(57)【要約】本明細書で提供されるシステム、方法および組成物は、核酸ライブラリーの調製に関する。いくつかの実施形態は、一本鎖核酸のライゲーションによる核酸ライブラリーの調製を含む。上記方法の一実施形態では、反応種の自己コンカテマー化の可能性を減少させることにより、一本鎖核酸を調製する。例えば、３’アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションするために、３’アダプターは、自己コンカテマー化を阻害する保護基を有し得る。同様に、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化して、自己コンカテマー化を阻害し得る。
2020509778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；および
（ｅ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記リン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２アダプターが基体に付着されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記基体がビーズまたはフローセルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｅ）の前に、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記キャプチャープローブが、前記第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キャプチャープローブの３’末端が保護基を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記キャプチャープローブの５’末端が保護基を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することが、前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することが、前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼおよび５’デアデニラーゼと接触させることを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化することが、前記ライゲーション一本鎖核酸をキナーゼと接触させることを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は二本鎖核酸であること；
（ｂ）前記二本鎖核酸を５’エキソヌクレアーゼと接触させて、一本鎖３’オーバーハングを有する複数の改変二本鎖核酸を得ること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記改変二本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記第１アダプターにライゲーションされた前記改変二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて、複数の一本鎖核酸を得ること；および
（ｅ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
【請求項１５】
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記ライゲーション第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせること；
（ｅ）前記キャプチャープローブを伸長させ、前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第２アダプターの３’末端は保護基を含み、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
【請求項１７】
前記伸長キャプチャープローブから前記ハイブリダイズライゲーション第１アダプターを除去することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記キャプチャープローブが基体に付着されている、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記基体がビーズまたはフローセルを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記キャプチャープローブがキャプチャープローブインデックスを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記キャプチャープローブが切断可能リンカーを含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記切断可能リンカーを切断することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リンカーを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記リンカーは第１アダプターおよび第２アダプターを含み、前記リンカーの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；
（ｅ）前記リン酸化核酸の３’末端を脱保護し、ライゲーションにより前記脱保護核酸を環状化することであって、それにより、環状核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記リンカーが、前記第１アダプターと前記第２アダプターとの間に切断可能部位を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記切断可能リンカーにおける切断により、前記環状核酸を線状化することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記切断可能部位がウラシル残基を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記環状核酸をウラシル特異的切除試薬と接触させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウラシル特異的切除試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩから選択される酵素を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくともプライマーを前記第１アダプターまたは前記第２アダプターにハイブリダイズさせることを含む方法により、前記環状核酸を増幅することをさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅することが、ＰＣＲおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅することが、前記環状核酸を、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼと接触させることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記一本鎖核酸の５’末端の脱リン酸化が、前記一本鎖核酸をホスファターゼと接触させることを含む、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）〜（ｅ）を単一反応体積で実施する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）〜（ｅ）を単一反応容器で実施する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがシーケンシングプライマー結合部位を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１アダプターがＰ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２アダプターがＰ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがアダプターインデックスを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１アダプターインデックスが前記第２アダプターインデックスと異なる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記アダプターインデックスが、前記複数の核酸の供給源を示す、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記保護基が３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記リガーゼが一本鎖核酸リガーゼを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
体積排除剤の存在下で、前記第１アダプターのライゲーションおよび／または前記第２アダプターのライゲーションを実施する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記体積排除剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、前記第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも約６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、前記第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数の核酸がＲＮＡを含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数の核酸がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記複数の核酸の平均核酸サイズが約２００ヌクレオチド未満である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数の核酸が低品質核酸供給源から得られる、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数の核酸が固定サンプルから得られる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
核酸の前記ライブラリーを増幅することをさらに含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
核酸の前記ライブラリーからシーケンスデータを得ることをさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法により調製される、核酸ライブラリー。
【請求項５５】
第１アダプターであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含み、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む第１アダプター；
リガーゼ；ならびに
構成要素であって、体積排除剤、キナーゼ、ホスファターゼ、５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼ、５’デアデニラーゼ、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼ、ウラシル特異的切除試薬、および第２アダプターであって、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む第２アダプターからなる群より選択される構成要素
を含む、キット。
【請求項５６】
リンカーが前記第１および前記第２アダプターを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
複数の核酸；
第１アダプターであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含む
第１アダプター；
リガーゼ；および
体積排除剤
を含む反応体積を含む、反応容器。
【請求項５８】
前記複数の核酸が一本鎖核酸である、請求項５７に記載の反応容器。
【請求項５９】
前記第１アダプターが前記複数の一本鎖核酸の３’末端にライゲーションされており、それにより、複数の改変一本鎖核酸を形成する、請求項５８に記載の反応容器。
【請求項６０】
非ライゲーション第１アダプターがキャプチャープローブにハイブリダイズされている、請求項５９に記載の反応容器。
【請求項６１】
前記キャプチャープローブが、前記第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む、請求項６０に記載の反応容器。
【請求項６２】
前記複数の核酸が、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸である、請求項５７に記載の反応容器。
【請求項６３】
前記第１アダプターが、３’オーバーハングを有する前記複数の二本鎖核酸の３’末端にライゲーションされており、それにより、複数の改変二本鎖核酸を形成する、請求項６２に記載の反応容器。
【請求項６４】
第２アダプターをさらに含む、請求項５７〜６３のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項６５】
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、請求項６４に記載の反応容器。
【請求項６６】
脱リン酸化剤を含む、請求項５７〜６５のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項６７】
前記脱リン酸化剤がホスファターゼを含む、請求項６６に記載の反応容器。
【請求項６８】
前記ホスファターゼが不活性化されている、請求項６７に記載の反応容器。
【請求項６９】
前記体積排除剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項７０】
前記反応体積が少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む、請求項６９に記載の反応容器。
【請求項７１】
前記反応体積が少なくとも約６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む、請求項６９に記載の反応容器。
【請求項７２】
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがシーケンシングプライマー結合部位を含む、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項７３】
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがアダプターインデックスを含む、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項７４】
前記第１アダプターインデックスが前記第２アダプターインデックスとは異なる、請求項７３に記載の反応容器。
【請求項７５】
前記アダプターインデックスが、前記複数の一本鎖核酸の供給源を示す、請求項７３に記載の反応容器。
【請求項７６】
前記保護基が３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む、請求項５７〜７５のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項７７】
前記保護基が３’スペーサーＣ３を含む、請求項５７〜７６のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項７８】
前記リガーゼが一本鎖核酸リガーゼを含む、請求項５７〜７７のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項７９】
前記複数の核酸がＲＮＡを含む、請求項５７〜７８のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項８０】
前記複数の核酸がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む、請求項５７〜７８のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項８１】
前記複数の一本鎖核酸が低品質核酸供給源から得られる、請求項５７〜８０のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項８２】
前記複数の核酸が固定サンプルから得られる、請求項８１に記載の反応容器。
【請求項８３】
請求項５７〜８２のいずれか一項に記載の反応容器を含む、フローセル。
【請求項８４】
請求項５７〜８２のいずれか一項に記載の反応容器と、シーケンシングデータを得るための検出器とを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２０日に出願された“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＬＩＢＲＡＲＩＥＳ”と題する米国仮出願番号第６２／４７３５９５号に基づく優先権を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、電子形式の配列表を含む。配列表は、２０１８年３月１５日に作成されたＩＬＬＩＮＣ３６２ＷＯＳＥＱＬＩＳＴという名称のファイルとして提供され、約４ｋｂのサイズである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本明細書で提供されるシステム、方法および組成物は、核酸ライブラリーの調製に関する。いくつかの実施形態は、一本鎖核酸のライゲーションによる核酸ライブラリーの調製を含む。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
いくつかの次世代シーケンシング技術は、ゲノム全配列の高速かつ経済的な決定に利用可能である。典型的には、シーケンシングの前に、二本鎖標的ゲノムＤＮＡサンプルからテンプレート核酸のライブラリーを調製する。サンプル調製は、通常、より大きなＤＮＡ鎖を、次世代シーケンシング技術により適したより小さなＤＮＡ断片に切断するＤＮＡ断片化工程を含む。多くの場合、アダプターをＤＮＡ断片の末端に付加するが、これは、ＤＮＡ末端修復とそれに続くアダプターライゲーションにより、またはより最近ではトランスポソーム系を使用することにより達成され得る。トランスポザーゼとトランスポゾン配列との複合体であるトランスポソームの使用は、同時のゲノム断片化および断片のアダプターライゲーションを可能にし、それにより、ライブラリー調製を単純化する。ライブラリーの調製方法は、典型的には労働集約的であり、異なる段階でいくつかの実践的な工程を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
いくつかの実施形態は、核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の核酸を得ること（ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸である）；（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；（ｄ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；および（ｅ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記リン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない。
【０００７】
いくつかの実施形態では、第２アダプターは基体に付着されている。いくつかの実施形態では、基体はビーズまたはフローセルを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態はまた、工程（ｅ）の前に、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態はまた、非ライゲーション一本鎖第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブの３’末端は保護基を含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブの５’末端は保護基を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態はまた、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することを含む。いくつかの実施形態では、非ライゲーション一本鎖第１アダプターの消化は、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、非ライゲーション一本鎖第１アダプターの消化は、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼおよび５’デアデニラーゼと接触させることを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ライゲーション一本鎖核酸の５’末端のリン酸化は、ライゲーション一本鎖核酸をキナーゼと接触させることを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態は、核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の核酸を得ること（ここで、前記複数の核酸は二本鎖核酸である）；（ｂ）前記二本鎖核酸を５’エキソヌクレアーゼと接触させて、一本鎖３’オーバーハングを有する複数の改変二本鎖核酸を得ること；（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記改変二本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；（ｄ）前記第１アダプターにライゲーションされた前記改変二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて、複数の一本鎖核酸を得ること；および（ｅ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない。
【００１４】
いくつかの実施形態は、核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の核酸を得ること（ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸である）；（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；（ｄ）前記ライゲーション第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせること；および（ｅ）前記キャプチャープローブを伸長させ、前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションし（ここで、前記第２アダプターの３’末端は保護基を含む）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態はまた、伸長キャプチャープローブからハイブリダイズライゲーション第１アダプターを除去することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは基体に付着されている。いくつかの実施形態では、基体はビーズまたはフローセルを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブはキャプチャープローブインデックスを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは切断可能リンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、切断可能リンカーを切断することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態は、核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の核酸を得ること（ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸である）；（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；（ｃ）リンカーを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、前記リンカーは第１アダプターおよび第２アダプターを含み、前記リンカーの３’末端は保護基を含む）；（ｄ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；および（ｅ）前記リン酸化核酸の３’末端を脱保護し、ライゲーションにより前記脱保護核酸を環状化し、それにより、環状核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、リンカーは、第１アダプターと第２アダプターとの間に切断可能部位を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態はまた、切断可能リンカーにおける切断により、環状核酸を線状化することを含む。いくつかの実施形態では、切断可能部位はウラシル残基を含む。いくつかの実施形態はまた、環状核酸をウラシル特異的切除試薬と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ウラシル特異的切除試薬は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩから選択される酵素を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態はまた、少なくともプライマーを第１アダプターまたは第２アダプターにハイブリダイズさせることを含む方法により、環状核酸を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、増幅は、ＰＣＲおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、増幅は、環状核酸を、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼと接触させることを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸の５’末端の脱リン酸化は、一本鎖核酸をホスファターゼと接触させることを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）〜（ｅ）を単一反応体積で実施する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）〜（ｅ）を単一反応容器で実施する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１アダプターおよび／または第２アダプターは、シーケンシングプライマー結合部位を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第１アダプターは、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む。いくつかの実施形態では、第２アダプターは、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１アダプターおよび／または第２アダプターは、アダプターインデックスを含む。いくつかの実施形態では、第１アダプターインデックスは、第２アダプターインデックスと異なるものである。いくつかの実施形態では、アダプターインデックスは、複数の核酸の供給源を示すものである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、保護基は、３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、リガーゼは一本鎖核酸リガーゼを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、体積排除剤の存在下で、第１アダプターのライゲーションおよび／または第２アダプターのライゲーションを実施する。いくつかの実施形態では、体積排除剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する。いくつかの実施形態では、少なくとも約６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、複数の核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、複数の核酸の平均核酸サイズは約２００ヌクレオチド未満である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、複数の核酸は低品質核酸供給源から得られる。いくつかの実施形態では、複数の核酸は固定サンプルから得られる。
【００３３】
いくつかの実施形態はまた、核酸のライブラリーを増幅することを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態はまた、核酸のライブラリーからシーケンスデータを得ることを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの方法により調製される核酸ライブラリーを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態は、第１アダプター（ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含み、前記第１アダプターは、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む）；リガーゼ；ならびに体積排除剤、キナーゼ、ホスファターゼ、５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼ、５’デアデニラーゼ、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼ、ウラシル特異的切除試薬および第２アダプター（ここで、前記第２アダプターは、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む）からなる群より選択される構成要素を含むキットを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは第１および第２アダプターを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態は、複数の核酸；第１アダプター（ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；リガーゼ；および体積排除剤を含む反応体積を含む反応容器を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、複数の核酸は一本鎖核酸である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、第１アダプターは、複数の一本鎖核酸の３’末端にライゲーションされており、それにより、複数の改変一本鎖核酸を形成する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、非ライゲーション第１アダプターは、キャプチャープローブにハイブリダイズされている。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、複数の核酸は、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、第１アダプターは、３’オーバーハングを有する複数の二本鎖核酸の３’末端にライゲーションされており、それにより、複数の改変二本鎖核酸を形成する。
【００４２】
いくつかの実施形態はまた、第２アダプターを含む。いくつかの実施形態では、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない。
【００４３】
いくつかの実施形態はまた、脱リン酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、脱リン酸化剤はホスファターゼを含む。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは不活性化されている。
【００４４】
いくつかの実施形態では、体積排除剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、反応体積は、少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、反応体積は、少なくとも約６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、第１アダプターおよび／または第２アダプターは、シーケンシングプライマー結合部位を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、第１アダプターおよび／または第２アダプターは、アダプターインデックスを含む。いくつかの実施形態では、第１アダプターインデックスは、第２アダプターインデックスと異なるものである。いくつかの実施形態では、アダプターインデックスは、複数の一本鎖核酸の供給源を示すものである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、保護基は、３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、保護基は３’スペーサーＣ３を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、リガーゼは一本鎖核酸リガーゼを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、複数の核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、複数の一本鎖核酸は低品質核酸供給源から得られる。いくつかの実施形態では、複数の核酸は固定サンプルから得られる。
【００５１】
いくつかの実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの反応容器を含むフローセルを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの反応容器と、シーケンシングデータを得るための検出器とを含むシステムを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、一実施形態による、一本鎖核酸のライブラリーを調製する方法の概略図である。二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて一本鎖核酸を形成し、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化し、３’保護基を含有するＰ７’アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし、ライゲーション一本鎖核酸の５’末端を再リン酸化し、非リン酸化５’末端を含有するＰ５アダプターをライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションすることにより、ライブラリーを調製し得る。
【００５４】
【図２】図２は、一実施形態による、一本鎖核酸のライブラリーを調製する方法の概略図である。５’エキソヌクレアーゼを用いて二本鎖核酸を部分的に消化して３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を形成し、脱ハイブリダイズさせて一本鎖核酸を形成し、３’保護基を含有するＰ７’アダプターを、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸の３’末端にライゲーションし得、３’オーバーハングを有するライゲーション二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて一本鎖核酸を形成し得、非リン酸化５’末端を含有するＰ５アダプターをライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし得る。
【００５５】
【図３】図３は、一実施形態による、ビーズを使用して一本鎖核酸（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ）のライブラリーを調製する方法の概略図を示す。一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化し、３’保護基を含有するＰ５’アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし、第１ライゲーション産物を、ビーズに付着されたＰ５キャプチャープローブにハイブリダイズさせ、キャプチャープローブを伸長させ、伸長キャプチャープローブからハイブリダイズ第１ライゲーション産物を除去し、３’保護基を含有するＰ７’アダプターを伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションすることにより、ライブラリーを調製し得る。
【００５６】
【図４Ａ】図４Ａは、一実施形態による、環状一本鎖核酸のライブラリーを調製する方法の概略図である。二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて一本鎖核酸を形成し、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化し；Ｐ７’アダプターと、切断可能部位（「Ｕ」）と、３’保護基（「Ｒ」）を有するＰ５アダプターとを含むリンカーを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし；ライゲーション一本鎖核酸の５’末端を再リン酸化し；ライゲーション一本鎖核酸の３’末端を脱保護し、脱保護核酸を環状化して、環状一本鎖核酸を含むライブラリーのメンバーを形成することにより、ライブラリーを調製し得る。
【００５７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ｂの環状核酸を、切断可能部位（「Ｕ」）を切断することにより線状化し得るか、またはＰＣＲによりもしくはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により増幅し得る概略図である。
【００５８】
【図５】図５は、図１に示されている実施形態を含む一本鎖核酸のライブラリーを調製する方法の概略図である。図５に示されているように、Ｐ７配列を有するキャプチャープローブは、標的核酸にライゲーションされたＰ７’アダプターに、および過剰な非ライゲーションＰ７’アダプターにハイブリダイズする。非ライゲーションＰ７’アダプターへのキャプチャープローブのハイブリダイゼーションは、他の核酸への非ライゲーションＰ７’アダプターのライゲーションを阻害する。
【００５９】
【図６】図６は、一実施形態による、一本鎖核酸のライブラリーを調製する方法の概略図である。二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて一本鎖核酸を形成し、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化し、３’保護基を含有するＰ７’アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし、５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼおよび５’デアデニラーゼを用いて消化することにより過剰な非ライゲーション一本鎖Ｐ７’アダプターを除去し、ライゲーション一本鎖核酸の５’末端を再リン酸化し、非リン酸化５’末端を含有するＰ５アダプターをライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションすることにより、ライブラリーを調製し得る。
【００６０】
【図７】図７は、６０ｍｅｒ一本鎖核酸（３’ＯＨ−６０−Ｐｈｏｓ５’）の５’末端を脱リン酸化し、生成物（３’ＯＨ−６０−ＯＨ５’）がコンカテマーを形成し得ないことを確認する実験の結果を示す。上のパネルは、脱リン酸化を示す概略図である。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６１】
【図８】図８は、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を脱リン酸化６０ｍｅｒ一本鎖核酸（３’ＯＨ−６０−ＯＨ５’）の３’末端にライゲーションする実験の結果を示す。上のパネルは、ライゲーションを示す概略図である。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６２】
【図９】図９は、３’保護基を有するライゲーション６４ｍｅｒアダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−６０−ＯＨ）を含有する１２４ｍｅｒ脱リン酸化一本鎖核酸の５’末端を再リン酸化する実験の結果を示す。上のパネルは、キナーゼ反応を示す概略図である。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６３】
【図１０】図１０は、非リン酸化５’末端（５’−Ｐ５−ＯＨ）を有する６０ｍｅｒＰ５アダプターを１２４ｍｅｒ一本鎖核酸（３’Ｃ３−６０−Ｂ２−Ｐｈｏｓ）の５’末端にライゲーションする実験の結果を示す。１２４ｍｅｒ一本鎖核酸は、３’保護基を有するライゲーション６４ｍｅｒアダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を含む。上のパネルは、ライゲーションを示す概略図である。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６４】
【図１１】図１１は、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を一本鎖脱リン酸化無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の３’末端にライゲーションする実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６５】
【図１２】図１２は、キナーゼ（ＰＮＫ）を用いて脱リン酸化ｃｆＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ［Ａｐｅｘ］）を処理し、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を再リン酸化ｃｆＤＮＡの３’末端にライゲーションした実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６６】
【図１３】図１３は、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を脱リン酸化ｃｆＤＮＡの３’末端にライゲーションし、キナーゼ（ＰＮＫ）を用いて、得られた第１ライゲーション産物（３’Ｃ３−Ｐ７−ｃｆＤＮＡ−ｐｈｏｓ５’）を処理し、非リン酸化５’末端を有する６０ｍｅｒＰ５アダプター（５’−Ｐ５−ＯＨ）を第１ライゲーション産物の５’末端にライゲーションして第２ライゲーション産物（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）を形成した実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００６７】
【図１４】図１４は、実施例２のライゲーション産物、ならびにライゲーション産物抽出物Ｂ１および抽出物Ｂ２からの増幅産物を示すゲルを示す。「参照」レーンでは、抽出物Ｂ１は２つの黒枠によりマークされ、抽出物Ｂ２は１つの白枠によりマークされている。
【００６８】
【図１５】図１５は、増幅ライゲーション産物、抽出物Ｂ１および抽出物Ｂ２の電気泳動図を示す。ピークは、１２６ｂｐプライマーダイマー（Ｐ７’−Ｐ５）、２９２ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）および４８０ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）種を示す。
【００６９】
【図１６】図１６は、様々な比でＳＰＲＩビーズを使用して増幅産物を抽出した結果を示すゲルを示す。
【００７０】
【図１７】図１７は、３’保護基を含有する６３ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７’−Ｐｈｏｓ５’）を一本鎖脱リン酸化ｃｆＤＮＡの３’末端にライゲーションする実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７１】
【図１８】図１８は、５’および３’保護基を含有する６３ｍｅｒＰ７キャプチャープローブ（３’Ｃ３−Ｐ７−Ｃ３５’）の存在下で、非リン酸化５’末端を有する６０ｍｅｒＰ５アダプター（５’−Ｐ５−ＯＨ）を第１ライゲーション産物（３’Ｃ３−Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−ｐｈｏｓ５’）の５’末端にライゲーションする実験の結果を示す。上のパネルは、ライゲーションを示す概略図である。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７２】
【図１９】図１９は、増幅ライゲーション産物、抽出物Ｂ１および抽出物Ｂ２の電気泳動図分析を示す。ピークは、１２６ｂｐプライマーダイマー（Ｐ７’−Ｐ５）、２９２ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）および４８０ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）種を示す。
【００７３】
【図２０】図２０は、増幅前、増幅後、およびＳＰＲＩビーズによる抽出後のライゲーション産物のゲルを示す。
【００７４】
【図２１】図２１は、様々な濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で、脱リン酸化５’末端を有する３９ｍｅｒオリゴ１（５’ＯＨ−オリゴ１−ＯＨ３’）を、リン酸化３’保護基を有する３７ｍｅｒオリゴ２（５’ｐｈｏｓ−オリゴ２−ｐｈｏｓ３’）にライゲーションする実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７５】
【図２２】図２２は、様々なオリゴ１：オリゴ２比を用いて、脱リン酸化５’末端を有する３９ｂｐオリゴ１（５’ＯＨ−オリゴ１−ＯＨ３’）を、リン酸化３’保護基を有する３７ｂｐオリゴ２（５’ｐｈｏｓ−オリゴ２−ｐｈｏｓ３’）にライゲーションする実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７６】
【図２３】図２３は、様々な量のリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ）を用いて、脱リン酸化５’末端を有する３９ｂｐオリゴ１（５’ＯＨ−オリゴ１−ＯＨ３’）を、リン酸化３’保護基を有する３７ｂｐオリゴ２（５’ｐｈｏｓ−オリゴ２−ｐｈｏｓ３’）にライゲーションする実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７７】
【図２４】図２４は、リン酸化３’保護基を有する３７ｍｅｒオリゴ２（５’ｐｈｏｓ−オリゴ２−ｐｈｏｓ３’）を、ビーズにコンジュゲートされた脱リン酸化５’末端を有する３９ｍｅｒオリゴ１（５’ＯＨ−オリゴ１−ＯＨ３’）にライゲーションする実験の結果を示す。オリゴ１のウラシル部位をカットするウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用したビーズからの切断により、ライゲーション産物をアッセイした。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７８】
【図２５】図２５は、４５％ＰＥＧを有する最終反応体積で、リン酸化３’保護基を有する３７ｍｅｒオリゴ２（５’ｐｈｏｓ−オリゴ２−ｐｈｏｓ３’）を、ビーズにコンジュゲートされた脱リン酸化５’末端を有する３９ｍｅｒオリゴ１（５’ＯＨ−オリゴ１−ＯＨ３’）にライゲーションする実験の結果を示す。表は、下のパネルに示されているゲルで実施およびランした反応の条件を概説する。
【００７９】
【図２６】図２６は、一実施形態による、ビーズを使用して一本鎖核酸（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ）のライブラリーを調製する方法の概略図を示す。一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化し、３’保護基を含有するＰ５’アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし、第１ライゲーション産物を、フローセルに付着されたＰ５キャプチャープローブにハイブリダイズさせ、キャプチャープローブを伸長させ、伸長キャプチャープローブからハイブリダイズ第１ライゲーション産物を除去し、相補的プライマーをハイブリダイズさせ、３’保護基を含有するＰ７’アダプターを伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションし、相補的プライマーを脱ハイブリダイズさせることにより、ライブラリーを調製し得る。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
詳細な説明
本明細書で提供されるシステム、方法および組成物の実施形態は、核酸ライブラリーの調製に関する。いくつかの実施形態は、一本鎖核酸をアダプターにライゲーションして、少量の供給源核酸から核酸のライブラリーを調製することを含む。いくつかの実施形態は、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸をアダプターにライゲーションして、少量の供給源核酸から核酸のライブラリーを調製することを含む。いくつかの実施形態は、一本鎖核酸を、アダプターを含むリンカーにライゲーションして、少量の供給源核酸から環状核酸のライブラリーを調製することを含む。
【００８１】
一実施形態では、反応種の自己コンカテマー化の可能性を減少させることにより、一本鎖核酸を調製する。例えば、３’アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションするために、３’アダプターは、自己コンカテマー化を阻害する保護基を有し得る。同様に、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化して、自己コンカテマー化を阻害し得る。この反応からのライゲーション産物は、３’保護基を有するライゲーション一本鎖核酸を含むであろう。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸の３’末端への３’アダプターのライゲーションは、非常に効率的であることが見出され、体積排除剤の存在下で実施された。５’アダプターがその５’末端にライゲーションされ得るように、３’保護基を有するライゲーション一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化し得る。５’アダプターを、３’保護基を有する再リン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションするために、５’アダプターは、自己コンカテマー化を阻害するための脱リン酸化５’末端を有し得る。この反応からのライゲーション産物は、５’アダプターおよび３’アダプターを有する一本鎖核酸を含むであろう。アダプターは、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位およびインデックスを含み得る。本明細書で使用される場合、「インデックス」は、核酸にタグ付加するために、および／または核酸の供給源を同定するために分子識別子および／またはバーコードとして使用され得るヌクレオチドの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、インデックスは、単一の核酸または核酸のサブ集団を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、単一反応容器、単一体積で、一本鎖核酸ライブラリーを調製し得る。加えて、本明細書で提供される実施形態は、その後の増幅反応で形成するプライマーダイマー産物の可能性を減少させ得る。
【００８２】
一実施形態による例示的な方法は、図１に概説されている。示されているように、標的一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化して、その後のライゲーション工程におけるコンカテマーの形成を防止する。一本鎖リガーゼを使用して、第１アダプターを脱リン酸化標的の３’末端にライゲーションする。第１アダプターによるコンカテマーの形成を防止するために、第１アダプターの３’末端を保護し得る。キナーゼを用いてライゲーション標的の５’末端を再リン酸化し、一本鎖リガーゼを使用して第２アダプターを脱リン酸化標的の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを形成する。第２アダプターによるコンカテマーの形成を防止するために、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていなくてもよい。
【００８３】
一実施形態による別の例示的な方法は図２に概説されており、アダプターを、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸にライゲーションする。いくつかの実施形態では、第１アダプターを、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸の３’末端にライゲーションし得る。第１アダプターによるコンカテマーの形成を防止するために、第１アダプターの３’末端を保護し得る。第１アダプターにライゲーションされた二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて、複数の一本鎖核酸を得ることができる。第２アダプターを一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし得る。
【００８４】
一実施形態による別の例示的な方法は図３に概説されており、ビーズに付着されたアダプターを使用して、核酸のライブラリーを調製し得る。いくつかのこのような実施形態では、一本鎖リガーゼを使用して、第１アダプターを脱リン酸化標的の３’末端にライゲーションする。ライゲーション第１アダプターを、ビーズに付着されたキャプチャープローブにハイブリダイズさせ得る。キャプチャープローブを伸長させ得、第２アダプターを伸長キャプチャープローブにライゲーションし得る。ビーズから洗浄することにより、非ライゲーション一本鎖アダプターを除去し得る。核酸のライブラリーを調製するためのいくつかの実施形態であって、ビーズに付着されたアダプターの使用を含むいくつかの実施形態は、インデックスを核酸ライブラリーに付加するために有用である。例えば、第１インデックスを含む第１アダプターをビーズに付着させ得、第２インデックスおよびキャプチャープローブを含む第２アダプターを第１アダプターにライゲーションし得る。キャプチャープローブにハイブリダイズさせた標的核酸を伸長させて、第１および第２インデックスを組み込み得る。
【００８５】
一実施形態による別の例示的な方法は図４Ａに概説されており、第１および第２アダプターを含むリンカーを使用して、一本鎖環状核酸のライブラリーを調製し得る。いくつかのこのような実施形態では、環状核酸の切断可能部位の切断が、一方の末端に第１アダプターと、線状核酸の他方の末端に第２アダプターとを有する線状核酸をもたらし得るように、リンカーは、第１アダプターと第２アダプターとの間に切断可能部位を含み得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、アダプター配列中のプライマー部位を使用して、核酸のライブラリーを増幅し得る。いくつかの実施形態では、その後の増幅工程の効率は、プライマーダイマーの形成により減少され得る。その後の増幅工程の効率を増加させるために、ライゲーション産物から非ライゲーション一本鎖アダプターを除去し得る。図５に概説されており、本明細書にさらに記載される例は、キャプチャープローブとのハイブリダイゼーションによる非ライゲーション一本鎖第１アダプターの除去を含む。図６に概説されており、本明細書にさらに記載される別の例は、５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼおよび５’デアデニラーゼを使用した消化による非ライゲーション一本鎖第１アダプターの除去を含む。
一本鎖ライブラリーの調製
【００８７】
本明細書で提供されるシステム、方法および組成物のいくつかの実施形態は、アダプターを標的核酸にライゲーションする方法を含む。本明細書で提供される核酸ライブラリーを調製するための本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、有利には、単一反応体積で実施され得る。
【００８８】
アダプターは、一本鎖核酸などの核酸を含む。アダプターは、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド未満であるか、それらを超えるか、もしくはそれらに等しいか、または前述のサイズのいずれか２つの間の範囲である長さを有する短い核酸を含み得る。アダプターは、シーケンシングプライマー結合部位、増幅プライマー結合部位および／またはインデックスを含み得る。例えば、アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列またはそれらの相補体を含み得る。インデックスは、核酸分子の供給源を同定するために有用であり得る。本明細書で提供される実施形態で有用なインデックスの使用および調製の例は、国際公開第２０１２／０６１８３２号および国際公開第２０１４／１４２８５０号；ならびに米国特許第９０７４２５１号、米国特許８８２９１７１号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。いくつかの実施形態では、例えば一方または両方の末端におけるアダプターの伸長を防止する保護基の付加により、コンカテマーの形成を防止するようにアダプターを改変し得る。保護基は、ワークフローのその後の工程中にそれが付着される化合物の反応を阻止する任意の化学部分、例えば、リガーゼによるアダプターの活性化、リン酸との反応および自己反応を阻止する部分である。３’保護基の例としては、３’スペーサーＣ３、ジデオキシヌクレオチド、および基体への付着が挙げられる。３’保護基のさらなる例としては、１つまたはそれを超えるヒドロキシル基、チオール、アジドまたはアルキンで必要に応じて置換されたアルキルが挙げられる。いくつかの態様では、保護基は、その後の操作、例えば濃縮、精製、さらなる官能化などに有用な官能性を提供し得る。５’保護基の例としては、脱リン酸化５’ヌクレオチド、および基体への付着（例えば、保護基が、リンカーを介して必要に応じて付着された基体である場合）が挙げられる。
【００８９】
標的核酸は、一本鎖核酸および二本鎖核酸を含む。二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて一本鎖核酸を形成する方法は当技術分野で周知であり、熱的または化学的方法が挙げられる。標的核酸の例としては、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ；ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｓＲＮＡもしくはｒＲＮＡ；またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドが挙げられる。核酸は、ホスホジエステル結合を含有し得、例えば、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダイトおよびペプチド核酸骨格および結合を含む他の種類の骨格を含み得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンならびに塩基アナログ、例えば（３−ニトロピロールを含む）ニトロピロールおよび（５−ニトロインドールを含む）ニトロインドールなどを含む塩基の任意の組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの非特異的塩基を含み得る。非特異的塩基は、１つを超える異なる種類の塩基と塩基対形成し得、例えば、ゲノムＤＮＡサンプルなどの複合体核酸サンプルにおけるランダムハイブリダイゼーションに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはインサートに含める場合に有用であり得る。非特異的塩基の例としては、アデニン、チミンまたはシトシンと塩基対形成し得るイノシンが挙げられる。他の例としては、ヒポキサンチン、５−ニトロインドール、アシル化５−ニトロインドール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロイミダゾールおよび３−ニトロピロールが挙げられる。少なくとも２つ、３つ、４つまたはそれを超える種類の塩基と塩基対形成し得る非特異的塩基が使用され得る。
【００９０】
標的核酸は、サンプル中の二本鎖核酸の平均サイズが約２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ未満であるか、それらを超えるか、もしくはそれらに等しいか、または前述のサイズのいずれか２つの間の範囲であるサンプルを含み得る。いくつかの実施形態では、サンプル中の一本鎖核酸の平均サイズは、約２０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド未満であるか、それらを超えるか、もしくはそれらに等しいか、または前述のサイズのいずれか２つの間の範囲である。サンプルは、約５０μｇ、１０μｇ、５μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、４００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ未満であるか、それらを超えるか、もしくはそれらに等しいか、または前述の量のいずれか２つの間の範囲である量の標的核酸を含み得る。標的核酸は、低品質核酸供給源、例えば分解サンプル、例えば固定サンプルおよび古代サンプルから得られ得る。固定サンプルの例としては、化合物、例えばホルマリン、グルタルアルデヒド、アルコール、オスミン酸およびパラホルムアルデヒドで固定されたものが挙げられる。固定サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルを含み得る。古代サンプルは、約５年、１０年、２０年、５０年、１００年、５００年、１０００年を超えるか、または前述の年のいずれか２つの間の範囲である年を有するものを含み得る。
【００９１】
核酸、例えば核酸の５’ヌクレオチドを脱リン酸化する方法は、核酸をホスファターゼと接触させることを含む。ホスファターゼの例としては、子ウシ腸ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、南極ホスファターゼおよびＡＰＥＸアルカリホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。
【００９２】
一本鎖核酸をライゲーションする方法は、一本鎖核酸をリガーゼと接触させることを含む。一本鎖リガーゼの例としては、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、メタノバクテリウムＲＮＡリガーゼおよびＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）が挙げられる。２つの核酸を一緒にライゲーションする方法は、体積排除剤の存在下で反応体積によるものであり得る。本明細書で使用される場合、「体積排除剤」は、反応、例えばライゲーション反応が起こり得る有効体積を減少させる薬剤を含み得る。体積排除剤の例としては、ポリマー、例えば不活性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、デキストラン、ヘタスターチおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。本明細書で提供される実施形態で有用なＰＥＧの例としては、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ８０００が挙げられる。反応体積は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％未満であるか、それらを超えるか、もしくはそれらに等しいか、または前述の割合のいずれか２つの間の範囲である濃度、例えば（重量／体積）の体積排除剤を含み得る。
【００９３】
核酸、例えば核酸の５’ヌクレオチドをリン酸化する方法は、核酸をキナーゼと接触させることを含む。キナーゼの例としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが挙げられる。
【００９４】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、単一反応体積で実施され得る。いくつかの実施形態では、核酸を調製する方法は、短縮期間内、例えば約１２時間未満の期間、約６時間未満の期間または約３時間未満の期間内に実施され得る。
【００９５】
一実施形態は図１に示されており、標的二本鎖ＤＮＡ断片を脱リン酸化および変性して標的一本鎖ＤＮＡを形成する。リガーゼ、例えばＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を用いて、リン酸化５’末端、Ｐ７’配列および保護３’末端を含む第１の６４ｂｐアダプターを標的一本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ライゲーションＤＮＡを形成する。キナーゼ、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ライゲーションＤＮＡの５’末端をリン酸化する。Ｐ５配列を含む第２の６０ｂｐアダプターをリン酸化ライゲーションＤＮＡの５’にライゲーションして、ＤＮＡライブラリーのメンバー（５’−Ｐ５−ｓｓＤＮＡインサート−Ｐ７−３’）を形成する。例示的なプライマー配列は、Ｐ５プライマー配列（配列番号０１：ａａｔｇａｔａｃｇｇｃｇａｃｃａｃｃｇａ）；Ｐ５’プライマー配列（配列番号０２：ｔｃｇｇｔｇｇｔｃｇｃｃｇｔａｔｃａｔｔ）；Ｐ７プライマー配列（配列番号０３：ｃａａｇｃａｇａａｇａｃｇｇｃａｔａｃｇａ）；およびＰ７’プライマー配列（配列番号０４：ｔｃｇｔａｔｇｃｃｇｔｃｔｔｃｔｇｃｔｔｇ）を含み得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、核酸のライブラリーを調製する方法は、標的一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化して、その後のライゲーション工程におけるコンカテマーの形成を防止すること；一本鎖リガーゼを使用して、第１アダプターを脱リン酸化標的の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は保護されている）；ライゲーション標的の５’末端の再リン酸化すること；一本鎖リガーゼを使用して、第２アダプターを脱リン酸化標的の５’末端にライゲーションし（ここで、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含み得る。いくつかの実施形態では、第２アダプターは基体に付着されている。いくつかの実施形態では、基体はビーズを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態は、第２アダプターを脱リン酸化標的の５’末端にライゲーションする前に、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、非ライゲーション一本鎖第１アダプターをキャプチャープローブにハイブリダイズさせ得る。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、キャプチャープローブへのハイブリダイゼーションは、一本鎖第２アダプターへの非ライゲーション第１アダプターのライゲーションを阻害する。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブの３’末端は保護基を含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブの５’末端は保護基を含む。いくつかの実施形態では、消化により、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去し得る。いくつかの実施形態では、非ライゲーション一本鎖第１アダプターの消化は、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼと接触させ、５’デアデニラーゼとも必要に応じて接触させることを含む。
【００９８】
別の実施形態は図２に示されており、５’エキソヌクレアーゼを用いて二本鎖標的核酸を部分的に消化して、一本鎖３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を形成する。リガーゼ、例えばＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）を用いて、リン酸化５’末端、Ｐ７’配列および保護３’末端を含む第１の６４ｂｐアダプターを標的二本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ライゲーションＤＮＡを形成する。ライゲーションＤＮＡを脱ハイブリダイズさせて、一本鎖核酸を形成する。Ｐ５配列を含む第２の６０ｂｐアダプターをリン酸化ライゲーションＤＮＡの５’にライゲーションして、ＤＮＡライブラリーのメンバー（５’−Ｐ５−ｓｓＤＮＡインサート−Ｐ７−３’）を形成する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、核酸のライブラリーを調製する方法は、標的二本鎖核酸を５’エキソヌクレアーゼと接触させて、一本鎖３’オーバーハングを有する複数の改変二本鎖核酸を得ること；リガーゼおよび体積排除剤の存在下で、第１アダプターを改変二本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；第１アダプターにライゲーションされた改変二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて、複数の一本鎖核酸を得ること；リガーゼの存在下で、第２アダプターを一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含み得る。
【０１００】
一実施形態は図３に示されており、アルカリホスファターゼを用いて標的一本鎖ＤＮＡを脱リン酸化する。リガーゼ、例えばＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）を用いて、リン酸化５’末端、Ｐ５’配列および保護３’末端を含む第１アダプターを標的一本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ライゲーションＤＮＡを形成する。第１アダプターを介してライゲーションＤＮＡを、Ｐ５配列を含有するキャプチャープローブにハイブリダイズさせ、ビーズに付着させる。キャプチャープローブを伸長させて伸長ＤＮＡを形成し、伸長ＤＮＡからライゲーションＤＮＡを除去する。リガーゼ、例えばＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）を用いて、リン酸化５’末端、Ｐ７’配列および保護３’末端を含む第２アダプターを伸長ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ビーズに付着されたＤＮＡライブラリーのメンバー（Ｐ５−インサート’−Ｐ７’）を形成する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、核酸のライブラリーを調製する方法は、標的一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；リガーゼおよび体積排除剤の存在下で、第１アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；ライゲーション第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせること；キャプチャープローブを伸長させること、およびリガーゼの存在下で、第２アダプターを伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションし（ここで、第２アダプターの３’末端は保護基を含む）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含み得る。いくつかの実施形態はまた、伸長キャプチャープローブからハイブリダイズライゲーション第１アダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは基体に付着されている。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブを有する基体は、フローセル、ビーズ、ガラス、制御細孔ガラス、プラスチック、シリコン、溶融シリカ、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、シリコン誘導体、ヒ化ガリウム、リン化インジウム、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、石英、樹脂またはポリマーもしくはコポリマー（例えば、ポリスチレン）である。基体は、複数の材料の層または材料の混合物から構成され得る。基体は、剛性または半剛性のものであり得る。基体は、板状、丸状またはテクスチャード加工のものであり得る。いくつかの実施形態では、基体は、その上にコーティングされた１つまたはそれを超えるポリマー材料を有する剛性材料、例えばガラスおよび／またはシリカ誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、基体はビーズを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブはキャプチャープローブインデックスを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブインデックスは、キャプチャープローブの供給源を示すものである。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは切断可能リンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、切断可能リンカーを切断することを含む。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブを基体、例えばフローセルに付着させ（図２６を参照のこと）、次いで、基体上で伸長を行う。基体がフローセルである場合、得られたライブラリーを直接配列決定し得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、例えば図２６に示されているように、相補的プライマーを伸長キャプチャープローブにハイブリダイズさせること、３’保護基を含有するＰ７’アダプターを伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションすること、および相補的プライマーを脱ハイブリダイズさせることをさらに含む。
【０１０２】
一実施形態は図４Ａに示されており、標的二本鎖ＤＮＡ断片を脱リン酸化し、変性させて標的一本鎖ＤＮＡを形成する。５’から３’にリン酸化５’末端、Ｐ７’配列、切断可能部位（「Ｕ」）、Ｐ５配列および保護３’末端（「Ｒ」）を含むアダプターを提供する。リガーゼを用いて、アダプターを標的一本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ライゲーションＤＮＡを形成する。キナーゼを用いて、ライゲーションＤＮＡの５’末端をリン酸化する。ライゲーションＤＮＡの保護３’末端を脱保護し、リガーゼによるライゲーションによりライゲーションＤＮＡを環状化して、環状一本鎖ＤＮＡを含むライブラリーのメンバーを形成する。いくつかの実施形態では、様々な技術のいずれか１つにより、環状核酸を使用して、一本鎖核酸を生成し得る。いくつかの例示的な実施形態は図４Ｂに示されており、ウラシル残基を含み得る切断可能部位を切断することにより、環状核酸を線状化し得る。また、アダプター内のプライマー部位を使用した増幅、例えばＰＣＲにより、環状核酸を使用して、一本鎖核酸を生成し得る。また、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により、環状核酸を増幅し得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、核酸のライブラリーを調製する方法は、標的一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；リンカーを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、リンカーは第１アダプターおよび第２アダプターを含み、リンカーの３’末端は保護基を含む）；ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；リン酸化核酸の３’末端を脱保護すること、およびライゲーションにより脱保護核酸を環状化し、それにより、環状核酸のライブラリーを得ることを含み得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、リンカーは、第１アダプターと第２アダプターとの間に切断可能部位を含む。いくつかのこのような実施形態では、環状核酸の切断可能部位の切断は、一方の末端に第１アダプターと、線状核酸の他方の末端に第２アダプターとを有する線状核酸をもたらし得る。いくつかの実施形態では、切断可能部位としては、制限部位、少なくとも１つのウラシル残基を含む部位、ならびに非定型塩基、例えば８−オキソグアニンおよびジチオール基を含有する部位が挙げられる。いくつかの実施形態は、切断可能部位における切断により、環状核酸を線状化することを含む。切断可能部位の切断の例は、部位をウラシル特異的切除試薬、例えばウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩもしくはそれらの混合物から選択される酵素と接触させること、または部位を制限エンドヌクレアーゼと接触させることを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態はまた、プライマーを第１および第２アダプターにハイブリダイズさせることを含むことにより、環状核酸を増幅することを含む。増幅方法の例としては、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およびクラスタ増幅が挙げられる。いくつかのこのような実施形態では、ＲＣＡによる増幅を溶液中で実施し得るか、または環状一本鎖核酸を表面、例えばフローセルの表面上に捕捉させ、増幅し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、環状核酸を、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼと接触させることを含む。例示的なポリメラーゼとしては、パイロコッカス様プルーフリーディングポリメラーゼ、例えばＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態は、一本鎖核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の一本鎖核酸を得ること；（ｂ）一本鎖核酸をＡＰＥＸアルカリホスファターゼと接触させ、それにより、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；（ｃ）ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）および少なくとも４５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応体積で、第１アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は３’スペーサーＣ３保護基を含む）；（ｄ）ライゲーション一本鎖核酸をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと接触させ、それにより、ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；ならびに（ｅ）リガーゼおよびＰＥＧの存在下で、第２アダプターをリン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし（ここで、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態は、一本鎖核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の二本鎖核酸を得ること；（ｂ）二本鎖核酸を５’エキソヌクレアーゼと接触させて、一本鎖３’オーバーハングを有する複数の改変二本鎖核酸を得ること；（ｃ）ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼおよび少なくとも４５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応体積で、第１アダプターを改変二本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は３’スペーサーＣ３保護基を含む）；（ｄ）第１アダプターにライゲーションされた改変二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて、複数の一本鎖核酸を得ること；および（ｅ）リガーゼおよびＰＥＧの存在下で、第２アダプターを一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし（ここで、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態は、一本鎖核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の一本鎖核酸を得ること；（ｂ）一本鎖核酸をＡＰＥＸアルカリホスファターゼと接触させ、それにより、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；（ｃ）ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼおよび少なくとも４５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応体積で、第１アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は３’スペーサーＣ３保護基を含む）；（ｄ）ライゲーション一本鎖核酸をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと接触させ、それにより、ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；（ｅ）一本鎖第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせることにより、ライゲーション一本鎖核酸から非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去すること（ここで、キャプチャープローブは、３’スペーサーＣ３保護基を含む３’末端、非リン酸化５’末端、および第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む）；ならびに（ｆ）リガーゼおよびＰＥＧの存在下で、第２アダプターをリン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし（ここで、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む方法を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態は、ビーズに付着された核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数の一本鎖核酸を得ること；（ｂ）一本鎖核酸をＡＰＥＸアルカリホスファターゼと接触させ、それにより、一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；（ｃ）ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼおよび少なくとも４５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応体積で、第１アダプターを一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすること（ここで、第１アダプターの３’末端は３’スペーサーＣ３保護基を含む）；（ｄ）ライゲーション第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせること（ここで、キャプチャープローブはビーズに付着されている）；（ｅ）キャプチャープローブを伸長させること；ならびに（ｆ）リガーゼおよびＰＥＧの存在下で、第２アダプターを伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションし（ここで、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない）、それにより、核酸のライブラリーを得ることを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態は、インデックス付き核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）第１インデックスを含む複数の第１一本鎖核酸（ここで、第１一本鎖核酸の５’末端は複数のビーズに付着されている）と、第２インデックスおよびキャプチャープローブを含む複数の第２一本鎖核酸（ここで、第２一本鎖核酸の３’末端は３’スペーサーＣ３保護基を含む）とを得ること；（ｂ）ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼおよび少なくとも４５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応体積で、第１一本鎖核酸の３’末端を第２一本鎖核酸の５’末端にライゲーションすること；（ｃ）標的核酸をキャプチャープローブにハイブリダイズさせること；ならびに（ｄ）標的核酸を伸長させ、それにより、インデックス付き核酸のライブラリーを得ることを含む。
非ライゲーション一本鎖アダプターの除去
【０１１１】
本明細書で提供されるシステム、方法および組成物のいくつかの実施形態は、ライゲーションアダプター、例えば一本鎖核酸にライゲーションされたアダプターから一本鎖非ライゲーションアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションアダプターからの一本鎖非ライゲーションアダプターの除去は、調製される核酸ライブラリーを増幅する（例えば、その後の増幅工程におけるプライマーダイマー形成の可能性または量を減少させる）効率を増加させ得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態は、一本鎖非ライゲーションアダプターを除去するシステムまたは方法を含み、一本鎖非ライゲーションアダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせることを含み得る。一実施形態は図５に示されており、標的二本鎖ＤＮＡ断片を脱リン酸化し、変性させて標的一本鎖ＤＮＡを形成する。リガーゼを用いて、リン酸化５’末端、Ｐ７’配列および保護３’末端を含む第１の６４ｂｐアダプターを標的一本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ライゲーションＤＮＡを形成する。キナーゼ、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ライゲーションＤＮＡの５’末端をリン酸化する。Ｐ７配列を含有するキャプチャープローブへのハイブリダイゼーションにより、ライゲーションＤＮＡから非ライゲーション第１アダプターを除去する。Ｐ５配列を含む第２の６０ｂｐアダプターをリン酸化ライゲーションＤＮＡの５’にライゲーションして、ＤＮＡライブラリーのメンバー（５’−Ｐ５−ｓｓＤＮＡインサート−Ｐ７−３’）を形成する。いくつかのこのような実施形態では、キャプチャープローブへのハイブリダイゼーションは、一本鎖第２アダプターへの非ライゲーション第１アダプターのライゲーションを阻害し得る。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、一本鎖非ライゲーションアダプターの少なくとも一部の相補体を含み得る。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、コンカテマーの形成を防止するために３’および／または５’保護基を含み得る。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、基体、例えばビーズに付着され得る。
【０１１３】
一本鎖非ライゲーションアダプターを除去するいくつかの実施形態は、一本鎖非ライゲーションアダプターを消化することを含み得る。いくつかのこのような実施形態は、一本鎖非ライゲーションアダプターをヌクレアーゼ、例えば５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼ、例えばＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と接触させることを含み得る。一実施形態は図６に示されており、標的二本鎖ＤＮＡ断片を脱リン酸化し、変性させて標的一本鎖ＤＮＡを形成する。リガーゼを用いて、リン酸化５’末端、Ｐ７’配列および保護３’末端を含む第１の６４ｂｐアダプターを標的一本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションして、ライゲーションＤＮＡを形成する。５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼおよび５’デアデニラーゼによる消化により、非ライゲーション第１アダプターを除去する。キナーゼ、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ライゲーションＤＮＡの５’末端をリン酸化する。Ｐ５配列を含む第２の６０ｂｐアダプターをリン酸化ライゲーションＤＮＡの５’にライゲーションして、ＤＮＡライブラリーのメンバー（５’−Ｐ５−ｓｓＤＮＡインサート−Ｐ７−３’）を形成する。
【０１１４】
一本鎖非ライゲーションアダプターを除去するいくつかの実施形態は、ビーズの使用を含み得る。有利には、ビーズの使用は、ビーズからの反応物の成分と、ビーズに付着された成分とを洗浄することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１アダプターを脱リン酸化一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし得る。第１アダプターは３’保護基を含み得、標的配列を含み得る。標的配列を、基体に付着されたキャプチャープローブにハイブリダイズさせ得る。いくつかの実施形態では、基体はビーズを含み得る。キャプチャープローブは、シーケンシングプライマー部位、インデックスおよび増幅プライマー部位を含み得る。基体およびハイブリダイズライゲーション一本鎖核酸から一本鎖非ライゲーションアダプターを洗浄し得る。キャプチャープローブを伸長させ得る。いくつかの実施形態では、伸長キャプチャープローブからハイブリダイズライゲーション一本鎖核酸を除去し得る。第２アダプターを伸長キャプチャープローブの５’末端にライゲーションし得る。いくつかの実施形態では、第２アダプターは、３’末端に保護基を含む。第２アダプターは、シーケンシングプライマー部位、インデックスおよび増幅プライマー部位を含み得る。
インデックス付きライブラリーの調製
【０１１５】
本明細書で提供されるシステム、方法および組成物のいくつかの実施形態は、インデックス付き核酸ライブラリーを調製する方法を含む。アダプターおよび／またはキャプチャープローブは、インデックスを含み得る。本明細書で提供される実施形態で有用なインデックスの使用および調製の例は、国際公開第２０１２／０６１８３２号および国際公開第２０１４／１４２８５０号；ならびに米国特許第９０７４２５１号、米国特許第８８２９１７１号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションにより、インデックスを標的核酸に組み込み得る。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブ、アダプターまたは標的核酸の伸長により、インデックスを核酸に組み込み得る。したがって、本明細書で提供される方法により、インデックス付きライブラリーを容易に調製し得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、キャプチャープローブの集団を調製し得る。いくつかの実施形態では、第１アダプターを第２アダプターにライゲーションすることにより、キャプチャープローブを調製し得る。アダプターはそれぞれ、インデックスを含み得る。第１アダプターは、基体、例えばビーズに付着させ得る。第２アダプターは、ハイブリダイゼーションプローブを含み得る。ハイブリダイゼーションプローブは、標的一本鎖核酸にハイブリダイズし得る。標的一本鎖核酸をハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズさせ、伸長させ、それにより、アダプターの１つまたはそれよりも多くのインデックスに相補的な配列を組み込み得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態は、第１インデックスを含む複数の第１アダプター（ここで、第１アダプターの５’末端は５’保護基を含む）と、第２インデックスおよびキャプチャープローブを含む複数の第２アダプター（ここで、第２アダプターの３’末端は３’保護基を含む）とを得ることを含み得る。いくつかの実施形態はまた、リガーゼの存在下で、第１一本鎖核酸の３’末端を第２一本鎖核酸の５’末端にライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸をキャプチャープローブにハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を伸長させ、それにより、インデックス付き核酸のライブラリーを得ることを含む。いくつかの実施形態はまた、伸長標的核酸を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、５’保護基は、脱リン酸化ヌクレオチド、または基体への付着を含む。いくつかの実施形態では、基体は複数のビーズを含む。
キット、反応容器、フローセル
【０１１８】
本明細書で提供されるシステムおよび方法の実施形態は、核酸、例えば一本鎖核酸および／または二本鎖核酸へのアダプターのライゲーションにより、核酸ライブラリーを調製するために有用な構成要素のいずれか１つまたはそれよりも多くを含有するキット、反応容器およびフローセルを含む。例示的な構成要素としては、第１アダプター（ここで、第１アダプターの３’末端は保護基を含む）、リガーゼ、体積排除剤、脱リン酸化剤、第２アダプター（ここで、第２アダプターの５’末端は保護基を含む）、シーケンシングプライマー、増幅プライマー、インデックスを含む核酸、および５’エキソヌクレアーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で提供される任意の方法のための試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは反応容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、反応容器を含むフローセルを含み得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態は、本明細書で提供される方法を実施し得る反応体積を含む反応容器を含む。いくつかのこのような実施形態では、反応容器は、本明細書で提供される方法の任意の段階または工程の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、反応容器は、複数の核酸、例えば一本鎖核酸および／または二本鎖核酸；第１アダプター（ここで、第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；リガーゼ；ならびに体積排除剤を含み得る。いくつかの実施形態では、反応容器はまた、第２アダプターを含み得る。いくつかの実施形態では、反応容器はまた、脱リン酸化剤を含み得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、反応容器は反応体積を含み得る。いくつかの実施形態では、反応体積は、複数の核酸、例えば一本鎖核酸および／または二本鎖核酸；第１アダプター（ここで、第１アダプターの３’末端は保護基を含む）；第２アダプター；脱リン酸化剤；リガーゼ；ならびに体積排除剤を含み得る。いくつかの実施形態では、反応体積は、第１インデックスを含む複数の第１一本鎖核酸（ここで、第１一本鎖核酸の５’末端は５’保護基を含む）；第２インデックスおよびキャプチャープローブを含む複数の第２一本鎖核酸（ここで、第２一本鎖核酸の３’末端は３’保護基を含む）；ならびにリガーゼを含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、第１アダプターを複数の一本鎖核酸の３’末端にライゲーションし、それにより、複数の改変一本鎖核酸を形成する。いくつかの実施形態では、非ライゲーション第１アダプターをキャプチャープローブにハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態では、キャプチャープローブは、第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、第２アダプターの５’末端はリン酸化されていない。いくつかの実施形態では、第２アダプターを複数の改変一本鎖核酸の５’末端にライゲーションする。いくつかの実施形態では、脱リン酸化剤はホスファターゼを含む。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは不活性化されている。ホスファターゼの例としては、子ウシ腸ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、南極ホスファターゼおよびＡＰＥＸアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、第１アダプターおよび／または第２アダプターは、シーケンシングプライマー結合部位を含み得る。シーケンシング結合部位の例としては、Ｐ７配列、その相補体またはその逆相補体；およびＰ５配列、その相補体またはその逆相補体が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、第１アダプターおよび／または第２アダプターは、アダプターインデックスを含み得る。いくつかの実施形態では、第１アダプターインデックスは、第２アダプターインデックスと異なるものである。いくつかの実施形態では、アダプターインデックスは、複数の一本鎖核酸の供給源を示すものである。
【０１２５】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、第１インデックスを含む複数の第１一本鎖核酸（ここで、第１一本鎖核酸の５’末端は５’保護基を含む）；第２インデックスおよびキャプチャープローブを含む複数の第２一本鎖核酸（ここで、第２一本鎖核酸の３’末端は３’保護基を含む）；ならびにリガーゼを含む反応体積を含む反応容器を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、保護基は、３’スペーサーＣ３、ジデオキシヌクレオチドまたはリン酸基を含む。いくつかの実施形態では、保護基は、基体への付着を含み得る。基体の例としては、ビーズが挙げられる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、体積排除剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される。本明細書で提供される実施形態で有用なＰＥＧの例としては、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ８０００が挙げられる。反応体積は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％未満であるか、それらを超えるか、もしくはそれらに等しいか、または前述の割合のいずれか２つの間の範囲である濃度、例えば（重量／体積）の体積排除剤を含み得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、リガーゼは一本鎖核酸リガーゼを含む。一本鎖核酸リガーゼの例としては、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、メタノバクテリウムＲＮＡリガーゼおよびＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ）が挙げられる。
【０１２９】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書で提供される反応容器を含むフローセルを含む。いくつかの実施形態は、本明細書で提供される反応容器と、シーケンシングデータを得るための検出器とを含むシステムを含む。
【０１３０】
フローセルは、１つまたはそれを超える流体試薬が流れ得る表面を有するチャンバーを含み得る。一般に、フローセルは、流体の流れを促進するための入口開口部および出口開口部を有するであろう。本開示の方法において容易に使用され得るフローセルおよび関連流体システムおよび検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号；米国特許第７，０５７，０２６号；国際公開第９１／０６６７８号；国際公開第０７１１２３７４４号；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，４０５，２８１号および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【実施例】
【０１３１】
実施例１−一本鎖標的核酸へのアダプターのライゲーション
標的核酸として一本鎖ＤＮＡを使用して、４段階一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリー調製方法を実施した。図１は、標的核酸の５’脱リン酸化；標的核酸の３’末端への３’アダプターのライゲーション（ここで、３’アダプターの３’末端は、自己コンカテマー化を阻害するために保護されている）；ライゲーション標的核酸の５’脱リン酸化の再リン酸化；およびライゲーション標的核酸の５’末端への５’アダプターのライゲーション（ここで、５’アダプターの５’末端は、自己コンカテマー化を阻害するために保護されている）を含む４つの工程の概要を提供する。
【０１３２】
脱リン酸化工程を調べるために、２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む反応体積で、アルカリホスファターゼのＡＰＥＸホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、６０ｍｅｒ一本鎖核酸（３’ＯＨ−６０−Ｐｈｏｓ５’）の５’末端を脱リン酸化した。一本鎖リガーゼのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）リガーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して５’脱リン酸化の程度をアッセイして、脱リン酸化産物がコンカテマーを形成しなかったことを確認した。図７に示されているように、アルカリホスファターゼの脱リン酸化効率は約１００％であった。
【０１３３】
第１ライゲーション工程を調べるために、２５％ＰＥＧを含有する反応体積でＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを使用して、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を脱リン酸化６０ｍｅｒ一本鎖核酸（３’ＯＨ−６０−ＯＨ５’）の３’末端にライゲーションした。Ｐ７’アダプターの３’末端を保護して、自己コンカテマー化を阻害した。図８に示されているように、このライゲーション工程（レーン２）の収率は９７．５％であると決定された。
【０１３４】
キナーゼ工程を調べるために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用して、３’保護基を有するライゲーション６４ｍｅｒアダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−６０−ＯＨ）を含有する１２４ｍｅｒ脱リン酸化一本鎖核酸の５’末端を再脱リン酸化した。図９に示されているように、再リン酸化は約９９％の収率を有すると決定された。
【０１３５】
第２ライゲーション工程を調べるために、１．６％ＰＥＧを含有する反応体積でＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを使用して、非リン酸化５’末端（５’Ｐ５−ＯＨ）を有する６０ｍｅｒＰ５アダプターを１２４ｍｅｒ一本鎖核酸（３’Ｃ３−６０−Ｂ２−Ｐｈｏｓ）の５’末端にライゲーションした。１２４ｍｅｒ一本鎖核酸は、３’保護基を有するライゲーション６４ｍｅｒアダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を含んでいた。図１０に示されているように、このライゲーション工程（レーン２）の収率は＞８５％であると決定された。したがって、４段階ｓｓＤＮＡライブラリー調製アプローチの全体的な収率は＞８０％であった。
実施例２−無細胞標的核酸へのアダプターのライゲーション
【０１３６】
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用して、図１に概説されているスキームを実施した。ＡＰＥＸアルカリホスファターゼを使用して二本鎖標的核酸を脱リン酸化し、脱ハイブリダイズさせて、一本鎖標的核酸を形成した。第１ライゲーション工程を調べるために、２２．５％ＰＥＧを含有する反応体積でＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを３時間使用して、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を一本鎖脱リン酸化無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の３’末端にライゲーションした。図１１に示されているように、このライゲーション工程（レーン２）の収率は９５％超であると決定された。
【０１３７】
キナーゼ工程を調べるために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて脱リン酸化ｃｆＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ［Ａｐｅｘ］）を処理し、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を再リン酸化ｃｆＤＮＡの３’末端にライゲーションした。１１．２５％ＰＥＧを含有する体積で、反応を１時間実施した（図１２）。
【０１３８】
第２ライゲーション工程を調べるために、３’保護基を含有する６４ｍｅｒＰ７’アダプター（３’Ｃ３−Ｐ７−ｐｈｏｓ５’）を脱リン酸化ｃｆＤＮＡの３’末端にライゲーションし、キナーゼ（ＰＮＫ）を用いて、得られた第１ライゲーション産物（３’Ｃ３−Ｐ７−ｃｆＤＮＡ−ｐｈｏｓ５’）を処理し、非リン酸化５’末端（５’Ｐ５−ＯＨ）を有する６０ｍｅｒＰ５アダプターを第１ライゲーション産物の５’末端にライゲーションして、第２ライゲーション産物（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）を形成した。３．８％ＰＥＧを含有する反応体積でＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを使用して、反応を実施した。図１３は、ライゲーション産物（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）および（Ｐ７’−Ｐ５）を示す。
実施例３−ライゲーション産物の分析
【０１３９】
実施例２のライゲーション産物をゲル上で分離し、ライゲーション産物のバンドをゲルから抽出し、抽出したライゲーション産物を増幅し、キャピラリー電気泳動（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して増幅産物を分離した。
【０１４０】
ライゲーション産物をゲル上で分離し、バンドＢの抽出物Ｂ１および抽出物Ｂ２をゲルから切り取った。図１４に示されているように、レーン「参照」では、抽出物Ｂ１は２つの黒枠によりマークされており、抽出物Ｂ２は１つの白枠によりマークされている。ＰＣＲ  Ｐ７プライマーに対して１：４０〜１：２０の比で非ＰＣＲ（増幅不能）Ｐ７プライマーを含むＰＣＲにより、２４サイクルで抽出物を増幅した。サンプルに対して２：１の比で固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）ビーズを使用して、ＰＣＲ産物を抽出した。結果は、図１４に示されている。
【０１４１】
キャピラリー電気泳動（ＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ）により、抽出物Ｂ１およびＢ２の増幅産物をさらに分析した。図１５に示されているように、抽出物Ｂ２は主に１２７ｂｐ（Ｐ７’−Ｐ５）種を含有しており、抽出物Ｂ１は、２９２ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）種および４８０ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）種を含んでいた。
【０１４２】
ゲル抽出物を精製するために使用したＳＰＲＩビーズの量を変化させて、プライマーダイマーを除去するために有効な比を決定した（図１６）。１．２：１のＳＰＲＩビーズ：サンプル（ｖ：ｖ）がプライマーダイマーの除去に最も有効であり、ｃｆＤＮＡライブラリーの大部分が喪失しなかった。
実施例４−非ライゲーションＰ７’プライマーの捕捉
【０１４３】
図５に概説されているスキームを使用して、過剰な非ライゲーションＰ７’プライマーを除去した。簡潔に言えば、標的核酸の３’末端へのＰ７’アダプタープライマーのライゲーション後、Ｐ７’アダプタープライマーに相補的なＰ７プライマーを反応体積に追加した。Ｐ７プライマーは、その５’および３’末端に保護基を含んでいた。Ｐ７プライマーの追加後、Ｐ５アダプターを再リン酸化ライゲーション標的核酸の５’末端にライゲーションした。
【０１４４】
２５％ＰＥＧを含有する反応体積で、６３ｍｅｒＰ７’プライマー（３’Ｃ３−Ｐ７’ｐｈｏｓ５’）をｃｆＤＮＡの３’末端にライゲーションした。図１７に示されているように、ライゲーション産物の収率は＞９５％であった。キャプチャープローブの存在下におけるライゲーションを調べるために、５’保護基および３’保護基を含有する６３ｍｅｒＰ７キャプチャープローブ（３’Ｃ３−Ｐ７−Ｃ３５’）の存在下で、非リン酸化５’末端（５’Ｐ５−ＯＨ）を有する６０ｍｅｒＰ５アダプターを第１ライゲーション産物（３’Ｃ３−Ｐ７’ｃｆＤＮＡ−ｐｈｏｓ５’）の５’末端にライゲーションした。６．５％ＰＥＧを含有する反応体積で、反応を実施した。図１８は、ライゲーション産物（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）および（Ｐ７’−Ｐ５）を示す。
【０１４５】
ライゲーション産物をさらに分析した。図１９に示されているように、ライゲーション産物をゲル上でサイズごとに分離し、特定のバンドをゲルから抽出し、抽出物Ｂ１および抽出物Ｂ２を増幅した。キャピラリー電気泳動により増幅産物を分析したところ、１２７ｂｐ（Ｐ７’−Ｐ５）種、２９２ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）種および４８０ｂｐ（Ｐ７’−ｃｆＤＮＡ−Ｐ５）種を含んでいた。図２０は、増幅前、増幅後、およびＳＰＲＩビーズによる抽出後のライゲーション産物のゲルを示す。
【０１４６】
非ＰＣＲ  Ｐ７を組み込んで過剰なＰ７’を捕捉することにより、プライマーダイマーの形成を有意に減少させた。加えて、１．２×ＳＰＲＩを使用した除去により、ｃｆＤＮＡライブラリーの有意な喪失を伴わずに、プライマーダイマーを有意に減少させた。
実施例５−ビーズにコンジュゲートされた一本鎖核酸のライゲーション
【０１４７】
様々なＰＥＧ濃度における２つのオリゴマー（オリゴ１およびオリゴ２）間のライゲーションの効率を調べた。オリゴ１は保護３’末端（ＯＨ）を含んでおり、オリゴ２は保護５’末端（ｐｈｏｓ）を含んでいたので、ライゲーションは、単一のライゲーションオリゴ１−オリゴ２産物をもたらした。反応条件は、それぞれ０、１９、３８および４５％ＰＥＧを含む２０μＬの最終反応体積で、１０ｐｍｏｌの各オリゴ＋２μＬの１０×バッファー＋１μＬの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬの５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（１００Ｕ／μＬ）＋１５μＬの０、２５、５０または６０％ＰＥＧを含んでいた。結果は、図２１に示されている。４５％ＰＥＧを含有する反応体積は、ライゲーションされたオリゴ１およびオリゴ２の５５．９％の収率を提供した。
【０１４８】
様々なオリゴ２濃度におけるオリゴ１とオリゴ２との間のライゲーションの効率を調べた。反応条件は、１０ｐｍｏｌのオリゴ１＋１０×ｐｍｏｌのオリゴ２＋２μＬの１０×バッファー＋１μＬの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬの５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（１００Ｕ／μＬ）＋１５μＬの６０％ＰＥＧを含んでおり、４５％ＰＥＧを含む２０μＬの最終反応体積を提供した。結果は、図２２に示されている。４倍過剰なオリゴ２および＋２×ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを含有する反応体積は、ライゲーションされたオリゴ１およびオリゴ２の７９．６％の収率を提供した。
【０１４９】
様々なＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ濃度におけるオリゴ１とオリゴ２との間のライゲーションの効率を調べた。反応条件は、１０ｐｍｏｌの各オリゴ＋２μＬの１０×バッファー＋１μＬの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬの５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ＸμＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（１００Ｕ／μＬ）＋１５μＬの６０％ＰＥＧを含んでおり、４５％ＰＥＧを含む２０μＬの最終反応体積を提供した。結果は、図２３に示されている。８倍濃度のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを含有する反応体積は、ライゲーションされたオリゴ１およびオリゴ２の７５．３％の収率を提供した。
【０１５０】
ヒドラジン−アルデヒドカップリングを介して、オリゴ１をビーズにコンジュゲートした。３９ｍｅｒオリゴ１は２つのウラシル塩基を含んでおり、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用してこれを切断して、より短い２７ｍｅｒオリゴ（オリゴ１＊）を生産し得る。
【０１５１】
ライゲーション反応において、ビーズにコンジュゲートされた様々な濃度のオリゴ１を調べた。ＵＤＧによるその後の処理により、コンジュゲートオリゴ１へのオリゴ２のライゲーションを分析した。ライゲーション反応条件では、ビーズ付着に使用されるオリゴ１の量がビーズ上のオリゴ１の量に等しいと想定した。４つの濃度の全オリゴ１インプットを試験した：０．５ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌおよび４ｎｍｏｌ。全ビーズ溶液の１０％を使用したので、各反応物中のオリゴ１量は、０．１ｎｍｏｌ、０．２ｎｍｏｌ、０．３ｎｍｏｌおよび０．４ｎｍｏｌに等しいと想定された。反応混合物：１０μＬのビーズ溶液（２倍濃縮）、オリゴ２（０．４ｎｍｏｌ）、２μＬの１０×バッファー、１μＬの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬの５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（１００Ｕ／μＬ）＋５μＬの９０％ＰＥＧは、２２．５％ＰＥＧを含む２０μＬの最終反応体積を提供する。反応物を６０℃で３時間インキュベートし、８０℃で１０分間不活性化した。反応物中のオリゴ１：オリゴ２比：０．０５ｎｍｏｌ（１：８）；０．１ｎｍｏｌ（１：４）、０．２ｎｍｏｌ（１：２）、０．４ｎｍｏｌ（１：１）。最終反応体積１０μＬで１０μＬのＬＭＸ１を用いてウラシル切断を実施し、３７℃で１時間インキュベートした。結果は、図２４に示されている。１：１のオリゴ１：オリゴ２比を含有する反応体積は、ライゲーションされたオリゴ１およびオリゴ２の８５．２％の収率を提供した。４５％ＰＥＧを有する最終反応体積について、アッセイを繰り返した。結果は、図２５に示されている。１：１のオリゴ１：オリゴ２比を含有する反応体積は、ライゲーションされたオリゴ１およびオリゴ２の８４．５％の収率を提供した。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「特徴とする」と同義であり、包括的または非限定的であり、記載されていないさらなるエレメントまたは方法工程を除外しない。
【０１５３】
上記説明は、いくつかの本発明の方法および材料を開示する。本発明は、方法および材料の改変、ならびに製作方法および装置の変更を許容する。本明細書に開示される本発明の本開示または実践の考察から、このような改変は当業者には明白であろう。その結果として、本発明は本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲および趣旨内にあるすべての改変および代替を包含することを意図する。
【０１５４】
限定されないが、公開および非公開出願、特許ならびに参考文献を含む本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、それにより本明細書の一部とされる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲内では、本明細書は、任意のこのような矛盾事項に取って代わり、および／または優先することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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