(57)【要約】  ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析の方法及び使用である。方法は、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップと、前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてオリゴヌクレオチド配列成分を分析するステップと、を含み、ハイスループットシークエンシングライブラリーの前記構築に使用される伸長用プライマーの配列は、順次に配列２の第１−２２位に示されるＤＮＡ分子と、Ｎ個の塩基Ａ、塩基Ｔ、塩基Ｃ又は塩基Ｇとからなり、前記Ｎは６以上の整数である。実験により証明されるように、ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法は、オリゴヌクレオチド配列における各成分の純度及び含有量を迅速、正確かつ網羅的に分析できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築方法であって、
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の３’末端にｐｏｌｙテールを付加して、ｐｏｌｙテールが付加された生成物を得るステップ１）と、
前記ｐｏｌｙテールが付加された生成物に対して逆方向伸長・増幅を行い、逆方向伸長・増幅生成物を得るステップ２）であって、
前記逆方向伸長・増幅に使用されるプライマーは、前記検査対象のオリゴヌクレオチドと伸長用プライマーとからなり、
前記伸長用プライマー配列は、順次に配列２の第１−２２位に示されるＤＮＡ分子と、Ｎ個の塩基Ａ、塩基Ｔ、塩基Ｃ又は塩基Ｇとからなり、前記Ｎは６以上の整数である、ステップ２）と、
前記逆方向伸長・増幅生成物を沈降させ、沈殿生成物を得るステップ３）と、
前記沈殿生成物に対して末端修復、Ａテール付加、リンガー接続及びＰＣＲ増幅を順次に行い、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得るステップ４）とを含む、
方法。
【請求項２】
前記伸長用プライマー配列が配列１、配列２、配列３又は配列４に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記伸長用プライマー配列が配列１に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの長さが８−１２０ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ１）請求項１に記載の伸長用プライマー
ａ２）ａ１）の前記伸長用プライマーを含むＰＣＲ試薬
ａ３）ａ１）の前記伸長用プライマー又はａ２）の前記ＰＣＲ試薬を含むキット、のうちのいずれか１つである、
製品。
【請求項８】
前記ＰＣＲ試薬における前記伸長用プライマーの最終濃度が０．１−１００μＭであることを特徴とする、請求項７に記載の製品。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築における、請求項７又は８に記載の製品の使用。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド配列不純物の分析における、請求項７又は８に記載の製品の使用。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法であって、
請求項１−６のいずれか１項に記載の方法により、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップ（１）と、
前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてオリゴヌクレオチド配列成分を分析するステップ（２）とを含む、
方法。
【請求項１２】
人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列成分の分析における、請求項１１に記載の方法の使用。
【請求項１３】
人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列中の各成分の純度及び／又は含有量の分析における、請求項１１に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に属し、具体的には、ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、中国の国内外のますます多くの製薬会社が遺伝子医薬品に取り組んできて、さまざまな疾患を治療するための新規遺伝子医薬品の研究・開発に多くの投資を行っている。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド技術は、ＲＮＡに相補可能な、人工的に合成又は生物合成されたＤＮＡ又はＲＮＡを使用して、疾患の発生に関連する遺伝子の発現をブロック及び阻害する治療法であり、遺伝子変異によって引き起こされる腫瘍や遺伝病の治療に使用できる。
【０００３】
アンチセンス技術は新しい医薬品開発方法であり、この技術を使用して研究・開発された医薬品はアンチセンス医薬品と呼ばれ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）に係る。核酸ハイブリダイゼーションの原理によれば、アンチセンス医薬品は、特定の遺伝子とハイブリダイズし、遺伝子レベルで病原性タンパク質の産生を妨害し、つまり、核酸からタンパク質への遺伝情報の伝達を妨害する。従来の医薬品は、主に病原性タンパク質自体に直接作用するのに対して、アンチセンス医薬品は、タンパク質を産生する遺伝子に作用する。従来の医薬品と比較して、アンチセンス医薬品は、より高い選択性と効率を有し、感染症、炎症、心血管疾患や腫瘍などの多くの疾患の治療に広く使用できる。
【０００４】
遺伝子治療とは、標的細胞に外来の正常な遺伝子を導入することで、遺伝子の欠陥や異常によって引き起こされる疾患を修正又は補償し、治療の目的を達成することである。大まかに言って、遺伝子治療には、ＤＮＡレベルで使用されるある疾患を治療するための手段及び新しい技術を含めることもできる。
【０００５】
アンチセンスＤＮＡは、主にアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＡＳ−ＯＤＮ）を指し、ＡＳ−ＯＤＮは、標的遺伝子ｍＲＮＡの１つ又は複数の部位（相補領域）に相補的な、人工的に合成される短配列一本鎖ＤＮＡフラグメントであり、標的遺伝子の発現を抑制又は減少させることができる。ＡＳ−ＯＤＮは、二本鎖ＤＮＡに結合して転写を調節すること、ｍＲＮＡ前駆体又はスプライスジャンクションに結合してｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを抑制し、スプライスされたｍＲＮＡの核から細胞質への輸送に影響すること、細胞質のｍＲＮＡに結合して翻訳をブロックすること、特異的タンパク質に結合して遺伝子発現を調節することなど、さまざまな標的に作用することができる。
【０００６】
アンチセンスＤＮＡは人工的に合成された配列であるため、合成プロセス中に塩基の挿入と欠損が起り、その結果、合成ＤＮＡに大量の不純物が生じ、合成された配列を精製した後に製薬に用いるため、精製された各配列成分を分析及び確認する必要がある。しかし、現在、一本鎖オリゴヌクレオチド配列の分析に好適な解決手段はない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明が解決しようとする技術的課題は、人工的に合成されるオリゴヌクレオチド配列における各成分配列の組成並びにその純度及び／又は含有量を迅速、正確且つ網羅的に分析することである。
【０００８】
上記技術的課題を解決するために、まず、本発明は、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築方法を提供する。
【０００９】
本発明に係るオリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築方法は、
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の３’末端にｐｏｌｙテールを付加して、ｐｏｌｙテールが付加された生成物を得るステップ１）と、
前記ｐｏｌｙテールが付加された生成物に対して逆方向伸長・増幅を行い、逆方向伸長・増幅生成物を得るステップ２）であって、
前記逆方向伸長・増幅に使用されるプライマーは、前記検査対象のオリゴヌクレオチドと伸長用プライマーからなり、
前記伸長用プライマー配列は、順次に配列２の第１−２２位に示されるＤＮＡ分子と、Ｎ個の塩基Ａ、塩基Ｔ、塩基Ｃ又は塩基Ｇとからなり、前記Ｎは６以上の整数であるステップ２）と、
前記逆方向伸長・増幅生成物を沈降させ、沈殿生成物を得るステップ３）と、
前記沈殿生成物に対して、末端修復、Ａテール付加、リンガー接続及びＰＣＲ増幅を順次に行い、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得るステップ４）と、を含む。
【００１０】
上記方法では、前記オリゴヌクレオチドの長さが８−１２０ｂｐであってもよい。前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡであってもよい。本発明の具体的な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡであり、そのヌクレオチド配列は配列５であり、大きさが２１ｂｐである。
【００１１】
上記方法では、ステップ１）において、前記ｐｏｌｙテールは、ｐｏｌｙ  Ａテール、ｐｏｌｙ  Ｇテール、ｐｏｌｙ  Ｃテール又はｐｏｌｙ  Ｔテールであってもよく、本発明の具体的な実施形態では、前記ｐｏｌｙテールはｐｏｌｙ  Ａテールであり、
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の３’末端にｐｏｌｙテールを付加する前記方法は、具体的には、以下のとおりである。ターミナルトランスフェラーゼ  １．５μＬ、検査対象のオリゴヌクレオチド  １μＬ、ｄＡＴＰ（又はｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＧＴＰ）（２５μＭ）  ０．５μＬ、５×ＴｄＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ及びヌクレアーゼフリー水を均一に混合して、反応系（全体積２０μＬ）を得る。反応系における前記検査対象のオリゴヌクレオチドの最終濃度は５μＭである。
【００１２】
上記方法では、ステップ２）において、前記Ｎは６以上の任意の整数であってもよい。本発明の具体的な実施形態では、具体的には、前記Ｎは２０である。Ｎが２０である場合、前記伸長用プライマー配列は、配列１に示されるＤＮＡ分子、配列２に示されるＤＮＡ分子、配列３に示されるＤＮＡ分子、又は配列４に示されるＤＮＡ分子である。本発明の具体的な実施形態では、前記伸長用プライマー配列は、配列１に示されるＤＮＡ分子である。
【００１３】
前記逆方向伸長・増幅反応系（全体積５０μＬ）は、２×Ｐｈａｔａ  Ｍａｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）  ２μＬ、伸長用プライマー  ２μＬ、検査対象のオリゴヌクレオチド  １μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ  １μＬ及びヌクレアーゼフリー水からなる。逆方向系における前記伸長用プライマーの最終濃度は４μＭであり、逆方向系における前記検査対象のオリゴヌクレオチドの最終濃度は２μＭである。
【００１４】
上記方法では、ステップ３）において、前記沈降物には、酢酸ナトリウムによる沈降方法が使用され、逆方向伸長・増幅生成物に対して酢酸ナトリウムによる沈降を行う方法は、具体的には、以下のとおりである。
３ａ）逆方向伸長・増幅生成物に酢酸ナトリウム、無水エタノール及びグリコーゲンを加える。
３ｂ）遠心分離して、上澄み液を捨てて、沈降物を収集する。
３ｃ）前記沈降物にエタノールを加え、遠心分離して、上澄み液を捨てて、沈降物を収集する。
前記ステップ３ａ）では、逆方向伸長・増幅生成物に１／１０体積の酢酸ナトリウム、２．５倍体積の無水エタノール及びグリコーゲン１μＬを加え、前記酢酸ナトリウムのｐＨは５．２であり、前記グリコーゲンの濃度は２０ｍｇ／ｍＬであり、
前記ステップ３ｂ）では、前記遠心分離の条件として、１２０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、
前記ステップ３ｃ）では、前記遠心分離条件として、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、前記エタノールは、８０体積％のエタノールであり、
前記ステップ３ａ）と前記ステップ３ｂ）との間には、−８０℃で３０分間放置するステップをさらに含み、前記ステップ３ｃ）は１回繰り返される。
上記方法では、ステップ４）において、前記沈殿生成物に対して末端修復、Ａテール付加、リンガー接続及びＰＣＲ増幅を順次に行う方法は、具体的には、以下のとおりである。
【００１５】
４ａ）前記沈殿生成物に対して末端修復とＡテール付加を行って、修復生成物を得る。
４ｂ）前記修復生成物にリンガーを付加して、リンガーが付加された生成物を得る。
４ｃ）前記リンガーが付加された生成物に対してＰＣＲ増幅を行い、増幅生成物として、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するハイスループットシークエンシングライブラリーを得る。
【００１６】
前記ステップ４ａ）では、前記沈殿生成物に対して末端修復とＡテール付加を行う方法は、具体的には、以下のとおりである。沈殿生成物  １５μＬ、１０×末端修復緩衝液  ３μＬ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ  ２μＬ、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔ４  ＰＮＫ）  ２μＬ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ０．５μＬ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ０．５μＬ及びヌクレアーゼフリー水７μＬを均一に混合して反応させる。
【００１７】
前記ステップ４ｂ）では、前記修復生成物にリンガーを付加する方法は、具体的には、以下のとおりである。修復生成物  ３０μＬ、１０×Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １５μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ２μＬ、Ｙ型リンガー  ２μＬ及びヌクレアーゼフリー水  １μＬを均一に混合して反応させる。
【００１８】
前記ステップ４ｃ）では、前記リンガーが付加された生成物に対してＰＣＲ増幅を行う方法は、具体的には、以下のとおりである。リンガーが付加された生成物  ５μＬ、プライマーそれぞれ  ２μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１０ｍＭ）  １μＬ、２×Ｐｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μＬ、Ｐｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｉｄｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬ及びヌクレアーゼフリー水  １４μＬを均一に混合して反応させる。反応系における前記プライマーの最終濃度は１μＭである。
【００１９】
前記ステップ４ｂ）と前記ステップ４ｃ）との間には、精製ステップをさらに含み、前記精製は磁気ビーズを用いて行われてもよい。
【００２０】
前記ステップ４ｃ）の後には、精製ステップをさらに備え、前記精製は、シリカゲルカラムを用いて行われてもよい。
【００２１】
上記技術的課題を解決するために、本発明はさらに製品を提供する。
【００２２】
本発明に係る製品は、ａ１）−ａ３）のうちのいずれか１つである。
ａ１）上記伸長用プライマー
ａ２）ａ１）の前記伸長用プライマーを含むＰＣＲ試薬
ａ３）ａ１）の前記伸長用プライマー又はａ２）の前記ＰＣＲ試薬を含むキット。
【００２３】
上記製品では、前記ＰＣＲ試薬における前記伸長用プライマーの最終濃度は０．１−１００μＭである。本発明の具体的な実施形態では、前記ＰＣＲ試薬における前記伸長用プライマーの最終濃度は１００μＭである。
【００２４】
オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するハイスループットシークエンシングライブラリーの構築における上記製品の使用も本発明の特許範囲に属する。
【００２５】
オリゴヌクレオチド配列不純物の分析における上記製品の使用も本発明の特許範囲に属する。
【００２６】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、オリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法をさらに提供する。
【００２７】
本発明に係るオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法は、
上記方法によってオリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップ（１）と、
前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてヌクレオチド配列成分を分析するステップ（２）と、を含む。
【００２８】
上記技術的課題を解決するために、最後に、本発明は、上記方法の新用途を提供する。
【００２９】
本発明は、人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列成分の分析における上記方法の使用を提供する。
【００３０】
本発明は、人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列中の各成分の純度及び／又は含有量の分析における、上記方法の使用をさらに提供する。
【００３１】
実験により証明されるように、本発明に係るハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法は、オリゴヌクレオチド配列における各成分の純度及び含有量を迅速、正確かつ網羅的に分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法のフローチャートである。
【図２】酢酸ナトリウムによる沈殿生成物の電気泳動検査結果である。
【図３】ＰＣＲ増幅生成物の電気泳動検査結果である。
【図４】精製後のＰＣＲ増幅生成物の電気泳動検査結果である。
【図５】ハイスループットシークエンシングデータの分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
特に断らない限り、下記実施例に使用される実験方法はすべて常法である。
【００３４】
特に断らない限り、下記実施例に使用される材料、試薬などは、すべて市販品として入手できる。
【００３５】
下記実施例におけるＴ４  ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＥＢ（北京）有限公司の製品であり、製品のカタログ番号がＭ０２０３Ｌである。ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ及びＬａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔは、すべてＮＥＢ公司の製品であり、製品のカタログ番号がＭ０２１０Ｓであり、以下、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＦｒａｇｍｅｎｔはＤＮＡ  ポリメラーゼＩと呼ばれる。Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅは、ＮＥＢ公司の製品であり、製品のカタログ番号がＭ０２０１である。Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ及びＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔは、ＮＥＢ公司の製品であり、製品のカタログ番号がＭ０２７５である。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅは、ＮＥＢ公司の製品であり、製品のカタログ番号がＭ０２０２Ｌである。ターミナルトランスフェラーゼは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（中国）の製品であり、製品のカタログ番号がＥＰ０１６２である。デオキシアデノシン三リン酸は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（中国）の製品であり、製品のカタログ番号が１０２１６０１８である。Ｐｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｉｄｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｖａｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄの製品であり、製品のカタログ番号がＰ５０５である。
【００３６】
下記実施例では、１０×末端修復緩衝液の処方
溶質及びその濃度：９００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μｇ／μＬ  ＢＳＡ及び４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
溶媒：ｐＨ８．３、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液５００ｍＭ。
【００３７】
実施例１
ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法
一、オリゴヌクレオチドへのｐｏｌｙテール付加
１、オリゴヌクレオチド配列の３’末端にｐｏｌｙ  Ａテールを付加する際に、表１に記載の各試薬及び添加量でテール付加反応系を調製した。オリゴヌクレオチド配列は、５’−ＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣ−３’（配列５）である。オリゴヌクレオチド配列は上海捷瑞生物工程有限公司により合成される。
2020534868.tif 000002
２、３７℃で２５ｍｉｎ反応させた。
３、７０℃で１０ｍｉｎ反応させ、ターミナルトランスフェラーゼを不活性化させた。
【００３８】
二、逆方向伸長・増幅
１、上記ステップ一で得られた反応生成物に表２に示される各試薬を加えて、逆方向伸長・増幅系を調製した。
2020534868.tif 000003
伸長用プライマーｅｘｔｐＴ配列は、以下のとおりである。
５’−ＧＡＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＧＡＣＧＧＣＡＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列１）。
２、ステップ１で調製された逆方向伸長・増幅系をＰＣＲ装置に入れて、表３に示される反応プログラムを行った。
2020534868.tif 000004
【００３９】
三、酢酸ナトリウムによる沈降
１、ステップ二で得られた生成物に、１／１０体積の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２．５倍体積の無水エタノール及び濃度２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲン１μＬを加えた。
２、−８０℃で３０分間放置した。
３、１２０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄みを捨てて、沈降物を収集した。
４、沈降物に８０％エタノール１ｍＬを加え、次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上澄みを捨てて、沈降物を収集した。
５、ステップ４を１回繰り返した。
６、室温で乾燥し、ＴＥ  ３０μＬを加えて溶解した。
７、沈殿生成物の品質を検査した。ステップは、具体的には、以下のとおりである。１２％ＰＡＧＥゲルを調製して、２００Ｖ電気泳動を４０分間行い、カセットにおいて１０分間染色し、ゲルイメージングシステムにて結像して写真を撮る。電気泳動検査結果を図２に示した。
【００４０】
四、末端修復
１、表４における各試薬及び添加量で末端修復反応系を調製した。調製後、均一に混合して、瞬時遠心を行った。
2020534868.tif 000005
２、ステップ１における末端修復反応系に対してＰＣＲ装置において表５に示されるプログラムを行った。
2020534868.tif 000006
【００４１】
五、リンガー接続
１、表６における各試薬及び添加量でリンガー接続反応系を調製した。調製後、均一に混合して、瞬時遠心を行った。
2020534868.tif 000007
上記Ｙ型リンガーは、ＵＡＦとＡＩ５とからなり、その配列がそれぞれ以下のとおりである。
ＵＡＦ（下線で表記された塩基にチオ修飾を行う）：５−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ；
ＡＩ５（下線で表記された塩基にリン酸修飾を行う）：５−ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ。
上記Ｙ型リンガー配列は、すべて上海捷瑞生物工程有限公司により合成されものであえる。リンガー接続反応系におけるリンガーの濃度はすべて１．６μＭである。
２、リンガー接続反応系をＰＣＲ装置に入れて１６℃で２時間反応させ、リンガー接続生成物を得た。
【００４２】
六、リンガー接続生成物の精製
１、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズ（ベックマン・コールター株式会社製のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｋｉｔ、製品のカタログ番号Ａ６３８８０）を振とうさせて、十分に均一に混合した。
２、上記ステップ五で得られた連結生成物に１×のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズを加え、ピペットを用いて１０回均一に混合し、室温で１分間放置した。
３、マグネットスタンドに入れて５分間吸着させ、上澄みを捨てた。
４、磁気ビーズに調製されたばかりの８０％エタノール２００μＬを加えて、室温で３０ｓ放置し、上澄みを捨てた。
５、上記ステップ４を１回繰り返した。
６、濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．０）を５０μＬ加えて溶出し、上澄みを新しい遠心分離管に移した。
７、１倍体積の磁気ビーズを加えて、ピペットを用いて１０回均一に混合し、室温で１分間放置した。
８、磁気ビーズに調製されたばかりの８０％エタノール２００μＬを加えて、室温で３０ｓ放置し、上澄みを捨てた。
９、上記ステップ８を１回繰り返した。
１０、蓋を開けて室温で１０分間放置した。
１１、濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．０）５０μＬを加え、ピペットを用いて均一に混合し、室温で１分間放置した。
１２、マグネットスタンドで５分間放置し、上澄みを別の遠心分離管に移し、精製後のリンガー接続生成物を得た。
【００４３】
七、リンガー接続生成物のＰＣＲ増幅
１、精製後のリンガー接続生成物に表７に記載の各試薬を加え、添加量を表７に示すようにし、ＰＣＲ増幅系を調製した。
2020534868.tif 000008
プライマーｍＰＦ配列は、以下のとおりである（上海捷瑞生物工程有限公司により合成される）：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ；
プライマーｍＲＰＩ５配列は、以下のとおりである（上海捷瑞生物工程有限公司により合成される）：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ。上記プライマー配列では、下線で表記される塩基にチオ修飾が行われた。
２、４５μＬ／本でＰＣＲ管に分注し、次に連結生成物５μＬを加えた。
３、ＰＣＲ増幅系をＰＣＲ装置に入れて、表８に示されるＰＣＲ反応プログラムに従って増幅を行い、ＰＣＲ増幅生成物を得た。ＰＣＲ増幅生成物についてゲル電気泳動検査を行い、結果を図３に示した。
2020534868.tif 000009
【００４４】
八、ＰＣＲ増幅生成物の精製
１、上記電気泳動に必要なバンドを切り取り、上海捷瑞生物工程有限公司製のアガロースゲルＤＮＡ回収キット（遠心カラム型、ＧＫ２０４２−５０）を用いてゲルを回収した。
２、ゲルにＢｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４００μＬを加えて、５０℃のウォーターバス に入れ、塊状ゲルを溶解した。
３、その間に２分間おきに１回振動させた。
４、溶解した塊状ゲルをシリカゲルカラムに移し替え、室温で２分間放置し、６０００回転／分で１分間遠心分離し、廃液を捨てた。
５、シリカゲルカラムに  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５００μＬを加えて、室温で３分間放置した。
６、１２０００回転／分で１分間遠心分離し、廃液を捨てた。
７、ステップ６を１回繰り返した。
８、１２０００回転／分で１分間遠心分離し、シリカゲルカラムを別の１．５ｍＬ遠心分離管に移し替えた。
９、シリカゲルカラムにヌクレアーゼフリー水３０μＬを加えて、室温で２分間放置した。
１０、１２０００回転／分で１分間遠心分離し、上澄み液を収集して、精製後のＰＣＲ増幅生成物を得た。精製後のＰＣＲ増幅生成物に対して電気泳動検査を行い、結果を図４に示し、Ｍ：２０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ；１：ライブラリーゲル回収生成物であり、図から明らかなように、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得ることに成功した。
【００４５】
九、ハイスループットシークエンシング及びデータ分析
１、ハイスループットシークエンシング
ステップ八で構築されたライブラリーに対して、Ｈｉｓｅｑ  ３０００プラットフォーム用の単一末端１５０ｂｐシークエンシングモードでシークエンシングを行った。
２、ハイスループットシークエンシング結果分析
ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ−０．３３ソフトウェア（ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ−０．３３ソフトウェアのウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｓａｄｅｌｌａｂ．ｏｒｇ／ｃｍｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ）を使用して、リード３’末端の低品質の塩基を除去し、自作されるｐｅｒスクリプトＥｘｔｒａｃｔＶａｌｉｄ．ｐｌによりリンガーを含有する順方向シークエンシングのリードを抽出し、ｃｕｔａｄａｐｔ１．２．１ソフトウェア（ｃｕｔａｄａｐｔ１．２．１ソフトウェアのウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｍａｒｃｅｌｍ／ｃｕｔａｄａｐｔ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｔａｇ／ｖ１．２．１）を用いてリードにおけるＰｏｌｙＡリンガーを除去し、自作されるｐｅｒスクリプトＦｉｌｔｅｒＴＮ．ｐｌによりＮ及びＰｏｌｙＴリンガーを含有するリードを除去し、自作されるｐｅｒｌスクリプトｔｒｉｍ＿ｐｏｌｙｔａｉｌ．ｐｌにより、末端ではｄＮＴＰの不純さにより加えられるエラー塩基を含むＰｏｌｙテールを除去し、自作されるｐｅｒｌスクリプトＦａｓｔＱ＿ＲｅａｄＦｉｌｔｅｒＢｙＬｅｎｇｔｈ．ｐｌにより長すぎる又は短すぎるリードを濾過により除去し、ＦＡＳＴＸ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ０．０．１３ソフトウェア（ＦＡＳＴＸ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ０．０．１３ソフトウェアのウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ／）におけるｆａｓｔｘ＿ｃｏｌｌａｐｓｅｒモジュールを用いて反復配列をマージし、１つだけあるリードを除去した。下記式によりオリゴヌクレオチドの各成分の純度を算出した。各成分割合（％）＝この成分のリード数／各成分のリード数の和×１００％。
結果を表９及び図５に示した。結果から分かるように、得られた９６６４５８９本のオリゴヌクレオチド配列のうち、オリゴヌクレオチド配列（ＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣ）と完全にマッチするオリゴヌクレオチド配列は合計７８３０３５２本であり、その割合が８１．０２％である。オリゴヌクレオチド配列に比べて、５’末端で配列の一部が欠損したオリゴヌクレオチド配列は、合計１３３１９９０本であり、その割合が１３．７８％であり、オリゴヌクレオチド配列に比べて、３’末端では配列の一部が欠損したオリゴヌクレオチド配列は、合計１４４４３９本であり、その割合が１．４９％であり、オリゴヌクレオチド配列に比べて、５’末端及び３’末端ともに配列の一部が欠損したオリゴヌクレオチド配列は、合計１８６９７本であり、その割合が０．１９％であり、いくつかの（たとえば、挿入、欠損、エラー塩基の混入など）のオリゴヌクレオチド配列では、合計３３９１１１本であり、その割合が３．５１％である。上記結果から明らかなように、本発明に係る方法は、オリゴヌクレオチド配列における各成分の含有量及びその割合を正確かつ網羅的に分析できた。
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注：オリゴヌクレオチド配列はＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣである。
３、データ分析
まず、ｎｃｂｉ−ｂｌａｓｔ−２．２．２８＋ソフトウェア（ｎｃｂｉ−ｂｌａｓｔ−２．２．２８＋ソフトウェアのウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／ｂｌａｓｔ＋／２．２．２８／）を使用して、オリゴヌクレオチド基準配列と比較し、自作されるスクリプトにより比較結果を解析し、解析的結果を標準化し、次に標準化した結果を分類し、最後に、分類した結果を統計した。
含有量が０．１％より大きい成分及び含有量の分析結果を表１０に示した。Ｎ−１のリード数とＮ＋１のリード数の分析結果を表１１及び表１２に示した。表には、含有量が０．１％よりも大きい各成分のオリゴヌクレオチド配列及びその含有量、Ｎ−１のリード数及びＮ＋１のリード数における各成分の含有量及び割合が示されている。
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注：オリゴヌクレオチド配列はＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣである。
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注：オリゴヌクレオチド配列はＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣである。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法を提供する。本発明に係る方法は、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップと、前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてオリゴヌクレオチド配列成分を分析するステップと、を含み、前記ハイスループットシークエンシングライブラリーの構築に使用される伸長用プライマー配列は、順次に配列２の第１−２２位に示されるＤＮＡ分子と、Ｎ個の塩基Ａ、塩基Ｔ、塩基Ｃ又は塩基Ｇとからなり、前記Ｎは６以上の整数である。実験により証明されるように、本発明に係るハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法は、オリゴヌクレオチド配列における各成分の純度及び含有量を迅速、正確かつ網羅的に分析できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築方法であって、
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の３’末端にｐｏｌｙテールを付加して、ｐｏｌｙテールが付加された生成物を得るステップ１）と、
前記ｐｏｌｙテールが付加された生成物に対して逆方向伸長・増幅を行い、逆方向伸長・増幅生成物を得るステップ２）であって、
前記逆方向伸長・増幅に使用されるプライマーは、前記検査対象のオリゴヌクレオチドと伸長用プライマーとからなり、
前記伸長用プライマー配列は、順次に配列２の第１−２２位に示されるＤＮＡ分子と、Ｎ個の塩基Ａ、塩基Ｔ、塩基Ｃ又は塩基Ｇとからなり、前記Ｎは６以上の整数である、ステップ２）と、
前記逆方向伸長・増幅生成物を沈降させ、沈殿生成物を得るステップ３）と、
前記沈殿生成物に対して末端修復、Ａテール付加、リンガー接続及びＰＣＲ増幅を順次に行い、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得るステップ４）とを含む、
方法。
【請求項２】
前記伸長用プライマー配列が配列１、配列２、配列３又は配列４に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記伸長用プライマー配列が配列１に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの長さが８−１２０ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ１）請求項１に記載の伸長用プライマー
ａ２）ａ１）の前記伸長用プライマーを含むＰＣＲ試薬
ａ３）ａ１）の前記伸長用プライマー又はａ２）の前記ＰＣＲ試薬を含むキット、のうちのいずれか１つである、
製品。
【請求項８】
前記ＰＣＲ試薬における前記伸長用プライマーの最終濃度が０．１−１００μＭであることを特徴とする、請求項７に記載の製品。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法であって、
請求項１−６のいずれか１項に記載の方法により、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップ（１）と、
前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてオリゴヌクレオチド配列成分を分析するステップ（２）とを含む、
方法。
【請求項１０】
人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列成分の分析における、請求項９に記載の方法の使用。
【請求項１１】
人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列中の各成分の純度及び／又は含有量の分析における、請求項９に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
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