(57)【要約】  本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ＲＮＡのエクソンスキップを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明のある態様では、ＧＬＤＣの活性を調節するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）の活性を調節するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はその発現産物を改変する、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
細胞周期停止又はアポトーシスを誘導するために、ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡのエクソンのスキップを誘導することによって、ＧＬＤＣの発現を阻害する、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズし、１種以上のＲＮＡ結合スプライシング調節因子に対して立体障害効果を発揮する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
立体障害によりｍＲＮＡの翻訳を妨げる、請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ＧＬＤＣ  ＲＮＡのエクソン、イントロン又はエクソン−イントロン境界の標的領域に特異的にハイブリダイズし、前記標的領域が、エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、イントロン６、イントロン７、及びイントロン８からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１〜配列番号９４から選択されるいずれか１つの配列を含む、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
修飾されたポリヌクレオチド骨格を含む、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が、少なくとも１つのポリヌクレオチドの糖を置きかえた修飾部分を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記修飾部分がホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及び非ペプチドデンドリマーオクタグアニジン部分標識モルホリノオリゴマーからなる群より選択される、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項９〜請求項１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記修飾ヌクレオチド間結合が修飾されたホスフェートを含む、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記修飾されたホスフェートが、非架橋酸素原子を置換する硫黄原子、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、及びホスホロアミデートからなる群より選択される、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ヒドロカルビルリボ核酸、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡ、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホジエステル、２’−メトキシエチルホスホロチオエート、２−メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’−Ｏ−ヒドロカルビＭＭＩ、デオキシメチルホスホネート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’−チオＤＮＡ、４’−チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’−アミデート、デオキシ３’−アミデート、２’−Ｏ−ヒドロカルビル３’−アミデート、ロックド核酸（Locked Nucleic Acids）、シクロヘキサン核酸、トリサイクルＤＮＡ、２’−フルオロ−アラビノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート、カルバメート結合、ホスホトリエステル結合、ナイロン骨格修飾、及び前述の骨格の混合物からなる群より選択される骨格を含む、請求項１〜請求項１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞への取り込みを増進する１つ以上のコンジュゲートに化学的に連結されている、請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ＧＬＤＣ発現癌患者の治療に使用するための、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記患者はさらなる抗癌剤又は治療を施される、請求項１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、結腸癌、黒色腫、精巣癌、甲状腺癌、神経膠腫、カルチノイド腫瘍及び葉状腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１８又は請求項１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２２】
そのままで、又は送達剤と複合して、患者への非経口投与に適している、請求項２１に患者の組成物。
【請求項２３】
前記キャリアが、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、請求項２１〜請求項２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は医薬的有効量の請求項２１〜請求項２４のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項２６】
キャリアが、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記組成物が、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２５〜請求項２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
癌を治療するための医薬の製造における、ＧＬＤＣの活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はＧＬＤＣの発現産物を改変する、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２９〜請求項３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
癌を有する患者における予後の分類又は決定を補助するための方法、又は癌を有する患者のための治療戦略を選択するための方法であって、試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルを評価することを含む方法。
【請求項３４】
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルに関する情報を利用して治療レジメンを選択するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が前記患者から得られ、前記試料が、癌が疑われるか、癌が発見された組織の試料であるか、又は前記組織に由来する細胞を含む、請求項３３又は請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルが上昇したレベルである場合、選択される前記治療レジメンが、ＧＬＤＣ活性の阻害剤又はＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルの調節剤で患者を処置することを含む、請求項３３〜請求項３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記阻害剤又は前記調節剤が、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導する方法であって、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２１〜請求項２４のいずれか１項に記載の組成物を細胞に送達することにより、ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導することを含む方法。
【請求項３９】
エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、又はエクソン２１のいずれか１つがスキップされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３８又は請求項３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒト細胞が癌細胞であり、前記癌が、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、任意で容器中に、添付文書、パッケージラベル、説明書又は他のラベルを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ＲＮＡのエクソンスキップを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
より詳細には、本出願は癌の領域に関し、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などのグリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）を過剰発現する癌、及びリンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫）、神経膠芽腫、乳癌、前立腺癌、肺癌、及び結腸癌などの他の癌の領域に関する。ＧＬＤＣタンパク質存在量の直接的かつ選択的な標的化（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）媒介エクソンスキップによる）は癌細胞の細胞周期停止及び／又はアポトーシスをもたらすことが、本明細書において示される。また、正常組織におけるＧＬＤＣの部分的枯渇（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）媒介エクソンスキップによる）が、有害作用を有さないという証拠も提供される。
【背景技術】
【０００３】
ＧＬＤＣはオキシドレダクターゼのファミリ−に属する酵素であり、特に、アクセプターとしてジスルフィドを有するドナーのＣＨ−ＮＨ２基に作用する酵素である。この酵素は、グリシン、セリン及びトレオニンの代謝に関与する。それは、補因子としてピリドキサ−ルホスフェートを使用する。ＧＬＤＣは、全ての真核生物においてグリシンの分解を触媒するグリシン切断系を形成する４つのタンパク質のうちの１つである。ヒトにおける高レベルのグリシン又はグリシン蓄積は、グリシン脳症（glycine encephalopathy）として知られている。
【０００４】
本明細書における明らかに先に公開された文献のリスト又は議論は、必ずしも、その文書が最新技術の一部であること、又は一般的な知識であることを確認するものと解釈されるべきではない。
【０００５】
本明細書で言及される文書はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様においては、ＧＬＤＣの活性を調節するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【０００７】
好ましくは、調節という用語は、ＧＬＤＣの活性；ＧＬＤＣへのＲＮＡスプライシング又は翻訳後プロセシング；ＧＬＤＣのリン酸化；ｍＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ前駆体の発現並びにタンパク質発現の両方を含む、ＧＬＤＣの発現レベル；又はＧＬＤＣの細胞内局在化のうちの１つ以上の活性化、阻害、遅延、抑制又は干渉を指す。好ましくは本発明において、オリゴヌクレオチドは、活性；又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパクの質発現レベルのうち１つ以上を調節する。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はその発現産物を改変する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドがＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡのエクソンのスキップを誘導することによって、細胞周期停止及び／又はアポトーシスを誘導して、ＧＬＤＣの発現を阻害する。より詳細には、ＧＬＤＣ発現細胞におけるＧＬＤＣの発現をオリゴヌクレオチドが阻害する。
【０００８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドはＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズする。本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリックＤＮＡ相補性、フ−グステイン結合、又は当該分野で公知の他の配列特異的結合の規則に従って、水素結合による核酸の２つ又は３つの鎖の間の相互作用を意味する。ハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の異なるストリンジェンシー条件下で実施され得る。
【０００９】
より好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが１つ以上のＲＮＡ結合スプライシング調節因子に対して立体障害効果を発揮する。例えば、ある実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、立体障害によってｍＲＮＡの翻訳を妨げる。
【００１０】
好ましくはオリゴヌクレオチドがＧＬＤＣ  ＲＮＡのエクソン、イントロン又はエクソンイントロン境界である標的領域に特異的にハイブリダイズし、標的領域はエクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、イントロン６、イントロン７及びイントロン８を含む群から選択される任意のものである。これらの配列を以下の表に示す。
【００１１】
2020500034.tif 000002
【００１２】
2020500034.tif 000003
【００１３】
2020500034.tif 000004
【００１４】
2020500034.tif 000005
【００１５】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９４のいずれか１つから選択される配列を含む。配列番号１〜１２を表１に示す。表１に示される配列に加えて、表２は、ＧＬＤＣ転写物においてエクソンスキップを誘導することもできるｓｈＡＯＮ（配列番号１３〜９４）の代替配列を示す。
【００１６】
【表１】
2020500034.tif 000006
【００１７】
【表２】
2020500034.tif 000007
【００１８】
2020500034.tif 000008
【００１９】
2020500034.tif 000009
【００２０】
2020500034.tif 000010
【００２１】
本発明の種々の実施形態において、表１又は表２に示される各配列は、１つ以上のエクソン／イントロンを標的とし得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＧＬＤＣ標的エクソンの効率的かつ特異的なスキップをもたらすｓｈＡＯＮの選択。ＧＬＤＣを標的とする１００ｎＭのｓｈＡＯＮを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を用いてＡ５４９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１６〜２４時間後に細胞を回収し、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。特異的標的エクソンのスキップの誘導におけるｓｈＡＯＮ効率を、標的エクソンをカバーする領域のＰＣＲ増幅、続いてＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析によって決定した。ｓｈＡＯＮ効率は、全アンプリコンに対してのエクソンスキップを有するアンプリコンの百分率として提示される。タンパク質合成及びＲＮＡ分解を防止するために、トランスフェクションの５時間後に、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを培養培地に添加した。ａ）特異的エクソンスキップを示すＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の画像。ｂ)各ｓｈＡＯＮによって誘導されたエクソンスキップ効率の計算値。ｃ）バンドのＤＮＡ配列決定は、特定の標的エクソンのスキップを確認するためにアガロースゲル（（ａ）に示される）から切り出されたスキップされた転写物に対応する。ｄ）スキップされた転写物がＮＭＤによって分解される程度を、上記と同じ条件下であるがシクロヘキシミドの非存在下でのｓｈＡＯＮトランスフェクションによって推定した。２つの実験条件におけるスキップ効率の比較では、シクロヘキシミド処理試料においてスキップされた転写物の割合がより高く、シクロヘキシミドがスキップされた転写物をＮＭＤから保護することが示されている。
【図２】選択された３つのｓｈＡＯＮは低用量で標的エクソンスキップを誘導し、ＧＬＤＣタンパク質発現を阻害する。ａ）用量応答曲線。ｂ)１４４時間までの異なる時点でのスキップ効率を示すタイムコース実験。ｃ) ロード対照としてβ−アクチンを用いたＧＬＤＣタンパク質のウェスタンブロッティング。
【図３】ｓｈＡＯＮは、Ａ５４９細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害する。ａ)１０ｎＭでのｓｈＡＯＮトランスフェクション後のＡ５４９細胞の増殖曲線。ＮＣはスクランブルされたｓｈＡＯＮ、ｌｉｐｏ  ｏｎｌｙはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００のみ。ｂ)トランスフェクション後１２０時間でのＡ５４９細胞生存率に対する種々の濃度のｓｈＡＯＮの効果。ｃ)１０ｎＭのｓｈＡＯＮ７ｃ、７Ｄ又は８Ｄでトランスフェクトした１２０時間後のＡ５４９、ＭＲＣ５及びＨＬＦ細胞間の細胞生存率の比較。ｄ)ｓｈＡＯＮでトランスフェクトしたＡ５４９細胞の軟寒天アッセイ。コロニー数をトランスフェクションの７日後に計数し、ＮＣに対して正規化した。「＊」は、結果がスクランブルされたＡＯＮコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）ことを示す。
【図４】ｓｈＡＯＮは肺腫瘍球細胞においてＧＬＤＣノックダウンを誘導し、細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害した。ａ）腫瘍球細胞におけるｓｈＡＯＮ誘導エクソンスキップ効率の用量応答曲線（デンシトメトリー分析により測定）。トランスフェクションの２４時間後に細胞を回収した。ｓｈＡＯＮトランスフェクションの５時間後に１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添加して、スキップされた転写物がＮＭＤを受けるのを阻害した。ｂ）ロード対照としてβ−アクチンを用いた腫瘍球細胞におけるＧＬＤＣタンパク質（２００ｎＭ）のウェスタンブロッティング（トランスフェクションの７２時間後）。ｃ）トランスフェクションの７２時間後に細胞生存率アッセイを用いて測定したｓｈＡＯＮ用量応答。ｄ）１５０ｎＭのｓｈＡＯＮでトランスフェクトした腫瘍球細胞の増殖曲線。ｅ）ｓｈＡＯＮでトランスフェクトした腫瘍球細胞の軟寒天アッセイ。コロニーの数を、トランスフェクションの７日後に計数し、そしてＮＣ試料に対して正規化した。「＊」は、結果がスクランブルされたＡＯＮコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）ことを示す。
【図５】ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは、他のタイプの癌においてＧＬＤＣダウンレギュレーションを誘導するのに有効であり得る。ａ)異なる細胞系におけるＧＬＤＣ発現のリアルタイムＰＣＲ測定。ｂ）ＭＬＬ細胞株においてＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮ（１００ｎＭ）で誘導されたエクソンスキップの効率（ｓｈＡＯＮトランスフェクションの５時間後に２５μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを添加）。
【図６】ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは、免疫不全マウスにおいて皮下成長したヒト腫瘍異種移植片において、エクソンスキップを誘導し、腫瘍成長を阻害した。ａ)ｓｈＡＯＮ ７Ｄ又はＮＣ(スクランブル）のいずれかで処置したマウス（７〜８マウス／処置群）由来の腫瘍質量を比較するドットプロット。２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示すエラーバーと共に中央値を示す。７Ｄ処置マウス由来の腫瘍の中央値は、ＮＣ処置マウス由来よりも６０％小さい；Ｐ値＝０．０００６７６（対応なしｔ試料検定）及び０．００３９１（対応なしＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）。ｂ)マウスから抽出した２０個の腫瘍試料（スクランブル対照群１２個、ｓｈＡＯＮ ７Ｄ群８個）において、ｓｈＡＯＮ ７Ｄによって誘導されたエクソン７のスキップをＮＣと比較したゲル電気泳動分析。ＲＮＡ分解のために検出可能なＰＣＲ産物を有さない試料は、ゲル光に含まれない。
【図７】ｓｈＡＯＮ ７Ｄは、トランスフェクション剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）の非存在下で、エクソンスキップ、ＧＬＤＣダウンレギュレーション及びＴＳ３２細胞増殖阻害を誘導することができた。ｓｈＡＯＮ ７Ｄ（１００ｎＭ）で誘導された、トランスフェクションの２４時間後におけるリポフェクタミンの有無による（ａ）特異的エクソンスキップ及び（ｂ）のＧＬＤＣ転写物ダウンレギュレーションの比較。(ｃ)トランスフェクションの７２時間後のリポフェクタミンの非存在下でのＴＳ３２細胞増殖に対するｓｈＡＯＮ ７Ｄの効果。トランスフェクション剤（リポフェクタミン）の非存在下で、１００ｎＭ濃度のｓｈＡＯＮ ７Ｄは、エクソン７スキップ、ＧＬＤＣダウンレギュレーション、及びＴＳ３２細胞増殖阻害を、それぞれ５５％、３７％及び１８％の効率で誘導することができた。ｓｈＡＯＮ ７Ｄ濃度が２００ｎＭに増加すると、細胞増殖阻害は３２％に増加した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、グリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）発現を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｈＡＯＮ）の立体障害に関する。特に、このようなｓｈＡＯＮは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び他の癌のための薬物候補として使用され得る。GLDC mRNAのナンセンス変異依存分解を誘導するためのｓｈＡＯＮの適用は、以前の研究では説明されていない。したがって、本発明は、ＮＳＣＬＣ及び他の癌についてのＧＬＤＣに対する高度に有効な（ＩＣ５０＜１０ｎＭ）薬物候補の群についての新規化学式を開発するために使用され得る。
【００２４】
「オリゴヌクレオチド」は、任意のポリヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドからなるオリゴマーである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせから構成され得る。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」又はその複数形は、本明細書で論じられ、他の方法で当技術分野で知られている修飾形態と交換可能である。ある例において、当技術分野は、天然に存在するヌクレオチドのみならず重合され得るヌクレオチドの改変物をも包含する「核酸塩基」という用語を使用する。従って、ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然の核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）ならびにキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ［３］Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュ−ドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、及び米国特許第５，４３２，２７２号及びSusan M. Freier and Karl−Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429−4443に記載の「非天然の」核酸塩基を意味する。用語「核酸塩基」はまた、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環アナログ及び互変異性体も含む。さらに、天然及び非天然の核酸塩基には、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号（Merigan et ah)、Chapter 15 by Sanghvi, Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, Englisch et ah, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722 (特に622頁及び623頁を参照）及びthe Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607に開示されているものが含まれる。種々の局面において、ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」を含み、これは、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として働く特定の「ユニバ−サル塩基」を含む、核酸塩基のように働き得る複素環化合物などの化合物を含む。ユニバ−サル塩基には、３−ニトロピロ−ル、任意で置換されているインド−ル（例えば、５−ニトロインド−ル）、及び任意で置換されているヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバ−サル塩基としては、ピロ−ル、及び当技術分野で公知のユニバ−サル塩基を含むジアゾ−ル誘導体又はトリアゾ−ル誘導体が挙げられる。
【００２５】
ポリヌクレオチドはまた、修飾された核酸塩基を含み得る。「修飾塩基」は天然塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及び／又はチミン）と対合することができ、かつ／又は天然に存在しない塩基と対合することができるものであることが当技術分野で理解される。例示的な修飾塩基はＥＰ１０７２６７９及びＷＯ９７／１２８９６に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、−アデニン及びグアニンの６−メチル化体及び他のアルキル誘導体、−アデニン及びグアニンの２−プロピル化体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュ−ドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ−ル、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザアデニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザアデニン及び３−デアザアデニンが含まれるが、限定されない。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）オン）などの三環ピリミジン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が含まれる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されたものも含まれ得る。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et ah, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289- 302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているものが含まれる。これらの塩基の特定のものは、ポリヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む）を含む。５−メチルシトシン置換は０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加させることが示されており��特定の態様では、２’Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１  号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第  ６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号及び第５，６８１，９４１号を参照されたい。
【００２６】
当業者は、本開示のアンチセンスポリヌクレオチドを容易に設計し得る。例えば、当分野における一般的な教示には、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるWee and Pramono et al, PLoS One 3:e1844 (2008); Pramono ZA et al, WO/2011/078,797; Pramono and Wee et al, Hum Gene Ther 23:781-790 (2012); Aartsma-Rus et al, Methods Mol Biol. 867: 117-29 (2012); Aartsma-Rus et al, Methods Mol Biol. 867: 97-116 (2012); van Roon-Mom et al., Methods Mol Biol. 867: 79-96 (2012)が含まれるが、これらに限定されない。一般的なガイドラインはまた、３つの連続したＧ又はＣヌクレオチドを回避する試み、自己構造の形成に有利でない長さ及び配列を選択すること（ヘアピン化を回避する）、ならびにプライマー二量体を形成しそうな配列を回避することを含む。いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスポリヌクレオチドは、該アンチセンスポリヌクレオチドが完全にＰＲＤＭ１５核酸のエクソン内部にある配列に特異的にハイブリダイズするか、又は該アンチセンスポリヌクレオチドがＰＲＤＭ１５核酸に特異的にハイブリダイズしたときに該アンチセンスポリヌクレオチドの約１つのヌクレオチドが前記イントロン−エクソン境界にまたがる配列に特異的にハイブリダイズするように、エクソン又はイントロン−エクソン境界に特異的にハイブリダイズするように設計されたものである。アンチセンスポリヌクレオチドが完全にエクソン内部にある配列に特異的にハイブリダイズするいくつかの実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドの末端は、エクソンの末端から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヌクレオチド分離れていることが意図される。
【００２７】
他の実施形態では、本開示のアンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヌクレオチドがイントロン−エクソン境界にまたがるように、ＧＬＤＣ核酸のイントロン−エクソン境界に特異的にハイブリダイズするように設計されたものである。ヌクレオチドが、エクソン側又はイントロン側のいずれかで「イントロン−エクソン境界にまたがる」ことができることが理解される。したがって、イントロン配列に特異的かつ主に（predominantly）ハイブリダイズし、隣接するエクソンにハイブリダイズするヌクレオチドが１つのみであるアンチセンスポリヌクレオチドは、１つのヌクレオチドだけ「イントロン−エクソン境界にまたがる」。同様に、エクソン配列に特異的にハイブリダイズし、隣接するイントロンにハイブリダイズするヌクレオチドが１つのみであるアンチセンスポリヌクレオチドは、１つのヌクレオチドだけ「イントロン−エクソン境界にまたがる」。前述の実施形態のいずれかにおいて、アンチセンスポリヌクレオチドは少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上のヌクレオチド長までである。
【００２８】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾されたポリヌクレオチド骨格を含み得る。修飾ポリヌクレオチド骨格は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの糖を置き換えた修飾部分を含んでもよい。
【００２９】
修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド単位の１つ以上の糖及び／又は１つ以上のヌクレオチド間結合の両方がそれぞれ「天然に存在しない」糖（すなわち、リボース又はデオキシリボース以外の糖）又はヌクレオチド間結合で置換されたものについて使用されることが意図される。ある局面において、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を意図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格はアミド含有（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位間のペプチド結合）骨格に置き換えられている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、及び第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７１５００を参照されたい。修飾ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖基を含み得る。ある局面では、糖の修飾は、２’位のヒドロキシル基が糖環の３’ 位又は４’ 位の炭素原子と繋げられて二環式糖基を形成しているロックド核酸（Locked Nucleic Acids, ＬＮＡ）を含む。ある局面においてその結合は２’ 位の酸素原子と４’ 位の炭素原子とを架橋するメチレン（ＣＨ [２] −） [ｎ]基であり、ここでｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製はＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾ポリヌクレオチド骨格を含む。修飾ポリヌクレオチド骨格は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの糖を置きかえた修飾部分を含みうる。修飾部分は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及び非ペプチドデンドリマーオクタグアニジン部分タグ付きモルホリノオリゴマーを含む群より選択され得る。
【００３０】
様々な実施形態では、修飾ポリヌクレオチド骨格は少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。修飾ヌクレオチド間結合は、修飾されたホスフェートを含む。より好ましくは、修飾されたホスフェートは、非架橋酸素原子を置換する硫黄原子、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、及びホスホロアミデートを含む群より選択されるいずれか１つを含む。
【００３１】
本発明の種々の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチル−オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ヒドロカルビルリボ核酸、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡ、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホジエステル、２’−メトキシエチルホスホロチオエート、２−メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＭＭＩ、デオキシ−メチルホスホネート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’−チオＤＮＡ、４’−チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’−アミデート、デオキシ３’−アミデート、２’−Ｏ−ヒドロカルビル３’−アミデート、ロックド核酸、シクロヘキサン核酸、三環ＤＮＡ、２’フルオロアラビノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート、カルバメート結合体、ホスホトリエステル結合体、ナイロン骨格修飾、及び前述の骨格の混合物からなる群より選択されるいずれか１つの骨格を含む。
【００３２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞への取り込みを増強する１つ以上のコンジュゲートに化学的に連結されている。
【００３３】
本開示の化合物はまた、遺伝的疾患の処置の目的で、予防又は治療として使用され得る。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＬＤＣ発現癌患者の治療に使用することができる。患者には、さらなる抗癌剤又は治療剤を投与してもよい。癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、血液悪性腫瘍、肺癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、網膜芽細胞腫、甲状腺癌、及び神経膠腫、カルチノイド及び葉状腫瘍を含む群から選択されるいずれか１つである。血液悪性腫瘍は、リンパ腫又は白血病のいずれかである。特に、リンパ腫はＢ細胞リンパ腫である。より詳細には、Ｂ細胞リンパ腫は濾胞性リンパ腫又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
【００３４】
本発明の別の態様では、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。この組成物はそのままでも送達剤と複合した状態でも患者への非経口投与に適している。キャリアは、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、経口、又は直腸、又は経粘膜、又は腸、又は筋肉内、又は皮下、又は髄内、又は髄腔内、又は直接脳室内、又は静脈内、又は硝子体内、又は腹腔内、又は鼻腔内、又は眼内に投与される。
【００３５】
医薬的に許容されるキャリアとは、一般に、キャリアが生物学的に有害でないか、又は望ましくない効果を引き起こさない、対象への投与に適した材料を指す。このようなキャリアは、典型的には薬剤の不活性成分である。典型的には、キャリアは、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれる医薬組成物の任意の他の成分と、有害な様式で相互作用することなく、活性成分と共に対象に投与される。適切な医薬キャリアはその全体が参照により本明細書に組み込まれるMartin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed, Mack Publishing Co, Easton, Pa, (1990)に記載されている。
【００３６】
本開示のより具体的な形態においては、治療有効量のアンチセンスポリヌクレオチドを、医薬的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリアと共に含む医薬組成物が提供される。このような組成物としては種々の緩衝液含量（例えば、リン酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、ならびに、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）及び充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）のような添加剤が挙げられる。この材料は例えば、限定されるものではないが、ポリ乳酸又はポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状調製物に、又はリポソームに組み込むことができる。ヒアルロン酸を使用してもよい。このような組成物は、開示された組成物の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。組成物は、液体形態で調製されてもよく、又は凍結乾燥形態などの乾燥粉末であってもよい。
【００３７】
本発明に従って提供される医薬組成物が当技術分野で知られている任意の手段によって投与することができることは理解されるであろう。好ましくは、投与のための医薬組成物は、注射、経口、又は肺もしくは鼻経路によって投与される。アンチセンスポリヌクレオチドは、種々の実施形態において、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下の投与経路によって送達される。
【００３８】
本発明のアンチセンス分子は任意の医薬的に許容される塩、エステル、もしくはエステルの塩、又は、ヒトを含む動物への投与の際に生物学的に活性な代謝産物又はその残基を（直接又は間接的に）提供することができる任意の他の化合物を包含する。したがって、例えば、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグ及び医薬的に許容される塩、かかるプロドラッグの医薬的に許容される塩、並びに他の生物学的同等物にも関する。
【００３９】
用語「医薬的に許容される塩」は本発明の化合物の生理学的及び医薬的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、それに望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。
【００４０】
ポリヌクレオチドについて、医薬的に許容される塩の好ましい例としては、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン（例えば、スペルミン及びスペルミジン）などのカチオンと形成される塩、(ｂ)無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸）と形成される酸付加塩、(ｃ)有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸）と形成される塩、及び（ｄ）元素（塩素、臭素、ヨウ素など）のアニオンから形成される塩、が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物は、局所又は全身治療が所望されるかどうか、及び治療されるべき領域に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は局所的（眼及び直腸送達を含む粘膜を含む）、肺、例えば、粉末又はエアロゾルの吸入（ネブライザ−、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮によるものを含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内又は脳室内投与が含まれる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するポリヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００４１】
本開示の医薬製剤は、簡便には単位剤形で提示されてもよく、製薬業界で周知の従来技術に従って調製されてもよい。このような技術は、活性成分を医薬キャリア又は賦形剤と会合させる工程を含む。一般に、製剤は活性成分を液体キャリア又は細かく分割された固体キャリア又はその両方と均一に会合させ、次いで、必要であれば、製品を成形することによって調製される。
【００４２】
追加の治療剤との併用療法もまた、本開示によって企図される。本開示の組成物と同時に送達され得る治療剤の例としてはグルココルチコイドステロイド（例えば、これらに限定されないが、プレドニゾン及びデフラザコート）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、βアドレナリン受容体遮断薬、抗線維症剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明が例えば、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）を用いて、適切な宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を指示するような、遺伝子治療において使用され得る。このようなベクターは例えば、宿主細胞中でポリヌクレオチドを増幅して有用な量を作製するために、及び組換え技術を使用してタンパク質を発現するために有用である。いくつかの実施形態では、ベクターが本発明のポリヌクレオチドが発現制御配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されている発現ベクターである。
【００４４】
したがって、本発明のさらに別の態様は患者において癌を治療する方法を提供し、この方法は、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬的有効量の組成物を投与することを含む。キャリアは、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子、ｐＨ感受性リポソームや抗体結合リポソームなどのリポソーム、ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物は、経口、又は直腸、又は経粘膜、又は腸、又は筋肉内、又は皮下、又は髄内、又は髄腔内、又は直接脳室内、又は静脈内、又は硝子体内、又は腹腔内、又は鼻腔内、又は眼内に投与することができる。これまでのところ、実績のある全身投与の選択肢には、静脈内、腹腔内、鼻腔内及びくも膜下腔内が含まれる。ＡＳＯと、ナノ粒子やポリマー又はリポソームを基とするビヒクルなどの送達キャリアと複合体化することで、特定の組織へのＡＳＯの送達効率をさらに増大しうる。
【００４６】
癌は、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫を含む群から選択される任意の１つであり得る。
【００４７】
ある実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００４８】
本発明のなお別の局面において、癌を処置するための薬剤の製造におけるＧＬＤＣの活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が提供される。オリゴヌクレオチドは、活性又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する。ある実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００４９】
本発明の別の局面において、癌を有する患者における予後の分類又は決定を補助するための、又は癌を有する患者のための治療戦略を選択するための方法が提供され、この方法は、試料中のＧＬＤＣ核酸、タンパク質又は活性のレベルを評価することを包含する。この方法は、試料中のＧＬＤＣ核酸、タンパク質又は活性のレベルに関する情報を利用して、治療レジメンを選択する工程を包含する。様々な実施形態では試料は患者から得られ、試料は癌が疑われるか、癌が発見された組織試料であるか、又は前記組織由来の細胞を含む。試料中のＧＬＤＣ核酸、タンパク質又は活性のレベルが上昇したレベルである場合、選択された治療レジメンは、ＧＬＤＣ活性の阻害剤又はＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルの調節剤で患者を治療することを含む。様々な実施形態では、阻害剤又は調節剤が本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００５０】
本発明の別の態様では、ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導する方法であって、本発明の第１の態様によるアンチセンスポリヌクレオチド、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を細胞に送達し、それによってＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導することを含む方法が提供される。
【００５１】
好ましくは、エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、又はエクソン２１がスキップされる。
【００５２】
様々な実施形態では、細胞はヒト細胞であってよい。該ヒト細胞は癌細胞であり、該癌は、ＮＳＣＬＣ、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫を含む群から選択されるいずれか１つである。
【００５３】
本発明の別の態様では、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、任意で容器、及び添付文書、パッケージラベル、取扱説明書、又は他のラベルを含むキットが提供される。
【００５４】
有利であることに、本発明は、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡのエクソンスキップを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＧＬＤＣ発現癌の治療のための前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００５５】
当業者は、上記方法の適用が多くの他の疾患の治療における使用に適切なアンチセンス分子を同定するための広範な適用を有することを理解するであろう。
【００５６】
本発明を完全に理解し、容易に実用的に実施できるようにするために、本発明の好ましい実施形態のみを非限定的な例により説明するが、その説明は添付の例示的な図面を参照している。
【実施例】
【００５７】
実施例１
本稿では、ＮＳＣＬＣ(非小細胞肺癌）の治療戦略として、ＧＬＤＣ(グリシンデカルボキシラ−ゼ）ｍＲＮＡをそれぞれ分解する１２個の新規ｓｈＡＯＮ（立体障害アンチセンスオリゴヌクレオチド）を同定した（添付の図１）。ＧＬＤＣは、ＮＳＣＬＣからの腫瘍開始細胞において高度に発現され、細胞形質転換及び腫瘍形成を促進する（Zhang et al. Cell 2012; Jain et al. Science 2012）；触媒能力が不活性なＧＬＤＣは、細胞形質転換を促進することができない。ｓｈＡＯＮは、すべての塩基がホスホロチオエート骨格によって結合した２’−Ｏ−メチルで修飾されている化学修飾合成一本鎖ＲＮＡ分子である。各ｓｈＡＯＮは、新生したばかりのＧＬＤＣ  ｍＲＮＡに特異的部位で相補的に結合するように設計され、エクソン認識及びそのスプライシングに重要なＲＮＡ結合スプライシングレギュレーターに対して立体障害効果を発揮する。機構的としては、成熟ＲＮＡにおいて多数の下流の未成熟終止コドンを生成する特異的なフレーム外エクソン（out-of-frame exon）の排除をｓｈＡＯＮが誘導すると、得られるｍＲＮＡがナンセンス変異依存分解プロセスを介して分解の標的とされるというものである。
【００５８】
本発明者らはヒト癌細胞株及び患者の原発性癌細胞についてのさらなるインビトロバリデ−ションのために、３つの最も効率的なｓｈＡＯＮを選択する。癌細胞株において、各ｓｈＡＯＮは、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡにおける特異的エクソンスキップ及びその後のＧＬＤＣタンパク質発現の抑制をＩＣ５０＜１０ｎＭで誘導し（図２）、癌細胞増殖の７０％超を阻害する（図３）。原発性癌細胞において、ｓｈＡＯＮは、肺腫瘍球細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害する（図４）。さらに、ｓｈＡＯＮは、急性白血病細胞株におけるＧＬＤＣのダウンレギュレーションに有効である（図５）。本発明者らはさらに、ＮＳＣＬＣ患者由来の肺腫瘍球細胞を移植したマウスにおけるインビボ研究のための１つのｓｈＡＯＮを選択する。移植マウスにｓｈＡＯＮを腹腔内注射によって計画的に投与すると、ヒト腫瘍増殖の６０％が阻害された（図６）。
【００５９】
本発明を以下により詳細に説明する。
【００６０】
材料及び方法
細胞株培養
ヒト肺腺癌上皮細胞株Ａ５４９を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持した。正常ヒト胎児肺線維芽細胞ＭＲＣ−５細胞及びヒト成人肺線維芽細胞ＨＬＦ細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【００６１】
腫瘍球培養
腫瘍球ＴＳ３２細胞を、以前に記載されたように調製し（Zhang, WC; et al., 2012）、無処理シャーレ中において、０．４％ＢＳＡ（Sigma）、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）を補充したＩＴＳ（Sigma）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。新鮮な培地を３日毎に補充した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（EMD-Millipore）で分割して、単一細胞懸濁液を得た。
【００６２】
ｓｈＡＯＮの設計・合成
ｓｈＡＯＮは、我々の特許された計算方法を用いて設計され、Sigma-Aldrich Pte Ltd（シンガポール）によって２’−Ｏ−メチルで修飾されたホスホロチオエート骨格（２ＯＭｅＰＳ）を伴い合成された。スクランブルされたシーケンスを有するｓｈＡＯＮが全ての実験に含まれた。
【００６３】
ｓｈＡＯＮによる細胞トランスフェクション
全ての細胞／細胞株についての細胞トランスフェクションの間のトランスフェクション培地として、抗生物質（すなわち、ペニシリン−ストレプトマイシン）を含まない増殖培地を使用した。
【００６４】
Ａ５４９細胞を、１ｍＬのトランスフェクション培地を含む６ウェルプレートに１．０〜１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。細胞が約４０％コンフルエンスに達し、培養培地をトランスフェクション前に９００μＬに減少させた。ｓｈＡＯＮ (１００ｐｍｏｌ中）：リポフェクタミン２０００（μＬ中）＝１：２の固定比を有する様々な濃度の１０×トランスフェクション混合物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Invitrogen）中で１００μＬの総容量に調製し、室温で２０分間インキュベートし、細胞培養物に添加した。
【００６５】
ＴＳ３２細胞を、９００μＬのトランスフェクション培地を含む２４ウェルプレートに、１．０〜１．５×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。様々な量のｓｈＡＯＮ及び固定量のリポフェクタミン２０００（５μＬ）を含む１０×トランスフェクション混合物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で１００μＬの総容量に調製し、室温で２０分間インキュベートし、細胞培養物に添加した。再現性を確実にするために、トランスフェクションは、通常、２連又は３連で行った。
【００６６】
ｓｈＡＯＮ誘導エクソンスキップ効率の測定のために、シクロヘキシミド（Sigma）をトランスフェクションの５時間後に細胞培地に添加（１００μｇ／ｍｌ）して、タンパク質合成及びＲＮＡ分解を停止させた。
【００６７】
ｓｈＡＯＮで誘導されたエクソンスキップの効率とｍＲＮＡダウンレギュレーションの定量
ｓｈＡＯＮによるトランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ（AmbionTurbo DNA−Ｆｒｅｅキット）で処理してコンタミＤＮＡを除去し、ランダムヘキサマーと共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Invitrogen）を製造業者の説明書に従って使用してｃＤＮＡに転写した。
【００６８】
ｓｈＡＯＮ誘導エクソンスキップの効率の測定のために、標的エクソン及び両側の少なくとも１つの隣接エクソンをカバーする領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。次いで、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定によって確認し、特異的標的エクソンのスキップを確認した。エクソンスキップ効率は、全産物に対する標的エクソンスキップ産物の量を計算することによってゲル画像のデンシトメトリー分析を行い推定した。密度測定分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, 米国）を用いて行った。
【００６９】
標的エクソン中及び標的エクソンの外側のプライマーを用いて定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を行い、対応する試料中の内因性参照としてＧＡＤＰＨを用いて、スキップ効率の計算のために、スクランブル配列を用いて同じ濃度のｓｈＡＯＮでトランスフェクトした細胞と比較して、全長ＧＬＤＣ転写物の量を測定した。
【００７０】
細胞生存率アッセイ
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（Sigma）又はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイ（Promega）を用いて、９６ウェルプレート（１００μＬ培地／ウェル中３．５×１０３細胞）中で細胞生存率及び増殖の計測を行った。９６ウェルプレートにおいて細胞をｓｈＡＯＮとリポフェクタミン２０００との混合物でトランスフェクトした。ＭＴＴアッセイ（接着細胞に使用）では、培地を、ＭＴＴ(０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地（１００μＬ／ウェル）で置換し、３７℃で４時間インキュベートし、次いで１００μＬのイソプロパノールに交換した。波長５７０ｎｍのマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて６３０ｎｍでバックグラウンドを差し引いて吸光度を測定し、生細胞数に対する吸光度の較正曲線を用いて生細胞数に変換した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存率アッセイ（懸濁細胞の場合）では、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ試薬を添加し（１１μＬ／ウェル）、３７℃で４時間インキュベートした。励起５７０ｎＭ及び発光６００ｎｍのマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて蛍光を測定した。再現性を確実にするために、アッセイを少なくとも２回行い、トランスフェクションを各実験において３連のウェルで行った。
【００７１】
軟寒天アッセイ
ｓｈＡＯＮトランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、ＤＭＥＭ培地中の０．４％のノーブル寒天に再懸濁し、固化した底層（ＤＭＥＭ培地中の０．６％の貴寒天）を含む９６ウェルプレート上にプレーティング（５×１０３細胞／ウェル）した。各ウェルを１００μＬの増殖培地で覆い、標準培養条件下で１週間インキュベートした。細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅで染色し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いてコロニー計数を行った。
【００７２】
ウエスタンブロッティング（濃度・会社のダブルチェックの必要性）
Ｈａｌｔプロテア−ゼ阻害剤カクテルを含有するＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液を用い、４℃で１０分間穏やかに振盪することで、細胞からタンパク質を抽出した。細胞残屑を、最高速度（１２，０００ｇ？）で２０分間、４℃で遠心分離することによって除去し、上清のタンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを使用して、製造業者の指示に従って測定した。製造業者の説明書に従って調製した８％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-rad）に、各試料からの１６μｇのタンパク質をロードし、次いで、Ｂｉｏ−ｒａｄニトロセルロースメンブレンに移した。ＰＢＳＴ中の５％乳で１時間ブロッキングした後、メンブレンを３％乳／ＰＢＳＴ中のウサギ抗ヒトＧＬＤＣポリクローナル抗体（１：２０００）と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて、３％乳／ＰＢＳＴ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ(１：４０００）と共に室温で３時間インキュベ−トした。ウェスタンブロッティングのためのロード対照としてβ−アクチンを使用し、第１及び第２の抗体としてマウス抗ヒトβ−アクチン抗体（１：１０００）及び西洋ワサビペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧ(１：４０００）をそれぞれ使用した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Thermo Scientific）を用いたＥＣＬシステムによって可視化した。
【００７３】
マウス異種移植実験
４〜６週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウスに、無血清培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ(ＢＤ)(１：１）中の腫瘍球の単細胞懸濁液を皮下移植した（５００，０００細胞／マウス）。ｓｈＡＯＮ５０ｍｇ／ｋｇを週３回腹腔内投与した。６週間の注射後にマウスを屠殺し、腫瘍を抽出し、秤量した。Micro Smash MS-100（４５００ｒｐｍで３×４５秒）中の０．５ｍｍガラスビーズ（Sigma-Aldrich）を用いた細胞を破壊した後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液をそれぞれ使用して、全ＲＮＡ及びタンパク質を腫瘍試料から抽出した。
【００７４】
結果
ＧＬＤＣ標的エクソンの効率的かつ特異的なスキップにつながるｓｈＡＯＮの選択
ＧＬＤＣ転写物中の２５個のエクソンのうち、５個のフレーム外エクソン（エクソン７、８、１３、１５及び１６）を、ｓｈＡＯＮを設計するための我々の標的として選択した。各々が個々にスキップされるとき、得られる転写物は標的エクソンの下流にシフトしたリーディングフレームを有し、スキップされた転写物中に複数のＰＴＣを生成する。結果として、標的遺伝子は、転写物が活発に分解されるナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）経路の組み合わせを介してダウンレギュレートされるか、又は、切り縮められた非機能的遺伝子産物の翻訳を導くかのいずれかである。著者らが以前に開発し、検証した計算法を用いて、２０個のｓｈＡＯＮ（４個のｓｈＡＯＮ／エクソン）を設計した。スクランブルされた配列を有する１つのｓｈＡＯＮを、ネガティブコントロールとして全ての実験に含めた。これらのｓｈＡＯＮは安定性及び配列特異性を増加させるために、ホスホロチオエート骨格及び２’−Ｏ−メチルリボース修飾（２ＯＭｅＰＳ）を有するものとして合成した。
【００７５】
本発明者らは、Ａ５４９ヒト肺腺癌上皮細胞をトランスフェクトすることによって、ＧＬＤＣ転写物の特異的エクソンスキップを誘導する設計されたｓｈＡＯＮの能力を試験し（図１）、１００ｎＭのｓｈＡＯＮを用いて、トランスフェクションの２４時間後のＡ５４９細胞においてＧＬＤＣ標的エクソンスキップを誘導する際のスキップ効率の計算値に基づいて、最良のｓｈＡＯＮを選択した。２０個の設計されたｓｈＡＯＮのうち１２個は、標的エクソンのスキップを誘導することができた。表１では１２個の有効なｓｈＡＯＮの式を表示している。全体として、エクソン７及びエクソン８を標的とするｓｈＡＯＮは、標的エクソンスキップを誘導するのにより効率的であった。３つのｓｈＡＯＮ（７Ｄ、７Ｃ、及び８Ｄ）は、ＧＬＤＣ転写物の８０％以上において標的エクソンのスキップを誘導することができたので選択した。
【００７６】
【表３】
2020500034.tif 000011
【００７７】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは低用量で標的エクソンのスキップを誘導し、ＧＬＤＣタンパク質発現を阻害した
Ａ５４９細胞における特異的エクソンスキップの誘導に対する３つの選択されたｓｈＡＯＮの時間及び用量応答効果を、続けてデンシトメトリー分析を行うＰＣＲによって評価した。図２ａに示されるように、３つのｓｈＡＯＮの全ては、３．５〜７ｎＭの範囲のＩＣ５０という低用量で特異的エクソンスキップを誘導し得る。１０ｎＭのｓｈＡＯＮを用いた時間経過実験によると（図２ｂ）、エクソンスキップの誘導に対するそれらの効果は時間と共に減少したが、トランスフェクションの７２時間後にも依然としてＧＬＤＣ転写物の４０％超においてスキップを誘導することができた。
【００７８】
本発明者らはＡ５４９細胞におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ転写物のダウンレギュレートにおける３つの選択されたｓｈＡＯＮの効果を測定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を行った。ｑＰＣＲ分析では、スクランブルされたｓｈＡＯＮでトランスフェクトされた細胞と比較したところ、１０ｎＭのＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮでのトランスフェクションでは、２４時間後に７０％超のＧＬＤＣ全長転写物のダウンレギュレーションが示された。トランスフェクションの７２時間後、３つのｓｈＡＯＮの各々は依然として４０％超のダウンレギュレーションを誘導し得、これはデンシトメトリーからの結果と一致する。
【００７９】
ウェスタンブロッティング分析を行って、タンパク質レベルでのＧＬＤＣ発現に対する選択したｓｈＡＯＮの効果を調べた（図２ｃ）。１０ｎＭ又は２０ｎＭの選択されたｓｈＡＯＮによるトランスフェクションの７２時間後に、ほぼ完全な枯渇に至るタンパク質レベルの低下が存在した。
【００８０】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮはＡ５４９細胞増殖及び腫瘍形成を阻害する
肺癌細胞は高レベルのＧＬＤＣに依存することが見出されている(Zhang WC, et al, Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):259-72）。ｓｈＡＯＮは細胞にトランスフェクトされた場合、ＧＬＤＣの効果的なノックダウンを誘導し得るので、本発明者らは癌細胞の増殖及び増殖に対するそれらの効果を試験した。Ａ５４９細胞生存率を、種々の濃度の選択されたｓｈＡＯＮでのトランスフェクションの０、２４、４８、７２及び１２０時間後にＭＴＴアッセイを用いて測定し、未処理細胞、リポフェクタミン２０００又はスクランブルされたｓｈＡＯＮでトランスフェクトされた細胞を含むいくつかのネガティブコントロールと比較した。ｓｈＡＯＮ誘導ＧＬＤＣノックダウンは、トランスフェクション後１２０時間まで細胞増殖を阻害するようであった（図３ａ及び図３ｂ）。細胞増殖の阻害は５ｎＭのｓｈＡＯＮによる３５％阻害から、３０ｎＭのｓｈＡＯＮによるほぼ１００％阻害まで増加した。図３ｃに示すように、１０ｎＭのｓｈＡＯＮでトランスフェクトした場合、２つの非癌細胞、ＨＬＦ及びＭＲＣ−５の増殖は阻害されないようであったが、Ａ５４９細胞では細胞増殖の約７０％が阻害された。
【００８１】
次に、ｓｈＡＯＮトランスフェクトＡ５４９細胞を、典型的には腫瘍形成性と相関する足場固定非依存性増殖の尺度である軟寒天中コロニー形成能力について調べた。トランスフェクションの７日後、３つのＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮで処理した細胞は、スクランブルされたｓｈＡＯＮで処理した細胞と比較して、軟寒天中で７０〜９２％少ないコロニーを生じ、これはｓｈＡＯＮ誘導ＧＬＤＣノックダウンが癌細胞腫瘍形成性を大きく阻害したことを示す。
【００８２】
ｓｈＡＯＮは肺腫瘍球細胞においてＧＬＤＣノックダウンを誘導し、細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害した
癌幹細胞（ＣＳＣ）又は腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）は腫瘍増殖を駆動及び持続する能力を有し、インビトロ培養で増殖させた場合、球体形成によって単離及び濃縮（enrich）され得る。そのため、本発明者らは、腫瘍開始細胞について高度に濃縮された腫瘍球細胞の増殖に影響を及ぼすことにおけるＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮの効果を試験した。図４ａに示すように、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮはＧＬＤＣ転写物中の特異的標的エクソンのスキップを効果的に誘導することができ、スキップ効率は５１〜９３％の範囲であり、ＩＣ５０は６５ｎＭ〜２２０ｎＭの範囲である（図４ａ）。ウェスタンブロッティングを用いて測定したタンパク質レベルでは、ＧＬＤＣタンパク質発現も効果的に阻害された（図４ｂ）。腫瘍球細胞における効果的なエクソンスキップ及びＧＬＤＣノックダウンを誘導するためには、Ａ５４９細胞におけるよりも多量のｓｈＡＯＮが必要であった。
【００８３】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて測定したところ、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮ処理細胞の増殖／増殖は、スクランブルされたｓｈＡＯＮで処理した腫瘍球細胞と比較して、５７〜７５％阻害された。軟寒天アッセイではまた、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮ処理細胞によって形成されたコロニー数が、スクランブルされたｓｈＡＯＮ処理細胞によって形成されたコロニー数の６１〜７３％減少したことが示された。
【００８４】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは、他の種類の癌においてＧＬＤＣダウンレギュレーションを誘導するのに有効であり得る
ＧＬＤＣの過剰発現は、非小細胞肺癌において見出されたばかりでなく、他のタイプの癌においても報告された(Zhang WC, 2012）。我々はｑＰＣＲを用いて２つのＭＬＬ白血病細胞株におけるＧＬＤＣ発現を評価し、ＧＬＤＣがそれらの両方において過剰発現され、一方、非癌細胞のＧＬＤＣの発現は約６００倍少ないことを確認した（図５ａ）。そのため、本発明者らは、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮがこれらの２つのＭＬＬ細胞株において有効であり得るかどうかを試験した。図５ｂに示されるように、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは両方のＭＬＬ細胞株においてＧＬＤＣ転写物の５０％超において特定のエクソンのスキップを誘導し、本発明者らの設計したｓｈＡＯＮが他のタイプの癌にも有効であり得ることを示した。
【００８５】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは移植腫瘍の増殖を阻害した
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験におけるｓｈＡＯＮ ７Ｄの効果を試験するために、免疫不全マウスに腫瘍球細胞を移植し、続いてｓｈＡＯＮ ７Ｄの腹腔内注射を行った。図６に示されるように、７Ｄ及びＮＣ処置マウス由来の腫瘍は、それぞれ０．３２５ｇ及び０．８２０ｇの中央値、すなわち腫瘍増殖の６０％阻害と計量された（Ｐ値＝０．０００６７６（対応なしｔ試料検定）及び０．００３９１（対応なしＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定））。腫瘍試料２０点（対照群からの１２点及びｓｈＡＯＮ ７Ｄ群からの８点）のＲＮＡ分析では、７Ｄ処置がすべての処置された腫瘍試料においてＧＬＤＣエクソン７又はエクソン７及び８（軽度）のスキップを引き起こしたが、ＮＣ処置された腫瘍試料においてＧＬＤＣエクソンスキップはほとんど観察されなかったことが示された。
【００８６】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、設計又は構造の詳細に多くの変形又は修正を行うことができることを理解するであろう。
【図１】
2020500034.tif 000012
【図２】
2020500034.tif 000013
【図３】
2020500034.tif 000014
【図４】
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【図５】
2020500034.tif 000016
【図６】
2020500034.tif 000017
【図７】
2020500034.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月6日(2018.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号９４から選択されるいずれか１つの配列を含み、
ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡのエクソンのスキップを誘導することによって、ＧＬＤＣの発現を阻害して、細胞周期停止又はアポトーシスを誘導する、
グリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）の活性を阻害するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はその発現産物を改変する、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズし、１種以上のＲＮＡ結合スプライシング調節因子に対して立体障害効果を発揮する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
立体障害によりｍＲＮＡの翻訳を妨げる、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ＧＬＤＣ  ＲＮＡのエクソン、イントロン又はエクソン−イントロン境界の標的領域に特異的にハイブリダイズし、前記標的領域が、エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、イントロン６、イントロン７、及びイントロン８からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
修飾されたポリヌクレオチド骨格を含む、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が、少なくとも１つのポリヌクレオチドの糖を置きかえた修飾部分を含む、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾部分がホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及び非ペプチドデンドリマーオクタグアニジン部分標識モルホリノオリゴマーからなる群より選択される、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記修飾ヌクレオチド間結合が修飾されたホスフェートを含む、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記修飾されたホスフェートが、非架橋酸素原子を置換する硫黄原子、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、及びホスホロアミデートからなる群より選択される、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ヒドロカルビルリボ核酸、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡ、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホジエステル、２’−メトキシエチルホスホロチオエート、２−メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’−Ｏ−ヒドロカルビＭＭＩ、デオキシメチルホスホネート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’−チオＤＮＡ、４’−チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’−アミデート、デオキシ３’−アミデート、２’−Ｏ−ヒドロカルビル３’−アミデート、ロックド核酸（Locked Nucleic Acids）、シクロヘキサン核酸、トリサイクルＤＮＡ、２’−フルオロ−アラビノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート、カルバメート結合、ホスホトリエステル結合、ナイロン骨格修飾、及び前述の骨格の混合物からなる群より選択される骨格を含む、請求項１〜請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞への取り込みを増進する１つ以上のコンジュゲートに化学的に連結されている、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＧＬＤＣ発現癌患者の治療に使用するための、請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記患者はさらなる抗癌剤又は治療を施される、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、結腸癌、黒色腫、精巣癌、甲状腺癌、神経膠腫、カルチノイド腫瘍及び葉状腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１６又は請求項１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２０】
そのままで、又は送達剤と複合して、患者への非経口投与に適している、請求項１９に患者の組成物。
【請求項２１】
前記キャリアが、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、請求項１９〜請求項２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は医薬的有効量の請求項１９〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項２４】
キャリアが、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記組成物が、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２３〜請求項２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
癌を治療するための医薬の製造における、ＧＬＤＣの活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はＧＬＤＣの発現産物を改変する、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２７〜請求項２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
癌を有する患者における予後の分類又は決定を補助するための方法、又は癌を有する患者のための治療戦略を選択するための方法であって、試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルを評価することを含み、
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルが上昇したレベルである場合、選択される治療レジメンが、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＧＬＤＣ活性の阻害剤で患者を処置することを含む方法。
【請求項３２】
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルに関する情報を利用して治療レジメンを選択するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料が前記患者から得られ、前記試料が、癌が疑われるか、癌が発見された組織の試料であるか、又は前記組織に由来する細胞を含む、請求項３１又は請求項３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導する方法であって、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１９〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物を細胞に送達することにより、ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導することを含む方法。
【請求項３５】
エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、又はエクソン２１のいずれか１つがスキップされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３４又は請求項３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヒト細胞が癌細胞であり、前記癌が、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、任意で容器中に、添付文書、パッケージラベル、説明書又は他のラベルを含むキット。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月5日(2019.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ＲＮＡのエクソンスキップを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
より詳細には、本出願は癌の領域に関し、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などのグリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）を過剰発現する癌、及びリンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫）、神経膠芽腫、乳癌、前立腺癌、肺癌、及び結腸癌などの他の癌の領域に関する。ＧＬＤＣタンパク質存在量の直接的かつ選択的な標的化（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）媒介エクソンスキップによる）は癌細胞の細胞周期停止及び／又はアポトーシスをもたらすことが、本明細書において示される。また、正常組織におけるＧＬＤＣの部分的枯渇（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）媒介エクソンスキップによる）が、有害作用を有さないという証拠も提供される。
【背景技術】
【０００３】
ＧＬＤＣはオキシドレダクターゼのファミリ−に属する酵素であり、特に、アクセプターとしてジスルフィドを有するドナーのＣＨ−ＮＨ２基に作用する酵素である。この酵素は、グリシン、セリン及びトレオニンの代謝に関与する。それは、補因子としてピリドキサ−ルホスフェートを使用する。ＧＬＤＣは、全ての真核生物においてグリシンの分解を触媒するグリシン切断系を形成する４つのタンパク質のうちの１つである。ヒトにおける高レベルのグリシン又はグリシン蓄積は、グリシン脳症（glycine encephalopathy）として知られている。
【０００４】
本明細書における明らかに先に公開された文献のリスト又は議論は、必ずしも、その文書が最新技術の一部であること、又は一般的な知識であることを確認するものと解釈されるべきではない。
【０００５】
本明細書で言及される文書はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様においては、ＧＬＤＣの活性を調節するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【０００７】
好ましくは、調節という用語は、ＧＬＤＣの活性；ＧＬＤＣへのＲＮＡスプライシング又は翻訳後プロセシング；ＧＬＤＣのリン酸化；ｍＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ前駆体の発現並びにタンパク質発現の両方を含む、ＧＬＤＣの発現レベル；又はＧＬＤＣの細胞内局在化のうちの１つ以上の活性化、阻害、遅延、抑制又は干渉を指す。好ましくは本発明において、オリゴヌクレオチドは、活性；又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパクの質発現レベルのうち１つ以上を調節する。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はその発現産物を改変する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドがＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡのエクソンのスキップを誘導することによって、細胞周期停止及び／又はアポトーシスを誘導して、ＧＬＤＣの発現を阻害する。より詳細には、ＧＬＤＣ発現細胞におけるＧＬＤＣの発現をオリゴヌクレオチドが阻害する。
【０００８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドはＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズする。本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリックＤＮＡ相補性、フ−グステイン結合、又は当該分野で公知の他の配列特異的結合の規則に従って、水素結合による核酸の２つ又は３つの鎖の間の相互作用を意味する。ハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の異なるストリンジェンシー条件下で実施され得る。
【０００９】
より好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが１つ以上のＲＮＡ結合スプライシング調節因子に対して立体障害効果を発揮する。例えば、ある実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、立体障害によってｍＲＮＡの翻訳を妨げる。
【００１０】
好ましくはオリゴヌクレオチドがＧＬＤＣ  ＲＮＡのエクソン、イントロン又はエクソンイントロン境界である標的領域に特異的にハイブリダイズし、標的領域はエクソン２（配列番号９５）、エクソン３（配列番号９６）、エクソン６（配列番号９７）、エクソン７（配列番号９８）、エクソン８（配列番号９９）、エクソン９（配列番号１００）、エクソン１０（配列番号１０１）、エクソン１２（配列番号１０２）、エクソン１３（配列番号１０３）、エクソン１５（配列番号１０４）、エクソン１６（配列番号１０５）、エクソン１９（配列番号１０６）、エクソン２０（配列番号１０７）、エクソン２１（配列番号１０８）、イントロン６（配列番号１０９）、イントロン７（配列番号１１０）及びイントロン８（配列番号１１１）を含む群から選択される任意のものである。これらの配列を以下の表に示す。
【００１１】
2020500034.tif 000019
【００１２】
2020500034.tif 000020
【００１３】
2020500034.tif 000021
【００１４】
2020500034.tif 000022
【００１５】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９４のいずれか１つから選択される配列を含む。配列番号１〜１２を表１に示す。表１に示される配列に加えて、表２は、ＧＬＤＣ転写物においてエクソンスキップを誘導することもできるｓｈＡＯＮ（配列番号１３〜９４）の代替配列を示す。
【００１６】
【表１】
2020500034.tif 000023
【００１７】
【表２】
2020500034.tif 000024
【００１８】
2020500034.tif 000025
【００１９】
2020500034.tif 000026
【００２０】
2020500034.tif 000027
【００２１】
本発明の種々の実施形態において、表１又は表２に示される各配列は、１つ以上のエクソン／イントロンを標的とし得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＧＬＤＣ標的エクソンの効率的かつ特異的なスキップをもたらすｓｈＡＯＮの選択。ＧＬＤＣを標的とする１００ｎＭのｓｈＡＯＮを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を用いてＡ５４９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１６〜２４時間後に細胞を回収し、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。特異的標的エクソンのスキップの誘導におけるｓｈＡＯＮ効率を、標的エクソンをカバーする領域のＰＣＲ増幅、続いてＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析によって決定した。ｓｈＡＯＮ効率は、全アンプリコンに対してのエクソンスキップを有するアンプリコンの百分率として提示される。タンパク質合成及びＲＮＡ分解を防止するために、トランスフェクションの５時間後に、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを培養培地に添加した。ａ）特異的エクソンスキップを示すＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の画像。ｂ)各ｓｈＡＯＮによって誘導されたエクソンスキップ効率の計算値。ｃ）バンドのＤＮＡ配列決定は、特定の標的エクソンのスキップを確認するためにアガロースゲル（（ａ）に示される）から切り出されたスキップされた転写物に対応する。ここで［バンド１］に示される配列は配列番号１１２であり、［バンド２］に示される配列は配列番号１１３であり、［バンド３］に示される配列は配列番号１１４である。ｄ）スキップされた転写物がＮＭＤによって分解される程度を、上記と同じ条件下であるがシクロヘキシミドの非存在下でのｓｈＡＯＮトランスフェクションによって推定した。２つの実験条件におけるスキップ効率の比較では、シクロヘキシミド処理試料においてスキップされた転写物の割合がより高く、シクロヘキシミドがスキップされた転写物をＮＭＤから保護することが示されている。
【図２】選択された３つのｓｈＡＯＮは低用量で標的エクソンスキップを誘導し、ＧＬＤＣタンパク質発現を阻害する。ａ）用量応答曲線。ｂ)１４４時間までの異なる時点でのスキップ効率を示すタイムコース実験。ｃ) ロード対照としてβ−アクチンを用いたＧＬＤＣタンパク質のウェスタンブロッティング。
【図３】ｓｈＡＯＮは、Ａ５４９細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害する。ａ)１０ｎＭでのｓｈＡＯＮトランスフェクション後のＡ５４９細胞の増殖曲線。ＮＣはスクランブルされたｓｈＡＯＮ、ｌｉｐｏ  ｏｎｌｙはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００のみ。ｂ)トランスフェクション後１２０時間でのＡ５４９細胞生存率に対する種々の濃度のｓｈＡＯＮの効果。ｃ)１０ｎＭのｓｈＡＯＮ７ｃ、７Ｄ又は８Ｄでトランスフェクトした１２０時間後のＡ５４９、ＭＲＣ５及びＨＬＦ細胞間の細胞生存率の比較。ｄ)ｓｈＡＯＮでトランスフェクトしたＡ５４９細胞の軟寒天アッセイ。コロニー数をトランスフェクションの７日後に計数し、ＮＣに対して正規化した。「＊」は、結果がスクランブルされたＡＯＮコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）ことを示す。
【図４】ｓｈＡＯＮは肺腫瘍球細胞においてＧＬＤＣノックダウンを誘導し、細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害した。ａ）腫瘍球細胞におけるｓｈＡＯＮ誘導エクソンスキップ効率の用量応答曲線（デンシトメトリー分析により測定）。トランスフェクションの２４時間後に細胞を回収した。ｓｈＡＯＮトランスフェクションの５時間後に１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添加して、スキップされた転写物がＮＭＤを受けるのを阻害した。ｂ）ロード対照としてβ−アクチンを用いた腫瘍球細胞におけるＧＬＤＣタンパク質（２００ｎＭ）のウェスタンブロッティング（トランスフェクションの７２時間後）。ｃ）トランスフェクションの７２時間後に細胞生存率アッセイを用いて測定したｓｈＡＯＮ用量応答。ｄ）１５０ｎＭのｓｈＡＯＮでトランスフェクトした腫瘍球細胞の増殖曲線。ｅ）ｓｈＡＯＮでトランスフェクトした腫瘍球細胞の軟寒天アッセイ。コロニーの数を、トランスフェクションの７日後に計数し、そしてＮＣ試料に対して正規化した。「＊」は、結果がスクランブルされたＡＯＮコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）ことを示す。
【図５】ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは、他のタイプの癌においてＧＬＤＣダウンレギュレーションを誘導するのに有効であり得る。ａ)異なる細胞系におけるＧＬＤＣ発現のリアルタイムＰＣＲ測定。ｂ）ＭＬＬ細胞株においてＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮ（１００ｎＭ）で誘導されたエクソンスキップの効率（ｓｈＡＯＮトランスフェクションの５時間後に２５μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを添加）。
【図６】ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは、免疫不全マウスにおいて皮下成長したヒト腫瘍異種移植片において、エクソンスキップを誘導し、腫瘍成長を阻害した。ａ)ｓｈＡＯＮ ７Ｄ又はＮＣ(スクランブル）のいずれかで処置したマウス（７〜８マウス／処置群）由来の腫瘍質量を比較するドットプロット。２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示すエラーバーと共に中央値を示す。７Ｄ処置マウス由来の腫瘍の中央値は、ＮＣ処置マウス由来よりも６０％小さい；Ｐ値＝０．０００６７６（対応なしｔ試料検定）及び０．００３９１（対応なしＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）。ｂ)マウスから抽出した２０個の腫瘍試料（スクランブル対照群１２個、ｓｈＡＯＮ ７Ｄ群８個）において、ｓｈＡＯＮ ７Ｄによって誘導されたエクソン７のスキップをＮＣと比較したゲル電気泳動分析。ＲＮＡ分解のために検出可能なＰＣＲ産物を有さない試料は、ゲル光に含まれない。
【図７】ｓｈＡＯＮ ７Ｄは、トランスフェクション剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）の非存在下で、エクソンスキップ、ＧＬＤＣダウンレギュレーション及びＴＳ３２細胞増殖阻害を誘導することができた。ｓｈＡＯＮ ７Ｄ（１００ｎＭ）で誘導された、トランスフェクションの２４時間後におけるリポフェクタミンの有無による（ａ）特異的エクソンスキップ及び（ｂ）のＧＬＤＣ転写物ダウンレギュレーションの比較。(ｃ)トランスフェクションの７２時間後のリポフェクタミンの非存在下でのＴＳ３２細胞増殖に対するｓｈＡＯＮ ７Ｄの効果。トランスフェクション剤（リポフェクタミン）の非存在下で、１００ｎＭ濃度のｓｈＡＯＮ ７Ｄは、エクソン７スキップ、ＧＬＤＣダウンレギュレーション、及びＴＳ３２細胞増殖阻害を、それぞれ５５％、３７％及び１８％の効率で誘導することができた。ｓｈＡＯＮ ７Ｄ濃度が２００ｎＭに増加すると、細胞増殖阻害は３２％に増加した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、グリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）発現を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｈＡＯＮ）の立体障害に関する。特に、このようなｓｈＡＯＮは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び他の癌のための薬物候補として使用され得る。GLDC mRNAのナンセンス変異依存分解を誘導するためのｓｈＡＯＮの適用は、以前の研究では説明されていない。したがって、本発明は、ＮＳＣＬＣ及び他の癌についてのＧＬＤＣに対する高度に有効な（ＩＣ５０＜１０ｎＭ）薬物候補の群についての新規化学式を開発するために使用され得る。
【００２４】
「オリゴヌクレオチド」は、任意のポリヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドからなるオリゴマーである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせから構成され得る。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」又はその複数形は、本明細書で論じられ、他の方法で当技術分野で知られている修飾形態と交換可能である。ある例において、当技術分野は、天然に存在するヌクレオチドのみならず重合され得るヌクレオチドの改変物をも包含する「核酸塩基」という用語を使用する。従って、ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然の核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）ならびにキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ［３］Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュ−ドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、及び米国特許第５，４３２，２７２号及びSusan M. Freier and Karl−Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429−4443に記載の「非天然の」核酸塩基を意味する。用語「核酸塩基」はまた、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環アナログ及び互変異性体も含む。さらに、天然及び非天然の核酸塩基には、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号（Merigan et ah)、Chapter 15 by Sanghvi, Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, Englisch et ah, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722 (特に622頁及び623頁を参照）及びthe Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607に開示されているものが含まれる。種々の局面において、ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」を含み、これは、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として働く特定の「ユニバ−サル塩基」を含む、核酸塩基のように働き得る複素環化合物などの化合物を含む。ユニバ−サル塩基には、３−ニトロピロ−ル、任意で置換されているインド−ル（例えば、５−ニトロインド−ル）、及び任意で置換されているヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバ−サル塩基としては、ピロ−ル、及び当技術分野で公知のユニバ−サル塩基を含むジアゾ−ル誘導体又はトリアゾ−ル誘導体が挙げられる。
【００２５】
ポリヌクレオチドはまた、修飾された核酸塩基を含み得る。「修飾塩基」は天然塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及び／又はチミン）と対合することができ、かつ／又は天然に存在しない塩基と対合することができるものであることが当技術分野で理解される。例示的な修飾塩基はＥＰ１０７２６７９及びＷＯ９７／１２８９６に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、−アデニン及びグアニンの６−メチル化体及び他のアルキル誘導体、−アデニン及びグアニンの２−プロピル化体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュ−ドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ−ル、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザアデニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザアデニン及び３−デアザアデニンが含まれるが、限定されない。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）オン）などの三環ピリミジン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が含まれる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されたものも含まれ得る。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et ah, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289- 302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているものが含まれる。これらの塩基の特定のものは、ポリヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む）を含む。５−メチルシトシン置換は０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加させることが示されており��特定の態様では、２’Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１  号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第  ６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号及び第５，６８１，９４１号を参照されたい。
【００２６】
当業者は、本開示のアンチセンスポリヌクレオチドを容易に設計し得る。例えば、当分野における一般的な教示には、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるWee and Pramono et al, PLoS One 3:e1844 (2008); Pramono ZA et al, WO/2011/078,797; Pramono and Wee et al, Hum Gene Ther 23:781-790 (2012); Aartsma-Rus et al, Methods Mol Biol. 867: 117-29 (2012); Aartsma-Rus et al, Methods Mol Biol. 867: 97-116 (2012); van Roon-Mom et al., Methods Mol Biol. 867: 79-96 (2012)が含まれるが、これらに限定されない。一般的なガイドラインはまた、３つの連続したＧ又はＣヌクレオチドを回避する試み、自己構造の形成に有利でない長さ及び配列を選択すること（ヘアピン化を回避する）、ならびにプライマー二量体を形成しそうな配列を回避することを含む。いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスポリヌクレオチドは、該アンチセンスポリヌクレオチドが完全にＰＲＤＭ１５核酸のエクソン内部にある配列に特異的にハイブリダイズするか、又は該アンチセンスポリヌクレオチドがＰＲＤＭ１５核酸に特異的にハイブリダイズしたときに該アンチセンスポリヌクレオチドの約１つのヌクレオチドが前記イントロン−エクソン境界にまたがる配列に特異的にハイブリダイズするように、エクソン又はイントロン−エクソン境界に特異的にハイブリダイズするように設計されたものである。アンチセンスポリヌクレオチドが完全にエクソン内部にある配列に特異的にハイブリダイズするいくつかの実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドの末端は、エクソンの末端から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヌクレオチド分離れていることが意図される。
【００２７】
他の実施形態では、本開示のアンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヌクレオチドがイントロン−エクソン境界にまたがるように、ＧＬＤＣ核酸のイントロン−エクソン境界に特異的にハイブリダイズするように設計されたものである。ヌクレオチドが、エクソン側又はイントロン側のいずれかで「イントロン−エクソン境界にまたがる」ことができることが理解される。したがって、イントロン配列に特異的かつ主に（predominantly）ハイブリダイズし、隣接するエクソンにハイブリダイズするヌクレオチドが１つのみであるアンチセンスポリヌクレオチドは、１つのヌクレオチドだけ「イントロン−エクソン境界にまたがる」。同様に、エクソン配列に特異的にハイブリダイズし、隣接するイントロンにハイブリダイズするヌクレオチドが１つのみであるアンチセンスポリヌクレオチドは、１つのヌクレオチドだけ「イントロン−エクソン境界にまたがる」。前述の実施形態のいずれかにおいて、アンチセンスポリヌクレオチドは少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上のヌクレオチド長までである。
【００２８】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾されたポリヌクレオチド骨格を含み得る。修飾ポリヌクレオチド骨格は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの糖を置き換えた修飾部分を含んでもよい。
【００２９】
修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド単位の１つ以上の糖及び／又は１つ以上のヌクレオチド間結合の両方がそれぞれ「天然に存在しない」糖（すなわち、リボース又はデオキシリボース以外の糖）又はヌクレオチド間結合で置換されたものについて使用されることが意図される。ある局面において、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を意図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格はアミド含有（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位間のペプチド結合）骨格に置き換えられている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、及び第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７１５００を参照されたい。修飾ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖基を含み得る。ある局面では、糖の修飾は、２’位のヒドロキシル基が糖環の３’ 位又は４’ 位の炭素原子と繋げられて二環式糖基を形成しているロックド核酸（Locked Nucleic Acids, ＬＮＡ）を含む。ある局面においてその結合は２’ 位の酸素原子と４’ 位の炭素原子とを架橋するメチレン（ＣＨ [２] −） [ｎ]基であり、ここでｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製はＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾ポリヌクレオチド骨格を含む。修飾ポリヌクレオチド骨格は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの糖を置きかえた修飾部分を含みうる。修飾部分は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及び非ペプチドデンドリマーオクタグアニジン部分タグ付きモルホリノオリゴマーを含む群より選択され得る。
【００３０】
様々な実施形態では、修飾ポリヌクレオチド骨格は少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。修飾ヌクレオチド間結合は、修飾されたホスフェートを含む。より好ましくは、修飾されたホスフェートは、非架橋酸素原子を置換する硫黄原子、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、及びホスホロアミデートを含む群より選択されるいずれか１つを含む。
【００３１】
本発明の種々の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチル−オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ヒドロカルビルリボ核酸、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡ、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホジエステル、２’−メトキシエチルホスホロチオエート、２−メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＭＭＩ、デオキシ−メチルホスホネート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’−チオＤＮＡ、４’−チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’−アミデート、デオキシ３’−アミデート、２’−Ｏ−ヒドロカルビル３’−アミデート、ロックド核酸、シクロヘキサン核酸、三環ＤＮＡ、２’フルオロアラビノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート、カルバメート結合体、ホスホトリエステル結合体、ナイロン骨格修飾、及び前述の骨格の混合物からなる群より選択されるいずれか１つの骨格を含む。
【００３２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞への取り込みを増強する１つ以上のコンジュゲートに化学的に連結されている。
【００３３】
本開示の化合物はまた、遺伝的疾患の処置の目的で、予防又は治療として使用され得る。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＬＤＣ発現癌患者の治療に使用することができる。患者には、さらなる抗癌剤又は治療剤を投与してもよい。癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、血液悪性腫瘍、肺癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、網膜芽細胞腫、甲状腺癌、及び神経膠腫、カルチノイド及び葉状腫瘍を含む群から選択されるいずれか１つである。血液悪性腫瘍は、リンパ腫又は白血病のいずれかである。特に、リンパ腫はＢ細胞リンパ腫である。より詳細には、Ｂ細胞リンパ腫は濾胞性リンパ腫又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
【００３４】
本発明の別の態様では、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。この組成物はそのままでも送達剤と複合した状態でも患者への非経口投与に適している。キャリアは、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、経口、又は直腸、又は経粘膜、又は腸、又は筋肉内、又は皮下、又は髄内、又は髄腔内、又は直接脳室内、又は静脈内、又は硝子体内、又は腹腔内、又は鼻腔内、又は眼内に投与される。
【００３５】
医薬的に許容されるキャリアとは、一般に、キャリアが生物学的に有害でないか、又は望ましくない効果を引き起こさない、対象への投与に適した材料を指す。このようなキャリアは、典型的には薬剤の不活性成分である。典型的には、キャリアは、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれる医薬組成物の任意の他の成分と、有害な様式で相互作用することなく、活性成分と共に対象に投与される。適切な医薬キャリアはその全体が参照により本明細書に組み込まれるMartin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed, Mack Publishing Co, Easton, Pa, (1990)に記載されている。
【００３６】
本開示のより具体的な形態においては、治療有効量のアンチセンスポリヌクレオチドを、医薬的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリアと共に含む医薬組成物が提供される。このような組成物としては種々の緩衝液含量（例えば、リン酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、ならびに、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）及び充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）のような添加剤が挙げられる。この材料は例えば、限定されるものではないが、ポリ乳酸又はポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状調製物に、又はリポソームに組み込むことができる。ヒアルロン酸を使用してもよい。このような組成物は、開示された組成物の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。組成物は、液体形態で調製されてもよく、又は凍結乾燥形態などの乾燥粉末であってもよい。
【００３７】
本発明に従って提供される医薬組成物が当技術分野で知られている任意の手段によって投与することができることは理解されるであろう。好ましくは、投与のための医薬組成物は、注射、経口、又は肺もしくは鼻経路によって投与される。アンチセンスポリヌクレオチドは、種々の実施形態において、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下の投与経路によって送達される。
【００３８】
本発明のアンチセンス分子は任意の医薬的に許容される塩、エステル、もしくはエステルの塩、又は、ヒトを含む動物への投与の際に生物学的に活性な代謝産物又はその残基を（直接又は間接的に）提供することができる任意の他の化合物を包含する。したがって、例えば、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグ及び医薬的に許容される塩、かかるプロドラッグの医薬的に許容される塩、並びに他の生物学的同等物にも関する。
【００３９】
用語「医薬的に許容される塩」は本発明の化合物の生理学的及び医薬的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、それに望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。
【００４０】
ポリヌクレオチドについて、医薬的に許容される塩の好ましい例としては、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン（例えば、スペルミン及びスペルミジン）などのカチオンと形成される塩、(ｂ)無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸）と形成される酸付加塩、(ｃ)有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸）と形成される塩、及び（ｄ）元素（塩素、臭素、ヨウ素など）のアニオンから形成される塩、が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物は、局所又は全身治療が所望されるかどうか、及び治療されるべき領域に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は局所的（眼及び直腸送達を含む粘膜を含む）、肺、例えば、粉末又はエアロゾルの吸入（ネブライザ−、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮によるものを含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内又は脳室内投与が含まれる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するポリヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００４１】
本開示の医薬製剤は、簡便には単位剤形で提示されてもよく、製薬業界で周知の従来技術に従って調製されてもよい。このような技術は、活性成分を医薬キャリア又は賦形剤と会合させる工程を含む。一般に、製剤は活性成分を液体キャリア又は細かく分割された固体キャリア又はその両方と均一に会合させ、次いで、必要であれば、製品を成形することによって調製される。
【００４２】
追加の治療剤との併用療法もまた、本開示によって企図される。本開示の組成物と同時に送達され得る治療剤の例としてはグルココルチコイドステロイド（例えば、これらに限定されないが、プレドニゾン及びデフラザコート）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、βアドレナリン受容体遮断薬、抗線維症剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明が例えば、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）を用いて、適切な宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を指示するような、遺伝子治療において使用され得る。このようなベクターは例えば、宿主細胞中でポリヌクレオチドを増幅して有用な量を作製するために、及び組換え技術を使用してタンパク質を発現するために有用である。いくつかの実施形態では、ベクターが本発明のポリヌクレオチドが発現制御配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されている発現ベクターである。
【００４４】
したがって、本発明のさらに別の態様は患者において癌を治療する方法を提供し、この方法は、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬的有効量の組成物を投与することを含む。キャリアは、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子、ｐＨ感受性リポソームや抗体結合リポソームなどのリポソーム、ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物は、経口、又は直腸、又は経粘膜、又は腸、又は筋肉内、又は皮下、又は髄内、又は髄腔内、又は直接脳室内、又は静脈内、又は硝子体内、又は腹腔内、又は鼻腔内、又は眼内に投与することができる。これまでのところ、実績のある全身投与の選択肢には、静脈内、腹腔内、鼻腔内及びくも膜下腔内が含まれる。ＡＳＯと、ナノ粒子やポリマー又はリポソームを基とするビヒクルなどの送達キャリアと複合体化することで、特定の組織へのＡＳＯの送達効率をさらに増大しうる。
【００４６】
癌は、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫を含む群から選択される任意の１つであり得る。
【００４７】
ある実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００４８】
本発明のなお別の局面において、癌を処置するための薬剤の製造におけるＧＬＤＣの活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が提供される。オリゴヌクレオチドは、活性又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する。ある実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００４９】
本発明の別の局面において、癌を有する患者における予後の分類又は決定を補助するための、又は癌を有する患者のための治療戦略を選択するための方法が提供され、この方法は、試料中のＧＬＤＣ核酸、タンパク質又は活性のレベルを評価することを包含する。この方法は、試料中のＧＬＤＣ核酸、タンパク質又は活性のレベルに関する情報を利用して、治療レジメンを選択する工程を包含する。様々な実施形態では試料は患者から得られ、試料は癌が疑われるか、癌が発見された組織試料であるか、又は前記組織由来の細胞を含む。試料中のＧＬＤＣ核酸、タンパク質又は活性のレベルが上昇したレベルである場合、選択された治療レジメンは、ＧＬＤＣ活性の阻害剤又はＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルの調節剤で患者を治療することを含む。様々な実施形態では、阻害剤又は調節剤が本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００５０】
本発明の別の態様では、ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導する方法であって、本発明の第１の態様によるアンチセンスポリヌクレオチド、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を細胞に送達し、それによってＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導することを含む方法が提供される。
【００５１】
好ましくは、エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、又はエクソン２１がスキップされる。
【００５２】
様々な実施形態では、細胞はヒト細胞であってよい。該ヒト細胞は癌細胞であり、該癌は、ＮＳＣＬＣ、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫を含む群から選択されるいずれか１つである。
【００５３】
本発明の別の態様では、本発明の第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、任意で容器、及び添付文書、パッケージラベル、取扱説明書、又は他のラベルを含むキットが提供される。
【００５４】
有利であることに、本発明は、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡのエクソンスキップを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＧＬＤＣ発現癌の治療のための前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００５５】
当業者は、上記方法の適用が多くの他の疾患の治療における使用に適切なアンチセンス分子を同定するための広範な適用を有することを理解するであろう。
【００５６】
本発明を完全に理解し、容易に実用的に実施できるようにするために、本発明の好ましい実施形態のみを非限定的な例により説明するが、その説明は添付の例示的な図面を参照している。
【実施例】
【００５７】
実施例１
本稿では、ＮＳＣＬＣ(非小細胞肺癌）の治療戦略として、ＧＬＤＣ(グリシンデカルボキシラ−ゼ）ｍＲＮＡをそれぞれ分解する１２個の新規ｓｈＡＯＮ（立体障害アンチセンスオリゴヌクレオチド）を同定した（添付の図１）。ＧＬＤＣは、ＮＳＣＬＣからの腫瘍開始細胞において高度に発現され、細胞形質転換及び腫瘍形成を促進する（Zhang et al. Cell 2012; Jain et al. Science 2012）；触媒能力が不活性なＧＬＤＣは、細胞形質転換を促進することができない。ｓｈＡＯＮは、すべての塩基がホスホロチオエート骨格によって結合した２’−Ｏ−メチルで修飾されている化学修飾合成一本鎖ＲＮＡ分子である。各ｓｈＡＯＮは、新生したばかりのＧＬＤＣ  ｍＲＮＡに特異的部位で相補的に結合するように設計され、エクソン認識及びそのスプライシングに重要なＲＮＡ結合スプライシングレギュレーターに対して立体障害効果を発揮する。機構的としては、成熟ＲＮＡにおいて多数の下流の未成熟終止コドンを生成する特異的なフレーム外エクソン（out-of-frame exon）の排除をｓｈＡＯＮが誘導すると、得られるｍＲＮＡがナンセンス変異依存分解プロセスを介して分解の標的とされるというものである。
【００５８】
本発明者らはヒト癌細胞株及び患者の原発性癌細胞についてのさらなるインビトロバリデ−ションのために、３つの最も効率的なｓｈＡＯＮを選択する。癌細胞株において、各ｓｈＡＯＮは、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡにおける特異的エクソンスキップ及びその後のＧＬＤＣタンパク質発現の抑制をＩＣ５０＜１０ｎＭで誘導し（図２）、癌細胞増殖の７０％超を阻害する（図３）。原発性癌細胞において、ｓｈＡＯＮは、肺腫瘍球細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害する（図４）。さらに、ｓｈＡＯＮは、急性白血病細胞株におけるＧＬＤＣのダウンレギュレーションに有効である（図５）。本発明者らはさらに、ＮＳＣＬＣ患者由来の肺腫瘍球細胞を移植したマウスにおけるインビボ研究のための１つのｓｈＡＯＮを選択する。移植マウスにｓｈＡＯＮを腹腔内注射によって計画的に投与すると、ヒト腫瘍増殖の６０％が阻害された（図６）。
【００５９】
本発明を以下により詳細に説明する。
【００６０】
材料及び方法
細胞株培養
ヒト肺腺癌上皮細胞株Ａ５４９を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持した。正常ヒト胎児肺線維芽細胞ＭＲＣ−５細胞及びヒト成人肺線維芽細胞ＨＬＦ細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【００６１】
腫瘍球培養
腫瘍球ＴＳ３２細胞を、以前に記載されたように調製し（Zhang, WC; et al., 2012）、無処理シャーレ中において、０．４％ＢＳＡ（Sigma）、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）を補充したＩＴＳ（Sigma）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。新鮮な培地を３日毎に補充した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（EMD-Millipore）で分割して、単一細胞懸濁液を得た。
【００６２】
ｓｈＡＯＮの設計・合成
ｓｈＡＯＮは、我々の特許された計算方法を用いて設計され、Sigma-Aldrich Pte Ltd（シンガポール）によって２’−Ｏ−メチルで修飾されたホスホロチオエート骨格（２ＯＭｅＰＳ）を伴い合成された。スクランブルされたシーケンスを有するｓｈＡＯＮが全ての実験に含まれた。
【００６３】
ｓｈＡＯＮによる細胞トランスフェクション
全ての細胞／細胞株についての細胞トランスフェクションの間のトランスフェクション培地として、抗生物質（すなわち、ペニシリン−ストレプトマイシン）を含まない増殖培地を使用した。
【００６４】
Ａ５４９細胞を、１ｍＬのトランスフェクション培地を含む６ウェルプレートに１．０〜１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。細胞が約４０％コンフルエンスに達し、培養培地をトランスフェクション前に９００μＬに減少させた。ｓｈＡＯＮ (１００ｐｍｏｌ中）：リポフェクタミン２０００（μＬ中）＝１：２の固定比を有する様々な濃度の１０×トランスフェクション混合物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Invitrogen）中で１００μＬの総容量に調製し、室温で２０分間インキュベートし、細胞培養物に添加した。
【００６５】
ＴＳ３２細胞を、９００μＬのトランスフェクション培地を含む２４ウェルプレートに、１．０〜１．５×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。様々な量のｓｈＡＯＮ及び固定量のリポフェクタミン２０００（５μＬ）を含む１０×トランスフェクション混合物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で１００μＬの総容量に調製し、室温で２０分間インキュベートし、細胞培養物に添加した。再現性を確実にするために、トランスフェクションは、通常、２連又は３連で行った。
【００６６】
ｓｈＡＯＮ誘導エクソンスキップ効率の測定のために、シクロヘキシミド（Sigma）をトランスフェクションの５時間後に細胞培地に添加（１００μｇ／ｍｌ）して、タンパク質合成及びＲＮＡ分解を停止させた。
【００６７】
ｓｈＡＯＮで誘導されたエクソンスキップの効率とｍＲＮＡダウンレギュレーションの定量
ｓｈＡＯＮによるトランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ（AmbionTurbo DNA−Ｆｒｅｅキット）で処理してコンタミＤＮＡを除去し、ランダムヘキサマーと共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Invitrogen）を製造業者の説明書に従って使用してｃＤＮＡに転写した。
【００６８】
ｓｈＡＯＮ誘導エクソンスキップの効率の測定のために、標的エクソン及び両側の少なくとも１つの隣接エクソンをカバーする領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。次いで、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定によって確認し、特異的標的エクソンのスキップを確認した。エクソンスキップ効率は、全産物に対する標的エクソンスキップ産物の量を計算することによってゲル画像のデンシトメトリー分析を行い推定した。密度測定分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, 米国）を用いて行った。
【００６９】
標的エクソン中及び標的エクソンの外側のプライマーを用いて定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を行い、対応する試料中の内因性参照としてＧＡＤＰＨを用いて、スキップ効率の計算のために、スクランブル配列を用いて同じ濃度のｓｈＡＯＮでトランスフェクトした細胞と比較して、全長ＧＬＤＣ転写物の量を測定した。
【００７０】
細胞生存率アッセイ
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（Sigma）又はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイ（Promega）を用いて、９６ウェルプレート（１００μＬ培地／ウェル中３．５×１０３細胞）中で細胞生存率及び増殖の計測を行った。９６ウェルプレートにおいて細胞をｓｈＡＯＮとリポフェクタミン２０００との混合物でトランスフェクトした。ＭＴＴアッセイ（接着細胞に使用）では、培地を、ＭＴＴ(０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地（１００μＬ／ウェル）で置換し、３７℃で４時間インキュベートし、次いで１００μＬのイソプロパノールに交換した。波長５７０ｎｍのマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて６３０ｎｍでバックグラウンドを差し引いて吸光度を測定し、生細胞数に対する吸光度の較正曲線を用いて生細胞数に変換した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存率アッセイ（懸濁細胞の場合）では、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ試薬を添加し（１１μＬ／ウェル）、３７℃で４時間インキュベートした。励起５７０ｎＭ及び発光６００ｎｍのマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて蛍光を測定した。再現性を確実にするために、アッセイを少なくとも２回行い、トランスフェクションを各実験において３連のウェルで行った。
【００７１】
軟寒天アッセイ
ｓｈＡＯＮトランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、ＤＭＥＭ培地中の０．４％のノーブル寒天に再懸濁し、固化した底層（ＤＭＥＭ培地中の０．６％の貴寒天）を含む９６ウェルプレート上にプレーティング（５×１０３細胞／ウェル）した。各ウェルを１００μＬの増殖培地で覆い、標準培養条件下で１週間インキュベートした。細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅで染色し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いてコロニー計数を行った。
【００７２】
ウエスタンブロッティング（濃度・会社のダブルチェックの必要性）
Ｈａｌｔプロテア−ゼ阻害剤カクテルを含有するＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液を用い、４℃で１０分間穏やかに振盪することで、細胞からタンパク質を抽出した。細胞残屑を、最高速度（１２，０００ｇ？）で２０分間、４℃で遠心分離することによって除去し、上清のタンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを使用して、製造業者の指示に従って測定した。製造業者の説明書に従って調製した８％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-rad）に、各試料からの１６μｇのタンパク質をロードし、次いで、Ｂｉｏ−ｒａｄニトロセルロースメンブレンに移した。ＰＢＳＴ中の５％乳で１時間ブロッキングした後、メンブレンを３％乳／ＰＢＳＴ中のウサギ抗ヒトＧＬＤＣポリクローナル抗体（１：２０００）と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて、３％乳／ＰＢＳＴ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ(１：４０００）と共に室温で３時間インキュベ−トした。ウェスタンブロッティングのためのロード対照としてβ−アクチンを使用し、第１及び第２の抗体としてマウス抗ヒトβ−アクチン抗体（１：１０００）及び西洋ワサビペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧ(１：４０００）をそれぞれ使用した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Thermo Scientific）を用いたＥＣＬシステムによって可視化した。
【００７３】
マウス異種移植実験
４〜６週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウスに、無血清培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ(ＢＤ)(１：１）中の腫瘍球の単細胞懸濁液を皮下移植した（５００，０００細胞／マウス）。ｓｈＡＯＮ５０ｍｇ／ｋｇを週３回腹腔内投与した。６週間の注射後にマウスを屠殺し、腫瘍を抽出し、秤量した。Micro Smash MS-100（４５００ｒｐｍで３×４５秒）中の０．５ｍｍガラスビーズ（Sigma-Aldrich）を用いた細胞を破壊した後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液をそれぞれ使用して、全ＲＮＡ及びタンパク質を腫瘍試料から抽出した。
【００７４】
結果
ＧＬＤＣ標的エクソンの効率的かつ特異的なスキップにつながるｓｈＡＯＮの選択
ＧＬＤＣ転写物中の２５個のエクソンのうち、５個のフレーム外エクソン（エクソン７、８、１３、１５及び１６）を、ｓｈＡＯＮを設計するための我々の標的として選択した。各々が個々にスキップされるとき、得られる転写物は標的エクソンの下流にシフトしたリーディングフレームを有し、スキップされた転写物中に複数のＰＴＣを生成する。結果として、標的遺伝子は、転写物が活発に分解されるナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）経路の組み合わせを介してダウンレギュレートされるか、又は、切り縮められた非機能的遺伝子産物の翻訳を導くかのいずれかである。著者らが以前に開発し、検証した計算法を用いて、２０個のｓｈＡＯＮ（４個のｓｈＡＯＮ／エクソン）を設計した。スクランブルされた配列を有する１つのｓｈＡＯＮを、ネガティブコントロールとして全ての実験に含めた。これらのｓｈＡＯＮは安定性及び配列特異性を増加させるために、ホスホロチオエート骨格及び２’−Ｏ−メチルリボース修飾（２ＯＭｅＰＳ）を有するものとして合成した。
【００７５】
本発明者らは、Ａ５４９ヒト肺腺癌上皮細胞をトランスフェクトすることによって、ＧＬＤＣ転写物の特異的エクソンスキップを誘導する設計されたｓｈＡＯＮの能力を試験し（図１）、１００ｎＭのｓｈＡＯＮを用いて、トランスフェクションの２４時間後のＡ５４９細胞においてＧＬＤＣ標的エクソンスキップを誘導する際のスキップ効率の計算値に基づいて、最良のｓｈＡＯＮを選択した。２０個の設計されたｓｈＡＯＮのうち１２個は、標的エクソンのスキップを誘導することができた。表１では１２個の有効なｓｈＡＯＮの式を表示している。全体として、エクソン７及びエクソン８を標的とするｓｈＡＯＮは、標的エクソンスキップを誘導するのにより効率的であった。３つのｓｈＡＯＮ（７Ｄ、７Ｃ、及び８Ｄ）は、ＧＬＤＣ転写物の８０％以上において標的エクソンのスキップを誘導することができたので選択した。
【００７６】
【表３】
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【００７７】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは低用量で標的エクソンのスキップを誘導し、ＧＬＤＣタンパク質発現を阻害した
Ａ５４９細胞における特異的エクソンスキップの誘導に対する３つの選択されたｓｈＡＯＮの時間及び用量応答効果を、続けてデンシトメトリー分析を行うＰＣＲによって評価した。図２ａに示されるように、３つのｓｈＡＯＮの全ては、３．５〜７ｎＭの範囲のＩＣ５０という低用量で特異的エクソンスキップを誘導し得る。１０ｎＭのｓｈＡＯＮを用いた時間経過実験によると（図２ｂ）、エクソンスキップの誘導に対するそれらの効果は時間と共に減少したが、トランスフェクションの７２時間後にも依然としてＧＬＤＣ転写物の４０％超においてスキップを誘導することができた。
【００７８】
本発明者らはＡ５４９細胞におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ転写物のダウンレギュレートにおける３つの選択されたｓｈＡＯＮの効果を測定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を行った。ｑＰＣＲ分析では、スクランブルされたｓｈＡＯＮでトランスフェクトされた細胞と比較したところ、１０ｎＭのＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮでのトランスフェクションでは、２４時間後に７０％超のＧＬＤＣ全長転写物のダウンレギュレーションが示された。トランスフェクションの７２時間後、３つのｓｈＡＯＮの各々は依然として４０％超のダウンレギュレーションを誘導し得、これはデンシトメトリーからの結果と一致する。
【００７９】
ウェスタンブロッティング分析を行って、タンパク質レベルでのＧＬＤＣ発現に対する選択したｓｈＡＯＮの効果を調べた（図２ｃ）。１０ｎＭ又は２０ｎＭの選択されたｓｈＡＯＮによるトランスフェクションの７２時間後に、ほぼ完全な枯渇に至るタンパク質レベルの低下が存在した。
【００８０】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮはＡ５４９細胞増殖及び腫瘍形成を阻害する
肺癌細胞は高レベルのＧＬＤＣに依存することが見出されている(Zhang WC, et al, Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):259-72）。ｓｈＡＯＮは細胞にトランスフェクトされた場合、ＧＬＤＣの効果的なノックダウンを誘導し得るので、本発明者らは癌細胞の増殖及び増殖に対するそれらの効果を試験した。Ａ５４９細胞生存率を、種々の濃度の選択されたｓｈＡＯＮでのトランスフェクションの０、２４、４８、７２及び１２０時間後にＭＴＴアッセイを用いて測定し、未処理細胞、リポフェクタミン２０００又はスクランブルされたｓｈＡＯＮでトランスフェクトされた細胞を含むいくつかのネガティブコントロールと比較した。ｓｈＡＯＮ誘導ＧＬＤＣノックダウンは、トランスフェクション後１２０時間まで細胞増殖を阻害するようであった（図３ａ及び図３ｂ）。細胞増殖の阻害は５ｎＭのｓｈＡＯＮによる３５％阻害から、３０ｎＭのｓｈＡＯＮによるほぼ１００％阻害まで増加した。図３ｃに示すように、１０ｎＭのｓｈＡＯＮでトランスフェクトした場合、２つの非癌細胞、ＨＬＦ及びＭＲＣ−５の増殖は阻害されないようであったが、Ａ５４９細胞では細胞増殖の約７０％が阻害された。
【００８１】
次に、ｓｈＡＯＮトランスフェクトＡ５４９細胞を、典型的には腫瘍形成性と相関する足場固定非依存性増殖の尺度である軟寒天中コロニー形成能力について調べた。トランスフェクションの７日後、３つのＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮで処理した細胞は、スクランブルされたｓｈＡＯＮで処理した細胞と比較して、軟寒天中で７０〜９２％少ないコロニーを生じ、これはｓｈＡＯＮ誘導ＧＬＤＣノックダウンが癌細胞腫瘍形成性を大きく阻害したことを示す。
【００８２】
ｓｈＡＯＮは肺腫瘍球細胞においてＧＬＤＣノックダウンを誘導し、細胞の生育／増殖及び腫瘍形成を阻害した
癌幹細胞（ＣＳＣ）又は腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）は腫瘍増殖を駆動及び持続する能力を有し、インビトロ培養で増殖させた場合、球体形成によって単離及び濃縮（enrich）され得る。そのため、本発明者らは、腫瘍開始細胞について高度に濃縮された腫瘍球細胞の増殖に影響を及ぼすことにおけるＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮの効果を試験した。図４ａに示すように、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮはＧＬＤＣ転写物中の特異的標的エクソンのスキップを効果的に誘導することができ、スキップ効率は５１〜９３％の範囲であり、ＩＣ５０は６５ｎＭ〜２２０ｎＭの範囲である（図４ａ）。ウェスタンブロッティングを用いて測定したタンパク質レベルでは、ＧＬＤＣタンパク質発現も効果的に阻害された（図４ｂ）。腫瘍球細胞における効果的なエクソンスキップ及びＧＬＤＣノックダウンを誘導するためには、Ａ５４９細胞におけるよりも多量のｓｈＡＯＮが必要であった。
【００８３】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて測定したところ、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮ処理細胞の増殖／増殖は、スクランブルされたｓｈＡＯＮで処理した腫瘍球細胞と比較して、５７〜７５％阻害された。軟寒天アッセイではまた、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮ処理細胞によって形成されたコロニー数が、スクランブルされたｓｈＡＯＮ処理細胞によって形成されたコロニー数の６１〜７３％減少したことが示された。
【００８４】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは、他の種類の癌においてＧＬＤＣダウンレギュレーションを誘導するのに有効であり得る
ＧＬＤＣの過剰発現は、非小細胞肺癌において見出されたばかりでなく、他のタイプの癌においても報告された(Zhang WC, 2012）。我々はｑＰＣＲを用いて２つのＭＬＬ白血病細胞株におけるＧＬＤＣ発現を評価し、ＧＬＤＣがそれらの両方において過剰発現され、一方、非癌細胞のＧＬＤＣの発現は約６００倍少ないことを確認した（図５ａ）。そのため、本発明者らは、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮがこれらの２つのＭＬＬ細胞株において有効であり得るかどうかを試験した。図５ｂに示されるように、ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは両方のＭＬＬ細胞株においてＧＬＤＣ転写物の５０％超において特定のエクソンのスキップを誘導し、本発明者らの設計したｓｈＡＯＮが他のタイプの癌にも有効であり得ることを示した。
【００８５】
ＧＬＤＣ  ｓｈＡＯＮは移植腫瘍の増殖を阻害した
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験におけるｓｈＡＯＮ ７Ｄの効果を試験するために、免疫不全マウスに腫瘍球細胞を移植し、続いてｓｈＡＯＮ ７Ｄの腹腔内注射を行った。図６に示されるように、７Ｄ及びＮＣ処置マウス由来の腫瘍は、それぞれ０．３２５ｇ及び０．８２０ｇの中央値、すなわち腫瘍増殖の６０％阻害と計量された（Ｐ値＝０．０００６７６（対応なしｔ試料検定）及び０．００３９１（対応なしＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定））。腫瘍試料２０点（対照群からの１２点及びｓｈＡＯＮ ７Ｄ群からの８点）のＲＮＡ分析では、７Ｄ処置がすべての処置された腫瘍試料においてＧＬＤＣエクソン７又はエクソン７及び８（軽度）のスキップを引き起こしたが、ＮＣ処置された腫瘍試料においてＧＬＤＣエクソンスキップはほとんど観察されなかったことが示された。
【００８６】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、設計又は構造の詳細に多くの変形又は修正を行うことができることを理解するであろう。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
グリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）の活性を調節するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜２＞
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、＜１＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜３＞前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はその発現産物を改変する、＜２＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜４＞
細胞周期停止又はアポトーシスを誘導するために、ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡのエクソンのスキップを誘導することによって、ＧＬＤＣの発現を阻害する、＜３＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜５＞
ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズし、１種以上のＲＮＡ結合スプライシング調節因子に対して立体障害効果を発揮する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜６＞
立体障害によりｍＲＮＡの翻訳を妨げる、＜５＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜７＞
ＧＬＤＣ  ＲＮＡのエクソン、イントロン又はエクソン−イントロン境界の標的領域に特異的にハイブリダイズし、前記標的領域が、エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、イントロン６、イントロン７、及びイントロン８からなる群より選択されるいずれか１つである、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜８＞
配列番号１〜配列番号９４から選択されるいずれか１つの配列を含む、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜９＞
修飾されたポリヌクレオチド骨格を含む、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１０＞
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が、少なくとも１つのポリヌクレオチドの糖を置きかえた修飾部分を含む、＜９＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１１＞
前記修飾部分がホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及び非ペプチドデンドリマーオクタグアニジン部分標識モルホリノオリゴマーからなる群より選択される、＜１０＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１２＞
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、＜９＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１３＞
前記修飾ヌクレオチド間結合が修飾されたホスフェートを含む、＜１２＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１４＞
前記修飾されたホスフェートが、非架橋酸素原子を置換する硫黄原子、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、及びホスホロアミデートからなる群より選択される、＜１３＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１５＞
リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ヒドロカルビルリボ核酸、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡ、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホジエステル、２’−メトキシエチルホスホロチオエート、２−メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’−Ｏ−ヒドロカルビＭＭＩ、デオキシメチルホスホネート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’−チオＤＮＡ、４’−チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’−アミデート、デオキシ３’−アミデート、２’−Ｏ−ヒドロカルビル３’−アミデート、ロックド核酸（Locked Nucleic Acids）、シクロヘキサン核酸、トリサイクルＤＮＡ、２’−フルオロ−アラビノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート、カルバメート結合、ホスホトリエステル結合、ナイロン骨格修飾、及び前述の骨格の混合物からなる群より選択される骨格を含む、＜１＞〜＜１４＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１６＞
アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞への取り込みを増進する１つ以上のコンジュゲートに化学的に連結されている、＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１７＞
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１８＞
ＧＬＤＣ発現癌患者の治療に使用するための、＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１９＞
前記患者はさらなる抗癌剤又は治療を施される、＜１８＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜２０＞
前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、結腸癌、黒色腫、精巣癌、甲状腺癌、神経膠腫、カルチノイド腫瘍及び葉状腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つである、＜１８＞又は＜１９＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜２１＞
＜１＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
＜２２＞
そのままで、又は送達剤と複合して、患者への非経口投与に適している、＜２１に患者の組成物。
＜２３＞
前記キャリアが、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、＜２２＞に記載の組成物。
＜２４＞
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、＜２１＞〜＜２３＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜２５＞
＜１＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は医薬的有効量の＜２１＞〜＜２４＞のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、患者における癌を治療する方法。
＜２６＞
キャリアが、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子；ｐＨ感受性リポソーム、抗体結合リポソームなどのリポソーム；ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、Ｕ７ ｓｎＲＮＡなどのＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、＜２５＞に記載の方法。
＜２７＞
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記組成物が、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、＜２５＞又は＜２６＞に記載の方法。
＜２８＞
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、＜２５＞〜＜２７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２９＞
癌を治療するための医薬の製造における、ＧＬＤＣの活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
＜３０＞
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、＜２９＞に記載の使用。
＜３１＞
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はＧＬＤＣの発現産物を改変する、＜３０＞に記載の使用。
＜３２＞
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、＜２９＞〜＜３１＞のいずれか１項に記載の使用。
＜３３＞
癌を有する患者における予後の分類又は決定を補助するための方法、又は癌を有する患者のための治療戦略を選択するための方法であって、試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルを評価することを含む方法。
＜３４＞
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルに関する情報を利用して治療レジメンを選択するステップをさらに含む、＜３３＞に記載の方法。
＜３５＞
前記試料が前記患者から得られ、前記試料が、癌が疑われるか、癌が発見された組織の試料であるか、又は前記組織に由来する細胞を含む、＜３３＞又は＜３４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３６＞
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルが上昇したレベルである場合、選択される前記治療レジメンが、ＧＬＤＣ活性の阻害剤又はＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルの調節剤で患者を処置することを含む、＜３３＞〜＜３５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３７＞
前記阻害剤又は前記調節剤が、＜１＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、＜３６＞に記載の方法。
＜３８＞
ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導する方法であって、＜１＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド＞又は＜２１＞〜＜２４＞のいずれか１項に記載の組成物を細胞に送達することにより、ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップを誘導することを含む方法。
＜３９＞
エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、又はエクソン２１のいずれか１つがスキップされる、＜３８＞に記載の方法。
＜４０＞
前記細胞がヒト細胞である、＜３８＞又は＜３９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜４１＞
前記ヒト細胞が癌細胞であり、前記癌が、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選択されるいずれか１つである、＜４０＞に記載の方法。
＜４２＞
＜１＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、任意で容器中に、添付文書、パッケージラベル、説明書又は他のラベルを含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号９４から選択されるいずれか１つの配列を含み、
ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡのエクソンのスキップを誘導することによって、ＧＬＤＣの発現を阻害して、細胞周期停止又はアポトーシスを誘導する、
グリシンデカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ）の活性を阻害するための単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はその発現産物を改変する、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ＧＬＤＣのｍＲＮＡ前駆体又は成熟ｍＲＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズし、１種以上のＲＮＡ結合スプライシング調節因子に対して立体障害効果を発揮する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
立体障害によりｍＲＮＡの翻訳を妨げる、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ＧＬＤＣ  ＲＮＡのエクソン、イントロン又はエクソン−イントロン境界の標的領域に特異的にハイブリダイズし、前記標的領域が、エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、イントロン６、イントロン７、及びイントロン８からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
修飾されたポリヌクレオチド骨格を含む、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が、少なくとも１つのポリヌクレオチドの糖を置きかえた修飾部分を含む、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾部分がホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及び非ペプチドデンドリマーオクタグアニジン部分標識モルホリノオリゴマーからなる群より選択される、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記修飾されたポリヌクレオチド骨格が少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記修飾ヌクレオチド間結合が修飾されたホスフェートを含む、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記修飾されたホスフェートが、非架橋酸素原子を置換する硫黄原子、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、及びホスホロアミデートからなる群より選択される、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−ヒドロカルビルリボ核酸、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡ、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホロチオエート、２’−Ｆ−ホスホジエステル、２’−メトキシエチルホスホロチオエート、２−メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’−Ｏ−ヒドロカルビＭＭＩ、デオキシメチルホスホネート、２’−Ｏ−ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’−チオＤＮＡ、４’−チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’−アミデート、デオキシ３’−アミデート、２’−Ｏ−ヒドロカルビル３’−アミデート、ロックド核酸（Locked Nucleic Acids）、シクロヘキサン核酸、トリサイクルＤＮＡ、２’−フルオロ−アラビノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート、カルバメート結合、ホスホトリエステル結合、及びナイロン骨格修飾からなる群より選択される一つ又は複数の修飾を有する骨格を含む、請求項１〜請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞への取り込みを増進する１つ以上のコンジュゲートに化学的に連結されている、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＧＬＤＣ発現癌患者の治療に使用するための、請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記患者はさらなる抗癌剤又は治療を施される、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、結腸癌、黒色腫、精巣癌、甲状腺癌、神経膠腫、カルチノイド腫瘍及び葉状腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１６又は請求項１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２０】
そのままで、又は送達剤と複合して、患者への非経口投与に適している、請求項１９に患者の組成物。
【請求項２１】
前記キャリアが、ナノ粒子、リポソーム、ウイルスベクター、カチオン性脂質、ポリマー、ＵｓｎＲＮＡ、及び細胞膜透過ペプチドからなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、経口、直腸、経粘膜、腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内に投与される、請求項１９〜請求項２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
癌を治療するための医薬の製造における、ＧＬＤＣの活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが、活性、又はｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルのうち１つ以上を調節する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが、ＧＬＤＣの発現を阻害するか、又はＧＬＤＣの発現産物を改変する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２３〜請求項２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
癌を有する患者における予後の分類又は決定を補助するための方法、又は癌を有する患者のための治療戦略を選択するための方法であって、試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルをｅｘ  ｖｉｖｏで評価することを含み、
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルが上昇したレベルである場合、選択される治療レジメンが、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＧＬＤＣ活性の阻害剤で患者を処置することを含む方法。
【請求項２８】
前記試料中のＧＬＤＣの核酸、タンパク質又は活性のレベルに関する情報を利用して治療レジメンを選択するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が前記患者から得られ、前記試料が、癌が疑われるか、癌が発見された組織の試料であるか、又は前記組織に由来する細胞を含む、請求項２７又は請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップをｅｘ  ｖｉｖｏで誘導する方法であって、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１９〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物をｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に送達することにより、ＧＬＤＣｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキップをｅｘ  ｖｉｖｏで誘導することを含む方法。
【請求項３１】
エクソン２、エクソン３、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１９、エクソン２０、又はエクソン２１のいずれか１つがスキップされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３０又は請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト細胞が癌細胞であり、前記癌が、血液悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、肝臓癌、子宮癌、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むキット。
【国際調査報告】
2020500034.tif 000029
2020500034.tif 000030
2020500034.tif 000031