(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含有するペプチド、ｐＨ調整剤および充填剤を含む医薬組成物であって、前記ペプチドは中枢神経系損傷を治療する活性ペプチドである、医薬組成物を提供する。また、本発明は、キメラペプチド、ｐＨ調整剤、および充填剤を含む医薬組成物であって、前記キメラペプチドは活性ペプチドおよび内在化ペプチドを含む医薬組成物も提供する。さらに、本発明は、活性ペプチドまたはキメラペプチドを含む医薬組成物の医学的使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド、ｐＨ調整剤、および充填剤を含む医薬組成物であって、前記ペプチドはアミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントの１つまたは複数の保存的置換によって生成された変異体であり、好ましくは、前記保存的置換は、ＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間での置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群より選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドであり、前記内在化ペプチドは、前記キメラペプチドの細胞による取り込みを促進できる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ｐＨ調整剤は、ヒスチジン緩衝液、アルギニン緩衝液、コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、グルコン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれ、好ましくはクエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、またはヒスチジン／アルギニン緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン／アルギニン緩衝液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
組成物のｐＨが約５．５〜８、好ましくは約６〜７．５、より好ましくは約６〜７、さらに好ましくはが約６．５〜７、最も好ましくは約６．５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒスチジン／アルギニン緩衝液中のヒスチジン／アルギニンの含有量は、重量で、約１％〜１０％、好ましくは約３％〜１０％である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記充填剤は、トレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、シクロデキストリン、デキストラン−４０、ソルビトール、スクロース、グリシン、およびそれらの任意の組み合わせ、好ましくはトレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれており、より好ましくはトレハロースである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：０．０５〜１：１０、好ましくは約１：０．５〜１：５、より好ましくは約１：０．８〜１：３、最も好ましくは約１：１である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
充填剤はトレハロースであり、ｐＨ調整剤はヒスチジン／アルギニン緩衝液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ペプチド対トレハロースの質量比は約１：１である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
組成物のｐＨは約６．５±０．５である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
抗凍結剤および／または界面活性剤をさらに含み、好ましくは、抗凍結剤はポリエチレングリコールであり、および／または界面活性剤はポリソルベートであり、好ましくはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
脱アミド化阻害剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、予備凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせることによって得られる再構成製剤の形態である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳類における神経系損傷と該損傷に起因した関連疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安、およびてんかんからなる群より選ばれる疾患を治療、改善または予防するために用いられ、あるいは神経保護剤として用いられる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、哺乳類における神経系損傷と該損傷に関連した疾患または疼痛、神経変性疾患、不安、およびてんかんからなる群より選ばれる疾患を治療、改善または予防する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物の、哺乳類における神経系損傷と該損傷に関連した疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安、およびてんかんからなる群より選ばれる疾患を治療、改善または予防するための医薬または神経保護剤の製造における使用。
【請求項２１】
前記疾患は、脳卒中、または脳卒中による神経系損傷である、請求項１８に記載の医薬組成物、請求項１９に記載の方法、または請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記脳卒中は虚血性卒中、出血性脳卒中、および虚血性卒中から変換された出血性卒中を含み、好ましくは、前記脳卒中は虚血性卒中である、請求項２１に記載の医薬組成物、方法または使用。
【請求項２３】
前記神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷である、請求項１８に記載の医薬組成物、請求項１９に記載の方法、または請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記損傷または疼痛は末梢神経系または中枢神経系に位置する、請求項１８に記載の医薬組成物、請求項１９に記載の方法、または請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中または脊髄損傷、脳や脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷を含む、請求項１８に記載の医薬組成物、請求項１９に記載の方法、または請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む、請求項１８に記載の医薬組成物、請求項１９に記載の方法、または請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療の分野に関し、特に、中枢神経系損傷を治療するための組成物および使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は、中老や高齢者の急性脳血管疾患であり、且つ若年層への進展する傾向がある。それは、現在、世界中にヒトに最も有害である３つの疾患（癌、心血管疾患、糖尿病）の一つである。中国では、毎年、約３００万人が脳血管疾患に起因して死亡し、米国やヨーロッパよりも４〜５倍高く、日本の３．５倍であり、タイやインドなどの発展途上国よりもさらに高くなっている。発病率が年間のあたり８．７％の速率で上昇し、再発率が３０％を超え、５年内に再発率が５４％に達し、脳卒中患者の生存者の７５％が様々な程度で作業能力を失い、重度の障害が４０％である。
【０００３】
脳卒中は、虚血性脳卒中および出血性脳卒中という２つの種類に大きく分けることができ、虚血性脳卒中は、脳卒中患者の総数の８５％を占める。現在、虚血性脳卒中の治療薬は、主に次の種類：血管拡張剤（例えば、ジピリダモールなど）、微小循環を改善し、血液容量を拡張する薬物（例えば、低分子デキストランなど）、血栓溶解薬（例えば、ウロキナーゼなど）、抗凝固療法、血小板凝集防止剤（例えば、アスピリンなど）、漢方薬、神経保護（神経細胞保護剤）などに分けられるが、これらの薬は、ほとんど副作用が大きく、潜在的なリスクがあり、または治療効果が著しくない問題を持っているため、脳卒中の発病メカニズムを検討してその発病メカニズムに対して医薬品開発を行い、脳血管疾患の発生や進展を予防および治療するために重要な社会的意義を持っている。
【０００４】
脳卒中は、局所虚血領域、脳出血領域および／または創傷領域における神経細胞死であることを特徴とする。脳虚血により引き起こされる神経細胞死または損傷は、カスケード反応のプロセスであり、脳虚血後、組織の血液灌流が減少し、興奮性神経伝達物質が増加し、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体を活性化させ、イオンチャネルの開放、カルシウムイオンの流入を引き起こし、多くの酵素を活性化させてシグナルカスケード反応をもたらし、複数の経路における神経細胞損傷を誘発する。その下流のシナプス後密度９５タンパク質（ＰＳＤ−９５）は、様々なタンパク質との相互作用を介して一連の虚血性損傷を引き起こし、脳虚血損傷の鍵サイトであり、同時に薬物療のための潜在的な標的であるため、ＰＳＤ−９５阻害剤の研究開発は、脳卒中を含む多種の興奮性神経毒性による神経系損傷に対して非常に大きい薬用意義を持っている。
【０００５】
また、研究によれば、興奮性神経伝達物質ＮＭＤＡは、不安、てんかん、および様々な神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病またはハンチントン病などにおいて重要な役割を果たしていることが示されている。例えば、研究によれば、中枢におけるグルタミン酸作動系の過剰興奮は不安をもたらすことができ、且つＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）は、グルタミン酸興奮性神経毒性の主要な部分を担っていることが示されている。てんかんの発作は、起動、発作性放電の維持および拡大、並びに発作性放電の抑制という３つの異なる連続病態生理学的プロセスを含み、該プロセスにおいてグルタミン酸、アスパラギン酸などの興奮性神経伝達物質は重要な役割を果たしている。アルツハイマー病では、ＰＳＤ−９５はＧｌｕＲ６−ＰＳＤ−９５−ＭＬＫ３経路により、それにつながる神経毒性のメカニズムに関与している。さらに、ハンチントン病では、ＰＳＤ−９５はＮＭＤＡ受容体、およびハンチンチンの突然変異体の神経毒性のメディエーターである。したがって、ＰＳＤ−９５阻害剤の研究開発は、上記の疾患の治療、改善および予防のためにも重要な意味を持っている。
【０００６】
ペプチド薬物は、薬物の保存条件によって制限され、環境ストレスに抵抗する能力が限られている。ペプチド薬物は、薬物の保存条件によって制限され、環境ストレスに抵抗する能力が限られている。ペプチドは、高温および長期保存期間中にｐＨ(ｐＨ値)の変化を起こす可能性があり、一定の程度の分解を発生して、純度の低下、外観の劇的な変化、および保存期間の短縮をもたらし、それにより薬物の有効性に影響を与える可能性がある。さらに、ペプチド薬物の輸送に高い要求があり、ペプチド薬物の大規模な商業的使用が制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ペプチド薬物の技術的改善が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、ペプチド、ｐＨ調整剤、および充填剤を含む医薬組成物であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントの１つまたは複数の保存的置換によって生成された変異体であり、好ましくは、前記保存的置換は、ＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間での置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群より選ばれる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメント（セグメント）がＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドであり、前記内在化ペプチドは、前記キメラペプチドの細胞による取り込みを促進できる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、内因性ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ｐＨ調整剤は、ヒスチジン緩衝液、アルギニン緩衝液、コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、グルコン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれ、好ましくはクエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、またはヒスチジン／アルギニン緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン／アルギニン緩衝液である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、組成物のｐＨが約５．５〜８、好ましくは約６〜７．５、より好ましくは約６〜７、さらに好ましくはが約６．５〜７、最も好ましくは約６．５である。
いくつかの実施形態において、ヒスチジン／アルギニン緩衝液中のヒスチジン／アルギニンの含有量は、重量で、約１％〜１０％、好ましくは約３％〜１０％である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記充填剤は、トレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、シクロデキストリン、デキストラン−４０、ソルビトール、スクロース、グリシン、およびそれらの任意の組み合わせ、好ましくはトレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれており、より好ましくはトレハロースである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：０．０５〜１：１０、好ましくは約１：０．５〜１：５、より好ましくは約１：０．８〜１：３、最も好ましくは約１：１である。
いくつかの実施形態において、充填剤はトレハロースであり、ｐＨ調整剤はヒスチジン／アルギニン緩衝液である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：１である。
いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは約６．５±０．５である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、組成物は、抗凍結剤および／または界面活性剤をさらに含み、好ましくは、抗凍結剤はポリエチレングリコールであり、および／または界面活性剤はポリソルベートであり、好ましくはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、組成物は、脱アミド化阻害剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、予備凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせることによって得られる再構成製剤の形態である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、哺乳類における神経系損傷と該損傷に起因した疾患若しくは疼痛、神経変性疾患、不安、およびてんかんからなる群より選ばれる疾患を治療、改善または予防するために用いられ、あるいは神経保護剤として用いられる。
【００２１】
第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象（個体）に投与することを含む、哺乳類における神経系損傷および損傷に関連した疾患若しくは疼痛、神経変性疾患、不安、またはてんかんの治療、改善または予防方法を提供する。
【００２２】
第３の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の医薬組成物の、哺乳類における神経系損傷と該損傷に関連した疾患若しくは疼痛、神経変性疾患、不安、およびてんかんからなる群より選ばれる疾患を治療、改善または予防するための医薬または神経保護剤の製造における使用を提供する。
【００２３】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、疾患は、脳卒中、または脳卒中に起因する神経系損傷である。
【００２４】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、脳卒中は、虚血性卒中、出血性卒中、および虚血性卒中から変換された出血性卒中を含み、好ましくは、前記脳卒中は虚血性卒中である。
【００２５】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷である。
【００２６】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、損傷または疼痛は、末梢神経系または中枢神経系に位置する。
【００２７】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中または脊髄損傷、脳や脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞（ニューロン）損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷を含む。
【００２８】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】プルダウン実験でＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を検出することを示している図である。Ｍはタンパク質分子量マーカーを表し、レーン１はＨｉｓ＋ＰＤＺ１／２＋Ｐ５であり、レーン２は単独のＰ５であり、レーン３はＨｉｓ＋Ｐ５であり、レーン４はＨｉｓ＋ＰＤＺ１／２である。レーン１に示す溶出バンドには、Ｐ５およびＰＤＺ１／２の両方を含み、Ｐ５がＰＤＺ１／２ドメインと結合できることが裏付けられる。
【図２】ポリペプチドＰ５がラットＭＣＡＯモデルの脳切片に対するＴＴＣ染色を示す図である。ａ．通常群、ｂ．偽操作群（シャム群）、ｃ．モデル群、ｄ．陽性対照薬ブチルフタリド（ＮＢＰ）注射群、ｅ．ＮＡ−１、１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｆ．ＹＥ−ＮＡ−１、１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｇ．Ｐ５−１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｈ．Ｐ５−３ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．Ｐ５−１ｍｇ／ｋｇ体重、ｊ．予防投与群Ｐ５−１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｋ．予防投与群Ｐ５−３ｍｇ／ｋｇ体重、ｌ．予防投与群Ｐ５−１ｍｇ／ｋｇ体重。
【図３】ポリペプチドＰ５の異なる用量群がラットＭＣＡＯモデルの治療および予防投与で、脳梗塞体積の統計的データを示す図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】ラット脳におけるポリペプチドＰ５の分布を示す図である。
【図５】ラットの脳のＴＴＣ染色を示す図である。
【図６】ラット脳のパラフィン切片のＨＥ染色の結果を示す図である。Ａ：通常群、Ｂ：偽操作群、Ｃ：モデル群、Ｄ：陽性対照投与群、Ｅ：ＮＡ−１、Ｆ：ＹＥ−ＮＡ−１群、Ｇ：Ｐ５群、Ｈ：Ｐ５予防投与群。
【図７】０日目のＰ５凍結乾燥製剤（Ｎｏ．０、Ｎｏ．１、およびＮｏ．２）の成形と安定性に対するさまざまな充填剤の影響を示す図である。
【図８】０日目のＰ５凍結乾燥製剤（Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、およびＮｏ．５）の成形と安定性に対するさまざまな充填剤の影響を示す図である。
【図９】１週目のＰ５凍結乾燥製剤（Ｎｏ．０、Ｎｏ．１、およびＮｏ．２）の成形と安定性に対するさまざまな充填剤の影響を示す図である。
【図１０】１週目のＰ５凍結乾燥製剤（Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、およびＮｏ．５）の成形と安定性に対するさまざまな充填剤の影響を示す図である。
【図１１】ヒスチジン／アルギニンを使用して組成物のｐＨを調整した１週目の結果（すなわち、ｐＨ範囲スクリーニング実験ＩＩ）を示す図である。
【図１２】ヒスチジン／アルギニンを使用して組成物のｐＨを調整した２週目の結果（すなわち、ｐＨ範囲スクリーニング実験ＩＩ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本出願の発明者らは、中枢神経系損傷の治療用ペプチドを開発し、該ペプチドをより実用化するために、広範な研究に基づいて、ペプチド、充填剤、およびｐＨ緩衝液を含む組成物を鋭意研究して開発し、このような組成物は、以下の利点の少なくとも１つを持っている。
【００３１】
１．医薬に好ましい外観を有する、白色の緩い凍結乾燥塊（凍結乾燥塊状物）を提供し、充填剤が（白色の緩い凍結乾燥塊の）崩壊温度を改善し、凍結乾燥保護を与え、タンパク質の長期保存安定性の向上に有益な効果をもたらす。
【００３２】
２．アモルファスガラス状のマトリックスを提供し、水素結合を介してタンパク質に結合することにより、乾燥中に除去される水分子を置き換えてペプチドの安定性を向上させる。これにより、ペプチドのコンフォメーションを維持するように寄与し、凍結乾燥サイクル中のペプチドの分解を最小限に抑え、最終製品の長期安定性を向上させる。
【００３３】
３．環境ストレスに耐性があり、比較的長い貯蔵期間にわたって分解しないようにすることができ、その外観、純度、不純物の含有量は、臨床使用の要件を満たすことができる。
【００３４】
定義
特に断らない限り、本明細書に記載された用語は、一般的に、当業者によって理解される意味を有する。
【００３５】
本明細書に記載のアミノ酸に対して単一文字または３文字の略語は、国際慣習に従っているものである。
【００３６】
用語「キメラペプチド」は、自然に互いに結合していないペプチド成分を有するペプチドを意味する。前記２つのペプチド成分は、融合タンパク質として、または化学結合によって互いに結合されてもよい。
【００３７】
用語「ＰＤＺドメイン」は、約９０アミノ酸のモジュラータンパク質ドメインを意味し、脳シナプスタンパク質ＰＳＤ−９５、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）分離コネキシンディスク・ラージＤｉｓｃｓ−Ｌａｒｇｅ（ＤＬＧ）、および上皮タイトジャンクションタンパク質Ｚ０１（Ｚ０１）とが高い配列同一性（例えば、少なくとも６０％）を有することを特徴とする。ＰＤＺドメインは、ディスク・ラージホモログリピート（「ＤＨＲｓ」）およびＧＬＧＦリピートとしても呼ばれている。ＰＤＺドメインは、通常、コアコンセンサス配列（Ｄｏｙｌｅ，  Ｄ．  Ａ．，  １９９６，Ｃｅｌｌ  ８５：１０６７−７６）を保持することを示す。例示的なＰＤＺドメイン含有タンパク質およびＰＤＺドメイン配列は、米国特許出願Ｎｏ．１０／７１４，５３７に開示された。
【００３８】
用語「ＮＭＤＡ受容体」または「ＮＭＤＡＲ」は、ＮＭＤＡと相互作用することが知られている膜関連タンパク質を指す。これらの受容体は、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびサルなど）であってもよい。
【００３９】
用語「特異的結合」とは、２つの分子（例えば、リガンドと受容体）間の結合を指し、多くの他の異なる分子の存在下であっても、１種の分子（例えば、リガンド）と他の１種の特定の分子（例えば、受容体）に結合する能力、すなわち、異種分子の混合物中に、１種の分子と別の１種の分子に優先的に結合する能力を特徴とする。リガリガンドと受容体との特定的結合も、次のように、過剰量の非標識リガンドが存在する場合、検出可能に標識されたリガンドと受容体との結合が低下した（すなわち、結合競合実験）ことが実証された。
【００４０】
用語「統計的に有意」とは、ｐ値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）で、好ましくは０．０１未満（ｐ＜０．０１）で、最も好ましくは０．００１未満（ｐ＜０．００１）であることを意味する。
【００４１】
用語「機能的変異体」は、母体（親）と同一または類似の生物学的機能および特性を有する変異体を指す。非限定的な例として、「機能的変異体」は、母体における１つまたは複数の所で保存的置換を行うことによって得られてもよい。
【００４２】
用語「内因性ペプチド」は、細胞透過性ペプチドとも呼ばれ、タンパク質薬物の分野で広く用いられ、その機能は、それに結合した活性ペプチドが細胞に取り込まれ、および吸収されることを促進することである。非限定的な例として、内因性ペプチドは、Ｔａｔペプチドであってもよく、その中で、Ｔａｔペプチドの非限定的な例としては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）であってもよい。
【００４３】
第１の態様によれば、本発明は、ペプチド、ｐＨ調整剤、および充填剤を含む医薬組成物であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含む、医薬組成物を提供する。前記ペプチドは、本明細書に「活性ペプチド」とも呼ばれ、本発明のキメラペプチドにおいて、中枢神経系損傷の治療のために、または神経保護剤の活性部位として用いられる。
【００４４】
既存の研究では、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５との間の相互作用を阻害する活性ペプチドは、ＮＭＤＡＲの構造に基づくものである。例えば、ＮＭＤＡＲ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ４０９９６１２）は、Ｃ末端における２０個のアミノ酸のＦＮＧＳＳＮＧＨＶＹＥＫＬＳＳＬＥＳＤＶ、およびＰＬモチーフＥＳＤＶを有する。いくつかの活性ペプチドは、ＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端の一部アミノ配列を選択することにより、ＮＭＤＡＲ２ＢとがＰＳＤ−９５に対する競争阻害を生じる。ある研究では、上記ペプチドにおけるＥＳＤＶまたはＬＥＳＤＶセグメントは、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５タンパク質との相互作用を阻害することで重要な役割を果たしていることが考えられる。本出願の発明者は、任意の理論に縛られず、驚くべきことに、本明細書に記載の活性ペプチドＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）中に、上記のＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端のアミノ酸組成に対してＫＬ後のＳＳの２つの残基を含まない同時に、ＰＬモチーフに対してＮ末端方向におけるＹＥＫＬアミノ酸配列を増加したことを見出し、本発明ではこのような変更が活性ペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を高めることが裏つけられる。同時に、ＹＥＫＬモチーフに対して、そのＣ末端におけるＬＤＴＥＩセグメントは、変更することができ、活性ペプチドの活性に影響を及ぼさなく、またはその活性を高める可能性があることが予想されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に係る機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントに１つまたは複数の所で保存的置換によって生成された変異体である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、保存的な置換は、ＤとＥの間、ＬとＶとＩの間、およびＴとＳの間の置換からなる群から選ばれる。
【００４６】
いくつかの特定の実施形態において、機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明に記載の機能的変異体は、前記ペプチドと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。本領域で既に分かるように、２種の蛋白質の間の「同一性（アイデンティティ）」は、１種のタンパク質のアミノ酸配列と、その保守的アミノ酸で置換された第２種の蛋白質の配列との比較によって決定される。２種のタンパク質の間の同一性の程度は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムおよび方法によって決定される。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって決定される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の機能的変異体は、上記ペプチドに比べると、上記で開示された具体的なペプチドと異なっている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換、削除、追加、および／または挿入を有する。
【００４９】
前述のように、機能的変異体は、１つまたは多数の置換、削除、追加、および／または挿入により、上記で開示された特定のペプチドから区別することができる。これらの変異体は、天然に存在しまたは合成的に生成したものでもよい。例えば、本明細書に記載の上記ペプチド配列の１つ以上を修飾し、本明細書に記載の当該分野によく知られている様々な技術のいずれかでその生物活性を評価することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドであり、前記内在化ペプチドは、前記キメラペプチドの細胞による取り込みを促進できる。
【００５１】
活性ペプチドおよび内因性ペプチドをキメラペプチドに組み込む主な目的は、より良好に活性ペプチドを作用の標的に送達することにあると、当業者によって理解されるべきである。また、当業者は、活性ペプチドの作用ターゲットが主に神経細胞内にあるために、神経細胞に特異的に適合することができる内因性ペプチドが好ましいと、理解すべきである。いくつかの実施形態において、内因性ペプチドはＴａｔペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｔａｔペプチドのアミノ酸配列はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）である。いくつかの実施形態において、キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む。
【００５２】
内因性ペプチドは、アミド結合を介して活性ペプチドに連結されて融合ペプチドを形成することができると理解すべきであるが、また、化学結合などの他の適切な手段を介して連結されてもよい。２つのコンポーネントのカップリングは、カップリング剤や接合剤により実現できる。このような試薬の多くは市販されており、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載されている。架橋剤のいくつかの例としては、Ｊ−スクシンイミド−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＯＰ）またはＮ、Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ、Ｎ’−エチリデン−ビス−（ヨードアセトアミド）または、６〜１１個の炭素メチレン橋（ｃａｒｂｏｎ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅｓ）を有する他のこのような試薬（これはチオール基に対して比較的特異的である）、および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（それとアミノ基およびチロシン基とが不可逆的な結合を形成する）が挙げられる。その他の架橋剤は、Ｐ，Ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（これはアミノ基とフェノール基と不可逆的な架橋を形成する）、ジエチルアミンヘキサン酸ジメチル（これはアミノ基に特異的である）、フェノール−１，４−ジスルホニルクロライド（これは主にアミノ基と反応する）、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネートまたは  ジイソチオシアネート、またはフェニルアゾ−ｐ−ジイソシアネート（これは主にアミノ基と反応する）、グルタルアルデヒド（これはいくつかの異なる側鎖と反応する）およびビスジアゾ化ベンチジン（これは主にチロシンやヒスチジンと反応する）。
【００５３】
また、上記のようなペプチドは、必要に応じて誘導体化（例えば、アセチル化、リン酸化、および／またはグリコシル化）を行って、それらの阻害剤に対する親和性を促進し、阻害剤の細胞膜を横切る輸送能を促進し、またはその安定性を促進することができる。
【００５４】
本発明に係る活性ペプチド、およびそれを内因性ペプチドに融合した融合ペプチドは、固相合成法または組換え方法で合成される。ペプチドミメティクスは、科学文献および特許文献に記載の様々なプロトコルや方法により合成することができ、前記科学文献および特許文献は、例えば、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｇｉｌｍａｎら（編集）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ（１９９８）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９  ：２０５−２２３；  Ｈｒｕｂｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １  ：  １１４−１１９；  ０ｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９９７）Ｍｏｌ．  Ｄｉｖｅｒｓ．  ３：  １７−２７；  ０ｓｔｒｅｓｈ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６７：  ２２０−２３４」が挙げられる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ｐＨ調整剤は、ヒスチジン緩衝液、アルギニン緩衝液、コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、グルコン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれる。いくつかの実施形態において、ｐＨ調整剤は、クエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、またはヒスチジン／アルギニン緩衝液から選ばれる。いくつかの実施形態において、ｐＨ調整剤は、ヒスチジン／アルギニン緩衝液から選ばれる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは、約５．５〜８（例えば、約５．５、６、６．５、７、７．５、８）である。いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは約６〜７．５である。いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは約６〜７である。いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは約６．５〜７である。いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは約６．５である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ヒスチジン／アルギニン緩衝液中のヒスチジン／アルギニンの含有量は、重量で、約１％〜１０％（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％）である。いくつかの実施形態において、ヒスチジン／アルギニン緩衝液中のヒスチジン／アルギニンの含有量は、重量で、約３％〜１０％である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、前記充填剤は、トレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、シクロデキストリン、デキストラン−４０、ソルビトール、スクロース、グリシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれる。いくつかの実施形態において、充填剤は、トレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、充填剤はトレハロースである。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：０．０５〜１：１０である。いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：０．５〜１：５である。いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：０．８〜１：３である。いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：１である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、充填剤はトレハロースであり、ｐＨ調整剤はヒスチジン／アルギニン緩衝液である。
いくつかの実施形態において、ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：１である。
いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは約６．５±０．５である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、組成物は、抗凍結剤および／または界面活性剤をさらに含み、好ましくは、抗凍結剤はポリエチレングリコールであり、および／または界面活性剤はポリソルベートであり、好ましくはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
いくつかの実施形態において、組成物は、脱アミド化阻害剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、予備凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせることによって得られる再構成製剤の形態である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、組成物の投与方式は、非経口、静脈内、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内であってもよい。好ましくは静脈内投与である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌、および実質的に等張性である。注射については、活性ペプチドまたはキメラペプチドを含む組成物を水溶液に加えて調製してもよく、好ましくは、（注射部位に不快感を低減させるために）生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液に加えて調製する。当該溶液は、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化薬剤を含有してもよい。
【００６４】
前述製剤に加えて、活性ペプチドまたはキメラペプチドを含む組成物をデポー製剤として製剤化してもよい。そのような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば、化合物は、適当なポリマー材料、または疎水性材料（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして調製され）、またはイオン交換樹脂と共に製剤化することができ、または、例えば難溶性塩のような難溶性誘導体に製剤化することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている活性ペプチドまたはキメラペプチドが荷電の側鎖または末端を含むことができるため、それらは、遊離酸もしくは塩基として、または薬学的に許容される塩として前記製剤のいずれかに含めることができる。薬学的に許容される塩は、実質的に遊離塩基の生物学的活性を保持し、無機酸との反応しによって調製されたものである。医薬塩は、対応する遊離塩基のフォームよりも、水および他のプロトン性溶媒中に溶けやすい傾向がある。
【００６６】
活性ペプチドまたはキメラペプチドは、意図した目的を効果的に達成する（例えば、損傷的な脳卒中関連障害の損傷効果を低減させる）ための量で用いられる。治療有効量とは、本発明に係る活性ペプチドまたはキメラペプチドで治療していない患者（または動物モデル）対照グループにおける中枢神経系の損傷に対して、本発明に係る活性ペプチドまたはキメラペプチドで治療している患者（または動物モデル）における脳卒中によって引き起こされる損傷を有意に低減するのに十分な量を意味する。本明細書に記載の方法によって扱われていない比較可能な患者対照グループにおける平均出力（梗塞ボリュームまたは障害指数によって測定される）に比べると、個体（対象）として治療された患者がより良い出力を達成した場合、この量は治療有効であると見なされる。個体として治療された患者がランキンスケール（Ｒａｎｋｉｎ  ｓｃａｌｅ）において２以下の障害を示しており、またはランキンスケールにおいて７５以上を示している場合、この量も治療有効量であると考えられる。比較可能な、治療していないグループに比べると、治療された患者グループが障害スケールに有意な改善（すなわち、障害がより少ない）のスコア分布を示している場合、この用量も治療上有効であると考えられる（Ｌｅｅｓら、ＮＥｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６；  ３５４：  ５８８−６００を参照）。治療的に有効なレジメンは、治療的に有効な用量および上記所望な目的を達成するために必要な投与頻度の組み合わせを表す。通常、単回投与で十分なものとすることができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、好ましい投与量範囲は、脳卒中後６時間以内患者体重１ｋｇあたり活性ペプチドまたはキメラペプチド０．００１〜２０μｍｏｌを含み、必要に応じて患者体重１ｋｇあたり活性ペプチドまたはキメラペプチド０．０３〜３μｍｏｌとする。いくつかの方法において、６時間以内、患者体重１ｋｇあたり活性ペプチドまたはキメラペプチド０．１〜２０μｍｏｌを投与する。いくつかの方法において、６時間以内、患者体重１ｋｇあたり活性ペプチドまたはキメラペプチド０．１〜１０μｍｏｌを投与し、より好ましくは、６時間以内、患者体重１ｋｇあたり活性ペプチドまたはキメラペプチド約０．３μｍｏｌを投与する。また、他の場合、用量範囲は患者体重１ｋｇあたり活性ペプチドまたはキメラペプチド０．００５〜０．５μｍｏｌである。６．２で除することにより、異なる表面積：質量比を補償して体重１ｋｇあたりの用量をラットからヒトに変換することができる。グラムで計算し、ヒトに適用される活性ペプチドまたはキメラペプチドの適切な用量は、患者体重０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇを含み、またはより好ましくは患者体重０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜１ｍｇ／ｋｇを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、投与される活性ペプチドまたはキメラペプチドの量は、治療されている被験者の体重、痛みの重症度、投与方法、処方医師の調整に依存している。症状が検出可能か、または検出不能の時に、治療を繰り返すことができる。治療には、単独または他の薬と組み合わせてを提供することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の活性ペプチドまたはキメラペプチドの治療に有効な投与量は、有意な毒性を引き起こすことがなく、治療上の有益効果を与えることができる。キメラペプチドの毒性は、標準的な薬学的手順によって細胞培養または実験動物において測定し、例えば、ＬＤ５０（個体群群の５０％を殺す用量）やＬＤ１ＯＯ（個体群群の１００％％を殺す用量）を測定して決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数である。高い治療指数を示しているキメラペプチドまたはペプチドミメティクスが好ましい（例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５、Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、第１頁を参照）。
【００７０】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、神経系損傷または該損傷による病気や痛みを治療、改善または予防するために用いられ、あるいは神経保護剤として用いられる。いくつかの実施形態において、前記神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷であり、前記損傷は末梢神経系または中枢神経系に位置する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中または脊髄損傷、脳や脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および低酸素症、虚血、機械的損傷、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、虚血性脳卒中に起因する神経系損傷を治療、改善または予防するために用いられるものである。
【００７２】
脳卒中は、中枢神経系中の被害の血流によって引き起こされる障害である。可能な原因は、塞栓、出血、血栓を含む。いくつかの神経細胞（ニューロン細胞）は、被害の血流に起因してすぐに死亡する。これらの細胞は、その構成分子（グルタミン酸を含む）を放出し、そして前記構成分子はＮＭＤＡ受容体を活性化させ、前記ＮＭＤＡ受容体が細胞内カルシウムレベルおよび細胞内酵素レベルを高め、これにより、さらに多くの神経細胞死（興奮性神経毒性カスケード増幅）にさせる。中枢神経系組織の死亡を梗塞と言われる。梗塞体積（すなわち、脳中に脳卒中による死亡の神経細胞の体積）は、脳卒中による病理学的損傷の程度の指標として使用できる。症候性効果は、梗塞の体積と梗塞の脳における存在場所との両方に依存している。障害指数は、症候性損傷の尺度（指標）、例えば、ランキン卒中出力ランキンスケール（Ｒａｎｋｉｎ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｃａｌｅ，  Ｒａｎｋｉｎ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭｅｄＪ；  ２：  ２００−１５（１９５７））およびバーテルインデックス（Ｂａｒｔｈｅｌ  Ｉｎｄｅｘ）として用いることができる。ランキンスケールは、次のとおり患者の全身状態（全身症状）を直接に評価することに基づいている。
０：症状がまったくない。
１：症状があるが、重大な障害がなく、日常の仕事や活動を実行できる。
２：軽度の障害で、すべての以前の活動を実行することができないが、助けなしに自分の身辺の世話をすることができる。
３：いくつかの助けを必要となる中等度の障害であるが、助けなしに歩くことができる。
４：中等度から重度の障害であり、助けなしに歩くことができなく、助けがなければ自分の体の世話をすることができない。
５：重度の障害であり、寝たきり、失禁、且つ持続的なケアと注意を必要とする。
【００７３】
Ｂａｒｔｈｅｌインデックスは、患者の日常生活における１０種類の基本的な活動を実施する能力について一連の質問に基づき、前記質問から０と１００の間のスコアを得、低いスコアはより多くの障害を表す（Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：５６−６１（１９６５））。
【００７４】
あるいは、ウエブ（ＷＷＷ）上ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｔｏｒｓ／ＮＩＨ＿Ｓｔｒｏｋｅ＿Ｓｃａｌｅ＿Ｂｏｏｋｌｅｔ．ｐｄｆから入手可能であるＮＩＨ脳卒中スケールを用いて脳卒中の重症度／出力を測定することができる。該スケールは、患者の意識、運動、感覚、言語機能のレベルの評価を含む１１グループの機能を実行する患者の能力に基づいている。
【００７５】
虚血性脳卒中は、より明確に、脳への血流の閉塞による脳卒中の１種類であることを指定している。そのような閉塞の潜在的な病状は、最も一般的に、血管壁に沿って脂肪沈着が起こっていることである。この病症（状態）は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれている。これらの脂肪沈着は、２種類の閉塞を引き起こす可能性がある。脳血栓症は、血管の閉塞部で形成された血栓（血塊）を指す。「脳塞栓症」は、通常、様々な塞栓（例えば、心臓内の壁性血栓、動脈硬化性プラーク、脂肪、腫瘍細胞、線維軟骨または空気など）のような血流に伴って脳動脈に入って血管を閉塞し、側副循環で補償できない場合、該脳動脈での血液供給領域における脳組織が虚血性壊死を引き起こして局所神経障害となっていることを意味する。塞栓症の第２の要因は、動脈細動と呼ばれる不整脈である。これは、次の病症を引き起こし、その中、血塊が心に形成し、移動して脳に転送されることが可能である。虚血性脳卒中の他の潜在的な原因は、出血、血栓、動脈や静脈の切断、心停止、何らかの原因（出血を含む）によるショック、および脳血管または脳に導入する血管に対する外科的損傷あるいは心臓手術に行く医原性原因が挙げられる。虚血性脳卒中は、すべての脳卒中症例の約８３％を占めている。
【００７６】
いくつかの他の神経学的病症（障害）は、ＮＤＭＡＲにより媒介される興奮性神経毒性による神経細胞死を引き起こす可能性もある。上記病症（障害）は、神経変性疾患、不安、てんかん、低酸素症、脳卒中と関係のないＣＮＳへの損傷、例えば外傷性脳損傷および脊髄損傷などが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられ、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、予備凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせることによって得られる再構成製剤の形態である。
【００７８】
第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象（個体）に投与する神経系損傷および損傷に関連した疾患若しくは疼痛、神経変性疾患、不安、またはてんかんの治療、改善または予防方法を提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中または脊髄損傷、脳や脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、対象（個体）は、虚血性脳卒中に罹患している対象（個体）である。いくつかの実施形態において、本発明に係る第１の態様に記載の医薬組成物の投与によれば、脳虚血に起因した脳梗塞部分の体積を低減することができる。
【００８２】
第３の態様では、本発明は、第１の態様に記載の医薬組成物の、神経系損傷および損傷に関連した疾患若しくは疼痛、神経変性疾患、不安、またはてんかんの治療、改善または予防のための医薬または神経保護剤の製造における使用を提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中または脊髄損傷、脳や脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、前記医薬は、虚血性脳卒中に起因する神経系損傷を治療、改善または予防するために用いられるものである。
【００８６】
上記の詳細な説明は、本発明を当業者にさらに明確に理解させるだけを目指しているが、いずれの態様を限定するものではないことを理解すべきである。当業者は、前記実施形態に様様な修正および変更をすることができる。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、単に本発明のいくつかの実施形態を説明するために提供されたものであり、如何なる制限の目的または性質にならない。
【００８８】
実施例１
活性ペプチド分子のスクリーニング
既に報告された研究結果によれば、Ｔａｔ膜貫通ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を選択して他の異なる数のアミノ酸に連結してペプチドライブラリーを形成した。ペプチドライブラリーにおけるキメラペプチド分子を、それぞれ生体外で発現・精製されたＰＤＺ１／２ドメインに相互作用し、相互作用力の強さによりポリペプチドに対して予備スクリーニングをした。
【００８９】
固定相分子（リガンド）は、ＰＤＺ１／２タンパク質で、分子量：約２０ｋＤ、濃度：２ｍｇ／ｍＬである。移動相分子（分析物）は、スクリーニングされているポリペプチドで、分子量：約２ｋＤ、濃度：１０ｍｇ／ｍＬであった。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器を使用して、ＣＭ５チップが固定に用いられた。泳動緩衝液は、ＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。アミノカップリング法を用いて固定した。リガンドの濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。固定緩衝液は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であった。一定量の１４００ＲＵでフロー細胞（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）２に固定された。流速が１０μＬ／ｍＬであり、リガンド試料導入が１分間である。再生液がＰＨ２．０＋２．５の１０ｍＭのＧｌｙを用い、再生は流速３０μＬ／分間で行った。試料導入時間は３０ｓであった。
【００９０】
動力学的分析は以下の条件で行われ、すなわち、対照チャネル：フロー細胞１、泳動緩衝液：ＰＢＳ、運行モード：Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｉｚａｒｄモード、濃度勾配：６．２５ｎ、１２．５ｎ、２５ｎ、５０ｎ、１００ｎ、２００ｎ、４００ｎＭ、試料導入時間：１分間、解離時間：２分間、流速：３０μＬ／分間。
【００９１】
データは、フィッティングソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１により適合（フィッティング）させた。フィッティングモデルは、１：１の結合モデルである。解離定数ＫＤ値は作用力に反比例した。
【００９２】
スクリーニングにより、ＰＤＺ１／２ドメインと強い相互作用能力を持つキメラペプチドが得られ、Ｐ５と命名し、その配列は次の通りである。
【００９３】
Ｐ５：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）
報告された研究における類似のキメラペプチドと直接に比較するために、次のような配列を持つ対照キメラペプチドＮＡ−１が導入された。
【００９４】
ＮＡ−１：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号：４）
また、Ｐ５とＮＡ−１との構造的差異を比較することにより、キメラペプチドＮＡ−１の活性ペプチドのＮ末端に２つの残基ＹＥを追加したキメラペプチドＹＥ−ＮＡ−１はさらに導入され、その配列は、次の通りである。
【００９５】
ＹＥ−ＮＡ−１：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号：５）
キメラペプチドＮＡ−１、ＹＥ−ＮＡ−１とＰ５と同時に上記のＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を試験した結果、下記表１に示した。
【００９６】
【表１】
2020536065.tif 000002
【００９７】
表１に示すように、対照キメラペプチドＮＡ−１に比べると、キメラペプチドＹＥ−ＮＡ−１およびＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用力はより強く、且つＰ５の作用性質はより良い。したがって、本発明者らの推測によれば、活性ペプチドのＮ末端に付加的な２つのアミノ酸残基ＹＥは、ポリペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用に対して一定の強化効果をもたらした。また、Ｐ５は、ＹＥ−ＮＡ−１のカルボキシル末端に対して疎水性が比較的弱いセリン（ＳＳ）２つを低減した。発明者らの推測によれば、これによりポリペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用をさらに高める可能性がある。
【００９８】
以下の実験において、さらにキメラペプチドＰ５を試験し、且つ一部の実験においてＮＡ−１およびＹＥ−ＮＡ−１を対照とした。
【００９９】
実施例２
プルダウン実験でＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を検出する
Ｐ５がＰＤＺ１／２ドメインとを相互作用できることを裏付けるために、プルダウン実験をした。
【０１００】
カラムは、１００μＬのＨｉｓビーズおよび１ｍＬのＭＣＡＣ−０緩衝液を用いて５分間平衡させた。４℃で振とうした。得られた混合物を、４℃で５０００ｇで１分間遠心分離させ、上澄みを捨てた。混合物に、ＰＤＺ１／２タンパク質１ｍｇを加え、そして緩衝液を用いて１ｍＬになるまで追加した。４℃で、得られた混合物を１時間回転して結合させた。前記混合物を、４℃で５０００ｇで１分間遠心分離させ、上澄みを捨てた。得られた混合物を、１ｍＬのＭＣＡＣ‐０緩衝液を用いて、１回あたり５分間（４℃で、振とうで洗浄し）で３回洗浄した。混合物に、Ｐ５タンパク質１ｍｇを加え、そして緩衝液を用いて１ｍＬになるまで追加した。４℃で、得られた混合物を２時間回転して結合させた。前記混合物を、４℃で５０００ｇで１分間遠心分離させ、上澄みを捨てた。得られた混合物を、１ｍＬの溶解液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、１回あたり５分間（４℃で、振とうで洗浄し）で３回洗浄した。洗浄後、２０μＬのＭＣＡＣ−３００を加えた。遠心分離し、溶出液を取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行った。実験結果は図１に示した。
【０１０１】
図１に示すように、キメラペプチドＰ５の溶出バンドに、Ｐ５とＰＤＺ１／２ドメインとの両方を同時に含んでおり、これにより、キメラペプチドＰ５がＰＤＺ１／２ドメインに結合できることを裏付けた。
【０１０２】
実施例３
ラットＭＣＡＯモデルに対するキメラペプチドの治療効果
ＭＣＡＯ調製法および採点基準は、次の通りである。
【０１０３】
局所脳虚血再灌流モデルの作製は、ロンガ（ｌｏｎｇａ）によって提案された可逆中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）縫合法に従ってラットの脳解剖学的構造に基づいて改善し、局所脳虚血再灌流モデルの作製した。１０％抱水クロラールを用いて用量０．３ｍＬ／ｋｇで腹腔内投与して麻酔させた。麻酔後、頚部正中線で切開して総頚動脈（ＣＣＡ）、外頚動脈（ＥＣＡ）と翼口蓋動脈を露出させた。モノフィラメントナイロン釣り糸（０．２６ｍｍ）の糸端部（０．５ｃｍ）をパラフィンで被覆し、長さ２０ｍｍの位置をマークし、全てのラットに対して右側ＣＣＡ切口部から挿入され、翼口蓋動脈が誤挿入を防止するために一時的にクランプで締められた。咬合線の長さは、ＣＣＡ分岐部から約１８〜２０ｍｍとし、動物体重によって決め、右側にある中大脳動脈を閉塞し、次いで皮膚を縫合し、咬合線の末端部が皮膚に固定された。虚血が２時間に達した後、慎重に咬合線を抽出し、すなわち、再灌流を形成した。偽手術対照は、ナイロン釣り糸が挿入されていない操作以外、手術群と同様にした。体の温度は、虚血期間および再灌流後２時間、（３７±０．５）℃に維持した。モデルの成功マーカーとしては、ラットが手術麻酔から覚めた後、左側の肢体が麻痺しており、直立が不安定になっていることで、ラットの尾を持ち上げた時に片側に回すことは、モデル成功の判断基準である。
【０１０４】
神経学的機能欠陥徴候の採点は、動物が麻酔から目覚めた後２４時間でＬｏｎｇａおよびＢｅｄｅｒｓｏｎの５点法に参照して採点した。０点：神経損傷の症状がない、１点：対側の前足を完全に伸ばすことができない、２点：対側に回す、３点：対側に傾き倒れる、４点：自発的に歩くことができず、意識消失を起こす。点数が高いほど、動物の行動障害がより深刻であると表す。
【０１０５】
実験動物および材料
動物：成年ＳＤラット（Ｖｉｔｔａｌｉａ）、ＳＰＦグレード、体重２２０〜２５０ｇ、雄を用いた。
【０１０６】
機器および薬品：線切断用鋏１つ、眼科手術鋏２つ、湾曲ピンセット４つ、手術用縫合糸４＃と５＃、三角形縫合針６×１７、直径０．２６ｍｍの咬合線、持針器１つ。Ｅｎｂｉｐｕ塩化ナトリウム注射剤（石薬グループ恩必普薬業有限公司（Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ＮＢＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．））、抱水クロラール、フロセミド（２０ｍｇ／瓶）、硫酸ゲンタマイシン（８０ｍｇ／瓶）、綿棒、医用トレイなど。ポリペプチドは、金斯瑞生物科技公司（Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）により合成された。
【０１０７】
実験の群分け（グルーピング）
実験動物は、陰性対照群、偽手術群、モデル群、陽性薬Ｅｎｂｉｐｕ群、ＮＡ−１群、ＹＥ−ＮＡ−１群およびＰ５群に分けした。虚血１時間後、各群のラットに、尾静脈注射によりそれぞれ生理食塩水、陽性薬Ｅｎｂｉｐｕ、ＮＡ−１（１０ｍｇ／ｋｇ），ＹＥ−ＮＡ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ５（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ５（３ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ５（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。正常群と偽手術群には、何の薬を投与しなかった。
【０１０８】
梗塞体積の計算
評点評価後、ラットを断頭により犠牲死させ、脳組織を速やかに取って−２０℃の冷蔵庫に入れ、１０分間後、室温環境下に置いた。そして、前記脳をラット脳切片用金型に配置して嗅球、小脳および低脳幹部を切除した後、プロファイルに示すような厚さ（間隔）２ｍｍで５回カットして６つの脳連続冠状粗切片にカットした。その後、脳切片は速やかに２％のＴＴＣを含む溶液５ｍＬに入れ、恒温３７℃、遮光で３０分間インキュベートし、この期間５分間おきに脳切片を反転した。ＴＴＣ染色後、正常組織はローズレッドを呈し、梗塞組織は未染色で白色を呈した。各群の脳切片をきれいに配列し、撮影して保存し、画像解析システムのソフトウエアで処理して統計し、各脳切片の梗塞面積を計算して各脳切片の厚さ２ｍｍを乗じた。個々の動物は、それぞれのすべての脳切片の梗塞面積に厚さを掛けて加算すると、脳梗塞体積となる。体積は、脳浮腫の影響を排除するために、大脳半球を占める割合として表した。
【０１０９】
実験結果
実験結果を図２に示した。図２における脳梗塞体積のデータの統計的分析に基づき、図３に示すような脳梗塞体積データ統計のヒストグラムを作成し、同時に、脳梗塞体積の具体的な統計データを次の表２に示した。その結果によれば、最高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）であるＰ５の治療投与および予防投与のいずれも脳虚血のラットにおける脳梗塞体積を有意に約５０％（ｐ＜０．０１）減少した一方、陽性薬Ｅｎｂｉｐｕ注射群は約１６％（ｐ＜０．０１）のみ減少し、ＮＡ−１群は約１６％（ｐ＜０．０１）減少し、ＹＥ−ＮＡ−１群は約２６％（ｐ＜０．０１）減少したことがわかった。２番目に高い用量（３ｍｇ／ｋｇ）であるＰ５の治療投与および予防投与のいずれも、脳梗塞体積をよりよく減少した。さらに、データでは、梗塞体積を減少した数値がＰ５用量の増加に伴って減少していることを示し、治療効果が薬物の濃度に正相関することを示した。中でも、ポリペプチドＹＥ−ＮＡ−１の治療効果は、ＮＡ−１よりも有意によくなかった。発明者の推測によると、２つのアミノ酸ＹＥの追加では、ポリペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの間の相互作用を高めたところ、ＮＡ−１よりもよい治療効果を示す可能にさせる。
【０１１０】
【表２】
2020536065.tif 000003
【０１１１】
実施例４
ラット脳におけるＰ５の分布
正常対照ラットとラットＭＣＡＯモデルは、モデリングしてから１時間後に、それぞれ、蛍光標識されたポリペプチドＦＩＴＣ−Ｐ５（１０ｍｇ／ｋｇ）含有生理食塩水を尾静脈から注射した。投与後１２時間の時点でラットを犠牲死させ、迅速に脳を取り出し、小動物生体イメージングシステム装置に入れて蛍光検出した。蛍光検出が完了した後、脳組織をＴＴＣ染料溶液に入れて染色し、虚血領域と薬物分布との相関性を決定した。図４および図５に示すように、正常ラット脳は、ＴＴＣで完全に染色することができ、その中で蛍光標識されたポリペプチドの分布がなかったが、虚血ラット脳の虚血部位は、ＴＴＣで染色することができなかったと共に、蛍光標識されたポリペプチドは中動脈領域をコア虚血領域とする虚血部位に分布しており、このように、ポリペプチドＰ５は虚血部位に標的として分布して治療効果を発揮することができ、且つその分布量が虚血程度に正相関することを示唆している。
【０１１２】
実施例５
ＨＥ染色による組織学的変化の観察（評価）
各群のラットのいずれも虚血後２４時間の時点に断頭して脳を取り出し、視交叉の付近により冠状切片を厚さ約４ｍｍでカットし、切片を１０％ホルマリン溶液で固定して７０％から１００％までの濃度勾配のアルコールで脱水した。その後、切片は、キシレンで２回透明化させ、さらにパラフィンに包埋させ、パラフィンブロックを注意深くトリムした後、パラフィン切片機に固定し、厚さ４μｍの切片にカットし、パラフィン切片を完全に展開し、清浄な乾燥したガラススライドに付着し、４℃の冷蔵庫に保存し、通常のＨＥ染色を行い、染色結果を光学顕微鏡で観察した。
【０１１３】
実験結果は、図６のように示した。正常な脳組織の神経細胞は、核仁（核小体）が明晰で、核が円形で、核膜が完備している。虚血モデル群のラットの虚血側における脳組織は、重度の神経細胞壊死が現れ、細胞が膨張し、核凝縮し、細胞質が緩くて軽く染色し、且つ空胞化した。Ｐ５、１０ｍｇ／ｋｇ治療・予防投与群は、上記の病理学的変化を有意に改善し、その結果、陽性薬Ｅｎｂｉｐｕ注射液、ＮＡ−１およびＹＥ−ＮＡ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群よりも優れていた。
【０１１４】
実施例６
急性毒性試験
ラットに対する急性毒性試験結果は、用量２００ｍｇ／ｋｇ体重の場合、Ｐ５がラットに致死効果および有意な毒性副作用を持たないことが明らかにされた。
【０１１５】
実施例７
Ｐ５凍結乾燥製剤の調製法
以下、凍結乾燥製剤の調製法は、例として充填剤をトレハロースとし、ｐＨ調整剤をアルギニン溶液として説明し、その他の凍結乾燥製剤は同様の方法で調製される。
Ｐ５凍結乾燥製剤の調製は、以下の手順で行われる。
５％アルギニン溶液を配合して用意し、
トレハロースおよびＰ５ペプチドをそれぞれ秤量し、
８０％の注射用水を加え、完全に溶解させるまで撹拌し、
アルギニン溶液を加え、ｐＨを６．５±０．５に調整した。
水を全量まで加え、均一に撹拌し、
それぞれ０．４５μｍおよび０．２２μｍのフィルターでろ過し、
バイアルに濾液を入れて部分シールする。
【０１１６】
真空凍結乾燥を行い、そのうち、
予備凍結：−３０℃で３時間維持し、
昇華：−２０℃で３時間維持し、−１０℃で５時間維持し、５℃で１０時間維持し、
再乾燥：３０℃で５時間維持し、
真空シールし、
アルミプラスチック複合キャップを圧延で付けた。
【０１１７】
実施例８
Ｐ５凍結乾燥製剤の成形および安定性に対するさまざまな充填剤の影響
試験方法：
Ｐ５凍結乾燥製剤の成形と安定性に対する効果を評価するために、さまざまな充填剤を選択し、サンプルを６０℃の安定性試験チャンバーに２週間入れ、１週目と２週目の終わりにそれぞれサンプリングして検出した。トレハロース、シクロデキストリン、マンニトール、ラクトース、およびグルコースをそれぞれ充填剤として使用した場合、さまざまなサンプルの特性、溶液の澄清度と色、ｐＨ、不純物、およびＰ５含有量を観察し
【０１１８】
【表３】
2020536065.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2020536065.tif 000005
【０１２０】
検出方法：
外観：目視検査方法で検出され、検出対象物が白色の緩い凍結乾燥塊または粉末とする必要がある。
【０１２１】
溶液の澄清度と色：サンプルを取り、水１ｍＬを加えて溶解し、溶液が澄清で無色でなければなく、溶液が濁っている場合、Ｎｏ．１の標準濁度溶液（『中国薬局方（中国薬典）』第４部の通則０９０２の第一法）よりも濃いことはできない。発色している場合、黄色Ｎｏ．１標準溶液（『中国薬局方』第４部の通則０９０１の第一法）よりも深いことはできない。
【０１２２】
ｐＨ：溶液の澄清度と色の項目下での溶液を取り、『中国薬局方』第４部の通則０６３１の配合濃度測定方法に従ってサンプルを測定した。
不純物：
高性能液体クロマトグラフィによって測定される。そのうち、クロマトグラフィー条件は、次の通りであり、
クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）、
移動相：
Ａ：０．０６５％ＴＦＡ−水、
Ｂ：０．０５％ＴＦＡ−アセトニトリル
溶出法：グラジエント溶出、０〜３０分、５〜６５％  Ｂ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３６℃、検出波長：２２０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
適量のＰ５ペプチドを取って水に溶解し、対照溶液として１ｍＬあたり約２ｍｇのＰ５ペプチドを含む溶液を作成する。
【０１２３】
サンプルを取って水を加えて溶解し、希釈して１ｍＬあたり約２ｍｇを含む被験サンプルとし、上記溶液を１０μＬ精密に引き出し、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。含有量は外部参照機器のピーク面積から計算され、不純物は面積正規化法から計算される。
最後に、被験サンプルの澄清度は、標準濁度溶液の澄清度の測定結果との比較によって決定される。
【０１２４】
実験結果：
【表５】
2020536065.tif 000006
【０１２５】
【表６】
2020536065.tif 000007
【０１２６】
【表７】
2020536065.tif 000008
【０１２７】
不純物については、０日目に各サンプル（Ｎｏ．０〜Ｎｏ．５）で不純物が検出されなかった。１週目で、Ｎｏ．１（トレハロース）の最大単一不純物は０．２１％であり、総不純物は０．３％であり、対照サンプル（Ｎｏ．０）よりも有意に小さかったため、トレハロースがより明確な保護効果を有することが明らかにされた。
【０１２８】
同時に、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．５の不純物の含有量が観察され、その最大単一不純物および総不純物がＮｏ．１（トレハロース）よりも劣ることが分かり、シクロデキストリン、マンニトール、ラクトース、およびグルコースは、保護効果の点でトレハロースより劣っていたことが明らかにされた。
【０１２９】
特性については、トレハロース、シクロデキストリン、マンニトール、およびラクトースは、１週目にサンプルを白色の緩い凍結乾燥塊のままで維持したが、対照サンプルはわずかに萎縮し、Ｎｏ．５（グルコース）は酷く萎縮し、黄色の塊として示された。トレハロース、シクロデキストリン、マンニトールは、２週目に依然としてサンプルを白色の緩い凍結乾燥塊のままで維持したが、対照サンプルはわずかに萎縮した。
【０１３０】
ｐＨについては、１週目と２週目にサンプルＮｏ．０とＮｏ．１のｐＨに有意な変化はなかったが、１週目にサンプルＮｏ．４とＮｏ．５のｐＨが低下し、２週目にサンプルＮｏ．２とＮｏ．３のｐＨが上昇した。
【０１３１】
澄清度と色については、１週目にサンプルＮｏ．０〜Ｎｏ．４のいずれも澄清で無色でしたが、サンプルＮｏ．５は澄清で黄色に変わった。２週目にサンプルＮｏ．０〜Ｎｏ．３のいずれも澄清で無色でした。
【０１３２】
上記分析に基づいて、特性、溶液の澄清度と色、ｐＨ、不純物、および含有量を総合的に考慮して、トレハロースを次のテストの充填剤として選択した。
【０１３３】
実施例９
Ｐ５凍結乾燥製剤の成形および安定性に対するトレハロース投与量の影響
さまざまな含有量のトレハロースを使用したＰ５凍結乾燥製剤の成形を観察し、使用する検出方法は実施例８に記載されたものを参照する。
【０１３４】
【表８】
2020536065.tif 000009
【０１３５】
【表９】
2020536065.tif 000010
【０１３６】
各サンプルのそれぞれを６０℃の安定性試験チャンバーに２週間入れ、１週目と２週目の終わりにそれぞれサンプリングして検出した。異なる割合のＰ５：トレハロースを使用した場合、さまざまなサンプルの特性、溶液の澄清度と色、ｐＨ、不純物、および含有量を観察した。
【０１３７】
【表１０】
2020536065.tif 000011
【０１３８】
【表１１】
2020536065.tif 000012
【０１３９】
【表１２】
2020536065.tif 000013
【０１４０】
【表１３−１】
2020536065.tif 000014
【表１３−２】
2020536065.tif 000015
【０１４１】
各サンプルのそれぞれを４０℃の安定性試験チャンバーに３か月間入れ、１月目と３月目の終わりにそれぞれサンプリングして検出した。異なる割合のＰ５：トレハロースを使用した場合、さまざまなサンプルの特性、溶液の澄清度と色、ｐＨ、不純物、および含有量を観察した。
【０１４２】
【表１４】
2020536065.tif 000016
【０１４３】
実験結論：
不純物について、サンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．９は、６０℃で１週間または２週間の場合、不純物（最大単一不純物および総不純物）含有量は、対照サンプル（Ｎｏ．０）の不純物よりも有意に小さかったため、トレハロースがより明確な保護効果を有することが明らかにされた。
【０１４４】
実験Ｉ（Ｐ５：トレハロース＝１：０．２５〜１：１）について、トレハロース投与量の増加に伴い、不純物の含有量は徐々に減少し、トレハロースの保護効果が徐々に増加することが明らかにされた。
【０１４５】
実験ＩＩ（Ｐ５：トレハロース＝１：１．５〜１：５）について、１週目または２週目の終わりに、サンプルＮｏ．５〜Ｎｏ．９とサンプルＮｏ．４の不純物（Ｐ５：トレハロース＝１：１）と比較して有意差がなく、トレハロースの保護効果がもはや改善されないことが明らかにされた。
したがって、Ｐ５とトレハロースの割合は１：１である場合より適切である。
【０１４６】
ｐＨについて、各サンプルのｐＨは、対照サンプルのｐＨと比較して、６０℃で２週間または４０℃で１か月間保存される場合、約６．０から約７．０に変化したことが存在し、ｐＨを安定させるためにｐＨ緩衝剤を組成物に添加する必要があることが明らかにされた。
【０１４７】
実施例１０
凍結乾燥製剤の溶液澄清度および不純物に対するさまざまなｐＨの影響
凍結乾燥製剤の溶液澄清度および不純物に対するさまざまなｐＨの影響を観察し、使用する検出方法は実施例８に記載されたものを参照する。
実験Ｉ：クエン酸およびリン酸水素二ナトリウムを使用して組成物のｐＨを調整する。
【０１４８】
【表１５】
2020536065.tif 000017
【０１４９】
実験Ｉの結果と分析
【表１７】
2020536065.tif 000018
【０１５０】
【表１８】
2020536065.tif 000019
【０１５１】
【表１９】
2020536065.tif 000020
【０１５２】
スクリーニング実験Ｉについて、クエン酸およびリン酸水素二ナトリウムの緩衝液体系を使用し、ｐＨ範囲を４．０〜８．０に調整した。対照サンプル（Ｎｏ．０）およびサンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．５は、６０℃で２週間の場合、それらのｐＨのいずれも安定である。澄清度の観察から、対照サンプル（Ｎｏ．０）は、良好な澄清度を有し、サンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．４はわずかに濁っていることが分かった。１週目または２週目の場合、対照サンプル（Ｎｏ．０）の特性をそのままで維持し、ｐＨ調整済みのサンプルは有意に萎縮して崩壊した。さらに、ｐＨの上昇に伴い、サンプル中の不純物が徐々に減少することもわかった。したがって、本発明者らは、他のｐＨ調整剤を使用して、より高いｐＨ範囲で実験ＩＩを行った。
【０１５３】
実験ＩＩ：ヒスチジン／アルギニンを使用して組成物のｐＨを調整した。
【表１６】
2020536065.tif 000021
【０１５４】
実験ＩＩの結果と分析
【表２０】
2020536065.tif 000022
【０１５５】
【表２１】
2020536065.tif 000023
【０１５６】
【表２２】
2020536065.tif 000024
【０１５７】
スクリーニング実験ＩＩでは、ヒスチジン／アルギニン緩衝液体系を使用して、ｐＨ範囲を７〜１０に調整した。２週目に、対照サンプル（Ｈ０）のｐＨは変化した（すなわち、５．９から６．５になった）が、サンプルＨ１〜Ｈ５のｐＨは安定していた。対照サンプル（Ｈ０）の不純物含有量は、０日目と比較して有意に増加したが、サンプルＨ１、Ｈ２、およびＨ３の不純物含有量は増加しなかった。対照サンプル（Ｈ０）の澄清度は非常によかったが、サンプルＨ１〜Ｈ５のいずれも濁りがあり、サンプルＨ２の濁りが最も低くなった。したがって、ｐＨ範囲を６．５±０．５に制御することが望ましい。
【０１５８】
また、上記のようにｐＨ調整剤を添加しない場合、さまざまなサンプルのｐＨの変化も異なった。例えば、充填剤のスクリーニング実験のサンプルＮｏ．２では、６０℃で２週間保存した場合、そのｐＨが有意に変化しなかった。ｐＨ範囲のスクリーニング実験ＩのサンプルＮｏ．０では、６０℃で２週間保存した場合、そのｐＨが有意に変化しなかった。ｐＨ範囲のスクリーニング実験ＩＩのサンプルＨ０では、６０℃で２週間保存した場合、ｐＨの変化範囲が０．５でｐＨが有意に変化した。トレハロース投与量のスクリーニング実験ＩＩのサンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．５では、６０℃で２週間保存した場合、ｐＨの変化範囲が１．０でｐＨが有意に変化した。
【０１５９】
本明細書に引用されている全ての出版物、特許文献は、個々の出版物または特許がそれぞれ本明細書に組み込まれて参照としていることを明確に示されているように、参照により本明細書に援用する。本発明に開示された真の精神および範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載の実施形態に対して様様な変更および均等物に置き換えることができる。特に文脈で断らない限り、本明細書に記載の実施態様に係る任意の特徴、ステップや実施形態は、任意の他の特徴、ステップや実施形態とを組み合わせて用いることができる。
【図１】
2020536065.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド、ｐＨ調整剤、および充填剤を含む医薬組成物であって、前記ペプチドはアミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含み、
前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）に１つ以上の保存的置換を有する変異体である、医薬組成物。
【請求項２】
前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントの１つまたは複数の保存的置換によって生成された変異体であり、前記保存的置換は、ＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間での置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群より選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩ（配列番号：６）セグメントを、ＬＤＴＥＬ（配列番号：７）、ＬＤＴＥＶ（配列番号：８）、ＬＤＴＤＩ（配列番号：９）、ＬＤＴＤＬ（配列番号：１０）、ＬＤＴＤＶ（配列番号：１１）、ＬＤＳＥＩ（配列番号：１２）、ＬＤＳＥＬ（配列番号：１３）、ＬＤＳＥＶ（配列番号：１４）、ＬＤＳＤＩ（配列番号：１５）、ＬＤＳＤＬ（配列番号：１６）、ＬＤＳＤＶ（配列番号：１７）、ＬＥＴＥＩ（配列番号：１８）、ＬＥＴＥＬ（配列番号：１９）、ＬＥＴＥＶ（配列番号：２０）、ＬＥＴＤＩ（配列番号：２１）、ＬＥＴＤＬ（配列番号：２２）、ＬＥＴＤＶ（配列番号：２３）、ＶＤＴＥＩ（配列番号：２４）、ＶＤＴＥＬ（配列番号：２５）、ＶＤＴＥＶ（配列番号：２６）、ＶＤＴＤＩ（配列番号：２７）、ＶＤＴＤＬ（配列番号：２８）、ＶＤＴＤＶ（配列番号：２９）、ＩＤＴＥＩ（配列番号：３０）、ＩＤＴＥＬ（配列番号：３１）、ＩＤＴＥＶ（配列番号：３２）、ＩＤＴＤＩ（配列番号：３３）、ＩＤＴＤＬ（配列番号：３４）、ＩＤＴＤＶ（配列番号：３５）、ＩＥＴＥＩ（配列番号：３６）、ＩＥＴＥＬ（配列番号：３７）、ＩＥＴＥＶ（配列番号：３８）、ＩＥＴＤＩ（配列番号：３９）、ＩＥＴＤＬ（配列番号：４０）、およびＩＥＴＤＶ（配列番号：４１）からなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその前記機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドであり、前記内在化ペプチドは、前記キメラペプチドの細胞による取り込みを促進できる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を含み、好ましくは、前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ｐＨ調整剤は、ヒスチジン緩衝液、アルギニン緩衝液、コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、グルコン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれ、好ましくはクエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、またはヒスチジン／アルギニン緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン／アルギニン緩衝液である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
組成物のｐＨが約５．５〜８、好ましくは約６〜７．５、より好ましくは約６〜７、さらに好ましくはが約６．５〜７、最も好ましくは約６．５である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ヒスチジン／アルギニン緩衝液中のヒスチジン／アルギニンの含有量は、重量で、約１％〜１０％、好ましくは約３％〜１０％である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記充填剤は、トレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、シクロデキストリン、デキストラン−４０、ソルビトール、スクロース、グリシン、およびそれらの任意の組み合わせ、好ましくはトレハロース、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれており、より好ましくはトレハロースである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ペプチド対トレハロースの質量比は、約１：０．０５〜１：１０、好ましくは約１：０．５〜１：５、より好ましくは約１：０．８〜１：３、最も好ましくは約１：１である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、予備凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤の形態、または凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせることによって得られる再構成製剤の形態である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳類における神経系損傷と該損傷に起因した関連疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安、およびてんかんからなる群より選ばれる疾患を治療、改善または予防するために用いられ、あるいは神経保護剤として用いられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記疾患は、脳卒中、または脳卒中による神経系損傷であり、
前記脳卒中は虚血性卒中、出血性脳卒中、および虚血性卒中から変換された出血性卒中を含み、好ましくは、前記脳卒中は虚血性卒中である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷であり、
前記興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中または脊髄損傷、脳や脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
既存の研究では、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５との間の相互作用を阻害する活性ペプチドは、ＮＭＤＡＲの構造に基づくものである。例えば、ＮＭＤＡＲ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ４０９９６１２）は、Ｃ末端における２０個のアミノ酸のＦＮＧＳＳＮＧＨＶＹＥＫＬＳＳＬＥＳＤＶ（配列番号：４２）、およびＰＬモチーフＥＳＤＶ（配列番号：４３）を有する。いくつかの活性ペプチドは、ＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端の一部アミノ配列を選択することにより、ＮＭＤＡＲ２ＢとがＰＳＤ−９５に対する競争阻害を生じる。ある研究では、上記ペプチドにおけるＥＳＤＶまたはＬＥＳＤＶ（配列番号：４４）セグメントは、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５タンパク質との相互作用を阻害することで重要な役割を果たしていることが考えられる。本出願の発明者は、任意の理論に縛られず、驚くべきことに、本明細書に記載の活性ペプチドＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）中に、上記のＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端のアミノ酸組成に対してＫＬ後のＳＳの２つの残基を含まない同時に、ＰＬモチーフに対してＮ末端方向におけるＹＥＫＬ（配列番号：４５）アミノ酸配列を増加したことを見出し、本発明ではこのような変更が活性ペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を高めることが裏つけられる。同時に、ＹＥＫＬモチーフに対して、そのＣ末端におけるＬＤＴＥＩセグメントは、変更することができ、活性ペプチドの活性に影響を及ぼさなく、またはその活性を高める可能性があることが予想されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に係る機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントに１つまたは複数の所で保存的置換によって生成された変異体である。
【国際調査報告】
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