(57)【要約】  細胞医療のフレキシブルな微調整を可能とする薬剤デリバリープラットフォームが提供される。具体的には、人工機能性融合タンパク質が、高い親和性を有し、かつ、少なくとも１つの薬剤ペイロードを運搬するリガンドに結合されており、該薬剤ペイロードが細胞内に取り込まれることで、該移植細胞を用いた細胞医療の効果を視覚化および制御することが可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．第１の成分と第２の成分とを備えた融合タンパク質からなり、第１成分および第２成分は、ペプチドリンカーにより結合されており、第１成分は非膜タンパク質であり、第２成分は膜アンカーペプチドまたはタンパク質である、移植用の標的細胞上の人工機能性タンパク質と、
ｂ．リンカーに結合し、前記人工機能性タンパク質の少なくとも１つの成分に対する固有の高親和性を有する、少なくとも１つの小リガンドと、
ｃ．前記リンカーに結合し、前記人工機能性タンパク質の少なくとも１つの成分に前記小リガンドが結合した際の前記標的細胞に関連する、少なくとも１つの薬剤ペイロードと、
を備える、細胞医療用の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２】
前記薬剤ペイロードは、イメージング剤である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項３】
前記薬剤ペイロードは、細胞毒性薬である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項４】
前記薬剤ペイロードは、遺伝子発現の修飾物質である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項５】
前記薬剤ペイロードは、細胞活性の修飾物質である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項６】
前記イメージング剤は、蛍光色素ローダミン、フルオレセイン、およびＳ０４５６からなる群から選択される、請求項２に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項７】
前記イメージング剤は、放射性同位体キレート造影部分、ＥＣ  ２０キレートヘッド、ＮＯＴＡ、およびＤＯＴＡからなる群から選択される、請求項２に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項８】
前記細胞毒性薬は、チューブリシン、ＤＭ１、ＤＭ４、およびアウリスタチンからなる群から選択される、請求項３に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項９】
前記修飾物質は、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害薬、およびＰＩ３Ｋ阻害薬からなる群から選択される、請求項４に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１０】
前記修飾物質は、ＨＤＡＣ阻害薬、キナーゼ阻害薬、および代謝阻害薬からなる群から選択される、請求項４に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１１】
前記修飾物質は、ＧＳＫ３ベータ阻害薬、ＭＡＯ−Ｂ阻害薬、およびＣｄｋ５阻害薬からなる群から選択される、請求項４に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１２】
前記修飾物質は、ＲＯＲγｔアゴニストである、請求項４に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１３】
前記薬剤ペイロードは、ｓｉＲＮＡ  ｍｉ１８１ａ１である、請求項４に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１４】
前記薬剤ペイロードは、ＳＨＰ１／２、ＴＣ−ＰＴＰに対する阻害薬を含む、ホスファターゼ阻害薬である、請求項４に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１５】
前記薬剤ペイロードは、前記人工機能性タンパク質の少なくとも１つの成分に前記小リガンドが結合している場合に、前記標的細胞に取り込まれる、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１６】
前記小リガンドと前記薬剤ペイロードとを連結する前記リンカーは、以下に示す群から選択される、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【化１】
2020508042.tif 000037
【請求項１７】
前記人工機能性タンパク質の成分は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、ウロキナーゼ受容体、ＦＫ５０６結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、フルオレセインイソチオシアネート に対する単鎖フラグメント可変成分、および、ジニトロフェノールに対する単鎖フラグメント可変部分からなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項１８】
前記小リガンドは、以下に示す群から選択される、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【化２】
2020508042.tif 000038
2020508042.tif 000039
【請求項１９】
第１成分はＦＫＢＰであり、第２成分は、第１成分にグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを付与するペプチドであり、前記小リガンドは、ＦＫ５０６またはこの誘導体である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２０】
第２成分は、完全長型または短縮型の葉酸受容体である、請求項１９に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。  
【請求項２１】
前記ペプチドリンカーは、ＳＧＧＧＳの少なくとも１つのセグメントである、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２２】
前記人工機能性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２からなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２３】
前記人工機能性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１２−１５からなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２４】
前記移植用標的細胞は免疫細胞である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２５】
前記移植用標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３−４から選択されるアミノ酸配列を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２６】
前記小リガンド複合体は、式Ｉを有する、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【化３】
2020508042.tif 000040
【請求項２７】
前記移植用標的細胞は、患者に不足している生化学物質を合成するよう構成された、幹細胞、前駆細胞、または移植細胞である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２８】
前記移植用標的細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞である、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項２９】
前記小リガンドは、蛍光色素または放射性プローブにさらに結合している、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項３０】
前記小リガンドは、内因性遺伝子発現の調節因子にさらに結合している、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項３１】
前記小リガンドは、導入された導入遺伝子発現の調節因子にさらに結合している、請求項１に記載の薬剤デリバリープラットフォーム。
【請求項３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２−１５から選択されるアミノ酸配列を発現する構成物を備える、キメラ抗原受容体Ｔ細胞。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２−１５からなる群から選択されるアミノ酸配列をエンコードする、ＤＮＡ構成物。
【請求項３４】
発現ベクター中のＥＦ１ａプロモーターに作動可能に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２のいずれかを備える、ＦＫＢＰ−ＦＲａ融合受容体をエンコードするＤＮＡ構成物。
【請求項３５】
前記発現ベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を有するｐＷＰＩである、請求項３４に記載のＤＮＡ構成物。
【請求項３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：６−８のいずれかを備える、ＤＮＡ構成物。
【請求項３７】
挿入遺伝子ｈＦＫＢＰ−ＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびヒト抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を備える、移植細胞。
【請求項３８】
挿入遺伝子ｍＦＫＢＰ−ＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびマウス抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を備える、移植細胞。
【請求項３９】
ａ．移植されることにより細胞医療機能を有する、移植用標的細胞を識別し、
ｂ．前記標的細胞の表面上に、第１成分と第２成分とを備え、第１成分および第２成分はペプチドリンカーにより結合され、第１成分は非膜タンパク質であり、第２成分はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーペプチドまたはタンパク質である、人工機能性タンパク質を提供し、
ｃ．前記標的細胞に、薬剤ペイロードがリンカーを介して小リガンドに結合された薬剤複合体を提供し、前記小リガンドは、前記人工機能性タンパク質のうちの少なくとも１つの成分に対して高い親和性をもって結合し、前記薬剤ペイロードと共に、前記標的細胞に取り込まれ、
ｄ．前記標的細胞の前記細胞医療機能を調整するために、該標的細胞内において前記薬剤ペイロードの薬剤を放出させる、
工程を備える、細胞医療効果を調整する方法。
【請求項４０】
前記細胞医療機能は、患者に対して光学誘導手術を提供する、請求項３９に記載の細胞医療効果を調整する方法。
【請求項４１】
前記細胞医療機能は、標的細胞の増殖を制御する、請求項３９に記載の細胞医療効果を調整する方法。
【請求項４２】
前記細胞医療機能は、標的細胞が関与する癌細胞に対して細胞毒性を発現させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記移植用標的細胞は、免疫細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記移植用標的細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記移植用標的細胞は、患者に不足している生化学物質を合成するよう構成された、幹細胞、前駆細胞、または移植細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬剤ペイロードは、ローダミンおよびＦＩＴＣの蛍光色素から選択されるイメージング剤、あるいは、ＥＣ  ２０キレートヘッド、ＮＯＴＡ、およびＤＯＴＡから選択される放射性同位体イメージング剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記薬剤ペイロードは、チューブリシン、ＤＭ１、ＤＭ４、およびアウリスタチンからなる群から選択される細胞毒性薬である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記薬剤ペイロードは、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害薬、およびＰＩ３キナーゼ阻害薬を含むキナーゼ阻害薬、または、ｍｉ１８１ａ１のｓｉＲＮＡから選択される遺伝子発現の修飾物質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記移植された標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２−１５からなる群から選択される融合タンパク質を備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記人工機能性タンパク質成分は、ＦＲａ、ＦＲｂ、ｕＰＡＲ、ＦＫＢＰ、ＤＨＦＲ、ＦＩＴＣに対するｓｃＦｖ、およびＤＮＰに対するｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記小リガンドは、以下に示す群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【化２】
2020508042.tif 000041
2020508042.tif 000042
【請求項５２】
前記小リガンドと前記薬剤ペイロードとを結合する前記リンカーは、以下に示す群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【化１】
2020508042.tif 000043
【請求項５３】
前記標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる群から選択される人工機能性ＦＫＢＰ−リンカー−ＦＲａ融合タンパク質を備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記移植された標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択される人工機能性抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ構成物を備えるＣＡＲ  Ｔ細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤複合体は、式Ｉを備えるＦＫ５０６−放出リンカーを備え、ＦＫ５０６の結合ドメインは、約１００ｐＭのＦＫＢＰに対する親和性を有する、請求項３９に記載の方法。
【化３】
2020508042.tif 000044
【請求項５６】
前記標的細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞であり、前記薬剤複合体は、移植後の前記ＣＡＲ  Ｔ細胞により誘発される高サイトカイン血症を制御するよう構成されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞であり、前記薬剤複合体は、該ＣＡＲ  Ｔ細胞の不必要な増殖を制御するよう構成された修飾物質を含有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的細胞は、患者に不足している生化学物質を合成するよう構成された、幹細胞、前駆細胞、または移植細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的細胞はＮＫ細胞であり、前記薬剤複合体は、Ｔｈ１７細胞による細胞免疫応答を制御するためのＲＯＲγｔアゴニストである、請求項３９に記載の方法。  
【請求項６０】
前記薬剤ペイロードは、ＳＨＰ１／２、ＴＣ−ＰＴＰに対する阻害薬を含むがこれらに限定されないホスファターゼ阻害薬である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１７年２月１７日に出願された米国特許仮出願６２／４６０，１１８による優先権の利益を主張する。その内容は、本明細書に完全に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細胞医療用の薬剤デリバリープラットフォームを提供する。具体的には、人工機能性タンパク質が、少なくとも１つの薬剤ペイロードを運搬する高親和性リガンドに結合し、該薬剤ペイロードは、該人工機能性タンパク質を介して移植細胞内に取り込まれ、移植細胞医療効果を調整する。
【背景技術】
【０００３】
この数十年間で、細胞タイプ、デリバリー方法、適切な疾患モデルの点では、当該分野は非常に進歩しつつある。細胞タイプの点では、現在の細胞医療は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）、腫瘍モデル用の細胞、再生医療に基づく幹細胞に概ね分類される。
【０００４】
ＣＡＲ  Ｔは、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、人工Ｔ細胞受容体としても知られるが、 免疫エフェクター細胞（通常、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が、対応する抗原を有する標的細胞を認識し、その細胞毒性を呈することを可能にする。ＣＡＲ  Ｔ技術の台頭および発達は、特定のタイプの癌に対して有望であり、生物学的研究および臨床研究の両分野において、ＣＡＲ  Ｔ技術は大いに注目されている。
【０００５】
再生医療は、医療分野を刷新するものであり、損傷した組織や臓器を完全に治癒させる可能性を有し、今日においては回復不能とされる病状を有する患者にとって解決策と希望を与えるものである。発生および細胞生物学、免疫学、および他の分野における前進は、既存の再生療法を改良し、新たな療法を開発する機会をもたらす。
【０００６】
幹細胞は、分化という過程を経て、皮膚細胞、脳細胞、肺細胞など様々な異なるタイプの細胞に進化する能力を有する。幹細胞は、新たな臨床的応用を可能にするため、再生医療において重要な要素である。
【０００７】
成体幹細胞および胚幹細胞を含む様々な幹細胞は、再生医療で利用される。さらに、臍帯血中で発見された細胞などを含む様々なタイプの前駆細胞や、誘導多能性幹細胞と呼ばれる生物工学的に作られた細胞が、再生医療で利用されている。それぞれのタイプの細胞は、特有の性質を有し、いくつかの細胞は他の細胞に比べてより汎用性を有する。
【０００８】
開発途上にある再生医療の多くは、特定の患者自身の細胞から開始される。たとえば、患者の皮膚細胞が採取され、これらの細胞に特定の特徴を付与するためにラボラトリーで再プログラム化され、疾患を治癒させるために患者に戻される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔは、白血病治療の臨床的応用に大きな成功を収めたが、急激な腫瘍細胞の溶解により発生するサイトカインストームや、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の急激な増殖による正常なＣＤ１９＋Ｂ細胞の死滅といった致死的な副作用が生じるため、ＣＡＲ  Ｔ細胞をより精密に制御する必要がある。幹細胞に基づいた再生医療において、分化プロセスや、標的組織における移植細胞の栄養的役割に関して、より深く理解をする努力が行われている。一方、これらのプロセスは、標的細胞の再生にさらに寄与可能である、幹細胞に特定的にデリバリーされるいくつかの小分子薬剤によって代替される可能性がある。
【００１０】
その他、ＣＡＲ  Ｔ細胞および幹細胞に基づいた再生医療に関する長年の懸念としては、移植細胞の腫瘍形成能がある。要するに、ＣＡＲ  Ｔ細胞または幹細胞のいずれにおいても移植された細胞の移植後の活性を制御するシークレットな経路を持たせることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、細胞医療の微調整を可能とする薬剤デリバリープラットフォームを提供する。該薬剤デリバリーシステムは、
ａ．第１の成分と第２の成分とを備えた融合タンパク質からなり、第１成分および第２成分は、ペプチドリンカーにより結合されており、第１成分は非膜タンパク質であり、第２成分は膜アンカーペプチドまたはタンパク質である、移植用の標的細胞上の人工機能性タンパク質と、
ｂ．リンカーに結合し、前記人工機能性タンパク質の少なくとも１つの成分に対する固有の高親和性を有する、少なくとも１つの小リガンドと、
ｃ．前記リンカーに結合し、前記人工機能性タンパク質の少なくとも１つの成分に前記小リガンドが結合した際の前記標的細胞に関連する、少なくとも１つの薬剤ペイロードと、
を備える。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、イメージング剤の薬剤ペイロードを有する。かかるイメージング剤は、蛍光色素ローダミン、フルオレセイン、およびＳ０４５６からなる群から選択される。あるいは、かかるイメージング剤は、放射性同位体キレートイメージング部分、ＥＣ  ２０キレートヘッド、ＮＯＴＡ、およびＤＯＴＡからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、細胞毒性薬の薬剤ペイロードを有する。かかる細胞毒性薬は、チューブリシン、ＤＭ１、ＤＭ４、およびアウリスタチンからなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、遺伝子発現の修飾物質の薬剤ペイロードを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、細胞活性の修飾物質の薬剤ペイロードを有する。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、前記修飾物質は、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害薬、およびＰＩ３Ｋ阻害薬からなる群、ＨＤＡＣ阻害薬、キナーゼ阻害薬、および代謝阻害薬からなる群、ＧＳＫ３ベータ阻害薬、ＭＡＯ−Ｂ阻害薬、およびＣｄｋ５阻害薬からなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、前記修飾物質は、ホスファターゼ阻害薬、ＲＯＲγｔアゴニスト、またはｓｉＲＮＡ  ｍｉ１８１ａ１である。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤ペイロードは、ＳＨＰ１／２、ＴＣ−ＰＴＰに対する阻害薬を含むがこれらに限定されない、ホスファターゼ阻害薬である。
【００１９】
いくつかの実施形態においては、該薬剤デリバリープラットフォームにおける前記薬剤ペイロードは、前記小リガンドが前記人工機能性タンパク質の少なくとも１つの成分に結合している場合に、前記標的細胞に取り込まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、前記小リガンドと前記薬剤ペイロードとを結合する放出リンカーを有する。該リンカーは、以下に示す群から選択される。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
いくつかの実施形態においては、前記人工機能性タンパク質成分は、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、葉酸受容体ベータ（ＦＲｂ）、ウロキナーゼ受容体（ｕＰＡＲ）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、フルオレセインイソチオシアネート に対する単鎖フラグメント可変成分（ＦＩＴＣに対するｓｃＦｖ）、および、ジニトロフェノールに対する単鎖フラグメント可変成分（ＤＮＰに対するｓｃＦｖ）からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、前記小リガンドは、以下に示す群から選択される。
【００２４】
【化２】
2020508042.tif 000004
2020508042.tif 000005
【００２５】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、第１成分としてのＦＫＢＰ、第２成分としての、第１成分にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを付与するペプチドを有し、前記小リガンドは、ＦＫ５０６またはその誘導体である。いくつかの実施形態においては、前記ＦＫ５０６誘導体は、カルシニューリン結合サイトを無効化する。
【００２６】
いくつかの実施形態においては、第２成分は、完全長型または短縮型の葉酸受容体（ＦＲ）である。
【００２７】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、前記人工機能性タンパク質の第１成分および第２成分を結合するための柔軟なペプチドリンカーＳＧＧＧＳの少なくとも１つのセグメントを有する。
【００２８】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２（それぞれ、マウスＦＫＢＰ−ＦＲａのアミノ酸配列およびヒトＦＫＢＰ−ＦＲａのアミノ酸配列）からなる群から選択される人工機能性タンパク質を備える。
【００２９】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１２−１５から選択される人工機能性タンパク質を備える。
【００３０】
いくつかの実施形態においては、前記移植用標的細胞は免疫細胞である。たとえば、該免疫細胞は、ＮＫ細胞またはキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ  Ｔ）細胞であることができる。かかるＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３−４から選択されるアミノ酸配列を発現する。
【００３１】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、式Ｉで表される小リガンド複合体を有する。
【００３２】
【化３】
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【００３３】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（マウス抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ構成物のアミノ酸配列）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ヒト抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ構成物のアミノ酸配列）を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞としての移植用標的細胞を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態においては、前記小リガンドは、薬剤の吸収を追跡するための蛍光色素または放射性プローブにさらに結合される。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤デリバリープラットフォームは、内因性遺伝子発現の調節因子または導入された導入遺伝子発現の調節因子にさらに結合される小リガンドを備える。
【００３６】
前記薬剤デリバリープラットフォームのいくつかの実施形態においては、前記移植用標的細胞は、患者に不足している生化学物質を合成するよう設計された、幹細胞、前駆細胞、または移植細胞である。
【００３７】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１２−１５から選択されるアミノ酸配列を発現する構成物を備えるＣＡＲ  Ｔ細胞を提供する。
【００３８】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１２−１５からなる群から選択されるアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ構成物を提供する。
【００３９】
本発明は、発現ベクター中のＥＦ１ａプロモーターに作動可能に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２のいずれかを備えるＦＫＢＰ−ＦＲａ融合受容体をエンコードするＤＮＡ構成物を提供する。いくつかの実施形態においては、かかる発現ベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を有するｐＷＰＩである。
【００４０】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：６−８のいずれかを備えるＤＮＡ構成物を提供する。
【００４１】
本発明は、挿入遺伝子ｈＦＫＢＰ−ＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびヒト抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を備える移植細胞を提供する。
【００４２】
本発明は、挿入遺伝子ｍＦＫＢＰ−ＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびマウス抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を備える移植細胞を提供する。
【００４３】
本発明は、細胞医療効果を調整する方法を提供する。該方法は、
ａ．移植されることにより細胞医療機能を有する、移植用標的細胞を識別し、
ｂ．前記標的細胞の表面上に、第１成分と第２成分とを備え、第１成分および第２成分はペプチドリンカーにより結合され、第１成分は非膜タンパク質であり、第２成分はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーペプチドまたはタンパク質である、人工機能性タンパク質を提供し、
ｃ．前記標的細胞に、薬剤ペイロードがリンカーを介して小リガンドに結合された薬剤複合体を提供し、前記小リガンドは、前記人工機能性タンパク質のうちの少なくとも１つの成分に対して高い親和性をもって結合し、前記薬剤ペイロードと共に、前記標的細胞に取り込まれ、
ｄ．前記標的細胞の前記細胞医療機能を調整するために、該標的細胞内において前記薬剤ペイロードの薬剤を放出させる、
工程を備える。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、前記細胞医療機能は、患者に光学誘導手術を提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、前記細胞医療機能は、前記標的細胞の増殖を制御する。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、前記細胞医療機能は、前記標的細胞が関与する癌細胞に対して細胞毒性を発現させる。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は免疫細胞である。たとえば、該標的細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【００４８】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は、患者に不足している生化学物質を合成するよう構成された、幹細胞、前駆細胞、または移植細胞である。
【００４９】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤ペイロードは、ローダミンおよびＦＩＴＣの蛍光色素から選択されるイメージング剤、あるいは、ＥＣ  ２０キレートヘッド、ＮＯＴＡ、およびＤＯＴＡから選択される放射性同位元素イメージング剤である。
【００５０】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤ペイロードは、チューブリシン、ＤＭ１、ＤＭ４、およびアウリスタチンからなる群から選択される細胞毒性薬である。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤ペイロードは、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害薬、およびＰＩ３キナーゼ阻害薬を含むキナーゼ阻害薬、または、ｍｉ１８１ａ１のｓｉＲＮＡから選択される遺伝子発現の修飾物質である。
【００５２】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１２−１５からなる群から選択される融合タンパク質を備える。
【００５３】
いくつかの実施形態においては、前記人工機能性タンパク質成分は、ＦＲａ、ＦＲｂ、ｕＰＡＲ、ＦＫＢＰ、ＤＨＦＲ、ＦＩＴＣに対するｓｃＦｖ、およびＤＮＰに対するｓｃＦｖからなる群から選択される。
【００５４】
いくつかの実施形態においては、前記小リガンドは、以下に示す群から選択される。
【００５５】
【化２】
2020508042.tif 000007
2020508042.tif 000008
【００５６】
いくつかの実施形態においては、小リガンドと薬剤ペイロードとを結合するための前記リンカーは、以下に示す群から選択される。
【００５７】
【化１】
2020508042.tif 000009
【００５８】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる群から選択される人工機能性ＦＫＢＰ−リンカー−ＦＲａ融合タンパク質を備える。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択される人工機能性抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ構成物を備えるＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【００６０】
いくつかの実施形態においては、前記薬剤複合体は、式Ｉを備えるＦＫ５０６−放出リンカーを備え、ＦＫ５０６の結合ドメインは、約４ｐＭ〜約１００ｐＭのＦＫＢＰに対する親和性を有する。
【００６１】
【化３】
2020508042.tif 000010
【００６２】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞であり、前記薬剤複合体は、移植後の前記ＣＡＲ  Ｔ細胞の過剰な高サイトカイン血症を制御するためにＧＳＫ３ｂ阻害薬、ＭＡＰＫ阻害薬からなる群から選択される阻害薬を備える。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞であり、前記薬剤複合体は、該ＣＡＲ  Ｔ細胞の不必要な増殖を制御するように構成された修飾物質を備える。      
【００６４】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は幹細胞または前駆細胞であり、前記薬剤複合体は、骨折修復を促進するためのＧＳＫ３ｂ阻害薬を備える。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞は患者に不足している生化学物質を合成するよう構成された、幹細胞、前駆細胞、または移植細胞であり、前記薬剤複合体は、パーキンソン病を含む神経変性疾患を治療するためのＭＡＯ−Ｂ阻害薬およびｃｄｋ５阻害薬からなる群から選択される阻害薬を備える。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、前記標的細胞はＮＫ細胞であり、前記薬剤複合体は、Ｔｈ１７細胞による細胞免疫応答を制御するためのＲＯＲγｔアゴニストを備える。
【００６７】
本発明の上記およびその他の特徴、並びにその態様および効果は、以下の図面、関連する説明、および特許請求の範囲により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞医療用のＦＫＢＰ−ＦＲａおよびＦＫ５０６−ペイロードによる薬剤デリバリープラットフォームの概要図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞へのペイロードのデリバリーのためのシークレットな経路プラットフォームの図解である。
【図２Ａ】図２Ａの左図は、ハイライトされたＦＫＢＰ結合サイト（黄色）および誘導サイト（赤色）を備えるＦＫ５０６の化学構造である。図２Ａの右図は、カルシニューリンＡフラグメント（緑色）、カルシニューリンＢ（青緑色）、ＦＫＢＰ１２（紫色）およびＦＫ５０６（黄色）、ＰＤＢ：１ＴＣＯの三元複合体の共結晶構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、人工機能性融合タンパク質における２つもモジュールの様々な組み合わせの選択肢と、それぞれのリガンドの選択を、可能性のある誘導サイトをハイライトして示した図である。
【図３】図３の左図は、２０１５年にＳｕｎ  Ｊ．らが著した『The quest for spatio-temporal control ofCAR T cells』から引用した、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性のネガティブ調整およびポジティブ調整を示す。図３の右図は、２０１１年にＭａｌｃｏｌｍ  Ｋ．Ｂ．らが著した『Inducible Apoptosis as a Safety Switch for Adoptive Cell Therapy』から引用した、ＡＰ１９０３（ＦＫ５０６ダイマー）により誘発されたＦＫＢＰ−ｃａｓｐａｓｅ９によるアポトーシスのメカニズム、および、ＡＰ１９０３の構造を示した図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＦＫＢＰ−ＦＲａインサートを有するｐＷＰＩ発現ベクターマップである（ｈＦＲａ１−２４：赤色、ＦＫＢＰ：黄色、ｈＦＲａ２５−２５８：赤色）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦＲａ陽性ＫＢ細胞および非形質導入Ｋ５６２細胞との比較において、５０ｋＤａ付近の高次のバンドに表れる、ＦＫＢＰ−ＦＲａ導入Ｋ５６２細胞を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ペイロードキャリア構成物およびＣＡＲ  Ｔ構成物の設計を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ（ＦＦ３と記される）の構成物設計を示す。Ｎ端末からＣ端末まで、シグナルペプチド、ヒトＦＫＢＰタンパク質、３つのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーとして表されるヒトＦＲａの１−２４ａａと、ヒトＦＲａの２５−２５８ａａとを有する。ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳ（ＦＦ１と記される）では、他の部分を変更せずに、ＦＦ３の３つのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーが、１つのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに置き換えられる。
【図４Ｅ】図４Ｅは、４ｍ５．３ＦＲの構成物設計を示す。Ｎ端末からＣ端末まで、ｈＣＤ８シグナルペプチド、ＦＩＴＣに対する４Ｍ５．３抗体のｓｃＦｖ、ＧＳリンカー、ヒトＦＲａの２５−２５８ａａを有する。
【図５】図５は、ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳ融合受容体における、ＦＲおよびＦＫＢＰ間の干渉を示す。ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳ融合タンパク質における葉酸の結合は、０．０１ｎＭの低濃度で、ＦＫ５０６−ローダミンの結合を阻害し、５０ｎＭでＦＫ５０６−ローダミン結合を完全に消滅させる。
【図６】図６は、ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳジャーカット細胞における、ＯＴＬ３８に結合後のＦＫ５０６−ローダミン強度の低下を示す。融合受容体内における、ＦＫ５０６−ローダミン（ドナー）からＯＴＬ３８（ＦＡ−Ｓ０４５６、アクセプタ、ｅｘ／ｅｍ：７７４／７９４ｎｍ）へのＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、ＦＲおよびＦＫＢＰ間の相互作用を示す。
【図７】図７は、ＦＫＢＰおよびＦＲ間におけるリンカーを長くすることにより、ＦＫＢＰおよびＦＲ間における干渉は大幅に低下することを示す図である。ＦＦ１（ＦＫＢＰおよびＦＲ間の１ＧＳ）と比較すると、ＦＦ３（ＦＫＢＰおよびＦＲ間の３ＧＳ）は、１０ｎＭのＦＡ（人体におけるＦＡの生理的濃度に匹敵）存在下におけるＦＫ５０６−ローダミンの結合を保持する。
【図８】図８は、ＰＩ−ＰＬＣ処理によるＧＰＩアンカー融合受容体ＦＦ３の放出を示す。ＦＦ３融合受容体を有するジャーカットＴ細胞は、２０ｎＭ  ＦＡ−ＦＩＴＣ（ＥＣ１７）との飽和結合を示すが、５ｍＵのＰＩ−ＰＬＣ処理あるいは５０ｍＵのＰＩ−ＰＬＣ処理後では、ＦＡ−ＦＩＴＣは細胞への結合を失う。このことは、ＧＰＩアンカーＦＦ３融合受容体の放出を示す。
【図９】図９は、ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体におけるＦＡ−ローダミン結合曲線を示す。ヒトＴ細胞上に安定して発現されるＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体は、ＦＲ＋ＫＢ細胞（１ｎＭ付近のＫｄ）におけるＦＡ−ローダミンの親和性に匹敵する高親和性（Ｋｄ＝０．９５ｎＭ）により、葉酸誘導体（ＦＡ−ローダミン）に結合することができる。したがって、融合受容体におけるＦＲの結合特性は保持される。
【図１０】図１０は、ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体におけるＦＫ５０６−ローダミン結合曲線を示す。ヒトＴ細胞上に安定して発現されるＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体は、高親和性（Ｋｄ＝３．９３ｎＭ）により、ＦＫ５０６誘導体（ＦＫ５０６−ローダミン）に結合することができるため、融合受容体におけるＦＫＢＰの結合特性は保持される。
【図１１】図１１は、ＳＬＦ−ＦＩＴＣは比較的高い結合親和性（Ｋｄ＝６２ｎＭ）により、ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体に結合するが、フリーなＳＬＦ（１００ｘ、プレインキュベーション）との競合がこの結合を阻害することを示す。ＦＫ５０６の模倣であるＳＬＦは、親リガンドＦＫ５０６と比較するとＦＫＢＰＦＲ融合受容体への結合親和性が１０倍も低く、これまでの報告と合致する。
【図１２】図１２は、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体におけるＦＡ−ローダミン結合曲線を示す。ＦＡ−ローダミンは、ＦＲ＋ＫＢ細胞（１ｎＭ付近のＫｄ）におけるＦＡ−ローダミンの親和性に匹敵する高親和性（Ｋｄ＝２．２５ｎＭ）により、ヒトＴ細胞上に安定して発現される４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体に結合することができる。したがって、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体におけるＦＲ結合特性は保持される。
【図１３】図１３は、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体におけるＦＩＴＣ−ＡＦ６４７結合曲線を示す。ＦＩＴＣ−ＡＦ６４７は、高親和性（Ｋｄ＝８．０３ｎＭ）によりヒトＴ細胞に安定して発現される４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体に結合することができる。１００ｘ  ｃｏｍｐは、フリーのＦＩＴＣナトリウムを示す。ＦＩＴＣを有するｓｃＦｖ  ４Ｍ５．３の結合特性は、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体において保持される。
【図１４】図１４は、ＦＡ−チューブリシンは、ＦＦ３＋ヒトＴ細胞に対する、受容体の特異的な毒性効果を発揮させうることを示す。ＦＡ（ＦＡの１００ｘプレインキュベーション）による補償により、該効果は阻害される。このことは、ＦＦ３融合受容体システムを介してフリーの薬剤チューブリシンが問題なく吸収および放出されることを示す。
【図１５】図１５は、ＦＡ−チューブリシンが、混合ヒトＴ細胞培養液におけるｈＦＦ３＋群を特異的に致死させることを示す。ｈＦＦ３＋細胞の絶対数は、ＦＡ−Ｔｕｂ濃度が上昇するに伴い低下するが、ｈＦＦ３−細胞も放出された薬剤により致死するが、高濃度においてはバイスタンダー効果が表れる。
【図１６】図１６は、ＳＬＦ−Ｔｕｂが、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）＝１３８ｎＭのｈＦＦ３＋ジャーカット細胞を特異的に致死させることを示す。これは、ＳＬＦ−ＴｕｂがＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体によって問題なく取り込まれ、該細胞内においてチューブリシンが放出されたことを示す。
【図１７】図１７は、ＦＩＴＣ−ＤＭ４およびＦＩＴＣ−Ｔｕｂは両者とも特異的に４Ｍ５．３ＦＲ＋ヒトＴ細胞を致死させるが、ＦＩＴＣ−Ｔｕｂがより高いＩＣ５０を有することを示す。フリーなＦＩＴＣナトリウム（１００ｘ、プレインキュベーション）による補償では、受容体介在致死効果が阻害される。このことは、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体を介してＦＩＴＣ−細胞毒性薬がＴ細胞に問題なく取り込まれ、放出されることを示す。
【図１８】図１８は、ＦＩＴＣ−チューブリシンが、混合ヒトＴ細胞培養において４Ｍ５．３ＦＲ＋群を特異的に致死させることを示す。ＦＩＴＣ−Ｔｕｂ濃度が上昇するに伴い、４Ｍ５．３ＦＲ＋細胞の絶対数は低下する一方、４Ｍ５．３ＦＲ−細胞も、放出された薬剤により致死するが、高濃度ではバイスタンダー効果が表れる。
【図１９】図１９は、ＦＩＴＣ−ＤＭ４は、混合ヒトＴ細胞培養において４Ｍ５．３ＦＲ＋群を特異的に致死させることを示す。ＦＩＴＣ−ＤＭ４濃度が上昇するに伴い、４Ｍ５．３ＦＲ＋細胞の絶対数は低下する一方、４Ｍ５．３ＦＲ−細胞も放出された薬剤により致死するが、高濃度ではバイスタンダー効果が表れる。
【図２０】図２０は、１０ｎＭ濃度のダサチニブ（Ｌｃｋ阻害薬）およびイブルチニブ（ＩＴＫ阻害薬）により、ＣＤ１９＋ラージ腫瘍細胞（ターゲット）に対する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＦＭＣ６３  ＣＡＲ  Ｔ、エフェクター）の溶解効果が低下することを示す。２つのエフェクター：ターゲット比（Ｅ：Ｔ）が試された。通常のＴ細胞およびＣＤ１９−Ｋ５６２細胞を有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ネガティブ制御として使用された。
【図２１】図２１は、ＦＩＴＣ−ダサチニブにより、ラージ細胞に対するＦＭＣ６３＋４Ｍ５．３ＦＲ＋ｈＴ細胞の溶解効果を低下させることができることを示す。これは、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体を介してＦＩＴＣ−ダサチニブがＴ細胞に問題なく吸収かつ放出され、Ｔ細胞内へダサチニブが放出されたことを示す。
【図２２】図２２は、濃度が１００ｎＭのＴＣ−ＰＴＰ阻害薬が、疲弊した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ１９＋ラージ細胞による７倍の刺激によって生成される。詳しくは、以下に記載した工程を参照）における共阻害薬分子群を減少させることを示す。ＰＤ−１、ＬＡＧ３、およびダブルポジティブ個体群とも、処理によって減少する。このことは、ＴＣ−ＰＴＰ阻害薬のようなホスファターゼ阻害薬は、疲弊したＣＡＲ  Ｔ細胞を回復させるためのシークレットなゲートウェイプラットフォーム用のペイロードとして使用可能であることを示す。
【００６９】
配列リスト  
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  マウスＦＫＢＰ−ＦＲａのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  ヒトＦＫＢＰ−ＦＲａのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  マウス抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ構成物のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４  ヒト抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ構成物のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  ヒトＴ細胞形質導入用のｖｅｃｔｏｒ  ｐＷＰＩ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６  マウスＴ細胞形質導入用のｐＭＰ７１  ｇｂ  ＮｏｔＩＥｃｏＲＩマウス抗ＣＤ１９
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ｐＷＰＩ−ＦＲａ  １−２４  ＦＫＢＰ  ＦＲａ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  ｐＷＰＩｍＦＫＢＰ−ｍＦＲａ  ＳＧＧＧＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９  ｐＨＲ  ＥｃｏｒＩ  ｈＡｎｔｉ  ｃｄ１９  １Ｄ３  ｍｙｃ  ｈｉｎｇｅ  ｃｄ２８  ｃｄ３ｚｅｔａ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  ｐＷＰＩ  ｐｍｅｉ  ｍＡｎｔｉ  ｃｄ１９  １Ｄ３  ｍｙｃ  ｈｉｎｇｅ  ｃｄ２８  ｃｄ３ｚｅｔａ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１  ＧＰＩアンカーアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ−１ＳＧ−ＦＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  ＧＰＩアンカーアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ−３ＳＧ−ＦＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  ＧＰＩアンカーアミノ酸配列を有する４Ｍ５．３−ＦＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４  ＦＭＣ６３−Ｔ２Ａ−ＦＫＢＰ３ＳＧＦＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５  ＦＭＣ６３−Ｔ２Ａ−４Ｍ５．３ＳＧＦＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６  シグナルペプチドを有するＦＲｂ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７  シグナルペプチドを有するｕＰＡＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８  ＤＨＦＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９  ＦＩＴＣ：４Ｍ５．３（Ｋｄ＝２００ｐＭ）に対するｓｃＦｖ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０  ＦＩＴＣ  ４Ｄ５Ｆｌｕ（Ｋｄ＝１０ｎＭ）に対するｓｃＦｖ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１  ＤＮＰ  ＳＰＥ７に対するｓｃＦｖ
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明の概念は、図面および明細書に詳細に記載したが、図面および明細書に記載された結果物は例示にすぎず、本発明の特徴を限定するものではない。例示的な実施形態が示されているものとして、本発明の範囲内に含まれるすべての変更および修正は保護されるべきである。
【００７１】
特に定義しない限り、化学的および技術的な術語は、本発明の技術分野における当業者に通常理解されている意味と同一の意味を有するものとする。
【００７２】
本発明は、移植細胞の表面上に融合受容体を遺伝的に組み込むことにより、移植細胞活性を制御する新規のプラットフォームを提供する。これらの移植細胞は、小分子リガンドと移植細胞の表面上の融合受容体との間の固有の高親和性を利用して、薬剤ペイロードを結合した小分子リガンドによって特異的に標的とされる。融合受容体の一部によって、結合体は移植細胞内に取り込まれ、ペイロードが移植細胞内に取り込まれると、放出リンカーを介してペイロードは放出される。移植細胞のタイプや、移植細胞に課される所望の調整に基づいて、薬剤ペイロードはさまざまな機能を呈する。結合体におけるペイロードを変化させることにより、たとえば、細胞毒性薬またはキナーゼ阻害薬を用いることにより、薬剤ペイロードは、増殖、分化またはサイトカイン放出特性など、移植細胞の複数の側面を制御するために使用され得る。
【００７３】
ペプチジルプロリンイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅｓ）群は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、シクロフィリンおよびパルブリンからなる。ヒトにおいては、１８  ＦＫＢＰｓ、２４シクロフィリン、および３パルブリンがある。これらのうちで、ＦＫＢＰ５１とＦＫＢＰ５２は、ＦＫＢＰ１２（ＫＤＦＫ５０６≒０．２ｎＭ）と比較すると、高から中程度である、ＫＤＦＫ５０６≒１０４ｎＭ、および、ＫＤＦＫ５０６≒２３ｎＭという、ＦＫ５０６との結合親和性をそれぞれ有する。さらに、これら２つのＦＫＢＰのいずれも、細胞膜上に発現せず、ヒトのシステムにおいてはクロス結合活性をほとんど有しない。ＦＫＢＰＷＴよりもＦＫＢＰ１２Ｆ３６ＶやＦＫＢＰ５１Ｆ６７Ｖへの親和性がより高く、野生型タンパク質の全体構造を保持する合成リガンドを構成する努力もなされている。これらのリガンドを有するすべてのホモログおよび変異タンパク質を本発明に適用することができる。
【００７４】
具体的には、１つの実施形態においては、例示ペアである小分子リガンドと融合受容体とがＦＫ５０６−ＦＫＢＰとして選択される。すべてのプロセスについて、図１Ａに一般化して示した。まず、ＦＫ５０６−ペイロードがＦＫＢＰ−ＦＲａ人工機能性細胞に結合し、この結合で、膜貫通融合タンパク質は、ペイロード−リンカー−ＦＫ５０６を取り込む。次に、取り込まれたＦＫ５０６−ペイロードはリンカーで切断され、ペイロードは細胞内に放出される。細胞タイプおよびペイロードタイプにより、放出された薬剤ペイロードは所望の機能を発揮する。
【００７５】
図１Ｂは、特定のキメラ抗原受容体Ｔ細胞による細胞医療を示す。このモデルでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｎ端末からＣ端末までの構造を有し、適切なシグナルペプチドを備える融合タンパク質を備え、ＧＰＩアンカーのタンパク質モジュール１に結合したタンパク質モジュール２は癌細胞に表出される。いくつかの実施形態においては、癌細胞はＣＤ１９表面タンパク質を有しており、標的リガンドが融合受容体の少なくとも１つのモジュールに結合している場合には、このＣＤ１９表面タンパク質が、ＣＡＲ  Ｔ細胞に認識され、ＣＡＲ  Ｔ細胞が有するペイロードと係合する。通常は、標的リガンドはこれらのモジュールのいずれか１つに対して高親和性を有し、リガンドと結びついたペイロードは標的細胞内に取り込まれ、放出されて、キメラ抗原受容体を介して癌細胞と係合する。
【００７６】
図２Ｂに示すように、ＧＰＩアンカータンパク質には多数の異なる組み合わせが存在し、モジュール１およびそのリガンド、モジュール２の標的細胞表面タンパク質およびそのリガンドとして提示される。モジュール１のタンパク質またはモジュール２のタンパク質、あるいは両者が、リガンド結合ペイロードデリバリーを促進するために高親和性の標的リガンドに係合する。たとえば、ＦＲａ−リンカー−ＦＫＢＰ構造を備える融合タンパク質は実現可能であり、ＦＲａはＦＡ誘導体と係合し、同時に、ＦＫＢＰはＦＫ５０６誘導体と係合し、ＦＡ誘導体またはＦＫ５０６誘導体のいずれかあるいは両方が、細胞毒性薬、イメージング剤、または修飾物質などのペイロードと結合することができる。このように同一または異なるペイロードを運搬する柔軟性を有するため、異なるまたは同一のペイロードによる予期せぬ効果、相乗効果または調整作用が得られ、また、ペイロードがイメージング剤である場合には標的細胞を観察することが可能となる。当該システムのペイロードデリバリーの柔軟性および多様性の利点は、さらなる例示により明らかにされる。
【００７７】
同様にして、ＧＰＩアンカータンパク質とペアになるリガンドの他の実施形態は、ｕＰＡＲとペアになる、以下に示すリガンドである。
【００７８】
【化４】
2020508042.tif 000011
【００７９】
また、リガンド構造としては、たとえば、ＦＩＴＣまたはその誘導体は、ＦＩＴＣに対する抗体の変異体（ｓｃＦｖ）の単鎖フラグメントに結合する構造（化５）、ＦＫＢＰとペアになるリガンド構造（化６）、ＤＨＦＲとペアになるリガンド構造（化７）、あるいは、ＤＮＰに対するｓｃＦＶとペアになるリガンド構造（化８）がある。
【００８０】
【化５】
2020508042.tif 000012
【００８１】
【化６】
2020508042.tif 000013
【００８２】
【化７】
2020508042.tif 000014
【００８３】
【化８】
2020508042.tif 000015
【００８４】
当該デリバリーシステムにおける例示的なリガンドータンパク質ペアとしてＦＫ５０６−ＦＫＢＰを選択するいくつかの利点について言及する。利点１：ＦＫＢＰは、ほ乳類の細胞膜上に自然に存在する膜タンパク質ではないため、ＦＫ５０６−ペイロード結合体は、標的細胞に特異的に結合する。利点２：ＦＫＢＰタンパク質は、分子量が１２ｋＤａである比較的小さなタンパク質であるため、受容体の構造および吸収特性に与える摂動を最小限にして他の受容体と融合させることが容易となる。利点３：ＦＫ５０６はヒトの体内に自然に存在しないため、融合受容体は阻害されない。利点４：ＦＫ５０６−ＦＫＢＰとの結合親和性は約４ｐＭであるため、薬剤ペイロードは高親和性を有して運搬される。利点５：ＦＫ５０６−ＦＫＢＰの共結晶構造が利用可能であり、ＦＫ５０６の安定した誘導体サイトは、ＦＫ５０６およびカルシニューリン間の不要な結合を無効にしつつ、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰの結合を保持する（図２Ａを参照）。
【００８５】
ＦＫＢＰの配列は変更することが可能であると考えられ、対応するＦＫ５０６リガンドも、変更されたＦＫＢＰと変更されたＦＫ５０６が本明細書中で例示した所望の親和性またはそれ以上の親和性を保持する範囲内で、変更可能である。
【００８６】
融合タンパク質の他の部分には、モノマーとしての良好な取り込み工程を有するために葉酸受容体（ＦＲ）が選択される。従来の研究によれば、「マジック炭酸塩」に結合された葉酸抱合体は、ＦＲを介して取り込まれ、細胞内の還元環境によって切断される。このメカニズムを利用して、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰ結合体における薬剤ペイロードは、ＦＲによって取り込まれ、細胞質に放出される。
【００８７】
ＣＡＲ  Ｔ療法の大きな可能性と、重度の副作用により、いくつかの制御されたＣＡＲ  Ｔ細胞設計が報告されている。その大多数は、Ｔ細胞活性のために、ブールゲートあるいはカスケード経路のいずれかを組み込むことによるＯＮ／ＯＦＦスイッチに焦点が当てられている（Ｓｕｎ  Ｊ．らによる『The quest for spatio-temporal control of CAR T cells』（２０１５年）から引用した、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性のネガティブな調整およびポジティブな調整を示す図３左図を参照）。Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｋ．Ｂ．のグループは、ＦＫＢＰ−ｃａｓｐａｓｅ９融合タンパク質を設計し、標的細胞のアポトーシスを誘発するためにＦＫ５０６ダイマーを使用した（Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｋ．Ｂ．らによる『Inducible Apoptosis as aSafety Switch for Adoptive Cell Therapy』（２０１１年）から引用した、ＡＰ１９０３（ＦＫ５０６ダイマー）により誘発されるＦＫＢＰ−ｃａｓｐａｓｅ９によるアポトーシスのメカニズムと、ＡＰ１９０３の構造を示す、図３右図を参照）。
【００８８】
本発明は、これらの報告された方法に対していくつかの利点を有する。利点１：バイナリーＯＮ／ＯＦＦスイッチの代わりに、本発明のプラットフォームは複数の種類の調整ペイロードを運搬することができ、標的細胞の複数の側面を変更することができるため、バイナリーＯＮ／ＯＦＦスイッチと比較すると非常に柔軟性に富む。利点２：制御部分であるＦＫ５０６−ペイロードは小分子であるため、プレ人工機能性細胞と比較すると、線形制御および投薬量の最適化が可能である。利点３：プラットフォームは、ＣＡＲ  Ｔ細胞内だけでなく、その他複数の幹細胞に基づいた再生医療において利用することが可能である。
【００８９】
本発明によるプラットフォームの最新かつ最も重要な内容は、生じうる副作用あるいは細胞医療の効率向上のいずれにも対応可能に選択される多機能ペイロードにある。たとえば、以下の条件の場合に、細胞毒性薬は移植細胞に運搬される。条件１：抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のように、細胞が過剰に増殖し、正常な臓器またはシステムに影響を与える場合。条件２：レンチウイルスに基づく遺伝子操作および幹細胞の固有の特性により、細胞が腫瘍形成性になった場合。
【００９０】
一方で、いくつかの細胞医療は、標的組織の抑制的な微小環境により、ほとんど成功していない。たとえば、固形腫瘍に対するＣＡＲ  Ｔ細胞医療においては、低い浸透率とは別に、ＭＤＳＣおよび腫瘍細胞によってＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および活性が非常に抑制されている。これは、ＲＯＲｒｔアゴニストまたはＭＡＰキナーゼ阻害薬に誘導されるＴ細胞活性、ＴＬＲ８アゴニストに誘導されるＣＡＲ  Ｔ細胞内におけるグランザイムＢの発現により軽減される可能性がある。本発明のペイロードにはＲＯＲｒｔなどの細胞内標的がより好適ではあるが、細胞膜上における近接性により、ＴＬＲ８などの膜受容体もアクセス可能である。
【００９１】
幹細胞再生療法においては、ペイロードは疾患モデルに応じてより多様化する。遺伝子デリバリープラットフォームとして幹細胞を利用して開発された、予め固定化された遺伝子を運搬する代わりに、本発明では、移植細胞およびその微小環境に対する微調整が可能であり、多様な小分子ペイロードによる所望の表現型を得ることが可能となっている。当該小分子は、ＦＫＢＰ−ＦＲａが過剰に発現している移植細胞を特異的に標的とするＦＫ５０６に結合しているため、小分子による正常組織を非特異的に標的とすることが回避される。
【００９２】
実施例の１つとして、骨再生療法における骨折修復のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるＢＭＰ２の過剰発現の誘導が挙げられる。ＢＭＰ２および／またはＶＥＧＦの発現レベルは、本発明の薬剤ペイロードデリバリーシステムによって、移植細胞にＧＳＫ３ベータ阻害薬を導入することにより向上させることができる。ＧＳＫ３ベータ阻害薬は、骨折修復のために望ましい薬剤である。したがって、ＧＳＫ３ベータ阻害薬は、骨折部位内の移植されたＭＳＣおよび微小環境の機能をさらに調整するために利用可能なペイロードとして理想的である。
【００９３】
薬剤ペイロードデリバリーシステムの他の実施例としては、アルツハイマー病やパーキンソン病などを含む神経変性疾患がある。これらの神経変性疾患では、ＭＳＣベースの治療が将来的な成功の鍵となっている。ＭＳＣは、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、その他の複数のサイトカインを過剰発現させるために操作される。一方で、ＭＡＯ−Ｂ阻害薬のような小分子は、星状細胞において、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＢＤＮＦの発現を増加させることが確認されている。ＰＩ３Ｋ阻害薬（ＢＥＺ２３５）、Ｃｄｋ５阻害薬（ロスコビチン）、およびＧＳＫ３ｂ阻害薬（ＮＰ−１２）などのいくつかのキナーゼ阻害薬も、アルツハイマー病を治療するものとして提案されている。神経変性モデルにおけるＭＳＣへこれらの小分子を特異的に運搬するＦＫ５０６−ＦＫＢＰのペアを使用することにより、再生効率が向上するとともに、他の非標的組織におけるこれらの強力な阻害薬およびアゴニストによる副作用が回避されることになる。
【００９４】
［材料および方法］
（化合物および合成工程）
標的リガンドは、リンカーを介してペイロードと結合する。リンカー最適化オプションを以下に記載する。ペイロードは、Ｉ．イメージング、II．細胞毒性薬、III．調節性小分子薬剤の３種類に分類される。
【００９５】
（リンカー最適化）
【化１】
2020508042.tif 000016
【００９６】
（化合物の分類）
区分  機能          例
Ｉ    イメージング  蛍光色素：ローダミン、ＦＩＴＣ
放射性同位体イメージング：ＥＣ  ２０キレートヘッド、
ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ
II    細胞毒性薬    微小管阻害薬：チューブリシン、ＤＭ１、ＤＭ４
III   修飾物質      キナーゼ阻害薬：ダサチニブ、ＭＥＫ１／２ｉ、ＰＩ３Ｋｉ
ｓｉＲＮＡ：ｍｉ１８１ａ１
【００９７】
［詳細な化合物の構造と合成経路］
（ＦＫ５０６−ローダミン）
【化９】
2020508042.tif 000017
【００９８】
工程：ジメチルホルムアミド中のローダミン−ＮＨＳエステル（１．０当量）をＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ３−ＮＨ２（１．２当量）およびジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）と常温で２時間反応させた。当該生成物は、ＵＶ検出器を備える分取逆相ＨＰＬＣによって精製された。精製されたローダミン−ＰＥＧ３−ＮＨ−Ｂｏｃ結合体（１．０当量）は、１：１０  ＴＦＡ−ジクロロメタンシステムで２時間撹拌されることにより、Ｂｏｃ脱保護された。粗遊離アミン生成物は、ジメチルホルムアミド中に溶解され、ジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）の存在下において、ＥＤＣ（２．０当量）、ＨＯＢＴ（２．０当量）により活性化された。１５分後、ＦＫ５０６−ＣＯ２Ｈ（１．２当量、文献『Bioorg. Med. Chem.』１７巻（２００９年）の５７６３頁−５７６８頁に記載された手順を利用して合成された）を添加し、当該反応混合物を一晩中撹拌した。ＵＶ検出器を備える分取逆相ＨＰＬＣ（２８０ｎＭの波長で監視された）での精製後、最終ＦＫ５０６−ローダミン結合体を単離した。当該粗生成物は、Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８分取ＨＰＬＣカラム（水）上にロードされ、９５％５ｍＭリン酸ナトリウム（移動相Ａ、ｐＨ７．４）と５％アセトニトリル（移動相Ｂ）で開始し、流量１２ｍＬ／分において３５分で、移動相Ａが０％および移動相Ｂが５０％に到達する勾配条件で、溶出された。生成物ピークの保持時間は、７分間のＨＰＬＣ−ＭＳ分析における前記勾配中（移動相Ｂが０−５０％）で２．５分であった（ＥＳＩｍ／ｚ＝１５３９．６、略語：ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール；ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＨＯＢＴ＝ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー）。
【００９９】
（ＦＫ５０６−ＮＩＲ色素）
【化１０】
2020508042.tif 000018
【０１００】
合成工程：
【化１１】
2020508042.tif 000019
【０１０１】
（ＳＬＦ−ＦＩＴＣ）
【化１２】
2020508042.tif 000020
【０１０２】
合成工程：
【化１３】
2020508042.tif 000021
【０１０３】
（ＳＬＦ−ＥＣ２０）
【化１４】
2020508042.tif 000022
【０１０４】
合成工程：
【化１５】
2020508042.tif 000023
【０１０５】
（ＳＬＦ−チューブリシン）
【化１６】
2020508042.tif 000024
【０１０６】
合成工程：
【化１７】
2020508042.tif 000025
【０１０７】
（ＦＩＴＣ−ＡＦ６４７）
【化１８】
2020508042.tif 000026
【０１０８】
合成工程：
【化１９】
2020508042.tif 000027
【０１０９】
（ＦＩＴＣ−ＤＭ４）
【化２０】
2020508042.tif 000028
【０１１０】
合成工程：
【化２１】
2020508042.tif 000029
【０１１１】
工程：ジメチルスルホキシド中のＤＭ４（１．０当量）を、２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エタン−１−アミン（１．０当量）およびジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）と常温で１時間反応させた。得られた粗生成物をＦＩＴＣ（１．０当量）と反応させ、反応混合物を１時間撹拌した。ＵＶ検出器を備える分取逆相ＨＰＬＣ（２８０ｎＭの波長で監視された）での精製後、最終ＦＩＴＣ−ＤＭ４結合体を単離した。当該粗生成物は、Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８分取ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上にロードされ、９５％５ｍＭリン酸ナトリウム（移動相Ａ、ｐＨ７．４）と５％アセトニトリル（移動相Ｂ）で開始し、流量１２ｍＬ／分において１０分で、移動相Ａが０％および移動相Ｂが１００％に到達する勾配条件で、溶出された。生成物ピークの保持時間は、７分間のＨＰＬＣ−ＭＳ分析における前記勾配中（移動相Ｂが０−１００％）で４．２３分であった（ＥＳＩｍ／ｚ＝１２４４．８、略語：ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネート；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー）。
【０１１２】
（ＦＩＴＣ−Ｔｕｂ）
【化２２】
2020508042.tif 000030
【０１１３】
合成工程：
【化２３】
2020508042.tif 000031
【０１１４】
（ＦＩＴＣ−ＥＣ２０）
【化２４】
2020508042.tif 000032
【０１１５】
合成工程：
【化２５】
2020508042.tif 000033
【０１１６】
（ＦＩＴＣ−ダサチニブ）
【化２６】
2020508042.tif 000034
【０１１７】
合成工程：
【化２７】
2020508042.tif 000035
【０１１８】
［実験手順］
（細胞培養）
２９３ＴＮ細胞を１０％ＦＢＳのＤＭＥＭで培養した（レンチウイルスパッケージングへの抗生物質なし）。ラージ細胞およびジャーカット細胞を１０％ＦＢＳ、１０％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ−１６４０で培養した。プライマリーのヒトＴ細胞は、フィコールを使用してｈＰＢＭＣから単離し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（１９０５１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ社）を用いたネガティブ選択によって濃縮され、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８（１１１６１Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）によって１日間活性化され、３０ＩＵ  ｈＩＬ２（１３０−０９７−７４５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．社）を補ったＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養された。Ｔ細胞は、２０％ヒトＡＢ血清（ＨＰ１０２２、Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）および１０％ＤＭＳＯを有するＲＰＭＩ−１６４０で凍結保存された。
【０１１９】
（レンチウイルスのパッケージング）
リポフェクタミン２０００を使用し、導入遺伝子発現ベクターおよびパッケージングプラスミド混合物（ＣＰＣＰ−Ｋ２Ａ、Ｃｅｌｌｅｃｔａ社）による、２９３ＴＮ細胞のトランスフェクション（形質移入）を介して、パントロピックＶＳＶ−Ｇジェードタイプ化レンチウイルスを作製した。２４時間後、ウイルス上清が得られ、濃縮されたうえで、同日に解凍された特定の細胞株あるいはプライマリーのＴ細胞に添加された。Ｔ細胞形質導入のために、ウイルス上清および８ｕｇ／ｍｌのポリブレンを添加後に、細胞を２５００ｒｐｍかつ３７℃で９０分間遠心分離した。
【０１２０】
（結合アッセイ）
結合アッセイについては、リガンド−色素のみ、あるいは、リガンド−色素と自由リガンド（１００ｘ、３０分間予培養済み）とともに、細胞を４℃で３０分間培養した。培養後、細胞を３回洗浄し、２％ＦＢＳ  ＰＢＳで再懸濁し、死細胞を排除するために７−ＡＡＤを添加した。ＦＫ５０６−ローダミンおよびＦＡ−Ｓ０４５６のＦＲＥＴイメージング：融合受容体の占有率を求めるために、指示された通りの工程と濃度でＦＫＢＰ−ＦＲａ＋  ジャーカット細胞をＦＡ／ＦＡ−Ｓ０４５６、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６−ローダミンとともに培養した。ＦＲＥＴは、同一あるいは近傍の受容体上のＦＡ−ＯＴＬ３８にエネルギーが移動するに従って、ＦＡ−ローダミンの強度の喪失によって視覚化され、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターによって検知された。結果はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析された。
【０１２１】
（ＧＰＩアンカータンパク質を放出するためのＰＩ−ＰＬＣ処理）
１×１０５細胞を、消化バッファー（２％ＢＳＡ）において、５ｍＵまたは５０ｍＵ  ＰＩ−ＰＬＣ（Ｐ５５４２−５ＵＮ、Ｓｉｇｍａ社）で、３０分間３７℃で培養した。培養後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、リガンド色素とともに氷上で３０分間培養した。
【０１２２】
（細胞生存率アッセイ）
細胞は、９６％ウエルプレートに播種され、自由リガンド（１００ｘプレインキュベーション）による競合がある場合とない場合の両者について、濃度の異なる特定のリガンド−細胞毒性薬とともに９６枚のウェルプレートに細胞を播種し、２時間培養した。２時間の培養後、温かい培地で細胞を３回洗浄し、新たな培地を補充した。７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｇ７５７０、Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって細胞数を検査し、あるいは受容体陽性細胞をリガンド色素で染色することにより定量化した。
【０１２３】
（ＣＡＲ  Ｔ細胞溶解効果）
１×１０５ＣＡＲ  Ｔ細胞および一定数のラージ細胞を、治療薬とともにまたはなしで、Ｅ：Ｔ比に基づき９６枚のウェルプレートで共培養した。２４時間後、１００ｕｌの上清がＬＤＨアッセイのために取り出された。溶解率は、（治療群−ＣＡＲ  Ｔのみ）／（最大溶解−ＣＡＲ  Ｔのみ）％として算出した。
【０１２４】
（ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊）
培地を変えることなく、１×１０６ラージ細胞を、１２時間毎に２４枚のウェルプレートの１×１０６ＣＡＲ  Ｔ細胞に繰り返し添加した。疲弊状況は、より低い溶解効果と共阻害分子（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３およびＴｉｍ−３）のより高い発現によって特徴づけられた。
【０１２５】
（リガンド−細胞毒性薬による融合受容体陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の生体内除去）
４×１０５ｌｕｃ＋ラージ細胞をＮＳＧマウスに静脈注射した。６日後、１×１０７  融合受容体陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈注射した。８日目に、リガンド−細胞毒性薬（０．５ｕｍｏｌｅ／ｋｇ、１ｕｍｏｌｅ／ｋｇ）を再度静脈注射した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射後、３日ごとに採取された血清サンプルを用いて、ＥＬＩＳＡによってＩＬ２およびＩＮＦｒを計測した。末梢血中のＣＡＲ  Ｔ細胞について、フローサイトメトリー（流動細胞計測法）を使用してカウントした。
【０１２６】
（リガンド−薬剤による融合受容体陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の生体内調整）
４×１０５ｌｕｃ＋ラージ細胞をＮＳＧマウスに静脈注射した。６日後、１×１０７  融合受容体陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈注射した。７日目に、リガンド−薬剤（０．５ｕｍｏｌｅ／ｋｇ、１ｕｍｏｌｅ／ｋｇ）を再度静脈注射した。ＣＡＲ  Ｔ  細胞の疲弊モデルの場合には、１×１０５  ＣＡＲ  Ｔ細胞を６日目に静脈注射し、末梢血にＣＡＲ  Ｔ細胞集団が出現し、腫瘍量が安定せず増加し続ける場合には、リガンド−薬剤（０．５ｕｍｏｌｅ／ｋｇ、１ｕｍｏｌｅ／ｋｇ）を静脈注射した。
【０１２７】
（生体内イメージングおよび融合受容体陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞のトラッキング）
２×１０６ラージ細胞をＮＳＧマウスの右肩に皮下注射した。１４日後、１×１０７融合受容体陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈注射した。６日目に、静脈注射によりマウスに９９ｍＴｃが結合された結合体（１０ｎＭｏｌ、１５０μＣｉ）を投与し、ＳＰＥＣＴイメージング装置によって撮像した。
【実施例】
【０１２８】
１．融合タンパク質および融合タンパク質の発現の設計
１．１  ＦＫＢＰ−ＦＲ融合受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の設計
ＦＫ５０６誘導体の合成：ＦＫ５０６−ローダミンおよびＦＫ５０６−チューブリシンの合成については、材料および方法欄に記載した。
【０１２９】
ｈＦＲａはＧＰＩアンカー膜タンパク質であり、シグナルペプチドとしてＮ端末に２４のアミノ酸を有する。膜存在特性および取り込み特性を保持するために、完全長型のＦＲａを使用し、ｈＦＫＢＰ配列と、ｈＦＲａのＴ２４およびＲ２５間のフレキシブルペプチドリンカー（ＳＧＧＧＳ）とを組み込む（図４Ａ）。フレキシブルリンカーは、人体の一般的な酵素消化に耐性があるように選択される。形質導入Ｔ細胞においてタンパク質を発現するための所望のプロモーターとしてのＥＦ１ａとともに、配列の全体をｐＷＰＩレンチウイルス発現ベクターに挿入する。
【０１３０】
１．２  形質導入した細胞におけるＦＫＢＰ−ＦＲ融合受容体の発現
ＦＫＢＰ−ＦＲａの発現は、レンチウイルスが形質導入されたＫ５６２におけるウエスタンブロット試験によって確認される。形質導入Ｋ５６２細胞の溶解は、ｈＦＲａ抗体に対する非形質導入細胞と比較して、５０ｋＤａのあたりに特異的なバンドを示す（図４Ｂ）。
【０１３１】
１．３  ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳの融合タンパク質の構築（ＦＦ３と記される）
図４Ｄを参照（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。Ｎ端末からＣ端末まで、シグナルペプチドとしてのヒトＦＲａの１−２４ａａ、ヒトＦＫＢＰタンパク質、３つのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、および、ヒトＦＲａの２５−２５８ａａを有する。ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳ（ＦＦ１と記される）の構築設計においては、ＦＦ３の３つのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、他の部分を変更することなく、１つのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに置き換えられる。結合アッセイに示されるように、リンカーの長さを増やすことにより、融合タンパク質の２つの成分間の干渉が低減される。
【０１３２】
１．４  ＧＳリンカーを有するＦＩＴＣ−ｓｖＦｖ−ＦＲ融合タンパク質の構築
図４Ｅを参照。当該構成物は、４Ｍ５．３ＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）とも呼ばれる。Ｎ端末からＣ端末まで、ｈＣＤ８シグナルペプチド（ｓｐ）、４Ｍ５．３（対ＦＩＴＣ）のｓｖＦｖ、ＧＳリンカー、ヒトＦＲａの２５−２５８ａａを有する。
【０１３３】
１．５  ＦＫ５０６−９９ｍＴｃ  ＰＥＴ  イメージングによる、生体内における、ＦＫＢＰ−ＦＲａ／ＦＫＢＰｔＦＲａ陽性細胞の非侵襲性トラッキング
ＣＡＲ  Ｔ細胞モデル用に、１×１０６ＫＢ細胞を、超免疫不全マウス（ＮＳＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に皮下移植した。腫瘍が１００ｍｍ３を超えた後、１５００万の抗−ＦＩＴＣ  ＣＡＲ＋  ＦＫＢＰ−  ＦＲａ＋のヒト細胞、または、抗−ＦＩＴＣ  ＣＡＲ＋  ＦＫＢＰ−  ＦＲａ−のヒトＴ細胞を、当該マウスに静脈注射した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を誘導するために、指定された日数、ＦＩＴＣ−ＦＡを注射した。以下の手順で、ＣＡＲ  Ｔ細胞を移植した後、マウスを２日ごとに撮像した。イメージングの当日には、前になされた報告に基づいて、９９ｍＴｃ（テクネチウム９９）とともに、ＦＫ５０６−ＥＣ２０ヘッドが配合された。１００ｕｌ溶液中の２００ｕＣｉ（マイクロキューリー）の９９ｍＴｃを、それぞれのマウスに静脈注射し、腫瘍領域、脾臓、およびリンパ節に焦点を当てて、ＭｉＬａｂ  ＰＥＴ／ＣＴによって全身像を撮影した。ＰＭＯＤソフトウェアによって３Ｄ画像を作成した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を移植後、約１０日後にイメージングを行った後、マウスを安楽死させ、それぞれの臓器における９９ｍＴｃの分布をガンマカウンターによってカウントした。
【０１３４】
造血幹細胞移植モデル用に、以前に報告されたとおりに、ヒト化ＮＳＧマウスを作製した。１０００万のＣＤ３４＋  ＦＫＢＰ−  ＦＲａ＋のｈＨＳＣをヒト化ＮＳＧマウスに静脈注射した。４ヶ月後、上述のとおりに、ＦＫ５０６−９９ｍＴｃを用いて、骨髄と脊椎に焦点を当てて全身像を撮影した。
【０１３５】
２．ＦＫ５０６−ペイロードに特異的に結合および取り込むためのＦＫＢＰ−ＦＲａ融合受容体
２．１  ＦＫ５０６−ローダミンに特異的に結合するＦＫＢＰ−ＦＲａ融合受容体
結合アッセイとして、リガンド色素のみ、または、リガンド色素および自由リガンド（１００ｘ、３０分間予培養済み）とともに、４℃で３０分間、細胞を培養した。培養後、細胞を３回洗浄し、２％ＦＢＳ  ＰＢＳで再懸濁し、死細胞を排除するために７−ＡＡＤを添加した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターを用いた。結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析された。
【０１３６】
２．２．  ＦＫＢＰ−ＦＲａ融合受容体によるＦＫ５０６−ローダミンの結合（ＦＫ５０６−ローダミンおよびＦＡ−Ｓ０４５６のＦＲＥＴイメージング）
融合受容体の占有率を求めるために、指示された工程と濃度で、ＦＫＢＰ−  ＦＲａ＋ジャーカット細胞を、ＦＡ／ＦＡ−Ｓ０４５６、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６−ローダミンとともに培養した。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、同一あるいは近傍の受容体上のＦＡ−ＯＴＬ３８にエネルギーが移動するに従って、ＦＡ−ローダミンの強度の喪失によって視覚化され、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターによって検知された。結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析された。
【０１３７】
図５は、ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳ融合タンパク質における葉酸の結合が、０．０１ｎＭという低量でも、ＦＫ５０６−ローダミンの結合を阻害し、５０ｎＭでＦＫ５０６−ローダミン結合を完全に消失させることを示す。
【０１３８】
図６は、ＦＫＢＰＦＲ１ＧＳジャーカット細胞が、葉酸受容体標的色素であるＯＴＬ３８に結合した後のＦＫ５０６−ローダミン強度の低下を示す。ＦＫ５０６−ローダミン（ドナー）からＯＴＬ３８（ＦＡ−Ｓ０４５６、アクセプタ、ｅｘ／ｅｍ：７７４／７９４ｎｍ）へのＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、融合受容体内におけるＦＲおよびＦＫＢＰ間の相互作用を示す。
【０１３９】
図７は、リンカーを長くすることにより、融合タンパク質の２つの成分であるＦＫＢＰおよびＦＲ間における干渉が大幅に低下することを示す。ＦＦ１（ＦＫＢＰおよびＦＲ間の１ＧＳ）と比較すると、ＦＦ３（ＦＫＢＰおよびＦＲ間の３ＧＳ）は、１０ｎＭのＦＡ（人体におけるＦＡの生理的濃度に匹敵）存在下におけるＦＫ５０６−ローダミンの結合を保持する。
【０１４０】
２．３．  ＧＰＩアンカーＦＦ３融合受容体の放出
ＦＦ３融合タンパク質を有するＰＩ−ＰＬＣ処理Ｔ細胞を使用することにより、ＧＰＩアンカー受容体ＦＦ３が放出された。ＦＦ３融合受容体を有するジャーカットＴ細胞は、２０ｎＭのＦＡ−ＦＩＴＣ（ＥＣ１７）との飽和結合を示すが、５ｍＵのＰＩ−ＰＬＣまたは５０ｍＵのＰＩ−ＰＬＣによる処理後は、ＦＡ−ＦＩＴＣは細胞への結合を失う。このことは、ＧＰＩアンカーＦＦ３融合受容体の放出を意味する。
【０１４１】
２．４  ヒトＴ細胞における融合タンパク質ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳのＦＲ結合特性の保持
ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体におけるＦＡ−ローダミン結合曲線を示す。ヒトＴ細胞上に安定して発現されるＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体は、ＦＲ＋ＫＢ細胞（１ｎＭ付近のＫｄ）におけるＦＡ−ローダミンの親和性に匹敵する、高親和性（Ｋｄ＝０．９５ｎＭ）により、葉酸誘導体（ＦＡ−ローダミン）に結合することができる。したがって、融合受容体におけるＦＲの結合特性は保持される。図９を参照。
【０１４２】
２．５  ヒトＴ細胞における融合タンパク質ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳのＦＫＢＰ結合特性の保持
ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体におけるＦＫ５０６−ローダミン結合曲線を示す。ヒトＴ細胞上に安定して発現されるＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体は、高親和性（Ｋｄ＝３．９３ｎＭ）により、ＦＫ５０６誘導体（ＦＫ５０６−ローダミン）に結合することができるため、融合受容体におけるＦＫＢＰの結合特性は保持される。図１０を参照。
【０１４３】
２．６  相対的に高い結合親和性（Ｋｄ＝６２ｎＭ）による、ＳＬＦ−ＦＩＴＣのＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体への結合
自由ＳＬＦ（１００ｘ、プレインキュベーション）との競合により結合が阻害される。ＦＫ５０６の模倣であるＳＬＦは、親リガンドＦＫ５０６と比較すると、ＦＫＢＰＦＲ  融合受容体への結合親和性が１０倍も低い。図１１を参照し、図１０と比較されたい。
【０１４４】
２．７  ４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体におけるＦＡ−ローダミンの結合曲線
ＦＡ−ローダミンは、ＦＲ＋ＫＢ細胞（１ｎＭ付近のＫｄ）におけるＦＡ−ローダミンの親和性に匹敵する、高親和性（Ｋｄ＝２．２５ｎＭ）により、ヒトＴ細胞上に安定して発現される４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体に結合することができる。したがって、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体におけるＦＲ結合特性は保持される。図１２を参照。
【０１４５】
２．８  ４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体におけるＦＩＴＣ−ＡＦ６４７結合曲線
ＦＩＴＣ−ＡＦ６４７は、高親和性（Ｋｄ＝８．０３ｎＭ）により、ヒトＴ細胞に安定して発現される４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体に結合することができる。「１００ｘ  ｃｏｍｐ」は、自由ＦＩＴＣナトリウムを示す。ＦＩＴＣを有するｓｃＦｖの４Ｍ５．３の結合特性は、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体において保持される。図１３を参照。
【０１４６】
３．１．  ＦＦ３＋ヒトＴ細胞に対するＦＡ−チューブリシンの致死効果
ＦＡ−チューブリシンは、ＦＦ３＋ヒトＴ細胞に対する受容体特異的致死効果を発揮する。ＦＡ（ＦＡの１００ｘプレインキュベーション）による補償は、かかる効果を阻害する。このことは、ＦＦ３融合受容体システムを介して自由薬剤チューブリシンが問題なく取り込みおよび放出されることを意味する。図１４を参照。
【０１４７】
３．２  混合ヒトＴ細胞培養におけるｈＦＦ３＋群に対するＦＡ−チューブリシンの致死効果
ＦＡ−チューブリシンは、混合ヒトＴ細胞培養におけるｈＦＦ３＋群を特異的に致死させる。ｈＦＦ３＋細胞の割合は、ＦＡ−チューブリシンの濃度が上昇するに伴い、低下する。図１５を参照。
【０１４８】
３．３  ＩＣ５０＝１３８ｎＭのｈＦＦ３＋ジャーカット細胞を特異的に致死させるＳＬＦ−チューブリシン
ＳＬＦ−チューブリシンを、ｈＦＦ３ジャーカット細胞とともに２時間培養することにより、受容体陽性細胞を致死させることができる。これは、ＳＬＦ−チューブリシンが、ＦＫＢＰＦＲ３ＧＳ融合受容体によって問題なく取り込まれ、該細胞内においてチューブリシンが放出されることを示す。図１６を参照。
【０１４９】
３．４  ４Ｍ５．３ＦＲ＋ヒトＴ細胞に対するＦＩＴＣ−ＤＭ４およびＦＩＴＣ−チューブリシンの致死効果
ＦＩＴＣ−チューブリシンがより高いＩＣ５０を有するが、ＦＩＴＣ−ＤＭ４およびＦＩＴＣ−チューブリシンは両者とも、特異的に４Ｍ５．３ＦＲ＋ヒトＴ細胞を致死させる。自由ＦＩＴＣナトリウム（１００ｘ  プレインキュベーション）による補償は、受容体介在致死効果を阻害する。このことは、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体を介して、ＦＩＴＣ−細胞毒性薬がＴ細胞に問題なく取り込まれ、放出されることを示す。図１７を参照。
【０１５０】
３．５  混合ヒトＴ細胞培養におけるＦＩＴＣ−チューブリシンの４Ｍ５．３ＦＲ＋群に対する特異的致死効果
ＦＩＴＣ−チューブリシンの濃度が上昇するに伴い、４Ｍ５．３ＦＲ＋細胞の絶対数は低下する一方で、４Ｍ５．３ＦＲ−細胞も放出された薬剤により致死するが、高濃度ではバイスタンダー効果が表れる。図１８を参照。
【０１５１】
３．６  混合ヒトＴ細胞培養におけるＦＩＴＣ−ＤＭ４の４Ｍ５．３ＦＲ＋群に対する特異的致死効果
ＦＩＴＣ−ＤＭ４濃度が上昇するに伴い、４Ｍ５．３ＦＲ＋細胞の絶対数は低下する一方で、４Ｍ５．３ＦＲ−細胞も放出された薬剤により致死するが、高濃度ではバイスタンダー効果が表れる。図１９を参照。
【０１５２】
３．７  ＣＤ１９＋ラージ細胞に対する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞へのキナーゼ阻害薬調整効果
１０ｎＭ濃度のダサチニブ（Ｌｃｋ阻害薬）およびイブルチニブ（ＩＴＫ阻害薬）は、ＣＤ１９＋ラージ腫瘍細胞（ターゲット）に対する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＦＭＣ６３  ＣＡＲ  Ｔ、エフェクター）の溶解効果を低下させる。２つのエフェクター：ターゲット比（Ｅ：Ｔ）について試験を行った。通常のＴ細胞およびＣＤ１９−Ｋ５６２細胞を有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ネガティブ制御として使用された。図２０を参照。
【０１５３】
３．８  ＦＩＴＣ−ダサチニブによる、ラージ細胞に対するＦＭＣ６３＋４ＭＦＲ＋ｈＴ細胞の溶解効果の低減
これは、４Ｍ５．３ＦＲ融合受容体を介してＦＩＴＣ−ダサチニブがＴ細胞に問題なく取り込まれかつ放出され、Ｔ細胞内へダサチニブが放出されることを示す。図２１を参照。
【０１５４】
３．９  濃度が１００ｎＭのＴＣ−ＰＴＰ阻害薬による、疲弊した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞における共阻害薬分子群の低減
疲弊した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ラージ細胞による７倍の刺激によって生成される。詳しくは、材料および方法欄を参照。ＰＤ−１ポジティブ、ＬＡＧ３ポジティブ、およびダブルポジティブ群は、処理によって減少する。図２２を参照。
【０１５５】
４．細胞医療の活性を制御するためのその他のＦＫ５０６−ペイロード
当該薬剤ペイロードデリバリーシステムの技術的に有益な特徴は、多機能性を有することにある。適用可能性のあるペイロードとそれぞれの効果について、以下の表１に示す。小分子ペイロードは、次のパラメータに基づいて選択された。１．生体内外における自由薬剤の機能性アッセイが、既刊文献または弊社研究所での試験で確認されていること。２．薬剤の化学構造が、誘導体化のための比較的アクセスしやすい遊離アミンを有すること。３．ＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認薬であるか、手頃な価格で市販されたものであることが好ましい。ＦＫ５０６−ペイロードは、まず生体外実験で試験し、マルチプレックスイムノアッセイによってＴ細胞活性および幹細胞のサイトカイン放出について観察する。生体疾患モデル用には、確立された安定したＣＡＲ  Ｔ医療用および骨折のマウスモデルは、出願人の研究所に所有されており、神経変性マウスモデルに関しては、いくつかの共同所有者が存在する。
【０１５６】
ＦＫＢＰ−ＦＲａ細胞医療プラットフォームおよび対応するペイロードの応用可能性
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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