(57)【要約】  少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング用造影剤であって、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む光音響イメージング用造影剤が提供される。また、この開示された光音響イメージング用造影剤を単独で又は組み合わせて容積体（任意に、被験者又は体の一部、細胞、組織又はそれらの器官）の１つの画像を生成するために使用する方法も提供される。さらに、複数の本明細書に開示されているバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、及び／又は誘導体を同時に含む光音響イメージング用造影剤を使用して、容積体（任意に、被験者又は体の一部、細胞、組織又はそれらの器官）の多重光音響イメージングのための組成物及び方法が提供される。  【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング用造影剤であって、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む光音響イメージング用造影剤。
【請求項２】
複数の異なるバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤であって、各バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体が、６５０〜１０７０ｎｍの範囲に異なる吸収スペクトルを有する光音響イメージング用造影剤。
【請求項３】
（ｉ）前記光音響イメージング用造影剤が、少なくとも３つの異なるバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体を含み、
（ｉｉ）各バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体が、７００〜９５０ｎｍの範囲にピーク吸収値を有する吸収スペクトルを有し、かつ
（ｉｉｉ）該少なくとも３つの吸収スペクトルが７００〜９５０ｎｍの範囲で実質的に重ならない、
請求項２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項４】
前記メタロバクテリオクロリンが、ニッケル、鉄及びコバルトからなる群から選択される１つの金属を含む、請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項５】
ある容積体の１つの画像を生成する方法であって、
（ａ）該容積体を、少なくとも１つの放射線吸収成分を含む造影剤であって、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む造影剤と接触させる段階、
（ｂ）該容積体を放射線にさらす段階、
（ｃ）放射線によって該容積体に発生した超音波を検出する段階、及び
（ｄ）該造影剤を含む該容積体又はその一部の光音響画像を生成する段階、
を含む方法。
【請求項６】
前記バクテリオクロリン、前記メタロバクテリオクロリン、又は前記それらの誘導体が、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの一成分である、及び/又は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの中に封入されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
６５０〜１０７０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
６５０〜９００ｎｍ、７００〜９５０ｎｍ及び／又は７５０〜９５０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記造影剤が、複数の異なるバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含み、各バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体が、６５０〜１０７０ｎｍの範囲に異なる吸収スペクトルを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記造影剤がターゲティング剤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲティング剤が、腫瘍細胞もしくは癌細胞又はそれらに結合する血管内皮細胞の上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンド及び／又は標的が、腫瘍に結合した抗原を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記部分が、腫瘍に結合した抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ある容積体の多重光音響イメージングのための方法であって、
（ａ）該容積体を、複数の放射線吸収成分を含む造影剤であって、該複数の放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む造影剤と接触させる段階、
（ｂ）該容積体を放射線にさらす段階であって、該放射線が、該複数の放射線吸収成分によって異なるように吸収される波長に較正されている段階、
（ｃ）放射線が複数の放射線吸収成分によって異なるように吸収されるにつれて、放射線によって該容積体に発生した複数の超音波を異なるように検出する段階、及び
（ｄ）該造影剤を含む該容積体又はその一部の光音響画像を生成する段階であって、該光音響画像が、異なるように検出される複数の超音波から生成される段階、
を含む方法。
【請求項１５】
前記複数のバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体のうちの１又はそれ以上が、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの一成分である、及び/又は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの中に封入されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
６５０〜１０７０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
６５０〜９００ｎｍ、７００〜９５０ｎｍ及び／又は７５０〜９５０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の放射線吸収成分の各成分が、６５０〜１０７０ｎｍの範囲に異なる吸収スペクトルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の放射線吸収成分の１又はそれ以上の成分がターゲティング剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターゲティング剤が、腫瘍細胞もしくは癌細胞又はそれらに結合する血管内皮細胞の上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンド及び／又は標的が、腫瘍に結合した抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記部分が、腫瘍に結合した抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の放射線吸収成分の２又はそれ以上の成分がターゲティング剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の放射線吸収成分の前記２又はそれ以上の成分が異なるターゲティング剤を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記容積体が、被験者又はその身体の一部（任意に、細胞、組織及び／又はその器官）である、請求項５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記容積体が、腫瘍細胞、癌細胞、又は腫瘍もしくは癌に結合した血管細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記造影剤が、被験者（任意にヒト）における使用について生理学的に許容される、請求項５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記造影剤が、光音響イメージング用造影剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物中に提供される、請求項５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記医薬組成物がヒトにおける使用に薬学的に許容される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング用造影剤であり、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む光音響イメージング用造影剤であって、該少なくとも１つの放射線吸収成分が、下式
【化１】
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又はこれらの金属化されたものからなる群から選択される１つの化合物を含む光音響イメージング用造影剤。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの放射線吸収成分が、錯化金属を含むＢ１〜Ｂ３の金属化誘導体及びＢ１０７を含み、該錯化金属が、ニッケル、コバルト及び鉄からなる群から選択される、請求項３０に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項３２】
前記光音響イメージング用造影剤が、被験者（任意にヒト）における使用について生理学的に許容される、請求項１〜４、３０及び３１のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項３３】
請求項１〜４及び３０〜３２のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤及び、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３４】
前記医薬組成物がヒトにおける使用に薬学的に許容される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本発明は、2017年2月3日に出願された米国仮特許出願第62/454,493号の優先権を主張し、本明細書にはその全体が参照により組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
この発明は、概して、ヒドロポルフィリン及びヒドロポルフィリンの接合体、キレート及び誘導体、並びにこれらを光音響イメージング用の造影剤として使用する方法に関する。特に、本発明は、メタロバクテリオクロリン、及びこれを光音響イメージング方法に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
光音響イメージング（PAI）は、光エネルギーの音響エネルギーへの変換という現象に基づく新しい医療用イメージングモダリティです(Bell, 1880)。PAIは、生理的組織が、光に対するよりも、音波に対して干渉がはるかに少ないため、蛍光のような他の厳密に光学的な画像化方法に比べて、明かな利点を提供する。PAIは、定義上依然として光励起及びそれに続く内因性の吸収及び散乱による光の損失を必要とするが、音響信号応答の干渉がより低いので、最大5又は7cmまでのはるかに深い深さにおける、形体のイメージングを可能にする(de Zerda et al., 2012; Wilson et al., 2013; Wang & Yao, 2016)。
【０００４】
光音響イメージング（PAI）は、メラニン及びヘモグロビンのような内因性生体分子からシグナルを収集することに加えて、一般的な造影剤及び標的PAIプローブの両方を検出するために使用することができる。典型的には、このような試薬は、ピーク光吸収を近赤外（NIR）スペクトル領域（例えば、680〜1100nm）内に有し、その範囲では生物学的干渉が低減される。IRDye 800CW (Marshall et al., 2010)、量子ドット、金ナノ粒子及びカーボンナノチューブ (de Zerda et al., 2012)などのいくつかの近赤外(NIR)試薬が開発中であるが、これまでのほとんどのPAI研究では、内因性プローブ（例えば、メラニン又はヘモグロビン）又は外因性プローブであるインドシアニングリーン（ICG）のいずれかを採用していた。このICGは、カルボシアニン色素であり、規制当局の承認を受けたが、吸収スペクトルが非常に広いという問題がある（図1を参照）。ICGの広い吸収スペクトルは、対応する広いPAIシグナルをもたらし、これは、典型的な実験でICGが造影剤として使用される場合に区別可能な追加の標的バイオマーカーの数を制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臨床医は、理想的には、癌のような複雑な病気の確認のために一度の実行で複数のバイオマーカーを測定したいと考えている。近赤外（NIR）スペクトル範囲内で複数のバイオマーカーの同時検出を可能にするために、本明細書において、非常に狭い吸収スペクトルとPAIスペクトルを提供することにより最小限の重複で、コンパクトな近赤外（NIR）スペクトルウィンドウ（例えば、650〜1070 nm）内で多重検出を可能にする、PAI薬の範疇の合成バクテリオクロリンに基づくPAI試薬が開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ここでは、本発明のいくつかの実施態様を列挙し、多くの場合、これらの実施態様の変形及び置換を列挙する。これらは、多数の様々な実施態様の単なる例示に過ぎない。所与の実施態様における１又はそれ以上の代表的な要素も同様に例示的なものである。そのような実施態様は、典型的には、示された要素の有無にかかわらず存在することができる。同様に、これらの要素は、ここに挙げられているか否かに関わらず、本発明の他の実施態様にも適用することができる。過度の繰り返しを避けるために、ここでは、そのような要素の可能な組み合わせを全て列挙したり、提案したりはしていない。
【０００７】
本発明は、いくつかの実施態様において、光音響イメージング（PAI）用造影剤を提供する。いくつかの実施態様において、このPAI用造影剤は、少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング用造影剤であって、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施態様において、このPAI用造影剤は、複数の異なるバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含み、各バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体が、６５０〜１０７０ｎｍの範囲に異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施態様において、このPAI用造影剤は、少なくとも３つの異なるバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体を含み、各バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体は、７００〜９５０ｎｍの範囲にピーク吸収値を有する吸収スペクトルを有し、かつ該少なくとも３つの吸収スペクトルは７００〜９５０ｎｍの範囲で実質的に重ならない。いくつかの実施態様において、このメタロバクテリオクロリンは、ニッケル、鉄及びコバルトからなる群から選択される１つの金属を含む。
【０００８】
本発明は、いくつかの実施態様において、ある容積体又はその一部の１つの画像を生成する方法をも提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、該容積体又はその一部に、少なくとも１つの放射線吸収成分を含む造影剤であって、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む造影剤を投与する段階、該容積体又はその一部を放射線にさらす段階、放射線によって該容積体又はその一部に発生した超音波を検出する段階、及び投与された造影剤を含む該容積体又はその一部の光音響画像を生成する段階、を含む。いくつかの実施態様において、前記バクテリオクロリン、前記メタロバクテリオクロリン、又は前記それらの誘導体が、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの一成分である、及び/又は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの中に封入されている。いくつかの実施態様において、６５０〜１０７０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する。いくつかの実施態様において、６５０〜９００ｎｍ、７００〜９５０ｎｍ及び／又は７５０〜９５０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する。いくつかの実施態様において、前記生理学的に許容される造影剤は、複数の異なるバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含み、各バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体が、６５０〜１０７０ｎｍの範囲に異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施態様において、前記造影剤はターゲティング剤を含む。いくつかの実施態様において、前記ターゲティング剤は、腫瘍細胞もしくは癌細胞又はそれらに結合する血管内皮細胞の上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む。いくつかの実施態様において、前記リガンド及び／又は標的は、腫瘍に結合した抗原を含む。いくつかの実施態様において、前記部分は、腫瘍に結合した抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む。
【０００９】
本発明は、いくつかの実施態様において、ある容積体又はその一部の多重光音響イメージングのための方法をも提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、該容積体又はその一部に、複数の放射線吸収成分を含む造影剤であって、該複数の放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む造影剤を投与する段階、該容積体又はその一部を放射線にさらす段階であって、該放射線が、該複数の放射線吸収成分によって異なるように吸収される波長に較正されている段階、放射線が複数の放射線吸収成分によって異なるように吸収されるにつれて、放射線によって該容積体又はその一部に発生した複数の超音波を異なるように検出する段階、及び投与された造影剤を含む該容積体又はその一部の光音響画像を生成する段階であって、該光音響画像が、異なるように検出される複数の超音波から生成される段階、を含む。いくつかの実施態様において、前記複数のバクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、又はそれらの誘導体のうちの１又はそれ以上は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの一成分である、及び/又は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの中に封入されている。いくつかの実施態様において、６５０〜１０７０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する。いくつかの実施態様において、６５０〜９００ｎｍ、７００〜９５０ｎｍ及び／又は７５０〜９５０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を使用する。いくつかの実施態様において、前記複数の放射線吸収成分の各成分は、６５０〜１０７０ｎｍの範囲に異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施態様において、前記複数の放射線吸収成分の１又はそれ以上の成分はターゲティング剤を含む。いくつかの実施態様において、前記ターゲティング剤は、腫瘍細胞もしくは癌細胞又はそれらに結合する血管内皮細胞の上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む。いくつかの実施態様において、前記リガンド及び／又は標的は、腫瘍に結合した抗原を含む。いくつかの実施態様において、前記部分は、腫瘍に結合した抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む。いくつかの実施態様において、前記複数の放射線吸収成分の２又はそれ以上の成分はターゲティング剤を含む。いくつかの実施態様において、前記複数の放射線吸収成分の前記２又はそれ以上の成分は異なるターゲティング剤を含む。いくつかの実施態様において、該異なるターゲティング剤は、同じ又は異なる標的及び／又は標的部位に結合する、及び/又は、そうでなければその中に蓄積する。
【００１０】
本発明の方法のいくつかの実施態様において、この容積体は、被験者又はその身体の一部（任意に、細胞、組織及び／又はその器官）である。いくつかの実施態様において、前記容積体は、腫瘍細胞、癌細胞、又は腫瘍もしくは癌に結合した血管細胞を含む。いくつかの実施態様において、この造影剤は、生理学的に許容される１つの造影剤又は生理学的に許容される複数の造影剤である。いくつかの実施態様において、前記造影剤は、ヒトにおける使用について生理学的に許容される。いくつかの実施態様において、前記造影剤は、光音響イメージング用造影剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物中に提供される。いくつかの実施態様において、この医薬組成物はヒトにおける使用に薬学的に許容される。いくつかの実施態様において、この容積体は、ターゲティング剤による標的になり得る１又はそれ以上の標的及び／又は標的化部位を含む。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本発明はまた、複数の光音響イメージング用造影剤を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の光音響イメージング用造影剤は、少なくとも１つの放射線吸収成分を含み、該放射線吸収成分は、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、この少なくとも１つの放射線吸収成分は、下式
【化１】
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からなる群から選択される１つの化合物を含む。
【００１２】
いくつかの実施態様において、前記少なくとも１つの放射線吸収成分は、錯化金属を含むＢ１〜Ｂ３の金属化誘導体及びＢ１０７を含み、該錯化金属は、ニッケル、コバルト及び鉄からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、この誘導体は、下式
【化２】
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（式中、Ｍは金属であり、Ｍは任意にニッケル、コバルト及び鉄からなる群から選択される金属である。）からなる群から選択される１つの化合物を含む。いくつかの実施態様において、前記光音響イメージング用造影剤は、被験者（任意にヒト）における使用について生理学的に許容される。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本発明は医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される１又はそれ以上の光音響イメージング用造影剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む。いくつかの実施態様において、この医薬組成物はヒトにおける使用に薬学的に許容される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】水中のインドシアニングリーン（ICG）の吸収スペクトルを示し(Landsman et al., 1976から転載)、トルエン中の３つのバクテリオクロリンのパネルと並べたものである。この図のB2（2,12-ジフェニル）のスペクトルは、同様の2,12-ジメシチルバクテリオクロリンのスペクトル(Chen et al., 2012から)で表されている。
【図２】バクテリオクロロフィルａ（Ａ）、安定波長可変バクテリオクロリンの一般的デザイン（Ｂ）、及びニッケルバクテリオクロリンＢ１０７（Ｃ）の構造を示す。
【図３】寒天ファントム内で深さ３ｍｍ（Ａ）又は６ｍｍ（Ｂ）で画像化されたインドシアニングリーン（ICG）（破線）とＮｉ−メタロバクテリオクロリンＢ１０７（実線）の信号を比較するプロットである。これらの試料は、それぞれの色素のピーク（７９５及び７６５ｎｍ）における光学濃度（７．５Ｏ．Ｄ．）が等しくなるように導入された。
【図４】インドシアニングリーン（ICG）（灰色）に対するＢ１０７（黒）の、波長が８００ｎｍのレーザーを用いた経時的ＰＡＩ信号強度を比較するプロットである。
【図５】スペクトル的に異なる吸収帯を有する３つのバクテリオクロリン（バクテリオクロリンＢ１〜Ｂ３）の構造を示す。バクテリオクロリンＢ１〜Ｂ３の代表的な吸収スペクトルは図１に示されている。
【図６】バクテリオクロリンの例示的で非限定的な合成スキームを示す。式中、Ｂ１においてＲ１及びＲ２は水素原子であり；Ｂ２においてＲ１はフェニル基、Ｒ２はＣＯ２Ｍｅであり；Ｂ３においてＲ１はＢｒであり、Ｒ１はその後後段において薗頭カップリングによりフェニルエチニル基に変換される。Ｂ３においてＲ２はＣＯ２Ｍｅである。
【図７】生体共役性テザー（ＭはＮｉ、Ｆｅ、Ｃｏである。）を有する水溶性メタロバクテリオクロリン（左）及びメタロクロリン（右）の例を示す。このカルボキシレートは、生体分子上のアミンにバイオ共役するための反応性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル、ペンタフルオロフェニルなどを含む）、又は生体分子上のチオールへカップリングするためのヨードアセトアミド又はマレイミドのような他の基に変換され得る。
【図８】３つのメタロバクテリオクロリン（メタロバクテリオクロリンＭＢ１〜ＭＢ３）の構造を示す。式中、Ｍは、金属であり、任意にニッケル、コバルト及び鉄からなる群から選択される金属である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、以下でより完全に記載される。しかし、そこには本発明のいくつかの実施態様が示されるが、全てではない。実際、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載の実施態様に限定されるものと解釈すべきではない。これらの実施態様は、その開示が適用される法的要件を満たすように提供されたものである。
【００１６】
Ｉ．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、以下に別途定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することを意図したものである。本明細書で採用される技術への言及は、当業者にとって明らかなこれらの技術の変形又は同等の技術の置換を含む、当技術分野で一般に理解されている技術へ言及したものである。
以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本発明の説明を促進するために説明される。
本発明を説明するにあたり、多くの技術及び段階が開示されることが理解されるであろう。これらの各々は個々の利益を有し、それぞれは、他に開示された技術の１又はそれ以上又は任意に全てと共に使用することもできる。
従って、明瞭化のために、この説明では、不必要に個々の段階の可能な組み合わせのすべて繰り返すことを控える。にもかかわらず、明細書及び特許請求の範囲は、そのような組み合わせが完全に本発明の範囲及び特許請求の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
【００１７】
長年の特許法慣習に従って、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、使用される場合、「１つ以上」を指す。従って、例えば、「１つのPAI用造影剤」は、複数のPAI用造影剤を含む、など。
本明細書で使用される「約」という用語は、質量、重量、時間、容量、濃度又は割合(%)のような測定可能な値を指すとき、明記される値から、いくつかの実施態様において±20％、いくつかの実施態様において±10％、いくつかの実施態様において±5％、いくつかの実施態様において±0.1％の変動を含み、これらの変動は開示された方法を実施するために適当なものである。
本明細書で使用される場合、実体を列挙する文脈で使用される時、「及び／又は」という用語は、単独又は組み合わせで存在する実体を指す。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に含むが、また、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意並びに全ての組み合わせ及び部分組み合わせも含む。
【００１８】
「を含む（including）」、「を含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である「を含む（comprising）」という用語は、包括的又は無制限であり、引用されない追加の要素及び/又は方法ステップを除外しない。「を含む」は、特許請求の言語で使用される専門用語であり、名前を挙げた要素が存在するが、他の要素が追加されても依然として特許請求の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「のみから成る」という語句は、特許請求の範囲内に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。「のみから成る」という語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、それは、その条項内に説明される要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。
本明細書で使用される場合、「から本質的に成る」という語句は、特許請求の範囲を、明記される材料又はステップ、並びにクレームの基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えないものの範囲に限定する。
「を含む」、「から成る」及び「から本質的に成る」という用語に関して、これら３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主張される主題は、その他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。例えば、「含む」によって包含される範囲は、いくつかの実施態様において「から本質的に成る」によって包含されるものよりも広くなることができ、これはいくつかの実施態様において「のみから成る」よりも広い範囲を有することができる、ことが理解されよう。従って、「含む」という用語の使用は「から本質的に成る」及び「のみから成る」を包含し、「から本質的に成る」の使用はまた「のみから成る」も包含すると理解されよう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「バクテリオクロリン」は、４つの＝ＣＨ−結合を介して結合する２つのピロール及び２つのピロリンから成る大複素環式芳香族環をいう。本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオクロリン」は、バクテリオクロリン及びイソバクテリオクロリンの両方を含み、その誘導体も包含する。この誘導体は金属化誘導体を含むが、これに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、語句「光音響イメージング用造影剤」は、標的（任意に、被験者内に存在する標的）と接触したときに、標的を光音響イメージングによって画像化することを可能にする組成物をいう。いくつかの実施態様において、光音響イメージング用造影剤は、少なくとも１つの放射線吸収分子を含み、この分子は、いくつかの実施態様において、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む。１つの放射線吸収分子はそれ自体で光音響イメージング用造影剤であり得ることに留意されたい。従って、異なる複数の放射線吸収分子の組み合わせが存在する実施形態において、その組成物は全体として光音響イメージング用造影剤と見なすことができ、いくつかの実施態様において、個々の放射線吸収分子はそれぞれ光音響イメージング用造影剤と見なすことができる。
【００２１】
本明細書で使用するとき、吸収スペクトルに関して「実質的に重ならない」という語句は、比較される吸収スペクトルの重なる割合（％）が、いくつかの実施態様において５０％未満、いくつかの実施態様において４０％未満、いくつかの実施態様において３０％未満、いくつかの実施態様において２５％未満、いくつかの実施態様において２０％未満、いくつかの実施態様において１５％未満、いくつかの実施態様において１０％未満、及びいくつかの実施態様において５％未満であることを意味する。いくつかの実施態様において、この吸収スペクトルに関して「実質的に重ならない」という語句は、複数の吸収スペクトルが、少なくとも15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm又は 95 nm離れ、いずれも６５０〜１０７０ｎｍの範囲内であるピークを有することを意味する。実質的に重ならない複数の吸収スペクトルの例は、図１に示すＢ１、Ｂ２及びＢ３のスペクトルである。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「生理学的に許容される」及び「薬学的に許容される」は、本発明の組成物及び方法が適用される被験者に安全に使用できると認められるような組成物（いくつかの実施態様においては、薬学的組成物）に関する用語である。
本明細書で使用される場合、用語「容積体」は、光音響画像が望まれる可能性があるものすべてを指す。限定的でない例として、この容積体は、被験者中に存在するか又は被験者から単離された細胞、組織又は器官であってもよい。いくつかの実施態様において、この容積体は、被験者内の生理学的に関連する空間又は腔であってもよい。
【００２３】
ＩＩ．本発明の組成物
バクテリオクロロフィルａ（図２Ａ参照）のような天然分子由来の試薬とは異なり、バクテリオクロリン及びバクテリオクロリンの誘導体の完全合成設計は、波長可変バクテリオクロリンへのアクセスを提供する(Taniguchi et al., 2008)。バクテリオクロリン及びバクテリオクロリンの誘導体を合成的に設計することができることの利点は、これが、光音響イメージング（PAI）に対して明確な利益を有する非常に狭い吸収帯を有する近赤外（NIR）試薬のパレットの開発を容易にすることである。色素の吸収幅を表す半値全幅（fwhm）に基づくと、バクテリオクロリンの近赤外（NIR）吸収バンドの半値全幅（fwhm）は、通常25 nm又はそれ以下である。合成バクテリオクロリンの吸収極大及び他のスペクトル特性は容易に「調整」することができるので、調整したバクテリオクロリン及びバクテリオクロリンの誘導体のポートフォリオは、複数の色素間の重なり最小にして、より小さなスペクトル範囲内に収まるように設計することができる。図１は、３つの例示的なバクテリオクロリン（Ｂ１〜Ｂ３）の吸収スペクトルとインドシアニングリーン（ICG）の吸収スペクトルとの違いを示す。通常インドシアニングリーン（ICG）の検出に割り当てられているスペクトル空間内において、スペクトルの重複が最小限で吸収プロファイルが狭いため、３つまでのバクテリオクロリンを潜在的に検出することができた。これらの利点は、同じ実験において複数の疾患特異的バイオマーカーのより複雑な分析を可能にし、そして最終的には光音響イメージング（PAI）に基づく多重臨床アッセイの開発を加速させるであろう。
【００２４】
バクテリオクロリンの例にバクテリオクロロフィルａ（図２Ａ）があるが、これは、多数の（疎水性）置換基及びキラル中心が存在するため、広範囲の合成修飾にはすぐには適さない天然産物である。その還元ピロール環はまた、合成操作中に脱水素化を受けやすい。しかし、最近の一連の合成の進歩により、安定した調整可能なバクテリオクロリンへのアクセスが提供されている。還元型ピロリン環にジェミナルジメチル基が存在すると、脱水素化又は酸化プロセスが阻害され、耐性の高いバクテリオクロリンが得られる（図２Ｂ）。β−ピロール位（図２ＢのＲ２、Ｒ３、Ｒ１２、Ｒ１３）及びメソ位（図２ＢのＲ５、Ｒ１５）に様々な基を導入することによって、吸収極大を容易に操作することが可能になり、７００ｎｍから９００ｎｍ以上までの範囲のどこでも所望の吸収を得ることができる。
【００２５】
光音響イメージング（PAI）に対するバクテリオクロリンの第２の説得力のある利点は、バクテリオクロリンをニッケルと錯化することによるPAIシグナルの実質的な増加であり、これは本明細書に記載の結果によって示されている。遊離基本型バクテリオクロリン及びいくつかのメタロバクテリオクロリン（Ｚｎ、Ｐｄ）は典型的には０．２５までの範囲の量子収率（Φ（ｆ））を有する蛍光を示し、ある場合には実質的な三重項状態（量子収率（Φ（isc）)が最大０．８０）を示す。ニッケル−バクテリオクロリン錯体は、本質的にその三重項状態への変換は起こらずに、その一重項状態の極めて急速な非放射性崩壊を示す（Ｂ１０７の超高速ダイナミクスは基底状態への崩壊が〜１０ｐｓであることを示唆する）と考えられている。何らかの特定の作用機序に束縛されることを望まないが、この励起状態は非常に短寿命であるため、これはPAIシグナルをさらに増強すると仮定される。これらの特性はこれまでに認識されており、クロロフィル及びバクテリオクロロフィルのニッケル誘導体を特徴付けた研究で報告されているが(Pilch et al., 2013)、このような設計の分子を用いたPAI試薬を製造しまた特徴付ける試みは報告されていない。これが、前述のバクテリオクロロフィルａ及び他の天然物の合成操作の困難さによるものであることは疑いない。図３は、寒天ファントムと６８０〜９７０ｎｍの波長可変レーザー走査を用いた市販のPAIシステムとを用いて、ニッケルバクテリオクロリン（B107）をインドシアニングリーン（ICG）と比較したPAIデータを示す。この化合物（B107）は、寒天の２つの深さにおいて、同等の光学濃度のインドシアニングリーン（ICG）よりも５倍強い測定シグナルを示した。この非常に増強されたシグナル強度は、標的化プローブを用いたPAIが、現在インドシアニングリーン（ICG）を用いてアクセス可能なものよりも実質的により深い組織深度で行われ得ることを示唆した。これらのデータを表１にまとめる。
【００２６】
【表１】
2020508344.tif 000005
【００２７】
ニッケル−バクテリオクロリン錯体の第三の利点及び更なる利益は、その改善された光安定性である。図４は、連続８００ｎｍレーザー照射で測定した寒天ファントム中のインドシアニングリーン（ICG）とNi−バクテリオクロリンＢ１０７のシグナルを示す。その増強された安定性は、励起三重項状態への変換が抑えられ、かつその後の一重項酸素の生成時の劣化が抑えられていることに起因している可能性がある。
【００２８】
以上まとめると、PAI用造影剤としてバクテリオクロリン及びバクテリオクロリンの誘導体を使用することの利益には以下のものが含まれる：
−波長が可変で発光が狭いため、多重化が可能になる。合成デザインは、可溶化基とバイオ共役テザーを追加することに適している。
−メタロバクテリオクロリン（Ｍは、Ｎｉ、Ｆｅ及び／又はＣｏである。）のシグナルが非常に強化されたため、従来のマーカーよりも深い深さにおけるバイオマーカーのＰＡＩ検出が可能になる。及び
−プローブの安定性が増したため、光音響顕微鏡法、画像誘導手術及び画像取得に長時間を要するその他の手続きにとって有用である。
本発明は、ニッケルバクテリオクロリンに加えて、いくつかの実施態様において、対応する鉄（Ｆｅ）及び／又はコバルト（Ｃｏ）のメタロバクテリオクロリンを提供し、これらもＰＡＩに対するシグナルの増強をもたらす。
【００２９】
いくつかの実施態様において、このメタロバクテリオクロリンは、器官、血管、リンパ節、及びリンパ系など（但し、これらに限定されない。）の生理学的対象物の一般的画像イメージング用の造影剤として使用でき、いくつかの実施態様において、このメタロバクテリオクロリンは、ターゲティング剤を付着させることによってターゲティングプローブとして使用できる。本明細書で使用されるとき、用語「ターゲティング剤」は、本発明の組成物に結合したときに、細胞、組織又は器官（但し、これらに限定されない。）などの標的部位におけるこの組成物の蓄積を増強する如何なる分子をも指す。例えば、反応性リンカー又はテザーを介した抗体へのメタロバクテリオクロリンの結合は、遊離基本型バクテリオクロリンについて既に確立されている方法によって達成することができる。いくつかの実施態様において、カルボキシレート又はＰＥＧ鎖などの可溶化基は、本発明の標的化組成物（すなわち、ターゲティング剤が複合体化されたバクテリオクロリン又はバクテリオクロリンの誘導体）の生物標識効率及び生物複合体安定性を改善することができる。例えば、Jiang et al., 2015; Zhang et al., 2016.を参照されたい。
【００３０】
いくつかの実施態様において、ＰＡＩシグナルをさらに増強するために及び／又は生体内分布に影響を及ぼすために、メタロバクテリオクロリンをナノ粒子、マイクロビーズ、ミセル又は他の担体構造体に組み込むことが好ましい場合がある。メタロバクテリオクロリン（但し、これに限定されない。）などのバクテリオクロリン及びその誘導体を含むヒドロポルフィリンを、マイクロビーズに組み込むための例示的方法は、例えば、国際公開ＷＯ207/214637に開示されており、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。この他のナノ粒子として、リポソームやドープされたシリカナノ粒子が含まれる。
バクテリオクロリン及びその誘導体に加えて、いくつかの実施態様において、イソバクテリオクロリンやより長波長の近赤外（NIR）に吸収を有するいくつかのクロリン（但し、これに限定されない。）などの他のヒドロポルフィリンが、ＰＡＩパネルに使用される。
バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン及びそれらの誘導体は、いくつかの実施態様において、イメージング療法又は画像誘導療法（例えば、画像誘導手術又は画像誘導薬物送達）のためのマルチカラーＰＡＩパネル及びマルチモーダルマルチカラーパネルに使用することができる。マルチモードの例には、蛍光／ＰＡＩ及びＭＲＩ／ＰＡＩが含まれる。
生体共役性テザーを有する水溶性メタロバクテリオクロリン及びメタロクロリンの非限定的な例を図７に示す。
【００３１】
ＩＩＩ．バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン及びそれらの誘導体の合成
本発明の放射線吸収分子を合成するための出発材料として使うことができるバクテリオクロリンは、当業者に公知の如何なる方法によって製造してもよい。バクテリオクロリン及びその関連分子を合成するための例示的な方法は、例えば、U.S. Patent Nos. 6,559,374; 7,470,785; 7,534,807; 8,129,520; 8,173,691; 8,173,692; 8,207,329; 8,304,561; 8,664,260; 9,365,722; 及び9,822,123; 並びに国際公開WO 2017/214637に開示されており、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。バクテリオクロリン及びその関連分子を合成するための特定の例示的な方法を以下に示す。
【００３２】
いくつかの実施態様において、本発明のバクテリオクロリンを合成する方法は、酸の存在下、有機溶媒中で、下記一般式ＩＩＡ
【化３】
2020508344.tif 000006
で表される一対の化合物を縮合させる段階を含む。
【００３３】
式中、各Ｒ'は独立してＣ１〜Ｃ４アルキルを表すか、又は両方のＲ'は共同してＣ２〜Ｃ４アルキレンを表し、一般式Ｉ（式中、Ｒ５は水素原子又はアルコキシである。）で表される化合物を作る。
Ｒ５が水素原子である場合、任意に臭素化し、次いで任意にさらに該化合物をＲ５位で置換して、一般式ＩＡを作る。
【００３４】
ここで、一般式ＩＡは、下式である。
【化４】
2020508344.tif 000007
式中、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボン酸、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、二置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホキシル、スルホニル、スルホネート、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシアシルアミノ、アミノアシルオキシ、親水性基、連結基、表面付着基、及びターゲティング基からなる群から独立して選択される、
又は、Ｒ１及びＲ２は共同して＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ３及びＲ４は共同して＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ６及びＲ７、又はＲ７及びＲ８は共同して縮合芳香族又はヘテロ芳香族環系を表す。
いくつかの実施態様において、一般式Ｉの化合物はその後、必要に応じて金属化されてもよい。
【００３５】
代替として、本発明のバクテリオクロリンを合成するための方法は、第１の溶媒を含む組成物中で、一般式ＩＩＢの化合物及び一般式ＩＩＩの化合物を縮合させて中間体を製造する段階、
ここで、一般式ＩＩＢの化合物は、下式で表される構造を有する。
【化５】
2020508344.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は下記で提供される通りである。）
ここで、一般式ＩＩＩの化合物は、下式で表される構造を有する。
【化６】
2020508344.tif 000009
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は下記で提供される通りであり、かつ、Ｒ２１及びＲ２２はそれぞれ独立して水素原子、アルキル及びアリールからなる群から選択される、又はＲ２１及びＲ２２は共同してＣ２−Ｃ４アルキレンを表す。）
及び、酸の存在下第２の溶媒中でこの中間体を縮合して、一般式ＩＶの化合物又はその金属接合体を生成する段階を含んでもよい。
【００３６】
ここで、一般式ＩＶの化合物は、下式又はその金属接合体（例えば、その金属キレート）で定義される。
【化７】
2020508344.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニルアルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボン酸、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、二置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホキシル、スルホニル、スルホネート、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシアシルアミノ、アミノアシルオキシ、親水性基、連結基、表面付着基、及びターゲティング基からなる群から独立して選択される、
又は、Ｒ１及びＲ２は共同して＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ３及びＲ４は共同して＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ９及びＲ１０は共同して＝Ｏ又はスピロアルキルであり
又は、Ｒ１１及びＲ１２は共同して＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ１５及びＲ１６は共同して＝Ｏであり、
又は、Ｒ５及びＲ６は共同して縮合芳香族又はヘテロ芳香族環系を表し、
又は、Ｒ６及びＲ７は共同して縮合芳香族又はヘテロ芳香族環系を表し、
又は、Ｒ１３及びＲ１４は共同して縮合芳香族又はヘテロ芳香族環系を表し、かつ
Ｚは電子求引性基である（例えば、−ＣＯ２Ｒ１７、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１７Ｒ１８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、−ＣＮ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ１７Ｒ１８、−ＰＯ（ＯＲ１７）２、−ＳＯ２ＯＲ１７、−ＳＯ２ＮＲ１７Ｒ１８、−ＳＯ２Ｒ１７及び−ＳｉＲ１７Ｒ１８Ｒ１９、ここで、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は、それぞれの場合、独立して、水素原子、アルキル及びアリールからなる群から選択される。）である。）
【００３７】
バクテリオクロリンを合成するための追加的な例示的経路には、Liu & Lindsey, 2016に記載されたNorthern-Southern Route、及びZhang & Lindsey, 2017に記載された環状イソシクロ環を有するバクテリオクロリン大環状化合物の合成方法が含まれる。これらの開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
バクテリオクロリンパネルに使用することができる３つの例示的なバクテリオクロリン（例えば、バクテリオクロリンＢ１〜Ｂ３）を図５に示す。これらは、対応するメタロバクテリオクロリンに変換されることができ（図８に示す）、ＰＡＩ中で同様のピークの広がりを有し、それらの間の重複が少なく、ピークスペクトル波長が遊離基本型バクテリオクロリンから２０〜３０ｎｍシフトする、と予想される。図６は、バクテリオクロリンＢ１〜Ｂ３の合成方法の概要である。バクテリオクロリンＢ１及びＢ２は、対応するピロール−２−カルボキシアルデヒドから出発して、公知の方法（Krayer et al., 2010を参照のこと）により５工程で合成することができる。バクテリオクロリンＢ３は、７９０ｎｍ付近で所望の吸収を達成するためにフェニルエチニル基を導入するための薗頭カップリングを受けるブロモ置換バクテリオクロリン（Ｒ１はＢｒである。）を必要とする。バクテリオクロリンＢ３の類似体が合成されており、この期待波長を満たすことが確認された。
【００３９】
各バクテリオクロリンの金属化は、本質的にChen et al., 2012に記載されているような最近開発された方法によって達成することができる。合成バクテリオクロリンの金属化は、電子求引性から電子豊富性までにわたる様々な置換パターンを生じる合成バクテリオクロリンをカバーするように進化している。この金属化には、一般に、バクテリオクロリンの性質に応じて、２つの方法を利用することができる。電子豊富性バクテリオクロリンは、ＴＨＦ中で強塩基（ＮａＨ又はＬＤＡ）で処理し、続いて６０℃で金属塩（ＭＸｎ）を添加することによって金属化することができる。電子不足性バクテリオクロリンは、高温においてＤＭＦ中で金属塩（ＭＸｎ）により処理することによって金属化することができる。これら２つの方法は、従来、種々の合成Ｚｎ−、Ｃｕ−、Ｐｄ−及びＮｉ−バクテリオクロリンを調製するために使用されてきた。これらの方法を、遊離基本型バクテリオクロリンをＦｅ及びＣｏで金属化して、Ｆｅ及びＣｏバクテリオクロリンを合成するために使用することができる。
【００４０】
ＩＶ．本発明の構成物を用いた光音響イメージング（PAI）の方法
光音響イメージングは、非イオン化レーザーパルスを生物学的組織に送達することによる技術である。この送達されたエネルギーの一部が吸収され熱に変換されて、過渡的な熱弾性膨張と超音波放射を引き起こす。生成した超音波はその後検出され、分析されて生物学的組織の画像が生成される。一般に、超音波放射が大きいと、生理学的に特異的な光吸収コントラストが明らかになる。次いで、標的領域の２Ｄ又は３Ｄ画像が形成される。例えば、米国特許出願公開2005/0085725; 2009/0066949; 2009/0069653; 2010/0226003;及び2012/0296192; 米国特許6,738,653; 7,864,307; 7,916,283; PCT国際公開WO 2002/008740; 及びXu & Wang, 2006; Li & Wang, 2009; Li et al., 2009; Wang, 2009; Yang et al., 2009;を参照されたい。これらの開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ある容積体の１つの画像を生成する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、（ａ）該容積体を、少なくとも１つの放射線吸収成分を含む造影剤であって、該放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む造影剤と接触させる段階、（ｂ）該容積体を放射線にさらす段階、（ｃ）放射線によって該容積体に発生した超音波を検出する段階、及び（ｄ）該造影剤を含む該容積体又はその一部の光音響画像を生成する段階、を含む。
【００４２】
本発明は、また、いくつかの実施態様において、ある容積体の多重光音響イメージングのための方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、（ａ）該容積体を、複数の放射線吸収成分を含む造影剤であって、該複数の放射線吸収成分が、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む造影剤と接触させる段階、（ｂ）該容積体を放射線にさらす段階であって、該放射線が、該複数の放射線吸収成分によって異なるように吸収される波長に較正されている段階、（ｃ）放射線が複数の放射線吸収成分によって異なるように吸収されるにつれて、放射線によって該容積体に発生した複数の超音波を異なるように検出する段階、及び（ｄ）該造影剤を含む該容積体又はその一部の光音響画像を生成する段階であって、該光音響画像が、異なるように検出される複数の超音波から生成される段階、を含む。
【００４３】
従って、本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、及びインビトロでの使用において使用することができる。インビボで使用される場合、本発明の方法は、被験者（場合により、ヒト）に使用するため生理学的に許容される造影剤を使用することができる。いくつかの実施態様において、この造影剤は医薬組成物の一部として製剤化され、それは、いくつかの実施態様において、さらに１又はそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含んでもよい。いくつかの実施態様において、この医薬組成物は、ヒトにおける使用に薬学的に許容されるものである。適切な製剤には、水性及び非水性の無菌注射溶液が含まれ、これは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び製剤を意図するレシピエントの体液と等張にする溶質を含んでもよく、更に、懸濁剤や増粘剤を含んでもよい水性及び非水性の無菌懸濁液を含んでもよい。これら製剤は、単位用量又は複数用量の容器（例えば、密封アンプル及びバイアル）に入れて提供することができ、また、使用直前に滅菌液体担体（例えば、注射用の水）の添加のみを必要とする凍結又は凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。いくつかの例示的な成分は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（いくつかの実施態様において、0.1〜10mg / ml、いくつかの実施態様において、約2.0mg / ml）、及び/又はマンニトール又は他の糖（いくつかの実施態様において、10〜100mg / ml、いくつかの実施態様において、約30mg / ml）、及び/又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。更に、問題となっている製剤の種類を考慮して、当該技術分野で従来知られている如何なるこの他の薬剤を使用してもよい。
【００４４】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、イメージング又は画像誘導治療のための、マルチカラー光音響イメージング（PAI）パネル及び/又はマルチモーダルマルチカラーパネルの造影剤及び/又は成分として使用される（例えば、米国特許第8,617,522号参照。この開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。）。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例は、例示的な実施態様を提供する。本発明及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲から逸脱することなく多くの変更、改変、及び変更を行うことができることを理解するであろう。
【００４６】
実施例で用いた材料と方法
インドシアニングリーン（ICG）は、Sigma-Aldrich 社(カタログ番号：I2633; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, USA)から入手した。ニッケルバクテリオクロリンＢ１０７は、文献（Sun et al., 2013 and Chen et al, 2012）の記載のようにして調製した。各色素は、イメージング実験の前に、所望の濃度でＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。寒天ファントムを調製するための型は、典型的には直径９０ｍｍのガラス製ペトリ皿であった
【００４７】
実施例１
ファントムの用意
高度に精製された寒天粉末（カタログ番号：A7921; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, USA)を、最終濃度２．０％まで水（試薬グレード、タイプＩ）に溶解し、電子レンジで融解温度９５℃まで加熱した。混合のため、加熱と混合の３０秒間サイクルを３回行って、滑らかな寒天調製物を得た。寒天を含有する瓶を、焦げ付き（吸収係数の検出可能な増加を引き起こす）を回避するために、標準的なホットプレートと二重ボイラーを使用して、７５〜８５℃に１〜３時間保持した。この高温における待機期間は、気泡のゆっくりとした放出を可能にし、無視できるほどの吸収及び非常に低い濁度を有する寒天溶液を生成する。このファントムの望ましい光学特性は最終濃度２０％（１：５ｖ／ｖ）の、散乱媒体としての１．０％低脂肪ミルク及び吸収媒体としてのインドインク(Higgins Black 44201; Chartpak, Inc., Leeds, Massachusetts, USA)を加えることによって達成された。ミルクのタンパク質の沈殿を避けるために、これらの添加は54〜58℃の範囲で行われた。この溶液を、ミルクとインクの均質性を維持するために、攪拌棒を用いて溶液をゆっくりと継続的に、また泡や発泡を引き起こさないような速度で、攪拌した。
【００４８】
このファントムマトリックスを分配する前に、ペトリ皿を５０℃のホットプレート上で１分間予熱した。このファントムマトリックス溶液を予熱した２５ｍｌ血清ピペットを用いて型に分配し、適切な硬化及び安定した光学的性質（２０〜２５℃）に到達するために、静置した。形成したファントムが４時間以内に使用されなかった場合、それらは蒸発を制限するために密封された。一般に、形成したファントムは、冷蔵保存された場合には、８時間以内又は７２時間以内に使用された。それらを冷蔵した場合、使用前に周囲温度に温めた。これにより、硬化前にファントムマトリックスが均一に広がることが可能になり、ファントム表面が光学的に平坦になることができる（５０〜５３℃のファントムマトリックス内で２回迅速に吸引し、分配される）。典型的には、２０ｍｌのファントムマトリックスを添加して３±１０％ｍｍ厚の金型を得た。寒天層を横切ってその下に所望の深さまで伸びたポリエチレンチューブ中の色素からの光音響イメージング（PAI）シグナルを測定するために、この厚さ３ｍｍのファントムを必要に応じて積み重ねた。
【００４９】
実施例２
寒天ファントムと色素の光音響イメージング
ソフトウェアバージョン1.7.2.を装備したＶＥＶＯ（登録商標）ＬＡＺＲ ２１００イメージングシステム(VisualSonics, Inc., Toronto, Ontario, Canada)を用いて光音響イメージングを行った。この装置は、超音波を光音響モード（PA）イメージングと組み合わせたもので、2倍のNd：YAG波長可変レーザーで励起された光パラメトリック発振器レーザー（OPO）を採用している。イメージングは、指定された時間、5 nmのステップサイズのPAスキャニングモード（680-900 nm）又は固定波長で行われた。複数の色素を、シリンジを介してＰＥ５０ポリエチレンチューブ(0.023インチx 0.038インチ（0.58cmｘ0.97cm）; Braintree Scientific, Braintree, Massachusetts, USA)に入れ、イメージング実験の間、各端部を固定した。寒天ファントムの表面に超音波ゲルを塗布して、トランスデューサーとファントムとの間の効率的な結合を確実にした。チューブ及びその結合する画像領域は、ＰＡ強度定量のために超音波信号及びＰＡ信号によって分離された。図３及び４に提示されたデータは、６３μＭのＮｉ−バクテリオクロリン（Ｂ１０７）及び５０μＭのインドシアニングリーン（ICG）の溶液についてのものであり、Ｎｉ−バクテリオクロリンは、ＩＣＧと比較して、寒天の２つの深さにおいて約５倍大きいシグナルを示した。
【００５０】
実施例３
他のメタロバクテリオクロリンの調製及び寒天ファントムとそれを用いた色素の光音響イメージング
またNi−バクテリオクロリンB107に対応するコバルト(Co)−及び鉄(Fe)−バクテリオクロリンを、図6に示す基本スキームを用いて調製した。さらに、バクテリオクロリンB1〜B3に対応するNi-、Co-、及びFe-バクテリオクロリンも、図6に示す基本スキームを用いて調製した。例示的な金属化バクテリオクロリンを図８に示す。
寒天ファントム及びこれらＢ１０７のＣｏ−及びＦｅ−バクテリオクロリン誘導体並びにバクテリオクロリンＢ１〜Ｂ３のＮｉ−、Ｃｏ−及びＦｅ−バクテリオクロリン誘導体を用いた色素の光音響イメージングを、本質的に実施例２に記載の通りに行った。さまざまな信号及び正規化された信号を相互に比較し、インドシアニングリーン（ICG）の信号と比較した。
【００５１】
参考文献
以下に列挙するすべての参考文献、並びにそれらのすべての特許、特許出願及び出版物、科学雑誌論文並びにデータベースエントリを含む本明細書で引用されるすべての参考文献（但し、これらに限定されない）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらは、本明細書で使用される方法論、技術、及び／又は組成物を補足し、説明し、背景を提供し、又は教示する。
【００５２】
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本発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更されてもよいことが理解されるであろう。さらに、前述の説明及び実施例は、例示のみを目的としたものであり、本発明を限定することを目的とするものではない
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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