(57)【要約】  本明細書に記載されるものは、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかの少なくとも８０％同一性をもつ配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを使用して、式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸のエナンチオマーを選択的に加水分解する方法ならびに前記方法の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーを選択的に加水分解する方法であって、式Ｉ
【化１】
2020536523.tif 000007
［式中、Ｘはハロゲンであり、
Ｒは１〜６個の炭素原子のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は炭素原子γまたはδにおいて直鎖または分岐状であることができる］、
−前記アルファハロアルカン酸のＲ−エナンチオマーとＳ−エナンチオマーとのラセミ体を用意すること、
−配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用意すること、
−前記ラセミ体を１〜８時間反応させること、
ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有する前記ポリペプチドに対しては、ｐＨが９〜１０の範囲であり、温度が１５〜３５℃の範囲であり、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有する前記ポリペプチドに対しては、ｐＨが９〜１０の範囲であり、温度が５５〜６５℃の範囲であり、
９０．０〜９９．９％のＲ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率が、１〜８時間後に達成されること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体と、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを含んでなる細胞全体のバイオマスとの比が、２：１〜１５：１、好ましくは３：１〜１０：１、最も好ましくは４：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉの前記アルファハロアルカン酸のハロゲンが、臭化物または塩化物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉの前記アルファハロアルカン酸の部分Ｒが、エチル、ブチル、２−メチル−プロピル、およびメチル−シクロプロピルからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ−エナンチオマーの前記エナンチオマー過剰率が９０．０〜９９．９である、前記アルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーの選択的加水分解のための、請求項１〜４に記載の方法の使用。
【請求項６】
式ＩＩ
【化２】
2020536523.tif 000008
［式中
Ｒは１〜６個の炭素原子のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は炭素原子γまたはδにおいて分岐状であることができる］
に記載のアルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーを選択的に加水分解する方法であって、
配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを使用する
方法。
【請求項７】
Ｒ−エナンチオマーの前記エナンチオマー過剰率が９０．０〜９９．９である、前記アルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーの前記選択的加水分解のための、請求項５に記載の方法の使用。
【請求項８】
前記アルキル鎖が炭素原子γまたはδにおいて分岐し、炭素原子γまたはδにおける分岐に続く炭素原子が環状である、請求項１または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生物などの生物系では、時として、同じ化学物質のエナンチオマーの効果に著しい違いがあることがよく知られている。たとえば、薬物では多くの場合、ある薬物の一方のエナンチオマーだけが所望の生理作用に関与し、他方のエナンチオマーは活性が低く、不活性であり、ときには反対作用(counteractive)であることもある。
【０００２】
したがって、所望のエナンチオマーのみを得るためにさまざまな方法が存在する。１つの方法はキラル分割として知られている。この方法は、ラセミ体の化合物を調製し、それを異なるエナンチオマーに分離するものである。別の方法は、不斉合成、すなわち所望の化合物を高エナンチオマー過剰率で調製するためのさまざまな技術の使用である。
【０００３】
ラセミ混合物として存在する分子の類は、アルファハロアルカン酸である。これらのアルファハロアルカン酸のＲエナンチオマーまたはＳエナンチオマーは、分析目的のために、例えば、米国特許第５１５４７３８号に記載のキャピラリーガスクロマトグラフィーによって分離することができる。合成目的の場合、キラルアルファハロアルカン酸を調製する最も実用的な方法は、ストリキニーネもしくはブルシン塩を用いたラセミ分割、またはＲ−２−アミノ酪酸の立体選択的臭素化によるものである。しかし、これらの反応のためのキラル前駆体または試薬、例えば［Ｒ−２−アミノ酪酸］は、対費用効果がよくない。くわえて、それらの反応をより大規模に、さらには工業的規模で推し進めることは困難である。例えば、Ｒ−２−アミノ酪酸の立体選択的臭素化は時間がかかり、低温（−１０〜５℃）を必要とし、反応の進行を監視するのが難しい。そのうえ、ニトロソ系（nitroseous）ガスが反応中に生じ、これは労働安全上の問題となっている。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、式Ｉのアルファハロアルカン酸のＲエナンチオマーとＳエナンチオマーの分離の分離を可能にするかつ／または容易にするための、代替的で、より対費用効果が高く、時間効率がよく、より安全な方法を発明することであった。
【０００５】
本発明は、式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーを選択的に加水分解する方法であり、
【化１】
2020536523.tif 000002
［式中、Ｘはハロゲンであり、
Ｒは１〜６個の炭素原子のアルキル鎖であり、前記（said）アルキル鎖は炭素原子γまたはδにおいて直鎖または分岐状であることができる］、
−  前記アルファハロアルカン酸のＲ−エナンチオマーとＳ−エナンチオマーのラセミ体を用意すること、
−  配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用意すること、
−  ラセミ体を１〜８時間反応させること
ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに対しては、ｐＨは９〜１０の範囲であり、温度は１５〜３５℃の範囲であり、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに対しては、ｐＨは９〜１０の範囲であり、温度は５５〜６５℃の範囲であり、
−  ９０．０〜９９．９％のＲ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率が１〜８時間後に達成されること
を含んでなる
方法を提供することによってこの目的を達成する。
【０００６】
この方法は、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドが、式Ｉのアルファハロアルカン酸のＳエナンチオマーを、所与の反応条件下で非常に効率よく選択的に加水分解する、すなわち高い空時収率を達成するので、式Ｉのアルファハロアルカン酸のＲエナンチオマーとＳエナンチオマーの異なる反応挙動に基づいて、２つのエナンチオマーの分離を可能にし、かつ／または容易にする、代替的で、より対費用効果が高く、時間効率がよい方法であるという利点がある。加水分解反応の選択性は、９０〜９９％という残留Ｒ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率によって示されている。言い換えれば、驚くべきことに、特定の条件が、Ｒ−エナンチオマーを誘導する、より対費用効果が高く、時間効率がよく、より安全な方法を容易にすることが見出された。
【０００７】
上記のように、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、所与の反応条件下で非常に効率よく選択的に加水分解する。この反応の間、Ｒ−エナンチオマーは変化しないが、Ｓ−エナンチオマーはその立体異性の転換によって加水分解される。
【０００８】
前記方法の好ましい実施態様では、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなり、式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸においてＸは、フッ素（fluor）である。驚くべきことに、これらの条件下で、配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用いると、式Ｉに記載のフッ素（fluor）含有アルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーも選択的に加水分解され、１〜８時間後に９０．０〜９９．９％のＲ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率が達成されることが初めて見出された。
【０００９】
「含んでなる（comprising）」という用語は、記載された部品、ステップ、または成分の存在を特定するものと解釈されるべきであるが、１つまたは複数の追加の部品、ステップ、または成分の存在を排除するものではない。
【００１０】
単語を単数形で言及する場合、複数形も本明細書に含まれることが理解される。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈がたった１つの要素が存在することを明確に要求しない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「エナンチオマー(enantiomer)」という用語は、重ね合わせることができない（同一でない）互いの鏡像である所与の分子の２つの立体異性体のうちの１つを指す。化合物中の単一のキラルな原子または類似の構造上の特徴によって、その化合物は、重ね合わせることができず、それぞれが他方の鏡像である２つの可能な構造を有するようになる。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「ラセミ体」または「ラセミ基質」という用語は、キラル分子の２つの立体異性体を等量有する混合物を指す。
【００１３】
上記のように、配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、式ＩのＸはフッ素（fluor）以外のハロゲンから選択され、上記の方法は１〜８時間実施され、ｐＨは９〜１０の範囲であり、温度は１５〜３５℃の範囲である。
【００１４】
これらの条件を用いると、驚くべきことに、配列番号１に記載のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドが、９９％を超えるエナンチオマー過剰率値（図３参照）および１６．６ｇ生成物  Ｌ−１  ｈ−１（１００ｇ／ｌの基質濃度で）の空時収率に確実に到達することが分かった。
【００１５】
ラセミ基質であることに起因して、Ｒ−エナンチオマーの最大収率は５０％であり、したがって１００ｇ／ｌの基質濃度を用いる最大収率は５０ｇ／ｌであることに留意されたい。さらに、より低い基質濃度、例えば５０ｇ／ｌを用いれば、空時収率はさらにより高くなることになる。しかし、より高い基質濃度は工業規模の生産プロセスに有益である。
【００１６】
好ましい実施態様では、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、４〜６時間実施され、ｐＨは９．５であり、温度は２０〜３０℃の範囲である。これらの条件を用いると、３時間後に完全な転換、すなわち９０％ｅｅに達することができる。
【００１７】
この反応のとりわけ好ましい実施態様では、温度は２５℃である。
【００１８】
ｐＨは好ましくは９〜１０の範囲、最も好ましくは９．５である。
【００１９】
２５℃の反応温度と９．５のｐＨでは、１時間後に完全転換率、すなわち９０％ｅｅに達した。したがって、これらの条件は、とりわけ高い空時収率をもたらす。新鮮に発酵したバイオマスとして用意された、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合（すなわちポリペプチドが細胞全体(whole cell)に含まれている）、得られた空時収率は、５０ｇ生成物  Ｌ−１  ｈ−１であった。
【００２０】
上記のように、配列番号４に記載のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、上記の方法は１〜８時間実施され、ｐＨは９〜１０の範囲であり、温度は５５〜６５℃の範囲であり、９０．０〜９９．９％のＲ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率が１〜８時間後に達成される。好ましい実施態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、上記の方法は４〜６時間実施され、ｐＨは９．５であり、温度は５９〜６１℃の範囲である。
【００２１】
この反応のとりわけ好ましい実施態様では、温度は６０℃である。
【００２２】
ｐＨは好ましくは９〜１０の範囲、最も好ましくは９．５である。
【００２３】
本明細書に記載のデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、または前記ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【００２４】
配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドはまた、その核酸配列によって特徴付けすることもできる。
【００２５】
したがって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、提供されるポリペプチドは次の群から選択される。
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるポリペプチド、
ｂ）配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性のヌクレオチド配列を含んでなる単離されたコドン最適化核酸断片、
ｃ）配列番号２に相補的な配列を含んでなる単離核酸断片、
ｄ）ｂ）の前記単離核酸断片またはｃ）の前記相補体（complementary）に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる単離核酸断片、
ｅ）配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性のヌクレオチドを含んでなる単離核酸断片、
ｆ）配列番号３に相補的な配列を含んでなる単離核酸断片、
ｇ）ｅ）の前記単離核酸断片またはｆ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる単離核酸断片。
【００２６】
したがって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、ポリペプチドは、異なる核酸配列によってコードされうる。これは遺伝子コードの縮重の結果である。
【００２７】
この遺伝子コードの縮重の結果、アミノ酸は１つまたは複数のコドンによってコードされうる。異なる生物では、アミノ酸をコードするコドンは異なる頻度で使われる。コーディング核酸配列のコドンを、発現される配列が組み込まれるべき生物におけるそれらの使用の頻度に適合させることは、特定の細胞において、翻訳されたタンパク質の量の増加および／または問題のｍＲＮＡの安定性に寄与しうる。問題の宿主細胞または宿主におけるコドンの使用の頻度は、当業者によって、ある特定のコドンが、ある特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度に関して、問題の生物の可能な限り多くのコーディング核酸配列を調べることによって決定することができる。ある特定の生物のコドンの使用の頻度は当業者に公知であり（http://www.kazusa.or.jp/codon/を参照）、コンピュータプログラムに実装された特別に開発されたアルゴリズム（例えば、Grote et al., 2005, Nucleic Acids Research 33, W526-W531; doi: 10.1093/nar/gki376）を用いて簡単かつ迅速に決定することができる。そのようなアルゴリズムを使用するツールは、公的にアクセス可能であり、ウェブインターフェースとして、とりわけ、ワールドワイドウェブ上で、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）などのようなさまざまな機関から無料で提供される（例えば、http://www.jcat.de、http://gcua.schoedl.de/、http://www.kazusa.or.jp/codon/、http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html、http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/）。コーディング核酸配列のコドンを、その配列が発現されることが意図されている生物におけるそれらの使用の頻度に適合させることは、インビトロ突然変異誘発によって、または好ましくは、遺伝子配列の新規（de novo）合成によって行うことができる。核酸配列の新規合成のための方法は、当業者に公知である。新規合成は、例えば、最初に個々の核酸オリゴヌクレオチドを合成すること、これらをそれに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて、その結果ＤＮＡ二本鎖を形成すること、次いで所望の核酸配列が得られるように個々の二本鎖オリゴヌクレオチドを連結することによって行うことができる。ある特定の標的生物にコドンが使用される頻度の適合を含む核酸配列の新規合成は、そのサービスを提供する会社（例えばＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ）に外部委託することもできる。
【００２８】
配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性のヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸断片は、それぞれ、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは配列番号２または配列番号３と１００％の配列同一性を有する。
【００２９】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドの場合、提供されるポリペプチドは次の群から選択される。
ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるポリペプチド、
ｂ）配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性のヌクレオチド配列を含んでなる単離されたコドン最適化核酸断片、
ｃ）配列番号５に相補的な配列を含んでなる単離核酸断片、
ｄ）ｂ）の前記単離核酸断片またはｃ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる単離核酸断片、
ｅ）配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性のヌクレオチドを含んでなる単離核酸断片、
ｆ）配列番号６に相補的な配列を含んでなる単離核酸断片、
ｇ）ｅ）の前記単離核酸断片またはｆ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる単離核酸断片。
【００３０】
デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチド−ここでは配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド−もまた、異なる核酸配列によってコードされうる(can be encoded for by)。上で説明したように、やはりこれは遺伝子コードの縮重の結果である。
【００３１】
やはりこの場合も、配列番号５または配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性のヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸断片は、それぞれ、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは配列番号５または配列番号６と１００％の配列同一性を有する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「加水分解」という用語は、ハロゲンがヒドロキシル基によって置換される、炭素−ハロゲン結合の酵素触媒加水分解開裂である。いくつかの酵素は２−ハロアルカン酸の加水分解的脱ハロゲン化を触媒し、対応する２−ヒドロキシアルカン酸を生成する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「選択的に加水分解する」という用語は、加水分解を触媒するいくつかの酵素（すなわちポリペプチド）が立体選択的活性を示すという事実を指す。言い換えれば、選択的加水分解によって、Ｒ−エナンチオマーまたはＳ−エナンチオマーのいずれかのエナンチオマー過剰が酵素の優先傾向（preference）に応じて作り出される。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「エナンチオマー過剰率」または「ｅｅ値」という用語は、キラル物質の純度の尺度を指す。これは、試料が一方のエナンチオマーを他方のエナンチオマーよりも多量に含む程度を反映する。ラセミ混合物のｅｅは０％であり、一方で単一の完全に純粋なエナンチオマーのｅｅは１００％である。一方のエナンチオマーが７０％、他方が３０％の試料のｅｅは、４０％（７０％−３０％）である。
【００３５】
ｅｅ値を決定する方法は、当該技術分野で公知である。ｅｅ値は、例えば、キラルカラムを備えたガスクロマトグラフィー装置を用いて測定することができる。
【００３６】
したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、加水分解反応を触媒する際に立体選択的活性を示す。この立体選択的活性はｅｅ値で表すことができる。上記のように、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、非常に高いｅｅ値に達する立体選択的活性を示す。
【００３７】
基質の転換、生成物の形成、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）、および空時収率(space time yield)（ＳＴＹ）パラメーターを用いて、所与の酵素が所与の反応に適していることを確実に断定することができる。本明細書で使用される場合、「空時収率」という用語は、一定の時間内の特定の体積において、所与の基質濃度から作り出される生成物の量を指す。
【００３８】
場合によっては、本明細書で与えられる空時収率値はまた、所与の反応で使用される細胞抽出物または細胞全体の特定の量に関して設定される（実施例３および５を参照）。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、細胞中のＲＮＡ分子（例えばイントロン配列を含まないｍＲＮＡに直接）に転写され、ポリペプチドの発現を調節できる調節領域に作動可能に連結された領域（転写領域）を含んでなるヌクレオチドからなるＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、非翻訳調節領域（例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサー）、例えば翻訳開始に関与する配列を含んでなる５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、および例えば転写終結部位を含んでなる３’非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された連結された配列を含んでなることができる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現」または「遺伝子発現」という用語は、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域（コード領域）がｍＲＮＡ分子に転写されるプロセスを指す。次いで、ｍＲＮＡ分子は、例えば、翻訳開始およびアミノ酸鎖への翻訳（ポリペプチド）、および翻訳終止コドンによる翻訳終結によって、細胞内で（転写後プロセスによって）さらに処理される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「野生型（Wild type）」（「野生型（wildtype）」または「野生型（wild-type）」とも書かれる）という用語は、それが天然で最も一般的に起こるような酵素または遺伝子の典型的な形態を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、任意のペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはタンパク質を指す。ポリペプチドはペプチド結合でつながった連続したアミノ酸からなる。ポリマーは、直鎖状でも分岐状でもよく、修飾されたアミノ酸を含んでなってもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。ポリペプチドは、ヒト、非ヒト、および対応する天然のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸ポリマー、および非天然のアミノ酸ポリマーの人工的または化学的模倣物でありうる。この用語はまた、自然作用または化学的修飾のいずれかによって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、アシル化、リン酸化、または、限定されないが、蛍光マーカー、粒子、ビオチン、ビーズ、タンパク質、放射性標識、化学発光タグ、生物発光標識などの標識成分との結合などの他の操作によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、パーセンテージとして表される、２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」という用語は、比較される位置の数で割られた、同一の残基を有する２つの最適にアラインメントされた配列における位置の数（×１００）を指す。ギャップ、すなわち、残基が一方の配列には存在するが他方には存在しない位置は、同一でない残基を有する位置とみなされる。２つの配列の「最適アラインメント」は、２つの配列を全長にわたってアラインメンすることによって見いだされる。言い換えれば、２つの同一の配列がアラインメントされた場合、配列同一性値は１００％である。
【００４４】
ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のアラインメントされた配列は、典型的には、マトリクス内の行として表される。同一または類似の文字が連続する列にアラインメントされるように、ギャップが残基間に挿入される。
【００４５】
配列同一性を決定するために、欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（The European Molecular Biology Open Software Suite）（EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276- 277、例えばhttp://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.htmlを参照）のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53）を、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティー＝１０（ヌクレオチドの場合）／１０（タンパク質の場合）およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５（ヌクレオチドの場合）／０．５（タンパク質の場合））を用いて使用することができる。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質については、デフォルトのスコアリングマトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００４６】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ならびに／またはモルホリノを含んでなる、任意の一本鎖または二本鎖核酸分子を示すことを意図する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、外来の遺伝子材料を別の細胞に伝達するために使用される分子媒体を指す。ベクター自体は、一般に、挿入断片（目的の配列）とベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。別の細胞に遺伝情報を伝達するためのベクターの目的は、典型的には、標的細胞中の挿入断片を単離、増殖、または発現することである。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」という用語は、プラスミドベクター、すなわち、複製起点（「ＯＲＩ」）に起因して好適な宿主内で自律的な複製が可能な環状ＤＮＡ配列を指す。さらに、プラスミドは、外来ＤＮＡを細胞に導入することを意図した形質転換または他の手順の成功を示すための選択マーカー、および挿入断片の挿入を可能にするための複数の制限酵素コンセンサス部位を含む複数のクローニング部位を含んでなることができる。クローニングベクターまたはドナーベクターと呼ばれるプラスミドベクターは、クローニングを容易にし、目的の配列を増幅するために使用される。発現ベクターまたはアクセプターベクターと呼ばれるプラスミドベクターは、特定の標的細胞における目的の遺伝子の発現に特異的である。これらのプラスミドベクターは、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、導入遺伝子、およびターミネーター配列からなる発現カセットを表す。発現制御のために、これらのプラスミドはプラスミド骨格上に局在するリプレッサーを含有する。発現プラスミドは、異なる宿主細胞における増殖および選択を可能にする要素を含有するシャトルプラスミドでありうる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」または「選択的にハイブリダイズする」という用語は、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有するｐＨ７．２の０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を含有するハイブリダイゼーション溶液中での、６５℃で１６時間の、問題の核酸配列の反応ならびに９．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液中で６５℃にて２０分間２回洗浄することを指す。
【００５０】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、細胞溶解物として用意される、かつ／または細胞全体内に含まれる（is comprised）。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「細胞全体」という用語は、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドが、それが発現されている細胞中にもたらされるという事実、すなわち、前記細胞の細胞壁が意図的に破壊されていないという事実を指す。
【００５２】
前記細胞全体は、例えば、発酵プロセスで生成される新鮮なバイオマスでありうる。代替的に、細胞全体は使用前に凍結することができる。
【００５３】
言い換えれば、驚くべきことに、（組換え）細胞全体で発現している酵素、すなわち配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、細胞内にしか存在しないが、基質の生物学的利用能は酵素が細胞内で基質と反応できるのに十分であることが見出された。
【００５４】
酵素合成に用いられる大腸菌（E.coli）細胞は、全タンパク質含量の一定の割合で所望の酵素を生産することが見出された。言い換えれば、所与の量の全細胞タンパク質（例えば５ｇ）は、常に同じ量の可溶性酵素濃度を含んでなる。さらに、この理由から、細胞溶解物の代わりに細胞全体を実験に使用することができた。
【００５５】
細胞全体の使用には、細胞抽出物を提供するための高価で時間のかかる方法を用いる必要がないという利点がある。
【００５６】
一実施態様では、前記細胞全体は、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、ＪＭ１０１、ＢＬ２１ＤＥ３、ＤＨ５アルファの群から選択される大腸菌細胞である。
【００５７】
さらに、選ばれた大腸菌は、配列番号７のプラスミドを保持し、そのプラスミドから配列番号１からなる酵素を発現することが好ましい。
【００５８】
代替的に、選ばれた大腸菌は、配列番号８のプラスミドを保持し、そのプラスミドから配列番号４からなる酵素を発現する。
【００５９】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体に対する反応の開始時に添加されるか、または前記デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、開始時および前記アルファハロアルカン酸のラセミ体に対する反応中の異なる時点で添加される。
【００６０】
驚くべきことに、異なる投与量プロファイルはプロセス性能に影響を及ぼさない。したがって、当業者は、問題のプロセスに最も適した投与プロファイルを選択することができる。特許請求の範囲に記載された酵素のこの特性は、所与の生産プロセスにおいて酵素を使用するための最大の柔軟性を提供する。
【００６１】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するデハロゲナーゼ活性ポリペプチドをもつポリペプチドは、開始時および前記アルファハロアルカン酸のラセミ体に対する反応中の異なる時点で添加され、添加されるポリペプチドの濃度は各時点で同じである。
【００６２】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、開始時および前記アルファハロアルカン酸のラセミ体に対する反応中の異なる時点で添加され、添加されるポリペプチドの濃度は異なる時点で異なる。
【００６３】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、ラセミ体が、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列もしくは前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するデハロゲナーゼ活性ポリペプチドをもつポリペプチドに添加されるか、または前記デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドがラセミ体に添加される。
【００６４】
配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドに、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体が添加される場合、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体のすべてが、反応の開始時に添加されるのが好ましく、ラセミ体のｐＨ値は、添加前反応条件に対して最適化される。
【００６５】
驚くべきことに、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドに、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体、すなわち基質が添加されようと、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体に、前記デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドが添加されようと、プロセス性能に影響を及ぼさない。
【００６６】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、本明細書に記載のデハロゲナーゼ活性をもつ２つのポリペプチドのいずれかは、細胞全体として、ｐＨ９．５で用意され、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体は、ポリペプチドに添加され、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体はまた、ｐＨ９．５で用意され、ｐＨ９．５は、好適な塩基を用いた滴定によって反応の間、一定に保たれる。
【００６７】
例えば、好適な塩基は、ＫＯＨ水溶液またはＮａＯＨ水溶液からなる群より選択することができる。
【００６８】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では(Insome embodiments)、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のラセミ体の濃度は、８０〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは９０〜１５０ｇ／Ｌであり、最も好ましくは、濃度は１００ｇ／Ｌである。言い換えれば、アルファハロアルカン酸のラセミ体の濃度は、完全な転換が達成できるように選択されることが好ましい。
【００６９】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、活性のある細胞全体として用意され、前記活性細胞全体のバイオマスは１５〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは２５〜１００ｇ／Ｌの濃度を有する。
【００７０】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸のラセミ体と、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを含んでなる細胞全体のバイオマスとの比は、２：１〜１５：１、好ましくは３：１〜１０：１、最も好ましくは４：１である。
【００７１】
配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、より高い基質濃度によって阻害されるので、基質、すなわち式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸と、酵素、すなわち細胞全体に含まれており（is comprised）、バイオマスとして供給される、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドとの比は、基質濃度が低いほど増加する。
【００７２】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸のハロゲンＸは、臭化物および塩化物からなる群より選択される。
【００７３】
本明細書に記載される方法の一実施態様では、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸の部分Ｒは、１〜６個の炭素原子のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は、炭素原子ガンマまたはデルタであり、そして、炭素原子γまたはδにおける分岐に続く炭素原子は環状である。
【００７４】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、式Ｉに記載の前記アルファハロアルカン酸の部分Ｒは、エチル、ブチル、２−メチル−プロピル、およびメチル−シクロプロピルからなる群より選択される。
【００７５】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、ｐＨ値は、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムなどの好適な塩基を用いた滴定によって一定に保たれる。
【００７６】
反応条件は容易にスケールアップできることが見出されたので、１ｍｌ〜数千リットルの反応体積が可能である。
【００７７】
本明細書に記載の方法の一実施態様では、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、前記デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、ハロ酸デハロゲナーゼ(haloacid dehalogenase)である。
【００７８】
本明細書に記載の方法の好ましい実施態様では、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、配列番号１の配列からなり、２−クロロ酪酸、２−ブロモ−ヘキサン酸、２−ブロモ−４−メチルペンタン酸、および２−ブロモ−３−シクロプロピル−プロパン酸からなる群より選択されるラセミ基質と反応する。
【００７９】
本明細書に記載の方法の代替的な好ましい実施態様では、デハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、配列番号４の配列からなり、２−クロロ酪酸、２−フルオロ酪酸、２−ブロモ−ヘキサン酸、および２−ブロモ−４−メチルペンタン酸からなる群より選択されるラセミ基質と反応する。
【００８０】
選ばれたアルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーの選択的加水分解に続いて、Ｒ−エナンチオマーおよび加水分解されたエナンチオマーが混合物として存在する。いくつかの用途では、Ｒ−エナンチオマーのみを得る、すなわち精製することが有益である。したがって、選ばれた式Ｉに記載のアルファハロアルカン酸のＲ−エナンチオマーおよび加水分解エナンチオマーの混合物はさらに処理される。
【００８１】
更なる面では、本明細書に記載されるものは(A further aspect what is described herein)、前記アルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーの選択的加水分解のための本明細書に記載の方法の使用に関し、そこにおいてＲ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率は９０．０〜９９．９である。
【００８２】
驚くべきことに、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドを、式Ｉ（式中、Ｘはハロゲンであり、配列番号１の場合にはフッ素（fluor）以外のハロゲンであり、Ｒは６個までの炭素原子を含有するアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は炭素原子γまたはδにおいて直鎖または分岐状であることができる）によるアルファハロアルカン酸のＲ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマーを含んでなるラセミ体と、１〜８時間接触させる（配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドでは、ｐＨは９〜１０の範囲であり、温度は１５〜３５℃の範囲である、または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドでは、ｐＨは９〜１０の範囲であり、温度は５５〜６５℃の範囲である）ために使用すると、前記ポリペプチドは、前記アルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーの選択的加水分解を行うことになり、そこにおいてＲ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率は９０．０〜９９．９であることが見出された。
【００８３】
このような高いエナンチオマー過剰率は非常にまれであるあり、とりわけ配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドは、１〜８時間という非常に短い反応時間で９０〜９９のエナンチオマー過剰率値に達するので、この結果は意外であった。
【００８４】
したがって、驚くべきことに、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドを記載の条件で使用することによって、配列番号１もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるポリペプチドの有する２つのエナンチオマーの異なる反応挙動に基づいて式Ｉのアルファハロアルカン酸のＲエナンチオマーとＳエナンチオマーの分離を可能にし、かつ／または容易にする、代替的で、より安全で、より対費用効果が高く、時間効率のよい方法が可能となることが見出された。
【００８５】
別の面では、本明細書に記載されるものは、式ＩＩ
【化２】
2020536523.tif 000003
［式中
Ｒは１〜６個の炭素原子のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は炭素原子γまたはδにおいて直鎖または分岐状であることができる］
に記載のアルファハロアルカン酸のエナンチオマーを選択的に加水分解する方法であって、
配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを使用する方法に関する。
【００８６】
意外にも、配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、式ＩＩの、すなわちフッ素を含んでなるアルファハロアルカン酸のＳエナンチオマーを、非常に効率よく、かつ高いエナンチオマー過剰率で選択的に加水分解することが見出された。
【００８７】
好ましくは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用いる上記方法は、５５〜６５℃、ｐＨ９．５で行われる。
【００８８】
したがって、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの場合、上記のアルファハロアルカン酸にくわえて、２−フルオロ酪酸もまたとりわけ好ましい。
【００８９】
別の面では、本明細書に記載されているものは、Ｒ−エナンチオマーのエナンチオマー過剰率が９０．０〜９９．９である、式ＩＩのアルファハロアルカン酸のＳ−エナンチオマーの選択的加水分解のための、配列番号４に記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、デハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する。
【００９０】
好ましい実施態様では、本発明の方法は次のように行われる。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドを、室温、ｐＨ９．５で２−ブロモブタン酸に添加する。３Ｍ水酸化カリウムを用いた滴定によってｐＨ値を一定に保ちながら、反応を４〜６時間進行させる。
【００９１】
とりわけ好ましい実施態様では、本発明の方法は次のように行われる。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドを含有する細胞抽出物としての全細胞タンパク質１０ｍｇ／ｍｌを、１００ｇ／ｌの２−ブロモブタン酸に室温、ｐＨ９．５にて、６Ｌの反応体積で添加する。３Ｍ水酸化カリウムを用いた滴定によってｐＨ値を一定に保ちながら、反応を４〜６時間進行させる。
【００９２】
別の好ましい実施態様では、本発明の方法は次のように行われる。配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、温度５５℃、ｐＨ９．５で２−ブロモブタン酸に添加する。３Ｍ水酸化カリウムを用いた滴定によってｐＨ値を一定に保ちながら、反応を４〜６時間進行させる。
【００９３】
更なるとりわけ好ましい実施態様では、本発明の方法は次のように行われる。配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるデハロゲナーゼ活性をもつポリペプチドを含有する細胞抽出物としての全細胞タンパク質１０ｍｇ／ｍｌを、２−フルオロ酪酸に温度５５℃、ｐＨ９．５で添加する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ｐＨ値、すなわち９．５および温度、すなわち２５℃に関して最適化された条件下で行われた反応を示す。この場合、１００ｇ／Ｌの２−ブロモ酪酸を基質として使用し、２０ｍＭのグリシンを存在させ、２ｇ／Ｌの細胞溶解物、すなわちｐＫＡ８１ａ−ＨＡＤＨ−ＰＰ−ＡＪプラスミドを有する大腸菌ＭＧ１６５５を使用して、デハロゲナーゼ酵素を発現させた。細胞溶解物を１時間おきに３回加えた。
【図２】図２は、図１の反応の最適ｐＨがｐＨ８〜ｐＨ１０であることを示す。
【図３】図３は、（無菌の）細胞溶解物を使用する代わりに、特許請求の範囲に記載された酵素を発現する細胞全体も転換反応に使用できることを示す。
【図４】図４は、基質が用意され、酵素が基質に添加される場合に、転換反応の効率が維持されることを示す。
【図５】図５は、酵素が発酵培養液として用意され、基質が添加される場合に、転換反応の効率が維持されることを示す。
【実施例】
【００９５】
実施例１  選択されたハロ酸デハロゲナーゼの活性のスクリーニング
Ｐ．プチダ（putida）ＡＪ、Ｐ．プチダ（putida）１０９、およびＳ．トコダイイ（tokodaii）７由来の異なるハロ酸デハロゲナーゼ（Jones et al., 1992 (J Gen Microbiol. 1992 Apr;138(4):675-83、Kawasaki et al., 1994 Biosci Biotechnol Biochem. 1994 Jan;58(1):160-3、およびBachas-Daunert et al.、2009 Appl Biochem Biotechnol. 2009 Nov;159(2):382-93）を、大腸菌ＭＧ１６５５にクローニングし、ＩＰＴＧ処理によって過剰発現させた。５０ｇ／Ｌの２−ブロモ酪酸を基質として使用し、２×１．６ｇ／Ｌの細胞溶解物を反応の開始時および３．５時間後に加えた。その間、ｐＨは９であり、温度は３７℃に設定した。
【００９６】
ガスクロマトグラフィーを用いた分析によって、活性と立体選択性、すなわちＳ−エナンチオマーの優先的加水分解が、３つの酵素すべてについて示され、Ｐ．プチダＡＪ由来の酵素（配列番号１）が９０％超のｅｅ値に達する最も高い選択性を示した。
【００９７】
実施例２  反応結果に対するｐＨの影響
至適ｐＨ範囲を試験するために、反応条件を以下のように設定した。
−１００ｇ／Ｌ  ２−ブロモ酪酸（基質）
−Ｐ．プチダＡＪハロ酸デハロゲナーゼ（配列番号１）を発現する（６回、１時間おき）大腸菌の１．５ｇ／Ｌの細胞溶解物
−２０ｍＭグリシン
−気温：２５℃
−ｐＨ：８．０、９．０、１０．０で一定に保った
図２に示されるように、最良の結果は９〜１０のｐＨで得られる。
【００９８】
実施例３：Ｐ．プチダＡＪのハロ酸デハロゲナーゼ、すなわち、配列番号１からなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用いた高エナンチオマー過剰率の生成のための選択的脱ハロゲン化の更なる最適化
【００９９】
最初の例では、１０ｍＭグリシン中の１００ｇ／ｌのｒａｃ−２−ブロモ酪酸を基質として使用した。基質が３７℃よりも２５℃のほうが安定であり、したがって自己加水分解が防止された（データ示さず）ので、酵素活性の最適温度が３７℃であったにもかかわらず、反応は２５℃で行った。
【０１００】
酵素を細胞溶解物として用意し、反応の開始時にすべて添加するか、または２ｍｇ／ｍｌの濃度で１時間おきに加えた。約４時間後に反応が完了するまで、３Ｍ  ＫＯＨを用いた滴定によりｐＨを９．５で一定に保った。次に、濃Ｈ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ１．５に調整し、細胞片をセライトで濾過した。ＭＴＢＥを用いて抽出を行い、残留２−ヒドロキシ酪酸を除去するための洗浄はＣｕＳＯ４水溶液を用いて行った。最後に真空で濃縮を行った。
【０１０１】
驚くべきことに、反応は９９％超のエナンチオマー過剰率値に確実に達することが見出された（データ示さず）。
【０１０２】
これらの高いエナンチオマー過剰率、すなわち、反応後にアルファハロアルカン酸のＲ−エナンチオマーおよびアルファハロアルカン酸の前者のＳ−エナンチオマーのヒドロキシル化生成物のみが存在するという事実は、この方法を大規模な工業規模での使用に魅力的なものにする。
【０１０３】
実施例４：細胞全体を用いた転換
驚くべきことに、細胞溶解物を調製する代わりに、細胞全体を転換に使用できることが見出された。これは、（無菌の）細胞溶解物を調製する時間のかかる工程を省略できるという利点を有する。
【０１０４】
最初のケースでは、１００ｇ／Ｌの濃度のラセミ体２−ブロモ酪酸を基質として使用した。反応パラメーターは、１５０ｍｌ、２５℃、５００ｒｐｍ、２０ｍＭグリシン緩衝液、およびｐＨ９．５に設定した。ｐＨは３Ｍ  ＫＯＨを用いて一定に保った。基質混合物を用いて反応容器を調製し、酵素の添加、すなわち、Ｐ．プチダＡＪ由来のデハロゲナーゼ酵素、すなわち配列番号１からなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する大腸菌ＭＧ１６５５の添加によって反応を開始した。細胞を、反応の開始時に、または１、２、および３時間後に段階的に、それぞれ８．３ｇ／Ｌ（図３参照）の濃度で添加した。酵素を含有する細胞全体の最終濃度は２５ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌであった。反応は４時間後に完了した。図３および下表に示した結果は、反応が１時間を超えて、例えば４時間行われるのが理想的であることを示す。
【０１０５】
【表１】
2020536523.tif 000004
【０１０６】
その後、反応を繰り返したが、Ｐ．プチダＡＪ由来のデハロゲナーゼ酵素、すなわち配列番号１からなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する大腸菌ＭＧ１６５５細胞からなるバイオマスは、基質を添加する前に反応容器に加えた。結果を図４と下表に示す。これらの結果は、最初に細胞全体を含んでなるバイオマスとして酵素を提供し、基質を前記バイオマスに加えることが可能であることを示す。
【０１０７】
【表２】
2020536523.tif 000005
【０１０８】
さらに、発酵培養液を用いて転換を行った。再び、ｐＫＡ８１ａ−ＨＡＤＨ−ＰＰ−ＡＪプラスミドを有する大腸菌ＭＧ１６５５を用いて、デハロゲナーゼ酵素、すなわち配列番号１からなるデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現させた。酵素生産は、標準的なプロトコールを用いた最少培地中での大腸菌の発酵によって行った。遺伝子発現後、１００ｇ／Ｌの細胞濃度に達した。その後、生体内変換（biotransformation）を未処理発酵培養液で行った。発酵培養液を２５℃に冷やし、３Ｍ  ＫＯＨを加えることによってｐＨを９．５に調整した。デハロゲナーゼ反応は、１００ｇ／Ｌの２−ブロモ酪酸、０．５倍量（体積／体積）のｐＨ９．５のグリシン緩衝液、および２倍量（体積／体積）の５Ｍ  ＫＯＨを含有する基質混合物を加えることによって開始した。反応は１時間後に完全転換、すなわち９０％ｅｅに達した（図５参照）。
【０１０９】
得られたヒドロキシ酪酸とＲ−２−ブロモ酪酸の混合物から、約３０％の純度のＲ−２−ブロモ酪酸を、酸性化や抽出などの標準的な技術を用いて得ることができる。
【０１１０】
実施例５  更なる基質の試験
２−ブロモ酪酸に加えて、更なる基質を試験した。その結果を下に記載する。
【０１１１】
【表３】
2020536523.tif 000006
【０１１２】
実施例６：スケールアップ
反応を２０００リットルにスケールアップするための前提条件は、酵素が、細胞溶解物を調製する必要なしにバイオマスとして用意された細胞全体に含まれて使用されうるという発見であった。したがって、大規模では経済的に不可能である、細胞溶解物の濾過などの時間と費用のかかる調製工程を省略することができた。さらに、細胞全体中に基質（ラセミ体）または酵素を含んでなるバイオマスを加えることによって反応を開始できるという知見は、装置が最大限の柔軟性をもって使用できることを意味した。この方法をさらに適合させるために、ｐＨ滴定に使用したＫＯＨ（上記参照）を５０％ＮａＯＨに換え、製品抽出用溶媒をＭＴＢＥからＭＩＢＫに変更し、かつ副生成物の除去に使用したＣｕＳＯ４をＣａＣｌ２に換え、より容易で、かつより安価な廃棄物処理を可能にした。
【図１】
2020536523.tif 000009
【図２】
2020536523.tif 000010
【図３】
2020536523.tif 000011
【図４】
2020536523.tif 000012
【図５】
2020536523.tif 000013
【配列表】
2020536523000001.app
【国際調査報告】
2020536523.tif 000014
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