(57)【要約】本開示は、（ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＳＮＡＰ２５、ＳＮＡＰ２３、ＰＴＥＮなど）を切断するボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）プロテアーゼのアミノ酸配列バリアント、および、これを進化させる方法を提供する。いくつかの態様において、本開示により記載されるプロテアーゼは、細胞において見出される、細胞内環境中のものであるタンパク質を切断するために有用である。いくつかの態様において、本開示により記載されるプロテアーゼは、増大したまたは異常なＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＳＮＡＰ２３またはＰＴＥＮの発現または活性に関連する疾患、例えば、がんおよび神経の障害を処置するために有用である。本開示のいくつかの側面は、持続的な定方向進化によりＢｏＮＴプロテアーゼバリアントを作製するための方法を提供する。
2020534025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢｏＮＴプロテアーゼを進化させるための方法であって、
（ａ）宿主細胞の集合を、プロテアーゼをコードする遺伝子を含み感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子を欠損するファージベクターの集合と接触させること、ここで、
（１）宿主細胞は、ベクターの移行を受けることができる；
（２）ベクターは、宿主細胞におけるプロテアーゼの発現を可能にし、宿主細胞により複製されることができ、および複製されたベクターは、第２の宿主細胞中に移行することができる；
（３）宿主細胞は、プロテアーゼの活性に応答して、（ａ）の感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子によりコードされる遺伝子産物を発現し、遺伝子産物発現のレベルは、プロテアーゼの活性に依存する；
（ｂ）プロテアーゼをコードする遺伝子の変異、および目的のプロテアーゼをコードする遺伝子を含むベクターの宿主細胞から宿主細胞への移行を可能にする条件下において、宿主細胞の集合をインキュベートすること、ここで、宿主細胞を、宿主細胞集合から取り除き、宿主細胞の集合に、ベクターを内包しないフレッシュな宿主細胞を補充する；
（ｃ）（ｂ）における宿主細胞集合から複製されたベクターを単離すること、ここで、複製されたベクターは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異バージョンを含む、
を含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られる、タンパク質。
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質をコードする、核酸。
【請求項４】
配列番号２８６（野生型ＢｏＮＴ  Ｅ）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、表１において記載されるアミノ酸変異のうちの少なくとも１つを含む、前記タンパク質。
【請求項５】
ＳＮＡＰ２５タンパク質を切断する、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＳＮＡＰ２５タンパク質が、配列番号２９２において記載される配列（例えばＳＮＡＰ２５野生型基質）を含む、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
ＳＮＡＰ２３タンパク質を切断する、請求項２または４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
ＳＮＡＰ２３タンパク質が、配列番号２９３において記載される配列（ＳＮＡＰ２３野生型基質）を含む、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
ＰＴＥＮタンパク質を切断する、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＰＴＥＮタンパク質が、配列番号３１１において記載される配列（ＰＴＥＮ基質配列）を含む、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
表１において記載される、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸変異を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
アミノ酸配列変異のうちの少なくとも１つは、Ｉ１８、Ｃ２６、Ｑ２７、Ｅ２８、Ｆ２９、Ｙ６８、Ｌ８９、Ｓ９９、Ｇ１０１、Ｎ１１８、Ｇ１２７、Ｑ１４１、Ｅ１５４、Ｅ１５９、Ｎ１６１、Ｓ１６２、Ｓ１６３、Ｒ１６８、Ｍ１７２、Ｋ２２５、Ｃ２３１、Ｉ２３２、Ｉ２３３、Ｎ２３８、Ｑ２９５、Ｑ３５４、Ｙ３５７、Ｉ３９６、Ｐ３９８、Ｌ４０４、およびＩ４０９からなる群より選択されるアミノ酸位置において導入される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
アミノ酸変異のうちの少なくとも１つが、Ｉ１８Ｖ、Ｃ２６Ｙ、Ｑ２７Ｈ、Ｅ２８Ｋ、Ｆ２９Ｌ、Ｙ６８Ｈ、Ｌ８９Ｐ、Ｓ９９Ａ、Ｓ９９Ｔ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｇ１２７Ｓ、Ｑ１４１Ｋ、Ｅ１５４Ｇ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｒ１６８Ｋ、Ｍ１７２Ｋ、Ｋ２２５Ｅ、Ｃ２３１Ｒ、Ｉ２３２Ｔ、Ｉ２３３Ｔ、Ｎ２３８Ｓ、Ｑ２９５Ｒ、Ｉ３９６Ｓ、Ｐ３９８Ｌ、Ｑ３５４Ｒ、Ｙ３５７Ｐ、Ｌ４０４*およびＩ４０９Ｔからなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
配列番号１〜１００のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
神経毒ＨＣＣドメイン、および／または神経毒転位ドメイン（ＨＣＮ）をさらに含む、請求項１１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
配列番号２８７（野生型ＢｏＮＴ  Ｆ）に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、タンパク質は、表２において記載されるアミノ酸変異のうちの少なくとも１つを含む、前記タンパク質。
【請求項１７】
ＶＡＭＰ７タンパク質またはＶＡＭＰ８タンパク質を切断する、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
ＶＡＭＰ７タンパク質が、配列番号３２２において記載される配列（例えばＶＡＭＰ７野生型基質）を含むか、または、ＶＡＭＰ８タンパク質が、配列番号２８９において記載される配列（例えばＶＡＭＰ８野生型基質）を含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
ＶＡＭＰ１またはＶＡＭＰ２タンパク質を切断する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＶＡＭＰ１タンパク質が、配列番号２９０において記載される配列（例えばＶＡＭＰ１野生型基質）を含むか、または、ＶＡＭＰ２タンパク質が、配列番号２９１において記載される配列（例えばＶＡＭＰ２野生型基質）を含む、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
表２において記載される、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸変異を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
アミノ酸配列変異のうちの少なくとも１つが、Ｓ７０、Ｎ７６、Ｖ１０６、Ｅ１６４、Ｓ１６６、Ｓ１６７、Ｎ１８４、Ｖ１９３、Ｙ１９９、Ｅ２００、Ｓ２２４、Ｒ２４０、Ａ２５８、Ｎ２７６、Ｌ２９１、Ｔ３３５、Ｓ３５０、Ｆ３６０、Ｙ３７２、Ｌ３７５、Ｎ３９６、Ｐ４１０、Ｄ４１８、Ｇ４２０、Ｌ４２１、Ｖ４２２、Ｅ４２３、Ｋ４２４、Ｉ４２５、Ｖ４２６からなる群より選択されるアミノ酸位置において誘導される、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
アミノ酸変異のうちの少なくとも１つが、Ｓ７０Ｆ、Ｎ７６Ｄ、Ｖ１０６Ａ、Ｅ１６４Ｋ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｎ１８４Ｋ、Ｖ１９３Ｍ、Ｙ１９９Ｈ、Ｅ２００Ｇ、Ｅ２００Ｋ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｆ、Ｒ２４０Ｌ、Ａ２５８Ｓ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｔ、Ｌ２９１Ｍ、Ｔ３３５Ｓ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｌ３７５Ｒ、Ｎ３９６Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｄ４１８Ｙ、Ｇ４２０Ａ、Ｌ４２１Ｗ、Ｖ４２２Ｌ、Ｅ４２３Ｒ、Ｋ４２４、Ｉ４２５Ｓ、Ｖ４２６*からなる群より選択される、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
配列番号１０１〜２８５または３９０〜３９３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
神経毒ＨＣＣドメイン、および／または神経毒転位ドメイン（ＨＣＮ）をさらに含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
請求項２または４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に受入可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
（ｉ）配列番号１〜２８５もしくは３９０〜３９３のいずれか１つに記載されるようなアミノ酸配列を含むタンパク質；または
（ｉｉ）請求項４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質
をコードする、単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
細胞内タンパク質を切断する方法であって、細胞に、請求項４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を送達することを含み、ここで、タンパク質が、細胞内環境中にある細胞内タンパク質に接触する、前記方法。
【請求項３０】
細胞内環境が、対象、任意にヒトまたはマウスなどの哺乳動物対象の中のものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象において特定の細胞内タンパク質の活性を低下させるための方法であって、対象に、請求項４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３２】
対象は、前記細胞内タンパク質の活性の増大と関連する疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象においてＳＮＡＲＥタンパク質活性を低下させるための方法であって、対象に、請求項４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
対象は、前記ＳＮＡＲＥタンパク質の活性の増大と関連する疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
対象においてＶＡＭＰ７活性を低下させるための方法であって、対象に、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
対象は、ＶＡＭＰ７活性の増大と関連する疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
疾患が、がん、移植拒絶、または移植片対宿主疾患である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象においてＶＡＭＰ８活性を低下させるための方法であって、対象に、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
対象においてＰＴＥＮ活性を低下させるための方法であって、対象に、請求項２に記載のタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
対象は、細胞死または老化により特徴づけられる疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
疾患が、虚血性神経損傷（脳卒中）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、または脊髄損傷である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞においてＶＡＭＰ７活性を低下させるための方法であって、細胞を、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４３】
細胞が、ＶＡＭＰ７活性の増大により特徴づけられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞においてＶＡＭＰ８活性を低下させるための方法であって、細胞を、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４５】
細胞においてＰＴＥＮ活性を低下させるための方法であって、細胞を、請求項２に記載のタンパク質の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
ＰＴＥＮの阻害が細胞分裂および／または組織再生を誘導することが予測される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
対象においてＳＮＡＰ２３活性を低下させるための方法であって、対象に、請求項４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４８】
対象は、過剰分泌の疾患を有するか、またはこれを有することが疑われ、およびここで、ＳＮＡＰ２３の切断が、前記分泌を予防し得る、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
疾患が、糖尿病、自己免疫障害またはクッシング病である、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年８月２５日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／５５０，４０８、表題「EVOLUTION OF BONT PEPTIDASES」、の出願日の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願の全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
連邦により支援された研究
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号ＥＢ０２２３７６、ＧＭ１１８０６２およびＧＭ１２２２６１下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
過去数十年間にわたり、医学界は、薬学的治療剤の組成における古典的な小分子から生体高分子（biomacromolecule）への顕著な変化を目撃してきた。高分子治療剤の数の増加は、生物学的な系における高度に特異的な相互作用についてのそれらの潜在能力の結果であり、分子生物学および生体分子工学における改善により促進されてきた。それらの素晴らしい成功にもかかわらず、高分子治療剤は、それらの制御可能な細胞質への送達の顕著な課題のせいで、殆どもっぱら細胞外標的に限られていた。高分子送達の領域において多くの注目すべき進歩がなされてきた一方で、この重要な問題は、細胞内標的に取り組む高分子治療剤の開発および使用に対する主要な障壁であり続ける。代替として、いくつかの天然のタンパク質系が、細胞質へ自己送達することができる。しかし、これらの系を、必要な結合または触媒活性、および治療効果についての特異性を持たせるように再操作する能力は、ほぼ未開である。
【発明の概要】
【０００４】
要旨
本開示は、新規のボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）プロテアーゼバリアントおよびこれを進化させる方法に関する。本明細書において記載されるとおり、ＢｏＮＴはビルトインの細胞質ゾル送達機構を提供し、これがＢｏＮＴが細胞内標的を切断することを可能にするので、ＢｏＮＴプロテアーゼは、連続進化のための魅力的な候補である。いくつかの態様において、所望される基質（例えば、疾患関連細胞内タンパク質）を切断する進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントが、本明細書において記載される。本開示は、部分的に、例えば２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号（その全内容は、本明細書において参考として援用される）において記載されるようなファージ依存的連続進化（phage-assisted continuous evolution：ＰＡＣＥ）により、標準のＢｏＮＴ切断基質を欠失する標的タンパク質を切断するＢｏＮＴプロテアーゼバリアントを生成することができるという発見に基づく。
【０００５】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるような進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、ＢｏＮＴ軽鎖（ＬＣ）およびＢｏＮＴ重鎖（ＨＣ）を含む全長毒素の一部として発現されてもよい。典型的には、触媒プロテアーゼドメインは、ＢｏＮＴの軽鎖（ＬＣ）において位置する。ＢｏＮＴ  ＨＣは、一般に、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントが細胞膜を超えて細胞内環境中の標的タンパク質を切断することを可能にするドメインをコードし、これが、それらを、可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体（Soluble NSF Attachment Protein Receptors：ＳＮＡＲＥ）タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８など）などの細胞内タンパク質の異常な活性に関連する疾患（例えばがん、神経の障害など）を処置するために有用にする。本明細書において記載される進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、進化型ＢｏＮＴ  ＬＣ、または進化型ＢｏＮＴ  ＬＣおよびＨＣの両方を含んでもよいことが理解されるべきである。いくつかの態様において、進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、野生型ＢｏＮＴ  ＨＣを含む。いくつかの態様において、進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、野生型ＢｏＮＴ  ＨＣと比較して１つ以上のアミノ酸変異を有するＢｏＮＴ  ＨＣを含む。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  ＨＣの受容体結合ドメインは、細胞表面受容体またはリガンドに結合することができるタンパク質ドメインにより置き換えられている。いくつかの態様において、このタンパク質ドメインは、抗体、レシチン、モノボディー（monobody）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ホルモンまたはシグナル伝達因子の形態をとってよい。
【０００６】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、野生型ボツリヌス神経毒血清型Ｅから、非標準のＢｏＮＴ  Ｅ基質、例えばＳＮＡＰ２３またはＰＴＥＮを切断するように進化した、または、標準のＢｏＮＴ  Ｅ基質ＳＮＡＰ２５を野生型ＢｏＮＴ  Ｅより高い効率で切断するように進化したタンパク質（例えば進化型ＢｏＮＴ  Ｅプロテアーゼバリアント、「ＢｏＮＴ  Ｅバリアント」としてもまた言及される）を提供する。いくつかの態様において、野生型ＢｏＮＴ  Ｅは、配列番号２８６において記載される配列：
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQHILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSINEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTTCIITQQQNPLITNRKGINIEEFLTFGGNDLNIITVAQYNDIYTNLLNDYRKIASKLSKVQVSNPQLNPYKDIFQEKYGLDKDASGIYSVNINKFDDILKKLYSFTEFDLATKFQVKCRETYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIIKPITGRGLVKKIIRF*
を含む。
【０００７】
いくつかの側面において、本開示は、配列番号２８６（野生型ＢｏＮＴ  Ｅ）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供し、ここで、当該タンパク質は、表１において記載されるアミノ酸変異のうちの少なくとも１つを含む。
【０００８】
いくつかの側面において、本開示は、野生型ボツリヌス神経毒血清型Ｆから、非標準のＢｏＮＴ  Ｆ基質、例えばＶＡＭＰ７を切断するように進化した、または標準のＢｏＮＴ  Ｆ基質（例えばＶＡＭＰ１）を野生型ＢｏＮＴ  Ｆより高い効率で切断するように進化した、タンパク質（例えば進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼバリアント、「ＢｏＮＴ  Ｆバリアント」としてもまた言及される）を提供する。いくつかの態様において、野生型ＢｏＮＴ  Ｆは、配列番号２８７において記載される配列：
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKF*
を含む。
【０００９】
いくつかの側面において、本開示は、配列番号２８７（野生型ＢｏＮＴ  Ｆ）に対して少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％など）同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供し、当該タンパク質は、表２において記載されるアミノ酸変異のうちの少なくとも１つを含む。
【００１０】
いくつかの側面において、本開示は、細胞内小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断する進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントに関する。ＶＡＭＰは、ＳＮＡＲＥタンパク質ファミリーのメンバーであり、典型的には、シナプス小胞の融合などの小胞の融合および小胞の分泌を媒介する。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ＶＡＭＰの異常な機能は、特定の疾患、例えば運動ニューロン疾患に関連する。したがって、特定のＶＡＭＰを切断する進化型ＢｏＮＴプロテアーゼは、いくつかの態様において、細胞または対象の内側においてＶＡＭＰタンパク質活性を低下させるために有用である。いくつかの態様において、タンパク質（例えば、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント）は、小胞結合膜（ＶＡＭＰ）タンパク質、例えば、ＶＡＭＰ７タンパク質またはＶＡＭＰ８タンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＶＡＭＰ７タンパク質は、配列番号２８８において記載される配列：
MAILFAVVARGTTILAKHAWCGGNFLEDFERSRAFNFLNEIKKRFQTTYGSRAQTALPYAMNSEFSSVLAAQLKHHSENKGLDKVMETQAQVDELKGIMVRNIDLVAQRGERLELLIDKTENLVDSSVTFKTTSRNLARAMCMKNLKLTIIIIIVSIVFIYIIVSPLCGGFTWPSCVKK
を含むか、または、
ＶＡＭＰ８タンパク質は、配列番号２８９において記載される配列：
MEEASEGGGNDRVRNLQSEVEGVKNIMTQNVERILARGENLEHLRNKTEDLEATSEHFKTTSQKVARKFWWKNVKMIVLICVIVFIIILFIVLFATGAFS
を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、タンパク質（例えば、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント）は、ＶＡＭＰ１またはＶＡＭＰ２タンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＶＡＭＰ１タンパク質は、配列番号２９０において記載される配列：
MSAPAQPPAEGTEGTAPGGGPPGPPPNMTSNRRLQQTQAQVEEVVDIIRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFESSAAKLKRKYWWKNCKMMIMLGAICAIIVVVIVRRG
を含むか、または、
ＶＡＭＰ２タンパク質は、配列番号２９１において記載される配列：
MSATAATAPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST
を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、タンパク質（例えば、ＢｏＮＴ  Ｅバリアント）は、ＳＮＡＰ２５タンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＰ２５タンパク質は、配列番号２９２において記載される配列：
MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG
を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、タンパク質（例えば、ＢｏＮＴ  Ｅバリアント）は、ＳＮＡＰ２３タンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＰ２３タンパク質は、配列番号２９３において記載される配列：
MDNLSSEEIQQRAHQITDESLESTRRILGLAIESQDAGIKTITMLDEQKEQLNRIEEGLDQINKDMRETEKTLTELNKCCGLCVCPCNRTKNFESGKAYKTTWGDGGENSPCNVVSKQPGPVTNGQLQQPTTGAASGGYIKRITNDAREDEMEENLTQVGSILGNLKDMALNIGNEIDAQNPQIKRITDKADTNRDRIDIANARAKKLIDS
を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、タンパク質（例えば、ＢｏＮＴ  Ｅバリアント）は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）タンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＰＴＥＮタンパク質は、配列番号２９４において記載される配列：
MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｅバリアントプロテアーゼは、表１において記載される、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸変異を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントプロテアーゼは、表２において記載される、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０の、アミノ酸変異を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｅバリアントのアミノ酸配列変異のうちの少なくとも１つは、Ｉ１８、Ｃ２６、Ｑ２７、Ｅ２８、Ｆ２９  Ｙ６８、Ｌ８９、Ｓ９９、Ｇ１０１、Ｎ１１８、Ｇ１２７、Ｑ１４１、Ｅ１５４、Ｅ１５９、Ｎ１６１、Ｓ１６２、Ｓ１６３、Ｒ１６８、Ｍ１７２、Ｋ２２５、Ｃ２３１、Ｉ２３２、Ｉ２３３、Ｎ２３８、Ｑ２９５、Ｑ３５４、Ｙ３５７、Ｉ３９６、Ｐ３９８、Ｌ４０４、およびＩ４０９からなる群より選択されるアミノ酸位置において導入される。
【００１８】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｅバリアントは、Ｑ２７Ｈ、Ｓ９９Ａ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｍ１７２Ｋ、Ｉ１３２Ｔ、Ｑ３５４Ｒ、Ｙ３５７Ｐから選択される１つ以上の変異を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｅバリアントのアミノ酸変異のうちの少なくとも１つは、Ｉ１８Ｖ、Ｃ２６Ｙ、Ｑ２７Ｈ、Ｅ２８Ｋ、Ｆ２９Ｌ、Ｙ６８Ｈ、Ｌ８９Ｐ、Ｓ９９Ａ、Ｓ９９Ｔ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｇ１２７Ｓ、Ｑ１４１Ｋ、Ｅ１５４Ｇ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｒ１６８Ｋ、Ｍ１７２Ｋ、Ｋ２２５Ｅ、Ｃ２３１Ｒ、Ｉ２３２Ｔ、Ｉ２３３Ｔ、Ｎ２３８Ｓ、Ｑ２９５Ｒ、Ｉ３９６Ｓ、Ｐ３９８Ｌ  Ｑ３５４Ｒ、Ｙ３５７Ｐ、Ｌ４０４*およびＩ４０９Ｔからなる群より選択される。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｅバリアント（例えば表７からのＢｏＮＴ  Ｌ２Ｂ）は、以下の変異Ｑ２７Ｈ、Ｓ９９Ａ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｍ１７２Ｋ、Ｉ１３２Ｔ、Ｑ３５４Ｒ、およびＹ３５７Ｐを含む。
【００２０】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントのアミノ酸配列変異のうちの少なくとも１つは、Ｓ７０、Ｎ７６、Ｖ１０６、Ｅ１６４、Ｓ１６６、Ｓ１６７、Ｎ１８４、Ｖ１９３、Ｙ１９９、Ｅ２００、Ｓ２２４、Ｒ２４０、Ａ２５８、Ｎ２７６、Ｌ２９１、Ｔ３３５、Ｓ３５０、Ｆ３６０、Ｙ３７２、Ｌ３７５、Ｎ３９６、Ｐ４１０、Ｄ４１８、Ｇ４２０、Ｌ４２１、Ｖ４２２、Ｅ４２３、Ｋ４２４、Ｉ４２５、およびＶ４２６からなる群より選択されるアミノ酸位置において導入される。
【００２１】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントのアミノ酸変異のうちの少なくとも１つは、Ｓ７０Ｆ、Ｎ７６Ｄ、Ｖ１０６Ａ、Ｅ１６４Ｋ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｎ１８４Ｋ、Ｖ１９３Ｍ、Ｙ１９９Ｈ、Ｅ２００Ｇ、Ｅ２００Ｋ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｆ、Ｒ２４０Ｌ、Ａ２５８Ｓ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｔ、Ｌ２９１Ｍ、Ｔ３３５Ｓ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｌ３７５Ｒ、Ｎ３９６Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｄ４１８Ｙ、Ｇ４２０Ａ、Ｌ４２１Ｗ、Ｖ４２２Ｌ、Ｅ４２３Ｒ、Ｋ４２４、Ｉ４２５Ｓ、Ｖ４２６*からなる群より選択される。
【００２２】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント（例えばＢｏＮＴ  Ｆ  ２０２０−Ｌ２Ａ；配列番号３９０）は、以下の変異を含む：Ｖ１０６Ａ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｅ２００Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｌ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｇ４２０Ａ、Ｌ４２１Ｗ、Ｖ４２２Ｌ、Ｅ４２３Ｒ、Ｉ４２５Ｓ、およびＶ４２６*。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント（例えばＢｏＮＴ  Ｆ  ２０２０−Ｌ３Ａ；配列番号３９１）は、以下の変異を含む：Ｓ１６６Ｙ、Ｎ１８４Ｋ、Ｅ２００Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｆ、Ｔ３３５Ｓ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｎ３９６Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｄ４１８Ｙ、およびＥ４２３Ｋ。
【００２３】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントのアミノ酸変異のうちの少なくとも１つは、Ｋ２９、Ｋ３１、Ｙ７２、Ｎ９９、Ｖ１０６、Ｙ１１３、Ｖ１３１、Ｓ１４１、Ｉ１５０、Ｖ１５５、Ｓ１６６、Ｓ１６７、Ｍ１７４、Ｇ１７７、Ｇ１７８、Ｎ１８４、Ｖ１９３、Ｅ２００、Ｙ２１０、Ｔ２１４、Ｅ２１５、Ｓ２２４、Ｒ２４０、Ｆ２６７、Ｆ２７０、Ｎ２９３、Ｉ２９７、Ｒ３０３、Ｔ３３５、Ｓ３５０、Ｆ３６０、Ｙ３７２、Ｎ３９６、Ｐ４１０、Ｄ４１８、Ｆ４２０、およびＥ４２３からなる群より選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントのアミノ酸変異のうちの少なくとも１つ（例えば、表２９において記載されるＢｏＮＴ  Ｆバリアント）は、Ｋ２９Ｅ、Ｋ３１Ｎ、Ｙ７２Ｈ、Ｎ９９Ｓ、Ｖ１０６Ａ、Ｙ１１３Ｃ、Ｖ１３１Ｇ、Ｓ１４１Ｔ、Ｉ１５０Ｔ、Ｖ１５５Ｉ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｍ１７４Ｔ、Ｇ１７７Ａ、Ｇ１７８Ａ、Ｎ１８４Ｔ、Ｖ１９３Ｍ、Ｅ２００Ｇ、Ｙ２１０Ｈ、Ｔ２１４Ｉ、Ｅ２１５Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｌ、Ｆ２６７Ｉ、Ｆ２７０Ｖ、Ｎ２９３Ｄ、Ｉ２９７Ｌ、Ｒ３０３Ｃ、Ｔ３３５Ｓ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｎ３９６Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｄ４１８Ｙ、Ｆ４２０Ｓ、およびＥ４２３Ｋからなる群より選択される。
【００２５】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント（例えばＢｏＮＴ  Ｆ  ３０４１−Ｌ２Ｄ；配列番号３９２）は、以下の変異を含む：Ｋ２９Ｅ、Ｖ１０６Ａ、Ｉ１５０Ｔ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｍ１７４Ｔ、Ｅ２００Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｌ、Ｒ３０３Ｃ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｎ３９６Ｈ、およびＰ４１０Ｌ。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント（例えばＢｏＮＴ  ３０４１−Ｌ２Ｆ；配列番号３９３）は、以下の変異を含む：Ｙ７２Ｈ、Ｖ１０６Ａ、Ｖ１３１Ｇ、Ｓ１４１Ｔ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｍ１７４Ｔ、Ｅ２００Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｌ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｎ３９６Ｈ、およびＰ４１０Ｌ。
【００２６】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントのアミノ酸変異のうちの少なくとも１つは、Ｎ６、Ｙ１０、Ｒ４９、Ｉ５２、Ｄ５８、Ｅ６０、Ａ６３、Ｅ６６、Ｓ７０、Ｔ９０、Ｖ１０６、Ｔ１２３、Ｔ１３２、Ｖ１４５、Ｇ１５９、Ｄ１６１、Ｓ１６６、Ｓ１６７、Ｎ１８４、Ｅ２００、Ｙ２０１、Ｎ２１１、Ｆ２１７、Ｓ２２４、Ａ２２６、Ａ２３２、Ｒ２４０、Ｉ２６２、Ｌ２６４、Ｄ２７４、Ｎ３１４、Ｇ３２５、Ｄ３３１、Ｓ３３３、Ｔ３３５、Ｎ３３９、Ｓ３５０、Ｆ３６０、Ｔ３６７、Ｆ３６９、Ｙ３７２、Ｖ３７７、Ｎ３７９、Ｎ３９６、Ｎ４０９、Ｐ４１０、Ｄ４１８、およびＥ４２３からなる群より選択される。
【００２７】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントのアミノ酸変異のうちの少なくとも１つ（例えば、表３０において記載されるＢｏＮＴ  Ｆバリアント）は、Ｎ６Ｓ、Ｙ１０Ｃ、Ｒ４９Ｌ、Ｉ５２Ｖ、Ｄ５８Ｙ、Ｅ６０Ｄ、Ａ６３Ｖ、Ｅ６６Ｋ、Ｓ７０Ｈ、Ｔ９０Ｉ、Ｖ１０６Ａ、Ｔ１２３Ｍ、Ｔ１２３Ｓ、Ｔ１３２Ｉ、Ｖ１４５Ｉ、Ｇ１５９Ｓ、Ｄ１６１Ｇ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｎ１８４Ｋ、Ｅ２００Ｇ、Ｙ２０１Ｈ、Ｎ２１１Ｓ、Ｆ２１７Ｌ、Ｓ２２４Ｉ、Ａ２２６Ｓ、Ａ２３２Ｔ、Ｒ２４０Ｌ、Ｉ２６２Ｔ、Ｌ２６４Ｍ、Ｄ２７４Ｍ、Ｎ３１４Ｓ、Ｇ３２５Ｓ、Ｄ３３１Ｇ、Ｓ３３３Ｆ、Ｔ３３５Ｉ、Ｎ３３９Ｓ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｔ３６７Ｓ、Ｆ３６９Ｆ、Ｙ３７２Ｈ、Ｖ３７７Ｉ、Ｎ３７９Ｈ、Ｎ３９６Ｈ、Ｎ４０９Ｄ、Ｐ４１０Ｌ、Ｄ４１８Ｙ、およびＥ４２３Ｋからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｅバリアントは、配列番号１〜１００のいずれか１つに記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントは、配列番号１０１〜２８５のいずれか１つに記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントは、配列番号３９０〜３９３のいずれか１つに記載されるようなアミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、ＢｏＮＴ重鎖を含む。一般に、ＢｏＮＴ重鎖は、神経毒ＨＣＣドメイン、および神経毒転位ドメイン（ＨＣＮ）を含む。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ＨＣＣドメインは、細胞の前シナプス終末からの特異的受容体に結合し、ＨＣＮドメインは、ＢｏＮＴ  ＬＣを細胞中に転位させ、プロテアーゼの触媒ドメインの細胞内送達をもたらす。いくつかの態様において、進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアント（例えば、ＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアント）は、神経毒ＨＣＣドメイン、および／または神経毒転位ドメイン（ＨＣＮ）、例えば、ボツリヌス毒素ＨＣＣまたはＨＣＮドメインまたは破傷風毒素ＨＣＣまたはＨＣＮドメインをさらに含む。
配列番号２９５
CKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYF（ＢｏＮＴ  Ｆ  ＨＣＮ、転位ドメイン）；
【００３０】
配列番号２９６
NKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN（ＢｏＮＴ  Ｆ  ＨＣＣ、結合ドメイン）；
【００３１】
配列番号２９７
CKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKS（ＢｏＮＴ  Ｅ  ＨＣＮ、転位ドメイン）；
配列番号２９８
SSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFEIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK（ＢｏＮＴ  Ｅ  ＨＣＣ、結合ドメイン）
【００３２】
いくつかの側面において、本開示は、本明細書において記載されるようなタンパク質（例えば、ＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアント）および薬学的に受入可能な賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００３３】
いくつかの側面において、本開示は、配列番号１〜２８５または３９０〜３９３のいずれか１つに記載されるようなアミノ酸配列を含むＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアントをコードする、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、単離された核酸は、宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞（例えばヒト細胞、マウス細胞など）中に含まれる。
【００３４】
いくつかの側面において、本開示は、細胞内タンパク質を切断する方法を提供し、当該方法は、細胞に、本明細書において記載されるＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアントを送達することを含み、ここで、タンパク質は、細胞中の細胞内タンパク質と接触する。いくつかの態様において、細胞は、対象、例えばヒトまたはマウスなどの哺乳動物対象中のものである。
【００３５】
いくつかの側面において、本開示は、対象においてＶＡＭＰ７活性を低下させるための方法を提供し、当該方法は、対象に、本明細書において記載されるＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアントの有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、増大したかまたは異常なＶＡＭＰ７活性、例えば、がん、移植拒絶、または移植片対宿主疾患により特徴づけられる疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる。
【００３６】
いくつかの側面において、本開示は、対象においてＶＡＭＰ８活性を低下させるための方法を提供し、当該方法は、対象に、本明細書において記載されるＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアントの有効量を投与することを含む。
【００３７】
いくつかの側面において、本開示は、対象においてＰＴＥＮ活性を低下させるための方法を提供し、当該方法は、対象に、本明細書において記載されるＢｏＮＴ  Ｅバリアントの有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、神経変性により特徴づけられ、ＰＴＥＮ活性の阻害が一過性に細胞の再生を誘導し得る疾患、例えば、虚血性神経損傷（脳卒中）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、または脊髄損傷を有するか、またはこれを有することが疑われる。
【００３８】
いくつかの側面において、本開示は、対象においてＳＮＡＰ２３活性を低下させるための方法を提供し、当該方法は、対象に、本明細書において記載されるＢｏＮＴ  Ｅバリアントの有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、過剰分泌により特徴づけられ、ＳＮＡＰ２３の切断が前記分泌を予防し得る疾患、例えば、糖尿病、自己免疫障害またはクッシング病を有するか、またはこれを有することが疑われる。
【００３９】
いくつかの側面において、本開示は、ファージ依存的連続進化（ＰＡＣＥ）を用いて進化型ＢｏＮＴ  ＥバリアントまたはＢｏＮＴ  Ｆバリアントを作製する方法に関する。ＰＡＣＥ技術の一般的概念は、例えば、２００９年９月８日に出願され２０１０年３月１１日にＷＯ２０１０／０２８３４７として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６１９４；２０１１年１２月２２日に出願され２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７；２０１３年６月２０日に出願された米国出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／９２２，８１２；２０１５年１０月２２日に出願されＷＯ２０１６／０７７０５２として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５７０１２；および２０１６年４月１５日に出願されＷＯ２０１６／１６８６３１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５において記載されており、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、本明細書において記載される進化型プロテアーゼ（例えば本明細書において記載されるＰＡＣＥ技術を用いて進化させたプロテアーゼ）は、先に記載されたＢｏＮＴプロテアーゼと比較してより高い効率および／または特異性をもって、特定の基質（例えばＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＳＮＡＰ２５、ＳＮＡＰ２３またはＰＴＥＮ）を切断する。
【００４０】
上の要旨は、本明細書において開示される技術のいくつかの態様、利点、特徴および用途を、非限定的な様式において説明および概説することを意図する。本開示は、しかし、上の要旨において記載される態様に限定されない。本明細書において開示される技術の他の態様、利点、特徴および用途は、詳細な説明、例および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ボツリヌス神経毒による中毒の機構を描写する模式図である。
【００４２】
【図２】図２は、ファージ依存的連続進化（ＰＡＣＥ）の模式的概略である。
【００４３】
【図３】図３は、プロテアーゼのＰＡＣＥ選択のための、タンパク質分解により活性化されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの模式的描写である。
【００４４】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＢｏＮＴプロテアーゼの進化のためのＰＡＣＥ選択を示す。図４Ａは、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ７タンパク質配列のアラインメントを示す。太字の残基は、ＢｏＮＴ  Ｆ切断活性のために重要であることが実験により決定されている。下線の残基は、完全に保存されている。図４Ｂは、ＰＡＣＥアクセサリープラスミド（ＡＰ）中への組み込みのための代表的Ｔ７−ＰＡＰコンストラクトを示す。図４Ｃは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、ＢｏＮＴ発現ファージの選択のための、ＶＡＭＰ１由来およびＶＡＭＰ２由来のＴ７−ＰＡＰコンストラクトに対する、相対的切断活性の分析を示す。図４Ｄは、反復ＰＡＣＥを通しての、ＢｏＮＴ  Ｆファージクローンにおける新規の活性の進化を示す。ＢｏＮＴ  Ｆ（１．５）は、Ｔ７−ＰＡＰ（ＶＡＭＰ７１．５）ＡＰに対するＰＡＣＥ選択の後で単離された代表的ファージクローンを示す。上から下へ、配列は、配列番号３２４〜３３３に対応する。
【００４５】
【図５】図５は、非選択性プロテアーゼに対する直交性ポリメラーゼ戦略を描写する模式図、および負の選択コンストラクトの例である。上から下へ、配列は、配列番号３３４〜３３７に対応する。
【００４６】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＢｏＮＴプロテアーゼのタンパク質分解活性を示す。図６Ａは、ＳＮＡＲＥ由来のＰＡ−ＲＮＡＰコンストラクト中のＢｏＮＴ軽鎖（ＬＣ）タンパク質分解活性を示す。図６Ｂは、改善されたＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ２切断活性を示すＰＡＣＥにより進化したクローンに対する、野生型ＢｏＮＴ血清型ＢおよびＦについての比較データを示す。
【００４７】
【図７】図７は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ７、およびＶＡＭＰ８の一次配列アラインメントを示す。血清型ＢおよびＦについてのＢｏＮＴ  ＬＣ切断部位を、それぞれ下および上にマークする。矢印でマークされた残基は、残基の側鎖の除去により、ＶＡＭＰ２に対して少なくとも５０％の切断活性の低下をもたらす。上から下へ、配列は、配列番号３３８〜３４１に対応する。
【００４８】
【図８】図８は、ＶＡＭＰ１の単一残基変異体の集合に対して変化した活性を示す進化型ＢｏＮＴ  Ｆバリアントを示す。Ｌ１／Ｌ２は、ＶＡＭＰ１  Ｌ５５Ａを切断するように進化させられ、Ｌ３／４は、ＶＡＭＰ１  Ｄ５８Ｇを切断するように進化させられ、Ｌ５／Ｌ６は、ＶＡＭＰ１  Ｄ６５Ｉを切断するように進化させられた。
【００４９】
【図９】図９は、ＢｏＮＴ  ＢおよびＢｏＮＴ  ＦをＶＡＭＰ１／２を切断するように進化させることができることを示す、ルシフェラーゼアッセイデータを示す。
【００５０】
【図１０】図１０は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ７およびＶＡＭＰ８のアミノ酸配列のアラインメント（上）ならびにＶＡＭＰ１からＶＡＭＰ７への進化のトラジェクトリーの例（下）を示す。ＡＰ：アクセサリープラスミド。上から下へ、配列は、配列番号３４２〜３４６に対応する。
【００５１】
【図１１】図１１は、ＢｏＮＴ  ＦおよびＢｏＮＴ  ＢのＶＡＭＰ２（天然の基質）切断ドメインと、ＶＡＭＰ７とのアラインメントを示す。上から下へ、配列は、配列番号３４７〜３４９に対応する。
【００５２】
【図１２】図１２は、ＰＡＣＥによるＢｏＮＴ  ＢおよびＦの進化（例えばＢｏＮＴ  ＦについてはＡＰの９７７、９８３および９８６を用いて）が、活性が改善されたＢｏＮＴバリアントをもたらすことを示すデータを示す。
【００５３】
【図１３】図１３は、ＢｏＮＴ軽鎖（ＬＣ）選択の検証に関する代表的データを示す；データは、ＶＡＭＰ１に対するＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼの進化がＳ１６６Ｙ変異を濃縮し、これが広く増大した活性を付与することを示す。
【００５４】
【図１４】図１４は、ＶＡＭＰ７を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントの生成についての飛び石進化の経路の一例を示す。
【００５５】
【図１５】図１５は、３つの異なる実験（ラグーン１〜６）からのＢｏＮＴ  Ｆバリアントについてのプロテアーゼ活性アッセイを示す。各々の実験は、異なる単一部位変異（Ｌ５５Ａ、Ｄ５８ＧまたはＤ６５Ｉ）を含むＶＡＭＰ１基質を切断するクローンを生じる。
【００５６】
【図１６】図１６は、二重変異体基質を切断するＢｏＮＴ  Ｆを進化させるためのＰＡＣＥ実験の模式的描写である；二重変異体ＶＡＭＰ１（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ）のアミノ酸配列もまた示す。上から下へ、配列は、配列番号３４７〜３４９に対応する。
【００５７】
【図１７】図１７は、ＰＡＣＥにより生じる特定のＢｏＮＴ  Ｆバリアントが、二重変異体ＶＡＭＰ１基質（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ）を切断することができることを示す、プロテアーゼ依存的ルシフェラーゼアッセイデータを示す。
【００５８】
【図１８】図１８は、ＶＡＭＰ１〜ＶＡＭＰ７の飛び石進化のトラジェクトリーの一例を示す。上から下へ、配列は、配列番号３５０〜３５１に対応する。
【００５９】
【図１９】図１９は、ＰＡＣＥにより生じる特定のＢｏＮＴ  Ｆバリアントが、三重変異体ＶＡＭＰ１基質（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ）を切断することができることを示す、プロテアーゼ依存的ルシフェラーゼアッセイデータを示す。上から下へ、配列は、配列番号３５０〜３５１に対応する。
【００６０】
【図２０】図２０は、ＰＡＣＥにより生じる特定のＢｏＮＴ  Ｆバリアントが、三重変異体ＶＡＭＰ１基質（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ／Ｋ６０Ｒ）を切断することができることを示す、プロテアーゼ依存的ルシフェラーゼアッセイデータを示す。上から下へ、配列は、配列番号３５０〜３５１に対応する。
【００６１】
【図２１】図２１は、変異Ｖ４４Ｋ（図中でＶ４３として示される）およびＱ３２Ｍ（図中でＱ３３として示される）を含むＶＡＭＰ１基質に対するプロテアーゼの活性を、容易に進化させることができることを示すデータを示す。上から下へ、配列は、配列番号３５２〜３５３に対応する。
【００６２】
【図２２】図２２は、漸進的により複雑となるＶＡＭＰ基質に対する反復選択が、ＶＡＭＰ７を切断するいくつかのＢｏＮＴ  Ｆバリアントを生じることを示すデータを示す。
【００６３】
【図２３】図２３は、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ７アミノ酸配列のアラインメントを、７つのＶＡＭＰ７変異（Ｖ４４Ｋ／Ｋ５３Ｌ／Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ／Ｋ６０Ｒ／Ｄ６５Ｉ）を含むＡＰ−Ｖ７−１９４ＫＬと共に示す。上から下へ、配列は、配列番号３５４、３５０および３５１に対応する。
【００６４】
【図２４】図２４は、２つのＢｏＮＴ  Ｆ進化型バリアント（２０２０  Ｌ２Ａ、２０２０  Ｌ３Ａ）のタンパク質発現についてのタンパク質ブロット分析を示す。
【００６５】
【図２５】図２５は、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ８のアミノ酸配列のアラインメントならびに二重変異体アクセサリープラスミド（ＡＰ）の模式図である。上から下へ、配列は、配列番号３５５〜３５６に対応する。
【００６６】
【図２６】図２６は、ＶＡＭＰ７進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼがより広範な活性プロフィールを有することを示す、代表的データを示す。
【００６７】
【図２７】図２７は、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ８のアミノ酸配列のアラインメントを、ＶＡＭＰ８を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントを進化させるために用いられたいくつかのＡＰと共に示す。データは、ＶＡＭＰ８  ＡＰは、高いバックグラウンドを有するが、ＶＡＭＰ８を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントを同定したことを示す。上から下へ、配列は、配列番号３５５〜３５６に対応する。
【００６８】
【図２８】図２８は、野生型ＢｏＮＴ  ＥがＳＮＡＰ２５タンパク質を切断することを示すデータを示す。
【００６９】
【図２９】図２９は、ＳＮＡＰ２５の位置１７９における残基の変異（例えばＤ１７９Ｋ）が、ＢｏＮＴ  Ｅによるプロテアーゼ活性を消失させたことを示す。
【００７０】
【図３０】図３０は、ＳＮＡＰ２３を切断するＢｏＮＴ  Ｅバリアントを作製するために用いられたＰＡＣＥ戦略、ならびに、ＰＡＣＥにより生じるいくつかのＢｏＮＴ  ＥバリアントがＳＮＡＰ２３を切断することができることを示すデータを示す。
【００７１】
【図３１】図３１は、野生型ＢｏＮＴ  ＡおよびＢｏＮＴ  Ｅプロテアーゼが、そこでＳＮＡＰ２５を切断するが、ＳＮＡＰ２３は切断しない、ＳＮＡＰ２５アミノ酸配列の一部およびペプチド結合を示す。上から下へ、配列は、配列番号３５７〜３６２に対応する。
【００７２】
【図３２】図３２は、治療標的であるホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）を切断するためのＢｏＮＴ  ＥのＰＡＣＥについての飛び石の模式図を示す。上から下へ、配列は、配列番号３６３〜３８９に対応する。
【００７３】
【図３３】図３３は、ＰＴＥＮを切断するいくつかのＢｏＮＴ  Ｅバリアントについての発光アッセイデータを示す。
【００７４】
【図３４】図３４は、進化型ＢｏＮＴ  Ｅバリアント（Ｌ２Ｆ  ０３１０１７）を発現させ、Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、漸増濃度のイミダゾールにより溶離したことを示す。
【００７５】
【図３５】図３５は、ＢｏＮＴ  Ｅ  Ｌ２Ｆが、ＳＮＡＰ２５およびＰＴＥＮ基質の両方を切断することを示すデータを示す。
【００７６】
【図３６】図３６は、負の選択ＰＡＣＥが、ＢｏＮＴ  Ｅバリアントにより改善されたＰＴＥＮ基質切断をもたらすことを示すデータを示す。
【００７７】
【図３７】図３７は、正および負の両方の選択のＰＡＣＥの後のＢｏＮＴ  ＥバリアントＬ２Ｂが、単一のペプチド結合において全長ヒトＰＴＥＮタンパク質を切断し、ほぼ予測された分子量のフラグメントを生じることを示すデータを示す。
【００７８】
【図３８】図３８Ａ〜３８Ｂは、プロテアーゼ発現および進化型ＢｏＮＴプロテアーゼの単離を示す。図３８Ａは、進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼｍ２０２０−Ｌ２Ａ（「ｍ」はタンパク質のＮ末端上のマルトース結合タンパク質タグを示す）のウェスタンブロットを示す。図３８Ｂは、精製されたＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼｍ２０２０−Ｌ２Ａおよびｍ２０２０−Ｌ３ＡのＮｉ−ＮＴＡ（上）、ならびにその後のＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼｍ２０２０−Ｌ２Ａおよびｍ２０２０−Ｌ３Ａのアミロース精製のウェスタンブロットを示す。
【図３９】図３９は、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント２０２０−Ｌ２Ａプロテアーゼが、ＶＡＭＰ７切断アッセイにより測定された場合にin vitroで活性であることを示すデータを示す。配列番号３９４〜３９５（上および下）を示す。
【００７９】
【図４０】図４０は、ＶＡＭＰ７におけるＢｏＮＴ  Ｆバリアント２０２０−Ｌ２Ａプロテアーゼの切断部位が、ＭＳにより測定された場合に、予測される切断部位と比較してシフトしたことを示すデータを示す。配列番号３９６〜４０１（上および下）を示す。
【００８０】
【図４１】図４１は、ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼバリアント（ＰＡＣＥ−３４０１）のＶＡＭＰ７切断活性を改善するための高厳密性ＰＡＣＥ実験の結果を示す。ＶＡＭＰ２（配列番号３９６）およびＶＡＭＰ７（配列番号３９７）についての配列を示す。
【００８１】
【図４２】図４２は、２０２０−Ｌ２Ａおよび２０２０−Ｌ３Ａ  ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼ含有ファージをＰＡＣＥ−３０４１クローンと比較する、ルシフェラーゼアッセイデータを示す。１２２−９５１−ｐｒｏＢ＝低厳密性ＶＡＭＰ１；１２２−０９２−ｐｒｏＢ−低厳密性ＶＡＭＰ７；３１４−０９２ＱＳ−ｐｒｏＢ＝高厳密性ＶＡＭＰ７。
【００８２】
【図４３】図４３は、２０２０−Ｌ２Ａおよび２０２０−Ｌ３Ａ  ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼ含有ファージを、３１４−０９２ＱＳ−ｐｒｏＢラグーンから単離されたＰＡＣＥ−３０４１クローンと比較するルシフェラーゼアッセイデータを示す。
【００８３】
【図４４】図４４は、ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼバリアント（ｍ３０４１−Ｌ２Ｄおよびｍ３０４１−Ｌ２Ｆ）のin vitroでの特徴づけに関するデータを示す。
【００８４】
【図４５】図４５は、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントｍ３０４１−Ｌ２Ｄおよびｍ３０４１−Ｌ２Ｆのin vitroでの検証に関するデータを示す。クローンｍ３０４１−Ｌ２Ｆは、in vitroで触媒活性を保持したことが観察された。
【００８５】
【図４６】図４６は、進化型ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントの選択性に関するデータを示す。ＢｏＮＴ  Ｆ  ２０２０−Ｌ２Ａ試料について、オフターゲット切断が観察された。
【００８６】
【図４７】図４７は、ＰＡＣＥ実験ＰＡＣＥ−２３００（ＶＡＭＰ７について正の選択、ＶＡＭＰ１について負の選択）に関するデータを示す。３１３−０９２−ｐｒｏＢ（ＶＡＭＰ７＋）＝ＶＡＭＰ７基質に対する正の選択；Ｔ３ｎｅｇ−９５１−ｐｒｏＤ（ＶＡＭＰ１−）＝同時のＶＡＭＰ１基質に対する負の選択。ＶＡＭＰ２（配列番号３９６）およびＶＡＭＰ７（配列番号３９７）を示す。
【００８７】
【図４８】図４８は、ＰＡＣＥ実験ＰＡＣＥ−２３００に関するルシフェラーゼアッセイデータを示す。明らかな選択性を有する１つのクローン：ＢｏＮＴ  Ｆ（２３００−Ｌ３Ｂ）。
【００８８】
【図４９】図４９は、ｍ２３００−Ｌ３Ｂのin vitroでの特徴づけに関するデータを示す。ｍ２３００−Ｌ３Ｂプロテアーゼは、ＶＡＭＰ７に対する活性を保持する。ＶＡＭＰ１／７について、ｍ２３００−Ｌ３Ｂ対ｍ２０２０−Ｌ２Ａについて、in vitroでの選択性における改善が観察された。ＶＡＭＰ１／７について、ｍ２３００−Ｌ３Ｂ対ｍ２０２０−Ｌ３Ａについて、in vitroでの選択性の実質的な改善が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
定義
用語「プロテアーゼ」とは、本明細書において用いられる場合、アミノ酸残基をタンパク質中に一緒に連結させるペプチド（アミド）結合の加水分解を触媒する酵素を指す。当該用語は、天然に存在するプロテアーゼおよび操作されたプロテアーゼの両方を包含する。多くのプロテアーゼは、当該分野において公知である。プロテアーゼは、それらの触媒残基により分類することができ、プロテアーゼのクラスは、限定することなく、セリンプロテアーゼ（セリンアルコール）、スレオニンプロテアーゼ（スレオニン二級アルコール）、システインプロテアーゼ（システインチオール）、アスパラギン酸プロテアーゼ（アスパラギン酸カルボン酸）、グルタミン酸プロテアーゼ（グルタミン酸カルボン酸）、およびメタロプロテアーゼ（金属イオン、例えば亜鉛）を含む。括弧内の構造は、各々のクラスのプロテアーゼのそれぞれの触媒部分に対応する。いくつかのプロテアーゼは、高度に無差別的（promiscuous）であり、広範なタンパク質基質を切断する（例えばトリプシンまたはペプシン）。他のプロテアーゼは、高度に特異的であり、特異的配列を有する基質のみを切断する。例えばトロンビンなどのいくつかの血液凝固性プロテアーゼ、および例えばＨＣＶまたはＴＥＶプロテアーゼなどのいくつかのウイルスのプロテアーゼは、高度に特異的なプロテアーゼである。別の例において、ボツリヌス毒素プロテアーゼ（ＢｏＮＴ）は、一般に、特異的なＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。非常に特異的な様式において切断するプロテアーゼは、典型的には、それらの基質の複数のアミノ酸残基に結合する。好適なプロテアーゼ、およびときに「プロテアーゼ基質」としても言及されるプロテアーゼ切断部位はまた、当業者には明らかであり、限定することなく、merops.sanger.ac.ukにおいてアクセス可能なMEROPSデータベースにおいて列記され、Rawlings et al. (2014) MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res 42, D503-D509において記載されるプロテアーゼを含み、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。本開示は、この点において限定されない。
【００９０】
用語「タンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、ペプチド結合により一緒に連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、本明細書において用いられる場合、任意のサイズ、構造または機能のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを指す。典型的には、タンパク質は、少なくとも３アミノ酸長であろう。タンパク質は、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を指してもよい。本発明のタンパク質は、好ましくは、天然のアミノ酸のみを含むが、非天然のアミノ酸（すなわち、天然には存在しない化合物であるが、ポリペプチド鎖中に組み込むことができるものを含む；例えば、cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gifを参照：これは、機能的イオンチャネル中に首尾よく組み込まれた非天然のアミノ酸の構造を示す）および／または当該分野において公知であるようなアミノ酸アナログを、代替的に使用してもよい。また、本発明のタンパク質中のアミノ酸の１つ以上は、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合、官能化または他の修飾などのためのリンカーなどの化学実体の付加により、修飾することができる。タンパク質はまた、単一の分子であってもよく、多分子複合体であってもよい。タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なるフラグメントであってもよい。タンパク質は、天然に存在するもの、組み換え、または合成、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００９１】
用語「ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）プロテアーゼ」とは、本明細書において用いられる場合、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）に由来するか、またはこれに対して少なくとも７０％の配列相同性（もしくはこれに対して少なくとも７０％の同一性）を有するプロテアーゼ、例えばクロストリジウム属の細菌（例えばC. botulinum）に由来するＢｏＮＴを指す。構造的には、ＢｏＮＴタンパク質は、２つの保存されたドメイン、「重鎖」（ＨＣ）および「軽鎖」（ＬＣ）を含む。ＬＣは、タンパク質の触媒活性を担う亜鉛メタロプロテアーゼドメインを含む。ＨＣは、典型的には、神経細胞への結合を担うＨＣＣドメイン、および細胞中へのタンパク質の転位を媒介するＨＣＮドメインを含む。ＢｏＮＴ  ＨＣドメインの例は、以下の配列番号２９９および３００において記載されるアミノ酸配列により代表される。
ＢｏＮＴ  Ｅ  ＨＣＣドメイン
SSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFEIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK（ＢｏＮＴ  Ｅ  ＨＣＣ、結合ドメイン）
ＢｏＮＴ  Ｅ  ＨＣＮ  ドメイン
CKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKS（ＢｏＮＴ  Ｅ  ＨＣＮ、転位ドメイン）
７つのＢｏＮＴの血清型が存在し、これらはＢｏＮＴ  Ａ〜Ｇと表される。ＢｏＮＴ血清型Ａ、ＣおよびＥは、シナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ２５）を切断する。ＢｏＮＴ血清型Ｃはまた、シンタキシンを切断することが観察されている。ＢｏＮＴ血清型Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断する。野生型ＢｏＮＴプロテアーゼ（例えばＢｏＮＴ  Ｅ）により切断されるＳＮＡＰ２５基質の例は、配列番号３０１において記載されるアミノ酸配列により代表される。野生型ＢｏＮＴプロテアーゼ（例えばＢｏＮＴ  Ｅ）により切断されるＶＡＭＰ基質（例えばＶＡＭＰ１）の例は、配列番号３０２において記載されるアミノ酸配列により代表される。
ＳＮＡＰ２５基質配列
MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG
ＶＡＭＰ１基質配列
MSAPAQPPAEGTEGTAPGGGPPGPPPNMTSNRRLQQTQAQVEEVVDIIRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFESSAAKLKRKYWWKNCKMMIMLGAICAIIVVVIVRRG
野生型ＢｏＮＴプロテアーゼは、ボツリヌス菌ゲノム中に天然に存在するような、ＢｏＮＴプロテアーゼのアミノ酸配列を指す。野生型ＢｏＮＴプロテアーゼの例は、配列番号３０３〜３０９において記載されるアミノ酸配列により代表される。
ボツリヌス神経毒血清型Ａ
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLL
ボツリヌス神経毒血清型Ｂ
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQM
ボツリヌス神経毒血清型Ｃ
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKF
ボツリヌス神経毒血清型Ｄ
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKV
ボツリヌス神経毒血清型Ｅ
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKV
ボツリヌス神経毒血清型Ｆ
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKF
ボツリヌス神経毒血清型Ｇ
MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNAPPTPG
【００９２】
用語「ＢｏＮＴプロテアーゼバリアント」とは、本明細書において用いられる場合、天然に存在するかまたは野生型のＢｏＮＴタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２８６または配列番号２８７）と比較して、例えばＰＡＣＥ法の適用の結果としてまたは遺伝子操作（例えば組み換え遺伝子発現、遺伝子合成など）によりアミノ酸配列中に導入された１つ以上のアミノ酸のバリエーションを有する、タンパク質（例えば、ＢｏＮＴプロテアーゼ）を指す。アミノ酸配列のバリエーションは、例えば、コード配列中の任意の特定の位置におけるコドンの変化、１つ以上のアミノ酸の欠失（例えば、短縮型タンパク質）、１つ以上のアミノ酸の挿入、または前述のものの任意の組み合わせをもたらす、プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の変化の結果として、プロテアーゼのアミノ酸配列中に１つ以上の変異した残基を含んでもよい。ある態様において、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼと比較して、異なる標的ペプチド（例えばより広範なまたは異なる基質特異性を有する）を切断する。例えば、いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼバリアントは、ＶＡＭＰ７タンパク質またはペプチドを切断する。
【００９３】
用語「連続進化」とは、本明細書において用いられる場合、所望される進化型生成物、例えば所望される活性を有する新規のタンパク質をコードする新規の核酸を生成するために、核酸の集合を、複数のラウンドの（ａ）複製、（ｂ）変異（または集合中の核酸のヌクレオチドの一次配列の修飾）および（ｃ）選択の標的とする、進化の手順を指し、ここで、複製、変異および選択の複数のラウンドは、研究者の相互作用なしに行うことができ、およびここで、プロセス（ａ）〜（ｃ）は、同時に行うことができる。典型的には、進化の手順は、in vitroで、例えば宿主細胞として培養中の細胞を用いて、行われる。一般的に、本明細書において提供される連続進化プロセスは、目的の遺伝子が、宿主細胞中での複製および別の宿主細胞への伝達を含む生活環を経る核酸ベクター中で提供される系に依存し、ここで、当該生活環の重要な成分が非活性化され、当該成分の再活性化は、目的の遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列における所望されるバリエーションに依存する。
【００９４】
いくつかの態様において、目的の遺伝子（例えば、ＢｏＮＴプロテアーゼをコードする遺伝子）は、目的の遺伝子の活性に依存した様式において細胞から細胞に伝達される。いくつかの態様において、伝達ベクターは、細胞に感染するウイルス、例えば、バクテリオファージまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、細菌宿主細胞に感染するファージベクターである。いくつかの態様において、伝達ベクターは、ドナー細菌細胞からレシピエント細菌細胞に伝達された接合性（conjugative）プラスミドである。
【００９５】
いくつかの態様において、目的の遺伝子を含む核酸ベクターは、ファージ、ウイルスベクター、またはネイキッドＤＮＡ（例えば可動化プラスミド）である。いくつかの態様において、細胞から細胞への目的の遺伝子の伝達は、感染、トランスフェクション、形質導入、接合（conjugation）、またはネイキッドＤＮＡの取り込みを介するものであり、細胞から細胞への伝達の効率（例えば伝達率）は、目的の遺伝子によりコードされる生成物の活性に依存する。例えば、いくつかの態様において、核酸ベクターは、目的の遺伝子を内包するファージであり、ファージ伝達の効率（感染を介するもの）は、ファージ粒子の生成のために必要とされるタンパク質（例えばＭ１３ファージについてはｐＩＩＩ）が、目的の遺伝子の所望される活性の存在下においてのみ宿主細胞中で発現されるという点において、目的の遺伝子の活性に依存的である。
【００９６】
例えば、いくつかの態様は、進化させるべき目的の遺伝子を含むウイルスベクターの集合が、宿主細胞のフロー、例えばラグーン（lagoon）を通るフロー中で複製する、連続進化系を提供し、ここで、イルスベクターは、感染性ウイルス粒子の生成のために必須であるタンパク質をコードする遺伝子を欠損し、およびここで、遺伝子は、宿主細胞中で、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物またはその変異バージョンにより活性化することができるコンディショナルプロモーターの制御下にある。いくつかの態様において、コンディショナルプロモーターの活性は、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物の所望される機能に依存する。その中の目的の遺伝子が遺伝子産物タンパク質配列中に導入されたアミノ酸のバリエーションの結果として所望される機能を獲得していないウイルスベクターは、コンディショナルプロモーターを活性化しないか、最小限の活性化しか達成し得ないが、一方、目的の遺伝子中に導入された、所望される機能を付与する任意の変異は、コンディショナルプロモーターの活性化をもたらすであろう。コンディショナルプロモーターは、ウイルス生活環のために必須のタンパク質、例えばｐＩＩＩを制御するので、このプロモーターの活性化は、有利な変異を獲得しているベクターにとってのウイルスの拡散および複製における利点に直接的に対応する。
【００９７】
用語「フロー」とは、本明細書において宿主細胞に関して用いられる場合、フレッシュな宿主細胞が、宿主細胞集合、例えばラグーンにおける宿主細胞集合中に導入されており、限られた時間にわたり集合中に残り、次いで宿主細胞集合から取り除かれる、宿主細胞の流れ（stream）を指す。単純な形態において、宿主細胞のフローは、制御された速度で管またはチャネルを通るフローであってよい。他の態様において、宿主細胞のフローは、一定容積の細胞培養培地を保持し、インフローおよびアウトフローを含む、ラグーンを通るように指向される。フレッシュな宿主細胞の導入は、連続的であっても間欠的であってもよく、除去は、受動的（例えばオーバーフローによるもの）であっても、能動的（例えば能動的なサイフォンまたはポンプによるもの）であってもよい。除去は、さらに、無作為であってもよく、例えば、宿主細胞の撹拌懸濁培養が提供される場合、取り除かれた液体培養培地は、フレッシュに導入された宿主細胞ならびにラグーン中にしばらくあった宿主細胞集合のメンバーであった細胞を含むであろう。しかしながら、理論において、細胞は、ラグーンからの除去を不確定に回避し得、平均的な宿主細胞は、限定された期間わたってのみラグーン中に残り、これは、主にラグーンを通る培養培地（および懸濁された細胞）のフロー速度により決定される。
【００９８】
ウイルスベクターは、フレッシュな未感染の宿主細胞が提供される一方で感染細胞が取り除かれる宿主細胞のフロー中で複製するので、研究者の相互作用なしで、複数の連続したウイルス生活環が起こり得、これは、単一の進化実験において複数の有利な変異の蓄積を可能にする。
【００９９】
用語「ファージ依存的連続進化（ＰＡＣＥ）」とは、本明細書において用いられる場合、ファージをウイルスベクターとして使用する連続進化を指す。
【０１００】
用語「ウイルスベクター」とは、本明細書において用いられる場合、好適な宿主細胞中に導入された場合に、複製されて、ウイルスゲノムを別の宿主細胞に伝達することができるウイルス粒子にパッケージングされることができる、ウイルスゲノムを含む核酸を指す。ウイルスベクターという用語は、短縮されているかまたは部分的なウイルスゲノムを含むベクターに拡大解釈される。例えば、いくつかの態様において、感染性ウイルス粒子の生成のために必須なタンパク質をコードする遺伝子を欠失するウイルスベクターが提供される。好適な宿主細胞、例えば欠失した遺伝子をコンディショナルプロモーターの制御下において含む宿主細胞においては、しかし、かかる短縮型ウイルスベクターは、複製して、短縮されたウイルスゲノムを別の宿主細胞中に伝達することができるウイルス粒子を生成することができる。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ファージ、例えば、線維状ファージ（例えばＭ１３ファージ）である。いくつかの態様において、進化させるべき目的の遺伝子を含むウイルスベクター、例えばファージベクターが提供される。
【０１０１】
用語「核酸」とは、本明細書において用いられる場合、ヌクレオチドのポリマーを指す。ポリマーとして、以下を挙げることができる：天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルシュードウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、および２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えばメチル化された塩基）、挿入された塩基、修飾された糖（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾されたリン酸基（例えばホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト連結）。
【０１０２】
用語「目的の遺伝子」または「目的のプロテアーゼをコードする遺伝子」とは、本明細書において用いられる場合、本明細書において記載されるような連続進化プロセスにおいて進化させるべき目的の遺伝子産物（例えばＢｏＮＴプロテアーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸コンストラクトを指す。当該用語は、本明細書において記載される方法による連続進化プロセスの結果である、目的の遺伝子の任意のバリエーションを含む。例えば、いくつかの態様において、目的の遺伝子は、進化させるべきプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸コンストラクトであり、当該ヌクレオチド配列は、コード配列の発現が、ウイルスゲノム中の１つ以上のプロモーターの制御下となるように、ウイルスベクター（例えばファージゲノム）中にクローニングされている。他の態様において、目的の遺伝子は、進化させるべきプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列、および当該コード配列に作動的に連結されたプロモーターを含む、核酸コンストラクトである。ウイルスベクター（例えばファージゲノム）中にクローニングされる場合、かかる目的の遺伝子のコード配列の発現は、異種性プロモーターの制御下にあり、いくつかの態様においてはまた、ウイルスゲノム中の１つ以上のプロモーターにより影響を受けてもよい。
【０１０３】
用語「目的の遺伝子の機能」とは、用語「目的の遺伝子の活性」と交換可能に用いられる場合、目的の遺伝子によりコードされる遺伝子産物（例えば核酸またはタンパク質）の機能または活性を指す。例えば、目的の遺伝子の機能は、酵素活性（例えば所望される基質の切断の発生をもたらすタンパク質分解活性など）、転写を活性化させる能力（例えば特異的プロモーター配列を標的とする転写活性化の活性）、結合を形成する活性（例えば共有結合の形成をもたらす酵素活性）、または結合活性（例えば、タンパク質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ結合活性）であってもよい。
【０１０４】
用語「プロモーター」とは、細胞の転写機構により認識されて下流の遺伝子の転写を開始させることができる配列を有する核酸分子を指す。プロモーターは、構成的に活性であってもよく、これはプロモーターが、所与の細胞の状況において常に活性であることを意味し、または、プロモーターは、条件的に活性であってもよく、これは、プロモーターは、特異的条件下においてのみ活性であることを意味する。例えば、コンディショナルプロモーターは、プロモーター中の調節エレメントと関連するタンパク質を基本の転写機構に連結する特異的タンパク質の存在下においてのみ、または、阻害分子の不在下においてのみ、活性であってもよい。条件的に活性なプロモーターのサブクラスは、活性のために小分子「誘導因子」の存在を必要とする、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの例として、これらに限定されないが、アラビノース誘導性プロモーター、Tet-onプロモーター、およびタモキシフェン誘導性プロモーターが挙げられる。多様な構成的、条件的および誘導性のプロモーターは、当業者に周知であり、当業者は、本発明を実施することにおいて有用な多様なかかるプロモーターを確認することができ、これらは、この点において限定されない。
【０１０５】
用語「ウイルス粒子」とは、本明細書において用いられる場合、ウイルスのタンパク質のコーティング、およびいくつかの場合においては脂質のエンベロープと結合した、ウイルスゲノム、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを指す。例えば、ファージ粒子は、野生型ファージゲノムによりコードされるタンパク質中にパッケージングされるファージゲノムを含む。
【０１０６】
用語「感染性ウイルス粒子」とは、本明細書において用いられる場合、それが含むウイルスゲノムを好適な宿主細胞中に輸送することができるウイルス粒子を指す。全てのウイルス粒子が、ウイルスゲノムを好適な宿主細胞を伝達することができるわけではない。これを達成することができない粒子は、非感染性ウイルス粒子として言及される。いくつかの態様において、ウイルス粒子は、複数の異なるコートタンパク質を含み、ここで、コートタンパク質の１つまたはいくつかを、ウイルス粒子の構造を損なうことなく取り除くことができる。いくつかの態様において、少なくとも１つのコートタンパク質は、感染性の喪失を伴うことなく取り除くことができない、ウイルス粒子が提供される。ウイルス粒子が、感染性を付与するタンパク質を欠失する場合、ウイルス粒子は、感染性ではない。例えば、ファージタンパク質（例えばｐＶＩＩＩ）のコート中にパッケージングされるが、ｐＩＩＩ（タンパク質ＩＩＩ）を欠失するファージゲノムを含むＭ１３ファージ粒子は、非感染性Ｍ１３ファージ粒子である。なぜならば、ｐＩＩＩは、Ｍ１３ファージ粒子の感染特性のために必須であるからである。
【０１０７】
用語「ウイルス生活環」とは、本明細書において用いられる場合、ウイルスゲノムの宿主細胞中への挿入、宿主細胞中でのウイルスゲノムの複製、および宿主細胞によるウイルスゲノムの複製産物のウイルス粒子中へのパッケージングを含む、ウイルスの複製周期を指す。
【０１０８】
いくつかの態様において、提供されるウイルスベクターは、ファージである。用語「ファージ」とは、本明細書において用語「バクテリオファージ」と交換可能に用いられる場合、細菌細胞に感染するウイルスを指す。典型的には、ファージは、遺伝材料を封入している外側のタンパク質キャプシドからなる。遺伝材料は、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡであってよく、直鎖状または環状の形態であってよい。ファージおよびファージベクターは、当業者に周知であり、本明細書において提供される方法を行うために有用であるファージの非限定的な例は、λ（Lysogen）、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７、Ｔ１２、Ｒ１７、Ｍ１３、ＭＳ２、Ｇ４、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、ＰｈｉＸ１７４、Ｎ４、Φ６、およびΦ２９である。ある態様において、本発明において利用されるファージは、Ｍ１３である。さらなる好適なファージおよび宿主細胞は、当業者には明らかであり、本発明は、この側面において限定されない。さらなる好適なファージおよび宿主細胞の例示的な記載については、Elizabeth KutterおよびAlexander Sulakvelidze: Bacteriophages: Biology and Applications.  CRC Press；第１版（２００４年１２月）、ISBN：0849313368；Martha R. J. ClokieおよびAndrew M. Kropinski：Bacteriophages：Methods and Protocols、第１巻：Isolation, Characterization, and Interactions（Methods in Molecular Biology）Humana Press；第１版（２００８年１２月）、ISBN：1588296822；Martha R. J. ClokieおよびAndrew M. Kropinski：Bacteriophages：Methods and Protocols、第２巻：Molecular and Applied Aspects（Methods in Molecular Biology）Humana Press；第１版（２００８年１２月）、ISBN：1603275649を参照；これらの全ては、好適なファージおよび宿主細胞、ならびにかかるファージの単離、培養および操作のための方法およびプロトコルの開示のために、本明細書においてそれらの全体において参考として援用される）。
【０１０９】
いくつかの態様において、ファージは、線維状ファージである。いくつかの態様において、ファージは、Ｍ１３ファージである。Ｍ１３ファージは、当業者に周知であり、Ｍ１３ファージの生物学は、広範に研究されてきている。野生型Ｍ１３ファージ粒子は、約６．４ｋｂの環状の一本鎖ゲノムを含む。ある態様において、Ｍ１３ファージの野生型ゲノムは、１１個の遺伝子、ｇＩ〜ｇＸＩを含み、これらは順に、それぞれ１１個のＭ１３タンパク質、ｐＩ〜ｐＸＩをコードする。ｇＶＩＩＩは、またしばしばファージ粒子の主要構造タンパク質としても言及されるｐＶＩＩＩをコードし、一方、ｇＩＩＩは、Ｍ１３ファージ粒子の感染性のために必要とされる、マイナーコートタンパク質としてもまた言及されるｐＩＩＩをコードする。
【０１１０】
Ｍ１３の生活環は、ｐＩＩＩタンパク質を介する好適な細菌宿主細胞の性線毛へのファージの接着、および宿主細胞中へのファージゲノムの挿入を含む。環状の一本鎖ファージゲノムは、次いで、複製型（ＲＦ）とも称される環状の二本鎖ＤＮＡに変換され、これからファージ遺伝子転写が開始される。野生型Ｍ１３ゲノムは、９個のプロモーターおよび２個の転写終結因子、ならびに複製の起点を含む。このプロモーターのシリーズは、２個の転写終結因子（ｇＶＩＩＩおよびＩＶ）に最も近い遺伝子が最も高いレベルで転写されるような、転写の勾配をもたらす。野生型Ｍ１３ファージにおいては、１１個全ての遺伝子の転写が、同じ方向に進行する。ファージによりコードされるタンパク質のうちの１つであるｐＩＩは、宿主細胞中での直鎖状の一本鎖ファージゲノムの生成を開始し、これはその後、環状化され、ｐＶにより結合されて安定化される。環状化した一本鎖Ｍ１３ゲノムは、次いで、ｐＶＩＩＩにより結合され、一方、ｐＶは、ゲノムから引き剥がされて、これがパッケージングプロセスを開始させる。パッケージングプロセスの終了時において、ｐＩＩＩの複数のコピーが、野生型Ｍ１３粒子に接着し、それにより、別の宿主細胞に感染して生活環を終える用意ができている感染性ファージを生成する。
【０１１１】
Ｍ１３ファージゲノムは、例えば、野生型遺伝子のうちの１つ以上を欠失させること、および／または異種性の核酸コンストラクトをゲノム中に挿入することにより、操作することができる。Ｍ１３は、厳密なゲノムサイズの制限を有さず、４２ｋｂまでの挿入物が報告されている。このことは、関与すべき遺伝子の長さについての限定を課すことなく目的の遺伝子を進化させるための連続進化実験においてＭ１３ファージベクターを用いることを可能にする。
【０１１２】
用語「選択ファージ」とは、本明細書において用語「選択プラスミド」と交換可能に用いられる場合、進化させるべき目的の遺伝子を含み、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる全長タンパク質をコードする遺伝子を欠損する、改変されたファージを指す。例えば、本明細書において提供されるいくつかのＭ１３選択ファージは、進化させるべきプロテアーゼをコードする核酸配列を、例えばＭ１３プロモーターの制御下において含み、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされるファージタンパク質をコードする遺伝子、例えばｇＩ、ｇＩＩ、ｇＩＩＩ、ｇＩＶ、ｇＶ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＩＸもしくはｇＸまたはこれらの任意の組み合わせの全てまたは一部を欠損する。例えば、本明細書において提供されるいくつかのＭ１３選択ファージは、進化させるべきプロテアーゼをコードする核酸配列を、例えばＭ１３プロモーターの制御下において含み、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされるタンパク質をコードする遺伝子、例えばｐＩＩＩタンパク質をコードするｇＩＩＩ遺伝子の全てまたは一部を欠損する。
【０１１３】
用語「ヘルパーファージ」とは、本明細書において用語「ヘルパーファージミド」および「ヘルパープラスミド」と交換可能に用いられる場合、ファージ生活環のために必要とされるファージ遺伝子、または複数のかかる遺伝子を含むが、ファージ粒子中へのゲノムパッケージングのために必要とされる構造エレメントを欠損する、核酸コンストラクトを指す。例えば、ヘルパーファージは、ファージ複製の起点を欠損する野生型ファージゲノムを提供することができる。いくつかの態様において、ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子を含むが、感染性粒子の生成のために必要とされる遺伝子、例えば全長ｐＩＩＩ遺伝子を欠損するヘルパーファージが提供される。いくつかの態様において、ヘルパーファージは、ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子の全てではなく、そのうちのいくつかのみを提供する。ヘルパーファージは、ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子を欠損する改変ファージが、宿主細胞中でのファージの生活環を完成させることを可能にするために有用である。典型的には、ヘルパーファージは、ファージゲノムにおいては欠損しているファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子を含み、それによりファージゲノムを補完するであろう。連続進化に関して、ヘルパーファージは、典型的には、選択ファージを補完するが、いずれも感染性ファージ粒子の生成のために必要とされるファージ遺伝子を欠損する。
【０１１４】
用語「複製産物」とは、本明細書において用いられる場合、宿主細胞によるウイルスゲノム複製の結果である核酸を指す。これは、宿主細胞中に挿入されたウイルスゲノムから宿主細胞により合成される任意のウイルスゲノムを含む。当該用語は、未変異の複製産物および変異した複製産物を含む。
【０１１５】
用語「アクセサリープラスミド」とは、本明細書において用いられる場合、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子を、コンディショナルプロモーターの制御下において含むプラスミドを指す。本明細書において記載される連続進化に関して、アクセサリープラスミドのコンディショナルプロモーターは、典型的には、進化させるべき目的の遺伝子の機能により活性化される。したがって、アクセサリープラスミドは、コンディショナルプロモーターを活性化することができる目的の遺伝子を担持するウイルスベクターの所与の集合中のそれらのウイルスベクターに、競合的利点を伝える機能を果たす。「活性化性」の目的の遺伝子を担持するウイルスベクターのみが、宿主細胞中で感染性ウイルス粒子を生成するために必要とされる遺伝子の発現を誘導することができ、それにより、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞のフロー中での伝播を可能にする。目的の遺伝子の非活性化性のバージョンを担持するベクターは、一方、感染性ウイルスベクターを生成するために必要とされる遺伝子の発現を誘導せず、したがって、フレッシュな宿主細胞に感染することができるウイルス粒子へとパッケージングされない。
【０１１６】
いくつかの態様において、アクセサリープラスミドのコンディショナルプロモーターは、その転写活性が、活性化機能により、例えば目的の遺伝子によりコードされるタンパク質の機能により、広範にわたり、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０桁の規模にわたり、調節され得るプロモーターである。いくつかの態様において、コンディショナルプロモーターの転写活性のレベルは、目的の遺伝子の所望される機能に直接的に依存する。このことは、コンディショナルプロモーターの最小限の活性化のみを示す目的の遺伝子のバージョンを含むウイルスベクター集合により、連続進化プロセスを開始させることを可能にする。連続進化のプロセスにおいて、コンディショナルプロモーターの活性を増大させる、目的の遺伝子の任意の変異は、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子の、より高い発現レベルへと、およびしたがって目的の遺伝子の最少活性型または機能喪失型バージョンを担持する他のウイルスベクターに対する競合的利点へと、直接的に翻訳される。
【０１１７】
本明細書において提供されるような連続進化の手順においてアクセサリープラスミドにより課される選択圧の厳密性は、調節することができる。いくつかの態様において、低コピー数のアクセサリープラスミドの使用は、アクセサリープラスミド上のコンディショナルプロモーターを活性化する目的の遺伝子のバージョンについての選択の厳密性の増大をもたらし、一方、高コピー数のアクセサリープラスミドの使用は、より低い選択の厳密性をもたらす。用語「高コピー数のプラスミド」および「低コピー数のプラスミド」は、当該分野において理解され、当業者は、所与のプラスミドが高コピー数のプラスミドであるか低コピー数のプラスミドであるかを確認することができるであろう。いくつかの態様において、低コピー数のアクセサリープラスミドは、約５〜約１００の、宿主細胞集合中の宿主細胞１個あたりのプラスミドの平均コピー数を示すプラスミドである。いくつかの態様において、非常に低いコピー数のアクセサリープラスミドは、約１〜約１０の、宿主細胞集合中の宿主細胞１個あたりのプラスミドの平均コピー数を示すプラスミドである。いくつかの態様において、非常に低いコピー数のアクセサリープラスミドは、細胞１個あたり単一コピーのプラスミドである。いくつかの態様において、高コピー数のアクセサリープラスミドは、約１００〜約５０００の、宿主細胞集合中の宿主細胞１個あたりのプラスミドの平均コピー数を示すプラスミドである。アクセサリープラスミドのコピー数は、大部分において、使用される複製の起点に依存するであろう。当業者は、所望されるコピー数を達成するために、好適な複製の起点を決定することができるであろう。
【０１１８】
いくつかの態様において、アクセサリープラスミドによって課される選択の厳密性圧はまた、転写アウトプットがより高いかまたはより低い変異体または代替的なコンディショナルな転写因子（例えば、Ｑ６４９Ｓ変異を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の使用を通して調節することができる。いくつかの態様において、より低い転写アウトプットの使用は、アクセサリープラスミド上のコンディショナルプロモーターを活性化する目的の遺伝子のバージョンについての選択の厳密性の増大をもたらし、一方、より高い転写アウトプット機構の使用は、より低い選択の厳密性をもたす。
【０１１９】
アクセサリープラスミドの機能、すなわち、ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子を、その活性が目的の遺伝子の機能に依存するコンディショナルプロモーターの制御下において提供することは、代替的な方法において宿主細胞に付与することができることが、理解されるべきである。かかる代替法として、これらに限定されないが、コンディショナルプロモーターおよびそれぞれの遺伝子を含む遺伝子コンストラクトの宿主細胞のゲノム中への永続的挿入、または異なるベクター、例えば、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、もしくは人工染色体を用いてそれを宿主細胞中に導入することが挙げられる。アクセサリープラスミドの機能を宿主細胞に付与するためのさらなる方法は、当業者には明白であり、本発明は、このことに限定されない。
【０１２０】
用語「変異原」とは、本明細書において用いられる場合、所与の生物系、例えば宿主細胞において、変異を誘導するか、または変異の比率をその系における変異の天然に存在するレベルを超えるレベルまで増大させる作用因子(agent)を指す。連続進化の手順において有用ないくつかの例示的な変異原は、本明細書において別の場所において提供され、他の有用な変異原は、当業者には明白であろう。有用な変異原として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：電離放射線、紫外線照射、塩基アナログ、デアミド化剤（例えば亜硝酸）、挿入剤（例えば臭化エチジウム）、アルキル化剤（例えばエチルニトロソウレア）、トランスポゾン、ブロミン、アジド塩、ソラレン、ベンゼン、３−クロロ−４−（ジクロロメチル）−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン（ＭＸ）（ＣＡＳ番号７７４３９−７６−０）、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｓ−（フタルイミドメチル）ホスホロジチオエート（phos-met）（ＣＡＳ番号７３２−１１−６）、ホルムアルデヒド（ＣＡＳ番号５０−００−０）、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド（ＡＦ−２）（ＣＡＳ番号３６８８−５３−７）、グリオキサール（ＣＡＳ番号１０７−２２−２）、６−メルカプトプリン（ＣＡＳ番号５０−４４−２）、Ｎ−（トリクロロメチルチオ）−４−シクロヘキサン−ｌ，２−ジカルボキシミド（カプタン）（ＣＡＳ番号１３３−０６−２）、２−アミノプリン（ＣＡＳ番号４５２−０６−２）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）（ＣＡＳ番号６６−２７−３）、４−ニトロキノリン−１−オキシド（４−ＮＱＯ）（ＣＡＳ番号５６−５７−５）、Ｎ４−アミノシチジン（ＣＡＳ番号５７２９４−７４−３）、アジ化ナトリウム（ＣＡＳ番号２６６２８−２２−８）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）（ＣＡＳ番号７５９−７３−９）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）（ＣＡＳ番号８２０−６０−０）、５−アザシチジン（ＣＡＳ番号３２０−６７−２）、クメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）（ＣＡＳ番号８０−１５−９）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）（ＣＡＳ番号６２−５０−０）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＥＮＮＧ）（ＣＡＳ番号４２４５−７７−６）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（ＣＡＳ番号７０−２５−７）、５−ジアゾウラシル（ＣＡＳ番号２４３５−７６−９）、およびｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＢＨＰ）（ＣＡＳ番号７５−９１−２）。さらなる変異原は、本明細書において提供されるような連続進化の手順において用いることができ、本発明は、この点において限定されない。
【０１２１】
理想的には、変異原は、所与の宿主細胞またはウイルスベクターの集合において所望される変異速度を誘導する濃度または暴露のレベルにおいて用いられるが、宿主細胞が変異原に暴露される平均時間枠、または宿主細胞がフレッシュな宿主細胞により置き換えられる前に宿主細胞のフローにおいて存在する時間内に用いられる場合、宿主細胞にとって著しく毒性ではない。
【０１２２】
用語「変異誘発性プラスミド」とは、本明細書において用いられる場合、変異原として作用する遺伝子産物をコードする遺伝子を含むプラスミドを指す。いくつかの態様において、遺伝子は、校正能力を欠損するＤＮＡポリメラーゼをコードする。いくつかの態様において、遺伝子は、細菌のＳＯＳストレス応答に関与する遺伝子、例えば、ＵｍｕＣ、ＵｍｕＤ’、またはＲｅｃＡ遺伝子である。いくつかの態様において、遺伝子は、ＧＡＴＣメチラーゼ遺伝子、例えば、デオキシアデノシンメチラーゼ（damメチラーゼ）遺伝子である。いくつかの態様において、遺伝子は、半メチル化（hemimethylated）ＧＡＴＣ配列の結合に関与するもの、例えばseqA遺伝子である。いくつかの態様において、遺伝子は、変異原性ヌクレオベース核外輸送（export）の抑制に関与するもの、例えばemrRである。いくつかの態様において、遺伝子は、ウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼの阻害に関与するもの、例えばウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ugi）遺伝子である。いくつかの態様において、遺伝子は、シチジンの脱アミノ化に関与するもの（例えば、ヤツメウナギからのシチジンデアミナーゼ）、例えば、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）である。
【０１２３】
用語「宿主細胞」とは、本明細書において用いられる場合、本明細書において提供されるような連続進化プロセスのために有用なウイルスベクターの宿主となることができる細胞を指す。細胞は、ウイルスベクターの遺伝子の発現、ウイルスゲノムの複製、および／またはウイルス粒子の生成を支持する場合、ウイルスベクターの宿主となることができる。細胞が、所与のウイルスベクターのために好適な宿主細胞であるか否かを決定するための一基準は、細胞が、ウイルスベクターが由来する元の野生型ウイルスゲノムのウイルス生活環を支持することができるか否かを決定することである。例えば、本明細書において記載されるいくつかの態様において提供されるように、ウイルスベクターが改変Ｍ１３ファージゲノムである場合には、好適な宿主細胞は、野生型Ｍ１３ファージの生活環を支持することができる任意の細胞である。連続進化プロセスにおいて有用なウイルスベクターのために好適な宿主細胞は、当業者に周知であり、本発明は、この点において限定されない。
【０１２４】
いくつかの態様において、改変ウイルスベクターは、本明細書において提供されるような連続進化プロセスにおいて有用である。いくつかの態様において、かかる改変ウイルスベクターは、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子を欠損する。かかる態様において、好適な宿主細胞は、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子を、例えば、構成的またはコンディショナルなプロモーターの制御下において（例えば本明細書において記載されるようなアクセサリープラスミドの形態において）含む細胞である。いくつかの態様において、用いられるウイルスベクターは、複数のウイルス遺伝子を欠損する。かかる態様において、好適な宿主細胞は、ウイルス粒子の生成のために必要とされるウイルス遺伝子を提供するヘルパーコンストラクトを含む細胞である。細胞は、本明細書において提供される方法において用いられるウイルスベクターの生活環を実際に支援するためには必要とされない。例えば、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子をコンディショナルプロモーターの制御下において含む細胞は、プロモーターを活性化することができる目的の遺伝子を含まないウイルスベクターの生活環を支援しなくともよいが、それでもなお、かかるウイルスベクターのための好適な宿主細胞である。いくつかの態様において、ウイルスベクターはファージであり、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、E. coli細胞である。好適なE. coli宿主株は、当業者に明らかであり、これらに限定されないが、New England Biolabs（NEB）Turbo、Top10F’、DH12S、ER2738、ER2267、XL1-Blue MRF’およびDH10Bを含む。これらの株の名称は、当該分野において認識されており、これらの株の遺伝子型は、よく特徴づけられている。上の株は、単に例示的なものであり、本発明は、この点において限定されないことが、理解されるべきである。
【０１２５】
用語「フレッシュ」とは、本明細書において宿主細胞に関して、用語「非感染（non-infected）」または「未感染（uninfected）」と交換可能に用いられる場合、本明細書において提供される連続進化プロセスにおいて用いられるような目的の遺伝子を含むウイルスベクターに感染していない宿主細胞を指す。フレッシュな宿主細胞は、しかし、進化させるべきベクターに無関係なウイルスベクターに、または同じもしくは類似の型のベクターであるが目的の遺伝子を担持していないものに感染していてもよい。いくつかの態様において、宿主細胞は、原核細胞、例えば、E. coli細胞などの細菌細胞である。
【０１２６】
いくつかの態様において、宿主細胞は、E. coli細胞である。ＰＡＣＥのいくつかの態様において、例えば、Ｍ１３選択ファージを使用する態様において、宿主細胞は、一般的にＦ因子、性決定因子、またはＦ−プラスミドとしても言及される稔性因子を発現するE. coli細胞である。Ｆ因子は、細菌が接合のために必要であり、特定のファージによる、例えばＭ１３ファージによるE. coli細胞の感染のために必須である性線毛を生成することを可能にする細菌のＤＮＡ配列である。例えば、いくつかの態様において、Ｍ１３−ＰＡＣＥのための宿主細胞は、遺伝子型F’proA+B+ Δ(lacIZY）zzf::Tn10(TetR）/ endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacIZYA araD139 Δ(ara, leu）7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC）proBA::pir116 λ--のものである。いくつかの態様において、Ｍ１３−ＰＡＣＥのための宿主細胞は、遺伝子型F’proA+B+ Δ(lacIZY）zzf::Tn10(TetR）lacIQ1PN25-tetR luxCDE/endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL(StrR）ΔlacIZYA araD139 Δ(ara,leu）7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC）proBA::pir116 araE201 ΔrpoZ Δflu ΔcsgABCDEFG ΔpgaC λ-のもの、例えばCarlson, J. C., et al. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat. Chem. Biol. 10, 216-222(2014）において記載されるようなS1030細胞である。いくつかの態様において、Ｍ１３−ＰＡＣＥのための宿主細胞は、遺伝子型F’proA+B+ Δ(lacIZY）zzf::Tn10 lacIQ1 PN25-tetR luxCDE Ppsp(AR2）lacZ luxR Plux groESL / endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacIZYA araD139 Δ(ara,leu）7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC）proBA::pir116 araE201 ΔrpoZ Δflu ΔcsgABCDEFG ΔpgaC λ-のもの、例えばHubbard, B. P. et al. Continuous directed evolution of DNA-binding proteins to improve TALEN specificity. Nature Methods 12, 939-942（2015）において記載されるようなS2060細胞である。
【０１２７】
用語「対象」とは、本明細書において用いられる場合、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は、げっ歯類である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子操作されており、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、いずれの性別のものであってもよく、発達の任意の段階におけるものであってよい。いくつかの態様において、対象は、細胞内タンパク質（例えばＳＮＡＲＥタンパク質、ＰＴＥＮなど）の活性の増大により特徴づけられる疾患を有する。いくつかの態様において、細胞内タンパク質の活性の増大により特徴づけられる疾患は、がん、移植拒絶、移植片対宿主疾患、虚血性神経損傷（脳卒中）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、脊髄損傷、糖尿病、自己免疫障害、アレルギーまたはクッシング病である。いくつかの態様において、対象は、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えばＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＳＮＡＰ２３、ＳＮＡＰ２５など）の活性の増大により特徴づけられる疾患を有する。いくつかの態様において、対象は、ＶＡＭＰタンパク質（例えばＶＡＭＰ７）の活性の増大により特徴づけられる疾患を有する。いくつかの態様において、ＶＡＭＰ７活性の増大により特徴づけられる疾患は、がん、移植拒絶、または移植片対宿主疾患である。いくつかの態様において、対象は、ＶＡＭＰ８タンパク質の発現の増大により特徴づけられる疾患を有する。いくつかの態様において、ＶＡＭＰ８活性の増大により特徴づけられる疾患は、がんである。いくつかの態様において、対象は、神経変性により特徴づけられ、ＰＴＥＮ活性の阻害が一過性に細胞の再生を誘導し得る疾患、例えば、虚血性神経損傷（脳卒中）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、または脊髄損傷を有するか、またはこれを有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、過剰分泌により特徴づけられ、ＳＮＡＰ２３の切断が前記分泌を予防し得る疾患、例えば、糖尿病、自己免疫障害、アレルギーおよびクッシング病を有するか、またはこれを有することが疑われる。
【０１２８】
用語「細胞」とは、本明細書において用いられる場合、個々の生物に、例えば哺乳動物に由来する細胞を指す。細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。いくつかの態様において、細胞は、真核細胞、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ハムスター細胞、サル細胞などである。いくつかの態様において、細胞は、ＶＡＭＰ７発現の増大により特徴づけられる（神経細胞など）。いくつかの態様において、細胞は、ＶＡＭＰ７レベル／発現の増大により特徴づけられる疾患、例えば、がん、移植拒絶、または移植片対宿主疾患などを有するかまたはこれを有することが疑われる対象から得られる。いくつかの態様において、細胞は、ＰＴＥＮレベル／発現の増大により特徴づけられる疾患、例えば虚血性神経損傷（脳卒中）を有するかまたはこれを有することが疑われる対象から得られる。
【０１２９】
用語「細胞内環境」とは、本明細書において用いられる場合、細胞の外膜により含まれる微小環境を形成する水性の生体液（例えば細胞質ゾル）を指す。例えば、対象において、細胞内環境は、標的器官または組織の細胞の細胞質（例えばＣＮＳ組織における神経細胞の細胞質ゾル）を含んでもよい。別の例において、細胞の環境は、細胞培養プレートまたはフラスコなどのin vitro培養容器中に収容される細胞培養増殖培地により囲まれている細胞の細胞質である。
【０１３０】
用語「増大した活性」とは、本明細書において用いられる場合、１つの細胞または対象における、その分子の活性の増大により特徴づけられない正常な細胞または対象（例えば「正常」または「対照」の細胞または対象）と比較した、特定の分子の活性の増大（例えば発現の増大を介する）を指す。例えば、増大したＰＴＥＮ活性を有する細胞は、正常（例えば健常）なレベルのＰＴＥＮ活性を有する対照細胞より高いＰＴＥＮの機能（例えばＰＴＥＮにより媒介されるホスファターゼ活性）により特徴づけられる。別の例において、増大したＶＡＭＰ７活性を有する細胞は、（例えば正常（例えば健常）な量のＶＡＭＰ７を発現する対照細胞より）高いＶＡＭＰ７活性により特徴づけられる。生体分子（例えばサイトカイン、タンパク質、核酸など）の相対的発現レベルを決定する方法は、当業者には公知であり、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）、ウェスタンブロット、タンパク質定量アッセイ（例えばＢＣＡアッセイ）、フローサイトメトリーなどが挙げられる。
【０１３１】
本明細書において用いられる場合、「異常な活性」とは、細胞または対象における、正常な健常な細胞または対象と比較して異なるレベルの遺伝子産物（例えばタンパク質）活性を指す。異常な活性の例として、これらに限定されないが、細胞または対象における、正常な健常な細胞または対象と比較した、当該遺伝子産物をコードする遺伝子の発現の増大に起因する遺伝子産物の活性の増大、当該遺伝子産物をコードする遺伝子の発現の低下に起因する遺伝子産物の活性の喪失、当該遺伝子産物をコードする遺伝子のエピジェネティック制御に起因する遺伝子産物の機能の変化などが挙げられる。
【０１３２】
詳細な説明
導入
プロテアーゼは、生命の全てのドメインにおけるタンパク質機能のユビキタスな調節因子であり、既知のタンパク質配列のうちの約１パーセントで存在する。基質特異的プロテアーゼは、研究ツールとして、および血友病などの疾患を処置するために天然のプロテアーゼの欠損を補完する、または単にそれらのネイティブの機能を行う（例えば、ボツリヌス毒素の場合にはＳＮＡＲＥタンパク質の切断を触媒する）治療剤として、有用であることが証明されている。
【０１３３】
研究者らは、産業的用途のために、熱安定性および溶媒耐性を増大させたプロテアーゼを設計または進化させてきた。同様に、動態学が改善されおよびより長期の活性を有する少数の治療用プロテアーゼが設計されてきた。プロテアーゼが、疾患に関連すると考えられるタンパク質を分解させるための広範に有用なプラットフォームとして役立つ可能性は、しかし、既知のプロテアーゼのネイティブの基質の範囲により大きく限定されている。テイラーメイドの結合特異性を有する治療用モノクローナル抗体の作製の大成功と比較して、新規のタンパク質切断特異性を有するプロテアーゼの作製は、挑戦であることが証明されている。
【０１３４】
目的の標的タンパク質を分解することができるプロテアーゼの進化は、しばしば、基質配列特異性を１つより多くの位置において変更することを必要とし、したがって、多世代の進化を必要とし得る。世代間における研究者の介入を殆どまたは全く必要としない連続進化の戦略は、したがって、野生型プロテアーゼの好ましい基質からの配列とは実質的に異なる標的タンパク質を切断することができるプロテアーゼを進化させるために好適であり得る。ファージ依存的連続進化（ＰＡＣＥ）において、進化中の選択ファージ（ＳＰ）の集合は、固定された容積の容器中で、入ってくる宿主細胞（例えばE. coli）の培養により連続的に希釈される。ＳＰは、進化中の目的の遺伝子が、ファージの感染性のために必須の遺伝子である遺伝子ＩＩＩを置き換えている、改変されたファージゲノムである。進化中の目的の遺伝子が所望される活性を有する場合、それが宿主細胞においてアクセサリープラスミド（ＡＰ）からの遺伝子ＩＩＩの発現を誘発し、それにより進化中の遺伝子の活性なバリアントをコードする感染性の次世代を生じる。ＳＰの変異速度は、ＭＰ６（例えば、２０１６年４月１５日に出願され２０１６年１０月２０日にＷＯ２０１６／１６８６３１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５において記載されるもの：その全内容は、本明細書において参考として援用される）などの誘導性の変異誘発性プラスミド（ＭＰ）を用いて制御され、これは、誘導により、ＳＰの変異速度を＞３００，０００倍増大させる。連続希釈の速度は、ファージの複製よりも遅いがE. coliの複製よりも早いので、変異は、ＳＰにおいてのみ蓄積する。
【０１３５】
本開示のいくつかの側面は、プロテアーゼの定方向進化、特に細胞内タンパク質（例えばＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＳＮＡＰ２３、ＰＴＥＮなど）を切断するプロテアーゼの進化のために、ＰＡＣＥを使用することができるという認識に基づく。いくつかの態様において、本開示により記載されるプロテアーゼは、野生型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）プロテアーゼ、例えば、ＢｏＮＴ  ＥまたはＢｏＮＴ  Ｆから進化させる。プロテアーゼは、ポリペプチド基質との接触の複雑なネットワークをリモデリングするために、多くの逐次変異を必要とする場合があり、したがって、従来の反復進化法によっては容易には操作されない。ＰＡＣＥが、数百ラウンドの反復進化法に等しいものを数日間以内に行う能力は、従来の方法によっては非実用的である複雑なプロテアーゼ進化実験を可能にする。
【０１３６】
本開示は、ＰＡＣＥにより媒介される、ＢｏＮＴプロテアーゼ（例えばＢｏＮＴ  ＥまたはＢｏＮＴ  Ｆ）の、細胞内タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）を切断するような進化の実現可能性を説明するデータを提供する。例において記載されるとおり、ネイティブではコンセンサスな基質配列ＭＧＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲＩＭＥＫＡＤ（配列番号３１０）を切断するＢｏＮＴ  Ｅプロテアーゼを、ＰＡＣＥにより、コンセンサスな基質とは異なりＰＴＥＮ中に存在する標的配列、ＮＧＳＬＣＤＱＥＩＤＳＩＣＳＩＥＲＡＤＮ（配列番号３１１）を切断するように進化させた。また例において記載されるが、ネイティブではコンセンサスな基質配列ＴＳＮＲＲＬＱＱＴＱＡＱＶＥＥＶＶＤＩＩＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＳＳＡＡＫＬＫＲ（配列番号３１２）を切断するＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼを、ＰＡＣＥにより、標的配列、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＫＧＬＤＫＶＭＥＴＱＡＱＶＤＥＬＫＧＩＭＶＲＮＩＤＬＶＡＱＲＧＥＲＬＥＬＬＩＤＫＴＥＮＬＶＤＳＳＶＴＦＫＴＴＳＲＮＬＡＲＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１３）を切断するように進化させた。進化の飛び石の経路を構築し、ＰＡＣＥを用いて約２，０００世代の進化を行った後で、生じるＢｏＮＴプロテアーゼバリアント（例えばＢｏＮＴ  ＥバリアントおよびＢｏＮＴ  Ｆバリアント）は、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼ（例えば配列番号２８６または２８７）と比較して２０個までのアミノ酸置換を含み、ヒトＶＡＭＰ７またはＰＴＥＮを、意図された標的ペプチド結合において切断することが観察された。まとめると、本明細書において記載される研究は、変更された基質特性およびヒトの疾患に関連すると考えられるタンパク質を切断する能力を有するプロテアーゼ（例えばＢｏＮＴプロテアーゼバリアント）を作製するためのプラットフォームを確立する。
【０１３７】
ＰＡＣＥ技術は、例えば、２００９年９月８日に出願され２０１０年３月１１日にＷＯ２０１０／０２８３４７として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６１９４；２０１１年１２月２２日に出願され２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７；および２０１３年６月２０日に出願された米国出願、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／９２２，８１２；２０１５年１０月２２日に出願されＷＯ２０１６／０７７０５２として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５７０１２；および２０１６年４月１５日に出願されＷＯ２０１６／１６８６３１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５において、先に記載されており、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。当業者は、本明細書において提供されるＰＡＣＥ技術、戦略、方法、組成物、系、および試薬は、それらの出願において記載されるＰＡＣＥ技術の多くの側面と、例えば、それらの出願において開示される器具、ラグーン、宿主細胞の型、細胞フローのパラメーター、選択の厳密性（例えば高い選択厳密性、低い選択厳密性など）、正の選択戦略、負の選択戦略、プラスミド、ベクターなどと組み合わせて用いてもよいことを、理解するであろう。
【０１３８】
バリアントＢｏＮＴプロテアーゼおよびその使用
本開示は、野生型ＢｏＮＴ  ＥまたはＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼ（例えば配列番号２８６または２８７）に由来し、表１または表２において表されるアミノ酸バリエーションのうちの少なくとも１つを有する、ＢｏＮＴプロテアーゼのバリアントを提供する。アミノ酸配列におけるバリエーションは、一般に、ＤＮＡコード配列中の変異、挿入または欠失から生じる。ＤＮＡ配列の変異は、ナンセンス変異（例えば、短縮型タンパク質を生じる転写終結コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡ））、ミスセンス変異（例えば、コード配列のリーディングフレームをシフトさせる挿入または欠失変異）、またはサイレント変異（例えば、コグネートなタンパク質において通常存在する同じアミノ酸をコードするコドンをもたらす、コード配列の変化であって、またときに同義変異としても言及される）をもたらし得る。いくつかの態様において、ＤＮＡ配列の変異は、非同義な（すなわち、保存的、半保存的、またはラジカルな）アミノ酸置換をもたらす。
【０１３９】
一般に、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼは、微生物クロストリジウム・ボツリヌムの遺伝子によりコードされる。野生型ＢｏＮＴプロテアーゼと本明細書において提供されるＢｏＮＴプロテアーゼバリアントとの間のバリエーションの量またはレベルは、２つの遺伝子またはタンパク質の間の核酸配列またはアミノ酸配列の％同一性としても表すことができる。いくつかの態様において、バリエーションの量は、アミノ酸配列レベルにおける％同一性として表される。いくつかの態様において、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントおよび野生型ＢｏＮＴプロテアーゼは、アミノ酸配列レベルにおいて、約７０％〜約９９．９％同一、約７５％〜約９５％同一、約８０％〜約９０％同一、約８５％〜約９５％同一、または約９５％〜約９９％同一である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼと、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．９％同一である。
【０１４１】
本開示のいくつかの側面は、配列番号２８６または２８７において記載されるような野生型ＢｏＮＴプロテアーゼに対して、約９０％〜約９９．９％（例えば約９０％、約９０．５％、約９１％、約９１．５％、約９２％、約９２．５％、約９３％、約９３．５％、約９４％、約９４．５％、約９５％、約９５．５％、約９６％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．２％、約９９．４％、約９９．６％、約９９．８％、または約９９．９％）の同一性を有する、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼを提供する。いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼに対して、９９．９％を超えて同一ではない。
【０１４２】
本開示のいくつかの側面は、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼ（例えば配列番号２８６または２８７）と比較して、１〜２０個のアミノ酸置換（例えば変異）を有するバリアントＢｏＮＴプロテアーゼを提供する。いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼ（例えば配列番号２８６または２８７）と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換を有する。
【０１４３】
野生型ＢｏＮＴプロテアーゼとバリアントＢｏＮＴプロテアーゼと間のバリエーションの量またはレベルはまた、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列と比較した、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列中に存在する変異の数として表すことができる。いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列は、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列と比較して、約１個の変異〜約１００個の変異、約１０個の変異〜約９０個の変異、約２０個の変異〜約８０個の変異、約３０個の変異〜約７０個の変異、または約４０〜約６０個の変異を含む。いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列は、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列と比較して、１００個より多くの変異を含む。いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、表１において提供されるバリエーション（例えばアミノ酸置換）から選択される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個のアミノ酸のバリエーションを含む。いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、表２において提供されるバリエーション（例えばアミノ酸置換）から選択される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個のアミノ酸のバリエーションを含む。
表１：ユニークなＢｏＮＴ  Ｅ変異
【表１】
2020534025.tif 000003
表２：ユニークなＢｏＮＴ  Ｆ変異
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１４４】
バリアントＢｏＮＴプロテアーゼをコードするアミノ酸配列中に存在する変異の特定の組み合わせは、当該バリアントＢｏＮＴプロテアーゼの「遺伝子型」として言及することができる。例えば、バリアントＢｏＮＴ  Ｅプロテアーゼの遺伝子型は、野生型ＢｏＮＴ  Ｅプロテアーゼ（例えば配列番号２８６；野生型ＢｏＮＴ  Ｅ）と比較して、変異Ｑ２７Ｈ、Ｓ９９Ａ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｍ１７２Ｋ、Ｉ１３２Ｔ、Ｑ３５４Ｒ、Ｙ３５７Ｐを含んでもよい。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントの遺伝子型は、以下の変異を含む：Ｖ１０６Ａ、Ｓ１６６Ｙ、Ｓ１６７Ｉ、Ｅ２００Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｌ、Ｓ３５０Ｇ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｇ４２０Ａ、Ｌ４２１Ｗ、Ｖ４２２Ｌ、Ｅ４２３Ｒ、Ｉ４２５Ｓ、およびＶ４２６*（例えば、停止コドン）。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントの遺伝子型は、以下の変異を含む：Ｓ１６６Ｙ、Ｎ１８４Ｋ、Ｅ２００Ｇ、Ｓ２２４Ｉ、Ｒ２４０Ｆ、Ｔ３３５Ｓ、Ｆ３６０Ｌ、Ｙ３７２Ｈ、Ｎ３９６Ｈ、Ｐ４１０Ｌ、Ｄ４１８Ｙ、およびＥ４２３Ｋ。バリアントＢｏＮＴプロテアーゼの遺伝子型のさらなる例を、表８〜２７、２９および３０において示す。
【０１４５】
いくつかの態様において、バリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、表１または表２において提供される少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の変異を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つ変異は、以下からなる群より選択される：Ｉ１８Ｖ、Ｃ２６Ｙ、Ｑ２７Ｈ、Ｅ２８Ｋ、Ｆ２９Ｌ、Ｙ６８Ｈ、Ｌ８９Ｐ、Ｓ９９Ａ、Ｓ９９Ｔ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｇ１２７Ｓ、Ｑ１４１Ｋ、Ｅ１５４Ｇ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｒ１６８Ｋ、Ｍ１７２Ｋ、Ｋ２２５Ｅ、Ｃ２３１Ｒ、Ｉ２３２Ｔ、Ｉ２３３Ｔ、Ｎ２３８Ｓ、Ｑ２９５Ｒ、Ｉ３９６Ｓ、Ｐ３９８Ｌ、Ｑ３５４Ｒ、Ｙ３５７Ｐ、Ｌ４０４*、およびＩ４０９Ｔ、およびＩ４０９Ｔ。いくつかの態様において、少なくとも１つ変異は、以下からなる群より選択される：Ｑ２７Ｈ、Ｓ９９Ａ、Ｇ１０１Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｅ１５９Ｌ、Ｎ１６１Ｙ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６３Ｒ、Ｍ１７２Ｋ、Ｉ１３２Ｔ、Ｑ３５４Ｒ、およびＹ３５７Ｐ。いくつかの態様において、本明細書において記載されるようなバリアントＢｏＮＴプロテアーゼは、表２８において提供される配列番号１〜２８５から選択される配列を含むか、またはこれからなる。いくつかの態様において、小文字のアミノ酸残基は、アミノ酸置換を示す。
表２８
【表２８−１】
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【表２８−２】
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【表２８−３】
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【表２８−４】
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【表２８−５】
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【表２８−６】
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【表２８−７】
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【表２８−８】
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【表２８−９】
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【表２８−１０】
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【表２８−１１】
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【表２８−１２】
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【表２８−１３】
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【表２８−１４】
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【表２８−１５】
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【表２８−１６】
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【表２８−１７】
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【表２８−１８】
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【表２８−１９】
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【表２８−２０】
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【表２８−２１】
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【表２８−２２】
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【表２８−２３】
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【表２８−２４】
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【表２８−２５】
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【表２８−２６】
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【表２８−２７】
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【表２８−２８】
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【表２８−２９】
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【表２８−３０】
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【表２８−３１】
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【表２８−３２】
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【表２８−３３】
2020534025.tif 000038
【表２８−３４】
2020534025.tif 000039
【表２８−３５】
2020534025.tif 000040
【表２８−３６】
2020534025.tif 000041
【表２８−３７】
2020534025.tif 000042
【表２８−３８】
2020534025.tif 000043
【表２８−３９】
2020534025.tif 000044
【表２８−４０】
2020534025.tif 000045
【表２８−４１】
2020534025.tif 000046
【表２８−４２】
2020534025.tif 000047
【表２８−４３】
2020534025.tif 000048
【表２８−４４】
2020534025.tif 000049
【表２８−４５】
2020534025.tif 000050
【表２８−４６】
2020534025.tif 000051
【表２８−４７】
2020534025.tif 000052
【表２８−４８】
2020534025.tif 000053
【表２８−４９】
2020534025.tif 000054
【表２８−５０】
2020534025.tif 000055
【表２８−５１】
2020534025.tif 000056
【０１４６】
本開示は、部分的に、改変されたペプチド切断活性（改変されたペプチド切断機能）を有するＢｏＮＴプロテアーゼバリアントを生成するために、連続進化法（例えばＰＡＣＥ）が有用であるという発見に関する。例えば、いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、ＶＡＭＰ７またはＶＡＭＰ８タンパク質またはペプチドを切断する。いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、ＰＴＥＮタンパク質またはペプチドを切断する。いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、標的配列：
MAILFAVVARGTTILAKHAWCGGNFLEDFERSRAFNFLNEIKKRFQTTYGSRAQTALPYAMNSEFSSVLAAQLKHHSENKGLDKVMETQAQVDELKGIMVRNIDLVAQRGERLELLIDKTENLVDSSVTFKTTSRNLARAMCMKNLKLTIIIIIVSIVFIYIIVSPLCGGFTWPSCVKK
（配列番号３１４）または
GGSGGSGGSKGLDKVMETQAQVDELKGIMVRNIDLVAQRGERLELLIDKTENLVDSSVTFKTTSRNLARGGSGGSGGS
（配列番号３１５）
を切断する。
【０１４７】
いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、標的配列：
MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
（配列番号３１６）または
NGSLCDQEIDSICSIERADN
（配列番号３１７）
を切断する。
【０１４８】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、
MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG
（ＳＮＡＰ２５）（配列番号３１８）、MSAPAQPPAEGTEGTAPGGGPPGPPPNMTSNRRLQQTQAQVEEVVDIIRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFESSAAKLKRKYWWKNCKMMIMLGAICAIIVVVIVRRG
（ＶＡＭＰ１）（配列番号３１９）、
MGNEIDTQNRQIDRIMEKAD
（ＳＮＡＰ２５；配列番号３２０）、および
TSNRRLQQTQAQVEEVVDIIRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFESSAAKLKR
（ＶＡＭＰ１；配列番号３２１）
から選択される標的配列を切断するか、および／または、
ＶＡＭＰ７ペプチド標的配列、例えば、
MAILFAVVARGTTILAKHAWCGGNFLEDFERSRAFNFLNEIKKRFQTTYGSRAQTALPYAMNSEFSSVLAAQLKHHSENKGLDKVMETQAQVDELKGIMVRNIDLVAQRGERLELLIDKTENLVDSSVTFKTTSRNLARAMCMKNLKLTIIIIIVSIVFIYIIVSPLCGGFTWPSCVKK
（配列番号３２２）、または
GGSGGSGGSKGLDKVMETQAQVDELKGIMVRNIDLVAQRGERLELLIDKTENLVDSSVTFKTTSRNLARGGSGGSGGS
（配列番号３２３）
を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、標的ペプチド（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）を、野生型ＢｏＮＴプロテアーゼより高い活性で切断する。標的ペプチド（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）を、より高い活性で切断するＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、当該ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントが由来した元の野生型ＢｏＮＴプロテアーゼの触媒効率と比較して、約１．１倍、約１．５倍、２倍〜約１００倍、約５倍〜約５０倍、または約１０倍〜約４０倍の範囲の触媒効率の増大を有していてもよい。いくつかの態様において、本明細書において記載されるＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、野生型ＢｏＮＴがそのネイティブの基質（例えばＳＮＡＰ２５、ＶＡＭＰ１など）を切断する触媒効率の約１％〜約１００％（例えば約１％、２％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％、１００％）で、標的ペプチド（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）を切断する。触媒効率は、当該分野において公知の任意の好適な方法を用いて、例えばHarris et al. (2009) Methods Enzymol. 463; 57-71において記載される方法を用いて、測定または決定することができる。
【０１４９】
一般に、改変された特異性を有するプロテアーゼの進化は、もっぱら、治療に関連する細胞外タンパク質の破壊に焦点を当ててきた。しかし、ＢｏＮＴは、ビルトインの細胞質ゾル送達機構を提供し、それにより、いくつかの態様において、細胞内標的を分解することができる。例えば、いくつかの態様において、本明細書において記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、細胞膜を越えるプロテアーゼの輸送を促進する１つ以上のタンパク質ドメインを含む。いくつかの態様において、膜を越える輸送を促進する１つ以上のタンパク質ドメインは、ＢｏＮＴ  ＨＣ、ＢｏＮＴ  ＨＣＣドメイン、およびＢｏＮＴ  ＨＣＮドメインから選択される。いくつかの態様において、本開示により記載されるＢｏＮＴプロテアーゼバリアントは、細胞膜を超えて、神経細胞の型の細胞内環境に侵入することができる。
【０１５０】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるプロテアーゼを使用するための方法を提供する。いくつかの態様において、かかる方法は、プロテアーゼ標的切断配列を含むタンパク質を、例えばex vivoで、in vitroで、またはin vivoで（例えば対象において）、プロテアーゼと接触させることを含む。いくつかの態様において、プロテアーゼと接触させられるタンパク質は、治療標的である。いくつかの態様において、治療標的は、ＶＡＭＰ７である。一般に、ＶＡＭＰ７は、輸送小胞のそれらの標的膜への融合を媒介する、細胞内の可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor：ＳＮＡＲＥ）ファミリータンパク質である。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ＶＡＭＰ７は、腫瘍浸潤の間のＭＴ１−ＭＭＰ分泌、ならびに（例えば臓器移植の間の）グランザイムＢおよびパーフォリンの分泌のメディエーターとして機能する。したがって、いくつかの側面において、本開示は、細胞においてＶＡＭＰ７活性を低下させる方法を提供し、当該方法は、細胞を、本明細書において記載されるようなバリアントＢｏＮＴプロテアーゼと接触させるか、またはこれを細胞の細胞内環境中に導入することを含む。
【０１５１】
いくつかの態様において、治療標的は、ＰＴＥＮである。一般に、ＰＴＥＮは、腫瘍抑制因子として機能するテンシンドメインおよびホスファターゼドメインを含む、細胞内タンパク質である。ＰＴＥＮはまた、脳卒中後の虚血性神経損傷を媒介することが観察されている。したがって、いくつかの側面において、本開示は、細胞においてＰＴＥＮ活性を低下させる方法を提供し、当該方法は、細胞を、本明細書において記載されるようなＢｏＮＴプロテアーゼバリアント（例えばＢｏＮＴ  Ｅバリアント）と接触させるか、またはこれを細胞内環境中に導入することを含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、細胞（または細胞内環境）は、正常な細胞または細胞外環境（例えば、標的タンパク質の活性の増大により特徴づけられない健常な細胞または細胞外環境）と比較して、増大したか、または所望されない、標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）の活性により特徴づけられる。いくつかの態様において、標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）の活性の増大は、細胞において、標的タンパク質の活性が、正常な健常な細胞または細胞外環境における標的タンパク質の活性に対して、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍である場合に起こる。いくつかの態様において、標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＰＴＥＮなど）の発現の増大により特徴づけられる細胞は、標的遺伝子の活性の増大に関連する疾患、例えばＶＡＭＰ７の過剰発現または活性の増大に関するがんを有するかまたはこれを有することが疑われる対象（例えばヒトまたはマウスなどの哺乳動物対象）に由来する。
【０１５３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮなど、または配列番号３１４〜３２３において記載されるアミノ酸配列を含むペプチドを含むタンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮなど））を、本明細書において記載されるＢｏＮＴプロテアーゼバリアントと、in vitroで接触させる（例えば切断する）ことを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、標的タンパク質を、本明細書において記載されるプロテアーゼバリアントとin vivoで接触させることを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮなど、または配列番号３１４〜３２３において記載されるアミノ酸配列を含むペプチドを含むタンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮ））を、本明細書において記載されるＢｏＮＴプロテアーゼバリアントと、細胞内環境において接触させることを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、例えばプロテアーゼを局所的にまたは全身的に対象に投与することにより、標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮなど、または配列番号３１４〜３２３において記載されるアミノ酸配列を含むペプチドを含むタンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮ））を、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントと、対象において接触させることを含む。かかる態様において、プロテアーゼバリアントは、対象における全長の（または機能的な）標的タンパク質（例えばＶＡＭＰ７、ＰＴＥＮなど）のレベルの測定可能な低下をもたらす、またはプロテアーゼバリアントにより標的タンパク質の切断によって生成される切断生成物のレベルの測定可能な増大をもたらすために、有効な量において、対象に投与される。
【０１５４】
ＰＡＣＥを用いるＢｏＮＴプロテアーゼバリアントの操作
本開示のいくつかの側面は、ＢｏＮＴプロテアーゼを進化させるための方法を提供する。いくつかの態様において、（ａ）宿主細胞の集合を、進化させるべきプロテアーゼをコードする遺伝子を含むベクターの集合と接触させることを含む、プロテアーゼを進化させる方法が提供される。ベクターは、典型的には、１つの細胞から別の細胞へのファージベクターの移行のために必要とされる少なくとも１つの遺伝子、例えば感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子を欠損する。提供される方法のいくつかの態様において、（１）宿主細胞は、ベクターの移行を受けることができる；（２）ベクターは、宿主細胞におけるプロテアーゼの発現を可能にし、宿主細胞により複製されることができ、および複製されたベクターは、第２の宿主細胞中に移行することができる；および（３）宿主細胞は、プロテアーゼの活性に応答して、感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子によりコードされる遺伝子産物を発現し（ａ）、遺伝子産物発現のレベルは、プロテアーゼの活性に依存する。本明細書において提供されるプロテアーゼ進化の方法は、典型的には、（ｂ）プロテアーゼをコードする遺伝子の変異と、目的のプロテアーゼをコードする遺伝子を含むベクターの宿主細胞から宿主細胞への移行とを可能にする条件下において、宿主細胞の集合をインキュベートすることを含む。宿主細胞は、一定の速度において、例えば、宿主細胞が細胞集合中に留まる平均時間（これは、宿主細胞が分裂するために必要とする平均時間より短いが、ベクターの生活環（取り込み、複製、および別の宿主細胞への移行）の完了のためには十分に長い）をもたらす速度において、宿主細胞集合から取り除かれる。宿主細胞の集合は、ベクターを内包しないフレッシュな宿主細胞を補充する。いくつかの態様において、フレッシュな細胞による補充の速度は、細胞集合からの細胞の除去の速度と実質的に一致し、これは、細胞集合内で、実質的に一定の細胞数または細胞密度をもたらす。本明細書において提供されるプロテアーゼ進化の方法は、典型的にはまた、（ｃ）ステップ（ｂ）の宿主細胞集合から複製されたベクターを単離することを含み、ここで、複製されたベクターは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異バージョンを含む。
【０１５５】
いくつかの態様は、連続進化系を提供し、ここで、進化させるべき目的のプロテアーゼをコードする遺伝子を含むウイルスベクター、例えばＭ１３ファージベクターの集合は、宿主細胞のフロー、例えばラグーンを通るフロー中で複製し、ここで、ウイルスベクターは、感染性ウイルス粒子の生成のために必須であるタンパク質をコードする遺伝子を欠損し、およびここで、その遺伝子は、宿主細胞において、コンディショナルプロモーターの制御下にあり、その活性は、目的のプロテアーゼの活性に依存する。いくつかの態様において、コンディショナルプロモーターからの転写は、転写因子およびプロテアーゼの標的部位を含むリンカーを介して転写活性化因子に融合している阻害性タンパク質を含む融合タンパク質の切断により、活性化されるものであってもよい。
【０１５６】
本明細書において記載されるプロテアーゼＰＡＣＥ技術のいくつかの態様は、「選択ファージ」を利用し、これは、進化させるべき目的の遺伝子を含み、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる全長タンパク質をコードする遺伝子を欠損する改変されたファージである。かかる態様において、選択ファージは、宿主細胞のフロー中で複製して進化するベクターとして働く。例えば、本明細書において提供されるいくつかのＭ１３選択ファージは、進化させるべきプロテアーゼをコードする核酸配列を、例えばＭ１３プロモーターの制御下において含み、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされるファージタンパク質をコードする遺伝子、例えばｇＩ、ｇＩＩ、ｇＩＩＩ、ｇＩＶ、ｇＶ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＩＸ、またはｇＸ、またはこれらの任意の組み合わせの、全てまたは一部を欠損する。例えば、本明細書において提供されるいくつかのＭ１３選択ファージは、進化させるべきプロテアーゼをコードする核酸配列を、例えばＭ１３プロモーターの制御下において含み、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされるタンパク質をコードする遺伝子、例えばｐＩＩＩタンパク質をコードするｇＩＩＩ遺伝子の全てまたは一部を欠損する。
【０１５７】
所望される活性を有するプロテアーゼを進化させるための一必須条件は、かかる活性を示す変異したプロテアーゼバリアントに選択的利点を付与する選択系を提供することである。発現系、およびプロテアーゼ活性により活性化される不活性な形態において転写活性化因子を含む融合タンパク質は、本明細書において提供されるプロテアーゼＰＡＣＥ技術のいくつかの態様の重要な特徴を構成する。
【０１５８】
いくつかの態様において、転写活性化因子は、標的プロモーターからの転写を直接駆動する。例えば、かかる態様において、転写活性化因子は、ＲＮＡポリメラーゼであってよい。好適なＲＮＡポリメラーゼおよびかかるＲＮＡポリメラーゼにより標的とされるプロモーター配列は、当業者に周知である。例示的な好適なＲＮＡポリメラーゼとして、これらに限定されないが、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｔ７プロモーター配列を標的とする）およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３プロモーターを標的とする）が挙げられる。さらなる好適なＲＮＡポリメラーゼは、本開示に基づいて当業者には明らかであり、本開示は、この点において限定されない。
【０１５９】
いくつかの態様において、転写活性化因子は、転写を直接的には駆動しないが、宿主細胞の転写機構を特異的な標的プロモーターに動員する。例えばＧａｌ４またはＶＰ１６トランス活性化因子のトランス活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの融合物などの好適な転写活性化因子は、本開示に基づいて当業者には明らかであり、本開示は、この点において限定されない。
【０１６０】
いくつかの態様において、宿主細胞の基礎転写機構を通した感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子の発現の漏れやすさ（leakiness）を最小限にするために、プロテアーゼ活性を、宿主細胞において内因的には発現されない転写活性化因子を介して増強されたファージパッケージングに関連づけることは、有利である。例えば、いくつかの態様において、外因性転写活性化因子の不在下においては宿主細胞においては活性ではないか最小限に活性にしか活性でないプロモーターから、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子の発現を駆動し、プロテアーゼ（例えばＢｏＮＴプロテアーゼバリアント）の活性をファージパッケージング効率に関連づける発現系の一部として、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどの外因性転写活性化因子を提供することが望ましい。いくつかの態様において、感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子は、宿主細胞において、転写活性化因子により活性化されるプロモーターの制御下において（例えば、転写活性化因子がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである場合にはＴ７プロモーターの制御下において、および転写活性化因子がＴ３ポリメラーゼである場合にはＴ３プロモーターの制御下において、など）発現される。
【０１６１】
いくつかの態様において、転写活性化因子は、例えば、ＤＮＡの結合または転写を直接的に妨害することにより、転写活性化因子を宿主細胞のタンパク質分解機構を通した分解のためにターゲティングすることにより、または転写活性化因子の宿主細胞からの輸出もしくは転写活性化因子がその標的プロモーターからの転写を活性化することができない宿主細胞の区画への局在を指揮することにより、転写活性化因子の転写活性を直接的に阻害するかまたは別段に妨害する阻害剤に融合される。いくつかの態様において、阻害剤は、転写活性化因子のＮ末端に融合される。他の態様において、それは、活性化因子のＣ末端に融合される。
【０１６２】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるプロテアーゼ進化法は、変異誘発によりベクターの集合を多様化する初期相または間欠的な相を含み、ここで、細胞を、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異誘発のために好適な条件下で、所望される活性を獲得している進化型プロテアーゼバリアントについての厳密な選択の不在下において、または任意の選択の不在下において、インキュベートする。かかる低厳密性選択または選択なしの期間は、所望されるプロテアーゼ活性の不在下において感染性ファージ粒子の生成のための遺伝子の発現を支援すること、例えば、それぞれのパッケージングタンパク質をコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下において含む誘導性発現コンストラクトを提供し、プロモーターの発現を誘導する条件下において、例えば誘導剤の存在下においてインキュベートすることにより、達成することができる。好適な誘導性プロモーターおよび誘導性発現系は、本明細書において、ならびに、２０１１年１２月２２日に出願され２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７；および２０１３年６月２０日に出願された米国出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／９２２，８１２；２０１５年１０月２２日に出願されＷＯ２０１６／０７７０５２として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５７０１２；および２０１６年４月１５日に出願されＷＯ２０１６／１６８６３１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５において記載され、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。さらなる好適なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現系は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、当該方法は、変異したプロテアーゼのバージョンについての厳密な選択の相を含む。誘導性発現系が選択圧を和らげるために用いられる場合は、選択の厳密性は、ラグーン中の細胞の集合から誘導剤を取り除き、それにより誘導性プロモーターからの発現をオフにして、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子の任意の発現が、必ずプロテアーゼ活性依存的発現系から生じるようにすることにより、増大させることができる。
【０１６３】
本明細書において提供されるＰＡＣＥプロテアーゼ進化法の一側面は、始めに提供された目的のプロテアーゼをコードするベクターの変異である。いくつかの態様において、その中でベクターが複製する細胞のフロー中の宿主細胞を、天然の変異速度を増大させる条件下においてインキュベートする。このことは、宿主細胞を、特定の型の放射線などの変異原と、もしくは変異原性化合物に接触させることにより、または当該細胞において細胞の変異速度を増大させることが知られている遺伝子を発現させることにより、達成することができる。さらなる好適な変異原は、当業者には公知であり、限定することなく、２０１１年１２月２２日に出願され２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７；および２０１３年６月２０日に出願された米国出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／９２２，８１２；２０１５年１０月２２日に出願されＷＯ２０１６／０７７０５２として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５７０１２；および２０１６年４月１５日に出願されＷＯ２０１６／１６８６３１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５において記載されるものを含み、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用され、本開示は、この点において限定されない。
【０１６４】
いくつかの態様において、宿主細胞は、進化させるべきプロテアーゼをコードする感染性ファージ粒子の（例えばＭ１３ファージの）生成のための少なくとも１つの遺伝子をコードするアクセサリープラスミドと、ヘルパーファージとを含み、ヘルパーファージとアクセサリープラスミドとは、一緒になって、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる全ての遺伝子を含む。したがって、かかる態様において、転写活性化因子から阻害剤を取り外す（untether）ことができるプロテアーゼバリアントをコードしないベクターのバリアントは、アクセサリープラスミドからの感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子の発現の増大をもたらすことができないので、効率的にパッケージングされない。一方、転写活性化因子から阻害剤を効率的に切断することができるプロテアーゼバリアントをコードするベクターのバリアントは、アクセサリープラスミドからの感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる少なくとも１つの遺伝子の転写の増大をもたらし、それにより、感染性ファージ粒子へと効率的にパッケージングされるであろう。
【０１６５】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるプロテアーゼＰＡＣＥ法は、所望されるプロテアーゼ活性についての正の選択に加えて、所望されないプロテアーゼ活性についての負の選択をさらに含む。かかる負の選択の方法は、例えば、特異的な標的部位に指向したプロテアーゼの切断効率を増大させる場合に、プロテアーゼ特異性を維持するために有用である。このことにより、例えば、治療用プロテアーゼに関して一般に所望されないオフターゲット部位へのプロテアーゼ活性の増大を含む、一般に増大したプロテアーゼ活性を示すプロテアーゼの進化を回避することができる。
【０１６６】
いくつかの態様において、負の選択は、進化型プロテアーゼの所望されない活性を不利なものとすることにより、本明細書において記載されるような連続進化プロセスの間に適用される。このことは、例えば、所望される進化型プロテアーゼが、標的部位に対して高い特異性を有する酵素（例えば改変されているが拡大されてはいない特異性を有するプロテアーゼ）である場合に、有用である。いくつかの態様において、所望されない活性、例えばオフターゲットプロテアーゼ活性の負の選択は、所望されない活性によりｐＩＩＩの産生を妨害させ、それにより所望されない活性を有する遺伝子産物をコードするファージゲノムの伝播を阻害することにより、達成される。いくつかの態様において、ｐＩＩＩのドミナントネガティブバージョンの発現、またはｇＩＩＩ  ＲＢＳおよび／もしくはｇＩＩＩ開始コドンに対して相補的なアンチセンスＲＮＡの発現を、所望されないプロテアーゼ活性の存在に関連づける。好適な負の選択戦略およびＭ１３  ｐＩＩＩのドミナントネガティブバージョンなどの負の選択のために有用な試薬は、本明細書において、ならびに２０１１年１２月２２日に出願され２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７；および２０１３年６月２０日に出願された米国出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／９２２，８１２；２０１５年１０月２２日に出願されＷＯ２０１６／０７７０５２として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５７０１２；および２０１６年４月１５日に出願されＷＯ２０１６／１６８６３１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５において記載され、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０１６７】
いくつかの態様において、非標的基質に対する活性に対する対抗選択は、所望されない進化型プロテアーゼ活性をファージ伝播の阻害に関連づけることにより、達成される。いくつかの態様において、正の選択および負の選択の両方のコンストラクトが宿主細胞中に存在する二重選択戦略が、連続進化実験の間に適用される。かかる態様において、正および負の選択コンストラクトは、二重選択アクセサリープラスミドとしてもまた言及される同じプラスミド上に位置する。
【０１６８】
同時二重選択戦略を用いる１つの利点は、正の選択コンストラクトと比較すると、負の選択コンストラクトの活性または発現のレベルに基づいて、選択厳密性を精密に調整することができることである。二重選択戦略の別の利点は、選択が、所望される活性または所望されない活性の存在または不在ではなく、所望される活性と所望されない活性との比に依存し、ひいてはそれにより生じるそれぞれのファージ粒子中に組み込まれるｐＩＩＩとｐＩＩＩ−ｎｅｇとの比に依存することである。
【０１６９】
例えば、いくつかの態様において、宿主細胞は、感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子のドミナントネガティブ形態をコードする発現コンストラクト、例えばｐＩＩＩタンパク質のドミナントネガティブ形態（ｐＩＩＩ−ｎｅｇ）を、正の選択系を駆動する転写活性化因子以外の転写活性化因子により活性化される誘導性プロモーターの制御下において含む。遺伝子のドミナントネガティブ形態の発現は、進化型ファージが示し得る任意の選択的利点を減少させるかまたは完全に否定し、それにより、ラグーンからの所望されない活性を示す任意のバリアントを希釈または根絶する。
【０１７０】
例えば、正の選択系が、感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子の発現を駆動するＴ７プロモーター、および所望されるプロテアーゼ活性により切断されるプロテアーゼ標的部位を含むリンカーを介してＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤に融合したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む場合、負の選択系は、非Ｔ７ベースの系であるべきである。例えば、かかる態様において、負の選択系は、例えば感染性ファージ粒子の生成のための少なくとも１つの遺伝子のドミナントネガティブ形態の発現を駆動するＴ３プロモーターおよび所望されないプロテアーゼ活性により切断されるプロテアーゼ標的部位を含むリンカーを介してＴ３−ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤に融合したＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを含む点において、Ｔ３ポリメラーゼ活性に基づくものであってもよい。いくつかの態様において、負の選択ポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼをＴ３プロモーターからは転写することができるがＴ７プロモーターからは転写することができないようにする１つ以上の変異、例えば：Ｎ６７Ｓ、Ｒ９６Ｌ、Ｋ９８Ｒ、Ｈ１７６Ｐ、Ｅ２０７Ｋ、Ｅ２２２Ｋ、Ｔ３７５Ａ、Ｍ４０１Ｉ、Ｇ６７５Ｒ、Ｎ７４８Ｄ、Ｐ７５９Ｌ、Ａ７９８Ｓ、Ａ８１９Ｔなどを含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子である。いくつかの態様において、負の選択ポリメラーゼは、所望されないプロテアーゼ活性により切断されるプロテアーゼ標的部位を含むリンカーを介してＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤に融合していてもよい。一緒に用いられる場合、かかる正−負のＰＡＣＥ選択は、所望される活性を示すが所望されない活性は示さないプロテアーゼの進化をもたらす。いくつかの態様において、所望されない機能は、オフターゲットプロテアーゼ切断部位の切断である。いくつかの態様において、所望されない機能は、プロテアーゼ切断部位の外側での融合タンパク質のリンカー配列の切断である。
【０１７１】
本発明のいくつかの側面は、ｐＩＩＩのドミナントネガティブバリアント（ｐＩＩＩ−ｎｅｇ）を提供または利用する。これらの側面は、ｐＩＩＩの２つのＮ末端ドメインおよび短縮された終結能力がないＣ末端ドメインを含むｐＩＩＩバリアントは、不活性であるのみならず、ｐＩＩＩのドミナントネガティブバリアントであるという認識に基づく。ｐＩＩＩの２つのＮ末端ドメインおよび短縮された終結能力がないＣ末端ドメインを含むｐＩＩＩバリアントは、Bennett, N. J.；Rakonjac, J., Unlocking of the filamentous bacteriophage virion during infection is mediated by the C domain of pIII. Journal of Molecular Biology 2006, 356(2), 266-73において記載され；その全内容は、本明細書において参考として援用される。かかるｐＩＩＩバリアントのドミナントネガティブ特性は、２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７においてより詳細に記載されており、その全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０１７２】
本明細書におけるいくつかの態様において提供されるようなｐＩＩＩ−ｎｅｇバリアントは、効率的にファージ粒子中に組み込まれるが、感染の間の侵入のための粒子の開錠（unlocking）を触媒せず、同じファージ粒子中に野生型ｐＩＩＩが存在する場合においてすら、それぞれのファージを非感染性にしている。したがって、かかるｐＩＩＩ−ｎｅｇバリアントは、ＰＡＣＥに関して、例えば、ｐＩＩＩ−ｎｅｇバリアントコードする核酸配列を、その認識が望ましくない認識モチーフを含むプロモーターの制御下において含む、発現コンストラクトを提供することにより、負の選択戦略を考案するために有用である。他の態様において、ｐＩＩＩ−ｎｅｇは、例えば、ｐＩＩＩ−ｎｅｇコード配列が、そのいずれの認識も所望されるヌクレアーゼ標的部位またはリプレッサー認識部位を含むプロモーターにより制御される、発現コンストラクトを提供することにより、正の選択戦略において用いられる。
【０１７３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法によるプロテアーゼＰＡＣＥ実験は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１００００回、またはそれより多くの連続したウイルス生活環のために十分な時間にわたり、実行される。ある態様において、ウイルスベクターはＭ１３ファージであり、１回のウイルス生活環の長さは、約１０〜２０分間である。
【０１７４】
いくつかの態様において、宿主細胞を、ベクターと接触させ、および／または懸濁培養においてインキュベートする。例えば、いくつかの態様において、細菌細胞を、液体培養培地中の懸濁培養においてインキュベートする。細菌の懸濁培養のために好適な培養培地は、当業者に明らかであり、本発明は、この点において限定されない。例えば、Molecular Cloning： A Laboratory Manual、第２版、Sambrook、FritschおよびManiatis編（Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989）；Elizabeth KutterおよびAlexander Sulakvelidze：Bacteriophages：Biology and Applications.  CRC Press；第１版（２００４年１２月）、ISBN：0849313368；Martha R. J. ClokieおよびAndrew M. Kropinski：Bacteriophages：Methods and Protocols、第１巻：Isolation, Characterization, and Interactions（Methods in Molecular Biology）Humana Press；第１版（２００８年１２月）、ISBN：1588296822；Martha R. J. ClokieおよびAndrew M. Kropinski：Bacteriophages：Methods and Protocols、第２巻：Molecular and Applied Aspects（Methods in Molecular Biology）Humana Press；第１版（２００８年１２月）、ISBN：1603275649を参照；これらの各々は、細菌宿主細胞培養のために好適な培養培地の開示について、本明細書においてそれらの全体において参考として援用される）。
【０１７５】
本明細書において提供されるプロテアーゼＰＡＣＥ法は、典型的には、ラグーン中で行われる。本明細書において提供されるようなプロテアーゼＰＡＣＥ法を行うための好適なラグーンおよび他の研究設備は、別の場所において詳細に記載されている。例えば、２０１２年６月２８日にＷＯ２０１２／０８８３８１として公開された国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７を参照：その全内容は、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、ラグーンは、活発に複製するベクター（例えば目的のプロテアーゼをコードする遺伝子を含むファージベクター）の集合、および宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）の集合を含む、細胞培養容器を含む。いくつかの態様において、ラグーンは、ラグーン中へのフレッシュな宿主細胞の導入のためのインフロー、およびラグーンからの宿主細胞の除去のためのアウトフローを含む。いくつかの態様において、インフローは、フレッシュな宿主細胞の培養を含むタービドスタットに連結される。いくつかの態様において、アウトフローは、廃棄物容器またはシンクに連結される。いくつかの態様において、ラグーンは、ラグーン中への変異原の導入のためのインフローをさらに含む。いくつかの態様において、そのインフローは、変異原の溶液を保持する容器に連結される。いくつかの態様において、本明細書において別の場所で詳細に記載されるように、ラグーンは、遺伝子発現の誘導因子の、例えば、宿主細胞中で（例えば変異誘発性プラスミドの一部として）変異誘発を促進する遺伝子の発現を駆動する誘導性プロモーターを活性化する誘導因子の、ラグーン中への導入のためのインフローを含む。いくつかの態様において、そのインフローは、誘導因子の溶液、例えばアラビノースの溶液を含む容器に連結される。
【０１７６】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるＰＡＣＥ法は、本明細書において記載されるような好適な器具において行われる。例えば、いくつかの態様において、器具は、本明細書において記載されるような宿主細胞を含むタービドスタットに連結されたラグーンを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、E. coli宿主細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、本明細書において記載されるようなアクセサリープラスミド、本明細書において記載されるようなヘルパープラスミド、本明細書において記載されるような変異誘発性プラスミド、および／または本明細書において記載されるような融合タンパク質をコードする発現コンストラクト、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ラグーンは、本明細書において記載されるような選択ファージ、例えば目的のプロテアーゼをコードする選択ファージを、さらに含む。いくつかの態様において、ラグーンは、変異誘発性プラスミドのための誘導因子、例えば、アラビノースを含む容器に連結される。いくつかの態様において、宿主細胞は、Ｆ’プラスミドを含むE. coli細胞、例えば、遺伝子型F’proA+B+ Δ(lacIZY）zzf::Tn10(TetR）/ endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacIZYA araD139 Δ(ara,leu）7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC）proBA::pir116 λ-の細胞である。
【０１７７】
本発明のいくつかの側面は、本明細書において記載されるような連続進化プロセスのための宿主細胞に関する。いくつかの態様において、コンディショナルプロモーターの制御下における感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる少なくとも１つのウイルスタンパク質をコードする遺伝子、およびコンディショナルプロモーターを標的とする転写活性化因子を含みプロテアーゼ切断部位を含むリンカーを介して阻害剤に融合した融合タンパク質を含む、宿主細胞が提供される。例えば、いくつかの態様は、ファージ依存的連続進化プロセスのための宿主細胞を提供し、ここで、宿主細胞は、感染性ファージ粒子の生成のために必要とされる遺伝子、例えばＭ１３  ｇＩＩＩを、本明細書において記載されるようなコンディショナルプロモーターの制御下において含む、アクセサリープラスミドを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、本明細書において記載されるような融合タンパク質をコードする発現コンストラクトを、例えば同じアクセサリープラスミド上に、または別のベクター上に含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、選択ファージ中に含まれない任意のファージの機能を、例えばヘルパーファージの形態において、さらに提供する。いくつかの態様において、提供される宿主細胞は、変異誘発を誘導するタンパク質をコードする遺伝子を含む発現コンストラクト、例えば本明細書において提供されるような変異誘発性プラスミドを、さらに含む。
【０１７８】
いくつかの態様において、改変ウイルスベクターは、本明細書において提供されるような連続進化プロセスにおいて用いられる。いくつかの態様において、かかる改変ウイルスベクターは、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子を欠損する。かかる態様において、好適な宿主細胞は、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子を、例えば構成的またはコンディショナルなプロモーターの制御下において（例えば、本明細書において記載されるようなアクセサリープラスミドの形態において）含む細胞である。いくつかの態様において、用いられるウイルスベクターは、複数のウイルス遺伝子を欠損する。かかる態様において、好適な宿主細胞は、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされるウイルス遺伝子を提供するヘルパーコンストラクトを含む細胞である。細胞は、本明細書において提供される方法において用いられるウイルスベクターの生活環を実際に支援することは必要とされない。例えば、感染性ウイルス粒子の生成のために必要とされる遺伝子をコンディショナルプロモーターの制御下において含む細胞は、プロモーターを活性化することができる目的の遺伝子を含まないウイルスベクターの生活環を支援しなくともよいが、それでもなお、かかるウイルスベクターのための好適な宿主細胞である。
【０１７９】
いくつかの態様において、宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、E. coli細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である。宿主細胞の型は、無論、使用されるウイルスベクターに依存し、好適な宿主細胞／ウイルスベクターの組み合わせは、当業者には容易に明白となるであろう。
【０１８０】
いくつかの態様において、ウイルスベクターはファージであり、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、E. coli細胞である。好適なE. coli宿主株は、当業者に明らかであり、これらに限定されないが、New England Biolabs（NEB）Turbo、Top10F’、DH12S、ER2738、ER2267、およびXL1-Blue MRF’を含む。これらの株の名称は、当該分野において認識されており、これらの株の遺伝子型は、よく特徴づけられている。上の株は、単に例示的なものであり、本発明はこの点において限定されないことが、理解されるべきである。
【０１８１】
いくつかのＰＡＣＥの態様において、例えばＭ１３選択ファージを使用する態様において、宿主細胞は、Ｆ因子、性決定因子またはＦプラスミドとしても一般に言及される稔性因子を発現するE. coli細胞である。Ｆ因子は、細菌が接合のために必要な性線毛を生成することを可能にする細菌のＤＮＡ配列であって、特定のファージ、例えばＭ１３ファージによるE. coli細胞の感染のために必須である。例えば、いくつかの態様において、Ｍ１３−ＰＡＣＥのための宿主細胞は、遺伝子型F’proA+B+ Δ(lacIZY）zzf::Tn10(TetR）/ endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacIZYA araD139 Δ(ara,leu）7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC）proBA::pir116 λのものである。
【０１８２】
本明細書において開示される技術の態様、利点、特徴および用途のうちのいくつかは、以下の例からより完全に理解されるであろう。例は、本開示の利点のうちのいくつかを説明し、特定の態様を記載することを意図するが、本開示の完全な範囲を例示することは意図せず、したがって、本開示の範囲を限定するものではない。
【０１８３】
例
例１
細胞質送達が可能な最も注目すべきタンパク質系に、７つの血清学的に区別し得るボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ  Ａ〜Ｇ）を含むクロストリジウム属の神経毒および単一の破傷風シンタキシン神経毒（ＴｅＮＴ）がある。これらのモジュラータンパク質は、単一の１５０ｋＤａの単一のタンパク質として発現され、これは、１００ｋＤａの「重鎖」（ＨＣ）および５０ｋＤａの「軽鎖」（ＬＣ）の２つの成分にタンパク質分解され、これらは、単一のジスルフィド結合を通して会合し続ける。ＢｏＮＴ  ＨＣは、コリン作動性運動神経終末への結合に寄与するＨＣＣ結合ドメインおよびＨＣＮ転位ドメインに、さらに細区画される。ニューロンによる結合およびエンドサイトーシスにより、エンドソームによる酸性化が、転位ドメイン（ＨＣＮ）の構造的再組織化を駆動し、これが、神経毒にテザリングされたＬＣ亜鉛メタロプロテアーゼ（ＢｏＮＴ  ＬＣ）を細胞質へと輸送する（図１）。プロテアーゼは、次いで、ジスルフィド結合の還元の後で放出され、小胞膜融合（ＳＮＡＲＥ）タンパク質のタンパク質分解による切断による神経伝達物質の放出を遮断するするように進み、それにより麻痺を引き起こす（図１）。このイベントの触媒の性質、およびこれらのプロテアーゼの長い細胞内での寿命は、ＢｏＮＴ神経毒を既知の最も強力な神経毒性剤の一つとしている。
【０１８４】
２つのＢｏＮＴ血清型（ＢｏＮＴ  ＡおよびＢｏＮＴ  Ｂ）は、頸部ジストニア、眼瞼痙攣、および痙縮（spasticity）を含むいくつかの治療的適用について承認されている。野生型ＢｏＮＴに基づく治療剤は、神経細胞に対しての、および特異的ＳＮＡＲＥタンパク質に対しての、それらの精巧な選択性のために注目すべきであるが、これらの特徴はまた、細胞化学を調節するためのこれらのタンパク質のより広範な適用を制限する。ＢｏＮＴ毒素を、新規のニューロンのサブタイプへ、または非神経細胞へ再ターゲティングすることにおいて著しい進歩がなされている一方で、ＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼについての優先的なＳＮＡＲＥ基質は、主にニューロンのシグナル伝達において機能する。この限定要因を克服するためにＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼの活性を改変する努力が受けてきた成功は、はるかにより限定されており、ＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼのための新たな細胞内標的へのアクセスの難しさは、なおＢｏＮＴ型治療戦略を拡大する上での主な障壁であり続けている。
【０１８５】
タンパク質分解は、最も一般的な翻訳後修飾の１つを代表し、選択的なＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼを細胞内の新規の基質に向け直す能力は、強力な治療ツールを構成するであろう。プロテアーゼを疾患関連タンパク質を恒久的に改変するように再プログラミングすることは、タンパク質工学のコミュニティ内での積年の目標であるが、プロテアーゼの活性および選択性を改変することの困難が、医薬におけるプロテアーゼの広範な利用を制限してきた。プロテアーゼを再プログラミングする実質的な努力は、再方向づけされた進化により、プロテアーゼの活性および選択性を調整することの実現可能性を示してきた。しかし、今日までの殆どの報告されている成功は、一般的に大きく損なわれた活性のレベルを伴う単一残基の特異性の変更に限定されていたため、プロテアーゼの治療的適用は、これまでのところ、ネイティブの機能をin vivoで行うプロテアーゼに限定されていた。ＢｏＮＴプロテアーゼは、この傾向から逃れられない。プロテアーゼ工学における限定された成功のみが報告されており、これまでのところ、ＢｏＮＴ治療の適用を実質的に拡大することは不可能であった。
【０１８６】
ファージ依存的連続進化（ＰＡＣＥ）は、近年、ＲＮＡポリメラーゼにおける新たなプロモーター選択性、タンパク質−ＤＮＡ相互作用の中での新たな結合選択性、タンパク質−タンパク質相互作用における新たな結合活性、およびウイルスのプロテアーゼの中での薬物耐性を含むタンパク質における新たな活性の開発のための強力な戦略として現れてきた。ＰＡＣＥ選択は、必須遺伝子ＩＩＩおよびその産物であるコートタンパク質ｐＩＩＩの欠損に起因して新たな宿主に感染することができない改変型Ｍ１３線維状バクテリオファージの周囲で構築される（図２）。この必須遺伝子は、E. coli宿主細胞に移動されており、その転写は、目的の特定の活性の制御下に置かれる。改善された活性を選択するために、進化させるべきタンパク質は、ファージ（選択ファージ）により担持され、細菌宿主感染により発現される。ｐＩＩＩは、この感染プロセスのために必須であるので、活性なライブラリーメンバーを担持するファージのみが、感染性の次世代を産生することができ、それらの感染性は、コードされるタンパク質の活性に比例して増大する。選択自体は、動的なラグーン環境において行われ、これは、新たなE. coli細胞による、および不活性なファージライブラリーメンバーを取り除く定常的なアウトフローによる、定常的な希釈を経て、それにより、最も活性なタンパク質バリアントを含むファージのみが存続することを可能にする。ＰＡＣＥにおいて、変異誘発、選択および複製を、in situで行い制御する能力は、伝統的な定方向進化のアプローチよりも多くの利点を提供する。一般に、ＰＡＣＥは、数百ラウンドの進化を、最小限の研究者の介入を伴う１週間のＰＡＣＥ実験の経過において行うことができるので、より大きな遺伝子ライブラリーによるはるかにより早い選択を可能にし、約１００倍のタンパク質進化の試みの速度の増大をもたらす。選択厳密性および変異誘発率を制御することにおける改善は、ＰＡＣＥが、所与のタンパク質の適応地形（adaptive landscape）の大部分の領域をカバーすることを可能にし、それを、新規のタンパク質活性にアクセスする上で、合理的設計の試みを凌ぐことができる強力なアプローチにしている。高度に効率的である一方で、ＰＡＣＥ選択は、選択を駆動するために、タンパク質活性の遺伝子−ＩＩＩの転写への連結、例えば、ＢｏＮＴプロテアーゼおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３／４Ａプロテアーゼを含むプロテアーゼの進化を駆動することができる、プロテアーゼ活性化Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（本明細書において以後Ｔ７−ＰＡＰとして言及される）を必要とする。このプラットフォームの例において、遺伝子−ＩＩＩは、Ｔ７プロモーターの制御下に置かれ、コグネートなＴ７ポリメラーゼが、プロテアーゼ感受性リンカーによりＴ７リゾチームとの融合コンストラクトとして発現される。Ｔ７リゾチームは、Ｔ７  ＲＮＡＰの天然の阻害剤であるため、Ｔ７ｐｏｓは、連結ドメインがタンパク質分解により切断されない限り、ｐＩＩＩを転写することができない（図３）。加水分解により、Ｔ７ポリメラーゼは活性化され、アクセサリープラスミド中のＴ７プロモーターから遺伝子−ＩＩＩを転写することができる。重要なことに、Ｔ７ｐｏｓのリンカ��領域は、多様な切断配列を収容するように変化させることができ、共発現されたプロテアーゼの固有の選択性に対して感受性である。
【０１８７】
ヒトを含む真核生物は、生化学的プロセスを区画化および制御するために、脂質膜に重度に依存する。ＳＮＡＲＥタンパク質の相補的なセットは、小胞性の細胞小器官の輸送を制御し、それにより細胞が分泌、オートファジーおよび膜のリモデリングをもたらす膜融合イベントを触媒する、主な機構である。これらのプロセスに対する制御を通してシグナルネットワークを制御するための明白な潜在能力にもかかわらず、この治療戦略は、なお未踏であり続けており、既知の唯一の小分子分泌阻害剤は、低い特異性および高い毒性に起因して、限定された臨床でのバイアビリティーを有する。ＢｏＮＴ神経毒は、この限定に対する解決法を提案するが、この治療戦略の範囲を拡大するために、それらの活性の拡大を必要とする。ＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  ＤおよびＢｏＮＴ  ＦのＬＣプロテアーゼは、小胞結合膜タンパク質−１（ＶＡＭＰ１）およびＶＡＭＰ２を選択的に加水分解し、それにより神経伝達物質分泌を遮断する。しかし、ＶＡＭＰ７（ＴＩ−ＶＡＭＰ）などのいくつかの他のＶＡＭＰファミリーメンバーは、オートファジー、細胞膜のリモデリングおよび分泌を含む重要な細胞のイベントを媒介するが、ＢｏＮＴプロテアーゼによっては切断されない。ＶＡＭＰ７は、腫瘍細胞浸潤の間のＭＴ１−ＭＭＰ分泌に寄与する主なｖ−ＳＮＡＲＥであり、また、移植の試みにおける主要な障害であるナチュラルキラーにより媒介される細胞死の間のグランザイムＢおよびパーフォリンの分泌をも媒介する。天然のＢｏＮＴ基質に対する緊密な関係を考慮すると、ＶＡＭＰ７は、ＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼ活性を、細胞内化学の生体高分子の調節について同時に拡大し、適用をターゲティングされた輸送および分泌の阻害剤について拡大するための、理想的な第１の標的を代表する。
【０１８８】
潜在的な治療関連性を有する操作されたＢｏＮＴプロテアーゼを提供することに加えて、この例は、ＢｏＮＴプラットフォームを用いて、細胞内生物学的処置を拡大するための基礎を確立する。
【０１８９】
ＰＡＣＥを用いるＢｏＮＴの進化
第一世代のＴ７−ＰＡＰコンストラクトは、短い（７アミノ酸の）基質配列のみを有し、可撓性のリンカーを隣接させることにより、加水分解されない状態においてＴ７リゾチーム結合を可能にした（図４Ｂ）。しかし、この縮合した切断配列は、ＢｏＮＴプロテアーゼにおける伸長された基質認識部位とは劇的に異なる。ＶＡＭＰを切断するＢｏＮＴプロテアーゼは、単離されたペプチドにおいて効率的な加水分解を行うために、約３０アミノ酸の配列を必要とし、したがって、それは、伸長された基質配列が、プロテアーゼ依存的転写活性を保持しつつＴ７−ＰＡＰ中に組み込まれることができるか否かを確立するために、必須となる。組み換え発現されたＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼ（本明細書において以後ＢｏＮＴ  Ｎとして注解され、ここで、Ｎは神経毒血清型を表す）の発現およびタンパク質分解活性を評価するために、３つのＶＡＭＰ１を切断するＢｏＮＴ血清型（ＢｏＮＴ  ＬＣ  Ｂ、ＤおよびＦ）の各々を含む選択ファージミドを得た。これらのプロテアーゼは、カップリングされたルシフェラーゼアッセイにおいて、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ２に連結したＴ７−ＰＡＰコンストラクト（Ｔ７−ＰＡＰ（ＶＡＭＰ１）／Ｔ７−ＰＡＰ（ＶＡＭＰ２））に対してアッセイした（図４Ｃ）。生じたデータは、ＢｏＮＴ  Ｆは、E. coliのＭ１３ファージ感染により発現され、ＳＮＡＲＥ由来のＴ７−ＰＡＰからプロテアーゼ依存的転写を駆動することができることを示す。選択ファージは、次いで、Ｔ７−ＰＡＰＶＡＭＰ１基質に対するＰＡＣＥに供され、天然の基質に対する切断活性を劇的に改善する変異（Ｓ１６６Ｙ）を生じた（図４Ｄ、３列）。これらの結果は、ＳＮＡＲＥ−タンパク質に適応させたＴ７−ＰＡＰを用いて、ＰＡＣＥ選択を、ＢｏＮＴプロテアーゼの進化に適用することができることを示す。
【０１９０】
ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼの無差別性（promiscuity）の先の特徴づけは、ＶＡＭＰ１における効率的な切断活性のために重要な残基の集合を明らかにし、これらの部位の数は、ＶＡＭＰ７における保存されないアミノ酸と一致する（図４Ａ）。これらの残基（図４Ｂにおいて示されるとおり）を、ＢｏＮＴプロテアーゼ再プログラミングのための最初のＰＡＣＥのトラジェクトリーを評価するための、一次標的として選択した。ＶＡＭＰ７を標的とする進化のためのＶＡＭＰ１の単一変異体基質を含むＴ７−ＰＡＰをコードするＡＰのパネルを生成し、これらのコンストラクトに対するＢｏＮＴ  Ｆ（ｗｔ）および進化型ＢｏＮＴ  Ｆ（Ｓ１６６Ｙ）の活性を測定した。これらの単一変異体基質の多くは、より活性なＢｏＮＴ  Ｆ（ＶＡＭＰ１）進化型プロテアーゼを用いて、効率的に切断された。ＶＡＭＰ１（Ｄ５８Ｇ）変異を担持するＴ７−ＰＡＰ（ＶＡＭＰ７１．１）ＡＰは、より低い切断効率を示し（図４Ｄ）、これを、その後のＰＡＣＥ選択のためにターゲティングした。７２時間のＰＡＣＥ正の選択の後で、劇的に増強した切断活性を有するファージ（図４Ｄ）を選択した。選択されたバリアントは、高度に濃縮された変異のセット：Ｓ１６６Ｙ、Ｒ２４０ＬおよびＹ３７２Ｈを担持した。
【０１９１】
負の選択およびＶＡＭＰ７を切断する進化型プロテアーゼ
正の選択は、一般に、低い特異性を伴う、より広範な活性をもたらすので、それは、所望されるＶＡＭＰ７配列について高い特異性を有するＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼについて選択するための負の選択戦略を開発するために、重要であった。ここで、Ｔ３ポリメラーゼ標的配列から選択的に転写する改変型Ｔ７ポリメラーゼを、Ｔ７リゾチームに融合させて、直交性プロテアーゼ活性化ポリメラーゼ（Ｔ３ｎｅｇ−ＰＡＰ）を作製し、非選択的ＢｏＮＴ（例えば、所望されないタンパク質分解活性を有するＢｏＮＴ）による切断により、遺伝子ＩＩＩのドミナントネガティブ変異体、ｐＩＩＩ−ｎｅｇの発現にカップリングさせた。ｐＩＩＩ−ｎｅｇの競合的発現は、新たな宿主に感染することができないファージを生じることによりファージ伝播を効果的に抑制し、Ｔ３ｎｅｇのプロテアーゼ感受性リンカー中のオフターゲット配列の切断により開始される（図５）。この遺伝子カセット（直交性ポリメラーゼおよびｐＩＩＩ−ｎｅｇを含む）は、別々のプラスミド上でコードされているので、基質（Ｔ３ｎｅｇ）の濃度および加水分解イベントごとに生成されるｐＩＩＩ−ｎｅｇの量は、プラスミドコピー数、プロモーターの操作、および生じたｍＲＮＡ転写物のリボソーム結合配列の最適化を通して調節することができる。このことは、調節可能な負の選択の厳密性を可能にし、選択的なＢｏＮＴ変異体を濃縮することができる可能性を増大させる。ＶＡＭＰ１とＶＡＭＰ７との間の特定の進化のトラジェクトリーは、多数の非天然のＳＮＡＲＥタンパク質配列をカバーする。したがって、高い特異性を得るためには、相対的に少数の天然に存在するオフターゲット基質のみに対する負の選択を行う。いくつかの態様において、ＶＡＭＰ１に連結したＴ３ｎｅｇ−ＰＡＰは、進化型プロテアーゼのための最も可能性が高いオフターゲット基質に対して選択する。標的ＶＡＭＰ７に対する高度の特異性を保証するために、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３およびＶＡＭＰ８などの関連するＳＮＡＲＥタンパク質を用いて、さらなるin vitroでの基質プロファイリングを行うことができる。
【０１９２】
進化型ＢｏＮＴプロテアーゼの特徴づけ
進化型ＢｏＮＴプロテアーゼの化学的および生物学的特性を検討した。ＢｏＮＴ  Ｆ  ＬＣプロテアーゼの組み換え発現および単離を行い、これは、in vitroでの切断アッセイのための材料を得るために十分であった。進化型ＢｏＮＴプロテアーゼの単一変異体復帰変異を、酵素活性および特異性を制御する上でのそれらの役割を調べるためにアッセイする。ゲル電気泳動およびＬＣ／ＭＳの両方により、ＳＮＡＲＥ基質切断をアッセイして、酵素動態学を決定する。進化型プロテアーゼの安定性（熱およびタンパク質分解の両方の）を、定量的アッセイにおいて評価する。ＶＡＭＰ７を切断することにより選択的膜融合の遮断を引き起こすＢｏＮＴバリアントの治療上の潜在能力は、例えばＭＴ１−ＭＭＰ分泌モデルを用いて、当該バリアントがヒト細胞においてターゲティングされた分泌阻害剤として機能する能力を特徴づけることにより検討する。簡単に述べると、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントを、トランスフェクションを介してＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞中に導入し、蛍光ゼラチンプレート培地を用いて、細胞外マトリックス分解をアッセイする。Transwell遊走アッセイもまた行う；ｓｉＲＮＡおよび抗ＶＡＭＰ７抗体データを、ＢｏＮＴ活性と比較して、ＢｏＮＴプロテアーゼバリアント処置の相対強度を決定する。この浸潤アッセイにおけるＶＡＭＰ７機能についての直交性アッセイとして、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体による表面標識もまた行う。
【０１９３】
例２
ＢｏＮＴプロテアーゼバリアントのＰＡＣＥ
プロテアーゼの活性および選択性が短い（約７アミノ酸の）ペプチド配列により支配される先の選択とは対照的に、ＢｏＮＴ  ＬＣ血清型は、それらのコグネートなＳＮＡＲＥタンパク質基質の伸長された配列を認識する。データは、ＶＡＭＰ１の残基２８〜８７に伸びる６０アミノ酸のフラグメントが、Ｔ７  ＲＮＡＰとＴ７リゾチームとの間の好適なリンカーとして働き、タンパク質分解による切断によるポリメラーゼの３倍までの活性化を提供することを示す（図６Ａ）。注目すべきことに、ＢｏＮＴ血清型ＢおよびＦは、この基質に対して最良に機能し、これはそれらのin vivoでの活性と一致し、一方、他のＢｏＮＴ  ＬＣ血清型は、もっぱらそれらのコグネートな基質について、ＰＡ−ＲＮＡＰの活性化を示す（ＢｏＮＴ  Ｅは、ＳＮＡＰ２５に対して）。ＶＡＭＰ１  ＰＡ−ＲＮＡＰは、ＰＡＣＥ選択を行うために十分であることが示されており、見かけのＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ２切断活性が増大したＢｏＮＴ  ＢおよびＢｏＮＴ  Ｆバリアントを生じた（図６Ｂ）。
【０１９４】
ＰＡＣＥの効率は、タンパク質が、連続的に改変される一連の基質の認識を、劇的に改変される最終的な基質に向かって進化させる、飛び石アプローチを実用的にする。ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ７およびＶＡＭＰ８のアラインメントは、高度な配列相同性を示すが、ＢｏＮＴ  ＢおよびＢｏＮＴ  Ｆの両方の血清型についての、活性を促進する残基における顕著な偏差をも示す（図６Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｂ  Ｌ２ＦおよびＢｏＮＴ  Ｆ  Ｌ３Ｅ、ならびに図７を参照）。ＶＡＭＰ１  ＰＡ−ＲＮＡＰ中へのＶＡＭＰ７／８標的配列における各々のアミノ酸置換（または置換のセット）の連続的導入と、生じたＡＰコンストラクトに対するその後のＰＡＣＥ選択により、野生型プロテアーゼ特異性を徐々に進化させる、進化の経路を設計した。この戦略は、所望されるＶＡＭＰ基質へ向かうタンパク質活性の漸進的なシフトをもたらす、ＬＣ変異の段階的蓄積を可能にする。
【０１９５】
ＢｏＮＴ  ＢおよびＦ  ＬＣについての基線の無差別性および潜在的な進化のトラジェクトリーを調べるための手段として、ネイティブのＶＡＭＰ１の残基が対応するＶＡＭＰ７またはＶＡＭＰ８の残基に変換されている、ＶＡＭＰ１  ＰＡ−ＲＮＡＰのおける単一残基変異体のパネルをアッセイした。データは、ＢｏＮＴ  Ｆ  ＬＣは、個々のＶＡＭＰ７置換のうちの多くを耐容するが、これらの置換のうちの３つ（ＶＡＭＰ１  Ｌ５５Ａ、Ｄ５８ＧおよびＤ６５Ｉ）は、プロテアーゼ依存的ルシフェラーゼシグナルを減弱したことを示す。野生型活性レベルからの挑戦的な選択肢を入れるために、これらのような特に困難な置換を初めにターゲティングした。各々のこれらの変異体基質の切断についての別のＰＡＣＥ選択により、それぞれの変異体基質に対して改善された活性を有する進化したバリアントが得られ、このことは、設計されたＰＡ−ＲＮＡＰコンストラクトが、ＢｏＮＴプロテアーゼの進化を促進することを示す（図８）。重要なことに、新たなＰＡ−ＲＮＡＰコンストラクトを開発することができる容易性、およびＰＡＣＥ選択の効率は、複数の進化の経路を並行して調べることを可能にし、それにより、成功の確率を増大させる。例えば、図８における進化型ＢｏＮＴ  Ｆバリアントの各々は、ＶＡＭＰ７に対してより高い類似性を有する新たな基質にアクセスするよう進展させることができる、異なる進化のトラジェクトリーを代表する。
【０１９６】
例３
ＰＡＣＥによるＢｏＮＴ  Ｆの進化
ＢｏＮＴ血清型Ｂ、ＤおよびＦに対して、初回通過（first-pass）ＰＡＣＥ進化を行った。ルシフェラーゼアッセイデータは、プロテアーゼ活性を改変するために、例えばネイティブのＶＡＭＰ１／２基質の切断を増大させるために、ＢｏＮＴ  ＢおよびＢｏＮＴ  Ｆを進化させることができることを示す（図９）。図１０は、ＶＡＭＰ１についてのＶＡＭＰ７を切断するプロテアーゼへの進化のトラジェクトリーの一例、およびこれを達成するためのアクセサリープラスミドの例を示す。
【０１９７】
ＶＡＭＰ７は、食作用、有糸分裂、細胞の遊走、膜の修復および増殖に関与する。図１１は、ＢｏＮＴ  ＦおよびＢｏＮＴ  Ｂ  ＶＡＭＰ２（天然の基質）の切断ドメインとＶＡＭＰ７とのアラインメントを表す。図１２は、ＰＡＣＥによるＢｏＮＴ  ＢおよびＦの進化（例えば、ＢｏＮＴ  ＦについてはＡＰの９７７、９８３および９８６を用いる）が、改善された活性を有するＢｏＮＴバリアントをもたらしたことを示すデータを提供する。図１３は、ＢｏＮＴ軽鎖（ＬＣ）選択の検証に関する代表的データを示す；データは、ＶＡＭＰ１に対するＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼの進化は、広範に増大した活性を付与するＳ１６６Ｙ変異を濃縮することを示す。ＡＰ−９７７に対するＢｏＮＴ  Ｆ（Ｓ１６６Ｙ）の進化はまた、改変された基質残基（Ｄ−＞Ｇ）に直接的に接触する位置２４０における変異を強力に濃縮する。
【０１９８】
図１４は、ＶＡＭＰ７を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントの生成のための飛び石進化経路の一例を示す。図１５は、３つの異なる実験（ラグーン１〜６）からのＢｏＮＴ  Ｆバリアントについてのプロテアーゼ活性アッセイを示す。各々の実験は、異なる単一変異体バリアント（Ｌ５５Ａ、Ｄ５８Ｇ、Ｄ６５Ｉ）を生じた。ラグーン１〜４を、二重変異体基質（ＡＰ−０１５：Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ）ＡＰを用いるＰＡＣＥ実験に供した。
【０１９９】
図１６は、ＢｏＮＴ  Ｆを進化させるための二重変異体ＰＡＣＥ実験の模式的描写を示す；二重変異体ＶＡＭＰ１（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ）のアミノ酸配列もまた示す。プロテアーゼ依存的ルシフェラーゼアッセイのデータは、ＰＡＣＥにより二重変異体ＶＡＭＰ１基質を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントが生じたことを示す（図１７）。
【０２００】
図１８は、ＶＡＭＰ７を切断するためのＢｏＮＴ  Ｆの変異のための、進化の「飛び石」戦略の一例を示す。図１９は、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントの三重変異体（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ）選択についての代表的データを示す。データは、バリアントＬ１３２−Ｌ１ＣおよびＬ１３２−Ｌ３Ａが、３つのＶＡＭＰ７変異（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ）を含むＶＡＭＰ１を切断することを示す。
【０２０１】
図２０は、ＢｏＮＴ  Ｆバリアントの四重変異体（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ／Ｋ６０Ｒ）選択についての代表的データを示す。いくつかの選択されたＢｏＮＴ  Ｆバリアント（例えば２１６−Ｌ１Ｃ、２１６−Ｌ１Ｅ、２１６−Ｌ３Ｂ、２１６−Ｌ３Ｇ）が４つのＶＡＭＰ７変異（Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ／Ｋ６０Ｒ）を含むＶＡＭＰ１を切断することが観察され、このことは、ＶＡＭＰ１における５つの最も許容されない変異部位のうちの４つが取り組みの対象となったことを示している。図２１は、Ｖ４４Ｋ（図中、Ｖ４３として示される）およびＱ３２Ｍ（図中、Ｑ３３として示される）に対するプロテアーゼの活性は、容易に進化させることができることを示す。ＶＡＭＰ７の末端を耐容するＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼもまた、観察されている。
【０２０２】
漸進的により複雑となるＶＡＭＰ基質に対する反復選択は、ＶＡＭＰ７を切断するいくつかのＢｏＮＴ  Ｆバリアントを提供した（図２２）。図２３は、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ７のアミノ酸配列のアラインメントを、７つのＶＡＭＰ７変異（Ｖ４４Ｋ／Ｋ５３Ｌ／Ｌ５５Ａ／Ｄ５８Ｇ／Ｑ５９Ｅ／Ｋ６０Ｒ／Ｄ６５Ｉ）を含むＡＰ−Ｖ７−１９４ＫＬと共に示す。下の表３は、４８時間にわたるＡＰ−Ｖ７−１９４ＫＬと、その後の２４時間にわたるＡＰ−Ｖ７−１９４ＫＬ＋ＡＰ−０９２と、その後の４８時間にわたるＡＰ−０９２によるＰＡＣＥの後で、いくつかのＢｏＮＴ  Ｆバリアントにおいて観察された変異を示す。
【表３】
2020534025.tif 000057

【０２０３】
いくつかのＶＡＭＰ７切断性ＢｏＮＴ  Ｆバリアントを、in vitroで発現させた。図２４は、２つのＢｏＮＴ  Ｆ進化型バリアント（２０２０  Ｌ２Ａ、２０２０  Ｌ３Ａ）のタンパク質発現についてのタンパク質ブロット分析を示す。
【０２０４】
ＶＡＭＰ７進化型プロテアーゼを、次いで、ＶＡＭＰ８二重変異体基質のパネルをスクリーニングするために用いた。図２５は、スクリーニングにおいて用いられたＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ８のアミノ酸配列および二重変異体アクセサリープラスミド（ＡＰ）のアラインメントの模式図を示す。データは、ＶＡＭＰ７進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼがより広範な活性プロフィールを有することを示す（図２６）。
【０２０５】
図２７は、ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ８のアミノ酸配列のアラインメントを、ＶＡＭＰ８を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントを進化させるために用いられたいくつかのＡＰと共に示す。データは、ＶＡＭＰ８  ＡＰは、高いバックグラウンドを有するが、ＶＡＭＰ８を切断するＢｏＮＴ  Ｆバリアントを同定したことを示す（図２７）。
【０２０６】
例４
ＰＡＣＥによるＢｏＮＴ  Ｅの進化
野生型ＢｏＮＴ  Ｅは、ＳＮＡＰ２５タンパク質を切断する（図２８）。この例は、ＳＮＡＰ２３およびＰＴＥＮタンパク質などのネイティブではない基質を切断するようなＢｏＮＴ  Ｅの進化を説明する。第１に、ＳＮＡＰ２５残基１６６〜１８６の切断を、プロテアーゼ依存的発光アッセイにより試験した。データは、ＳＮＡＰ２５の位置１７９における残基の変異（例えばＤ１７９Ｋ）は、ＢｏＮＴ  Ｅによるプロテアーゼ活性を無効にしたことを示す（図２９）。
【０２０７】
２つの異なるＰＡＣＥ実験を行った。第１の実験（ラグーン１および２）において、ＢｏＮＴ  Ｅタンパク質バリアントは、２つの基質の勾配（ＳＮＡＰ２５およびＳＮＡＰ２５  Ｄ１７９Ｋ）の存在下において進化した。第２の実験（ラグーン３および４）において、ＢｏＮＴ  Ｅタンパク質バリアントは、異なる２つの基質の勾配（ＳＮＡＰ２５およびＳＮＡＰ２３）の存在下において進化した。下の表４は、各々の実験において生じたバリアントの変異を示す。データは、ＳＮＡＰ２３を切断するいくつかのＢｏＮＴ  Ｅバリアントが進化したことを示す（図３０）。
【表４】
2020534025.tif 000058
【０２０８】
次に、治療標的を切断するＢｏＮＴ  Ｅバリアントが進化し得るか否かを検討した。図３１は、ＳＮＡＰ２５のアミノ酸配列の一部ならびに野生型ＢｏＮＴ  ＡおよびＢｏＮＴ  ＥプロテアーゼがＳＮＡＰ２５を切断するがＳＮＡＰ２３を切断しないペプチド結合を示す。図３２は、治療標的であるホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）を切断するようなＢｏＮＴ  ＥのＰＡＣＥについての飛び石の模式図を示す。下の表５および６は、各々の実験において生じたＢｏＮＴ  Ｅバリアントの変異を示す。
【表５】
2020534025.tif 000059
【表６】
2020534025.tif 000060
【０２０９】
ＰＴＥＮを切断するＢｏＮＴ  Ｅバリアントの同時の正の（ｐｒｏＢ厳密性）および負の選択（ＳＮＡＰ２５、ｐｒｏＡからｐｒｏＢまでを混合する）を行った。ＰＴＥＮを切断するいくつかのＢｏＮＴ  Ｅバリアントの進化が観察された（図３３）。下の表７は、この実験において生じたＢｏＮＴ  Ｅバリアントの変異を示す。
【表７】
2020534025.tif 000061
【０２１０】
進化型ＢｏＮＴ  Ｅバリアント（Ｌ２Ｆ  ０３１０１７）を発現させ、イミダゾールの濃度を増大させることにより精製した（図３４）。ＳＮＡＰ２５およびＰＴＥＮを基質として用いて、タンパク質分解アッセイを行った。データは、ＢｏＮＴ  Ｅ  Ｌ２ＦがＳＮＡＰ２５およびＰＴＥＮの両方を切断することを示す（図３５）。負の選択を用いたＰＡＣＥは、例えば図３６において示されるようなＬ２Ｂバリアントにより、改善されたＰＴＥＮ切断をもたらす。
ＰＡＣＥ進化の表
表８：ＢｏＮＴ  Ｅ  ＰＡＣＥ１バリアント
【表８−１】
2020534025.tif 000062
ＢｏＮＴ  Ｅ  ＰＡＣＥ１バリアントの固有のアミノ酸配列を、配列番号１〜２６において提供する。
表８（続き）：ＢｏＮＴ  Ｅ  ＰＡＣＥ１バリアント
【表８−２】
2020534025.tif 000063
ＢｏＮＴ  Ｅ  ＰＡＣＥ１バリアントの固有のアミノ酸配列を、配列番号１〜２６において提供する。
【表９−１】
2020534025.tif 000064
【表９−２】
2020534025.tif 000065
【表１０−１】
2020534025.tif 000066
【表１０−２】
2020534025.tif 000067
【表１１−１】
2020534025.tif 000068
【表１１−２】
2020534025.tif 000069
【表１２】
2020534025.tif 000070
【表１３】
2020534025.tif 000071
【表１４】
2020534025.tif 000072
【表１５】
2020534025.tif 000073
【表１６−１】
2020534025.tif 000074
【表１６−２】
2020534025.tif 000075
【表１７−１】
2020534025.tif 000076
【表１７−２】
2020534025.tif 000077
【表１８−１】
2020534025.tif 000078
【表１８−２】
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【表１９−１】
2020534025.tif 000080
【表１９−２】
2020534025.tif 000081
表２０：ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ７（１６０５２０）バリアント
【表２０】
2020534025.tif 000082
ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ７バリアントの固有のアミノ酸配列を、配列番号１９０〜１９８において提供する。
表２１：ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ８（１６０７２０）バリアント
【表２１】
2020534025.tif 000083
ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ８バリアントの固有のアミノ酸配列を、配列番号１９９〜２０８において提供する。
表２２：ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ９（１６０８２９）バリアント
【表２２】
2020534025.tif 000084
ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ９バリアントの固有のアミノ酸配列を、配列番号２０９〜２１１において提供する。
【表２３−１】
2020534025.tif 000085
【表２３−２】
2020534025.tif 000086
【表２４−１】
2020534025.tif 000087
【表２４−２】
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【表２５−１】
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【表２５−２】
2020534025.tif 000090
【表２６−１】
2020534025.tif 000091
【表２６−２】
2020534025.tif 000092
【表２７】
2020534025.tif 000093
【０２１１】
例５
進化型ＢｏＮＴプロテアーゼの特徴づけ
この例は、進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼの発現および単離を説明する。ＰＡＣＥ−２０２０  ＢｏＮＴ  ＦプロテアーゼバリアントＬ２Ａをコードする核酸を含む発現コンストラクトを作製した。発現コンストラクトはまた、Ｎ末端のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグおよびポリ−ヒスチジンＣ末端タグを含んだ。形質転換細胞を、細胞撹乱物質（disruptor）溶解と、その後のＮｉ−ＮＴＡを用いる一次精製およびアミロースカラム（これは、ＭＢＰに結合する）による二次精製の標的とした。
【０２１２】
図３８Ａ〜３８Ｂは、進化型ＢｏＮＴプロテアーゼのプロテアーゼ発現および単離を示す。図３８Ａは、進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼｍ２０２０−Ｌ２Ａのウェスタンブロットを示す（「ｍ」はタンパク質のＮ末端上のマルトース結合タンパク質タグを示す）。図３８Ｂは、Ｎｉ−ＮＴＡ（上）で精製されたＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼｍ２０２０−Ｌ２Ａおよびｍ２０２０−Ｌ３Ａと、その後のＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼｍ２０２０−Ｌ２Ａおよびｍ２０２０−Ｌ３Ａのアミロース精製のウェスタンブロットを示す。
【０２１３】
ＶＡＭＰ７切断アッセイを用いて、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント２０２０−Ｌ２Ａのin vitroでの活性を試験した。図３９は、ＢｏＮＴ  Ｆバリアント２０２０−Ｌ２Ａプロテアーゼがin vitroで活性であることを示すデータを示す。図４０は、ＶＡＭＰ７におけるＢｏＮＴ  Ｆバリアント２０２０−Ｌ２Ａプロテアーゼの切断部位が、ＭＳにより測定される場合に、予測される切断部位に対して相対的にシフトしたことを示すデータを示す。
【０２１４】
進化型ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼの活性を改善するために、高度に厳密な正の選択を用いるＰＡＣＥ実験を行った。図４１は、ＰＡＣＥ−３４０１の間に用いられた選択戦略を示す。表２９は、ＰＡＣＥ−３４０１から単離されたクローン中に存在する変異を表す。
【表２９−１】
2020534025.tif 000094
【表２９−２】
2020534025.tif 000095
【０２１５】
ＰＡＣＥ−３０４１  ＢｏＮＴ  Ｆバリアントの活性を検討するために、ルシフェラーゼアッセイを行った。ＰＡＣＥ−３０４１プロテアーゼバリアントは、それらが進化した元の親ＰＡＣＥ−２０２０プロテアーゼバリアントと比較して改善した見かけの活性を有したことが観察された。例えば、図４２は、２０２０−Ｌ２Ａおよび２０２０−Ｌ３Ａ  ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼ含有ファージをＰＡＣＥ−３０４１クローンと比較する、ルシフェラーゼアッセイデータを示す。
【０２１６】
図４３は、２０２０−Ｌ２Ａおよび２０２０−Ｌ３Ａ  ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼ含有ファージを、３１４−０９２ＱＳ−ｐｒｏＢラグーンから単離されたＰＡＣＥ−３０４１クローンと比較する、ルシフェラーゼアッセイデータを示す。
【０２１７】
ＢｏＮＴ  Ｆ  ＰＡＣＥ−３０４１バリアントは、発現させることおよび単離させることが困難であったことが観察された；しかし、２つのクローン、３０４１−Ｌ２Ｆおよび３０４１−Ｌ２Ｄは、首尾よく単離され、組み換え発現された。図４４を参照。ｍ３０４１−Ｌ２Ｆのin vitroでの検証を、その後に行った。図４５は、ｍ３０４１−Ｌ２Ｆがin vitroで触媒活性を保持したことを示すデータを示す。
【０２１８】
ＢｏＮＴ  Ｆ  ２０２０プロテアーゼバリアントの選択性もまた試験した。図４６を参照。データは、ＢｏＮＴ  Ｆ  ２０２０−Ｌ２Ａ試料について、オフターゲット切断が観察されたことを示した。
【０２１９】
ＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼバリアントの選択性を改善するために、二重選択アプローチを用いた。簡単に述べると、ＶＡＭＰ７切断についての正の選択を、ＶＡＭＰ１切断についての負の選択と組み合わせた（ＰＡＣＥ−２３００として言及される）。ＰＡＣＥ−２３００から単離されたＢｏＮＴ  Ｆプロテアーゼバリアントの遺伝子型を、表２９において示す。
【表３０−１】
2020534025.tif 000096
【表３０−２】
2020534025.tif 000097
【０２２０】
見かけの活性を有する単一クローンをＰＡＣＥ−２３００から単離し、これをクローニングし、組み換え発現させた。ルシフェラーゼアッセイデータは、ＢｏＮＴ  Ｆ  ２３００−Ｌ３Ｂがin vitroで活性であることを示した（図４８）。さらに、in vitroでの特徴づけ実験を行った。図４９は、ｍ２３００−Ｌ３Ｂのin vitroでの特徴づけに関するデータを示す。ｍ２３００−Ｌ３Ｂプロテアーゼは、ＶＡＭＰ７に対する活性を保持する。ｍ２３００−Ｌ３Ｂについて、ｍ２０２０−Ｌ２Ａに対して、ＶＡＭＰ１／７についてのin vitroでの選択性の改善が観察された。ｍ２３００−Ｌ３Ｂについて、ｍ２０２０−Ｌ３Ａに対して、ＶＡＭＰ１／７についてのin vitroでの選択性の実質的な改善が観察された。
【図１−２】
2020534025.tif 000098
【図３】
2020534025.tif 000099
【図４ＡＢ】
2020534025.tif 000100
【図４ＣＤ】
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【図５】
2020534025.tif 000102
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020534025.tif 000104
【図７】
2020534025.tif 000105
【図８】
2020534025.tif 000106
【図９】
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【図１０】
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【図１１−１２】
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【図１３】
2020534025.tif 000110
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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