(57)【要約】  本発明は、ビタミンＡの生産のための重要な構成要素であるレチニルエステル、特に酢酸レチニルなどの生産に関する。レチニルエステルはレチノールの酵素変換によって生成することができ、本プロセスは、アセチル−トランスフェラーゼ（ＡＴＦ）活性を有し、したがってレチノールを酢酸レチノール／レチニルにアセチル化する酵素の使用を含む。前記プロセスは特に、ビタミンＡの生物工学的生産のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチル化活性、例えばレチノールアセチル化活性、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］活性、より好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１活性を有する酵素を含むカロテノイド産生宿主細胞であって、レチノールからレチニルエステルへの変換率が少なくとも１０％でレチニルエステル混合物を産生する、カロテノイド産生宿主細胞。
【請求項２】
トランス−レチノールのアセチル化に対する優先性のあるレチノールアセチル化活性を有する酵素を含む、請求項１に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項３】
前記レチニルエステルが酢酸レチニルから選択される、請求項１又は２に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項４】
異種アセチルトランスフェラーゼ、好ましくは異種アセチルトランスフェラーゼ１を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項５】
前記アセチルトランスフェラーゼ、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１が、植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌から選択され、好ましくは、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、エウオニムス属（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びラカンケア属（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項６】
前記アセチルトランスフェラーゼが、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、エウオニムス・アラトゥス（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ａｌａｔｕｓ）、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミケス・クドリアヴゼヴィ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、サッカロミケス・アルビロコラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ａｒｂｉｒｏｃｏｌａ）、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、又はラカンケア・フェルメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）から選択されるアセチルトランスフェラーゼ１である、請求項５に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項７】
前記アセチルトランスフェラーゼ１が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１６又は１８に従うアセチルトランスフェラーゼ１に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項６に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、パラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項９】
酢酸レチニルを含む前記レチニルエステルがさらにビタミンＡに変換される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項１０】
アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］の酵素活性、好ましくは、アセチルトランスフェラーゼ１の活性によって、酢酸レチニルを含むレチニルエステル混合物を生産するためのプロセスであって、レチノールを、前記アセチルトランスフェラーゼ、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１と接触させることを含み、前記レチノールの少なくとも約６５〜９０％がトランス−アイソフォームである、プロセス。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞を用いる、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
（ａ）本明細書で定義されるアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］をコードする核酸分子を、適切なカロテノイド産生宿主細胞、好ましくは請求項１〜９のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）少なくとも約６５〜９０％をトランス−レチノールとしてトランス−及びシス−レチノールを含むレチノールを、シス−及びトランス−酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下で酢酸レチニルをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【請求項１３】
トランス−及びシス−酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物を生産するためのアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］の使用であって、前記酢酸の少なくとも約６５〜９０％がトランス−アイソフォームであり、前記アセチルトランスフェラーゼが請求項１〜９のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞において異種発現され、前記酢酸レチニル混合物がトランス−及びシス−レチノールを含むレチノール混合物の変換によって得られ、前記レチノールの少なくとも約６５〜９０％がトランス−アイソフォームである、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ビタミンＡの生産のための重要な構成要素であるレチニルエステル、特に酢酸レチニルなどの生産に関する。レチニルエステルはレチノールの酵素変換によって生成することができ、本プロセスは、アセチル−トランスフェラーゼ（ＡＴＦ）活性を有し、したがってレチノールを酢酸レチノール／レチニルにアセチル化する酵素の使用を含む。前記プロセスは特に、ビタミンＡの生物工学的生産のために有用である。
【０００２】
レチニルエステル、特に酢酸レチニルは、特にビタミンＡなどのレチノイドの生産のための重要な中間体又は前駆体である。ビタミンＡを含むレチノイドは、食物による供給を受けなければならないヒトにとって非常に重要で不可欠な栄養素の１つである。レチノイドは、特に視覚、免疫系及び成長に関して、ヒトの健康な状態を促進する。
【０００３】
特にビタミンＡ及びその前駆体である、レチノイドの現在の化学的生産方法は、例えば、高エネルギー消費、複雑な精製工程及び／又は望ましくない副産物などのいくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、過去数十年間にわたって、特にビタミンＡ及びその前駆体であるレチノイドを製造するために、より経済的且つ生態学的であり得る、微生物変換工程を含む他のアプローチが研究されている。
【０００４】
一般に、レチノイドを産生する生物系は産業的に扱いが困難であり、且つ／或いは非常に低レベルの化合物を生じるので、産業規模の単離が経済的利益において実用的でない。これには、このような生物系におけるレチノイドの不安定性、又は比較的高い副産物の生成を含むいくつかの理由がある。
【０００５】
サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）由来のＡｔｆ１の作用による、例えばアスタキサンチンなどのカロテノイドのアセチル化は、既に報告されている（国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレット）。しかしながら、アスタキサンチンのアセチル化ヒドロキシ基はベータ−イオノン環構造上に位置するので、これらの酵素は通常非常に狭い基質特異性を有するが、レチノールのアセチル化ヒドロキシ基は分子の脂肪性端部上にあって、ベータ−イオノン環上ではない。そのためこれらのアセチル化ヒドロキシ官能基はそれぞれ非常に異なる局所構造状況にあり、したがってその活性部位においてわずかな構造変化を有する種々のＡＴＦ酵素は、レチノイド対カロテノイドにおいてこれらのヒドロキシ基に対して非常に異なる親和性を有し得る。したがって、既に開示されたようなカロテノイドにおけるＳｂＡＴＦ１の活性から、当業者は、レチノイドに対する作用がどのようになるかを予測することができない。
【０００６】
したがって、ベータ−カロテンからビタミンＡの生産のためのレチノイド構成要素への変換に対する産物特異性及び／又は生産性が改善された酵素の使用を含む代替（生物工学的）経路を探すことが継続中の課題である。特に、レチノールから例えば酢酸レチニルなどのレチニルエステルへの変換に関与する酵素の生産性を最適化することが望ましい。
【０００７】
驚くことに、我々は今回、レチニルエステル、例えば酢酸レチニルの生成に対して少なくとも約１０％の全変換率で、レチノール、好ましくはトランス−レチノールをレチニルエステル、特に酢酸レチニルに変換することができる特異的なアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）を特定することができた。
【０００８】
特に、本発明は、レチノールをレチニルエステル、特に酢酸レチニルにアセチル化する活性を有する、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞において発現されるアセチル化酵素［ＥＣ２．３．１．８４］、特にＡｔｆ１に関し、酢酸レチニルの産生に対する全変換率は、前記宿主細胞により産生されるレチノイド混合物内のレチノイドの総量を基準として少なくとも約１０％、好ましくは１２、１５、２０、３０、４０、５０、８０、９０又はさらに１００％である、すなわち、レチニルエステル、特に酢酸レチニルの量は、宿主細胞により産生される前記レチノイド混合物中に存在するレチノールの量と比較して、少なくとも１０％である。本明細書で定義されるＡｔｆ１酵素は、特に、トランス−レチノール、又はトランス−レチノールの割合が少なくとも６５％でシス−及びトランス−レチノールを含むレチノール混合物のアセチル化に有用であり、トランス−レチニルエステルの形成がもたらされる。
【０００９】
「アセチルトランスフェラーゼ」、「レチノールアセチル化酵素」、「レチノールアセチル化活性を有する酵素」又は「ＡＴＦ」という用語は本明細書において互換的に使用され、トランス−アイソフォームで産生される酢酸レチニルが少なくとも８０％、約８７、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までの量で、レチノールから酢酸レチニルへの変換を触媒することができる酵素［ＥＣ２．３．１．８４］を指す。前記ＡＴＦは、レチニルエステル、例えば酢酸レチニルの生成に対して少なくとも約１０％、好ましくは１２、１５、２０、３０、４０、５０、８０、９０又はさらに１００％（前記宿主細胞により産生されるレチノイド混合物内のレチノイドの総量を基準として）の全変換率で、レチノール、好ましくはトランス−レチノールをレチニルエステル、特に酢酸レチニルに変換することができる。好ましいアイソフォームはＡＴＦ１である。
【００１０】
レチノールの酵素触媒作用に関連する「変換」、「酵素変換」、「アセチル化」又は「酵素的アセチル化」という用語は本明細書において互換的に使用され、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の作用を指す。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「真菌宿主細胞」という用語は、特に、宿主細胞としての酵母、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などを含む。
【００１２】
ＡＴＦ酵素は単離形態（例えば、無細胞系）において使用されてもよいし、又は例えば、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞において発現されてもよい。酵素は、内在性酵素として発現されても、異種酵素として発現されてもよい。好ましくは、本明細書に記載される酵素は、例えば、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞に異種酵素として導入及び発現される。
【００１３】
本発明に従う適切なＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素は、例えば、植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌などの任意の供給源から得ることができる。特に有用なＡＴＦ、好ましくはＡＴＦ１酵素は、酵母、特にサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はラカンケア属（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）から得られ、好ましくは、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、例えば、ＳｂＡＴＦ１（ＡＨＸ２３９５８．１に由来するポリペプチド配列）など、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｍｉｒａｎｔｉｎａ）（ＬｍＡＴＦ１；配列番号３３）、又はラカンケア・フェルメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、例えばＬｆＡＴＦ１（ＳＣＷ０２９６４．１に由来するポリペプチド配列）若しくはＬｆｆＡＴＦ１（ＬＴ５９８４８７に由来するポリペプチド配列）などから得られる。さらに、特に有用なＡＴＦ１酵素は、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、エウオニムス属（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ）、マルス属（Ｍａｌｕｓ）、又はフラガリア属（Ｆｒａｇａｒｉａ）から選択される植物を含むがこれらに限定されない植物から得られ、好ましくは、Ｐ．ヒブリダ（Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ）、例えばＰｈＡＴＦ（ＡＢＧ７５９４２．１に由来するポリペプチド配列）、Ｅ．アラトゥス（Ｅ．ａｌａｔｕｓ）、例えばＥａＣＡｃＴ（ＡＤＦ５７３２７．１に由来するポリペプチド配列）、Ｍ．ドメスティカ（Ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（ＡＹ５１７４９１に由来するポリペプチド配列）、又はＦ．アナナッサ（Ｆ．ａｎａｎａｓｓａ）（ＡＥＭ４３８３０．１に由来するポリペプチド配列）から得られる。さらに、特に有用なＡＴＦ１酵素は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、好ましくは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られ、例えば、ＥｃＣＡＴ（ＥＤＳ０５５６３．１に由来するポリペプチド配列）などである。
【００１４】
一実施形態では、本明細書で定義されるＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１酵素活性を有する、すなわちレチノールのアセチル化によるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）（ＰｈＡＴＦ）などの植物から得ることができ、特に、ＡＢＧ７５９４２．１に由来するポリペプチド配列に対して少なくとも約６０％、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号１１に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、７０、７５、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１５】
一実施形態では、本明細書で定義されるＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１酵素活性を有する、すなわちレチノールのアセチル化によるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、エウオニムス・アラトゥス（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ａｌａｔｕｓ）（ＥａＣＡｃＴ）などの植物から得ることができ、特に、ＡＤＦ５７３２７．１に由来するポリペプチド配列に対して少なくとも約６０％、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド（前記配列は、適切なカロテノイド産生宿主細胞において、本明細書に記載される適切な条件下で発現される）、例えば、配列番号７に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１６】
さらなる実施形態では、本明細書で定義されるＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１酵素活性を有する、すなわちレチノールのアセチル化によるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｃＣＡＴ）などの細菌から得ることができ、特に、ＥＤＳ０５５６３．１に由来するポリペプチド配列に対して少なくとも約６０％、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号５に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１７】
一実施形態では、本明細書で定義されるＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１酵素活性を有する、すなわちレチノールのアセチル化によるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（ＳｂＡＴＦ１）などの酵母から得ることができ、特に、配列番号１に対して少なくとも約６０％、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１８】
別の実施形態では、本明細書で定義されるＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１酵素活性を有する、すなわちレチノールのアセチル化によるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｍｉｒａｎｔｉｎａ）（ＬｍＡＴＦ１）などの酵母から得ることができ、特に、配列番号１３に対して少なくとも約６０％、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００１９】
更に別の実施形態では、本明細書で定義されるＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１酵素活性を有する、すなわちレチノールのアセチル化によるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、ラカンケア・フェルメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）などの酵母から得ることができ、特に、ＬＴ５９８４８７又はＳＣＷ０２９６４．１に由来するポリペプチド配列に対して少なくとも約６０％、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号１６又は１８によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。
【００２０】
本明細書に記載される宿主細胞は、レチニルエステルの産生に対して少なくとも約１０％、好ましくは１２、１５、２０、３０、４０、５０、８０、９０又はさらに１００％の割合でレチノールをレチニルエステル、特に酢酸レチニルに変換することができる。好ましくは、このような全変換率は、少なくとも約６５％の割合がトランス−レチノールであり、例えば、少なくとも約６８、７０、７５、８０、８５、８７、９０、９２、９５、９８、９９又は最大１００％までがトランス−アイソフォームのレチノールであり、例えば、約６５〜９０％がトランス−アイソフォームである、シス−及びトランス−レチノールを含むレチノール混合物から得られ、これらは、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において産生される。
【００２１】
好ましくは、本明細書に記載されるような大量のトランス−レチノールを産生するカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、レチニルエステルに対して少なくとも約１０％の全変換率で、得られたレチノールをレチニルエステル、例えば酢酸レチニルに変換する宿主細胞と同じである。好ましくは、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１の作用によってレチニルエステル、特に酢酸レチニルに変換され得るレチノール混合物は、少なくとも６５％のトランス−レチノール、例えば、約６５〜９０％のトランス−アイソフォームを含み、レチニルエステル混合物中に少なくとも６５％の割合のトランス−レチニルエステルをもたらす。
【００２２】
したがって、一実施形態では、本発明は、レチノール混合物中に少なくとも６５％の割合のトランス−レチノールを有するシス−及びトランス−レチノールの混合物を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、前記レチノール混合物は、レチニルエステル、特に酢酸レチニルに対して少なくとも１０％の変換率で、レチノール、好ましくはトランス−レチノールからレチニルエステル、例えば酢酸レチニルへの変換を触媒する本明細書で定義される特異的ＡＴＦ、特にＡｔｆ１によって変換され、少なくとも６５％の割合のトランス−レチニルエステル、例えばトランス−酢酸レチニルを有し得る。
【００２３】
本明細書で定義される宿主細胞に、遺伝子及び／又はタンパク質、例えば、好ましくは少なくとも６５％のエステルがトランス−アイソフォームであるレチニルエステル、特に酢酸レチニルの形成に対する選択性を有するＡＴＦなどのコピーをより多く生じさせるための改変は、強力なプロモーター、適切な転写及び／若しくは翻訳エンハンサーの使用、又はカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞への１つ若しくは複数の遺伝子コピーの導入を含み、所与の時間におけるそれぞれの酵素の蓄積の増大をもたらし得る。当業者には、宿主細胞に基づいてどの技術を使用するかが分かる。遺伝子発現の増大又は低減は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００２４】
核酸又はアミノ酸への突然変異の発生、すなわち突然変異誘発は、例えば、ランダム若しくは部位特異的（ｓｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、例えば放射線などの作用物質によって生じる物理的損傷、化学的処理、又は遺伝因子の挿入などによる種々の方法で実施され得る。当業者には、突然変異を導入する方法が分かる。
【００２５】
したがって、本発明は、発現ベクター、又は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた本明細書に記載されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。本明細書に記載されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードする、発現ベクター上の又は染色体ＤＮＡに組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むこのようなカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、組換え宿主細胞と呼ばれる。カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードする遺伝子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１６又は１８に対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの１つ又は複数のコピーを含有し、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするこのような遺伝子の過剰発現をもたらし得る。遺伝子発現の増大は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００２６】
本明細書で開示される配列と、少なくとも約１０％の全変換率でレチニルエステル、例えば酢酸レチニルとして得られる、レチノール（好ましくは、トランス−アイソフォーム）からレチニルエステル（好ましくは、トランス−アイソフォーム）、特に酢酸レチニルへのアセチル化に対する優先性とに基づいて、レチノールからレチニルエステル、特に酢酸レチニルへの変換に使用され得る、本明細書で定義されるレチノールアセチル化活性を有するポリペプチドをコードするさらなる適切な遺伝子を容易に推定することができる。したがって、本発明は、新規のアセチル化酵素を同定するための方法に関し、ここで、レチノールの変換からのレチニルエステル、特に酢酸レチニルの産生に対する優先性を有する新規のＡＦＴ酵素、特にＡｔｆ１酵素のスクリーニングプロセスにおけるプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１６又は１８などの既知の配列に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドが使用され、好ましくは、レチノールは、少なくとも約６５％のレチノールをトランス−レチノールとして含む。アセチル化作用が、産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約１０％のレチニルエステル、特に酢酸レチニルをもたらす限り、ＡＴＦ活性、特にＡｔｆ１活性を有し、本明細書で開示されるあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されるレチノールからのレチニルエステル、特に酢酸レチニルの産生のために使用され得る。
【００２７】
本発明は特に、レチニルエステル、特に酢酸レチニルの生産プロセスにおけるこのような新規のＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の使用に関し、ここで、レチノールＬＣ−アシルの生産は低減される。このプロセスは、前記ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素を発現する適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いて実施することができ、好ましくは、前記酵素をコードする遺伝子は異種発現される、すなわち前記宿主細胞に導入される。レチニルエステル、特に酢酸レチニルはさらに、（既知の）適切な化学的又は生物工学的機構の作用によってビタミンＡに変換され得る。
【００２８】
したがって、本発明は、本明細書で定義されるＡｔｆ１酵素の１つの酵素活性によって酢酸レチニル、好ましくは少なくとも６５％の割合のトランス−酢酸レチニルを含むレチニルエステル混合物を生産するためのプロセスに関し、レチノール、好ましくはトランス−レチノール、又は少なくとも６５〜９０％のトランス−アイソフォームを有するレチノール混合物を、前記Ａｔｆ１酵素と接触させることを含む。特に、本発明は、ビタミンＡの生産プロセスに関し、前記プロセスは、（ａ）本明細書で定義されるＡｔｆ１酵素の１つをコードする核酸分子を、本明細書で定義される適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入することと、（ｂ）前記発現されたＡｔｆ１の作用によって、好ましくは少なくとも６５〜９０％の割合のトランス−レチノールを有するレチノールを、トランス−及びシス−酢酸レチニルの混合物に酵素変換、すなわちアセチル化することと、（３）当業者に知られている適切な条件下で前記酢酸レチニルをビタミンＡに変換することを含む。
【００２９】
「配列同一性」、「同一性％」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的で、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列同一性の割合を決定するために、配列は最適な比較を目的として整列されることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアライメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アライメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって行われてもよい。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列はいずれも、このアルゴリズムによって整列され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列につては、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択的パラメータは、１０のギャップ−オープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらの異なるパラメータ全てがわずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを用いたときに２つの配列の全体の同一性の割合は有意に変化されないことを認識するであろう。
【００３０】
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメントの後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：両方の配列内の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメント内の対応する位置の数を、アライメント内のギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「最長同一性」として標識される。比較される両方のアミノ酸配列が、そのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、これらは同一である、すなわち１００％の同一性を有する。本明細書で定義される植物に由来する酵素に関して、当業者には、植物由来の酵素が例えば葉緑体プロセシング酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素により切断され得る葉緑体標的シグナルを含有し得ることが分かる。
【００３１】
本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素は、酵素活性を変更しないアミノ酸置換、すなわち野生型酵素に関して同じ特性を示し、レチノールからレチニルエステル、特に酢酸レチニルへの変換を触媒するアミノ酸置換を保有する酵素も包含し、ここで、レチノール、例えば、少なくとも６５％のトランス−レチノールを含むレチノール混合物の少なくとも約１０％は、レチニルエステル、特に酢酸レチニルに変換される。このような突然変異は「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載される酵素の（酵素）活性を変更しない。
【００３２】
本発明に従う核酸分子は、本明細書で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ又は断片、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得る断片、又は本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡＴＦ１の一部をコードする断片を含み得る。ＡＴＦ遺伝子、特にＡＴＦ１遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種からの他の相同体の同定及び／又はクローニングにおいて使用するために設計されるプローブ及びプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、これは、通常、本明細書で開示されるヌクレオチド配列の少なくとも約１２若しくは１５、好ましくは約１８若しくは２０、より好ましくは約２２若しくは２５、さらにより好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、若しくは７５以上の連続ヌクレオチド、又はこれらの断片若しくは誘導体に対して好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００３３】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃における６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃における１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回又は複数回の洗浄である。
【００３４】
高ストリンジェント条件には、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むか又は含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、又は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、及び２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含む溶液などの溶液中でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識化系；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙを用いて調製）を用いた４２℃における２時間〜４日間のインキュベーションと、その後、室温において２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で５〜１５分間フィルターを２回洗浄し、次に、６５〜６８℃において０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ又は０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５〜３０分間２回洗浄することが含まれる。
【００３５】
本明細書で定義される特異的ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の１つをコードする酵素／ポリヌクレオチドの発現は、カロテノイド／レチノイドの産生に適しており、且つ本明細書に記載される機能的等価物又は誘導体を含む本明細書で開示される酵素の１つをコードする核酸の発現を可能にする（微）生物を含む任意の宿主系において達成することができる。適切なカロテノイド／レチノイド産生宿主（微）生物の例は、細菌、藻類、酵母を含む真菌、植物又は動物細胞である。好ましい細菌は、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、例えばパラコックス・ゼアキサンチニファキエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などのパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）のものである。好ましい真核微生物、特に酵母を含む真菌は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）などのフィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、例えばブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）などのブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。特に好ましいのは、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）若しくはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞における発現、又はエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）における発現、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現である。
【００３６】
宿主細胞に応じて、レチノールのアセチル化のための本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、それぞれの宿主細胞における発現のために最適化され得る。当業者には、このような改変ポリヌクレオチドを作成する方法が分かる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、このような宿主最適化核酸分子が本明細書で定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、これらも包含することが理解される。
【００３７】
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドを含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、これは、宿主細胞又は酵素の成長又は発現パターンに影響を与えずに、前記宿主細胞における発現のために最適化されている。特に、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、酵母、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などから選択され、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１５、１７、又は１９に対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリヌクレオチドから選択される。
【００３８】
本発明に関して、例えば、微生物、真菌、藻類又は植物などの生物は、原核生物の国際命名規約又は藻類、真菌、及び植物の国際命名規約（メルボルン規約）によって定義されるような、同じ生理学的特性を有するこのような種の同義語又はバソニムも含むことが理解される。したがって、例えば、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｍｉｒａｎｔｉｎａ）菌株は、日本由来のジゴサッカロミケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種ＩＦＯ１１０６６菌株の同義語である。
【００３９】
本発明は、例えば、ビタミンＡの生産における構成要素として使用され得るレチニルエステル、特に酢酸レチニルを生産するためのプロセスに関し、ここで、レチニルエステルは、本明細書に記載されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の作用により本明細書で開示されるレチノールのアセチル化によって生成され（特に、少なくとも６５％をトランス−レチノールとして含むレチノールの変換から得られる少なくとも６５％のトランス−アイソフォームのレチニルエステルを含む）、アセチル化酵素は、好ましくは、本明細書に記載される適切な条件下、適切な宿主細胞において異種発現される。産生されるレチニルエステル、特に酢酸レチニルは、培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。本明細書で定義される前記アセチル化エステルは、ビタミンＡをもたらす多段階プロセスにおける構成要素として使用することができる。ビタミンＡは、当該技術分野で知られているように培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。
【００４０】
好ましくは、本明細書に記載されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の使用によるレチノールのアセチル化は、宿主細胞により産生されるレチノイド混合物中に存在するアセチル化レチノイド、すなわちレチニルエステルの、少なくとも約１０％、例えば、１２、１５、２０、３０、４０、５０、８０、９０又はさらに１００％の増大をもたらす。好ましいのは、本明細書で定義されるＡｔｆ１酵素の作用によるトランス−レチノールからトランス−レチニルエステルへのアセチル化である。
【００４１】
ベータ−カロテン産生遺伝子、本明細書で定義されるＡＴＦ遺伝子、特にＡＴＦ１遺伝子、任意選択的に、ベータ−カロテン酸素化酵素をコードする遺伝子、任意選択的に、レチナール還元酵素をコードする遺伝子、及び／又はビタミンＡの生合成に必要とされるさらなる遺伝子を発現することができる宿主細胞、すなわち微生物、藻類、真菌、動物又は植物細胞は、好気性又は嫌気性条件下で適切な栄養分が補充され、それぞれのカロテノイド産生宿主細胞に対して当業者により知られているような水性培地中で培養され得る。任意選択的に、このような培養は、当該技術分野において知られている電子の移動に関与するタンパク質及び／又は補助因子の存在下で行われる。宿主細胞の培養／成長は、バッチ、流加バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、半連続又は連続モードで行うことができる。宿主細胞に応じて、好ましくは、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体（レチナール、レチノール、レチニルエステルなど）などのレチノイドの産生は、当業者に知られているように異なり得る。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択されるベータ−カロテン及びレチノイド産生宿主細胞の培養及び単離は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される宿主細胞におけるベータ−カロテン及びレチノイドの産生に関して、方法は、例えば、米国特許出願公開第２００７０１６６７８２号明細書に記載されている。
【００４２】
本明細書で使用される場合、酵素に関して「比活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。比活性は、規定温度において所与の期間に規定量のタンパク質によって消費される基質及び／又は産生される産物の量を定義する。通常、比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）で略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）という比活性の単位の定義は、本文書を通して互換的に使用される。酵素は、インビボで、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内、又は適切な基質が存在する適切な（無細胞）系内でその触媒活性を実施すれば活性である。当業者には、酵素活性の測定方法が分かる。レチノールの変換からのレチニルエステルの産生、特に酢酸レチニルの産生について本明細書で定義される適切なＡＴＦ、特にＡｔｆ１の能力を評価するための分析方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの実施例４などに記載されている。簡単には、レチニルエステル、特に酢酸レチニル、レチノール、トランス−レチナール、シス−レチナール、ベータ−カロテンなどの産物の力価は、ＨＰＬＣによって測定することができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、カロテノイド産生宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、カロテノイド、例えばベータ−カロテンの産生をもたらす宿主細胞である。カロテノイド産生宿主細胞を作成するための遺伝子及び方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットが参照される。産生されるカロテノイドに応じて、異なる遺伝子が関与し得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、レチノイド産生宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、ベータ−カロテンからレチナール、レチノール及びレチニルエステルへの酵素変換によって、レチノイド、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体の産生をもたらす宿主細胞である。これらのポリペプチドは、本明細書で定義されるＡＴＦを含む。ビタミンＡ経路の遺伝子、及びレチノイド産生宿主細胞の作成方法は、当該技術分野において知られている。
【００４５】
本明細書で使用されるレチノイドは、レチナール、レチノール酸、レチノール、レチノイン酸メトキシド（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）、酢酸レチニル、レチニルエステル、４−ケト−レチノイド、３ヒドロキシ−レチノイド又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されないアポカロテノイドとしても知られているベータカロテン切断産物を含む。本明細書で使用される長鎖レチニルエステルは、少なくとも約８個、例えば、９、１０、１２、１３、１５又は２０個の炭素原子及び最大約２６個まで、例えば、２５、２２、２１個又はそれより少ない炭素原子からなり、好ましくは最大約６個までの不飽和結合、例えば、０、１、２、４、５、６個の不飽和結合を有する炭化水素エステルを定義する。長鎖レチニルエステルは、リノール酸、オレイン酸又はパルミチン酸を含むが、これらに限定されない。レチノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。
【００４６】
本明細書で使用されるレチナールは、ＩＵＰＡＣ名（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエナールで知られている。これは、本明細書では互換的にレチンアルデヒド又はビタミンＡアルデヒドと称され、シス−及びトランス−アイソフォームの両方、例えば、１１−シスレチナール、１３−シスレチナール、トランス−レチナール及び全トランスレチナールなどが含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される「カロテノイド」という用語は、当該技術分野においてよく知られている。これは、２つの２０炭素ゲラニルゲラニルピロリン酸分子の連結により天然で形成される長い４０炭素の結合イソプレノイドポリエンを含む。これらには、４−ケト位置又は３−ヒドロキシ位置で酸化されてカンタキサンチン、ゼアキサンチン、又はアスタキサンチンをもたらし得る、フィトエン、リコペン、及び例えばベータ−カロテンなどのカロテンが含まれるが、これらに限定されない。カロテノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットに記載される。
【００４８】
本明細書で使用されるビタミンＡは、水溶液中に見られるビタミンＡの任意の化学形態（例えば、その遊離酸形態で非解離、又はアニオンとして解離）であり得る。本明細書で使用される用語は、生物工学的ビタミンＡ経路における全ての前駆体又は中間体を含む。また、酢酸ビタミンＡも含む。
【００４９】
本明細書に記載されるレチニルエステルは、好ましくは、酢酸レチニル及び／又は他のエステル、例えば長鎖レチニルエステルなどを含むアセチル化形態を含む「レチニルエステル混合物」の形態で存在する。好ましくは、レチニルエステル混合物は、少なくとも約６５％、例えば、７０、７５、８０、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までの酢酸エステルであるレチニルエステル、すなわち酢酸レチニルを含む。
【００５０】
「長鎖レチニルエステル」という用語は、少なくとも約８個、例えば、９、１０、１２、１３、１５又は２０個の炭素原子及び最大約２６個まで、例えば、２５、２２、２１個又はそれより少ない炭素原子からなり、好ましくは最大約６個までの不飽和結合、例えば、０、１、２、４、５、６個の不飽和結合を有する炭化水素エステルを定義する。長鎖レチニルエステルは、レチニル−リノラート（ｒｅｔｉｎｙｌ−ｌｉｎｏｌａｔｅ）、オレイン酸レチニル又はパルミチン酸レチニルを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明は特に、以下の実施形態（１〜（１７）を特徴とする。
【００５２】
（１）アセチル化活性、例えば、レチノールアセチル化活性、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）［ＥＣ２．３．１．８４］を有する酵素、より好ましくは、アセチルトランスフェラーゼ１（Ａｔｆ１）活性を有する酵素を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記酵素が、レチノール、好ましくはトランス−レチノールから、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも１０％の割合のアセチル化レチノール、すなわち酢酸レチニルを有する酢酸レチニル混合物への変換を触媒する、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５３】
（２）レチノールアセチル化活性、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］活性、より好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１活性を有する酵素を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞が、酢酸レチニルを含むレチニルエステル混合物を産生し、混合物が、少なくとも約６５％、好ましくは８０、８７、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までのトランス−アイソフォームのレチニルエステルを含む、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５４】
（３）レチニルエステルが酢酸レチニルから選択される、実施形態（１）又は（２）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５５】
（４）異種アセチルトランスフェラーゼ、好ましくは異種アセチルトランスフェラーゼ１を含む、実施形態（１）、（２）又は（３）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５６】
（５）アセチルトランスフェラーゼ、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１が植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌又は細菌から選択され、好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、フラガリア属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エウオニムス属（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ）、マルス属（Ｍａｌｕｓ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、又はラカンケア属（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）から選択される、実施形態（１）、（２）、（３）又は（４）のカロテノイド産生宿主細胞。
【００５７】
（６）アセチルトランスフェラーゼが、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エウオニムス・アラトゥス（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ａｌａｔｕｓ）、マルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｍｉｒａｎｔｉｎａ）又はラカンケア・フェルメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）から選択されるアセチルトランスフェラーゼ１である、実施形態（５）のカロテノイド産生宿主細胞。
【００５８】
（７）アセチルトランスフェラーゼ１が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１６又は１８に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、実施形態（６）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５９】
（８）宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、酵母を含む真菌から、より好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から、さらにより好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）のカロテノイド産生宿主細胞。
【００６０】
（９）宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）又はパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）から選択される、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）のカロテノイド産生宿主細胞。
【００６１】
（１０）酢酸レチニルを含むレチニルエステルがさらにビタミンＡに変換される、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）又は（９）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００６２】
（１１）アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］の酵素活性、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１の活性によって酢酸レチニルを含むレチニルエステル混合物を生産するためのプロセスであって、レチノールを前記アセチルトランスフェラーゼ、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１と接触させることを含み、レチノールの少なくとも約６５〜９０％がトランス−アイソフォームである、プロセス。
【００６３】
（１２）実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）又は（１０）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いる、実施形態（１１）のプロセス。
【００６４】
（１３）（ａ）本明細書で定義されるアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］をコードする核酸分子を、適切なカロテノイド産生宿主細胞、好ましくは、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）又は（９）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）少なくとも約６５〜９０％をトランス−レチノールとしてトランス−及びシス−レチノールを含むレチノールを、シス−及びトランス−酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下で酢酸レチニルをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【００６５】
（１４）トランス−及びシス−酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物を生産するための、上記の及び本明細書で定義されるアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］の使用であって、酢酸レチニルの少なくとも約６５〜９０％がトランス−アイソフォームであり、アセチルトランスフェラーゼが、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）又は（１０）のカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において異種発現され、前記酢酸レチニル混合物がトランス−及びシス−レチノールを含むレチノール混合物の変換によって得られ、レチノールの少なくとも約６５〜９０％がトランス−アイソフォームである、使用。
【００６６】
（１５）アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］の酵素活性、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１の活性によって酢酸レチニルを含むレチニルエステル混合物を生産するためのプロセスであって、レチノールを前記アセチルトランスフェラーゼ、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１と接触させることを含み、混合物中のトランス−アイソフォームのシス−アイソフォームに対する比率が少なくとも約４である、プロセス。
【００６７】
（１６）（ａ）アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］をコードする核酸分子を適切なカロテノイド産生宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）レチノールを、少なくとも約４：１の比率のトランス−及びシス−酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下でレチノールをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【００６８】
（１７）少なくとも約４：１の比率のトランス−及びシス−酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物を生産するためのアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］の使用であって、アセチルトランスフェラーゼが適切なカロテノイド産生宿主細胞において異種発現される、使用。
【００６９】
以下の実施例は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは全く意図されない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に国際公開第２００８０４２３３８号パンフレット、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレット、国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレット、国際公開第２００９１２６８９０号パンフレット、米国特許第２００７０１６６７８２号明細書、米国特許第２０１６０１３０６２８号明細書の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【００７０】
［実施例］
［実施例１：一般的な方法、菌株、及びプラスミド］
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。
【００７１】
［振とうプレートアッセイ］
通常、８００μｌの０．２５％酵母抽出物、０．５％ペプトン（０．２５Ｘ  ＹＰ）に、１０μｌの新たに成長させたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を播種し、８００μｌの鉱油（Ｄｒａｋｅｏｌ５、Ｐｅｎｒｅｃｏ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋａｒｎｓ  Ｃｉｔｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）でオーバーレイし、炭素源として鉱油中５％のコーン油及び／又は水相中５％のグルコースを用いた。２４ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ２４  Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ  Ｗｈａｔｍａｎ  ７７０１−５１０２）において形質転換体を成長させ、マットシール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｐｌａｔｅ  Ｍａｔｓ  ２４０１０ＣＭ）で被覆し、Ｑｉａｇｅｎ  Ａｉｒｐｏｒｅ  Ｔａｐｅ  Ｓｈｅｅｔｓ（１９５７１）で無菌密封し、Ｉｎｆｏｒｓマルチプレートシェーカー（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）においてＹＰＤ培地中３０℃、８００ＲＰＭで４日間振とうさせた。鉱油画分を振とうプレートウェルから取り出し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて、順相カラムでＨＰＬＣにより分析した。この方法は実施例２、３、４において使用される。
【００７２】
［ＤＮＡ形質転換］
菌株をＹＰＤプレート培地上で一晩成長させることにより形質転換させる。５０μｌの細胞をプレートからこすり取り、１μｇの形質転換ＤＮＡ、通常は組込み形質転換のための直鎖ＤＮＡ、４０％のＰＥＧ  ３５５０ＭＷ、１００ｍＭの酢酸リチウム、５０ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌ中、４０℃で６０分間のインキュベーションにより形質転換させ、選択培地に直接プレーティングするか、或いは優性抗生物質マーカー選択の場合は、細胞をＹＰＤ液体培地において３０℃で４時間増殖させた後、選択培地にプレーティングする。
【００７３】
［ＤＮＡ分子生物学］
ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）においてＮｈｅｌ及びＭｌｕｌ末端を用いて遺伝子を合成した。国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットの場合のように、通常、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換におけるマーカー選択のために、遺伝子をＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」、ＭＢ６１５７ＨｙｇＲ、及びＭＢ８３２７ＮａｔＲベクターにサブクローニングした。遺伝子及びマーカーＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌ（ＭＢ５０８２）又はＰｖｕｌｌ（ＭＢ６１５７及びＭＢ８３２７）のランダム非相同末端結合によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれゲル電気泳動及びＱｉａｇｅｎゲル精製カラムにより精製した。ＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」マーカーは、ＦＯＡにおけるＵＲＡ３カセットの環状切除（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｅｘｃｉｓａｎｔ）の選択を可能にする無償性の反復隣接配列のために再使用が可能であった。ＮａｔＲ及びＨｙｇＲマーカーは、隣接Ｌｏｘ部位のために切除をもたらすＣｒｅリコンビナーゼの一過性発現によって除去することができる。
【００７４】
［プラスミドのリスト］
使用するプラスミド、菌株、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表１、２及び配列表に記載される。ヌクレオチド配列番号２、４、６、８、１０、１２、１５、１７及び１９は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現に対してコドン最適化される。
【００７５】
【表１】
2020534807.tif 000002
【００７６】
【表２】
2020534807.tif 000003
【００７７】
［順相レチノール法］
Ｗａｔｅｒｓ  ７１７オートサンプラーに取り付けたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリーポンプを用いて、サンプルを注入した。安全シリカガードカラムキットを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｓｉｌｉｃａ（２），１５０ｘ４．６ｍｍを使用して、レチノイドを分離した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、３０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸、又はゼアキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、６０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸のいずれかからなる。それぞれの流速は、０．６ｍＬ／分である。カラム温度は周囲温度である。注入容積は２０μＬである。検出器は、２１０ｎｍから６００ｎｍまでを収集するフォトダイオードアレイ検出器である。表３に従って分析物を検出した。
【００７８】
【表３】
2020534807.tif 000004
【００７９】
［サンプル調製］
条件に応じて種々の方法によりサンプルを調製した。全培養液又は洗浄培養液サンプルのために、秤量したＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）管に培養液を入れ、移動相を添加した。製造指示書に従って最高設定３ＸにおいてＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｃｏｒｐ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）内でサンプルを処理した。洗浄培養液中、サンプルを微量遠心管において１００００ｒｐｍで１分間、１．７ｍｌ管内で回転させ、培養液をデカントし、１ｍｌの水を添加し、混合し、ペレットにし、デカントして、元の容積にした。混合物を再度ペレットにし、適切な量の移動相中に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ビーズビーティングにより処理した。鉱油画分の分析のために、サンプルを４０００ＲＰＭで１０分間回転させ、ポジティブディスプレイスメントピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）により油を上部からデカントして除去し、移動相中に希釈し、ボルテックスにより混合し、ＨＰＬＣ分析によりレチノイド濃度を測定した。
【００８０】
［発酵条件］
発酵は既に記載された条件と同一であり、好ましくはシリコーン油又は鉱油のオーバーレイと、好ましくは、０．５Ｌ〜５Ｌの全容積のベンチトップ反応器内に供給されたグルコース又はコーン油である攪拌槽とを用いた（国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットを参照）。一般的に、生産性が増大された流加バッチ攪拌漕反応器を用いて同じ結果が観察され、レチノイドの生産のためのシステムの有用性が実証された。好ましくは、５％のグルコースを用いて発酵をバッチ処理し、溶解酸素が急落した後に２０％のシリコーン油を添加し、供給を再開して、供給プログラムを通して２０％の溶解酸素を達成した。或いは、供給物としてコーン油を使用し、脂肪族レチノイドを捕集するための第２の相として鉱油を使用した。
【００８１】
［実施例２：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチノイドの産生］
異種ＡＴＦ１の発現のために、トランスレチノール産生菌株ＭＬ１７９６８を、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）での選択のためにハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＲ）に連結されたアセチルトランスフェラーゼ遺伝子断片を含有する精製Ｐｖｕｌｌ遺伝子断片で形質転換した。プレーティングの前に培養物をＹＰＤ中で４時間増殖させて、抗生物質耐性遺伝子を合成した。特に、オーバーレイとしてのシリコーン油と共に０．２５Ｘ  ＹＰ中の炭素源として１０％のグルコースを用いて、振とうプレートアッセイにおいてアシル化について単離株をスクリーニングし、成功した単離株をグルコース供給物及びシリコーン油オーバーレイと共に流加バッチ攪拌漕反応器においてさらにスクリーニングし、生産性の一桁の増大が示され、レチノイドの生産における有用性が示された。分析からのデータは表４に示される。
【００８２】
【表４】
2020534807.tif 000005
【００８３】
［実施例３：サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチノイドの産生］
通常、ベータカロテン菌株は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０１３０６２８号明細書又は国際公開第２００９１２６８９０号パンフレットに記載される）ような標準的方法に従って、ベータカロテンを産生している構築されたゲラニルゲラニルシンターゼ、フィトエンシンターゼ、リコペンシンターゼ、リコペンシクラーゼなどの酵素をコードする異種遺伝子で形質転換される。本明細書で定義されるＡＴＦ酵素を導入すること、及び／又は過剰発現させることにより、特に少なくとも６０％のトランス−アイソフォームを有する酢酸レチニルの産生に関して同様の結果が得られる。さらに、ベータカロテンオキシダーゼ遺伝子で形質転換される場合、レチナールを産生することができる。さらに、レチノールデヒドロゲナーゼで形質転換されると、レチノールを産生することができる。任意選択的に、内在性レチノールアシル化遺伝子を欠失させることができる。このアプローチを用いて、トランス−アイソフォームに対する特異性、又は酢酸レチニルに対する生産性に関して同様の結果が得られる。
【配列表】
2020534807000001.app
【国際調査報告】
2020534807.tif 000006
2020534807.tif 000007
2020534807.tif 000008