(57)【要約】【解決手段】核酸分析物が付着する付着部位を含む第１区域と、付着部位をわたって第１流動媒体を流すことによって核酸を漸進的に核酸構成ヌクレオシド三リン酸に加ピロリン酸分解する第１経路と、付着部位周りからのヌクレオシド三リン酸を除去する第２経路と、第２経路において、水不混和性キャリアの水性微小液滴からなる第２媒体を生み出す手段と、光学的に媒介されるエレクトロウェッティングを用いて微小液滴を操作する微小液滴操作区域であり、微小液滴操作区域は、第１複合壁であり、第１透明基板、第１透明基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第１透明導体層、第１透明導体層上の、３００〜１０００ｎｍの厚さを有し、４００〜１０００ｎｍの波長範囲の電磁照射によって活性化される光活性層、及び第１透明導体層上の、１２０〜１６０ｎｍの厚さを有する第１誘電体層を含む第１複合壁と、第２複合壁であり、第２基板、第２基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第２導体層、及び任意に、第２導体層上の、１２０〜１６０ｎｍの厚さを有する第２誘電体層を含む第２複合壁と、からなり、第１誘電体層及び第２誘電体層の露出面は、１０μｍ未満の間隔で配置されて、微小液滴を含むように適合されるマイクロ流体空間を画定する、微小液滴操作区域と、第１複合壁及び第２複合壁にわたって、第１透明導体層及び第２導体層を接続する電圧を供給する交流電源と、光活性層に衝突させて、第１誘電体層の表面上の対応する第1一過性エレクトロウェッティング箇所を誘起するように適合される光励起層のバンドギャップより高いエネルギを有する第1電磁放射源と、一過性エレクトロウェッティング箇所の配置を変えることにより、少なくとも１つの第1エレクトロウェッティング経路を生成し、第１エレクトロウェッティング経路に沿って微小液滴を移動させることができるように、光活性層上での電磁照射の衝突点を操作する手段と、微小液滴操作区域の下流に配置され、又は微小液滴操作区域と一体の、検出区域と、検出区域で微小液滴に衝突するように適合される第２電磁放射源、及び微小液滴から放射される蛍光又はラマン散乱を検出する検出器を備える蛍光又はラマン散乱検出システムと、を備える、核酸分析物を調査する装置を提供する。【選択図】図１
2020525769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分析物が付着する付着部位を含む第１区域と、
前記付着部位をわたって第１流動媒体を流すことによって核酸を漸進的に核酸構成ヌクレオシド三リン酸に加ピロリン酸分解する第１経路と、
前記付着部位周りからのヌクレオシド三リン酸に関する第２経路と、
前記第２経路において、水不混和性キャリアの水性微小液滴からなる第２媒体を生み出す手段と、
光学的に媒介されるエレクトロウェッティングを用いて前記微小液滴を操作する微小液滴操作区域であり、前記微小液滴操作区域は、
第１複合壁であり、
第１透明基板、
前記第１透明基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第１透明導体層、
前記第１透明導体層上の、３００〜１０００ｎｍの厚さを有し、４００〜１０００ｎｍの波長範囲の電磁照射によって活性化される光活性層、及び
前記第１透明導体層上の、１２０〜１６０ｎｍの厚さを有する第１誘電体層
を含む第１複合壁と、
第２複合壁であり、
第２基板、
前記第２基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第２導体層、及び
前記第２導体層上の、１２０〜１６００ｎｍの厚さを有する第２誘電体層
を含む第２複合壁と、
からなり、前記第１誘電体層及び第２誘電体層の露出面は、１０μｍ未満の間隔で配置されて、微小液滴を含むように適合されるマイクロ流体空間を画定する、微小液滴操作区域と、
前記第１複合壁及び第２複合壁にわたって、前記第１透明導体層及び第２導体層を接続する電圧を供給する交流電源と、
前記光活性層に衝突させて、前記第１誘電体層の表面上の対応する第１一過性エレクトロウェッティング箇所を誘起するように適合される光励起層のバンドギャップより高いエネルギを有する少なくとも１つの第1電磁放射源と、
前記一過性エレクトロウェッティング箇所の配置を変えることにより、少なくとも１つの第1エレクトロウェッティング経路を生成し、前記第１エレクトロウェッティング経路に沿って前記微小液滴を移動させることができるように、前記光活性層上での電磁照射の衝突点を操作する手段と、
前記微小液滴操作区域の下流に配置され、又は前記微小液滴操作区域と一体の、検出区域と、
前記検出区域で前記微小液滴に衝突するように適合される第２電磁放射源、及び前記微小液滴から放射される蛍光又はラマン散乱を検出する検出器を備える蛍光又はラマン散乱検出システムと、
を備える、核酸分析物を調査する装置。
【請求項２】
前記検出区域がエレクトロウェッティング箇所のアレイを含むことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記検出区域が、前記微小液滴が通過する毛細管のブロックを含み、
第２電磁放射の衝突点がマイクロ流体チャンネルの出口であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
ビードがある領域に固定され、別個の微小液滴が前記領域上で順次動かされ、各液滴が前記ビードをある期間の間濡らし、前記期間後、前記領域が前記ビードを乾かす又は部分的に乾かすことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記ビードにわたって動かされる水性微小液滴が、一時的に前記水性微小液滴と接触するときに、前記ビード上でデオキシリボ核酸の加ピロリン酸分解が起きることを特徴とする、請求項４と請求項１〜３の何れか一項とに記載の装置。
【請求項６】
前記付着部位が、前記核酸分析物が付着するビードを受けるように適合されることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記第１区域の上流に、ビードを調製する調製区域を更に備え、
前記ビードは第２エレクトロウェッティング経路によって前記調製区域から前記第１区域まで移動することを特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記第２エレクトロウェッティング経路が、誘電体被覆電極及び／又は誘電体被覆光活性層に対応する第２エレクトロウェッティング箇所からなることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記第１複合壁及び第２複合壁がそれぞれ、前記第１誘電体層及び前記第２誘電体層上に、第１防汚層及び第２防汚層を更に備えることを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の装置。
【請求項１０】
マイクロ流体空間が、前記第１複合壁及び第２複合壁に取り付けられるスペーサによって更に画定されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
マイクロ流体空間が、２μｍ〜８μｍの深さを有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
互いに付随して走る複数の第１エレクトロウェッティング経路を更に含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記第１エレクトロウェッティング経路と交差して、少なくとも１つの微小液滴合流箇所を作るように適合される、複数の第３エレクトロウェッティング経路を更に備えることを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
連続的流体の一連供給チャンネルが、前記微小液滴操作区域のインタフェースとなり、前記連続的流体の一連供給チャンネルを用いて、その後液滴化され操作される投入試薬を供給することを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記光活性層上での前記電磁照射の前記衝突点を操作する前記手段が、前記第１エレクトロウェッティング経路、第２エレクトロウェッティング経路及び第３エレクトロウェッティング経路のいずれか又はすべてを生み出し、経路における、それぞれの微小液滴の、他のすべての微小液滴に対する移動を同期させる、マイクロプロセッサを備えることを特徴とする、請求項１〜１４の何れか一項に記載の装置。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の装置を、天然又は合成起源のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のシーケンサに対して使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、核酸分子を調査するための装置、特に天然又は合成起源のDNA又はRNAを配列決定するための装置に関する。
【０００２】
出願人先の出願を示す特許文献１−５において、出願人は単一ヌクレオチドの秩序だった流れ、好ましくは単一ヌクレオシド三リン酸の流れを生成するための、ポリヌクレオチド分析物の漸進的消化を含む新しい配列決定方法を記載しており、その各々を、微小液滴流中の対応する微小液滴中に1つずつ捕捉できる。その後、それぞれの液滴を化学的及び/又は酵素的に操作して、液滴が最初に含有していた特定の一ヌクレオチドを明らかにすることができる。1つの実施形態において、これらの化学的及び/又は酵素的操作は、1つ以上の2成分オリゴヌクレオチドプローブ型の使用を含む方法を含み、その各々は、分析物が構成される単一ヌクレオチド型の1つを選択的に捕捉することができるように適合される。典型的にはそのようなプローブタイプの各々において、2つのオリゴヌクレオチド成分のうちの1つは特性フルオロフォアを含み、プローブの未使用状態ではこれらのフルオロフォアの蛍光を発する能力が近くに位置するクエンチャーの存在によって、または自己消光によって消えたままである。使用において、プローブがその対応する単一ヌクレオチドを捕捉したとき、プローブは、その後のエキソヌクレアーゼ分解又はヌクレオチド鎖切断に感受的にされ、それによって、フルオロフォアをクエンチャー及び/又は互いから遊離させ、フルオロフォアが自由に蛍光を発することを可能にする。この手段により、それぞれの液滴に存在する元の一ヌクレオチドを、分光手段により間接的に推測することができる。
【０００３】
配列決定装置を設計する際に、例えば、数千の微小液滴を蛍光の有無について分析される他の内容物及び/又はそれらの内容物とマージされ得る位置に確実に送達され得ることを確実にするために、数千の微小液滴を操作することが必要である。
【０００４】
これを行う1つの考えられる方法は、エレクトロウェッティング力によって微小液滴を推進することができる基材上の経路を確立することである。このように比較的大きな液滴を操作するための装置は当該分野において以前に説明されている。例えば、特許文献６−８を参照のこと。典型的には、当該装置は液滴を、例えば、不混和性キャリア流体の存在下で、カートリッジ又はチューブの2つの対向する壁によって画定されるマイクロ流体チャンネルを通って移動させることによって達成される。カートリッジ又はチューブの壁に埋め込まれているのは、誘電体層で覆われている電極であり、誘電体層の各々は層のエレクトロウェッティング電界特性を変更するために、間隔をおいて迅速にスイッチを入れたり切ったりすることができるように、A/Cバイアス回路に接続されている。このことは、所与の経路に沿って液滴を操縦するために使用することができる局所的な指向性毛管力を生じさせる。
【０００５】
光学的に媒介されるエレクトロウェッティングに基づくこのアプローチの変形例は例えば、引用文献９−１１に教示されている。特に、これらの3つの特許出願のうちの第1のものは、第1及び第2の壁によって画定されるマイクロ流体キャビティを含み、第1の壁が複合体設計であり、基板、光導電及び絶縁(誘電体)層から構成される、各種マイクロ流体デバイスを開示する。光導電層と絶縁層との間には互いに電気的に絶縁され、光活性層に結合された導電性セルの配列が配置され、その機能は絶縁層上に対応する個別の液滴受信位置を生成することである。これらの箇所では、液滴の表面張力特性をエレクトロウェッティング力の手段によって変更することができる。次に、光導電層に当たる光によって導電性セルのスイッチを入れたり切ったりすることができる。この手法は、その有用性が電極の配置によってある程度依然として制限されているが、切替えがはるかに容易かつ迅速になるという長所を有する。さらに、液滴を移動させることができる速度、及び実際の液滴経路を変化させることができる程度には制限がある。
【０００６】
この後者のアプローチの二重壁の実施形態は、非特許文献１に開示されている。ここでは、誘電体層上に堆積されたテフロン（登録商標）AFの表面を横切る光学的エレクトロウェッティングを用いて、100〜500μmの大きさの比較的大きな液滴の操作を可能にするセルについて説明する。パターン化されていない電気的にバイアスされたアモルファスシリコン上の光パターンは、概略的な形態で記載されている。しかしながら、表される機構では、誘電体層は薄く(100nm)、光活性層を支持する壁上にのみ配置されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2014/053853号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2014/053854号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2014/167323号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2014/167324号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2014/111723号パンフレット
【特許文献６】米国特許第6,565,727号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第2013/0233425号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第2015/0027889号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第2003/0224528号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第2015/0298125号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第2016/0158748号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】University of California at Berkeley thesis UCB/EECS-2015-119 by Pei
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
出願人らは、現在、信頼性のある単一ヌクレオチド検出方法の要件に従って、数千の微小液滴を同時に操作することができる核酸分子調査装置を開発した。これは、コンピュータソフトウェアのアプリケーションによって容易に再構成可能であるという利点を有し、例えば、ユーザが最適な精度、スループット、又は特定のエピジェネティック修飾を検出するために容易に適応することを可能にすることによって、非常に汎用性がある。したがって、本発明によれば、
核酸分析物が付着する付着部位を含む第１区域と、
前記付着部位をわたって第１流動媒体を流すことによって核酸を漸進的に核酸構成ヌクレオシド三リン酸に加ピロリン酸分解する第１経路と、
前記付着部位周りからのヌクレオシド三リン酸を除去する第２経路と、
前記第２経路において、水不混和性キャリアの水性微小液滴からなる第２媒体を生み出す手段と、
光学的に媒介されるエレクトロウェッティングを用いて前記微小液滴を操作する微小液滴操作区域であり、前記微小液滴操作区域は、
第１複合壁であり、
第１透明基板、
前記第１透明基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第１透明導体層、
前記第１透明導体層上の、３００〜１０００ｎｍの厚さを有し、４００〜１０００ｎｍの波長範囲の電磁照射によって活性化される光活性層、及び
前記第１透明導体層上の、１２０〜１６０ｎｍの厚さを有する第１誘電体層
を含む第１複合壁と、
第２複合壁であり、
第２透明基板、
前記第２基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第２導体層、及び
任意に、前記第２導体層上の、２５〜５０ｎｍの厚さを有する第２誘電体層
を含む第２複合壁と、
からなり、前記第１誘電体層及び第２誘電体層の露出面は、１０μｍ未満の間隔で配置されて、微小液滴を含むように適合されるマイクロ流体空間を画定する、微小液滴操作区域と、
前記第１複合壁及び第２複合壁にわたって、前記第１透明導体層及び第２導体層を接続する電位差を供給する交流電源と、
前記光活性層に衝突させて、前記第１誘電体層の表面上の対応する第１一過性エレクトロウェッティング箇所を誘起するように適合される光励起層のバンドギャップより高いエネルギを有する少なくとも１つの第1電磁放射源と、
前記第１一過性エレクトロウェッティング箇所の配置を変えることにより、少なくとも１つの第1エレクトロウェッティング経路を生成し、前記第１エレクトロウェッティング経路に沿って前記微小液滴を移動させることができるように、前記光活性層上での電磁照射の衝突点を操作する手段と、
前記微小液滴操作区域の下流に配置され、又は前記微小液滴操作区域と一体の、検出区域と、
前記検出区域で前記微小液滴に衝突するように適合される第２電磁放射源、及び前記微小液滴から放射される前記蛍光又はラマン散乱を検出する検出器を備える蛍光又はラマン散乱検出システムと、
を備える、核酸分析物を調査する装置が提供される。
【００１０】
本発明の装置は核酸分析物の構成ヌクレオチドを分析するのに特に適しており、一実施形態では、デオキシリボ核酸又はリボ核酸を配列決定するための装置である。核酸分析物がDNAである応用では、核酸分析物が好適には二本鎖ポリヌクレオチドであり、原則的に無制限であり得るヌクレオチド鎖長を有することができ、例えば、ゲノム断片中に見出される何百万ものヌクレオチド塩基類対まで有することができる。したがって、一実施形態では分析物が少なくとも50、好ましくは少なくとも150ヌクレオチド塩基類対長あり、適切には500を超え、1000を超え、場合によっては5000超のヌクレオチド塩基類対の長さである。一実施形態では分析物が天然起源のDNA(例えば、植物、動物、細菌またはウィルスに由来する遺伝物質)であるが、本方法は部分的若しくは完全な合成DNA、又は実際には天然では一般に遭遇しないヌクレオチド塩基類からなるヌクレオチド、すなわち、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシル以外の核酸塩基を有するヌクレオチドから完全に若しくは部分的に構成される他の核酸の配列決定に等しく適用可能である。このような核酸塩基の例には、そのような核酸塩基の例には、4-アセチルシチジン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、2-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノ-メチルウリジン、ジヒドロウリジン、2-O-メチルプソイドウリジン、2-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンチルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、5-メトキシウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5 -オキシ酢酸、ウィブトキソシン、ウィブトシン、プソイドウリジン、クエオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、2-O-メチル-5-メチルウリジンおよび2-O-メチルウリジンを含む。分析物がRNAである場合、同様の考察が適用される。
【００１１】
装置の第1の区域において、分析物は3-5’方向に漸進的にピロリン酸化されて、単一ヌクレオシド三リン酸の流れを生成し、その順序は、分析物の配列の順序に対応する。加ピロリン酸分解そのものは、一般に、ポリメラーゼのような酵素を含む反応媒体の存在下、20〜90℃の温度で行われる。適切には、それは単一のヌクレオシド三リン酸が水性である流動流体媒体によって粒子の周りの加ピロリン酸分解領域から連続的に除去されるように実施される。一実施形態では、この媒体は緩衝化され、加ピロリン酸分解反応を維持するのに必要な他の成分(ポリメラーゼ、ピロリン酸アニオン、マグネシウムカチオンなど)も含む。別の実施形態では、媒体が(a)出願人らの以前の出願で特定されたプローブ型(または均等の機能を有するプローブ);(b)プローブを関連する単一ヌクレオシド三リン酸(例えば、ポリメラーゼ及び/又はリガーゼ)に結合させ、捕捉させるために必要な種々の化学物質および酵素、ならびに(3)使用されたプローブのその後のエキソヌクレアーゼ分解を起こさせるために必要な酵素、のうちの1つ以上をさらに含む。一実施形態では、これらの成分のいくつか又は全ては、一緒に又は段階的に、流れている水系媒体又はそこから形成された微小液滴(場合によっては)に、いくつかの他の点または区域で導入される。例えば、これらの成分の一部または全部を微小液滴にその後直接導入することは、インジェクターを用いた注入によって、又は微小液滴合体によって達成することができる。
【００１２】
望ましいことに、本装置は、加ピロリン酸分解の速度ができるだけ速く、かつ、1つの実施形態において、この速度は1秒当たり1単位ヌクレオシド三リン酸から50単位ヌクレオシド三リン酸までの範囲内にあるように、運用可能なように設計される。ポリヌクレオチドの漸進的分解に適用される加ピロリン酸分解反応についてのさらなる情報は、例えばJ. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028.に見出すことができる。
【００１３】
装置の第1の区域は、分析物に結合するように適合された付着部位を含むことによって部分的に特徴付けられる。一実施形態では、この部位が2つの異なる表面領域を有する粒子に一時的に結合するように適合される。適切には、この部位は、例えば化学的に修飾された金属コーティングを介して、分析物の分子を有する対応する粒子に解放可能に付着できるように修飾された、第1区域内に位置する表面を含む。一実施形態では、この粒子がビード、例えば、グラス、シリカ, アルミナ、金属又は非分解性高分子などの不活性物質から作製されたマイクロビードである、ビードを含む。別の実施形態では、粒子が磁気的に操作されることを可能にする常磁性物質のコアを有する。
【００１４】
粒子上の2つの異なる表面区域は、それぞれ付着部位及び分析物上の相補的部位に結合するように適合される。一実施形態では、これら領域の第1領域が化学修飾された金属コーティング、例えば、金、銀、銅又は他の金属の官能化コーティングから構成される。別の実施形態では、これら領域のうちの第2領域が分析物の分子に物理的または化学的に結合するように特定的に適合された粒子上の1つまたは複数の反応部位から構成される。
【００１５】
粒子および付着部位上の反応部位を作り出すことができる多くの方法がある。例えば、粒子上の第1領域については、金属蒸着法、原子層堆積又はプラズマ堆積等の公知の手法を用いて、まず粒子を金属で部分的に被覆することにより作製することができる。その後、金属表面を化学的に修飾して、付着部位上の相補的な第2の部分に可逆的に結合することができる1つ以上の第1の部分を導入することができる。一実施形態では、第1および第2の部分のこれらの対がそれらの間に生成される結合が環境温度または環境温度付近で可逆的に作製され、破壊され得るように選択される。この手段により、ビードを付着部位に付着させることができ、分析物を加ピロリン酸分解によって分解でき、その後、ビードを基板から分離させることができ、基板は次に別の新しいビードを受け取ることができる。1つの実施形態では、これらの第1および第2の部分の対が、例えば補完的なビオチン部分を有するアビジン又はストレプトアビジン部分を使用することにより、加ピロリン酸分解の条件下で安定したタンパク質複合体の形成につながりうる。別の実施形態では、これらの対が、例えば、ポリヒスチジン/キレート化金属イオン対(低pH又はイミダゾール若しくは強金属キレート化剤の存在下で破壊された結合);ボロン酸/適切な炭水化物一対(低pHで破壊された結合)又はマレイミド/セレノール対(メタ-クロロペルオキシ安息香酸を使用して破壊された結合)におけるような、不安定な化学結合を作り出すことができる。これらの場合には、第1区域を通って流れる水系媒体のpH又は組成物を変化させることによって、続いて粒子を分離することができる。したがって、装置の一実施形態では、第1区域が、以下でさらに説明するように、第1区域から粒子を導入および除去するための手段、又は粒子分離手段を第1区域に導入および除去するための手段をさらに含む。別の実施形態では分離時に、粒子は、装置の残りの部分を通過するそれ自体の微小液滴に懸濁された付着部位から除去される。もし、このアプローチがある実施形態で用いられるならば、粒子は、加ピロリン酸分解が完了したときにユーザが検出できるようにするそれ自身の特徴的蛍光マーカー又はラマン散乱マーカーを含むだろう。
【００１６】
1つの好ましい実施形態において、上記の部分の対は、複数のヒスチジン残留分(好ましくは6より大きい)及び例えばコバルト、銅又はニッケルのような遷移金属のニトロトリアセテート(NTA)又はイミノジアセテート(IDA)塩類誘導体から選択されるキレート化剤部分からなるポリヒスチジン部分を含む。これらの第1および第2の部分はそれぞれ、粒子および付着部位上に、どちらかの方向の周りに展開され得ることが理解される。
【００１７】
同様に、粒子の第2領域の場合には、分析物反応部位を作り出すことができる多くの方法がある。したがって、一実施形態では、粒子のコーティングされていない表面を、例えば、シリカ、アルミナ又はガラスビード、エポキシシラン、アミノヒドロカルビルシラン又はメルカプトシランのような官能化剤で下塗りして、分析物を付着させることができる化学反応部位を生成することができる。その後、これらの反応部位を末端プライマー反応性基、例えば一実施形態では、アミン、スクシニル又はチオール基を含むように対応して修飾された分析物の誘導体で処理することができる。別の実施形態において、化学的付着は、アダプターオリゴヌクレオチドへのライゲーションを介して、または上記のタンパク質複合体の型を介して起こり得る。
【００１８】
さらに別の実施形態では、そのようにプライミングされた粒子が1つの分析物反応部位のみを有する第2領域を含み、その結果、分析物の1つの分子のみが付着され得る。これは分析物が小さなポリヌクレオチド断片である場合に重要となることがあり、さもなければ、複数の分子が調製中に付着する傾向があり、これは望ましくないからである。立体効果がこのような結果を妨げるように働くので、ポリヌクレオチド断片が大きい場合、それはあまり問題ではない。適切には、粒子が0.5〜5ミクロン(μｍ)の範囲の最大直径を有するであろう。
【００１９】
好ましい一実施形態では、粒子は球状ビーズであり、第1および第2領域は表面上で互いに当接する半球状領域を含む。この実施形態では、粒子が好適には磁気コアを有するビーズであり、例えば、Dynabeads(登録商標)の名称で販売されているビーズである。
【００２０】
ビードが磁性コアを有する実施形態では、配列決定装置の近傍に配置された永久磁石の電磁石から誘導された磁場を用いて、ビードを分解部位に取り付けたり、分解部位から取り外したりすることができる。
【００２１】
第1区域は好適には取り付け部位を含む構造を含むマイクロ流体寸法のチャンバであるか、又は別の実施形態ではその内面が部分的に取り付け部位をコーティングされたマイクロ流体チューブを含む。一実施形態では、取り付け部位が粒子を密着させることができる台座をさらに含むことができる。別の実施形態では、粒子が表面結合によって、又は磁気的に、所望の位置で適所に保持されてもよい。さらに別の実施形態では、粒子が例えば、付着部位に近接して電磁石を適用することによって付着部位に誘導されることを可能にする強磁性コアまたは面を有する可能性がある。さらに別の実施形態では、粒子が従来の又は光学的に媒介されるエレクトロウェッティングオンデバイス(EWOD)技術を使用して、付着部位に毛管力を適用することによって、付着部位に配置され、付着部位から除去される。したがって、一実施形態では、第1区域が、室又は管内に、誘電体コーティングされた電極または光活性要素(永久的または一過性であってもよい)をさらに含み、このために、必要に応じて活性化されてもよい。
【００２２】
一実施形態では、装置が、ビードが調製される第1区域の上流に位置する調製区域と、第2エレクトロウェッティング経路の手段によって調製ゾーンから付着部位にビードを移動させるための手段とをさらに含む。
【００２３】
加ピロリン酸分解の後、互いに空間的および時間的に分離し、分析物のヌクレオチド配列に対応する順序で配置された単一ヌクレオシド三リン酸を含む、流れる第２流体媒体、例えば第２水系媒体は、付着部位の周囲から除去される。一実施形態では、加ピロリン酸分解が第1流体媒体の連続流中で起こり、その後、液滴化され、第2流体媒体中にあらかじめ存在していたヌクレオシド三リン酸分子のカプセル化を引き起こす。
【００２４】
別の実施形態では、ピロリン分解が、液滴化された第1流体媒体中で過渡的な様式で起こり、不混和性キャリア媒体中に懸濁される微小液滴が、その表面上で駆動される際に、標的ビードを一時的に湿潤および脱湿潤させる。従って、液滴がビーズと接するときにヌクレオシド三リン酸分子がDNAストランドから放出される場合、それはすぐにカプセル化され、次いで、微小液滴がビーズから脱湿するときに、第2液体媒体中で下流に除去される。
【００２５】
この微小液滴湿潤/脱湿潤方法論は、分析物に対して実施される漸進的化学変換が加ピロリン酸分解以外である場合、配列決定以外の応用を有することが理解される。したがって、本発明の第2の態様によれば、（ａ）それぞれ化学的変換を起こす媒体からなる微小液滴の流れを生成するステップと、（ｂ）前記化学的変換を起こすことができる条件下で、各微小液滴を次々に、所与の箇所で、所与の期間、標的分子と接触させるステップと、（ｃ）前記所与の期間の最後に、前記微小液滴を前記所与の箇所から除去するステップと、を含むことを特徴とする、所与の箇所に固定される標的分子の化学的変換を実施する一般的な方法が提供される。一実施形態では、前記化学的変換が上述のタイプの加ピロリン酸分解であり、第3の態様は、（ａ）それぞれ加ピロリン酸分解媒体からなる水性微小液滴の流れを生成するステップと、（ｂ）加ピロリン酸分解を起こすことができる条件下で、各微小液滴を次々に、所与の箇所で、所与の期間、標的ポリヌクレオチドと接触させるステップと、（ｃ）前記所与の期間の最後に、前記微小液滴を前記所与の箇所から除去するステップと、を含むことを特徴とする、所与の箇所に固定される標的ポリヌクレオチドの加ピロリン酸分解を実施する方法を提供する。この実施形態では、ステップ(c)で除去された微小液滴の少なくともいくつかは、上記の手段のいずれかによって所与の箇所に固定化された標的ポリヌクレオチドに由来する単一のヌクレオシド三リン酸を含む。別の実施形態では、除去された微小液滴が標的のヌクレオチド配列に対応するヌクレオシド三リン酸の秩序だった気流に対応する。好適には、微小液滴が本明細書に記載されるタイプの不混和性キャリア中に懸濁される。
【００２６】
さらに別の実施形態において、第2流体媒体は水性であり、第2区域に送達され、その後そこで、対応する水性微小液滴の流れに変換され、その少なくとも一部は、単一のヌクレオシド三リン酸分子を含む。一実施形態では、これは炭化水素、フルオロカーボン、又はシリコーンオイルなどの不混和性液を含む流動キャリア媒体中に、第2水性媒体を、適切な寸法および形状の微小液滴生成ヘッドから噴出させることによって達成される。
【００２７】
所与の微小液滴が複数の単一のヌクレオシド三リン酸分子を含むリスクを回避するために、加ピロリン分解ステップにおいてそれらを放出すること、及び/又は、生成された各充填微小液滴が平均で1〜20、好ましくは2〜10個の空白部によって分離されるように第1区域を通る流体の流れを調整することが好ましい。好適には、微小液滴が500pL(ピコリットル)未満、好ましくは65pL未満、より好ましくは4pL未満、さらにより好ましくは2pL未満の有限体積を有する。最も好ましくは、それらの全ての体積が4fL(フェムトリットル)〜4pLの範囲である。一実施形態では、装置を通る微小液滴流速が50〜3000微小液滴/秒、好ましくは100〜2000微小液滴/秒である。
【００２８】
その後、微小液滴流は、微小流体的に操作され、微小液滴操作ゾーンに送達され得る。
【００２９】
微小液滴操作区域に関しては、これは第1及び第2の基板、第1及び第2の導体層、光活性層、並びに第1及び第2の誘電体層からなる第1及び第2複合壁から構成されるか、又はそれによって画定される構成であることが適切である。一実施形態では、この区域が、空洞でありマイクロ流体空間を収容するチップ又は扁平状カートリッジを含む。別の実施形態では、少なくとも第1基板及び第1導体層が透明であり、電磁波照射源(例えば、多重レーザービーム又はLEDダイオード)からの光が光活性層に直接当たることを可能にする。別の実施形態では、第2の基板、第2の導体層、及び第2の誘電体層は同じ目的を達成できるように透明である。さらに別の実施形態では、これらの層はすべて透明であり、両側から照明を行うことができる。
【００３０】
適切には、第1及び第2の基板が、機械的に強い材料、例えば、ガラス、金属又はエンジニアリングプラスティックから作られる。一実施形態では、基板がある程度の柔軟性を有することができる。さらに別の実施形態では、第1及び第2の基板が100〜1000μmの厚さを有する。
【００３１】
第1及び第2の導体層は、第1及び第2の基板の一方の表面に位置し、典型的には非常に薄く、それぞれ70〜250nm、好ましくは70〜150nmの厚さを有する。一実施形態では、これらの層のうちの少なくとも1つは酸化インジウムスズ(ITO)などの透明導電材、銀などの導電性金属の非常に薄いフィルム、又はPEDOTなどの導電性高分子から作製される。当該層は、連続シートとして、又はワイヤなどの一連の別個の構造として形成することができる。あるいは、導体層が、電磁波がメッシュの隙間の間に向けられる導電材のメッシュであってもよい。
【００３２】
光活性層は、好適には、電磁放射線源による刺激に応答して、局所的な電荷領域を生成することができる半導体材料から構成される。例としては、300〜1000nmの範囲の厚さのアモルファスシリコンが挙げられる。一実施形態では、光活性層が可視光の適用によって活性化される。
【００３３】
第1の壁の場合には光活性層は、任意に第2の壁の場合には導電層は、非常に薄く典型的には120〜160nmの範囲の誘電体層で被覆される。この層の誘電特性は、107V/m超の高誘電強度及び3超の誘電率を含むことが好ましい。一実施形態では、誘電体層が、高純度アルミナ又はシリカ、ハフニア又は薄い非導電性高分子膜から選択される。
【００３４】
装置の別のバージョンでは、少なくとも第1の誘電体層、好ましくは両誘電体層が防汚層でコーティングされて、各種エレクトロウェッティング箇所で所望の微小液滴/油/表面接触角度を確立するのを助け、さらに、液滴が装置にわたって移動するときに、微小液滴の中身が表面に付着し、減少することを防止する。第2の壁が第2の誘電体層を含まない場合、第2の防汚層は、第2の導体層上に直接的に適用されてもよい。最適な性能のためには、防汚層が、25℃で大気-液体-表面3点インタフェースとして測定した場合、50〜70°の範囲にあるはずの接触角度の確立を助けるべきである。キャリア相の選択に依存して、水性エマルションで満たされた装置における微小液滴の同じ接触角度はより高く、100°を超える高さになるであろう。一実施形態では、これらの層が50nm未満の厚さを有し、典型的には単分子層である。別の実施形態では、これらの層が、アルコキシシリル等の親水性基で置換されたメタクリル酸メチル又はその誘導体などのアクリル酸塩エステルの重合体から構成される。好ましくは、防汚層の一方又は両方が最適な性能を保証するために疎水性である。
【００３５】
第1及び第2の誘電体層、したがって第1及び第2の壁は、深さが10μm未満であり、その中に微小液滴が含まれるマイクロ流体空間を画定する。一実施形態では、微小液滴が微小液滴空間に含まれる前に、微小液滴は、微小液滴空間の深さよりも10%を超える、適切には20%を超える固有直径を有する。これは、例えば、装置に、所望の直径を有する微小液滴がキャリア媒体中に生成される、マイクロ流体オリフィスなどの上流入口を提供することによって達成され得る。この手段によって、微小液滴は、装置に入ると圧縮を受け、微小液滴の圧縮されていない球状条件より高い表面ポテンシャルエネルギーの追加により、特定の操作のための向上したエレクトロウェッティング性能をもたらす。
【００３６】
別の実施形態では、マイクロ流体空間が、第1及び第2の壁を所定の深さまで離して保持するための1つ又は複数のスペーサを含む。スペーサに対する選択肢には、光パターニングによって生成された中間レジスト層から生み出されたビード又はピラー、隆起部等が含まれる。様々なスペーサ幾何学的形状を使用して、ピラーの線によって画定される、細いチャネル、先細りのチャネル、又は部分的に囲まれたチャネルを画定することもできる。注意深いデザインによって、これらの構造を使用して、微小液滴の変形を助け、続いて液滴分割を行い、変形した微小液滴に対して操作を実施することができる。
【００３７】
第1の壁と第2の壁との間の深さは、微小液滴の変形のレベルに影響を及ぼし、微小液滴の運動を妨げる表面抵抗を付加または除去する。第1の壁と第2の壁との間の間隔が装置を横切って変化するように装置を構造化することによって、好ましい性能プロファイルが様々な動作に利用可能である複合装置を有することができ、例えば、そのような領域は5μm径の微小液滴が分割のために変形されるべき領域において2um未満の深さを有することができ、隣接する領域は、同様のサイズの微小液滴が受ける表面抵抗がより少なく、したがってより高速で移動することができる約5μmの間隔を有することができる。
【００３８】
第1及び第2の壁は導体層に取り付けられたA/C電源を使用してバイアスされ、これらの間に、適切には10〜50ボルトの電位差を提供する。
【００３９】
本発明のシーケンシング装置は、400〜1000nmの範囲の波長及び光励起可能層のバンドギャップよりも高いエネルギを有する電磁放射源をさらに含む。好適には、光活性層が、採用される放射線の入射強度が0.01〜0.2 Wcm-2であるエレクトロウェッティング箇所で、活性化されるであろう。電磁放射源は、一実施形態では高度に減衰され、別の実施形態では画素化される光活性層上に対応する光励起領域を生成するように同様に画素化される。この手段によって、第1の誘電体層上の画素化される対応エレクトロウェッティング箇所が誘起される。米国特許出願公開第2003/0224528号明細書に教示された設計とは対照的に、これらの画素化エレクトロウェッティング点は、導電性セルが存在しないので、第1の壁の対応する永久構造とは関連しない。その結果、本発明の装置では照度がない場合、第1の誘電体層の表面上の全ての点は、エレクトロウェッティング箇所になる傾向が等しい。これは、装置を非常に柔軟にし、エレクトロウェッティング経路を高度にプログラム可能にする。この特性を、従来技術で教示された永久構造のタイプと区別するために、我々は我々の装置で生成されたエレクトロウェッティング箇所を「一過的」として特性付けることを選択し、我々の出願の特許請求の範囲は、それに応じて解釈されるべきである。
【００４０】
ここで教示される最適化された構造デザインは、得られる複合体積層体が高誘電強度及び高誘電率を有するより厚い中間層(酸化アルミニウム又はハフニアなど)の性能と組み合わされた、コーティングされた単層(又は非常に薄い機能層)からの防汚及び接触角修正特性を有するという点で、特に好都合である。得られる積層構造は、10μm未満、例えば2〜8、2〜6、2〜5又は2〜4μmの径を有するような、非常に小さな体積の微小液滴の操作に非常に適している。これらの極めて小さな微小液滴では、液滴寸法が誘電体積層の厚さに近づき始め、したがって、液滴を横切る場勾配(エレクトロウェッティング誘起運動の必要条件)がより厚い誘電体に関して低減されるので、光活性層の上に最小厚さの全非導電性積層を有することの性能上の利点は極めて好都合である。
【００４１】
電磁放射源が画素化される場合、電磁放射源は、LEDからの光によって照明される反射スクリーンを使用して直接的又は間接的に適切に供給される。これは、一過的エレクトロウェッティング箇所の非常に複雑なパターンが迅速に生成され、第1の誘電体層において破壊されることを可能にし、それによって、厳密に制御されたエレクトロウェッティング力を使用して、エレクトロウェッティング経路に沿って微小液滴が正確に操縦されることを可能にする。これは、複数のエレクトロウェッティング経路に沿って数千のこのような微小液滴を同時に操作することを目的とする場合に特に有利である。このようなエレクトロウェッティング経路は、第1の誘電体層上の仮想的エレクトロウェッティング箇所の連続体から構成されると考えることができる。
【００４２】
光活性層への電磁放射線源の衝突点は、従来の円形を含む任意の好都合な形状とすることができる。一実施形態では、これらの点の形態が対応する画素化の形態によって決定され、別の形態では、微小液滴がマイクロ流体空間に入ると、微小液滴の形態に完全に又は部分的に対応する。1つの好ましい実施形態では衝突点、したがってエレクトロウェッティング箇所は三日月形であってもよく、微小液滴の意図された移動方向に配向されてもよい。別の実施形態では、第2の壁はまた、第2の誘電体層上に、同じ電磁波源又は本明細書に記載される種類の第2の源のいずれかを手段することによって、さらなる一過性エレクトロウェッティング箇所を誘導することを可能にする光活性層を含む。好適には、エレクトロウェッティング箇所自体が第1の壁に付着する微小液滴表面よりも小さく、液滴と表面誘電体との間に形成される接点線を横切る最大場強度勾配を与える。第2の光活性層を追加することにより、ウェットエッジを微小液滴操作区域の上面から下面に移行させることが可能になり、各微小液滴に代替または追加のエレクトロウェッティング力を目標に適用することが可能になる。
【００４３】
一実施形態では、光活性層上の電磁波放射の衝突点を操作するための手段が、第1の誘電体層及び任意選択で第2の誘電体層上に、複数の同時に流れる例えば並列の、第1のエレクトロウェッティング経路を生成するように適合又はプログラムされる。別の実施形態では、第1及び任意選択で第2の誘電体層上に、第1のエレクトロウェッティング経路と交差する複数の第3のエレクトロウェッティング経路も生成して、異なる経路に沿って移動する異なる微小液滴を合流させることができる少なくとも1つの微小液滴合流箇所を生成するように適合又はプログラムされる。第1及び第3のエレクトロウェッティング経路は互いに直角に、又は正面を含む任意の角度で交差してもよい。この実施形態は、追加の成分、例えばヌクレオシド三リン酸捕捉システムの成分及び/又は種々の酵素並びに他の化学成分を、微小液滴操作区域中の微小液滴中に送達することが所望される場合に特に有用である。1つの好ましい実施形態では、捕捉システムが未使用状態では非蛍光性である蛍光プローブに基づく。適切なシステムの例としては上記で教示された出願人らの特許出願のもの、さらに出願人らの未公開欧州特許出願、出願番号EP16187112.4、EP16187493.8及びEP16189791.3が挙げられるが、このリストは限定として解釈されるべきではない。多数の第1、第2、および第3のウェッティング経路が使用されるさらに別の実施形態では、衝突点を操作するための手段がマイクロプロセッサによって適切に制御され、マイクロプロセッサは、それに沿って微小液滴が通過する経路を生成するだけでなく、互いに対する各微小液滴の動きを同期させる。
【００４４】
本発明のシーケンサは微小液滴操作区域(例えば、チップ内)と一体であり得るか、又はその下流に別々に位置し得る検出ゾーンと、微小液滴に衝突するように適合された関連する蛍光又はラマン散乱システムとをさらに含む。1つの好ましい実施形態において、エキソヌクレアーゼ消化またはヌクレオチド鎖切断によって遊離されるフルオロフォアに由来する蛍光検出が使用される。一実施形態では、検出区域が、微小液滴が従来のEWOD（誘電体上のエレクトロウェッティング）又は光学的に媒介されるEWODの1つまたは組合せによって最終的に駆動される箇所が提供される表面を含むことができる。そのような表面は微小液滴のための最終目的地を作り出すために、ウェルなどのような構造でプロファイルされてもよい。この実施形態では、蛍光検出システムが、第2の電磁放射をこれらの最終目的地に衝突させて、光検出器などによって検出される微小液滴からの蛍光放出を刺激するように構成される。別の実施形態では、検出区域が、各微小液滴が積み重ねられ、出口点で蛍光検出システムによって取り調べられる前に移動する毛細管のブロックを含む。
【００４５】
蛍光検出システムに関して、当該システムは各々の微小液滴の含有物を調べるための、例えば1つ以上のレーザー又はLEDのような第2の電磁波放射の1つ以上の源と、使用されている特定の捕捉システムで使用される種々の蛍光体の特徴的な蛍光波長又は波長エンべロープに同調された1つ以上の光検出器又は均等の装置とから構成される。その後、光検出器によって検出される任意の蛍光は、分析物の配列のデータ特性を明らかにするために、既知のアルゴリズムを使用してコンピュータで処理および分析することができる電気信号を生じる。
【００４６】
一実施形態では、本発明の装置が、中央マイクロプロセッサと、その様々な動作のいくつかまたはすべてを制御および自動化するための関連するコンピュータプログラム/アルゴリズムとをさらに含む。
【００４７】
本発明の装置は、対応する配列決定方法と関連して使用され得ることが明らかである。したがって、本発明の第４の態様によれば、
水性加ピロリン酸分解媒体を、第１経路に配置される付着部位に固定される分析物と接触させて、これにより前記分析物を漸進的に前記分析物の構成ヌクレオシド三リン酸に加ピロリン酸分解するステップと、
第２水性媒体の形をとるヌクレオシド三リン酸を、前記付着部位周りから、第２マイクロ流体経路を経て除去するステップと、
不混和性キャリア媒体内の前記第２水性媒体に由来する微小液滴を、光学的に媒介されるエレクトロウェッティング装置を用いて操作するステップと、
電磁放射源によって各微小液滴に照射するときに、各微小液滴において放出されるフルオロフォアに由来する蛍光を検出するステップと、
を含む、
ポリヌクレオチド分析物を調査する方法であり、
前記エレクトロウェッティング装置は、
第１複合壁であり、第１透明基板、第１透明基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第１透明導体層、第１透明導体層上の、３００〜１０００ｎｍの厚さを有し、４００〜１０００ｎｍの波長範囲の電磁照射によって活性化される光活性層、及び第１透明導体層上の、１２０〜１６０ｎｍの厚さを有する第１誘電体層からなる第１複合壁と、
第２複合壁であり、第２基板、第２基板上の、７０〜２５０ｎｍの厚さを有する第２透明導体層、及び任意に、第２導体層上の、２５〜５０ｎｍの厚さを有する第２誘電体層からなる第２複合壁と、
前記第１複合壁及び第２複合壁にわたって、前記第１透明導体層及び第２透明導体層を接続する電位差を供給する交流電源と、
前記光活性層に衝突させて、前記第１誘電体層の表面上の対応する一過性エレクトロウェッティング箇所を誘起するように適合される光励起層のバンドギャップより高いエネルギを有する少なくとも１つの電磁放射源と、
前記一過性エレクトロウェッティング箇所の配置を変えることにより、少なくとも１つの第1エレクトロウェッティング経路を生成し、前記第１エレクトロウェッティング経路に沿って微小液滴を移動させることができるように、前記光活性層上での電磁照射の衝突点を操作する手段と、
を備え、
前記第１誘電体層及び第２誘電体層の露出面は、１０μｍ未満の間隔で配置されて、前記微小液滴を含むように適合されるマイクロ流体空間を画定し、
前記微小液滴は、操作時のある時点において、ヌクレオシド三リン酸の一部又は全部をさらに含み、
オリゴヌクレオチド捕捉システムは、不使用状態では蛍光を発しない蛍光プローブと、蛍光状態において使用される前記オリゴヌクレオチド捕捉システムから前記フルオロフォアを放出させることができる、ポリメラーゼ並びに任意にリガーゼ及びエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼとからなる、
方法が提供される。
【００４８】
分析物は天然又は合成起源のDNA又はRNAであってもよく、選択される捕捉システムはそれと適合する。本方法は配列決定に特に適しており、一実施形態では、上述の本発明の第3の態様と共に有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】マイクロ流体チップの平面図である。
【図２】種々の微小液滴がどのように操作されるかを示す微小液滴操作区域の部分断面図である。
【図３】典型的な微小液滴の上面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
次に、ポリヌクレオチドDNA分析物を配列決定するのに適した本発明による装置を、以下の図および説明によって説明する。
【００５１】
図1はマイクロ流体チップの平面図を示し、当該マイクロ流体チップは透明プラスチック製の単一チップに一体化された微小液滴調製区域1と微小液滴操作区域3とを含む。１は、入口4、5、および6に取り付けられた流体7、8、及び9を包含する領域を含み、入口4、5、および6は、それぞれ、加ピロリン酸分解流、無機ピロホスファターゼ流、及び出願人らの以前の出願の1つに従ってヌクレオシド三リン酸を同定するために必要とされる種々の検出化学物質および酵素の流れをチップに導入する。次いで、これらの流れは、それぞれオリフィス7a、8a及び9aに送達され、そこから種々の微小液滴7b、8b及び9bが生成される(例えば、液滴ディスペンシングヘッドを使用して、またはより大きな中間液滴から切断することによって)。10は、常磁性ポリマー複合体マイクロビーズ11を含むリザーバであり、これに配列決定されるべきポリヌクレオチド分析物の単一分子が付着される。11の各々は、エレクトロウェッティング経路12に沿って位置7cに輸送され、そこで保持され、7bの流れと接触される。このプロセスにおいて、11に付着した分析物は、各7bが11から離脱した後、それが空であるか、または1つのヌクレオシド三リン酸分子のみを含むような速度で、漸進的に加ピロリン酸分解される。離脱後、微小液滴8b及び9bとともに7bは、図2に示された機構によって、30〜40℃の温度で、様々なオプトエレクトロウェッティング経路（optoelectrowetting paths、ここでは正方形状エレクトロウェッティング箇所25によって定められる)に沿って操作される3に移動させられる。このプロセスでは、7b及び8bが第１合流点12で合流して中間微小液滴13を生成させ、その後、第2合流点14で9bと合流して、60〜75℃の温度でオプトエレクトロウェッティングによってインキュベート領域16を通って前方に移動する複数の最終微小液滴15の流れを生成し、内容物をインキュベートし、必要な化学反応および酵素反応を起こさせる。その後、15は、検出ゾーン2内の最終位置に輸送され、そこで、LED源からの光及び光検出器を用いて検出される各微小液滴によって放出される任意の蛍光で問い合わせられる。光検出器の出力は、既知の配列決定アルゴリズムを用いて分析することができる分析物の配列に対応するデータストリームである。
【００５２】
図2は、種々の微小液滴がどのように操作されるかを示す3の部分断面図を表し、３は、各々が厚さ130nmの導電性酸化インジウムスズ(ITO)18a及び18b の透明層で被覆された厚さ500μmの頂部及び底部ガラスプレート又は透明プラスチックプレート(17a及び17b)を含む。18a及び18b の各々はA/C源19に接続され、18b上の酸化インジウムスズ層は接地されている。18bは厚さ800nmのアモルファスシリコン層20で被覆されている。18a及び20は、それぞれ、高純度アルミナ又はハフニア21a及び21b の厚さ160nmの層でコーティングされ、これらは次に、ポリ(3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート)22単層でコーティングされて、これら表面を疎水性にする。21a及び21bはスペーサー(図示せず)を使用して3μm離間され、その結果、微小液滴は装置に導入されたときにある程度の圧縮を受ける。発光ダイオード光源23によって照明された反射性の画素化されたスクリーンの画像は、一般に17bの下に配置され、0.01Wcm2の水準の可視光(波長660又は830nm)がそれぞれのダイオード24から放射され、17b及び18bを通る多数の上方向の矢印の方向に伝播することによって20に衝突させられる。種々の衝突点において、光励起された電荷領域26が20内に生成され、これは、対応するエレクトロウェッティング箇所25において、21b内に変更された液体-固体接触角度を誘起する。これらの変更された特性は、微小液滴をある点25から別の点へと推進するために必要な毛管力を提供する。23は、あらかじめプログラムされたアルゴリズムによって、26のアレイのどれが任意の時点で照明されるかを決定するマイクロプロセッサ（図示せず）によって制御される。この手段により、種々の微小液滴を、図1に示す種々の経路に沿って同期した方法で移動させることができる。
【００５３】
図3は、接触の程度を画定する点線輪郭7’を有するとともに、21b上の位置25に位置する典型的な微小液滴(ここでは7b)の上面図を示す。この例では、26が7bの移動方向に三日月形状である。
【図１】
2020525769.tif 000003
【図２】
2020525769.tif 000004
【図３】
2020525769.tif 000005
【国際調査報告】
2020525769.tif 000006
2020525769.tif 000007
2020525769.tif 000008