(57)【要約】  共有結合、例えば、イソペプチド結合を形成して、キャプシドタンパク質上に標的化リガンドを提示する特異的タンパク質：タンパク質結合対を介して、組換えウイルスキャプシド粒子を再配向させるための組成物および方法を本明細書に提供し、この標的化リガンドが、対象細胞上に発現される細胞表面マーカーに特異的に結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質に操作可能に連結されたタンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバーを含み、任意選択的に、前記第１のメンバーがペプチドタグであり、任意選択的に、前記第１のメンバーおよび／または変異が前記キャプシドタンパク質の天然指向性を減少させるかまたは無効にする、組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質：タンパク質結合対の第２の同族メンバーをさらに含み、前記第１および第２のメンバーが共有結合によって結合されている、請求項１に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項３】
前記共有結合がイソペプチド結合である、請求項２に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項４】
前記第２のメンバーが標的化リガンドに操作可能に連結され、任意選択的に、前記標的化リガンドが結合部分である、請求項２または３に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項５】
前記第１のメンバーは、前記第１のメンバーを前記キャプシドタンパク質に連結する第１および／または第２のリンカーと隣接し、前記第１および／または第２のリンカーが、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項６】
前記第１および第２のリンカーが同一ではない、請求項５に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項７】
前記第１および第２のリンカーが同一であり、１０アミノ酸長である、請求項５に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項８】
前記ウイルスキャプシドタンパク質のその天然受容体への結合に関与するアミノ酸位置に変異をさらに含み、前記変異が、異種ペプチドの前記キャプシドタンパク質への挿入、前記キャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸の異種ペプチドとの置換、前記キャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項９】
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質の形質導入効率が、
（ｉ）１０％減少されるか、
（ｉｉ）２０％減少されるか、
（ｉｉｉ）３０％減少されるか、
（ｉｖ）４０％減少されるか、
（ｖ）５０％減少されるか、
（ｖｉ）６０％減少されるか、
（ｖｉｉ）７０％減少されるか、
（ｖｉｉｉ）８０％減少されるか、
（ｉｘ）９０％減少されるか、または
（ｘ）無効にされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１０】
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のキャプシド遺伝子に由来し、前記キャプシド遺伝子が、ＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、任意選択的に、前記キャプシドの結合に関与するアミノ酸位置に変異をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１１】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される、請求項１０に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１２】
前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ２である、請求項１０に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１３】
前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ９である、請求項１０に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質：タンパク質結合対が、
（ｉ）ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、
（ｉｉ）ＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇ、
（ｉｉｉ）イソペプタグ：ピリン−Ｃ、
（ｉｖ）ＳｎｏｏｐＴａｇ：ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、または
（ｖ）ＳｐｙＴａｇ００２：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１５】
前記第１のメンバーおよび任意のリンカーが一緒になって約５０以下のアミノ酸長である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１６】
前記第１のメンバーがＳｐｙＴａｇである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１７】
前記第２の同族メンバーがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１８】
前記第２の同族メンバーがＫＴａｇである、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項１９】
前記第１のメンバーがＫＴａｇであり、前記第２の同族メンバーがＳｐｙＴａｇである、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２０】
前記第１のメンバーがＳｎｏｏｐＴａｇであり、前記第２の同族メンバーがＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒである、
請求項２〜１５のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２１】
前記第１のメンバーがイソペプタグであり、前記第２の同族メンバーがピリン−Ｃである、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２２】
前記第１のメンバーがＳｐｙＴａｇ００２であり、前記第２の同族メンバーがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２である、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２３】
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質または前記組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドが、適切な標的化リガンドを含む前記ウイルスキャプシドタンパク質またはキャプシドと比較して、前記適切な標的化リガンドの非存在下で標的細胞に感染することが減少されるかまたは無効にされている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２４】
前記結合部分が、抗体またはその一部分である、請求項４〜２３のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２５】
前記抗体またはその一部分がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合されている、請求項２４に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２６】
前記抗体またはその一部分が、Ｃ末端でリンカーに融合されており、前記リンカーが、前記リンカーのＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合されている、請求項２５に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２７】
前記リンカーが、配列番号４８（ＧＳＧＥＳＧ）として表される配列を含む、請求項２６に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２８】
前記標的化リガンドが、配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含む、請求項４〜２７のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２９】
前記標的化リガンドが、細胞表面分子に特異的に結合し、任意選択的に、細胞表面マーカーが、
（ｉ）アシアロ糖タンパク質１（ＡＳＧＲ１）、
（ｉｉ）ＥＮＴＰＤ３、
（ｉｉｉ）ＰＴＰＲＮ、
（ｉｖ）ＣＤ２０、
（ｖ）ＣＤ６３、または
（ｖｉ）Ｈｅｒ２である、請求項４〜２８のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項３０】
前記細胞表面分子がアシアロ糖タンパク質１（ＡＳＧＲ１）である、請求項２９に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項３１】
前記細胞表面分子がＣＤ６３である、請求項２９に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項３２】
前記細胞表面分子がＥＮＴＤＰ３である、請求項２９に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む、組換えウイルスキャプシド。
【請求項３４】
前記特異的結合対の任意のメンバーを欠いている参照ウイルスキャプシドタンパク質をさらに含む、請求項３３に記載の組換えウイルスキャプシド。
【請求項３５】
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質および前記参照ウイルスキャプシドタンパク質が、それぞれ、前記ウイルス粒子のその天然リガンドとの結合に関与する少なくとも１つの残基の変異を含む、請求項３４に記載の組換えウイルスキャプシド。
【請求項３６】
１：１〜１：１５の比率で前記組換えウイルスキャプシドタンパク質および前記参照ウイルスキャプシドタンパク質を含む、請求項３４または３５に記載の組換えウイルスキャプシド。
【請求項３７】
請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドによって封入された対象ヌクレオチドを含む、組換えウイルスベクター。
【請求項３８】
前記対象ヌクレオチドが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項３７に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項３９】
前記対象ヌクレオチドが、ヒトプロモーターの制御下にある、請求項３７に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項４０】
前記対象ヌクレオチドが、非ヒトプロモーターの制御下にある、請求項３７に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項４１】
前記対象ヌクレオチドがレポーター遺伝子である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項４２】
前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項４１に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項４３】
前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子がコード）、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ＭｍＧＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせをコードする、請求項４１に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項４４】
前記対象ヌクレオチドが、治療用タンパク質、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたはその一部分（複数可）をコードするヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド、およびｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
【請求項４５】
（ａ）請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のウイルスキャプシド、または請求項３７〜４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター、および（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項４６】
対象ヌクレオチドを標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載のウイルス粒子または請求項４５に記載の組成物に接触させることを含み、前記ウイルスキャプシドが、前記標的細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する標的化リガンドを含む、方法。
【請求項４７】
前記標的細胞が、生体外にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的細胞が、対象の生体内にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が、ヒトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的細胞が、ヒト標的細胞である、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的細胞がヒト肝細胞であり、前記標的化リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ１）に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的細胞がヒト神経細胞であり、前記標的化リガンドがＧＡＢＡに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的細胞がヒトＴ細胞であり、前記標的化リガンドが、ＣＤ３、任意選択的にＣＤ３εに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的化リガンドがＰＴＰＲＮに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的細胞がヒト造血細胞であり、前記標的化リガンドがＣＤ３４に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的細胞がヒト腎細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的細胞がヒト癌細胞であり、前記標的化リガンドが腫瘍関連抗原に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記腫瘍抗原がＥ６、Ｅ７、またはＨｅｒ２である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的化リガンドがＣＤ２０に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的化リガンドがヒトグルカゴン受容体に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的化リガンドがＣＤ６３に特異的に結合する、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的化リガンドが、ヒト細胞外ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ３（ｈＥＮＴＰＤ３）に特異的に結合する、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
足場および／またはアダプターを有するウイルスキャプシドタンパク質を提供する方法であって、
（ａ）特異的タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバーをコードする核酸、および任意選択的にリンカーを、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、前記特異的結合対の前記第１のメンバーを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意選択的に前記リンカーを形成する、挿入することと、
（ｂ）ウイルス粒子の生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、前記パッケージング細胞が前記核酸を含む、培養することと、を含む、方法。
【請求項６４】
ウイルス粒子を生成する方法であって、前記ウイルス粒子の生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することを含み、前記パッケージング細胞が、特異的タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバーを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意選択的に前記第１のメンバーを前記キャプシドタンパク質に連結するアミノ酸リンカーを含む、方法。
【請求項６５】
前記パッケージング細胞が、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび／または導入プラスミドをさらに含む、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記パッケージング細胞が、参照モザイクキャプシドをコードするプラスミドをさらに含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記パッケージング細胞を溶解することと、アデノ随伴ウイルスベクターを細胞可溶化物から単離することと、をさらに含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ａ．細胞片を除去することと、
ｂ．ウイルス粒子を含有する上清をヌクレアーゼで処理することと、
ｃ．ウイルス粒子を濃縮することと、
ｄ．前記ウイルス粒子を精製することと、
ｅ．ａ〜ｄの任意の組み合わせと、をさらに含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、前記キャプシドタンパク質の天然指向性に関与する位置にアミノ酸の変異をさらに含み、前記変異が、前記キャプシドタンパク質への異種ペプチドの挿入、前記キャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸の異種ペプチドとの置換、前記キャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法に従って作製される、ウイルス粒子。
【請求項７１】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞。
【請求項７２】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
ＥＦＳウェブ経由でテキストファイルとして提出
ファイル１０３５９ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記述されている配列表は、１８３キロバイトであり、２０１８年６月２７日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書の開示は、概して、遺伝物質の細胞への標的化導入に有用な指向性改変組換えウイルス粒子およびそれらを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
特定の標的細胞への遺伝子の送達は、様々な慢性疾患および遺伝的疾患の潜在的治療のための現代医学における最も重要な技術のうちの１つとなっている。現在のところ、理想的な遺伝子送達媒体がないために、遺伝子療法の臨床適用における進歩が制限されている。治療的な成功を達成するために、遺伝子送達媒体は、非標的細胞の形質導入を回避しながら、標的細胞を形質導入することができる必要がある。具体的には、ウイルスの天然指向性が所望の治療標的組織または細胞タイプに合わない場合、天然指向性が削除または軽減され、所望の指向性が首尾よく操作されている組換えウイルス粒子に対する必要性がある。（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら）
【０００４】
近年では、ベクター開発の大部分の進展は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびアデノウイルス（Ａｄ）などの非エンベロープウイルス（例えば、エンベロープ（例えば、脂質二重層）を有しないウイルスキャプシドタンパク質によって形成されるキャプシドを含むウイルス）、ならびにレトロウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルスなどのエンベロープウイルス（例えば、キャプシドが脂質二重層によって囲まれているウイルス）を使用して達成されている。ＡＡＶは、控えめな免疫原性のみであり、毒性の所見なしに広範囲の種および組織を生体内に形質導入することができるため、ＡＡＶ系ベクターは多くの研究の焦点となっている。
【０００５】
ＡＡＶは、小さな非エンベロープ性の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶゲノムは、４．７ｋｂであり、それぞれ、２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）、およびＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレームによって特徴付けられる。２つのＩＴＲは、ＡＡＶ複製およびキャプシド形成に必要不可欠な唯一のシスエレメントである。Ｒｅｐリーディングフレームは、分子量７８ｋＤ、６８ｋＤ、５２ｋＤ、および４０ｋＤの４つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、主に、ＡＡＶゲノムの転写および複製を調節する機能を果たす。Ｃａｐリーディングフレームは、８３〜８５ｋＤ（ＶＰ１）、７２〜７３ｋＤ（ＶＰ２）、および６１〜６２ｋＤ（ＶＰ３）の分子量を有する３つの構造（キャプシド）ウイルスタンパク質（ＶＰ）をコードする。ＡＡＶビリオンにおける総タンパク質のうちの８０％以上は、ＶＰ３を含み、成熟ビリオンＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３において、およそ１：１：１０の相対的存在量で見出されている。生体内で、３つのタンパク質は、ビリオン様構造、例えば、ウイルスのキャプシドへと自然発生的に集合する。したがって、感染細胞におけるウイルスキャプシド形成がウイルスＤＮＡ合成とは無関係に進行するように見える（Ｋｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７９３によって検証されている）。
【０００６】
すべての既知のＡＡＶセロタイプの中でも特に、ＡＡＶ２は、その感染クローンが最初に作製されたため、おそらく最も良好に特徴付けられたセロタイプである。（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）。続いて、いくつかのＡＡＶセロタイプの完全な配列も決定されている（例えば、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９−３１９；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．５（３）２８５−９７；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３−６８３３；Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．，２２１：２０８−２１７を参照されたい）。一般に、すべてのＡＡＶは、８０％を超えるヌクレオチド配列の同一性を共有している。
【０００７】
ＡＡＶは、他のウイルスベクターとは異なり、ＡＡＶが任意の既知のヒト疾患と関連していることが示されておらず、一般に病原性とはみなされていないため、ヒト遺伝子療法のための有望なベクターである。（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９）。さらに、ＡＡＶは、有糸分裂後の組織を比較的低い免疫原性で安全に形質導入するものであり、ウイルスは時として宿主染色体に統合される場合があるが、ヒト染色体１９のセーフハーバー遺伝子座に、Ｒｅｐタンパク質がトランスに供給された場合にのみ、非常に頻繁に統合される。ＡＡＶゲノムは、感染細胞中で迅速に環状化および鎖状体化し、感染細胞内に安定したエピソーム状態で存在し、ペイロードの長期の安定した発現を提供する。
【０００８】
ウイルス／リガンド：細胞／受容体相互作用を介した感染細胞であるＡＡＶを含むいくつかのウイルスは、最終的に、感染細胞によるウイルスのエンドサイトーシスをもたらす。このリガンド：受容体相互作用は、ウイルスベクターの研究の大部分の焦点となっており、例えば、標的細胞によって発現された受容体を介した、野生型ウイルスによる非天然型標的細胞への感染に対して天然に許容状態である細胞からのウイルスの天然指向性を再配向させるために操作することができる。
【０００９】
理論上、任意の細胞表面タンパク質またはマーカーに向かうベクターの再標的化は、大部分の細胞表面受容体が、恒常的である（例えば、再生使用のため）か、またはリガンドに誘導される（例えば、受容体に媒介される）かのいずれかでエンドサイトーシスの経路に関与するため、感染をもたらすはずである。これら受容体は、クラスリン被覆ピット中で塊状になり、クラスリン被覆小胞を介して細胞を進入し、受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、その後、細胞表面に再生使用して、細胞内で分類されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。このように、ウイルスベクターを再標的化するためのプラットフォームは、多くの場合、ウイルスベクターの天然指向性を削除し、標的細胞単独でまたは主に標的細胞によって発現される受容体またはマーカーにウイルスベクターを再配向することを目的としている。ウイルスベクターを使用した標的化遺伝子療法の進歩のうちの多くは、ウイルスベクターの非組換え（非遺伝子）または組換え（遺伝子）改変として要約することができ、これらの結果として、ウイルスベクターの天然指向性のシュードタイピング、拡張、および／または再標的化がもたらされる。（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｎｉｃｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２７３−９３；Ｖｅｒｈｅｉｊｉ  ａｎｄ  Ｒｏｔｔｉｅｒ（２０１２）Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１２：１−１５）。
【００１０】
最も一般的な手法は、ウイルスキャプシドタンパク質の組換え遺伝子改変であり、そのため、ウイルスキャプシドの表面である。一方、間接的な組換え手法では、ウイルスキャプシドは、異種「足場」で改変され、その後、アダプターに連結される。アダプターは、足場および標的細胞の両方に結合する。直接的な組換え標的化手法において、標的化リガンドは、ウイルスキャプシドに直接挿入されるか、またはウイルスキャプシドに連結され、すなわち、タンパク質ウイルスキャプシドが改変されて異種リガンドを発現する。次に、リガンドは、標的細胞上で優先的にまたは標的細胞上でのみ発現される受容体またはマーカーを再配向、例えば結合する。
【００１１】
手法のそれぞれに、利点および欠点がある。ウイルスを遺伝子改変する能力は、キャプシドの構造を維持すること、および標的化リガンドまたは足場に耐用性があるかまたはこれを適切に提示するキャプシドタンパク質内の位置に標的化リガンドまたは足場を配置することを必要とする。例えば、ウイルスタンパク質に導入される標的化リガンドまたは足場は、改変されたキャプシドの構造を妨げることなく、直接リガンドまたは足場が標的リガンドまたは足場として使用可能な天然分子のスペクトルを正確に制限することができない可能性があるように、サイズ制限を満たす必要がある。さらに、ウイルスキャプシドに直接挿入される標的化リガンドの使用は、モジュール式でなく、すべての標的に対して再操作される必要がある。足場プラットフォームは、使用されるアダプターの柔軟性およびモジュール式の性質において有利であるが、ウイルス粒子およびアダプター上の足場は、イオン状に相互作用し、２つの別個の実体のままであり、それらの相互作用の固有の不安定性により、それらの実用性を生体内で制限し得る。こうした２つの構成要素システムでは、最適な形質導入効率が困難になる可能性がある。
明らかに、様々な標的細胞に対する対象となる核酸の標的化導入に適応可能な状態を維持しながら、改変ウイルス構造の完全性を維持するウイルスベクターシステムに対する必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７９３
【非特許文献２】Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１
【非特許文献３】Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９−３１９
【非特許文献４】Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．５（３）２８５−９７
【非特許文献５】Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３−６８３３
【非特許文献６】Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．，２２１：２０８−２１７
【非特許文献７】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９
【非特許文献８】Ｎｉｃｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２７３−９３
【非特許文献９】Ｖｅｒｈｅｉｊｉ  ａｎｄ  Ｒｏｔｔｉｅｒ（２０１２）Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１２：１−１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
特異的結合対の第１のメンバーおよび第２の同族メンバーを利用することによって、以前の再標的化戦略に固有の問題を解決するウイルス再標的化戦略であって、第１のメンバーおよび第２の同族メンバーが、特異的に化学的結合、好ましくは共有結合を形成するよう相互作用する、ウイルス標的化戦略を本明細書に記載する。第１のメンバーは、キャプシドタンパク質上に提示されるとき、第２の同族メンバーに融合された任意の標的リガンドの足場として機能するが、第１のメンバーおよび第２の同族メンバーの結合時に、イソペプチド結合形態、および組換えウイルス粒子が、一成分標的化ベクターとして機能する。
【００１４】
特異的結合対、例えば、ペプチドタグの第１のメンバーを含む異種アミノ酸配列を提示するように遺伝子改変された組換えウイルス粒子（例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質、組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシド、および／または対象ヌクレオチドを封入する組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクター）であって、アミノ酸配列が５０未満のアミノ酸長であり、かつ組換えウイルスキャプシド／粒子タンパク質が天然指向性を減少させるか、または無効にする、組換えウイルス粒子を本明細書に提供する。組換えウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターの指向性は、特異的結合対の第２の同族メンバーとのイソペプチド結合の形成に際して復元および／または再配向され得、この第２のメンバーは、標的細胞に特異的に結合する標的化リガンドと融合される。このような結合により、標的化リガンドを提示する組換えウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターが生じる。標的化リガンドがリンカーを介して組換えウイルスキャプシド／ベクターによって、かつ／またはウイルスキャプシドの表面上に限定された量で提示されるとき、驚くべきことに、形質導入効率および特異性が増強される。こうしたウイルス粒子、これらを含む組成物、およびこれらを作製および使用する方法を本明細書に提供する。
【００１５】
したがって、キャプシドタンパク質に操作可能に連結（例えば、共有結合）されたペプチドタグを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、ウイルスキャプシドタンパク質が、真核細胞に感染するウイルスのキャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグが、特異的結合対の第２の同族メンバーとのイソペプチド結合を形成する特異的結合対の第１のメンバーである、組換えウイルスキャプシドタンパク質を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質（真核細胞に感染するウイルスのキャプシド遺伝子に由来し得る、例えば、真核細胞に感染するウイルスの遺伝子改変キャプシドタンパク質である）は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された特異的結合対（すなわち、ペプチドタグ）の第１のメンバーを含み、かつ特異的結合対の第２の同族メンバーをさらに含み、特異的結合対の第１および第２のメンバーは、共有（イソペプチド）結合によって結合されており、例えば、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された第１のメンバーを含み、かつ第１のメンバーに共有結合された特異的結合対の第２の同族メンバーをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質（真核細胞に感染するウイルスのキャプシド遺伝子に由来し得る、例えば、真核細胞に感染するウイルスの遺伝子改変キャプシドタンパク質である）は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された特異的結合対（すなわち、ペプチドタグ）の第１のメンバーを含み、かつ標的化リガンドに融合された特異的結合対の第２の同族メンバーをさらに含み、特異的結合対の第１および第２のメンバーは、共有（イソペプチド）結合によって結合されており、例えば、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された特異的結合対の第１のメンバーを含み、かつ第１のメンバーに共有結合された特異的結合対の第２の同族メンバーをさらに含み、特異的結合対の第２の同族メンバーは、標的細胞上で細胞表面マーカー（例えば、細胞表面オリゴ糖、細胞表面受容体、および／または細胞表面マーカーなど）に特異的に結合する標的化リガンドに操作可能に連結される。また、組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシド、および本明細書に記載のウイルスキャプシドによって封入された対象ヌクレオチドを含むウイルスベクターを本明細書に記載する。また、本明細書に記載の組換えウイルス粒子（例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質、組換えウイルスキャプシド、および／または組換えウイルスベクター）を含む組成物、対象ヌクレオチドの標的化送達のためにそれらを使用する方法、およびそれらを作製する方法を記載する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（特異的結合対の第１のメンバー）は、第１または第２のリンカー、例えば、少なくとも１アミノ酸長であるアミノ酸スペーサーを介して、キャプシドタンパク質に操作可能に連結される（フレームに翻訳される、化学的に付着される、かつ／またはこれによって提示される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、第１および／または第２のリンカー、例えば、第１および／または第２のアミノ酸スペーサーと隣接し、それらのスペーサーのそれぞれが、少なくとも１アミノ酸長である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは同一でない。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長または２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、または３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、または４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、または５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、または５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、または６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、または７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、または８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、または９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、または９アミノ酸長、または１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、それぞれ独立して１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、または９アミノ酸長、または１０アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、配列および／または長さが同一であり、それぞれ長さが１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ４アミノ酸長であり、例えば、リンカーは、ＧＬＳＧ（配列番号４０）である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ６アミノ酸長であり、例えば、第１および第２のリンカーは、それぞれＧＬＳＧＳＧの配列（配列番号４１）を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ８アミノ酸長であり、例えば、第１および第２のリンカーは、それぞれＧＬＳＧＬＳＧＳの配列（配列番号４２）を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ１０アミノ酸長であり、例えば、第１および第２のリンカーはそれぞれ、ＧＬＳＧＬＳＧＬＳＧ（配列番号４３）またはＧＬＳＧＧＳＧＬＳＧ（配列番号４４）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ１０アミノ酸長よりも長い。
【００１９】
一般に、ペプチドタグおよび任意選択的に本明細書に記載の１つ以上のリンカー、例えば、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、約５アミノ酸長〜約５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、少なくとも５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または１つ以上のリンカーとのペプチドタグは、８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または１つ以上のリンカーとのペプチドタグは、１５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または１つ以上のリンカーとのペプチドタグは、２７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、２９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または１つ以上のリンカーとのペプチドタグは、３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または１つ以上のリンカーとのペプチドタグは、３８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、４０アミノ酸長よりも長い。いくつかの実施形態では、単独でのまたは１つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、５０アミノ酸長以下である。
【００２０】
一般に、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、非エンベロープウイルスのキャプシド遺伝子に由来し得、例えば、非エンベロープウイルスの遺伝子改変キャプシドタンパク質を発現するように改変されたキャップ遺伝子であり、非エンベロープウイルスは、ヒト細胞、またはヒト細胞、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに一般に感染する非エンベロープウイルスのセロタイプに感染する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質（またはＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の一部分）をコードするＡＡＶキャプシド遺伝子に由来し、遺伝子改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される、ヒトに感染するＡＡＶセロタイプの遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするように改変されたキャップ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質をそれぞれコードするＡＡＶ２もしくはＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質、または遺伝子改変ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質をそれぞれコードするように改変されたＡＡＶ２もしくはＡＡＶ９キャップ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ６  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードするように改変されたＡＡＶ６キャップ遺伝子によってコードされ、このＡＡＶ６  ＶＰ１キャプシドタンパク質の野生型アミノ酸配列は、配列番号５１としてそれぞれ表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードするように改変されたＡＡＶ２キャップ遺伝子によってコードされ、このＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質の野生型アミノ酸配列は、配列番号９としてそれぞれ表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードするように改変されたＡＡＶ９キャップ遺伝子によってコードされ、このＡＡＶ９  ＶＰ１キャプシドタンパク質の野生型アミノ酸配列は、配列番号３１としてそれぞれ表される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶキャプシド遺伝子に由来し（これによってコードされ）、キメラキャプシド遺伝子は、複数の核酸配列を含み、複数の核酸配列のそれぞれが、異なるＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質の部分をコードし、複数の核酸配列が一緒になって、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来する。
【００２２】
概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、任意選択的にリンカーを介して、組換えキャプシドタンパク質に操作可能に連結された（例えば、これに挿入された、かつ／またはこれによって提示された）ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）を含むように改変され、そのため、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカー自体が、それぞれ、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーを欠いている参照キャプシドタンパク質、または参照キャプシドキャプシドを含むキャプシドと比較して、組換えキャプシドタンパク質またはこれを含むキャプシドの天然指向性を減少させ、かつ／または無効にする。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、野生型参照キャプシドタンパク質の天然指向性に関与するキャプシドタンパク質の領域、例えば、細胞標的化に関与するキャプシドタンパク質の領域に操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、任意選択的にリンカーを介して、Ａｄ繊維タンパク質のノブドメインに操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、Ａｄ繊維タンパク質のＨＩループに操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、ＡＡＶキャプシドタンパク質中の露出された可変ループに操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の露出された可変ループに操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質の露出された可変ループに操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。
【００２３】
いくつかの実施形態では、（ｉ）ウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードするＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグは、任意選択的にリンカーを介して、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｉ４５３またはＩ５８７のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）に操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）か、（ｉｉ）ウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、ＡＡＶ６  ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置Ｉ５８５のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）に操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）か、または（ｉｉｉ）ウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードするＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグは、任意選択的にリンカーを介して、位置Ｉ４５３もしくはＩ５８９  ＡＡＶ９  ＶＰ１キャプシドのアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）に操作可能に連結される（例えば、これに挿入され、かつ／またはこれによって提示される）。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）は、任意選択的にリンカーを介して、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の４５３、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の５８７、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１の５８５、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の４５３、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の５８９からなる群から選択されるアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）に操作可能に連結され、例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の４５３、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の５８７、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１の５８５、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の４５３、およびＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の５８９からなる群から選択されるアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の位置４５３のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入される（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の位置５８７のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入される（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１の位置５８５のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入される（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の位置４５３のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入される（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の位置５８９のアミノ酸（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）の直後に挿入される（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合される）。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーは、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置５８７と５８８との間（または同じキャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸）に挿入および／または提示される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質は、（第２の異なる）変異を含み、これは、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーに加えたものであり得る。いくつかの実施形態では、（第２の異なる変異）は、キャプシドタンパク質への異種ペプチドの挿入、１つ以上の異種アミノ酸とのキャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸の置換、キャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し（例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質であり）、ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーを含み、かつ変異、例えば、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質中のＲ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ変異（または同じＡＡＶ２キャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質中の対応する変異）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ２  ＶＰ１タンパク質の位置４５３のアミノ酸（またはＡＡＶ２キャプシド遺伝子によってコードされたＡＡＶ２  ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸）の直後に挿入された（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合された）ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーを含み、かつＲ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａからなる群から選択される変異（または同じＡＡＶ２キャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質中の対応する変異）をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質の位置５８７のアミノ酸（または同じＡＡＶ２キャプシド遺伝子からコードされたＡＡＶ２  ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸）の直後に挿入された（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合された）ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーを含み、かつＲ５８５Ａ、Ｒ５８８Ａからなる群から選択される変異、および／または同じＡＡＶ２キャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質中の対応する変異をさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ９  ＶＰ１タンパク質の位置４５３のアミノ酸（またはＡＡＶ９キャプシド遺伝子からコードされたＡＡＶ９  ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸）の直後に挿入された（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合された）ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーを含み、かつＷ５０３Ａ変異（または同じＡＡＶ２キャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質中の対応する変異）をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質であり、ＡＡＶ９  ＶＰ１タンパク質の位置５８９のアミノ酸（または同じＡＡＶ９キャプシド遺伝子からコードされたＡＡＶ９  ＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸）の直後に挿入された（例えば、当該アミノ酸のＣ末端に融合された）ペプチドタグ（タンパク質：タンパク質結合対の第１のメンバー）および任意選択的なリンカーを含み、かつＷ５０３Ａ変異（または同じＡＡＶ２キャプシド遺伝子からコードされたＶＰ２および／もしくはＶＰ３キャプシドタンパク質中の対応する変異）をさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質：タンパク質結合対は、ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇ００２：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２、ＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇ、イソペプタグ：ピリン−Ｃ、およびＳｎｏｏｐＴａｇ：ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、ＳｐｙＴａｇ（またはその生物学的活性部分）であり、タンパク質（第２の同族メンバー）は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（またはその生物学的活性部分）である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、ＳｐｙＴａｇ（またはその生物学的活性部分）であり、タンパク質（第２の同族メンバー）は、ＫＴａｇ（またはその生物学的活性部分）である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、ＫＴａｇ（またはその生物学的活性部分）であり、タンパク質（第２の同族メンバー）は、ＳｐｙＴａｇ（またはその生物学的活性部分）である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、ＳｎｏｏｐＴａｇ（またはその生物学的活性部分）であり、タンパク質（第２の同族メンバー）は、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（またはその生物学的活性部分）である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、イソペプタグ（またはその生物学的活性部分）であり、タンパク質（第２の同族メンバー）は、ピリン−Ｃ（またはその生物学的活性部分）である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ（第１のメンバー）は、ＳｐｙＴａｇ００２（またはその生物学的活性部分）であり、タンパク質（第２の同族メンバー）は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２（またはその生物学的活性部分）である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＳｐｙＴａｇを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドまたはウイルスベクターを含む組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質のアミノ酸配列として表１に列挙された任意の配列番号として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１３として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１５として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１７として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１９として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２１として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２３として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシド、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物を含む組換えウイルスキャプシドであるウイルスベクターは、配列番号２５として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２７として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２９として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号３５として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号３７として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシド、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物を含む組換えウイルスキャプシドであるウイルスベクターは、配列番号３９として表されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、特異的結合対の第２の同族タンパク質メンバーに共有結合された特異的結合対（例えば、ペプチドタグ）の第１のメンバーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、標的化リガンドに操作可能に連結された同族タンパク質（第２のメンバー）を含むアダプターポリペプチドに共有結合されたペプチドタグ（第１のメンバー）を含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、任意選択的にリンカーを介して、タンパク質（第２のメンバー）に操作可能に連結される、例えば、タンパク質に融合される。概して、標的化リガンドは、結合部分、例えば、天然リガンド、抗体、多特異性結合分子などであり得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、抗体またはその一部分である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質および重鎖定常ドメインに結合する可変ドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質およびＩｇＧ重鎖定常ドメインに結合する可変ドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質およびＩｇＧ重鎖定常ドメインに結合する可変ドメインを含む抗体であり、ＩｇＧ重鎖定常ドメインは、例えば、リンカーを介して、ペプチドタグとのイソペプチド共有結合を形成するタンパク質（例えば、タンパク質：タンパク質結合対の第２のメンバー）に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質に操作可能に連結され、かつＳｐｙＴａｇに共有結合されたＳｐｙＴａｇ、抗体可変ドメインを含む標的化リガンドに連結されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含むアダプターポリペプチド、ならびにＩｇＧ重鎖ドメインを含み、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＩｇＧ重鎖ドメインは、アミノ酸リンカー、例えば、ＧＳＧＥＳＧ（配列番号４８）を介して連結される。いくつかの実施形態では、アダプターポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４重鎖の一部分を含む配列番号４６として表される配列を含み、当該ＩｇＧ４部分は、リンカー（配列番号４８）を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に連結された配列番号４９として表される配列を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、標的化リガンドに融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに共有結合されたＳｐｙＴａｇを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターコードする表１に列挙された任意の配列番号として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１３として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１５として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１７として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１９として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスキャプシド、および／または組換えウイルスキャプシド形成物を含む組成物を含む組換えウイルスキャプシド、ウイルスベクターが、配列番号２１として表されるアミノ酸配列と、配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２３として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２５として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２７として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号２９として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号３５として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスキャプシド、および／または組換えウイルスキャプシド形成物を含む組成物を含む組換えウイルスキャプシド、ウイルスベクターが、配列番号３７として表されるアミノ酸配列と、配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号３９として表されるアミノ酸配列、および配列番号４６として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。
【００３１】
一般に、標的化リガンドは、哺乳類（例えば、ヒト）真核細胞、例えば、標的細胞の表面上に発現される、細胞表面分子、例えば、オリゴ糖、受容体、細胞表面マーカーなどに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞、（ヒト）脳細胞、（ヒト）Ｔ細胞、（ヒト）腎細胞、（ヒト）腸細胞、（ヒト）肺細胞、（ヒト）癌細胞、または異種病原体に感染した（ヒト）細胞に結合する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、ｈＡＳＧＲ１によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）神経細胞、例えば、ＧＡＢＡ、トランスフェリンなどによって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３εによって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ＣＤ６３に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４によって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）腎細胞によって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）筋細胞、例えば、インテグリンによって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、ｒ標的化リガンドは、（ヒト）癌細胞によって発現される分子、例えば、腫瘍関連抗原、例えば、アディポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、アルファ−アクチニン−４、アルファ−胎児タンパク質（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、ベータ−カテニン、ＢＩＮＧ−４、ＣＡ−１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、Ｅ６、Ｅ７、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、へプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＣＣＤＣ１１０としても知られているＫＭＨＮ１、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、Ｍｉｄｋｉｎｅ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、���Ｙ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、多形性上皮ムチン（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、セセルニン１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１または−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＧＦ−ｂｅｔａＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ−ｌｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、Ｋｒａｓ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＨＰＶ  Ｅ２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＷＴ−１抗原（リンパ腫および他の固形腫瘍中の）、ＥｒｂＢ受容体、Ｍｅｌａｎ  Ａ［ＭＡＲＴ１］、ｇｐ  １００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ  ７５、およびＴＲＰ−２（黒色腫中の）、ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３（膀胱癌、頭頸部癌、および非小細胞癌中の）、ＨＰＶ  ＥＧおよびＥ７タンパク質（子宮頸癌中の）、ムチン［ＭＵＣ−１］（乳癌、膵癌、結腸癌、および前立腺癌）、前立腺特異的抗原［ＰＳＡ］（前立腺癌中の）、癌胎児性抗原［ＣＥＡ］結腸癌、乳癌、および胃腸癌中の）、ならびにＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ−１、ＣＡＧＥ−１，２，８、ＣＡＧＥ−３  ＴＯ  ７、ＬＡＧＥ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＮＡ−８８、ＧｎＴＶ、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２などの共通の腫瘍特異的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、Ｅ６および／またはＥ７に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、Ｈｅｒ２に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ＣＤ６３に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、ヒトエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ３（ｈＥＮＴＰＤ３）に結合する。
【００３３】
一般に、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、標的化リガンド、例えば、標的リガンドに操作可能に連結された第２のメンバーの非存在下では標的細胞に感染することができない。概して、適切な標的化リガンドの非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、天然指向性を減少させるか、または無効にし、例えば、参照ウイルスキャプシド、例えば、参照ウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシド、例えば、野生型対照ウイルスキャプシドタンパク質、または参照ウイルスキャプシドタンパク質と同一であるが、標的化リガンドならびに任意選択的にタンパク質：タンパク質結合対のいずれかもしくは両方を欠いているウイルスキャプシドタンパク質の形質導入と比較して、形質導入に対して天然に許容状態の参照細胞を標的化するか、これに結合する能力を減少させるか、または無効にする。いくつかの実施形態では、ＳｐｙＴａｇを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質の形質導入効率は、対照の野生型ウイルスキャプシドタンパク質と比較して、減少されるか、または無効にされる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、例えば、表１に列挙された本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも１０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも２０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも３０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも４０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも５０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも６０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも７０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも７５％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも８０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも８５％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも９０％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも９５％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも９９％の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドによる制御細胞の形質導入は、例えば、対象ヌクレオチドの発現を測定する方法、例えば、レポーターアッセイなどを介して無効にされる、例えば、検出不能である。
【００３５】
逆に、適切なアダプターポリペプチドに共有結合されたペプチドタグを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシド、例えば、標的化リガンドに共有結合された同族タンパク質は、標的細胞に感染することができ、例えば、参照ウイルスキャプシド、例えば、参照ウイルスキャプシドタンパク質、例えば、野生型対照キャプシドタンパク質を含むキャプシドの形質導入と比較して、形質導入に対して天然に許容状態の参照細胞を標的化し、これに結合する部分的または完全に復元された能力を有する。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも１０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも２０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも３０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも４０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも５０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも６０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも７０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも７５％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも８０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも８５％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも９０％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも９５％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも９９％の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に共有結合された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの形質導入効率と同一の形質導入効率を表す。
【００３６】
同様に、適切なアダプターポリペプチドに共有結合されたペプチドタグを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質、例えば、標的化リガンドに操作可能に連結された同族タンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、標的細胞に感染することができ、例えば、タンパク質：タンパク質結合対のいずれかまたは両方を欠いている、例えば、参照キャプシドタンパク質を含むことを除いて、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同一である参照ウイルスキャプシドの形質導入と比較して、形質導入に対して天然に許容状態の参照細胞を標的化し、これに結合する増強された能力を有する。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも１０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも２０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも３０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも４０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも５０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも６０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも７０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも７５％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも８０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも８５％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも９０％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも９５％大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表１に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも９９％大きい形質導入効率を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルス性キャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、モザイクキャプシドであり、例えば、少なくとも２セットのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含み、それらの各セットは、異なるキャップ遺伝子によってコードされ、例えば、ペプチドタグ、および特定の比率でペプチドタグを含まない参照キャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、参照キャプシドタンパク質は、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同じセロタイプを有する野生型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含むという点で、野生型の参照キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、参照のキャプシドタンパク質は、対照の参照キャプシドタンパク質がペプチドタグを欠いていることを除いて、組換えウイルスキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含むという点で、対照の参照キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、参照キャプシドタンパク質は、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同じセロタイプを有するが、野生型キャプシドタンパク質の指向性を減少させる変異（例えば、アミノ酸配列の欠失、アミノ酸配列の挿入、キメラ化など）のための野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸は入れると実質的に同一のアミノ酸配列を含むという点で、変異型の野生型参照タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質を１：１〜１：１５の範囲の比率で含むか、本明細書に記載の方法は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質を１：１〜１：１５の範囲の比率で組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は１：２である。いくつかの実施形態では、比率は１：３である。いくつかの実施形態では、比率は１：４である。いくつかの実施形態では、比率は１：５である。いくつかの実施形態では、比率は１：６である。いくつかの実施形態では、比率は１：７である。いくつかの実施形態では、比率は１：８である。いくつかの実施形態では、比率は１：９である。いくつかの実施形態では、比率は１：１０である。いくつかの実施形態では、比率は１：１１である。いくつかの実施形態では、比率は１：１２である。いくつかの実施形態では、比率は１：１３である。いくつかの実施形態では、比率は１：１４である。いくつかの実施形態では、比率は１：１５である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質、およびこれも表１に列挙されたその適切な参照キャプシドタンパク質（またはその参照キャプシドタンパク質の組み合わせ）を１：１〜１：１５の範囲の比率（組換えキャプシドタンパク質：参照キャプシドタンパク質（複数可））で含むか、または本明細書に記載の方法は、表１に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質、およびこれも表１に列挙されたその適切な参照キャプシドタンパク質（またはその参照キャプシドタンパク質の組み合わせ）を１：１〜１：１５の範囲の比率（組換えキャプシドタンパク質：参照キャプシドタンパク質（複数可））で組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は１：２である。いくつかの実施形態では、比率は１：３である。いくつかの実施形態では、比率は１：４である。いくつかの実施形態では、比率は１：５である。いくつかの実施形態では、比率は１：６である。いくつかの実施形態では、比率は１：７である。いくつかの実施形態では、比率は１：８である。いくつかの実施形態では、比率は１：９である。いくつかの実施形態では、比率は１：１０である。いくつかの実施形態では、比率は１：１１である。いくつかの実施形態では、比率は１：１２である。いくつかの実施形態では、比率は１：１３である。いくつかの実施形態では、比率は１：１４である。いくつかの実施形態では、比率は１：１５である。
【００３９】
表１は、（１）本明細書に記載のペプチドタグを含む例示的かつ非制限的な組換えウイルスキャプシドタンパク質、（２）標的化ベクターの非存在下で共有タンパク質タグを含む組換えキャプシドタンパク質の形質導入効率の減少または無効化を決定するために任意選択的に参照として使用され得る例示的かつ非制限的な例の対応する対照（Ｃ）の野生型ウイルスキャプシドタンパク質、および（３）モザイクキャプシドを生成するための対応する参照ウイルスキャプシドタンパク質の例示的かつ非制限的な例のアミノ酸配列として表される配列同定番号（配列番号）、ならびに／またはタンパク質：タンパク質結合類および標的化リガンドを含む組換えキャプシドタンパク質の形質導入効率の復元を決定するための参照としての使用を提供する。
【表１−１】
2020525020.tif 000002
【表１−２】
2020525020.tif 000003
【００４０】
概して、本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、モザイクウイルスキャプシドを含む、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドを含み、ウイルスキャプシドは、対象ヌクレオチドを封入する。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、非ヒトプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＡＧＧプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターである。
【００４１】
概して、対象ヌクレオチドは、１つ以上の遺伝子であり得、これは、検出可能なマーカー、例えば、レポーター、または治療用ポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子である。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどからなる群から選択される検出可能なマーカーをコードするレポーター遺伝子である。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、緑色蛍光タンパク質である。他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたはその一部分（複数可）をコードするヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド、分泌酵素、治療用タンパク質をコードする遺伝子などからなる群選択される。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、例えば、２つの別個の機能を提供する少なくとも２つのドメインを含むタンパク質をコードする。
【００４２】
本明細書に記載の組成物は、概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターを含み、例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質（例えば、モザイクキャプシドを含む）キャプシドを含み、キャプシドは対象ヌクレオチドを封入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、（１）本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシドを有するウイルスベクター、および（２））薬学的に許容可能な担体を含む。
【００４３】
また、組換えウイルスキャプシドタンパク質、これを含むウイルスベクター、組成物などを作製および使用する方法も本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどを再配向すること、標的細胞への診断／治療用カーゴを送達することなどを含む方法は、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスベクターと標的細胞（生体外または生体内、例えば、ヒト中にあり得る）を接触させることを含み、ウイルスキャプシドまたはウイルスベクターは、標的細胞の表面上に発現されたタンパク質に特異的に結合する標的化リガンドを含む。このような方法は、組換えウイルスベクターを生成すること、例えば、ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞が、参照キャプシドタンパク質をコードするプラスミドの非存在または存在下でペプチドタグ（第１のメンバー）を含むキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含む、培養すること、標的化リガンドに操作可能に連結された第２の同族部材により組換えキャプシドタンパク質をインキュベートすることなどを第１の工程として含み得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）肝細胞であり、（モザイク）組換えウイルスベクターは、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、（ｈ）ＡＳＧＲ１に特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）神経細胞であり、（モザイク）組換えウイルスベクターは、ＧＡＢＡ、トランスフェリン受容体などに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）Ｔ細胞であり、（モザイク）組換えウイルスベクターは、ＣＤ３、例えばＣＤ３εに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）造血幹細胞であり、（モザイク）組換えウイルスベクターは、ＣＤ３４に特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）腎細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）筋細胞であり、（モザイク）組換えウイルスベクターは、インテグリンに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、（ヒト）癌細胞であり、（モザイク）組換えウイルスベクターは、腫瘍関連抗原、例えば、Ｅ６およびＥ７、Ｈｅｒ２などに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）に結合する。
【００４４】
また、ウイルスキャプシドを不活性化し、かつ／またはウイルスベクターを生成する方法であって、概して、（ａ）異種タンパク質をコードする核酸を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、ペプチドタグを含む（参照キャプシドタンパク質をコードするプラスミドの非存在または存在下で）遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形成することと、および／または（ｂ）ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞がヌクレオチド配列を含む、培養することと、を含む、方法を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび／または導入プラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを細胞溶解物から単離することと、をさらに含む。いくつかの実施形態ではさらに、本方法は、（ａ）細胞片を除去することと、（ｂ）ＭｇＣｌ２の存在下で、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉを有するウイルスベクターを含有する上清を処理することと、（ｃ）ウイルスベクターを濃縮することと、（ｄ）ウイルスベクターを精製することと、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせと、をさらに含む。また、本明細書に記載の方法に従って作製されたウイルスベクター、および本明細書に記載のウイルスベクターを生成するために有用なパッケージング細胞、例えば、組換えキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むパッケージング細胞を本明細書に提供する。
【００４５】
特許または出願書類は、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。色付きの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開の写しは、要求により、および必要な料金を支払うことにより、当局に提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】「感染していない」ＨＥＲ２−陽性（＋）２９３  ｈＥｒｂＢ２もしくはＨＥＲ２−陰性（−）２９３親細胞、または「ＡＡＶ２  Ｎ５８７−ＳｐｙＴａｇ」粒子に感染した細胞もしくは「ＡＡＶ２  Ｎ５８７−ＳｐｙＴａｇ＋Ｃ６．５−ＳｐｙＣ」粒子に感染した細胞のいずれかによる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を評価する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）から得られた散布プロットを提供する。両方のウイルスのキャプシドが、以下の変異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチド（配列番号１）の挿入。Ｃ６．５−ＳｐｙＣ粒子を、ＳｐｙＴａｇを介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｃ６．５）と接合させた。ウイルスは、形質転換のマーカーとしてＧＦＰを発現する。
【図２】「感染していない」ＨＥＲ２−陽性（＋）２９３  ｈＥｒｂＢ２もしくはＨＥＲ２−陰性（−）２９３親細胞、または「ＡＡＶ２  Ｎ５８７−ＳｐｙＴａｇ」粒子に感染した細胞もしくは「ＡＡＶ２  Ｎ５８７−ＳｐｙＴａｇ＋ＳｐｙＣ−抗ＨＥＲ２」粒子に感染した細胞のいずれかによる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を評価する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）から得られた散布プロットを提供する。両方のウイルスのキャプシドが、以下の変異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチド（配列番号１）の挿入。ＳｐｙＣ−抗ＨＥＲ２粒子を、ＳｐｙＴａｇを介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と接合させた。ウイルスは、形質転換のマーカーとしてＧＦＰを発現する。
【図３】「ＡＡＶ２野生型」粒子に感染したＨＥＲ２−陽性（＋）２９３  ｈＥｒｂＢ２もしくはＨＥＲ２−陰性（−）２９３親細胞、または「ＡＡＶ２  Ｇ４５３−ＳｐｙＴａｇ＋ＳｐｙＣ−抗ＨＥＲ２」粒子に感染した細胞による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を評価する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）から得られた散布プロットを提供する。「ＡＡＶ２野生型」キャプシドは、変異または改変（配列番号９）を有せず、「ＡＡＶ２  Ｇ４５３−ＳｐｙＴａｇ」キャプシドは、１０アミノ酸リンカー（配列番号２９）に隣接する残基Ｇ４５３の直後に挿入される「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質と、ＳｐｙＴａｇを有しないが、変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ（配列番号１１）を含有する「ＡＡＶ２  ＨＢＭ」キャプシドとの間で１：７の比率から構成されるモザイクウイルス粒子である。ＡＡＶ２  Ｇ４５３−ＳｐｙＴａｇモザイク粒子を、ＳｐｙＴａｇを介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と接合させた。ウイルスは、形質転換のマーカーとしてＧＦＰを発現する。
【図４Ａ】ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質によって共有される直鎖状エピトープを認識するＢ１抗体を使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ「ＳｐｙＣ−抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ」に融合された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖと、以下の変異を有するキャプシドから構成されるＡＡＶ２粒子のパネルとの間の反応を分析する、ウエスタンブロットを提供する。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および様々な長さのアミノ酸リンカー（リンカー１、リンカー２、リンカー４、リンカー６、リンカー８、およびリンカー１０）（配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）に隣接する残基Ｎ５８７の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。
【図４Ｂ】以下の変異を有するキャプシドから構成されるＡＡＶ２ウイルス粒子による感染の５日後のＧＦＰを発現するＨＥＲ２＋細胞（灰色、ｙ軸）のパーセンテージ対ＧＦＰを発現するＨＥＲ２−細胞のパーセンテージ（黒色、ｙ軸）を提供する。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および示された長さ（リンカー１、リンカー２、リンカー４、リンカー６、リンカー８、およびリンカー１０）（それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、および２５）（ｘ軸）のアミノ酸リンカーに隣接するＮ５８７−ＳｐｙＴａｇ。ＡＡＶ２  Ｎ５８７−ＳｐｙＴａｇ粒子を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖと接合させた。
【図５Ａ】ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質によって共有される直鎖状エピトープを認識するＢ１抗体を使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ「ＳｐｙＣ−抗Ｈｅｒ２抗体に融合され抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と、以下の変異を有するキャプシドから構成されるＡＡＶ２ウイルス粒子のパネルとの間の反応を分析する、ウエスタンブロットを提供する。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および様々な長さのアミノ酸リンカー（リンカーなし、リンカー１、リンカー２、リンカー４、リンカー６、リンカー８、およびリンカー１０）（それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）に隣接する残基Ｎ５８７の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。
【図５Ｂ】野生型（ｗｔ）ＡＡＶ２粒子、または以下の変異を有するキャプシドから構成されるＡＡＶ２ウイルス粒子による感染の５日後のＧＦＰを発現するＨＥＲ２＋細胞（灰色、ｙ軸）のパーセンテージ対ＧＦＰを発現するＨＥＲ２−細胞のパーセンテージ（黒色、ｙ軸）を提供する。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および示された長さのアミノ酸リンカー（リンカーなし、リンカー１、リンカー２、リンカー４、リンカー６、リンカー８、およびリンカー１０）（それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、および２５）（ｘ軸）に隣接するＮ５８７−ＳｐｙＴａｇ。ＡＡＶ２  Ｎ５８７  ＳｐｙＴａｇ粒子を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と接合させた。
【図６Ａ】ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質により共有される直鎖状エピトープを認識するＢ１抗体を使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）の「ＳｐｙＣ−抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ」に融合された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ  Ｃ６．５と、モザイクＡＡＶ２ウイルス粒子のパネルとの間の反応を分析するウエスタンブロットを提供し、ここで、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、変異Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、およびＮ５８７−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇ（配列番号２５）を含有する「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質と、変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含有するが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１１）を含まない「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質との間の混合物から構成される。「ＳｐｙＴａｇ」および「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質を、様々な比率（１：０、１：１、および１：３）で混合した。
【図６Ｂ】変異Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、およびＮ５８７−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇ（配列番号２５）を含有する「リンカー１０」キャプシドタンパク質と、変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含有するが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１１）を含まない「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質との間の混合物から構成されるモザイクＡＡＶ２ウイルス粒子（ｘ軸）による感染の５日後のＨＥＲ２＋２９３  ｈＥｒｂＢ２細胞（灰色バー）およびＧＦＰを発現するＨＥＲ２−２９３親細胞（黒色バー）（ｙ軸）のパーセンテージを提供する。「リンカー１０」および「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質を、様々な比率（１：０、３：１、１：１、および１：３）で混合し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖに接合させた。
【図７Ａ】ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質により共有される直鎖状エピトープを認識するＢ１抗体を使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）の「ＳｐｙＣ−抗ＨＥＲ２抗体」に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と、モザイクＡＡＶ２ウイルス粒子のパネルとの間の反応を分析するウエスタンブロットを提供し、ここで、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、変異Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、およびＮ５８７−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇ（配列番号２５）を含有する「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質と、変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含有するが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１１）を含まない「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質との間の混合物から構成される。「ＳｐｙＴａｇ」および「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質を、様々な比率（１：０、３：１、１：１、および１：３）で混合した。
【図７Ｂ】変異Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、およびＮ５８７−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇ（配列番号２５）を含有する「リンカー１０」キャプシドタンパク質と、変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含有するが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１１）を含まない「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質との間の混合物から構成されるモザイクＡＡＶ２ウイルス粒子（ｘ軸）による感染の５日後のＨＥＲ２＋２９３  ｈＥｒｂＢ２細胞（灰色バー）およびＧＦＰを発現するＨＥＲ２−２９３親細胞（黒色バー）（ｙ軸）のパーセンテージを提供する。「リンカー１０」および「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質を、様々な比率（１：０、３：１、１：１、および１：３）で混合し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））に接合させた。
【図８Ａ】ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質により共有される直鎖状エピトープを認識するＢ１抗体を使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）の「ＳｐｙＣ−抗ＨＥＲ２抗体」に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と、モザイクＡＡＶ２ウイルス粒子のパネルとの間の反応を分析するウエスタンブロットを提供し、ここで、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質と、変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含有するが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１１）を含まない「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質との間の混合物から構成される。「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質は、変異Ｒ５８５Ａ、Ｒ５８８Ａ、および残基Ｇ４５３（配列番号２７）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入を含む「Ｇ４５３  ＳｐｙＴａｇ」、ならびに変異Ｒ５８５Ａ、Ｒ５８８Ａ、および残基Ｇ４５３の直後の、１０個のリンカーアミノ酸（配列番号２９）によるいずれかの側に隣接するＳｐｙＴａｇペプチドの挿入を含む「Ｇ４５３リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ」を含む。示された「Ｇ４５３  ＳｐｙＴａｇ」および「Ｇ４５３リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ」キャプシドを、様々な比率（１：０、１：３、および１：７）で「ＨＢＭ」キャプシドと混合した。
【図８Ｂ】変異Ｒ５８５Ａ、Ｒ５８８Ａ、および残基Ｇ４５３（配列番号２７）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入を含有する「Ｇ４５３  ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質、または変異Ｒ５８５Ａ、Ｒ５８８Ａ、および残基Ｇ４５３の直後の、かつ１０個のリンカーアミノ酸（配列番号２９）によっていずれかの側上で隣接するＳｐｙＴａｇペプチドの挿入を含有する「Ｇ４５３リンカー１０ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質、および変異Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含有するが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１１）を含有しない「ＨＢＭ」キャプシドタンパク質との間の混合物から構成される、野生型「ｗｔ」またはモザイクＡＡＶ２ウイルス粒子（ｘ軸）による感染の５日後にＧＦＰ（ｙ軸）を発現する、ＨＥＲ２＋２９３  ｈＥｒｂＢ２細胞（灰色バー）およびＨＥＲ２−２９３親細胞（黒色バー）のパーセンテージを提供する。「Ｇ４５３  ＳｐｙＴａｇ」または「Ｇ４５３リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ」および「ＨＢＭ」キャプシドを、様々な比率（１：０の「純粋な」、１：３、および１：７）で混合し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））に接合させた。
【図９−１】「ＡＡＶ２  ｗｔ」粒子、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗体なし」粒子、または「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗ＡＳＧＲ１」粒子の感染後のＡＳＧＲ１発現に対する細胞陽性（＋）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を評価する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）から得られた散布プロットを提供する。「ＡＡＶ２  ｗｔ」キャプシドは、変異または改変（配列番号９）を有しない野生型であり、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ」キャプシドは、以下の変異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗ＡＳＧＲ１」粒子を、ＡＳＧＲ１に特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。また、「ＡＡＶ２  ｗｔ」粒子、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗体なし」粒子、または「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗ＣＤ６３」粒子の感染後のＣＤ６３発現に対する細胞陽性（＋）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を評価する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）から得られた散布プロットも示す。「ＡＡＶ２  ｗｔ」キャプシドは、変異または改変（配列番号９）を有しない野生型であり、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ」キャプシドは、以下の変異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗ＣＤ６３」粒子を、ＣＤ６３に特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。ウイルスは、形質転換のマーカーとしてＧＦＰを発現する。また、「ＡＡＶ９  ｗｔ」粒子、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  無関連抗体」粒子、または「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗ＰＴＰＲＮ」粒子の感染後のＰＴＰＲＮ発現に対する細胞陽性（＋）による緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を評価する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）から得られた散布プロットも示す。「ＡＡＶ９  ｗｔ」キャプシドは、変異または改変を有しない野生型（配列番号３１）であり、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ」キャプシドは、ＳｐｙＴａｇが１０アミノ酸リンカー（配列番号２９）に隣接する残基Ｇ４５３の直後に挿入された「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質間に、かつＳｐｙＴａｇを有しないが、天然の受容体結合を減少させる残基Ｎ５８７（配列番号５３）の直後に挿入されたＭｙｃタグアミノ酸配列を含有するキャプシド間に、１：７の比率で構成されるモザイクウイルス粒子である。「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  無関連抗体」粒子を、ＰＴＰＲＮに結合しないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ  抗ＰＴＰＲＮ」粒子を、ＰＴＰＲＮに特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。ウイルスは、形質転換のマーカーとしてＧＦＰを発現する。「ＡＡＶ２  ｗｔ」粒子、「ＡＡＶ２＋無関連ｍＡｂ」粒子、「ＡＡＶ２＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子、および「ＡＡＶ２＋抗ｈＣＤ２０」粒子の感染後の、ｈＥＮＴＰＤ３に対する細胞陽性（＋）によるホタルルシフェラーゼ発現を評価するルシフェラーゼアッセイの結果も示す。「ＡＡＶ２  ｗｔ」キャプシドは、変異または改変を有しない野生型であり（配列番号９）、「ＡＡＶ２＋抗体」のキャプシドは、以下の���異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。「ＡＡＶ２＋無関連ｍＡｂ」粒子を、ｈＥＮＴＰＤ３に結合しないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。「ＡＡＶ２＋抗ｈＣＤ２０」粒子を、ｈＥＮＴＰＤ３＋細胞上に発現されず、さらなる陰性対照として機能する、ｈＣＤ２０に特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。「ＡＡＶ２＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子を、ｈＥＮＴＰＤ３に特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。ウイルスは、形質導入のマーカーとしてホタルルシフェラーゼを発現する。「ＡＡＶ２  ｗｔ」粒子、「ＡＡＶ２＋無関連ｍＡｂ」粒子、「ＡＡＶ２＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子、および「ＡＡＶ２＋抗ｈＣＤ２０」粒子の感染後の、ｈＣＤ２０に対する細胞陽性（＋）によるホタルルシフェラーゼ発現を評価するルシフェラーゼアッセイの結果も示す。「ＡＡＶ２  ｗｔ」キャプシドは、変異または改変を有しない野生型であり（配列番号９）、「ＡＡＶ２＋抗体」のキャプシドは、以下の変異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。「ＡＡＶ２＋無関連ｍＡｂ」粒子を、ｈＥＮＴＰＤ３に結合しないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。「ＡＡＶ２＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子を、ｈＣＤ２０＋細胞上に発現されず、さらなる陰性対照として機能する、ｈＥＮＴＰＤ３に特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。「ＡＡＶ２＋抗ｈＣＤ２０」粒子を、ｈＣＤ２０に特異的に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合抗体に接合させた。ウイルスは、形質導入のマーカーとしてホタルルシフェラーゼを発現する。
【図９−２】同上。
【図１０Ａ】ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質によって共有される直鎖状エピトープを認識するＢ１抗体を使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号３）「ＳｐｙＣ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ」に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））と、ＡＡＶ９ウイルス粒子のパネルとの間の反応を分析する、ウエスタンブロットを提供する。これらのＡＡＶ９ウイルス粒子は、受容体の結合を減少させる変異Ｗ５０３Ａ、およびリンカーを有しないか、または１０アミノ酸リンカーに隣接する残基Ａ５８９もしくはＧ４５３の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入を含むキャプシド、あるいは、変異Ｗ５０３Ａを含む「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質と、Ａ５８９−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇもしくはＧ４５３−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇのいずれかとの間に１：７の比率で構成されるモザイクＡＡＶ９ウイルス粒子から構成され、ここで、「Ｗ５０３Ａ」キャプシドタンパク質は、変異Ｗ５０３Ａを有するが、ＳｐｙＴａｇを有しない。
【図１０Ｂ】ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ｘ軸）に融合された抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））に接合されたＡＡＶ９ウイルス粒子における感染の５日後のＧＦＰを発現するＨＥＲ２＋２９３  ｈＥｒｂＢ２細胞（灰色バー）およびＨＥＲ２−２９３親細胞（黒色バー）（ｙ軸）のパーセンテージを提供する。これらのＡＡＶ９ウイルス粒子は、受容体の結合を減少させる変異Ｗ５０３Ａ、およびリンカーを有しないか、または１０アミノ酸リンカーに隣接する残基Ａ５８９（もしくはＧ４５３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入を含むキャプシド、あるいは、変異Ｗ５０３Ａを含む「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質と、Ａ５８９−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇもしくはＧ４５３−リンカー１０−ＳｐｙＴａｇのいずれかとの間に１：７の比率で構成されるモザイクＡＡＶ９ウイルス粒子から構成され、ここで、「Ｗ５０３Ａ」キャプシドタンパク質は、変異Ｗ５０３Ａを有するが、ＳｐｙＴａｇを有しない。ウイルスは、形質転換のマーカーとしてＧＦＰを発現する。
【図１１】肝細胞上にヒトＡＳＧＲ１を発現するように遺伝子導入により改変されたＣ５７ＢＬ／６マウスから採取された肝試料の免疫蛍光顕微鏡画像を提供する。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によるか、または対象となるＣＡＧＧ  ｅＧＦＰヌクレオチドを担持し、かつ（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＣＤ３抗体（ＡＡＶ  ＳｐｙＴ−抗ｈＣＤ３  ＣＡＧＧ  ｅＧＦＰ）または（２）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＡＳＧＲ１抗体（ＡＡＶ  ＳｐｙＴ−抗体ｈＡＳＧＲ１  ＣＡＧＧ  ｅＧＦＰ）によって改変された、ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２粒子の２．５ｘ１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／動物による、静脈内注射の１０日後に試料を回収した。マウスを、４％のＰＦＡで屠殺し、遺伝子導入により灌流した。肝臓、腎臓、心臓の器官を回収し、１５％のスクロース中で脱水し、その後、３０％のスクロース中で脱水した。次に、器官を、スライド上で凍結切片化し、ニワトリ抗ＥＧＦＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）  およびＡｌｅｘａ−４８８接合抗ニワトリ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。各画像は、１匹のマウスを表す。「ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２」キャプシドは、以下の変異を含む。Ｒ５８５Ａ、ｄｅｌＲ５８８、および残基Ｎ５８７（配列番号１３）の直後のＳｐｙＴａｇペプチドの挿入。ウイルスは、形質導入のマーカーとしてｅＧＦＰを発現する。
【図１２】リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によるか、または対象となるホタルルシフェラーゼヌクレオチドを担持し、かつ（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＣＤ６３抗体または（２）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＡＳＧＲ１抗体によって改変された、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ２粒子、またはＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２粒子の３．０ｘ１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／動物による、静脈内注射の１４日後の、肝細胞上にヒトＡＳＧＲ１を発現しない個々のマウス（対照）および肝細胞上にヒトＡＳＧＲ１を発現する遺伝子改変マウス（ＡＳＧＲ１ヒト化マウス）の蛍光画像を提供する。これらの「ＡＡＶ２」ウイルス粒子は、ＳｐｙＴａｇが１０アミノ酸リンカー（配列番号２９）に隣接する残基Ｇ４５３の直後に挿入された「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質間に、かつＳｐｙＴａｇを有しないが、天然の受容体結合を減少させる残基Ｎ５８７（配列番号５３）の直後に挿入されたＭｙｃタグアミノ酸配列を含有するキャプシド間に、１：７の比率で構成されるモザイクウイルス粒子である。ウイルスは、形質導入のマーカーとしてホタルルシフェラーゼを発現する。マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、ルシフェリン基質を注射し、ＩＶＩＳスペクトル生体内撮像システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して１０分後に撮像した。
【図１３】リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または野生型（ｗｔ）ＡＡＶ９粒子の１．０ｘ１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）／動物、または対象となるＣＭＶ  ｅＧＦＰヌクレオチドを担持し、かつ（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＡＳＧＲ１抗体（ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋無関連ｍＡｂ）または（２）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＥＮＴＰＤ３抗体抗体（ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗−ＥＮＴＰＤ３）によって改変された、ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２粒子の１．０ｘ１０１３ウイルスゲノム（ｖｇ）／動物による静脈内注射の４週間後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取された肝臓および膵臓試料の免疫組織化学画像を提供する。マウスを屠殺し、肝臓および膵臓を回収し、１０％の中性緩衝ホルマリン中に固定した。次に、器官をスライド上に埋め込み、凍結切片化し、抗ＧＦＰ抗体で染色した。各画像は、１匹のマウスを表す。これらの「ＡＡＶ２」ウイルス粒子は、ＳｐｙＴａｇが１０アミノ酸リンカー（配列番号２９）に隣接する残基Ｇ４５３の直後に挿入された「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質間に、かつＳｐｙＴａｇを有しないが、天然の受容体結合を減少させる残基Ｎ５８７（配列番号５３）の直後に挿入されたＭｙｃタグアミノ酸配列を含有するキャプシド間に、１：７の比率で構成されるモザイクウイルス粒子である。ウイルスは、形質導入のマーカーとしてｅＧＦＰを発現する。ＥＮＴＰＤ３は、他の細胞タイプの中でも特に、膵島細胞および舌中に発現されるが、肝臓中には発現されないことが報告されている。ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２粒子は、肝臓から脱離され、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋無関連ｍＡｂ」または「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子を注射したマウスの肝臓中にｅＧＦＰ発現は観察されなかった。「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子を注射したマウスのうちの１つの膵臓試料中に、膵島中の陽性染色が検出された。
【図１４】リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または２．０ｘ１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）／動物の野生型（ｗｔ）ＡＡＶ９粒子、または対象となるＣＭＶ  ｅＧＦＰ核酸を担持し、かつ（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＡＳＧＲ１抗体（ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋無関連ｍＡｂ）または（２）ＥＮＴＰＤ３（ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗ＥＮＴＰＤ３）に結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ヒトＥＮＴＰＤ３抗体によって改変された、ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２粒子による静脈内注射の１４日後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取された肝臓および舌試料の免疫組織化学画像を提供する。マウスを屠殺し、肝臓および舌を回収し、１０％の中性緩衝ホルマリン中に固定した。次に、器官をスライド上に埋め込み、凍結切片化し、抗ＧＦＰ抗体で染色した。各画像は、１匹のマウスを表し、３匹のマウスに注射し、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋無関連ｍＡｂ」および「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗ＥＮＴＰＤ３」群から分析し、すべてが類似のＧＦＰ発現パターンを示した。これらの「ＡＡＶ２」ウイルス粒子は、ＳｐｙＴａｇが１０アミノ酸リンカー（配列番号２９）に隣接する残基Ｇ４５３の直後に挿入された「ＳｐｙＴａｇ」キャプシドタンパク質間に、かつＳｐｙＴａｇを有しないが、天然の受容体結合を減少させる残基Ｎ５８７（配列番号５２）の直後に挿入されたＭｙｃタグアミノ酸配列を含有するキャプシド間に、１：７の比率で構成されるモザイクウイルス粒子である。ウイルスは、形質導入のマーカーとしてｅＧＦＰを発現する。ＥＮＴＰＤ３は、マウスの舌中に表現されるが、肝臓中には発現されない（公共のデータベースＧｅｎｅＰａｉｎｔ．ｏｒｇ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ａｓｓａｙ／ＭＧＩ：５４２３０２１およびＲｉｋｅｎ  ＦＡＮＴＯＭ５  ｐｒｏｊｅｃｔ，ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｄａｔａｓｅｔから抽出されたデータ）ことが報告されている。ｅＧＦＰ発現は、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋無関連ｍＡｂ」または「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗ＥＮＴＰＤ３」粒子を注射した肝臓中には観察されなかったが、「ＡＡＶ２  ＳｐｙＴａｇ＋抗−ＥＮＴＰＤ３」粒子を注射した３匹のマウスすべての舌中に検出された。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
ＷＯ２０１６／１１２９１は、ワクチン接種の目的で、免疫原性抗原をＡＰ２０５キャプシド上に高密度で提示する、改変バクテリオファージＡＰ２０５由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生産するための特異的結合対（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ）の利用を記載している。理論上、ウイルスベクターを再標的化する目的で、ウイルスベクターの天然指向性が実質的に減少されるか、または無効にされることを確実にするために、このようなウイルスキャプシドの高度な改変が望ましい場合がある。しかしながら、標的化リガンドをウイルス表面上にこのように高密度で提示することは、形質導入効率を妨げる可能性がある。実施例４および５を参照されたい。最適な形質導入効率を達成するためには、メンバーを用いたウイルス表面の改変の程度が減少されるときに最適な形質導入効率が生じることが発見された。このように、遺伝子改変ウイルス粒子、これらを含む組成物、およびこれらを作製および使用する方法を本明細書に提供する。
【００４８】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４９】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別段明確に指示されない限り、複数形の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法、および／または本明細書に記載の、かつ／もしくは当業者には本開示を読むと明らかになるタイプの工程を含む。
【００５０】
「抗体」という用語には、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）を含む、免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、少なくとも３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および任意選択的にＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的な領域が散在する。各重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略される場合があり、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略され得る）。典型的な四量体抗体構造は、２つの同一の抗原結合ドメインを含み、それらのそれぞれがＶＨドメインおよびＶＬドメインの会合によって形成され、それらのそれぞれがそれぞれのＣＨおよびＣＬドメインと一緒に抗体Ｆｖ領域を形成する。単一ドメイン抗体は、単一抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨまたはＶＬを含む。抗原の抗原結合ドメイン、例えば、抗原の特異的結合対の第１のメンバーを認識し、これに結合する抗体の一部は、「パラトープ」とも呼ばれる。それは、抗体のＦｖ領域の小さい領域（５〜１０個のアミノ酸の）であり、断片抗体結合（Ｆａｂ領域）の一部であり、抗体の重鎖および／または軽鎖の部分を含有し得る。パラトープは、パラトープが特異的結合対の第１のメンバーに高親和性で結合する場合に、特異的結合対の第１のメンバーに特異的に結合する。「高親和性」抗体という用語は、約１０−９Ｍ以下（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２Ｍ）の特異的結合対のその標的となる第１のメンバーに対するＫＤを有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定され、別の実施形態では、ＫＤは、ＥＬＩＳＡによって測定される。
【００５１】
「相補性決定領域」という語句または「ＣＤＲ」という用語は、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、通常（すなわち、野生型動物では）、免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域の間に見られる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系配列、または再配列されたもしくは再配列されていない配列によって、例えば、ナイーヴ細胞もしくは成熟したＢ細胞またはＴ細胞によってコードされ得る。ＣＤＲは、体細胞変異されている（例えば、動物生殖細胞系でコードされた配列と異なり）、ヒト化されている、かつ／またはアミノ酸置換、付加、もしくは欠失で改変されている場合がある。いくつかの環境下（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によってコードすることができ、当該２つ以上の配列は、例えば、（例えば、再配列されていない核酸配列においては）連続していないが、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ−Ｄ−Ｊ再組み合わせ）の結果として、Ｂ細胞核酸配列においては連続している。
【００５２】
「逆位末端配列」または「ＩＴＲ」という語句は、効率的な複製に必要なアデノ随伴ウイルスのゲノム中の対称核酸配列を含む。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ  ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製の起源としての役割を果たし、ＡＡＶベクターを生成するための必須シス構成要素である。
【００５３】
「軽鎖」という語句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列を含み、別段の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトκ軽鎖およびヒトλ軽鎖ならびにＶｐｒｅＢを含む。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。一般に、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、当該遺伝子配列は、一般に、生殖細胞系に存在するＶセグメントおよびＪセグメントのレパートリーに由来するＶＬセグメントおよびＪＬセグメントを含む。様々な生物体に対するＶ軽鎖セグメントおよびＪ軽鎖セグメントの配列、位置、および命名は、ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで見ることができる。軽鎖は、例えば、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第１のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の第１のメンバーまたは第２のメンバーのいずれも選択的に結合しない軽鎖を含む。軽鎖はまた、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第１のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の１つ以上の第１のメンバーの結合および認識により重鎖または別の軽鎖に結合し、これを認識するか、またはこれを補助する軽鎖を含む。一般的な軽鎖または汎用軽鎖には、ヒトＶκ１〜３９Ｊκ遺伝子またはヒトＶκ３〜２０Ｊκ遺伝子に由来する軽鎖を含み、それらの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。例示的なヒトＶＬセグメントは、ヒトＶκ１〜３９遺伝子セグメント、ヒトＶκ３〜２０遺伝子セグメント、ヒトＶλ１〜４０遺伝子セグメント、ヒトＶλ１〜４４遺伝子セグメント、ヒトＶλ２〜８遺伝子セグメント、ヒトＶλ２〜１４遺伝子セグメント、およびヒトＶλ３〜２１遺伝子セグメントを含み、それらの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。１つの生物体（例えば、ヒトもしくは齧歯類、例えば、ラットもしくはマウス、または鳥類、例えば、ニワトリ由来の可変ドメイン、および同じまたは異なる生物体（例えば、ヒトもしくは齧歯類、例えば、ラットもしくはマウス、または鳥類、例えば、ニワトリ）由来の定常領域を含む軽鎖を作製することができる。
【００５４】
「約」または「およそ」という用語は、ある値の統計的に有意義な範囲内にあることを含む。このような範囲は、所与の値または範囲の１０倍以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、よりいっそう好ましくは５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容可能な変動は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。
【００５５】
「キャプシドタンパク質」という用語は、ウイルスのキャプシドの一部であるタンパク質を含む。アデノ随伴ウイルスについては、キャプシドタンパク質は、一般に、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３と呼ばれ、それらは単一のキャップ遺伝子によってコードされる。ＡＡＶについては、３つのＡＡＶキャプシドタンパク質が、代替的なｍＲＮＡスプライシングおよび／または代替的な翻訳開始コドン使用を介したキャップオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から重複様式で生成されるが、３つのタンパク質すべてが共通の終止コドンを使用する。Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６５９５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ２のＶＰ１は、一般に、２．４ｋｂのｍＲＮＡ上のＡＴＧ開始コドン（アミノ酸Ｍ１）から翻訳されるが、ＡＡＶ２のＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ２生成のためのより弱いＡＣＧ開始コドン（アミノ酸Ｔ１３８）、および最も豊富なキャプシドメタンタンパク質であるＶＰ３の生成のための次の利用可能なＡＴＧコドン（アミノ酸Ｍ２０３）に対するリードスルー翻訳を使用して、より小さい２．３ｋｂのｍＲＮＡから生じる。Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ｓｕｐｒａ；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９−１９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。アデノ随伴ウイルスのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られており、一般に保存されており、特にデペンドパルボウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）内に保存されている。上記のＲｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。例えば、上記のＲｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）は、図４Ｂに、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、およびＡＡＶ６のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３キャプシドタンパク質のためのアミノ酸配列アラインメントを提供し、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のそれぞれの開始部位は矢印で示され、可変ドメインはボックスで示されている。したがって、本明細書に提供されるアミノ酸位置は、ＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質に関連して提供され得、さらに明記されない本明細書に提供されるアミノ酸位置は、配列番号１として表される主要なコードタンパク質ＶＰ１のＡＡＶ２配列を指すが、当業者であれば、ＡＡＶのＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質内の同じアミノ酸の位置、および異なるセロタイプの中のアミノ酸の対応する位置をそれぞれ容易に決定することができるであろう。したがって、本明細書に提供されるアミノ酸位置は、ＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質に関連して提供され得、さらに明記されない本明細書に提供されるアミノ酸位置は、配列番号９として表される主要なコードタンパク質ＶＰ１のＡＡＶ２配列を指すが、当業者であれば、ＡＡＶのＶＰ２および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質内の同じアミノ酸の位置、および異なるＡＡＶセロタイプの中の対応するアミノ酸および位置をそれぞれ容易に決定することができるであろう。さらに、当業者であれば、「キメラキャプシドタンパク質」の形成のために異なるＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質間のドメインを交換することがで��るであろう。
【００５６】
「キメラＡＡＶキャプシドタンパク質」の生成のための２つのＡＡＶキャプシドタンパク質構築物間のドメイン交換が記載されている。例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １５（１１）：１９５５−１９６２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。「キメラＡＡＶキャプシドタンパク質」には、アミノ酸配列、例えば、２つ以上の異なるＡＡＶセロタイプ由来のドメインを含み、ＡＡＶ様ウイルスキャプシド／ウイルス粒子を形成することができ、かつ／または形成する、ＡＡＶキャプシドタンパク質が含まれる。キメラＡＡＶキャプシドタンパク質は、キメラＡＡＶキャプシド遺伝子、例えば、複数の、例えば少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされ、その複数のそれぞれは、区別可能なＡＡＶセロタイプのキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子の一部分と同一であり、その複数は共に、機能的キメラＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする。特定のＡＡＶセロタイプに関連してキメラキャプシドタンパク質を参照することは、キャプシドタンパク質が、そのセロタイプのキャプシドタンパク質由来の１つ以上のドメイン、および異なるセロタイプのキャプシドタンパク質由来の１つ以上のドメインを含むことを示している。例えば、ＡＡＶ２キメラキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２  ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の１つ以上のドメイン、ならびに異なるＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質の１つ以上のドメインを含む、キャプシドタンパク質を含む。
【００５７】
「モザイクキャプシド」は、少なくとも２セットのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含み、それらの各セットは、異なるキャップ遺伝子によってコードされる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のモザイクキャプシドは、異種エピトープをコードする核酸配列の挿入により遺伝子改変されたキャップ遺伝子によってコードされる組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含み、参照キャップ遺伝子、例えば、組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と同じＡＡＶセロタイプの野生型ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする野生型参照キャップ遺伝子、組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と同一であるが、異種エピトープが非存在であるＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする対照参照キャップ遺伝子、組換えＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質と同じＡＡＶセロタイプであるが、変異により野生型ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質の指向性が好ましくは減少された変異（例えば、導入、置換、欠失）を有する実質的に野生型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする変異野生型参照キャップ遺伝子によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、参照キャップ遺伝子は、キメラＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードする。
【００５９】
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という語句には、任意の生物体由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列が含まれる。重鎖可変ドメインは、別段の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲ、およびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端方向に）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、特異的結合対の第１のメンバーを特異的に認識する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のＫＤにより特異的結合対の第１のメンバーを認識する）ことができ、細胞を発現し、細胞から分泌可能であり、かつ少なくとも１つのＣＤＲを含む、断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、当該遺伝子配列は、一般に、生殖細胞系に存在するＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントのレパートリー由来のＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントを含む。様々な生物体についてのＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントの配列、位置、および命名は、ＩＭＧＴデータベースで見ることができ、これは、インターネット経由でＵＲＬが「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」の世界的なウェブ（ｗｗｗ）でアクセス可能である。
【００６０】
「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」などの用語は、重鎖定常領域に動作可能に結び付けられた可変領域を含む免疫グロブリン様鎖を含む単量体またはホモ二量体の免疫グロブリン分子を指し、これは、重鎖定常領域が典型的には機能的ＣＨ１ドメインを欠いているため軽鎖と会合することができない。したがって、「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」などの用語は、（ｉ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に操作可能に連結された可変ドメインを含む免疫グロブリン様鎖の１つを含む単量体単一ドメイン抗原結合タンパク質、または（ｉｉ）２つの免疫グロブリン様鎖を含むホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質であって、そのそれぞれが、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に操作可能に連結された可変ドメインを含む、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質の両方を包含する。様々な態様では、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質は、２つの同一の免疫グロブリン様鎖を含み、それらのそれぞれが、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている同一の重鎖定常領域に操作可能に連結された同一の可変ドメインを含む。さらに、単一ドメイン抗原結合タンパク質の各免疫グロブリン様鎖は、重鎖定常領域遺伝子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせ）の配列（および、任意選択的に、ヒンジ領域）をコードするＣＨ１における欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子配列に連結された、重鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ）、軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ、ＪＬ）、またはそれらの組み合わせに由来し得る可変ドメインを含む。重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＨ単一ドメイン抗体または「ＶＨ単一ドメイン抗体結合タンパク質」と呼ばれる場合があり、例えば、米国特許第８，７５４，２８７、米国特許公開第２０１４／０２８９８７６；号、同第２０１５／０１９７５５３号、同第２０１５／０１９７５５４号、同第２０１５／０１９７５５５号、同第２０１５／０１９６０１５号、同第２０１５／０１９７５５６号、同第２０１５／０１９７５５７号（それらのそれぞれは、それらの全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。軽鎖遺伝子セグメント由来の可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼ばれる場合があり、例えば、米国特許公開第２０１５／０２８９４８９号（その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【００６１】
「軽鎖」という語句には、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、別段の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトカッパ（κ）軽鎖およびヒトラムダ（λ）軽鎖、ならびにＶｐｒｅＢが含まれる。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。一般に、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、当該軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、一般に、生殖細胞系に存在する軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントおよび軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含む。様々な生物体についての軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントの配列、位置、および命名は、ＩＭＧＴデータベースで見ることができ、これは、インターネット経由でＵＲＬが「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」の世界的なウェブ（ｗｗｗ）でアクセス可能である。軽鎖には、例えば、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第１のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の第１のメンバーまたは第２のメンバーのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。軽鎖にはまた、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第１のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の１つ以上の第１のメンバーに結合し、これを認識することにより重鎖に結合し、これを認識するか、または重鎖を補助する軽鎖が含まれる。軽鎖にはまた、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第１のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の１つ以上の第１のメンバーに結合し、これを認識することにより重鎖に結合し、これを認識するか、または重鎖を補助する軽鎖が含まれる。一般的な軽鎖または汎用軽鎖は、ヒトＶκ１〜３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３〜２０Ｊκ１遺伝子由来の軽鎖を含み、それらの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」という語句は、互いに直接的または間接的に相互作用するか、または別様に互いに協働して生態学的事象に加わる、構成要素または要素の物理的な並置（例えば、３次元空間での）を含み、当該並置は、こうした相互作用および／または協働を達成するかまたは可能にする。一例を挙げると、核酸中の制御配列（例えば、発現制御配列）は、その存在または非存在がコード配列の発現および／または活性に影響を与えるようにコード配列に対して位置する場合に、コード配列に対して「操作可能に連結されている」と言われる。多くの実施形態では、「操作可能な連結」は、互いに関連する構成要素または要素の共有結合を含む。当業者であれば、いくつかの実施形態では、共有結合は、効果的で操作可能な連結を達成する必要がないことを容易に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、核酸制御配列であって、それらが制御しているコード配列と操作可能に連結される核酸制御配列は、対象ヌクレオチドと連続している。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、１つ以上のこうした制御配列は、トランスまたは対象のコード配列を制御するための距離において作用する。いくつかの実施形態では、「発現制御配列」という用語は、本明細書で使用される場合、それらが連結されているコード配列の発現および処理に影響を与えるのに必要なおよび／または十分なポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡ処理シグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、タンパク質安定性を強化する配列、および／またはいくつかの実施形態では、タンパク質分泌を強化する配列であり得る、またはこれらを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の制御配列は、特定の宿主細胞もしくは生物体、またはそれらのタイプで優先的にまたはそれらでのみ活性である。一例を挙げると、原核生物では、制御配列は、典型的には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物では、多くの実施形態では、制御配列は、典型的に、プロモーター、エンハンサー、および／または転写終結配列を含む。当業者であれば、多くの実施形態で、「制御配列」という用語は、発現および処理に不可欠な構成要素を指し、いくつかの実施形態で、その存在が発現に有利である構成要素（例えば、リーダー配列、標的化配列、および／または融合パートナー配列を含む）を含むことを理解するであろう。
【００６３】
「組換えキャプシドタンパク質」という用語には、野生型ウイルスの対応するキャプシドタンパク質と比較して、少なくとも１つの変異を有するキャプシドタンパク質が含まれ、当該野生型は、比較研究のための参照および／または対照ウイルスであり得る。組換えキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に挿入され得、かつ／またはこれによって提示され得る異種アミノ酸配列を含む、キャプシドタンパク質を含む。この文脈における「異種」とは、ウイルスと比較して異種を意味し、これからキャプシドタンパク質が由来する。挿入されるアミノ酸は、キャプシドタンパク質の２つの所与のアミノ酸の間に単に挿入され得る。アミノ酸の挿入はまた、挿入部位におけるキャプシドタンパク質の所与のアミノ酸の欠失と共に行われる場合があり、例えば、１つ以上のキャプシドタンパク質アミノ酸は、５つ以上の異種アミノ酸によって置換される）。
【００６４】
「再標的化」または「再配向」とは、野生型ベクターが組織内のいくつかの細胞および／または生物体内のいくつかの器官内のいくつかの細胞を標的化し、組織または器官の一般的な標的化が、異種エピトープの挿入によって減少されるか、または無効にされ、生物体内の組織または特異的器官中のより特異的な細胞の再標的化が、特異的細胞によって発現されるマーカーに結合する標的化リガンドにより達成されるというシナリオを含み得る。こうした再標的化または再指向はまた、野生型ベクターが組織を標的化し、組織の標的化が、異種エピトープの挿入によって減少されるか、または無効にされ、完全に異なる組織への再標的化が標的化リガンドにより達成されるというシナリオを含み得る。
【００６５】
「特異的結合対」、「タンパク質：タンパク質結合対」などは、イソペプチド結合形成を可能にするか、または促進する条件下で結合される、共有イソペプチド結合を形成するように相互作用する、２つのタンパク質（例えば、第１のメンバー（例えば、第１のポリペプチド））および第２の同族メンバー（例えば、第２のポリペプチド）を含み、「同族」という用語は、イソペプチド結合を形成するように一緒に機能する、すなわち、一緒に反応する構成要素を指す。したがって、イソペプチド結合形成を可能にするか、または促進する条件下で、共有イソペプチド結合を形成するように一緒に効率的に反応する２つのタンパク質はまた、ペプチドリンカーの「相補的」対であるとも称され得る。共有イソペプチド結合を形成するように相互作用することができる特異的結合対は、Ｖｅｇｇｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：５０６で再検討されており、これらは、ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇ００２：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２、ＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇ、イソペプタグ：ピリンＣ、ＳｎｏｏｐＴａｇ：ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒなどのペプチド：ペプチド結合対を含む。概して、ペプチドタグは、タンパク質：タンパク質結合対のメンバーを指し、これは、概して、３０アミノ酸長よりも短く、第２の同族タンパク質と共有イソペプチド結合を形成するが、ここで、第２の同族タンパク質は、概して、より大きいが、これもＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇシステムなどの３０アミノ酸長よりも短い場合がある。
【００６６】
「イソペプチド結合」という用語は、カルボキシル基またはカルボキサミド基とアミノ基との間のアミド結合を指し、ここで、アミノ基の少なくとも１つは、タンパク質主鎖に由来しないか、または代替的に、タンパク質骨格の一部でないものと見られる。イソペプチド結合は、単一のタンパク質内に形成され得るか、または２つのペプチド間もしくはペプチドとタンパク質との間で生じ得る。したがって、イソペプチド結合は、単一のタンパク質内の分子内に、または分子内に、すなわち、２つのペプチド／タンパク質分子間に、例えば、２つのペプチドリンカー間に、形成され得る。典型的には、イソペプチド結合は、リジン残基と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸残基、またはタンパク質もしくはペプチド鎖からなる末端カルボキシル基との間に生じ得るか、またはタンパク質もしくはペプチド鎖のアルファ−アミノ末端と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、もしくはグルタミン酸残基との間に生じ得る。イソペプチド結合に関与する対の各残基は、本明細書では反応性残基と呼ばれる。本発明の好ましい実施形態では、イソペプチド結合は、リジン残基とアスパラギン残基との間に、またはリジン残基とアスパラギン酸残基との間に形成され得る。特に、イソペプチド結合は、リジンの側鎖アミンと、アスパラギンのカルボキサミド基またはアスパラギン酸のカルボキシル基との間に生じ得る。
【００６７】
ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、米国特許第９，５４７，００３号およびＺａｋｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ  １０９：Ｅ６９０−Ｅ６９７に記載されており（それらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓフィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢのＣｎａＢ２ドメインに由来している。ドメインを分割することによって、Ｚａｋｅｒｉらは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する１１２アミノ酸ポリペプチドである、その同族タンパク質「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」に対するアミド結合を形成する、配列ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号１）を有するペプチド「ＳｐｙＴａｇ」を得た。（Ｚａｋｅｒｉ（２０１２），ｓｕｐｒａ）。ＣｎａＢ２ドメインに由来するさらなる特異的結合対は、ＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇであり、これは、ＳｐｙＬｉｇａｓｅの存在下でイソペプチド結合を形成する。（Ｆｉｅｒｅｒ（２０１４）ＰＮＡＳ  １１１：Ｅ１１７６−１１８１）。ＳｐｙＬｉｇａｓｅは、反応性リシンを含含有するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒからのβ鎖を削除することによって操作され、その結果、アミノ酸配列ＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤ（配列番号２）を有する１０残基ペプチドタグである、ＫＴａｇを得た。ＳｐｙＴａｇ００２：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２システムは、Ｋｅｅｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ５６：１６５２１−２５に記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＳｐｙＴａｇ００２は、配列番号５４として表されるアミノ酸配列ＶＰＴＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫを有し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２（配列番号５５）に結合する。
【００６８】
ＳｎｏｏｐＴａｇ：ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒシステムは、Ｖｅｇｇｉａｎｉ（２０１６）ＰＮＡＳ  １１３：１２０２−０７に記載されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の接着剤であるＲｒｇＡのＤ４  Ｉｇ様ドメインを分割して、ＳｎｏｏｐＴａｇ（残基７３４〜７４５、配列番号５）およびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（残基７４９〜８６０）を形成した。ＳｎｏｏｐＴａｇおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒのインキュベーションにより、相補的タンパク質間に特異的な自然イソペプチド結合が生じる。上記のＶｅｇｇｉａｎｉ（２０１６））を参照されたい。
【００６９】
イソペプタグ：ピリン−Ｃ特異的結合対は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の主なピリンタンパク質Ｓｐｙ０１２８に由来した。（Ｚａｋｅｉｒ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｔｈ（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２：４５２６−２７）。イソぺプタグは、配列番号７として表されるアミノ酸配列ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥを有し、ピリン−Ｃ（Ｓｐｙ０１２８の残基１８〜２９９）に結合する。ＳｎｏｏｐＴａｇおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒのインキュベーションにより、相補的タンパク質間に特異的な自然イソペプチド結合が生じる。上記のＺａｋｅｉｒ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｔｈ（２０１０）を参照されたい。
【００７０】
「ペプチドタグ」という用語は、（１）ペプチドタグでタグ付きのタンパク質に対して異種であり、（２）イソペプチド結合を形成することができる特異的タンパク質：タンパク質結合対のメンバー、および（３）５０以下のアミノ酸長である、ポリペプチドを含む。
【００７１】
「標的細胞」という用語には、対象ヌクレオチドの発現が所望の任意の細胞が含まれる。好ましくは、標的細胞は、以下に記載のように、細胞を標的化リガンドにより標的化することを可能にする受容体をそれらの表面上に呈する。
【００７２】
「形質導入」または「感染」などの用語は、ウイルスベクターによる標的細胞核への核酸の導入を指す。形質導入などに関連する効率という用語、例えば、「形質導入効率」という用語は、例えば、対象ヌクレオチドを含むウイルスベクターのセット数とのインキュベーション後の対象ヌクレオチドを発現する細胞の画分（例えば、パーセンテージ）を指す。形質導入効率を決定するよく知られている方法には、蛍光レポーター遺伝子により形質導入された蛍光活性化細胞ソーティング、対象ヌクレオチドの発現のためのＰＣＲなどが含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語には、「正常」（変異体、疾患の、変更されたなどとは対照的に）な状態または文脈で自然界に見られる構造および／または活性を有する実体を含む。当業者であれば、野生型ウイルスベクター、例えば、野生型キャプシドタンパク質が、比較研究における参照ウイルスベクターとして使用され得ることを理解するであろう。一般に、参照ウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターは、試験ウイルスキャプシドタンパク質／キャプシド／ベクターと同一であるが、効果が試験される変化に対して同一である。例えば、特異的結合対の第１のメンバーを試験ウイルスベクターに挿入する、例えば、形質導入効率に対する効果を決定するために、試験ウイルスベクターの形質導入効率（適切な標的化リガンドの存在または非存在下で）は、特異的結合対の第１のメンバーの存在を除いて、あらゆる例（例えば、さらなる変異、対象となるヌクレオチド、ウイルスベクターおよび標的細胞の数など）において試験ウイルスベクターと同一である参照ウイルスベクターの形質導入効率と比較され得る（必要に応じて、適切な標的化リガンドの非存在または存在下で）。
【００７４】
本明細書に記載の再標的化戦略は、上記に記載の足場および直接的な組換え手法の両方の利点を提供し、ならびに両方に固有の欠点のうちの多くを解決する。この戦略は、第１のメンバーおよび第２の同族メンバーが互いに特異的に結合し、結合すると、ウイルス粒子を同族メンバーに融合された任意の標的化リガンドに永久的に連結させる共有結合を形成する、特異的結合対を利用する。このような遺伝子改変ウイルス粒子を用いると、ウイルスキャプシドが損なわれない状態である限り、指向性が維持され、例えば、他の足場手法と比較した本明細書に提供されるシステムの１つの利点は、「アダプター」、例えば、標的化リガンドが直接的な組換え手法と類似した組換えウイルス粒子に結合される能力である。しかしながら、直接的な組換え手法とは対照的に、本明細書に記載のシステムは、組換えウイルス粒子がアダプターに見られる可変性を一定に維持することができる、例えば、同族メンバーが標的化リガンドを示差するように融合され、次に異なる融合タンパク質が標的細胞に従ってウイルス粒子に連結され得るという点で、足場アダプター手法の柔軟性を維持している。
【００７５】
組換えウイルスキャプシドタンパク質およびウイルスベクターおよび核酸
特異的結合対の第１のメンバーを含む異種アミノ酸配列を提示するように遺伝子改変された組換えウイルス粒子（例えば、ウイルスキャプシドタンパク質、ならびに組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドおよび／または組換えウイルスベクター）であって、アミノ酸配列が、５０アミノ酸長よりも短く、組換えウイルスキャプシド／粒子タンパク質が、天然指向性を減少させるか、または無効にする、組換えウイルス粒子を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、特異的結合対の第２の同族メンバーをさらに含み、第１および第２のメンバーは、共有結合され、第２のメンバーは、標的化リガンドに融合される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、特異的結合対の第１のメンバーおよび１つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、リンカーに隣接する特異的結合対の第１のメンバーを含み、例えば、異種アミノ酸配列は、第１のリンカーのＮ末端〜Ｃ末端、特異的結合対の第１のリンカー、および第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１および第２のリンカーは同一である。
【００７７】
一般に、本明細書に記載の異種アミノ酸配列は、例えば、自身による特異的結合対の第１のメンバーを含むか、または１つ以上のリンカーと組み合わせて、約５アミノ酸長〜約５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、少なくとも５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、１９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、２９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、３９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、４９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、５０アミノ酸長である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、特異的結合対は、ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合対であり、第１のメンバーは、ＳｐｙＴａｇであり、第２の同族メンバーは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。いくつかの実施形態では、特異的結合対は、ＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇであり、第１のメンバーは、ＳｐｙＴａｇであり、第２の同族メンバーは、ＫＴａｇである。いくつかの実施形態では、特異的結合対は、ＳｐｙＴａｇ：ＫＴａｇであり、第１のメンバーは、ＫＴａｇであり、第２の同族メンバーは、ＳｐｙＴａｇである。いくつかの実施形態では、特異的結合対は、イソペプタグ：ピリン−Ｃであり、第１のメンバーは、イソペプタグであり、第２の同族メンバーは、ピリン−Ｃまたはその一部分である。いくつかの実施形態ではである。特異的結合対は、ＳｎｏｏｐＴａｇ：ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒであり、第１のメンバーは、ＳｎｏｏｐＴａｇであり、第２の同族メンバーは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄキャプシドタンパク質、例えば、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、およびＡｄ７からなる群から選択されるＡｄセロタイプのキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄ２キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄ５キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＡｄウイルスキャプシドタンパク質は、繊維タンパク質ドメイン中に、例えば、繊維タンパク質、繊維ノブ、および／または繊維ノブのＨＩループのカルボキシ末端に、特異的結合対の第１のメンバーを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質遺伝子、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶセロタイプのキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子またはＡＡＶ９キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、その野生型アミノ酸配列は、配列番号９として表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変ＡＡＶ９  ＶＰ１キャプシドタンパク質であり、その野生型アミノ酸配列は、配列番号３１として表される。
【００８１】
一般に、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、特異的結合対の第１のメンバーが、キャプシドタンパク質またはそれを含むキャプシドの天然指向性を減少させ、かつ／または無効にするように、キャプシドタンパク質に挿入され、かつ／またはこれによって提示される特異的結合対の第１のメンバーを含む。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーは、野生型参照キャプシドタンパク質の天然指向性に関与するキャプシドタンパク質の領域、例えば、細胞受容体に関与するキャプシドタンパク質の領域に挿入される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーは、Ａｄ繊維タンパク質のノブドメインに挿入され、かつ／またはこれによって提示される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーは、Ａｄ繊維タンパク質のＨＩループに挿入され、かつ／またはこれによって提示される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１のＮ５８７、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＧ４５３、およびＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１のＡ５８９からなる群から選択されるアミノ酸位置の後に挿入される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーは、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドのアミノ酸Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入および／または提示される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および／または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３５、３７、または３９として表されるアミノ酸配列を含む。ＡＡＶ２を使用することによって同定されるさらなる好適な挿入部位は、当該技術分野でよく知られており（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５−８６４７）、Ｉ−１、Ｉ−３４、Ｉ−１３８、Ｉ−１３９、Ｉ−１６１、Ｉ−２６１、Ｉ−２６６、Ｉ−３８１、Ｉ−４４７、Ｉ−４４８、Ｉ−４５９、Ｉ−４７１、Ｉ−５２０、Ｉ−５３４、Ｉ−５７０、Ｉ−５７３、Ｉ−５８４、Ｉ−５８７、Ｉ−５８８、Ｉ−５９１、Ｉ−６５７、Ｉ−６６４、Ｉ−７１３、およびＩ−７１６を含む。本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ−１、Ｉ−３４、Ｉ−１３８、Ｉ−１３９、Ｉ−１６１、Ｉ−２６１、Ｉ−２６６、Ｉ−３８１、Ｉ−４４７、Ｉ−４４８、Ｉ−４５９、Ｉ−４７１、Ｉ−５２０、Ｉ−５３４、Ｉ−５７０、Ｉ−５７３、Ｉ−５８４、Ｉ−５８７、Ｉ−５８８、Ｉ−５９１、Ｉ−６５７、Ｉ−６６４、Ｉ−７１３、Ｉ−７１６、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に挿入される特異的結合対の第１のメンバーを含む、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質であり得る。さらなるＡＡＶセロタイプを使用することによって同定されるさらなる好適な挿入部位は、よく知られており、Ｉ−５８７（ＡＡＶ１）、Ｉ−５８９（ＡＡＶ１）、Ｉ−５８５（ＡＡＶ３）、Ｉ−５８５（ＡＡＶ４）、およびＩ−５８５（ＡＡＶ５）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ｉ−５８７（ＡＡＶ１）、Ｉ−５８９（ＡＡＶ１）、Ｉ−５８５（ＡＡＶ３）、Ｉ−５８５（ＡＡＶ４）、Ｉ−５８５（ＡＡＶ５）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に挿入される特異的結合対の第１のメンバーを含むＡＡＶ２キャプシドタンパク質であり得る。
【００８２】
本明細書で使用される命名Ｉ−＃＃＃は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＶＰ１タンパク質に関するアミノ酸数を＃＃＃に命名する挿入部位を指すが、このような挿入は、直接Ｎ末端もしくはＣ末端に、好ましくは所与のアミノ酸の５つのアミノ酸のＮ末端またはＣ末端の配列における１つのアミノ酸のＣ末端に、所与のアミノ酸の好ましくは３つの、より好ましくは２つの、特に１つのアミノ酸（複数可）のＮ末端もしくはＣ末端に位置し得る。追加的に、本明細書で言及される位置は、ＡＡＶキャプシド遺伝子によってコードされるＶＰ１タンパク質に関するものであり、対応する位置（およびその変異）は、参照ＡＡＶキャプシド遺伝子によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の配列アラインメントを実施することによって、キャプシド遺伝子によってコードされるＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質について簡単に識別することができる。
【００８３】
したがって、キャップ遺伝子のこれらの部位のうちの１つのコード核酸の対応する位置への挿入は、キャプシドタンパク質がずらされた開始コドンと同じ遺伝子の重複したリーディングフレームによってコードされるので、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３への挿入につながる。したがって、例えば、ＡＡＶ２については、この命名によると、アミノ酸１〜１３８の挿入のみがＶＰ１に挿入され、１３８〜２０３の挿入は、ＶＰ１およびＶＰ２に挿入され、２０３〜Ｃ末端の挿入は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に挿入され、これは当然のことながら、挿入部位Ｉ−５８７についても当てはまる。したがって、本発明は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質における対応する挿入を有するＡＡＶの構造遺伝子を包含する。
【００８４】
追加的に、少なくとも大きな延伸の高度保存および密接に関連するファミリーメンバーの大きなメンバーにより、列挙されているＡＡＶ以外のＡＡＶの対応する挿入部位は、アミノ酸アラインメントを実施することによって、またはキャプシド構造の比較によって同定することができる。例えば、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９−１９、および異なるＡＡＶキャプシドタンパク質の例示的なアラインメントについての米国特許第９，６２４，２７４号（それらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を減少させるか、または無効にし、例えば、野生型参照ウイルスベクターおよび／または標的細胞による感染に対して天然に許容状態の細胞の形質導入は、適切な標的化リガンドに融合される結合対の第２の同族部材との共有結合の非存在下で検出不能である。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、例えば、野生型参照ウイルスベクターによる感染に対して天然に許容状態である細胞の形質導入と比較して、ウイルスベクターの天然指向性を減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも５％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも５％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも１０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも２０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも３０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも４０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも５０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも６０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも７０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも８０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも９０％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも９５％減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも９０％減少させる。特異的結合対の第１のメンバーの挿入（提示）が組換えウイルスキャプシドの天然指向性を完全に無効にしない実施形態では、このような組換えウイルスキャプシドの天然指向性は、第２の異なる変異によってさらに減少され得る。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９セロタイプに由来し得、特異的結合対の第１のメンバーを含み得、変異、例えば、Ｗ５０３Ａ変異をさらに含み得る。
【００８６】
このウイルスのその天然宿主からの脱離は、天然宿主細胞によるウイルスベクターの取り込みがウイルスベクターの有効量を制限するため、特に、ウイルスベクターの全身投与対局所的または局所領域的投与が意図されている場合に重要である。ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の場合、ＨＳＰＧは、多数の細胞、特に肝細胞におけるウイルス取り込みのための主な受容体であると報告されている。ＡＡＶ２については、ＨＳＰＧ結合活性は、５つの基本アミノ酸、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｒ５８５、Ｒ５８８、およびＫ５３２（Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１０７２−８１）の群に依存している。したがって、好ましい点変異は、標的細胞へのウイルスベクターの結合のための主な受容体としてのＨＳＰＧの場合、天然受容体によって媒介される所与の標的細胞に対するウイルスベクターの形質導入活性を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９５％減少させるものである。
【００８７】
結果として、ＨＳＰＧ結合ウイルスベクターに対して好ましいさらなる変異は、Ｒ、Ｋ、またはＨなどの塩基性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、およびＴなどの非塩基性アミノ酸、好ましくはＡ、またはこの位置にそのようなアミノ酸を欠いている、異なるが高度に保存されたＡＡＶセロタイプの対応する位置に存在するアミノ酸によって、それぞれのウイルスのＨＳＰＧ結合に関与するＲまたはＫを除去または置換する変異である。結果として、好ましいアミノ酸置換は、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｒ４８７Ｇ、Ｋ５３２Ａ、Ｋ５３２Ｄ、Ｒ５８５Ａ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８５Ｑ、Ｒ５８５Ａ、またはＲ５８８Ｔ、特にＡＡＶ２に対するＲ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ、ならびにＡＡＶ６に対するＫ５３１ＡまたはＫ５３１Ｅである。本発明の特に好ましい一実施形態では、これらの２つの点変異が大幅にＨＳＰＧ結合活性をもたらすのに十分であるように、２つの点変異のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを追加的に含有するＡＡＶ２のキャプシドタンパク質変異体である。これらの点変異は、ＨＳＰＧ発現細胞からの効率的な脱離を可能にし、標的化のために、その新しい標的細胞に対するそれぞれの変異体ウイルスの特異性を増加させる。
【００８８】
標的化リガンド
本明細書に記載のウイルス粒子は、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入され／これによって提示される特異的結合対の第１のメンバーとの共有結合を特異的に形成する特異的結合対の第２のメンバーをさらに含み、第２のメンバーは、標的化リガンドに融合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞、例えば、（ヒト）真核細胞（例えば、標的細胞）上の細胞表面タンパク質の表面上に発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）腎細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）脳細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）リンパ球（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）Ｔ細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）Ｂ細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）樹状細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）マクロファージ（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）ＮＫ細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）腎臓細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（例えば、ヒト）癌細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に異種病原体に感染された（ヒト）細胞（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。
【００８９】
標的化リガンドによって標的化され得る好適であり、そのための標的化リガンド、例えば、抗体またはそれらの一部分が既に利用可能である、細胞表面タンパク質、例えば、細胞表面受容体は多数存在する。このような構造には、クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合性抗原、様々なサイトカインのための受容体（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３などのための受容体）、細胞型特異的性病ホルモン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、コロニー刺激成長因子、内皮成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経膠由来神経栄養因子、グリア細胞成長因子、ｇｒｏ−ｂｅｔａ／ｍｉｐ  ２、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、インターフェロン（α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γＩＦＮ、コンセンサスＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４）、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、マクロファージ／単球走化性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化タンパク質２、血小板由来成長因子、幹細胞因子、形質転換成長因子、腫瘍壊死因子、血管内非成長因子、リポタンパク質（ＰＲＬＲなどのさらなるまたは他のタイプ１膜貫通受容体、ＧＣＧＲなどのＧ−タンパク質結合受容体、Ｎａｖ１．７、ＡＳＩＣ１、またはＡＳＩＣ２などのイオンチャネルを含む）、細胞接着分子、アミノ酸などの代謝物質のための輸送分子、Ｂリンパ球またはＴリンパ球の光源受容体（例えば、Ｂ細胞受容体および関連するタンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０など）、ならびにＴ細胞受容体および関連するタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など）、テトラスパニンタンパク質（例えば、ＣＤ６３）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ウイルスベクター複合体のための標的として分化細胞表面抗原に結合する標的化リガンドを用いることによって、細胞型の特異的感染を可能にする。
【００９０】
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）腎細胞、すなわち、肝臓特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）脳細胞、脳細胞特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）造血細胞、すなわち、造血細胞特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）Ｔ細胞、すなわち、Ｔ細胞特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）Ｂ細胞、すなわち、Ｂ細胞特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）樹状細胞、すなわち、樹状細胞特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）マクロファージ、すなわち、マクロファージ特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）ＮＫ細胞、すなわち、ＮＫ細胞特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）腎細胞、すなわち、腎臓特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）膵臓細胞、すなわち、膵臓特異的マーカーによって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）腸細胞、すなわち、腸特異的マーカー（例えば、のみ）によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に（ヒト）癌細胞、すなわち、腫瘍関連抗原（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に異種病原体に感染された（ヒト）細胞（例えば、のみ）によって発現されるタンパク質に結合する。（１）細胞／組織／器官によって特異的に発現されるか、またはその発現が細胞／組織／器官中に濃縮され、（２）本明細書に記載の標的化リガンドとして有用な抗原結合タンパク質によって認識されるタンパク質は、よく知られており、ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇでも見ることができ、Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１２４８−５０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。以下の表２は、標的化リガンドとして有用であり得る抗原結合タンパク質が利用可能である例示的および非限定的な器官特異的マーカー、およびこのようなマーカーを発現する細胞／組織／器官を提供している。
【表２−１】
2020525020.tif 000004
【表２−２】
2020525020.tif 000005
【００９１】
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）肝細胞、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、ｈＡＳＧＲ１によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）脳細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３εによって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、例えば、（ヒト）腎細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、例えば、インテグリンなどの（ヒト）筋細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、（ヒト）癌細胞、例えば、腫瘍関連抗原、例えば、Ｅ６およびＥ７によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＣＧＲ）に結合する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原に結合する。特定の腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、例えば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、β−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ−８、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えば、ＧＡＧＥ−１、−２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６、および−１２）、ＭＡＲＴ−１、メソセリン、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ−１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、およびウロプラキン−３が挙げられる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、免疫応答、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０などに関連するＣＤマーカーに結合する。
【００９４】
本発明の一実施形態は、本発明の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造である。多量体構造は、本明細書に記載の特異的結合対の第１のメンバーを含む、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも６０個の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む。これらは、定常ウイルスキャプシド（空のウイルス粒子）またはウイルスベクター（対象ヌクレオチドを封入するキャプシド）を形成することができる。ウイルス性ゲノムをパッケージングすることができるウイルスベクターの形成は、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドをウイルスベクターとして使用するための非常に好ましい特徴である。
【００９５】
本発明の一実施形態は、上記に記載のキャプシドタンパク質をコードする核酸である。核酸は、好ましくは、本特許請求の範囲の核酸を含むベクターである。核酸、特にベクターは、本発明のキャプシドタンパク質を組換え発現するために必要である。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの組換えウイルスキャプシドタンパク質および／またはこれらをコードする核酸、好ましくは、遺伝子導入ベクターの製造および遺伝子導入ベクターとしての使用のための少なくとも１つの多量体構造（例えば、ウイルスベクター）の使用である。
【００９７】
使用および作製方法
本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質のさらなる実施形態は、対象ヌクレオチド、例えば、レポーター遺伝子または治療遺伝子を標的細胞に送達するためのそれらの使用である。概して、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子（複数可）または治療遺伝子（複数可）と隣接する５’および３’逆位末端配列（ＩＴＲ）配列を一般に含み得る導入プラスミドであり得る（これはＡＡＶベクター内に包含される場合、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターの制御下であり得る）。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、５’〜３’：５’ＩＴＲ、プロモーター、遺伝子（例えば、レポーターおよび／または治療遺伝子）、および３’ＩＴＲを含む導入プラスミドである。
【００９８】
有用なプロモーターの非限定的な例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、脾臓焦点形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター（１．２ｋｂ  ＥＦｌａプロモーター、または０．２ｋｂ  ＥＦｌａプロモーター）、キメラＥＦ  １ａ／ＩＦ４−プロモーター、およびホスホグリセロートキナーゼおよびホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。内部エンハンサーはまた、対象となる遺伝子の発現を増加させるためにウイルス構築物中に存在し得る。例えば、ＣＭＶエンハンサー（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用し得る。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、ニワトリβ−アクチンプロモーターと組み合わせて使用することができる。
【００９９】
様々なレポーター遺伝子（または検出可能部分）を、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造に封入することができる。例示的なレポーター遺伝子には、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子がコード）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ＭｍＧＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の方法は、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子の使用を用いる標的化ベクターの構築を実証しているが、本開示を読んだ当業者であれば、本明細書に記載の非ヒト動物が、レポーター遺伝子の非存在下で、または当該技術分野で知られている任意のレポーター遺伝子を用いて生産され得ることを理解するであろう。
【０１００】
様々な治療遺伝子を、例えば、導入ベクターの一部として、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造に封入することもできる。治療遺伝子の非限定的な例としては、毒素（例えば、自殺遺伝子）、治療抗体またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたはその一部分（複数可）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどをコードする治療遺伝子が挙げられる。
【０１０１】
本発明のさらなる実施形態は、組換えキャプシドタンパク質の調製のためのプロセスであり、本方法は、
ａ）好適な条件下で組換えキャップシステムタンパク質をコードする核酸を発現する工程と、
ｂ）工程ａ）の発現されたキャプシドタンパク質を単離する工程と、を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルス粒子は、参照キャプシドタンパク質との特定の比率で、モザイクキャプシド、例えば、本明細書に記載の遺伝子改変されたキャプシドタンパク質を含む（例えば、標的化リガンドとの共有結合の存在または非存在下で）を含む。こうしたモザイクウイルス粒子を作製するための方法は、
ａ）好適な条件下で、組換えキャプシドタンパク質をコードする核酸および参照キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチドを１：１〜１０：１の比率（ｗｔ／ｗｔ）で発現することと、
ｂ）工程ａ）の発現されたキャプシドタンパク質を単離することと、を含む。
【０１０３】
一般に、本方法に従って形成されたモザイクキャプシドは、モザイクキャプシドを生成するのに使用されるモザイクキャプシドをコードする核酸の比率（ｗｔ：ｗｔ）と同様の改変キャプシドタンパク質：参照キャプシドタンパク質比を有すると考えられるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質（または参照キャプシドタンパク質の組み合わせ）を１：１〜１：１５の範囲の比率で含むか、または本明細書に記載の方法は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質（または参照キャプシドタンパク質の組み合わせ）を１：１〜１：１５の範囲の比率で組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は１：２である。いくつかの実施形態では、比率は１：３である。いくつかの実施形態では、比率は１：４である。いくつかの実施形態では、比率は１：５である。いくつかの実施形態では、比率は１：６である。いくつかの実施形態では、比率は１：７である。いくつかの実施形態では、比率は１：８である。いくつかの実施形態では、比率は１：９である。いくつかの実施形態では、比率は１：１０である。いくつかの実施形態では、比率は１：１１である。いくつかの実施形態では、比率は１：１２である。いくつかの実施形態では、比率は１：１３である。いくつかの実施形態では、比率は１：１４である。いくつかの実施形態では、比率は１：１５である。
【０１０４】
本発明のさらなる実施形態は、ウイルスの指向性を変更させるための方法であって、（ａ）異種アミノ酸配列をコードする核酸を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、異種アミノ酸配列を含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形成する工程と、および／または（ｂ）ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞が核酸を含む、培養する工程と、を含む、方法である。本発明のさらなる実施形態は、キャプシドタンパク質の表面上の標的化リガンドを提示するための方法であって、（ａ）核酸が特異的結合対の第１のメンバーを含むキャプシドタンパク質をコードする好適な条件下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸（および任意選択的に、参照キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチドを含む）を発現する工程と、（ｂ）工程（ａ）の特異的結合対の第１のメンバーを含む発現されたキャプシドタンパク質またはこれを含むキャプシドを単離する工程と、（ｃ）第１のメンバーと第２のメンバーとの間のイソペプチド結合の形成を可能にするのに好適な条件下で、特異的結合対の第２の同族メンバーによりキャプシドタンパク質またはキャプシドをインキュベートする工程であって、特異的結合対の第２の同族メンバーが、標的化リガンドと融合される、工程と、を含む、方法である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび／または導入プラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを細胞溶解物から単離することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）細胞片を除去することと、（ｂ）ヌクレアーゼを有するウイルスベクター、例えば、ＤＮａｓｅ  ＩおよびＭｇＣｌ２を含有する上清を処理することと、（ｃ）ウイルスベクターを濃縮することと、（ｄ）ウイルスベクターを精製することと、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせと、をさらに含む。
【０１０６】
本明細書に記載のウイルスベクターの生成に有用なパッケージング細胞には、例えば、ウイルスに対して許容状態の動物細胞、もしくはウイルスに対して許容状態になるように改変された細胞、または例えば、リン酸カルシウムなどの形質転換剤の使用によるパッケージング細胞構築物が含まれる。本明細書に記載のウイルスベクターの生成に有用なパッケージング細胞株の非限定的な例としては、例えば、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関［ＡＴＣＣ］番号ＣＲＬ−１５７３）、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ−抗原を含有するＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔまたは２９３Ｔ）、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞、ヒト肉腫細胞株ＨＴ−１０８０（ＣＣＬ−１２１）、リンパ芽球様細胞株ラージー（ＣＣＬ−８６）、上皮神経膠芽腫−星状細胞腫様細胞株Ｕ８７−ＭＧ（ＨＴＢ−１４）、Ｔ−リンパ腫細胞株ＨｕＴ７８（ＴＩＢ−１６１）、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴＩ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ−Ｔ細胞などが挙げられる。
【０１０７】
Ｌ９２９細胞、Ｃｏｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９，７４３０−７４３６に概説されているＦＬＹウイルスパッケージング細胞系、ＮＳ０（マウス骨髄腫）細胞、ヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ、ＣＡＰ−Ｔ）、酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含むがこれらに限定されない）、植物細胞（タバコＮＴｌ、ＢＹ−２を含むがこれらに限定されない）、昆虫細胞（ＳＦ９、Ｓ２、ＳＦ２１、Ｔｎｉ（例えば、Ｈｉｇｈ５）を含むがこれらに限定されない）、または細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉを含むがこれに限定されない）。
【０１０８】
さらなるパッケージング細胞およびシステム、核酸ゲノムをシュードタイプ化ウイルスベクターにパッケージングするためのパッケージング技術およびベクターについては、例えば、Ｐｏｌｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，（１９９９）９６：４５９８−４６０３を参照されたい。パッケージングの方法には、ウイルス成分を永久的に発現するパッケージング細胞を使用すること、または細胞をプラスミドで過渡的にトランスフェクトすることが含まれる。
【０１０９】
さらなる実施形態には、ウイルスを再配向する方法、および／またはレポーターもしくは治療遺伝子を標的細胞に送達する方法が含まれ、本方法は、細胞を生体外または生体内で形質導入するための方法を含み、本方法は、本明細書に記載のキャプシドを含むウイルスベクターと標的細胞を接触させる工程を含み、キャプシドは、標的細胞によって発現される受容体に特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は生体外にある。他の実施形態では、標的細胞は、対象、例えばヒトの生体内にある。
【０１１０】
標的細胞
本明細書に開示される組換えウイルスベクターを使用して、対象ヌクレオチドを送達するために、多種多様な細胞を標的化することができる。標的細胞は、一般に、対象ヌクレオチドおよび所望の効果に基づいて選択されるであろう。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、標的細胞を送達して、酵素欠損症、ならびにＸ連鎖重症複合免疫不全などの免疫力低下などの生物体の欠損を回復させるタンパク質を生成することができるようにし得る。したがって、いくつかの実施形態では、通常は、動物のタンパク質を生成する細胞が標的化される。他の実施形態では、タンパク質が最も有益である領域内の細胞が標的化される。
【０１１２】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子などの対象ヌクレオチドは、標的細胞内の特定の遺伝子の発現を阻害し得る。対象ヌクレオチドは、例えば、病原体ライフサイクルに関与する遺伝子の発現を阻害し得る。したがって、病原体から感染しやすいか、または病原体により感染された細胞が標的化され得る。他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、標的細胞中の毒素の生成に関与する遺伝子の発現を阻害し得る。
【０１１３】
他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、それが発現される細胞を殺傷する毒性タンパク質をコードし得る。この場合、腫瘍細胞または他の不要な細胞が標的化され得る。
【０１１４】
さらに他の実施形態では、治療用タンパク質をコードする対象ヌクレオチド。
【０１１５】
対象ヌクレオチドの発現が所望される標的細胞の特定の集団が同定されると、標的細胞の集団上で特異的に発現される標的受容体が選択される。標的受容体は、細胞の集団に対してのみ発現され得るか、または他の細胞の集団に対するよりもこの細胞の集団に対してより大きい程度に発現され得る。発現が特異的になるにつれて、送達が標的細胞に対してより特異的に配向され得る。文脈に応じて、マーカーの（およびしたがって、遺伝子送達の）の特異性の所望の量は変化し得る。例えば、毒性遺伝子を導入するためには、非標的細胞を殺傷することを避けるために高い特異性が最も好ましい。収穫するためのタンパク質の発現、またはグローバルな影響が所望される分泌生成物の発現については、より少ないマーカー特異性が必要とされ得る。
【０１１６】
上記に考察されるように、標的受容体は、標的化リガンドを同定または作成することができる任意の受容体であり得る。好ましくは、標的受容体は、受容体などのペプチドまたはポリペプチドである。しかしながら、他の実施形態では、標的受容体は、結合パートナーによって認識され得る炭水化物または他の分子であり得る。標的受容体のための結合パートナー（例えば、リガンド）が既に知られている場合、それは親和性分子として使用され得る。しかしながら、結合分子が不明である場合、標準的な手順を使用して標的受容体に対する抗体を生成することができる。次に、抗体を標的化リガンドとして使用することができる。
【０１１７】
したがって、標的細胞は、例えば、（１）特定の用途（例えば、治療、回収されるタンパク質の発現、および疾患抵抗の付与）および（２）所望の量の特異性を有するマーカーの発現を含む、様々な因子に基づいて選択され得る。
【０１１８】
標的細胞は、いかなる方法でも限定されず、生殖系列細胞および細胞株ならびに体細胞および細胞株の両方を含む。標的細胞は、いずれかの起源由来の幹細胞であり得る。標的細胞が生殖系列細胞である場合、標的細胞は、好ましくは、単細胞胚および胚幹細胞（ＥＳ）からなる群から選択される。
【０１１９】
医薬組成物、剤形、および投与
さらなる実施形態は、少なくとも１つの組換えウイルスキャプシドタンパク質、および本発明による適切な標的化リガンド、ならびに／または本発明による核酸を含む、医薬品を提供する。好ましくは、こうした医薬品は、遺伝子導入粒子に有用である。
【０１２０】
本明細書に記載のウイルス粒子、および薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む医薬組成物も本明細書に開示する。追加的に、本明細書に記載のウイルス粒子を含む医薬剤形を本明細書に開示する。
【０１２１】
本明細書で考察されるように、本明細書に記載のウイルス粒子は、様々な治療用途（生体内および生体外で）のために、また研究ツールとして使用することができる。
【０１２２】
本明細書に開示されるウイルス粒子に基づく医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容可能な担体および／または賦形剤を使用して、任意の従来的な方法で製剤化され得る。ウイルス粒子は、投与するために、例えば、注射、吸入、もしくは単離によって（口もしくは鼻のいずれかを通して）、または経口、口腔内、非経口、もしくは直腸内投与によって、または腫瘍に直接投与することによって処方され得る。
【０１２３】
医薬組成物は、全身投与、局所投与、または局在化投与を含む、様々な投与様式のために製剤化され得る。技術および製剤は、例えば、Ｒｅｍｒｎｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見られ得る。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む、注射が好ましい。注射のために、医薬組成物は、好ましくは、ハンク溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液で、液体溶液中に製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、固体形態で製剤化され得、使用直前に再溶解または懸濁され得る。医薬組成物の凍結乾燥形態も好適である。
【０１２４】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に従来的な手段によって調製される、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤はまた、当該技術分野でよく知られている方法によって被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとり得るか、または使用前に水もしくは他の好適な媒体を含む構成のために乾燥生成物として提示され得る。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば、ａｔｉｏｎｄ油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いた従来的な手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含むことができる。
【０１２５】
医薬組成物は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続注入によって、非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、任意選択的に添加された防腐剤を用いて、例えば、アンプルまたは多用量容器内で単位剤形で提示することができる。医薬組成物は、油性媒体または水性媒体中に懸濁液、溶液、または乳濁液として製剤化することができ、また懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤を含む、他の薬剤を含有し得る。
【０１２６】
追加的に、医薬組成物は、デポ調製として製剤化することもできる。これらの長時間作用する製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、好適な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。他の好適な送達システムには、長期間にわたる薬物の局所的な非浸潤性送達の可能性を提供するマイクロスフェアが含まれる。この技術には、炎症または虚血を引き起こすことなく、冠動脈カテーテルを介して器官の任意の選択される部分に注射することができる前毛細血管サイズを有するマイクロスフェアが含まれ得る。投与された治療薬は、マイクロスフェアから徐々に放出され、選択される組織中に存在する周囲細胞によって吸収される。
【０１２７】
全身投与は、経粘膜的手段または経皮的手段によっても可能である。経粘膜的投与または経皮的投与については、浸透するためのバリアに適切な浸透剤が製剤中に使用される。こうした浸透剤は、一般に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜的投与、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。加えて、洗剤を使用して浸透を促進し得る。経粘膜的投与は、鼻腔内噴霧または座薬を使用して生じ得る。局所投与のために、本明細書に記載のウイルス粒子は、当該技術分野で一般に知られている、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。治癒を加速させるために、洗浄溶液を局所的に使用して損傷または炎症を治療することもできる。
【０１２８】
注射可能な使用に好適な医薬品形態には、滅菌水溶液または分散液、ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤、滅菌注射溶溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれ得る。すべての場合において、医薬品形態は、滅菌される必要があり、かつ流体である必要がある。また、製造条件および特定の保存パラメータ（例えば、冷却および凍結）の条件下で安定している必要があり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される必要がある。
【０１２９】
本明細書に開示される製剤が対象における免疫応答を促進する治療剤として使用される場合、治療剤は、中性または塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）であって、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸などで形成される、酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基などにも由来し得る。
【０１３０】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆の使用によって、分散の場合は必要な粒子径の維持によって、かつ界面活性剤の使用の場合によって維持することができる。微生物の作用の防止は、当該技術分野で知られている様々な抗菌剤および抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤の組成物、例えば、アルミニウムモノステアリン酸およびゼラチン使用によってもたらされ得る。
【０１３１】
滅菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙されている様々な他の成分を用いて、活性化合物または構築物を適切な溶媒中に必要な量で組み込むことによって調製することができ、その後に濾過滅菌を行う。
【０１３２】
処方の際、溶液は、投与製剤と適合する方法で、かつ治療上有効な量で投与され得る。製剤は、上記に記載の注射可能な溶液のタイプなど、様々な剤形で容易に投与されるが、徐放性カプセルまたはマイクロ粒子およびマイクロスフェアなども用いることができる。
【０１３３】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を好適に緩衝化し、最初に液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースと等張させるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に好適である。この文脈では、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には分かるであろう。例えば、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に１回分の用量を溶解し、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加するか、または提案される注入部位に注射することができる。
【０１３４】
投与に責任を有する人物は、いずれの場合でも、個々の対象に対する適切な用量を決定するであろう。例えば、対象は、病原性微生物に対する、または対象の条件（例えば、癌）に対する必要性もしくは曝露に応じて、ある期間の間毎日もしくは毎週、または月１回、年２回、もしくは年１回、本明細書に記載のウイルス粒子を投与され得る。
【０１３５】
静脈内、腫瘍内、皮下、または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化される化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態には、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体、リポソーム製剤、徐放性カプセル、生分解性形態、および現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
【０１３６】
また、鼻腔内もしくは吸入可能な溶液もしくは噴霧、エアロゾル、または吸入剤も使用し得る。鼻腔溶液は、ドロップまたは噴霧中の鼻腔通路に投与するように設計された水溶液であり得る。鼻腔溶液は、鼻の分泌に多くの点で類似しているように調製され得る。したがって、水性の鼻腔溶液は、通常、等張性であり、わずかに緩衝化されて、ｐＨ５．５〜７．５を維持する。加えて、必要に応じて、眼科調製物および適切な薬物安定剤に使用されるものと類似した抗菌防腐剤を製剤に含めることができる。様々な市販の鼻腔調製物が知られており、例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤を含むことができ、喘息予防のために使用される。
【０１３７】
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムとしての賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または粉末の形態をとる。特定の定義された実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体を含むか、または硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセルで囲まれ得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または食事の食品により直接組み込まれ得る。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤により組み込まれ得、摂取性錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で使用され得る。
【０１３８】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下：トラガントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンとしての結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、およびスクロース、ラクトース、もしくはサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ油、イチャクソウの油、もしくはチェリー香味料などの香味剤を含有し得る。投薬単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体が含有され得る。様々な他の材料が被覆として、または別様に、投薬単位の物理的形態を変更するために存在し得る。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、シェラック、糖、またはそれらの両方で被覆され得る。エリキシル剤のシロップは、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、ならびにチェリーまたはオレンジ風味などの香味剤を含有し得る。
【０１３９】
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、方法および組成物と併用するためのキットに関する場合がある。キットはまた、好適な容器、例えば、バイアル、チューブ、ミニチューブもしくはマイクロチューブ、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器も含み得る。さらなる構成要素または薬剤が提供される場合、キットは、この薬剤または構成要素が配置され得る１つ以上のさらなる容器を含み得る。本明細書のキットはまた、典型的には、ウイルス粒子および市販のための密封閉じ込めにおける任意の他の試薬容器を含む手段を含むであろう。こうした容器は、所望のバイアルが保持される注射またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。任意選択的に、記載されている組成物のためには、例えば、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗真菌もしくは抗菌剤、または抗腫瘍剤などの１つ以上のさらなる活性薬剤が必要とされ得る。
【０１４０】
本明細書に開示されている組成物は、当該技術分野で知られている任意の手段によって投与することができる。例えば、組成物は、静脈内、腫瘍内、皮内、動脈内、腹腔内、傷害内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、腟内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、髄腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内に、経口で、局所的に、吸入、注射、注入、持続注入、局在化灌流での、カテーテル、洗浄を介した、クリーム、または脂質組成物中での、対象への投与を含み得る。
【０１４１】
当業者に知られている任意の方法は、本明細書に記載のウイルス粒子、パッケージング細胞、および粒子構築物の大規模生成に使用され得る。例えば、マスターおよびワーキングシードストックは、適した主要ＣＥＦにおけるＧＭＰ条件下で、または他の方法によって調製され得る。パッケージング細胞は、大きな表面積のフラスコにプレーティングして、ほぼ合流点まで成長させ、ウイルス粒子を精製し得る。細胞を収穫し、単離および精製された培養培地中にウイルス粒子を放出し得るか、または機械的破損によって細胞内ウイルス粒子を放出することができる（細胞片は、大孔深度濾過およびエンドヌクレアーゼで消化された宿主細胞ＤＮＡによって除去することができる）。ウイルス粒子を、その後精製し、接線流濾過によって濃縮し、その後透析濾過し得る。得られた濃縮バルクを、安定化剤を含有する緩衝液で希釈することによって製剤化し、バイアルに充填し、凍結乾燥し得る。組成物および製剤は、後で使用するために保存され得る。使用のために、凍結乾燥ウイルス粒子を、希釈剤を添加することによって再構成することができる。
【０１４２】
併用療法で使用される特定のさらなる薬剤を、当該技術分野で知られている任意の手段によって製剤化および投与することができる。
【０１４３】
本明細書に開示されている組成物は、アルミニウム塩および他の鉱物アジュバント、テンソ活性剤、細菌誘導体、媒体、およびサイトカインなどのアジュバントも含み得る。アジュバントはまた、拮抗免疫調節特性を有し得る。例えば、アジュバントは、Ｔｈ１免疫性またはＴｈ２免疫性を刺激することができる。本明細書に開示されている組成物および方法はまた、アジュバント療法を含み得る。
【実施例】
【０１４４】
これらの実施例は、例示のためだけに提供されており、本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０１４５】
材料および方法
細胞株および抗体
２９３個の細胞株すべてを、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および１％のＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中に維持した。対応するｃＤＮＡを発現するベクターにより、親２９３細胞株をレンチウイルス形質導入することによって、２９３  ｈＥｒｂＢ２および２９３ｈＡＳＧＲ１／２細胞株を生成した。すべての細胞株を、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＴＣコア施設から得た。Ｂ１抗体は、ＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３によって共有される直鎖状エピトープを認識する。
【０１４６】
ＡＡＶキャプシドタンパク質構築物
所望のＳｐｙＴａｇ挿入、隣接するリンカーアミノ酸、およびさらなる変異をコードするＧｅｎｅＢｌｏｃｋを、ＩＤＴから購入し、製造業者のプロトコル（ＮＥＢ）に従ってＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して、ＢｓｉＷＩおよびＸｃｍＩで消化されたｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  ｗｔまたはｐＡＡＶ９−ＣＡＰ  ｗｔにクローニングした。
【０１４７】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへの抗体への融合
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをコードするＧｅｎｅＢｌｏｃｋをＩＤＴから購入し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して、可撓性アミノ酸リンカーＧＳＧＥＳＧ（配列番号４８）によって分離される各構築物のＣ末端におけるｓｃＦｖまたは抗体重鎖の発現プラスミドへとコード配列をフレーム単位でクローニングした。
【０１４８】
ＡＡＶウイルスベクターの調製
以下のプラスミド：ｐＡｄヘルパー、レポータータンパク質をコードするＡＡＶ２  ＩＴＲ含有ゲノムプラスミド、およびＡＡＶ  ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子をコードするｐＡＡＶ−ＣＡＰプラスミドであって、ｓｃＦｖまたは抗体の重鎖および軽鎖のいずれかをコードするさらなるプラスミドを有するか、または有しないプラスミドによりＰＥＩ  Ｐｒｏを使用して２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってウイルスを生産した。ｓｃＦｖおよび抗体重鎖構築物は、すべて、上記に記載のＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合されている。ＯｐｔｉＭＥＭにおいてトランスフェクトを行い、８時間後に培地を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および１％のＬ−Ｇｌｕｔを補充したＤＭＥＭに変更した。
【０１４９】
トランスフェクトされたパッケージング細胞を、３７℃で３日間インキュベートし、次に、標準的凍結解凍プロトコルを使用して細胞溶解物からウイルスを回収した。簡潔に言うと、パッケージング細胞を、分解およびペレット化することによって持ち上げた。上清を除去し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＭｇＣｌ２［ｐＨ８．０］の溶液中に細胞を再懸濁した。ドライアイス／エタノール浴と３７℃の水浴との間で激しく攪拌しながら細胞懸濁液をシャットリングすることからなる３つの連続する凍結解凍サイクルを介した細胞溶解によって、細胞内ウイルス粒子を放出させた。ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（５０Ｕ／ｍｌの細胞溶解物）により時々混合しながら３７℃で６０分間溶解物を処理することによって、粘土を減少させた。次に、細胞片を遠心単離によってペレット化し、得られた上清を、０．２２μｍのＰＶＤＦ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを通して、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１００膜（１００ＫＤａのＭＷＣＯ）フィルターカートリッジを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットの上部チャンバー内に直接濾過した。フィルターユニットを、上部チャンバー内で所望の体積に達するまで５〜１０分間隔で遠心単離し、次に、濃縮粗ウイルスを低タンパク質結合管にピペッティングし、４Ｃで保存した。力価（ミリリットル当たりのウイルス性ゲノム  ｖｇ／ｍＬ）を、既知の濃度のウイルスの標準曲線を使用してｑＰＣＲによって決定した。
【０１５０】
細胞感染／形質導入およびフローサイトメトリー分析
細胞に感染させるために、培養中の細胞の培地にウイルス粒子を直接加え、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。各ウェル中の培地を２４時間後に置換し、細胞を５日間インキュベートした。感染後５日目に、細胞をトリプシン処理し、２％のＦＢＳによりＰＢＳ中に再懸濁し、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメトリー上で回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【０１５１】
ウエスタンブロット解析
ＳｐｙＴａｇ付きタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３と、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタグ付き抗体またはｓｃＦｖとの間の反応を、ウエスタンブロット分析によって観察した。還元剤を含むＮｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシンＳＤＳ試料緩衝液を、等体積の粗ウイルス調製物に加え、試料を８５℃まで５分間加熱し、次に、室温まで冷却し、プレキャスト４〜１２％のトリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に装填した。タンパク質を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、湿潤導入を介してＰＶＤＦ上にブロットした。膜を、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＴＢＳブロッキング緩衝液でブロッキングし、マウスモノクロ−ナルＢ１抗体（ＡＲＰ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）でプローブして、４℃で一晩、ＴＢＳＴ中に１：１００で希釈した。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、赤外線接合抗マウス二次抗体でプローブし、ｔｈｅ  Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ上で撮像した。
【０１５２】
実施例１  残基Ｎ５８７でＡＡＶ２キャプシドに挿入されたペプチドに対するｓｃＦｖのコンジュゲートは、抗原特異的標的化を配向する
以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ａ−１】
2020525020.tif 000006
【表Ａ−２】
2020525020.tif 000007
【０１５３】
上記に記載のウイルス粒子でインキュベートされた細胞を、感染のためのフローサイトメトリー分析によって評価した。
【０１５４】
ヘパリン結合変異（ＨＢＭ）Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを保有するＡＡＶ２、ならびにキャプシド位置Ｎ５８７におけるＳｐｙＴａｇペプチドを、Ｃ６．５−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＨＥＲ２に結合するｓｃＦｖの存在下または非存在下で生成し、そのＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させる。ＨＥＲ２的化ｓｃＦｖに接合されたＡＡＶ２は、ＨＥＲ２＋細胞に特異的に感染し、ＨＥＲ２−細胞の背景感染は非常に少ない。図１
【０１５５】
実施例２  残基Ｎ５８７においてＡＡＶ２キャプシドに挿入されたペプチドへの抗体の結合は、抗原特異的な標的化を配向する
以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｂ】
2020525020.tif 000008
【０１５６】
ＨＥＲ２に結合する抗体である、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、野生型ＡＡＶ２およびヘパリン結合変異（ＨＢＭ）Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを保有するＡＡＶ２、ならびにキャプシド位置Ｎ５８７におけるＳｐｙＴａｇペプチドを生成し、重鎖のＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させる。上記に記載のウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を観察した。ＨＥＲ２標的化抗体に接合されたＡＡＶ２は、ＨＥＲ２＋細胞に特異的に感染し、ＨＥＲ２−細胞の背景感染は非常に少ない。図２
【０１５７】
実施例３  残基Ｇ４５３においてＡＡＶ２キャプシドに挿入されたペプチドへの抗体の接合は、抗原特異的標的化を配向する
残基Ｎ５８７およびＧ４５３は、それぞれ、ビリオン表面から離れて延在するタンパク質スパイクを形成するＡＡＶ２キャプシドの露出された領域上にある。残基は２つの異なるスパイク上にあるため、残基Ｇ４５３の後に挿入されたＳｐｙＴａｇが残基Ｎ５８７の後に挿入されたＳｐｙＴａｇと同じように機能するかどうかを調査した。以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｃ】
2020525020.tif 000009
【０１５８】
ＨＥＲ２に結合する抗体である、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、野生型ＡＡＶ２およびヘパリン結合変異（ＨＢＭ）Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを保有するＡＡＶ２、ならびにキャプシド位置Ｇ４５３におけるＳｐｙＴａｇペプチドを生成し、重鎖のＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させる。ＳｐｙＴａｇ発現キャプシドをＨＢＭキャプシドと混合することによって、ウイルスをモザイクとして生成した。上記に記載のウイルス粒子を感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を観察した。ＨＥＲ２標的化抗体に接合されたＡＡＶ２は、ＨＥＲ２＋細胞に特異的に感染し、ＨＥＲ２−細胞の背景感染は非常に少ない。図３
【０１５９】
実施例４  ｓｃＦｖによるＡＡＶビリオンの改変を増加させると、それらの感染性が減少する
ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ反応の効率を最適化するための試みにおいて、ペプチドタグを各側上の可撓性リンカーアミノ酸に隣接させることによって、ウイルス表面上のＳｐｙＴａｇの送達性が改善された。リンカー長の増加に隣接するＮ５８７  ＳｐｙＴａｇ挿入変異体のパネルを生成し、ＨＥＲ２に結合するｓｃＦｖである、Ｃ６．５−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの存在下または非存在下で、これらのＡＡＶ２  Ｒｅｐ−Ｃａｐ構築物を使用してウイルスを調製し、そのＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させる。ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−タグ付きＣ６．５との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−タグ付きｓｃＦｖと反応したＳｐｙＴａｇ付きキャプシドタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズの増加を示す。上記に記載のウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を測定した。
【０１６０】
以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｄ】
2020525020.tif 000010
【０１６１】
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー  ＳｐｙＴａｇ構築物は、以下を含む。
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー１  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー２  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー４  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー６  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー８  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
【０１６２】
ＳｐｙＴａｇがリンカーアミノ酸に隣接していない場合、ＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ｓｃＦｖ複合体は、ウエスタンブロッティングによって検出不能であり、ウイルスは、ＨＥＲ２＋細胞の低レベルの特異的形質導入を達成した。図４。リンカー長が増加する（１〜６つのアミノ酸）につれて、ＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ｓｃＦｖ複合体は、ウエスタンブロッティングを介して検出可能となり始め、ウイルスの形質導入効率が増加した。図４。しかしながら、ＳｐｙＴａｇが２つの最も長いリンカー（８〜１０個のアミノ酸）に隣接したとき、ほぼすべてのＶＰタンパク質がウエスタンブロッティングによってＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈと反応したが、これらの完全に装飾されたウイルスは、もはや効率的に細胞を形質導入しなかった。図４。したがって、ｓｃＦｖによるＡＡＶ粒子の過剰な改変は、標的細胞を形質導入する能力にとって有害であり、かつウイルスを標的細胞に再標的化するためには、少数の接合ｓｃＦｖのみが必要であると分かった。
【０１６３】
実施例５  抗体によるＡＡＶビリオンの改変の増加は、その感染性を減少させる
リンカー長の増加に隣接するＮ５８７  ＳｐｙＴａｇ挿入変異のパネルを使用して、ＨＥＲ２に結合する抗体である、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、これらのＡＡＶ２  Ｒｅｐ−Ｃａｐ構築物を使用してウイルスを調製し、重鎖のＣ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合させる。ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−タグ付きＨｅｒｃｅｐｔｉｎ重鎖（Ｖｈ）との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−タグ付き抗体と反応したＳｐｙＴａｇ付きキャプシドタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズの移行を示すであろう。
【０１６４】
以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｅ】
2020525020.tif 000011
【０１６５】
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー  ＳｐｙＴａｇ構築物は、以下を含む。
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー１  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー２  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー４  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー６  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー８  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭ
【０１６６】
ＳｐｙＴａｇがリンカーアミノ酸に隣接していないか、または非常に短いアミノ酸に隣接している場合、ＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体は、ウエスタンブロッティングによって検出されなかったが、ウイルスは、野生型レベルに近い効率でＨＥＲ２＋細胞に特異的に感染した。図５。逆に、ＳｐｙＴａｇがより長いリンカー（６つ以上のアミノ酸）に隣接する場合、ほぼすべてのＶＰタンパク質が、ウエスタンブロッティングによってＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈと反応したが、これらの完全に装飾されたウイルスは、もはや感染しなかった。図５。抗体によるＡＡＶ粒子の改変の増加は、標的細胞を形質導入する能力にとって有害であり、かつウイルスを標的細胞に再標的化するためには、少数の接合抗体のみが必要である。
【０１６７】
実施例６  モザイク性は、ウイルス粒子の形質導入効率を調節する
長い可撓性リンカーは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−融合ｓｃＦｖとのＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶキャプシドの効率的な反応を可能にするが、ｓｃＦｖによるＡＡＶ粒子の過剰改変は、標的細胞を形質導入するそれらの能力にとって有害であるため、各ビリオン上のＳｐｙＴａｇの数が減少される一方で、すべてがＲ５８５Ａ  Ｒ５８８Ａヘパリン結合変異（ＨＢＭ）を保有する、非ＳｐｙＴａｇ付きキャプシド構築物との高度に反応性のＳｐｙＴａｇ付き構築物の異なる比率の混合物であるモザイクＡＡＶ粒子を生産することによって、ＳｐｙＴａｇの送達性および効率的な反応性が維持された。以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｆ】
2020525020.tif 000012
【０１６８】
ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭとｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｒ５８５Ａ  Ｒ５８８Ａプラスミドとの間の比率は、トランスフェクション混合中、純粋なｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｎ５８７  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭビリオンを表す１：０（４ｕｇ：０ｕｇ）、３：１（３ｕｇ：１ｕｇ）、１：１（２ｕｇ：２ｕｇ）、または１：３（１ｕｇ：３ｕｇ）のいずれかであった。ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｇ４５３  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭと、ｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｒ５８５Ａ  Ｒ５８８Ａプラスミドとの間の比率は、トランスフェクション混合中、純粋なｐＡＡＶ２−ＣＡＰ  Ｇ４５３  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭビリオンを表す１：０（４ｕｇ：０ｕｇ）、１：３（１ｕｇ：３ｕｇ）、または１：７（０．５ｕｇ：３．５ｕｇ）のいずれかであった。ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−タグ付き抗ＨＥＲ  ｓｃＦｖまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ｔａｇ付きＨｅｒｃｅｐｔｉｎ重鎖（Ｖｈ）との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−タグ付きｓｃＦｖまたは抗体と反応したＳｐｙＴａｇ付きキャプシドタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズの移行を示すであろう。ＳｐｙＣａｔｈｃｅｒ抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖとのＮ５８７  ＳｐｙＴａｇ  リンカーパネルの反応を図６に示す。ＳｐｙＣａｔｈｃｅｒ抗ＨＥＲ２抗体とのＮ５８７  ＳｐｙＴａｇリンカーパネルの反応を図７に示す。上記に記載のモザイクウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を測定した図６〜７。高度に反応性のあるリンカー１０に隣接するＳｐｙＴａｇキャプシドの量が減少し、非ＳｐｙＴａｇ付きキャプシドの数が増加するにつれて、ウエスタンブロッティングによってＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ｓｃＦｖ複合体の量の減少が観察され、これはウイルスの形質導入効率の増加と結び付いた図６〜７。ビリオンを装飾する抗体数と再標的化ウイルスによる形質導入効率との間に逆の関係が実証された。
【０１６９】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−抗ＨＥＲ２抗体とのＧ４５３  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭおよびＧ４５３  リンカー１０  ＳｐｙＴａｇ  ＨＢＭの反応を図８に示す。Ｇ４５３におけるＳｐｙＴａｇ挿入の両方が、ＳｐｙＴａｇ単独またはリンカー１０に隣接するＳｐｙＴａｇのいずれかにおいて、ウエスタンブロッティングによって測定されるようにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ｔａｇ付きＨｅｒｃｅｐｔｉｎと非常に効率的に反応し、これは、Ｇ４５３挿入部位はリンカーアミノ酸に隣接しない限り容易に反応しない、Ｎ５８７よりも天然に送達性が高いことを示唆している。Ｎ５８７リンカーパネルで観察されたように、ウイルスがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体によって重度に改変されたとき、ウイルスはもはや感染しなかった。したがって、抗体によるＡＡＶ粒子の高レベルの改変は、標的細胞を形質導入する能力にとって有害であり、Ｇ４５３の後に挿入されたＳｐｙＴａｇは、Ｎ５８７に挿入されたＳｐｙＴａｇよりも天然に送達性が高いことが分かる。
【０１７０】
実施例７  さらなる抗体標的対と共にＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用して、生体外で特異的標的化を達成することができる
ＡＡＶをＨＥＲ２以外の標的に再標的化するＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ手法の能力を調査した。さらなる細胞表面タンパク質を標的化するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタグ付き抗体をクローニングし、ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶをこれらの追加の標的を発現する細胞タイプに再標的化するこれらの抗体の能力を調査した。ＡＳＧＲ１およびＣＤ６３を標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｇ】
2020525020.tif 000013
【０１７１】
ＰＴＰＲＮを標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｈ】
2020525020.tif 000014
【０１７２】
ＥＮＴＰＤ３およびＣＤ２０を標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｉ】
2020525020.tif 000015
【０１７３】
ヒトタンパク質ＡＳＧＲ１、ＣＤ６３、ＰＴＰＲＮ、ＥＮＴＰＤ３、およびＣＤ２０を認識する抗体重鎖および軽鎖をコードするＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＶｈおよびＶｋプラスミドを試験した。少数の露出したＳｐｙＴａｇを有するモザイクＡＡＶ粒子を生産するために、ＳｐｙＴａｇおよび非ＳｐｙＴａｇ付きプラスミドは、抗体を使用してＡＡＶを再標的化するためのＳｐｙＴａｇと非ＳｐｙＴａｇキャプシドとの理想的な比率であることが以前に決定された、１：７の比率でトランスフェクション混合中に存在した。ＡＳＧＲ１、ＣＤ６３、またはＰＴＰＲＮを発現する細胞を、上記に記載のモザイクＡＡＶ２粒子に感染させ、フローサイトメトリーによって形質導入を測定した。ＡＳＧＲ１、ＣＤ６３、およびＰＴＰＲＮ特異的抗体に接合したＡＡＶ２は、それぞれＡＳＧＲ１、ＣＤ６３、およびＰＴＰＲＮを発現する同族標的細胞に特異的に感染することができ、抗体の非存在下では非常に低い背景感染を提示した。ＥＮＴＰＤ３またはＣＤ２０を発現する細胞を、上記に記載のＡＡＶ２粒子に感染させ、標準的なプロトコルを使用したルシフェラーゼアッセイによって形質導入を測定した。ＥＮＴＰＤ３およびＣＤ２０特異的抗体に接合したＡＡＶ２は、それぞれＥＮＴＰＤ３およびＣＤ２０を発現する同族標的細胞に特異的に感染することができ、抗体の非存在下では非常に低い背景感染を提示した。図９
【０１７４】
実施例８  ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、ＡＡＶ９の再標的化のために適合され得る
他のＡＡＶセロタイプに対するＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムの適合性を試験した。ＡＡＶ９は、高い力価ウイルスを生成する広く使用されているセロタイプであり、マウスの組織の形質導入に非常に効率的である。ＡＡＶ２がヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、ＡＡＶ９がガラクトースに結合するため、受容体結合に重要な残基は、ＡＡＶ２とＡＡＶ９との間で異なる。受容体結合において重要であることが知られている残基は、利用可能な文献（Ｂｅｌｌ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｕｒｄａ，Ｂ．Ｌ．，Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ，Ｋ．，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ９  ｃａｐｓｉｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６（１３），７３２６−７３３３．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４８−１２）から決定され、これには、Ｎ４７０、Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６、およびＷ５０３が含まれる。Ｗ５０３Ａ変異は、この単一アミノ酸変異が受容体結合を大きく減少させたため、変異体構築物を生成する際に使用するための受容体結合変異として選択された。ＡＡＶ２  Ｎ５８７およびＧ４５３が内部に存在する２つの突起部（可変ループ）に対してオルソロガスなＡＡＶ９キャプシドの領域も同定され、ＡＡＶ９において対応する残基は、Ａ５８９およびＧ４５３である。ＳｐｙＴａｇを、隣接するリンカーアミノ酸を有し、かつ有しないＡＡＶ９内のこれらの２つの部位に、受容体結合変異Ｗ５０３Ａと組み合わせて、挿入した。
【０１７５】
以下のプラスミドおよび数量で、１つの１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｊ】
2020525020.tif 000016
【０１７６】
ＡＡＶ９  ｗｔ、ＡＡＶ９−ＣＡＰ  Ａ５８９ＳｐｙＴ＿Ｗ５０３Ａ、ＡＡＶ９−ＣＡＰ  Ａ５８９  リンカー１０ＳｐｙＴ＿Ｗ５０３Ａ、およびＡＡＶ９−ＣＡＰ  Ｇ４５３  リンカー１０ＳｐｙＴ＿Ｗ５０３Ａについて、各プラスミドのうちの４μｇを、各トランスフェクションのために使用した。
【０１７７】
モザイクウイルスについては、ＳｐｙＴａｇと非ＳｐｙＴａｇ付きＲｅｐ−Ｃａｐプラスミドとの１：７の比率を達成するために、３．５ｕｇのｐＡＡＶ９−ＣＡＰ  Ｗ５０３Ａおよび０．５ｕｇのｐＡＡＶ９−ＣＡＰ  Ａ５８９リンカー１０ＳｐｙＴ＿Ｗ５０３ＡまたはｐＡＡＶ９−ＣＡＰ  Ｇ４５３リンカー１０ＳｐｙＴ＿Ｗ５０３Ａのいずれかを、各トランスフェクションのために使用した。
【０１７８】
細胞形質導入、フローサイトメトリー分析、およびウエスタンブロット分析を、上記に記載のように実施した。
【０１７９】
ＡＡＶ９  ＲＣ  Ａ５８９およびＧ４５３  ＳｐｙＴａｇ挿入は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎとの反応を支援し、ＨＥＲ２＋細胞の特異的形質導入を媒介した。図１０。ＡＡＶ２と同様に、隣接するリンカーを有しないＡＡＶ９  ＲＣ  Ａ５８９に挿入されたＳｐｙＴａｇは、送達性が非常に低く、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの反応が不十分であった。図１０。逆に、スパイタグのいずれかの側上にアミノ酸リンカーを加えることで、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに対してより堅牢な反応性が許容され、またいくつかの反応性の高いＳｐｙＴａｇを有するモザイク粒子は、標的細胞の形質導入において非常に効率的であった。図１０。
【０１８０】
実施例９  ＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ粒子−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体の生体内での再標的化
生体内でｈＡＳＧＲ１を発現する肝細胞に対してＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈを再標的化することができるかどうかを決定するために、それらの肝細胞がＣ５７ＢＬ／６背景に対してｈＡＳＧＲ１を発現するように遺伝子改変されたマウス、および対照の野生型マウスに、野生型ＡＡＶ単独またはレポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質もしくはホタルルシフェラーゼを担持するＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈウイルス粒子（純粋な粒子またはモザイク粒子として、かつアミノ酸リンカーを有するか、または有しない）を腹腔内注射した。対照としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射したマウスが挙げられる。ＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈが肝臓から脱離され、他の器官に再標的化され得るかどうかを決定するために、レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質を担持する野生型ＡＡＶのみまたはＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈウイルス粒子（モザイク粒子として）を血管内注射した。肝臓からの脱離および別の器官への再標的化を実証するために、肝臓で発現することが知られていないが、膵島細胞（Ｓｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３０５：Ｅ１３１９−Ｅ１３２６，２０１３）および一般に入手可能なデータベースによる舌（ＧｅｎｅＰａｉｎｔ．ｏｒｇ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ａｓｓａｙ／ＭＧＩ：５４２３０２１  ａｎｄ  Ｒｉｋｅｎ  ＦＡＮＴＯＭ５  ｐｒｏｊｅｃｔ，ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｄａｔａｓｅｔから抽出されたデータ）などの他の器官中に発現されているため、タンパク質ＥＮＴＰＤ３を選択した。
【０１８１】
ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ６３、ヒトＡＳＧＲ１（どれも野生型マウス中には発現されない）またはヒトＥＮＴＰＤ３（マウスタンパク質も認識する）を標的とするＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ｔａｇ付き抗体が、クローニングされ、またこれらの抗体が、生体内にｅＧＦＰまたはホタルルシフェラーゼのいずれかを担持するＳｐｙＴａｇ付きＡＡＶ２を再標的化するこれらの抗体の能力を試験した。以下のプラスミドおよび数量で、１５ｃｍのプレートの２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
【表Ｋ−１】
2020525020.tif 000017
【表Ｋ−２】
2020525020.tif 000018
【０１８２】
ヒトタンパク質ＡＳＧＲ１、ＣＤ３、またはＣＤ６３を認識する抗体重鎖および軽鎖をコードするＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＶｈおよびＶｋプラスミドを、それらの肝臓細胞がＣ５７ＢＬ／６背景上にｈＡＳＧＲ１を発現するように遺伝子改変されたマウスにおいて試験した。ヒトタンパク質ＡＳＧＲ１（非標的化対照として）またはマウスおよびヒトタンパク質ＥＮＴＰＤ３を認識する抗体をコードするＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＶｈおよびＶｋプラスミドを、野生型マウスにおいて試験した。感染の１０日後、マウスを屠殺し、レポーター遺伝子の発現を試験し、肝臓、脾臓、および腎臓を固定し、ニワトリ抗ＥＧＦＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）およびＡｌｅｘａ−４８８接合抗ニワトリ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色した。動物の発光を試験するために、感染の１４日後、生きた動物を  イソフルランを使用して麻酔し、１０分後にＩＶＩＳスペクトル生体内生体内撮像システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して撮像した。図１１および図１２は、ＡＡＶ２−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体による感染が、ｈＡＳＧＲ１再標的化ＡＡＶを注射したｈＡＳＧＲ１発現マウスの肝臓でのみ検出され、ｈＡＳＧＲ１を発現しない野生型マウスの肝臓では検出されなかったことを示す。他の器官では陽性ＥＧＦは検出されなかった（データに示さず）。
【０１８３】
図１３は、ｈＡＳＧＲ１が野生型マウスで発現されないため、非標的化対照としてＥＮＴＰＤ３またはｈＡＳＧＲ１を標的化する抗体に接合されたＡＡＶの注射後の野生型マウスの肝臓および膵臓におけるｅＧＦＰ発現のための免疫組織化学染色を示す。感染の４週間後に、感染動物から器官を採取し、１０％の好中球緩衝ホルマリン中に４８時間固定し、次に、免疫組織化学を介してｅＧＦＰのために染色した。図１３は、ＡＡＶ２−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体が野生型マウスの肝臓から脱離されたことを示しており、ＥＮＴＰＤ３およびｈＡＳＧＲ１を標的化する抗体に接合されたＡＡＶを注射したマウスすべてが肝臓におけるｅＧＦＰ発現の類似の欠損を示した。ＥＮＴＰＤ３を標的化する抗体に接合されたＡＡＶを注射したマウスは、膵島においてｅＧＦＰを発現する細胞を有し、ここでＥＮＴＰＤ３が発現されると考えられる。
【０１８４】
図１４は、ｈＡＳＧＲ１が野生型マウスで発現されないため、非標的化対照としてＥＮＴＰＤ３またはｈＡＳＧＲ１を標的化する抗体に接合されたＡＡＶの注射後の野生型マウスの肝臓および舌におけるｅＧＦＰ発現のための免疫組織化学染色を示す。感染の１４日後に、感染動物から器官を採取し、１０％の好中球緩衝ホルマリン中に４８時間固定し、次に、免疫組織化学を介してｅＧＦＰのために染色した。
図１４は、ＡＡＶ２−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体が野生型マウスの肝臓から脱離されたことを示しており、ＥＮＴＰＤ３およびｈＡＳＧＲ１を標的化する抗体に接合されたＡＡＶを注射したマウスすべてが肝臓におけるｅＧＦＰ発現の類似の欠損を示した。非標的化無関連抗体（抗ＡＳＧＲ１）に接合されたＡＡＶを注射した３匹のマウスすべてが、舌における染色を示しておらず、抗ＥＮＴＰＤ３に接合された３匹のマウスすべてが、舌におけるｅＧＦＰ発現細胞を示しており、ここでＥＮＴＰＤ３が発現されると考えられる。
【０１８５】
実施例１０  標的化リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子の送達
また、１つ以上の自殺遺伝子、生物学的治療（例えば、抗体）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、ｓｈＲＮＡなどのセラピュティックカーゴを、標的化細胞タイプに特異的に送達するための、ＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体の能力も記載する。
【０１８６】
自殺遺伝子を特定の細胞に送達するためのＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体の能力を試験するために、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：５５９−５７０）によって記載されるＨＥＲ２＋乳癌の異種移植片ヌードマウスモデルを使用する。
【０１８７】
自殺遺伝子（ＳＧ）を担持するＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体を、材料および方法に記載されるものと同様に生産する。
【０１８８】
細胞株ＢＴ４７４乳癌、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌、およびＣａｌｕ−３肺癌の細胞株は、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞株である（Ｂｕｎｎ  Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：３２３９−３２５０、Ｐｅｇｒａｍ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２２４１−２２５１、Ｓｐｉｒｉｄｏｎ  ＣＩ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１７２０−１７３０）。Ａ−６７３横紋筋肉腫およびＨｅＬａ子宮頸癌は、ＨＥＲ２陰性ヒト腫瘍細胞株であり、ＢＥＡＳ−２ｂは、不死化気管支上皮ＨＥＲ２陰性細胞株である（Ｊｉａ  ＬＴ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３２５７−３２６２；Ｋｅｒｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９：４４８−４５４；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｒａｍｉｒｅｚ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００３；１４１：１３８−１４２）。これらの細胞株のうちのすべてを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、ＡＴＣＣによって推奨される培地中に維持する。
【０１８９】
マウス生後６〜８週間の雌ヌードマウスを得て、特定の病原体のない条件下で収容する。０日目に、マウスに、（１）１０７  ＢＴ４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｃａｌｕ−３、Ａ−６７３、またはＨｅＬａを右脇腹に皮下注射し、（２）レポーター（例えば、ＥＧＦＰ）または自殺遺伝子を担持する静脈内ＶＰ−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｖｈ複合体を静脈内で処理した。未処理の動物（腫瘍細胞のみを注射した動物）、レポーターまたは自殺遺伝子を担持する野生型ＡＡＶ粒子を注射した動物、ＳｐｙＴａｇウイルス粒子のみを注射した動物が、対照として機能している。すべての動物を、注射および処理１日後に適切なプロドラッグにより処理する。各腫瘍のサイズを、キャリパーを使用して毎週２回測定し、腫瘍体積は、長さ×幅２×０．５２として計算する。罹患状態、腫瘍潰瘍化、腫瘍直径１５ｍｍ、または腫瘍体積１０００ｍｍ３となったときに、マウスを屠殺し、屠殺日を死亡日として記録する。レポーター遺伝子を担持するウイルス粒子を注射した動物の肝臓、脾臓、腎臓、および腫瘍を固定し、レポーター遺伝子発現を可視化する。
【０１９０】
自殺誘導遺伝子の標的化送達が記載されている（Ｚａｒｏｇｏｕｌｉｄｉｓ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１６８４９）が、本実施例は、本明細書に記載のウイルス粒子を使用して標的化ＨＥＲ２リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子の送達を記載している。追加的な実験では、自殺遺伝子は、本明細書に記載のウイルス粒子を使用した１つ以上の他の標的リガンドを発現する別の細胞タイプに送達される。標的化に好適なレポーターの例示的かつ非制限的な例には、ウイルス粒子、例えば、カルシーニン胚性抗原（ＣＥＡ）のエンドサイトーシスを媒介するレポーター（Ｑｉｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．３１６：３１−３８）および血管内皮成長因子レポーター（ＶＥＧＦＲ）（Ｌｅｎｇ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．３２：１１０３−１１１１、Ｌｉｕ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．９１：７４５−７５２）が含まれる。標的化され得るさらなる受容体には、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（Ｈｅｉｍｂｅｒｇｅｒ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．９：１０８７−１０９８）、表面抗原分類４４（ＣＤ４４）（Ｈｅｉｄｅｒ  ＫＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：５６７−５７９）、表面抗原分類１３３（ＣＤ１３３  ａｋａ  ＡＣ１３３）（Ｚｈａｎｇ  ＳＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ  Ｍｅｄ．；１０：８５）、葉酸受容体（ＦＲ）（Ｄｕａｒｔｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４９（３）：２６４−７２）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）または表面抗原分類７１（ＣＤ７１）（Ｈａｂａｓｈｙ  ＨＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．１１９（２）：２８３−９３）、ムチン（Ｔｏｒｒｅｓ  ＭＰ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２０１２；１８（１７）：２４７２−８１）、ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ−４）（Ｍａｌｅｃｋｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２（５））、腫瘍耐性抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）（Ｍａｌｅｃｋｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．３：１３４）が含まれる。
【０１９１】
本発明はいくつかの実施形態を参照して特に示され、記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示の様々な実施形態に対して形態および詳細の変更を行うことができ、また本明細書に開示の様々な実施形態は、特許請求の範囲の範囲に対する制限として機能することを意図していないことは、当業者であれば理解するであろう。
【０１９２】
本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの好ましい方法および材料をこれより記載する。本明細書に引用されたすべての出版物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【図１】
2020525020.tif 000019
【図２】
2020525020.tif 000020
【図３】
2020525020.tif 000021
【図４Ａ】
2020525020.tif 000022
【図４Ｂ】
2020525020.tif 000023
【図５Ａ】
2020525020.tif 000024
【図５Ｂ】
2020525020.tif 000025
【図６Ａ】
2020525020.tif 000026
【図６Ｂ】
2020525020.tif 000027
【図７Ａ】
2020525020.tif 000028
【図７Ｂ】
2020525020.tif 000029
【図８Ａ】
2020525020.tif 000030
【図８Ｂ】
2020525020.tif 000031
【図９−１】
2020525020.tif 000032
【図９−２】
2020525020.tif 000033
【図１０Ａ】
2020525020.tif 000034
【図１０Ｂ】
2020525020.tif 000035
【図１１】
2020525020.tif 000036
【図１２】
2020525020.tif 000037
【図１３】
2020525020.tif 000038
【図１４】
2020525020.tif 000039
【配列表】
2020525020000001.app
【国際調査報告】
2020525020.tif 000040
2020525020.tif 000041
2020525020.tif 000042
2020525020.tif 000043
2020525020.tif 000044
2020525020.tif 000045
2020525020.tif 000046
2020525020.tif 000047
2020525020.tif 000048
2020525020.tif 000049