呅䱌䕑偄剗䅖䵋䭖奓兌䡑䥎児䕒噖呄䝔乌卑䱈兓䱈䭎呇䵐呋䭑䅒䱁呙套剖克䕒䅖兑呆䅈兇䝇䥌䕅呐䑇䱅呐䭋則乒䙒坋假十兑䱉兆奁剅䭑偎䭓䕅䕒䱔䕖䍅剎䕁䥃剑噇偓兓允䱇升䱎呖噅噒乙䙗乁剒䕋䅅剆䭈卌䝁䵄䅒乁坌卐䱐䥍剋䭓之䱓䱁䱓䅔兄噍䅓䱌䅄偅䥐奌䕓䑙呐偒卆䅅䵓䝍䱌乔䅌剄䱅䡖䥍坎䭁噒䝐噆䱄䱔䑈噑䱈䕌䅃䱗䥅䵌䝉噌剗䵓䡅䝐䱋䙌偁䱎���剄兎䭇噃䝅噍䥅䑆䱍䅌協剓剆䵍䱎䝑䕅噆䱃卋䥉䱌华噇呙䱆卓䱔卋䕌䭅䡄䡉噒䑌䥋䑔䱔䡉䵌䭁䝁呌兌兑先䱒允䱌䥌卌䥈䡒卍䭎䵒䡅奌䵓䍋之噖䱐䑙䱌䕌䱍䅄剈䡌偁協䝒䅇噓䕅䑔卑䱈呁䝁呓卓午兌奋䥙䝔䅅䝅偆呁䕖兆䱙䑐䑔剄剈䕉䭅䭒呒䕙䙔卑䵉䭋偓卆假䑔剐偐剐䥒噁卐卒䅓噓䭐䅐児奐䙐協䱓呓义䑙䙅呐噍偆䝓䥑兓十䱁偁偁児䱖児偁偁偁偁䵁卖䱁允偁偁偖䱖偁假児噁偁䅐䭐呐䅑䕇呇卌䅅䱌䱑䙑䑄䑅䝌䱁䝌华䑔䅐䙖䑔䅌噓乄䕓兆䱑乌䝑偉䅖䡐呔偅䱍䕍偙䅅呉䱒呖䅇剑偐偄偁偁䝌偁䱇乐䱇卌䑇䑅䕆䥓䑁䑍卆䱁卌䥑卓볯芀戼㹲鎁臣超裥꾁胣ꊻ蛥뮴胦銂郥誸臣鮁苣銼胥꺁苧膪蓧覤闧袼㍋〱誁苣뎁㕓㘳袼敒䅬苣뎃菣꾂돨誸臣趽뷧覼볯銂㙰覃菣ꒂ菣薆臣ꮐ苣䢀䅅超裥銂郥肂胣鎁臣超裥銂䕈㍁볯炈㔶匯㌵䔶䬯ㄳ儰볯ꢁ釥뚁胣劂汥誸臣䮮ㄳ儰臣膀䕈㍁臣誁臣ꚁ볯銼볯ꪕ鯧ꮁ鯧鎽臣膀㕓㘳꾁胣䢁䅅ꮁ臣蒁臣颼볯隼闧꺛臣뢛뷥馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀듧麃臣誁臣ꚁ苣ꆃ菣鞊軥鞏껥鎽臣몙迧銂ꫨ躰迥붃臣랂苣蚃菣銂迦鮾臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨躰藥몁볤邭臣膀苣鶃菣벃苣릂苣뚈뻥馁苣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣鶃菣벃苣릂苣醊裥馁苣몁볤邭臣鞁臣膀臣ꢁ臣낁胣䊁汣誁苣뎁볯뺁臣꾁䅃䄭瑫臣馌臣覂苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鶃菣骃菣膃菣꾁捂㉬臣龁臣䎯ⵁ歁ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꊂ菣袃菣랂苣銂諦뚈臣讂臩鶼귥ꢁ臣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杴慣捧杴瑧杧慡条杣捧杧杣捧瑣杧杴慣捧杣杧杣捧条捣杴杣捣杴条瑣捧捧杧杣条杣捧瑴慴捣瑴慴捣慡瑡瑡杧杣杴慣瑴杧瑧捧捧慣杧杣捣杧捧慡条捧瑣杧慡杴杧杴捧杧杴慡瑡杧捧杧捧杧慣捧捡杣瑡慴慴捡条杣杣瑣慧杴条捣捧瑴慴捣瑡慴捧杣杣瑡慡杣杣慡慡捡条捣杴慴捴杴慣慧杴慡慣捧瑣捧捧捧杧慡慧慴捣捧杧杴慴瑴瑡杴杣杣杣杣瑡慣捴捧慧杴杣瑡杧瑡慴瑴杧杧捣条杧慣捣瑣杧杴捡杣杴条慣捧杧杴瑧杧杴瑧捴杴捧杧杣捧杧瑣捣杧杴瑧杧杴瑧捴杴瑡瑡捴条瑡慧捣慣慧捧捣慧捧条捣杴条杣杣条杣杴杧杣瑡杣杣杴捡慣瑴捡瑣捧捡杣杣条捣杴条杣杴条慣捧捡瑣瑡瑣捧瑡杴瑧瑡慣捧条慡捡杣杧慣慡捧捧杣慡捡杴瑣慧瑴慴慴捧捡慣捧慡捣杴捧慧捧杧杣杴捣慧捧杣瑣瑴条杣捧条杣捧条杣捧捡杣瑡瑴慴捣瑣慧捣瑡慴捧条捣杴慣捧杣慧条瑡瑴杴杣捡瑣瑡慴瑴捧慣捴条慴捴瑡杣慣捧捣捧杴捡瑣瑴杧杣捧杧慣捣慡条杴慧慡瑴慡条慡捴慴条慴볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀䱉㌱慒袼畨㜰볯嚉器⁬捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉噅䱑䕖䝓䝇噌偑䝇䱓䱒䍓䅁䝓呆呆奋噇坈剖䅑䝐䝋䕌噗噁坋䝁升䑔乙䅓䵌剓呆卉䑒䅎之䱓䱙䵑华剌䕁呄噁奙䅃䑒剈䅄䑍坙兇呇噌噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䑓光呍卑卐䱓䅓噓䑇噒䥔䍔䅔䱓噓卓奔䡌套兑偋䭇偁䱋䥌卙協䱎十噇卐䙒䝓䝓䝓䑔呆呌卉䱓偑䑅䅆奔䍙先䡙卒䱐䙔䝇呇噋䥅䕋䭓볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣���讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鞊뷤뺁臣꾁臣꺁룤ꢃ苣鞁臣꾁捳癆臣膀諦䦗ㅌ刳㉡볯䦈ㅌ″敺慴楫敮볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鞊뷤뺁臣꾁臣꺁룤ꢃ苣鞁臣꾁捳癆臣膀藩鞈闧랏볯钼臣몤臣貂苣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣杧捣瑣瑧捧瑣捣瑣瑣捡条捣瑣慣杧慴捣捴瑡杴条慧捧杴瑧慣捡瑡慣捣慣慧捡慣慧条捧捴杣瑣瑣捧慡杴捧条慣杴瑧瑡杧条慣捴慡捣杴捡条瑣杧慣杴慴瑣瑧捧条捣瑣杧慡捴捣杴瑡慣捡瑧瑧慣杧瑣捧条杴捣瑡杣条慡慧捣慣慧杧瑡捧杴条杣慧瑴瑣捧捣捧捡慡杧捴捴条瑣杧捧条瑴瑴捣条瑣杴慣杴捴杣条捡捡慣慡瑡杣条瑧杧捣慣瑧瑴瑧慡条慧捣杴瑣瑣慴慣瑴慴慡慧慡瑣瑴瑴杣杣条杧捡杧瑴慣覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨鞊뷤뺁臣꾁臣꺁룤ꢃ苣鞁臣꾁捳癆臣膀諦䦗ㅌ刳㉡볯䦈ㅌ″敺慴楫敮볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風諦鎽臣龁臣鶁臣肸菩节臣辁臣环䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉假偖卐䅔剌䱙䕉䱅乖呉乑䭑偁䍌䝎䵓坖䥓䱎䅔䵇䍙䅁䕌䱓义卖䍇䅓䕉呋剑䱍䝓䍆䡐噋䅓兇卆䱓噈䑒䭔䕉䅖䙑䭖䱄䱌䱈䭋䙌䕒則覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀慯䑇袼䈸覼汖桖猠䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯憈杴瑣捴捴瑣杧杴捡慡捧瑣捴杴瑣瑣瑧慧瑧慴捣捡捡捣条慣瑴捣捴瑣慧捴捣条瑡瑧杴杴瑡慧捣慣慡瑣捣捡捴捴捣杴捣杴捴条捴瑴杧条瑡慣条捣捴慡捴捴瑴捧条瑡瑣条捴条条捣瑴瑣慡慡慡慴瑡杧慡捡捡瑣瑴瑴捡瑡杴瑧捡瑣捧条慡瑧慣杧捣条捴捴慣慡捧捴瑣慴捴慴慣慡瑧瑴捣慡捣慧瑣瑴瑣杧杧捴捣条捡条瑧捴条杴捧条杴慧捴条杧捡瑡瑡瑴慣慣瑣慣条瑡慣捧条条杴慧杧瑣慧杧瑡瑣杧慧瑧瑴瑡瑴瑣捧捴捴慡条慴慣慣慴瑴捣瑧捡捡瑡捴杧条杧杧慧捣慡捧捴慧捧杴慡捡慧杧杣慧杧杧捧捴杴捧杧杣慧杧瑡瑣杧杧慧杧杧捧条杣条瑧慧慡瑣杧杴慧瑧瑣杧条慧杧瑣杴瑧捧杴捣杴杧慧瑴瑣瑣慧慧瑣瑣捣杴杴慣捡瑴瑣慧瑧捴捡瑣捴捡杴瑡慴瑣捡瑡慧瑣杴杧捴杣捣条捣捴慣条慡条捧捡瑴慧瑧杧瑴杧瑧瑴慴瑴条慡捡条条瑣慡杴瑧慴慣慣捡条条慴慣瑡捣瑡瑣瑧慧条杧捴杧瑴慣捣瑡瑴捣条条瑡慡瑴捣慣慡捧瑡捣捴慴捴瑴慣慡杴慡慣捣瑣慧慧捡杴条慧慣瑧捧慣瑣慴瑴捡杴杴慣条条捴捴慴捡杴杧捣瑴杴捡慴瑣杧杧捣慡杧慣捣捡捴捴捡条捴捴瑣慣볯芀戼㹲蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣澁䝡㉄볯㢈㙂볯嚉噬⁨捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣���䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉噄䵖兔偔卌偌卖䝌兄十卉剃卓卑䱌之䝎呎䱆坈䱙䭑䝓卑䭐䱌奉噋乓䱒䝓偖剄卆升升呇䙙䱔䥋剓䕖䕁䱄噇䙙千卑䡔偉呙䝆䝇䭔䕌䭌䝒䝇升䝇䝇䝓䝇升噅䱋䕖䝓䝇噌偌䑇䱓䱒䍓呁䕓呆呆奄䵙坔剖偑剐䅋䕌䱗䙇剉剎乁奇呔奅偎噓䝋䙒䥔剓乄兓䥓奌兌乍䱔呒䑅䅓奔䍙剁卖坎䙁奄䝗䝑呔呌卖覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥鞼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀佒ㅒ볯劈㈱볯玉䙣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣㲂牢ਾ臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯颼臣몤臣貂苣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼瑡捧杴瑣捧杴瑧慧慣条捣杴瑣捧杴杴杣条瑣捧捣慣捣捣捧瑣瑴瑣捧杴瑡捣捣慣杧慡慣捧捴瑧杣慡条杣捧杧慣慧瑣杧杴捡捡瑣杧杣捧条捣杴捡捣杴条瑣捧慡杧捣条杣捧瑴杣捡瑴慣捧捧瑣捡慴慣杴条瑣杧瑧捣捧慣杧捣捣杴捧慡杧慧瑣杧慡杴慧捴捧慣捣瑡瑣捡捣慣捧条杣捧慡慧捣慴瑣捡捧慣捣杴杧杴慡杣慧杣瑧捴捡慣捴捴慣捧慧慣捡捧捣条慡慣捣瑧杧捡瑣捧条瑡慧捡条捣杴捡条捣捧杣捡杣杧捣捡瑣捡瑴瑴捧捧慣慧慧慣捧慴杣捣慧杣捡杧杣捣瑣瑧捴慡慣捴杴杧捧捣杴捧捡捣杴瑧慧慣瑡瑣瑣条杣捧杧条捧杧瑡瑣杧杴捧杧条慧条杴捧杧杣慧杧瑡瑣慧捧杴瑧捧杴捡捣条条捣捣捴杴杴捴杴瑣捧捣杴杧慡捧捣杴捣慡慧捴捡瑣瑧捡捣杴条慣捧捧捣捡慡慧捣慧慣捣瑡杣捡杴瑧瑡慣捧条瑣捧条杧杣条捧捣捣条瑡捡瑣慧杴慣杧杴慣慧捧慧杣捧条瑣捡捡慣条条捧慣杧杣杴捣杣捡杣瑧捴条杣慧捴慴捧捴杴捧捧杣捡杣瑣捡瑣慧捴瑡捣捣条杣杴慣杧捣慧杴捡慧杧捣慧瑴捡慴瑣瑧杧杣捣慧瑣捡瑡杣捧杧瑣捡瑧瑧捴杧杣慧杧慣捣慣捧杴捡杣杴捡杣捧볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯馼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯劈剏袼ㅒ覼捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥骼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉䕑䱑䕖䝓則噌偔䝇䱓䱔䍓䅋䝓䑆卆奁䵙坓剖䅑䝐䝋䕌䥗呁奉卐䝓呋奙呁噗䝎䙒䥔卓乄允呎䑖兌乍䱓䅔䑁䅒奔䍆剁卄䅙䑄䅇䙌䥎䝗䝐䱔呖卉䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䱅䱖兔偓噓䅓䱁升䅐䥋䍔䱔卓䡁呋呄䑉套兑兌䕇偁奒䵌噑卑䝄奓䭔偒噇䑐䙒䝓卓䝓䑁奒䥌偉噓䅑䑄䅅奄䍙䅇奄䝉奇䙖䝇呇䱑噔䝔볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯馼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉器⁬捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥袼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慣杧瑴慣捧杴瑧捧条捴杴慧捧杴条瑧慧条慡捧瑣杧杧捣捴条杴慡杧捴捴瑣捧慡杧瑣捴杴瑧慴慣捣瑴慴捣慡瑴瑡慧慴慴慡瑴杧瑧慧慧慣杧捣捣杴慧慣条杧瑣杴条杴慧瑴杧瑡杧瑡瑴瑡捣杴慧慧杴瑧条慴捣慡瑡瑡慡杴条慡瑡捴慡杧捣慡杧瑣捡捣杴捡条瑣慧慣慣捴慣捣条慣慣捧瑣捡瑡杧条瑣慧杧条捣杴条瑡瑣慧杴捡捡条瑣瑧瑧瑡慴瑣瑧捧瑴瑣杧瑡瑡慧条瑡捧慴杴慧瑣捡杴杧杧慣���杧捡慣慣瑧慣慣瑧瑣捣捴覼볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣䎯㍄ꮁ觧낕髧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉器⁬捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥骼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉噑䱑兖䝓䕁䭖偋䅇噓噋䍓䅋䝓呙呆奎䥄坎剖䅑䝐䝑䕌䥗均奉䝐䝄呓奋䕎䙋䅋䅋䱔䅔呄呓呓奁䕍剌䱓卒䑄䅔奖䍙十奇䑅䵁奄䝗䝑呔呖卖覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯銼臣몤臣貂苣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉噬⁨捳癆臣貃苣것苣膃菣超裥骼瑡捧瑴瑣捣杴瑧慧慣条捣瑴瑣捧捴杴杴条瑴捡慣慣捣慣捧瑡捴瑣捣杴瑡捣慣慧慣捴慣慧杴捡捣条捴捴慣捴瑣慣瑣瑧瑣捧瑡瑣瑧条慧慧慣慧瑧慣捣瑡慣瑡杴慴条捧慴瑧慣杧捡瑡慴瑡条瑣瑡瑴慧捧杴瑧瑴慣捧条慡捡慣杧慧慡捧捣瑣慡慧捣瑣慧捴慴慴慧捧慡瑡条瑡杴瑧条瑡杧杧捴捣瑡慣条瑧捴捴杴捧条杴慧捴杴杧慣条瑡慴慴瑣瑣慣捣瑡慣捧条捣杴慣捧瑣慧条瑡瑴杴慣捡瑴瑡慴瑣捧瑴捧条慴杴瑡慧瑧瑴捣捴捴捡瑡瑴杧条慧杧慧捣慡杧杴慧慧捴慡覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯ꮁꓧ閁苣讂苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣袼䑃㌳볯梈䠲㈱볯嚉噬⁨捳癆臣ꊂ菣躃藩超裥骼䱍䱌呖䱓䱌䕃偌偈䙁䱌偉䥄䵑兔偓卓卌十䝖剄呖义䭃十䑑义奓卌䙗兑偋䭇偁呋䥌剙乁䱒䑖噇卐䙒䝓䝓䝓䑑呙呌卉䱓偑䑅䅆奔䍙兌䑙䙅䱐䙔䝇呇噋䥅覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨玘䙣꾁胣超裥ꪕ迥颼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅藩鞈苣ꮐ苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯钼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯隼臣몤臣貂苣뢠藩超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風捳癆臣膀藩鞈闧랏볯鞼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯邼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯䦈䝧銃菣뢂臣貃苣것苣膃菣超裥骼慧慧捧慡瑧捡杧捡杣捣瑣捧捣捣瑣杴捣瑣볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣骃菣떂菣꾁胣超裥ꪕ迥醼볯鎼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂볯䦈䝧銃菣뢂臣ꊂ菣躃藩超裥骼卅奋假䍐偐偃볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣骃菣떂菣꾁胣超裥ꪕ迥醼볯鎼臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣뢠藩超裥銂郥肂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣���꣨릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯邼볯ꮁꓧ閁苣讂ꃦ뢅藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ苣骃菣떂菣꾁胣趉꣨颪냥讞菣궃菣벃苣벃臣趉꣨躰藥몁볤邭臣鎖臣趽뷧馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風볯꺼볯릂菣벃苣벃臣膀藩鞈闧랏볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂藩鞈苣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