(57)【要約】  PD1特異的キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞の養子細胞移植を介して、PDL1および／またはPDL2陽性癌を治療するために有用な方法および組成物を提供する。Dap 10などの共刺激ドメインを有効性を高めるために含めることもできる。【選択図】図１Ａ
2020536531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死リガンド1（PDL 1）およびプログラム細胞死リガンド2（PDL2）の少なくとも1つに特異的な細胞外結合ドメインと
膜貫通ドメインと
細胞質シグナル伝達ドメインと
を含む、キメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のCARポリペプチドであって、
前記細胞外ドメインがプログラム細胞死受容体1(PD1)細胞外ドメインである、CARポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のCARポリペプチドであって、
前記細胞質シグナル伝達ドメインがCD3ζ細胞質ドメインである、CARポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のCARポリペプチドであって、
DNAX活性化タンパク質10(Dap 10)共刺激ドメインをさらに含む、CARポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のCARポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが配列番号3と少なくとも90%同一の配列を含む、CARポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のCARポリペプチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のCARを発現するように遺伝子改変されたＴリンパ球。
【請求項８】
請求項７に記載のＴリンパ球および薬学的に許容される担体を含む養子細胞移植用組成物。
【請求項９】
１つまたは複数の化学療法剤または放射線療法剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、
前記癌の細胞はPDL1およびPDL2のうちの少なくとも1つを発現するものであり、
プログラム細胞死リガンド1（PDL1）およびプログラム細胞死リガンド2（PDL2）の少なくとも1つに対して特異的な細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとを含むCARを発現するように遺伝子改変されたTリンパ球を含む養子細胞移植用組成物の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記細胞外ドメインがプログラム細胞死受容体1(PD 1)細胞外ドメインである、方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法であって、
前記細胞質シグナル伝達ドメインがCD 3ζ細胞質ドメインである、方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記CARが、Dap10共刺激ドメインをさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記CARが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記癌がリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、膵臓癌、乳癌、および卵巣癌からなる群より選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法であって、
１つまたは複数の化学療法剤または放射線療法剤を投与する工程をさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、癌の治療のための、PD1リガンドを標的とするキメラ抗原受容体およびそれを発現する遺伝子操作されたＴ細胞に関する。 特に、キメラ抗原受容体は、治療の有効性を増強するためにDap 10などの共刺激ドメインを含み得る。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（CAR）でT細胞を操作することは、T細胞の抗腫瘍効果を高めるための1つのアプローチである。CARはT細胞の特異性を変え、かつ、腫瘍関連抗原に対してMHCに依存しない認識を可能にするために使用され、これにより腫瘍への標的を促進させる。癌治療にCAR修飾T細胞を使用する利点には、広範囲の腫瘍タイプを認識する能力、腫瘍が免疫検出を回避するために使用するメカニズムを克服する能力、T細胞機能を強化する能力を含む。しかし、T細胞上の抑制性受容体発現のアップレギュレーションと腫瘍微小環境における抑制性リガンドの発現は、CAR‐T細胞の応答と有効性を制限する。
【０００３】
癌患者において、免疫応答の負の調節がT細胞の持続的な活性化の後にしばしば生じる。抗腫瘍T細胞応答の阻害に重要な役割を果たすそのような阻害性受容体の一つはプログラム細胞死受容体1（PD l、CD279）であり、T細胞の活性化直後にアップレギュレートされ、増殖、サイトカイン産生および細胞毒性を含むT細胞受容体とCD28シグナル伝達に関する複数の下流のT細胞機能を阻害する。PD 1受容体は、プログラム細胞死リガンド1（PDL1、B7-H1、CD274）とプログラム細胞死リガンド2（PDL2、B7-DC、CD273）の2つの異なるリガンドに結合し、これらのどちらも多くの種類の固形腫瘍やリンパ腫を含む血液悪性腫瘍で過剰発現する。 PD1リガンドを標的とする効果的な治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、PD1リガンドを標的とし、養子Ｔ細胞療法に適したＣＡＲを提供する。
【０００５】
本開示の一態様は、プログラム細胞死リガンド1(PDL1)およびプログラム細胞死リガンド2(PDL2)の少なくとも１つに特異的な細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；および細胞質シグナル伝達ドメインを含むCARポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態においては、細胞外ドメインはプログラム細胞死受容体1（PD 1）細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインはCD 3ζ細胞質ドメインである。いくつかの実施形態において、CARポリペプチドは、DNAX活性化タンパク質10(Dap10)共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも90%同一の配列を含む。
【０００６】
本開示の別の態様においては、本開示に従ってCARを発現するように遺伝子改変されたTリンパ球を提供する。
【０００７】
本開示の別の態様においては、本開示のTリンパ球および薬学的に許容される担体を含む養子細胞移植用組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、組成物は、１つまたは複数の化学療法剤または放射線療法剤をさらに含む。
【０００８】
本開示の別の態様においては、治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、当該癌の細胞がPDL1およびPDL2の少なくとも1つを発現し、当該対象に本開示の養子細胞移植用組成物の治療有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、癌はリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、膵臓癌、乳癌、および卵巣癌からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｆ】キメラプログラム細胞死1（chPD 1）T細胞は、プログラム細胞死リガンド（PDL）を発現するRMA細胞をPD 1依存的に溶解する。（a）chPD 1 -Dap 10、chPD 1 -CD28の代表的なベクターマップ、および、野生型（wt）PD 1受容体。（b）エフェクターマウス非形質導入、wtPD l、または、chPD l（黒）T細胞を抗PD lまたはアイソタイプコントロール抗体で染色し、また（c）マウスchPD l T細胞を抗PDL 1もしくは抗PDL2またはアイソタイプコントロール抗体で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。（d）RMA細胞を抗PDL 1もしくは抗PDL2またはアイソタイプコントロール抗体で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。(e)非形質導入（四角）、wtPD 1（三角形）、またはchPD 1（円）T細胞を、示されたエフェクターとターゲット（E：T）の比率（1:1、5:1、25:1）でRMA細胞とともにエフェクター細胞として用い、細胞溶解を、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを用いて測定した。 chPD l T細胞は、非形質導入T細胞またはwtPD l T細胞と比較して、すべてのE：T比において有意に高い特異的溶解を示した（* P <0 0001）。(f) PD 1受容体依存性を示すために、wtPD 1またはchPD 1 T細胞を、腫瘍細胞とのインキュベーション前に、抗PD 1抗体（白塗記号）または対照ＩｇＧ抗体（黒塗記号）とインキュベートした。 PD 1受容体を遮断すると、対照と比較してすべての比率で腫瘍細胞に対するchPD 1 T細胞の細胞毒性が有意に低下した（* P <0 001）。データは平均+ SDとして表示され、少なくとも3回の試験を含む。
【図２Ａ−Ｂ】キメラプログラム細胞死1（chPD 1）T細胞とともにRMA細胞を培養すると、炎症誘発性サイトカインが分泌される。非形質導入T細胞、野生型（wt）PD 1発現T細胞（黒）、またはchPD l発現（白）T細胞をRMA細胞または培地とともに培養した。24時間後、（a）炎症性サイトカインインターフェロン-y（IFN-y）、腫瘍壊死因子-cc（TNF-a）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および、インターロイキン‐2（IL-2）、および、（b）抗炎症性サイトカインIL-10の分泌を、ELISAにより無細胞上清中で測定した。 RMA細胞と培養した場合、chPD l T細胞は、wtPD l T細胞と比較して、炎症誘発性サイトカインのレベルが高く、抗炎症性サイトカインのレベルが低下した（* P <0 001）。データは平均+ SDとして表示し、少なくとも3回の試験を含む。
【図３Ａ−Ｄ】キメラプログラム細胞死1（chPD 1）T細胞による治療は腫瘍量を軽減し、RMA-GFP保有マウスの生存率を向上させる。RMA-GFP細胞（2×106）を0日目にB6マウスに静脈内注射（i.v.）した。マウスを（a）2日後または（b）5日後に、PBS、または、野生型(wt)PD1（黒）T細胞もしくはchPD 1（白）T細胞（5 x 106）の１用量分でi.v.処置し、または、（c）5日後および8日後にwtPD 1 T細胞またはchPD 1 T細胞を2用量でi.v.処置した。RMA-GFP細胞注入の13日後にマウスを殺し、腫瘍量は脾臓およびリンパ節のRMA-GFP細胞の数を計測することにより決定した（n= 6）。 （d）5日後および1 2日後にマウスは2用量のwtPD 1-T細胞またはchPD 1 T細胞で静脈内投与の処置し、マウスの生存率を測定した（n = 7）。 chPD l T細胞は、wtPD l T細胞またはPBSと比較して、RMA腫瘍量を有意に減少させ、生存率を増加させた（* P <0 01）。データは平均+ SDとして示され、2つの独立した試験を含む。
【図４Ａ−Ｃ】キメラプログラム細胞死1（chPD 1）-Dap 10 T細胞は、chPD 1 -CD28 T細胞と比較して、炎症誘発性サイトカインのレベルが上昇し、抗炎症性サイトカインのレベルが低下している。野生型（wt）PD 1-（黒）、chPD 1 -Dap 10（白）、またはchPD 1 -CD28を発現するT細胞をRMA細胞または培地とともに培養した。24時間後、（a）サイトカインおよび（b）ケモカインの分泌を無細胞上清中でELISAまたはLEGENDplex分析により測定した。RPD細胞と培養した場合、chPD 1 -Dap 10 T細胞は、wtPD 1-またはchPD 1 -CD28 T細胞と比較して、炎症誘発性サイトカインのレベルが高く、抗炎症性サイトカインのレベルが低下した（* P <0.01）。（c）wtPD l（三角形）T細胞、chPD l -Dap 10（円）T細胞、またはchPD l -CD28（ひし形）T細胞を、示されたエフェクターtpターゲット（E：T）比（1：1、5：1、25：1）でRMA細胞とともにエフェクター細胞として使用し、細胞溶解を、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを用いて測定した。データは平均+ SDとして表示し、少なくとも3回の試験を含む。
【図５Ａ−Ｂ】Dap 10共刺激ドメインを含めると、キメラプログラム細胞死1（chPD 1）T細胞にセントラルメモリー表現型が誘導される。野生型（wt）PD 1-（黒）、chPD 1 -Dap 10（白）、またはchPD 1 -CD28を発現するT細胞をRMA細胞または培地とともに培養した。24時間後、（a）エフェクターとセントラルメモリーの分化を制御する遺伝子の発現をRT-PCRにより測定し、または（b）細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで測定した。RMA細胞による刺激は、培地中の培養と比較して、遺伝子または細胞表面マーカーの発現を変化させた（* P <0 01）。データは平均+ SDとして示し、少なくとも２回の試験を含む。
【図６Ａ−Ｃ】キメラプログラム細胞死1（chPD 1）-Dap 10 T細胞による治療は、chPD 1 -CD28 T細胞による治療と比較して、腫瘍量の大幅な減少とRMA-GFP保有マウスの生存率の向上につながる。RMA-GFP細胞（2 x 106）を0日目にB6マウスに静脈内注射（i.v.）した。5日後および8日後に、2用量の野生型（wt）PD 1（黒）T細胞、chPD 1 -Dap 10（白）T細胞、または、chPD 1 -CD28 T細胞（5 x 106）をマウスへ静脈注射し、（a）RMA-GFP細胞注入より１３日目にマウスをと殺し、腫瘍量を、脾臓およびリンパ節のRMA-GFP細胞数を計測することにより決定した（n = 6）。（b）マウスの生存率を測定した（n = 6）。chPD 1 -CD28 T細胞は、wtPD 1 T細胞と比較してRMA腫瘍量を有意に減少させ、生存率を増加させた（* P <0 01）。chPD 1 -Dap 10 T細胞は、RMA腫瘍量を有意に減少させ、chPD 1 -CD28 T細胞よりも生存を向上させた（#P <0 01）。（c）腫瘍細胞注射より5日後に、RMA保有マウスに対して5 x 106のLy5.1+ chPD l -Dap l0（白）T細胞またはchPD l -CD28 T細胞を静脈注射により処置した。脾臓およびリンパ節細胞は、T細胞注射後のさまざまな時点で単離し、Ly5.1+CD3+細胞の割合を計算した（n=4）。chPD 1 -Dap 10 T細胞は、chPD 1 -CD28 T細胞と比較してin vivoでの持続性が増加した（* P <0 01）。データは平均+ SDとして示し、2つの独立した試験を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
宿主の免疫システムを利用して癌と戦う免疫療法は、癌の治療に重要な選択肢を提供する。T細胞は、罹患した細胞を標的として排除することにより、疾患から個人を保護する。腫瘍特異的T細胞は単離した後、活性化と体外での拡大を行い、その後患者に再注入して癌の退行を媒介することができ、これは養子T細胞療法と呼ばれるプロセスである。
【００１１】
本明細書では、PD1リガンドを標的とする、すなわち、PDL1またはPDL2の少なくとも１つを標的とするCARを提供する。キメラPD 1受容体（chPD 1）ポリペプチドは、PDL1およびPDL2の少なくとも1つに特異的な細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；および、細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換可能に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、この用語は、例えば、当技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野では一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、これらは多くの種類が存在する。
【００１３】
「ポリペプチド」には例えば、とりわけ生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００１４】
PDL1およびPDL2の少なくとも１つに特異的な（すなわち、それを標的とし、認識し、または結合する）細胞外結合ドメインは、PD1(CD279)受容体の細胞外ドメインであり得る。PD 1受容体は、Tリンパ球などの細胞表面にあるタンパク質であり、個体自身の細胞に対する免疫系の応答を調節する役割を果たす。ヒトでは、PD 1タンパク質はPDCDI遺伝子によってコードされる。PD 1の代表的なアミノ酸配列は、配列番号１で提供される。いくつかの実施形態においては、ドメインはPD 1のアミノ酸1〜155を含むか、またはそれらからなる。
【００１５】
膜貫通ドメインは、細胞膜におよぶ疎水性ポリペプチドを含む。特に、膜貫通ドメインは、細胞膜の片側（細胞外）から細胞膜の反対側（細胞内または細胞質）に及ぶ。膜貫通ドメインは、アルファヘリックスもしくはベータバレル、またはそれらの組み合わせの形態であり得る。膜貫通ドメインはポリトピック型タンパク質であってもよく、ポリトピック型タンパク質は多くの膜貫通セグメント、各アルファヘリックス、ベータシート、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態においては、CAR内のドメインの１つと天然に結びつく膜貫通ドメインが使用される。別の実施形態では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることを回避するために、選択またはアミノ酸置換によって修飾することができる。
【００１６】
例えば、膜貫通ドメインには、T細胞受容体αまたはβ鎖の膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3s、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含む。
【００１７】
人工的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシンやバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。一実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインのそれぞれの末端に存在する。
【００１８】
CARの細胞質シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達を担っており、免疫細胞の活性化または阻害および免疫応答をもたらす。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化または不活性化を担い得る。したがって、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを変換し、細胞に特定の機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。本開示のCARで使用するためのシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体連結に続くシグナル伝達を開始するためのT細胞受容体の細胞質配列および協調して作用する共受容体、ならびに、これらと同じ機能を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列であり得る。細胞質シグナル伝達配列は、ITAMの免疫受容活性化チロシンモチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能するさまざまな受容体の細胞質内尾部に見られる明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。ITAMの例には、非限定的な例として、TCRzeta、FcRgamma、FcRbeta、FcRepsilon、CD3gamma、CD3delta、CD3epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66d由来のものが含まれる。いくつかの実施形態において、CARのシグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施において、シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータのアミノ酸52〜164を含むか、またはそれらからなる。
【００１９】
一部の実施形態では、PD1の阻害ドメインは、細胞質シグナル伝達ドメインの活性化ドメインで置き換えられ、したがって、負のPD1シグナルを切り替えて、Ｔ細胞の活性化シグナルになる。これは、PD1の免疫抑制効果を減らし、代わりにPD 1リガンドとの相互作用時に抗腫瘍免疫を誘導する。
【００２０】
CAR T細胞に共刺激ドメインを含めると、サイトカインの分泌、分化、細胞毒性、増殖および生存を含むT細胞機能を増強できる。本開示のCARと適合する共刺激受容体には、Dap 10、CD28、OX40、ICOS、4-I BB（CD 137）、NKG2C、およびNKG2Dからの機能的ドメイン、ならびに、それらの活性断片、機能的誘導体、および、組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。実施例1に示されるように、CD28およびDap 10は、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ、AKT/タンパク質キナーゼBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼを含む様々なシグナル伝達経路を活性化する。ただし、CD28とDap 10の刺激は、エフェクターT細胞に独特の作用があるようであり、これにはβ-カテニン、核因子-κB、の哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）を含むシグナル伝達経路の異なる活性化が含まれ、異なるサイトカイン分泌とT細胞分化を導く。具体的には、CD28と比較すると、Dap 10による共刺激は、CD8 T細胞のメモリ細胞への分化と炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導するが、抗炎症性サイトカインは誘導しない。したがって、いくつかの実施形態では、CARにDap 10共刺激ドメインを含めることがCD28よりも優先される場合がある。
【００２１】
本明細書に開示されるポリペプチドの機能保存的誘導体または変異体は、ポリペプチドの構造（およびそれをコードするDNA配列）に加えられ得る修飾および変化から生じ、なお所望の特性（例えば殺腫瘍活性および/または免疫刺激作用）を有する機能的分子を得る。機能保存的誘導体はまた、その機能性を保持するポリペプチドの断片からなり得る。
【００２２】
したがって、機能保存的誘導体または変異体は、タンパク質中の所定のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンホメーションおよび機能を変換することなく変更されたものであり、以下に限定されないが、類似する特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸同士の置換を含む。保存されているものとして示されているアミノ酸以外のアミノ酸はタンパク質によって異なり、その結果、類似の機能を持つ任意の2つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なり、たとえば、クラスター法などによるアライメントプログラムにより決定されるように、70％から99％であり得、類似性はMEGALIGNアルゴリズムに基づく。機能保存的誘導体には、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって決定された、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、または95％以上のアミノ酸同一性を持ち、それが比較される天然または親タンパク質と同じまたは実質的に同様の特性または機能を有するポリペプチドもまた含まれる。例えば、殺腫瘍作用をそれほど失うことなく、特定のアミノ酸をタンパク質構造内の他のアミノ酸に置換することができる。そのタンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力と性質であるため、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列で、もちろんそのDNAコーディング配列で行うことができ、それでも同様の特性を持つタンパク質を取得できる。したがって、本開示のポリペプチド配列、または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、それらの生物学的活性をそれほど失うことなく、様々な変更を加えることができると考えられる。前記殺腫瘍活性と免疫刺激活性は、例えば実施例で言及されるアッセイなどの、当技術分野で周知の様々な技術によって評価することができる。
【００２３】
上記で概説したように、保存的アミノ酸置換は、したがって、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の特性のいくつかを考慮に入れる例示的な置換は当業者に周知であり、以下が含まれる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸;セリンとスレオニン;グルタミンとアスパラギン;そしてバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００２４】
本開示のポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングすることができる。「ベクター」は、単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドを細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、以下に限定されないが、線形ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、ファージミド、コスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない。ウイルスには、ファージ、ファージ誘導体が含まれる。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞への核酸の導入に機にする非プラスミドおよび非ウイルス性化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
一実施形態において、ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、組み込みベクター、および配列決定ベクターが含まれる。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。一実施形態において、操作された細胞は、ポリヌクレオチド配列を発現するようにウイルスにより形質導入される。
【００２６】
ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択可能なマーカーを含む。
【００２７】
キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドの発現は、例えば、これらに限定されないが、SFFVプロモーター、ヒト伸長因子1la（EF）プロモーター、CAG（CMVエンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーター）プロモーター、ヒト伸長因子Ia（EF）プロモーターを含む発現ベクターを使用して達成することができる。利用されるそれほど強くない/より低い発現プロモーターの例には、サルウイルス40（SV40）初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター、ユビキチンC（UBC）プロモーター、およびホスホグリセリン酸キナーゼ1（PGK）プロモーターまたはそれらの一部が含まれるが、これらに限定されない。キメラ抗原受容体の誘導性発現は、例えば、テトラサイクリン応答性プロモーターを使用して達成することができ、これには以下に限定されないが、TRE3GV（Tet応答性エレメント；すべての世代、好ましくは第3世代を含む）、誘導性プロモーター（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）、またはそれらの一部もしくは組み合わせを含む。
【００２８】
細胞に遺伝子を導入および発現する方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターとの関連で、ベクターは、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【００２９】
養子T細胞療法は、個体の血液からT細胞を単離し、それらのT細胞を遺伝子操作して、本開示のCARを発現させることを含む。次に、操作されたT細胞を体外で増殖させ、個体に注入し戻す。CAR T細胞は、がん細胞上の標的抗原に結合し、それらを殺す。
【００３０】
本開示の実施形態は、例えば、操作された細胞を提供し、それらは例えば、本明細書に記載のCARポリペプチドまたはそれをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞/リンパ球である。「操作された細胞」とは、遺伝子、DNAもしくはRNA配列、またはタンパク質もしくはポリペプチドの付加または改変によって改変、形質転換、または操作された任意の生物の任意の細胞を意味する。本開示の単離された細胞、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞は、CARまたはCAR複合体をコードするDNAまたはRNA配列を含み、細胞表面でキメラ受容体を発現するNK細胞およびT細胞などの単離された免疫細胞を含む。単離された宿主細胞および操作された細胞は、例えば、ＮＫ細胞活性またはＴリンパ球活性を増強、癌の処置、および感染症の処置のために使用され得る。
【００３１】
本明細書に開示されるキメラ抗原受容体ポリペプチドをその膜に発現および／または組み込むことができる任意の細胞を使用することができる。一実施形態では、操作された細胞は免疫調節細胞を含む。
【００３２】
免疫調節細胞には、CD4 T細胞（ヘルパーT細胞）、CD8 T細胞（細胞毒性T細胞、CTL）などのT細胞（またはTリンパ球）、およびメモリーT細胞またはステムセルメモリーT細胞が含まれる。別の実施形態では、Ｔ細胞はナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ Ｔ細胞）を含む。
【００３３】
本開示の実施形態は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法を提供し、前記がんの細胞は、PDL1およびPDL2の少なくとも1つを発現し、当該方法は、本開示に従ってCARを発現するように遺伝子操作されたT細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。
【００３４】
細胞の性質に応じて、細胞は例えば哺乳類などの宿主生物にさまざまな方法で導入されてもよい。特定の実施形態では、細胞は腫瘍の部位に導入されてもよいが、別の実施形態では、細胞は癌に指向するか、または癌に指向するように改変される。使用される細胞の数は、多くの状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコル、例えば、投与回数、細胞が増殖する能力、組換え構築物の安定性などに依存する。細胞は分散物として適用されてもよく、通常、対象の部位またはその近くに注入される。細胞は、生理学的に許容される培地中に含むことができる。
【００３５】
特定の実施形態において、投与経路は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下であり得る。複数回の投与は、同じ経路または異なる経路によるものであり得る。いくつかの実施形態では、複数の投与量、例えば、2、3、4、5、またはそれ以上の投与量を、ある期間、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10日以上にわたって与える。
【００３６】
CAR T細胞の注入後の悪影響の1つは、サイトカイン放出症候群（CRS）として知られる免疫活性化の開始である。いくつかの実施形態では、IFN-γ、GM-CSF、IL-10およびIL-6から選択される1つまたは複数のサイトカインの上昇を誘発しない共刺激ドメインが使用される。いくつかの実施形態においては、トシリズマブ（ＩＬ−６アンタゴニスト）などのＣＲＳ療法が、本開示のＣＡＲと同時にまたは連続して投与される。いくつかの実施形態では、放射線療法および／または化学療法が、本開示のＣＡＲと同時にまたは連続して投与される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「癌」、「過剰増殖」および「腫瘍性」という用語は、自律的増殖、すなわち、急速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状態または様相を有する細胞を指す。過剰増殖および腫瘍性の疾患状態は病理学的、すなわち、疾患状態を特徴付けるかもしくは構成するものとして分類され、または、非病理学的、すなわち、正常からの逸脱であるが、疾患状態に関連していないものとして分類される。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の段階に関係なく、すべてのタイプの癌性増殖もしくは発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、もしくは臓器を含むことを意味する。
【００３８】
「癌転移」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、1つの器官または部分から別の隣接しない器官または部分への腫瘍の広がりを指す。
【００３９】
PDL1およびPDL2の少なくとも1つを発現する任意の癌または転移性癌は本発明の療法を使用して標的化することができ、これらには以下に限定されないが、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、脳癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、脾臓癌、胆嚢癌、肛門癌、精巣癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、骨癌、および結腸癌を含む。
【００４０】
「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、これは、癌に罹患しているもしくは罹患の疑いがあるか、癌のリスクがあるか、またはその素因がある哺乳動物などの動物を指す。用語は人間を指す場合がある。この用語には、馬、牛、羊、家禽、魚、豚、猫、犬、動物園の動物、ヤギ、類人猿（ゴリラやチンパンジーなど）、ならびに、ラットおよびマウスなどのげっ歯類を含む、食品、スポーツ、またはペットとして飼育される家畜も含む。典型的な対象には、癌にかかりやすい、癌にかかっている、または癌にかかった人が含まれる。
【００４１】
本明細書で用いられる「治療する」または「治療」という用語は、そのような用語が適用される障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の1つまたは複数の症状を逆転、緩和、進行の阻害、または改善することを意味する。例えば、本開示の治療は、前記癌の成長を遅らせる、前記癌における腫瘍細胞の数を減らす、腫瘍量を減らす、または前記癌を排除することができる。
【００４２】
「治療的有効量」とは、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比で癌を治療する（例えば、腫瘍増殖を制限する、または腫瘍転移を遅延または阻止する）のに十分な量の分子を意味する。しかしながら、本開示の分子および組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。特定の対象に対する特定の治療上有効な用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用した特定のポリペプチドの活性;使用する特定の組成；被験者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定のポリペプチドの排泄速度；治療期間;使用する特定のポリペプチドと組み合わせてもしは同時に同時に使用される薬剤；ならびに、医療分野でよく知られているような要素を含むさまざまな要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。
【００４３】
本明細書に記載されているT細胞療法は、標準治療（例えば、放射線療法、ホルモン療法）と組み合わせることができる。いくつかの実施形態においては、本開示のＴリンパ球は、１つまたは複数の化学療法剤または放射線療法剤と連続的または同時に投与することができる。
【００４４】
一実施形態において、前記化学療法剤または放射線療法剤は、抗癌剤として使用される治療活性剤である。例えば、前記抗癌剤は、以下に限定されないが、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンなどの白金錯体、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシドやテニポシドなどのエピポドフィロトキシン、イリノテカンやトポテカンなどのカンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、L-アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンと組み合わせた5-フルオロウラシル、ドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン、レバミゾール、エストラムスチン、ナイトロジェンマスタード、カルムスチンおよびロムスチンなどのニトロソウレア、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、メシル酸イマチニブ、ヘキサメチルメラミン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ATPase阻害剤、チルホスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービマイシンA、ゲニステイン、エルブスタチン、およびラベンダスチンAを含む。1つの態様において、追加の抗癌剤は、次の種類の薬剤の1つまたは組み合わせから選択され得るが、これらに限定されない：アルキル化剤、植物アルカロイド、DNAトポイソメラーゼ阻害剤、葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、DNA代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法、レチノイド、光増感剤または光線力学療法、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、イソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、MDR阻害剤およびCa2+ ATPase阻害剤。
【００４５】
追加の抗癌剤は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、成長阻害因子、ホルモン、可溶性受容体、デコイ受容体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体、モノボディ、ポリボディから選択することができるが、これらに限定されない。
【００４６】
さらなる治療活性剤は制吐剤であり得る。適切な制吐剤には、メトクロプラミド、ドンペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキナミド、ビエタナチン、ブロモプリド、ブクリプジン、クレボプリド、シクリジン、ジメンヒドリナート、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリジン、メタタタール、メトピマジン、ナビロン、ピパマジン、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカンナビノール、チエチルペラジン、チオプロペラジン、トロピセトロン。好ましい実施形態において、制吐剤はグラニセトロンまたはオンダンセトロンである。
【００４７】
さらに別の実施形態では、他の治療活性剤は、オピオイドまたは非オピオイド鎮痛剤であり得る。適切なオピオイド鎮痛剤には、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、オキシモルホン、オキシコドン、メトポン、アポモルヒネ、ブプレノルフィン、メペリジン、ロペラミド、エトヘプタジン、ベータプロジン、ジフェノキシラート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾン、ペマゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドン、およびプロポキシフェンが含まれるが、これらに限定されない。適切な非オピオイド鎮痛剤には、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラック、メクロフェナメート、メフェナム酸ナカムスプロム、ナフメトン、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカム、スリンダクが含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
さらに別の実施形態では、さらなる治療活性剤は抗不安薬であり得る。適切な抗不安薬には、ブスピロン、ならびにジアゼパム、ロラゼパム、オキサザパム、クロラゼプ酸、クロナゼパム、クロルジアゼポキシドおよびアルプラゾラムなどのベンゾジアゼピンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書で使用される「放射線治療薬」という用語は、限定されることなく、癌を治療または改善するのに有効であることが当業者に知られている任意の放射線治療薬を指すものとする。例えば、放射線治療薬は、近接照射療法または放射性核種療法で投与されるような薬剤であり得る。そのような方法は、化学療法および／または別の放射線療法などであるがこれらに限定されない１つまたは複数の追加の癌療法の投与を任意でさらに含むことができる。
【００５０】
本開示の別の態様は、本開示によるＴリンパ球および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、必要に応じて、ヒトなどの対象に投与された場合に有害、アレルギーまたは他の有害な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、有毒な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの製剤補助剤を指す。
【００５１】
本開示のＴリンパ球は、安定性を維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培養培地などに含まれ得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注射可能な製剤に医薬的対して許容されるビヒクルを含む。これらは、特に等張の無菌食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または、場合により滅菌水または生理食塩水の添加にて注射液の構成が可能な乾燥組成物、特に、凍結乾燥組成物であり得る。
【００５３】
注射用途に適した剤形には、滅菌水溶液または分散液；ごま油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む製剤;および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、シリンジ注入しやすい程度に流動性でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００５４】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩として本開示の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤には微生物の成長を防ぐための防腐剤を含むことができる。
【００５５】
薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、塩酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される塩を含む。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導できる。
【００５６】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の組成物における使用によってもたらされ得る。
【００５７】
無菌注射液は、必要量のTリンパ球を、上記に列挙した他のいくつかの成分を含む適切な溶媒に組み込んだ後、必要に応じてろ過滅菌する。一般に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙したもののうち必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に無菌濾過した溶液から活性成分の粉末と任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００５８】
直接注射用のさらなる溶液または高濃度の溶液の調製も考えられ、溶媒としてのDMSOの使用は、非常に迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達することが想定される。
【００５９】
製剤化すると、溶液は、投与製剤に適合する方法で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記の注射可能な溶液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与され、薬物放出カプセルなども採用することができる。
【００６０】
例えば、水溶液での非経口投与の場合、必要に応じて溶液を適切に緩衝化し、最初に液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。投与量のいくらかの変動は、治療されている対象の状態に応じて必然的に生じうる。投与の責任者は、いずれにしても、個々の被験者に適切な用量を決定する。
【００６１】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本開示の組成物に加えて、他の薬学的に許容される形態には、例えば、経口投与用の錠剤またはその他の固形物;リポソーム製剤;徐放性カプセル;および現在使用されているその他の製剤が含まれる。
【００６２】
本明細書に記載される組成物のいずれもキットに含まれ得る。非限定的例示において、本開示による組換えにより発現したＣＡＲsを有する細胞治療で使用するための１つまたは複数の細胞および／または細胞治療で使用する１つまたは複数の細胞を生成する試薬が、キットに含まれ得る。キットの構成要素は、適切な容器手段で提供される。特定の実施形態では、キットは、ベクター、プライマー、酵素（制限酵素、リガーゼ、ポリメラーゼなど）、緩衝液、ヌクレオチドなどの組換工学用試薬を含む。
【００６３】
キットの一部の構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化できる。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に成分を入れることができ、好ましくは、適切に分注することができる。キットに複数の構成要素がある場合、キットには通常、追加の構成要素を個別に配置できる2番目、3番目、またはその他の追加の容器手段も含まれ得る。しかしながら、成分の様々な組み合わせが１つのバイアルに含まれてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、商業的販売のために厳重に管理された構成要素を含むための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。
【００６４】
本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、そのため、当然ながら変化し得ることが理解される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解される。
【００６５】
本明細書で引用されたすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように参照により本明細書に組み込まれ、また引用する刊行物に関連する方法および/または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日の前のその開示に対するものであり、本発明が、先行発明を理由としてそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される発行日は実際の発行日と異なる場合があり、個別に確認する必要がある場合がある。
【００６６】
値の範囲が提供されている場合、文脈が明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限、およびその述べられた範囲は、本発明の範囲内に含まれる。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立して、より狭い範囲に含まれてもよく、本発明内に包含され、記載された範囲内の特定の除外された限定に従う。記載された範囲が限定の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００６７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈から明らかにそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように記載されてもよいことに留意されたい。したがって、この記載は、クレーム要素の引用に関連する「単独」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用に対する基準として機能することを意図する。
【００６８】
この開示を読むことで当業者には明らかであるように、本明細書で説明および図示した個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または主旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。いずれの記載された方法も、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施可能である。
【００６９】
本発明は、本発明をさらに説明する以下の非限定的な実施例によってさらに説明されるが、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、またそのように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１．リンパ腫の免疫療法としてのキメラ−ＰＤ１−Ｄａｐ１０受容体を発現するマウスＴ細胞の養子移入
概要
T細胞の養子移入は有望な癌治療であり、キメラ抗原受容体の発現は腫瘍認識とT細胞エフェクター機能を増強することができます。本明細書では、CD3ζの細胞質ドメインに融合したPD1細胞外ドメインを含むマウスキメラPD1受容体（chPD1）が提供される。さらに、キメラ抗原受容体療法は、さまざまな共刺激ドメインを使用して効力を高める。したがって、chPD1受容体にDap10またはCD28共刺激ドメインを含めることを比較して、リンパ腫のマウスモデルで最適な抗腫瘍免疫を誘導するドメインを決定した。chPD1 T細胞は炎症性サイトカインを分泌し、RMAリンパ腫細胞を溶解した。chPD1 T細胞の養子移入は、腫瘍の構築を有意に減少させ、リンパ腫を有するマウスにおいて腫瘍のない生存をもたらした。Dap10またはCD28ドメインを含むchPD1受容体を比較すると、両方の受容体が炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導し、chPD1-CD28 T細胞は抗炎症性サイトカインも分泌したが、chPD1-Dap10 T細胞は分泌しなかった。さらに、chPD1-Dap10は、エフェクターメモリー表現型を誘発するchPD1-CD28と比較して、セントラルメモリーT細胞表現型を誘発した。また、chPD1-Dap10 T細胞は、chPD1-CD28 T細胞と比較して、in vivoでの持続性と抗腫瘍効果が増強していた。したがって、chPD1 T細胞の養子移入はリンパ腫の新しい治療法であり、キメラ抗原受容体にDap10共刺激ドメインを含めることは、抗腫瘍療法において好ましいサイトカインプロファイルとT細胞分化表現型を誘導できうる。
【００７１】
材料および方法
wtPD1およびchPD1コンストラクトの作製
CD3ζ、PD1、CD28、およびDap10のマウスcDNAクローンは、OriGene（Rockville、MD）から購入した。chPD1-Dap10およびchPD1-CD28受容体は、Phusion（登録商標）high fidelity DNA polymerase（New England BioLabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用し、オーバーラップPCRによって作製した。chPD1‐Dap10受容体を作製するために、マウスPD1受容体の細胞外ドメイン[アミノ酸（aa）1−155]は、CD28の膜貫通領域（aa 141−177）ならびにDap10（aa 57−79）およびCD3ζ（aa 52−164）の細胞質ドメインにインフレームで融合させた。chPD1‐CD28受容体を作製するため、マウスPD1受容体の細胞外ドメイン（aa 1−155）を、CD28の膜貫通ドメイン（aa 141−177）および細胞質ドメイン（aa 178−218）ならびにCD3ζ（aa52−164）の細胞質ドメインにインフレームで融合させた。野生型PD1（wtPD1）受容体を作製するために、PD1受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン（aa 1〜190）を使用した。すべての構築物は、プラスミドおよび構築物のNotIおよびEcoRI消化を使用してpQCXINレトロウイルス発現ベクターにクローニングし、続いてベクターに連結させた。エコトロピック（ecotropic）レトロウイルスの上清は、製造元の指示（Clontech、Mountain View、CA）に従ってEcoPack 2−293細胞株を使用して発現させた。Xfectポリマーを使用して、EcoPack 2−293細胞に、pEcoエンベロープベクターおよびRetroX-Qベクターセット（Clontech）のpQCXINレトロウイルス発現ベクターを同時トランスフェクションした。RetroXコンセントレーターは、初代マウスT細胞の形質導入前に、エコトロピックなレトロウイルス上清を濃縮するために使用した。
【００７２】
T細胞におけるwtPD1およびchPD1受容体の発現
オスのC57BL / 6（B6）およびB6.SJL-Ptprca（Ly5.1コンジェニック）マウスは、Taconic Biosciences（ニューヨーク州ハドソン）から購入した。マウスは、各実験の開始時に8〜12週齢であった。すべての動物実験は、ロングウッド大学の施設内動物使用および管理委員会の承認に従い、また承認を得て実施した。B6またはLy5.1コンジェニックマウスの脾臓細胞をコンカナバリンA（1μg/ ml）で18時間活性化した。T細胞（0.5×106細胞/ ml）は、8μg/ mlのポリブレンと25U / mlの組換えヒトインターロイキン-2（IL-2）の存在下で1000gで1時間遠心分離することにより形質導入、その後レトロウイルスの上清を除去する前に６時間培養し、10％熱不活化ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlストレプトマイシン、1 mMピルビン酸塩、10 mM HEPES、0.1mM非必須アミノ酸および50μM 2-メルカプトエタノールを補充した新鮮な完全RPMI-1640培地に置換した。感染の2日後、G418（0 mg / ml）+ 25 U / ml組換えヒトIL-2を含む完全なRPMI-1640培地でT細胞をさらに3日間選択しました。生細胞は、Histopaque-1083（Sigma、ミズーリ州セントルイス）を使用して分離し、機能分析の前にG418なしでさらに2日間拡大培養した。
【００７３】
RT‐PCR
製造元の指示（Promega、Madison、WI）に従って、SV Total RNA分離キットを使用して、RMA細胞またはT細胞から全RNAを分離した。ランダムヘキサマープライマー（Fermentas、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いるRevertAid First Strand cDNA合成キットを使用してcDNAを作製した。RT-PCRのテンプレートとして、100 ngのcDNAを使用してPDL1、PDL2、β-アクチンの遺伝子発現を測定した。Maxima SYBRGreen qPCRマスターミックス（Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州）および遺伝子特異的プライマーを使用した：
β-アクチンF 5'-GTGTGATGGTGGGAATGGGTCAGA-3 '（配列番号4）、
β-アクチンR 5'-TACGACCAGAGGCATACAGGGACA-3' （配列番号：5）、
PDL1 F 5'-GCTCCAAAGGACTTGTACGTG-3 '（配列番号：6）、
PDL1 R 5'-TGATCTGAAGGGCAGCATTTC-3'（配列番号：7）、
PDL2 F 5'-CTGCCGATACTGAACCTGAGC-3 '（配列番号：8）、
PDL2 R 5'-GCGGTCAAAATCGCACTC-3'（配列番号：9）。
T細胞分化遺伝子T-bet、BLIMP1、EomesおよびBCL6の遺伝子特異的プライマーは以前に記載されている。プライマーはIntegrated DNA Technologies（Coralville、IA）から購入した。
【００７４】
フローサイトメトリー
RMAおよびT細胞上のPDL1とPDL2の発現、およびT細胞上のPD1の発現は、フローサイトメトリーを使用してテストした。細胞をアロフィコシアニン標識抗PDL1（クローン10F.9G2）、フィコエリスリン標識抗PDL2（クローンTY25）、またはフィコエリスリン標識抗PD1（クローンRMP1-30）抗体またはアイソタイプコントロールで染色した。T細胞分化研究では、wtPD1またはchPD1 T細胞（2×105細胞/ウェル）をRMA細胞（2×105細胞/ウェル）で24時間刺激し、フローサイトメトリーで細胞表面マーカーの発現を分析した。細胞をフィコエリトリン標識抗CD127（クローンA7R34）または抗KLRG1（クローン2F1 / KLRG1）およびアロフィコシアニン標識抗CD62L（クローンMEL-14）またはアイソタイプコントロールで染色した。T細胞表面発現を分析するために、RMA細胞をインキュベーション前にCFSEで標識し、CFSE+細胞をゲートアウトした。すべての抗体はBioLegend（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。細胞蛍光は、Accuri C6フローサイトメーターを使用して測定した。
【００７５】
chPD1 T細胞によるサイトカイン産生および細胞毒性
chPD1、wtPD1、および形質導入していないT細胞（105）は、丸底の96ウェルプレートでRMA細胞（105）または培地とともに培養した。24時間後、無細胞上清におけるインターフェロン-γ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、IL-2およびIL-10の存在を、製造元（BioLegend）の指示に従ってELISAにより試験した。製造元の指示に従い、マウスTヘルパーサイトカインおよびマウス炎症誘発性ケモカインLEGENDPlexアッセイ（BioLegend）を用いて、無細胞上清におけるサイトカインおよびケモカイン分泌も測定した。
【００７６】
腫瘍細胞の溶解を測定するために、chPD1、wtPD1、および非形質導入T細胞（105）を、エフェクターとターゲットの比率を変えてRMAで培養しました（E：T 25：1、5：1、および1：1）。製造業者の指示に従い、乳酸デヒドロゲナーゼ細胞毒性アッセイキット（Pierce、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、5時間後に特異的溶解を測定した。PD1受容体を遮断するために、標的細胞を加える前に、T細胞を37°で2時間、抗PD1モノクローナル抗体（クローンRMP1-14、20μg/ ml、低エンドトキシン、アジドフリーLEAF精製物、BioLegend）またはアイソタイプコントロールモノクローナル抗体とともにプレインキュベートした。
【００７７】
遺伝子組換えT細胞によるマウスの治療
RMAおよびRMA-GFP細胞は完全RPMI-1640で増殖させた。RMA-GFP細胞（2×106）をB6マウスに静脈注射した。腫瘍組織量試験では、マウスに1用量のwtPD1またはchPD1修飾T細胞（5×106）を、腫瘍注射の2日後または5日後に静脈内投与するか、または腫瘍注射の5日後および8日後にT細胞を2用量投与した。腫瘍組織量の決定のために、脾臓およびリンパ節（腋窩、上腕および鼠径部）を腫瘍注射の13日後に収集した。リンパ組織を機械的に切り裂き、赤血球をACK溶解バッファー（0.15 mol / l NH4Cl、1 mmol / l KHCO3、0.1 mmol / l）で溶解しました。細胞をカウントし、GFP +細胞の割合をフローサイトメトリーで決定した。腫瘍細胞の総数は、GFP +細胞のパーセンテージに細胞の総数を掛けて決定した。生存試験のために、マウスは腫瘍細胞注入後5日目と8日目にwtPD1またはchPD1 T細胞（5×106）で処理した。マウスの健康状態を綿密に監視し、ストレスの兆候（呼吸困難、脚の引きずり、背中の丸まり、または毛皮の波打ち）が観察されたときにマウスを屠殺した。T細胞生存率の分析のために、RMA保有マウスは、腫瘍細胞注射の5日後にコンジェニックLy5.1 + chPD1-Dap10またはchPD1-CD28 T細胞（5×106）を静脈内投与し、T細胞注射後1、3、7 、10、14または18日後にマウスを屠殺した。脾臓およびリンパ節細胞をFcRブロックおよびマウスγ-グロブリン（Jackson ImmunoResearch、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）とインキュベートして非特異的結合を防ぎ、フィコエリスリン結合抗CD3およびアロフィコシアニン結合抗CD45.1（クローンA20）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【００７８】
統計分析
統計分析は、複数のグループを比較するときに、対応のない両側スチューデントt検定または事後Tukey検定による分散分析を使用して行った。データは、Shapiro−Wilk検定を使用して正規分布であると判断された。プログラムRを、データの統計分析に使用した。すべての実験は、T細胞の少なくとも2つの独立したセットで3回繰り返して行われ、P値<0.05は有意であると見なした。生存研究では、カプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、ログランク検定とPRISMソフトウェア（GRAPHPADソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分析した。
【００７９】
結果
chPD1 T細胞は炎症誘発性サイトカインを分泌し、PD1依存的にPDL発現RMA細胞を溶解する
腫瘍細胞で発現するPD1リガンドを標的とするために、PD1受容体の細胞外領域をDap10共刺激受容体およびCD3ζの細胞内領域と融合させることにより、chPD1受容体を作製した（図1a）。PD1受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインからなるwtPD1受容体も、コントロールとして作製した。形質導入していない活性化T細胞と比較してPD1受容体の細胞表面発現が増加することで示されるように、chPD1およびwtPD1受容体は活性化マウスT細胞で発現に成功した（図1b）。wtPD1 T細胞とchPD1 T細胞との両方が、活性化されたCD4 +（〜10％）およびCD8 +（〜90％）T細胞の混合を構成していた。
【００８０】
活性化T細胞はときどきPDL1を発現し、これはchPD1 T細胞を互いに殺傷する可能性がある。9そのため、PDL1およびPDL2の発現をchPD1 T細胞で評価した。得られたchPD1 T細胞の数は、テストしたすべてのT細胞バッチにたいするwtPD1 T細胞の数と類似していた。さらに、chPD1およびwtPD1 T細胞での有意なPDL1またはPDL2発現は観察されなかった（図1c）。最後に、wtPD1またはchPD1 T細胞を培地のみで培養した場合、有意なレベルの細胞死は観察されなかった。これらのデータは、chPD1 T細胞が有意なレベルのPDLを発現しないことを示唆している。
【００８１】
マウスリンパ腫細胞株RMAがchPD1 T細胞の潜在的な標的であるかどうかを判断するために、PDL1およびPDL2の発現を測定した。RMA細胞は、フローサイトメトリーによって決定されたように、細胞表面PDL1およびPDL2を発現していた（図1d）。PD1リガンドのRT-PCRも行い、RMA細胞はPDL1およびPDL2のmRNAも発現していた。 chPD1 T細胞は、wtPD1受容体を発現するT細胞または非形質導入エフェクターT細胞よりもRMA細胞を大幅に溶解した（図1e）。アッセイの前にT細胞をブロッキング抗PD1抗体と共にインキュベートすると、chPD1 T細胞による腫瘍細胞の死滅がなくなるため、この溶解はPD1受容体に依存していた（図1f）。
【００８２】
腫瘍細胞溶解に加えて、T細胞は炎症促進性サイトカインを分泌して抗腫瘍免疫を高める。15、30非形質導入またはwtPD1 T細胞と比較して、chPD1 T細胞は有意な量の炎症誘発性サイトカインIFN-γ、TNF-α、GM-CSFおよびIL-2を分泌したが、RMA細胞と培養した場合んは抗炎症性サイトカインIL-10を分泌しなかった（図2）。これらのデータを合わせると、RMA細胞がPD1リガンドを発現し、chPD1受容体の発現が炎症誘発性サイトカインの分泌とRMAマウスリンパ腫細胞株の溶解を誘導したことを示す。
【００８３】
chPD1 T細胞による治療は、腫瘍量の減少とRMA-GFP保有マウスの生存率の増加をもたらす
マウスに静脈注射すると、RMA腫瘍細胞は脾臓とリンパ節に移動する：ここで、このモデルは同系の免疫応答性マウスにおけるヒトリンパ腫の特徴を示す。31そのため、リンパ腫の治療法として生体内でchPD1 T細胞を使用する可能性について調査した。PD1のリガンドは健康な組織でも発現する可能性があるため、chPD1 T細胞の安全性を最初にテストした。ナイーブマウスから分離した脾細胞、肝細胞、肺細胞と培養した場合、chPD1 T細胞は溶解せず、またIFN-γを分泌しなかった。さらに、chPD1 T細胞の注射後、ナイーブマウスは有害な症状や血清IFN-γレベルの増加を示さなかったことから、chPD1 T細胞は健康な組織を標的にしていないことが示唆された。次に、chPD1 T細胞の抗腫瘍効果をテストするために、リンパ腫を有するマウスを、腫瘍細胞注射の2日後にchPD1 T細胞の単回投与で処理し、腫瘍組織量を脾臓とリンパ節で測定した（図3a）。PBSまたはwtPD1 T細胞で処理したマウスと比較して、RMA腫瘍量はchPD1 T細胞で処理したマウスで有意に減少した。PBSまたはwtPD1 T細胞で処理したマウスの腫瘍組織量は有意差はなく、これはwtPD1 T細胞が腫瘍組織量を減少させなかったことを示す。
【００８４】
より定着した腫瘍組織に対するchPD1 T細胞のin vivo治療効果を試験するために、腫瘍細胞注入の5日後に、マウスをwtPD1またはchPD1 T細胞で処理した。chPD1 T細胞で処理したマウスの脾臓およびリンパ節では腫瘍細胞のレベルは低いが検出可能なレベルとなり、chPD1 T細胞での処理によりこれらの定着した腫瘍は有意に減少しました（図3b）。 CAR T細胞による複数の治療が抗腫瘍効果を高めることが以前の研究で示されているので、腫瘍を有するマウスは、腫瘍細胞注射の5および8日後にwtPD1またはchPD1 T細胞の2つの治療剤を注射した。3、30-322用量のchPD1 T細胞で処置したマウスでは、腫瘍細胞の腫瘍レベルが検出できなかった（図3c）。さらに、腫瘍細胞注入後20日目までに腫瘍により死亡したwtPD1 T細胞で治療したマウスと比較して、2用量のchPD1 T細胞で治療したマウスは生存期間が有意に増加し、リンパ腫を有するマウスの70％において腫瘍のない長期生存が認められた。（図3d）。これらのデータは、定着したリンパ腫のchPD1 T細胞治療が生存率を高め、chPD1 T細胞の複数回投与が担癌マウスの長期生存を導いたことを示す。
【００８５】
chPD1‐Dap10 T細胞は、chPD1‐CD28 T細胞と比較して、増加したレベルの炎症誘発性サイトカインと減少したレベルの抗炎症性サイトカインを分泌する
CARsに共刺激ドメインを含めると、T細胞の抗腫瘍エフェクター機能が強化され、各共刺激受容体はT細胞に独自の効果をもたらす。15、16したがって、Dap10ドメインについての他の共刺激受容体との包含と比較するために、Dap10細胞質ドメインの代わりにCD28の細胞質ドメインを含むchPD1受容体を作製した（図1a）。共刺激受容体間でしばしば異なる1つのエフェクター機能は、サイトカイン分泌を誘導するそれらの能力である。26-28そのため、chPD1-Dap10およびchPD1-CD28 T細胞による炎症性および抗炎症性サイトカインの分泌を比較した。IFN-γの分泌は同様であったが、chPD1-Dap10 T細胞は、より多くの炎症誘発性サイトカインTNF-α、GM-CSF、IL-17、およびIL-21を分泌した。対照的に、chPD1-CD28 T細胞はより多くのIL-2およびTヘルパー2型/抗炎症性サイトカインIL-5およびIL-10を分泌した（図4a）。chPD1‐Dap10およびchPD1‐CD28 T細胞も、活性化した正常なT細胞に制御された同様の量の炎症性ケモカインを分泌し、（RANTES）マクロファージ炎症性タンパク質1αおよび1βを分泌した。2つのCARのサイトカイン分泌プロファイルは異なっていたが、chPD1-Dap10およびchPD1-CD28 T細胞によるT細胞の増殖、生存または腫瘍細胞溶解に有意差はなかった（図4c）。したがって、これらの受容体によって誘導されるエフェクター機能には、特に異なるサイトカイン分泌の誘導に関して、いくつかの有意な違いが存在した。
【００８６】
Dap10共刺激ドメインの包含は、chPD1 T細胞にセントラルメモリー表現型が誘導される
CAR T細胞の有効性に重要なもう一つの特徴は、T細胞の分化表現型にある。CD28を含むCARsは、エフェクターメモリーまたはエフェクター細胞の表現型をよく誘導し、生体内での生存期間は長くはないが、セントラルメモリーの表現型を誘導するCARsは、通常、生体内で長く持続し、抗腫瘍効果が強くなる。3ナチュラルキラーグループ2D（NKG2D）/ Dap10の刺激は最近、マウスエフェクターCD8細胞でセントラルメモリー表現型を誘導することが示されており、chPD1-Dap10 T細胞とchPD1-CD28 T細胞との分化表現型を比較した。29 RMA細胞と培養すると、chPD1-CD28 T細胞は、エフェクター細胞の分化に関与する転写因子、T-betおよびBLIMP-1の遺伝子発現を増加させましたのに対し、chPD1-Dap10 T細胞は、セントラルメモリー分化をサポートする転写因子、EomesおよびBCL-6の発現を増加させた（図5a）。さらに、chPD1-Dap10 T細胞はセントラルメモリー表現型に関連する細胞表面マーカー（CD127hi、CD62Lhi、KLRG1lo）を発現し、chPD1-CD28 T細胞はエフェクターメモリー表現型マーカー（CD127lo、CD62Llo、KLRG1hi）を発現した（図5b）。これらのデータは、chPD1-Dap10およびchPD1-CD28受容体が異なるT細胞表現型を誘導し、in vivo抗腫瘍効果の変化に寄与している可能性があることを示す。
【００８７】
chPD1‐CD28 T細胞による治療と比較して、chPD1‐Dap10 T細胞による治療は、腫瘍組織量のより大きな減少およびRMA‐GFP保有マウスの生存の増加をもたらす
chPD1-Dap10およびchPD1-CD28 T細胞のin vivo治療効果を比較するために、リンパ腫を有するマウスをwtPD1、chPD1-Dap10、またはchPD1-CD28 T細胞の2用量で処理した。chPD1‐Dap10またはchPD1‐CD28 T細胞による治療は腫瘍組織量を有意に減少させ、chPD1‐Dap10 T細胞はchPD1‐CD28 T細胞よりも腫瘍組織量を大幅に減少させた（図6a）。さらに、2用量のchPD1-Dap10 T細胞による治療は、chPD1-CD28 T細胞による治療を受けたマウス（14％のマウス）と比較して、より高い割合のマウス（66％のマウス）で長期の腫瘍のない生存をもたらした（図6b）。 chPD1-Dap10 T細胞の抗腫瘍効果の増強に寄与した1つの潜在的要因は、リンパ腫を有するマウスの脾臓およびリンパ節におけるそれらのin vivoでの高い持続性であった（図6c）。Ly5.1 + chPD1-Dap10 T細胞は、T細胞注射の14日後に脾臓とリンパ節のフローサイトメトリーで検出可能であったが、chPD1-CD28 T細胞は10日後には検出されなかった。chPD1 T細胞は、このリンパ腫のマウスモデルで腫瘍組織量を減少させ、生存率を高めることができ。また、Dap10共刺激ドメインを含めると、CD28を含むchPD1受容体と比較して、in vivoでの治療効果が高めることができた。
【００８８】
考察
CARsの導入により、癌に対するT細胞療法の潜在的な有効性が劇的に増加した。1、3、33しかしながら、PD1受容体の発現を含むT細胞の阻害性受容体発現のアップレギュレーション、および腫瘍微小環境における阻害リガンドの発現はCAR T細胞の応答性と有効性を制限する。9、34-36この研究は、新規chPD1受容体の発現がリンパ腫のマウスモデルにおいてT細胞抗腫瘍効果を増強することを示す。結果は、ｃｈＰＤ１受容体形質導入Ｔ細胞が腫瘍上のＰＤＬ発現を標的とし、ＰＤＬとの相互作用がＴ細胞の阻害の代わりに活性化を誘導することを示唆している。chPD1を発現するT細胞は、炎症誘発性サイトカインを分泌し、PDLを発現する腫瘍細胞を溶解し、リンパ腫を有するマウスにおいて腫瘍組織量を減少させ、腫瘍のない生存を増加させた。さらに、Dap10共刺激ドメインを含むchPD1受容体は、CD28共刺激ドメインを含むchPD1受容体と比較して機能的により優れていた。
【００８９】
T細胞をPD1阻害から保護する多くの新しいメカニズムが開発されている。PD1遮断に加えて、PD1の細胞質ドメインをCD28の細胞質ドメインに置き換えるPD1-CD28スイッチ受容体の発現は、T細胞の阻害を防ぐことが示されている。37-40腫瘍特異的T細胞受容体またはCARと共発現した場合、PD1-CD28スイッチ受容体は、細胞外シグナル調節キナーゼリン酸化、サイトカイン分泌、増殖、グランザイムB発現に示されるように、T細胞活性化を誘導し、抗腫瘍機能を増強する。37-40私たちの研究は、PD1細胞外ドメインをDap10またはCD28の細胞外ドメインおよびとCD3ζに直接つなげたCARを発現するT細胞の有効性をテストすることであり、活性化と共刺激シグナルの両方を同じ受容体内で提供し、T細胞において2つの受容体を共発現する必要性をなくすことである。さらに、これまでのPD1スイッチ受容体研究の多くは、免疫不全マウスモデルでのヒトT細胞の抗腫瘍効果をテストしていた。37、38しかしながら、CAR T細胞は、完全な抗腫瘍効果のために宿主免疫応答の誘導を必要とすることがよくある。15,30-32さらに、免疫不全マウスでのヒトCAR T細胞の有効性のテストでは、抗腫瘍免疫応答における骨髄由来サプレッサー細胞や制御性T細胞を含む他の免疫細胞の役割は調査されていない。したがって、マウスchPD1受容体の作製により、免疫応答性宿主におけるchPD1 T細胞の有効性の研究が可能になり、T細胞が患者の体内で遭遇する可能性が高い腫瘍微小環境を再現する。
【００９０】
CARsに共刺激ドメインを含めると抗腫瘍効果が高まるため、CAR T細胞臨床試験の大部分は、CD3ζとCD28または4-1BB共刺激ドメインからなる第2世代のCARsを使用しています。1、3、4、15 、16、33、41 CD28または4‐1BBシグナル伝達ドメインを持つCAR T細胞に観察される1つの違いは、4‐1BBの包含がセントラルメモリー表現型を誘発し、これらのT細胞は生体内でより長く持続し、より強力な抗腫瘍作用を有するが、一方でCD28-CARを有するT細胞はエフェクターメモリーまたはエフェクター細胞の表現型を誘導し、生体内での生存期間は長くはない。3、42 4‐1BBを含むCARを発現するT細胞におけるセントラルメモリー表現型の誘導は、呼吸能力の増強、脂肪酸酸化の増加、ミトコンドリア生合成の増強を含む明確な代謝特性により部分的に引き起こされたのに対し、CD28ドメインを持つCAR T細胞はエフェクターメモリー細胞を誘導し、解糖特性を増強した。42本研究では、 Dap10共刺激ドメインの包含は、in vivoで優れた抗腫瘍免疫を誘導した。理論に縛られないが、これは、セントラルメモリー表現型の誘導により潜在的に引き起こされ、chPD1-Dap10 T細胞のin vivo生存を増強できた可能性がある。興味深いことに、mTORは好気性解糖などのT細胞の特定の代謝経路を活性化し、CD28共刺激と比較して、NKG2D / Dap10による活性化はmTORの弱い活性化を示す。29、43したがって、mTORの活性化、代謝、および細胞分化の誘導は、CAR T細胞の成功において重要な特徴である可能性がある。
【００９１】
クリニックでは、CAR T細胞の注入後の副作用の1つに、サイトカイン放出症候群として知られる免疫活性化の発症がある。44，45これには、CAR T細胞注入後のIFN-γ、GM-CSF、IL-10およびIL-6を含むサイトカインの上昇を含む可能性があり、Iサイトカインの劇的な増加は、一般に養子移入細胞の増殖と活性化に相関する。45この研究では、chPD1-Dap10 T細胞とchPD1-CD28 T細胞の間に観察された1つの違いは、サイトカインの差次的発現にあり、chPD1‐Dap10 T細胞はより多くの炎症誘発性サイトカインTNF‐α、GM‐CSF、IL‐17およびIL‐21を分泌し、chPD1‐CD28 T細胞はより多くのIL‐2ならびにTヘルパー2型/抗炎症性サイトカインIL-5およびIL-10を分泌する（図4）。炎症誘発性サイトカインの分泌は抗腫瘍免疫に有益であり、抗炎症性サイトカインの同時分泌は免疫応答を阻害する可能性があるが、T細胞の抗腫瘍効果を妨げることなく、制御されていない炎症を緩和または防止する適切なCAR設計を選択することが課題として残っているかもしれない。chPD1 T細胞を投与された担癌マウスは、治療後に悪影響を示さず、長期間生存した。しかしながら、サイトカイン放出症候群の重症度の程度は、注入時の疾患の負荷によっておそらく決定されうる。44-47chPD1‐Dap10 T細胞からの炎症性サイトカインの高分泌は、おそらくそれらのより強力な抗腫瘍効果に寄与するが、炎症性サイトカインの分泌が有害な量の炎症を誘発するかどうかを決定するために、より多くの腫瘍組織量を有するマウスのサイトカイン放出症候群の症状を観察してもよい。さらに、chPD1-Dap10 T細胞は、IL-6R遮断剤などのサイトカイン放出症候群を予防する薬剤と組み合わせることができる。
【００９２】
この研究では、chPD1受容体にDap10共刺激ドメインを含めてもIL-10の分泌は誘導されなかったが、CD28ドメインを含めると誘導された。 CD28によって誘導されるIL-10の分泌は、抗原提示細胞上のMHC分子、CD28リガンド、および細胞間接着分子-1のダウンレギュレーションを介してT細胞の抗腫瘍応答を変化させることが示される。48結果として、宿主T細胞応答が阻害され、炎症誘発性サイトカインの分泌が抑制される。さらに、いくつかの研究では、抗炎症性サイトカインの分泌がCAR T細胞の有効性を阻害するだけでなく、慢性毒性を誘発することも示されている。49したがって、理論に縛られないが、chPD1-Dap10 T細胞からのIL-10分泌の減少は、in vivo抗腫瘍効果の増強に寄与している可能性がある。
【００９３】
要約すると、リンパ腫の免疫適格マウスモデルで強力な抗腫瘍T細胞応答の誘導と長期の無腫瘍生存をもたらす新しいchPD1受容体が開発された。Dap10共刺激受容体の含有によりもたらされる炎症誘発性サイトカインの強力な誘導は、抗腫瘍療法に有益である。
【００９４】
実施例２免疫療法としてキメラ−ＰＤ１−Ｄａｐ１０受容体を発現するヒトＴ細胞。
腫瘍反応性T細胞の養子移入は、多くの癌に対する有望な抗腫瘍療法である。T細胞による腫瘍認識を強化するために、腫瘍抗原を認識する受容体に融合したシグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体（CAR）を作製し、T細胞で発現させた。実施例１に示されるように、新しいキメラ抗原受容体の標的である１つの受容体は、ＰＤ１である。なぜなら、ＰＤ１受容体のリガンドは多くの癌タイプで発現しているためである。本研究では、PD1受容体細胞外ドメインとCD3ゼータの活性化ドメインからなるヒトのキメラPD1受容体（chPD1）を開発した。実施例１で論じたように、Ｄａｐ１０共刺激ドメインもｃｈＰＤ１受容体に含めた。ＣＡＲの核酸配列は配列番号２に示され、アミノ酸配列は配列番号３に示す。新規CARは多種多様な腫瘍を標的とすることができるか確認するために、ヒトリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、膵臓、乳房、および卵巣のがん細胞株に対するchPD1 T細胞の抗腫瘍効果を測定した。テストした8つの細胞株のうち、すべてが細胞表面にPD1リガンドを発現し、chPD1 T細胞の潜在的な標的であった。chPD1受容体は正常にヒトT細胞の表面に発現し、chPD1 T細胞の発現はすべての腫瘍細胞株の有意な腫瘍細胞溶解を誘発し、炎症性（IFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-17）を分泌しました、およびIL-21）サイトカインの分泌を促した。このように、chPD1-Dap10 T細胞の養子移入は、複数の種類の癌を治療するための新しい治療戦略となる。
【００９５】
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本発明をその好ましい実施形態で説明してきたが、当業者は、本発明が添付の特許請求の範囲の主旨および範囲内で変形して実施できることを認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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