(57)【要約】  本発明は、免疫療法の分野、より具体的には、癌の治療における使用のための組成物に関する。本発明はまた、医薬組成物のような、かかる方法により得られ得る組成物に関する。より具体的には、本発明は、対象における癌の治療に適当な組成物を得るｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、対象からもたらされる初代腫瘍細胞を用意する工程、および腫瘍細胞を、ブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程を含む、方法に関する。【選択図】図１−１
2020534875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の治療に適当な組成物を得るｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、
ａ）前記対象からもたらされる初代腫瘍細胞を用意する工程、および
ｂ）前記腫瘍細胞をブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、工程ｂ）が行われる前に、細胞の数を増大させるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞が、免疫賦活性化合物、好ましくは、インターフェロンガンマ、および前記ＢＥＴ阻害剤と、工程ｂ）において同時または連続して接触される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、工程ｂ）の後にｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍原性ではないように、処理される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記腫瘍細胞を、前記対象から得られるＴ細胞または樹状細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、固形腫瘍または血液系の癌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌がメラノーマである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＥＴ阻害剤が、ＪＱ１、ＭＫ−８６２８、ＢＭＳ−９８６１５８、ＩＮＣＢ５４３２９、ＡＢＢＶ−０７５、ＣＰＩ−０６１０、ＦＴ−１１０１、ＧＳ−５８２９、ＧＳＫ５２５７６２、ＰＬＸ５１１０７、Ｔｅｎ−０１０、ＯＴＸ−０１５、ＣＰＩ−０６１０、３−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキナゾリン−２−オン、２−チアゾリジノン、ＣＰＩ−２０３、Ｉ−ＢＥＴ７６２（ＧＳＫ５２５７６２Ａ）、Ｉ−ＢＥＴ１５１（ＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、およびＲＶＸ２０８からなる群から選択され、好ましくは、前記ＢＥＴ阻害剤が、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ１５１（ＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、およびＩ−ＢＥＴ７６２（ＧＳＫ５２５７６２Ａ）からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）における前記腫瘍細胞が、オルガノイドまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により得られ得る、組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により得られた、組成物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の組成物、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬における使用のための、請求項１１または１２において定義された組成物、または請求項１３において定義される医薬組成物。
【請求項１５】
癌の治療における使用のための請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記治療が、前記組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含む、組成物。
【請求項１６】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１１または１２において定義された組成物、または請求項１３において定義された医薬組成物の使用であって、前記治療が、前記組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含む、使用。
【請求項１７】
対象における癌の治療方法であって、前記対象に請求項１１または１２において定義された組成物、または請求項１３において定義された医薬組成物を投与する工程を含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含む、方法。
【請求項１８】
前記治療が、免疫調節化合物、血管新生阻害剤、化学療法剤またはｃ−Ｍｙｃダウンレギュレーションからなる群から選択される薬物の全身または局所投与と組み合わされ、好ましくは、前記薬物が、ＢＥＴ阻害剤、免疫賦活性サイトカイン、Ｔｏｌｌ様受容体の天然、内在性もしくは合成リガンド、他の免疫賦活性受容体のリガンド、免疫チェックポイントのモジュレーター、またはアゴニストモジュレーターからなる群から選択される免疫調節化合物である、請求項１５に記載の使用のための組成物、または請求項１６に記載の使用、または請求項１７に記載の癌の治療方法。
【請求項１９】
１種または複数の腫瘍細胞における腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を増大させるブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）の使用。
【請求項２０】
対象における癌の治療において使用するためのブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）であって、前記治療が、組成物の前記対象への投与を含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、前記対象における前記癌が、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を示さないか、または低レベルで示す腫瘍細胞を含むことを特徴とする、阻害剤。
【請求項２１】
対象における癌の治療のための医薬の製造におけるブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）の使用であって、前記治療が、組成物の前記対象への投与を含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、前記対象における前記癌が、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を示さないか、または低レベルで示す腫瘍細胞を含むことを特徴とする、使用。
【請求項２２】
対象における癌の治療方法であって、前記対象にブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）を投与する工程を含み、前記対象における前記癌が、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を示さないか、または低レベルで示す腫瘍細胞を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２３】
対象における癌の治療において使用するためのブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）であって、前記治療が、組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、前記対象における前記癌が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞を含むことを特徴とする、阻害剤。
【請求項２４】
対象における癌の治療のための医薬の製造におけるブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）の使用であって、前記治療が、組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、前記対象における前記癌が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞を含むことを特徴とする、使用。
【請求項２５】
対象における癌の治療方法であって、前記対象にブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）を投与する工程を含み、前記対象における前記癌が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２６】
ブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの前記阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）の投与が、前記対象における前記癌の前記腫瘍細胞における腫瘍特異的新規抗原の前記発現および提示を増大させる、請求項２０または２３に記載の使用のための阻害剤、または請求項２１または２４に記載の使用、または請求項２２または２５に記載の方法。
【請求項２７】
ブロモドメインおよび末端外ドメインファミリーメンバーの前記阻害剤（ＢＥＴ阻害剤）が、免疫調節化合物、血管新生阻害剤、化学療法剤またはｃ−Ｍｙｃダウンレギュレーションからなる群から選択される薬物の全身または局所投与と組み合わされ、好ましくは、前記薬物が、免疫賦活性サイトカイン、Ｔｏｌｌ様受容体の天然、内在性もしくは合成リガンド、他の免疫賦活性受容体のリガンド、免疫チェックポイントのモジュレーター、またはアゴニストモジュレーターからなる群から選択される免疫調節化合物である、請求項２０、２３または２６に記載の使用のための阻害剤、または請求項２１、２４または２６に記載の使用、または請求項２２、２５または２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野、より具体的には、癌の治療における使用のための組成物に関する。本発明はまた、医薬組成物のような、かかる方法により得られ得る組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫チェックポイント分子をブロッキングする抗体の使用により活性化されている注目に値する臨床上の成功を伴った、癌の免疫療法アプローチの大いなる増加が見られる１。非常に有望な結果がまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化されたＴ細胞の養子移植および様々な治療ワクチン接種ストラテジーのような、他のタイプの免疫療法を経験している癌患者において得られた２〜７。
【０００３】
これらの実質的な進歩にも関わらず、多くの免疫療法は、癌患者の巨大なグループにおいて臨床的な恩恵を導くのに失敗している。この主な理由は、抗腫瘍免疫が、しばしば、腫瘍が利用する免疫回避機序により無効にされることである。この点において、免疫療法に対する不十分な臨床応答の鍵となる根底にある要因は、免疫系による癌抗原の認識を妨げる多くの腫瘍の固有の能力である（Ｃａｖａｌｌｏ、Ｄｅ  Ｇｉｏｖａｎｎｉ、Ｎａｎｎｉ、Ｆｏｒｎｉ、およびＬｏｌｌｉｎｉ、２０１１年；Ｋｈａｎ、Ｇｒｅｇｏｒｉｅ、およびＴｏｍａｓｉ、２００８年；Ｌａｎｄｓｂｅｒｇら、２０１２年；ＭｃＧｒａｎａｈａｎら、２０１７年；ＭｕｎｎおよびＭｅｌｌｏｒ、２０１３年；Ｒｅｓｐａら、２０１１年；Ｓｅｔｉａｄｉら、２００８年；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ、Ａｒｅｎｓ、Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ、ｖａｎ  Ｈａｌｌ、およびＭｅｌｉｅｆ、２０１６年；Ｗｏｏら、２０１２年；Ｚａｒｅｔｓｋｙら、２０１６）。証拠は、インターフェロン−ガンマシグナル伝達または抗原提示機構における破壊により典型的に引き起こされ得る、これらの能力が、腫瘍に獲得され得、これにより、良好な初期の応答および継続免疫療法にも関わらず、患者において遅延した再発をしばしば導き得ることを示す８。従って、癌免疫療法の有効性を改善する新たな方法が明らかに必要である。
【０００４】
免疫療法における可能性のあるツールとしての自己腫瘍細胞の使用が以前に記載されているが、腫瘍細胞は十分なＴ細胞応答を誘導するのに失敗しているので、今までのところ、かかる試みはほとんど成功しなかった。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、とりわけ、これらの課題を克服することを目的にする。特に、本発明は、初代自己腫瘍細胞を使用することを目的にし、ブロモドメインおよび末端外ドメインタンパク質の阻害剤（ＢＥＴ阻害剤またはＢＥＴｉ）を用いてこれらの細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで直接処置する方法を提供することにより、既存の療法または免疫療法を改善することを目的にする。
【０００６】
以下で詳細に考察される通り、本発明者らは、驚くべきことに、ＢＥＴ阻害剤が、治療理由に有益である、腫瘍細胞に対する多数の効果を有することを見出した。特に、付随の実施例において示される通り、ＢＥＴ阻害剤は、腫瘍細胞において、インターフェロン−ガンマシグナル伝達を増強し、インターフェロン−ガンマにより誘導される抗原提示を増大させ、恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＨＬＡクラスＩＩ発現を抑制し、恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）産生を抑制し、恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現を抑制する。それ故、本発明者らの知見は、腫瘍固有の分子経路を標的化し、それらの免疫原性を増強することにより、癌免疫療法の有効性を改善する魅力的な方法をもたらす。
【０００７】
それ故、本発明は、腫瘍細胞に対するＢＥＴ阻害剤の効果に関する本発明者らの驚くべき知見に基づき、癌を治療する新規の使用、方法および組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明は、特定のサブグループの癌を有する患者へのＢＥＴ阻害剤の直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ投与をも提供する。さらなる態様において、本発明は、初代癌細胞または患者からもたらされた癌細胞株を、ＢＥＴ阻害剤にｅｘ  ｖｉｖｏで曝露して、それらの免疫原性を増強させ、これにより、例えば、自己ワクチン接種により、抗腫瘍免疫応答を促進するための免疫原性ビークルとしての使用に適当なこれらの細胞を作製する、アプローチを提供する。
【０００８】
それ故、本発明は、対象からもたらされる初代腫瘍細胞または対象からもたらされる腫瘍細胞株を用意する工程、および腫瘍細胞をＢＥＴ阻害剤とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程を含む、対象における癌の治療に適当な組成物を得るｅｘ  ｖｉｖｏの方法に関する。あるいは、ＢＥＴ阻害剤は、１個または複数の腫瘍細胞位置にｉｎ  ｖｉｖｏで投与され得る。
【０００９】
本発明はまた、癌の治療におけるかかる方法およびそれらの使用により得られ得るか、または得られる組成物に関する。
【００１０】
本発明はまた、１個または複数の腫瘍細胞における腫瘍特異的新規抗原および／または腫瘍関連抗原の発現および提示を増大させるためのＢＥＴ阻害剤の使用に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＢＥＴ阻害剤がかかる患者に投与され、１個または複数の腫瘍細胞位置において１個または複数の腫瘍細胞における腫瘍特異的新規抗原および／または腫瘍関連抗原の（インターフェロン−ガンマにより誘導される）発現および提示を増強するか、１個または複数の腫瘍細胞位置において１個または複数の腫瘍細胞におけるインターフェロンガンマシグナル伝達を増強するか、または１個または複数の腫瘍細胞位置において１個または複数の腫瘍細胞における、ＨＬＡクラスＩＩ、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ７３のような、免疫抑制経路に関与するタンパク質の発現を抑制する、特定のサブグループの癌を有する患者を治療する使用および方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】ＪＱ１は、自己ＴＩＬによる認識のためメラノーマ細胞を差次的に感作させる。上の列：ＡＮＲＵ、ＲＯＡＬ、ＫＡＤＡおよびＡ３７５腫瘍細胞を７２時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγの存在下で培養し、洗浄し、回収し、続いて、さらに２４時間、自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）と、およびＡ３７５細胞について同種Ｔ細胞と共培養した。ＥＬＩＳＡにより決定した、共培養上清におけるＩＦＮγレベルにより示す通り、ＫＡＤＡを除き、ＪＱ１単独によりまたはＩＦＮγとの組み合わせで、ＤＭＳＯで処置した腫瘍細胞と比較して、Ｔ細胞認識を強力かつ有意に増強した。第２および第３の列：フローサイトメトリーにより決定した、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた７２時間の処置後のＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡクラスＩ発現のヒストグラムオーバーレイ。第４および第５の列：ＴＩＬによる腫瘍の増強した認識が、ＰＤ−Ｌ１発現に対する効果と関連しないが、ＪＱ１の存在下で、ＩＦＮγによる増強したＨＬＡクラスＩ誘導とより一致するように思われることを示す、フローサイトメトリーにより決定した、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた７２時間の処置後の、ＰＤ−Ｌ１の定量した発現およびＨＬＡクラスＩ発現。第６の列：ＩＦＮγによるその誘導を、ＪＱ１の存在下で抑制し得るが、Ｔ細胞による認識と明確な関連はないことを示す、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いたＡＮＲＵ、ＲＯＡＬ、ＫＡＤＡおよびＡ３７５腫瘍細胞の７２時間の処置後のＨＬＡクラスＩＩの定量した発現。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図２】ＪＱ１は、ＰＤ−Ｌ１と独立してＴＩＬによる腫瘍認識を増強する。ＡＮＲＵ細胞を、０、１２、２４、４８および７２時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγの存在下で培養し、次に、洗浄し、回収し、続いてさらに２４時間、自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）と、ＰＤ−Ｌ１についてのブロッキング抗体の不存在および存在下で共培養した。ＥＬＩＳＡにより決定した、共培養上清におけるＩＦＮγレベルにより示す通り、ＰＤ−Ｌ１をブロッキングする抗体の存在の効果なく、ＤＭＳＯで処置した腫瘍細胞と比較して、ＴＩＬ認識をより長い処置を用いて次第に増強した。
【図３Ａ−１】ＪＱ１は、抗原提示機構のＩＦＮγによる誘導した活性化を強化する。（Ａ）ＡＮＲＵ、ＲＯＡＬ、ＫＡＤＡおよびＡ３７５細胞の、７２時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた処置後、ｍＲＮＡ発現レベルを、広範囲の抗原提示機構（ＡＰＭ）の分子のｑＰＣＲにより研究した。本発明者らは、ＪＱ１が、これらの成分のほとんどについて、ＩＦＮγによるそれらの誘導、ＨＬＡクラスＩ、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２について観察されている大抵の公表された効果を強化することを見出した。
【図３Ａ−２】同上。
【図３Ｂ−１】（Ｂ）ＪＱ１の存在下、全ての時間ポイントにおけるＩＦＮγによるＡＰＭ成分の誘導を明確に強化したことを示す、未処理のＡＮＲＵ細胞および１２、２４、４８および７２時間、０．４μＭ  ＪＱ１および／または２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγを用いて処置したＡＮＲＵ細胞におけるＡＰＭ成分のｍＲＮＡ発現レベル。
【図３Ｂ−２】同上。
【図３Ｃ−１】（Ｃ）ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた７２時間の処置後のＡＮＲＵ、ＲＯＡＬ、ＫＡＤＡおよびＡ３７５細胞のウエスタンブロット解析はまた、ＪＱ１の存在下で、タンパク質レベルでのＩＦＮγによるＡＰＭ成分の増強した誘導を示した。これは、ＨＬＡクラスＩ重鎖について最も明白であり、概して、Ａ３７５細胞において明らかに見られた。
【図３Ｃ−２】同上。
【図４】ＪＱ１は、自己腫瘍浸潤性リンパ球による腫瘍関連および変異抗原の認識を増強する。ＡＮＲＵ腫瘍細胞を、０．４μＭ  ＪＱ１および／または２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγを用いて、７２時間処理し、続いて、腫瘍関連抗原ＭＡＲＴ−１、または２種の異なる腫瘍特異的変異抗原、ＥＴＶ６．９およびＮＵＰ２１０（正と指定）のいずれかに対するそれらの特異性についてソーティングした自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）と共培養した。腫瘍細胞をまた、ソーティングしていないＴＩＬ、および前述の腫瘍抗原についての特異性を有しないＴＩＬ（「負」と指定）と共培養した。ＥＬＩＳＡにより測定した、共培養上清におけるＩＦＮγレベルにより示す通り、ＪＱ１は、示した抗原に対する特異性を有する全３種のＴＩＬ集団による認識を、ＩＦＮγ単独またはＤＭＳＯによる事前処理後に観察したものと類似するか、またはそれより強い程度まで改善した。
【図５】ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ１５１およびＩ−ＢＥＴ７６２の存在下でのＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導の用量依存性増強。細胞を、７２時間、ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ１５１またはＩ−ＢＥＴ７６２を単独またはＩＦＮγとの組み合わせで用いて処理した。フローサイトメトリーにより決定した、ＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導を、全てのこれらのＢＥＴｉとの組み合わせで使用したときに、明らかに用量に依存して増大させた。
【図６−１】ＪＱ１は、ＩＦＮγが誘導したＨＬＡクラスＩ発現ならびに複数の免疫チェックポイント分子の恒常的およびＩＦＮγが誘導した抑制を増強する。図１において描く通り、自己ＴＩＬによる早期継代のメラノーマ細胞株の増強した認識が、ＪＱ１の存在下ならびに、ＰＤ−Ｌ１に対する効果を有さない、ＡＮＲＵおよびＲＯＡＬの場合におけるＩＦＮγによる増強ＨＬＡクラスＩ誘導と一致することを示す、フローサイトメトリーにより決定した、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた７２時間の処理後のＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩおよびＩＤＯの定量した発現。恒常的とＩＦＮγが誘導したＨＬＡクラスＩＩ発現の両方を、同様にＪＱ１が明らかに抑制し、一方、それはまた、ＩＦＮγが誘導したＩＤＯ発現を抑制する。
【図６−２】同上。
【図７】ＪＱ１は、抗原提示機構のＩＦＮγが誘導した活性化を強化し、ＩＦＮγシグナル伝達経路における鍵となるタンパク質の発現を増強する。様々な起源の市販のヒト腫瘍細胞株におけるフローサイトメトリーにより決定した、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた７２時間処理後のＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩおよびＣＤ７３の定量した発現。データは、ＪＱ１が、Ａ５４９（肺癌腫）、ＨＣＴ１１６（結腸癌腫）およびＨｅＬａ（子宮頸癌腫）細胞におけるＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導を増強し、一方、ＪＱ１が、ＩＦＮγによるＣＤ７３誘導を抑制することを示す。
【図８Ａ−１】ＪＱ１は、抗原提示機構のＩＦＮγが誘導した活性化を強化し、ＩＦＮγシグナル伝達経路における鍵となるタンパク質の発現を増強する。（Ａ）ＡＮＲＵ、ＲＯＡＬ、ＫＡＤＡおよびＡ３７５細胞の、７２時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた処置後、ｍＲＮＡ発現レベルを、広範囲の抗原提示機構（ＡＰＭ）の分子のｑＰＣＲにより研究した。本発明者らは、ＪＱ１が、これらの成分のほとんどについて、ＩＦＮγによるそれらの誘導、ＨＬＡクラスＩ、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＬＭＰ１０について観察されている大抵の公表された効果を強化することを見出した。
【図８Ａ−２】同上。
【図８Ｂ】（Ｂ）その同族受容体へのＩＦＮγライゲーションの下流のシグナル伝達に決定的に関与する２種のタンパク質ＳＴＡＴ１およびＪＡＫ１のＡＮＲＵ、ＲＯＡＬおよびＡ３７５細胞におけるＲＴ−ｑＰＣＲにより測定したｍＲＮＡ発現レベル。データは、ＪＱ１が、ＩＦＮγによるＳＴＡＴ１の誘導を強力に増強し、一方、ＪＱ１自体および組み合わせが、ＪＡＫ１発現を一貫して増大させることを示す。
【図９−１】２４時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγとインキュベーションしたＡＮＲＵ細胞の溶解物における質量分析によるタンパク質発現変化の解析。他の処置条件において存在する量と等しいＤＭＳＯの量を用いた対照処置における発現に対する倍率変化を描く。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図１０Ａ】２４時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγとインキュベーションしたＡＮＲＵ細胞の溶解物における質量分析によるタンパク質発現変化の解析。（Ａ）ＩＦＮγおよび／またはＪＱ１を用いた処置の２４時間後の質量分析ＡＮＲＵ細胞により検出したタンパク質上の遺伝子セット濃縮解析。ＩＦＮγにより誘導したが、それらの誘導を、ＪＱ１の存在下で行ったＩＦＮγ処置の場合において強化するか、または抑制した、タンパク質のサブセットにおける解析により同定した、それらのｐ値に従いランク付けした有意に濃縮した経路を描く。赤色において、ＩＦＮγによる誘導を、ＩＦＮγ処置をＪＱ１と組み合わせて行ったときに、最も抑制した、タンパク質を含む経路。
【図１０Ｂ】（Ｂ）図９Ａにおける遺伝子セット濃縮解析についても使用したタンパク質のサブセットのネットワーク解析。赤色において、ＩＦＮγによる誘導を、ＩＦＮγ処置をＪＱ１と組み合わせて行ったときに、最も抑制した、タンパク質を含むノード。
【図１１】ウエスタンブロット解析により示す通り、ＭＹＣ発現を、ＪＱ１単独またはＩＦＮγとの組合せでの７２時間の処理によりダウンレギュレーションする。
【図１２】ＴＩＬによる腫瘍認識のＪＱ１が誘導した増強は、ＰＤ−Ｌ１に依存しないが、ＨＬＡクラスＩのブロックにより抑止される。ＡＮＲＵ細胞を、０、１２、２４、４８および７２時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγの存在下で培養し、次に、洗浄し、回収し、続いてさらに２４時間、自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）と、ＰＤ−Ｌ１についてのブロッキング抗体の不存在および存在下で共培養した。ＥＬＩＳＡにより決定した、共培養上清におけるＩＦＮγレベルにより示す通り、ＰＤ−Ｌ１をブロッキングする抗体の存在の効果なく、ＤＭＳＯで処置した腫瘍細胞と比較して、ＴＩＬ認識をより長い処置を用いて次第に増強した。同時に、ＨＬＡクラスＩのブロックは、ＴＩＬによる腫瘍認識をほぼ完全に抑止した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ある種の腫瘍が、免疫応答を効率的に誘導することができないという課題に取り組む。この課題は、患者が、ＢＥＴ阻害剤を用いて処置されるか、または初代腫瘍細胞が、腫瘍から単離されるか、または腫瘍細胞株が、腫瘍からもたらされ、ＢＥＴ阻害剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベーションされる、本発明により克服される。かかる組成物は、次に、その対象に投与されるとき、初代腫瘍細胞のドナーにおいて有効なＴ細胞免疫応答を誘導することができる。初期に（すなわち、処置前）、処置されていない個体における標的抗原は、認識されないか、または保護抗腫瘍免疫を誘発するのに十分効率的に少なくとも認識されないけれども、治療免疫応答は、様々な腫瘍抗原に対するワクチン接種により誘導され得ることは、当業者により理解される。これは、転移性癌における腫瘍の局所処置が、処置された腫瘍の退縮ばかりでなく、局所処置の範囲外の腫瘍の退縮を導くという現象である、いわゆる、アブスコパル効果の観察により支持される。この効果は、多種多様な免疫療法の腫瘍内適用後に記載されており、これは、局所性の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化が、全身のＴ細胞介在性腫瘍根絶を導き得ることを示している（Ｆｒａｎｓｅｎ、Ｓｌｕｉｊｔｅｒ、Ｍｏｒｒｅａｕ、Ａｒｅｎｓ、及びＭｅｌｉｅｆ、２０１１年；Ｆｒａｎｓｅｎ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｓ、Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ、Ａｒｅｎｓ、およびＭｅｌｉｅｆ、２０１３年；Ｉｓｈｉｈａｒａら、２０１７年；Ｋｉｍら、２０１２年；Ｍａｒａｂｅｌｌｅ、Ｔｓｅｌｉｋａｓ、ｄｅ  Ｂａｅｒｅ、およびＨｏｕｏｔ、２０１７年；Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉら、２０１８年）。
【００１４】
かかる処置は、腫瘍細胞に対する免疫応答を非常に改善し、既存の免疫療法と置き換わるか、または組み合わせて使用される有用なツールをもたらし得る。ＢＥＴ阻害剤が、特に、インターフェロン−ガンマへの同時または続く曝露と組み合わせたとき、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞における抗原提示を非常に誘導することができることを、驚くべきことに見出したので、幾つかの利点は、かかる方法を使用することと関連する。
【００１５】
幾つかの利点はまた、患者へのＢＥＴ阻害剤の全身投与と比較したとき、かかる方法を使用することと関連する。本発明の方法は、対象へのＢＥＴ阻害剤の全身または局所投与を必要としないので、それは、阻害剤に対する毒性または有害な応答と関連する任意の可能性のある課題、ならびに阻害剤が、腫瘍に有効に達し得ないという課題を排除する。同時に、ＢＥＴｉの経口および／または静脈内および／または腫瘍内および／または任意の他の方法でのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞のチェックポイントブロックまたは養子移植のような、患者を処置するのに使用される他の免疫療法の有効性を増強し得るので、依然として高い関連性がある。
【００１６】
それ故、本発明は、対象からもたらされる初代腫瘍細胞、または対象からもたらされる腫瘍細胞株を用意する工程、および腫瘍細胞をＢＥＴ阻害剤とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程を含む、対象における癌の治療に適当な組成物を得るｅｘ  ｖｉｖｏの方法に関する。
【００１７】
上で記載された方法において、対象からもたらされる腫瘍細胞、または腫瘍細胞株の処理は、自己腫瘍細胞の抗原提示を強く誘導する。かかる処理された細胞が、対象に投与されるとき、腫瘍特異的Ｔ細胞応答が誘導され、かかる細胞が、腫瘍特異的免疫応答を誘発するために対象において使用するのに非常に適当なものになる。
【００１８】
ＢＥＴ阻害剤が、腫瘍細胞において抗原提示を大いに誘導することができるという本発明者らの驚くべき知見は、対象からもたらされる初代腫瘍細胞に適用可能であるばかりでなく、同じＨＬＡクラスＩ血清型またはハプロタイプの関係において共有される（新規）抗原を発現し得る対象からもたらされる腫瘍細胞株または（市販の）同種細胞株のような、腫瘍細胞株において抗原提示を誘導するため使用することができることは、理解される。従って、本発明が、対象からもたらされる初代腫瘍細胞を含む方法、使用および／または組成物を指す場合、本発明者らはまた、対象からもたらされる腫瘍細胞株および／または標的化可能な腫瘍抗原を発現するＨＬＡ一致同種細胞株を含める。
【００１９】
ＢＥＴ阻害剤は、臨床試験において抗癌、免疫抑制、および他の効果を有する薬物の種類であり、研究において広く使用される。これらの分子は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴのような、ブロモドメインおよびエキストラ末端モチーフ（ＢＥＴ）タンパク質のブロモドメインに可逆的に結合する。それらは、ＢＥＴタンパク質とアセチル化ヒストンと転写因子の間のタンパク質とタンパク質の相互作用を妨げると考えられる。２０１０年以降、ＢＥＴブロモドメインを標的にする能力がある多数の分子が記載されている。
【００２０】
腫瘍細胞は、全ての細胞と同様に、ＨＬＡクラスＩ複合体を使用して、表面上の抗原を提示する。変異は、腫瘍細胞において蓄積するので、これらの抗原の一部は、新規抗原を含む。かかる新規抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のような、Ｔ細胞により非自己として検出され、これにより、腫瘍細胞において特異的に標的化された免疫応答をもたらし得る。
【００２１】
腫瘍は、かかる免疫応答を回避する方法を発生することが知られており、１つのかかる方法は、ＰＤ−Ｌ１をアップレギュレーションすることにより、ＨＬＡ介在性Ｔ細胞活性化を抑制する。
【００２２】
ブロモドメインおよびエキストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質のファミリーの小分子阻害剤は、様々な腫瘍マウスモデル、ならびに様々なヒト癌細胞株において恒常的および誘導可能なＰＤ−Ｌ１発現を強力に抑制することが最近見出されたので、この点において非常に興味深い９、１０。重要なことに、抗ＰＤ−１チェックポイントブロックと組み合わせたＢＥＴタンパク質の阻害は、Ｍｙｃ−ｄｒｉｖｅｎリンパ腫を生じるマウスにおいて相乗的応答を導く１０。
【００２３】
生理的に、ＢＥＴタンパク質は、ブロモドメイン（ＢＲＤ）モジュールを使用して、ＤＮＡヒストン末端上のアセチル化リジンに結合し、これにより、転写因子および他の核タンパク質のためのスキャフォールドとして働いて、遺伝子転写を制御する、エピジェネティック「リーダー」のクラスを形成する。この方法において、それらは、ｃ−Ｍｙｃ、および様々な抗アポトーシスタンパク質のような、鍵となる癌遺伝子の発現を制御する１１。
【００２４】
ＢＥＴ阻害剤（ＢＥＴｉ）は、腫瘍成長を阻害するための標的療法としての使用のため元々開発された抗癌薬物の比較的新しいクラスである。これらの効果は、ＢＲＤ２およびＢＲＤ３と共に、主要なＢＥＴｉ標的の１つである、ＢＥＴタンパク質ＢＲＤ４の過剰発現により特徴付けられる稀な悪性度の、ＮＵＴ正中癌腫におけるＢＥＴｉ  ＪＱ１について最初に記載された１２。
【００２５】
後の研究は、Ｍｙｃ由来血液系腫瘍、メラノーマおよびニューロブラストーマを含む、幾つかの他のタイプの癌におけるＪＱ１ならびにＢＥＴ阻害剤Ｉ−ＢＥＴ１５１およびＩ−ＢＥＴ７６２の比較可能な効果を報告した１３〜１５。Ｂｒｄ４は、全てのこれらの研究において主な標的であると考えられ、一方、Ｍｙｃ由来腫瘍に対する効果はまた、Ｍｙｃダウンレギュレーションに関与する１６、１７。これらの結果の結果として、様々なＢＥＴ阻害剤が、現在、固形腫瘍と血液系癌の両方のための抗増殖剤として早期臨床開発にある。これまでのところ、これは、ＢＥＴ阻害剤が、実際に、患者において管理可能かつ逆転可能な毒性を含む抗腫瘍活性を発揮することができることを示している１８。
【００２６】
癌の可能性のある処置としてＢＥＴ阻害剤を用いて得られた有望な結果にも関わらず、幾つかの欠点が、依然として、克服される必要がある。例えば、ＢＥＴ阻害剤の全身投与は、毒性であり得るか、または自己免疫応答のような不所望な効果をもたらし得る。さらに、腫瘍タイプに依存して、ＢＥＴ阻害剤は、それらの効果を発揮するのに十分な量で腫瘍に達し得ない。最後に、全ての腫瘍タイプが、ＢＥＴ阻害剤を用いた処置に応答するわけではないことが知られている。
【００２７】
ＰＤ−Ｌ１発現の低減と独立して、ＢＥＴ阻害剤が、それらの天然の環境から単離された腫瘍細胞において、特に、インターフェロン−ガンマへの同時または続くと組み合わせて、増大した抗原提示をもたらすことが、ここで見出された。特に、以下の実施例において示される通り、本発明者らは、ＢＥＴ阻害剤が、腫瘍細胞に対する以下の効果：増大したインターフェロン−ガンマシグナル伝達；増大した抗原提示（例えば、増大したインターフェロン−ガンマにより誘導される）抗原提示）；抑制された恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＨＬＡクラスＩＩ発現；抑制された恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）産生；抑制された恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現；ならびに抑制された恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＣＤ７３発現を有することを見出した。これらの知見に基づき、新規および改善された治療ストラテジーが、本発明者らにより開発され、これにより、ＢＥＴ阻害剤の従前では未知の効果の使用をもたらす。
【００２８】
この効果に対して、癌を有する対象から初代腫瘍細胞を単離し、ＢＥＴ阻害剤を用いてこれらの初代腫瘍細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理する方法が、開発される。この方法において、強力に増大した抗原提示を有する初代腫瘍細胞が得られる。かかる細胞は、対象に投与して、有効な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を生成し得るので、有用である。
【００２９】
本発明者らの知識の限りでは、癌の治療における使用のための組成物を得るためのＢＥＴ阻害剤を用いた初代腫瘍細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処置は、以前に記載されていない。
【００３０】
ここで、驚くべきことに、癌を有する患者から腫瘍細胞を単離すること、およびこれらの細胞をＢＥＴ阻害剤を用いて処理することが、これらの細胞の抗原提示、特に、腫瘍特異的新規抗原提示を大いに増大させることが見出された。それ故、これらの細胞は、処理された細胞が、腫瘍からもたらされ、これにより、免疫系の引き金を引いて、腫瘍細胞に対して応答するので、腫瘍細胞特異的免疫応答を誘導するための、当該患者における免疫療法のためのビークルとして非常に適している。
【００３１】
かかる効果は、同種細胞が使用されるなら、観察されない。ＢＥＴ阻害剤の効果は、ＰＤ−Ｌ１のみの低減した発現により仲介されると以前に考えられていたので、初代腫瘍細胞由来の自己細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理するためのＢＥＴ阻害剤の使用は、今まで考えられていないか、または示唆されていない。
【００３２】
ここで提示されたデータは、増大した抗原提示の効果は、ＰＤ−Ｌ１発現に依存しないことを示す。
【００３３】
今や、本発明者らは、ＢＥＴ阻害が、ＰＤ−Ｌ１制御に対する任意の効果と関係なく、抗原提示機構（例えば、インターフェロンガンマ曝露により引き起こされる）の増強された活性化を通じて、自己および同種Ｔ細胞による認識のためｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を感作させ得ることを見出したので、それは、初代腫瘍細胞が、対象から単離され、ＢＥＴ阻害剤と接触させ、対象に戻して投与され、および／または例えば、養子移植による療法を確かにするため、それを使用して、自己Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大する、より有効な治療への道を開く。
【００３４】
ここで、本発明者らは、ＢＥＴ阻害が、自己Ｔ細胞による認識のためヒトメラノーマおよび他の癌細胞を感作し得ることを示す。重要なことに、ＢＥＴ阻害は、ＰＤ−Ｌ１を抑制することによりばかりでなく、抗原提示機構のインターフェロン−ガンマにより誘導される活性化を増強することにより、この効果を誘導する。
【００３５】
ここで、本発明はまた、腫瘍細胞が、免疫賦活性化合物およびＢＥＴ阻害剤と、同時または連続のいずれかで接触される、上で記載された方法に関する。特に好ましい免疫賦活性化合物は、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、インターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）経路の刺激因子のアゴニスト、サイクリン依存性４および／または６の阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である。
【００３６】
本発明者らは、これらの機序が、自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）により認識されるべき患者由来のメラノーマ細胞を強く感作させることを示す。さらに、ＰＤ−Ｌ１および抗原提示に対するＢＥＴ阻害の効果は、Ｍｙｃと独立して、部分的または完全に誘導された。
【００３７】
ＢＥＴ阻害剤は、卵巣癌およびＢ細胞リンパ腫を含む、様々なタイプの癌において恒常的ＰＤ−Ｌ１発現およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現を抑制することが示された。さらに、腫瘍成長の阻害は、マウスにおいてインタクトな免疫系を必要とすることが示された１０。ここで、本発明者らは、ＢＲＤ４の阻害が、ＰＤ−Ｌ１発現を抑制することを示す。
【００３８】
本発明の関係において、用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、腫瘍細胞がもたらされる対象の外側で生じると理解されるべきである。対象は、動物またはヒトであってもよく、対象はまた、非ヒト哺乳類であってもよい。
【００３９】
対象は、癌または癌腫、固形腫瘍または血液系の癌を有してもよい。本明細書において使用される、用語「患者」は、医師または獣医師による処置または検査を経験している対象を指す。
【００４０】
初代腫瘍細胞は、癌を有する対象を同定し、対象からサブセットもしくは実質的な部分、または全てでさえも取り除くことにより、もたらされる。癌を有する対象を診断し、当該対象における腫瘍を同定し、腫瘍の部分または全部を取り除く方法は、一般に、当業者に公知である。腫瘍細胞を対象から単離する適当な方法の非限定的な例は、外科手術、生検または採決によるものである。当業者は、腫瘍細胞を得る他の方法、および腫瘍タイプに依存して、それを行う最も適当な方法を知っている。
【００４１】
腫瘍細胞が、対象から単離されると、それらは、任意選択で、非腫瘍細胞または細胞外物質のような、不純物から分離されてもよい。好ましくは、腫瘍細胞は、対象から単離されると、適当な培地において維持されるが、本発明において、腫瘍細胞は、例えば、細胞を凍結させるか、または適当な保存培地において細胞を維持することにより、後の使用のため保存されることが想定される。
【００４２】
本発明の関係において、用語、初代腫瘍細胞は、対象における腫瘍から単離され、ゲノムを修飾して、不死の細胞株を生成することのような、腫瘍細胞を実質的に修飾することなく、ｅｘ  ｖｉｖｏ処置のため調製される細胞と解釈されるべきである。
【００４３】
初代腫瘍細胞が、対象からの単離後、それらをＢＥＴ阻害剤と接触させる工程の前に拡大されてもよいことは理解されるべきである。初代腫瘍細胞をｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大する方法は、当業者に周知である。
【００４４】
タンパク質を含有するＢＥＴモチーフの機能をブロックするか、阻害するか、またはダウンレギュレーションすることができるＢＥＴ阻害剤は、当業者に公知である。タンパク質含有ＢＥＴドメインの非限定的な例は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴタンパク質である。ＢＥＴ阻害剤は、当該技術分野において記載されており、当業者に周知である。それ故、本明細書において使用されるとき、用語、ＢＥＴ阻害剤は、タンパク質含有ＢＥＴドメインをブロッキングするか、阻害するか、またはダウンレギュレーションする能力がある任意の化合物、分子または組成物を指す。本発明によるＢＥＴ阻害剤のクラスの非限定的な例は、小分子、アンチセンスヌクレオチドおよび抗体である。
【００４５】
小分子ＢＥＴ阻害剤は、一般に、ブロモドメインおよびエキストラ末端モチーフ（ＢＥＴ）タンパク質のブロモドメインに可逆的に結合し、ＢＥＴタンパク質とアセチル化ヒストンと転写因子の間のタンパク質とタンパク質の相互作用を妨げることができる。
【００４６】
本発明による小分子ＢＥＴ阻害剤の好ましい例は、ＪＱ１、ＭＫ−８６２８、ＢＭＳ−９８６１５８、ＩＮＣＢ５４３２９、ＡＢＢＶ−０７５、ＣＰＩ−０６１０、ＦＴ−１１０１、ＧＳ−５８２９、ＧＳＫ５２５７６２、ＰＬＸ５１１０７、Ｔｅｎ−０１０、ＯＴＸ−０１５、ＣＰＩ−０６１０、３−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキナゾリン−２−オン、２−チアゾリジノン、ＣＰＩ−２０３、Ｉ−ＢＥＴ７６２（ＧＳＫ５２５７６２Ａ）、Ｉ−ＢＥＴ１５１（ＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、およびＲＶＸ２０８からなる群から選択されるＢＥＴ阻害剤である。
【００４７】
ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ１５１（ＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、およびＩ−ＢＥＴ７６２（ＧＳＫ５２５７６２Ａ）からなる群から選択されるＢＥＴ阻害剤が、特に好ましい。
【００４８】
本発明はまた、本明細書において記載される、小分子ＢＥＴ阻害剤の化学修飾を含むことは、さらに理解される。本発明のより好ましい実施形態において、小分子ＢＥＴ阻害剤は、ＪＱ１、ＭＫ−８６２８、ＢＭＳ−９８６１５８、ＩＮＣＢ５４３２９、ＡＢＢＶ−０７５、ＣＰＩ−０６１０、ＦＴ−１１０１、ＧＳ−５８２９、ＧＳＫ５２５７６２、ＰＬＸ５１１０７、Ｔｅｎ−０１０、ＯＴＸ−０１５、およびＣＰＩ−０６１０からなる群から選択される。しかしながら、ＢＥＴ阻害剤が、新規または以前に知られていない小分子ＢＥＴ阻害剤であってもよいことが、さらに想定される。化合物のＢＥＴ阻害活性は、例えば、ブロモドメインおよびエキストラ末端モチーフタンパク質を用いて破壊する技術および化合物のブロモドメインおよびエキストラ末端モチーフタンパク質への結合の検出を使用して、当業者により容易に評価され得る。
【００４９】
好ましくは、小分子ＢＥＴ阻害剤は、例えば、少なくとも６時間、より好ましくは、少なくとも８時間、より好ましくは、少なくとも１０時間、なおより好ましくは、少なくとも１２、なおより好ましくは、少なくとも１８時間、なおより好ましくは、少なくとも２４、最も好ましくは、少なくとも３０時間のような、細胞がそれらの表面上で新規抗原を発現するのを可能にするのに十部な時間、腫瘍細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで提供される。
【００５０】
あるいは、本発明によるＢＥＴ阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮのような、だがこれらに限定されない、アンチセンス遺伝子サイレンサーであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸および／またはリボ核酸および／またはヌクレオチド類似体のような人工ヌクレオチドを含んでもよく、ヌクレオチドは、中性塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、または非天然の塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドはまた、修飾された骨格を含んでもよい。修飾された骨格を有する核酸アナログの非限定的な例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。当業者は、タンパク質含有ＢＥＴドメインのダウンレギュレーションを有効に達成するために、プロトコールおよび設計ストラテジーを知っている。
【００５１】
本発明の関係において、用語、対象における癌の治療に適当な組成物は、対象に投与されるとき、抗腫瘍免疫応答の引き金を引く能力がある組成物として解釈されるべきである。好ましくは、抗腫瘍応答は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の誘導である。好ましくは、本発明による組成物の腫瘍細胞上での増大した抗原提示である、かかる応答が、誘導される。
【００５２】
初代腫瘍細胞をＢＥＴ阻害剤とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることは、応答、好ましくは、増大した抗原提示である応答を誘導するのに十分な量および時間、ＢＥＴ阻害剤を細胞にもたらすと理解されるべきである。好ましくは、ＢＥＴ阻害剤は、濃度１〜１０．０００倍、ＩＣ５０値、好ましくは、５〜２０００倍、ＩＣ５０値、より好ましくは、１０〜１０００倍、ＩＣ５０値をｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞に提供され、最も好ましくは、濃度は、タンパク質含有ＢＥＴドメインについて当該ＢＥＴ阻害剤のＩＣ５０値、２５〜２５０倍である。
【００５３】
ＪＱ１の場合において、第１および第２のブロモドメインについてのＩＣ５０値は、それぞれ、７７ｎＭおよび３３ｎＭであり、それ故、本発明の方法においてＢＥＴ阻害剤として使用されるとき、ＪＱ１の濃度は、好ましくは、５０ｎＭ〜５００μＭ、より好ましくは、２５０ｎＭ〜１００μＭ、より好ましくは、５００ｎＭ〜５０μＭであり、最も好ましくは、本発明による方法において使用されるとき、ＪＱ１の濃度は、１μＭ〜１０μＭである。なおより好ましくは、濃度は、０．１μＭ〜１０μＭである。
【００５４】
ＢＥＴ阻害剤を用いた処置の濃度または持続時間は、それぞれの個々のＢＥＴ阻害剤について調節されてもよく、当業者は、例えば、本発明の方法において使用されるＢＥＴ阻害剤の濃度を調節する開始ポイントとして個々のＩＣ５０またはＫｉ値を使用して、そのようにし得ることを知っていることは、理解されるべきである。
【００５５】
本発明の関係において、用語、腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、腫瘍細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に指示されるＴ細胞仲介性免疫応答として解釈されるべきである。ＢＥＴ阻害剤の処置として、腫瘍細胞における増大した抗原提示をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでもたらし、これは、腫瘍特異的抗原の増大した提示をもたらす。かかる腫瘍特異的抗原は、非天然の腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞により仲介される免疫応答を誘発することが示されている。
【００５６】
好ましくは、本発明の方法は、対象における癌を治療するのに適当な組成物を提供し、癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌のカポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、皮膚の基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、小児カルチノイド腫瘍、未知の原発の癌腫、心臓（心）腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、胚性腫瘍、生殖細胞腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、子宮頸癌、胆管癌腫、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、小児頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃の（胃）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、小児頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、卵巣生殖細胞腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性疾患、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞および小細胞）、リンパ腫、男性乳癌、悪性骨線維性組織球腫および骨肉腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、中皮腫、転移性癌、原発不明の転移性頚部扁平上皮癌、ＮＵＴ遺伝子関与正中管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、ニューロブラストーマ、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口唇および口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫および悪性骨の線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽細胞腫、妊娠および乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発性癌、腎細胞（腎臓）癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児（軟部組織肉腫）、唾液腺癌（頭頚部癌）、肉腫、小児血管腫瘍（軟部組織肉腫）、ユーイング肉腫（骨癌）、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、骨肉腫（骨癌）、子宮肉腫、セザリー症候群（リンパ腫）、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮癌、頚部扁平上皮癌、胃（胃の）癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌胸腺腫および胸腺癌腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、尿管および腎盂、移行細胞癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍（軟部組織肉腫）、外陰癌、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００５７】
全ての腫瘍が、ＢＥＴ阻害剤を用いた処置に応答するわけではないことは、当該技術分野において記載されている。ここで、驚くべきことに、少なくとも幾つかの腫瘍が、腫瘍細胞のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）との同時刺激によるＢＥＴ阻害剤の効果に応答性となり得ることが見出された。それ故、ＢＥＴ阻害剤とＩＦＮγの両方を用いた初代腫瘍細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処置は、そうでなければ、ＢＥＴ阻害剤単独での処置に非応答性である腫瘍細胞における増大した抗原提示をもたらす。それ故、応答性細胞を、投与したとき、ここで、対象において首尾よく使用して、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を呼び起こし得る。
【００５８】
ここで、本発明はまた、腫瘍細胞が、インターフェロンガンマおよびＢＥＴ阻害剤と、同時または連続のいずれかで接触される、上で記載された方法に関する。
【００５９】
ＢＥＴ阻害剤およびガンマインターフェロンを用いた同時または続く処置は、免疫応答が、自己腫瘍細胞上での抗原提示の相乗的増大に起因して、相乗的に増大されるというさらなる利点を有する。それ故、ＢＥＴ阻害剤およびＩＦＮγを用いた、対象からもたらされた腫瘍細胞の処置は、ＢＥＴ阻害剤またはＩＦＮγ単独を用いた腫瘍細胞の処置と比較して、対象に投与されたとき、相乗的により強い腫瘍特異的Ｔ細胞応答をもたらす。
【００６０】
本発明による方法を有効に開発するために、組成物は、対象に投与されたとき、腫瘍原性でないことが、考慮されなければならない。
【００６１】
故に、本発明は、対象に投与する前に、組成物を処理して、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍原性であることを防ぐ、上で記載された方法に関する。
【００６２】
それ故、好ましくは、初代腫瘍細胞を含む組成物は、組成物において含有される細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与されたとき、増殖することができないような方法で、処理される。かかる処理方法の例は、細胞を電離放射線の対象にすること、または細胞を有糸分裂阻害剤または細胞周期阻害剤の対象にすることであるが、他の方法が、当業者に公知である。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態において、組成物を処理して、それを電離放射線の対象にすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍原性であることを防ぐ、方法が提供される。好ましくは、細胞は、少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは、少なくとも３０Ｇｙ、なおより好ましくは、少なくとも４０Ｇｙ、最も好ましくは、５０Ｇｙ以上の対象にされる。
【００６４】
本発明のなおさらに好ましい実施形態において、腫瘍細胞を、対象から得られるＴ細胞または樹状細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程をさらに含む、方法が提供される。
【００６５】
本発明により処理される腫瘍細胞は、Ｔ細胞（例えば、自己Ｔ細胞）または樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大のため、または樹状細胞上での腫瘍抗原の提示を促進するため使用され得ることが、想定される。この好ましい方法の利点は、Ｔ細胞または樹状細胞が、組成物において活性化され、それ故、方法が、対象における癌を治療するため使用され得るということである。
【００６６】
本方法をまた使用して、患者の免疫療法に適当なＴ細胞および／または樹状細胞を生じさせることができるか、またはそれをまた使用して、癌の免疫療法に適当な腫瘍細胞および／またはＴ細胞および／または樹状細胞の組み合わせを得ることができる。
【００６７】
それ故、本発明のさらに好ましい実施形態において、対象における癌の治療に適当な組成物を得るｅｘ  ｖｉｖｏ方法が提供され、方法は、腫瘍細胞を、対象から得られるＴ細胞または樹状細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程をさらに含み、組成物は、ＢＥＴ阻害剤を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処理した、Ｔ細胞、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大したＴ細胞、もしくは樹状細胞またはその組み合わせを含む。Ｔ細胞を拡大する方法は、当該技術分野において公知であり、実施例２において例証される。
【００６８】
本発明による方法は、ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡクラスＩ）またはＰＤ−Ｌ１が陰性である腫瘍細胞について特に有利であり得るか、またはＨＬＡまたはＰＤ−Ｌ１の低発現を有するか、または発現を有さない。本発明の関係において、用語「ＨＬＡ陰性またはＨＬＡクラスＩ陰性またはＰＤ−Ｌ１陰性」は、ＨＬＡ、ＨＬＡクラスＩまたはＰＤ−Ｌ１の発現（例えば、これらのタンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫染色を使用して、例えば、免疫組織化学またはフローサイトメトリーを行うとき）が、アップレギュレーションされず、および／または検出可能でないと解釈されるべきである。
【００６９】
実施形態において、腫瘍は、発現レベルが、非腫瘍細胞のものまたは正常腫瘍細胞のものを有意に超えないなら、ＨＬＡ陰性またはＰＤ−Ｌ１陰性であるとみなされる。
【００７０】
発現は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを指してもよい。
【００７１】
ＰＤ−Ｌ１陽性である腫瘍の存在は、ＢＥＴｉがまた、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍の免疫原性を増強し得るので、適格であるべき患者に必須ではない。
【００７２】
故に、本発明のなおさらに好ましい実施形態において、腫瘍細胞が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞である、方法が提供される。
【００７３】
加えて、本発明の方法および使用は、ＩＦＮ−ガンマ受容体の下流の破壊された、またはほとんど機能していない分子シグナル伝達を伴った腫瘍を有する患者、および／またはインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、および／またはＨＬＡクラスＩＩおよび／またはＰＤ−Ｌ１の高い、恒常的またはＩＦＮ−ガンマにより誘導される発現を伴った腫瘍を有する患者に特に、有利であり得る。
【００７４】
本発明による方法を使用して、癌の治療に適当な組成物を得てもよく、癌は、固形腫瘍または血液系の癌であることが、想定される。好ましくは、癌は、メラノーマである。
【００７５】
固形腫瘍はまた、新生物として言及され、圧倒的多数の腫瘍タイプ、典型的には、血液系の癌とみなされない全ての腫瘍を包含する。血液系の癌はまた、増血およびリンパ組織の主要として当業者に公知であり、白血病、リンパ腫およびミエローマを含む。
【００７６】
本発明のなおさらに好ましい実施形態において、癌がメラノーマである、方法が提供される。
【００７７】
本発明のなおさらに好ましい実施形態において、工程ａ）における腫瘍細胞が、オルガノイドまで成長する、方法が提供される。
【００７８】
全ての初代腫瘍細胞が、ｅｘ  ｖｉｖｏでの培養物において容易に維持されるわけではないことは、当該技術分野において一般に公知である。これを克服する１つの方法は、初代腫瘍細胞からオルガノイドを成長させて、安定な細胞培養物を確立することである。次に、かかるオルガノイドを、本発明の方法によるＢＥＴ阻害剤を用いて処理することができる。腫瘍細胞からオルガノイドを成長させるプロトコールは、当業者に公知であり、オランダ、ユトレヒトにおけるＨｕｂｒｅｃｈｔ研究所のＨａｎｓ  ＣｌｅｖｅｒｓおよびＴｏｎ  Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇにより、広く記載されている。
【００７９】
本発明のさらなる態様において、本発明による方法により得られ得る組成物が、提供される。
【００８０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本発明による方法により得られた組成物が、提供される。
【００８１】
本発明のさらなる態様において、上で記載された組成物および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物が、提供される。
【００８２】
かかる組成物は、腫瘍特異的新規抗原の増大した発現および提示により特徴付けられ、用語「増大した」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの正常な非腫瘍細胞および／または処理されていない腫瘍細胞と比較した、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示のレベルを指す。
【００８３】
さらなる態様において、本発明は、医薬における使用のための本発明の組成物または医薬組成物を提供する。
【００８４】
さらなる態様において、本発明は、治療が、組成物の対象への投与を含み、好ましくは、当該投与は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含む、癌の治療における使用のための組成物を提供する。
【００８５】
代替の実施形態において、本発明は、組成物の対象への投与を含む、癌を治療する方法であって、当該投与が、好ましくは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含む、方法を提供する。
【００８６】
代替の実施形態において、本発明は、癌の治療のための医薬の製造における本発明による組成物の使用を提供する。
【００８７】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための組成物であって、上で記載される治療は、免疫調節化合物、血管新生阻害剤、化学療法剤またはｃ−Ｍｙｃダウンレギュレーションからなる群から選択される薬物のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの全身または局所投与と組み合わされ、好ましくは、薬物は、ＢＥＴ阻害剤、免疫賦活性サイトカイン、Ｔｏｌｌ様受容体の天然、内在性もしくは合成リガンド、他の免疫賦活性受容体のリガンド、免疫チェックポイントのモジュレーター、またはアゴニストモジュレーター、エピジェネティック薬物（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤およびＤＮＭＴ阻害剤）または標的療法のための化合物（例えば、ＢＲＡＦ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤）からなる群から選択される免疫調節化合物である、組成物を提供する。
【００８８】
化学療法剤の非限定的な例は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格かく乱物質（タキサン）、エポチロン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、トポイソメラーゼＩの阻害剤、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、ペプチド抗生物質、プラチナベースの剤、レチノイド、ビンカアルカロイドおよび誘導体を含む。ｃ−Ｍｙｃを阻害するか、またはダウンレギュレーションする非限定的な方法は、小分子化合物、ＲＮＡ干渉、または抗体を使用することを含む。
【００８９】
本発明による免疫賦活性サイトカインの非限定的な例は、タイプＩおよびＩＩインターフェロン：ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、およびガンマＣファミリーのサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−３５である。
【００９０】
ｔｏｌｌ様受容体の天然、内在性または合成リガンドの非限定的な例は、
−ＴＬＲ１（例えば、トリアシル化リポペプチド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ）
−ＴＬＲ２（例えば、リポ多糖、熱殺傷リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））
−ＴＬＲ３（例えば、ポリＩ：Ｃ）
−ＴＬＲ４（例えば、リポ多糖、ＭＰＬＡ）
−ＴＬＲ５（例えば、フラゲリン）
−ＴＬＲ６（例えば、ＦＳＬ１）
−ＴＬＲ７（例えば、イミキモド）
−ＴＬＲ８（例えば、Ｒ８４８）
−ＴＬＲ９（例えば、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド）
−ＴＬＲ１０ 
−減弱および／もしくは断片化ウイルスまたは細菌に基づく任意のＴＬＲアゴニスト
−任意の内在性リガンド（例えば、熱ショックタンパク質）
についての天然、内在性または合成リガンドを含む。
他の免疫賦活性受容体のリガンドの非限定的な例は、
−高度なグリカチオン最終産物の受容体（ＲＡＧＥ）
−インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）
についての天然、内在性または合成リガンドを含む。
【００９１】
免疫チェックポイントのモジュレーターの非限定的な例は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＧＡＬ９、およびＡ２ａＲからなる群から選択されてもよい。モジュレーターは、ペプチド、抗体、干渉ＲＮＡ、または小分子であり得る。幾つかの場合において、免疫モジュレーターは、モノクローナル抗体、またはＩｇ融合タンパク質である。
【００９２】
アゴニストモジュレーターの非限定的な例は、刺激免疫分子に対するモジュレーター、例えば、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、またはＨＶＥＭを含む。モジュレーターは、ペプチド、抗体、干渉ＲＮＡ、または小分子であり得る。幾つかの場合において、免疫モジュレーターは、モノクローナル抗体、またはＩｇ融合タンパク質である。
【００９３】
エピジェネティック薬物の非限定的な例は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴｉ）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含む。標的癌療法のための薬物の非限定的な例は、ＡＰＲ−２４６を含む。
【００９４】
上で考察され、以下の実施例において示される通り、本発明者らは、ＢＥＴ阻害剤が、腫瘍細胞に対する以下の効果：増大したインターフェロン−ガンマシグナル伝達；増大した抗原提示；抑制した恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＨＬＡクラスＩＩ発現；抑制された恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）産生；および抑制された恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現を有することを示した。従って、さらなる態様において、本発明は、１個または複数の腫瘍細胞においてインターフェロン−ガンマシグナル伝達を増大させる；および／または１個または複数の腫瘍細胞において抗原提示を増大させる；１個または複数の腫瘍細胞において恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＨＬＡクラスＩＩ発現を抑制する；１個または複数の腫瘍細胞において恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）産生を抑制する；および／または１個または複数の腫瘍細胞において恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現を抑制するＢＥＴ阻害剤の使用を提供する。腫瘍細胞においてこれらの効果を生じさせることは、新規の治療方法、使用および組成物の生成において有益であることは、当業者により理解される。
【００９５】
好ましい実施形態において、本発明は、１個または複数の腫瘍細胞において腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を増大させるＢＥＴ阻害剤の使用を提供する。
【００９６】
加えて、本発明者らの知見に従い、本発明は、腫瘍細胞に対する以下の効果：インターフェロン−ガンマシグナル伝達を増大させる；抗原提示を提示させる；恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＨＬＡクラスＩＩ発現を抑制する；恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ  （ＩＤＯ）産生を抑制する；および恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現を抑制する、の１種または複数を有するＢＥＴ阻害剤の使用を提供する。かかる使用は、新規の治療方法、使用および組成物の生成において有益であることは、当業者により理解される。
【００９７】
ＢＥＴ阻害剤の有益な効果の本発明者らの驚くべき知見は、かかる阻害剤の新規使用を同定し、ＢＥＴ阻害剤を使用して処置され得る癌を有する患者の新規サブグループを同定する。上で考察された通り、ＢＥＴ阻害剤は、腫瘍成長を阻害するための抗腫瘍療法としての使用について以前に記載されていた。しかしながら、本発明者らの知見は、ここで、ＢＥＴ阻害剤を使用して、別の方法で、特に、腫瘍細胞の抗原提示を誘導し、および／または増大させることにより、癌を治療することができ、腫瘍特異的Ｔ細胞応答が、患者において誘導され、それが、腫瘍特異的免疫応答を導くことを示す。
【００９８】
本発明者らの知見は、ＢＥＴ阻害剤を使用して処置され得る、癌を有する患者の幾つかの新規のサブグループ、特に：
（ｉ）腫瘍特異的新規抗原および／または共有される抗原の発現および提示を有さないか、または低いレベルを有する腫瘍細胞を含む癌を有する患者―かかる患者において、ＢＥＴｉは、抗原の（インターフェロン−ガンマにより誘導される）提示を増強し、これが、Ｔ細胞による腫瘍のより良好な認識および根絶を導き；および／または
（ｉｉ）ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤＬ−１陰性腫瘍細胞を含む癌を有する患者―かかる患者において、ＢＥＴｉは、ＨＬＡの（インターフェロン−ガンマにより誘導される）発現を誘導し、これが、Ｔ細胞による腫瘍のより良好な認識および根絶を導き；および／または
（ｉｉｉ）低いまたは不存在のＨＬＡクラスＩ発現を有する腫瘍細胞を含む癌を有する患者―かかる患者において、ＢＥＴｉは、ＨＬＡの（インターフェロン−ガンマにより誘導される）発現を増強し、これが、Ｔ細胞による腫瘍のより良好な認識および根絶を導き；および／または
（ｉｖ）不十分なインターフェロン−ガンマ応答性およびシグナル伝達を有する腫瘍細胞を含む癌を有する患者―かかる患者において、ＢＥＴｉは、誘導されたインターフェロン−ガンマに対する腫瘍の応答性を増大させ、これが、より良好な抗原提示およびＴ細胞による腫瘍のより良好な認識および根絶を導き；および／または
（ｖ）高いインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を有する腫瘍細胞を含む癌を有する患者（Ｈｏｌｍｇａａｒｄら、２０１５年；Ｈｏｒｎｙａｋら、２０１８年；ＭｕｎｎおよびＭｅｌｌｏｒ、２０１３年）―かかる患者において、ＢＥＴｉは、ＩＤＯの（インターフェロン−ガンマにより誘導される）発現を抑制し、これが、Ｔ細胞の低減した免疫抑制、従って、腫瘍のより良好なＴ細胞介在性根絶を導き；および／または
（ｖｉ）高いＨＬＡクラスＩＩ発現（Ｄｏｎｉａら、２０１５年；Ｈｅｍｏｎら、２０１１年）を有する腫瘍細胞を含む癌を有する患者―かかる患者において、ＢＥＴｉは、ＨＬＡクラスＩＩの（インターフェロン−ガンマにより誘導される）発現を抑制する。理解される通り、健康な状態において、ＨＬＡクラスＩＩは、免疫応答を促進するための免疫系の専門の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）上で発現されるのみであるが、病原状態において、ＨＬＡクラスＩＩは、しばしば、腫瘍において異常に発現され、幾つかの方法で、最も重要なことには、ちょうどＰＤ１と同様に、Ｔ細胞を負に制御し、ＣＤ４  Ｔ細胞の場合において、それらを抑制性表現型に対してそれらをゆがめる分子である、ＬＡＧ３についてのリガンドであることにより、免疫応答を抑制するのに働く；および／または
（ｖｉｉ）例えば、健常な細胞におけるＣＤ７３の発現の正常なレベルと比較して、上昇したおよび／または高いＣＤ７３発現を有する腫瘍細胞を含む癌を有する患者（Ｄ．  Ａｌｌａｒｄ、Ｃｈｒｏｂａｋ、Ａｌｌａｒｄ、Ｍｅｓｓａｏｕｄｉ、およびＳｔａｇｇ、２０１８年）―かかる患者において、ＢＥＴｉは、ＣＤ７３の（インターフェロン−ガンマにより誘導される）発現を抑制し、これが、Ｔ細胞の低減した免疫抑制、従って、腫瘍のより良好なＴ細胞介在性根絶を導く
を同定する。ＣＤ７３は、細胞外ＡＴＰのアデノシンへの分解を触媒し、Ｔ細胞の機能を抑制する。
【００９９】
かかる腫瘍細胞および関連する分子マーカーを同定し、特徴付け、これにより、試験されるべき患者サブグループを同定する方法は、医薬および分子生物学の当業者に公知である。
【０１００】
本発明の好ましい態様において、対象における癌の治療における使用のためのＢＥＴ阻害剤であって、治療が、対象への組成物の投与を含み、好ましくは、当該投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、対象における癌が、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を示さないか、または低レベルで示す、腫瘍細胞を含むことを特徴とする、ＢＥＴ阻害剤が提供される。
【０１０１】
本発明の別の好ましい態様において、対象における癌の治療のための医薬の製造におけるＢＥＴ阻害剤の使用であって、治療が、対象への組成物の投与を含み、好ましくは、当該投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み；対象における癌が、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を示さないか、低レベルで示す腫瘍細胞を含むことを特徴とする、ＢＥＴ阻害剤の使用が提供される。
【０１０２】
本発明の別の好ましい態様において、対象における癌の治療の方法であって、対象における癌が、腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を示さないか、または低レベルで示す腫瘍細胞を含むことを特徴とする、対象にＢＥＴ阻害剤を投与する工程を含む、方法が提供される。
【０１０３】
ＢＥＴ阻害剤の適当な投与アプローチ、投薬、および投与計画は、当業者に公知である。好ましくは、ＢＥＴ阻害剤は、経口および／または皮下注射により投与され得る。ＢＥＴ阻害剤の好ましい投与量は、１日当たり１ｍｇ、または１日当たり２ｍｇ、または１日当たり５ｍｇ、または１日当たり１０ｍｇ、または２０ｍｇ／１日当たり、または１日当たり３０ｍｇ、または１日当たり４０ｍｇ、または１日当たり５０ｍｇ、または１日当たり６０ｍｇ、または１日当たり７０ｍｇ、または１日当たり８０ｍｇ、または１日当たり９０ｍｇ、または１日当たり１００ｍｇ、または１日当たり１５０ｍｇ、または１日当たり２００ｍｇ以上である。好ましくは、ＢＥＴ阻害剤は、かかる投薬量で、および／またはかかる経路により、毎日１回、１日以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１または２８日間投与される。
【０１０４】
例えば、ＢＥＴ阻害剤ＲＯ６８７０８１０（ＪＱ１に基づくＢＥＴ阻害剤）は、１日１回（漸増用量で）、皮下注射を介して、２８日サイクル（継続して２８日間の投与もしくは２１日間の投与、続いて、７日間の薬物なし）または２１日間のサイクル（１４日間の投与、続いて、７日間の薬物なし）のいずれかにおいて投与されてもよい。
【０１０５】
ＢＥＴ阻害剤ＯＴＸ０１５／ＭＫ−８６２８（ＢＥＴ阻害剤）は、開始用量１０ｍｇで、経口（ＰＯ）で、１日１回（ＱＤ）、継続して１回のサイクル当たり２１日間投与されてもよい。
【０１０６】
ＢＥＴ阻害剤ＺＥＮ００３６９４は、１日１回、２８日のサイクルで経口投与されてもよい。
【０１０７】
ＢＥＴ阻害剤ＧＳＫ５２５７６２は、５ミリグラム（ｍｇ）の開始用量で、経口で、１日に１回投与されてもよい。用量増大および／または用量調節を行い、忍容性および安全性の問題に取り組んでもよい。１日当たり最大２００ｍｇの用量に達するまで、用量増大を続けてもよい。ＧＳＫ５２５７６２は、１ｍｇ、１０ｍｇおよび３０ｍｇの錠剤において提供されてもよく、および／または２４０ミリリットル（ｍＬ）の水と共に投与されてもよい。
【０１０８】
本発明の好ましい態様において、対象における癌の治療における使用のためのＢＥＴ阻害剤であって、治療が、対象への組成物の投与を含み、好ましくは、当該投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、対象における癌が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤＬ−１陰性腫瘍細胞を含むことを特徴とする、ＢＥＴ阻害剤が提供される。
【０１０９】
本発明の別の好ましい態様において、対象における癌の治療のための医薬の製造におけるＢＥＴ阻害剤の使用であって、治療が、対象への組成物の投与を含み、好ましくは、当該投与が、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腫瘍内投与またはその組み合わせを含み、対象における癌が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤＬ−１陰性腫瘍細胞を含むことを特徴とする、使用が提供される。
【０１１０】
本発明の別の好ましい態様において、対象における癌の治療方法であって、対象にＢＥＴ阻害剤を投与する工程を含み、対象における癌が、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤＬ−１陰性腫瘍細胞を含むことを特徴とする方法が、提供される。
【０１１１】
ＨＬＡ陰性腫瘍細胞および／またはＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞を同定する方法は、医薬および生化学の当業者に周知である。
【０１１２】
好ましくは、本発明の方法および使用において、ＢＥＴ阻害剤の投与は、対象における癌の腫瘍細胞での腫瘍特異的新規抗原の発現および提示を増大させる。加えて、本発明者らの知見に従い、ＢＥＴ阻害剤の投与は、インターフェロン−ガンマシグナル伝達を増大させ；抗原提示を増大させ；恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＨＬＡクラスＩＩ発現を抑制し；恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）産生を抑制し；恒常的およびインターフェロン−ガンマにより誘導されるＰＤ−Ｌ１発現を抑制する。
【０１１３】
好ましくは、本発明の方法および使用において、ＢＥＴ阻害剤は、免疫調節化合物、血管新生阻害剤、化学療法剤またはｃ−Ｍｙｃダウンレギュレーションからなる群から選択される薬物の全身または局所投与と組み合わされ、好ましくは、薬物は、免疫賦活性サイトカイン、Ｔｏｌｌ様受容体の天然、内在性または合成リガンド、他の免疫賦活性受容体のリガンド、免疫チェックポイントのモジュレーター、またはアゴニストモジュレーターからなる群から選択される免疫調節化合物である。
【０１１４】
ＢＥＴ阻害剤が、かかる薬物と組み合わせて投与される場合、ＢＥＴ阻害剤および薬物が、任意の順で投与されてもよく―例えば、ＢＥＴ阻害剤は、さらなる薬物の前、および／または同時、および／または後に投与されてもよいことは、理解される。
【０１１５】
さらに、ＢＥＴ阻害剤は、照射、外科手術、化学療法、標的療法および／またはチェックポイントブロック療法の１種または複数を含む、他の抗癌療法と組み合わせて投与されてもよい。ＢＥＴ阻害剤が、かかる療法と組み合わせて投与される場合、ＢＥＴ阻害剤および薬物が、任意の順で投与されてもよく―例えば、ＢＥＴ阻害剤は、さらなる療法の前、および／または同時、および／または後に投与されてもよいことは、理解される。
【０１１６】
結論として、最初の投与についての本研究は、ＢＥＴ阻害が、高度に生理的に関連するモデルにおける、ヒトメラノーマ細胞に対する機能的および抗原特異的Ｔ細胞応答をブーストし得ることを示す。全体として、提示されるデータは、ＪＱ１が、単独またはＩＦＮγとの組み合わせのいずれかで、ＰＤ−Ｌ１抑制と関連なく、ＴＩＬ認識について腫瘍細胞を強く感作させることができることを示す。重要なことに、本発明者らは、ＢＥＴ阻害が、ＰＤ−Ｌ１の制御と独立して、ＡＰＭ成分を活性化するＩＦＮγの能力を増強することにより、その感作効果を主に誘導するという証拠を提示する。その上、強力なＰＤ−Ｌ１ダウンレギュレーションにも関わらず、感作は、ＫＡＤＡ細胞において観察されないという事実は、ＪＱ１の感作効果が、抗原提示機構の活性化により主に介在されることを示唆する。事実、本発明者らは、ＢＥＴ阻害が、腫瘍関連抗原と腫瘍特異的変異抗原の両方の認識をブーストすることができるという証拠を提示し、後者は、癌免疫療法中に抗腫瘍Ｔ細胞応答の有効性に特に関連すると証明された。
【０１１７】
免疫抑制経路が、癌細胞によるよりむしろ、免疫系によりもたらされることが、前に仮定されている。例えば、メラノーマ微小環境におけるＰＤ−Ｌ１、ＩＤＯおよびＴｒｅｇの誘導が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によりもたらされることが示されている２２。これは、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を通じて主に仲介されるので、ＢＥＴ阻害剤の適用は、負のものを低減しながら、ＣＤ８  Ｔ細胞応答の正の効果を増強する非常に魅力的な方法であり得る。これはまた、負の調節免疫チェックポイントを標的にする癌免疫療法アプローチが、いわゆる「ホット」腫瘍（すなわち、既存のＴ細胞浸潤を有する）を有する患者にとってより有益であり得ることを示唆する。他方、本発明による方法は、それが、ＡＰＭの活性化を通じてＴ細胞の流入の引き金を引くので、いわゆる「コールド」腫瘍（すなわち、Ｔ細胞浸潤を有さない）を有する患者の治療に特に適合される。
【０１１８】
メラノーマにおける機能を失う変異を模倣するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ライブラリーに基づく、Ｎａｔｕｒｅにおける非常に最近の研究は、癌免疫療法ベースのＴ細胞に対する抵抗性に関与する遺伝子の大部分が、抗原提示およびＩＦＮγシグナル伝達における鍵となる役割を有し、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓの患者腫瘍における細胞溶解活性と相関することを見出した２３。本発明者らの知見は、ＢＥＴｉがこれらの経路に正確に影響することを示すという事実は、免疫療法ベースのＴ細胞の臨床上の有効性を改善するための高度な手段であり得るという概念へのさらなる支持を与える。同時に、ＢＥＴｉは、細胞培養物における明らかな抗増殖能力を提示し、これが、それを、複数のレベルで腫瘍に影響する非常に魅力的なタイプの抗癌医薬にする。
【０１１９】
感作：ブロモドメインおよび末端外ドメイン（ＢＥＴ）ファミリーメンバーの阻害剤は、腫瘍において複数の効果を誘導することが知られている。増殖を抑制し、亜ポトーシスを誘導する標的療法として使用することが本来意図されるが、ＢＥＴ阻害が、様々な腫瘍マウスおよびヒト癌細胞株におけるＰＤ−Ｌ１の発現を強く抑制することが最近見出された。これはまた、ヒトメラノーマ細胞において見られるが、これが、抗腫瘍免疫応答について有する機能的因果関係について研究されていない。それ故、本発明者らは、ヒトメラノーマ細胞の機能的免疫原性についてのこれらの機序の重要性を決定するよう設定した。
【０１２０】
早期継代のヒトメラノーマ細胞株は、７２時間、ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１を用いて、単独またはインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）との組み合わせのいずれかで処理された。細胞は、続いてトリプシン処理され、洗浄され、２４時間、自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）と共培養された。共培養上清は、ＴＩＬによる腫瘍認識についての測定値として、ＩＦＮγレベルについてのＥＬＩＳＡにより評価された。細胞株はまた、ＪＱ１および／またはＩＦＮγを用いた処置後のＰＤ−Ｌ１の発現レベルについてのフローサイトメトリーにより評価された。
【０１２１】
ＪＱ１を、単独またはＩＦＮγとの組み合わせでのいずれかで用いた早期継代の腫瘍細胞株の処置は、自己ＴＩＬによる認識のためそれらを著しく感作させた。重要なことに、ＪＱ１は、ＨＬＡクラスＩ、β２ミクログロブリン、および抗原提示機構の成分を誘導するＩＦＮγの能力を明確に増強した。ＰＤ−Ｌ１発現は、ＪＱ１により実際に抑制されたが、ＩＦＮγにより誘導された抗原提示にたいするその増強効果は、ＴＩＬによる改善された機能的認識とずっとより強く一致した。これはまた、ＪＱ１の感作効果が、細胞が、ベースラインおよびＩＦＮγ処置後にＰＤ−Ｌ１について陰性であるとき観察されたという観察により強調された。本発明者らは、ＢＥＴ阻害が、実際に、恐らく、ＰＤ−Ｌ１抑制と独立した機序を通じて、ヒトメラノーマ細胞に対する抗腫瘍免疫を促進することができると結論づける。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：材料及び方法
細胞株および培養物
早期継代のメラノーマ細胞株ＡＮＲＵ、ＲＯＡＬおよびＫＡＤＡを、公開されたプロトコールに基づき、カロリンスカ大学病院の腫瘍クリニック（倫理許可：＃２０１１／１４３−３２／１）において患者から確立した２１。マイコプラズマフリー（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔキット）細胞株は、本研究において使用したとき、それらの第１５〜４５代の継代であった。
【０１２３】
腫瘍浸潤性リンパ球の培養および拡大
腫瘍浸潤性リンパ球の培養および拡大を、以前に公開された通り行った４。腫瘍の小片（およそ０．５ｃｍ３）を、１ｍｍ３の小片に分けた。それぞれの小片を、（外科手術の日に収集した血漿の遠心分離および熱不活化により生成した）２％自己血漿および６，０００ＩＵ／１ｍＬのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を添加した１ｍＬ／ウェルＣｅｌｌＧｒｏ培地を含有する２４ウェルプレートの１ウェルに入れた。培養の１日目に、それぞれのウェルにおける培地体積の半分を、血漿およびＩＬ−２を添加した新鮮培地で置き換えた。３〜４日間の培養後に、腫瘍片から出現したリンパ球を、通常、見ることができた。培養物を、通常通りモニターし、コンフルエンスに達する前に分けた。およそ２週間後、拡大しているウェルを、プールし、カウントした。巨大なＴ細胞を生じさせるため、ＴＩＬを、およそ１４日間、自己の照射したフィーダー（４０Ｇｙ、ＴＩＬ：フィーダー比１：５０〜１：８０）の存在下で、３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２および３０ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｃｉｌａｇ、Ｚｕｇ、スイス）と共に培養した。必要に応じて、細胞を分けるか、または培地を交換した。培養を、縦型Ｔ７５フラスコにおいて開始したが、回収の１週間前にＶｕｅＬｉｆｅ細胞培養バッグに移した。培養の最後に、細胞を、回収し、プールし、特徴付け、カウントし、凍結した。
【０１２４】
フローサイトメトリー
次の抗体：抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ  ＡＰＣ−Ｃｙ７（クローンＷ６／３２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）、ＣＤ２７４  ＢＶ７８６（クローンＭＩＨ１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｌａｋｅｓ、ＮＪ、米国）を用いた染色後に、フローサイトメトリーを行った。全てのデータを、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ  ２０００［？］フローサイトメーター（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウウェアバージョン１０（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して解析した。
【０１２５】
実施例２：ＪＱ１は、自己ＴＩＬによる認識のためメラノーマ細胞を差次的に感作させる
本発明者らは、ここで、ＪＱ１を用いた患者由来の早期継代のメラノーマ細胞株の処理は、自己ＴＩＬによる認識を増強することを示す。恒常的と誘導したＰＤ−Ｌ１発現の両方に対するＢＥＴ阻害の可能性のある抑制効果を研究するために、本発明者らはまた、ＩＦＮγと組み合わせたＪＱ１の感作効果を研究した。加えて、細胞を、ＩＦＮγ単独により処理して、Ｔ細胞認識のための標的細胞の感作について公知の生理学的指示と比較して、ＪＱ１の可能性のある感作効果の強さの概念を得た。これと共に、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡクラスＩ発現を、前処理した腫瘍細胞におけるフローサイトメトリーにより評価して、腫瘍−ＴＩＬ共培養物における機能的観察が、標的細胞認識の際にＴ細胞活性化の鍵となる決定因子である両方のマーカーである、ＰＤ−Ｌ１発現またはＨＬＡクラスＩ発現における変化と関連するかどうかを見出した。
【０１２６】
ＡＮＲＵの７２時間、ＪＱ１単独の存在下での培養および続く、２４時間、自己ＴＩＬとの共培養後、本発明者らは、ＩＦＮγ産生の増大したレベルにより示す（図１ａ、上の列）、Ｔ細胞認識における用量に依存した増大を観察した。対照的に、ＩＦＮγ単独またはＪＱ１との組み合わせでのＡＮＲＵの事前処理は、共培養中に、Ｔ細胞認識における増大を導かなかった（図１ａ、第２の列）。興味深いことに、ＡＮＲＵ細胞上でのこの分子の発現は、全ての条件下で全体的に存在しなかったので、これらの観察は、ＰＤ−Ｌ１の発現に対する効果と一致しなかった。同時に、本発明者らは、ＪＱ１の存在下でのＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導の一貫した増強を観察し、一方、ＨＬＡクラスＩＩのアップレギュレーションを、実際に抑制した（図１）。
【０１２７】
ＡＮＲＵを用いた本発明者らの知見と対照的に、ＪＱ１単独での事前処理は、より高い濃度でさえ、自己ＴＩＬによる認識のため、早期継代の細胞株ＲＯＡＬおよびＫＡＤＡを感作させなかった。ＲＯＡＬの場合において、ＩＦＮγ単独を用いた処理は、自己ＴＩＬによる認識のため細胞を感作させなかった。しかしながら、ＴＩＬは、ＪＱ１とＩＦＮγの組み合わせを用いて前処理したＲＯＡＬ細胞を有意に良好および相乗的に認識した。ＡＮＲＵについて観察したものと類似して、全ての状態下で存在しないなら、ＲＯＡＬ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現は周辺であり、一方、ＨＬＡクラスＩ発現を、再度、ＪＱ１の存在下で、ＩＦＮγにより有意により強く誘導した。
【０１２８】
ＫＡＤＡについての結果は、他のもの由来の複数の方法で突出した。まず、ＩＦＮγ事前処理は、ＴＩＬへの認識のためＫＡＤＡを強く感作させた、一方、ＩＦＮγとＪＱ１の組み合わせは、事実、自己ＴＩＬによる腫瘍細胞認識における低減を導いた。厳密に言うと、ＫＡＤＡは、ＪＱ１が強く抑制した、高い恒常的およびより高いＩＦＮγが誘導したＰＤ−Ｌ１発現レベルを提示した。再度、ＡＮＲＵおよびＲＯＡＬについて観察したものと対照的に、ＪＱ１は、実際に、ＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導を低減した。注目すべきは、任意の事前処理後のＴＩＬによる腫瘍認識を、共培養物を、ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体の存在下で行ったとき、常に完全に抑制した。
【０１２９】
一緒に、これらのデータは、ＪＱ１が、単独またはＩＦＮγとの組み合わせのいずれかで、ＰＤ−Ｌ１発現の不存在下で、ＴＩＬによる認識のため腫瘍細胞を顕著に感作させることができることを示す。これらの効果を、ＪＱ１の存在下で、ＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩの増強した誘導と共に細胞株においてのみ観察した。対照的に、ＪＱ１は、メラノーマ細胞を感作させるのに失敗し、強いＰＤ−Ｌ１抑制に関わらず、ＩＦＮγが誘導した感作を低減しさえした。強いＰＤ−Ｌ１ダウンレギュレーションにも関わらず、ＫＡＤＡ細胞において感作を観察しないと言う事実は、ＪＱ１の感作効果、および恐らく他の研究において観察した免疫学的効果も、抗原提示機構の活性化により主に介在されることを示唆する。
【０１３０】
実施例３：ＪＱ１は、ＰＤ−Ｌ１と独立してＴＩＬによる腫瘍認識を増強する
次に、本発明者らは、ＪＱ１が、ＰＤ−Ｌ１に対する効果に関わらず、ＴＩＬによる機能的腫瘍認識を増強することができることをさらに確認するために設定した。これを試験するために、本発明者らは、ＡＮＲＵ腫瘍細胞を、２４時間、自己ＴＩＬと、ＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体の存在および不存在下で共培養した。適当なＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体は、市販であり、抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−Ｌ１）抗体（クローン２９Ｅ．２Ａ３；カタログ番号３２９７０９；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−Ｌ１）抗体（クローンＭＩＨ３；カタログ番号３７４５０２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）中和抗体（カタログ番号７１２１３；ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１／ＣＤ２７４ブロッキング抗体（クローンＲ６３９；カタログ番号１００８４−Ｒ６３９；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１抗体（カタログ番号ＡＦ１５６；Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む。腫瘍細胞を、１２、２４、４８および７２時間前処理して、フローサイトメトリーによる経時的な任意のＰＤ−Ｌ１誘導または抑制についてチェックし、共培養物におけるＴＩＬによる認識のため腫瘍のＪＱ１が誘導する感作の時間動態を定義した。本発明者らは、ＡＮＲＵ腫瘍細胞が、全ての条件下でＰＤ−Ｌ１陰性であるなら、自己ＴＩＬによる認識が、任意の時間ポイントにおいてＰＤ−Ｌ１ブロックにより影響されるべきでないと考えた。実際に、ＰＤ−Ｌ１ブロックの効果を、事前処理のいずれかの後に、ＡＮＲＵ腫瘍−ＴＩＬ共培養物において観察しなかった（図２）。加えて、任意の時間の持続時間のＩＦＮγ事前処理は、ＴＩＬによる腫瘍認識の発生を導かなかった。ＴＩＬによる改善した認識を、ＪＱ１とインキュベーションした腫瘍の場合にのみ観察し、一方、効果は、ＪＱ１単独を用いた７２時間の事前処理後に明らかに最も突出した。
【０１３１】
実施例４：ＪＱ１は、抗原提示機構のＩＦＮγによる誘導した活性化を強化する
図１におけるデータは、ＪＱ１が、ＡＮＲＵおよびＲＯＡＬおよびＡ３７５細胞上でＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導を増強することを示す。さらに、ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体の存在は、常に、前処理した腫瘍との共培養物においてＴ細胞認識を完全に抑止した。これにより、本発明者らは、ＪＱ１が、これらの細胞株における抗原提示のレベルでその効果を誘導すると仮定した。それ故、本発明者らは、ＪＱ１単独および／またはＩＦＮγを用いた事前処理後の抗原提示機構（ＡＰＭ）の周知の成分のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を研究した。本発明者らは、ＪＱ１が、これらの成分のほとんどについて、ＩＦＮγによるそれらの誘導（図３ａ）、ＨＬＡクラスＩ、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２について観察されている大抵の公表された効果を強化することを見出した。
【０１３２】
これらの効果の時間動態を研究するために、ＡＮＲＵ細胞株を、同じ方法で、１２、２４、４８および７２時間処理した。再度、ＪＱ１は、全ての時間ポイントにおいてＩＦＮγによるＡＰＭ成分の誘導を強化した（図３ｂ）。ＪＱ１の存在下でＩＦＮγによるＡＰＭ成分の増強した誘導はまた、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＨＬＡクラスＩ重鎖、ＬＭＰ２およびＬＭＰ１０についてウエスタンブロットにより説明した通り、タンパク質レベルで観察することができた（図３ｃ）。これは、ＨＬＡクラスＩ重鎖について最も明白であり、概して、Ａ３７５細胞において明らかに見られた。
【０１３３】
実施例５：ＪＱ１は、自己ＴＩＬによる腫瘍関連および変異抗原の認識を増強する
故に、本発明者らは、ＪＱ１処置後の自己ＴＩＬによる増強した腫瘍認識が、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的変異抗原に指示されるかどうかの疑問を強調した。それ故、本発明者らは、ＡＮＲＵ細胞を、腫瘍関連抗原ＭＡＲＴ−１、またはＥＴＶ６．９およびＮＵＰ２１０と命名した２種の異なる腫瘍特異的変異抗原のいずれかに対するそれらの特異性についてソーティングしたＴＩＬと共培養した。本発明者らは、ＪＱ１が、ＩＦＮγ単独と比較して、非常に類似またはずっと高い程度、全３種のＴＩＬ集団による認識を改善したことを見出した（図４）。これは、ＢＥＴ阻害が、様々なタイプの腫瘍抗原の認識を実際に改善することができることを示唆する。
【０１３４】
実施例６：ＪＱ１は、ＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩによる誘導を用量に依存して増強する
ヒトメラノーマ細胞上でＨＬＡクラスＩ誘導を強化するＪＱ１の能力をさらに確認するために、本発明者らは、標準濃度のＩＦＮγと組み合わせた増大するＪＱ１濃度の効果を試験した。Ａ３７５とＲＯＡＬ細胞上両方で、本発明者らは、ＪＱ１の存在下で、ＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導の明らかな用量に依存した増強を検出した（図５、上の列）。同様の観察を、ＡＮＲＵ細胞についてなした（データは示していない）。
【０１３５】
実施例７：Ｉ−ＢＥＴ１５１およびＩ−ＢＥＴ７６２の存在下でのＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導の用量依存性増強
他のＢＥＴｉが、ＪＱ１と類似の、ＨＬＡクラスＩ上の効果を仲介することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、Ａ３７５およびＲＯＡＬ細胞を、Ｉ−ＢＥＴ１５１およびＩ−ＢＥＴ７６２単独またはＩＦＮγと組み合わせで処理した。本発明者らは、ＩＦＮγによるＨＬＡクラスＩ誘導が、これらのＢＥＴｉと組み合わせて使用したとき、明らかに増大したことを見出した（図５、第２および第３の列）。これは、特に、ＩＦＮγとの組み合わせで、ＨＬＡクラスＩ発現をブーストする能力が、ＢＥＴｉの普遍的な特性であることを示唆する。
【０１３６】
実施例８：小分子ＢＥＴ阻害剤またはＢＥＴ阻害の任意の他の手段を用いた自己腫瘍細胞の処理の基本的なプロトコール
・それぞれの患者について、自己腫瘍細胞株を、本明細書において記載した通り、確立した。
・腫瘍細胞を、少なくとも１日、ＢＥＴ阻害剤（ＢＥＴｉ）を用いて処理した。ＢＥＴｉ処理中または処理後、腫瘍細胞をまた、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）および／または多種多様な他の免疫賦活性化合物（例えば、タイプＩインターフェロン）に曝露してもよい。
・腫瘍細胞免疫原性に対するＢＥＴｉの効果を、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ、ＰＤ−Ｌ１ならびにインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼを含む、多種多様な免疫学的マーカーにおける発現の変化、および共培養物における自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を活性化するそれらの能力を決定することにより、評価した。
【０１３７】
実施例９：単独または互いの組み合わせのいずれかで適用した、ＢＥＴｉで処理した腫瘍の可能性のある使用：
１．照射するか、または任意の他の方法の対象にして、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍原性を防いだ自己ＢＥＴｉで処理した腫瘍細胞を患者に投与することによる、個別化した治療癌ワクチンとしての使用。
２．例えば、プロトコール２（以下を参照）（Ｄｉｊｋｓｔｒａら、２０１８年）に従い、養子細胞療法のため使用することができる腫瘍抗原特異的ＴＩＬ（例えば、自己腫瘍抗原特異的ＴＩＬ）または自己ＰＢＭＣのｅｘ  ｖｉｖｏ活性化および拡大を促進するため。
３．例えば、プロトコール２（以下を参照）に従い、養子細胞療法における使用のためｅｘ  ｖｉｖｏでの（専門の）抗原提示細胞（ＡＰＣ）による腫瘍特異的抗原の提示を促進するため。
４．例えば、プロトコールＸ（以下を参照）に従い、腫瘍特異的抗原を同定するため。
５．バイオインフォマティックツールにより推定したエピトープの提示および免疫原性を検証するため。
【０１３８】
実施例１０：個別化した治療ワクチンとしての使用
・患者への投与に関する重要なパラメーター：
○注射した腫瘍細胞の数は１０〜１×１０１３の範囲にあってもよい
○腫瘍細胞を、皮内（ｉ．ｄ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）および腫瘍内（ｉ．ｔ）注射することができる
○注射を１回行い得るか、または任意の種類の頻度（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年）で任意の回数繰り返すことができる
・ｅｘ  ｖｉｖｏで処理した自己腫瘍細胞を受け取っている全ての患者を、予め処置するか、または同時もしくは続いて、任意の方法（例えば、照射、化学療法、標的化化合物および免疫調節物質、またはその組み合わせにより）で処置してもよく、ＢＥＴｉで処理した腫瘍細胞を用いた処理の最善の結果を生じると予測することができる。
【０１３９】
実施例１１：腫瘍抗原特異的ＴＩＬのｅｘ  ｖｉｖｏ活性化および拡大を促進するためのＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞の使用
・それぞれの患者について、自己腫瘍細胞株を、本明細書において記載した通り、確立した。
・腫瘍細胞を、７２時間以上、いずれかのＢＥＴｉをもちいて処理した。ＢＥＴｉ処理中または処理後、腫瘍細胞をまた、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）および／または多種多様な他の免疫賦活性化合物（例えば、タイプＩインターフェロン）に曝露してもよい。
・続いてまたは同時のいずれかで、腫瘍細胞を、本明細書において記載される通り生成した、自己ＰＢＭＣ由来の自己腫瘍浸潤性リンパ球またはＴ細胞と共培養する。
・共培養中、インターロイキン−２およびアゴニスト抗ヒトＣＤ３ε抗体ＯＫＴ３のような、さらなる免疫賦活性化合物を加えてもよい。
・低濃度のＢＥＴｉはまた、これが、養子免疫療法モデルにおいてＴ細胞持続および機能を増強することが示されているので、ＴＩＬ拡大または自己ＰＢＭＣからのＴ細胞の拡大中に、存在してもよい２４。
【０１４０】
実施例１２：専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示を増強するＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞の使用
・自己初代樹状細胞、単球由来の樹状細胞、または人工ＡＰＣを、全体または断片化ＢＥＴｉで処置した自己腫瘍にｅｘ  ｖｉｖｏで曝露することができる。
【０１４１】
実施例１３：免疫原性腫瘍特異的抗原を同定するためのＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞の使用。
・自己ＴＩＬおよび／または抹消Ｔ細胞とのＢＥＴｉで処置した腫瘍の共培養
・この共培養物において最も強く活性化したＴ細胞クローンを決定し、ソーティングする。
・同定したＴ細胞クローンの抗原特異性を評価する。
・ＢＥＴｉを含む、免疫賦活性化合物を用いた処置の後または同時に患者に投与することができる個別化したペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡベースのワクチンを設計するための情報を使用する。
【０１４２】
ＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞をまた使用して、ＤＮＡ配列決定データ（例えば、全エクソームｓｅｑｕｅｎｃｉｎｆデータ）を使用したバイオインフォマティクスツールにより予測した腫瘍特異的抗原エピトープの提示および免疫原性を検証してもよい。
【０１４３】
実施例１４：プロトコール
プロトコール１Ａ：腫瘍細胞株の生成
早期継代メラノーマ細胞株を、公開されたプロトコールに従い生成する２５。簡単に言うと、細胞株を、次の工程により確立する。
１）初代腫瘍および／または遠隔転移から、腫瘍組織標本を、外科的切除、穿刺吸引または他の手段により得て、輸送のため１５％ウシ胎児血清を添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、Ｒ１５として言及する）において維持する。
２）輸送中に組織から培地に放出された細胞を収集し、Ｒ１５における培養物に別々に入れる。
３）腫瘍組織標本を重力測定し、Ｒ１５においてメスを用いて細分化する。
４）細分化中に放出された細胞を、Ｒ１５における培養物に別々に入れる。
５）残る組織ぶつ切りを、ＲＰＭＩ＋５％ＦＢＳ中の３１２５単位／１ｇのコラゲナーゼタイプ１を用いて、スピナーフラスコにおいて、３７℃および５％ＣＯ２にて、組織タイプに依存して、１〜４時間切断する。線維化腫瘍組織のため、６２５０単位／１ｇのコラゲナーゼタイプ１を使用することができる。
６）切断後、細胞を２回洗浄し、Ｒ１５を含む組織培養フラスコにおいて凍結保存するか、または直接培養する。
７）差次的結合、栄養飢餓および差次的トリプシン処理方法を使用して、線維芽細胞の混入物を除去する。
８）単離した腫瘍細胞を、組織培養フラスコにおいてＲ１５中で成長させ、コンフルエントな単層を確立するまで、必要に応じて、培地を１週間に２回以上、培地を交換する。コンフルエンスの時に、接着細胞を、室温のカルシウムおよびマグネシウムフリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して遊離させ、Ｒ１５培地に再懸濁する。
９）培養した腫瘍細胞を慣習的にトリプシン処理し、回収し、寒冷バイアルにおいて冷凍結保存培地中１０〜２０  １０６細胞／ｍｌで懸濁する。
【０１４４】
プロトコール１Ｂ：小分子ＢＥＴ阻害剤（ＢＥＴｉ）またはＢＥＴ阻害の任意の他の手段を用いた自己腫瘍細胞の処理の基本的なプロトコールの例
１）それぞれの患者について、自己腫瘍細胞株を、プロトコール１Ａに従い確立する。
２）腫瘍細胞を、少なくとも１日間、ＢＥＴタンパク質、例えば、０．１〜１０μＭの濃度のＪＱ１を阻害する任意の手段により処理する。
３）ＢＥＴｉ処理前、中または後、腫瘍細胞をまた：
・インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）
・任意の他の免疫賦活性化合物（例えば、タイプＩインターフェロン）
・癌選択性を有する任意の標的化化合物（例えば、ＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤）
に曝露してもよい。
４）腫瘍細胞の免疫原性に対するＢＥＴｉの効果を、以下により評価する。
・ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ、ＰＤ−Ｌ１およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼを含む、多種多様な免疫学的マーカーにおける発現の変化を決定すること。
・共培養物における自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を活性化するそれらの能力。
【０１４５】
任意選択の修飾
・工程４において使用した腫瘍（細胞）を、ＢＥＴタンパク質、例えば、０．１〜１００μＭの濃度のＪＱ１を阻害する任意の手段により処理してもよい。処理をまた、１〜１００００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＦＮγ、または任意の他の免疫賦活性化合物（例えば、タイプＩインターフェロン）、またはＢＥＴｉで処理した細胞を用いた患者の処理を改善すると予想することができる標的化化合物と組み合わせて行ってもよい。
・腫瘍細胞の処理は、ｉＤＣとの共培養前に１〜３０日以上の持続時間行ってもよい。あるいは、ＢＥＴブロモドメイン阻害とＩＦＮγの両方が、ＤＣの免疫原性を促進すると記載されているので、腫瘍細胞の処理は、ｉＤＣとの共培養中に行ってもよい。
・腫瘍細胞はまた、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０および／もしくはガンマＣファミリーの免疫刺激サイトカイン、ＣＤ８３および樹状細胞もしくはＴ細胞動員ケモカイン、または抗原提示細胞としてのＢＥＴで処理した腫瘍の機能を増強し得る任意の他の分子をコードする遺伝子を用いた形質導入を経験してもよい。
【０１４６】
プロトコール２：腫瘍浸潤性リンパ球の培養および拡大
１）腫瘍生検（およそ０．５ｃｍ３の）を、初代腫瘍または遠隔転移から得る。
２）腫瘍組織を、１ｍｍ３の小片に細分化する。
３）腫瘍小片を、それぞれ：
・２％自己血漿（組織を得る日に生成する）
・６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン−２（ＩＬ−２）
を添加した１ｍＬ／ウェル  ＣｅｌｌＧｒｏを含有する２４ウェルプレートの１つのウェルに入れる。
４）培養の１日目：それぞれのウェルにおける培地体積の半分を、自己血漿およびＩＬ−２を添加した新鮮培地で置き換える。
５）培養の３〜４日目：リンパ球が通常出現し始める。
６）培養物を、通常通りモニターし、コンフルエンスに達する前に分ける。
７）およそ２週間後、拡大しているさいぼうを含むウェルを、プールし、カウントする。
８）巨大な細胞数を生じるために、ＴＩＬをおよそ１４日間：
・自己の照射したＰＢＭＣ（４０Ｇｙ、ＴＩＬ：フィーダー比１：５０〜１：８０）
・３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２
・３０ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）
の存在下で培養する。
９）必要に応じて、細胞を分けるか、または培地を交換する。
１０）培養を、縦型Ｔ７５フラスコにおいて開始するが、回収の１週間前にＶｕｅＬｉｆｅ細胞培養バッグに移すことができる。
１１）最後に、細胞を、回収し、プールし、特徴付け、カウントし、凍結する。
【０１４７】
プロトコール３：単球由来樹状細胞の生成
樹状細胞（ＤＣ）を、公開されたプロトコールに従い、生成する２６。簡単に言うと、プロトコールは、次の工程を含む。
１）単球を、水簸により白血球除去製品から単離する。
２）単球を、ＣｅｌｌＧｒｏ培地中、２百万個の細胞／１ｍＬにて、ＶｕｅＬｉｆｅ細胞培養バッグにおいて：
・１００ｎｇ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
・２０ｎｇ／ｍＬインターロイキン−４（ＩＬ−４）
の存在下で培養する。
３）培養の２日目：新鮮サイトカイン含有培地１体積を加える。
４）培養の５日目：
・未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を：
ｉ）例えば、ＢＥＴｉにｅｘ  ｖｉｖｏで曝露した腫瘍細胞からもたらされた自己腫瘍溶解物（百万個の細胞当たり１０〜３０μｇ）
ｉｉ）例えば、ＢＥＴｉにｅｘ  ｖｉｖｏで曝露した、自己腫瘍細胞（全体）
ｉｉｉ）任意の手段により溶解または断片化した、自己腫瘍細胞（例えば、ＢＥＴｉにｅｘ  ｖｉｖｏでまず曝露してもよい）
に曝露してもよい。
添加前に、腫瘍細胞を照射するか、または任意の他の方法で処理して、ＤＣとの共培養において成長することを防いでもよい。
・ｉＤＣの細胞数を、上の通り、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを添加した培地中２百万個の細胞／ｍＬに調節する。
・ｉＤＣの成熟を：
ｉ）２０ｎｇ／ｍＬ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α
ｉｉ）任意の（組み合わせの）他のｉＤＣを成熟させることができる免疫賦活性化合物、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体のリガンド、またはインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）
の添加により誘導する。
５）７日目、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）を回収し、カウントし、特徴決定し、１７．５百万個の細胞のアリコートにおいて凍結する。余分の工程をここで含めて、ｉＤＣ成熟のため使用した化合物を、任意の他の手段により洗い流すか、または除去してもよい。
６）ＤＣワクチン接種の日に、１アンプルの凍結ｍＤＣを、３７℃のウォーターバスにおいて迅速に融解し、カウントし、生存率を評価する。細胞を、ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）０．２ｍＬに再懸濁し、インスリンシリンジを使用して皮内投与する。
【０１４８】
工程４において使用した腫瘍（細胞）を、ＢＥＴタンパク質、例えば、０．１〜１０μＭの濃度のＪＱ１を阻害する任意の手段により処理してもよい。１〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＦＮγと組み合わせて、処理をまた行ってもよい。腫瘍細胞の処理は、ｉＤＣとの共培養前に１〜５日の持続時間行ってもよい。あるいは、ＢＥＴブロモドメイン阻害とＩＦＮγの両方が、ＤＣの免疫原性を促進すると記載されているので、腫瘍細胞の処理は、ｉＤＣとの共培養中に行ってもよい。
【０１４９】
プロトコール４：ＢＥＴｉで処理した腫瘍を有する患者の処置についての一般的なガイドライン
・ｅｘ  ｖｉｖｏで処理した自己腫瘍細胞を投与する全ての患者を、重篤な免疫抑制ではなく、ＢＥＴｉで処理した腫瘍細胞を用いた処理の最善の結果を生じると予想できる任意の方法（例えば、照射、化学療法、標的化化合物、エピジェネティック薬物および免疫調節物質、またはその組み合わせによる）で前処置してもよい。
・ｅｘ  ｖｉｖｏでＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞を投与する患者を、ＢＥＴｉで処理した腫瘍細胞を用いた処理の最善の結果を生じると予想できる任意の方法、特に、ＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞を用いた処理の効果をさらに増強すると予想することができる免疫調節剤で同時または続いて処置してもよい。
・これらのガイドラインは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞を用いた処置の臨床結果に実際に有益に影響し得ないさらなる処置を早期に経験した、同時に有するか、または将来的に経験する、ｅｘ  ｖｉｖｏでＢＥＴｉで処理した自己腫瘍細胞を用いて患者を処置する可能性を排除しない。
【０１５０】
図６において示す通り、ＪＱ１は、ＩＦＮγが誘導したＨＬＡクラスＩ発現ならびに複数の免疫チェックポイント分子の恒常的およびＩＦＮγが誘導した抑制を増強する。
【０１５１】
図７において示す通り、ＪＱ１は、抗原提示機構のＩＦＮγが誘導した活性化を強化し、ＩＦＮγシグナル伝達経路における鍵となるタンパク質の発現を増強する。
【０１５２】
図８において示す通り、ＪＱ１は、抗原提示機構のＩＦＮγが誘導した活性化を強化し、ＩＦＮγシグナル伝達経路における鍵となるタンパク質の発現を増強する。
【０１５３】
図９は、２４時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγとインキュベーションしたＡＮＲＵ細胞の溶解物における質量分析によるタンパク質発現変化の解析を示す。
【０１５４】
図１０は、２４時間、ＪＱ１および／またはＩＦＮγとインキュベーションしたＡＮＲＵ細胞の溶解物における質量分析によるタンパク質発現変化の解析を示す。
【０１５５】
図１１において示す通り、ウエスタンブロット解析により示す通り、ＭＹＣ発現を、ＪＱ１単独またはＩＦＮγとの組合せでの７２時間の処理によりダウンレギュレーションする。
【０１５６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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