(57)【要約】本発明は、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体及びこれを含む薬学的組成物、及び上記タンパク質結合体を製造する方法に関する。上記タンパク質結合体は、免疫グロブリンFcの結合部位の連結と脂肪酸分子の物質内結合を通じて、生理活性ポリペプチドの血中半減期を延長させ、優れた生体内力価を有し、免疫反応誘発の危険がないタンパク質結合体を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体。
【請求項２】
上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチドは、一つ以上の脂肪酸分子が生理活性ポリペプチドに結合されたものであり、上記改質に使用された脂肪酸分子は上記免疫グロブリンFc領域に連結されていないことを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質結合体。
【請求項３】
上記生理活性ポリペプチドを改質した脂肪酸分子は、脂肪酸または脂肪酸誘導体である、請求項1又は請求項2に記載のタンパク質結合体。
【請求項４】
上記非ペプチド性重合体リンカーが両末端の反応基を通じて脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合で連結された、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項５】
上記免疫グロブリンFc領域が、非糖鎖化されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項６】
上記免疫グロブリンFc領域は、CH1、CH2、CH3及びCH4ドメインからなる群から選択される1個〜4個のドメインからなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項７】
上記免疫グロブリンFc領域が、ヒンジ(hinge)領域をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項８】
上記免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、これらの組み合わせ(combination)及びこれらのハイブリッド(hybrid)のFc領域からなる群から選択される免疫グロブリンFc断片である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項９】
上記免疫グロブリンFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、これらの組み合わせ及びこれらのハイブリッドのFc領域からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１０】
上記免疫グロブリンFc断片が、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１１】
上記免疫グロブリンFc断片が、IgG4 Fc断片である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１２】
上記免疫グロブリンFc断片が、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc断片である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１３】
上記非ペプチド性重合体リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１４】
上記非ペプチド性重合体リンカーは、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはポリエチレングリコールである、請求項1〜13のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１５】
上記非ペプチド性重合体リンカーの両末端が、それぞれ免疫グロブリンFc領域のN末端、リジン残基、またはアルギニン残基と生理活性ポリペプチドのN末端、C末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基、または各末端または残基の遊離反応基に結合されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１６】
上記生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１７】
上記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類(GLP-1など)、エキセンディン類(Exendin4など)、オキシントモジュリン、G-プロテイン関連受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、タンパク質A、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-1アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質-E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIa、VIII、IX、及びXIII、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質C、C-反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、 アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類及びそれぞれの誘導体からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１８】
上記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン-アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、血液因子、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン様ペプチド類、エキセンディン類及びそれぞれの誘導体またはアナログからなる群から選択される、請求項1〜17のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項１９】
上記生理活性ポリペプチドはインスリンまたはそのアナログであり、上記生理活性ポリペプチドを改質した脂肪酸分子は脂肪酸または脂肪酸誘導体であり、上記非ペプチド重合体リンカーはポリエチレングリコールである、請求項1〜18のいずれか一項に記載のタンパク質結合体。
【請求項２０】
上記インスリンアナログは、インスリンB鎖の8番アミノ酸、インスリンB鎖の23番アミノ酸、インスリンB鎖の24番アミノ酸、インスリンB鎖の25番アミノ酸、インスリンA鎖の1番アミノ酸、インスリンA鎖の2番アミノ酸及びインスリンA鎖の19番アミノ酸からなる群から選択された一つのアミノ酸がアラニンに置換されたり、A鎖の14番アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギンに置換された、請求項18又は請求項19に記載のタンパク質結合体。
【請求項２１】
(a) 1つ以上の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び1つ以上の免疫グロブリンFc領域を両末端に反応基を有する1つ以上の非ペプチド性重合体リンカーを通じて共有結合で連結してタンパク質結合体を製造する段階;及び 
(b)上記(a)段階を通じて製造した非ペプチド性重合体リンカーを通じて共有結合で連結された、脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域を必須に含み、上記非ペプチド性重合体リンカーが免疫グロブリンFc断片に結合したタンパク質結合体を分離する段階を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載のタンパク質結合体の製造方法。
【請求項２２】
上記非ペプチド性重合体または脂肪酸分子の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、請求項21に記載の製造方法。
【請求項２３】
上記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基である、請求項22に記載の製造方法。
【請求項２４】
上記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタン酸、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタン酸、スクシンイミジルプロピオン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドまたはスクシンイミジルカルボネートである、請求項22に記載の製造方法。
【請求項２５】
上記非ペプチド性重合体リンカーは、各末端にそれぞれアルデヒドグループ、マレイミド反応基またはスクシンイミド誘導体を有する、請求項21〜24のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２６】
上記脂肪酸分子は、各末端にそれぞれアルデヒドグループ、マレイミド反応基またはスクシンイミド誘導体を有する、請求項21〜25のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２７】
上記(a)段階は 
(a1)非ペプチド性重合体リンカーの一方の末端に免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結して連結体を製造する段階;及び
(a2)上記(a1)段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域中の他の一つと共有結合で連結する段階を含む、請求項21〜26のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２８】
上記(a1)段階で脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体リンカーの反応モル比は1:1〜1:30であり、免疫グロブリンFc断片と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:1〜1:20である、請求項27に記載の製造方法。
【請求項２９】
上記(a1)段階は、pH 4.0〜9.0で行われることを特徴とする、請求項28に記載の製造方法。
【請求項３０】
上記(a1)段階は、4.0〜25℃で行われることを特徴とする、請求項27に記載の製造方法。
【請求項３１】
上記(a1)段階で免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlであることを特徴とする、請求項27〜30のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項３２】
上記(a2)段階において連結体:免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.1〜1:20であることを特徴とする、請求項27に記載の製造方法。
【請求項３３】
上記(a2)段階は、pH 4.0〜9.0で行われることを特徴とする、請求項27又は請求項32に記載の製造方法。
【請求項３４】
上記(a2)段階は、4.0〜25℃で行われることを特徴とする、請求項27又は請求項32に記載の製造方法。
【請求項３５】
上記(a2)段階において免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlであることを特徴とする、請求項27〜34のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項３６】
上記(a1)段階及び(a2)段階が還元剤の存在の下で行われることを特徴とする、請求項27〜35のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項３７】
上記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩及びピリジンホウ酸塩からなる群から選択される、請求項36に記載の製造方法。
【請求項３８】
上記(a2)段階において連結体を分離するために、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーから選択される精製方法を単独または複数で行う、請求項27に記載の製造方法。
【請求項３９】
上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基がクオータナリーアンモニウム(Q)、クオータナリーアミノエチル(QAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、ジメチルアミノメチル(DMAE)、またはトリメチルアミノエチル(TMAE)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項38に記載の製造方法。
【請求項４０】
上記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基がメチルスルホネート(S)、スルホプロピル(SP)、カルボキシメチル(CM)、ポリアスパラギン酸(Poly aspartic acid)、スルホエチル(SE)、スルホプロピル(SP)、ホスフェート(P)またはスルホネート(S)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項37に記載の製造方法。
【請求項４１】
上記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の作用基がフェニル(phenyl)、オクチル(octyl)、(イソ)プロピル(iso)propyl)、ブチル(butyl)及びエチル(ethyl)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項38に記載の製造方法。
【請求項４２】
上記親和性クロマトグラフィーの樹脂の作用基が、プロテインA(proteinA)、ヘパリン(heparin)、ブルー(blue)、ベンザミジン(benzamidine)、金属イオン(コバルト、ニッケル、銅)及び脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び生理活性ポリペプチドと結合したタンパク質結合体の構成成分の一部あるいは全体に対する抗体からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項38に記載の製造方法。
【請求項４３】
上記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂がスーパーデックス(superdex)、セファクリル(sephacryl)、スーパーロース(superose)及びセファデックス(sephadex)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項38に記載の製造方法。
【請求項４４】
上記(b)段階のタンパク質結合体を分離する段階は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーから選択される精製方法を単独または複数で行う、請求項21に記載の製造方法。
【請求項４５】
上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基が、クオータナリーアンモニウム(Q)、クオータナリーアミノエチル(QAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、ジメチルアミノメチル(DMAE)、またはトリメチルアミノエチル(TMAE)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項44に記載の製造方法。
【請求項４６】
上記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基が、メチルスルホネート(S)、スルホプロピル(SP)、カルボキシメチル(CM)、ポリアスパラギン酸(Poly aspartic acid)、スルホエチル(SE)、スルホプロピル(SP)、ホスフェート(P)またはスルホネート(S)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項44に記載の製造方法。
【請求項４７】
上記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の作用基が、フェニル(phenyl)、オクチル(octyl)、(イソ)プロピル(iso)propyl)、ブチル(butyl)及びエチル(ethyl)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項44に記載の製造方法。
【請求項４８】
上記親和性クロマトグラフィーの樹脂の作用基が、プロテインA(proteinA)、ヘパリン(heparin)、ブルー(blue)、ベンザミジン(benzamidine)、金属イオン(コバルト、ニッケル、銅)及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと結合したタンパク質結合体の構成成分の一部あるいは全体に対する抗体からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項44に記載の製造方法。
【請求項４９】
上記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂の作用基が、スーパーデックス(superdex)、セファクリル(sephacryl)、スーパーロース(superose)及びセファデックス(sephadex)からなる群から選択されるもののうちの一つである、請求項44に記載の製造方法。
【請求項５０】
上記(b)段階は、タンパク質結合体を構成する脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンFc領域が免疫グロブリンFc領域のN末端を通じて結合したタンパク質結合体を分離することを特徴とする、請求項21に記載の製造方法。
【請求項５１】
(a')非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結して連結体を製造する段階であって、脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比は1:1〜1:30であり、免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体リンカーの反応モル比が1:1〜1:20であり、還元剤が1〜100mMの濃度で含まれ、pH 4.0〜9.0、反応温度4.0〜25℃で行われ、免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlである段階; 
(b')上記(a')段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の非ペプチド性重合体リンカーの他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域中、他の一つと共有結合で連結する段階であって、連結体と免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドリンカーの反応モル比が1:0.1〜1:20であり、還元剤が1〜100mMの濃度で含まれ、pH 4.0〜9.0、反応温度4.0〜25℃で行われ、免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlである段階;及び 
(c')上記(b')段階を通じて製造した共有結合で連結された脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体リンカー及び免疫グロブリンFc領域を必須的に含み、上記脂肪酸分子が免疫グロブリンFcと結合したタンパク質結合体を分離する段階を含む、 請求項1〜20のいずれか一項に記載のタンパク質結合体の製造方法。
【請求項５２】
請求項1〜20のいずれか一項に記載のタンパク質結合体を有効成分として含む生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性増加用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結されたタンパク質結合体、これを含む薬学的組成物、及び上記タンパク質結合体を製造する方法に関する。上記タンパク質結合体は免疫グロブリンFcの結合部位の連結と脂肪酸分子の物質内結合を通じて、生理活性ポリペプチドの血中半減期を延長させ、優れた生体内力価を有し、免疫反応誘発の危険がないタンパク質結合体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、一般に、安定性が低いため容易に変性し、血液内のタンパク質加水分解酵素により分解され、腎臓及び肝臓を通じて簡単に除去される。従って、薬理成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、大部分が注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことは、患者に多大な苦痛をもたらすようになる。このような問題点を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長い間高く持続させ、薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなタンパク質薬物の持続性製剤は、タンパク質薬物の安定性を高めるとともに、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【０００３】
タンパク質を安定化させ、タンパク質加水分解酵素との接触及び腎クリアランスを抑制するための方法として、従来は、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol:以下、「PEG」と略称)のように溶解度の高い高分子をタンパク質薬物の表面に化学的に付加させる方法が用いられてきた。しかし、PEGを結合させる場合にタンパク質の安定性は向上しうるものの、生理活性タンパク質の力価が著しく低下し、PEGの分子量が増加するほどタンパク質との反応性が低くなり、収率が減少する問題がある。
【０００４】
一方、免疫グロブリン(immunoglobulin、Ig)は、大きく抗原結合部位を有するFab領域と補体結合領域を有するFc領域に分けられるが、変形された免疫グロブリンのFc領域を利用した遺伝子組換え方式の融合タンパク質の製造方法は、米国登録特許第6,277,375号、第6,410,008号、第6,444,792号（特許文献1〜3）などに開示されている。しかし、このような遺伝子組換え方法により生産されたFc融合タンパク質は、免疫グロブリンFc領域の特定部位、即ち、アミノ末端またはカルボキシ末端のみでタンパク質融合が可能であり、同種二量体の形態のみで発現し、単量体の形態では生産が困難であり、糖鎖化タンパク質間または非糖鎖化タンパク質間の融合のみが可能であるため、糖鎖化タンパク質と非糖鎖化タンパク質の融合は不可能な短所がある。また、融合により新たに生じたアミノ酸配列により免疫反応が誘発されるだけでなく、リンカー部位に対するタンパク質加水分解酵素の敏感性が増加することがある。
【０００５】
そこで、本発明者らは早くからリンカーを使用した結合体の製造が結合部位及び結合される両タンパク質の方向性を選択して調節することができ、単量体、二量体または多量体の製造が可能であり、同種または異種形態をいずれも製造可能な長所があることを確認した。そこで、目的タンパク質を含まない天然型免疫グロブリンFc領域のみを大腸菌から高い収率で大量に生産して持続型剤形に使用し、このような組み換え方法により生産された大腸菌由来の免疫グロブリンFc領域を使用し、交差結合剤を媒介として目的タンパク質との結合体を生産する方法を既に出願した大韓民国公開番号第10-2005-0047032号（特許文献4）に言及したことがある。また、本発明者らは、上記特許において、従来は同時に達成することが困難なものと考えられていた活性減少の最小化と安定性の増加を同時に実現できる持続性タンパク質薬物製剤であって、糖鎖があるか、またはない遺伝子組換えまたは天然型由来の免疫グロブリンFc領域、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドを相互共有結合により連結させて製造したタンパク質結合体が生理活性タンパク質の血中半減期を画期的に増加させ、公知となったタンパク質薬物に比べて高い力価を維持することを確認している。
【０００６】
しかし、生理活性ポリペプチドの短所を改善するためのタンパク質結合体薬物の場合、生体内におけるより長い活性と優れた力価の発揮のための新たな改善は絶えず求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国登録特許第6,277,375号公報
【特許文献２】米国登録特許第6,410,008号公報
【特許文献３】米国登録特許第6,444,792号公報
【特許文献４】大韓民国特許公開番号第10-2005-0047032号
【特許文献５】国際特許公開第97/34631号
【特許文献６】国際特許公開第96/32478号
【特許文献７】大韓民国登録特許第10-1058290号
【特許文献８】大韓民国特許公開番号第10-2014-0106452号
【特許文献９】国際特許公開第2014/133324号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】H.Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979
【非特許文献２】Chou他、PNAS通巻112、第8号、2401〜2406ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一つの目的は、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、上記タンパク質結合体を製造する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、上記タンパク質結合体を有効成分として含む、生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性が増加した、薬剤学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明を実現するための一つの様態は、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体を提供する。
【００１３】
一つの具体例として、上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチドは、一つ以上の脂肪酸分子が生理活性ポリペプチドに結合したものであり、上記改質に使用された脂肪酸分子は免疫グロブリンFc領域に連結されていないことを特徴とする。また、上記改質に使用された脂肪酸分子は、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンFc領域を連結させるリンカーではないことを特徴とする。
【００１４】
他の具体例として、上記生理活性ポリペプチドを改質した脂肪酸分子は、脂肪酸または脂肪酸誘導体であることを特徴とする。
【００１５】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記非ペプチド性重合体リンカーが両末端の反応基を通じて脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合で連結されたことを特徴とする。
【００１６】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されることを特徴とするタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００１７】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc領域はCH1、CH2、CH3及びCH4ドメインからなる群から選択される1個〜4個のドメインからなるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００１８】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc領域がヒンジ（hinge）領域をさらに含むタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００１９】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc領域がIgG、IgA、IgD、IgE、IgM、これらの組み合わせ(combination)及びこれらのハイブリッド（hybrid）のFc領域からなる群から選択される免疫グロブリンFc断片である、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２０】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc領域がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、これらの組み合わせ及びこれらのハイブリッドのFc領域からなる群から選択される、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２１】
先の具体例のいずれか一つによる他の具体例として、上記免疫グロブリンFc断片が同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２２】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc断片がIgG4 Fc断片であるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２３】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記免疫グロブリンFc断片がヒト非糖鎖化IgG4 Fc断片であるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２４】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記非ペプチド性重合体リンカーはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２５】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記非ペプチド性重合体リンカーは脂肪酸、脂肪酸誘導体またはポリエチレングリコールであるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２６】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記結合体を構成する一部(moiety)である上記非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものであるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２７】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記アルデヒド基はプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基であってもよい。
【００２８】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタン酸、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタン酸、スクシンイミジルプロピオン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドまたはスクシンイミジルカルボネートであるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００２９】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記非ペプチド性重合体リンカーは各末端にそれぞれアルデヒドグループ、マレイミド反応基またはスクシンイミド誘導体を有するものである、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３０】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記脂肪酸分子は各末端にそれぞれアルデヒドグループ、マレイミド反応基またはスクシンイミド誘導体を有するものである、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３１】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記非ペプチド性重合体リンカーの両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域のN末端、リジン残基、またはアルギニン残基と生理活性ポリペプチドのN末端、C末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基、または各末端または残基の遊離反応基に結合しているものである、タンパク質結合体であることを特徴とする。上記遊離反応基は非ペプチド性重合体リンカー以外の他の反応基と結合していない反応基であり、非ペプチド性重合体リンカーと結合する前に、遊離している反応基だけでなく、各末端または残基に修飾(modification)を通じて上記非ペプチド性重合体リンカーと結合し得る反応基を含むが、これに制限されない。
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されるタンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３２】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類(GLP-1など)、エキセンディン類(Exendin4など)、オキシントモジュリン、G-プロテイン関連受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、タンパク質A、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、 腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-1アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質-E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIa、VIII、IX、及びXIII、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質C、C-反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類及びそれぞれの誘導体からなる群から選択されるものである、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３３】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン-アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、血液因子、インスリン、オキシトモジュリン、グルカゴン様ペプチド類、エキセンディン類及びそれぞれの誘導体またはアナログからなる群から選択されるものである、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３４】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記生理活性ポリペプチドは、インスリンまたはそのアナログであり、上記生理活性ポリペプチドを改質した脂肪酸分子は脂肪酸または脂肪酸誘導体であり、上記非ペプチド重合体リンカーはポリエチレングリコールである、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３５】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記インスリンアナログは、インスリンB鎖の8番アミノ酸、インスリンB鎖の23番アミノ酸、インスリンB鎖の24番アミノ酸、インスリンB鎖の25番アミノ酸、インスリンA鎖の1番アミノ酸、インスリンA鎖の2番アミノ酸及びインスリンA鎖の19番アミノ酸からなる群から選択された一つのアミノ酸がアラニンに置換されたり、A鎖の14番アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギンに置換されたものである、タンパク質結合体であることを特徴とする。
【００３６】
本発明を実現するための他の様態は、上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体を製造する方法を提供することである。
【００３７】
本発明を実現するためのより具体的な一つの様態は、(a)一つ以上の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び一つ以上の免疫グロブリンFc領域を両末端に反応基を有する一つ以上の非ペプチド性重合体リンカーを通じて共有結合で連結してタンパク質結合体を製造する段階;及び(b)上記(a)段階を通じて製造した非ペプチド性重合体リンカーを通じて共有結合で連結された、脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域を必須に含み、上記非ペプチド性重合体リンカーが免疫グロブリンFc断片に結合したタンパク質結合体を分離する段階を含む、上記タンパク質結合体の製造方法であることを特徴とする。
【００３８】
一つの具体例として、上記(a)段階は、(a1)非ペプチド性重合体リンカーの一方の末端に免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結して連結体を製造する段階;及び(a2)上記(a1)段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域中の他の一つと共有結合で連結する段階を含む、製造方法であることを特徴とする。
【００３９】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a1)段階で脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体リンカーの反応モル比は1:1〜1:30であり、免疫グロブリンFc断片と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:1〜1:20であることを特徴とする。
【００４０】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a1)段階は、pH 4.0〜9.0で行われることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４１】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a1)段階は、4.0〜25℃で行われることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４２】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a1)段階において免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlであることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４３】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a2)段階において連結体:免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.1〜1:20であることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４４】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a2)段階は、pH 4.0〜9.0で行われることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４５】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a2)段階は、4.0〜25℃で行われることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４６】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a2)段階において免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlであることを特徴とする、製造方法であることを特徴とする。
【００４７】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a1)段階及び(a2)段階が還元剤の存在の下で行われることを特徴とするものである、製造方法であることを特徴とする。
【００４８】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記還元剤がシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩及びピリジンホウ酸塩からなる群から選択される、製造方法であることを特徴とする。
【００４９】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(a2)段階において連結体を分離するために、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーから選択される精製方法を単独または複数で行うものである、製造方法であることを特徴とする。
【００５０】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基がクオータナリーアンモニウム(Q)、クオータナリーアミノエチル(QAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、ジメチルアミノメチル(DMAE)、またはトリメチルアミノエチル(TMAE)からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５１】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基がメチルスルホネート(S)、スルホプロピル(SP)、カルボキシメチル(CM)、ポリアスパラギン酸(Poly aspartic acid)、スルホエチル(SE)、スルホプロピル(SP)、ホスフェート(P)またはスルホネート(S)からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５２】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の作用基がフェニル（phenyl）、オクチル（octyl）、（イソ）プロピル（（iso）propyl）、ブチル（butyl）及びエチル（ethyl ）からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５３】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記親和性クロマトグラフィーの樹脂の作用基がプロテインA(proteinA)、ヘパリン(heparin)、ブルー(blue)、ベンザミジン(benzamidine)、金属イオン(コバルト、ニッケル、銅)及び脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び生理活性ポリペプチドと結合したタンパク質結合体の構成成分の一部あるいは全体に対する抗体からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５４】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂がスーパーデックス（superdex）、セファクリル（sephacryl）、スーパーロース（superose）及びセファデックス（sephadex）からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５５】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(b)段階のタンパク質結合体を分離する段階は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーから選択される精製方法を単独または複数で行う、製造方法であることを特徴とする。
【００５６】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基がクオータナリーアンモニウム(Q)、クオータナリーアミノエチル(QAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、ジメチルアミノメチル(DMAE)、またはトリメチルアミノエチル(TMAE)からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５７】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂の作用基がメチルスルホネート(S)、スルホプロピル(SP)、カルボキシメチル(CM)、ポリアスパラギン酸(Poly aspartic acid)、スルホエチル(SE)、スルホプロピル(SP)、ホスフェート(P)またはスルホネート(S)からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５８】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の作用基がフェニル（phenyl）、オクチル（octyl）、（イソ）プロピル（（iso）propyl）、ブチル（butyl）及びエチル（ethyl ）からなる群から選択されるもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００５９】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記親和性クロマトグラフィーの樹脂の作用基がプロテインA(proteinA)、ヘパリン(heparin)、ブルー(blue)、ベンザミジン(benzamidine)、金属イオン(コバルト、ニッケル、銅)及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと結合したタンパク質結合体の構成成分の一部あるいは全体に対する抗体からなる群から選択されたもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００６０】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂の作用基が、スーパーデックス（superdex）、セファクリル（sephacryl）、スーパーロース（superose）及びセファデックス（sephadex）からなる群から選択されているもののうちの一つである、製造方法であることを特徴とする。
【００６１】
先の具体例のいずれか一つによる具体例として、上記(b)段階は、タンパク質結合体を構成する脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンFc領域が免疫グロブリンFc領域のN末端を通じて結合したタンパク質結合体を分離することを特徴とするものである、製造方法であることを特徴とする。
【００６２】
本発明を具現するための他の形態は、(a')非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結して連結体を製造する段階であり、脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比は1:1〜1:30であり、免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体リンカーの反応モル比が1:1〜1:20であり、還元剤が1〜100mMの濃度で含まれ、pH 4.0〜9.0、反応温度4.0〜25℃で行われ、免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlである段階:(b')上記(a')段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の非ペプチド性重合体リンカーの他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域中、他の一つと共有結合で連結する段階であり、連結体と免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドリンカーの反応モル比が1:0.1〜1:20であり、還元剤が1〜100mMの濃度で含まれ、pH 4.0〜9.0、反応温度4.0〜25℃で行われ、免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlである段階; 及び(c')上記(b')段階を通じて製造した共有結合で連結された脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体リンカー及び免疫グロブリンFc領域を必須に含み、上記非ペプチド性重合体リンカーが免疫グロブリンFcと結合したタンパク質結合体を分離する段階を含む、上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体の製造方法を提供する。
【００６３】
本発明を具現するための他の様態は、上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体を含む組成物である。
【００６４】
一つの具体例として、上記組成物は、生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性増加用薬学的組成物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００６５】
本発明は、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド、即ち、一つ以上の脂肪酸分子が結合した生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域がリンカーの非ペプチド性重合体で連結された、新たな形態のタンパク質結合体及びその製造方法を提供する。本発明のタンパク質結合体は、既存のタンパク質結合体に比べて画期的に優れた生体内持続性及び力価が増加した特徴を有する。そこで、本発明により製造されたタンパク質結合体は、多様な生理活性ポリペプチド薬物の持続型製剤の開発に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１ａ】製造された(PBA-F)-脂肪酸-天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体をSDS-PAGEを通じて確認した結果を示した図面である。
【図１ｂ】製造された(PBA-F)-脂肪酸-インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体をSDS-PAGEを通じて確認した結果を示した図面である。
【図２ａ】製造された(PBA-F)-脂肪酸-天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体の純度をRP-HPLC、IE-HPLC及びSE-HPLC分析を通じて確認した結果を示した図面である。X軸は分(min)を、Y軸はmAUを表す。
【図２ｂ】製造された(PBA-F)-脂肪酸-インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体の純度をRP-HPLC、IE-HPLC及びSE-HPLC分析を通じて確認した結果を示した図面である。X軸は分(min)を、Y軸はmAUを表す。
【図３】製造された持続型インスリン及びアナログ結合体間の糖尿病モデルマウスで血糖降下効力を比較したグラフである。
【図４】Ins-PBA-Fの模式図である。
【図５】脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド(インスリン)と免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーのポリエチレングリコールと連結された、本発明のタンパク質結合体の一模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の一様態は、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体を提供する。具体的には、上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチドは、一つ以上の脂肪酸分子が生理活性ポリペプチドに結合したもので、上記改質に使用された脂肪酸分子は、免疫グロブリンFc領域に連結されていないことを特徴とする。上記改質に使用された脂肪酸分子はリンカーとして作用しないため、リンカーではなく、免疫グロブリンFc領域に連結されないことを特徴とする。
【００６８】
本発明者らは、従来に実質的に製造及びその効果を確認できなかった新たな構造である、脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを通じて連結された、タンパク質結合体を製造し、このような新規なタンパク質結合体の構造が既存のタンパク質医薬品に使われていた、タンパク質結合体に比べて、持続性及び力価が優れていることを確認した (表1及び図3)。このような確認を通じて、本発明者らは新たなタンパク質結合体の構造を開発し、本発明の一様態として提供するものである。
【００６９】
上記脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチドは、一つ以上の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【００７０】
本発明における用語、「タンパク質結合体（complex）」または「結合体」とは、脂肪酸分子で改質された、1つ以上の生理活性ポリペプチド、1つ以上の非ペプチド性重合体リンカー及び1つ以上の免疫グロブリンFc領域をそれぞれ一部(moiety)で含み、これら構成要素が共有結合で相互に連結されていることを意味する。上記非ペプチド性重合体は、結合体を構成するために結合体の構成前に両末端に反応基を有するものであってもよいが、これに制限されない。また、上記「結合体」と区別するために、生理活性ポリペプチド、脂肪酸分子、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンFc領域から選択された2種類の物質分子のみが共有結合で連結された構造物は「連結体(conjugate) 」と表示することができる。
【００７１】
本発明のタンパク質結合体は、非ペプチド性重合体リンカーが、両末端反応基を通じて一つ以上の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合で連結されるものであってもよい。
【００７２】
本発明における用語、「生理活性ポリペプチド」とは、上記タンパク質結合体の一部（moiety）をなす一構成であってもよく、生体内である生理作用を有するポリペプチドを総称する概念であり、ポリペプチド構造を有するという共通点を有し、多様な生理活性を有する。上記生理活性ポリペプチドは遺伝表現と生理機能を調整し、生体内で機能調節に関与する物質の欠乏や過剰な分泌により非正常な病態を示す際にこれを正す役割を有するものを含め、一般的なタンパク質治療剤も含めることができる。また、上記生理活性ポリペプチドは天然型ポリペプチド以外にもその誘導体もすべて含む概念である。
【００７３】
本発明において「生理活性ポリペプチド」、「生理活性タンパク質」、「活性タンパク質」または「タンパク質薬物」とは、生体内における生理的現象に作用剤及び/または拮抗作用を示すポリペプチドまたはタンパク質を意味する用語であり、相互交換的に使用されてもよい。
【００７４】
本発明における「脂肪酸分子」とは、上記タンパク質結合体の一部(moiety)をなす一構成であってもよく、脂肪酸または脂肪酸誘導体を意味し、上記繰り返し単位はペプチド結合ではなく任意の共有結合を通じて相互に連結されるものであってもよいが、これに制限されない。改質に用いられる脂肪酸分子中、脂肪酸はモノマー（monomer）である脂肪酸またはモノマーである脂肪酸が重合反応をなして重合体をなしたもの、またはそれぞれの誘導体をすべて含むが、これに制限されない。
【００７５】
本発明における用語、「脂肪酸（fatty acid）」とは、上記結合体の一部(moiety)をなす一構成であってもよく、1個のカルボキシ基(-COOH)を有する炭化水素鎖のカルボン酸を意味し、R-COOHの化学式を有する1価のカルボン酸を総称して脂肪酸という。
【００７６】
本発明の脂肪酸は、炭化水素鎖をなす炭素骨格間の結合により飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸であってもよい。上記不飽和脂肪酸は、炭化水素鎖をなす炭素骨格の結合中に、二重結合を1個以上有する脂肪酸を意味し、炭素骨格の結合がすべて単一結合のみからなる脂肪酸は飽和脂肪酸である。
【００７７】
また、本発明の脂肪酸は、直鎖構造を有する脂肪酸であってもよく、アルキル基に側鎖がある脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、炭化水素鎖をなす炭素数によって短鎖/中鎖/長鎖脂肪酸に分類することができ、一般に、炭素数1〜6個を有する場合に短鎖脂肪酸、6〜12個を有する場合に中鎖脂肪酸、14以上は長鎖脂肪酸に分類することができる。なお、不飽和脂肪酸の場合は二重結合の位置によって特性が異なり得る。
【００７８】
本発明の脂肪酸はR-COOHの化学式を有するカルボン酸であり、当該R基は、線状または分枝状の飽和炭化水素基を含むものであってもよく、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸であってもよく、短鎖、中鎖または長鎖脂肪酸であってもよく、具体的には、炭化水素鎖をなす炭素数が1〜40のものであってもよく、さらに具体的には炭素数が4〜30のものであってもよいが、これに制限されない。例えば、本発明の脂肪酸は、ギ酸（HCOOH、form acid）、酢酸（CH3COOH）、プロピオン酸（C2H5COOH）、酪酸（C3H7COOH）、吉草酸（C4H9COOH ）、カプロン酸（C5H11COOH）、エナント酸（C6H13COOH）、カプリル酸（C7H15COOH）、ペラルゴン酸（C8H17COOH）、カプリン酸（C9H19COOH）、ウンデシル酸（C10H21COOH）、ラウリン酸（C11H23COOH）、トリデシル酸（C12H25COOH）、ミリスチン酸（C13H27COOH）、ペンタデシル酸（C14H29COOH）、パルミチン酸（C15H31COOH）、マルガリン酸（C16H33COOH）、ステアリン酸（C17H35COOH）、ノナデカン酸（C18H37COOH）、アラキジン酸（C19H39COOH）、ベヘン酸（C21H43COOH）、リグノセリン酸（C23H47COOH）、セロチン酸（C25H51COOH）、ヘプタコサン酸（C26H53COOH）、モンタン酸（C28H57COOH）、メリシン酸（C29H59COOH）、ラッセル酸（C31H63COOH）、アクリル酸（CH2=CHCOOH）、クロトン酸（CH3CH=CHCOOH）、イソクロトン酸（CH3CH=CHCOOH）、ウンデシレン酸（CH2=CH（CH 2）8COOH）、オレイン酸（C17H33COOH）、エライジン酸（C17H33COOH）、セトレイン酸（C21H41COOH）、エルカ酸（C21H41COOH）、ブラシジン酸（C21H41COOH）、ソルビン酸（C5H7COOH、F2）、リノール酸（C17H31COOH、F2）、リノレン酸（C17H29COOH、F3）、アラキドン酸（C19H31COOH、F4）、プロピオール酸（CH≡CCOOH）、ヒアルロン酸（C14H21NO11）n）及びステアロール酸（C17H31COOH、F1）からなる群から選択されたものであってもよいが、これらに限定されない。
【００７９】
また、本発明の脂肪酸分子は、上記説明された脂肪酸の誘導体、類似体などであってもよく、特に脂肪酸をなす炭化水素が線状、分枝状以外の環状基を含む変異体であってもよい。上記炭化水素に含まれる環状基は、飽和ホモシクロ、ヘテロシクロ、芳香族縮合または非縮合ホモシクロまたはヘテロシクロであってもよく、エーテル結合、不飽和結合及び置換基を有してもよい。その例として、脂肪酸誘導体はPBA化合物が連結された脂肪酸であってもよいが、これに制限されない。
【００８０】
それ以外にも、本発明の脂肪酸分子は、当該分野において既に公知となった上記脂肪酸の誘導体、類似体及び当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体、及び類似体も本発明の範囲に含まれる。本発明の脂肪酸分子は、分子量が0.1〜100kDaの範囲、具体的には、0.1〜30 kDaの範囲のものであってもよく、本発明の脂肪酸分子は一種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが使用されてもよいが、これに制限されない。
【００８１】
「非ペプチド性重合体」とは、上記タンパク質結合体の一部(moiety)をなす一構成であってもよく、繰り返し単位が2個以上結合された生体適合性重合体を意味し、上記繰り返し単位はペプチド結合ではなく、任意の共有結合を通じて互いに連結されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００８２】
本発明における「免疫グロブリンFc領域」とは、上記結合体の一部(moiety)をなす一構成であってもよく、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1(CH1)と軽鎖不変領域1(CL1)を除いた残りの部分を意味し、免疫グロブリンFc領域は重鎖不変領域にヒンジ(hinge)領域をさらに含むこともある。特に、免疫グロブリンFc領域全体及びその一部を含む断片であってもよく、本発明では、免疫グロブリンFc領域は免疫グロブリン断片と混用されてもよい。
【００８３】
天然型Fcは、重鎖不変領域1においてAsn297部位に糖鎖が存在するが、大腸菌由来の組み換えFcは糖鎖がない形態で発現される。Fcから糖鎖が除去されれば、重鎖不変領域1に結合するFcガンマ受容体1、2、3と補体(c1q)の結合力が低下して抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去される。
【００８４】
本発明における「免疫グロブリン不変領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1(CH1)と軽鎖不変領域(CL)を除いた、重鎖不変領域2(CH2)及び重鎖不変領域3(CH3)(または重鎖不変領域4(CH4)を含む)部分を含むFc断片を意味することがあり、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)の部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリン不変領域は天然型と実質的に同等または向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全体重鎖不変領域1(CH1)及び/または軽鎖不変領域(CL)を含む拡張された免疫グロブリン不変領域であってもよい。また、CH2及び/またはCH3に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。即ち、本発明の免疫グロブリン不変領域は(1)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン、(2)CH1ドメイン及びCH2ドメイン、(3)CH1ドメイン及びCH3ドメイン、(4)CH2ドメイン及びCH3ドメイン、(5)1個または2個以上の不変領域ドメインと免疫グロブリンヒンジ領域(またはヒンジ領域の一部)との組み合わせ、(6)重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。免疫グロブリンFc断片をはじめとする不変領域は生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するには安全である。また、免疫グロブリンFc断片は、免疫グロブリン全体の分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製及び収率の面で有利なだけでなく、アミノ酸配列が抗体ごとに異なり、高い非均質性を示すFab部分が除去されるため、物質の同質性が大きく増加し、血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待することができる。
【００８５】
一方、免疫グロブリン不変領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、好ましくは、ヒト起源である。また、免疫グロブリン不変領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM由来またはこれらの組み合わせ(combination)またはこれらの混成(hybrid)による不変領域からなる群から選択されることができる。好ましくは、ヒト血液に最も豊富なIgGまたはIgM由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったIgG由来であってもよい。本発明において免疫グロブリンFc領域は、同一な起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体であってもよい。
本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリン不変領域(好ましくは、Fc領域)を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及びIgEのFc断片からなるグループから選択された2個以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００８６】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、短鎖の免疫グロブリン不変領域(好ましくは、Fc領域)内に2個以上の異なる起源の免疫グロブリン不変領域に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。即ち、IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及びIgD FcのCH1、CH2、CH3及びCH4からなるグループから選択された1個、または4個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域をさらに含むことができる。
【００８７】
IgGもIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせまたはこれらの混成化した形態も可能である。具体的には、IgG2及びIgG4サブクラスであり、さらに具体的には補体依存的傷害(CDC、Complementdependent cytotoxicity)のようなエフェクター機能(effector function)がほとんどないIgG4のFc領域であってもよい。
【００８８】
また、免疫グロブリン不変領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリン不変領域糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法、及び微生物を利用した遺伝工学的方法のような通常の方法が用いられてもよい。ここで、免疫グロブリン不変領域において糖鎖が除去された免疫グロブリン不変領域は補体(c1q)の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。この点で、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より合致する形態は糖鎖が除去されたり、非糖鎖化された免疫グロブリン不変領域と言える。したがって、さらに具体的には、ヒトIgG4由来の非糖鎖化したFc領域、即ち、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc領域を使用することができる。ヒト由来のFc領域はヒト生体において抗原として作用し、これに対する新たな抗体を生成するなどの望ましくない免疫反応を起こし得る非ヒト由来のFc領域に比べて望ましいと言える。
【００８９】
なお、本発明の免疫グロブリン不変領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体(mutant)を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中、一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより異なる配列を有することを意味する。例えば、IgG Fcの場合、結合に重要と知られた214〜238、297〜299、318〜322または327〜331番アミノ酸残基が変形のために、適当な部位として利用されてもよい。また、二硫化結合を形成できる部位が除去されたり、天然型FcからN末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、天然型FcのN末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、C1q結合部位が除去されてもよく、ADCC部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリン不変領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第97/34631号(特許文献5)、国際特許公開第96/32478号(特許文献6)などに開示されている。
【００９０】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸の交換は、当該分野において公示となっている(H.Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979(非特許文献1))。最も通常起こる交換は、アミノ酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間の交換である。場合によってはリン酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、グリコシル化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などで修飾(modification)されてもよい。
【００９１】
上述した免疫グロブリン不変領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン不変領域と同一の生物学的活性を示すが、免疫グロブリン不変領域の熱、pHなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体であってもよい。また、このような免疫グロブリン不変領域は、ヒト及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはこの誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合にはFab及びFcに切断され、ペプシンを処理する場合にはpF'c及びF(ab)2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion chromatography)などを利用してFcまたはpF'cを分離することができる。
【００９２】
具体的には、ヒト由来の免疫グロブリン不変領域を微生物から得た組換え型免疫グロブリン不変領域であってもよいが、これに制限されない。
【００９３】
本発明のタンパク質結合体は、[脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド/非ペプチド性重合体リンカー/免疫グロブリンFc領域]の単位構造を一つ以上含んでもよく、ここで、全ての構成要素は共有結合により線状に連結されてもよい。非ペプチド性重合体リンカーは、両末端に反応基を有することができるため、これを通じて生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合で連結される。即ち、一つの免疫グロブリンFc領域に、脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと結合した非ペプチド性重合体リンカーの連結体が一つ以上共有結合で連結されることにより、免疫グロブリンFc領域を媒介体にして生理活性ポリペプチド単量体、二量体あるいは多量体を形成することができ、これを通じて生体内活性及び安定性の増加をより効果的に達成することができる。
【００９４】
上記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基（maleimide）及びスクシンイミド（succinimide）誘導体で構成された群から選択されることが望ましい。上記において、スクシンイミド誘導体としては、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタン酸、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタン酸、スクシンイミジルプロピオン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドまたはスクシンイミジルカルボネートが用いられてもよい。特に、上記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小化し、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域とそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物はアミド結合で連結されたものより遥かに安定している。
【００９５】
本発明の非ペプチド性重合体または脂肪酸分子の両末端反応基は互いに同一または異なってもよい。上記非ペプチド性重合体または脂肪酸分子は、両末端にアルデヒドグループ反応基を有するものであってもよく、また、上記非ペプチド性重合体または脂肪酸分子は両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド反応基を有するか、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド反応基を有してもよいが、これに制限されない。
【００９６】
例えば、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有することができる。もう一つの例として、一方の末端にはスクシンイミジル基を、他方の末端にはプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有することができる。プロピオンの両末端にヒドロキシ反応基を有するポリ(エチレングリコール)を非ペプチド性重合体として利用する場合には、公知となった化学反応により上記ヒドロキシ基を上記多様な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形した反応基を有するポリ(エチレングリコール)を利用して本発明のタンパク質結合体を製造することができる。
【００９７】
脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体リンカーを媒介にして連結される場合には、上記非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域のN末端と生理活性ポリペプチドのN末端(アミノ末端)、C末端(カルボキシル末端)、リジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、またはシステイン残基の遊離反応基に結合しているものであってもよい。
【００９８】
本発明の非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLA(poly(lactic acid))及びPLGA(poly(lactic-glycolic acid))のような生分解性高分子、脂質重合体、脂肪酸、キチン類、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよく、具体的には、ポリエチレングリコール（PEG）あるいは脂肪酸であってもよいが、これらに限定されない。当該分野において既に公知となったこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も、本発明の非ペプチド性重合体の範囲に含まれる。非ペプチド性重合体としては、分子量が1〜100 kDaの範囲のもの、具体的には、1〜20 kDaの範囲のものを使用することができる。
【００９９】
本発明の生理活性ポリペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質のような様々な生理活性ポリペプチド、及びこれらの変異体及び類似体、またはアナログを例示することができる。
【０１００】
具体的には、生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類(例:インターフェロン-アルファ、-ベータ及び-ガンマ、水溶性タイプ-I-インターフェロン受容体など)、コロニー刺激因子、インターロイキン類(例:インターロイキン-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30など)とインターロイキン受容体類(例:IL-1受容体、IL-4受容体など)、酵素類(例:グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、iduronate-2-sulfatase、α-galactosidase-A、agalsidase alpha、beta、alpha-L-iduronidase、butyrylcholinesterase、Chitinase、glutamate decarboxylase、imiglucerase、lipase、Uricase、Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase、neutral endopeptidase、myeloperoxidaseなど)、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質類(例:IL-18bp、TNF-binding proteinなど)、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、タンパク質A、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-1アンチトリプシン、アルブミン、alpha-lactalbumin、アポリポタンパク質E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、angiopoeitin類、ヘモグロビン、thrombin、thrombin receptor activating peptide、thrombomodulin、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、プラスミノーゲン活性因子、fibrin-binding peptides、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、hirudin、タンパク質C、C-反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、angiostatin、angiotensin、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン、グルカゴン誘導体、グルカゴン様ペプチド、エキセンディン(Exendin4)、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、elcatonin、結合組織活性因子、tissue factor pathway inhibitor、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類(例:nerve growth factor、cilliary neurotrophic factor、axogenesis factor-1、brain-natriuretic peptide、glial derived neurotrophic factor、Netrin、neurophil inhibitor factor、neurotrophic factor、neurturinなど)、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、 膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、autotaxin、lactoferrin、Myostatin、受容体類(例:TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1 receptor、VEGF receptor、B cell activating factor receptorなど)、受容体拮抗物質(例:IL1-Raなど)、細胞表面抗原(例:CD 2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69など)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類(例:scFv、Fab、Fab'、F(ab')2及びFd)、ウイルス由来ワクチン抗原など様々な種類を含むが、これに制限されない。
【０１０１】
特に、具体的には、本発明の生理活性ポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で人体に投与される時、投与頻度の高いヒト成長ホルモン、インターフェロン類(インターフェロン-アルファ、-ベータ、-ガンマなど)、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、エキセンディン類、抗体断片類及びそれぞれの誘導体などであってもよい。また、上記生理活性ポリペプチドの天然型と実質的に同等または増加した機能、構造、活性または安定性を有する限り、任意の変異体または誘導体、またはそのアナログも本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。
【０１０２】
本発明におけるインスリンとは、インスリン受容体刺激活性を有するすべてのペプチドまたは変形ペプチドを網羅するが、例えば、天然型インスリン、速効性インスリン、basalインスリン、天然型インスリンにおいて、一部のアミノ酸が置換(substitution)、追加(addition)、除去(deletion)及び修飾(modification)のいずれか一つの方法またはこれらの方法の組み合わせを通じて変形が起きた物質であるインスリンアナログ、またはこれらの断片であってもよい。また、本発明においてインスリンは短い半減期を克服するための持続型技術を適用した持続型インスリンであってもよい。望ましくは、1週間1回投与が可能な持続型インスリンあるいは持続型インスリンアナログである。本発明によるインスリンの具体的な例を一部のみを挙げれば、大韓民国登録特許第10-1058290号(特許文献7)、大韓民国特許公開番号第10-2014-0106452号(特許文献8)、国際特許公開第2014/133324号(特許文献9)に記載されたインスリンまたはインスリンアナログとその持続型を含むが、その範囲は制限されない。
【０１０３】
本発明における用語、「インスリンアナログ」とは、天然型配列で1つ以上のアミノ酸が変形したものを意味する。
【０１０４】
上記インスリンアナログは、天然型に比べてインスリンの力価が減少及び/またはインスリン受容体結合力が減少した、インスリンのB鎖またはA鎖のアミノ酸が変異したインスリンアナログであってもよい。
【０１０５】
上記インスリンアナログは、インスリンB鎖の8番アミノ酸、インスリンB鎖の23番アミノ酸、インスリンB鎖の24番アミノ酸、インスリンB鎖の25番アミノ酸、インスリンA鎖の1番アミノ酸、インスリンA鎖の2番アミノ酸及びインスリンA鎖の19番アミノ酸からなる群から選択された一つのアミノ酸がアラニンに置換されたり、A鎖の14番アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギンに置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
【０１０６】
その例として、上記生理活性ポリペプチドはインスリンまたはそのアナログであり、上記生理活性ポリペプチドを改質した脂肪酸分子は脂肪酸または脂肪酸誘導体であり、上記非ペプチド重合体リンカーはポリエチレングリコールである、タンパク質結合体であってもよいが、これに制限されない。
【０１０７】
本発明において、抗体断片は、特定抗原に結合できる能力を有するFab、Fab'、F(ab')2、FdまたはscFvであってもよく、好ましくは、Fab'である。Fab断片は、軽鎖の可変ドメイン(VL)及び不変ドメイン(CL)と重鎖の可変ドメイン(VH)及び第1不変ドメイン(CH1)を含む。Fab'断片はCH1ドメインのカルボキシル末端にヒンジ(hinge)領域からの一つ以上のシステインを含む数個のアミノ酸残基が付加されているという点でFabの断片と区別される。Fd断片は、VH及びCH1ドメインのみで構成された断片であり、F(ab')2は二分子のFab'断片がジスルフィド結合あるいは化学的反応を通じて結合したものである。scFvは、VL及びVHドメインのみがペプチドリンカーで連結された単一ポリペプチド鎖である。
【０１０８】
また、本発明のタンパク質結合体は、ウシ成長ホルモンまたはブタ成長ホルモンのような動物成長ホルモンの持続型タンパク質製剤及びインターフェロンのような動物の疾病治療または予防用タンパク質の持続型タンパク質製剤の開発にも使用することができる。
【０１０９】
もう一つの態様として、本発明は、本発明のタンパク質結合体の製造方法を提供する。特に、本発明は、(a)一つ以上の脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び一つ以上の免疫グロブリンFc領域を両末端に反応基を有する一つ以上の非ペプチド性重合体リンカーを通じて共有結合で連結してタンパク質結合体を製造する段階;及び(b)上記(a)段階を通じて製造した非ペプチド性重合体リンカーを通じて共有結合で連結された、脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域を必須に含み、上記非ペプチド性重合体リンカーが免疫グロブリンFc断片に結合したタンパク質結合体を分離する段階を含む、タンパク質結合体の製造方法を提供する。
【０１１０】
本発明の免疫グロブリンFc領域は、単量体(dimer)の形態であってもよいが、同型二量体(homodimer)または異形二量体(heterodimer)の形態であってもよい。これにより、本発明のタンパク質結合体を構成する免疫グロブリンFc領域は一つ以上の非ペプチド性重合体リンカーと免疫グロブリンFc領域を通じて結合することができる。特に、本発明の免疫グロブリンFc領域は同型二量体の形態であってもよく、これを通じて免疫グロブリンFc領域の同型二量体に1個または2個の非ペプチド性重合体リンカーと連結されてもよい。この場合、非ペプチド性重合体リンカーはそれぞれ生理活性ポリペプチドと結合できるので、タンパク質結合体を構成することができる。
【０１１１】
これにより、本願発明のタンパク質結合体は、1個または2個以上の非ペプチド性重合体リンカー、1個または2個以上の脂肪酸分子で改質された生理活性ポリペプチド及び1個または2個以上の免疫グロブリンFc領域が共有結合で連結されて製造することができる。
【０１１２】
上記(a) 段階において、三つの構成要素の共有結合は順次または同時に起こりうる。例えば、非ペプチド性重合体の両末端に、それぞれ生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域を結合させる場合には、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンFc領域のいずれか一つを先に非ペプチド性重合体の一方の末端に結合させた後、残りの成分を非ペプチド性重合体の他方の末端に結合させる方式で順次反応を進めることが、目的とするタンパク質結合体以外の副産物の生成を最小化し、高純度に製造するのに有利である。
【０１１３】
したがって、上記(a)段階は、(i)非ペプチド性重合体リンカーの一方の末端に免疫グロブリンFc領域の特定の位置または脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドを共有結合により連結させる段階;(ii)上記反応混合物から非ペプチド性重合体に免疫グロブリンFc領域の特定の位置または生理活性ポリペプチドが結合された連結体を均質に分離する段階;及び(iii)分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域の特定位置が結合されたタンパク質結合体を生成する段階を含むことができる。
【０１１４】
一方、本発明において、上記(a)段階は、(a1)非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域または脂肪酸分子が連結された生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結して連結体を製造する段階;及び(a2)上記(a1)段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に脂肪酸分子が連結された生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域中の他の一つと共有結合で連結する段階を含むものであってもよい。
【０１１５】
具体的には、上記(a)段階は、(a1')非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域を共有結合で連結して連結体を製造する段階;及び(a2')上記(a1')段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に生理活性ポリペプチドを共有結合で連結する段階を含むものであってもよい。
【０１１６】
または、上記(a)段階は、(a1'')非ペプチド性重合体の一方の末端に生理活性ポリペプチドを共有結合で連結して連結体を製造する段階;及び(a2'')上記(a1'')段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域を共有結合で連結する段階を含むものであってもよい。
【０１１７】
本発明において、上記(a1)段階、(a1')段階または(a1'')段階で脂肪酸分子が連結されている形態の生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体リンカーの反応モル比は1:1〜1:30であり、免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:1〜1:20であってもよい。具体的には、上記(a1')段階で免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:1〜1:20であってもよく、特に1:1〜1:15、1:1〜1:10または1:1〜1:4の範囲であってもよく、上記(a1'')段階で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比が1:1〜1:30であってもよく、特に1:1〜1:15、1:1〜1:10の範囲であってもよい。上記反応モルの比率により製造収率及びコストが最適化され得る。
【０１１８】
また、本発明において上記(a1)段階、(a1')段階または(a1'')段階は、pH 4.0〜9.0で行われるものであってもよく;上記(a1)段階、(a1')段階または(a1'')段階は4.0〜25℃で行われるものであってもよく;上記(a1)段階、(a1')段階または(a1'')段階で免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlのものであってもよい。
【０１１９】
本発明において、上記(a2)段階、(a2')段階または(a2'')段階において連結体:免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.1〜1:20であってもよく、特に1:0.2〜1:10の範囲であってもよい。具体的には、上記(a2')段階において連結体:生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.1〜1:20であってもよく、上記(a2'')段階において連結体:免疫グロブリンFc領域の反応モル比が1:0.1〜1:20であってもよい。上記反応モルの比率により製造収率及びコストが最適化され得る。
【０１２０】
また、本発明において上記(a2)段階、(a2')段階または(a2'')段階は、pH 4.0〜9.0で行われるものであってもよく;上記(a2)段階、(a2')段階または(a2'')段階は4.0〜25℃で行われたものであってもよく;上記(a2)段階、(a2')段階または(a2'')段階で免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlのものであってもよい。
【０１２１】
一方、本発明の製造方法は、(a')非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドのいずれか一つと共有結合で連結して連結体を製造する段階であり、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比は1:1〜1:30であり、免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:1〜1:20であり、還元剤が1〜100 mMの濃度で含まれ、pH 4.0〜9.0、反応温度4.0〜25℃で行われ、免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlである段階:(b')上記(a')段階で製造した連結体を分離し、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域中の他の一つと共有結合で連結する段階であり、連結体と免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.1〜1:20であり、還元剤が1〜100 mMの濃度で含まれ、pH 4.0〜9.0、反応温度4.0〜25℃で行われ、免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が0.1〜100mg/mlである段階;及び(c')上記(b')段階を通じて製造した共有結合で連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンFc領域を必須に含み、上記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンFc領域のN末端を通じて結合したタンパク質結合体を分離する段階を含む、位置特異的タンパク質結合体の製造方法であってもよいが、これに制限されない。
【０１２２】
本発明において、上記(a1)段階、(a1')段階、(a1'')段階、(a2)段階、(a2')段階、及び(a2'')段階の反応は、反応に参与する非ペプチド性重合体の両末端の反応基の種類を考慮し、必要に応じて還元剤の存在の下で行うことができる。本発明において還元剤として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩またはピリジンホウ酸塩などが使用されてもよい。このとき、本発明において還元剤(例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム)の濃度と反応溶液の温度、pH、そして反応に参与する生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域の全濃度が全体的に製造収率と純度に重要であり、均質な高純度の結合体を最大限多く製造するための様々な条件の組み合わせが必要である。製造しようとする生理活性ポリペプチドの特性に応じて様々な条件が可能であり、制限されないが、一般に、還元剤(例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム)は1〜100 mMの濃度で含まれ、反応溶液の温度は0〜25℃、pH 4.0〜9.0であってもよく、反応タンパク質の濃度(反応時に含まれる免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの濃度が5〜100mg/mlの条件であってもよい。
【０１２３】
一方、上記(a2)段階、(a2')段階及び(a2'')段階で連結体を分離することは、分離された連結体に要求される純度、疎水性、分子量及び電荷量のような特性を考慮し、タンパク質の分離に使用される通常の方法の中で必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーを含む様々な公知の方法を適用して行うことができ、必要によっては、より高純度に精製するために複数の互いに異なる方法を組み合わせて使用することができる。
【０１２４】
製造しようとする生理活性ポリペプチドの特性に応じて多様な条件が可能であるが、一般に、非ペプチド性重合体に結合された免疫グロブリンFc領域、または生理活性ポリペプチド連結体を分離するために、サイズ排除クロマトグラフィーが最も適用しやすいが、今後のスケールアップと希望する特定の位置ではない別の位置に非ペプチド性重合体が結合された異性体あるいは製造中に生成されうる少量の変性体を分離するためには、疎水性クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーが使用されてもよい。
【０１２５】
本発明において、上記(b)段階は、最終的に高純度の結合体を精製するために、疎水性、分子量及び電荷量のような特性を考慮し、タンパク質の分離に使用される通常の方法のうち必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む様々な公知の方法を適用することができ、必要によっては、より高純度に精製するために複数の互いに異なる方法を組み合わせて使用することができる。製造しようとする生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体及びFc不変領域からなる結合体の性質に応じて多様な分離条件が可能であるが、一般に、非ペプチド性重合体の両末端に生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域がそれぞれ共有結合により連結された結合体を分離するために、やはりサイズ排除クロマトグラフィーが最も適用しやすい。しかし、今後、大量生産と希望する特定の位置ではない別の位置に非ペプチド性重合体を含む生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンFc領域が結合した異性体や副反応物質、製造中に生成され得る少量の変性体、未反応生理活性ポリペプチド、非ペプチド重合体及び免疫グロブリンFc領域などを効果的に分離するためには、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーを組み合わせるものであってもよい。疎水性クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせる方法が望ましく、疎水性クロマトグラフィーへの組み合わせまたはイオン交換クロマトグラフィーへの組み合わせも可能であり、製造しようとする結合体によってはイオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性クロマトグラフィーを単独で使用する方法も可であるが、これに制限されない。
【０１２６】
本発明において、イオン交換クロマトグラフィーは、特定のpHにおいてタンパク質が電荷性を帯びることを利用し、電荷を帯びたイオン樹脂が固定されたクロマトグラフィーを通過させ、タンパク質の移動速度の差を通じてタンパク質を分離することであり、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーであってもよい。
【０１２７】
上記アニオン交換クロマトグラフィーは、カチオン樹脂を用いるものであり、当該アニオン交換クロマトグラフィーを構成する樹脂の作用基がクオータナリーアンモニウム(Q)、クオータナリーアミノエチル(QAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、ジメチルアミノメチル(DMAE)、またはトリメチルアミノエチル(TMAE)からなる群から選択されるもののうちの一つであってもよいが、これに制限されない。
【０１２８】
なお、上記カチオン交換クロマトグラフィーは、アニオン樹脂を用いるものであり、当該カチオン交換クロマトグラフィーを構成する樹脂の作用基がメチルスルホネート(S)、スルホプロピル(SP)、カルボキシメチル(CM)、ポリアスパラギン酸(Poly aspartic acid)、スルホエチル(SE)、スルホプロピル(SP)、ホスフェート(P)またはスルホネート(S)からなる群から選択されるもののうちの一つであってもよいが、これに制限されない。
【０１２９】
本発明において、疎水性クロマトグラフィーは、これを構成する樹脂の作用基がフェニル(phenyl)、オクチル(octyl)、(イソ)プロピル(iso)propyl)、ブチル(butyl)及びエチル(ethyl)からなる群から選択されるもののうちの一つであってもよいが、これに制限されない。
【０１３０】
本発明において、サイズ排除クロマトグラフィーは、これを構成する樹脂がスーパーデックス(superdex)、セファクリル(sephacryl)、スーパーロース(superose)、及びセファデックス(sephadex)からなる群から選択されるもののうちの一つであってもよいが、これに制限されない。
【０１３１】
併せて、本発明において親和性クロマトグラフィーは、特定のタンパク質と相互作用できるリガンドが付着した樹脂を利用し、当該リガンドと相互作用をするかどうかによってタンパク質の移動速度の差を利用してタンパク質を分離するものであり、上記親和性クロマトグラフィーを構成する樹脂の作用基はプロテインA（proteinA）、ヘパリン（heparin）、ブルー(blue)、ベンザミジン(benzamidine)、金属イオン（コバルト、ニッケル、銅）及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び生理活性ポリペプチドと結合したタンパク質結合体の構成成分の一部あるいは全体に対する抗体からなる群から選択されるもののうちの一つであってもよいが、これに限定されない。
【０１３２】
もう一つの態様として、本発明は、上記タンパク質結合体または上記タンパク質結合体の製造方法により製造されたタンパク質結合体を有効成分として含む生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性が増加した薬学的組成物を提供する。
【０１３３】
上記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含むことができる。
【０１３４】
本発明の薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を通じて投与することができるが、好ましくは、注射剤の形態で投与されてもよい。また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供できるように、当業界においてよく知られた方法を用いて剤形化することができる。剤形は、錠剤、丸剤、粉末、サシェ(sachet)、エリキシル(elixir)、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射用液、滅菌粉末などの形態であってもよい。製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用されてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【０１３５】
本発明のタンパク質結合体の実際の投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重症度などの様々な関連因子とともに、活性成分である生理活性ポリペプチドの種類によって決定される。本発明のタンパク質結合体は、血中持続性と生体内の力価が非常に優れるため、本発明のタンパク質結合体を含むペプチド製剤の投与量、投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
【０１３６】
以下、下記実施例により本発明をより詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０１３７】
実施例1.アシル化した天然型インスリン及び免疫グロブリンFcが非ペプチド性重合体により連結された結合体の製造
アシル化した天然型インスリンが免疫グロブリンFc切片に非ペプチド性重合体で連結された結合体を製造した。
【０１３８】
具体的には、アシル化したインスリンとして、12-ドデカン酸を通じて天然型インスリンが4-カルボキシ-3-フルオロフェニルボロン酸(PBA-F)に連結されたアシル化インスリン(以下、これをIns-PBA-Fと略す)を引用された文献にある方法を使用して合成して結合体の製造に使用した(Chou他、PNAS通巻112、第8号、2401〜2406ページ(非特許文献2))。
【０１３９】
具体的には、12-ドデカン酸から合成を開始し、通常の条件でDCC(dicyclohexylcarbodiimide)/NHS(N-hydroxysuccinimide)カップリング反応を利用してインスリンのB鎖29番リジン残基のε-アミノ基が12-ドデカン酸のカルボキシ基とアミド結合で連結した。
【０１４０】
インスリンのアシル化に利用される12-(4-ボロノ-2-フルオロベンズアミド)ドデカン酸の製造方法は次の通りである。
【０１４１】
(3-フルオロ-4-(12-メトキシ-12-オキソドデシル)カルバモイル)フェニル)ボロン酸(5.15 g、13.04 mmol)及び水酸化リチウム(1.56 g、65.20 mmol)を3:1 MeOH/水溶液(80 mL)で溶かした。窒素存在の下で一晩中混ぜながら反応し、溶媒は真空で除去した。その後、上記反応物を水に溶かした後、1N HClを利用してpH 1に酸性化した後、沈殿物をフィルターで得た。カラムクロマトグラフィー(DCM内に0-20%MeOH)で白色産物を得た (3.23 g、8.48 mmol、65%)。
【０１４２】
1H NMR(CD3OD)δ7.73(m、3h)、δ3.35(t、2H)、δ2.26(t、2H)、δ1.60(m、4H)、δ1.31(m、14H)13C NMR(CD3OD)δ177.0、129.7、127.7、121.1、121.0、40.3、34.2、29.9、29.7、29.5、27.3、25.4 HRMS:calculated 381.2123;found:381.2124
【０１４３】
インスリンのアシル化は次の方法で行った。
【０１４４】
上記12-(4-ボロノ-2-フルオロベンズアミド)ドデカン酸、またはミリスチン酸(20.67μmol)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(4.26 mg、20.67μmol)、及びN-ヒドロキシスクシンイミド(2.38 mg、20.67μmol)をテトラヒドロフラン(1 mL)で溶かし、室温で4時間撹拌した。
【０１４５】
天然型インスリン(100 mg、17.23μmol)を0.1 M Na2CO3(1 mL)で溶かし、その後、上記を攪拌しながら反応させている12-(4-ボロノ-2-フルオロベンズアミド)ドデカン酸の反応物に添加した。1時間後、0.2 M CH3NH2(1 mL)及び6N HCl(26μL)を上記反応物に添加した。反応の結果、溶液及び沈殿物は遠心分離し、ペレットをDMSO(2 mL)に再懸濁した。生成物を逆相HPLC(Atlantis C18 column(250×10 mm、5μm;Waters))で精製した。分画物を収集し、減圧の下に凍結乾燥して白色産物を得た。上記産物はQSTAR hybrid Q-TOF (Koch Institute Swanson Biotechnology Center Biopolymers and Proteomics core)を用いてデコンボリューションESIで確認した。
【０１４６】
得られた質量は、以下の通りである:Ins-PBA-F、予測:6153、実際:6115.
【０１４７】
このアシル化インスリンでは、パラカルボキシフェニルボロン酸が12-ドデカン酸のアミノ基と、天然型ヒトインスリンのB鎖29番リジンのε-アミノ基が12-ドデカン酸のカルボキシ基とアミド結合で連結されている。その模式図は図4に示した。アシル化した天然型インスリンは(PBA-F)-脂肪酸-天然型インスリンと混用される。
【０１４８】
次いで、3.4K PropionALD(2)PEG(両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を有するように変形された分子量3.4 kDaであるポリエチレングリコール、日本NOF社)をIns-PBA-FのN末端に連結するために、Ins-PBA-Fと3.4K PropionALD(2)PEGのモル比を1:4、Ins-PBA-Fの濃度を5mg/mlにして4〜8℃で約2時間反応させた。この時、反応は50mMのクエン酸ナトリウム(sodium citrate)緩衝液(pH 5.0)とイソプロパノールの混合溶媒に還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride(NaCNBH3)が添加された環境の下で行われた。反応が終了した後、上記反応液は20mMのクエン酸ナトリウム(sodium citrate)(pH 3.0)、エタノールが含まれたバッファと0.25M KClの濃度勾配を利用してSP Sepharose High Performance(GE、米国)に適用してモノ-PEG化した(Monopegylated)(PBA-F)-脂肪酸-天然型インスリンを精製した。
【０１４９】
次に、上記精製されたモノ-PEG化したIns-PBA-Fと免疫グロブリンFcのN末端に結合するために、反応モル比1:1.2、総タンパク質の濃度を約20mg/mlにして、約20〜25℃で約16時間反応させた。反応液は100mMのヘペス(HEPES)緩衝液(pH8.2)と塩化ナトリウムに還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境の下で行われた。反応が終了した後、上記反応液は20mMのトリス(Tris)(pH 7.5)と0.15Mの塩化ナトリウムの濃度勾配を利用してSource15Q(GE、米国)に適用し、硫酸アンモニウムと20mMのトリス(pH7.5)の濃度勾配を利用してSourceISO(GE、米国)に適用し、免疫グロブリンFcにIns-PBA-FがPEGにより共有結合で連結された結合体を精製した。
【０１５０】
精製された結合体は、IE-HPLC、SE-HPLC、RP-HPLC及びSDS-PAGEを使用して純度を分析し、95%以上の純度を有することを確認した (図1a及び図2a)。
【０１５１】
実施例2.アシル化したインスリンアナログ及び免疫グロブリンFcが非ペプチド性重合体により連結された結合体の製造
アシル化したインスリンアナログが免疫グロブリンFc切片に非ペプチド性重合体で連結された結合体を製造した。インスリンアナログは、国際特許公開第2014/133324号(特許文献9)の実施例に記載されたインスリンA鎖またはB鎖中、アミノ酸が変異したインスリンアナログを利用した。
【０１５２】
下記表1に上記インスリンアナログのそれぞれのA鎖またはB鎖のアミノ酸の変化配列及びアナログ名を示した。即ち、アナログ1の場合、A鎖の1番グリシンがアラニンに置換され、アナログ4の場合、B鎖の8番グリシンがアラニンに置換された形態である。
【０１５３】
【表１】
2020535199.tif 000003
【０１５４】
下記表2には、具体的なインスリンアナログ1〜9のDNA配列及びタンパク質配列を示した。
【０１５５】
【表２】
2020535199.tif 000004
2020535199.tif 000005
2020535199.tif 000006
2020535199.tif 000007
【０１５６】
天然型インスリンの代わりにインスリンアナログを使用した以外は、実施例1に記載された実験の手順にそのまま従い、アナログ結合体は95%以上の純度を示した。(図1b及び図2b)。アシル化したインスリンアナログは、(PBA-F)-脂肪酸-インスリンアナログと混用される。
【０１５７】
実施例3.アシル化した天然型インスリン結合体とアシル化したインスリンアナログ結合体のin vitro活性の比較
本発明の非ペプチド性重合体が結合した生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域がリンカーである非ペプチド性重合体に連結されたタンパク質結合体が既存のタンパク質結合体と比較して相対力価が減少し、力価が優れているかどうかを確認した。
【０１５８】
具体的には、上記実施例1及び2で製造した(PBA-F)-脂肪酸が連結された天然型及びインスリンアナログ持続型タンパク質結合体のin vitro活性を確認するために、ヒトインスリン受容体(human insulin receptor)を過剰発現させたCHO(chinese hamster ovary)細胞株を利用してインスリン受容体のリン酸化(phosphorylation)を測定する方法を利用した。
【０１５９】
上記細胞株を1週間に2回または3回継代培養し、96ウェルプレートに5×104個のヒトインスリン受容体が発現されたCHO細胞をそれぞれ分注して24時間培養した。
【０１６０】
持続型インスリンアナログの力価確認及び比較のために、ヒトインスリンを344.4nMから3倍ずつ0.2nMまで連続的に希釈し、持続型インスリンアナログと持続型インスリンアナログを20037.1nMから3倍ずつ9.2nMまで連続的に希釈した。上記培養されたヒトインスリン受容体が発現されたCHO細胞をKRB緩衝液で洗浄し、連続的に希釈された各物質を100μlずつ上記細胞に添加した後、10分間、37℃の温度条件でCO2培養器で培養した。その後、細胞溶解緩衝液(cell lysis buffer)を25μlずつ加えて細胞を溶解させた、上記細胞溶解物をPhospho-Insulin ReceptorβSandwich ELISA kit(Cell signaling、USA)に適用してリン酸化したインスリン受容体を測定し、これからEC50値を算出した後、in vitro活性を比較した。2回繰返し試験による各物質のEC50値及びヒトインスリン比相対力価は、以下の表3に示した。実施例1と2の結合体の力価は、アシル化されていないヒト天然型インスリン、アシル化されていない天然型インスリンを使用した以外は、実施例1と同様の構造の天然型インスリンFc結合体(天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体)とアシル化されていない、実施例2と同一の配列のインスリンアナログを使用した以外は実施例2と同様の構造のインスリンアナログFc結合体(インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体)と対比した。実施例1と2を除いたこれら比較用結合体はWO2014/133324(特許文献9)に記載した通り製造した。ヒト天然型インスリンを基準としたとき、天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体、インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体、実施例1のアシル化した天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体、実施例2のアシル化したインスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体のin vitro活性はそれぞれ5.4、2.1、2.8及び2.2%であった。
【０１６１】
【表３】
2020535199.tif 000008
【０１６２】
上記のような結果は、本発明で新たに開発した非ペプチド性重合体で改質された生理活性ポリペプチド持続型タンパク質結合体のin vitro 力価が類似し、非ペプチド性重合体への改質がin vitro 上で問題とならないことを示唆するものである。
そこで、本発明者らは、上記非ペプチド性重合体で改質された生理活性ポリペプチド持続型タンパク質結合体が実際の生体内で効力が向上するかを確認するために、下記in vivo効力実験を行った。
【０１６３】
実施例4.アシル化した天然型インスリン結合体とアシル化したインスリンアナログ結合体のin vivoの効力の比較
本発明の非ペプチド性重合体が結合した生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンFc領域がリンカーである非ペプチド性重合体に連結されたタンパク質結合体が既存のタンパク質結合体と比較して生体内の持続性が増加したかどうかを確認した。
【０１６４】
糖尿病動物のモデルとして広く使われているSTZ(streptozotocin)誘導された糖尿病マウスをこの研究のために使用した。糖尿病マウスを誘導するために、7週齢のC57BL/6マウスを4時間絶食させた後、STZを50mg/kg(10mM citrate buffer、pH 4.5)を単回投与した。STZ投与4-7日後、血糖測定機(OneTouch（登録商標）Ultra（登録商標）、LifeScan,Inc.、USA)を使用し、糖尿病が誘発されたかどうかを確認し、血糖が〜400mg/mLに到達した糖尿病マウスのみを試験に使用した。
【０１６５】
糖尿病のマウスは、群1:Vehicle(単回注射)、群2:インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体100nmol/kg(単回注射)、群3:(PBA-F)-脂肪酸-インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体100nmol/kg(単回注射)、群4:(PBA-F)-脂肪酸-天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体100nmol/kg(単回注射)に分離されて試験物質の投与が行われた。研究期間中、血糖は、試験物質投与後、0、2、4、8時間、1、1.25、2、2.25、3、4、5、6、7、8、9、10日に測定され、測定された10日間の血糖変化値を用いてAUCを算出した。統計処理は一元ANOVAを使用して賦形剤群及び試験群の間を比較した。
【０１６６】
血糖変化及び算出されたAUC値は図3に示した。Vehicleの投与群に比べ、インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体、(PBA-F)-脂肪酸-インスリンアナログ-免疫グロブリンFc結合体、(PBA-F)-脂肪酸-天然型インスリン-免疫グロブリンFc結合体はそれぞれ-11%、-27%、-8%の血糖の減少効力を示した。
【０１６７】
上記のような結果は、本発明で新たに開発された非ペプチド性重合体で改質された生理活性ポリペプチド持続型タンパク質結合が既存のタンパク質結合体に比べてin vivo効果に優れていることを示唆する結果である。
【０１６８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１ａ】
2020535199.tif 000009
【図１ｂ】
2020535199.tif 000010
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2020535199.tif 000012
【図３】
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【図４】
2020535199.tif 000014
【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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