(57)【要約】本発明は、アセチルコリン受容体結合ペプチドに関し、より詳細にはアセチルコリンが作用するアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を遮断し、シワ改善の効果を示す新規なペプチドに関する。本発明によるペプチドは、アセチルコリン受容体と結合強度が高く、アセチルコリンと強く結合し、アセチルコリンの分泌を抑制することによって、本発明によるペプチドを有効成分として含む化粧品組成物及び薬学的組成物は、優れたシワ改善の効果を示す。
2020525033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１乃至６の何れか一つ以上の一般式で表されるアミノ酸配列を含む、アセチルコリン受容体結合ペプチド。
［一般式１］ＷＴＷＫＧ−Ｘｎ
［一般式２］ＴＷＫＧ−Ｘｎ
［一般式３］ＷＫＧ−Ｘｎ
［一般式４］ＫＧ−Ｘｎ
［一般式５］Ｇ−Ｘｎ
［一般式６］Ｘｎ
（前記Ｘｎは、１乃至６個の任意のアミノ酸からなるシーケンスを表す）
【請求項２】
前記Ｘｎは、下記の配列１乃至１１からなるグループより選択される何れかである、請求項１に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。
［配列番号１］ＫＧＴＬＮＲ、
［配列番号２］ＲＫＳＬＬＲ、
［配列番号３］ＥＤＫＧＫＮ、
［配列番号４］ＲＤＫＬＱＭ、
［配列番号５］ＱＬＧＱＬＳ、
［配列番号６］ＧＲＬＳＡＳ、
［配列番号７］ＲＱＬＮＮＱ、
［配列番号８］ＤＮＬＱＮＮ、
［配列番号９］ＬＹＱＲＬＧ、
［配列番号１０］ＮＫＱＶＫＦ、
［配列番号１１］ＥＴＹＤＳＫ
【請求項３】
前記ペプチドは、配列番号１２乃至２２の配列の何れかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。
［配列番号１２］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
［配列番号１３］ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲ
［配列番号１４］ＷＴＷＫＧＥＤＫＧＫＮ
［配列番号１５］ＷＴＷＫＧＲＤＫＬＱＭ
［配列番号１６］ＷＴＷＫＧＱＬＧＱＬＳ
［配列番号１７］ＷＴＷＫＧＧＲＬＳＡＳ
［配列番号１８］ＷＴＷＫＧＲＱＬＮＮＱ
［配列番号１９］ＷＴＷＫＧＤＮＬＱＮＮ
［配列番号２０］ＷＴＷＫＧＬＹＱＲＬＧ
［配列番号２１］ＷＴＷＫＧＮＫＱＶＫＦ
［配列番号２２］ＷＴＷＫＧＥＴＹＤＳＫ
【請求項４】
前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、下記配列番号２３乃至２６で表されるアミノ酸配列の何れかの配列を含む、請求項１に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。［配列番号２３］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
［配列番号２４］ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲ
［配列番号２５］ＷＴＷＫＧＥＤＫＧＫＮ
［配列番号２６］ＷＴＷＫＧＲＤＫＬＱＭ
【請求項５】
前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、下記配列番号２７乃至３１で表されるアミノ酸配列の何れかの配列を含む、請求項１に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。［配列番号２７］ＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
［配列番号２８］ＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
［配列番号２９］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮ
［配列番号３０］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬ
［配列番号３１］ＫＧＴＬＮＲ
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載のペプチドをコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１乃至５の何れか１項に記載のペプチド、又は請求項６に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有するシワ改善用化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１乃至５の何れか１項に記載のペプチド、又は請求項６に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有するシワ改善用薬学的組成物。
【請求項９】
（１）ペプチドライブラリーを作製後、ベクターに挿入して組み換えファージを製造する段階と、
（２）前記組み換えファージとアセチルコリン受容体とを混合した後、バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を実施してアセチルコリン受容体と結合するファージを選別する段階と、
（３）前記段階（２）で選別されたファージに対して、アセチルコリン受容体と、対照群との酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）を実施する段階と、
（４）前記酵素免疫分析の実施結果を分析し、対照群に対してアセチルコリン受容体とシグナルの強度が１．５倍以上であるファージを選別する段階と、
を含むアセチルコリン受容体結合ペプチドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルコリン受容体結合ペプチドに関し、より詳細にはアセチルコリンが作用するアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を遮断し、シワ改善の効果を示すペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、健康な生に対する関心が増加し、生活水準の向上、女性の社会進出増加、高齢化の加速化等により、消費者の化粧品に対するニーズは、美しく飾るための用途からますます機能的用途を要求するものに変化している。
【０００３】
肌の老化現象を防止し、より健康且つ弾力のある肌を維持するために、シワ改善の効果がある生理活性物質を開発しようとする研究活動が絶えず行われてきた。代表的に１９９５年光老化した肌の改善のための治療剤としてトレチノイン酸（ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）が米国ＦＤＡの許可を受け、これより副作用の少ないレチノールが、１９９０年代中後半から化粧品の原料に使用され始め、本格的にシワ改善の化粧品が発売され始めた。それ以降、女性ホルモン類似物質、各種植物から抽出した抗酸化剤などがシワ改善の原料として化粧品に導入された。
【０００４】
しかしながら、このような化粧品原料は、ほとんど効能が不十分であるか、または肌副作用を誘発するなど、さまざまな問題点を持っていた。また、効能が良い原料であっても、現在の化粧品原料は、肌に作用する範囲が制限的であり、ほとんどコラーゲンの合成促進、コラーゲン分解抑制、活性酸素の除去のように、肌に及ぼす効能が類似しており、より新しく、より強力であり、より根本的なシワ改善を希望する顧客の要求を十分に満たすことができなかった。これによって、最新の肌科学理論に基づいて、新しい肌老化のメカニズムを解明し、これを遮断したり遅らせることができる原料と技術に対する研究が、化粧品産業で活発に行われている。
【０００５】
最近、ペプチド成分を化粧品に使用して肌のシワを改善する研究が活発に行われている。ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）は、アミノ酸が２つ以上結合して形成された物質であるが、化学合成、酵素反応、又はたんぱく質からの加水分解によって製造される。
【０００６】
一方、アセチルコリンは、末梢神経系で骨格筋と内臓の筋肉の運動に関与し、脳では学習と記憶に影響を与える。運動神経と筋肉が出会う場所で、神経伝達物質であるアセチルコリンの分泌を妨げると、筋肉の収縮を抑制し、筋肉が麻痺されながらシワが伸びるが、これを利用したものの一例として、ボトックスがこれに該当する。ボトックスは、運動神経末端で筋肉の収縮に必須の物質であるアセチルコリンが分泌される過程を妨げる。その結果、筋肉が動くことができなくなり、筋肉によって誘発されたシワがなくなる。
【０００７】
したがって、同じ原理でアセチルコリンの分泌を抑制するペプチドを開発すれば、肌のシワ改善、及び予防を期待することができるものと予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許公報第１０−０５５３１７４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を抑制するペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、下記一般式１乃至６の何れかの一般式で表されるアミノ酸配列を含むアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供することを本発明の一側面とする。
【００１１】
［一般式１］ＷＴＷＫＧ−Ｘｎ
【００１２】
［一般式２］ＴＷＫＧ−Ｘｎ
【００１３】
［一般式３］ＷＫＧ−Ｘｎ
【００１４】
［一般式４］ＫＧ−Ｘｎ
【００１５】
［一般式５］Ｇ−Ｘｎ
【００１６】
［一般式６］Ｘｎ
【００１７】
（前記Ｘｎは、１乃至６個の任意のアミノ酸からなるシーケンスを表す）
【００１８】
本発明において、用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）又はその断片」とは、アミド結合（又はペプチド結合）で連結された２個以上のアミノ酸からなるポリマーを意味する。本発明の目的上、シワ改善の効果を示すペプチド又はその断片を意味する。
【００１９】
本発明のペプチド又はその断片は、標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期、又はペプチドの安定性を増加させるための特定の目的で考案されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００２０】
本発明のペプチド又はその断片は、当分野に広く公知となった様々な方法で獲得できる。詳細には、遺伝子組み換えとたんぱく質発現システムを用いて製造するか、又はペプチド合成のような化学的合成を通じて試験管内で合成する方法、及び無細胞たんぱく質合成法などで製造されることができる。
【００２１】
より具体的には、この分野でよく知られている方法、例えば、自動ペプチド合成器によって合成でき、遺伝子操作技術によって生産することもできるが、これに制限されるわけではない。例えば、遺伝子操作を通じて融合パートナーと本発明のペプチドからなる融合たんぱく質をコーディングする融合遺伝子を製造し、それによって宿主微生物を形質転換させた後、宿主微生物から融合たんぱく質の形態で発現させた後、たんぱく質分解酵素又は化合物を用いて融合たんぱく質から本発明のペプチドを切断、分離して、希望するペプチドを生産することができる。このため、例えば、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａやエンテロキナーゼのようなたんぱく質分解酵素、ＣＮＢｒ、又はヒドロキシルアミンのような化合物によって切断されることができるアミノ酸残基をコーディングするＤＮＡ配列を融合パートナーと本発明のペプチド遺伝子との間に挿入できる。
【００２２】
本発明によるアセチルコリン受容体と結合し、アセチルコリンの分泌を抑制するペプチドにおいて、前記Ｘｎは、配列番号１乃至１１の配列の何れかのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２３】
［配列番号１］ＫＧＴＬＮＲ、
【００２４】
［配列番号２］ＲＫＳＬＬＲ、
【００２５】
［配列番号３］ＥＤＫＧＫＮ、
【００２６】
［配列番号４］ＲＤＫＬＱＭ、
【００２７】
［配列番号５］ＱＬＧＱＬＳ、
【００２８】
［配列番号６］ＧＲＬＳＡＳ、
【００２９】
［配列番号７］ＲＱＬＮＮＱ、
【００３０】
［配列番号８］ＤＮＬＱＮＮ、
【００３１】
［配列番号９］ＬＹＱＲＬＧ、
【００３２】
［配列番号１０］ＮＫＱＶＫＦ、
【００３３】
［配列番号１１］ＥＴＹＤＳＫ
【００３４】
本発明によるアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を抑制するペプチドにおいて、前記ペプチドは、配列番号１２乃至２２の配列の何れかのアミノ酸配列を含むことができる。
【００３５】
［配列番号１２］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
【００３６】
［配列番号１３］ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲ
【００３７】
［配列番号１４］ＷＴＷＫＧＥＤＫＧＫＮ
【００３８】
［配列番号１５］ＷＴＷＫＧＲＤＫＬＱＭ
【００３９】
［配列番号１６］ＷＴＷＫＧＱＬＧＱＬＳ
【００４０】
［配列番号１７］ＷＴＷＫＧＧＲＬＳＡＳ
【００４１】
［配列番号１８］ＷＴＷＫＧＲＱＬＮＮＱ
【００４２】
［配列番号１９］ＷＴＷＫＧＤＮＬＱＮＮ
【００４３】
［配列番号２０］ＷＴＷＫＧＬＹＱＲＬＧ
【００４４】
［配列番号２１］ＷＴＷＫＧＮＫＱＶＫＦ
【００４５】
［配列番号２２］ＷＴＷＫＧＥＴＹＤＳＫ
【００４６】
本発明によるアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を抑制するペプチドにおいて、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、下記配列番号２３乃至２６で表
されるアミノ酸配列の何れかの配列を含むことを特徴とする。
【００４７】
［配列番号２３］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
【００４８】
［配列番号２４］ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲ
【００４９】
［配列番号２５］ＷＴＷＫＧＥＤＫＧＫＮ
【００５０】
［配列番号２６］ＷＴＷＫＧＲＤＫＬＱＭ
【００５１】
本発明によるアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を抑制するペプチドにおいて、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、下記配列番号２７乃至３１で表されるアミノ酸配列の何れかの配列を含むことを特徴とする。下記配列番号２７乃至３１で表されるアミノ酸配列は、最適化のために、配合割合２３乃至２６で表されるアミノ酸配列のうち一部が欠失した構造である。
【００５２】
［配列番号２７］ＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
【００５３】
［配列番号２８］ＷＫＧＫＧＴＬＮＲ
【００５４】
［配列番号２９］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮ
【００５５】
［配列番号３０］ＷＴＷＫＧＫＧＴＬ
【００５６】
［配列番号３１］ＫＧＴＬＮＲ
【００５７】
また、本発明は、
（１）ペプチドライブラリーを作製後、ベクターに挿入して組み換えファージを製造する段階と、
（２）前記組み換えファージとアセチルコリン受容体とを混合した後、バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を実施してアセチルコリン受容体と結合するファージを選別する段階と、
（３）前記段階（２）で選別されたファージに対して、アセチルコリン受容体と、対照群との酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）を実施する段階と、
（４）前記酵素免疫分析の実施結果を分析し、対照群に対してアセチルコリン受容体と結合シグナルの強度が１．５倍以上であるファージを選別する段階と、を含むアセチルコリン受容体結合ペプチドのスクリーニング方法を提供することを本発明のまた別の側面とする。
【００５８】
本発明によるアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリンの分泌を抑制するペプチドの選別方法において、前記（１）ペプチドライブラリーを作製後、ベクターに挿入して組み換えファージを製造する段階での前記ペプチドライブラリーは、配列番号１乃至１１の何れかの塩基配列からなるＤＮＡライブラリーを用いて作製されたものであってもよい。
【００５９】
また、本発明は、本発明によるペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。また、前記生体構造物に対して結合活性を示すことができるペプチドをコーディングすることができる限り、前記塩基配列と相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドもやはり、本発明で提供するポリヌクレオチドの範疇に含まれることができるが、好ましくは８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドになることができ、より好
ましくは９０％以上の相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドになることができ、最も好ましくは９５％以上の相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドになることができる。
【００６０】
また、本発明は、本発明によるペプチドを有効成分として含有するシワ改善用化粧品組成物を提供することを別の側面とする。
【００６１】
また、本発明は、前記のペプチドを有効成分として含有するシワ改善用薬学的組成物を提供することを別の側面とする。
【００６２】
本発明によるシワ改善用薬学的組成物は、本発明のペプチド又はこれらの薬学的に許容可能な塩を単独で含有するか、又は一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含有することができる。
【００６３】
本発明における用語、「薬学的に許容」とは、治療効果を示すことができる程度の充分な量と、副作用を引き起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、又は同時使用される薬物等、医学分野によく知られている要素に応じて、当業者によって容易に決定されることができる。
【００６４】
薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体、又は非経口投与用担体をさらに含むことができる。
【００６５】
経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸等を含むことができる。また、非経口投与用担体は、水、適合なオイル、食塩水、水性グルコース、及びグリコール等を含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適合な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル−又はプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考とすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。
【００６６】
本発明のシワ改善用薬学的組成物は、ヒトをはじめとした哺乳動物にどんな方法でも投与できる。例えば、経口又は非経口的に投与できる。非経口的な投与方法としては、これに限定されるわけではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、又は直腸内投与であり得る。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、経皮投与されることができる。前記で「経皮投与」とは、本発明の薬学的組成物を細胞または肌に投与して、本発明の組成物に含有された活性成分が肌内へ伝達されるようにすることをいう。例えば、本発明の薬学的組成物を注射型剤形で製造し、これを３０ゲージの細い注射針で肌を軽く刺す（ｐｒｉｃｋ）する方法、又は肌に直接的に塗布する方法で投与されることができる。
【００６７】
本発明の薬学的組成物は、前述したような投与経路によって、経口投与用又は非経口投与用製剤で剤形化できる。
【００６８】
経口投与用製剤の場合、本発明の組成物は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等で、当業界に公知となった方法を用いて剤形化できる。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体賦形剤と配合してから
これを粉砕し、適合な補助剤を添加した後、顆粒混合物で加工することによって、錠剤又は糖衣錠剤を収得することができる。適合な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、及びマルチトール等を含む糖類と、トウモロコシ澱粉、ミール澱粉、米澱粉、及びジャガイモ澱粉等を含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチル−セルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤が含まれることができる。また、場合によって、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はナトリウムアルジネート等を崩壊剤として添加できる。
【００６９】
非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイール剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル、及び鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知となった方法で剤形化できる。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般に公知となった処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【００７０】
本発明のペプチドの全有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で患者に投与されることができ、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されることができる。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度によって有効成分の含量を異にすることができる。
【発明の効果】
【００７１】
本発明によるペプチドは、アセチルコリン受容体と結合強度が高く、アセチルコリンと強く結合し、アセチルコリンの分泌を抑制することによって、本発明によるペプチドを有効成分として含む化粧品組成物及び薬学的組成物は、優れたシワ改善の効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の一実施例に係るランダムペプチドＤＮＡライブラリーの作製結果である。
【図２】本発明の一実施例に係るバイオパニング段階でアセチルコリン受容体に対する特異性の増加可否を確認した結果である。
【図３】本発明の一実施例に係るバイオパニング段階で回収した組み換えファージの陰性対照群であるストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）に対してアセチルコリン受容体に対するＥＬＩＳＡの結果を示すものである。
【図４】本発明の一実施例に係るＥＬＩＳＡの結果で、アセチルコリン受容体ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）のシグナル比率が１．５倍以上である組み換えファージのシーケンシングによる選別されたペプチドの多重整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の結果である。
【図５】本発明の一実施例に係る陽性対照群であるＳｙｎａｋｅとＶｉａｌｏｘと選別されたペプチドの結合能を測定した結果である。
【図６】本発明の一実施例に係る陽性対照群であるＳｙｎａｋｅの結合能を測定した結果である。
【図７】本発明の一実施例に係る選別されたペプチドの結合能を測定した結果である。
【図８】本発明の一実施例に係る最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）のための欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）したペプチドの結合能を比較した結果である。
【図９】本発明の一実施例に係る欠失したペプチドの結合能を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
【００７４】
実施例１．ランダムペプチドファージライブラリーの製造
【００７５】
１−１．４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒのランダムペプチドの作製及びベクターへの挿入
【００７６】
ランダムペプチドライブラリー（ＷＴＷＫＧ（Ｘ）ｎ、Ｘ＝ランダムアミノ酸、ｎ＝４乃至６）を製造するために、ＤＮＡライブラリー４ｍｅｒ（ＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴ）、５ｍｅｒ（ＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＫＫＮＮＫＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴ）、６ｍｅｒ（ＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＫＫＮＮＫＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴ）を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）。
【００７７】
二つの１本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）プライマー（ＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧ、ＡＡＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣ）でＰＣＲを用いて２本鎖のインサート（Ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｉｎｓｅｒｔ）を増幅した。ランダムペプチドＤＮＡライブラリーの作製結果を図１に示した。
【００７８】
これをファージミドベクター（Ｐｈａｇｅｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＩＧＴ）に挿入するために、ファージミドベクターとＰＣＲを用いて増幅したインサートＤＮＡを制限酵素で処理した。
【００７９】
約１０μｇのインサートＤＮＡをＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で８時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約１０μｇのファージミドベクターをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで８時間処理し、ＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）を入れて１時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製した結果を図１に示し、４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒのペプチドライブラリーＤＮＡはそれぞれ１．８×１０９、３．２×１０８、５．９×１０８個作製した。
【００８０】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてインサートＤＮＡ（３μｇ）をファージミドベクター（１０μｇ）と１８℃で１５時間連結した後、エタノールで沈殿させて、ＴＥバッファー１００μＬでＤＮＡを溶解させた。
【００８１】
１．２  電気穿孔
【００８２】
前記実施例１．１で製造された各４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒのランダムインサートＤＮＡを含んでいるファージミドベクター１００μＬを４μＬずつ２５個に分注し、電気穿孔を行った。
【００８３】
より詳細には、コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を氷上で溶かし、２００μＬのコンピテント細胞をインサートＤＮＡを含んでいるそれぞれのファージミド
ベクター溶液４μＬと混合した後、冷却して準備された０．２ｃｍのキュベットに入れた後、１分の間に氷上に置いた。
【００８４】
電気穿孔機（ＢｉｏＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を２００Ωで２５μＦ及び２．５ｋＶの条件でプログラムし、準備されたキュベットの水気を除去して電気穿孔機に位置させた後、パルスを加えた（時間定数は４．５乃至５ｍｓｅｃ）。以降、直ちに３７℃で準備した２０ｍＭのグルコースが含まれた１ｍＬのＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培地に入れた後、得られた総２５ｍＬの細胞を１００ｍＬの試験管に移した。一時間の間に３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合して培養した後、ライブラリーの個数を測定するために、１０μＬを分注してから希釈して、アンピシリンａｇａｒ培地に塗抹した。分注した後に残留する細胞を１ＬのＬＢに２０ｍＭのグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを入れて、３０℃で一日培養した。４℃で４，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、沈殿された細胞を除いた上層液を全て除去し、４０ｍＬのＬＢで再懸濁させた後、グリセロールを最終濃度２０％以上入れて、−８０℃に保管した。
【００８５】
１．３  ランダムペプチドライブラリーで組み換えファージの生産
【００８６】
前記実施例１．２で−８０℃に保存された４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーで組み換えファージを生産した。
【００８７】
３０ｍＬのＳＢ液体培地に−８０℃に保管されたライブラリー１ｍＬを追加し、２０分間３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合して培養した。ここに、ヘルパーファージ（Ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）（１０１０ｐｆｕ）とアンピシリン（最終の濃度５０μｇ／ｍＬ）を入れて、再度１時間の間に同じ条件で培養した。そして、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）が含まれたＳＢ液体培地３０ｍＬに移して、同じ条件で１６時間以上培養して組み換えファージを生産した。生産された組み換えファージを４℃で５，０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、上層液を得て、上層液にＰＥＧ／ＮａＣｌを５：１の体積比（ｖ／ｖ）で混合し、氷に１時間放置させた後、４℃で２０分間１３，０００ｒｐｍの速度で遠心分離して上層液は慎重に除去し、１ｍＬのＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ）でペレットを再懸濁させた。
【００８８】
実施例２．アセチルコリン受容体に結合するペプチドのスクリーニング方法  
【００８９】
２．１  アセチルコリン受容体のバイオパニング
【００９０】
アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）ａｌｐｈａ  １（１０μｇ／ｍＬ）を９６  ｗｅｌｌ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｔｅの８個のウェルに５０μＬずつ入れた後、４℃で一夜の間に放置し、翌日ＰＢＳ２００μＬで１回洗浄した後、２％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）２００μＬを入れて常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨ててＰＢＳ２００μＬで３回洗浄した。
【００９１】
ここに、前記実施例１．３でそれぞれ製造された４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒのランダムペプチド組み換えファージを含む溶液４００μＬ及び２％ＢＳＡ４００μＬを混合し、ウェル（ｗｅｌｌ）当たりの１００μＬずつ入れて、常温で１時間放置した。８個のウェル（ｗｅｌｌ）の溶液を全て除去し、０．１％ＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した後、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）をウェル（ｗｅｌｌ）当たりの１００μＬずつ入れて１０分間ファージを溶出させて、８００μＬのＥ−ｔｕｂｅに合わせて、ここに１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）２００μＬを入れて中和させた。
【００９２】
各バイオバニング毎にｉｎｐｕｔファージ及びｏｕｔｐｕｔファージの数を測定するた
めに、ＯＤ＝０．７であるＥ．ｃｏｉｌに混ぜてアンピシリンが含まれたａｇａｒ培地に塗抹した。パニングを繰り返すために、ｏｕｔｐｕｔファージ５００μＬを５ｍＬのＥ．ｃｏｉｌと混ぜて、３７℃で２００ｒｐｍの速度で３０分間混合して培養した後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びヘルパーファージ（１×１０１０ｐｆｕ）添加し、同じ方法で３０分間培養した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）が含まれた５０ｍＬのＳＢ培地に移して、同じ方法で一日間培養した。培養液を４℃で５，０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、上層液にＰＥＧ／ＮａＣｌ［２０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）及び１５％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）］を５：１の割合で添加した後、氷に１時間静置させた。４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で２０分間遠心分離後、上層液を完全に除去し、１ｍＬのＰＢＳ溶液でファージペレットを懸濁した後、２次バイオパニングに使用した。各パニングの段階毎に前記と同じ方法で使用し、洗浄過程の回数を３回、５回、７回、及び１０回として、６ｍｅｒのライブラリー（Ｓ６）をアセチルコリン受容体たんぱく質に対して５回にかけてバイオパニングを実施した条件とＩｎｐｕｔファージ、Ｏｕｔｐｕｔファージの結果を下記表１に整理した。
【００９３】
【表１】
2020525033.tif 000003
【００９４】
２．２  アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）のインプットファージ（Ｉｎｐｕｔ  ｐｈａｇｅ）のＥＬＩＳＡ
【００９５】
前記ライブラリーの各インプットファージ（Ｉｎｐｕｔ  ｐｈａｇｅ）のＥＬＩＳＡをストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）及びアセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）に対して行った。
【００９６】
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍＬのアセチルコリン受容体とストレプトアビジンを各ウェル当たりの５０μＬずつ１０個ずつ入れて、４℃で一日間放置した。以降、全てのウェルを０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで希釈した２％ＢＳＡを使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００９７】
前記表１における組み換えファージである三番目（３ｒｄＳ６）、四番目（４ｔｈＳ６）、及び五番目（５ｔｈＳ６）のインプットファージ８００μＬ及び１０％ＢＳＡ２００μＬを混合し、１００μＬずつアセチルコリン受容体とストレプトアビジンウェルにそれぞれ３ウェルずつ分注し、３０℃で１時間静置した。０．０５％ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ＨＲＰ−コンジュゲート抗−Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：１，０００で希釈して３０℃で１時間反応させた。０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）溶液１００μＬを分注し、発色反応を誘導した後、１００μＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加して反応を中止させた。以降、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度の測定結果を図２に示した。
【００９８】
２．３  アセチルコリン受容体に特異的なファージ検索（ｃｏｌｏｎｙ  ＥＬＩＳＡ）
【００９９】
前記表１における、四番目（４ｔｈＳ６）、五番目（５ｔｈＳ６）のアウトプットファージをＥ．ｃｏｉｌに接種させた後、プラークがプレート当たりの１００乃至２００個程度になるように塗抹した。滅菌されたチップを用いてプラーク５０個を１ｍＬのＳＢ−アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）培養液に接種した後、３７℃で５時間振とう培養してヘルパーファージを３０μＬずつ添加し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。培養液を１２，０００ｒｐｍの速度で２分間遠心分離して上層液を回収した後、２％ＢＳＡを入れてこれをファージ検索に使用した。
【０１００】
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに５μｇ／ｍＬのアセチルコリン受容体、ストレプトアビジンを各ウェル（ｗｅｌｌ）当たりの５０μＬずつ５０個のウェル（ｗｅｌｌ）に入れて、４℃で一日間放置した。翌日、全てのウェル（ｗｅｌｌ）のたんぱく質を除去し、２％ＢＳＡを使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した。各クローン別に増幅したファージ溶液１００μＬずつを全てのウェル（ｗｅｌｌ）に分注し、３０℃で１時間静置した。０．０５％ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ＨＲＰ−コンジュゲート抗−Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：２，０００で希釈して１００μＬずつ分注し、３０℃で１時間反応させた。０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液１００μＬを分注して発色反応を誘導した後、１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を中止させた。以降、結果を図３に整理した。
【０１０１】
図３を参照とし、ストレプトアビジンに対してアセチルコリン受容体のシグナルが１．５倍以上出たファージのプラスミドを精製し、シーケンシングを依頼した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄｅａｊｏｎ、Ｋｏｒｅａ）。シーケンシングプライマーは、ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣを使用した。
【０１０２】
シーケンシングを通じて、アセチルコリン受容体に特異的結合能を有するペプチドシーケンスを図４及び下記の表２に整理した。
【０１０３】
【表２】
2020525033.tif 000004
【０１０４】
実施例３．発掘したペプチドのアセチルコリン結合力の比較実験
【０１０５】
前記表２において、ペプチドのうち、多重整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を通じてシーケンスの類似性を示すＳ６＿１（ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）、Ｓ６＿２（ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲ）、Ｓ６＿３（ＷＴＷＫＧＥＤＫＧＫＮ）、Ｓ６＿４（ＷＴＷＫＧＲＤＫＬＱＭ）を合成した。
【０１０６】
このアセチルコリン受容体に対する結合力を比較するために、バイオセンサチップを用いて、ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）実験を行った（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。選択されたアセチルコリン受容体のたんぱく質をＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定し、最大５００秒までａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを観察した。観察条件はランニングバッファー２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、速度３０μＬ／分、ペプチド濃度１０μＭ（Ｓ６＿１、Ｓ６＿２、Ｓ６＿３、Ｓ６＿４）の条件で行った。
【０１０７】
結合力の比較実験結果、図５に整理した。
【０１０８】
実施例４．発掘したペプチドＳ６＿１と陽性対照群との結合力の比較実験
【０１０９】
発掘したペプチドであるＳ６＿１（ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）と欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）したフォームであるＳｃ＿１＿Ｃ６（ＫＧＴＬＮＲ）と、陽性対照群であるＳｙｎａｋｅとＶｉａｌｏｘのアセチルコリン受容体に対する結合力を比較するために、バイオセンサチップを用いてｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）実験を行った（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１１０】
選択されたアセチルコリン受容体のたんぱく質をＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定し、最大５００秒までａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを観察した。観察条件は、ランニングバッファー２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ
７．４）、速度３０μＬ／分、ペプチド濃度１０μＭ（Ｓｙｎａｋｅ、Ｖｉａｌｏｘ、Ｓ６＿１、Ｓ６＿１＿Ｃ６）の条件で行った。結合力の比較実験結果、図６に整理した。
【０１１１】
実施例５．Ｓ６＿１のペプチド及びＳｙｎａｋｅペプチドの親和力測定
【０１１２】
発掘したペプチドであるＳ６＿１（ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）と、陽性対照群であるＳｙｎａｋｅのアセチルコリン受容体に対する親和力を確認するために、バイオセンサチップを用いてｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）実験を行った（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。アセチルコリン受容体をＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定し、最大５００秒までａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを観察した。観察条件は、ランニングバッファー２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、速度３０μＬ／分で行った。濃度１０乃至５０μＭ（Ｓｙｎａｋｅ）、濃度０．１乃至１０μＭ（ペプチドＳ６＿１）の条件で行った。それぞれの結果を図７（Ｓｙｎａｋｅ）及び図８（ペプチドＳ６＿１）に示した。
【０１１３】
実施例６．Ｓ６＿１のペプチドの最適化及び結合力の比較実験
【０１１４】
Ｓ６＿１の最適化のためにＮ−末端とＣ−末端で一つと二つずつアミノ酸を除去したペプチドであるＳ６＿１＿Ｃ１０（ＴＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）、Ｓ６＿１＿Ｃ９（ＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）とＳ６＿１＿Ｃ１０＿ｅｎｄ（ＷＴＷＫＧＫＧＴＬＮ）、Ｓ６＿１＿Ｃ９＿ｅｎｄ（ＷＴＷＫＧＫＧＴＬ）を合成した。
【０１１５】
これらのペプチドのアセチルコリン受容体に対する結合力を比較するために、バイオセンサチップを用いてｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）実験を行った（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１１６】
選択されたアセチルコリン受容体のたんぱく質をＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定し、最大５００秒までａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを観察した。観察条件は、ランニングバッファー２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、速度３０μＬ／分、ペプチド濃度１０μＭ（Ｓｙｎａｋｅ、Ｖｉａｌｏｘ、Ｓ６＿１、Ｓ６＿１＿Ｃ１０、Ｓ６＿１＿Ｃ９、Ｓ６＿１＿Ｃ１０＿ｅｎｄ、Ｓ６＿１＿Ｃ９＿ｅｎｄ、Ｓ６＿１＿Ｃ６）の条件で行った。結果を図９に整理した。
【０１１７】
実施例７．Ｓ６＿１＿Ｃ９のペプチドの親和力測定
【０１１８】
前記実施例６で製造された最適化されたＳ６＿１＿Ｃ９のペプチド（ＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）のアセチルコリン受容体に対する親和力を確認するために、バイオセンサチップを用いてｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）実験を行った（Ｂ
ｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１１９】
選択されたアセチルコリン受容体のたんぱく質をＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定し、最大５００秒までａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを観察した。観察条件は、ランニングバッファー２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ
７．４）、速度３０μＬ／分、濃度０．１乃至０．５μＭ（ペプチドＳ６＿１＿Ｃ９）の条件で行った。
【０１２０】
結果を図１０に整理した。図１０を参照すると、Ｓ６＿１＿Ｃ９のペプチド（ＷＫＧＫＧＴＬＮＲ）はアセチルコリンに対して、Ｓｙｎａｋｅに対して約１００倍高い結合能を示すことが確認できる。
【０１２１】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は単に好ましい実施態様であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１】
2020525033.tif 000005
【図２】
2020525033.tif 000006
【図３】
2020525033.tif 000007
【図４】
2020525033.tif 000008
【図５】
2020525033.tif 000009
【図６】
2020525033.tif 000010
【図７】
2020525033.tif 000011
【図８】
2020525033.tif 000012
【図９】
2020525033.tif 000013
【図１０】
2020525033.tif 000014
【配列表】
2020525033000001.app
【国際調査報告】
2020525033.tif 000015
2020525033.tif 000016
2020525033.tif 000017
2020525033.tif 000018
2020525033.tif 000019
2020525033.tif 000020