(57)【要約】  ここでは、識別可能な反復モチーフを欠く非構造的ポリペプチドを描写する。ここでは、少なくとも１つの非構造的ポリペプチド及び少なくとも１つの結合ポリペプチドを包含する融合タンパク質もまた、描写する。さらに、疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法を描写する。方法は、対象に有効量の融合タンパク質を投与する工程を包含し得る。
2020500150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
認識可能な反復モチーフを有しない非構造的ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）よりも低い温度では可溶性であるか、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）よりも高い温度では可溶性であるか、又はそれらの組み合わせであり、前記ＬＣＳＴ及びＵＣＳＴが、それぞれ独立して約０℃から約１００℃である、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＬＣＳＴ及びＵＣＳＴが、それぞれ独立して約２５℃から約３７℃である、請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項３】
前記非構造的ポリペプチドが、少なくとも５０アミノ酸の配列を含み、
前記アミノ酸の少なくとも１０％が、プロリン（Ｐ）であり、及び
前記アミノ酸の少なくとも２０％が、グリシン（Ｇ）である、
請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項４】
前記非構造的ポリペプチドが、配列を含み、前記アミノ酸の少なくとも４０％がバリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ），イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される、請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項５】
言語的複雑性スコアが１５よりも大きい、請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項６】
前記非構造的ポリペプチドが、配列番号７〜１８のいずれかの５０アミノ酸サブ配列を含む、請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項７】
前記非構造的ポリペプチドが、３つの連続した同一アミノ酸を含有しない配列を含み、
いずれの５〜１０アミノ酸サブ配列も、前記非構造的ポリペプチド中に、一度よりも多くは出現せず、及び
前記非構造的ポリペプチドが、プロリン（Ｐ）から開始及び終了するサブ配列を含む場合、前記サブ配列が、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）をさらに含む、
請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項８】
前記非構造的ポリペプチドが、少なくとも５０アミノ酸の配列を含み、
前記アミノ酸の少なくとも１０％が、プロリン（Ｐ）であり、
前記アミノ酸の少なくとも２０％が、グリシン（Ｇ）であり、
前記アミノ酸の少なくとも４０％が、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、
前記配列が、３つの連続した同一アミノ酸を含有せず、
いずれの５〜１０アミノ酸サブ配列も、前記非構造的ポリペプチド中に、一度よりも多くは出現せず、及び
前記非構造的ポリペプチドが、プロリン（Ｐ）から開始及び終了するサブ配列を含む場合、前記サブ配列が、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）をさらに含む、
請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号７〜１８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の非構造的ポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの結合ポリペプチド及び少なくとも１つの請求項１〜９のいずれか一項に記載の非構造的ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、複数の非構造的ポリペプチドを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が、複数の結合ポリペプチドを含む、請求項１０又は１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
少なくとも２つの近接した結合ポリペプチドの間に配置されるリンカーをさらに含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
少なくとも２つの近接した非構造的ポリペプチドの間に配置されるリンカーをさらに含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記リンカーが、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含む、請求項１３又は１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記リンカーが、配列番号２１（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）3）からなるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記リンカーが、配列番号２２（ＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰＥＰＱＰＱＧ）からなるアミノ酸配列を含む、請求項１３又は１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
複数の結合ポリペプチドが、オリゴマーを形成する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記結合ポリペプチドが、標的に結合し、前記融合タンパク質が、１つよりも多い標的に結合する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記結合ポリペプチドが、プロテインＡを含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
少なくとも１つの非構造的ポリペプチドが、熱応答性ポリペプチドを含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの結合ポリペプチドと前記少なくとも１つの非構造的ポリペプチドとの間に配置される、少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記融合タンパク質が、前記少なくとも１つの結合ポリペプチドと前記少なくとも１つの非構造的ポリペプチドとの間に配置される、複数のリンカー含む、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの結合ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非構造的ポリペプチドのＮ末端に配置される、請求項１０〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの結合ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非構造的ポリペプチドのＣ末端に配置される、請求項１０〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質が、放出制御製剤の形で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質が、対象への投与時にデポ剤を形成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が、前記対象に、静脈内、動脈内、又は腹腔内投与される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が、癌を含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が、腫瘍組織内に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が、前記少なくとも１つの結合ポリペプチドの標的と関連する疾患である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対象における疾患を診断する方法であって、
対象からの試料と請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを接触させる工程；及び
前記融合タンパク質の前記標的への結合を検出して、前記試料中の標的の存在を判定する工程であって、前記試料中の前記標的の存在が、前記対象における前記疾患を示す工程、
を含む方法。
【請求項３４】
前記疾患が、癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、及び整形外科的障害から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の標的の存在を判定する方法であって、
前記試料と請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを、前記融合タンパク質と前記試料中の前記標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下において、接触させる工程；及び
前記複合体の存在を検出する工程であって、前記複合体の存在が前記試料中の前記標的を示す工程、
を含む方法。
【請求項３６】
前記試料は対象から得られ、及び前記方法が、疾患を診断するか、予後予測するか、又は前記対象の治療の効力を評価する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、前記対象の治療の効力を評価する工程をさらに含む場合、必要に応じて前記対象の治療を改変して効力を改善する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
疾患についての治療の有効性の判定を、それを必要とする対象において行う方法であって、
前記対象からの試料と請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを、前前記融合タンパク質と記試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下において、接触させる工程；
前記試料中の複合体のレベルを判定する工程であって、前記複合体のレベルは前記試料中の前記標的のレベルを示す工程；及び
前記試料中の前記標的のレベルを前記標的の対照レベルと比較する工程であって、前記標的のレベルが前記対照レベルと異なる場合に、前記治療が前記疾患の治療において有効である又は有効でないと判定する工程、
を含む方法。
【請求項３９】
対象における疾患を診断する方法であって、
前記対象からの試料と請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを接触させる工程；
前記試料中の標的のレベルを判定する工程；及び
前記試料中の前記標的のレベルを前記標的の対照レベルと比較する工程であって、前記標的のレベルが前記対照レベルと異なることが、前記対象における疾患を示す工程、
を含む方法。
【請求項４０】
前記対照レベルが、前記対象が治療を開始した期間よりも前又はその期間中の時点の、前記対象における前記レベルに対応し、及び前記試料が、より遅い時点で前記対象から採取される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、前記対象の治療中の期間の時点で前記対象から採取され、及び前記対照レベルが、無疾患レベル又は前記対象が治療を開始した期間よりも前の時点における前記レベルに対応する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、前記治療が前記疾患の治療において有効でないと判定された場合に、前記治療を改変するか、又は前記対象に異なる治療を施与することをさらに含む、請求項３８及び４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記融合タンパク質が、レポーターにより標識される、請求項２６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患が、癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、及び整形外科的障害から選択される、請求項２６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１６年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３９９，１２３号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金ＧＭ０６１２３２のもとで政府支援を受けて作成された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質は、臨床的な標的に対する特異性及び選択性のために操作された場合、有用な治療薬となり得る。それらの複雑性、多能性、耐性、及び多様性によって、しばしば低分子医薬の優れた代替となり、かつ長い半減期、特異性、及び選択性によって、治療専門家にとって魅力的となり得る。タンパク質操作は、タンパク質又は関心のある受容体を標的とした有力な治療法の発展を可能にするとはいえ、身体はそのようなタンパク質療法を無効にする多くの機構を有する。それゆえに、信頼性があり、かつ広く適応可能なタンパク質送達溶液が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、認識可能な反復モチーフを有しない非構造的ポリペプチドであって、ポリペプチドが、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）よりも低い温度では可溶性であるか、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）よりも高い温度では可溶性であるか、又はそれらの組み合わせであり、ＬＣＳＴ及びＵＣＳＴが、それぞれ独立して約０℃から約１００℃である、ポリペプチドを開示する。
【０００５】
他の態様では、少なくとも１つの結合ポリペプチド及び少なくとも１つの開示される非構造的ポリペプチドを含む融合タンパク質を開示する。
【０００６】
他の態様では、疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の開示される融合タンパク質を対象に投与する工程を含む方法を開示する。
【０００７】
他の態様では、対象における疾患を診断する方法であって、対象からの試料と開示される融合タンパク質とを接触させる工程；及び融合タンパク質の標的への結合を検出して、試料中の標的の存在を判定する工程であって、試料中の標的の存在が、対象における疾患を示す工程、を含む方法を開示する。
【０００８】
他の態様では、試料中の標的の存在を判定する方法であって、試料と開示される融合タンパク質とを、融合タンパク質と試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下において、接触させる工程；及び複合体の存在を検出する工程であって、複合体の存在が試料中の標的を示す工程、を含む方法を開示する。
【０００９】
他の態様では、疾患についての治療の有効性の判定を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象からの試料と開示される融合タンパク質とを、融合タンパク質と試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下において、接触させる工程；試料中の複合体のレベルを判定する工程であって、複合体のレベルは試料中の標的のレベルを示す工程；及び試料中の標的のレベルを標的の対照レベルと比較する工程であって、標的のレベルが対照レベルと異なる場合に、治療が疾患の治療において有効である又は有効でないと判定する工程、を含む方法を開示する。
【００１０】
他の態様では、対象における疾患を診断する方法であって、対象からの試料と開示される融合タンパク質とを接触させる工程；試料中の標的のレベルを判定する工程；及び試料中の標的のレベルを標的の対照レベルと比較する工程であって、標的のレベルが対照レベルと異なることが、対象の疾患を示す工程、を含む方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ａ［０．５］及びＡ［０．２］配列（配列番号１及び配列番号２）のアミノ酸組成物を示す図である。同様に、図は、それぞれ、配列番号４、６、８、及び１０並びに配列番号３、５、７、及び９のポリペプチドのアミノ酸組成物もまた示す。
【図２】図２は、代表的な非反復かつ非構造的ポリペプチド（配列番号１１〜１８）のアミノ酸組成物を示す図である。各非反復かつ非構造的ポリペプチドは、２４０アミノ酸を含む。各アミノ酸配列は、おおよそ１／６のプロリン（Ｐ）残基、おおよそ１／３のグリシン（Ｇ）残基、かつおおよそ１／２のＸ残基を含み、Ｘはバリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択された１以上のアミノ酸である。Ｘに選択された各アミノ酸は、互いに同一頻度で存在し得る（配列番号１１〜１８）。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｂ）は、反復ポリペプチド（配列番号３〜６）及び代表的な非反復ポリペプチド（配列番号７〜１０）の転移温度の特徴づけを示すグラフである。図３（Ａ）は、２００アミノ酸を含む、反復ポリペプチド及び代表的な非反復ポリペプチドを示すグラフである。図３（Ｂ）は、４００アミノ酸を含む、反復ポリペプチド及び代表的な非反復ポリペプチドを示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｂ）は、代表的な非反復かつ非構造的ポリペプチド（配列番号１１〜１８）の転移温度の特徴づけを示すグラフである。図４（Ａ）は、２５μＭのＰＢＳ中の、代表的な非反復かつ非構造的ポリペプチドの、転移温度の特徴づけを示すグラフである。図４（Ｂ）は、様々な尿素濃度のＰＢＳ中の、代表的な非反復かつ非構造的ポリペプチドの転移温度の特徴づけを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰｓ）は、反復ポリペプチドである。「ＥＬＰ」は、ペンタペプチド反復配列（ＶＰＧＸＧ）nを含むポリペプチドであり、ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、かつｎは１以上の整数である（配列番号２３）。ＥＬＰは下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）挙動を有するとして調査され、かつ、みなされてきた。ＥＬＰは、例えば、ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰ（配列番号１）又はＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ（配列番号２）、ここではそれぞれＡ［０．５］及びＡ［０．２］と言及する（ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓを参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）、の反復サブ配列を包含し得る。例えば、Ａ［０．２］ｒｅｐ−２００（配列番号３、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）8）は、８回繰り返し、全長で２００アミノ酸に達するＡ［０．２］サブ配列を包含する。Ａ［０．５］−ｒｅｐ２００（配列番号４、（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰ）20）は、２０回繰り返し、全長で２００アミノ酸に達するＡ［０．５］サブ配列を包含する。Ａ［０．２］ｒｅｐ−４００（配列番号５、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）16）は、１６回繰り返し、全長で４００アミノ酸に達するＡ［０．２］サブ配列を包含する。Ａ［０．５］−ｒｅｐ４００（配列番号６、（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰ）40）は、４０回繰り返し、全長で４００アミノ酸に達するＡ［０．５］サブ配列を包含する。これらの配列のアミノ酸構成を、図１に描写する。
【００１３】
ここで開示するのは、ＥＬＰの必須ペンタペプチド配列を欠くにもかかわらず、意外にも依然としてＬＣＳＴ挙動を有する、非反復かつ非構造的のポリペプチドである。したがって、開示される非構造的ポリペプチドは二次構造を欠き（ＣＤによる）、かつ熱応答性であり、すべての非構造的ポリペプチドは、ポリペプチド中に識別可能な反復配列を有しない。
【００１４】
１．定義
別途定義されない限り、ここで使用されるすべての技術及び科学用語は、当技術分野における当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。矛盾する場合、定義を含め本文献が優先する。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、ここに記載のものと類似の又は均等な方法及び材料を本発明の実施又は試験で使用することができる。ここで言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、参照により全体として組み込まれる。ここに開示の材料、方法、及び実施例は、説明目的に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００１５】
ここで使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びそれらの変形語は、追加の作用又は構造の可能性を除外しない制約のない（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）移行句、用語、又は語を意図するものである。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の参照対象を包含する。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、ここに提示される実施形態又は要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、」「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）、」他の実施形態を企図する。
【００１６】
ここでの数値範囲の列挙は、別途ここで示さない限り、単にその範囲に収まる各々の分離した数値を個々に指すための簡略表記法として機能することを意図するに過ぎず、各々の分離した数値は、ここに列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％〜５０％であると記載したとき、例えば２％から４０％、１０％から３０％、又は１％から３％などの値を本明細書で明確に列挙することを意図している。これらは明確に意図することの例示に過ぎず、また列挙される、最小値と最大値との間の数値及びこれらを含む数値のすべての組み合わせは、本出願において明確に言及されたものとみなされる。
【００１７】
量とともに使用される修飾語句「約」は、言及された値を包括し、及び文脈によって規定される（例えば、それは少なくとも、特定の量の測定と関連する誤差の程度を含む）。修飾語句「約」は、また、二つの終点の絶対的な値によって定義される範囲を開示するものとみなされる。例えば、「約２から約４」という表現は、「２から４」という範囲をも開示する。用語「約」は、示された数字のプラス側又はマイナス側１０％を指し得る。例えば、「約１０％」は、９％から１１％の範囲を示すことができ、「約１」は、０．９〜１．１を示すことができる。「約」のほかの意味は、例えば四捨五入など、文脈から明らかであり、例えば、「約１」は０．５から１．４をも意味し得る。
【００１８】
ここで用いられるように、用語「親和性」は、結合ポリペプチドの標的（即ち、結合相手）に対する結合力を指す。
【００１９】
ここで用いられるように、用語「作動薬」は、受容体に結合し、かつ当該受容体を活性化して、生物学的反応を生じさせる存在を指す。「拮抗薬」は、作動薬の作用又はシグナル伝達を、阻害又は抑制する。「逆作動薬」は、作動薬の働きと反対の働きを引き起こす。作動薬、拮抗薬、及び逆作動薬の活性は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、又はこれらの組み合わせによって判定し得る。
【００２０】
ここで用いられるように、用語「バイオマーカー」は、疾患又は病態の同定及び／又は分類において有用な、変動濃度で対象中に存在する天然に生じる生物学的分子を指す。バイオマーカーとしては、疾患についての指標若しくはマーカーとして使用される遺伝子、タンパク質、ポリヌクレオチド、核酸、リボ核酸、ポリペプチド、又は他の生物学的分子を包含し得る。一部の実施形態において、バイオマーカーは、疾患マーカーを含む。例えば、バイオマーカーは、疾患を有する対象中で、アップレギュレーション又はダウンレギュレーションされる遺伝子であり得る。別の例として、バイオマーカーは、疾患を有し、又は疾患を発症するリスクを有する対象中でレベルが増加又は減少するポリペプチドであり得る。一部の実施形態においては、バイオマーカーは、小分子を含む。一部の実施形態においては、バイオマーカーは、ポリペプチドを含む。
【００２１】
ここで用いられるように、用語「対照」、「参照レベル」、及び「参照」は、互換的に使用される。参照レベルは、計測結果の評価対象となるベンチマークとして用いられる、所定の値又は範囲であり得る。ここで用いられる「対照群」は、対照対象の群を指す。所定レベルは、対照群からのカットオフ値であり得る。所定レベルは、対照群からの平均値であり得る。カットオフ値（又は所定のカットオフ値）は、適応インデックスモデル（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｍｏｄｅｌ）（ＡＩＭ）法により決定することができる。カットオフ値（又は所定のカットオフ値）は、患者群の生物学的試料から受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により決定することができる。生物学的技術において一般に公知であるＲＯＣは、ある条件を別の条件から区別するための、例えば、ＣＲＣを有する患者の同定におけるそれぞれのマーカーの性能を決定するための、試験の能力の決定法である。ＲＯＣ分析の記載は、Ｐ．Ｊ．Ｈｅａｇｅｒｔｙ  ｅｔ．ａｌ．（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２０００，５６，３３７−４４）に提供され、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる。あるいは、カットオフ値は、患者群の生物学的試料の四分位分析により決定することができる。例えば、カットオフ値は、２５〜７５パーセンタイル範囲の任意の値、好ましくは、２５パーセンタイル、５０パーセンタイル又は７５パーセンタイル、及びより好ましくは、７５パーセンタイルのいずれかの値に対応する値を選択することにより決定することができる。このような統計分析は、当技術分野における任意の方法を使用して実施することができ、かつ多数の市販のソフトウェアパッケージ（例えば、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ  ＬＰ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｘ；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ．からのもの）を介して実行することができる。標的又はタンパク質活性についての、健常又は正常の、レベル又は範囲は、標準的技法に従って定義することができる。
【００２２】
ここで用いられるように、用語「発現ベクター」は、当技術分野で公知のプラスミド、ウイルス又は別の媒体を示し、これらは、所望のタンパク質をコードするための核酸配列を挿入又は導入することができる
【００２３】
ここで用いられるように、用語「宿主細胞」は、核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入、コンジュゲーションなどを受けやすい細胞である。宿主細胞は、植物、細菌、酵母、真菌、昆虫、動物などに由来し得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を包含する。
【００２４】
ここで用いられるように、用語「レポーター」、「レポーター群」、「標識」、及び「検出可能標識」は、ここでは互換的に用いられる。レポーターは、検出可能なシグナルを生成し得る。標識は、肉眼又は機器による手段により検出可能なシグナルを産生し得る。レポーター群の、シグナル伝達の物理的性質（例えば、蛍光、電気化学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ））及び化学的性質が異なる種々のレポーター群を使用することができる。種々のレポーターとしては、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などのようなシグナル産生物質が含有される。一部の実施形態においては、レポーターは、放射標識を含む。レポーターは、光を産生する部分、例えばアクリジニウム化合物、及び蛍光を産生する部分、例えばフルオレセインを包含し得る。一部の実施形態においては、レポーターからのシグナルは、蛍光シグナルである。レポーターは、フルオロフォアを含み得る。フルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、アクリロダン（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）、バダン（６−ブロモ−アセチル−２−ジメチルアミノ−ナフタレン）、ローダミン、ナフタレン、ダンシルアジリジン（ｄａｎｚｙｌ  ａｚｉｒｉｄｉｎｅ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、フルオレセイン、ジピロメテンホウ素ジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）、４−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（ＮＢＤ）、Ａｌｅｘａ蛍光色素、及びそれらの誘導体が挙げられる。フルオレセイン誘導体としては、例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセイン、及びイソチオシアネートを包含し得る。
【００２５】
ここで用いられるように、用語「試料」又は「試験試料」は、標的の存在及び／又はレベルを、検出又は判定すべき任意の試料を意味し得る。試料は、液体、溶液、エマルジョン、又は懸濁液を包含し得る。試料は、医学的試料を包含し得る。試料としては、任意の生物学的体液又は組織、例えば、血液、全血、血漿及び血清のような血液の分画、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙液、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻汁、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、嘔吐物、糞便物質、肺組織、末梢血単核細胞、全白血球、リンパ節細胞、脾細胞、扁桃腺細胞、癌細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、又はそれらの組み合わせを包含し得る。一部の実施形態においては、試料は、アリコートを含む。他の実施形態において、試料は、生体液を含む。試料は、当該技術分野で公知の任意の手段により得ることができる。試料は、患者から得られたままで直接使用することができ、又は例えば濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活性化、試薬の添加などにより前処理して、ここで検討されるとおり、又はそうでなければ当技術分野で公知のとおり、何らかの様式で試料の特徴を改変することができる。
【００２６】
ここで用いられるように、用語「対象」は、本明細書に描写する融合タンパク質を所望するか又はそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。対象は、人間又は非ヒト動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、霊長類又は非霊長類であり得る。哺乳動物は、ヒトのような霊長類；例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、及びモルモットのような非霊長類、；又は、例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザルのような非ヒト霊長類であり得る。対象は、任意の年齢又は発育段階のもの、例えば、成人、青年、又は幼児などであり得る。
【００２７】
ここで用いられるように、用語「転移」又は「相転移」は、熱応答性ポリペプチドの凝集を指す。相転移は、ＬＣＳＴ又は逆転移温度Ｔtと呼ばれる特定の温度で、急激にかつ可逆的に生じる。転移温度（ＬＣＳＴ又はＴt）未満では、熱応答性ポリペプチドは、高度に可溶性である。転移温度を超えて加熱した場合、熱応答性ポリペプチドは疎水的に崩壊及び凝集し、別個のゲル様相を形成し得る。相転移挙動は、ポリペプチドの放出を制御及び／又は遅らせるために、対象の組織内で薬剤デポを形成するために用いられ得る。「逆転移サイクリング」は、熱応答性ポリペプチドのためのタンパク質精製法である。タンパク質精製法は、可溶相及び不溶相を介して溶液をサイクルさせ、それにより汚染物質を取り除き、かつクロマトグラフィーの必要性を排除するための、熱応答性ポリペプチドの可逆的相転移挙動の使用を含み得る。
【００２８】
ここで用いられるように、用語「サブ配列」は、他の連続したアミノ酸配列の中に存在する、連続したアミノ酸配列を指す。サブ配列は、少なくとも２つのアミノ酸を包含する。一部の実施形態においては、サブ配列は、長さが２から５０、２から２０、２から１５、又は２から１０の連続的なアミノ酸である。一部の実施形態においては、サブ配列は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の連続的なアミノ酸を包含する。
【００２９】
ここで用いられるように、用語「実質的に同一」は、第１及び第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又は１１００アミノ酸領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が同一であることを意味し得る。
【００３０】
ここで用いられるように、用語「治療」又は「治療すること」は、疾患からの対象の保護を指す場合、その疾患を予防、抑制、抑止、改善、又は完全に排除することを意味する。疾患の予防は、本発明の組成物を対象に疾患発症前に投与することを含む。疾患の抑制は、本開示の組成物を、対象に、疾患誘導後であるがその臨床的所見前に投与することを含む。疾患の抑止又は改善は、本開示の組成物を、対象に、疾患の臨床的所見後に投与することを含む。
【００３１】
ここで用いられるように、用語「結合価」は、潜在的な結合ユニット又は結合部位を指す。用語「多価の」は、複合的な潜在的結合ユニットを指す。用語「多量体の」及び「多価の」は、本明細書において互換的に用いられる。
【００３２】
ここで用いられるように、用語「バリアント」は、ポリヌクレオチドに関して、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列又はその一部の相補鎖；（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列又はその相補鎖と実質的に同一のポリヌクレオチド；又は（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチド、その相補鎖、又はそれと実質的に同一な配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。
【００３３】
「バリアント」は、さらに、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドとして定義することができる。「生物学的活性」の代表例は、特異的抗体若しくはポリペプチドにより結合される能力、又は免疫応答を促進する能力を含む。バリアントは、実質的に同一な配列を意味し得る。バリアントは、その機能的断片を意味し得る。バリアントは、ポリペプチドの多重コピーをも意味し得る。多重コピーは、タンデムであっても、リンカーによって離隔されていてもよい。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと、実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも意味し得る。アミノ酸の保存的置換、即ち、アミノ酸を類似する特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する異なるアミノ酸に置き換えることは、典型的には、マイナーチェンジを伴うとして、当技術分野で認識されている。このようなマイナーチェンジは、部分的には、アミノ酸のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することにより同定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２，１５７，１０５−１３２を参照されたい。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシー指数のアミノ酸が置換され得、タンパク質機能を依然として保持することは、当技術分野で公知である。一態様において、±２のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｉｃｅｓ）を有するアミノ酸が置換されている。アミノ酸の疎水性を利用して、生物学的機能を保持するポリペプチドをもたらす置換を明らかにすることも可能である。ポリペプチドという面において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、当該ポリペプチドの最大局所平均親水性（参照によりここに完全に取り込まれる米国特許第４，５５４，１０１号に考察される、抗原性及び免疫原性と十分に相関することが報告された有用な尺度）の計算が可能となる。類似する親水性値を有するアミノ酸の置換は、当技術分野で理解されている生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するポリペプチドをもたらし得る。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸により実施することができる。アミノ酸の疎水性指数（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）及び親水性値の両方が、当該アミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と対応するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性により明らかにされるとおり、アミノ酸、及び特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解される。
【００３４】
バリアントは、全遺伝子配列又はその断片の全長にわたって実質的に同一であるポリヌクレオチド配列であり得る。ポリヌクレオチド配列は、遺伝子配列又はその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列又はその断片の全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列又はその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が同一であり得る。
【００３５】
２．非構造的ポリペプチド
ここでは、非構造的ポリペプチドを開示する。非構造的ポリペプチドは、ＣＤにより観察されるような二次構造を欠き、識別可能な反復配列を欠く、任意の適切なポリペプチドを含み得る。さらに、非構造的ポリペプチドは、一定の濃度において、ＬＣＳＴよりも低く、及び／又はＵＣＳＴよりも高いと可溶性であり、それによって、「熱応答性ポリペプチド」と言及され得るような相転移特性がポリペプチドに付与される。ＬＣＳＴは、これよりも低いとポリペプチドが混和性となる温度である。ＵＣＳＴは、これよりも高いとポリペプチドが混和性となる温度である。ＬＣＳＴは、ＵＣＳＴから分離し、かつ別個の温度である。一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、ＵＣＳＴ挙動のみを有し得る。一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、ＬＣＳＴ挙動のみを有し得る。一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、ＵＣＳＴ挙動及びＬＣＳＴ挙動の両方を有し得る。このような実施形態においては、ＵＣＳＴはＬＣＳＴよりも高い。非構造的ポリペプチドは、約０℃から約１００℃、例えば約１０℃から約５０℃、又は約２０℃から約４２℃であるＬＣＳＴを有し得る。非構造的ポリペプチドは、約０℃から約１００℃、例えば約１０℃から約５０℃、又は約２０℃から約４２℃であるＵＣＳＴを有し得る。一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、室温（約２５℃）と体温（約３７℃）との間の転移温度（ＬＣＳＴ及び／又はＵＣＳＴ）を有し得る。非構造的ポリペプチドは、当該非構造的ポリペプチドを対象に投与するときの濃度において、体温よりも低いか、又は体温よりも高い、ＬＣＳＴ及び／又はＵＣＳＴを有し得る。熱応答性非構造的ポリペプチドは、様々な温度及び濃度で相転移し得る。熱応答性非構造的ポリペプチドは、それが結合又は共役する第２のポリペプチドの効能に影響を与えない可能性がある。さらに、熱応答性非構造的ポリペプチドは、任意の、所望の転移温度、分子量、及びフォーマットに適合させることが可能である。
【００３６】
非構造的ポリペプチドは、様々な量及び種類のアミノ酸を包含し得る。例えば、非構造的ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸の配列であって、アミノ酸の少なくとも１０％がプロリン（Ｐ）であり、かつアミノ酸の少なくとも２０％がグリシン（Ｇ）である、配列を包含し得る。一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、配列であって、アミノ酸の少なくとも４０％が、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ），及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択された配列を包含し得る。一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、３つの連続した同一のアミノ酸を含有しない配列であって、いずれの５〜１０アミノ酸サブ配列も、非構造的ポリペプチドに一度よりも多くは出現せず、かつ非構造的ポリペプチドがプロリン（Ｐ）から開始及び終了するサブ配列を含む場合には、当該サブ配列がさらに少なくとも１つのグリシン（Ｇ）を包含する、配列を包含し得る。
【００３７】
一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸の配列であって、アミノ酸の少なくとも１０％がプロリン（Ｐ）であり；アミノ酸の少なくとも２０％がグリシン（Ｇ）であり；アミノ酸の少なくとも４０％が、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ），及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され；当該配列は３つの連続した同一のアミノ酸を含まず；いずれの５〜１０アミノ酸サブ配列も、非構造的ポリペプチドに一度よりも多くは出現せず；及び非構造的ポリペプチドがプロリン（Ｐ）から開始及び終了するサブ配列を含む場合には、当該サブ配列がさらに少なくとも１つのグリシン（Ｇ）を含む、配列を包含し得る。
【００３８】
コンピューターアルゴリズム（後述の実施例において考察する）によって同定された、いずれかの非反復配列の短いサブ配列は、熱応答性挙動を維持し得る。５０アミノ酸ほどのサブ配列を含む非構造的ポリペプチドは、アルゴリズムの必要条件を満たし得るとともに、上記配列規則と同一の規則に束縛されるために、全長配列に似た組成物は十分に非反復となる。これまでの研究で、天然変性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、５０アミノ酸未満の長さの非構造的ポリペプチドにコードされ得ることが示されてきた（Ｒａｄｉｖｏｊａｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．を参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）。さらに、５０アミノ酸ほどのＥＬＰは、熱応答性ＬＣＳＴ挙動を示し得るとともに、０から１００℃の範囲の転移温度が測定されている（Ａｌａｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．を参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）。したがって、一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、配列番号７〜１８のいずれかの５０アミノ酸のサブ配列を含み得る。
【００３９】
上述したように、非構造的ポリペプチドは、アミノ酸の識別可能な反復配列を欠く可能性がある。非構造的ポリペプチドの、過度な繰り返しによる冗長性は、言語的複雑性（ｌｉｎｇｕｉｓｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）スコアにより特徴づけられ得る。言語的複雑性スコアは、同一のアルファベット及びウィンドウ長から考えられる特有サブ配列の総数で割った、与えられた配列中の特有サブ配列の総数によって、定義される（Ｔｒｏｙａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）。言語的複雑性スコアのさらなる詳細は、下記の実施例１に見いだされ得る。非構造的ポリペプチドは、１５よりも大きいか、１６よりも大きいか、１７よりも大きいか、１８よりも大きいか、１９よりも大きいか、又は２０よりも大きい言語的複雑性スコアを有し得る。
【００４０】
一部の実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、配列番号７〜１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含み得る。
【００４１】
３．融合タンパク質
ここでは、少なくとも１つの上述した非構造的ポリペプチドを包含し得る融合タンパク質もまた、開示する。融合タンパク質は、少なくとも１つの結合ポリペプチド及び少なくとも１つのリンカーを、さらに包含し得る。
【００４２】
一部の実施形態においては、融合タンパク質は、１つよりも多い結合ポリペプチドを包含し得る。融合タンパク質は、少なくとも１の、少なくとも２の、少なくとも３の、少なくとも４の、少なくとも５の、少なくとも６の、少なくとも７の、少なくとも８の、少なくとも９の、少なくとも１０の、少なくとも１１の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、又は少なくとも２０の結合ポリペプチドを包含し得る。融合タンパク質は、３０未満の、２５未満の、又は２０未満の結合ポリペプチドを包含し得る。融合タンパク質は、１から３０の、例えば１から２０、又は１から１０の結合ポリペプチドを包含し得る。このような実施形態においては、結合ポリペプチドは、互いに同一又は異なるものであり得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、互いにタンデムに配置された１つ以上の結合ポリペプチドを包含し得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、２から６の結合ポリペプチドを含有し得る。例えば、融合タンパク質は、２つの結合ポリペプチド、３つの結合ポリペプチド、４つの結合ポリペプチド、５つの結合ポリペプチド、又は６つの結合ポリペプチドを包含し得る。
【００４３】
一部の実施形態においては、融合タンパク質は、１つ以上の非構造的ポリペプチドを包含し得る。融合タンパク質は、少なくとも１の、少なくとも２の、少なくとも３の、少なくとも４の、少なくとも５の、少なくとも６の、少なくとも７の、少なくとも８の、少なくとも９の、少なくとも１０の、少なくとも１１の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、又は少なくとも２０の非構造的ポリペプチドを包含し得る。融合タンパク質は、３０未満の、２５未満の、又は２０未満の非構造的ポリペプチドを包含し得る。融合タンパク質は、１から３０の、例えば１から２０、又は１から１０の非構造的ポリペプチドを包含し得る。このような実施形態においては、非構造的ポリペプチドは、互いに同一又は異なるものであり得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、互いにタンデムに配置された１つ以上の非構造的ポリペプチドを包含し得る。
【００４４】
一部の実施形態においては、融合タンパク質は、モジュールリニアポリペプチド（ｍｏｄｕｌａｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）として配列し得る。例えば、モジュールリニアポリペプチドは、次の構造のうちいずれかに配列し得る：［結合ポリペプチド］m−［リンカー］k−［非構造的ポリペプチド］；［非構造的ポリペプチド］−［リンカー］k−［結合ポリペプチド］m；［結合ポリペプチド］m−［リンカー］k−［非構造的ポリペプチド］−［結合ポリペプチド］m−［リンカー］k−［非構造的ポリペプチド］；又は［非構造的ポリペプチド］−［結合ポリペプチド］m−［リンカー］k−［非構造的ポリペプチド］−［結合ポリペプチド］m、ここで、ｋ及びｍはそれぞれ独立した１以上の整数である。一部の実施形態においては、ｍは２０以下の整数であり得る。一部の実施形態においては、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０と等しい整数であり得る。一部の実施形態においては、ｋは、１０以下の整数であり得る。一部の実施形態においては、ｋは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０と等しい整数であり得る。一部の実施形態においては、少なくとも１つの結合ポリペプチドは、少なくとも１つの非構造的ポリペプチドのＮ末端に配置し得る。一部の実施形態においては、少なくとも１つの結合ポリペプチドは、少なくとも１つの非構造的ポリペプチドのＣ末端に配置し得る。
【００４５】
一部の実施形態においては、１以上の熱応答性ポリペプチドを含む融合タンパク質は、室温（約２５℃）と体温（約３７℃）との間の転移温度を有し得る。熱応答性の非構造的ポリペプチドは、当該融合タンパク質を対象に投与するときの濃度において、体温よりも低い又は体温よりも高い、ＬＣＳＴ又はＵＣＳＴを有し得る。
【００４６】
融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法に従って、宿主細胞中で組み換えによって発現させることができる。融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって、精製することができる。例えば、融合タンパク質は、液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、若しくは親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、又は超遠心分離技術を用いて精製することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、クロマトグラフィーを用いずに精製することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、逆転移サイクリングを用いて精製することができる。
【００４７】
ａ．結合ポリペプチド
結合ポリペプチドは、少なくとも１つの標的に結合可能な任意のポリペプチドを含み得る。結合ポリペプチドは、少なくとも１つの標的に結合可能である。「標的」は、結合ポリヌクレオチドによって結合されることが可能な存在であり得る。標的は、例えば、他のポリペプチド、細胞表面受容体、糖、抗体、小分子、又はそれらの組み合わせを包含し得る。標的は、バイオマーカーであり得る。標的は、受容体活性化作用により活性化されるか、又は拮抗作用により阻害され得る。結合ポリペプチドは、標的に特異的に結合し得る。結合ポリペプチドは、標的に結合することで、ターゲティング部位（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）、作動薬、拮抗薬、又はそれらの組み合わせとして機能し得る。
【００４８】
結合ポリペプチドは、標的に結合するモノマーであり得る。モノマーは、１つ以上の標的に結合し得る。結合ポリペプチドは、オリゴマーを形成し得る。結合ポリペプチドは、同一又は異なる結合ポリペプチドとオリゴマーを形成し得る。オリゴマーは、標的と結合し得る。オリゴマーは、１つ以上の標的と結合し得る。オリゴマー中の１つ以上のモノマーは、１つ以上の標的と結合し得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、多価であり得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、多数の標的に結合し得る。一部の実施形態においては、結合ポリペプチド単独の活性は、融合タンパク質の一部である場合の結合ポリペプチドの活性と同様であり得る。
【００４９】
一部の実施形態においては、結合ポリペプチドは、１つ以上の足場タンパク質を含み得る。ここで用いられるように、「足場タンパク質」は、比較的安定し、かつはっきりした三次元構造を有する１つ以上のポリペプチドドメインを指す。足場タンパク質は、親和性操作の可能性をさらに有し得る。一部の実施形態においては、足場タンパク質は、特定の標的に結合するように操作され得る。結合ポリペプチドが１つ以上の足場タンパク質を含む実施形態においては、足場タンパク質は同一又は異なるものであり得る。
【００５０】
一部の実施形態においては、結合ポリペプチドはプロテインＡを含み得る。プロテインＡは、もともと黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来する４２ｋＤのタンパク質である。これは、免疫グロブリンＧ抗体の定常領域（Ｆｃ）に対する高い結合親和性を示し得る。プロテインＡは、すべてＦｃ抗体に結合可能な、５つの連結されたドメインを包含する。固定されたプロテインＡは、様々な抗体の精製に用いることができる（例えば、Ｈｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂを参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）。
【００５１】
ｂ．リンカー
上述したように、融合タンパク質は、さらに少なくとも１つのリンカーを包含し得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、１つ以上のリンカーを包含し得る。このような実施形態においては、リンカーは互いに同一又は異なるものであり得る。融合タンパク質は、少なくとも１の、少なくとも２の、少なくとも３の、少なくとも４の、少なくとも５の、少なくとも６の、少なくとも７の、少なくとも８の、少なくとも９の、少なくとも１０の、少なくとも１１の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２５の、少なくとも３０の、少なくとも３５の、少なくとも４０の、少なくとも４５の、少なくとも５０の、少なくとも５５の、少なくとも６０の、少なくとも６５の、少なくとも７０の、少なくとも７５の、少なくとも８０の、少なくとも８５の、少なくとも９０の、少なくとも９５の、又は少なくとも１００のリンカーを包含し得る。融合タンパク質は、５００未満の、４００未満の、３００未満の、又は２００未満のリンカーを包含し得る。融合タンパク質は、１から１０００のリンカー、例えば１０から９００、１０から８００、又は５から５００のリンカーを包含し得る。
【００５２】
リンカーは、結合ポリペプチドと非構造的ポリペプチドとの間、結合ポリペプチドの間、非構造的ポリペプチドの間、又はそれらの組み合わせに配置され得る。多数のリンカーは、互いに近接して配置され得る。多数のリンカーは、互いに近接し、かつ結合ポリペプチドと非構造的ポリペプチドの間に配置され得る。
【００５３】
リンカーは、任意の適切なアミノ酸配列及び長さのポリペプチドであり得る。リンカーは、スペーサーペプチドとして機能し得る。リンカーは、ポリペプチドドメインの間に存在し得る。リンカーは、結合ポリペプチドの結合ドメインを十分に分離し得、一方で結合ドメインの活性を保存し得る。一部の実施形態においては、リンカーは、荷電アミノ酸を含み得る。一部の実施形態においては、リンカーは、柔軟であり得る。一部の実施形態においては、リンカーは、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含み得る。一部の実施形態においては、リンカーは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（配列番号２１）からなるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態においては、リンカーは、少なくとも１つのプロリンを含み得る。一部の実施形態においては、リンカーは、配列番号２２からなるアミノ酸配列を含み得る。
【００５４】
ｃ．ポリヌクレオチド
さらに、ここに詳述される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを開示する。ベクターは、ここに詳述される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含し得る。ポリペプチドの発現を得るため、ベクターは、典型的にはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターであって、直接転写のためのプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及びタンパク質をコードする核酸である場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。ベクターの例としては、ｐｅｔ２４がある。適切なバクテリアプロモーターは、当技術分野で周知である。さらに、ここに詳述されるように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに形質転換又は形質移入される宿主細胞を開示する。タンパク質発現のためのバクテリアの発現システムは利用可能であり、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が挙げられる（Ｐａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９８３，２２，２２９−２３５；Ｍｏｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８３，３０２，５４３−５４５、ここで、どちらも、参照により全体としてここに組み込まれる）。このような発現システムのためのキットは、商業的に利用可能である。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核発現システムは、当技術分野で周知であり、かつこれもまた商業的に利用可能である。レトロウイルスの発現システムもまた、用いることができる。
【００５５】
４．投与
上で詳述した融合タンパク質は、製薬技術分野の当業者に公知の標準的技術に従って、処方することができる。融合タンパク質を含むこのような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、及び病態などの因子、並びに投与の経路を考慮に入れて、適量でかつ医療技術分野の当業者に公知の技術によって、投与することができる。
【００５６】
融合タンパク質は、予防的又は治療的に投与することができる。予防的投与においては、融合タンパク質は、反応を誘発するのに適した量で投与することができる。治療的投与においては、融合タンパク質は、それを必要とする対象に対して、治療的効果を引き出すのに適した量で投与することができる。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」と定義される。この用途に効果的な量は、例えば、レジメン管理された融合タンパク質の特定の組成物、投与の様式、疾患の病期及び重症度、患者の全身の健康状態、並びに処方する医師の判断に依存するであろう。
【００５７】
融合タンパク質は、すべての内容が参照により全体としてここに組み込まれる、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，１５，６１７−６４８）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，５８０，８５９号、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ（米国特許第５，７０３，０５５号、１９９７年１２月３０日発行）；及びＣａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，６７９，６４７号、１９９７年１０月２１日発行）に描写されているような、当技術分野で公知の方法によって投与することができる。融合タンパク質を、粒子又はビーズに合成することで、例えばワクチン銃（ｖａｃｃｉｎｅ  ｇｕｎ）を用いて個体に投与可能となる。当技術分野の当業者は、生理学的に容認可能な化合物を含む、薬剤的に容認可能な担体の選択は、例えば投与経路に依存することを了知しているであろう。
【００５８】
融合タンパク質は、様々な経路を介して送達され得る。典型的な送達経路は、例えば、皮内、筋肉内又は皮下投与の非経口投与を包含し得る。他の経路は、経口投与、鼻腔内、膣内、経皮、静脈内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、及び上皮性の経路を包含し得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、対象に、静脈内、動脈内、又は腹腔内投与することができる。
【００５９】
融合タンパク質は、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤のような液状製剤であり得る。融合タンパク質は、リポソーム、マイクロスフェア、又は他の高分子マトリックス（例えば、内容が参照により全体としてここに組み込まれる、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７０３，０５５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ｔｏ  ＩＩＩ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９３）に描写される方法による）に取り込まれ得る。リポソームは、リン脂質又は他の脂質からなり得、かつ無毒で生理学的に容認及び代謝可能であり、比較的生成及び投与が簡単な担体になり得る。
【００６０】
融合タンパク質は、ワクチンであり得る。ワクチンは、エレクトロポレーション、例えば内容が参照により全体としてここに取り込まれる、米国特許第７，６６４，５４５号に描写される方法により、投与することができる。エレクトロポレーションは、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３０２，８７４；５，６７６，６４６；６，２４１，７０１；６，２３３，４８２；６，２１６，０３４；６，２０８，８９３；６，１９２，２７０；６，１８１，９６４；６，１５０，１４８；６，１２０，４９３；６，０９６，０２０；６，０６８，６５０；及び５，７０２，３５９に描写されている方法及び／又は装置によることができる。エレクトロポレーションは、低侵襲装置（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｖｉｃｅ）を介して実行することができる。
【００６１】
一部の実施形態においては、融合タンパク質は、放出制御製剤の形で投与することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、１つ以上の熱応答性ポリペプチドを含み得、熱応答性ポリペプチドは、転移温度であって、融合タンパク質が投与前に可溶のままであるような、かつ融合タンパク質が投与時に対象中でゲル様デポ剤に移行するような、転移温度を有する。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、１つ以上の熱応答性ポリペプチドを含み得、熱応答性ポリペプチドは、転移温度であって、融合タンパク質が室温で可溶のままであるような、かつ融合タンパク質が投与時に対象中でゲル様デポ剤に移行するような、転移温度を有する。例えば、一部の実施形態においては、融合タンパク質は、１つ以上の熱応答性ポリペプチドを含み得、熱応答性ポリペプチドは、室温（約２５℃）と体温（約３７℃）との間の転移温度を有し、これにより、融合タンパク質は投与されてデポ剤を形成することができる。ここで用いられるように、「デポ剤」は融合タンパク質を含むゲル様の組成物であり、融合タンパク質を少しずつ放出する。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、皮下又は腫瘍内に注入されてデポ剤（コアセルベート）を形成し得る。デポ剤は、制御された及び／又は徐放性の融合タンパク質の放出を提供し得る。デポ剤は、例えば循環又は腫瘍への、徐放性の融合タンパク質の放出を提供し得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも１週間、少なくとも１．５週間、少なくとも２週間、少なくとも２．５週間、少なくとも３．５週間、少なくとも４週間、又は少なくとも１か月の期間にわたって、デポ剤から放出され得る。
【００６２】
５．検出
ここで用いられるように、用語「検出する」又は「存在を判定する」は、検出不可能な濃度、低濃度、通常濃度、又は高濃度の１つ以上の融合タンパク質、標的、又は標的に結合した融合タンパク質の定性的計測を指す。検出は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の検出を包含し得る。検出は、１つ以上の融合タンパク質又は標的の存在と、１つ以上の融合タンパク質又は標的の非存在を包含し得る。検出は、１つ以上の融合タンパク質又は標的のレベルの定量化もまた、包含し得る。用語「定量化する」又は「定量化」は、互換的に使用することができ、かつ相対又は絶対にかかわらず、物質（例えば、融合タンパク質又は標的）の量又は存在量を判定する過程を指し得る。任意の適切な検出方法は、本開示の一般的な範囲に収まる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、検出のために付着されたレポーターを含み得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、レポーターによって標識することができる。一部の実施形態においては、標的に結合した融合タンパク質の検出は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット上のバンド強度、フローサイトメトリー、放射性標識イメージング、細胞結合アッセイ、活性アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、免疫アッセイを包含する方法により、又は当技術分野で公知の様々な他の方法により、判定することができる。
【００６３】
一部の実施形態においては、融合タンパク質が標的に結合及び／又は標的を検出する抗体模倣物である実施形態を含め、任意の免疫アッセイを利用することができる。免疫アッセイは、例えば、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、順方向若しくは逆方向競合阻害アッセイのような競合阻害アッセイ、蛍光偏光アッセイ、又は競合結合アッセイであり得る。ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。標的への融合タンパク質の特異的免疫学的結合は、融合タンパク質に付着している直接的標識を介して、又はアルカリホスファターゼ若しくはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような間接的標識を介して検出することができる。固定された融合タンパク質の使用は、免疫アッセイに取り込むことができる。融合タンパク質は、種々の支持体、例えば、磁気又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、固体材料片などの上に固定化することができる。融合タンパク質又は複数の融合タンパク質を固体支持体上に整列させてコートすることにより、アッセイストリップを調製することができる。次いで、このストリップを試験生物学的試料中に浸漬させることができ、次いで、洗浄および検出ステップを介して迅速に処理して、計測可能なシグナル、例えば有色スポットを生成することができる。
【００６４】
６．方法
ａ．疾患を治療する方法
他の態様では、疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法を開示する。方法は、有効量のここに記載の融合タンパク質を対象に投与することを含み得る。疾患は、癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、及び整形外科的障害から選択され得る。一部の実施形態においては、疾患は、少なくとも一つの結合ポリペプチドの標的と関連する疾患であり得る。
【００６５】
代謝疾患は、体内の異常な化学的反応が、正常な代謝プロセスを変動させる場合に生じ得る。代謝疾患は、例えば、インスリン耐性、非アルコール性脂肪肝疾患、２型糖尿病、インスリン耐性疾患、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝障害、高血糖症、高インスリン血症、高脂肪血症、及びグルコース代謝障害を包含し得る。
【００６６】
自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質及び組織に対する身体の異常な免疫応答から生じ得る。自己免疫疾患は、限定されるものではないが、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、心筋炎、乾癬、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び線維筋痛を包含し得る。
【００６７】
心血管疾患は、心臓又は血管にかかわる疾患のクラスである。心血管疾患は、例えば、狭心症及び心筋梗塞（心臓発作）のような冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、及び静脈血栓症を包含し得る。
【００６８】
整形外科的障害又は筋骨格障害は、四肢、頸部、及び背部を支持する体内の関節、靭帯、筋肉、神経、腱、及び構造の障害又は疼痛である。整形外科的障害は、疼痛を引き起こし、かつ正常な活動を害する変性疾患及び炎症病態を包含し得る。整形外科的障害は、例えば、手根管症候群、上顆炎、及び腱炎を包含し得る。
【００６９】
癌は、限定されるものではないが、乳癌、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳癌、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、肉腫、気管癌、頭頸部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ癌、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌腫、肉腫、及び軟部組織癌を包含し得る。一部の実施形態においては、癌は、結腸直腸癌であり得る。一部の実施形態においては、癌は、結腸直腸腺癌であり得る。
【００７０】
一部の実施形態においては、本開示は、関心の腫瘍学的標的のための抗体模倣物の開発における、足場タンパク質の使用方法を提供する。足場タンパク質操作の出現に伴って、立体的かつ構築的制限によって妨げられない有効なタンパク質薬の設計実現性が到来する。有効なタンパク質薬は、診断及び治療において有用となり得るが、標的領域への送達を成功させるには、大きな試練が提起され得る。
【００７１】
ｂ．疾患を診断する方法
他の態様では、疾患を診断する方法を開示する。方法は、ここに記載の融合タンパク質を対象に投与する工程、及び標的への融合タンパク質の結合を検出して対象における標的の存在を判定する工程を包含し得る。標的の存在は、対象における疾患を示し得る。一部の実施形態においては、方法は、対象からの試料とここに記載の融合タンパク質とを接触させる工程、試料中の標的のレベルを判定する工程、及び試料中の標的のレベルを標的の対照レベルと比較する工程であって、標的のレベルが対照レベルと異なることが、対象の疾患を示す工程、を包含し得る。一部の実施形態においては、疾患は、癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、及び整形外科的障害から選択され得る。一部の実施形態においては、標的は、疾患マーカー又はバイオマーカーを含み得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、標的に結合及び／又は標的を検出するための抗体模倣物として機能し得る。
【００７２】
ｃ．標的の存在を判定する方法
他の態様では、試料中の標的の存在を判定する方法を開示する。方法は、試料とここに記載の融合タンパク質とを、融合タンパク質と試料中の標的との間で複合体を形成することを可能にする条件下で接触させる工程、及び複合体の存在を判定する工程を包含し得る。複合体の存在は、試料中の標的を示し得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、検出のためのレポーターで標識され得る。
【００７３】
一部の実施形態においては、試料は、対象から得ることができ、及び方法は、診断、予後予測、又は対象の治療の効力を評価する工程をさらに包含し得る。方法が対象の治療の効力を評価する工程を包含する場合、方法は、必要に応じて対象の治療を改変して効力を改善する工程をさらに包含し得る。
【００７４】
ｄ．治療の有効性を判定する方法
他の態様では、疾患に対する治療の有効性の判定を、それを必要とする対象において行う方法を開示する。方法は、対象からの試料とここに記載の融合タンパク質を、融合タンパク質と試料中の標的の間で複合体を形成することを可能にする条件下で接触させる工程、試料中の複合体のレベルを判定する工程であって、複合体のレベルが試料中の標的のレベルを示す工程、及び試料中の標的のレベルを標的の対照レベルと比較する工程であって、標的のレベルが対照レベルと異なる場合に、治療が疾患の治療において有効である又は有効でないと判定する工程、を包含し得る。
【００７５】
時点としては、疾患の発症前、療法の施与前、療法の施与中の様々な時点、療法が完了した後、又はそれらの組み合わせを包含し得る。対象への融合タンパク質の投与時には、融合タンパク質は標的に結合し得、標的の存在は、様々な時点での対象における疾患の存在を示す。一部の実施形態においては、標的は、疾患マーカー又はバイオマーカーを含み得る。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、標的への結合及び／又は標的の検出のための抗体模倣物として機能し得る。様々な時点における融合タンパク質の標的への結合の比較は、疾患が悪化したか否か、疾患が進行したか否か、療法が疾患を治療又は予防するように機能しているか否か、又はそれらの組み合わせを示し得る。
【００７６】
一部の実施形態においては、対照レベルは、対象が治療を開始した期間の前又はその期間中の時点での対象におけるレベルに対応し得、かつ試料は、より遅い時点で対象から採取される。一部の実施形態においては、試料は、対象が治療を受けている期間中の時点で採取され得、かつ対照レベルは、無疾患レベル又は対象が治療を開始した期間よりも前の時点におけるレベルに対応する。一部の実施形態においては、方法は、治療が疾患の治療において有効でないと判定される場合、治療を改変するか、又は異なる治療を対象に施与することをさらに包含し得る。
【００７７】
７．実施例
実施例１：非反復かつ非構造的ポリペプチドの同定
ＥＬＰの非反復の並び替え版を、産生及び試験した。コンピューターアルゴリズムを用いて、２００又は４００アミノ酸を含む配列であって、各々の配列がＥＬＰの対照物と同一のアミノ酸構成を有するが、並び替えられ又は再配列されたアミノ酸順序を有する配列を同定した。生成した配列は、５から１０アミノ酸を含む少なくとも１つのサブ配列であって、（ａ）３つの連続した同一アミノ酸を含んだか、（ｂ）配列に一度よりも多く出現したか、又は（ｃ）０以上のグリシン（Ｇ）でないアミノ酸によって分離される、少なくとも２つのプロリン（Ｐ）を含んだサブ配列である場合に却下したため、十分に非反復である。このような束縛により、どちらも構造破壊残基（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）として同定されているプロリン（Ｐ）及びグリシン（Ｇ）の、十分な分散が増進された。
【００７８】
アルゴリズムは、さらに、８つの非反復配列のパネルであって、各々が、１／６がプロリン（Ｐ）であり、かつ１／３がグリシン（Ｇ）である２４０アミノ酸を含む配列を同定した。残りのアミノ酸は、エラスチンに存在する９つの異なるアミノ酸の、様々な組み合わせであった。これらの配列のアミノ酸構成を、図２に描写する。
【００７９】
各々の非構造的ポリペプチド配列の反復性を、言語的複雑性スコアの算出によって定量した。言語的複雑性は、同一のアルファベット及びウィンドウから考えられる特有サブ配列の総数で割った、与えられた配列中の特有サブ配列の総数によって、定義される。スコアを、タンパク質解析ツールであるＣＩＤＥＲ（Ｈｏｌｅｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．を参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）を用いて算出した。ウィンドウ長を、各配列の全配列長と同一となるように設定した。最終スコアは、言語的複雑性スコア及び配列の長さを意味する全配列長の結果として与えられる。配列番号３〜６の反復ポリペプチド配列及び配列番号７〜１８の非反復ポリペプチド配列の最終スコアの結果を、表１に報告する。非反復ポリペプチド配列のすべての最終スコアは、１５．０よりも大きかった。
表１：反復（配列番号３〜６）及び非反復（配列番号７〜１８）ポリペプチド配列の反復性の特徴づけ
【表１】
2020500150.tif 000003
【００８０】
実施例２：非反復かつ非構造的ポリペプチドの発現
全ヌクレオチド配列を、示さない限り、アミノ酸配列からコドンスクランブリングを用いて逆翻訳した（Ｔａｎｇ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒ．を参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）。Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１９）をコードするＮ末端リーダー配列及びＧｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号２０）をコードするＣ末端Ｈｉｓ−タグ尾部を、示さない限り、遺伝子に組み込んだ。すべての遺伝子を、商業的合成方法により合成し、かつ改変ｐＥＴ−２４ａ（＋）プラスミド（Ｇｅｎ９  Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）にクローニングした。結果として得られたプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１株コンピテントセルに形質転換した。
【００８１】
コロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを加えた２〜５ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）に播種し、３７℃及び２５０ｒ．ｐ．ｍで一晩生育させた。１ミリリットルの種菌を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを加えた１ＬのＴＢに播種し、３７℃及び２５０ｒ．ｐ．ｍで６〜７時間生育させた。終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて発現を誘導し、細胞を追加で２４時間生育させた。非構造的ポリペプチドを、前述したように（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．を参照されたい、ここで、その開示は参照により全体としてここに組み込まれる）、逆転移サイクリング（ＩＴＣ）によって精製した。
【００８２】
実施例３：非反復的かつ非構造的ポリペプチドの特徴づけ
非構造的ポリペプチドの逆転移温度を特徴づけるため、２５μＭで吸光度３５０ｎｍのペプチド溶液を、Ｃａｒｙ  ３００  紫外線可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて溶液温度機能として監視した。逆転移温度を、周囲の疎水性の増加に伴って蛍光が増加するＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ色素によっても監視した。温度応答性ポリマーは、水溶液中の疎水効果に起因して相転移を示した。そこで、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓTMリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、蛍光を溶液温度機能として監視した。逆転移温度を、濁度又は蛍光勾配の最大値における温度として定義した。
【００８３】
濁度特性は、ＰＢＳ中で２５μＭである全ての構成物に対し、約０℃と約１００℃との間の加熱曲線又は冷却曲線からなり、当該濁度特性が、Ａ［０．２］（配列番号７及び９）及びＡ［０．５］（配列番号８及び１０）の非反復版が、それらの反復性対照物（配列番号３及び５並びに配列番号４及び６）と同様に、転移温度を有するＬＣＳＴ相挙動を維持することを示した。さらに、非構造的ポリペプチドは、０℃と１００℃との間で下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）挙動を示した（図３（Ａ）〜（Ｂ）及び図４（Ａ）〜（Ｂ）を参照されたい）。
【表２−１】
2020500150.tif 000004
【表２−２】
2020500150.tif 000005
【表２−３】
2020500150.tif 000006
【図１】
2020500150.tif 000007
【図２】
2020500150.tif 000008
【図３（Ａ）】
2020500150.tif 000009
【図３（Ｂ）】
2020500150.tif 000010
【図４（Ａ）】
2020500150.tif 000011
【図４（Ｂ）】
2020500150.tif 000012
【配列表】
2020500150000001.app
【国際調査報告】
2020500150.tif 000013
2020500150.tif 000014
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