(57)【要約】  本発明は、例えば、胞子形成細菌を標的化するための、又はCディフィシル、サルモネラ属、大腸菌又はストレプトコッカス属を標的化するためのガイド型ヌクレアーゼ、CRISPR/Casシステム、crRNA、シングルgRNA、ベクター、方法及び医薬組成物に関する。
2020525049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するための宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、クロストリジウム属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【請求項２】
遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、請求項1に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【請求項３】
Cas3が、配列番号275〜286及び273から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1又は2に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項４】
(i)のリピート配列が、配列番号290〜513及び138〜209から選択されるリピート配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列である、請求項1から3のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項５】
リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146及び496〜513、
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306及び370〜384、
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166、
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175; 
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181及び470〜476;
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である、請求項4に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項６】
標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、請求項1から5のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項７】
標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、請求項1から5のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項８】
標的配列の転写が、宿主細胞種の細胞において、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT、又は
(i)SpoIIR
によって制御される、請求項1から7のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項９】
標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に制御する産物をコードする遺伝子により含まれる、請求項1から8のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項１０】
標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子又はその相同体、オルソログ又は機能的同等物により含まれる、請求項1から9のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項１１】
標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、請求項1から10のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項１２】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、大腸菌細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【請求項１３】
遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、請求項12に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【請求項１４】
Cas3が、配列番号287〜289、261及び263から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項12に記載のシステム又は請求項13に記載の遺伝子操作された配列。
【請求項１５】
リピート配列が、配列番号514〜731及び210〜213から選択されるリピート配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列である、請求項12から14のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項１６】
リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号210〜212及び691〜695、
(b)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O157:H7株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号213、677及び678、
(c)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌042株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号514〜518、
(d)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌1303株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号519〜521;
(e)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌536株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号522〜527;
(f)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌55989株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号528又は529;
(g)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ACN001株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号530〜532;
(h)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、;配列番号533〜545
(i)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC IMT5155株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜537;
(j)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号538〜542;
(k)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O78株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号543〜545;
(l)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号546〜560;
(m)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B REL606株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号556〜560;
(n)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BL21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号561〜574;
(o)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW25113株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号575〜578;
(p)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW2592株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号579〜582;
(q)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌C(例えば、ATTC8739)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号583〜588;
(r)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌DH1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号589〜597;
(s)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌E24377A株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号598〜600;
(t)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ECC-1470株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号601〜603;
(u)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ED1a株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号604〜608;
(v)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ER2796株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号609〜612;
(w)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ETEC(例えば、H10407)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号613〜618;
(x)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LF82株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号644〜667;
(y)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LY180株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号668〜670;
(z)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O104:H4株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号671〜673;
(aa)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O111:H(例えば、1128)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号674〜676;
(bb)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌P12b株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号679〜684;
(cc)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN033株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号685;
(dd)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN061株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号686〜689;
(ee)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌SECEC SMS-3-5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号690;
(ff)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12 MC4100株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号691〜695;
(gg)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UM146株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号696〜699;
(hh)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMN026株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号700〜707;
(ii)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNF18株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号708〜711;
(jj)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNK88株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号712〜715;
(kk)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UT189株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号716〜720;
(ll)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌VR50株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号721〜723;
(mm)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌W株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号724〜729;又は
(nn)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌Xuzhou21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号730若しくは731
から選択されるリピート配列である、請求項15に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項１７】
PAMが、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はからなる、請求項12から16のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項１８】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、ストレプトコッカス属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3(任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含む)又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号266を含む)又はそのオルソログ又は相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【請求項１９】
遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で、配列番号266を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、請求項18に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【請求項２０】
PAMが、AA、AT又はAGを含む又はからなる、請求項18に記載のシステム又は請求項19に記載の遺伝子操作された配列。
【請求項２１】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、サルモネラ属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号268又は270を含む)又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【請求項２２】
遺伝子操作された配列が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で、配列番号268若しくは270を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む、請求項21に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【請求項２３】
Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、請求項1から22のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項２４】
遺伝子操作された配列が、核酸ベクター、任意選択で、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド又は接合性プラスミドにより含まれる、請求項1から23のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項２５】
遺伝子操作された配列のコピーが、複数の担体細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、請求項1から24のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項２６】
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又はその前記オルソログ又は相同体を組み合わせることが可能であり、Cas3が、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減でき、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、ヒト又は動物対象における前記宿主細胞の感染を処置又は予防するための請求項1から25のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列。
【請求項２７】
請求項1から26のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された配列及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２８】
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、クロストリジウム属感染を処置する、方法。
【請求項２９】
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象において大腸菌感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、大腸菌ではなく、
各宿主細胞は、
(a)AWGを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号261、263及び287〜289から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号262若しくは264のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、大腸菌感染を処置する、方法。
【請求項３０】
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)ストレプトコッカス属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記ストレプトコッカス属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は配列番号266のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、ストレプトコッカス属感染を処置する、方法。
【請求項３１】
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてサルモネラ属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)サルモネラ属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記サルモネラ属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)PAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、方法は、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程とを含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記のそれぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、サルモネラ属感染を処置する、方法。
【請求項３２】
Casであり、宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようにプログラムされ、それによって、プログラムされたヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変可能であり、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、請求項1、3から12、14から18、20、21及び23から26のいずれか一項に記載のシステムにおいて使用するためのガイド型ヌクレアーゼ。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３４】
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT又は
(i)SpoIIR
によって、宿主細胞種の細胞において標的遺伝子の転写が制御される、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３５】
ヌクレオチド配列が、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT又は
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３６】
標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子又はその相同体、オルソログ又は機能的同等物により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３７】
標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３８】
標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードする、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３９】
標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB又はCtpB遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項４０】
宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項４１】
宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項４２】
標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、請求項32に記載のヌクレアーゼ。
【請求項４３】
宿主細胞に感染又は形質転換可能である核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合性プラスミド)であって、請求項32から42のいずれか一項に記載のヌクレアーゼをコードするベクター。
【請求項４４】
ヌクレアーゼをプログラミングするための1種若しくは複数のcrRNA若しくはガイドRNA(gRNA)と組み合わせた状態にあり、又はこのようなcrRNA若しくはgRNAをコードする核酸と組み合わせた状態にある、請求項32から42のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又は請求項43に記載のベクター。
【請求項４５】
ヌクレアーゼがCas3であり、Cas又はベクターが、1種又は複数のCASCADE Cas(任意選択で、CasA、B、C、D及びE又はCas1若しくはCas2)をコードする核酸と組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、宿主細胞の標的配列を改変するために前記CASCADE Casとともに作動可能である、請求項32から42のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又は請求項43に記載のベクター。
【請求項４６】
Casヌクレアーゼが、大腸菌、Cディフィシル、サルモネラ・エンテリカ又はSサーモフィルスCas3である、請求項32から45のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又はベクター。
【請求項４７】
Cas3が、配列番号273及び275〜286、261、263、287〜289、265、267及び269から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項46に記載のヌクレアーゼ又はベクター。
【請求項４８】
細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主細菌細胞において請求項32から42及び44から47のいずれか一項に記載のヌクレアーゼと組み合わせることが可能であるcrRNA又はシングルgRNAをコードする又は含む核酸分子。
【請求項４９】
crRNA又はシングルgRNAが、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列と少なくとも70%同一である配列により含まれる配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、請求項48に記載の核酸。
【請求項５０】
宿主細胞を感染又は形質転換可能である核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合性プラスミド)であって、請求項48又は49に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項５１】
ヒト又は動物対象において疾患又は状態を処置又は予防するための医薬であって、宿主細胞によって媒介される疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、請求項1から27及び32から50のいずれか一項に記載のシステム、配列、ベクター、ヌクレアーゼ又は核酸を含む医薬。
【請求項５２】
宿主細胞が、任意選択で、表18及び19中の株並びに表24中の配列番号275〜286について列挙された株から選択されるCディフィシル株のCディフィシル宿主細胞である、対象のCディフィシル感染を処置するための、請求項51に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、胞子形成細菌を標的化するための、又はCディフィシル(difficile)、サルモネラ属(Salmonella)、大腸菌(E coli)又はストレプトコッカス属(Streptococcus)を標的化するためのガイド型ヌクレアーゼ、CRISPR/Casシステム、crRNA、シングルgRNA、ベクター、方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌集団成長を阻害すること及び混合物中の種々の種の相対比を変更することは、例えば、水路、飲料水の処置のための広範囲の産業及び設定において、又はその他の環境設定において適用される。また、病原性感染を低減するために、又は腸内若しくは口腔細菌叢のバランスを取り直すために、ヒト及び非ヒト動物、例えば、家畜において細菌を変更することにおいても適用が見られる。最近、種々の体重若しくは肥満プロファイルを有するヒトにおいて腸内細菌の相対割合を解析すること、又はクローン病等の疾患の場面における可能性のある細菌の影響を調査することに関心が集まってきた。
【０００３】
ファージに対する細菌の自然免疫機構は豊富であるが、十分に考証された細菌適応免疫システムとして、CRISPR/Casシステムがある。遺伝子操作されたCRISPR/Casシステムは、細菌から動物及び植物細胞にわたる様々な種類の原核及び真核細胞における核酸の正確な改変のために使用されてきた(例えば、Jiang Wら(2013)を参照のこと)。細菌及び古細菌等の原核生物は、ウイルス(例えば、バクテリオファージ)及びプラスミド等の移動性侵入者に対する抵抗性を提供するために、CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated)と呼ばれる適応免疫システムをコードする。バクテリオファージ(又はファージ)が地球上で最も豊富な生物学的実体であり、その細菌餌食を10倍、数で上回ると推定されることを説明する、Seedら(2013)を参照されたい。ファージ捕食の絶え間ない脅威が、広範囲の細菌免疫機序の進化につながり、これが、次いで、多様なファージ免疫回避戦略の進化をもたらし、ダイナミックな共進化的せめぎあいをもたらしている。
【０００４】
宿主免疫は、記憶遺伝子座(CRISPRアレイ)における侵入者DNA配列の組込み、この遺伝子座からのガイドRNAの形成及びプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と隣接して位置する同族侵入者DNA(プロトスペーサー)の分解に基づいている。例えば、国際公開第2010/075424号を参照のこと。宿主CRISPRアレイは、様々なエレメント:1つ又は複数のリピート-スペーサー-リピートユニットのすぐ5'のリーダー(プロモーターを含む)を含み、ここで、リピートは同一であり、スペーサーは異なる。侵入ウイルス又はプラスミド核酸からスペーサー配列を獲得することによって、宿主防御システムは、ウイルス又はプラスミドによる将来の侵入に取り組むための記憶として作用するように、CRISPRアレイ(リピートと隣接している各スペーサー)中に新規スペーサーを組み込むことができる。最近獲得されたスペーサーは、リーダーの直後に宿主アレイ中に挿入される傾向があるということが観察されている。
【０００５】
CRISPR遺伝子座及びその関連遺伝子(Cas)が、細菌及び古細菌にファージ及びその他の侵入遺伝エレメントに対する適応免疫性を付与することを説明する、Helerら(2014)を参照されたい。あらゆる免疫システムの基本的な必要条件は、より効率的に再発性感染に対処するために過去の感染の記憶を構築する能力である。CRISPR-Cas免疫システムの適応特性は、侵入分子のDNA配列を記憶し、「スペーサー」の形態でCRISPRアレイの繰り返し配列の間にそれを組み込むその能力に頼っている。スペーサーの転写は、小さいアンチセンスRNAを作り出し、これが、RNAガイド型Casヌクレアーゼによって使用されて、細胞を感染から保護するために侵入核酸を切断する。新規スペーサーの獲得によって、CRISPR-Cas免疫システムが、新規脅威に対して迅速に適応することが可能となり、したがって「適応」(すなわち、ベクター配列スペーサー獲得)と呼ばれる。
【０００６】
Seedら(2013)は、CRISPR/Casシステムによってコードされたファージが、細菌宿主のファージ阻害性染色体島に対抗するために使用された事象の顕著な展開を報告した。報告によれば、ファージによる溶解性感染の成功は、CRISPRスペーサーと標的染色体島の間の配列同一性に依存していた。このような標的化の非存在下で、ファージによってコードされるCRISPR/Casシステムは、新規スペーサーを獲得して迅速に進化し、染色体島の有効な標的化を確実にしてファージ複製を回復できた。Bondy-Denomyら(2012)には、CRISPR/Casシステムの阻害を媒介する遺伝子の早期に観察された例が記載されている。緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に感染するバクテリオファージのゲノムにおいて5種の別個の「抗CRISPR」遺伝子が見い出された。ファージの抗CRISPR遺伝子の突然変異は、それを機能的CRISPR/Casシステムを有する細菌に感染できないようにし、CRISPR/Casによって標的とされるファージのゲノムへの同遺伝子の付加は、それがCRISPR/Casシステムを逃れることを可能にした。
【０００７】
未熟なRNAは、CRISPRアレイから転写され、その後、成熟されてcrRNAを形成する。一部のCRISPR/Casシステムはまた、未熟crRNA中のリピートとハイブリダイズして、プレcrRNAを形成でき、それによって更なるプロセシングが、成熟RNA又はcrRNAをもたらすトランス活性化RNA(tracrRNA)をコードする配列も含む。cRNAの構造は、関与するCRISPR/Casシステムの型(I、II又はIII型)によって変わる。
【０００８】
CRISPR関連(cas)遺伝子は、CRISPRアレイと関連することが多い。詳細な比較ゲノム解析によって、多数の異なるcas遺伝子が同定されており、40種の細菌及び古細菌ゲノムの最初の解析によって、45種のcas遺伝子ファミリーが存在し、2種の遺伝子、cas1及びcas2のみが普遍的に存在する可能性があることが示唆された。Cas1及びCas2は、アレイへの新規スペーサー獲得に必須であり、したがって、ファージ又はプラスミドに由来する侵入者核酸に対する抵抗性を発達させる機序において重要であると考えられている。Nunezら(2015)は報告により、Cas1-Cas2複合体がスペーサーDNA獲得を触媒する最小機構であることを実証し、Cas1-Cas2媒介性適応免疫のための配列及び構造特異性を提供することにおけるCRISPRリピートの重要性を明らかに説明した。
【０００９】
CRISPR/Casシステムはまた、侵入者ヌクレオチド配列中の同族認識モチーフ(PAM)と隣接する侵入者核酸を切断するためのヌクレアーゼ(例えば、Cas9)を発現する配列を含む。ヌクレアーゼのPAM認識は、Casヌクレアーゼの各型に特異的である。侵入者配列中のPAMは、プロトスペーサー配列のすぐ3'にあることがあり、ヌクレアーゼは通常、PAMの3〜4ヌクレオチド上流(5')を切断する。PAM配列の保存は、CRISPR-Casシステム間で異なり、cas1及びリーダー配列と進化的に連結していると思われる。Fineranら(2014)は、侵入者は、プロトスペーサー又はその隣接PAMの領域(「シード領域」)中に点突然変異を作製することによって大腸菌(Escherichia coli)K12においてI-E型CRISPR-Cas免疫を逃れることができるが、宿主は、獲得を含むポジティブフィードバックプロセス(「プライミング」)において新規スペーサーを組み込むことによって免疫性を迅速に回復させることを観察した。今日まで、PAMは、いくつかのI型及びII型システムにおいて十分に特性決定されており、プロトスペーサー中の突然変異の効果が考証されている(Fineranら(2014)中の参考文献5、14、23、46、47を参照のこと)。Fineranら(2014)は、結果がこれまでの論文と一致してPAM及びシード配列の重要な役割を実証すると結論づけた。
【００１０】
Semenovaら(2011)は、シード配列の役割を調べ、大腸菌サブタイプCRISPR/Casシステムの場合には、crRNAマッチングの必要条件は、PAMの直後のシード領域に対して厳密であると結論づけた。彼らは、シード領域における突然変異は、プロトスペーサーDNAに対するcrRNAガイド型Cascade複合体の結合親和性を低減することによってCRISPR/Cas媒介性免疫を無効にすることを観察した。
【００１１】
3つの主要な種類の適応免疫の各々のCRISPR免疫の段階は、以下の通りである:
(1)獲得は、Cas1及びCas2による侵入DNAの認識及びプロトスペーサーの切断によって始まり、
(2)プロトスペーサー配列は、リーダー配列に隣接するダイレクトリピートにライゲーションされ、
(3)一本鎖伸長が、CRISPRを修復し、ダイレクトリピートを複製する。
【００１２】
crRNAプロセシング及び干渉段階は、3つの主要な種類のCRISPRシステムの各々で異なって起こる。一次CRISPR転写物は、Casによって切断され、crRNAが生じる。I型システムでは、Cas6e/Cas6fは、ダイレクトリピート中のヘアピンループによって形成されたssRNA及びdsRNAの接合部で切断する。II型システムは、トランス活性化(tracr)RNAを使用してdsRNAを形成し、これが、Cas9及びRNaseIIIによって切断される。III型システムは、切断のためにダイレクトリピート中のヘアピンループを必要としないCas6相同体を使用する。II型及びIII型システムでは、二次トリミングが、5'又は3'末端のいずれかで実施されて、成熟crRNAが生じる。成熟crRNAは、Casタンパク質と会合して、干渉複合体を形成する。I型及びII型システムでは、crRNA及びPAM間の塩基対合は、侵入DNAの分解を引き起こす。III型システムは、分解の成功にPAMを必要とせず、III-A型システムでは、crRNAと、III-B型システムによって標的とされるDNAではなくmRNAとの間の塩基対合が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第2010/075424号
【特許文献２】国際公開第2014/124226号
【特許文献３】国際公開第2013/176772号
【特許文献４】米国公開第20160333348号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Turnbaugh,P.J.、R.E.Ley、M.A.Mahowald、V.Magrini、E.R.Mardi及びJ.I.Gordon. 2006、「An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest」、Nature 444:1027〜1131頁
【非特許文献２】Nat Commun. 2014年7月24日、5:4498. doi: 10.1038/ncomms5498、「A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human faecal metagenomes」、Dutilh BEら
【非特許文献３】FEBS Lett. 2010年6月3日、584(11):2421〜6頁、doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010年4月21日、「Mining metagenomic data for novel domains: BACON、a new carbohydrate-binding module」、Mello Lら
【非特許文献４】Robertsら(2009) (Trends Microbiol. 2009年6月;17(6):251〜8頁. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009年5月20日;「A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements」、Roberts A、Mullany P)
【非特許文献５】「Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass Spectrometry」、Kaveh Eら、PLoS One. 2012;7(6):e38515; 2012年6月7日オンラインで公開doi:10.1371/journal.pone.0038515
【非特許文献６】Appl Environ Microbiol. 2015年4月;81(8):2696〜705頁  doi:10.1128/AEM.00096-15. Epub 2015年2月6日、「Targetting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy」、Khalifa L
【非特許文献７】F.A. Ranら、「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature、doi:10.1038/nature14299、2015年
【非特許文献８】PLoS Genet、2013年;9(9):e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844. Epub 2013年9月26日、「Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: bacteria and beneficial plasmids」、Jiang Wら
【非特許文献９】Kugelberg Eら、Establishment of a superficial skin infection model in mice by using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes、Antimicrob Agents Chemother、2005年;49:3435〜3441頁
【非特許文献１０】Pastagia Mら、A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains、Antimicrob Agents Chemother、2011年;55:738〜744頁
【非特許文献１１】BMC Biol.、2014年5月19日;12:36. doi: 10.1186/1741-7007-12-36、「Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity」、Krupovic Mら
【非特許文献１２】Liangら、Int J Infect Dis. 2015年1月;30:1〜6頁、doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015.、Epub 2014年11月5日、「Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene」
【非特許文献１３】Nature、2013年2月28日;494(7438):489〜91頁、doi: 10.1038/nature11927、「A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity」、Seed Kdら
【非特許文献１４】Nucleic Acids Res.、2013年10月;41(19):9033〜48頁、doi: 10.1093/nar/gkt654.、Epub、2013年7月30日、「High-resolution definition of the Vibrio cholerae essential gene set with hidden Markov model-based analyses of transposon-insertion sequencing data」、Chao MCら
【非特許文献１５】Infect Immun.、2015年9月;83(9):3381〜95頁、doi: 10.1128/IAI.00411-15.、Epub、2015年6月8日、「A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio cholerae Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System Modulates Virulence Gene Expression」、Wang Qら
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の記述
本発明の第1の構成
本発明者らは、以下の特徴のうち1つ又は複数を用いて細菌叢(ヒト、動物又は環境細菌叢)中に一緒に天然に存在する細菌の混合コンソーシアム中の特定の細菌株の集団成長の阻害を初めて実証したと考えている:
・野生型細胞を標的化すること、
・野生型内因性Casヌクレアーゼ活性を利用すること、
・必須及び抗生物質耐性遺伝子を標的化すること
による集団成長阻害であって、
・標的が野生型配列である、集団成長阻害。
【００１６】
本発明者らは、以下の特徴を用いて混合細菌集団においてこれを実証した:
・ヒト細菌叢(例えば、腸細菌叢)種の混合集団において細菌成長阻害を標的化することであって、
・集団が3種の異なる種を含む、標的化すること、
・それらの種のうち1種の選択的死滅及びその他の種の細胞を温存することを含むこと、
・このような阻害から温存される系統学的に近縁の種の存在下で細胞成長阻害を標的化すること、
・標的ファーミキューテス門(Firmicutes)の種及び非ファーミキューテス門の種を含む混合集団において細胞成長阻害を標的化すること、
・混合集団中の、特定のファーミキューテス門の株の細胞成長阻害を標的化し、一方で、異なるファーミキューテス門の種を温存すること、
・混合集団中の、特定のグラム陽性細菌株の細胞成長阻害を標的化し、一方で、異なるグラム陽性細菌種を温存すること、
・病原性(ヒトにおいて)細菌種を標的化し、一方で、共生(commensul)ヒト腸内細菌種を温存すること、
・病原性細菌種を標的化し、一方で、プロバイオティック(priobiotic)ヒト腸内細菌種を温存すること、
・表面上の混合細菌集団において細胞成長阻害を標的化すること、
・特定の細菌種が単独で、又はコンソーシアム中で複数のその他の細菌種と混合された場合に少なくとも10倍の成長阻害を達成すること、及び
・特定の細菌種の2種の異なる株の少なくとも10倍の成長阻害を達成すること。
【００１７】
野生型細胞において内因性Cas活性を利用する能力は、生物(例えば、ヒト及び動物)及び環境における宿主細胞感染のin situ処置にとって極めて有用である。ヒト、動物又は植物細菌叢等の野生型(すなわち、遺伝子操作されていない、又は事前に操作されている)細菌集団の処置もまた、本発明を使用して対処できる。混合集団において選択的成長阻害を達成する能力は、ヒト、動物又は植物細菌叢等の細菌集団に対処するために、又は環境マイクロバイオームに対処するために有用である。この特性はまた、医薬の製造(例えば、本明細書において開示されている任意の処置又は予防のためにヒト又は動物対象に投与するための細菌細胞移植片;又は本発明の生成物細菌集団を含む除草剤若しくは殺虫剤組成物を製造)するのに有用であり、選択的死滅を使用して、混合集団中の種々の細菌の比を選択的に変更して、医薬、除草剤若しくは殺虫剤を生成する、又はそれから医薬、除草剤若しくは殺虫剤が製造される細菌集団を生成することができる。例えば、このような処置又は予防を達成するために、医薬を、ヒト又は動物レシピエントに鼻腔内移植できる。
【００１８】
以下の実施例では、固体表面上の細菌集団(グラム陽性ファーミキューテス門集団)において成長阻害を対処した。>10倍の集団成長阻害が達成された。標的化は、抗生物質耐性遺伝子に向けられた。本発明は、抗生物質耐性菌の成長を阻害するのに有用となり、標的配列は、抗生物質耐性遺伝子の配列である。例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列の、抗生物質との共投与は有効であり得る。これは、ヒト若しくは動物対象における宿主細胞感染のより完全な処置若しくは予防を提供し得る、及び/又はヒト若しくは動物への投与のための治療上有効な抗生物質用量の低減を可能にし得る。これは、抗生物質の過剰投与並びにヒト及び動物集団における耐性の発生に関する懸念の増大を考慮しても有用である。本発明はまた、工業用若しくは医学用流体、表面、装置若しくは容器を処置するために(例えば、食物、消費材、化粧品、個人のヘルスケア製品、石油又はオイル製造のために)、又は水路、水、飲料、食料若しくは化粧品を処置するためにex vivo及びin vitroで適用され、宿主細胞は、流体、表面、装置、容器、水路、水、飲料、食料又は化粧品によって、又はその上に含まれる。本発明はまた、腐食、バイオフィルム及び生物付着の管理において適用される。第1の構成は、以下の概念を提供する:
【００１９】
細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比の変更のための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌が宿主細胞を含み、
各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを改変し、
標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞成長が阻害される、使用。
【００２０】
細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための、態様1の使用のための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含むシステム:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1種の核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現させるためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、宿主CRISPR/Casシステムを改変する少なくとも1種の核酸ベクターの間で分離される。
【００２１】
これは、本発明者らが、混合及び非混合細胞集団において少なくとも10倍の選択的宿主細胞成長阻害を示す本明細書における実施例によって例示される。混合物は、ヒト細菌叢において見られる種及び株の組合せを模倣する。
【００２２】
集団の成長を阻害するための細菌宿主細胞集団の野生型内因性Casヌクレアーゼ活性の使用であって、各宿主細胞が、野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内因性CRISPR/Casシステムを有し、使用が、集団の宿主細胞を形質転換することを含み、各形質転換された宿主細胞が、宿主細胞における宿主改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)をもたらすための遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換され、HM-cRNA又はgRNAが、内因性Casをガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列を標的にハイブリダイズする能力がある配列を含み、cRNA又はgRNAが、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、宿主細胞の形質転換後、集団の成長が阻害される。
【００２３】
細菌宿主細胞を死滅させるための、又はその成長を低減するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用(任意選択で、使用は、上記の直前の段落の使用に従う)であって、各宿主細胞について、システムは、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、
Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、使用。
【００２４】
したがって、HM-cRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である。
【００２５】
代替において、HM-crRNA及びtracrRNAは、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれる。
【００２６】
内因性Casヌクレアーゼを利用することによって、本発明の実施形態は、内因性Casヌクレアーゼ活性を使用する(すなわち、ヌクレアーゼ活性を活性化又は増強するための宿主細胞の先行する遺伝子改変を必要としない)。したがって、一例では、Casヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型遺伝子によってコードされる。一例では、ヌクレアーゼは、宿主細胞において内因性Casヌクレアーゼ(又はCasヌクレアーゼ遺伝子)レプレッサーの不活性化を伴わずに細胞死滅又は成長阻害を達成するように活性である。したがって、本発明は、有効なCas媒介性細胞死滅又は成長低減を引き起こすための先行する操作を必要とすることなく、野生型細菌集団に対処することができる。したがって、集団がその野生型環境(例えば、水路又はヒト若しくは動物マイクロバイオームにより含まれている)にあるときに、集団をcRNAに曝露することができる。
【００２７】
一例では、第1の細菌は、バクテロイデス門(Bacteroidetes)(例えば、バクテロイデス属(Bacteroides))の細胞である。一例では、第2の細菌は、ファーミキューテス門の細胞である。方法は、例えば、体重の増加又は肥満症(例えば、第1の細菌がファーミキューテス門の細胞である)を処置又は予防するためである、例えば、腸細菌叢集団(例えば、ex vivo又はin vivo)における比を変更するために使用される。
【００２８】
第1の構成はまた、以下を提供する:第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を、前記亜集団を含む細菌の混合集団において変更する方法であって、第1の細菌は、ファージに感染した宿主細胞(例えば、バクテロイデス門の細胞)であり、第2の細菌は、前記ファージに感染していない(又はバクテロイデス門の細菌ではない)、ベクター核酸を宿主細胞に導入するために1つ又は複数のステップで混合集団を複数のベクターと組み合わせる工程と、混合集団で細菌を成長させ、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更される工程とを含み、
各ベクターは、細胞において前記ファージの標的ヌクレオチド配列を改変するために、ファージに感染した宿主細胞に導入するための遺伝子操作されたファージ改変(PM)CRISPRアレイを含み、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及びファージに感染した宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために感染宿主細胞においてファージ標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である、方法。
【００２９】
第2の構成では、本発明は、以下を提供する:
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための(例えば、第1の構成の使用のための)宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1種の核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現させるためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素が、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1種の核酸ベクター間で分離され、
任意選択で、構成要素(i)は、宿主細胞にとって内因性である、システム。
【００３０】
第2の構成はまた、前記ファージのゲノムを改変するための第1の構成の方法において使用するための、遺伝子操作されたファージ改変(PM)CRISPRアレイを提供し、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1種又は複数の配列ファージに感染した宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために感染宿主細胞において、ファージゲノム標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である。
【００３１】
一例では、ファージは、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス属)ファージ、例えば、crAssファージである。
【００３２】
一例では、アレイは、宿主細胞CRISPR/Casシステムとともに機能的であるCRISPRリピートを含む。これは、細菌混合物中の所望の細胞のためのアレイの選択性を増大するために有益である。これはまた、宿主細胞におけるアレイの機能に必要な1種又は複数のCasタンパク質(及び/又はtracrRNA)をコードする嵩高いヌクレオチド配列を含むことが必要ではない場合があるので、アレイ及び本発明のアレイを含有するベクターの製造を単純化する。代替において、アレイに同族のCas9をコードする配列及び任意選択で、同族のtracrRNAをコードする配列が提供される。
【００３３】
第3の構成では、本発明は、以下を提供する:
内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞を改変するための遺伝子操作された核酸ベクターであって、
(a)CRISPR/Casシステムにおける使用のための、又は本発明に記載の使用のための、複数の異なるcrRNA(例えば、シングルガイドRNA、すなわち、gRNA)を発現するための核酸配列を含み、
(b)Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞において第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞において第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
(c)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、任意選択で、両遺伝子は異なり、
(d)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、
(e)第1の配列は、必須遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、又は、
(f)第1の配列は、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ
ベクター。
【００３４】
第3の構成はまた、本発明の方法において使用するための核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージ又はファージミド)であって、本発明のCRISPRアレイを含むベクターを提供する。
【００３５】
第4の構成では、本発明は、以下を提供する:
宿主細胞において宿主細菌細胞(例えば、上記のような病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を改変するための、遺伝子操作されたCRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ又はファージミド)であって、
(a)CRISPRアレイは、crRNA(例えば、gRNAとして提供される)の発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)アレイは、異なる種の第1及び第2の細菌細胞の間で水平伝達可能であるトランスポゾンにより含まれる
ベクター。
【００３６】
第5の構成では、本発明は、以下を提供する:
可動遺伝エレメント(MGE)を含む又はからなる遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクターであって、MGEは、伝達の起点(oriT)及び宿主細胞において宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列を改変するためのCRISPRアレイを含み、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)ベクターは、(i)第1の宿主細胞の第1及び第2の核酸位置の間を伝達可能であり、各位置は、染色体若しくはプラスミド上の位置であり、標的配列は、宿主細胞により含まれるか、又は(ii)第1及び第2の宿主細胞の間を伝達可能であり、標的配列は、第1及び/若しくは第2の宿主細胞により含まれる、
遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクター。
【００３７】
第6の構成では、本発明は、以下を提供する:
工業用又は家庭用のシステムにおける基板の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基板の表面を、基板のMIC又は生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団と接触させ、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数のヌクレオチド配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基板のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法。
【００３８】
別の実施形態では、以下が提供される。
粗製油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備により含まれる基板の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基板の表面を、第1の宿主細胞の集団と接触させ、第1の宿主細胞は、基板のMIC又は生物付着を媒介する第1の種の硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB)、細胞外高分子物質産生菌(EPSB)、酸産生菌(APB)、硫黄-又は硫酸-酸化菌(SOB)、鉄酸化菌(IOB)、マンガン酸化菌(MOB)、アンモニア産生菌(AmPB)又は酢酸産生菌(AcPB)であり、表面及び細胞集団を、海水、淡水、水圧破砕液又は井戸中の液体から選択される液体と接触させる方法であり、
(i)液体を、第1の宿主細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと混合することによって、細胞集団をベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイが宿主細胞中に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列であり、
(c)(a)の各配列は、第1の宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、前記第1の宿主細胞の標的配列に対して80%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基板のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法。
【００３９】
その他の実施形態は、以下を提供する:
方法において使用するためのベクターであって、第1の細胞は、硫酸還元菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞であり、ベクターは、SRBを標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイは、(a)〜(c)に規定されるとおりである
ベクター。
【００４０】
別の実施形態では、工業用又は家庭用のシステムにおける流体の微生物生物付着を制御する方法であって、流体は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数のヌクレオチド配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法が提供される。
例えば、船又はボートのバラスト水において細菌生物付着を制御する方法であって、水は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法が提供される。
【００４１】
その他の実施形態は、以下を提供する:CRISPRアレイを含むバラスト海水(例えば、海水のサンプル又はコンテナ中の海水)であって、バラスト水が本方法によって得られる、又は得ることが可能であるバラスト水。バラスト海水を含む船、ボート、海上コンテナ又は掘削装置。第1の細胞がコレラ菌(Cholera)(例えば、ビブリオ(vibrio))、例えば、O1又はO139)、大腸菌又はエンテロコッカス属(Enterococci)の種の細胞である本方法において使用するためのベクターであって、細胞を標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイは、方法の(a)及び(b)に定義の通りであるベクター。
【００４２】
本発明はまた、この第6の構成において、又は医学的使用のため、又は食品若しくは飲料処理のため等のその他の適用のために使用するのに適しているベクター及びCRISPRアレイも提供する。この目的のために、以下が提供される:細菌宿主細胞に導入するためのCRISPRアレイを含むベクターであって、細菌は、水系伝染可能であり、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための配列及び前記宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するためのヌクレオチド配列であり、
(c)(a)の配列は、crRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、宿主細胞標的配列に対して80%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである
ベクター。
【００４３】
以下も提供される:複数のこのようなベクターを含む水又は食品処理組成物。ヒトにおける細菌感染(例えば、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)感染)の処置又は予防のための医薬であって、複数のこのようなベクターを含む医薬。本発明はまた、細菌集団、組成物、食料及び飲料を提供する。例えば、食料又は飲料は、乳製品である。
【００４４】
第7の構成では、本発明は、以下を提供する:
第1の態様において、
第1のCasをコードする発現可能な遺伝子を改変する方法であって、
(a)ガイドRNA(gRNA1)を、前記遺伝子から発現される第1のCasの存在下でCas遺伝子と組み合わせる工程と、
(b)gRNA1を、前記Cas遺伝子の配列(例えば、そのプロモーター又は第1のCasをコードするDNA配列)とハイブリダイズさせて、第1のCasを遺伝子にガイドさせ、それによって、Casが、Cas遺伝子を改変する工程と
を含む方法。
【００４５】
例えば、本方法において使用するための、第1の核酸ベクター又はベクターの組合せであって、
(a)第1のベクター又は前記組合せのベクターは、第1の部位(CS1)でPS1を改変するための第1のCasをガイドするために所定のプロトスペーサー配列(PS1)と相補的であるガイドRNA(gRNA1、例えば、シングルgRNA)をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、PS1は、第1のCasに対して同族であるPAM(P1)に隣接するか、又は発現可能な配列は、tracrRNAとともにgRNA1を形成するcrRNAをコードし、
(b)PS1及びP1は、発現可能な第1のCasをコードする遺伝子の配列であり、PS1は、第1のCasによってCS1で改変されることが可能である
第1の核酸ベクター又はベクターの組合せ。
【００４６】
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞において、又はin vitroでCas活性を調節するために有用である。本発明は、Casをコードする遺伝子を標的化して、Cas活性を制限することを含み、これは、Casの一次的な調節にとって有利である。本発明はまた、細胞のゲノムを改変する場合に、例えば、オフターゲットCas切断の機会を低減するために、Cas活性のストリンジェンシーの増大が望まれる設定において有用であり得る。適用は、例えば、細胞又は細胞を含む組織若しくは生物の遺伝子療法又は標的遺伝子組換えのために、例えば、オフターゲット効果が最小化されなければならない、又は避けられなければならないヒト、動物又は植物細胞の改変においてである。例えば、ヒトにおいて遺伝子療法のために、又は疾患若しくは状態の処置若しくは予防のために患者に投与されるべきヒト細胞(例えば、iPS細胞)において所望の変化を得るためにCas改変を使用する場合に、極めて高いストリンジェンシーが必要とされる。本開示は、これらの適用を本発明の方法及び製品の一部として提供する。
【００４７】
本発明はまた、ベクターにおける、特に、ウイルスベクターにおける制限された挿入能の問題に対処する。
【００４８】
したがって、本発明の第8の構成は、以下を提供する:
1.4kb超の、CRISPR/Casシステムの構成要素をコードする外因性DNA配列を含む核酸ベクターであって、配列は、宿主細胞(本明細書における任意の細胞、例えば、ヒト、動物又は細菌又は古細菌)において、1つ又は複数のHM-若しくはPM-crRNA又はgRNAを発現するための遺伝子操作されたアレイ又は遺伝子操作された配列(任意選択で、本明細書において記載されるような)を含み、アレイ又は遺伝子操作された配列は、cRNA又はgRNAに対して同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まず、任意選択で、少なくとも2、3又は4つのcRNA又はgRNAが、外因性DNAによってコードされる、核酸ベクター。
【００４９】
1.4kb超又は4.2kb超の外因性DNA配列を含む核酸ベクターであって、外因性DNAは、CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の構成要素をコードし、宿主細胞において1つ又は複数のHM-crRNA又はgRNAを発現するための遺伝子操作されたアレイ又は配列(例えば、本明細書において記載されるもののようないずれかのもの)を含み、外因性配列は、cRNA又はgRNAに対して同族であるヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、任意選択で、少なくとも2つの異なるcRNA又はgRNAが外因性DNAによってコードされる、核酸ベクター。
【００５０】
本発明の第9の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、Casヌクレアーゼをコードする複数のベクター及び宿主改変(HM)crRNAと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてベクターによってコードされるCas及びHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてベクターによってコードされるCasとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casヌクレアーゼを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
【００５１】
本発明の第10の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
宿主細胞集団成長を少なくとも5、10-、100、1000、10000、100000又は1000000倍低減する、方法。
【００５２】
本発明の第11の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
表面での宿主細胞集団成長を阻害する、方法。
【００５３】
本発明の第12の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
第1の種は、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有し、混合集団中の第1の細菌の成長は、前記HMシステムによって阻害されない、方法。
【００５４】
本発明の第13の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、第3の細菌種を含む、方法。
【００５５】
本発明の第14の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、宿主細胞と同一種の細菌細胞の更なる亜集団を含み、前記更なる亜集団の細菌細胞は、前記標的配列を含まない、方法。
【００５６】
本発明の第15の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
各宿主細胞は、複数の前記標的配列を含む、方法。
【００５７】
本発明の第16の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
宿主細胞において、Cas発現が誘導され、それによって、宿主細胞において前記発現されたCas及びHM-crRNAが組み合わされ、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
【００５８】
本発明の第17の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAの産生を誘導する工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、HM-cRNAの産生のための遺伝子操作された核酸配列からのRNAの発現は、宿主細胞において誘導可能であり、遺伝子操作された配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
【００５９】
本発明の第18の構成は、以下を提供する:
第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
(a)細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
(b)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
【００６０】
本発明の第19の構成は、以下を提供する:
細菌宿主細胞を形質転換可能であるベクターであって、本発明の方法において使用するための、(i)宿主細胞において発現可能であるSピオゲネス(pyogenes)Cas9ヌクレオチド配列及び(ii)任意選択で、少なくとも1つの本発明のHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の挿入に適応可能であり、ベクターが(i)(及び任意選択で、(ii))を含む場合に、宿主細胞を形質転換可能であり、Cas(及び任意選択で、少なくとも1つのHM-crRNA(例えば、gRNA)を発現可能である、ベクター。
【００６１】
本発明の第20の構成は、以下を提供する:
本発明のベクターをそれぞれ含む複数の細菌宿主細胞であって、ベクターによってコードされるCas(及び任意選択で、前記HMcrRNA)は、宿主細胞において発現される、又は発現可能であり、細菌細胞は、第1の亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団により含まれ、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団(前記複数の細菌宿主細胞)を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種である、複数の細菌宿主細胞。
【００６２】
本発明の第21の構成は、以下を提供する:
宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識し、それによって、プログラムされたヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変可能であるようにプログラムされているガイド型ヌクレアーゼであって、ヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、ガイド型ヌクレアーゼ。
【００６３】
一態様では、ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼであり、
(a)Casヌクレアーゼは、配列番号273のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738若しくは738若しくは274のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号273のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、配列番号138〜209から選択されるリピート配列及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG若しくはTCAを含む若しくはからなるPAMとともに作動可能であるか、又は
(b)Casヌクレアーゼは、配列番号261若しくは263のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262若しくは264のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号261若しくは263のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、配列番号210〜213から選択されるリピート配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG若しくはATGを含む若しくはからなるPAMとともに作動可能であるか、又は
(c)Casヌクレアーゼは、配列番号265のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号265のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、配列番号215〜218から選択されるリピート配列及びNNAGAAW、NGGNG若しくはAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含む若しくはからなるPAMとともに作動可能であるか、又は
(d)Casヌクレアーゼは、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ若しくは相同体であり、Casヌクレアーゼは、リピート配列配列番号214とともに作動可能である。
【００６４】
本発明の第22の構成は、以下を提供する:
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム属(Clostridium)感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数のコピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号138〜209から選択されるリピート配列(又はそれと少なくとも70%同一である配列)である、1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号273のアミノ酸配列を含む、又は配列番号738若しくは274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞は死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、クロストリジウム属感染を処置する、方法。
【００６５】
宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞の成長を低減するための宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、クロストリジウム属細胞であり
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のための、HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と、
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【００６６】
システムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためにHM-crRNAをコードし、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【００６７】
本発明の第23の構成は、以下を提供する:
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象において大腸菌感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、大腸菌ではなく、
各宿主細胞は、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号261若しくは263のアミノ酸配列を含む、又は配列番号262若しくは264のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、大腸菌感染を処置する、方法。
【００６８】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、大腸菌細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【００６９】
システムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためにHM-crRNAをコードし、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3は、配列番号261、263及び287〜289から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号262若しくは264を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【００７０】
本発明の第24の構成は、以下を提供する:
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)ストレプトコッカス属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記ストレプトコッカス属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は配列番号266のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、ストレプトコッカス属感染を処置する、方法。
【００７１】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、ストレプトコッカス属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号266を含む)又はそのオルソログ又は相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【００７２】
システムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためにHM-crRNAをコードし、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3は、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は任意選択で、配列番号266を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【００７３】
本発明の第25の構成は、以下を提供する:
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてサルモネラ属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)サルモネラ属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記サルモネラ属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)PAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、サルモネラ属感染を処置する、方法。
【００７４】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、サルモネラ属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピートと、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号268若しくは270を含む)又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【００７５】
システムにおいて使用するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためにHM-crRNAをコードし、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3は、任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は任意選択で、配列番号268若しくは270を含むヌクレオチド配列によってコードされ、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と、
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【００７６】
本発明はまた、このような方法において使用するための、例えば、ヒト又は動物対象において宿主細胞感染を処置又は予防するための、システム、遺伝子操作されたヌクレオチド配列及び複数の細菌担体細胞を提供する。
【００７７】
本明細書において、任意の構成において、例えば、cRNAは、1つ又は複数のシングルガイドRNA(gRNA)によって提供され、この場合には、「CRISPRアレイ」は、前記gRNA)をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を指し得る。したがって、配列は、細胞内でgRNAを発現するために、宿主細胞において発現されることが可能である。
【００７８】
本発明は、細菌の観点で主に説明されるが、古細菌にも準用可能である。
【００７９】
本明細書における1つの構成での任意の特性は、一例では、本明細書における1つ又は複数の態様にこのような組合せを含める可能性のために、本発明の異なる構成と組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】キシロース誘導可能システムを示す図である。
【図２】ST1-CRISPRアレイを示す図である。
【図３】この研究において使用した株のTH寒天上でのスポットアッセイを示す図である。全ての株を、TH寒天上37℃において20時間成長させた。一晩培養物の連続希釈を、大腸菌(E.coli)、Lラクチス(Lactis)及びSミュータンス(mutans)について二連で、並びにSサーモフィルス(thermophilus)の両方の株について三連で行い、個々のコロニーをカウントした。
【図４】異なる培養条件下でのSサーモフィルス、Sミュータンス(mutans)、Lラクチス(lactis)及び大腸菌の選択的成長を示す図である。テトラサイクリンを使用して、SサーモフィルスLMD-9を選択的に成長させることはできなかった。しかしながら、3gl-1のPEAが、大腸菌の成長を制限しながら、SサーモフィルスLMD-9を選択的に成長させることを証明した。図4Aは、共生(commencal)腸内細菌を示す。図4Bは、標的種の類を示し、図4Cは、標的種を示す。
【図５】2つのキシロース誘導カセットの構築を説明する図である(図5B及び5Cは、図5Aにおいて説明する野生型Bメガテリウム(megaterium)オペロンに基づく(Xieら、2013年))。図5B:野生型Bメガテリウムオペロン(左)に基づく2つのキシロース誘導カセットの構築(中央、右)(Xieら、2013年)。
【図６】プラスミドpBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldhaを用いたストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptoccocus thermophilus)におけるキシロース誘導可能なカセットの特徴決定を示した図である。蛍光の明らかな応答を、キシロースの量の増大に伴い観察することができる。
【図７】pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylAにおけるCRISPRアレイの設計を説明する図である。アレイは、誘導可能なキシロースプロモーター下でSサーモフィルス遺伝子及び強力な恒常的プロモーターP3A下でtracrRNAを標的にする2つのスペーサー配列を含有する。
【図８】プラスミドpBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldh+XylAを用いた(図8A)及びpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylAを用いた(図8B)ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9の形質転換効率を示す図である。
【図９】キシロース誘導可能なCRISPR装置の図である。キシロース誘導の際、Sサーモフィルス(thermophiles)LMD-9ゲノム上のpolIIIとtetAの両方を標的にするCRISPRアレイが発現される。恒常的に発現されるtracrRNAと一緒に、複合体がCas9と共に形成される。この複合体は、SサーモフィルスLMD-9ゲノムにおけるtetA及びpolIII遺伝子において二本鎖中断を導入し、これにより、制限された細胞生存率を生じる。
【図１０】プラスミドpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA(図10A及び10C)又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA(図10B及び10D)を用いたストレプトコッカス・サーモフィルスDSM20617(T)の成長阻害を示す図である。誘導されない(図10A及び10B)並びに誘導された(図10C及び10D)。63時間のインキュベーション後に、写真を撮った。最終の左コーナーにおけるコロニーカウント(最初の行:>1000、>1000、最終の行:336、113)。
【図１１】Sサーモフィルス、Lラクチス及び大腸菌由来の16S配列の最尤系統樹を示す図である。
【図１２】pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylAプラスミドのいずれかを有する大腸菌、Lラクチス及びSサーモフィルスの同時培養における選択的Sサーモフィルス(thermophilus)成長阻害を示す図である。pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylAプラスミドを有する大腸菌の間で成長差はなかった(図12B及び12E)。しかしながら、本発明者らが予想した通り、Sサーモフィルス(2.5 gl-1 PEAを添加したTH寒天上で選択的に成長する、図12C及び12F)は、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA(強力)又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA(弱い)プラスミド間での形質転換効率における減少を示す。これにより、本発明者らは、細胞の混合集団における標的Sサーモフィルス亜集団の選択的成長阻害を示した。最終の左コーナーにおけるコロニーカウント(最初の行:>1000、>1000、68、最終の行:>1000、>1000、32)。
【図１３】spCas9及びリボソームRNAサブユニット16sを標的にする自己標的化sgRNAの発現を制御する制御因子を示す図である。
【図１４】外来CRISPR-Casシステムによる大腸株の特異的標的化を示す図である。sgRNAは、大腸菌TOP10の様なK-12由来大腸株のゲノムを標的にし、一方、試験した他の株は影響されなかった。
【図１５】この研究において使用した個々の細菌種の連続希釈液及びCRISPR-Cas9システムの誘導なしでのTH寒天における混合培養物を用いたスポットアッセイを示す図である。
【図１６】異なる選択培地上での希釈液103のスポットアッセイを示す図である。2.5 gl-1PEAを含むTHは、Bスブチリス(subtilis)単独の選択培地である。マルトースを添加したマッコンキーは、グラム陰性及び腸内桿菌を選択的に単離し、マルトース発酵に基づきそれらを鑑別するように設計された細菌用選択及び鑑別培地である。したがって、TOP10ΔmalK変異体は、プレート上で白色のコロニーを生じ、一方、Nissleは、ピンク色のコロニーを生じる;Aは、大腸菌(E coli)ΔmalK、Bは、大腸菌Nissileであり、Cは、Bスブチリス(subtilis)であり、Dは、Lラクチス(L lactis)であり、Eは、混合培養物であり;マッコンキー-/B及びEでの画像は、ピンク色を出現し;マッコンキー+/B及びEでの画像は、ピンク色を出現する。
【図１７】異なる培地及び選択プレート上でのこの研究において使用した細菌の選択的成長を示す図である。
【図１８】接合完了体Cディフィシル(difficile)の完全な死滅を示す図である。ベクターとしての接合プラスミドによる、生菌担体細菌種からもたらされたgRNAをコードするCRISPRアレイを使用した、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)の完全な高精度の死滅が示される。ベクターを含有する担体細菌(大腸菌)ドナー株を、設計したアレイのデリバリーの際に死滅されたクロストリジウム・ディフィシルを用いて作製した。これは、クロストリジウム・ディフィシルの内因性Cas3機構を利用した。クロストリジウム・ディフィシル細胞の100%の死滅を達成し、この図において示す。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
微生物集団成長の阻害及び微生物比の変更
本発明は、細菌集団成長を阻害する、又は細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更するための、例えば、ヒト又は動物マイクロバイオームを変更するための、例えば、ヒトの細菌叢におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス属)、ファーミキューテス門及び/又はグラム陽性菌又は陰性菌の割合を変更するための、方法、使用、システム、アレイ、cRNA、gRNA及びベクターに関する。例えば、本明細書において記載される第1〜第3の構成を参照のこと。本発明は、例えば、宿主細菌細胞、例えば、バクテロイデス門の細胞又はファーミキューテス門の細胞の1つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を改変することを含む。
【００８２】
2つの主な腸管内の門、バクテロイデス門及びファーミキューテス門のそれぞれのレベルが、ヒト及び無菌マウスの両方において肥満症と関連していると指摘するいくつかの研究がある。研究の著者らは、炭水化物代謝が重要な因子であると推定している。彼らは、肥満個体の細菌叢は、より重度にファーミキューテス門の細菌が豊富であり、バクテロイデス門が少ないことを観察しており、彼らは、この細菌混合物は、与えられた食物からエネルギーを引き出すことにおいて痩せた個体の細菌叢(反対の割合を有する)よりも効率的であり得ると推測している。いくつかの研究において、彼らは、バクテロイデス門の相対的存在量は、肥満個体が体重を減らすと増加すること、更に、肥満マウスの細菌叢が無菌マウスに伝達されると、これらのマウスは、痩せたマウスの細菌叢を受け取った対照群よりもより多くの脂肪を蓄えることを見い出した。例えば、Turnbaugh,P.J.、R.E.Ley、M.A.Mahowald、V.Magrini、E.R.Mardi及びJ.I.Gordon. 2006、「An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest」、Nature 444:1027〜1131頁を参照のこと。
【００８３】
概念
本発明は、宿主細胞標的を伴う以下の概念を提供する:
1.細菌宿主細胞を死滅させるための、又はその成長を低減するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、各宿主細胞について、システムは、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、
Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、使用。
【００８４】
概念1は、代替として、以下を提供する:
細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更するための、宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌は、宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、任意選択で、Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、使用。
【００８５】
概念1はまた、以下を提供する:細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更する方法であって、第2の細菌は、宿主細胞を含み、混合集団を宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムと組み合わせ、それによって、第2の細菌宿主細胞を死滅させる、又は前記細胞の成長を低減し、それによって、前記比を変更する工程を含み、各宿主細胞について、システムは、以下の(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドする配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換し、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、
任意選択で、Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、
標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる又は宿主細胞成長を低減する、方法。
【００８６】
概念1はまた、以下を提供する:
細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を変更するための、宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌は、各々標的プロトスペーサー配列を含む複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは、上で定義した構成要素(ii)及び(iii)を含み、システムは、Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含み、前記構成要素(ii)及び前記Casをコードする配列は、宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクターにより含まれ、それによって、(i)によってコードされるHM-crRNAは、宿主細胞において標的配列を改変するためにCasを標的にガイドし、
Casヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性であり、標的配列は、Casによって改変され、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞成長を低減する、使用。
【００８７】
一実施形態では、第1の細菌の成長は阻害されない、又は前記宿主細胞の成長阻害は、第1の細胞の少なくとも2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、50x、100x又は1000xの成長阻害である。成長阻害は、阻害倍数として、又はパーセンテージとして(本明細書において記載されるような)算出できる。別の例では、阻害は、培養サンプルにおいて分光光度計によって測定し、所定のcrRNA/gRNA処置期間の開始時及び終了時に光吸光度(例えば、OD600での)を調べる(倍数又はパーセンテージによる阻害を決定する場合にはこのような期間の記載を参照のこと)。一例では、宿主細胞サンプルの吸光度の増大(所定の期間の開始時の吸光度をその期間の終了時の吸光度と比較した)は、対照サンプル(前記cRNA又はgRNAに曝露されていない)についてよりも小さい、例えば、前者の増大は、後者についてよりも、少なくとも10、100、1000、10000若しくは100000倍小さい(例えば、OD600として調べられる)。一例では、成長阻害の決定(すなわち、所定の期間の最後)は、各サンプルの中間対数増殖相(例えば、所定の期間の開始後6〜7時間)で行う。
【００８８】
一例では、宿主細胞は、生物又は環境(例えば、水路細菌叢、水細菌叢、ヒト若しくは動物腸細菌叢、ヒト若しくは動物口腔細菌叢、ヒト若しくは動物膣細菌叢、ヒト若しくは動物皮膚若しくは毛細菌叢又はヒト若しくは動物腋窩細菌叢) により含まれる細菌叢集団により含まれ、集団は、生物又は環境と相利共生又は共生である第1の細菌及び前記宿主細胞を含む第2の細菌を含み、宿主細胞は、生物又は環境にとって有害な(例えば、病原性)である。一実施形態では、集団は、ex vivoである。
【００８９】
第2の細菌亜集団に対する第1の細菌亜集団の比が増大される。
【００９０】
概念1はまた、以下に更に記載されるような宿主細胞成長を阻害するための使用を提供する。
2.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための(例えば、概念1の使用のための)宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、以下の(i)〜(iv)に従う構成要素を含み:
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1種の核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現させるためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素が、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する少なくとも1種の核酸ベクターの間で分離され、
任意選択で、構成要素(i)は、宿主細胞にとって内因性である、システム。
【００９１】
代替において、HM-crRNA及びtracrRNAは、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれる。
【００９２】
内因性Casヌクレアーゼを利用することによって、本発明の実施形態は、内因性Casヌクレアーゼ活性を使用する(すなわち、ヌクレアーゼ活性を活性化又は増強するための宿主細胞の先行する遺伝子改変を必要としない)。したがって、一例では、Casヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型遺伝子によってコードされる。一例では、ヌクレアーゼは、宿主細胞において内因性Casヌクレアーゼ(又はCasヌクレアーゼ遺伝子)レプレッサーの阻害を伴わずに細胞死滅又は成長低減を達成するのに活性である。したがって、本発明は、有効なCas媒介性細胞死滅又は成長低減を引き起こすための先行する操作を必要とすることなく、野生型細菌集団に対処することができる。したがって、集団がその野生型環境(例えば、水路又はヒト若しくは動物マイクロバイオームにより含まれている)にあるときに、集団をcRNAに曝露することができる。
【００９３】
一例では、第2の細菌は、バクテロイデス門(Bacteroidetes)(例えば、バクテロイデス属(Bacteroides))の細胞である。一例では、第2の細菌は、ファーミキューテス門(Firmicutes)の細胞である。使用、システム又は方法は、例えば、体重の増加又は肥満症(例えば、第2の細菌がファーミキューテス門の細胞である)を処置又は予防するためである、例えば、腸細菌叢集団(例えば、ex vivo又はin vivo)における比を変更するために使用される。
【００９４】
一例では、使用、方法、システム、ベクター、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、cRNA又はgRNAは、混合集団を含むヒト又は非ヒト動物の細菌叢を治療的又は予防的にバランスを取り直すため、例えば、肥満症、糖尿病IBD、GI管状態又は口腔状態を処置又は予防するためである。
【００９５】
一例では、本明細書において述べられる細菌叢は、ヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚血流、咽頭又は口腔マイクロバイオーム)の細菌叢である。
【００９６】
一例では、本明細書において述べられる細菌叢は、腋窩細菌叢であり、使用、方法、システム、ベクター、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、cRNA又はgRNAは、ヒトの体臭を予防又は低減するためである。
【００９７】
一例では、宿主細胞集団又は混合集団は、ヒト消費用の飲料又は水(例えば、水路又は飲料水)によって保持される。
【００９８】
一例では、使用、方法、システム、ベクター、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、cRNA又はgRNAは、病原性感染を低減するため、又は腸若しくは経口細菌叢のバランスを取り直すため、例えば、ヒト若しくは動物において肥満症若しくは疾患を処置若しくは予防するためのものである。例えば、使用、方法、システム、ベクター、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、cRNA又はgRNAは、腸細菌叢においてクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium dificile)細菌をノックダウンするためのものである。
【００９９】
一例では、第1の細菌は、バクテロイデス属の細菌であり、第2の細菌は、ファーミキューテス門又は病原性細菌、例えば、腸内細菌である。一例では、宿主細胞又は第2の細菌は、例えば、ストレプトコッカス属(Streptococcus)(例えば、サーモフィルス(thermophilus)及び/又はピオゲネス(pyogenes))、バチルス属(Bacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、リステリア属(Listeria)、クロストリジウム属(Clostridium)、ヘリオバクテリウム属(Heliobacterium)及びスタフィロコッカス属(Staphylococcus)の細胞から選択されるファーミキューテス門の細胞である。一例では、混合集団は、バクテロイデス属及びメトロニダゾール(MTZ)耐性Cディフィシル(dificile)株630亜集団を含有し、宿主細胞は、前記Cディフィシル細胞を含む。
【０１００】
一例では、宿主細胞集団、混合集団又はシステムは、腸又は経口細菌叢を定植する及びそのバランスを取り直すために、ヒト又は非ヒト動物に投与するための組成物(例えば、飲料、マウスウォッシュ又は食料)により含まれる。
【０１０１】
一例では、使用又は方法、又はシステム、ベクター、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、cRNA又はgRNAの生成物は、粘膜、腸、口腔、鼻腔内、直腸内、膣内、眼内又は頬側投与によるヒト又は非ヒト動物への投与のためである。
【０１０２】
本明細書における任意の構成の一例では、混合集団(アレイ、gRNA、crRNA又は遺伝子操作された配列と組み合わせる前)は、ヒト又は動物対象の細菌叢(microiota)、例えば、腸若しくは本明細書において開示される任意のその他の細菌叢又は本明細書において開示される任意のマイクロバイオームの細菌叢のサンプルである。一例では、この場合には、本発明の使用の生成物は、本明細書において開示されるようなヒト又は動物対象の処置又は療法にとって有用である改変された細菌叢集団である。
3.ベクター(単数又は複数)が、Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼをコードする配列を欠く、概念2のシステム。
4.各宿主細胞が、ヒト細菌叢において見られる株又は種のものである、任意選択で、宿主細胞が、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞が、腸内細菌科又はヒトに関して(例えば、ヒト腸において)プロバイオティックである、共生している若しくは相利共生である細菌である、概念1から3のいずれか1つの使用、方法又はシステム。一例では、宿主細胞は、ファーミキューテス門(Firmicute)、例えば、ストレプトコッカス属の細胞である。
5.混合細菌集団における(例えば、ヒトにおける、例えば、ヒト細菌叢における)バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス属)の細菌の割合の変更のための、概念1から4のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
6.ファーミキューテス門に対するバクテロイデス門の相対比を増大するための概念5の使用、方法又はシステム。
7.前記Casヌクレアーゼが、細胞の内因性II型CRISPR/Casシステムによって提供される概念1から6のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
8.構成要素(iii)が、宿主細胞に対して内因性である、概念1から7のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
9.標的配列が、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子又は必須遺伝子により含まれる概念1から8のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
10.アレイが抗生物質組成物により含まれ、アレイが、抗生物質剤と組み合わせた状態にある、概念1から9のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
11.代替としてHM-crRNA及びtracrRNAが、例えば、ベクターによって提供されるシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、概念1から10のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
12.宿主細胞が、対象のHM-配列をコードする遊離末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含む、及び/又はシステムが、HM-DNAをコードする配列を含み、HM-DNAが、HM-DNAを宿主ゲノムに(例えば、染色体若しくはエピソーム部位)へ挿入するための標的配列中の、又はその両端に位置する配列(単数若しくは複数)に対してそれぞれ相同である配列(単数若しくは複数)を含む、概念1から12のいずれか1つの使用、方法又はシステム。
13.内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞を改変するための遺伝子操作された核酸ベクターであって、
(a)概念1から12のいずれか1つに記載のCRISPR/Casシステム、方法又は使用において使用するための複数の異なるcrRNA(例えば、gRNA)を発現するための核酸配列を含み、
(b)任意選択で、Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞において第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞において第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
(c)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、任意選択で、両遺伝子は異なり、
(d)第1の配列は、抗生物質耐性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、
(e)第1の配列は、必須遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA により含まれ、又は
(f)第1の配列は、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれる、
遺伝子操作された核酸ベクター。
14.ベクターによってコードされるcRNA(例えば、シングルガイドRNA)とともに作動可能である1つ又は複数のCasを含む、宿主細胞の内側の概念13のベクター。
15.HM-CRISPRアレイが、同一スペーサーの複数のコピーを含む、概念1から14のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
16.ベクターが、複数のHM-CRISPRアレイを含む、概念1から15のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
17.各ベクターが、プラスミド、コスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージである、概念1から16のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
18.システム又はベクターが、crRNA(例えば、gRNA)をコードする核酸配列の2つ、3つ又はそれより多いコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性又は必須遺伝子配列)を標的化するための同一スペーサー配列を含む、概念1から17のいずれか1つの使用、方法、システム又はベクター。
19.コピーが2つ又はそれより多いベクターCRISPRアレイの間で分離される、概念18の使用、方法、システム又はベクター。
20.概念1から19のいずれか1つにおいて列挙されたシステム又はベクターを含む細菌宿主細胞。
21.抗生物質剤(例えば、ベータ-ラクタム系抗生物質)と組み合わせた、概念2〜20のいずれか1つのシステム、ベクター又は細胞。
22.宿主細胞又は各宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、リステリア属、大腸菌(E coli)、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はクロストリジウム属の宿主細胞である、概念1から21のいずれか1つの使用、方法、システム、ベクター又は細胞。一例では、宿主細胞又は各宿主細胞は、ファーミキューテス門の細胞、例えば、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、リステリア属又はクロストリジウム属の細胞である。
【０１０３】
一例では、各CRISPRアレイは、宿主細胞におけるそれぞれのcrRNA(例えば、シングルガイドRNAにより含まれる)の発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、(ii)S1は、前記標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである。
【０１０４】
一例では、R1及びR1'は、それぞれ、第2の宿主細胞種のCRISPRアレイの第1及び第2のリピート配列と少なくとも95%同一である。一例では、R1及びR1'は、それぞれ、前記種の、例えば、前記種の前記宿主細胞のCRISPRアレイの第1の(最も5')及び第2の(第1のリピートのすぐ3'にあるリピート)リピート配列に対して、少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である。一例では、R1及びR1'は、前記宿主細胞において標的を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼ(例えば、Sサーモフィルス、Sピオゲネス又はSオーレウス(aureus)Cas9)とともに機能的である。
【０１０５】
本発明の代替概念1の使用は、実施例によって実証されるように以下を提供する:
【０１０６】
集団の成長を阻害するための細菌宿主細胞集団の野生型内因性Casヌクレアーゼ活性の使用であって、各宿主細胞は、野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内因性CRISPR/Casシステムを有し、使用は、集団の宿主細胞を形質転換することを含み、形質転換される宿主細胞は各々、宿主細胞において宿主改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)を提供するために遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換され、HM-cRNA又はgRNAは、内因性Casを標的にガイドするために宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能である配列を含み、cRNA又はgRNAは、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼに対して同族であり、宿主細胞の形質転換後、集団の成長が阻害される、使用。
【０１０７】
以下の実施例では、阻害は、固体表面の細菌集団(グラム陽性ファーミキューテス門)において取り組まれた。宿主細胞集団成長の>10倍の阻害が達成された。標的化は、抗生物質耐性遺伝子及び必須遺伝子に向けられた。本発明は、抗生物質耐性菌の成長を阻害するのに有用となり、標的配列は、抗生物質耐性遺伝子の配列である。一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列の、抗生物質との共投与は有効であり得る。これは、ヒト若しくは動物対象における宿主細胞感染のより完全な処置若しくは予防を提供し得る、及び/又はヒト若しくは動物への投与のための治療上有効な抗生物質用量の低減を可能にし得る。これは、抗生物質の過剰投与並びにヒト及び動物集団における耐性の発生に関する懸念の増大を考慮しても有用である。
【０１０８】
表面上の宿主細胞成長を阻害する本発明の能力の実証は、本発明が、ヒト又は動物対象において本明細書において開示されるような細菌叢によって媒介される又は引き起こされる疾患又は状態を処置又は予防するためのものである実施形態では、重要であり、望ましいものである。このような細菌叢は、通常、対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼内、膣、肛門、耳、鼻又は咽頭組織)と接触しており、したがって、表面上の細菌叢細菌種(ストレプトコッカス属によって例示される)の成長を阻害する活性の実証は、この有用性を支持すると本発明者らは考えている。
【０１０９】
一例では、野生型宿主細胞内因性Cas9又はcfp1活性が使用される。遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、外因性Casヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせた状態にない場合もある。
【０１１０】
一例では、宿主細胞は、野生型(例えば、遺伝子操作されていない)細菌細胞である。別の例では、宿主細胞を、遺伝子操作し(例えば、外因性ヌクレオチド配列を染色体に導入するために、又は例えば、宿主細胞の染色体若しくはプラスミド上の内因性ヌクレオチド配列を改変するために)、宿主細胞は、crRNA又はgRNAとともに作動可能である野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内因性CRISPR/Casシステムを含む。一例では、前記形質転換後に前記宿主細胞の細菌コロニーの形成が阻害される。一例では、前記形質転換後に、宿主細胞の増殖が阻害される。一例では、前記形質転換後に、宿主細胞は、死滅する。
【０１１１】
「に対して同族」とは、内因性Casが、宿主細胞において標的にガイドされるべきcrRNA又はgRNA配列とともに作動可能であることを意図する。当業者は、このようなCasガイドは、一般に、細菌細胞におけるCRISPR/Cas活性、例えば、内因性活性野生型CRISPR/Casシステムを有する細菌細胞における野生型CRISPR/Cas活性の特性であるということを理解するであろう。
【０１１２】
「野生型」Cas活性によって、当業者には明らかとなろうが、内因性Casは、遺伝子操作されたCasではない、又は細胞が、内因性Cas活性を抑制解除するように遺伝子操作されていないということが意図される。これは、Casヌクレアーゼ活性が天然で抑制されている特定の細菌とは対照的である(すなわち、野生型Casヌクレアーゼ活性がない、又は本発明にとって有用ではなく、反対に、例えば、内因性Cas活性が、細胞集団成長阻害を達成するために利用され得る場合にin situで野生型宿主細胞に対処することに適用可能である)。
【０１１３】
一例では、宿主細胞集団成長の阻害は、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列に曝露されていない前記宿主細胞の成長と比較して、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10倍である。例えば、成長阻害は、宿主細胞の第2のサンプル(単独又は混合細菌集団中)のコロニー数と比較して、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10倍の宿主細胞の第1のサンプル(単独又は混合細菌集団中)の少ない細菌コロニー数によって示され、第1の細胞は、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列によって形質転換されているが、第2のサンプルは、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列に対して曝露されていない。一実施形態では、コロニー数を、第1のサンプルが遺伝子操作された配列に曝露された後、12、24、36又は48時間で調べる。一実施形態では、コロニーを、固体寒天上in vitroで(例えば、ペトリディッシュで)成長させる。したがって、成長阻害は、標的配列を含む細胞又は集団の成長における低減(処置なし、すなわち、対照サンプル成長と比較して<100%成長)によって示され得る、又はこのような成長の完全排除であり得るということが理解される。一例では、宿主細胞集団の成長は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は95%低減される、すなわち、所定の期間(例えば、宿主細胞においてcRNA又はgRNAと組み合わせた後24時間又は48時間)にわたって、すなわち、宿主細胞集団の成長は、前記cRNA若しくはgRNAに曝露されていないが、前記所定の期間の間、同一条件下で維持されてきた対照宿主細胞集団の成長よりも少なくともこのようなパーセント低い。一例では、成長の低減パーセントは、前記期間の最後に(例えば、対照サンプルの中間対数増殖相に)各集団のサンプル中のコロニー数を比較することによって決定する。例えば、時間ゼロで試験集団を、crRNA又はgRNAに曝露した後、試験及び対照集団のサンプルをとり、各サンプルを寒天プレートにプレーティングし、前記所定の期間同一条件下でインキュベートする。期間の最後に、各サンプルのコロニー数及び相違パーセンテージをカウントする(すなわち、試験コロニー数を対照コロニー数によって除し、次いで、100を乗じ、次いで、結果を100から差し引いて、成長低減パーセンテージを得る)。対照コロ
ニー数を試験コロニー数によって除することによって相違倍数を算出する。
【０１１４】
したがって、集団における宿主細胞数の増殖の低減によって集団成長の阻害を示すことができる。これは、ヌクレアーゼによる細胞死滅及び/又は標的プロトスペーサー配列でのヌクレアーゼの作用による宿主細胞増殖(分裂及び/又は細胞成長)の下方制御によるものであり得る。本明細書において開示されるような処置又は予防の実施形態では、ヒト又は動物対象の宿主細胞負担が低減され、それによって、疾患又は状態が処置される(例えば、低減又は排除される)又は予防される(すなわち、疾患又は状態を発生する対象のリスクが低減される若しくは排除される)。
【０１１５】
本発明は、飲料及び食料(又はこれらを製造、加工若しくは貯蔵する装置)により含まれる環境において(例えば、水又は水路、冷却又は加熱装置において)天然に見られる野生型細菌集団又はヒト若しくは動物細菌叢により含まれる野生型細菌集団を標的化するのに有用である。したがって、死滅又は成長阻害に対して受容性にする宿主細胞のプレ改変があり得ない、又は望ましくない状況(例えば、対象の腸又はその他の位置の細菌叢のin situ処置が望まれる場合)には、本発明には、有用性がある。別の適用では、本発明には、宿主細胞によって引き起こされる又は媒介される疾患又は状態を処置又は予防するために、ヒト又は動物対象に投与するための医薬をex vivo製造するために有用性があり、医薬は、本発明の使用又は方法の生成物である改変された混合細菌集団(例えば、1人又は複数のヒトドナーの糞便又は腸細菌叢から得られた)を含み、集団は、宿主細胞の種又は株とは異なる種又は株の細菌の亜集団を含む。前者の亜集団細胞は、標的を含まず、したがって、使用又は方法によって改変されない。したがって、例えば、本明細書において開示される代謝若しくはGI状態又は疾患を処置又は予防するための医薬を製造するために、混合集団において特定のファーミキューテス門の亜集団の割合を低減し、バクテロイデス門を温存するために方法を使用できる。このような方法で、本発明は、このような使用のための、又はヒト若しくは動物における前記処置又は予防のための改変された細菌移植片(例えば、改変された糞便移植片)医薬を提供できる。例えば、in vitroで1種又は複数の細菌叢を改変して、医学的使用(例えば、代謝状態(肥満症又は糖尿病等)又はGI管状態(例えば、本明細書において記載される任意のこのような状態)又は癌(例えば、GI管癌)の処置又は予防)のための、又は化粧品若しくは個人的衛生使用のための(例えば、ヒトでの局所使用のための、例えば、ヒトの腋窩若しくはヒトのその他の関連位置への局所適用によって腋窩若しくはその他の体臭を低減するための)、ヒト又は動物へ投与するための、細菌の改変された収集物を提供するために方法を使用できる。別の例では、アレイ、crRNA、gRNA又は遺伝子操作されたヌクレオチド配列をヒト又は動物に投与し、宿主細胞は、ヒト又は動物によって保持される、例え
ば、ヒト又は動物の細菌叢(腸細菌叢又は本明細書において開示される任意のその他の種類の細菌叢(micriobiota)等)により含まれる。このような方法で、宿主細胞によって媒介される又は引き起こされる疾患又は状態を処置又は予防できる。一例では、形質転換はin vitroで実施され、任意選択で、アレイ、crRNA、gRNA又は遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞にエレクトロポレーションされる核酸により含まれる。一例では、核酸はRNA(例えば、gRNAのコピー)である。別の例では、核酸は、宿主細胞におけるその発現のためにcrRNA又はgRNAをコードするDNAである。
【０１１６】
したがって、一例では、本発明は、対象の細菌叢の宿主細胞によって媒介される又は引き起こされる疾患又は状態を処置又は予防するために、ヒト又は動物対象の細菌叢により含まれる野生型細菌宿主細胞の集団において宿主細胞改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)を提供するための遺伝子操作されたヌクレオチド配列を提供し、cRNA又はgRNAは、Casを標的にガイドするために、宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能であり、Casを標的にガイドする配列を含み、cRNA又はgRNAは、野生型ヌクレアーゼ活性を有する内因性宿主細胞Casヌクレアーゼに対して同族であり、宿主細胞の形質転換後に、集団の成長が阻害され、疾患又は状態が処置又は予防される。
【０１１７】
一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、本明細書において定義されるようなHM-CRISPRアレイを含む。一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、シングルガイドRNAをコードする。一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、ガイドRNA(例えば、シングルガイドRNA)又はcrRNAである。一例では、遺伝子操作された配列は、宿主細胞に感染可能であるバクテリオファージにより含まれ、形質転換は、バクテリオファージによる宿主細胞の形質導入を含む。バクテリオファージは、本明細書において記載されるようなバクテリオファージであり得る。一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞を形質転換可能であるプラスミド(例えば、接合性プラスミド)により含まれる。プラスミドは、本明細書において記載されるようなプラスミドであり得る。一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞に及び/又は宿主細胞間で伝達可能であるトランスポゾンにより含まれる。トランスポゾンは、本明細書において記載されるようなトランスポゾンであり得る。
【０１１８】
本発明の任意の使用又は方法は、細胞においてcRNA又はgRNAを産生するために宿主細胞を核酸ベクターで形質転換することを含み得る。例えば、遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含むベクター又は核酸は、経口的に、静脈内に、局所に、眼内に、鼻腔内に、吸入によって、直腸投与によって、耳によって、膣投与によって、又は本明細書において開示される任意のその他の投与経路によって、そうでなければ、混合細菌集団を含む(例えば、ヒト又は動物の細菌叢の一部として)ヒト又は動物に投与され、投与によって、宿主細胞がベクター又は核酸を用いて形質転換される。
【０１１９】
一例では、宿主細胞集団は、ex vivoである。一例では、混合集団は、ヒト又は動物対象により含まれ、対象における宿主細胞感染が処置又は予防される。
【０１２０】
一例では、第1及び第2の細菌は、細菌が相利共生的に生存する微生物コンソーシアムにより含まれる。一例では、コンソーシアムは、ヒト又は動物細菌叢であり、一例では、コンソーシアムは、ヒト又は動物により含まれる(例えば、使用、システム、遺伝子操作された配列、ベクター又は細胞は、ヒト又は動物中のコンソーシアムの宿主細胞による感染を処置するためのものであり、例えば、宿主細胞は、ヒト又は動物において、抗生物質耐性又は有害な疾患若しくは状態を媒介する又は引き起こす)。以下の実施例において使用される種(大腸菌、Lラクチス(lactis)及びSサーモフィルス)は、ヒト及び動物腸細菌叢において相利共生的に共存する株である。実施例はまた、混合グラム陽性及びグラム陰性細菌集団における標的化も対処する。更に、実施例は、両方ともヒト細菌叢において見られる、ファーミキューテス門(Sサーモフィルス)の集団及び腸内細菌科(Enterobacteriaceae)(大腸菌)の集団に対処する。腸内細菌科のその他の例として、サルモネラ属、エルシニア・ペスティス(Yersinia pesti)、クレブシエラ属(Klebsiella)、シゲラ属(Shigella)、プロテウス属(Proteus)、エンテロバクター属(Enterobacter)、セラチア属(Serratia)及びシトロバクター属(Citrobacter)がある。
【０１２１】
一例では、方法、使用、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、アレイ、crRNA、gRNA、ベクター又はシステムは、ヒト腸細菌叢集団において宿主細胞感染を処置するためのものであり、任意選択で、集団はまた、ヒト共生腸内細菌及び/又は腸内細菌科である第1の細菌を含み、例えば、宿主細胞及び共生細胞(第1及び第2の細菌)は、ヒト腸細菌叢において相利共生的に生存する。
【０１２２】
一例では、使用又はシステムは、バクテロイデス門の細菌及びその他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門の細菌の割合の変更のためのものである。例えば、集団における1種又は複数の又はすべてのファーミキューテス門に対する(例えば、ストレプトコッカス属に対する)バクテロイデス門の相対比を増大するためのものである。この場合には、宿主細胞は、標的を含むファーミキューテス門の細胞であり得る。一例では、集団は、ヒト又は動物対象により含まれる細菌叢の細菌集団であり、方法、使用、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、ベクター又はシステムは、(i)含まれる(例えば、混合集団により含まれる)前記宿主細胞によって対象において感染を処置するため、(ii)対象において前記宿主細胞によって媒介される状態若しくは疾患を処置若しくは予防するため、(iii)前記宿主細胞によって引き起こされる若しくは媒介されるヒトの体臭を低減するため、又は(iv)ヒトの個人的衛生処置のためのものである。一例では、本発明の遺伝子操作されたヌクレオチド配列、アレイ、crRNA、gRNA又はベクターは、このようなシステムにおける使用又は本発明の使用のためのものである。
【０１２３】
一例では、状態又は疾患は、代謝又は胃腸の疾患又は状態、例えば、肥満症、IBD、IBS、クローン病又は潰瘍性大腸炎である。一例では、状態又は疾患は、癌、例えば、固体腫瘍又はGI癌(例えば、胃癌)、肝臓癌又は膵臓癌である。一例では、状態は、抗生物質(例えば、本明細書において開示される任意の抗生物質)に対して耐性であるか、又は応答性が低減している。
【０１２４】
一例では、細胞は、細胞における前記HM-crRNAの産生において構成要素(ii)とともに作動可能である内因性RNアーゼIIIを含む。代替において、1種又は複数のベクターは、宿主細胞におけるRNアーゼの発現のためのこのようなRNアーゼIIIをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
一例では、必須遺伝子(標的を含む)は、細胞のDNAポリメラーゼをコードする。これは、以下に例示される。
【０１２６】
使用、システム、ベクター又は細胞の一例では、アレイ、cRNA又はgRNAは、NGG、NAG、NGA、NGC、NGGNG、NNGRRT又はNNAGAAWプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば、AAAGAAA又はTAAGAAA PAM(これらの配列は、5'から3'に記載されている)に隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能である配列を含む。一実施形態では、PAMは、プロトスペーサー配列の3'末端にすぐ隣接している。一例では、Casは、Sオーレウス、Sサーモフィルス(theromophilus)又はSピオゲネスCasである。一例では、Casは、Cpf1であり、及び/又はPAMは、TTN又はCTAである。
【０１２７】
一例では、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、crRNA、gRNA又はアレイは、抗生物質剤と組み合わせた状態にあり、例えば、標的は、抗生物質耐性遺伝子により含まれ、抗生物質は、前記薬剤である。実施形態では、宿主細胞は、抗生物質に対して感受性である。例えば、抗生物質を使用して宿主細胞の存在の感染(例えば、集団を含むヒト又は製造容器/装置における)を根絶するには不十分な感受性があり得るが、抗生物質は、宿主細胞亜集団の大きさ又は成長を弱らせることができる、又は低減することができ、一方で、さらなる死滅又は成長阻害は、本発明に記載のCas改変(例えば、標的切断)を使用して達成される。
【０１２８】
本発明は、ヒト又は動物対象における前記宿主細胞の感染の抗生物質(第1の抗生物質) 処置の方法のための、使用、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、ベクター又は細胞を提供し、抗生物質耐性遺伝子(第1の抗生物質に対する耐性について)が、宿主細胞においてシステム又はベクターによってCasによって標的とされ、方法は、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、ベクター又は細胞及び抗生物質を対象に投与することを含む。遺伝子は、宿主細胞において下方制御され、すなわち、遺伝子によってコードされるタンパク質生成物の発現が低減又は排除され、それによって、抗生物質耐性は下方制御される。感染は、対象において低減又は予防される。一例では、抗生物質は、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、ベクター又は細胞と同時に投与され、別の例では、投与は、逐次である(例えば、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作されたヌクレオチド配列、ベクター又は細胞の前の抗生物質)。本発明のこの特性は、例えば、このような宿主細胞感染を処置するために抗生物質単独が十分に有効ではない場合に、対象において抗生物質処置を増強するために有用であり得る。抗生物質は、本明細書において開示される任意の抗生物質、例えば、テトラサイクリンであり得る。
【０１２９】
一例では、各遺伝子操作されたヌクレオチド配列又はベクターは、前記CRISPRアレイ又は前記crRNA若しくはgRNAをコードする配列を含み、抗生物質耐性遺伝子(例えば、カナマイシン耐性)を更に含み、HM-crRNA又はgRNAは、抗生物質耐性遺伝子を標的化しない。一例では、標的配列は、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子により含まれ、抗生物質は、第1の抗生物質(例えば、カナマイシン)とは異なる。このように、システム、遺伝子操作された配列又はベクターは、自身を標的化することなく宿主を標的化できる。第1の抗生物質の存在下では第1の抗生物質耐性遺伝子を含有する細胞が生存利点を有するであろうから(遺伝子操作された配列又はベクターによって形質転換されていない宿主細胞が、第1の抗生物質に対して耐性ではない場合)、第1の抗生物質に対して宿主細胞を曝露することによって、正の選択圧によるそこでの遺伝子操作された配列又はベクターの保持を促進できる。したがって、一例は、以下を提供する:宿主細胞においてcRNA又はgRNAをコードする配列の維持を促進するために、前記抗生物質(例えば、カナマイシン)及び前記遺伝子操作された配列又はベクターに対して宿主細胞又は混合集団を曝露することを含む本発明の使用;又は本発明のシステム、遺伝子操作された配列、アレイ若しくはベクターは、前記抗生物質と組み合わせた状態にある。
【０１３０】
一例では、cRNA又はgRNA又は構成要素(ii)をコードする配列は、宿主細胞種において作動可能な構成プロモーター(例えば、強力なプロモーター)又は誘導プロモーター下にある。一例では、構成要素(iii)は、宿主細胞種で差動可能な構成プロモーター又は誘導プロモーター下にある。
【０１３１】
一例では、宿主細胞又は各宿主細胞は、グラム陽性細胞である。別の例では、宿主細胞又は各宿主細胞は、グラム陽性細胞である。
【０１３２】
一例では、方法、使用、システム、遺伝子操作された配列又はベクターは、ヒト腸細菌叢集団において、宿主細胞感染を処置するためのものであり、任意選択で、集団は、ヒト共生腸内細菌(すなわち、ヒトと共生する腸内細菌)を含む。
【０１３３】
方法、使用、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作された配列又はベクターの一例では、宿主細胞は、ヒト又は動物対象により含まれる混合細菌集団により含まれ、方法、使用、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作された配列又はベクターは、(i)混合集団により含まれる前記宿主細胞によって対象において感染を処置するため、(ii)前記宿主細胞によって媒介される状態若しくは疾患を対象において処置若しくは予防するため、(iii)前記宿主細胞によって引き起こされる若しくは媒介されるヒトの体臭を低減するため、又は(iv)ヒトの個人的衛生処置のためのものである。
【０１３４】
方法、使用、システム、アレイ、crRNA、gRNA、遺伝子操作された配列又はベクターの一例では、工業用若しくは医学用流体、固体表面、装置若しくは容器(例えば、食物、消費材、化粧品、個人のヘルスケア製品、石油又はオイル製造のために)をin vitro処理するためのもの、又は水路、水、飲料、食料若しくは化粧品を処置するためのものであり、宿主細胞は、流体、表面、装置、容器、水路、水、飲料、食料又は化粧品によって、又はその上に含まれる。
【０１３５】
本発明はまた、本明細書における任意の概念の使用又は方法によって得ることができる細菌のex vivo混合集団を提供する。
【０１３６】
一例では、使用又は方法の混合集団又は生成物は、医学的又は栄養学的(nutiritional)使用のための容器中にある。例えば、容器は、滅菌容器、例えば、吸入器である、又はシリンジ若しくはIVニードルに接続されている。
【０１３７】
一例では、使用又は方法の生成物集団は、そのマイクロバイオームを定植するためにヒト又は動物へ投与するために有用である。
【０１３８】
本発明は、使用又は方法の集団生成物を含む、ヒト又は非ヒト動物消費のための食料又は飲料を提供する。
【０１３９】
本明細書において、任意の構成、概念又は態様の一例では、バクテロイデス属は、カッカエ(caccae)、カピロサス(capillosus)、セルロシリチクス(cellulosilyticus)、コプロコラ(coprocola)、コプロフィルス(coprophilus)、コプロスイス(coprosuis)、ディスタソニス(distasonis)、ドレイ(dorei)、エゲルチー(eggerthii)、フェシス(faecis)、フィネゴルジー(finegoldii)、フルクス(fluxus)、フラガリス(fragalis)、インテスチナリス(intestinalis)、メラニノゲニクス(melaninogenicus)、ノルジー(nordii)、オレイシプレヌス(oleiciplenus)、オラリス(oralis)、オバツス(ovatus)、ペクチノフィルス(pectinophilus)、プレベイウス(plebeius)、ステルコリス(stercoris)、テタイオタオミクロン(thetaiotaomicron)、ユニフォルミス(uniformis)、ブルガツス(vulgatus)及びキシラニソルベンス(xylanisolvens)から選択される種である。例えば、バクテロイデス属は、テタイオタオミクロンであり、例えば、宿主細胞又は混合集団は、ex vivo又はin vitro腸細菌叢集団である。一例では、宿主細胞、第1又は第2の細菌亜集団は、複数の異なるバクテロイデス門種又は複数のバクテロイデス属種(例えば、Bテタイオタオミクロン及びBフラガリスを含む)又はバクテロイデス属及びプレボテラ属(Prevotella)の種を含む。本明細書において、一例では、プレボテラ属は、ベルゲンシス(bergensis)、ビビア(bivia)、ブッカエ(buccae)、ブッカリス(buccalis)、コプリ(copri)、メラニノゲニカ(melaninogenica)、オリス(oris)、ルミニコラ(ruminicola)、タンネレ(tannerae)、チモネンシス(timonensis)及びベロラリス(veroralis)から選択される種である。代替において、宿主細胞、第1又は第2の細菌は、ファーミキューテス門の細胞である。一例では、宿主細胞、第1又は第2の亜集団は、アネロトルンクス属(Anaerotruncus)、アセタネロバクテリウム属(Acetanaerobacterium)、アセチトマクルム属(Acetitomaculum)、アセチビブリオ属(Acetivibrio)、アネロコッカス属(Anaerococcus)、アネロフィルム属(Anaerofilum)、アネロシヌス属(Anaerosinus)、アネロスチペス属(Anaerostipes)、アネロボラックス属(Anaerovorax)、ブチリビブリオ属(Butyrivibrio)、クロストリジウム属、カプラコッカス属(Capracoccus)、デハロバクター属(Dehalobacter)、ジアリスター属(Dialister)、ドレア属(Dorea)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、エタノリゲネンス(Ethanoligenens)、フェカリバクテリウム属(Faecalibacterium)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、グラシリバクター属(Gracilibacter)、グゲンヘイメラ属(Guggenheimella)、ヘスペリア属(Hespellia)、ラクノバクテリウム属(Lachnobacteriium)、ラクノスピラ属(Lachnospira)、ラクトバチルス属、ロイコノストック属(Leuconostoc)、メガモナス属(Megamonas)、モリエラ属(Moryella)、ミツオケラ属(Mitsuokella)、オリバクテリウム属(Oribacterium)、オキソバクター属(Oxobacter)、パピリバクター属(Papillibacter)、プロプリオンスピラ属(Proprionispira)、シュードブチリビブリオ属(Pseudobutyrivibrio)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ロセブリア属(Roseburia)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、サルシナ属(Sarcina)、セイノネラ属(Seinonella)、シュトレウォルチア属(Shuttleworthia)、スプロバクター属(Sporobacter)、スプロバクテリウム属(Sporobacterium)、ストレプトコッカス属、スブドリグラヌルム属(Subdoligranulum)、シントロフォコッカス属(Syntrophococcus)、サーモバシルス属(Thermobacillus)、ツリバクター属(Turibacter)及びウェイセラ属(Weisella)から選択される1種又は複数のファーミキュー���ス門を含む又はからなる。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、クロストリジウム属の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、エンテロコッカス属(Enterococcus)の細胞からなる(及び任意選択で、その他亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、ルミノコッカス属(Ruminococcus)の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、ストレプトコッカス属の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属 (例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、フェカリバクテリウム属(Faecalibacterium)の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。例えば、フェカリバクテリウム属(Faecalibacterium)は、フェカリバクテリウム・プラウスニトジー(Faecalibacterium prausnitzii)(例えば、A2-165、L2-6、M21/2又はSL3/3)である。
【０１４０】
一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、アネロトルンクス属、アセタネロバクテリウム属、アセチトマクルム属、アセチビブリオ属、アネロコッカス属、アネロフィルム属、アネロシヌス属、アネロスチペス属、アネロボラックス属、ブチリビブリオ属、クロストリジウム属、カプラコッカス属、デハロバクター属、ジアリスター属、ドレア属、エンテロコッカス属、エタノリゲネン属、フェカリバクテリウム属、フソバクテリウム属、グラシリバクター属、グゲンヘイメラ属、ヘスペリア属、ラクノバックテリウム属、ラクノスピラ属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、メガモナ属、モリエラ属、ミツオケラ属、オリバクテリウム属、オキソバクター属、パピリバクター属、プロプリオニスピラ属、シュードブチリビブリオ属、シュードラミバクター属、ロゼブリア属、ルミノコッカス属、サルシナ属、セイノネラ属、シュトレウォルチア属、スプロバクター属、スプロバクテリウム属、ストレプトコッカス属、スブドリグラヌルム属、シントロフォコッカス属、サーモバシルス属、ツリバクター属及びウェイセラ属から選択される1種又は複数のファーミキューテス門を含む又はからなる。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、クロストリジウム属(例えば、ディフィシル)の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、エンテロコッカス属の細胞からなる(及び任意選択で、その他亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、ルミノコッカス属の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、ストレプトコッカス属の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞及び/又は腸内細菌科(例えば、大腸菌)の細胞からなる)。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、フェカリバクテリウム属の細胞からなる(及び任意選択で、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)の細胞からなる。一例では、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団は、ストレプトコッカス属の細胞(任意選択で、Sサーモフィルス及び/又はピオゲネスの細胞)からなり、その他の亜集団は、バクテロイデス属(例えば、テタイオタオミクロン)及び/又は腸内細菌科(例えば、大腸菌)の細胞からなる。
【０１４１】
本発明の使用又は方法の集団生成物は、一実施形態では、粘膜、腸、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、眼内又は頬側投与によってヒト又は非ヒト動物に投与するためのものである。
【０１４２】
任意選択で、宿主細胞又は第1若しくは第2の亜集団細胞は、Bフラガリス細菌であり、集団は、水によって保持される。
【０１４３】
本発明のアレイ、システム、遺伝子操作された配列、ベクター又はgRNAを含む好適な飲料として、例えば、プロバイオティックドリンク、例えば、適応させたYakult(商標)、Actimel(商標)、Kevita (商標)、Activia(商標)、Jarrow(商標)又はヒト消費のための同様のドリンクがある。
【０１４４】
ファージ配列標的
本発明の態様では、標的配列は、宿主細菌細胞に感染するファージの配列である。本発明によって達成されるようなファージゲノムの所望の改変は、ファージ死滅又はノックダウンに関するだけでなく、代わりに、宿主細胞における所望のファージ遺伝子又は調節エレメント活性化であり得る(例えば、ファージが所望のタンパク質又は宿主細胞生存力又は増殖の増大と関連しているその他の生成物を発現する場合)。或いは、改変は、例えば、ファージ標的部位に本発明に従って標的とされる誘導可能Casの使用による、誘導可能ファージ遺伝子発現調節であり得る。一実施形態では、本発明は、宿主細胞においてCasヌクレアーゼを用いて切断することによってファージ標的部位を改変することを提供する。これは、例えば、以下の様々な理由のために有用であり得る:
A.標的部位を突然変異して活性化又は不活性化するため(例えば、遺伝子ノックダウン又は抗宿主遺伝子の不活性化のため、又はファージ標的が宿主染色体中に組み込まれる場合には宿主細胞を死滅させるため)、
B.標的配列又は標的配列を含むより大きな配列を欠失するため(例えば、本発明が、ファージゲノム中の間隔のあいた部位を標的化する第1及び第2のPM-crRNAとともに使用され、各部位における切断が、切断の間のファージ核酸の欠失をもたらす場合)、
C.所望のPM-DNA配列を宿主細胞ゲノム中に挿入するため(例えば、所望のPM-DNAの相同組換え挿入のために宿主核酸における1つ又は複数のPM-crNAによってガイドされる切断を提供することによって)。
【０１４５】
本発明は、以下の態様を提供する:
1.第1及び第2の細菌の亜集団の相対比を、前記亜集団を含む細菌の混合集団において変更する方法であって、第1の細菌は、宿主細胞(例えば、バクテロイデス門の宿主細胞)であり(第1の細菌は、任意選択で、ファージによって感染し、第2の細菌は、前記ファージによって感染しない(又はバクテロイデス門ではない))、ベクター核酸(例えば、そのPM含有トランスポゾン)を宿主細胞に導入するために1つ又は複数のステップで混合集団を、複数のベクターと組み合わせる工程と、混合集団で細菌を成長させ、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更される工程とを含み、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更され、
各ベクターは、細胞において標的ヌクレオチド配列(例えば、前記ファージの)を改変するために宿主細胞に導入するための遺伝子操作されたファージ改変(PM)CRISPRアレイを含み、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である。
【０１４６】
ファージ配列を標的化して、ファージ生存力、増殖又は感染性に必要な遺伝子を不活性化することによって、一態様では、本発明は、ファージに感染した宿主細胞によるその取り込み及び保持を促進し得る正の選択的利点をアレイに提供する。宿主細胞が死滅される、又は成長が低減される場合には、集団における第2の細菌に対する第1の細菌の相対比が低減される。本発明は、例えば、ヒト又は動物対象における疾患又は状態の処置又は予防(リスクを低減する)のための医薬として使用するためのこのような生成物集団を提供し、医薬は対象に投与される。疾患又は状態は、本明細書において開示される任意の疾患又は状態であり得る。一例では、シングルガイドRNA(gRNA)は、crRNAを提供するために宿主細胞において発現され、各ベクターは、このようなgRNAをコードする発現可能な遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
PM-アレイを使用する一例では、標的配列は、バクテロイデス・テタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)配列である。任意選択で、標的配列は、Bフラガリスにより含まれない。これは、例えば、改変が標的配列を切断するか、又はそうでなければ、標的配列を非機能的にし、それによって、Bフラガリスを標的化せずにBテタイオタオミクロン宿主細胞の比が増大される場合、混合集団が本明細書において記載されるような腸細菌叢集団である場合に有用である。したがって、Bフラガリスは、膿瘍と関連するいくつかの設定では、この例は、これのリスクを低減し、一方で、例えば、肥満症又は糖尿病又はIBDを処置又は予防するために、例えば、腸細菌叢のバランスを取り直すために有用である本発明のように、比の変更(Bテタイオタオミクロン細胞割合の増大)を可能にする。
【０１４８】
プロモーター(又はHM-若しくはPM-アレイ)は、宿主細胞において作動可能である。一例では、プロモーターは、ウイルス又はファージプロモーター、例えば、T7プロモーターである。別の例では、プロモーターは、細菌プロモーター(例えば、宿主細胞種のプロモーター)である。
2.第1の細菌が、バクテロイデス属(例えば、テタイオタミクロン(thetaiotamicron)又はフラガリス)、アリスタイプ属(Alistipes)、アルカリフレクス属(Alkaliflexus)、パラバクテロイデス(Parabacteroides)、タンネレラ属(Tannerella)、キシラニバクター属(Xylanibacter)及び/又はプレボテラ属の細菌である態様1の方法。
3.第2の細菌が、ファーミキューテス門の細菌(例えば、第1の細菌がバクテロイデス門又はバクテロイデス属である場合)である、態様1又は2の方法。
4.第2の細菌亜集団に対する第1の細菌亜集団の比が増大される、すなわち、前記方法が実施された後に、以前よりも大きい、態様1から3のいずれか1つの方法。
5.混合集団が、その腸又は経口細菌叢を定植し、バランスを取り直すために、ヒト又は非ヒト動物へ投与するための組成物(例えば、飲料、マウスウォッシュ又は食料)により含まれ、例えば、混合集団が、in vitro又はヒト又は非ヒト動物においてin vivoである、態様4の方法。
6.第2の細菌亜集団に対する第1の細菌亜集団の比が減少される、すなわち、前記方法が実施された後に、以前よりも小さい、態様1、2又は3の方法。
7.混合集団が、ヒト消費のための飲料又は水(例えば、水路又は飲料水)によって保持される、態様6の方法。
8.各ベクターが、プラスミド、ファージ(例えば、パッケージングされたファージ)又はファージミドである、態様1から7のいずれか1つの方法。
9.各ベクターが、ファージ(例えば、パッケージングされたファージ)であり、ベクター核酸が、宿主細胞へのファージベクター核酸形質導入によって、すなわち、ファージベクターによる宿主細胞の感染によって宿主細胞に導入される、態様8の方法。一例では、ファージは、本明細書において記載されるような1つ又は複数のトランスポゾンを含む。
10.各ベクターが、プラスミドであり、ベクター核酸が、ベクターを保持する細菌から形質転換又は水平プラスミド伝達によって宿主細胞に導入される、態様8の方法。一例では、プラスミドは、本明細書において記載されるような1つ又は複数のトランスポゾンを含む。一例では、ベクターを保持する細菌は、非バクテロイデス門又は非バクテロイデス属種である。
【０１４９】
更に又は或いは、ベクターを保持する細菌は、非ファーミキューテス門の種である。一例では、ベクターを保持する細菌は、ラクトバチルス属種(例えば、アシドフィルス(acidophilus)(例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ(brevis)、ブルガリクス(bulgaricus)、プランタルム(plantarum)、ラモサス(rhammosus)、フェルメンツム(fermentum)、カウカシクス(caucasicus)、ヘルベチクス(helveticus)、ラクチス、レウテリ(reuteri)又はカゼイ(casei)例えば、カゼイシロタ(casei Shirota))、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)の種(例えば、ビフィダム(bifidum)、ブレブ(breve)、ロングム(longum)又はインファンティス(infantis))、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)及びエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)からなる群から選択される1種又は複数の種の細菌である。例えば、細菌は、Lアシドフィルス又はラクチス細菌である。
11.前記バクテロイデス門ファージのゲノムを改変するために態様1から10のいずれか1つの方法において使用するための、遺伝子操作されたバクテロイデス門ファージ改変(PM)CRISPRアレイであって、
(a)PM-CRISPRアレイは、PM-crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及びバクテロイデス門のファージに感染した宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)PM-crRNAは、標的配列を改変するために感染宿主細胞において、バクテロイデス門ファージゲノム標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である
アレイ。
12.態様1〜10のいずれか1つの方法において使用するための核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージ又はファージミド)であって、態様11のPM-CRISPRアレイを含むベクター。
【０１５０】
一般的な実施形態では、代替として、態様12に以下が提供される:
宿主細胞において宿主細菌細胞(例えば、上記のような病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を改変するための遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ又はファージミド)であって、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において、標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である
ベクター。
【０１５１】
プロモーターは、宿主細胞において作動可能である。一例では、プロモーターは、ウイルス又はファージプロモーター、例えば、T7プロモーターである。別の例では、プロモーターは、細菌プロモーター(例えば、宿主細胞種のプロモーター)である。
【０１５２】
一例では、アレイは、本明細書において記載されるトランスポゾンにより含まれる。一例では、アレイは、本明細書において記載されるような担体細菌により含まれる。一例では、ファージ又は宿主細胞の1つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を標的化するために複数のアレイが提供され、複数のアレイは、本明細書において記載されるような細菌細胞、例えば、担体、第1のレシピエント又は第2のレシピエント細胞により含まれる。一例では、担体細胞は、本明細書において記載されるような飲料(例えば、ヒト消費のためのプロバイオティックドリンク)又は食料により含まれる。一例では、アレイ又は担体細菌は、ヒト又は動物の感染を処置又は予防するためにヒト又は非ヒト動物へ投与するためのものであり、例えば、宿主細胞は、病原性である。一例では、アレイ又は担体細菌は、ヒト又は動物の肥満症、糖尿病又はIBDを処置又は予防するためにヒト又は非ヒト動物の腸へ投与するためのものである。
13.ヒト又は非ヒト動物消費のための細菌細胞、例えば、プロバイオティック細胞により含まれる、態様11又は12のアレイ又はベクター。
14.ベクターが、前記混合集団と組み合わせることのために使用される、又は混合集団と組合せのためのものである第3の細菌集団(例えば、本明細書において記載される担体細菌)により含まれ、それによって、ベクター核酸が、形質転換によって(例えば、第3の細菌から第1の細菌宿主細胞への水平プラスミドベクター又はトランスポゾン伝達によって)又は形質導入によって(例えば、第1の細菌宿主細胞のファージベクター感染(inefection)によって)宿主細胞に導入される、態様1から13のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
15.アレイ若しくはベクター又は各アレイ若しくはベクターが、ヒト又は非ヒト動物腸共生又は相利共生細菌細胞(例えば、本明細書において記載されるような担体細菌細胞)により含まれる、態様1から14のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。したがって、細胞は、ヒト又は非ヒト動物と共生又は相利共生する腸内細菌種のものである。
16.ベクター又は各ベクターが、ファーミキューテス門の宿主細胞において、又はバクテロイデス門のファージに感染した宿主細胞(例えば、バクテロイデス属の細胞)において作動可能であり、任意選択で、態様15に規定されるように共生又は相利共生細菌細胞において作動可能である複製起点を含むプラスミド、ファージ又はファージミドである、態様12から15のいずれか1つの方法又はベクター。一例では、複製起点は、oriT又は本明細書において記載される任意のその他の複製起点である。
17.ベクター又は各ベクターが、(1)バクテロイデス属の細胞ではないヒト若しくは非ヒト動物共生若しくは相利共生細菌細胞と(2)バクテロイデス属の細胞である前記ファージに感染した細胞の間、又は(3)ファーミキューテス門の細胞ではないヒト若しくは非ヒト動物共生若しくは相利共生細菌細胞と(4)標的配列を含むファーミキューテス門の細胞の間で水平伝達可能である配列(例えば、本明細書において記載されるトランスポゾン)を含む、プラスミド又はファージミドである、態様12から16のいずれか1つの方法又はベクター。
18.ベクター又は各ベクターが、(1)バクテロイデス属の細胞である前記ファージに感染した細胞と、(2)ヒト又は非ヒト動物腸へのプロバイオティック投与に適している細菌細胞の間又は(3)標的配列を含むファーミキューテス門の細胞と、(4)ヒト又は非ヒト動物腸へのプロバイオティック投与に呈している細菌細胞の間で水平伝達可能であるプラスミド又はファージミド配列(例えば、本明細書において記載されるトランスポゾン)である、態様12から17のいずれか1つの方法又はベクター。
19.共生、相利共生又はプロバイオティック種が、ラクトバチルス属種(例えば、アシドフィルス((例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ、ブルガリクス、プランタルム、ラモサス、フェルメンツム、カウカシクス、ヘルベチクス、ラクチス、レウテリ又はカゼイ例えば、カゼイシロタ)、ビフィドバクテリウム属種(例えば、ビフィダム、ブレブ、ロングム又はインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される、態様15から18のいずれか1つの方法又はベクター。
【０１５３】
プロモーターが、前記ファージに感染したバクテロイデス門の宿主細胞における、及び態様15から19のいずれか1つに規定されるような共生、相利共生又はプロバイオティック細菌細胞における、又は標的配列を含むファーミキューテス門の細胞における及び態様15から19のいずれか1つに規定されるような共生、相利共生若しくはプロバイオティック細菌細胞における前記配列の転写のために作動可能である、態様1から18のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。例えば、プロモーターは、ウイルス又は細菌プロモーター、例えば、T7プロモーターである。一例では、プロモーターは、宿主細胞プロモーター、例えば、宿主CRISPR/Casアレイのプロモーターである。
20.改変が、(i)標的配列の切断、(ii)標的配列を含む遺伝子の転写を下方制御すること、(iii)標的配列を含む遺伝子の転写を上方制御すること又は(iv)標的で核酸配列を付加、欠失若しくは置換することである、本明細書における態様1から19のいずれか1つの方法、アレイ若しくはベクター又は任意の使用。
21.バクテロイデス門のファージが、crAssファージ、GB-124ファージ、GA-17ファージ、HB-13ファージ、H16-10ファージ、B40-8ファージ及びBフラガリスファージATCC51477-B1から選択されるバクテロイデス属のファージである、態様1から20のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。Nat Commun. 2014年7月24日、5:4498頁、doi: 10.1038/ncomms5498、「A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human faecal metagenomes」、Dutilh BEらが参照される。crAssファージ約97kbpゲノムは、公的に利用可能なメタゲノムにおいて、一緒のその他の既知ファージよりも6倍多量であり、それぞれ、ウイルス様粒子(VLP)に由来するメタゲノム及び全コミュニティーメタゲノム中のすべてのリードの最大90%及び22%を含み、公的データベース中のすべてのヒト糞便メタゲノムシーケンシングリードの1.68%に達する。新規共生プロファイリングアプローチを使用して、Dutilhらは、バクテロイデス属と関連するタンパク質相同体及びファージゲノムにコードされる独特の炭水化物結合ドメインと一致するこのファージのためのバクテロイデス属の宿主を予測した。
22.標的配列が、宿主細胞感染性、ファージ溶原性若しくは溶解性サイクル又はファージ生存力にとって必要であるファージ遺伝子、例えば、必須遺伝子又はコートタンパク質遺伝子により含まれる、本明細書における態様1から21のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター又は任意の使用。
23.標的配列が、BACON(バクテロイデス門関連炭水化物結合)ドメインをコードする配列(例えば、宿主が、バクテロイデス属の宿主である)又はエンドリシンをコードする配列により含まれる、態様1から22のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。FEBS Lett. 2010年6月3日、584(11):2421〜6頁、doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010年4月21日、「Mining metagenomic data for novel domains: BACON、a new carbohydrate-binding module」、Mello Lらが参照される。ファージ構造タンパク質中のBACONドメインの存在は、粘液モデルとの提案されたバクテリオファージ接着によって説明され得る。このモデルによれば、ファージは、カプシドによって提示される炭水化物結合ドメイン(免疫グロブリン様フォールド又はBACONドメイン等)を介して腸粘液層を構成するムチン糖タンパク質と接着し、ファージが感染する細菌とのより頻繁な相互作用を促進する。
25.CRISPRアレイが、宿主細胞におけるcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、
(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、
(ii)S1は、前記標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
本明細書における態様1から24のいずれか1つの方法、アレイ若しくはベクター又は任意の使用。例えば、標的配列は、プロトスペーサーを含むか、本発明のアレイが、宿主細胞中にある場合には、Casに対して同族であるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)にすぐ隣接するプロトスペーサー配列により含まれ、Casはまた、アレイから発現されるcrRNAに対して同族である。一実施形態では、Casは、細胞に対して内因性である。別の例では、Casは、例えば、本発明のベクターによって提供される宿主細胞に対して外因性である。
26.R1及びR1'が、宿主細胞と同一種の細胞のCRISPRアレイのリピート配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である、態様25の方法、アレイ又はベクター。
27.R1及びR1'は、CRISPRアレイ(例えば、テタイオタミクロン及びフラガリス(例えば、バクテロイデス(Bacteroides fragalis)NCTC 9343から選択されるバクテロイデス属種のII-C型アレイ)のリピート配列に対して各々少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、宿主細胞が、リピート配列とともに機能的であるCRISPR/Casシステムを含み、例えば、前記種のバクテロイデス属の細胞である、態様25の方法、アレイ又はベクター。
28.R1及びR1'が、前記種の、例えば、前記種の前記宿主細胞のCRISPRアレイの第1の(最も5')及び第2の(第1のリピートのすぐ3'にあるリピート)リピート配列に対して、それぞれ、少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である、態様27の方法、アレイ、使用又はベクター。一例では、アレイは、II-C型アレイである。一例では、アレイ又はベクターは、R2-S2-R2'を更に含み、スペーサーS2は、スペーサーS1と同一又は異なっており(例えば、宿主細胞又はファージゲノム中の異なる標的部位を標的化するために)、R2及びR2'は、宿主細胞において機能的であり、任意選択で、R1と同一である。例えば、R1、R1'、R2及びR2'の各々は、BフラガリスCRISPRリピートである。
29.(iii)R1及びR1'の各々が、バクテロイデス属種の細胞のCRISPRアレイ(例えば、II-C型アレイ)のリピート配列に対して同一であり、種が、カッカエ、カピロサス、セルロシリチクス、コプロコラ、コプロフィルス、コプロスイス、ディスタソニス、ドレイ、エゲルチー、フェシス、フィネゴルジー、フルクス、フラガリス(例えば、フラガリスNCTC 9343)、インテスチナリス、メラニノゲニクス、ノルジー、オレイシプレヌス、オラリス、オバツス、ペクチノフィルス、プレベイウス、ステルコリス、テタイオタオミクロン、ユニフォルミス、ブルガツス及びキシラニソルベンスからなる群から選択され、(iv)宿主細胞が、リピート配列とともに機能的であるCRISPR/Casシステムを含み、前記群から選択される種のバクテロイデス属の細胞(例えば(iii)の選択された種と同一の種)である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
30.R1及びR1'が、標的配列の改変のために前記宿主バクテロイデス門又はファーミキューテス門の細胞のCRISPR/Casシステムとともに機能的である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。一例では、R1、R1'、R2及びR2'は、同一細菌種、例えば、テタイオタミクロン若しくはフラガリス等のバクテロイデス属又はサーモフィルス若しくはピオゲネス等のストレプトコッカス属のII型(例えば、II-C型)CRISPR/Casシステムリピートである。
31.R1及びR1'が、バクテロイデス門 (例えば、バクテロイデス属若しくはプレボテラ属)又はファーミキューテス門(例えば、ストレプトコッカス属)の細胞のCRISPRアレイ(例えば、II-C型アレイ)のリピート配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
32.R1及びR1'の各々が、表2の配列番号1〜5から選択される配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、任意選択で、第1の細菌細胞が、例えば、表2における種又は株(例えば、選択された配列に対して列挙された種又は株)のバクテロイデス属の細胞である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
33.R1及びR1'の各々が、表2の配列番号6〜11から選択される配列と少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、任意選択で、第1の細菌細胞が、例えば、表2における種又は株(例えば、選択された配列に対して列挙された種又は株)のプレボテラ属の細胞である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
34.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために前記宿主細胞においてcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼとの組み合わせた状態にある、態様1から33のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。例えば、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対してすぐ隣接するプロトスペーサー配列を含み、任意選択で、PAMは、バクテロイデス門の宿主細胞により含まれるCasヌクレアーゼに対して同族である。一例では、Casは、II-C型Casヌクレアーゼである。
35.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために前記宿主細胞においてcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼをコードする核酸配列との組み合わせた状態にある、態様1から34のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
36.R1及びR1'が、前記宿主細胞において標的を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼ(例えば、Sピオゲネス、Sサーモフィルス又はSオーレウスCas9)とともに機能性であり、任意選択で、方法、アレイ又はベクターが態様34又は35に更に従い、任意選択で、Casは前記Cas9である、態様25の方法、アレイ、使用又はベクター。
37.態様1から10又は14から36のいずれか1つの方法によって得ることができる細菌のex-vivo混合集団又は本明細書における使用。例えば、混合集団は、医学的又は栄養学的使用のための容器中にある。例えば、容器は、滅菌容器である。
38.治療的、予防的、化粧的、ヒト又は非ヒト動物体重低減(例えば、美容的低減)又は栄養学的使用のためのヒト又は非ヒト動物へ投与するための組成物であって、態様37の混合集団を含む組成物。一例では、組成物は、経口、全身、吸入的、直腸内、眼内、頬側又は膣内投与のためのものである。一例では、組成物は、ヒト又は非ヒト動物の腸又は口腔へ投与するためのものである。
39.態様37の混合集団又は態様38の組成物を含む、ヒト又は非ヒト動物消費用の食料又は飲料。
40.栄養補助食品又はプロバイオティック飲料若しくは食料である、態様39の食料又は飲料。
41.ヒト若しくは非ヒト動物における、又は飲料水におけるバクテロイデス門の感染を処置又は予防するための抗生物質組成物であって、態様11から36のいずれか1つのアレイ又はベクターを含み、任意選択で、改変が、態様21(iii)又は(iv)に記載の抗生物質組成物。
42.ヒト又は非ヒト動物において腸バクテロイデス門の割合を増大するための(例えば、肥満症、糖尿病(例えば、I型)又はGI炎症状態を処置又は予防するために)プロバイオティック組成物であって、態様11から36のいずれか1つのアレイ又はベクターを含み、任意選択で、改変が、態様21(iii)又は(iv)に記載のプロバイオティック組成物。
43.ヒト又は動物におけるファーミキューテス門に対する腸バクテロイデス属の相対割合を増大するための、例えば、肥満症、糖尿病(例えば、I型糖尿病)又はGI状態(例えば、クローン病、IBD、IBS又は潰瘍性大腸炎)を処置又は予防するための、態様38、41又は42の組成物。
【０１５４】
代替において、本発明の任意の構成における「アレイ」は、宿主細胞における発現のためのHM-crRNA又はgRNAをコードする遺伝子操作されたヌクレオチド配列によって代わり得る。したがって、アレイに関する本明細書における態様のいずれかの特性は、代替法において、このような遺伝子操作された配列に準用し得る。
【０１５５】
可動遺伝エレメント及びCRISPRシステム
44.宿主細胞において、宿主細菌細胞(例えば、上記のようなファーミキューテス門又は病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を改変するための、遺伝子操作されたCRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ又はファージミド)であって、
(a)CRISPRアレイは、宿主細胞におけるcrRNA(例えば、gRNAにより含まれる)の発現のための1つ又は複数の配列及び配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)アレイは、異なる種の第1及び第2の細菌細胞の間で水平伝達可能であるトランスポゾンにより含まれる
核酸ベクター。
任意選択で、Casヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型内因性Casヌクレアーゼである。
45.アレイが、ヒト又は非ヒト動物へ投与するためのものであり、第1の細胞種が、ヒト又は動物に対して非病原性であり、第2の細胞種が、ヒト又は動物に対して病原性であり、アレイが第1の細胞により含まれる、態様44のベクター。
46.第1の細胞種が、ヒト又は動物と共生又は相利共生する種、例えば、腸細菌叢種である、態様45のベクター。
47.第1の細胞種が、ラクトバチルス属種(例えば、アシドフィルス (例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ、ブルガリクス、プランタルム、ラモサス、フェルメンツム、カウカシクス、ヘルベチクス、ラクチス、レウテリ又はカゼイ例えば、カゼイシロタ)、ビフィドバクテリウム属種(例えば、ビフィダム、ブレブ、ロングム又はインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される種である、態様45又は46のベクター。
48.ヒト又は動物消費のための飲料(例えば、プロバイオティックドリンク)又は食料により含まれる、態様44から47のいずれか1つのベクター。
49.標的配列を標的化するための少なくとも1つのリピート-スペーサー-リピートユニットを含み、リピートが、宿主細胞のCRISPR/Casシステムのリピートと少なくとも95%(例えば、96、97、98、99又は100%)同一であり、ベクターのリピートが、標的ヌクレオチド配列を改変するために宿主システムのCasをガイドするように宿主細胞において作動可能である、態様44から48のいずれか1つのベクター。
50.Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をコードする配列を欠く、態様49のベクター。
【０１５６】
本発明に従う宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列の標的化は、ベクター(例えば、侵入ウイルス)に対する宿主細胞耐性を除去するのに、又は耐性の発生若しくは増大を低減するのに有用である。例えば、本発明は、それによって、内因性CRISPR/Casシステムの活性を標的化すること及びノックダウンし、その結果、新規ベクター(例えば、ファージ)スペーサー獲得が阻害されることの利点を提供する。
【０１５７】
可動化の特性は、伝達に必要であるシス作用領域(oriT)の存在である。この領域は、伝達事象を開始するためにプラスミドにおいて部位特異的及び鎖特異的ニックが作製されるDNAプロセシングの開始部位である。本発明は、以下のように可動遺伝エレメント(MGE)を使用する更なる実施形態を提供する:
【０１５８】
1.可動遺伝エレメント(MGE)を含む又はからなる遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクターであって、MGEは、伝達の起点(oriT)及び宿主細胞において宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノム又はウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列を改変するためのCRISPRアレイを含み、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、
(c)ベクターは、(i)第1の宿主細胞の第1及び第2の核酸位置の間を伝達可能であり、各位置は、染色体若しくはプラスミド上の位置であり、標的配列は、宿主細胞により含まれるか、又は(ii)第1及び第2の宿主細胞の間を伝達可能であり、標的配列は、第1及び/若しくは第2の宿主細胞により含まれる、
遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクター。
【０１５９】
MGEの例として、ICE、トランスポゾン、プラスミド及びバクテリオファージがある。伝達の起点(oriT)は、DNAの伝達に必要である短い配列(例えば、最大500bp)であり、細菌宿主からレシピエントへのコンジュゲーションの際にそれを含有する。oriTは、シス作用性である-伝達されている同一DNAで見られ、DNAとともに伝達される。通常の伝達の起点は、3つの機能的に規定されたドメイン:ニッキングドメイン、伝達ドメイン及び終結ドメインを含む。
【０１６０】
任意選択で、プロモーターは、第1及び第2の(及び任意選択で、第3の)細胞において前記配列の転写のために作動可能である。
【０１６１】
任意選択で、標的配列は、第2の細胞により含まれる。任意選択で、標的配列は、第2の細胞により含まれない。
【０１６２】
一例では、第1及び第2の細胞は、異なる細菌種(例えば、腸、腋窩、膣若しくは口の、例えば、ヒトマイクロバイオーム集団において見られる種)のものである。一例では、第1及び第2の細胞は、ex vivoである。別の例では、第1及び第2の細胞は、in vivo又はex vivoヒト腸、膣、腋窩又は口腔マイクロバイオームにより含まれる。
2.MGEが、組み込み及び接合性エレメント(ICE)である、又はそれを含む、実施形態1のベクター。或いは、MGEは、可動化可能MGE(すなわち、可動化されるために、MGEによって保持されない遺伝子によってコードされる因子を使用できる)である。MGEに関連して用語「可動化可能」及び「接合性」は、当業者には容易に明らかである。
【０１６３】
本発明の適したICEの例及び適したoriTの供給源を提供する、ICEbergデータベース(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)が参照される。一例では、ICEは、群1〜28から選択されるICEを含むICEファミリーのメンバーであり、又はoriTは、このようなファミリーのメンバーのoriTである:1=SXT/R391、2=Tn916、3=Tn4371、4=CTnDOT/ERL、5=ICEclc、6=ICEBs1、7=ICEHin1056、8=PAPI-1、9=ICEMlSym(R7A)、10=ICESt1、11=SPI-7、12=ICE6013、13=ICEKp1、14=TnGBS1、15=Tn5253、16=ICESa2603、17=ICEYe1、18=10270-RD.2、19=Tn1207.3、20=Tn1806、21=ICEA5632、22=ICEF-I/II、23=ICEAPG2、24=ICEM、25=10270-RD.1、26=Tn5801、27=PPI-1、28=ICEF-III。ファミリーの説明は、ICEbergデータベースに見られる。例えば、Tn916ファミリーは、Robertsら(2009) (Trends Microbiol. 2009年6月;17(6):251〜8頁. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009年5月20日;「A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements」、Roberts A、Mullany P)によって定義された。Tn916ファミリーに属するエレメントは、以下の基準によって定義される:それらは、Robertsらにおいて示される一般的な組織を有さなくてはならず、DNAレベルで配列及び構造において元のTn916と同様であるコア領域(コンジュゲーション及び調節モジュール)を有さなくてはならない。例外として、いくつかの接合性トランスポゾン、例えば、これまでこのファミリーに分類されているTn1549及び対応する参考文献に記載されるような高度のタンパク質類似性を有するものがある。
3.ICEが、トランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである実施形態2のベクター。一例では、MGEは、機能的ヘルパーエレメントの存在下で可動化可能である可動化可能トランスポゾンであり、任意選択で、トランスポゾンは、前記ヘルパーエレメントと組み合わせた状態にある。
4.ベクターがプラスミドであり、任意選択で、MGEが、プラスミドにより含まれるトランスポゾンである、実施形態1から3のいずれか1つのベクター。例えば、トランスポゾンは、接合性トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、可動化可能トランスポゾン(例えば、プラスミドによって、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の遺伝子によってコードされる1つ又は複数の因子を使用して可動化可能)。任意選択で、トランスポゾンは、I型トランスポゾンである。任意選択で、トランスポゾンは、II型トランスポゾンである。
5.oriTが、第1及び第2の宿主細胞において機能的である実施形態1から4のいずれか1つのベクター。これは、例えば、第1及び第2の細胞が異なる種のものである場合に、細菌集団中の細菌全体への広がり及び伝播を促進するのに有用である。
6.第1の細胞により含まれる場合に、第1の細胞が、MGEを第2の細胞に伝達するように作動可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、配列がMGEにより含まれない、実施形態5のベクター。これは、このような配列についてMGE中の空間を使用することを避けるのに有用である。例えば、これは、細胞間の伝達のためのより緻密なMGEの構築を可能にする、又は例えば、宿主細胞中のそれぞれの配列を標的化するため、若しくは第1及び第2の宿主細胞中の異なる配列を標的化するために複数のスペーサーを含むように、より大きな若しくはより多いCRISPRアレイを含めることを可能にする。
7.配列が、ベクターにより含まれない、実施形態6のベクター。これは、このような配列についてベクター又はMGE中の空間を使用することを避けるのに有用である。例えば、これは、細胞間の伝達のためのより緻密なベクター又はMGEの構築を可能にする、又は例えば、宿主細胞中のそれぞれの配列を標的化するため、若しくは第1及び第2の宿主細胞中の異なる配列を標的化するために複数のスペーサーを含むように、及び/若しくはCasタンパク質、例えば、Cas9をコードする1つ又は複数の配列を含むように、より大きな若しくはより多いCRISPRアレイを含めることを可能にする。
8.配列が、第1の細胞の接合性トランスポゾンにより含まれる、実施形態6又は7のベクター。これは、(例えば、ヒトマイクロバイオーム中の異なる細菌種の)第1及び第2の宿主細胞間の本発明のMGEの水平伝達のために、MGEの外側の因子を利用して、接合性転位を達成することを可能にするので有用である。
9.トランスポゾンが、トランスでMGEを第2の細胞に伝達するように作動可能である、実施形態8のベクター。これは、(例えば、ヒトマイクロバイオーム(micribiome)中の異なる細菌種の)第1及び第2の宿主細胞間の本発明のMGEの水平伝達のために、MGEの外側の因子を利用して、接合性転位を達成することを可能にするので有用である。例えば、本発明のMGEのoriTは、宿主細胞の接合性トランスポゾンにより含まれるoriTと同一である。これは、第1及び第2の宿主細胞(例えば、異なる種、例えば、ヒトマイクロバイオーム種の細菌細胞)間でのMGEの水平伝達を達成するために、本発明のMGEが宿主細胞によってコードされる因子とともに作動することを可能にするのに有用である。これは、MGEがより緻密であることを可能にし、上で論じられるようなCRISPRアレイ及び/又はCas遺伝子のための空間を開放する。
【０１６４】
用語「トランスで作動可能」とは、MGE(又は全ベクター、例えば、MGEを含有するプラスミド)を第2の細胞に伝達するために、ベクターヌクレオチド配列の外側の宿主ヌクレオチド配列から発現されるタンパク質(例えば、宿主細胞の接合性トランスポゾンによって発現されるタンパク質)を使用する水平伝達のために、MGE(ICE)が作動可能であることを意味する。
10.第1の細胞により含まれる場合に、MGEのoriTが、第1の細胞のICEにより含まれるoriTと同一であり、ICEが、MGEを第2の細胞に伝達するようにトランスで作動可能である、実施形態1から9のいずれか1つのベクター。
11.ベクターoriTが、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)又はプレボテラ属トランスポゾンのoriTである、実施形態1から10のいずれか1つのベクター。これは、第1及び/又は第2の宿主細胞が、それぞれ、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)又はプレボテラ属の細胞である場合に有用である。例えば、第1の細胞は、このような種の細胞であり、第2の細胞は、ファーミキューテス門の細胞であり、標的配列は、第2の細胞により含まれるが、第1の細胞により含まれず、それによって、CRISPRアレイは、第2の細胞中のCasに標的配列を切断するように指示する。一例では、標的配列は、第2の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子により含まれ(後者については、任意選択で、ベクターは、前記抗生物質と組み合わせた状態にある、又は前記抗生物質との組合せでヒト若しくは非ヒト動物に投与される)。任意選択で、トランスポゾンは、CTnDot又はCTnERLトランスポゾンであり、ベクターは、テトラサイクリンと組み合わせた状態にある、又はテトラサイクリンとの組合せでヒト若しくは非ヒト動物に投与される。
12.ベクターoriTが、CTnDot、CTnERL SXT/R391、Tn916又はTn4371ファミリートランスポゾンoriTである、実施形態1から11のいずれか1つのベクター。
13.MGEが、第1及び第2の末端リピート配列並びにリピート配列間のCRISPRアレイを含む、実施形態1から12のいずれか1つのベクター。
14.MGEが、トランスポゾンコピーを、それが第2の位置に伝達している場合には(1)第1の核酸位置に、又は(2)第2の細胞に伝達している場合には第1の細胞中に残す、実施形態1から13のいずれか1つのベクター。これは、宿主細胞を含む細菌集団におけるMGEの増殖及び維持を促進するのに有用である。代替において、MGEは、トランスポゾンコピーを、(i)それが第2の位置に伝達されている場合には第1の核酸位置に、又は(ii)それが第2の細胞に伝達している場合には第1の細胞中に残さない。
15.第1及び/又は第2の細胞により含まれる場合の(例えば、第1及び第2の細胞により含まれるベクターの第1及び第2のコピー)、実施形態1から14のいずれか1つのベクター。
16.第1及び第2の細胞が、異なる種の細胞である、実施形態15のベクター。例えば、第1の細胞は、ラクトバチルス属の細胞(例えば、本明細書において記載されるような)であり、及び/又は第2の細胞は、バクテロイデス門(Bcteroidetes)(例えば、バクテロイデス属の細胞、例えば、本明細書において記載されるような細胞)又はファーミキューテス門の細胞(例えば、本明細書において記載されるような細胞)である。一例では、例えば、GI状態若しくは糖尿病を処置若しくは予防するために、又は肥満症を処置若しくは予防するためにヒトの腸マイクロバイオームに投与するために、第1の細胞は、バクテロイデス門(Bcteroidetes)(例えば、バクテロイデス属の細胞、例えば、本明細書において記載されるような細胞)であり、第2の細胞は、ファーミキューテス門の細胞(例えば、本明細書において記載されるような細胞)である。
17.第1及び第2の細胞が、細菌又は古細菌細胞である、実施形態15又は16のベクター。
18.第1の細胞が、ヒトにおいて非病原性(例えば、共生又は相利共生細菌細胞)であり、任意選択で、第2の細胞が、ヒトにおいて病原性細胞である、実施形態16又は17のベクター。代替において、第2の細胞が、ヒトにおいて非病原性細胞である。用語「ヒトにおいて非病原性」とは、ヒトのマイクロバイオーム(例えば、腸、膣、腋窩又は口腔マイクロバイオーム)においては病原性又は実質的な病原性を伴わずに存在し得るが、ヒトのその他の環境においては病原性である特定の細菌種(例えば、バクテロイデス属種、例えば、フラガリス)等の細胞を含む。当業者ならば、第1の細胞種は、ヒト中又はヒト上で保持することができ、第2の細胞種は、ヒト中又はヒト上で低減されなければならないということを容易に理解するであろう。例えば、CRISPRアレイは、第2の細胞のゲノムを改変して、死滅させる又はヒト中又はヒト上での細胞生存力若しくは成長を低減する。例えば、標的部位は、第2の細胞により含まれ、部位は、前記Casヌクレアーゼによって切断され、それによって、標的部位を含む遺伝子を不活性化又は下方制御する。例えば、遺伝子は、第2の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子である。一例では、遺伝子は、病原性遺伝子である。
19.第2の細胞(各宿主細胞)が、(i)例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性及びテイコプラニンから選択される抗生物質に対して耐性であるスタフィロコッカス・オーレウス細胞、(ii)例えば、セファロスポリン系剤(例えば、セフタジジム)、カルバペネム系剤(例えば、イミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド系剤(例えば、ゲンタマイシン又はトブラマイシン)及びコリスチンから選択される抗生物質に対して耐性の、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeuroginosa)細胞、(iii)例えば、カルバペネムに対して耐性のクレブシエラ属(例えば、ニューモニエ(pneumoniae))の細胞、(iv)例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、β-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン及びペニシリンから選択される抗生物質に対して耐性のストレプトコッカス属(例えば、ニューモニエ又はピオゲネス)の細胞、(v)例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシン及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に対して耐性のサルモネラ属(例えば、血清型チフィ(Typhi))の細胞、(vi)例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のシゲラ属(Shigella)の細胞、(vii)例えば、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシンに対する耐性から選択される抗生物質に対して耐性の結核菌(mycobacterium tuberculosis)細胞、(viii)例えば、バンコマイシンに対して耐性のエンテロコッカス属の細胞、(ix)例えば、セファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性の腸内細菌科細胞、(x)例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン(itrofurantoin)、セファレキシン及びアモキシシリンから選択される抗生物質に対して耐性の大腸菌(E coli)細胞、(xi)例えば、フルオロキノロン系抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のクロストリジウム属(例えば、ディフィシル(dificile))の細胞、(xii)例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射用セファロスポリン)、アジスロマイシン及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に対して耐性のナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonnorrhoea)細胞、(xiii)例えば、ベータ-ラクタム、メロペネム及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のアシネトバクター・バウマニー(Acinetoebacter baumannii)細胞、又は(xiv)例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のカンピロバクター属(Campylobacter)の細胞から選択される細胞である実施形態1から19のいずれか1つのベクター又は本明細書における任意の使用。このような種は、ヒトに対して病原性であり得る。
20.標的部位が、第2の細胞の抗生物質耐性遺伝子により含まれ、抗生物質が、実施形態19において列挙されたそれぞれの抗生物質である、実施形態19のベクター又は使用。
21.第1の細胞が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)の細胞、;ラクトバチルス属(例えば、アシドフィルス (例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビ、ブルガリクス、プランタルム、ラモサス、フェルメンツム、カウカシクス、ヘルベチクス、ラクチス、レウテリ又はカゼイ例えば、カゼイシロタ)、ビフィドバクテリウム属種(例えば、ビフィダム、ブレブ、ロングム又はインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウム、アリスタイプ属、アルカリフレクス属、パラバクテロイデス属、タンネレラ属又はキシラニバクター属の細胞である、実施形態15〜20のいずれか1つのベクター。
22.(i)の第1及び/又は第2の核酸位置が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)の細胞により含まれるか、又は(ii)の第1及び/又は第2の宿主細胞が、バクテロイデス門 (例えば、バクテロイデス目若しくはバクテロイデス属)若しくはプレボテラ属の細胞である、実施形態1から22のいずれか1つのベクター。
23.第1の細胞が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス目又はバクテロイデス属)の細胞であり、第2の細胞が、ファーミキューテス門(例えば、クロストリジウム属又はスタフィロコッカス属)の細胞である、例えば、ベクターが、GI状態若しくは糖尿病を処置若しくは予防するために、又は肥満症を処置若しくは予防するためにヒトの腸マイクロバイオームに投与するためのものである、実施形態22のベクター。
24.第1の細胞(各第1の細胞)が、環境(例えば、水又は土壌環境)において環境的に許容され、任意選択で、第2の細胞(各宿主細胞)が環境において許容されない、実施形態16又は17のベクター(又は本明細書における任意の使用)。水環境は、当業者には容易に明らかであろうが、例えば、海洋又は水路(例えば、湖、運河、河川又は貯水池)環境であり得る。一例では、水環境は、ヒト消費のために意図される飲料水又は汚水である。一例では、土壌環境は、農地の土壌又は採掘現場(例えば、鉱物又は金属採掘現場)の土壌である。
【０１６５】
「許容される」及び「許容されない」によって、当業者は、第1の細胞種は、環境において保持することができ、第2の細胞種は、環境において低減されなくてはならないということを容易に理解するであろう。例えば、CRISPRアレイは、第2の細胞のゲノムを死滅させる又は環境において細胞生存力若しくは成長を低減するように改変する。例えば、標的部位は、第2の細胞により含まれ、部位は、前記Casヌクレアーゼによって切断され、それによって、標的部位を含む遺伝子を不活性化又は下方制御する。例えば、遺伝子は、第2の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子である。一例では、遺伝子は、病原性遺伝子である。
【０１６６】
一例では、環境は、ヒトのマイクロバイオーム、例えば、口腔マイクロバイオーム又は腸マイクロバイオーム又は血流である。一例では、環境は、ヒト中又はヒト上の環境ではない。一例では、環境は、非ヒト動物中又は非ヒト動物上の環境ではない。一実施形態では、環境は、大気環境である。一実施形態では、環境は、農業環境である。一実施形態では、環境は、油又は石油回収環境、例えば、油田若しくは石油油田又は油井若しくは石油油井である。一例では、環境は、ヒト又は非ヒト動物消費用の食料若しくは飲料中又は食料若しくは飲料上の環境である。
【０１６７】
一例では、本明細書におけるベクター、システム、ベクター、アレイ、crRNA、gRNA、方法又は任意の使用は、産業が、医療及びヘルスケア、医薬、ヒト食物、動物食物、植物肥料、飲料、乳製品、食肉加工、農業、牧畜、家禽農業、魚介類農業、獣医、油、ガス、石油化学製品、水処理、汚水処理、包装、電子工学及びコンピュータ、個人のヘルスケア及びトイレタリー、化粧品、歯科用、非医療歯科用、眼用、非医療眼用、鉱物採掘及び加工、金属採掘及び加工、採石、航空、自動車、鉄道、船舶、空間環境、土壌処理、パルプ及び紙、衣類製造、染料、印刷、接着剤、大気処理、溶媒、生体防御、ビタミンサプリメント、冷貯蔵、ファイバー浸漬及び製造、バイオテクノロジー、化学薬品、工業用クリーニング製品、家庭用クリーニング製品、石鹸及び界面活性剤、消費者向け製品、森林、魚釣り、レジャー、リサイクル、プラスチック、皮革、レザー及びスウェード、廃棄物管理、葬儀及び葬祭、燃料、建築、エネルギー、鉄鋼及びタバコ産業分野からなる群から選択される分野の産業である、産業において使用するためのものである、又は環境が、産業環境である。
25.改変された標的部位での組込みのための核酸(例えば、DNA)と組み合わせた実施形態1から24のいずれか1つのベクター。
【０１６８】
一例では、改変は、標的部位の切断であり、核酸(例えば、DNA)は、宿主細胞における相同組換えによって組み込まれる。これは、本発明のベクターを使用する宿主細胞ゲノムの正確な標的化された改変を達成するために有用である。
26.組み込むための核酸は、調節エレメント又はエキソン配列、例えば、ヒト配列である、又はそれを含む、実施形態25のベクター。
27.MGEの可動化のためのトランスポサーゼと組み合わせた、実施形態1から26のいずれか1つのベクター。
28.ベクター又はMGEが、第1の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第1の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、実施形態1から27のいずれか1つのベクター。
29.ベクター又はMGEが、第2の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第2の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、実施形態1から28のいずれか1つのベクター。
30.ベクター又はMGEが、第1及び第2の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、第1及び第2の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、実施形態1から29のいずれか1つのベクター。毒素-抗毒素モジュールの使用は、選択的利点、したがって、MGE保持及び広がりを付与するのに有用である。例えば、モジュールは、I型モジュール、例えば、Hok-Sokモジュールである。例えば、モジュールは、II型モジュール、例えば、HiCa-HicBモジュールである。例えば、モジュールは、tad-ata型毒素-抗毒素モジュールである。例えば、モジュールは、プラスミド中毒モジュールである。一例では、第1及び/又は第2の細胞は、バクテロイデス属の細胞であり、モジュールは、バクテロイデス属種のモジュール、例えば、Txe/YoeBファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1を参照のこと)、RelE/StbEファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9A0を参照のこと)、HigAファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/D7J8V2又は http://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0を参照のこと)、RelE/StbEファミリー中毒モジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R5F4を参照のこと)。ベクター又はMGE中の毒素-抗毒素の使用は、所望の細胞(例えば、第1及び第2の及び/又は第3の細菌細胞)以外のベクターを有する細胞の破壊を可能にするのに有用であり得る。この例では、MGE又はベクターは、細菌毒素-抗毒素モジュールの毒素遺伝子及び同族抗毒素遺伝子を含み、毒素及び抗毒素遺伝子の発現は、例えば、異なるプロモーターから別個に調節される。例えば、毒素遺伝子は、第1の、第2の(及び第3の)細胞において構成的に活性であるプロモーターを含むことができ、その結果、毒素は常に産生される。抗毒素遺伝子は、第1及び/又は第2の細胞において1つ又は複数の因子(例えば、発現されたタンパク質)によって誘導可能であるが、異なる株又は種の非標的細胞ではそうではないプロモーターを含みうる。公知であるように、抗毒素は、細菌毒素/抗毒素システムにおける毒素よりも本質的に安定ではなく、したがって、ベクター又はMGEの、標的細胞ではない(例えば、第1及び/又は第2の細胞ではない)細胞への伝達は、抗毒素発現の不在下又はより低い抗毒素活性下での毒素発現につながり、したがって、非標的細胞の細胞死につながる。したがって、これは、標的細胞(第1、第2及び第3の細胞)に対して本発明のベクターを取り込み、保持する選択圧を作り出し、その結果、中に所望のCRISPRアレイ活性を有することができ、集団(腸細菌叢等)中の標的細胞にわたって伝播されうる。これはまた、非標的細胞へのベクター又はMGEの広がりを制限し、その結果、アレイの効果は、集団において制御される-この点において、非標的細胞に対してベクターを取り込まない圧力があることとなり、そうする場合には、レシピエント細胞は集団中で生存せず、それによって、MGE及びアレイを有する非標的細胞の複製を制限することとなる。
31.第1及び第2の細胞は、同一門のもの(例えば、両細菌細胞)であり、ベクターは、(d)第1の細胞及び/又は第2の細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一門の別の細胞ではそうではない、(e)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(f)第1の細胞及び/又は第2の細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一綱の別の細胞ではそうではない、(g)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(h)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一科の別の細胞ではそうではない、(i)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一属の別の細胞ではそうではない、(j)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一種の別の細胞ではそうではない、(k)第1の細胞及び/又は第2の細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一株の別の細胞ではそうではない、実施形態1から30のいずれか1つのベクター。
【０１６９】
これは、マイクロバイオームにおける本発明のベクター(例えば、混合細菌集団における第2の宿主細胞種の選択的死滅のための)の選択性を提供する。これは、例えば、複製又は操作のために特定のタンパク質の発現(例えば、crRNAを産生するための発現)を必要とするように、MGE又はアレイ(例えば、そのプロモーター)を遺伝子操作することによって達成できる。例えば、第1及び/又は第2の細胞において作動するが、その他の細胞では作動しないプロモーターからプロモーターを選択できる、又はその複製開始部位の1つ若しくは複数が、第1及び/又は第2の細胞において産生されるが、その他の細胞では産生されないタンパク質若しくはその他の因子に依存するようにMGEが遺伝子操作される。
32.第1のベクターが、第1の細胞により含まれ、第2のベクターが、第2の細胞により含まれ、細胞が異なる種の細胞(例えば、異なる細菌種)であり、ベクターMGEの一方又は両方が第3の細胞(例えば、細菌細胞)に伝達可能であり、第3の細胞種が、第1若しくは第2の細胞の種と同一であるか、又は第1及び第2の細胞種とは異なる種である、細胞の混合集団中の実施形態1から31のいずれか1つのベクターの第1及び第2のコピー。これは、第1の細胞が担体として作用し得るので(例えば、非病原性である場合、ヒト(huma)又は動物に投与されてもよく、その結果、ヒト又は動物に定植する、例えば、そのマイクロバイオーム)有用である。水平伝達によって、担体は、本発明のCRISPRアレイを第3の細胞に伝達し、伝播し得る(直接的に、又は第2の細胞を介して、後者はアレイのリザーバーとして作用する)。次いで、アレイは、第3の細胞において標的配列のCas改変(例えば、切断)を媒介して、例えば、第3の細胞の必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を不活性化又は下方制御することができる。
【０１７０】
本明細書において全般的に、標的配列が細胞の抗生物質耐性遺伝子により含まれる場合には、本発明のベクター、遺伝子操作された配列又はアレイは、ヒト又は動物に抗生物質と一緒に(同時に又は逐次)投与されてもよい。これは、標的配列を含む細胞を死滅させる又はその増殖を低減するのに有用である。この点において、ベクター、遺伝子操作された配列又はアレイは、抗生物質を含む組成物により含まれ、標的配列は、前記抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子の配列である。
【０１７１】
任意選択で、混合集団は、第3の細胞を含む。
【０１７２】
一例では、各々本発明のベクターを含む複数の第1の細胞が提供される。一例では、各々本発明のベクターを含む複数の第2の細胞が提供される。一例では、各々本発明のベクターを含む、複数の第2の細胞と組み合わせた複数の第1の細胞が提供される。一例では、複数の第2の細胞及び複数の第3の細胞と組み合わせた複数の第1の細胞が提供され、前記複数のうち少なくとも2種(又はそのすべて)の細胞が、本発明のベクターを含む。
33.ベクター又はMGEが、第1、第2及び第3の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第1、第2及び第3の細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された(すなわち、より少ない)抗毒素遺伝子を含む、実施形態32のベクター。
34.MGEが、接合性トランスポゾンであり、oriTが、第1及び第2の宿主細胞において機能的であり、MGEが、第1及び第2の末端リピート配列及びリピート配列の間のCRISPRアレイを含み、第1及び第2の細胞が細菌細胞であり、第2の細胞が、ヒト細菌叢細胞種(例えば、病原性種)であり、標的部位が、第2の細胞により含まれるが、第1の細胞により含まれず、前記改変が、第2の細胞において前記標的を含む遺伝子又は調節配列を不活性化する、又は下方制御する、実施形態1から33のいずれか1つのベクター。
【０１７３】
それによって第1の細胞が、MGEの水平伝達によって伝達されうる本発明のアレイの担体及びリザーバーとして作用できることは有用である。
【０１７４】
一例では、MGEは、接合性バクテロイデス門トランスポゾンであり、oriTは、第1及び第2の宿主細胞において機能的であるバクテロイデス門oriTであり、MGEは、第1及び第2の末端リピート配列及びリピート配列の間のCRISPRアレイを含み、第1及び第2の細胞は細菌細胞であり、第1の細胞は、バクテロイデス門細胞であり、第2の細胞は、ファーミキューテス門の細胞(例えば、クロストリジウム属又はスタフィロコッカス属の細胞)であり、標的部位は、第2の細胞により含まれるが、第1の細胞により含まれず、前記改変は、第2の細胞において前記標的を含む遺伝子又は調節配列を不活性化する、又は下方制御する。
35.第1又は第2の細胞により含まれる場合の、実施形態34のベクター。
36.第1及び第2の細胞が、混合細菌細胞集団、例えば、ヒト又は非ヒト動物(例えば、イヌ、ネコ又はウマ)腸、膣、腋窩又は口腔細菌叢種の細胞の集団により含まれる、実施形態1から35のいずれか1つのベクター。上記で説明されたように、集団は、そのマイクロバイオームを定植するためにヒト又は動物へ投与するために有用である。
37.各細胞が、実施形態1から36のいずれか1つに記載のベクターを含む、実施形態22に規定されるような複数の細胞を含むex vivo組成物。或いは、組成物は、in vivo、例えば、非ヒト動物におけるものである。
38.実施形態1から36のいずれか1つのベクター又は実施形態37の組成物を含むヒト又は非ヒト動物消費用の飲料又は食料。飲料は、例えば、ヒト又は動物において肥満症又はGI状態を処置又は予防するための、ヒト又は動物による、例えば、毎日、2日に1回又は週に1回の消費のための、例えば、プロバイオティックドリンクであり得る。
39.各細胞が、実施形態1から36のいずれか1つに記載のベクターを含む、複数のバクテロイデス属の細胞を含む組成物。
【０１７５】
細胞が、例えば、ヒト又は動物において肥満症又はGI状態を処置又は予防するために、ヒト又は動物のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)へ投与するための、本発明のアレイの担体及びリザーバーとして作用し得ることは有用である。
40.第1の細胞の亜集団及び第2の細胞の亜集団を含む細菌細胞の混合集団であって、第1の細胞は、実施形態1から36のいずれか1つに記載のベクターを含み、ベクターは、第1及び第2の細胞亜集団間で水平伝達可能である、細菌細胞の混合集団。このような集団は、細菌が、ヒト又は動物の1つ又は複数のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)に定植するように、ヒト又は動物に投与することができる(例えば、鼻腔内に)ので有用である。特に、それらの細胞がヒト又は動物にとって非病原性である(例えば、腸マイクロバイオームにおいて非病原性)場合に、第1の(及び任意選択で、同様に第2の)細胞は、本発明のCRISPRアレイの担体として作用し得る。マイクロバイオームは、本明細書において開示される任意のその他のマイクロバイオーム又は細菌叢集団であり得る。
41.第1及び第2の細菌種の一方又は両方が、ヒト又は非ヒト動物の腸細菌叢に定植可能であり、任意選択で、第1の細菌が、ヒト又は動物と共生又は相利共生している、実施形態40の集団。第1の細菌は、ヒト又は動物に安全に投与することができ、その後、細菌叢のその他の細胞への伝達のために本発明のアレイの担体として作用し得ることが有用である。
42.混合集団が、飲料又は水(例えば、ヒト消費用の水路又は飲料水)又は土壌によって保持される、実施形態40の集団。水又は土壌における集団の提供は、環境において、又は(水について)加熱、冷却又は工業システムにおいて、又は飲料水貯蔵容器においてこのような処置をするのに有用である。
任意の実施形態の一例では、第2の細胞は、標的配列を含むコレラ(cholera)細胞であり、標的配列が改変される場合に、細胞が死滅されるか、又は細胞増殖が低減される。一例では、第2の細胞は、ヒト消費用の水(例えば、ヒト消費用に処理する前又は処理した後のこのような水)により含まれる。一例では、ベクターは、ヒトにおいてこれらを処置又は予防するためにヒトに投与するための医薬組成物により含まれる。
43.in vitroで実施形態1から36のいずれか1つに記載の複数のベクターを含む組成物。例えば、組成物は、工業用装置又は容器(例えば、例えば、食物、消費材、化粧品、個人の健康製品、石油又はオイル製造のための)において多種細菌集団と混合される。
44.そのマイクロバイオームを治療的又は予防的に定植し、バランスを取り直すために、又はヒト若しくは動物を美容的に変更するために(例えば、美容的体重減少のために)、ヒト又は非ヒト動物に投与するための、実施形態1から44のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料又は集団。
45.宿主細胞において標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、
(1)宿主細胞を、担体細胞と組み合わせる工程であって、
(a)担体細胞は、標的を改変するためのCRISPRアレイを含むCRISPR核酸ベクターを含み、
(b)CRISPRアレイは、宿主細胞における、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び配列の転写のためのプロモーターを含み、
(c)crRNAは、標的配列を改変するために、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である
工程と、
(2)細胞を一緒に培養する工程であって、ベクターが担体細胞から宿主細胞に伝達され、それによって、crRNAが、宿主細胞において標的配列とハイブリダイズして、Casをガイドし、標的が改変される、工程と
を含む方法。
【０１７６】
一例では、方法は、ex vivoで実施される。一例では、方法は、美容的方法であり、治療的又は予防的医学方法ではない。
46.ベクターが、実施形態1から36のいずれか1つに従う、実施形態45の方法。
47.宿主細胞は、ヒト又は非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種の細胞であり、任意選択で、宿主細胞は、病原性細菌種の細胞である、実施形態45又は46の方法。一例では、本明細書における任意のマイクロバイオームは、腸、膣、腋窩、頭皮、皮膚又は口腔マイクロバイオームから選択される。
48.担体細胞が、ヒト又は非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種と共生又は相利共生する種のものである、実施形態45から47のいずれか1つの方法。一例では、担体細胞は、例えば、鼻腔内に、局所に又は経口的に投与される場合に、ヒトに対して非病原性である。
【０１７７】
本明細書における任意の構成、概念、態様、実施形態又は例等では、本発明のベクター、組成物、アレイ又は集団は、ヒト又は非ヒト動物に鼻腔内に、局所に又は経口的に投与される、又はこのような投与のためのものである。ヒト又は動物のマイクロバイオームを処置する目的の当業者ならば、対象のマイクロバイオームに応じて、最良の投与経路を決定することができるであろう。例えば、マイクロバイオームが腸マイクロバイオームである場合には、投与は、鼻腔内又は経口的であり得る。マイクロバイオームが、頭皮又は腋窩マイクロバイオームである場合には、投与は局所的であり得る。マイクロバイオームが口又は咽頭中である場合には、投与は経口的であり得る。
49.宿主細胞が、ヒト又は非ヒト動物の腸マイクロバイオーム細菌種のものである、実施形態45から48のいずれか1つの方法。
50.第1及び第2の細菌宿主細胞種の亜集団を含む細菌の混合集団における前記亜集団の相対比を変更する方法であって、
A:前記第1の細菌宿主細胞を提供する工程と、
B:第2の細菌宿主細胞を提供する工程であって、第2の細胞が、第1の細胞に対して異なる種又は株の細胞である工程と、
C:遺伝子操作されたCRISPRアレイを第1の細菌宿主細胞導入する工程であって、各CRISPRアレイは、前記第2の宿主細胞におけるcrRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び配列の転写のためのプロモーターを含み、crRNAは、標的配列を改変するために宿主細胞において、前記第2の細胞により含まれる標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能である工程と、
D:第1及び第2の細菌細胞を一緒に組み合わせて、混合細菌集団を製造する工程と、
E:混合集団における細菌成長を可能にし、その結果、第1の細菌細胞から第2の細菌細胞へのCRISPRアレイの水平伝達が生じる工程であって、第2の細胞中の標的配列が、Cas改変され、それによって、前記第1及び第2の細菌の相対比が変更される、工程と
を含む方法。
51.各CRISPRアレイが、実施形態1から26のいずれか1つに従う、実施形態50の方法。
52.工程Eの混合集団の第1のサンプルを得ること、及び任意選択で、細胞の第2のサンプル中の第2の細胞の割合に対する、第1のサンプル中の第2の細胞の割合を比較することを更に含み、第2のサンプルが、工程Bにおいて第2の細胞を提供するために使用される細菌細胞の混合集団のサンプルであり、比較により、第2の細胞の割合が、工程E後に増大又は減少されていることが示される、実施形態50又は51の方法。
53.第2のサンプルが、ヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚又は口腔細胞)のサンプルである、実施形態52の方法。
54.ヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚又は口腔細胞)のサンプルが、工程Bの第2の細胞を提供するために使用される、実施形態50から53のいずれか1つの方法。
55.第1の細胞の組換え培養集団が、工程Aに使用される、実施形態50から54のいずれか1つの方法。
56.工程Eにおいて、プラスミド、ICE又はトランスポゾン水平伝達が使用され、各プラスミド、ICE又はトランスポゾンが、前記CRISPRアレイを含む、実施形態50から55のいずれか1つの方法。
57.例えば、肥満症、糖尿病IBD、GI管状態又は口腔状態を処置又は予防するために、治療的又は予防的に、ヒト又は非ヒト動物の細菌叢のバランスを取り直すための、実施形態50から56のいずれか1つの方法。糖尿病は、I型又はII型であり得る。一例では、予防は医学的である。一例では、本明細書において予防は、非医学的、例えば、美容的又は衛生目的である。例えば、細菌叢は、腋窩細菌叢であり、方法は、ヒトの体臭を防ぐ又は低減するためである。例えば、この場合には、方法は、ヒト体臭の生成及び/又は持続を媒介する宿主細菌細胞の成長又は生存力を下方制御する。
58.担体及び宿主細胞とは異なる種又は株の第3の細菌宿主細胞を提供することを含み、第3の細胞が、工程Eにおいて混合集団により含まれ、又は工程E後に前記集団と組み合わされ、第3の宿主細胞へのCRISPRアレイの水平伝達が生じる、実施形態50から57のいずれか1つの方法。
59.第3の細胞が、前記標的配列を含まない、実施形態58の方法。
このように、第3の細胞は、アレイの担体として作用することができ、標的配列を含む宿主細胞へアレイを水平伝達可能である。
60.第3の細胞が、Cas改変の標的配列を含まない、実施形態58の方法。
61.担体(及び任意選択で、同様に第3の)細胞が、実施形態21に列挙される種のもの、例えば、バクテロイデス門の細胞である、実施形態50から60のいずれか1つの方法。
62.宿主細胞が、実施形態19に列挙される種のもの又はファーミキューテス門の細胞である、実施形態50から60のいずれか1つの方法。
63.各ベクターが、プラスミド、ファージ(例えば、パッケージングされたファージ)又はファージミドである、又はそれにより含まれる、実施形態1から62のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
64.改変が、(i)標的配列を切断すること、(ii)標的配列を含む遺伝子の転写を下方制御すること、(iii)標的配列を含む遺伝子の転写を上方制御すること又は(iv)標的で核酸配列を付加、欠失又は置換することである、実施形態1から63のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
65.各標的配列が、宿主細胞の調節エレメント又は遺伝子により含まれる配列であり、遺伝子が、必須遺伝子、CRISPR遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子であり、任意選択で、調節エレメントが、このような遺伝子のエレメントである、実施形態1から64のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。代替において、遺伝子は病原性遺伝子である。
66.各標的配列が、ファージゲノムにより含まれる配列であり、ファージが、宿主細胞により含まれる、実施形態1から65のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、標的配列は、宿主細胞感染性、ファージ溶原性若しくは溶解性サイクル又はファージ生存力、例えば、必須遺伝子若しくはコートタンパク質遺伝子にとって必要であるファージ遺伝子により含まれる.
【０１７８】
一例では、バクテロイデス門のファージは、crAssファージ、GB-124ファージ、GA-17ファージ、HB-13ファージ、H16-10ファージ、B40-8ファージ及びBフラガリスファージATCC51477-B1から選択されるバクテロイデス属のファージである。これは、例えば、ヒト又は動物の腸マイクロバイオームにおいてバクテロイデス門に生存利点を提供するために有用である。このように、ファーミキューテス門に対するバクテロイデス門の比を変更して、後者に対する前者の割合を増大することができる(例えば、肥満症を処置又は予防するために)。一例では、標的配列は、BACON(バクテロイデス門関連炭水化物結合)ドメインをコードする配列(例えば、宿主が、バクテロイデス属の宿主である)又はエンドリシンをコードする配列により含まれる。
67.各CRISPRアレイが、宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のために配列R1-S1-R1'を含み、
(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、
(ii)S1は、前記標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
実施形態1から67のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
68.R1及びR1'が、それぞれ、第2の宿主細胞種のCRISPRアレイの第1及び第2のリピート配列と少なくとも95%同一である、実施形態67のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
69.R1及びR1'が、標的配列の改変のために前記宿主細胞のCRISPR/Casシステムとともに機能的である、実施形態67又は68のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
70.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼと組み合わせた状態にある、実施形態1から69のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)にすぐ隣接するプロトスペーサー配列を含む。
71.アレイ又は各アレイが、標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼをコードする核酸配列と組み合わせた状態にある、実施形態1から70のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
72.R1及びR1'が、前記宿主細胞において標的を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼ(例えば、Sピオゲネス又はSオーレウスCas9)とともに機能する、実施形態67から71のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法であって、任意選択で、実施形態70又は71に更に従い、Casが、前記Cas9である、ベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
73.実施形態50から72のいずれか1つの方法によって得ることができる細菌のex-vivo混合集団。
74.治療的、予防的、美容的、ヒト又は非ヒト動物体重低減(例えば、美容的低減)又は栄養的使用のためにヒト又は非ヒト動物に投与するための組成物であって、実施形態73の混合集団を含む組成物。
75.実施形態73の混合集団又は実施形態74の組成を含む、ヒト又は非ヒト動物消費用の食料又は飲料。
76.栄養補助食品又はプロバイオティック飲料若しくは食料である、実施形態75の食料又は飲料。
77.ヒト若しくは非ヒト動物において、又は飲料水若しくは土壌において細菌感染を処置又は予防するための抗生物質組成物であって、実施形態1から36及び63から72のいずれか1つのベクターを含む、組成物。
78.ヒト又は非ヒト動物において腸バクテロイデス門の割合を増大するための(例えば、肥満症、糖尿病又はGI炎症性状態を処置又は予防するため)プロバイオティック組成物であって、実施形態1から36及び63から72のいずれか1つのベクターを含む、組成物。
79.例えば、肥満症、糖尿病又はGI状態を処置又は予防するために、ヒト又は動物におけるファーミキューテス門(Fermicutes)に対する腸バクテロイデス属の相対割合を増大するための実施形態74、77又は78の組成物。
80.ベクターが、アレイとともに作動可能であるCasヌクレアーゼをコードする配列を含まない、実施形態1から79のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。これは、ベクター中の空間を節約するのに有用である(例えば、宿主細胞標的化のためにより大きなアレイ又はより多くのアレイを含めることを可能にするために-これは、複数のゲノム位置を標的化して、本発明のアレイに対する耐性の進化の可能性を低減するのに有用である)。
81.MGEが、アレイとともに作動可能であるCasヌクレアーゼをコードする配列を含まない、実施形態1から80のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。これは、MGE中の空間を節約するのに有用である(例えば、宿主細胞標的化のためにより大きなアレイ又はより多くのアレイを含めることを可能にするために-これは、複数のゲノム位置を標的化して、本発明のアレイに対する耐性の進化の可能性を低減するのに有用である)。例えば、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする大きな配列を含むことを避けることが可能である。
82.アレイが、第1及び/又は第2の細胞と同一の種又は株の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である、実施形態80又は81のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、アレイは、宿主細胞又は第3の細胞と同一の種又は株の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である。これは、ベクター又はMGE中の空間を節約するのに有用である(例えば、宿主細胞標的化のためにより大きなアレイ又はより多くのアレイを含めることを可能にするために-これは、複数のゲノム位置を標的化して、本発明のアレイに対する耐性の進化の可能性を低減するのに有用である)。
83.第1及び第2の細胞が、異なる種の細菌細胞であり、第2の細胞が、ヒト細菌叢種のものであり、第1の細胞が、前記ヒト細菌叢において非病原性である種のものであり、標的配列が、第1の細胞のゲノムにより含まれず、MGEが、第1及び第2の細胞において作動可能であるoriTを含み、MGEが、第1の細胞から第2の細胞へ水平伝達可能である、実施形態1から82のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料又は集団。
【０１７９】
代替において、以下が提供される:
担体及び宿主細胞が、異なる種の細菌細胞であり、宿主細胞が、ヒト細菌叢種のものであり、担体細胞が、前記ヒト細菌叢において非病原性である種のものであり、標的配列が、担体細胞のゲノムにより含まれず、MGEが担体及び宿主細胞において作動可能であるoriTを含み、MGEが、担体細胞から宿主細胞へ水平伝達可能である、実施形態1から83のいずれか1つの方法。
84.ベクターが、バクテリオファージにより含まれ、バクテリオファージが、第1の細胞(担体)に感染して、MGEを第1の(担体)細胞中に導入することが可能である、態様83のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
85.標的配列が、第2の(宿主)細胞のゲノムにより含まれる(例えば、ゲノムの必須遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子により含まれる)、実施形態83又は84のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
86.第2の(宿主)細胞種が、前記ヒト細菌叢において病原性であり、標的配列が、標的配列の切断又は前記標的配列を含む遺伝子を下方制御することによって改変される、実施形態85のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、第2の(宿主)細胞は、実施形態19の特性(i)〜(xiv)のいずれか1つに記載の細胞である。一例では、第2の(宿主)細胞は、ファーミキューテス門細胞であり、ベクターは、ヒトにおいて肥満症を処置又は予防するためのものである。
87.第2の(宿主)細胞種が、前記ヒト細菌叢において非病原性である、実施形態83、84又は85のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
88.第2の(宿主(hosst))細胞が、バクテロイデス門又はプレボテラ属の細胞であり、任意選択で、MGEが、前記ヒト細菌叢の第2の(宿主(hosst))細胞種からファーミキューテス門種に水平伝達可能である、実施形態83から87のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。後者は、標的配列がファーミキューテス門により含まれるが、第1の(担体)又は第2の(宿主)細胞により含まれない場合に、例えば、ヒトにおいて肥満症を処置又は予防するために有用である。
89.MGEが、前記ヒト細菌叢の第2の(宿主)細胞種から第3の細菌細胞種に水平伝達可能であり、第3の細胞種が、前記ヒト細菌叢において病原性であり、前記標的配列を含む、実施形態83から88のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。一例では、第1の(担体)及び第2の(宿主)細胞は、標的配列を含まない。
90.第3の細胞が、態様19の特性(i)〜(xiv)のいずれか1つに記載の細胞である、実施形態89のベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
91.MGEが、アレイのリピート配列とともに作動可能であるCasエンドヌクレアーゼをコードする配列を欠き、ベクターが、MGEの外側にこのような配列(例えば、Cas9をコードする)を含む、実施形態1から90のいずれか1つのベクター、組成物、食料、飲料、集団又は方法。
一般特性のいずれもまた、本構成に当てはまりうる。本明細書における任意のその他の構成、態様、段落、例、実施形態又は概念の特性のいずれもまた、MGEを使用する本構成と組み合わせてもよい。
したがって、本発明は、段落として番号がつけられた以下の特性を提供する;これらの段落は、列挙されるような態様のいずれにも、又は実施形態1から91のいずれにも、又は本明細書における任意のその他の構成にも当てはまる:
1.標的配列が、宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それによって、宿主細胞において宿主CRISPR/Casシステムを改変するためにcrRNAがCasを標的にガイドする、態様44から50のいずれか1つのベクター。
2.宿主CRISPR/Casシステムが、I、II又はIII型システムであり、標的配列が、少なくとも1種、2種又は3種の更なる宿主株又は種において前記型のシステム中に保存されたヌクレオチド配列であり、前記更なる株又は種が、前記宿主とは異なる、段落1のベクター。
3.標的配列が、ストレプトコッカス属種(例えば、Sサーモフィルス又はSピオゲネスCRISPR/Casシステム配列に対して同一である、段落1又は2のベクター。
4.宿主CRISPR/Casシステムの標的配列が、
i.第1のリピートの最も5'のヌクレオチドと連続する(及び任意選択で、前記リピートの最も5'のヌクレオチドを含む、例えば、第1のリピートの5'末端に第1の3ヌクレオチドを含む)CRISPRアレイリーダー又はリーダープロモーター配列、
ii.第1のリピートのすぐ5'の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)のヌクレオチドの連続ヌクレオチドの配列、
iii.第1のリピートの最も5'のヌクレオチオの最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列、
iv.第1のスペーサーリピートのすぐ3'にある最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列(及び任意選択で、配列が、第1のスペーサーの最も3'のヌクレオチドを含む、例えば、第1のリピートの3'末端に少なくとも3ヌクレオチドを含む)
を含む、段落1から3のいずれか1つのベクター。
5.アレイが、核酸ベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)により含まれ、
i.crRNAが、構造R-S-R(式中、R=CRISPRリピート及びS=CRISPRスペーサー)を含むか、又はからなり、Sが、(5'から3'方向に)V-HR又はHR-V(式中、V=ベクターのDNA配列と同一の配列及びHR=前記宿主細胞CRISPRアレイのCRISPRアレイのリピートのDNA配列)を含み
ii.HRの配列が、宿主CRISPRアレイ中のVの配列とすぐ近接し、
iii.crRNAが、細胞における宿主CRISPRアレイの改変のために、宿主CRISPRアレイのスペーサーとハイブリダイズして、Casを宿主標的にガイドすることが可能である
段落1、2又は3のベクター。
例えば、Vは、ファージベクターコートタンパク質をコードする配列の配列である。この点において、Helerらは、細菌耐性の研究において、3種のCRISPR独立、バクテリオファージ耐性突然変異体が、ファージ吸着において著しい防御を示す(約50%)ことを見い出し、これは、それらがエンベロープ耐性突然変異を保持する可能性が最も高いことを示す。
6.第1のcrRNAが、ベクター中に存在する核酸とハイブリダイズしない、又は実質的にハイブリダイズしない段落5のベクター。例えば、第1のcrRNAは、ベクター中のVとハイブリダイズしない、又は宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするよりも強力にはハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーション試験は、当業者には日常的なものである。例えば、ベクターDNAを単離又は合成すること及びそれをcrRNAとともにインキュベートすることによってin vitroで決定できる。例えば、PCRを使用する標準技術を使用して、ハイブリダイゼーションが起こったか否かを検出できる(例えば、宿主細胞において見られるであろうpH及び温度条件下で試験される)。
7.V=ベクターDNAの1又は最大40(例えば、最大15)の連続ヌクレオチドである、段落5又は6のベクター。標的配列中に見られるプロトスペーサー中のPAMのすぐ5'のシード配列は、crRNA対合及びCRISPR/Casシステムの切断する機能にとって重要である。このシード配列は、PAMのすぐ5'におよそ15又は12の連続ヌクレオチドを含む。
8.アレイが、ベクターにより含まれ、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中の標的配列とハイブリダイズ可能である(例えば、それと同一である、又は90%を超える同一性を有する)配列を含み、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、任意選択で、ベクターが、宿主細胞において機能的Cas及び/又はtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含み、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含む、態様又は段落1から8のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
9.CRISPRアレイが、ベクターにより含まれ、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中の標的配列とハイブリダイズ可能である(例えば、それと同一である、又は90%を超える同一性を有する)配列を含み、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、ベクターが、宿主細胞においてtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含まず、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含み、HM-CRISPRアレイが、宿主細胞において、任意選択で、宿主tracrRNAを使用してCas(例えば、内因性宿主Casヌクレアーゼ)を宿主標的部位にガイドするために機能的である、態様又は段落1から9のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
10.リピートが、宿主アレイ中のリピートに対して同一であり、本発明のCRISPRアレイが、宿主CRISPR/CasシステムのCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9)によって認識されるPAMを含まない、段落8又は9の方法、アレイ又はベクター。Cas配列を取り除く能力によって、本発明のアレイにおいて空間が開放される。
【０１８０】
「必須遺伝子」は、その存在又は発現が、宿主細胞成長にとって、又は細胞生存力の促進若しくは持続にとって必要とされる、宿主中の遺伝子である。耐性遺伝子は、その存在又は発現が、抗宿主薬物、例えば、抗生物質、例えば、ベータ-ラクタム系抗生物質に対する完全又は部分的耐性を提供するために必要とされる、宿主中の遺伝子である。病原性遺伝子は、その存在又は発現が、宿主細胞が感染可能である、例えば、宿主が病原体である(例えば、植物、動物、ヒト、家畜、コンパニオンペット、植物、鳥、魚又は昆虫の)生物の感染性にとって必要である宿主中の遺伝子である。
11.CRISPRアレイが、非宿主細胞Cas(例えば、宿主システムが、II若しくはIII形である、I型システムCas;宿主システムが、I若しくはIII形である、II型システムCas;又は宿主システムがI若しくはII形であるIII形システムCas)と組み合わせた状態にあり、任意選択で、宿主細胞が、非宿主Casの型と同一である型のCasを含まない又は発現しない、態様又は段落1から10のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。これは、CRISPRアレイが、自身中(例えば、ベクター中)の配列又は宿主中のベクターによってコードされるCasを標的化しないので、有用である。
12.CRISPRアレイが、tracrRNA配列又はtracrRNA配列をコードする配列(例えば、アレイと同一核酸上の)と組み合わせた状態にあり、任意選択で、tracrRNA配列及びHM-crRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、態様又は段落1から12のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
13.CRISPRアレイが、Cas又はCasをコードする配列と組み合わせた状態にあり、任意選択で、アレイが、宿主細胞ゲノムに組み込まれており、Casが宿主細胞に対して内因性である、又は外因性配列によってコードされる態様又は段落1から13のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。一例では、Casをコードする配列は、例えば、プラスミド又はファージ等のウイルスから宿主に導入されている外因性配列である。
14.CRISPRアレイが、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージのヌクレオチド配列により含まれる、態様又は段落1から13のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。ファージミドは、パッケージングされたファージである。プロファージは、細胞中の宿主染色体又はエピソームに組み込まれたファージである。
15.CRISPRアレイが、宿主細胞ゲノムに、例えば、染色体又はエピソーム核酸に組み込まれている、態様又は段落1から14のいずれか1つの方法、アレイ又はベクター。
【０１８１】
一例では、アレイは、標的配列又は標的配列を含む遺伝子に対して作用する転写又は翻訳アクチベーターにコンジュゲートされた死滅したCas(例えば、dCas9)と組み合わせた状態にある。これは、例えば、宿主細胞において(宿主培養物における製造のために、例えば、食物、ドリンク、医学又は本明細書において開示されるような本発明の任意のその他の適用のために、例えば、宿主が微生物である場合に抗生物質をコードするように、又は所望の外因性タンパク質をコードするように、例えば、所望の遺伝子、例えば、宿主細胞においてこれまでに遺伝子操作されている外因性遺伝子配列の)遺伝子発現のスイッチを入れるために有用である。
16.例えば、細胞、例えば、微生物に感染するための、又は医学若しくは歯学において使用するための、態様又は段落1から15のいずれか1つのCRISPRアレイを含むウイルス(例えば、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)。
17.その第1及び第2のビリオンが、異なるアレイリーダー若しくはプロモーターを含む、及び/又は宿主細胞中の、若しくは異なる宿主株中の異なる標的配列を標的化するための、段落16に記載のビリオンの集団。
18.各アレイが態様又は段落1から17のいずれか1つに記載のCRISPRアレイの収集物であって、第1のアレイが、crRNA転写のための第1のプロモーターを含み、第2のアレイが、第1のプロモーターとは異なるcrRNA転写のための第2のプロモーターを含み、各プロモーターが、宿主プロモーターに対して同一である、又はその相同体であり、任意選択で、第1の又は両方のプロモーターが、宿主Cas(例えば、Cas1、2、9又はCsn2)プロモーター又は宿主CRISPRアレイプロモーターに対して同一である、CRISPRアレイの収集物。例えば、第1のプロモーターは、内因性Casヌクレアーゼプロモーター又は内因性Cas1若しくはCas2プロモーター又は高度に若しくは構成的に発現される、若しくは宿主細胞の必須、病原性若しくは耐性遺伝子である内因性(endogeous)遺伝子のプロモーターである。内因性プロモーターを使用することによって、宿主プロモーターを保つための宿主の進化の間の圧力となり、したがって、これは、アレイの1つ又は複数のプロモーターを標的化する宿主CRISPR/Cas防御システムの可能性を低下させる。
19.第1のアレイが、1つ又は複数のスペーサー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又はそれより多いスペーサー)を含み、第2のアレイが、1つより多いスペーサー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又はそれより多いスペーサー)を含み、第2のアレイの前記スペーサーが、第1のアレイの1つ又は複数のスペーサーに対して同一である、本発明のCRISPRアレイの収集物。これは、HM-アレイ中の多くのこのようなスペーサー(又は更に、スペーサーを複数のアレイにわたって分配すること)が、宿主細胞がスペーサーの一部を欠失しようとも一部のHM-アレイスペーサーが宿主細胞にある機会を増大することを証明するので、HM-アレイスペーサーの相同組換えによって宿主耐性を逃れるのに有用である。欠失に対する防御はまた、異なるアレイ中のスペーサーの同一コピーの両端に位置する異なるリピートを使用することによって増強される。したがって、本発明は、以下を提供する:
20.第1のアレイのスペーサー(又は前記スペーサー)は、同一である第1のリピートが両端に位置し、第2のアレイのスペーサー(又は前記スペーサー)は、同一である第2のリピートが両端に位置し、第1のリピートが、第2のリピートとは異なる、段落18又は19の収集物。
21.第1のリピートが、宿主細胞CRISPR/Casシステム中のリピートに対して同一である、段落20の収集物。
22.第1のリピートが、宿主CRISPR/Casシステム中のリピートとは異なる、段落20の収集物。
23.第1及び第2のアレイが、同一宿主細胞中に、又は同一ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)中に含有される、段落18から22のいずれか1つの収集物。
24.第1のアレイが、第1のベクターに含有され、第2のアレイが、第1のアレイを含有しない第2のベクター中に含有される(例えば、ベクターが、プラスミド又はビリオン(例えば、同一ウイルス種の)又はパッケージングされたファージ(例えば、同一ファージ種の)である、段落18から22のいずれか1つの収集物。
一実施形態では、本発明の方法において使用されるベクターは、段落18から24のいずれか1つのアレイにより含まれるベクターである。
25.段落1から24のいずれか1つに従う、アレイ、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は収集物を含む宿主細胞。
【０１８２】
一般的な特性(以下を参照のこと)のいずれも、本構成に当てはまり得る。
【０１８３】
本発明の一例は、アレイに対する宿主適応性及び耐性のリスクを低減するために以下を提供する:
【０１８４】
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための本発明のCRISPRアレイ又はベクターであって、
a.宿主細胞は、標的配列の転写のための第1の内因性プロモーター(第1の宿主プロモーター)を含み、
b.CRISPRアレイは、crRNAをコードする配列及びcrRNAの転写のための第1のプロモーターを含み、crRNAは、任意選択で、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれ、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを標的にガイドすることが可能であり、
c.第1のプロモーターの配列は、第1の宿主プロモーターの配列とは異なる第2の内因性宿主プロモーターの配列である
本発明のCRISPRアレイ又はベクター。
【０１８５】
一例では、宿主における必須遺伝子のプロモーターであるプロモーターが、各ベクター(例えば、ファージ)CRISPRユニットに使用される-そして、宿主は、crRNAを十分に発現する(プロモーターが、常にスイッチを入れられなければならない、又はスイッチを入れられなければならないことが多い宿主遺伝子に由来する場合には構成的に)。宿主は、そのプロモーターから離れて容易に適応することはなく、そのため、耐性を容易に獲得することはないしない。任意選択で、宿主適応(耐性)の機会を減少させるために、異なるベクターCRISPRユニットに異なる必須プロモーターを使用することが可能である。アレイ(又は異なるアレイ)によって宿主において標的とされている病原性又は必須又は耐性遺伝子のプロモーターを使用することができる。ファージに対する耐性を獲得するためには、宿主は、内因性遺伝子プロモーター及び標的遺伝子組換え部位(例えば、細胞成長、生存力又は抗宿主薬物(例えば、抗生物質)耐性にとって必須であるコード配列中にある場合がある)を突然変異する必要があり、したがって、そのように遺伝子を不活性化するリスクもある。
【０１８６】
コピーが、本発明のとおりの宿主細胞配列を標的化するための同一スペーサー配列を含む、crRNAをコードする核酸配列の複数のコピーの本発明のとおりの提供は、ベクターからの有用な標的化スペーサーの宿主除去(例えば、宿主細胞相同組換えによる)の機会を低減するために有利である。本発明の同一又は複数のHMアレイで、複数の標的化スペーサーを柔軟に提供することができ、耐性を逃れる別の方法を提供する。
【０１８７】
したがって、本発明は、以下の概念を提供する:
1.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、I、II又はIII型)であって、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含むシステム:
(i)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記のようなアレイ)であって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
(iv)crRNAをコードする核酸配列のシステムの前記構成要素が、2、3又はそれより多いコピー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又はそれより多い)を含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、宿主病原性、耐性又は必須遺伝子配列又はベクター適応性を媒介する宿主CRISPR/Casシステム構成要素の配列)を標的化するための同一スペーサー配列を含む。
【０１８８】
例えば、システムは、同一スペーサーを含むcrRNAをコードする核酸配列の4つ以上、又は5つ以上の前記コピーを含む。これは、宿主において所望のcRNAの発現を増大するのに有利である。更に、これは、1つより多い配列が標的化される必要があるので(特に、5、10、15、20、30、40、50又は100若しくはそれより多くといったコピーがあり得る場合)、宿主耐性を避けるより大きな機会を提供する。種々のアレイ、例えば、ベクターにわたるコピーの分布は、同一DNA鎖上で間隔をあけたこれらを含み、所望のcRNAをコードする配列の切除につながり得る、スペーサー間又は両端に位置するリピート間の組換えの機会を低減するのに有用である。宿主がすべてのコピーを切除する機会は、多数のベクターアレイにわたって分配されたコピーを提供することによって低減され、また所望のスペーサーの多数のコピーを含むことによっても低減される(例えば、第1のベクターアレイ中の多数のコピー及び第2のベクターアレイ中の多数のコピー-各々所望のスペーサーの2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又は100又はそれより多いコピーを含む、少なくとも2、3、4、5、6、10又はそれより多いこのようなアレイを含むことが可能である)。
2.システムの前記構成要素が、同一スペーサーを含むcrRNAをコードする核酸配列の4、5、10、15又は20より多くの前記コピーを含む、概念1のシステム。
3.コピーが、2つ又はそれより多い核酸ベクターCRISPRアレイの間で分離される、概念1又は2のシステム。
4.第1及び第2のHMアレイを含み、第1及び第2のベクターCRISPRアレイが、同一宿主細胞中又は同一ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージ)中に含有される、概念3のシステム。
5.第1のアレイが、第1のベクター中に含有され、第2のアレイが、第1のアレイを含有しない第2のベクター中に含有される(例えば、ベクターが、プラスミド又はビリオン(例えば、同一ウイルス種の)又はファージミド(例えば、同一ファージ種の)である)、概念3又は4のシステム。
6.リピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピートに対して同一である、概念1から5のいずれか1つのシステム。
7.リピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピートに対して同一ではない、概念1から5のいずれか1つのシステム。
8.概念1から7のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む宿主細胞。
9.概念1から8のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む、抗菌組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤又はマウスウォッシュ)。
【０１８９】
一般特性(以下を参照のこと)のいずれも、本概念に当てはまり得る。
【０１９０】
分離されたCRISPR/CAS9システム
この構成は、外因性配列を保持するための制限された能力を有する標的ベクター、例えば、ウイルス又はファージにおいて空間を開放するのに有利である。空間を開放することによって、より多くの標的化スペーサー又はアレイを含むことができ、これは、宿主耐性を避けるために有用である。特に、sp又はsaCas9等の嵩高いCas配列について、例えば、ベクター中に内因性Casエンドヌクレアーゼをコードするのではなく、それを利用することは有利である。更に、非宿主供給源に由来するいくつかの外因性Casを用いた場合に見られることがあるような劣性の適合性の機会はない。ウイルス、例えば、ファージゲノムサイズを低減する能力はまた、宿主細胞取り込み(宿主細胞におけるウイルスの感染及び/又は維持)を促進するために有益であり得る。いくつかの例では、利点は、ベクター(例えば、ファージ)による宿主の侵入が、侵入核酸と闘う宿主の試みにおいて、宿主Casヌクレアーゼの発現の増大を含め、宿主CRISPR/Cas活性を上方制御し得るということである。しかし、これはまた、アレイ、ベクター、システム及びこの構成の発明のその他の態様が、宿主Casによって認識される1つ又は複数のリピートを含む場合に、これらとともに内因性Casを提供するために有用である。本発明が、宿主CRISPRアレイを標的化する1つ又は複数のスペーサーを含む場合には(同様に本発明の第1の構成のとおり)、次いで、これは、宿主CRISPRアレイ自体の不活性化を促進し、次いで、自身のCasヌクレアーゼを使用して、自身のCRISPRシステムを不活性化する「自殺」宿主細胞と似ている。
【０１９１】
したがって、本発明は、例として番号付けされた以下の特性を提供する:
1.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、I、II又はIII型)であって、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含むシステム:
(i)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記のようなアレイ)であって、HM-crRNAが、標的配列を改変するために宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
(iv)システムの前記構成要素が、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして標的配列を改変する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離される。
【０１９２】
本明細書において「分離された」とは、ベクターが、システムの構成要素の1つ又は複数(しかしすべてではない)を含み、宿主細胞が、構成要素の1つ又は複数(しかしすべてではない)を含み、ベクターが、宿主細胞により含まれない1つ又は複数の構成要素を含むことを意味する。一実施形態では、ベクター及び宿主細胞は、構成要素のいずれも共通して共有するのではなく、例えば、宿主細胞は、構成要素(i)を含み、ベクターが、構成要素(ii)を含み、いずれかのベクターが、構成要素(iii)を含み、及び/又は宿主細胞が、構成要素(iii)を含む。ベクターが、宿主細胞の内側にある場合には(例えば、組み込まれた又はエピソームベクター、例えば、プロファージとして)、ベクターは、宿主細胞を形質転換したベクターによって提供されている核酸である(及びこのような核酸によって提供されるシステムの構成要素は、その場合には、細胞構成要素として構築されない)ということが意図される。これは、形質転換された宿主の核酸(例えば、染色体及びエピソーム核酸)をシーケンシングすること及び同一種の形質転換されていない宿主から(例えば、宿主が微生物、例えば、細菌又は古細菌である場合には、同一宿主親コロニー又はクローンから)得た配列に対してこれを比較することによって容易に決定できる。
【０１９３】
任意選択で、システムは、CRISPR/Cas9システムである。任意選択で、(a)のヌクレアーゼは、I型Casヌクレアーゼである。任意選択で、(a)のヌクレアーゼは、II型Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。任意選択で、(a)のヌクレアーゼは、III型Casヌクレアーゼである。
2.構成要素の少なくとも1つが、宿主細胞に対して内因性である、例1のシステム。
3.構成要素(i)が、宿主細胞に対して内因性である、例1又は2のシステム。
4.構成要素(iii)が、宿主細胞に対して内因性である、例1から3のいずれか1つのシステム。
5.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、I、II又はIII型)であって、(a)〜(e)に記載の構成要素を含むシステム:
a.Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする少なくとも1つの核酸配列、
b.スペーサー配列(HM-スペーサー)及びHM-crRNAをコードするリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイであって、HM-crRNAが、宿主細胞において宿主標的配列とハイブリダイズして、前記Casを標的にガイドすることが可能である配列を含む、遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
c.任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
d.システムの前記構成要素が、少なくとも第1と、第2の核酸ベクターの間で分離され、第1のベクターが構成要素(a)を含むが、第2のベクターは、構成要素(a)を欠き、
e.ベクターが、宿主細胞を同時に又は逐次同時形質転換でき、それによって、HM-crRNAが、宿主細胞においてCasを標的にガイドして、標的配列を改変する。
上記で提供される「分離された」の定義は、第1及び第2のベクターを含む本例に準用する。
一実施形態では、tracrRNA配列は、ベクターによって提供されないが、内因性宿主細胞CRISPR/CasシステムのtracrRNA配列であり、tracrRNAは、宿主細胞においてCasを標的にガイドするための成熟crRNAへのその後のプロセシングのために、細胞においてHM-crRNAとハイブリダイズ可能である。
6.第1のベクターが、構成要素(a)を含み、第2のベクターが、構成要素(b)及び(c)を含む、例5のシステム。
7.第1及び/又は第2のベクターが各々、1つ、2つ、3つ又はそれより多い更なる遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイを含む、例5又は6のシステム。
8.第1及び第2のベクターのうち一方が、ファージミドであり、もう一方のベクターが、ヘルパーファージである、例5から7のいずれか1つのシステム。
9.crRNA配列及びtracrRNA配列が、例えば、ベクターによって提供されるシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、例1から8のいずれか1つ(例えば、例3又は6)のシステム。
10.各ベクターが、外因性核酸の挿入のための制限された能力を有する、例1から9のいずれか1つのシステム。
11.ベクター又はベクターが、ウイルス(例えば、ビリオン、パッケージングされたファージ、ファージミド又はプロファージ)である、例1から10のいずれか1つのシステム。
12.宿主細胞が、対象のHM-配列をコードする遊離末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含む、及び/又はシステムが、HM-DNAをコードする配列を含み(例えば、ベクターに、又は宿主細胞ゲノムに、又はそのエピソームに組み込まれた)、HM-DNAが、標的配列中の、又はその両端に位置する配列(単数若しくは複数)に対してそれぞれ相同である配列(単数若しくは複数)を含む、例1から11のいずれか1つのシステム。
【０１９４】
鎖が、遊離末端、すなわち、宿主又はベクターDNAに組み込まれていない末端を含み、その結果、鎖が1つ又は2つの遊離末端を有し、すなわち、DNAが、それぞれすぐ5'及び又は3'隣接するヌクレオチドと結合していない。
13.標的部位が、宿主細胞においてCasによって(例えば、前記CasヌクレアーゼがCas9である場合にCas9によって)切断され、HM-DNAが、宿主ゲノムに(例えば、染色体又はエピソーム部位に)HM-DNAを挿入するために、切断部分の5'及び3'それぞれ両端に位置する相同である第1及び第2の配列を含む、例12のシステム。
14.挿入が、相同性指定指向組換え(HDR)によってである、例13のシステム。
15.挿入が、非相同末端結合(NHEJ)によってである、例13のシステム。
16.HM-配列が、調節エレメント(例えば、内因性プロモーターと置き換わるプロモーター、例えば、誘導プロモーター)、転写阻害配列、転写増強配列、標識又は外因性タンパク質若しくはドメインをコードする配列である、又はそれをコードする、例12から15の任意の1つのシステム。
17.第1及び第2のHM-DNAを含み、第1のHM-DNAの配列が、第2のDNAの配列と相補的であり、それによって、DNAが、宿主細胞において相同組換えによって組み合わされ、宿主細胞ゲノムへの(例えば、染色体又はエピソーム部位への)挿入のために組み合わされたHM-DNAを形成することができる、例12から16のいずれか1つのシステム。
18.ベクター又はベクターが、宿主細胞に感染して、システム構成要素を含むベクター核酸を細胞に導入することが可能である、例1から17のいずれか1つのシステム。
19.前記Casヌクレアーゼがニッカーゼである、例1から18のいずれか1つのシステム。
20.細胞が細菌又は古細菌であり、前記Casヌクレアーゼが、細菌又は古細菌の内因性II型CRISPR/Casシステムによって提供される、例1から19のいずれか1つのシステム。
21.ベクター(単数又は複数)が、前記宿主細胞の内側であり、任意選択で、宿主DNAに組み込まれる、例1から20のいずれか1つのシステム。
22.ベクター(単数又は複数)が、Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする配列を欠く、例1から21のいずれか1つのシステム。
23.内因性CRISPR/Casシステムを含む微生物宿主細胞に感染するための、遺伝子操作された核酸ウイルスベクター(例えば、上記のようなベクター、ビリオン又はパッケージングされたファージ)であって、
(a)例1から22のいずれか1つに記載のCRISPR/Casシステムにおいて使用するための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み、
(b)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
(c)第1の配列は、抗微生物(例えば、抗生物質)耐性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、抗微生物耐性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、任意選択で、遺伝子は、異なっており、
(d)第1の配列は、抗微生物耐性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子若しくは病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、
(e)第1の配列は、必須遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子若しくは病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、又は
(f)第1の配列は、病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれ、第2の配列は、必須遺伝子若しくは病原性遺伝子(若しくはそのRNA)により含まれる
ベクター。
24.内因性CRISPR/Casシステムを含む宿主細胞を形質転換するための、遺伝子操作された(宿主細胞中のベクターから直接遺伝子操作された、又は単離され、ベクターが、宿主を形質転換した遺伝子操作されたベクターに由来した)核酸ベクターであって、任意選択で、上記のようなベクターであり、
(a')例1から25のいずれか1つに記載のCRISPR/Casシステムにおいて使用するための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み、
(b')Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列を欠き、
第1の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第1の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、第2の前記crRNAは、前記宿主細胞中の第2の核酸配列とハイブリダイズ可能であり、前記第2の配列は、前記第1の配列とは異なり、
第1及び/又は第2の配列は、
(c')前記宿主CRISPRアレイ中のリピートDNA又はRNA配列(例えば、リピートは、最も5'のリピート(第1のリピート)である)、
(d')tracrRNA配列又はDNA配列をコードするtracrRNA、
(e')CRISPRアレイリーダー配列、
(f')Cas遺伝子プロモーター(例えば、Cas1、Cas2又はCsn2プロモーター)、
(g')CRISPRアレイリーダープロモーター配列又は
(h')CasをコードするDNA又はRNA配列(例えば、Casは、Cas9、Cas1、Cas2又はCsn2である)であって、例えば、第1の前記crRNAは、宿主Cas1遺伝子配列(又はそのRNAの配列)を標的化可能であり、第2の前記crRNAは、宿主Cas2遺伝子配列(又はそのRNAの配列)を標的化可能である、CasをコードするDNA又はRNA配列
である、又はそれを含む宿主CRISPR/Casシステムの標的配列である
ベクター。
25.第1及び/又は第2の標的配列が、
i.第1のリピートの最も5'のヌクレオチドと連続する(及び任意選択で、前記リピートの最も5'のヌクレオチドを含む)例えば、第1のリピートの5'末端に第1の3ヌクレオチドを含む、CRISPRアレイリーダー又はリーダープロモーター配列、
ii.第1のリピートのすぐ5'の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列、
iii.第1のリピートの最も5'のヌクレオチオの最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列、又は
iv.第1のスペーサーのすぐ3'にある(任意選択で、配列が、第1のスペーサーの最も3'のヌクレオチドを含む)、例えば、第1のリピートの3'末端に少なくとも3ヌクレオチドを含む、最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30又は32)の連続ヌクレオチドの配列
である、又はそれを含む、例24のベクター。
26.標的配列又は各標的配列が、配列番号1〜44からなる群から選択される配列又はその相補体により含まれる、例24又は25のベクター。
27.第1のcrRNAが、構造R-S-R(式中、R=CRISPRリピート及びS=CRISPRスペーサー)を含むか、又はからなり、Sが、(5'から3'方向に)V-HR又はHR-V(式中、V=ベクターのDNA配列と同一の配列及びHR=前記宿主細胞CRISPR/CasシステムのCRISPRアレイのリピートのDNA配列)を含み、第1のcrRNAは、細胞において宿主CRISPRアレイの改変のために、宿主CRISPRアレイのスペーサーとハイブリダイズして、CasをcrRNAの標的にガイドすることが可能である、例24から26のいずれか1つのベクター。
28.第1のcrRNAが、ベクター中に存在する核酸と実質的にハイブリダイズしない、例えば、第1のcrRNAが、ベクター中のVとハイブリダイズしない、又は宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするよりも強力にはハイブリダイズしない、例27のベクター。これを決定することに関する上記の考察は、この例にも当てはまる。
29.V=ベクターDNAの1又は最大40(例えば、最大15)の連続ヌクレオチドである、例27又は28のベクター。例えば、V=ベクターDNAの1、2、3、4、5、6、7 8 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40の連続ヌクレオチド。
30.i.宿主CRISPR/Casシステムが、同族PAMを認識でき、
j.ベクターDNAが、プロトスペーサー配列のすぐ3'にこのようなPAMを含み、
k.V=プロトスペーサーの1又は最大40(例えば、最大15)のヌクレオチド、及び
l.HR=宿主CRISPRアレイのリピートの連続配列に対して同一の配列
である、例29のベクター。
31.宿主アレイのリピートの前記連続配列が、宿主リピートの少なくとも50%の配列である(例えば、宿主リピートの最も5'又は最も3'のヌクレオチドを含む)例30のベクター。
32.V=1〜40(例えば、最大15)の最も3'のプロトスペーサー連続ヌクレオチド及び任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も5'のヌクレオチドを含む、例30又は31のベクター。
33.V=1〜40(例えば、最大15)の最も5'のプロトスペーサー連続ヌクレオチド及び任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も3'のヌクレオチドを含む、例30又は31のベクター。
34.R=宿主CRISPR/Casシステムによって認識されるリピートである、例27から33のいずれか1つのベクター。或いは、R=宿主CRISPR/Casシステムによって認識されないリピートである。この場合には、好ましくは、ベクターは、Rと同族である、すなわち、宿主細胞においてRとともに機能可能であるCasヌクレアーゼ(及び任意選択で、tracrRNA)のヌクレオチド配列を含む。
35.第1の配列が、(c')〜(h')のいずれか1つに従い、第2の配列が、宿主必須遺伝子、病原性遺伝子又は耐性遺伝子から選択される、例24から34のいずれか1つに記載のベクター。
36.内因性CRISPR/Casシステムを含む微生物宿主細胞に感染するための例1から22のいずれか1つのシステムにおいて使用するための、遺伝子操作された核酸ウイルスベクター(例えば、ビリオン又はパッケージングされたファージ)であって、
a.宿主において第1のcrRNAを発現するための第1の核酸配列を含み、
b.第1の配列は、(5'から3'方向に)R1a-S1-R1bを含み、R1a=第1のCRISPRリピートであり、R1aは任意選択であり、R1b=第2のCRISPRリピートであり、S1=宿主配列(例えば、例23又は24において列挙される宿主配列)と相補的であるCRISPRスペーサーであり、R1a及びR1bは、宿主Casヌクレアーゼ(例えば、II型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9)によって認識され、
c.(i)(b)のリピートを認識するCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列及び/又は(ii)第1の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く
ベクター。
例えば、ベクターは、ファージにより含まれる核酸ベクターである。
37.d.宿主において第2のcrRNAを発現するための第2の核酸配列を含み、第2のcrRNAが、第1のcrRNAとは異なり、
e.第2の配列が、(5'から3'方向に)R2a-S2-R2bを含み、R2a=第1のCRISPRリピートであり、R2aは任意選択であり、R2b=第2のCRISPRリピートであり、S2=宿主配列(例えば、例23又は24において列挙される宿主配列)と相補的であるCRISPRスペーサーであり、R2a及びR2bは、宿主Casヌクレアーゼ(例えば、I又はII型ヌクレアーゼ、例えば、Cas6)によって認識される、例36のベクター。
【０１９５】
したがって、例えば、第1及び第2の核酸配列は、例えば、同一又は異なるCRISPRアレイにおいて同一のパッケージングされたファージミドにより含まれる。
38.(iii)(e)のリピートを認識するCas(例えば、Cas6)をコードする核酸配列及び/又は(iv)第2の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く、例37のベクター。
39.内因性CRISPR/Casシステムを含む微生物宿主細胞に共感染するための、例1から22のいずれか1つのシステムにおいて使用するための、遺伝子操作された核酸ウイルスベクター(例えば、上記のようなベクター、ビリオン又はパッケージングされたファージ)の収集物であって、第1のベクター及び第2のベクターを含み、
f.第1のベクターは、例36に従い、
g.第2のベクターは、宿主において第2のcrRNAを発現するための第2の核酸配列を含み、第2のcrRNAは、第1のcrRNAとは異なり、
h.第2の配列は、(5'から3'方向に)R2a-S2-R2bを含み、R2a=第1のCRISPRリピートであり、R2aは任意選択であり、R2b=第2のCRISPRリピートであり、S2=宿主配列と相補的であるCRISPRスペーサーであり、R2a及びR2bは、宿主Casヌクレアーゼ(例えば、I又はII型ヌクレアーゼ、例えば、Cas6)によって認識される
収集物。
例えば、第1のベクターは、第1のパッケージングされたファージミドにより含まれ、第2のベクターは、第2のパッケージングされたファージミドにより含まれる。
40.第2のベクターが、(v)(b)のリピートを認識するCas(例えば、Cas9)をコードする核酸配列及び/又は(vi)第1の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を含む、例39の収集物。
【０１９６】
例えば、この場合には、Cas機能は、内因性宿主システムによって提供される。これは、ベクター空間(例えば、より多くの宿主が標的化するHM-アレイスペーサーを含むために)を節約し、ベクター及びアレイ構築を簡素化する。
41.第2のベクターが、(vii)(h)のリピートを認識するCas(例えば、Cas6)をコードする核酸配列及び/又は(viii)第2の配列によってコードされるcrRNA配列と相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く、例39又は40の収集物。
【０１９７】
例えば、この場合には、Cas機能は、内因性宿主システムによって提供される。
42.第1及び第2のベクターが各々、(ix)(b)のリピートを認識するCas(例えば、Cas9)をコードする核酸配列及び(x)(h)のリピートを認識するCas(例えば、Cas6)をコードする核酸配列を欠き、任意選択で、収集物が、(b)及び(h)のリピートを認識する1つ又は複数のCasを含む宿主細胞により含まれる、例39の収集物。
43.(ix)及び/又は(x)に記載の核酸配列を含む第3のベクター(例えば、ビリオン又はファージ)を更に含む、例42の収集物。
44.各ベクターが、それぞれのパッケージングされたビリオン若しくはファージミド又はそれぞれのビリオン若しくはファージ核酸により含まれる、例39から43のいずれか1つの収集物。
45.R1a及びR1bが、同一リピート配列を含む、例36から44のいずれか1つのベクター又は収集物。
46.R2a及びR2bが、同一リピート配列を含む、例37から45のいずれか1つのベクター又は収集物。
47.(b)のリピートが、(e)のリピートを認識するCasヌクレアーゼとは異なるCasヌクレアーゼによって認識される、例37から46のいずれか1つのベクター又は収集物。
48.宿主が、異なる型(例えば、I型及びII型システム、I型及びIII型システム、II型及びIII型システム又はI、II及びIII型システム)のCRISPR/Casシステムを含む、例37から47のいずれか1つのベクター又は収集物。
49.(b)のリピートが、II型Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9によって認識される、例36から48のいずれか1つのベクター又は収集物。
50.(e)のリピートが、I又はIII型Casヌクレアーゼ、例えば、Cas6によって認識される、例37から49のいずれか1つのベクター又は収集物。
51.ベクターが、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージである、例23から50のいずれか1つのベクター又は収集物。
52.ベクターによってコードされるcRNAとともに作動可能である1つ又は複数のCasを含む宿主細胞の内側の、例23から51のいずれか1つのベクター又は収集物。
53.Cas9を含む宿主細胞の内側の、例23から52のいずれか1つのベクター又は収集物。
54.HM-DNA(例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド上の、又は宿主細胞ゲノム若しくはそのエピソーム中の)と組み合わせたベクター又は収集物であって、HM-DNAが、例12から17のいずれか1つに列挙されるとおりである、例23から53のいずれか1つのベクター又は収集物。
55.複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み、前記crRNAが、宿主細胞において少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50又は100のDNA配列を標的化可能である、例1から54のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
56.第1のcrRNA又は前記Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ではないが、宿主ベクター適応を媒介するCasヌクレアーゼのDNA配列(又はそのRNAの配列)を標的化可能である第1のcRNAをコードする核酸配列を含み、任意選択で、第2のcrRNA又は宿主において耐性、病原性若しくは必須宿主遺伝子(又はそのRNA)の配列を標的化可能である第2のcRNAをコードする核酸配列を含む、例1から55のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
57.crRNAをコードする核酸配列の2つ、3つ又はそれより多いコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性若しくは必須遺伝子配列又はベクター適応を媒介するが、前記Casヌクレアーゼではない宿主CRISPR/Casシステム構成要素の配列)を標的化するための同一スペーサー配列を含む、例1から56のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
58.コピーが、2つ又はそれより多いベクターCRISPRアレイ間で分離される、例57のシステム、ベクター又は収集物。
59.ベクターリピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピート又は宿主CRISPRアレイに対して同一である(例えば、各ベクターリピートが、宿主リピートと少なくとも95%の配列同一性を有する)例1から58のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
60.ベクターリピートが、宿主CRISPRアレイ中のリピート又は宿主CRISPRアレイと同一ではない、例1から58のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
61.同一宿主細胞中に、又は同一ベクター(例えば、プラスミド又はウイルス又はビリオン又はファージ又はプロファージ又はファージミド)によって含有される第1及び第2のベクターCRISPRアレイを含む、例1から60のいずれか1つのシステム、ベクター又は収集物。
62.第1のアレイが、第1のベクター中に含有され、第2のアレイが、第1のアレイを含有しない第2のベクター中に含有される(例えば、ベクターは、プラスミド又はビリオン(例えば、同一ウイルス種の)又はファージミド(例えば、同一ファージ種の)である、例61のシステム、ベクター又は収集物。
63.例1から62のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む宿主細胞。
64.例1から62のいずれか1つに記載のシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージを含む抗菌組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤又はマウスウォッシュ)。
【０１９８】
微生物と一緒のコンディショニング
本発明は、微生物(例えば、ファージ及び/又は細菌集団)を製造する方法であって、宿主及びウイルスを共進化を促進するように一緒にコンディショニングすること並びに、したがって、宿主のウイルス(例えば、ファージ)に対するコンディショニング、逆もまた同じを含む方法を提供する。crRNA発現又は活性の抑制可能な制御を使用して、本発明は、例えば、抗生物質耐性標的遺伝子組換えを用いて、又は用いずに、宿主におけるスペーサーによってガイドされるCas作用によって強いられるストレスを伴って、又は伴わずに、調整が生じることを可能にするように、所望のスペーサー活性がオン又はオフを切り替えられることができる制御可能な方法で、共進化を意図的に調節する。このように、細菌集団を、所望の遺伝子のファージ不活性化が引き起こされ得る状況(例えば、乳製品又は食品製造培養)において使用するために、又は細菌を死滅させる、若しくは調節するように、例えば、抗生物質耐性をノックダウンするために使用されるファージの調整において使用するために調整することができる。この構成は、本方法が、宿主とともの培養の際にアレイの抗生物質耐性遺伝子不活性化活性を意図的に抑制するので、一実施形態において、宿主の抗生物質耐性遺伝子を標的化する本発明の1つ又は複数のCRISPRアレイを保持するウイルス、例えば、ファージとともに抗生物質耐性菌宿主の培養を更に可能にする。したがって、宿主細胞の成長、培養能力を妨害する抗生物質耐性不活性化効果を伴わずに(これは、別の方法でファージ拡大を最小化する)、耐性細菌宿主集団を使用して培養で(例えば、工業的培養容器又は植物で)ファージを成長させることができ、ファージ及び宿主が共進化し、相互に調整することを可能にし、一方で、所望のファージのすべてのその他の構成要素が、培養された宿主集団に同調することを依然として可能にする。得られたファージ集団のサンプルの試験を、例えば、抗生物質耐性宿主細胞集団を使用して、ただし、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子のアレイ標的化について抑制解除された試験ファージを用いて実験室規模で実施できる。原核細胞及びファージ設定における遺伝子発現の天然に存在する及び合成の抑制は、当業者に周知であり、例えば、tetシステム又は光誘導システムである。
【０１９９】
したがって、本発明は、段落として番号づけられた以下の特性を提供する:
1.微生物製造方法であって、
(a)宿主細胞におけるヌクレオチド配列標的化のための宿主CRISPR/Casシステムを含む宿主細胞を提供する工程と、
(b)宿主細胞に感染可能であるウイルスを提供する工程であって
(i)ウイルスは、宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための1つ又は複数の遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記のようなアレイ)を含み、
(ii)第1の前記HM-アレイは、標的配列を改変するために第1の宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の標的にガイドすることが可能であるスペーサー配列(HM-スペーサー)を含む第1のHM-crRNAをコードし、任意選択で、第1の標的配列の改変は、宿主細胞成長又は生存力を低減し、
(iii)第1のHM-アレイは、第1のHM-crRNAの転写について可逆的に抑制可能であり、及び/又は第1のHM-crRNA活性が抑制可能である
工程と、
(c)ウイルスを用いて宿主細胞に感染させて、1つ又は複数のHM-CRISPRアレイを細胞中に導入する工程と、
(d)細胞における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制する工程と、
(e)感染宿主細胞を培養して、ウイルスの集団(PV1)を含む宿主細胞の集団(PH1)を製造する工程と、
(f)ウイルス集団PV1及び/又は培養宿主細胞集団を得る工程と
を含む、方法。
【０２００】
一例では、第1のHM-crRNAは、標的配列を改変するために第1の宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の標的にガイドすることが可能であるHM-スペーサーを含み、標的配列は、宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それによって、第1のHM-crRNAは、Casを標的にガイドして、宿主細胞において宿主CRISPR/Casシステムを改変し、標的配列の改変は、宿主CRISPR/Casシステムの機能を低減又は排除する。
【０２０１】
代替において、改変は、宿主において遺伝子の発現を増強又は阻害する。一実施形態では、遺伝子は、必須遺伝子、病原性遺伝子又は耐性遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子)である。一実施形態では、改変は、宿主に対して内因性又は外因性である遺伝子産物の発現を増強する。一例では、宿主は、外因性ヌクレオチド配列(例えば、所望のタンパク質を産生するための)を含む遺伝子操作された宿主であり、改変は、宿主細胞における所望のタンパク質の発現を増強又は阻害する。一例では、所望のタンパク質は、抗生物質であり、宿主細胞は、微生物、例えば、細菌又は古細菌細胞である。したがって、方法は、ウイルス集団を製造するための宿主細胞の培養の培養を可能にし、そうでなければ、宿主細胞集団の拡大を妨害する抗生物質は、発現されない。その後、単離されたウイルス集団の1種又は複数のウイルスは、単離後に第1のHM-crRNA抑制が除去されることがあり、それによって、能動的な抗生物質ウイルス組成物を提供するので、宿主細胞成長又は生存力を低減するための抗菌組成物において使用できる。したがって、本発明は、宿主細胞において抗生物質を発現可能であるウイルスを含む、このような方法及びこのような抗生物質組成物を提供する。発現を活性化する改変は、例えば、転写アクチベーターにコンジュゲートされたCas(例えば、Cas9)を提供することによって達成でき、Casは、第1のHM-crRNAの同族Casであり、アクチベーターは、所望の外因性又は内因性遺伝子の転写を活性化する。発現を阻害する改変は、例えば、死んだCas(例えば、dCas9)を提供することによって達成でき、CAsは、第1のHM-crRNAの同族Casであり、所望の外因性又は内因性遺伝子の転写を阻害する。
【０２０２】
crRNA転写又は活性の抑制は、部分的である場合も、完全である場合もある(すなわち、宿主におけるアレイからのcrRNAの活性なし又は転写なし)。活性とは、crRNAの、改変のためにCasを第1の宿主標的部位にガイドするために同族宿主配列とハイブリダイズする能力を指す。
【０２０３】
一例では、ウイルスは、細胞に導入された場合にそのように抑制されず、方法は、例えば、化学的、物理的、機械的、磁力、光又は抑制を引き起こすその他の薬剤を使用することによって、ウイルスが細胞に感染した後に工程(d)を実施することを含む。一実施形態では、第1のHM-アレイは、第1のHMcrRNAの転写について抑制可能なプロモーター(HM-プロモーター)を含み、プロモーターは、(例えば、レプレッサー剤、例えば、化学物質又はタンパク質をプロモーターに結合することによって)第1のHM-アレイが細胞に導入された後に抑制される。
【０２０４】
別の例では、ウイルスは、例えば、化学的、物理的、機械的、磁力、光又は抑制を引き起こすその他の薬剤を使用することによって、工程(c)が実施される前にそのように抑制される。一実施形態では、第1のHM-アレイは、第1のHMcrRNAの転写について抑制可能なプロモーター(HM-プロモーター)を含み、プロモーターは、第1のHM-アレイが細胞に導入される前に抑制され(例えば、レプレッサー剤、例えば、化学物質又はタンパク質をプロモーターに結合することによって)、その後、抑制された第1のHM-アレイが細胞に導入される。
【０２０５】
一実施形態では、工程(f)は、PV1を単離する工程を含む。一実施形態では、工程は、PV1又はそのウイルスをPH1の宿主細胞から分離する工程を含んでいた。
2.工程(e)又は(f)後にウイルス集団における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制解除する工程を更に含み、任意選択で、その後に、宿主細胞を培養する工程を更に含む、段落1の方法。
3.A.任意選択で、(a)、(f)又は段落2の更に培養された細胞の宿主細胞と同一である、宿主細胞の集団(PH2)を得る工程と、
B.Aの宿主細胞に集団PV1に由来するウイルスを感染させる工程と、
C.細胞における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制する工程と、
D.感染宿主細胞を培養して、ウイルスの集団(PV2)を含む宿主細胞の集団(PH3)を製造する工程と、
E.ウイルス集団PV2(又はそのウイルス)及び/又は培養宿主細胞集団を得る工程と
を含む、段落1又は2の方法。
4.工程(D)又は(E)後にウイルス集団における第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を抑制解除する工程を更に含み、任意選択で、その後に、宿主細胞を培養する工程を更に含む、段落3の方法。
5.更なる宿主細胞又は宿主細胞の集団(PH4)でウイルス集団PV1又はPV2の単離されたサンプルを試験する工程を含み、任意選択で、更なる細胞又は集団PH4が、(a)の細胞に対して同一であり、試験する工程が、更なる細胞又は集団PH4に前記サンプルのウイルスを感染させる工程と、任意の宿主細胞成長が生じることを可能にする期間、待機する工程と、更なる細胞又は集団PH4の所定の活性(例えば、細胞成長又は生存力)が改変されている(例えば、低減されている、低減された宿主細胞成長又は生存力*等)か、又は生じているかを決定する工程とを含み、細胞(単数又は複数)の内側のウイルスが、前記期間の間、抑制解除された第1のHM-crRNAの転写及び/又は第1のHM-crRNA活性を有する、段落1から4のいずれか1つの方法。
*これは、寒天にプレーティングされた細胞又はPH4に、サンプルのウイルスが添加される場合に、プラーク形成のための標準アッセイを使用して試験できる。
6.宿主細胞のすべてが、微生物細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)であり、第1の標的配列の改変が、宿主細胞成長又は生存力を低減し、前記決定する工程が、抗菌活性**が生じたことを決定する、段落5の方法。
**これは、標準プラークアッセイを使用して決定できる。
7.期間が、少なくとも1、5、10、30、60又は120分である、段落5又は6の方法。
8.(a)の細胞及び任意選択で、PH1、PH2及び/又はPH3細胞が、第1の標的配列を含まず、更なる細胞又は集団PH4細胞が、第1の標的配列を含む、段落5から7のいずれか1つの方法。
9.(a)の細胞及び任意選択で、PH1、PH2及び/又はPH3細胞が、第1の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含まず、第1の標的配列が、このような遺伝子の標的配列であり、任意選択で、更なる細胞又は集団PH4細胞が、前記遺伝子を含む、段落1から8のいずれか1つの方法。
10.(a)の細胞及び任意選択で、PH1、PH2及び/又はPH3細胞が、第1の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含み、第1の標的配列が、このような遺伝子の標的配列である、段落1から7のいずれか1つの方法。
11.宿主細胞のすべてが、微生物細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)であり、第1の標的配列の改変が、宿主細胞成長又は生存力を低減する、又は抗生物質に対する宿主細胞耐性を低減する、段落1から10のいずれか1つの方法。
12.宿主細胞のすべてが、ヒト、動物(例えば、非ヒト動物)又は植物の感染性疾患病原体である、段落1から11のいずれか1つの方法。
13.宿主細胞のすべてが、例えば、エシェリキア属(Escherichia)(例えば、大腸菌(E coli)O157:H7又はO104: H4)、シゲラ属(Shigella)(例えば、ディセンテリエ(dysenteriae))、サルモネラ属(Salmonella)(例えば、チフィ(typhi)又はエンテリカ(enterica)、例えば、血清型チフィムリウム(typhimurium)、例えば、DT104)、エルウィニア属(Erwinia)、エルシニア属(Yersinia)(例えば、ペスチス(pestis))、バチルス属(Bacillus)、ビブリオ属(Vibrio)、レジオネラ属(Legionella)(例えば、ニューモフィリア(pneumophilia))、シュードモナス属(Pseudomonas)(例えば、エルギノーサ(aeruginosa))、ナイセリア属(Neisseria)(例えば、ゴンノレア(gonnorrhoea)又はメニンギティディス(meningitidis))、ボルデテラ属(Bordetella)(例えば、パータスス(pertussus))、ヘリコバクター属(Helicobacter)(例えば、ピロリ(pylori))、リステリア属(Listeria)(例えば、モノサイトゲネス(monocytogenes))、アルゴバクテリウム属(Agrobacterium)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)(例えば、オーレウス(aureus)、例えば、MRSA)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)(例えば、ピオゲネス(pyogenes)又はサーモフィルス(thermophilus))、エンテロコッカス属(Enterococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)(例えば、ディフィシル(dificile)又はボツリナム(botulinum))、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)(例えば、アミコラツム(amycolatum))、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)(例えば、ツベルキュロシス(tuberculosis))、トレポネマ属(Treponema)、ボレリア属(Borrelia)(例えば、バーグドルフェリ(burgdorferi))、フランシセラ属(Francisella)、ブルセラ属(Brucella)、カンピロバクター属(Campylobacter)(例えば、ジェジュニ(jejuni))、クレブシエラ属(Klebsiella)(例えば、ニューモニエ(pneumoniae))、フランキア属(Frankia)、バルトネラ属(Bartonella)、リケッチア属(Rickettsia)、シュワネラ属(Shewanella)、セラチア属(Serratia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、ブロコトリックス属(Brochothrix)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、ビブリオ属(例えば、コレラ(cholera)、例えば、O139又はブルニフィクス(vulnificus))、ヘモフィルス属(Haemophilus)(例えば、インフルエンザ(influenzae)、ブルセラ属(例えば、アボルツス(abortus))、フランシセラ属(Franciscella)、キサントモナス属(Xanthomonas)、エーリキア属(Erlichia)(例えば、シャフェンシス(chaffeensis))、クラミジア属(Chlamydia)(例えば、ニューモニエ)、パラクラミジア属(Parachlamydia)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス(faecalis)又はファセイム(faceim)、例えば、リネゾリド耐性)、オエノコッカス属(Oenococcus)及びアシネトバクター属(Acinetoebacter)(例えば、バウマニー(baumannii)、例えば、多剤耐性)の種から選択された同一種のものである、段落1から13のいずれか1つの方法。
14.宿主細胞のすべてが、例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性及びテイコプラニンから選択される抗生物質に対して耐性のスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)細胞である、請求項13の方法。
15.宿主細胞のすべてが、例えば、セファロスポリン系剤(例えば、セフタジジム)、カルバペネム系剤(例えば、イミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド系剤(例えば、ゲンタマイシン又はトブラマイシン)及びコリスチンから選択される抗生物質に対して耐性の、シュードモナス・エルギノーサ細胞である、請求項13の方法。
16.宿主細胞のすべてが、例えば、カルバペネムに対して耐性のクレブシエラ属(例えば、ニューモニエ)の細胞である、請求項13の方法。
17.宿主細胞のすべてが、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、β-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン及びペニシリンから選択される抗生物質に対して耐性のストレプトコッカス属 (例えば、ニューモニエ又はピオゲネス)の細胞である、請求項13の方法。
18.宿主細胞のすべてが、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシン及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に対して耐性のサルモネラ属(例えば、血清型チフィ)の細胞である、請求項13の方法。
19.宿主細胞のすべてが、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のシゲラ属の細胞である、請求項13の方法。
20.宿主細胞のすべてが、例えば、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシンに対する耐性から選択される抗生物質に対して耐性の結核菌(mycobacterium tuberculosis)細胞である、請求項13の方法。
21.宿主細胞のすべてが、例えば、バンコマイシンに対して耐性のエンテロコッカス属の細胞である、請求項13の方法。
22.宿主細胞のすべてが、例えば、セファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性の腸内細菌科細胞である、請求項13の方法。
23.宿主細胞のすべてが、例えば、トリメトプリム、イトロフラントイン(itrofurantoin)、セファレキシン及びアモキシシリンから選択される抗生物質に対して耐性の大腸菌細胞である、請求項13の方法。
24.宿主細胞のすべてが、例えば、フルオロキノロン系抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のクロストリジウム属(例えば、ディフィシル)の細胞である、請求項13の方法。
25.宿主細胞のすべてが、例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射用セファロスポリン)、アジスロマイシン及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に対して耐性のナイセリア・ゴンノレア(Neisseria gonnorrhoea)細胞である、請求項13の方法。
26.宿主細胞のすべてが、例えば、ベータ-ラクタム、メロペネム及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して耐性のアシネトバクター・バウマニー(Acinetoebacter baumannii)細胞である、請求項13の方法。
27.宿主細胞のすべてが、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して耐性のカンピロバクター属の細胞である、請求項13の方法。
28.宿主細胞が、ベータ(β)-ラクタマーゼを産生する、段落1から27のいずれか1つの方法。
29.宿主細胞が、段落14から27のいずれか1つに列挙される抗生物質に対して耐性である、段落1から28のいずれか1つの方法。
30.第1の標的配列が、宿主細胞に前記抗生物質に対する耐性を付与する産物をコードする遺伝子の配列である、段落29の方法。
31.第1の標的配列が、抗生物質耐性遺伝子の配列である(すなわち、宿主細胞に抗生物質に対する耐性、例えば、メチシリン耐性を付与するための)及び/又は集団PH1、集団PH2、集団PH3及び集団PH4のうち1つ、複数又はすべてが、抗生物質又は前記抗生物質(例えば、段落13から27のいずれか1つに列挙された抗生物質)に対して耐性である、段落1から30のいずれか1つの方法。
32.ウイルス集団PV1又はPV2の抑制解除されたウイルスが、抗菌活性(例えば、抗菌活性、例えば、ウイルスがファージである場合に)を有し、任意選択で、宿主細胞(単数又は複数)が、段落30に列挙される第1の標的配列を含み、第1の標的の改変が、前記抗菌活性を提供する、段落1から31のいずれか1つの方法。
33.段落5に従属する場合に、PH4の細胞が、抗生物質(例えば、段落13から27のいずれか1つに列挙された抗生物質)に対して耐性であり、(a)及びPH2の細胞が、前記抗生物質に対して耐性ではない、段落1から32のいずれか1つの方法。これは、培養すること及び拡大することを、抗生物質耐性宿主細胞を取り扱うことのリスク(例えば、これらの不適切な(inadequante)封じ込め及び薬物製造プラントからの漏れのリスク)を伴わずに比較的安全に実施できるので、薬物使用のためのウイルスの製造を補助する。それにもかかわらず、PH4に対する試験は、封じ込め実験室又は抗生物質耐性宿主株の使用のために設定されているその他の施設において実施できる。PH4に対する試験の場合には、第1のHM-crRNAは抑制解除され、その結果、本発明のHMアレイによる宿主細胞における耐性遺伝子の改変が可能となる。
34.宿主CRISPR/Casシステムが、I、II又はIII型システムであり、標的配列が、(a)の宿主細胞と同一属の少なくとも1つ、2つ又は3つの更なる宿主株又は種における前記型のシステムにおいて保存されたヌクレオチド配列である、段落1から33のいずれか1つの方法。
35.ウイルスが、ファージ又はファージミドである、段落1から34のいずれか1つの方法。
36.(b)のウイルスが、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、ミオウイルス科(Myoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、シホウイルス科(Siphoviridae)又はテクティウイルス科(Tectiviridae)のウイルスである、段落35の方法。
37.(b)のウイルスが、天然に存在するファージ、例えば、(a)の細胞と同一株である細胞から誘導されたファージである、段落35又は36の方法。
38.(b)のファージが、ファージ耐性細菌を使用する選択圧によって得られた突然変異ファージである、段落35、36又は37の方法。
39.(b)において、
(iv)前記1種又は複数のHMアレイが、標的配列を改変するために第2の宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の第2の標的にガイドすることが可能であるHMスペーサーを含む第2のHM-crRNAをコードするHMアレイを含み、第2の標的配列が、宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それによって、第2のHM-crRNAが、Casを第2の標的にガイドして、宿主細胞において宿主CRISPR/Casシステムを改変し、第2の標的配列の改変が、宿主CRISPR/Casシステムの機能を低減又は排除し、
(v)(iv)のHMアレイが、第2の宿主標的配列とハイブリダイズ可能な第2のHM-crRNAの転写のために(a)の細胞において活性である、
段落1から38のいずれか1つの方法。
【０２０６】
一実施形態において、(ii)及び(iv)のHMアレイは、同一HMアレイである。別の実施形態では、それらは異なるHMアレイ (例えば、異なるCRISPR/Cas型のアレイ、例えば、I及びII型又はII及びIII型又はI及びIII型又は異なるII型アレイ)である。
40.PH1〜4のいずれか1つ又はすべての細胞が、前記第2の標的配列を含む、段落39の方法。
41.第2の標的配列が、段落11から24のいずれか1つに列挙されるような細胞の属又は種(例えば、Sサーモフィルス又はSピオゲネス又はSオーレウス)のCRISPR/Casシステム配列に対して同一である、段落39又は40の方法。
42.第2の標的配列が、配列番号1〜44からなる群から選択される配列又はその相補体により含まれる、段落39から41のいずれか1つの方法。
43.第2の標的配列が、
A.リピートDNA又はRNA配列(例えば、リピートは、前記宿主CRISPRアレイ中の最も5'のリピート(第1のリピート)である)、
B.tracrRNA配列又はDNA配列をコードするtracrRNA、CRISPRアレイリーダー配列、
C.Cas遺伝子プロモーター(例えば、Cas1、Cas2又はCsn2プロモーター)、
D.CRISPRアレイリーダープロモーター配列又は
E.CasをコードするDNA又はRNA配列(例えば、Casは、Cas9、Cas1、Cas2又はCsn2である)
を含む、段落39から42のいずれか1つの方法。
44.第2の標的配列が、
F.第1のリピートの最も5'のヌクレオチドと連続する(及び任意選択で、前記リピートの最も5'のヌクレオチドを含む)CRISPRアレイリーダー又はリーダープロモーター配列、
G.第1のリピートのすぐ5'の最大20の連続ヌクレオチドの配列、
H.第1のリピートの最も5'のヌクレオチオの最大20の連続ヌクレオチドの配列、又は
I.第1のスペーサーリピートのすぐ3'にある(任意選択で、配列が、第1のスペーサーの最も3'のヌクレオチドを含む)最大20の連続ヌクレオチドの配列
を含む、段落39から43のいずれか1つの方法。
45.J.第2のHM-crRNAが、構造R-S-R(式中、R=CRISPRリピート及びS=CRISPRスペーサー)を含むか、又はからなり、Sが、(5'から3'方向に)V-HR又はHR-V(式中、V=(b)のウイルスのDNA配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一の配列及びHR=前記宿主細胞CRISPR/CasシステムのCRISPRリピートのDNA配列)を含み、
K.宿主CRISPR/Casシステムにおいて、HRの配列が、Vの配列とすぐ連続しており、
L.第2のHM-crRNAが、細胞における宿主CRISPR/Casシステムの改変(例えば、切断又は不活性化)のために、宿主CRISPR/Casシステムのスペーサーとハイブリダイズして、Casをスペーサーにガイドすることが可能である、
段落39から44のいずれか1つの方法。
46.V=ウイルスDNAの1又は最大40(例えば、最大15)の連続ヌクレオチドである、段落45の方法。
47.第2のHM-crRNAが、(b)のウイルスの核酸と実質的にハイブリダイズしない段落39から46のいずれか1つの方法。
48.a.宿主CRISPR/Casシステムが、同族PAMを認識でき、
b.(b)のウイルスの核酸が、プロトスペーサー配列のすぐ3'にこのようなPAMを含み、
c.V=プロトスペーサーの1又は最大40(例えば、最大15)のヌクレオチドであり、
d.HR=宿主CRISPR/Casシステムのリピートの連続配列に対して同一の配列である、
段落45から47のいずれか1つの方法。
49.宿主システムのリピートの前記連続配列が、宿主リピートの少なくとも50%の配列(例えば、宿主リピートの最も5'又は最も3'のヌクレオチドを含む)である、段落48の方法。
50.プロトスペーサー連続ヌクレオチドのV=1〜40(例えば、最大15)の最も3'であり、任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も5'のヌクレオチドを含む、段落45又は46の方法。
51.プロトスペーサー連続ヌクレオチドのV=1〜40(例えば、最大15)の最も5'であり、任意選択で、リピートの前記連続配列が、宿主リピートの最も3'のヌクレオチドを含む、段落48又は49の方法。
52.R=宿主CRISPR/Casシステムによって認識されるリピートである、段落45から51のいずれか1つの方法。
53.各HM-CRISPRが、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中のそれぞれの標的配列とハイブリダイズ可能であり、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、任意選択で、(b)のウイルスの核酸が、宿主細胞において機能的Cas及び/又はtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含み、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含む、段落1から52のいずれか1つの方法。
54.各HM-CRISPRアレイが、(5'から3'方向に)第1のリピート配列、第1のスペーサー配列及び第2のリピート配列を含み、スペーサー配列が、宿主細胞中のそれぞれの標的配列とハイブリダイズ可能である配列を含み、アレイが、宿主細胞におけるリピート及びスペーサーの転写のためのプロモーターを更に含み、ベクターが、宿主細胞においてtracrRNA配列をコードするためにCasヌクレアーゼをコードする配列及び/又はtracrRNAをコードする配列を含まず、tracrRNA配列が、第1又は第2のリピートと相補的である配列を含み、HM-CRISPRアレイが、宿主細胞において、任意選択で、宿主tracrRNAを使用してCas(例えば、内因性宿主Casヌクレアーゼ)をそれぞれの宿主標的部位にガイドするために機能的である、段落1から53のいずれか1つの方法。
55.リピートが、宿主CRISPR/Casシステム中のリピートに対して同一であり、HM-CRISPRアレイ又は各HM-CRISPRアレイが、宿主CRISPR/CasシステムのCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9)によって認識されるPAMを含まない、段落53又は54の方法。
56.各HM-CRISPRアレイが、HM-スペーサーの1つより多いコピー(例えば、少なくとも2つ、3つ又は4つのコピー)を含む、段落1から55のいずれか1つの方法。
57.第2又は第3のHM-crRNA(更なるHM-crRNA)をコードし、更なるHM-crRNAが、宿主標的配列とハイブリダイズして、Casを宿主細胞中の標的にガイドすることが可能であるヌクレオチド配列を含み、任意選択で、標的配列が、宿主細胞の必須、病原性若しくは耐性遺伝子の、又は宿主細胞のCRISPR/Casシステムの必須構成要素のヌクレオチド配列である、段落1から56のいずれか1つの方法。
58.宿主細胞においてそれぞれのHM-crRNAを産生するために、HM-CRISPRアレイ又は各HM-CRISPRアレイが、宿主細胞の内因性CRISPRリピートに対して同一であるCRISPRリピート配列を含む、段落1から57のいずれか1つの方法。
59.(b)のウイルスが、(a)の宿主細胞において機能的であるCas(非宿主Cas)をコードするヌクレオチド配列を含み(例えば、非宿主Casは、I型システムCasであり、宿主システムは、II又はIII型であるか、又はII型システムCasであり、宿主システムは、I又はIII型であるか、又はIII型システムCasであり、宿主システムは、I又はII型である)、任意選択で、宿主細胞は、非宿主Casの型と同一である型のCasを含まない、又は発現しない、段落1から58のいずれか1つの方法。
60.(b)のウイルスが、tracrRNA配列をコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択で、tracrRNA配列及び第1のHM-crRNAが、シングルガイドRNA(gRNA))により含まれる、段落1から59のいずれか1つの方法。
61.HM-crRNA又は各HM-crRNAが、それぞれのシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、段落1から60のいずれか1つの方法。
62.第1のHM-アレイが、第1の標的配列におけるCas切断、第1の標的配列(又は第1の標的配列を含む遺伝子)の活性下、第1の標的配列(又は第1の標的配列を含む遺伝子)のノックダウン又は第1の標的配列の突然変異を引き起こすように作動可能である、段落1から61のいずれか1つの方法。
63.任意選択で、集団が、PV1又はPV2と同一である、又はウイルスが、このような集団から得ることができる、段落1から62のいずれか1つの方法によって得ることができるウイルス、宿主細胞又はウイルス集団。
64.任意選択で、PH1、PH2、PH3若しくはPH4又は段落1から63のいずれか1つにおいて列挙される培養細胞集団と同一である、段落1から63のいずれか1つの方法によって得ることができる宿主細胞(例えば、細菌細胞)集団。
65.(b)のウイルスの核酸を含まない、又は前記第1のHM-アレイ又は前記第2のHM-アレイ(例えば、PCRによって決定されるような)を含まない、段落64の宿主細胞集団。
66.医学的又は歯科的又は眼科的使用のための(例えば、生物における感染を処置若しくは予防するための、又は生物における感染の広がりを制限するための)段落63から65のいずれか1つのウイルス、宿主細胞又は集団。
67.食物、飲料、乳製品又は美容的使用(例えば、化粧料、例えば、メーキャップにおける使用)のための、又は衛生使用(例えば、衛生品、例えば、石鹸における使用)のための、段落63から66のいずれか1つに記載のウイルス、宿主細胞又は集団を含む組成物。
68.医療における、又は歯科治療的若しくは予防的使用のための、段落63から67のいずれか1つに記載の組成物、ウイルス、宿主細胞又は集団の使用。
69.化粧品使用(例えば、化粧料、例えば、メーキャップにおける使用)における、又は衛生使用(例えば、衛生品、例えば、石鹸における使用)のための、段落63から68のいずれか1つに記載の組成物、ウイルス、宿主細胞又は集団の使用。
70.微生物宿主細胞を改変するための(例えば、細胞又は微生物細胞の培養物を死滅させる、又はその成長の低減するための)、段落63から69のいずれか1つの使用、ウイルス、宿主細胞又は集団。
71.ウイルス又は前記集団中のウイルスが、宿主細胞溶解のためにホリン及び/又はエンドリシンを発現し、任意選択で、エンドリシンが、ファージphi11、ファージTwort、ファージP68、ファージphiWMY又はファージKエンドリシン(例えば、MV-Lエンドリシン又はP-27/HPエンドリシン)である、段落1から63及び66から70のいずれか1つの方法、ウイルス又はウイルス集団。
72.ウイルス又は前記集団中のウイルスが、宿主細胞溶解のためにホリン及び/又はエンドリシンを発現しない、段落1から63及び66から70のいずれか1つの方法、ウイルス又はウイルス集団。
73.ウイルス(例えば、(b)のウイルス)又は各前記集団中のウイルスが、(a)の宿主細胞において機能的な抗菌物質、例えば、抗生物質剤、例えば、ベータ-ラクタム系抗生物質(例えば、段落13から27のいずれか1つに列挙された抗生物質)と組み合わせた状態にある、段落1から63及び66から70のいずれか1つの方法、ウイルス又はウイルス集団。
【０２０７】
腐食、バイオフィルム及び生物付着の制御
本発明は、特に、工業用又は家庭用システムにおける基質又は流体の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法に関する。本発明はまた、本方法において使用するための処理された流体及びベクターに関する。
【０２０８】
腐食は、一連の化学的、物理的及び(微)生物学的処置の結果であり、金属(例えば、鉄鋼又は鉄)、プラスチック及び石等の材料の劣化につながる。それは、世界的な問題であり、大きな社会的及び経済的帰結を伴う。化学的に製造された製品に基づく現在の腐食制御戦略は、厳しい環境規制のますます増大する圧力下にある。更に、それらはかなり非効率的であり、使用される薬剤に対する微生物(例えば、細菌)耐性によって妨害されることもある。したがって、環境的に優しい、持続可能な腐食制御戦略が緊急に必要である。腐食は、種々の電気化学的反応を実施し、二次的効果を有し得るタンパク質及び代謝産物を分泌する種々の微生物の複雑なプロセスによって影響を受ける。
【０２０９】
微生物腐食プロセスの重大性は、工業的及び家庭的に使用される金属並びにステンレス鋼、ニッケル及びアルミニウムベースの合金等の合金並びにコンクリート、アスファルト及びポリマー等の材料の多くは、微生物によって容易に分解されるという事実から明らかである。保護的コーティング、阻害剤、オイル及びエマルジョンも微生物分解の対象である。
【０２１０】
微生物腐食(MIC)は、炭化水素製造及び加工設備、水分配システム、船、鉄道車両並びにその他の種類の金属及び非金属工業用及び家庭用システムに影響を及ぼす費用のかかる問題である。特に、MICは、製造、輸送及び貯蔵システムを含む炭化水素燃料インフラに相当な損傷を引き起こすことが知られており、壊滅的環境汚染結果を伴うことが多い。石油産業では、パイプ腐食のおよそ40%が、微生物腐食に原因があり、毎年、オイルの製造、輸送及び貯蔵において巨大な金銭的損失につながる。パイプバイオフィルムは、壁のインクラステーションのプロセスにより設備における流体速度の低減を引き起こし得る。更に、腐食の結果としてパイプの漏れが生じ、環境及び生産性に対して影響を与えることになる。
【０２１１】
MICは、土壌、淡水及び海水等の環境において起こり、すべての腐食損傷の30パーセントより多くの原因であると推定される。MICは、細菌等の微生物の固定、代謝産物の放出及び普通、腐食プロセスを誘導する又は加速するバイオフィルムの形成によって起こる。腐食プロセスに関与する細菌の群の中には、硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB)、細胞外高分子物質産生菌(EPSB)、酸産生菌(APB)、硫黄-又は硫酸-酸化菌(SOB)、鉄又はマンガン酸化菌(IOB)、アンモニア産生菌(AmPB)及び酢酸産生菌(AcPB)が含まれる。小サブユニットリボソームRNA遺伝子パイロシーケンシング調査によって、酢酸産生菌(アセトバクター属(Acetobacter)の種及びグルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)の種)が、燃料等級のエタノール及び水に曝露された環境において蔓延していることが示されている。
【０２１２】
環境条件下での微生物成長は、電気化学的反応に直接的又は間接的に影響する。微生物-基質相互作用は、最初の接着及びバイオフィルム形成につながる。基質への細菌等の微生物の付着、代謝産物の放出及びバイオフィルムの形成は、基質表面での電気化学条件に影響し、腐食プロセスを誘導又は加速し、それによって、MICのプロセスを媒介する。金属基質上での細菌バイオフィルムの形成は、以下の段階を含む:I-金属上での有機及び無機分子の吸着によるフィルムの形成、これは、金属表面での負荷分散を改変し、細菌の影響供給源としても働き、液体中に存在する浮遊性微生物の接着を促進する、II-マイクロコロニーを形成する好気性菌の接着及び増殖、III-いくつかの固着菌による細胞外高分子物質(EPS)の産生、IV-呼吸により酸素を消費し、厳密な嫌気性菌によって必要とされるようなバイオフィルム中の局所嫌気的環境を作り出す、好気性浮遊性微生物細胞によるコロニー形成、V-バイオフィルム厚の増大、これは、外層の脱落に好都合に働き得る。バイオフィルムに接着した細菌によって産生されたEPSは、その成長にとって必須のイオンを捕獲し、それらは、低い栄養利用能の場合には栄養供給源として役立つ上に、差別的通気領域の生成に好都合に働くことによって、接着の手段及び腐食の機序に干渉する殺生物剤から細菌を保護する手段として使用される。差別的通気による腐食のプロセスは、通気領域(バイオフィルムを取り囲む)及び非通気領域(バイオフィルムの下)を有する金属基質上のバイオフィルムの不均等な分布によって生じる。金属表面上でのバイオフィルム形成は、酸素含量を減少させ、ほぼ完全嫌気生活のレベルに達する。シュードモナス属は、主なEPS産生者の属である。
【０２１３】
腐食菌によって媒介されるMIC生物腐食プロセスの一例は、以下のとおりである:(A)淡水、海水、工業用/家庭用システム又は貯蔵タンクから得た好気性腐食菌は、表面にコンディショニングフィルムを有する工業用又は家庭用システムの設備及びパイプラインに接触を図る。(B)EPS産生菌は、設備/パイプライン壁を攻撃し、EPSを産生し、これが、その他の微生物による接着にとって都合よい環境を作り出す。(C)パイプライン壁への腐食菌のその他の群の接着が起こり、これがその代謝産物を放出し、細胞分裂によってマイクロコロニーに発達し、利用可能な酸素を消費する。鉄酸化菌の作用は、第二鉄沈殿の大きな蓄積をもたらし、設備/パイプラインの封鎖につながり、硫黄酸化菌によって放出された硫酸は、環境の酸性化を促進する。(D)低酸素濃度及び酸産生菌によって放出された有機酸は、硫化水素(H2S)を産生する硫酸還元菌の付着及び発達に都合がよく、それによって、腐食プロセスを加速し、局所pHを還元する。(E)鉄沈殿物によって部分的に封鎖され、微小漏出を有し、細菌バイオフィルムを含有する、腐食した設備/パイプライン結果、H2Sは、影響を受けたシステムを運転する個人に重篤な健康リスクを提起する。更に、厚いバイオフィルム及びスラッジの生成は、生物付着につながり、システムの機能を妨害する。
【０２１４】
同様に、細菌集団は、水貯蔵所又はリザーバー等の流体中(例えば、飲料水中又は冷却システムの水中)で増殖し、それによって、流体の生物付着を媒介することができる。これはまた、流体の酸性化とも呼ばれ得る。一例として、水路又は飲料水リザーバー酸性化がある。
【０２１５】
本発明は、以下の態様1以降を提供することによって、MIC及び生物付着のこのような問題に対処する:
1.工業用又は家庭用のシステムにおける基板の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基板の表面を、基板のMIC又は生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団と接触させ、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数のヌクレオチド配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9又はCpf1)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基板のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程と
を含む方法。
【０２１６】
一例では、システムは、設備(例えば、工業的プロセスにおいて使用するための)を含み、表面は、前記設備の表面である。一例では、各アレイは、遺伝子操作されたアレイ、例えば、本明細書において開示される任意の遺伝子操作されたアレイである。一実施形態では、ベクターは、本明細書において開示されるような遺伝子操作されたCRISPR核酸ベクターである。一例では、生物付着は、微生物バイオフィルム及び/又はスラッジ形成、増殖又は維持を含む。一例では、第1の宿主細胞は、固着性である。態様1又は4(以下)の一例では、「制御すること」は、前記MIC又は生物付着を防ぐこと、低減すること又は排除すること又はシステムにおける前記MIC若しくは生物付着の広がりを低減することを含む。細菌がMIC又は生物付着を媒介する方法の限定されない例は、上に記載されている。細胞成長又は増殖又は維持は、例えば、細胞生存力の特徴である。したがって、一例では、方法は、宿主細胞増殖及び/又は維持を低減する。一例では、方法は、宿主細胞を死滅させる。
2.前記宿主細胞が、前記基質と接触している微生物バイオフィルムにより含まれる、態様1の方法。
3.前記表面及び宿主細胞が、流体、例えば、水性液(例えば、海水、淡水、貯蔵水又は飲用水)と接触している、態様1又は2の方法。
【０２１７】
淡水は、氷床、氷冠、氷河、氷山、沼地、池、湖、川及び細流において地表に、並びに帯水層及び地下の細流において地下水として地下に天然に存在する水である。淡水は、一般に、低濃度の溶解塩及びその他の完全溶解固体を有することを特徴とする。この用語は、海水及び汽水を具体的に排除するが、鉄泉等のミネラルが豊富な水は含む。一例では、前記淡水は、これらの淡水の種類のいずれかである。飲用水は、ヒト又は動物(例えば、家畜)消費用の水である。一例では、流体は、システムが冷却システムである工業用冷却水、システムが汚水処理又は貯蔵システムである汚水、システムが飲料水処理、貯蔵、輸送又は送達システムである飲料水、システムが紙製造又は処理システムである製紙水、システムがスイミングプール又はスイミングプール水処理若しくは貯蔵システムであるスイミングプール水、システムが消火システムである消火器水又は任意のパイプ、タンク、ピット、池又は流れ中の工業的プロセス水から選択される。
4.工業用又は家庭用システムにおいて流体の微生物生物付着を制御する方法(例えば、リザーバー又は容器において液体の細菌酸性化を制御するための)であって、流体は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによって、CRISPRアレイは宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程を含み、
宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAの発現を可能にすること、それによって、宿主細胞において標的配列を改変すること、その結果、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御を得ることを含む、方法。
【０２１８】
一例では、流体は、液体である。一例では、流体は、ガス状流体である。
【０２１９】
システム:任意の態様の一例のシステムは、以下からなる群から選択される:
石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送システム;炭化水素回収、処理、貯蔵又は輸送システム;粗製油回収、処理、貯蔵又は輸送システム;天然ガス回収、処理、貯蔵又は輸送システム、(例えば、油井、油掘削装置、油掘削設備、油ポンピングシステム、油パイプライン、ガス掘削装置、ガス抽出設備、ガスポンピング設備、ガスパイプライン、石油タンカー、ガスタンカー、油貯蔵設備又はガス貯蔵設備);水処理又は貯蔵設備、水リザーバー(例えば、飲用水リザーバー)、エア又は水コンディショニング(例えば、冷却又は加熱)設備、例えば、クーラントチューブ、冷却器又は熱交換器;医学又は手術設備;環境(例えば、土壌、水路又は空気)処理設備;紙製造又はリサイクリング設備;発電所、例えば、火力又は原子力発電所;燃料(例えば、炭化水素燃料、例えば、石油、ディーゼル又はLPG)貯蔵設備;採鉱又は冶金、鉱物又は燃料回収システム、例えば、採鉱場又は採鉱設備;エンジニアリングシステム;船舶設備;貨物又は物品貯蔵設備(例えば、積荷容器);食品又は飲料製造、加工又は包装設備;クリーニング設備(例えば、ランドリー設備、例えば、洗浄機又は食器洗浄機);ケータリング(例えば、家庭用又は商業的ケータリング)設備;農業設備;建設(例えば、建築、公共施設インフラ又は道路建設)設備;航空設備;航空宇宙設備;輸送設備(例えば、動力車(例えば、車、大型トラック又はバン);鉄道車両;航空機(例えば、飛行機)又は海洋若しくは水路船舶(例えば、ボート又は船、潜水艦又はホバークラフト));包装設備、例えば、消費材包装設備;又は食品若しくは飲料包装設備;電子工学(例えば、コンピュータ又は携帯電話又はその電子工学構成要素);又は電子工学製造又は包装設備;歯学設備;工業用又は家庭用配管(例えば、海中パイプ)又は貯蔵容器(例えば、水タンク又は燃料タンク(例えば、ガソリンタンク、例えば、乗り物のガソリンタンク));地下設備;建築物(例えば、住居又はオフィス又は商業店舗又は工場又は発電所);道路;橋梁;農業設備;工場システム;粗製油又は天然ガス探査設備;オフィスシステム;及び家庭用システム。
【０２２０】
一例では、システムは、農業、油又は石油産業、食品又はドリンク産業、衣類産業、包装産業、電子工学産業、コンピュータ産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医薬産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費者製品産業、医薬産業、採鉱産業、クリーニング産業、林業産業、漁業産業、レジャー産業、リサイクリング産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプ又は紙産業、織物産業、衣類産業、レザー又はスウェード又は動物皮革産業、タバコ産業及び鉄鋼産業からなる群から選択される産業又は業種において使用される。一例では、処置される表面又は流体は、前記選択された産業において使用される設備の表面又は流体である。一例では、システムは、粗製油産業において使用される。一例では、システムは、天然ガス産業において使用される。一例では、システムは、石油産業において使用される。一例では、システムは、海上コンテナ、プラットフォーム又は掘削装置(例えば、海上で使用するための、又は海上の油若しくはガスプラットフォーム又は掘削装置)、船又はボートである。一実施形態では、このようなシステムは、海上で固定され、例えば、海上で非一時的に固定され、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24カ月又はそれより長く(例えば、連続数カ月)間海上に固定されている。一実施形態では、このようなシステムは、国又は州の海域に、例えば、非一時的にこのような海域の海上にある、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24カ月又はそれより長く(例えば、連続した月)の間、前記国の海域にある。
【０２２１】
一例では、処置されるべき基質表面は、ステンレス鋼、炭素鋼、銅、ニッケル、黄銅、アルミニウム、コンクリート、プラスチック又は木材を含む。一例では、基質は、金属溶接部又は接合部である。一例では、表面は、金属(例えば、鋼又は鉄)又は非金属(例えば、プラスチック、コンクリート、アスファルト、木材、ゴム又は石)表面である。一例では、金属は、合金(例えば、ステンレス鋼、黄銅又はニッケル合金、亜鉛合金、銅合金、ニッケル合金又はアルミニウム合金)である。一例では、表面は、人工ポリマー表面である。一例では、表面は、基質コーティングである。一例では、基質は、土壌、淡水又は海水と接触している。
【０２２２】
一例では、流体は、飲用水、水路、汽水又は液体燃料、例えば、ガソリン若しくはディーゼル(例えば、車又は電動乗り物のための)、LPG、ケロシン、アルコール(例えば、エタノール、メタノール又はブタノール)、液体水素又は液体アンモニア)であり、一例では、流体は保存された液体燃料である。一例では、流体は、油又は非水性液である。一例では、流体は、水路又は水域により含まれる液体、例えば、海水、淡水、飲用水、川、細流、池、湖、貯水池、貯蔵水(例えば、水貯蔵タンク又は冷却設備中)、地下水、井戸水、岩石層中の水、土壌水又は雨水である。一例では、液体は海水である。一例では、基質は、この段落において記載された液体と接触している。一例では、流体又は液体は、油、水溶液、水圧破砕流体、燃料、二酸化炭素、天然ガス、油/水混合物、燃料/水混合物、塩含有水、大洋水又は海水、汽水、淡水の供給源、湖、川、細流、沼地、池、湿地、雪又は氷の解凍からの流出液、湧水、地下水、帯水層、降水、周囲温度(例えば、室温で)液体であり、疎水性であるが有機溶媒に可溶性である任意の物質、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、ジエチルエーテル、植物油、石油化学油、粗製油、精製石油化学製品、揮発性エッセンシャルオイル、化石燃料、ガソリン、炭化水素混合物、ジェット燃料、ロケット燃料、バイオ燃料からなる群から選択される。一例では、流体は、油/水混合物である。
【０２２３】
用語「微生物腐食」又は「MIC」とは本明細書において、特に断りのない限り、微生物集団、例えば、細菌又は古細菌集団の少なくとも1種のメンバーの作用のために、システムの任意の要素(基質)が構造的に損なわれるプロセスを指す。用語「生物付着」とは、本明細書において、特に断りのない限り、微生物(細菌及び/又は古細菌等)が、流体(例えば、水若しくは水性液又は炭化水素又は石油化学製品)と接触している基質表面上に蓄積するプロセスを指す。流体(例えば、水若しくは水性液又は炭化水素又は石油化学製品)中の微生物(細菌及び/又は古細菌等)の望ましくない蓄積及び増殖、すなわち、流体の「酸性化」も含まれる。一例では、細菌は、船又はボートバラスト水により含まれ、細菌は、環境的に望ましくない。用語「基質」とは、本明細書において、細胞が付着することができ、バイオフィルムが形成し、成長できる、又は生物付着(例えば、スライム又はスラッジ形成)が生じ得る任意の種類の表面を指す。基質は、石油化学製品、燃料、粗製油又はガス配管システムにおける設備の表面等の「工業的」基質又は調理台若しくはシャワーの基質若しくは庭の基質等の「非工業用」(例えば、家庭用、例えば、家庭又はオフィス) 基質であり得る。
【０２２４】
態様のいずれかの代替において、宿主細菌細胞の集団の代わりに、集団は、第1の種の古細菌細胞の集団である。
5.前記流体が、水性液(例えば、海水、淡水、貯蔵水又は飲用水)である態様4の方法。
6.流体をベクターと混合すること、それによって、宿主細胞をベクターと接触させることを含む、態様3から5のいずれか1つの方法。例えば、ベクターが、液体(任意選択で、抗生物質又は殺生物剤とも)と予め混合されることもあり、次いで、混合物が表面(態様1)又は態様4の流体と接触している流体に添加される。
7.各標的配列が、宿主細胞病原性、耐性又は必須遺伝子配列、例えば、エキソン又はその調節配列である、態様1から6のいずれか1つの方法。耐性は、抗生物質耐性であり得る。一例では、宿主細胞を、宿主細胞生存力を低減するために、前記抗生物質及び前記ベクターと接触させる。
8.標的配列の改変が、宿主細胞死滅及び/又は宿主細胞成長若しくは増殖の低減をもたらす、態様1から7のいずれか1つの方法。増殖は、例えば、表面と接触している細胞拡大又は細胞分布である。
9.ベクターが、同一CRISPRアレイを含む、態様1から8のいずれか1つの方法。
10.宿主細胞が、細菌又は古細菌細胞である、態様1から9のいずれか1つの方法。代替において、第1の細胞の代わりに、藻類細胞である。
11.第1の宿主細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞(例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞)である態様1から10のいずれか1つの方法。一例では、細胞が、デスルホトマキュラム・ニグリフィカン(Desulfotomaculum nigrifican)、デスルファシナム・インフェルナム(Desulfacinum infernum)、サーモデスルホバクテリウム・モビル(Thermodesulfobacterium mobile)、サーモデスルホハブダス・ノルベジクス(Thermodesulforhabdus norvegicus)、アーカエオグロブス・フルジダス(Archaeoglobus fulgidus)、デスルホミクロビウム・アプシェロナム(Desulfomicrobium apsheronum)、デスルホビブリオ・ガボネンシ(Desulfovibrio gabonensi)、デスルホビブリオ・ロングス(Desulfovibrio longus)、デスルホビブリオ・ビエトナメンシス(Desulfovibrio vietnamensis)、デスルホバクテリウム・セトニカム(Desulfobacterium cetonicum)、デスルホマキュラム・ハロフィルム(Desulphomaculum halophilum)、デスルホバクター・ビブリオホルミス(Desulfobacter vibrioformis)及びデスルホトマキュラム・サーモシステルナム(Desulfotomaculum thermocisternum)細胞からなる群から選択される。一例では、集団は、これらの細胞種のうち2種以上の混合物を含む。
12.表面又は流体が、粗製油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備により含まれる、態様11の方法。粗製油は、世界において最も重要なエネルギー供給源の1種である。粗製油が、種々の技術プロセスによって、ガソリン、油、パラフィン油、滑沢剤、アスファルト、家庭用燃料油、ワセリン及びポリマー等の消費者向け製品に精製される、精製-石油化学産業を含む多数の産業において原材料として使用される。油由来製品も、多数のその他の化学プロセスにおいて一般に使用される。代替において、流体は、前記消費者向け製品であり、表面は、このような消費者向け製品と接触している。
13.表面が、海水、水圧破砕液若しくは井戸中の液体と接触している、又は流体が海水、水圧破砕液若しくは井戸中の液体である、態様11又は12の方法。
14.方法の工程(i)が、第2の種の微生物細胞の集団(第2の宿主細胞)を提供する工程であって、第2の細胞は前記ベクターを含み、ベクターは、第2の宿主細胞から第1の宿主細胞に伝達可能である工程と、第2の宿主細胞を第1の宿主細胞を組み合わせ、それによって、ベクターが第1の宿主細胞に導入される工程とを含む、態様1から13のいずれか1つの方法。一例では、第2の細胞は、環境において(例えば、水又は土壌環境において)環境的に、工業的に、又は家庭的に許容され、第1の宿主細胞が、環境において許容されない。
15.第1の宿主細胞が、前記ベクターとの接触の前に、微生物細胞の混合物により含まれ(例えば、微生物バイオフィルムにより含まれる)、混合物が、前記第2の種の細胞を含む、態様14の方法。
16.前記第2の種が、バチルス属種又は硝酸還元菌又は硝酸還元硫化物酸化菌(NRB)である、態様14又は15の方法。
17.NRBが、カンピロバクター属種、ニトロバクター属(Nitrobacter)の種、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)の種、チオミクロスピラ属(Thiomicrospira)の種、スルフロスピリウム属(Sulfurospirillum)の種、タウエラ属(Thauera)の種、パラコッカス属(Paracoccus)の種、シュードモナス属種、ロドバクター属(Rhodobacter)の種及びデスルホビブリオ属(Desulfovibrio)の種からなる群から選択される、又は前記種のうち少なくとも2種を含む、態様16の方法。
18.NRBが、ニトロバクター・ブルガリ(Nitrobacter vulgari)、ニトロソモナス・ユーロペア(Nitrosomonas europea)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・エルギノーサ、パラコッカス・デニトリフィカン(Paracoccus denitrifican)、スルフロスピリルム・デレイアナム(Sulfurospirillum deleyianum)及びロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)からなる群から選択される、態様17の方法。
19.前記第1の種の宿主細胞を、前記ベクターと同時に又は逐次、殺生物剤と接触させる工程を含む、態様1から18のいずれか1つの方法。一例では、宿主細胞と接触している組成物中で予め混合されたベクター及び殺生物剤が提供される。
20.殺生物剤が、テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(THPS)、グルタルアルデヒド、一酸化塩素、二酸化塩素、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、ジブロモニトリロプロプリオンアミド(DBNPA)、メチレンビス(チオシアネート)(MBT)、2-(チオシアノメチルチオ)ベンゾチアゾール(TCMTB)、ブロノポール、2-ブロモ-2-ニトロ-1,3-プロパンジオール(BNPD)、トリブチルテトラデシルホスホニウムクロリド(TTPC)、タウリンアミド及びその誘導体、フェノール、第四級アンモニウム塩、塩素含有剤、キナルジニウム(quinaldinium)塩、ラクトン、有機色素、チオセミカルバゾン、キノン、カルバメート、尿素、サリチルアミド、カルバニリド、グアニド、アミジン、イミダゾリン、酢酸、安息香酸、ソルビン酸、プロピオン酸、ホウ酸、デヒドロ酢酸、亜硫酸、バニリン酸、p-ヒドロキシベンゾエートエステル、イソプロパノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、ホルムアルデヒド、ヨウ素及びその溶液、ポビドン-ヨウ素、ヘキサメチレンテトラミン、ノキシチオリン、1-(3-クロロアリル)-3,5,7-トリアゾ-1-アゾニアアダマンタンクロリド、タウロリジン、タウルルタム、N-(5-ニトロ-2-フルフリリデン)-l-アミノ-ヒダントイン、5-ニトロ-2-フラルデヒドセミカルバゾン、3,4,4'-トリクロロカルバニリド、3,4',5-トリブロモサリチルアニリド、3-トリフルオロメチル-4,4'-ジクロロカルバニリド、8-ヒドロキシキノリン、1-シクロプロピル-6-フルオロ-1,4-ジヒドロ-4-オキソ-7-(1-ピペラジニル)-3-キノリンカルボン酸、1,4-ジヒドロ-1-エチル-6-フルオロ-4-オキソ-7-(1-ピペラジニル)-3-キノリンカルボン酸、過酸化水素、過酢酸、ナトリウムオキシクロロセン、パラクロロメタキシレノール、2,4,4'-トリクロロ-2'-ヒドロキシジフェノール、チモール、クロルヘキシジン、塩化ベンズアルコニウム、塩化セチルピリジニウム、銀スルファジアジン、硝酸銀、臭素、オゾン、イソチアゾロン、ポリオキシエチレン(ジメチリミノ)エチレン(ジメチリミノ)エチレンジクロリド、2-(t-ブチルアミノ)-4-クロロ-6-エチルアミノ-5'-トリアジン(テルブチラジン)及びそれらの組合せからなる群から選択される、態様19の方法。一例では、殺生物剤は、テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(THPS)である。一例では、殺生物剤は、第四級アンモニウム化合物である。
21.システムが、採鉱、運送、粗製油、ガス又は石油化学製品回収若しくは処理、水圧破砕、大気若しくは水加熱若しくは冷却、飲用水製造、貯蔵若しくは送達、炭化水素の輸送及び廃水処置からなる群から選択される産業運転において使用される、態様1から20のいずれか1つの方法。
22.表面が、前記選択された産業において使用される設備の表面である、又は流体が、前記選択された産業において使用される設備により含まれる流体である、態様21の方法。
23.表面が、台所、浴槽又は庭の設備の表面である、又は流体が、台所、浴槽又は庭の設備により含まれる、態様1から22のいずれか1つの方法。例えば、設備は、家庭用設定において使用される。
24.態様3に従属する場合に、流体が、容器(例えば、水タンク又はボトル)中に含有される飲用液体であり、表面が、液体と接触している容器の表面である、態様1から23のいずれか1つの方法。
25.各ベクターが、可動遺伝エレメント(MGE)を含み、MGEが、伝達の起点(oriT)及び前記CRISPRアレイを含み、MGEが、前記第1の種の宿主細胞と、前記工業用又は家庭用システム中の更なる微生物宿主細胞の間で伝達可能である、態様1から24のいずれか1つの方法。例えば、更なる細胞は、環境において(例えば、水又は土壌環境において)環境的に、工業的に、又は家庭的に許容され、第1の宿主細胞が、環境において許容されない。
26.oriTが、第1の及び更なる宿主細胞において機能的である、態様25の方法。
27.前記第1の及び更なる宿主細胞が、前記表面と接触している流体のバイオフィルムにより含まれ、又は前記細胞が、前記流体により含まれる、態様25又は26の方法。
28.前記更なる細胞が、態様16から18のいずれか1つにおいて列挙されるような種の細胞である、態様25、26又は27の方法。一例では、MGEは、更なる細胞から、第1の宿主細胞に伝達可能である、及び/又は逆もまた同じである。
29.更なる細胞が、前記第1の種の細胞である、態様25から27のいずれか1つの方法。
【０２２５】
例えば、この実施形態では、MGEは、前記システム中の集団中の第1の細胞の中で伝達可能である。MGEが、その他の細胞への伝達プロセスにおいて自身のコピーを残す場合には、これは、次いで、システム中の細胞集団を介してMGEを、したがって、CRISPRアレイを増殖させ、広げ、それによって、アレイの標的配列改変効果を広げる手段を提供する。これは、例えば、表面と接触している、又は流体中のバイオフィルム中にアレイの広がりを作り出すのに有効であり得、従来の殺生物剤を用いるバイオフィルムの浸透が最適以下であることがあるので有用である。
30.各MGEが、組み込み及び接合性エレメント(ICE)である、若しくはそれを含む、又は各ベクターが、前記第1の種の宿主細胞に感染可能であるファージであり、各MGEは、前記細胞間の伝達が可能であるファージ核酸である、態様25から29のいずれか1つの方法。
31.各ICEが、トランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである、態様30の方法。
32.各ベクターが、任意選択で、態様25から31のいずれか1つに記載のMGEを含むプラスミドである、態様1から31のいずれか1つの方法。
33.第1の及び/又は更なる細胞が、MGEをその他の細胞に伝達するように作動可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、MGEにより含まれない、態様25から32のいずれか1つの方法。
34.配列が、ベクターにより含まれない、態様33の方法。
35.配列が、第1の細胞及び/又は更なる細胞の接合性トランスポゾンにより含まれる、態様33の方法。
36.トランスポゾンが、第1の及び更なる細胞間でMGEを伝達するようにトランスで作動可能である、態様35の方法。
37.MGEのoriTが、第1の細胞及び/又は更なる細胞のICEにより含まれるoriTと同一であり、ICEが、第1の及び更なる細胞間でMGEを伝達するようにトランスで作動可能である、態様25から36のいずれか1つの方法。
38.ベクターoriTが、SRB又はNRBトランスポゾンのoriTである、態様25から37のいずれか1つの方法。
39.各MGEが、第1及び第2の末端リピート配列並びにリピート配列間の前記CRISPRアレイを含む、態様25から38のいずれか1つの方法。
40.MGEが、CRISPRアレイコピーを(1)前記更なる宿主細胞に伝達された場合に第1の宿主細胞のゲノム中に、又は(2)第1の宿主細胞に伝達された場合に前記更なる宿主細胞中に残す、態様25から39のいずれか1つの方法。例えば、コピーは、伝達が起こる細胞のゲノム中に残されたトランスポゾン又はプロファージにより含まれる。
41.第1の及び更なる細胞が、異なる種の細菌細胞である(例えば、それぞれ、SRB及びNRB又はSRB及びバチルス属の細胞)、態様25から40のいずれか1つの方法。
42.態様30に従属する場合、MGEの可動化のためにトランスポサーゼと組み合わせた、態様25から41のいずれか1つの方法。
43.ベクター又はMGEが、前記第1の種の宿主細胞において作動可能である毒素-抗毒素(antioxin)モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、別の種の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、態様1から42のいずれか1つの方法。これらの実施形態は、標的配列を含む第1の宿主細胞におけるベクター/MGE(及びしたがってCRISPRアレイ)の保持に好都合に働く選択圧を作り出すのに有用である。
44.ベクター又はMGEが、前記第2の又は更なる細胞において作動可能である毒素-抗毒素モジュールを含み、任意選択で、毒素-抗毒素モジュールが、第2の又は更なる細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減された抗毒素遺伝子を含む、態様1から43のいずれか1つの方法。これは、第2の又は更なる細胞においてCRISPRアレイの集団を維持するのに有用である(例えば、このような細胞が第1の細胞も含むバイオフィルム中に存在する場合)が、毒素-抗毒素モジュールは、第1の宿主細胞において更なる死滅(的配列改変の作用を上回る、及び超える)を提供する。一例では、ベクター又はMGEは、第1の宿主細胞において、及び前記第2の又は更なる細胞において作動可能である毒素-抗毒素モジュールを含む。
45.毒素-抗毒素モジュールが、第1及び第2の又は更なる細胞以外の細胞において作動可能ではない、又は作動が低減されている、態様43又は44のいずれか1つの方法。したがって、第1及び第2の(又は更なる)細胞の両方においてCRISPRアレイを維持するための選択圧があり得る。普通、これは、次いで、混合集団中の細胞間でのMGE中のアレイの水平伝達のためのリザーバーを提供する(例えば、表面又は流体により含まれる集団と接触しているバイオフィルム)。
46.第1及び第2の細胞(又は第1の及び更なる細胞)が、のもの(例えば、両細菌細胞)であり、ベクターが、(A)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一門の別の細胞ではそうではない、(B)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(C)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞において複製可能又は作動可能であるが、同一綱の別の細胞ではそうではない、(D)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一目の別の細胞ではそうではない、(E)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一科の別の細胞ではそうではない、(F)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一属の別の細胞ではそうではない、又は(G)第1の細胞及び/又は第2の(又は更なる)細胞では複製可能又は作動可能であるが、同一種の別の細胞ではそうではない、態様25から45のいずれか1つの方法。
47.態様25に従属する場合に、各MGEが、接合性トランスポゾンであり、oriTが、第1の及び更なる(又は第2の)宿主細胞において機能的であり、MGEが、第1及び第2の末端リピート配列並びにリピート配列間の前記CRISPRアレイを含み、第1の及び更なる(又は第2の)細胞が細菌細胞であり、標的部位が、第1の細胞により含まれるが、更なる(又は第2の)細胞により含まれず、前記改変が、第1の細胞において前記標的を含む遺伝子又は調節配列を不活性化又は下方制御し、その結果、第1の宿主細胞生存力の低減及び前記MIC又は生物付着の制御が得られる、態様25又は態様26から46のいずれか1つの方法。
48.各CRISPRアレイが、第1の宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、
(i)R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、
(ii)S1は、前記第1の宿主細胞の標的配列に対して95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
態様1から47のいずれか1つの方法。
49.R1及びR1'が、それぞれ、第1の宿主細胞種のCRISPRアレイの第1及び第2のリピート配列と少なくとも 95、96、97、98又は99%同一である、態様48の方法。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
50.R1及びR1'が、標的配列の改変のために、前記第1の種の前記宿主細胞のCRISPR/Casシステムとともに機能的である、態様48又は49の方法。
51.第1の宿主細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞であり、R1及びR1'が、それぞれ、第1の宿主細胞種のCRISPRアレイのリピート配列(例えば、第1のリピート)と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様48から50のいずれか1つの方法。
52.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号50~74、125〜128及び49からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様51の方法。表1を参照のこと。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
53.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号51及び125〜126、54及び127、69及び128からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様51の方法。配列番号51及び125〜126、54及び127、69及び128は、1種より多いSRB種で見られる。これは、本発明のCRISPRアレイを用いて1種より多いSRB種を標的化するために、例えば、SRB種が、処置されるべき工業用又は家庭用システム中に共存する場合に、例えば、基質と接触している集団又はバイオフィルムにおける、又は処置されるべき流体における共存は、特に有用である。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
54.R1及びR1'の配列が同一である、態様48から53のいずれか1つの方法。
55.第1の宿主細胞に導入された各アレイが、その標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9及び/又はCfp1)と組み合わせて導入される、態様1から54のいずれか1つの方法。
一例では、任意の構成にある本明細書におけるCasは、ヌクレアーゼ 活性について非活性化され、任意選択で、標的配列アクチベーター又はデプレッサーを含む。本明細書におけるCas9は、例えば、Sピオゲネス又はSオーレウスCas9である。
56.第1の宿主細胞に導入された各アレイが、標的配列を改変するために宿主細胞においてそれぞれのcrRNAとともに機能する1種又は複数のCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9及び/又はCfp1)をコードする核酸配列と組み合わせて導入される、態様1から55のいずれか1つの方法。
57.R1及びR1'が、前記第1の宿主細胞において標的配列を改変するためにII型Cas9ヌクレアーゼとともに機能性であり、任意選択で、方法が態様55又は56に更に従い、Casが前記Cas9である、態様48から56のいずれか1つの方法。
58.前記ベクター又はMGEのすべて又は一部が、それぞれのアレイとともに作動可能であるCasヌクレアーゼをコードする配列を含まない、態様1から57のいずれか1つの方法。
59.前記それぞれのアレイが各々、第1の種の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である、態様58の方法。
60.態様25に従属する場合に、各MGEが、アレイのリピート配列とともに作動可能であるCasエンドヌクレアーゼをコードする配列を欠き、それぞれのベクターが、MGEの外側のこのような配列(例えば、Cfp1のCas9をコードする)を含む、態様25又は態様26から59のいずれか1つの方法。
61.粗製油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備(例えば、粗製油タンカー、油掘削装置又は石油掘削設備) により含まれる基質の微生物腐食(MIC)又は生物付着を制御する方法であって、基質の表面を、第1の宿主細胞の集団と接触させ、第1の宿主細胞は、基質のMIC又は生物付着を媒介する第1の種の硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB)、細胞外高分子物質産生菌(EPSB)、酸産生菌(APB)、硫黄-又は硫酸-酸化菌(SOB)、鉄酸化菌(IOB)、マンガン酸化菌(MOB)、アンモニア産生菌(AmPB)又は酢酸産生菌(AcPB)であり、表面及び細胞集団を、海水、淡水、水圧破砕液又は井戸(例えば、油又は天然ガス井)中の液体から選択される液体と接触させる方法であり、
(i)液体を、第1の宿主細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと混合することによって、細胞集団をベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイが宿主細胞中に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9又はCfp1)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列であり、
(c)(a)の各配列は、第1の宿主細胞におけるそれぞれのcrRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、前記第1の宿主細胞の標的配列に対して70、75、80、85、90又は95%以上同一であるヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記基質のMIC又は生物付着の制御をもたらす工程とを含む方法。一実施形態では、R1及びR1'の両方が存在する。
62.態様1に従属する場合に、態様1又は態様1から61のいずれか1つに従う、態様61の方法。
63.各ベクターが、第1の宿主細胞に感染可能であるファージである、又は前記CRISPRアレイを含むMGE(例えば、トランスポゾン)を含むベクターであり、MGEが、第1の宿主細胞に伝達可能である、態様61又は62の方法。
64.第1の細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞である、態様61、62又は63の方法。
65.R1及びR1'が、それぞれ、第1の宿主細胞種のCRISPRアレイのリピート配列(例えば、第1のリピート)と少なくとも95、96、97、98又は99%同一であり、ベクターアレイが、第1の種の細胞において見られるCasエンドヌクレアーゼとともに作動可能である、態様64の方法。一例では、R1及びR1'は、同一配列である。
66.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号50〜74、125〜128及び49からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様65の方法。一例では、R1及びR1'は、同一配列である。
67.R1及びR1'が、それぞれ、配列番号51及び125~126、54及び127、69及び128からなる群から選択されるリピート配列と少なくとも95、96、97、98又は99%同一である、態様66の方法。表1を参照のこと。これは、本発明のCRISPRアレイを用いて1種より多いSRBを標的化するために、例えば、SRB種が、処置されるべき工業用又は家庭用システム中に共存する場合に、例えば、基質と接触している集団又はバイオフィルムにおける、又は処置されるべき流体における共存は、特に有用である。一例では、R1及びR1'は、同一配列である。
68.前記複数のベクターが、更なるベクターを含み、更なるベクターが各々、前記集団により含まれる更なる宿主細胞を標的化するための1種又は複数のCRISPRアレイを含み、更なる宿主細胞種が、第1の宿主細胞種とは異なり、工程(i)において、前記集団の更なる細胞を、更なる細胞を形質転換又は形質導入可能である複数の前記更なるベクターと接触させ、各ベクターが、CRISPRアレイを含み、それによって、CRISPRアレイが、更なる宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイが、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAが、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、前記更なる宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列が、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列であり、
工程(ii)が、前記更なる宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、更なる宿主細胞において標的配列を改変する、態様1から67のいずれか1つの方法。
69.更なる宿主細胞が、前記基質又は流体のMIC又は生物付着を媒介し、工程(ii)が、更なる宿主細胞生存力の低減及び前記基質又は流体のMIC又は生物付着の制御をもたらす、態様68の方法。
70.船又はボートのバラスト水において細菌生物付着を制御する方法であって、水は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む、方法。
71.第1の宿主細胞が、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、大腸菌又はエンテロコッカス属(Enterococci)の種の細胞である、態様70の方法。
72.工程(i)が、例えば、船又はボートの船体においてバラスト水をベクターと混合することを含む、態様70又は71の方法。
73.船又はボートが、海洋乗り物であり、水が海水である、態様70から72のいずれか1つの方法。
74.船又はボートの代わりに、バラスト水が、容器又は海上での掘削プラットフォーム、例えば、油プラットフォーム又は油掘削装置により含まれる、態様70から72のいずれか1つの方法。一例では、船、ボート、容器、プラットフォーム又は掘削装置が、海上で(すなわち、その位置に非一時的に)固定されている。
75.船又はボートからバラスト水を排出する方法であって、排出されたバラスト水が、態様70から74のいずれか1つの方法によって処置された水を含む、方法。
76.水が、水域、例えば、海、大洋又は水路(例えば、川、運河、湖又は貯水池)中に、又は容器中に排出される、態様75の方法。
77.バラスト水が、態様70から76のいずれか1つの方法によって得られる、又は得ることができる、CRISPRアレイを含むバラスト海水。
78.態様77のバラスト海水を含む船、ボート、容器又は掘削装置。
79.第1の細胞が、硫酸還元菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はデスルホトマキュラム属(Desulfotomaculum)の細胞であり、各ベクターが、SRBを標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイが、態様61の(a)〜(c)に規定されるとおりである、態様61から69のいずれか1つの方法において使用するためのベクター。
80.R1及びR1'が、態様65から67のいずれか1つに従う、態様79のベクター。
81.第1の細胞が、コレラ (例えば、ビブリオ、例えば、O1又はO139)、大腸菌又はエンテロコッカス属種の細胞であり、ベクターは、細胞を標的化するための1つ又は複数のCRISPRアレイを含み、各アレイが、態様70の(a)及び(b)に規定されるとおりである、態様70から76のいずれか1つの方法において使用するためのベクター。
82.前記細胞に感染可能なバクテリオファージである、態様79から81のいずれか1つのベクター。
83.前記細胞に伝達可能なトランスポゾン又はMGEである、態様79から81のいずれか1つのベクター。
84.各ベクターが、態様82又は83に従い、任意選択で、前記細胞の生存力を低減可能である殺生物剤又は抗生物質と組み合わた状態にある、複数のベクター。
【０２２６】
MIC又は生物付着を媒介する細菌:一例では、第1の宿主細胞は、硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB)、細胞外高分子物質産生菌(EPSB、例えば、シュードモナス属)、酸産生菌(APB)、硫黄-又は硫酸-酸化菌(SOB)、鉄-又はマンガン酸化菌(IOB)、アンモニア産生菌(AmPB)及び酢酸産生菌(AcPB)からなる群から選択される。例えば、第1の宿主細胞が、AcPB(例えば、アセトバクター属(Acetobacter)種及び/又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)種)であり、表面は、炭化水素燃料(例えば、燃料等級エタノール)及び/又は水と接触している。
【０２２７】
以下は、本発明の関連細菌の例である(一例では、第1の宿主細胞は、以下の種のいずれかの細胞である)。アシドチオバチルス属(Acidithiobacillus)の細菌は、硫酸を産生する。アシジチオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)、アシドチオバチルス属細菌の亜属は、頻繁に下水管に損傷を与える。フェロバチルス・フェロオキシダンス(Ferrobacillus ferrooxidans)は、鉄を酸化鉄及び水酸化鉄に直接酸化する。その他の細菌は、有機及び無機両方の種々の酸又はアンモニアを産生する。酸素の存在下では、3種すべてが環境中に広く存在するチオバチルス・チオオキシダンス(Thiobacillus thiooxidans)、チオバチルス・チオパルス(Thiobacillus thioparus)及びチオバチルス・コンクレチボルス(Thiobacillus concretivorus)のような好気性菌は、一般的な腐食を引き起こす因子であり、生体硫化物腐食をもたらす。酸素が存在しない場合には、嫌気性菌、特に、デスルホビブリオ属(Desulphovibrio)及びデスルホトマキュルム属(Desulphotomaculum)が一般的である。デスルホビブリオ・サリキシゲンス(Desulphovibrio salixigens)は、少なくとも2.5%の濃度の塩化ナトリウムを必要とするが、D.ブルガリス(vulgaris)及びD.デスルフリカンス(desulphuricans)は、淡水及び塩水の両方で成長できる。D.アフリカヌス(africanus)は、もう一つの一般的な腐食を引き起こす微生物である。デスルホトマキュルム(Desulphotomaculum)属は、硫酸還元胞子形成菌を含む。デスルホトマキュルム・オリエンチス(Desulphotomaculum orientis)及びニグリフィカンス(nigrificans)が、腐食プロセスに関与している。硫酸還元剤は、還元環境を必要とし、それらは繁栄するために少なくとも約100mVの電極電位を必要とする。である。しかし、生成された硫化水素は、少量であってもこの移行を達成することができ、そのため、成長は、ひとたび開始すると加速する傾向がある。
【０２２８】
一例では、第1の宿主細胞は、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ガリオネラ属(Gallionella)の種、シュードモナス属種、バチルス属種(例えば、B.サブチリス(subtilis)、B.セレウス(cereus)、B.プミルス(pumilus)又はB.メガテリウム(megaterium)、チオバチルス属(Thiobacillus)の種、スルホロブス属(Sulfolobus)の種、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、シュードモナス・エルギノーサ、P.スツッツェリ(stutzeri)、ミクロコッカス属(Micrococcus)、エンテロコッカス属、スタフィロコッカス属(例えば、S.オーレウス、E.フェカリス(faecalis)又はM.ルテウス(luteus)の細胞である。一例では、第1の宿主細胞は、前記種のうち2種以上の混合物を含む。これらの種は、インドの北西及び南西領域に位置するディーゼル及びナフサ輸送パイプラインから単離されており、これらのコンソーシアムの存在下でのパイプライン鋼の局在する腐食との関連は、実証された。種々の欧州の航空機メーカーの合同事業によって、航空機構築においてよく使用されるアルミニウム合金における強力な腐食損傷におけるミクロコッカス属、エンテロコッカス属、スタフィロコッカス属及びバチルス属に由来する単離株の関与が確認された。これらの細菌は、微小酸性環境を作り出すことができ(酸産生菌)、これがその他の細菌の発達に好都合に働き、又は、EPSを産生し、バイオフィルムの形成に好都合に働く(EPS産生菌)。したがって、本発明の一実施形態では、処置されるべきシステムの表面(例えば、鋼表面)を、ディーゼル又はナフサと接触させ、又は処置されるべき流体は、ディーゼル又はナフサである(任意選択で、第1の宿主細胞は、この段落において規定される1種又は複数の種のものである)。本発明の一実施形態では、処置されるべきシステムの表面(例えば、アルミニウム含有表面、例えば、航空機表面)を、ミクロコッカス属、エンテロコッカス属、スタフィロコッカス属及びバチルス属(第1の宿主細胞)のうち1種、2種、3種又はすべてと接触させる。この段落における任意の実施形態の一例では、表面は、システムの鋼又はアルミニウム構成要素の表面である。
【０２２９】
酸産生菌:好気性菌は、酢酸、ギ酸、乳酸、プロピオン酸及び酪酸等の短鎖有機酸をその代謝の生成物として有機材料の発酵代謝から産生することができる。それらはまた、好気性代謝による最初の生着菌である。これらの微生物は、ガススタンド及び油を含め、種々の環境に存在する。有機酸は、SRBの基質として働き、腐食力を加速し、そのうえ、周囲の媒体のpHを低減する。SRBは更に、産生された多量の有機酸は、金属脱分極において作用し、局所腐食プロセスを開始する。
【０２３０】
硫黄酸化菌:硫黄酸化菌は、硫化物、亜硫酸塩、チオ硫酸塩及びいくつかの場合には、硫黄等の無機硫黄化合物の酸化から成長に必要なエネルギーを得る、好気性及び通性嫌気性微生物である。酸化的代謝は、硫酸の生成をもたらし、これは、環境酸性化を促進する。この群は、多数の属を包含し、アシドチオバチルス属は最も研究されている。群はまた、スルホロブ属(Sulfolobu)、チオミクロスピラ属(Thiomicrospira)、ベギアトア属(Beggiatoa)、アシジチオバチルス属及びチオトリクス属(Thiothrix)に由来する細菌種並びに種チオスフェラ・パントトロファ(Thiosphaera pantotropha)及びパラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)も含む。一例では、第1の宿主細胞は、これらの種のいずれか1種の細胞である。
【０２３１】
鉄酸化菌:鉄酸化菌は、その代謝に必要なエネルギーを鉄酸化から得る大きな多様な群に属する好気性微生物である。結果として、水酸化鉄が形成され、これは、一般に、基質表面上に不溶性沈殿物を形成し、異なる酸素レベルを有する領域を促進する。それらは、川、湖から得た水及び油製品中に広く見られる。それらは、大部分は自発運動鞘を有し、その存在は、腐食生成物として沈殿された第二鉄の多量の堆積によって検出できる。この堆積又は無機付着物が、油パイプラインにおける封鎖等の工業設備にとっての問題につながる。最も一般的なものとして、チオバチルス・フェロキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans)及びクレノトリックス属(Crenothrix)、ガリネラ属(Gallionella)、レプトトレックス属(Leptothrix)及びスフェロチルス属(Spherotillus)がある。一例では、第1の宿主細胞は、これらの種のいずれか1種の細胞である。
【０２３２】
硫黄-又は硫酸-還元菌(SRB):SRBは、細菌及び限定嫌気性古細菌を含む形態学的に及び系統学的に不均一な群を形成するが、いくつかの種は、酸素に対して相当な耐性を有する。それらは、主に、グラム陰性菌で中温性であり、一部は、好熱性で、全般的に胞子形成性である。これらの微生物は、モノ-又はジカルボン酸脂肪酸、アルコール、炭化水素及び芳香族化合物を含む、低分子量の種々の有機化合物を、電子受容体として硫酸イオン又はその他の硫黄化合物(チオ硫酸、亜硫酸等)を使用して酸化することができる。アセテート、ラクテート、ピルベート及びエタノールは、SRBによって最もよく使用される基質である。SRB成長の刺激は、硫酸の豊富な海水等の水性媒体の注入がある油回収の際に微生物と組み合わされた腐食生成物の堆積によって説明されるバイオフィルム中に存在する嫌気的条件による。多量の生体硫化水素が産生されることがあり、パイプライン中で形成されたH2Sのほとんど、その他の油、ガス又は石油化学製品回収、処理、貯蔵又は輸送設備は、SRBの代謝活性に端を発する。油産業に対する別の経済的影響として、H2Sによる油及びガスの酸性化がある。
【０２３３】
SRBの代謝活性と関連していた多くの経済的損失を考慮して、SRBの代謝活性の制御及びその後の生体H2S生成の阻害に役立つ、モリブデン酸塩、硝酸塩及び亜硝酸塩等の環境的に有害な及び毒性の代謝阻害剤の使用及び殺生物剤の適用に努力が向けられてきた。
【０２３４】
いくつかの機序が、代謝阻害剤を使用することによって生体H2Sの形成プロセスを封じ込めるように寄与する:I-競合的SRB排除をもたらす、SRBと、通常の電子供与体による亜硝酸塩又は硝酸塩の還元剤である従属栄養細菌の間の競合、II-H2Sの生物学的産生は低い酸化還元電位(-100mV未満)でのみ起こるので、硝酸還元の中間体(亜酸化窒素及び一酸化窒素)の存在による酸化還元電位の増大、III-硫酸の代わりに硝酸塩を還元するいくつかのSRBのエネルギー代謝の変化、IV-硝酸塩又は亜硝酸塩を使用してH2を再酸化し、H2Sをもたらす、硫化物酸化菌及び硝酸又は亜硝酸還元菌、V-SRBにおける硫酸還元によって最終酵素工程を阻害するための、亜硝酸塩による異化型亜硫酸レダクターゼの阻害。
【０２３５】
本発明の特定の実施形態では、処置されるベき、又は処置されるべき流体により含まれる基質と接触している宿主細胞集団をまた、本発明のベクターの存在下で1種若しくは複数の硝酸塩及び/又は1種若しくは複数の亜硝酸塩と接触させる。例えば、工程(i)において、ベクターと同時に又は逐次に、硝酸塩/亜硝酸塩及びベクターを、油、ガス、石油化学製品、水又は工業的又は家庭的システムにより含まれるその他の流体と組み合わせる(例えば、それに注入する)。同様に、更に、又は或いは、SRBの制御機序としてこれらのシステムにおいてモリブデン酸塩もまた使用してもよい。したがって、一実施形態において、処置されるべき、又は処置されるべき流体により含まれる基質と接触している宿主細胞集団をまた、本発明のベクターの存在下で 1種又は複数のモリブデン酸塩と接触させる。例えば、工程(i)において、ベクターと同時に又は逐次に、モリブデン酸塩及びベクターを、油、ガス、石油化学製品又は工業的又は家庭的システムにより含まれるその他の流体と組み合わせる(例えば、それに注入する)。
【０２３６】
その他の実施形態では、本発明のベクターの存在下で集団を、硝酸還元菌及び/又は硝酸還元硫化物酸化菌(NRSOB)(本明細書においてまとめて、「NRB」)と接触させる。例えば、ベクターと同時に又は逐次に、NRBを、油、ガス、石油化学製品、水又は工業的又は家庭的システムにより含まれるその他の流体と組み合わせる(例えば、それに注入する)。一例では、NRBは、本発明のベクターを含み、ベクターは、NRB細胞から第1の宿主細胞(SRB細胞)に伝達可能であり、NRB及びSRB細胞を組み合わせた後に、ベクターをSRB細胞に導入する。一例では、SRB細胞は、前記ベクターとの接触の前に微生物細胞の混合物により含まれ(例えば、微生物バイオフィルムにより含まれる)、混合物は、NRB種の細胞を含む。したがって、この場合には、本発明は、SRB細胞を、NRB細胞(ベクターを含有する)と接触させることを含み、NRB細胞種はすでに、標的化されるべきバイオフィルムにおいてSRBと共存しており、したがって、適合性及びバイオフィルム細胞集団へのベクターを含有するNRBの取り込みの機会が増大する。これは、ベクターのバイオフィルム中に取り込まれる機会を増大するのに有用であり、それによって、バイオフィルム内で、SRB細胞を改変する有効性の機会及び本発明のCRISPRアレイの増殖の機会を増大する(特に、アレイが、トランスポゾン等の可動遺伝エレメントにより含まれる、又は本明細書において記載されるようなファージにより含まれる場合)。
【０２３７】
SRB及びNRBは、通常、細菌の成長のために必要とされる、特定の油田及び産業用水システム中に存在する同一の非ポリマー炭素供給源(アセテート等)について競合する。SRBとの比較においてNRBの成長速度を増大することによって、NRBは、利用可能な非ポリマー炭素供給源の消費においてSRBを打ち負かす可能性があり、SRBから、その成長し、望ましくない硫化物を作り出す能力を奪い、腐食速度を低減する。更に、システム、例えば、油田又は工業用水システムにおいて、SRBの成長速度を阻害することによって、NRBは優勢となり、再度、利用可能な非ポリマー炭素についてSRBを打ち負かす可能性がある。したがって、集団中のSRB細胞を、NRBと接触させることは、集団におけるSRBに対するNRBの比を増大することによってSRB細胞生存力を低減するのに役立ち得る。
【０２３８】
一実施形態では、本発明は、第1の宿主細胞(例えば、SRB)を含む集団を、有機及び/又は無機硝酸塩及び亜硝酸塩と接触させることを含む。これらは、存在するNRBの成長を刺激するように働き、したがって、NRBがSRBを打ち負かすことに役立つ。有機及び無機硝酸塩又は無機亜硝酸塩を、特定の油田及び工業用水システムに注入して使用してもよい。本開示において使用するための入手可能な無機硝酸塩及び無機亜硝酸塩として、例えば、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム化合物、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム及びそれらの混合物が挙げられる。これらの有機及び無機硝酸塩及び無機亜硝酸塩は、一般に利用可能であるが、非限定的であり、任意の適当な硝酸塩又は亜硝酸塩を使用してもよい。
【０２３９】
使用される有機又は無機硝酸塩又は亜硝酸塩の量は、システム中の集団中に存在する硫酸及び/又は有機酸の量及びSRBに対抗するために必要されるNRBの予測量を含むいくつかの因子に応じて変わる。特定の実施形態では、液体と接触している基質のMICを処置するために、又は本発明に従う液体の生物付着を処置するために、使用される有機又は無機硝酸塩又は亜硝酸塩の濃度は、バッチ適用法を使用して適用された場合に、液体の質量で2000ppm未満、或いは、質量で500〜1600ppm、或いは、質量で約900から1100ppmの間である。連続運転によって適用される場合には、有機又は無機硝酸塩又は亜硝酸塩の濃度は、重量で500ppm未満、或いは10から500ppmの間、或いは液体の10から100ppmの間であり得る。
【０２４０】
一実施形態では、集団を、NPB(例えば、ベクターを含む)並びに硝酸塩及び/又は亜硝酸塩と同時に又は逐次に本発明のベクターと接触させる。
【０２４１】
適したNRBとして、嫌気的硝酸還元を実施可能である任意の種類の細菌、例えば、従属栄養性硝酸還元菌及び硝酸還元硫化物酸化菌が挙げられる。一例では、NRBは、カンピロバクター属種、ニトロバクター属種、チオバチルス属種、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)の種、チオミクロスピラ属(Thiomicrospira)の種、スルフロスピリウム属(Sulfurospirillum)の種、タウエラ属種、パラコッカス属(Paracoccus)の種、シュードモナス属種及びロドバクター属(Rhodobacter)の種からなる群から選択される1種、2種、3種又はそれより多い(例えば、1種又は複数の)NRBを含む。例えば、NRBは、ニトロバクター・ブルガリ(Nitrobacter vulgari)、ニトロソモナス・ユーロペア(Nitrosomonas europea)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・エルギノーサ、パラコッカス・デニトリフィカン(Paracoccus denitrifican)、スルフロスピリルム・デレイアナム(Sulfurospirillum deleyianum)及びロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)のうち1種又は複数から選択される。
【０２４２】
特定の実施形態では、NRBは、粗製油、ガス、石油化学製品若しくは水回収、処理、輸送又は貯蔵システム(例えば、その設備における)において見られる、又は水井戸若しくは油井等の地下層において見られるNRB株である。NRBを、システム条件下で代謝するように最適化してもよい。NRBは、例えば、NRB株のライブラリーから選択されるか、又は処置されるべきシステム若しくは同様のシステムから培養されてもよい。 
【０２４３】
システムにおいてSRB細胞と接触されるNRBの量は、予測されるSRBの量並びに存在し得る任意の殺生物剤を含む、いくつかの因子に応じて変わり得る。地下層に注入されると、地下層の透過性及び多孔度も同様に考慮され得る。本開示の特定の実施形態では、液体に注入されるNRBの量は、1から108細菌数/液体1mlの間、或いは、10から104細菌数/液体1mlの間である。
【０２４４】
NRBがSRBを打ち負かすようシミュレートすることに加え、硝酸塩を用いる本開示の特定の実施形態では、更なるSRB阻害剤を導入することが望ましい場合がある。一例では、SRBを、9,10-アントラキノン、モリブデン酸塩(モリブデン酸ナトリウム及び/又はモリブデン酸リチウム等)及びそれらの混合物からなる群から選択される1種又は複数のSRB阻害剤と接触させる。本開示の特定の実施形態では、モリブデン酸塩を液体の質量で5〜100ppmの範囲で液体に添加する。
【０２４５】
一例では、本発明のベクター及び1種又は複数の殺生物剤(すなわち、SRB殺生物剤等の第1の 宿主細胞の殺生物剤)を、第1の細胞を混合物と接触させる前に、例えば、処置されるべき表面と接触している液体への混合物の注射又は処置されるべき流体への混合物の注射によって混合する。
【０２４６】
ベクターを含有するNRB細胞に加えて、又はそれとは別に、本発明は、本発明のベクターを含むバチルス属の細胞の種の使用を考慮する。
【０２４７】
一実施形態では、ベクターは、SRBに感染可能であるバクテリオファージであり、ファージを第1の宿主細胞(例えば、SRB)と接触させ、それによって、本発明に従うその改変のためにファージに含まれるCRISPRアレイが第1の宿主細胞に導入される。一実施形態では、第1の細胞がSRBである場合、SRBを、NRBと同時に又は逐次に本発明のファージベクターとも接触させる。NRBと接触させることの代わりに、又はそれに加えて、SRBを硝酸塩及び/又は亜硝酸塩と接触させる。
【０２４８】
MICに関与する例示的機序は、以下のとおりであり、一実施形態では、方法を使用して「制御すること」は、以下から選択される機序を低減することを含む:
【０２４９】
・金属表面での水酸化鉄の堆積による生体内鉱質形成、金属/溶液界面での電気化学的プロセスの改変、腐食の誘導の微生物(例えば、細菌)促進、
・バイオフィルムの形成に好都合に働くEPSの生成、
・金属の腐食に作用する酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(AHH)の放出による石油製品の分解の微生物(例えば、細菌)促進、
・腐食プロセスを増大する硫酸の生成、及び
・硫黄の酸化。
【０２５０】
一実施形態では、方法は、以下から選択される還元機序を含む:
・表面が金属表面である、表面での水酸化鉄の堆積による生体内鉱質形成の細菌促進、
・EPSの生成、
・表面が金属表面である、酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(AHH)の放出によるシステムにおける石油製品の分解の細菌促進、
・硫酸の生成、及び
・硫黄の酸化。
【０２５１】
MIC又は生物付着(BIFOULING)制御に適用可能な例
細菌と関連する腐食及び/又は生物付着を低減するための本発明によって想定される特定の適用例がある。以下に記載する適用は、本発明の概念を制限しようとするものではなく、単に、細菌によって誘導される腐食を制御するために、又は環境汚染を低減するために本発明を使用できる方法の例示である。
【０２５２】
酸性鉱山排水:酸性鉱山排水では、細菌成長が、環境における酸度を増大することがある。酸の生成、したがって、環境被害の可能性のための反応スキームが存在する。酸性鉱山排水の問題は、重大な環境問題として世界中で認識されている。酸性鉱山排水の起源は、黄鉄鉱及び鉱物を含有するその他の硫化物の風化及び酸化である。鉱山排水は、黄鉄鉱、硫化鉄が露出し、空気及び水と反応して硫酸及び溶解イオンを形成すると形成される。この鉄の一部又はすべてが沈殿して、鉱山排水を含有する細流の底に赤色、橙色又は黄色の沈降物を形成し得る。酸性流出液は、銅、鉛、水銀等の重金属を地下水又は地表水に更に溶解する。酸性鉱山排水進行の速度及び程度は、特定の細菌の作用によって増大され得る。
【０２５３】
一例では、したがって、システムは、鉱山である、又は鉱山に含まれる。流体は鉱山排水流体であり、方法は、鉱山排水によって引き起こされる硫酸を低減する。一例では、表面は、鉱山排水流体と接触している。
【０２５４】
一例では、第1の宿主細胞は、アシジチオバチルス・フェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)、アシジチオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)、アシジチオバチルス・デントリフィカンス(Acidithiobacillus denitrificans)、レプトスピリルム・フェロオキシダンス(Leptospirillum ferrooxidans)又はスルホバチルス・サーモスルフィドオキシダンス(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)の細胞又はこれらのうち2種以上の混合物である。
【０２５５】
水圧破砕:水圧破砕は、ガス及びその他の炭化水素の抽出を促進するために岩層を破壊する方法である。本質的に、ひとたび、ガスを有する層が同定されると、ガスに近づくために地面に井戸を垂直及び水平方向の両方に掘る。次いで、水圧破砕が完了すると、井戸を使用し、高圧水、砂及び多量の化学物質を使用して頁岩を破壊して、裂け目及び亀裂を重荷の強烈な圧力によって閉じられることから維持する。何百万ガロンの水を使用して井戸を破砕するために使用される。破砕流体の30%から70%の間が「逆流」として表面に戻る。逆流は、塩を含む、破砕水に溶解されるあらゆる物を含有する。溶解されるものは、場所に応じて異なる。逆流は、井戸の敷地でプラスチックで裏打ちされたピットに保持され、トラックで運ばれ、処置され、その後廃棄される。ある時点で、大流量の比較的低塩分の水が、少ない流れであるが、それを「逆流」水と区別する、はるかに高い塩分の「生成水」に変わる。
【０２５６】
いずれかの場合にも、微生物腐食(MIC)の問題は存在する。特に興味深いものは、SRBである。一例では、したがって、システムは、水圧破砕システムであり、流体は、水圧破砕液(例えば、逆流水又は生成水)であり、処置されるべき表面は、このような液体と接触している。方法は、例えば、SRB生存力を低減し(例えば、液体においてSRBを死滅させる及び/又はSRB増殖を低減する)、第1の宿主細胞は、SRBである。
【０２５７】
例えば、第1の宿主細胞は、アシドチオバチルス属の細菌、アシジチオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)、フェロバチルス・フェロオキシダンス(Ferrobacillus ferrooxidans)、チオバチルス・チオオキシダンス(Thiobacillus thiooxidans)、チオバチルス・チオパルス(Thiobacillus thioparus)、チオバチルス・コンクレチボルス(Thiobacillus concretivorus)、デスルホビブリオ属(例えば、サリキシゲンス(salixigens)、ブルガリ(vulgari)、デスルフリカンス(desulphuricans)又はアフリカヌス(africanus))又はデスルホトマキュルム属(Desulphotomaculum)(例えば、オリエンチス(orientis)又はニグリフィカンス(nigrificans))の細胞又はこれらの種のうち2種以上の混合物である。
【０２５８】
冷却設備(例えば、冷却タワー):冷却タワー等の冷却設備における細菌の存在は、いくつかの方法で冷却の機能に悪影響を及ぼすことがある。例えば、SRBは、冷却タワー、熱交換器等の壁上に酸性状態を作出することを支持し、これは、腐食及び修復が行われる間の冷却システムのシャットダウンの可能性につながる。更に、例えば、熱交換機の壁上のバイオフィルムは、熱交換機の熱伝達係数を低減し、冷却システムの運転効率の低下をもたらす.
【０２５９】
更に、鉄含有構成要素の腐食は、特に有害であり得る。鉄の鉄(II)への酸化及び硫酸の硫化物イオンへの還元は、in situで結果として生じる鉄硫化物の沈殿及び腐食性水素イオンの生成を伴い、SRBを介して起こり得る。硫酸還元菌による鉄の腐食は、迅速であり、普通の錆の発生とは異なり、自然治癒しない。デスルホビブリオ属によって産生される結節は、第一鉄硫化物の柔らかい黒色中心部分を含有する、黒色酸化磁鉄と混合された赤色酸化第二鉄の外殻からなる。
【０２６０】
したがって、一例では、システムは。冷却システムであり、流体は、システムにより含まれる流体(例えば、水又は水性液)であり、又は処置されるべき表面は、このような流体と接触している冷却設備の表面である。一例では、第1の宿主細胞は、SRB(例えば、本明細書において開示される任意のSRB)である。一例では、表面は、鉄含有表面である。
【０２６１】
一例では、第1の宿主細胞は、レジオネラ属の細胞である。このような種は、ヒトの健康にとって有害であり、水冷、加熱、処理又は貯蔵設備において増殖される。一例では、したがって、システムは、このような設備である。
【０２６２】
パイプライン腐食:炭化水素及び石油化学パイプラインは、細菌成長を可能にするのに十分な水分を含むことが多く、例えば、SRBによって引き起こされるMICをもたらす。MICは、パイプラインの内表面と直接接触している、嫌気性であるSRBを保護する好気性菌のバイオフィルムによって引き起こされることが多い。これは酸性条件及びその他の金属腐食条件を作り出し、これは、局在する腐食及びパイプの最終的な失敗をもたらす。
【０２６３】
一例では、システムは、第1の宿主細胞(例えば、SRB)と接触している表面を含む設備表面(例えば、パイプライン又は掘削設備)を含む。例えば、システムは、粗製油、炭化水素、石油化学製品(例えば、ディーゼル又は石油)、ガス又は水回収、処理、貯蔵又は輸送システムである。例えば、パイプラインは、石油化学パイプラインである。例えば、パイプラインは、油又はガス掘削装置により含まれる。例えば、パイプライン表面は、海水と接触している。例えば、パイプライン表面は、石油化学流体、粗製油又は天然ガスと接触している。
【０２６４】
廃水処置:廃水処置は、有機汚染物質を除去するために廃水処置プラントの下流に活性化スラッジを添加することを含む。したがって、水を廃水処置施設において処理した後、多数の有機汚染物質が存在し、これは、細菌によって「消化」され得る。したがって、廃水処置施設からの流出液を処置するために、タンク/容器中の処置水に活性化スラッジを添加する。
【０２６５】
しかし、時には、タンク/容器中の細菌(活性化スラッジ、廃水自体又は周囲の環境に起因するか否かにかかわらず)が支配し、極めて急速に成長する。このような迅速な成長は、糸状型の細菌成長をもたらし得る。細糸は、タンク又は容器中の細菌集団の最大20〜30%を形成することがあり、それらは浮遊する。この糸状成長は、バルキングスラッジとして知られるものをもたらす。本発明は、廃水処置における重要な態様であるバルキングスラッジ制御のために利用されることができる。
【０２６６】
したがって、一例では、システムは、水処置システムであり、表面は、システムの容器の表面であり、表面は、水及び第1の宿主細胞と接触しており、又は処理されるべき流体は、前記水及び細胞を含む。一例では、方法は、廃水システムのスラッジにおける細菌成長を制御する。
【０２６７】
船舶運送及び輸送:船及びボートは、海水又は水路(例えば、川、湖、池又は淡水)と接触しているその外表面(例えば、船体)でMICを起こすことがある。内側船体表面もまた、それらが、通常、細菌等のMIC媒介微生物を保持し得る水分又は液体と接触している、例えば、バラスト水と接触しているので、MICを受けることがある。例えば、海水は、海上での安定性を提供するために、船(例えば、石油タンカー)の船体中に保持されることが多く、このような海水は、SRBを媒介する細菌を保持する。その他の輸送乗り物、例えば、モーター駆動の乗り物(車、トラック、バン又は大型トラック)、列車、宇宙船及び航空機も影響を受けやすいものであり得る。
【０２６８】
したがって、一例では、システムは、輸送乗り物(例えば、物品及び/又は人又は家畜を輸送するための、例えば、車、トラック、バン又は大型トラック、列車、宇宙船又は航空機)である。例えば、乗り物は、船又はボート、例えば、油、ガス又は石油化学製品海洋容器(例えば、石油タンカー)である。一例では、処置されるべき表面は、海水と接触している。一例では、表面は、船又はボート船体の外表面である。一例では、表面は、船又はボート船体の内表面である。
【０２６９】
バラスト水における細菌持続又は成長(生物付着):本発明の具体的な適用として、ビブリオ・コレラエ、大腸菌及び/又はエンテロコッカス属種等の望ましくない細菌を低減するための海洋乗り物(例えば、船又はボート)バラスト水の処置がある。
【０２７０】
船舶運送は、世界の物品の90%超を動かし、およそ2~30億トンのバラスト水の世界規模の伝達に関与しており、これは、日常的にその安定性を維持するために船によって運ばれる。同様の容量のバラスト水はまた、毎年、国及び領域内で国内的に伝達されている可能性がある(GloBallast Partnership、www.globallast.imo.org)。バラスト水は、自然に進化した生物多様性を脅かす侵入海洋生物の主な供給源として認識されており、その結果はますます実現されるようになっている(Anilら.2002)。起源の場所から輸送された、又は輸送の間に形成された疾患を引き起こす病原性細菌の意図しない導入は、社会及び人の健康に直接的な影響を及ぼし得る。船バラストタンクは、種々の非常在性脊椎動物、無脊椎動物、植物、顕微鏡的藻類、細菌等を保有する(Williamsら.1988;Carlton及びGeller 1993;Smithら1996;Ruizら2000;Drakeら2002、2005、2007;Mimuraら2005)。細菌等の微生物は、その高い天然の存在量、休止期を形成する能力及び広範囲の環境条件に耐える能力のために、その他の生物よりも多数で異国環境に導入される。バラストタンク中に入れられたすべての生物が生き残らない場合があるが、細菌及び微小藻類は、シスト、胞子又はその他の生理学的休止期を形成することによって長期間の好ましくない条件を生き残ることができる(Roszakら,1983;Hallegraeff及びBolch 1992;Anilら,2002;Carneyら.2011)。これらの微生物は、ひとたび放出されると、受動的分散を容易にするその小さい大きさ及び後生動物よりも簡単な生存のための必要条件のために侵入性であるように十分に適している(Deming 1997)。シンガポール港において船から調べられたバラストサンプル中のビブリオ属種の細胞の濃度は、1.1〜3.9×104ml-1の範囲にあった(Joachimsthalら2004)。疾患を引き起こす病原性細菌の意図しない導入は、人の健康に対する影響を含め、直接的な社会的影響を及ぼし得る。初期の研究では、チェサピーク湾に導入された病原体のほとんどが、水柱自体よりもプランクトンと関連する細菌を起源とすることがわかった(Ruizら2000)。したがって、細菌及び古細菌等のバラスト水微生物は、バラスト水処置/管理プログラムにおいて大きな関心のあるものである。
【０２７１】
国際海事機関(IMO)は、2004年に船舶のバラスト水と沈降物の制御と管理に関する国際条約(バラスト水管理条約)を採用し、これらの有害な効果を防ぐことを目的とした条約を策定した。米国では、バラスト水管理に関する米国沿岸警備隊の最終規則は2012年6月に施行され、米国海域のバラスト水排出に適用される。
【０２７２】
海上でのバラスト水交換は、バラスト水管理の理想的な方法とは見なされておらず、処置方法の開発にかなりの努力が払われている。これらの方法は、IMOのバラスト水管理条約の標準D-2に従わなければならない。標準D2は、処置された排出されたバラスト水は以下を有さなくてはならないことを指定している:
・立方メートルあたりの最小寸法が50マイクロメートル以上の10より少ない生存生物、
・ミリリットルあたりの最小寸法が50マイクロメートル未満及び10マイクロメートル以上の10より少ない生存生物。
【０２７３】
更に、標準D2では、指示微生物の排出が、以下の通りの指定濃度を超えてはならないと指定している:
・100ミリリットルあたり1コロニー形成単位(cfu)未満、又は1グラム(湿重量)の動物プランクトンサンプルあたり1cfu未満の毒性原性ビブリオ・コレラエ菌(O1及びO139)、
・100ミリリットルあたり250cfu未満の大腸菌(Escherichia coli)
・100ミリリットルあたり100cfu未満の腸のエンテロコッカス属。
【０２７４】
これらは、ヒトの健康標準としての指示微生物であるが、それらはこれらの種類に限定されない。実際、事実、いくつかの場合には、使用されたバラスト水処置は、辞退を悪化させ得ることが示唆されている。細菌を食べる小生物を除去することによって、一部の処置システムは、バラストタンクを細菌インキュベーターに変え、その結果、処置された排出物は、より高い濃度の細菌を一貫して含有し、一部の試験では、未処置のままであった排出物よりも数千倍高かった。この増大された細菌は、ヒト病原体を含み得る。
【０２７５】
したがって、本発明(例えば、態様70又は態様70に従属する態様に従う)の一例では、システムは、船又はボート又は海洋乗り物(例えば、港、ドック又は海上での船又はボート、例えば、石油タンカー)である。一例では、第1の宿主細胞を含む流体は、船又はボート海洋乗り物のバラスト水(例えば、船又はボートバラスト水、例えば、石油タンカーバラスト水)である。一例では、システムは、例えば、海上での海上コンテナ又はプラットフォーム又は掘削装置(例えば、油又はガス掘削装置)である。一例では、流体は、容器、プラットフォーム又は掘削装置等のバラスト水である。
【０２７６】
一実施形態では、有害な細菌(本発明、例えば、態様70又は態様70に従属する態様に記載の第1の宿主細胞)は、ビブリオ・コレラエ、ビブリオ・ルモイエンシス(Vibrio rumoiensis)、ビブリオ属種、大腸菌、エンテロコッカス属種、シュードモナス・シンキサンタ(Pseudomonas synxantha)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、ビブリオ・レンツス(Vibrio lentus)、シュードアルテロモナス・マリナ(Pseudoalteromonas marina)、シュードアルテロモナス・テトラドニス(Pseudoalteromonas tetraodonis)、シュードアルテロモナス属(Pseudoalteromonas)の種、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)、ビブリオ・スプレンジヅス(Vibrio splendidus)、ビブリオ・シクリトロフィクス(Vibrio cyclitrophicus)、エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ビブリオ・ロチフェリアヌス(Vibrio rotiferianus)、シュードアルテロモナス・ウンジナ(Pseudoalteromonas undina)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シュードモナス・フルバ(Pseudomonas fulva)、シュードモナス・トラッシー(Pseudomonas tolaasii)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、ビブリオ・ツビアシー(Vibrio tubiashii)、ハロモナス・ベヌスタ(Halomonas venusta)、イジオマリナ・ロイヒエンシス(Idiomarina loihiensis)、ビブリオ・シクリトロフィクス(Vibrio cyclitrophicus)、ビブリオ・ツビアシー(Vibrio tubiashii)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シュードアルテロモナス属(Pseudoalteromonas)の種、シュードアルテロモナス・アトランチカ(Pseudoalteromonas atlantica)、シュードモナス・シンキサンタ(Pseudomonas synxantha)、シュードモナス・スツッツゼリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードアルテロモナス・カラギーノボラ(Pseudoalteromonas carrageenovora)、テナシバクルム属(Tenacibaculum)の種、バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)、ビブリオ・ナトリゲンス(Vibrio natriegens)、バチルス・ベクリュゲンシス(Bacillus baekryungensis)、エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae)、ラクトバチルス・ペントスス(Lactobacillus pentosus)、シュードアルテロモナス・カラギーノボラ(Pseudoalteromonas carrageenovora)及びシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)からなる群から選択される種のものである。
【０２７７】
一例では、第1の宿主細胞は、好気性従属栄養細菌である。一例では、第1の宿主細胞は、ビブリオ・コレラエ細胞(例えば、株O1及び/又はO139)である。一例では、第1の宿主細胞は、大腸菌細胞である。一例では、第1の宿主細胞は、エンテロコッカス属種の細胞である。
【０２７８】
「Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass Spectrometry」、Kaveh Eら、PLoS One. 2012;7(6):e38515; 2012年6月7日オンラインで公開doi:10.1371/journal.pone.0038515(参照により本明細書に組み込まれる)には、バラスト水中の細菌をモニタリングするための適した迅速な費用効率の高い方法が開示されている。
【０２７９】
本発明の特定の例は、以下の通りである:
船又はボートのバラスト水において細菌生物付着を制御する方法であって、水は、前記生物付着を媒介する第1の微生物種(コレラ菌、大腸菌又はエンテロコッカス属種等)の第1の宿主細胞の集団を含み、
(i)集団を、細胞を形質転換又は形質導入することが可能である複数のベクターと接触させる工程であって、各ベクターは、CRISPRアレイを含み、それによってCRISPRアレイは、宿主細胞に導入され、
(a)各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1つ又は複数の配列及び宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)各crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するための遺伝子配列である
工程と、
(ii)宿主細胞においてCasの存在下で前記cRNAを発現させ、それによって、宿主細胞において標的配列を改変し、宿主細胞生存力の低減及び前記生物付着の制御をもたらす工程と
を含む、方法。
【０２８０】
一例では、工程(i)は、例えば、船又はボートの船体においてバラスト水を、ベクターと混合することを含む。
【０２８１】
一例では、船又はボートは、海洋乗り物であり、水は海水である。船又はボートの代わりに、代替において、バラスト水は、海上の容器又は掘削プラットフォーム、例えば、油プラットフォーム又は油掘削装置により含まれる。
【０２８２】
本発明はまた、船又はボートから得た排出バラスト水を含み、排出バラスト水は、上記の具体例の方法によって処置された水を含む。一例では、水は、水域、例えば、海、大洋又は水路(例えば、川、運河、湖又は貯水池)に排出される。
【０２８３】
本発明はまた、CRISPRアレイを含む船又はボートバラスト水を含み、バラスト水は、上記の具体例によって得られる、又は得ることができる。本発明はまた、CRISPRアレイを含む海上コンテナバラスト水を含み、バラスト水は、上記の具体例によって得られる、又は得ることができる。本発明はまた、海上のプラットフォーム又は掘削装置(例えば、油又はガス掘削装置)のバラスト水を含み、水は、CRISPRアレイを含み、バラスト水は、上記の具体例によって得られる、又は得ることができる。アレイは、具体例の(a)及び(b)において列挙されたとおりである。
【０２８４】
[参考文献]
2020525049.tif 000003
2020525049.tif 000004
2020525049.tif 000005
2020525049.tif 000006
2020525049.tif 000007
【０２８５】
本発明はまた、以下のとおりにベクター及びCRISPRアレイを提供する。
85.細菌宿主細胞に導入するためのCRISPRアレイを含むベクターであって、細菌は、水系伝染可能であり、
(a)CRISPRアレイは、crRNAの発現のための配列及び前記宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、
(b)crRNAは、標的配列を改変するために(例えば、標的配列を切断するために)宿主細胞において、宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドすることが可能であり、標的配列は、宿主細胞生存力を媒介するためのヌクレオチド配列(例えば、遺伝子又は調節配列)であり、
(c)(a)の配列は、crRNAの発現及び産生のための配列R1-S1-R1'を含み、R1は、第1のCRISPRリピートであり、R1'は、第2のCRISPRリピートであり、R1又はR1'は、任意選択であり、S1は、宿主細胞標的配列に対して80%以上同一である(例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%同一である)ヌクレオチド配列を含む又はからなる第1のCRISPRスペーサーである、
ベクター。
【０２８６】
「水系伝染」とは、前記細菌の細胞が、異なる生物間で、生物内で、異なる環境間で、又は生物及び環境間で、水又は水性液において広がることが可能であることを意味する。例として、ビブリオ・コレラエ(Vibro cholera)、エンテロコッカス属種及び大腸菌がある。ビブリオ・コレラエは、極性の鞭毛を有するグラム陰性のカンマ型細菌である。ガンマプロテオバクテリア(Gamma Proteobacteria)の綱に属する。V.コレラエ(cholerae)、古典的及びエルトール(El Tor)の2つの主要な生物型及び多数の血清型がある。V.コレラエは、コレラ、小腸の重度細菌感染の病原因子であり、発展途上国における死亡の主原因である。V.コレラエの病原性遺伝子は、V.コレラエ感染を検出し、研究するために興味深い標的である。これらの遺伝子のほとんどが、プロファージ1、2として構築されたTCP(毒素共調節線毛)及びCTX(コレラ毒素)と名付けられた2つの病原性アイランド中に位置している。TCPは、線毛を介した宿主接着に関与している遺伝子のクラスターを含有し、一方、CTX遺伝子は、コレラ毒素3の合成に関与している。
【０２８７】
一実施形態では、ベクターは、単離されたベクター(すなわち、前記 宿主細胞にはないベクター)である。一例では、ベクターは、遺伝子操作されたベクター又は合成ベクター(すなわち、天然に存在しないベクター)である。
【０２８８】
一例では、アレイは、ICP1アレイ、すなわち、ICP1 Vコレラエファージのアレイであり、例えば、ファージは、ICP1_2003_A、ICP1_2004_A、ICP1_2005_A、ICP1_2006_E又はICP1_20011_Aである。一例では、アレイは、CR1又はCR2 ICP1ファージアレイ、例えば、このようなアレイの遺伝子操作された又は天然に存在しない誘導体である。
【０２８９】
一例では、CRISPRアレイ及びCasは、1-E型又は1-F型、例えば、亜型システム17である。
【０２９０】
一例では、CRISPRアレイは、それぞれのcrRNAの発現のための複数の配列及び前記宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターと関連するものを含む。
【０２９１】
一例では、ベクター又は各ベクターは、複数の(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)前記CRISPRアレイを含む。
【０２９２】
一例では、ベクターは、前記Casをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２９３】
別の例では、ベクターは、このような配列を欠く。例えば、この場合には、アレイは、宿主細胞によって産生される1つ又は複数のCasとともに作動可能である。
86.細胞が、ビブリオ・コレラエ、エンテロコッカス属又は大腸菌の細胞である、態様85のベクター。
87.ベクターが、前記Casを発現可能であるヌクレオチド配列を欠く、態様85又は86のベクター。
一例では、したがって、ベクターは、Casヌクレアーゼをコードしない。代替において、ベクターは、前記Casをコードする。
88.標的配列が、17〜45の連続ヌクレオチド、例えば、18、19、20又は21の連続ヌクレオチドのプロトスペーサー配列である、態様85、86又は87のベクター。
一例では、各スペーサー(S1)は、17〜45の連続ヌクレオチド、例えば、18、19、20、21、30、31、32又は33の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。VコレラエPLEのプロトスペーサー配列は、例えば、32の連続ヌクレオチドであり、これを標的化するベクターは、例えば、32のヌクレオチドPLE配列に対して100%又は少なくとも80、90若しくは95%同一である32の連続ヌクレオチドのスペーサー配列を有する。ベクターが、複数のスペーサーを含む場合には、スペーサーは、異なるスペーサーの混合物であり得る、又は同一スペーサーであり得る。例えば、アレイは、複数のスペーサーを含み、スペーサーのサブセットは同一である。同一スペーサーは、例えば、宿主細胞の病原性因子をコードする遺伝子のプロトスペーサー配列に対して相同であり得る。複数のスペーサーを使用することは、ひとたびベクターが細胞の内側にあると、宿主が1つ又は複数のスペーサーを切断する場合には有利であり得る-未切断スペーサーが依然としてcrRNAを形成し、標的配列に進むことができる。ベクター中又はアレイ中の異なるスペーサーの混合物を使用することは、侵入ベクターに対する宿主の適応のリスクを最小にし、それによって、耐性を最小にするのに有利である。
89.標的配列が、病原性、耐性又は必須遺伝子配列である、態様85から88のいずれか1つのベクター。一例では、標的配列は、PICI様エレメント(PLE)、例えば、V.コレラエPLE、例えば、PLE1の配列である。
90.標的配列が病原性アイランド配列であり、任意選択で、宿主細胞が、ビブリオ・コレラエ細胞であり、標的配列がTCP、CTX又はVPI配列である、態様85~89のいずれか1つのベクター。一例では(例えば、宿主が、ビブリオ属である)病原性アイランドは、TCP(毒素共調節線毛)又はCTX(コレラ毒素)である。ビブリオ属病原性アイランド(VPI)は、毒素共調節線毛(TCP)の生成に主に関与する遺伝子を含有する。それは、2つの反復領域(att様部位)が両側に位置する大きな遺伝子エレメント(約40kb)であり、構造でファージゲノムと類似する。VPIは、いくつかのその他の遺伝子とともに、2つの遺伝子群、TCPクラスター及びACFクラスターを含有する。acfクラスターは、4種の遺伝子:acfABCDからなる。tcpクラスターは、15種の遺伝子:tcpABCDEFHIJPQRST及び調節遺伝子toxTからなる。
91.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、標的配列が、CTXφ遺伝子配列である、態様85から90のいずれか1つベクター。コレラ毒素の遺伝子は、CTXphi(CTXφ)、V.コレラエゲノムに挿入されたテンペレートバクテリオファージによって保持される。CTXφは、あるV.コレラエ株から別のものにコレラ毒素遺伝子遺伝子を伝染させることができる、1つの水平遺伝子導入の形態。毒素共調節線毛の遺伝子は、VPI病原性アイランド(VPI)によってコードされる。
92.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、標的配列が、ctxB、tcpA、ctxA、tcpB、wbet、hlyA、hapR、rstR、mshA又はtcpP配列である態様85から90のいずれか1つのベクター。
93.標的配列が、17〜45の連続ヌクレオチド(例えば、18、19、20又は21の連続ヌクレオチド)であり、グラム陽性菌のファージ誘導性染色体アイランド(PICI)、例えば、スタフィロコッカス・オーレウス病原性アイランド(SaPI)の配列と少なくとも80%(例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%同一)同一である、態様85~92のいずれか1つのベクター。ICP1ファージ(aka ICP1関連ファージ)スペーサー配列の例は、以下に提供されている。これらのスペーサー配列は、Vコレラエ中の標的配列(プロトスペーサー配列)に対して相同である。
94.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、crRNAが、ビブリオ・コレラエの細胞中のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5、4又は3つのヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズ可能であり、PAMがGAである、態様85から93のいずれか1つのベクター。
95.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、細胞が、エルトール(El Tor)O1又はO139ビブリオ・コレラエ細胞である、態様85~94のいずれか1つのベクター。一例では、V.コレラエは、血清型O1エルトール(El Tor)N16961、エルトール(El Tor)生物型18又はエルトール(El Tor)株MJ-1236である。一例では、宿主細胞は、大腸菌O157:H7細胞である。
96.ベクターが、前記宿主細胞に感染可能であるバクテリオファージである、態様85から95のいずれか1つのベクター。一例では、宿主細胞は、大腸菌であり、ファージは、λ又はT4ファージである。一例では、宿主細胞は、エンテロコッカス属の細胞であり、ファージは、エンテロコッカス属ファージIME-EF1、phiEF24C、φEf1又はEFDG1である(Appl Environ Microbiol. 2015年4月;81(8):2696〜705頁 doi:10.1128/AEM.00096-15. Epub 2015年2月6日、「Targetting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy」、Khalifa Lらを参照のこと)。
97.宿主細胞が、ビブリオ・コレラエであり、ベクターが、ビブリオ・コレラエの細胞に感染可能であるバクテリオファージである、態様96のベクター。
98.バクテリオファージが、CTXφ、ICPIファージ及びミオウイルスから選択され、例えば、ファージが、ICP1_2003_A、ICP1_2004_A、ICP1_2005_A、ICP1_2006_E又はICP1_20011_A、任意選択で、遺伝子操作された、天然に存在しないファージである、態様97のベクター。
99.ベクターが、ICE、例えば、トランスポゾンである、又はそれを含む態様85から98のいずれか1つのベクター。ICEは、本明細書において記載されるICEの特性のいずれも含み得る。
100.トランスポゾンが、第1から第2の前記宿主細胞に伝達可能である接合性トランスポゾンである、態様99のベクター。
101.トランスポゾンが、CRISPRアレイのコピーを第1の細胞に残す態様99又は100のベクター。
102.各アレイが、それぞれの可動遺伝エレメント(MGE)により含まれ、MGEが、宿主細胞において作動可能である伝達の起点(oriT)を含む、態様85から101のいずれか1つのベクター。MGEは、本明細書において記載される任意のMGEに従うものであり得る。
103.ベクターが、遺伝子操作されたベクターである、態様85から102のいずれか1つのベクター。
104.態様85から103のいずれか1つに記載の複数のベクターを含む水又は食品処置組成物。
一例では、水は、バラスト水、海水、汽水、淡水、飲料水、水路水(例えば、入り江 水)又は工業用水である。一例では、水は、ヒトGI管流体中の水である。
一例では、宿主細胞は、甲殻類、魚類、イネ又は穀物により含まれる。一例では、組成物は、食品を処置するためのものであり、宿主細胞は、大腸菌O157:H7細胞である。一例では、標的配列は、大腸菌 (例えば、O157:H7)宿主細胞において志賀毒素をコードする配列である。これまでに記載された水系種の代替において、宿主細胞は、サルモネラ属又はリステリア属の細胞である。
105.ヒトにおけるビブリオ・コレラエ感染の処置又は予防のための医薬であって、態様85から103のいずれか1つに記載の複数のベクターを含む、医薬。代替において、本発明は、ヒトにおける大腸菌感染の処置又は予防のための医薬であって、本発明の複数のベクターを含む医薬を提供する。代替において、本発明は、ヒトにおけるエンテロコッカス属感染の処置又は予防のための医薬であって、本発明の複数のベクターを含む医薬を提供する。
106.抗宿主細胞抗生物質又は抗宿主細胞殺生物剤を更に含む、態様104又は105の組成物又は医薬。
【０２９４】
以下の実施例5は、コレラに関連する実施例である。
【０２９５】
一般特性のいずれも(以下を参照のこと)本構成(第6の構成)にあてはまり得る。以下の任意の構成を、例えば、本明細書における1つ又は複数の態様に含めるために特性の組合せを提供するために本構成と組み合わせることができる。
【０２９６】
CAS活性の調節
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞において、又はin vitroでCas活性を調節するために有用である。本発明は、Casをコードする遺伝子を標的化して、Cas活性を制限することを含み、これは、Casの一次的な調節にとって有利である。本発明はまた、細胞のゲノムを改変する場合に、例えば、オフターゲットCas切断の機会を低減するために、Cas活性のストリンジェンシーの増大が望まれる設定において有用であり得る。適用は、例えば、細胞又は細胞を含む組織若しくは生物の遺伝子療法又は標的遺伝子組換えのために、例えば、オフターゲット効果が最小化されなければならない、又は避けられなければならないヒト、動物又は植物細胞の改変においてである。例えば、ヒトにおいて遺伝子療法のために、又は疾患若しくは状態の処置若しくは予防のために患者に投与されるべきヒト細胞(例えば、iPS細胞)において所望の変化を作製するためにCas改変を使用する場合に、極めて高いストリンジェンシーが必要とされる。本開示は、これらの適用を本発明の方法及び製品の一部として提供する。
【０２９７】
本発明は、したがって、以下の条項を提供する:
1.第1のCasをコードする発現可能な遺伝子を改変する方法であって、
(a)ガイドRNA(gRNA1)をCas遺伝子と前記遺伝子から発現される第1のCasの存在下で組み合わせる工程と、
(b)gRNA1を前記Cas遺伝子の配列(例えば、そのプロモーター又は第1のCasをコードするDNA配列)とハイブリダイズさせて、第1のCasを遺伝子にガイドし、それによって、CasがCas遺伝子を改変する工程と
を含む、方法。
【０２９８】
一例では、方法は、in vitroで細胞不含方法(例えば、リコンビニアリング方法)である。別の例では、方法は、細胞で実施され、遺伝子は、自身をコードするCasによって切断される(すなわち、遺伝子を切断するために内因性Casが使用される)。
2.Casがヌクレアーゼであり、Cas遺伝子が切断される、条項1の方法。
3.Cas遺伝子が、突然変異され、下方制御され、又は不活性化される、条項1又は2の方法。
4.第1のCasがCas9である、条項1から3のいずれか1つの方法。
5.gRNA1が、単一ガイドRNAである、条項1から4のいずれか1つの方法。
6.方法が宿主細胞において実施される、条項1から5のいずれか1つの方法。
7.細胞が、原核細胞、例えば、細菌又は古細菌細胞(例えば、大腸菌細胞)である、条項6の方法。
8.リコンビニアリング法である、条項6の方法。
9.細胞が、ヒト又は非ヒト動物病原体種又は株(例えば、Sオーレウス)のものである、条項6、7又は8の方法。
10.細胞が、ヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸イクロバイオーム種の細胞である、条項6から9のいずれか1つの方法。
11.Cas遺伝子が、宿主CRISPR/Casシステムにより含まれる、条項6から10のいずれか1つの方法。
【０２９９】
任意選択で、外因性の第1のCasをコードする配列は、方法において使用されず、例えば、宿主細胞は、gRNA1に対して同族である(cognage)野生型内因性Casヌクレアーゼを含む。
12.細胞が、真核細胞(例えば、ヒト、非ヒト動物、酵母又は植物細胞)である、条項6の方法。
13.非ヒト胚、非ヒト接合体、非ヒト生殖細胞又はヒト若しくは動物(例えば、方法は、美容的方法である)において実施され、任意選択で、手術又は療法又は診断によるヒト又は動物身体の処置のための方法ではない、条項12の方法。
14.Cas遺伝子が、工程(a)において細胞に導入されている核酸により含まれる、条項6から13のいずれか1つの方法。
15.核酸ベクターによる形質転換又は宿主細胞における核酸ベクターの維持に対する、宿主細胞抵抗性の発生を低減するための、条項6から14のいずれか1つの方法。
16.ヒト若しくは動物の医学療法、予防若しくは診断のための(例えば、ヒト若しくは動物、方法がヒト若しくは動物細胞において実施される場合にはヒト又は動物細胞の遺伝子療法のための、又は方法が細菌細胞において実施される場合にはヒト若しくは動物における細菌感染を処置若しくは予防するための)、条項1から15のいずれか1つの方法又は核酸又はその細胞生成物。
17. in vitroで実施される、条項1から6のいずれか1つの方法。
18.in vivoで実施され、任意選択で、ヒト胚で実施されず、任意選択で、手術又は療法又は診断によるヒト又は動物身体の処置のためではない、条項1から16のいずれか1つの方法。
19.工程(a)においてCas遺伝子と組み合わされている第1の核酸からの転写によってgRNA1が産生される条項1から18のいずれか1つの方法。
20.細胞において実施され、工程(a)においてgRNA1をコードする第1の核酸が、細胞に導入され、又は工程(a)においてcrRNAをコードする第1の核酸が、細胞に導入され、crRNAが、細胞においてtracrRNAとともにgRNA1を形成する、条項19の方法。
21.Cas遺伝子が、第1のCasによって改変される、標的部位(CS-t)を含む標的核酸と組み合わされ、
I.Cas遺伝子が、第1のCasに対して同族である第1のプロトスペーサー(PS1)隣接PAM(P1)を含み、PS1が、第1のCasによって第1の部位(CS1)で改変され(例えば、切断され)、
II.gRNA1が、第1のCasをガイドするためにPS1と相補的である配列を含み、工程(b)においてPS1がCS1で改変され、
III.標的核酸が、プロトスペーサー配列(PS-t)隣接するPAM(P-t)を含み、P-tが第1のCasに対して同族であり、
IV.工程(b)の前又はその間に、ガイドRNA(gRNA-t)を、標的核酸及び前記遺伝子から発現された第1のCasを組合せることを含み、gRNA-tが、PS-tとハイブリダイズし、第1のCasをガイドして、CS-tを改変し、
V.任意選択で、改変された標的核酸を単離又はシーケンシングすることを含む、
条項19又は20の方法。
22.gRNA-tが、工程IVにおいてCasと組み合わされている核酸(例えば、前記第1の核酸)からの転写によって生成される、任意の条項21の方法。
23.細胞において実施され、核酸がcrRNAをコードし、crRNAが、細胞においてtracrRNAとともにgRNA-tを形成する、条項22の方法。
24.gRNA1の生成が、gRNA-tの生成後に開始され、それによって、PS1が改変される(例えば、切断される)前に標的核酸のコピーにおいてPS-tが改変され(例えば、切断される)て、第1のCas発現を下方制御又は不活性化する、条項21から23のいずれか1つの方法。
25.切断された標的核酸を、更なる核酸と組み合わせる工程を更に含み、それによって核酸間の相同組換えが起こり、
(i)標的核酸のヌクレオチド配列が、欠失され、
(ii)更なる核酸のヌクレオチド配列が、欠失され、
(iii)標的核酸のヌクレオチド配列が、更なる核酸に挿入され、及び/又は
(iv)更なる核酸のヌクレオチド配列が、標的核酸に挿入される、
条項1から24のいずれか1つの方法。
26.(i)が起こり、それによって、標的核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを不活性化する、条項25の方法。
27.(i)が起こり、それによって、標的核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを活性化する、条項25の方法。
28.(ii)が起こり、それによって、更なる核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを不活性化する、条項25、26又は27の方法。
29.(ii)が起こり、それによって、更なる核酸のヌクレオチド配列又は調節エレメントを活性化する、条項25、26又は27の方法。
30.(iii)が起こり、任意選択で、挿入される配列を更なる核酸の調節エレメントと機能的な関係に置き、及び/又は新規マーカー配列を作り出す、条項25から29のいずれか1つの方法。
31.(iv)が起こり、任意選択で、挿入される配列を標的核酸の調節エレメントと機能的な関係に置き、及び/又は新規マーカー配列を作り出す、条項25から30のいずれか1つの方法。
32.新規マーカー配列又はその発現産物を検出して、相同組換えが起こったことを調べる工程を更に含む、条項30又は31の方法。
33.標的核酸産物、更なる核酸産物及び/又は第1のベクター産物を単離又はシーケンシングする工程を更に含む、条項21から32のいずれか1つの方法。
34.第1のベクターが、条項35から55のいずれか1つにおいて規定されるようなものである、条項1から33のいずれか1つの方法。
35.例えば、項1の方法において使用するための、第1の(例えば、単離された)核酸ベクター又はベクターの組合せであって、
(a)第1のベクター又は前記組合せのベクターは、第1の部位(CS1)でPS1を改変するための第1のCasをガイドするために所定のプロトスペーサー配列(PS1)と相補的であるガイドRNA(gRNA1、例えば、単一gRNA)をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、PS1は、第1のCasに対して同族であるPAM(P1)に隣接するか、又は発現可能な配列は、tracrRNAとともにgRNA1を形成するcrRNAをコードし、
(b)PS1及びP1は、発現可能な第1のCasをコードする遺伝子の配列であり、PS1は、第1のCasによってCS1で改変されることが可能である
第1の核酸ベクター又はベクターの組合せ。
【０３００】
任意の構成における本明細書における各ベクターは、指定の配列を保持する直鎖状又は環状(例えば、閉環状、任意選択で、スーパーコイル状)DNAでありうる。
36.第1のCasが、ヌクレアーゼであり、CS1が、ヌクレアーゼによって切断されることが可能である、条項35のベクター又は組合せ。
37.第1のCasがCas9である、条項35又は36のベクター又は組合せ。
38.gRNA1が、単一ガイドRNAである、条項35から37のいずれか1つのベクター又は組合せ。
39.ヌクレオチド配列が、gRNA1を生成するために原核細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)において発現可能である、条項35から38のいずれか1つのベクター又は組合せ。
40.条項39のベクター又は組合せを含むリコンビニアリングキット(例えば、細胞は、リコンビニアリング許容大腸菌細胞である)。
41.ヌクレオチド配列が、gRNA1を生成するために真核細胞(例えば、ヒト、動物、植物又は酵母細胞)において発現可能である、条項35から38のいずれか1つのベクター又は組合せ。
42.第1のベクター又は前記組合せのベクター(例えば、第2のベクター)が、第1のCasをガイドしてPS-tを改変(例えば、切断する)ために、標的核酸の所定のプロトスペーサー配列(PS-t)と相補的であるガイドRNA(gRNA-t、例えば、単一gRNA)をコードする発現可能な ヌクレオチド配列を含む、又は発現可能な配列が、tracrRNAとともにgRNA-tを形成するcrRNAをコードし、標的核酸が、PS-t隣接PAM(P-t)を含み、P-tが、PS-tを改変するために第1のCasに対して同族である、条項35から41のいずれか1つのベクター又は組合せ。
43.更に、前記標的核酸と組み合わせた、条項42のベクター又は組合せ。
44.前記標的核酸が、細胞の染色体又はエピソーム核酸である、条項43のベクター又は組合せ。
45.細胞が、ヒト又は非ヒト動物病原体種又は株(例えば、Sオーレウス)の細胞ある、条項44のベクター又は組合せ。
46.細胞が、ヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸マイクロバイオーム種の細胞である、条項45又は45のベクター又は組合せ。
47.PS-tが、細胞(例えば、原核細胞)の必須遺伝子、病原性遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子配列により含まれる、条項44から46のいずれか1つのベクター又は組合せ。
48.第1のCasが、PS-tを改変する(例えば、切断する)場合に、遺伝子が下方制御される、又は不活性化される、条項47のベクター又は組合せ。
49.第1のCasが、PS-tを改変する場合に、遺伝子が上方制御される、又は活性化される、条項47のベクター又は組合せ。
50.第1のCas(例えば、第1のベクターにより含まれる)をコードする前記遺伝子と組み合わせた、条項35から49のいずれか1つのベクター又は組合せ。
51.細胞が、第1のCasをコードする前記遺伝子を含むCRISPR/Casシステムを含む、条項35から50のいずれか1つのベクター又は組合せ。
52.ヒト又は非ヒト動物において疾患又は状態を処置、予防又は診断するための、例えば、ヒト若しくは動物、方法がヒト若しくは動物細胞において実施される場合にはヒト又は動物細胞の遺伝子療法のための、又は方法が細菌細胞において実施される場合にはヒト若しくは動物における細菌感染を処置若しくは予防するための、条項35から51のいずれか1つのベクター又は組合せ。
53.条項35から52のいずれかに記載の第1のベクター又は組合せを含む、食料、食品成分又は前駆体成分、飲料、水(例えば、ヒト消費のために意図される)、産業用又は環境様物質(例えば、油、石油製品、土壌若しくは水路若しくは貯水池又は油、石油製品、土壌、水、食料、食料成分若しくは前駆体を回収若しくは処理するための設備又は前駆体の飲料若しくは飲料成分)。
54.条項35から52のいずれかに記載の第1のベクター又は組合せを含む抗生物質(例えば、抗細菌又は抗古細菌)組成物。
55.ヒト又は動物において疾患又は状態(例えば、細菌感染又は肥満症)を処置又は予防するための医薬であって、条項35から52のいずれかに記載の第1のベクター又は組合せを含む医薬。
一例では、ベクター、組合せ、医薬又は抗生物質が、医学デバイス又は医学容器(例えば、シリンジ、吸入器又はIVバッグ)により含まれる。
【０３０１】
一般特性のいずれも(以下を参照のこと)本構成にあてはまりうる。以下の任意の構成を、例えば、本明細書における1つ又は複数の態様に含めるために特性の組合せを提供するために本構成と組み合わせることができる。
【０３０２】
一般に適用可能な特性
以下の特性は、本発明の任意の構成(例えば、その態様、実施形態、概念、条項又は例のいずれかにおける)に適用する。
【０３０３】
一例では、標的配列は、染色体配列、内因性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列、外来配列ではない及び/又は非ファージ配列(すなわち、これらのもう1つ若しくは全て)であり、例えば、配列は、宿主細胞染色体により含まれる抗生物質抵抗性遺伝子又は必須遺伝子配列のような、野生型宿主染色体細胞配列である。一例では、配列は、宿主細胞プラスミド配列、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子配列である。
【０３０４】
一例では、少なくとも2つの標的配列は、Cas、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子及び必須遺伝子により改変される。この方法での複数の標的化は、エスケープ変異体宿主細胞の進化を低減するのに有用であり得る。
【０３０５】
一例では、Casは、野生型内因性宿主細胞Casヌクレアーゼであり、及び/又はそれぞれの宿主細胞は、野生型宿主細胞である。従って、実施形態において、本発明は、内因性Casを抑制解除する必要なく、宿主細胞を使用して、まず関連するCas活性をもたらす。一例では、各宿主細胞は、恒常的Casヌクレアーゼ活性、例えば、恒常的野生型Casヌクレアーゼ活性を有する。一例では、宿主細胞は、細菌細胞であり;他の例では、宿主細胞は、古細菌(archael)細胞である。内因性Casの使用は、空間が、HM-若しくはPM-cRNA又はgRNAをコードするベクターにおいて解放されることを可能にするので、有利である。例えば、II型Cas9ヌクレオチド配列は大きく、代わりの宿主細胞の内因性Casの使用は、II型CRISPR/Casシステムが、本発明において宿主細胞改変のため使用されるときの場合において、有利である。4.2キロベース(kb)において測定される、最も一般に利用されるCas9は、Sピオゲネス(pyogenes)に由来する。それは、効率的なヌクレアーゼである一方、分子の長さは、ベクターが収容することができる遺伝子物質の量の制限を後押しし、これにより、生きている動物の組織及び本明細書において記載される他の設定においてCRISPRを使用することに障壁を引き起こす(F.A. Ranら、「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature、doi:10.1038/nature14299、2015年を参照)。従って、実施形態において、本発明のベクターは、AAVベクターであるか、又はただのAAVベクターにすぎない外来DNA挿入能を有し、Casは、宿主細胞の内因性Casであり、細胞は、細菌又は古細菌の細胞である。
【０３０６】
SサーモフィルスCas9(UniProtKB-G3ECR1(CAS9_STRTR))ヌクレオチド配列は、1.4kbのサイズを有する。
【０３０７】
したがって、実施形態において、本発明は以下を提供する。
【０３０８】
1.4kbより大きい又は4.2kbより大きい、CRISPR/Casシステムの構成要素をコードする外来DNA配列を含む核酸ベクターであって、配列が、宿主細胞(本明細書における任意の細胞、例えば、ヒト、動物(anial)又は細菌又は古細菌宿主細胞)において1つ若しくは複数のHM-又はPM-crRNA或いはgRNAを発現するための遺伝子操作されたアレイ又は遺伝子操作された配列(任意選択で、本明細書において記載される)を含み、アレイ又は遺伝子操作された配列が、cRNA又はgRNAに同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まず;任意選択で、少なくとも2、3若しくは4つのcRNA又はgRNAが、外来DNAによりコードされる、核酸ベクター。実施形態において、宿主細胞は、crRNA又はgRNAに同族であるCasヌクレアーゼを発現する細菌又は古細菌細胞である。別の例では、ヒト又は動物(例えば、げっ歯類、ラット若しくはマウス)細胞との使用用と同様に、Casヌクレアーゼは、異なる核酸ベクターによりコードされる。一例では、細胞は、ヒト又は動物細胞であり、ベクターは、AAV又はレンチウイルスベクターである。一例では、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞を含み、宿主細胞は、前記Casを発現する。一例では、宿主細胞は、エクスビボでのヒト又は動物細胞である。
【０３０９】
本発明はまた、以下を提供する。
【０３１０】
1.4kbより大きい又は4.2kbより大きい外来DNA配列を含む核酸ベクターであって、外来DNAが、CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分をコードし、宿主細胞において1つ若しくは複数のHM-crRNA又はgRNAを発現するための、遺伝子操作されたアレイ又は配列(例えば、本明細書において記載されるもののようないずれか)を含み、外来配列が、cRNA又はgRNAに同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き;任意選択で、少なくとも2つの異なるcRNA又はgRNAが、外来DNAによりコードされる、核酸ベクター。一例では、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞を含み、宿主細胞は、前記Casを発現する。一例では、cRNA又はgRNAは、宿主細胞においてそれぞれの標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力があり、各プロトスペーサー配列が、抗生物質抵抗性又は必須宿主遺伝子により含まれる。これは、本明細書において行われた実施例により例示され、本発明者らは、混合及び非混合細胞集団において、少なくとも10倍の選択的な宿主細胞成長阻害を示す。混合物は、ヒト細菌叢においてみられる種及び株の組合せを模倣する。
【０３１１】
「CRISPR/Casシステムの構成要素をコードする外来DNA配列」により、ベクター骨格に挿入されているDNA又は前記挿入が既に生じている(例えば、組換えのような、組換えDNAテクノロジーを使用して)ベクターの子孫におけるこのようなDNAを意味する。一例では、外来DNAは、ベクターの挿入能力の95、90、80、85、70又は60%である。
【０３１２】
一例では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、外来DNA挿入の特に制限された能力を有し、これにより、ウイルスパッケージング能力は、考慮される必要がある。余白は、コートタンパク質及びポリメラーゼを発現するためのような、不可欠なウイルス機能をコードする配列に残される必要がある。一例では、ベクターは、ファージベクター又はAAV若しくはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞である場合、有用である。
【０３１３】
本発明は、組合せ製品キット(例えば、本明細書において記載されるヒト又は動物対象において疾患又は状態を処置又は予防するための)を提供し、キットは、アレイ、ベクター、システム、細胞、遺伝子操作されたcRNA若しくはgRNAをコードする配列又はcRNA若しくはgRNAを含み、抗生物質(第1の抗生物質)との組合せであり、cRNA又はgRNAは、細菌宿主細胞抗生物質抵抗性遺伝子により含まれるプロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力があり、抗生物質が、前記第1の抗生物質である。抗生物質は、本明細書において開示される任意の抗生物質であり得る。実施形態において、抗生物質は、アレイ、ベクター、システム、細胞、遺伝子操作されたcRNA若しくはgRNAをコードする配列又はcRNA若しくはgRNAを含む製剤において組み合わされる。一例では、キットは、アレイ、ベクター、システム、細胞、遺伝子操作されたcRNA若しくはgRNAをコードする配列又はcRNA若しくはgRNAを含む容器とは異なる容器において抗生物質を含む。
【０３１４】
実施形態において、別段特定されない限り、その又は各細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、原虫細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、コンパニオンアニマル細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、真核生物細胞、原核生物細胞、ヒト細胞、動物細胞、げっ歯類細胞、昆虫細胞又は植物細胞である。加えて、この場合では、好ましくは、細胞は、同じ門、目、ファミリー又は属のものである。
【０３１５】
用語「遺伝子操作された」の使用により、本発明のアレイ、配列、ベクター、MGE又は任意の他の構成、概念、態様、実施形態、段落又は実施例等が、天然で生じないことは、当業者にとって容易に明らかである。例えば、MGE、ベクター又はアレイは、MGE、ベクター又はアレイの他の配列又は構成要素と一緒に、天然で生じない1つ若しくは複数の配列又は構成要素を含む。例えば、アレイは、各宿主細胞の組換え、人工、合成又は各宿主細胞に外来(すなわち、非内因性又は野生型でない)である。
【０３１６】
一例では、本発明のアレイ又はベクターは、単離され、例えば、宿主細胞から単離される。一例では、アレイ又はベクターは、アレイのリピート配列と一緒に細胞において天然でみられるCasエンドヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせた状態にない。
【０３１７】
一例では、ベクター、MGE又はアレイは、宿主細胞にないとき、Casエンドヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせた状態にない。一例では、ベクター又はMGEは、Casエンドヌクレアーゼをコードする配列を含まない。
【０３１８】
一例では、標的改変又は切断は、dsDNA Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9、例えば、spCas9又はsaCas9)により行われ、これにより、切断の修復は、非相同末端結合(NHEJ)による。これは、典型的には、修復部位において変異(インデル)を導入し、それが、標的部位(例えば、必須遺伝子又はその調節エレメントのような、ファージ遺伝子又は調節エレメント)の不活性化に有用である。別の例において、切断は、1本鎖において切断する(しかし、2本鎖DNA切断を行わない)ssDNA Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼ)により、行われる。これは、インデルの機会を低減する、切断物のHDR修復を好ましくするのに有用である。これは、標的部位(又は遺伝子若しくはそれを含む調節エレメント)が所望される場合、例えば、HM-又はPM-DNAが、部位の所望される改変のため標的部位において挿入される場合、有用であり得る。例えば、この場合では、改変された遺伝子は、宿主DNA-コード配列に融合されたHM-DNA-コードアミノ酸、又はファージDNA-コード配列に融合されたPM-DNA-コードアミノ酸配列を含む融合タンパク質を産生する。本発明はまた、このような方法により得られるか、又は得られ得る融合タンパク質をコードする配列を提供する。別の例では、HM-又はPM-DNAは、融合産物が、宿主若しくはファージ遺伝子又は調節エレメントDNAに融合された前記DNAを含み、これにより、融合遺伝子を産生するように、調節エレメント(例えば、遺伝子発現を調節するためのプロモーター、エンハンサー、リプレッサー又は誘導可能なスイッチ)を含む。本発明はまた、このような方法により得られるか、又は得られ得る融合遺伝子を提供する。実施形態において、本発明は、このような融合遺伝子を含むベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ又はプラスミド)を提供し、任意選択で、ベクターは、細菌細胞(例えば、原核生物、真核生物、細菌、古細菌又は酵母細胞)において含有される。一例では、細胞は、インビトロのものである。
【０３１９】
一例では、HM-又はPM-DNAは、細胞内部のベクターDNAである。例えば、ベクターにおけるHM-又はPM-DNAは、宿主細胞又はベクター配列のいずれかによりコードされる部位特異的リコンビナーゼの作用により切断される部位特異的組換え部位(例えば、frt又はlox部位)に隣接することができる。別の例では、ベクターは、HM-又はPM-DNAのRNAコピーに転写されるDNA及びRNAからHM-又はPM-DNAを産生するための逆転写酵素(例えば、ベクター核酸配列によりコードされる)を含む。これは、標的部位の1つ又は複数における効率的及び有効な導入の機会を増大させるための所望のHM-又はPM-DNAの多数のコピーを産生するのに有用である。別の実施形態において、HM-又はPM-DNAは、宿主細胞を形質導入したか、又は形質転換した第2のベクター(例えば、第2のファージ又はプラスミド)の核酸であるか、又はそれによりコードされる。例えば、これは、ヘルパーファージ(第1のファージベクターのパッケージングのため要求される1つ又は複数のコートタンパク質をコードし得る)であることができる。別の例では、DNAは、ベクターDNAにおいて提供され、アームに隣接し、5'アームは、ベクターが宿主細胞において含有され、3'アームが、このようなPAMにより直後の下流(3')に隣接するとき、Casヌクレアーゼにより認識されるPAMを含み、これにより、Cas切断物が、宿主標的配列において、切断物に隣接する宿主配列に相同であるよう設計され得るその隣接アームを用いてHM-又はPM-DNAを自由にし、これにより、HM-DNAが、宿主ゲノムに統合されるか、又はPM-DNAが、ファージゲノムに統合される。1つの態様において、本発明は、HM-又はPM-DNA及びアームを含む核酸又はこのような核酸を含むベクター(例えば、ファージ又はパッケージされたファージ)を提供し、任意選択で、ベクターは、宿主細胞により含有される。任意選択で、HM-DNAは、本明細書において定義されるHM-アレイと組み合わせた状態にある。任意選択で、PM-DNAは、本明細書において定義されるPM-アレイと組み合わせた状態にある。
【０３２０】
本発明の特定の適用は、エクス又はインビボで混合細菌集団におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細菌の割合の変更である。上で考察した通り、これは、不所望のバクテロイデス門に汚染された河川又は飲料水の処理のような環境上の処理又は例えば、このような目的のためヒト又は動物への投与のための細菌培養物を産生するためのヒト又は動物における好ましい有用な共生又は相利共生バクテロイデス門に有用であり得る。後者の例では、本発明は、バクテロイデス門対ファーミキューテス門の相対比を増大させるのに有用であり、それが、体重の減少と関連し、これにより、医薬又は化粧用目的のための肥満の処置又は予防における有用性を見いだす。
【０３２１】
研究は、バクテロイデスが、クロストリジウム・ディフィシルの感染を予防するのに役割を果たすことを示唆する。可能性のある病原体の侵入及び増殖を制限する免疫応答の発生は、Bフラジリス(fragilis)に深く依存する。又は、パネート細胞タンパク質は、Bテタイオタオミクロン(thetaiotomicron)による刺激に応答して抗菌ペプチドを産生し得、これらの分子は、病原体が、腸でコロニー形成するのを妨げ得る。加えて、Bテタイオタオミクロンは、パネート細胞が、グラム陽性生物のペプチドグリカンへの結合によりその抗菌効果を発揮する殺菌レクチン、RegIIIを産生するよう誘導することができる。従って、腸内細菌の混合集団におけるバクテロイデス(例えば、ディスタソニス(thetaiotomicron)及び/又はフラジリス(fragilis))の割合を増大させるためのその構成のいずれかにおける本発明の使用は、集団又はヒト若しくは非ヒト動物の腸の病原細菌を制限するのに有用である。
【０３２２】
Hooperらは、Bテタイオタオミクロンが、フコースリプレッサー遺伝子及びシグナル伝達システムにより媒介される複雑な相互作用において腸のフコシル化を改変することができることを示した。転写解析を使用して、Bテタイオタオミクロン(thetaiotaomicron)が、栄養素吸収、粘膜のバリア強化、及び血管新生因子の産生を含む、様々な宿主遺伝子の発現を調節し得ることが、示された。
【０３２３】
実施形態において、混合集団は、第1及び第2の細菌からなる(すなわち、さらなる細菌集団がない)。
【０３２４】
一例では、その又は各アレイは、ベクター中の組換えアレイ及び/又はベクター中の単離されたアレイである。一例では、アレイは、宿主細胞(例えば、微生物、細菌又は古細菌の細胞)において含有される。一例では、前記Casは、宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。宿主のCasを利用することにより、これは、アレイにおける宿主タイプのリピートの効率的な使用及びそうでなければウイルス又はファージのような、ベクターにおいて制限される能力を自由にする、内因性crRNAも使用する可能性を可能にする(II型Cas9のようなCas遺伝子配列は巨大であることに注意する)。
【０３２５】
一例では、宿主CRISPR/Casシステムは、I型システムである。一例では、宿主CRISPR/Casシステムは、II型システムである。一例では、宿主CRISPR/Casシステムは、III型システムである。
【０３２６】
本発明のHM-crRNA又はgRNAによりガイドされるcasは、宿主内因性Cas又は標的配列においてPAMと適合可能なベクターによりコードされるCasである。
【０３２７】
任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、グラム陰性細菌(例えば、スピリルム属(spirilla)又はビブリオ属(vibrio))である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、グラム陽性細菌である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、マイコプラズマ属(mycoplasma)、クラミジア属(chlamydiae)、スピロヘータ属(spirochete)又はマイコバクテリウム属(mycobacterium)である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ストレプトコッカス属(Streptococcus)(例えば、ピオゲネス(pyogenes)又はサーモフィルス(thermophilus))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)(例えば、アウレウス(aureus)、例えば、MRSA)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、大腸菌(例えば、O157:H7)宿主であり、例えば、Casは、ベクター(vecor)によりコードされるか、又は内因性宿主Casヌクレアーゼ活性は、抑制解除される。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、シュードモナス(Pseudomonas)属(例えば、エルジノーサ(aeruginosa))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ビブリオ属(Vibro)(例えば、コレラエ(cholerae)(例えば、O139)又はバルニフィカス(vulnificus))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ナイセリア属(Neisseria)(例えば、ゴノレエ(gonnorrhoeae)又はメニンギティディス(meningitidis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ボルデテラ属(Bordetella)(例えば、パータシス(pertussis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ヘモフィルス属(Haemophilus)(例えば、インフルエンザエ(influenzae))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、シゲラ属(Shigella)(例えば、ディゼンテリエ(dysenteriae))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ブルセラ属(Brucella)(例えば、アボルタス(abortus))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、フランシセラ属(Francisella)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ザントモナス属(Xanthomonas)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、エルウィニア属(Erwinia)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、レジオネラ属(Legionella)(例えば、ニューモフィラ(pneumophila))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、リステリア属(Listeria)(例えば、モノサイトゲネス(monocytogenes))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、カンピロバクター属(Campylobacter)(例えば、ジェジュニ(jejuni))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、エルシニア属(Yersinia)(例えば、ペスチス(pestis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ボレリア属(Borelia)(例えば、ブルグドルフェリ(burgdorferi))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、ヘリコバクター属(Helicobacter)(例えば、ピロリ(pylori))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、クロストリジウム属(Clostridium)(例えば、ディ���ィシル(dificile)又はボツリヌム)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、エーリキア属(Erlichia)(例えば、シャフェンシス(chaffeensis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、サルモネラ属(Salmonella)(例えば、チフィ(typhi)又はエンテリカ(enterica)、例えば、血清型チフィリウム(typhimurium)、例えば、DT104)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、クラミジア属(Chlamydia)(例えば、ニューモニエ(pneumoniae))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、パラクラミジア属(Parachlamydia)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)(例えば、アミコラタム(amycolatum))宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、クレブシエラ属(Klebsiella)(例えば、ニューモニエ)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、エンテロコッカス属(Enterococcus)(例えば、フェカリス(faecalis)又はフェシウム(faecim)、例えば、リネゾリド抵抗性)宿主である。任意選択で、宿主(又は第1及び/若しくは第2の細菌)は、アシネトバクター属(Acinetobacter)(例えば、バウマンニ(baumannii)、例えば、複数の薬物抵抗性)宿主である。
【０３２８】
一例では、細胞は、原核細胞である。一例では、細胞は、細菌細胞である。一例では、細胞は、古細菌細胞である。一例では、細胞は、微生物細胞である。一例では、細胞は、微生物細胞である。一例では、細胞は、魚類細胞である。一例では、細胞は、鳥類細胞である。一例では、細胞は、爬虫類細胞である。一例では、細胞は、クモ類細胞である。一例では、細胞は、酵母細胞(例えば、サッカロマイセス属(Saccharomyces)細胞)である。一例では、宿主細胞は、植物細胞である。一例では、宿主細胞は、動物細胞(例えば、ヒト細胞ではなく、例えば、げっ歯類細胞ではない)である。一例では、宿主細胞は、ヒト細胞(例えば、胚における又はヒトにおける細胞ではない)、例えば、インビトロの宿主細胞である。一例では、細胞は、家畜又はコンパニオンアニマル細胞(例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ若しくはウサギ細胞)である。一例では、宿主細胞は、昆虫細胞(そのライフサイクルのいずれかのステージ、例えば、卵、幼虫又は蛹にある昆虫)である。一例では、宿主細胞は、原虫細胞である。一例では、細胞は、頭足類細胞である。
【０３２９】
任意選択で、アレイ、システム、遺伝子操作されたヌクレオチド配列又はベクター核酸は、宿主細胞が、真核生物の細胞、例えば、植物又は動物であるとき、例えば、核を標的にするための、(例えば、1、2つ又はそれ以上の)核局在化シグナル(NLS)を更に含む。一例では、NLSは、特に、真核生物の宿主細胞における標的化における使用のため、本発明のCasをコードする核酸配列及び/又は本発明のアレイの各末端に隣接する。
【０３３０】
tracrRNA配列は、例えば、tracrRNAを使用しない型のCasシステムのため、本発明のアレイ又はベクターから取り除かれてもよい。
【０３３１】
一例では、標的にガイドされるCasは、エキソヌクレアーゼである。任意選択で、本明細書において述べられるニッカーゼは、二重の(doube)ニッカーゼである。
【０３３２】
ニッカーゼの例は、Cas9ニッカーゼ、すなわち、不活性化された2つのヌクレアーゼドメインの1つ-RuvC及び/又はHNHドメインのいずれかを有するCas9である。
【０３３３】
任意選択で、宿主システムは、I型システムである(任意選択で、アレイ、HM-crRNA又はgRNAは、異なるCRISPRシステム、例えば、II又はIII型のものである)。任意選択で、例えば、Casが、宿主システムを用いて作動しないか、又は効率的に作動しない場合、アレイ又は遺伝子操作された配列は、ウイルス又はプラスミドにおいてアレイ、HM-crRNA又はgRNAと同じシステムのCasをコードするヌクレオチド配列と組み合わせた状態にある。任意選択で、宿主システムは、II型システムである(任意選択で、アレイ、HM-crRNA又はgRNAは、異なるCRISPRシステム、例えば、I又はIII型のものである)。任意選択で、例えば、Casが、宿主システムを用いて作動しないか、又は効率的に作動しない場合、アレイ又は遺伝子操作された配列は、ウイルス又はプラスミドにおいてアレイ、HM-crRNA又はgRNAと同じシステムのCasをコードするヌクレオチド配列と組み合わせた状態にある。任意選択で、宿主システムは、III型システムである(任意選択で、アレイ、HM-crRNA又はgRNAは、異なるCRISPRシステム、例えば、I又はII型のものである)。任意選択で、例えば、Casが、宿主システムを用いて作動しないか、又は効率的に作動しない場合、遺伝子操作された配列のアレイは、ウイルス又はプラスミドにおいてアレイと同じシステムのCasをコードするヌクレオチド配列と組み合わせた状態にある。
【０３３４】
ベクターDNAを使用するという本明細書における記述はまた、文脈から可能な場合、代替の実施形態において、ベクターRNAを準用する。例えば、ベクターが、RNAベクターである場合である。したがって、本発明の全ての特性は、文脈から可能なとき、本明細書におけるベクターDNAに言及するとき、代替の開示においてであり、「DNA」の代わりに「RNA」として読まれるべきである。一例では、その又は各ベクターはまた、逆転写酵素をコードする。
【０３３５】
一例では、その又は各アレイ又は遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、ナノ粒子ベクターにより、又はリポソームにおいて提供される。
【０３３６】
一例では、Casは、切断のためのCasヌクレアーゼ、中断するためのデッドCas(dCas)又は標的を活性化するための転写活性化因子に結合されたdCasである。
【０３３７】
一例では、宿主CRISPR/Casシステムは、宿主におけるヌクレオチド配列標的化のための宿主CRISPRアレイ及び同族宿主Casを含む。一例では、宿主標的配列は、少なくとも5、6、7、8、9、10、20、30又は40個の近接するヌクレオチドを含む。一例では、標的配列は、Cas、例えば、Cas9により切断される。実施形態において、配列は、スペーサー内にない。
【０３３８】
一例では、その又は各アレイ又は遺伝子操作された配列は、宿主におけるcrRNA又はgRNAの転写に機能的な外来プロモーターを含む。
【０３３９】
一例では、その又は各アレイリピートは、宿主アレイにおけるリピートと同一であり、CRISPRアレイは、宿主CRISPR/CasシステムのCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9)により認識されるPAMを含まない。これは、HM-crRNA及びgRNAのリピート配列に準用する。この実施形態は、CRISPRアレイが、内因性宿主Casを使用して宿主標的配列を標的化することを簡単に可能にするので、有利である。次に、これは、アレイが、宿主機構による使用に合わせられ、これにより、宿主細胞において機能することを目的とするので、効率的である。加えて、又は或いは(例えば、アレイが、外来(非宿主内因性)Casをコードする配列との組合せで提供される場合)、この実施形態は、CRISPRアレイリピートが、pre-crRNAの産生のため内因性tracrRNAにハイブリダイズし、宿主標的配列とハイブリダイズする成熟crRNAにプロセシングするので、CRISPRアレイが内因性でコードされるtracrRNAを使用することを可能にする。次に、後者の複合体は、内因性Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をガイドするか、又はCRISPRアレイにより含まれる配列から産生されるCasをガイドすることができる。したがって、この実施形態は、CRISPRアレイを含有するが、tracrRNA-及び/又はCasヌクレアーゼをコードする配列を含まないベクター(例えば、パッケージされたウイルス又はファージ)を簡単に構築するという可動性をもたらす。これは、ベクター構築のためより直接的であり、またそれは、ベクター、特に、ウイルスベクター(例えば、ファージ)についての能力の制限を考慮して生じるのに有用であるベクター(例えば、ウイルス又はファージ)における価値のある空間を自由にする。追加の空間は、例えば、アレイにおける多くのさらなる空間の包含を可能にするため、例えば、宿主遺伝子を不活性化するか又は宿主における発現のため所望の非宿主配列においてもたらすためのような、改変のため宿主ゲノムを標的にするために有用であり得る。加えて又は或いは、空間を使用して、ベクターにおいて複数のCRISPRアレイを含むことができる。これらは、例えば、第1のアレイが、第1のCRISPR/Cas型(例えば、II型又はII型-A)のものであり、第2のアレイが、第2の型(例えば、I若しくはIII型又はII-B型)のものであり得る配置であり得る。加えて又は或いは、アレイは、宿主において異なるCasヌクレアーゼを使用することができる(例えば、1つのアレイは、宿主Casヌクレアーゼとともに作動可能であり、第2のアレイは、外来Casヌクレアーゼ(すなわち、ベクターによりコードされるヌクレアーゼ)とともに作動可能である)。これらの態様は、ベクターが導入されると、宿主における標的化のための機構をもたらし、次に、宿主が、より広い範囲の構成要素を標的にする必要があるので、ベクターに対する宿主抵抗性を低減するために有益である。例えば、宿主が、第1のCRISPRアレイ配列に基づき新規スペーサーを取得することができたなら、第2のCRISPRアレイは、依然として、宿主細胞におけるそれぞれの標的配列を標的にするため宿主において機能し得る。従って、この実施形態は、ベクターへの宿主順応を低減するのに有用である。
【０３４０】
別の利点は、(例えば、この配置を用いて)CRISPRアレイにおいて複数のコピーの同じスペーサー(例えば、宿主細胞における標的部位を標的にするために使用されるスペーサー)を含む(又はベクターにおける複数のこのようなアレイに分布する)ことを可能にすることである。細菌及び古細菌のような、宿主の順応は、スペーサーが有益な宿主DNAを標的にするそれらのアレイからのスペーサーの喪失を含み得るので、これは有益である(PLoS Genet、2013年;9(9):e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844. Epub 2013年9月26日、「Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: bacteria and beneficial plasmids」、Jiang Wら)。スペーサーリピート単位の除去が、リピート配列の組換えを通じて生じることが、考えられる。従って、本発明の本態様によると、宿主標的配列にハイブリダイズするためのスペーサーの複数(例えば、2、3、4、5、10,15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100以上)のコピーを含む本発明の1、2、3、4、5、6つ以上のCRISPRアレイ又は遺伝子操作された配列が提供される。これは、宿主細胞における組換えにより喪失されるこれらのスペーサーの全ての機会を低減する。この態様のさらなる適用において、CRISPRアレイは、1つ又は複数(例えば、2、3、4、5、10,15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90以上)のスペーサーコピーを含む第1のアレイ及び1つ又は複数(例えば、2、3、4、5、10,15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90以上)の同一スペーサーコピーを含む第2のアレイを含み、第1のアレイにおけるスペーサーコピーは、第1のリピートに隣接する各々であり、第2のアレイにおける同一スペーサーコピーは、第2のリピートに隣接する各々であり、第1のリピートは、第2のリピートと異なる。これは、第1及び第2のリピートの少なくとも一方を、宿主Casヌクレアーゼ(又は同じ宿主Casヌクレアーゼ)により認識されないよう選択して、アレイの1つより多くに関与する宿主順応の機会を低減し得るという利点を有する。一例では、第1のアレイは、宿主細胞によりコードされず、第1のリピートについての同族CasであるCasヌクレアーゼ配列と組み合わせた状態にある。任意選択で、また、第2のアレイは、宿主細胞によりコードされず、第2のリピートについての同族CasであるCasヌクレアーゼ配列(例えば、第1のアレイについてのものと同じ又は異なる)と組み合わせた状態にある。
【０３４１】
実施形態は、第1のベクターにおいて含有される第1のアレイ及び第1のアレイを含有しない第2のベクターにおいて含有される第2のアレイを提供する(例えば、ベクターが、プラスミド又はビリオン(例えば、同じウイルスタイプのもの)又はパッケージされたファージ(例えば、同じファージタイプのもの)である)。ベクターは、同じ宿主細胞に同時又は連続して導入され得るので、これは有用である。従って、宿主が、第1のアレイに対する抵抗性を獲得するとき、第2のアレイを導入して、抵抗性宿主(例えば、細菌又は古細菌)が既に同時発生していない第2のアレイを提供し、これにより、宿主細胞に対する第2の改変(例えば、ノックダウン)の波をもたらす。第1及び第2のアレイ及びスペーサーと異なるスペーサー又はアレイを含む、第3のこのようなベクターを、第2のベクターと同時又は連続して宿主細胞に導入して、第1のアレイにおけるスペースに対して抵抗性である宿主の進化中には予め存在していない宿主細胞改変へのさらなる経路をもたらし得るので、これはまた、可動性をもたらす。アレイの代わりに、本発明の遺伝子操作されたヌクレオチド配列を使用することができる。
【０３４２】
従って、1つの実施形態において、本発明は、宿主細胞を改変するための組成物を提供し、組成物は、本明細書において記載される任意のアレイ又は遺伝子操作された配列を提供する。従って、1つの実施形態において、本発明は、宿主細胞を改変するための組成物を提供し、組成物は、第1のベクター(例えば、ビリオン又はパッケージされたファージ)において本明細書において記載される第1のアレイ及び第2のベクター(例えば、それぞれ、ビリオン又はパッケージされたファージ)における本明細書において記載される第2のアレイを提供し、第2のアレイは、1つ又は複数の宿主標的配列を標的にし、第1のアレイにより含まれない1つ又は複数のスペーサーを含む。アレイの代わりに、本発明の遺伝子操作されたヌクレオチド配列を使用することができる。
【０３４３】
実施形態において、アレイ又は遺伝子操作された配列は、ヴィロファージベクターにおいて含有され、宿主は、細胞に感染し得る代替のウイルスである。例えば、宿主は、アメーバ細胞に感染した巨大なウイルスである。例えば、宿主は、スプートニクウイルス、ピソウイルス、ミミウイルス、ママウイルス、メガウイルス又はパンドラウイルスであり、例えば、宿主ウイルスは、水中にいる。この実施形態の例において、本発明は、水又は汚水処理(例えば、精製、例えば、水路、河川、湖、池又は海の処理)のためである。
【０３４４】
実施形態において、その若しくは各ベクター又は遺伝子操作された配列は、ΦΝΜ1ファージであるか、又はそれにより含まれ、例えば、宿主細胞は、S.アウレウス(例えば、MRSA)細胞である。
【０３４５】
一般的な特性はまた、以下の条項を提供する。
1.本発明の任意の態様によるアレイ、遺伝子操作された配列、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物を含む、抗菌組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、消毒薬又は口腔洗浄薬)。
2.医療又は歯科又は眼科使用のため(例えば、生物における感染を処置若しくは予防又は生物における感染の広がりを制限するため)の、条項1の組成物。
【０３４６】
一例では、生物は、植物又は動物、例えば、脊椎動物(例えば、本明細書において開示される任意の哺乳類若しくはヒト)又は作物又は食用植物である。
3.化粧用の使用(例えば、化粧製品、例えば、メーキャップにおける使用)のため、又は衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージを含む組成物、組成物、集団、集合物、使用又は方法。
4.歯科治療又は予防的使用のための医薬における、条項1〜35のいずれか1つに記載のアレイ、遺伝子操作された配列、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物を含む組成物の使用。
5.化粧用の使用(例えば、化粧製品、例えば、メーキャップにおける使用)における、又は衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、集合物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージを含む組成物、組成物、集団、集合物、使用又は方法の使用。
6.宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変する能力がある(HM)CRISPR/Cas9システム(例えば、I、II又はIII型)を改変している宿主における本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、組成物、集団又は集合物の使用であって、アレイ、遺伝子操作された配列、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物は本発明による、使用。
7.アレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物が、宿主細胞内にない、条項4、5又は6の使用。
8.アレイ、遺伝子操作された配列、集合物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団又は集合物が、宿主細胞(例えば、微生物、細菌又は古細菌細胞)内である、条項5又は6の使用。
9.微生物細胞を改変するため(例えば、細胞の成長若しくは微生物細胞の培養を死滅させる又は低減させるため)の、条項4〜6のいずれか1つの使用。
10.宿主細胞(例えば、微生物細菌又は古細菌)における標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、システム、集合物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団又は集合物を用いて宿主細胞を形質転換し、これにより、標的ヌクレオチド配列が、改変されたCasである工程を含み、宿主標的配列が、細胞の宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列である、方法。
11.核酸ベクターによる形質転換に対する宿主細胞抵抗性又は宿主細胞における核酸ベクターの維持の発生を低減する方法であって、宿主細胞が、標的ヌクレオチド配列を含み、本発明によるアレイ、遺伝子操作された配列、集合物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団又は集合物を用いて宿主細胞を形質転換し、これにより、標的ヌクレオチド配列が、改変された(例えば、切断された、変異誘発された又はノックダウンされた)Casである、工程を含む、方法。
12.ベクターが、宿主細胞に感染する能力があるウイルスであり、形質転換工程が、ベクターを用いて宿主細胞を感染させる工程を含む、条項11の方法。
13.宿主細胞が、細菌又は古細菌細胞であり、ベクターが、ファージ又はファージミドである、条項11又は12の方法。
14.宿主標的配列が、ベクター配列スペーサーの宿主CRISPR/Casにより介在される取得に必須である、条項11〜13のいずれか1つの方法。
15.少なくとも成分(ii)が、宿主細胞溶解のためのエンドリシンを発現する能力があるウイルス(例えば、ファージ)において含有され、任意選択で、エンドリシンが、ファージphi11、ファージTwort、ファージP68、ファージphiWMY又はファージKエンドリシン(例えば、MV-Lエンドリシン又はP-27/HPエンドリシン)である、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、細胞、集合物、組成物、使用又は方法。
16.宿主細胞溶解のためのエンドリシンとの組合せにおける、例えば、MV-Lエンドリシン若しくはP-27/HPエンドリシン又はその機能的相同体との組合せにおける、条項15のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
17.抗微生物、例えば、抗生物質剤、例えば、ベータ-ラクタム抗生物質との組合せにおける、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
18.宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)又はクロストリジウム属の宿主細胞である、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
19.宿主細胞が、スタフィロコッカス属(例えば、Sアウレウス)の宿主細胞であり、少なくとも成分(ii)が、I、II又はIII型スタフィロコッカス属のファージ(例えば、パッケージされたファージ)、任意選択で、カウドウイルス又はミオウイルス科ファージにおいて含有される、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、集合物、細胞、組成物、使用又は方法。
20.宿主細胞が、ベータ-ラクタム抗生物質抵抗性ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)、メチシリン抵抗性ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)(MRSA)、バンコマイシン抵抗性ストレプトコッカス・アウレウス(Streptococcus aureus)又はテイコプラニン抵抗性ストレプトコッカス・アウレウスであり、任意選択で、標的配列が、それぞれ、宿主ベータ-ラクタム抗生物質抵抗性遺伝子、メチシリン抵抗性遺伝子、バンコマイシン抵抗性遺伝子又はテイコプラニン抵抗性遺伝子の配列である、いずれかの先行する条項のアレイ、遺伝子操作された配列、システム、ベクター、細胞、集合物、組成物、使用又は方法。
【０３４７】
本発明のファージベクターを産生し、試験する適当な方法は、例えば、国際公開第2014/124226号において開示される一般的な方法である。
【０３４８】
可動性遺伝子エレメント、トランスポゾン及び担体(本発明の任意の構成について)
プラスミドは、バクテロイデス種において高度に共通し、株の20〜50%においてみられる。多くのプラスミドは、oriT及びトランス活性化可動遺伝子を有し、それらが結合により移行されることを可能にする。従って、一例では、ベクターは、oriT及び/又は可動遺伝子を含むプラスミドであり、例えば、第1又は第2の細菌は、バクテロイデスである。一例では、遺伝子操作された配列は、このようなベクターにより含まれる。
【０３４９】
一例では、宿主細胞、又は第1若しくは第2の細菌は、トランスポゾンを天然で含む。可動性と接合トランスポゾンの両方は、独立して複製せず、むしろ、それらは、切除され、染色体DNAに統合され、染色体DNAに沿ってコピーされる。接合トランスポゾンは、プラスミドとバクテリオファージの両方の幾つかの特性に似ている切除及び統合の機序を有する。結合性トランスポゾンは、バクテロイデスの中でも実際に遍在性であり、バクテロイデス株の80%より多くが、少なくとも1つの接合トランスポゾンを含有する。少なくとも2つのファミリーに属するバクテロイデスの接合トランスポゾン;CTnDotが、記載された最善のものである。しばしば、それらがみられる株の名称が、命名に加えられる(例えば、BテタイオタオミクロンのDOT株においてみられない、CTnDot)。染色体に挿入することができることに加えて、バクテロイデス接合トランスポゾンは、共生プラスミドに挿入することができ、それらをプラスミドに統合し、別の細胞へのプラスミドと接合トランスポゾンのハイブリッドの移行を促進することにより、それらをシスで移動することができる(すなわち、それは、物理的に隣接する実体上で作用し得る)。それらはまた、プラスミドから物理的に離れたまま、プラスミドの移行を促進するのに必要とされる因子を供給することにより、共生プラスミドを「トランスで」移動することができる。
【０３５０】
接合トランスポゾンは、プラスミドにするように、互いを除外せず、故に、株は、1つより多くの接合トランスポゾンを蓄積することができる。更に、株における接合トランスポゾンの1つより多くのコピーが、転位(トランス活性化)の刺激を生じるという幾つかの証拠がある。理論的に、これは、さらなる接合トランスポゾンが、環境において蓄積するので、他の細菌へのトランスポゾン遺伝子の移行はまた増大し、遺伝子の分配の有意な上昇が存在することを示唆する。バクテロイデストランスポゾンの多くは、tetQ遺伝子を有し、これにより、テトラサイクリン抵抗性を付与する。更に、自己移行及び他の活動は、tetQ-rteA-rteBオペロンにより制御される、低レベルのテトラサイクリンにより有意に刺激される。テトラサイクリンは、2成分制御システムのセンサー及び活性化因子成分をコードする、rteA及び-Bの転写を増大する。順に、RteBは、自己移行に必要である、rteCの発現を活性化する。
【０３５１】
一例では、ベクター(例えば、遺伝子操作された配列を含むベクター)は、トランスポゾンを含み、トランスポゾンは、本発明の遺伝子操作された配列、HM-又はPM-アレイを含み、トランスポゾンは、宿主細胞において又は第1若しくは第2の細菌宿主細胞種作動可能である。実施形態において、トランスポゾンは、バクテロイデス属(Bactroides)トランスポゾン(例えば、CTnDotトランスポゾン、例えば、Bテタイオタオミクロン又はBフラジリス(fragalis)CTnDotトランスポゾン)及び宿主細胞であるか、又は第1又は第2の細菌は、バクテロイデス(例えば、前記CTnDotトランスポゾンと同じ種のもの)であるか、又は含む。一例では、トランスポゾンは、接合トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、可動性トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、バクテロイデス細胞の間を移行可能である。一例では、トランスポゾンは、intDOT配列を含む。一例では、トランスポゾンは、oriTを含む。一例では、トランスポゾンは、宿主細胞の間でのトランスポゾンの結合性移行のための1つ又は複数の接合ポアタンパク質をコードする。
【０３５２】
一例では、本発明は、バクテロイデスtetQ遺伝子を含むトランスポゾンを提供する。一例では、トランスポゾンは、バクテロイデスtetQ-rteA-rteBオペロンを更に含む。一例では、第1又は第2の細菌は、バクテロイデスである。一例では、トランスポゾンは、宿主細胞間でのトランスポゾンの結合性移行のための1つ又は複数の接合ポアタンパク質をコードし、1つ若しくは複数の本発明のアレイ又は遺伝子操作された配列、oriT、intDOT配列及びtetQ-rteA-rteBオペロンを含む、バクテロイデスCTnDotトランスポゾンであり、任意選択で、投与のためであるか、又はテトラサイクリンとの組合せにおいて本明細書において述べられる前記ヒト又は非ヒト動物に投与される。大部分のバクテロイデスCTnsの移行は、テトラサイクリンにより刺激される。トランスポゾンは、宿主細胞におけるインテグラーゼとともに作動可能であるか、又はトランスポゾンと同じ又は異なるベクター上にある外来インテグラーゼとともに作動可能である。実施形態において、ベクターは、トランスポゾン及び同族インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むファージ(例えば、パッケージされたファージ)である。ファージは、トランスポゾンの複製及び切除のため、例えば、混合細菌集団(例えば、腸内細菌叢集団)における隣接している宿主細胞への接合移行のため、宿主細菌細胞に感染する能力がある。
【０３５３】
実施形態において、トランスポゾンは、宿主細胞間でのトランスポゾン移行に必要な1つ又は複数の遺伝子配列を有するベクターにより含まれ、前記遺伝子配列は、ベクター核酸上のトランスポゾンの外側にある。例えば、ベクターは、宿主細胞(例えば、バクテロイデス宿主細胞)に感染する能力があるパッケージングされたファージであり、ファージ核酸は、本発明のアレイを含む前記トランスポゾン及びトランスポゾンの上流又は下流に、トランスポゾンの接合性移行のため作動可能な1つ又は複数の遺伝子(例えば、リラクセーズをコードし、タンパク質をカップリングし、及び/又はトランスポゾン接合移行のため架橋タンパク質を接合させる1つ又は複数の遺伝子;及び/又はmobとtraオペロンの一方又は両方)を含み、1つ、複数又は全てのこれらの遺伝子が、トランスポゾンにより含まれない。一例では、これらの遺伝子は、第1の宿主細胞内部での染色体DNAからのトランスポゾンの切除のための遺伝子である。従って、トランスポゾンは、その細胞内部を移動することができ、それと共に、第2の宿主細胞へのその後の接合性移行に必要な遺伝子を有する。トランスポゾンの外側のベクター上にこの方法でトランスポゾン遺伝子の幾つかをもたらすことにより、これは、移動したトランスポゾンにより収容され、保有され得るように、本発明の遺伝子操作された配列又はアレイDNAの包含のためトランスポゾンにおける余地を開放する。本発明は、本発明の方法、使用又はシステムにおける使用のため、又は一般に、細菌細胞への導入のため(この場合では、ファージ配列の標的化の代わりに、トランスポゾンにおいて含まれるアレイが、細菌標的配列を標的にして、トランスポゾンを有する細胞におけるCasを使用して、配列を改変する、例えば、それを切断することができる)の1つ又は複数のこのようなトランスポゾンを含むこのようなベクターを提供する。
【０３５４】
CTnDot切除及び統合の分子機序は、転位よりむしろバクテリオファージのものにより密接に似ている。CTnDOTインテグラーゼ及び切除タンパク質自体は、バクテリオファージ由来のものと非常に類似する。従って、1つの実施形態において、本発明のトランスポゾンの1つ若しくは複数のインテグラーゼ及び/又は切除タンパク質の機能は、それぞれ、ファージインテグラーゼ及び/又は切除タンパク質によりもたらされ、トランスポゾンは、機能が、ファージタンパク質によりもたらされるこのようなインテグラーゼ又は切除タンパク質をコードする対応する遺伝子を含まない。
【０３５５】
一例では、トランスポゾンは、rteC及びオペロンxis2c-xis2d-orf3-excを含む。任意選択で、加えて、ベクターは、トランスポゾンの外側に(例えば、ベクター核酸におけるトランスポゾンの上流又は下流に)mob及びtraオペロンを含む。従って、これは、本発明のCRISPRアレイ配列又は遺伝子操作された配列をもたらすためのトランスポゾンにおける空間を解放する。
【０３５６】
多くの接合トランスポゾンは、他のエレメントを移動することができ。例えば、多くの共生プラスミドは、トランスの接合トランスポゾンにより動員される。これは、oriTを含有するプラスミドが、レシピエント細胞への移行のためCTnによりもたらされる接合ポアタンパク質を利用するとき、生じる。バクテロイデスCTnsはまた、シスでの、CTnsに典型的でない特性のとき、エレメントを動員することが示されている。例えば、CTnDOTが、染色体から切除され、プラスミド上に統合されるなら、それは、接合ポア、oriT、及び動員(リラクセーズ/カップリング)タンパク質をもたらし、これにより、それが、「シスで」作用することにより、プラスミド全体を移行することを可能にし得る。トランスとシスの両方の機序の動員を使用するこの能力は、普通でなく、バクテロイデスCTnsが、他のエレメントを動員するより高い能力を有することを示唆する。
【０３５７】
一例では、本発明のベクターは、本発明の1つ若しくは複数の遺伝子操作された配列又はアレイ及び接合ポアタンパク質をコードする宿主細胞種CTnDotトランスポゾンに同族であるoriTを含むプラスミドであり、これにより、プラスミドは、前記CTnDotトランスポゾンを含む宿主細胞において可動性である。従って、プラスミドは、宿主細胞間で水平方向で移行する能力があり、これにより、このような宿主細胞(例えば、バクテロイデス細胞)の集団における本発明のアレイを伝播する。一例では、本発明は、担体細菌の集団を含む組成物を提供し、担体細菌は、本発明のこのようなプラスミドベクターと適合可能であり、これにより、ベクターは、担体及びレシピエント細菌が混合されるとき、同族CTnDotトランスポゾンを含むレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデス又はファーミキューテス門、例えば、ストレプトコッカス属細胞)に水平方向で移行する能力がある。一例では、担体細菌は、ヒト又は非ヒト動物の食物摂取のための飲料(例えば、本明細書において記載されるもののような、プロバイオティクスドリンク)又は食料により含まれ、これにより、担体細菌は、ヒト又は動物により(例えば、口腔において又は腸において)により保有されるレシピエント細菌と混合することができる。CTnDOT様ファミリー内の他のトランスポゾンは、CTnERL及びCTn341を含むが、これらのエレメントは、CTnDOTと異なり、これにより、CTnDotトランスポゾンの代わりに、本発明の一般的な態様のトランスポゾンは、トランスポゾンが、細菌又は古細菌の宿主細胞により含まれるとき、1つ若しくは複数の細菌又はファージヌクレオチド標的部位を標的化するための1つ若しくは複数の所望のCRISPRアレイ又は遺伝子操作された配列を有する、CTnERL又はCTn341トランスポゾンであり得る。
【０３５８】
接合トランスポゾンの移行が生じるために、生じる3つの主な工程が存在する。第1の工程は、密接に結合した環状中間体を形成するための染色体からの切除である。二番目に、次に、1本鎖コピーは、接合ポアを通じてレシピエント細胞に移行され、その後、コピーは2本鎖になる。三番目に、未変性の2本鎖CTnは、レシピエントの染色体に統合する。CTnのコピーは、ドナー細胞において保持されるので、結合性転位は、複製である。エレメントは、染色体内に存在するため、それはまた、子孫細胞に垂直に移行される。所望のCRISPRアレイ又は遺伝子操作された配列(及び任意選択で、Cas配列)が、CTns上に存在するとき、それらは、集団内で容易に移行されるばかりでなく、それらはまた、世代から世代で非常に安定して維持されるため、これは重要である。これは、例えば、保持された抗菌抵抗性決定因子を用いてみられる通りである。更に、バクテロイデスが、これらの遺伝子をバクテロイデス属以外の他の生物に播種する、可能性としては、腸を通じて一過性に通過する生物に、これらのエレメントを移送しさえする、抗生物質抵抗性決定因子のリザーバーとして作用し得ると考えられる。同様に、本発明のアレイ又は遺伝子操作された配列のリザーバーは、例えば、肥満、糖尿病若しくはIBD又は本明細書において開示される任意の他の疾患若しくは状態を処置又は予防するため、ヒト又は非ヒト動物に投与さえる本発明のベクターを使用して生成され得る。
【０３５９】
一例では、バクテロイデス細胞(例えば、ヒト又は非ヒト動物の腸又は口腔における)により保有される能力があるトランスポゾン(例えば、CTnDot)により含まれる1つ若しくは複数のアレイ又は配列を使用することにより、所望のCRISPRアレイ又は遺伝子操作された配列を活用することができ、アレイ/配列は、宿主バクテロイデス細胞の配列を標的にしないが、異なる種(例えば、ファーミキューテス門細胞又は病原性細菌細胞、例えば、ストレプトコッカス属、Cディフィシル、Hピロリ、サルモネラ、リステリア属、エルシニア属、シゲラ属(Shigella)又はカンピロバクター属細胞)の腸細菌叢細胞(例えば、細菌細胞)により含まれるヌクレオチド配列を標的にする。従って、この方法で、本発明のアレイ又は配列の隣接しているレシピエント病原体又は不所望の細菌への移行が生じ得、レシピエント細胞内部で、本発明のアレイが、宿主細胞におけるそれぞれの標的部位にCasをガイドして、部位を改変する(例えば、切断する)よう作動可能である。この場合では、アレイ/配列は、レシピエント細胞の内部で内因性CRISPR/Casシステムを用いてアレイ/配列が作動し得るように、対象となるレシピエント細胞においてみられるリピート配列を含むことができる。これは、本発明のベクター、遺伝子操作された配列又はトランスポゾンにおいてCas及び/又はtracrRNAをコードする配列を含む必要を回避し、これにより、空間を開放し、構築を単純化する。増大した空間は、レシピエント細胞におけるさらなる標的部位を標的化するためのさらなるスペーサーの包含を可能にするのに有用である。代替において、トランスポゾンアレイ又は配列は、II型Cas9をコードする配列及び同族リピート配列を含む。例えば、Cas9(本明細書において述べられる任意のCas9)は、Sピオゲネス、Sサーモフィルス又はSアウレウスCas9であり、任意選択で、ニッカーゼ又はdCas9(「デッドCas9」)であってもよい。バクテロイデスは、偏性嫌気性菌であり(又は嫌気性環境について強力な優先度を有し)、典型的には、腸環境の外側で病原性であるので、それは、例えば、ヒト又は動物の腸又は口腔に投与されるとき、本発明のベクター又はトランスポゾンについての担体としてバクテロイデス細胞を使用することは望ましくはないか
もしれない。これに対処するために、本発明は、本発明のベクター、遺伝子操作された配列又はトランスポゾンを有する細菌の担体集団を提供し、担体細菌は、このようなベクター、配列又はトランスポゾンと適合可能であり、これにより、ベクター、配列又はトランスポゾンは、担体及びレシピエント細菌が混合されるとき、腸細菌叢におけるレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデス)への水平方向の移行を可能にする。一例では、担体細菌は、ヒト又は非ヒト動物の食物摂取のための飲料(例えば、本明細書において記載されるもののような、プロバイオティクスドリンク)又は食料により含まれ、これにより、担体細菌は、ヒト又は動物により(例えば、口腔において又は腸において)により保有されるレシピエント細菌と混合することができる。実施形態において、ベクター、配列又はトランスポゾンは、本発明のCRISPRアレイを含み、アレイは、例えば、配列を切断して、標的配列を含む遺伝子を不活性化することにより、レシピエント細胞により含まれるヌクレオチド配列を標的にして、標的配列を改変する。代替において、ベクター、配列又はトランスポゾンは、第1のレシピエント細菌と異なる種である、細菌の第2のレシピエント集団への水平方向の移行(例えば、接合トランスポゾン移行)を可能にし、ヌクレオチド配列標的部位は、第2のレシピエント細菌により含まれるが、第1のレシピエント細菌により含まれず、これにより、標的部位は、第2のレシピエント細菌(宿主細胞)におけるCasにより改変される。
【０３６０】
一例では、第1のレシピエント細菌は、バクテロイデス細菌であり、第2のレシピエント細菌は、ファーミキューテス門又は病原性細菌、例えば、腸内細菌である。一例では、担体細菌は、担体細菌、第1の細菌及び第2の細菌により固定される能力がある1つ又は複数の接合トランスポゾン(例えば、CTnDotトランスポゾン)を含む本発明のベクター(例えば、ファージ又はプラスミド)を含み、例えば、トランスポゾンは、oriTを含み、担体細菌、第1の細菌及び第2の細菌は、oriTと適合可能である。
【０３６１】
代替において、担体細菌は、本発明のベクター、遺伝子操作された配列又はトランスポゾンを、例えば、動物又は非ヒト動物において、例えば、腸、口腔におけるファーミキューテス門又は病原性細菌に又は全身性(例えば、血中)に移行する能力がある。一例では、病原性細菌は、Cディフィシル、Hピロリ、病原性大腸菌、サルモネラ属、リステリア属、エルシニア属、シゲラ属(Shigella)、Sアウレウス、ストレプトコッカス属又はカンピロバクター属の細菌である。
【０３６２】
一例では、担体細菌は、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種(例えば、アシドフィルス(acidophilus)(例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビス(brevis)、ブルガリカス(bulgaricus)、プランタルム(plantarum)、ラムモサス(rhammosus)、ファーメンタム(fermentum)、コーカサス(caucasicus)、ヘルベティカス(helveticus)、ラクチス(lactis)、ロイテリ(reuteri)又はカゼイ(casei)、例えば、カゼイ・シロタ(casei Shirota))、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)種(例えば、ビフィドゥム(bifidum)、ブレベ(breve)、ロングム(longum)又はインファンティス(infantis))、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される1つ又は複数の種の細菌である。例えば、細菌は、Lアシドフィルス細菌である。
【０３６３】
可動性プラスミドの様な、可動性トランスポゾンは、自己移行することができないが、TcRヘルパーエレメントの存在下で細胞間を移行することができる。この種類の最も一般的に考察されるバクテロイデストランスポゾンは、Tn4399、Tn4555、及び非複製バクテロイデス単位を含む。可動性トランスポゾンTn4555は、例えば、バクテロイデス・ブルガータス(Bacteroides vulgatus)の臨床上の単離物における伝達性セフォキシチン抵抗性の研究中に最初に検出された。したがって、実施形態において、本発明のトランスポゾンは、可動性トランスポゾン(例えば、バクテロイデス可動性トランスポゾン)、例えば、本発明の1つ若しくは複数のアレイ又は配列を含むTn4399又はTn4555である。トランスポゾンは、TcRヘルパーエレメントと組み合わせた状態にある。
【０３６４】
一例では、本発明のトランスポゾンは、エンテロコッカス属Tn916又はグラム陽性Tn1546トランスポゾンである。トランスポゾン(例えば、CTnDot、Tn4399又はTn4555トランスポゾン)は、例えば、その末端のリピート及び/又はトランスポサーゼ若しくはリゾルバーゼをコードする配列により、特徴付けることができる。代替の例において、ベクター又はトランスポゾンは、pMB1、pBR322、ColE1、R6K(pir遺伝子との組合せ)、p15A、pSC101、F1及びpUCから選択される複製起源を含む。一例では、トランスポゾンは、トランスポゾン可動又は移行のため必要とされる因子(例えば、抗生物質、例えば、テトラサイクリン)と組み合わせた状態にある。一例では、トランスポゾンは、抗生物質抵抗性遺伝子(例えば、テトラサイクリン抵抗性遺伝子)を含み、トランスポゾンは、(例えば、ヒトに前記抗生物質と同時又は連続して投与される)前記抗菌と組み合わせた状態にある。一例では、トランスポゾンは、同族トランスポゾンと組み合わせたpiggyBac、マリナー又はスリーピングビューティー(Sleeping Beauty)トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、I型トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、II型トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、Tnファミリートランスポゾンである。
【０３６５】
細菌宿主における抗菌抵抗性の標的化
抗生物質抵抗性は、世界中の問題である。抗生物質抵抗性の新たな形態は、国境を越え、容易に国家間で広がり得る。抵抗性の多くの形態は、顕著な速度で広がる。世界の保健の指導者は、抗生物質抵抗性微生物を、世界中の全ての国における人々にとって「壊滅的な脅威を引き起こす」「悪夢の細菌」と記載した。米国において毎年、少なくとも200万人の人々が、その感染を処置するよう設計された抗生物質の1つ又は複数に抵抗性である細菌の重篤な感染を得る。これらの抗生物質抵抗性感染の直接的な結果として、少なくとも23,000人の人々が毎年死亡する。抗生物質抵抗性感染に合併した他の状態で、より多くが死亡する。加えて、ほぼ250,000人の人々が、毎年、クロストリジウム・ディフィシル(Cディフィシル)感染のため病院でのケアを必要とする。これらの感染の大部分において、抗生物質の使用は、病気を導く主要な関与因子である。米国において毎年、Cディフィシル感染で、少なくとも14,000人の人々が死亡する。これらの感染の多くは、予防することができる。抗生物質抵抗性感染は、既に大いに悩まされた米国及び他の医療制度に、相当かつ回避できるコストを加算する。多くの場合において、抗生物質抵抗性感染は、抗生物質を用いて容易に処置可能である感染と比較して、延長した及び/又は高価な処置を要求し、病院滞在を拡大し、追加の医師の訪問及び健康ケアを必要とし、よりひどい障害及び死をもたらす。米国経済に対する抗生物質抵抗性の総経済コストを計算するのは困難である。概算は変動するが、過度の直接的なヘルスケアコストにおいて200億ドルもの高い範囲にあり、1年毎に350億ドルもの高さの生産性を失うため社会に対する追加のコストを伴う(2008ドル)。抗生物質の使用は、世界中で抗生物質抵抗性を導く1つの最も重要な要因である。抗生物質は、ヒト医薬において使用される最も一般的に処方される薬物である。しかしながら、人々に処方される全抗生物質の最大50%は、必要とされず、最適には、処方されることが有効ではない。抗生物質をまた、食用動物において一般的に使用して、疾患を予防し、制御し、処置し、食物を生み出す動物の成長を促進する。成長を促進するための抗生物質の使用は、必須ではなく、実施を廃止すべきである。米国食品医薬品局(FDA)の近年の指導は、この目標に向けた筋道
を記載する。食用動物において使用される薬物の量を、ヒトにおいて使用される量と直接比較することは困難であるが、より多くの抗生物質が、食物の産生において使用されるという証拠が存在する。
【０３６６】
抗生物質抵抗性の成長における他の主な因子は、人から人又は食物を含む、環境における非ヒト源から人への細菌抵抗性株の拡大である。これらの致命的な感染と闘うのを助ける、4つの中心的な作用が存在する:1.感染を予防し、抵抗性の拡大を予防すること;2.抵抗性細菌をトラッキングすること;3.今日の抗生物質の使用を改善すること;及び4.新規の抗生物質の開発を促進し、抵抗性細菌についての新たな診断試験を開発すること。細菌は、我々が開発した抗生物質に抵抗する方法を必ず見出し、これが、新たな抵抗性が発生することを防ぎ、既に存在する抵抗性が拡大することを妨げる、攻撃的な作用が現在必要とされる理由である。
【０３６７】
本発明は、抗生物質抵抗性宿主を標的にするため、及び本発明の組成物に対するさらなる抵抗性を発生する宿主の可能性を低減するための改良された手段を提供する。
【０３６８】
宿主細胞及び本発明を使用したこのような細胞における抗生物質抵抗性の試験のさらなる例は、以下のとおりである。
1.任意選択で、宿主細胞は、スタフィロコッカス・アウレウス細胞、例えば、メチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン及びテイコプラニンから選択される抗生物質に抵抗性のスタフィロコッカス・アウレウス細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
2.任意選択で、宿主細胞は、シュードモナス・エルギノーサ細胞、例えば、セファロスポリン(例えば、セフタジジム)、カルバペネム(例えば、イミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド(例えば、ゲンタマイシン又はトブラマイシン)から選択される抗生物質に対して抵抗性のシュードモナス・エルギノーサ細胞であり、コリスチン及び宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
3.任意選択で、宿主細胞は、クレブシエラ属 (例えば、ニューモニエ)細胞、例えば、カルバペネムに対して抵抗性のクレブシエラ属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
4.任意選択で、宿主細胞は、ストレプトコッカス属(Streptoccocus)(例えば、サーモフィルス、ニューモニエ又はピオゲネス)細胞、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン及びペニシリンから選択される抗生物質に対して抵抗性のストレプトコッカス属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
5.任意選択で、宿主細胞は、サルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシン及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に対して抵抗性のサルモネラ細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
6.任意選択で、宿主細胞は、シゲラ属(Shigella)細胞、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して抵抗性のシゲラ属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
7.任意選択で、宿主細胞は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(mycobacterium tuberculosis)細胞、例えば、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に抵抗性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
8.任意選択で、宿主細胞は、エンテロコッカス属の細胞、例えば、バンコマイシンに対して抵抗性のエンテロコッカス属の細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
9.任意選択で、宿主細胞は、腸内細菌科細胞、例えば、セファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して抵抗性の腸内細菌科細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
10.任意選択で、宿主細胞は、大腸菌細胞、例えば、トリメトプリム、イトロフラントイン、セファレキシン及びアモキシシリンから選択される抗生物質に対して抵抗性の大腸菌細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
11.任意選択で、宿主細胞は、クロストリジウム属(例えば、ディフィシル)細胞、例えば、フルオロキノロン抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に対して抵抗性のクロストリジウム属細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
12.任意選択で、宿主細胞は、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonnorrhoea)細胞、例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射可能なセファロスポリン)、アジスロマイシン及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に対して抵抗性のナイセリア・ゴノレエ細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
13.任意選択で、宿主細胞は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetoebacter baumannii)細胞、例えば、ベータ-ラクタム、メロペネム及びカルバペネムから選択された抗生物質に対して抵抗性のアシネトバクター・バウマンニ細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
14.任意選択で、宿主細胞は、カンピロバクター属の細胞、例えば、シプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に対して抵抗性のカンピロバクター属の細胞であり、宿主標的部位(又は標的部位の1つ又は複数)は、前記抗生物質に対する宿主抵抗性を付与する遺伝子により含まれる。
15.任意選択で、宿主細胞は、ベータ(β)-ラクタマーゼを産生する。
16.任意選択で、宿主細胞は、例1〜14のいずれか1つにおいて列挙された抗生物質に対して抵抗性である細菌宿主細胞である。
【０３６９】
実施形態において、宿主細胞は、USA300 Sアウレウス株細胞である。
【０３７０】
一例では、その又は各宿主標的配列は、宿主細胞のプラスミド、例えば、Sアウレウスプラスミド(例えば、USA300株のもの)、例えば、Sアウレウス細胞のpUSA01、pUSA02又はpUSA03プラスミドにより含まれる標的により含まれる。一例では、第1及び/又は第2の標的は、宿主mecA、mecA2又はsek遺伝子配列(例えば、Sアウレウス株細胞のもの)により含まれる。一例では、第1及び/又は第2の標的は、宿主病原性アイランドのヌクレオチド(例えば、DNA)配列により含まれる。例では、本発明のスペーサーは、国際公開第2014/124226号の26頁の表1において開示されるスペーサーを含むか、又はからなり、スペーサー配列は、参照により本明細書に取り込まれる。一例では、遺伝子操作された配列、HM-crRNA又はgRNAは、このようなスペーサーを含む。
【０３７１】
マウス皮膚コロニー形成アッセイ(例えば、国際公開第2014/124226号、Kugelberg Eら、Establishment of a superficial skin infection model in mice by using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes、Antimicrob Agents Chemother、2005年;49:3435〜3441頁又はPastagia Mら、A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains、Antimicrob Agents Chemother、2011年;55:738〜744頁において開示される)における抗菌抵抗性細菌宿主の成長の低減又は死滅又は阻害に有効である、本発明の組成物、使用、方法、システム、ベクター、集合物、アレイ、遺伝子操作された配列、ウイルス、ファージ、ファージミド、プロファージ又はビリオンであって、第1及び/又は第2の標的は、前記抗生物質に対する抵抗性を付与する宿主遺伝子により含まれ、例えば、宿主は、Sアウレウス(例えば、USA300株)宿主である。
【０３７２】
位置854757〜858863においてcas9遺伝子を有する、参照Sピオゲネス配列は、Genbank受託番号NC_002737の下で入手可能である。SピオゲネスCas9アミノ酸配列は、番号NP_269215の下で入手可能である。これらの配列は、本発明における使用のため参照により本明細書に取り込まれる。明示的に、又は参照によりそこに取り込まれるかに関わらず、20150079680において開示されるさらなる配列はまた、本発明における使用のため参照により本明細書に取り込まれる。国際公開第2013/176772号における配列及び方法の開始も参照され、それは、参照により本明細書に取り込まれる。例であるtracrRNA配列は、国際公開第2014/124226号の15頁において開示されるものであり、本発明における使用のため、参照により本明細書に取り込まれる。
【０３７３】
一例では、その又は各リピートは、長さ20〜50(例えば、24〜47、例えば、30、29、28、27、26、25又は24)の隣接するヌクレオチドを含むか、又はからなる。
【０３７４】
一例では、その又は各スペーサーは、長さ18〜50(例えば、24〜47、又は20〜40、例えば、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18)、例えば、19又は20の隣接するヌクレオチドを含むか又はからなる。
【０３７５】
一例では、第1のリピート(本発明のHM-アレイにおいて最も5')は、第1の宿主標的を含む配列に相補的であるスペーサー配列のすぐ5'にある。新たに獲得されたスペーサー(例えば、進入ファージ配列のもの)が、細菌におけるこの位置において一般に取り込まれ、これにより、この方法での本発明の第1のスペーサーの位置決めが、その使用を促進するのに有用であるという観察を鑑みて、これは有用である。
【０３７６】
一例では、ウイルス(例えば、ファージ)核酸は、複製起源(ori)及びパッケージング部位を含む。一例では、ウイルスの核酸はまた、必須カプシドタンパク質をコードする1つ、複数又は全ての遺伝子、例えば、rinA、terS及びterL遺伝子を含む。一例では、これらの1つ、複数又は全てが、本発明のウイルスの同時感染のためであるコンパニオンヘルパーウイルス(例えば、ヘルパーファージ)により代わりに含まれ、これは、宿主において作動可能なさらなるHM-アレイ核酸及び/又はさらなるCasをコードする核酸を含むための後者における空間を開放する。一例では、ウイルス核酸は、野生型ファージゲノムのフラグメントを含み、フラグメントは、少なくともrinA、terS及びterL遺伝子又はファージタンパク質をコードする均等な遺伝子を含むゲノムの連続したヌクレオチドからなる。
【０３７７】
一例では、宿主細胞は、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである。
【０３７８】
一例では、その又は各標的部位は、宿主病原体接着、コロニー形成、進入、免疫応答阻害、病原性、必須タンパク質又は機能発現又は毒素生成を媒介する遺伝子により含まれる。一例では、遺伝子は、細胞毒、アルファ-溶血素、ベータ-溶血素、ガンマ-溶血素、ロイコシジン、パントン・バレンタイン型ロイコシジン(PVL)、外毒素、TSST-1、エンテロトキシン、SEA、SEB、SECn、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、表皮剥脱毒素、ETA又はETBをコードする遺伝子であり、任意選択で、宿主は、Sアウレウス、例えば、MRSAである。
【０３７９】
一例では、その又は各CRISPRアレイは、本明細書において開示される構成、実施形態、例、概念、態様、段落又は条項のいずれかによるアレイである。一例では、その又は各遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、本明細書において開示される構成、実施形態、例、概念、態様、段落又は条項のいずれかによる遺伝子操作されたヌクレオチド配列である。
【０３８０】
一例では、その又は各ベクターは、本明細書において開示される構成、実施形態、例、概念、態様、段落又は条項のいずれかによるベクターである。
【０３８１】
本明細書において開示される構成、実施形態、例、態様、段落又は条項のいずれかによる例において、ベクター又はMGEは、キャスポゾンであるか、又はそれを含む。MGEは、以下で更に記載される。一例では、キャスポゾンは、ファミリー1、2又は3のキャスポゾンである。一例では、本発明のMGEは、キャスポゾン末端逆方向リピート及び任意選択で、キャスポゾンCas1をコードする配列を含む。一例では、本発明のMGEは、キャスポゾンマイナスCas1であるか、又はそれを含み、宿主細胞のCas1を用いた可動のため作動可能である。キャスポゾンの詳細については、BMC Biol.、2014年5月19日;12:36. doi: 10.1186/1741-7007-12-36、「Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity」、Krupovic Mらを参照のこと。
【０３８２】
本発明のさらなる例となる適用
一例では、組成物(例えば、抗生物質と組み合わせたHM組成物又は遺伝子操作された配列)は、以下のいずれかである。一例では、組成物は、医療、眼科、歯科又は医薬組成物(例えば、抗宿主ワクチンにより含まれる)である。一例では、組成物は、抗菌組成物、例えば、抗生物質又は抗ウイルス薬、例えば、医薬、消毒薬又は口腔洗浄薬である。一例では、組成物は、化粧用組成物(例えば、顔又は身体のメーキャップ組成物)である。一例では、組成物は、除草剤である。一例では、組成物は、農薬である(例えば、宿主がバチルス属(Bacillus)(例えば、チューリンゲンシス(thuringiensis))宿主であるとき)。一例では、組成物は、飲料(例えば、ビール、ワイン又はアルコール飲料)添加物である。一例では、組成物は、食品添加物である(例えば、宿主が、大腸菌、サルモネラ、リステリア属又はクロストリジウム属(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)。一例では、組成物は、水添加物である。一例では、組成物は、水生動物環境(例えば、魚のタンクにおける)のための添加剤である。一例では、組成物は、油又は石油化学工業組成物であるか、又はこのような組成物において含まれる(例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属宿主であるとき)。一例では、組成物は、油又は石油化学製品の添加剤である。一例では、組成物は、化学添加剤である。一例では、組成物は、消毒薬(例えば、ヒト又は動物使用のため、例えば、外科手術又は医療使用のため、又は赤ちゃんの授乳のための装置を無菌化するための)である。一例では、組成物は、ヒト又は動物使用のための個人用衛生組成物である。一例では、組成物は、環境での使用のため、例えば、土壌処理又は環境の汚染除去(例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属宿主であるとき、例えば、汚水から、又は油、石油化学製品若しくは化学物質から)のための組成物である。一例では、組成物は、植物の成長刺激因子である。一例では、組成物は、油、石油化学製品、金属又は鉱物抽出における使用のための組成物である。一例では、組成物は、織物の処理又は添加剤である。一例では、組成物は、動物の皮、皮革又はスウェード処理又は添加剤である。一例では、組成物は、色素添加剤である。一例では、組成物は、飲料(例えば、ビール又はワイン)醸造又は発
酵添加物である(例えば、宿主が、ラクトバチルス属宿主であるとき)。一例では、組成物は、紙添加剤である。一例では、組成物は、色素添加剤である。一例では、組成物は、接着剤添加剤である。一例では、組成物は、抗ヒト又は動物又は植物寄生組成物である。一例では、組成物は、空気添加剤(例えば、宿主が、レジオネラ属宿主であるとき、例えば、エアコンディショニング装置における空気又はそれにより産生される空気のための)である。一例では、組成物は、抗凍結添加剤である(例えば、宿主が、レジオネラ属宿主である場合)。一例では、組成物は、目薬又は眼科用組成物(例えば、コンタクトレンズ液)である。一例では、組成物は、乳製品により含まれる(例えば、組成物は、牛乳又は乳製品にあるか、又はそれであり、例えば、宿主は、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属又はリステリア属宿主である)。一例では、組成物は、家庭用又は産業用洗浄製品であるか、又はそれにより含まれる(例えば、宿主が、大腸菌、サルモネラ、リステリア属又はクロストリジウム属(例えば、ボツリヌム)宿主である場合)。一例では、組成物は、燃料により含まれる。一例では、組成物は、溶媒(例えば、水以外)により含まれる。一例では、組成物は、ベーキング添加物(例えば、食品のベーキング添加物)である。一例では、組成物は、実験室用試薬(例えば、バイオテクノロジー又は組換えDNA若しくはRNAテクノロジーにおける使用のための)である。一例では、組成物は、織物浸漬剤により含まれる。一例では、組成物は、ビタミン合成プロセスにおける使用のためである。一例では、組成物は、抗作物又は植物妨害組成物である(例えば、宿主が、腐生細菌であるとき)。一例では、組成物は、抗腐食化合物、例えば、金属腐食を予防するか、又は低減するための抗腐食化合物である(例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属宿主であるとき、例えば、油抽出、処置若しくは汚染要件;金属抽出、処理又は汚染装置;又は鉱物抽出、処理又は汚染装置である腐食の低減又は予防における使用のための)。一例では、組成物は、農業用又は農場用組成物であるか、又はこのような組成物において含まれる。一例では、組成物は、貯蔵牧草添加物である。本発明は、この段落における使用のため又はこの段落において記載される任意の適用における使用のための本明細書において記載されるHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas、HM-組成物又はgRNAasを提供し、例えば、宿主細胞は、微生物細胞又は細菌若しくは古細菌細胞である。本発明は、この段落において記載される任意の適用方法を提供し、方法は、本発明のHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas、gRNA又はHM-組成物を宿主細胞(例えば、微生物、細菌又は古細菌細胞)と合わせる工程を含む。実施形態において、宿主細胞は、ヒト(若しくはヒト胚)又は動物に存在しない。
【０３８３】
本発明の任意の態様は、産業又は家庭での使用のためであるか、又はこのような使用のための方法において使用される。例えば、それは、農業、油又は石油産業、食品又は飲料産業、布産業、パッケージング産業、電気産業、コンピューター産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医療産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費者向製品産業、医薬産業、採鉱産業、洗浄産業、林業、漁業、レジャー産業、リサイクル産業、化粧産業、プラスチック産業、パルプ若しくは紙産業、テキスタイル産業、布産業、皮革又はスウェード又は動物の皮産業、タバコ産業又は鉄鋼業のためのであるか、又はそれにおいて使用される。
【０３８４】
本明細書において、デスルホビブリオ属宿主の記述がある場合、宿主は、代わりに、デスルフォバルブス属(Desulfobulbus)、デスルフォバクター属(Desulfobacter)、デスルフォバクテリウム属(Desulfobacterium)、デスルフォコッカス属(Desulfococcus)、デスフォモニル属(Desulfomonile)、デスルフォネマ属(Desulfonema)、デスルフォボツルス(Desulfobotulus)又はデスルフォアルクルス(Desulfoarculus)宿主或いは本明細書において開示される任意の他の硫黄還元細菌であり得る。油、水、汚水又は環境適用についての実施形態において、宿主は、デスルホビブリオ・カピラツス(Desulfovibrio capillatus)宿主である。
【０３８５】
広範な微生物学的解析及び16S rRNA配列決定は、属デスルホビブリオが、環境から単離され得る硫酸還元真正細菌のおよそ8つの異なる群の1つであることを示した。これらの群の7つは、グラム陰性であり、一方、1つは、グラム陽性細菌(デスルフォトマクラム(Desulfotomaculum))を表す。属デスルホビブリオは、むしろ小さいゲノムを有する。当初の推定は、Dブルガリス(vulgaris)及びDギガス(gigas)(本発明による宿主であり得る)のゲノムについて、それぞれ、1.7Mbp及び1.6Mbpである。これは、本発明における使用のための所望の標的配列(例えば、必須又は抵抗性遺伝子における配列)の同定を目的とする。Dデスルフリカンス(desulfuricans)(本発明による宿主であり得る)G200の常在性プラスミドは、シャトルベクターの構築を可能にし(Wall、1993年、ベクターが、本発明のためのベクターとして使用され得る)、並びにDブルガリス・ヒルデンバラ(vulgaris Hildenborough)(本発明による宿主であり得る)(Seyedirashti、1992年)由来の2つのバクテリオファージの単離及び特徴決定は、デスルホビブリオ種を効率的に遺伝子操作するための他の方法を提供し得る。一例では、ベクターは、mu又はmu様バクテリオファージである。
【０３８６】
例である宿主は、デスルホビブリオ・ブルガリス亜種のブルガリス・ポストゲート(vulgaris Postgate)及びキャンベル(Campbell)である(ATCC(登録商標)29579(商標))株命名:NCIB8303[DSM644、Hildenborough]。
【０３８７】
マイトマイシンC又はUVを用いた細菌の処理を予め使用して、細菌からファージを誘導し(Driggers及びSchmidt)、これは、本発明の任意の例又は態様における使用のためのベクターを生成するのに適した宿主一致ファージを得る適当な方法である。
【０３８８】
本発明の適用は、乳業(例えば、チーズ若しくはバター若しくは乳製品の製造)又は発酵(例えば、ワイン若しくは酢若しくはダイズ)又はビール醸造又はパン製造業においてである。例えば、乳業の適用のため、本発明の方法は、乳酸産生細菌(例えば、ラクトバチルス属宿主細胞)の培養物を培養物から乳酸を産生する期間発酵させる工程、及びその後、細菌と混合された本発明の1つ又は複数のアレイ、システム、ベクター、集団又は集合物からのcrRNAの発現を引き起こすことにより、細菌の成長を阻害する工程を含み、これにより、細菌による乳酸産生が、低減されるか、又は阻害される、乳製品を製造する方法である。これは、食品/飲料の腐敗若しくは不所望な食品/飲料の味及び/又は匂いを低減するのに有用である。一例では、細菌において誘導可能なHM-アレイが含まれ、方法は、第1の期間の後に、インデューサー剤を添加する工程を含む。
(参考文献)
Wall, J. D.、B. J. Rapp-Giles、及びM. Rousset、1993年、「Characterization of a small plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction」、J. Bacteriol.、175:4121〜4128頁;
Seyedirashti Sら;J Gen Microbiol.、1992年7月;138(7):1393〜7頁、「Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)」;
Driggers及びSchmidt、J. gen. Virol.、(1970年)、6、421〜427頁、「Induction of Defective and Temperate Bacteriophages in Caulobacter」。
【０３８９】
概念:細菌の混合集団、例えば、細菌叢における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比の変更
1.細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比の変更のための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第2の細菌が宿主細胞を含み、
各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを改変し、
標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞成長が阻害される、使用。
2.細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を改変するための、概念1の使用のための宿主改変(HM)CRISPR/Casシステムであって、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)宿主細胞標的配列、並びに宿主標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する能力がある配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む遺伝子操作された宿主改変(HM)CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するためのDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換することができる少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを改変する、宿主改変(HM)CRISPR/Casシステム。
3.ベクター又は複数のベクターが、Cas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼをコードする配列を欠く、概念2のシステム。
4.各宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、いずれかの先行する概念の使用又はシステム。
5.(a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門の細菌の部分の変更;(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス門亜集団(宿主細胞)の比率の低減;(c)混合集団における第1のファーミキューテス門種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のファーミキューテス門種を含む、低減;(d)混合細菌集団における第1のグラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のグラム陽性細菌種を含む、低減;(e)混合細菌集団における細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない異なる細菌種を含み、第1の種が、他の種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に対して少なくとも80、82、83、84、85、90又は95%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を含む、低減;(f)混合細菌集団における第1の細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸プロバイオティック種である、低減;又は(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸細菌叢種((宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸共生種である、低減のための、概念1又は4の使用。
6.(a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門の細菌の部分の変更;(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス門亜集団(宿主細胞)の比率の低減;(c)混合集団における第1のファーミキューテス門種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のファーミキューテス門種を含む、低減;(d)混合細菌集団における第1のグラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のグラム陽性細菌種を含む、低減;(e)混合細菌集団における細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない異なる細菌種を含み、第1の種が、他の種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に対して少なくとも80、82、83、84、85、90又は95%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を含む、低減;(f)混合細菌集団における第1の細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸プロバイオティック種である、低減;又は(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸共生種である、低減のための、概念2又は3の使用であって、(a)〜(g)が、ヒト又は動物対象において、(i)比率が低減されない前記細菌種による細菌叢感染;又は(ii)比率が低減される前記細菌種による疾患若しくは状態を処置又は予防するためである、概念2又は3の使用。
7.バクテロイデス門対ファーミキューテス門の相対比を増大させるための、概念5又は6の使用又はシステム。
8.前記Casヌクレアーゼが、細胞の内因性II型CRISPR/Casシステムによりもたらされる、任意の先行する概念の使用又はシステム。
9.構成要素(i)が、宿主細胞にとって内因性である、任意の先行する概念の使用又はシステム。
10.標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、任意の先行する概念の使用又はシステム。
11.標的配列が宿主染色体配列である、任意の先行する概念の使用又はシステム。
12.或いは、HM-crRNA及びtracrRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)、例えば、ベクターによりもたらされるシングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、任意の先行する概念の使用又はシステム。
13.宿主細胞が、対象となるHm-配列をコードするフリーな末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含み、及び/又はシステムが、HM-DNAをコードする配列を含み、HM-DNAが、HM-DNAを宿主ゲノムに(例えば、染色体又はエピソーム部位に)挿入するための標的配列において又はそれに隣接する配列又は複数の配列に相同である配列又は複数の配列を含む、任意の先行する概念の使用又はシステム。
14.内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞を改変するための、概念1の使用のための遺伝子操作された核酸ベクターであって、ベクターが、
(a)CRISPR/Casシステムにおける使用のため又は任意の先行する概念に記載の使用のための、複数の異なるcrRNA(例えば、gRNAにより含まれる)を発現する核酸配列を含み;
(b)任意選択で、Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
前記crRNAの第1のものが、前記宿主細胞における第1の核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記crRNAの第2のものが、前記宿主細胞における第2の核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記第2の配列が、前記第1の配列と異なり;
(c)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;任意選択で、遺伝子が異なり;
(d)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;
(e)第1の配列が、必須伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;又は
(f)第1の配列が、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれる、遺伝子操作された核酸ベクター。
15.ベクターによりコードされるcRNA(例えば、シングルガイドRNA)とともに作動可能である1つ又は複数のCas含む宿主細胞内部の、概念14のベクター。
16.HM-CRISPRアレイが、同じスペーサーの複数のコピーを含む、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
17.ベクターが、複数のHM-CRISPRアレイを含む、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
18.各ベクターが、ウイルス又はファージである、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
19.システム又はベクターが、crRNA(例えば、gRNA)をコードする核酸配列の2、3つ以上のコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、抵抗性又は必須遺伝子配列)を標的にするための同じスペーサー配列を含む、任意の先行する概念の使用、システム又はベクター。
20.コピーが、2つ以上のベクターCRISPRアレイの間の分離される、概念19の使用、システム又はベクター。
21.任意の先行する概念において列挙されるシステム又はベクターを含む、細菌宿主細胞。
22.アレイが、抗生物質剤と組み合わせた状態にあり;又は使用が、宿主細胞を第1の抗生物質に曝露することを含み、標的配列が、前記第1の抗生物質に対する抵抗性についての抗生物質抵抗性遺伝子により含まれる、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
23.宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス、サルモネラ属、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、又はクロストリジウム属宿主細胞である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
24.各ベクターが、概念14又は15に記載のものである、概念1〜13又は16〜23のいずれか1つの使用、システム又は細胞。
25.宿主細胞集団成長が、前記HM-アレイ又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換されていない前記宿主細胞の集団の成長と比較して少なくとも5分の1低減される、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
26.表面上での宿主細胞集団成長が阻害される、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。一例では、集団は、ヒト組織表面(例えば、腸組織表面、例えば、インビボ又はエクスビボでの)と接触している。
27.第1の細菌が、ヒト(例えば、ヒト腸における)とプロバイオティック、共生又は相利共生である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
28.第1及び第2の細菌が、共にファーミキューテス門であり、異なる種又は株の細菌であり;又は第1の細菌が、腸内細菌科であり、第2の細菌が、ファーミキューテス門である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
29.宿主細胞が、細菌細胞の代わりに、古細菌細胞であるか、又は各集団が、細菌集団の代わりに、古細菌集団である、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
30.宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により又はそれ上に含まれる、産業又はエクスビボ医療用流体、表面、装置又は容器を処理するための;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、概念1、4、5、7〜13、16〜20及び22〜29のいずれか1つの使用。
31.HM-cRNA又はgRNAが、隣接のNNAGAAW又はNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力がある配列を含む、任意の先行する概念の使用、システム、ベクター又は細胞。
32.1.4kbより大きい外来DNA配列を含む、任意の先行する概念に記載の核酸ベクター、又は使用、システム又は細胞における使用のためのベクターであって、外来DNAが、CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の構成要素をコードし、宿主細胞においてHM-crRNA又はgRNAを発現するための遺伝子操作されたアレイを含み、外来配列が、cRNA又はgRNAと同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き;少なくとも2つの異なるcRNA又はgRNAが、外来DNAにより(例えば、少なくとも2つのHM-CRISPRアレイにより)コードされる、ベクター。
33.ベクターが、宿主細胞を形質転換する能力があるウイルスベクターである、概念32のベクター。
34.cRNA又はgRNAが、宿主細胞においてそれぞれの標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力があり、各プロトスペーサー配列が、抗生物質抵抗性又は必須宿主遺伝子により含まれる、概念32又は33のベクター。
35.宿主細胞が、ヒト細菌叢種の細胞である、概念32〜34のいずれか1つのベクター。
【０３９０】
実施形態:表面での細菌の集団成長の阻害及び処置のための野生型内因性Casの利用
1.集団の成長を阻害するための細菌宿主細胞集団の野生型内因性Casヌクレアーゼ活性の使用であって、集団が、複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞が、野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内因性CRISPR/Casシステムを有し、使用が、集団の宿主細胞を形質転換することを含み、各形質転換された宿主細胞が、宿主細胞における宿主改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)をもたらすための遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換され、HM-cRNA又はgRNAが、内因性Casをガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列を標的にハイブリダイズする能力がある配列を含み、cRNA又はgRNAが、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、宿主細胞の前記形質転換後、集団の成長が阻害される。
宿主細胞は、同じ種又は株のものであってもよい。
2.宿主細胞集団成長の阻害が、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換されていない前記宿主細胞の集団の成長と比較して、少なくとも5分の1の成長における低減である、実施形態1の使用。
3.表面上での集団成長が、阻害される、実施形態1の使用。
4.表面上での集団成長が、阻害される、実施形態2の使用。
5.前記阻害が、各宿主細胞のための、前記宿主細胞の死滅又は成長の低減のためのHM-CRISPR/Casシステムの使用を含み、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)前記Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)前記HM-crRNAをコードするスペーサー配列(HM-スペーサー)及びリピートを含む、遺伝子操作された宿主改変HM-CRISPRアレイ、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクター間で分離され、これにより、HM-crRNAが、前記Casを標的にガイドして、標的配列を改変し、
標的配列が、宿主細胞においてCasにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞成長が阻害される、実施形態1の使用。
6.細菌の混合集団における第1及び第2の細菌の亜集団の相対比の変更のための、任意の先行する実施形態の使用であって、第2の細菌が宿主細胞を含む、使用。
7.宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、実施形態6の使用。
8.宿主細胞が、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞が、ヒト(例えば、ヒト腸において)とプロバイオティック、共生又は相利共生である腸内細菌科又は細菌である、実施形態6又は7の使用。
9.任意選択で、集団におけるバクテロイデス門対1つ以上又は全てのファーミキューテス門種(例えば、対ストレプトコッカス属)の相対比を増大するための、バクテロイデス門細菌及び他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の変更のための、いずれかの先行する実施形態の使用。
10.混合集団における第1の細菌対第2の細菌の相対比を変更するための、任意の先行する実施形態の使用であって、第1及び第2の細菌が、共にファーミキューテス門であり、異なる種又は株の細菌であり、第2の細菌が、宿主細胞を含む、使用。一例では、使用は、第1の細菌の第2の細菌に対する比率を増大させる。
11.遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、外来Casヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせた状態にない、実施形態1の使用。
12.ベクター又は複数のベクターが、Casヌクレアーゼをコードする配列を欠く、実施形態5の使用。
13.各宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、実施形態1の使用。
14.各宿主細胞が、ヒト細菌叢においてみられる株又は種のものである、実施形態6の使用。
15.各宿主細胞が、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞が、ヒト(例えば、ヒト腸において)とプロバイオティック、共生又は相利共生である腸内細菌科又は細菌である、実施形態13の使用。
16.使用が、バクテロイデス門細菌及び他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変更し、任意選択で、使用が、集団におけるバクテロイデス門対1つ以上又は全てのファーミキューテス門種(例えば、ストレプトコッカス属)の相対比を変更する、実施形態1の使用。
17.第1及び第2の細菌が、共にファーミキューテス門であり、使用が、混合集団における第1対第2の細菌の相対比を変更する、実施形態1の使用。一例では、使用は、第1の細菌の第2の細菌に対する比率を増大させる。
18.前記Casヌクレアーゼが、宿主細胞内因性II型CRISPR/Casシステムによりもたらされ、及び/又はHM-cRNA又はgRNAが、隣接5'-NNAGAAW-3'プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力がある配列を含む、実施形態1の使用。
19.前記Casヌクレアーゼが、宿主細胞内因性II型CRISPR/Casシステムによりもたらされる、実施形態5の使用。
20.構成要素(ii)が、宿主細胞にとって内因性である、実施形態5の使用。
21.各形質転換された宿主細胞が、細胞内の前記HM-crRNAの産生において構成要素(ii)とともに作動可能である内因性RNaseIIIを含む、実施形態5の使用。
22.標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、実施形態1の使用。
23.遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、抗生物質剤と組み合わせた状態にある、実施形態1の使用。
24.HM-crRNA及びtracrRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれる、実施形態5の使用。
25.形質転換された宿主細胞各々が、対象となるHm-配列をコードするフリーな末端を有するデオキシリボ核酸鎖(HM-DNA)を含み、HM-DNAが、HM-DNAを宿主ゲノムに挿入するための、標的配列において又は隣接する配列又は複数の配列にそれぞれ、相同である配列又は複数の配列を含み、HM-DNA配列が、宿主細胞ゲノムに挿入される、実施形態1の使用。
26.宿主細胞プロトスペーサー標的配列にハイブリダイズするための、宿主細胞において、複数の異なるcrRNA(又はgRNA)を発現させることを含み、前記crRNA(又はgRNA)の第1のものが、第1のプロトスペーサー核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記crRNA(又はgRNA)の第2のものが、第2のプロトスペーサー核酸配列にハイブリダイズする能力があり、前記第2の配列が、前記第1の配列と異なり、
(a)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;任意選択で、遺伝子が異なり;
(b)第1の配列が、抗生物質抵抗性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;
(c)第1の配列が、必須伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ;又は
(d)第1の配列が、病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれ、第2の配列が、必須又は病原性遺伝子(又はそのRNA)により含まれる、
実施形態1の使用。
27.宿主細胞が、ヒト又は動物対象により含まれる混合細菌集団により含まれ、使用が、(i)対象において、混合集団により含まれる前記宿主細胞により感染を処置するか;(ii)前記宿主細胞により媒介される状態又は疾患の対象におけるリスクを処理するか、又は低減するか;(iii)前記宿主細胞により引き起こされるか、又は媒介される体の匂いを低減するか;又は(iv)ヒトの個人用衛生処置である、実施形態6の使用。
28.使用が、ヒト又は動物対象における前記宿主細胞による感染を処置するか、又はリスクを低減し、宿主細胞各々が、前記標的プロトスペーサー配列を含む抗生物質抵抗性遺伝子(第1の抗生物質に対する抵抗性について)を含み、使用が、遺伝子操作されたヌクレオチド配列及び第1の抗生物質を対象に投与することを含み、感染が、対象において低減されるか、又は予防される、実施形態1の使用。
29.各遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、抗生物質抵抗性遺伝子を更に含み、HM-crRNA又はgRNAが、抗生物質抵抗性遺伝子を標的にせず、使用が、集団を前記抗生物質及び複数の前記遺伝子操作された配列に曝露し、これにより、宿主細胞におけるHM-crRNA又はgRNAをコードする配列の維持を促進することを含む、実施形態1の使用。
30.宿主細胞が、グラム陽性細胞又はストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス、サルモネラ、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、Vコレラエ又はクロストリジウム属細胞である、実施形態1の使用。
31.産業用又は医療用流体、表面、装置又は容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、実施形態1の使用であって、宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により又は上に含まれ、宿主細胞集団の成長は、前記処理を行うことにより、阻害される、使用。
代替において、任意の実施形態は、任意の先行する実施形態に従属する。
態様:混合集団における担体と宿主細胞間の水平方向の移行
1.担体細菌を含む混合細菌集団を産生する方法であって、集団が、それぞれ、第1及び第2の細菌の第1及び第2の亜集団を含み、亜集団が、互いに異なる第1及び第2の種の細菌であり、第2の細菌が、複数の宿主細胞を含み、担体細菌が、各々が、宿主細胞における宿主細胞改変(HM)cRNA又はガイドRNA(gRNA)をもたらすための遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含む第1の細菌細胞であり、HM-cRNA又はgRNAが、第1のCasヌクレアーゼを標的にガイドして、標的を改変するため、宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズする能力がある配列を含み、担体細菌が、標的配列を含まず、
a.各々が前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含む、複数の核酸を用意する工程;
b.前記複数の核酸を、それぞれ、第1及び第2の細菌種の第1及び第2の亜集団を含む第1の混合集団と合わせる工程、第2の亜集団が宿主細胞を含み;
c.核酸が、宿主細胞の存在下で前記第1の亜集団の細胞を形質転換することを可能にし、これにより、前記担体細胞及び前記宿主細胞を含む第2の混合集団を産生する工程、担体細胞により含まれる前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、宿主細胞に水平方向で移行して、形質転換された宿主細胞における前記HM-cRNA又はgRNAの産生のため宿主細胞を形質転換する能力がある、
を含む、方法。
2.第2の混合集団を得る工程を更に含む、態様1の方法。
3.複数の担体細胞を第2の混合集団から単離する工程を更に含む、態様1の方法。
4.形質転換された宿主細胞において前記HM-cRNA又はgRNAを産生する工程を更に含み、前記HM-crRNA又はgRNA配列が、前記形質転換された宿主細胞における標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズし、第1のCasヌクレアーゼを標的にガイドし、これにより、第1のCasヌクレアーゼを用いて標的を改変する、態様1の方法。
5.前記標的改変を含む宿主細胞を得る工程を更に含む(例えば、宿主細胞が、前記第1の細菌種を含む混合集団により含まれる)、態様4の方法。
6.cRNA又はgRNAが、宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、ヌクレアーゼが、前記第1のCasヌクレアーゼである、態様1の方法。
7.cRNA又はgRNAが、担体細胞の内因性Casヌクレアーゼと同族であり、ヌクレアーゼが、前記第1のCasヌクレアーゼである、態様1の方法。
8.ヌクレアーゼが、野生型ヌクレアーゼ活性を有する、態様7の方法。
9.第1のCasヌクレアーゼがCas9である、態様1、6、7又は8の方法。
10.Cas9が、ストレプトコッカス属Cas9である、態様9の方法。
11.各遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、それぞれの核酸ベクターにより含まれ、ベクターが、担体と宿主細胞の間の水平方向の移行の能力がある、態様1の方法。
12.各遺伝子操作された配列が、それぞれの可動遺伝要素、例えば、トランスポゾン又はプラスミドにより含まれる、態様1又は11の方法。
13.宿主細胞の前記形質転換後に、宿主細胞亜集団の成長が阻害される、態様1の方法。
14.宿主細胞集団成長の阻害が、前記遺伝子操作されたヌクレオチド配列を用いて形質転換されていない前記宿主細胞の集団の成長と比較して、少なくとも5分の1である、態様13の方法。
15.表面上での宿主細胞集団成長が、阻害される、態様13又は14の方法。
【０３９１】
代替において、任意の態様は、任意の先行する態様に従属する。
【０３９２】
一例では、方法は、例えば、本明細書において記載される、ヒト、動物又は植物対象において疾患又は状態を処置又は予防する方法であり、前記処置又は予防をもたらす。本発明は、方法により得られるか、又は得られ得る混合細菌集団をこのような処置又は予防方法にもたらす。
【０３９３】
一例では、方法は、例えば、本明細書において記載される、環境、設備、装置、容器、河川、水、流体、食料、飲料、細菌叢、マイクロバイオーム又は化粧品の混合細菌集団上で行われ、第1の細胞と比較して、宿主細胞の比率を低減する。
【０３９４】
一例では、方法の産物は、ヒト又は動物の肥満、糖尿病又はIBDを処置又は予防するための、ヒト又は非ヒト動物の腸への投与のためである。
【０３９５】
一例では、第1及び第2の種は、ヒト又は非ヒト動物腸共生又は相利共生細菌の種である。
【０３９６】
方法の産物は、細菌が、ヒト又は動物の1つ又は複数のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)を集合するように、ヒト又は動物に(例えば、鼻腔内)投与され得るので、有用である。第1の細胞は、特に、それらの細胞が、ヒト又は動物にとって非病原性(例えば、腸マイクロバイオームにおいて非病原性)であるとき、担体として作用する。マイクロバイオームは、本明細書において開示される任意の他のマイクロバイオーム又は細菌叢集団であり得る。
【０３９７】
一例では、第1の第2の細菌種は、ヒト又は非ヒト動物の腸細菌叢を集合させる能力があり、第1の細菌は、ヒト又は動物と共生又は相利共生である。有用であるには、第1の細菌は、ヒト又は動物に安全に投与され得、その後の細菌叢の宿主細胞への遺伝子操作された配列の移行のための担体として作用し得る。
【０３９８】
一例では、遺伝子操作された配列は、本明細書において開示される任意のアレイ又はベクターにより含まれる。一例では、方法は、本明細書において開示される任意のCRISPR/Casシステムを使用する。
【０３９９】
一例では、第1の細胞は、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス(Bacteroidales)又はバクテロイデス)細胞;ラクトバチルス属(例えば、アシドフィルス(例えば、La-5、La-14又はNCFM)、ブレビス、ブルガリカス、プランタルム、ラムモサス、ファーメンタム、コーカサス、ヘルベティカス、ラクチス、ロイテリ又はカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ);ビフィドバクテリウム属(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングム又はインファンティス);ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophiles);エンテロコッカス・フェシウム;アリスティペス属(Alistipes);アルカリフレックス属(Alkaliflexus);パラバクテロイデス属(Parabacteroides);タンネレラ属(Tannerella);大腸菌;又はキシラニバクター属(Xylanibacter)細胞である。
【０４００】
一例では、宿主細胞は、ヒト細菌叢種のものであり、担体細胞は、前記ヒト細菌叢において非病原性である種の細胞であり、標的配列は、担体細胞のゲノムにより含まれず、遺伝子操作された配列は、担体及び宿主細胞において作動可能であるoriTを含むMGEにより含まれ、MGEが、担体細胞から宿主細胞に水平方向に移行可能である。一例では、遺伝子操作された配列、MGE又はベクターは、バクテリオファージにより含まれ、バクテリオファージは、第1の細胞(担体)に感染して、MGEを第1の(担体)細胞に感染する能力がある。その後、MGEは、宿主細胞に水平方向に移行する能力がある。
【０４０１】
一例では、第1の細胞は、バクテロイデス門又はプレボテラ属(Prevotella)細胞であり、任意選択で、MGEは、第1の細胞種から前記ヒト細菌叢のファーミキューテス門種(宿主細胞)に水平方向に移行する能力がある。後者は、標的配列が、ファーミキューテス門により含まれるが、第1の(担体)細胞に含まれないとき、例えば、ヒトにおける肥満を処置又は予防するのに有用である。
【０４０２】
以下の番号をつけた段落は、本発明の態様の幾つかを記載する。本発明は、少なくとも以下を提供する。
1.細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、混合集団が、それぞれ、第1及び第2の細菌叢種の第1及び第2の細菌亜集団を含み、種は異なり、第2の細菌亜集団が、宿主細胞集団を含み、細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数のコピーと合わせる工程、及び宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程を含み、各遺伝子操作された核酸配列が、HM-CRISPR/Casシステムを形成するようそれぞれの宿主細胞におけるCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された配列が、スペーサー及びHM-crRNAをコードするリピート配列を含み、HM-crRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある配列を含み、任意選択で、HM-システムが、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、これにより、HM-crRNAが、宿主細胞における宿主標的配列のCas改変をガイドし、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、前記宿主細胞集団の比率を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変化させる、方法。
2.標的ヌクレオチド配列の改変のため、宿主細胞の内因性Casヌクレアーゼを使用する工程を含む、段落1の方法。
3.前記Cas改変を受けていない宿主細胞の対照集団の成長と比較して、少なくとも5分の1宿主細胞集団の成長を低減する工程を含む、段落1又は2の方法。
4.表面上での宿主細胞集団成長を阻害する工程を含む、段落1、2又は3の方法。
5.第1の種が、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有し、混合集団における第1の細菌の成長が、前記HM-システムにより阻害されない、段落1、2、3、又は4の方法。
6.第1の種が、ヒト腸共生種及び/又はヒト腸プロバイオティック種である、段落1〜5のいずれかの方法。
7.第1の種が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)であり、任意選択で、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞である、段落1〜6のいずれかの方法。
8.宿主細胞が、ファーミキューテス門の細胞である、段落1〜7のいずれかの方法。
9.宿主細胞が、ファーミキューテス門の細胞である、段落1〜8のいずれかの方法。
10.宿主細胞が、ファーミキューテス門の細胞である、段落1〜9のいずれかの方法。
11.各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素:(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列;(ii)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列及びリピートを含む遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイ;(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクターの間で分離され、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変し;及び標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減されることを含み、方法が、(iv)のベクターを宿主細胞に導入する工程、及び宿主細胞における前記HM-crRNAを発現させ、HM-cRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変することを可能にする工程を含み、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減され、これにより、細菌の混合集団における前記亜集団の相対比が変更される、段落1〜10のいずれかの方法。
12.構成要素(i)が、各宿主細胞にとって内因性である、段落11の方法。
13.各ベクターが、ウイルス又はファージである、段落12の方法。
14.各標的配列が、隣接NNAGAAW又はNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である、段落11の方法。
15.或いは、HM-crRNA及びtracrRNAが、シングルガイドRNA(gRNA)により含まれ、前記gRNAを宿主細胞に導入する工程又は宿主細胞におけるgRNAを発現させる工程を含む、段落1〜14のいずれかの方法。
16.第1及び第2の種の各々が、それぞれファーミキューテス門の種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、段落1〜15のいずれかの方法。
17.第1及び第2の種の各々が、それぞれグラム陽性種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、段落1〜16のいずれかの方法。
18.ヒト又は動物対象の宿主細胞感染を処置するための、段落1〜17のいずれか1つの方法であって、宿主細胞を第1の抗生物質に曝露する工程を含み、標的配列が、各々、前記第1の抗生物質に対する抵抗性についての抗生物質抵抗性遺伝子により含まれ、宿主細胞感染が、対象において処置される、方法。
19.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置するか、又はリスクを低減するための、段落1〜18のいずれか1つの方法であって、疾患又は状態が、前記第2の細菌種により媒介され、第1の細菌が、ヒトとプロバイオティック、共生又は相利共生であり(例えば、ヒト腸において)、第1の細菌細胞が、前記標的配列を含まず、前記Casによる標的配列改変が、行われ、宿主細胞の成長が、前記対象において阻害されるが、第1の細胞の成長は、阻害されず、疾患又は状態が処置されるか、又は疾患又は状態のリスクが、前記対象において低減される、方法。
20.産業用又は医療用流体、表面、装置若しくは容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、段落1〜19のいずれか1つの方法であって、前記宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により含まれるか、又はそれ上にあり、宿主細胞成長が阻害され、これにより、前記処置を行う、方法。
21.各宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、ビブリオ属又はクロストリジウム属の細胞である、段落1〜20のいずれか1つの方法。
22.各標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、段落1〜21のいずれか1つの方法。
23.混合集団におけるバクテロイデスの比率を増大させるための、段落7の方法であって、前記増大が生じる、方法。
24.Bテタイオタオミクロン及び/又はフラジリスの比率が、増大される、段落23の方法。
25.混合集団により含まれるバクテロイデス門対ファーミキューテス門又はグラム陽性宿主細胞の相対比が、増大される、段落7の方法。
26.Bテタイオタオミクロン及び/又はフラジリスの比率が、増大される、段落25の方法。
27.ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくするための、段落1〜24のいずれかの方法。
28.態様1の産物を含む細菌培養物を産生する工程、及び培養物をヒト又は動物に投与し、これにより、前記ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくする工程を含む、段落27の方法。
29.ヒト又は動物における腸バクテロイデス(例えば、Bテタイオタオミクロン(thetaiotamicron))によるパネート細胞刺激のための、段落1の方法であって、混合集団が、バクテロイデス第1の細菌を含む腸内細菌を含み、態様1の産物が、前記ヒト又は動物において産生されるか、又はヒト又は動物に投与され、これにより、パネート細胞が刺激される、方法。
30.ヒト又は動物において腸バクテロイデス(例えば、Bフラジリス)に対する免疫応答を発生させるための、態様1の方法であって、混合集団が、バクテロイデス第1の細菌を含む腸内細菌を含み、態様1の産物が、前記ヒト又は動物において産生されるか、又はヒト又は動物に投与され、これにより、前記免疫応答が発生する、方法。
【０４０３】
本発明のさらなる例示される条項
本発明はまた、異なる種及び株の混合微生物集団における1回目の成功した宿主細胞標的化及び内因性又は外来(ベクターによりコードされるCas)の使用のための確立である、以下の実施例6において例示される、以下の条項1以降に関する。
1.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、Casヌクレアーゼをコードする複数のベクター及び宿主改変(HM)crRNAと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてベクターによってコードされるCas及びHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてベクターによってコードされるCasとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casヌクレアーゼを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
2.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
宿主細胞集団成長を少なくとも5、10-、100、1000、10000、100000又は1000000倍低減する、方法。
3.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
表面での宿主細胞集団成長を阻害する、方法。
4.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
第1の種は、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有し、混合集団中の第1の細菌の成長は、前記HMシステムによって阻害されない、方法。
5.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、第3の細菌種を含む、方法。
6.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
工程(a)の混合集団は、宿主細胞と同一種の細菌細胞の更なる亜集団を含み、前記更なる亜集団の細菌細胞は、前記標的配列を含まない、方法。
前記さらなる亜集団の細胞は、前記HM-CRISPR/Casシステムの存在下で死滅されないか、又は宿主細胞集団成長が、前記システムの存在下で低減される。
7.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更し、
各宿主細胞は、複数の前記標的配列を含む、方法。
8.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
宿主細胞において、Cas発現が誘導され、それによって、宿主細胞において前記発現されたCas及びHM-crRNAが組み合わされ、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
9.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAの産生を誘導する工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、HM-cRNAの産生のための遺伝子操作された核酸配列からのRNAの発現は、宿主細胞において誘導可能であり、遺伝子操作された配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
10.第1の細菌亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団を改変する方法であって、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種であり、
a.  細菌叢細菌の混合集団を、宿主改変(HM)crRNAをコードする複数のベクターと組み合わせる工程と、
b.  宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、ベクター遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、宿主細胞においてCasヌクレアーゼとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)前記HM-crRNAをコードするスペーサー及びリピート配列を含む核酸配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードする核酸配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である核酸配列と
を含み、
任意選択で、HMシステムは、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
それによって、HM-crRNAは、宿主細胞において宿主標的配列のCas改変をガイドし、それによって、宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞集団成長を低減し、それによって、前記宿主細胞集団の割合を低減し、混合細菌集団における細菌の前記亜集団の相対比を変更する、方法。
11.Casが、ベクターによりコードされる、条項2〜10のいずれか1つの方法。
12.Casが、宿主細胞ゲノムによりコードされる、条項2〜10のいずれか1つの方法。
13.宿主細胞集団成長を少なくとも5分の1低減する、いずれかの先行する条項の方法。
14.表面上の宿主細胞集団成長を阻害する、いずれかの先行する条項の方法。
15.第1の種が、宿主細胞種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を、混合集団における第1の細菌の成長が、前記HM-システムにより阻害されない、いずれかの先行する条項の方法。
16.第1の種が、グラム陰性種であり、任意選択で、第2の種が、グラム陰性種である、条項15の方法。
17.第1の種が、グラム陽性種であり、第2の種が、グラム陰性種である、条項1〜15のいずれか1つの方法。
18.工程(a)の混合集団が、第3の種を含み、第3の種が、グラム陰性種である、いずれかの先行する条項の方法。
19. 工程(a)の混合集団が、第3の細菌種を含む、いずれかの先行する条項の方法。
20.第3の種が、グラム陽性種である、条項19の方法。
21.第1及び第2の種が、グラム陰性種である、条項20の方法。
22.工程(a)の混合集団が、宿主細胞と同じ種の細菌細胞のさらなる亜集団を含み、前記さらなる亜集団の細菌細胞が、前記標的配列を含まない、いずれかの先行する条項の方法。
23.ベクターが、HM-crRNA配列を含むシングルガイドRNA(HM-gRNA)を発現する、いずれかの先行する条項の方法。
24.方法が、宿主細胞におけるHM-cRNAの産生において内因性宿主細胞RNaseIII及び/又は内因性宿主細胞tracrRNAを使用する工程を含む、条項1〜22のいずれか1つの方法。
25.各宿主細胞が、複数の前記標的配列(例えば、リボソームRNAをコードする配列、例えば、16s rRNAをコードする配列)を含む、いずれかの先行する条項の方法。
26.各宿主細胞が、前記標的配列の少なくとも2、3、4、5、6又は7つのコピーを含む、条項25の方法。
27.前記標的配列が、前記第2の種の細菌において保存される、いずれかの先行する条項の方法。
例えば、標的配列は、前記第2の種の細菌の株において保存され、任意選択で、前記第2の種の細菌の第2の株において保存されない。
28.前記標的配列は、必須遺伝子により含まれ、及び/又は宿主細胞におけるタンパク質発現のため要求される、いずれかの先行する条項の方法。
29.宿主細胞が、前記第2の種の第1の株のものであり、前記遺伝子標的配列が、前記株に存在するが、標的配列が、異なる株のものである第2の種の細菌に存在しない、いずれかの先行する条項の方法。
30.工程(a)の混合集団が、前記異なる株の細菌の亜集団を含む、条項29の方法。
例えば、標的配列は、前記第2の種の細菌の株において保存され、任意選択で、前記第2の種の細菌の第2の株において保存されない。
31.第1の種は、グラム陰性種であり、工程(a)の混合集団は、第3の種の細菌の亜集団を含み、第3の種は、グラム陽性種である、条項30の方法。
32.第1の種が、グラム陽性種であり、工程(a)の混合集団が、第3の種の細菌の亜集団を含み、第3の種が、グラム陰性種である、条項30の方法。
33.第2の種が、グラム陰性種である、条項30、31又は32の方法。
34.第2の種が、腸内細菌科種である、いずれかの先行する条項の方法。
35.第2の種が、大腸菌である、いずれかの先行する条項の方法。
36.第2の種が、ヒト又は動物腸細菌叢種である、いずれかの先行する条項の方法。
37.各種が、環境上の種、又はヒト若しくは動物(例えば、腸)細菌叢種であり、及び/又は宿主細胞が、ヒト細菌叢種の細胞である、いずれかの先行する条項の方法。
38.Cas発現が、宿主細胞において誘導可能である、いずれかの先行する条項の方法。
39.Cas発現が、宿主細胞において誘導される、いずれかの先行する条項の方法。
40.HM-cRNA発現が、宿主細胞において誘導可能である、いずれかの先行する条項の方法。
41.HM-crRNA発現が、宿主細胞において誘導される、いずれかの先行する条項の方法。
42.細菌宿主細胞を形質転換する能力があるベクターであって、ベクターが、宿主細胞において発現可能である(i)SピオゲネスCas9ヌクレオチド配列、(ii)任意選択で、いずれかの先行する条項の方法における使用のための、いずれかの先行する条項において定義された少なくとも1つのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の挿入物を収容する能力があり、ベクターが、(i)(及び任意選択で、(ii))を含むとき、ベクターが、宿主細胞を形質転換し、Cas(及び任意選択で、少なくとも1つのHM-crRNA(例えば、gRNA)を発現する能力がある、ベクター。
43.発現されるCasが、Cas9である、条項42のベクター。
代替において、発現されるCasは、Cas3、例えば、大腸菌Cas3である。発現されるCasは、Casを宿主細胞における1つ又は複数の標的配列に標的化するよう、宿主細胞において発現されるHM-crRNAと作動可能である。
44.ヒト又は動物における疾患又は状態を処置又は予防するためであるか、又はヒト又は動物における疾患又は状態を処置又は予防する、いずれかの先行する条項の方法又はベクター。
45.項42から44のいずれか1つのベクターをそれぞれ含む複数の細菌宿主細胞であって、ベクターによってコードされるCas(及び任意選択で、前記HMcrRNA)は、宿主細胞において発現される、又は発現可能であり、細菌細胞は、第1の亜集団及び第2の細菌亜集団を含む細菌叢細菌の混合集団により含まれ、第1の亜集団は、第1の細菌叢種を含み、第2の亜集団は、第2の細菌叢種の宿主細胞集団(前記複数の細菌宿主細胞)を含み、第2の種は、第1の細菌叢種とは異なる種である、複数の細菌宿主細胞。
46.ヒト又は動物における疾患又は状態を処置又は予防するための、条項45の複数の細胞。
47.第1の細菌叢種が、ヒト腸共生種及び/又はヒト腸プロバイオティック種である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
48.第1の細菌叢種が、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)であり、任意選択で、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
49.宿主細胞集団が、ファーミキューテス門細胞からなる、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
50.各宿主細胞について、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列;
(ii)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むHM-crRNAをコードするスペーサー配列及びリピートを含む遺伝子操作されたHM-CRISPRアレイ;
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)システムの前記成分が、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも1つの核酸ベクターの間の分離であり、これにより、HM-crRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変する、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、
標的配列が、Casにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減され;
(iv)のベクターを宿主細胞に導入する工程及び宿主細胞における前記HM-crRNAを発現させて、HM-cRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する工程を含み、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が、低減され、これにより、細菌の混合集団における前記亜集団の相対比を変更する、方法、ベクター又は複数の細胞。
51.各ベクターが、ウイルス又はファージであり、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
52.各標的配列が、隣接NNAGAAW又はNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
53.第1及び第2の種の各々が、それぞれのファーミキューテス門種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
54.第1及び第2の種の各々が、それぞれのグラム陽性種であり、第1の細菌の成長が、HM-システムにより阻害されない、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
55.ヒト又は動物対象の宿主細胞感染を処置するための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、宿主細胞を第1の抗生物質に曝露する工程を含み、標的配列が、各々、前記第1の抗生物質に対する抵抗性についての抗生物質抵抗性遺伝子により含まれ、宿主細胞感染が、対象において処置される、方法、ベクター又は複数の細胞。
56.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置するための、又はリスクを低減するための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、疾患又は状態が、前記第2の細菌種により媒介され、第1の細菌種が、ヒトとプロバイオティック、共生又は相利共生であり(例えば、ヒト腸において)、第1の細菌種細胞が、前記標的配列を含まず、前記Casによる標的配列改変が、行われ、宿主細胞の成長が、前記対象において阻害されるが、第1の細菌種細胞の成長が、阻害されず、疾患又は状態が、処置されるか、又は前記対象における疾患又は状態の成長が、低減される、方法、ベクター又は複数の細胞。
57.産業用又は医療用流体、表面、装置若しくは容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、前記宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により含まれる、宿主細胞成長が阻害され、これにより、前記処置を行う、方法、ベクター又は複数の細胞。
58.各宿主細胞が、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ属、リステリア属、大腸菌、デスルホビブリオ属、ビブリオ属又はクロストリジウム属の細胞である、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
59.各標的配列が、抗生物質抵抗性遺伝子、病原性遺伝子又は宿主細胞の必須遺伝子により含まれる、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
60.前記増大が行われる、混合集団におけるバクテロイデスの比率を増大させるための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
61.Bテタイオタオミクロン及び/又はBフラジリス(fragilis)の比率が、増大される、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
62.混合集団により含まれるバクテロイデス門対ファーミキューテス門若しくはグラム陽性宿主細胞の相対比が、増大される、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
63.ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくするための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞。
64.条項1の産物を含む細菌培養物を産生する工程、及び培養物をヒト又は動物に投与し、これにより、前記ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくする工程を含む、いずれかの先行する条項の方法。
例えば、方法が、態様1の産物を含む細菌培養物を産生する工程、及び培養物をヒト又は動物に投与し、これにより、前記ヒト又は動物における共生又は相利共生バクテロイデス門を好ましくする工程を含む。
65.ヒト又は動物における腸バクテロイデス(例えば、Bテタイオタオミクロン)によるパネート細胞刺激のための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、第1の細菌種が、バクテロイデス種であり、方法が、前記ヒト又は動物における前記変更された比率を含む混合集団を産生する工程、及び前記変更された比率を含む前記混合集団をヒト又は動物に投与し、これにより、パネート細胞が刺激される工程を含む、方法、ベクター又は複数の細胞。
66.ヒト又は動物における腸バクテロイデス(例えば、Bフラジリス)に対する免疫応答を発生させるための、いずれかの先行する条項の方法、ベクター又は複数の細胞であって、第1の細菌種が、バクテロイデス種であり、方法が、前記ヒト又は動物において産生される前記変更された比率を含む混合集団を産生する工程、及び前記変更された比率を含む前記混合集団をヒト又は動物に投与し、これにより、前記免疫応答が発生する工程を含む、方法、ベクター又は複数の細胞。
【０４０４】
実施形態において、複数のベクターが、各々が、宿主細胞におけるCasの発現のための前記Casをコードするヌクレオチド配列、及び細胞における1つ又は複数のcrRNA(例えば、シングルガイドRNAにより含まれる)を発現させるためのヌクレオチド配列を含むベクターを含む。
【０４０５】
実施形態において、ベクターが、複数のCasタンパク質(例えば、Cas9及びCas1(及び/又はCas2);又はI型CasA、B、C、D、E及びCas3)をコードする。実施形態において、Casは、Cas9、dCas9又はCas3(例えば、I型Cas3又は大腸菌Cas3又はサルモネラ・チフィリウムCas3)である。
【０４０６】
実施形態において、各ベクターが、Casヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列及び宿主改変(HM)crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列を含む。
【０４０７】
実施形態において、ベクターは、少ないコピー数のベクター、例えば、プラスミド又はファージミドを含む。別の実施形態において、ベクターは、多いコピー数のベクター、例えば、プラスミド又はファージミドを含む。
【０４０８】
実施形態において、各HM-crRNAが、ベクターの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞においてベクターによりコードされるCasとともに作動可能である。複数のHM-crRNAは、同じ、それぞれの宿主細胞においてベクターによりコードされるCasとともに作動可能であってもよい。
【０４０９】
実施形態において、第2の種は、グラム陽性種である。実施形態において、第2の種は、グラム陰性種である。実施形態において、第1又は第3の種は、Lラクチスである。実施形態において、第1又は第3の種は、Bスブチリスである。実施形態において、第1のものは、Lラクチスであり、第3の種は、Bスブチリスである。実施形態において、第1のものは、Lラクチスであり、第3の種は、Bスブチリスである。一例では、第2の種は、大腸菌である。一例では、第3の種は、PEAを含有する培地、例えば、PEA1リットル当たり2.5gを含有するTH培地において又は上で成長する能力がある。一例では、混合集団が、第1、第2及び第3の種と異なる、第4の細菌種の第4の細菌亜集団を含む。
【０４１０】
実施形態において、前記ベクターは、例えば、寒天ゲル上のような、表面上で、インビトロでの宿主細胞集団成長を、インビトロでの少なくとも5、10、100、1000、10000、100000又は1000000倍低減する能力がある。例えば、方法は、前記Cas改変を受けていない宿主細胞の対照集団の成長と比較して、宿主細胞集団成長を少なくとも前記倍率低減する工程を含む。実施形態において、前記ベクターは、インビトロでの宿主細胞集団成長を、第3の種(及び任意選択で、第4の種も)の存在下で、インビトロでの少なくとも5、10、100、1000、10000、100000又は1000000倍低減する能力があり、第1、第2、第3及び第4の種が、互いに異なる。
【０４１１】
一例では、宿主細胞集団が、表面上にあり、これにより、宿主細胞集団成長が、前記表面上で阻害される。
【０４１２】
実施形態において、各ベクターが、複数のHM-CRISPRアレイを含む。実施形態において、システム又は各ベクターが、HM-crRNA(例えば、gRNA)をコードする核酸配列の2、3つ以上のコピーを含み、コピーが、宿主細胞配列(例えば、病原性、抵抗性又は必須遺伝子配列)を標的化するための同じスペーサー配列を含む。
【０４１３】
一例では、方法は、インビトロのものである。一例では、方法は、インビボ(例えば、ヒト又は動物における、例えば、その腸マイクロバイオームにおいて;又は植物において又は上)のものである。
【０４１４】
一例では、方法は、(a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門の細菌の部分の変更;(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス門亜集団(宿主細胞)の比率の低減;(c)混合集団における第1のファーミキューテス門種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のファーミキューテス門種を含む、低減;(d)混合細菌集団における第1のグラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない第2のグラム陽性細菌種を含む、低減;(e)混合細菌集団における細菌種(宿主細胞)の比率の低減であって、混合集団が、成長が前記cRNAにより阻害されない異なる細菌種を含み、第1の種が、他の種の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に対して少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を含む、低減;(f)混合細菌集団における第1の細菌ヒト腸細菌叢種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸プロバイオティック種である、低減;又は(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸細菌叢種((宿主細胞、例えば、ファーミキューテス門)の比率の低減であって、混合集団が異なる細菌種を含み、異なる種が、成長が前記cRNAにより阻害されないヒト腸共生種である、低減のための、前記変更又は低減が行われる(例えば、エクスビボ、インビボ又はヒト若しくは動物細菌叢(例えば、腸細菌叢))。
【０４１５】
疾患又は状態は、(例えば、本明細書において述べられる腸若しくは皮膚細菌叢又はマイクロバイオームのような、細菌叢又はマイクロバイオームにおける)ヒト又は動物における前記第2の種の細胞の存在により媒介されるか、又は関連する。一例では、第2の種が、(方法の対象である前記動物の同じ種の)ヒト又は動物にとって病原性であり、方法は、前記第2の種の細胞により感染を処置するか、又は予防する。
【０４１６】
本明細書における任意の態様、段落、実施形態、例、概念又は構成は、組み合わされるか、又は本明細書における以下の任意の条項1に準用されてもよい。方法、システム、ベクター又は複数の細胞は、本明細書において開示される任意の方法における使用又は使用のため使用されてもよい。
【０４１７】
米国公開第20160333348号の開示並びにその継続出願及び一部継続出願(本出願を除く)は、参照により取り込まれ、本明細書における任意の態様、段落、実施形態、例、概念又は構成は、組み合わされるか、又は明細書における以下の任意の条項1に準用されてもよい。
【０４１８】
プログラムヌクレアーゼ、標的化胞子形成種、Cディフィシル、Bスブチリス、大腸菌、サルモネラ菌等
本発明のさらなる構成は、以下を提供する。
宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされるガイド型ヌクレアーゼであって、これにより、プログラムされたヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列を改変する能力があり、任意選択で、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる。
【０４１９】
本発明のさらなる構成の第1の態様は、以下を提供する。
ヌクレアーゼは、宿主細胞における宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムの一部として作動可能であるCasヌクレアーゼであり、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)(a)HM-crRNAをコードするスペーサー配列及び1つ又は複数のリピート配列を含む遺伝子操作された核酸配列であって、スペーサーが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含み;又は(b)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むガイドRNA(例えば、シングルガイドRNA)をコードする遺伝子操作されたヌクレオチド配列、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)構成要素(ii)が、宿主細胞を形質転換し、これにより、HM-crRNA又はガイドRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変する能力がある核酸ベクターにより含まれ、
標的配列が、Casヌクレアーゼにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減される。
【０４２０】
本発明のさらなる構成の第2の態様は、以下を提供する。
ヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼであり、
(a)Casヌクレアーゼは、配列番号273又は275〜286のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列に少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号273のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号138〜209又は290〜513から選択されるリピート配列及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(b)Casヌクレアーゼが、配列番号261又は263又は287〜289から選択されるアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(c)Casヌクレアーゼが、配列番号265のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列に少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号265のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号215〜218から選択されるリピート配列及びNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(d)Casヌクレアーゼが、配列番号267又は269のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、リピート配列の配列番号214とともに作動可能である。
【０４２１】
これらの態様は、宿主細胞が、Cディフィシル細胞;大腸菌細胞;Sサーモフィルス細胞;又はSエンテリカ細胞である場合、特に有用である。例えば、システムは、ヌクレアーゼをプログラム化するためのRNA(例えば、cRNA又はシングルgRNA)をコードするベクター(例えば、バクテリオファージ又はファスミド)との組合せにおける前記細胞の内因性Cas3及びカスケードを含んでもよい。一例では、このようなベクターは、例えば、対象におけるCディフィシル、大腸菌又はサルモネラ感染を処置又は予防するための、ヒト又は動物対象への投与のための、本明細書において開示される担体、例えば、ラクトバチルス属(例えば、Lロイテリ)担体により含まれ得る。
【０４２２】
本発明は、一部、ある種の因子及びレギュロンが、Cディフィシル及び枯草菌のような、ファーミキューテス門における胞子形成中に遺伝子発現を制御し、したがって、これらが、特に、宿主を死滅させるためか、又は宿主細胞集団の成長を低減するための、宿主ゲノムのヌクレアーゼにより媒介される改変に適当な標的を作製するという知見に基づく。
【０４２３】
クロストリジウム・ディフィシル、グラム陽性、嫌気性、胞子形成細菌は、緊急の病原体であり、院内下痢症の最も主要な原因である。クロストリジウム・ディフィシルは、病院を含む環境においてこの細菌の残留性を促進する抵抗性の胞子を生じる。その伝播は、胞子による腸の汚染により媒介される。4つのシグマ因子σF、σE、σG及びσKにより支配されるコンパートメント特異的遺伝子発現のカスケード。CディフィシルのSpoIIIDはまた、σEレギュロンの多くのメンバーの転写を表し、sigK発現を活性化する母細胞株の発現において役割を果たす。前胞子産物SpoIIRは、プロ-σEのプロセシングに要求される。Spo0AとσHの両方が、効率的なCディフィシル胞子形成に要求される。これらの種類の因子、対照及び相互作用は、ファーミキューテス門の間で胞子形成プロセスにおいて重要である。
【０４２４】
2種の巨大な毒素、エンテロトキシンTcdA及び細胞毒TcdBは、Cディフィシル感染(CDI)の症状の発生に要求される主要な病原性因子である。
【０４２５】
枯草菌における胞子形成の開始時に、胞子形成している細胞は、胞子細胞をより大きな母細胞及びより小さな前胞子(将来の胞子)に分割する非対称の分裂を経験する。次に、前胞子は、母細胞により完全に飲み込まれ、より後の休眠胞子は、溶解により母細胞から放出される。胞子形成の発生プログラムは、主に、4つのシグマ因子:σF、σE、σG及びσKの順次活性化により支配される。それらの活性は、σF及びσGについて前胞子に、σE及びσKについて母細胞に限定される。遺伝子発現のコンパートメント化は、非対称の分裂後に活性化するσF及びσE及び母細胞による前胞子の貪食の完了後のσG及びσKを用いた形態形成と結び付けられ。
【０４２６】
枯草菌において、遺伝子発現における協調した変化が、母細胞と前胞子の間のコミュニケーションの存在を含む2つのコンパートメントにおける分裂前の胞子嚢と後の胞子嚢の両方における形態学的分化の根底にある。応答制御因子Spo0A、及びホスホリレーに関与する5つのキナーゼ、直ちにリン酸化されるタンパク質及びホスファターゼ制御胞子形成の開始。代替のシグマ因子σHは、spo0Aを翻訳し、sigFはまた、早期胞子形成工程を制御する。Spo0A-Pレベルが、臨界閾値に達したとき、Spo0A-Pが、spoIIEを含む胞子形成遺伝子を活性化し、並びにそれぞれ、σF及びσEをコードするspoIIAA-spoIIAB-sigFとspoIIGA-sigEオペロンの両方を活性化する。その合成後、ホスファターゼSpoIIEが、抗抗シグマ因子SpoIIAAを脱リン酸化し、これにより、非対称の細胞分裂の完了後のSpoIIABから活性なσFの放出を導くまで、σFは、抗シグマ因子SpoIIABにより不活性を維持される。次に、σFは、母細胞におけるプロ-σEの活性なσEへのプロセシングに要求される分泌タンパク質をコードするspoIIRを含む前胞子における約50種の遺伝子を転写する。σEは、順に、母細胞に特異的な遺伝子の発現を制御し、SpoIIID制御因子の合わせた活性を用いてsigK発現を活性化する。前胞子において、σFはまた、sigG転写を制御する。しかしながら、σGは、母細胞による前胞子貪食の完了と同時に活性になる。貪食完了後、σEにより制御されるSpoIIIAタンパク質は、前胞子特異的なSpoIIQタンパク質と一緒に、前胞子における巨大分子合成の可能性を維持することが要求される。RNAポリメラーゼσGホロ酵素は、胞子形成の最後の因子シグマであるσKのプロセシング及び活性化に関与するSpoIVB又はCtpB様のタンパク質を含む前胞子における95種の遺伝子を転写した。
【０４２７】
4種の胞子形成に特異的なシグマ因子は、クロストリジウムにおいて保存され、Cディフィシルに存在する。これはまた、胞子形態形成に関与する鍵遺伝子についての場合である。抵抗性胞子は、両方のクロストリジウムのsigF及びsigG変異体により、並びにCアセトブチリカムのsigE変異体により形成され、一方、CパーフリンジェンスのsigE及びsigK変異体は、胞子形成するそれらの能力において著しく欠損している。興味深いことに、CアセトブチリカムのsigE及びsigF変異体は、非対称の分裂中隔を形成するのに失敗し、一方、sigK変異体が、CパーフリンジェンスにおけるsigE変異体より、胞子形成におけるより早期に遮断される。CディフィシルsigF及びsigE変異体は、非対称の段階において静止し、一方、sigG変異体は、貪食の完了後に遮断されるが、枯草菌においてとは異なり、前胞子の周りでの電気密度コート物質の蓄積を示す。これらの変異体は、胞子形成することができない。CディフィシルのsigK変異体は、同質遺伝子野生型株より4桁少ない大きさの熱抵抗性を形成する。発生している胞子の周りでのコート沈着の徴候を示さない一方、この変異体は、少なくとも一部の皮質物質の蓄積を示す。
【０４２８】
枯草菌における胞子形成の特徴は、遺伝子発現の前胞子と母細胞特異的な株を結び付ける細胞と細胞のシグナル伝達経路の存在である。これらの経路は、胞子形成の決定的な形態学的な段階において作動するので、結果は、形態形成の経過と密接に一致した、2つのラインの遺伝子発現の協調した展開である。実際、σFは、母細胞におけるプロ-σEのσEへの活性化に要求され、σEは、順に、前胞子においてσGを活性化するのに必要である。最後に、σGは、母細胞におけるプロ-σKのσKへの活性化に要求される。枯草菌において、σFは、前胞子内部の膜を超えて膜間の空間に分泌される、シグナル伝達タンパク質SpoIIRの産生をもたらし、そこで、それは、母細胞におけるSpoIIGA依存性プロ-σEプロセシングを刺激する。spoIIR遺伝子の不活性化は、Cディフィシルの胞子形成する完全な不能をもたらすことが観察されている。
【０４２９】
枯草菌において、σG活性の大部分は、貪食完了後に生じる。加えて、飲み込まれた前胞子におけるsigG標的遺伝子の発現は、少なくとも一部、SpoIIIAタンパク質の合成を通じた母細胞におけるσE活性化に依存する。枯草菌において、sigGは、プロ-σKプロセシングの制御を通じて母細胞におけるσKレギュロンの発現を調節する。sigG変異体は、貪食完了直後に遮断され、前胞子の周りの表面層の構築の兆候を全く示さない。
【０４３０】
Cディフィシルにおいて、幾つかの遺伝子は、胞子形成に必須であると同定され:胞子形成の主要な制御因子をコードする、spo0A、及び移行期の鍵となるシグマ因子であるσHをコードする、sigH、その両方が、Cディフィシルにおける胞子形成に要求されることがすでに示されている。それらの活性を調節するタンパク質(SpoIIAA、SpoIIAB、SpoIIE、及びSpoIIGA)と一緒に、前胞子と母細胞特異的な早期RNAポリメラーゼシグマ因子(それぞれ、σF及びσE)の両方を含む、Spo0A及びσHにより直接調節され、従って、胞子形成の開始に関与する遺伝子がまた、同定される。胞子形成のステージIIに関与する遺伝子(spoIIQ、spoIID、spoIIP、及びspoIIR)、ステージIIIに関与する遺伝子(spoIIIAA、spoIIIAB、spoIIIAD、spoIIIAE、spoIIIAF、spoIIIAG、spoIIIAH、及びspoIIID)、並びにステージIV(spoIVA、spoIVB'、及びsipL)を含む、σF及びσEレギュロンにおける多くの遺伝子はまた、胞子形成に要求されると思われる。これらの遺伝子の間で、spoIIRは、既に特徴決定され、spoIID、spoIIP、spoIIQ、及びspoIIIA遺伝子座に属する遺伝子は、前胞子貪食に関与する枯草菌タンパク質の相同体をコードするので、顕著である。SpoIIIDは、sigK発現を活性化し、胞子形態形成中に幾つかの補助的役割を果たす、母細胞制御性ネットワークの重大な成分であり、一方、spoIVA及びsipLは、前胞子の表面へのコートタンパク質の標的化に関与する鍵となる胞子形態形成タンパク質をコードする。Cディフィシルにおける胞子形成を調節するシグナル伝達カスケードにおける後の工程を制御する分子機序についてはほとんど知られていないが、これらのプロセスに関与すると考えらえる多数の遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、後期前胞子特異的シグマ因子σGをコードする、sigG、並びにσGレギュロン、spoIVB、spoVAC、spoVAD、及びspoVAEに属する遺伝子を含んだ。2つの小さい酸溶解性タンパク質をコードする遺伝子、SspA及びSspBを含む、胞子形成に関与する他の注目すべき遺伝子が、この群において同定された。
【０４３１】
trpS、metK、及びCD0274は、Cディフィシル630Δermにおいて必須であることが示されている。従って、一例では、標的配列は、trpS、metK又はCD0274により含まれる。
【０４３２】
胞子形成は、特に、鍵となる制御因子成分Spo0A並びに4つの胞子形成特異的シグマ因子σE、σF、σG、及びσKに関する、クロストリジウム目及びバチルス目の間で大いに保存されている古代の細菌細胞分化プログラムである。Spo0AとσH両方が存在し、Cディフィシルにおける胞子形成に要求される一方、CディフィシルにおけるSpo0Aのリン酸化は、枯草菌におけるSpo0A活性を調節する複雑なリン酸リレーと異なる単純な2成分システムを含む。胞子は、最初の感染性因子であり、研究により、胞子形成の優れた制御因子であるSpo0Aを産生することができないCディフィシルの変異体株が、環境において効率的に持続し、疾患を伝播することができないことが示された。従って、一例では、標的配列は、Spo0Aにより含まれる。従って、一例では、標的配列は、Spo0A、trpS、metK、及びCD027:胞子形成に特異的なシグマ因子(例えば、σH、σE、σF、σG、及びσK)をコードする遺伝子配列、sigF、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、sigK、SpoIIID、sigE、sigF又はsigGにより含まれる。
【０４３３】
一例では、標的配列は、σF、σE、σG及びσKレギュロン、例えば、Cディフィシルのレギュロンにより含まれる遺伝子により含まれる。一例では、標的配列は、spoIIAA-spoIIAB-sigF又はspoIIGA-sigEオペロンにより含まれる遺伝子により含まれ、例えば、細胞は、Cディフィシル細胞である。spoIIAA-spoIIAB-sigFオペロンは、合成に関与し、σFの活性化/不活性化は、RNAポリメラーゼσH補酵素により転写され、Spo0Aにより正に調節される。poIIGA-sigE-sigG遺伝子座は、sigGにより調節される遺伝子、例えば、SpoVA、SspA、SspB及びPdaA様の胞子形成に鍵となるものを含む。
【０４３４】
胞子形成におけるSpoVT:枯草菌における前胞子制御性ネットワークに関与する2つの転写制御因子RfsA及びSpoVTの役割。SpoVTは、σGレギュロンのメンバーの約半分の合成を調節する。RfsAは、Cディフィシル及び幾つかのクロストリジウムのゲノムに存在せず、一方、SpoVTのオルソログ(枯草菌のSpoVTと55%同一)が存在する。
【０４３５】
SpoIIIDレギュロン:枯草菌において、SpoIIIDは、σE標的遺伝子のほぼ半分を正又は負に調節する。枯草菌及びCディフィシルにおいて、SpoIIIDは、σEレギュロンの多くのメンバーの転写のスイッチを切り、sigKの発現及びσKレギュロンのメンバーの発現のスイッチを入れる、母細胞株の遺伝子発現において中心的な役割を果たす。一例では、標的配列は、例えば、Bスブチリス又はCディフィシル細胞の、SpoIIIDレギュロンにより含まれる。
【０４３６】
本発明の本構成は、以下の記載において更に記載される。
【０４３７】
記載
1.宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされるガイド型ヌクレアーゼであって、これにより、プログラムされたヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列を改変する能力があり、任意選択で、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる。
一例では、ヌクレアーゼは、RNA(例えば、crRNA)により人工的にプログラムされる。
シグマ因子は、プロモーターの認識及び開口、並びにRNA合成における開始工程を含む、転写開始において重要な役割を果たす細菌RNAポリメラーゼ(RNAP)の複数のドメインサブユニットである。
2.ヌクレオチド配列が、転写が、宿主細胞種又は株におけるシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、記載1のヌクレアーゼ。
3.ヌクレオチド配列が、宿主細胞種又は株におけるシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
4.ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
5.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により宿主細胞種の細胞において調節される、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
6.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
7.シグマ因子が、Cディフィシル又はBスブチリスσE;σF;σG;σH;若しくはσK、その相同体又はオルソログである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
実施形態において、相同体、オルソログ又は均等物は、選択された遺伝子と同じ機能を有するか、又は選択された遺伝子によりコードされる産物と同じ機能を有する産物をコードする。
8.シグマ因子が、配列番号223、225、227、239及び243から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、細胞は、Cディフィシル細胞である。
9.ヌクレオチド配列が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
10.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、宿主細胞は、Cディフィシルではない種のものである。
実施形態において、相同体、オルソログ又は均等物は、選択された遺伝子と同じ機能を有するか、又は選択された遺伝子によりコードされる産物と同じ機能を有する産物をコードする。
相同体:共通の祖先DNA又はタンパク質配列からの継承による、第2の遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列に関連する遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列。用語、相同体は、遺伝子複製現象により分けられる遺伝子間の関連又は遺伝子複製現象により分けられる遺伝子間の関係に適用し得る。
オルソログ:オルソログは、種分化により、共通の先祖遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列から進化した異なる種における遺伝子、ヌクレオチド又はタンパク質配列である。通常、オルソログは、進化の経過において同じ機能を保持する。
11.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるヌクレオチド配列により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
12.標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるアミノ酸配列をコードする、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
13.標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB又はCtpB遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
14.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
15.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
16.標的配列が、ステージI、II、III、IV又はVの胞子形成遺伝子により含まれるか、又は胞子コートタンパク質をコードする、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
17.ヌクレアーゼが、さらなるプログラム化ヌクレアーゼと組み合わせた状態にあり、さらなるヌクレアーゼが、宿主細胞のさらなる標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされ、これにより、さらなるプログラム化ヌクレアーゼが、さらなるヌクレオチド配列を改変する能力があり、任意選択で、さらなるヌクレオチド配列が、宿主細胞における前記シグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
一例では、ヌクレアーゼは、同じタイプのヌクレアーゼ、例えば、Cas3又は9のコピーである。一例では、ヌクレアーゼは、宿主細胞にとって内因性である(例えば、内因性I型CディフィシルCasヌクレアーゼ)。
18.さらなる標的配列が、記載9〜16のいずれか1つにおいて列挙される遺伝子又は配列により含まれる、記載17のヌクレアーゼ。
19.その又は各ヌクレアーゼが、宿主細胞の内因性Casである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、Casヌクレアーゼ、ベクター又はシステムは、宿主細胞により含まれる。
20.その又は各ヌクレアーゼが、宿主細胞に感染するか、又は形質転換する能力がある核酸ベクター(例えば、バクテリオファージ、ファスミド又は接合プラスミド)により含まれるCasである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
21.その又は各ヌクレアーゼが、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるヌクレオチド配列によりコードされるCasから選択されるCasである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
22.その又は各ヌクレアーゼが、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択されるアミノ酸配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるアミノ酸配列を含むCasから選択されるCasである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
23.その又は各ヌクレアーゼが、配列番号138〜218から選択される(例えば、配列番号138〜209から選択される)リピート配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)であるリピート配列とともに作動可能であるCasであり、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
24.宿主細胞が、胞子形成する細菌種の細胞である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
25.カスケードが、宿主細胞種において胞子形成を調節する、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
26.宿主細胞が、ファーミキューテス門、クロストリジウム目、クロストリジウム属、ペプトストレプトコッカス目、クロストリディオイデス目又はバチルス属の種、例えば、表18において列挙されるCディフィシル株のものである、いずれかの先行する記載(例えば、記載24又は25)のヌクレアーゼ。
実施形態において、株は、630、ATCC43255、CD3、R20291、CD69、CD002、CF5及びM120から選択される。一例では、株は、Cディフィシル630である。
27.前記改変が、宿主細胞により含まれる染色体又はエピソーム配列を切断する、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
染色体又はエピソーム配列が、標的配列を含む。
28.前記改変が、宿主細胞を死滅させるか、又は細胞の成長又は増殖を低減する、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
29.ヌクレアーゼが、インビトロのものである、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
30.ヌクレアーゼが、任意選択で、遺伝子操作されたcrRNA又はガイドRNA(例えば、シングルgRNA)を用いてプログラムされるCasヌクレアーゼ(例えば、Cas3若しくは9、又はcpf1)である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
31.ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼをコードする核酸ベクター(例えば、バクテリオファージ又はファスミド)及び任意選択で、ヌクレアーゼをプログラムするための、1つ又は複数のRNAと組み合わせた状態にある、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
32.ヌクレアーゼが、I型Cas3であり、前記ベクターが、1つ又は複数のCASCADE Cas(例えば、CasA、B、C、D及びE並びに/又はCas1若しくはCas2)をコードするか、又は前記ベクターが、前記CASCADE Casをコードする第2のベクターと組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、標的配列を改変するための前記CASCADE Casとともに作動可能である、記載31のヌクレアーゼ。
33.ヌクレアーゼが、I型Cas3であり、宿主細胞において1つ又は複数のCASCADE Cas(例えば、CasA、B、C、D及びE並びに/又はCas1若しくはCas2)と組み合わせた状態にあり、CASCADE Casの1つ又は複数が、宿主細胞の内因性ヌクレオチド配列によりコードされ、前記Cas3が、標的配列を改変するための前記CASCADE Casとともに作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
34.ヌクレアーゼが、I型Cas(例えば、I-B、-C又は-E型Cas、例えば、Cas3)である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
任意選択で、ヌクレアーゼが、CASCADE Casである。
35.Casヌクレアーゼ(及び任意選択で、CASCADE Cas)が、大腸菌、Cディフィシル、サルモネラ  エンテリカ又はSサーモフィルスのCas3である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
36.ヌクレアーゼが、宿主細胞における宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムの一部として作動可能であるCasヌクレアーゼであり、システムが、(i)〜(iv)に記載の構成要素を含み、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの核酸配列、
(ii)(a)HM-crRNAをコードするスペーサー配列及び1つ又は複数のリピート配列を含む遺伝子操作された核酸配列であって、スペーサーが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含み;又は(b)宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、前記Casヌクレアーゼを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する配列を含むガイドRNA(例えば、シングルガイドRNA)をコードする遺伝子操作されたヌクレオチド配列、
(iii)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列、
(iv)構成要素(ii)が、宿主細胞を形質転換し、これにより、HM-crRNA又はガイドRNAが、Casを標的にガイドして、宿主細胞における宿主標的配列を改変する能力がある核酸ベクターにより含まれ、
標的配列が、Casヌクレアーゼにより改変され、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が低減される、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
或いは、Casヌクレアーゼは、宿主細胞における標的配列の転写又はそれからの転写を表すためのdCasである。
任意選択で、方法は、(iv)のベクターを宿主細胞に導入する工程及び宿主細胞における前記HM-crRNAを発現させて、HM-cRNAが、宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的にガイドして、標的配列を改変する工程を含み、これにより、宿主細胞が死滅するか、又は宿主細胞成長が、低減され、これにより、細菌の混合集団における前記亜集団の相対比を変更する。
37.(iv)の前記ベクターとの組合せにおける、記載36のヌクレアーゼ。
38.成分(i)が、(iv)のベクターにより、又は異なるベクターにより含まれる、記載37のヌクレアーゼ。
39.ヌクレアーゼが、宿主細胞の内因性核酸配列によりコードされる、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ。
この例において、宿主細胞は、内因性ヌクレアーゼ活性を含む。
40.記載36〜39のいずれか1つにおいて定義される、宿主改変システム。
41.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、宿主が、前記Casヌクレアーゼ又はその相同体若しくはオルソログをコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、前記Casヌクレアーゼが、宿主細胞において作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
42.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、
(a)Casヌクレアーゼが、配列番号273のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号273のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号138〜209から選択されるリピート配列及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(b)Casヌクレアーゼが、配列番号261又は263のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号210〜213から選択されるリピート配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(c)Casヌクレアーゼが、配列番号265のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列に少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号265のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、配列番号215〜218から選択されるリピート配列及びNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMとともに作動可能である;又は
(d)Casヌクレアーゼが、配列番号267又は269のアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むCasのオルソログ又は相同体であり、Casヌクレアーゼが、リピート配列の配列番号214とともに作動可能である
いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
43.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、Casが、
(a)配列番号を含むリピート及びCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM;
(b)配列番号を含むリピート及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;又は
(c)配列番号を含むリピート及びNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM
とともに作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
本明細書におけるヌクレオチド配列は、5'から3'方向で書かれる。
任意選択で、システムは、抑制されたCasを含み、
(a)Casが、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるか、又は配列番号49〜52から選択される配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMを含むリピートとともに作動可能であるそのオルソログ又は相同体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、大腸菌細胞である;又は
(b)Casが、配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるか、又は配列番号53を含むリピートとともに作動可能であるそのオルソログ又は相同体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Sエンテリカである;又は
(c)Casが、配列番号62から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるか、又はNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAG含むか、又はからなるPAMとともに作動可能でありオルソログ又は相同体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Sサーモフィラスの細胞である。
任意選択で、システムは、抑制されたCasを含み、Casは、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌細胞である、配列番号49〜52から選択される配列及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMを含むリピート;
(b)宿主細胞が、Sエンテリカである、配列番号53を含むリピート;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、Sサーモフィラスの細胞である、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM、
とともに作動可能である。
任意選択で、システムは、抑制されたCasを含み、Casは、
(a)任意選択で、Casヌクレアーゼが、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、大腸菌細胞である、AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;又は
(b)任意選択で、Casヌクレアーゼが、配列番号62から選択されるアミノ酸配列、又は選択された配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Sサーモフィラスの細胞である、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM
とともに作動可能である。
任意選択で、プロトスペーサーは、宿主細胞のゲノムにおける前記PAMのすぐ3'にある少なくとも5、6、7、8、9又は10個の隣接するヌクレオチドの配列を含む。
任意選択で、プロトスペーサーは、宿主細胞のゲノムにおける前記PAMのすぐ5'にある少なくとも5、6、7、8、9又は10個の隣接するヌクレオチドの配列を含む。
44.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、Casが、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM、任意選択で、Casヌクレアーゼが、I-B型Casであり、及び/又は配列番号273のアミノ酸配列を含むか、又はそのオルソログ又は相同体である;
(b)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM、任意選択で、Casヌクレアーゼが、配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むか、又はそのオルソログ又は相同体である;
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM、任意選択で、Casヌクレアーゼが、I-B型Casであり、及び/又は配列番号266のアミノ酸配列を含むか、又はそのオルソログ又は相同体である
とともに作動可能である、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ又はシステム。
45.
(a)記載42(a)、43(a)又は44(a)、宿主細胞が、Cディフィシルの細胞であり、任意選択で、細胞が、配列番号138〜209から選択されるリピート配列及び各標的配列の5'のCCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMを含む;
(b)記載42(b)、43(b)又は44(b)、宿主細胞が、大腸菌細胞である;
(c)記載42(c)、43(c)又は44(c)、宿主細胞が、Sサーモフィルスの細胞である;又は
(d)記載42(d)、宿主細胞が、Sエンテリカの細胞である
に記載のヌクレアーゼ又はシステム。
任意選択で、Casは、I-B型Casであるか、又はシステムは、I-B型システムである。
46.標的ヌクレオチド配列が、前記PAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含み、前記PAMが、宿主細胞の染色体又はエピソームにより含まれるか、又は配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、記載42〜45のいずれか1つに記載のヌクレアーゼ又はシステム。
本明細書において開示される任意のヌクレオチド配列に関して、本発明はまた、本明細書において開示されるPAMのすぐ3'又は5'にある隣接する5、10、15、20、30、40又は50個のヌクレオチドを含むか、又はからなる標的ヌクレオチド配列を提供し、PAMが、参照配列により含まれる。全てのこのような標的配列は、あたかも本明細書において別々に記載されるかのように、本説明において含まれるか、又は本明細書において開示される参照配列の隣接のヌクレオチド配列の全て又は一部により含まれる。
47.ヌクレアーゼが、Casヌクレアーゼであり、
(A)
(a)宿主細胞が、任意選択で、Cディフィシル細胞であり;
(b)Casが、記載42(a)、43(a)又は44(a)において列挙される通りであり;
(c)Casが、記載42(a)又は43(a)において列挙されるリピートとともに作動可能であり;
(d)標的ヌクレオチド配列が、記載42(a)、43(a)又は44(a)において列挙されるPAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含む;又は
(B)
(e)宿主細胞が、任意選択で、大腸菌細胞であり;
(f)Casが、記載42(b)、43(b)又は44(b)において列挙される通りであり;
(g)Casが、記載42(b)又は43(b)において列挙されるリピートとともに作動可能であり;
(h)標的ヌクレオチド配列が、記載42(b)、43(b)又は44(b)において列挙されるPAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含む;又は
(C)
(i)宿主細胞が、任意選択で、Sサーモフィルスの細胞であり;
(j)Casが、記載42(c)、43(c)又は44(c)において列挙される通りであり;
(k)Casが、記載42(c)又は43(c)において列挙されるリピートとともに作動可能であり;
(l)標的ヌクレオチド配列が、記載42(c)、43(c)又は44(c)において列挙されるPAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含む
いずれかの先行する記載に記載のヌクレアーゼ又はシステム。
48.ヌクレアーゼが、TALEN、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼである、いずれかの先行する記載1〜29及び31に記載のヌクレアーゼ又はシステム。
49.記載40〜47のいずれか1つに記載のシステムにおける使用のための、遺伝子操作されたヌクレオチド配列を含むベクター、核酸又はHM-CRISPRアレイ、遺伝子操作されたヌクレオチド配列が、記載36(ii)において定義される通りであり、及び/又はいずれかの先行する記載に記載のヌクレアーゼをコードするベクター、核酸又はHM-CRISPRアレイ。
50.ベクターが、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、記載49のベクター。
51.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防するための医薬であって、疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、いずれかの先行する記載のヌクレアーゼ、システム、ベクター、核酸又はアレイを含む、医薬。
52.対象のCディフィシル感染を処置するための、記載51の医薬であって、宿主細胞が、Cディフィシル宿主細胞、例えば、表18における株から選択される株である、医薬。
53.細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主細菌又は古細菌細胞において記載1〜39及び41〜48のいずれか1つのヌクレアーゼと組み合わせることが可能である核酸配列(例えば、RNA、crRNA又はシングルgRNA配列)をコードする又は含む核酸分子。
54.ヌクレアーゼが、Casであり、核酸が、RNA、crRNA又はシングルgRNAをコードするか、又はそれであり、任意選択で含み、RNA、crRNA又はシングルRNAが、配列番号138〜218から選択される(例えば、配列番号138〜209から選択される)リピート配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは100%同一)である1つ又は2つのリピート配列各々を含み、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシルの細胞である、記載34の核酸。
55.記載53又は54において列挙される核酸又は核酸配列を含む、核酸ベクター(例えば、バクテリオファージ、ウイルス、ファスミド、プラスミド又は接合プラスミド)。
56.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防するための、記載53〜55のいずれか1つに記載の核酸又はベクター。
57.混合細菌又は古細菌の集団により含まれる複数の宿主細胞を改変する方法であって、集団が、(i)第1の種又は株の細菌又は古細菌細胞の第1の亜集団、及び(ii)前記複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の細胞が、前記混合集団の第1の細胞ではない、宿主細胞を改変する能力を有する標的配列及びヌクレアーゼを含まず、方法が、混合集団を、記載1〜39及び41〜56のいずれか1つのヌクレアーゼ、ベクター、核酸、アレイ又は医薬と組み合わせ、これにより、記載40〜48のいずれか1つのシステムを形成する工程を含み、これにより、ヌクレアーゼが、宿主細胞により含まれる標的配列を改変し、これにより、宿主細胞を改変するか、又は死滅させる、方法。
一例では、本発明は、混合集団を含むヒト又は非ヒト動物(antimal)における疾患又は状態を処置又は予防するためであり、疾患又は状態は、前記宿主細胞種又は株の細菌により媒介されるか、又は引き起こされる。
58.宿主細胞が、記載42〜45のいずれか1つにおいて定義されるPAMを含み、標的ヌクレオチド配列が、前記PAMのすぐ3'にある少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70個の隣接するヌクレオチドの配列を含み、前記PAMが、宿主細胞の染色体又はエピソームにより含まれ、標的配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、記載57の方法。
59.産業又はエクスビボ医療用流体、表面、装置若しくは容器を処理するため;又は河川、水、飲料、食料又は化粧品を処理するための、記載57又は58の方法であって、宿主細胞が、流体、表面、装置、容器、河川、水、飲料、食料又は化粧品により含まれるか、又はそれ上にある、方法。
任意選択で、細胞は、表25の種から選択される種の細胞から選択される。
【０４３８】
段落:本発明はまた、以下の段落において概念を提供する。
1.混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム属感染を処置する方法であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム属種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数のコピーを含む医薬組成物を投与する工程と、
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(g)配列番号138〜209から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列と、
(h)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
システムは、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、配列番号273のアミノ酸配列を含む、又は配列番号738若しくは274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞は死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、クロストリジウム属感染を処置する、方法。
【０４３９】
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、Cas3は、配列番号275〜286から選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むか、又は前記選択された配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるアミノ酸配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、Cas3アミノ酸配列は、前記選択された配列から1個又は複数のアミノ酸変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、アミノ酸置換及び/又は欠損である。
【０４４０】
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピートは、前記選択された配列に同一であるヌクレオチド配列を含むか、又は前記選択された配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるヌクレオチド配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、リピートは、前記選択された配列から1個又は複数のヌクレオチド変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、ヌクレオチド置換及び/又は欠損である。
【０４４１】
任意選択で、宿主細胞は、クロストリジウム属の宿主細胞である。
2.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、段落1の方法。
3.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落1又は2の方法。
4.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、いずれかの先行する段落の方法。
5.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により、宿主細胞の細胞において調節される、いずれかの先行する段落の方法。
6.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する段落の方法。
7.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落3〜6のいずれか1つの方法。
8.シグマ因子が、配列番号223、225、227、239及び243から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、段落3〜7のいずれか1つの方法。
9.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、いずれかの先行する段落の方法。
10.標的配列が、ステージI、II、III、IV又はVの胞子形成遺伝子により含まれるか、又は胞子コートタンパク質をコードする、いずれかの先行する段落の方法。
11.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、いずれかの先行する段落の方法。
12.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落1〜10のいずれか1つの方法。
13.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、いずれかの先行する段落の方法。
14.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、いずれかの先行する段落の方法。
15.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、いずれかの先行する段落の方法。
16.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、いずれかの先行する段落の方法。
17.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落16の方法。
18.ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、大腸菌でなく、
各宿主細胞が、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
システムが、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又は大腸菌感染が処置される、方法。
【０４４２】
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、Cas3は、配列番号287〜289から選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むか、又は前記選択された配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるアミノ酸配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、Cas3配列は、前記選択された配列から1個又は複数のアミノ酸変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、アミノ酸置換及び/又は欠損である。
【０４４３】
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピートは、前記選択された配列に同一であるヌクレオチド配列を含むか、又は前記選択された配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるヌクレオチド配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、リピートは、前記選択された配列から1個又は複数のヌクレオチド変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、ヌクレオチド置換及び/又は欠損である。
【０４４４】
これらのオプションのいずれかの代替において、宿主細胞は、代わりに、サルモネラ、Sエンテリカ又はネズミチフス菌細胞である。大腸菌及びサルモネラは、幾分関連し、これにより、この代替において、大腸菌リピートは、サルモネラ宿主において使用される。
19.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、段落18の方法。
20.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、段落18又は19の方法。
21.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落18、19又は20の方法。
22.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、段落18〜21のいずれか1つの方法。
23.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、段落18〜23のいずれか1つの方法。
24.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落18〜23のいずれか1つの方法。
25.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、段落18〜24のいずれか1つの方法。
26.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、段落18〜25のいずれか1つの方法。
27.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落18〜25のいずれか1つの方法。
28.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、段落18〜27のいずれか1つの方法。
29.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、段落18〜28のいずれか1つの方法。
30.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落29の方法。
31.ヒト又は非ヒト動物対象におけるストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のストレプトコッカス属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記ストレプトコッカス属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含む又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列;
を含み、
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み、
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び、
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
システムが、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み;
発現されたHM-crRNAは、配列番号265のアミノ酸配列を含む、又は配列番号266のヌクレオチド配列によってコードされる、CASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞の比率が低減されるか、又はストレプトコッカス属感染が処置される、方法。
32.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、段落31の方法。
33.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、段落31又は32の方法。
34.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落31、32又は33の方法。
35.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、段落31〜34のいずれか1つの方法。
36.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、段落31〜35のいずれか1つの方法。
37.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落35又は36の方法。
38.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、段落31〜37のいずれか1つの方法。
39.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、段落31〜38のいずれか1つの方法。
40.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落31〜38のいずれか1つの方法。
41.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、段落31〜40のいずれか1つの方法。
42.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、段落31〜41のいずれか1つの方法。
43.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落42の方法。
44.ヒト又は非ヒト動物対象におけるサルモネラ属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のサルモネラ属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記サルモネラ属種は異なり、
各宿主細胞が、
(a)PAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列;
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程と
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
システムが、任意選択で、tracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列を含み;
発現されたHM-crRNAは、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含む、又は配列番号268若しくは270のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞の比率が低減されるか、又はサルモネラ属感染が処置される、方法。
45.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、段落44の方法。
46.工程(e)が、対象に前記Cas3及び/又はCASCADE Casをコードする核酸を投与する工程を含む、段落44又は45の方法。
47.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、段落44、45又は46の方法。
48.標的ヌクレオチド配列が、その転写が宿主細胞種においてシグマ因子により直接的又は間接的に調節される遺伝子により含まれる、段落44〜47のいずれか1つの方法。
49.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、段落44〜48のいずれか1つの方法。
50.シグマ因子が、σE;σF;σG;σH;又はσKである、段落48又は49の方法。
51.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、段落44〜50のいずれか1つの方法。
52.PAM及び標的配列が、宿主細胞の染色体配列である、段落44〜51のいずれか1つの方法。
53.PAM及び標的配列が、宿主細胞のエピソーム配列である、段落44〜51のいずれか1つの方法。
54.工程(e)が、対象に、前記遺伝子操作された配列を含む複数の核酸ベクターを投与する工程を含み、ベクターが、ウイルス、バクテリオファージ、ファスミド又はプラスミド(例えば、接合プラスミド)である、段落44〜53のいずれか1つの方法。
55.工程(e)が、対象に前記遺伝子操作された配列を含む複数の担体細菌細胞を投与する工程を含み、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、段落44〜54のいずれか1つの方法。
56.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落55の方法。
57.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、クロストリジウム属細胞(例えば、段落1〜17のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号138〜209から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号273のアミノ酸配列、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
58.段落57のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号273のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号138〜209から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列。
任意選択で、本明細書における遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、DNA配列である。任意選択で、本明細書における遺伝子操作されたヌクレオチド配列は、RNA配列である。
59.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、大腸菌細胞(例えば、段落18〜30のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号261又は263のアミノ酸配列、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
60.段落59のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号261又は263のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列。
61.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、ストレプトコッカス属細胞(例えば、段落31〜43のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号265のアミノ酸配列、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
62.段落61のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT若しくはAGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列。
63.宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、サルモネラ細胞(例えば、段落44〜56のいずれか1つにおいて定義される)であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(iii)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(iV)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
(b)任意選択のtracrRNA配列又はtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(c)CASCADE Cas;及び
(d)宿主細胞においてCas3を発現するための、配列番号267又は269のアミノ酸配列、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
64.段落63のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
65.各crRNAが、シングルガイドRNA(シングルgRNA)により含まれ、シングルgRNAが、tracrRNA配列を含む、段落57〜64のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
66.遺伝子操作された配列が、核酸ベクター、例えば、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド又は接合プラスミドにより含まれる、段落57〜65のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
67.遺伝子操作された配列のコピーが、複数の担体細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属の細胞である、段落57〜66のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
68.担体細胞が、Lロイテリ細胞である、段落67のシステム又は遺伝子操作された配列。
69.対象における前記宿主細胞の感染を処置又は予防するため、ヒト又は動物対象に投与するための、段落67又は68において定義される複数の担体細菌細胞であって、発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が、低減され得、これにより、対象における前記宿主細胞の比率を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、担体細菌細胞。
70.ヒト又は動物対象において前記宿主細胞の感染を処置又は予防するための、段落57〜68のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列であって、発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が、低減され得、これにより、対象における前記宿主細胞の比率を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、システム又は遺伝子操作された配列。
71.段落57〜70のいずれか1つの遺伝子操作された配列又は複数の細菌細胞及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物
【０４４５】
条項:本発明は、例において、以下の条項を提供する。
1.宿主細胞を死滅させる、又は宿主細胞の成長を低減するための宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、クロストリジウム属細胞であり
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のための、HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(iii)1つ又は複数のリピート配列と、
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と、
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【０４４６】
条項1の例において、
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減するための、宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムが提供され、
宿主細胞が、クロストリジウム属細胞であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含み;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞においてCas3又はそのオルソログ又は相同体を発現させるための、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列を含むCas3
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
【０４４７】
一例では、宿主細胞が、株O27、002、017、018、027、078、244又は1420細胞である。
【０４４８】
任意選択で、リピート配列は、配列番号213であり、Cas3は、配列番号261のアミノ酸配列を含み、例えば、宿主細胞は、株O27、002、017、018、027、078、244又は1420のような、Cディフィシルの高病原性株である。
2.条項1のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【０４４９】
一例では、条項2は、以下を提供する。
条項1のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274を含むヌクレオチド配列によりコードされ、
(i)配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
3.Cas3が、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
4.(i)のリピート配列が、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列;又は前記選択された配列に少なくとも70%同一である配列である、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
5.リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146又は496〜513;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306又は370〜384;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181又は470〜476;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である、条項4のシステム又は遺伝子操作された配列。
6.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
7.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、条項1〜5のいずれかの1つのシステム又は遺伝子操作された配列
5.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により、宿主細胞種の細胞において調節される、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
9.標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的又は間接的に調節する産物をコードする遺伝子により含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
10.標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23において列挙される遺伝子から選択される遺伝子、又はその相同体、オルソログ又は機能的な均等物により含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
11.標的配列が、ステージI、II、III、IV又はVの胞子形成遺伝子により含まれるか、又は胞子コートタンパク質をコードする、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
12.宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、大腸菌細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(iii)1つ又は複数のリピートと、
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、AWGを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【０４５０】
任意選択で、リピート配列が、配列番号213であり、Cas3が、配列番号261のアミノ酸配列を含み、例えば、宿主細胞が、大腸菌O157:H7細胞である。一例では、条項12は、以下を提供する。
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、大腸菌であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、ヌクレオチド配列;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞においてCas3又はそのオルソログ又は相同体を発現させるための、配列番号261、263及び287〜286から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列を含むCas3
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
13.条項12のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号261、263及び287〜289のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【０４５１】
一例では、条項13は、以下を提供する。
条項12のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号261、263及び287〜289から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、AWGを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
14.Cas3が、配列番号261、263及び287〜286から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、条項12のシステム又は条項13の遺伝子操作された配列。
15.リピート配列が、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列、又は前記選択された配列に少なくとも70%同一である配列である、条項12〜14のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
16.リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号210〜212又は691〜695;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O157:H7株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号213、677又は678;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌042株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号514〜518;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌1303株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号519〜521;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌536株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号522〜527;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌55989株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号528又は529;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ACN001株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号530〜532;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜545;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC IMT5155株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜537;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号538〜542;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O78株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号543〜545;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号546〜560;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B REL606株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号556〜560;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BL21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号561〜574;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW25113株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号575〜578;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW2592株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号579〜582;又は
(q)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌C(例えば、ATTC8739)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号583〜588;又は
(r)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌DH1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号589〜597;又は
(s)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌E24377A株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号598〜600;又は
(t)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ECC-1470株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号601〜603;又は
(u)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ED1a株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号604〜608;又は
(v)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ER2796株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号609〜612;又は
(w)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ETEC(例えば、H10407)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号613〜618;又は
(x)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LF82株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号644〜667;又は
(y)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LY180株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号668〜670;又は
(z)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O104:H4株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号671〜673;又は
(aa)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O111:H(例えば、1128)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号674〜676;又は
(bb)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌P12b株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号679〜684;又は
(cc)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN033株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号685;又は
(dd)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN061株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号686〜689;又は
(ee)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌SECEC SMS-3-5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号690;又は
(ff)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12 MC4100株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号691〜695;又は
(gg)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UM146株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号696〜699;又は
(hh)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMN026株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号700〜707;又は
(ii)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNF18株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号708〜711;又は
(jj)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNK88株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号712〜715;又は
(kk)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UT189株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号716〜720;又は
(ll)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌VR50株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号721〜723;又は
(mm)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌W株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号724〜729;又は
(nn)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌Xuzhou21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号730又は731
から選択されるリピート配列である、条項15のシステム又は遺伝子操作された配列。
17.PAMが、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか又はからなる、条項12〜16のいずれか1つのシステム又は遺伝子操作された配列。
18.宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、ストレプトコッカス属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号266を含む)又はそのオルソログ又は相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【０４５２】
条項18の例において、
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、ストレプトコッカス属の細胞であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(iii)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞におけるCas3を発現するための、配列番号265のアミノ酸配列、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システムが提供される。
19.条項18のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は任意選択で、配列番号266を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【０４５３】
一例では、条項19は、以下を提供する。
条項18のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力があり、標的配列が、NNAGAAW、NGGNG又はAWを含むか、又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
20.PAMが、AA、AT又はAGを含むか又はからなる、条項18のシステム又は条項19の遺伝子操作された配列。
21.宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するためのHM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、サルモネラ属細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞において発現されたCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、
(iii)任意選択で、配列番号214である1つ又は複数のリピートと、
(iv)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)任意選択で、配列番号267若しくは269のアミノ酸配列を含むCas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのヌクレオチド配列(任意選択で、配列番号268若しくは270を含む)又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減できる、システム。
【０４５４】
一例では、条項21は、以下を提供する。
宿主細胞を死滅させるため、又は宿主細胞の成長を低減させるための、HM-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞が、サルモネラ細胞であり、
(a)宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列;
(b)CASCADE Cas;及び
(c)宿主細胞においてCas3を発現するための、配列番号267又は269のアミノ酸配列、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列を含むCas3、又はそのオルソログ又は相同体
を含み;
発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が低減され得る
システム。
22.条項21のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号267又は269のアミノ酸配列を任意選択で含むか、又は配列番号268又は270を任意選択で含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)任意選択で、配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
【０４５５】
一例では、条項22は、以下を提供する。
条項21のシステムにおける使用のための遺伝子操作されたヌクレオチド配列であって、遺伝子操作された配列が、宿主細胞における前記HM-crRNAの発現のためのHM-crRNAをコードし、各crRNAが、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、Cas3が、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270を含むヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子操作された核酸配列が、
(i)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(ii)宿主細胞標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む、遺伝子操作されたヌクレオチド配列。
23.Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
24.遺伝子操作された配列が、核酸ベクター、任意選択で、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド又は接合プラスミドにより含まれる、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
25.遺伝子操作された配列のコピーが、複数のキャリア細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属の細胞である、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
26.ヒト又は動物対象において前記宿主細胞の感染を処置又は予防するための、システム又は遺伝子操作された配列であって、発現されたHM-crRNAが、宿主細胞におけるCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ又は相同体と組み合わせる能力があり、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が、死滅され得るか、又は宿主細胞集団成長が、低減され得、これにより、対象における前記宿主細胞の比率を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列。
27.いずれかの先行する条項のシステム又は遺伝子操作された配列及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
28.ヒト又は非ヒト動物対象におけるクロストリジウム属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記クロストリジウム属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号273及び275〜286のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はクロストリジウム属感染が処置される、方法。
【０４５６】
一例では、条項28は、以下を提供する。
ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のクロストリジウム属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記クロストリジウム属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号273及び275〜286のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号738又は274のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はクロストリジウム属感染が処置される、方法。
29.ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、大腸菌でなく、
各宿主細胞が、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号261、263及び287〜286のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又は大腸菌感染が処置される、方法。
【０４５７】
一例では、条項29は、以下を提供する。
ヒト又は非ヒト動物対象における大腸菌感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数の大腸菌宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、大腸菌でなく、
各宿主細胞が、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号261、263及び287〜289のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号262又は264のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又は大腸菌感染が処置される、方法。
30.ヒト又は非ヒト動物対象におけるストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)ストレプトコッカス属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記ストレプトコッカス属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はストレプトコッカス属感染が処置される、方法。
【０４５８】
一例では、条項30は、以下を提供する。
ヒト又は非ヒト動物対象におけるストレプトコッカス属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のストレプトコッカス属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記ストレプトコッカス属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含むか、又はからなるPAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号215〜218から選択されるリピート配列である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号265のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号266のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はストレプトコッカス属感染が処置される、方法。
31.ヒト又は非ヒト動物対象におけるサルモネラ属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)サルモネラ属種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記サルモネラ属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)PAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)任意選択で、配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、任意選択で、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はサルモネラ属感染が処置される、方法。
【０４５９】
一例では、条項31は、以下を提供する。
ヒト又は非ヒト動物対象におけるサルモネラ属感染を処置する方法であって、対象が、混合細菌集団を含み、集団が、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)複数のサルモネラ属種の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種が、前記サルモネラ属種と異なり、
各宿主細胞が、
(a)PAM;
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列;
(c)宿主細胞におけるCas3ヌクレアーゼと作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列;
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;
第1の細胞が、前記PAMのすぐ3'にある前記標的配列を含まず、
(e)対象に、宿主改変(HM)cRNAをコードする複数のコピーの遺伝子操作された核酸配列を含む医薬組成物を投与する工程;及び
(f)宿主細胞においてHM-crRNAを発現させる工程
を含み;
各HM-crRNAが、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によりコードされ、それぞれの宿主細胞において発現されるCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasが、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列が、
(g)配列番号214である、1つ又は複数のリピート配列;及び
(h)前記宿主細胞標的配列にハイブリダイズして、Casを宿主細胞における標的配列にガイドする能力がある前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列
を含む核酸配列を含み;
発現されたHM-crRNAが、配列番号267又は269のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号268又は270のヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体によりコードされる、CASCADE Cas及びCas3と組み合わされ、Cas3が、標的配列を改変するために宿主細胞における前記HM-crRNAとともに作動可能であり、これにより、宿主細胞が死滅されるか、又は宿主細胞集団成長が低減され、これにより、対象における前記宿主細胞集団の比率が低減されるか、又はサルモネラ属感染が処置される、方法。
32.ヌクレアーゼが、Casであり、宿主細菌又は古細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようプログラムされ、これにより、プログラムされるヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変する能力があり、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子により媒介される遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、条項1、3〜14〜18、20、21及び23〜26のいずれか1つのシステムにおける使用のためのガイド型ヌクレアーゼ。
33.ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、条項32のヌクレアーゼ。
34.標的遺伝子の転写が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A; 
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
により、宿主細胞種の細胞において調節される、条項32のヌクレアーゼ。
35.ヌクレオチド配列が、
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;又は
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、条項32のヌクレアーゼ。
36.標的ヌクレオチド配列が、表12〜表17及び表23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子又はその相同体、オルソログ又は機能的同等物により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
37.標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
38.標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードする、項32に記載のヌクレアーゼ。
39.標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB又はCtpB遺伝子により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
40.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
41.宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、項32に記載のヌクレアーゼ。
42.標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、項32に記載のヌクレアーゼ。
43.条項32〜42のいずれか1つのヌクレアーゼをコードする、宿主細胞に感染するか、又は形質転換する能力がある核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合プラスミド)。
44.ヌクレアーゼ又はベクターが、ヌクレアーゼをプログラムするための1つ又は複数のcrRNA又はガイドRNA(gRNA)と組み合わせた状態にあるか、又はこのようなcrRNA又はgRNAをコードする核酸と組み合わせた状態にある、条項32〜42のいずれか1つのヌクレアーゼ又は条項43のベクター。
45.ヌクレアーゼが、Cas3であり、Cas又はベクターが、1つ又は複数のCASCADE Cas(任意選択で、CasA、B、C、D及びE;又はCas1若しくはCas2)をコードする核酸と組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、宿主細胞の標的配列を改変するための前記CASCADE Casとともに作動可能である、条項32〜42のいずれか1つのヌクレアーゼ又は条項43のベクター。
46.Casヌクレアーゼが、大腸菌、Cディフィシル、サルモネラ  エンテリカ又はSサーモフィルスCas3である、条項26〜39のいずれか1つのヌクレアーゼ又はベクター。
47.Cas3が、配列番号273及び275〜286、261、263、287-289、265、267及び269から選択されるアミノ酸配列、又は前記選択される配列に少なくとも70%同一である配列を含む、条項46のヌクレアーゼ又はベクター。
48.細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主細菌細胞において条項32〜36、42及び44〜47のいずれか1つのヌクレアーゼと組み合わせることが可能であるcrRNA又はシングルgRNAをコードする又は含む核酸分子。
49.crRNA又はシングルgRNAが、配列番号138〜209及び290〜513から選択されたリピート配列と少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98、又は99%同一(若しくは100%同一)である配列により含まれる配列を含み、任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、条項48の核酸。
50.条項48又は49の核酸を含む、宿主細胞に感染するか、又は形質転換する能力がある核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合プラスミド)。
51.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防するための医薬であって、宿主細胞により媒介される疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、条項1〜27及び32〜50のいずれか1つのシステム、配列、ベクター、ヌクレアーゼ又は核酸を含む、医薬。
52.宿主細胞が、Cディフィシル宿主細胞であり、任意選択で、表18及び19における株並びに表24における配列番号275〜286について挙げられる株から選択されるCディフィシル株のものである、対象のCディフィシル感染を処置するための、条項51の医薬。
【０４６０】
本明細書における任意の構成は、例えば、これらの条項のいずれかにおいて列挙されるCas3及び/又はこれらの条項のいずれかにおいて列挙されるリピート配列を使用してもよく、本明細書における構成は、このようなCas3及び/又はリピートを利用するものと準用して解釈されてもよい。
【０４６１】
一例では、Casは、表18及び19における株並びに表24における配列番号275〜286について挙げられる株から選択されるCディフィシル株のCas3であり、任意選択で、宿主細胞は、前記株の細胞である。
【０４６２】
本発明者らは、高病原性リボタイプのCディフィシル002、027及び他のもののCas3配列が、それら全てが、配列番号275〜286の1つ又は複数の80%内の同一性のアミノ酸配列を含むという点に関して関連すると決定した。従って、このタイプのCas3の使用は、ヒト又は動物対象におけるCディフィシル(例えば、Cディフィシル002及び/又は027)感染を処置又は予防するのに有用である。一例では、株は、ヒト感染症についての高病原性株である。一例では、株は、O27、002、017、018、027、078、244又は1420である。本発明は、このような目的のためのこのような使用及び任意の構成を提供する。
【０４６３】
代替において、リピート配列は、列挙されるリピート配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である。
【０４６４】
代替において、Cas3配列は、列挙されるCas3配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である。例えば、Cas3は、保存的アミノ酸置換によってのみ前記列挙されるCas3と異なる。
【０４６５】
一例では(例えば、混合細菌集団に関する本発明の方法において)、宿主細胞(又は第1の細胞若しくは第2の細胞)属或いは種は、表25において挙げられる属又は種から選択される。本発明の例において、Cas(例えば、I、II又はIII型Cas、例えば、Cas3又は9のような、Casヌクレアーゼ)は、表25において挙げられる属又は種から選択される属又は種の細菌により含まれるCasであり、任意選択で、宿主細胞(又は第1の細胞若しくは第2の細胞)は、同じ属又は種のものである。この例では、Casは、本明細書における実施形態に有用である、前記宿主細胞(又は第1若しくは第2の細胞)にとって内因性であり、内因性Casを使用して、標的配列が改変される。この場合では、HM-アレイは、前記細胞、属又は種のリピート配列に少なくとも90、95、96、97、98又は99%同一である(若しくは100%同一である)1つ又は複数のリピートヌクレオチド(例えば、DNA又はRNA)配列を含んでもよく、これにより、Casは、細胞において1つ又は複数の標的配列を修復するためのHM-アレイによりコードされるcRNAとともに作動可能である。一例では、Casは、I型Cas3であり、I型カスケードを用いて使用され、Cas3及びカスケードの1つ又は両方が、宿主又は第1の細胞にとって内因性であるか、又はベクター由来(すなわち、宿主又は第1の細胞にとって外来)である。
【０４６６】
一例では、本発明の方法は、他の細胞を標的にしないで、細菌叢又は混合集団における宿主細胞を選択的に死滅させ、例えば、他の細胞は、(a)宿主細胞種の株と関連する株のもの、又は(b)宿主細胞種と異なる種のものであり、宿主細胞種と系統的に関連し、他の種又は株は、宿主細胞種又は株の16sリボソームRNAをコードするDNA配列に少なくとも80%同一である16sリボソームRNAをコードするDNA配列を有する。実施形態において、宿主細胞は、表25から選択される第1の種のものであり、他の細胞は、表25から選択される異なる種のものである。一例では、種は、同じ属のものであるか、又は異なる属のものである。
【０４６７】
一例では、Casは、Cas9ヌクレアーゼ(ニッカーゼ、DNA、RNA及び/又はPAM認識並びに結合)、Cas3、Cas3'又はCas3"である。
【０４６８】
一例では、本明細書におけるCas又はCASCADE Cas又はタンパク質は、I型カスケードポリペプチドから選択される。本明細書において使用される、「I型カスケードポリペプチド」は、I型CRISPR-Casシステムにおけるプレ-crRNAの処理及びその後の標的DNAへの結合に関与するポリペプチドの複合体を形成するポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは、I型サブタイプI-A、I-B、I-C、1-D、I-E及びI-Fのカスケードポリペプチドを含むが、これらに限定されない。I-A型カスケードポリペプチドの非限定的な例は、Cas7(Csa2)、Cas8al(Csxl3)、Cas8a2(Csx9)、Cas5、Csa5、Cas6a、Cas3'及び/又はCas3"を含む。I-B型カスケードポリペプチドの非限定的な例は、Cas6b、Cas8b(Cshl)、Cas7(Csh2)及び/又はCas5を含む。I-C型カスケードポリペプチドの非限定的な例は、Cas5d、Cas8c(Csdl)、及び/又はCas7(Csd2)を含む。I-D型カスケードポリペプチドの非限定来な例は、CaslOd(Csc3)、Csc2、Cscl、及び/又はCas6dを含む。I-E型カスケードポリペプチドの非限定来な例は、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cas7(CasC)、Cas5(CasD)及び/又はCas6e(CasE)を含む。I-F型カスケードポリペプチドの非限定来な例は、Cysl、Cys2、Cas7(Cys3)及び/又はCas6f(Csy4)を含む。I-U型カスケードポリペプチドの非限定来な例は、Cas8c、Cas7、Cas5、Cas6及び/又はCas4を含む。いくつかの実施形態において、I型ポリペプチドは、Cas3、Cas3'ヌクレアーゼ又はCas3"ヌクレアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも70%同一性(例えば、少なくとも若しくは約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%)を含む。いくつかの実施形態において、I型カスケードポリペプチドは、Cas7(Csa2)、Cas8al(Csxl3)、Cas8a2(Csx9)、Cas5、Csa5、Cas6a、Cas6b、Cas8b(Cshl)、Cas7(Csh2)、Cas5、Cas5d、Cas8c(Csdl)、Cas7(Csd2)、CaslOd(Csc3)、Csc2、Cscl、Cas6d、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cas7(CasC)、Cas5(CasD)、Cas6c(CasE)、Cysl、Cys2、Cas7(Cys3)、Cas6f(Csy4)、Cas6又はCas4のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性(例えば、少なくとも若しくは約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%)を含む。
【０４６９】
I型CRISPR-Casシステムは、前記技術分野において周知であり、例えば、以下を含む:Archaeoglobus fulgidusは、典型的なI-A型CRISPR-Casシステムを含み、クロストリジウム・クライベリDSM 555は、典型的なI-B型CRISPR-Casシステムを含み、バチルス・ハロデュランスC-125は、典型的なI-C型CRISPR-Casシステムを含み、シアノセイス属の種PCC 802は、典型的なI-D型CRISPR-Casシステムを含み、大腸菌-12は、典型的なI-E型CRISPR-Casシステムを含み、ジオバクター・サルフレドゥセンスは、典型的なI-U型CRISPR-Casシステムを含み、エルシニア・シュードツベルクロシスYPIIIは、典型的なI-F型CRISPR-Casシステムを含む。
【０４７０】
いくつかの実施形態において、本発明を用いて有用なII型ヌクレアーゼは、Cas9(例えば、spCas9又はstCas9)のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性(例えば、少なくとも若しくは約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%)を含む。II型CRISPR-Casシステムは、前記技術分野において周知であり、例えば、レジオネラ・ニューモフィラ株パリ、ストレプトコッカス・サーモフィルスCNRZ1066及びナイセリア・ラクタミカ020-06を含む。
【０４７１】
いくつかの実施形態において、本発明を用いて有用なIII型ヌクレアーゼは、Cas6、CaslO(又はCsml)、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、及びCsm6、Cmrl、CaslO(又はCmr2)、Cmr3、Cmr4、Cmr5、及びCmr6、Cas7、CaslO、Cas7(Csm3)、Cas5(Csm4)、Cas7(Csm5)、Csm6、Cas7(Cmrl)、Cas5(Cmr3)、Cas7(Cmr4)、Cas7(Cmr6)、Cas7(Cmr6)、Cmr5、Cas5(Cmr3)、Cas5(CslO)、Csm2、Cas7(Csm3)、及び全1473のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性(例えば、少なくとも若しくは約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%)を含む。III型CRISPR-Casシステムは、前記技術分野において周知であり、例えば、典型的なIII-A型CRISPR-Casシステムを含むスタフィロコッカス・エピデルミデスRP62A、典型的なIII-B型CRISPR-Casシステムを含むパイロコッカス・フリオサスDSM3638、典型的なIII-C型CRISPR-Casシステムを含むメタノサーモバクター・サームオートトロフィカス株デルタ11、及び典型的なIII-D型CRISPR-Casシステムを含むロゼイフレクサス菌種Rs-1を含む。
【０４７２】
いくつかの実施形態において、本発明を用いて有用なIV型ヌクレアーゼは、Csf4(dinG)、Csfl、Cas7(Csf2)及び/又はCas5(csf3)のアミノ酸配列に対して少なくとも70%同一性(例えば、少なくとも若しくは約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%)を含む。IV型CRISPR-Casシステムは、前記技術分野において周知であり、例えば、アシジチオバチルス・フェロオキシダンスATCC23270は、典型的なIV型CRISPR-Casシステムを含む。
【０４７３】
いくつかの実施形態において、本発明を用いて有用なV型ヌクレアーゼは、Cpfl、Casl、Cas2、又はCas4のアミノ酸配列に対して少なくとも70%同一性(例えば、少なくとも若しくは約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%)を含む。V型CRISPR-Casシステムは、前記技術分野において周知であり、例えば、典型的なV型CRISPR-Casシステムを含むフランシセラ属cf.フランシセラ・ノビシダFxlを含む。
【０４７４】
大腸菌におけるI-E型CRISPR-CasシステムについてのPAMは、AAG、GAG、GAG、及びATGを含み、このようなPAMは、例えば、細胞が大腸菌細胞であるとき、本発明において使用され得る。SサーモフィルスCRISPR1(NNAGAAW)又はCRISPR3(NGGNG)についてのPAMは、本発明において使用されてもよく、例えば、細胞は、Sサーモフィルス細胞である。
【０４７５】
SサーモフィルスDGCC7710のゲノム配列によると、CRISPR4/Casシステムのcas3遺伝子は、推定分子量約106kDaを有する926個のアミノ酸のタンパク質をコードする。配列データは、受託番号HQ453272の下GenBankデータベースに寄託されている。実施形態において、本発明のヌクレアーゼは、このようなCas3である。
【０４７６】
一例では、以下のクロストリジウム・ディフィシル構成要素の1つ又は複数が、本発明において使用されてもよい。
【０４７７】
【表１】
2020525049.tif 000008
【０４７８】
クロストリジウム属リピート
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列(例えば、アレイ又は遺伝子操作された核酸により含まれるリピート)は、配列番号138〜209及び290〜513から選択されるリピート配列である。
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列は、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146及び496〜513;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306及び370〜384;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181及び470〜476;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である。
【０４７９】
任意選択で、Cas3は、配列番号275〜286から選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むか、又は前記選択された配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるアミノ酸配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、Cas3アミノ酸配列は、前記選択された配列から1個又は複数のアミノ酸変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、アミノ酸置換及び/又は欠損である。
【０４８０】
任意選択で、リピートは、前記選択された配列に同一であるヌクレオチド配列を含むか、又は前記選択された配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるヌクレオチド配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、リピートは、前記選択された配列から1個又は複数のヌクレオチド変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、ヌクレオチド置換及び/又は欠損である。
【０４８１】
任意選択で、宿主細胞は、クロストリジウム属の宿主細胞である。
【０４８２】
大腸菌リピート
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列は、配列番号210〜213及び514〜731から選択されるリピート配列である。
任意選択で、本発明の方法、アレイ、配列又は他の構成における代替において、リピート配列は、
(a)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号210〜212及び691〜695;又は
(b)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O157:H7株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号213、677及び678;又は
(c)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌042株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号514〜518;又は
(d)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌1303株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号519〜521;又は
(e)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌536株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号522〜527;又は
(f)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌55989株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号528又は529;又は
(g)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ACN001株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号530〜532;又は
(h)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜545;又は
(i)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC IMT5155株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号533〜537;又は
(j)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号538〜542;又は
(k)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌APEC O78株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号543〜545;又は
(l)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号546〜560;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌B REL606株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号556〜560;又は
(n)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BL21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号561〜574;又は
(o)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW25113株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号575〜578;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌BW2592株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号579〜582;又は
(q)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌C(例えば、ATTC8739)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号583〜588;又は
(r)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌DH1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号589〜597;又は
(s)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌E24377A株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号598〜600;又は
(t)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ECC-1470株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号601〜603;又は
(u)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ED1a株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号604〜608;又は
(v)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ER2796株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号609〜612;又は
(w)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌ETEC(例えば、H10407)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号613〜618;又は
(x)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LF82株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号644〜667;又は
(y)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌LY180株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号668〜670;又は
(z)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O104:H4株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号671〜673;又は
(aa)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌O111:H(例えば、1128)株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号674〜676;又は
(bb)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌P12b株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号679〜684;又は
(cc)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN033株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号685;又は
(dd)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌PCN061株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号686〜689;又は
(ee)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌SECEC SMS-3-5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号690;又は
(ff)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌K12 MC4100株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号691〜695;又は
(gg)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UM146株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号696〜699;又は
(hh)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMN026株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号700〜707;又は
(ii)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNF18株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号708〜711;又は
(jj)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UMNK88株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号712〜715;又は
(kk)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌UT189株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号716〜720;又は
(ll)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌VR50株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号721〜723;又は
(mm)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌W株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号724〜729;又は
(nn)任意選択で、宿主細胞が、大腸菌Xuzhou21株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号730又は731
から選択されるリピート配列である。
【０４８３】
任意選択で、Cas3は、配列番号287〜289から選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むか、又は前記選択された配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるアミノ酸配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、Cas3配列は、前記選択された配列から1個又は複数のアミノ酸変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、アミノ酸置換及び/又は欠損である。
【０４８４】
任意選択で、リピートは、前記選択された配列に同一であるヌクレオチド配列を含むか、又は前記選択された配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるヌクレオチド配列を含む。一例では、同一性は、少なくとも80%である。一例では、同一性は、少なくとも85%である。一例では、同一性は、少なくとも90%である。一例では、同一性は、少なくとも95%である。代替において、リピートは、前記選択された配列から1個又は複数のヌクレオチド変更を含み、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、ヌクレオチド置換及び/又は欠損である。
【０４８５】
これらのオプションのいずれかの代替において、宿主細胞は、代わりに、サルモネラ、Sエンテリカ又はネズミチフス菌細胞である。大腸菌及びサルモネラは、幾分関連し、これにより、この代替において、大腸菌リピートは、サルモネラ宿主において使用される。
【０４８６】
任意選択で、宿主株は、腸管出血性大腸菌(EHEC)、大腸菌血清型O157:H7又は志賀毒素産生大腸菌(STEC))である。一例では、宿主細胞は、次の大腸菌株:
・志賀毒素産生大腸菌(STEC)(STECは、ベロ毒素産生大腸菌(VTEC)としても言及され得る);
・腸管出血性大腸菌(EHEC)(この病原系は、食物由来の大流行と関連してニュースにおいて最も一般的に聞かれるものである);
・腸内毒素原性大腸菌(ETEC);
・腸管病原性大腸菌(EPEC);
・腸管凝集性大腸菌(EAEC);
・腸管侵入性大腸菌(EIEC);及び
・分散接着性大腸菌(DAEC)
から選択される。
【０４８７】
一例では、Cas3は、これらの大腸菌株から選択される株のCas3である。
【０４８８】
一例では、リピートは、任意選択で、前記リピートから1つ又は複数のヌクレオチド変更を含む、これらの大腸菌株から選択される株のリピートであり、例えば、変更は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13個の変更からなる。任意選択で、変更は、ヌクレオチド置換及び/又は欠損である。
【０４８９】
腸管出血性大腸菌(EHEC)血清型O157:H7は、世界中の血性下痢及び溶血性尿毒症症候群(HUS)の大流行に関与するヒト病原体である。従来の抗菌薬は、EHEC感染と関連する罹患率及び死亡率の大部分に関与する強力な志賀毒素の放出を促進する、EHECにおけるSOS応答の引き金を引く。ウシは、EHECの天然のリザーバーであり、およそ75%のEHEC大流行が、混入したウシ由来の製品の消費と結び付けられる。EHECは、ヒトにおいて疾患を引き起こすが、成体の反芻動物において無症候性である。大腸菌血清型O157:H7(EHEC)感染の特徴は、腹部疝痛及び血性下痢、並びに生命を脅かす合併症の溶血性尿毒症症候群(HUS)を含む。現在、EHEC感染のための処置の必要がある(Goldwater及びBettelheim、2012年)。従来の抗生物質の使用は、志賀毒素により媒介される細胞傷害性を憎悪させる。疾病管理予防センターにより行われた疫学研究において、EHEC腸炎のための抗生物質を用いて処置された患者は、HUSを発症するより高いリスクを有していた(Slutskerら、1998年)。追加の研究は、EHEC感染における抗生物質の禁忌をサポートし、EHECと関連する出血性大腸炎のための抗生物質療法中の小児は、HUSを発症する増大した機会を有していた(Wongら、2000年;Zimmerhackl、2000年;Safdarら、2002年;Tarrら、2005年)。従来の抗生物質は、染色体に統合されたラムダ状プロファージゲノム内にコードされるstx遺伝子の複製及び発現を増強することにより、志賀毒素の産生を促進する。本発明のアプローチは、ヌクレアーゼ切断にかかっている。Stx誘導はまた、EHEC細胞エンベロープのファージにより媒介される溶解を促進し、これにより、志賀毒素の環境への放出及び播種を可能にする(Karchら、1999年;Matsushiroら、1999年;Wagnerら、2002年)。従って、有利には、本発明は、ヒト及び動物対象におけるEHECを処置する代替手段を提供する。これは、ヌクレアーゼ作用により産生される抗EHEC作用(従来の抗生物質作用と逆)の速度及び持続についての驚くべき結果と共に、以下で例示される。
【０４９０】
一例では、対象(例えば、ヒト)は、溶血性尿毒症症候群(HUS)に罹患しているか、又はリスクがあり、例えば、対象は、EHEC大腸菌感染のような、大腸菌感染に罹患している。
【０４９１】
代替の例では、宿主は、例えば、表18又は25において開示される、本明細書において開示されるクロストリジウム属の任意の種又は株である。
【０４９２】
代替の例では、宿主は、本明細書において開示されるサルモネラの任意の種又は株である。
【０４９３】
代替の例では、宿主は、本明細書において開示されるストレプトコッカス属の任意の種又は株である。
【実施例１】
【０４９４】
環境上の処理又は汚染除去
油、金属及び鉱物産業
実施形態において、宿主細胞は、坑道又はフィールド;金属鉱山又はフィールド;油のフィールド又は油若しくは石油化学製品に存在する(例えば、宿主が、嫌気性硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属の細菌であるとき、これらのいずれかについて)。一例では、この組成物は、酸化剤(例えば、次亜塩素酸ナトリウム)、四級アンモニウム化合物又はイソチアゾロンを含むか、又は次亜塩素酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物又はイソチアゾロンと同時又は連続して投与される。デスルホビブリオ属の細菌宿主を改変するために本発明において使用するための適当なベクターの例は、バクテリオファージである。以下の参考文献は、デスルホビブリオ属に感染するファージを単離する適当な方法を記載する。本発明におけるベクターとしての使用については、参考文献のいずれかが記載するバクテリオファージを使用してもよい。或いは、ベクターは、ナノ粒子により提供される。
【０４９５】
Heidelbergらは、2つのコピーのほぼ同一のミュー様バクテリオファージDVUO189-221、DVU2847-79、DVU2688-733を記載し、バクテリオファージのレムナントは、デスフォビブリオ・ブルガリス・ヒルデンバラ(Desufovibrio vulgaris Hildenborough)のゲノムに存在する。かかるファージは、本発明における使用のためのファージベクターを設計する基礎であり得る。
【０４９６】
(参考文献)
(i)Seyedirashti Sら、J Gen Microbiol.、1991年7月;137(7):1545〜9頁、「Induction and partial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541」;
(ii)Seyedirashti Sら、J Gen Microbiol.、1992年7月;138(7):1393〜7頁、「Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)」;
(iii)*Walker CBら;Environ Microbiol.、2006年11月;8(11):1950〜9頁、「Recovery of temperate Desulfovibrio vulgaris bacteriophage using a novel host strain」;
(iv)Mirandaら、Corrosion Science 48、(2006年)、2417〜2431頁、「Biocorrosion of carbon steel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio capillatus isolated from a Mexican oil field separator」;
(v)Eydalら、The ISME Journal、(2009年)、3、1139〜1147頁;doi:10.1038/ismej.2009.66;2009年6月11日にオンラインで公開、「Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis isolated from deep groundwater」;
(vi)Walker CBら;Environ Microbiol.、2009年9月;11(9):2244〜52頁、doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.01946.x、「Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vulgaris genome plasticity」。
*[本文献に記載される配列は、受託番号DQ826728-DQ826732の下GenBankに寄託され、参照により本明細書に取り込まれる]
【実施例２】
【０４９７】
水又は汚水処理又は環境(例えば、土壌)の金属汚染除去
本発明の代替の適用は、水又は汚水処理のための、本明細書に記載するHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas又はHM-組成物を提供し、例えば、宿主が、硫黄還元細菌、例えば、デスルホビブリオ属の細菌である。
【０４９８】
一例では、宿主における標的ヌクレオチド配列は、重金属抵抗性遺伝子の配列である。任意選択で、又は、宿主は、デスルホビブリオ属の細菌、例えば、Dブルガリスである。
【実施例３】
【０４９９】
医療上の使用
本発明の代替の適用は、ヒト又は動物における細菌感染を処置、予防又は低減する(例えば、その広がり若しくは拡大を低減する)ための本明細書において記載されるHM-CRISPRアレイ、HM-CRISPR/Casシステム、HM-crRNA、HM-スペーサー、HM-DNA、HM-Cas又はHM-組成物を提供する。
第1の例において、感染は、ヒトにおいてMRSA宿主細胞により引き起こされる。宿主細胞は、スタフィロコッカス・アウレウス宿主細胞であり、本発明のHM-アレイは、I、II又はIII型スタフィロコッカス属のパッケージされたファージ(カウドウイルス目又はミオウイルス科ファージ)の集団に含有される。ファージ集団は、メチシリン若しくはバンコマイシンと共に、又はなしで、MRSA感染患者に投与される。1回の試験において、ファージHM-アレイは、宿主細胞における、(i)内因性SアウレウスCRISPRアレイのリーダープロモーターの3'にある20個のヌクレオチドの領域及び(ii)メチシリン抵抗性遺伝子を標的にする。バンコマイシンが投与されるとき、通常より少ない用量が、患者に投与される。宿主細胞感染が、ノックダウンされ、ファージ医薬に対する抵抗性が、確立されないか、又は通常より少ない速度又は重症度で確立されることが予想される。他の試験において、設計は、これらの試験におけるファージがまた、必須のSアウレウス遺伝子ftsZを標的にすることを除き、同一である(Liangら、Int J Infect Dis. 2015年1月;30:1〜6頁、doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015.、Epub 2014年11月5日、「Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene」)。
さらなる試験は、上記の試験を繰り返すが、ファージKエンドリシンを、メチシリンに加えて又は代わりに投与した。
(参考文献)
1.Jiang Wら、Nucleic Acids Res.、2013年11月;41(20):e188. doi: 10.1093/nar/gkt780. Epub、2013年9月2日、「Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice」;
2.Seed KDら、Nature、2013年2月28日;494(7438):489〜91頁、doi: 10.1038/nature11927、「A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity」;
3.Semenova Eら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2011年6月21日;108(25):10098〜103頁、doi: 10.1073/pnas.1104144108.、Epub、2011年6月6日、「Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence」;
4.Heler Rら、Mol Microbiol.、2014年7月;93(1):1〜9頁、doi: 10.1111/mmi.12640.、Epub、2014年6月4日、「Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas immune systems」;
5.Gomaaら、MBio.、2014年1月28日;5(1):e00928〜13頁、doi: 10.1128/mBio.00928-13、「Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting CRISPR-Cas systems」;
6.Fineran PCら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2014年4月22日;111(16):E1629〜38頁、doi: 10.1073/pnas.1400071111.、Epub、2014年4月7日、「Degenerate target sites mediate rapid primed CRISPR adaptation」;
7.Wiedenheftら、Nature、2011年9月21日;477(7365):486〜9頁、doi: 10.1038/nature10402、「Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system」;
8.Bondy-Denomyら、Nature、493、429〜432頁(2013年1月17日)、doi:10.1038/nature11723、「Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system」;
9.Nunez JKら、Nature、2015年3月12日;519(7542):193〜8頁、doi: 10.1038/nature14237.、Epub、2015年2月18日、「Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity」。
【実施例４】
【０５００】
混合腸内細菌叢集団における細菌の比率の変更
混合腸細菌叢試料におけるクロストリジウム・ディフィシル細菌のノックダウンを参照にして記載する、本実施例に従い、細菌の比率の変更を行う。試料は、バクテロイデス及びメトロニダゾール(MTZ)抵抗性Cディフィシル株630亜集団を含有する。エクスビボ混合集団を、本発明に従い、CRISPRアレイを含有するよう遺伝子操作した担体細菌(ラクトバチルス・アシドフィルスLa-14及び/又はLa-5)の集団と組み合わせる。
【０５０１】
各CRISPRアレイを、担体細菌及びCディフィシル細胞と適合可能であるプラスミド上に含む。アレイは、oriT、intDOT配列、tetQ-rteA-rteBオペロン、rteC及びオペロンxis2c-xis2d-orf3-excも含む、バクテロイデス・シータイオタオミクロンCTnDotトランスポゾンにより含まれる。1つの実験では、mob及びtraオペロンを取り除く(担体細菌と組み合わせた混合物において、トランスポゾンが移行するバクテロイデス細胞が供給するこれらに頼る代わりに)。別の実験では、mob及びtraオペロンを、トランスポゾン中に含む。
【０５０２】
細胞質膜を超えたタンパク質の転移は、全ての細菌において必須のプロセスである。その中心にATPase、SecA、及び膜チャンネル、SecYEGを含むSecシステムは、このタンパク質輸送の大部分に関与し得る。第2の並行するSecシステムは、多数のグラム陽性種において記載されている。SecA2が、Sec基質のサブセットの転移に関与することが研究された、この付属のSecシステムは、エネルギーを与えるATPase、SecA2の第2のコピーの存在により特徴付けられる。多くの病原性グラム陽性種と共通して、クロストリジウム・ディフィシルは、2つのコピーのSecAを有する。S層タンパク質(SLP)及び追加の細胞壁タンパク質(CwpV)の排出は、SecA2に依存する。細胞壁における成熟SLPのレベルにおける低減と共に、SLPの細胞質前駆体SlpA及び他の細胞壁タンパク質の蓄積を、ドミナントネガティブなsecA1又はsecA2アレルにおいて観察する。更に、ドミナントネガティブなアレル又はSecA1若しくはSecA2のアンチセンスRNAノックダウンのいずれかの発現は、成長を顕著に障害し、これは、両方のSecシステムが、Cディフィシルにおいて必須であることを示している。
【０５０３】
Cディフィシル株630(流行性の型X)は、4,290,252bpを有する1つの環状染色体(G+C含有量=29.06%)及び7,881bpを有する環状プラスミド(G+C含有量=27.9%)を有する。全ゲノムを配列決定し、ゲノムの11%が、接合トランスポゾンのような可動遺伝子エレメントからなることを見いだした。これらのエレメントは、その抗菌抵抗性、病原性、宿主相互作用及び表面構造の創出に関与する遺伝子を有するCディフィシルをもたらす。例えば、CディフィシルのcdeA遺伝子は、多剤及び毒性化合物排出(MATE)ファミリーにおける公知の流出輸送体と相同であることが知られている多剤流出ポンプを産生する。タンパク質は、細胞からの薬物のエネルギー依存性及びナトリウム結合流出を促進する。加えて、Cディフィシルにおけるcme遺伝子は、他の細菌における多剤抵抗性をもたらすことが示されている。
【０５０４】
アレイは、Cディフィシル細胞の必須遺伝子(SecA2)中の配列を標的にするためのR1-S1-R1'CRISPR単位を含む。別の実験において、標的化は、MTZ及び任意選択で、1つ又は複数の他の抗Cディフィシル抗生物質の存在下でcdeA遺伝子に対してである。各スペーサーは、SecA又はcdeA遺伝子の20merのヌクレオチド配列を含み、配列は、リピート配列に同族であるCディフィシル株630CRISPR/CasシステムのPAMを含む。各リピートは、Cディフィシル株630リピートと同一であり、配列
5'-ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3'(配列番号118)
を有する。
【０５０５】
代替のセットの実験において、リピートについて以下の配列を使用する:
5'-GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3'(配列番号119)。
【０５０６】
リピートは、混合集団におけるCディフィシル細胞にとって内因性であるCasと共に機能する。細菌の混合集団を、Cディフィシル感染に罹患しているヒト患者の糞便試料由来のエクスビボ試料として回収する。混合集団を、インビトロで担体細菌と混合し、37℃、嫌気的条件下でインキュベーションして、テトラサイクリンの存在下で腸状態を模倣する。CRISPRアレイを含有するトランスポゾンは、混合物中のバクテロイデス及びCディフィシルに移行すると予想する。更に、後者の細胞における標的部位は、Casヌクレアーゼ作用により切断され、これにより、混合集団におけるCディフィシルの比率が低減する(バクテロイデス対Cディフィシルの比率を増大させる)と予想する。
【０５０７】
次の実験において、担体細菌を含む飲料を作り、ヒト患者はこれを連続する数日間1回又は2回消費する。患者に、処置期間中、テトラサイクリンも投与する。糞便解析により、糞便試料におけるCディフィシルの比率が低減する(バクテロイデス対Cディフィシルの比率が増大する)ことを明らかにすると予測する。
【実施例５】
【０５０８】
コレラの処置又は予防
世界保健機関(WHO)コレラファクトシート第107号(2015年7月にアップデート)を参照のこと。コレラは、細菌ビブリオ・コレラエが混入した食物又は水の摂取により引き起こされる急性下痢性感染である。研究者は、毎年、およそ1400〜4300万のケースが存在し、コレラが原因で、世界中で毎年28000〜142000人が死亡していると推定している。2時間〜5日間という短いインキュベーション期間は、潜在的な爆発的なパターンの大流行の引き金を引く要因である。コレラは、極端に病原性のある疾患である。これは、小児と成人の両方に影響し、数時間以内に殺傷し得る。Vコレラエに感染した人の約80%は、症状を発症しないが、細菌は、感染の1〜10日後に彼らの顔面に存在し、環境に戻り、他の人々を感染させる可能性がある。症状を発症する人のうち、80%が、軽度又は中度の症状を有し、一方、およそ20%が、重篤な脱水症状を伴った急性水様性下痢を発症する。処置しないままなら、これが死を導き得る。
【０５０９】
Vコレラエの2つの血清群-O1及びO139-が、大流行を引き起こす。VコレラエO1が、大流行の大部分を引き起こし、一方、1992年にバングラデシュで初めて同定されたO139は、東南アジアに限られている。非O1及び非O139Vコレラエのいずれも、軽度の下痢を引き起こし得るが、流行を引き起こさない。近年、新たなバリアント株が、アジア及びアフリカの幾つかの地域で検出された。知見は、これらの株が、より重篤なコレラを引き起こし、このケースは、より高い死亡率を有すると示唆する。Vコレラエの主要なリザーバーは、人並びにしばしば富栄養化と関連する不快な水及び河口のような飲料水媒介の供給源である。
【０５１０】
ビブリオ・コレラエ血清群O1が、重篤な下痢性疾患コレラの主要な原因因子であり、溶菌性Vコレラエファージが、特に、ベンガル湾の周囲の地方特有の領域における疾病負荷の影響に関与していることを記載している、Nature、2013年2月28日;494(7438):489〜91頁、doi: 10.1038/nature11927、「A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity」、Seed KDら(参照により取り込まれる)を参照のこと。著者らは、ICP1(下痢性疾患の研究についての国際センターのため、バングラデシュコレラファージ1)の単離が、2001〜201114から集め、彼らの刊行物において記載した研究におけるコレラ患者の米とぎ汁様糞便試料の間で偏在しているVコレラエO1特異的病原性ミオウイルスと関連することを記載した。
【０５１１】
著者らは、ICP1 CRISPR/Casシステムが、2つのCRISPR遺伝子座(CR1及びCR2と命名)及び組織化及びタンパク質産物が、1-F型(エルシニア・ペスチス)サブタイプシステム17のCasタンパク質に相同である、6つのcas遺伝子からなることを説明している。Vコレラエは、2つの生物型、古典的及びEl Torに分けられ、前者は、より早期の大流行と関連し、その後、El Tor生物型18に取って代わられる。古典的株VコレラエO395は、I-E型(大腸菌)サブタイプ17に属するCRISPR/Cas システムを有し、今日まで、CRISPR/Casシステムを有するEl Tor株の記載はない。従って、ICP1ファージにおけるCRISPR/Casシステムの源は分かっていない。
【０５１２】
下線を引いたcrRNAにおける予想ステムを形成する部分的に回帰性の配列を含むCR1及びCR2コンセンサス直接リピートのRNA配列は、以下の通りである
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA[配列番号75]。
【０５１３】
本発明の実施例において、アレイのその又は各リピートは、配列番号75に少なくとも80、90、95、96、97、98又は99%同一(若しくは配列番号75に同一)である配列を含むか又はからなる。
【０５１４】
ICP1 CRISPRにおけるスペーサーの大部分は、1964年にインドにおいて単離された古典的株O395、1994年にバングラデシュにおいて単離されたEl Tor株MJ-1236、及び2001〜2011年にICDDR,Bにおいて収取された幾つかのEl Tor株を含む、Vコレラエ株のサブセットにおいてみられる18kbアイランド内の配列に100%の同一性を示す。18kbアイランドは、原型スタフィロコッカス・アウレウス病原性アイランド(SaPI)を含む、グラム陽性細菌のファージ誘導可能な染色体アイランド(PICI)に類似する。SaPIは、ある種のファージによる感染後に切除、環状化及び複製するように誘導される。それらは、それら自体の乱雑な広がりを可能にするファージ複製サイクルと干渉する様々な機序を使用し、これにより、さらなるファージ捕食から周囲の細菌集団を保護することができる。ICP1 CRISPR/Casシステムが標的化するVコレラエ18kbアイランドの組織化は、1つの末端にインテグラーゼ相同体及び宿主種のものより低いGC含有量(47.5%と比較して37%)を有する、PICIのSaPIサブセットにおいて観察されるものと、長さ、塩基組成、及び組織化が類似する。したがって、18kbエレメントは、VコレラエPICI様エレメント(PLE)として言及される。
【０５１５】
【化１】
2020525049.tif 000009
【０５１６】
[ヌクレオチド配列=配列番号76(32bpのプロトスペーサー配列(配列番号77)を灰色で陰を付け、本開示は、灰色で陰を付けた最初のTで始まり、灰色で陰を付けた最後のCで終わる配列を含む);及びアミノ酸配列=配列番号78]
【０５１７】
Seedらは、CR1及びCR2アレイが、GA PAM配列の認識により作動することを決定した。Seedらはまた、研究したICP1関連ファージCRISPRアレイにおけるスペーサーの大部分が、VコレラエPLEに対する同一性を示すことを見いだした。スペーサーを、以下の表3において示し;本発明のアレイにおけるS1を、例えば、これらの配列のいずれか1つから選択する。実施形態において、S1を、下線を引いた配列のいずれか1つから選択する。
【０５１８】
一例では、本発明のアレイ(又は各アレイ)は、下線を引いたスペーサー配列の1つ、複数又は全てを含む遺伝子操作されたアレイである。アレイスペーサーは、以下の通り天然に存在しない配置を含むことができる。
【０５１９】
例えば、アレイは、8a及び/又は9a型、並びに1a〜7a型の0、1、2、3、4、5又は6つ(だが7つではない)のスペーサーを含む。例えば、アレイは、4b型、及び1b〜3b型の0、1又は2、3つ(だが、3つ以上ではない)のスペーサーを含む。例えば、アレイは、8a型並びに9a、4b、1c、3d、1e及び3e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。例えば、アレイは、9a型並びに8a、4b、1c、3d、1e及び3e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。例えば、アレイは、4b型並びに8a、9a、1c、3d、1e及び3e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。例えば、アレイは、1c型並びに8a、9a、4b、3d、1e及び3e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。例えば、アレイは、3d型並びに8a、9a、4b、1c、1e及び3e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。例えば、アレイは、1e型並びに8a、9a、4b、1c、3d及び3e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。例えば、アレイは、3e型並びに8a、9a、4b、1c、3d及び1e型の1つ、複数又は全てのスペーサーを含む。
【０５２０】
別の天然に存在しない構成において、ベクターは、本発明の第1及び第2のアレイを含み、アレイは、1a〜1gから選択される少なくとも2つのスペーサー(例えば、8a、9a、4b、1c、3d、1e及び3eから選択される少なくとも2つのスペーサー)を含み、スペーサーは、同じICP1ファージゲノムのスペーサーではなく、例えば、ICP1_2011_A、又はICP1_2006_E、又はICP1_2005_A又はICP1_2004_Aのいずれのスペーサーではない(上記の表におけるスペーサーに関する)。従って、実施形態において、以下である。
【０５２１】
第1のアレイは、ICP1_2011_Aスペーサー配列(例えば、8a及び/又は9a)を含み、第2のアレイは、ICP1_2006_E、ICP1_2005_A又はICP1_2004_Aのスペーサー配列(例えば、4b、1c、3d、1e及び3eから選択される1つ又は複数のスペーサー)を含む。
【０５２２】
一例では、ベクターは、8a、9a、4b、1c、3d、1e及び3eから選択される1、2、3、4、5、6つ又は全7つのスペーサー型を含む。一例では、ベクターは、前記選択されたタイプの1つ又は複数のコピーを含む。一例では、ベクターにおけるその、幾つか又はそれぞれのアレイは、第1のスペーサー(アレイのプロモーターに最も近い)を含み、第1のスペーサーは、8a、9a、4b、1c、3d、1e及び3eから選択される。天然のアレイが、第1のスペーサーを最も頻繁に使用するので、この方法での配置は、有利である。
【０５２３】
高密度トランスポゾン変異誘発の高処理DNA配列決定への結び付け(トランスポゾン挿入配列決定)が、細菌成長及び生存に対する個々の遺伝子座の関与の同時かつゲノム全体での評価を可能にすることを開示する、Nucleic Acids Res.、2013年10月;41(19):9033〜48頁、doi: 10.1093/nar/gkt654.、Epub、2013年7月30日、「High-resolution definition of the Vibrio cholerae essential gene set with hidden Markov model-based analyses of transposon-insertion sequencing data」、Chao MCら(参照により取り込まれる)を参照のこと。HMM結果は、128種の遺伝子が、LBにおけるV.コレラエの最適な成長に要求されることを示す。本発明の標的配列は、これらの遺伝子のいずれか1つの配列であり得る(遺伝子名及び配列は、本発明のベクターの標的配列の提供における使用のため、及び本明細書における態様において可能な包含のため、参照により明白に取り込まれる)。
【０５２４】
例えば、それぞれ、5.6及び4.7の平均読み取り値を有する、vc0309及びvc0753における挿入変異体は、成長がひどく減弱された。同様に、vc0237及びvc1773変異体は、インビトロ競合実験において野生型細胞より適合しなかった。リストはまた、vca0360、vca0477、vca0486及びvca0488を含む推定毒素/抗毒素付加遺伝子座由来の多数の抗毒素遺伝子を含む。かかる遺伝子は、活性な毒素と関連するとき、必須であると仮定する。
【０５２５】
著者らは、表4における必須のVコレラエ遺伝子を見出した。著者らは、必須であると思われる200種より多くの遺伝子間領域を同定した。
【０５２６】
従って、本発明の実施例において、宿主細胞が、ビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列は、vc0631、vc2024、vc2626、vc2763-vc2767又はvc2768-vc2770配列である。本発明の実施例において、宿主細胞が、ビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列は、vc0309及びvc0753、vc0237及びvc1773、vca0360、vca0477、vca0486又はvca0488配列である。
【０５２７】
Infect Immun.、2015年9月;83(9):3381〜95頁、doi: 10.1128/IAI.00411-15.、Epub、2015年6月8日、「A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio cholerae Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System Modulates Virulence Gene Expression」、Wang Qら(参照により取り込まれる)を参照のこと。著者らは、生物の主な腸コロニー形成因子である、TCPの主要なサブユニットをコードする、tcpAの発現のため要求される新たな因子を同定するためのトランスポゾン挿入部位(TIS)配列決定ベースのストラテジーを使用した。tcpA発現を調節することが知られた遺伝子の大部分を同定することを除き、スクリーニングにより、Vコレラエホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)の酵素I(EI)及びHpr成分をコードする、ptsI及びptsHを得た。TcpAの低減した発現に加えて、EI、Hpr、又は関連するEIIA(Glc)タンパク質を欠く株は、ほどんとコレラ毒素(CT)を産生せず、幼いマウスの腸での減弱したコロニー形成能力を有していた。PTSは、それ自体が、病原性遺伝子発現の中心的な活性化因子である、toxTの発現を調節する、tcpPH及びaphABの発現を調節することにより、病原性遺伝子発現を調節する。
【０５２８】
従って、本発明の実施例において、宿主細胞が、ビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列は、tcpA配列又はtcpAモジュレーター配列(すなわち、tcpA自体又はその発現産物を介して調節するヌクレオチド配列)である。例えば、配列は、ptsI又はptsH配列である。一例では、標的配列は、ホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)の配列、又はtcpPH、aphAB若しくはtoxT配列である。実施例において、標的配列は、EIIA(Glc)タンパク質をコードする遺伝子配列である。
【０５２９】
本発明に適当な標的配列、以下のいずれか1つの配列(病原性遺伝子に下線を引いてある)をまた、表5において示す。
【０５３０】
実施形態において、細胞は、ビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列は、これらの遺伝子のいずれかである配列である。
【０５３１】
病原性遺伝子を、表6に示す。
【０５３２】
実施形態において、細胞は、ビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列は、これらの遺伝子のいずれかである配列である。
【０５３３】
TCP及びCTX病原性アイランド由来の遺伝子
実施形態において、細胞は、ビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列は、ace、cep、ctxA、ctxB、orfU、zot、rstA、rstB、rstR、acfA、acfB、acfC、tagE、aldA、int、tagA、tagD、tcpA、tcpB、tcpC、tcpD、tcpE、tcpF、tcpH、tcpI、tcpJ、tcpP、tcpQ、tcpR、tcpS、tcpT又はtoxT配列である。
【実施例６】
【０５３４】
野生型内因性Casを利用することによる特異的な細菌叢細菌集団の成長の阻害
1.材料及び方法
1.1.株
以下の株を、本実施例並びに実施例7及び8のコースにおいて使用した:大腸菌MG1655、大腸菌TOP10、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9(ATCC BAA-491、Manassas、Virginia)、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM20617(T)(DSMZ社、Braunschweig、Germany)、ラクトコッカス・ラクチスMG1363及びストレプトコッカス・ミュータンス・クラーク1924DSM20523(DSMZ社、Braunschweig、Germany)。
【０５３５】
培地選択のコース及び遺伝子構造物の試験中、異なる連鎖球菌の株を使用した。ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9(ATCC BAA-491)及び大腸菌TOP10を、それらの適合性のある成長要件を理由に、検討した。別段示さない限り、全ての株を、トッドヘヴィットブロス(TH)(T1438 Sigma-Aldrich社)において、好気性条件で37℃にて培養した。株を、25%グリセロール中-80℃にて保存した。
【０５３６】
1.2.鑑別成長培地
全ての株を、TH培地上37℃において20時間成長させた。Sサーモフィルス用の選択培地は、3gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であった。PEAを培地に加え、121℃にて15分間、15psiにおいてオートクレーブにかけた。1.5%(wt/vol)寒天を対応する培地に加えることにより、寒天プレートを調製した。選択又はプラスミド維持が必要なとき、30μgml-1カナマイシンを、サーモフィルス株及び大腸菌の両方のために使用し、500μgml-1を、Sミュータンスのため使用した。
【０５３７】
幾つかの場合において、株及びプラスミドに依存し、最大48時間のより長いインキュベーションが、PEAを添加した培地上での成長を観察するのに必要とし得る。使用する生物の生存率を制御するために、対照TH寒天を並行して行わなければならない。
【０５３８】
1.3.クローニング
全てのサブクローニング手法において、大腸菌(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 Chemically Competent cells)を使用した。Phusionポリメラーゼを使用して、PCRを行った。全てのPCR産物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-NagelによるNucleospin Gel及びPCR Clean-upを用いて精製した。精製したフラグメントを、総容量34μlの1μl酵素を含む1×FD緩衝液中の制限酵素DpnIを用いて切断した。切断した反応物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-NagelによるNucleospin Gel及びPCR Clean-upを用いて再度精製した。製造元のプロトコール(New England Biolabs社)に従い、10μl反応物において、Gibsonアセンブリーを行った。
【０５３９】
製造元の指示に従い、Qiagenキットを使用して、プラスミドDNAを調製した。グラム陽性株のための改変は、細胞溶解を促進するための0.5%グリシン及びリゾチームを添加した培地での細菌の成長を含んでいた。
【０５４０】
1.4.形質転換
1.4.1エレクトロコンピテント大腸菌細胞及び形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 Chemically Competent E. coli)を、クローニング及び実験のため使用した。エレクトロポレーションを、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して、標準設定:1800V、25μF及び200Ωを使用して行った。パルス後、LB-SOC培地1mlを加え、細胞を37℃にて1時間インキュベーションした。形質転換した細胞を、50μgml-1カナマイシンを含有するLB寒天において播種した。
【０５４１】
1.4.2エレクトロコンピテントSサーモフィルス細胞の調製
エレクトロポレーションプロトコールを、Somkuti及びSteinberg、1988年から改変した。40mM DL-スレオニン(T8375 Sigma-Aldrich社)を添加したTHブロスにおけるストレプトコッカス・サーモフィルスの一晩培養物を、同じ培地5mlにおいて100倍希釈し、OD6000.3〜0.5(およそ接種後2.5時間)まで成長させた。10,000×gにおいて10分間、4℃での遠心分離により、細胞を収集し、氷冷洗浄緩衝液(0.5Mスクロース+10%グリセロール)5mlを用いて3回洗浄した。細胞を洗浄した後、エレクトロポレーション緩衝液(0.5Mスクロース、10%グリセロール及び1mM MgCl2)中OD60015〜30に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液における細胞を、使用(1時間以内)まで4℃で維持するか、又はエッペンドルフ中のアリコート50μlを、液体窒素中において凍結し、後の使用のため-80℃において保存した。
【０５４２】
1.4.3エレクトロポレーションSサーモフィルス細胞
精製したプラスミドDNA1μlを、細胞懸濁液50μlに加え、エレクトロポレーションを、予め冷却した2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットにおいて行った。エレクトロポレーション設定は、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して、2500V、25μF及び200Ωであった。電気パルス直後、THブロス1mlを、細胞に加え、懸濁液を、氷上で10分間維持し、続いて、細胞を、3時間、37℃でインキュベーションした。抵抗性遺伝子の発現のための時間を置いた後、細胞を、30μgml-1カナマイシンを含有するTH寒天プレートに播種した。構築物に依存して、コロニーは、37℃でのインキュベーションの12〜48時間、目に見えた。
【０５４３】
1.5.XylSプラスミドの構築
本研究において使用した全てのプラスミドは、ストレプトコッカス・クレモリス由来の潜在性プラスミドpWV01からもたらされた広範な宿主範囲の発現ベクター(Bryksin及びMatsumura、2010年)であるpBAV1K-T5に基づき、Gibsonの方法を使用した他のフラグメントとの構築のためのオーバーハングを含有するものを使用して、骨格を増幅した。
【０５４４】
XylRリプレッサーの前方にプロモーターgyrAをクローニングすること(図1)により、キシロース誘導可能なシステムを構築した。XylRリプレッサーを、Gibsonアセンブリーのためのオーバーハングを含むリバースプライマー並びにgyrAプロモーター(Xieら、2013年)及び構築のための対応するオーバーハングをpBAV1KT5骨格に導入するために使用するウルトラマーであるフォワードプライマーを用いて、枯草菌の株SCK6(Zhangら、2011年)から増幅した。得られたフラグメントを、Pldha+PxylAハイブリッドプロモーター(Xieら、2013年)を含むウルトラマーを用いてpCL002(未公開の研究)から増幅したmCherryに隣接させた。製造元の指示に従い、3つの得られたPCR産物をGibson Master Mix(登録商標)(New England Biolabs社)において構築した。産物を、大腸菌TOP10エレクトロコンピテント細胞において最終的に形質転換した。図1を参照のこと。
【０５４５】
1.6.CRISPRアレイプラスミドの設計及び構築
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、4種の異なるCRISPRシステム(Sapranauskasら、2011年)を有し、本研究のため、II型CRISPR1(ST1-CRISPR)システムを選択した。標的配列の設計は、LMD-9の入手可能なゲノム配列(GenBank:CP000419.1)に基づく。ST1-CRISPRアレイを、CRISPRアレイリピート及びスペーサーのみをキシロース誘導可能なプロモーター(Xieら、2013年)の下に、続いて、対応するtracrRNAを連鎖球菌種のための強力な恒常的プロモーターの下に(Sorgら、2014年)含有するよう設計した(図2、配列番号)。
【０５４６】
tracrRNAはまた、crRNAの成熟において役割を果たし、Sサーモフィルス内因性RNaseIIIによりプロセシングし、crRNAとの複合体を形成させる。この複合体は、エンドヌクレアーゼST1-Cas9のためのガイドとして作用する(Horvath及びBarrangou、2010年)。キシロース誘導可能なプロモーターからの合成アレイの転写後、内因性Cas9及びRNAsesは、それを機能的gRNAにプロセシングする。gRNA/Cas9複合体は、標的の場所において2本鎖切断を引き起こす。
【０５４７】
アレイの設計は、GC含有量の高い2種の特異的な標的配列、及びcrRNAの正確な成熟に必要ではないと示唆されている(Horvath及びBarrangou、2010年)、tracrRNAの低減した部分(すなわち、完全なtracrRNA配列未満)を使用した。
【０５４８】
2種の標的は、必須遺伝子(DNAポリメラーゼIIIサブユニットアルファ)及び抗生物質抵抗性遺伝子(tetA様遺伝子)であった(配列番号)。
【０５４９】
プライマーを使用して、pBAV1KT5-XylR-PldhA骨格を増幅した。製造元(New England Biolabs社)の指示に従い、CRISPRアレイgBlock及びオーバーハングを有する骨格を、Gibson Master Mix(登録商標)において構築した。産物を、大腸菌TOP10エレクトロコンピテント細胞において最終的に形質転換した。
【０５５０】
1.7.ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9におけるキシロース誘導可能なシステムの特徴決定
一晩定常フェーズの培養物を、対応する抗生物質を含むTHブロスに1:100希釈した。中期指数基の細胞を、異なる濃度のD-(+)-キシロース(0、0.001、0.01、0.1、0.5及び1%wt/vol)とインキュベーションし、細胞培養物を培地において直接測定して、細胞懸濁液又は懸濁緩衝液(PBS緩衝液)上での培地の自己蛍光の程度を評価した。細胞培養物の20μlの試料を、平底を有する96ウェルプレート上、PBS緩衝液において1/10希釈した。細胞懸濁液又は培地の蛍光を、プレートリーダー上で読み取った。励起波長558nm及び発光波長612nmを使用して、mCherry蛍光を測定した。再懸濁した細胞の吸光度を、OD600nmにおいて測定した。最低、3種の独立した生物学的複製を、各実験について行った。
【０５５１】
1.8.SサーモフィルスにおけるCRISPRアレイの活性化
SサーモフィルスのDNAポリメラーゼIII及びtetAを標的化するCRISPRアレイを含有するプラスミドを含む、SサーモフィルスLMD-9及び大腸菌TOP10の両方を、プラスミド維持のため30μgml-1カナマイシンを添加した培養物3mlにおいて一晩成長させた。翌日、96ウェルの深いウェルプレートに、30μgml-1カナマイシンを添加した、新鮮TH培地中の一晩培養物の1/100の500μlを接種した。中期指数期の細胞培養物を、1%キシロースを用いて誘導した。Sサーモフィルス及び大腸菌単独に対する死滅効果を試験した。試験した各株及び条件について、陰性対照を、キシロースなしで維持した。細胞をOD約0.5まで成長させ、次に、96ウェルレプリケーター(Mettler Toledo Liquidator(商標)96)を使用して、TH培地に10倍連続希釈して、滴容量5μLを、1gl-1PEAを添加したTH寒天上プレートにスポットした。プレートを、24時間、37℃にてインキュベーションし、コロニー形成単位(CFU)を、三連の測定値から計算した。
【０５５２】
2.結果
2.1成長条件及び選択培地
本発明者らは、本発明者らが同時培養実験のため使用することを計画した全ての株について成長を支持する細菌の株及び培養プロトコールを提示する。本発明者らは、THブロス中37℃での大腸菌との類似の成長を支持することができる、Sサーモフィルス株LMD-9を使用した(図3)。
【０５５３】
異なる細菌を混合培養から区別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天を用いて、大腸菌を選択的に成長させることが可能であるが、Sサーモフィルスの選択的成長のための特定の培地は存在しない。PEA寒天は、グラム陰性(大腸菌)からグラム陽性(Sサーモフィルス)の単離のため使用する選択培地である。加えて、本発明者らは、異なる濃度のPEAは、他のグラム陽性の成長を部分的に阻害し、それが、本研究において使用する他のグラム陽性細菌間の選択を可能にする(図4)。3gl-1のPEAが、大腸菌の成長を制限しながら、SサーモフィルスLMD-9を選択的に成長させることを証明した。
【０５５４】
2.2誘導可能なシステムの設計及び検証
ストレプトコッカス属の種のための誘導システムは、異種性キシロース誘導カセット(Xyl-S)を作製することにより、バチルス・メガテリウムのキシロースオペロン(図5)に基づき、既に開発されている。xylR及びxylAプロモーターを、それぞれ、gyrA及びldhプロモーターを恒常的に発現するSミュータンスで置き換えた。ストレプトコッカス属の種のためのこの発現カセットは、異なる種間の選択性及び発現レベルにおける相違を示すが、システムを、Sサーモフィルスにおいて試験していない(Xieら、2013年)。したがって、本発明者らは、Sサーモフィルスにおいてキシロース誘導カセットを検証するためにまず提示した。
【０５５５】
xylRプロモーターをSミュータンスのgyrAプロモーターで置き換えるが、内因性BメガテリウムxylAプロモーターを未変性のままにすることのみにより、代替バージョンの誘導カセットを構築した。キシロース誘導可能なシステムの設計中、本発明者らは、誘導可能なプロモーターの両方のバージョン、バチルス・メガテリウムにおいて見られる天然のPXylAプロモーター及びPXylAプロモーターのリプレッサー結合部位と融合した高度に保存されたプロモーターPldhaのハイブリッドプロモーターを考慮した(図5)。数種のストレプトコッカス属の種のみが、キシロースを代謝することが報告されており、従って、他のストレプトコッカス属の種におけるxylAプロモーターを認識するための制御性機構は、恐らく違うであろう。したがって、本発明者らは、両方のキシロース誘導システムを構築したが、ただPldha+XylAシステムを用いたmCherryの誘導能を試験した。
【０５５６】
キシロースによるmCherry誘導可能な発現を決定するために、プラスミド(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA)を含む細胞の中期指数期の培養物を、異なる濃度のキシロースを用いて誘導した。誘導の6時間後、本発明者らは、培養物におけるmCherry蛍光を測定し、本発明者らは、プラスミドを有する細胞における実質的により高い全体的な発現レベルを観察した(図6)。システムが、キシロースを加えなかった培養物においてでさえ実質的なレベルの基礎発現を示したことに気付くのは、価値がある。これは、システムが、「もれやすく」、死滅アレイの文脈において、これは、システムがキシロースを含む前でさえ、細胞死を導き得ることを意味する。しかしながら、本研究の続くコースにおいて、本発明者らは、プラスミド(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA及びpBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)の両方のバージョンを使用した。
【０５５７】
2.3CRISPR/CAS9アレイの設計
CRISPRアレイにおけるゲノム標的化スペーサーが、SサーモフィルスLMD-9において死を引き起こし得るかどうかを決定するために、本発明者らは、設計したCRISPRアレイを、既に構築した2つのキシロース誘導可能なシステム(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA及びpBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)に挿入した。これらのプラスミドにおいて、本発明者らは、mCherryを、CRISPRアレイを含有するgBlockで置き換えた(図7)。Pldha+XylAプロモーターを含むバリアントは、より強力であると予想され、PxylAより高い基礎活性を有する(Xieら、2013年)。
【０５５８】
2.4内因性Cas9を使用した細菌集団成長の阻害
本発明者らが、大腸菌においてプラスミドを構築した後、プラスミドをSサーモフィルスに形質転換した。これにより、本発明者らが、特定の細菌種の細胞死を引き起こすかどうかを決定することを可能にする。興味深いことに、強力なPldh+XylAハイブリッドプロモーターを含有するプラスミドに曝露したSサーモフィルスにおける細菌宿主集団サイズ(細菌を成長させ、寒天プレート上のコロニーをカウントすることにより示す)は、弱い通常のPxylAプロモーターを含有するプラスミドに曝露したSサーモフィルスと比較して10分の1であり(図8;強力なアレイ発現を含む52個のコロニー対弱いアレイ発現を含む556個のコロニー、10.7倍の差)、2種の株は、エレクトロコンピテントSサーモフィルス細胞の同じバッチを使用して並行して形質転換した。これは、本発明者らに、Sサーモフィルス遺伝子を標的化するCRISPRアレイを有するプラスミドが、内因性Casヌクレアーゼ及びRNaseIIIを使用して、細胞を死滅させ、これにより、集団成長を10分の1に阻害することができることを示唆する。
【０５５９】
本発明者らは、PxylAプロモーターを含むプラスミドにより形質転換した宿主細胞における弱いアレイ発現が、強力なプロモータープラスミドを用いたものよりずっと弱い程度の細胞死滅を導くことを予想する。本発明者らは、観察した10分の1の阻害より大きい集団成長阻害が、強力なアレイ発現の活性の比較が、いずれのアレイをコードするプラスミドに曝露されていないSサーモフィルス(例えば、腸細菌叢から直接単離した細菌)と行ったかを決定すると予想する。従って、本発明者らは、内因性Casヌクレアーゼを利用するための、宿主細胞におけるアレイ(又はシングルガイドRNA)発現は、環境における標的宿主細胞の有効な成長阻害、本明細書において述べた医薬及び他の設定をもたらすのに有用であると考える。抗生物質の同時投与はまた、特に、1つ又は複数の抗生物質抵抗性遺伝子を標的化するとき、成長阻害を増強するのに有用であり得る。
【０５６０】
3.考察及び見解
この研究において、本発明者らは、内因性Cas9システムを使用して、Sサーモフィルスを特異的に死滅させるためのCRISPRアレイを設計することを提示する。死滅シグナルに渡る対照を得るために、本発明者らは、Sサーモフィルスにおいて適用し得る誘導可能なシステムを適用しようと努めた。Bメガテリウム由来のキシロース誘導可能なXylRシステムを、Sミュータンス(Xie、2013年)においては既に適用したが、Sサーモフィルスにおいては適用していない。本研究において、本発明者らは、Sサーモフィルスにおいて設計したXylR-mCherry-Pldhaを使用してxylR誘導システムの機能性を示した。本発明者らは、0.1%wt/volが、SサーモフィルスにおいてXylRシステムを完全に誘導するのに十分であることを見いだした(図6)。
【０５６１】
Sサーモフィルス及び大腸菌を同時培養するときの存在量を観察するために、本発明者らは、3gl-1のPEAを含む培養培地の添加が、大腸菌の成長を制限しながら、Sサーモフィルスの選択的成長を可能にすることを確立した(図4)。
【０５６２】
SサーモフィルスLMD-9ゲノムにおけるDNAポリメラーゼIIIサブユニットアルファ及びtetA様遺伝子を標的化するST1-CRISPRアレイを、キシロース誘導可能なプロモーター下に置いた(Xieら、2013年)。これらの領域の標的化は、2本鎖切断を導き、これにより、Sサーモフィルスの生存率を制限するべきである(図9)。遺伝子操作したアレイを、コードするCRISPRアレイをプロセシングするための内因性CRISPR/Cas機構を使用して、Sサーモフィルスゲノムを標的化するよう設計し、アレイは、大腸菌のような無関連の株の成長に対する影響を有さないと予測されるので、類似の標的でさえ、そのゲノム上で見ることができる。これを、実施例8において考察した混合細菌集団(ヒト細菌叢の態様を模倣する)において首尾よく試験した。
【０５６３】
表面上での宿主細胞成長を阻害する本発明の能力の証明は、本発明が、ヒト又は動物対象において本明細書において開示した細菌叢により媒介されるか、又は生じる疾患又は状態を処置又は予防するためである実施形態において重要であり、所望される。かかる細菌叢は、典型的には、対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼球、膣、肛門、耳、鼻又は咽頭組織)と接触しているので、従って、本発明者らは、表面上での細菌叢の細菌種(ストレプトコッカス属により例示される)の成長を阻害する活性の証明は、この有用性を支持する。
【実施例７】
【０５６４】
異なる株における特定の細菌叢細菌集団の成長の阻害
実施例6は、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9の特定の成長阻害を示した。ここで、本発明者らは、成長阻害が、第2の株:ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM20617においても得られ得ることを示す。したがって、実施例6において記載した方法を、後者の株に適用した(SサーモフィルスDSM20617についての選択培地が、2.5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であることを除く)。
【０５６５】
CRISPRアレイプラスミドを用いて形質転換したストレプトコッカス・サーモフィルスDSM20617を、カナマイシン抵抗性の発現を可能にする37℃において3時間の期間、液体培地において回復のためインキュベーションした。回復期間の後、細胞を、1%キシロースの存在下で異なる選択培地において播種して、細胞死を誘導し、対照としてキシロースを含まないものを伴った(図10)。(1)キシロース誘導により、Sサーモフィルスの成長を阻害することができる(「強力な」プロモータープラスミド対対照についてのおよそ10分の1)こと、(2)「強力な」システム(pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA)が、「弱い」システム(pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA)より成長阻害を生じることは明白である。
【実施例８】
【０５６６】
異なる細菌叢種の混合体における選択的細菌集団の成長の阻害
次に、本発明者らは、3種の混合集団における特定の細菌種の選択的成長阻害を示した。本発明者らは、ヒト及び動物の腸細菌叢においてみられる種を選択した(SサーモフィルスDSM20617(T)、ラクトバチルス・ラクチス及び大腸菌)。本発明者らは、2つのグラム陽性種(Sサーモフィルス及びLラクチス)を含めて、これが、前者の種の選択的死滅についての能力に影響を与えるかどうかを観察して、更に、これは、Sサーモフィルスと系統的に関連する種である(2つの種間の高い16sリボソームRNA配列同一性により示す)ので、Lラクチスを選択する困難さを増大させる(細菌叢における状況をより密接に模倣する)。Sサーモフィルス及びLラクチスは、共にファーミキューテス門である。更に、細菌叢を模倣するために、ヒト共生腸種(大腸菌)を含めた。
【０５６７】
1.材料及び方法
実施例6において提示した方法は、株を使用した(選択培地が、2.5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であることを除く)。
【０５６８】
1.1エレクトロコンピテントLラクチス細胞の調製
0.5Mスクロース及び1%グリシンを添加したTH培地におけるLラクチスの一晩培養物を、同じ培地5mlにおいて100倍希釈し、OD6000.2〜0.7(接種後およそ2時間)まで30℃にて成長させた。7000×gにおいて5分間、4℃にて細胞を収集し、氷冷洗浄緩衝液(0.5Mスクロース+10%グリセロール)5mlを用いて3回洗浄した。細胞を洗浄した後、エレクトロポレーション緩衝液(0.5Mスクロース、10%グリセロール及び1mM MgCl2)中OD60015〜30に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液における細胞を、使用(1時間以内)まで4℃で維持するか、又はエッペンドルフ中のアリコート50μlを、液体窒素中において凍結し、後の使用のため-80℃において保存した。
【０５６９】
全ての種についてのエレクトロポレーション条件は、実施例6において記載した通りであった。
1.2CRISPRアレイの活性化:混合体実験
SサーモフィルスDSM20617、LラクチスMG1363及び大腸菌TOP10を、SサーモフィルスのDNAポリメラーゼIII及びtetAを標的化するCRISPRアレイを含有するプラスミドを用いて遺伝子形質転換した。形質転換後、全ての細胞を、単独及び共同培養において3時間37℃において成長させて、これにより、プラスミドにおいてコードされる抗生物質抵抗性を発生させるための回復を可能にした。本発明者らは、CRISPRによりコードされる成長阻害の読み取り値としての形質転換効率を使用することを決定した。したがって、細胞を回復させた後、培養物を、TH培地、PEAを添加したTH及び全てカナマイシンを添加したマッコンキー寒天に播種し、1%キシロースにより誘導した。
【０５７０】
2.結果
2.0Lラクチス、大腸菌及びSサーモフィルス間の系統学的相違
Sサーモフィルス及びLラクチスの16SrrNAをコードするDNA配列における計算した配列類似性を、83.3%と決定した。以下の16S配列を使用した:大腸菌:AB030918.1、Sサーモフィルス:AY188354.1、Lラクチス:AB030918。以下のパラメーター:-gapopen10.0、-gapextend0.5、-endopen10.0、-endextend0.5、-aformat3対、-snucleotide1、-snucleotide2を含む指針(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)を用いて、配列を整列させた。図11は、Sサーモフィルス、Lラクチス及び大腸菌由来の16S配列の最尤系統樹を示す。
【０５７１】
2.1成長条件及び選択培地
Sサーモフィルス及びLラクチスは、多くの発酵食品及びヨーグルトに一般に使用される。これらの株は、宿主との密接な関連を形作る腸微生物であることが一般に知られおり、Sサーモフィルス及びLラクチスが系統的に密接に関連するという、これらの生物の16SリボソームRNA領域の従前の特徴決定が示されている(Ludwigら、1995年)ので、本発明者らはこれらの株を選択する。並行して、本発明者らはまた、大腸菌はまた、腸微生物コミュニティーにおいて一般に見られるので、本発明者らの混合集団の同時培養実験のためこの生物の成長を評価した。本発明者らは、本発明者らが同時培養実験のため使用することを計画した全ての株について成長を支援する細菌の株及び培養プロトコールを提示する。本発明者らは、全ての株が、37℃でのTHブロスにおける成長を支援することが可能であることを見いだした(図3)。
【０５７２】
異なる細菌を混合培養から区別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天を用いて、大腸菌を選択的に成長させることが可能であるが、Sサーモフィルスの選択的成長のための特定の培地は存在しない。PEA寒天は、グラム陰性(大腸菌)からグラム陽性(Sサーモフィルス)の単離のため使用する選択培地である。加えて、異なる濃度のPEAが、異なるグラム陽性種及び株の成長を部分的に阻害し、それが、本研究において使用する他のグラム陽性細菌間での選択を可能にする。2.5gl-1のPEAを使用して、Lラクチス及び大腸菌の成長を制限しながら、Sサーモフィルスを選択的に成長させることを証明した。
【０５７３】
全ての株を、カナマイシン選択マーカーを有するpBAV1KT5のベクター骨格を使用したプラスミドを用いて形質転換し、本発明者らは、30μgml-1のカナマイシンを添加した培地が、プラスミドを維持しながら、細胞を成長させるのに十分であることを見いだした。
【０５７４】
2.3混合集団における形質転換及び選択的成長の阻害
本発明者らは、CRISPRアレイを含有するプラスミドを用いてSサーモフィルス、Lラクチス及び大腸菌を形質転換し、等しい量で合わせた全ての細菌種の混合体においてそれらを培養し、それにより、本発明者らが、Sサーモフィルスにおいて細胞死を特異的に引き起こし得るかを決定することを可能にした。本発明者らは、全ての種を、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylAプラスミドを用いて形質転換した。
【０５７５】
図12は、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylAプラスミドのいずれかを有する大腸菌、Lラクチス及びSサーモフィルスの同時培養における選択的Sサーモフィルス成長阻害を示す。pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylAプラスミドを有する大腸菌の間で成長差はなかった(中ほどのカラム)。しかしながら、本発明者らが予想した通り、Sサーモフィルス(2.5gl-1PEAを添加したTH寒天上で選択的に成長する、最後のカラム)は、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA(強力)又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA(弱い)プラスミド間での形質転換効率における減少を示す。これにより、本発明者らは、細胞の混合集団における標的Sサーモフィルス亜集団の選択的成長阻害を示した。
【０５７６】
(参考文献)
・Barrangou, R.、Fremaux, C.、Deveau, H.、Richards, M.、Patrick Boyaval、Moineau, S.、Horvath, P.、(2007年)、CRISPRProvides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes.、Science、315(3月)、1709〜1712頁。
・Bryksin, A. V、及びMatsumura, I.、(2010年)、Rational design of a plasmid origin that replicates efficiently in both gram-positive and gram-negative bacteria、PloS One、5(10)、e13244頁。
・Chan CTY、Lee JW、Cameron DE、Bashor CJ、Collins JJ:“Deadman” and “Passcode” microbial kill switches for bacterial containment、Nat Chem Biol、2015年、12(12月):1〜7頁。
・Horvath, P.、Romero, D. A.、Coute-Monvoisin, A.-C.、Richards, M.、Deveau, H.、Moineau, S.、Barrangou, R.、(2008年)、Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus、Journal of Bacteriology、190(4)、1401〜12頁。
・Ludwig, E. S.、Klipper, R.、Magrum L.、Wose C.、及びStackebrandt, E.、(1985年)、The phylogenetic position of Streptococcus and Enterococcus. Journul of Gencwl Microhiologj.、131、543〜55 1頁。
・Mercenier, A.、(1990年)、Molecular genetics of Streptococcus thermophilus.、FEMS Microbiology Letters、87(1〜2)、61〜77頁。
・Samarzija, D.、Antunac, N.、及びHavranek, J.、(2001年)、Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo、51(1)、35〜48頁、から回収。
・Sapranauskas, R.、Gasiunas, G.、Fremaux, C.、Barrangou, R.、Horvath, P.、及びSiksnys, V.、(2011年)、The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli、Nucleic Acids Research、39(21)、9275〜9282頁。
・Somkuti, G. A.、及びSteinberg, D. H.、(1988年)、Genetic transformation of Streptococcus thermophilus by electroporation. Biochimie、70(4)、579〜585頁。
・Sorg, R. A.、Kuipers, O. P.、及びVeening, J.-W.、(2014年)、Gene expression platform for synthetic biology in the human pathogen Streptococcus pneumoniae、ACS Synthetic Biology、4(3)、228〜239頁。
・Suvorov, a.、(1988年)、Transformation of group A streptococci by electroporation、FEMS Microbiology Letters、56(1)、95〜99頁。
・Xie, Z.、Qi, F.、及びMerritt, J.、(2013年)、Development of a tunable wide-range gene induction system useful for the study of streptococcal toxin-antitoxin systems、Applied and Environmental Microbiology、79(20)、6375〜84頁。
・Zhang, X. Z.、及びZhang, Y. H. P.、(2011年)、Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis、Microbial Biotechnology、4(1)、98〜105頁。
【実施例９】
【０５７７】
混合した細菌混合体における選択的種及び株の成長阻害のためのベクターがコードするシステム
実施例8において、本発明者らは、驚くべきことに、異なる種の混合した混合体における選択的集団成長阻害について、宿主細菌における内因性Casヌクレアーゼ活性を利用する可能性を確立した。次に、本発明者らは、異なる種の混合した混合体における選択的集団成長阻害について、ベクターがコードするCas活性を使用する代わりの可能性を調査した。本発明者らは、3種の異なる種、及び標的細菌の代わりの株を更に含む混合集団における特定の細菌種の選択的成長阻害を示した。本発明者らは、驚くべきことに、予め決定した標的種のまさに標的株の選択的成長阻害を示す。更に、代替の株を、ベクターがコードするCRISPR/Casシステムは標的にせず、ヒト又は動物の腸細菌叢エレメントを模倣した混合した細菌の混合体におけるこのようなベクターが生じたシステムのすばらしい特異性を確立するのが望ましい。
【０５７８】
本発明者らは、ヒト及び動物の腸細菌叢においてみられる種を選択した(枯草菌、ラクトバチルス・ラクチス及び大腸菌)。本発明者らは、2つの株のヒト共生腸種、大腸菌を含めた。本発明者らは、一方の株における死滅化を標的化するため使用するが、他のものでは標的化しない配列相違を有するにも関わらず、密接に関連する株間を区別し得るかを見るための対象と考えた。細菌叢における大腸菌の幾つかの株が望ましいので、これは対象であり、一方、他のものが望ましくてもよく(例えば、ヒト又は動物に病原性)、従って、その株をノックダウンするためのCas改変のための標的であり得る。
1.材料及び方法
1.1.プラスミド及び株
表7及び8を参照。別段示さない限り、全ての株を、トッドヘヴィットブロス(TH)(T1438 Sigma-Aldrich)において、好気性条件で37℃にて培養した。株を、25%グリセロール中-80℃にて保存した。
自己標的化sgRNA-Cas9複合体は、それぞれ、テオフィリンリボスイッチ及びAraC/PBAD発現系によりしっかり調節された。Cas9のしっかりした調節は、大腸菌において安定的に行うのに望ましい。プラスミドは、大腸菌のK-12株を標的化するシングルガイドRNA(sgRNA)を含むストレプトコッカス・ピオゲネス由来の外来Cas9を含有していた。したがって、K-12由来の株TOP10は、システムが活性化されたとき、2本鎖自己切断及び続く死に影響されやすかった。Nissleの様な大腸菌の株は、同じ標的配列を有し、したがって、それらは、sgRNA-Cas9活性により影響されなかった。実施例9において使用した配列を示す、以下の表9〜11を参照のこと。本発明者らは、シングルgRNA設計を使用して、死滅化を促進するための複数の場所での宿主細胞ゲノムを切断する機会を増大させた、標的細胞において保存され、複数のコピー(7つのコピー)で提示される標的配列(リボソームRNAをコードする配列)を選択する。
図13は、spCas9及びリボソームRNAサブユニット16sを標的にする自己標的化sgRNAの発現を制御する制御因子を示す。
1.2.鑑別成長培地
全ての株を、TH培地上37℃において20時間成長させた。Bスブチリス用の選択培地は、5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であった。PEAを培地に加え、121℃にて15分間、15psiにおいてオートクレーブにかけた。1.5%(wt/vol)寒天を対応する培地に加えることにより、寒天プレートを調製した。
1.3.クローニング
全てのサブクローニング手法において、大腸菌(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 Chemically Competent cells)を使用した。Phusion(商標)ポリメラーゼを使用して、PCRを行った。全てのPCR産物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-Nagel(商標)によるNucleospin(商標)Gel及びPCR Clean-upを用いて精製した。精製したフラグメントを、総容量34μlの1μl酵素を含む1×FD緩衝液中の制限酵素DpnIを用いて切断した。切断した反応物を、製造元のプロトコールに従い、Macherey-NagelによるNucleospin Gel及びPCR Clean-upを用いて再度精製した。製造元のプロトコール(New England Biolabs社)に従い、10μl反応物において、Gibsonアセンブリーを行った。
製造元の指示に従い、Qiagenキットを使用して、プラスミドDNAを調製した。グラム陽性株のための改変は、細胞溶解を促進するための0.5%グリシン及びリゾチームを添加した培地での細菌の成長を含んでいた。
1.4.形質転換
1.4.1エレクトロコンピテント大腸菌細胞及び形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞(One Shot(登録商標)ThermoFischer社 TOP10 electrompetent E. coli)を、クローニング及び実験のため使用した。エレクトロポレーションを、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して、標準設定:1800V、25μF及び200Ωを使用して行った。パルス後、LB-SOC培地1mlを加え、細胞を37℃にて1時間インキュベーションした。形質転換した細胞を、対応する抗生物質を含有するLB寒天において播種した。
1.5.大腸菌及び混合体実験におけるsgRNA-Cas9の活性化
K-12由来の株のリボソームRNAをコードする配列を標的化するsgRNAを含有するプラスミドを含む大腸菌TOP10とNissleの両方、及び他の細菌を、一晩、THブロス3mlにおいて成長させた。翌日、細胞を、OD約0.5まで成長させ、次に、96ウェルレプリケーター(Mettler Toledo Liquidator(商標)96)を使用して、TH培地に10倍連続希釈して、液滴4μLを、TH寒天、インデューサー(1%アラビノース及び2mMテオフィリン)を含むTH寒天、2.5gl-1PEAを添加したTH寒天及び1%マルトースを添加したマッコンキー寒天にスポットした。プレートを、20時間、37℃にてインキュベーションし、コロニー形成単位(CFU)を、三連の測定値から計算した。
2.結果
2.1外来CRISPR-Cas9システムを使用した大腸菌の株の特異的標的化
本発明者らは、まず、システムが、大腸菌TOP10とNissleの両方において死滅化システムを導入することにより、2つの大腸菌の株間で区別できるかを試験した。
2.1混合培養物における外来CRISPR-Cas9システムを使用した大腸菌の標的化
両方の大腸菌の株、Bスブチリス、Lラクチスについて二連で、及び混合培養物について三連で、一晩培養物の連続希釈を行った。全ての株を、37℃にて20時間、インデューサーを含む選択プレート、及び含まない選択プレートにおいて成長させた。システムの導入は、他の細菌を未変性のままにしながら、K-12由来株を標的化するsgRNA-Cas9を活性化する。
異なる細菌を混合培養から区別することは、異なる種の細胞数を決定し、種の特異的な除去を決定するために重要である。マッコンキー寒天は、大腸菌を選択的に成長させ、PEA寒天は、グラム陰性(大腸菌)からグラム陽性(Bスブチリス)の単離のため使用される選択培地である。加えて、本発明者らは、異なる濃度のPEAが、他のグラム陽性のものの成長を部分的に阻害することを見いだした。2.5gl-1のPEAが、L大腸菌及びLラクチスの成長を制限しながら、Bスブチリスを選択的に成長させることを証明した。
図14は、誘導可能な、外来のベクターから生じたCRISPR-Casシステムによる大腸株の特異的標的化を示す。sgRNAは、K-12由来大腸株の大腸菌TOP10のゲノムを標的にし、一方、試験した他の株は影響されなかった。
図15は、この研究において使用した個々の細菌種の連続希釈液及びCRISPR-Cas9システムの誘導なしでのTH寒天における混合培養物を用いたスポットアッセイを示す。
図16は、異なる選択培地上での希釈液103のスポットアッセイを示す。2.5gl-1PEAを含むTHは、Bスブチリス(subtilis)単独の選択培地である。マルトースを添加したマッコンキーは、グラム陰性及び腸内桿菌を選択的に単離し、マルトース発酵に基づきそれらを鑑別するように設計された細菌用選択及び鑑別培地である。したがって、TOP10ΔmalK変異体は、プレート上で白色のコロニーを生じ、一方、Nissleは、ピンク色のコロニーを生じる;Aは、大腸菌(E coli)ΔmalK、Bは、大腸菌Nissleであり、Cは、Bスブチリス(subtilis)であり、Dは、Lラクチス(L lactis)であり、Eは、混合培養物であり;マッコンキー-/B及びEでの画像は、ピンク色を出現し;マッコンキー+/B及びEでの画像は、ピンク色を出現する。図17は、異なる培地及び選択プレート上でのこの研究において使用した細菌の選択的成長を示す。本発明者らは、混合集団における標的大腸菌の株(図17におけるx軸上の「大腸菌」)を明らかに選択的に死滅する一方、他の関連する株(「大腸菌-Nissle」)を同様に死滅しないことを観察することができる。混合集団における標的株の死滅化は、本実験において1000倍であった。
【０５７９】
(参考文献)
[1]Zhang, X. Z.、及びZhang, Y. H. P.、(2011年)、Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis、Microbial Biotechnology、4(1)、98〜105頁、http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x。
[2]Wegmann, U.、O'Connell-Motherway, M.、Zomer, A.、Buist, G.、Shearman, C.、Canchaya, C.、Kok, J.、(2007年)、Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363、Journal of Bacteriology、189(8)、3256〜70頁、http://doi.org/10.1128/JB.01768-06。
【実施例１０】
【０５８０】
接合プラスミドベクター及びCas3によるクロストリジウム・ディフィシルのインビトロCRISPR死滅化
本実施例は、宿主にとって内因性であるCas3及びリピート配列を使用したクロストリジウム・ディフィシルの迅速かつ高精度の死滅化についての例を提供する。
【０５８１】
本実験は、ベクター(本発明者らが、CRISPRによりガイドされるベクター(CGV(商標))と呼ぶ)としての接合プラスミドにより生菌担体細菌種からもたらされるgRNAをコードするCRISPRアレイを使用したクロストリジウム・ディフィシル高精度の死滅を含む。担体細菌(CRISPRによりガイドされるベクター(CGV(商標))を含有する大腸菌ドナー株)を、設計したアレイを含有するCGV(商標)のデリバリーの際に死滅するクロストリジウム・ディフィシルを用いて作製した。このCGV(商標)は、クロストリジウム・ディフィシル630Δermの内因性Cas3機構を利用した。クロストリジウム・ディフィシル細胞の100%の死滅を達成した。
【０５８２】
導入
クロストリジウム・ディフィシル (Cディフィシル)は、健常個体の腸に無症候性コロニー形成し得る胞子形成ヒト日和見病原体である。院内下痢症のような、罹患しているCディフィシルと関連する疾患の2つの主なリスク因子は、年齢及び抗生物質処置であり、致死的な結果を有し得る。本発明者らの研究の対象であるCディフィシル630Δermは、十分に特徴付けられた株であり、変異体検体の作製のため広く使用されている。
研究目的
目的1:結合によるCGVのデリバリー
Cディフィシルを特異的に標的化し、死滅するためのアレイを含有するCRISPRによりガイドされるベクター(CGV)を設計し、構築した。アレイを欠く同じCGVを構築して、接合効率についての対照として使用した。両方のCGVを、担体株大腸菌CA434に形質転換し、プラスミドを対象のCディフィシル630Δermの本発明者らの株に接合するためのドナー株として使用した。
【０５８３】
目的2:クロストリジウム・ディフィシル内因性Cas3機構の利用
レシピエント標的株CディフィシルにおけるデリバリーされたCRISPRアレイの転写の際、内因性Cas3をガイドして、それ自体のDNAを切断し、これにより、細菌の死を導いた。
【０５８４】
目的3:クロストリジウム・ディフィシル630Δermの除菌
設計したCGVを使用した接合完了体Cディフィシル細胞の効率的な死滅の達成
材料及び方法
細菌の株及び成長条件
大腸菌の株CA434を、Chain Biotech社から取得した。それを、栄養素豊富な培地(2×YT)にて培養し、一晩、37℃及び250rpmにて成長させた。CGVを維持するために要求されるとき、培地に12,5μg/mLチアンフェニコールを添加した。
【０５８５】
クロストリジウム・ディフィシル630Δermを、5g/L酵母抽出物、0.03%L-システイン、250μg/ml D-サイクロセリン及び8μg/mlセフォキシチン(BHIS+CC)を添加したBHI寒天上で成長させた。Cディフィシルを、一晩、Coyビニル嫌気キャビネットにおいて、92%N2、6%CO2及び2%H2の雰囲気下、37℃にて成長させた。ドナーCA434とCディフィシルの接合物を、普通のBHI寒天上で成長させて、ドナー株の成長を可能にした。接合後の接合完了体の選択のため、チアンフェニコールを、12.5μg/mLの終濃度までBHIS+CCプレートに加えた。全てのプレートを、1.5時間乾燥させて、この培地のブロスバージョンと共に、嫌気チャンバーに使用の少なくとも3時間前に移動した。
【０５８６】
CGV移行法
大腸菌CA434の担体細胞を、本発明者らのCGV(対照ベクターpMTL84151-FJ797649及びCRISPRベクターpMTL84151-cdCRISPR1)のいずれかのエレクトロポレーションにより得た。それを行うために、大腸菌CA434の一晩培養物を、選択せずに新鮮な2×YT培地に1:100希釈し、OD600約0.5まで成長させた。次に、標準的な手法(Sharanら、2009年)によりそれらをエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテント細胞を、プラスミドpMTL84151-FJ797649又はpMTL84151-cdCRISPR1のいずれかを用いて、形質転換し、2×YTにおいて1時間37℃にて振盪(250rpm)しながら回復させた。最終的に、それらを、形質転換体の選択のための12.5μg/mLチアンフェニコールを添加したLB寒天上に播種した。形質転換体を、Cディフィシルとの接合のため、12.5μg/mLチアンフェニコールを添加した液体2×YTにおいて、37℃及び250rpmにて成長させた。ドナー細胞1mlを、4000×gにて2分間遠心分離し、上清を取り除き、PBS400μlを用いて注意深く洗浄した。第2の遠心分離サイクル後、ペレットを、BHI非選択的プレートにおけるCディフィシルとの接合のため嫌気チャンバーに移した。改変したプロトコール(Des Purdyら、2002年)に従い、接合のため、Cディフィシルを調製した。Cディフィシル630Δermを、選択的BHIS+CCプレートにおいて一晩インキュベーションし、それから、掻爬物を、一晩、非選択的BHI1mlにおいて接種し、接合のため、一晩インキュベーションした。その培養物200μlを使用して、ペレット化したドナー細胞を再懸濁し、混合培養物を、非選択的BHIプレートの上部に20μlのスポットで播種した。接合物を24時間インキュベーションして、接合を可能にした。インキュベーション後、プレート全体を、無菌の接種ループを用いて徹底的に掻把し、BHIに再懸濁し、連続希釈液を、ドナー大腸菌の成長を妨げるためのBHI+CCプレート上及び接合完了体のさらなる選択のためチアンフェニコールを添加したBHI+CC上に播種した。48時間後に、シングルコロニーをカウントした。
【０５８７】
結果
対照CGVを有するCディフィシル接合完了体を選択する、BHI+CC+チアンフェニコールプレートの複製物は、1回の接合実験当たり約600〜750CFUを生じる一定数のコロニーを示した。CディフィシルのCRISPRアレイを含むCGVを有する大腸菌CA434との接合のため、プレートは何もなく、コロニーを観察しなかった。これは、CRISPRアレイを受け取った接合完了体Cディフィシル630Δerm細胞の100%の死滅に変える(図18:接合完了体Cディフィシル630Δermの死滅を参照)。
【０５８８】
考察及び結論
この実験の結果は、本発明者らが、所望のCRISPRアレイを含有するCGVを、大腸菌担体細菌からCディフィシル630Δermに首尾よく接合できたことを示す。本発明者らはまた、非常に効率的なCRISPR死滅のためCディフィシル内因性Cas3機構を首尾よく利用し得る。
【０５８９】
(参考文献)
Purdy D, O'Keeffe TA, Elmore M, Herbert M, McLeod A, Bokori-Brown M, Ostrowski A,Minton NP. (2002) Conjugative transfer of clostridial shuttle vectors from Escherichia coli to Clostridium difficile through circumvention of the restriction barrier. Molec. Microbiology 46(2), 439-452
Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., and Court, D. L. (2009) Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat. Protoc. 4, 206-223
【０５９０】
表及び配列
TABLE 1:本発明における使用のためのSRBのリピート配列
例えば、システムが、粗製油、天然のガス若しくは水回収、処理又は保存装置であるとき、R1及びR1'の各々が、これらのリピートコンセンサス配列から選択することができる。
【０５９１】
【表２Ａ】
2020525049.tif 000010
【０５９２】
【表２Ｂ】
2020525049.tif 000011
【０５９３】
【表２Ｃ】
2020525049.tif 000012
【０５９４】
【表２Ｄ】
2020525049.tif 000013
【０５９５】
【表２Ｅ】
2020525049.tif 000014
【０５９６】
【表２Ｆ】
2020525049.tif 000015
【０５９７】
【表２Ｇ】
2020525049.tif 000016
【０５９８】
【表２Ｈ】
2020525049.tif 000017
【０５９９】
【表２Ｉ】
2020525049.tif 000018
【０６００】
以下の例により説明する通り、移行を読み取る。
【０６０１】
【表３】
2020525049.tif 000019
【０６０２】
位置3491653において開始し、位置3498191において終わるCRISPRアレイを、デスルホビブリオ・デスルフリカンスND132において見出し、アレイは、各々がリピートと隣接した98個のスペーサー配列を有し、リピート各々が、配列番号51及び125-126の配列を有する。このようなリピートはまた、注意番号1の下の他の細菌のアレイにおいて見出す(表における最終カラム)。
【０６０３】
TABLE 2:(a)バクテロイデス属リピート
【０６０４】
【表４】
2020525049.tif 000020
【０６０５】
(b)プレボテラ属リピート
【０６０６】
【表５】
2020525049.tif 000021
【０６０７】
TABLE 3:
下線=VコレラエPLE内の配列と100%同一性を有するCRISPRスペーサー
【０６０８】
【表６】
2020525049.tif 000022
【０６０９】
TABLE 4:
【０６１０】
【表７】
2020525049.tif 000023
【０６１１】
TABLE 5:
【０６１２】
【表８】
2020525049.tif 000024
【０６１３】
TABLE 6:
【０６１４】
【表９】
2020525049.tif 000025
【０６１５】
TABLE 7.実施例9において使用される株
【０６１６】
【表１０】
2020525049.tif 000026
【０６１７】
TABLE 8.実施例9において使用されるプラスミド
【０６１８】
【表１１】
2020525049.tif 000027
【０６１９】
実施例9において使用する配列を示す、以下の表9〜11も参照のこと。
【０６２０】
TABLE 9:pCasens3における遺伝子部分の配列の使用(実施例9を参照)
【０６２１】
【表１２Ａ】
2020525049.tif 000028
【０６２２】
【表１２Ｂ】
2020525049.tif 000029
【０６２３】
【表１２Ｃ】
2020525049.tif 000030
【０６２４】
【表１２Ｄ】
2020525049.tif 000031
【０６２５】
【表１２Ｅ】
2020525049.tif 000032
【０６２６】
TABLE 10:pDual2における遺伝子部分の配列の使用(実施例9を参照)
【０６２７】
【表１３Ａ】
2020525049.tif 000033
【０６２８】
【表１３Ｂ】
2020525049.tif 000034
【０６２９】
TABLE 11:標的配列(実施例9を参照)
【０６３０】
【表１４】
2020525049.tif 000035
【０６３１】
【表１５Ａ】
2020525049.tif 000036
【０６３２】
【表１５Ｂ】
2020525049.tif 000037
【０６３３】
【表１５Ｃ】
2020525049.tif 000038
【０６３４】
【表１５Ｄ】
2020525049.tif 000039
【０６３５】
【表１５Ｅ】
2020525049.tif 000040
【０６３６】
【表１５Ｆ】
2020525049.tif 000041
【０６３７】
【表１５Ｇ】
2020525049.tif 000042
【０６３８】
【表１５Ｈ】
2020525049.tif 000043
【０６３９】
【表１５Ｉ】
2020525049.tif 000044
【０６４０】
【表１５Ｊ】
2020525049.tif 000045
【０６４１】
【表１５Ｋ】
2020525049.tif 000046
【０６４２】
【表１５Ｌ】
2020525049.tif 000047
【０６４３】
【表１５Ｍ】
2020525049.tif 000048
【０６４４】
【表１５Ｎ】
2020525049.tif 000049
【０６４５】
【表１５Ｏ】
2020525049.tif 000050
【０６４６】
【表１５Ｐ】
2020525049.tif 000051
【０６４７】
【表１６Ａ】
2020525049.tif 000052
【０６４８】
【表１６Ｂ】
2020525049.tif 000053
【０６４９】
【表１６Ｃ】
2020525049.tif 000054
【０６５０】
【表１６Ｄ】
2020525049.tif 000055
【０６５１】
【表１７Ａ】
2020525049.tif 000056
【０６５２】
【表１７Ｂ】
2020525049.tif 000057
【０６５３】
【表１７Ｃ】
2020525049.tif 000058
【０６５４】
【表１７Ｄ】
2020525049.tif 000059
【０６５５】
【表１７Ｅ】
2020525049.tif 000060
【０６５６】
TABLE 17:SpoIIID、SpoVT又はSpoIIRによる胞子形成遺伝子の発現の調節
【０６５７】
【表１８】
2020525049.tif 000061
【０６５８】
TABLE 18:Cディフィシル株
【０６５９】
【表１９−１】
2020525049.tif 000062
【表１９−２】
2020525049.tif 000063
【表１９−３】
2020525049.tif 000064
【表１９−４】
2020525049.tif 000065
【表１９−５】
2020525049.tif 000066
【表１９−６】
2020525049.tif 000067
【０６６０】
TABLE 19:Cディフィシルリピート配列
【０６６１】
【表２０Ａ】
2020525049.tif 000068
【０６６２】
【表２０Ｂ】
2020525049.tif 000069
【０６６３】
【表２０Ｃ】
2020525049.tif 000070
【０６６４】
【表２０Ｄ】
2020525049.tif 000071
【０６６５】
【表２０Ｅ】
2020525049.tif 000072
【０６６６】
【表２０Ｆ】
2020525049.tif 000073
【０６６７】
【表２０Ｇ】
2020525049.tif 000074
【０６６８】
【表２０Ｈ】
2020525049.tif 000075
【０６６９】
【表２０Ｉ】
2020525049.tif 000076
【０６７０】
TABLE 20:大腸菌リピート配列
【０６７１】
【表２１Ａ】
2020525049.tif 000077
【０６７２】
【表２１Ｂ】
2020525049.tif 000078
【０６７３】
【表２１Ｃ】
2020525049.tif 000079
【０６７４】
【表２１Ｄ】
2020525049.tif 000080
【０６７５】
【表２１Ｅ】
2020525049.tif 000081
【０６７６】
【表２１Ｆ】
2020525049.tif 000082
【０６７７】
【表２１Ｇ】
2020525049.tif 000083
【０６７８】
【表２１Ｈ】
2020525049.tif 000084
【０６７９】
【表２１Ｉ】
2020525049.tif 000085
【０６８０】
TABLE 21:サルモネラエンテリカ亜種エンテリカネズミチフスリピート配列
【０６８１】
【表２２】
2020525049.tif 000086
【０６８２】
TABLE 22:ストレプトコッカス・サーモフィルスリピート配列
【０６８３】
【表２３】
2020525049.tif 000087
【０６８４】
TABLE 23:Cディフィシル、Bスブチリス等の胞子形成、シグマ因子カスケード及び標的配列
【０６８５】
【表２４Ａ】
2020525049.tif 000088
【０６８６】
【表２４Ｂ】
2020525049.tif 000089
【０６８７】
【表２４Ｃ】
2020525049.tif 000090
【０６８８】
【表２４Ｄ】
2020525049.tif 000091
【０６８９】
【表２４Ｅ】
2020525049.tif 000092
【０６９０】
【表２４Ｆ】
2020525049.tif 000093
【０６９１】
【表２４Ｇ】
2020525049.tif 000094
【０６９２】
【表２４Ｈ】
2020525049.tif 000095
【０６９３】
【表２４Ｉ】
2020525049.tif 000096
【０６９４】
【表２４Ｊ】
2020525049.tif 000097
【０６９５】
【表２４Ｋ】
2020525049.tif 000098
【０６９６】
【表２４Ｌ】
2020525049.tif 000099
【０６９７】
【表２４Ｍ】
2020525049.tif 000100
【０６９８】
【表２４Ｎ】
2020525049.tif 000101
【０６９９】
【表２４Ｏ】
2020525049.tif 000102
【０７００】
【表２４Ｐ】
2020525049.tif 000103
【０７０１】
【表２４Ｑ】
2020525049.tif 000104
【０７０２】
【表２４Ｒ】
2020525049.tif 000105
【０７０３】
【表２４Ｓ】
2020525049.tif 000106
【０７０４】
【表２４Ｔ】
2020525049.tif 000107
【０７０５】
【表２４Ｕ】
2020525049.tif 000108
【０７０６】
【表２４Ｖ】
2020525049.tif 000109
【０７０７】
【表２４Ｗ】
2020525049.tif 000110
【０７０８】
【表２４Ｘ】
2020525049.tif 000111
【０７０９】
【表２４Ｙ】
2020525049.tif 000112
【０７１０】
【表２４Ｚ】
2020525049.tif 000113
【０７１１】
【表２４ＡＡ】
2020525049.tif 000114
【０７１２】
【表２４ＢＢ】
2020525049.tif 000115
【０７１３】
【表２４ＣＣ】
2020525049.tif 000116
【０７１４】
【表２４ＤＤ】
2020525049.tif 000117
【０７１５】
【表２４ＥＥ】
2020525049.tif 000118
【０７１６】
【表２４ＦＦ】
2020525049.tif 000119
【０７１７】
【表２４ＧＧ】
2020525049.tif 000120
【０７１８】
【表２４ＨＨ】
2020525049.tif 000121
【０７１９】
【表２４ＩＩ】
2020525049.tif 000122
【０７２０】
【表２４ＪＪ】
2020525049.tif 000123
【０７２１】
【表２４ＫＫ】
2020525049.tif 000124
【０７２２】
【表２４ＬＬ】
2020525049.tif 000125
【０７２３】
【表２４ＭＭ】
2020525049.tif 000126
【０７２４】
【表２４ＮＮ】
2020525049.tif 000127
【０７２５】
【表２４ＯＯ】
2020525049.tif 000128
【０７２６】
【表２４ＰＰ】
2020525049.tif 000129
【０７２７】
【表２４ＱＱ】
2020525049.tif 000130
【０７２８】
【表２４ＲＲ】
2020525049.tif 000131
【０７２９】
【表２４ＳＳ】
2020525049.tif 000132
【０７３０】
【表２４ＴＴ】
2020525049.tif 000133
【０７３１】
【表２４ＵＵ】
2020525049.tif 000134
【０７３２】
【表２４ＶＶ】
2020525049.tif 000135
【０７３３】
【表２４ＷＷ】
2020525049.tif 000136
【０７３４】
【表２４ＸＸ】
2020525049.tif 000137
【０７３５】
【表２４ＹＹ】
2020525049.tif 000138
【０７３６】
【表２４ＺＺ】
2020525049.tif 000139
【０７３７】
【表２４ＡＡＡ】
2020525049.tif 000140
【０７３８】
【表２４ＢＢＢ】
2020525049.tif 000141
【０７３９】
【表２４ＣＣＣ】
2020525049.tif 000142
【０７４０】
【表２４ＤＤＤ】
2020525049.tif 000143
【０７４１】
【表２４ＥＥＥ】
2020525049.tif 000144
【０７４２】
【表２４ＦＦＦ】
2020525049.tif 000145
【０７４３】
【表２４ＧＧＧ】
2020525049.tif 000146
【０７４４】
【表２４ＨＨＨ】
2020525049.tif 000147
【０７４５】
【表２４ＩＩＩ】
2020525049.tif 000148
【０７４６】
【表２４ＪＪＪ】
2020525049.tif 000149
【０７４７】
【表２４ＫＫＫ】
2020525049.tif 000150
【０７４８】
【表２４ＬＬＬ】
2020525049.tif 000151
【０７４９】
【表２４ＭＭＭ】
2020525049.tif 000152
【０７５０】
【表２４ＮＮＮ】
2020525049.tif 000153
【０７５１】
【表２４ＯＯＯ】
2020525049.tif 000154
【０７５２】
【表２４ＰＰＰ】
2020525049.tif 000155
【０７５３】
【表２４ＱＱＱ】
2020525049.tif 000156
【０７５４】
【表２４ＲＲＲ】
2020525049.tif 000157
【０７５５】
【表２４ＳＳＳ】
2020525049.tif 000158
【０７５６】
【表２４ＴＴＴ】
2020525049.tif 000159
【０７５７】
【表２４ＵＵＵ】
2020525049.tif 000160
【０７５８】
【表２４ＶＶＶ】
2020525049.tif 000161
【０７５９】
【表２４ＷＷＷ】
2020525049.tif 000162
【０７６０】
【表２４ＸＸＸ】
2020525049.tif 000163
【０７６１】
【表２４ＹＹＹ】
2020525049.tif 000164
【０７６２】
【表２４ＺＺＺ】
2020525049.tif 000165
【０７６３】
【表２４ＡＡＡＡ】
2020525049.tif 000166
【０７６４】
【表２４ＢＢＢＢ】
2020525049.tif 000167
【０７６５】
【表２４ＣＣＣＣ】
2020525049.tif 000168
【０７６６】
【表２４ＤＤＤＤ】
2020525049.tif 000169
【０７６７】
【表２４ＥＥＥＥ】
2020525049.tif 000170
【０７６８】
【表２４ＦＦＦＦ】
2020525049.tif 000171
【０７６９】
【表２４ＧＧＧＧ】
2020525049.tif 000172
【０７７０】
【表２４ＨＨＨＨ】
2020525049.tif 000173
【０７７１】
【表２４ＩＩＩＩ】
2020525049.tif 000174
【０７７２】
【表２４ＪＪＪＪ】
2020525049.tif 000175
【０７７３】
【表２４ＫＫＫＫ】
2020525049.tif 000176
【０７７４】
【表２４ＬＬＬＬ】
2020525049.tif 000177
【０７７５】
【表２４ＭＭＭＭ】
2020525049.tif 000178
【０７７６】
【表２４ＮＮＮＮ】
2020525049.tif 000179
【０７７７】
【表２４ＯＯＯＯ】
2020525049.tif 000180
【０７７８】
【表２４ＰＰＰＰ】
2020525049.tif 000181
【０７７９】
【表２４ＱＱＱＱ】
2020525049.tif 000182
【０７８０】
【表２４ＲＲＲＲ】
2020525049.tif 000183
【０７８１】
【表２４ＳＳＳＳ】
2020525049.tif 000184
【０７８２】
【表２４ＴＴＴＴ】
2020525049.tif 000185
【０７８３】
【表２４ＵＵＵＵ】
2020525049.tif 000186
【０７８４】
【表２４ＶＶＶＶ】
2020525049.tif 000187
【０７８５】
【表２４ＷＷＷＷ】
2020525049.tif 000188
【０７８６】
【表２４ＸＸＸＸ】
2020525049.tif 000189
【０７８７】
【表２４ＹＹＹＹ】
2020525049.tif 000190
【０７８８】
【表２４ＺＺＺＺ】
2020525049.tif 000191
【０７８９】
【表２４ＡＡＡＡＡ】
2020525049.tif 000192
【０７９０】
【表２４ＢＢＢＢＢ】
2020525049.tif 000193
【０７９１】
【表２４ＣＣＣＣＣ】
2020525049.tif 000194
【０７９２】
【表２４ＤＤＤＤＤ】
2020525049.tif 000195
【０７９３】
【表２４ＥＥＥＥＥ】
2020525049.tif 000196
【０７９４】
【表２４ＦＦＦＦＦ】
2020525049.tif 000197
【０７９５】
【表２４ＧＧＧＧＧ】
2020525049.tif 000198
【０７９６】
【表２４ＨＨＨＨＨ】
2020525049.tif 000199
【０７９７】
【表２４ＩＩＩＩＩ】
2020525049.tif 000200
【０７９８】
【表２４ＪＪＪＪＪ】
2020525049.tif 000201
【０７９９】
【表２４ＫＫＫＫＫ】
2020525049.tif 000202
【０８００】
【表２４ＬＬＬＬＬ】
2020525049.tif 000203
【０８０１】
【表２４ＭＭＭＭＭ】
2020525049.tif 000204
【０８０２】
【表２４ＮＮＮＮＮ】
2020525049.tif 000205
【０８０３】
【表２４ＯＯＯＯＯ】
2020525049.tif 000206
【０８０４】
【表２４ＰＰＰＰＰ】
2020525049.tif 000207
【０８０５】
【表２４ＱＱＱＱＱ】
2020525049.tif 000208
【０８０６】
【表２４ＲＲＲＲＲ】
2020525049.tif 000209
【０８０７】
【表２４ＳＳＳＳＳ】
2020525049.tif 000210
【０８０８】
【表２４ＴＴＴＴＴ】
2020525049.tif 000211
【０８０９】
【表２４ＵＵＵＵＵ】
2020525049.tif 000212
【０８１０】
【表２４ＶＶＶＶＶ】
2020525049.tif 000213
【０８１１】
【表２４ＷＷＷＷＷ】
2020525049.tif 000214
【０８１２】
【表２４ＸＸＸＸＸ】
2020525049.tif 000215
【０８１３】
【表２４ＹＹＹＹＹ】
2020525049.tif 000216
【０８１４】
【表２４ＺＺＺＺＺ】
2020525049.tif 000217
【０８１５】
【表２４ＡＡＡＡＡＡ】
2020525049.tif 000218
【０８１６】
【表２４ＢＢＢＢＢＢ】
2020525049.tif 000219
【０８１７】
【表２４ＣＣＣＣＣＣ】
2020525049.tif 000220
【０８１８】
【表２４ＤＤＤＤＤＤ】
2020525049.tif 000221
【０８１９】
【表２４ＥＥＥＥＥＥ】
2020525049.tif 000222
【０８２０】
【表２４ＦＦＦＦＦＦ】
2020525049.tif 000223
【０８２１】
【表２４ＧＧＧＧＧＧ】
2020525049.tif 000224
【０８２２】
【表２４ＨＨＨＨＨＨ】
2020525049.tif 000225
【０８２３】
【表２４ＩＩＩＩＩＩ】
2020525049.tif 000226
【０８２４】
【表２４ＪＪＪＪＪＪ】
2020525049.tif 000227
【０８２５】
【表２４ＫＫＫＫＫＫ】
2020525049.tif 000228
【０８２６】
【表２４ＬＬＬＬＬＬ】
2020525049.tif 000229
【０８２７】
【表２４ＭＭＭＭＭＭ】
2020525049.tif 000230
【０８２８】
【表２４ＮＮＮＮＮＮ】
2020525049.tif 000231
【０８２９】
【表２４ＯＯＯＯＯＯ】
2020525049.tif 000232
【０８３０】
【表２４ＰＰＰＰＰＰ】
2020525049.tif 000233
【０８３１】
【表２４ＱＱＱＱＱＱ】
2020525049.tif 000234
【０８３２】
【表２４ＲＲＲＲＲＲ】
2020525049.tif 000235
【０８３３】
【表２４ＳＳＳＳＳＳ】
2020525049.tif 000236
【０８３４】
【表２４ＴＴＴＴＴＴ】
2020525049.tif 000237
【０８３５】
【表２４ＵＵＵＵＵＵ】
2020525049.tif 000238
【０８３６】
【表２４ＶＶＶＶＶＶ】
2020525049.tif 000239
【０８３７】
【表２４ＷＷＷＷＷＷ】
2020525049.tif 000240
【０８３８】
【表２４ＸＸＸＸＸＸ】
2020525049.tif 000241
【０８３９】
【表２４ＹＹＹＹＹＹ】
2020525049.tif 000242
【０８４０】
【表２４ＺＺＺＺＺＺ】
2020525049.tif 000243
【０８４１】
【表２４ＡＡＡＡＡＡＡ】
2020525049.tif 000244
【０８４２】
【表２４ＢＢＢＢＢＢＢ】
2020525049.tif 000245
【０８４３】
【表２４ＣＣＣＣＣＣＣ】
2020525049.tif 000246
【０８４４】
【表２４ＤＤＤＤＤＤＤ】
2020525049.tif 000247
【０８４５】
【表２４ＥＥＥＥＥＥＥ】
2020525049.tif 000248
【０８４６】
【表２４ＦＦＦＦＦＦＦ】
2020525049.tif 000249
【０８４７】
【表２４ＧＧＧＧＧＧＧ】
2020525049.tif 000250
【０８４８】
【表２４ＨＨＨＨＨＨＨ】
2020525049.tif 000251
【０８４９】
【表２４ＩＩＩＩＩＩＩ】
2020525049.tif 000252
【０８５０】
【表２４ＪＪＪＪＪＪＪ】
2020525049.tif 000253
【０８５１】
【表２４ＫＫＫＫＫＫＫ】
2020525049.tif 000254
【０８５２】
【表２４ＬＬＬＬＬＬＬ】
2020525049.tif 000255
【０８５３】
【表２４ＭＭＭＭＭＭＭ】
2020525049.tif 000256
【０８５４】
【表２４ＮＮＮＮＮＮＮ】
2020525049.tif 000257
【０８５５】
【表２４ＯＯＯＯＯＯＯ】
2020525049.tif 000258
【０８５６】
【表２４ＰＰＰＰＰＰＰ】
2020525049.tif 000259
【０８５７】
【表２４ＱＱＱＱＱＱＱ】
2020525049.tif 000260
【０８５８】
【表２４ＲＲＲＲＲＲＲ】
2020525049.tif 000261
【０８５９】
【表２４ＳＳＳＳＳＳＳ】
2020525049.tif 000262
【０８６０】
TABLE 25:例となる細菌
【０８６１】
【表２５−１】
2020525049.tif 000263
【表２５−２】
2020525049.tif 000264
【表２５−３】
2020525049.tif 000265
【表２５−４】
2020525049.tif 000266
【表２５−５】
2020525049.tif 000267
【表２５−６】
2020525049.tif 000268
【０８６２】
【表２６−１】
2020525049.tif 000269
【表２６−２】
2020525049.tif 000270
【表２６−３】
2020525049.tif 000271
【表２６−４】
2020525049.tif 000272
【０８６３】
【表２７Ａ】
2020525049.tif 000273
【０８６４】
【表２７Ｂ】
2020525049.tif 000274
【０８６５】
【表２７Ｃ】
2020525049.tif 000275
【０８６６】
【表２７Ｄ】
2020525049.tif 000276
【０８６７】
【表２７Ｅ】
2020525049.tif 000277
【０８６８】
【表２７Ｆ】
2020525049.tif 000278
【０８６９】
【表２７Ｇ】
2020525049.tif 000279
【０８７０】
【表２７Ｈ】
2020525049.tif 000280
【０８７１】
【表２７Ｉ】
2020525049.tif 000281
【０８７２】
【表２７Ｊ】
2020525049.tif 000282
【０８７３】
【表２７Ｋ】
2020525049.tif 000283
【０８７４】
【表２７Ｌ】
2020525049.tif 000284
【０８７５】
【表２７Ｍ】
2020525049.tif 000285
【０８７６】
【表２７Ｎ】
2020525049.tif 000286
【０８７７】
【表２７Ｏ】
2020525049.tif 000287
【０８７８】
【表２７Ｐ】
2020525049.tif 000288
【０８７９】
【表２７Ｑ】
2020525049.tif 000289
【０８８０】
【表２７Ｒ】
2020525049.tif 000290
【０８８１】
【表２７Ｓ】
2020525049.tif 000291
【０８８２】
【表２７Ｔ】
2020525049.tif 000292
【０８８３】
【表２７Ｕ】
2020525049.tif 000293
【０８８４】
【表２７Ｖ】
2020525049.tif 000294
【０８８５】
【表２７Ｗ】
2020525049.tif 000295
【０８８６】
【表２７Ｘ】
2020525049.tif 000296
【０８８７】
【表２７Ｙ】
2020525049.tif 000297
【０８８８】
【表２７Ｚ】
2020525049.tif 000298
【０８８９】
【表２７ＡＡ】
2020525049.tif 000299
【０８９０】
【表２７ＢＢ】
2020525049.tif 000300
【０８９１】
【表２７ＣＣ】
2020525049.tif 000301
【０８９２】
【表２７ＤＤ】
2020525049.tif 000302
【０８９３】
【表２７ＥＥ】
2020525049.tif 000303
【０８９４】
TABLE 26.Cディフィシルを選択的にCRISPR死滅させるためのゲノム標的及びCasの配列(実施例10を参照)
(a)Cディフィシルを標的化するpMTL84151-cdCRISPR1における設計スペーサーの概要
【０８９５】
【表２８】
2020525049.tif 000304
【０８９６】
(b)Cas配列(配列番号738)
【０８９７】
【表２９Ａ】
2020525049.tif 000305
【０８９８】
【表２９Ｂ】
2020525049.tif 000306
【０８９９】
TABLE 27:配列:
一例では、本発明の1つ又は複数のスペーサーは、この配列表におけるそれぞれの配列を標的にする。配列番号1〜44は、II型CRISPR/Casシステム配列、例えば、ストレプトコッカス属の配列である。
【０９００】
【表３０Ａ】
2020525049.tif 000307
【０９０１】
【表３０Ｂ】
2020525049.tif 000308
【０９０２】
【表３０Ｃ】
2020525049.tif 000309
【０９０３】
【表３０Ｄ】
2020525049.tif 000310
【０９０４】
【表３０Ｅ】
2020525049.tif 000311
【０９０５】
【表３０Ｆ】
2020525049.tif 000312
【図１】
2020525049.tif 000313
【図２】
2020525049.tif 000314
【図３】
2020525049.tif 000315
【図４】
2020525049.tif 000316
【図５】
2020525049.tif 000317
【図６】
2020525049.tif 000318
【図７】
2020525049.tif 000319
【図８】
2020525049.tif 000320
【図９】
2020525049.tif 000321
【図１０】
2020525049.tif 000322
【図１１】
2020525049.tif 000323
【図１２】
2020525049.tif 000324
【図１３】
2020525049.tif 000325
【図１４】
2020525049.tif 000326
【図１５】
2020525049.tif 000327
【図１６】
2020525049.tif 000328
【図１７】
2020525049.tif 000329
【図１８】
2020525049.tif 000330
【配列表】
2020525049000001.app
【国際調査報告】
2020525049.tif 000331
2020525049.tif 000332
2020525049.tif 000333
2020525049.tif 000334
2020525049.tif 000335