(57)【要約】  本技術は、一般に、様々な細胞株における組換えタンパク質の産生を増加させるための方法に関する。実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の効果の阻害が行われ、結果として細胞株からのタンパク質の産生が増加する。タンパク質の産生が増加した細胞株及びそのような細胞株を調製する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている単離細胞。
【請求項２】
前記単離細胞が真核細胞である、請求項１に記載の単離細胞。
【請求項３】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２に記載の単離細胞。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞が、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３に記載の単離細胞。
【請求項５】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が、前記単離細胞の前記ＵＬＫ１遺伝子を変異させる又は編集することによって阻害されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離細胞。
【請求項６】
前記変異又は編集が、前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の触媒残基、又は翻訳後修飾された前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の残基を除去又は阻害する、或いはドミナントネガティブ変異をもたらす、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項７】
前記変異又は編集が、前記細胞における前記ＵＬＫ１遺伝子の発現を減少させる又はノックアウトする、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項８】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が、転写後遺伝子干渉によって阻害されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離細胞。
【請求項９】
前記転写後遺伝子干渉が、ｓｉＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ干渉、又は小分子干渉を利用する、請求項８に記載の単離細胞。
【請求項１０】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果の阻害が、前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞と比較して、組換えタンパク質産生の増加をもたらす、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離細胞。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質が、分泌タンパク質、膜アンカータンパク質、又は細胞内タンパク質である、請求項１０に記載の単離細胞。
【請求項１２】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項１０又は１１に記載の単離細胞。
【請求項１３】
前記組換えタンパク質産生の増加が少なくとも約３０％である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の単離細胞。
【請求項１４】
前記組換えタンパク質産生の増加が約５０％〜約５００％である、請求項１３に記載の単離細胞。
【請求項１５】
組換えタンパク質を生産する方法であって、
ａ．前記組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子を、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている単離細胞に導入するステップ；
ｂ．前記組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で前記単離細胞を培養するステップ；及び
ｃ．前記組換えタンパク質が前記単離細胞によって分泌されたら、前記組換えタンパク質を前記単離細胞又は前記培地から単離するステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記単離細胞が真核細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が、前記単離細胞のＵＬＫ１遺伝子を変異させる又は編集することによって阻害されている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異又は編集が、前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の触媒残基、又は翻訳後修飾された前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の残基を除去又は阻害する、或いはドミナントネガティブ変異をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異又は編集が、前記細胞におけるＵＬＫ１遺伝子の発現を減少させる、又はノックアウトする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が、転写後遺伝子干渉によって阻害されている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記転写後遺伝子干渉が、ｓｉＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ干渉、又は小分子干渉を利用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果の阻害が、前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞と比較して、前記組換えタンパク質産生の増加をもたらす、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えタンパク質が、分泌タンパク質、膜アンカータンパク質、又は細胞内タンパク質である、請求項１５又は２４に記載の単離細胞。
【請求項２６】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項１５又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えタンパク質産生の増加が少なくとも約３０％である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換えタンパク質産生の増加が約５０％〜約５００％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組換えタンパク質の産生に使用するための単離細胞を作製する方法であって：
ａ．前記単離細胞のＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を阻害するステップ；及び
ｂ．前記単離細胞の増殖を可能にする条件下で前記単離細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項３０】
前記単離細胞が真核細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が、前記単離細胞の前記ＵＬＫ１遺伝子を変異させる又は編集することによって阻害される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記変異又は編集が、前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の触媒残基、又は翻訳後修飾された前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の残基を除去又は阻害する、或いはドミナントネガティブ変異をもたらす、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記変異又は編集が、前記単離細胞におけるＵＬＫ１遺伝子の発現を減少させる、又はノックアウトする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が、転写後遺伝子干渉によって阻害される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記転写後遺伝子干渉が、ｓｉＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ干渉、又は小分子干渉を利用する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果の阻害が、前記ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞と比較して、組換えタンパク質産生の増加をもたらす、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記組換えタンパク質が、分泌タンパク質、膜アンカータンパク質、又は細胞内タンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換えタンパク質産生の増加が少なくとも約３０％である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組換えタンパク質産生の増加が約５０％〜約５００％である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年９月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、００９８−０００１ＷＯｌ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１７，２２５バイトである。
【０００２】
発明の分野
本技術は、一般に、様々な細胞株における組換えタンパク質の産生を増加させるための方法に関する。実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の効果の阻害が行われ、結果として細胞株からのタンパク質の産生が増加する。タンパク質の産生が増加した細胞株、及びそのような細胞株を調製する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バイオ医薬品が医学においてますます重要になるにつれて、哺乳動物細胞などの真核細胞を含む様々な細胞型からの治療用タンパク質収量を増加させる必要がある。これはまた、高度かつ安定に発現する組換え細胞株、特に哺乳動物細胞株の要望にも関係している。
【０００４】
治療用タンパク質の産生のための組換え細胞クローンの作製は、一般に、高発現クローンを検出して単離するために個々のクローンの広範なスクリーニングを必要とする。しかしながら、スクリーニングプロセスの過程で高発現クローンが同定されたとしても、これらの最初に高発現するクローンは、多くの場合、それらの有利な発現特性を失い、発現収率が時間とともに低下する。したがって、正常に発現する細胞の集団内で、長期間の培養中に高い産生安定性も有し、したがって組換えタンパク質の発現が徐々に失われにくい細胞を同定するために注意を払わなければならない。したがって、通常は大規模に生産される治療用タンパク質及び他の組換えポリペプチドの産生のための組換え細胞クローンの作製は、大規模な生産に必要な発現安定性も示す高発現細胞クローンを同定するために、過剰で時間のかかる個々のクローンのスクリーニングを含む。
【０００５】
したがって、様々な細胞株から大量の組換えタンパク質を産生させるための方法、及びそのような細胞株を作製するための方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
上記を考慮して、本明細書では、タンパク質産生の増加につながる、ＵＬＫ１遺伝子を含む遺伝子の効果を阻害するための方法を提供する。タンパク質産生の増加のために細胞株を調製するための方法、及び阻害することができ、それによってタンパク質産生の増加をもたらす遺伝子を同定するための方法も提供される。
【０００７】
本発明の実施形態は、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている単離細胞に関する。
【０００８】
例示的な細胞には、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞を含む真核細胞が含まれる。
【０００９】
実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果は、単離細胞のＵＬＫ１遺伝子を変異させる又は編集することによって阻害される。適切には、変異又は編集は、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の触媒残基、又は翻訳後修飾されるＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ若しくは複数の残基を除去又は阻害する。さらなる実施形態では、変異又は編集は、細胞のＵＬＫ１遺伝子の発現を減少させる又はノックアウトする。
【００１０】
さらなる実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果は、ｓｉＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ干渉、又は小分子干渉を含み得る転写後遺伝子干渉によって阻害される。
【００１１】
実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果の阻害は、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞と比較して、組換えタンパク質産生の増加をもたらす。適切には、組換えタンパク質産生の増加は少なくとも約３０％であり、他の実施形態では、組換えタンパク質産生の増加は約５０％〜約５００％である。
【００１２】
適切には、組換えタンパク質は、分泌タンパク質、膜アンカータンパク質、又は細胞内タンパク質である。実施形態では、組換えタンパク質は抗体である。
【００１３】
本明細書では、組換えタンパク質を産生する方法も提供される。そのような方法は、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子を、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている単離細胞に導入することを含む。単離細胞は、組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養される。次いで、組換えタンパク質が単離細胞によって分泌されたら、組換えタンパク質を、単離細胞又は培地から単離する。
【００１４】
組換えタンパク質の産生に使用するための単離細胞を作製する方法も提供され、この方法は、単離細胞のＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を阻害すること、及び単離細胞の増殖を可能にする条件下で単離細胞を培養することを含む。
【００１５】
さらに別の実施形態では、その発現産物が阻害されると、組換えタンパク質産生の増加をもたらす遺伝子のスクリーニングの方法が本明細書で提供される。この方法は、単離細胞における遺伝子の発現産物の機能を阻害して阻害された単離細胞を作製すること、及び組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子を阻害された単離細胞に導入することを含む。次いで、阻害された単離細胞を、組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、組換えタンパク質を阻害された単離細胞から単離する。組換えタンパク質の産生量を決定し、これを、遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞における組換えタンパク質の産生量と比較する。阻害された単離細胞における組換えタンパク質の産生量の少なくとも約３０％の増加は、その発現産物が阻害されると、組換えタンパク質産生の増加をもたらす遺伝子を示す。
【００１６】
図面の簡単な説明
本技術の上記及び他の特徴及び態様は、実施形態の以下の説明からよりよく理解することができ、添付の図面に例示されている。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本技術の原理を説明するのにさらに役立つ。図面内の構成要素は必ずしも縮尺どおりではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本明細書に記載の実施形態による、目的の遺伝子をスクリーニングするための実験計画のフローチャートを示す。
【図２】図２は、３つの異なるモデルタンパク質を発現するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、異なるレベルのタンパク質発現を実証する、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＣｒｉｐｔｏ−Ｆｃタンパク質の産生の異なるレベルを実証するＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを示す。
【図４】図４は、本明細書の実施形態による、一次スクリーニングにおける２４ウェルにわたるスクリーニングデータを示す。
【図５】図５は、ＰＬＡＰ及びＧＦＲａ２を発現する細胞株に対する、ＣｒｉｐｔｏＦＣ細胞株で活性であった一次ヒットの確認スクリーニングの結果を例示する円グラフを示す。
【図６】図６は、本明細書に記載の組換えタンパク質発現アッセイを使用して、様々な化合物で処理したときの細胞生存率を示す。
【図７】図７は、本明細書に記載の組換えタンパク質アッセイを使用して、細胞を様々な化合物で処理したときの酵素活性を示す。
【図８】図８は、ＰＬＡＰ細胞アッセイで産生されたタンパク質の体積を示す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＵＬＫ１遺伝子についての遺伝子編集実験の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｅｘｐｉ２９３−Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃ細胞におけるＵＬＫ１遺伝子のｓｉＲＮＡダウンレギュレーションの結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｓｉＲＮＡで達成されたｍＲＮＡノックダウンの程度を示す。
【図１１】図１１は、ＵＬＫ１活性の遺伝子阻害後の異なるレベルのタンパク質発現を実証するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１２Ａ−１２Ｃ】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＵＬＫ１阻害剤で処理した後のＣＨＯ細胞株に対する細胞培養パラメータの効果を示す。
【図１２Ｄ−１２Ｅ】図１２Ｄ〜図１２Ｅは、ＵＬＫ１阻害剤で処理した後のプロテインＡ分析によって測定されたＣＨＯ細胞株におけるＡｂ００１の体積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）及び比生産性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書に示され、説明される特定の実施は例であり、いかなる形であれ他に本出願の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【００１９】
本明細書で言及される公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される任意の参考文献と本明細書の特定の教示との間の矛盾は、後者を優先して解決されるものとする。同様に、技術分野で理解される単語又は語句の定義と、本明細書で具体的に教示する単語又は語句の定義との間の矛盾は、後者を優先して解決されるものとする。
【００２０】
本明細書で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確にそうではないと指示しない限り、それらが言及する語の複数形も具体的に包含する。「約」という語は、本明細書では、〜くらい、その辺り、大体、又はおよそを意味するために使用される。「約」という語が数値範囲と共に使用される場合、記載される数値の上下の限界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という語は、本明細書では、規定された値の上下に２０％の分散で数値を修正するために使用される。
【００２１】
本明細書で使用される科学技術用語は、特段の記載がない限り、本出願が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者に公知の様々な方法論及び材料を参照する。
【００２２】
本明細書に記載の方法、プロセス、細胞、及び組成物は、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている細胞（哺乳動物細胞などの真核細胞を含む）が、大幅に改善された収量で目的の組換えタンパク質産物を発現できるという驚くべき発見に基づいている。
【００２３】
単離細胞
実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている単離細胞が本明細書で提供される。
【００２４】
ヒトＵＬＫ１遺伝子のｍＲＮＡヌクレオチド配列は、配列番号１として以下に提供される。
ＮＭ＿００３５６５．２  ホモサピエンスｕｎｃ−５１様オートファジー活性化キナーゼ１  （ＵＬＫ１），  ｍＲＮＡ
【化１】
2020536513.tif 000002
【化２】
2020536513.tif 000003
【００２５】
ヒトＵＬＫ１タンパク質のアミノ配列は、配列番号２として以下に提供される。
ｓｐ｜Ｏ７５３８５｜ＵＬＫ１＿ＨＵＭＡＮ  セリン／トレオニン−プロテインキナーゼ  ＵＬＫ１  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＵＬＫ１  ＰＥ＝１  ＳＶ＝２
【化３】
2020536513.tif 000004
【００２６】
ＵＬＫ１遺伝子の阻害を標的とすることに加えて、本明細書に記載の方法を利用して、組換えタンパク質の産生に関与する様々な遺伝子の発現産物を標的として阻害することができる。本明細書に記載されるように、遺伝子の阻害（又はその発現産物の阻害）が、タンパク質発現の増加を提供するだけではなく、細胞の生存率に悪影響を与えず、タンパク質の回収、単離、及び最終的な使用、並びに組成物製剤の可能性を最大にする該遺伝子を標的とすることが望ましい。
【００２７】
本明細書に記載されるように、細胞のタンパク質の産生を増加させるために標的とすることができる遺伝子の構築において、細胞の小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）中に引き起こされるが、ストレス応答を維持しながら、分泌機構による出力に対して制限効果を有するプロセスを標的とすることが望ましい。ストレス中の細胞のＵＰＲは、小胞体（ＥＲ）を数倍に拡大して、ＥＲの能力を一時的に高める。ＥＲの拡大は、細胞の恒常性を維持するために、制御下でオルガネラを分解するオートファジーによって相殺される。
【００２８】
ＵＬＫ１遺伝子は、セリン／トレオニン−プロテインキナーゼＵＬＫ１をコードする。ＵＬＫ１遺伝子は、飢餓に応答した細胞のオートファジーに関与している。ＵＬＫ１タンパク質は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼＰＩＫ３Ｃ３の上流に作用して、オートファゴソームの前駆体であるオートファゴフォア（ａｕｔｏｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ）の形成を調節する。ＵＬＫ１タンパク質は、オートファジーの調節フィードバックループの一部であり、ＲＰＴＯＲとの相互作用を介して、ラパマイシン複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の哺乳動物標的の下流のエフェクター及び負の調節因子の両方として作用する。ＵＬＫ１タンパク質はまた、小胞体（ＥＲ）から出る小胞の選別、及び小胞の行き先がゴルジ体又は分解性リゾチームかどうかの判断に関与していることが確認されている。
【００２９】
これらの活性に基づいて、本明細書に記載されるように、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を阻害することが、恐らく、ＵＰＲ中のＥＲの分解の阻害及び分泌小胞の分解経路への集中の防止によって、細胞による組換えタンパク質の産生を増加させることが判明した。しかしながら、ＵＬＫ１遺伝子発現産物の効果を阻害することは、細胞増殖に全く悪影響を与えない。
【００３０】
本明細書で使用される「ＵＬＫ１遺伝子」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１の核酸によってコードされるタンパク質と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を共有するタンパク質をコードする任意の内因性遺伝子を指す。そのような遺伝子によってコードされるタンパク質は、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２の核酸によってコードされるタンパク質と同じ機能を有する。前記遺伝子は、非改変細胞により発現される発現産物の機能を阻害するために、本明細書に記載されるように改変することができる。「ＵＬＫ１遺伝子」という語は、ＵＬＫのコード領域及び非コード領域、並びに遺伝子のプロモーター領域及び５’非翻訳領域を包含する。
【００３１】
「ＵＬＫ１タンパク質」又は「ＵＬＫ１遺伝子の発現産物」という語及び本明細書で使用される類似の表現は、ＵＬＫ１の相同体及び相同分子種を包含し、特に、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は配列番号１によってコードされるタンパク質と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の相同性又は同一性を共有する任意のタンパク質を包含する。そのようなＵＬＫ１タンパク質は、適切には、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１の核酸によってコードされるタンパク質と同じ機能を有する。相同性、同一性はそれぞれ、タンパク質の全長にわたって計算することができる。
【００３２】
本明細書で使用される「タンパク質の産生」、又は「タンパク質産生」、又は「組換えタンパク質の産生」の量は、一般に細胞培養物１ｍＬ当たりのタンパク質（ｍｇ）（ｍｇ／ｍＬ）で測定される細胞又は細胞株の体積生産又は体積生産性を意味する。
【００３３】
本明細書に記載されるように、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果は、様々なメカニズム又は作用によって阻害され、それによって、ＵＬＫ１遺伝子を欠失若しくはノックアウトすることによって、又はＵＬＫ１遺伝子に変異を導入することによって、内因性遺伝子ＵＫＬ１の機能的発現を低下させる、減少させる、又はなくすことができる。さらに、発現産物は、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の作用をなくす若しくは阻害することによって、又はＵＬＫ１遺伝子の発現産物の活性を中和することによって阻害することができる。
【００３４】
本明細書に記載されるように、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物、したがってＵＬＫ１タンパク質の効果を、例えば遺伝子レベル又はタンパク質レベルで阻害することができる。ＵＬＫ１の効果は、例えば、ＵＬＫ１タンパク質の構造／配列の改変、転写、及び／又は翻訳によって阻害することができる。
【００３５】
例えば、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現が細胞内で減少する又はなくなるため、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を細胞内で阻害することができる。例えば遺伝子サイレンシングによって、又は前記遺伝子を欠失させることによって、ＵＬＫ１遺伝子の発現を変更することは、目的の組換え産物を高収率で発現できる細胞を提供する例示的な方法である。ＵＬＫ１遺伝子の発現レベルが細胞内で低下する又はゼロになる、したがって、それぞれ変更された細胞によって機能的ＵＬＫ１タンパク質がより少なく産生されるか又は全く産生されない場合、目的の組換え産物（タンパク質）の発現収率が増加する。機能的ＵＬＫ１発現と組換えタンパク質の発現収率との間のこの相関は、予想外の発見である。
【００３６】
ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を低下させる、減少させる、又はなくすこと（機能的発現なし）は、例えば、ＵＬＫ１遺伝子の発現レベルを低下させることによって、又はＵＬＫ１の発現産物の機能を破壊することによって、又はそのような方法の組み合わせによって達成することができる。
【００３７】
例示的な一実施形態では、細胞は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子編集、遺伝子サイレンシング、又はこれらの任意の組み合わせによってＵＬＫ１遺伝子の機能的発現が低下する、減少する、又はなくなるように変更することができる。すなわち、変異又は遺伝子編集は、ＵＬＫ１遺伝子及び／又はＵＬＫ１遺伝子産物（タンパク質）の発現を減少させる、発現を低下させる、又は発現をなくす（ノックアウトする）。
【００３８】
一実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を、遺伝子ノックアウトによって細胞内で減少させる又はなくすことができる。遺伝子ノックアウトとは、遺伝子の機能を破壊することにより遺伝子を動作不能にする遺伝子技術である。例えば、核酸をコード配列に挿入し、それによって遺伝子機能を破壊することができる。さらに、完全なＵＬＫ１遺伝子又はその一部を欠失させることができ、それによって、それぞれ変更された細胞によって機能性タンパク質が発現されない。さらなる実施形態は、１つ又は複数のノックアウト変異をコード配列に導入することができ、これにより、非機能性又は低機能性の発現産物となり、１つ又は複数のフレームシフト変異を導入することができ、結果として非機能性又は低機能性タンパク質となる。或いは、又はさらに、切断された非機能性又は低機能性タンパク質が得られるように、１つ又は複数の終止コドンをコード配列に導入することができる。したがって、一実施形態によると、ＵＬＫ遺伝子は、非機能性又は低機能性の発現産物を提供する１つ又は複数の変異を含む。他の選択肢には、限定されるものではないが、ＵＬＫ遺伝子の５’及び／若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は他の調節要素におけるプロモーター内に１つ又は複数の変異が含まれる。一実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子のプロモーター機能は、例えば、プロモーター欠失を導入することによって、又はプロモーターと転写開始点の間に構築物を導入することによって破壊される。標的遺伝子の発現を抑制又はなくすために遺伝子ノックアウトを達成するための方法は、本明細書に記載されているだけでなく、当業者に周知である。さらなる実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現の調節に関与する調節要素、例えば、転写因子、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲを標的とすることによってＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を低下させる、減少させる、若しくはなくすことができる、又は他の調節要素を、例えば、ノックアウト、欠失、ダウンレギュレーション、若しくは調節要素の活性を不活性化若しくは低下させる任意の他の変更によって標的にすることができ、これにより、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を防止する又は減少させ、それによって遺伝子の内因性発現産物の効果が阻害される。
【００３９】
実施形態では、ＵＫＬ１遺伝子の変異は、ＵＫＬ１遺伝子産物の活性部位又はＡＴＰ結合ポケットを変異させることにより発現産物の機能又は活性化に影響を与えることによってＵＬＫ１遺伝子の機能又は効果を阻害することができる。さらなる変異により、以下に列挙されるような部位におけるタンパク質のアミノ酸配列を改変することができる。
【００４０】
【表１】
2020536513.tif 000005
【００４１】
当業者は、これらのアミノ酸位置を阻害するために、遺伝子配列における潜在的な核酸変異を決定することができる。
【００４２】
さらなる実施形態では、ドミナントネガティブ変異（アンチモルフ変異（ａｎｔｉｍｏｒｐｈｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）を利用して、ＵＬＫ−１遺伝子を阻害することができる。ドミナントネガティブ変異は、野生型アレルに対して拮抗的に作用する遺伝子産物の変化をもたらす。これらの変異は通常、分子機能の変化（多くの場合不活性）をもたらし、優性又は半優性表現型によって特徴付けられる。
【００４３】
例示的な一実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子は、遺伝子エンジニアリングによって機能的にノックアウトされる。例として、限定されるものではないが、エンジニアリングされたヌクレアーゼ（ＧＥＥＮ）を用いたゲノム編集などのゲノム編集が挙げられる。これは、人工的にエンジニアリングされたヌクレアーゼ、又は「分子ハサミ」を使用して、ＤＮＡが、ゲノムに対して挿入される、置換される、又は除去される遺伝子エンジニアリングの一種である。ヌクレアーゼは、ゲノムの望ましい位置に特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製し、細胞の内因性メカニズムを利用して、相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の自然のプロセスによって誘導された切断を修復する。例示的なエンジニアリングされたヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、及びエンジニアリングされたメガヌクレアーゼ再エンジニアリングホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【００４４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集の例示的な標的配列には以下が含まれる：
ヒトＵＬＫ１のＵＬＫ１  ｇＲＮＡ  Ｃ８  ＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＧ（エクソン１の２８１〜２９９）（配列番号３）
ヒトＵＬＫ１のＵＬＫ１  ｇＲＮＡ  Ｄ８  ＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧ（エクソン１の３３６〜３５３）（配列番号４）
【００４５】
実施形態では、細胞のゲノムに存在するＵＬＫ１遺伝子の１つ又は複数のコピーを変更して、例えばノックアウトする又は欠失させて、細胞のＵＬＫ１遺伝子の発現産物を減少させる又はなくすため、その効果を阻害する。したがって、一実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子の少なくとも１つのコピーが、細胞のゲノムにおいて欠失される又は機能的に不活性化される。例えば、（２つ以上のコピーが存在する場合は）ＵＬＫ１遺伝子の１つ又は複数のコピーに１つ又は複数の変異を挿入して、非機能性又は低機能性の発現産物を提供するか、又はすべての発現をなくす若しくは低減することができるため、細胞のＵＬＫ１の効果が阻害される。一実施形態によると、２つ以上のコピーが存在する場合、ＵＬＫ１遺伝子のすべてのコピーが細胞内で適切に変更される。
【００４６】
例示的な実施形態では、変異又は遺伝子編集により、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ又は複数の触媒残基が除去又は阻害される。「触媒残基」は、タンパク質との反応若しくは結合が起こる又は触媒される、タンパク質構造の１つ又は複数の部位を指す。これらの触媒残基の１つ又は複数を変異又は編集することにより、細胞内で産生され得るＵＬＫ１遺伝子産物は正常に機能できなくなり、結果としてＵＬＫ１タンパク質の機能が低下する、減少する、又は完全に消失する。
【００４７】
さらなる実施形態では、変異又は遺伝子編集により、翻訳後修飾されるＵＬＫ１遺伝子の発現産物の１つ又は複数の残基を阻害することができる。すなわち、ＵＬＫ１タンパク質の１つ又は複数の残基を変異させる又は編集することができ、結果として、機能が低下した、減少した、又は完全に消失した、阻害されたＵＬＫ１タンパク質産物となる。
【００４８】
本明細書で使用される「単離細胞」という語は、生きている生物（例えば、植物、昆虫、又は動物）の外部にある細胞を指す。本明細書に記載の方法で調製及び利用できる例示的な細胞には、原核細胞及び真核細胞が含まれる。本明細書に記載されるように、細胞は、細胞培養物、細胞株、及び細胞クローンなどとして提供することができる。例示的な原核細胞には、大腸菌（Ｅ．  Ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）などの細菌が含まれる。真核細胞には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する細胞株を含む昆虫細胞などが含まれる。例示的な真核細胞には、げっ歯類細胞、ヒト細胞、及びサル細胞などの哺乳動物細胞が含まれる。適切な真核細胞は、例えばハムスター又はマウスに由来する細胞などのげっ歯類細胞である。それらは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などのチャイニーズハムスター細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、マウス３Ｔ３線維芽細胞、及びＳＰ２／０細胞であり得る。ＣＨＯ細胞の例としては、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ、ＣＨＯ−ＳＳＦ３、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１が挙げられる。さらなる真核細胞株には、ヒト胚性臓（ＨＥＫ）細胞、マウス骨髄腫リンパ芽球様細胞、ヒト胎児網膜細胞、及びヒト羊膜細胞などが含まれる。
【００４９】
均一であり、したがって予測可能な特性を有する産生細胞株を提供するために、細胞（例えば、真核細胞）のゲノムを変更して阻害を達成することが望ましい。次いで、それぞれ変更された細胞に、目的のタンパク質産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は他の担体をトランスフェクトすることができる。例えば、ＣＨＯ細胞におけるＵＬＫ１遺伝子の発現を減少させる又はなくすことにより、著しく増加した収量で組換えタンパク質産物を産生できるＣＨＯ細胞が提供される。さらなる実施形態では、ヒト細胞に由来する真核細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、造血細胞、及びＨｅＬａ細胞を利用することができる。別の選択肢は、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７細胞、及びＶｅｒｏ細胞を含むサル細胞である。
【００５０】
本明細書に記載されるように、細胞は、ＵＬＫ１を内因的に発現する対応する非改変細胞と比較して、細胞におけるＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を阻害するように改変される。阻害は、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を減少させる若しくはなくすことによって、又はＵＬＫ１遺伝子産物の活性若しくは効果を阻害することによって達成される。
【００５１】
一実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子の欠失は、染色体切断を介して行うことができる。染色体切断は、例えばＭＴＸ、アフィジコリン、又はハイグロマイシンなどの、染色体切断を促進する毒性物質で細胞を処理することによって誘発することができる。染色体切断を誘発するための他の選択肢には、限定されるものではないが、放射線、照射、変異誘発物質、発癌性物質、及びブレオマイシンが含まれる。染色体切断はまた、トランスフェクション、例えばエレクトロポレーション中に自然に起こり得る。染色体切断を誘発した後、所望の切断点（ＵＬＫ１遺伝子の欠失をもたらす）を有する細胞を、それらのＤＮＡを分析することによって同定することができる。
【００５２】
ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現は、様々な活性によって、例えば、転写物がほとんど若しくは全く生成されないようにＵＬＫ１遺伝子のプロモーター及び／若しくはエンハンサーを変更することによって、又は転写若しくは転写後遺伝子サイレンシングなどの遺伝子サイレンシング技術によって影響を受け得る。一実施形態によると、単離細胞は、ＵＬＫ１遺伝子のプロモーター領域に１つ又は複数の変異を含み得る。例えば、プロモーター領域を、低機能性又は非機能性プロモーターを提供するために変更することができ、プロモーターを完全に除去することもできる。或いは、又はさらに、プロモーターとＵＬＫ１ポリペプチドの産生を停止するＵＬＫ１遺伝子の開始コドンとの間に停止コドンを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を加えることが可能である。
【００５３】
機能的遺伝子発現の低減は、発現が低下した、減少した、又はなくなったレベルさえも達成し得る。転写後遺伝子サイレンシングは、アンチセンス分子又はＲＮＡ干渉を媒介する分子によって達成され得る。本明細書に記載されるように、転写後遺伝子サイレンシングは、ｓｉＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ干渉、又は小分子干渉を利用することができる。
【００５４】
例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＵＬＫ１遺伝子の転写されたＲＮＡに特異的に結合し、結果としてＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成され、逆転写又はメッセンジャーＲＮＡ翻訳が停止されるように設計することができる。多くの形態のアンチセンスが開発されており、酵素依存性アンチセンス又は立体遮断（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アンチセンスに広く分類することができる。酵素依存性アンチセンスには、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性に依存して、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びホスホロチオエートアンチセンスを含む標的ｍＲＮＡを分解する形態が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、転写鎖としてアンチセンス鎖を含むアンチセンス構築物からの発現によって細胞内で産生される。トランス切断触媒ＲＮＡ（リボザイム）は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定の標的用に特別に設計することができ、かつ細胞ＲＮＡのバックグラウンドで部位特異的に任意のＲＮＡ種を切断するようにエンジニアリングすることができる。切断事象により、ｍＲＮＡが不安定になり、タンパク質の発現を防止する。それぞれのアンチセンス分子が永久に発現されるように細胞のゲノムを変更することができる。
【００５５】
転写後レベルでのＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を減少させるのに有用なさらなる一実施形態は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づき、それにより細胞からの組換えタンパク質の産生が増加することになる。ＲＮＡｉによって遺伝子をサイレンシングするための方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、並びに細胞内で実際のＲＮＡｉ誘導化合物に処理されるそれらの前駆体が含まれる。
【００５６】
例えば、ｓｉＲＮＡを、ＵＬＫ１遺伝子のサイレンシングに使用することができる。ｓｉＲＮＡは、各鎖に３’オーバーハングを有する二本鎖分子として提供することができる。平滑末端分子も使用することができる。ｓｉＲＮＡは、デソキシヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含むことができ、さらに、修飾ヌクレオチドを含むことができる。ｓｉＲＮＡ化合物のいくつかの実施形態及びバリエーションが当技術分野で公知であり、ＵＬＫ１遺伝子の発現を減少させるために使用することができる。ＲＮＡレベルで標的ＵＬＫ１遺伝子の領域を標的とする例示的なｓｉＲＮＡは、特定の設計アルゴリズムを適用して、適切な計算方法を使用することによって特定することができる。
【００５７】
例示的なｓｉＲＮＡ化合物には、以下に列挙されるものが含まれる：
【００５８】
【表２】
2020536513.tif 000006
【００５９】
標的転写物に対するｓｉＲＮＡを得るために、二本鎖分子を細胞に直接トランスフェクトすることができる。或いは、ｓｉＲＮＡは、長鎖ｄｓＲＮＡ、又は小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をｓｉＲＮＡに変換する酵素であるダイサーによるプロセシングから生じ得る。これらの前駆体又は最終的なｓｉＲＮＡ分子は、外因的に（人工的に）作製することができ、次いで、様々なトランスフェクション法によって細胞に導入することができる。さらなる実施形態によると、ＲＮＡｉ誘導化合物は、細胞にトランスフェクトされるベクターによって発現され得る。ｓｉＲＮＡの場合、これは、２本の鎖間にループを導入することで実現でき、したがって、後に細胞内で機能的ｓｉＲＮＡに処理できる単一転写物が生成される。そのような転写カセットは、典型的には、核内低分子ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写を通常は誘導するＲＮＡポリメラーゼ３プロモーター（例えば、Ｕ６又はＨ１）を使用する。次いで、ベクターから得られたｓｈＲＮＡ転写物がダイサーによって処理され、それにより適切に特徴的な３’オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子が生成される。一実施形態によると、そのようなｓｈＲＮＡを提供するベクターは、細胞のゲノムに安定して組み込まれる。次いで、それぞれのｓｈＲＮＡを提供するベクターを含む細胞を、目的の産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトすることができる。或いは、同時トランスフェクション戦略を使用することができ、この戦略では、ｓｈＲＮＡを生成するベクターが、目的の産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に同時トランスフェクトされる。
【００６０】
転写遺伝子サイレンシングは、エピジェネティックな改変を含み得る。一実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子の発現は、ＤＮＡメチル化を含むエピジェネティックなサイレンシングにより低下する。さらに、ＵＬＫ１遺伝子の配列を変更して、ｍＲＮＡの半減期を短縮することができる。これはまた、それぞれ変更された細胞におけるＵＬＫ１タンパク質の効果の減少を達成する。
【００６１】
一実施形態によると、細胞（例えば、真核細胞）のゲノムは、内因的に発現されるＵＬＫ１タンパク質よりも低い機能性又は非機能性の変異ＵＬＫ１の異種発現によってＵＬＫ１の効果を阻害するように変更される。この実施形態では、単離細胞は、目的のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドに加えて、変異ＵＬＫ１をコードするさらなる異種ポリヌクレオチドを含む。ＵＬＫ１のそれぞれの非機能性又は低機能性変異型を過剰発現させることによって、ドミナントネガティブ表現型を作製することができる。細胞のＵＬＫ１の効果を阻害し、したがって減少させるさらなる選択肢は、ＵＬＫ１を中和し、したがって細胞のＵＬＫ１の効果を阻害する抗体などのタンパク質の異種発現である。一実施形態によると、ＵＬＫ１と機能的に相互作用する分子の機能的発現を減少させる又はなくすことにより、細胞におけるＵＬＫ１の効果が阻害される。
【００６２】
さらなる実施形態では、低分子量化合物、すなわち小分子を使用して、プロモーターの調節領域への転写因子の結合を特異的に阻害することによって、又は標的遺伝子の転写に必要な転写のアクチベーターを阻害することによって、又はＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を直接阻害することによってＵＬＫ１遺伝子の発現を阻害する。それぞれの阻害化合物には、限定されるものではないが、特に小分子、タンパク質、及びペプチドなどの化合物が含まれる。別の可能性は、例えばタンパク質のユビキチン化を刺激することによって、タンパク質産物の分解を刺激する低分子量化合物などの化合物を使用することである。
【００６３】
また、例えばタンパク質の破壊又は活性の制限によって、翻訳されたタンパク質を阻害するために小分子を使用することができる。実施形態では、小分子は、例えばタンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）技術を使用して、タンパク質の分解を媒介することによって機能し得る。また、イントラボディ分子（すなわち、細胞内抗体）を使用して、発現したタンパク質に結合させて、該タンパク質を機能しなくなるようにする又は破壊することができる。例示的な小分子は、本明細書及び実施例に記載されており、ＵＬＫ１阻害剤、ＭＲＴ６８９２１（ＵＬＫ１のＩＣ５０は約２．９ｎＭ）などの化合物が含まれる：
【化４】
2020536513.tif 000007
【００６４】
例示的な実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現は、少なくとも３分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも７５分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも１２５分の１、少なくとも２５０分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも７５０分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも１２５０分の１、少なくとも１５００分の１、少なくとも１７５０分の１、又は少なくとも２０００分の１などに減少する。ＵＬＫ１遺伝子の発現の減少量は、例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ又はその他の高感度ＲＮＡ検出方法を使用して決定することができる。そのような減少は、ＵＬＫ１遺伝子の発現が減少していない非改変参照細胞と比較して測定することができる。
【００６５】
さらなる実施形態では、ＵＬＫ１遺伝子の発現は、減少量を決定するために、細胞の別の天然遺伝子と比較して測定することができる。例えば、ＵＬＫ１遺伝子の発現は、同じ細胞における１８ＳリボソームＲＮＡの発現（１００％に設定）と比較して、０．０５％以下、０．０４７５％以下、０．０４５％以下、０．０４２５％以下、０．０４％以下、０．０３７５％以下、０．０３５％以下、０．０３２５％以下、０．０３％以下、０．０２７５％以下、０．０２５％以下、０．０２２５％以下、０．０２％以下、０．０１７５％以下、０．０１５％以下であり得る。一実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子の発現は、同じ細胞における１８Ｓ  ＲＮＡの発現（１００％に設定）と比較して、０．００１％以下、０．０００１％以下、又はさらには０．００００１％以下など、さらに減少させることができる。
【００６６】
ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現は、適切に阻害される、すなわち、減少する、低下する、又はなくなるため、結果として、変更細胞が目的の産物をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる場合、目的の組換えタンパク質産物の発現及び産生が、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現が阻害されていない（すなわち、低下していない、減少していない、又はなくなっていない）対応する細胞と比較して増加する。一実施形態によると、目的の組換えタンパク質産物の発現は、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現が低下していない、減少していない、又はなくなっていない対応する細胞における発現と比較して、少なくとも約２０％、より適切には少なくとも約３０％増加する。
【００６７】
適切には、組換えタンパク質の発現は、当技術分野で公知の方法を使用して産生されるタンパク質の体積（例えば、ｍＬ）として測定され、したがって、産生の増加は産生されるタンパク質の体積の増加を指す。さらなる実施形態によると、目的の組換えタンパク質産物の発現は、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現が低下しない、減少しない、又はなくならない対応する細胞における発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１００％、又は約３０％〜約７００％、約４０％〜約６００％、約５０％〜約５００％、又は約１００％〜約５００％増加する。
【００６８】
本明細書で使用される「異種ポリヌクレオチド」又は「異種核酸」及び同様の表現は、例えばトランスフェクションなどの組換え技術の使用によって真核細胞に導入されているポリヌクレオチド配列を指す。「ポリヌクレオチド」は、特に、通常はあるデオキシリボース又はリボースから別のデオキシリボース又はリボースに結合しているヌクレオチドのポリマーを指し、文脈に応じてＤＮＡ及びＲＮＡを指す。「ポリヌクレオチド」という語には、サイズの制限は含まれない。
【００６９】
特定の実施形態では、細胞は、目的の産物をコードする異種ポリヌクレオチド、選択マーカーをコードする異種ポリヌクレオチド、及び／又は前記細胞から発現又は分泌されるレポーターポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない。それぞれの「空」細胞は、組換え産生技術のクローニング細胞株として使用することができる。次いで、それぞれの細胞に、例えば適切な発現ベクターを使用して、目的のタンパク質産物をコードする異種ポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができる。したがって、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害され、組換え産物をまだ発現せず、まだ分泌していないそのような「空」細胞は、組換え産生されることになる目的の所望の産物に応じて、異なる発現ベクターでトランスフェクトすることができる。したがって、そのような細胞株は、異なるプロジェクト、すなわち、目的の異なる産物、特に目的の分泌ポリペプチドの産生に使用することができる。トランスフェクションは一過性又は安定性であり得る。
【００７０】
本明細書に記載されるように、適切な実施形態では、細胞（例えば、真核細胞）は、目的の産物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。目的の産物は、適切には、細胞で大量に発現される組換え産物である。適切には、目的の産物はポリペプチドである。さらに、細胞は、選択マーカーをコードする異種ポリヌクレオチド及び／又はレポーターをコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。これにより、正常にトランスフェクトされ、したがって目的の産物を発現する宿主細胞の選択が単純化される。さらに、細胞は、異なる選択マーカー及び／又はレポーターポリペプチドをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態によると、目的の産物をコードする異種ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み込まれる。
【００７１】
発現ベクターを使用して、異種ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ得る。目的の産物をコードするポリヌクレオチド及び選択マーカー又はレポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、同じ発現ベクター上又は異なる発現ベクター上に位置し得る。細胞への導入は、目的の産物をコードするポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって達成することができる。発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに適切に組み込まれる（安定したトランスフェクション）。異種核酸がゲノムに挿入されていない場合、細胞が有糸分裂すると、異種核酸が、後期に失われる可能性がある（一過性トランスフェクション）。安定したトランスフェクションは、目的のポリペプチドなどの目的の産物を工業規模で生産するための高発現細胞クローンの作製に適している。発現ベクターなどの異種核酸を宿主細胞に導入するための例示的な方法には、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、並びに微粒子銃及びポリマー媒介遺伝子導入などが含まれる。組換え媒介アプローチを使用して、異種ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに導入することができる。
【００７２】
目的の組換え産物の発現を達成するために使用される発現ベクターは、通常は発現カセットの要素として、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写休止又は終結シグナルなどの、転写を誘導するのに適した転写制御要素を通常は含む。所望の産物がポリペプチドである場合、適切な翻訳制御要素、例えば、リボソームの動員に適した５’キャップ構造につながっている５’非翻訳領域及び翻訳プロセスを終了させる停止コドンがベクターに含まれる。
【００７３】
実施形態では、目的の産物をコードするポリヌクレオチド並びに選択マーカー及び／又はレポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに適切に含まれる。例えば、前記ポリヌクレオチドのそれぞれは、別個の発現カセットに含まれ得る。少なくとも２つのそれぞれのポリヌクレオチドが１つの発現カセットに含まれることも本発明の範囲内である。一実施形態によると、少なくとも１つの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素は、同じ発現カセットから発現されるポリヌクレオチド間に機能的に位置する。それにより、別個の翻訳産物が前記転写物から確実に得られる。それぞれのＩＲＥＳベースの発現技術並びに他のバイシストロン系及びポリシストロン系は、当技術分野で周知である。
【００７４】
実施形態では、発現ベクターは、発現カセットの要素として少なくとも１つのプロモーター及び／又はプロモーター／エンハンサー要素を含み得る。プロモーターは、構成的に機能するものと、誘導又は抑制によって調節されるものとの２つのクラスに分類することができる。両方とも適している。多くの細胞型で発現を誘導する強力な構成的プロモーターには、限定されるものではないが、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＳＶ４０及びラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにマウス３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ＥＦｌαが含まれる。一実施形態によると、プロモーター及び／又はエンハンサーは、ＣＭＶ及び／又はＳＶ４０から得られる。転写プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓｅ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーター、及びβ−アクチンプロモーターからなる群から選択することができる。
【００７５】
目的の発現産物は、目的の産物をコードするポリヌクレオチドによってコードされる遺伝情報の転写、翻訳、又は発現の任意の他の事象によって産生され得る任意の生物学的産物であり得る。目的の産物は、ポリペプチド及び核酸、特にＲＮＡからなる群から選択することができる。産物は、薬学的又は治療的に活性な化合物、又はアッセイなどで利用される研究ツールであり得る。適切には、目的の産物は、ポリペプチド、特に組換えポリペプチド、すなわち宿主細胞で大量に産生されるポリペプチドである。目的の任意のポリペプチドは、本明細書に記載の方法で発現させることができる。「ポリペプチド」という語は、ペプチド結合によって１つに連結されたアミノ酸のポリマーを含む分子を指す。ポリペプチドには、タンパク質（例えば、５０個を超えるアミノ酸を有する）及びペプチド（例えば、２〜４９個のアミノ酸）を含む、任意の長さのポリペプチドが含まれる。ポリペプチドには、任意の活性、機能、又はサイズのタンパク質及び／又はペプチドが含まれ、かつ分泌タンパク質、膜アンカータンパク質、又は細胞内タンパク質が含まれる。
【００７６】
例示的なポリペプチド及び組換えポリペプチドには、酵素（例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ）、受容体、輸送体、殺菌性及び／又はエンドトキシン結合タンパク質、構造ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、糖タンパク質、球状タンパク質、免疫ポリペプチド、毒素、抗生物質、ホルモン、成長因子、血液因子、又はワクチンなどが含まれる。ポリペプチドは、ペプチドホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、抗体又はその機能的な抗体断片若しくは変異体を含む免疫グロブリン、及びＦｃ融合タンパク質であり得る。本明細書に記載されるように発現される目的のポリペプチドはまた、抗体の重鎖若しくは軽鎖などのポリペプチドのサブユニット若しくはドメイン、又はその機能的断片若しくは誘導体であり得る。
【００７７】
「目的の産物」、「目的のポリペプチド」、「タンパク質産物」、「ポリペプチド産物」、「組換えタンパク質」、「目的のタンパク質」、及び「組換えポリペプチド」という語は互換的に使用され、文脈によって、そのような個々のサブユニット又はドメイン、又はそれぞれのサブユニット若しくはドメインから構成される最終タンパク質を指し得る。実施形態では、目的のポリペプチドは、免疫グロブリン分子、適切には抗体、又は抗体の重鎖若しくは軽鎖などのそのサブユニット若しくはドメインである。本明細書で使用される「抗体」という語は、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むタンパク質を指す。「抗体」という語には、天然に存在する抗体、並びにすべての組換え型の抗体、例えば、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及びキメラ抗体が含まれる。各重鎖は通常、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。各軽鎖は通常、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。しかしながら、「抗体」という語には、単一ドメイン抗体、重鎖抗体、すなわち１つ又は複数、特に２つの重鎖のみから構成される抗体、及びナノボディ、すなわち単一の単量体可変ドメインのみから構成される抗体などの他の種類の抗体も含まれる。上述のように、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、目的のポリペプチドとして、抗体の１つ又は複数のサブユニット又はドメイン、例えば、重鎖又は軽鎖又はその機能的断片若しくは誘導体をコードし得る。そのようなサブユニット又はドメインは、同じ又は異なる発現カセットから発現され得る。特に抗体の「機能的断片又は誘導体」は、抗体に由来し、同じ抗原、特に抗体と同じエピトープに結合することができるポリペプチドを指す。抗体の断片又は誘導体の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、それぞれの重鎖及び軽鎖の可変領域及び第１の定常ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）重鎖の可変領域及び第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームの重鎖及び軽鎖可変領域からなるＦｖ断片；（ｖ）ｓｃＦｖ断片、単一ポリペプチド鎖からなるＦｖ断片；（ｖｉ）互いに共有結合した２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；並びに（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との結合が分子内ではなく分子間でのみ生じ得るように互いに共有結合した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からなるマルチボディー（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）が挙げられる。
【００７８】
本明細書に記載されるように、実施形態では、細胞は、目的の産物をコードする異種ポリヌクレオチドに加えて、選択マーカーをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド及び／又はレポーターポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。「選択マーカー」は、適切な選択培養条件下で、前記選択マーカーを発現する宿主細胞の選択を可能にする。それにより、発現ベクターで正常にトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な選択条件下で選択することができる。典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、薬物、抗生物質、若しくは他の毒物などの選択剤に対する耐性を付与する又は宿主細胞の代謝障害若しくは異化障害を補償する。選択マーカーは、陽性又は陰性選択マーカーであり得る。実施形態では、選択マーカーは、選択マーカーを欠く宿主細胞の生存及び／又は増殖に不可欠な化合物の非存在下又は減少下で、宿主細胞が生存及び増殖することを可能にする。宿主細胞の生存及び／又は増殖に十分な高い濃度の必須化合物を含まない又は少ない量の前記必須化合物を含む培地で宿主細胞を培養することにより、選択マーカーを発現する宿主細胞のみが生存し、かつ／又は増殖することができる。
【００７９】
一実施形態によると、選択可能マーカーは、薬物が関与する選択条件に耐性を付与するタンパク質をコードする薬物耐性マーカーである。様々な選択可能マーカー遺伝子が記載されている（例えば、国際公開第９２／０８７９６号パンフレット、国際公開第９４／２８１４３号パンフレット、国際公開第２００４／０８１１６７号パンフレット、国際公開第２００９／０８０７５９号パンフレット、国際公開第２０１０／０９７２４０号パンフレットを参照）。例えば、１つ又は複数の抗生物質に対する耐性を付与する少なくとも１つの選択可能マーカーを使用することができる。選択可能マーカーは、一実施形態によると、増幅可能な選択可能マーカーであり得る。増幅可能な選択可能マーカーは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にし、宿主細胞内での前記ベクターの遺伝子増幅を促進し得る。哺乳動物細胞などの真核細胞で一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子には、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、グルタミンシンテターゼ、アスパラギンシンテターゼの遺伝子、及びネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ウアバイン、ブラストサイジン、ヒスチジノールＤ、ブレオマイシン、フレオマイシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８０】
「レポーターポリペプチド」を利用することができ、これにより、報告特性（例えば、蛍光）に基づいてレポーターポリペプチドを発現する細胞の同定が可能となる。レポーター遺伝子は通常、宿主細胞に生存率の改善を提供しない。しかしながら、レポーターポリペプチドの発現を使用して、レポーターポリペプチドを発現する細胞と発現しない細胞とを区別することができる。したがって、レポーター遺伝子により、正常にトランスフェクトされた宿主細胞の選択が可能になる。適切なレポーターポリペプチドには、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及びルシフェラーゼが含まれる。説明したように、目的の産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、２つ以上の選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子も含み得る。さらに、選択マーカーをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチド及び／又はレポーターポリペプチドをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチドは、目的の産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと同時トランスフェクトされる１つ又は複数の異なる発現ベクターで提供することもできる。そのような同時トランスフェクション戦略は、同様に、当技術分野で周知の選択を可能にする。
【００８１】
細胞に含まれる発現ベクター又は少なくとも２つの発現ベクターの組み合わせは、さらなるベクター要素をさらに含み得る。例えば、さらなる目的の産物をコードする少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドを利用することができる。宿主細胞によって産生されて適切に分泌される最終ポリペプチドはまた、いくつかの個々のサブユニット又はドメインから構成されるタンパク質であり得る。それぞれのタンパク質の例は、免疫グロブリン分子、特に重鎖及び軽鎖を含む抗体である。異なる個々のサブユニット又はドメインから構成されるそれぞれのタンパク質を産生するためのいくつかの選択肢があり、適切なベクターの設計は当技術分野で公知である。一実施形態によると、前記タンパク質の２つ以上のサブユニット又はドメインは、１つの発現カセットから発現される。この実施形態では、１つの長い転写物が、タンパク質の個々のサブユニット又はドメインのコード領域を含むそれぞれの発現カセットから得られる。一実施形態によると、少なくとも１つのＩＲＥＳ要素（内部リボソーム進入部位）は、個々のサブユニット又はドメインのコード領域間に機能的に位置し、各コード領域の前に分泌リーダー配列が存在する。それにより、別個の翻訳産物が前記転写物から得られ、最終タンパク質が正しく構築され、分泌され得ることが保証される。
【００８２】
抗体の発現などのいくつかの実施形態では、異なる発現カセットから個々のサブユニット又はドメインを発現させることが望ましい。一実施形態によると、目的の産物を発現するために使用される発現カセットは、モノシストロン性発現カセットである。発現ベクター又は発現ベクターの組み合わせに含まれる発現カセットは、モノシストロン性であり得る。一実施形態によると、目的の産物を発現するために設計された各発現カセットは、目的のポリペプチドとして発現されるタンパク質の１つのサブユニット又はドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。抗体の場合、１つの発現カセットが抗体の軽鎖をコードすることができ、別の発現カセットが抗体の重鎖をコードすることができる。個々の発現カセットからの個々のサブユニット又はドメインの発現後、抗体などの最終タンパク質は、前記サブユニット又はドメインから構築され、宿主細胞によって分泌される。この実施形態は、抗体などの免疫グロブリン分子の発現に特に適している。この場合、目的の産物をコードする第１の異種ポリヌクレオチドは、例えば免疫グロブリン分子の重鎖又は軽鎖をコードし、目的の産物をコードする第２の異種ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子の他の鎖をコードする。
【００８３】
細胞及び細胞株を作製する方法
さらなる実施形態では、組換えタンパク質の産生に使用するための単離細胞を作製する方法が本明細書で提供される。本明細書に記載される方法は、複数の実験又はタンパク質の産生手順を可能にするように、維持及び継代することができる細胞株を作製するために適切に使用される。
【００８４】
実施形態では、本明細書に記載の方法は、単離細胞におけるＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を阻害すること、及び単離細胞の増殖を可能にする条件下で単離細胞を培養することを含む。
【００８５】
ＵＬＫ１遺伝子の発現産物（ＵＬＫタンパク質）の効果を阻害するための方法は、本明細書に記載されており、ＵＬＫ１遺伝子及び発現されたＵＬＫ１タンパク質を阻害する作用を含む。
【００８６】
例示的な一実施形態では、この方法は、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を減少させる又はなくすことを含み、それにより、細胞におけるＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果を阻害する。適切な方法が本明細書で説明されている。一実施形態によると、細胞（例えば、真核細胞）のゲノムを変更して、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を減少させる又はなくすことができる。例えば、遺伝子ノックアウトを、ＵＬＫ１遺伝子に導入することができる。一実施形態によると、そのような遺伝子ノックアウトは、ＵＬＫ１遺伝子のすべてのコピーに導入される。別の実施形態によると、ＵＬＫ１遺伝子は欠失される。ＵＬＫ１遺伝子のすべてのコピーが、ゲノムから欠失されてもよい。一実施形態によると、この方法は、染色体の一部を欠失させることを含み、欠失された部分はＵＬＫ１遺伝子を含む。欠失された部分は、テロメア領域に対応してもよい。そのような欠失は、例えば染色体切断を誘発する薬剤を使用することにより誘発され得る。ここで、誘発される染色体切断により前記遺伝子のすべてのコピーが欠失されるため、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現が減少した又はなくなった細胞を得るために、細胞をそのような薬剤で繰り返し処理することができる。
【００８７】
ＵＬＫ１遺伝子の阻害を行うことができる、真核細胞及び適切な哺乳動物細胞を含む例示的な細胞が本明細書で説明されている。適切な実施形態では、調製される細胞は、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。
【００８８】
単離細胞を培養する方法及び細胞を増殖させることができる条件は、特定の細胞株に特有であり、当技術分野で公知である。そのような培養方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）に開示されている。培養方法には、様々な培地の使用と、保存及び継代ができ、それらの継続的な使用を可能にする安定した細胞を作製するために細胞株の増殖を可能にするステップとが含まれる。ＵＬＫ１遺伝子の適切な阻害を有する細胞の選択は、細胞集団の遺伝子構成のスクリーニングを含め、本明細書に記載の様々な方法を用いて行うことができる。
【００８９】
本明細書で使用される、細胞株又は細胞培養物を指す場合の「安定な」又は「安定性」は、一般に、少なくとも６〜１４週間の細胞増殖の期間にわたる体積生産性（すなわち、タンパク質の体積生産（ｍｇ／ｍＬ））の減少が３０％未満であることを意味する。この安定性は、たとえＵＬＫ１遺伝子又は遺伝子発現が細胞株で阻害されたとしても、タンパク質産生の増加のために細胞株の再現可能な使用を可能にする本明細書に記載の方法の予想外の発見である。例示的な実施形態では、本明細書に記載の細胞株は、約８〜１２週間、適切には約８〜１０週間にわたって、体積生産性が２５％未満、２０％未満、１０％未満、又は５％未満減少するような安定性を示す。
【００９０】
細胞は、適切な培地で培養することができる。適切な培地又は効果的な培地は、細胞が目的の異種ポリペプチド／タンパク質を増殖及び／又は発現することができる任意の培地を指す。そのような培地は、典型的には、炭素、窒素、及びリン酸源を含む水性培地であるが、適切な塩、ミネラル、金属、及び他の栄養素も含み得る。微生物及び他の細胞は、従来のバイオリアクターで、バッチ、流加、細胞リサイクル、及び連続発酵を含む任意のプロセスで培養することができる。培地のｐＨは、特定の生物の増殖及びタンパク質の産生に適したｐＨに調整される。増殖に必要な酸素を供給し、二酸化炭素の過剰な蓄積を回避するために、増殖チャンバーを通気することができる。様々な宿主細胞の培地及び条件は、当技術分野で公知である。
【００９１】
細胞のＵＬＫ１遺伝子を変異させる又は編集するための様々な方法が本明細書に記載されており、これらの方法には、ＵＬＫ１遺伝子の遺伝子編集、変異、又はノックアウト、及びＵＬＫ１遺伝子の転写後遺伝子干渉による方法が含まれる。
【００９２】
本明細書に記載されるように、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されると、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞と比較して、組換えタンパク質の産生が増加する。この産生の増加は、ＵＬＫ１遺伝子／タンパク質産物が阻害されていない細胞と比較して、適切には少なくとも約３０％程度、より適切には約５０％〜約５００％である。
【００９３】
分泌タンパク質、膜アンカータンパク質、及び細胞内タンパク質を含む例示的な組換えタンパク質は、本明細書に記載の細胞によって産生させることができる。
【００９４】
目的の産物を産生する方法
さらなる実施形態では、目的の産物、適切には組換えタンパク質を産生する方法が本明細書で提供される。そのような方法には、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子を単離細胞に導入することが含まれる。適切には、細胞は、本明細書に記載されるように改変され、ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている。単離細胞は、組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養される。次いで、組換えタンパク質が細胞から単離される。
【００９５】
本明細書で提供される、真核細胞を含む細胞は、目的のポリペプチド又はタンパク質などの目的の産物を組換え産生するための産生宿主細胞として適している。例えば、ＵＬＫ１遺伝子の機能的発現を減少させる又はなくすことによって細胞のＵＬＫ１遺伝子の発現産物の効果が阻害されている細胞の適切な例、並びに目的の産物（組換えタンパク質）の例が本明細書に詳細に記載されている。本明細書に記載されているように、目的の産物、適切には組換えタンパク質は、ＵＬＫ１遺伝子又はＵＬＫ１遺伝子の発現産物が阻害されていない細胞よりも、阻害された細胞でより大量に産生される。本明細書に記載されるように、実施形態では、産生される組換えタンパク質の量は、阻害されたＵＬＫ１遺伝子又はＵＬＫ１遺伝子発現産物を含まない細胞による量よりも少なくとも３０％、例えば約５０％〜約５００％増加する。
【００９６】
本明細書に記載されるように、真核細胞は、適切には脊椎動物細胞、より適切には哺乳動物細胞である。一実施形態によると、この方法は、目的の産物をコードするポリヌクレオチドを真核細胞に導入すること、及び目的の産物を発現する宿主細胞を選択することを含む。導入は、上記のトランスフェクションによって達成することができる。選択は、様々なレポーター遺伝子及び選択可能マーカーの使用を含め、本明細書に記載の方法を使用して行うことができる。適切には、目的の産物をコードする異種ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれている宿主細胞が選択される。例示的な宿主細胞には、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びに本明細書に記載の他の真核細胞が含まれる。
【００９７】
目的の産物、例えば発現された組換えポリペプチド又はタンパク質を単離するための方法は、当技術分野で公知である。そのような方法には、例えばクロマトグラフィー分離などの使用を含め、様々な細胞溶解ステップ及び濾過が含まれる。
【００９８】
一実施形態によると、宿主細胞は、無血清条件下で培養される。目的の発現産物は、宿主細胞を破壊し、次いで産物を単離することによって得ることができる。適切には、目的の産物は、ポリペプチド又はタンパク質である。ポリペプチドは、培地に適切に発現され、例えば分泌され、この培地から得ることができる。この目的のために、適切なリーダーペプチドを、目的のポリペプチドに提供することができる。分泌を達成するためのリーダー配列及び発現カセットの設計は、当技術分野で周知である。これにより、タンパク質などのポリペプチドを高収率で産生させて、効率的に得る／単離することができる。
【００９９】
適切には産生される目的のポリペプチドである目的の産物は、当技術分野で公知の方法により回収し、さらに精製し、単離し、処理し、かつ／又は改変することができる。例えば、ポリペプチドは、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、限外濾過、抽出、又は沈殿を含む従来の手順によって栄養培地から回収することができる。精製ステップなどのさらなる処理ステップは、限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出を含む、当技術分野で公知の様々な手順によって行うことができる。さらに、単離及び精製された目的のポリペプチドは、さらに処理され、組成物、例えば医薬組成物に製剤化することができる。
【０１００】
本明細書に記載の細胞の細胞増殖条件には、目的のタンパク質の発現を促進するものが含まれ得る。本明細書で使用される「発酵」という語は、文字通りの発酵が利用される実施形態及び他の非発酵培養モードが利用される実施形態を含む。いくつかの実施形態では、発酵培地は、富栄養培地、最少培地、及び無機塩培地の中から選択することができる。
【０１０１】
本明細書に記載の発現系は、任意の発酵形式で培養することができる。例えば、バッチ、流加、半連続、及び連続発酵モードを、本明細書では使用することができる。タンパク質が細胞外培地に排出される場合、連続発酵が好ましい。
【０１０２】
発酵は、任意の規模で行うことができる。したがって、マイクロリットル規模、センチリットル規模、及びデシリットル規模の発酵量を使用することができる：１リットル規模及びそれよりも大きい発酵量を使用することができる。いくつかの実施形態では、発酵量は１リットル以上である。別の実施形態では、発酵量は、５リットル以上、１０リットル以上、１５リットル以上、２０リットル以上、２５リットル以上、５０リットル以上、７５リットル以上、１００リットル以上、２００リットル以上、５００リットル以上、１，０００リットル以上、２，０００リットル以上、５，０００リットル以上、１０，０００リットル以上、又は５０，０００リットル以上である。
【０１０３】
目的の産物を産生するための細胞の増殖、培養、及び／又は発酵は、細胞の生存を可能にする温度範囲内、好ましくは約４℃〜約５５℃（両端を含む）の範囲内の温度で行われる。したがって、例えば、細胞に関して本明細書で使用される用語「増殖」（及び「増殖する」、「増殖している」）、「培養」（及び「培養する」）、及び「発酵」（及び「発酵させる」、「発酵している」）は本質的に、約４℃〜約５５℃（両端を含む）の温度範囲内の「増殖」、「培養」、及び「発酵」を意味する。さらに、「増殖」は、活性な細胞の分裂及び／又は拡大の両方の生物学的状態、並びに分裂していない細胞及び／又は拡大していない細胞が代謝的に維持されている生物学的状態を示すために使用され、「増殖」という語の後者の使用は、「維持」という用語と同義である。
【０１０４】
目的の産物の発現は、細胞外ポリペプチド又はタンパク質の産生をもたらし得る。この方法は、ペリプラズム又は細胞外培地から目的のポリペプチド又はタンパク質を精製するステップも含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、目的の産物、例えばタンパク質の産生を可能にし、次いでタンパク質を細胞培養物から回収する。いくつかの実施形態では、タンパク質の回収は、細胞及び／又は細胞破片を除去するための遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質を回収することは、細胞及び／又は細胞破片を除去するために濾過することを含む。
【０１０５】
目的の産物、特にタンパク質及びペプチドは、限定されるものではないが、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動法、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーなどの実体による選択的沈殿、及び免疫精製法などを含む、当技術分野で周知の標準的な技術によってかなりの純度まで単離及び精製することができる。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、リガンドと可逆的に融合され得る。適切なリガンドを用いて、タンパク質を選択的に精製カラムに吸着させ、次いで、比較的純粋な形でカラムから分離することができる。次いで、融合タンパク質が、酵素活性によって除去される。さらに、イムノアフィニティーカラム又はＮｉ−ＮＴＡカラムを使用してタンパク質を精製することができる。一般的な技術は、例えば、Ｒ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：  Ｎ．Ｙ．  （１９８２）；  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，５１１，５０３；  Ｓ．  Ｒｏｅ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）；  Ｄ．  Ｂｏｌｌａｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓａ，  Ｉｎｃ．  （１９９６）；  Ａ  Ｋ  Ｐａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，  １８（２）：  ｐ／１８２−９２  （２０００）；  ａｎｄ  Ｒ．  Ｍｕｋｈｉｊａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６５（２）：  ｐ．  ３０３−６  （１９９５）にさらに説明されている。例えば下記も参照されたい、Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  （１９９０）  “Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  １８２，  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｉｓ  ｓｅｒｉｅｓ；  Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，  ＮＹ；  ａｎｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ｅ．ｇ．，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．，  ｏｒ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  Ｃａｌｉｆ。組換え技術との組み合わせにより、適切なセグメント、例えばＦＬＡＧ配��又はプロテアーゼ除去可能配列を介して融合できる同等物への融合が可能になる。また、例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ  （１９８９）  Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  １２：６９−７０；  Ｈｏｃｈｕｌｉ  （１９９０）  “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ”  ｉｎ  Ｓｅｔｌｏｗ  （ｅｄ．）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７−９８，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：  Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＱＵＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  Ｃａｌｉｆも参照されたい。
【０１０６】
発現タンパク質の検出は、当技術分野で公知の方法によって達成することもでき、これには、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット法、又は免疫沈降が含まれる。
【０１０７】
細胞の上清に存在する発現された組換えタンパク質及びポリペプチドは、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離することができる。例えば、最初の塩分画は、不要な宿主細胞タンパク質（又は細胞培地に由来するタンパク質）の多くを目的の異種ポリペプチドから分離することができる。そのような例の１つは、硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、その溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質は、疎水性が高ければ高いほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコルは、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％になるように飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含む。この濃度は、最も疎水性の高いタンパク質を沈殿させる。次に、（目的のタンパク質が疎水性でない限り）沈殿物を廃棄し、目的のタンパク質が沈殿する既知の濃度まで硫酸アンモニウムを上清に加える。次いで、沈殿物を緩衝液に可溶化し、必要に応じて、透析又は透析濾過によって過剰な塩を除去する。冷エタノール沈殿などのタンパク質の溶解度に依存する他の方法は、当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用することができる。
【０１０８】
目的のポリペプチド又はタンパク質は、その分子量を使用して、異なる細孔径の膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎ膜又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通る限外濾過を用いてより大きいサイズ及びより小さいサイズのタンパク質から分離することができる。最初のステップとして、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフを有する細孔径の膜を通して限外濾過することができる。限外濾過の残余分は、目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子カットオフを有する膜に対して限外濾過することができる。目的の異種ポリペプチドは、膜を通過して濾液に入る。次いで、濾液を、以下に説明するようにクロマトグラフィーにかけることができる。
【０１０９】
目的のポリペプチドは、そのサイズ、正味表面電荷、疎水性、及びリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラムマトリックスに結合させ、タンパク質を免疫精製することができる。これらの方法はすべて、当技術分野で周知である。クロマトグラフィー技術は、任意の規模で、多くの異なるメーカー（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の機器を使用して行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【０１１０】
目的の産物、特に組換えポリペプチド及びタンパク質の大規模生産のための方法は、当技術分野で公知であり、この方法には、細胞培養又はバット手順（ｖａｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の使用が含まれる。そのような大規模生産の例には、バッチ、流加、細胞リサイクル、及び連続発酵が含まれる。
【０１１１】
タンパク質産生の増加をもたらす遺伝子のスクリーニング方法
さらなる実施形態では、その発現産物が阻害されると、組換えタンパク質産生の増加をもたらす遺伝子のスクリーニング方法が本明細書で提供される。本明細書に記載の方法を使用して、細胞によるタンパク質産生に関与している可能性があり、かつ阻害される又はその発現産物が阻害されると、細胞によるタンパク質産生の増加を可能にする遺伝子を検出する、決定する、又は確認することができる。
【０１１２】
この方法は、単離細胞における遺伝子の発現産物の機能を阻害して阻害された単離細胞を作製することを含む。遺伝子及びその発現産物の機能を阻害する様々な方法が本明細書に記載されており、これらの方法には、遺伝子変異、遺伝子編集、及び遺伝子ノックアウト、ＲＮＡ干渉などの様々な転写後遺伝子阻害方法、並びに所望の遺伝子の発現産物の機能又は作用を直接阻害することによる発現産物自体の阻害が含まれる。
【０１１３】
この方法は、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子（すなわち、核酸）を阻害された単離細胞に導入することをさらに含む。ベクターなどを含む組換え遺伝子を導入する様々な方法が本明細書に記載されている。
【０１１４】
次いで、阻害された細胞は、組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養される。例示的な条件は、本明細書に記載されており、当技術分野でも周知である。
【０１１５】
次いで、組換えタンパク質は、産生されると、細胞から単離される。濾過法を含む組換えタンパク質を単離するための様々な方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。次いで、回収された単離組換えタンパク質の量が決定され、阻害された単離細胞間で、遺伝子の発現産物の効果が阻害されていない細胞における組換えタンパク質の産生の量と比較される。すなわち、遺伝子（又は遺伝子の発現産物）の阻害がタンパク質産生の増加をもたらすかどうかを判定するために、組換えタンパク質の量を、阻害された細胞と対照細胞の両方で測定して比較する。阻害された単離細胞における組換えタンパク質の産生量の少なくとも約３０％の増加は、遺伝子、その発現産物が阻害されると、組換えタンパク質生産が増加することを示す。適切には、産生量の増加は約５０％〜約５００％である。
【０１１６】
本明細書に記載されるように、そのような遺伝子のスクリーニングに利用できる細胞は、適切には、ＨＥＫ細胞及びＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む真核細胞である。
【０１１７】
遺伝子の発現産物を阻害する様々な方法が本明細書に記載されており、これらの方法には、遺伝子を変異させること、編集すること、又はノックアウトすることが含まれる。遺伝子の発現産物の機能又は発現を阻害するための方法（様々な転写後修飾など）を使用して、遺伝子が細胞のタンパク質の産生に関与しているかどうかを決定することができる。
【０１１８】
遺伝子転写、タンパク質翻訳、タンパク質の代謝、細胞の分泌能力、及びアポトーシスなどのメカニズムに関与する遺伝子は、阻害された場合に、タンパク質の産生に対する効果を決定するためにスクリーニングできる遺伝子の適切なクラスである。本明細書に記載されるハイスループットアッセイは、標的とすることができる多数の潜在的な遺伝子（及び発現産物）の発見を可能にする。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：組換えタンパク質の発現に関連する遺伝子のスクリーニング方法の開発
阻害されると、組換えタンパク質の発現を改善することになる内因性遺伝子をスクリーニングするために以下の方法を開発した。以下に説明するように、組換えタンパク質の発現を調節するタンパク質（したがって遺伝子）の決定を可能にするハイスループットスクリーニング技術を開発した。
【０１２０】
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞株を、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、３つのモデルタンパク質、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃ、ＰＬＡＰ、及びｈＧＦＲα２の１つの標的化統合のためのベクター、並びにゲノムのＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼを発現するベクターを用いて同時トランスフェクトした。以下の表３に示すように、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃは大量発現タンパク質として、ＰＬＡＰは中程度発現タンパク質として、ｈＧＦＲα２は低発現タンパク質としての役割を果たした。４８時間後、ピューロマイシン又はブラストサイジンによる選択を適用して、ベクターを組み込んだ細胞を濃縮した。１４日後、細胞を、フローサイトメトリーによって９６ウェルプレートの単一細胞として選別した。単一コロニーを分離した後、細胞を増殖させ、分析して、各クローンにおける組換え標的遺伝子の遺伝子コピー数を決定した。遺伝子コピー数の分析は、組換え遺伝子のコピー数を既知の参照遺伝子（ＸＸ）と比較するデジタル液滴ＰＣＲを用いて行った。モデルタンパク質のそれぞれについて、それぞれ１つ及び３つ（ＳＥＡＰ）又は４つ（ＧＦＲａ２及びＣｒｉｐｔｏＦＣ）の統合遺伝子コピーを含む２つの細胞株を同定した。組換えタンパク質の発現が確認され、図３Ａ及び図３ＢのＣｒｉｐｔｏＦＣで示されるように、遺伝子コピー数と相関することが分かった。すべてのスクリーニング実験では、統合ベクターの単一コピーを含む細胞株を使用し、複数の遺伝子コピーを有する細胞株を、タンパク質発現の増加の陽性対照として使用した。
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
各タンパク質モデルの発現クローンを選択したら、遺伝子編集／変異又は発現タンパク質の阻害（例えば、小分子阻害による）を行って、組換えタンパク質発現に対して異なる遺伝子が有する効果を決定することができる。モデルタンパク質のそれぞれについて、それぞれ単一又は複数の遺伝子コピーを含む２つの細胞株を単離した。図１は、目的の遺伝子をスクリーニングするための実験計画のフローチャートを示す。
【０１２３】
図２は、異なるモデルタンパク質を発現するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞のフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を示す。前述のように、モデルタンパク質に対する抗体は、細胞における各タンパク質の発現を示し、モデルシステムを使用して組換えタンパク質発現に対する遺伝子機能の阻害の効果を評価できることを実証した。モデルタンパク質に対する抗体でアッセイした野生型細胞は、ＰＬＡＰを除いてタンパク質発現を示さなかったが、内因性タンパク質のある程度のバックグラウンド発現が検出された。図３Ａは、開発されたＦＡＣＳ法が、異なるレベルのタンパク質発現（Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃ）を区別し、異なるコピー数（１、３、４）の送達の影響を分析できることを示す。図３Ｂは、ＳＤＳ−Ｐａｇｅを介してＣｒｉｐｔｏ−Ｆｃの発現レベルを確かめている。これらの結果は、モデル系を使用して、遺伝子の機能及び／又は様々な遺伝子の発現産物の機能を阻害することの効果を調べて、組換えタンパク質発現に対するそれらの効果を決定することができる。さらに、このモデルは、３８４ウェルシステムに拡張され、ハイスループットの実験と分析が可能になった。
【０１２４】
図４は、一次スクリーニングでの２４ウェルにわたるスクリーニングデータを示す。Ｘ軸は、各ウェルからのサンプリング時間を表示する。各データポイントは、サンプリングされたウェル内の単一細胞の蛍光（Ｙ軸）に対応する。ＣｒｉｐｔｏＦＣ遺伝子の単一遺伝子コピーを含む細胞株のＤＭＳＯ（ブランク）対照が図６に示されている。また、ＣｒｉｐｔｏＦＣ遺伝子の４つのコピーを含むＣｒｉｐｔｏＦＣ細胞株である陽性対照も示されている。Ｘ軸の１１０〜１１５の間に表示されるサンプルは、陽性小分子ヒットを含むウェルの結果である。
【０１２５】
実施例２：タンパク質発現の増加を提供するための小分子化合物のスクリーニング
上記の細胞アッセイを利用して、組換えタンパク質発現を増加させる能力について小分子化合物の大きいライブラリーをスクリーニングした。約１９，２００の化合物を試験した。ライブラリーは、生物学的活性に関する情報が利用可能な化合物から構成されていた。各化合物は、ＥＣ５０≦１００ｎＭの少なくとも１つのタンパク質標的に対して生物活性を有する。ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞株を一次スクリーニングに使用した。細胞を、３８４ウェルプレートに播種し、１．２ｕＭの化合物で７２時間処理した。次いで、蛍光標識に結合したＣｒｉｐｔｏＦＣに対する抗体で細胞を染色し、蛍光検出を可能にした。ＣｒｉｐｔｏＦＣの発現は、図４に示すように、単一生細胞のフローサイトメトリーによって測定した。Ｚスコア＞１０のカットオフを使用すると、一次スクリーニングにおいて組換えタンパク質の発現に正の効果があると特定された化合物が５１５個存在した。
【０１２６】
Ｚスコア計算は、プレート上のデータの中心と広がりを計算する。ＨＴＳプレートでは、化合物ウェルの活性の中央値は中心がゼロにあり、広がりは、ロバスト標準偏差によって定義されたゼロ付近で測定された。次いで、個々の化合物を、以下の式を用いて、その活性がプレートの中央値からどれだけ離れているかを示すロバスト標準偏差の単位で測定する：
【数１】
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【０１２７】
ｘ＝ウェルの生データ値、ｍ＝選択された対照ウェル群の中央値、そしてＲＳＤは、選択されたウェル群のロバスト標準偏差（ＭＡＤ＊１．４８３）である。
【０１２８】
３のＺスコアは、化合物の活性がプレートの中央値から３ｒＳＤであり、活性化合物の強力な指標であることを示す（３ＳＤ＝９９．７％信頼度）。Ｚスコアの主要な利点は、プレート間及びアッセイ間で化合物の活性を比較し、データの拡散（又はノイズ）を考慮に入れ、活性率（％）を計算しないことである。
【０１２９】
一次スクリーニングからのヒットを確認するために、蛍光化合物を除去するために抗体−コンジュゲートを追加することなく、利用可能な陽性ヒットをカウンタースクリーニングにかけた。並行して、各化合物の最高濃度が６μＭである１０点の濃度応答曲線を決定した。固有の蛍光を欠き、タンパク質発現を用量依存的に少なくとも３０％増加させた化合物のみを、確認されたヒットとしてカウントした。合計で９８個の化合物を、ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞株におけるＣｒｉｐｔｏＦＣ発現を増加させる真のヒットとして確認した。化合物の生物学的活性に関する利用可能な知識を使用して、以下の表４の遺伝子リストが、組換えタンパク質産生の阻害及び結果として生じた増加についての潜在的な標的であると決定した。
【０１３０】
【表４】
2020536513.tif 000010
【０１３１】
ＧＲＦα２及びＰＬＡＰを発現する異なる細胞でさらなる研究を行った。ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８で行った同じアッセイを、ＧＦＲＡ２の単一遺伝子コピーを含む細胞株で行った。ＨＥＫ２９３細胞において内因性ＰＬＡＰのバックグラウンドがわずかに増加したため（図２）、ＰＬＡＰの発現を、ＨＥＫ２９３  ＰＬＡＰ細胞株によって分泌される酵素活性を測定することによって決定した。ＰＬＡＰの活性測定は、リン酸ｐ−ニトロフェニルのｐ−ニトロフェニルへの分解に基づいており、これは、４０５ｎｍでの吸光度の増加として追跡することができる。図５は、ＰＬＡＰ及びＧＦＲａ２を発現する細胞株に対する、ＣｒｉｐｔｏＦＣ細胞株で活性であった９８の一次ヒットの確認スクリーニングの結果を示す。９８のヒットのうち３２（３３％）が、３つのモデルタンパク質すべての比生産性に有意な正の効果をもたらし、３７％（３５＋２）が、２つのモデルタンパク質のみに影響を与え、最終的に３０％のみが、ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞株に正の効果を有していた。
【０１３２】
実施例３：目的の標的遺伝子としてのＵＬＫ１の決定
以下の実施例は、その阻害が組換えタンパク質産生の増加をもたらす、遺伝子としてＵＬＫ１を決定する際に行われた実験を説明する。
【０１３３】
組換えタンパク質発現に関与することが文献で示唆されている化合物と比較するために、ＨＥＫ２９３  ＰＬＡＰ細胞株を含む５ｍｌの培養物で研究を行った。細胞を０．２×１０５細胞／ｍｌで播種し、化合物で７２時間処理した。各化合物は、決定されたＥＣ５０の１０倍又は最大５μＭで使用した。７２時間後、生細胞密度（図６）及びＰＬＡＰ活性（図７）を決定した。この実験で、細胞の生存率及び成長特性に対しては影響が最も少なく、同時にＰＬＡＰ発現に対しては最大の正の効果を有する１０の化合物の生物学的活性の注釈を分析することにより、表現型効果の原因となる第１の候補遺伝子としてＵＬＫ１を選択した（表６）。
【０１３４】
図６は、７２時間での生細胞密度として測定された、細胞生存率に対する化合物の効果を示す。図７は、７２時間でこれらの同じ細胞で測定されたＰＬＡＰ遺伝子産物の酵素活性を示す。これらの研究に基づいて、細胞の生存率に影響を与えないが、酵素活性に最大の効果（最も高いタンパク質産生）を有する化合物をさらなる分析のために選択した。
【０１３５】
図８は、選択化合物のＰＬＡＰの体積生産性を示す。以下の表５は、化合物ＭＲＴ６８９２１を含む３つの異なるタンパク質標的に対する各化合物のＡＣ５０濃度を示す。図８に示されているように、すべての化合物は、ＰＬＡＰの体積生産性を約３００〜６００％増加させた。
【０１３６】
【表５】
2020536513.tif 000011
【０１３７】
この研究からの最高のヒットの分析により、８／１０のヒットがＵＬＫ１遺伝子発現産物に対するものであることが明らかになった。以下の表６は、標的の分析結果を示す。
【０１３８】
【表６】
2020536513.tif 000012
【０１３９】
ＵＬＫ１遺伝子の発現産物の活性を阻害することがタンパク質の産生にどのように影響するかをさらに検討するために、ＣＲＩＳＰＲを用いてＵＬＫ１遺伝子をノックアウト又は編集する研究を行った。ＵＬＫ１遺伝子を、ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ細胞において改変し、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃを、上記のように組換えタンパク質産物として使用した。ノックアウト実験のために、ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞に、Ｃａｓ９とガイドＲＮＡを１：１の比率でコードするベクターで同時トランスフェクトした。ＵＬＫ１ノックアウト実験では、２つのガイドＲＮＡ（以下の配列番号３及び４）を同時に、Ｃａｓ９と共に同時トランスフェクトした。
ヒトＵＬＫ１のＵＬＫ１  ｇＲＮＡ  Ｃ８  ＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＧ（エクソン１の２８１〜２９９）（配列番号３）
ヒトＵＬＫ１のＵＬＫ１  ｇＲＮＡ  Ｄ８  ＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧ（エクソン１の３３６〜３５３）（配列番号４）
【０１４０】
Ｃａｓ９をコードするベクターはまた、トランスフェクションの２日後に蛍光細胞の濃縮を可能にする緑色蛍光タンパク質を発現する。タンパク質発現の分析を、トランスフェクションの６日後に上記のフローサイトメトリーによって行った。結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。例示されているように、ＵＬＫ１遺伝子に対して行われたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集は、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃ酵素活性の１．６倍の増加をもたらし、非標的アプローチと比較してタンパク質産生の増加を示した。ＵＬＫ２、ＵＬＫ３、又はＭＡＰ３ｋ７遺伝子をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて編集した場合は、有意な変化は認められなかった。
【０１４１】
また、ｓｉＲＮＡを使用して、Ｅｘｐｉ２９３−Ｃｒｉｐｔｏ−Ｆｃ細胞のＵＬＫ１遺伝子をダウンレギュレートした。図１０Ａに示されているように、ＵＬＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、スクランブルされた対照と比較して、タンパク質の産生において１．４倍の増加をもたらした。タンパク質産生の増加を提供する標的遺伝子は他になかった。実験的に、ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞を３８４ウェルプレートに１２３０細胞／ウェルで播種し、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて３０ｎＭ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしてトランスフェクション複合体を作製した。プレートを３７℃で３日間インキュベートしてから、ＣｒｉｐｔｏＦＣ発現を上記のように分析した。図１０Ｂは、様々なｓｉＲＮＡ構築物を用いて達成されたｍＲＮＡノックダウンの程度（平均残存率（％））を示し、ｍＲＮＡ発現を減少させる効果を実証している。
【０１４２】
実施例４：ＵＬＫ１活性が阻害された細胞株における組換えタンパク質産生の増加の実証
上で実証されたように、ＵＬＫ１が、組換えタンパク質の産生能力が改善された要因であると決定した後、ＵＬＫ１遺伝子が阻害された２つのクローンＨＥＫ２９３細胞株を単離した。細胞株の作製のために、非改変ＨＥＫ２９３及びＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞に、Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−ＧＦＰとガイドＲＮＡを１：１の比率でコードするベクターを同時トランスフェクトした。ＵＬＫ１ノックアウト実験では、２つのガイドＲＮＡ（以下の配列番号５及び６）を同時に、Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−ＧＦＰと共に同時トランスフェクトした（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ  ｌａ：ｇＲＮＡ  ｌｂの比率は１：０．５：０．５）。
ヒトＵＬＫ１のＵＬＫ１  ｇＲＮＡ  ｌａ  ＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＧ（配列番号５）
ヒトＵＬＫ１のＵＬＫ１  ｇＲＮＡ  １ｂ  ＣＧＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣ（配列番号６）
【０１４３】
クローン細胞株を、単一ＧＦＰ陽性細胞の９６ウェルプレートへの蛍光支援細胞選別によって得た。細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清、３７℃、及び５％ＣＯ２で維持した。各クローンの十分な細胞が得られたら、それらを浮遊培養及びＥｘｐｉ２９３発現培地に戻した。意図した欠失部位にわたるＰＣＲによる遺伝子分析により、所望の欠失がＵＬＫ１遺伝子アレルにわたるクローンの同定が可能になった。Ｅｘｐｉ２９３  ＵＬＫ  ＫＯ（９Ｆ６）及びＥｘｐｉ２９３  １Ｂ８  ＵＬＫ１  ＫＯ（１Ｃ１１）の各細胞のバックグラウンドのために、１つのクローンをさらなる実験で選択した。
【０１４４】
【表７】
2020536513.tif 000013
【０１４５】
Ｅｘｐｉ２９３及びＥｘｐｉ２９３  ＵＬＫ１  ＫＯ（９Ｆ６）を、ＨＥＫ２９３  ＣｒｉｐｔｏＦＣ  １Ｂ８細胞株の作製に使用されたＣｒｉｐｔｏ−ＦＣをコードするプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの前日にＥｘｐｉ２９３発現培地に２×１０６細胞／ｍｌで播種し、３７℃、８％ＣＯ２、１５０ｒｐｍで、三角フラスコでインキュベートした。翌日、細胞に、ポリエチレンイミンと複合体を形成した１μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。タンパク質発現レベルを評価する前に、細胞を、３７℃及び８％ＣＯ２、２５０ｒｐｍで、ｔｕｂｅｓｉｎ５０チューブで６日間インキュベートした。Ｃｒｉｐｔｏ−ＦＣの発現が安定している細胞株を０．５×１０６細胞／ｍｌで播種し、同じ条件下で３日間インキュベートしてから、ＣｒｉｐｔｏＦＣの発現レベルを測定した。図１１から分かるように、ＵＬＫ１遺伝子がノックアウトされた細胞株は、安定に（１．４倍）及び一過性（３．２倍）にトランスフェクトされた細胞株の両方で、組換えＣｒｉｐｔｏＦＣ発現が増加している。
【０１４６】
ヒトＩｇＧ１  Ａｂ００１を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、Ａｍａｘａヌクレオフェクション系及び試薬（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＣＨＯ懸濁細胞を発現プラスミドでトランスフェクトすることによって作製した。発現プラスミドは、グルタミンシンテターゼ選択可能マーカーに加えて、Ａｂ００１重鎖及び軽鎖遺伝子をコードした。トランスフェクト細胞を選択し、５０μΜのメチオニンスルホキシミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で独自の培地で維持した。クローン細胞株を、限界希釈クローニングによって得て、通気された三角フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ）で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中、３７°Ｃで日常的に培養し、１４０ｒｐｍで振盪し、３〜４日ごとに継代した。細胞の濃度及び生存率を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した自動トリパンブルー排除アッセイによって決定した。
【０１４７】
Ａｂ００１を発現するＣＨＯ細胞株を、複製フラスコにおいて最終体積４５ｍＬで、７×１０５細胞／ｍｌで接種した。ＵＬＫ１阻害剤を水で希釈した。接種後３日目に、ＵＬＫ１阻害剤のアリコートを３連の培養物に添加して最終濃度を１μＭとし、３連の未処理培養物と比較した。培養期間中、すべての培養液に独自の栄養飼料を５回ボーラス添加し、グルコースのレベルをモニタリングし、維持した。培養サンプルを経時的に収集し、これを用いて、プロテインＡ分析を使用してＡｂ００１の力価を定量化した。
【０１４８】
１μＭのＵＬＫ１阻害剤の単回投与は、Ａｂ００１を発現する安定な細胞株において体積力価（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｔｒｅ）の有意な増加を達成するのに十分であり、細胞増殖及び細胞生存率への影響は最小限であった（図１２Ａ〜図１２Ｂ）。
【０１４９】
本明細書に記載の方法及び用途に対する他の適切な修正及び適合を、いずれの実施形態の範囲からも逸脱することなく行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。以下の例は、例示のみを目的として本明細書に含められ、限定することを意図するものではない。
【０１５０】
本明細書では特定の実施形態を例示し、説明してきたが、特許請求の範囲は、説明及び図示した特定の形態又は要素の構成に限定されないことを理解されたい。本明細書では、例示的な実施形態を開示し、特定の用語を使用しているが、それらは、一般的かつ説明的な意味でのみ使用し、限定目的ではない。上記の教示に照らして、実施形態の修正及び変形は可能である。したがって、実施形態は、具体的に説明したものとは別の方法で実施できることを理解されたい。
【０１５１】
様々な実施形態を上で説明してきたが、それらは、本技術の例示及び例として提示されているだけであり、限定としてではないことを理解されたい。関連技術の技術者には、本技術の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることは明らかであろう。したがって、本技術の広さ及び範囲は、上記の実施形態のいずれによっても制限されるべきではなく、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物にしたがってのみ規定されるべきである。また、本明細書で説明した各実施形態及び本明細書で引用した各参考文献の各特徴は、任意の他の実施形態の特徴と組み合わせて使用できることも理解されたい。本明細書で議論されるすべての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｃ】
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【図１２Ｄ−１２Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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