(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）および（ＩＩ）【化１】2020509074.tif 000054（式中、基は、本明細書において定義されるとおりである）に示される構造を有する三環系のβ−セクレターゼ阻害剤ならびにその互変異性体および立体異性形態に関する。本発明は、このような化合物を含む医薬組成物、このような化合物および組成物を調製するプロセスならびにアルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症、βアミロイドに伴う認知症、加齢黄斑変性、２型糖尿病および他の代謝障害など、β−セクレターゼが関与する障害を防止および処置するためのこのような化合物および組成物の使用も対象とする。
2020509074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2020509074.tif 000051
（式中、
Ｒは、ハロ、Ｃ１〜３アルキルオキシ、シアノ、２−シアノ−ピリジン−５−イル、３−シアノ−ピリジン−５−イルおよびピリミジン−５−イルからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基で任意選択的に置換されるフェニルであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルからなる群から選択され；但し、
ａ）Ｒ３が水素であり、かつＲ４が水素もしくはＣ１〜３アルキルであるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであるか；または
ｂ）Ｒ３が水素であり、かつＲ４がＣ１〜３アルキルオキシであるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであるか；または
ｃ）Ｒ３が水素であり、かつＲ４がＣ３〜６シクロアルキルであるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキルもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであるか；または
ｄ）＞ＣＲ３Ｒ４が＞（Ｃ＝Ｏ）であるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであり；ここで、
アリールは、フェニルまたはハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；
ヘテロアリールは、ハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、インダゾリル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選択され；および
Ｒ２は、水素またはＣ１〜３アルキルである）
の化合物またはその互変異性体もしくは立体異性形態あるいはその薬学的に許容される付加塩または溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであり；
Ｒ３は、水素であり；
Ｒ４は、水素またはＣ１〜３アルキルであり；ここで、
アリールは、フェニルまたはハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；および
ヘテロアリールは、ハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、インダゾリル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アリールは、フェニルまたはハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；および
ヘテロアリールは、ハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリルおよびオキサジアゾリルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１は、アリール、ヘテロアリールまたはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ水素であり；
アリールは、フェニルまたはハロ、Ｃ１〜３アルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；および
ヘテロアリールは、ハロ、Ｃ１〜３アルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリルおよびオキサジアゾリルからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒは、１または２個の独立に選択されるハロ置換基で任意選択的に置換されるフェニルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２は、Ｃ１〜３アルキル、特にメチルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
治療有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物を調製するプロセスであって、薬学的に許容される担体を治療有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物と混合することを含むプロセス。
【請求項９】
医薬品として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症またはβアミロイドに伴う認知症の処置、防止または予防に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
アルツハイマー病、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症およびβアミロイドに伴う認知症からなる群から選択される障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物または請求項７に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
β部位アミロイド切断酵素の活性を調節する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物または請求項７に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１３】
アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症またはβアミロイドに伴う認知症を処置または防止するための薬剤の製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物または請求項７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
式（Ｉ）または（ＩＩ）（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、請求項１〜６のいずれか一項に定義されるとおりである）による化合物を調製するプロセスであって、工程ａ）またはｂ）
【化２】
2020509074.tif 000052
に示されるように、パラジウム（０）の存在下において、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）（式中、Ｘは、ハロまたはトリフラートを示す）の化合物を式（Ｖ）（式中、Ｘ’は、ハロであり、かつＲ１、Ｒ３およびＲ４は、請求項１〜６のいずれか一項に定義されるとおりである）の有機亜鉛化合物による根岸型反応に供することを含むプロセス。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）
【化３】
2020509074.tif 000053
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、請求項１〜６のいずれか一項に定義されるとおりであり、かつＸは、ハロである）
の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）および（ＩＩ）
【化１】
2020509074.tif 000003
（式中、基は、本明細書において定義されるとおりである）
に示される構造を有する三環系のβ−セクレターゼ阻害剤ならびにその互変異性体および立体異性形態に関する。本発明は、このような化合物を含む医薬組成物、このような化合物および組成物を調製するプロセスならびにアルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症、βアミロイドに伴う認知症、加齢黄斑変性、２型糖尿病および他の代謝障害など、β−セクレターゼが関与する障害を防止および処置するためのこのような化合物および組成物の使用も対象とする。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老化に伴う神経変性疾患である。ＡＤ患者は、認知障害および記憶喪失を患い、不安症などの行動問題も抱えている。ＡＤに罹患している人の９０％超が散発型の障害を有する一方、この症例の１０％未満は、家族性または遺伝性である。米国では、６５歳で１０人に約１人がＡＤを有し、８５歳で２人に１人がＡＤに罹患している。初期診断からの平均余命は、７〜１０年であり、ＡＤ患者は、介護付き生活施設でのまたは家族による広範な介護を必要とする。人口に占める高齢者の数が増加するにつれ、ＡＤに対する医学的関心が高まっている。現在使用可能なＡＤの治療は、この疾患の症状を単に処置するものに過ぎず、それには認知性を改善するためのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤ならびにこの病気に伴う行動問題をコントロールするための抗不安薬および抗精神病薬が含まれる。
【０００３】
ＡＤ患者の脳における顕著な病理学的特徴は、タウタンパク質の過剰リン酸化によって生じる神経原線維変化およびβアミロイド１−４２（Ａβ１−４２）ペプチドの凝集によって形成されるアミロイド斑である。Ａβ１−４２は、オリゴマー、次いで原線維を形成し、最終的にアミロイド斑を形成する。オリゴマーおよび原線維は、特に神経毒性があると考えられており、ＡＤに関連する神経損傷の大部分を引き起こし得る。Ａβ１−４２の形成を防止する薬剤は、ＡＤを処置するための疾患修飾薬となる可能性がある。Ａβ１−４２は、７７０個のアミノ酸から構成されるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生成する。Ａβ１−４２のＮ末端がβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）により切断された後、γセクレターゼによりＣ末端が切断される。γセクレターゼは、Ａβ１−４２に加えて、主要な切断産物であるＡβ１−４０ならびにＡβ１−３８およびＡβ１−４３も遊離する。これらのＡβ型も凝集してオリゴマーおよび原線維を形成し得る。したがって、ＢＡＣＥ１の阻害剤は、Ａβ１−４２ならびにＡβ１−４０、Ａβ１−３８およびＡβ１−４３の形成を防止することが期待され、ＡＤの処置における治療薬となる可能性がある。
【０００４】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、インスリン耐性により、および膵β細胞からのインスリン分泌が不十分になることにより、血糖調節が良好に機能せず、高血糖になることが原因となる。Ｔ２Ｄの患者は、微小血管および大血管の疾患ならびに糖尿病性腎症、網膜症および心血管疾患を含む一連の関連合併症のリスクが高い。Ｔ２Ｄの罹患率の上昇は、世界の人々のますます体を動かすことが減ってきているライフスタイルおよび高エネルギー食品の摂取と関係がある。
【０００５】
β細胞の機能不全ならびにその結果として生じるインスリン分泌の大幅な低下および高血糖は、Ｔ２Ｄの発症を示す。現行の処置のほとんどは、顕性Ｔ２Ｄを特徴付けるβ細胞量の減少を防止するものではない。しかしながら、ＧＬＰ−１類似体、ガストリンおよび他の薬剤が最近開発されたことでβ細胞の維持および増殖が実現可能になり、これにより糖耐性を高め、顕性Ｔ２Ｄの進行を遅くすることが示されている。
【０００６】
Ｔｍｅｍ２７は、β細胞の増殖およびインスリン分泌を促進するタンパク質として同定されている。Ｔｍｅｍ２７は、β細胞の表面から構成的に脱落している４２ｋＤａの膜糖タンパク質であり、完全長細胞Ｔｍｅｍ２７の分解から生じる。トランスジェニックマウスにおいてＴｍｅｍ２７を過剰発現させると、糖尿病の食事性肥満ＤＩＯモデルにおいてβ細胞量が増加し、糖耐性が改善する。さらに、齧歯類のβ細胞増殖アッセイ（例えば、ＩＮＳ１ｅ細胞を使用）においてＴｍｅｍ２７のｓｉＲＮＡをノックアウトすると、増殖速度が低下する。これは、β細胞量の調節におけるＴｍｅｍ２７の役割を示すものである。
【０００７】
ＢＡＣＥ２は、Ｔｍｅｍ２７の分解を担うプロテアーゼである。これは、膜結合アスパルチルプロテアーゼであり、ヒト膵β細胞中でＴｍｅｍ２７と共存している。これは、ＡＰＰ、ＩＬ−１Ｒ２およびＡＣＥ２を分解する能力があることも知られている。ＡＣＥ２を分解する能力があることは、高血圧の調節におけるＢＡＣＥ２の役割の可能性を示すものである。
【０００８】
さらに、ＢＡＣＥ１および／またはＢＡＣＥ２の阻害剤は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、動脈血栓症、自己免疫性／炎症性疾患、乳がんなどのがん、心筋梗塞および脳卒中などの心血管疾患、皮膚筋炎、ダウン症候群、胃腸疾患、多形性膠芽腫、グレーブス病、ハンチントン病、封入体筋炎（ＩＢＭ）、炎症性反応、カポジ肉腫、コストマン病、エリテマトーデス、マクロファージ性筋膜炎、若年性突発性関節炎、肉芽腫性関節炎、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、関節リウマチ、シェーグレン症候群、脊髄小脳失調症１、脊髄小脳失調症７、ウィップル病またはウィルソン病の治療処置および／または予防処置にも使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、式（Ｉ）および（ＩＩ）
【化２】
2020509074.tif 000004
（式中、
Ｒは、ハロ、Ｃ１〜３アルキルオキシ、シアノ、２−シアノ−ピリジン−５−イル、３−シアノ−ピリジン−５−イルおよびピリミジン−５−イルからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基で任意選択的に置換されるフェニルであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルからなる群から選択され；但し、
ａ）Ｒ３が水素であり、かつＲ４が水素もしくはＣ１〜３アルキルであるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであるか；または
ｂ）Ｒ３が水素であり、かつＲ４がＣ１〜３アルキルオキシであるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであるか；または
ｃ）Ｒ３が水素であり、かつＲ４がＣ３〜６シクロアルキルであるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキルもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであるか；または
ｄ）＞ＣＲ３Ｒ４が＞（Ｃ＝Ｏ）であるとき、Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであり；ここで、
アリールは、フェニルまたはハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；
ヘテロアリールは、ハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、インダゾリル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選択され；および
Ｒ２は、水素またはＣ１〜３アルキルである）
の化合物、その互変異性体および立体異性形態ならびにそれらの薬学的に許容される付加塩および溶媒和物を対象とする。
【００１０】
本発明の実例となるものとして、薬学的に許容される担体と、上記化合物のいずれかとを含む医薬組成物がある。本発明の一例として、上記化合物のいずれかと、薬学的に許容される担体とを混合することによって作製される医薬組成物がある。本発明を例示するものとして、医薬組成物を作製するプロセスであって、上記化合物のいずれかと、薬学的に許容される担体とを混合することを含むプロセスがある。
【００１１】
本発明を例示するものとして、β−セクレターゼ酵素によって媒介される障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の上記化合物または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法がある。
【００１２】
本発明をさらに例示するものとして、β−セクレターゼ酵素を阻害する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の上記化合物または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法がある。
【００１３】
本発明の一例として、アルツハイマー病、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症、βアミロイドに伴う認知症および加齢黄斑変性、好ましくはアルツハイマー病、２型糖尿病および他の代謝障害からなる群から選択される障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の上記化合物または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法がある。
【００１４】
本発明の別の例として、（ａ）アルツハイマー病、（ｂ）軽度認知障害、（ｃ）老衰、（ｄ）認知症、（ｅ）レビー小体型認知症、（ｆ）ダウン症候群、（ｇ）脳卒中に伴う認知症、（ｈ）パーキンソン病に伴う認知症、（ｉ）βアミロイドに伴う認知症または（ｊ）加齢黄斑変性、（ｋ）２型糖尿病および（ｌ）他の代謝障害の処置を、それを必要としている対象において行うのに使用するための、上記化合物のいずれかがある。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、上に定義した式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物ならびにその薬学的に許容される付加塩および溶媒和物を対象とする。式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、β−セクレターゼ酵素（β部位切断酵素、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ１、Ａｓｐ２もしくはメマプシン２またはＢＡＣＥ２としても知られる）の阻害剤であり、アルツハイマー病、軽度認知障害、老衰、認知症、脳卒中に伴う認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、パーキンソン病に伴う認知症、βアミロイドに伴う認知症および加齢黄斑変性、好ましくはアルツハイマー病、軽度認知障害または認知症、より好ましくはアルツハイマー病、２型糖尿病および他の代謝障害の処置に有用であり得る。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）および（ＩＩ）
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルで任意選択的に置換されるＣ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであり；
Ｒ３は、水素であり；
Ｒ４は、水素またはＣ１〜３アルキルであり；ここで、
アリールは、フェニルまたはハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；および
ヘテロアリールは、ハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルキルオキシ、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシおよびポリハロ−Ｃ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、インドリル、インダゾリル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリルおよびベンゾチアゾリルからなる群から選択され；および
Ｒ２は、本明細書において定義されるとおりである）
の化合物に関する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）および（ＩＩ）
（式中、
アリールは、フェニルまたはハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；および
ヘテロアリールは、ハロ、シアノ、Ｃ１〜３アルキル、モノ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、ポリ−ハロ−Ｃ１〜３アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリルおよびオキサジアゾリルからなる群から選択され；および
Ｒ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、本明細書において定義されるとおりである）
の化合物に関する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）および（ＩＩ）
（式中、
Ｒ１は、アリール、ヘテロアリールまたはＣ１〜３アルキルで任意選択的に置換される４−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニルであり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ水素であり；
アリールは、フェニルまたはハロ、Ｃ１〜３アルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２もしくは３個の置換基で置換されたフェニルであり；および
ヘテロアリールは、ハロ、Ｃ１〜３アルキルおよびＣ１〜３アルキルオキシからなる群からそれぞれ独立に選択される１、２または３個の置換基でそれぞれ任意選択的に置換されるピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリルおよびオキサジアゾリルからなる群から選択され；および
ＲおよびＲ２は、本明細書において定義されるとおりである）
の化合物に関する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）および（ＩＩ）
（式中、
Ｒは、１または２個の独立に選択されるハロ置換基で任意選択的に置換されるフェニルであり；および
Ｒ１〜Ｒ４は、本明細書において定義されるとおりである）
の化合物に関する。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）および（ＩＩ）
（式中、Ｒ２は、Ｃ１〜３アルキル、特にメチルであり、かつＲ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、本明細書において定義されるとおりである）
の化合物に関する。
【００２１】
本発明は、特に、三環式骨格中の炭素中心Ｃ４ａおよびＣ１０ａがシス配置である（すなわち、ＨおよびＲは、骨格平面の同じ側に突出している）化合物
【化３】
2020509074.tif 000005
に関する。
【００２２】
したがって、特に、本発明は、以下に示す式（Ｉ’）および（ＩＩ’）の化合物ならびに式（Ｉ”）および（ＩＩ”）の化合物に関し、ここで、（Ｉ”）および（ＩＩ”）において、三環のコアは、図面の平面にあり、ＨおよびＲは、図面の平面の上方に突出している（結合が太い楔
【化４】
2020509074.tif 000006
で示される）か、または三環のコアは、図面の平面にあり、ＨおよびＲは、図面の平面の下方に突出している（結合が平行線の楔
【化５】
2020509074.tif 000007
で示される）。
【化６】
2020509074.tif 000008
【００２３】
定義
「ハロ」は、フルオロ、クロロおよびブロモを意味し、「Ｃ１〜３アルキル」は、１、２もしくは３個の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状の飽和アルキル基、例えばメチル、エチル、１−プロピル、２−プロピルなどを意味し、「Ｃ１〜３アルキルオキシ」は、エーテル基を意味し、但し、Ｃ１〜３アルキルは、前に定義したとおりであり、「モノ−およびポリハロＣ１〜３アルキル」は、前に定義したとおりの１、２、３または可能であればそれを超えるハロ原子で置換された、前に定義したとおりのＣ１〜３アルキルを意味し、「モノ−およびポリハロＣ１〜３アルキルオキシ」は、エーテル基（但し、モノ−およびポリハロＣ１〜３アルキルは、前に定義したとおりである）を意味し、「Ｃ３〜６シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する「対象」という用語は、処置、観察または実験の目的物となるかまたは目的物となっている動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００２５】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医によって求められている、組織系、動物またはヒトにおける生物学的または医学的応答（処置されている疾患または障害の症状の軽減を含む）を誘発する活性化合物または医薬剤の量を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「組成物」という用語は、特定の成分を特定の量で含む生成物および特定の成分の特定の量での組合せから直接的または間接的に得られる任意の生成物を包含するものとする。
【００２７】
上記および下記では、「式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物」という用語は、その付加塩、溶媒和物および立体異性体を含むものとする。
【００２８】
「立体異性体」または「立体化学的異性形態」という用語は、上記または下記で同義的に使用される。
【００２９】
本発明は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の全ての立体異性体を純粋な立体異性体または２種以上の立体異性体の混合物として含む。
【００３０】
エナンチオマーは、重ね合わせることができない互いの鏡像となっている立体異性体である。エナンチオマーの対の１：１混合物は、ラセミ体またはラセミ混合物である。ジアステレオマー（またはジアステレオ異性体）は、エナンチオマーではない立体異性体であり、すなわち鏡像の関係にない。化合物が二重結合を含有する場合、置換基は、Ｅ配置またはＺ配置となり得る。化合物が二置換シクロアルキル基を含有する場合、置換基は、シス配置またはトランス配置となり得る。したがって、本発明は、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、Ｅ異性体、Ｚ異性体、シス異性体、トランス異性体およびこれらの混合物を含む。
【００３１】
絶対配置は、カーン・インゴルド・プレローグ表示法に従って特定される。不斉原子における配置は、ＲまたはＳで特定される。絶対配置が不明である分割化合物は、平面偏光を回転させる方向によって（＋）または（−）で示すことができる。
【００３２】
特定の立体異性体が同定される場合、これは、前記立体異性体が実質的に他の異性体を含まない、すなわち他の異性体を５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、より一層好ましくは５％未満、特に２％未満、最も好ましくは１％未満のみ伴うことを意味する。したがって、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が例えば（Ｒ）と特定される場合、これは、その化合物が実質的に（Ｓ）異性体を含まないことを意味し、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が例えばＥと特定される場合、これは、その化合物が実質的にＺ異性体を含まないことを意味し、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が例えばシスと特定される場合、これは、その化合物が実質的にトランス異性体を含まないことを意味する。
【００３３】
医薬で使用される場合、本発明の化合物の付加塩は、毒性のない「薬学的に許容される付加塩」を指す。しかしながら、他の塩が本発明による化合物またはその薬学的に許容される付加塩の調製に有用であることがある。本化合物の好適な薬学的に許容される付加塩としては、例えば、化合物の溶液を塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬学的に許容される酸の溶液と混合することによって形成され得る酸付加塩が挙げられる。さらに、本発明の化合物が酸部分を有する場合、その薬学的に許容される好適な付加塩としては、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩またはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩またはマグネシウム塩および好適な有機配位子と形成される塩、例えば第四級アンモニウム塩を挙げることができる。
【００３４】
薬学的に許容される付加塩の調製に使用することができる代表的な酸として、以下に限定されるものではないが、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アシル化アミノ酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、（＋）−樟脳酸、樟脳スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−グルタミン酸、β−オキソ−グルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメチルスルホン酸およびウンデシレン酸が挙げられる。薬学的に許容される付加塩の調製に使用することができる代表的な塩基として、以下に限定されるものではないが、アンモニア、Ｌ−アルギニン、ベネタミン、ベンザチン、水酸化カルシウム、コリン、ジメチルエタノールアミン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、２−（ジエチルアミノ）−エタノール、エタノールアミン、エチレン−ジアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、ヒドラバミン、１Ｈ−イミダゾール、Ｌ−リシン、水酸化マグネシウム、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、ピペラジン、水酸化カリウム、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリジン、第二級アミン、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロメタミンおよび水酸化亜鉛が挙げられる。特定の塩は、トリフルオロ酢酸付加塩である。
【００３５】
化合物の名称は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）によって取り決められた命名規則に従って、または国際純正・応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（ＩＵＰＡＣ）によって取り決められた命名規則に従って命名された。互変異性形態の場合、その構造の示される互変異性形態の名称が命名された。示されていない他の互変異性形態も本発明の範囲内に含まれる。
【００３６】
化合物の調製
実験手順１
式（Ｉ）および（ＩＩ）による最終化合物は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の中間体化合物から、根岸型反応により、当該技術分野で知られている反応条件に従って調製することができる。このような条件には、通常、パラジウム（０）、例えばＰｄ（ＰＰｈ３）４またはニッケル触媒、配位子、例えばＲｕＰｈｏｓ、トリフェニルホスフィン、ｄｐｐｅ、ＢＩＮＡＰの存在下における式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の中間体の式（Ｖ）の有機亜鉛化合物による反応が含まれる。反応スキーム１では、Ｘは、ハロまたはトリフラートを示し、Ｘ’は、ハロであり、他の全ての可変要素は、式（Ｉ）および（ＩＩ）において定義されるとおりである。
【化７】
2020509074.tif 000009
【００３７】
中間体化合物の調製
実験手順２
式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の中間体化合物は、式（ＶＩ）および（ＶＩＩ）（式中、ＱおよびＰＧは、塩基不安定性（例えば、アシル）または酸不安定性（例えば、トリチル）保護基を示す）の中間体化合物を脱保護することによって得ることができる。反応スキーム２では、Ｘは、ハロまたはトリフラート基、特にブロモを示し、他の全ての可変要素は、式（Ｉ）および（ＩＩ）において定義されるとおりである。
【化８】
2020509074.tif 000010
【００３８】
実験手順３
式（ＩＩＩ）（式中、Ｘは、Ｂｒである）の中間体化合物（本明細書では、式（ＩＩＩ−ａ）の中間体と称する）は、当該技術分野で知られている臭素化手順により、式（ＩＩＩ−ｂ）の中間体化合物から調製することができる。前記臭素化は、例えば、アセトニトリルなどの好適な不活性溶媒中、例えば室温（ｒ．ｔ．）などの好適な温度において、反応が完了するまで、例えば１６時間にわたり、対応する式（ＩＩＩ−ｂ）の中間体化合物を例えばＮ−ブロモコハク酸イミドなどの臭素化剤で処理することによって都合よく行うことができる。
【００３９】
式（ＩＩＩ−ｂ）の中間体化合物は、当該技術分野で知られている手順に従って、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などの保護基ＰＧによって保護する必要があり得る。前記反応は、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）などの好適な触媒の存在下、ＴＨＦなどの好適な不活性溶媒中、好適な反応条件下、例えば好都合な温度、通常ｒ．ｔ．において、反応が確実に完了する時間にわたって中間体化合物（ＩＩＩ−ｂ）を二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルで処理することによって都合よく行うことができる。
【００４０】
次いで、保護した中間体（ＩＩＩ−ｃ）を上記のように臭素化して（ＩＩＩ−ｄ）を得、次いでこれを周囲温度において好適な溶媒中または無溶媒で、例えばトリフルオロ酢酸またはギ酸などの好適な酸で処理して脱保護することにより、中間体（ＩＩＩ−ａ）を得ることができる。
【００４１】
反応スキーム３では、ＱおよびＰＧは、保護基であり、他の可変要素は、全て式（Ｉ）におけるように定義される。
【化９】
2020509074.tif 000011
【００４２】
代わりに、式（ＩＩＩ−ａ）の中間体は、反応スキーム２に類似の手順のもとで脱保護することができる。
【００４３】
実験手順４
式（ＩＩＩ）（式中、Ｒ２は、Ｃ１〜３アルキルである）の中間体（本明細書では、式（ＩＩＩ−ｅ）の中間体と称する）は、対応する式（ＩＩＩ−ｂ）（式中、Ｒ２は、メチルである）の中間体（本明細書では、式（ＩＩＩ−ｂ’）の中間体と称する）をヨウ化Ｃ１〜３アルキルと反応させることにより調製することができる（反応スキーム３）。反応は、例えば、反応混合物を１００℃で加熱するなどの熱条件下で行うことができる。反応スキーム４では、可変要素は、全て式（Ｉ）におけるように定義される。
【化１０】
2020509074.tif 000012
【００４４】
実験手順５
式（ＩＩＩ−ｂ）の中間体化合物は、当該技術分野で知られている環化手順に従って式（ＶＩＩＩ）の中間体化合物から調製することができる。前記環化は、例えば、ＤＣＭなどの好適な反応溶媒中、好適な反応条件下、例えば好都合な温度、通常ｒ．ｔ．において、反応が確実に完了する時間にわたって式（ＶＩＩＩ）の中間体化合物を１−クロロ−Ｎ，Ｎ−２−トリメチルプロペニルアミンなどの好適な試薬で処理することによって都合よく行うことができる。
【００４５】
式（ＶＩＩＩ）の中間体化合物は、例えば、ＤＣＭなどの好適な不活性溶媒中、好都合な温度、通常ｒ．ｔ．において、反応が完了するまで、例えば３時間にわたり、対応する式（ＩＸ）の中間体化合物を例えばベンジルイソチオシアネートなどの好適な試薬と反応させることにより（その結果、化合物（ＶＩＩＩ）および（ＩＩＩ−ｄ）（式中、Ｑは、フェニル（Ｃ＝Ｏ）−である）を生じる）調製することができる。
【００４６】
式（ＩＸ）の中間体化合物は、当該技術分野で知られているアジリジン環の開環手順に従って、対応する式（Ｘ）の中間体化合物から調製することができる。前記反応は、水素雰囲気下、例えばアルカノール（例えば、メタノール、エタノールなど）などの好適な溶媒中、ラネーニッケルなどの好適な触媒の存在下、好都合な温度、通常ｒ．ｔ．において、反応が完了するまで、例えば６時間にわたって反応物を撹拌することによって実施することができる。
【００４７】
式（Ｘ）の中間体化合物は、対応する式（ＸＩ）の中間体を式（ＸＩＩ）（式中、Ｒは、上で定義されるとおりであり、Ｘは、例えば、−Ｍｇ−ハロゲン化物である）の中間体と反応させることにより調製することができる。この反応は、ＴＨＦなどの好適な反応不活性溶媒中、好適な反応条件下、例えば好都合な温度、通常−７８℃〜室温の範囲において、確実に反応が完了する時間にわたって行われ得る。式（ＸＩＩ）の中間体化合物は、市販品を購入するか、または文献の手順に従って合成することができる。
【化１１】
2020509074.tif 000013
【００４８】
実験手順６
式（ＸＩ）の中間体化合物は、当該技術分野で知られている環化手順に従って、対応する式（ＸＩＩＩ）の中間体化合物を反応させることによって調製することができる。前記環化は、例えば、ＴＨＦなどの好適な反応不活性溶媒中、好適な反応条件下、例えば好都合な温度、通常５０℃において、反応が確実に完了する時間にわたって式（ＸＩＩＩ）の中間体化合物を例えば塩酸などの好適な酸で処理することによって都合よく行うことができる。
【００４９】
式（ＸＩＩＩ）の中間体化合物は、当該技術分野で知られているカップリング手順に従って式（ＸＩＶ）の中間体化合物を反応させることによって調製することができる。前記変換は、イソプロピルマグネシウムクロリド−塩化リチウム錯体などの好適なメタル化試薬および例えばシアン化銅（Ｉ）ジ（塩化リチウム）錯体溶液などの好適な有機銅アート試薬前駆体の存在下で式（ＸＩＶ）の中間化合物を対応するシアノ銅酸塩試薬に変換し、続いて臭化アリルなどの適切なハロゲン化物を添加することによって都合よく行うことができる。反応は、例えば、ＴＨＦなどの好適な反応不活性溶媒中、好都合な温度、通常−７０℃〜ｒ．ｔ．において、確実に反応が完了する時間にわたって行われ得る。
【００５０】
式（ＸＩＶ）の中間体化合物は、当該技術分野で知られているウィッティヒ反応手順に従って式（ＸＶ）の中間体化合物を反応させることによって調製することができる。前記反応は、例えば、カリウムビス（トリメチルシリル）アミドなどの好適な塩基の存在下、例えばトルエンなどの好適な反応不活性溶媒中、好適な温度、通常−１０℃〜ｒ．ｔ．において、確実に反応が完了する時間にわたって式（ＸＶ）の中間体化合物を例えばメトキシメチルトリフェニルホスホニウムクロリドなどの好適なホスホニウム塩で処理することによって都合よく行うことができる。
【００５１】
式（ＸＶ）の中間体化合物は、一般に、市販品を購入するか、または文献の手順に従って合成することができる。
【００５２】
反応スキーム６では、可変要素は、全て式（Ｉ）におけるように定義される。
【化１２】
2020509074.tif 000014
【００５３】
実験手順７
代わりに、式（ＸＩ）の中間体化合物は、式（ＸＩＩ−ａ）（式中、Ｒ’は、例えば、クロスカップリング反応、アルキル化反応および脱保護反応などの当業者に知られた手順を使用することによってＲに変換することができる任意の基である）の有機金属種の添加を受けることができる。中間体化合物（Ｘ−ａ）は、前述の実施例に記載したのと同じ合成経路を用いて合成を続けることができる。当業者であれば、合成過程のいずれの時点でＲ’からＲへの変換を行うことが適切であるかを判断することができるであろう。
【化１３】
2020509074.tif 000015
【００５４】
化合物の調製  −  フローケミストリー
本明細書に記載のＣｙｃｌＯｐｓ（商標）プラットフォームを用いて、多くの化合物を合成し、スクリーニングし、それは、高い成功範囲（６１〜９６％の成功率）で機能した。フロー合成システムは、ＦｌｏｗＣｏｍｍａｎｄｅｒ（商標）ソフトウェアによって制御される一体化されたバルブおよび試薬ループを備えたＶａｐｏｕｒｔｅｃ（登録商標）Ｒ４反応器およびＲ２ポンプモジュールを利用した。ケミストリーの複雑さに応じて、最大で４つまでの反応器、ポンプおよびバルブを使用した。最終反応器からの生成物は、生成物のアリコートを精製システムに注入することを可能にするＨＰＬＣ注入バルブに流入した。合成システムにおける分散による材料の損失は、いくつかの方法で最小限に抑えられた。最初に、分散を最小限に抑えるために、システム全体にわたって小口径の管を使用した。第２に、反応物および生成物の定常状態濃度が反応器内で確実に達成されるように試薬ループサイズを選択した。最後に、最大生成物濃度の時点において、すなわち定常状態条件下でアリコートが確実に採取されるようにＨＰＬＣへの注入の時間を調節した。一般に、試薬のフレッシュボトルの使用および／またはその場での試薬の生成は、合成結果を改善し得る。
【００５５】
実験手順８
式（Ｉ）および（ＩＩ）による最終化合物は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の中間体化合物から、根岸型反応により調製することができる。一般的には、１つの容器に溶媒（例えば、ＮＭＰ）中の式（ＩＩＩ−ａ’）の中間体を入れる。第２の容器にブロモまたはクロロ根岸亜鉛酸塩（例えば、ベンジル亜鉛（ＩＩ）ブロミド）を加え、第３の容器で好適な溶媒中の触媒（例えば、ＮＭＥまたはＴＨＦ中のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２またはＲｕＰｈｏｓ−Ｐｄ−Ｇ２）を調製する。３つの容器をＧｉｌｓｏｎ  ２１５に装填し、２５０μＬの注入ループに注入し、続いて各ポンプを３３μＬ／ｍｉｎで作動させながら、８０℃に加熱した２ｍＬのステンレス鋼コイル上に注入する。反応は、通常、２０分で完了する。流出物は、２０μＬのループを通してプラットフォームの精製およびアッセイ部に自動的に注入される。
【化１４】
2020509074.tif 000016
【００５６】
薬効薬理
本発明の化合物およびその薬学的に許容される組成物は、ＢＡＣＥを阻害し、したがってアルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、老衰、認知症、レビー小体型認知症、脳アミロイド血管症、多発梗塞性認知症、ダウン症候群、パーキンソン病に伴う認知症、アルツハイマー型認知症、血管性認知症、ＨＩＶ疾患による認知症、頭部外傷による認知症、ハンチントン病による認知症、ピック病による認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病による認知症、前頭側頭型認知症、ボクサー認知症、βアミロイドに伴う認知症および加齢黄斑変性、２型糖尿病ならびに他の代謝障害の処置または防止に有用であり得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「処置」という用語は、疾患の進行を遅延、中断、阻止もしくは停止するかまたは症状を軽減し得る全てのプロセスを指すものとするが、必ずしも全症状の完全な排除を示すものではない。
【００５８】
本発明は、ＡＤ、ＭＣＩ、老衰、認知症、レビー小体型認知症、脳アミロイド血管症、多発梗塞性認知症、ダウン症候群、パーキンソン病に伴う認知症、アルツハイマー型認知症、βアミロイドに伴う認知症および加齢黄斑変性、２型糖尿病ならびに他の代謝障害からなる群から選択される疾患または病態の処置または防止に使用するための、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）による化合物、その立体異性形態またはその薬学的に許容される酸付加塩もしくは塩基付加塩にも関する。
【００５９】
本発明は、ＡＤ、ＭＣＩ、老衰、認知症、レビー小体型認知症、脳アミロイド血管症、多発梗塞性認知症、ダウン症候群、パーキンソン病に伴う認知症、アルツハイマー型認知症、βアミロイドに伴う認知症および加齢黄斑変性、２型糖尿病ならびに他の代謝障害からなる群から選択される疾患または病態の処置、防止、改善、調節またはそれらのリスクの軽減に使用するための、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）による化合物、その立体異性形態またはその薬学的に許容される酸付加塩もしくは塩基付加塩にも関する。
【００６０】
上で既に述べたように、「処置」という用語は、必ずしも全症状の完全な排除を示すものではないが、上記の障害のいずれかの対症処置を指す場合もある。式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の有用性に鑑みて、上記の疾患のいずれか１つに罹患しているヒトを含む温血動物などの対象を処置する方法または上記の疾患のいずれか１つに罹患しているヒトを含む温血動物などの対象を予防する方法が提供される。
【００６１】
前記方法は、治療有効量の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、その立体異性形態、その薬学的に許容される付加塩または溶媒和物の、ヒトを含む温血動物などの対象への投与、すなわち全身投与または局所投与、好ましくは経口投与を含む。
【００６２】
したがって、本発明は、上記の疾患のいずれかを防止および／または処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明による化合物を投与することを含む方法にも関する。
【００６３】
本発明は、βサイトアミロイド切断酵素の活性を調節する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明によるかつ特許請求の範囲で定義される化合物または本発明によるかつ特許請求の範囲で定義される医薬組成物を投与することを含む方法にも関する。
【００６４】
処置方法は、１日に１〜４回摂取する投薬計画で活性成分を投与することも含み得る。これらの処置方法では、本発明による化合物は、投与前に製剤化されることが好ましい。本明細書で下記に記載するように、好適な医薬製剤は、よく知られ、容易に入手可能な成分を使用して既知の手順で調製される。
【００６５】
アルツハイマー病またはその症状を処置または防止するのに好適であり得る本発明の化合物は、単独で投与されるか、または１種または複数の追加の治療剤と併用投与され得る。併用療法には、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物および１種または複数の追加の治療薬を含有する単一医薬投与製剤の投与ならびに式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物および各追加の治療薬（それ自体個別の医薬投与製剤）の投与が含まれる。例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物および治療薬は、患者に錠剤またはカプセル剤などの単一経口投与組成物で一緒に投与され得、または各薬剤が個別の経口投与製剤で投与され得る。
【００６６】
当業者は、本明細書に記載の疾患または病態の別の命名法、疾病分類および分類体系に精通しているであろう。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ＆Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ第５版（ＤＳＭ−５（商標））は、神経認知障害群（ＮＣＤ）（重度と軽度との両方）、特にアルツハイマー病による神経認知障害、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）による神経認知障害、レビー小体病による神経認知障害、パーキンソン病による神経認知障害または血管性ＮＣＤ（多発性梗塞を伴って存在する血管性ＮＣＤなど）などの用語を使用している。このような用語は、本明細書に記載の疾患または病態の一部の別の名称として当業者が使用する場合がある。
【００６７】
医薬組成物
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害、老衰、認知症、レビー小体型認知症、ダウン症候群、脳卒中に伴う認知症、パーキンソン病に伴う認知症およびβアミロイドに伴う認知症および加齢黄斑変性、２型糖尿病ならびに他の代謝障害など、β−セクレターゼの阻害が有益である疾患を防止または処置するための組成物も提供する。前記組成物は、治療有効量の式（Ｉ）または（ＩＩ）による化合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む。
【００６８】
活性成分を単独で投与することが可能であるが、医薬組成物としてそれを提供することが好ましい。したがって、本発明は、本発明による化合物を薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物をさらに提供する。担体または希釈剤は、組成物の他の成分と混合可能であり、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、薬学の技術分野においてよく知られる任意の方法によって調製され得る。治療有効量の特定の化合物は、有効成分として、塩基形態または付加塩形態において、薬学的に許容される担体と組み合わされて均質な混合物にされるが、これは、投与に所望される製剤の形態に応じて多様な形態をとり得る。これらの医薬組成物は、好ましくは、経口、経皮もしくは非経口投与などの全身投与；または吸入、鼻腔スプレー、点眼剤を介したものもしくはクリーム、ゲルもしくはシャンプーなどを介したものなどの局所投与に好適な単位剤形であることが望ましい。例えば、経口剤形の組成物の調製では、懸濁剤、シロップ、エリキシル剤および液剤などの経口液体製剤の場合、例えば水、グリコール、油、アルコールなど；または散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤の場合、デンプン、糖類、カオリン、滑沢剤、結合剤および崩壊剤などの固体担体など、通常の医薬媒体のいずれかを使用することができる。錠剤およびカプセル剤は、その投与が容易であるため、最も有利な経口単位剤形であり、その場合、固体医薬担体が明らかに使用される。非経口組成物の場合、担体は、通常、滅菌水を少なくとも大部分含むことになるが、例えば溶解性を促進する他の成分が含まれ得る。例えば、担体が生理食塩水、ブドウ糖溶液または生理食塩水とブドウ糖溶液との混合物を含む注射用溶液を調製することができる。注射用懸濁剤も調製することができ、その場合、適切な液体担体および懸濁化剤などが使用され得る。経皮投与に好適な組成物では、担体は、皮膚に重大な有害作用を引き起こさない任意の性質の少量の好適な添加剤と任意選択により組み合わせて、浸透促進剤および／または好適な湿潤剤を任意選択により含む。前記添加剤は、皮膚への投与を容易にすることができ、かつ／または所望の組成物の調製に役立ち得る。これらの組成物は、様々な方法で例えば経皮パッチ、スポットオンまたは軟膏として投与され得る。
【００７０】
投与を容易にし、投与量を均一にするために、前述の医薬組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書および特許請求の範囲で使用する単位剤形は、一体型投与に好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性成分を含有する。そのような単位剤形の例としては、錠剤（割線入り錠剤またはコーティング錠を含む）、カプセル剤、丸剤、分包散剤、カシェ剤、注射用溶液または懸濁剤、小さじ量および大さじ量など、ならびにそれらを分割して複合したものがある。
【００７１】
正確な投与量および投与頻度は、当業者によく知られているように、使用される式（Ｉ）または（ＩＩ）の特定の化合物、処置される特定の病態、処置される病態の重症度、特定の患者の年齢、体重、性別、障害の程度および全身の健康状態ならびにその個体が摂取している可能性がある他の医薬に依存する。さらに、前記有効１日量は、治療対象の応答に応じて、および／または本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて減少または増加され得ることが明らかである。
【００７２】
投与方法に応じて、医薬組成物は、有効成分を０．０５〜９９重量％、好ましくは０．１〜７０重量％、より好ましくは０．１〜５０重量％および薬学的に許容される担体を１〜９９．９５重量％、好ましくは３０〜９９．９重量％、より好ましくは５０〜９９．９重量％含むことになるであろう。パーセンテージは、全て組成物の全重量に基づく。
【００７３】
本化合物は、経口、経皮もしくは非経口投与などの全身投与；または吸入、鼻腔スプレー、点眼剤を介したものもしくはクリーム、ゲルもしくはシャンプーなどを介したものなどの局所投与のために使用することができる。本化合物は、経口投与されることが好ましい。正確な投与量および投与頻度は、当業者によく知られているように、使用される式（Ｉ）または（ＩＩ）による特定の化合物、処置される特定の病態、処置される病態の重症度、特定の患者の年齢、体重、性別、障害の程度および全身の健康状態ならびにその個体が摂取している可能性がある他の医薬に依存する。さらに、前記有効１日量は、治療対象の応答に応じておよび／または本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて減少または増加され得ることが明らかである。
【００７４】
単回剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の量は、処置される疾患、哺乳動物種および特定の投与方式に応じて変動するであろう。しかし、一般的な指針として、本発明の化合物の好適な単位用量は、例えば、好ましくは０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの有効化合物を含有し得る。好ましい単位用量は、１ｍｇ〜約５００ｍｇである。より好ましい単位用量は、１ｍｇ〜約３００ｍｇである。より一層好ましい単位用量は、１ｍｇ〜約１００ｍｇである。このような単位用量は、１日２回以上、例えば１日２、３、４、５または６回、しかし好ましくは１日当たり１または２回投与することができるため、体重７０ｋｇの成人のための総用量は、１回の投与当たり対象の体重１ｋｇ当たり０．００１〜約１５ｍｇの範囲である。好ましい投与量は、１回の投与につき対象の体重１ｋｇ当たり０．０１〜約１．５ｍｇであり、このような治療は、数週間または数カ月間、場合により数年間にわたり得る。しかし、当然のことながら、当業者によく理解されているように、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、処置される個体の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投与時間および投与経路、排泄率、以前投与された他の薬物ならびに治療を受ける特定の疾患の重症度を含む様々な要因に依存するであろう。
【００７５】
典型的な投与量は、１ｍｇ〜約１００ｍｇの錠剤もしくは１ｍｇ〜約３００ｍｇの錠剤を１錠、１日１回もしくは１日数回服用または活性成分の含量を比較的多く含有する徐放カプセル剤もしくは錠剤を１つ、１日１回服用とすることができる。徐放効果は、異なるｐＨ値で溶解するカプセル材料により、浸透圧で徐々に放出するカプセルにより、または他の既知の任意の放出制御手段により得ることができる。
【００７６】
当業者に明らかであろうように、これらの範囲外の投与量を使用することが必要となる場合があり得る。さらに、臨床医または治療医は、個々の患者の応答に応じて治療を開始、中断、調整または終了する方法および時点を知っているであろうことにも留意されたい。
【００７７】
上記の組成物、方法およびキットについて、当業者は、それぞれに使用するのに好ましい化合物が上記で好ましいと記載されている化合物であることを理解するであろう。組成物、方法およびキットについてより一層好ましい化合物は、下記の非限定的な実施例で提供される化合物である。
【実施例】
【００７８】
実験の部
以下では、「ａｑ．」という用語は、水性を意味し、「ｒ．ｍ．」は、反応混合物を意味し、「ｒ．ｔ．」または「ＲＴ」は、室温を意味し、「ＤＩＰＥＡ」は、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを意味し、「ＤＩＰＥ」は、ジイソプロピルエーテルを意味し、「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを意味し、「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを意味し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを意味し、「ＥｔＯＨ」は、エタノールを意味し、「ＥｔＯＡｃ」は、エチルアセテートを意味し、「ＡｃＯＨ」は、酢酸を意味し、「ｉＰｒＯＨ」は、イソプロパノールを意味し、「ｉＰｒＮＨ２」は、イソプロピルアミンを意味し、「ＭｅＣＮ」は、アセトニトリルを意味し、「ＭｅＯＨ」は、メタノールを意味し、「Ｐｄ（ＯＡｃ）２」は、パラジウム（ＩＩ）ジアセタートを意味し、「ｒａｃ」は、ラセミを意味し、「ｓａｔ．」は、飽和を意味し、「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを意味し、「ＳＦＣ−ＭＳ」は、超臨界流体クロマトグラフィー／質量分析を意味し、「ＬＣ−ＭＳ」は、液体クロマトグラフィー／質量分析を意味し、「ＧＣＭＳ」は、ガスクロマトグラフィー／質量分析を意味し、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＲＰ」は、逆相を意味し、「ＵＰＬＣ」は、超高速液体クロマトグラフィーを意味し、「Ｒｔ」は、保持時間（分）を意味し、「［Ｍ＋Ｈ］＋」は、化合物の遊離塩基のプロトン化質量を意味し、「ＤＡＳＴ」は、三フッ化ジエチルアミノ硫黄を意味し、「ＤＭＴＭＭ」は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドを意味し、「ＨＡＴＵ」は、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し、「ＨＢＴＵ」は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し、「Ｘａｎｔｐｈｏｓ」は、（９，９−ジメチル−９Ｈ−キサンテン−４，５−ジイル）ビス［ジフェニルホスフィン］を意味し、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を意味し、「Ｅｔ２Ｏ」は、ジエチルエーテルを意味し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味し、「ＮＭＲ」は、核磁気共鳴を意味し、ＬＤＡは、リチウムジイソプロピルアミドを意味し、「ＤＩＰＡ」は、ジイソプロピルアミンを意味し、「ｎ−ＢｕＬｉ」は、ｎ−ブチルリチウムを意味する。「ｈ」は、時間を意味する。「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｓｏｌ．」は、溶液を意味し、「ＢＯＣ」は、ｔ−ブトキシカルボニルを意味し、「ＤＭＡＰ」は、ジメチルアミノピリジンを意味し、「ＮＢＳ」は、Ｎ−ブロモスクシンイミドを意味し、「Ｐｄ（ＰＰｈ３）４」は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を意味し、「ＲｕＰｈｏｓ」は、［［２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジイソプロポキシビフェニル］］を意味し、「ＤＢＵ」は、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを意味し、「ＳＱＤ」は、シングル四重極検出器を意味し、「ＭＳＤ」は、質量選択検出器を意味し、「ＢＥＨ」は、架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッドを意味し、「ＤＡＤ」は、ダイオードアレイ検出器を意味し、「ＨＳＳ」は、高強度シリカを意味し、「Ｑ−Ｔｏｆ」は、四重極飛行時間型質量分析計を意味し、「ＣＬＮＤ」は、化学発光窒素検出器を意味し、「ＥＬＳＤ」は、蒸発光散乱検出器を意味する。
【００７９】
中間体１３および１４ならびに化合物１０の合成について、Ｖａｐｏｕｒｔｅｃ  Ｒ２＋Ｒ４ユニットにおいて、ベンダーによって提供される標準的なリアクターを用いてフローケミストリー反応を行った。
【００８０】
立体化学的配置の割り当ておよび図形表示
中間体／化合物の中心Ｃ４ａおよびＣ１０ａの立体配置は、以下のように示されている：
ａ）中間体／化合物がエナンチオピュアであり、絶対立体配置が知られている場合、例えば立体配置がＣ４ａ（Ｒ）、Ｃ１０ａ（Ｓ）に対応し、化合物が単一のジアステレオ異性体およびエナンチオピュアである場合、コアは、
【化１５】
2020509074.tif 000017
として表され；
ｂ）中間体／化合物がエナンチオピュアであるが、絶対立体配置が知られていない場合、コアは、
【化１６】
2020509074.tif 000018
（ここで、楔は、シスジアステレオ異性体を示すためにランダムに割り当てられている）として表され；シス相対配置の他の純粋なエナンチオマーが単離されている場合、中間体／化合物は、他の単離エナンチオマー中間体／化合物と区別するために、
【化１７】
2020509074.tif 000019
として表され；
ｃ）中間体／化合物がシス相対配置の２つのエナンチオマーのラセミ混合物である場合、コアは、
【化１８】
2020509074.tif 000020
として表されている。
【００８１】
中間体／化合物の立体化学的絶対配置は、化学合成法およびＮＭＲ（相対立体配置の割り当て）ならびに種々のエナンチオピュア類似体のＢＡＣＥ１酵素との共結晶化（示された化合物のインビトロ活性と共に、これにより化合物におけるＲ基の好ましい配向を確認することができる）に基づいて理論的に説明されている。
【００８２】
Ａ．中間体の調製
中間体１
【化１９】
2020509074.tif 000021
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＤＩＰＡ（３．５ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）の混合物を−２０℃に冷却し、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘプタン中２．７Ｍ、９．２ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分間撹拌した後、ｒ．ｍ．を−７５℃に冷却し、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の２−フルオロ−３−ヨードピリジン（５．５５ｇ、２５ｍｍｏｌ）を滴下した。−６５℃で２ｈ撹拌を続けた。ｒ．ｍ．を−７５℃に冷却し、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のギ酸エチル（２．３ｍＬ、２８ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、ナトリウムメトキシド（５．８ｍＬ、０．９５ｇ／ｍＬ、２５ｍｍｏｌ、純度２５％）を滴下した。冷却浴を取り除き、ｒ．ｍ．をｒ．ｔ．にし、塩水（５０ｍＬ）、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で処理し、層を分離した。水層をＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出し、有機層をまとめて塩水（５０ｍＬ）で処理し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、中間体１（６．１５ｇ、９４％）を得、これをそのまま次の反応工程で使用した。
【００８３】
中間体２
【化２０】
2020509074.tif 000022
トルエン（１５０ｍＬ）中のメトキシメチルトリフェニルホスホニウムクロリド（８．４ｇ、２４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物にカリウムビス（トリメチルシリル）アミド（トルエン中０．７Ｍ、３４ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を−１０℃で滴下した。この温度で３０分間撹拌を続けた。トルエン（２０ｍＬ）中の中間体１（２．１ｇ、８ｍｍｏｌ）を滴下し、２時間後、水（５０ｍＬ）でｒ．ｍ．の反応を停止させ、層を分離した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して黄褐色の油状物を得た。この油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン  ０／１００〜１０／９０）により精製して、中間体２を油状物（１．８６ｇ、８０％）として得た。
【００８４】
中間体３
【化２１】
2020509074.tif 000023
撹拌し冷却した（−７０℃）、ＴＨＦ（５００ｍＬ）中の中間体２（３０ｇ、１００ｍｍｏｌ）の混合物に、内部温度を−６５℃未満に維持しながら、イソプロピルマグネシウムクロリド−塩化リチウム錯体（１０５ｍＬ、１．３Ｍ、１４０ｍｍｏｌ）を滴下した。添加が完了したところで、撹拌を１．５ｈ続けた。次いで、シアン化銅（Ｉ）ジ（塩化リチウム）錯体溶液（１０５ｍＬ、１Ｍ、１１０ｍｍｏｌ）を−７０℃で滴下し、１５分後、臭化アリル（２８ｍＬ、３１ｍｍｏｌ）を滴下した。ｒ．ｍ．をｒ．ｔ．にし、次いで塩水（１００ｍＬ）で反応を停止させ、Ｅｔ２Ｏ（０．３Ｌ）および水（０．１Ｌ）で希釈し、層を分離した。有機層をまずアンモニアで少しずつ青色が消失するまで洗浄し（５×０．２Ｌ）、次いで塩水（０．１Ｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＤＣＭ／ヘプタン  ９８／２〜１００／０）で精製して、中間体３（１９．６ｇ、９３％）を得た。
【００８５】
中間体４
【化２２】
2020509074.tif 000024
中間体３（１９．６ｇ、９５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）溶液を撹拌し、６ＭのＨＣｌ水溶液（７０ｍＬ、４２０ｍｍｏｌ）で処理し、ｒ．ｍ．を５０℃で３０分間加熱した。ｒ．ｍを氷水（０．２Ｌ）に注ぎ入れ、ｐＨが中性になるまでＮａ２ＣＯ３飽和溶液で処理した。ｒ．ｍ．をＤＣＭ（３×０．１Ｌ）で抽出し、有機層をまとめてＭｇＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液にトリエチルアミン（４０ｍＬ、２９０ｍｍｏｌ）、次いで塩酸ヒドロキシルアミン（８ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を１ｈ続けた。ｒ．ｍ．をＮａＨＣＯ３飽和溶液（０．１Ｌ）で希釈し、層を分離した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、メカニカルスターラーを備えた１Ｌの四つ口フラスコに移し、０℃（内部温度）に冷却した。この冷却した溶液に次亜塩素酸ナトリウム（２１０ｍＬ、４７０ｍｍｏｌ）を滴下した。添加完了後、ｒ．ｍ．をｒ．ｔ．にし、ｒ．ｔ．で終夜撹拌を続けた。層を分離し、水層をＤＣＭ（０．２ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめてＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、固体を得、これをＤＩＰＥ（０．１Ｌ）から再結晶させて、中間体４（８．６４ｇ、４４％）を得た。
【００８６】
中間体５
【化２３】
2020509074.tif 000025
窒素雰囲気下において１−ブロモ−２，４−ジフルオロベンゼン（９．７ｍＬ、７０．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４３ｍＬ）中で撹拌し、−１５℃に冷却した。イソプロピルマグネシウムクロリド（ＴＨＦ中２Ｍ、４３ｍＬ、８６．１ｍｍｏｌ）を−１５℃で滴下した。ｒ．ｍ．を０〜５℃で１ｈ撹拌し、次いで再度−１５℃に冷却し、ＴＨＦ（４３ｍｌ）に溶解した中間体４（７．２ｇ、３５．２６ｍｍｏｌ）を滴下した。次いで、この混合物をｒ．ｔ．に到達させ、６０ｍＬのＮＨ４Ｃｌ飽和溶液に滴下し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、中間体５を得た（１１．１５ｇ、９９％）。
【００８７】
中間体６
【化２４】
2020509074.tif 000026
ＥｔＯＨ（４７３ｍＬ）中のＲａｎｅｙ（登録商標）−Ｎｉｃｋｅｌ（６４ｇ）およびチオフェン（ＤＩＰＥ中４％、８５ｍＬ）を水素化フラスコに入れた後、ＥｔＯＨ（４７３ｍＬ）に溶解した中間体５（１７．２ｇ、５４ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコを脱気し、次いで水素ガスでフラッシュした後、１４℃で６ｈ撹拌した。ｒ．ｍ．をｄｉｃａｌｉｔｅ（登録商標）で濾過し、ＥｔＯＨおよびＴＨＦで洗浄した後、生成物を蒸発により濃縮した。生成物を精製した（シリカ、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  ０／１００〜６／９４）。純粋な画分を蒸発させて、中間体６を得た（１０．３４ｇ、６０％）。
【００８８】
中間体７
【化２５】
2020509074.tif 000027
中間体６（１０．３４ｇ、３２ｍｍｏｌ）を氷浴中のＤＣＭ（１３０ｍＬ）に溶解した後、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のベンゾイルイソチオシアナート（７．３８ｇ、４５．１９ｍｍｏｌ）を混合物に滴下し、ｒ．ｍ．をｒ．ｔ．で１．５ｈ撹拌した。少量の氷を依然として撹拌しているｒ．ｍ．に加え、生成物を、ＤＣＭを用いて抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発によって濃縮した。有機層をカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン  ０／１００〜８０／２０）により精製した。生成物を含む画分を集め、蒸発により濃縮して、中間体７（１５ｇ、９６％）を得た。
【００８９】
中間体８および８Ａ
【化２６】
2020509074.tif 000028
窒素フロー下、ｒ．ｔ．において、中間体７（３．５ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（９１ｍＬ）中で撹拌した後、１−クロロ−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルプロペニルアミン（２．６２ｍＬ、１９．８０ｍｍｏｌ）を滴下し、ｒ．ｍ．を１０分間撹拌した。反応が完了に至ったところで、２０ｍＬのＮａＨＣＯ３飽和水溶液で反応を停止させ、１０分間撹拌した。有機物質を、ＤＣＭを用いて抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発により濃縮した。この物質をＤＩＰＥ中で撹拌して白色固体を得、これを濾別し、オーブン中で乾燥させて２．４６ｇの混合物を得、これをＰｒｅｐ  ＳＦＣ（固定相：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  Ｄｉａｃｅｌ  ＡＤ  ３０×２５０ｍｍ、移動相：ＣＯ２、０．２％のｉＰｒＮＨ２を含有するＭｅＯＨ）により精製して、中間体８（１．９９ｇ、３３％、純粋なエナンチオマー）および中間体８ａ（１．６７、２８％  純粋なエナンチオマー）を得た。
【００９０】
中間体９
【化２７】
2020509074.tif 000029
ＴＨＦ（２０ｍＬ、０．８９ｇ／ｍＬ、０．２５ｍｏｌ）中の中間体８（２．２ｇ、０．００４７ｍｏｌ）の混合物を撹拌し、ＢＯＣ無水物（１．２４ｇ、０．００５７ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５０ｍｇ、０．０００４１ｍｏｌ）で処理した。ｒ．ｔ．で１ｈ撹拌した後、ｒ．ｍ．をＮａＨＣＯ３飽和溶液（２０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめて塩水（２０ｍＬ）で処理し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、中間体９を白色泡状物（２．７７ｇ、９９％）として得た。
【００９１】
中間体１０
【化２８】
2020509074.tif 000030
ＡＣＮ（２５０ｍＬ、０．７９ｇ／ｍＬ、４．８１ｍｏｌ）中の中間体９（２．７７ｇ、０．００４９ｍｏｌ）の混合物を撹拌し、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１ｇ、０．００５６ｍｏｌ）を少量ずつ加え、そのｒ．ｍ．をｒ．ｔ．で４日間撹拌した後、さらにＮ−ブロモスクシンイミド（０．２ｇ、０．００１１ｍｏｌ）を加え、撹拌をさらに３ｈ続けた。ｒ．ｍ．を４０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３、水（０．１Ｌ）、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出し、有機層をまとめて塩水（０．１Ｌ）で処理し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、オフホワイト色の固体を得た。これを、ヘプタン中、０〜５０％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出する１２０ｇのＲｅｄｉｓｅｐフラッシュカラムを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、中間体１０を明るい白色の固体として得た（２．１ｇ、収率６７％）。
【００９２】
中間体１１
【化２９】
2020509074.tif 000031
中間体１０（１３．７１ｇ、２１ｍｍｏｌ）およびギ酸（７９．７ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）をｒ．ｔ．で１ｈ撹拌した。ｒ．ｍ．中に存在するギ酸を蒸発させ、生成物をＮａ２ＣＯ３で塩基性化した後、ＤＣＭで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発により濃縮し、ＤＩＰＥから結晶化させて、生成物を得た。この結晶を濾別し、乾燥させて、中間体１１を得た（９．３２ｇ、８１％）。
【００９３】
中間体１２
【化３０】
2020509074.tif 000032
中間体１１（９．３２ｇ、１７ｍｍｏｌ）、ＤＢＵ（２５．５ｍＬ、１７１ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（１９２．８ｍＬ）を圧力管に入れ、６０℃で終夜撹拌した。このｒ．ｍ．を蒸発により濃縮した後、この物質をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＤＣＭ〜５％ＭｅＯＨ（ＤＣＭ中））により２回精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発により濃縮して、中間体１２（６．８４ｇ、９１％）を得た。
【００９４】
中間体１３
【化３１】
2020509074.tif 000033
ＬｉＣｌ溶液（ＴＨＦ中０．５Ｍ、５ｍＬ、３ｍｍｏｌ）中の４−（ヨードメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（［１０１６９１−９４−５］、５６５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を、Ｒ２＋Ｒ４を使用し、活性化Ｚｎ（１２ｇ）を含有するカラムを通して６０℃において０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。Ｉ２／ＬｉＣｌによる滴定は、０．２８Ｍの有機亜鉛試薬濃度を示した。この溶液をさらに精製することなく次の工程で使用した。
【００９５】
中間体１４
【化３２】
2020509074.tif 000034
４−（ブロモメチル）−３，５−ジメチルシロキサゾール（４７５．１ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を、Ｒ２＋Ｒ４を使用し、活性化Ｚｎを含有するカラムを通して４０℃において０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。この溶液をそのまま次の工程に使用した。
【００９６】
Ｂ．化合物の調製
実施例１  −  化合物１の調製
【化３３】
2020509074.tif 000035
中間体１３の溶液（６０８μＬ、０．２８Ｍ、０．２ｍｍｏｌ）を中間体１２（２５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．６４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）およびＲｕＰｈｏｓ（２．６５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．２５ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を１００℃で１０分間、マイクロ波照射下で加熱した。この混合物について１０％ＮＨ４Ｃｌで反応を停止させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ  ０／１００〜１００／０）により精製した。所望の画分を集め、溶媒を蒸発させて、生成物を得、これをＲＰ  ＨＰＬＣ（固定相：Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０×１００ｍｍ  ５μｍ、移動相：ＮＨ４ＨＣＯ３／ＡＣＮ）によりさらに精製して、化合物１（２ｍｇ、８％）をオフホワイト色の泡状物として得た。
【００９７】
実施例２  −  化合物２の調製
【化３４】
2020509074.tif 000036
中間体１４の溶液（０．２７Ｍ、６７３μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を中間体１２（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（１．０２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）およびＲｕＰｈｏｓ（４．２ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．２５ｍＬ）溶液に加えた。この混合物をマイクロ波オーブン内において１００℃で１０分間加熱した。この混合物について１０％ＮＨ４Ｃｌで反応を停止させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ  ０／１００〜１００／０）により精製した。所望の画分を集め、溶媒を蒸発させて、生成物を得、これをＲＰ  ＨＰＬＣ（固定相：Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０×１００ｍｍ  ５μｍ、移動相：ＮＨ４ＨＣＯ３／ＡＣＮ）によりさらに精製して、化合物２（３．４ｍｇ、（１６％）をオフホワイト色の泡状物として得た。
【００９８】
実施例３  −  化合物５の調製
【化３５】
2020509074.tif 000037
手順ａ：中間体１２（５０ｍｇ）を（４−メトキシベンジル）亜鉛（ＩＩ）クロリド溶液（０．５Ｍ、１．１ｍＬ）に溶解した。ＲｕＰｈｏｓＰｄＧ２（５ｍｇ）を加え、反応物を８０℃で３０分間、マイクロ波照射下で加熱した。この混合物を水に注ぎ、ＤＣＭで抽出した。有機物を乾燥させ、濾過し、蒸発させて、ガムを得、これをＲＰ  ＨＰＬＣ（固定相：Ｃ１８（２）Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（登録商標）１５０ｍｍ×２１．２ｍｍ  ５μｍ；移動相  １０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４水溶液）により精製して、化合物５（９ｍｇ、１６％）を白色固体として得た。
【００９９】
実施例４  −  化合物９の調製
【化３６】
2020509074.tif 000038
２，６−ジメチルベンジルブロミド（３３．９１ｍｇ、０１７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．３５ｍＬ）溶液を、Ｒ２＋Ｒ４を使用し、活性化Ｚｎを含有するカラムを通して４０℃において０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。結果物を中間体１２（２５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．６４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ（２．６５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．２５ｍＬ）溶液に集め、マイクロ波オーブン内において１００℃で１０分間加熱した。この混合物について１０％ＮＨ４Ｃｌで反応を停止させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ  ０／１００〜１００／０）により精製した。所望の画分を集め、溶媒を蒸発させて、粗化合物９を得、これをＲＰ  ＨＰＬＣ（固定相：Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０×１００ｍｍ  ５μｍ、移動相：ＮＨ４ＨＣＯ３／ＣＨ３ＣＮ）によりさらに精製して、化合物９（９ｍｇ、３３％）をオフホワイト色の泡状物として得た。
【０１００】
実施例５  −  化合物１０の調製
【化３７】
2020509074.tif 000039
化合物１０の合成を化合物５ａの合成と類似の方法で行い、中間体９から出発し、それを中間体８〜１２と同じ合成変換に供し、次いで根岸カップリングのために、中間体１２の純粋なエナンチオマーを、（２，６−ジメチルベンジルブロミドのＴＨＦ溶液を、Ｒ２＋Ｒ４を使用して、活性化Ｚｎを含有するカラムに４０℃、０．５ｍＬ／ｍｉｎで通すことによって）インサイチューで生成した２，６−ジメチルベンジル亜鉛（ＩＩ）ブロミドと反応させて化合物１０（４０ｍｇ、７３％）を得た。
【０１０１】
実施例６
基本手順フローケミストリーによる化合物の調製
１つの容器に溶媒（例えば、ＮＭＰ（４００μＬ））中の中間体１２（２０ｍｇ）を入れた。第２の容器にブロモまたはクロロ根岸亜鉛酸塩（例えば、ベンジル亜鉛（ＩＩ）ブロミド（４００μＬ、ＴＨＦ中０．５Ｍ））を加え、第３の容器で溶媒中の触媒（例えば、ＴＨＦ（４００μＬ）中のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１．７ｍｇ、０．０５当量））を調製した。３つの容器をＧｉｌｓｏｎ  ２１５に装填し、２５０μＬの注入ループに注入し、続いて各ポンプを３３μＬ／ｍｉｎで作動させながら、８０℃に加熱した２ｍＬのステンレス鋼コイル上に注入した。流出物は、２０μＬのループを通してプラットフォームの精製およびアッセイ部に自動的に注入された。
【０１０２】
下の表１および２に例示され（＊Ｅｘ．Ｎｏ．）、上記実施例の１つと同様に調製された（Ｅｘ  Ｎｏ．で示される）式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物を列挙する。塩の形態が示されていない場合、その化合物は、遊離塩基として得られたものである。「Ｅｘ．Ｎｏ．」は、実施例番号を指し、そのプロトコルに従ってその化合物が合成された。「Ｃｏ．Ｎｏ．」は、化合物番号を意味する。
【０１０３】
【表１】
2020509074.tif 000040
【０１０４】
【表２】
2020509074.tif 000041
【０１０５】
Ｃ．分析の部
融点
値は、ピーク値または融解範囲であり、この分析方法に通常付随する実験上の不確実性を伴って得られる。複数の化合物について、ＤＳＣ８２３ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）で融点を測定した。融点を１０℃／分の温度勾配で測定した。最高温度は、３００℃であった。
【０１０６】
ＬＣＭＳ
ＬＣＭＳ基本手順１
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定を、それぞれの方法で指定されたＬＣポンプ、ダイオードアレイ（ＤＡＤ）検出器またはＵＶ検出器およびカラムを使用して行った。必要に応じて追加の検出器を含めた（下の方法の表を参照されたい）。
【０１０７】
カラムからの流れを、大気圧イオン源を備えた質量分析計（ＭＳ）に導入した。化合物の公称モノアイソトピック分子量（ＭＷ）の特定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えば、走査範囲、データ取込時間など）を設定することは、当業者の知識の範囲内である。データ取得は、適切なソフトウェアを用いて行った。化合物は、それらの実測保持時間（Ｒｔ）およびイオンで表される。データの表で別に指定しない場合、報告した分子イオンは、［Ｍ＋Ｈ］＋（プロトン化分子）および／または［Ｍ−Ｈ］−（脱プロトン化分子）に対応する。化合物を直接イオン化できなかった場合、付加物の種類を記載する（すなわち［Ｍ＋ＮＨ４］＋、［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−など）。複数の同位体パターンを有する分子（Ｂｒ、Ｃｌなど）について、報告される値は、最も低い同位体質量について得られた値である。全ての結果は、用いられた方法に通常付随する実験上の不確実性を伴って得られた。
【０１０８】
以下では、「ＳＱＤ」は、シングル四重極検出器を意味し、「ＭＳＤ」は、質量選択検出器を意味し、「ＲＴ」は、室温を意味し、「ＢＥＨ」は、架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッドを意味し、「ＤＡＤ」は、ダイオードアレイ検出器を意味し、「ＨＳＳ」は、高強度シリカを意味し、「Ｑ−Ｔｏｆ」は、四重極飛行時間型質量分析計を意味し、「ＣＬＮＤ」は、化学発光窒素検出器を意味し、「ＥＬＳＤ」は、蒸発光散乱検出器を意味する。
【０１０９】
【表３】
2020509074.tif 000042
【０１１０】
【表４】
2020509074.tif 000043
【０１１１】
ＬＣＭＳ基本手順２
ＨＰＬＣ−ＭＳを、ベンダーソフトウェア（ＯｐｅｎＬｙｎｘ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（商標）ｖ４．１、ＳＱ検出器ｖ４．１、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｒｉｖｅｒ  Ｖ４．１およびＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）ｖ４．１）を使用する、質量分析システム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）にタンデム連結された、ＰＤＡ検出器、二元溶媒マネージャーおよびＳＱ検出器を含むＡｃｑｕｉｔｙ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＵＫ）を使用して実施した。平行蒸発光散乱検出器（３８５−ＬＣ、Ｖａｒｉａｎ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）を、アクティブスプリッタ（Ｍｏｄｅｌ  ＥＨＭＡ、１０ポートバルブ；Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ、独自のＣｙｃｌｏｆｌｕｉｄｉｃハードウェアによりアクティブスプリットを実現）を介してシステムに組み込んだ。直接注入質量分析を、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）ｖ２．０  ＳＲ２、Ｔｕｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｖ２．０およびＱｕａｌ  Ｂｒｏｓｗｅｒ  ｖ２．０ベンダーソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用するＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱｄｕｏで行った。
【０１１２】
【表５】
2020509074.tif 000044
【０１１３】
【表６】
2020509074.tif 000045
【０１１４】
ＮＭＲ
複数の化合物について、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、３００ＭＨｚ  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄマグネットを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ、４００ＭＨｚで運転するＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−４００分光器、５００ＭＨｚで運転するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  Ｉ、３６０ＭＨｚで運転するＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−３６０または６００ＭＨｚで運転するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００分光器において、クロロホルム−ｄ（重水素化クロロホルム、ＣＤＣｌ３）またはＤＭＳＯ−ｄ６（重水素化ＤＭＳＯ、ジメチル−ｄ６スルホキシド）を溶媒として用いて記録した。化学シフト（δ）は、内部標準として使用したテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告する。
【０１１５】
【表７】
2020509074.tif 000046
【０１１６】
Ｄ．薬理学的な実施例
本発明で提供される化合物は、β部位ＡＰＰ切断酵素１（ＢＡＣＥ１）の阻害剤である。アスパラギン酸プロテアーゼであるＢＡＣＥ１の阻害は、アルツハイマー病（ＡＤ）の処置に適していると考えられている。βアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からのβアミロイドペプチド（Ａβ）の産生および蓄積は、ＡＤの発症および進行において重要な役割を果たしていると考えられている。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からＡβドメインのＮ末端側およびＣ末端側をそれぞれβ−セクレターゼおよびγセクレターゼで順次切断することにより産生される。
【０１１７】
式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、その酵素活性阻害能により、ＢＡＣＥ１において実質的にその効果を有すると予想される。このような阻害剤の挙動は、下記の生化学的蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイおよびＳＫＮＢＥ２細胞における細胞αＬｉｓａアッセイを用いて試験され、これらのアッセイは、このような化合物、とりわけ式（Ｉ）による化合物の同定に好適であり、表８および表９に示す。
【０１１８】
ＢＡＣＥ１の生化学的ＦＲＥＴに基づくアッセイ
このアッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイである。このアッセイのための基質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）β−セクレターゼ切断部位の「スェーデン」Ｌｙｓ−Ｍｅｔ／Ａｓｎ−Ｌｅｕ変異を含有する、ＡＰＰ由来の１３アミノ酸ペプチドである。この基質は、２つのフルオロフォアも含有する。すなわち、（７−メトキシクマリン−４−イル）酢酸（Ｍｃａ）は、３２０ｎｍの励起波長と４０５ｎｍの発光とを有する蛍光ドナーであり、２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）は、専有の消光剤アクセプターである。これらの２つの基間の距離は、光励起すると、共鳴エネルギー移動を通してドナー蛍光エネルギーがアクセプターにより顕著に消光されるように選択されている。ＢＡＣＥ１により切断されると、フルオロフォアＭｃａが消光基Ｄｎｐから分離され、ドナーの十分な蛍光収率が回復される。蛍光の増強は、タンパク質分解速度と直線的に相関する。
【０１１９】
簡潔に述べると、３８４ウェルフォーマットで最終濃度０．０４μｇ／ｍｌの組換えＢＡＣＥ１タンパク質を化合物またはＤＭＳＯの存在下においてインキュベーションバッファ（５０ｍＭクエン酸バッファ  ｐＨ５．０、０．０５％ＰＥＧ）中、２０μＭ基質と共に室温で４５０分間インキュベートする。次に、様々なインキュベーション時間（０、３０、６０、９０、１２０および４５０分）で蛍光測定（励起３２０ｎｍおよび発光４０５ｎｍ）によってタンパク質分解量を直接測定する。全ての実験に対して、時間曲線（０分〜１２０分で３０分毎）を使用して、高対照の最小基底シグナルが見出される時間を決定する。この時点（Ｔｘ）のシグナルを、４５０分の時点のシグナルから減算するために使用する。結果をＴ４５０とＴｘとの間の差としてＲＦＵで表す。
【０１２０】
最小二乗和法により、％対照ｍｉｎ対化合物濃度のプロットに対して最良適合曲線をフィットさせる。これから、ＩＣ５０値（活性の５０％阻害を引き起こす阻害濃度）を得ることができる。
ＬＣ＝低対照値の中央値
＝低対照：酵素を用いない反応
ＨＣ＝高対照値の中央値
＝高対照：酵素を用いた反応
％効果＝１００−［（試料−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００］
％対照＝（試料／ＨＣ）×１００
％対照ｍｉｎ＝（試料−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００
【０１２１】
次の例示化合物を基本的に上記のように試験し、次の活性が示された。
【０１２２】
【表８】
2020509074.tif 000047
【０１２３】
ＳＫＮＢＥ２細胞における細胞αＬＩＳＡアッセイ
２つのαＬｉｓａアッセイにおいて、全Ａβレベルと、産生され、ヒト神経芽細胞腫ＳＫＮＢＥ２細胞の培地中に分泌されるＡβ１−４２のレベルとを定量する。このアッセイは、野生型アミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ６９５）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＫＮＢＥ２に基づいている。本化合物を希釈し、これらの細胞に添加し、１８時間インキュベートし、次いでＡβ１−４２および全Ａβの測定を行う。全ＡβおよびＡβ１−４２をサンドイッチαＬｉｓａによって測定する。αＬｉｓａは、ストレプトアビジンコートビーズおよび抗体Ａｂ４Ｇ８またはｃＡｂ４２／２６結合アクセプタービーズに付着したビオチン化抗体ＡｂＮ／２５を用いる、それぞれ全ＡβおよびＡβ１〜４２を検出するためのサンドイッチアッセイである。全ＡβまたはＡβ１−４２の存在下において、ビーズは、極めて接近する。ドナービーズの励起により一重項酸素分子の放出が起こり、それによりアクセプタービーズで一連のエネルギー移動が起こり、その結果、発光が生じる。発光を１時間のインキュベーション後に測定する（励起６５０ｎｍおよび発光６１５ｎｍ）。
【０１２４】
最小二乗和法により、％対照ｍｉｎ対化合物濃度のプロットに対して最良適合曲線をフィットさせる。これから、ＩＣ５０値（活性の５０％阻害を引き起こす阻害濃度）を得ることができる。
【０１２５】
ＬＣ＝低対照値の中央値
＝低対照：αＬｉｓａにおいてビオチン化Ａｂを用いることなく、化合物なしで予備インキュベートした細胞
ＨＣ＝高対照値の中央値
＝高対照：化合物なしでプレインキュベートした細胞
％効果＝１００−［（試料−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００］
％対照＝（試料／ＨＣ）×１００
％対照ｍｉｎ＝（試料−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００
【０１２６】
次の例示化合物を基本的に上記のように試験し、次の活性が示された。
【０１２７】
【表９】
2020509074.tif 000048
【０１２８】
ＢＡＣＥ２の生化学的ＦＲＥＴに基づくアッセイ
このアッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイである。このアッセイのための基質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）β−セクレターゼ切断部位の「スェーデン」Ｌｙｓ−Ｍｅｔ／Ａｓｎ−Ｌｅｕ変異を含有する。この基質は、２つのフルオロフォアも含有する。すなわち、（７−メトキシクマリン−４−イル）酢酸（Ｍｃａ）は、３２０ｎｍの励起波長と４０５ｎｍの発光とを有する蛍光ドナーであり、２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）は、専有の消光剤アクセプターである。これらの２つの基間の距離は、光励起すると、共鳴エネルギー移動を通してドナー蛍光エネルギーがアクセプターにより顕著に消光されるように選択されている。β−セクレターゼにより切断されると、フルオロフォアＭｃａが消光基Ｄｎｐから分離され、ドナーの十分な蛍光収率が回復される。蛍光の増強は、タンパク質分解速度と直線的に相関する。
【０１２９】
簡潔に述べると、３８４ウェルフォーマットで化合物の非存在下または存在下においてインキュベーションバッファ（５０ｍＭクエン酸バッファ  ｐＨ５．０、０．０５％ＰＥＧ、ＤＭＳＯなし）中、１０μＭ基質と共に最終濃度０．４μｇ／ｍｌの組換えＢＡＣＥ２タンパク質を室温で４５０分間インキュベートする。次に、タンパク質分解量をＴ＝０およびＴ＝４５０で蛍光測定（励起３２０ｎｍおよび発光４０５ｎｍ）によって直接測定する。結果をＴ４５０とＴ０との間の差としてＲＦＵ（相対蛍光単位）で表す。
【０１３０】
最小二乗和法により、％対照ｍｉｎ対化合物濃度のプロットに対して最良適合曲線をフィットさせる。これから、ＩＣ５０値（活性の５０％阻害を引き起こす阻害濃度）を得ることができる。
【０１３１】
ＬＣ＝低対照値の中央値
＝低対照：酵素を用いない反応
ＨＣ＝高対照値の中央値
＝高対照：酵素を用いた反応
％効果＝１００−［（試料−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００］
％対照＝（試料／ＨＣ）×１００
％対照ｍｉｎ＝（試料−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００
【０１３２】
次の例示化合物を基本的に上記のように試験し、次の活性が示された。
【０１３３】
【表１０】
2020509074.tif 000049
【０１３４】
生化学的アッセイ  −  自動
一般的方法
他に示さない限り、全ての生化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、Ｕ．Ｋ．から購入し、分析用またはより高級な非水性溶媒はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、Ｕ．Ｋ．から購入した。ＭｉｌｌｉＱ水（Ｅｌｉｘ  ５＆ＭｉｌｌｉＱ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、生物学的バッファを作るためのベース水性溶媒として使用した。５０ｍＭクエン酸溶液（１．００２４４；Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５０ｍＭクエン酸三ナトリウム（１．０６４４８；Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の撹拌溶液に最終ｐＨが５．０に達するまで添加することによってベースアッセイバッファを調製した。これに、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）（Ｐ１４５８；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の４０％溶液を０．０５％の最終濃度まで添加し、したがって、ベースバッファは、０．０５％ＰＥＧを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０から構成された。全てのアッセイを３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ４５１４；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でルーチン的に実施し、３７±１℃で６０分間インキュベートした後、終点蛍光強度を読み取った。（７−メトキシルクマリン−４−イル）酢酸ベースの基質β−セクレターゼ基質ＶＩ（Ｍ２４６５；Ｂａｃｈｅｍ）を１００％ＤＭＳＯ（Ｄ／４１２１／ＰＢ０８；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中の１ｍＭストックとして調製した。ベースバッファにＤＭＳＯを最終濃度１％（体積／体積）まで添加することによってアッセイバッファを調整した。β−セクレターゼＩ（１８．６４μＭ；「ＢＡＣＥ１」）およびβ−セクレターゼＩＩ（４．６５μＭ；「ＢＡＣＥ２」）をＪａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ、Ｂｅｅｒｓｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手し、凍結アリコート（約２０μｌ）として保存し、必要に応じて解凍した。
【０１３５】
手動アッセイ
典型的には、１２．５μｌのアッセイバッファをアッセイプレートのＢ〜Ｐ列に分配した。Ａ列に対し、アッセイバッファで適切に希釈した試験化合物１８．７５μｌを添加した。試料の６．２５μｌアリコートをＡ列からＢ列に移し、試料をピペットで３回混合した。このプロセスをプレートに沿って繰り返し、６．２５μｌの溶液をＮ列での混合後に廃棄した。Ｏ列およびＰ列を陽性および陰性対照とした。Ｐ列に６．２５μｌのベースバッファを加えた。Ａ列〜Ｏ列に対し、ベースバッファで希釈した６．２５μｌの酵素（新しく調製した４０ｎＭのＢＡＣＥ１または４０ｎＭのＢＡＣＥ２）を加えた。１００％ＤＭＳＯ溶液中の１ｍＭをＨＰＬＣグレードの水（Ｏｐｔｉｍａ  Ｗ６−２１２；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に希釈して作った、新たに調製した８０μＭ基質６．２５μｌを全ウェルに添加し、アッセイを開始した。アッセイプレートを覆い、３７±１℃で６０分間インキュベートした。ウェルの蛍光強度を、３６０／４０５ｎｍ（励起／発光）で１ウェル当たり９回の読み取りプロトコル（５０ｍｓインテグレーション；密度３、０．２５ｍｍ間隔；ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｐａｒａｄｉｇｍプレートリーダー；ＴＵＮＥカートリッジ；ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ  ６．３ソフトウェア；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて読み取り、９回の読み取りの中央値をテキストファイルとして出力した。ベンダーから供給される非線形回帰分析モデルを用いたＰｒｉｓｍソフトウェアｖ６．３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、データの分析を行った。ＩＣ５０を決定するために、４パラメータロジスティック可変傾斜モデルを用いて、生蛍光強度データを陰性対照に固定された「ボトム」にフィットさせた。
【０１３６】
自動バイオアッセイハードウエア
ＣｙｃｌＯｐｓバイオアッセイモジュールは、画分収集ステーション、試薬ステーション、液体処理ロボット、プレートストアおよび統合プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｐａｒａｄｉｇｍ、ＴＵＮＥカートリッジ、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ６．３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から構成された。分画収集ステーションは、Ｈポータルキャリッジ（Ｆｅｓｔｏ  ＡＧ＆ＣｏＫＧ、Ｅｓｓｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に搭載された３８４ウェル収集プレート（Ｐ−３８４−２４０ＳＱ−Ｃ；Ａｘｙｇｅｎ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、シリンジドライブおよび２００μｌループを備えた２方向６ポート注入バルブ（ＶＩＣＩ  ＡＧ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｃｈｅｎｋｏｎ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から構成された。注入バルブの出力は、３８４ウェル収集プレートの全ての位置にアドレス可能であった。試薬ステーションは、油圧冷却（１０〜１２℃）アルミニウムセグメントからなり、各セグメントは、ＳＢＳマイクロタイタープレートフットプリントを収容するように作製された。独立したアドレス可能な試薬ステーションをこれらのセクション内に収容した。必要に応じて、標準的な実験室用プラスチック器具（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ、Ｆａｌｃｏｎチューブなど）を収容するために特注のアルミニウムハウジングを使用した。必要に応じて、試薬リザーバを覆い、蓋は、テフロン（登録商標）被覆プローブが溶液に到達できる穴を含んだ。液体処理システムに存在する試薬は以下のとおりであった。
・覆った試薬リザーバ（３９０００７；Ｐｏｒｖａｉｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｌｅａｔｈｅｒｈｅａｄ、ＵＫ）に収容されたプローブ洗浄溶液（約１５０ｍｌ；３３．３：３３．３：３３．３  水：プロパン−２−オール（Ｐ／７５０８／１７；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）：メタノール（Ｍ／４０５８／１７；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））
・アッセイバッファ溶液
・ＨＰＬＣグレード水
・５ｍｌ用Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（００３０  １１９．４０１；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入った、ベースバッファで希釈された４０ｎＭのＢＡＣＥ１
・１．５ｍｌ用Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（００３０  ０００．９１９；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入った、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０％グリセロール（１６３７４；ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を含有する２５ｍＭのトリス（６４８３１１；Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）、ｐＨ７．５で希釈された４００ｎＭのＢＡＣＥ２
・１．５ｍｌ用Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入った、１００％ＤＭＳＯ中の１ｍＭの基質（周囲温度で保持）
・２本の空の１．５ｍｌ用Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ
【０１３７】
液体処理システムは、グリッパーアームおよび単一のテフロン被覆ステンレス鋼プローブを備えたＬＩＳＳＹシステム（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から構成された。全ての液体処理工程間において、テフロン被覆ステンレス鋼プローブをプローブ洗浄溶液で洗浄し、続いてシステム液（水）で洗浄した。バイオアッセイシステムの制御は、ＷｉｎＬＩＳＳＹソフトウェア（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｋ）およびＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ（これは、ＷｉｎＬＩＳＳＹ自動化コマンド制御下にあった）を使用して行った。プレートストアは、アッセイプレートのスタック（Ｃｏｓｔａｒ  ４５１４）を収容した。入力リレーおよび出力リレーは、バイオアッセイモジュールとＣｙｃｌＯｐｓ制御ソフトウェアとの間の接点閉鎖制御およびフィードバックを可能にした。プレートストアは、液体処理システムによって到達され得るアッセイプレートのスタックを収容するアルミニウムラックであった。
【０１３８】
自動バイオアッセイプロセス
希釈モジュールの出力は、「ロード」位置に設置された収集ステーション注入弁を通って流れた。入力ポーリングモードに設定されたＷｉｎＬＩＳＳＹにより、ＣｙｃｌＯｐｓ制御ソフトウェアによる接点閉鎖でバイオアッセイプロトコルを開始した。第１の動作は注入弁を「注入」位置に作動させ、ループ内容物を分離し、画分収集システムは、ループ内容物を収集プレート上のアドレス可能なウェルに分配した。同時に、液体処理システムは、アッセイプレートを液体処理ベッド上のアッセイステーションに送達した。アッセイプレートのカラムに対し、液体ハンドリングシステムは、１２．５μｌのアッセイ緩衝液をＢ列からＰ列までアッセイプレートの２つのカラムに分配した。Ａ列には、収集プレートの各ウェルから１８．７５μｌの試験化合物を加えた。Ａ列からのサンプルの６．２５μｌアリコートをＢ列に移した。このプロセスを両方のカラムに対してプレートに沿って繰り返し、６．２５μｌの試薬をＮ列で廃棄した。Ｏ列およびＰ列は、陽性対照および陰性対照とした。Ｐ列に６．２５μｌのアッセイバッファを加えた。第１のカラムのＡ列〜Ｏ列に対し、ベースバッファ中に保存された６．２５μｌの４０ｎＭのＢＡＣＥ１を添加した。ＢＡＣＥ２酵素を添加するために、１７．５μｌの４００ｎＭのＢＡＣＥ２を１５７．５μｌのベースバッファで希釈した。これを、指定された受入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で１７５μｌの溶液を５回ピペッティングすることによって混合し、次いで６．２５μｌの希釈ＢＡＣＥ２をそれぞれのカラムに加えた。ＭＣＡ基質について、１００％ＤＭＳＯ中の３０．８μｌの１ｍＭのＭＣＡ基質を３８５μｌのＨＰＬＣ水で希釈した。これを、指定された受入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で４００μｌを５回ピペッティングすることによって混合し、次いで６．２５μｌをそれぞれのカラムに加えた。次いで、アッセイプレートをプレートリーダーキャリッジに移し、引出しを閉じ、アッセイインキュベーションを開始した。６０分後、ＷｉｎＬＩＳＳＹは、蛍光強度を読み取るプロトコルファイルをロードして実行するようにプレートリーダーに指示するサブルーチンを実行した。このプロトコルファイルは、マイクロタイタープレートを読み取り、対応するデータをテキストファイルとして書き込むのに必要なパラメータを含んだ。１ウェル当たり９回の読み取りプロトコル（５０ｍｓインテグレーション；密度３、０．２５ｍｍ間隔）のプロトコルを用いて、蛍光強度を３６０／４０５ｎｍ（励起／発光）で読み取り、９回の読み取りの中央値をテキストファイルとして出力した。
【０１３９】
ＣｙｃｌＯｐｓバイオアッセイデータ分析
ＣｙｃｌＯｐｓソフトウェアを、バイオアッセイ共有データファイルフォルダをポーリングするように設定した。データを保存する際、ＷｉｎＬＩＳＳＹは、バイオアッセイが完了したことをＣｙｃｌＯｐｓソフトウェアに通知する出力接点閉鎖信号を送信した。ＣｙｃｌＯｐｓソフトウェアが開き、処理し、データを分析した。データ処理は、被験物質の各濃度を対応する列に（希釈モジュールから受け取ったデータと共に）付加することからなった。その後、データは、４パラメータロジスティックモデルを用いる非線形回帰分析によって分析され（ＭＡＴＬＡＢ；ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）、ＩＣ５０が決定された。スパンは、ベースライン（すなわちＰ列）と最大観察陽性対照率（すなわちＯ列）との間で固定した。データの品質を維持するために、自動バイオアッセイデータ分析を管理するためのルールを設定した。第１の例において、７５パーセント以上の活性または２５パーセント以下の活性が観察された場合、データを排除した。これにより、良好な分析を実施するのに十分な滴定データが存在することが確実になった。その後、適合の質をＲ−２乗値によって判定した。この値が０．８５を下回った場合、データを排除した。全ての場合において、排除は、システムに報告されるバイオアッセイ失敗タグをもたらした。外れ値の分析を、以前に記載されているように（Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｅ．，（２００６），ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７，１２３）、Ｑ値１０％で行った。自動ＩＣ５０分析では、適合フラグのエラーが生成される前に最大３つの外れ値を除外することができる。バイオアッセイデータの交差検証を、非線形回帰分析４パラメータロジスティック可変傾斜モデルを用いるＰｒｉｓｍソフトウェアｖ６．３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．）を用いて同じものを分析して、生蛍光強度データを陰性対照に固定された「ボトム」に適合させることによって達成した。
【０１４０】
【表１１】
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【国際調査報告】
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