(57)【要約】本発明は、尿素サイクル異常症を有する患者を治療するための方法及び組成物を提供する。遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することによって、尿素サイクルに関与する酵素をコードする遺伝子を調整するための方法及び組成物もまた提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包する細胞中のＯＴＣ遺伝子発現を増加させるための方法であって、前記細胞を、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＨＳＰ９０、ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＴＢＫ１、ＩＫＢＫＥ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される標的を阻害する有効量の化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記細胞が、肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３であり、前記化合物が、モメロチニブ及びバリシチニブからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、モメロチニブである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、バリシチニブである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的が、ＨＳＰ９０であり、前記化合物が、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、及びレタスピマイシンＨＣｌからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記標的が、ＭＡＰＫであり、前記化合物が、ＢＩＲＢ７９６、パマピモド、及びＰＨ−７９７８０４からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記標的が、ＥＧＦＲであり、前記化合物が、ムブリチニブ（ＴＡＫ  １６５）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記標的が、ＦＧＦＲであり、前記化合物が、ＸＬ２２８である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的が、ＢＲＡＦまたはＲＡＦ１であり、前記化合物が、リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）及びＢＭＳ−２１４６６２からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的が、ＫＤＲまたはＦＬＴ１であり、前記化合物が、フォレチニブ／ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的が、ＴＢＫ１またはＩＫＢＫＥであり、前記化合物が、ＢＸ７９５である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的が、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、またはＰＲＫＡＢ１であり、前記化合物が、ドルソモルフィンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包する細胞中のＯＴＣ遺伝子発現を増加させるための方法であって、前記細胞を、ＪＡＫ１、ＷＳＴＲ１、ＹＡＰ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＹＮ、ＳＭＡＤ３、ＮＴＲＫ１、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＦＧＦＲ４、ＩＮＳＲ、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＦＧＦＲ２、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲＢ、ＩＲＦ５、ＦＧＦＲ１、ＥＰＨＢ１、ＦＹＮ、ＦＬＴ４、ＹＹ１、ＩＲＦ１、ＩＧＦ−１、ＳＭＡＤ１、ＤＤＲ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、及びＳＭＡＤ２からなる群から選択される標的を阻害するｓｉＲＮＡ化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包するヒト対象におけるＯＴＣ発現を増加させるための方法であって、前記対象に、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＨＳＰ９０、ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＴＢＫ１、ＩＫＢＫＥ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される標的を阻害する有効量の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記標的が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、またはＪＡＫ３であり、前記化合物が、モメロチニブ及びバリシチニブからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が、モメロチニブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、バリシチニブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的が、ＨＳＰ９０であり、前記化合物が、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、及びレタスピマイシンＨＣｌからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的が、ＭＡＰＫであり、前記化合物が、ＢＩＲＢ７９６、パマピモド、及びＰＨ−７９７８０４からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的が、ＥＧＦＲであり、前記化合物が、ムブリチニブ（ＴＡＫ  １６５）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的が、ＦＧＦＲであり、前記化合物が、ＸＬ２２８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的が、ＢＲＡＦまたはＲＡＦ１であり、前記化合物が、リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）及びＢＭＳ−２１４６６２からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的が、ＫＤＲまたはＦＬＴ１であり、前記化合物が、フォレチニブ／ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的が、ＴＢＫ１またはＩＫＢＫＥであり、前記化合物が、ＢＸ７９５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的が、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、またはＰＲＫＡＢ１であり、前記化合物が、ドルソモルフィンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＯＴＣ突然変異が、非ゼロの酵素活性パーセントに関連する、表２０に示される突然変異からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１７年１０月６日出願の米国仮特許出願第６２／５６８，８９３号の利益を主張し、この全開示は、あらゆる目的で参照のために組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、配列表を含み、これはＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年１０月９日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、２０９３１０１１ＵＳＰＲＯＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズは７５８，８４７バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ヒトにおける尿素サイクル異常症の治療のための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
尿素サイクル異常症は、尿素サイクルを介する廃棄窒素の代謝の欠陥によって引き起こされる遺伝性疾患の群である。尿素サイクルは、タンパク質異化の産物であるアンモニアから尿素を産生する生化学反応のサイクルである。尿素サイクルは、主に肝細胞のミトコンドリア中で起こる。肝臓によって産生された尿素は、血流に入り、ここで腎臓に移動して、最終的に尿中に排泄される。尿素サイクル中の酵素または輸送体のうちのいずれかにおける遺伝的欠陥は、高アンモニア血症（血中アンモニア上昇）またはサイクル中間体の蓄積を引き起こし得る。次いで、アンモニアは、血液を通して脳に到達し、それが脳浮腫、発作、昏睡、生存者における長期障害、及び／または死を引き起こし得る。
【０００５】
尿素サイクル異常症の発症及び重症度は、大きく異なる。それは、サイクル中の欠陥タンパク質の位置及び欠陥の重症度によって影響される。酵素のうちのいずれかの重度の欠損または活性の完全非存在につながる突然変異は、生後数日間にアンモニア及び他の前駆体代謝物の蓄積をもたらし得る。尿素サイクルは、アンモニアの主要なクリアランスシステムであるため、この経路の完全な崩壊は、アンモニアの急速な蓄積及び関連症状の発現をもたらす。軽度〜中度の突然変異は、アンモニアを解毒するいくらかの能力を提供する広範囲の酵素機能を示し、軽度〜中度の尿素サイクル異常症をもたらす。
【０００６】
国立尿素サイクル異常症財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｒｅａ  Ｃｙｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によれば、尿素サイクル異常症の発生率は、米国において出生数８，５００人あたり１人であると推定される。個々の尿素サイクル異常症の推定発生率は、１：２，０００，０００未満〜約１：５６，５００まで異なる（ＮＡ  Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｅａ  Ｃｙｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，２０１５（非特許文献1）を参照）。それらは、子供及び大人の両方で起こる。これらの異常症は、幼児において最も頻繁に診断されるが、一部の子供は、幼児期まで症状を発現しない。重篤な尿素サイクル異常症を有する新生児は、生後３６〜４８時間以内に破滅的に病気になる。軽度または中度の尿素サイクル異常症を有する子供において、症状は、早ければ１歳で見られ得る。早期症状には、肉または他の高タンパク質食品を嫌うこと、あやしても泣き止まないこと、成長障害、精神錯乱、及び多動性行動が含まれる。症状は、頻繁な嘔吐のエピソード、無気力、せん妄、及び昏睡に進行し得る。軽度の尿素サイクル欠陥を有する一部の個人は、成人期に診断される。アンモニア蓄積は、病気またはストレス（例えば、ウイルス感染、手術、長期絶食、過剰な運動、及び過剰なダイエット）によって引き起こされる場合があり、血漿アンモニア濃度の複数の軽度上昇をもたらす。適切な診断及び治療がなければ、これらの個人は、永続的な脳損傷、昏睡、及び死の危険にさらされる。
【０００７】
尿素サイクル異常症の治療は、生涯のプロセスである。症状は、通常、食事制限、アミノ酸サプリメント、薬物治療、透析、及び／または血液濾過を含む戦略の組み合わせを使用することによって管理される。食事管理は、体内で産生されたアンモニアのレベルを制限するための鍵である。食物タンパク質、炭水化物、及び脂肪の慎重なバランスは、エネルギーニーズのための適正カロリー、ならびに細胞増殖及び発達のための適正必須アミノ酸を提供しながら、タンパク質摂取を低下させるために必要である。尿素サイクル異常症の種類に応じて、アルギニンまたはシトルリンなどのアミノ酸サプリメントを食事に付加してもよい。フェニル酪酸ナトリウム（ＢＵＰＨＥＮＹＬ（登録商標）、フェニル酪酸グリセロール（ＲＡＶＩＣＴＩ（登録商標））、及び安息香酸ナトリウムは、尿素サイクル異常症の治療のためのＦＤＡ承認薬である。それらは、腎臓が尿素の代わりに過剰な窒素を排泄するのを可能にする窒素結合剤として機能する。透析及び／または血液濾過は、血漿アンモニア濃度を正常な生理的レベルに迅速に低減するために使用される。他の治療及び管理オプションが失敗した場合、または新生児発症性ＣＰＳ１及びＯＴＣ欠損症については、肝移植がオプションである。移植代替案は、有効であることが証明されているが、手術のコスト、ドナーの不足、及び免疫抑制剤の起こり得る副作用は、克服困難であり得る。
【０００８】
したがって、尿素サイクル異常症の治療のための有効な治療薬を開発する未だ満たされていない高い必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＮＡ  Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｅａ  Ｃｙｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，２０１５
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、とりわけ、尿素サイクル異常症を有する対象を治療する方法を提供する。これらの方法は、カルバモイルリン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ１（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、溶質キャリアファミリー２５メンバー１５（ＳＬＣ２５Ａ１５）、及び溶質キャリアファミリー２５メンバー１３（ＳＬＣ２５Ａ１３）から選択される１つ以上の遺伝子の発現を調整することができる有効量の化合物を対象に投与することを含む。そのような化合物は、小分子、ポリペプチド、抗体、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド、またはゲノム編集剤であり得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、表２〜１０から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包する細胞を、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＨＳＰ９０、ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＴＢＫ１、ＩＫＢＫＥ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される標的を阻害する有効量の化合物と接触させることによって、該細胞中のＯＴＣ発現を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、標的は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、またはＪＡＫ３であり、化合物は、モメロチニブ及びバリシチニブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＨＳＰ９０であり、化合物は、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、及びレタスピマイシンＨＣｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＭＡＰＫであり、化合物は、ＢＩＲＢ７９６、パマピモド、及びＰＨ−７９７８０４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＥＧＦＲであり、化合物は、ムブリチニブ（ＴＡＫ  １６５）である。いくつかの実施形態では、標的は、ＦＧＦＲであり、化合物は、ＸＬ２２８である。いくつかの実施形態では、標的は、ＢＲＡＦまたはＲＡＦ１であり、化合物は、リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）及びＢＭＳ−２１４６６２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＫＤＲまたはＦＬＴ１であり、化合物は、フォレチニブ／ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９）である。いくつかの実施形態では、標的は、ＴＢＫ１またはＩＫＢＫＥであり、化合物は、ＢＸ７９５である。いくつかの実施形態では、標的は、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、またはＰＲＫＡＢ１であり、化合物は、ドルソモルフィンである。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ突然変異は、非ゼロの残留ＯＴＣ機能に関連する表２６の突然変異の一覧から選択される突然変異である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包するヒト対象におけるＯＴＣ発現を、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＨＳＰ９０、ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＴＢＫ１、ＩＫＢＫＥ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される標的を阻害する有効量の化合物を該対象に投与することによって増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、またはＪＡＫ３であり、化合物は、モメロチニブ及びバリシチニブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＨＳＰ９０であり、化合物は、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、及びレタスピマイシンＨＣｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＭＡＰＫであり、化合物は、ＢＩＲＢ７９６、パマピモド、及びＰＨ−７９７８０４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＥＧＦＲであり、化合物は、ムブリチニブ（ＴＡＫ  １６５）である。いくつかの実施形態では、標的は、ＦＧＦＲであり、化合物は、ＸＬ２２８である。いくつかの実施形態では、標的は、ＢＲＡＦまたはＲＡＦ１であり、化合物は、リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）及びＢＭＳ−２１４６６２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的は、ＫＤＲまたはＦＬＴ１であり、化合物は、フォレチニブ／ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９）である。いくつかの実施形態では、標的は、ＴＢＫ１またはＩＫＢＫＥであり、化合物は、ＢＸ７９５である。いくつかの実施形態では、標的は、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、またはＰＲＫＡＢ１であり、化合物は、ドルソモルフィンである。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ突然変異は、非ゼロの残留ＯＴＣ機能に関連する表２０の突然変異の一覧から選択される突然変異である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＣＰＳ１の発現を調整することができる場合があり、表２から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＯＴＣの発現を調整することができる化合物は、表３から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＳＳ１の発現を調整することができる場合があり、表４から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＳＬの発現を調整することができる場合があり、表５から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＮＡＧＳの発現を調整することができる化合物は、表６から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＲＧ１の発現を調整することができる場合があり、表７から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＬＣ２５Ａ１５の発現を調整することができる場合があり、表８から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＬＣ２５Ａ１３の発現を調整することができる場合があり、表９から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＮＡＧＳ、ＡＲＧ１、ＳＬＣ２５Ａ１５、及びＳＬＣ２５Ａ１３からなる群から選択される３つ以上の遺伝子の発現を調整することができる場合があり、表１０から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、化合物は、標的遺伝子の発現を増加させ得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、少なくとも約４０％増加され得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、対象の肝臓中で増加され得る。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、カルバモイルリン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ））欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）欠損症であり得る。いくつかの実施形態では、尿素サイクル異常症は、シトリン欠損症であり得る。
【００１６】
細胞中の１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整する方法もまた、本明細書に提供される。この方法は、尿素サイクル関連遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる有効量の化合物を細胞に導入することを含む。尿素サイクル関連遺伝子は、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＮＡＧＳ、ＡＲＧ１、ＳＬＣ２５Ａ１３、及びＳＬＣ２５Ａ１５から選択される１つ以上であり得る。化合物は、小分子、ポリペプチド、抗体、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド、またはゲノム編集剤であり得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、表２〜１０から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＣＰＳ１の発現を調整することができる場合があり、表２から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＯＴＣの発現を調整することができる化合物は、表３から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＳＳ１の発現を調整することができる場合があり、表４から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＳＬの発現を調整することができる場合があり、表５から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＮＡＧＳの発現を調整することができる化合物は、表６から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＲＧ１の発現を調整することができる場合があり、表７から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＬＣ２５Ａ１５の発現を調整することができる場合があり、表８から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＬＣ２５Ａ１３の発現を調整することができる場合があり、表９から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＮＡＧＳ、ＡＲＧ１、ＳＬＣ２５Ａ１３、及びＳＬＣ２５Ａ１５からなる群から選択される３つ以上の遺伝子の発現を調整することができる場合があり、表１０から選択される少なくとも１つ、またはその誘導体もしくは類似体である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、化合物は、尿素サイクル関連遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、尿素サイクル関連遺伝子の発現は、少なくとも約４０％増加される。いくつかの実施形態では、細胞は、尿素サイクル関連遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００１９】
血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）媒介性シグナル伝達経路を調整することができる場合がある有効量の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中の１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整する方法もまた、本明細書に提供される。尿素サイクル関連遺伝子は、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＮＡＧＳ、ＡＲＧ１、ＳＬＣ２５Ａ１３、及びＳＬＣ２５Ａ１５から選択され得る。化合物は、小分子、ポリペプチド、抗体、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド、またはゲノム編集剤であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＤＧＦＲ阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、化合物は、ＣＰ−６７３４５１、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、アムバチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、クレノラニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＤＧＦＲ活性化剤であり得る。いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＤＧＦ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、化合物は、尿素サイクル関連遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、尿素サイクル関連遺伝子の発現は、少なくとも約４０％増加される。いくつかの実施形態では、細胞は、尿素サイクル関連遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００２２】
細胞中の１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整する方法が、本明細書にさらに提供される。この方法は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−Ｂ）シグナル伝達経路を調整することができる場合がある有効量の化合物を細胞に導入することを含む。尿素サイクル関連遺伝子は、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＮＡＧＳ、ＡＲＧ１、ＳＬＣ２５Ａ１３、及びＳＬＣ２５Ａ１５から選択され得る。化合物は、小分子、ポリペプチド、抗体、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド、またはゲノム編集剤であり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を活性化する。いくつかの実施形態では、化合物は、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、ＢＭＰ２、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、アクチビン、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、ノーダル、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、抗ミュラー管ホルモン、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、化合物は、尿素サイクル関連遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、尿素サイクル関連遺伝子の発現は、少なくとも約４０％増加される。いくつかの実施形態では、細胞は、尿素サイクル関連遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００２５】
本発明はまた、細胞中のＣＰＳ１遺伝子の発現を調整する方法を提供する。この方法は、ＣＰＳ１遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＬＡＮＣＬ１−ＡＳ１及びＬＡＮＣＬ１を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＬＯＣ１０７９８５９７８である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＰＳ１遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００２６】
本発明はまた、ＯＴＣ遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＯＴＣ遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＲＰＧＲを含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＬＯＣ３９２４４２を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＯＴＣ遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００２７】
本発明はまた、ＡＳＳ１遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＡＳＳ１遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＨＭＣＮ２及びＬＯＣ１０７９８７１３４を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＦＵＢＰ３及びＬＯＣ１００２７２２１７を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＳＳ１遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００２８】
本発明はまた、ＡＳＬ遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＡＳＬ遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＬＯＣ６４４６６７を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＣＲＣＰを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＳＬ遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００２９】
本発明はまた、ＮＡＧＳ遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＮＡＧＳ遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＰＰＹを含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＴＭＥＭ１０１を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＡＧＳ遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００３０】
本発明はまた、ＡＲＧ１遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＡＲＧ１遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＲＰＬ２１Ｐ６７を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＥＮＰＰ３を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＲＧ１遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００３１】
本発明はまた、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＭＲＰＳ３１を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＭＩＲ６２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【００３２】
本発明はまた、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＤＹＮＣ１Ｉ１を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＲＮＵ６−５３２Ｐを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】核中の染色体のパッケージング、染色体が組織化される局在性位相ドメイン、ＴＡＤ中の絶縁近傍、及び最後に特定の疾患遺伝子の周りのシグナル伝達中心（複数可）の配置の例を示す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、絶縁近傍のＣＴＣＦ境界の線形及び３Ｄ配置を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、直列絶縁近傍及びそのような絶縁近傍に形成された遺伝子ループを示す。
【図４】より大きな絶縁近傍内に含まれる絶縁近傍の概念、及び各々において起こり得るシグナル伝達を示す。
【図５】転写因子、シグナル伝達タンパク質、及び／またはクロマチン調節因子を含む、シグナル伝達中心の構成成分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、哺乳類対象、特にヒト対象における尿素サイクル異常症の治療のための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、尿素サイクルに関与するタンパク質（例えば、酵素または輸送体）をコードする少なくとも１つの遺伝子の調整のための化合物及び関連使用を提供する。
【００３５】
シグナル伝達分子の結合部位
シグナル伝達分子について、一連のコンセンサス結合部位、または結合部位の結合モチーフは、本発明者らによって特定されている。これらのコンセンサス配列は、シグナル伝達分子の、または１つ以上のシグナル伝達分子を含む複合体の染色体、遺伝子、またはポリヌクレオチドに沿った結合部位を反映する。これらの部位は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１１によって提供され、本明細書の表１３として下記に再現される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、結合部位は、複数のシグナル伝達分子または分子の複合体に関連している。さらに、そのようなモチーフまたは部位の非限定例はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１２によって提供され、本明細書の表１４として下記に再現される。
【００３７】
ある特定のパターンが結合モチーフに見出されることがさらに特定されている。複合体についてのそのようなパターンの一覧は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１３及び１４によって提供され、単一分子については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１５及び１６に提供される。これらの各々は、本明細書の表１５〜１８としてそれぞれ下記に再現される。
【００３８】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５のモチーフ表１３〜１６において、ある特定の指示子が、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って使用される。このコードは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１７に示され、本明細書の表１９として下記に再現される。
【００３９】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１８は、様々な細胞シグナル伝達経路において機能する転写因子（ＴＦ）及び／またはクロマチンリモデリング因子（ＣＲ）として作用するものを含む、シグナル伝達分子の一覧を提供する。本明細書に記載される方法を使用して、絶縁近傍内でコードされる一次近傍遺伝子の調節配列領域に関連する１つ以上のシグナル伝達分子の発現を阻害または活性化することができる。したがって、これらの方法は、未治療対照と比較して、治療剤による治療時に差次的に発現される１つ以上の一次近傍遺伝子のシグナル伝達シグネチャーを変更することができる。
【００４０】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１８のシグナル伝達タンパク質をコードする転写物の様々な実施形態は、内部停止コドンを含有する。これらの内部停止コドンは、複数のポリペプチドの翻訳をもたらす。一実施形態では、Ｕ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１８に教示されるシグナル伝達タンパク質の断片であるポリペプチドは、シグナル伝達特性を有し得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８〜１９などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１などの断片であり得る。非限定例として、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３〜３７などの断片であり得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１９〜２１、ならびに参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表２２−２６及び２８から選択される少なくとも１つの化合物を使用して、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または解明するために、調節配列領域に由来するＲＮＡを調整することができる。
【００４２】
ＩＩ．尿素サイクル異常症及び関連遺伝子
本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、１つ以上の尿素サイクル異常症を治療することができる。本明細書で使用される場合、「尿素サイクル異常症」という用語は、尿素サイクルの欠陥または機能不全によって引き起こされる任意の障害を指す。尿素サイクルは、タンパク質異化の産物である、アンモニアから尿素を産生する生化学反応のサイクルである。それは、カルバモイルリン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、及びアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）を含む５つの重要な酵素で構成されるが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）などの他の酵素、ならびにオルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）及びシトリンなどのミトコンドリアアミノ酸輸送体も必要とする。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「尿素サイクル関連遺伝子」は、その遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）が尿素サイクルに関与する遺伝子を指す。尿素サイクル関連遺伝子としては、ＣＰＳ１（ＣＰＳ１をコードする）、ＯＴＣ（ＯＴＣをコードする）、ＡＳＳ１（ＡＳＳ１をコードする）、ＮＡＧＳ（ＮＡＧＳをコードする）、ＡＲＧ１（ＡＲＧ１をコードする）、ＳＬＣ２５Ａ１５（ＯＲＮＴ１をコードする）、及びＳＬＣ２５Ａ１３（シトリンをコードする）が挙げられるが、これらに限定されない。尿素サイクル関連遺伝子またはそれらの調節領域における突然変異は、機能不全タンパク質の産生及び尿素サイクルの崩壊につながり得る。場合によっては、尿素サイクル異常症を有する患者は、尿素サイクル関連遺伝子の単一機能的対立遺伝子及び突然変異型対立遺伝子を担持し得る。これは、不十分な量の機能的タンパク質の産生をもたらす。この現象は、「ハプロ不全」として知られている。
【００４４】
尿素サイクルは、主に肝細胞のミトコンドリア中で起こる。肝臓によって産生された尿素は、血流に入り、ここで腎臓に移動して、最終的に尿中に排泄される。尿素サイクル中の酵素または輸送体のうちのいずれかにおける遺伝的欠陥は、高アンモニア血症（血中アンモニア上昇）またはサイクル中間体の蓄積を引き起こし得る。次いで、アンモニアは、血液を通して脳に到達し、それが脳浮腫、発作、昏睡、生存者における長期障害、及び／または死を引き起こし得る。
【００４５】
尿素サイクル異常症の発症及び重症度は、大きく異なる。それは、サイクル中の欠陥タンパク質の位置及び欠陥の重症度によって影響される。経路における最初の４つの酵素（ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、及びＡＳＬ）または共因子プロデューサー（ＮＡＧＳ）のうちのいずれかの重度の欠損または活性の完全非存在につながる突然変異は、生後数日間にアンモニア及び他の前駆体代謝物の蓄積をもたらし得る。尿素サイクルは、アンモニアの主要なクリアランスシステムであるため、この経路の完全な崩壊は、アンモニアの急速な蓄積及び関連症状の発現をもたらす。軽度〜中度の突然変異は、アンモニアを解毒するいくらかの能力を提供する広範囲の酵素機能を示し、軽度〜中度の尿素サイクル異常症をもたらす。
【００４６】
国立尿素サイクル異常症財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｒｅａ  Ｃｙｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によれば、尿素サイクル異常症の発生率は、米国において生産児８，５００人あたり１人であると推定される。個々の尿素サイクル異常症の推定発生率は、１：２，０００，０００未満〜約１：５６，５００まで異なる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＮＡ  Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｅａ  Ｃｙｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，２０１５を参照）。それらは、子供及び大人の両方で起こる。これらの異常症は、幼児において最も頻繁に診断されるが、一部の子供は、幼児期まで症状を発現しない。重篤な尿素サイクル異常症を有する新生児は、生後３６〜４８時間以内に破滅的に病気になる。軽度または中度の尿素サイクル異常症を有する子供において、症状は、早ければ１歳で見られ得る。早期症状には、肉または他の高タンパク質食品を嫌うこと、あやしても泣き止まないこと、成長障害、精神錯乱、または多動性行動が含まれる。症状は、頻繁な嘔吐のエピソード、無気力、せん妄、及び昏睡に進行し得る。軽度の尿素サイクル欠陥を有する一部の個人は、成人期に診断される。アンモニア蓄積は、病気またはストレス（例えば、ウイルス感染、手術、長期絶食、過剰な運動、及び過剰なダイエット）によって引き起こされる場合があり、血漿アンモニア濃度の複数の軽度上昇をもたらす。適切な診断及び治療がなければ、これらの個人は、永続的な脳損傷、昏睡、及び死の危険にさらされる。
【００４７】
尿素サイクル異常症の治療は、生涯のプロセスである。症状は、通常、食事制限、アミノ酸サプリメント、薬物治療、透析、及び／または血液濾過を含む戦略の組み合わせを使用することによって管理される。食事管理は、体内で産生されるアンモニアのレベルを制限するための鍵である。食物タンパク質、炭水化物、及び脂肪の慎重なバランスは、エネルギーニーズのための適正カロリー、ならびに細胞増殖及び発達のための適正必須アミノ酸を提供しながら、タンパク質摂取を低下させるために必要である。尿素サイクル異常症の種類に応じて、アルギニンまたはシトルリンなどのアミノ酸サプリメントを食事に付加してもよい。フェニル酪酸ナトリウム（ＢＵＰＨＥＮＹＬ（登録商標）、フェニル酪酸グリセロール（ＲＡＶＩＣＴＩ（登録商標））、及び安息香酸ナトリウムは、尿素サイクル異常症の治療のためのＦＤＡ承認薬である。それらは、腎臓が尿素の代わりに過剰な窒素を排泄するのを可能にする窒素結合剤として機能する。透析及び／または血液濾過は、血漿アンモニア濃度を正常な生理的レベルに迅速に低減するために使用される。他の治療及び管理オプションが失敗した場合、または新生児発症性ＣＰＳ１及びＯＴＣ欠損症については、肝移植がオプションである。移植代替案は、有効であることが証明されているが、手術のコスト、ドナーの不足、及び免疫抑制剤の起こり得る副作用は、克服困難であり得る。
【００４８】
特定の種類の尿素サイクル異常症としては、リン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）欠損症、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）欠損症、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）欠損症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）欠損症、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）欠損症、及びシトリン欠損症が挙げられるが、これらに限定されない。これらの障害のうちのいずれか１つ以上は、本明細書に記載される組成物及び方法によって治療または標的化され得る。
【００４９】
カルバモイルリン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、カルバモイルリン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）欠損症を治療することができる。ＣＰＳ１欠損症（ＭＩＭ＃２３７３００）は、ＣＰＳ１遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。ＣＰＳ１は、アンモニア及び重炭酸塩からのカルバモイルリン酸塩の合成を触媒する。ＣＰＳ１欠損症は、最も重篤な種類の尿素サイクル異常症である。ＣＰＳ１欠損症を引き起こすおよそ１０の突然変異が、ＣＰＳ１遺伝子において特定されている。完全なＣＰＳ１欠損症を有する個人は、新生児期に高アンモニア血症を急速に発現する。危機から良好に救済された子供は、繰り返される高アンモニア血症のエピソードの慢性的な危険にさらされる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＰＳ１遺伝子の発現を調整することを含む。ＣＰＳ１はまた、カルバモイルリン酸シンターゼ１、ミトコンドリア；カルバモイルリン酸シンターゼ（アンモニア）；ＥＣ  ６．３．４．１６；カルバモイルリン酸シンターゼ［アンモニア］、ミトコンドリア；カルバモイルリン酸シンテターゼＩ；カルバモイルリン酸シンテターゼＩ：ＣＰＳａｓｅ  Ｉ；ＣＰＳＡＳＥ１；及びＰＨＮと称され得る。ＣＰＳ１遺伝子は、２ｑ３４の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置２１０，４７７，６８２〜２１０，６７９，１０７における順鎖上の染色体２上にある。ＬＡＮＣＬ１−ＡＳ１（ＥＮＳＧ０００００２３４２８１）及びＬＡＮＣＬ１（ＥＮＧＳ０００００１１５３６５）は、ＣＰＳ１の上流にある遺伝子であり、ＬＯＣ１０７９８５９７８は、ＣＰＳ１の下流にある遺伝子である。ＣＰＳ１−ＩＴ１（ＥＮＳＧ０００００２８０８３７）は、順鎖上のＣＰＳ１内に位置する遺伝子である。ＣＰＳ１遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１３７３、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ３１３２７及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ００００００２１８２６を有する。ＣＰＳ１のゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される。
【００５１】
オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療することができる。ＯＴＣ欠損症（ＭＩＭ＃３１１２５０）は、ＯＴＣ遺伝子における突然変異によって引き起こされるＸ連鎖遺伝性疾患である。ＯＴＣは、カルバモイルリン酸塩とオルニチンとの間の反応を触媒して、シトルリン及びリン酸塩を形成する。５００を超えるＯＴＣ遺伝子突然変異が、ＯＴＣ欠損症を有する人々において特定されている。ＯＴＣ活性の完全な非存在によって引き起こされるこの障害の重篤な早期発症型は、通常、男性に影響を及ぼす。この形態は、ＣＰＳ１欠損症と同様に重篤である。この障害の後期発症型は、男性及び女性の両方において起こる。これらの個人は、生涯の間に高アンモニア血症を発現し、多くは高アンモニア血症に対する長期の医療管理を必要とする。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＯＴＣ遺伝子の発現を調整することを含む。ＯＴＣはまた、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ；オルニチントランスカルバモイラーゼ；ＥＣ  ２．１．３．３；ＯＴＣａｓｅ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア；ＥＣ  ２．１．３；及びＯＣＴＤとも称され得る。ＯＴＣ遺伝子は、Ｘｐ１１．４の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置３８，３５２，５４５〜３８，４２１，４５０における順鎖上の染色体Ｘ上にある。ＲＰＧＲ（ＥＮＳＧ０００００  １５６３１３）は、ＯＴＣの上流にある遺伝子であり、ＬＯＣ３９２４４２は、ＯＴＣの下流にある遺伝子である。ＴＤＧＦ１Ｐ１（ＥＮＳＧ０００００２２７９８８）は、逆鎖上のＯＴＣ内に位置する遺伝子である。ＯＴＣ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ５００９、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ００４８０及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ００００００３６４７３を有する。ＯＴＣのゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される。
【００５３】
アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）欠損症を治療することができる。シトルリン血症Ｉ型としても知られるＡＳＳ１欠損症（ＭＩＭ＃２１５７００）は、ＡＳＳ１遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。ＡＳＳ１は、シトルリンとアスパラギン酸塩からのアルギニノコハク酸塩の合成を触媒する。ＡＳＳ１欠損症を引き起こす約１１８の突然変異が、ＡＳＳ１遺伝子において特定されている。この障害の早期発症型もまた、かなり重篤であり得る。高アンモニア血症に関連する症状は、多くの場合、致命的である。罹患した個人は、いくらかの廃棄窒素を尿素サイクル中間体に組み込むことができ、これが治療を他の尿素サイクル異常症よりもわずかに容易にする。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＳＳ１遺伝子の発現を調整することを含む。ＡＳＳ１はまた、ＥＣ  ６．３．４．５、アルギニノコハク酸シンターゼ、ＡＳＳ、アルギニノコハク酸シンテターゼ１、アルギニノコハク酸シンテターゼ１、アルギニノコハク酸シンテターゼ、シトルリン−アスパラギン酸リガーゼ、及びＣＴＬＮ１とも称される。ＡＳＳ１遺伝子は、９ｑ３４．１１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置１３０，４４４，９２９〜１３０，５０１，２７４における順鎖上の染色体９上にある。ＨＭＣＮ２（ＥＮＳＧ０００００１４８３５７）及びＬＯＣ１０７９８７１３４は、ＡＳＳ１の上流にある遺伝子であり、ＦＵＢＰ３（ＥＮＳＧ０００００１０７１６４）及びＬＯＣ１００２７２２１７は、ＡＳＳ１の下流にある遺伝子である。ＬＯＣ１０５３７６２９４は、逆鎖上のＡＳＳ１の３′領域と重複する遺伝子である。ＡＳＳ１遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ４４５、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ００９６６及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１３０７０７を有する。ＡＳＳ１のゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される。
【００５５】
アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）欠損症を治療することができる。ＡＳＬ欠損症（ＭＩＭ＃２０７９００）は、ＡＳＬ遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。ＡＳＬは、アルギニノコハク酸を切断して、尿素サイクルの第４のステップにおいてアルギニン及びフマル酸塩を産生する。ＡＳＬ遺伝子中の３０を超える異なる突然変異が、世界的に特定されている。この障害は、重篤な新生児早期発症型及び後期発症型を有する。重篤な新生児発症型は、他の尿素サイクル異常症のものと区別できない。後期発症型は、急性感染またはストレスによって誘起されるエピソード性高アンモニア血症から、高アンモニア血症の任意の記録されたエピソードの非存在下での認知障害、行動異常、及び／または学習障害に及ぶ。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＳＬ遺伝子の発現を調整することを含む。ＡＳＬはまた、アルギノサクシナーゼ、ＥＣ  ４．３．２．１、ＡＳＡＬ、及びアルギニノサクシナーゼとも称され得る。ＡＳＬ遺伝子は、７ｑ１１．２１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置６６，０７５，７９８〜６６，０９３，５５８における順鎖上の染色体７上にある。ＬＯＣ６４４６６７は、ＡＳＬの上流にある遺伝子であり、ＣＲＣＰ（ＥＮＳＧ０００００２４１２５８）は、ＡＳＬの下流にある遺伝子である。ＡＳＬ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ４３５、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０４４２４及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１２６５２２を有する。ＡＳＬのゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される。
【００５７】
Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）欠損症を治療することができる。ＮＡＧＳ欠損症（ＭＩＭ＃２３７３１０）は、ＮＡＧＳ遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。ＮＡＧＳは、グルタミン酸塩及びアセチル−ＣｏＡからのＮ−アセチルグルタミン酸塩（ＮＡＧ）の産生を触媒する。ＮＡＧは、ＣＰＳ１の共因子である。ＮＡＧＳ遺伝子におけるおよそ１２の突然変異が、ＮＡＧＳ欠損症を有する人々において特定されている。ＣＰＳ１は、ＮＡＧの非存在下で不活性になるため、ＮＡＧＳ欠損症の症状は、ＣＰＳ１欠損症の症状を模倣する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＮＡＧＳ遺伝子の発現を調整することを含む。ＮＡＧＳはまた、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、ミトコンドリア、ＥＣ  ２．３．１．１、ＡＧＡＳ、及びＡＲＧＡと称され得る。ＮＡＧＳ遺伝子は、１７ｑ２１．３１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置４４，００４，５４６〜４４，００９，０６３における順鎖上の染色体１７上にある。ＰＰＹ（ＥＮＳＧ０００００１０８８４９）は、ＮＡＧＳの上流にある遺伝子であり、ＴＭＥＭ１０１（ＥＮＳＧ００００００９１９４７）は、ＮＡＧＳの下流にある遺伝子である。ＰＹＹ（ＥＮＳＧ０００００１３１０９６）は、逆鎖上のＮＡＧＳと重複する遺伝子である。ＮＡＧＳ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１６２４１７、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８Ｎ１５９及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１６１６５３を有する。ＮＡＧＳのゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される。
【００５９】
アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）欠損症を治療することができる。ＡＲＧ１欠損症（ＭＩＭ＃２０７８００）は、ＡＲＧ１遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。ＡＲＧ１は、尿素サイクルにおける最終ステップである、オルニチン及び尿素へのアルギニンの加水分解を触媒する。酵素機能の部分的または完全な喪失を引き起こす４０を超える突然変異が、ＡＲＧ１遺伝子において見出されている。ＡＲＧ１の欠陥は、神経症状を伴うより微細な障害である、高アルギニン血症を引き起こす。アルギナーゼ欠損症は、通常、約３歳までに明らかになる。それは、筋肉の異常な緊張（攣縮）によって引き起こされる、特に脚における硬直として最も頻繁に出現する。他の症状には、正常より遅い成長、発達遅延及び発達上のマイルストーンの段階的喪失、知的障害、発作、震え、ならびに平衡性及び整合性の困難（運動失調）が含まれ得る。時折、高タンパク質食または病気もしくは食べ物のない期間（絶食）によって引き起こされるストレスは、アンモニアをより迅速に血中に蓄積させ得る。このアンモニアの急増は、易怒性のエピソード、拒食、及び嘔吐につながり得る。一部の罹患した個人において、アルギナーゼ欠損症の徴候及び症状は、あまり重篤でない場合があり、晩年まで出現しない場合がある。高アンモニア血症は、アルギナーゼ欠損症において稀であるか、または通常は重篤でない。アルギナーゼ欠損症は、非常に稀な障害であり、３００，０００〜１，０００，０００人あたり１人に起こると推定されている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＲＧ１遺伝子の発現を調整することを含む。ＡＲＧ１はまた、肝臓型アルギナーゼ；Ｉ型アルギナーゼ；アルギナーゼ、肝臓；及びＥＣ  ３．５．３．１とも称され得る。ＡＲＧ１遺伝子は、６ｑ２３．２の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置１３１，５７３，１４４〜１３１，５８４，３３２における順鎖上の染色体６上にある。ＲＰＬ２１Ｐ６７（ＥＮＳＧ０００００２１９７７６）は、ＡＲＧ１の上流にある遺伝子であり、ＥＮＰＰ３（ＥＮＳＧ０００００１５４２６９）は、ＡＲＧ１の下流にある遺伝子である。ＭＥＤ２３（ＥＮＳＧ０００００１１２２８２）は、逆鎖上のＡＲＧ１と重複する遺伝子である。ＡＲＧ１遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３８３、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０５０８９及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１１８５２０を有する。ＡＲＧ１のゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される。
【００６１】
オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）欠損症を治療することができる。高オルニチン血症−高アンモニア血症−ホモシトルリン血症（ＨＨＨ）症候群としても知られるＯＲＮＴ１欠損症（ＭＩＭ＃２３８９７０）は、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。ＯＲＮＴ１は、オルニチンを内部ミトコンドリア膜を通してミトコンドリアマトリックスに輸送する輸送体タンパク質であり、それが尿素サイクルに関与する。オルニチンの輸送失敗は、尿素サイクルの中断及びアンモニアの蓄積をもたらす。Ｆ１８８ｄｅｌｔａ、Ｅ１８０Ｋ、Ｔ３２Ｒ、Ｑ８９Ｘ、Ｇ２７Ｒ、Ｇ１９０Ｄ、Ｒ２７５Ｑ、及び１３ｑ１４微小欠失等を含む、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子におけるおよそ１７の突然変異が、ＯＲＮＴ１欠損症を有する個人において特定されている（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９９  Ｊｕｎ；２２（２）：１５１−８、Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）６０，４２３−４２９、Ｓａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｒｉｅｆ  ＃４５７（２００１））。罹患した新生児は、典型的に、無気力、筋緊張低下、及び発作を呈する。未治療の場合、生後数日以内に死亡する。生存者の大半は、錐体路徴候を有し、痙性対麻痺を伴う（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９２  Ｎｏｖ；１２１（５  Ｐｔ  １）：７２５−３０、Ｓａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００１；５７（５）：９１１）。大部分は、ミオクローヌス発作、運動失調、及び精神遅滞を有する。この障害のより軽度な形態は、成人において報告されており、タンパク質に富む食事の後に徴候的となる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子の発現を調整することを含む。ＳＬＣ２５Ａ１５はまた、溶質キャリアファミリー２５メンバー１５、溶質キャリアファミリー２５（ミトコンドリアキャリア、オルニチン輸送体）メンバー１５、オルニチン輸送体１、ＯＲＮＴ１、ミトコンドリアオルニチン輸送体１、Ｄ１３Ｓ３２７、ＯＲＣ１、及びＨＨＨとも称され得る。ＳＬＣ２５Ａ１５は、１３ｑ１４．１１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置４０，７８９，４１２〜４０，８１０，１１１における順鎖上の染色体１３上にある。ＭＲＰＳ３１（ＥＮＳＧ０００００１０２７３８）は、ＳＬＣ２５Ａ１５の上流にある遺伝子であり、ＭＩＲ６２１（ＥＮＳＧ０００００２０７６５２）は、ＳＬＣ２５Ａ１５の下流にある遺伝子である。ＴＰＴＥ２Ｐ５（ＥＮＳＧ０００００１６８８５２）は、逆鎖上のＳＬＣ２５Ａ１５と重複する遺伝子である。ＳＬＣ２５Ａ１５は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１０１６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９Ｙ６１９及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１０２７４３を有する。ＳＬＣ２５Ａ１５のゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される。
【００６３】
シトリン欠損症
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して、シトリン欠損症を治療することができる。シトルリン血症ＩＩ型としても知られるシトリン欠損症（新生児発症ＭＩＭ＃６０５８１４及び成人発症＃６０３４７１）は、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。シトリンは、尿素サイクルへのアスパラギン酸塩の輸送体に関与する輸送体タンパク質である。シトリンの喪失は、アスパラギン酸塩の輸送をブロックし、ＡＳＳがアルギニノコハク酸塩を産生する能力を減少させる。ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子における２０を超える突然変異が、成人発症ＩＩ型シトルリン血症を有する人々において特定されている。それは、新生児においては、シトリン欠損症によって引き起こされる新生児肝内胆汁うっ滞（ＮＩＣＣＤ）として、年長児においてはシトリン欠損症によって引き起こされる成長障害及び脂質異常（ＦＴＴＤＣＤ）として、及び成人においてはＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）における神経精神症状を伴う再発性高アンモニア血症として現れ得る。新生児肝内胆汁うっ滞の原因としてのシトリン欠損症は、ほとんど排他的にアジア人幼児において起こる（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  ２００６；１４８：６４２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１４  Ａｕｇ；２３３（４）：２７５−８１、Ｔｚｕｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｑｕｅｓ．，ＥＣ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２．５（２０１６）、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６  Ｊｕｌ  １１；６：２９７３２）。この疾患の成人発症形態は、脂肪肝、高アンモニア血症、及び神経症状を特徴とする（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；１０７：５３７、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｎｕｔｒ  ２０１０；５０：６８２）。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子の発現を調整することを含む。ＳＬＣ２５Ａ１３はまた、溶質キャリアファミリー２５メンバー１３、ミトコンドリアアスパラギン酸塩グルタミン酸塩キャリア２、溶質キャリアファミリー２５（アスパラギン酸塩／グルタミン酸塩キャリア）メンバー１３、ＡＲＡＬＡＲ２、シトリン、カルシウム結合ミトコンドリアキャリアタンパク質Ａｒａｌａｒ２、及びＣＴＬＮ２とも称され得る。ＳＬＣ２５Ａ１３は、７ｑ２１．３の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置９６，１２０，２２０〜９６，３２２，１４７における逆鎖上の染色体７上にある。ＤＹＮＣ１Ｉ１（ＥＮＳＧ０００００１５８５６０）は、ＳＬＣ２５Ａ１３の上流にある遺伝子であり、ＲＮＵ６−５３２Ｐ（ＥＮＳＧ０００００２０７０４５）は、ＳＬＣ２５Ａ１３の下流にある遺伝子である。ＣＹＣＳＰ１８、ＭＩＲ５９１（ＥＮＳＧ０００００２０８０２５）、及びＲＰＬ２１Ｐ７４は、ＳＬＣ２５Ａ１３内に位置する遺伝子である。ＳＬＣ２５Ａ１３は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１０１６５、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＵＪＳ０及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００００４８６４を有する。ＳＬＣ２５Ａ１３のゲノム配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される。
【００６５】
ＩＩＩ．本発明の組成物及び方法
本発明は、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整して、尿素サイクル異常症を治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法のうちのいずれか１つ以上を使用して、対象における尿素サイクル異常症を治療することができる。
【００６６】
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本発明による組成物での治療が提供される動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、対象は、尿素サイクル異常症、例えば、ＣＰＳ１欠損症、ＯＴＣ欠損症、ＡＳＳ１欠損症、ＡＳＬ欠損症、ＮＡＧＳ欠損症、ＡＲＧ１欠損症、ＯＲＮＴ１欠損症、及び／またはシトリン欠損症を診断されているか、またはその症状を有し得る。他の実施形態では、対象は、尿素サイクル異常症、例えば、ＣＰＳ１欠損症、ＯＴＣ欠損症、ＡＳＳ１欠損症、ＡＳＬ欠損症、ＮＡＧＳ欠損症、ＡＲＧ１欠損症、ＯＲＮＴ１欠損症、及び／またはシトリン欠損症にかかり易いか、またはその危険性があり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、対象は、尿素サイクル関連遺伝子内またはその付近に突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＰＳ１遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＯＴＣ遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳＳ１遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳＬ遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＮＡＧＳ遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＲＧ１遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、尿素サイクル関連遺伝子の１つの機能的対立遺伝子及び１つの突然変異型対立遺伝子を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象は、尿素サイクル関連遺伝子の２つの突然変異型対立遺伝子を担持し得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの尿素サイクル関連遺伝子の発現の調節不全を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの尿素サイクル関連タンパク質の欠乏を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、部分的に機能的である少なくとも１つの尿素サイクル関連タンパク質を有し得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、細胞または対象における尿素サイクル関連遺伝子の発現を増加させることができる。遺伝子発現の変化は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される様々な技法、例えばＲＮＡ−ｓｅｑ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで評価され得る。遺伝子発現の変化は、治療した細胞または対象における標的遺伝子発現のレベルを、未治療または対照の細胞または対象における発現のレベルで除算することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、約２５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約８０％、約８０％〜約１００％、約１００％〜約１２５％、約１００〜約１５０％、約１５０％〜約２００％、約２００％〜約３００％、約３００％〜約４００％、約４００％〜約５００％、または５００％超の尿素サイクル関連遺伝子の発現の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１５倍、約１８倍、約２０倍、約２５倍、または３０倍超の尿素サイクル関連遺伝子の発現の倍率変化を引き起こす。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法によって誘導される尿素サイクル関連遺伝子の発現の増加は、尿素サイクル異常症の１つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。
【００７２】
小分子
いくつかの実施形態では、尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整するために使用される化合物は、小分子を含み得る。本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、低分子量薬物、すなわち、生物学的プロセスの調節を助け得る５０００ダルトン未満の有機化合物を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの構成成分（例えば、転写因子、シグナル伝達タンパク質）を干渉し、それによってこれらの遺伝子の発現を調整する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、絶縁近傍の境界を変更する、及び／または１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子に関連するシグナル伝達中心を崩壊させ、それによってこれらの遺伝子の発現を調整する。
【００７３】
小分子スクリーニングを実施して、絶縁近傍のシグナル伝達中心を通して作用する小分子を特定して、尿素サイクル関連遺伝子の選択群の発現を調整し得る遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することができる。例えば、既知のシグナル伝達アゴニスト／アンタゴニストが投与され得る。信用できるヒットは、シグナル伝達中心を通して作用し、標的遺伝子の発現を調整することが知られている小分子によって特定され、検証される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる小分子化合物としては、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、アファチニブ、ベシル酸アムロジピン、アムバチニブ、ＡＺＤ２８５８、ＢＡＹ  ８７−２２４３、ＢＩＲＢ  ７９６、ｂｍｓ−９８６０９４（ｉｎｘ−１８９）、ボスチニブ、カルシトリオール、ＣＤ  ２６６５、セリチニブ、ＣＩ−４ＡＳ−１、ＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）、ＣＰ−６７３４５１、クレノラニブ、クリゾチニブ、ダラプラジブ、ダサチニブ、デオキシコルチコステロン、エキノマイシン、エンザスタウリン、エピネフリン、エルロチニブ、ＥＶＰ−６１２４（塩酸塩）（エンセニクリン）、ＥＷ−７１９７、ＦＲＡＸ５９７、ＧＤＣ−０８７９、ＧＯ６９８３、ＧＳＫ２３３４４７０、ＧＺＤ８２４ジメシレート、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、メレスチニブ、ＭＫ−０７５２、モメロチニブ、オリゴマイシンＡ、ＯＳＵ−０３０１２、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ＰＨＡ−６６５７５２、フェンホルミン、ホルボール１２，１３−ジブチラート、ピフィスリン−μ、ＰＮＤ−１１８６、プレドニゾン、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、リファンピシン、セマキシニブ、ＳＩＳ３、ＳＫＬ２００１、ＳＭＩ−４ａ、Ｔ０９０１３１７、ＴＦＰ、サリドマイド、チボザニブ、ＴＰ−４３４（エラバサイクリン）、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、及びジボテンタン、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物のうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを対象に投与して、ＣＰＳ１欠損症、ＯＴＣ欠損症、ＡＳＳ１欠損症、ＡＳＬ欠損症、ＮＡＧＳ欠損症、ＡＲＧ１欠損症、ＯＲＮＴ１欠損症、及び／またはシトリン欠損症などの尿素サイクル異常症を治療することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＮＳＣ  ３３０５０７またはＣＰ  １２７３７４としても知られる１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）は、５ｎＭの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）、正常細胞に由来するＨＳＰ９０よりも腫瘍細胞に由来するＨＳＰ９０について１００倍高い結合親和性を有する強力なＨＳＰ９０阻害剤である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、アファチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＢＩＢＷ２９９２としても知られるアファチニブは、それぞれ０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、１０ｎＭ、及び１４ｎＭのＩＣ５０を有するＥＧＦＲ（野生型）、ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ）、ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）、及びＨＥＲ２を含む、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）／ＨＥＲ２を可逆的に阻害する。それは、ゲフィチニブ耐性Ｌ８５８Ｒ−Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ突然変異体に対して１００倍活性が高い。
【００７７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ベシル酸アムロジピン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。Ｎｏｒｖａｓｃとしても知られるアムロジピンは、１．９ｎＭのＩＣ５０を有する長期作用性カルシウムチャネル遮断薬である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、アムバチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＭＰ−４７０としても知られるアムバチニブは、それぞれ１０ｎＭ、４０ｎＭ、及び８１ｎＭのＩＣ５０を有するｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、及びＦＬＴ３の強力な多標的化阻害剤である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＡＺＤ２８５８、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＡＺＤ２８５８は、６８ｎＭのＩＣ５０を有する選択的ＧＳＫ−３阻害剤である。それは、ラットにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化し、骨質量を増加させる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＢＡＹ  ８７−２２４３、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＢＡＹ  ８７−２２４３は、強力かつ選択的な低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）阻害剤である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＢＩＲＢ  ７９６、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ドラマピモドとしても知られるＢＩＲＢ  ７９６は、０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）、ＪＮＫ２と比較して３３０倍優れた選択性を有する高度に選択的なｐ３８α  ＭＡＰＫ阻害剤である。それは、ｃ−ＲＡＦ、Ｆｙｎ、及びＬｃｋに対して弱い阻害を示し、ＥＲＫ−１、ＳＹＫ、ＩＫＫ２、ＺＡＰ−７０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＫＡ、ＰＫＣ、及びＰＫＣα／β／γのわずかな阻害を示す。
【００８２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ｂｍｓ−９８６０９４（ｉｎｘ−１８９）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＩＮＸ−０８１８９、ＩＮＸ−１８９、またはＩＤＸ−１８９としても知られるＢｍｓ−９８６０９４は、グアノシンヌクレオチド類似体（２′−Ｃ−メチルグアノシン）のプロドラッグである。Ｂｍｓ−９８６０９４は、もともとＩｎｈｉｂｉｔｅｘ（２０１２年にＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって買収される）によって開発されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）阻害剤である。それは、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療のための第ＩＩ相臨床治験中であった。しかしながら、この研究は、予想外の心臓及び腎臓の有害事象に起因して中止された。
【００８３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ボスチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＳＫＩ−６０６としても知られるボスチニブは、それぞれ１．２ｎＭ及び１ｎＭのＩＣ５０を有する新規のデュアルＳｒｃ／Ａｂｌ阻害剤である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、カルシトリオール、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３またはＲｏｃａｌｔｒｏｌとしても知られるカルシトリオールは、ビタミンＤのホルモン的に活性な形態であり、カルシトリオールは、ビタミンＤ受容体を活性化するビタミンＤ３の活性代謝物である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＣＤ  ２６６５、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＣＤ  ２６６５は、それぞれＲＡＲγ、ＲＡＲβ、及びＲＡＲαに対して１１０ｎＭ、３０６ｎＭ、及び１０００ｎＭ超のＫｄ値を有する選択的ＲＡＲβγアンタゴニストである。それは、レチノイン酸誘導アポトーシスをエクスビボでブロックする。
【００８６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、セリチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＬＤＫ３７８としても知られるセリチニブは、０．２ｎＭのＩＣ５０を有するＡＬＫに対する強力な阻害剤であり、それぞれＩＧＦ−１Ｒ及びＩｎｓＲに対して４０倍及び３５倍の選択性を呈する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＣＩ−４ＡＳ−１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＣＩ−４ＡＳ−１は、強力なステロイドアンドロゲン受容体アゴニスト（ＩＣ５０＝１２ｎＭ）である。それは、５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の作用を模倣する。それは、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターをトランス活性化し、ＭＭＰ１プロモーター活性を抑制する。また、それぞれ６ｎＭ及び１０ｎＭのＩＣ５０値を有する５α−レダクターゼＩ型及びＩＩ型を阻害する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ロシレチニブとしても知られるＣＯ−１６８６は、Ｔ７９０Ｍを含むＥＧＦＲの突然変異体形態を特異的に標的とする、新規の不可逆的な経口的に送達されるキナーゼ阻害剤である（ＩＣ５０＝２１ｎＭ）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＣＰ−６７３４５１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。１０ｎＭ／１ｎＭのＩＣ５０を有するＰＤＧＦＲα／βの選択的阻害剤であり、他の血管新生受容体よりも４５０倍超の選択性を呈する。ＣＰ  ６７３４５１はまた、抗血管新生活性及び抗腫瘍活性を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、クレノラニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＣＰ−８６８５９６としても知られるクレノラニブは、２．１ｎＭ／３．２ｎＭのＫｄを有するＰＤＧＦＲα／βの強力かつ選択的な阻害剤である。それはまた、ＦＬＴ３を強力に阻害し、Ｖ５６１Ｄ突然変異ではなくＤ８４２Ｖ突然変異に対して感受性である。それは、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＥＧＦＲ−２、ＴＩＥ−２、ＦＧＦＲ−２、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、及びＳｒｃよりもＰＤＧＦＲに対して１００倍超選択的である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、クリゾチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＰＦ−２３４１０６６としても知られるクリゾチニブは、それぞれ１１ｎＭ及び２４ｎＭのＩＣ５０を有するｃ−Ｍｅｔ及びＡＬＫの強力な阻害剤である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ダラプラジブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ダラプラジブは、２７０ｐＭのＩＣ５０を有するリポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）の選択的で経口的に活性な阻害剤である。Ｌｐ−ＰＬＡ２は、脂質代謝を炎症と関連付けることができ、主要な動脈中に存在する動脈硬化プラークの安定性の増加につながる。ダラプラジブは、アテローム性動脈硬化のための考えられる追加の治療として研究されている。
【００９３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ダサチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ダサチニブは、それぞれの１ｎＭ未満、０．８ｎＭ、及び７９ｎＭのＩＣ５０を有する、Ａｂｌ、Ｓｒｃ、及びｃ−Ｋｉｔを標的とする新規の強力な多標的化阻害剤である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、デオキシコルチコステロン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。酢酸デオキシコルチコステロンは、副腎皮質ステロイドの置換療法のための筋肉内注射に使用されるステロイドホルモンである。デオキシコルチコステロンの１１β−ヒドロキシル化は、コルチコステロンにつながる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、エキノマイシン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）は、解糖、血管新生、移動、及び侵入に関与する遺伝子を制御する転写因子である。エキノマイシンは、ＨＩＦ−１媒介性遺伝子転写の細胞透過性阻害剤である。それは、配列特異的にＤＮＡに挿入し、低酸素反応性エレメントへのＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−１βのいずれかの結合をブロックすることによって作用する。エキノマイシンは、１．２ｎＭの半最大有効濃度（ＥＣ５０）値を有するＵ２１５細胞中の低酸素誘導ＨＩＦ−１転写活性を可逆的に阻害する。それは、血管内皮増殖因子の低酸素誘導発現を阻害し、血管新生をブロックし、海馬ニューロン中の興奮性シナプス伝達を変更する。エキノマイシンはまた、スルビビンの発現を障害し、メルファランに対する複数の骨髄腫細胞の感受性を強化する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、エンザスタウリン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＬＹ３１７６１５としても知られるエンザスタウリンは、６ｎＭのＩＣ５０を有する強力なＰＫＣβ選択的阻害剤であり、ＰＫＣα、ＰＫＣγ、及びＰＫＣεに対して６〜２０倍の選択性を呈する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、エピネフリン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。エピネフリンＨＣｌは、ホルモン及び神経伝達物質である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、エルロチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。エルロチニブは、ヒトｃ−Ｓｒｃまたはｖ−ＡｂｌよりもＥＧＦＲに対して感受性が１０００倍超高い、２ｎＭのＩＣ５０を有するＥＧＦＲ阻害剤である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＥＶＰ−６１２４（塩酸塩）（エンセニクリン）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。エンセニクリンとしても知られるＥＶＰ−６１２４塩酸塩は、α７ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の新規の部分アゴニストである。ＥＶＰ−６１２４は、α７  ｎＡＣｈＲに対する選択性を示し、ヘテロマー性α４β２  ｎＡＣｈＲを活性化または阻害しない。
【０１００】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＥＷ−７１９７を含み得る。ＥＷ−７１９７は、それぞれ１３ｎＭ及び１１ｎＭのＩＣ５０を有する、非常に強力な選択的で経口的にバイオアベイラブルなＴＧＦ−β受容体ＡＬＫ４／ＡＬＫ５阻害剤である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＦＲＡＸ５９７、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＦＲＡＸ５９７は、それぞれＰＡＫ１、ＰＡＫ２、及びＰＡＫ３に対して８ｎＭ、１３ｎＭ、及び１９ｎＭのＩＣ５０を有するグループＩ  ＰＡＫの強力なＡＴＰ競合阻害剤である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＧＤＣ−０８７９、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＧＤＣ−０８７９は、ｃ−ＲＡＦに対して同様に活性を有する０．１３ｎＭのＩＣ５０を有する新規の強力な選択的Ｂ−Ｒａｆ阻害剤である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＧＯ６９８３、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＧＯ６９８３は、それぞれ７ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、及び１０ｎＭのＩＣ５０を有するＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣγ、及びＰＫＣδに対するｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤である。それは、ＰＫＣζに対してあまり強力ではなく、ＰＫＣμに対して不活性である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＧＳＫ２３３４４７０、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＧＳＫ２３３４４７０は、約１０ｎＭのＩＣ５０を有し、他の密接に関連するＡＧＣ−キナーゼにおいて活性を有しない新規のＰＤＫ１阻害剤である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＧＺＤ８２４ジメシレート、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＧＺＤ８２４は、それぞれ０．３４ｎＭ及び０．６８ｎＭのＩＣ５０を有するＢｃｒ−Ａｂｌ（野生型）及びＢｃｒ−Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）に対する新規の経口的にバイオアベイラブルなＢｃｒ−Ａｂｌ阻害剤である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。アルドキソルビシンとしても知られるＩＮＮＯ−２０６は、抗新生物活性を有するアントラサイクリン抗生物質ドキソルビシン（ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）の６−マレイミドカプロイルヒドラゾン誘導体プロドラッグである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＬＤＮ１９３１８９、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＬＤＮ１９３１８９は、それぞれ５ｎＭ及び３０ｎＭのＩＣ５０を有するＢＭＰ  Ｉ型受容体ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の転写活性を阻害する選択的ＢＭＰシグナル伝達阻害剤であり、ＴＧＦ−Ｂと比較してＢＭＰに対して２００倍の選択性を呈する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＬＤＮ−２１２８５４、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＬＤＮ−２１２８５４は、ＡＬＫ２に対して１．３ｎＭのＩＣ５０を有する強力かつ選択的なＢＭＰ受容体阻害剤であり、それぞれＡＬＫ１、ＡＬｋ３、ＡＬＫ４、及びＡＬＫ５よりも約２倍、６６倍、１６４１倍、及び７１３５倍の選択性を呈する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、メレスチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＬＹ２８０１６５３としても知られるメレスチニブは、２ｎＭのＫｄ、０．００１３２分−１の薬力学的滞留時間（Ｋｏｆｆ）、及び５２５分の半減期（ｔ１／２）を有する、ＭＥＴチロシンキナーゼのＩＩ型ＡＴＰ競合スローオフ（ｓｌｏｗ−ｏｆｆ）阻害剤である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＭＫ−０７５２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＭＫ−０７５２は、５ｎＭのＩＣ５０値を有する、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡβ４０へのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断を低減する、γ−セクレターゼの強力な可逆的阻害剤である。経口的に投与されたＭＫ−０７５２が、アカゲザルの脳において新たなアミロイドβタンパク質の生成を用量依存的に低減するため、それは、経口的にバイオアベイラブルであり、血液脳関門を通過する。ＮＯＴＣＨ経路に対するその効果を通じて、ＭＫ−０７５２は、腫瘍移植片中の乳癌幹細胞の数を低減し、乳癌腫瘍を有するマウスにおける化学療法薬ドセタキセルの有効性を強化する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、モメロチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＣＹＴ３８７としても知られるモメロチニブは、１１ｎＭ／１８ｎＭのＩＣ５０及びＪＡＫ３と比較しておよそ１０倍の選択性を有する、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２のＡＴＰ競合阻害剤である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、オリゴマイシンＡ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。オリゴマイシンＡは、ＡＴＰシンターゼの阻害剤であり、酸化的リン酸化及びミトコンドリアの結合膜上で起こる全てのＡＴＰ依存的プロセスを阻害する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＯＳＵ−０３０１２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＯＳＵ−０３０１２は、５μＭのＩＣ５０及びＯＳＵ−０２０６７よりも２倍の効力の増加を有する、組み換えＰＤＫ−１の強力な阻害剤である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＳＢ１５１８としても知られるパクリチニブは、それぞれ無細胞アッセイにおいて２３ｎＭ及び２２ｎＭのＩＣ５０を有する、強力かつ選択的な阻害剤ＪＡＫ２及びＦＬＴ３である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＰＨＡ−６６５７５２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＰＨＡ−６６５７５２は、９ｎＭのＩＣ５０、ＲＴＫまたはＳＴＫよりもｃ−Ｍｅｔに対して５０倍超の選択性を有する、強力かつ選択的なＡＴＰ競合ｃ−Ｍｅｔ阻害剤である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、フェンホルミン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。塩酸フェンホルミンは、ビグアニドクラスからの抗糖尿病薬である、フェンホルミンの塩酸塩である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ホルボール１２，１３−ジブチラート、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ホルボール１２，１３−ジブチラートは、タンパク質キナーゼＣ活性化剤である。それは、血管平滑筋の収縮を誘導し、血管平滑筋中のＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）を阻害する。活性は、細胞内Ｃａ２＋濃度を変更しない。それはまた、オポッサム腎細胞中のＮａ＋、Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの活性を阻害する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ピフィスリン−μ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ピフィスリン−μは、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２に対するその親和性を低減することによってｐ５３活性を特異的に阻害し、それはまた、ＨＳＰ７０機能及び自食作用を阻害する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＰＮＤ−１１８６、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＰＮＤ−１１８６、ＶＳ−４７１８は、１．５ｎＭのＩＣ５０を有する可逆的かつ選択的な焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、プレドニゾン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。プレドニゾンは、抗炎症活性及び免疫抑制活性を有する合成グルココルチコイドである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。Ｒ７８８ナトリウム塩水和物（フォスタマチニブ）、活性代謝物Ｒ４０６のプロドラッグは、４１ｎＭのＩＣ５０を有する強力なＳｙｋ阻害剤である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、リファムピシン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。リファムピシンは、細菌性ＤＮＡ依存的ＲＮＡ合成を阻害するため、リファマイシンクラスの抗生物質のメンバーである（Ｋｉ＝約１ｎＭ）。この化合物は、ヒトにおけるＲＮＡ合成に直接影響しないが、抗生物質としてのその使用は、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ、ＥＣ５０＝約２μＭ）の活性化に向かうその効力によって制限され、これが薬物代謝を変更する酵素の上方調節をもたらす。核受容体ＰＸＲへのリファムピシンのアクセスは、ＯＡＴポリペプチド（ＯＡＴＰ）ファミリーの有機アニオン輸送体（ＯＡＴ）を介した細胞へのその輸送を必要とする。輸送体基質として作用することによって、リファムピシンは、０．５８〜１８μＭの範囲のＫｉ／ＩＣ５０値を有するＯＡＴＰを阻害する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、セマキサニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。セマキサニブは、潜在的な抗新生物活性を有するキノロン誘導体である。セマキサニブは、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のチロシンキナーゼドメインへのＡＴＰ結合を可逆的に阻害する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＳＩＳ３、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＳＩＳ３は、Ｓｍａｄ３の特異的阻害剤である。それは、ＭＡＰＫ／ｐ３８、ＥＲＫ、またはＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路に影響することなく、Ｓｍａｄ３リン酸化を抑制することによってＴＧＦ−Ｂ及びアクチビンシグナル伝達を阻害する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＳＫＬ２００１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＳＫＬ２００１は、アキシン／β−カテニン相互作用を崩壊させるＷｎｔ／β−カテニン経路の新規のアゴニストである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＳＭＩ−４ａ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＳＭＩ−４ａは、Ｐｉｍ−２に対して中度の効力を有する、１７ｎＭのＩＣ５０を有するＰｉｍ１の強力な阻害剤である。他のセリン／トレオニン−またはチロシン−キナーゼを著しく阻害しない。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、Ｔ０９０１３１７、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。Ｔ０９０１３１７は、５０ｎＭのＥＣ５０を有する、強力な非選択的ＬＸＲアゴニストである。コレステロール流出調節及びＨＤＬ代謝に関連するＡＢＣＡ１発現を増加させる。それはまた、ＰＰＡＲ−δの筋発現を増加させ、インビボで抗肥満効果を示す。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＴＦＰ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。トリフルオペラジン（ＴＦＰ）は、中枢抗アドレナリン作動性、抗ドーパミン作動性、及び最小抗コリン作動性効果を有する。それは、中間皮質及び中脳辺縁経路においてドーパミンＤ１及びＤ２受容体を遮断することによって機能すると考えられ、幻覚、妄想、ならびに混乱した思考及び発話のような統合失調症の症状を緩和または最小化する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、サリドマイド、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。サリドマイドは、鎮静薬、免疫調整薬として導入され、また多くのがんの症状を治療するために調査されている。サリドマイドは、ＣＲＢＮ−ＤＤＢ１−Ｃｕｌ４Ａ複合体である、Ｅ３ユビキチンリガーゼを阻害する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、チボザニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＡＶ−９５１としても知られるチボザニブは、３０ｎＭ／６．５ｎＭ／１５ｎＭのＩＣ５０を有するＶＥＧＦＲ１／２／３の強力かつ選択的なＶＥＧＦＲ阻害剤である。それはまた、ＰＤＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔを阻害するが、ＦＧＦＲ−１、Ｆｌｔ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦ−１Ｒに対して低い活性を呈する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＴＰ−４３４（エラバサイクリン）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。エラバサイクリンとしても知られるＴＰ−４３４は、テトラサイクリン特異的流出及びリボソーム保護を含む主要な抗生物質耐性機構を発現する細菌に対して活性を有する新規の広域フルオロサイクリン抗生物質である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＷＹＥ−１３２としても知られるＷＹＥ−１２５１３２は、０．１９ｎＭのＩＣ５０を有する、高度に強力なＡＴＰ競合ｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ対ＰＩ３ＫまたはＰＩ３Ｋ関連キナーゼｈＳＭＧ１及びＡＴＲに対して高度に選択的である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ジボテンタン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＺＤ４０５４としても知られるジボテンタンは、２１ｎＭのＩＣ５０を有する、経口的に投与される強力かつ特異的なエンドセリンＡ受容体（ＥＴＡ）受容体アンタゴニストである。
【０１３４】
ポリペプチド
いくつかの実施形態では、尿素サイクル関連遺伝子の発現を変更するための化合物は、ポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される（天然または非天然の）アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、コードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長となる。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができるポリペプチド化合物としては、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、ＢＭＰ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３ｂ）、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＧＦ−１、ノーダル、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−ａ、及びＷｎｔ３ａ、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物のうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを対象に投与して、ＣＰＳ１欠損症、ＯＴＣ欠損症、ＡＳＳ１欠損症、ＡＳＬ欠損症、ＮＡＧＳ欠損症、ＡＲＧ１欠損症、ＯＲＮＴ１欠損症、及び／またはシトリン欠損症などの尿素サイクル異常症を治療することができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、アクチビン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。アクチビンは、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−Ｂ）ファミリーの一部である、異なるβサブユニットアイソフォームのホモ二量体またはヘテロ二量体である。成熟アクチビンＡは、２つの１１６アミノ酸残基βＡサブユニット（βＡ−βＡ）を有する。アクチビンは、中胚葉誘導、神経細胞分化、骨リモデリング、造血、及び繁殖生理を含む、多種多様な生物活性を示す。アクチビンは、ＦＳＨ、ＬＨ、ＧｎＲＨ、及びＡＣＴＨなどのホルモンの産生及び調節に関与する。アクチビンＡを発現することが特定された細胞としては、線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、破骨細胞、骨髄単球、前立腺上皮、ニューロン、軟骨細胞、骨芽細胞、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞、及び卵巣顆粒膜細胞が挙げられる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、抗ミュラー管ホルモン、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。抗ミュラー管ホルモンは、雄性分化を媒介するＴＧＦ−Ｂ遺伝子ファミリーのメンバーである。抗ミュラー管ホルモンは、そうでなければ子宮及び卵管に分化するミュラー管の退行を引き起こす。抗ミュラー管ホルモンにおけるいくつかの突然変異は、持続的なミュラー管症候群をもたらす。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＢＭＰ２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）は、ＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーに属する。ＢＭＰファミリーメンバーは、胚組織及び成体組織の両方における細胞増殖及び分化の調節因子である。ＢＭＰ２は、常染色体優性遺伝疾患である進行性骨化性繊維異形成症（筋炎）に対する候補遺伝子である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＥＧＦ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、広範囲の表皮細胞及び上皮細胞の増幅を刺激する、ポリペプチド増殖因子である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＦＧＦ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＦＧＦ−１及び内皮細胞増殖因子としても知られる線維芽細胞増殖因子−酸性（ＦＧＦ−酸性）は、現在２３メンバーを含む、ＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦ酸性及び塩基性は、ファミリーの他のメンバーとは異なり、シグナルペプチドを欠き、伝統的なタンパク質分泌経路以外の機構によって明らかに分泌される。ＦＧＦ酸性は、脳内で大量に検出されている。ＦＧＦ酸性を発現することが知られている他の細胞としては、肝細胞、血管平滑筋細胞、ＣＮＳニューロン、骨格筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、腸管上皮細胞、ならびに下垂体好塩基性細胞及び好酸性細胞が挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３ｂ）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＢＭＰ３ｂとしても知られるＧＤＦ１０は、ＢＭＰファミリー及びＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーのメンバーである。ＧＤＦ１０は、大腿骨、脳、肺、骨格、筋肉、膵臓、及び精巣において発現され、結球における役割を有し、恐らくは、骨格形態形成における複数の役割を有する。ヒトでは、ＧＤＦ１０  ｍＲＮＡは、胎児の蝸牛及び肺において、ならびに成人の精巣、網膜、松果体、及び他の神経組織において見出される。これらのタンパク質は、切断されて７つの保存システイン残基を含有する成熟タンパク質を産生する、多塩基タンパク質分解性プロセシング部位を特徴とする。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＢＭＰ９としても知られるＧＤＦ２は、ＢＭＰファミリー及びＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰ９は、前脳基底核コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）の成熟、ならびにこれらの細胞がアセチルコリンに反応する能力の誘導及び維持における役割を有する。ＢＦＣＮは、学習、記憶、及び注意のプロセスに重要である。ＢＭＰ９は、肝細胞中のヘプシジン（抗菌性を有するカチオン性ペプチド）の強力な誘導因子であり、鉄代謝を調節することができる。ＢＭＰ９の生理的受容体は、アクチビン受容体様キナーゼ１、ＡＬＫ１（ＡＣＶＲＬ１としても知られる）、ＴＧＦ−Ｂ受容体ファミリーの内皮特異的Ｉ型受容体であると考えられている。ＢＭＰ９は、インビボで同所性骨形成を誘導する最も強力なＢＭＰのうちの１つである。大部分のＢＭＰのブロッカーであるＢＭＰ３は、ＢＭＰ９に影響しないと思われる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＨＧＦ／ＳＦ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ヘパトポエチンＡ及び分散因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ペプチダーゼＳ１ファミリー（プラスミノーゲンサブファミリー）に属する多面発現マイトジェンである。それは、間葉細胞によって産生され、上皮細胞、内皮細胞、及び造血前駆体細胞に作用する。ＨＧＦは、がん原遺伝子ｃ−Ｍｅｔ受容体に結合して、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化する。それは、細胞増殖、運動性、及び形態形成を調節し、また血管新生、腫瘍形成、及び組織再生において重要な役割を果たす。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＩＧＦ−１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ソマタメジンＣとしても知られるインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンと分子構造が似ているホルモンである。ヒトＩＧＦ−Ｉは、様々な組織によって変動的に発現される、２つのアイソフォーム（ＩＧＦ−ＩＡ及びＩＧＦ−ＩＢ）を有する。成熟ヒトＩＧＦ−Ｉは、マウス及びラットＩＧＦ−Ｉとそれぞれ９４％及び９６％の配列同一性を共有する。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦの別のリガンド）の両方は、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦＩＲ）を通してシグナル伝達し得るが、ＩＧＦ−ＩＩは、単独でＩＧＦ−ＩＩ受容体（ＩＧＦＩＩＲ／マンノース−６−リン酸受容体）に結合し得る。ＩＧＦ−Ｉは、子供の成長において重要な役割を果たし、成人においてタンパク質同化効果を持ち続ける。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ノーダル、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ノーダルは、ＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーの分子の１３ｋＤａメンバーである。ヒトにおいて、それは、２６アミノ酸シグナル配列、２１１アミノ酸プロドメイン、及び１１０アミノ酸成熟領域を含有する、３４７アミノ酸プレプロ前駆体として合成される。そのＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーメンバーシップと一貫して、それは、ジスルフィド結合ホモ二量体として存在し、システインノットモチーフを実証することが予想される。成熟ヒトノーダルは、それぞれ成熟イヌ、ラット、ウシ、及びマウスノーダルと９９％、９８％、９６％、及び９８％同一のアミノ酸である。ノーダルは、２つの受容体複合体を通してシグナル伝達し、これらの両方は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ受容体のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含有する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＰＤＧＦ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、２つのペプチド鎖Ａ及び鎖Ｂからなるジスルフィド結合二量体である。ＰＤＧＦは、３つのサブフォーム：ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢを有する。それは、過形成、胚ニューロン発達、走化性、及び呼吸器管上皮細胞発達を含む、いくつかの生物学的プロセスに関与する。ＰＤＧＦの機能は、２つの受容体（ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ）によって媒介される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＴＮＦ−α、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＴＮＦタンパク質スーパーファミリーのプロトタイプメンバーであるＴＮＦ−αは、ホモ三量体ＩＩ型膜タンパク質である。膜結合ＴＮＦ−αは、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によって切断されて、可溶性ホモ三量体を生成する。ＴＮＦ−αの膜及び可溶性形態の両方が、生物学的に活性である。ＴＮＦ−αは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを含む様々な免疫細胞によって産生される。ＴＮＦ−αに対する細胞反応は、受容体ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２との相互作用を通して媒介され、細胞型及び生物学的状況に依存する細胞生存及びアポトーシスの両方を好む経路の活性化をもたらす。キナーゼ経路（ＪＮＫ、ＥＲＫ（ｐ４４／４２）、ｐ３８  ＭＡＰＫ、及びＮＦ−ｋＢ）の活性化は、細胞の生存を促進するが、カスパーゼ−８のＴＮＦ−α媒介性活性化は、プログラム細胞死につながる。ＴＮＦ−αは、細菌感染、特に結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する炎症及び宿主防御において重要な調節的役割を果たす。自己免疫におけるＴＮＦ−αの役割は、関節リウマチ及びクローン病を治療するためにＴＮＦ−α作用をブロックすることによって強調される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することができる化合物は、Ｗｎｔ３ａ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌されたシグナル伝達タンパク質をコードする構造的に関連する遺伝子からなる。これらのタンパク質は、腫瘍発生、ならびに細胞運命の調節及び胚形成中のパターニングを含む、いくつかの発達プロセスにおいて実装されている。これらの遺伝子は、ＷＮＴ遺伝子ファミリーのメンバーである。マウスＷｎｔ３ａタンパク質に対して９６％、及び別のＷＮＴ遺伝子産物であるヒトＷＮＴ３タンパク質に対して８４％のアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする。この遺伝子は、染色体１ｑ４２領域内の別のファミリーメンバーであるＷＮＴ１４遺伝子とクラスター化する。
【０１４９】
抗体
いくつかの実施形態では、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を変更するための化合物は、抗体を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体、抗体断片、それらの変異体または誘導体を含む本発明の抗体は、尿素サイクル関連遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの少なくとも１つの構成成分と特異的に免疫反応性である。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の生物活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体）、及びダイアボディなどの抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、主にアミノ酸系分子であるだけでなく、糖部分を有するなど、１つ以上の修飾も含み得る。
【０１５１】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。残基「Ｆｃ」断片もまた産生され、その名前は、それが容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有しながら依然として抗原に架橋し得る、Ｆ（ａｂ′）２断片が得られる。本発明の抗体は、これらの断片のうちの１つ以上を含み得る。本明細書の目的に関しては、「抗体」は、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含み得る。
【０１５２】
「未変性抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」という用語は、配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される特定の抗体ドメインを指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。
【０１５４】
任意の脊椎動物種由来の抗体「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κとλと呼ばれる２つの明確に異なる型のいずれかに割り当てることができる。抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。無傷抗体には５つの主要なクラス、すなわち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらのドメインは一緒に、単一のポリペプチド鎖に結合される。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする。
【０１５６】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメインＶＬに接続した重鎖可変ドメインＶＨを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を生成させる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳述されており、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
本発明の抗体は、当該技術分野において既知の方法によって産生されるか、または本出願に記載されるポリクローナルまたはモノクローナルまたは組み換えであり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の細胞（またはクローン）の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体は除外され、そのような変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【０１５８】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であるが、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片が含まれる。
【０１５９】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体からの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の抗体からの超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【０１６０】
「超可変領域」という用語は、抗体を参照して本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む抗体の抗原結合ドメイン内の領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を決定する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、その標的抗原またはエピトープに相補的である構造を含む抗体の領域を指す。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、抗体模倣体であり得る。「抗体模倣体」という用語は、抗体の機能または効果を模倣し、それらの分子標的に特異的に高い親和性で結合する任意の分子を指す。そのようなものとして、抗体模倣体は、ナノボディ等を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、抗体模倣体は、当該技術分野において既知のものであり得、アフィボディ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ及びＫｕｎｉｔｚ、ならびにドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗体模倣体は、１つ以上の非ペプチド領域を含み得る。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語は、未変性抗体と比較してアミノ酸配列、組成物または構造にいくつかの相違を含む、構造及び／または機能において抗体に似ている生体分子を指す。
【０１６４】
モノクローナルであるかポリクローナルであるかにかかわらず、抗体の調製は当該技術分野において既知である。抗体の産生のための技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ″Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ″Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【０１６５】
本発明の抗体は、それらの標的分子（複数可）、それらを生成するために使用される抗原、それらの機能（アゴニストとしてもしくはアンタゴニストとして）及び／またはそれらが機能する細胞ニッチを特徴とし得る。
【０１６６】
抗体機能の測定は、インビトロまたはインビボで正常な生理的条件下、標準に対して行われ得る。測定はまた、抗体の存在または非存在に対して行われ得る。そのような測定方法には、血清または血液などの組織または流体中の標準測定、例えば、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、活性アッセイ、レポーターアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アレイ、遺伝子アレイ、リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ等が含まれる。
【０１６７】
本発明の抗体は、結合を介して（可逆的または不可逆的に）１つ以上の標的部位にそれらの効果を及ぼす。理論に束縛されるものではないが、抗体の結合部位を表す標的部位は、最も多くの場合、タンパク質またはタンパク質ドメインまたは領域によって形成される。しかしながら、標的部位はまた、糖、脂質、核酸分子または任意の他の形態の結合エピトープなどの生体分子を含み得る。
【０１６８】
代替として、または追加として、本発明の抗体は、結合またはコンジュゲートされた薬物ペイロードを特定の標的部位に送達または輸送するように作用する、リガンド模倣体または非伝統的なペイロードキャリアとして機能し得る。
【０１６９】
本発明の抗体によって引き出される変化は、細胞中の新形態変化をもたらし得る。本明細書で使用される場合、「新形態変化」は、新たなまたは異なる変化または変更である。そのような変化は、細胞外、細胞内及び細胞間シグナル伝達を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物または薬剤は、タンパク分解性事象を変更または制御するように作用する。そのような事象は、細胞内または細胞外であり得る。
【０１７１】
本発明の化合物、ならびにそれらを生成するために使用される抗原は、主にアミノ酸系分子である。これらの分子は、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」であり得る。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２〜５０個以上のアミノ酸を有するアミノ酸系分子を指す。特別な指示語が、より小さいペプチドに適用され、「ジペプチド」は、２つのアミノ酸分子を指し、「トリペプチド」は、３つのアミノ酸分子を指す。５０を超える連続アミノ酸を有するアミノ酸系分子は、ポリペプチドまたはタンパク質とみなされる。
【０１７３】
「アミノ酸」及び「アミノ酸」という用語は、全て天然に存在するＬ−α−アミノ酸ならびに非天然に存在するアミノ酸を指す。アミノ酸は、以下のような１文字または３文字のいずれかの指示語によって特定され：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、アミノ酸は、最初にそれぞれ３文字コード及び１文字コードによって挿入句的に列挙される。
【０１７４】
ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション機構を介して機能するものを含むオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ構築物（ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等）、アプタマー及びリボザイムなどの一本鎖または二本鎖にかかわらず、尿素サイクル関連遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更するために、または摂動刺激として使用され得る。
【０１７５】
そのようなオリゴヌクレオチドはまた、治療薬としても役立ち得るため、それらの治療負債及び治療成果は、それぞれ本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調べることによって改善または予測され得る。
【０１７６】
ゲノム編集アプローチ
ある特定の実施形態では、尿素サイクル関連遺伝子の発現は、尿素サイクル関連遺伝子に関連する絶縁近傍（複数可）及び／またはゲノムシグナル伝達中心（複数可）を定義する染色体領域を変更することによって調整され得る。例えば、タンパク質産生は、尿素サイクル関連遺伝子の発現を抑制するために機能する遺伝子シグナル伝達ネットワークの構成成分を標的とすることによって増加され得る。
【０１７７】
絶縁近傍に付随する遺伝子発現を変更する方法は、シグナル伝達中心を変更すること（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、シグナル伝達中心結合部位を変化させるか、または突然変異した場合に修復／置換する）ことを含む。これらの変更は、早期の／不適切な細胞死経路の活性化（多くの免疫障害の鍵となる）、過少／過剰な遺伝子産物の産生（可変抵抗器仮説としても知られる）、過少／過剰な酵素の細胞外分泌の産生、系統分化の防止、系統経路の切り替え、幹細胞性の促進、自己調節フィードバックループで開始または干渉、細胞代謝におけるエラーの開始、不適切な刷り込み／遺伝子サイレンシング、及び傷のあるクロマチン状態の形成を含む、様々な結果をもたらし得る。追加として、当該技術分野において周知のものを含むゲノム編集アプローチを使用して、コヒーシンネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすことによって新たなシグナル伝達中心を作成することができる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチは、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の特定の位置に一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を導入する方法を含み得る。そのような切断は、相同指向型修復（ＨＤＲ）及び非相同末端接合（ＮＨＥＪ）などの内因性細胞プロセスであり得、定期的に修復される。ＨＤＲは、本質的に、相同ＤＮＡ配列の存在下で二本鎖ＤＮＡ切断を修復する誤りのない機構である。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組換えである。それは、特定のＤＮＡ配列を切断ポイントで挿入または置換するためのテンプレートとして、相同配列を利用する。相同ＤＮＡ配列のテンプレートは、内因性配列（例えば、姉妹染色分体）または外因性もしくは供給された配列（例えば、プラスミドもしくはオリゴヌクレオチド）であり得る。そのようなものとして、ＨＤＲを利用して、所望の領域における置換または挿入などの精密な変更を導入することができる。対照的に、ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合する誤りがちな修復機構であり、切断部位においていくつかのヌクレオチドを喪失、付加または突然変異させる可能性がある。得られる小さな欠失または挿入（「インデル」と呼ばれる）または突然変異は、遺伝子発現を崩壊または強化し得る。追加として、同じＤＮＡ上に２つの切断が存在する場合、ＮＨＥＪは、介在セグメントの欠失または逆転につながり得る。そのため、ＮＨＥＪを利用して、切断部位に挿入、欠失または突然変異を導入することができる。
【０１７９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＣＴＣＦアンカー部位を欠失し、そのアンカー部位に関連する絶縁近傍内の遺伝子発現を調整することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２０１６を参照されたい。絶縁近傍の境界の崩壊は、関連したシグナル伝達中心の適切な機能に必要な相互作用を防止する。欠失した近傍境界に直ぐ隣接する発現遺伝子の変化もまた、そのような崩壊に起因して観察されている。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、既存のＣＴＣＦアンカー部位を修飾することができる。例えば、既存のＣＴＣＦアンカー部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを有するＮＨＥＪを誘導することによって突然変異もしくは逆転され得るか、または触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及び１つ以上のガイドＲＮＡと標的結合することによってマスクされ得る。既存のＣＴＣＦアンカー部位の変更は、既存の絶縁近傍の形成を崩壊させ、これらの絶縁近傍内に位置する遺伝子の発現を変更し得る。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、新たなＣＴＣＦアンカー部位を導入することができる。ＣＴＣＦアンカー部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及びＣＴＣＦアンカー部位の配列を含有するドナーテンプレートを有する選択部位にＨＤＲを誘導することによって導入され得る。新たなＣＴＣＦアンカー部位の導入は、新たな絶縁近傍を作成する、及び／または既存の絶縁近傍を変更することができ、それがこれらの絶縁近傍の隣に位置する遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、シグナル伝達中心結合部位を変えることによってシグナル伝達中心を変更することができる。例えば、シグナル伝達中心結合部位が、関連した転写因子とのシグナル伝達中心のアセンブリに影響を及ぼす突然変異を含む場合、突然変異部位は、供給された訂正ドナーテンプレートの存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを使用して、突然変異またはその付近に二本鎖ＤＮＡ切断を導入することによって修復され得る。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、絶縁近傍（例えば、エンハンサー）内の領域に結合することによって近傍遺伝子の発現を調整し、転写をブロックすることができる。そのような結合は、シグナル伝達中心への転写因子の動員及び転写の開始を防止し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＤＮＡを切断しない触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、これらの遺伝子のコード領域における短い欠失の導入を介して近傍遺伝子の発現をノックダウンすることができる。修復されたとき、そのような欠失は、フレームシフトをもたらし、遺伝子によって産生されたｍＲＮＡ中に早期停止コドン、続いてナンセンス変異依存分解機構を介してｍＲＮＡ分解を導入する。これは、シグナル伝達経路の活性化及び抑制構成成分の発現の調整に有用であり得、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ、ＡＳＬ、ＮＡＧＳ、及びＡＲＧ１などの疾患遺伝子を含むこれらの経路の制御下で、遺伝子発現の減少または増加をもたらす。
【０１８５】
他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、結合ネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすこともできる。
【０１８６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを利用して、特定の配列を標的とし、標的核酸を分解する細菌適応免疫系である。それらは、ゲノム編集及び／または転写調整の分野における様々な適用における使用のために適応されている。当該技術分野において既知または本明細書に開示される酵素またはオルソログのうちのいずれも、ゲノム編集のために本明細書における方法で利用することができる。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系であり得る。Ｃａｓ９は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と一緒に機能して、二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。２つのＲＮＡを操作して、ｃｒＲＮＡの３′端をｔｒａｃｒＲＮＡの５′端にリンカーループを用いて接続することによって、単一分子ガイドＲＮＡを形成することができる。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願第ＷＯ２０１３／１７６７７２は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多くの例及び適用を提供し、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓに由来するものが含まれる。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系であり得る。Ｃｐｆ１は、単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、ＩＩ型系と対照的にｔｒａｃｒＲＮＡが欠如している。Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチド５′オーバーハングを有するねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断を産生する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ２２；１６３（３）：７５９−７１は、ゲノム編集適用において使用され得るＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの例を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系には、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、及びラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来するものが含まれる。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、１つまたは他のヌクレアーゼドメインを不活化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集の特異性を高めることができる。ニッカーゼは、ＨＤＲ対ＮＨＥＪを促進することが示されている。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから向けられることもあれば、標的エリアに隣接するニッカーゼの対を用いて向けられることもある。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的領域（例えば、ＣＴＣＦアンカー部位またはエンハンサー）に結合し、それらの機能を干渉し得る。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１などのＣａｓヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを包含する。触媒部位における重要な残基を突然変異させることは、標的部位にのみ結合するが、切断をもたらさない変異体を作成する。染色体領域（例えば、ＣＴＣＦアンカー部位またはエンハンサー）への結合は、絶縁近傍またはシグナル伝達中心の適切な形成を崩壊させ、したがって標的領域の隣に位置する遺伝子の変化した発現につながり得る。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素に融合された追加の機能的ドメイン（複数可）を含み得る。機能的ドメインは、転写活性化、転写抑制、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び／またはクロマチンリモデリングを含むが、これらに限定されないプロセスに関与し得る。そのような機能的ドメインには、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４もしくはＫＲＡＢ、ＳＩＤもしくはＳＩＤ４Ｘ）、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能ドメインまたは化学的誘導性／制御可能ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、以下のうちの１つまたは組み合わせとして細胞または患者に投与され得る：１つ以上のポリペプチド、ポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、またはポリペプチドをコードする１つ以上のＤＮＡ。
【０１９３】
ガイド核酸
ある特定の実施形態では、ガイド核酸を使用して、関連したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向することができる。ガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素とのそれらの結合によって、ガイド核酸及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に対する標的特異性を提供し、したがってガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を指向することができる。
【０１９４】
一態様では、ガイド核酸は、ＲＮＡ分子であり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾され得る。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、ゲノム内の異なる部位において複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性活性を媒介するために提供され得る。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つ以上のＲＮＡ分子またはＲＮＡ配列をコードする１つ以上のＤＮＡとして細胞または患者に投与され得る。
【０１９７】
リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及びガイド核酸は各々、細胞または患者に別個に投与され得る。
【０１９８】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、１つ以上のガイド核酸と予め複合体化され得る。次に、予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
【０１９９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、本発明のゲノム編集アプローチは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を伴う。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ切断ドメインに結合している遺伝子操作ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから構成されたモジュラータンパク質である。典型的なＤＮＡ切断ドメインは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインである。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能することから、ＺＦＮの対は、対向ＤＮＡ鎖上の同族の標的「半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に対し、それら２つが触媒活性のＦｏｋＩドメインが二量体化できるようにするための正確な間隔を開けて結合するように操作されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間でゲノム編集の開始ステップとしてのＤＮＡ二本鎖切断がもたらされる。
【０２００】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ある特定の実施形態では、本発明のゲノム編集アプローチは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を伴う。ＴＡＬＥＮは、別のフォーマットのモジュラーヌクレアーゼに相当し、これはＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することによって生成され、同時並行的に作動して標的化されたＤＮＡ切断を達成する。ＺＦＮにおけるＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーモチーフからなるが、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化剤様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質に由来し、これらはもともと、植物病原性微生物Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種において説明されている。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸リピートの直列アレイから構成され、各リピートは、典型的には長さ最大２０ｂｐの標的ＤＮＡ配列（標的配列の全長は最大４０ｂｐとなる）内で単一の塩基対を認識する。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置１２及び１３にちょうど２つのアミノ酸を含む反復可変２残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ４つのＲＶＤ：Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーの場合よりもはるかに簡略な認識コードを構成するため、ヌクレアーゼ設計に関してはジンクフィンガーをしのぐ優位性に相当する。それでもＺＦＮと同様、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は特異性において絶対的ではないため、ＴＡＬＥＮも、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用による恩恵を受けてオフターゲット活性を低減している。
【０２０１】
尿素サイクル関連遺伝子の調整
本明細書に記載される組成物及び方法は、１つ以上の尿素サイクル関連遺伝子の発現を調整することにおいて有効であり得る。そのような組成物及び方法を使用して、尿素サイクル異常症を治療することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＣＰＳ１の発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＣＰＳ１発現を調整するために使用することができる化合物としては、ダサチニブ、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、ボスチニブ、エピネフリン、ＦＲＡＸ５９７、メレスチニブ、デオキシコルチコステロン、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＧＺＤ８２４ジメシレート、ＰＮＤ−１１８６、Ｗｎｔ３ａ、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン、ＴＮＦ−α、アクチビン、ＩＧＦ−１、プレドニゾン、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＥＧＦ、ＢＡＹ  ８７−２２４３、ＣＰ−６７３４５１、ＦＧＦ、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３ｂ）、ＬＤＮ１９３１８９、アムバチニブ、モメロチニブ、エキノマイシン、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ＢＭＰ２、クリゾチニブ、ＬＤＮ−２１２８５４、サリドマイド、ＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）、ジボテンタン、及びそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）は、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、Ｓｒｃシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、エピネフリンは、アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＲＡＸ５９７は、ＰＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ミネラルコルチコイド受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）は、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷代謝酵素／プロテアーゼシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＺＤ８２４ジメシレートは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＰＮＤ−１１８６は、ＦＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３ａは、ＷＮＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ノーダルは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、抗ミュラー管ホルモンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αは、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫ、またはアポトーシス経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、アクチビンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩｎｓＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、ＧＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＨＧＦ／ＳＦは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＡＹ  ８７−２２４３は、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３ｂ）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ２は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＬＤＮ−２１２８５４は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ及び／またはチロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ジボテンタンは、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質シグナル伝達経路を摂動させて、ＣＰＳ１発現を調整する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＰＳ１遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＣＰＳ１遺伝子は、２ｑ３４の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置２１０，４７７，６８２〜２１０，６７９，１０７における順鎖上の染色体２上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＣＰＳ１の発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、ｐ３００、及びＳＭＣ１が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、及びＹＹ１が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ７Ｌ２、ＥＳＲＡ、ＦＯＳ、ＮＲ３Ｃ１、ＪＵＮ、ＮＲ５Ａ２、ＲＢＰＪＫ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＲ１Ｉ１、ＮＦ−ｋＢ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＴＥＡＤ１、及びＴＰ５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＯＴＣの発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＯＴＣ発現を調整するために使用することができる化合物としては、ＣＰ−６７３４５１、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、エキノマイシン、クレノラニブ、サリドマイド、アムバチニブ、ダサチニブ、モメロチニブ、アクチビン、Ｗｎｔ３ａ、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、ＴＮＦ−α、抗ミュラー管ホルモン、ピフィスリン−μ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＲＡＸ５９７、ノーダル、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＢＩＲＢ  ７９６、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、アクチビンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３ａは、ＷＮＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）は、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αは、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫ、またはアポトーシス経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、抗ミュラー管ホルモンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−μは、ｐ５３シグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩｎｓＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＲＡＸ５９７は、ＰＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ノーダルは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では��ＨＧＦ／ＳＦは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＩＲＢ  ７９６は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＯＴＣ発現を調整する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＯＴＣ遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＯＴＣ遺伝子は、Ｘｐ１１．４の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置３８，３５２，５４５〜３８，４２１，４５０における順鎖上の染色体Ｘ上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＯＴＣの発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＢＲＤ４が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＹＹ１、及びＨＮＦ１Ａが挙げられ得るが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ７Ｌ２、ＨＩＦ１ａ、ＥＳＲＡ、ＮＲ３Ｃ１、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＦ−ｋＢ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４、及びＴＥＡＤ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＡＳＳ１の発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＡＳＳ１発現を調整するために使用することができる化合物としては、ダサチニブ、ＣＰ−６７３４５１、エキノマイシン、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、エピネフリン、ＦＲＡＸ５９７、ボスチニブ、ＴＰ−４３４（エラバサイクリン）、ＢＭＰ２、ＳＭＩ−４ａ、アムバチニブ、クレノラニブ、デオキシコルチコステロン、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、ＴＮＦ−α、Ｔ０９０１３１７、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、エピネフリンは、アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＲＡＸ５９７は、ＰＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、Ｓｒｃシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＰ−４３４（エラバサイクリン）は、テトラサイクリン特異的流出シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ２は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＳＭＩ−４ａは、ＰＩＭシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ミネラルコルチコイド受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）は、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αは、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫ、またはアポトーシス経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｔ０９０１３１７は、ＬＸＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＳ１発現を調整する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＳＳ１遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＡＳＳ１遺伝子は、９ｑ３４．１１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置１３０，４４４，９２９〜１３０，５０１，２７４における順鎖上の染色体９上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＡＳＳ１の発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、ｐ３００、及びＳＭＣ１が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＭＹＣ、及びＹＹ１が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＣＲＥＢ１、ＮＲ１Ｈ４、ＨＩＦ１ａ、ＥＳＲＡ、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＲ１Ｉ１、ＮＦ−ｋＢ、ＮＲ３Ｃ１、ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４、及びＴＥＡＤ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＡＳＬの発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＡＳＬ発現を調整するために使用することができる化合物としては、ＣＰ−６７３４５１、エキノマイシン、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ダサチニブ、オリゴマイシンＡ、メレスチニブ、アムバチニブ、クレノラニブ、エピネフリン、ＢＡＹ  ８７−２２４３、サリドマイド、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、オリゴマイシンＡは、ＡＴＰチャネルシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、エピネフリンは、アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＡＹ  ８７−２２４３は、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＳＬ発現を調整する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＳＬ遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＡＳＬ遺伝子は、７ｑ１１．２１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置６６，０７５，７９８〜６６，０９３，５５８における順鎖上の染色体７上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＡＳＬの発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、及びｐ３００が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＭＹＣが挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＲＥＢ１、ＮＲ１Ｈ４、ＨＩＦ１ａ、ＥＳＲＡ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＲＢＰＪＫ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＲ１Ｉ１、ＮＦ−ｋＢ、ＮＲ３Ｃ１、ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＴＥＡＤ１、及びＴＰ５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＮＡＧＳの発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＮＡＧＳ発現を調整するために使用することができる化合物としては、ＡＺＤ２８５８、エンザスタウリン、ボスチニブ、セマキサニブ、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、ＴＰ−４３４（エラバサイクリン）、フェンホルミン、クリゾチニブ、ＳＭＩ−４ａ、ダサチニブ、カルシトリオール、ピフィスリン−μ、ＰＨＡ−６６５７５２、ダラプラジブ、サリドマイド、ＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）、ＯＳＵ−０３０１２、プレドニゾン、ＧＳＫ２３３４４７０、アファチニブ、チボザニブ、ＳＫＬ２００１、ＧＤＣ−０８７９、ＥＶＰ−６１２４（塩酸塩）（エンセニクリン）、ベシル酸アムロジピン、Ｔ０９０１３１７、ＧＯ６９８３、アクチビン、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＳＩＳ３、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ホルボール１２，１３−ジブチラート、ＣＤ  ２６６５、エルロチニブ、セリチニブ、ＢＭＰ２、ＴＦＰ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＣＩ−４ＡＳ−１、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＺＤ２８５８は、ＧＳＫ−３シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、エンザスタウリンは、エピジェネティクスまたはＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、Ｓｒｃシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、セマキサニブは、ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）は、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＰ−４３４（エラバサイクリン）は、テトラサイクリン特異的流出シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、フェンホルミンは、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＳＭＩ−４ａは、ＰＩＭシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、カルシトリオールは、ビタミンＤ受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−μは、ｐ５３シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＰＨＡ−６６５７５２は、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴまたはチロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつか���実施形態では、ＯＳＵ−０３０１２は、ＰＤＫ−１シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、ＧＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ２３３４４７０は、ＰＤＫ−１シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、アファチニブは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、チボザニブは、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＳＫＬ２００１は、ＷＮＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＣ−０８７９は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＥＶＰ−６１２４（塩酸塩）（エンセニクリン）は、膜輸送体／イオンチャネルシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ベシル酸アムロジピンは、カルシウムチャネルシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｔ０９０１３１７は、ＬＸＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＯ６９８３は、ＰＫＣシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、アクチビンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）は、ｍＴＯＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＳＩＳ３は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ホルボール１２，１３−ジブチラートは、ＰＫＣシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＤ  ２６６５は、ＲＡＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、エルロチニブは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、セリチニブは、ＡＬＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ２は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＦＰは、カルモジュリンシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＨＧＦ／ＳＦは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＩ−４ＡＳ−１は、アンドロゲン受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＮＡＧＳ発現を調整する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＮＡＧＳ遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＮＡＧＳ遺伝子は、１７ｑ２１．３１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置４４，００４，５４６〜４４，００９，０６３における順鎖上の染色体１７上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＮＡＧＳの発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、及びｐ３００が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＹＹ１、及びＨＮＦ１Ａが挙げられ得るが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ７Ｌ２、ＨＩＦ１ａ、ＡＨＲ、ＥＳＲＡ、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＲ１Ｉ１、ＮＦ−ｋＢ、ＮＲ３Ｃ１、ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４、ＴＥＡＤ１、及びＴＰ５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＡＲＧ１の発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＡＲＧ１発現を調整するために使用することができる化合物としては、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、ダサチニブ、ＣＰ−６７３４５１、メレスチニブ、エキノマイシン、アムバチニブ、エピネフリン、ボスチニブ、Ｗｎｔ３ａ、抗ミュラー管ホルモン、ノーダル、アクチビン、ＩＧＦ−１、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、ＴＮＦ−ａ、ピフィスリン−μ、ＰＤＧＦ、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、クレノラニブ、プレドニゾン、ＨＧＦ／ＳＦ、モメロチニブ、ＥＧＦ、デオキシコルチコステロン、ＦＧＦ、サリドマイド、フェンホルミン、チボザニブ、ＢＡＹ  ８７−２２４３、ＧＺＤ８２４ジメシレート、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３ｂ）、ＰＮＤ−１１８６、ＦＲＡＸ５９７、ＢＭＰ２、オリゴマイシンＡ、リファムピシン、ＭＫ−０７５２、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）は、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、エピネフリンは、アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、Ｓｒｃシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３ａは、ＷＮＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、抗ミュラー管ホルモンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ノーダルは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、アクチビンは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩｎｓＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）は、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷代謝酵素／プロテアーゼシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αは、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫ、またはアポトーシス経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−μは、ｐ５３シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を���整する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、ＧＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＨＧＦ／ＳＦは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ミネラルコルチコイド受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、フェンホルミンは、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、チボザニブは、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＡＹ  ８７−２２４３は、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＺＤ８２４ジメシレートは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ３ｂ）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＰＮＤ−１１８６は、ＦＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＲＡＸ５９７は、ＰＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ２は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、オリゴマイシンＡは、ＡＴＰチャネルシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、リファムピシンは、ＰＸＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＭＫ−０７５２は、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路を摂動させて、ＡＲＧ１発現を調整する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＲＧ１遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＡＲＧ１遺伝子は、６ｑ２３．２の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置１３１，５７３，１４４〜１３１，５８４，３３２における順鎖上の染色体６上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＡＲＧ１の発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、及びｐ３００が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＹＹ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＭＹＣが挙げられ得るが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＨＩＦ１ａ、ＥＳＲＡ、ＮＲ３Ｃ１、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＦ１Ｉ１、ＳＭＡＤ２／３、ＳＴＡＴ１、及びＴＥＡＤ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＳＬＣ２５Ａ１５の発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整するために使用することができる化合物としては、ダサチニブ、ＦＲＡＸ５９７、メレスチニブ、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、ボスチニブ、ｂｍｓ−９８６０９４（ｉｎｘ−１８９）、エピネフリン、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、エキノマイシン、コルチコステロン、ＩＧＦ−１、ＣＰ−６７３４５１、ＧＺＤ８２４ジメシレート、ＥＷ−７１９７、ＰＤＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＦＲＡＸ５９７は、ＰＡＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）は、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、Ｓｒｃシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、エピネフリンは、アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、低酸素活性化シグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ミネラルコルチコイド受容体シグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩｎｓＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＧＺＤ８２４ジメシレートは、ＡＢＬシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＥＷ−７１９７は、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３ａは、ＷＮＴシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１５発現を調整する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＣ２５Ａ１５遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＳＬＣ２５Ａ１５は、１３ｑ１４．１１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置４０，７８９，４１２〜４０，８１０，１１１における順鎖上の染色体１３上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＳＬＣ２５Ａ１５の発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＢＲＤ４が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、及びＹＹ１が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質は、ＥＳＲＡ、Ｊｕｎ、ＲＸＲ、ＮＲ１Ｉ１、ＮＦ−ｋＢ、ＮＲ３Ｃ１、ＳＭＡＤ２／３、及びＴＰ５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、ＳＬＣ２５Ａ１３の発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。ＳＬＣ２５Ａ１３発現を調整するために使用することができる化合物としては、ＴＦＰ、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、及びそれらの誘導体または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＴＦＰは、カルモジュリンシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１３発現を調整する。いくつかの実施形態では、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）は、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷代謝酵素／プロテアーゼシグナル伝達経路を摂動させて、ＳＬＣ２５Ａ１３発現を調整する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。ＳＬＣ２５Ａ１３は、７ｑ２１．３の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置９６、１２０、２２０〜９６、３２２、１４７における逆鎖上の染色体７上にある。絶縁近傍に関連する任意のクロマチンマーク、クロマチン関連タンパク質、転写因子、及び／またはシグナル伝達タンパク質、及び／または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＳＬＣ２５Ａ１３の発現を調整する。クロマチンマーク及び／またはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、ｐ３００、及びＳＭＣ１が挙げられるが、これらに限定されない。転写因子としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＡＴＦ５、ＯＮＥＣＵＴ２、ＹＹ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＭＹＣが挙げられ得るが、これらに限定されない。シグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ７Ｌ２、ＨＩＦ１ａ、ＥＳＲＡ、ＮＲ３Ｃ１、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＮＲ１Ｉ１、ＮＦ−ｋＢ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＴＡＴ１、ＴＥＡＤ１、及びＴＰ５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、複数の尿サイクル関連遺伝子の発現を調整することによって尿素サイクル異常症を治療することができる。非限定例として、本発明の方法を使用して、以下の遺伝子の群のうちのいずれか１つの発現を調整することができる。ＮＡＧＳ、ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＯＴＣ、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＯＴＣ、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＡＳＳ１、ＣＰＳ１、ＮＡＧＳ、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＯＴＣ、及びＡＲＧ１；ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＯＴＣ、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＮＡＧＳ、ＣＰＳ１、ＡＬＳ、ＯＴＣ、及びＡＲＧ１；ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＯＴＣ、及びＡＲＧ１；ＡＳＳ１、ＣＰＳ１、ＮＡＧＳ、及びＡＲＧ１；ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＯＴＣ、及びＡＲＧ１；ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＮＡＧＳ、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、及びＡＲＧ１；ＣＰＳ１、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１３；ＣＰＳ１、ＡＲＧ１、及びＳＬＣ２５Ａ１５；ＣＰＳ１、ＡＳＬ、及びＡＲＧ１；ＣＰＳ１、ＮＡＧＳ、及びＡＲＧ１；ＣＰＳ１、ＯＴＣ、及びＡＲＧ１；ＮＡＧＳ、ＡＳＳ１、及びＯＴＣ；ＯＴＣ、ＮＡＧＳ、及びＡＲＧ１。複数の尿素サイクル関連遺伝子を調整するために使用することができる化合物としては、ダサチニブ、エキノマイシン、ＣＰ−６７３４５１、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ボスチニブ、エピネフリン、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、アムバチニブ、ＦＲＡＸ５９７、サリドマイド、クレノラニブ、ＢＭＰ２、デオキシコルチコステロン、ＴＮＦ−α、Ｗｎｔ３ａ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、アクチビン、ＨＧＦ／ＳＦ、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、ＧＺＤ８２４ジメシレート、ＢＡＹ  ８７−２２４３、プレドニゾン、ノーダル、モメロチニブ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、抗ミュラー管ホルモン、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、及びピフィスリン−μが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、複数の尿素サイクル関連遺伝子を標的化することは、各々が尿素サイクル関連遺伝子を特異的に調整する化合物の組み合わせを利用することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、複数の尿素サイクル関連遺伝子を標的化することは、複数の尿素サイクル関連遺伝子を調整することができる単一化合物を利用することによって達成され得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物を、フェニル酪酸ナトリウム（ＢＵＰＨＥＮＹＬ（登録商標））、フェニル酪酸グリセロール（ＲＡＶＩＣＴＩ（登録商標））、及び安息香酸ナトリウムなどの他の薬物と組み合わせて使用して、尿素サイクル異常症を治療することができる。
【０２２１】
ＩＶ．製剤及び送達
薬学的組成物
本発明に従い、組成物は薬学的組成物として調製され得る。そのような組成物は、１つ以上の活性成分、及び最も多くの場合、薬学的に許容される賦形剤を含む必要があることが理解されよう。
【０２２２】
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、少なくとも１つのペイロードを含み得る。非限定例として、薬学的組成物は、１、２、３、４または５つのペイロードを含み得る。
【０２２４】
本明細書に提供される薬学的組成物に関する説明は、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を主に対象としているが、そのような組成物が、一般に任意の他の動物への、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることは、当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするためにヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、存在する場合は単に通常の実験によって、そのような修飾を設計及び／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／または他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／または七面鳥などの商業的に関連する鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。
【０２２６】
製剤
本発明の製剤には、限定されないが、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象中への移動または移植のための）及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
【０２２７】
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分及び任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を指す。
【０２２８】
一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と関連付けるステップを含む。
【０２２９】
本明細書に記載される組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を１つ以上の賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と関連付け、その後、必要であれば、及び／または望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に成形及び／または梱包するステップを含む。
【０２３０】
本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、梱包、及び／または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別量を指す。活性成分の量は、対象に投与されるであろう活性成分の投与量及び／または例えば、そのような投与量の半分もしくは３分の１などのそのような投与量の便利な画分にほぼ等しい。
【０２３１】
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０２３２】
賦形剤及び希釈剤
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト及び獣医用途の使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たし得る。
【０２３３】
賦形剤には、本明細書で使用される場合、所望の特定の投薬形態に適するように、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等が含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤及びその組成物を調製するための技法は、当該技術分野において既知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照）。従来の賦形剤媒体の使用は、例えば任意の望ましくない生物学的効果をもたらすか、またはそうでなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害に相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と両立し得ない場合を除いて、本開示の範囲内で企図され得る。
【０２３４】
例示的な希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３５】
不活性成分
いくつかの実施形態では、薬学的組成物製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない１つ以上の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の製剤で使用され得る不活性成分のうちの全てまたはいくつかが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され得るか、どれも承認されない場合がある。
【０２３６】
一実施形態では、薬学的組成物は、限定されないが、１，２，６−ヘキサントリオール；１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｓ−（１−グリセロール））；１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジパルミトイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））；１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））；１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−Ｏ−トリルビグアニド；２−エチル−１，６−ヘキサンジオール；酢酸；氷酢酸；無水酢酸；アセトン；アセトン重亜硫酸ナトリウム；アセチル化ラノリンアルコール；アセチル化モノグリセリド；アセチルシステイン；ＤＬ−アセチルトリプトファン；アクリレートコポリマー；アクリル酸−イソオクチルアクリレートコポリマー；アクリル系接着剤７８８；活性炭；Ａｄｃｏｔｅ  ７２Ａ１０３；接着テープ；アジピン酸；Ａｅｒｏｔｅｘ樹脂３７３０；アラニン；凝集アルブミン；コロイド状アルブミン；ヒトアルブミン；アルコール；脱水アルコール；変性アルコール；希釈アルコール；Ａｌｆａｄｅｘ；アルギン酸；アルキルアンモニウムスルホン酸ベタイン；アルキルアリールスルホン酸ナトリウム；アラントイン；αアリル−イオノン；アーモンド油；α−テルピネオール；α−トコフェロール；α−トコフェロール酢酸塩、Ｄｌ−；α−トコフェロール、Ｄｌ−；酢酸アルミニウム；クロルヒドロキシアラントイン酸アルミニウム；水酸化アルミニウム；水酸化アルミニウム−スクロース、水和；水酸化アルミニウムゲル；水酸化アルミニウムゲルＦ  ５００；水酸化アルミニウムゲルＦ  ５０００；モノステアリン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；アルミニウムポリエステル；ケイ酸アルミニウム；アクテニルコハク酸デンプンアルミニウム；ステアリン酸アルミニウム；塩基性酢酸アルミニウム；無水硫酸アルミニウム；アメルコールＣ；アメルコール−Ｃａｂ；アミノメチルプロパノール；アンモニア；アンモニア溶液；強アンモニア溶液；酢酸アンモニウム；水酸化アンモニウム；ラウリル硫酸アンモニウム；アンモニウムノノキシノール−４硫酸塩；Ｃ−１２〜Ｃ−１５直鎖第一級アルコールエトキシレートのアンモニウム塩；硫酸アンモニウム；Ａｍｍｏｎｙｘ；両性物質−２；両性物質−９；アネトール；無水クエン酸；無水デキストロース；無水ラクトース；無水クエン酸三ナトリウム；アニス油；Ａｎｏｘｉｄ  Ｓｂｎ；消泡剤；アンチピリン；アパフルラン；杏仁油Ｐｅｇ−６エステル；Ａｑｕａｐｈｏｒ；アルギニン；Ａｒｌａｃｅｌ；アスコルビン酸；パルミチン酸アスコルビル；アスパラギン酸；ペルーバルサム；硫酸バリウム；蜜蝋；合成蜜蝋；ベヘネス−１０；ベントナイト；塩化ベンザルコニウム；ベンゼンスルホン酸；塩化ベンゼトニウム；臭化ベンゾドデシニウム；安息香酸；ベンジルアルコール；安息香酸ベンジル；塩化ベンジル；Ｂｅｔａｄｅｘ；ビバプシチド；次没食子酸ビスマス；ホウ酸；Ｂｒｏｃｒｉｎａｔ；ブタン；ブチルアルコール；ビニルメチルエーテル／マレイン酸無水物コポリマーのブチルエステル（１２５０００Ｍｗ）；ステアリン酸ブチル；ブチル化ヒドロキシアニソール；ブチル化ヒドロキシトルエン；ブチレングリコール；ブチルパラベン；酪酸；Ｃ２０−４０  Ｐａｒｅｔｈ−２４；カフェイン；カルシウム；炭酸カルシウム；塩化カルシウム；グルセプト酸カルシウム；水酸化カルシウム；乳酸カルシウム；カルコブトロール；カルジアミドナトリウム；カロキセト酸三ナトリウム；カルテリドールカルシウム；カナダバルサム；カプリル酸／カプリン酸三グリセリド；カプリル酸／カプリン酸／ステアリン酸三グリセリド；カプタン；Ｃａｐｔｉｓｏｌ；カラメル；カルボマー１３４２；カルボマー１３８２；カルボマー９３４；カルボマー９３４ｐ；カルボマー９４０；カルボマー９４１；カルボマー９８０；カルボマー９８１；カルボマーホモポリマーＢ型（架橋アリルペンタエリスリトール）；カルボマーホモポリマーＣ型（架橋アリルペンタエリスリトール）；二酸化炭素；カルボキシビニルコポリマー；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム；カルボキシポリメチレン；カラギーナン；カラギーナン塩；ひまし油；ニオイヒバ油；セルロース；微結晶セルロース；Ｃｅｒａｓｙｎｔ−Ｓｅ；セレシン；Ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−１２；Ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−１５；Ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−３０；セテアリルアルコール／セテアレス−２０；セテアリルエチルヘキサノエート；セテス−１０；セテス−２；セテス−２０；セテス−２３；セトステアリルアルコール；塩化セトリモニウム；セチルアルコール；セチルエステル蝋；パルミチン酸セチル；塩化セチルピリジニウム；クロロブタノール；クロロブタノールヘミ水和物；無水クロロブタノール；クロロクレゾール；クロロキシレノール；コレステロール；コレス；コレス−２４；クエン酸塩；クエン酸；クエン酸一水和物；含水クエン酸；コカミド硫酸エーテル；酸化コカミン；ココベタイン；ココジエタノールアミド；ココモノエタノールアミド；ココアバター；ココ−グリセリド；ココナッツ油；水素化ココナッツ油；水素化ココナッツ油／パーム核油グリセリド；ココイルカプリロカプレート；コーラニチダ種抽出物；コラーゲン；着色懸濁液；トウモロコシ油；綿実油；クリームベース；クレアチン；クレアチニン；クレゾール；クロスカルメロースナトリウム；クロスポビドン；硫酸銅；無水硫酸銅；シクロメチコン；シクロメチコン／ジメチコンコポリオール；システイン；塩酸システイン；無水塩酸システイン；Ｄｌ−システイン；Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２８；Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３３；Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３６；Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３９；Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．１０；ダルファムピリジン；Ｄａｕｂｅｒｔ  １−５  Ｐｅｓｔｒ（Ｍａｔｔｅ）１６４ｚ；デシルメチルスルホキシド；ＤｅｈｙｄａｇワックスＳｘ；デヒドロ酢酸；Ｄｅｈｙｍｕｌｓ  Ｅ；安息香酸デナトニウム；デオキシコール酸；デキストラン；デキストラン４０；デキストリン；デキストロース；デキストロース一水和物；デキストロース溶液；ジアトリゾ酸；ジアゾリジニル尿素；ジクロロベンジルアルコール；ジクロロジフルオロメタン；ジクロロテトラフルオロエタン；ジエタノールアミン；ジエチルピ��カーボネート；セバシン酸ジエチル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；フタル酸ジエチルヘキシル；アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム；ジイソプロパノールアミン；アジピン酸ジイソプロピル；ジリノール酸ジイソプロピル；ジメチコン３５０；ジメチコンコポリオール；ジメチコンＭｄｘ４−４２１０；ジメチコン医療用流体３６０；ジメチルイソソルビド；ジメチルスルホキシド；ジメチルアミノエチルメタクリレート−ブチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマー；ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト；ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサンコポリマー；ジノセブアンモニウム塩；Ｄｌ−ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；ジプロピレングリコール；ココアンフォ二酢酸二ナトリウム；ラウレススルホコハク酸二ナトリウム；ラウリルスルホコハク酸二ナトリウム；スルホサリチル酸二ナトリウム；ジソフェニン；ジビニルベンゼンスチレンコポリマー；Ｄｍｄｍヒダントイン；ドコサノール；ドクサートナトリウム；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ２８０−２５１６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ３８７−２５１６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８０−１１９６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２０７０；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２１９４；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２２８７；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２２９６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２８８８；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２９７９；エデト酸カルシウム二ナトリウム；エデト酸二ナトリウム；無水エデト酸二ナトリウム；エデト酸ナトリウム；エデト酸；卵リン脂質；エントスホン；エントスホンナトリウム；エピラクトース；エピテトラサイクリン塩酸塩；Ｅｓｓｅｎｃｅ  Ｂｏｕｑｕｅｔ  ９２００；エタノールアミン塩酸塩；酢酸エチル；オレイン酸エチル；エチルセルロース；エチレングリコール；エチレン酢酸ビニルコポリマー；エチレンジアミン；エチレンジアミン二塩酸塩；エチレン−プロピレンコポリマー；エチレン−酢酸ビニルコポリマー（２８％酢酸ビニル）；エチレン−酢酸ビニルコポリマー（９％酢酸ビニル）；ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル；エチルパラベン；ユーカリプトール；エキサメタジム；食用脂；硬質脂；脂肪酸エステル；脂肪酸ペンタエリスリトールエステル；脂肪酸；脂肪族クエン酸アルコール；脂肪族アルコール；Ｆｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１；Ｆｄ＆Ｃ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏ．３；Ｆｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．４；Ｆｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．４０；Ｆｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．１０（リストから除外）；Ｆｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．５；Ｆｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６；塩化鉄；酸化鉄；風味剤８９−１８６；風味剤８９−２５９；風味剤Ｄｆ−１１９；風味剤Ｄｆ−１５３０；風味増強剤；イチジク風味剤８２７１１８；ラズベリー風味剤Ｐｆｃ−８４０７；風味剤Ｒｈｏｄｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｏ．Ｒｆ  ４５１；フルオロクロロ炭化水素；ホルムアルデヒド；ホルムアルデヒド溶液；分画ココナッツ油；香料３９４９−５；香料５２０ａ；香料６．００７；香料９１−１２２；香料９１２８−Ｙ；香料９３４９８ｇ；バルサムパイン香料Ｎｏ．５１２４；ブーケ香料１０３２８；Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ香料６４０１−Ｂ；Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ香料６４１１；香料クリームＮｏ．７３４５７；香料Ｃｓ−２８１９７；香料Ｆｅｌｔｏｎ  ０６６ｍ；香料Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ  ４７３７３；香料Ｇｉｖａｕｄａｎ  Ｅｓｓ  ９０９０／１ｃ；香料Ｈ−６５４０；香料ハーブ１０３９６；香料Ｎｊ−１０８５；香料  Ｐ  Ｏ  Ｆｌ−１４７；香料Ｐａ５２８０５；香料Ｐｅｒａ  Ｄｅｒｍ  Ｄ；香料Ｒｂｄ−９８１９；香料Ｓｈａｗ  Ｍｕｄｇｅ  Ｕ−７７７６；香料Ｔｆ  ０４４０７８；香料Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ  Ｋ  ２７７１；香料Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｎ５１９５；フルクトース；酸化ガドリニウム；ガラクトース；γシクロデキストリン；ゼラチン；架橋ゼラチン；ゼルフォームスポンジ；ゲランガム（低アシル）；Ｇｅｌｖａ  ７３７；ゲンチシン酸；ゲンチシン酸エタノールアミド；グルセプテートナトリウム；グルセプテートナトリウム二水和物；グルコノラクトン；グルクロン酸；Ｄｌ−グルタミン酸；グルタチオン；グリセリン；水素化ロジンのグリセロールエステル；クエン酸グリセリル；イソステアリン酸グリセリル；ラウリン酸グリセリル；モノステアリン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル／プロピレングリコール；パルミチン酸グリセリル；リシノール酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル−ラウレス−２３；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇステアレート；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ−１００ステアレート；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ−４０ステアレート；ステアリン酸グリセリル−ステアラミドエチルジエチルアミン；トリオレイン酸グリセリル；グリシン；塩酸グリシン；ジステアリン酸グリコール；ステアリン酸グリコール；塩酸グアニジン；グアーガム；ヘアコンディション（１８ｎ１９５−１ｍ）；ヘプタン；ヘタスターチ；ヘキシレングリコール；高密度ポリエチレン；ヒスチジン；ヒトアルブミン微小球；ヒアルロン酸ナトリウム；炭化水素；可塑化炭化水素ゲル；塩酸；希釈塩酸；ヒドロコルチゾン；ヒドロゲルポリマー；過酸化水素；水素化ひまし油；水素化パーム油；水素化パーム／パーム核油Ｐｅｇ−６エステル；水素化ポリブテン６３５−６９０；水酸化物；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸；ヒドロキシメチルセルロース；ヒドロキシステアリン酸ヒドロキシオクタコサニル；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース２９０６；ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；ヒプロメロース２２０８（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース２９１０（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース；イミド尿素；ヨウ素；ヨードキサミン酸；塩酸イオフェタミン；アイリッシュモス抽出物；イソブタン；イソセテス−２０；イソロイシン；アクリル酸イソオクチル；イソプロピルアルコール；イソステアリン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル−ミリスチルアルコール；パルミチン酸イソプロピル；ステアリン酸イソプロピル；イソステアリン酸；イソステアリルアルコール；等張塩化ナトリウム溶液；Ｊｅｌｅｎｅ；カオリン；Ｋａｔｈｏｎ  Ｃｇ；Ｋａｔｈｏｎ  Ｃｇ  ＩＩ；乳酸塩；乳酸；Ｄｌ−乳酸；Ｌ−乳酸；ラクトビオン酸；ラクトース；ラクトース一水和物；含水ラクトース；Ｌａｎｅｔｈ；ラノリン；ラノリンアルコール−鉱物油；ラノリンアルコール；無水ラノリン；ラノリンコレステロール；ラノリン非イオン性誘導体；エトキシル化ラノリン；水素化ラノリン；塩化ラウラルコニウム；酸化ラウラミン；ラウルジモニウム加水分解動物コラーゲン；硫酸ラウレス；ラウレス−２；ラウレス−２３；ラウレス−４；ラウリン酸ジエタノールアミド；ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド；ラウロイルサルコシン；乳酸ラウリル；硫酸ラウリル；ラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ  Ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）花頂；レシチン；未漂白レシチン；卵黄レシチン；水素化レシチン；水素化ダイズレシチン；ダイズレシチン；レモン油；ロイシン；レブリン酸；リドフェニン；軽鉱物油；軽鉱物油（８５Ｓｓｕ）；（＋／−）−リモネン；Ｌｉｐｏｃｏｌ  Ｓｃ−１５；リシン；酢酸リシン；リシン一水和物；マグネシウムケイ酸アルミニウム；マグネシウムケイ酸アルミニウム水和物；塩化マグネシウム；硝酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；マレイン酸；マンニトール；Ｍａｐｒｏｆｉｘ；メブロフェニン；医療用接着剤修飾Ｓ−１５；医療用消泡剤Ａ−Ｆエマルジョン；メドロン酸二ナトリウム；メドロン酸；メグルミン；メントール；メタクレゾール；メタリン酸；メタンスルホン酸；メチオニン；メチルアルコール；メチルグルセス−１０；メチルグルセス−２０；メチルグルセス−２０セスキステアレート；メチルグルコースセスキステアレート；ラウリン酸メチル；メチルピロリドン；サリチル酸メチル；ステアリン酸メチル；メチルボロン酸；メチルセルロース（４０００Ｍｐａ．Ｓ）；メチルセルロース；メチルクロロイソチアゾリノン；メチレンブルー；メチルイソチアゾリノン；メチルパラベン；マイクロクリスタリンワックス；鉱物油；モノグリセリド及びジグリセリド；クエン酸モノステアリル；モノチオグリセロール；マルチステロール抽出物；ミリスチルアルコール；乳酸ミリスチル；ミリスチル−γ−ピコリニウムクロリド；Ｎ−（カルバモイル−メトキシＰｅｇ−４０）−１，２−ジステアロイル−セファリンナトリウム；Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；ナイアシンアミド；ニオキシム；硝酸；窒素；非オキシノールヨウ素；非オキシノール−１５；非オキシノール−９；ノルフルラン；オートミール；オ���タデセン−１／マレイン酸コポリマー；オクタン酸；オクチサレート；オクトキシノール−１；オクトキシノール−４０；オクトキシノール−９；オクチルドデカノール；オクチルフェノールポリメチレン；オレイン酸；オレス−１０／オレス−５；オレス−２；オレス−２０；オレイルアルコール；オレイン酸オレイル；オリーブ油；オキシドロン酸二ナトリウム；オキシキノリン；パーム核油；酸化パルミタミン；パラベン；パラフィン；白色パラフィン；Ｐａｒｆｕｍクリーム４５／３；ピーナッツ油；精製ピーナッツ油；ペクチン；Ｐｅｇ  ６−３２ステアレート／ステアリン酸グリコール；Ｐｅｇ植物油；Ｐｅｇ−１００ステアレート；Ｐｅｇ−１２グリセリルラウレート；Ｐｅｇ−１２０グリセリルステアレート；Ｐｅｇ−１２０メチルジオレイン酸グルコース；Ｐｅｇ−１５コカミン；Ｐｅｇ−１５０ジステアレート；Ｐｅｇ−２ステアレート；Ｐｅｇ−２０ソルビタンイソステアレート；Ｐｅｇ−２２メチルエーテル／ドデシルグリコールコポリマー；Ｐｅｇ−２５プロピレングリコールステアレート；Ｐｅｇ−４ジラウレート；Ｐｅｇ−４ラウレート；Ｐｅｇ−４０ひまし油；Ｐｅｇ−４０ソルビタンジイソステアレート；Ｐｅｇ−４５／ドデシルグリコールコポリマー；Ｐｅｇ−５オレエート；Ｐｅｇ−５０ステアレート；Ｐｅｇ−５４水素化ひまし油；Ｐｅｇ−６イソステアレート；Ｐｅｇ−６０ひまし油；Ｐｅｇ−６０水素化ひまし油；Ｐｅｇ−７メチルエーテル；Ｐｅｇ−７５ラノリン；Ｐｅｇ−８ラウレート；Ｐｅｇ−８ステアレート；Ｐｅｇｏｘｏｌ  ７ステアレート；ペンタデカラクトン；ペンタエリスリトールココエート；ペンテト酸ペンタナトリウム；ペンテト酸カルシウム三ナトリウム；ペンテト酸；ペパーミント油；ペルフルトレン；パフューム２５６７７；パフュームブーケ；パフュームＥ−１９９１；パフュームＧｄ  ５６０４；パフュームＴａｎａ  ９０／４２  Ｓｃｂａ；パフュームＷ−１９５２−１；ペトロラタム；白色ペトロラタム；石油蒸留物；フェノール；液化フェノール；Ｐｈｅｎｏｎｉｐ；フェノキシエタノール；フェニルアラニン；フェニルエチルアルコール；酢酸フェニル水銀；硝酸フェニル水銀；卵黄ホスファチジルグリセロール；リン脂質；卵黄リン脂質；ホスホリポン９０ｇ；リン酸；パインニードル油（Ｐｉｎｕｓ  Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）；ピペラジン六水和物；プラスチベース−５０ｗ；ポラクリリン；塩化ポリドロニウム；ポロキサマー１２４；ポロキサマー１８１；ポロキサマー１８２；ポロキサマー１８８；ポロキサマー２３７；ポロキサマー４０７；ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン無水物）；セバシン酸；ポリ（ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン／メチルヒドロゲンシロキサン）ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチル末端遮断；ポリ（Ｄｌ−乳酸−Ｃｏ−グリコール酸），（５０：５０；ポリ（Ｄｌ−乳酸−Ｃｏ−グリコール酸）、末端エチルエステル（５０：５０；ポリアクリル酸（２５００００Ｍｗ）；ポリブテン（１４００Ｍｗ）；ポリカルボフィル；ポリエステル；ポリエステルポリアミンコポリマー；ポリエステルレーヨン；ポリエチレングリコール１０００；ポリエチレング���コール１４５０；ポリエチレングリコール１５００；ポリエチレングリコール１５４０；ポリエチレングリコール２００；ポリエチレングリコール３００；ポリエチレングリコール３００−１６００；ポリエチレングリコール３３５０；ポリエチレングリコール４００；ポリエチレングリコール４０００；ポリエチレングリコール５４０；ポリエチレングリコール６００；ポリエチレングリコール６０００；ポリエチレングリコール８０００；ポリエチレングリコール９００；黒酸化鉄を含有する高密度ポリエチレン（＜１％）；硫酸バリウムを含有する低密度ポリエチレン（２０〜２４％）；ポリエチレンＴ；ポリエチレンテレフタレート；ポリグラクチン；ポリグリセリル−３オレエート；ポリグリセリル−４オレエート；ポリヒドロキシエチルメタクリレート；ポリイソブチレン；ポリイソブチレン（１１０００００Ｍｗ）；ポリイソブチレン（３５０００Ｍｗ）；ポリイソブチレン１７８−２３６；ポリイソブチレン２４１−２９４；ポリイソブチレン３５−３９；低分子量ポリイソブチレン；中分子量ポリイソブチレン；ポリイソブチレン／ポリブテン接着剤；ポリラクチド；ポリオール；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００；ポリオキシエチレンアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンプロピレン；ポリオキシル２０セトステアリルエーテル；ポリオキシル３５ひまし油；ポリオキシル４０水素化ひまし油；ポリオキシル４０ステアレート；ポリオキシル４００ステアレート；ポリオキシル６及びポリオキシル３２パルミトステアレート；ジステアリン酸ポリオキシル；ポリオキシルステアリン酸グリセリル；ポリオキシルラノリン；パルミチン酸ポリオキシル；ステアリン酸ポリオキシル；ポリプロピレン；ポリプロピレングリコール；ポリクオタニウム−１０；ポリクオタニウム−７（７０／３０アクリルアミド／Ｄａｄｍａｃ；ポリシロキサン；ポリソルベート２０；ポリソルベート４０；ポリソルベート６０；ポリソルベート６５；ポリソルベート８０；ポリオレタン；酢酸ポリビニル；ポリビニルアルコール；ポリ塩化ビニル；ポリ塩化ビニル−ポリ酢酸ビニルコポリマー；ポリビニルピリジン；ポピーシード油；カリ；酢酸カリウム；カリウムミョウバン；重炭酸カリウム；重亜硫酸カリウム；塩化カリウム；クエン酸カリウム；水酸化カリウム；ピロ亜硫酸カリウム；二塩基性リン酸カリウム；一塩基性リン酸カリウム；カリウム石鹸；ソルビン酸カリウム；ポビドンアクリレートコポリマー；ポビドンヒドロゲル；ポビドンＫ１７；ポビドンＫ２５；ポビドンＫ２９／３２；ポビドンＫ３０；ポビドンＫ９０；ポビドンＫ９０ｆ；ポビドン／エイコセンコポリマー；ポビドン；Ｐｐｇ−１２／Ｓｍｄｉコポリマー；Ｐｐｇ−１５ステアリルエーテル；Ｐｐｇ−２０メチルグルコースエーテルジステアレート；Ｐｐｇ−２６オレエート；Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｗａｔ；プロリン；Ｐｒｏｍｕｌｇｅｎ  Ｄ；Ｐｒｏｍｕｌｇｅｎ  Ｇ；プロパン；推進剤Ａ−４６；没食子酸プロピル；炭酸プロピレン；プロピレングリコール；プロピレングリコールジアセタート；プロピレングリコールジカプリレート；プロピレングリコールモノラウレート；プロピレングリコー���モノパルミトステアレート；プロピレングリコールパルミトステアレート；プロピレングリコールリシノレート；プロピレングリコール／ジアゾリジニル尿素／メチルパラベン／プロピルパラベン；プロピルパラベン；硫酸プロタミン；タンパク質加水分解物；Ｐｖｍ／Ｍａコポリマー；クオタニウム−１５；クオタニウム−１５  シス形態；クオタニウム−５２；Ｒａ−２３９７；Ｒａ−３０１１；サッカリン；サッカリンナトリウム；無水サッカリンナトリウム；サフラワー油；Ｓｄアルコール３ａ；Ｓｄアルコール４０；Ｓｄアルコール４０−２；Ｓｄアルコール４０ｂ；Ｓｅｐｉｎｅｏ  Ｐ６００；セリン；ゴマ油；シアバター；Ｓｉｌａｓｔｉｃブランド医療グレードチュービング；Ｓｉｌａｓｔｉｃ医療用接着剤、シリコーンＡ型；歯科用シリカ；ケイ素；二酸化ケイ素；コロイド状二酸化ケイ素；シリコーン；シリコーン接着剤４１０２；シリコーン接着剤４５０２；シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ  Ｑ７−４２０１；シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ  Ｑ７−４３０１；シリコーンエマルジョン；シリコーン／ポリエステルフィルムストリップ；シメチコン；シメチコンエマルジョン；Ｓｉｐｏｎ  Ｌｓ  ２０ｎｐ；ソーダ灰；酢酸ナトリウム；無水酢酸ナトリウム；アルキル硫酸ナトリウム；アスコルビン酸ナトリウム；安息香酸ナトリウム；重炭酸ナトリウム；亜硫酸ナトリウム；亜硫酸水素ナトリウム；ホウ酸ナトリウム；ホウ酸ナトリウム十水和物；炭酸ナトリウム；炭酸ナトリウム十水和物；炭酸ナトリウム一水和物；セトステアリル硫酸ナトリウム；塩素酸ナトリウム；塩化ナトリウム；塩化ナトリウム注射；静菌性塩化ナトリウム注射；硫酸コレステリルナトリウム；クエン酸ナトリウム；ココイルサルコシン酸ナトリウム；デオキシコール酸ナトリウム；亜ジチオン酸ナトリウム；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；グルコン酸ナトリウム；水酸化ナトリウム；次亜塩素酸ナトリウム；ヨウ化ナトリウム；乳酸ナトリウム；Ｌ−乳酸ナトリウム；ラウレス−２硫酸ナトリウム；ラウレス−３硫酸ナトリウム；ラウレス−５硫酸ナトリウム；ラウロイルサルコシン酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム；ラウリルスルホ酢酸ナトリウム；ピロ亜硫酸ナトリウム；硝酸ナトリウム；リン酸ナトリウム；リン酸ナトリウム二水和物；二塩基性リン酸ナトリウム；無水二塩基性リン酸
ナトリウム；二塩基性リン酸ナトリウム二水和物；二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物；二塩基性リン酸ナトリウム七水和物；一塩基性リン酸ナトリウム；無水一塩基性リン酸ナトリウム；一塩基性リン酸ナトリウム二水和物；一塩基性リン酸ナトリウム一水和物；ポリアクリル酸ナトリウム（２５０００００Ｍｗ）；ピロリン酸ナトリウム；ピロリドンカルボン酸ナトリウム；デンプングリコール酸ナトリウム；コハク酸ナトリウム六水和物；硫酸ナトリウム；無水硫酸ナトリウム；硫酸ナトリウム十水和物；亜硫酸ナトリウム；スルホコハク酸化ウンデシクレンモノアルキロールアミドナトリウム；酒石酸ナトリウム；チオグリコール酸ナトリウム；チオリンゴ酸ナトリウム；チオ硫酸ナトリウム；無水チオ硫酸ナトリウム；トリメタリン酸ナトリウム；キシレンスルホン酸ナトリウム；Ｓｏｍａｙ  ４４；ソルビン酸；ソルビタン；イソステアリン酸ソルビタン；モノラウリン酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタン；モノパルミチン酸ソルビタン；モノステアリン酸ソルビタン；セスキオレイン酸ソルビタン；トリオール酸ソルビタン；トリステアリン酸ソルビタン；ソルビトール；ソルビトール溶液；ダイズ粉；ダイズ油；スペアミント油；鯨蝋；スクアラン；安定化オキシクロロ複合体；２−エチルヘキサン酸スズ；塩化スズ；無水塩化スズ；フッ化スズ；酒石酸スズ；デンプン；アルファデンプン１５００；トウモロコシデンプン；ステアラルコニウムクロリド；ステアラルコニウムヘクトライト／炭酸プロピレン；ステアラミドエチルジエチルアミン；ステアレス−１０；ステアレス−１００；ステアレス−２；ステアレス−２０；ステアレス−２１；ステアレス−４０；ステアリン酸；ステアリン酸ジエタノールアミド；ステアロキシトリメチルシラン；ステアルトリモニウム加水分解動物コラーゲン；ステアリルアルコール；吸入用無菌水；スチレン／イソプレン／スチレンブロックコポリマー；サクシマー；コハク酸；スクラロース；スクロース；ジステアリン酸スクロース；スクロースポリエステル；スルファセタミドナトリウム；スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン；二酸化硫黄；硫酸；亜硫酸；Ｓｕｒｆａｃｔｏｌ  Ｑｓ；Ｄ−タガトース；タルク；トール油；牛脂グリセリド；酒石酸；Ｄｌ−酒石酸；Ｔｅｎｏｘ；Ｔｅｎｏｘ−２；Ｔｅｒｔ−ブチルアルコール；Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド；Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン；テトラキス（２−メトキシイソブチルイソシアニド）銅（Ｉ）テトラフルオロホウ酸塩；オルトケイ酸テトラプロピル；テトロホスミン；テオフィリン；チメロサール；トレオニン；チモール；スズ；二酸化チタン；トコフェロール；トコフェルソラン；完全非経口栄養、脂質エマルジョン；トリアセチン；トリカプリリン；トリクロロモノフルオロメタン；トリデセス−１０；トリエタノールアミン硫酸ラウリル；トリフルオロ酢酸；中鎖トリグリセリド；トリヒドロキシステアリン；Ｔｒｉｌａｎｅｔｈ−４リン酸塩；Ｔｒｉｌａｕｒｅｔｈ−４リン酸塩；クエン酸三ナトリウム二水和物；三ナトリウムＨｅｄｔａ；トリトン７２０；トリトンＸ−２００；トロラミン；トロマンタジン；トロメタミン（ＴＲＩＳ）；トリプトファン；チロキサポール；チロシン；ウンデシレン酸；Ｕｎｉｏｎ  ７６  Ａｍｓｃｏ−Ｒｅｓ  ６０３８；尿素；バリン；植物油；水素化植物油グリセリド；水素化植物油；ベルセタミド；Ｖｉｓｃａｒｉｎ；ビスコース／綿；ビタミンＥ；乳化蝋；Ｗｅｃｏｂｅｅ  Ｆｓ；白色セレシン蝋；白色蝋；キサンタンガム；亜鉛；酢酸亜鉛；炭酸亜鉛；塩化亜鉛；及び酸化亜鉛などの少なくとも１つの不活性成分を含む。
【０２３７】
本明細書に開示される薬学的組成物製剤は、カチオンまたはアニオンを含み得る。一実施形態では、製剤は、限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ＋及びそれらの組み合わせなどの金属カチオンを含む。非限定例として、製剤は、ポリマー及び金属カチオンとの複合体を含み得る（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号を参照）。
【０２３８】
本発明の製剤はまた、１つ以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、本化合物は、既存の酸または塩基部分を（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって）その塩形態に変換することによって修飾される。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の好物または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機酸等が含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩化水素塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ性土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含む、非毒性アンモニウム、４級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。
【０２３９】
溶媒は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ′−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩等である。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称される。
【０２４０】
Ｖ．投与及び投薬
投与
「投与する」及び「導入する」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細胞または対象への薬学的組成物の送達を指す。対象への送達の場合、薬学的組成物は、肝細胞などの所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって送達され、それにより所望の効果（複数可）がもたらされる。
【０２４１】
方法の一態様では、薬学的組成物は、限定されないが、経腸（腸の中）、胃腸、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜の中）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ）、脳内（大脳の中）、脳室内（脳室の中）、上皮（皮膚の上に適用）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈の中）、静脈内ボーラス、点滴、動脈内（動脈の中）、筋内（筋肉の中）、心内（心臓の中）、骨内注入（骨髄の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹腔の中に注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通して）、空洞内注射（病理的空洞の中）、腔内（陰茎の基部の中）、膣内投与、子宮内、羊水外投与、経皮（全身分配のための無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経腟、吹送（スノーティング）、舌下、口唇下、坐薬、点眼薬（結膜上）、点耳薬中、耳（耳の中または耳を介して）、頬（頬に向かって指向される）、結膜、皮膚、歯（１本または複数の歯に）、電気浸透、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹部内、羊水内、動脈内、胆管内、気管支内、髄液嚢内、軟骨内（軟骨内）、仙骨内（馬尾内）、槽内（大槽小脳延髄槽内）、角膜間（角膜内）、歯冠内、冠内（冠状動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張性空間内）、円板内（ディスク内）、管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内または硬膜下）、上皮内（上皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（小腸の遠位部分内）、病変内（局在化病変内または直接導入）、腔内（管の腔内）、リンパ内（リンパ内）、髄内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、心筋内（心筋内）、眼内（目内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺またはその気管支内）、鼻腔内（鼻または眼窩腔内）、脊髄内（脊柱内）、関節滑液嚢内（関節の滑液腔内）、腱内（腱内）、精巣内（精巣内）、髄腔内（任意のレベルの脳脊髄軸での脳脊髄液内）、胸腔内（胸郭内）、管内（臓器の管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳内）、血管内（１本または複数の血管内）、心室内（心室内）、イオン泳動（可溶性塩のイオンが身体の組織中に移行する電流によって）、灌水（開放創または体腔を浸すまたは洗い流す）、喉頭（咽頭の上に直接）、鼻腔胃（鼻を通して胃の中に）、密封包帯法（後に領域を密封する包帯によって被覆される局所経路投与）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（局所または全身効果のために経口的または経鼻的に吸入することによって気道内）、眼球後（脳端の後ろまたは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通るかまたは胎盤全体）、経気管（気管の壁を通る）、経鼓膜（鼓室全体または鼓室を通る）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス及び脊柱などの経路を介して投与され得る。
【０２４２】
投与様式には、注射、注入、点滴、及び／または摂取が含まれる。「注射」には、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。いくつかの例において、経路は静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または注入による投与を行うことができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、全身的に細胞に投与され得る。「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」及び「末梢的に投与される」という表現は、標的部位、組織、または臓器に直接ではない形で投与することを指し、それにより、代わりに対象の循環系に侵入し、したがって代謝及び他の類似プロセスに供される。他の実施形態では、本発明の化合物は、エクスビボで細胞に投与され得る。すなわち、化合物は、臓器または組織から除去された細胞に投与され、対象の体外、例えば、初代培養物中で保持され得る。
【０２４４】
投薬
「有効量」という用語は、特定の疾患及び／または病態の少なくとも１つ以上の徴候または症状を予防または軽減するために必要な活性成分の量を指し、所望の効果を提供するための組成物の十分な量に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与したときに特定の効果を促進するのに十分である活性成分を含む、活性成分または組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更（例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること）、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。
【０２４５】
本発明の薬学的、診断的、または予防的組成物は、疾患、障害及び／または病態を予防、治療、管理、または診断するために有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式等に応じて対象ごとに異なり得る。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。本発明による組成物は、典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために単一剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、合理的な医療判断の範囲内で担当医師により決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の個体についての具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切な診断用量レベルは、治療される障害及び障害の重篤度；用いられる具体的なペイロードの活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与の時間及び投与の経路；治療の期間；活性成分と組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、本発明による薬学的組成物は、１日あたり対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを、１日１回以上送達して、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために十分な投与量レベルで投与され得る。
【０２４７】
本発明の組成物の所望の投与量は、１回のみ、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、多回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。多回投与を用いる場合、本明細書に記載されるものなどの分割投与レジメンが使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または全日用量の２用量以上への分割、例えば「単一単位用量」の２回以上の投与である。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
【０２４８】
ＶＩ．定義
「類似体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物に構造的に関連し、基準化合物と共通の機能的活性を共有する化合物を指す。
【０２４９】
「生物学的」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物、植物、動物、またはヒト細胞などの様々な天然源から作製された医薬製品を指す。
【０２５０】
「境界」という用語は、本明細書で使用される場合、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。
【０２５１】
「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、単剤もしくはその薬学的に許容される塩、または生物活性剤もしくは薬物を指す。
【０２５２】
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物とは構造が異なるが、基準分子の本質的特性を保持する。
【０２５３】
「下流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る、一次近傍遺伝子の下流にある遺伝子を指す。
【０２５４】
「薬物」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の診断、治癒、軽減、治療、または予防における使用のために意図され、身体の構造または任意の機能に影響を及ぼすことが意図される食品以外の物質を指す。
【０２５５】
「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、転写因子によって結合されたときに、関連遺伝子の転写を強化する調節ＤＮＡ配列を指す。
【０２５６】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物、例えば染色体のゲノムアーキテクチャの単位またはセグメントを指す。遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。遺伝子は、連続または非連続ポリヌクレオチドとしてコードされ得る。遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０２５７】
「ゲノムシグナル伝達中心」、すなわち「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、絶縁近傍内または複数の絶縁近傍中の遺伝子の調節に関与するシグナル伝達分子／シグナル伝達タンパク質の状況特異的複合アセンブリに結合することができる領域を含む、当該絶縁近傍内の領域を指す。
【０２５８】
「ゲノム系アーキテクチャ」という用語は、本明細書で使用される場合、個体のゲノムの組織化を指し、染色体、位相関連ドメイン（ＴＡＤ）、及び絶縁近傍を含む。
【０２５９】
「薬草調製物」という用語は、本明細書で使用される場合、植物の一部、または他の植物材料、または組み合わせを活性成分として含有する生薬を指す。
【０２６０】
「絶縁近傍」（ＩＮ）という用語は、本明細書で使用される場合、コヒーシンによって共占有されるＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）を含み得、かつ絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響を及ぼし得る、染色体配列中の２つの相互作用部位のルーピングによって形成される染色体構造を指す。
【０２６１】
「インスレーター」という用語は、本明細書で使用される場合、それらの間に位置しているときに遺伝子をエンハンサーが活性化する能力をブロックし、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に寄与する、調節エレメントを指す。
【０２６２】
「マスター転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を変更（増加または減少）し、細胞型特異的エンハンサーを確立する、シグナル伝達分子を指す。マスター転写因子は、他の転写因子などの追加のシグナル伝達タンパク質をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。
【０２６３】
「最小絶縁近傍」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの近傍遺伝子、ならびに、プロモーター及び／またはエンハンサー及び／またはリプレッサー領域などの近傍遺伝子の発現または抑制を促進する関連した調節配列領域（ＲＳＲ）（複数可）を有する、絶縁近傍を指す。
【０２６４】
「調整する」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子の発現及び／または遺伝子産物の活性における変更（例えば、増加または減少）を指す。
【０２６５】
「近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、絶縁近傍内に位置する遺伝子を指す。
【０２６６】
「浸透度」という用語は、本明細書で使用される場合、その変異体遺伝子の関連した特性（表現型）も呈する遺伝子の特定の変異体（例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子または一般遺伝子型）を担持する個体の割合を指し、いくつかの状況では、臨床症状を呈する、したがって連続体上に存在する突然変異を有する個体の割合として測定される。
【０２６７】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される（天然または非天然の）アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、コードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長となる。
【０２６８】
「一次近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子を指す。
【０２６９】
「一次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。
【０２７０】
「一次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。
【０２７１】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を定義し、かつどのＤＮＡ鎖が転写されるかを示す転写の方向を定義する、ＤＮＡ配列を指す。
【０２７２】
「調節配列領域」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されないが、染色体に沿った領域、区分または区域を含み、ここで、近傍遺伝子の発現を変更するためにシグナル伝達分子との相互作用が起こる。
【０２７３】
「リプレッサー」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡに結合し、したがって転写の速度を減少させることによって遺伝子の発現を調節する、任意のタンパク質を指す。
【０２７４】
「二次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界を指す。
【０２７５】
「二次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界を指す。
【０２７６】
「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達分子（例えば、転写因子）などの所定の生体分子セットと相互作用して遺伝子発現を状況特異的な方法で調節する、生存生物の所定の領域を指す。
【０２７７】
「シグナル伝達分子」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、有機小分子、脂質、糖または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実体を指す。
【０２７８】
「シグナル伝達転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更し、細胞−細胞シグナル伝達分子としても作用する、シグナル伝達分子を指す。
【０２７９】
「小分子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的プロセスの調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、５０００ダルトン未満の有機化合物を指す。
【０２８０】
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本発明による組成物での治療が提供される動物を指す。
【０２８１】
「スーパーエンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞同一性を定義する遺伝子の発現を駆動する転写エンハンサーの大きなクラスターであることを指す。
【０２８２】
「治療剤」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を治癒するか、または疾患の症状を改善する能力を有する物質を指す。
【０２８３】
「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）成果」という用語は、本明細書で使用される場合、ＧＳＣまたはＧＳＮの摂動の結果として生じる任意の結果または効果（正、負またはヌル）を指す。治療成果の例には、疾患もしくは障害に関連する望ましくない病態もしくは負の病態の改良もしくは改善、副作用もしくは症状の軽減、疾患もしくは障害の治癒、またはＧＳＣもしくはＧＳＮの摂動に関連する任意の改良が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８４】
「位相関連ドメイン」（ＴＡＤ）という用語は、本明細書で使用される場合、染色体のモジュラー組織化を表し、異なる細胞型の生物によって共有される境界を有する、構造を指す。
【０２８５】
「転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を変更（増加または減少）するシグナル伝達分子である。
【０２８６】
「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）負債」という用語は、本明細書で使用される場合、望ましくない、有害である、または、治療法の正の成果を弱める、治療または治療レジームに関連する特徴または特性を指す。治療負債の例には、例えば、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性または薬物動態もしくは薬力学的リスクの欠失または喪失が含まれる。
【０２８７】
「上流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の上流にある遺伝子を指す。
【０２８８】
「尿素サイクル異常症」という用語は、本明細書で使用される場合、尿素サイクルにおける欠陥または機能不全によって引き起こされる任意の障害を指す。
【０２８９】
「尿素サイクル関連遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、その遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）が尿素サイクルに関与する遺伝子を指す。
【０２９０】
尿素サイクル異常症（例えば、ＯＴＣ欠損症）の治療のためのゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）または全体遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の摂動のための組成物及び方法が、本明細書に記載される。本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、添付の以下の記載で説明される。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の材料及び方法を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい材料及び方法は、これから説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、その説明から明らかになるであろう。この説明において、単数形は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が制御する。
【０２９１】
本発明はさらに、以下の非限定的な実施例によって説明される。
【実施例】
【０２９２】
実施例１．実験手順
Ａ．肝細胞細胞培養
凍結保存した肝細胞を、平板培地中で１６時間培養し、維持培地に４時間移した。無血清培地上で２時間培養し、次いで化合物を添加した。遺伝子発現分析の前に、肝細胞を無血清培地上で１６時間維持した。一次ヒト肝細胞を、液体窒素冷凍庫（約−１３０℃）の気相中で保存した。
【０２９３】
一次ヒト肝細胞を播種するために、細胞のバイアルをＬＮ２冷凍庫から回収し、３７℃の水浴中で解凍し、氷のかけらのみが残るまで優しく旋回させた。１０ｍＬの血清学的ピペットを使用して、細胞をバイアルから優しく分注し、２０ｍＬの冷解凍培地を含有する５０ｍＬのコニカルチューブの側面下に優しく分注した。バイアルを約１ｍＬの解凍培地ですすぎ、リンスをコニカルチューブに添加した。最大２バイアルを、２０ｍＬの解凍培地の１つのチューブに添加することができる。
【０２９４】
コニカルチューブ（複数可）を優しく２〜３回反転させ、４℃で１０分間１００ｇで制動力を低減して（例えば、９のうち４）遠心分離した。解凍培地をゆっくりゆっくり吸引して、ペレットを避けた。４ｍＬの冷平板培地を、側面の下にゆっくり添加し（２バイアルを１つのチューブに複合する場合、８ｍＬ）、バイアルを優しく数回反転させて細胞を再懸濁した。
【０２９５】
１００μＬの十分に混合された細胞が４００μＬの希釈トリパンブルーに添加されるまで、細胞を氷上で保持し、優しく反転させることによって混合した。血球計数器（またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）を使用して細胞をカウントし、生存性及び１ｍＬあたりの生細胞を記録した。細胞を所望の濃度に希釈し、コラーゲンＩで被覆したプレート上に播種した。細胞をゆっくり優しくプレート上に、一度に１〜２ウェルのみに分注した。残りの細胞を、優しく反転させることによって頻繁にチューブ内で混合した。細胞を、６ｍＬの冷平板培地（１０ｃｍ）中にプレートあたり約８．５×１０６細胞で播種した。代替として、６ウェルプレートの場合ウェルあたり１．５×１０６細胞（１ｍＬ培地／ウェル）、１２ウェルプレートの場合ウェルあたり７×１０５細胞（０．５ｍＬ／ウェル）、または２４ウェルプレートの場合ウェルあたり３．７５×１０５細胞（０．５ｍＬ／ウェル）。
【０２９６】
全ての細胞及び培地をプレートに添加した後、プレートをインキュベーターに移し（３７℃、５％  ＣＯ２、約９０％湿度）、前後に、次いで左右に各々数回揺らして、細胞をプレートまたはウェル全体に均一に分布させた。プレート（複数可）をプレーティング後最初の１時間にわたって１５分ごとに再度揺らした。プレーティングの約４時間後（または細胞を午後にプレーティングした場合は朝一番に）、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、完全維持培地を添加した。一次ヒト肝細胞を維持培地中で維持し、毎日新鮮な培地に移した。
【０２９７】
Ｂ．肝細胞の枯渇及び化合物処理
治療の２〜３時間前に、上記のように培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を新鮮な遺伝培地（完全）または修飾された維持培地４ｂのいずれかに変えた。
【０２９８】
化合物ストックを、１０００倍最終濃度で調製し、２段階希釈で培地に添加して、細胞に添加したときに化合物が溶液から沈殿するリスクを低減し、妥当なピペット量を保証した。１つずつ、各化合物を温かい（約３７℃）修飾された維持培地中で最初に１０倍希釈し（初期希釈＝ＩＤ）、ボルテックスすることによって混合し、ＩＤを細胞培養物中に１００倍希釈した（例えば、０．５ｍＬの培地を含有する２４ウェルプレートの１ウェル中に５．１μＬ）。プレートを慎重に旋回させることによって混合し、全てのウェルを処理した後、インキュベーターに一晩戻した。所望される場合、別個のプレート／ウェルをビヒクルのみの対照及び／または正の対照で処理した。マルチウェルプレートを使用する場合、対照を各プレート上に含めた。約１８時間後、細胞をさらなる分析、例えば、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ等のために採取した。
【０２９９】
Ｃ．培地組成
解凍培地は、６ｍＬの等張パーコール及び１４ｍＬの高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１９６５または同様のもの）を含有していた。平板培地は、１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）、ならびに５ｍＬのＦＢＳ、１０μＬのデキサメタゾン、及び３．６ｍＬのプレーティング／維持カクテルを含有するＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ平板培地からの補足パック＃ＣＭ３０００を含有していた。ストックトリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５２５０）を、ＰＢＳ中で１：５に希釈した。
【０３００】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ完全維持培地は、補足パック＃ＣＭ４０００（１μＬのデキサメタゾン及び４ｍＬの維持カクテル）ならびに１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）を含有していた。
【０３０１】
修飾された維持培地は、刺激因子（デキサメタゾン、インスリン等）を有しておらず、１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）、２ｍＭまで１ｍＬのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｇ７５１３）、１５ｍＭまで１．５ｍＬのＨＥＰＥＳ（ＶＷＲ  ＃Ｊ８４８）、及び各々５０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで０．５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０）を含有していた。
【０３０２】
Ｄ．ＤＮＡ精製
ＤＮＡ精製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１２（１２）：３８４１−３８４６（２０１５）補助情報に記載されるように行った。１ミリリットルの２．５Ｍグリシンを、固定細胞の各プレートに添加し、５分間インキュベートしてホルムアルデヒドをクエンチした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を４℃で５分間、１，３００ｇでペレット化した。次いで、４×１０７細胞を各チューブに収集した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有する１ｍＬの氷冷Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液で、氷上で５分間優しく溶解した（緩衝液レシピは以下に提供される）。細胞溶解物を、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液中の２４％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースで形成された２．５量のスクロースクッションの上に積層した。この試料を４℃で１０分間、１８，０００ｇで遠心分離して、核ペレットを単離した（上澄みは、細胞質画分を表していた）。核ペレットをＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで１回洗浄した。核ペレットを０．５ｍＬのグリセロール緩衝液で優しく再懸濁し、続いて等量の核溶解緩衝液で氷上で２分間インキュベートした。この試料を４℃で２分間、１６，０００ｇで遠心分離して、クロマチンペレットを単離した（上澄みは、核可溶性画分を表していた）。クロマチンペレットをＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄した。クロマチンペレットを−８０℃で保存した。
【０３０３】
Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含有していた。グリセロール緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．８５ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールを含有していた。核溶解緩衝液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１ｍＭのＤＴＴ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ、１Ｍの尿素、及び１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含有していた。
【０３０４】
Ｅ．クロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）
一次肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞について以下のプロトコルを使用してＣｈＩＰ−ｓｅｑを実施して、組成物を決定し、シグナル伝達中心の位置を確認した。
【０３０５】
ｉ．細胞架橋
２×１０７細胞を、ＣｈＩＰ−ｓｅｑの各実行に使用した。２ｍＬの新鮮な１１％ホルムアルデヒド（ＦＡ）溶液を、１５ｃｍプレート上の２０ｍＬの培地に添加して、１．１％の最終濃度に到達させた。プレートを短時間旋回させ、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、ＦＡを、１ｍＬの２．５Ｍグリシンをプレートに添加し、室温で５分間インキュベートすることによってクエンチした。培地を１Ｌビーカーに破棄し、細胞を２０ｍＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ（１０ｍＬ）をプレートに添加し、細胞をプレートから掻き落とした。細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移し、チューブを氷上に置いた。プレートを、追加の４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１５ｍＬのチューブ内で細胞と複合した。チューブを５分間、１，５００ｒｐｍ、４℃で卓上遠心分離機で遠心分離した。ＰＢＳを吸引し、細胞を液体窒素中で急速冷凍した。ペレットを、使用準備が整うまで−８０℃で保存した。
【０３０６】
ｉｉ．予ブロック磁気ビーズ
３０μＬのタンパク質Ｇビーズ（反応あたり）を、１．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを、磁気分離によって室温で３０秒間収集した。ビーズを、４℃で１０分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、１ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄した。５μｇの抗体を、ブロッキング溶液中の２５０μＬのビーズに添加した。混合物を清潔なチューブに移し、４℃で一晩回転させた。翌日に、抗体を含有する緩衝液を取り除き、ビーズを、４℃で１０分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、１．１ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄した。ビーズを、５０μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、使用準備が整うまで氷上で保持した。
【０３０７】
ｉｉｉ．細胞溶解、ゲノム断片化、及びクロマチン免疫沈降
ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルを、使用前に溶解緩衝液１（ＬＢ１）に添加した。５０倍溶液の場合、１錠を１ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。カクテルをアリコートで−２０℃で保存した。細胞を、各チューブ内での８ｍＬのＬＢ１中に再懸濁し、４℃で１０分間、回転器上でインキュベートした。核を、４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心沈降させた。ＬＢ１を吸引し、細胞を、各チューブ内での８ｍＬのＬＢ２中に再懸濁し、４℃で１０分間、回転器上でインキュベートした。
【０３０８】
ＣＯＶＡＲＩＳ（登録商標）Ｅ２２０ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ（商標）超音波処理器を、高細胞数についての製造元の推奨に従ってプログラムした。ＨｅｐＧ２細胞を１２分間音波処理し、一次肝細胞試料を１０分間音波処理した。溶解物を清潔な１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、チューブを４℃で１０分間、２０，０００ｇで遠心分離して残屑をペレット化した。上澄みを、予め結合された抗体を有する予めブロックされたタンパク質Ｇビーズを含有する２ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。５０μＬの上澄みをインプットとして保存した。インプット材料を、使用準備が整うまで−８０℃で保持した。チューブを４℃で一晩、ビーズで回転させた。
【０３０９】
ｉｖ．洗浄、溶出、及び架橋逆転
全ての洗浄ステップは、チューブを４℃で５分間回転させることによって実施した。洗浄ステップごとに、ビーズを清潔なＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。ビーズを、磁石を使用して１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で収集した。ビーズを１．１ｍＬの音波処理緩衝液で２回洗浄した。磁気スタンドを使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを１．１ｍＬの洗浄緩衝液２で２回洗浄し、磁気スタンドを再度使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを１．１ｍＬの洗浄緩衝液３で２回洗浄した。全ての残留洗浄緩衝液３を取り除き、ビーズを１．１ｍＬのＴＥ＋０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液で１回洗浄した。残留ＴＥ＋０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液を取り除き、ビーズをＴＥ緩衝液で毎回３０秒間にわたって２回洗浄した。残留ＴＥ緩衝液を取り除き、ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁した。２５０μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液を、５０μＬのインプットに添加し、チューブを６５℃で１時間、ビーズで回転させた。インプット試料を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
【０３１０】
ｖ．クロマチン抽出及び沈降
インプット及び免疫沈降（ＩＰ）試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液をＩＰ及びインプット試料に添加して、ＳＤＳを希釈した。ＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）をチューブに添加し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で１．５時間インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速での遠心分離によって調製した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各プロテイナーゼＫ反応に添加し、約１．２ｍＬの混合物中でＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させた。水相を２つの清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１．５μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加した。混合物を−２０℃で一晩または−８０℃で１時間沈降させ、４℃で２０分間、最大速度で遠心沈降させた。エタノールを取り除き、チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈降させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。２５μＬのＨ２Ｏを各免疫沈降（ＩＰ）及びインプットペレットに添加し、５分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのＤＮＡを組み合わせ、各試料について５０μＬのＩＰ及び５０μＬのインプットＤＮＡを得た。１μＬのこのＤＮＡを使用し、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｑ３２８５４）を使用してプルダウンＤＮＡの量を測定した。免疫沈降材料の全量は、数ｎｇ（ＴＦの場合）〜数百ｎｇ（クロマチン修飾の場合）の範囲であった。６μＬのＤＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲを使用して分析して、富化を決定した。必要に応じてＤＮＡを希釈した。富化が良好であった場合、残りをＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製に使用した。
【０３１１】
ｖｉ．ＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製
Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｒｉｇｏｓ（ＮＥＢ、＃６６０９Ｓ）を使用するＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡライブラリー調製キット（ＮＥＢ、＃Ｅ７６４５）を使用して、製造元の指示に従い、以下の修正とともにライブラリーを調製した。ライブラリー調製のための残りのＣｈＩＰ試料（約４３μＬ）及び１μｇのインプット試料を、プロトコルの末端修復部分の前に５０μＬの量にした。接着プレートシール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＢ０５５８）で密封し、少なくとも１つの空のウェルを異なる試料の間に残した９６ウェルの半スカート状ＰＣＲプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＢ１４００）において、加熱した蓋を有するＰＣＲマシンで末端修復反応を実行した。未希釈のアダプターをインプット試料に使用し、１：１０に希釈したアダプターを５〜１００ｎｇのＣｈＩＰ材料に使用し、１：２５に希釈したアダプターを５ｎｇ未満のＣｈＩＰ材料に使用した。加熱した蓋を取り外したＰＣＲマシンで連結反応を実行した。アダプター連結されたＤＮＡを、清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移し、Ｈ２Ｏを使用して量を９６．５μＬにした。
【０３１２】
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃Ｂ２３３１７）を使用して、２００〜６００ｂｐのＣｈＩＰ断片を選択した。３０μＬのビーズを９６．５μＬのＣｈＩＰ試料に添加して、６００ｂｐより長い断片に結合させた。より短い断片を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。１５μＬのビーズを添加して、２００ｂｐより長いＤＮＡに結合し、新鮮に調製された７５％エタノールを使用して、ビーズをＤＮＡで２回洗浄した。１７μＬの０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液を使用して、ＤＮＡを溶出した。約１５μＬを収集した。
【０３１３】
３μＬのサイズ選択されたインプット試料及びＣｈＩＰ試料の全て（１５μＬ）をＰＣＲに使用した。サイズ選択されたＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイを使用して測定した。約５〜１０ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡを有するインプット試料及びＣｈＩＰ試料については７サイクル、及び５ｎｇ未満のサイズ選択されたＤＮＡを有する場合は１２サイクルにわたってＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物（２５μＬ）の半分を、製造元の指示に従い、２２．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃Ａ６３８８０）で精製した。ＰＣＲ産物を、１７μＬの０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液で溶出し、ＰＣＴ産物の量をＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイを使用して測定した。５ｎｇ未満のＰＣＲ産物を有する試料の残りの半分について、追加の４サイクルのＰＣＲを実行し、ＤＮＡを２２．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製した。濃度を測定して、収率の増加が存在したかどうかを決定した。両方の半分を複合し、Ｈ２Ｏを使用して量を最大５０μＬにした。
【０３１４】
２回目のＤＮＡの精製は、１７μＬの０．１Ｘ  ＴＥ中の４５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して実行し、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイを使用して、最終収率を測定した。このプロトコルは、２０ｎｇ〜１ｍｇのＰＣＲ産物を産生する。ライブラリーの質を、必要に応じて、製造元の推奨に基づいて高感度ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、＃５０６７−４６２６）を使用し、１μＬの各試料をＨ２Ｏで希釈することによって検証した。
【０３１５】
ｖｉｉ．試薬
１１％のホルムアルデヒド溶液（５０ｍＬ）は、１４．９ｍＬの３７％ホルムアルデヒド（最終濃度１１％）、１ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ（最終濃度０．１Ｍ）、１００μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度１ｍＭ）、５０μＬの０．５Ｍ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度０．５ｍＭ）、及び２．５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）（最終濃度５０ｍＭ）を含有していた。
【０３１６】
ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中の０．５％  ＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び１００ｍＬ  ＰＢＳ中の５００ｍｇのＢＳＡを含有していた。ブロッキング溶液は、使用の最大約４日前に調製してもよい。
【０３１７】
溶解緩衝液１（ＬＢ１）（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１００％グリセロール溶液、２５ｍＬの１０％  ＮＰ−４０、及び１２．５ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３１８】
溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１０００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３１９】
音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％  ＳＤＳを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２０】
プロテイナーゼ阻害剤は、ＬＢ１、ＬＢ２、及び音波処理緩衝液に含まれていた。
【０３２１】
洗浄緩衝液２（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３５ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％  ＳＤＳを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２２】
洗浄緩衝液３（５００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＬの１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液、２５ｍＬの１０％  ＮＰ−４０、及び５０ｍＬの５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２３】
ＣｈＩＰ溶出緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％  ＳＤＳ、及び４１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２４】
Ｆ．ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の分析
各試料からの全てのパスフィルター読み取り値を、デフォルトオプションでｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ０．４．４を使用して、シーケンシングアダプターからトリミングした。トリミングした読み取り値を、デフォルトパラメーターとともにｂｗａバージョン０．７．１５（Ｌｉ（２０１３）ａｒＸｉｖ：１３０３．３９９７ｖ１）を使用して、ヒトゲノムに対してマッピングした（ｈｓ３８ｄ１／ＧＣＡ＿０００７８６０７５．２とマージされたアセンブリＧＲＣｈ３８／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５「ｎｏ  ａｌｔ」分析セット）。ｐｉｃａｒｄ２．９．０を使用して、整列させた読み取り値の複製を評価し（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｈｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）、ＭＡＰＱ＜２０の読み取り値または標準ＳＡＭフラッグ０ｘ１８０４に一致するものを破棄した。標準ＱＣを適用して（読み取り値の完全性、マッピング統計、ライブラリーの複雑性、断片バイアス）、不満足な試料を取り除いた。ＭＡＣＳ２バージョン２．１．０（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２００８）９（９）：Ｒ１３７）を使用し、試料を全細胞抽出物対照と比較することによって、強化されたＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを特定し、有意なピークを０．０１未満の調整ｐ値を有するものとして選択した。既知の反復「ブラックリスト」領域と重複するピーク（ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８９（７４１４：５７−７４）を破棄した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルもまた、読み取り深度によって正規化し、ＵＣＳＣブラウザーを使用して可視化した。
【０３２５】
Ｇ．ＲＮＡ−ｓｅｑ
このプロトコルは、以下のプロトコルの修飾バージョンである。ＭａｇＭＡＸ  ｍｉｒＶａｎａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ単離キットユーザーガイド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＭＡＮ００１１１３１  Ｒｅｖ  Ｂ．０）、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｅ７４９０）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｅ７４２０）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃Ｅ７４９０１）。
【０３２６】
ＭａｇＭａｘ  ｍｉｒＶａｎａキット指示書（１４〜１７頁の「細胞からＲＮＡを単離する」と題されるセクション）を、培養物中の細胞から全ＲＮＡを単離するために使用した。接着細胞を含有するマルチウェルプレート（通常は２４ウェルプレート）のウェルあたり２００μＬの溶解結合混合物を使用した。
【０３２７】
ｍＲＮＡ単離及びライブラリー調製のために、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール及びＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｅｐキットを使用した。上記の細胞から単離されたＲＮＡを定量化し、５０μＬのヌクレアーゼ不含水中５００μｇの各試料中で調製した。このプロトコルは、微量遠心管または９６ウェルプレート中で実行することができる。
【０３２８】
８０％エタノールを新たに調製し、全ての溶出を０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液中で行う。Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズを必要とするステップの場合、ビーズを使用前に室温にした。試料の量を最初に測定し、ビーズを分注した。セクション１．９Ｂ（１．９Ａではない）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ（＃Ｅ６６０９）に使用した。ＰＣＲ富化を開始する前に、Ｑｕｂｉｔ（ＤＮＡ高感度キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃Ｑ３２８５４）を使用して、ｃＤＮＡを定量化した。ＰＣＲ反応を１２サイクルにわたって実行した。
【０３２９】
ＰＣＲ反応の精製（ステップ１．１０）後、Ｑｕｂｉｔ  ＤＮＡ高感度キットを使用して、ライブラリーを定量化した。１μＬの各試料を１〜２ｎｇ／μＬに希釈して、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＮＡ高感度キット、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＃５０６７−４６２６）上で実行した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒが清浄でなかった場合（およそ３００ｂｐの１つの狭いピーク）、０．９Ｘまたは１．０Ｘのビーズ：試料比を使用して、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズクリーンアップステップを繰り返した。次いで、試料をＱｕｂｉｔで再度定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で再度実行した（１〜２ｎｇ／μＬ）。
【０３３０】
ＩＮＴＡＣＴ精製された核または新皮質核全体からの核ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２で増幅させた。ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を使用してシーケンシングした。
【０３３１】
Ｈ．ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析
各試料からの全てのパスフィルター読み取り値を、ＳＴＡＲバージョン２．５．３ａ（整列パラメーターａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭｉｎ＝２０、ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ＝１００００００、ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ＝９９９、ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＬｍａｘ＝０．０５、ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＴｙｐｅ＝ＢｙＳＪｏｕｔ、ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ＝２０、ａｌｉｇｎＳＪｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ＝８、ａｌｉｇｎＳＪＤＢｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ＝１、ａｌｉｇｎＭａｔｅｓＧａｐＭａｘ＝１００００００）を介した２つのパスマッピングを使用して、ヒトゲノム（ｈｓ３８ｄ１／ＧＣＡ＿０００７８６０７５．２とマージされたアセンブリＧＲＣｈ３８／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５「ｎｏ  ａｌｔ」分析セット）に対してマッピングした（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１２）２９（１）：１５−２１）。ゲノムアラインメントを、ヒトＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子セットリリース２４（Ｈａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２０１２）２２（９）：１７６０−１７７４）からの参照転写物アノテーションに基づいて、トランスクリプトームアラインメントに変換した。固有かつマルチマッピングされたトランスクリプトームアラインメントを使用し、ストランドを考慮してＲＳＥＭバージョン１．３．０（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｅｗｅｙ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１１）１２：３２３）を使用し、信頼区間サンプリング計算を含めて、遺伝子レベルの存在量推定値を計算して、基礎となるベイズモデルから存在量（マッピングされた断片１００万個あたりのエクソン１キロベースあたりのカウント及び正規化したＦＰＫＭ−断片）の事後平均推定値（ＰＭＥ）に到達した。標準ＱＣを適用して（読み取り値の完全性、マッピング統計、ライブラリーの複雑性、断片バイアス）、不満足な試料を取り除いた。ＤＥＳｅｑ２バージョン１．１６．１によって実装された負の二項分布モデルを使用して、差次的遺伝子発現を計算した（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２０１４）１５（１２）：５５０）。ＰＭＥカウントデータ（明示的にモデル化された複製対全実験対照）、正規化した中央比を使用し、帰納的最大値ではなく最尤推定を使用し、許容される調整ｐ値を決定するときにクックの距離カットオフの使用を不能にして、Ｌｏｇ２倍率変化及び有意値を計算した。有意差のある遺伝子は、０．０１未満の調整ｐ値、１以上または−１以下のｌｏｇ２倍率変化、及び１以上のＰＭＥ  ＦＰＫＭを有する少なくとも１つの複製を有するものとして割り当てた。ＲＮＡ−ｓｅｑシグナルもまた、読み取り深度によって正規化し、ＵＣＳＣブラウザーを使用して可視化した。
【０３３２】
Ｉ．ＡＴＡＣ−ｓｅｑ
肝細胞を一晩播種し、次いで血清及び他の因子を取り除いた。２〜３時間後、細胞を化合物で処理し、一晩インキュベートした。細胞を採取し、核を転位反応のために調製した。５０，０００ビーズ結合した核を、Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｎ  ８６，１３６９−１３８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＦＣ−１２１−１０３０）を使用して転位させた。９〜１２サイクルのＰＣＲ増幅後、ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００上でシーケンシングした。伸長を有するバーコード化されたプライマーを使用して、７２℃で５分間ＰＣＲを実施し、次いで最終ＰＣＲ産物をシーケンシングした。
【０３３３】
各試料から得られた全ての読み出し値を、データ分析にＰｈｒｅｄスコア≧２０及び読み出し長≧３０を必要とするｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ０．４．１を使用してトリミングした。トリミングした読み出し値を、Ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．９）を使用し、パラメーター：−ｔ−ｑ−Ｎ  １−Ｌ  ２５−Ｘ  ２０００  ｎｏ−ｍｉｘｅｄ  ｎｏ−ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔを用いて、ヒトゲノム（ｈｇ１９ビルド）に対してマップした。全てのマップされていない読み出し値、固有にマップされていない読み出し値及びＰＣＲ重複を取り除いた。全てのＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを、ＭＡＣＳ２を使用し、パラメーター：−−ｎｏｌａｍｂｄａ−ｎｏｍｏｄｅｌ−ｑ  ０．０１−−ＳＰＭＲを用いて呼び出した。ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを、ＵＣＳＣゲノムブラウザーにおいて可視化した。注釈の付いたプロモーター（ＲｅｆＳｅｑ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ及びＵＣＳＣ  Ｋｎｏｗｎ  Ｇｅｎｅデータベースの複合）から少なくとも２ｋｂ離れたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを、遠位ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークとして選択した。
【０３３４】
Ｊ．ｑＲＴ−ＰＣＲ
ｑＲＴ−ＰＣＲを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７（４０）１７３１５−１７３２０（２０１０）に記載されているように実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、６０℃のアニーリングとともに、ＢｉｏＲａｄからのｉＱ５マルチカラーｒｔＰＣＲ検出システムを使用し、ｃＤＮＡを用いて実施した。
【０３３５】
ｑＲＴ−ＰＣＲによって測地される発現の倍率変化の分析を、以下の技法を使用して実施した。対照はＤＭＳＯであり、処理は選択された化合物（ＣＰＤ）であった。内部対照は、ＧＡＰＤＨまたはＢ−アクチンであり、関心対象の遺伝子は標的である。最初に、正規化のために以下４つの条件：ＤＭＳＯ：ＧＡＰＤＨ、ＤＭＳＯ：標的、ＣＰＤ：ＧＡＰＤＨ、及びＣＰＤ：標的の平均を計算した。次に、（ＤＭＳＯ：標的）−（ＤＭＳＯ：ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣＴ対照及び（ＣＰＤ：標的）−（ＣＰＤ：ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣＴ実験を使用して対照及び処理の両方のΔＣＴを計算して、内部対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。次いで、ΔＣＴ実験−ΔＣＴ対照によってΔΔＣＴを計算した。２−（ΔΔＣＴ）によって発現倍率変化を計算した（本明細書に提供されるＲＮＡ−Ｓｅｑ結果によって２倍発現変化が示された）。
【０３３６】
Ｋ．端部対タグシーケンシング（ＣｈＩＰ−ＰＥＴ）によるクロマチン相互作用分析
ＣｈＩＡ−ＰＥＴは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｐｅｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２，４９０−５０３、Ｆｕｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，５８−６４、Ｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７９１／３７７０、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １４８，８４−９８、及びＤｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９，３７４−３８７において以前に記載されているように実施した。手短に言えば、胚幹（ＥＳ）細胞（最大１×１０８細胞）を、室温で２０分間１％ホルムアルデヒドで処理し、次いで０．２Ｍグリシンを使用して中和した。架橋クロマチンは、音波処理によって３００〜７００ｂｐのサイズ長に断片化された。抗ＳＭＣ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００−０５５Ａ）を使用して、ＳＭＣ１結合されたクロマチン断片を富化した。ＣｈＩＰ  ＤＮＡの部分を、濃度定量化のため、及び定量的ＰＣＲを使用する富化分析のために抗体で被覆されたビーズから溶出した。ＣｈＩＡ−ＰＥＴライブラリー構築の場合、ＣｈＩＰ  ＤＮＡ断片は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して末端修復した。ＣｈＩＰ  ＤＮＡ断片を２アリコートに分割し、リンカーＡまたはリンカーＢのいずれかを断片端部に連結した。２つのリンカーは、ヌクレオチドバーコードとして使用された２つのヌクレオチドが異なる（リンカーＡはＣＧ、リンカーＢはＡＴ）。リンカー連結後、２つの試料を複合し、２０ｍＬ量で希釈して、異なるＤＮＡ−タンパク質複合体間の連結を最小化することによって近位連結のために調製した。近位連結反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で実施し、２２℃で２０時間揺らすことなくインキュベートした。近位連結中に、同じリンカー配列を有するＤＮＡ断片は、同じクロマチン複合体内で連結され、これがホモ二量体リンカー組成を有する連結産物を生成した。しかしながら、異なるクロマチン複合体からＤＮＡ断片間のキメラ連結もまた起こり得、したがってヘテロ二量体リンカー組成を有する連結産物を産生する。これらのヘテロ二量体リンカー産物を使用して、非特異的連結の頻度を評価し、次いで取り除かれる。
【０３３７】
ｉ．１日目
ＣｈＩＰについて記載されるように細胞を架橋した。冷凍細胞ペレットを、使用準備が整うまで−８０℃の冷凍庫で保存した。このプロトコルは、６つの１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中で冷凍された少なくとも３×１０８細胞（チューブあたり５０００万細胞）を必要とする。６つの１００μＬタンパク質Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（各ＣｈＩＡ−ＰＥＴ試料について）を、氷上の６つの１．５ｍＬエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを１．５ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄し、各洗浄ステップの間に４℃で１０分間回転させながらインキュベートして、効率的なブロッキングを可能にした。タンパク質Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、６つのチューブの各々において２５０μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、１０μｇのＳＭＣ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ３００−０５５Ａ）を各チューブに添加した。ビーズ・抗体混合物を、４℃で回転させながら一晩インキュベートした。
【０３３８】
ｉｉ．２日目
ビーズを１．５ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄して、未結合のＩｇＧを取り除き、毎回４℃で１０分間、回転させながらインキュベートした。Ｓｍｃ１結合ビーズを、１００μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、４℃で保存した。最終溶解緩衝液１（試料あたり８ｍＬ）を、５０倍プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液１（ＬＢ１）に添加することによって調製した（１：５０）。８ｍＬの最終溶解緩衝液１を、各冷凍細胞ペレット（試料あたり８ｍＬ×６）に添加した。細胞を完全に再懸濁し、上下にピペットすることによって氷上で解凍した。細胞懸濁液を４℃で１０分間、回転させながら再度インキュベートした。懸濁液を４℃で５分間、１，３５０×ｇで遠心分離した。同時に、最終溶解緩衝液２（試料あたり８ｍＬ）を、５０×プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液２（ＬＢ２）に添加することによって調製した（１：５０）。
【０３３９】
遠心分離後、上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を８ｍＬの最終溶解緩衝液２中に完全に再懸濁した。細胞懸濁液を４℃で１０分間、回転させながらインキュベートした。懸濁液を４℃で５分間、１，３５０×ｇで遠心分離した。インキュベーション及び遠心分離中に、最終音波処理緩衝液（試料あたり１５ｍＬ）を、５０×プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を音波処理緩衝液に添加することによって調製した（１：５０）。上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を１５ｍＬの最終音波処理緩衝液中に完全に再懸濁した。核抽出物を、氷上の１５の１ｍＬ  Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅ２２０音波処理チューブに抽出した。１０μＬのアリコートを使用して、ゲル上の音波処理されていないクロマチンのサイズをチェックした。
【０３４０】
Ｃｏｖａｒｉｓ音波処理器を、製造元の指示に従ってプログラムした（２０００万細胞あたり１２分＝１２×１５＝３時間）。試料を上記のように順次シーケンシングした。目標は、クロマチンＤＮＡを２００〜６００ｂｐに切断することである。音波処理断片が大きすぎる場合、擬陽性がより頻繁になる。音波処理された核抽出物を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中に分注した。１．５ｍＬの試料を４℃で１０分間、完全速度で遠心分離する。上澄み（ＳＮＥ）を新しい予め冷却された５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中にプールし、音波処理緩衝液で１８ｍＬの量にした。２つの５０μＬのチューブを、インプットとして、また断片のサイズをチェックするために取った。２５０μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液を添加し、逆架橋は６５℃で一晩、オーブン内で起こった。架橋の逆転後、音波処理断片のサイズをゲル上で決定した。
【０３４１】
３ｍＬの音波処理抽出物を、６つの清潔な１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブの各々において、ＳＭＣ１抗体を有する１００μＬのタンパク質Ｇビーズに添加した。ＳＮＥ・ビーズ混合物を含有するチューブを、４℃で一晩回転させながらインキュベートした（１４〜１８時間）。
【０３４２】
ｉｉｉ．３日目
ＳＮＥ・ビーズ混合物の量の半分（１．５ｍＬ）を、６つの予め冷却されたチューブの各々に添加し、磁石を使用してＳＮＥを取り除いた。チューブを以下のように順次洗浄した。１）１．５ｍＬの音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；２）１．５ｍＬの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施する）；３）１．５ｍＬの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；４）１．５ｍＬのＬｉＣｌ緩衝液を添加し、細胞を再懸濁して、結合するために５分間回転させながらインキュベートした後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；５）１．５ｍＬの１Ｘ  ＴＥ＋０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して、結合するために５分間細胞を洗浄した後、液体を取り除き、１．５ｍＬの氷冷ＴＥ緩衝液を使用して、結合するために３０秒間細胞を洗浄した後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）。６つのチューブ全てからのビーズを、１倍氷冷ＴＥ緩衝液の１つの１，０００μＬチューブ中で順次再懸濁した。
【０３４３】
ＣｈＩＰ−ＤＮＡを以下のプロトコルを使用して定量化した。ビーズの１０（体積）パーセントまたは１００μＬを、磁石を使用して新たな１．５ｍＬチューブに移した。ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁し、チューブを６５℃で１時間、ビーズで回転させた。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。免疫沈降試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液を免疫沈降及びインプット試料に添加して希釈した。５μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。
【０３４４】
インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫをチューブに添加し、５５℃で１．５時間インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速での遠心分離によって調製した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを、各プロテイナーゼＫ反応に添加した。約１．２ｍＬの混合物をＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させた。水相を２つの清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加した。混合物を−２０℃で一晩または−８０℃で１時間沈降させた。
【０３４５】
混合物を４℃で２０分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除き、チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈降させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を全て取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。Ｈ２Ｏを各チューブに添加した。各チューブを５分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのＤＮＡを組み合わせ、５０μＬのＩＰ及び１００μＬのインプットＤＮＡを得た。
【０３４６】
収集されたＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｑ３２８５６）を使用してＣｈＩＰによって定量化した。１μＬのインターカレーター色素を各測定１μＬの試料と複合した。キットに付随する２つの標準物を使用した。ビーズのわずか１０％からのＤＮＡが測定された。９００μＬのビーズ懸濁液中の約４００ｎｇのクロマチンを、ｑＰＣＲによって測定されるエンハンサー及びプロモーターにおける良好な富化によって得た。
【０３４７】
ｉｖ．３日目または４日目
ＣｈＩＰ−ＤＮＡの末端鈍化を、以下のプロトコルを使用してビーズ上で実施した。残りのクロマチン／ビーズを、ピペットによって分割し、４５０μＬのビーズ懸濁液を２つのチューブに分注した。ビーズを磁石上で収集した。上澄みを取り除き、次いでビーズを以下の反応混合物中に再懸濁した：７０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２．１（ＮＥＢ、Ｍ０２０３Ｌ）、７μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、６１５．８μＬのｄＨ２０、及び７．２μＬの３Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０３Ｌ）。ビーズを３７℃で４０分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した（各洗浄あたり３０秒）。
【０３４８】
Ｏｎ−Ｂｅａｄ  Ａ−テーリングを、下記のようにＫｌｅｎｏｗ（３′〜５′エキソ−）マスターミックスを調製することによって実施した：７０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２、７μＬ  １０ｍＭ  ｄＡＴＰ、６１６μＬ  ｄＨ２０、及び７μＬの３Ｕ／μＬ  Ｋｌｅｎｏｗ（３′〜５′エキソ−）（ＮＥＢ、Ｍ０２１２Ｌ）。混合物を３７℃で５０分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した（各洗浄あたり３０秒）。
【０３４９】
リンカーを氷上で優しく解凍した。リンカーを、優しくピペットすることによって水と、次いでＰＥＧ緩衝液と十分混合した後、優しくボルテックスした。次いで、チューブあたり１３９４μＬのマスターミックス及び６μＬのリガーゼを添加し、反転によって混合した。パラフィルムをチューブ上に置き、チューブを１６℃で一晩（少なくとも１６時間）回転させながらインキュベートした。ビオチニル化リンカーを、以下の反応混合物を設定し、試薬を１１１０μＬのｄＨ２Ｏ、４μＬの２００ｎｇ／μＬのビオチニル化ブリッジリンカー、ＰＥＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する２８０μＬの５Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、及び６μＬの３０Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の順に添加することによって、ビーズ上でＣｈＩＰ−ＤＮＡに連結した。
【０３５０】
ｖ．５日目
エキソヌクレアーゼλ／エキソヌクレアーゼＩ  Ｏｎ−Ｂｅａｄ消化を、以下のプロトコルを使用して実施した。ビーズを磁石で収集し、１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する（各洗浄あたり３０秒）。洗浄緩衝液をビーズから取り除き、次いで以下の反応混合物中に再懸濁した：７０μＬの１０Ｘ  λヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｍ０２６２Ｌ）、６１８μＬのヌクレアーゼ不含ｄＨ２０、６μＬの５Ｕ／μＬ  λエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２６２Ｌ）、及び６μＬのエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、Ｍ０２９３Ｌ）。反応物を３７℃で１時間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、ビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した（各洗浄あたり３０秒）。
【０３５１】
全ての残留緩衝液を取り除き、ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁することによって、クロマチン複合体をビーズから溶出した。ビーズを含むチューブを６５℃で１時間回転させた。チューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
【０３５２】
ｖｉ．６日目
溶出された試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液を添加してＳＤＳを希釈した。３μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（３０ｍｇ／ｍＬ）をチューブに添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、チューブを５５℃で１．５時間再度インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速でそれらを遠心分離することによって沈降させた。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各プロテイナーゼＫ反応に添加し、約１．２ｍＬの混合物をＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｘｇで回転させた。
【０３５３】
水相を２つの清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加する。混合物を−８０℃で１時間沈降させた。チューブを４℃で３０分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除いた。チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈降させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を全て取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。３０μＬのＨ２Ｏをペレットに添加し、５分間放置した。ペレット混合物を短時間ボルテックスし、遠心沈降させてＤＮＡを収集した。
【０３５４】
Ｑｕｂｉｔ及びＤＮＡ高感度ＣｈＩＰを実施して、近位連結されたＤＮＡ産物を定量化し、その質を評価した。約１２０ｎｇの産物が得られた。
【０３５５】
ｖｉｉ．７日目
次いで、Ｎｅｘｔｅｒａ断片化（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の構成成分を調製した。１００ｎｇのＤＮＡを、１２．５μＬの２Ｘ断片化緩衝液（Ｎｅｘｔｅｒａ）、１μＬのヌクレアーゼ不含ｄＨ２０、２．５μＬのＴｎ５酵素（Ｎｅｘｔｅｒａ）、及び９μＬのＤＮＡ（２５ｎｇ）を含有する４つの２５μＬ反応物中に分割した。反応物の各々の断片化を、品質管理のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で分析した。
【０３５６】
反応物を５５℃で５分間、次いで１０℃で１０分間インキュベートした。２５μＬのＨ２Ｏを添加し、断片化されたＤＮＡをＺｙｍｏカラムを使用して精製した。３５０μＬの結合緩衝液を試料に添加し、混合物をカラム中に装填して、１３，０００ｒｐｍで３０秒間回転させた。フロースルーを再適用し、カラムを再度回転させた。カラムを２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、１分間回転させて膜を乾燥させる。カラムを清潔なエッペンドルフチューブに移し、２５μＬの溶出緩衝液を添加した。チューブを１分間遠心沈降させた。このステップを別の２５μＬの溶出緩衝液で繰り返した。全ての断片化されたＤＮＡを１つのチューブに複合した。
【０３５７】
ＣｈＩＡ−ＰＥＴを、以下のステップを使用してストレプトアビジンビーズ上で固定化した。２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液（４０ｍＬ）を、核酸のカップリングのために以下のように調製した：４００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１０ｍＭ最終）、８０μＬの１Ｍ  ＥＤＴＡ（１ｍＭ最終）、１６ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ（２Ｍ最終）、及び２３．５２ｍＬのｄＨ２Ｏ。１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液（４０ｍＬ全量）を、２０ｍＬのｄＨ２Ｏを２０ｍＬの２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液に添加することによって調製した。
【０３５８】
ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０を３０分間室温にし、３０μＬのビーズを新たな１．５ｍＬチューブに移した。ビーズを１５０μＬの２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。ビーズを１００μＬのｉＢｌｏｃｋ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁し、混合した。混合物を室温で４５分間、回転器上でインキュベートした。
【０３５９】
Ｉ−ＢＬＯＣＫ試薬を、０．２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ試薬（０．２ｇ）、１Ｘ  ＰＢＳまたは１Ｘ  ＴＢＳ（１０ｍＬの１０Ｘ  ＰＢＳまたは１０Ｘ  ＴＢＳ）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（５０μＬ）、及びＨ２Ｏを１００ｍＬまで含有するように調製した。１０Ｘ  ＰＢＳ及びＩ−ＢＬＯＣＫ試薬をＨ２Ｏに添加し、混合物を４０秒間マイクロ波処理し（沸騰させてはならない）、次いで撹拌した。溶液を冷却した後、Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した。溶液は不透明なままであったが、粒子は溶解された。使用するために溶液を室温に冷ました。
【０３６０】
ビーズのインキュベーション中に、５００ｎｇの剪断ゲノムＤＮＡを５０μＬのＨ２Ｏ及び５０μＬの２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液に添加した。ビーズがｉＢＬＯＣＫ緩衝液でのインキュベーションを終えたとき、それらを２００μＬの１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。洗浄緩衝液を破棄し、１００μＬの剪断ゲノムＤＮＡを添加した。混合物を室温で３０分間回転させながらインキュベートした。ビーズを２００μＬの１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。断片化ＤＮＡを、等量の２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液とともにビーズに添加し、室温で４５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを５００μＬの２ｘ  ＳＳＣ／０．５％  ＳＤＳ緩衝液（毎回３０秒）で５回洗浄し、続いて５００ｍＬの１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄し、各洗浄後に室温で５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを優しく再懸濁し、チューブを磁石上に置くことによって、Ｑｉａｇｅｎキットからの１００μＬの溶出緩衝液（ＥＢ）で１回洗浄した。上澄みをビーズから取り除き、それらを３０μＬのＥＢ中に再懸濁した。
【０３６１】
対合端シーケンシングライブラリーを、以下のプロトコルを使用してビーズ上に構築した。１０μＬのビーズを、１０サイクルの増幅でＰＣＲにより試験する。５０μＬのＰＣＲ混合物は、１０μＬのビーズＤＮＡ、１５μＬのＮＰＭ混合物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａキットから）、５μＬのＰＰＣ  ＰＣＲプライマー、５μＬのＩｎｄｅｘプライマー１（ｉ７）、５μＬのＩｎｄｅｘプライマー２（ｉ５）、及び１０μＬのＨ２Ｏを含有する。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施した：７２℃で３分間、次いで９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間、及び７２℃で５０秒間の１０〜１２サイクル、ならびに７２℃で５分間の最終延長でＤＮＡを変性させた。サイクルの数を調整して、４つの２５μＬの反応物とともに合計約３００ｎｇのＤＮＡを得た。ＰＣＲ産物は、不明確な量の時間にわたって４℃で保持され得る。
【０３６２】
ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用してクリーンアップした。ビーズを使用する前に３０分間室温にした。５０μＬのＰＣＲ反応物を新たなＬｏｗ−Ｂｉｎｄチューブに移し、（１．８倍量）９０μＬのＡＭＰｕｒｅビーズを添加した。混合物を十分にピペットし、室温で５分間インキュベートした。磁石を３分間使用してビーズを収集し、上澄みを取り除いた。３００μＬの新鮮に調製された８０％エタノールを磁石上のビーズに添加し、エタノールを慎重に破棄した。洗浄を繰り返し、次いで全てのエタノールを取り除いた。ビーズを磁石ラック上で１０分間乾燥させた。１０μＬのＥＢをビーズに添加し、十分に混合して、室温で５分間インキュベートした。溶出液を収集し、１μＬの溶出液をＱｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒに使用した。
【０３６３】
ライブラリーをクローン化して、以下のプロトコルを使用して複雑性を検証した。１μＬのライブラリーを１：１０で希釈した。ＰＣＲ反応を下記のように実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターにアニールするプライマーを選択した（Ｔｍ＝５２．２℃）。ＰＣＲ反応混合物（全量：５０μＬ）は、以下を含有していた：１０μＬの５Ｘ  ＧｏＴａｑ緩衝液、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬの１０μＭプライマーミックス、０．２５μＬのＧｏＴａｑポリメラーゼ、１μＬの希釈したテンプレートＤＮＡ、及び３２．７５μＬのＨ２Ｏ。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施した：９５℃で２分間、ならびに以下の条件：９５℃で６０秒間、５０℃で６０秒間、及び７２℃で３０秒間の２０サイクル、ならびに７２℃で５分間の最終延長でＤＮＡを変性させた。ＰＣＲ産物は、不明確な量の時間にわたって４℃で保持され得る。
【０３６４】
ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）プロトコルで連結した。５μＬの２Ｘ  Ｔ４  Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液、１μＬのｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ−Ｅａｓｙベクター、１μＬのＴ４リガーゼ、１μＬのＰＣＲ産物、及び２μＬのＨ２Ｏを、全量１０μＬまで複合した。産物を室温で１時間インキュベートし、２μＬを使用して星コンピテント細胞を形質転換した。２００μＬの５００μＬの細胞をＳＯＣ培地にプレーティングした。翌日、Ｔ７プロモータープライマーを使用して、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングのための２０コロニーを選択した。６０％クローンは、完全なアダプターを有し、１５％が部分的アダプターを有していた。
【０３６５】
ｖｉｉｉ．試薬
１０試料のタンパク質Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌカタログ番号１０００３Ｄからのものであった。ブロッキング溶液（５０ｍＬ）は、５０ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解された０．２５ｇのＢＳＡ（０．５％  ＢＳＡ、ｗ／ｖ）を含有し、使用前に４℃で２日間保存した。
【０３６６】
溶解緩衝液１（ＬＢ１）（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１００％グリセロール溶液、２５ｍＬの１０％  ＮＰ−４０、及び１２．５ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１０００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３６７】
音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％  ＳＤＳを含有していた。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。高塩音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３５ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％  ＳＤＳを含有していた。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３６８】
ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（５００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＬの１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液、２５ｍＬの１０％  ＮＰ−４０、及び５０ｍＬの５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３６９】
溶出緩衝液（５００ｍＬ）を使用して、２５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％  ＳＤＳ、及び４１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏを含有するＣｈＩＰ  ＤＮＡの量を定量化した。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３７０】
ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液（５０ｍＬ）は、５００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（最終１０ｍＭ）、１００μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（最終１ｍＭ）、５ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ（最終５００ｍＭ）、及び４４．４ｍＬのｄＨ２Ｏを含有していた。
【０３７１】
Ｌ．ＨｉＣｈＩＰ
ＣｈＩＡ−ＰＥＴの代替として、ＨｉＣｈＩＰを使用して、クロマチン相互作用及び立体配座を分析した。ＨｉＣｈＩＰは、ＣｈＩＡ−ＰＥＴよりも少ない細胞を必要とする。
【０３７２】
ｉ．細胞架橋
上のＣｈＩＰプロトコルに記載されるように細胞を架橋した。架橋した細胞を、−８０℃でペレットとして保存するか、または細胞を急速冷凍した直後にＨｉＣｈＩＰに使用した。
【０３７３】
ｉｉ．溶解及び制限
１５００万個の架橋細胞を５００μＬの氷冷Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液中に再懸濁し、４℃で３０分間回転させた。１５００万より多くの細胞量の場合、ペレットを接触生成のために半分に分割し、次いで音波処理のために組み合えた。細胞を２５００ｇで５分間遠心沈降し、上澄みを破棄した。ペレット化した核を、５００μＬの氷冷Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液で１回洗浄した。上澄みを取り除き、ペレットを１００μＬの０．５％  ＳＤＳ中に再懸濁した。再懸濁液を６２℃で１０分間インキュベートし、次いで２８５μＬのＨ２Ｏ及び５０μＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して、ＳＤＳをクエンチした。再懸濁液を十分に混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。５０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２及び３７５ＵのＭｂｏＩ制限酵素（ＮＥＢ、Ｒ０１４７）を混合物に添加して、３７℃で２時間回転させることによってクロマチンを消化した。より下位の出発物質の場合、より少ない制限酵素を使用し、１５μＬを１０００〜１５００万細胞に使用し、８μＬを５００万細胞、及び４μＬを１００万細胞に使用した。熱（６２℃で２０分間）を使用して、ＭｂｏＩを不活化した。
【０３７４】
ｉｉｉ．ビオチン組み込み及び近位連結
制限断片オーバーハングを満たし、ＤＮＡ端部をビオチンでマークするために、３７．５μＬの０．４ｍＭビオチン−ｄＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  １９５２４０１６）、１．５μＬの１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびに１０μＬの５Ｕ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きな（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（ＮＥＢ、Ｍ０２１０）を複合することによって、５２μＬの充填マスターミックスを反応させた。混合物を、３７℃で１時間回転させながらインキュベートした。
【０３７５】
９４８μＬの連結マスターミックスを添加した。連結マスターミックスは、１０ｍＭ  ＡＴＰを含む１５０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｂ０２０２）、１２５μＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０μＬの４００Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２）、及び６６０μＬの水を含有していた。混合物を、室温で４時間回転させながらインキュベートした。核を２５００ｇで５分間ペレット化し、上澄みを取り除いた。
【０３７６】
ｉｖ．音波処理
音波処理の場合、ペレットを核溶解緩衝液中で最大１０００μＬにした。試料をＣｏｖａｒｉｓミリチューブに移し、ＤＮＡを製造元の推奨するパラメーターでＣｏｖａｒｉｓ（登録商標）Ｅ２２０Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（商標）を使用して剪断した。各チューブ（１５００万細胞）を以下の条件下で４分間音波処理した。充填レベル５、デューティサイクル５％、ＰＩＰ１４０、及びサイクル／バースト２００。
【０３７７】
ｖ．プレクリアリング、免疫沈降、ＩＰビーズ捕捉、及び洗浄
試料を４℃で１５分間、１６，１００ｇで清澄化した。試料を各々約４００μＬの２チューブに分割し、７５０μＬのＣｈＩＰ希釈緩衝液を添加した。Ｓｍｃ１ａ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ３００−０５５Ａ）の場合、試料をＣｈＩＰ希釈緩衝液中で１：２に希釈して、０．３３％のＳＤＳ濃度を達成した。６０μＬのタンパク質Ｇビーズを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液中１０００万細胞ごとに洗浄した。ビーズ（プレクリアリング及び捕捉のため）及び抗体の量を、異なる量の細胞出発物質について直線的に調節した。タンパク質Ｇビーズをチューブあたり５０μＬ（ＨｉＣｈＩＰあたり１００μＬ）の希釈緩衝液中に再懸濁した。試料を４℃で１時間回転させた。試料を磁石上に置き、上澄みを新たなチューブに移した。７．５μｇの抗体を１０００万細胞ごとに添加し、混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベートした。別の６０μＬのタンパク質Ｇビーズを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液中１０００万細胞ごとに添加した。タンパク質Ｇビーズを、５０μＬの希釈緩衝液（ＨｉＣｈＩＰあたり１００μＬ）中に再懸濁し、試料に添加して、４℃で２時間回転させた。ビーズを低塩洗浄緩衝液、高塩洗浄緩衝液、及びＬｉＣｌ洗浄緩衝液で各々３回洗浄した。５００μＬの洗浄緩衝液を添加し、試料を磁石に対して動かすことによってビーズを前後に２回振り、次いで上澄みを取り除くことによって、磁石上で室温で洗浄を実施した。
【０３７８】
ｖｉ．ＣｈＩＰ  ＤＮＡ溶出
ＣｈＩＰ試料ビーズを１００μＬの新鮮なＤＮＡ溶出緩衝液中に再懸濁した。試料ビーズを室温で１０分間回転させながらインキュベートし、続いて３７℃で３分間振とうさせながらインキュベートした。ＣｈＩＰ試料を磁石上に置き、上澄みを新鮮なチューブに取り除いた。別の１００μＬのＤＮＡ溶出緩衝液をＣｈＩＰ試料に添加し、インキュベーションを繰り返した。ＣｈＩＰ試料の上澄みを再度取り除き、新たなチューブに移した。約２００μＬのＣｈＩＰ試料が存在していた。１０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を各試料に添加し、５５℃で４５分間振とうさせながらインキュベートした。温度を６７℃に高め、試料を少なくとも１．５時間振とうさせながらインキュベートした。ＤＮＡをＺｙｍｏ精製し（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃Ｄ４０１４）、１０μＬの水に溶出した。ポストＣｈＩＰ  ＤＮＡを定量化して、ライブラリーを正しいサイズ分布で生成するために必要とされるＴｎ５の量を推定した。これは、接触ライブラリーを適切に生成し、試料を過剰に音波処理せず、材料をストレプトアビジンビーズ上で頑強に捕捉したと推測した。１０００万細胞でのＳＭＣ１  ＨｉＣｈＩＰは、１５ｎｇ〜５０ｎｇのポストＣｈＩＰ  ＤＮＡの予想収率を有していた。１５０ｎｇより多くのポストＣｈＩＰ  ＤＮＡを有するライブラリーの場合、材料を除外し、最大１５０ｎｇをビオチン捕捉ステップに取り入れた。
【０３７９】
ｖｉｉ．Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのビオチンプルダウン及び調製
ビオチンプルダウンのための調製のために、５μＬのストレプトアビジンＣ−１ビーズをＴｗｅｅｎ洗浄緩衝液で洗浄した。ビーズを１０μＬの２Ｘビオチン結合緩衝液中に再懸濁し、試料に添加した。ビーズを室温で１５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石上で分離し、上澄みを破棄した。５００μＬのＴｗｅｅｎ洗浄緩衝液を添加することによってビーズを２回洗浄し、５５℃で２分間振とうさせながらインキュベートした。ビーズを１００μＬの１Ｘ（２Ｘから希釈した）ＴＤ緩衝液中で洗浄した。ビーズを２５μＬの２Ｘ  ＴＤ緩衝液、各５０ｎｇのポストＣｈＩＰ  ＤＮＡについて２．５μＬのＴｎ５、及び水中で５０μＬの量まで再懸濁した。
【０３８０】
Ｔｎ５は、４μＬの最大量を有していた。例えば、２５ｎｇのＤＮＡ転位の場合、１．２５μＬのＴｎ５を添加し、一方で１２５ｎｇのＤＮＡ転位の場合、４μＬのＴｎ５を使用した。正しい量のＴｎ５を使用して、適切なサイズ分布をもたらした。過剰転位された試料は、より短い断片を有し、より低いアラインメント率を呈していた（接合部は断片端部に近かった）。過小転位された試料は、大き過ぎてＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサー上で適切にクラスター化することができない断片を有する。ライブラリーを５サイクルで増幅させ、ライブラリーの転位のレベルに関係なく、深くシーケンシングされ、適切なサイズ分布を達成するために十分な複雑性を有していた。
【０３８１】
ビーズを５５℃で１０分間、合間に振とうさせながらインキュベートした。試料を磁石上に置き、上澄みを取り除いた。５０ｍＭ  ＥＤＴＡを試料に添加し、５０℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を迅速に磁石上に置き、上澄みを取り除いた。試料を５０℃で３分間、５０ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を５５℃で２分間、Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液中で２回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。
【０３８２】
ｖｉｉｉ．ＰＣＲ及びＰＣＲ後サイズ選択
ビーズを５０μＬのＰＣＲマスターミックス中に懸濁した（デュアルＩｎｄｅｘアダプター＃１５０５５２８９を有するＩｌｌｕｍｉｎａからのＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡライブラリー調製キット＃１５０２８２１２を使用する）。ＰＣＲを以下のプログラムを使用して実施した。２つの方法のうちの１つを使用して、サイクル数を推定した。（１）最初の５サイクル（７２℃で５分間、９８℃で１分間、９８℃で１５秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で１分間）を、通常のＰＣＲ上で実施し、次いで産物をビーズから取り除いた。次いで、０．２５Ｘ  ＳＹＢＲグリーンを添加し、試料をｑＰＣＲ上で実行した。試料を指数的増幅の開始時に取り出した。または（２）反応をＰＣＲ上で実行し、ポストＣｈＩＰ  Ｑｕｂｉｔからの材料の量に基づいてサイクル数を推定した（５０ｎｇ超は５サイクルで実行されたが、およそ５０ｎｇは６サイクルで実行され、２５ｎｇは７サイクルで実行され、１２．５ｎｇは８サイクルで実行された等）。
【０３８３】
ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。ライブラリーをＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからのキットを使用して精製し、１０μＬの水に溶出した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて両側サイズ選択を実施した。ＰＣＲ後、ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。次いで、２５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを添加し、上澄みを保持して７００ｂｐ未満の断片を捕捉した。上澄みを新たなチューブに移し、１５μＬの新鮮なビーズを添加して、３００ｂｐより大きい断片を捕捉した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズから１０μＬの水中に最終溶出を実施した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してライブラリーの質を検証した。
【０３８４】
ｉｘ．緩衝液
Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２００μＬの１０％  ＮＰ−４０、２００μＬの５０Ｘプロテアーゼ阻害剤、及び９．６８ｍＬの水を含有していた。核溶解緩衝液（１０ｍＬ）は、５００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１ｍＬの１０％  ＳＤＳ、２００μＬの５０Ｘプロテアーゼ阻害剤、及び８．３ｍＬの水を含有していた。ＣｈＩＰ希釈緩衝液（１０ｍＬ）は、１０μＬの１０％  ＳＤＳ、１．１ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２４μＬの５００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１６７μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３３４μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び８．３６５ｍＬの水を含有していた。低塩洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１０％  ＳＤＳ、１ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、２００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び８．３６ｍＬの水を含有していた。高塩洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１０％  ＳＤＳ、１ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、２００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び７．６６ｍＬの水を含有していた。ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５００μＬの５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＬの１０％  ＮＰ−４０、１ｍＬの１０％  Ｎａ−デオキシコール酸塩、２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、及び７．３８ｍＬの水を含有していた。
【０３８５】
ＤＮＡ溶出緩衝液（５ｍＬ）は、２５０μＬの新鮮な１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、５００μＬの１０％  ＳＤＳ、及び４．２５ｍＬの水を含有していた。Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液（５０ｍＬ）は、２５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２５０μＬの１０％  Ｔｗｅｅｎ−２０、及び３９．４５ｍＬの水を含有していた。２Ｘビオチン結合緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０μＬの０．５Ｍ、４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び５．８８ｍＬの水を含有していた。２Ｘ  ＴＤ緩衝液（１ｍＬ）は、２０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、２００μＬの１００％ジメチルホルムアミド、及び７７０μＬの水を含有する。
【０３８６】
Ｍ．肝細胞への投与のための薬物希釈
肝細胞の化合物処理の前に、ＤＭＳＯ中０．１ｍＭのストック薬物を０．９ｍＬのＤＭＳＯと混合することによって、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストック薬物を１０ｍＭに希釈して、最終量を１．０ｍＬにした。５μＬの希釈薬物を各ウェルに添加し、薬物のウェルあたり０．５ｍＬの培地を添加した。各薬物を三重に分析した。５μＬの薬物を４５μＬの培地に添加し、５０μＬを細胞上の４５０μＬの培地に添加することによって、１０００ｘまでの希釈を実施した。
【０３８７】
生物活性化合物もまた、肝細胞に投与した。１ｍＬのＤＭＳＯ中の生物活性化合物の１０００ｘストックを得るために、０．１ｍＬの１０，０００倍ストックを０．９ｍＬのＤＭＳＯと複合した。
【０３８８】
実施例２．刺激された肝細胞についてのＲＮＡ−ｓｅｑ研究
尿素サイクル酵素を調整する小分子を特定するために、一次ヒト肝細胞を単一培養として調製し、少なくとも１つの小分子化合物を細胞に適用した。
【０３８９】
ＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、肝細胞中の尿素サイクル酵素の発現に対する化合物の効果を決定した。摂動されていた細胞系中の発現レベルを非摂動系中の発現レベルで除算することによって、倍率変化を計算した。ｐ値≦０．０５を有する発現の変化を有意であるとみなした。
【０３９０】
肝細胞のシグナル伝達中心を摂動するために使用される化合物は、表１に列挙される少なくとも１つの化合物を含む。表中で、化合物はそれらのＩＤ、標的、経路、及び薬学的作用とともに列挙される。摂動シグナルとして選択された大部分の化合物は、当該技術分野において少なくとも１つの正準細胞経路を調整することが知られている。いくつかの化合物を、有効性の欠失に起因して第ＩＩＩ相臨床評価において失格した化合物から選択した。
【０３９１】
（表１）ＲＮＡ−ｓｅｑ中で使用される化合物
2020536871.tif 000003
2020536871.tif 000004
2020536871.tif 000005
2020536871.tif 000006
2020536871.tif 000007
2020536871.tif 000008
2020536871.tif 000009
2020536871.tif 000010
2020536871.tif 000011
2020536871.tif 000012
2020536871.tif 000013
2020536871.tif 000014
2020536871.tif 000015
2020536871.tif 000016
【０３９２】
実施例３．尿素サイクル酵素の発現を調整する化合物の特定
ＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析は、ＣＰＳ１、ＯＴＣ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、及び／またはＮＡＧＳの発現の有意な変化を引き起こしたいくつかの化合物を明らかにした。有意性は、選択された遺伝子標的について、ＦＰＫＭ≧１、ｌｏｇ２（倍率変化）≧０．５、及びｑ値≦０．０５として定義された。少なくとも１つの標的遺伝子において著しく調整された化合物のＲＮＡ−ｓｅｑ結果を表２〜１０に示す。表２は、ＣＰＳ欠損症に関連するＣＰＳ１の発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３９３】
（表２）化合物によって調整されるＣＰＳ１発現
2020536871.tif 000017
2020536871.tif 000018
【０３９４】
表３は、ＯＴＣ欠損症に関連するＯＴＣの発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３９５】
（表３）化合物によって調整されるＯＴＣ発現
2020536871.tif 000019
【０３９６】
表３Ａは、ＯＴＣ欠損症に関連するＯＴＣの発現を増加させることが観察された化合物について、追加のデータを提供する。１ｕＭ最終濃度でアッセイされた化合物ＨＳＰ−９９０及び塩酸レタスピマイシンを除く、１０ｕＭの最終濃度でアッセイされた化合物。
【０３９７】
（表３Ａ）化合物によって調整されるＯＴＣ発現
2020536871.tif 000020
2020536871.tif 000021
【０３９８】
実施例４．ＯＴＣ発現を上方調節するためのｓｉＲＮＡ剤の使用
一次ヒト肝細胞を、２４ウェルフォーマット（ウェルあたり１μＬ）でＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１３７７８０３０）を使用し、６ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした（最終濃度１０ｎＭの場合）。翌朝、培地を取り除き、修飾された維持培地でさらに２４時間置き換えた（上記を参照）。処理全体は４８時間続き、この時点で培地を取り除き、ＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ９６  ＱＩＡｃｕｂｅ  ＨＴキットカタログ番号７４１７１）と置き換えた。ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎから取得し、全て関心対象の特定の遺伝子内で別個の部位を標的とするように設計された４つのｓｉＲＮＡ二重鎖のプールである（「ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」として知られる）。ｓｉＲＮＡカタログ番号を、下記の表３Ｂに列挙する。それらは、対照非標的ｓｉＲＮＡ  Ｄ−００１２０６−１３−０５に対して試験された。
【０３９９】
単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲのために上記のように処理した。ＴａｑｍａｎアッセイをＯＴＣ測定に使用した。Ｈｓ００１６６８９２＿ｍ１
【０４００】
（表３Ｂ）ｓｉＲＮＡ剤はＯＴＣを上方調節する
2020536871.tif 000022
【０４０１】
表４は、ＡＳＳ１欠損症に関連するＡＳＳ１の発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０４０２】
（表４）化合物によって調整されるＡＳＳ１発現
2020536871.tif 000023
【０４０３】
表５は、ＡＳＬ欠損症に関連するＡＳＬの発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０４０４】
（表５）化合物によって調整されるＡＳＬ発現
2020536871.tif 000024
【０４０５】
表６は、ＮＡＧＳ欠損症に関連するＮＡＧＳの発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０４０６】
（表６）化合物によって調整されるＮＡＧＳ発現
2020536871.tif 000025
2020536871.tif 000026
【０４０７】
表７は、アルギナーゼ欠損症に関連するＡＲＧ１の発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０４０８】
（表７）化合物によって調整されるＡＲＧ１発現
2020536871.tif 000027
【０４０９】
表８は、ＯＲＮＴ１欠損症に関連するＳＬＣ２５Ａ１５の発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０４１０】
（表８）化合物によって調整されるＳＬＣ２５Ａ１５発現
2020536871.tif 000028
【０４１１】
表９は、シトリン欠損症に関連するＳＬＣ２５Ａ１３の発現を著しく増加させることが観察された化合物について、ｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０４１２】
（表９）化合物によって調整されるＳＬＣ２５Ａ１３発現
2020536871.tif 000029
【０４１３】
表１０は、複数の尿素サイクル関連遺伝子の発現を著しく増加させることが観察された化合物の一覧を提供する。
【０４１４】
（表１０）複数の遺伝子を調整する化合物
2020536871.tif 000030
2020536871.tif 000031
【０４１５】
上に示されるように、ダサチニブは、ｌｏｇ２倍率変化≧１で７つの尿素サイクル遺伝子の発現を著しく上方調節することが観察された。エキノマイシン及びＣＰ−６７３４５１は、６つの尿素サイクル遺伝子の発現を著しく上方調節することが観察された。ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ボスチニブ、エピネフリン、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、アムバチニブ、ＦＲＡＸ５９７、及びサリドマイドは、５つの尿素サイクル遺伝子の発現を著しく上方調節することが観察された。クレノラニブ、ＢＭＰ２、デオキシコルチコステロン、ＴＮＦ−α、Ｗｎｔ３ａ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、アクチビン、及びＨＧＦ／ＳＦは、４つの尿素サイクル遺伝子の発現を著しく上方調節することが観察された。１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）、ＧＺＤ８２４ジメシレート、ＢＡＹ  ８７−２２４３、プレドニゾン、ノーダル、モメロチニブ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、抗ミュラー管ホルモン、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、及びピフィスリン−μは、３つの尿素サイクル遺伝子の発現を著しく上方調節することが観察された。
【０４１６】
ダサチニブは、Ａｂｌ、Ｓｒｃ、及びｃ−Ｋｉｔを標的とする新規の強力な多標的化阻害剤である。これは、Ａｂｌ−、Ｓｒｃ−、またはｃ−Ｋｉｔ媒介性シグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子、特にＡｂｌ、Ｓｒｃ、またはｃ−Ｋｉｔを阻害することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４１７】
ムブリチニブ（ＴＡＫ−１６５）は、ＢＴ−４７４細胞において６ｎＭのＩＣ５０を有するＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の強力な阻害剤である。
【０４１８】
ＸＬ２２８は、がん細胞増幅、生存、及び転移において重要な役割を果たす標的である、インスリン様増殖因子１型受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、Ｓｒｃ、及びＡｂｌチロシンキナーゼを阻害するように設計されている。
【０４１９】
３つの特定された化合物、フォレチニブ／ＸＬ８８０、レゴラフェニブは、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、ＶＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子、特にＶＥＧＦＲを調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２０】
６つの特定された化合物、ＣＰ−６７３４５１、アムバチニブ、クレノラニブ、スニチニブ、アムバチニブ、及びＰＤＧＦは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、ＰＤＧＦＲ媒介性シグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子、特にＰＤＧＦＲを調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２１】
３つの特定された化合物、パゾパニブ、リニファニブ、レゴラフェニブは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）及び血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、ＰＤＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子、特にＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲを調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２２】
５つの特定された化合物、ＰＦ−０４９２９１１３（ＳＮＸ−５４２２）、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、塩酸レタスピマイシンは、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、シグナル伝達分子、特にＨＳＰ９０を調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２３】
５つの特定された化合物、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＢＭＰ２、アクチビン、ノーダル、及び抗ミュラー管ホルモン、ドルソモルフィンは、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−Ｂ）シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子、特にＴＧＦ−Ｂ及び／または骨形態形成タンパク質受容体１Ａ型（ＢＭＰＲ１Ａ）を調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２４】
５つの特定された化合物、モメロチニブ、バリシチニブ、ＧＬＰＧ０６３４、ＡＺＤ１４８０、ＬＹ２７８４５４４、ＴＡＫ−９０１、クエン酸トファシチニブは、ＪＡＫ媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、シグナル伝達分子、特にＪＡＫ／ＳＴＡＴを調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２５】
３つの特定された化合物、ＣＣＣＰ、ＢＸ７９５、ＭＲＴ６７３０７は、ＴＢＫ１／Ｉｋｋｅ媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、特にＴＢＫ１経路を通してシグナル伝達分子を調整することが、尿素サイクル酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２６】
７つの特定された化合物、ＡＳ６０２８０１（ベンタマピモド）、ＰＦ−００５６２２７１、ＢＩＲＢ  ７９６、パマピモド、Ｒ１４８７塩酸塩、バルドキソロン、ＰＨ−７９７８０４は、ＭＡＰＫ媒介性シグナル伝達経路の既知の調整因子である。これは、シグナル伝達分子、特にＭＡＰＫを調整することが、尿素サイクルの酵素を強力に上方調節し得ることを示唆する。
【０４２７】
ムブリチニブ（ＴＡＫ−１６５）は、ＢＴ−４７４細胞において６ｎＭのＩＣ５０を有するＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の強力な阻害剤である。
【０４２８】
ＸＬ２２８は、がん細胞増幅、生存、及び転移において重要な役割を果たす標的である、インスリン様増殖因子１型受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、Ｓｒｃ、及びＡｂｌチロシンキナーゼを阻害するように設計されている。
【０４２９】
スニチニブは、複数のＲＴＫを標的とすることによって細胞シグナル伝達を阻害する。これらには、全ての血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）及び血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）が含まれる。スニチニブはまた、ＧＩＳＴの大部分を駆動するＲＴＫであるＫＩＴ（ＣＤ１１７）を阻害する。加えて、スニチニブは、ＲＥＴ、ＣＳＦ−１Ｒ、及びｆｌｔ３を含む他のＲＴＫを阻害する。
【０４３０】
リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）は、生化学アッセイにおいてＲＡＦファミリーキナーゼ及びＥＧＦＲの活性を強力に阻害し、組み換えＢＲＡＦＶ６００Ｅキナーゼドメイン、ＥＧＦＲ、及びＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ突然変異体について、２３ｎＭ、２９ｎＭ、及び４９５ｎＭのＩＣ５０値を有する。
【０４３１】
フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）は、ＨＧＦＲ及びＶＥＧＦＲのＡＴＰ競合阻害剤であり、大部分はＭｅｔ及びＫＤＲについて、無細胞アッセイにおいて０．４ｎＭ及び０．９ｎＭのＩＣ５０を有する。Ｒｏｎ、Ｆｌｔ−１／３／４、Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα／β、及びＴｉｅ−２に対してあまり強力ではなく、ＦＧＦＲ１及びＥＧＦＲに対してほとんど活性がない。
【０４３２】
ＢＩＩＢ０２１は、ＨＳＰ９０の経口的に投与される完全な合成小分子阻害剤であり、それぞれ１．７ｎＭ及び３８ｎＭのＫｉ及びＥＣ５０を有する。
【０４３３】
ＮＶＰ−ＨＳＰ９９０（ＨＳＰ９９０）は、新規の強力な選択的ＨＳＰ９０阻害剤であり、ＨＳＰ９０α／βについて、０．６ｎＭ／０．８ｎＭのＩＣ５０を有する。
【０４３４】
ＩＰＩ−５０４は、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０の新規の水溶性の強力な阻害剤である。
【０４３５】
バリシチニブは、選択的かつ可逆的なヤヌスキナーゼ１（ＪＡＫ１）及び２（ＪＡＫ２）阻害剤である。
【０４３６】
ドラマピモド（ＢＩＲＢ  ７９６）は、ｐａｎ−ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤であり、無細胞アッセイにおいてｐ３８α／β／γ／δについて３８ｎＭ、６５ｎＭ、２００ｎＭ、及び５２０ｎＭのＩＣ５０を有し、ＴＨＰ−１細胞において０．１ｎＭのＫｄ、ＪＮＫ２に対して３３０倍優れた選択性でｐ３８αに結合する。
【０４３７】
パマピモドは、ｐ３８α  ＭＡＰキナーゼの強力な阻害剤である（ＩＣ５０＝１４ｎＭ）。１それは、ｐ３８βよりもｐ３８αに対して３０倍を超える選択性を示し、ｐ３８δまたはｐ３８γに対して活性を有さず、他の３５０キナーゼのパネルに対して限定された活性を有する。
【０４３８】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＢＭＳ−２１４６６２は、酵素ファルネシルトランスフェラーゼ、及びシグナル伝達に関与するタンパク質の数の翻訳後ファルネシル化を阻害し、これは、感受性腫瘍細胞におけるＲａｓ機能の阻害及びアポトーシスをもたらし得る。
【０４３９】
これらの結果はまた、尿素サイクルの発現は、他のシグナル伝達経路、例えばＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路、低酸素活性化シグナル伝達経路、Ｓｒｃシグナル伝達経路、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路、細胞サイクル／ＤＮＡ損傷経路、アドレナリン作動性受容体媒介性経路、ＰＡＫシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、及びアポトーシスに関連し得ることを示唆する。これらの経路のうちの１つを調整することはまた、尿素サイクル酵素の上方調節につながり得る。
【０４４０】
実施例５．シグナル伝達中心のゲノム位置及び組成物の決定
多層アプローチは、シグナル伝達中心の位置または「フットプリント」を特定するために本明細書で使用される。遺伝子及びエンハンサーの線形近接は、常にシグナル伝達中心の３Ｄ立体配座を決定するために有益であるとは限らない。
【０４４１】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用して、シグナル伝達中心のゲノム位置及び組成物を決定した。転写因子、シグナル伝達タンパク質、及びクロマチン修飾を含む６７標的に特異的な抗体は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用するＨｅｐＧ２細胞における検証のために選択された。これらの検証された抗体を幹細胞のＣｈＩＰ−ｓｅｑにおいて使用して、二次元（２Ｄ）マップを作成した。これらの抗体標的を表１１に示す。
【０４４２】
（表１１）一次ヒト肝細胞のＣｈＩＰ−ｓｅｑ標的
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【０４４３】
シグナル伝達タンパク質カラムにおいて、関連正準経路は「−」の後に含まれる。
【０４４４】
表１２は、クロマチンマーク、及びクロマチン関連タンパク質、転写因子、ならびに一次ヒト肝細胞中の各尿素サイクル関連遺伝子の絶縁近傍に関連する特定のシグナル伝達タンパク質／または因子を示す。
【０４４５】
（表１２）ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果
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【０４４６】
実施例６．ＲＮＡ−ｓｅｑ結果検証
初期ＲＮＡ−ｓｅｑ分析から特定された化合物は、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検証に供される。ｑＲＴ−ＰＣＲは、特定された化合物で刺激された第２のドナーからの一次ヒト肝細胞の試料上で実施される。化合物を、異なる濃度で異なる細胞ロットで試験する。ｑＲＴ−ＰＣＲを介して観察される遺伝子発現の倍率変化を、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの倍率変化と比較する。少なくとも１つの尿素サイクル酵素の発現のロバストな増加を引き起こす化合物を、さらなる特性化のために選択する。
【０４４７】
実施例７．関心対象の経路の崩壊
尿素サイクル酵素の発現の変化との関連を示した正準経路を、追加の化合物で摂動させて、尿素サイクル酵素の調節における経路の関与を確認する。一実施形態では、一次ヒト肝細胞を、ＰＤＧＦＲ媒介性シグナル伝達経路における異なる構成成分を標的とする追加の化合物で処理する。別の実施形態では、一次ヒト肝細胞を、ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路における異なる構成成分を標的とする追加の化合物で処理する。刺激された肝細胞における選択された尿素サイクル酵素の発現を、実施例１に記載されるようにＲＮＡ−ｓｅｑで分析する。肝星細胞もまた、同じ化合物で処理し、遺伝子発現に対する摂動された経路の効果を比較する。シグナル伝達タンパク質の結合パターンの変化を、ＣｈＩＰを使用して調べる。結果を利用して、選択された尿素サイクル酵素発現を制御する遺伝子シグナル伝達ネットワークを例証し、所望の方向に選択された尿素サイクル酵素を調整する追加の化合物を特定する。
【０４４８】
実施例８．他の肝細胞株における化合物試験
一実施形態では、候補化合物を肝星細胞において評価して、それらの有効性を確認する。星細胞中の標的遺伝子発現の変化を、ｑＲＴ−ＰＣＲで分析する。結果を、一次肝細胞からの結果と比較する。少なくとも１つの尿素サイクル酵素の一貫した誘導を示す化合物を、さらなる特性化のために選択する。
【０４４９】
実施例９．患者細胞における化合物試験
患者由来の誘導多能性幹（ｉＰＳ）肝芽細胞において候補化合物を評価して、それらの有効性を確認する。選択された患者は、尿素サイクル酵素のうちの少なくとも１つの欠損を有する。ｉＰＳ−肝芽細胞中の標的遺伝子発現の変化を、ｑＲＴ−ＰＣＲで分析する。結果を使用して、経路が患者細胞において同様に機能的であるか、また化合物が同じ影響を有するかを確認する。
【０４５０】
実施例１０．マウスモデルにおける化合物試験
候補化合物を、インビボ活性及び安全性について、尿素サイクル異常症（例えば、ＣＰＳ１欠損症、ＯＴＣ欠損症、ＡＳＳ１欠損症、ＡＳＬ欠損症、ＮＡＧＳ欠損症、アルギナーゼ欠損症、ＯＲＮＴ１欠損症、またはシトリン欠損症）のマウスモデルにおいて評価する。
【０４５１】
等価物及び範囲
当業者であれば、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。本発明の範囲は上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
【０４５２】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、１つまたは１つ超を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、群のメンバーのうちの１つ、１つ超、または全てが所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーのうちの１つ超、または全体が所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。
【０４５３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、制約がないことが意図され、追加の要素またはステップの包含を可能にするが、その必要がないことにも留意する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、したがって「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語もまた包含され、開示される。
【０４５４】
範囲が与えられている場合、エンドポイントは含まれる。さらに、特に記載されない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかである場合を除き、範囲として表される値は、文脈が明確に示さない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態の指定された範囲内の任意の特定の値または下位範囲をとることができることを理解する。
【０４５５】
加えて、先行技術内に入る本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解する。そのような実施形態は、当業者に既知であるとみなされるため、それらは、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも除外され得る。本発明の組成物のいずれの特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療成分または活性成分；任意の産生方法；任意の使用方法など）も、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、あらゆる理由により、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。
【０４５６】
使用されている単語は、限定ではなく説明の単語であり、添付の特許請求の範囲の権限内で、そのより広い態様において本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく変更が行われてもよいことを理解されたい。
【０４５７】
本発明は、いくつかの記載される実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の特定性で説明されてきたが、任意のそのような特定事項または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図しないが、添付の特許請求の範囲を参照して、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供するもの、したがって、本発明の意図される範囲を有効に包含するものとして解釈される。
【０４５８】
（表１３）結合部位またはシグナル伝達中心のモチーフ
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【０４５９】
（表１４）結合部位またはシグナル伝達中心のモチーフ
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【０４６０】
（表１５）遺伝子複合体モチーフパターン
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【０４６１】
（表１６）遺伝子複合体モチーフパターン
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【０４６２】
（表１７）単一遺伝子モチーフパターン
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【０４６３】
（表１８）単一遺伝子モチーフパターン
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【０４６４】
（表１９）ＩＵＰＡＣヌコエチドコード
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【０４６５】
（表２０）ＯＴＣ欠損症に関連するＯＴＣ遺伝子における突然変異
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１  ヌクレオチド＋１は、ＮＭ＿０００５３１．３の翻訳開始コドンのＡである。
２  欠失または挿入の場合、翻訳開始コドンのＡで始まるｃＤＮＡヌクレオチド番号が付与される。
３  ％）肝臓もしくは腸内の、または発現研究によって決定された残留活性、［１５Ｎ］尿素への残留窒素の組み込み。％）肝臓もしくは腸内の、または発現研究によって決定された残留活性、［１５Ｎ］尿素への残留窒素の組み込み。
【０４６６】
（表２１）選択された化合物のＣＡＳレジストリー番号
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明はまた、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することを含む、細胞中のＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上流近傍遺伝子は、ＤＹＮＣ１Ｉ１を含む。いくつかの実施形態では、下流近傍遺伝子は、ＲＮＵ６−５３２Ｐを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＬＣ２５Ａ１３遺伝子内またはその付近に少なくとも１つの突然変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
[本発明1001]
ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包する細胞中のＯＴＣ遺伝子発現を増加させるための方法であって、前記細胞を、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＨＳＰ９０、ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＴＢＫ１、ＩＫＢＫＥ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される標的を阻害する有効量の化合物と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1002]
前記細胞が、肝細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記標的が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３であり、前記化合物が、モメロチニブ及びバリシチニブからなる群から選択される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記化合物が、モメロチニブである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記化合物が、バリシチニブである、本発明1003の方法。
[本発明1006]
前記標的が、ＨＳＰ９０であり、前記化合物が、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、及びレタスピマイシンＨＣｌからなる群から選択される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1007]
前記標的が、ＭＡＰＫであり、前記化合物が、ＢＩＲＢ７９６、パマピモド、及びＰＨ−７９７８０４からなる群から選択される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1008]
前記標的が、ＥＧＦＲであり、前記化合物が、ムブリチニブ（ＴＡＫ  １６５）である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1009]
前記標的が、ＦＧＦＲであり、前記化合物が、ＸＬ２２８である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1010]
前記標的が、ＢＲＡＦまたはＲＡＦ１であり、前記化合物が、リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）及びＢＭＳ−２１４６６２からなる群から選択される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1011]
前記標的が、ＫＤＲまたはＦＬＴ１であり、前記化合物が、フォレチニブ／ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９）である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1012]
前記標的が、ＴＢＫ１またはＩＫＢＫＥであり、前記化合物が、ＢＸ７９５である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1013]
前記標的が、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、またはＰＲＫＡＢ１であり、前記化合物が、ドルソモルフィンである、本発明1001または1002の方法。
[本発明1014]
ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包する細胞中のＯＴＣ遺伝子発現を増加させるための方法であって、前記細胞を、ＪＡＫ１、ＷＳＴＲ１、ＹＡＰ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＹＮ、ＳＭＡＤ３、ＮＴＲＫ１、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＦＧＦＲ４、ＩＮＳＲ、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＦＧＦＲ２、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲＢ、ＩＲＦ５、ＦＧＦＲ１、ＥＰＨＢ１、ＦＹＮ、ＦＬＴ４、ＹＹ１、ＩＲＦ１、ＩＧＦ−１、ＳＭＡＤ１、ＤＤＲ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、及びＳＭＡＤ２からなる群から選択される標的を阻害するｓｉＲＮＡ化合物と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1015]
ＯＴＣ機能の部分的低減に関連するＯＴＣ突然変異を内包するヒト対象におけるＯＴＣ発現を増加させるための方法であって、前記対象に、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＨＳＰ９０、ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＴＢＫ１、ＩＫＢＫＥ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される標的を阻害する有効量の化合物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1016]
前記標的が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、またはＪＡＫ３であり、前記化合物が、モメロチニブ及びバリシチニブからなる群から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記化合物が、モメロチニブである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記化合物が、バリシチニブである、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記標的が、ＨＳＰ９０であり、前記化合物が、１７−ＡＡＧ、ＢＩＩＢ０２１、ＨＳＰ−９９０、及びレタスピマイシンＨＣｌからなる群から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1020]
前記標的が、ＭＡＰＫであり、前記化合物が、ＢＩＲＢ７９６、パマピモド、及びＰＨ−７９７８０４からなる群から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1021]
前記標的が、ＥＧＦＲであり、前記化合物が、ムブリチニブ（ＴＡＫ  １６５）である、本発明1015の方法。
[本発明1022]
前記標的が、ＦＧＦＲであり、前記化合物が、ＸＬ２２８である、本発明1015の方法。
[本発明1023]
前記標的が、ＢＲＡＦまたはＲＡＦ１であり、前記化合物が、リフィラフェニブ（ＢＧＢ−２８３）及びＢＭＳ−２１４６６２からなる群から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1024]
前記標的が、ＫＤＲまたはＦＬＴ１であり、前記化合物が、フォレチニブ／ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９）である、本発明1015の方法。
[本発明1025]
前記標的が、ＴＢＫ１またはＩＫＢＫＥであり、前記化合物が、ＢＸ７９５である、本発明1015の方法。
[本発明1026]
前記標的が、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、またはＰＲＫＡＢ１であり、前記化合物が、ドルソモルフィンである、本発明1015の方法。
[本発明1027]
前記ＯＴＣ突然変異が、非ゼロの酵素活性パーセントに関連する、表２０に示される突然変異からなる群から選択される、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５８】
（表１３）結合部位またはシグナル伝達中心のモチーフ
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５９】
（表１４）結合部位またはシグナル伝達中心のモチーフ
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2020536871.tif 000093
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６５】
（表２０）ＯＴＣ欠損症に関連するＯＴＣ遺伝子における突然変異
2020536871.tif 000094
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１  ヌクレオチド＋１は、ＮＭ＿０００５３１．３の翻訳開始コドンのＡである。
２  欠失または挿入の場合、翻訳開始コドンのＡで始まるｃＤＮＡヌクレオチド番号が付与される。
３  ％）肝臓もしくは腸内の、または発現研究によって決定された残留活性、［１５Ｎ］尿素への残留窒素の組み込み。％）肝臓もしくは腸内の、または発現研究によって決定された残留活性、［１５Ｎ］尿素への残留窒素の組み込み。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020536871000001.app
【国際調査報告】
2020536871.tif 000103
2020536871.tif 000104
2020536871.tif 000105