(57)【要約】  本発明は、ヒト網膜前駆体を得るｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、（ｉ）ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、（ｉｉ）色素細胞及び／又は神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程とを含む、方法に関する。好適には、ＲＰＥ細胞及び／又は神経網膜の前駆体を得るための更なる工程が実施され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト網膜前駆体を得るｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
（ｉ）ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、前記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
（ｉｉ）色素細胞及び／又は神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、前記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞特異的な神経促進培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてインスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸で構成され、任意選択でＴＧＦβ及び／又はＦＧＦ２を更に含む栄養細胞培地と、下記要素：炭素供給源、ビタミン、無機塩、アミノ酸及びタンパク質消化物の少なくとも一部を含むサプリメントとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞特異的な神経促進培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてプロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、インスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸を含むか、又はそれらからなり、任意選択でＴＧＦβ及び／又はＦＧＦ２を更に含み、更に好ましくは、前記幹細胞特異的な神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適にはヒト起源に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉｉ）は、前記接着培養物が、６０％〜８０％、好適には７０％〜８０％コンフルエンスに達するまで実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）は、少なくとも１６日間、好ましくは１９日〜３３日間実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）を得るための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉｉｉＲＰＥ）工程（ｉｉ）で得られた前記培養物から、少なくとも１つの色素細胞を収集する工程と、
（ｉｖＲＰＥ）工程（ｉｉｉＲＰＥ）で得られた該色素細胞を培養する工程と、
を更に含む、方法。
【請求項７】
工程（ｉｖＲＰＥ）における前記培養する工程は、接着培養物系中で実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
神経網膜細胞を得るための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉｉｉＮＲ）工程（ｉｉ）で得られた前記培養物から、少なくとも１つの神経上皮様構造由来の細胞を収集する工程と、
（ｉｖＮＲ）工程（ｉｉｉＮＲ）で得られた該細胞を培養する工程と、
を更に含む、方法。
【請求項９】
少なくとも１つの神経上皮様構造は、工程（ｉｉｉＮＲ）において収集される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｖＮＲ）において、前記培養培地に、少なくとも５日間、ＦＧＦ２が補充される、請求項８又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
光受容体細胞（photoreceptor cells：視細胞）又は支持網膜色素上皮（ＲＰＥ）の機能の障害又は完全な損失は、遺伝性網膜症及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）等の網膜疾患における不可逆的失明の主な原因である。緑内障における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅もまた、視力の不可逆的損失を引き起こす。多能性幹細胞の細胞誘導体を使用した細胞置換戦略は、変性した網膜を回復させる非常に有望なアプローチである。段階的な分化プロトコルは、網膜分化を模倣して、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞及びヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞からＲＰＥ細胞、ＲＧＣ及び光受容体を首尾よく生成するよう設計された［１〜１４］。最近のプロセスにより、ｈＥＳ又はｈｉＰＳは、胚様体から［１５〜１８］、又は単にコンフルエントなｈｉＰＳ培養物から［１９、２０］、３Ｄ網膜構造を効率的に形成することができることが実証された。網膜前駆体細胞、ＲＰＥ細胞及び神経網膜細胞を含む或る特定のヒト神経上皮系譜細胞の実質的に純粋な培養物を得るｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は、例えば特許文献１にすでに記載されている。
【０００２】
これらのアプローチの大部分が、培地中の動物由来の構成成分及び動物由来の基質又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養物中でのフィーダー細胞の存在に依存している。基本的に、フィーダー細胞は、細胞外分泌物、特に増殖因子を提供する、分裂することができない細胞（それにより「成長停止細胞」とも称される）の層で構成されて、通常は細胞増殖及び分化を促進するのに使用される。
【０００３】
しかしながら、多能性幹細胞の細胞誘導体の臨床的応用は、かかる細胞誘導体を得ることを実際に可能にする培養パラメーターの幾つかによって妨げられている。これらの最大の障害は、マウス／ヒト由来のフィーダー細胞の要件である。実際に、フィーダー細胞は、多能性幹細胞の成長及び分化に必須であるにもかかわらず、動物／ヒトウイルスを細胞に、最終的には患者に移行させる現実的なリスクを課す未知の因子群を生み出す。
【０００４】
したがって、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣに由来する移植可能な網膜細胞型の生成に関する現行の適正製造基準（ＧＭＰ）ガイドラインに従って、好適にはゼノフリーの（xeno-free：異種成分非含有）（ＸＦ、即ち、細胞培養培地の構成成分は全て、同じ生物に由来する）フィーダーフリー（feeder-free：フィーダー非含有）（ＦＦ）の方法（即ち、フィーダー細胞の使用を包含しない方法）を確立することが、将来の臨床的応用に必要とされる。
【０００５】
既知組成培地（chemically defined media）を有するフィーダーフリーの（ＦＦ）系の使用は、培養物ｈＥＳ細胞及びｈｉＰＳ細胞に関して記載されている［２１］。しかしながら、ＸＦ／ＦＦ培養条件は、網膜ニューロンに対する分化に関してはあまり文書化されていない［２６、２７］。
【０００６】
以下の実験の部で開示するように、本発明者らは、ここで、ｉＰＳ細胞を、フィーダーフリーの培養系に基づいて、好適には異種産物の非存在下で、新たな網膜分化プロトコルに付した。このプロトコルは、胚様体又は細胞凝集塊の形成を回避して、マトリゲル又は血清の非存在下で実施することができる。本発明者らは、幹細胞特異的な神経促進培地中で培養した接着ｈｉＰＳ細胞が、３週〜５週以内で眼野のアイデンティティを有する神経上皮様構造を生成することができ、３Ｄ培養に切り替えると、主要な網膜細胞型に分化できることを実証した。これらの条件下では、ｈｉＰＳ細胞は、発達的に適切な時間枠で網膜マーカーを迅速に発現しながら、神経網膜様組織に自己組織化して、ＲＧＣ及び光受容体等の種々の網膜細胞型を生じた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１７４４９２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の第１の目的は、ヒト網膜前駆体を得るｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
（ｉ）ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
（ｉｉ）色素細胞及び／又は神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
を含む、方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本文中で、「網膜前駆体細胞」とも呼ばれる「網膜前駆体」は、光受容体の前駆体及びＲＰＥに分化することができる細胞を含む、神経網膜の全ての細胞型を生成するのに適格な細胞を包含する。
【００１０】
「ヒト多能性幹細胞」は、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞及びヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞を含む。かかる細胞は、当該技術分野で既知の方法、例えば、Chungらによって詳述される胚の破壊を伴わない方法を使用して、容易に得られ得る［４５］。上記方法は好適には、ヒト人工多能性幹細胞を用いて実施される。
【００１１】
本明細書中の「フィーダー細胞」は、成長停止細胞を指す。「フィーダー細胞」は、線維芽細胞、特に、当該技術分野において幹細胞の培養に一般的に使用されるヒト包皮線維芽細胞、成体皮膚線維芽細胞及び初代マウス胚線維芽細胞を包含する。
【００１２】
上述するように、本発明の方法は、フィーダーフリーであり、したがって、フィーダー細胞の使用を必要としない。
【００１３】
上記方法の好ましい実施の形態において、ヒト多能性幹細胞の培養物及び幹細胞特異的な神経促進培地は、フィーダー細胞を欠如している。更に好ましい実施の形態において、ヒト多能性幹細胞の培養物及び幹細胞特異的な神経促進培地は、線維芽細胞を欠如しており、好適にはヒト包皮線維芽細胞、成体皮膚線維芽細胞及び初代マウス胚線維芽細胞を欠如している。好適には、ヒト多能性幹細胞の培養物及び幹細胞特異的な神経促進培地は、ヒト多能性幹細胞に由来しない如何なる細胞も欠如している。
【００１４】
好適には、上記方法は、異種産物の非存在下で実施され得る。上記方法の好ましい実施の形態によれば、幹細胞特異的な神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適には、幹細胞特異的な神経促進培地の構成成分は全て、ヒト起源に由来する。上記方法の更に好ましい実施の形態によれば、幹細胞特異的な神経促進培地のタンパク質は全て、ヒト起源に由来する。本発明において、この定義は、ヒト試料から単離される構成成分、より詳細にはタンパク質、及び組換えタンパク質等の組換えヒト構成成分の両方を包含すると理解されるべきである。組換えヒトタンパク質が使用される場合、使用する核酸配列がヒト起源であるか、又はヒト起源の配列に由来するならば、組換えヒトタンパク質は、ヒト細胞以外の生物において産生されてもよい。
【００１５】
「神経促進培地」は概して、ニューロン細胞の維持及び／又は成長を支持する培養培地を指す。神経促進培地は通常、栄養培地で構成され、該栄養培地には、下記要素：炭素供給源、ビタミン、無機塩、アミノ酸及びタンパク質消化物の少なくとも一部を含む神経促進サプリメントが補充されている。
【００１６】
しかしながら、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞のヒト網膜前駆体への分化は、フィーダーフリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用する場合に、幹細胞に適応させた特異的な神経促進培地の使用を必要とすることを実証した。
【００１７】
本発明において、「幹細胞特異的な神経促進培地」は、幹細胞特異的な栄養細胞培地、並びに下記要素：炭素供給源、ビタミン、無機塩、アミノ酸及びタンパク質消化物の少なくとも一部を含む神経促進サプリメントを含む。当業者は、幹細胞特異的な栄養細胞培地及び神経促進サプリメントの相対比率を容易に規定し得る。好ましくは、神経促進サプリメントの容量は、幹細胞特異的な神経促進培地の最終容量の１％〜２％に相当する。
【００１８】
Thermo Fischer ScientificによってＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地として商品化されたＥ８培地と呼ばれる適切な幹細胞特異的な栄養細胞培地は、Chenらによって記載されている［２１］。Ｅ８培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてインスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸、ＦＧＦ２、及びＴＧＦβ（又はＮＯＤＡＬ）で構成される。より正確には、この培地は、下記の通りにChenらに規定されている：Ｅ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム（６４ｍｇ／ｌ）、セレン酸ナトリウム（１４μｇ／ｌ）、ＦＧＦ２（１００μｇ／ｌ）、インスリン（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ３（５４３ｍｇ／ｌ）及びトランスフェリン（１０．７ｍｇ／ｌ）、ＴＧＦβ１（２μｇ／ｌ）又はＮＯＤＡＬ（１００μｇ／ｌ）を含有し、ここで、培地のオスモル濃度は、ｐＨ７．４で３４０ｍＯｓｍに調節される。
【００１９】
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ７（商標）（Thermo Fischer Scientific）として商品化されたＥ７培地又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）（Thermo Fischer Scientific）として商品化されたＥ６培地等のＥ８／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地に由来する幹細胞特異的な栄養細胞培地もまた、使用され得る。Ｅ７培地は、Ｅ８培地の組成と類似した組成を有するが、如何なるＴＧＦβも含有しない（即ち、ＴＧＦβを欠如している）。Ｅ７培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてインスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸、ＦＧＦ２で構成される。Ｅ６培地は、Ｅ８培地の組成と類似した組成を有するが、ＴＧＦβを欠如しており、ＦＧＦ２を欠如している。Ｅ６培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてインスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸で構成される。
【００２０】
好ましくは、幹細胞特異的な栄養細胞培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてインスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸で構成され、任意選択でＴＧＦβ及び／又はＦＧＦ２を更に含む。
【００２１】
ＴｅＳＲ（商標）−Ｅ８（STEMCELL Technologies）、ＴｅＳＲ（商標）−Ｅ７（STEMCELL Technologies）、ＴｅＳＲ（商標）−Ｅ６（STEMCELL Technologies）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（STEMGENT）及びｉＰＳ−Ｂｒｅｗ等の市販の幹細胞特異的な栄養細胞培地、特に、ＳｔｅｍＭＡＣＳ  ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ  ＸＦ基本培地（Miltenyi）として商品化された培地もまた、使用され得る。
【００２２】
幹細胞特異的な神経促進培地を得るのに適した神経促進サプリメントは、Ｎ２、Ｂ２７、Ｇ５及びＢＩＴ９５００サプリメント等の既知のサプリメント、並びにこれらに由来する任意のサプリメントの中から選択され得る。これらのサプリメント中に存在する構成成分を以下の表１に概要する。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
しかしながら、上記方法が、「ゼノフリー」で、即ち、異種産物の非存在下で実施されるべきである場合、神経促進サプリメントは、同じ生物に由来する構成成分のみで配合されるべきであり、本明細書中で「ゼノフリーの神経促進サプリメント」とも呼ばれる。したがって、上記方法の或る実施の形態において、神経促進サプリメントの構成成分は全て、同じ生物に由来し、好ましくは、神経促進サプリメントの構成成分は全て、ヒト起源に由来する。好ましくは、かかる実施の形態において、神経促進サプリメントは、Ｎ２サプリメント及びＢ２７サプリメントの中から選択され、ここで、神経促進サプリメントの構成成分は全て、同じ生物に由来し、更に好ましくはヒト起源に由来する。
【００２５】
適切なゼノフリーの神経促進サプリメントは、例えば、組換え構成成分又はヒト化構成成分のみで配合された完全Ｂ−２７（商標）無血清サプリメントであるＢ−２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ＸｅｎｏＦｒｅｅ  ＣＴＳ（商標）（Thermo Fisher Scientific）、及び組換え構成成分及びヒト化構成成分のみで配合された完全Ｎ２（商標）無血清サプリメントであるＮ２（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ＸｅｎｏＦｒｅｅ  ＣＴＳ（商標）（Thermo Fisher Scientific）である。
【００２６】
上記方法の或る実施の形態において、幹細胞特異的な神経促進培地は、血清アルブミンを欠如している。したがって、かかる実施の形態において、Ｎ２等の神経促進サプリメントの使用は、幹細胞特異的な神経促進培地の調製に好ましい。
【００２７】
好ましくは、本発明の方法で使用する幹細胞特異的な神経促進培地は、上記で列挙した培地の１つ等の幹細胞特異的な栄養細胞培地、及びＮ２サプリメントを含み、ここで、更に好ましくは、神経促進サプリメントの構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適にはヒト起源に由来する。
【００２８】
或る実施の形態において、本発明の方法で使用する幹細胞特異的な神経促進培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてプロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、インスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸を含むか、又はそれらからなり、任意選択でＴＧＦβ及び／又はＦＧＦ２を更に含み、更に好ましくは、幹細胞特異的な神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適にはヒト起源に由来する。
【００２９】
ＦＧＦ２は、多能性状態で多能性幹細胞を維持することにより分化の防止に寄与することは既知である。したがって、好ましくは、使用する幹細胞特異的な神経促進培地は、ＦＧＦ２を欠如している。好適には、本発明の方法で使用する幹細胞特異的な神経促進培地は、Ｅ６の組成を有する栄養培地とＮ２サプリメントとを含む。かかる実施の形態において、本発明の方法で使用する幹細胞特異的な神経促進培地は、ＮａＨＣＯ３でｐＨを調節したＤＭＥＭ／Ｆ１２中においてプロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、インスリン、セレン、トランスフェリン、Ｌ−アスコルビン酸を含むか、又はそれらからなり、ここで、更に好ましくは、幹細胞特異的な神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適にはヒト起源に由来する。
【００３０】
好適には、上記方法は、分化因子を使用せずに実施することができる。上記方法の好ましい実施の形態によれば、使用する幹細胞特異的な神経促進培地は、下記の分化因子：ノギン、Ｄｋｋ−１及びＩＧＦ−１の少なくとも１つを欠如している。特に、神経促進培地は、これらの３つの因子を欠如し得る。
【００３１】
工程（ｉ）で使用するヒト多能性幹細胞は、任意の種類の接着培養系で培養することができる。この培養に使用することができる表面の非限定的な例は、ガラス、プラスチック（場合によっては処理される）、ビトロネクチン、アラニン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ（商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ポリＬ−リジン、栄養細胞、又はＣｏｒｎｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）等の市販の任意の合成表面である。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの系で使用する表面は、例えば、ビトロネクチン、アラニン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、又はポリＬ−リジン等の少なくともヒト起源のタンパク質を含むか、又はそれらのみからなる。本発明において、培養物がゼノフリーであるべきである場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で使用する表面は、好ましくは、例えば、ヒトビトロネクチン、ヒトコラーゲン、ヒトラミニン、ヒトフィブロネクチン等の少なくともヒト起源のタンパク質を含むか、又はそれらのみからなる。「ヒト起源の分子」とは、本明細書中では、ヒトに見られる相当する分子のペプチド配列を有する分子を指す。かかる「ヒト起源の分子」は、ヒト試料由来の分子の単離によって、又は組換え分子の産生によって、容易に得ることができる。本発明において、機能性切断型タンパク質又は機能性タンパク質変異体もまた、使用され得る。「機能性切断型タンパク質」及び「機能性タンパク質変異体」とは、本明細書中では、総タンパク質の、多能性幹細胞の接着を促進する能力を保持する切断型タンパク質又はタンパク質変異体を指し、それは、当業者によって容易に検証することができる。
【００３２】
ビトロネクチンは特に、多能性細胞の培養を促進することが示されている。したがって、好適には、本発明において、工程（ｉ）で使用するヒト多能性幹細胞は、ビトロネクチン、好ましくはヒトビトロネクチン、更に好ましくは切断型ヒトビトロネクチンの存在下で培養される。好適には、工程（ｉ）で使用するヒト多能性幹細胞は、ヒトビトロネクチンのアミノ酸断片６２〜４７８に相当する組換え切断型ヒトビトロネクチンの存在下で培養される。Thermo Fischer Scientific又はSTEMCELL技術によって商品化された製品ＶＴＮ−Ｎは、例えば当該目的で使用され得る。
【００３３】
実験の部で記載するように、またこれは、必須ではないが、本発明による方法は、工程（ｉ）が、１日〜４日間、好ましくは２日間の多能性幹細胞の維持用の培養培地中での上記多能性幹細胞の接着培養の工程に先行されるように、実施することができる。好ましくは、多能性幹細胞の維持用の培養培地中での上記多能性幹細胞の接着培養の上記工程は、１日〜４日間、好ましくは２日間の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２）を欠如するように改変された、多能性幹細胞の維持用の培養培地を使用して実現される。この更なる工程に関する塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２）を欠如している適切な培地の非限定的な例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地、ＴｅＳＲ（商標）−Ｅ６培地及びMiltenyi BiotechによってＳｔｅｍＭＡＣＳ  ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ  ＸＦ基本培地として商品化された培地である。或いは、多能性幹細胞の維持用の培養培地における上記多能性幹細胞の接着培養の上記工程は、１日〜４日間、好ましくは２日間の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２）を含む多能性幹細胞の維持用の培養培地を使用して実現される。この更なる工程に関する塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２）を含む適切な培地の非限定的な例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地、ＴｅＳＲ（商標）−Ｅ８培地、及びＳｔｅｍＭＡＣＳ  ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ  ＸＦ完全培地（ＳｔｅｍＭＡＣＳ  ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ  ＸＦサプリメントを補充したＳｔｅｍＭＡＣＳ  ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ  ＸＦ基本培地）である。
【００３４】
本発明によれば、工程（ｉｉ）は、色素細胞及び／又は神経上皮様構造が出現するまで実施される。
【００３５】
上記において、以下の実験の部で「神経網膜様構造」とも呼ばれる「神経上皮様構造」は、神経促進培地中での培養の数日後に出現し始める明位相（phase-bright）構造を指す。これらの構造は、ＯＣＴ４等の多能性関連遺伝子を著しく発現せず、ＬＨＸ２、ＲＡＸ、ＰＡＸ６及びＳＩＸ３等の眼野指定（specification）と関連付けられる転写因子を発現する細胞で本質的に作製される。実験の部で開示するように、上記方法を実施する場合、色素細胞がまず出現し、神経上皮様構造は、ほとんどの場合で、色素細胞のパッチの近傍に出現する。
【００３６】
当然のことながら、本発明による方法を実施する場合、当業者は、各種マーカーの発現を検出することができる（各種マーカーの発現、又は各種マーカーが、もはや発現されないという事実のいずれかを調べるために、及び／又は各種マーカーの発現レベルを定量的に測定するために）。例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びイムノアッセイ等の当該技術分野で既知の任意の技法をこの目的に使用することができる。多能性に関するマーカーの例は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧであり、眼野に関するマーカーの例は、ＲＡＸ、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、ＬＨＸ２及びＳＩＸ３であり、最初の２つが好ましい。
【００３７】
本発明者らは、本発明の接着培養における細胞のコンフルエンスが、生存可能な色素細胞及び／又は神経上皮様構造を得るのに役割を果たし得ることを観察した。実際に、接着培養が、８０％コンフルエンスに達すると、得られる色素細胞及び／又は神経上皮様細胞は、品質が劣り、それらの生存度は影響を受ける。細胞培養生物学において、コンフルエンスは、培養皿又はフラスコ中の接着細胞の数の推定として一般的に使用される用語であり、細胞によって覆われる表面の比率を指す。当業者は、接着細胞に関するコンフルエンスの概念に精通しており、このコンフルエンスを評価することが可能であり、特にコンフルエンスが、培養表面全体上で均一ではない場合に、局所的に、即ち受容器（recipient）の１つの区域でのみ認めることができる。コロニー型の単層の場合、「８０％コンフルエンス」は、必要に応じて、幾つかのコロニーが、一定時間内で（punctually）他のコロニーと接触するようになる一方で、これらのコロニー間に幾らかの自由空間（表面の１０％〜３０％に相当する）が残存する状況として定義することができる。
【００３８】
好ましい実施の形態において、工程（ｉｉ）は、接着培養物が、６０％〜８０％、好適には７０％〜８０％コンフルエンスに達するまで実施される。好ましくは、本発明の方法において、細胞のコンフルエンスは、８０％に満たない。
【００３９】
上記方法の好ましい特定の実施の形態において、工程（ｉｉ）は、少なくとも１６日間、好ましくは１９日〜３３日間実施され、その結果、十分量の神経上皮様構造が出現する。当然のことながら、培養方法は、工程（ｉｉ）を短縮することができるように発展させることができる。上述するように、神経上皮様構造は、ＯＣＴ４等の多能性関連遺伝子を著しく発現せず、眼野指定と関連付けられる転写因子を発現する細胞で本質的に作製される。したがって、培養系に応じて、当業者は、少なくとも幾つかの細胞がＯＣＴ４を発現するのを止め、及び／又はＲＡＸ及びＰＡＸ６を発現し始める時間として、工程（ｉｉ）の終了を規定することを選択することができる。上述するように、この特性化は、ｑＲＴ−ＰＣＲ又は免疫染色等の任意の既知の技法によって実施することができる。
【００４０】
別の態様によれば、本発明は、ＲＰＥ細胞を得る方法であって、
（ｉ）ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
（ｉｉ）色素細胞が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
（ｉｉｉＲＰＥ）工程（ｉｉ）で得られた培養物から、少なくとも１つの色素細胞を収集する工程と、
（ｉｖＲＰＥ）工程（ｉｉｉＲＰＥ）で得られた該色素細胞を培養する工程と、
を含む、方法に関する。
【００４１】
この方法を実施する場合、当業者は、工程（ｉｉｉＲＰＥ）で収集される細胞が、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）及び／又はＺＯ−１を発現することを調べることができる。上述するように、当該技術分野で既知の任意の技法（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ及び免疫染色）をこの目的に使用することができる。
【００４２】
ＲＰＥ細胞を得る上記方法の好ましい実施の形態によれば、工程（ｉｖＲＰＥ）における培養は、接着培養系で実行される。上述するように、任意の接着培養系を使用することができる。
【００４３】
ＲＰＥ細胞を得る本発明の方法を実施する場合、細胞は、少なくとも５日間、工程（ｉｖＲＰＥ）で増幅される。好適には、工程（ｉｖＲＰＥ）の培養物は、数週間、維持及び増幅させて、大量のＲＰＥ細胞を得ることができ、例えば、色素細胞の約１０個のパッチが工程（ｉｉｉＲＰＥ）で収集され、３ｃｍ２の新たな皿に一緒に蒔いて、２週〜４週後に、又はＦＧＦ２を培養培地に添加する場合には（２日〜３日毎に１０ｎｇ／ｍｌ）、１０日〜１４日後に、ＲＰＥ細胞の実質的に純粋な（９９％）コンフルエントな接着培養物が得られる。
【００４４】
工程（ｉｉｉＲＰＥ）で得られる色素細胞を培養する工程（ｉｖＲＰＥ）は、任意のタイプの神経促進培地を使用して実施されてもよく、上述する幹細胞特異的な神経促進培地に限定されず、幹細胞特異的な神経促進培地もまた使用され得る。この工程を実施するのに適切な神経促進培地の非限定的な例は、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２ （ＤＭＥＭ／Ｆ１２）又はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））等の栄養培地で構成される任意の培地であり、上記栄養培地に、Ｎ２、Ｂ２７、Ｇ５及びＢＩＴ９５００サプリメント等の上記で規定するような神経促進サプリメント、並びにこれらに由来する任意のサプリメントを補充する。
【００４５】
好ましくは、工程（ｉｉｉＲＰＥ）で得られる色素細胞を培養する工程（ｉｖＲＰＥ）は、Ｎ２サプリメントを補充した、好適には１％ＭＥＭ非必須アミノ酸を更に補充したＤｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を使用して実施される。好ましくは、工程（ｉｉｉＲＰＥ）で得られる色素細胞を培養する工程（ｉｖＲＰＥ）において、神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適にはヒト起源に由来する。
【００４６】
本発明の別の態様は、神経網膜細胞を得る方法であって、
（ｉ）ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
（ｉｉ）神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
（ｉｉｉＮＲ）工程（ｉｉ）で得られた培養物から、少なくとも１つの神経上皮様構造由来の細胞を収集する工程と、
（ｉｖＮＲ）工程（ｉｉｉＮＲ）で得られた該細胞を培養する工程と、
を含む、方法である。
【００４７】
本明細書中の「神経網膜細胞」は、ＲＧＣ、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、光受容体細胞（桿体及び錐体）、ミュラーグリア細胞並びにこれらの細胞型のいずれかの前駆体を含む。
【００４８】
工程（ｉｉｉＮＲ）で得られる細胞を培養する工程（ｉｖＮＲ）は、任意のタイプの神経促進培地を使用して実施されてもよく、上述する幹細胞特異的な神経促進培地に限定されず、幹細胞特異的な神経促進培地もまた使用され得る。この工程を実施するのに適切な神経促進培地の非限定的な例は、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２ （ＤＭＥＭ／Ｆ１２）又はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））等の栄養培地で構成される任意の培地であり、上記栄養培地に、Ｎ２、Ｂ２７、Ｇ５及びＢＩＴ９５００サプリメント等の神経促進培地を得るのに適したサプリメント、並びにこれらに由来する任意のサプリメントを補充する。
【００４９】
好ましくは、工程（ｉｉｉＮＲ）で得られる細胞を培養する工程（ｉｖＮＲ）は、Ｂ２７サプリメントを補充した、好適には１％ＭＥＭ非必須アミノ酸を更に補充したＤｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を使用して実施される。好ましくは、工程（ｉｉｉＮＲ）で得られる細胞を培養する工程（ｉｖＮＲ）において、神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来し、好適にはヒト起源に由来する。
【００５０】
重要なことに、各種神経網膜細胞は、工程（ｉｖＮＲ）中の同じ時間に出現せず、その間に、培養細胞は分化する。したがって、工程（ｉｖＮＲ）の持続期間に応じて、異なる細胞型が形成する。出現の順序は、下記の通りである：まず、神経節細胞が出現した後、アマクリン細胞及び水平細胞が出現し、その後、光受容体が出現する。したがって、必要とされる細胞型に応じて、当業者は、必要な限り、最大およそ９ヵ月（およそ２９０日）間、培養工程（ｉｖＮＲ）を実施する。
【００５１】
以下の実験の部で例示するように、本発明のこの態様による方法は、工程（ｉｉｉＮＲ）において、少なくとも１つの神経上皮様構造を収集することによって実施され得る。これは、例えば、この構造を、接着細胞の層と機械的に分離することによって行われ得る。続いて、この構造を、マルチウェルプレートのウェル、ペトリ皿、フラスコ等の別の培養受容器において、単独で、又は他の神経上皮様構造と一緒に入れることができる。
【００５２】
この方法を実施する場合、当業者は、好適には、工程（ｉｉｉＮＲ）で収集される細胞が、眼野細胞に特徴的なＰＡＸ６及びＲＡＸを同時発現することを調べることができる。或いは、又はさらに、工程（ｉｉｉＮＲ）で収集される細胞による細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することができる。
【００５３】
特に好適な態様によれば、本発明は、上記工程（ｉ）〜工程（ｉｖＮＲ）を含む光受容体前駆体を得る方法に関し、ここで、工程（ｉｖＮＲ）は、少なくとも２１日間、好ましくは少なくとも２８日間実施される。当然のことながら、培養条件の将来の発展に応じて、この工程を更に短縮してもよい。
【００５４】
工程（ｉｖＮＲ）中のいかなる時間でも、当業者は、培養細胞におけるＮＲＬ及び／又はＣＲＸの発現を測定することによって、例えばｑＲＴ−ＰＣＲによって、光受容体系譜への分化を調べることができる。或いは、又はさらに、光受容体前駆体は、以下の実験の部で開示するように、リカバリン免疫染色を用いて同定することができる。本発明者らはまた、光受容体前駆体の細胞選別用の細胞表面マーカーとして使用することができるＣＤ７３が、リカバリンとともに同時発現されることを実証した。これは、好適には、工程（ｉｖＮＲ）後に光受容体前駆体の細胞選別の更なる工程を追加することによって、例えば、抗ＣＤ７３抗体を使用することによって使用され得る。光受容体前駆体に富んだ得られた細胞集団を、例えば、細胞移植又はスクリーニングアプローチに使用することができる。
【００５５】
任意選択で、ＤＡＰＴ等のノッチ阻害剤を、工程（ｉｖＮＲ）において、少なくとも１日間、好ましくは５日間以上、培養培地に添加することができる。ＤＡＰＴは、γ−セクレターゼ阻害剤、間接的にはノッチの阻害剤であり、本発明者らは、工程（ｉｖＮＲ）における数日間のその添加が、光受容体前駆体の生成を支持することを示した。
【００５６】
上記で開示する神経網膜細胞を得る方法の好ましい実施の形態によれば、工程（ｉｖＮＲ）における培養は、非接着培養系で実行される。例えば、工程（ｉｉｉＮＲ）で収集される神経上皮様構造は、浮遊構造として培養される。特定の実施の形態によれば、工程（ｉｉｉＮＲ）で収集される各神経上皮様構造はそれぞれ、個々の受容器／ウェルにおいて、浮遊構造として培養される。
【００５７】
非接着系の非限定的な例として、細胞が培地中で活発に懸濁された状態で保たれる磁気回転スピナーフラスコ又は振盪フラスコ又は皿、並びに細胞が攪拌された状態で保たれないが、基板に堅く結合することができない静置培養容器又はＴ−フラスコ及び瓶が挙げられる。
【００５８】
実験の部で記載するように、細胞又は神経上皮様構造は、好適には、振盪条件下で工程（ｉｖＮＲ）を実施することによって、培地中で活発に懸濁された状態で保たれ得る。例えば、三次元の培養物を攪拌する回転器等の任意の振盪機をこの目的で使用することができる。
【００５９】
神経網膜細胞を得る本発明の方法の別の好ましい実施の形態によれば、工程（ｉｖＮＲ）で使用する培養培地に、少なくとも５日間、ＦＧＦ２が補充される。この培養培地は、好ましくは、上記で規定するようなニューロン促進培地である。
【００６０】
本発明の利点の１つは、第１の接着培養物から、ＲＰＥ細胞（第１の培養、好ましくは接着）及び神経網膜の前駆体（第２の培養、好ましくは非接着）の両方を得るように、２つの異なる培養を並行して実施することができることである。したがって、本発明は、上記で規定するような工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）、続いて上記で同様に開示する工程（ｉｉｉＮＲ）及び工程（ｉｖＮＲ）と並行して実施される上記で規定する工程（ｉｉｉＲＰＥ）及び工程（ｉｖＲＰＥ）を含む、ＲＰＥ細胞及び神経網膜の前駆体の両方を得る方法に関する。
【００６１】
最も重要なことに、本発明は、高い純度で、主要なタイプ（ＲＰＥ、ＲＧＣ、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞及び光受容体）の何れかの大量の網膜細胞を、容易にかつ迅速に得る信頼性の高い方法を提供する。
【００６２】
これらの方法、及びそれらから得られる実質的に純粋な細胞培養物は、下記の領域で有用であると想定される：
移植／細胞療法：非限定的な例として、すでに失われた視力を回復するのを助長する失われた細胞の置換療法における、ＲＰＥ細胞及び／又は網膜前駆体細胞又はそれらから分化した細胞の使用が挙げられる。
ＲＧＣ、桿体、錐体及びＲＰＥ細胞を含む全ての細胞の機能を保護又は増強することが可能な作用物質を同定するための薬物スクリーニング。「作用物質」とは、本明細書中では、任意の種類の分子又は組成物を意味するが、任意の電磁放射線又は粒子線（ＵＶ、可視光、電離放射線等）等の非化学的物質も意味する。
幹細胞又はそれらの誘導体を使用して、病態生理学を研究するのに、また薬物スクリーニング又は特注療法にも使用することができる多能性細胞、特にｈｉＰＳ細胞からヒト網膜疾患モデルを産生すること。
網膜発達、組織形成、及びシナプス形成を含むが限定されない様々なプロセスを研究するのに有用な資源であるヒト神経発達の特有のモデル。
【００６３】
本発明は、下記図面及び実施例によって更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ゼノフリーかつフィーダーフリーの条件での接着ｈｉＰＳＣからの網膜オルガノイドの生成の図である。（Ａ）ｈｉＰＳＣからの網膜オルガノイド産生に関するプロトコルを示す模式図。（Ｂ）Ｄ０、Ｄ１４及びＤ２８の分化中のＤＫＫ１及びノギンのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、Ｄ０のｈｉＰＳＣ−２に対して正規化される。（Ｃ）Ｄ２８の接着ｈｉＰＳＣに由来する自己形成性神経網膜様構造。スケールバー＝１００μｍ。（Ｄ）Ｄ２９で単離した代表的な浮遊網膜オルガノイドの形態。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）Ｄ２８の網膜オルガノイドにおける眼野転写因子ＮＲＬ、ＣＲＸ、ＮＥＵＲＯＤ１及び多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、Ｄ０のｈｉＰＳＣ−２に対して正規化される。（Ｆ〜Ｇ）Ｄ２８〜Ｄ５６の網膜オルガノイドにおける眼野及び網膜特異的な転写因子及び前脳マーカーＦＯＸＧ１のＲＴ−ｑＰＣＲ時間経過分析。データは、Ｄ２８の網膜オルガノイドに対して正規化される。（Ｈ〜Ｏ）ＰＡＸ６、ＲＡＸ、ＶＳＸ２、ＭＩＴＦ及びＫｉ６７に関するＤ３５の網膜オルガノイド分泌の免疫染色。パネルＮの写真は、網膜オルガノイドの横断面に相当する。スケールバー＝１００μｍ。
【図２】浮遊培養中の網膜オルガノイドにおける光受容体分化の図である。（Ａ〜Ｂ）Ｄ３５〜Ｄ１７５の分化中の光受容体マーカーのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、Ｄ３５（Ａ）又はＤ５６（Ｂ）の網膜オルガノイドに対して正規化される。（Ｃ〜Ｎ）指定の分化時間でのＣＲＸ（Ｃ、Ｅ、Ｎ）、ＯＴＸ２（Ｃ）、ＣＤ７３（Ｄ、Ｆ、Ｊ）、リカバリン（Ｄ〜Ｆ、Ｉ、Ｌ）、ロドプシン（Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ）、Ｒ／Ｇオプシン（Ｈ）、青オプシン（Ｋ）、アセチル化チューブリン（Ｉ）及び錐体アレスチン（Ｊ、Ｎ）に関する網膜オルガノイド切片の免疫染色。核は、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバー＝５０μｍ（Ｃ、Ｄ、Ｇ〜Ｉ）又は１００μｍ（Ｅ、Ｆ、Ｊ〜Ｎ）。
【図３】ｈｉＰＳＣ由来の光受容体の成熟及び電気生理学的分析の図である。（Ａ〜Ｄ）Ｄ１９５網膜オルガノイドのロドプシン（Ａ〜Ｄ）、リカバリン（Ａ、Ｃ）又は錐体アレスチン（Ｂ）に関する免疫標識及び３ＤＩＳＣＯ透明化。スケールバー＝２００μｍ（Ａ〜Ｃ）及び２５μｍ（Ｄ）。（Ｅ〜Ｌ）外境界膜（＊）、基底小体（ＢＢ）、結合繊毛（ＣＣ）、中心小体（ＣＴ）、ミトコンドリア（ＭＴ）、内節（ＩＳ）及び乳頭スタック（ＤＳ）の存在を伴うＤ１１２及びＤ１９６の網膜オルガノイドの透過型電子顕微鏡法分析。光受容体特異的な微小管配置により、明らかに同定可能な９×３＋０基底小体複合体ＢＢ及び９×２＋０結合繊毛（ＣＣ）の存在が明らかとなった。スケールバー＝１μｍ（Ｅ、Ｇ、Ｈ）；５００ｎｍ（Ｆ、Ｉ、Ｌ）；１００ｎｍ（Ｊ、Ｋ）。（Ｍ）Ｄ１７５の解離網膜細胞に関するカルシウムイメージング。８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの適用前（左）及び適用中（右）に得られる２光子Ｆｕｒａ２−ＡＭ蛍光画像の例（例１及び例２）。１及び２と表示した例１に関する白矢印は、それぞれ、応答性細胞及び非応答性細胞を表す。例２に関して、矢印は、別の応答性細胞を表す。蛍光画像は、疑似色で表され、刺激前又は刺激中の２０秒の活性の平均である。ｃＧＭＰベースのカルシウム流入は、Ｆｕｒａ２−ＡＭ蛍光の減少に反映され、かかる応答は、両方の例において、隣接する細胞に影響を及ぼすことなく、１つの細胞で観察される。スケールバー＝５μｍ。（Ｎ）ベースライン蛍光からの変化パーセント（Δｆ／ｆ％）として表される、例１に関して表示される細胞１及び細胞２に対するｃＧＭＰ類似体の適用の蛍光生トレース及び影響。（Ｏ）３つの別個の試料由来の１１個の応答性細胞の蛍光振幅の平均減少を表すボックスプロット。
【図４】浮遊網膜オルガノイドからの網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラーグリア細胞及び双極細胞の順次生成の図である。（Ａ）Ｋｉ６７及びＶＳＸ２に関するＤ２８の凍結切片化した網膜オルガノイドの免疫蛍光染色。（Ｂ〜Ｆ）ＲＧＣ（ＢＲＮ３Ａ、ＰＡＸ６）、水平細胞（ＬＩＭ１、ＰＡＸ６）、アマクリン細胞（ＡＰ２、ＰＡＸ６）及び光受容体（ＯＴＸ２）に関するマーカーを使用したＤ３５〜Ｄ８４の網膜オルガノイドの免疫組織化学的分析。スケールバー＝１００μｍ。（Ｇ〜Ｊ）増殖性細胞に関するマーカー（Ｋｉ６７）、及び後期網膜細胞型であるミュラーグリア細胞に関するマーカー（ＧＳ、ＳＯＸ９）、及び双極細胞に関するマーカー（ＶＳＸ２、ＰＫＣα）を用いたＤ１４０以降の網膜オルガノイドの免疫組織化学的分析。核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバー＝１００μｍ（Ｈ、Ｉ）及び５０μｍ（Ｇ、Ｊ）。（Ｋ〜Ｍ）種々の時間での網膜オルガノイドにおける選択した神経網膜細胞型のＲＴ−ｑＰＣＲ分析：ＲＧＣ（ＢＲＮ３Ａ、ＢＲＮ３Ｂ）、水平細胞（ＬＩＭ）、アマクリン細胞（ＧＡＤ２）、ミュラーグリア細胞（ＧＬＡＳＴ１、ＲＬＢＰ１）及び双極細胞（ＰＫＣα）。データは、Ｄ２８（Ｋ、Ｌ）又はＤ５６（Ｍ）の網膜オルガノイドに対して正規化される。
【図５】総網膜オルガノイドにおける、又は解離細胞としての光受容体前駆体の効率的な凍結保存の図である。（Ａ〜Ｄ）Ｄ１００の網膜オルガノイドに対するＣＲＸ（Ａ、Ｂ）、ＣＤ７３（Ｃ、Ｄ）及びリカバリン（Ａ〜Ｄ）に関する免疫染色。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ〜Ｈ）Ｄ８４で凍結保存して、解凍後に更に１６日間培養した網膜オルガノイドに対するＣＲＸ（Ｅ、Ｆ）、ＣＤ７３（Ｇ、Ｈ）及びリカバリン（Ｅ〜Ｈ）に関する免疫染色。スケールバー＝１００μｍ。（Ｉ〜Ｐ）網膜オルガノイドを、Ｄ８４（Ｉ〜Ｌ）又はＤ１００（Ｍ〜Ｐ）で解離させて、網膜細胞を、５日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）で培養した（Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｎ）か、又は解凍後に５ＤＩＶで培養した（Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｐ）後、ＣＤ７３（Ｉ〜Ｌ）、ＣＲＸ（Ｍ〜Ｐ）及びリカバリン（Ｉ〜Ｐ）に関して免疫染色した。スケールバー＝１００μｍ（Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｏ）及び２５μｍ（Ｊ、Ｌ、Ｎ、Ｐ）。（Ｑ）非凍結網膜オルガノイド（対照、Ｎ＝７、８１４５０個の細胞に相当するオルガノイド切片）又はＤ８４で凍結保存した網膜オルガノイド（Ｎ＝１１、１１９３３９個の細胞に相当するオルガノイド切片）におけるＣＲＸ陽性細胞のＤ１００の定量分析。（Ｒ）新鮮な細胞集団（対照、ｎ＝３１３０３個の細胞）又はＤ１００網膜オルガノイド由来の凍結保存した解離細胞集団（ｎ＝１３９５８個の細胞）における二重ＣＲＸ／リカバリン陽性細胞の５ＤＩＶ後の定量分析。
【図６】ゼノフリーかつフィーダーフリーの条件でのｈｉＲＰＥ細胞の生成及び特性化の図である。（Ａ）ｉＰＳＣの接着培養由来のＲＰＥ細胞の生成、増幅及び保管に関する種々の工程を示す模式図。（＊）色素パッチの採取時間。（Ｂ）Ｄ４２のｈｉＰＳＣ−２からのｈｉＲＰＥ細胞の色素パッチの位相差画像。スケールバー＝３ｃｍ。（Ｃ〜Ｅ）それぞれ、採取後の６週（Ｗ６）及び継代培養後のＷ２又はＷ１４での、継代数０のｈｉＲＰＥ細胞（ｈｉＲＰＥｐ０）及び継代数３のｈｉＲＰＥ細胞（ｈｉＲＰＥｐ３）の位相差画像。スケールバー＝１００μｍ。（Ｆ）解凍後の培養物における２週のｈｉＲＰＥｐ３細胞のＭＩＴＦ及びＺＯ−１免疫染色。スケールバー＝１００μｍ。（Ｇ、Ｈ）ｈｉＲＰＥｐ３細胞におけるＢＥＳＴ１及びＥＲＺＩＮの典型的な分極発現を示すＺ−スタック共焦点画像。スケールバー＝１０μｍ。（Ｉ、Ｊ）解凍後に２週（Ｗ２）、６週（６Ｗ）又は１４週（Ｗ１４）培養したｈｉＲＰＥｐ３細胞における成熟ＲＰＥ関連マーカーのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、２ＷのｈｉＲＰＥｐ３細胞に対して正規化される。（Ｋ）ＲＰＥ細胞食作用活性の評価：ＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ蛍光の比を、ＦＩＴＣで標識したＰＯＳとの３時間のインキュベーション後にｈｉＲＰＥｐ３細胞、ＡＲＰＥ−１９細胞系統及び線維芽細胞において評価して、機能阻止抗体抗αｖβ５インテグリンの非存在下（青色バー）又は存在（赤色バー）下でのＰＯＳの結合及び取込みを決定した。値は、３つの別々の実験からの平均値±ＳＤを表す（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００５、＊＊＊＊：ｐ＜０．００１）。（Ｌ〜Ｑ）抗αｖβ５インテグリン阻止抗体の非存在下又は存在下でのｈｉＲＰＥｐ３、ＡＲＰＥ−１９及び線維芽細胞（核を青色で対比染色した）によるＦＩＴＣで標識したＰＯＳ（緑色）の内部移行の定量表示。スケールバー＝２５μｍ。
【図７】種々のｈｉＰＳＣ系統を用いた網膜オルガノイド形成の再現性の図である。３つの異なる、遺伝子挿入のない（integration-free）ｈｉＰＳＣ：エピソームアプローチによって初期化された成体皮膚線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ−２（Ａ〜Ｄ）；エピソームアプローチによって初期化された新生児包皮線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ−３（Ｅ、Ｆ）及びセンダイウイルス法によって初期化された成体皮膚線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ−４（Ｇ、Ｈ）から生成されるＤ２８の自己形成性神経網膜様構造（Ａ、Ｅ、Ｇ）並びにＤ２８（Ｂ、Ｆ）、Ｄ３５（Ｃ、Ｈ）及びＤ４２（Ｄ）の誘導された網膜オルガノイドの形態。スケールバー＝１００μｍ。網膜オルガノイド形成の効率は、３つの異なるｈｉＰＳＣ系統に関するＤ２８の１ｃｍ２当たりの構造数を算出することによって決定された（Ｉ）。別個の分化実験の数を、各ｈｉＰＳＣ系統に関して記録する。
【実施例】
【００６５】
実施例１：フィーダーフリー、ゼノフリーの方法を使用した、遺伝子挿入のないヒト人工多能性幹細胞の、網膜ニューロン及び網膜色素上皮細胞への信頼性の高い効率的な分化
１．１  実験手順
ヒト線維芽細胞及びｉＰＳ細胞培養
マイトマイシン不活性化マウス胚線維芽細胞に関して予め培養した樹立ｈｉＰＳＣ−２クローン［１９］を、フィーダーフリーの条件に適応させた。ｈｉＰＳＣ−２クローン細胞由来のｉＰＳコロニーを、酵素非含有のＧｅｎｔｌｅ細胞解離試薬（STEMCELL Technologies）２ｍｌ中で、室温にて７分〜１０分インキュベートした。解離溶液を吸引した後、フィーダー細胞を剥離させずに、ｉＰＳコロニーの中心を上下にピペッティングすることによって、予め加温した既知組成Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地（Thermo Fischer Scientific）２ｍｌ中に、剥離した細胞凝集体を再懸濁した。ヒトｉＰＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地の入った切断型組換えヒトビトロネクチン（ｒｈＶＴＮ−Ｎ）でコーティングした皿上に移した。標準的な５％ＣＯ２／９５％エアーインキュベーター中で、毎日培地を交換しながら、細胞を３７℃にて日常的に培養した。ｉＰＳ細胞を、週に１回、酵素非含有のＧｅｎｔｌｅ細胞解離試薬を用いて（２ｍｌ、室温にて７分間）継代培養した。剥離した細胞凝集体をＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地中に収集して、慎重に上下にピペッティングして、コンフルエンスに応じて、１／１０〜１／６０の比で再度蒔く細胞凝集体の一様な懸濁液を得た。フィーダーフリーの適応させたｈｉＰＳＣを、継代数３〜５後に網膜分化させた。ｈｉＰＳＣ−２クローンを、継代数１６（ｐ１６）で適応させて、ｐ２０〜ｐ４０で特性化及び分化に使用した。
【００６６】
網膜分化及びｈｉＰＳＣ由来の網膜細胞培養
網膜細胞分化は、幾つかの変更を伴って、これまでに確立されたプロトコル［２８］に基づいた。ヒトｉＰＳＣを、ｒｈＶＴＮ−Ｎ（Thermo Fischer Scientific）でコーティングした直径６ｃｍの皿において、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地中で７０％〜８０％コンフルエンスに増殖させた。０日目（Ｄ０）として定義されるこの時点で、ｈｉＰＳＣを、既知組成Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地（Thermo Fischer Scientific）中で培養した。２日後、培地を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地、１％ＣＴＳ（商標）（Cell Therapy Systems）Ｎ２サプリメント（Thermo Fischer Scientific）、１０ユニット／ｍｌのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Thermo Fischer Scientific）で構成されるＥ６Ｎ２培地に切り替えた。培地を２日〜３日毎に交換した。Ｄ２８で、同定された自己形成網膜オルガノイドを、針を使用して、周囲細胞とともに単離して、１０ｎｇ／ｍｌの動物由来成分非含有の（animal-free）組換えヒトＦＧＦ２（Peprotech）を補充したＰｒｏＢ２７培地中で、浮遊構造として６ウェルプレート（ウェル１つ当たり８個〜１２個のオルガノイド）において培養して、培地の半分を２日〜３日毎に交換した。ＰｒｏＢ２７培地は、既知組成ＤＭＥＭ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１、Ｌ−グルタミン）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、２％ＣＴＳ（商標）Ｂ２７サプリメント（Thermo Fischer Scientific）、１０ユニット／ｍｌのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで構成される。Ｄ３５で、ＦＧＦ２を除去して、「ＰｒｏＢ２７培地」の半分を、次の数週間、２日〜３日毎に交換した。
【００６７】
ｈｉＰＳＣ由来のＲＰＥ（ｈｉＲＰＥ）細胞培養に関して、同定された色素パッチをおよそＤ４２で切り出して、ＣＴＳ（商標）ＣＥＬＬＳｔａｒｔ（商標）（Thermo Fischer Scientific）でコーティングしたプレート上へ移して、継代数０（Ｐ０）として記録した。ｈｉＲＰＥ細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＣＴＳ（商標）Ｎ２サプリメント、１０ユニット／ｍｌのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで構成されるＰｒｏＮ２培地中で増殖させて、培地を２日〜３日毎に交換した。コンフルエンスで、トリプシンを使用して、ｈｉＲＰＥ細胞を解離させて、バンキング前の増殖用に、Ｔ−２５ｃｍ２のＣＴＳ（商標）ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（商標）でコーティングした皿上へ、５×１０４個の細胞／ｃｍ２で再度蒔いた。
【００６８】
ｈｉＰＳＣ由来の網膜細胞の凍結保存
Ｄ８４の３個〜５個の網膜オルガノイドを、冷Ｃｒｙｏｓｔｅｍ冷凍培地（Clinisciences）２５０μｌ中に懸濁して、イソプロパノールベースのＭｒ  Ｆｒｏｓｔｙ冷凍容器（Thermo Fischer Scientific）に入れた１．５ｍｌ容の低温チューブ（Nunc）中で、−８０℃にて最低４時間冷凍した。冷凍したチューブを、−１５０℃の冷凍庫中で長期間保管した。冷凍容器を用いた場合と同じ方法を使用して、ｈｉＲＰＥ細胞を、継代数１で、Ｃｒｙｏｓｔｅｍ冷凍培地中で（１．５×１０６個の細胞／２５０μｌ）冷凍して、−１５０℃で長期保管した。冷凍した網膜構造又はｈｉＲＰＥｐ１細胞を、水浴中で、３７℃にて迅速に解凍して、下流の研究用に予め加温した専用培地中に再懸濁させた。
【００６９】
網膜オルガノイド免疫染色−透明化及びイメージング
網膜オルガノイドをまず、回転振盪機上で、０．２％ゼラチン、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．０１％チメロサール（Sigma-Aldrich）を含有するＰＢＳ  １Ｘの溶液（ＰＢＳＧＴ）中でＲＴにて３時間インキュベートした。次に試料を、選択した一次抗体（データは示していない）を含有するＰＢＳＧＴに移し、１００ｒｐｍで回転しながら、３７℃にて３日間置いた。この後、ＲＴにてＰＢＳＧＴ中で３０分間、６回洗浄した。次に、試料を、ＰＢＳＧＴ中に１：６００で希釈したＣｙ３又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Interchim）のいずれかとコンジュゲートさせた適切な二次抗体をともに一晩インキュベートした。ＰＢＳＧＴ中でＲＴにて６回の３０分洗浄後、溶媒で透明化した器官の３Ｄイメージング（３ＤＩＳＣＯ）透明化手順［２９］まで、試料をＰＢＳ中４℃で保管した。
【００７０】
試料をまず、Ｈ２Ｏ中に希釈したテトラヒドロフラン（Sigma-Aldrich）の段階系列（５０％、８０％及び１００％）において、各工程に関して１時間脱水させた。この後、ジクロロメタン（Sigma-Aldrich）中で少なくとも２０分間、脱脂して、最終的に、試料をジベンジルエーテル（Sigma-Aldrich）中で一晩透明化した。これまでに記載されるように［２９］、ＩｍｓｐｅｃｔｏｒＰｒｏソフトウェア（LaVision BioTec）を使用した限外顕微鏡（LaVision BioTec）又は高解像度イメージング用の数値１０倍の対物レンズを用いた正立共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）のいずれかを用いて、３Ｄイメージングを実施した。３Ｄボリュームの画像は、Ｉｍａｒｉｓ  ｘ６４ソフトウェア（バージョン７．６．１、Bitplane）を使用して作成した。
【００７１】
１．２  結果
コンフルエントなｈｉＰＳＣからのゼノフリー／フィーダーフリーの条件での自己形成性網膜オルガノイドの生成
エピソームアプローチ［１９］によって予め生成された遺伝子挿入のないｉＰＳ細胞系統２（ｈｉＰＳＣ−２）由来のヒトｉＰＳＣコロニーを、合成基質として切断型組換えヒトビトロネクチン（ｒｈＶＴＮ−Ｎ）及び既知組成Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地を使用したＸＦ／ＦＦ培養系に適応させた［２１］。これらの新たな条件下で、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ｈｉＰＳＣ−２における多能性遺伝子の発現が、ｈＥＳＣで観察される発現と依然として同等であることが明らかとなった（データは示していない）。ＸＦ／ＦＦ条件で増殖させたｈｉＰＳＣ−２は、多能性マーカーＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４又はＳＯＸ２及びＴＲＡ１−６０を発現し（データは示していない）、正常な核型を示した（データは示していない）。およそ７０％コンフルエンスで、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地中で培養したｈｉＰＳＣコロニーを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地（ＦＧＦ２及びＴＧＦβを含まないＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地）中に２日間入れて、自己再生機構を遮断して、自発的分化を促進した。Ｎ２サプリメント単独は、フィーダー層上で培養したｈｉＰＳＣを網膜の運命へと誘導するのに十分であり得ることが報告されている［１９］ため、１％のＣＴＳ（商標）Ｎ２サプリメントを含有する種々の既知組成培地を試験した（図１Ａ）。このＸＦ／ＦＦ環境において、フィーダー層上のｈｉＰＳＣ［１９］を用いて確証したＰｒｏＮ２培地の使用は、残念にも細胞死を引き起こした（データは示していない）。それにも関わらず、１％のＣＴＳ（商標）Ｎ２サプリメントを含有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地に相当する新たな網膜分化培地（Ｅ６Ｎ２培地）を開発し、２８日で接着ｈｉＰＳＣから神経上皮様構造の自己形成を可能にした（図１Ａ）。このＸＦ／ＦＦ条件において、分化中のｉＰＳＣは、１４日（Ｄ１４）以内に、神経分化に必須である重要なＢＭＰ及びＷＮＴアンタゴニストである、それぞれＤＫＫ１及びノギンを内因的に発現し始めた（図１Ｂ）。分化の開始の約４週後に、自己形成性神経上皮様構造が、培養皿に出現した（図１Ｃ）。Ｄ２８のこれらの単離構造のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（図１Ｄ）により、多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）の発現を損失するとともに、ＳＩＸ３、ＭＩＴＦ、ＶＳＸ２、ＰＡＸ６、ＲＡＸ及びＬＨＸ２等の特異的なマーカーの頑強な発現を伴う眼野指定が明らかとなった（図１Ｅ）。Ｄ２８の免疫染色は、これらの構造が、ＶＳＸ２及びＫｉ６７を同時発現する有糸分裂網膜前駆体細胞（ＲＰＣ）の集団を含むことを示した（図４Ａ）。ＣＲＸ、ＮＲＬ、及びＮＥＵＲＯＤ１等の光受容体系譜に関与する転写因子の発現もまた、早ければＤ２８で検出された（図１Ｅ）。網膜オルガノイドは、Ｄ２８で周囲細胞と一緒に単離した後、浮遊構造として（図１Ｄ）、ＣＴＳＴＭ  Ｂ２７サプリメントを含有する培地（ＰｒｏＢ２７培地）中でヒトＦＧＦ２とともに１週間培養して（図１Ａ）、神経網膜の分化を支持した［３０］。球状オルガノイドは、サイズが増大し、神経上皮の遠位部分は、およそＤ４２で着色するようになった（図７Ｂ〜図７Ｄ）。分化プロセスの再現性を確認するために、２つの他のｈｉＰＳＣ系統を、分化プロセス���再現性に付して、２つの他のｈｉＰＳＣ系統を、ＸＦ／ＦＦ分化プロセスに付した。本発明者らの結果により、類似した網膜オルガノイドが、エピソームアプローチによって初期化された包皮線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ（図７Ｅ〜図７Ｆ）又はセンダイウイルスを用いたＸＦ／ＦＦ条件で初期化された成体皮膚線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ（図７Ｇ〜図７Ｈ）から差がなく得ることができることが実証された。Ｄ２８でこれらの３つのｈｉＰＳＣ系統に関して１ｃｍ２当たりの発達した構造の数の評価により、効率の観点で幾つかの予測される細胞系統間の可変性が明らかとなった（図７Ｉ）。網膜指定及び分化に関与する転写因子は、Ｄ３５後にＲＡＸ、ＳＩＸ３及びＶＳＸ２発現の顕著な増加を伴って、ＰｒｏＢ２７培地における浮遊培養中に、網膜オルガノイドにおいて依然として発現されたのに対して、非網膜前脳マーカーＦＯＸＧ１の発現は減少した（図１Ｆ）。Ｄ３５で、網膜オルガノイドを形成する細胞は、ＲＡＸ及びＰＡＸ６を同時発現し（図１Ｈ及び図１Ｉ）、それらの眼野のアイデンティティを確認した［３１］。この時点では、ＶＳＸ２＋細胞は、発達中の神経上皮の外側部分に主に位置し（図１Ｊ〜図１Ｌ）、同様にＰＡＸ６も発現した（図１Ｊ及び図１Ｋ）。ＭＩＴＦ＋細胞は、ＲＰＥ細胞に相当するオルガノイドの遠位部分に主に見られた（図１Ｌ及び図１Ｍ）。Ｄ３５で、ＰＡＸ６＋／ＶＳＸ２−細胞集団は、第１の有糸分裂後の分化中の網膜ニューロンに相当する神経上皮の内側部分で濃縮され（図１Ｊ及び図１Ｋ）、Ｋｉ６７増殖マーカーを発現しなかった（図１Ｎ及び図１Ｏ）。同じ位置の幾つかの細胞は、ＲＧＣ、ＢＲＮ３Ａの特異的マーカーにとって免疫反応性であることがわかった（図４Ｂ）。それにも関わらず、Ｄ３５で、網膜オルガノイドの外側部分は、ＶＳＸ２及びＫｉ６７の同時発現によって同定される増殖性ＲＰＣを依然として含有していた（図１Ｏ）。興味深いことに、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析により、光受容体前駆体の出現は、ＶＳＸ２及びＲＡＸ発現の減少を伴って（図１Ｆ）、ＮＲＬ、ＣＲＸ及びＮＥＵＲＯＤ１発現のアップレギュレーションによってＤ４２後に検出することができることが示された（図１Ｇ）。
【００７２】
ｈｉＰＳＣ由来の網膜オルガノイドからのＲＰＣの分化
オルガノイドＲＮＡ抽出物に関するＲＴ−ｑＰＣＲ分析により、ＲＰＣは、浮遊培養全体にわたってＣＲＸ（図１Ｇ）、リカバリン（ＲＣＶＲＮ）及び錐体アレスチン（ＣＡＲ）発現（図２Ａ）の増加を伴って、光受容体系譜に関係し得ることが示された。ロドプシン（ＲＨＯ）、青又は赤／緑（Ｒ／Ｇ）オプシン（ＯＰＳ）等の成熟光受容体に特異的な遺伝子の発現は、１００日後のみに出現する（図２Ｂ）。ＣＲＸ、ＯＴＸ２、及びＲＣＶＲＮにとって免疫反応性である未熟光受容体をＤ４９で同定することができ（図２Ｃ及び図２Ｄ）、これらのマーカーのより強力な発現が、Ｄ８４で観察された（図２Ｅ）。桿体及び錐体は、Ｄ２８１（およそ９ヵ月）まで長期間維持された培養におけるＲＨＯ又はＲ／Ｇ  ＯＰＳ、青ＯＰＳ及びＣＡＲ免疫染色のいずれかによって明らかに同定することができる（図２Ｇ〜図２Ｎ）。興味深いことに、４０日〜５０日後に、外側核層に似ている外部細胞層が、幾つかのｉＰＳＣ由来の網膜オルガノイドにおいて観察することができる（図２Ｈ、図２Ｉ）にもかかわらず、分化中の光受容体は、多くの場合、ロゼットの内側に見られた（図２Ｃ〜図２Ｇ）。細胞表面マーカーＣＤ７３は、分化の種々の時点で分化中のＲＣＶＲＮ＋光受容体において特異的に発現される（図２Ｄ、図２Ｆ）。光受容体によるＣＤ７３の発現は、ＲＣＶＲＮ、ＣＡＲ、青ＯＰＳ及びＲ／Ｇ  ＯＰＳとの同時発現によって、Ｄ１４０後に確認された（図２Ｊ）。逆に、ＣＤ７３は、ロゼット周辺に位置するＰＡＸ６＋細胞（ＲＧＣ及び水平／アマクリン細胞に相当する）によっては発現されなかった。効率的な光受容体分化はまた、Ｄ７７〜Ｄ１７５に、ＲＣＶＲＮ、ＣＡＲ、ＣＲＸ、ＲＨＯ、青ＯＰＳ及びＲ／Ｇ  ＯＰＳを発現する細胞を示す２つの他のｈｉＰＳＣ系統に由来する網膜オルガノイドでも観察された。１７５日齢の網膜オルガノイドでは、結合繊毛マーカーであるアセチル化チューブリンにより、ＲＣＶＲＮ＋細胞に並置された非常に薄い構造の存在が明らかとなり（図２Ｉ）、繊毛及び光受容体外側セグメント（ＰＯＳ）の形成を示唆した。桿体及び錐体を含有するロゼットの空間分布を分析するために、本発明者らは、Ｄ１９５の網膜オルガノイドに対して、光受容体特異的なマーカー及び３ＤＩＳＣＯ透明化手順を用いた全載免疫染色を実施した。この技術は、免疫組織化学と組み合わせると、区分する必要なく、透明な試料全体をイメージングすることを可能にする［２９］。ＲＣＶＲＮ／ＲＨＯ及びＣＡＲ／ＲＨＯの発現を特徴とする光受容体の空間配置が、３Ｄ再構築画像で観察された（図３Ａ、図３Ｂ）。ＲＨＯ＋桿体又はＣＡＲ＋錐体を含有するロゼットの正確な３Ｄパターンは、網膜オルガノイドの外側部分で可視化された（図３Ｃ）。透明化したＤ１９５のオルガノイドのＲＨＯ染色の高解像度共焦点イメージングにより、ロゼットの中心において出現するＰＯＳを暗示する強烈な紡錘染色が明らかとなった（図３Ｄ）。同様の染色が、種々の網膜オルガノイドにおいて錐体を同定するＣＡＲ抗体を用いた場合に観察された。１９５日齢のオルガノイドに関して実施したＴＵＮＥＬアッセイにより、ロゼットにおけるＲＣＶＲＮ、ＲＨＯ又は青ＯＰＳ染色によって同定される光受容体が、アポトーシスを受けないようであることが実証された。透過型電子顕微鏡法分析により、Ｄ１１２で光受容体特異的な微小管配置を伴う基底小体及び結合繊毛等の光受容体超微細構造の存在が確認された（図３Ｅ〜図３Ｋ）。幾つかの光受容体はまた、発達中のＰＯＳに相当する膜状材料を提示して、Ｄ１９６で明らかに同定された（図３Ｌ）。ｈｉＰＳＣ由来の光受容体が、機能成熟を達成することが可能であるかどうかを試験するために、本発明者らは、内向きの暗電流（ＩＤＣ）を示すそれらの能力を試験した。環状ヌクレオチド感受性（ＣＮＧ）チャネルの活性化によるＮａ＋及びＣａ２＋の流入に相当するＩＤＣは、光受容体のｃＧＭＰ濃度の増加の結果である。この「暗状態」を模倣するために、本発明者らは、これまでに記載されるように［１８］、膜浸透性ｃＧＭＰ類似体（８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ）を使用して、陽イオン性ＣＮＧチャネルを開放させて、ＩＤＣを導いた。Ｃａ２＋流入は、Ｄ１７５の網膜オルガノイド由来の解離細胞における細胞内蛍光Ｃａ２＋指示薬Ｆｕｒａ−２の生２光子イメージングを用いてモニタリングした。播種の４８時間後に、幾つかのＦｕｒａ−２を負荷した網膜細胞は、細胞内蛍光の減少によって観察されるように、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに曝露されるとカルシウム流入を示した（図３Ｍ〜図３Ｎ）。１１個の応答性光受容体の読取り中の最大蛍光変動の平均値は、−２２．５２％±１０．６３％である（分析した細胞１５１個、Ｎ＝４）（図３Ｏ）。細胞内蛍光の減少は、ｃＧＭＰ類似体に代わってＡＭＥＳパフに曝露した網膜細胞では観察されなかった（分析した細胞１５０個、Ｎ＝４）。これらの機能観察は、本明細書で報告するＸＦ／ＦＦ培養条件が、或る特定レベルの光受容体成熟を可能にするという本発明者らの形態学的データを支持する。網膜オルガノイド内のＲＰＣは、他の網膜細胞型を生じることが可能である。ＲＴｑＰＣＲ及びＢＲＮ３マーカーを使用した免疫染色によって、本発明者らは、分化の３５日後に、ＲＧＣの早期出現を確認した（図４Ｃ及び図４Ｋ）。興味深いことに、ＯＴＸ２＋光受容体を含有するロゼット周辺に局在化されたＢＲＮ３Ａ＋ＲＧＣは、ＰｒｏＢ２７培地を使用した場合に、８４日齢のオルガノイドにおいて依然として観察することができる（図４Ｆ）。類似した免疫蛍光分析により、２つの他のｈｉＰＳＣ系統に由来する網膜オルガノイドにおけるＲＧＣの分化が確認され、分化プロセスの再現性を確認した。分化中のアマクリン細胞及び水平細胞は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、それぞれＧＡＤ２及びＬＩＭ発現の誘導を伴って（図４Ｌ）、また免疫組織化学によって、それぞれＡＰ２＋／ＰＡＸ６＋及びＬＩＭ１＋／ＰＡＸ６＋細胞の存在を伴って（図４Ｄ及び図４Ｅ）検出された。ＲＴ−ｑＰＣＲにより、ＰＫＣα発現によって同定される双極細胞が後に出現することが実証され（図４Ｍ）、Ｄ２８１の免疫染色により、ＶＳＸ２及びＰＫＣαを同時発現する完全に分化した双極細胞の存在が確認された（図４Ｉ、図４Ｊ）。ミュラーグリア細胞の出現もまた、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、特異的なマーカーＧＬＡＳＴ１及びＲＬＢＰ１の誘導を伴って（図４Ｍ）、またグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）及びＳＯＸ９を同時発現する細胞の同定によって（図４Ｇ）示されるように、後になって観察された。Ｄ１４０で、非常に稀なＫｉ６７＋細胞（１セクション当たり５個未満の陽性細胞）により、網膜オルガノイドが、有糸分裂ＲＰＣの非存在によって確認される「成熟状態」に達したことが示される（図４Ｈ）。
【００７３】
網膜オルガノイド由来の光受容体前駆体の凍結保存
将来の細胞移植用の光受容体前駆体の潜在的使用［３２、３３］及び分化の長さを考慮して、本発明者らは、細胞を分化プロセスと平行して保管することが可能な種々の凍結保存アプローチを開発しようとした。第１の戦略は、ＣＤ７３が十分に発現される発達の段階で（Ｄ１００に近い、免疫蛍光によって示されるように）、総網膜オルガノイドを凍結保存することであった。Ｄ８４まで懸濁液中で培養した網膜オルガノイドを、冷Ｃｒｙｏｓｔｅｍ（商標）冷凍培地を使用して凍結保存して、光受容体の存在を、浮遊培養において、解凍の１６日後にＤ１００にオルガノイドにおいて検査した。冷凍した網膜オルガノイドは、同じ段階の冷凍していないオルガノイド（図５Ａ、図５Ｂ）に類似して、ＣＲＸ＋及びＲＣＶＲＮ＋光受容体前駆体を含有する無傷のロゼットの存在を示した（図５Ｅ、図５Ｆ）。興味深いことに、移植可能な細胞集団とみなされるＣＤ７３＋細胞［３４〜３６］は、依然として明らかに同定された。実際に、冷凍していないオルガノイド（図５Ｃ、図５Ｄ）と同様に、ＣＤ７３は、ＲＣＶＲＮ＋細胞において特異的に発現され（図５Ｇ、図５Ｈ）、光受容体におけるそれらの特異的な発現が確認される。Ｄ１００のＣＲＸ＋細胞の定量化（図５Ｑ）は、対照（冷凍していない）網膜オルガノイドと、冷凍した網膜オルガノイドにおいて、細胞の数間の如何なる有意な差も明らかにしなかった（ｐ＝０．１３４４；ｎ＝８１４５０及び計数した細胞１１９３３９個）。第２のアプローチでは、本発明者らは、オルガノイド由来の解離網膜細胞を凍結保存することができるかどうかを検査した。この場合、Ｄ８４又はＤ１００まで培養した網膜オルガノイドを、パパインを使用して解離させて、網膜細胞を冷Ｃｒｙｏｓｔｅｍ（商標）冷凍培地を使用して凍結保存した。解凍後、細胞をポリ−Ｄ−リジン／ラミニン処理したカバーガラス上に蒔いて、更に５日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）で培養した。免疫染色により、冷凍したＲＣＶＲＮ＋光受容体が、冷凍していない解離細胞と同様に、それらの強力なＣＤ７３発現を維持したことが明らかとなった（図５Ｉ〜図５Ｌ）。二重ＣＲＸ＋及びＲＣＶＲＮ＋細胞集団に関して、同様の観察を行った（図５Ｍ〜図５Ｐ）。したがって、定量化により、冷凍した細胞と対照細胞との間で、二重ＣＲＸ＋及びＲＣＶＲＮ＋細胞数の有意な差は観察されないことが示された（図５Ｒ）（ｐ＝０．５８３９、ｎ＝３１３０３及び計数した細胞２３９５８個）。
【００７４】
ｈｉＰＳＣ由来のＲＰＥ細胞の生成、増幅及びバンキング
ヒトｉＰＳ由来のＲＰＥ（ｈｉＲＰＥ）細胞を、Ｄ２８までＣＴＳＴＭ  Ｎ２サプリメントを２日後に連続添加しながら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地で培養したコンフルエントなｈｉＰＳＣから網膜オルガノイドへと同時に生成させた（図６Ａ）。自己形成性網膜オルガノイドを除去した後、細胞培養物をＰｒｏＮ２培地に切り替えた。およそＤ４２に、細胞の色素パッチを採取して、ｈｉＲＰＥ細胞をこれらのパッチから増幅させた（図６Ｂ、図６Ｃ）。２週後、継代数１のｈｉＲＰＥ細胞（ｈｉＲＰＥｐ１）を、細胞バンキング用に凍結保存して、継代数３の解凍したｈｉＲＰＥ細胞（ｈｉＲＰＥｐ３）を完全な特性化に使用した（図６Ｄ、図６Ｅ）。生成した上皮細胞は、重要なＲＰＥ特異的な転写因子ＭＩＴＦ及びタイトジャンクションマーカーＺＯ−１にとって免疫反応性であった（図６Ｆ）。ＭＩＴＦ＋細胞の数を計数することにより、陽性細胞９９．８３％±０．３１％（ｎ＝２０８２５９個の細胞）の細胞培養物の純度を確認した。ベストロフィン（ＢＥＳＴ１）及びエズリンに関する免疫染色は、それぞれ、細胞の側底膜及び頂端側でこれらのタンパク質の発現を伴う培養物中のｈｉＲＰＥ細胞の正確な分極を示した（図６Ｇ、図６Ｈ）。また、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析により、細胞が、凍結後に少なくとも更に継代数３で、ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ、ＭＥＲＴＫ及びＢＥＳＴ１等の成熟ＲＰＥ関連マーカーの発現を保持したことが実証される（図６Ｉ）。ｈｉＲＰＥｐ３細胞の長期培養物は、特にＲＰＥ６５に関して、ヒト初代培養物により近いＲＰＥ表現型を表し、成体ヒトＲＰＥ細胞において強力に発現される（図６Ｊ）。本発明者らは、バンキング後のｈｉＲＰＥ細胞が、典型的な自然ＲＰＥ機能を依然として示すかどうかを検討した。ＥＬＩＳＡを使用して、本発明者らは、各々の値１２．４ｎｇ／ｍｌ＋０．５ｎｇ／ｍｌ及び８０．５ｎｇ／ｍｌ＋８．８ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝３）で、ｈｉＲＰＥｐ３細胞による血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）分泌を示した。本発明者らはまた、ｈｉＲＰＥｐ３細胞が、ヒト不死化ＲＰＥ細胞系統ＡＲＰＥ−１９に類似して、ＦＩＴＣ標識ＰＯＳの特異的な食作用を実行することができることを実証した（図６Ｋ〜図６Ｑ）。線維芽細胞とは逆に、ｈｉＲＰＥ細胞及びＡＲＰＥ−１９細胞の両方によるＰＯＳ食作用は、これまでに実証されるように［３７、３８］、インテグリンαｖβ５に対する抗体によって阻止されて、ＲＰＥ細胞によるこの受容体に関連するＰＯＳ食作用の特異性を実証した。
【００７５】
この研究において、本発明者らは、将来の臨床グレードの産生に適した規定のＸＦ／ＦＦ培養系を使用して、接着ｈｉＰＳＣから網膜オルガノイド及びＲＰＥ細胞を生成する新たなプロトコルを提唱する。異種条件でこれまでに記載されるように［１９、２８］、ＥＢ形成及びＭａｔｒｉｇｅｌ等の基板の使用を回避するプロトコルを簡素に維持するために、ＸＦ／ＦＦ培養条件での網膜分化は、臨界点の評価を必要とした。本発明者らは、接着ｈｉＰＳＣの分化を開始する正しい時点を決定し、新たな既知組成分化培地を開発して、出現する網膜オルガノイドを収集する最適なタイミングを確立させた。ＸＦ限定培地においてｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの多能性を支持するヒトビトロネクチンによるフィーダーの置換［２１］は、増殖させたｉＰＳＣコロニーを、動物由来成分非含有のＣＴＳ（商標）サプリメント（ThermoFischer Scientific）を有する連続既知組成神経促進培地中に入れると、自己形成性神経網膜構造及びＲＰＥ細胞の生成を可能にする。神経及び網膜指定の２つの誘導物質であるＤＫＫ１及びノギンのｈｉＰＳＣによる内因性産生は、これまでに報告されるように［１９］、これらの構造の自己形成を説明することができた。ＣＴＳ（商標）Ｎ２サプリメントにおける組換えヒトインスリンの存在は、一般的に網膜系譜を促進するように添加されるＩＧＦ−１の役割［９、１２］に類似した役割を果たすことができた。ＰｒｏＢ２７培地中で浮遊網膜オルガノイドとして培養される単離構造は、本発明者らが、異種条件でこれまでに報告したもの［１９］に類似して、一連の重複した順序で、網膜細胞型全てにおいて複能性ＲＰＣの分化を可能にした。ＲＧＣは、早ければＤ３５で検出され、続いて水平細胞及びアマクリン細胞が検出された一方で、オプシン又はロドプシンを発現する成熟光受容体、及び双極細胞又はミュラーグリア細胞は、Ｄ１００後に明らかに同定された。興味深いことに、本発明者らの培養条件により、Ｄ２８１（９ヵ月を超える）まで、網膜オルガノイドにおける成熟Ｓ及びＬ／Ｍの桿体及び錐体の両方の維持が可能となった。特異的なＰＲ超微細構造の存在により、本発明者らのＸＦ／ＦＦ条件が、発達中のヒト網膜で観察される構造［３９］に類似した構造を有する光受容体の成熟を可能にすることが確認される。上級レベルの成熟の更なる証拠は、自然光受容体に類似した様式で、ｃＧＭＰ刺激に対する或る比率のｈｉＰＳＣ由来光受容体の感受性である。さらに、本発明者らは、網膜オルガノイドに対する組織透明化手順３ＤＩＳＣＯ［２９］の適応が、元の形状及び構造を保存しながら、透明なオルガノイドにおける蛍光標識した網膜細胞の分析を可能にすることを実証した。このアプローチは、網膜細胞型の開発、空間配置及びオルガノイド内での連結の全体的な見解を提供する。この技法は、高解像度顕微鏡法と組み合わせると、患者特異的なｉＰＳＣから生成される無傷の網膜オルガノイドにおける正常な特色及び病理学的特色の迅速で効率的な分析に使用することができる。
【００７６】
精製した光受容体前駆体に基づく将来の細胞療法戦略のために、本発明の方法は、１００日未満で、マウスにおける移植適合性細胞集団として記載される［３４〜３６］ＣＤ７３陽性光受容体前駆体の生成を可能にする。本発明者らは、ＣＤ７３が、光受容体前駆体のマーカーであり、稀な青オプシン錐体がＣＤ７３を発現しないマウス［４０］と対比して、分化した光受容体、特にＲ／Ｇ又は青オプシンを発現する錐体で発現され続けることを実証してきた。ＯＮＬ変性宿主網膜の移植も考慮すべきであるため、ＸＦ／ＦＦ条件でのｈｉＰＳＣに由来する網膜オルガノイドの無傷の神経網膜組織は、ｈＥＳＣ由来の網膜組織に関して最近提唱されているように［４１］、臨床的に有用であり得る。網膜シート移植のこの状況で、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣ由来の分化組織の個体発生段階は、首尾よい移植に関して明確に規定されるべきである。それにも関わらず、これらの細胞の治療的移植は、細胞量及び新鮮な細胞療法製品（ＣＴＰ）を用いて達成される可能性が低いという一貫性の観点で、一定の産生を必要とする。したがって、ＣＴＰの適正な凍結保存の開発は、所定の細胞集団の継続的な送達を保証する重大な局面である。総網膜オルガノイドの凍結保存により、冷凍−解凍構造で、ＣＤ７３＋光受容体前駆体集団が保存されることが実証された。これにより、特定の段階で網膜オルガノイドの大規模なストックを準備して、必要に応じて純粋な移植に適格なＣＤ７３＋細胞を送達することが可能となるはずである。さらに、本発明者らの冷凍方法により、ＣＤ７３の膜発現を損失せずに、光受容体前駆体を含む解離網膜細胞の凍結保存が可能となる。この観察は、解凍した解離網膜細胞、及び潜在的に、細胞移植用のＣＤ７３＋細胞の解凍した同種集団を代替的に使用することができることを強調している。しかしながら、どの種類の凍結保存プロセス及び精製方法が、より少ない細胞ストレスを誘導し、網膜下移植に最も有効であるかどうかを決定することは重要である。
【００７７】
光受容体前駆体の他に、本発明者らのＸＦ／ＦＦ条件でのｈｉＰＳＣ由来のＲＧＣの産生は、緑内障等のＲＧＣに影響を及ぼす網膜ジストロフィーの治療にとって重要な意味合いを有し得る。オルガノイドにおけるＲＧＣの素早い出現及びＮ２含有培地［１９］と比較して、より長くそれらを生存したまま維持するＣＴＳ（商標）Ｂ２７含有培地の使用により、ｈｉＰＳＣ由来のＲＧＣを使用した細胞ベースの療法アプローチの開発が促進されるはずである。本発明者らの凍結保存技法は、比較的初期段階で（５０日目よりも前に）網膜オルガノイドを冷凍させて、必要に応じて送達することができるＲＧＣ前駆体の冷凍ストックを作製するのに有用である。
【００７８】
本発明者らのプロトコルは、神経網膜に付随して、適正なＲＰＥ表現型並びにＰＯＳ食作用及び栄養因子分泌等のＲＰＥ特異的な機能を保持しながら、容易に増幅させて、継代培養して、冷凍することができるｈｉＰＳＣからのＲＰＥ細胞の生成を可能にする。遺伝子発現アッセイにより、ｈｉＲＰＥ細胞成熟は、培養時間の長さを延長することによって達成することができることが示された。６ｃｍ２の皿１つが、継代数３後に最大５億個のｈｉＲＰＥ細胞を産生することができるため、ｈｉＲＰＥ細胞の大規模産生は、本発明者らのＸＦ／ＦＦ条件を用いて達することができる。これまでの報告に基づいて、懸濁液中のｈＥＳＣ由来のＲＰＥ細胞［２５］又はｈｉＰＳＣ由来のＲＰＥ細胞のシート［４２］のいずれかを使用して、本発明者らは、本明細書で報告するＸＦ／ＦＦ分化プロトコルが、数千回の注入を実施するのに十分量の細胞を送達することができたと考える。これらの細胞の大規模産生は、全体的なハプロタイプｈｉＰＳＣバンキングの将来の開発とともに必要とされる可能性があり、ここで、共通のＨＬＡハプロタイプを有する限定数の細胞系統が、患者集団のかなりの部分に適合するように得られる［４３、４４］。
【００７９】
データは、接着ｈｉＰＳＣの簡素で効率的な網膜分化が、最小でＧＭＰ適合性の原材料を使って、臨床条件に近いＸＦ／ＦＦ環境で、本発明の方法を遂行することができることを示している。上記実施例によって示される本発明の方法は、ｈｉＰＳＣ由来の網膜細胞及び組織の大規模産生並びにバンキングを可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＭＰ準拠の網膜細胞製造プロトコルの開発に適している。このデータで使用するヒトｉＰＳＣは、非統合的なアプローチによって産生されており、したがって、統合的な送達系から産生されるｈｉＰＳＣの将来の臨床的応用にとっての主要な制限の１つに対処している。
【００８０】
参照文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【国際調査報告】
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