(57)【要約】  本発明の実施形態に係る胸腺オルガノイドを調製する方法が開示される。また、本発明の実施形態に係るインビトロで胸腺移出Ｔ細胞を調製する方法も開示される。また、哺乳類における病態、例えばがんを治療又は予防する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで胸腺オルガノイドを調製する方法であって、
（ｉ）インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させることと；
（ｉｉ）インビトロで前記内胚葉細胞を第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）細胞に分化させることと；
（ｉｉｉ）インビトロで前記第３ＰＰＥ細胞を胸腺上皮前駆様細胞（ＴＥＰＬＣ）に分化させることと；
（ｉｖ）インビトロ三次元培養で前記ＴＥＰＬＣを胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）に分化させることと；
（ｖ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の存在下においてインビトロ三次元培養で前記ＴＥＰＣを胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）に分化させることと；
（ｖｉ）インビトロ三次元培養で前記ＴＥＣから胸腺オルガノイドを形成させることとを含み、
前記胸腺オルガノイドが、β５ｔ、ＤＬＬ４、及びインターロイキン７のうちのいずれか１つ以上を発現し、
前記方法が、前記細胞を間葉又は間質細胞と共培養することを含まない方法。
【請求項２】
（ｖ）が、Ｗｎｔ３ａ及び線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）の一方又は両方の存在下においてインビトロ三次元培養で前記ＴＥＰＣをＴＥＣに分化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）の前に少なくとも１日間、哺乳類細胞基底マトリクスにおいて前記多能性幹細胞を培養することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＥＰＬＣが、ケラチン５＋／ケラチン８＋／ＦＯＸＮ１−である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞を継代することを含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉｉｉ）が、前記細胞を解離させることなく前記第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記胸腺オルガノイドが、ケラチン５＋／ケラチン８＋／ＦＯＸＮ１＋細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記胸腺オルガノイドが、ケラチン５＋／ケラチン８＋／胸腺プロテオソームβ５ｔ＋細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記胸腺オルガノイドが、ケラチン５高／ケラチン８低細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記胸腺オルガノイドが、ケラチン５低／ケラチン８高細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）〜（ｖｉ）のうちのいずれか１つ以上がゼノフリー培地で実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記胸腺オルガノイドを培養して、Ｔ細胞の分化を促進する１つ以上の自己タンパク質を過剰発現させることを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞の分化を促進する１つ以上の前記自己タンパク質が、ＤＬ１４及びＩＬ−７のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉｖ）が、１つ以上の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）因子の存在下で前記ＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させることを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のＭＳＣ因子が、ＦＧＦ７、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、トランスフォーミング成長因子β阻害剤（ＴＧＦβｉｎｈ）、及びシクロパミンのうちの１つ以上を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＳＣ因子のうちの１つ以上が、ＦＧＦ１０、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ８、ＴＧＦβｉｎｈ、及びシクロパミンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって生成される、胸腺オルガノイド。
【請求項１８】
インビトロで胸腺移出Ｔ細胞を調製する方法であって、前駆細胞を請求項１７に記載の胸腺オルガノイドに遊走させることと；前記細胞を前記胸腺オルガノイドから放出させることであって、前記胸腺オルガノイドから放出される前記細胞が、胸腺移出Ｔ細胞であることと；前記胸腺オルガノイドから前記胸腺移出Ｔ細胞を単離することとを含む方法。
【請求項１９】
哺乳類における病態の治療又は予防における使用のための、請求項１８に記載の方法によってインビトロで調製された胸腺移出Ｔ細胞。
【請求項２０】
前記病態が、がん、免疫不全、自己免疫病態、感染症、又は血液病態である、請求項１９に記載の、使用のための胸腺移出Ｔ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年９月２０日出願の米国仮出願第６２／５６０，９０８号の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究又は開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、国立がん研究所、外科部門によって、プロジェクト番号Ｚ０１ＢＣ０１０７６３の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞系列の細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、様々な病態、例えばがんの治療において良好な臨床結果をもたらすことができる。しかし、インビトロ又はエクスビボにおけるＴ細胞系列の細胞の生成は、困難であり得る。従って、ＡＣＴ用の細胞を調製するのに有用な改善された材料及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の実施形態は、インビトロで胸腺オルガノイドを調製する方法であって、（ｉ）インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させることと；（ｉｉ）インビトロで該内胚葉細胞を第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）細胞に分化させることと；（ｉｉｉ）インビトロで該第３ＰＰＥ細胞を胸腺上皮前駆様細胞（ＴＥＰＬＣ）に分化させることと；（ｉｖ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＰＬＣを胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）に分化させることと；（ｖ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の存在下においてインビトロ三次元培養で該ＴＥＰＣを胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）に分化させることと；（ｖｉ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＣから胸腺オルガノイドを形成させることとを含み、該胸腺オルガノイドが、β５ｔ、ＤＬＬ４、及びインターロイキン７のうちのいずれか１つ以上を発現し、該方法が、該細胞を間葉又は間質細胞と共培養することを含まない方法を提供する。
【０００５】
本発明の更なる実施形態は、本発明の方法によって調製される胸腺オルガノイドを提供する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、インビトロで胸腺移出Ｔ細胞（ｔｈｙｍｉｃ  ｅｍｉｇｒａｎｔ  ｃｅｌｌ）を調製する方法であって、前駆細胞を本発明の胸腺オルガノイドに遊走させることと；該細胞を該胸腺オルガノイドから放出させることであって、該胸腺オルガノイドから放出される該細胞が、胸腺移出Ｔ細胞であることと；該胸腺オルガノイドから該胸腺移出Ｔ細胞を単離することとを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、哺乳類における病態を治療又は予防する方法であって、本発明の方法によってインビトロで胸腺移出Ｔ細胞を調製することと；該哺乳類における該病態を治療又は予防するのに有効な量の該胸腺移出Ｔ細胞を該哺乳類に投与することとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態に係る、インビトロで胸腺オルガノイドを生成する方法を示す概略図である。
【図２】図２Ａは、フローサイトメトリーによる、アイソタイプ対照ＩｇＧ（４８８）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で染色されたＩｇＧの検出を示す実験データを示す。図２Ｂは、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞（ＨＣＢ）由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）によるＫ５及びＫ８の発現を示す実験データを示す。図２Ｃは、Ｔ細胞由来のｉＰＳ（Ｔ−ｉＰＳ）によるＫ５及びＫ８の発現を示す実験データを示す。図２Ｄは、フローサイトメトリーによるアイソタイプ対照ＩｇＧ（４８８）の検出を示す実験データを示す。ヒストグラムの左上隅の数字は、アイソタイプ対照ＩｇＧ（４８８）を使用して検出されなかった細胞の百分率である。右上隅の数字は、アイソタイプ対照ＩｇＧ（４８８）を使用して検出された細胞の百分率を表す。図２Ｅは、ＣＤ３４＋ＨＣＢ−ｉＰＳ細胞によるＦＯＸＮ１の発現を示す実験データを示す。ヒストグラムの左上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現していない細胞の百分率である。右上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現している細胞の百分率を表す。図２Ｆは、Ｔ−ｉＰＳ細胞によるＦＯＸＮ１の発現を示す実験データを示す。ヒストグラムの左上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現していない細胞の百分率である。右上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現している細胞の百分率を表す。
【図３】図３Ａは、１５日目のアイソタイプ対照ＩｇＧ（４８８）におけるＫ５及びＫ８の細胞発現を示す実験データを示す。図３Ｂは、２１日目のＸＦ培地におけるＨＣＢ−ｉＰＳ細胞によるＫ５及びＫ８の細胞発現を示す実験データを示す。図３Ｃは、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７及び５０ｍｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａを含む２１日目のＸＦ培地におけるＴ−ｉＰＳ細胞によるＫ５及びＫ８の細胞発現を示す実験データを示す。図３Ｄは、１５日目の対照細胞のＦＯＸＮ１の細胞発現を示す実験データを示す。ヒストグラムの左上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現していない細胞の百分率である。右上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現している細胞の百分率を表す。図３Ｅは、２１日目のＸＦ培地におけるＦＯＸＮ１の細胞発現を示す実験データを示す。ヒストグラムの左上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現していない細胞の百分率である。右上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現している細胞の百分率を表す。図３Ｆは、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７及び５０ｍｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａを含むＸＦ培地における２１日目のＦＯＸＮ１の細胞発現を示す実験データを示す。ヒストグラムの左上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現していない細胞の百分率である。右上隅の数字は、ＦＯＸＮ１を発現している細胞の百分率を表す。
【図４】本発明の実施形態に係る、ヒトｉＰＳ（０日目）の原始内胚葉（５〜９日目）、第３咽頭嚢（９〜１３日目）、及び胸腺上皮前駆様細胞（１４日目）への分化を示す概略図である。
【図５】図５Ａは、本発明の実施形態に係る、次にＫ５＋Ｋ８＋ＦＯＸＮ１＋胸腺オルガノイドに分化するＫ５＋Ｋ８＋ＦＯＸＮ１−細胞スフェロイドへのＴＥＰＬＣの分化を示す概略図である。図５Ｂは、３つの因子（３Ｆ）：ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びＦＧＦ７（ＫＧＦ）の存在下又は非存在下で成長させたＴＥＣの体積（μｍ３）を示すグラフである。
【図６】本発明の実施形態に係る、生存人工多能性幹細胞胸腺オルガノイド（ｉＴＯ）へのＴＥＰＬＣの分化（下）と比較した、最終的に崩壊する胸腺オルガノイドへのＴＥＰＬＣの分化（上）を示す概略図である。「Ａ」と名付けられた細胞は、より古く、より分化した細胞を示す。「Ｂ」と名付けられた細胞は、より若く、あまり分化していない細胞を示す。
【図７】様々な培地で成長させたオルガノイドの全オルガノイド面積と比較したβ５ｔ発現の比を示す実験データを示すグラフである。Ｙ軸は、全オルガノイド面積と比較したβ５ｔ発現の比を表す。Ｘ軸は、オルガノイドを成長させるために使用した様々な培養培地を表す。３Ｆ培地は、ＴＥＣ増幅培地＋１００ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４を含む。５Ｆ培地は、ＴＥＣ増幅培地＋１００ｍｇ／ｍＬ  ＦＧＦ８、１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０、１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−１、ＫＡＡＤ−シクロパミン  ０．５μＭ、及びＴＧＦβ−ＲＩキナーゼ阻害剤  ５μＭ（ＬＹ３６４９４７、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む。５Ｆ培地＋ＦＧＦ８は、線維芽細胞成長因子８が添加された上記５Ｆ培地を含む。５Ｆ＋阻害剤培地は、ＴＧＦβ−ＲＩキナーゼ阻害剤が添加された上記５Ｆ培地を含む。
【図８】本発明の実施形態に係る、ヒトＭＳＣ因子の添加がオルガノイド形成を改善することができるかどうかを検証するための実験設計プロトコルを示す概略図である。
【図９】本発明の実施形態に係る治療方法を示す概略図である。
【図１０Ａ】ＤＡＰＩ染色による細胞核の検出を示す、７日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１０Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体染色とコンジュゲートした抗ＦＯＸＮ１抗体の検出を示す、７日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影された図１０Ａと同じｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１１Ａ】ＤＡＰＩで染色された細胞核の検出を示す、４２日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１１Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ケラチン−８抗体の検出を示す、共焦点顕微鏡で撮影された図１１Ａに示したのと同じｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１２Ａ】ＤＡＰＩで染色された細胞核の検出を示す、図１１Ａに示した４２日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１２Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ケラチン−５抗体の検出を示す、共焦点顕微鏡で撮影された図１２Ａに示したのと同じｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１３Ａ】ＤＡＰＩで染色された細胞核の検出を示す、図１１Ａに示した４２日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１３Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした胸腺プロテオソーム（ｔｈｙｍｏｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）β５ｔ抗体の検出を示す、共焦点顕微鏡で撮影された図１３Ａに示したのと同じｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１４Ａ】ＤＡＰＩで染色された細胞核の検出を示す、４２日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１４Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の検出を示す、共焦点顕微鏡で撮影された図１４Ａに示したのと同じｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１５Ａ】ＤＡＰＩで染色された細胞核の検出を示す、４２日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１５Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＤＬＬ４抗体の検出を示す、共焦点顕微鏡で撮影された図１５Ａに示したのと同じｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【図１６Ａ】ＤＡＰＩで染色された細胞核の検出を示す、図１４Ａに示した、４２日間の３Ｄ培養後に共焦点顕微鏡で撮影されたｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。この画像のために調製されたスライドは、図１４Ａに示した組織切片と比較して、該オルガノイドの異なる組織切片のものである。
【図１６Ｂ】ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＩＬ−７抗体の検出を示す、共焦点顕微鏡で撮影された図１６Ａに示したｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドの画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施形態は、インビトロで胸腺オルガノイドを調製する方法を提供する。オルガノイドは、臓器のインビトロ三次元ミニチュアバージョンである。本発明の方法によって生成される胸腺オルガノイドは、ヒト胸腺の生理及び機能を模倣することができる。本発明の実施形態は、様々な利点のうちのいずれか１つ以上を提供することができる。例えば、本発明の方法によって生成される、ヒトｉＰＳ（人工多能性幹細胞）由来の胸腺オルガノイド（ｈｉＴＯ）は、哺乳類における病態、例えばがんを治療又は予防するのに有用であり得るＴ細胞系列の細胞（例えば、胸腺移出Ｔ細胞）を生成することができる。あるいは又は更に、本発明の方法は、胸腺で生じるポジティブセレクションプロセシングを模倣することができるオルガノイドを提供することができる。ポジティブセレクションプロセスとは、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を認識し、相互作用する、新たに形成された胸腺細胞の能力を指す。ヒト胸腺におけるポジティブセレクションの間、ＭＨＣに結合することができる胸腺細胞のみが生き延び、髄質に遊走し、成熟Ｔ細胞に分化することができる。本発明の方法の実施形態は、ヒト胸腺に類似している胸腺上皮細胞を三次元（３Ｄ）組織化で生成することができる。実施形態では、本発明の方法は、インビトロでＴ細胞を分化させることができる機構を有するオルガノイドを生成することができる。実施形態では、本発明は、自己Ｔ細胞を生成する方法を提供することができる。本発明の実施形態は、血液貯蔵のため、並びに病態、例えば、貧血及び他の血球減少症を治療するための、稀な血液型のＴ及びＮＫＴ細胞産物を生成する方法を提供することができる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、免疫不全の患者のためのＴ及びＮＫＴ細胞を生成することができる。
【００１０】
実施形態では、本発明の方法は、インビトロで多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることを含み得る。これに関して、該方法は、多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるのに十分な時間及び条件下で、多能性幹細胞を培養することを含み得る。例えば、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの存在下で多能性幹細胞を培養することを含み得る。本発明の方法において有用であり得るＴＧＦβスーパーファミリーの好適なメンバーとしては、例えば、アクチビンＡ、又はＷｎｔファミリーメンバー３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）と骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）と線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）との組み合わせが挙げられる。実施形態では、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、アクチビンＡの存在下で多能性幹細胞を培養することを含み得る。
【００１１】
あるいは又は更に、インビトロにおける多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化は、ＰＣＬポリ（ε−カプロラクトン、ナノファイバー足場）において、好適な低分子、例えばＲｈｏＫ阻害剤又はｉＤＥ１（胚体内胚葉の誘導因子１）の存在下で多能性幹細胞を培養することを含み得る。実施形態では、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、ＲｈｏＫ阻害剤の存在下で多能性幹細胞を培養することを含み得る。
【００１２】
別の実施形態では、インビトロにおける多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化は、例えば、アクチビン経路における上流又は下流の遺伝子を標的とすることを含み得る。
【００１３】
好適な多能性幹細胞は、任意の多能性幹細胞であってよい。多能性幹細胞は、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれかを生じさせる能力を有する。多能性幹細胞は、例えば、幹細胞、例えば胚幹細胞、核移植由来の胚幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等を含み得る。多能性幹細胞は、（ｉ）自己再生能及び（ｉｉ）多能性を含む幹細胞の表現型を有し得る。例えば、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣは、胚幹細胞（ＥＳＣ）と形態的に識別不可能であり得る。例えば、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣは、円形の大きな核小体及び小さな体積の原形質のうちのいずれか１つ以上を有し得る。あるいは又は更に、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣは、有糸分裂的に活性がある、活発に自己再生する、増殖する、及び分裂するの、うちの１つ以上であってよい。あるいは又は更に、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣは、様々な多能性関連遺伝子のうちのいずれか１つ以上を発現し得る。多能性関連遺伝子としては、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ｈＴＥＲＴ、及びＳＳＥＡ１を挙げることができるが、これらに限定されない。あるいは又は更に、多能性細胞、例えばｉＰＳＣは、様々な多能性関連マーカーのうちのいずれか１つ以上を発現し得る。例えば、ヒトｉＰＳＣは、マーカーＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、及びＮａｎｏｇのうちのいずれか１つ以上を発現し得る。マウスｉＰＳＣは、マーカーＳＳＥＡ−１を発現し得る。
【００１４】
実施形態では、本発明の方法は、インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させる前に少なくとも１日間、哺乳類細胞基底マトリクスにおいて多能性幹細胞を培養することを含み得る。本発明の方法において有用であり得る哺乳類細胞基底マトリクスの例は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ膜マトリクス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）である。本発明の実施形態では、哺乳類細胞基底マトリクスは、ＲｈｏＫ阻害剤を含む。本発明の実施形態では、細胞基底マトリクスは、多能性幹細胞を培養するのに好適な培地（例えば、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を含む。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させる前に少なくとも１日間、ＲｈｏＫ阻害剤と共に哺乳類細胞基底マトリクスにおいて多能性幹細胞を培養すると、該細胞のアポトーシスを低減又は阻止することができると考えられる。
【００１５】
実施形態では、該方法は、インビトロで内胚葉細胞を第３ＰＰＥ細胞に分化させることを含む。これに関して、該方法は、内胚葉細胞を第３ＰＰＥ細胞に分化させるのに十分な時間及び条件下で、内胚葉細胞を培養することを含み得る。例えば、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、レチノイン酸、ｗｎｔ／カテニンシグナル伝達阻害剤、例えばＩＷＲ−１、又は関連する小さな化学物質、例えば、ＪＷ６７、ＪＷ７４、ＮＳＣ６６８０３６、ＡＭＢＭＰ塩酸塩、ＦＨ５３５、カルジオノーゲン１、ＩＷＰ４、ＰＮＵ７４６５４、ｉＣＲＴ１４、ＫＹ０２１１１、ＩＣＧ００１、及びＣＣＴ０３１３７４臭化水素酸塩のうちの１つ以上の存在下で内胚葉細胞を培養することを含み得る。あるいは又は更に、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、ｗｎｔ／カテニン経路を阻害するか又はｗｎｔ／カテニン経路における上流若しくは下流の遺伝子を阻害するために、アプタマー及び／又は抗体の存在下で内胚葉細胞を培養することを含み得る。実施形態では、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、レチノイン酸及びＩＷＲ−１の存在下で内胚葉細胞を培養することを含み得る。第３咽頭嚢は、ヒト胸腺における胸腺上皮の一部を生じさせる構造である。咽頭嚢は、一過性の胚構造であり、そして、胸腺及び副甲状腺を含む頭蓋顔面器官を生じさせる。予定胸腺及び副甲状腺は、それぞれ、転写因子Ｆｏｘｎ１及びＧｃｍ２の発現によって特徴付けられる。
【００１６】
実施形態では、該方法は、インビトロで第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させることを含む。これに関して、該方法は、第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させるのに十分な時間及び条件下で、第３ＰＰＥ細胞を培養することを含み得る。例えば、該方法は、約３〜約６日間、Ｗｎｔ経路における１つ以上の分子、例えば、Ｗｎｔ３ａ及びＷｎｔ４、並びに／又はＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、アクチビン、ＴＧＦβ及び／若しくはインヒビン、又は関連する経路を誘発若しくは阻害する剤の存在下で第３ＰＰＥ細胞を培養することを含み得る。実施形態では、該方法は、約３〜約６日間、例えば約５日間、ＢＭＰ４及びＷｎｔ３ａの存在下で第３ＰＰＥ細胞を培養することを含み得る。
【００１７】
本発明の実施形態では、ＴＥＰＬＣは、ケラチン５＋／ケラチン８＋／ＦＯＸＮ１−である。本発明の実施形態では、ＴＥＰＬＣは、ケラチン５＋／ケラチン８＋／ＦＯＸＮ１−／β５ｔ−である。ヒト胸腺における細胞の大部分は、ケラチン５及びケラチン８を発現する。ケラチン５及びケラチン８を高発現する細胞の集団は、ＴＥＣ両能性又は前駆体領域と称される。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、ケラチン５＋／ケラチン８＋ＴＥＣ両能性又は前駆体領域は、胸腺皮質及び胸腺髄質を生じさせると考えられる。
【００１８】
別の実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させること；（ｉｉ）インビトロで該内胚葉細胞を第３ＰＰＥ細胞に分化させること；及び／又は（ｉｉｉ）該細胞を解離させることなく、インビトロで該第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させることを含む。好ましい実施形態では、該方法は、該細胞を解離させることなく、インビトロで第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させることを含む。
【００１９】
実施形態では、該方法は、インビトロ三次元培養でＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させることを含む。これに関して、該方法は、ＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させるのに十分な時間及び条件下で、ＴＥＰＬＣを培養することを含み得る。例えば、該方法は、ＴＥＣ増幅培地においてＴＥＰＬＣを培養することを含み得る。ＴＥＣ増幅培地は、例えば、ＥＢＭＢ、Ｂ２７血清代替物、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素Ｂ、及びヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を含み得る。ＴＥＣ増幅培地は、追加の因子を含んでいてもよい。該追加の因子は、例えば、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ７、及びＢＭＰ４を含み得る。ＴＥＰＬＣは、約６０日間〜約１５０日間、又は約６〜約６０日間、又は約２０〜約４５日間、例えば、約７日間又は４２日間培養してよい。培養期間は限定されず、例えば、数ヶ月間であってもよい。ＴＥＰＬＣを培養した結果、例えばＴＥＰＬＣの多層領域の中心に位置し得る三次元スフェロイドが得られ得る。該スフェロイドの一部を取り出し、３Ｄ培養に移してもよく、そこで、該細胞はＴＥＰＣに更に分化し得る。マウス胎児胸腺内のＴＥＰＣ集団は、Ｋ５＋Ｋ８＋ＴＥＣ、汎サイトケラチン＋ＥｐＣＡＭ＋又は汎サイトケラチン＋ＭＴＳ２４＋又はＥｐＣＡＭ１＋ＭＴＳ２４＋、ＭＴＳ２０＋、ＥｐＣＡＭ１＋ＣＤ２０５＋ＣＤ４０−、及びＣｌａｕｄｉｎ３／４ｌｏＵＥＡ１−を含む、幾つかの表面マーカーで区別されている。
【００２０】
特定の理論又は機序に縛られるものではないが、３Ｄ培養は、二次元（２Ｄ）培養、例えば、単層培養における胸腺間質細胞（ＴＳＭＣ）の２Ｄ培養と比較して、胸腺オルガノイドの発生の促進により有効であり得ると考えられる。好適な３Ｄ培養系は、任意の３Ｄ培養系、例えば、ハンギングドロッププレート及び超低接着マルチウェルプレートを含み得る。ハンギングドロッププレートは市販されており、例えば、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ，Ｐａｒｉｓｈ，ＮＹから入手可能なＰＥＲＦＥＣＴＡ３Ｄハンギングドロッププレートである。超低接着マルチウェルプレートも市販されており、例えば、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａから入手可能なＡＧＧＲＥＷＥＬＬ超低接着マルチウェルプレートである。
【００２１】
実施形態では、該方法は、ＢＭＰ４の存在下においてインビトロ三次元培養でＴＥＰＣをＴＥＣに分化させることを含む。これに関して、該方法は、ＴＥＰＣをＴＥＣに分化させるのに十分な時間及び条件下で、ＴＥＰＣを培養することを含み得る。実施形態では、本発明の方法は、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及び線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）のうちの１つ以上の存在下でインビトロ三次元培養においてＴＥＰＣをＴＥＣに分化させることを含む。好ましくは、該方法は、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びＦＧＦ７の全ての存在下においてインビトロ三次元培養でＴＥＰＣをＴＥＣに分化させることを含む。本明細書で使用するとき、「Ｗｎｔ３ａ」とは、Ｗｎｔファミリーメンバー３Ａを指す。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、上皮間葉転換を含む特定の上皮の形態学的プロセスに関与する分泌型シグナル伝達タンパク質をコードしている、構造的に関連する遺伝子を含む。
【００２２】
胚発生中、サイトケラチン５及びサイトケラチン８を共発現するＴＥＣの小さな集団が存在し、このことは、皮質及び髄質のＴＥＣを両方生じさせ得る前駆細胞（ＴＥＰＣ）の存在を示す。Ｅ１０．５における第３咽頭嚢の上皮細胞の全てが、ｃＴＥＣ及びｍＴＥＣをそれぞれ特徴付ける４Ｆ１及びＩＶＣ４の両方を発現することを示すことによって、幾つかの系統の証拠が、共通の前駆体の存在を支持している。ヒトＴＥＣはＢＭＰ４を生成し、胸腺細胞及び胸腺上皮はいずれも、このタンパク質に対する応答に関与する分子機構を発現する。更に、ヒト胸腺における皮質胸腺上皮細胞（ｃＴＥＣ）は、分化シグナルを提供し、未成熟Ｔリンパ球の指向性遊走及び集団増幅を制御し、そして、自己主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を認識することができるＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞の正の選択を行う。胸腺の上皮成分（ＴＥＣ）は、最終的に、ヒト胸腺の髄質を生じさせる。ＴＥＣは、共通のリンパ球前駆細胞からのＴ細胞の分化及び成熟を促進する、基本的な三次元構造を形成する。様々なＴＥＣの適切な分化及び組織化は、胸腺細胞の発生及びＴ細胞レパートリーの選択の両方に関与している。ＴＥＣ関連遺伝子としては、サブユニットベータ−５ｔ（Ｐｍｓｂ１１によってコードされている）、Ｌｙ−５１／ＣＤ２４９（Ｅｎｐｅｐ）、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）、及びセリンプロテアーゼ１６（Ｐｒｓｓ１６）、及びＣＤ２０５（ＤＥＣ−２０５，Ｌｙ７５）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
実施形態では、本発明の方法は、インビトロ三次元培養でＴＥＣから胸腺オルガノイドを形成することを含み得る。胸腺オルガノイドは、β５ｔ、ＤＬＬ４、及びインターロイキン７のうちのいずれか１つ以上を発現し得る。本明細書で使用するとき、用語「β５ｔ」とは、発生中の胸腺細胞のポジティブセレクションに関与する皮質胸腺上皮細胞でのみ発現する遺伝子マーカーを指す。本明細書で使用するとき、用語「ＤＬＬ４」とは、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド４を指す。デルタ遺伝子ファミリーは、ＤＳＬドメイン、ＥＧＦリピート、及び膜貫通ドメインを特徴とするＮｏｔｃｈリガンドをコードしている。本明細書で使用するとき、用語「インターロイキン７」又は「ＩＬ−７」とは、ヒトＴ細胞の発生に関与する、胸腺によって分泌される成長因子を指す。
【００２４】
本発明の実施形態では、該方法は、（ｉ）より若く、あまり分化していないＴＥＰＬＣ及び（ｉｉ）より古く、より分化した細胞（例えば、ＴＥＰＣ又はＴＥＣ）のコレクションを一緒に三次元培養に移し、そして、三次元培養で該細胞を培養して胸腺オルガノイドを形成させることを含み得る（図６）。より若く、あまり分化していないＴＥＰＬＣは、３Ｄスフェロイドにおいて、より古く、より分化した細胞（例えば、ＴＥＰＣ又はＴＥＣ）を取り囲み得る。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、球形構造を形成するより古く、より分化した細胞は、下層のより若く、あまり分化していない細胞よりも分化している可能性があると考えられる。より古く、より分化した細胞は、連続増幅後に疲弊している可能性がある。下層の細胞は、あまり分化していないので、後期のオルガノイド成長に寄与する可能性があると考えられる。
【００２５】
本発明の方法は、細胞を間葉又は間質細胞と共培養することを含み得、好ましい実施形態では、本発明の方法は、細胞を間葉又は間質細胞と共培養することを含まない。これに関して、本発明の方法は、本発明の方法の細胞のいずれか、すなわち、多能性幹細胞、内胚葉細胞、第３ＰＰＥ細胞、ＴＥＰＬＣ、ＴＥＰＣ、ＴＥＣ、又は胸腺オルガノイドを間葉又は間質細胞と共培養することを含まない。本明細書で使用するとき、用語「間葉」とは、細胞外マトリクスに埋め込まれている疎性細胞（ｌｏｏｓｅ  ｃｅｌｌｓ）で構成される組織の種類を指す。間葉は、細胞接触及び短時間作用型因子を通して発生中の器官の器官特異的特徴の確定において決定力のある役割を与える。間葉は、一次胚葉が発生し、細胞集団がその接着特性を失って、上皮のシートから剥離する前に形成される。上皮間葉転換と呼ばれるこのプロセスによって、胚の中胚葉層が生じる。上皮間葉転換は、細胞の増殖及び組織の修復において役割を果たし、多くの病理学的プロセスにおいて示されている。実施形態では、本発明の方法は、該細胞を間葉系幹細胞と共培養することを含まない。これに関して、本発明の方法は、本発明の方法における細胞のいずれか、すなわち、多能性幹細胞、内胚葉細胞、第３ＰＰＥ細胞、ＴＥＰＬＣ、ＴＥＰＣ、ＴＥＣ、又は胸腺オルガノイドを間葉系幹細胞と共培養することを含まない。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「間質細胞」とは、骨、軟骨、造血支持間質、及び脂肪細胞等の骨格組織成分の前駆体を指す。間質細胞は、様々な細胞型への分化を受けるように実験的に誘導することができる。更に、間質細胞は、胚幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成され得る。
【００２７】
実施形態では、本発明の方法は、該細胞を継代することを含まない。これに関して、（ｉ）インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させること；（ｉｉ）インビトロで該内胚葉細胞を第３ＰＰＥ細胞に分化させること；（ｉｉｉ）インビトロで該第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させること；（ｉｖ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させること；（ｖ）ＢＭＰ４の存在下においてインビトロ三次元培養で該ＴＥＰＣをＴＥＣに分化させること；及び（ｖｉ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＣから胸腺オルガノイドを形成させることのうちのいずれか１つ以上は、該細胞を継代することを含まない。継代は、培養細胞において実施される一般的な操作である。継代（継代培養、細胞の増幅又は分割とも称される）は、少数の細胞を新しい容器に移すことを伴う。細胞を定期的に分割した場合、継代によって、より長い期間にわたって該細胞を培養することが可能になるが、その理由は、長期にわたる高い細胞密度に関連する老化が回避されるためである。接着培養の場合、継代は、細胞を解離させることを伴う。継代は、一般的に、トリプシン−ＥＤＴＡの混合物又は他の酵素ミックスを用いて行われる。継代は、少数の解離させた細胞を新たな培地に播種することを伴い得る。実施形態では、本発明の方法は、該細胞を継代及び解離することを回避する。
【００２８】
実施形態では、本発明の方法は、ゼノフリー培地で実施される。本明細書で使用するとき、用語「ゼノフリー」とは、非ヒト動物成分への直接又は間接的な曝露が存在しないことを指す。ゼノフリー培地の利点としては、潜在的な夾雑物が存在しない、並びに培養培地の性能及び品質の両方において一貫性が向上することが挙げられる。これに関して、（ｉ）インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させること；（ｉｉ）インビトロで該内胚葉細胞を第３ＰＰＥ細胞に分化させること；（ｉｉｉ）インビトロで該第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させること；（ｉｖ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させること；（ｖ）ＢＭＰ４の存在下においてインビトロ三次元培養で該ＴＥＰＣをＴＥＣに分化させること；及び（ｖｉ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＣから胸腺オルガノイドを形成させることのうちのいずれか１つ以上（好ましくは全て）が、ゼノフリー培地で実施される。
【００２９】
実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）因子の存在下で、以下のうちのいずれか１つ以上を実施することを含み得る：（ｉ）インビトロで多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させること；（ｉｉ）インビトロで該内胚葉細胞を第３ＰＰＥ細胞に分化させること；（ｉｉｉ）インビトロで該第３ＰＰＥ細胞をＴＥＰＬＣに分化させること；（ｉｖ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させること；（ｖ）ＢＭＰ４の存在下においてインビトロ三次元培養で該ＴＥＰＣをＴＥＣに分化させること；及び（ｖｉ）インビトロ三次元培養で該ＴＥＣから胸腺オルガノイドを形成させること。好ましくは、該方法は、１つ以上のＭＳＣ因子の存在下でＴＥＰＬＣをＴＥＰＣに分化させることを含む。ＭＳＣ因子は、ＭＳＣ及び間葉から単離又は精製することができる。ＭＳＣ因子としては、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７又はＫＧＦ７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、タンパク質Ｗｎｔ−３ａ（Ｗｎｔ３ａ）、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβｉｎｈ）、及びシクロパミンのうちの１つ以上を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、１つ以上のＭＳＣ因子は、ＦＧＦ１０、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ８、ＴＧＦβ阻害剤、及びシクロパミンを含む。
【００３０】
他の実施形態では、本発明の方法は、胸腺オルガノイドを培養して、Ｔ細胞の分化に関与する１つ以上の自己タンパク質を過剰発現させることを含み得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞の分化に関与する１つ以上の自己タンパク質は、ＤＬＬ４及びＩＬ−７のうちの１つ以上を含む。実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞の分化に関与する１つ以上の分子、抗体、又は薬物と共に胸腺オルガノイドを培養することを含み得る。Ｔ細胞の分化に関与する１つ以上の分子、抗体、又は薬物としては、例えば、Ｉｌ−７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１ｂ、ＩＦＮ、アスコルビン酸、Ｔ細胞活性化抗体（特に、抗Ｃｄ−３、抗ＴＣＲａ又はＴＣＲｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４９ｄ）及び／又は免疫抑制薬を挙げることができる。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される本発明の方法のいずれかによって生成される胸腺オルガノイドを提供する。
【００３２】
実施形態では、本発明の方法によって生成される胸腺オルガノイドは、ケラチン５＋／ケラチン８＋／ＦＯＸＮ１＋細胞を含む。転写因子フォークヘッドボックスＮ１（ＦＯＸＮ１）は、胸腺上皮細胞の発生に関与している。
【００３３】
実施形態では、本発明の方法によって生成される胸腺オルガノイドは、ケラチン５＋／ケラチン８＋／胸腺プロテオソームβ５ｔ＋細胞を含み得る。上述の通り、β５ｔは、発生中の胸腺のポジティブセレクションに関与している。これも上述の通り、特定の理論又は機序に縛られるものではないが、ケラチン５＋／ケラチン８＋ＴＥＣ両能性又は前駆体領域は、ヒト胸腺において胸腺皮質及び胸腺髄質を生じさせると考えられる。
【００３４】
特定の実施形態では、胸腺オルガノイドは、ケラチン５高／ケラチン８低細胞を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、胸腺オルガノイドは、ケラチン５低／ケラチン８高細胞を含む。
【００３６】
本明細書で使用するとき、用語「陽性」（「＋」と略される場合もある）は、指定の細胞マーカーの発現に関連して、細胞が、例えば低い（が検出可能な）レベルの発現及び高い（高）レベルの発現を含み得る任意の検出可能なレベルで指定の細胞マーカーを発現することを意味する。用語「陰性」（「−」と称される場合もある）は、指定の細胞マーカーの発現に関連して本明細書で使用するとき、細胞が、任意の検出可能なレベルでは指定の細胞マーカーを発現しないことを意味する。用語「高い」（「高」と略される場合もある）は、指定の細胞マーカーの発現に関連して本明細書で使用するとき、免疫組織化学的方法（例えば、ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー、免疫蛍光アッセイ、及び顕微鏡）を使用して、指定の細胞マーカーの発現について陽性である他の細胞よりも明るく指定の細胞マーカーが染色される、指定の細胞マーカーの発現について陽性である細胞のサブセットを指す。例えば、指定の細胞マーカーが「高」レベルで発現する細胞は、指定の細胞マーカーの発現について陽性である他の細胞の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、若しくは約９５％、又は前述の値のうちのいずれか２つの範囲よりも明るく染色され得る。用語「低い」は、指定の細胞マーカーの発現に関連して本明細書で使用するとき、免疫組織化学的方法を使用して、指定の細胞マーカーの発現について陽性である他の細胞よりも暗く指定の細胞マーカーが染色される、指定の細胞マーカーの発現について陽性である細胞のサブセットを指す。例えば、指定の細胞マーカーが「低」レベルで発現する細胞は、指定の細胞マーカーの発現について陽性である他の細胞の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、若しくは約９５％、又は前述の値のうちのいずれか２つの範囲よりも暗く染色され得る。
【００３７】
本発明の方法によって生成される胸腺オルガノイドは、養子細胞療法のためのＴ細胞系列の細胞（例えば、胸腺移出Ｔ細胞）を生成するのに有用であり得る。従って、本発明の実施形態は、インビトロで胸腺移出Ｔ細胞を調製する方法を提供する。
【００３８】
該方法は、前駆細胞を本発明の胸腺オルガノイドに遊走させることを含み得る。例えば、Ｔ細胞系列へと発生する能力を有する任意の前駆細胞が、本発明の胸腺オルガノイドに遊走させるのに好適であり得る。好適な前駆細胞の例としては、原始中胚葉細胞、造血前駆体、多能性幹細胞由来細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞前駆体、ダブルポジティブＴ細胞、及び未成熟Ｔ細胞系列細胞を挙げることができる。実施形態では、前駆細胞の遊走は、前駆細胞を胸腺オルガノイドに播種することを伴い得る。
【００３９】
該方法は、支持細胞を胸腺オルガノイドに遊走させることを更に含み得る。本発明の胸腺オルガノイドに遊走させるのに好適であり得る支持細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、又は胸腺に一般的に存在し、ＴＥＰＣから直接には生成されない任意の他の細胞を挙げることができる。ＴＥＰＣから直接には生成されない好適な支持細胞の例としては、例えば、特に内皮細胞及び樹状細胞が挙げられる。支持細胞の遊走は、支持細胞を胸腺オルガノイドに播種することを伴い得る。
【００４０】
胸腺移出Ｔ細胞を調製する方法は、胸腺オルガノイドから該細胞を放出させることを含み得、該胸腺オルガノイドから放出される細胞は、胸腺移出Ｔ細胞である。胸腺オルガノイドからの細胞の放出は、例えば解剖顕微鏡を使用して、直接可視化の下で観察することができる。該細胞は、播種の約２〜約５日間後に胸腺オルガノイドから放出され始める場合があり、そして、約４〜約５週間又はそれ以上にわたって放出され続け得る。該細胞は、数ヶ月間又はそれ以上にわたって放出され続け得ると考えられる。
【００４１】
胸腺移出Ｔ細胞を調製する方法は、胸腺オルガノイドから胸腺移出Ｔ細胞を単離することを含み得る。胸腺オルガノイドからの胸腺移出Ｔ細胞の単離は、任意の好適な方法で実施してよい。例えば、該方法は、胸腺オルガノイドの３Ｄ培養物、例えば、ハンギングドロップから（例えば、ピペッティングによって）培地を取り出すことによって、放出されている細胞を穏やかに取り出すことを含み得る。好ましくは、胸腺オルガノイドからの胸腺移出Ｔ細胞の単離は、例えば、解剖顕微鏡を使用して、直接可視化の下で実施され得る。好ましくは、胸腺移出Ｔ細胞は、胸腺オルガノイドを吸引することもなく、破壊することもなく単離される。該方法は、胸腺オルガノイド培養物から取り出された培地を新鮮培地に交換することを含み得る。続いて、更なる胸腺移出Ｔ細胞の放出について、胸腺オルガノイドを観察してよい。
【００４２】
胸腺移出Ｔ細胞は、ＣＤ８α＋ＣＤ８β＋ＣＤ４−又はＣＤ８α−ＣＤ８β−ＣＤ４＋であり得る。あるいは又は更に、胸腺移出Ｔ細胞は、ＣＣＲＸ４−、ＣＤ３＋、ＣＤ６９−、ＭＨＣ−Ｉ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＣＣＲ７＋のうちのいずれか１つ以上である。好ましくは、胸腺移出Ｔ細胞は、ＣＣＲＸ４−、ＣＤ３＋、ＣＤ６９−、ＭＨＣ−Ｉ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＣＣＲ７＋の全てである。あるいは又は更に、胸腺移出Ｔ細胞は、ＴＣＲα＋ＴＣＲβ＋である。好ましくは、胸腺移出Ｔ細胞は、ＴＣＲα＋ＴＣＲβ＋である。
【００４３】
該方法は、胸腺移出Ｔ細胞をＴ細胞系列の任意の所望の細胞型に分化させることを更に含み得る。胸腺移出Ｔ細胞を分化させることによって調製され得る細胞型の例としては、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ幹細胞記憶細胞、エフェクタＴ細胞、エフェクタ記憶ＲＡ細胞（ＥＭＲＡ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、又はＴｈ１７細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の方法は、胸腺移出Ｔ細胞の単離又は精製された集団を生成することができる。本発明の方法によって調製される胸腺移出Ｔ細胞は、養子細胞療法のための細胞を調製するのに有用であり得る。用語「単離された」は、本明細書で使用するとき、その天然環境から取り出されたことを意味する。用語「精製された」は、本明細書で使用するとき、純度が増大したことを意味し、「純度」は、相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈されるべきではない。例えば、純度は、少なくとも５０％であってよく、６０％超、７０％超、又は８０％超であってもよく、１００％であってもよい。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、単離又は精製された細胞の集団を提供することができる。胸腺移出Ｔ細胞の集団は、胸腺移出Ｔ細胞以外の細胞、例えば、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて胸腺移出Ｔ細胞を含む不均質な集団であってよい。あるいは、該細胞の集団は、胸腺移出Ｔ細胞を主に含む（例えば、から本質的になる）、実質的に均質な集団であってもよい。本発明の実施形態では、該細胞の集団の約１％〜約１００％、例えば、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲が、胸腺移出Ｔ細胞を含む。
【００４６】
本発明の実施形態では、胸腺移出Ｔ細胞をインビトロで増幅する。細胞数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号、同第８，３８３，０９９号、及び米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号に記載されている通り、当技術分野において公知の多数の方法のいずれかによって実現することができる。例えば、細胞数の増幅は、該細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、放射線照射された同種ＰＢＭＣ）と共に培養することによって実施することができる。本発明の別の実施形態では、哺乳類に投与する前に、胸腺移出Ｔ細胞をインビトロで増幅しない。
【００４７】
本発明の実施形態では、抗原刺激後かつ胸腺移出Ｔ細胞の数の増幅後に、胸腺移出Ｔ細胞は、ＣＤ８α＋ＣＤ８β＋ＣＤ４−又はＣＤ８α−ＣＤ８β−ＣＤ４＋である。
【００４８】
胸腺移出Ｔ細胞の集団を組成物、例えば医薬組成物に製剤化してもよい。これに関して、医薬組成物は、本明細書に記載の胸腺移出Ｔ細胞の集団のいずれかと薬学的に許容し得る担体とを含み得る。該医薬組成物は、別の薬学的に活性のある剤（複数可）又は薬物（複数可）、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等と組み合わせて、胸腺移出Ｔ細胞の集団を含み得る。
【００４９】
好ましくは、担体は、薬学的に許容し得る担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の特定の細胞の集団に従来使用されているもののうちのいずれかであってよい。このような薬学的に許容し得る担体は、当業者に周知であり、公的に容易に入手可能である。薬学的に許容し得る担体は、使用条件下で有害な副作用も毒性も有しないものであることが好ましい。
【００５０】
担体の選択は、具体的な胸腺移出Ｔ細胞の集団によって、並びに該胸腺移出Ｔ細胞の集団を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。好適な製剤は、非経口、皮下、腫瘍内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、又は腹腔内に投与するもののうちのいずれかを含み得る。１つを超える経路を使用して胸腺移出Ｔ細胞の集団を投与してもよく、特定の例では、特定の経路が別の経路よりも即時かつより有効な応答を提供する場合がある。
【００５１】
好ましくは、胸腺移出Ｔ細胞の集団は、例えば静脈内に注射することによって投与される。胸腺移出Ｔ細胞の集団が投与されるとき、注射用の胸腺移出Ｔ細胞のための薬学的に許容し得る担体としては、任意の等張担体、例えば、通常生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／Ｌ  ＮａＣｌ、又は水１リットルあたり約９．０ｇ  ＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％デキストロース、又は乳酸リンゲル液を挙げることができる。実施形態では、薬学的に許容し得る担体にヒト血清アルブミンを補給する。
【００５２】
本発明の目的のために、投与される胸腺移出Ｔ細胞の集団又は医薬組成物の量又は用量（例えば、細胞の集団を投与する場合は細胞数）は、合理的な期間にわたって患者において、例えば治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、細胞の集団又は医薬組成物の用量は、投与時点から約２時間又はそれ以上、例えば、１２〜２４時間又はそれ以上の期間、病態を治療又は予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態では、期間は更に長くてもよい。用量は、治療される患者の体重に加えて、投与される具体的な細胞の集団又は医薬組成物の有効性、及び患者の病態によって決定される。
【００５３】
投与される用量を決定するための多くのアッセイが、当技術分野において公知である。本発明の目的のために、それぞれ異なる用量の胸腺移出Ｔ細胞を与えた哺乳類のセットの中で、所与の用量のこのような細胞を哺乳類に投与した際に標的細胞が溶解する程度を比較することを含むアッセイを使用して、患者に投与する開始用量を決定することができる。特定の用量を投与した際に標的細胞が溶解する程度は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
【００５４】
細胞の集団又は医薬組成物の用量は、特定の細胞の集団又は医薬組成物の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。典型的には、主治医は、様々な要因、例えば、年齢、体重、全体的な健康状態、食事、性別、投与される細胞の集団又は医薬組成物、投与経路、及び治療される病態の重篤度を考慮して、各個々の患者を治療する細胞の集団又は医薬組成物の投与量を決定する。
【００５５】
任意の好適な数の本発明の胸腺移出Ｔ細胞を哺乳類に投与することができる。理論的には１個の本発明の胸腺移出Ｔ細胞が増殖し、治療効果を与えることができるが、約１０２個以上、例えば、約１０３個以上、約１０４個以上、約１０５個以上、約１０８個以上の胸腺移出Ｔ細胞を投与することが好ましい。あるいは又は更に、約１０１２個以下、例えば、約１０１１個以下、約１０９個以下、約１０７個以下、又は約１０５個以下の胸腺移出Ｔ細胞を哺乳類に投与してよい。上記端点のうちのいずれか２つによって定められる量、例えば、約１０２〜約１０５個、約１０３〜約１０７個、約１０３〜約１０９個、又は約１０５〜約１０１０個の数の胸腺移出Ｔ細胞を哺乳類に投与してよい。例えば、約１０７〜約１０８個の胸腺移出Ｔ細胞を投与してよい。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明の方法によって生成される胸腺移出Ｔ細胞は、疲弊した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）よりも強力であり得ると考えられる。
【００５６】
また、本発明の実施形態は、哺乳類における病態を治療又は予防する方法であって、インビトロで胸腺移出Ｔ細胞を調製することと；該哺乳類における該病態を治療又は予防するのに有効な量の該胸腺移出Ｔ細胞を該哺乳類に投与することとを含む方法を提供する。
【００５７】
該方法は、哺乳類における病態を治療又は予防するのに有効な量の、本明細書に記載の胸腺移出Ｔ細胞の集団のいずれか又は本明細書に記載の該集団のいずれかを含む医薬組成物を該哺乳類に投与することを含む。本発明の実施形態では、該病態は、がん、免疫不全、自己免疫病態、感染症、又は血液病態である。
【００５８】
がんは、例えば、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、及び膀胱がんのいずれかを含む任意のがんであってよい。
【００５９】
免疫不全は、外部病原体に対して自身を防御する身体の能力が破壊された任意の病態であり得る。免疫不全は、放射線照射又は化学療法による免疫展開（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ）後に患者の免疫系が無防備状態になり、再構築の必要がある任意の病態であり得る。免疫不全としては、例えば、高齢者集団における枯渇した適応免疫系を挙げることができる。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明の胸腺オルガノイドは、原発性及び続発性の免疫不全の両方を治療するのに有用であり得る胸腺移出Ｔ細胞を生成することができると考えられる。治療又は予防することができる免疫不全の例としては、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ＡＩＤＳ、及び肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
自己免疫病態は、身体の免疫系が健常細胞を攻撃する任意の病態であり得る。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明の胸腺オルガノイドは、自己免疫病態を治療するのに有用であり得る胸腺移出Ｔ細胞を生成することができると考えられる。治療又は予防することができる自己免疫病態の例としては、関節リウマチ、ループス、１型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、側頭動脈炎、血管炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、及びリウマチ性多発筋痛が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
感染症は、例えば、ウイルス病態、細菌病態、真菌病態、又は原生動物病態等の感染性病態であり得る。がんは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるがんのいずれかであってよい。
【００６２】
本明細書における目的のために、「ウイルス病態」は、ヒトからヒトへ又は生物から生物へと伝染し得、ウイルスによって引き起こされる病態を意味する。本発明の実施形態では、ウイルス病態は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、及びカリシウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。例えば、ウイルス病態は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、及びアレナウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされ得る。
【００６３】
ウイルス病態は、例えば、インフルエンザ、肺炎、ヘルペス、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性疲労症候群、突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、腸炎、心炎、脳炎、細気管支炎、呼吸器乳頭腫症、髄膜炎、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、及び単核球症であり得る。
【００６４】
血液病態は、血液で発症する任意の非がん性病態であってよい。血液病態は、例えば、血球減少症（例えば、貧血、白血球減少症、及び好中球減少症）、出血性障害、例えば血友病、及び血餅であってよい。
【００６５】
用語「治療する」及び「予防する」、並びにこれらから派生する語は、本明細書で使用するとき、必ずしも１００％、すなわち、完全な治療又は予防を意味するものではない。どちらかといえば、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、患者における病態の任意の量の任意のレベルの治療又は予防を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防される病態の１つ以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、病態の再発を防ぐこと、病態又はその症状若しくは状態の発生を遅らせることを包含し得る。
【００６６】
用語「哺乳類」は、本明細書で使用するとき、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、サル、類人猿、及びヒトを含むがこれらに限定されない任意の哺乳類を指す。好ましくは、哺乳類は、ヒトである。
【００６７】
図９は、本発明の実施形態に係る治療方法の例を示す。第１の実施形態では、図９を参照すると、患者の腫瘍反応性Ｔ細胞をＴ細胞由来の人工多能性幹細胞（ｈＴ−ｉＰＳＣ）に再プログラミングすることができる。ヒトＴ−ｉＰＳＣの複数のコロニーを培養下で成長させることができ、そして、Ｔ細胞前駆体に分化させることができる。該Ｔ細胞前駆体を使用して、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される本発明の方法のいずれかによって調製された胸腺オルガノイドを播種することができる。
【００６８】
胸腺オルガノイドは、胸腺移出Ｔ細胞（例えば、誘導性胸腺移出Ｔ細胞（ｉＲＴＥ））又はナイーブＴ細胞を生成することができ、これらは、次いで、患者に再導入され得る。
【００６９】
別の実施形態では、図９を参照すると、患者の腫瘍反応性Ｔ細胞をｈＴ−ｉＰＳＣに再プログラミングすることができる。ｈＴ−ｉＰＳＣの複数のコロニーを培養下で成長させることができる。次いで、ｉＰＳＣから胸腺オルガノイドを調製する本発明の方法を実施してよく、その結果、胸腺オルガノイドが得られる。次いで、Ｔ細胞前駆体を使用して胸腺オルガノイドを播種してよく、これは、次いで、ｉＲＴＥ又はナイーブＴ細胞を生成することができ、次に、図９に示す通り患者に再導入され得る。
【００７０】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、無論、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１〜１３で使用される材料及び方法を以下に提供する。
【００７２】
ｈｉＰＳＣのＴＥＰＬＣへの分化（０〜１５日目）
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）（ＮＬ５−ＧＦＰ）をＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で維持した。ｈｉＰＳＣを増幅及び維持するために、培地を毎日交換し、２〜３日間ごとに１：３又は１：６の比でＭＡＴＲＩＧＥＬマトリクス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）コーティングされた皿に細胞を機械的に継代した後、該細胞は胸腺上皮細胞に分化し始める（１日目の前）。ｈｉＰＳＣのＴＥＰＬＣへの分化については、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，１３：２３０−２３６（２０１３）に教示されているプロトコルを改変した。要約すると、ゼノフリー条件で培養された細胞の生存を改善するために、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８培地＋ＲｈｏＫ阻害剤の入ったＭＡＴＲＩＧＥＬマトリクスでコーティングされた皿にｈｉＰＳＣを播種した（図１、０〜１日目）。以下の分化工程は、ｈｉＰＳＣに３Ｄ構造を形成させ、胸腺上皮細胞への分化を継続させるために、解離せずに、３日目に再プレーティング工程を加えたこと以外は、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載の通りである。
【００７３】
幹細胞の培養及び分化
誘導前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を軽く洗浄した。１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＣＴＩＶＩＮ  Ａタンパク質（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を補給した既知組成の無血清Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でｈｉＰＳＣを３日間培養した。次いで、０．２５％トリプシンで細胞を解離させ、５０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２の密度でＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングされた皿に再プレーティングした。更に２日間、細胞を同じ分化培地で培養した（図１、１〜６日目）。分化した細胞を１μＭ  全ｔｒａｎｓ型ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び２５μＭ  ＩＷＲ１（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）で４日間処理した（図１、６〜１０日目）。次いで、１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をＴＥＰＣの誘導のために使用した（図１、１０〜１５日目）。Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地を基本培地として使用した。全ての培地及び添加剤は、特に断りのない限り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。
【００７４】
ＴＥＰＬＣのＫ５＋Ｋ８＋ＦＯＸＮ１＋３Ｄ胸腺構造への分化
位相差顕微鏡下で顕微鏡下手術用ハサミを使用して、１５日間インビトロで分化させた後の３Ｄ胸腺構造を機械的にピッキングした。２Ｄ培養物を３ｍｍ×３ｍｍの正方形に切り出し、３７℃で超低接着Ｖ字底９６ウェルプレートにおけるＴＥＣ増幅培地（ＭＥＢＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）＋１０％  Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（Ｘ１）補給剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）＋２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ＋０．１ｐＭ  コレラ毒素Ｂ＋０．４ｎｇ／ｍＬ  ヒドロコルチゾン＋２．５μｇ／ｍＬ  インスリン）中で一晩懸濁培養した。オルガノイドを形成するために、１５日目に多層の分化したｈｉＰＳＣからハサミを使用して３Ｄ構造をピッキングし、ＴＥＣ増幅＋１００ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４中で培養した。間葉因子を同定するために、以下の試薬を前述の培地に添加した：１００ｍｇ／ｍＬ  ＦＧＦ８、１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０、１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−１、ＫＡＡＤ−シクロパミン０．５μＭ、及びＴＧＦｂ  ＲＩキナーゼ阻害剤５μＭ。ＭＳＣが再集合した場合、３回継代したヒト間葉系幹細胞を２０，０００細胞／オルガノイドで超低接着Ｖ字底９６ウェルプレートに播種した。
【００７５】
ＦＴＯＣの共焦点顕微鏡観察
一次抗体、二次抗体、及びＩｇＧアイソタイプは、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手した。６０℃で１時間加熱し、続いて、１０分間キシレンで洗浄し、次いで、漸減エタノール系列に再水和することによって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を脱脂した。脱脂後、マイクロ波を使用して、１×Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ＣＩＴＲＡ  ＰＬＵＳバッファ（カタログ番号ＨＫ０８６，ＢｉｏＧｅｎｅＸ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）中で１５分間スライドを煮沸した。脱イオン水で激しく洗浄した後、該スライドを１×ＰＢＳに浸漬した。染色前に、細胞及び組織切片の両方をブロッキングし、ＰＢＳ＋１％  ＦＢＳ＋０．１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００界面活性剤（Ｔ−ＦＢＳ）によって４℃で２時間透過処理した。Ｔ−ＦＢＳバッファで１：１００希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートした。Ｔ−ＦＢＳで３回洗浄した後、Ｔ−ＦＢＳバッファで１：２００希釈したＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲコンジュゲート二次抗体と共にサンプルを４℃で一晩インキュベートし、続いて、Ｔ−ＦＢＳで激しく洗浄した。据え付ける前に、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で核を対比染色した。オルガノイド全体を免疫蛍光染色するために、オルガノイド全体を一晩固定し、ブロッキングし、ＰＢＳ＋１％  ＦＢＳ＋０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｔ−ＦＢＳ）によって４℃で一晩透過処理した。Ｔ−ＦＢＳバッファで１：１０００希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートした。Ｔ−ＦＢＳで３回洗浄した後、Ｔ−ＦＢＳバッファで１：１０００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体と共にサンプルを４℃で一晩インキュベートし、続いて、Ｔ−ＦＢＳで激しく洗浄した。据え付ける前に、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で核を対比染色した。２０×Ｐｌａｎ−アポクロマート（開口数０．８）対物レンズを備えるＺＥＩＳＳ  ＬＳＭ８８０レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で蛍光画像を収集した。
【００７６】
実施例１
この実施例は、ゼノフリー培養でヒトｉＰＳＣから初期胸腺上皮前駆様細胞（ＴＥＰＬＣ）が生成されることを立証する。
【００７７】
２種類のヒトｉＰＳＣ（（１）ＨＣＢ：ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞及び（２）Ｔ−ｉＰＳ：Ｔ細胞由来ｉＰＳ）をｉＰＳ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＲｈｏキナーゼ阻害剤中で一晩培養して、アポトーシスを阻害し、該細胞を一晩ＭＡＴＲＩＧＥＬプレートコーティングに付着させた（図１、０〜１日目）。ｉＰＳＣをゼノフリー培地で培養した。図１に示す通り、該細胞をアクチビンＡ中で５日間培養した（図１、１〜６日目）。レチノイン酸及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤であるＩＷＲを６日目に添加し、該細胞を更に４日間培養した（図１、６〜１０日目）。ＢＭＰ４及びＷｎｔ３ａを１０日目に添加し、次いで、細胞を更に５日間培養し（図１、１０〜１５日目）、合計１５日間培養した。５日目までに、該細胞は胚体内胚葉を形成していた。１５日目に顕微鏡下手術用ハサミを使用して切片をピッキングし、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に供した。対照フローサイトメトリー実験で、ＩｇＧ（４８８）及びＩｇＧ（ＡＰＣ）の検出を測定した（図２Ａ及び２Ｄ）。１５日目にＦＡＣＳによって同定されたｈｉＰＳ由来初期胸腺上皮前駆様細胞は、図２Ｂ〜２Ｃ及び２Ｅ〜２Ｆに示す通り、異なる種類のヒトｉＰＳ細胞からＫ５＋／Ｋ８＋／ＦＯＸＮ１−ＴＥＰＬＣのロバストな分化を示した。
【００７８】
実施例２
この実施例は、ＦＯＸＮ１発現がＴＥＰＬＣの拡大培養によって誘導され得ることを立証する。
【００７９】
１５日目にピッキングしなかったことを除いて、実施例１に記載の通りヒトｉＰＳＣを培養した。その代わり、一方の培地にＸＦ培地を添加したが、第２の培地にはＸＦ培地＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７及び５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａを添加した。培養２１日目に、各培養において形成された細胞の切片を収集し、ＦＡＣＳに供した。結果を図３Ａ〜３Ｆに示す。図３Ａ〜３Ｆに示す通り、ＸＦ培地のみ及びＸＦ＋ＦＧＦ７＋Ｗｎｔ３ａ培地の両方において、１５日目の細胞と比較して２１日目の細胞ではより多数がＦＯＸＮ１を発現している。２１日目の細胞の顕微鏡分析から、ヒト胎児胸腺皮質でみられる細胞に類似している星状細胞様構造が明らかになった。
【００８０】
実施例３
この実施例は、ＴＥＰＬＣから３Ｄスフェロイドが発生することを立証する。
【００８１】
細胞を解離させることなく、また、細胞を継代することなく、実施例１に記載の通りヒトｉＰＳＣからＴＥＰＬＣを分化させた。図４に示す通り、培養１３〜１４日目までに、細胞は、ＴＥＰＬＣの多層領域における過剰成長の中心に３Ｄスフェロイドを形成し始めた。
【００８２】
実施例４
この実施例は、３Ｄスフェロイドの胸腺オルガノイドへの分化、及びｈｉＰＳ由来のオルガノイドが４２日間でケラチン５及びケラチン８を生成する三次元網目構造を形成したことを立証する。
【００８３】
実施例３に記載の通り、ヒトｉＰＳＣを三次元スフェロイドに分化させた。多層で成長している細胞を、顕微鏡下手術用ハサミを使用して正方形に切り出し、上皮細胞の増幅用に設計された培地：ＥＢＭＢ、Ｂ２７血清補給剤、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素Ｂ、及びヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）中において４２日間３Ｄ培養で培養した。４２日目に、オルガノイドを回収し、測定し、ＤＡＰＩで染色した。形成されたオルガノイドは、直径約１ｍｍであり、Ｋ５＋／Ｋ８＋である細胞（胸腺上皮細胞）の薄い多層を特徴としていた。また、染色から、オルガノイドの小さな領域が胸腺プロテオソームβ５ｔの小さな層を示すことが明らかになった。
【００８４】
この実施例に記載の方法は、細胞が平坦な表面上で対称でなければならないという前提に基づく二次元（２Ｄ）培養法とは対照的であった。２Ｄ培養では、細胞が第１の培養表面の全てを覆うのに十分な程度まで成長したとき、該細胞を収集し、第２の培養表面上でより低密度になるように継代する。
【００８５】
実施例５
この実施例は、特定の培地を添加することによって、ｉＰＳ由来の胸腺オルガノイドのエクスビボ成長の継続が可能になったことを立証する。
【００８６】
ＴＥＣの増幅を維持するのにどの因子が役立つかを決定するために、多様なサイトカイン及び成長因子をスクリーニングした。試験したサイトカイン及び成長因子の組み合わせとしては、特に、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ、ＦＧＦ７としても知られている）、Ｗｎｔ３ａ、及びＢＭＰ４の組み合わせが挙げられる。胸腺上皮前駆細胞の小さなスフェロイドを実施例３に記載の通り成長させた。１５日目に、多層皿で形成された小さなＫ５＋／Ｋ８＋／ＦＯＸＮ１−スフェロイドを位相差顕微鏡下で顕微鏡下手術用ハサミを使用して機械的にピッキングし、例えば、ＲＰＭＩ＋Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ、ａＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ＋ＰＳ、ＭＥＢＭ＋Ｂ２７＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）＋ＣＴＢ（１：１０００）＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＨＣ（１：１０００）＋２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ（１：１０００）＋５μｇ／ｍＬ  インスリン（１：２０００）、ＥＢＭＢ＋Ｂ２７＋ヒドロコルチゾン＋コレラ毒素＋ｈＥＧＦ、及びＭＥＢＭ＋Ｂ２７＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＨＣ（１：１０００）＋２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ（１：１０００）＋５μｇ／ｍＬ  インスリン（１：２０００）＋２０ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦ（１：５００）＋４ｎｇ／ｍＬ  ヘパリン（１：５００）を含む様々なバリエーションの培地組成下で培養した。ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びＦＧＦ７をＴＥＣ培地に添加すると、スフェロイドが更に７日間成長し続けることができ、その結果、図５Ａ〜５Ｂに示す通り、分離したｉＰＳ由来の胸腺オルガノイドが得られることが見出された。顕微鏡下での実験から、星状細胞様構造が明らかになった。ＤＡＰＩ及びＧＦＰによる染色から、Ｋ５及びＫ８の発現が明らかになった。ＩＨＣから、核におけるＦＯＸＮ１転写因子の発現が更に明らかになった。
【００８７】
実施例６
この実施例は、あまり分化していない胸腺上皮前駆体に取り囲まれているスフェロイドが、該スフェロイドのより長い成長期間にわたる成長を可能にすることを立証する。実施例５に記載の通り、スフェロイドを成長させた。１週間超にわたって成長させたスフェロイドの３Ｄ培養によって、図６に示す通り、崩壊するオルガノイドが生成されることが見出された。球形構造を形成する細胞（「初期ＴＥＰＣ」）は、より低いレベルの細胞（ＴＥＰＬＣ）よりも分化しており、該初期ＴＥＰＣは、連続増幅によって疲弊していると仮定した。更に、下層の細胞はあまり分化していないので、この層は、後期のオルガノイド成長に寄与し得ると仮定した。これら仮説を検証するために、図６に示す通り、多層構造の１４日目の胸腺上皮前駆様細胞を手術用ハサミで正方形に切り出し、ＴＥＣ培地＋ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びＦＧＦ７中で４２日間３Ｄ培養した。該正方形は、図６のより分化した細胞（Ａ）及びあまり分化していない細胞（Ｂ）を含んでいた。４２日目に、切片を切り出し、ＤＡＰＩで染色し、免疫組織化学的検査に供した。得られたオルガノイドの染色から、胸腺オルガノイドが３Ｄ構造のケラチン５＋／ケラチン８＋細胞を生成することが明らかになった。また、切り出し領域の一部がＫ５又はＫ８のシングルポジティグ細胞になり始めることも明らかになった。特定の理論又は仮説に縛られるものではないが、ＴＥＰＣは成長し、胸腺に主に機能を与える細胞である髄質及び皮質のＴＥＣに分化すると仮定される。皮質（シングルポジティブＫ８）及び髄質（シングルポジティブＫ５）は、通常、発生の後期に胸腺組織へと発生する。
【００８８】
実施例７
この実施例は、胸腺オルガノイドが、ヒトＴＥＣ前駆体領域に類似しているＫ５＋Ｋ８＋集団を生成することを立証する。
【００８９】
実施例６に記載の通り胸腺オルガノイドを成長させ、５６日目に切片を切り出した。切片を染色し、１６週齢のヒト胎児胸腺と比較した。この比較から、胸腺オルガノイドの細胞の大部分がヒト胸腺上皮細胞前駆体の段階の細胞（１６週目）と同等の量でケラチン５及びケラチン８を発現することが明らかになった。また、染色から、５６日目の胸腺オルガノイドの切片は胸腺プロテオソームβ５ｔも発現するが、ヒト胸腺皮質よりも少量であることが明らかになり、このことは、これら細胞が前駆体段階から移行中の胸腺上皮細胞である可能性があることを示唆している。染色から、胸腺オルガノイドがＤＬＬ４及びＩＬ−７（インビトロＴ細胞生成で使用されるサイトカイン）を発現することが更に明らかになった。
【００９０】
実施例８
この実施例は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）因子の添加によって、β５ｔ発現細胞の領域を有する胸腺オルガノイドが生成できることを立証する。
【００９１】
実施例５に記載の通り、ＫＧＦ（ＦＧＦ７）、ＢＭＰ４、及びＷｎｔ３ａがオルガノイドの成長に寄与しており、これら因子はＭＳＣによって発現するので、追加のＭＳＣ因子がオルガノイドの発生を促進することができると仮定した。従って、表１に示す通り、以下の追加の因子のうちの１つ以上を培地に添加した：ＦＧＦ１０、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ８（間葉系幹細胞によって分泌される因子）、及びＴＧＦβ阻害剤又はシクロパミン（ＴＥＣ増幅を損なわせる阻害剤又は因子）。これら追加の因子を用いて成長させたオルガノイドから切片を切り出した。ＤＡＰＩによる染色から、これらＭＳＣ因子及び阻害剤のうちの１つ以上を添加した結果、図７に示す通り、β５ｔ発現細胞の領域を有するオルガノイドが再現性よく得られることが明らかになった。
【００９２】
以下の表は、ｈｉＴＯ生成に対する特定のＭＳＣ因子の効果に関するデータを提示する。
【００９３】
【表１】
2020534004.tif 000002
【００９４】
実施例９
この実施例は、ＭＳＣ因子の添加がオルガノイド形成の再現性を改善することを立証する。
【００９５】
ヒトＭＳＣ因子の添加がオルガノイド形成の再現性を改善するかどうかを検証するために、図８に示す実験設計を確立した。胸腺オルガノイドを実施例５に記載の通り生成し、ＭＳＣを添加して４２日間３Ｄ培養した。これらオルガノイドが再現性よく生成されることはなく、このことは、ＭＳＣが、実施例８に列挙した分泌型ヒトＭＳＣ因子に加えて、オルガノイドの成長及び生存を制限し得る因子を含有している可能性があることを示す。従って、ＴＧＦβ阻害剤（ＴＥＣ生存を低下させることが報告されている因子）を使用した。補給的にＴＧＦβ阻害剤を添加した後、オルガノイドを切り出し、５６日目に染色した。明確な皮質領域を有する５６日目の胸腺オルガノイドが再現性よく形成され、１６週齢のヒト胎児胸腺と同じ強度で胸腺プロテオソームβ５ｔを発現していた。従って、ＭＳＣ因子＋ＴＧＦβ阻害剤の添加は、ＴＥＣの胸腺オルガノイドへの分化を促進する。
【００９６】
実施例１０
この実施例は、ｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドがＦＯＸＮ１を発現することを立証する。
【００９７】
実施例５に記載の通り、ｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドを調製し、７日間３Ｄ培養で培養した。７日目に、共焦点顕微鏡で画像を撮影し、この画像から、ＤＡＰＩによる染色が細胞核の検出を示すことが明らかになった（図１０Ａ）。対照ＩｇＧアイソタイプ（ｉｓｏｔｏｐｅ）をネガティブコントロールとして使用し（図示せず）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＦＯＸＮ１抗体を検出した（図１０Ｂ）。
【００９８】
実施例１１
この実施例は、ｈｉＴＯ細胞がケラチン５、ケラチン８、及び胸腺プロテオソームβ５ｔを発現することを立証する。
【００９９】
実施例４に記載の通り、ｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドを調製し、４２日間３Ｄ培養で培養した。４２日目に、共焦点顕微鏡で画像を撮影した。この画像から、ＤＡＰＩで染色された核の検出が明らかになった（図１１Ａ）。対照ＩｇＧアイソタイプ（ｉｓｏｔｏｐｅ）をネガティブコントロールとして使用し（図示せず）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ケラチン８抗体（図１１Ｂ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ケラチン５抗体（図１２Ｂ）、及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした胸腺プロテオソームβ５ｔ（図１３Ｂ）が全て検出された。
【０１００】
実施例１２
この実施例は、ｈｉＴＯ細胞がＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体ＨＬＡ−ＤＲを発現することを立証する。
【０１０１】
実施例４に記載の通り、ｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドを調製し、４２日間３Ｄ培養で培養した。４２日目に、共焦点顕微鏡で画像を撮影し、この画像は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗体の陽性染色を示した。この画像から、ＤＡＰＩで染色された核の検出が明らかになった（図１４Ａ）。対照ＩｇＧアイソタイプ（ｉｓｏｔｏｐｅ）はバックグラウンドレベルとしてのみ検出され（図示せず）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体が検出された（図１４Ｂ）。
【０１０２】
実施例１３
この実施例は、ｈｉＴＯ細胞がＤＬＬ４及びＩＬ−７を発現することを立証する。
【０１０３】
実施例４に記載の通り、ｈｉＰＳＣ由来のオルガノイドを調製し、４２日間３Ｄ培養で培養した。４２日目に、共焦点顕微鏡で画像を撮影し、この画像は、ＤＡＰＩで染色された核の検出を示し（図１５Ａ及び１６Ａ）、そして、ＩｇＧ対照アイソタイプ（ｉｓｏｔｏｐｅ）をネガティブコントロールとして使用した（図示せず）。図１５Ｂは、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＤＬＬ４抗体の検出を示す。図１６Ｂは、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ二次抗体とコンジュゲートした抗ＩＬ−７抗体の検出を示す。
【０１０４】
比較例１
この比較例は、失敗した胸腺オルガノイドを生成する試みを示すものである。
【０１０５】
胸腺オルガノイドを形成する方法を試みた。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯内皮細胞）及びヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の組み合わせを使用して、遠心分離、ヒドロゲル、又は懸濁によってＴＥＣを再集合させた。この方法は、胸腺オルガノイドを得ることに失敗した。
【０１０６】
比較例２
この比較例は、失敗した胸腺オルガノイドを生成する試みを示すものである。
【０１０７】
ヒト胎児組織を、ｉＰＳ由来のＴＥＰＬＣと再集合させた。この方法は、胸腺オルガノイドを得ることに失敗した。
【０１０８】
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって組み入れられると示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストの後の用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、特に主張しない限り、単に本発明をより深く解明することを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む、本明細書に記載される。好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法によって認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される発明主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際調査報告】
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