(57)【要約】  本明細書において、重要な試薬を導入する必要のない、または機器操作の段階間で小滴を回収して移す必要のない、デジタル小滴定量化のためのすべての必要なコンポーネントを含む連続流機器に関するシステムが記載される。デジタル定量化は、追加の流体または消耗型の取り扱いなしに、かつ流体を外部汚染のリスクに曝すことなく、行うことができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続流においてアッセイを実施するためのシステムであって、該システムは：
ａ．第１の入口と第１の出口を含む連続相用の流れ経路；
ｂ．第１の分散相を供給するように構成された第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ；
ｃ．第２の分散相を供給するように構成された第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ；
ｄ．コアレッサー；
ｅ．リアクタ；
ｆ．検出器；および、
ｇ．コントローラ、
を含む、システム。
【請求項２】
連続相は疎水性の試薬を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
連続相は油脂を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
連続相は、疎水性のフッ化油脂を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
疎水性のフッ化油脂は、ＦＣ−３２８３、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、３−エトキシ−１，１，１，２，３，４，４，５，５，６，６，６−ドデカフルオロ−２−トリフルオロメチル−ヘキサン、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＯＨ、パーフルオロオクタン、パーフルオロヘキサン、１，１，１−トリフルオロオクタン、および１，１，１，２，２−ペンタフルオロデカンから成る群から選択された試薬を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、親水性の試薬を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、水性の試薬を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、水を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
流れ経路の面はポリマーコーティングを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
流れ経路の面は撥水性コーティングを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
流れ経路の面はフルオロポリマーコーティングを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
フルオロポリマーは、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシポリマー、フッ化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、ポリエチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、全フッ素置換されたエラストマー、フルオロカーボン、フッ素ゴム、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、パーフルオロスルホン酸（ＰＦＳＡ）、およびパーフルオロポリオキセタンから成る群から選択された試薬を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
さらに界面活性剤を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
界面活性剤は、過フッ化炭化水素、炭化水素、およびシリコンから成る群から選択された試薬を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つの容積は、約１ピコリットルから約１ミリリットルの範囲である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
流れ経路は、約０．００１”から約０．５”の範囲の内部水力直径を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
システムは核酸の切片の複数のコピーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
第１の分散相が少なくとも１つの基質を含み、および第２の分散相が少なくとも１つの試薬を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
第１の分散相は生体サンプルまたは第１の薬物前駆体を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
第２の分散相は、溶解試薬または別の薬物前駆体を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
第１の分散相は少なくとも１つの核酸分子を含み、および第２の分散相は核酸増幅試薬を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
核酸増幅試薬は、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、緩衝液、および酵素から成る群から選択された試薬を含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
検出器は、蛍光シグナルを測定するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
コアレッサーは、エネルギーの外部ソースを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
エネルギーの外部ソースは、少なくとも２つの電極間の電界を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
少なくとも２つの電極間の電位は、約１００Ｖから約２５０００Ｖの範囲である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
外部ソースは、圧力源と機械的ソースの少なくとも１つを含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
圧力源はポンプである、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
リアクタは化学反応を引き起こすように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３０】
リアクタはエネルギーの外部ソースと連通する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３１】
リアクタは少なくとも１つの熱源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３２】
リアクタは複数の熱源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３３】
リアクタは、第１の熱源と第２の熱源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３４】
第１の熱源は８５℃から９５℃の範囲の温度で維持される、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
第１の熱源は約９０℃の温度で維持される、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
第２の熱源は、５５℃から７０℃の範囲の温度で維持される、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３７】
流れ経路は、第１の熱源と第２の熱源の少なくとも１つと熱交換する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３８】
流れ経路の試薬は、第１の熱源と第２熱源と連通して、反復して流れる、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
試薬は複数の反復を条件とする、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
複数の反復は、少なくとも３０の反復である、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
複数の反復は、少なくとも６０の反復である、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４２】
流れ経路は、図８の第１の熱源と第２熱源を通り抜ける、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４３】
リアクタはサーモサイクラーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４４】
コントローラは、第１の分散相と第２の分散相を混ぜる所要時間と混合のタイミングの少なくとも１つを指定するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４５】
システムは自動的に動作する、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１６年１２月２８日に出願の米国仮特許出願第６２／４３９，８１４号、および２０１６年１１月２８日に出願の米国仮特許出願第６２／４２７，０８６号の利益を主張するものであり、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
核酸の定量化は、医学的および生物学的な応用において不可欠の技術である。エマルジョンベースのポリメラーゼ変化反応（ＰＣＲ）を含む、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅等の、核酸を検出して定量化するための新たな方法は、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法等の従来の核酸増幅と比較して、より高い精度と利便性を提供する。特にエマルジョンベースのデジタル核酸増幅は、サンプル中の核酸配列の絶対的な定量化を可能にし、これは非常に正確である。ほとんどのシステムでのエマルジョンベースのデジタル核酸増幅の実施は、しかしながら、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅による分析前に、核酸がプライマーまたはプローブと結合する場であるサンプルの調製を依然として必要とする。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書において提供されるのは、連続流機器を使用して核酸を検出し、および定量化するためのシステムと関連方法である。本明細書に記載される分析システムは、ＰＣＲと逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の少なくとも１つを含む核酸増幅、および望ましい化学反応の生成物の検出等の、望ましい化学反応のための全てのコンポーネントを含む連続流機器であり得る。
【０００４】
本明細書に記載のシステム、デバイス、および関連方法は、迅速で、信頼できる、正確なサンプルの接触点分析を促進する。サンプルは、最小限の前入力処理を使用して分析され、それによって、現場条件下での、またはサンプル調製の環境が実行可能な実験室・非実験室条件でない時の、分析を促進する。実質的なサンプル処理は、デバイス内部で行われ、それによって、最小限の外部サンプル処理を有する「血液イン、データアウト（ｂｌｏｏｄ−ｉｎ  ｄａｔａ−ｏｕｔ）」ワークフローが達成可能である。合理化されたサンプル処理は、臨床的環境等のポイントオブケア、または実際の現場または伝染病の発生現場等のサンプル取得地点において、データ取得が迅速に行われることを可能にする。サンプル処理が最小限であるため、場合によっては、サンプルをデバイスに適用するのに先立って処理用にラボにサンプルを送る必要はない。コスト、処理時間、ユーザーの専門技術のレベル、サンプル処理におけるヒューマンエラーのリスク、および伝染性のサンプルまたはそうでなければ危険なサンプルの処理における実験技術者へのリスクは、劇的に減少する。
【０００５】
本明細書で構成されるいくつかの分析システムは、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅を行なうためのものである。分析システムはしばしば、内蔵システムで行われる化学反応に使用される全ての試薬を保管するように構成された保管エリアを含み、および、内蔵システムでの化学反応用の全てのデバイスコンポーネントを含む。したがって、ユーザーは、標的核酸を含むサンプルをシステムに提供してもよく、およびシステムは、ユーザーからのさらなる試薬の入力なく、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅を行なうことができる。いくつかの実施形態において、システムは、核酸の精製および／または抽出（例えば細胞溶解）のための試薬等の、標的核酸を含むサンプルの前処理のための試薬を含むように構成することができる。例えば、細胞、血液、呼吸器系の流体、および／または尿は、前処理用の異なるツールを使用する必要なしにＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するために、システムによって前処理することができる。多くの場合、本明細書に記載されるシステムは携帯用である。本明細書に記載されるシステムは、外部からの汚染にサンプルを曝すことなく、標的核酸サンプルの処理を可能にする。システムは、プロセスフローのためのサンプル核酸および／または試薬の望ましい量の正確で自動化された注入を提供するように構成することができる。システムによって提供される望ましい量のサンプル核酸と試薬の正確で自動化された注入は、現場でオンデマンドで、および／または病院および研究所でのデスクトップツールとして、コンパクトで、携帯可能な、サンプル核酸の連続流処理を可能にする。
【０００６】
＜引用による組み込み＞
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているかのような程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】プロセスのワークフローを表す。
【図２】システムのコンポーネントの典型的な配置を表す。
【図３】アッセイを実施するためのシステムの典型的な配置を表し、システムは、コアレッサー、小滴生成装置、リアクタ、検出器、およびコントローラを含む。
【図４】コアレッサー、リアクタ、検出器、およびコントローラを含むシステムの典型的な配置を表す。
【図５】独立したインジェクタを含むインジェクタ配置を表す。
【図６】スイッチングを有する同じインジェクタを含むインジェクタ配置を表す。
【図７】多数のポートを有するインジェクタを含むインジェクタ配置を表す。
【図８】インジェクタを使用するためのプロセスワークフローを表す。
【図９】インジェクタのコンポーネントを表す。
【図１０】インジェクタの入口と出口の配置を表す。
【図１１】インジェクタの腔の配置を表す。
【図１２】インジェクタの腔の代替的な配置を表す。
【図１３】１つのチャネルを含む円筒巻胴の断面図を表す。
【図１４】２つのチャネルを含む円筒巻胴の断面図を表す。
【図１５】インジェクタの腔の種々の配置を表す。
【図１６】カセットのコンポーネントを表す。
【図１７】カセットの入口と出口の配置を表す。
【図１８】カセットの腔の配置を表す。
【図１９】カセットの腔の代替的な配置を表す。
【図２０】独立した入口を有するコアレッサー配置を表す。
【図２１】共通の入口を有するコアレッサー配置を表す。
【図２２】同じ高さの独立した入口を有するコアレッサー配置を表す。
【図２３】独立した入口を有し、重力の助けで回収を行うコアレッサー配置を表す。
【図２４】連続相出口にバルブを有するコアレッサー配置を表す。
【図２５】重力トラップコアレッサーの断面図を表す。
【図２６】より小さなチャンネル径を有する重力トラップコアレッサーの断面図を表す。
【図２７】回転シールを有する重力トラップコアレッサーのコンポーネントを表す。
【図２８】重力トラップコアレッサーの入口と出口の配置を表す。
【図２９】重力トラップコアレッサーの腔の配置を表す。
【図３０】重力トラップコアレッサーの腔の代替的な配置を表す。
【図３１】検出器に関するプロセスワークフローを表す。
【図３２】光検出器、および光検出器と同じ場所を共用しない励起光源を含む検出器の構成を表す。
【図３３】光検出器、励起光源、およびと二色反射鏡を含む検出器の構成を表す。
【図３４】光検出器、励起光源、二色反射鏡、およびフィルタを含む検出器の構成を表す。
【図３５】２つの光検出器、１つの励起光源、および２つのダイクロイックミラーを含む検出器の構成を表す。
【図３６】２つの光検出器、２つの励起光源、フィルタ、およびダイクロイックミラーを含む検出器の構成を表す。
【図３７】光検出器、２つの励起光源、および１つのコントローラを含む検出器の構成を表す。
【図３８】２つの励起光源と１つの光検出器を含む検出器の構成を表す。
【図３９】多重化を可能にする検出器の構成を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書において、連続流のエマルジョンベースの化学反応を行うためのシステムと関連方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のシステムは、システムに提供されるサンプルで、および／または医薬化合物の化学合成を含む化学合成のために、核酸等の標的分析物の分析のための化学反応を含む、小滴における望ましい化学反応を行うように構成される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のシステムは、対象の分析物を含む流体サンプルを処理するために化学反応を行なうように構成される。本明細書に記載されるシステムは、分析物の分析を提供せずに、対象の分析物を抽出または定量化するために、化学反応を行なうように構成することができる。本明細書に記載されるシステムは、標的核酸の分析を行なわずに、細胞から標的核酸を抽出するために溶解反応を行なうように構成することができる。本明細書に記載されるシステムは、さらに標的核酸の分析を行なうように構成することができる。例えば、システムは、標的核酸の核酸増幅を行なうように構成されてもよい。本明細書に記載されるシステムは、標的医薬化合物の合成を含む、標的化合物を合成するために化学反応を行なうように構成することができる。
【０００９】
核酸増幅による核酸の検出と定量化は、様々な研究と医学的用途に有用である。核酸を素早く正確に検出して定量化することができるよう求められる。従来のＰＣＲ法等の従来の核酸増幅と比較して、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅は、より高い感度を可能にする。しかしながら、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅はしばしば、標的核酸サンプルおよび／または試薬の手動調製、および安定化とシステムにわたっての小滴の輸送を含む。
【００１０】
本明細書において提供されるのは、連続流機器を使用して核酸を検出して定量化するためのシステム、および関連方法であって、ここで、ＰＣＲ等のエマルジョンベースのデジタル核酸増幅用の全てのコンポーネントは、システム内に自己内蔵型である。いくつかの実施形態において、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅のために構成された分析システムは、内蔵システムでのエマルジョンベースのデジタル核酸増幅用の全ての試薬を含むように構成される。いくつかの実施形態において、システムは、例えばサンプル核酸の精製および／または抽出（例えば細胞溶解）のための試薬を含む、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅以外の反応を行なうための試薬を含むように構成することができる。多くの場合、本明細書に記載されるシステムは携帯用である。本明細書に記載される分析システムは、システムオペレーションの種々の段階中の、ユーザーの干渉のないエマルジョンベースのデジタル核酸増幅のための全ての必要なコンポーネントを提供する。例えば、ユーザーは、本明細書に記載されるシステムに、標的核酸を含むサンプルを供給することができ、およびサンプルの分析は、追加の流体および／またはユーザーによる消耗型の取り扱いなしに、連続的なワークフローで進めることができる。本明細書に記載されるシステムは、外部からの汚染にサンプルを曝すことなく、標的核酸サンプルの処理を可能にする。いくつかの例では、細胞を含む水、血液、呼吸器系の流体、および／または尿等のサンプルは、本明細書に記載されるシステムでの分析のために処理されるのに先立ってＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するために前処理する必要はない。
【００１１】
標的核酸を含むサンプルは、平行・多重検出のために同時に処理され、または連続・多重検出のために連続して処理され得る。分析システムは、サンプル核酸および／または試薬の自動化された正確な注入のために構成された、少なくとも１つのゼロデッドボリュームのインジェクタを含んでもよい。本明細書でさらに詳細に記載されるように、ゼロデッドボリュームのインジェクタは、システムでの反応のための流体が、ユーザーからの干渉なく自動的かつ正確に測定され得るように、ゼロデッドボリュームを有するもの等の噴射弁を含んでもよい。プライマー、プローブ、ポリメラーゼ酵素、および／または遊離したヌクレオチド等の、核酸のサンプルおよび試薬は、カセット、内蔵リザーバ、またはサンプル注入口から供給することができ、および、望ましい化学反応のためのサンプル核酸と試薬を含む反応小滴等の小滴を形成するためにシステムで結合することができる。いくつかの例では、サンプル核酸を含む小滴と試薬を含む小滴は、コアレッサーに供給され、ここでサンプルを含む小滴と試薬を含む小滴は、ＲＮＡに関する全ゲノムＰＣＲと逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等のＰＣＲを含む、核酸増幅反応用のサンプル核酸と試薬を含む反応小滴を形成するために結合される。いくつかの実施形態において、反応小滴はコアレッサーから小滴生成装置まで流される。小滴生成装置は、例えば望ましい容積の小滴を提供するために、多数の小滴に各反応小滴を分留してもよい。いくつかの実施形態において、小滴はその後、化学反応を小滴内で引き起こすリアクタを通り抜けることができる。例えば、小滴は、１セットのプライマーとプローブによって標的分子を増幅するためにサーモサイクラーを通り抜けることができる。いくつかの実施形態において、反応小滴は、小滴生成装置を通過することなく、コアレッサーからサーモサイクラーまで流されてもよい。分析システムは、小滴内の反応生成物の望ましい分析を提供するように構成されたリアクタの下流に１つ以上の検出器を含んでもよい。例えば、反応生成物を含む小滴または生成物小滴は、生成物小滴の内容物を分析することができるように、１つ以上の検出器コンポーネントを通過することができる。いくつかの実施形態において、検出器は、小滴内の反応生成物の濃度を判定するために使用することができる。濃度はポアソン分布を使用して分析することができる。例えば、標的分子の少なくとも１つのコピーを含む小滴は、検出中に蛍光を発し、デジタル１として計数されるが、蛍光を発しない小滴はデジタル０として計数される。次に１：全小滴の比率を計算し、ポアソンの統計学で補正し、そして容積を注入して絶対濃度を得ることができる。
【００１２】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、分析システムは多重化を提供するように構成することができる。多重化は、単一のサンプルが複数回分析されるのを可能にし、これは診断目的に有用であり得る。本明細書に記載されるように、多重化を可能にするシステムは、単一の初期サンプルから連続的および／または平行した標的の検出を可能にするように構成される。いくつかの例では、分析システムは、サンプル中の多数の標的が同時に分析されるように、平行した標的核酸の検出のために構成される。例えば、平行した多重化では、システムは、１つの標的核酸からの複数の放射頻度、および／または複数の標的核酸からの放射頻度を測定するように構成された複数の光検出器を含む検出器を含んでもよい。いくつかの例では、連続的な多重化は、多数の標的を連続して分析することを含む。時に、連続的な多重化は、流れ経路で連続して多数の検出器を使用して行なわれる。平行した多重化および／または連続的な多重化によって分析されるサンプルは、連続的および／または平行したサンプル多重化によってさらに分析され得る。いくつかの実施形態において、初期サンプルは、連続的な多重化のためにサブサンプリングすることができる。連続的なサンプル多重化は、第１のアリコートでの多数の標的の分析、次に結果に基づいて、第２のアリコートでの異なる標的の分析に、使用することができる。例えば、サンプルの最初のアリコートは、標的のいくつかの共通セットに関して分析することができるであろう。それらの標的に関して陰性の場合、システムは、さほど一般的でない標的の第２のセットの存在を検出するために第２のアリコートを注入するように構成することができる。プロセスは追加のアリコートと追加の試験により進むことができる。いくつかの例では、連続的なサンプル多重化は、プライマーとプローブの多数のセットを結合することにより行われる。いくつかの例では、本明細書に記載されるシステムは、サンプルを分析するためにマルチカラー検出を使用する。本明細書に記載されるシステムと方法は、労働コストと時間を節約することができ、他方で単一のサンプルからの多くの標的をアッセイすることができる。
【００１３】
本明細書において、より堅調で、以前のシステムよりも広いダイナミックレンジを有する核酸の定量化のシステムが記載される。以前のシステムを使用すると、しばしば手動での希釈、濃度の計算、および／または再アッセイが求められた。本明細書に記載されるシステムは、自動分析法を可能にする１つ以上のコンポーネントを含む。いくつかの実施形態において、システムは、注入のタイミングと量、コアレッサーへの外部ソースの適用、反応時間を含むリアクタに関するパラメータ、および検出器からの信号の処理の１つ以上を制御するのに使用することができるコントローラを含むことができる。例えば、コントローラは、分散相に加えられた希釈剤の量を適合させることができる。場合によっては、コントローラは状態機械である。コントローラは、多くの量の分散相が連続的に反応流れ経路を通過すること可能にすることができる。いくつかの例では、システムは、検出と定量化が内部フィードバックループを使用して行われることを可能にするために自動化される。例えば、サンプルの第１のアリコートが検出可能範囲の外部にある場合、システムは、量と濃度等のパラメータを自動的に調製し、第２のアリコートを注入する。
【００１４】
従来のエマルジョンベースのデジタル核酸増幅システムと比較して、本明細書に記載されるシステムは、汚染のほとんどまたは全くない反応が生じることを可能にすることができる。これは、研究および／または臨床診断に使用される生物試験法を含む、望ましい精度および／または信頼度を実証することができる生物試験法の提供にとって重要である。
【００１５】
核酸増幅に加えて、本明細書に記載されるシステムと方法は、自動化された薬物合成に使用することができる。例えば、第１の容積の分散相にある第１の薬物前駆体は、コアレッサーにある分散相の第２の容積の第２の薬物前駆体と結合する。
【００１６】
本明細書において記載されるシステムと方法は、化学反応用のサンプルおよび／または試薬の手動測定および／またはピペット操作なしで、または実質的になしで、自動化された連続流反応を可能にすることができる。システムに、化学反応用の、サンプルと適合性のある試薬を事前に装填してもよい。システムは、サンプルの前処理と、化学反応用の試薬の正確な測定を自動化するように構成されてもよい。例えば、標的核酸を含むサンプルをシステムに提供することができ、およびシステムは、望ましい化学反応を達成するために、および／またはサンプルの望ましい分析を提供するために、全てのプロセスを行なうことができる。化学反応は、手動のサンプル定量化および／または操作なしで、または実質的になしで、行うことができる。
【００１７】
＜デバイスの自動化ダイナミックレンジ＞
デジタルＰＣＲは典型的に、リアルタイムＰＣＲと比較して、低い全ダイナミックレンジに苦しむ。この１つの理由は、分析される小滴のうちで分析物の適切な分布を得るために適当なサンプル入力濃度を得ることが困難であるということである。
【００１８】
分析物はしばしば、それらが細分される小滴にポアソン分布を示す。サンプル中のＤＮＡの特異的配列の濃度の定量化は、満たされていない区画と全区画の比率を、基礎的なポアソン分布に相関させることによって判定される。１つ、２つ、またはより多くのＤＮＡ分子で満たされた区画が、定量化のデジタル特性ゆえに判別不能であるため（すなわち、すべて「１」または「存在」に定量化される）、満たされていない区画のみが、ポアソン分布における中心パラメータの基準と、およびそれに基づいた対象のサンプル中のＤＮＡの特異的配列の元々の濃度を提供することができる。元々の濃度が、生成された区画数に対してあまりにも高い場合、すべての区画またはほとんどの区画が「１」として定量化され、これは定量化を複雑にし、不可能にする場合もある。
【００１９】
本発明での自動化という特性は、典型的なデジタルＰＣＲでよりもはるかに大きい測定のダイナミックレンジを可能にする。特に、サンプルはデバイスに適用され、アリコートが処理され、そして結果のデータが分析される。サンプル分析物があまりにも高密度で存在する場合、場合によってはすでにデバイスに存在する、サンプルの第２のアリコートは、分析を妨害する単一の小滴中に多数の分析物分子を有する小滴の数を減らすように、希釈されて処理される。代替的に、サンプルまたは信号のない小滴の数があまりにも多いことによって証明されるように、サンプル分析物がアリコートに低すぎる濃度で存在する場合、次に、デバイス内のサンプルのより濃縮されたアリコートが、下流分析に最適な、または改善された分析物濃度になるように、反復に続いて処理される。
【００２０】
高ダイナミックレンジの例では、サンプルの第１のアリコートが機器に引き込まれ、ＰＣＲ試薬等の試薬と自動的に混合され、分配され、サーモサイクラーにかけられ、そして測定される。次に、自動コントローラは次の工程を決定する。１区画当たりの平均分子数が、デジタルＰＣＲ等の下流分析にとって許容可能な誤差範囲にある場合、測定が読み込まれる。この許容域は、いくつかのＰＣＲ用途等の多くの用途では、１区画当たり０．０００１〜５の分子である。１つの区画当たりの平均分子数が、許容可能な誤差範囲より大きい場合、測定誤差が高いか、サンプルが定量化不可能であるかのいずれかである（すなわち、小滴の区画のすべてまたはあまりにも多くが、多数の分析物が単一の区画にある場合でさえ、分析物に関して「１」または「存在」として測定される）。
【００２１】
サンプルの第２のアリコートが抜き取られ、そしてシステムは、ＰＣＲ試薬等の分析試薬または反応試薬の両方と、内蔵リザーバからの希釈水または他の適切な希釈剤を自動的に混合する。希釈物の量は、区画当たりの平均分子数を許容可能または分析的に意味のある範囲に戻すように、自動的に選択される。場合によっては、希釈物の量は、元々の濃度または以前の濃度のわずか０．１〜０．５にサンプルを希釈する。次に、サンプルの第２のアリコートは、サーモサイクラーにかけられ、またはそうでなければ反応条件にさらされ、そして結果として生じた区画において測定される。１区画当たりの平均分子数が許容可能な誤差範囲にある場合、測定が読み込まれる；１つの区画当たりの平均分子数が依然として高すぎる場合、プロセスが繰り返される。１つの区画当たりの平均分子数が低すぎる場合、より低い希釈比が選択される。代替的に、第１のアリコートに関して、「１」と測定される区画数が０である場合、濃度が低すぎてサンプリング誤差が引き起こされた（すなわち、サンプルは少量の標的分子を有したが、注入されたアリコートは標的分子のいずれをも含んでいなかった）。この場合は、システムは、第１のものよりも大きな容積のサンプルの第２のアリコートを拒否することができ、そうすると、標的分子がサンプルに存在するであろう場合にそれが検出される確率が増加する。このように、デジタルＰＣＲまたは他の分子反応または分析等の、任意の反応用のデバイスのダイナミックレンジは、当技術分野で利用可能な機器の限界をはるかに超えて、最大でリアルタイムＰＣＲのダイナミックレンジ以上に、自動的に拡張され得る。
【００２２】
他のデジタルＰＣＲ機器において手動で同等の結果を達成することは、サンプルの第１のアリコートとＰＣＲ試薬を手動で混合し、１区画当たりの標的分子の平均数を判定するために機器を手動で操作し、そして正確な定量化にとって高すぎる場合、手動でサンプルを希釈して１区画当たりの標的分子の許容可能な平均数を達成することによって、達成され得る。しかしながら、手動で同等の結果を達成することは、はるかに多い量の、機器への手動介入と労力を求める。これは、汚染の発生に加えて、希釈の量の計算と測定の両方におけるヒューマンエラーと変動性の可能性を招く。手動操作が増えるとしばしば適切な研究環境の必要が増すため、手動操作の増加はまた、デバイスの配置可能な場所の範囲を減らし、これは、直接的、即時のポイントオブケア分析、または当分野でのまたは回収施設でのサンプル分析と調和しないであろう。このデバイスは、手動操作を無くし、または劇的に減らし、したがって、手動によるエラーの可能性、ユーザーへのリスク、結果と変動性までの時間、および外部からの汚染の可能性を減らす。
【００２３】
自動化分注は、本明細書に開示されるデバイスと方法にさらなる有用性を加える。例えば、１つ以上の目標物の第１のセットが、はるかに稀である等の、１つ以上の第２の標的とは実質的に異なる濃度である場合、多数の標的に関する測定を考慮する場合に有用性を加える。これらの状況において、コストと解釈のための費用を減らすように、最も可能性のある、またはより豊富な標的を試験することが、しばしば有益である。例えば、診断の状況において、病院の実験室には、呼吸器症状を有する患者がいるかもしれない；細菌性髄膜炎等のより珍しい病気に関する試験を進める前に、通常の風邪とインフルエンザウイルスに関する試験をするのは当然であろう。これは、より珍しい病気が、患者のサンプルにより低い、またははるかに低い濃度で存在する分析物によって引き起こされた、またはそれに関連している可能性がある場合に特にあってはまる。
【００２４】
これを達成するために、システムは、サンプルの第１のアリコートを注入し、場合によっては、第１のセットからの最大４以上の標的に関連する最大４以上のプライマーとプローブ対を含むＰＣＲ試薬等の検出試薬と自動的に混ぜ合わせる。第１のアリコートは、分割され、サーモサイクラーにかけられ、そして測定され、または他の反応と検出のためのアプローチがとられる。第１のセットの少なくとも１つの標的の濃度が、第１の閾値を上回る場合、次に、標的に関連する疾病の診断が行われ、または、検出された分析物に関連する障害の存在を独立して調べるための工程を行うことができる。標的が、その標的に関連する濃度閾値を上回らない場合、次にシステムは、第２のアリコートを注入し、そして第２のセットからの最大４以上の標的に関連する最大４以上のプライマーとプローブ対を含むＰＣＲ試薬等の検出試薬と混ぜ合わせる。第２のアリコートは、分割され、サーモサイクラーにかけられ、そして測定され、または他の反応と検出のためのアプローチがとられる。第２のセットの少なくとも１つの標的の濃度が、その標的に関連する２の閾値を上回る場合、次に、標的に関連する疾病の診断が行われ、または、検出された分析物に関連する障害の存在を独立して調べるための工程を行うことができる。このプロセスは、第３のセット、第４のセット等からのますますより珍しい標的を含んで、拡張可能であり、または反復し行うことができ、したがって共通する標的の診断時間と共に、複雑で包括的なアッセイにかかるコストを減らす。このアプローチの有益性は、疾患または障害のパネルが、平行ではなく連続的に単一のサンプルから分析可能であることであり、それによって、より可能性のある疾患または障害がまず分析され、およびサンプル中で関連する分析物の検出に失敗したために最初のより可能性のある障害が除外された場合に限り、より稀な障害の検出のための試薬が使われる。すなわち、場合によってはより稀な障害の核酸マーカー等のマーカーに関して連続的に、および障害の可能性のある要因またはそうでなければ障害のマーカーに関連する分析物がサンプル中で検出されるまでのみ、平行ではなく連続的に単一のサンプルが分析される。システムが自動化されると、サンプル処理における手動での作業は最小限になり、したがって使用される試薬の量は減り、または最小限になり、なぜなら稀な、または可能性の低い障害に関連する分析物の検出のための試薬は、より一般的またはより可能性のある障害がアッセイされ、存在しないとされた時にのみ使用されるからである。
【００２５】
＜システムと方法＞
図１は、本明細書に記載の１つ以上の分析システムを使用した、標的核酸の検出および／または定量化の典型的なワークフロー（１００）を表す。場合によっては、標的核酸の濃度は不明である。図１を参照すると、ブロック（１０２）において、生のサンプルを調製することができる。いくつかの実施形態において、生のサンプルの調製は、内蔵システムで行うことができる。例えば、システムは、生のサンプルの調製のための試薬を保管するように構成された１つ以上のコンポーネントを含むことができる。標的核酸を含む、血液、尿、血清、リンパ、唾液、および／または汗等の生のサンプルは、処理のための分析システムに直接提供することができる。ブロック（１０４）において、標的核酸を含むサンプルは、分析システムの流れ経路に注入することができる。いくつかの実施形態において、システムは、流れ経路にサンプルの望ましい容積を注入するように構成されたゼロデッドボリュームのインジェクタを含むことができる。ゼロデッドボリュームのインジェクタは、分散相においてサンプル核酸を含むエマルジョンを形成するように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、インジェクタは、連続相においてサンプル核酸を含む小滴の第１の集団を形成するように構成することができる。ブロック（１０６）において、多くの試薬および／または賦形剤を、分析システムの経路に注入することができる。いくつかの実施形態において、システムは、流れ経路に望ましい量の試薬を注入するように構成されたゼロデッドボリュームのインジェクタを含むことができる。ゼロデッドボリュームのインジェクタは、分散相で試薬を含むエマルジョンを形成するように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、インジェクタは、連続相において試薬を含む小滴の第２の集団を形成するように構成することができる。連続相は、サンプル核酸を含む小滴の第１の集団のものと同じであってもよい。ゼロデッドボリュームのインジェクタは、サンプルに使用されるものと同じ、または異なるものでもよい。
【００２６】
ブロック（１０８）において、分散相の量を合体させることができる。例えば、第１の分散相と第２の分散相を合体させることができる。いくつかの実施形態において、システムは、合体された小滴を提供するために少なくとも１つの分散相のコンポーネントを合体するように構成されたコアレッサーを含む。いくつかの実施形態において、合体された小滴は、望ましい化学反応（例えばＰＣＲを含む、核酸増幅）に適した核酸と試薬を含む。例えば、第１の集団からの小滴は、第２の集団の小滴と合体させることができる。ブロック（１１０）において、分散相容積コンポーネントを混合することができる。いくつかの実施形態において、合体された小滴内での混合は、小滴内の試薬および／またはサンプル核酸の望ましい分布を促すように誘導され得る。いくつかの実施形態において、混合は、小滴内の試薬および／または核酸の一様な分布を促すために行なわれる。ブロック（１１２）において、小滴を生成することができる。いくつかの実施形態において、多数の小滴は、システムでの下流処理にとって望ましい量の小滴を提供する等のために、合体された小滴から生成することができる。多数の小滴の各々は、望ましい化学反応（例えばＰＣＲを含む、核酸増幅）に適した核酸と試薬を含み得る。ブロック（１１４）において、小滴内の反応を引き起こすことができる。例えば、小滴内の反応が引き起こされ得るように、核酸と試薬を含む小滴は、分析システムのリアクタを通って流れることができる。いくつかの実施形態では、リアクタはサーモサイクラーを含む。例えば、小滴は、小滴内の望ましい核酸増幅反応を引き起こすために、サーモサイクラーを通過することができる。ブロック（１１６）において、反応の生成物の検出を行なうことができる。小滴内の生成物を感知することができるように、反応の生成物を含む小滴は、検出器を通過することができる。ブロック（１１８）において、濃度を計算することができる。小滴内の反応生成物の濃度は、検出器によって提供される情報に基づいて算出することができる。
【００２７】
いくつかの例では、標的分子は核酸である。例えば、標的分子はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。本明細書に記載される１つ以上のシステムによって処理される標的核酸は浮動性であり得、または生存生物または非生存生物に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のシステムは、生存または非生存生物内に含まれている標的核酸を抽出するように構成することができる。例えば、１つ以上のシステムは溶解反応を行なうように構成することができる。場合によっては、溶解が内蔵システムで行われる。いくつかの例では、１つ以上のシステムは、溶解剤を含むリザーバを含むことができる。溶解は、機械的に、酵素によって、化学的に、熱によって、音波によって、超音波によって、またはそれらのいくつかの組み合わせで、行うことができる。例えば、化学的溶解は、システムにおいてタンパク質、脂質、および／または他の非核酸物質を分解するために使用される。溶解反応に続いて、ろ過工程を、溶解反応のろ過生成物に対してシステム内で行うことができ、その結果、対象の核酸をシステム内でのさらなる処理のために保存することができる。
【００２８】
場合によっては、溶解は内蔵ではないシステムで行なわれる。場合によっては、溶解システムのコンポーネントは使い捨てであり得る。代替的にまたは組み合わせて、溶解は、研究所の職員等のユーザーによって行なわれる。
【００２９】
いくつかの例では、標的核酸は、細胞、ウイルスまたは病原菌から分離される。いくつかの例では、標的核酸は、被験体の体液から単離される（例えば血液、尿、血清、リンパ、唾液、および／または汗）。場合によっては、標的核酸は組織から単離される。いくつかの実施形態において、標的核酸は、本明細書に記載される溶解と続くろ過によって、細胞から単離される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、単離された核酸は、液体内に閉じ込めることができる。閉じ込められた核酸は、いくつかの例ではその後、エマルジョンを形成するために不混和性の流体と混合される。例えば、単離された核酸を、エマルジョンの分散相に含むことができる。いくつかの例では、不混和性の流体は油脂である。典型的な油脂は、フッ化油脂、シリコン油、炭化水素油、および／または鉱油である。場合によっては、不混和性の流体は、油脂と１つ以上の界面活性剤を含む。場合によっては、不混和性の流体と液体の差分密度は、重力による２つの流体の分離を可能にする。
【００３１】
＜インジェクタ＞
ほとんどの場合にＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルは、インジェクタバルブを通って、本明細書に記載されるシステムに導入される。図２は、いくつかの実施形態に係る、典型的なシステム（２００）の概略図を表す。システム（２００）は、第１の分散相（２０１）用のリザーバ、第１の連続相（２０３）用のリザーバ、第２の分散相（２０５）用のリザーバ、第２の連続相（２０７）用のリザーバ、ゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２１１）、コアレッサー（２１３）、リアクタ（２１９）、および検出器（２２１）を含む。
【００３２】
第１の分散相（２０１）用のリザーバと第１の連続相（２０３）用のリザーバは、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）に、第１の分散相と第１の連続相をそれぞれ供給するように構成される。第２の分散相（２０５）用のリザーバと第２の連続相（２０７）用のリザーバは、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２１１）に、第２の分散相と第２の連続相をそれぞれ供給するように構成される。いくつかの実施形態において、第１の分散相と第２の分散相は、核酸の分析を可能にするために、システム（２００）による分析のための核酸、および／または化学反応用の試薬を含む水溶液であり得る。いくつかの実施形態では、第１の連続相と第２の連続相は、１つ以上の油脂および／または１つ以上の界面活性剤を含んでもよい。
【００３３】
図２を参照すると、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）の第１の入口（２３１）は、第１の分散相（２０１）のリザーバの出口と流体連通し、および第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）の第２の入口（２３３）は、第１の連続相（２０３）のリザーバの出口と流体連通している。第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）は、第１の分散相と第１の連続相を含む。ゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）によって形成された第１の分散相と第１の連続相は、システム（２００）でのさらなる処理のためにゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）の出口（２３５）を通って出ていくことができる。
【００３４】
ゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）は、コアレッサー（２１３）および／または第１の出口または廃棄物（２１５）と流体連通することができる。いくつかの実施形態において、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）によって形成された第１の分散相と連続相の少なくとも一部が、コアレッサー（２１３）に供給される。いくつかの実施形態において、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２０９）によって形成された第１の分散相と第１の連続相の少なくとも一部が、第１の出口または廃棄物（２１５）に供給される。時に、接続はＴ字路である。いくつかの例では、第１の出口または廃棄物（２１５）からの第１の分散相と第１の連続相は、廃棄物リザーバで回収され、または捨てられる。いくつかの例では、第１の出口または廃棄物（２１５）からの第１の分散相と第１の連続相は、再使用のためにリサイクルされ得る。場合によっては、第１の出口または廃棄物（２１５）は、管とポンプを含む。いくつかの実施形態において、分散相は分散相容器に再利用される。この分散相容器は分散相（２０１）のソースであり得る。代替的にまたは組み合わせて、分散相容器は、分散相容器に含まれるサンプルに行われるさらなる反応またはアッセイを可能にするために、取外し可能である。
【００３５】
図２を参照すると、第２の分散相は、化学反応の第２のコンポーネントを含むことができる。第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２１１）の第１の入口（２３９）は、第２の分散相（２０５）用のリザーバから第２の分散相を受け入れるように構成することができる。いくつかの実施形態において、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２１１）の第２の入口（２４１）は、第２の連続相（２０７）用のリザーバから第２の連続相を受け入れるように構成される。いくつかの例では、第１の連続相と第２の連続相は同じリザーバに保管することができる。さらに本明細書で詳細に記載されるように、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２１１）は、第２の分散相と第２の連続相を形成するように構成することができる。第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ（２１１）は、コアレッサー（２１３）に、第２の分散相と第２の連続相の少なくとも一部を供給するように構成された出口（２３７）を含むことができる。いくつかの実施形態において、システム（２００）は、出口または廃棄物（２１７）に、第２の分散相と第２の連続相の少なくとも一部を供給するように構成することができる。出口または廃棄物（２１７）は、廃棄物と接続され、リサイクルされ、または保管容器に接続されたものと、流体連通していてもよい。
【００３６】
さらに本明細書で詳細に記載されるように、コアレッサー（２１３）は、分散相の小滴等の分散相容積を合体させるように構成することができる。コアレッサー（２１３）は、リアクタ（２１９）と流体連通することができる。リアクタ（２１９）は化学反応を引き起こすように構成することができる。リアクタ（２１９）によって引き起こされた化学反応の生成物が、検出器（２２１）によって観察および／または分析可能なように、リアクタ（２１９）は検出器（２２１）と流体連通することができる。
【００３７】
反応流れ経路は様々な物質で構成することができる。いくつかの例では、反応流れ経路は、シリコンまたはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）等のポリマーから造られたマイクロボアチューブを含む。チューブの直径は、少なくとも０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、または３．０ｍｍ以上であり得る。いくつかの例では、チューブの直径は、多くとも０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、または３．０ｍｍ以上である。チューブの直径は、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、または３．０ｍｍ、あるいはこれらの数値の範囲内である。反応流れ経路は場合によっては、ミルにかけられた、または物質にエッチングされた１セットの流れチャネルを含む。物質は、ガラス、シリコン、金属、セラミック、または他の物質を含むことができ、およびチャネルは、例えば、アブレーション、エッチング、鋳造、穴あけ、またはポーキングの少なくとも１つによって作成される。いくつかの例では、反応流れ経路は、物質へと成形された管のセグメントと流れチャネルのセグメントを含む。
【００３８】
いくつかの例では、第１の連続相（２０３）のリザーバと第２の連続相（２０５）のリザーバ、シリンジ、および／または単回用量容器または補充可能な容器を含む容器、の少なくとも１つを含むことができる。いくつかの実施形態において、圧力源は、システム（２００）を通じて注入するために使用される。圧力源は、シリンジ、ダイアフラム、ぜん動ポンプ、往復ポンプ、遠心ポンプ、および／または真空ポンプ等のポンプであり得る。いくつかの例では、システム（２００）は、例えば、リザーバ（２０１）（２０３）（２０５）（２０７）の１つ以上を再充填することを含む、システム（２００）の１つ以上のコンポーネントの動作を制御するように構成されたコントローラを含む。例えば、コントローラは、シリンジポンプのレベルが低い場合等に、例えば注入の完了後に、および／または反応の完了後に、リザーバが自動的に再充填されるように、ポンプを制御するように構成されてもよい。
【００３９】
図３は、いくつかの実施形態に係る、典型的なシステム（３００）の概略図である。いくつかの実施形態において、システムはポアソン分布に従って反応アッセイを行なう。図３に示されるように、システム（３００）は、連続相ソース（３０１）、第１の分散相ソース（３０３）、第２の分散相ソース（３０５）、コアレッサー（３０７）、小滴生成装置（３０９）、リアクタ（３１１）、および検出器（３１３）を含むことができる。いくつかの実施形態において、連続相ソース（３０１）は、流れチャネル（３１５）等を介して、第１の分散相ソース（３０３）の入口と流体連通するように構成することができる。第１の分散相と第１の連続相は結合することができる。いくつかの実施形態において、連続相ソース（３０１）は、流れチャネル（３１９）等を介して、第２の分散相ソース（３０５）の入口と流体連通するように構成することができる。いくつかの例では、第２の分散相と第２の連続相は結合される。第１および第２の分散相と第１および第２の連続相を含むエマルジョンは、コアレッサー（３０７）に供給され得る。第１および第２の連続相は同じ組成を有し得る。例えば、第１および第２の分散相は、共通の連続相にある場合もある。コアレッサー（３０７）は、小滴生成装置（３０９）と流体連通することができる。小滴生成装置（３０９）は、リアクタ（３１１）と流体連通することができる。リアクタ（３１１）は、検出器（３１３）と流体連通することができる。
【００４０】
システム（３００）は、第１の連続相ソース（３０１）、第１の分散相ソース（３０３）、第２の分散相ソース（３０５）、コアレッサー（３０７）、小滴生成装置（３０９）、リアクタ（３１１）、および検出器（３１３）の１つ以上等の、システム（３００）の１つ以上のコンポーネントの動作を制御するように構成されたコントローラ（３２１）を含んでもよい。
【００４１】
図４は、いくつかの実施形態に係る、別の典型的なシステム（４００）の概略図である。いくつかの実施形態において、システムは、小滴へと分割されない分散相で反応を行なう。システム（４００）は、連続相ソース（４０１）、第１の分散相ソース（４０３）、第２の分散相ソース（４０５）、コアレッサー（４０７）、リアクタ（４０９）、および検出器（４１１）を含むことができる。システム（４００）の流れ経路は、流れ経路が小滴生成装置を含まないことを除けば、図３に関連して記載されるシステム（３００）のそれに類似する。流体は、小滴生成装置を通過することなく、コアレッサー（４０７）からリアクタ（４０９）まで流れる。システム（４００）は、そのコンポーネントの１つ以上の動作を制御するためにコントローラ（４１３）を含むことができる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、システムは、望ましいエマルジョンのエマルジョンの形成のために、独立したインジェクタを有することができる。例えば、図５のように、インジェクタは独立して配列することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、１つのインジェクタは、複数の分散相を注入するために使用することができる。いくつかの実施形態において、図６に示されるように、システムは、１つのインジェクタへの流れを制御するように構成された切換弁を含むことができる。場合によっては、システムは、図７に示されるように、多数のポートを有するインジェクタを含むことができる。時には、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くのインジェクタがある。場合によっては、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多くのポートがある。時には、少なくとも、約、または多くとも１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値の範囲内のインジェクタがある。場合によっては、少なくとも、約、または多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはこれらの数値の範囲内のポートがある。
【００４４】
＜インジェクタ＞
上記のゼロデッドボリュームのインジェクタ等のゼロデッドボリュームのインジェクタは、そこを通る多数の流路を有し得る。流路は、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口を含むことができる。いくつかの例では、入口は、外部ソースからシステムに導入される、サンプル核酸および／または試薬を含む多くの流体等の、多くの流体を許容する。例えば、サンプル核酸および／または試薬のためのソースは、システムの外側にあってもよい。いくつかの実施形態において、入口は、サンプル核酸および／または試薬がリザーバ内蔵システムからシステムの１つ以上の下流コンポーネントに移されることを可能にする。代替的にまたは組み合わせて、出口は廃棄物のためのものである。場合によっては、１つ以上のポンプは、サンプル核酸および／または試薬をインジェクタに装填する、および／またはサンプル核酸および／または試薬を下流コンポーネントに流すために使用することができる。例えば、サンプル核酸は、導入ポンプを使用してインジェクタの入口に装填することができる。
【００４５】
いくつかの例では、多数の流路は同時に使用される。いくつかの例では、インジェクタには少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８の流路がある。いくつかの例では、インジェクタには最大で１、２、３、４、５、６、７、または８の流路がある。いくつかの例では、インジェクタは、約１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値範囲内の流路を有する。典型的な流路は、サンプルの装填または注入を可能にする。いくつかの例における流路は、手動で選択される。場合によっては、流路は自動的に選択される。場合によっては、ソフトウェアは、自動または手動で流路を選択するために使用される。流路は、システムに注入される流体の望ましい量に部分的に基づいて選択されてもよい。時に、ソフトウェアは、あらかじめロードされた式に基づいて注入量を調整するための情報を含む。場合によっては、ユーザーは、サンプル核酸および／または試薬が提供された後に、追加入力を提供しない。例えば、システムは、提供されるサンプルおよび／または試薬の種類に部分的に基づいて、インジェクタ内の流路を選択するように構成することができる。多数の流路の使用はしばしば、特に標的分子の濃度が異なる場合に、流体を定量化する際の柔軟性、より大きなダイナミックレンジを可能にする。
【００４６】
図８は、いくつかの実施形態に係る、インジェクタの動作の典型的なワークフロー（８００）を表す。ブロック（８０２）において、インジェクタの第１の入口は、インジェクタのドラムの固定された内部容積に合わせて配置することができる。ブロック（８０４）において、分散相は、インジェクタの第１の入口を通過することができる。例えば、固定された内部容積が分散相によって満たされるまで、分散相を、インジェクタの第１の入口を通して固定された内部容積へと流すことができる。固定された内部容積にある分散相の容積は、固定された内部容積に等しい、または実質的に等しい。ブロック（８０６）において、ドラムは、ドラムの固定された内部容積を密封するために回転させることができる。ブロック（８０８）において、インジェクタの第２の入口は、固定された内部容積に合わせて配置することができる。ブロック（８１０）において、連続相は、分散相が変位するまで、第２の入り口を通って流れることができる。例えば、第２の入口は、連続相用のソースと流体連通することができ、および固定された内部容積は、下流コンポーネントに流体流動を提供するように構成された出口と流体連通することができる。連続相は、連続相ソースから固定された内部容積へと流れることができ、連続相は、固定された内部容積に既にある分散相を押し出す。連続相が固定された内部容積を満たし、すべての分散相を変位させるまで、連続相は流れることができる。分散相を変位させるために流される連続相の容積は、固定された内部容積に等しい、または実質的に等しくてもよい。ブロック（８１２）において、ドラムを、固定された内部容積を密封するために回転させることができる。
【００４７】
いくつかの例では、入口チューブはインジェクタに接続される。時に、インジェクタは回転弁である。インジェクタは少なくとも２つの界面を有し得る。いくつかの例では、インジェクタは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの界面を有する。いくつかの例では、インジェクタは、少なくとも、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの範囲内の数の界面を有する。いくつかの例では、インジェクタの面は、分散相よりも連続相に親和性がある。例えば、インジェクタの面は、油脂への親和性を有し、かつ水相をはね返すことができる。いくつかの例では、インジェクタの面は、疎水性または撥水性の少なくとも１つである。
【００４８】
図９は、インジェクタのコンポーネントを表す。図１０は、インジェクタの入口と出口の配置を表す。図１１は、インジェクタの腔の配置を表す。図１２は、インジェクタの腔の代替的な配置を表す。
【００４９】
場合によっては、サンプルはインジェクタの回転ドラムに入る。典型的な円筒巻胴（１３１３）の概略的な断面図は、図１３に表される。円筒巻胴（１３１３）は、キャップカバー（１３０３）（１３１５）、および固定された内部容積（１３１１）を有する内部チャンネルを含む。各キャップカバー（１３０３）（１３１５）は、固定された内部容積を出入りする流体流動のためのそれぞれのチャネルを含む。キャップカバー（１３０３）は、チャネル（１３０５）（１３０９）を含み、およびキャップカバー（１３１５）は、チャネル（１３１７）（１３１９）を含む。いくつかの実施形態において、チャネル（１３０５）は、インジェクタの入口（１３０１）に合わせて配置されるように構成することができる。いくつかの実施形態において、チャネル（１３０９）は、インジェクタの入口（１３０７）に合わせて配置されるように構成することができる。入口チャネル（１３０１）は、分散相の供給に接続され得る。入口（１３０７）は、連続相の供給に接続され得る。チャネル（１３１７）は、インジェクタの出口（１３２１）に合わせて配置されるように構成することができる。チャネル（１３１９）は、インジェクタの出口（１３２３）に合わせて配置されるように構成することができる。いくつかの実施形態において、ドラムのチャネルの全ての面は、連続相への親和性を有するコーティングを含む。時には、ドラムのチャネルの全ての面は疎水性コーティングを含む。いくつかの実施形態において、ドラムのチャネルの全ての面は親水性コーティングを含む。
【００５０】
第２の典型的なドラム（１４１３）の断面図は、いくつかの実施形態に従って図１４に表される。円筒巻胴（１４１３）は、キャップカバー（１４０３）（１４１７）、第１の固定された内部容積を含む第１の内部チャンネル（１４１１）、および第２の固定された内部容積を含む第２の内部チャンネル（１４１５）を含む。各キャップカバー（１４０３）（１４１７）は、内部チャンネル（１４１１）または（１４１５）を出入りするために流体流動のためのチャンネルを含む。チャネル（１４０５）は、インジェクタ（１４１３）の第１の入口（１４０１）に合わせて配置されるように構成することができる。チャネル（１４０９）は、インジェクタ（１４１３）の第２の入口（１４０７）に合わせて配置されるように構成することができる。チャネル（１４１９）は、インジェクタ（１４１３）の第１の出口（１４２１）に合わせて配置されるように構成することができる。チャネル（１４２３）は、インジェクタ（１４１３）の第２の出口（１４２５）に合わせて配置されるように構成することができる。第１の内部チャンネル（１４１１）は、チャネル（１４０５）とチャネル（１４２１）に合わせて配置されるように構成することができる。第２の内部チャンネル（１４１１）は、チャネル（１４０９）とチャネル（１４２５）に合わせて配置されるように構成することができる。２つの内部チャンネルの使用は、１つのチャネルを充満し、同時に他方のチャネルを空にしておくことができる。例えば、第１の内部チャンネル（１４１１）または第２の内部チャンネル（１４１５）の１つに流体を注入することができ、同時に他方は洗浄される。いくつかの実施形態において、ドラムのチャネルの全ての面は、疎水性または撥水性のコーティングを含む。いくつかの実施形態において、ドラムのチャネルの全ての面は親水性コーティングを含む。
【００５１】
図１５は、インジェクタの腔の種々の配置を表す。
【００５２】
場合によっては、ドラムは、本明細書に記載される固定された容積を有する内部チャンネル等の、少なくとも１つの流体チャンバを含む。場合によっては、ドラムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの流体チャンバを含む。場合によっては、ドラムは、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値の範囲内の流体チャンバを含む。チャンバの容積は、約１マイクロリットル（μＬ）から約５０μＬまでに及び得る。場合によっては、チャンバの容積は、少なくとも約１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、または５００μＬより大きい。場合によっては、チャンバの容積は、最大約１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、または５００μＬより大きい。場合によっては、チャンバの容積は、約１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、または５００μＬ、あるいはこれらの数値の範囲内である。場合によっては、チャンバの容積は、少なくとも１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、または５００μＬより大きい。場合によっては、チャンバの容積は、多くとも１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、または５００μＬより大きい。場合によっては、チャンバの容積は、少なくとも、多くとも、または約０．０１ピコリットル（ｐＬ）、０．０５ｐＬ、０．１ｐＬ、０．５ｐＬ、１ｐＬ、５ｐＬ、１０ｐＬ、１５ｐＬ、２０ｐＬ、２５ｐＬ、３０ｐＬ、３５ｐＬ、４０ｐＬ、５０ｐＬ、７５ｐＬ、１００ｐＬ、２５０ｐＬ、５００ｐＬ、１０００ｐＬ、０．０１ナノリットル（ｎＬ）、０．０５ｎＬ、０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、５ｎＬ、１０ｎＬ、１５ｎＬ、２０ｎＬ、２５ｎＬ、３０ｎＬ、３５ｎＬ、４０ｎＬ、５０ｎＬ、７５ｎＬ、１００ｎＬ、２５０ｎＬ、５００ｎＬ、１０００ｎＬ、０．０１マイクロリットル（μＬ）、０．０５μＬ、０．１μＬ  ０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１０００μＬ、１ミリリットル（ｍＬ）、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、または１０ｍＬ、あるいはこれらの数値の範囲内である。いくつかの例では、ドラムは複数のチャンバを含む。いくつかの実施形態において、ドラムは、ドラムの他のチャンバのものとは異なる容積を有する１つのチャンバを含む。
【００５３】
しばしば、インジェクタドラム内の核酸および／または試薬のサンプルの適当な位置は、ドラムのチャンバが核酸のサンプルおよび／または試薬によって完全に満たされた場合に規定され、ここでサンプルは、廃棄物ストリームに向かう余分な連続相とサンプルでドラムのチャンバを過剰に満たすことによって、ドラム内の連続相を変位させている。いくつかの場合にはサンプルの容積は、チャンバのサイズと等しい。これはサンプルの取り扱いを自動化することができる。
【００５４】
インジェクタドラムにあるサンプルに続いて、いくつかの例ではドラムを回転させ、その後にサンプルが下流の流路を通ってコアレッサーへと流れる。回転はモーターによって生じ得る。いくつかの例では、回転は、位置切替器を有するソレノイドを使用して行なわれる。時にサンプルは、サンプルインジェクタポンプを使用して、流路を通ってコアレッサーに向かう。いくつかの例では、ドラム内のサンプルは廃棄物出口に流れ込まない。いくつかの例では、ドラム内にないサンプルは流体経路にあり、かつ装填されている。時に、ドラム内にないサンプルは流体経路にあり、かつ装填されていない。
【００５５】
しばしば、下流の経路を通過するサンプルと接触する面は、不混和性の流体で下塗りされる。場合によっては、面はフッ化油脂等の油脂で下塗りされる。場合によっては、油脂は、サンプル中の標的分子が機器の面と接触するのを防ぐ。
【００５６】
いくつかの例では、インジェクタは、プライマーとプローブが選択されることを可能にする。場合によっては、プライマーとプローブはあらかじめ設計され、かつあらかじめ調製され、したがってユーザーはアッセイのために試薬を準備する必要がない。いくつかの例では、システムは、プライマーとプローブのリザーバに接続された切換弁を含む。リザーバは単回充填用または補充可能であり得る。いくつかの例では、リザーバは分離することができる。
【００５７】
＜カセット＞
サンプルに加えて、時には酵素、ｄＮＴＰ、プライマー、およびプローブ等の少なくとも１つの試薬もまた、ＰＣＲ等の核酸増幅に必要とされる。時に、カセット等のバルブは、本明細書に記載されるシステムに少なくとも１つの試薬を提供する。いくつかの例では、カセットは、設定容積であらかじめ装填された少なくとも１つのチャンバを含む。場合によっては、カセットは、液体が保管され、その後に装填されることを可能にする。しばしば、カセットには少なくとも２つの界面がある。いくつかの例では、噴射弁には少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの界面がある。いくつかの例では、噴射弁は、約、または多くとも１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値の範囲内の界面を有する。いくつかの例では、カセットは１つの流路を含む。例えば、１つの流路を有するカセットは、流体が１つの流路で装填と抜き取りをされることを可能にする。いくつかの例では、カセットバルブは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの流路を有する。いくつかの例では、カセットバルブは、約または多くとも１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値の範囲内の流路を有する。いくつかの例では、多数の流路が同時に使用される。
【００５８】
場合によっては、カセットはドラムを含む。ドラムは、例えば少なくとも１つの流体チャンバを有する。チャンバの容積は、約１μＬから約５０μＬの範囲であり得る。いくつかの実施形態のチャンバの容積は、約．０５ピコリットル（ｐＬ）から約５ミリリットル（ｍＬ）に及ぶ。場合によっては、チャンバの容積は、少なくとも約０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、または５００μＬである。場合によっては、チャンバの容積は、最大約０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、または約５００μＬより大きい。場合によっては、チャンバの容積は、少なくとも０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、または５００μＬである。場合によっては、チャンバの容積は、最大約０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、または約５００μＬより大きい。場合によっては、チャンバの容積は、約０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、または５００μＬ、あるいはこれらの数値の範囲内である。場合によっては、チャンバの容積は、少なくとも、多くとも、または約０．０１ピコリットル（ｐＬ）、０．０５ｐＬ、０．１ｐＬ、０．５ｐＬ、１ｐＬ、５ｐＬ、１０ｐＬ、１５ｐＬ、２０ｐＬ、２５ｐＬ、３０ｐＬ、３５ｐＬ、４０ｐＬ、５０ｐＬ、７５ｐＬ、１００ｐＬ、２５０ｐＬ、５００ｐＬ、１０００ｐＬ、０．０１ナノリットル（ｎＬ）、０．０５ｎＬ、０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、５ｎＬ、１０ｎＬ、１５ｎＬ、２０ｎＬ、２５ｎＬ、３０ｎＬ、３５ｎＬ、４０ｎＬ、５０ｎＬ、７５ｎＬ、１００ｎＬ、２５０ｎＬ、５００ｎＬ、１０００ｎＬ、０．０１マイクロリットル（μＬ）、０．０５μＬ、０．１μＬ、０．５μＬ、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、７５μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１０００μＬ、１ミリリットル（ｍＬ）、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、または１０ｍＬ、あるいはこれらの数値の範囲内である。いくつかの例では、異なる容積を有する少なくとも２つのチャンバが存在する。カセットの面はしばしば、疎水性と撥水性の少なくとも１つである。
【００５９】
場合によっては、流体は、流体導入ポンプを使用してカセットを通り抜ける。いくつかの例では、カセットの装填または保管された流体は、測定された量の流体がある場合、バルブ内の位置へともたらされる。いくつかの例では、カセットは、バルブ内の流体の位置をモニタリングすることによって、バルブ内の位置にもたらされる。指定された量がカセットのドラムに含まれるまで、流体はしばしばカセットに導入される。場合によっては、第２の流体が、ドラムの第２のチャネルに導入される。場合によっては、ドラムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの流れチャネルを含む。場合によっては、ドラムは、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値の範囲内の流れチャネルを含む。
【００６０】
いくつかの例では、カセットは、試薬用のリザーバを含む。例えば、リザーバは核酸増幅試薬を含む。場合によっては、リザーバは補充可能である。場合によっては、リザーバからの試薬は、ゼロデッドボリュームのバルブを通り抜ける。
【００６１】
図１６は、カセットのコンポーネントを表す。図１７は、カセットの入口と出口の配置を表す。図１８は、カセットの腔の配置を表す。図１９は、カセットの腔の代替的な配置を表す。
【００６２】
＜重力トラップコアレッサー＞
いくつかの実施形態において、重力トラップコアレッサーは、２つ以上の分散相を合体するように構成することができる。いくつかの実施形態において、重力トラップコアレッサーは、第１の分散相と第２の分散相を合体するように構成することができる。例えば、エマルジョンは、第１の連続相に小滴を含む第１の分散相と、第２の連続相に少なくとも１つの小滴を含む第２の分散相を含む。重力トラップコアレッサーは、第３の小滴を形成するために、第１の分散相の小滴を第２の分散相の小滴と結合し、その結果として第３の小滴が、多数の分散した実体ではなく単一の実体として、本明細書に記載のシステムの１つ以上のコンポーネントによってさらに処理され得るように、構成することができる。いくつかの実施形態において、重力トラップコアレッサーは、第３の連続相で第３の小滴を生成するように構成することができる。いくつかの実施形態において、第１の連続相、第２の連続相、および第３の連続相は同じ組成である。例えば、第１の連続相、第２の連続相、および第３の連続相は、１つ以上の油脂および／または１つ以上の界面活性剤を含むことができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、試薬を含む第１の分散相の小滴は、試薬と標的分子の両方を含む第３の分散相の第３の小滴を生成するために、標的分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む第２の分散相の小滴と結合される。試薬は、プライマー、プローブ、転写酵素、緩衝液、およびｄＮＴＰの少なくとも１つであり得る。いくつかの例では、試薬の量を判定することができる。例えば、第１の分散相の小滴中の試薬の量は、第１および第２の分散相の小滴を溶け合わせることによって形成された小滴が、それらの間の望ましい化学反応に適した試薬と標的分子の量を含むことができるように、第２の分散相の小滴における標的分子の種類および／または量に基づいて選択することができる。
【００６４】
本明細書において記載されるように、分散相は水性であり得る。いくつかの例では、分散相は、水の約５１％以上（質量またはモル濃度による）を含む。いくつかの例では、連続相は、分散相と不混和性、または実質的に不混和性である。例えば連続相は疎水性であり得、例えばフッ化油脂等の油脂を含む。時に、試薬および／または標的分子は分散相の小滴に閉じ込められる。場合によっては、分散相は界面活性剤でコーティングされる。時に、界面活性剤は、インジェクタの連続相によって送達される。界面活性剤は、連続相内で分散相を安定させ、および／または分散相と連続相の間の相互汚染を防ぐことができる。代替的にまたは組み合わせて、分散相は疎水性であり、および連続相は親水性である。例えば、分散相は、フッ化油脂等の油脂を含んでもよく、および連続相は水性であってもよい。
【００６５】
適切であろう典型的なフッ化油剤は、特にＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＦＣ−３２８３、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、およびＦＣ−７０を含む、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）（３Ｍ）の商標名で販売されている。適切なフッ化油脂の他の例は、３−エトキシ−１，１，１，２，３，４，４，５，５，６，６，６−ドデカフルオロ−２−トリフルオロメチル−ヘキサンである、Ｎｏｖｅｃ（商標）ＨＦＥ  ７５００  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｉｄを含む、Ｎｏｖｅｃ（商標）（３Ｍ）の商標名で販売されている。場合によっては、フッ素含有化合物は、Ｎｏｖｅｃ（商標）ＨＦＥ  ７０００として売られるＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＨ３である。場合によっては、フッ素含有化合物は、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノールＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＯＨである。場合によっては、フッ化油脂は、パーフルオロオクタンまたはパーフルオロヘキサン等のパーフルオロカーボンである。場合によっては、フッ素含有化合物は、１，１，１−トリフルオロオクタンまたは１，１，１，２，２−ペンタフルオロデカン等の、部分的なフッ素化炭化水素である。
【００６６】
場合によっては、第１の標的分子を含む第１の分散相からの小滴は、第２の標的分子を含む第２の分散相からの小滴と合体される。時に、サンプルは、少なくとも２つの分散相からの核酸を含む。標的分子の第１の分散相が、標的分子の第２の分散相と合体される例において、標的分子の各分散相は識別可能である。例えば、ヌクレオチドの配列は、分散相の標的分子上に結合され、ここで配列は、標的分子のソースを識別するのに十分な特異性を提供する多くのヌクレオチドを含むことができる（例えばバーコード）。時には、標的分子はその後に配列決定され、および標的分子のソースが、ヌクレオチドの配列に基づいて識別され得る。
【００６７】
場合によっては、核酸の質量濃度またはモル濃度等の濃度が判定される。時に、濃度は、標的分子を配列するべきかどうかを評価するために使用される。濃度は、場合によっては希釈物により調整される。例えば、水は希釈のために使用される。代替的にまたは組み合わせて、試薬は希釈される。いくつかの例では、濃度は、核酸シーケンシングへの適合性を評価するために判定される。
【００６８】
本明細書に記載されるシステムの典型的な操作は、図２０に示される。装填状態では、ジャンクションの入口（２００１）（２００３）は分散相を含む。分散相はジャンクション（２０１７）の方向に移動する。（２０１５）が閉じている場合、ジャンクション出口の取外し可能な拘束は「閉じた」状態であり、および（２０１５）が開いている場合、ジャンクション出口は「開いた」状態である。ジャンクション出口（２０１３）は連続相を含む。外部ソースはジャンクション出口には提供されない。「装填」状態では、少なくとも２つ分散相はジャンクション出口に位置し、そこでそれらは重力（２００９）によって捕らえられる。しばしば、ジャンクションの第１の出口では、分散相の少なくとも２つ部分は結合されていない。
【００６９】
図２１を参照すると、第１と第２のジャンクションは、１つの入口のみを含む。いくつかの例では、ジャンクションは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの入口を有する。いくつかの例では、第２のジャンクションは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多くの入口を有する。いくつかの例では、ジャンクションは、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの数値の範囲内の入口を含む。ジャンクション入口は時には水平に配向され、そうすると、入口の断面に垂直な入口の軸は、局所重力場の方向に平行な軸に対して約７５°より大きい角度である。場合によっては、水平に配向された軸は、第２のジャンクション出口の断面に垂直な第１のジャンクション出口の軸に対して垂直であるように配向される。そのような場合、ジャンクションの出口に向かって移動する分散相の傾向が増す。時に、第１のジャンクション入口と第２のジャンクション入口は水平に対向しており、そうすると、入口の水平なコンポーネントの中心軸は、互いに対して１６０°未満の角度ではない。そのような場合、入口での連続相の対向する流れは、入ってくる分散相の部分を遅くし、および分散相の部分がジャンクション出口の方へ移動する傾向を高める。
【００７０】
図２２に見られるように、ジャンクション入口（２２０１）（２２０３）は、終了点で接合し、かつ出口ジャンクション（２２１５）に接続されたチャネル（２２０５）（２２０７）を形成する。いくつかの例では、ジャンクション入口は、少なくとも１つの点を出口に接続する。場合によっては、ジャンクション入口は、多数の点を出口に接続する。いくつかの例では、共通のチャネルは、出口ジャンクションを結合する前に形成される。図２２を参照すると、ジャンクションの出口は、別の点のジャンクション入口（２２０１）（２２０３）に接続する。これは、分散相がジャンクション出口で確実に捕らえられることを可能にする。
【００７１】
図２２に見られるように、ジャンクション入口（２２０１）（２２０３）とジャンクション出口（２２１１）は接続して共通のチャネルを形成する。図２３を参照すると、チャネルが垂直方向から外れる垂直チャンネルの第２の方向にある点に分散相が流れないように、出口はチャネルの長さを有している。図２３に見られるように、入口（２３０１）（２３０３）の中心軸が４５°未満の角度までチャネル（２３１５）の中心軸から外れるように、入口（２３０１）（２３０３）を含むチャネルの一部が配向される。これは、連続相に対するその相対速度の方向に合わせて配置されたジャンクションに入る場合、分散相が垂直速度を有することを可能にし得る。例えば、連続相より低い質量密度を有する分散相については、垂直速度は低下する重力場の強度の方向にある。分散相は連続相より高い質量密度を有するが、垂直速度は、増加する重力場の強度の方向にあり得る。いくつかの例では、偏位は２０°未満である。
【００７２】
図２３を参照すると、ジャンクションの入り口は垂直に配向され、そうすると、入口の断面に垂直な軸は、重力場の方向に平行な軸を有し、多くとも約４５°の角度で配向される。いくつかの例では、角度は多くとも約２０°である。低下する場の方向に対して向けられた垂直な配向は、ジャンクション出口に向かって移動する分散相の傾向を強めることができる。分散相の質量密度が連続相のそれ未満である場合、垂直な配向は、低下する重力場の方向に小さな角度を作るように配向され得る。分散相の質量密度が連続相より大きい場合、垂直な配向は、増加する重力場の方向に小さな角度を作るように配向され得る。
【００７３】
図２４を参照すると、可撓性ポリマー管のバルブ（２４１５）は、ジャンクション出口に必要な取外し可能な拘束を提供することができる。ジャンクション出口は、モノリス（２４２１）の第１の軸と同軸の経路（２４１３）に続く。いくつかの例では、ジャンクション出口は、モノリスの下平面を貫通しない。時に、ジャンクション出口は同軸方向から外れて、モノリスの円筒状の側平面を貫通する。いくつかの例では、ジャンクションの出口は、モノリスの下平面を通り抜けて続いている。場合によっては、出口は、漏れに耐性のあるシールでモノリスに取り付けられたチャネルによって、モノリスの平面を越えて続いている。
【００７４】
図２５は、いくつかの実施形態に係る、重力トラップコアレッサーの概略的な断面図を表す。図２５は、本明細書に記載される重力トラップコアレッサーを使用した少なくとも１つの標的分子の検出と定量化の典型的なワークフローを例示する。分散相の第１の部分は点（２５０３）においてデバイスに導入され、ここでそれは第１の流れチャネル（２５０７）を通って流れる。分散相の第２の部分は点（２５１９）においてデバイスに導入され、ここでそれは第２の流れチャネル（２５１５）を通って流れる。第１の流れチャネルと第２の流れチャネルはジャンクション（２５０５）で出会い、ジャンクションへの第１の入口と第２の入口と呼ばれる。ジャンクションは、そこを通って連続相と分散相がジャンクションを出ることができる第１の出口と第２の出口を有する。第１の出口と第２の出口は、第１の出口と第２の出口を含むチャネルの断面に垂直な中心軸を共有する。流体用の流路は、垂直またはほぼ垂直なセグメントを有する（「垂直チャンネル」と呼ばれる）。第１の出口に関しては、流れは、垂直チャンネル（２５１１）の取外し可能な拘束によって妨害される（「デッドエンド」）。第２の出口に関しては、流れは、無妨害（２５０９）で続くことが許される。
【００７５】
図２５を参照すると、出口の配向は、分散相の少なくとも１つの部分がデッドエンド（２５１１）の方へ移動することを可能にする。時に、分散相の密度は連続相未満であり、そうすると、デッドエンドを指し示す第１の出口の中心軸に合わせて配置された単位ベクターは、局所重力場に合わせて配置されたベクターから逸脱し、４５°未満の角度で低下する重力場の方向を指し示す。代替的にまたは組み合わせて、分散相の密度は連続相未満のそれよりも大きく、そうすると、デッドエンドを指し示す第１の出口の中心軸に合わせて配置された単位ベクターは、局所重力場に合わせて配置されたベクターから逸脱し、約４５°未満の角度で増加する重力場の方向を指し示す。偏位は変動することができる。いくつかの例では、偏位は、最大約１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°または４５°である。いくつかの例では、偏位は、少なくとも１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、または４５°以上である。いくつかの例では、偏位は、約１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°または４５°、あるいはこれらの数値の範囲内である。いくつかの例では、偏位は１０°未満である。
【００７６】
図２５では、分散相の少なくとも２つの部分は、ジャンクション（２５０５）の第１の出口にあるデッドエンドによって重力的に閉じ込められる。連続相は、自由にジャンクション（２５１７）の第２の出口を流れることができる。分散相の少なくとも１つの部分は、少なくとも１つの界面エネルギーを有し得る。例えば、第１の表面エネルギーを有する分散相の第１の部分が、第２の裏面エネルギーを有する分散相の第２の部分と結合する場合、結合された界面エネルギーはより低いだろう。しばしば、結合された界面エネルギーは、分散相の第１の部分と分散相の第２の部分により占められた全表面エリアの減少ゆえに、第１の表面エネルギーと第２の裏面エネルギーの合計より低い。いくつかの例では、エネルギーは、分散相の第１の部分と分散相の第２の部分を結合するために加えられる。
【００７７】
いくつかの例では、少なくとも１つの分散相は界面活性剤に囲まれる。界面活性剤は電気的に分極化可能である。外部ソースが適用されるいくつかの場合には、少なくとも１つの分散相は、外部ソースによる界面活性剤のかたよりゆえに歪められる。
【００７８】
図２６は、モノリスから形成されたジャンクションを示す。示されるように、モノリスはほぼ円筒状の形状をとる。モノリスの断面に垂直なモノリス（２６２１）の第１の軸が存在し、およびモノリスのジャンクションは、軸上の少なくとも１つの点を含む。モノリスは、ジャンクション入口（２６０３）（２６１９）およびジャンクション出口（２６１１）（２６１７）を含む。いくつかの例では、分散相は、連続相より低い質量密度を有する。ジャンクション出口（２６１７）は、モノリス（２６２１）の軸と同軸である。ジャンクション出口（２６１１）は、モノリス（２６２１）の上平面を通り抜けて続いている。いくつかの例では、ジャンクション出口は、モノリスの上平面に、漏れに耐性のあるシールでぴったり嵌められることによって、続いていく。いくつかの例では、チャネルは、少なくとも０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、または３．０ｍｍ以上の内径を有する管を含む。いくつかの例では、管の直径は、多くとも０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、または３．０ｍｍ以上である。管は、アブレーション、エッチング、鋳造、穴あけ、プレス嵌め、またはポーキングの少なくとも１つによって、モノリスにはめることができる。いくつかの例での管は、連続相用の高親和性の物質でコーティングされる。例えば、連続相がフッ化油脂である場合、管はフルオロポリマーでコーティングされる。
【００７９】
図２７は、重力トラップコアレッサーの例のコンポーネントを表す。図２８は、重力トラップコアレッサーの例の入口と出口の配置を表す。図２９は、重力トラップコアレッサーの例の腔の配置を表す。図３０は、重力トラップコアレッサーの例の腔の代替的な配置を表す。
【００８０】
いくつかの例では、分散相は、連続相よりも大きな質量密度を有し、およびジャンクション出口の配向は逆向きである。ジャンクション出口は、モノリスの上平面、モノリスの下平面、またはモノリスの円筒状の側平面の少なくとも１つを通り抜ける。ジャンクションの入口は、ジャンクションの軸にある少なくとも１つの点を含み、および入口は、モノリスの円筒状の側平面を通り抜けて続いている。いくつかの例では、モノリスの下平面と、ジャンクション入口がモノリスの円筒状の側平面と交差する点との間の距離は、モノリスの下平面から、ジャンクション入口がモノリスの円筒状の側平面と交差する点までの距離と等しくない。距離は、モノリスの下平面の断面に垂直なモノリスの下平面の円周点から、モノリスの円筒状の側平面の交差点とを含むモノリスの軸と入口ジャンクションの軸に垂直な平面上の点まで、測定することができる。場合によっては、これらの距離は同じである。いくつかの例では、モノリスの円周上で方位角位置から測定される第１の入口の方位角の位置は、ジャンクションの第２の入口の方位角の位置とは異なる。第１の入口と第２の入口の方位角の位置は同じであり得る。場合によっては、距離はアセンブリ考察を融通するように選ばれる。例えば、様々なジャンクションの漏れに耐性のあるシールが、大きなコネクタによって生成され、または低いプロフィールである場合、方位角の位置等の距離は、密封のサイズと位置に適合される。
【００８１】
場合によっては、連続相は、モノリスの面に接している。時に、連続相は、フッ化油脂である。いくつかの例では、分散相は撥水性物質を含む。典型的な撥水性物質はフルオロポリマーである。いくつかの例では、フルオロポリマーは、限定されないが、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシポリマー、フッ化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、ポリエチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、全フッ素置換されたエラストマー、フルオロカーボン、フッ素ゴム、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、パーフルオロスルホン酸（ＰＦＳＡ）、およびパーフルオロポリオキセタンを含む物質のリストから選択される。いくつかの例では、撥水性物質で流体経路を裏打ちまたはコーティングする必要をなくすように、モノリスの全体がフルオロポリマーから製造される。
【００８２】
本明細書に記載されるモノリスは、容易に製造することができる。例えば、ジャンクションは、旋盤またはボール盤上等での半二重操作で排出される。場合によっては、限定されないがモノリスは、鋼、アルミニウム、クロム、ニッケル、銅または鉄を含むリストからの金属から構成される。時に、連続相との流体接触を意図したモノリスの面は、撥水性物質で裏打ちまたはコーティングされる。いくつかの例では、裏打ちは、ジャンクションの入口と出口を含むモノリスの円筒状の開放領域へと、フルオロポリマーの輪状の切片を挿入することによって達成され、ここで、フルオロポリマーの外径と、モノリスの円筒状の開放領域の内径との間の違いは、フルオロポリマー切片が、モノリスの円筒状の開放領域の内径よりわずかに大きい外径である範囲であり、そうすると、モノリスの円筒状の開放領域の内径に垂直に圧縮して弾性力をかけ、およびモノリスに液密の密封を作ることができる。
【００８３】
連続相と接触するモノリスの面は撥水性物質でコーティングすることができる。いくつかの例では、コーティングは、限定されないが、化学蒸着（ＣＶＤ）、物理蒸着法（ＰＶＤ）、開始剤を用いた化学蒸着（ｉＣＶＤ）、原子層堆積（ＡＬＤ）、分子層堆積（ＭＬＤ）、常圧ＣＶＤ（ＡＰＣＶＤ）、減圧ＣＶＤ（ＬＰＣＶＤ）、超高真空ＣＶＤ（ＵＨＶＣＶＤ）、エーロゾルによるＣＶＤ（ＡＡＣＶＤ）、ダイレクトリキッドインジェクションＣＶＤ（ＤＬＩＣＶＤ）、マイクロ波プラズマによるＣＶＤ（ＭＰＣＶＤ）、プラズマＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）、および燃焼化学蒸着（ＣＣＶＤ）によって、達成される。
【００８４】
いくつかの例では、コアレッサーは取外し可能な拘束を含む。取外し可能な拘束は、ゲートバルブ、ニードルバルブ、ボールバルブ、回転ピン、または摺動ピンの少なくとも１つであり得る。物質のモノリスのジャンクション出口に対する例取外し可能な拘束によれば、円筒状のポートは、ジャンクションと点の断面に垂直なジャンクション出口の軸と同軸の点から伸びる。モノリスと適合性のある物質の円筒状のプラグは、ポートに挿入され、したがって実質的に、ジャンクションの第１の出口の断面をカバーする。円筒状のプラグの部分は、撥水性物質から構成されるジャンクション出口へと伸びる。分散相の部分が通過しないよう出口が閉まっているように、円筒状のプラグの開口部は、様々な回転位置を可能にする。出口が開き、分散相が出ていくことができるように、円筒状プラグの開口部はまた、様々な回転位置を可能にする。場合によっては、円筒状のプラグは、円筒状のポートの内径より大きな外径を有する。時に、堅い密封が、円筒状のプラグとモノリスの間に提供される。円筒状のプラグは弾性であり得る。いくつかの例では、回転位置の小さな範囲が認められる。
【００８５】
ジャンクション出口用の取外し可能な拘束の第２の例によれば、ジャンクションの出口は、モノリスにある第１の腔と、漏れに耐性のある密封によってモノリスに接続された流れチャネルを含む。取外し可能な拘束はバルブによって生成される。バルブは連続相と互換性をもつ物質から構成される。いくつかの例では、連続相はフッ化油脂、およびバルブは撥水性物質から構成される。バルブはゲートバルブまたはフルポートボールバルブであり得る。場合によっては、バルブゲートは完全にはバルブ本体と接触せず、分散相の通過を可能にする。バルブがフルポートボールバルブである場合、バルブのポートの内径は、入口または出口チャネルの内径と同じである。これは、分散相の部分が捕らえられ、破裂するのを防ぐことができる。
【００８６】
いくつかの例では、分散相は、静電力、磁力、圧迫力または剪断力等の物理的力または電子力を使用して合体する。力は外部ソースによって提供することができる。例えば、分散相が単離されるように、圧上昇が連続相に加えられる。いくつかの例では、水相が上昇し、かつ油脂は上昇しないように、コアレッサーは重力を使用する。円錐形状等のチャンバの形状は、合体を改善することができる。いくつかの例では、分散相の第１の部分と分散相の第２の部分は、自然に結合する。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の分散相が結合される。いくつかの例では、最大約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の分散相が結合される。いくつかの例では、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはこれらの数値の範囲内の分散相が結合される。いくつかの例では、合体に続いて、合体された小滴がさらに、荒々しい渦によって混ぜられる。例えば、荒々しい渦は、合体された小滴を混ぜるために、流体加速（例えば管の曲がり、またはＴＵＲＢＵＬＩＺＥＲを通じて）と層流勾配を通じて剪断力を使用する。
【００８７】
外部ソースは、合体状態中にジャンクション出口で提供される。ジャンクション入口と出口は分散相のみを含む。ジャンクション出口は分散相と連続相の両方を含む。ジャンクション出口にある取外し可能な拘束は「閉じた」状態である。ジャンクション出口は「開いた」状態である。「閉じた」状態では、分散相の部分は、取外し可能な拘束を越えて流れることはできない。いくつかの例では、連続相は取外し可能な拘束を越えて流れる場合もある。「平らな」状態では、分散相の少なくとも２つの部分が結合されている。ジャンクション出口にある取外し可能な拘束は開いており、出口を「開いた」状態にし、および結合された分散相と連続相にジャンクション出口を通過させる。ジャンクションの入口と出口は連続相を含む。ジャンクション出口は「開いた」状態である。外部ソースは、出口にはあてがわれない。いくつかの例では、出口は、取外し可能な拘束を含む。「平らな」状態の間、連続相がジャンクション出口を通って出ていくように、ジャンクション出口は閉じられる。「作動可能な」状態では、ジャンクション入口と出口は連続相を含む。ジャンクション出口は「閉じた」状態であり、かつジャンクション出口は「開いた」状態である。分散相の部分はシステムにはない。ジャンクションの出口で適用される外部ソースはない。少なくとも２つの分散相はジャンクション入口を通過する。
【００８８】
実施形態によれば、ジャンクション出口で提供される電源は、第１の電極と、ジャンクション出口の反対側に配置された第２の電極を含むことができる。電位差は、ジャンクション出口にわたるような電極間で生成される。電界は、ジャンクション出口の分散相を囲む界面活性剤を極性化し、少なくとも２つの分散相を結合するためにエネルギーを提供する。いくつかの例では、電極は、ジャンクション出口にわたって電場強度を高めるように、鋭い点として形成される。いくつかの例では、第１の電極は、モノリスの第１のポートに挿入され、および第２の電極は、モノリスの第２のポートに挿入される。いくつかの例では、電極間の電位差は少なくとも１００Ｖである。いくつかの例では、電位は、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、または４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、または１０００００Ｖ以上である。いくつかの例では、電位差は、最大約１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、または１０００００Ｖ以上である。いくつかの例では、電位差は、少なくとも、多くとも、または約１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、または１０００００Ｖ、あるいはこれらの数値の範囲内である。電位は、約５０−３０００，１００−２５０００、２００−２００００、３００−１８０００、４００−１７０００、５００−１６０００、６００−１５０００、７００−１４０００、８００−１３０００、９００−１２０００、１０００−１００００、１２００−８０００、１４００−７０００、１６００−６０００、１８００−５０００、および２０００−４０００Ｖの範囲であり得る。場合によっては、電位は約１０００Ｖから約１００００Ｖの範囲である。時に、電流は直流である。いくつかの例では、電流は、約１０ｋＨｚから１００ｋＨｚの範囲で交流する。場合によっては、交流は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または１５０ｋＨｚ以上である。いくつかの例では、交流は、最大約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または１５０ｋＨｚ以上である。場合によっては、交流は、多くとも、または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ｋＨｚ、あるいはこれらの数値の範囲内である。
【００８９】
いくつかの例では、分散相は、連続相の導電率より大きな導電率を有する。導通性の違いは、部分的または完全に電界を消去するように、電荷またはイオンの動きを引き起こすことができる。いくつかの例では、分散相の面は０でない表面電荷を有し、ここで異なる量の分散相は反対の電荷を有し、および互いに引きつけ合う。連続相はその後、変位させることができる。場合によっては、必要なエネルギーは、面を乱すために提供され、および分散相の容積を合体させる。
【００９０】
ジャンクションの第１の出口に外部ソースを加える追加の例によれば、取外し可能な拘束は、連続相と分散相の通過を防ぐことができる。入口ポートは、ジャンクション出口と取外し可能な拘束の間にある。入口ポートは、連続相で満たすことができ、および連続相における圧力を高める手段に接続される。装填状態の間、第１の取外し可能な拘束は開いているが、他方で第２の取外し可能な拘束は閉じており、その結果、分散相の部分は重力捕捉によって回収される。一旦、分散相の全ての部分が回収されると、第１の取外し可能な拘束は閉じられる。合体を開始することができ、ここで連続相の圧力は、結合すべき分散相の部分に関する順に、入口ポートで増加する。圧力は、往復ポンプまたはぜん動ポンプ等のポンプの少なくとも１つよって増加され得る。代替的にまたは組み合わせて、温度上昇が、分散相を合体させるために使用される。
【００９１】
＜小滴生成装置＞
いくつかの実施形態において、核酸のサンプルを含む第１の小滴と、試薬を含む第２の小滴の合体によって形成された、合体された小滴は、小滴生成装置に供給することができる。例えば、本明細書に記載されるコアレッサーによって生成された、合体された小滴は、小滴生成装置へと流すことができる。小滴生成装置は、多数の小滴へと合体させた小滴を分留するように構成することができる。いくつかの実施形態において、合体された小滴の分留により形成された多数の小滴の各々は、望ましい化学反応を行なうために十分な核酸と試薬を含む。
【００９２】
いくつかの例では、小滴生成装置は、合体された小滴等の流体を分留するように構成されたＴ字ジャンクションタイプの分留装置を含む。代替的にまたは組み合わせて、小滴は、流体撹拌で、微小流体流れジャンクションで、および／または自然に、生成される。合体された小滴はしばしば、本明細書に記載の１つ以上の油脂等の不混和性の流体として、小滴生成装置に運ばれる。小滴生成装置の面は、撥水性と疎水性の少なくとも１つであり得る。場合によっては、小滴生成装置はさらに、小滴を多数の小滴に分ける。
【００９３】
いくつかの実施形態において、小滴生成装置は、少なくとも約１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００、１６０００、１８０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、１０００万の小滴を生成するように構成することができる。場合によっては、小滴生成装置は、最大約１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００、１６０００、１８０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、１０００万の小滴を生成するように構成することができる。いくつかの実施形態において、小滴生成装置は、少なくとも、多くとも、または約１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００、１６０００、１８０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、または１０００万、あるいはこれらの範囲内の数の小滴を生成するように構成される。
【００９４】
いくつかの例では、小滴生成装置によって生成された小滴は、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、または１０００ミクロン（μｍ）の直径を有する。場合によっては、小滴は、多くとも約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、または１０００μｍの直径を有する。場合によっては、小滴は、少なくとも、多くとも、または約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、または１０００μｍ、あるいはこれらの数値の範囲内の直径を有する。
【００９５】
＜リアクタ＞
本明細書において、少なくとも１つの標的分子を検出して定量化するためのシステムが記載される。いくつかの例では、化学反応はリアクタによって引き起こされる。リアクタは、温度、電界、磁場、音響エネルギー、および化学反応を引き起こすように構成された電磁放射線ソースの少なくとも１つを含んでもよい。
【００９６】
いくつかの例では、リアクタはサーモサイクラーを含む。従来のサーモサイクラーは、反応が固定され、およびサーモサイクラー内の温度が決められた熱プロフィールに従って上昇または低下するように、作動する。本明細書に記載されるサーマルサイクラーは、固定されたそれぞれの温度である少なくとも２つの温度帯を含むことができる。温度は、リアクタがその反応を引き起こすように構成された化学反応に基づいて、選択され得る。サンプル核酸と望ましい化学反応用の試薬の量を含む小滴、または反応小滴はしばしば、少なくとも２つの温度帯との熱接点にもたらされる。場合によっては、異なる温度のゾーン間の交互の熱接点が達成可能であろうように、反応小滴はチャネルを通って流れる。その結果、このように構成されたサーモサイクラーは、しばしばより効果的である。
【００９７】
いくつかの例では、反応小滴は、あらかじめ規定された熱プロフィールを達成するためにリアクタまたはサーモサイクラーを通過する。熱プロフィールは、望ましい化学反応を引き起こすために選択することができる。いくつかの実施形態において、熱プロフィールは、核酸増幅反応を引き起こすために選択することができる。反応小滴は、反応小滴における核酸増幅を達成するためにリアクタまたはサーモサイクラーを通って流れることができる。例えば、反応小滴は、第１の規定時間の間に第１の温度で、および第２の規定時間の間に第２の温度で、保持することができる。いくつかの実施形態において、反応小滴と少なくとも２つの温度帯との間の熱接点は、望ましい熱プロフィールを達成するために振動させることができる。リアクタサーモサイクラーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または８以上のゾーンまたはソースを有し得る。いくつかの例では、リアクタまたはサーモサイクラーは、最大約１、２、３、４、５、６、７、または８のゾーンまたはソースを有する。リアクタまたはサーモサイクラーは、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、または８、あるいはこれらの範囲内の数のゾーンまたはソースを有し得る。場合によっては、ゾーンは特定温度を含む。ゾーン温度または温度ソースは、少なくとも約１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または９５℃であり得る。ゾーン温度または温度ソースは、少なくとも、多くとも、または約１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または９５℃以上、あるいはこれらの数値の範囲内であり得る。例えば、ゾーンまたはソースは、核酸増幅酵素の活性化等のために、９５℃の温度を有する。場合によっては、第１の温度帯または第１の温度ソースは、８５℃以下から９５℃以上の範囲の温度を有する。第２の温度帯または第２の温度ソースは、５５℃以下から７０℃以上の範囲であり得る。いくつかの例では、第２のゾーンまたは第２の温度ソースは、６０℃の、６０℃未満の、６０℃より高い、約６０℃、または６０℃以下の範囲の温度を有し得る。温度ゾーンまたは温度ソースに関する温度は、核酸の変性、核酸アニーリング、および核酸増幅反応の核酸拡張段階の少なくとも１つを可能にするように選択することができる。
【００９８】
サーモサイクラーはしばしば、種々の温度で維持されるように構成された１つ以上のコンポーネントに巻きつけられた管を含む。反応小滴が反応小滴に関する望ましい熱プロフィールを達成するように、反応小滴は管を通って流れることができる。いくつかの例では、管は加熱ブロックに巻き付いている。いくつかの実施形態において、サーモサイクラーは、２つの加熱ブロックに巻きつけられた管を含み、各加熱ブロックは、特定の温度で維持されるように構成されている。場合によっては、管はヘビ状に巻き付けられている。管は、約０．０００００１インチ（”）から約０．２５”の範囲の内部水力直径を有し得る。管は、約０．０００００１インチ（”）またはそれ未満から、約５．０”またはそれより大きい範囲の内部水力直径を有し得る。場合によっては、内径は、少なくとも約０．０００００１”、０．０００００５”、０．００００１”、０．００００５”、０．０００１”、０．０００５”、０．００１”、０．００５”、０．０１”、０．０５”、０．１”、０．５”または１．０”である。場合によっては、内径は、多くとも約０．０００００１”、０．０００００５”、０．００００１”、０．００００５”、０．０００１”、０．０００５”、０．００１”、０．００５”、０．０１”、０．０５”、０．１”、０．５”、１．０”、または１．０”以上である。場合によっては、内径は、少なくとも、多くとも、または約０．０００００１”、０．０００００５”、０．００００１”、０．００００５”、０．０００１”、０．０００５”、０．００１”、０．００５”、０．０１”、０．０５”、０．１”、０．５”、１．０”、１．５”、２．０”、２．５”、３．０”、３．５”、４．０”、４．５”、または５．０”、あるいはこれらの数値の範囲内である。いくつかの例でのサーモサイクラーは、チップ上に微小流れチャネルを含む。
【００９９】
いくつかの例では、反応時間は、管および／またはチャネル内の流量速度によって判定される。場合によっては、反応時間は、管および／またはチャネルの長さによって決定される。しばしば反応時間は、流速と長さの少なくとも１つを変化させることによって変えられる。場合によっては、反応小滴は、少なくとも２つの加熱ブロックに接する管および／またはチャネルを、二回以上、通過する。例えば、少なくとも２つの加熱ブロックに接する管および／またはチャネルを反応小滴が通り抜ける回数は、核酸増幅サイクルの数に対応することが可能である。
【０１００】
従来のサーモサイクラーでは、加熱ブロックのまわりに多数のラップを収容するために、チャネルの軸は、浮力による流出があるように配向される。具体的には、分散相の小滴は、完全にはチャンネル径を満たすことができず、および異なるサイズの小滴は、可能性として浮力により異なる速度で移動することができるだろう。これは可能性として、小滴の軸分散、小滴の衝突、および可能性のある合体、切断、および汚染をもたらす。
【０１０１】
本明細書において記載されるサーモサイクラーは、平面のまたは実質的に平面の構成に流れを抑制することにより、浮力のある流出を解消することができる。いくつかの実施形態において、サーモサイクラーは、スラブ構成を含む１つ以上の加熱ブロックを含む。加熱ブロックは、加熱カードであり得る。いくつかの実施形態において、サーモサイクラーは、各温度帯の加熱ブロックを含むことができる。いくつかの例では、管および／またはチャネルは、各加熱ブロックとの熱交換に入れられ、ヘビ状の形態で各ゾーン内を通過する。サーモサイクラーは、各加熱ブロックのまわりに巻き付くように構成された各加熱ブロックの外部にある管を含み、ここで管は、各加熱ブロックの最長寸法に垂直な方向に沿って移動する。
【０１０２】
例えば、サーモサイクラーは、１つ以上のブロックの各々の内部にチャネルを含む１つ以上のブロックを含む。チャネルは、加熱ブロックのまわりに巻き付き、およびその最長寸法に垂直な方向に移動することができる。典型的なチャネルは、加熱ブロック内に作られた微小流れチャネル、または加熱ブロック内に作られた微小流れチャネルの一部を含む。場合によっては、チャネルはキャッピング層を含む。時に、キャッピング層は、高い熱伝導率を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、サーモサイクラーは、１つ以上の加熱ブロックとの熱接点に管とチャネルの両方を含む。いくつかの実施形態において、サーモサイクラーは、加熱ブロックに付着した自己内蔵型の可撓管を含む。場合によっては、可撓管は、加熱ブロック上の望ましい面パターンに一致するように調整される。場合によっては、可撓性タブは、ブロックの面上のあらかじめカットされたチャネル内の加熱ブロックにぴったりはまる。
【０１０４】
場合によっては、サーモサイクラーは、伝導性熱伝達と温度の均一性の少なくとも１つを改善するように構成される。例えば、管と加熱ブロックの１つ以上の面との間等の、サーモサイクラー内の空隙を除去するために、これは高い熱伝導率ペーストの使用により行われる。
【０１０５】
いくつかの例では、サーモサイクラーは、増幅に先立って逆転写用の１つ以上の化学反応を引き起こす。場合によっては、これは、逆転写を引き起こすように構成された温度に設定された別個の加熱ブロックによって達成される。加熱ブロックは長方形形状を含んでもよい。場合によっては、システムは、反応小滴が逆転写を引き起こすように構成された加熱ブロックを通って流れるかどうかをユーザーが選択することを可能にするために、１セットの切換弁を含む。いくつかの例では、別個の加熱ブロックは、ポリメラーゼ活性化等のために、酵素活性剤用の「ホットスタート」工程を含む核酸増幅のために構成された温度に設定される。いくつかの実施形態において、「ホットスタート」工程は、ポリメラーゼを活性化するために約９５℃の温度で行なうことができる。
【０１０６】
代替的にまたは温度と組み合わせて、反応は、電磁放射線の適用によって引き起こされる。電磁放射線は、いくつかの例では、反応流れ経路が少なくとも１つの周波数の電磁放射線に部分的に透過的である反応流れ経路の外部で提供される。いくつかの例では、反応流れ経路は、ガラス、セラミック、またはポリマー材料の少なくとも１つの管を含む。場合によっては、反応流れ経路は、電磁放射線の少なくとも１つの周波数に透過的である物質内のチャネルである。電磁放射線の波長は、場合によっては、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、または１０００ｎｍより大きい。いくつかの例では、電磁放射線の波長は、多くとも約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、または１０００ｎｍである。いくつかの例では、電磁放射線の波長は、少なくとも、多くとも、または約１０、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、
６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００ｎｍ、または１０００ｎｍより大きい、あるいはこれらの数値未満の範囲である。
【０１０７】
＜小滴検出＞
サーモサイクラー等のリアクタに反応を通した後に、小滴はしばしば個々に分析される。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、システムはリアクタの下流に検出器を含む。いくつかの例では、システムは、小滴を検出器に流す前に小滴をさらに互いに分離するために、流体ジャンクションを通り、小滴ストリームへなどのように流体を導入するように構成されたデバイスを含む。一旦、小滴が分離されると、検出器はしばしば、流れる小滴当たり少なくとも１つのデータポイントを得るように設定される。いくつかの例では、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、または５００以上のデータポイントが、１小滴ごとに回収される。場合によっては、最大約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、または５００以上のデータポイントが、１小滴ごとに回収される。場合によっては、少なくとも、多くとも、または約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、または５００、あるいはこれらの数値の範囲内のデータポイントが、１小滴ごとに回収される。
【０１０８】
場合によっては、小滴はその後、小滴検出器を通って流れ、そして信号が検出される。しばしば小滴は、光学的、電気的、機械的、または磁気的の少なくとも１つで測定される。信号は、限定されないが、電磁放射線の強度、電磁放射線の周波数、電界または磁場の力、または電界あるいは磁場の配向の少なくとも１つであり得る。場合によっては、小滴は素因と比較される。代替的にまたは組み合わせて、小滴は他の小滴と比較される。例えば濃度は、少なくとも１つの標的核酸分子を含む小滴の数を、含まない小滴と比較して判定することによって、定量化される。いくつかの例では、標的分子を有する小滴の数と、標的分子を含まなかった小滴の数の比率は、１つの小滴当たりの濃度を判定するために算出される。
【０１０９】
しばしば、本明細書に記載される１つ以上のシステムの数学的な運用上の原則が、ポアソン分布モデルに従って標的分子に適用される。ポアソン分布は、事象が特定の条件下で生じる時間間隔で、それらの事象が生じる回数をモデル化する。例えば、事象は、ある濃度の標的分子を含む小滴が生じる、１小滴当たりの回数である。小滴が形成される方法に関して以下の仮定が真であるため、ポアソン分布は適切なモデルである：
・ｋは、単一の小滴で見つかるであろう標的分子の数である。ｋは、０、１、２等の数値であり得る。
・いくらかの値ｋを有する小滴の発生は、他の小滴が他の任意の値ｋを伴って生じる確率に影響を与えない。すなわち、標的分子による小滴占有が、すべての小滴に独立して生じる。
・いくらかの値ｋを有する小滴が生成される割合は一定である。比率は、いくつかの間隔ではより高く、他の間隔ではより低い場合もある。
・濃度ｋを有する小滴がいくつかの間隔に生じる確率は、間隔の長さに比例する。
これらの条件が満たされる場合、ｋはポアソンの確率変数であると言われ、およびｋの分布はポアソン分布である。したがって、小滴内の分子標的の分布は、以下の式をとる。
【０１１０】
【数１】
2020500517.tif 000003
Ｐ［ｋ］がポアソン分布である場合、μが、その間隔中の１小滴当たりの分子の平均濃度である場合に、これは間隔中で無作為に選択された小滴が標的分子のｋコピーを含む確率として解釈してもよい。ｋは整数であるが、μは、０から間隔内のｋの極大値までのいくつかの実数である。標的成分の濃度を測定するアッセイに関して、標的成分の単位または分子は、ポアソン分布により小滴にわたって分散しており、および任意の小滴が標的成分のｋ単位または分子を含む確率は、Ｐ［ｋ］により得られる。システムの検出器は、単数から複数の成分を識別することができないが、０から１以上のコピーを識別することができる。０コピーを達成する確率は、Ｐ［０］＝Ｎ［０］／（Ｎ［０］＋Ｎ［１＋］）によって推定することができ、ここでＮ［０］は０コピーを有する小滴の数であり、Ｎ［１＋］は１つ以上のコピーを有するコピーの数である。このシステムについては、Ｐ［０］＝Ｎ［０］／（Ｎ［０］＋Ｎ［１＋］）によって推定することができ、ここでＮ［０］は、０コピーを有する閾値強度を下回る放射強度の小滴の数を数えることにより判定することができ、および［１］は、閾値強度を上回る放射強度の小滴の数を数えることにより判定することができる。ｋ＝０であるＰ［ｋ］に関する方程式を使用して、発明者らはμ＝−ｌｎ（Ｎ［０］／（Ｎ［０］＋Ｎ［１］））を得て、ここでｌｎは自然対数である。したがって、０の単位または標的分子を有する集団中の小滴の数と、集団中の小滴の総数との比率は、平均濃度μの直接測定を提供する。これは小滴ストリームにおける連続的な間隔において真である。この測定値に、間隔中の全ての反応小滴の合計容積を掛けることによって、間隔に含まれる標的分子の絶対濃度が、
【０１１１】
【数２】
2020500517.tif 000004
として測定され、ここでＣは、サンプル中の標的分子濃度であり、Ｖｄは小滴容積であり、および
【０１１２】
【数３】
2020500517.tif 000005
は間隔に含まれる全反応容積である。標的濃度の定量化のためのこの真直ぐなアプローチは、サンプルインジェクタ、コアレッサー、および小滴生成装置の高度な精度と反復可能な性質によって可能になる。具体的には、小滴の容積は、注入された全容積を制御することによって、あらかじめ知られている。競合するアプローチは、予測される小滴の容積に小滴の総数を掛け、小滴サイズが正確に制御され、およびこのサイズに一致しない小滴が拒絶されることを要求する。これは、そのハードウェア設計とソフトウェア分析にかなりの複雑性をもたらし、およびその正確度と精度と感度を落とす（なぜならいくつかの小滴を拒絶する必要があるからである）。正確で反復可能な分注を可能にする、小滴生成装置と合わせたインジェクタおよび混合器の設計である。生成された小滴の数とサイズにおける柔軟性を許容することによって、およびＮ［０］とＮ［１］に対する数値を得るために測定の異常値小滴を除外する必要を回避することによって、この機器は、より低い理論上の検出限界で、恣意的なダイナミックレンジにわたり、および現在使用されている他の市販のアプローチよりも高い精度で、標的分子濃度を定量化することができる。
【０１１３】
小滴検出器は、光学励起光源、コリメートオプティク、ダイクロイックフィルタ、対物オプティク、放射フィルタ、検出器、励起フィルタ、およびピンホールフィルタの少なくとも１つを含む。典型的な光学励起光源は、レーザー、発光ダイオード、フォトダイオード、光電子増倍管、およびフィルタリングされた広帯域ソースである。いくつかの例では、励起光源はパワーゲーティングされ、または連続的に電力を供給される。いくつかの例では、ピンホールフィルタは、隣接した小滴と流体を、分析される中央の小滴から排除するために、検出器の前に配置される。代替的にまたは組み合わせて、物体の後ろの焦点面に配置された時のピンホールは、共焦点アパーチャとして機能する。共焦点アパーチャは、場合によっては、焦点容積の外からの自動放射と散乱を除外する。場合によっては、小滴検出器は流れチャネルを含む。流れチャネルは、個々の小滴が光学軸に垂直な軸で流れることを可能にするために、圧縮され得る。摺動性の焦点は、焦点容積についての３つの直交方向に流れチャネルを配置するために使用することができる。
【０１１４】
いくつかの例では、検出器は、電磁放射線等の、励起光源への暴露に続いて、発せられた電磁放射線を測定する。時に、検出器は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の励起光源を含む。場合によっては、検出器は３つの励起光源を含む。場合によっては、検出器は、少なくとも、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはこれらの数値の範囲内の励起光源を含む。いくつかの例では、励起は、約３００〜約９００ｎｍの範囲である。励起は、少なくとも約３００、３５０、４００，４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、または９００ｎｍであり得る。時に、励起は、多くとも約３００、３５０、４００，４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または９００ｎｍ以上である。いくつかの例では、励起は、少なくとも、多くとも、または約３００、３５０、４００，４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、または９００ｎｍ、あるいはこれらの数値の範囲内である。検出器は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の、分散相によって発せられた周波数範囲を測定することができる。検出器は、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはこれらの数値の範囲内の、分散相によって発せられた周波数範囲を測定することができる。時に、検出器は３つの周波数範囲を測定する。放射は、少なくとも約３００、３５０、４００，４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または９００ｎｍ以上であり得る。時に、放射は、多くとも約３００、３５０、４００，４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または９００ｎｍ以上である。放射は、少なくとも、多くとも、または約３００、３５０、４００，４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、または９００ｎｍ、あるいはこれらの数値の範囲内である。いくつかの例では、光学フィルタが使用される。光学フィルタは、１つの望ましい周波数範囲外または１セットの望ましい周波数範囲外の電磁放射線を遮断するために使用することができる。時に、光学ピンホールは、分散相によって発せられた電磁放射線が光検出器に達するのを防ぐために使用される。
【０１１５】
図３１は、多重化を行なうための、変調された励起を含む検出器に関するプロセスワークフローの例を示す。いくつかの例では、検出器ワークフローは励起光源と検出を含む。図３１に示されるように、連続相は、検出器に小滴を導入する前に、隣接する小滴間の距離を増やすために、流れ経路に添加することができる。小滴は、刺激に起因して小滴により生成された信号が検出可能であるように、１つ以上の励起光源に曝され得る。検出された信号は、システムに存在するいかなる雑音も除去するために処理され得、および反応の進行を判定する等のために様々な測定を行なうために使用することができる。
【０１１６】
図３２を参照すると、検出器は、分散相が電磁放射線によって照らされる上流にある、連続相のソースと連続相用の入口を含む。連続相は、空間的に分離した容積の分散相に注入される（図３２）。
【０１１７】
図３３と図３４を参照すると、検出器は、励起光源、光検出器、少なくとも１つのダイクロイックミラー（３３０３）（３４０３）、および少なくとも１つのフィルタ（３４０５）（３４０７）を含む。いくつかの例では、検出器は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多くのダイクロイックミラーを含む。いくつかの例では、検出器は、多くともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはこれらの数値の範囲内のダイクロイックミラーを含む。いくつかの例では、検出器は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多くのフィルタを含む。いくつかの例では、検出器は、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはこれらの数値の範囲内のフィルタを含む。いくつかの例では、検出器は２つのダイクロイックミラー（３５０３）と（３５０５）を含む（例えば図３５）。図３６を参照すると、検出器は少なくとも１つの励起光源と少なくとも１つの光検出器を含む。各光検出器は、反応流れ経路と光検出器との間に配置された少なくとも１つのフィルタ（３６０３）（３６０５）を含む。図３６を参照すると、検出器は、少なくとも１つのフィルタ（３６０７）（３６０９）、および少なくとも１つのダイクロイックミラー（３６１１）（３６１３）を含む（図３６）。
【０１１８】
いくつかの例では、検出器はコントローラを含む。コントローラは、励起光源に関してオンとオフの状態を交互に行うために使用され得る（例えば図３７）。例えば、コントローラは、第１の励起光源のオフの状態と、第２の励起光源のオンの状態を交互に繰り返す。いくつかの例では、コントローラは、信号対雑音比を高めるために信号フィルタリングを適用する。典型的な信号フィルタリングは、ロックイン増幅器である。いくつかの例では、反応流れ経路の部分は透明である。コントローラは、多くの分散相に信号を割り当てるために検出器からのデータを同期させることができる。
【０１１９】
いくつかの例では、反応の進行を同時に追跡する。例えば、システムは、多数の励起光源と、前記多数の励起光源を検出することができる多数の光検出器を含む。いくつかの例では、反応流れ経路の部分は透明である。分散相が電磁放射線によって励起され、および放射強度が反応の進行に相関し得るように、反応流れ経路は励起光源に透過的であり得る。時に、検出器は、第２のソースからの１つのソースによって発せられる電磁放射線を空間に分化させるために、分散性の格子を含む（例えば図３８）。図３９は、多重化を可能にする検出器の構成を表す。例えば、図３９に示されるように、検出器は、第１の励起光源、および第２の励起光源から離間した光検出器と光検出器を含む、２つの検出領域を含むことができる。
【０１２０】
光検出器は多数の検出領域を含むことができる。いくつかの例では、信号は、染料または蛍光プローブ等の、光学的に反応する種の活動から生成される。染料の例として、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳＹＢＲゴールド、エチジウムブロマイド、メチレンブルー、ピロニンＹ、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｂｌｕｅ  Ｖｉｅｗ、またはフィコエリトリンがあげられる。種々様々な反応性蛍光プローブも使用することができる。発蛍光団は、芳香族またはヘテロ芳香族の化合物であり得る。発蛍光団は、例えばピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、ベンゾオキサゾール、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、犬歯、カルボシアニン、サリチル酸塩、アントラニラート、キサンテン染料、クマリンであり得る。典型的なキサンテン染料として、例えばフルオレセインとローダミン染料があげられる。フルオレセインとローダミンの染料は、限定されないが、６−カルボキシフルオレスセイン（ＦＡＭ）、２’７’―ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレスセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），Ｎ，Ｎ，Ｎ；Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）を含む。適切な蛍光プローブはまた、さらにアルファまたはベータ位置にアミノ基を有するナフチルアミン染料を含む。例えば、フチルアミノ化合物は、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸塩、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸塩、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホン酸塩、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含む。典型的なクマリンとして、例えば３−フェニル−７−イソシアナートクマリン；９−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ等のアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンズオキサゾリル）フェニル）マレイミド；例えば、インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５．５（Ｃｙ５．５）、３−（−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）等の、シアニン；１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９−［２（または４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルフォニル］−４（または２）（−スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−分子内塩（ＴＲまたはテキサスレッド）；またはＢＯＤＩＰＹＴＭ染料があげられる。
【０１２１】
マルチ発蛍光団信号は同時に測定することができる。例えば、核酸増幅反応にある多数の標的配列は、異なる周波数を発するレポーター染料（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｄｙｅ）に接合した多数の配列特異性プローブの使用により分析される。いくつかの例では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０より多くの、多数の配列特異性プローブが使用される。場合によっては、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０より多くの多数の配列特異性プローブが使用される。いくつかの例では、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、あるいはこれらの範囲内の数の、多重配列特異性プローブが使用される。多数の検出器を使用するよりもむしろ、本明細書には、単一の光検出器と多数の励起光源を使用して行なうことができる多重化の方法が記載される。場合によっては、多重パスフィルタは、サンプル上に各励起光源からの光を送り、そして検出器に戻すために使用される。励起光源と検出器との間のそのような循環は、達成されるべき多重化を可能にすることができる。場合によっては、各波長の小滴当たりの多数の読み取りが測定され、それは素因を相殺するために使用することができる。時に、循環は、例えば単一の分子検出（例えば抗原と他のタンパク質）において、低レベル信号を増幅するために使用される。場合によっては、連続的な多重化が行なわれる。
【０１２２】
いくつかの例では、本明細書に開示されるシステムと方法は、少なくとも１つのコンピュータプログラム、またはその使用を含む。コンピュータプログラムは、デジタル処理装置のＣＰＵで実行可能であり、特定のタスクを実行するために書き込まれる、一連の指示を含む。コンピュータ可読命令は、特定のタスクを行う、または特定のデータ型を実行する、ファンクション、オブジェクト、アプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）、データ構造等の、プログラムモジュールとして実装されてもよい。例えば、コンピュータプログラムに対する一連の命令は、試験すべき配列標的を識別するために連続的な多重化に使用される。試験すべき標的配列の識別は、自動化可能であり、またはユーザーによって選択され得る。
【０１２３】
いくつかの例では、コンピュータプログラムは、独立したコンピュータプロセスとして実行され、既存のプロセスへのアドオンではない、例えばプラグインではないプログラムであるスタンドアロンアプリケーションを含む。例えば、ユーザーは、システム上で行なわれる内蔵タッチスクリーン試験から選択を行う。
【０１２４】
場合によっては、コンピュータは外部デバイスを含む。いくつかの例では、コンピュータと外部デバイスとの間の通信は、物理的なケーブル、記憶装置、メモリデバイス、およびワイヤレス接続の少なくとも１つを通じて生じる。場合によっては、システムは、パソコン、タブレット、またはモバイルデバイスのソフトウェアシステムとインターフェースで接続する。
【０１２５】
例えば、システムは、ストレージおよび／またはメモリデバイスを含む。記憶装置および／またはメモリデバイスは、一時的または永久的にデータまたはプログラムを記憶するために使用される１つ以上の物理的な装置である。いくつかの実施形態において、デバイスは揮発性メモリであり、記憶した情報を維持するための電力を必要とする。代替的にまたは組み合わせて、デバイスは不揮発性メモリであり、およびデジタル処理デバイスに電力が供給されないときに記憶した情報を保持する。例えば、不揮発性メモリは、フラッシュメモリ、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ）、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）の少なくとも１つを含む。場合によっては、デバイスは、非限定的な例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースのストレージを含む、ストレージデバイスである。いくつかの例では、ストレージおよび／またはメモリデバイスは、本明細書に開示されるもの等のデバイスの組み合わせである。代替的にまたは組み合わせて、データは、より後の時点でアクセス可能な、または第三者のアプリケーションによって分析可能なデータベースにデータを保存することができるだろう。
【０１２６】
＜定義＞
特に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての専門用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有している。
【０１２７】
本明細書で使用されるように、用語「含んでいる」とその文法上の同等物は、述べられた特徴、整数、工程、動作、要素、および／またはコンポーネントの存在を規定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、動作、要素、コンポーネント、および／またはそれらのグループの存在または追加を妨げない。本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、表記される関連項目の１つ以上の任意の、および全ての組み合わせを含む。
【０１２８】
具体的に規定されない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるように、数または数の範囲に関する用語「約」は、定められた数の＋／−１０％、または範囲に関して表記される値の表記された下限より１０％下、および表記された上限の１０％上を意味すると理解される。
【０１２９】
本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指定していない限り、複数の参照物を含む。
【０１３０】
本明細書で使用されるように、用語「増幅する」および「増幅」は区別なく使用され、および一般的に、核酸の１つ以上のコピーを生成することを指す。
【０１３１】
本明細書で使用されるように、用語「核酸」および「核酸分子」は区別なく使用され、および一般的には、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）またはリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）のいずれかを指す。核酸は、任意の三次元構造をさらに有する場合もあり、および既知または未知の機能を行う場合もある。核酸の非限定的な例として、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から規定される遺伝子座、、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーがあげられる。核酸は、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、フッ化核酸（ＦＮＡ）、架橋核酸、およびチオヌクレオチド等の、メチル化されたヌクレオチドとヌクレオチドアナログ等の１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む場合もある。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、核酸の組立ての前または後に行われてもよい。核酸のヌクレオチドの配列は、例えばリンカーまたは他のタイプのスペーサー等の、非ヌクレオチド分子によって中断されてもよい。核酸は、検出可能な種との接合または結合等によって、重合後にさらに修飾されてもよい。いくつかの例では、核酸は、いくつかの実施形態において、他の核酸分子を増幅するのに使用可能なプライマーであってもよい。
【０１３２】
本明細書で使用されるように、用語「プライマー」は一般的に、鋳型核酸分子とハイブリダイズすることができ、かつ鋳型核酸分子を介して鋳型方向に向けられた方式で伸長させることができる核酸分子を指す。
【０１３３】
本明細書で使用されるように、用語「標的核酸」および「標的核酸分子」は区別なく使用され、および一般的に、標的配列を有する核酸分子の開始集団にある核酸分子を指し、それらの存在、量、および／またはヌクレオチド配列、またはこれらの１つ以上における変化を判定するのが望ましい。いくつかの例では、標的核酸分子は二重らせん構造であり得る。いくつかの例では、標的核酸分子は単鎖であり得る。一般的に、用語「標的核酸鎖」は、単鎖の標的核酸分子を指す。一般的に、用語「標的核酸配列」は、標的核酸の鎖にある核酸配列を指す。標的核酸分子または標的核酸配列は、遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボソームＲＮＡまたは他のものを含むＲＮＡの一部であり得る。標的核酸配列または標的核酸分子は、サンプルからの標的核酸配列または標的核酸分子、または増幅反応の生成物等の二次標的であり得る。
【０１３４】
本明細書で使用されるように、用語「円筒状の」またはその文法上の同等物は、閉じた二次元曲線を曲線の平面と交差する軸に沿って投影することによって作成された面を含む三次元形状を指す。曲線は、すべての場合で限定されるわけではないが、円、長方形、または楕円形であってもよい。いくつかの例では、用語「円筒状の」は円柱を指す。
【０１３５】
＜番号付けされた実施形態＞
実施形態Ｎｏ．１は、連続流においてアッセイを自動的に行うためのシステムを含み、該システムは：（ａ）連続相用の第１の入り口と第１の出口を含む流れ経路；（ｂ）第１の分散相を供給するように構成された、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｃ）第２の分散相を供給するように構成された、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｄ）コアレッサー；（ｅ）リアクタ；（ｆ）検出器；および（ｇ）コントローラ、を含む。実施形態Ｎｏ．２は、実施形態Ｎｏ．１のシステムを含み、ここでリアクタは、化学反応を引き起こすように構成される。実施形態Ｎｏ．３は、実施形態Ｎｏ．１−２のシステムを含み、ここでリアクタは外部エネルギー源を含む。実施形態Ｎｏ．４は、実施形態Ｎｏ．１−３のシステムを含み、ここでリアクタはサーモサイクラーである。実施形態Ｎｏ．５は、実施形態Ｎｏ．１−４のシステムを含み、ここで連続相は疎水性のフッ化油脂を含む。実施形態Ｎｏ．６は、実施形態Ｎｏ．１−５のシステムを含み、ここで第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは水を含む。実施形態Ｎｏ．７は、実施形態Ｎｏ．１−６のシステムを含み、ここで流れ経路の面はフルオロポリマーを含み、および第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは流れ経路を汚染しない。実施形態Ｎｏ．８は、実施形態Ｎｏ．１−７のシステムを含み、ここでフッ化油脂は、ＦＣ−３２８３、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、３−エトキシ−１，１，１，２，３，４，４，５，５，６，６，６−ドデカフルオロ−２−トリフルオロメチル−ヘキサン、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＯＨ、パーフルオロオクタン、パーフルオロヘキサン、１，１，１−トリフルオロオクタン、および１，１，１，２，２−ペンタフルオロデカンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．９は、実施形態Ｎｏ．１−８のシステムを含み、ここでフルオロポリマーは、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシポリマー、フッ化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、ポリエチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、全フッ素置換されたエラストマー、フルオロカーボン、フッ素ゴム、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、パーフルオロスルホン酸（ＰＦＳＡ）、およびパーフルオロポリオキセタンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．１０は、実施形態Ｎｏ．１−９のシステムを含み、さらに界面活性剤を含む。実施形態Ｎｏ．１１は、実施形態Ｎｏ．１−１０のシステムを含み、ここで界面活性剤は、過フッ化炭化水素、炭化水素、およびシリコンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．１２は、実施形態Ｎｏ．１−１１のシステムを含み、ここで、第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つの容積は、約１ピコリットルから約１ミリリットルの範囲である。実施形態Ｎｏ．１３は、実施形態Ｎｏ．１−１２のシステムを含み、ここで流れ経路は、約０．００１”から約０．５”の範囲の内部水力直径を含む。実施形態Ｎｏ．１４は、実施形態Ｎｏ．１−１３のシステムを含み、ここでシステムは核酸増幅反応を行なう。実施形態Ｎｏ．１５は、実施形態Ｎｏ．１−１４のシステムを含み、ここで第１の分散相は少なくとも１つの核酸分子を含み、および第２の分散相は核酸増幅試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１６は、実施形態Ｎｏ．１−１５のシステムを含み、ここで核酸増幅試薬は、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、緩衝液、および酵素の少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．１７は、実施形態Ｎｏ．１−１６のシステムを含み、ここで流れ経路は、核酸増幅を行なうために第１の温度帯から第２の温度帯へと循環する。実施形態Ｎｏ．１８は、実施形態Ｎｏ．１−１７のシステムを含み、ここで検出器は蛍光シグナルを測定する。実施形態Ｎｏ．１９は、実施形態Ｎｏ．１−１８のシステムを含み、ここでコアレッサーは、外部エネルギー源を含む。実施形態Ｎｏ．２０は、実施形態Ｎｏ．１−１９のシステムを含み、ここで外部エネルギー源は、少なくとも２つの電極間の電界によって提供される。実施形態Ｎｏ．２１は、実施形態Ｎｏ．１−２０のシステムを含み、ここで少なくとも２つの電極間の電位は、約１００Ｖから約２５０００Ｖの範囲である。実施形態Ｎｏ．２２は、実施形態Ｎｏ．１−２１のシステムを含み、ここで外部ソースは、圧力源と機械的ソースの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．２３は、実施形態Ｎｏ．１−２２のシステムを含み、ここで圧力源はポンプによって供給される。実施形態Ｎｏ．２４は、実施形態Ｎｏ．１−２３のシステムを含み、ここでリアクタは、固定された温度帯を含む。実施形態Ｎｏ．２５は、実施形態Ｎｏ．１−２４のシステムを含み、ここでリアクタは、少なくとも２つの固定された温度帯を含む。実施形態Ｎｏ．２６は、実施形態Ｎｏ．１−２５のシステムを含み、ここで流れ経路は、少なくとも２つ固定された温度帯の間を循環する。実施形態Ｎｏ．２７は、実施形態Ｎｏ．１−２６のシステムを含み、ここで反応経路は、規定された長さと速度に沿って循環する。実施形態Ｎｏ．２８は、実施形態Ｎｏ．１−２７のシステムを含み、ここで第１の分散相は生体サンプルを含み、および第２の分散相は溶解試薬を含む。実施形態Ｎｏ．２９は、実施形態Ｎｏ．１−２８のシステムを含み、ここで第１の分散相は第１の薬物前駆体を含み、および第２の分散相は第２の薬物前駆体を含む。実施形態Ｎｏ．３０、連続流においてアッセイを自動的に行うためのシステムを含み、該システムは：（ａ）連続相用の第１の入口、および第１の出口を含む流れ経路；（ｂ）第１の分散相を供給する、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｃ）第２の分散相を供給する、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｄ）コアレッサー；（ｅ）リアクタ；（ｆ）小滴生成装置；（ｇ）検出器；および（ｈ）コントローラを含み、ここで流れ経路の面は、連続相に対する親和性が増しており、および第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、界面活性剤でコーティングされる。実施形態Ｎｏ．３１は、実施形態Ｎｏ．１−３０のシステムを含み、ここでポアソン分布は、小滴の集団を分析するために使用される。実施形態Ｎｏ．３２は、実施形態Ｎ���．１−３１のシステムを含み、ここで小滴生成装置は、約２０００から約１００００００の範囲で多くの小滴を生成する。実施形態Ｎｏ．３３は、実施形態Ｎｏ．１−３２のシステムを含み、ここで小滴生成装置は、約３０００から３００００の範囲で多くの小滴を生成する。実施形態Ｎｏ．３４は、実施形態Ｎｏ．１−３３のシステムを含み、ここでシステムは、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅を行なう。実施形態Ｎｏ．３５は、実施形態Ｎｏ．１−３４のシステムを含み、ここで第１の分散相は少なくとも１つの標的核酸分子を含み、および第２の分散相は核酸増幅試薬を含む。実施形態Ｎｏ．３６は、実施形態Ｎｏ．１−３５のシステムを含み、ここで核酸増幅試薬は、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、緩衝液、および酵素の少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．３７は、実施形態Ｎｏ．１−３６のシステムを含み、ここで検出器は蛍光シグナルを測定する。実施形態Ｎｏ．３８は、実施形態Ｎｏ．１−３７のシステムを含み、ここで蛍光シグナルは、染料、蛍光プローブ、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプローブの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．３９は、実施形態Ｎｏ．１−３８のシステムを含み、ここでエマルジョンベースのデジタル核酸増幅は、連続的に多重化される。実施形態Ｎｏ．４０は、実施形態Ｎｏ．１−３９のシステムを含み、ここでエマルジョンベースのデジタル核酸増幅は、並行して多重化される。実施形態Ｎｏ．４１は、実施形態Ｎｏ．１−４０のシステムを含み、ここでコントローラは、自動クラスタリングアルゴリズムを使用して、自動的に限界信号を判定する。実施形態Ｎｏ．４２は、実施形態Ｎｏ．１−４１のシステムを含み、ここで自動クラスタリングアルゴリズムは、ｋ−ｍｅａｎｓクラスタ分析、単連結クラスタリング、完全連結クラスタリング、混合ガウスモデル、および密度ベースのクラスタリングの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．４３は、実施形態Ｎｏ．１−４２のシステムを含み、ここで連続相は疎水性のフッ化油脂を含む。実施形態Ｎｏ．４４は、実施形態Ｎｏ．１−４３のシステムを含み、ここで第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは水を含む。実施形態Ｎｏ．４５は、実施形態Ｎｏ．１−４４のシステムを含み、ここで流れ経路の面はフルオロポリマーを含み、および第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、流れ経路を汚染しない。実施形態Ｎｏ．４６は、実施形態Ｎｏ．１−４５のシステムを含み、ここでフッ化油脂は、ＦＣ−３２８３、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、３−エトキシ−１，１，１，２，３，４，４，５，５，６，６，６−ドデカフルオロ−２−トリフルオロメチル−ヘキサン、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＯＨ、パーフルオロオクタン、パーフルオロヘキサン、１，１，１−トリフルオロオクタン、および１，１，１，２，２−ペンタフルオロデカンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．４７は、実施形態Ｎｏ．１−４６のシステムを含み、ここでフルオロポリマーは、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラ��ルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシポリマー、フッ化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、ポリエチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、全フッ素置換されたエラストマー、フルオロカーボン、フッ素ゴム、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、パーフルオロスルホン酸（ＰＦＳＡ）、およびパーフルオロポリオキセタンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．４８は、実施形態Ｎｏ．１−４７のシステムを含み、ここで界面活性剤は、過フッ化炭化水素、炭化水素、およびシリコンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．４９は、実施形態Ｎｏ．１−４８のシステムを含み、ここでリアクタは、核酸増幅を行なうために第１の温度帯から第２の温度帯へと循環する。実施形態Ｎｏ．５０は、実施形態Ｎｏ．１−４９のシステムを含み、ここで第１の温度帯は、約８５℃から約９５℃の範囲である。実施形態Ｎｏ．５１は、実施形態Ｎｏ．１−５０のシステムを含み、ここでＤＮＡの変性は、第１の温度帯で生じる。実施形態Ｎｏ．５２は、実施形態Ｎｏ．１−５１のシステムを含み、ここで第２の温度帯は、約５５℃から約７０℃の範囲である。実施形態Ｎｏ．５３は、実施形態Ｎｏ．１−５２のシステムを含み、ここでアニーリングと拡張の少なくとも１つは、第２の温度帯で生じる。実施形態Ｎｏ．５４は、実施形態Ｎｏ．１−５３のシステムを含み、ここで循環数は、約２５から約４５の範囲である。実施形態Ｎｏ．５５は、実施形態Ｎｏ．１−５４のシステムを含み、さらに第３の温度帯を含む。実施形態Ｎｏ．５６は、実施形態Ｎｏ．１−５５のシステムを含み、ここで逆転写は、第３の温度帯で生じる。実施形態Ｎｏ．５７は、実施形態Ｎｏ．１−５６のシステムを含み、ここで核酸増幅の「ホットスタート」工程は、第３の温度帯で生じる。実施形態Ｎｏ．５８は、実施形態Ｎｏ．１−５７のシステムを含み、ここで第１の分散相は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質の少なくとも１つを含む。実施形態Ｎｏ．５９は、実施形態Ｎｏ．１−５８のシステムを含み、ここで第２の分散相は、抗原、レポーター分子、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、緩衝液、および酵素の少なくとも１つを含む。実施形
態Ｎｏ．６０は、連続流においてアッセイを自動的に行うための方法を含み、該方法は：（ａ）第１の分散相において少なくとも１つの標的分子を含むサンプルを調製する工程；（ｂ）エマルジョンの連続相を含む流れ経路に第１の分散相の望ましい量を自動的に注入する工程；（ｃ）第２の分散相の望ましい量を自動的に注入する工程；（ｄ）互いに近接している第１の分散相と第２の分散相を回収する工程；（ｅ）第１の分散相と第２の分散相を合体させる工程；（ｆ）結合させた第１の分散相と第２の分散相から小滴を生成する工程；（ｇ）小滴において反応を引き起こす工程；（ｈ）反応を検出する工程；（ｉ）臨界閾値を上回る、各小滴において少なくとも１つの化学反応の検出された最終的な進行を伴う小滴の数を、臨界閾値を下回る、少なくとも１つの化学反応の検出された最終的な進行を伴う小滴の数と比較することによって、サンプル中の標的分子の量を判定する工程、を含む。実施形態Ｎｏ．６１は、実施形態Ｎｏ．１−６０のいずれか１つを含み、フィードバックループによって判定された第２のアッセイのパラメータを自動的に調整する工程をさらに含む。実施形態Ｎｏ．６２は、実施形態Ｎｏ．１−６１のいずれか１つを含み、ここで標的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．６３は、実施形態Ｎｏ．１−６２のいずれか１つを含み、ここで反応は核酸増幅である。実施形態Ｎｏ．６４は、実施形態Ｎｏ．１−６３のいずれか１つを含み、ここで核酸増幅試薬は、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、緩衝液、および酵素の少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．６５は、実施形態Ｎｏ．１−６４のいずれか１つを含み、サンプルを溶解する工程をさらに含む。実施形態Ｎｏ．６６は、実施形態Ｎｏ．１−６５のいずれか１つを含み、ここで多くの水が、最初のアッセイの結果に従って自動的に注入される。実施形態Ｎｏ．６７は、実施形態Ｎｏ．１−６６のいずれか１つを含み、ここでサンプルは、細胞、ウイルス、病原菌、および流体の少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．６８は、実施形態Ｎｏ．１−６７のいずれか１つを含み、ここでサンプルは被験体からのものである。実施形態Ｎｏ．６９は、エマルジョンの分散相の量を測定するためのシステムを含み、該システムは：（ａ）固定された内部開口容積を有するモノリスを含む回転ドラム；（ｂ）入口用のチャネルを含むドラム用の第１のキャップカバー；（ｃ）出口用のチャネルを含むドラム用の第２のキャップカバー；（ｄ）第１の流れ経路への第１の入口を通じて、分散相の流れを引き起こす手段；（ｅ）固定された内部容積に含まれる分散相が、第２の流れ経路に流れ込むように、第２流れ経路への第２の入口を介した連続相の流れを引き起こす手段、を含む。実施形態Ｎｏ．７０は、実施形態Ｎｏ．１−６９のいずれか１つを含み、さらに複数の入口を含む。実施形態Ｎｏ．７１は、実施形態Ｎｏ．１−７０のいずれか１つを含み、さらに複数の出口を含む。実施形態Ｎｏ．７２は、実施形態Ｎｏ．１−７１のいずれか１つを含み、さらに注入用の複数のポートを含む。実施形態Ｎｏ．７３は、実施形態Ｎｏ．１−７２のいずれか１つを含み、ここで注入され���容積は、約１ｕＬから約５００ｕＬの範囲である。実施形態Ｎｏ．７４は、実施形態Ｎｏ．１−７３のいずれか１つを含み、さらにカセットを含む。実施形態Ｎｏ．７５は、実施形態Ｎｏ．１−７４のいずれか１つを含み、ここでカセットは、エマルジョンベースのデジタル核酸増幅試薬のためのリザーバである。実施形態Ｎｏ．７６は、エマルジョンの連続相において少なくとも１つの容積の分散相を合体させるためのシステムを含み、該システムは：（ａ）分散相の第１のソースに接続された第１の入り口と、エマルジョンの連続相を含む第１の流れチャネル；（ｂ）分散相の第２のソースに接続された第２の入り口と、エマルジョンの連続相を含む第２の流れチャネル；（ｃ）流れ経路に接続された第１の出口を含む第３の流れチャネルであって、ここで第１の軸は、チャネルの断面に垂直であり、および第１の軸は、増加する重力場の方向に合わせて配置された第２の軸と４５°未満の角度を形成する、第３の流れチャネル；（ｄ）取外し可能な拘束；（ｅ）連続相出口に接続された第２の出口を含む第４の流れチャネルであって、ここで第３の軸は、第３の流れチャネルの長さの少なくとも一部に対して、第２の軸と４５°未満の角度である、第４の流れチャネル；（ｆ）第１の流れチャネル、第２の流れチャネル、第３の流れチャネル、および第４の流れチャネルのジャンクション；（ｇ）外部ソース；および（ｈ）自動的に合体を行うためのコントローラ、を含む。実施形態Ｎｏ．７７は、実施形態Ｎｏ．１−７６のいずれか１つを含み、ここで外部ソースは、第３の流れチャネルに適用される。実施形態Ｎｏ．７８は、実施形態Ｎｏ．１−７７のいずれか１つを含み、ここで第１の流れチャネル、第２の流れチャネル、第３の流れチャネル、および第４の流れチャネルの少なくとも１つは、モノリスにある腔である。実施形態Ｎｏ．７９は、実施形態Ｎｏ．１−７８のいずれか１つを含み、ここで腔は、１／３２”から約１／２”の範囲の直径を有する。実施形態Ｎｏ．８０は、実施形態Ｎｏ．１−７９のいずれか１つを含み、ここで第３の流れチャネルと第４の流れチャネルの長さは、１／１６”から約６”の範囲である。実施形態Ｎｏ．８１は、実施形態Ｎｏ．１−８０のいずれか１つを含み、ここで第１の流れチャネル、第２の流れチャネル、第３の流れチャネル、および第４の流れチャネルの少なくとも１つは、管を含む。実施形態Ｎｏ．８２は、実施形態Ｎｏ．１−８１のいずれか１つを含み、ここで第１の流れチャネル、第２の流れチャネル、第３の流れチャネル、および第４の流れチャネルの少なくとも１つは、合体を高めるように配置される。実施形態Ｎｏ．８３は、実施形態Ｎｏ．１−８２のいずれか１つを含み、ここで取外し可能な拘束は、ゲートバルブ、ニードルバルブ、ボールバルブ、回転ピン、および摺動ピンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．８４は、実施形態Ｎｏ．１−８３のいずれか１つを含み、ここで外部ソースは、少なくとも２つの電極間の電界である。実施形態Ｎｏ．８５は、実施形態Ｎｏ．１−８４のいずれか１つを含み、ここで少なくとも２つの電極間の電位は、約１００Ｖから約１００００の範囲である。実施形態Ｎｏ．８６は、実施形態Ｎｏ．１−８５のいずれか１つを含み、ここで少なくとも２つの電極間の電位は、約５００Ｖから約２０００Ｖの範囲である。実施形態Ｎｏ．８７は、実施形態Ｎｏ．１−８６のいずれか１つを含み、ここで電界は、約１００ｋＨｚから約１０ｋＨｚの範囲の交流を有する。実施形態Ｎｏ．８８は、実施形態Ｎｏ．１−８７のいずれか１つを含み、ここで外部ソースは、圧力源と機械的ソースの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．８９は、実施形態Ｎｏ．１−８８のいずれか１つを含み、ここで圧力源はポンプによって供給される。実施形態Ｎｏ．９０は、実施形態Ｎｏ．１−８９のいずれか１つを含み、ここでコントローラは、合体のタイミングを制御する。実施形態Ｎｏ．９１は、実施形態Ｎｏ．１−９０のいずれか１つを含み、ここで少なくとも１つの容積の分散相は、標的分子を含む。実施形態Ｎｏ．９２は、実施形態Ｎｏ．１−９１のいずれか１つを含み、ここで少なくとも１つの容積の分散相は、酵素を含む。実施形態Ｎｏ．９３は、実施形態Ｎｏ．１−９２のいずれか１つを含み、ここで少なくとも１つの容積の分散相は、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、緩衝液、およびｄＮＴＰの少なくとも１つを含む。実施形態Ｎｏ．９４は、エマルジョンの連続相において少なくとも１つの容積の分散相を合体させるためのシステムを含み、該システムは：（ａ）第１の分散相の第１のソースに接続された第１の入り口と、エマルジョンの第１の連続相を含む第１の流れチャネル；（ｂ）第２の分散相の第２のソースに接続された第２の入り口と、エマルジョンの第２の連続相を含む第２の流れチャネル；（ｃ）流れ経路に接続された第１の出口を含む第３の流れチャネルであって、ここで第１の軸は、チャネルの断面に垂直であり、および第１の軸は、増加する重力場の方向に合わせて配置された第２の軸と４５°未満の角度を形成する、第３の流れチャネル；（ｄ）取外し可能な拘束；（ｅ）連続相出口に接続された第２の出口を含む第４の流れチャネルであって、ここで第３の軸は、第３の流れチャネルの長さの少なくとも一部に対して、第２の軸と４５°未満の角度である、第４の流れチャネル；（ｆ）第１の流体チャネル、第２の流体チャネル、第３の流体チャネル、および第４の流体チャネルのジャンクション；（ｇ）外部ソース；（ｈ）自動的に合体を行うためのコントローラ、を含み、ここで、第１の流れチャネル、第２の流れチャネル、第３の流れチャネル、および第４の流れチャネルの少なくとも１つの面は、第の１連続相と第２の連続相の少なくとも１つに対する親和性が増しており、および第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは界面活性剤でコーティングされる。実施形態Ｎｏ．９５は、エマルジョンの連続相において少なくとも１つの容積の分散相を合体させるためのシステムを含み、該システムは：（ａ）エマルジョン内の分散相と連続相の複数のソースのための入力に接続された流れチャネル；（ｂ）取外し可能な拘束；（ｃ）外部ソース；および（ｄ）自動的に合体を行うためのコントローラ、を含む。実施形態Ｎｏ．９６は、実施形態Ｎｏ．１−９５のいずれか１つを含み、ここで流れチャネルの面は、連続相に対する親和性が増しており、および分散相は界面活性剤でコーティングされる。実施形態Ｎｏ．９７は、少なくとも１つの容積の分散相の既知の量を自動的に結合するためのシステムを含み、該システムは：（ａ）第１の分散相を供給する、第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｂ）第２の分散相を供給する、第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ；および（ｃ）コアレッサー、を含む。実施形態Ｎｏ．９８は、実施形態Ｎｏ．１−９７のいずれか１つを含み、連続相のソースと第２のコアレッサーをさらに含む。実施形態Ｎｏ．９９は、実施形態Ｎｏ．１−９８のいずれか１つを含み、さらに小滴生成装置を含む。実施形態Ｎｏ．１００は、実施形態Ｎｏ．１−９９のいずれか１つを含み、ここでコアレッサーは、コアレッサーに試薬を提供する複数のインジェクタに接続される。実施形態Ｎｏ．１０１は、実施形態Ｎｏ．１−１００のいずれか１つを含み、ここで複数のインジェクタの少なくとも１つのインジェクタは水を提供する。実施形態Ｎｏ．１０２は、少なくとも１つの容積の分散相を合体させる方法を含み、該方法は：（ａ）第１の分散相の既知の量を注入する工程；（ｂ）第２の分散相の既知の量を注入する工程；（ｃ）コアレッサーにおいて第１の分散相と第２の分散相を捕らえる工程；（ｄ）外部ソースを適用する工程；および（ｅ）下流の流れ経路に対して取外し可能な拘束を開放する工程、を含む。実施形態Ｎｏ．１０３は、実施形態Ｎｏ．１−１０２のいずれか１つを含み、ここで取外し可能な拘束は、ゲートバルブ、ニードルバルブ、ボールバルブ、回転ピン、および摺動ピンの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．１０４は、実施形態Ｎｏ．１−１０３のいずれか１つを含み、ここで外部ソースは、少なくとも２つの電極間の電界である。実施形態Ｎｏ．１０５は、実施形態Ｎｏ．１−１０４のいずれか１つを含み、ここで少なくとも２つの電極間の電位は、約１００Ｖから約１００００の範囲である。実施形態Ｎｏ．１０６は、実施形態Ｎｏ．１−１０５のいずれか１つを含み、ここで少なくとも２つの電極間の電位は、約５００Ｖから約２０００Ｖの範囲である。実施形態Ｎｏ．１０７は、実施形態Ｎｏ．１−１０６のいずれか１つを含み、ここで電界は、約１００ｋＨｚから約１０ｋＨｚの範囲の交流を有する。実施形態Ｎｏ．１０８は、実施形態Ｎｏ．１−１０７のいずれか１つを含み、ここで外部ソースは、圧力源または機械的ソースの少なくとも１つである。実施形態Ｎｏ．１０９
は、実施形態Ｎｏ．１−１０８のいずれか１つを含み、ここで圧力源はポンプによって供給される。実施形態Ｎｏ．１１０は、サンプル中の分析物を定量化するためのシステムを含み、該システムは、あらかじめ測定された試薬カセット、連続的な試薬ストリームトラック、サンプル入力ポート、インジェクタ、コアレッサー、少なくとも１つの温度制御体、および検出器を含み、ここでシステムは、サンプル入力ポートへのサンプルの測定された送達を必要とせずに、分析物を定量化する。実施形態Ｎｏ．１１１は、実施形態Ｎｏ．１−１１０のいずれか１つを含み、さらに小滴生成装置を含む。実施形態Ｎｏ．１１２は、実施形態Ｎｏ．１−１１１のいずれか１つを含み、ここでシステムを動作させる工程は、システムオペレータによるサンプルまたは試薬の測定された分注を必要としない。実施形態Ｎｏ．１１３は、実施形態Ｎｏ．１−１１２のいずれか１つを含み、ここで、サンプルがシステムに導入された後、１時間以内にサンプル中の分析物が定量化される。実施形態Ｎｏ．１１４は、実施形態Ｎｏ．１−１１３のいずれか１つを含み、ここで、サンプルがシステムに導入された後、３０分以内にサンプル中の分析物が定量化される。実施形態Ｎｏ．１１５は、実施形態Ｎｏ．１−１１４のいずれか１つを含み、ここで、サンプルがシステムに導入された後、２０分以内にサンプル中の分析物が定量化される。実施形態Ｎｏ．１１６は、実施形態Ｎｏ．１−１１５のいずれか１つを含み、ここでシステムは、エマルジョンの個々の小滴において分析物の存在を測定する。実施形態Ｎｏ．１１７は、実施形態Ｎｏ．１−１１６のいずれか１つを含み、ここでシステムは、エマルジョンの個々の小滴における分析物の存在の測定を、エマルジョンの個々の小滴における分析物の存在の頻度の閾値と比較する。実施形態Ｎｏ．１１８は、実施形態Ｎｏ．１−１１７のいずれか１つを含み、ここで、エマルジョンの個々の小滴における分析物の存在の測定が閾値を上回る場合、システムはサンプルの残りのアリコートを希釈する。実施形態Ｎｏ．１１９は、実施形態Ｎｏ．１−１１８のいずれか１つを含み、ここでシステムは、希釈されたサンプルの残りのアリコートから生成されたエマルジョンの個々の小滴における分析物の存在を測定する。実施形態Ｎｏ．１２０は、実施形態Ｎｏ．１−１１９のいずれか１つを含み、ここで、エマルジョンの個々の小滴における分析物の存在の測定が域値を下回る場合、システムは、サンプルの残りのアリコートを濃縮する。実施形態Ｎｏ．１２１は、実施形態Ｎｏ．１−１２０のいずれか１つを含み、ここでシステムは、濃縮されたサンプルの残りのアリコートから生成されたエマルジョンの個々の小滴における分析物の存在を測定する。実施形態Ｎｏ．１２２は、実施形態Ｎｏ．１−１２１のいずれか１つを含み、システムの動作は、サンプル中の分析物の測定の間に試薬の測定された送達を必要としない。実施形態Ｎｏ．１２３は、実施形態Ｎｏ．１−１２２のいずれか１つを含み、システムの動作は、サンプル中の複数の分析物の測定の間に試薬の測定された送達を必要としない。実施形態Ｎｏ．１２４は、実施形態Ｎｏ．１−１２３のいずれか１つを含み、システムの動作は、複数のサンプル中の複数の分析物の測定の間に試薬の測定された送達を必要としない。実施形態Ｎｏ．１２５は、実施形態Ｎｏ．１−１２４のいずれか１つを含み、ここで分析物は第１の分析物であり、およびシステムは、単一のサンプル実行でサンプル中の第２の分析物を定量化する。実施形態Ｎｏ．１２６は、実施形態Ｎｏ．１−１２５のいずれか１つを含み、ここでシステムは、２０分以内に第１のサンプルを定量化する。実施形態Ｎｏ．１２７は、実施形態Ｎｏ．１−１２６のいずれか１つを含み、ここでシステムは、第１のサンプルの定量化に続いて５分以内に、第２のサンプルを定量化する。実施形態Ｎｏ．１２８は、実施形態Ｎｏ．１−１２７のいずれか１つを含み、ここでシステムは、第１のサンプルの定量化に続いて５分以内に、第２のサンプルを定量化する。実施形態Ｎｏ．１２９は、実施形態Ｎｏ．１−１２８のいずれか１つを含み、ここでサンプルは、少なくとも２０のサンプルを定量化する。実施形態Ｎｏ．１３０は、実施形態Ｎｏ．１−１２９のいずれか１つを含み、ここでサンプルは、少なくとも５０のサンプルを定量化する。実施形態Ｎｏ．１３１は、実施形態Ｎｏ．１−１３０のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは、少なくとも１０のサンプルを分析するのに十分な試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３２は、実施形態Ｎｏ．１−１３１のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは、少なくとも２０のサンプルを分析するのに十分な試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３３は、実施形態Ｎｏ．１−１３２のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは、少なくとも５０のサンプルを分析するのに十分な試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３４は、実施形態Ｎｏ．１−１３３のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは、少なくとも１００のサンプルを分析するのに十分な試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３５は、実施形態Ｎｏ．１−１３４のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは、少なくとも１０００のサンプルを分析するのに十分な試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３６は、実施形態Ｎｏ．１−１３５のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは、熱活性化された試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３７は、実施形態Ｎｏ．１−１３６のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは逆転写試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３８は、実施形態Ｎｏ．１−１３７のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは核酸増幅試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１３９は、実施形態Ｎｏ．１−１３８のいずれか１つを含み、ここであらかじめ測定された試薬カセットは耐熱の核酸を含む。実施形態Ｎｏ．１４０は、連続流でアッセイを行うためのシステムを含み、該システムは：（ａ）第１の入口と第１の出口を含む連続相用の流れ経路；（ｂ）第１の分散相を供給するように構成された第１のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｃ）第２の分散相を供給するように構成された第２のゼロデッドボリュームのインジェクタ；（ｄ）コアレッサー；（ｅ）リアクタ；（ｆ）検出器；および（ｇ）コントローラ、を含む。実施形態Ｎｏ．１４１は、実施形態Ｎｏ．１−１４０のいずれか１つを含み、ここで連続相は疎水性の試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１４２は、実施形態Ｎｏ．１−１４１のいずれか１つを含み、ここで連続相は油脂を含む。実施形態Ｎｏ．１４３は、実施形態Ｎｏ．１−１４２のいずれか１つを含み、ここで連続相は疎水性のフッ化油脂を含む。実施形態Ｎｏ．１４４は、実施形態Ｎｏ．１−１４３のいずれか１つを含み、ここで疎水性のフッ化油脂は、ＦＣ−３２８３、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、３−エトキシ−１，１，１，２，３，４，４，５，５，６，６，６−ドデカフルオロ−２−トリフルオロメチル−ヘキサン、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロ−１−ブタノール、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＯＨ、パーフルオロオクタン、パーフルオロヘキサン、１，１，１−トリフルオロオクタン、および１，１，１，２，２−ペンタフルオロデカンから成る群から選択された試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１４５は、実施形態Ｎｏ．１−１４４のいずれか１つを含み、ここで第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、親水性の試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１４６は、実施形態Ｎｏ．１−１４５のいずれか１つを含み、ここで第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、水性の試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１４７は、実施形態Ｎｏ．１−１４６のいずれか１つを含み、ここで第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つは、水を含む。実施形態Ｎｏ．１４８は、実施形態Ｎｏ．１−１４７のいずれか１つを含み、ここで流れ経路の面は、ポリマーコーティングを含む。実施形態Ｎｏ．１４９は、実施形態Ｎｏ．１−１４８のいずれか１つを含み、ここで流れ経路の面は、撥水性コーティングを含む。実施形態Ｎｏ．１５０は、実施形態Ｎｏ．１−１４９のいずれか１つを含み、ここで流れ経路の面は、フルオロポリマーコーティングを含む。実施形態Ｎｏ．１５１は、実施形態Ｎｏ．１−１５０のいずれか１つを含み、ここでフルオロポリマーは、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシポリマー、フッ化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、ポリエチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、全フッ素置換されたエラストマー、フルオロカーボン、フッ素ゴム、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、パーフルオロスルホン酸（ＰＦＳＡ）、およびパーフルオロポリオキセタンから成る群から選択された試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１５２は、実施形態Ｎｏ．１−１５１のいずれか１つを含み、界面活性剤を含む。実施形態Ｎｏ．１５３は、実施形態Ｎｏ．１−１５２のいずれか１つを含み、ここで界面活性剤は、過フッ化炭化水素、炭化水素、およびシリコンから成る群から選択された試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１５４は、実施形態Ｎｏ．１−１５３のいずれか１つを含み、ここで、第１の分散相と第２の分散相の少なくとも１つの容積は、約１ピコリットルから約１ミリリットルの範囲である。実施形態Ｎｏ．１５５は、実施形態Ｎｏ．１−１５４のいずれか１つを含み、ここで流れ経路は、約０．００１”から約０．５”の範囲の内部水力直径を含む。実施形態Ｎｏ．１５６は、実施形態Ｎｏ．１−１５５のいずれか１つを含み、ここでシステムは、核酸の切片の複数のコピーを含む。実施形態Ｎｏ．１５７は、実施形態１−１５６のいずれか１つを含み、ここで第１の分散相は少なくとも１つの基質を含み、および第２の分散相は少なくとも１つの試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１５８は、実施形態Ｎｏ．１−１５７のいずれか１つを含み、ここで第１の分散相は生体サンプルまたは第１の薬物前駆体を含む。実施形態Ｎｏ．１５９は、実施形態Ｎｏ．１−１５８のいずれか１つを含み、ここで第２の分散相は溶解試薬または第２の薬物前駆体を含む。実施形態Ｎｏ．１６０は、実施形態Ｎｏ．１−１５９のいずれか１つを含み、ここで第１の分散相は少なくとも１つの核酸分子を含み、および第２の分散相は核酸増幅試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１６１は、実施形態Ｎｏ．１−１６０のいずれか１つを含み、ここで核酸増幅試薬は、プライマー、プローブ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、緩衝液、および酵素から成る群から選択された試薬を含む。実施形態Ｎｏ．１６２は、実施形態Ｎｏ．１−１６１のいずれか１つを含み、ここで検出器は、蛍光シグナルを測定するように構成される。実施形態Ｎｏ．１６３は、実施形態Ｎｏ．１−１６２のいずれか１つを含み、ここでコアレッサーは、外部エネルギー源を含む。実施形態Ｎｏ．１６４は、実施形態Ｎｏ．１−１６３のいずれか１つを含み、ここで外部エネルギー源は、少なくとも２つの電極間の電界を含む。実施形態Ｎｏ．１６５は、実施形態Ｎｏ．１−１６４のいずれか１つを含み、ここで少なくとも２つの電極間の電位は、約１００Ｖから約２５０００の範囲である。実施形態Ｎｏ．１６６は、実施形態Ｎｏ．１−１６５８７のいずれか１つを含み、ここで外部ソースは、圧力源と機械的ソースの少なくとも１つを含む。実施形態Ｎｏ．１６７は、実施形態Ｎｏ．１−１６６のいずれか１つを含み、ここで圧力源はポンプである。実施形態Ｎｏ．１６８は、実施形態Ｎｏ．１−１６７のいずれか１つを含み、ここでリアクタは化学反応を引き起こすように構成される。実施形態Ｎｏ．１６９は、実施形態Ｎｏ．１−１６８のいずれか１つを含み、ここでリアクタは外部エネルギー源と連通する。実施形態Ｎｏ．１７０は、実施形態Ｎｏ．１−１６９のいず
れか１つを含み、ここでリアクタは少なくとも１つの熱源を含む。実施形態Ｎｏ．１７１は、実施形態Ｎｏ．１−１７０のいずれか１つを含み、ここでリアクタは複数の熱源を含む。実施形態Ｎｏ．１７２は、実施形態Ｎｏ．１−１７１のいずれか１つを含み、ここでリアクタは第１の熱源と第２の熱源を含む。実施形態Ｎｏ．１７３は、実施形態Ｎｏ．１−１７２のいずれか１つを含み、ここで第１の熱源は８５°Ｃ〜９５°Ｃの範囲の温度で維持される。実施形態Ｎｏ．１７４は、実施形態Ｎｏ．１−１７３のいずれか１つを含み、ここで第１の熱源は約９０°Ｃの温度で維持される。実施形態Ｎｏ．１７５は、実施形態Ｎｏ．１−１７４のいずれか１つを含み、ここで第２の熱源は約５５°Ｃ〜７０℃の範囲の温度で維持される。実施形態Ｎｏ．１７６は、実施形態Ｎｏ．１−１７５のいずれか１つを含み、ここで流れ経路は、第１の熱源と第２の熱源の少なくとも１つと熱交換する。実施形態Ｎｏ．１７７は、実施形態Ｎｏ．１−１７６のいずれか１つを含み、ここで流れ経路の試薬は、第１の熱源と第２の熱源と連通し、反復して流れる。実施形態Ｎｏ．１７８は、実施形態Ｎｏ．１−１７７のいずれか１つを含み、ここで試薬は、複数の反復にさらされる。実施形態Ｎｏ．１７９は、実施形態Ｎｏ．１−１７８のいずれか１つを含み、ここで複数の反復は、少なくとも３０の反復である。実施形態Ｎｏ．１８０は、実施形態Ｎｏ．１−１７９のいずれか１つを含み、ここで複数の反復は、少なくとも６０の反復である。実施形態Ｎｏ．１８１は、実施形態Ｎｏ．１−１８０のいずれか１つを含み、ここで流れ経路は、図８の第１の熱源と第２熱源を通り抜ける。実施形態Ｎｏ．１８２は、実施形態Ｎｏ．１−１８１のいずれか１つを含み、ここでリアクタは、サーモサイクラーである。実施形態Ｎｏ．１８３は、実施形態Ｎｏ．１−１８２のいずれか１つを含み、ここでコントローラ、第１の分散相と第２の分散相を混ぜる所要時間と混合のタイミングの少なくとも１つを指定するように構成される。実施形態Ｎｏ．１８４は、実施形態Ｎｏ．１−１８３のいずれか１つを含み、ここでシステムは自動的に動作する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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