(57)【要約】細胞の混合集団内の物理的に隣接するＤＮＡ配列を架橋し、目的の少なくとも１つのＤＮＡ配列が存在する架橋されたＤＮＡ接合を単離するために、ＤＮＡ捕捉テクノロジーと組み合わせてｉｎ  ｖｉｖｏ近接ライゲーションを実施するための方法および組成物が、提供される。本発明は、２つの配列が同じ染色体上にない場合であっても、目的のどの遺伝子／配列がどの株の背景中に存在するのかを試験するための迅速な方法（培養なし）を可能にする。
2020525046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定するための方法であって、
細胞中の１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で近接接合を生成するステップであって、前記細胞が、混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；
前記１つまたは複数の核酸と前記標的核酸との間での前記近接接合を捕捉するステップであって、前記近接接合を、前記標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および
前記標的核酸に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記近接接合中の前記１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、前記標的核酸を含む前記細胞中の前記１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
１つまたは複数の核酸と前記標的核酸との間での前記近接接合の生成が、
ｉ．）前記細胞を含む前記試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、前記架橋剤が、前記細胞中においてタンパク質および前記１つまたは複数の核酸を前記標的核酸と架橋させ、それによって、前記１つまたは複数の核酸と前記標的核酸との間で複合体を生成する、ステップ；
ｉｉ．）前記細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；
ｉｉｉ．）前記１つまたは複数の核酸と前記標的核酸との間での前記複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；
ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびに
ｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、前記１つまたは複数の核酸と前記標的核酸との間で前記近接接合を生成する、ステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋試薬が、ホルムアルデヒドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋クエンチャーがグリシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
エンドヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記放出させるステップが、前記架橋されたタンパク質を、プロテアーゼ、熱またはそれらの組合せから選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記放出させるステップが、前記複合体を断片化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、５’末端に付着した部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記部分がビオチンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、固体基材に結合される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記固体基材が、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される前記近接接合が、ビオチン標識される、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
ビオチン標識された前記近接接合が、前記近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、前記精製ステップが、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉するステップが、前記標的核酸を富化することをさらに含み、前記富化することが、前記標的核酸に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした前記近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーの前記セット中の各プライマーが、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉するステップが、前記標的核酸を富化することをさらに含み、前記富化することが、前記標的核酸に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした前記近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーの前記セット中の各プライマーが、ランダム配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチド、およびプライマーの前記セット中の各プライマーが、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分析するステップが、前記近接接合中の前記１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記分析するステップが、前記近接接合中に存在する前記１つまたは複数の核酸を標識することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
標識された１つまたは複数の核酸が、マイクロアレイにハイブリダイズされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的核酸が、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合細胞集団を含む前記試料が、個体における感染の部位に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合細胞集団を含む前記試料が、農業的試料に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記農業的試料が、ウシルーメンまたは厩肥である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸が、プラスミド、ウイルスまたはゲノムＤＮＡ中に存在する、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の核酸の各々が、プラスミド、ウイルスまたはゲノムＤＮＡ中に存在する、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸が、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合集団を含む前記試料が、腫瘍試料である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗生物質耐性遺伝子と関連する１つまたは複数の核酸を検出するための方法であって、
細胞中の１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で近接接合を生成するステップであって、前記細胞が、混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；
前記１つまたは複数の核酸と前記抗生物質耐性遺伝子との間での前記近接接合を捕捉するステップであって、前記近接接合を、前記抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および
前記抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記近接接合中の前記１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、前記抗生物質耐性遺伝子を含む前記細胞中の前記１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップ
を含む、方法。
【請求項３３】
１つまたは複数の核酸と前記抗生物質耐性遺伝子との間での前記近接接合の生成が、
ｉ．）前記細胞を含む前記試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、前記架橋剤が、前記細胞中においてタンパク質および前記１つまたは複数の核酸を前記抗生物質耐性遺伝子と架橋させ、それによって、前記１つまたは複数の核酸と前記抗生物質耐性遺伝子との間で複合体を生成する、ステップ；
ｉｉ．）前記細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；
ｉｉｉ．）前記１つまたは複数の核酸と癌遺伝子との間での前記複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；
ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびに
ｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、前記１つまたは複数の核酸と前記抗生物質耐性遺伝子との間で前記近接接合を生成する、ステップ
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記架橋試薬が、ホルムアルデヒドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記架橋クエンチャーがグリシンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
エンドヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記放出させるステップが、前記架橋されたタンパク質を、プロテアーゼ、熱またはそれらの組合せから選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記放出させるステップが、前記複合体を断片化することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、５’末端に付着した部分をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記部分がビオチンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、固体基材に結合される、請求項３２から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記固体基材が、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される前記近接接合が、ビオチン標識される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
ビオチン標識された前記近接接合が、前記近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、前記精製ステップが、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記捕捉するステップが、前記抗生物質耐性遺伝子を富化することをさらに含み、前記富化することが、前記抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした前記近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーの前記セット中の各プライマーが、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
前記捕捉するステップが、前記抗生物質耐性遺伝子を富化することをさらに含み、前記富化することが、前記抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした前記近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーの前記セット中の各プライマーが、ランダム配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチド、およびプライマーの前記セット中の各プライマーが、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記分析するステップが、前記近接接合中の前記１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記分析するステップが、前記近接接合中に存在する前記１つまたは複数の核酸を標識することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５４】
標識された１つまたは複数の核酸が、マイクロアレイにハイブリダイズされる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗生物質耐性遺伝子が、プラスミドまたは前記細胞のゲノム中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の核酸の各々が、プラスミドまたは前記細胞のゲノム中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項５７】
前記試料が、個体における感染の部位に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項５８】
前記試料が、農業的試料に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項５９】
前記農業的試料が、ウシルーメンまたは厩肥である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子と関連する１つまたは複数の核酸を検出するための方法であって、
細胞中の１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で近接接合を生成するステップであって、前記細胞が、個体に由来する混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；
前記１つまたは複数の核酸と前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子との間での前記近接接合を捕捉するステップであって、前記近接接合を、前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および
前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記近接接合中の前記１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子を含む前記細胞中の前記１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップ
を含む、方法。
【請求項６１】
１つまたは複数の核酸と前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子との間での前記近接接合の生成が、
ｉ．）前記試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、前記架橋剤が、前記細胞中においてタンパク質および前記１つまたは複数の核酸と前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子とを架橋させ、それによって、前記１つまたは複数の核酸と前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子との間で複合体を生成する、ステップ；
ｉｉ．）前記細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；
ｉｉｉ．）前記１つまたは複数の核酸と前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子との間での前記複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；
ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびに
ｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、前記１つまたは複数の核酸と前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子との間で前記近接接合を生成する、ステップ
を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記架橋試薬が、ホルムアルデヒドを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記架橋クエンチャーがグリシンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
エンドヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記放出させるステップが、前記架橋されたタンパク質を、プロテアーゼまたは熱から選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
前記放出させるステップが、前記複合体を断片化することを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】
抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、５’末端に付着した部分をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
前記部分がビオチンである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、固体基材に結合される、請求項６０から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記固体基材が、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される前記近接接合が、ビオチン標識される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７６】
ビオチン標識された前記近接接合が、前記近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、前記精製ステップが、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記捕捉するステップが、前記癌遺伝子を富化することをさらに含み、前記富化することが、前記癌遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした前記近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーの前記セット中の各プライマーが、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
前記捕捉するステップが、前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子を富化することをさらに含み、前記富化することが、前記癌遺伝子または前記腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした前記近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーの前記セット中の各プライマーが、ランダム配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７９】
前記オリゴヌクレオチド、およびプライマーの前記セット中の各プライマーが、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記分析するステップが、前記近接接合中の前記１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記分析するステップが、前記近接接合中に存在する前記１つまたは複数の核酸を標識することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項８２】
標識された１つまたは複数の核酸が、マイクロアレイにハイブリダイズされる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記混合集団を含む前記試料が、腫瘍試料である、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、全ての目的のためにその全体が本明細書で参照によって組み込まれる、２０１７年６月２６日出願の米国仮特許出願第６２／５２４，８１５号に基づく優先権の利益を主張している。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願と関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、本明細書中に参照によって組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＰＨＧＥ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約１ＫＢであり、２０１８年６月２６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
現在、細胞の内側の（例えば、異なる染色体上またはプラスミド上の）ゲノム中またはＤＮＡの異なる小片上で遠く離れているＤＮＡ配列の対について、どの２つのＤＮＡが同じ細胞に起源するかをショットガンシークエンシングによって判別することは、非常に困難であり得る。これは、プラスミドおよび他の可動性エレメントによって伝達され得る抗微生物耐性を追跡することを非常に困難にし得る。通常、目的の細胞は、培養を介してクローン的に精製され、次いで個々に配列決定される必要がある（この培養するステップの間に、目的の配列が失われ得る）。
【０００４】
本発明は、２つの配列が同じ染色体上にない場合であっても、目的のどの遺伝子／配列がどの株の背景中に存在するのかを試験するための迅速な方法（培養なし）を可能にすることによって、これらおよび他の必要に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
一態様では、細胞の混合集団（例えば、感染もしくはマイクロバイオーム試料または腫瘍由来の混合細胞集団など）内の物理的に隣接するＤＮＡ配列を架橋し、目的の少なくとも１つのＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子または発癌性対立遺伝子）が存在する架橋されたＤＮＡ接合を単離するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ近接ライゲーション方法（染色体コンフォメーション捕捉、３ｃ）をＤＮＡ捕捉テクノロジー（例えば、エキソーム捕捉、捕捉ｈｉ−ｃなど）と組み合わせる方法が、本明細書で提供される。目的の配列を含む架橋された接合が精製されると、目的の配列に付着した残りの配列が、分析または決定される。目的の配列に付着したまたはそれと関連した配列の分析または決定は、前記配列の標識、および特異的な他の配列について問い合わせるために設計されたマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、ならびに／または例えば次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用した前記配列の配列決定を必然的に伴い得る。
【０００６】
本明細書で提供される方法および組成物の最終的な成果は、目的の配列を選択する能力および目的の配列と同じ細胞中に存在する他の配列のうち１つまたは複数を決定する能力であり得る。
【０００７】
一態様では、標的核酸を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定するための方法であって、細胞中の１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で近接接合を生成するステップであって、細胞が、混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；１つまたは複数の核酸と標的核酸との間での近接接合を捕捉するステップであって、近接接合を、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした近接接合中の１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、標的核酸を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、１つまたは複数の核酸と標的核酸との間での近接接合の生成は、ｉ．）細胞を含む試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、架橋剤が、細胞中においてタンパク質および１つまたは複数の核酸を標的核酸と架橋させ、それによって、１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で複合体を生成する、ステップ；ｉｉ．）細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；ｉｉｉ．）１つまたは複数の核酸と標的核酸との間での複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびにｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で近接接合を生成する、ステップを含む。一部の場合には、架橋試薬は、ホルムアルデヒドを含む。一部の場合には、この方法は、複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む。一部の場合には、架橋クエンチャーは、グリシンである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、ＭＮａｓｅである。一部の場合には、放出させるステップは、架橋されたタンパク質を、プロテアーゼ、熱またはそれらの組合せから選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む。一部の場合には、放出させるステップは、複合体を断片化することを含む。一部の場合には、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、５’末端に付着した部分をさらに含む。一部の場合には、この部分は、ビオチンである。一部の場合には、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、固体基材に結合される。一部の場合には、固体基材は、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される。一部の場合には、ビーズは、磁性ビーズである。一部の場合には、この方法は、遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される近接接合が、ビオチン標識される。一部の場合には、ビオチン標識された近接接合は、近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、精製ステップは、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む。一部の場合には、捕捉するステップは、標的核酸を富化することをさらに含み、富化することは、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーは、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む。一部の場合には、捕捉するステップは、標的核酸を富化することをさらに含み、富化することは、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーは、ランダム配列を含む。一部の場合には、オリゴヌクレオチド、およびプライマーのセット中の各プライマーは、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む。一部の場合には、分析するステップは、近接接合中の１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む。一部の場合には、分析するステップは、近接接合中に存在する１つまたは複数の核酸を標識することを含む。一部の場合には、標識された１つまたは複数の核酸は、マイクロアレイにハイブリダイズされる。一部の場合には、標的核酸は、抗生物質耐性遺伝子である。一部の場合には、混合細胞集団を含む試料は、個体における感染の部位に由来する。一部の場合には、混合細胞集団を含む試料は、農業的試料に由来する。一部の場合には、農業的試料は、ウシルーメン（ｃｏｗ  ｒｕｍｅｎ）または厩肥である。一部の場合には、標的核酸は、プラスミド、ウイルスまたはゲノムＤＮＡ中に存在する。一部の場合には、１つまたは複数の核酸の各々は、プラスミド、ウイルスまたはゲノムＤＮＡ中に存在する。一部の場合には、標的核酸は、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である。一部の場合には、混合集団を含む試料は、腫瘍試料である。
【０００８】
別の態様では、抗生物質耐性遺伝子と関連する１つまたは複数の核酸を検出するための方法であって、細胞中の１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で近接接合を生成するステップであって、細胞が、混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間での近接接合を捕捉するステップであって、近接接合を、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした近接接合中の１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、抗生物質耐性遺伝子を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間での近接接合の生成は、ｉ．）細胞を含む試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、架橋剤が、細胞中においてタンパク質および１つまたは複数の核酸を抗生物質耐性遺伝子と架橋させ、それによって、１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で複合体を生成する、ステップ；ｉｉ．）細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；ｉｉｉ．）１つまたは複数の核酸と癌遺伝子との間での複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびにｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で近接接合を生成する、ステップを含む。一部の場合には、架橋試薬は、ホルムアルデヒドを含む。一部の場合には、この方法は、複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む。一部の場合には、架橋クエンチャーは、グリシンである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、ＭＮａｓｅである。一部の場合には、放出させるステップは、架橋されたタンパク質を、プロテアーゼ、熱またはそれらの組合せから選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む。一部の場合には、放出させるステップは、複合体を断片化することを含む。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、５’末端に付着した部分をさらに含む。一部の場合には、この部分は、ビオチンである。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、固体基材に結合される。一部の場合には、固体基材は、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される。一部の場合には、ビーズは、磁性ビーズである。一部の場合には、この方法は、遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される近接接合が、ビオチン標識される。一部の場合には、ビオチン標識された近接接合は、近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、精製ステップは、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む。一部の場合には、捕捉するステップは、抗生物質耐性遺伝子を富化することをさらに含み、富化することは、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーは、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む。一部の場合には、捕捉するステップは、抗生物質耐性遺伝子を富化することをさらに含み、富化することは、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーは、ランダム配列を含む。一部の場合には、オリゴヌクレオチド、およびプライマーのセット中の各プライマーは、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む。一部の場合には、分析するステップは、近接接合中の１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む。一部の場合には、分析するステップは、近接接合中に存在する１つまたは複数の核酸を標識することを含む。一部の場合には、標識された１つまたは複数の核酸は、マイクロアレイにハイブリダイズされる。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子は、プラスミドまたは細胞のゲノム中に存在する。一部の場合には、１つまたは複数の核酸の各々は、プラスミドまたは細胞のゲノム中に存在する。一部の場合には、試料は、個体における感染の部位に由来する。一部の場合には、試料は、農業的試料に由来する。一部の場合には、農業的試料は、ウシルーメンまたは厩肥である。
【０００９】
さらに別の態様では、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子と関連する１つまたは複数の核酸を検出するための方法であって、細胞中の１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で近接接合を生成するステップであって、細胞が、個体に由来する混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間での近接接合を捕捉するステップであって、近接接合を、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした近接接合中の１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間での近接接合の生成は、ｉ．）試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、架橋剤が、細胞中においてタンパク質および１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子とを架橋させ、それによって、１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で複合体を生成する、ステップ；ｉｉ．）細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；ｉｉｉ．）１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間での複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびにｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で近接接合を生成する、ステップを含む。一部の場合には、架橋試薬は、ホルムアルデヒドを含む。一部の場合には、この方法は、複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む。一部の場合には、架橋クエンチャーは、グリシンである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅである。一部の場合には、エンドヌクレアーゼは、ＭＮａｓｅである。一部の場合には、放出させるステップは、架橋されたタンパク質を、プロテアーゼまたは熱から選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む。一部の場合には、放出させるステップは、複合体を断片化することを含む。一部の場合には、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、５’末端に付着した部分をさらに含む。一部の場合には、この部分は、ビオチンである。一部の場合には、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、固体基材に結合される。一部の場合には、固体基材は、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される。一部の場合には、ビーズは、磁性ビーズである。一部の場合には、この方法は、遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される近接接合が、ビオチン標識される。一部の場合には、ビオチン標識された近接接合は、近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、精製ステップは、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む。一部の場合には、捕捉するステップは、癌遺伝子を富化することをさらに含み、富化することは、癌遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーは、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む。一部の場合には、捕捉するステップは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を富化することをさらに含み、富化することは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーは、ランダム配列を含む。一部の場合には、オリゴヌクレオチド、およびプライマーのセット中の各プライマーは、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む。一部の場合には、分析するステップは、近接接合中の１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む。一部の場合には、分析するステップは、近接接合中に存在する１つまたは複数の核酸を標識することを含む。一部の場合には、標識された１つまたは複数の核酸は、マイクロアレイにハイブリダイズされる。一部の場合には、混合集団を含む試料は、腫瘍試料である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、核酸（例えば、ＤＮＡ）捕捉テクノロジーと組み合わせて近接ライゲーションを使用して、細胞中の、目的の標的配列と関連するおよび／または目的の標的配列に隣接する核酸（例えば、ＤＮＡ）の存在を決定または検出するための方法を示す。一般に、細胞の混合集団（例えば、細胞Ａ、ＢおよびＣ）が、クロスリンカーで処理され、細胞の内側の近傍のＤＮＡ分子が捕獲され、架橋されたクロマチンが、細胞集団から精製され、引き続いて断片化され、近接ライゲーションが、同じ細胞中にあった配列間でキメラＤＮＡ接合を創出するために実施され、架橋が逆転され、それによって、近接ライゲーションされた接合が遊離され（例えば、逆転され）、特異的近接接合が選択および検出される。図１は、目的の配列にアニーリングされた、それに付着したビーズ（例えば、ビオチン）を含む捕捉プライマー（またはオリゴヌクレオチド）を使用して選択および検出すること、（例えば、磁性ビーズを使用して）捕捉プライマーを単離すること、ならびに近接接合をカバーする配列を、ＰＣＲまたは伸長／置き換えポリメラーゼを使用して延長させることを示す。回収されたＤＮＡ分子は、マイクロアレイまたは配列決定（例えば、次世代配列決定）を使用して分析される。あるいは、捕捉オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、アニーリングの前にビーズ（例えば、磁性ビーズ）に事前にローディングされ得、近接ライゲーションされた接合は、ビーズ結合した複合体を形成するためにビーズにローディングされ、これらは、適所で加熱およびアニーリングされ、次いで伸長される。伸長は、標識（例えば、Ｃｙ３）の存在下で実施され得、それによって、標識された（例えば、緑色）プローブを有するビーズが生じる。
【００１１】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、標的配列およびＨｉ−Ｃ相互作用を富化するための、本明細書で提供される捕捉Ｈｉ−Ｃ方法の使用を示す。図２Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム内の１００個のランダムに選択された領域の配列決定カバレッジ分布を示す。垂直線は、平均カバレッジの＞１標準偏差を示す、捕捉された配列について観察されたカバレッジを示す。図２Ｂは、そのそれぞれのプローブによる捕捉後の、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムの２つの異なる領域へのリード対マッピングのフラクションを示す。図２Ｃは、Ｈｉ−Ｃシグナルを示すリードのフラクションの別の指標である、互いに１０ｋｂよりも離れたリード対マッピングのフラクションを示す。図２Ｄは、非Ｈｉ−Ｃリードを示す、参照ゲノム配列中の互いに０塩基対離れたリード対マッピングのフラクションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
定義
以下の用語は、当業者によって十分に理解されると考えられるが、以下の定義が、本明細書に開示された主題の説明を容易にするために示される。
【００１３】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、その実体の１つまたは複数を指す、即ち、複数形の指示対象を指し得る。このように、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、本明細書で相互交換可能に使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」に対する言及は、それらの要素のうち１つおよび１つのみが存在することを文脈が明らかに要求しない限り、１つよりも多くの要素が存在する可能性を排除しない。
【００１４】
文脈が他を要求しない限り、本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびにそのバリエーション、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含むがそれらに限定されない」という、オープンで包括的な意味であると解釈すべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、それらの選択肢の一方、両方、またはそれらの任意の組合せのいずれかを意味すると理解すべきである。本明細書で使用する場合、用語「約」および「〜から本質的になる」は、特記しない限り、示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。
【００１５】
「一実施形態」または「ある実施形態」に対する本明細書を通じた言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特色、構造または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれ得ることを意味する。したがって、本明細書を通じた種々の場所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、全てが同じ実施形態を必ずしも指すわけではない。明確さのために別々の実施形態の状況で記載される本開示のある特定の特色は、単一の実施形態での組合せでも提供され得ることが理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の状況で記載される本開示の種々の特色は、別々に、または任意の適切な下位組合せでも提供され得る。
【００１６】
本開示を通じて、本明細書で提供される方法および組成物の種々の態様は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に簡便さおよび簡潔さのためであると理解すべきなのであって、本発明の範囲に対する硬直した限定として解釈すべきではない。したがって、範囲の記載は、全ての可能な下位範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると解釈すべきである。例えば、範囲の記載、例えば、１〜６は、下位範囲、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示していると解釈すべきである。これは、範囲の幅とは無関係に適用される。
【００１７】
特記しない限り、本明細書で提供される方法および組成物は、当該分野の技術範囲内の、有機化学、ポリマーテクノロジー、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術および説明を利用できる。かかる従来技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技術の具体的な例示は、以下の本明細書の実施例に対する言及によって行われ得る。しかし、他の等価な従来手順もまた、当然使用され得る。かかる従来技術および説明は、標準的な実験室マニュアル、例えば、Genome  Analysis:  A  Laboratory  Manual  Series  (Vols.  I-IV)、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cells:  A  Laboratory  Manual、PCR  Primer:  A  Laboratory  ManualおよびMolecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（全てCold  Spring  Harbor  Laboratory  Pressから）、Gait,  "Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach"  1984,  IRL  Press,  London,  Nelson  and  Cox  (2000)、Lehninger  et  al.,  (2008)  Principles  of  Biochemistry  5th  Ed.,  W.H.  Freeman  Pub.,  New  York,  N.Y.ならびにBerg  et  al.  (2006)  Biochemistry,  6.sup.th  Ed.,  W.H.  Freeman  Pub.,  New  York,  N.Y.において見出され得、これらは全て、全ての目的のためにその全体が本明細書で参照によって組み込まれる。
【００１８】
従来のソフトウェアおよびシステムもまた、本明細書で提供される方法および組成物において使用され得る。本発明のコンピューターソフトウェア製品は、典型的には、本発明の方法の論理ステップを実施するためのコンピューター実行可能な指示を有するコンピューター可読媒体を含む。適切なコンピューター可読媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリー、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが含まれる。コンピューター実行可能な指示は、適切なコンピューター言語またはいくつかの言語の組合せで書かれ得る。基礎計算生物学の方法は、例えば、Setubal  and  Meidanis  et  al.,  Introduction  to  Computational  Biology  Methods  (PWS  Publishing  Company,  Boston,  1997)；Salzberg,  Searles,  Kasif,  (Ed.),  Computational  Methods  in  Molecular  Biology,  (Elsevier,  Amsterdam,  1998)；Rashidi  and  Buehler,  Bioinformatics  Basics:  Application  in  Biological  Science  and  Medicine  (CRC  Press,  London,  2000)およびOuelette  and  Bzevanis  Bioinformatics:  A  Practical  Guide  for  Analysis  of  Gene  and  Proteins  (Wiley  &  Sons,  Inc.,  2.sup.nd  ed.,  2001)に記載されている。米国特許第６，４２０，１０８号を参照のこと。
【００１９】
本明細書で提供される方法および組成物はまた、種々の目的、例えば、プローブ設計、データの管理、分析、および器具操作のために、種々のコンピュータープログラム製品およびソフトウェアを使用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号を参照のこと。高密度マイクロアレイ分析を使用して遺伝子型決定することに関するコンピューター方法もまた、本発明の方法において使用され得る。例えば、米国特許公開第２００５０２５０１５１号、同第２００５０２４４８８３号、同第２００５０１０８１９７号、同第２００５００７９５３６号および同第２００５００４２６５４号を参照のこと。
【００２０】
さらに、本開示は、米国特許公開第２００３００９７２２２号、同第２００２０１８３９３６号、同第２００３０１００９９５号、同第２００３０１２０４３２号、同第２００４０００２８１８号、同第２００４０１２６８４０号および同第２００４００４９３５４号に示されるように、インターネットなどのネットワーク上に遺伝情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有し得る。
【００２１】
対立遺伝子は、細胞内、個体内または集団内の遺伝配列（例えば、遺伝子）の１つの特定の形態、遺伝子の配列内の少なくとも１つの、頻繁には１つよりも多くのバリアント部位の配列における、同じ遺伝子の他の形態とは異なる特定の形態を指し得る。異なる対立遺伝子間で異なるこれらのバリアント部位における配列は、「変動」、「多型」または「変異」と呼ばれ得る。各常染色体特異的染色体位置または「遺伝子座」において、個体は、２つの対立遺伝子を有し、一方は一方の親から遺伝し、一方は他方の親から遺伝する、例えば、一方は母親から遺伝し、一方は父親から遺伝する。個体は、ある遺伝子座において２つの異なる対立遺伝子を有する場合、その遺伝子座において「ヘテロ接合性」である。個体は、ある遺伝子座において２つの同一の対立遺伝子を有する場合、その遺伝子座において「ホモ接合性」である。
【００２２】
用語「アレイ」は、本明細書で使用する場合、合成または生合成のいずれかによって調製され得る分子の、意図的に創出された集合を指し得る。アレイ中の分子は、同一であってもよく、互いに異なってもよい。アレイは、可溶性分子のライブラリー；樹脂ビーズ、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子または他の固体支持体に繋がれた化合物のライブラリーなどの、種々の形式を取り得る。
【００２３】
用語「相補的な」は、本明細書で使用する場合、ヌクレオチド間または核酸間での、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと、配列決定もしくは増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間などでの、ハイブリダイゼーションまたは塩基対合を指し得る。本明細書で参照によって組み込まれるM.  Kanehisa  Nucleic  Acids  Res.  12:203  (1984)を参照のこと。
【００２４】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用する場合、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するように非共有結合するプロセスを指し得る；三本鎖ハイブリダイゼーションも理論的には可能である。得られた（通常は）二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」である。安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドの集団の割合は、本明細書で「ハイブリダイゼーションの程度」と呼ばれる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度などのストリンジェントな条件下で実施され得る。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度の条件が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適切である。ストリンジェントな条件については、例えば、上記の全ての目的のためにその全体が本明細書で参照によって組み込まれる、Sambrook,  Fritsche  and  Maniatis.  "Molecular  Cloning  A  laboratory  Manual"  2.sup.nd  Ed.  Cold  Spring  Harbor  Press  (1989)を参照のこと。一部の態様では、ハイブリダイゼーションのための塩濃度は、好ましくは、約２００ｍＭと約１Ｍとの間または約２００ｍＭと約５００ｍＭとの間である。ハイブリダイゼーション温度は、５℃の低さであり得るが、典型的には２２℃よりも高く、より典型的には約３０℃よりも高く、好ましくは約３７℃を超える。より長い断片は、特異的ハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基ミスマッチの程度を含む他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るので、パラメーターの組合せは、いずれか１つ単独の絶対的尺度よりも重要である。
【００２６】
本明細書で提供される方法および組成物においてポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施するための方法は、当該分野で任意の公知のものであり得、開発され得る。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、適用に依存して変動し得、Maniatis  et  al.  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (2.sup.nd  Ed.  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  1989)；Berger  and  Kimmel  Methods  in  Enzymology,  Vol.  152,  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques  (Academic  Press,  Inc.,  San  Diego,  Calif.,  1987)；Young  and  Davis,  P.N.A.S,  80:  1194  (1983)において言及されるものを含む、公知の一般的な結合方法に従って選択され得る。反復され制御されるハイブリダイゼーション反応を実施するための方法および装置は、その各々が本明細書で参照によって組み込まれる、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号に記載されている。
【００２７】
本明細書で提供される方法および組成物は、ある特定の好ましい実施形態では、リガンド間でのハイブリダイゼーションのシグナル検出もまた利用できる。その各々もまた全ての目的のためにその全体が本明細書で参照によって組み込まれる、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８３４，７５８号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号、同第６，２１８，８０３号および同第６，２２５，６２５号、米国特許公開第２００４００１２６７６号ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開された）を参照のこと。
【００２８】
シグナル検出および強度データの処理のための方法および装置は、その各々もまた全ての目的のためにその全体が本明細書で参照によって組み込まれる、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８００，９９２号、同第５，８３４，７５８号、同第５，８５６，０９２号、同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許公開第２００４００１２６７６号および同第２００５００５９０６２号、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開された）に開示されたものであり得る。
【００２９】
用語「混合集団」または時に「複合集団」による言及は、本明細書で使用する場合、望ましいおよび望ましくない核酸または細胞を両方とも含む任意の試料を指し得る。非限定的な例として、核酸の複合集団は、全ゲノムＤＮＡ、全ゲノムＲＮＡまたはそれらの組合せであり得る。全ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞の混合集団内の細胞の１つ、複数または全てに由来し得る。さらに、核酸の複合集団は、所与の集団について富化されていてもよいが、他の望ましくない集団を含み得る。例えば、核酸の複合集団は、望ましいメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列について富化されているが、一部の望ましくないリボソームＲＮＡ配列（ｒＲＮＡ）をなおも含む試料であり得る。
【００３０】
用語「ｍＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ転写物」には、本明細書で使用する場合、プレｍＲＮＡ転写物、転写物プロセシング中間体、翻訳の用意ができた成熟ｍＲＮＡおよび遺伝子（単数または複数）の転写物、またはｍＲＮＡ転写物に由来する核酸が含まれ得るが、これらに限定されない。転写物プロセシングには、スプライシング、編集および分解が含まれ得る。本明細書で使用する場合、ｍＲＮＡ転写物に由来する核酸は、その合成のためにｍＲＮＡ転写物またはその部分配列が鋳型として最終的に機能した核酸を指す。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、全てｍＲＮＡ転写物に由来し、かかる誘導された産物の検出は、試料中の元の転写物の存在および／または存在量を示す。したがって、ｍＲＮＡ由来の試料には、遺伝子（単数または複数）のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、プリンおよびピリミジン塩基、あるいは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指し得る。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的には見出され得るような糖およびリン酸基、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分が割り込み得る。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は一般に、本明細書に記載されるものなどのアナログを含む。これらのアナログは、核酸またはオリゴヌクレオシド配列中に取り込まれた場合に、溶液中での天然に存在する核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にするように、天然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと共通したいくつかの構造的特色を有する分子であり得る。典型的には、これらのアナログは、塩基、リボースまたはホスホジエステル部分を交換および／または改変することによって、天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから誘導され得る。これらの変化は、所望により、ハイブリッド形成を安定化もしくは不安定化するため、または相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を増強するために、オーダーメイドされ得る。
【００３２】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、少なくとも２、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長の範囲の核酸、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物を指し得る。本明細書で提供される方法および組成物のポリヌクレオチドには、天然の供給源から単離され得る、組換え産生され得るまたは人工的に合成され得る、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の配列、およびそれらの模倣物が含まれ得る。本明細書の発明で提供される方法および組成物のポリヌクレオチドのさらなる例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。本明細書で提供される方法および組成物は、ある特定のｔＲＮＡ分子において同定され、三重らせん中に存在すると推論されているフーグスティーン塩基対合などの非伝統的塩基対合が存在する状況もまた包含し得る。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で提供される方法および組成物において、相互交換可能に使用され得る。
【００３３】
用語「多型」は、本明細書で使用する場合、集団における、２つまたはそれよりも多くの遺伝的に決定された代替的配列または対立遺伝子の存在を指し得る。多型マーカーまたは部位は、相違が存在する遺伝子座であり得る。多型は、１つもしくは複数の塩基変化、挿入、リピートまたは欠失を含み得る。多型遺伝子座は、１塩基対の小ささであり得る。多型マーカーには、制限断片長多型、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純な配列リピート、および挿入エレメント、例えばＡｌｕが含まれる。最初に同定された対立遺伝子形態は、自由裁量で参照形態と指定され得、他の対立遺伝子形態は、代替的またはバリアント対立遺伝子と指定され得る。選択された集団において最も頻繁に存在する対立遺伝子形態は、野生型形態と呼ばれる場合があり得る。二倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。二対立遺伝子多型は、２つの形態を有し得る。三対立遺伝子多型は、３つの形態を有し得る。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、多型に含まれ得る。
【００３４】
用語「プライマー」は、本明細書で使用する場合、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合のための薬剤、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの存在下で、適切な条件、例えば、緩衝液および温度の下で、鋳型によって指示されるＤＮＡ合成のための開始点として作用することが可能な一本鎖オリゴヌクレオチドを指し得る。任意の所与の場合、プライマーの長さは、例えば、プライマーの意図した使用に依存し、一般には、１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と共に十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とし得る。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映しなくてもよいが、かかる鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズする鋳型の領域であり得る。プライマー対は、増幅される配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流プライマーおよび増幅される配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流プライマーを含むプライマーのセットであり得る。
【００３５】
用語「固体支持体」、「固体基材」、「支持体」および「基材」は、本明細書で使用する場合、相互交換可能に使用され得、剛性または半剛性の表面（単数または複数）を有する材料または材料の群を指し得る。多くの実施形態では、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、一部の実施形態では、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、エッチングされた溝などによって、異なる化合物のために合成領域を物理的に分離することが望まれ得る。他の実施形態によれば、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェアまたは他の幾何学的構成の形態を取る。例示的な基材については、米国特許第５，７４４，３０５号ならびに米国特許公開第２００９０１４９３４０号および同第２００８００３８５５９号を参照のこと。
概説
【００３６】
標的核酸と関連した１つまたは複数の核酸の存在を決定または検出するための方法および組成物が、本明細書で提供される。１つもしくは複数の核酸および／または標的核酸は、細胞の混合集団内の同じ細胞に由来し得るまたは同じ細胞に起源し得る。本明細書で提供される方法は、当該分野で現在公知の方法よりも効率的で、それほど時間がかからない様式での、標的核酸と関連した核酸（例えば、ＤＮＡ）配列の同定を可能にし得る。一部の場合には、この方法は、それらの配列が、異なる染色体またはプラスミド上に位置する場合であっても、核酸（例えば、ＤＮＡ）のある特定の配列または対立遺伝子が、混合集団中の同じ細胞内に共存するかどうかについての、迅速で配列決定が不要な問い合わせを可能にし得る。
【００３７】
本明細書で提供される方法は、細胞または核酸の任意の混合集団をデコンボリューションするために使用され得る。例えば、本明細書で提供される方法は、微生物細胞または微生物群の混合集団をデコンボリューションするために使用され得る。さらに、本明細書で提供される方法は、固形腫瘍内の同じ細胞中にどの対立遺伝子が存在するかを問うために使用され得る。本明細書で提供される方法および組成物による使用のための細胞または核酸の混合集団の他の非限定的な例は、臓器全体／全血液、混入したまたは混合された法医学的試料であり得る。
【００３８】
一実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、目的のクエリー遺伝子が捕捉ビーズに繋がれ得、マイクロアレイが、既知の供給源（例えば、細胞、または核酸のプール）由来の核酸のセットのために設計され得るように、診断試験の基礎として機能し得る。診断試験は、既知の供給源が微生物の公知の株または種であり得るように、微生物抗生物質耐性遺伝子を検出するためのものであり得る。この方法の間に生成される架橋されたクロマチンは、同じ細胞内の核酸（例えば、ＤＮＡ）配列の対間で近接接合を創出し得る。これらの接合は、捕捉またはＰＣＲ試薬を用いて選択され得、次いで、捕捉された配列がマイクロアレイ（または配列データベース）上の任意のまたは複数の核酸と細胞内で相互作用するかどうかを判別するために、マイクロアレイプローブにハイブリダイズされ得る（または配列決定され得る）。
【００３９】
当該分野で公知の方法（例えば、Ｈｉ−Ｃ）とは対照的に、本明細書で提供される方法は、ｄｅ  ｎｏｖｏでゲノムをアセンブルしないが、（配列決定を排除することによって、または配列決定が維持される場合には、配列ライブラリーの複雑さを徹底的に低減させることによって）、プロセスのコストを徹底的に低減させることができる。さらに、本明細書で提供される方法は、Ｈｉ−Ｃよりも顕著に速くかつ安価であり得、診断目的のためにはるかにスケーラブルであり得る。
【００４０】
図１に示されるように、本明細書で提供される方法は、以下を一般に含む。
【００４１】
１．混合細胞集団中の細胞（例えば、図１中の細胞Ａ、ＢおよびＣ）内の核酸および／またはタンパク質を、架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド）に供するステップ。次いで、架橋された核酸および／またはタンパク質複合体（例えば、クロマチン）は、細胞集団から放出または精製され得る。例えば、各細胞由来の架橋されたクロマチン（図１中で、それぞれ細胞Ａ、ＢまたはＣに由来するクロマチンを示すために、「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と表示される）が細胞から放出される図１を参照のこと。次いで、精製された架橋された複合体（例えば、クロマチン）は、断片化され得る。
【００４２】
２．架橋された分子から生成されたＤＮＡ末端を連結またはライゲーションして、近接接合を創出するステップ。一部の場合には、ＤＮＡ末端は、引き続くステップにおいてアフィニティービーズを用いて精製することができる接合を創出するために、ライゲーション前にビオチン化され得る。重要なことに、接合は、異なる株／種／細胞に起源する配列間では形成されない。
【００４３】
３．架橋されたクロマチンから近接接合を放出させるステップ。
【００４４】
４．近接接合を選択し、目的の標的配列に隣接するまたはそれと近接した１つまたは複数の核酸配列を検出するステップ。
架橋
【００４５】
一実施形態では、架橋は、核酸−核酸架橋またはタンパク質−核酸架橋を含むがこれらに限定されない群から選択される。本明細書で提供される方法に適切な架橋剤の例には、アルキル化剤、例えば、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ、カルムスチン）およびナイトロジェンマスタード、シスプラチン（シス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ））およびその誘導体、ソラレン、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組合せが含まれ得るが、これらに限定されない。一部の場合には、架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはそれらの組合せである。
【００４６】
一実施形態では、架橋剤で処理される細胞は、非哺乳動物細胞を含む。一実施形態では、非哺乳動物細胞は、魚類、両生類、昆虫、鳥類、酵母、真菌、細菌またはカビを含むがこれらに限定されない群から選択される細胞を含む。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞は、腫瘍またはがん細胞である。一実施形態では、腫瘍またはがん細胞は、腫瘍細胞の混合集団の一部である。一実施形態では、細胞は、微生物細胞を含む。一実施形態では、微生物細胞は、混合微生物集団の一部である。架橋剤もしくはクロスリンカーで処理されるまたは架橋剤もしくはクロスリンカーに供される細胞は、例えば、混合微生物集団または腫瘍試料であり得る。細胞は、インタクトであり得る。
【００４７】
インタクトな細胞は、さらなる薬剤（例えば、検出剤）を細胞中に進入させるために、架橋剤での処理後に透過処理され得る。透過処理は、細胞を透過処理剤で処理することによって実施され得る。本明細書で提供される方法における使用のための透過処理剤の例は、当該分野で公知の任意の透過処理剤、例えば、有機溶媒または界面活性剤などであり得る。有機溶媒は、メタノールまたはアセトンであり得る。界面活性剤は、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ−２０であり得る。
【００４８】
一実施形態では、架橋は、細胞内（重要なことに、細胞間では決してない）の核酸配列または分子（例えば、ＤＮＡ）の近傍の対間で架橋された接合を創出し得る。一部の接合は、同じ核酸分子上の核酸または遺伝子配列間であり得る。一部の場合には、接合は、１つまたは複数のプラスミド上の遺伝子とゲノムＤＮＡ内に存在する宿主細胞遺伝子との間であり得る。一部の場合には、接合は、複数の染色体上の核酸配列または遺伝子間であり得る。
架橋された接合の消化
【００４９】
一部の場合には、本明細書で提供される方法を使用して生成される架橋された接合（例えば、架橋されたクロマチン）は、ＤＮＡ末端を創出するために消化され得る。ＤＮＡ末端は、引き続くステップにおいて、互いに連結またはライゲーションされ得る。架橋された接合の消化は、例えば、制限酵素またはエンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅ  ＩまたはＭＮａｓｅ）などの酵素を使用して、実施され得る。一部の場合には、架橋された接合の断片化は、オーバーハングまたは「粘着」ＤＮＡ末端を生成する。オーバーハングまたは「粘着」末端は、「フィルイン」され得る、または平滑にされ得る。フィルインは、当該分野で公知の任意の方法または酵素、例えば、クレノウ断片などを使用して達成され得る。一部の場合には、断片化は、制限酵素消化によって達成され、オーバーハング末端は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用してフィルインされる。
ＤＮＡ末端の連結／ライゲーション
【００５０】
ＤＮＡ末端の消化および生成の後、生成されたＤＮＡ末端は、連続的な骨格を有する単一のより大きいポリヌクレオチドを産生するために、共有結合で付着されていてもよい。ＤＮＡ末端を連結するための方法は、当該分野で公知であり、これには、限定なしに、酵素的および非酵素的（例えば、化学的）方法が含まれる。非酵素的であるライゲーション反応の例には、本明細書で参照によって組み込まれる米国特許第５，７８０，６１３号および同第５，４７６，９３０号に記載される非酵素的ライゲーション技術が含まれる。一部の実施形態では、ＤＮＡ末端は、リガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼなどを介したライゲーションによって連結される。特徴付けられた反応条件を各々が有する複数のリガーゼが、当該分野で公知であり、これには、限定なしに、ｔＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｒｎｕｓｆｉ４ｆｏｎｎｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｒｏｄｕｃｗｓ  ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、熱安定性リガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定性ＤＮＡリガーゼ、ＶａｎＣ型リガーゼ、９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ  ＤＮＡリガーゼ、およびバイオプロスペクティングによって発見される新規リガーゼを含むＮＡＤ依存的リガーゼ；Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｔｈ  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩｌｌ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびバイオプロスペクティングによって発見される新規リガーゼを含むＡＴＰ依存的リガーゼ；ならびにそれらの野生型、変異体アイソフォーム、および遺伝子操作されたバリアントが含まれる。架橋された接合の消化は、ハイブリダイズ可能な配列、例えば、相補的なオーバーハングを有するＤＮＡ末端を生成でき、それによって、粘着末端ライゲーションのために有用であり得る。架橋された接合の消化は、平滑であるＤＮＡ末端を生成でき、それによって、平滑末端ライゲーションのために有用であり得る。一般に、５’リン酸が、ライゲーション反応において利用される。５’リン酸は、生成されたＤＮＡ末端の一方または両方によって提供され得る。５’リン酸は、必要に応じて、連結されるＤＮＡ末端に付加され得る、または連結されるＤＮＡ末端から除去され得る。
【００５１】
５’リン酸の付加または除去のための方法は、当該分野で公知であり、これには、限定なしに、酵素的および化学的プロセスが含まれる。５’リン酸の付加および／または除去において有用な酵素には、キナーゼ、ホスファターゼおよびポリメラーゼが含まれる。一部の実施形態では、２つの末端を連結する際に２つの共有結合が作製されるように、ライゲーション反応において連結される２つの末端の両方が、５’リン酸を提供する。一部の実施形態では、２つの末端を連結する際に共有結合が１つだけ作製されるように、ライゲーション反応において連結される２つの末端の一方のみが、５’リン酸を提供する。一部の実施形態では、３’リン酸は、ライゲーション前に除去される。
【００５２】
以前に記載したように、ＤＮＡ末端は、ビオチン標識された接合を創出するために、ライゲーション前にビオチン化され得る。
接合を放出させること
【００５３】
本明細書で議論したように、近接接合の生成後、架橋された核酸は、架橋の放出に供され得る。架橋の放出は、目的の標的配列（即ち、「クエリー遺伝子」）の捕捉、ならびにそれと関連するまたは目的の標的配列と近接して位置する任意のおよび全ての核酸の引き続く検出を促進し得る。放出は、全てのＤＮＡを放出させるように架橋を逆転させることによって、またはネイキッドＤＮＡ近接接合を放出させるように、架橋された／ライゲーションされたクロマチンを断片化することによって、実施され得る。架橋の逆転は、当該分野で公知の任意の方法を使用して達成され得る。例えば、架橋は、酵素的または非酵素的手段を使用して逆転され得る。架橋逆転のための酵素的手段の非限定的な例には、制限酵素、プロテアーゼまたはプロテイナーゼＫでの処理が含まれるが、非酵素的架橋逆転手段の非限定的な例には、熱処理が含まれる。一部の場合には、架橋を逆転させることは、少なくとも約５５℃、少なくとも約６５℃または少なくとも約９５℃まで架橋を加熱することを含む。一部の場合には、架橋を逆転させることは、プロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼと共にパーティションをインキュベートすることを含む。一部の場合には、酵素的手段（例えば、プロテアーゼまたはプロテイナーゼＫ）および非酵素的手段（例えば、熱処理）の組合せが、架橋を逆転させるために使用される。あるいは、架橋は、架橋された／連結された（例えば、ライゲーションされた）クロマチンを断片化するために超音波処理に供され得、それによって、ネイキッド近接接合を放出させ得る。一部の場合には、架橋の逆転が、ｐＨを変化させることによって、または例えばＵＶ光を使用して架橋を光で逆転させることによって達成することができるように、前記架橋を生成するために使用されるクロスリンカーは、例えば、ソラレンなど、可逆的である。
【００５４】
一部の実施形態では、近接接合は、精製および検出前に富化され得る。一実施形態では、ビオチン標識は、本明細書に記載されるように近接接合に付け足され、アビジンもしくはストレプトアビジン部分でコーティングされたまたはそれにカップリングされた基材、例えばアフィニティービーズなどに、ハイブリダイズまたは結合される。引き続いて、非結合複合体が、ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン）複合体から、洗浄または分離される。ビオチン選択は、近接接合の選択または精製前に、顕著な量の背景ＤＮＡを除去するように機能し得る。
選択および検出
【００５５】
近接接合の放出および／または富化後、目的のクエリー配列と関連する、それと共局在する、またはそれと近接した１つまたは複数の配列は、選択または精製され得、引き続いて検出され得る。一部の実施形態では、近接接合は、ＤＮＡ捕捉テクノロジー（エキソーム精製と同様の）を用いて富化される。一実施形態では、目的のクエリー配列は、目的のクエリー配列に対して相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチド（例えば、図１の捕捉プライマーを参照のこと）に曝露されることによって、選択または精製される。一実施形態では、適切な近接接合を捕捉するために使用されるオリゴヌクレオチド中の相補的な配列は、目的の異なるクエリー遺伝子もしくは配列のために変化させてもよく、および／または目的の遺伝子周囲の別個のもしくは異なる配列を各々が含む捕捉オリゴヌクレオチドのプールであり得る。
【００５６】
一実施形態では、目的のクエリーまたは標的配列に対して相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドは、それに付着した部分を有する。この部分は、好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端において付着される。一実施形態では、この部分は、ビオチンである（例えば、図１を参照のこと）。一実施形態では、目的のクエリー配列に対して相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドは、その５’末端に付着した部分（例えば、ビオチン）をさらに含む。この実施形態に加えて、捕捉オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを促進するまたは許容する条件下で、放出された近接接合に導入される。捕捉オリゴヌクレオチドは、これらの近接接合（例えば、ＤＮＡ接合）に結合でき、このとき、接合の少なくとも一方の側または部分は、捕捉オリゴヌクレオチド中に存在する配列に対して相補的なクエリー配列を含み、それによって、近接接合の少なくとも一方の側または部分に結合した捕捉オリゴヌクレオチドを含む複合体を生成する。次いで、複合体は、捕捉オリゴヌクレオチド上の（例えば、５’末端上の）部分を、固体基材またはマトリックスと複合体化させることによって、単離または精製され得る。捕捉オリゴヌクレオチドがビオチンで標識される場合、複合体化は、固体マトリックス、あるいはアビジンもしくはストレプトアビジンでコーティングされたまたはそれと複合体化されたマトリックスの使用を介して促進され得る。基材またはマトリックスは、ビーズ、例えば、磁性ビーズまたはアフィニティービーズなどであり得る。
【００５７】
別の実施形態では、目的のクエリー配列に対して相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドは、放出された近接接合に導入される前に、固体基材またはマトリックス（例えば、アフィニティービーズまたは磁性ビーズ）に付着される。この場合には、固体基材またはマトリックスは、捕捉オリゴヌクレオチドで事前にローディングされると言うことができる。捕捉オリゴヌクレオチドがビオチンで標識される場合、事前のローディングは、アビジンもしくはストレプトアビジンでコーティングされたまたはそれと複合体化された固体基材またはマトリックスの使用を介して促進され得る。次いで、放出された近接接合は、目的のクエリー配列に対して相補的な配列を含む前記固体基材またはマトリックスに、ハイブリダイゼーションを促進するまたは許容する条件下で、曝露され得る。基材またはマトリックスは、これらの近接接合（例えば、ＤＮＡ接合）に結合でき、このとき、接合の少なくとも一方の側または部分は、固体基材またはマトリックスに付着した配列に対して相補的なクエリー配列（例えば、「クエリー遺伝子」、例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含む。
【００５８】
したがって、上記実施形態に加えて、マトリックス／ビーズを精製することは、クエリー配列を含む接合を精製するように機能し得る。望ましい近接接合の捕捉後、目的のクエリー配列との近接接合中に存在する１つまたは複数の配列は、標識され得る。図１に示されるように、近接接合をカバーする配列は、ＰＣＲまたは伸長／置き換えポリメラーゼを使用して延長され得る。標識は、配列決定（例えば、ＮＧＳ）による、または標識された１つもしくは複数の配列に対して相補的な配列を含むマイクロアレイへのハイブリダイゼーション（接合の「他方の側」上の目的の配列の存在をアッセイするための）による、前記１つまたは複数の配列の検出を可能にするように機能し得る。１つまたは複数の配列の標識は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５標識されたｄＵＴＰ）を用いたＰＣＲなどを使用して、実施され得る。マイクロアレイ上の配列への、標識された１つまたは複数の配列の結合の検出は、当該分野で公知の任意の方法を使用して検出され得る。
【００５９】
別の実施形態では、クエリー配列を含む近接接合は、目的のクエリー配列の相補体が１つのプライマー上に配置されるが、第２のプライマーまたは第２のプライマーのセットが、ランダム配列、または公知の配列の混合プールに対して指向され得るような、ＰＣＲによって選択または増幅され得る。この実施形態では、第２のプライマーまたは第２のプライマーのセットは、ランダムになるように変動され得る、または公知の配列に対して指向されるプライマーの混合プールに限定され得る。一部の場合には、目的のクエリー配列との近接接合中に存在する１つまたは複数の配列は、標識され得る。標識は、標識された１つまたは複数の配列に対して相補的な配列を含むマイクロアレイへの、前記標識された１つまたは複数の配列の結合の際に、前記１つまたは複数の配列の検出を可能にするように機能し得る。１つまたは複数の配列の標識は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５標識されたｄＵＴＰ）を用いたＰＣＲなどを使用して、実施され得る。マイクロアレイ上の配列への、標識された１つまたは複数の配列の結合の検出は、当該分野で公知の任意の方法を使用して検出され得る。
【００６０】
さらに別の実施形態では、第１および／または第２のプライマーが、それに付け足された配列決定アダプター配列を有することができるように、選択は、本明細書に記載されるＰＣＲの使用を必然的に伴う。配列決定アダプター配列の存在は、配列決定ライブラリーの迅速な創出を可能にし得る。配列決定ライブラリーは、引き続いて、シーケンサー中にローディングされ得、配列決定され得る。シーケンサーは、当該分野で公知の任意の型の配列決定と適合性であり得る。一部の場合には、配列決定の型は、公知の次世代配列決定（ＮＧＳ）方法およびその使用のためのシステムである。例えば、ＮＧＳ配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、４５４パイロシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子配列決定、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定またはＮａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ配列決定であり得る。
微生物抗生物質耐性遺伝子の検出
【００６１】
一実施形態では、本明細書で提供される方法は、微生物細胞の１つの集団または混合集団を含む試料中の、標的核酸（即ち、目的のクエリー配列）との、１つまたは複数の微生物遺伝子の関連または存在を検出または決定するために利用される。１つまたは複数の微生物遺伝子は、試料中の細胞（例えば、微生物細胞）内の標的核酸と共局在され得、それと隣接し得、またはそれと近接し得る。試料は、微生物細胞またはその混合集団を含む任意の試料、例えば、個体または患者内の感染の部位などであり得る。１つもしくは複数の微生物遺伝子および／または標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、またはプラスミドもしくは他の染色体外実体上に位置する遺伝子であり得る。１つもしくは複数の微生物遺伝子および／または標的核酸は、毒性微生物遺伝子であり得る。一実施形態では、１つもしくは複数の微生物遺伝子および／または標的核酸は、抗生物質耐性遺伝子である。抗生物質耐性遺伝子は、当該分野で公知の抗生物質に対する耐性を付与する任意の遺伝子であり得る。抗生物質は、アミノグリコシド、ベータ−ラクタム、マクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンＢ（ＭＬＳＢ）、テトラサイクリン、バンコマイシンから選択され得る。抗生物質耐性遺伝子は、当該分野で公知の任意の抗生物質耐性遺伝子であり得る。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、任意の多剤トランスポーター遺伝子であり得る。抗生物質耐性遺伝子は、例えば、ａａｃ２ｉａ、ａａｃ２ｉｂ、ａａｃ２ｉｃ、ａａｃ２ｉｄ、ａａｃ２ｉ、ａａｃ３ｉａ、ａａｃ３ｉｉａ、ａａｃ３ｉｉｂ、ａａｃ３ｉｉｉ、ａａｃ３ｉｖ、ａａｃ３ｉｘ、ａａｃ３ｖｉ、ａａｃ３ｖｉｉｉ、ａａｃ３ｖｉｉ、ａａｃ３ｘ、ａａｃ６ｉ、ａａｃ６ｉａ、ａａｃ６ｉｂ、ａａｃ６ｉｃ、ａａｃ６ｉｅ、ａａｃ６ｉｆ、ａａｃ６ｉｇ、ａａｃ６ｉｉａ、ａａｃ６ｉｉｂ、ａａｄ９、ａａｄ９ｉｂ、ａａｄｄ、ａｃｒａ、ａｃｒｂ、ａｄｅａ、ａｄｅｂ、ａｄｅｃ、ａｍｒａ、ａｍｒｂ、ａｎｔ２ｉａ、ａｎｔ２ｉｂ、ａｎｔ３ｉａ、ａｎｔ４ｉｉａ、ａｎｔ６ｉａ、ａｐｈ３３ｉａ、ａｐｈ３３ｉｂ、ａｐｈ３ｉａ、ａｐｈ３ｉｂ、ａｐｈ３ｉｃ、ａｐｈ３ｉｉｉａ、ａｐｈ３ｉｖａ、ａｐｈ３ｖａ、ａｐｈ３ｖｂ、ａｐｈ３ｖｉａ、ａｐｈ３ｖｉｉａ、ａｐｈ４ｉｂ、ａｐｈ６ｉａ、ａｐｈ６ｉｂ、ａｐｈ６ｉｃ、ａｐｈ６ｉｄ、ａｒｎａ、ｂａｃａ、ｂｃｒａ、ｂｃｒｃ、ｂｌ１＿ａｃｃ、ｂｌ１＿ａｍｐｃ、ｂｌ１＿ａｓｂａ、ｂｌ１＿ｃｅｐｓ、ｂｌ１＿ｃｍｙ２、ｂｌ１＿ｅｃ、ｂｌ１＿ｆｏｘ、ｂｌ１＿ｍｏｘ、ｂｌ１＿ｏｃｈ、ｂｌ１＿ｐａｏ、ｂｌ１＿ｐｓｅ、ｂｌ１＿ｓｍ、ｂｌ２ａ＿１、ｂｌ２ａ＿ｅｘｏ、ｂｌ２ａ＿ｉｉｉ２、ｂｌ２ａ＿ｉｉｉ、ｂｌ２ａ＿ｋｃｃ、ｂｌ２ａ＿ｎｐｓ、ｂｌ２ａ＿ｏｋｐ、ｂｌ２ａ＿ｐｃ、ｂｌ２ｂｅ＿ｃｔｘｍ、ｂｌ２ｂｅ＿ｏｘｙ１、ｂｌ２ｂｅ＿ｐｅｒ、ｂｌ２ｂｅ＿ｓｈｖ２、ｂｌ２ｂ＿ｒｏｂ、ｂｌ２ｂ＿ｔｅｍ１、ｂｌ２ｂ＿ｔｅｍ２、ｂｌ２ｂ＿ｔｅｍ、ｂｌ２ｂ＿ｔｌｅ、ｂｌ２ｂ＿ｕｌａ、ｂｌ２ｃ＿ｂｒｏ、ｂｌ２ｃ＿ｐｓｅ１、ｂｌ２ｃ＿ｐｓｅ３、ｂｌ２ｄ＿ｌｃｒ１、ｂｌ２ｄ＿ｍｏｘａ、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ１０、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ１、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ２、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ５、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ９、ｂｌ２ｄ＿ｒ３９、ｂｌ２ｅ＿ｃｂｌａ、ｂｌ２ｅ＿ｃｅｐａ、ｂｌ２ｅ＿ｃｆｘａ、ｂｌ２ｅ＿ｆｐｍ、ｂｌ２ｅ＿ｙ５６、ｂｌ２ｆ＿ｎｍｃａ、ｂｌ２ｆ＿ｓｍｅ１、ｂｌ２＿ｇｅｓ、ｂｌ２＿ｋｐｃ、ｂｌ２＿ｌｅｎ、ｂｌ２＿ｖｅｂ、ｂｌ３＿ｃｃｒａ、ｂｌ３＿ｃｉｔ、ｂｌ３＿ｃｐｈａ、ｂｌ３＿ｇｉｍ、ｂｌ３＿ｉｍｐ、ｂｌ３＿ｌ、ｂｌ３＿ｓｈｗ、ｂｌ３＿ｓｉｍ、ｂｌ３＿ｖｉｍ、ｂｌｅ、ｂｌｔ、ｂｍｒ、ｃａｒａ、ｃａｔａ１０、ｃａｔａ１１、ｃａｔａ１２、ｃａｔａ１３、ｃａｔａ１４、ｃａｔａ１５、ｃａｔａ１６、ｃａｔａ１、ｃａｔａ２、ｃａｔａ３、ｃａｔａ４、ｃａｔａ５、ｃａｔａ６、ｃａｔａ７、ｃａｔａ８、ｃａｔａ９、ｃａｔｂ１、ｃａｔｂ２、ｃａｔｂ３、ｃａｔｂ４、ｃａｔｂ５、ｃｅｏａ、ｃｅｏｂ、ｃｍｌ＿ｅ１、ｃｍｌ＿ｅ２、ｃｍｌ＿ｅ３、ｃｍｌ＿ｅ４、ｃｍｌ＿ｅ５、ｃｍｌ＿ｅ６、ｃｍｌ＿ｅ７、ｃｍｌ＿ｅ８、ｄｆｒａ１０、ｄｆｒａ１２、ｄｆｒａ１３、ｄｆｒａ１４、ｄｆｒａ１５、ｄｆｒａ１６、ｄｆｒａ１７、ｄｆｒａ１９、ｄｆｒａ１、ｄｆｒａ２０、ｄｆｒａ２１、ｄｆｒａ２２、ｄｆｒａ２３、ｄｆｒａ２４、ｄｆｒａ２５、ｄｆｒａ２５、ｄｆｒａ２５、ｄｆｒａ２６、ｄｆｒａ５、ｄｆｒａ７、ｄｆｒｂ１、ｄｆｒｂ２、ｄｆｒｂ３、ｄｆｒｂ６、ｅｍｅａ、ｅｍｒｄ、ｅｍｒｅ、ｅｒｅａ、ｅｒｅｂ、ｅｒｍａ、ｅｒｍｂ、ｅｒｍｃ、ｅｒｍｄ、ｅｒｍｅ、ｅｒｍｆ、ｅｒｍｇ、ｅｒｍｈ、ｅｒｍｎ、ｅｒｍｏ、ｅｒｍｑ、ｅｒｍｒ、ｅｒｍｓ、ｅｒｍｔ、ｅｒｍｕ、ｅｒｍｖ、ｅｒｍｗ、ｅｒｍｘ、ｅｒｍｙ、ｆｏｓａ、ｆｏｓｂ、ｆｏｓｃ、ｆｏｓｘ、ｆｕｓｂ、ｆｕｓｈ、ｋｓｇａ、ｌｍｒａ、ｌｍｒｂ、ｌｎｕａ、ｌｎｕｂ、ｌｓａ、ｍａｃａ、ｍａｃｂ、ｍｄｔｅ、ｍｄｔｆ、ｍｄｔｇ、ｍｄｔｈ、ｍｄｔｋ、ｍｄｔｌ、ｍｄｔｍ、ｍｄｔｎ、ｍｄｔｏ、ｍｄｔｐ、ｍｅｃａ、ｍｅｃｒ１、ｍｅｆａ、ｍｅｐａ、ｍｅｘａ、ｍｅｘｂ、ｍｅｘｃ、ｍｅｘｄ、ｍｅｘｅ、ｍｅｘｆ、ｍｅｘｈ、ｍｅｘｉ、ｍｅｘｗ、ｍｅｘｘ、ｍｅｘｙ、ｍｆｐａ、ｍｐｈａ、ｍｐｈｂ、ｍｐｈｃ、ｍｓｒａ、ｎｏｒｍ、ｏｌｅｂ、ｏｐｃｍ、ｏｐｒａ、ｏｐｒｄ、ｏｐｒｊ、ｏｐｒｍ、ｏｐｒｎ、ｏｔｒａ、ｏｔｒｂ、ｐｂｐ１ａ、ｐｂｐ１ｂ、ｐｂｐ２ｂ、ｐｂｐ２、ｐｂｐ２ｘ、ｐｍｒａ、ｑａｃ、ｑａｃａ、ｑａｃｂ、ｑｎｒａ、ｑｎｒｂ、ｑｎｒｓ、ｒｏｓａ、ｒｏｓｂ、ｓｍｅａ、ｓｍｅｂ、ｓｍｅｃ、ｓｍｅｄ、ｓｍｅｅ、ｓｍｅｆ、ｓｒｍｂ、ｓｔａ、ｓｔｒ、ｓｕｌ１、ｓｕｌ２、ｓｕｌ３、ｔｃｍａ、ｔｃｒ３、ｔｅｔ３０、ｔｅｔ３１、ｔｅｔ３２、ｔｅｔ３３、ｔｅｔ３４、ｔｅｔ３６、ｔｅｔ３７、ｔｅｔ３８、ｔｅｔ３９、ｔｅｔ４０、ｔｅｔａ、ｔｅｔｂ、ｔｅｔｃ、ｔｅｔｄ、ｔｅｔｅ、ｔｅｔｇ、ｔｅｔｈ、ｔｅｔｊ、ｔｅｔｋ、ｔｅｔｌ、ｔｅｔｍ、ｔｅｔｏ、ｔｅｔｐａ、ｔｅｔｐｂ、ｔｅｔ、ｔｅｔｑ、ｔｅｔｓ、ｔｅｔｔ、ｔｅｔｕ、ｔｅｔｖ、ｔｅｔｗ、ｔｅｔｘ、ｔｅｔｙ、ｔｅｔｚ、ｔｌｒｃ、ｔｍｒｂ、ｔｏｌｃ、ｔｓｎｒ、ｖａｎａ、ｖａｎｂ、ｖａｎｃ、ｖａｎｄ、ｖａｎｅ、ｖａｎｇ、ｖａｎｈａ、ｖａｎｈｂ、ｖａｎｈｄ、ｖａｎｒａ、ｖａｎｒｂ、ｖａｎｒｃ、ｖａｎｒｄ、ｖａｎｒｅ、ｖａｎｒｇ、ｖａｎｓａ、ｖａｎｓｂ、ｖａｎｓｃ、ｖａｎｓｄ、ｖａｎｓｅ、ｖａｎｓｇ、ｖａｎｔ、ｖａｎｔｅ、ｖａｎｔｇ、ｖａｎｕｇ、ｖａｎｗｂ、ｖａｎｗｇ、ｖａｎｘａ、ｖａｎｘｂ、ｖａｎｘｄ、ｖａｎｘｙｃ、ｖａｎｘｙｅ、ｖａｎｘｙｇ、ｖａｎｙａ、ｖａｎｙｂ、ｖａｎｙｄ、ｖａｎｙｇ、ｖａｎｚ、ｖａｔａ、ｖａｔｂ、ｖａｔｃ、ｖａｔｄ、ｖａｔｅ、ｖｇａａ、ｖｇａｂ、ｖｇｂａ、ｖｇｂｂ、ｖｐｈ、ｙｋｋｃ、ｙｋｋｄまたはそれらの任意の組合せから選択され得る。抗生物質遺伝子は、今後発見されるまたは未だ記載されていない任意の抗生物質耐性遺伝子であり得る。
【００６２】
一実施形態では、適切な近接接合を捕捉するために使用される目的のクエリー配列は、任意の公知の微生物遺伝子である。例えば、目的のクエリー配列は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、本明細書で列挙される抗生物質耐性遺伝子のいずれか）である。この実施形態に加えて、目的のクエリー配列（例えば、本明細書で提供される抗生物質耐性遺伝子）に対して相補的な配列は、固体基材（例えば、アフィニティービーズまたは磁性ビーズ）に付着されていてもよいし、またはその上に事前にローディングされてもよい。次いで、放出された近接接合は、ハイブリダイゼーションを促進するまたは許容する条件下で、目的のクエリー配列に対して相補的な配列を含む前記固体基材に曝露され得る。望ましい近接接合の捕捉後、目的のクエリー配列（例えば、本明細書で提供される抗生物質耐性遺伝子）との近接接合中に存在する１つまたは複数の配列は、標識され得る。標識は、標識された１つまたは複数の配列に対して相補的な配列を含むマイクロアレイへの、前記標識された１つまたは複数の配列の結合の際に、前記１つまたは複数の配列の検出を可能にするように機能し得る。一部の場合には、マイクロアレイは、当該分野で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の抗生物質耐性遺伝子を含む。１つまたは複数の配列の標識は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５標識されたｄＵＴＰ）を用いたＰＣＲなどを使用して、実施され得る。マイクロアレイ上の配列への、標識された１つまたは複数の配列の結合の検出は、当該分野で公知の任意の方法を使用して検出され得る。
がん遺伝子の検出
【００６３】
一実施形態では、本明細書で提供される方法は、がんに罹患しているまたはがんを有する疑いがある患者から得られた試料中の、標的核酸（即ち、目的の配列）との、１つまたは複数の核酸の関連または存在を検出または決定するために利用される。１つまたは複数の核酸は、試料中の細胞内の標的核酸と共局在され得、それと隣接し得、またはそれと近接し得る。１つまたは複数の核酸は、特定の型のがんと関連する任意の遺伝子または遺伝子変異であり得る。標的核酸は、特定の型のがんと関連する任意の遺伝子または遺伝子変異であり得る。１つもしくは複数の核酸および／または標的核酸は、特定の型のがんと関連するまたは関連し得る、当該分野で公知の任意の癌遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子の変異体であり得る。試料は、固形腫瘍試料（例えば、組織生検）または体液試料であり得る。体液（液体生物学的試料または液体生検とも呼ばれる）は、血液（全血、白血球、末梢血単核球、バフィーコート、血漿および血清を含む）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、呼気、尿、精液、射精液、唾液、髄膜液（ｍｅｎｉｎｇｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、腺液（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、腹水、細胞、細胞性抽出物および脳脊髄液であり得る。一部の場合には、体液は、血液である。一部の場合には、腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍試料である。一部の場合には、腫瘍試料は、新鮮凍結試料である。
【００６４】
本明細書で提供される方法および組成物における使用のためのがんの非限定的な例には、副腎皮質がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳または神経系のがん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイドがん、消化管間質性がん、ホジキン病、腸がん、カポジ肉腫、腎臓がん、大腸がん、喉頭がん、下咽頭がん、喉頭および下咽頭がん、白血病、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、非ＨＣＬリンパ系腫瘍（ヘアリー細胞異型、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、脾びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫（ＳＤＲＰＳＢＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、全身性肥満細胞症、または脾リンパ腫／白血病・分類不能型（ＳＬＬＵ））、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、中咽頭がん、口腔および中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、成人軟部肉腫、皮膚がん、基底細胞皮膚がん、扁平上皮皮膚がん、基底細胞および扁平上皮皮膚がん、黒色腫、胃がん、小腸がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、子宮がん、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症ならびにウィルムス腫瘍が含まれる。
【００６５】
一実施形態では、適切な近接接合を捕捉するために使用される目的のクエリー配列は、任意の公知の癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の変異である。この実施形態に加えて、目的のクエリー配列（例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の変異）に対して相補的な配列は、固体基材（例えば、アフィニティービーズまたは磁性ビーズ）に付着されていてもよいし、またはその上に事前にローディングされてもよい。次いで、放出された近接接合は、ハイブリダイゼーションを促進するまたは許容する条件下で、目的のクエリー配列に対して相補的な配列を含む前記固体基材に曝露され得る。望ましい近接接合の捕捉後、目的のクエリー配列（例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の変異）との近接接合中に存在する１つまたは複数の配列は、標識され得る。標識は、標識された１つまたは複数の配列に対して相補的な配列を含むマイクロアレイへの、前記標識された１つまたは複数の配列の結合の際に、前記１つまたは複数の配列の検出を可能にするように機能し得る。一部の場合には、マイクロアレイは、当該分野で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の癌遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子の変異を含む。１つまたは複数の配列の標識は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５標識されたｄＵＴＰ）を用いたＰＣＲなどを使用して、実施され得る。マイクロアレイ上の配列への、標識された１つまたは複数の配列の結合の検出は、当該分野で公知の任意の方法を使用して検出され得る。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を示す目的で提供されるのであって、いずれの様式でも本開示を限定することを意味しない。本開示の精神内に包含されるその中での変化および他の使用は、特許請求の範囲によって定義されるように、当業者によって認識される。
（実施例１）
混合細胞集団に対する捕捉Ｈｉ−Ｃ方法の使用：原理の証拠
序文
【００６７】
この実施例は、混合細胞集団中の特異的標的配列に対するＨｉ−Ｃ相互作用について富化するための、本明細書で提供される捕捉Ｈｉ−Ｃ方法の使用に関する原理の証拠を実証する。
材料および方法
【００６８】
この方法を試験するために、微生物細胞（即ち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の混合集団に由来する近接接合のライブラリーを、本明細書で提供され、図１に記載される方法を使用して生成した。特に、インタクトなＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞の混合集団を、クロスリンカー（室温で２０分間の１％ホルムアルデヒド）で処理し、１％の最終濃度のグリシンでクエンチした。引き続いて、架橋されたクロマチンを、物理（ビーズ叩打）および化学（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００とその後の１％ＳＤＳ；６５℃まで加熱）の組合せによって混合微生物細胞集団から精製し、その後、架橋された材料をペレット化し、トリス緩衝食塩水で洗浄した。架橋されたクロマチン内のＤＮＡを、制限酵素消化によって断片化し、オーバーハング末端を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用してフィルインし、そのプロセスにおいてビオチン化デオキシアデノシン（deoxyadensosine）を取り込んだ。次いで、断片化された架橋されたクロマチンを、室温で４時間の、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用した近接ライゲーションに供した。架橋を、プロテイナーゼＫで処理し、６５℃まで１時間加熱することによって逆転させた。ＤＮＡを、カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。次いで、内部ビオチンを含む精製されたＤＮＡを、ストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズを使用して捕捉した。ＮＧＳ配列決定アダプターを、Ｎｅｘｔｅｒａ酵素を使用したタグメンテーション（即ち、ＤＮＡのトランスポゾン切断およびタグ化）によって、捕捉ＤＮＡ配列に付加した。ビーズを洗浄し、次いでＰＣＲに供して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合性を有する配列決定ライブラリー（即ち、インプットＨｉ−Ｃライブラリー）を創出した。
【００６９】
インプットＨｉ−ＣライブラリーのＰＣＲ増幅後、過剰なプライマーを、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）ビーズ方法を使用して除去し、蛍光光度法によって定量した。標的配列を含む近接接合の選択およびそれと関連した配列の検出を促進するために、これらの微生物種の各々中の領域にハイブリダイズすると予測される捕捉プローブを生成し（表１）、捕捉を、プローブの各々について独立して実施した。
【００７０】
【表１−１】
2020525046.tif 000003
【表１−２】
2020525046.tif 000004
【００７１】
より具体的には、別々の反応において、５００ｎｇの増幅され精製されたＨｉ−Ｃインプットライブラリーを、高塩緩衝液（６×ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび９０ｍＭクエン酸ナトリウム））および表１の捕捉プローブのうち１つを含む捕捉ハイブリダイゼーション反応に添加した。各捕捉プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合したビオチン分子を保有する１２０〜１５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドであることに留意すべきである。
【００７２】
各反応において、プローブおよびライブラリーを、９５℃まで加熱したサーモサイクラーにおいて、ハイブリダイゼーション溶液中で一緒に変性させた。５分間の変性期間後、プローブを、オリゴヌクレオチド捕捉プローブの予測された融点（Ｔｍ）よりも５℃低い温度で、ライブラリー中の標的配列にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションのこの期間の後、ハイブリダイゼーション反応を、捕捉プローブのＴｍよりも５℃低い温度で維持しつつ、ストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズを、ハイブリダイゼーション反応に添加した。５分間の結合後、ビーズ／ハイブリダイゼーション反応スラリーを、磁性チューブスタンド上に配置し、上清を除去した。ビーズを、加熱した６×ＳＳＣで３回洗浄し、低塩緩衝液（１×ＳＳＣ）で１回洗浄した。ビーズを、ＰＣＲ反応中に再懸濁し、インプットＨｉ−Ｃライブラリーの生成の間に増幅した。次いで、インプットおよび捕捉ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００を使用したハイスループット配列決定に供した。
結果
【００７３】
各場合において、プローブに対して相補的な配列は、同じゲノム中の他の領域と比較して、捕捉ライブラリーにおいて大きな比率を占めた（図２Ａ）。予測したとおり、捕捉された配列に対応するリードにおけるこの富化によって、捕捉された配列と関連するＨｉ−Ｃシグナルの割合における富化が観察された（図２Ｂ〜Ｄを参照のこと）。宿主ゲノムの２つの異なる領域間でのそれらのマッピングにおいて分割されたリードのフラクション（図２Ｂ）および参照ゲノム中の互いに１０ｋｂよりも離れたリード対マッピングのフラクション（図２Ｃ）は増加したが、互いに０距離のリード対マッピングのフラクションは、捕捉後に減少した（図２Ｄ）。これらの測定基準は、記載された捕捉Ｈｉ−Ｃ方法が、特異的配列に対するＨｉ−Ｃ相互作用を富化することが可能であることを示している。
本開示の番号付き実施形態
【００７４】
本開示によって企図される他の主題は、以下の番号付き実施形態に示される。
１．標的核酸を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定するための方法であって、
細胞中の１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で近接接合を生成するステップであって、細胞が、混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；
１つまたは複数の核酸と標的核酸との間での近接接合を捕捉するステップであって、近接接合を、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および
標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした近接接合中の１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、標的核酸を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップ
を含む、方法。
２．１つまたは複数の核酸と標的核酸との間での近接接合の生成が、
ｉ．）細胞を含む試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、架橋剤が、細胞中においてタンパク質および１つまたは複数の核酸を標的核酸と架橋させ、それによって、１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で複合体を生成する、ステップ；
ｉｉ．）細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；
ｉｉｉ．）１つまたは複数の核酸と標的核酸との間での複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；
ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびに
ｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、１つまたは複数の核酸と標的核酸との間で近接接合を生成する、ステップ
を含む、実施形態１に記載の方法。
３．架橋試薬が、ホルムアルデヒドを含む、実施形態２に記載の方法。
４．複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む、実施形態２に記載の方法。
５．架橋クエンチャーがグリシンである、実施形態４に記載の方法。
６．エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、実施形態２から５のいずれかに記載の方法。
７．エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅである、実施形態２から５のいずれかに記載の方法。
８．エンドヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、実施形態２から５のいずれかに記載の方法。
９．放出させるステップが、架橋されたタンパク質を、プロテアーゼ、熱またはそれらの組合せから選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む、実施形態２から８のいずれかに記載の方法。
１０．放出させるステップが、複合体を断片化することを含む、実施形態２から８のいずれかに記載の方法。
１１．標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、５’末端に付着した部分をさらに含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
１２．部分がビオチンである、実施形態１１に記載の方法。
１３．標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、固体基材に結合される、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
１４．固体基材が、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される、実施形態１３に記載の方法。
１５．ビーズが磁性ビーズである、実施形態１４に記載の方法。
１６．遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される近接接合が、ビオチン標識される、実施形態２から１５のいずれかに記載の方法。
１７．ビオチン標識された近接接合が、近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、精製ステップが、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．捕捉するステップが、標的核酸を富化することをさらに含み、富化することが、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーが、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
１９．捕捉するステップが、標的核酸を富化することをさらに含み、富化することが、標的核酸に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーが、ランダム配列を含む、実施形態１から１７のいずれかに記載の方法。
２０．オリゴヌクレオチド、およびプライマーのセット中の各プライマーが、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む、実施形態１８または１９に記載の方法。
２１．分析するステップが、近接接合中の１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．分析するステップが、近接接合中に存在する１つまたは複数の核酸を標識することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
２３．標識された１つまたは複数の核酸が、マイクロアレイにハイブリダイズされる、実施形態２２に記載の方法。
２４．標的核酸が、抗生物質耐性遺伝子である、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
２５．混合細胞集団を含む試料が、個体における感染の部位に由来する、実施形態２４に記載の方法。
２６．混合細胞集団を含む試料が、農業的試料に由来する、実施形態２４に記載の方法。
２７．農業的試料が、ウシルーメンまたは厩肥である、実施形態２６に記載の方法。
２８．標的核酸が、プラスミド、ウイルスまたはゲノムＤＮＡ中に存在する、実施形態２４から２７のいずれかに記載の方法。
２９．１つまたは複数の核酸の各々が、プラスミド、ウイルスまたはゲノムＤＮＡ中に存在する、実施形態２４から２８のいずれかに記載の方法。
３０．標的核酸が、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１から２３のいずれかに記載の方法。
３１．混合集団を含む試料が、腫瘍試料である、実施形態３０に記載の方法。
３２．抗生物質耐性遺伝子と関連する１つまたは複数の核酸を検出するための方法であって、
細胞中の１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で近接接合を生成するステップであって、細胞が、混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；
１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間での近接接合を捕捉するステップであって、近接接合を、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および
抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした近接接合中の１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、抗生物質耐性遺伝子を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップ
を含む、方法。
３３．１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間での近接接合の生成が、
ｉ．）細胞を含む試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、架橋剤が、細胞中においてタンパク質および１つまたは複数の核酸を抗生物質耐性遺伝子と架橋させ、それによって、１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で複合体を生成する、ステップ；
ｉｉ．）細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；
ｉｉｉ．）１つまたは複数の核酸と癌遺伝子との間での複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；
ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびに
ｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、１つまたは複数の核酸と抗生物質耐性遺伝子との間で近接接合を生成する、ステップ
を含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．架橋試薬が、ホルムアルデヒドを含む、実施形態３３に記載の方法。
３５．複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む、実施形態３３に記載の方法。
３６．架橋クエンチャーがグリシンである、実施形態３５に記載の方法。
３７．エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、実施形態３３から３６のいずれかに記載の方法。
３８．エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅである、実施形態３３から３６のいずれかに記載の方法。
３９．エンドヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、実施形態３３から３６のいずれかに記載の方法。
４０．放出させるステップが、架橋されたタンパク質を、プロテアーゼ、熱またはそれらの組合せから選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む、実施形態３３から３９のいずれかに記載の方法。
４１．放出させるステップが、複合体を断片化することを含む、実施形態３３から３９のいずれかに記載の方法。
４２．抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、５’末端に付着した部分をさらに含む、実施形態３２から４１のいずれかに記載の方法。
４３．部分がビオチンである、実施形態４２に記載の方法。
４４．抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、固体基材に結合される、実施形態３２から４３に記載の方法。
４５．固体基材が、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される、実施形態４４に記載の方法。
４６．ビーズが磁性ビーズである、実施形態４５に記載の方法。
４７．遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される近接接合が、ビオチン標識される、実施形態３３から４６のいずれかに記載の方法。
４８．ビオチン標識された近接接合が、近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、精製ステップが、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む、実施形態４７に記載の方法。
４９．捕捉するステップが、抗生物質耐性遺伝子を富化することをさらに含み、富化することが、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーが、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む、実施形態３２から４８のいずれかに記載の方法。
５０．捕捉するステップが、抗生物質耐性遺伝子を富化することをさらに含み、富化することが、抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーが、ランダム配列を含む、実施形態３２から４８のいずれかに記載の方法。
５１．オリゴヌクレオチド、およびプライマーのセット中の各プライマーが、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む、実施形態４９または５０に記載の方法。
５２．分析するステップが、近接接合中の１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む、実施形態５１に記載の方法。
５３．分析するステップが、近接接合中に存在する１つまたは複数の核酸を標識することを含む、実施形態３２から５２のいずれかに記載の方法。
５４．標識された１つまたは複数の核酸が、マイクロアレイにハイブリダイズされる、実施形態５３に記載の方法。
５５．抗生物質耐性遺伝子が、プラスミドまたは細胞のゲノム中に存在する、実施形態３２から５４のいずれかに記載の方法。
５６．１つまたは複数の核酸の各々が、プラスミドまたは細胞のゲノム中に存在する、実施形態３２から５５のいずれかに記載の方法。
５７．試料が、個体における感染の部位に由来する、実施形態３２から５６のいずれかに記載の方法。
５８．試料が、農業的試料に由来する、実施形態３２から５６のいずれかに記載の方法。
５９．農業的試料が、ウシルーメンまたは厩肥である、実施形態５８に記載の方法。
６０．癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子と関連する１つまたは複数の核酸を検出するための方法であって、
細胞中の１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で近接接合を生成するステップであって、細胞が、個体に由来する混合細胞集団を含む試料中に存在する、ステップ；
１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間での近接接合を捕捉するステップであって、近接接合を、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、ステップ；および
癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした近接接合中の１つまたは複数の核酸を分析するステップであって、それによって、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含む細胞中の１つまたは複数の核酸の存在を決定する、ステップ
を含む、方法。
６１．１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間での近接接合の生成が、
ｉ．）試料を、架橋剤と共にインキュベートするステップであって、架橋剤が、細胞中においてタンパク質および１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子とを架橋させ、それによって、１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で複合体を生成する、ステップ；
ｉｉ．）細胞を、１つまたは複数のアニオン性界面活性剤および１つまたは複数の非イオン性界面活性剤の組合せを含む溶解緩衝液中で溶解させるステップ；
ｉｉｉ．）１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間での複合体内の核酸を消化するステップであって、それによって、遊離核酸末端を生成する、ステップ；
ｉｖ．）消化された核酸をライゲーションするステップ；ならびに
ｖ．）架橋されたタンパク質から、１つまたは複数の近接接合を放出させるステップであって、それによって、１つまたは複数の核酸と癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子との間で近接接合を生成する、ステップ
を含む、実施形態６０に記載の方法。
６２．架橋試薬が、ホルムアルデヒドを含む、実施形態６１に記載の方法。
６３．複合体を架橋クエンチャーと共にインキュベートするステップをさらに含む、実施形態６１に記載の方法。
６４．架橋クエンチャーがグリシンである、実施形態６３に記載の方法。
６５．エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、実施形態６１から６４のいずれかに記載の方法。
６６．エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅである、実施形態６１から６４のいずれかに記載の方法。
６７．エンドヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、実施形態６１から６４のいずれかに記載の方法。
６８．放出させるステップが、架橋されたタンパク質を、プロテアーゼまたは熱から選択される作用因子で処理することによって、架橋を逆転させることを含む、実施形態６１から６７のいずれかに記載の方法。
６９．放出させるステップが、複合体を断片化することを含む、実施形態６１から６７のいずれかに記載の方法。
７０．抗生物質耐性遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、５’末端に付着した部分をさらに含む、実施形態６０から６９のいずれかに記載の方法。
７１．部分がビオチンである、実施形態７０に記載の方法。
７２．癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、固体基材に結合される、実施形態６０から７１に記載の方法。
７３．固体基材が、ビーズ、マルチウェルプレート中のウェル、またはスライドの表面から選択される、実施形態７２に記載の方法。
７４．ビーズが磁性ビーズである、実施形態７３に記載の方法。
７５．遊離核酸末端を、ステップｖ．）の前にビオチンで標識するステップをさらに含み、それによって、ステップｖ．）後に生成される近接接合が、ビオチン標識される、実施形態６１から７４のいずれかに記載の方法。
７６．ビオチン標識された近接接合が、近接接合を捕捉するステップの前に、精製ステップに供され、精製ステップが、ビオチンを、固体基材に付着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合させることを含む、実施形態７５に記載の方法。
７７．捕捉するステップが、癌遺伝子を富化することをさらに含み、富化することが、癌遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加することによって、ＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーが、１つまたは複数のさらなる標的核酸に対して相補的な配列を含む、実施形態６０から７６のいずれかに記載の方法。
７８．捕捉するステップが、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を富化することをさらに含み、富化することが、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした近接接合にプライマーのセットおよびＰＣＲ試薬を添加することによってＰＣＲを実施することを含み、プライマーのセット中の各プライマーが、ランダム配列を含む、実施形態６０から７６のいずれかに記載の方法。
７９．オリゴヌクレオチド、およびプライマーのセット中の各プライマーが、次世代配列決定（ＮＧＳ）システムと適合性を有するアダプター配列をさらに含む、実施形態７７または７８に記載の方法。
８０．分析するステップが、近接接合中の１つまたは複数の核酸を配列決定することを含む、実施形態７９に記載の方法。
８１．分析するステップが、近接接合中に存在する１つまたは複数の核酸を標識することを含む、実施形態６０から８０のいずれかに記載の方法。
８２．標識された１つまたは複数の核酸が、マイクロアレイにハイブリダイズされる、実施形態８１に記載の方法。
８３．混合集団を含む試料が、腫瘍試料である、実施形態６０から８２のいずれかに記載の方法。
【００７５】
上記種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が本明細書で参照によって組み込まれる。実施形態の態様は、なおさらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願および刊行物のコンセプトを使用するために、必要に応じて改変され得る。
【００７６】
これらおよび他の変化は、上に詳述した説明に照らして、実施形態に対してなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈すべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2020525046.tif 000005
【図２】
2020525046.tif 000006
【配列表】
2020525046000001.app
【国際調査報告】
2020525046.tif 000007
2020525046.tif 000008