(57)【要約】  本発明は、腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用を提供する。単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のＩＬ−２１遺伝子をインテグレーションされ、ＩＬ−２１遺伝子は腫瘍細胞内で発現されることができる。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し得、外来性のＩＬ−２１の抗腫瘍免疫効果をもまた充分に行使し得、その結果、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性殺傷効果およびＩＬ−２１の抗腫瘍免疫刺激効果は相乗効果を達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムが外来性のＩＬ−２１遺伝子をインテグレーションされ、ＩＬ−２１遺伝子が腫瘍細胞内で発現されることができる、単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項２】
ＴＫ遺伝子が外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機能欠損する、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項３】
外来性のＩＬ−２１遺伝子がＴＫ遺伝子内に挿入され、それによってＴＫ遺伝子の機能欠損を引き起こす、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項４】
ＶＧＦ遺伝子が、ノックアウトされることまたは外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機能欠損する、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項５】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがＷｙｅｔｈ株またはＷＲ株である、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項６】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムがさらに外来性のスクリーニング遺伝子をインテグレーションされ、外来性のスクリーニング遺伝子がｇｐｔ遺伝子および／またはＬａｃＺ遺伝子を包含するが、蛍光蛋白質遺伝子を包含しない、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項７】
外来性のＩＬ−２１遺伝子がマウスまたはヒトに由来する、請求項１または５に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
【請求項８】
医薬組成物が、活性成分としての請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の用量で含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、それが腫瘍内注射または静脈内投与によって投与されるように製剤される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のＩＬ−２１遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製するためのベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
腫瘍および／または癌の処置のための医薬の調製のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用。
【請求項１４】
腫瘍および／または癌が肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与することを含む、腫瘍および／または癌を処置するための方法。
【請求項１６】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の用量で、１日１回、連続１〜６日に渡って投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが腫瘍内注射または静脈内投与によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍および／または癌が肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を殺傷するが、正常細胞を害さない型のウイルスである。感染した腫瘍細胞内で複製した後に、新たなウイルス粒子を放出し、これが今度はそれらの周りの腫瘍細胞に感染し、さらに腫瘍溶解効果を行使する。この直接的な腫瘍溶解効果に加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスそれ自体および感染した腫瘍細胞に対する免疫応答を生ずるように体を有効に刺激し得る。腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果は、腫瘍細胞を選択的に殺傷することと、系統的な抗腫瘍免疫応答を生ずるように体を誘導することとの両方によって達成されるということが分かる。
【０００３】
１９世紀の終わりほども早くに、複数のウイルスが腫瘍発生の進行を緩和することが見いだされ、腫瘍治療の分野におけるウイルスのポテンシャルを指示した。遺伝子テクノロジーの発展によって、ウイルスゲノム構造はそれが腫瘍細胞内で選択的に複製され得るように改変され得、それによってその腫瘍標的化特性を強化する。過去１０年に、研究者は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、小型ＲＮＡウイルス、ワクシニアウイルス、および他のウイルスを遺伝子改変するための遺伝子組換え、遺伝子伝達、遺伝子ノックアウト、および他のテクノロジーによって、一連の腫瘍溶解性ウイルス製品を開発した。今までに、２０個よりも多くの製品が臨床研究の異なる段階に入っている。それらの中でも、中国ＣＦＤＡは、頭頸部腫瘍の処置について、上海三維生物技術有限公司の遺伝子改変された腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１の上市を２００５年に承認しており、これは世界で最初の腫瘍溶解性ウイルス医薬であった。１０年後になって、第２の腫瘍溶解性ウイルス医薬、Ａｍｇｅｎの遺伝子改変された腫瘍溶解性ヘルペスウイルスＴ−Ｖｅｃが、進行した悪性黒色腫の処置について、米国ＦＤＡおよび欧州連合ＥＭＡによって２０１５年に承認された。現行では、医薬として上市されている遺伝子改変された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはない。
【０００４】
腫瘍溶解性ウイルスによる腫瘍および／または癌の免疫療法により有効な医薬を開発する必要がなおある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
先行技術の既存の問題を解決するために、本発明は、腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用を提供する。
【０００６】
具体的には、本発明は次を提供する。
（１）  単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のＩＬ−２１遺伝子をインテグレーションされ、ＩＬ−２１遺伝子は腫瘍細胞内で発現されることができる。
（２）  （１）に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、ＴＫ遺伝子は、外来性のヌクレオチド配列が挿入されることによって機能的に欠損する。
（３）  （１）に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、外来性のＩＬ−２１遺伝子はＴＫ遺伝子内に挿入され、それによってＴＫ遺伝子の機能欠損を引き起こす。
（４）  （１）に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、ＶＧＦ遺伝子はノックアウトされることまたは外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機能欠損する。
（５）  （１）に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＷｙｅｔｈ株またはＷＲ株である。
（６）  （１）に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムはさらに外来性のスクリーニング遺伝子をインテグレーションされ、外来性のスクリーニング遺伝子はｇｐｔ遺伝子および／またはＬａｃＺ遺伝子を包含するが、蛍光蛋白質遺伝子を包含しない。
（７）  （１）または（５）に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、外来性のＩＬ−２１遺伝子はマウスまたはヒトに由来する。
（８）  医薬組成物であって、医薬組成物は活性成分としての（１）〜（７）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
（９）  （８）に従う医薬組成物であって、医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の用量で含む。
（１０）  （８）に従う医薬組成物であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内注射または静脈内投与によって投与される。
（１１）  （１）〜（７）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製するためのベクターであって、ベクターはプロモーターのコントロール下の外来性のＩＬ−２１遺伝子を含む。
（１２）  （１１）に従うベクターを含む宿主細胞。
（１３）  腫瘍および／または癌の処置のための医薬の調製のための、（１）から（７）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用。
（１４）  （１３）に従う使用であって、腫瘍および／または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する。
（１５）  腫瘍および／または癌を処置するための方法であって、（１）〜（７）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与することを含む。
（１６）  （１５）に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の用量で、１日１回、連続１〜６日に渡って投与される。
（１７）  （１５）に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内注射または静脈内投与によって投与される。
（１８）  （１５）に従う方法であって、腫瘍および／または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する。
【０００７】
先行技術と比較して、本発明は次の利点および有益な効果を有する。
【０００８】
本発明は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子の両方を機能欠損させることと、同時に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが免疫制御因子ＩＬ−２１の遺伝子を保有するようにさせることとを初めて提案し、その結果、得られた組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し得、免疫制御因子ＩＬ−２１を発現する。本概念に基づいて提供される腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、および方法は、腫瘍細胞内で選択的に複製および腫瘍細胞を殺傷し、さらに体の爾後の免疫応答を引き起こす腫瘍溶解性ウイルスの役割を充分に行使し得、外来性のＩＬ−２１の抗腫瘍免疫効果をもまた充分に行使し得る。本発明は、ＩＬ−２１遺伝子を腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにインテグレーションすることによって、本発明が腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性殺傷効果とＩＬ−２１の抗腫瘍免疫刺激効果とを相乗化し得るということを見いだした。
【０００９】
加えて、ワクシニアウイルスのＴＫおよびＶＧＦ遺伝子の両方の機能欠損はその腫瘍標的化特性を有効に強化し、それによって安全性を改善する。
【００１０】
加えて、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し、同時に外来性のＩＬ−２１を発現するので、それは体の抗腫瘍免疫応答を相乗的に刺激し得、それによって本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをＮＫ細胞と組み合わせることを可能にする。この概念に基づいて提供される医薬組成物および方法は、腫瘍細胞内で選択的に複製および腫瘍細胞を殺傷しかつさらに体の爾後の免疫応答を引き起こす本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの役割を充分に発揮するのみならず、腫瘍細胞を殺傷するＮＫ細胞の機能をもまた行使し得、腫瘍細胞内で選択的に複製する本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの特徴を巧妙に利用し、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有する腫瘍細胞がＮＫ細胞の特異的標的になるようにする。発現される外来性のＩＬ−２１もまたＮＫ細胞の致死性を強化し得、それによってＮＫ細胞の腫瘍殺傷効果をさらに強化する。これは最終的にさらに強化された相乗的な腫瘍殺傷効果を生ずる。
【００１１】
さらに、研究によって、本発明によって提案される組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの投与用量、投与順序、および投与間隔は、それらの組み合わせが最大の相乗効果を達成することを可能にし、同時にそれらの相互の制約を回避し、それゆえに腫瘍および／または癌を処置する有効な効果を達成する。
【００１２】
定義
本願において用いられる用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は当分野において通常認識される意味を包摂する。
本願において用いられる用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を溶解し得るウイルスを言う。
本願において用いられる用語「治療有効量」は、検出測定可能な治療もしくは阻害効果を見せるかまたは抗腫瘍応答を誘起するために有用な機能性薬剤または医薬組成物の量を言う。効果は当分野において公知のいずれかのアッセイ方法によって検出測定され得る。
本願において用いられる用語「投与する」または「投与」は、化合物、複合物、または組成物（ウイルスおよび細胞を包含する）を対象に提供することを言う。
本願において用いられる用語「患者」はヒトまたは非ヒト生物を言う。それゆえに、本願に記載される方法および組成物はヒトおよび獣類の疾患両方に適用可能である。ある種の実施形態では、患者は腫瘍を有する。いくつかのケースでは、患者は１つ以上の型の癌に同時に罹患し得る。
本願において用いられる用語「相乗効果」は、それらの単体の効果の合計よりも多大な効果を生ずる２つ以上の薬剤の間に生起する効果を言う。
本願において用いられる用語「ｐｆｕ」または「プラーク形成単位」はプラークを形成するウイルス数を言う。
本願において用いられる用語「ＭＯＩ」または「多重感染度」は、ウイルス数および細胞数の間の比、すなわち細胞あたりのウイルス感染を開始するために用いられるウイルス粒子数を言う。ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞、すなわち細胞数×ＭＯＩ＝トータルのＰＦＵ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ワクシニアウイルスＶＳＣ２０のＴＫ遺伝子にＩＬ−２１遺伝子を挿入するように構築された組換え体プラスミドの図解（すなわち、図に示されている「Ｄｖｖ−ＶＳＣ２０／ＶＧＦ−」）と、本発明の実施形態に従う組換えメカニズムの略図とを示している。本発明の１つの実施形態に従う組換え体の二重遺伝子欠損ワクシニアウイルス（組換え体ＤＤｖｖ）が、示されている組換えメカニズムによって得られる。
【図２】図２は、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを得るための１つの実施形態のフローチャートを示している。
【図３】図３は、本発明の例１において構築されたプラスミドの図解を示している。
【図４】図４は、ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ法によってＰ０世代組換え体ウイルスＤＤｖｖ−ＩＬ２１を鑑定した結果を示している。ＡはＰＣＲ法によるＰ０世代ウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の検出測定であり、ＢはＰＣＲ法によるＰ０世代ウイルスＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１の検出測定である。レーンＭ：Ｄ０００マーカー、レーン１：負のコントロール（すなわちＰＣＲ反応溶液）、レーン２：ＶＳＣ２０、レーン３：ＣＶ１細胞、レーン４：Ｐ０世代ウイルス。Ｃは、ＥＬＩＳＡによって鑑定されたＰ０世代ウイルスの培養上清のＩＬ２１の発現レベルを示している。図４Ｃでは、横軸は群であり、縦軸はＩＬ２１の濃度（ｐｇ／ｍＬ）である。横軸上に示されている「ＮＣ」はＣＶ１細胞を言い、「プラスミド」はｐＣＢ−ｍＩＬ２１を言う。
【図５】図５はプラークスクリーニング後の組換え体ウイルスの鑑定結果を示している。ＡおよびＢはそれぞれＰＣＲによる腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１およびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１の鑑定である。レーンＭ：Ｄ０００マーカー、レーン１：負のコントロール（すなわちＰＣＲ反応溶液）、レーン２：Ｐ０世代ウイルス、レーン３：ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１（図５Ａ）またはＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１（図５Ｂ）。ＣおよびＤはＰＣＲ法によるＴＫ領域鑑定である。図中のレーンＭ：Ｄ０００マーカー、レーン１：負のコントロール（すなわちＰＣＲ反応溶液）、レーン２：ＶＳＣ２０、レーン３：Ｐ０世代ウイルス、レーン４：ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１（図５Ｃ）またはＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１（図５Ｄ）。ＥおよびＧは、抗ＩＬ−２１抗体を用いるウエスタンブロットによってそれぞれ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１およびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１のＩＬ２１蛋白質の発現を示している。図に示されている「ＮＣ」はＣＶ１細胞を言う。ＦおよびＨは、細胞をそれぞれ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１およびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１に感染させた後の培養培地および細胞ライセートのＩＬ２１含量を示しており、ＥＬＩＳＡキットによって検出測定した。
【図６】図６は、５種類のマウス由来癌細胞に対するネズミＩＬ−２１断片を保有する組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の殺傷効果を示している。ＡはＢ１６細胞の実験結果であり、Ｂは４Ｔ１細胞の実験結果であり、ＣはＬＬＣ細胞の実験結果であり、ＤはＧＬ２６１細胞の実験結果であり、ＥはＣＴ２６細胞の実験結果である。図６Ａ〜Ｅは横軸に時間（ｈ）、縦軸に細胞殺傷率（％）を示す。
【図７】図７は、５種類のマウス由来癌細胞に対するネズミＩＬ−２１断片を保有する組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の殺傷効果曲線（Ａ〜Ｅ）およびＩＣ５０値（Ｆ）を示している。ＡはＢ１６細胞の実験結果であり、ＢはＣＴ２６細胞の実験結果であり、Ｃは４Ｔ１細胞の実験結果であり、ＤはＬＬＣ細胞の実験結果であり、ＥはＧＬ２６１細胞の実験結果である。図７Ａ〜Ｅは横軸にＭＯＩのｌｏｇ値、縦軸に細胞殺傷率（％）を示す。図７Ｆは横軸に細胞群、縦軸にＩＣ５０値（ＭＯＩ）を示す。
【図８】図８は、４種類のヒト癌細胞に対するヒトＩＬ−２１断片を保有する組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１の殺傷効果を示している。ＡはＡ５４９細胞の実験結果であり、ＢはＨｅｌａ細胞の実験結果であり、ＣはＳＫＯＶ３細胞の実験結果であり、ＤはＵ２５１細胞の実験結果である。図８Ａ〜Ｄは横軸に時間（ｈ）、縦軸に細胞殺傷率（％）を示す。
【図９】図９は、８種類のヒト癌細胞に対するヒトＩＬ−２１断片を保有する組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１の殺傷効果曲線（Ａ〜Ｈ）およびＩＣ５０値（Ｉ）を示している。ＡはＡ５４９細胞の実験結果であり、ＢはＨｅｐＧ２細胞の実験結果であり、ＣはＨｅｌａ細胞の実験結果であり、ＤはＨＴ２９細胞の実験結果であり、ＥはＳＫＯＶ３細胞の実験結果であり、ＦはＰＡＮＣ１細胞の実験結果であり、ＧはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の実験結果であり、ＨはＦａＤｕ細胞の実験結果である。図９Ａ〜Ｈは横軸にＭＯＩのｌｏｇ値、縦軸に細胞殺傷率（％）を示す。図９Ｉは横軸に細胞群、縦軸にＩＣ５０値（ＭＯＩ）を示す。
【図１０】図１０は、Ｂ１６腫瘍を持つマウスに対するネズミＩＬ−２１断片を保有する組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の抗腫瘍効果を示している。図１０Ａは腫瘍体積の時間曲線を示しており、横軸は投与時間（日）であり、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）である。図１０ＢはＴ／Ｃの時間曲線を示しており、横軸は投与時間（日）であり、縦軸はＴ／Ｃ（％）である。図１０Ｃは異なる用量群の腫瘍重量の比較結果を示しており、横軸は群であり、縦軸は腫瘍重量（ｇ）である。
【図１１】図１１は、腫瘍を持つＢ１６マウスに対するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の免疫効果のフローサイトメトリー分析を示している。ＡおよびＢは、ＣＤ４＋細胞の変化（Ａ）およびＣＤ８＋細胞の変化（Ｂ）を検出測定するための脾臓から抽出されたＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析である。ＣおよびＤは、ＣＤ４＋細胞の変化（Ｃ）およびＣＤ８＋細胞の変化（Ｄ）を検出測定するための腫瘍組織から抽出された腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析である。図１１Ａ〜Ｄでは、横軸は投与群であり、縦軸はＣＤ４＋ＴまたはＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ（％）である。
【図１２】図１２は、ＬＬＣ腫瘍を持つマウスに対するネズミＩＬ−２１断片を保有する組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の腫瘍阻害効果を示している。図１２Ａは腫瘍体積の時間曲線を示しており、横軸は投与時間（日）であり、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）である。図１２ＢはＴ／Ｃの時間曲線を示しており、横軸は投与時間（日）であり、縦軸はＴ／Ｃ（％）である。
【図１３】図１３は、ヒト腫瘍細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１に対するヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果を示している。横軸は群であり、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である。
【図１４】図１４は、Ｂ１６腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスに対するネズミＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果を示している。図１４Ａは処置後の腫瘍体積の変化曲線を示しており、横軸はＢ１６腫瘍細胞接種時間（日）であり、横軸上の矢印はＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１投与の時点を指示しており、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）である。図１４Ｂは処置後のＴ／Ｃの変化曲線を示しており、横軸はＢ１６腫瘍細胞接種時間（日）であり、縦軸はＴ／Ｃ（％）である。
【図１５】図１５は、Ｂ１６腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスに対するマウスＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびコントロールワクシニアウイルスの抗腫瘍効果の比較を示している。図１５Ａは処置後の腫瘍体積の変化曲線を示しており、横軸は投与後の時間（日）であり、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）である。図１５Ｂは処置後のＴ／Ｃの変化曲線を示しており、横軸は投与後の時間（日）であり、縦軸はＴ／Ｃ（％）である。図１５Ｃは処置後の腫瘍重量を示しており、横軸は群であり、縦軸は腫瘍重量（ｇ）である。
【図１６】図１６は、Ｂ１６腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスに対するマウスＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびコントロールワクシニアウイルスの免疫効果のフローサイトメトリー比較を示している。図１６Ａ〜Ｃは、フローサイトメトリーによって検出測定されたＣＤ４＋細胞（Ａ）、ＣＤ８＋細胞（Ｂ）、およびＮＫ細胞（Ｃ）の変化を示している。図１６Ａ〜Ｃでは、横軸は投与群であり、縦軸は、腫瘍組織中のトータルの免疫細胞に対する相対的な腫瘍組織中のＣＤ４＋Ｔ細胞数のパーセンテージ（％）（Ａ）、腫瘍組織中のトータルの免疫細胞に対する相対的な腫瘍組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞数のパーセンテージ（％）（Ｂ）、または腫瘍組織中のトータルの免疫細胞に対する相対的な腫瘍組織中のＮＫ細胞数のパーセンテージ（％）（Ｃ）である。
【図１７】図１７は、ＨＣＴ１１６腫瘍を持つ重度免疫不全マウスに対する、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの抗腫瘍効果の比較を示している。図１７Ａは処置後の腫瘍体積の変化曲線を示しており、横軸はＨＣＴ１１６腫瘍細胞の接種時間（日）であり、横軸上の矢印はＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１投与の時点を指示し、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）である。図１７Ｂは処置後のＴ／Ｃの変化曲線を示しており、横軸はＨＣＴ１１６腫瘍細胞接種時間（日）であり、縦軸はＴ／Ｃ（％）である。
【図１８】図１８Ａ〜Ｄは、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせによる、ＨＣＴ１１６腫瘍を持つ重度免疫不全マウスの処置後の腫瘍組織分析の比較を示している（定量ＰＣＲ法を用いている）。分析は、腫瘍組織のワクシニアウイルスＡ４６Ｒ遺伝子の相対的な発現レベル（Ａ）、ＩＬ−２１遺伝子の相対的な発現レベル（Ｂ）、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ遺伝子の相対的な発現レベル（Ｃ）、ＩＦＮ−γ遺伝子の相対的な発現レベル（Ｄ）を包含する。図１８Ａ〜Ｄでは、横軸は投与群であり、縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベル（単位：μｇ）に対して相対的な腫瘍組織の標的遺伝子（腫瘍のワクシニアウイルスのＡ４６Ｒ遺伝子（Ａ）、腫瘍のＩＬ−２１遺伝子（Ｂ）、腫瘍のＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ遺伝子（Ｃ）、腫瘍のＩＦＮ−γ遺伝子（Ｄ））のそれぞれの発現レベル（単位：ｐｇ）の比（ｐｇ／μｇ）である。
【図１９】図１９は、Ｂ１６腫瘍マウスにおける静脈内投与されたＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの分布を示している。横軸は組織および臓器の型であり、縦軸は、腎臓臓器のワクシニアウイルスＡ４６Ｒ遺伝子の発現量に対するそれぞれ各組織および臓器のワクシニアウイルスＡ４６Ｒ遺伝子の発現量の比較倍数である。
【図２０】図２０は、ヒト腫瘍細胞ＨｅｐＧ２に対するヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果を示している。横軸は群であり、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である。
【図２１】図２１は、ヒト腫瘍細胞ＨＣＴ１１６に対する、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果の比較を示している。図２１ＡはＮＫ群、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１群、およびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１＋ＮＫ群の比較を示す。図２１Ｂは各実験群の比較を示す。図２１ＡおよびＢでは、横軸は群であり、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である。
【図２２】図２２は、ヒト腫瘍細胞ＦａＤｕに対する、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果の比較を示している。図２２ＡはＮＫ群、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１群、およびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１＋ＮＫ群の比較を示す。図２２Ｂは各実験群の比較を示す。図２２ＡおよびＢでは、横軸は群であり、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である。
【００１４】
各図において、示されている場合には、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味する（一元配置ＡＮＯＶＡ統計分析法を用いて、示されているコントロール群と比較）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、付随する図面を参照して好ましい実施形態の次の詳細な記載によってさらに説明される。ただし、これは本発明を限定するわけではない。種々の改変または改善が本開示の趣旨から外れることなしに然るべくなされ得、よって、これらは本開示の範囲内であるということは当業者には明らかであろう。
【００１６】
本発明では、用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は当分野において通常認識される意味を包摂する。
【００１７】
人体は複雑なシステムであり、呼吸、循環、および消化などの十大システムから構成される。これらのシステムは協調連携して、人体内の種々の複雑な生命活動が正常に進むことを可能にする。腫瘍が生ずるときには、体は種々の免疫エフェクターメカニズムによって抗腫瘍効果を行使し得る。体の抗腫瘍メカニズムは細胞性免疫および液性免疫を包含する。それらは密接に結びついており、互いに影響し、種々の免疫エフェクター分子およびエフェクター細胞が関わる。通常は、細胞性免疫は抗腫瘍プロセスにおいて主導的な役割を発揮し、液性免疫はいくつかのケースでは相乗的な役割を発揮するということが信じられている。本発明は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、および腫瘍細胞を殺傷する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの特徴を利用することと、同時にそれが免疫制御因子ＩＬ−２１を保有するようにさせることとを提案し、その結果、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは選択的な腫瘍溶解性および体の抗腫瘍免疫効果の強化の機能を相乗的に行使する。この概念に基づき、本発明の発明者は、実験研究および理論的検討から、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子の両方を機能欠損させることとＩＬ−２１遺伝子をゲノム中にインテグレーションすることとによって、上述の相乗効果を達成することが可能であるということを発見した。
【００１８】
ワクシニアウイルス（ＶＶ）は今までに発見された最も大きくかつ最も複雑なウイルスの１つであり、これは痘瘡を防止するためのワクチンウイルスである。ウイルスの特殊な生物学的特性は、それが腫瘍免疫療法／遺伝子治療の分野において増々大きくなる注目を得るようにさせている。（１）安全性：ワクシニアウイルスは、細胞の細胞質内で複製し、宿主細胞ゲノムにはインテグレーションしないＤＮＡウイルスであり、外来性遺伝子によって誘導される変異を縮減する（文献：“Ｈｒｕｂｙ，  ＤＥ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３，１５３−１７０（１９９０）．”参照）。（２）高い発現効率：ワクシニアウイルスは非常に高い力価（＞１０９ｐｆｕ／ｍｌ）まで培養され得、通常は１〜３時間の感染が、感染した細胞の９０％よりも多くが目当ての遺伝子産物を発現するようにさせ得る（文献：“Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｍ．，Ｆａｌｋｎｅｒ，ＦＧ  ＆  Ｄｏｒｎｅｒ，Ｆ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ，  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｈｏｓｔｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６，２９５７−２９６２（１９９５）．”参照）。（３）広い範囲の感染細胞：分裂および非分裂細胞を包含するほぼ全ての型の哺乳類細胞に感染する（文献：“Ｈｒｕｂｙ，ＤＥ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．３，１５３−１７０（１９９０）．”参照）。（４）大きいゲノム容量：少なくとも２５ｋｂの外来性遺伝子が、その遺伝子安定性に影響することなしに挿入され得る（文献：“Ｈｒｕｂｙ，ＤＥ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３，１５３−１７０（１９９０）．”参照）。（５）安定性：温度に対して敏感でなく、医薬利用性が良好、用いることおよび輸送することが容易（文献：“Ｈｒｕｂｙ，ＤＥ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３，１５３−１７０（１９９０）．”参照）。（６）発現産物は天然の構造を有する：発現された産物はその天然配置に近い正しいグリコシル化および翻訳後プロセシングを有し得る（文献：“Ｈｒｕｂｙ，ＤＥ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３，１５３−１７０  （１９９０）．”参照）。これはウイルスが体の免疫応答を刺激するための免疫制御遺伝子を保有するために必須である。
【００１９】
ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子はワクシニアウイルス複製プロセスが依存する遺伝子の１つである。ワクシニアウイルスがＴＫ遺伝子を欠失する場合には、ＴＫ蛋白質を宿主細胞から供給することが必要である。しかしながら、ＴＫ蛋白質は正常な細胞周期においては一過的にのみ発現され得るが、ＴＫ蛋白質はほとんどの腫瘍細胞においては一貫して高発現される。よって、腫瘍組織におけるＴＫ蛋白質の発現特徴を用いることは、ＴＫ欠損ワクシニアウイルスの複製が正常細胞よりもむしろ腫瘍組織に限定されることを許し、それによって腫瘍標的化を改善する。ワクシニアウイルス遺伝子改変系が用いられ始めた１９８２年から、ＴＫ遺伝子領域は外来性遺伝子の挿入領域である（文献：“Ｂｙｒｄ，Ｃ．＆Ｈｒｕｂｙ，Ｄ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ．Ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｐｏｘｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２６９，３１−４０（２００４）．”参照）。
【００２０】
第２に、ワクシニアウイルスの細胞内複製および細胞間伝播は、宿主細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路の活性化に密接に関連する。ワクシニアウイルスは細胞に感染し、ウイルス成長因子（ＶＧＦ）を分泌し、これは感染したまたは近傍の未感染の細胞の表面のＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲ／Ｒａｓシグナル伝達経路を活性化し、これはワクシニアウイルスが複製および近傍の細胞に感染することにとって有利である。よって、ＶＧＦ欠損ワクシニアウイルスは正常細胞のＥＧＦＲ／Ｒａｓ経路を活性化し得ず、これは正常細胞に感染するそれらの能力を限定する。しかしながら、腫瘍細胞のＥＧＦＲシグナル伝達経路は活性化され、その結果、腫瘍細胞におけるＶＧＦ遺伝子を欠失するワクシニアウイルスの複製および感染は影響されない。つまり、腫瘍に対する効果の特異性は相対的に改善される（文献：“Ａｕｔｉｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂｅａｇｌｅｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．−Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  １，１−８（２０１４）．”参照）。
【００２１】
ＩＬ−２１（インターロイキン−２１）は多指向性のＩ型サイトカインであり、主にＴ細胞によって産生される。これは自然および獲得免疫応答を制御し、抗腫瘍免疫応答において重要な役割を発揮する。種々の免疫細胞およびシグナルトランスダクションに対するＩＬ−２１の効果が文献に報告されている（文献：“Ｌｅｏｎａｒｄ，ＷＪ  ＆  Ｗａｎ，Ｃ．ＩＬ−２１  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５，１−１０（２０１６）．”参照）。種々の型の免疫細胞は、主に次を包含する。１）ＣＤ４＋Ｔ細胞：増殖を促進し、サイトカインを産生する。Ｔｆｈ細胞：分化を促進し、胚中心機能を改善する。Ｔｈ１７細胞：分化および増殖を促進する。Ｔｒｅｇ細胞：その産生および生存を阻害する。２）ＮＫＴ細胞：増殖し、細胞傷害性を強化する。３）ＣＤ８＋Ｔ細胞：細胞傷害性、増殖および／または生存、抗腫瘍効果を改善する。４）ＮＫ細胞：細胞成熟、増殖を促進し、細胞傷害効果を増大させ、抗腫瘍活性を強化する。５）ＤＣ細胞：抗原提示機能を阻害し、アポトーシスを誘導する。６）マクロファージ：ファゴサイトーシスを強化する。７）Ｂ細胞：増殖および／またはアポトーシスを促進し、プラズマ細胞分化およびイムノグロブリン産生を促進する。８）加えて、ＩＬ−２１は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＭＡＲＫ／ＰＩ３Ｋ、および他のシグナル経路を包含する種々の腫瘍関連シグナル経路を活性化し、腫瘍発生を制御し得る。腫瘍免疫療法では、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化が鍵であり、多くの研究が、ＩＬ−２１がこの手続きにおいて重要な役割を発揮するということを充分に示している。ＩＬ−２１はＮＫ細胞の成熟を促進してＩＦＮ−γおよびパーフォリンを産生し、ＮＫ細胞によって媒介される抗腫瘍細胞傷害性を誘導して腫瘍細胞の表面のＮＫＧ２Ｄリガンドを標的化し、抗体依存性細胞媒介性傷害性（ＡＤＣＣ）を介してＮＫ細胞の致死性を増大させる（文献：“Ｓｐｏｌｓｋｉ，Ｒ．＆  Ｌｅｏｎａｒｄ，ＷＪ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２１：ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１３，３７９−３９５（２０１４）．”参照）。第２に、ＩＬ−２１はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、メモリーＴ細胞の生成を誘導し、ＩＦＮγ／グランザイムの分泌を促進して、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍の殺傷を強化し、再発腫瘍細胞に対する記憶免疫応答に寄与し得る。重要なことに、ＩＬ−２とは違って、ＩＬ−２１はＴｒｅｇ細胞の拡大を誘導せず、さらにＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫機能応答を強化する（文献：“Ｓｐｏｌｓｋｉ，Ｒ．＆  Ｌｅｏｎａｒｄ，ＷＪ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２１：ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１３，３７９−３９５（２０１４）．”参照）。免疫細胞に対するＩＬ−２１の多様な効果に基づいて、ＩＬ−２１は腫瘍微小環境において種々のエフェクター細胞を「再活性化」し得るということが示されている。いくつかの臨床研究が、ＩＬ−２１を単独でまたは腫瘍処置のための他の医薬との組み合わせで用いている。
【００２２】
よって、本発明は単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のＩＬ−２１遺伝子をインテグレーションされ、ＩＬ−２１遺伝子は腫瘍細胞内で発現されることができる。
【００２３】
本発明において用いられる用語「機能欠損」は、腫瘍溶解性ウイルスの遺伝子を言うときには、腫瘍溶解性ウイルスが、遺伝子が本来有するべき機能を果たし得ないということを意味する。つまり、機能は失われている。この目的は、例えば外来性の断片を遺伝子内に挿入することまたは遺伝子のノックアウトによって達成され得る。
【００２４】
よって、外来性のヌクレオチド配列がＴＫ遺伝子内に挿入されてその機能を欠損させ得る。外来性のヌクレオチド配列をＶＧＦ遺伝子内に挿入してその機能を欠損させることもまた可能であるが、ＶＧＦ遺伝子をノックアウトすることが好ましい。
【００２５】
好ましくは、外来性のＩＬ−２１遺伝子がＴＫ遺伝子内に挿入され、その結果、ＴＫ遺伝子は機能欠損し得、ＩＬ−２１遺伝子は腫瘍細胞の感染後に発現され得る。
【００２６】
本発明に用いられ得るワクシニアウイルスはＷｙｅｔｈ株またはＷＲ株を包含し、ＷＲ株の例はＶＳＣ２０である。
【００２７】
好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＶＳＣ２０ワクシニアウイルスを遺伝子改変することによって得られる。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスはＶＧＦ遺伝子を欠失するワクシニアウイルスであり、ＬａｃＺ遺伝子がＣ１１Ｒ部位に挿入されている。その調製方法は、科学文献：“ＭｃＣａｒｔ，ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００１）６１：８７５１−８７５７”に見いだされ得る。遺伝子改変は、外来性のＩＬ−２１遺伝子をＶＳＣ２０ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子内に挿入することを包含し、その結果、ＴＫ遺伝子が機能欠損する。具体的には、ＩＬ−２１遺伝子をワクシニアウイルスＶＳＣ２０のＴＫ遺伝子内に挿入するためのプラスミドの図解と、組換えメカニズムによる挿入の略図とが図１に示されている。
【００２８】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のスクリーニング遺伝子をもまたインテグレーションされ得る。外来性のスクリーニング遺伝子はｇｐｔ（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子および／またはＬａｃＺ遺伝子を包含するが、患者における蛍光蛋白質発現の潜在的危険性を回避するために蛍光蛋白質遺伝子を包含しない。
【００２９】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のスクリーニング遺伝子をインテグレーションされ得ない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐ７．５によってｇｐｔ遺伝子をコントロールし、合成ワクシニアウイルス初期プロモーターｐＳＥＬを用いることによって外来性のＩＬ−２１遺伝子をコントロールする。腫瘍溶解性ウイルスを構築するために、ｇｐｔおよびＩＬ−２１遺伝子はインビトロ細胞内組換えテクノロジーを用いることによってワクシニアウイルスＶＳＣ２０株のＴＫ遺伝子領域内に挿入された。２つのプロモーターはそれぞれ背中合わせでそれぞれの制御される遺伝子の発現を活性化した。
【００３１】
本発明は、さらに、外来性のＩＬ−２１遺伝子がＴＫ遺伝子内に挿入されてその機能欠損を引き起こし、かつ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのＶＧＦ遺伝子が機能欠損させられるときにのみ、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を殺傷し、体の爾後の免疫応答を引き起こし得、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって保有される外来性のＩＬ−２１遺伝子は抗腫瘍免疫効果を直接的に誘導し得るということを見いだしている。
【００３２】
好ましくは、外来性のＩＬ−２１遺伝子はマウスまたはヒトに由来する。
【００３３】
本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは生物工学の分野の関連する公知の方法によって得られ得、具体的な実施形態が図２に示されている。
【００３４】
本発明は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＩＬ−２１のそれぞれの特徴を考慮し、それらの役割を発揮するようにそれらを巧妙に組み合わせる。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍溶解を行使し、同時に、腫瘍細胞内で複製する機能によって、腫瘍細胞内でのＩＬ−２１の発現、それから細胞外への分泌を増大させて、さらに体の腫瘍免疫効果を誘導する。組み合わせられたそれらの効果は、より良好な治療効果を有する。
【００３５】
本発明によって開発された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに基づいて、本発明は医薬組成物をもまた提供し、医薬組成物は、活性成分としての本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
【００３６】
好ましくは、医薬組成物は治療有効量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む。ある種の実施形態では、医薬組成物の活性成分は、本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを１×１０５から５×１０９ｐｆｕ／日（例えば、１×１０５から３×１０９ｐｆｕ／日、１×１０５から１×１０８ｐｆｕ／日など）の用量で含む。
【００３７】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当分野において通常用いられる投与方法、例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、当分野において公知の他の活性成分、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、および同類をもまた含有し得、その用量及び投与経路はそれらのそれぞれの従来の様式で行われ得る。他の活性成分が包含される場合には、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは他の活性成分と混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在するべきである。例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは別個の容器に単体でパッケージングされる。
【００３９】
当業者は、本発明の医薬組成物がさらに好適な薬学的に許容される添加剤を含み得るということを理解するであろう。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。医薬製剤は当分野において公知の手続きによって調製され得る。例えば、化合物および同類を包含する活性成分は、通常の添加剤、希釈剤（例えばリン酸緩衝液または食塩水）、組織培養培地、および担体（例えば自家血漿またはヒト血清アルブミン）によって製剤され、懸濁液として投与され得る。他の担体はリポソーム、ミセル、ナノカプセル、ポリマーナノ粒子、固体脂質粒子を包含し得る（例えばＥ．Ｋｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｌｉｆｅ，６３：５８６−５９５，２０１１  参照）。本願において開示される医薬組成物の製剤のための技術の詳細は科学および特許文献に良く記載されている。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照。
【００４１】
本発明の別の態様は、本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製するためのベクターをもまた提供する。
【００４２】
ベクターは組換えメカニズムによってワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子の機能欠損を引き起こし得る。例えば、具体的な実施形態では、図１に示されている通り、組換え体ベクターは、ＴＫ相同断片ＴＫ−Ｌ、ＴＫ−Ｒ、ならびにＩＬ−２１遺伝子を活性化するための発現カセット、および外来性のスクリーニング遺伝子ｇｐｔを包含する。ワクシニアウイルスがＷＲ株であるときには、ＴＫ遺伝子の配列は、ＮＣＢＩ（すなわち、国立生物工学情報センター。ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＧｅｎＢａｎｋのＮＣ＿００６９９８と付番されたワクシニアウイルス遺伝子の８０７２４〜８１２５７ｂｐに示されている配列であり、ＴＫ−Ｌの配列は例えば８０７２４〜８０９６１ｂｐに示されている配列断片であり得、ＴＫ−Ｒの配列は例えば８１０３３〜８１２５７ｂｐに示されている配列断片であり得る。ベクターは、ＩＬ−２１遺伝子発現カセットおよびｇｐｔ遺伝子発現カセットを細胞内組換えメカニズムによってワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子領域内に挿入し得る（それゆえに、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのＮＣ＿００６９９８と付番されたワクシニアウイルス遺伝子の８０９６２〜８１０３２ｂｐに示されている配列断片が欠失させられる）。その結果、組換え体ワクシニアウイルスはＴＫ遺伝子の機能を失う。本発明の別の態様に従うと、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００４３】
本発明の別の態様は、腫瘍および／または癌を処置するための医薬の調製における本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用をもまた提供する。
【００４４】
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の別の態様は、腫瘍および／または癌を処置するための方法をもまた提供し、腫瘍および／または癌患者に本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与することを含む。
【００４６】
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与用量は、１〜６日連続投与で１日１回の治療有効量である（１日、２日、３日、４日、５または６日の連続投与を包含する）。治療有効量は好ましくは１×１０５から５×１０９ｐｆｕ／日の用量である（例えば、１×１０５から３×１０９ｐｆｕ／日の用量、１×１０５から１×１０８ｐｆｕ／日の用量など）。
【００４８】
必要な場合には、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、他の医薬、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、および同類との組み合わせでもまた用いられ得、それらの用量および投与経路はそれらのそれぞれの従来の様式で行われ得る。
【００４９】
具体的な状況および必要に基づいて、本開示に従う腫瘍および／または癌の処置のための方法は患者に１回または複数回適用され得る。
【００５０】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当分野において通常用いられる投与方法、例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
【００５１】
本発明は、
（Ａ）  第１の医薬組成物が本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第１の薬学的に許容される担体中に含む、第１の医薬組成物と、
（Ｂ）  第２の医薬組成物がＮＫ細胞を第２の薬学的に許容される担体中に含む、第２の医薬組成物と、
を含む治療薬をもまた提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、第１および第２の薬学的に許容される担体は同じである。他の実施形態では、第１の薬学的に許容される担体および第２の薬学的に許容される担体は異なる。
【００５３】
いくつかのケースでは、治療薬は医薬の組み合わせとしてもまた理解され得る。
【００５４】
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を殺傷するメカニズムは通常は類似である。種々の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与される。腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞との接触をするときに、それらは腫瘍細胞に感染し、それらに入るであろう。腫瘍溶解性ウイルスは主に腫瘍細胞内で複製および生殖するが、正常細胞内では複製しないかまたはほとんど複製しないので、感染した腫瘍細胞内では、大量の子孫腫瘍溶解性ウイルスが産生され、腫瘍細胞の溶解および死に至り得る。腫瘍細胞が溶解するときには、大量の腫瘍抗原および子孫腫瘍溶解性ウイルスが放出され得、それから、抗原がさらにインビボの免疫系を活性化し得、インビボのＮＫ細胞およびＴ細胞を刺激して残りの腫瘍細胞を攻撃し続ける。同時に、子孫腫瘍溶解性ウイルスはまだ感染していない腫瘍細胞に感染し得る。
【００５５】
ＮＫ細胞は幅広いスペクトルの腫瘍細胞を殺傷し得る免疫細胞であり、ＮＫ細胞は腫瘍細胞を正常細胞から見分け得る。ＮＫ細胞が腫瘍細胞との接触をするときに、それらは腫瘍細胞を異常細胞として認識し得、多種の相乗的プロセス、例えば受容体認識、抗体による標的認識（ＡＤＣＣ）、ならびに腫瘍細胞を間接的に殺傷することができるグランザイム、パーフォリン、およびインターフェロンの放出を介して腫瘍細胞を殺傷するであろう。インビトロの研究は、健康なＮＫ細胞はそのライフサイクルの間に最高で２７個の腫瘍細胞を殺傷し得るということを指示している。
【００５６】
ＮＫ細胞は抗ウイルス機能をもまた有する。正常細胞がウイルスによって感染される場合には、ウイルスは大量に複製し、感染した細胞は老化変性を呈し、それらの細胞膜上の蛋白質群の組成変化を示すであろう。このプロセスの間に、ＮＫ細胞は感染した細胞を敏感かつ有効に認識し、上に記載されているそれらが腫瘍細胞を殺傷するために用いる類似のアプローチによってこれらの細胞を殺傷し得、それによって正常細胞内でのウイルスの複製および増殖を阻害する。その後、抗原の刺激およびインターフェロンなどの免疫因子の効果の存在下で、他の型の免疫細胞がウイルスと戦い続けるであろう。
【００５７】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞の単体の特徴を考慮しており、それらを巧妙に組み合わせようとする。一緒に組み合わせられたときには、ＮＫ細胞の抗ウイルスメカニズムは腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞にもまた適用可能であり、抗腫瘍メカニズムを補完する。加えて、組み合わせ治療は、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞がＮＫ細胞の特異的標的になることを許し、これはそれらの腫瘍殺傷効果を改善し得る。腫瘍溶解性ウイルスは癌細胞内で選択的に複製するのみならず、それらを内側から殺傷するが、細胞膜上の蛋白質受容体群が変化することをもまた引き起こし、それゆえにＮＫ細胞による癌細胞の認識を容易化し得る。その結果、ＮＫ細胞は癌細胞を外側から攻撃し得る。よって、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞は癌細胞を相乗的に殺傷し、改善された効力を達成する。さらに、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは外来性のＩＬ−２１をもまた発現し、発現された外来性のＩＬ−２１はＮＫ細胞の殺傷力を強化し得、それによってＮＫ細胞の殺傷効果をさらに強化する。上に記載されている組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ使用は、腫瘍殺傷効果に対して驚くべき効果を生じ得る。
【００５８】
好ましくは、第１の医薬組成物の活性成分は本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり、第２の医薬組成物の活性成分はＮＫ細胞である。
【００５９】
好ましくは、第１の医薬組成物および第２の医薬組成物は互いと混合されることなしにそれぞれ独立して治療薬中に存在する。
【００６０】
本発明では、ＮＫ細胞は自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択され得る。好ましくは、ＮＫ細胞はインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞である。ＮＫ細胞の大スケールインビトロ拡大培養技術は公知であり、基本的に成熟している（例えば、次の科学文献を参照：“Ｓｏｍａｎｃｈｉ  ＳＳ，Ｌｅｅ  ＤＡ．Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｋ５６２  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  ＩＬ２１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１４４１：１７５−９３．”または“Ｐｈａｎ  ＭＴ，Ｌｅｅ  ＳＨ，Ｋｉｍ  ＳＫ，Ｃｈｏ  Ｄ．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｋ５６２  Ｆｅｅｄｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１４４１：１６７−７４．”）。臨床データは、自家ＮＫ細胞、半同種ＮＫ細胞（同種ＮＫ細胞に属する）、および臍帯血から調製されたＮＫ細胞が、人体への再循環後に、毒性の副作用がなく、長期依存性がなく、安全かつ有効であるということを確認した。
【００６１】
処置に用いられ得るＮＫ細胞の純度範囲は次の通りである。自家ＮＫ細胞の純度は８５％以上であり得、同種ＮＫ細胞の純度は９０％以上であり得る。不純物細胞はＮＫ−Ｔおよび／またはγδＴ細胞であり得る。好ましくは、ＮＫ細胞活性（生存率）は９０％以上であり、ＮＫ細胞殺傷活性は８０％以上である。
【００６２】
本発明の組み合わせ処置スキームでは、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの投与用量をさらに検討および最適化し、これは極めて重要である。好ましくは、第１の医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の用量で含み（例えば、１×１０５〜３×１０９ｐｆｕ／日の用量の組換え体腫瘍溶解性ウイルス、１×１０５〜１×１０８ｐｆｕ／日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）、第２の医薬組成物はＮＫ細胞を１×１０７〜１×１０１０細胞／日の用量で含有する（好ましくは、第２の医薬組成物はＮＫ細胞を１×１０８から５×１０９細胞／日の用量で含み、好ましくは、第２の医薬組成物はＮＫ細胞を１×１０９から４×１０９細胞／日の用量でもまた含む。より好ましくは、第２の医薬組成物はＮＫ細胞を１×１０９から３×１０９細胞／日の用量で含む）。好ましくは、治療薬の活性成分は、１×１０５から５×１０９ｐｆｕ／日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（例えば、１×１０５から３×１０９ｐｆｕ／日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、１×１０５から１×１０８ｐｆｕ／日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）および１×１０７から１×１０１０細胞／日の用量のＮＫ細胞（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、１×１０９から３×１０９細胞／日など）から構成される。
【００６３】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当分野において通常用いられる投与方法、例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
【００６４】
ＮＫ細胞は、当分野において通常用いられる投与方法を用いて、例えば静脈内投与され得る。
【００６５】
当業者は、本発明の治療薬がさらに好適な薬学的に許容される添加剤を含み得るということを了解するであろう。
【００６６】
本発明の治療薬は、当分野において公知の他の活性成分、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などをもまた含有し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の治療薬は１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。医薬製剤は当分野において公知の方法によって調製され得る。例えば、化合物などの活性成分は、通常の添加剤、希釈剤（例えばリン酸緩衝化食塩水または食塩水）、組織培養培地、および担体（例えば自家血漿またはヒト血清アルブミン）によって製剤され、懸濁液として投与され得る。他の担体はリポソーム、ミセル、ナノカプセル、ポリマーナノ粒子、固体脂質粒子を包含し得る（例えば文書“Ｅ．Ｋｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｌｉｆｅ，６３：５８６−５９５，２０１１”を参照）。本発明の治療薬を製剤する具体的な方法は科学および特許文献に見いだされ得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照。
【００６８】
本発明の治療薬は、種々の腫瘍および／または癌の処置のために用いられ得、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００６９】
本開示の治療薬の適用方法は次の通りである。最初に、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）後に、ＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与する。「組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）後に、ＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与する」は、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの最初の投与との間の時間間隔が１８〜７２時間の範囲であるか（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）、またはＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔が１８〜７２時間の範囲である（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）ということを意味する。好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔は１８〜７２時間の範囲である（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）。より好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔は２４〜４８時間の範囲である。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは治療有効量で１日１回、連続１〜６日に渡って投与され、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞／日の用量で（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、１×１０９から３×１０９細胞／日の用量）、１日１回、連続１〜６日に渡って投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与用量は、治療有効量、隔日、２〜６日の連続投与であり、ＮＫ細胞の投与用量は、１×１０７から１×１０１０細胞／日（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、１×１０９から３×１０９細胞／日）、隔日、２〜６日の連続投与である。ＮＫ細胞が組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８から７２時間後に腫瘍および／または癌患者に与えられるはずである限りは、上述の実施形態のいずれか１つまたはいずれかの他の代替的な実施形態が本開示に従って採用され得る。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞は間をおいて投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第１日に投与し、ＮＫ細胞を第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第３日に投与し、ＮＫ細胞を第４日に投与するなど）、または逐次に投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第１日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第３日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第４日に投与するなど）、あるいは他の用量レジメンを用いて投与され得る（例えば、最初に、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを連続１から６日に渡って１日１回投与し、１８から７２時間の間隔の後に、ＮＫ細胞を連続１から６日に渡って１日１回投与する）。好ましくは、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは最初に投与され、ＮＫ細胞は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの全ての用量を投与した１８から７２時間後に投与される。本開示の好ましい実施形態では、最初に、腫瘍および／または癌患者は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを与えられ、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは治療有効量で１回のみ与えられる。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８から７２時間後に、腫瘍および／または癌患者はＮＫ細胞を投与され、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量レベルで１回のみ投与される（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療有効量は好ましくは１×１０５から５×１０９ｐｆｕ／日の用量である（例えば、１×１０５から３×１０９ｐｆｕ／日の用量、１×１０５から１×１０８ｐｆｕ／日の用量）。
【００７１】
本発明は、腫瘍および／または癌を処置するための医薬の調製における本発明の治療薬の使用をもまた提供する。
【００７２】
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の別の態様に従うと、腫瘍および／または癌の処置のための相乗効果を備える組み合わせ医薬のキットもまた提供され、本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有する第１の容器およびＮＫ細胞を含有する第２の容器を包含し、第１の容器は第２の容器とは別個である。さらに、キットは投与のタイミングおよび経路を定める説明書を含む。好ましくは、キットは、それぞれ本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を含有する独立した容器と、投与のタイミングおよび経路を定める説明書とからなる。
【００７４】
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００７５】
好ましくは、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有する第１の容器は治療有効量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有し、ＮＫ細胞を含有する第２の容器は１×１０７〜１×１０１０細胞／日の用量を提供するために十分なＮＫ細胞を含有する（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日の用量のＮＫ細胞、１×１０９から４×１０９細胞／日の用量のＮＫ細胞、１×１０９から３×１０９細胞／日のＮＫ細胞など）。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療有効量は好ましくは１×１０５から５×１０９ｐｆｕ／日の用量である（例えば、１×１０５から３×１０９ｐｆｕ／日の用量、１×１０５から１×１０８ｐｆｕ／日の用量）。
【００７６】
好ましくは、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有する第１の容器は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを１×１０５〜１×１０８ｐｆｕ／日の用量で含有し、ＮＫ細胞を含有する第２の容器はＮＫ細胞を１×１０９から３×１０９細胞／日の用量で含有する。
【００７７】
本発明では、ＮＫ細胞は自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択され得る。好ましくは、ＮＫ細胞はインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞である。
【００７８】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当分野において通常用いられるそれらのそれぞれの投与方法、例えば腫瘍内注射または静脈内投与を用いて投与され得る。
【００７９】
ＮＫ細胞は、当分野において通常用いられる投与方法を用いて、例えば静脈内投与され得る。
【００８０】
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００８１】
本開示の別の態様は腫瘍および／または癌の処置のための方法をもまた提供し、逐次の様式で次のステップを含む。
１）  本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与すること、
２）  組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）後に、本開示に従うＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与すること。
【００８２】
「組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）後に、本開示に従うＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与する」は、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの最初の投与との間の時間間隔が１８〜７２時間の範囲であるか（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）、またはＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔が１８〜７２時間の範囲である（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）ということを意味する。好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔は１８〜７２時間の範囲である（例えば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）。より好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔は２４〜４８時間の範囲である。
【００８３】
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
【００８４】
腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍または癌細胞内で選択的に複製し、一定時間後にピークに達し得る。本発明の発明者は、一定時間の複製後に、腫瘍細胞内の腫瘍溶解性ウイルスがＮＫ細胞による腫瘍細胞の殺傷を促進し得ることを見いだした。よって、本発明によって提案される組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の投与順序および間隔は、２つの効果のピークのダブルピークオーバーラップを達成する。
【００８５】
本発明は、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの投与用量をさらに検討および最適化し、上述の投与順序および間隔によるそれらの連携が極めて重要であり、これは組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの抗腫瘍効力、ＮＫ細胞の抗腫瘍効力、および腫瘍細胞に対する上の２つの最も良好な相乗的な殺傷を決定する。
【００８６】
本開示の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは治療有効量で１日１回、連続１〜６日に渡って与えられ、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）、１日１回、連続１〜６日に渡って与えられる。本開示の別の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは治療有効量で、隔日で連続２から６日に渡って与えられ、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量レベルで（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）、隔日で連続２から６日に渡って与えられる。ＮＫ細胞が組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８から７２時間後に腫瘍および／または癌患者に与えられるはずである限りは、上述の実施形態のいずれか１つまたはいずれかの他の代替的な実施形態が本開示に従って採用され得る。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞は間をおいて投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第１日に投与し、ＮＫ細胞を第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第３日に投与し、ＮＫ細胞を第４日に投与するなど）、または逐次に投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第１日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第３日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第４日に投与するなど）、あるいは他の用量レジメンを用いて投与され得る（例えば、最初に、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを連続１から６日に渡って１日１回投与し、１８から７２時間の間隔の後に、ＮＫ細胞を連続１から６日に渡って１日１回投与する）。好ましくは、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは最初に投与され、ＮＫ細胞は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの全ての用量を投与した１８から７２時間後に投与される。本開示の好ましい実施形態では、最初に、腫瘍および／または癌患者は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを与えられ、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは治療有効量で１回のみ与えられる。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８から７２時間後に、腫瘍および／または癌患者はＮＫ細胞を与えられ、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量レベルで１回のみ投与される（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療有効量は好ましくは１×１０５から５×１０９ｐｆｕ／日である（例えば、１×１０５から３×１０９ｐｆｕ／日の用量、１×１０５から１×１０８ｐｆｕ／日の用量など）。
【００８７】
具体的な状況および必要に基づいて、本開示に従う腫瘍および／または癌の処置のための方法は患者に１回または複数回適用され得る。
【００８８】
本発明では、ＮＫ細胞は自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択され得る。好ましくは、ＮＫ細胞はインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞である。
【００８９】
腫瘍および／または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含する。
【００９０】
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当分野において通常用いられる投与方法、例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
【００９１】
ＮＫ細胞は、当分野において通常用いられる投与方法を用いて、例えば静脈内投与され得る。
【００９２】
本願の以降においては、本開示は例によってさらに説明または記載されるが、これらの例は本開示の保護の範囲を限定することを意図されていない。
【実施例】
【００９３】
別様に定められていない限り、次の例に用いられる実験法は生物工学の分野の従来の実験手続き、操作、材料、および条件を用いて行う。
【００９４】
別様に定められていない限り、それぞれの試薬の全てのパーセンテージ濃度（％）は体積によるパーセンテージ（％（ｖ／ｖ））を指示する。
【００９５】
次の例に用いた材料は次の通りである。
【００９６】
１．  ＣＶ１細胞およびＨｕ−１４３Ｂ細胞は武漢大学の中国典型培養物保蔵センターに由来する。
【００９７】
２．  腫瘍細胞
杭州市第一人民医院に由来するＦａＤｕヒト頭頸部癌細胞を例外として、残りの腫瘍細胞は中国典型培養物保蔵センターおよびＡＴＣＣに由来する。細胞はマッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳおよびＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの正常な環境において培養した。マッコイ５ＡおよびＭＥＭはＧＩＢＣＯから購入した。ウシ胎児血清ＦＢＳはＳＩＧＭＡから購入した。
【００９８】
３．  ＮＫ細胞
実験に用いたＮＫ細胞の起源は次の通りである。
各例に用いたＮＫ細胞は杭州康万達医薬科技有限公司によって培養および凍結保存されたヒトＮＫ細胞であった。ヒトＮＫ細胞は次のプロセスによって調製した。当分野の通常用いられる技術として、採血針を尺骨静脈に挿入して、免疫細胞ＰＢＭＣの抽出のために健康人の末梢静脈血を採集した。放射線照射済みＫ５６２フィーダー細胞（杭州鼎云生物技術有限公司から購入）を用いて、自家血漿培養によってＮＫ細胞を拡大し、ＮＫ細胞は最高で９０％の最終純度、最高で９０％の生存可能性、および最高で８５％のインビトロ腫瘍細胞殺傷率を有した。
【００９９】
４．  コントロールウイルス
コントロールウイルスとしての腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰは公知であり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＷＲ株に属する（例えば“Ｘ  Ｓｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ−ａｒｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ＴｈｅｒａｐｙＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．（２０１４）；２２  １，１０２−１１１”を参照）。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰはＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子両方を機能欠損し、外来性の赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）遺伝子を保有する。ＲＦＰ遺伝子はスクリーニング／レポーターの役割のみを発揮するので、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰの抗腫瘍機能はＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子を機能欠損する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと実質的に同等である。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰは当分野の従来技術を用いるＶＳＣ２０ワクシニアウイルスの遺伝子改変によってもまた得られ得る。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスはＶＧＦ遺伝子を欠失するワクシニアウイルスである。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスの調製方法は、“ＭｃＣａｒｔ，ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００１）６１：  ８７５１−８７５７”を参照。遺伝子改変は、外来性のＤｓＲｅｄ遺伝子（すなわちＲＦＰ遺伝子）を制御するための人工の合成ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐＳＥＬの使用と、インビトロ細胞内組換え技術を用いるワクシニアウイルスＶＳＣ２０株のＴＫ遺伝子領域内へのＤｓＲｅｄ遺伝子の挿入とを包含し、それによって腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰを構築する。その産生および精製は下に記載される調製例２に従って行われ得る。
【０１００】
５．  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは北京維通利華実験動物技術有限公司から購入した。重度免疫不全ＮＣＧマウスは浙江省動物センターから得た。
【０１０１】
６．  培養プレート
６ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり２ｍｌ培養体積）、２４ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり５００μｌ培養体積）、９６ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり２００μｌ培養体積）は全てコーニング社から入手可能である。
【０１０２】
７．  ｇｐｔスクリーニングドラッグの調製方法：０．１ＭのＮａＯＨを用いて、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌのミコフェノール酸（４００×）、１０ｍｇ／ｍｌの４０×キサンチン（４０×）、１０ｍｇ／ｍｌのヒポキサンチン（６７０×）を調製し、暗所で−２０℃に保存する。用いるときに１×ワーキング溶液を調製する：２５μｌミコフェノール酸＋２５０μｌキサンチン＋１５μｌヒポキサンチンを１０ｍｌのＤＭＥＭに追加する。
【０１０３】
８．  ＰＢＳ調合：８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．６ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．２〜７．４。
【０１０４】
９．  ＳＴＥ緩衝液調合：１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。
【０１０５】
１０．  次の例に用いた細胞計数方法は次の通りである。
ＭＴＴアッセイ：１０μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルの細胞に追加し、それから細胞をインキュベータ内で、３７℃で４時間に渡ってインキュベーションし、培養培地を吸って捨て、１５０μｌのＤＭＳＯを各ウェルに追加し、それからシェーカー上で低速で１０分に渡って振盪し、結晶物が充分に溶解することを許し、マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度値（ＯＤ４９０）を測定した。阻害率の計算式：細胞増殖阻害率（ＩＲ％）＝１−（ＯＤ４９０試験産物−ＯＤ４９０ブランク）／（ＯＤ４９０負のコントロール−ＯＤ４９０ブランク）×１００％。
トリパンブルー染色法を用いる細胞計数：細胞をＰＢＳによって洗浄し、トリプシンを用いて消化し、それから細胞をＰＢＳに懸濁した。懸濁液に、０．０４％（ｗ／ｖ）の終濃度でトリパンブルー溶液を追加した。それから、細胞計数を顕微鏡下で行った。これの間に、死細胞は青く染色され、生細胞はいずれかの色なしで透明に見えた。生細胞数を最終的なデータとして用いた。
【０１０６】
次の例に用いた略語を下に説明する。
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＰＳＧ：ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＲＦＰ：赤色蛍光蛋白質
ＴＩＬ：腫瘍浸潤リンパ球
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【０１０７】
調製例１：ＤＤｖｖ−ＩＬ２１腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの構築
次のプロセスは図２に見られ得る。
【０１０８】
（１）  プラスミド構築
それぞれヒトＩＬ−２１およびネズミＩＬ−２１遺伝子を保有するように、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの２つの株を構築した。これらはそれぞれＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１およびＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１と呼ぶ。
１）  ＮＣＢＩ遺伝子ライブラリー配列ＮＭ＿００１２９１０４１およびＮＭ＿０２１８０３に従って、トータルで２つのマウスＩＬ２１のＤＮＡ断片（ｍＩＬ−２１）およびヒトＩＬ２１のＤＮＡ断片（ｈＩＬ−２１）を遺伝子合成法によって合成した。具体的には、ｍＩＬ−２１は正常配列を有するマウス由来ＩＬ２１断片（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＭ＿００１２９１０４１のヌクレオチド配列の７２〜５６０ｂｐ断片）を含有する。その配列（配列番号１）を下に示す。
【０１０９】
【化１】
2020536533.tif 000002
【０１１０】
ＡＧＡＴＣＴはＢｇｌＩＩ認識配列であり、ＡＣＴＡＧＴはＳｐｅＩ認識配列である。
【０１１１】
ｈＩＬ−２１は正常配列を有するヒトＩＬ２１断片（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＭ＿０２１８０３のヌクレオチド配列の４７〜５３５ｂｐ断片）を含有する。その配列（配列番号２）は次の通りである。
【０１１２】
【化２】
2020536533.tif 000003
【０１１３】
ＡＧＡＴＣＴはＢｇｌＩＩ認識配列であり、ＡＣＴＡＧＴはＳｐｅＩ認識配列である。
【０１１４】
ＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼおよびＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを用いて切断を行い、ＩＬ２１遺伝子をｐＣＢプラスミド内に挿入した（起源は文献“Ｙｏｕｒｏｎｇ  ＦＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｚｅｏｃｉｎ  ａｎｄ  ＧＦＰ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｌａｂｅｌｓ  “Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，２０１２．３９（３）：１４８−１５２．”に見られ得る）。大腸菌ＤＨ５αを用いて、プラスミドｐＣＢ−ｍＩＬ２１およびｐＣＢ−ｈＩＬ２１を形質転換および抽出した（図３）。
【０１１５】
２）  Ｔ７ユニバーサルプライマーシーケンシングを用いてプラスミドｐＣＢ−ｍＩＬ２１およびｐＣＢ−ｈＩＬ２１を検出測定し、配列が正しいことを確認した。
【０１１６】
３）  ＴＩＡＮｐｒｅｐラピッドミニプラスミドキット（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ１０５−０３）を中量プラスミドＤＮＡ抽出に用いた。
【０１１７】
（２）  組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのパッケージングおよび鑑定
１）  良好な成長状態のＣＶ１細胞を選択し、６ウェルプレートに約４×１０５細胞／ウェルで広げ、次の日の細胞密度が８０％〜９０％に達するようにさせた。
【０１１８】
２）  ６ウェルプレートの培地を捨て、９×１０３ｐｆｕのＤｖｖ−ＶＳＣ２０ウイルスを含有する１ｍｌの血清不含かつ抗生物質不含のＤＭＥＭ培地（ウイルスの起源は、“ＭｃＣａｒｔ，ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００１）６１：８７５１−８７５７．”を参照）を、濃度が０．０３ｐｆｕ／細胞に達するように２つのウェルのそれぞれに追加し、上下左右に均一混合し、２時間に渡って３７℃で培養し、２０分毎に均一混合した。同時に、ウイルス溶液を追加することなしのコントロールウェルを設けた。
【０１１９】
３）  プラスミド／Ｌｉｐｏ２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬、ライフテクノロジーズ、１１６６８−０１９）混合溶液を調製する。溶液Ａ−５μｇのプラスミドを吸い取り、それを３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、１８０２６７９）に追加して均一混合し、室温で５分に渡ってインキュベーションする。溶液Ｂ−１２μｌのＬｉｐｏ２０００を吸い取り、３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩに追加して均一混合し、室温で５分に渡ってインキュベーションする。製剤された溶液Ａおよび溶液Ｂを混合し、穏やかに均一混合し、室温で１５分に渡ってインキュベーションして、プラスミド／Ｌｉｐｏ２０００混合物を得る。３００μｌのプラスミド／Ｌｉｐｏ２０００混合溶液を感染したウェルの１つに追加し、トランスフェクションプラスミドのみによるコントロールウェルを設ける。３７℃で４時間に渡ってインキュベーションする。１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳＧを含有する２ｍｌのＤＭＥＭ培地を各ウェルに補充する。
【０１２０】
４）  ２４時間後に、古い培地を捨て、それを５％ＦＢＳ＋１％ＰＳＧを含有するＤＭＥＭ培地に交換し、培養を約４８時間続ける。顕微鏡下で細胞の完全な変性を観察した後に、上清および細胞を採集し、３分間に渡って繰り返し凍結融解してウイルスを放出する。
【０１２１】
５）  ２００μｌのウイルス溶液を取り出し、ＴＩＡＮａｍｐウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキット（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ３１５）を用いてウイルスゲノムを抽出し、ＰＣＲ法を用いて、挿入されたＩＬ−２１遺伝子がバックボーンウイルス内にインテグレーションされたかどうかを検出測定する。同時に、５０μｌのウイルス溶液を取り、遠心し、上清をＥＬＩＳＡ試験用に取って（マウスＩＬ−２１ＤｕｏＳｅｔ−ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ、ＤＹ５９４−０５；ヒトＩＬ−２１Ｕｎｃｏａｔｅｄ−ＥＬＩＳＡ、インビトロジェン、８８−８２１８）、組換え体ワクシニアウイルスがＩＬ−２１蛋白質を発現したかどうかをさらに決定する。残りのウイルス溶液は−８０℃で保存し、Ｐ０と標識した。ＰＣＲ鑑定に用いたプライマー配列を表１に示す。陽性のウイルスのＰＣＲ検出測定によって得られた鑑定バンドのサイズを表２に示す。
【０１２２】
【表１】
2020536533.tif 000004
【０１２３】
【表２】
2020536533.tif 000005
【０１２４】
ＰＣＲ結果は、ＩＬ−２１遺伝子配列がウイルスのＴＫ領域内にインテグレーションされているということを示した。つまり、ウイルスは首尾よく組換えられた（図４Ａ〜Ｂ）。ＥＬＩＳＡ結果は、ＩＬ２１を含有する組換え体ウイルス上清（図では「ＤＤｖｖ−ｍＩＬ−２１」として示す）がＩＬ−２１蛋白質発現を示し、残りの細胞（図では「ＮＣ」として示す）、トランスフェクションプラスミド（ｐＣＢ−ｍＩＬ２１）、およびＶＳＣ２０コントロールはＩＬ−２１発現を示さない（図４Ｃ）ということを示した。
【０１２５】
（３）  組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのスクリーニング
１）  ＣＶ１細胞を６０ｍｍペトリ皿で培養した。８０％コンフルに達したときに、１ｍｌのウイルス希釈液を追加し、これは１５０μｌのＰ０ウイルスを含有した。２時間の感染後に、３ｍｌの１×ｇｐｔ含有スクリーニング試薬を追加し、スクリーニングを行った。細胞変性を観察し、ウイルスを採集し、Ｐ１ウイルスと標識する。ウイルスゲノム抽出キットを用いてＰＣＲ検証のためにウイルス遺伝子を抽出した。
【０１２６】
２）  ステップ１）を２回繰り返して、Ｐ３ウイルスを得る。これをＰＣＲ法によって検証する。
【０１２７】
３）  密度が８０％に達するまで、ＣＶ１細胞を１０ｃｍ皿で培養した。培地を捨て、３ｍｌの段階希釈したＰ３ウイルスを追加し、２時間に渡って感染させ、培養培地を除去し、０．８×ｇｐｔスクリーニング試薬を含有する８ｍｌの１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを追加し（Ｖ５％アガロースゲル：Ｖ１×ｇｐｔワーキング溶液＝１：４）、３７℃で４８時間に渡って培養し、シングルプラークを３００μｌの無菌ＰＢＳに拾い、繰り返し３回凍結融解してウイルスを放出する。１５０μｌのウイルス溶液を各プラークから取り、２４ウェルプレートでＣＶ１細胞を用いて小スケールの拡大を行った。ウイルスの完全な変性を約４８時間待った後に、ウイルスを採集し、２００μｌのウイルス溶液を用いてゲノムを抽出し、これをＰＣＲ法による検証に用いた。残りのウイルス溶液はＰ４と標識し、−８０℃で保存した。
【０１２８】
４）  ステップ３）を２〜３回繰り返す。ＰＣＲ法は、組換え体ウイルスがバックボーンウイルスＶＳＣ２０を含有しないということを確認した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法（一次抗体：ウサギ抗マウスＩＬ２１、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、＃５００−Ｐ２７８；ウサギ抗ＩＬ２１抗体、ａｂｃａｍ、ａｂ５９７８；二次抗体：ヤギ抗Ｒｂ、Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０５１）を用いて、ＩＬ２１蛋白質の発現を確認した。
【０１２９】
結果は、上のステップ４）から得られたウイルスがＰＣＲ鑑定によるＰ１／Ｐ２のＰＣＲ結果ではバンドを示さないということを示し、組換え体ウイルスが外来性の標的遺伝子ＩＬ−２１を保有する純粋なウイルスであり、そのバックボーンバックグラウンドウイルスＶＳＣ２０を含有しないということを指示した（図５Ａ〜Ｄ）。ウエスタンブロット結果は、ＤＤｖｖ−ＩＬ２１ウイルスがＩＬ−２１蛋白質を有効に発現し得、正しいサイズであることをもまた示した（図５Ｅ、Ｇ）。ＥＬＩＳＡ結果は、ＩＬ−２１蛋白質が組換え体ウイルスＤＤｖｖ−ＩＬ２１においては細胞培養上清および細胞ライセート（図では「細胞」として示されている）中に検出測定され得るということを示した。これはさらに分泌蛋白質としてのＩＬ−２１蛋白質の特徴を反映している（図５Ｆ、Ｈ）。
【０１３０】
調製例２：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの産生および精製
（１）  産生および精製
１）  ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１のＰ５−１サンプルおよびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１のＰ４−３サンプルの大量増幅５０枚の１５０ｍｍペトリ皿を用いて、Ｈｕ−１４３Ｂ細胞が約８０％まで成長したときに、およそ２×１０４ＰＦＵの５０μＬの小スケール増幅したウイルスを各ペトリ皿に追加して細胞を感染させ、３７℃かつ５％ＣＯ２で培養する。約２から３日の後に、細胞は顕微鏡下で丸く数珠状になることが観察され、いくつかの細胞はペトリ皿から剥離した。培養溶液／細胞を、セルスクレーパーを用いて採集し、−８０℃冷凍庫に保存した。
【０１３１】
２）  液体窒素およびオートクレーブ滅菌水を用いて、採集されたウイルス溶液を繰り返し３回凍結融解し、２０００ｒｐｍで３分に渡って遠心し、上清を採集する。
【０１３２】
３）  採集された上清を１２，０００ｒｐｍで１０分に渡って遠心し、上清を捨て、ペレットを５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、１２，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎに渡って遠心し、上清を捨て、ペレットを４ｍＬの３０％（ｗ／ｖ）ショ糖に再懸濁する。
【０１３３】
４）  ショ糖勾配の調製：６０％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、４０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液を超遠心チューブの底から最も上へ順にそれぞれ２ｍＬ追加し、最も上の層に４ｍＬの３０％（ｗ／ｖ）ショ糖に再懸濁したウイルス溶液を追加した。
【０１３４】
５）  ショ糖勾配を重層した後、２０分の３９，０００ｇ超遠心後に、ウイルスは５０％（ｗ／ｖ）ショ糖層に分布した乳白色のバンドとして観察され得る。ウイルスバンドを１ｍＬの平らに切った／大口のチップによって吸い取り、新たな遠心管の中に置いた（吸い取ったウイルスバンドの体積をＶ１として記録した）。
【０１３５】
６）  ウイルスをＶ１体積の２倍のＳＴＥ緩衝液によって洗浄して残余のショ糖を除去し、３５，０００×ｇで１時間に渡って遠心し、上清を捨て、ペレットをキープする。
【０１３６】
７）  ペレットをＶ１体積のＳＴＥに再懸濁し、３５，０００×ｇで３０分に渡って遠心し、ペレットをキープし、この操作を２回繰り返し、それからＰＢＳによって３回洗浄する。
【０１３７】
８）  最後に、予冷したＰＢＳにペレットを再懸濁し、均一混合し、それを無菌ＥＰチューブに小分けし、−８０℃に保存し、１つのチューブはウイルス力価検出測定のために４℃に取り置く。
【０１３８】
（２）  ウイルス力価検出測定
１）  ２つの６ウェルペトリ皿を用い、ウェルあたり約４×１０５個のＨｕＴＫ−１４３Ｂ細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩インキュベーションし、次の日の細胞量が８０％〜９０％に接近するようにさせる。
【０１３９】
２）  試験されるべき２００μｌのウイルスを１８００μｌの血清不含ＤＭＥＭによって１０倍段階希釈し、希釈が１０−４〜１０−８の範囲であるようにさせる。
【０１４０】
３）  ６ウェルプレートの細胞培養溶液を吸い取り、０．５ｍｌの希釈ウイルス溶液を追加し、各ウェルの希釈をマークし、同時に２つのブランクコントロールウェルを設け、それらを３７℃で２時間に渡って感染させる。６ウェルプレートを２０分毎に１回振盪して、ウェル内の一様な濡れを保証し、局所的乾燥を回避する。
【０１４１】
４）  ５％ＦＢＳを含有する２ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに追加し、３７℃で４８時間に渡ってインキュベーションする。
【０１４２】
５）  培養溶液を吸い取り、０．５ｍｌの０．１％クリスタルバイオレット染色溶液を各ウェルに追加し、室温で１０分に渡って染色し、染色溶液を除去し、ＰＢＳによって３回洗浄し、プレートをひっくり返して風乾し、撮影する。
【０１４３】
６）  各ウェルのウイルスプラーク数を計数する。ウイルス力価＝平均のウイルスプラーク数／（ウイルス希釈度×追加したウイルスの体積）。
【０１４４】
例えば、１０−５希釈ウェルに３０個のウイルスプラークがある場合には、ウイルス力価は３０／（１０−５×０．５）＝６×１０６ｐｆｕ／ｍｌである。
【０１４５】
増幅／精製後の各バッチのＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ウイルスおよびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスの力価は２×１０８から４×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１４６】
例１：異なるマウス腫瘍細胞に対するマウスＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの殺傷効果
Ｂ１６細胞（マウス黒色腫細胞）、ＧＬ２６１細胞（マウスグリオーマ細胞）、ＬＬＣ細胞（マウスルイス肺癌細胞）、ＣＴ−２６細胞（マウス結腸癌細胞）、４Ｔ−１細胞（マウス乳癌細胞）を包含するマウス腫瘍細胞を、９６ウェルプレートにウェルあたり５０００細胞で広げ、一晩培養して壁に接着するようにさせた。細胞を上の方法によって調製された１ＭＯＩのＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ウイルスに感染させ、腫瘍細胞のアポトーシスを、２４時間、４８時間、および６０時間後に（ＬＬＣ細胞、ＧＬ２６１細胞）、または２４時間、４８時間、および７２時間後に（Ｂ１６細胞、ＣＴ−２６細胞、４Ｔ−１細胞）、ＭＴＴによって検出測定した（ｎ＝３。２〜３回の繰り返し実験）。この試験のコントロール群は負のコントロール群（ウイルス感染なし）、組換え体マウス由来ＩＬ−２１蛋白質（ｒｍＩＬ−２１。Ｒ＆Ｄシステムズから購入）、および正のコントロール群（１μＭパクリタキセル。北京双鷺薬業から購入）であり、各実験群およびコントロール群について３つのデュプリケートウェルを設け、細胞殺傷率は負のコントロール群に対する実験群の比％であった。結果は、ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ウイルスの殺傷率が６０時間または７２時間後に種々の腫瘍細胞に対して６０％よりも多くを達成するということを示した。それらの中でも、ＣＴ−２６および４Ｔ１細胞に対するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ウイルスの殺傷率は２４時間の感染後に７０％に達した（図６参照）。
【０１４７】
例２：異なるネズミ腫瘍細胞に対する、ネズミＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの殺傷効果のＩＣ５０
Ｂ１６細胞、ＣＴ２６細胞、４Ｔ１細胞、ＬＬＣ細胞、およびＧＬ２６１細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり５０００細胞で広げた。これらを、上の方法によって調製した０．００２ＭＯＩ、０．０２ＭＯＩ、０．２ＭＯＩ、１ＭＯＩ、２ＭＯＩのＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ウイルスを用いて７２時間に渡って感染させ、それから細胞を細胞殺傷についてＭＴＴ試薬を用いて試験し、異なる腫瘍細胞に対するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１組換え体ワクシニアウイルスの殺傷効果の半数致死用量（ＩＣ５０値）を計算した（ｎ＝３。１回の実験）。結果は、Ｂ１６細胞、ＣＴ２６細胞、４Ｔ１細胞、ＬＬＣ細胞、およびＧＬ２６１細胞に対する組換え体ワクシニアウイルスのＩＣ５０がそれぞれ０．２３２ＭＯＩ、０．２１６ＭＯＩ、０．０７ＭＯＩ、０．３０４ＭＯＩ、および０．２２７ＭＯＩであるということを示した（図７参照）。異なる腫瘍細胞に対する本発明の組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１のＩＣ５０値は低く（０．３ＭＯＩよりも小さいかまたはおよそ等しい）、それは医薬利用の良好な見込みを有するということが分かる。
【０１４８】
例３：異なるヒト腫瘍細胞に対するヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスの殺傷効果
Ａ５４９（ヒト非小細胞肺癌細胞）、ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣腺癌細胞）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚癌細胞）、Ｕ２５１（ヒト神経膠細胞腫細胞）を９６ウェルプレートにウェルあたり５０００細胞で広げ、一晩の培養および壁への接着後に、細胞を上の方法によって調製された１ＭＯＩのＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスに感染させた。２４時間、４８時間、および７２時間後に、ＭＴＴアッセイを用いて腫瘍細胞アポトーシスを検出測定した（ｎ＝３。３回の繰り返し実験）。この試験のコントロール群は、負のコントロール群（ウイルス感染なし）、組換え体ヒト由来ＩＬ−２１蛋白質（ｒｈＩＬ−２１。Ｒ＆Ｄシステムズから購入）、および正のコントロール群（１μＭパクリタキセル）であった。各実験群および各コントロール群について３つのデュプリケートウェルを設け、細胞殺傷率は負のコントロール群に対する実験群の比％値であった。結果は、Ｈｅｌａ、Ａ５４９、ＳＫＶＯ３、Ｕ２５１細胞に対する組換え体ウイルスの殺傷効果が時間依存的であり、経時的に強化されるということを示した（図８参照）。加えて、結果は、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスが各腫瘍細胞に対して４８時間後には６０％よりも多くの殺傷率を、７２時間後には７０％よりも多くの殺傷率を有するということをもまた示した。
【０１４９】
例４：異なるヒト腫瘍細胞に対するヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスの殺傷効果のＩＣ５０
Ａ５４９、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌細胞）、Ｈｅｌａ、ＨＴ２９（ヒト結腸直腸癌細胞）、ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣腺癌細胞）、ＰＡＮＣ１（ヒト膵臓癌細胞）、ＳＫＨＥＰ−１（ヒト肝臓癌細胞）、ＦａＤｕ（ヒト咽頭扁平上皮癌細胞）を９６ウェルプレートにウェルあたり５０００細胞で広げた。細胞を、３倍段階希釈のＭＯＩの上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスに感染させ、その結果、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスのＭＯＩ濃度は０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０であった。感染の４８時間後に、ＭＴＴ試薬を用いて細胞殺傷を検出測定し、異なる腫瘍細胞に対するウイルスの殺傷のＩＣ５０値を計算した（ｎ＝３。１回の実験）。この研究の処置群およびコントロール群のそれぞれについては３つのデュプリケートウェルを設けた。結果は、種々の腫瘍細胞に対する組換え体ワクシニアウイルスの殺傷のＩＣ５０値が０．０５および０．４ＭＯＩの間であり、これらは全て相対的に低いことを示した（図９参照）。本発明の組換え体ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１は医薬利用の良好な見込みを有することが分かる。
【０１５０】
例５：Ｂ１６腫瘍マウスに対するマウスＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果
腫瘍を持つ免疫健康マウスの構築：対数増殖期のＢ１６細胞を用い、各Ｃ５７ＢＬ／６マウス（北京維通力華実験動物センター）の後ろ足背側に２００，０００細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約１００〜２００ｍｍ３と測定されたときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ上の方法によって調製された５×１０６ｐｆｕ（低用量）、１×１０７ｐｆｕ（高用量）のＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１を含有する１００μｌのＰＢＳおよびＰＢＳの腫瘍内投与によって、群あたり３匹のマウスで処置した。マウスの腫瘍サイズおよび体重を３日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１が腫瘍成長を有効に阻害し得、用量依存的であるということを示した（図１０Ａ）。投与後の第９日には、各投与群のＴ／Ｃ（腫瘍抑制有効性。つまり、コントロール群の腫瘍サイズに対する投与群の腫瘍サイズのパーセンテージ比。これは値が＜４０％であるときに有効である）は４０％よりも小さかった（図１０Ｂ）。マウスを第１２日に屠殺し、腫瘍を除去して腫瘍重量を検出測定した。これもまた類似の結果を示した（図１０Ｃ）。
【０１５１】
例６：Ｂ１６腫瘍マウスに対するマウスＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの抗腫瘍免疫活性化効果
対数増殖期のＢ１６細胞を用いた。各Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの後ろ足背側に２００，０００細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約１００〜２００ｍｍ３と測定されたときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ５×１０６ｐｆｕ（低用量）、１×１０７ｐｆｕ（高用量）の上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１を含有する１００μｌのＰＢＳおよびＰＢＳの腫瘍内投与によって、群あたり３匹のマウスで処置した。マウスを２週後に屠殺して脾臓および腫瘍組織を採集し、脾臓のＰＢＭＣおよび腫瘍組織の腫瘍細胞を抽出し、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）（抗体：抗マウスＣＤ３、抗マウスＣＤ８ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）（抗体：抗マウスＣＤ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、フローサイトメトリーを用いて検出測定した。結果は、組換え体ウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１を与えられたマウスの脾臓ＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の割合がＰＢＳ群と比較して有意に増大するということを示した（図１１Ａ〜Ｂ）。同時に、腫瘍組織の免疫細胞浸潤の分析は、ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２高用量群のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＩＬ）の割合がＰＢＳ群に対して相対的に増大するということを明らかにした（図１１Ｃ〜Ｄ）。
【０１５２】
例７：ＬＬＣ腫瘍マウスに対するネズミＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果
対数増殖期のＬＬＣ細胞を用い、各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後ろ足背側に１００万細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体１００〜２００ｍｍ３であるときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ１×１０６ｐｆｕ（低用量）、１×１０７ｐｆｕ（高用量）の上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１を含有する１００μｌのＰＢＳまたはコントロール群としての１００μｌのＰＢＳの腫瘍内投与によって、群あたり５匹のマウスで処置した。各群の腫瘍サイズおよび体重を３日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１がＬＬＣ腫瘍の成長を用量依存的な様式で有効に阻害し得るということを示した（図１２Ａ）。投与後の第９日に、高用量投与群のＴ／Ｃは４０％よりも小さかった（図１２Ｂ）。
【０１５３】
例８：ヒト腫瘍細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１に対する、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を２４ウェル培養プレートに３０％コンフルエントで播種し、３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間に渡ってＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ環境においてインキュベーションした。ＭＯＩ＝０．１５の上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスをＤＭＥＭ血清不含環境において追加した。６時間に渡って感染させた後で、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを培地交換のために追加し、３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間に渡って培養した。それから、新しいＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを培地交換のために追加し、ＮＫ細胞を追加し（エフェクター対標的細胞比ＮＫ：ＳＫ−ＨＥＰ−１＝５：１）、４８時間に渡ってインキュベーションし続け、死細胞および破片を洗い落とした。残りのＳＫ−ＨＥＰ−１生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１＋ＮＫ群であった。実験では、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の１つの群はウイルスおよびＮＫを追加せず、ブランク群とした。１つの群はＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスを対応する時点で追加したが、ただしＮＫは追加せず、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加したが、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスは追加せず、ＮＫ群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加し、同時にヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で追加したが、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスは追加せず、ＮＫ＋ＩＬ２１群とした。１つの群はウイルスおよびＮＫは追加しなかったが、ヒトＩＬ２１組換え体蛋白質は５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で対応する時点で追加し、ブランク＋ＩＬ２１群とした。各群の実験は３回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
【０１５４】
結果を図１３に示す（横軸は異なる群であり、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である）。ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でＮＫ細胞を投与した）はＳＫ−ＨＥＰ−１に対する有意な相乗的な殺傷効果を示した。相乗的な阻害率は約８７％である。この実験では、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス単独の阻害率はおよそ４７％であり、ＮＫ細胞単独の阻害率はおよそ１１％であり、ＮＫ＋ＩＬ２１群の阻害率はおよそ２２％であり、ブランク＋ＩＬ２１群の阻害率は約１％であった。ブランク群の阻害率は約０であった（図１３には示されていない）。
【０１５５】
結果は、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ使用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でＮＫ細胞を投与した）が、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約８７％であるということを示した。
【０１５６】
例９：Ｂ１６腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスに対する、ネズミＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果
腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスの構築：対数増殖期のＢ１６細胞を用い、各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後ろ足背側に２００，０００細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体８０〜１５０ｍｍ３と測定されたときに、実験の終わりまでの毎日３０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンの腹腔内注射を開始した。次の日に（すなわち、接種の１０日後に）、マウスを、それぞれ１×１０５ｐｆｕ（低用量）、１×１０６ｐｆｕ（中用量）、１×１０７ｐｆｕ（高用量）の上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１を含有する１００μｌのＰＢＳおよび１００μｌのＰＢＳの腫瘍内投与によって、群あたり５匹で処置した。腫瘍サイズおよび体重を３日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１が腫瘍成長を有効に阻害し得、用量依存的であることを示した（図１４Ａ）。投与後の第９日（すなわち、接種後の第１９日）には、中用量群および高用量群のＴ／Ｃ（有効腫瘍阻害率。つまり、コントロール群の腫瘍サイズに対する投与群の腫瘍サイズのパーセンテージ。これは、４０％よりも低いときに、医薬が有効であるということを指示する）は４０％よりも小さかった（図１４Ｂ）。
【０１５７】
例１０：Ｂ１６腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスに対するマウスＩＬ−２１断片を保有するＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびコントロールワクシニアウイルスの抗腫瘍効果の比較
対数増殖期のＢ１６細胞を用いた。各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後ろ足背側に２００，０００細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体８０〜１５０ｍｍ３と測定されたときに、実験の終わりまでの毎日３０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンの腹腔内注射を開始した。次の日に、マウスを、それぞれ１×１０６ｐｆｕの上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１、１×１０６ｐｆｕのＤＤｖｖ−ＲＦＰを含有する１００μｌのＰＢＳ、および１００μｌのＰＢＳの腫瘍内投与によって、群あたり３匹で処置した。各群の腫瘍サイズおよび体重を３日毎に測定した。結果は、ＤＤｖｖ−ＲＦＰと比較して、ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１が腫瘍成長を有効に阻害し得るということを示した（図１５Ａ）。投与後の第６日から、ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１群のＴ／Ｃは全て４０％よりも小さかった（図１５Ｂ）。実験後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を採集および秤量した。ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１群の腫瘍重量は有意に縮減された（図１５Ｃ）。同時に、腫瘍組織のＴＩＬ（ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）（抗体：抗マウスＣＤ３、抗マウスＣＤ８ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）（抗体：抗マウスＣＤ３、抗マウスＣＤ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を包含する）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）（抗体：抗マウスＮＫ１．１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の含量を、フローサイトメトリーによって検出測定した。結果は、ＤＤｖｖ−ＲＦＰおよびＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１の投与が腫瘍組織のＴＩＬ含量を有意に改善し得るということを示した。ＤＤｖｖ−ＲＦＰ群と比較して、腫瘍ＴＩＬ中のＣＤ４＋Ｔ細胞がＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１群では有意に増大しているということが示された（図１６Ａ〜Ｃ）。
【０１５８】
例１１：ＨＣＴ１１６腫瘍を持つ重度免疫不全マウスに対する、ヒトＩＬ−２１を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの抗腫瘍効果の比較
重度免疫不全ＮＣＧマウス（浙江省動物センターから得た）を用いて、マウスの後ろ足背側に５００万個のＨＣＴ１１６細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約８０〜１５０ｍｍ３と測定されたときに（接種後の約第７日に）、マウスを、それぞれ５×１０６ｐｆｕのＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス、５×１０６ｐｆｕのコントロールワクシニアウイルスを含有する１００μｌのＰＢＳ、および１００μｌのＰＢＳの腫瘍内投与によって、群あたり５匹のマウスで処置した。次の日から、各マウスの尾静脈に５×１０７個のＮＫ細胞／日を投与し、投与を３日に渡って続け、３日に渡って止め、これを１サイクルとした。トータルで３サイクルのＮＫ細胞を投与した。腫瘍サイズおよび体重をウイルス投与の始まりから２〜５日毎に測定した。結果は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ＲＦＰおよびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１両方が腫瘍成長を有効に阻害し得、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１がＤＤｖｖ−ＲＦＰよりも良好な腫瘍抑制効果を示すということを示した（図１７Ａ）。ＤＤｖｖ−ＲＦＰおよびＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１群の両方は投与の１２日後から４０％よりも小さいＴ／Ｃを有した（図１７Ｂ）。実験後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を採集した。定量ＰＣＲによって、腫瘍組織のワクシニアウイルスのＡ４６Ｒ遺伝子の発現レベル（標的遺伝子のプライマー配列は５’−ＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡ−３’（配列番号８）および５’−ＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号９）であった）、ＩＬ−２１遺伝子の発現レベル（標的遺伝子のプライマー配列は５’−ＣＣＡＡＣＴＡＡＡＧＴＣＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１０）および５’−ＣＴＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１１）であった）、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ遺伝子の発現レベル（標的遺伝子のプライマー配列は５’−ＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＴＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１３）であった）、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現レベル（標的遺伝子のプライマー配列は５’−ＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１４）および５’−ＧＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＣＧＴＴＧＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１５）であった）を検出測定した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部参照として用いた（標的遺伝子のプライマー配列は５’−ＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号１６）および５’−ＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１７）であった）。標的遺伝子の発現量はｐｇ／ＧＡＰＤＨのμｇとする。結果は、腫瘍内のＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１腫瘍溶解性ウイルスの複製がコントロールワクシニアウイルスＤＤｖｖ−ＲＦＰと有意には異ならないということを示し（図１８Ａ）、ＩＬ２１の発現は、腫瘍組織内のＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１腫瘍溶解性ウイルスの存在をさらに検証した（図１８Ｂ）。ＤＤｖｖ−ＲＦＰウイルスを投与されたコントロール群と比較して、腫瘍のＮＫ含量はＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１腫瘍溶解性ウイルスを投与された群では有意に増大し（図１８Ｃ）、免疫因子ＩＮＦ−γの��現もまた増大する（図１８Ｄ）ということが見いだされた。
【０１５９】
例１２：Ｂ１６腫瘍マウスにおける静脈内投与したＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１ワクシニアウイルスの分布
対数増殖期のＢ１６細胞を用いた。各雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの後ろ足背側に２００，０００細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約１００〜２００ｍｍ３と測定されたときに、マウスに、上の方法によって調製された５×１０９ｐｆｕのＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１腫瘍溶解性ウイルスを含有する１００μｌのＰＢＳを、トータル４匹のマウスで静脈内投与した。マウスを１週後に屠殺して心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、卵巣、および腫瘍組織を採集した。ＰＣＲ法を用いて種々の臓器におけるワクシニアウイルスの分布を検出測定した。具体的には、各組織および臓器におけるワクシニアウイルスのＡ４６Ｒ遺伝子の発現量を腎臓におけるワクシニアウイルスのＡ４６Ｒ遺伝子の発現量と比較した（標的遺伝子のプライマー配列は５’−ＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡ−３’（配列番号８）および５’−ＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号９）であった）。結果は、投与されたＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１腫瘍溶解性ウイルスが主に腫瘍組織に分布するということを示した。ＤＤｖｖ−ｍＩＬ２１腫瘍溶解性ウイルスはそれらの中の１匹のマウスの卵巣組織においてもまた検出測定され、ウイルスは他の臓器では検出測定されなかった（図１９）。
【０１６０】
例１３：ヒト腫瘍細胞ＨｅｐＧ２に対するヒトＩＬ−２１を保有するＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果
ＨｅｐＧ２細胞を２４ウェル培養プレートに３０％コンフルエントで播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ環境において３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間に渡ってインキュベーションした。ＤＭＥＭ血清不含環境において、ＭＯＩ＝０．０２７の上の方法によって調製されたＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスを追加して細胞を６時間に渡って感染させ、それから溶液をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、インキュベーションを３７℃かつ５％ＣＯ２で１８時間に渡って続けた。それから、液を新しいＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、ＮＫ細胞を追加し（エフェクター対標的細胞比ＮＫ：ＨｅｐＧ２＝３：１）、インキュベーションを４８時間に渡って続け、死細胞および破片を洗い落とし、残りのＨｅｐＧ２生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。この実験群はＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１＋ＮＫ群である。実験では、ＨｅｐＧ２細胞の１つの群はウイルスおよびＮＫを追加せず、ブランク（ＢＫ）群とした。１つの群はＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスを対応する時点で追加したが、ただしＮＫは追加せず、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加したが、ただしＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスは追加せず、ＮＫ群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加し、同時にヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で追加したが、ただしＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスは追加せず、ＮＫ＋ＩＬ２１群とした。１つの群はウイルスおよびＮＫは追加しなかったが、ただしヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で上のＮＫ追加時点に対応する時点で追加し、ブランク＋ＩＬ２１群とした。上のコントロール群では、対応する時点で液を交換した。各群の実験は３回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
【０１６１】
結果を図２０に示す（横軸は異なる群であり、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である）。ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ使用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でＮＫ細胞を投与した）はＨｅｐＧ２に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約７１％である。この実験では、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス単独の阻害率は約３４％であり、ＮＫ細胞単独の阻害率は約１４％であった。２つの合計を図中の点線によって示す。加えて、ＮＫ＋ＩＬ２１群の阻害率は約２５％であり、ブランク＋ＩＬ２１群の阻害率は約２％であった。ブランク群の阻害率は約０であった（図２０には示されていない）。
【０１６２】
結果は、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ使用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でＮＫ細胞を投与した）がＨｅｐＧ２細胞に対する有意な相乗的殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約７１％であるということを示した。
【０１６３】
例１４：ヒト腫瘍細胞ＨＣＴ１１６に対する、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果の比較
実験から、ＨＣＴ１１６細胞に対するＤＤＶＶ−ＲＦＰの殺傷用量は好適には約ＭＯＩ＝０．７であり、ＨＣＴ１１６細胞に対するＮＫ細胞の殺傷用量は好適にはエフェクター対標的細胞比ＮＫ：ＨＣＴ１１６が約５：１であるということが決定された。
【０１６４】
ＨＣＴ１１６細胞を２４ウェル培養プレートに３０％コンフルエントで播種し、マッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳ環境において３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間に渡ってインキュベーションした。マッコイ５Ａの血清不含環境において、ＭＯＩ＝０．７の上の方法によって調製されたＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１またはＤＤＶＶ−ＲＦＰを追加して、細胞を６時間に渡って感染させ、それからマッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳ環境において１８時間に渡って３７℃かつ５％ＣＯ２でさらにインキュベーションした。ＮＫ細胞（エフェクター対標的細胞比ＮＫ：ＨＣＴ１１６＝５：１）を爾後に追加し（培地は交換しなかった）、インキュベーションを４８時間に渡って続けた。死細胞および破片を洗い落とし、残りのＨＣＴ１１６生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はそれぞれＤＤＶＶ−ＲＦＰ＋ＮＫ群およびＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１＋ＮＫ群であった。実験では、ＨＣＴ１１６細胞の１つの群をキープし、ウイルスおよびＮＫは追加せず、ブランク群とした。１つの群は、ウイルスおよびＮＫは追加しなかったが、ただしヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で上のＮＫ追加時点に対応する時点で追加し、ブランク＋ＩＬ２１群とした。１つの群は、ＤＤＶＶ−ＲＦＰのみを対応する時点で追加したが、ただしＮＫを追加せず、ＤＤＶＶ−ＲＦＰ群とした。１つの群はＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１のみを対応する時点で追加したが、ただしＮＫは追加せず、ＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加したが、ただしウイルスは追加せず、ＮＫ群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加し、同時にヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で追加したが、ウイルスは追加せず、ＮＫ＋ＩＬ２１群とした。１つの群はＤＤＶＶ−ＲＦＰおよびＮＫを対応する時点で追加し、ヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度でＮＫ追加と同じ時点で追加し、ＤＤＶＶ−ＲＦＰ＋ＮＫ＋ＩＬ２１群とした。コントロール群では、対応する時点で液交換操作をした。各群の実験は３回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
【０１６５】
図２１Ａに示されている通り（Ｘ軸は異なる群であり、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である）、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ使用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でＮＫ細胞を投与した）はＨＣＴ１１６細胞に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約８６％である。この実験では、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス単独の阻害率は約４３％であり、ＮＫ細胞単独の阻害率は約１０％であった。２つの合計を図中の点線によって示す。ブランク群の阻害率は約０であった（図２１ＡまたはＢには示されていない）。
【０１６６】
加えて、図２１Ｂに示されている通り（Ｘ軸は異なる群であり、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である）、ＨＣＴ１１６細胞に対するＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１およびＮＫ細胞の組み合わせ使用の殺傷効果（阻害率は約８６％であった）は、同じ用量のＤＤＶＶ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果（阻害率は約６７％であった）よりも有意に高く、同じ用量のＤＤＶＶ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞ならびにヒトＩＬ２１組換え体蛋白質の組み合わせの殺傷効果（阻害率は約６４％であった）よりもまた有意に高い。ＤＤＶＶ−ＲＦＰ単独の阻害率は約３７％であり、ブランク＋ＩＬ２１群の阻害率は検出測定されず、ＮＫ＋ＩＬ２１群の阻害率は約１２％であった。他の群のデータは上と同じであった。
【０１６７】
上の結果は、ＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１がＨＣＴ１１６細胞内で選択的に複製し、それゆえにＨＣＴ１１６細胞を殺傷し、同時に外来性のＩＬ−２１を発現し、それによって、発現された外来性のＩＬ−２１がＮＫ細胞の致死性を強化し、ＨＣＴ１１６に対するＮＫ細胞の殺傷効果をさらに強化し、その結果、ＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１およびＮＫ細胞の組み合わせがＨＣＴ１１６細胞を殺傷する点で驚くべき効果を見せるということを指示している。
【０１６８】
例１５：ヒト腫瘍細胞ＦａＤｕに対する、ヒトＩＬ−２１断片を保有するＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１ワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせならびにコントロールワクシニアウイルスおよびヒトＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果の比較
ＦａＤｕ細胞を２４ウェル培養プレートに３０％コンフルエントで播種し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ環境において３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間に渡ってインキュベーションした。ＭＥＭの血清不含環境において、ＭＯＩ＝０．２の上の方法によって調製されたＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１またはＤＤＶＶ−ＲＦＰを追加して６時間の感染を許し、それからＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ環境において３７℃かつ５％ＣＯ２で１８時間に渡ってさらにインキュベーションした。ＮＫ細胞（エフェクター対標的細胞比ＮＫ：ＦａＤｕ＝５：１）を爾後に追加し（培地は交換しなかった）、インキュベーションを４８時間に渡って続けた。死細胞および破片を洗い落とした。残りのＦａＤｕ生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はそれぞれＤＤＶＶ−ＲＦＰ＋ＮＫ群およびＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１＋ＮＫ群であった。実験では、ＦａＤｕ細胞の１つの群はウイルスおよびＮＫを追加せず、ブランク群とした。１つの群はウイルスおよびＮＫを追加しなかったが、ヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で上のＮＫ追加時点に対応する時点で追加し、ブランク＋ＩＬ２１群とした。１つの群はＤＤＶＶ−ＲＦＰのみを対応する時点で追加したが、ただしＮＫは追加せず、ＤＤＶＶ−ＲＦＰ群とした。１つの群はＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１のみを対応する時点で追加したが、ただしＮＫは追加せず、ＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加したが、ウイルスは追加せず、ＮＫ群とした。１つの群はＮＫを対応する時点で追加し、同時にヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で追加したが、ただしウイルスを追加せず、ＮＫ＋ＩＬ２１群とした。１つの群はＤＤＶＶ−ＲＦＰおよびＮＫを対応する時点で追加し、ＮＫの追加と同時にヒトＩＬ２１組換え体蛋白質を５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で追加し、ＤＤＶＶ−ＲＦＰ＋ＮＫ＋ＩＬ２１群とした。コントロール群では、対応する時点で対応する液交換操作をした。各群の実験は３回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
【０１６９】
図２２Ａに示されている通り（Ｘ軸は異なる群であり、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である）、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルスおよびＮＫ細胞の組み合わせ使用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でＮＫ細胞を投与した）はＦａＤｕ細胞に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約７３％である。この実験では、ＤＤｖｖ−ｈＩＬ２１ウイルス単独の阻害率は約３７％であり、ＮＫ細胞単独の阻害率は約１３％であった。２つの合計は図中の点線によって示されている。ブランク群阻害率は約０であった（図２２ＡまたはＢには示されていない）。
【０１７０】
加えて、図２２Ｂに示されている通り（Ｘ軸は異なる群であり、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージ値である）、ＦａＤｕ細胞に対するＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１およびＮＫ細胞の組み合わせ使用の殺傷効果（阻害率は約７３％であった）は、同じ用量のＤＤＶＶ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組み合わせの殺傷効果（阻害率は約６６％であった）よりも有意に高く、同じ用量のＤＤＶＶ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞ならびにヒトＩＬ２１組換え体蛋白質の組み合わせのもの（阻害率は約６５％であった）よりもまた有意に高い。ＤＤＶＶ−ＲＦＰ単独の阻害率は約３９％であり、ブランク＋ＩＬ２１群の阻害率は検出測定されず、ＮＫ＋ＩＬ２１群の阻害率は約１４％であった。他の群のデータは上と同じであった。
【０１７１】
上の結果は、ＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１がＦａＤｕ細胞内で選択的に複製し、それゆえにＦａＤｕ細胞を殺傷し、同時に外来性のＩＬ−２１を発現し、それによって、発現された外来性のＩＬ−２１がＮＫ細胞の致死性を増大させ、それゆえにＦａＤｕに対するＮＫ細胞の殺傷効果をさらに強化し、その結果、ＤＤＶＶ−ｈＩＬ２１およびＮＫ細胞の組み合わせがＦａＤｕ細胞を殺傷する点で驚くべき効果を見せるということを指示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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