(57)【要約】導入遺伝子の選択的な発現のための組成物および方法が、本明細書に提供される。導入遺伝子の選択的な発現のための組成物および方法は、１つまたは複数のヒト制御エレメントを含み、このエレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結されると、少なくとも１つまたは複数の非標的細胞と比較して、標的細胞における導入遺伝子の選択的な発現（たとえば、細胞型選択的な発現）を促進することができる。ＣＮＳ内の１つまたは複数の非パルブアルブミン（ＰＶ）細胞と比べて、ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントを含む、核酸カセット。
2020515292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＳ内の１つまたは複数の非パルブアルブミン（ＰＶ）細胞と比べて、ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントを含む、核酸カセット。
【請求項２】
それぞれの制御エレメントが、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の核酸カセット。
【請求項３】
前記制御エレメントのうちの少なくとも１つが、ヒト由来である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項４】
前記制御エレメントのうちの少なくとも１つが、非ヒト哺乳動物に由来する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項５】
前記制御エレメントが、天然に存在しない、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項６】
前記制御エレメントが、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合の前記導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶニューロンにおける同じ導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項７】
前記非選択的制御エレメントが、構成的プロモーターである、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項８】
前記非選択的制御エレメントが、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡのうちのいずれか１つである、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項９】
前記制御エレメントが、前記共局在アッセイよって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合のＰＶニューロンにおける前記導入遺伝子の選択的な発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける前記導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項１０】
前記制御エレメントが、前記導入遺伝子を非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合のＰＶニューロンにおける発現よりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項１１】
前記制御エレメントが、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、７．５倍、８倍、９倍、または１０倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項１２】
前記共局在アッセイが、免疫組織化学的アッセイである、請求項６に記載の核酸カセット。
【請求項１３】
前記免疫組織化学的アッセイが、抗ＰＶ抗体を含む、請求項１２に記載の核酸カセット。
【請求項１４】
前記導入遺伝子が、イオンチャネルサブユニット、神経伝達物質制御因子、ＤＮＡ結合ドメイン、遺伝子編集タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片をコードする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項１５】
前記イオンチャネルサブユニットが、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットもしくはベータサブユニット、またはカリウムイオンチャネルのサブユニットである、請求項１４に記載の核酸カセット。
【請求項１６】
前記導入遺伝子が、（ｉ）配列番号３７〜４３、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１５に記載の核酸カセット。
【請求項１７】
前記導入遺伝子が、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、もしくはＫＶ３．３、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１５に記載の核酸カセット。
【請求項１８】
前記導入遺伝子が、（ｉ）ＳＴＸＢＰ１、（ｉｉ）その機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、神経伝達物質制御因子である、請求項１４に記載の核酸カセット。
【請求項１９】
前記導入遺伝子が、内因性遺伝子の発現をモジュレートする、ＤＮＡ結合タンパク質を含む、請求項１４に記載の核酸カセット。
【請求項２０】
前記内因性遺伝子が、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１である、請求項１９に記載の核酸カセット。
【請求項２１】
前記導入遺伝子が、遺伝子編集タンパク質を含む、請求項１４に記載の核酸カセット。
【請求項２２】
前記遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓタンパク質である、請求項２１に記載の核酸カセット。
【請求項２３】
組み合わせた前記制御エレメントが、サイズが２．５ｋｂを下回る、１．５ｋｂを下回る、１ｋｂを下回る、または５００ｂｐを下回る、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項２４】
前記非ＰＶ細胞が、ＣＮＳ内の非ＰＶ細胞型のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項２５】
前記非ＰＶ細胞が、興奮性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、星状細胞、小膠細胞、および運動ニューロンのうちの１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の核酸カセット。
【請求項２６】
直鎖状構築物である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項２７】
ベクターである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項２８】
前記ベクターが、プラスミドである、請求項２７に記載の核酸カセット。
【請求項２９】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２８に記載の核酸カセット。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２９に記載の核酸カセット。
【請求項３１】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である、請求項３０に記載の核酸カセット。
【請求項３２】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２９に記載の核酸カセット。
【請求項３３】
前記制御エレメントが、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＳＹＮ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５／６、ＳＳＴ、ＰＶ、またはＶＩＰの転写開始部位の１０ｋｂ以内に由来する、６００ｂｐを下回る連続的な配列を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の核酸カセット。
【請求項３４】
神経学的障害または状態を処置することを必要とする被験体において神経学的障害または状態を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から３３のいずれか一項に記載の核酸カセットを送達するステップを含む、方法。
【請求項３５】
ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現を増加させる方法であって、細胞を、請求項１から３３のいずれか一項に記載の核酸カセットと接触させるステップを含む、方法。
【請求項３６】
任意の導入遺伝子の発現を、ＣＮＳ内のＰＶニューロンに標的化する方法であって、ＰＶニューロン選択的制御エレメントのうちの１つまたは複数を、導入遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む、方法。
【請求項３７】
前記制御エレメントのそれぞれが、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記制御エレメントが、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合の前記導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶニューロンにおける同じ導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記非選択的制御エレメントが、構成的プロモーターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記非選択的制御エレメントが、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡのうちのいずれか１つである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記制御エレメントが、共局在アッセイによって測定した場合に、前記導入遺伝子に作動可能に連結された場合の非選択的制御エレメントと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける前記導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記制御エレメントが、前記導入遺伝子を非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合のＰＶニューロンにおける発現よりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記制御エレメントが、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、７．５倍、８倍、９倍、または１０倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記導入遺伝子が、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、遺伝子編集タンパク質、またはそれらの機能性断片のうちのいずれか１つである、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記制御エレメントおよび前記導入遺伝子が、ＡＡＶ内にある、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
神経学的状態または障害を処置することを必要とする被験体において神経学的状態または障害を処置する方法であって、細胞を、ＣＮＳ内の１つまたは複数の非ＰＶ細胞と比べて、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、前記導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数の制御エレメントを含む核酸カセットと接触させるステップを含む、方法。
【請求項４８】
前記制御エレメントのそれぞれが、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記導入遺伝子が、電位依存性イオンチャネルサブユニットまたはそのバリアントもしくは機能性断片である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記サブユニットが、ナトリウムイオンチャネルのベータサブユニットである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記サブユニットが、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記サブユニットが、カリウムイオンチャネルのものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記導入遺伝子が、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、およびＫＶ３．３、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記導入遺伝子が、ＤＮＡ結合タンパク質である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子をモジュレートする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記内因性遺伝子が、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記導入遺伝子が、遺伝子編集タンパク質である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓタンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記神経学的状態または障害が、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１のうちのいずれかにおけるハプロ不全または変異と関連する、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記神経学的状態または障害が、てんかん、神経変性、タウオパチー、またはニューロン興奮性低下である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記神経学的状態または障害が、ドラベ症候群である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記神経学的状態または障害が、アルツハイマー病である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記制御エレメントが、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合の前記導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶニューロンにおける同じ導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記非選択的制御エレメントが、構成的プロモーターである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記非選択的制御エレメントが、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡのうちのいずれか１つである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記制御エレメントが、共局在アッセイによって測定した場合に、前記導入遺伝子に作動可能に連結した場合の非選択的制御エレメントと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項６４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記制御エレメントが、前記導入遺伝子を非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合のＰＶニューロンにおける発現よりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項６４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記制御エレメントが、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、７．５倍、８倍、９倍、または１０倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、請求項６４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸カセットが、ＡＡＶである、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ドラベ症候群を処置する方法であって、細胞を、導入遺伝子を含むＡＡＶと接触させるステップを含み、前記導入遺伝子が、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、またはＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）それらの機能性断片、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである、方法。
【請求項７２】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子をモジュレートする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記内因性遺伝子が、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、またはＳＣＮ２Ｂである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＡＡＶが、前記導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数のＰＶニューロン選択的制御エレメントをさらに含む、請求項７１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記制御エレメントのそれぞれが、独立して、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
アルツハイマー病を処置する方法であって、細胞を、導入遺伝子を含むＡＡＶと接触させるステップを含み、前記導入遺伝子が、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、またはＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）それらの機能性断片、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである、方法。
【請求項７７】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子をモジュレートする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記内因性遺伝子が、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＡＡＶが、前記導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数のＰＶニューロン選択的制御エレメントをさらに含む、請求項７６から７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記制御エレメントのそれぞれが、独立して、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１７年４月３日に出願された米国仮出願第６２／４８０，９９８号の利益を主張する。この出願はその全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年３月２９日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、４６４８２−７０４＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが７８，２４８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
遺伝子療法は、ヒト疾患をどのように対処および処置するかに関するその莫大な可能性が、長期にわたり認識されている。薬物または外科手術に依存するのではなく、患者、特に、根底にある遺伝学的要因を有するものは、根底にある原因を直接的に標的とすることによって、処置することができる。さらに、根底にある遺伝学的原因を標的とすることによって、遺伝子療法は、患者を効果的に治癒するか、またはより長期間にわたる持続的な処置を提供する可能性を有する。しかしながら、それにもかかわらず、遺伝子療法の臨床適用は、依然として、いくつかの側面で改善を必要とする。懸念となっている１つの領域は、標的外作用である。標的外作用に対処するための有望なアプローチは、遺伝子療法の遺伝子発現を、目的の細胞型もしくは組織、または標的細胞型もしくは組織に標的化することである。そのため、遺伝子療法または遺伝子発現を、目的の組織または細胞型に標的化するための、エレメントおよびそれを使用する方法を特定する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
開示の概要
遺伝子療法およびその遺伝子／導入遺伝子の発現を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて所望される組織および／または細胞型に標的化することに対して、相当な必要性が存在する。標的化することによって、標的外作用を減少させ、標的組織および／または細胞型における治療有効性を増加させ、有効性を達成するために必要とされる有効用量を低下させることにより患者の安全性および寛容性を増加させることができる。
【０００５】
１つまたは複数の非標的組織または細胞型と比べて、標的組織または細胞型における導入遺伝子の選択的な発現のための組成物および方法が、本明細書において提供される。導入遺伝子の選択的な発現のための組成物および方法は、１つまたは複数の制御エレメント（ＲＥ）を含み、このエレメントは、導入遺伝子（たとえば、イオンチャネルサブユニットもしくは神経伝達物質制御因子、またはシンタキシン結合タンパク質）に作動可能に連結されると、１つまたは複数の非標的細胞型（たとえば、非パルブアルブミン（ＰＶ）細胞）と比較して、標的組織または細胞型（たとえば、ＰＶニューロン）における選択的または優先的な導入遺伝子の発現を促進することができるか、またはもたらすことができる。一部の事例では、ＲＥは、天然に存在しない配列である。一部の事例では、ＲＥは、ヒト由来の制御エレメントである。一部の事例では、ＲＥは、非ヒト種、たとえば、サル、またはイヌ、またはウサギ、またはマウスに由来する配列を含む。一部の事例では、本明細書に記載される組成物は、ウイルスベクターおよび／またはウイルス粒子、たとえば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞に送達される。一部の事例では、本明細書に記載される組成物は、遺伝子療法剤として細胞に送達される。ＣＮＳにおける遺伝子欠陥と関連する神経学的状態または障害を処置するための方法および組成物もまた、本明細書において企図される。一部の事例では、遺伝子欠陥によって影響を受ける関連細胞型または組織は、ＰＶ細胞である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、および／またはけいれんである。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。
【０００６】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の非標的細胞型、またはＣＮＳ内の非ＰＶ細胞と比べて、任意の標的細胞型、たとえば、ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントを含む、核酸カセットを企図する。一部の事例では、それぞれの制御エレメントは、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して判定される。一部の事例では、制御エレメントのうちの少なくとも１つは、ヒト由来である。一部の事例では、制御エレメントのうちの少なくとも１つは、非ヒト哺乳動物に由来する。一部の事例では、制御エレメントは、天然に存在しない。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶニューロンにおける同じ導入遺伝子の選択的な発現をもたらす。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、構成的プロモーターである。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡのうちのいずれか１つである。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合のＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子を非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合のＰＶニューロンにおける発現よりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布（natural  distribution）に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をも���らす。一部の事例では、共局在アッセイは、免疫組織化学的アッセイである。一部の事例では、免疫組織化学的アッセイは、抗ＰＶ抗体を含む。一部の事例では、共局在アッセイは、以下の実施例５に示されるように、実行される。一部の事例では、導入遺伝子は、イオンチャネルサブユニット、神経伝達物質制御因子、ＤＮＡ結合ドメイン、遺伝子編集タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片をコードする。一部の事例では、イオンチャネルサブユニットは、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットもしくはベータサブユニット、またはカリウムイオンチャネルのサブユニットである。一部の事例では、導入遺伝子は、（ｉ）配列番号３７〜４３、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つを含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して判定される。一部の事例では、導入遺伝子は、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、もしくはＫＶ３．３、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、導入遺伝子は、（ｉ）ＳＴＸＢＰ１、（ｉｉ）その機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、神経伝達物質制御因子である。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子の発現をモジュレートする、ＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の事例では、内因性遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の事例では、導入遺伝子は、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の事例では、遺伝子編集タンパク質は、Ｃａｓタンパク質である。一部の事例では、組み合わされた制御エレメントは、サイズが２．５ｋｂを下回る、２ｋｂを下回る、１．５ｋｂを下回る、１ｋｂを下回る、または５００ｂｐを下回る。一部の事例では、非ＰＶ細胞は、ＣＮＳ内の非ＰＶ細胞型のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、非ＰＶ細胞は、興奮性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、星状細胞、小膠細胞、および運動ニューロンのうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、核酸カセットは、直鎖状構築物である。一部の事例では、核酸カセットは、ベクターである。一部の事例では、ベクターは、プラスミドである。一部の事例では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の事例では、ウイ���スベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である。一部の事例では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０００７】
一態様では、本明細書に開示される核酸カセットのうちのいずれかの制御エレメントは、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＳＹＮ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５／６、ＳＳＴ、ＰＶ、および／またはＶＩＰの転写開始部位の１０ｋｂ以内に由来する、６００ｂｐを下回る連続的な配列を含む。
【０００８】
一態様では、神経学的障害または状態を処置することを必要とする被験体において神経学的障害または状態を処置する方法は、治療有効量の、本明細書に開示される核酸カセットのうちのいずれかを送達するステップを含む。一部の事例では、神経学的障害または状態は、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）である。一部の事例では、神経学的障害または状態は、ドラベ症候群またはアルツハイマー病である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。
【０００９】
一態様では、ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現を増加させる方法は、細胞を、本明細書に開示される核酸カセットと接触させるステップを含む。
【００１０】
一部の態様では、本開示は、任意の導入遺伝子の発現を、ＣＮＳ内のＰＶニューロンに標的化する方法であって、ＰＶニューロン選択的制御エレメントのうちの１つまたは複数を、導入遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む、方法を企図する。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して判定される。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶニューロンにおける同じ導入遺伝子の選択的な発現をもたらす。一部の事例では、免疫組織化学的アッセイは、抗ＰＶ抗体（たとえば、以下の実施例５に記載される）を含む。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、構成的プロモーターである。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡのうちのいずれか１つである。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントを導入遺伝子に作動可能に連結した場合と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子を非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合のＰＶニューロンにおける発現よりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、遺伝子編集タンパク質、またはそれらの機能性断���のうちのいずれか１つである。一部の事例では、制御エレメントおよび導入遺伝子は、ＡＡＶに含まれる。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である。
【００１１】
別の態様では、本開示は、神経学的状態または障害を処置することを必要とする被験体において神経学的状態または障害を処置する方法であって、細胞を、ＣＮＳ内の１つまたは複数の非ＰＶ細胞と比べて、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現をもたらす、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数の制御エレメントを含む核酸カセットと接触させるステップを含む、方法を企図する。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して判定される。一部の事例では、導入遺伝子は、電位依存性イオンチャネルサブユニット、またはそのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、サブユニットは、ナトリウムイオンチャネルのベータサブユニットである。一部の事例では、サブユニットは、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットである。一部の事例では、サブユニットは、カリウムイオンチャネルのものである。一部の事例では、導入遺伝子は、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、もしくはＫＶ３．３、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、内因性遺伝子をモジュレートする。一部の事例では、内因性遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質である。一部の事例では、遺伝子編集タンパク質は、Ｃａｓタンパク質、たとえば、Ｃａｓ９である。一部の事例では、神経学的状態または障害は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１のうちのいずれかにおけるハプロ不全または変異と関連する。一部の事例では、神経学的状態または障害は、てんかん、神経変性、タウオパチー、またはニューロン興奮性低下である。一部の事例では、神経学的状態または障害は、ドラベ症候群である。一部の事例では、神経学的状態または障害は、アルツハイマー病である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。一部の事例では、本開示の制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶニューロンにおける同じ導入遺伝子の選択的な発現をもたらす。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、構成的プロモーターである。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡのうちのいずれか１つである。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、非選択的制御エレメントを導入遺伝子に作動可能に連結した場合と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子を非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合のＰＶニューロンにおける発現よりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、核酸カセットは、ＡＡＶである。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である。
【００１２】
一態様では、本開示は、ドラベ症候群を処置する方法であって、細胞を、導入遺伝子を含むＡＡＶと接触させるステップを含み、導入遺伝子が、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、もしくはＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである、方法を提供する。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、内因性遺伝子をモジュレートする。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写モジュレーターである。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ９を含む。一部の事例では、内因性遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、またはＳＣＮ２Ｂである。一部の事例では、ＡＡＶは、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶニューロン選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントをさらに含む。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、独立して、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）その機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、アルツハイマー病を処置する方法であって、細胞を、導入遺伝子を含むＡＡＶと接触させるステップを含み、導入遺伝子が、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、もしくはＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである、方法を提供する。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、内因性遺伝子をモジュレートする。一部の事例では、内因性遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１である。一部の事例では、導入遺伝子は、転写モジュレーターを含むＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ９を含む。一部の事例では、ＡＡＶは、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶニューロン選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントをさらに含む。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、独立して、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１４】
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により援用されると示されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【００１５】
本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲において具体的に示す。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、配列番号３２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているＳＣＮ１ＢまたはｅＧＦＰのいずれかを含む組換えＡＡＶＤＪベクターで処置した後の、ＳＣＮ１Ａヘテロ接合型マウスにおけるてんかん発作の頻度（１２時間間隔当たりのてんかん発作数）を示す。このグラフは、各記録日の平均値と、平均の標準誤差を表す誤差のバーを示す。
【００１７】
【図２】図２は、様々なマウス、すなわち、野生型対照（ＷＴ）、未処置トランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ＡＰＰ／ＰＳ１）、または配列番号３２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているＳＣＮ１Ｂを含むｒＡＡＶで処理したトランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ＳＣＮ１Ｂ）の高ガンマパワー（５０〜１００Ｈｚ）を示す。
【００１８】
【図３Ａ】図３Ａは、配列番号１または配列番号８の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ９を新生児の時に全身注射した後の子犬から得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。ＣＡＧに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ９を対照として使用した。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ＋細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞が、矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞として示されている）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。
【００１９】
【図３Ｂ】図３Ｂは、免疫蛍光共局在アッセイによって測定した場合の、ＰＶ細胞における選択的な発現が、ＣＡＧ対照と比較した、ＰＶ＋でもあるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージで表されている、図３Ａで示した免疫蛍光共局在研究の定量を示す。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａは、配列番号１または配列番号８の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ９を全身注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。ＥＦ１αに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ９を対照として使用した。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ＋細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。
【００２１】
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫蛍光共局在アッセイによって測定した場合の、ＰＶ細胞における選択的な発現が、ＥＦ１α対照と比較した、ＰＶ＋でもあるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして表されている、図４Ａで示した免疫蛍光共局在研究の定量を示す。
【００２２】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｆは、配列番号２〜２２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶＤＪを直接ＣＮＳ注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。図５Ａは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｂは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号６、配列番号７、および配列番号９の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｃは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｄは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｅは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｆは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２２または配列番号３４を含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示し、ここで、配列番号３４は、事前に特徴付けられた非選択的制御エレメントであり、比較のための対照として使用した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｆは、配列番号２〜２２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶＤＪを直接ＣＮＳ注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。図５Ａは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｂは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号６、配列番号７、および配列番号９の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｃは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｄは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｅは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｆは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２２または配列番号３４を含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示し、ここで、配列番号３４は、事前に特徴付けられた非選択的制御エレメントであり、比較のための対照として使用した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｆは、配列番号２〜２２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶＤＪを直接ＣＮＳ注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。図５Ａは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｂは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号６、配列番号７、および配列番号９の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｃは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｄは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｅは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｆは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２２または配列番号３４を含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示し、ここで、配列番号３４は、事前に特徴付けられた非選択的制御エレメントであり、比較のための対照として使用した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｆは、配列番号２〜２２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶＤＪを直接ＣＮＳ注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。図５Ａは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｂは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号６、配列番号７、および配列番号９の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｃは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｄは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｅは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｆは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２２または配列番号３４を含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示し、ここで、配列番号３４は、事前に特徴付けられた非選択的制御エレメントであり、比較のための対照として使用した。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｆは、配列番号２〜２２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶＤＪを直接ＣＮＳ注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。図５Ａは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｂは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号６、配列番号７、および配列番号９の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｃは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｄは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｅは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｆは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２２または配列番号３４を含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示し、ここで、配列番号３４は、事前に特徴付けられた非選択的制御エレメントであり、比較のための対照として使用した。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆは、配列番号２〜２２の配列を含む制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶＤＪを直接ＣＮＳ注射した後の成体マウスから得たＣＮＳ細胞の免疫蛍光共局在アッセイを示す。下の列の画像はｅＧＦＰ＋細胞を示す。中央の列の画像は、抗ＰＶ抗体で染色したＰＶ細胞を示す。上の列の画像（組合せ画像）は、ＰＶ＋、ｅＧＦＰ＋蛍光（代表的なｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋細胞、または矢印によって示される白色または薄い灰色の細胞）とＤＡＰＩ＋との重複画像を示す。図５Ａは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｂは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号６、配列番号７、および配列番号９の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｃは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｄは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｅは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の１つを含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示す。図５Ｆは、ｅＧＦＰに作動可能に連結している配列番号２２または配列番号３４を含むＡＡＶＤＪで行った免疫蛍光共局在アッセイを示し、ここで、配列番号３４は、事前に特徴付けられた非選択的制御エレメントであり、比較のための対照として使用した。
【００２３】
【図６】図６は、免疫蛍光共局在アッセイによって測定した場合の、ＰＶ細胞における選択的な発現が、配列番号３４と比較した、ＰＶ＋でもあるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして表されている、図５Ａ〜５Ｆで示した免疫蛍光共局在研究の定量を示す。
【００２４】
【図７】図７は、本開示のＲＥ、たとえば、エンハンサー、プロモーター、および安定性エレメントを含む発現カセットの例の略図を示す。ＲＥは、プラスミド、ベクター、またはウイルスベクターであり得る発現カセット内の導入遺伝子の上流および／または下流に位置し得る。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
開示の詳細な説明
本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）と関連する疾患または状態、たとえば、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、および／またはけいれんを処置するための組成物、および遺伝子療法においてそのような組成物を使用する方法を企図する。
【００２６】
遺伝子療法は、細胞において治療効果をもたらすために、遺伝子または特定の核酸配列、たとえば、発現カセットを置き換える、修飾する、欠失させる、または付加することができる。一部の事例では、遺伝子療法は、治療効果を生じるかまたはもたらす発現カセットを細胞に送達するために使用される。一部の事例では、発現カセットを含むウイルスベクターを含む、ウイルス、たとえば、ＡＡＶを使用して、導入遺伝子を細胞に送達することができる。発現カセットは、細胞において発現されると治療効果を提供する導入遺伝子を含み得る。
【００２７】
遺伝子療法における１つの課題は、導入遺伝子が、遺伝子発現を達成するかまたは遺伝子発現の標的である、適切な目的とされる細胞型または標的細胞型において発現されることを確実にすることである。遺伝子療法の標的を定める従来的な方法は、送達方法および／またはビヒクル（たとえば、使用されるウイルスまたはウイルスのキャプシド配列を変化させること）に頼ることが多かった。１つまたは複数の非標的細胞型と比べて、標的細胞型における、発現カセットの標的化または発現カセットの選択的な発現に加えて、当該分野におけるもう１つの課題は、特に、遺伝子が、大型である場合に、治療効果を発揮するために、標的細胞型または組織における遺伝子発現を増加させることである。
【００２８】
本開示は、非コーディングヌクレオチド配列である複数の制御エレメントであって、任意の導入遺伝子に作動可能に連結させて、ＣＮＳ、たとえば、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の発現の選択性を増加または改善することができる、制御エレメントを提供する。本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを使用して、遺伝子発現の選択性を増加させることによって、遺伝子療法剤の有効性を向上させ、治療効果をもたらすのに必要とされる有効用量を減少させ、有害効果もしくは標的外作用を最小限に抑え、かつ／または患者の安全性および／もしくは寛容性を増加させることができる。
【００２９】
一態様では、１つまたは複数の制御エレメントは、発現カセットにおいて任意の導入遺伝子に作動可能に連結させて、細胞における遺伝子発現をモジュレートすること、たとえば、１つまたは複数の非標的細胞型または組織（たとえば、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型）と比べて、標的細胞型または組織（たとえば、ＰＶ細胞）における導入遺伝子の発現を標的とすることができる。一部の事例では、標的細胞型または組織における導入遺伝子の標的化発現には、標的細胞型または組織における遺伝子発現の増加が含まれる。導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントは、発現カセットの一部であり得、発現カセットは、直鎖状または環状の構築物、プラスミド、ベクター、ウイルスベクター、たとえば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターであり得る。そのような発現カセットは、遺伝子療法または被験体（たとえば、ヒト、患者、もしくは哺乳動物）への送達のために適合され得る。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントを、遺伝子に作動可能に連結させることにより、ＣＮＳ内の標的組織または細胞型、たとえば、パルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおける、遺伝子の標的化された発現がもたらされる。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）は、ＣＮＳ内の標的組織または細胞型、たとえば、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現の選択性を増加させる。一部の事例では、遺伝子療法剤は、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含み、ここで、制御エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結されており、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現を発動させる。
【００３０】
一部の事例では、ＰＶニューロンにおける遺伝子の選択的な発現は、内因性遺伝子のハプロ不全および／または遺伝子欠陥と関連する疾患または状態を処置するために使用され、ここで、遺伝子欠陥は、遺伝子における変異または遺伝子の制御不全であり得る。そのような遺伝子欠陥は、低減されたレベルの遺伝子産物ならびに／または機能および／もしくは活性が損なわれた遺伝子産物をもたらし得る。一部の事例では、発現カセットは、遺伝子、そのサブユニット、バリアント、または機能性断片を含み、ここで、発現カセットによる遺伝子発現は、遺伝子欠陥、損なわれた機能および／もしくは活性、ならびに／または内因性遺伝子の制御不全と関連する疾患または状態を処置するために使用される。一部の事例では、疾患または状態は、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんである。
【００３１】
一部の事例では、導入遺伝子は、イオンチャネルもしくは神経伝達物質制御因子、ＤＮＡ結合タンパク質、またはこれらのサブユニット、バリアント、もしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、ナトリウムイオンチャネルアルファサブユニット、ナトリウムイオンチャネルベータサブユニット、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、カリウムイオンチャネルまたはそのサブユニットである。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質（たとえば、内因性遺伝子の発現をモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質）、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子、たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１のうちのいずれか１つの発現をモジュレートする、ＤＮＡ結合タンパク質である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含むこと（including）」、「含む（includes）」、「有すること（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、またはこれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲内で、そのような用語は、「含む（comprising）」という用語と同様の様式で、包含的であることが意図される。
【００３３】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって判定される、特定の値に対する許容可能な誤差の範囲内であることを意味し、これは、部分的に、その値が、どのように測定または判定されるか、すなわち、測定システムの制限に依存するであろう。たとえば、「約」は、当該技術分野における慣例に従い、１または１を上回る標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％）の範囲を意味し得る。
【００３４】
「判定すること」、「測定すること」、「評価すること（evaluating）」、「評価すること（assessing）」、「アッセイすること」、「分析すること」という用語、およびそれらの文法上の同等物は、任意の形態の測定を指して、本明細書において互換可能に使用することができ、ある要素が存在するかしないかを判定すること（たとえば、検出）を含む。これらの用語は、定量的および／または定性的判定の両方を含み得る。アッセイすることは、相対的であっても絶対的であってもよい。
【００３５】
「発現」という用語は、核酸配列またはポリヌクレオチドが、ＤＮＡ鋳型から（たとえば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に、「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合は、発現には、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された（operably  linked）」、「作動可能な連結」、「操作可能に連結された（operatively  linked）」、またはこれらの文法上の同等物は、遺伝子エレメント、たとえば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置を指し、ここで、これらのエレメントは、エレメントが予測された様式で作動するのを許容する関係性にある。たとえば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る制御エレメントは、制御エレメントがコーディング配列の転写開始を補助する場合に、コーディング領域に操作可能に連結されている。この機能的関係性が維持される限り、制御エレメントとコーディング領域との間に、介在する残基が存在してもよい。
【００３７】
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを含むかまたはそれと会合し、ポリヌクレオチドを細胞に送達するのを媒介するために使用することができる、巨大分子または巨大分子の会合を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、一般に、標的における遺伝子の発現を促進するために、遺伝子に操作可能に連結された、遺伝子エレメント、たとえば、制御エレメントを含む。制御エレメントと、発現のために制御エレメントが作動可能に連結される１つまたは複数の遺伝子との組合せは、「発現カセット」と称される。
【００３８】
「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルスそのものまたはその誘導体を指して使用され得る。この用語は、すべての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含するが、そうでないことが求められる場合を除く。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される。「ＡＡＶ」という用語には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ならびにヒツジＡＡＶが含まれる。様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに天然の末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野において公知である。そのような配列は、文献、または公的なデータベース、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて見出すことができる。「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換の目的とされる配列を含む、ＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの、および一般的には２つの、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれであってもよい。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成される、ウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合は、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単純に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、そのようなベクターは、ｒＡＡＶ粒子内に含まれるため、ｒＡＡＶ粒子の産生には、必然的に、ｒＡＡＶベクターの産生が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、「治療法」などの用語は、所望される薬理学的および／または生理学的作用を得ることを指し、これには、疾患または障害を軽減すること、その進行を遅延もしくは緩徐化すること、その作用もしくは症状を低減すること、その発症を予防すること、それを阻害すること、その発症を緩和すること、疾患、障害、または病態に関して有益または所望される結果、たとえば、治療上の利益および／または予防上の利益を得ることが含まれるが、これらに限定されない。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特に、ヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し、これには、（ａ）疾患の素因があり得るかまたは疾患を生じる危険性にあり得るが、まだ疾患を有すると診断されていない被験体において、疾患が発症するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を停止させること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことが含まれる。治療上の利益には、処置されている根底にある障害の根絶または緩和が含まれる。また、治療上の利益は、根底にある障害と関連する生理学的症状のうちの１つまたは複数の根絶または緩和により達成され、そのため、被験体が、根底にある障害に依然として罹患している場合があったとしても、改善が、被験体において観察される。一部の事例では、予防上の利益については、本組成物は、特定の疾患を発症する危険性にある被験体、または疾患の生理学的症状のうちの１つもしくは複数を報告している被験体に投与されるが、この疾患の診断は、まだ行われていなくてもよい。本開示の方法は、任意の哺乳動物に使用することができる。一部の事例では、処置は、症状の減少または停止（たとえば、けいれんの頻度または期間の低減）をもたらし得る。予防的効果としては、疾患もしくは状態の出現の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の症状の発症の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の進行の緩徐化、停止、もしくは逆転、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
【００４０】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、以下に定義されるように、これに限定されないが疾患の処置を含む意図される適用を達成するのに十分な本明細書に記載される組成物の量を指す。治療有効量は、当業者によって容易に判定することができる、意図される処置適用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、または処置されている被験体および疾患状態、たとえば、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて、変動し得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答を誘導するであろう用量にも当てはまる。具体的な用量は、選択される具体的な組成物、従うべき投薬レジメン、組成物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、組成物が投与される組織、および組成物が運搬される物理的な送達システムに応じて、変動するであろう。
【００４１】
ヌクレオチドまたはペプチド配列の「断片」とは、「全長」配列であると考えられるものよりも短い配列を指すことを意味する。
【００４２】
分子の「バリアント」は、そのような配列の対立遺伝子変形形態、すなわち、分子全体またはその断片のいずれかに、構造および生物学的活性が実質的に類似である配列を指す。
【００４３】
「機能性断片」という用語は、分子の「断片」、「バリアント」、「類似体」、または「化学的誘導体」を含むことが意図される。
【００４４】
ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能性断片」は、配列の少なくとも生物学的に活性な断片を有するが、これは、全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれかで）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、全長配列に帰属することが公知の様式で、発現に影響を及ぼすその能力であり得る。たとえば、制御エレメントの機能性断片は、全長ＲＥとして転写に影響を及ぼす能力を保持する。
【００４５】
「被験体」および「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指して、本明細書において互換可能に使用される。「被験体」とは、動物、たとえば、哺乳動物、たとえば、ヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒトの治療法、獣医学的適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において、有用であり得る。一部の事例では、被験体は、哺乳動物であり、一部の事例では、被験体は、ヒトである。
【００４６】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、被験体の身体において生じる事象を指す。
【００４７】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、被験体の身体の外部で生じる事象を指す。たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、被験体の外部で行われる任意のアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、生存細胞または死細胞を用いる、細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイはまた、インタクトな細胞を用いない、無細胞アッセイも包含する。
【００４８】
同一性、変異、または試験配列の１つもしくは複数の位置が、参照配列の１つもしくは複数の指定された位置と比較してどこに含まれるかを評価するなどの目的での配列比較は、ニードルマン・ウンシュアルゴリズム（たとえば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/において利用可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアライナーを、必要に応じてデフォルトの設定とともに参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（たとえば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて利用可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムツールを、必要に応じてデフォルトの設定とともに参照されたい）、およびスミス・ウォーターマンアルゴリズム（たとえば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/において利用可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒアライナーを、必要に応じてデフォルトの設定とともに参照されたい）を含むがこれらに限定されない、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって行うことができる。最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを含め、選択されたアルゴリズムの任意の好適なパラメーターを使用して、評価することができる。
【００４９】
一般に、互換可能に使用することができる「配列同一性」または「配列相同性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド間またはアミノ酸間での厳密な対応を指す。典型的に、配列同一性を判定するための技法には、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を判定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を判定すること、ならびにこれらの配列を、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが含まれる。２つまたはそれを上回る配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、「相同性パーセント」とも称される、それらの「同一性パーセント」を判定することによって、比較することができる。より長い分子（たとえば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）内の配列であり得る、参照配列（たとえば、核酸またはアミノ酸配列）に対する同一性パーセントは、２つの最適にアライメントした配列間での厳密な一致の数を、参照配列の長さで除し、１００を乗じたものとして、計算することができる。同一性パーセントはまた、たとえば、バージョン２．２．９を含め、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能なａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して、配列情報を比較することによって、判定することもできる。ＢＬＡＳＴプログラムは、KarlinおよびAltschul、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：２２６４〜２２６８頁（１９９０年）のアライメント方法に基づくものであり、Altschulら、J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）、KarlinおよびAltschul、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻：５８７３〜５８７７頁（１９９３年）、ならびにAltschulら、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）において考察されている通りである。簡単に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、アライメントされた同一の記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のうちの短い方における記号の総数で除したものとして、同一性を定義する。このプログラムを使用して、比較されている配列の全長にわたって、同一性パーセントを判定することができる。デフォルトのパラメーターは、短いクエリ配列での、たとえば、ｂｌａｓｔｐプログラムでの検索を最適化するように提供される。このプログラムはまた、WoottonおよびFederhen、Computers  and  Chemistry、１７巻：１４９〜１６３頁（１９９３年）のＳＥＧプログラムによって判定される、クエリ配列のセグメントをマスキングにより排除（mask-off）するＳＥＧフィルターの使用が可能である。所望される配列同一性の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％、およびこれらの間の整数値である。典型的には、開示される配列と、請求される配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。一般に、厳密な一致は、参照配列の長さにわたって１００％の同一性を示す。一部の事例では、配列同一性パーセントへの言及は、ＢＬＡＳＴ（基本的な局所的アライメント検索ツール、Basic  Local  Alignment  Search  Tool）を使用して測定される、配列同一性を指す。他の事例では、ＣｌｕｓｔａｌＷが、複数の��列のアライメントに使用され得る。
【００５０】
別途示されない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、当業者にとってのものと同じ意味を有し、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来的な技法を採用することになるが、これらは、当業者の知識の範囲内である。
【００５１】
制御エレメント
制御エレメントは、目的とされる特定の組織または細胞型において、遺伝子の発現に影響を及ぼす（たとえば、発現を増加もしくは減少させる）ことができる、かつ／または遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子、たとえば、ｅＧＦＰ、導入遺伝子、もしくは治療用遺伝子）の選択的な発現をもたらす、核酸配列または遺伝子エレメントである。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子、イントロン、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、インシュレーター、リプレッサー、末端逆位反復（ＩＴＲ）配列、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、安定性エレメント、翻訳後応答エレメント、もしくはポリＡ配列、またはこれらの組合せであり得る。一部の事例では、制御エレメントは、プロモーターもしくはエンハンサー、またはそれらの組合せである。一部の事例では、制御エレメントは、ヒト配列に由来する。
【００５２】
一部の事例では、目的の細胞型は、ＰＶニューロンである。制御エレメントは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡレベルで機能し得る。制御エレメントは、目的の細胞型において、遺伝子発現の選択性をモジュレートするように機能し得る。制御エレメントは、遺伝子発現の転写の段階、翻訳後の段階、または翻訳の段階で、遺伝子発現をモジュレートするように機能し得る。制御エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、およびインシュレーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡレベルでは、制御は、翻訳（たとえば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化する安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシング、および／または転写終結のレベルで、生じ得る。一部の事例では、制御エレメントは、転写因子を、目的の細胞型における遺伝子発現の選択性を増加させるコーディング領域に動員することができる。一部の事例では、制御エレメントは、ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させる、産生されるＲＮＡの安定性を増加させる、および／またはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成の速度を増加させることができる。一部の事例では、制御エレメントは、ＲＮＡ分解を防止する、および／またはその安定性を増加させて、タンパク質合成を促進することができる。一部の事例では、制御エレメントは、標的外細胞型における転写および／または翻訳のプロセスを抑制する。一部の事例では、標的外細胞型としては、興奮性ニューロン、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型、および非ニューロンＣＮＳ細胞型が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
ＤＮＡａｓｅ高感受性、ＡＴＡＣ−Ｓｅｑ、およびＣｈＩＰ−Ｓｅｑを含むがこれらに限定されない様々なアッセイを使用して、推定上の非コーディング制御エレメント（ＲＥ）を特定することができる。これらのアッセイのそれぞれにおける酵素反応は、制御エレメントを予測すると考えられる状態である、オープン／アクセス可能な状態のクロマチンを優先的に標的とする。細胞型選択的制御エレメントを発見するために、目的とされる標的細胞型（たとえば、パルブアルブミンニューロン）のオープンクロマチン配列についてアッセイし、それを、非標的細胞型（たとえば、興奮性ニューロン）のオープンクロマチン配列と比較することができる。細胞型選択的遺伝子に対する近接性、種の保存、および／または配列モチーフ、たとえば、転写因子結合部位を含む、さらなるフィルターを適用して、標的選択をさらに洗練することができる。標的細胞型において固有に特定されるＤＮＡ配列を合成し、発現ベクターにクローニングしてもよい。制御エレメントの選択性は、公知の細胞型選択的タンパク質に対する共局在を定量化する免疫組織化学的方法を使用して、判定することができる。
【００５４】
たとえば、細胞型選択的制御エレメントを単離する１つの方法には、動物モデルに由来する目的の脳の組織または細胞型から、核を単離すること（これは、目的の組織または細胞型を単離する親和性精製方法を使用すること（たとえば、ＰＶニューロンを単離するために抗ＰＶ抗体をコーティングしたビーズを使用すること）によって、達成することができる）、高スループットの天然のプライミングおよびＤＮＡ合成を使用して、核内のオープンクロマチン領域に由来する配列のプールを生成すること、この配列のプールをシーケンシングして、目的の組織または細胞型における遺伝子発現を発動させる推定上の配列を特定すること、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞系においておよび／または動物モデルにおいて、レポーター系における選択的な発現を検証することが含まれる。
【００５５】
目的の組織または細胞型に選択的である候補の制御エレメントを特定するための別の方法には、目的の組織または細胞型を採取し、親和性精製を使用して、たとえば新皮質から核を単離するための抗ＧＦＰまたは抗Ｍｙｃ抗体およびプロテインＧコーティング磁気ビーズを使用して、この株のマウス新皮質からＧＦＰ＋／Ｍｙｃ＋核を単離するために、Ｒ２６−ＣＡＧ−ＬＳＬ−Ｓｕｎ１−ｓｆＧＦＰ−Ｍｙｃノックインマウスを使用することが含まれる。精製した核または新皮質核全体に由来する核ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換させ、Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（Ｎｕｇｅｎ  ７１０２）を用いて増幅させ、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を使用してシーケンシングすることができる。精製した核に由来するゲノムＤＮＡを、断片化し、これを使用して、メチルＣ−ｓｅｑライブラリーを作製することができ、これを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００を使用してシーケンシングすることができる。ＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリーを生成するために、ビーズに結合した核を、Ｔｎ５トランスポサーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＦＣ−１２１−１０３０）を使用して転位させる。９〜１２サイクルのＰＣＲ増幅を行った後、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を使用してシーケンシングする。ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーを生成するために、興奮性ニューロンの核を、小球菌ヌクレアーゼを使用して消化させてモノヌクレオソームにし、続いて、クロマチンの塩抽出、ならびにネイティブＣｈＩＰおよびライブラリーの構築を行い、これを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００においてシーケンシングすることができる。これらのライブラリーをシーケンシングした後、配列をマッピングして、たとえば、ＣＧリッチ領域における細胞型特異的低メチル化、ヒストン修飾、転写因子結合部位、および高度に発現される転写因子と関連するパターンにおける、相関を特定する。上述の複数のアッセイおよび／またはライブラリーから得られたオーバーラップする特徴および相関は、そのようなゲノム領域内の候補配列を、新皮質から単離された細胞における選択的な発現および／または高い発現と関連する、可能性のある制御エレメントとして、特定するための根拠を提供する。たとえば、メチルＣ−ｓｅｑライブラリー、ＣｈＩＰアッセイにおいて検出された低メチル化の間の強力なオーバーラップを特徴とするゲノム領域、および同じ領域における転写因子結合モチーフの濃縮は、このゲノム領域が、単離された組織または細胞型に選択的な推定上の制御エレメントの配列を含むことを示す収束的データを提供する。別の例として、候補ＰＶニューロン選択的制御エレメントを特定するために、ＰＶニューロンを単離し、単離したＰＶ細胞から核を精製することができ、それによって、上述の複数のシーケンシングアッセイにおいて活性として特定されたゲノム配列が、ＰＶ細胞選択的制御エレメント、たとえば、ＡＴＡＣ−ｓｅｑアッセイにおいて活性（オープンクロマチンの領域に対応する）、ＲＮＡ−ｓｅｑにおいて活性（この領域における活性な遺伝子発現および低いＤＮＡメチル化パターンを示す）、ならびにメチルＣ−ｓｅｑアッ��イにおいて活性（目的の細胞型に由来する一塩基解像度のメチロームマップ生成する）として特定されるゲノム領域である高い可能性を有する。
【００５６】
候補ゲノム領域が、目的の細胞型において選択的に活性であるとして特定されると、この領域内の配列を、ＰＣＲ方法を使用して生成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでさらなるアッセイにおいて試験して、配列の組織または細胞型選択性を検証することができる。そのような検証アッセイとしては、免疫組織化学的共局在アッセイが挙げられ、ここで、抗体または任意の検出可能なマーカーを使用して、目的の細胞型を標識し、第２の検出可能なマーカー、たとえば、蛍光性導入遺伝子を、推定上の制御エレメントに作動可能に連結させる。そのようなエレメントを含む発現カセットを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞に送達する。１つまたは複数の推定上の制御エレメントによって発動される選択的な発現は、目的の細胞型（その標識されたマーカー、たとえば、抗ＰＶ抗体からの検出可能なシグナルまたは蛍光によって測定される）および制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子の発現に対応する第２の検出可能なマーカー（たとえば、ｅＧＦＰまたはＲＦＰ）との間のオーバーラップを測定することによって、検証することができる。両方の検出可能なマーカーからのシグナルのオーバーラップは、観察されたオーバーラップの量が、制御エレメントを、対照、たとえば、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、非選択的制御エレメント、またはこれまでに特徴付けされている非選択的制御エレメントと置き換えた場合に観察されるオーバーラップよりも高い場合に、標識された細胞型における細胞型選択性を示す。目的の細胞型における検出可能なマーカーの発現に適合された様々なマウス株により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける制御エレメントの細胞型選択性の検証が可能である。たとえば、特定の細胞型においてＣｒｅを発現するいくつかのマウス株を、使用することができるが、これは、細胞型選択的なＣｒｅの発現が、目的の細胞型において、Ｃｒｅに誘導される蛍光タンパク質、たとえば、ＲＦＰの発現を発動させ得るためである。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそのような目的の細胞型を標識することにより、同じマウスにおける蛍光性またはレポーター導入遺伝子に作動可能に連結された推定上の制御エレメントと関連する、細胞型選択的な発現のレベルを判定することができる。共局在アッセイと同様に、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または非選択的制御エレメントで検出されたオーバーラップを上回る、両方のマーカーからのシグナルのオーバーラップは、試験した制御エレメントの細胞型選択性を示す。一部の事例では、使用されるマウス株は、Ｂ６  ＰＶ−Ｃｒｅマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）であり、これは、内因性Ｐｖａｌｂ発現を破壊することなく、パルブアルブミン発現ニューロン（たとえば、脳における介在ニューロンおよび後根神経節における自己受容性求心性感覚ニューロン）においてＣｒｅリコンビナーゼを発現する、Ｂ６  ＰＶ−Ｃｒｅノックインマウスである。
【００５７】
特定の細胞型に対する、制御エレメントの細胞型選択性を検証した後に、そのような制御エレメントの配列を、様々な変異誘発方法、たとえば、エラープローンＰＣＲ方法を使用して、その選択性を改善するように、変化させることができる。一部の事例では、細胞選択性を有する２つまたはそれを上回る制御エレメントを、組み合わせることができる。一部の事例では、組み合わせた制御エレメントは、目的の細胞型における遺伝子発現を発動させることにおいて、強化された細胞型選択性を呈する。一部の事例では、そのような制御エレメントは、その細胞型選択性を保持する最小限の量の配列を判定するために、一度に１つまたは複数の塩基が短縮される。細胞型選択性を保持するより小さな制御エレメントは、大きな導入遺伝子を含む遺伝子療法剤を作製するのに役立つか、またはベクターもしくはプラスミドのクローニング能力が、遺伝子療法を使用して送達したい導入遺伝子のサイズの観点で制限される場合に、役立つ。
【００５８】
本開示は、制御エレメントである複数のヌクレオチド配列を提供する。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントのうちのいずれか１つまたは複数は、パルブアルブミン細胞における遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、ＰＶ細胞選択的である。一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントは、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型における発現よりも、ＰＶ細胞における選択的な遺伝子発現と関連している。一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントは、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型における遺伝子発現の低減と関連している。
【００５９】
制御エレメントの非限定的な例としては、以下の表１に提供される配列番号１〜３２が挙げられる。
【表１−１】
2020515292.tif 000003
【表１−２】
2020515292.tif 000004
【表１−３】
2020515292.tif 000005
【表１−４】
2020515292.tif 000006
【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【００６０】
一態様では、本明細書に開示される制御エレメントは、細胞型選択的である。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、ＰＶニューロンに選択的である。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、ＣＮＳ内のＰＶニューロンに選択的である。一部の事例では、本明細書に開示されるＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは任意の制御エレメントは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回る非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型と比べて、ＰＶニューロンにおける選択的な遺伝子発現をもたらし得る。
【００６１】
一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントのうちのいずれか１つまたは複数は、標的細胞型、たとえば、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらすように、発現カセットにおいて導入遺伝子に作動可能に連結されている。一部の事例では、本明細書における実施形態のうちのいずれかの制御エレメントは、（ｉ）配列番号１〜３３、（ｉｉ）それらのバリアント、機能性断片、もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなる。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜３２のうちのいずれか１つを含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。
【００６２】
一部の事例では、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くを組み合わせて、より大きな制御エレメントを形成するか、または発現カセットにおいて遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くが、１〜５０個のヌクレオチドのリンカー配列を使用して、組み合わされる。一部の事例では、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くが、リンカー配列を用いることなく、組み合わされる。一部の事例では、配列番号３３の配列は、任意の２つの制御エレメント間のリンカーとして使用される。一部の事例では、任意の２つの制御エレメント間のリンカー配列は、配列番号３３、または配列番号３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。
【００６３】
一部の事例では、２つまたはそれを上回る制御エレメントが、発現カセットにおいて組み合わされるかまたは使用される場合、制御エレメントは、発現カセットにおいて、隣接している必要も連結されている必要もない。たとえば、１つの制御エレメントは、導入遺伝子の上流に位置していてもよく、一方で、第２の制御エレメントおよび／または追加の制御エレメントは、導入遺伝子の下流に位置していてもよい。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、導入遺伝子の上流に位置していてもよい。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、導入遺伝子の下流に位置していてもよい。
【００６４】
一部の事例では、配列番号１〜２２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を、配列番号２３〜３０、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数と組み合わせて、より大きな制御エレメントを形成することができる。たとえば、制御エレメントは、配列番号１および配列番号３０を含む。制御エレメントは、配列番号８および配列番号３０を含む。制御エレメントは、配列番号１および配列番号２３〜２９を含む。制御エレメントは、配列番号８および配列番号２３〜２９を含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号３０、または配列番号２３〜２９、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
【００６５】
一部の事例では、本開示の１つまたは複数の制御エレメントは、ＰＶ細胞における選択的な遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、標的細胞型において選択的な活性または機能を示す制御エレメントはまた、１つまたは複数の標的外細胞型、たとえば、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型、非阻害性ニューロン、または興奮性ニューロン、非ＰＶ細胞において、最小限の活性または機能を示す。
【００６６】
一部の事例では、遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントは、細胞における遺伝子発現をモジュレートし、これには、非標的細胞型と比べて、標的細胞型における選択的な発現が含まれるが、これに限定されない。標的細胞または細胞型における選択的な発現はまた、細胞選択的な発現または細胞型選択的な発現とも称することができる。
【００６７】
選択的な発現は、一般に、他の細胞（または非標的細胞型）と比較して、目的の細胞型（または標的細胞型）の細胞の高い画分における発現を指す。選択的な発現はまた、１つまたは複数の非標的細胞または細胞型と比べて、標的細胞または標的細胞型における優先的な発現として解釈することもできる。一部の事例では、本開示の１つまたは複数の制御エレメントの選択的な発現は、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または選択性なしで任意の細胞もしくは細胞型において発現を発動させることが公知の非選択的制御エレメントと比較される。一部の事例では、本開示の１つまたは複数の制御エレメントの選択的な発現は、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、非選択的制御エレメント、または制御エレメントなしの発現カセットと比較される。
【００６８】
非標的細胞型には、標的細胞もしくは標的細胞型と比較して異なるサブセット、サブタイプ、もしくは型の細胞、またはすべての非標的細胞型が含まれ得る。一部の事例では、遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントは、少なくとも１つの非標的細胞型、または少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは５つを上回る非標的細胞型と比べて、標的細胞型における選択的な発現をもたらす。一部の事例では、非標的細胞型は、標的細胞型を含まないすべての他の細胞型を指す。一部の事例では、非標的細胞型は、標的細胞型を含まない関連組織または臓器内のすべての他の細胞型、たとえば、ＣＮＳ内のすべての非標的細胞型、海馬におけるすべての非標的細胞型である。一部の事例では、非標的細胞または非標的細胞型は、標的細胞ではない細胞のサブセットまたはサブタイプを包含する。たとえば、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型には、パルブアルブミンではなくカルレチニンおよび／もしくはソマトスタチンを発現するＧＡＢＡ作動性細胞、またはパルブアルブミンを発現しないすべてのＧＡＢＡ作動性細胞が含まれ得る。一部の事例では、細胞型は、異なる細胞マーカー、形態学、表現型、遺伝子型、機能を有することによって、および／または細胞型を分類するための任意の他の手段によって、区別される。
【００６９】
目的の細胞または細胞型において制御エレメントによって発動される発現の選択性は、いくつかの手段で測定することができる。非標的細胞型と比べた、標的細胞型における遺伝子発現の選択性は、１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された遺伝子から検出可能なレベルの転写物を発現する標的細胞の数を、その遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって、測定することができる。そのような測定、検出、および定量化は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。
【００７０】
一部の事例では、ＰＶニューロンに対する選択性は、共局在アッセイを使用して判定することができる。一部の事例では、共局在アッセイは、免疫組織化学法に基づく。一部の事例では、検出可能なレポーター遺伝子を、導入遺伝子として使用することにより、細胞における遺伝子発現の検出および／または測定が可能となる。一部の事例では、標的細胞を特異的に標識する、検出可能なマーカー、たとえば、蛍光マーカーまたは抗体を使用して、標的細胞を検出および／または測定する。一部の事例では、共局在アッセイは、イメージング、たとえば、蛍光イメージングを利用して、異なる蛍光標識間でのオーバーラップ、たとえば、標的細胞を示す蛍光シグナルと、遺伝子発現を示す別の蛍光シグナルとの間のオーバーラップを判定する。一部の事例では、共局在アッセイに使用される蛍光標識としては、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、たとえば、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子、および緑色蛍光レポータータンパク質、たとえば、ｅＧＦＰが挙げられる。
【００７１】
一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結される遺伝子は、蛍光タンパク質、たとえば、ｅＧＦＰまたはＲＦＰであり、ここで、導入遺伝子の発現により、検出可能なシグナルが提供される。一部の事例では、組織は、ｅＧＦＰに関して染色されるか、またはｅＧＦＰからの蛍光は、蛍光顕微鏡を使用して直接的に検出される。標的細胞を特定する抗体など、異なる蛍光または検出可能なシグナルを有する第２の蛍光マーカーまたはレポーター遺伝子を使用して、標的細胞を示すことができる。たとえば、ＰＶニューロンと特異的に相互作用する抗ＰＶ抗体を使用して、遺伝子発現を測定するために使用される蛍光、たとえば、赤色の蛍光または赤色の染色とは区別することが可能な検出可能なシグナルを得ることができる。したがって、ｅＧＦＰが、ＰＶニューロンにおける選択的な発現を発動させる１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子であり、ＰＶニューロンが、抗ＰＶ抗体で標識される例では、ＰＶ細胞における遺伝子発現の選択性は、ＰＶ＋でもあるｅＧＦＰ＋の細胞の割合として測定される。そのようなアッセイでは、ｅＧＦＰ＋でもあるＰＶ＋細胞は、両方の蛍光シグナルのオーバーラップ、すなわち、赤色および緑色の蛍光のオーバーラップによって示される。そのような測定、分析、および／または検出は、目視検査またはコンピュータによって行うことができる。
【００７２】
一部の事例では、導入遺伝子を発現する目的の細胞型（または標的細胞型）の割合を、導入遺伝子を発現する非標的細胞型（または他の細胞）の割合と比較して測定して、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントの選択性を評価することもできる。同様に、発現の選択性はまた、１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を発現する標的細胞の数を、導入遺伝子を発現するすべての細胞の総数と比較することによって、測定することができる。いずれのアプローチでも、導入遺伝子を発現する標的細胞の数が多いほど、制御エレメントが標的細胞に対してより選択的である。一部の事例では、標的細胞は、ＰＶニューロンである。
【００７３】
一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型と比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞と比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらし、ここで、非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞は、カルレチニン（ＣＲ）、ソマトスタチン（ＳＯＭ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、またはこれらの組合せを発現するＧＡＢＡ作動性細胞のうちのいずれか１つまたは複数であり得る。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または５つを上回る非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性サブタイプと比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、すべての他の非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞、またはＰＶを発現しないすべての他のＧＡＢＡ作動性細胞、またはＰＶを発現しないすべての他のＣＮＳ細胞、またはＰＶを発現しないすべての他のニューロンと比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、ＣＮＳ内のすべての非ＰＶ細胞またはすべての非ＰＶニューロンと比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。
【００７４】
一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントは、ＰＶ細胞における導入遺伝子の選択的な発現をもたらし、ここで、導入遺伝子を発現するＰＶ細胞の割合は、導入遺伝子が、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または非選択的制御エレメント、たとえば、配列番号３４、もしくはその機能性断片、もしくはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列に作動可能に連結されているＰＶ細胞における遺伝子発現よりも高い割合である。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または非選択的制御エレメント、たとえば、配列番号３４、もしくはその機能性断片、もしくはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列に作動可能に連結された遺伝子の発現と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。
【００７５】
一部の態様では、制御エレメントは、ヒト由来であるか、またはヒト由来である配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、マウス由来であるか、またはマウス由来である配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、天然に存在しない配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、天然に存在しない。一部の事例では、１つまたは複数のヒト由来の制御エレメントを、別の制御エレメントと組み合わせて、天然に存在しない制御エレメントを生成する。一部の事例では、ヒト由来の制御エレメントを、マウス由来の制御エレメントと組み合わせる。
【００７６】
「ヒト由来」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトゲノム（またはヒトゲノムビルド）において見出される配列、またはそれらに相同な配列を指す。相同な配列は、ヒトゲノムの領域と比較して、少なくとも８０％の配列同一性（たとえば、ＢＬＡＳＴによって測定される）を有する領域を有する、配列であり得る。たとえば、ヒト配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同である配列は、ヒト由来と考えられる。一部の事例では、制御エレメントは、ヒト由来の配列および非ヒト由来の配列を含み、結果として、全体としての制御エレメントは、ヒトゲノムに対して低い配列同一性を有するが、一方で、制御エレメントの一部は、ヒトゲノムにおける配列に対して１００％の配列同一性（または局所的な配列同一性）を有する。
【００７７】
一部の事例では、ヒト由来の制御エレメントは、ヒト配列に対して１００％同一である配列である。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントの配列は、１００％ヒト由来である。
【００７８】
他の事例では、制御エレメント配列の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％が、ヒト由来である。たとえば、制御エレメントは、その配列のうちの５０％がヒト由来であり、残りの５０％が、非ヒト由来（たとえば、マウス由来または完全に合成）であり得る。さらなる例として、５０％がヒト由来であるとみなされ、３００ｂｐを含む制御エレメントは、ヒトゲノムにおける配列に対して、全体としては４５％の配列同一性を有し得るが、一方で、ＲＥの塩基対１〜１５０は、同様にサイズ決定したヒトゲノムの領域に対して９０％の同一性（局所的な配列同一性）を有し得る。
【００７９】
一部の事例では、ヒト由来の制御配列に対して相同である配列は、ヒト配列に対して少なくとも９０％同一である。一部の事例では、本明細書における制御エレメントは、配列番号１、２３〜３１、および３３のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。制御エレメントが、配列番号２３〜２９、またはそれらの機能性断片もしくは組合せのうちのいずれか１つまたは複数に対して、相同である（たとえば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性）配列を含む場合、そのような制御エレメントは、制御エレメントを有さない類似のベクターと比較して、作動可能に連結された導入遺伝子のより高度な発現をもたらす（プロモーターもまた、発現ベクターまたはカセットに存在する場合）。導入遺伝子のそのようなより高度な発現は、たとえば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞において観察され得る。
【００８０】
一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、配列番号３３などのリンカー配列ありまたはなしで、配列番号１〜２２のうちのいずれか１つまたは複数と組み合わせるか、またはそれらとの組合せで使用される、配列番号２３〜２９のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の事例では、本開示の任意の２つの制御エレメントは、１〜５０個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドリンカー、たとえば、配列番号３３またはそのバリアントを使用して、一緒に連結されている。一部の事例では、リンカー配列は、ヒト由来の配列である。一部の事例では、リンカー配列は、マウス由来であるかまたは天然に存在しない。一部の事例では、２つの制御エレメントは、リンカーなしまたは任意の介在配列なしで、結合される。一部の事例では、リンカーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、リンカー配列は、制限酵素部位、ライゲーション、ＰＣＲ、および／またはクローニングの結果である。
【００８１】
一部の事例では、ヒト由来の制御エレメントが、マウス由来の制御エレメントと組み合わされ、たとえば、配列番号８（マウス由来の配列）および配列番号２３〜２９（ヒト由来の配列）の組合せである、配列番号３２がある。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、追加のリンカー配列を伴わずに、直接的に組み合わされる。他の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、故意またはクローニングアーチファクトのいずれかであり得る、１つまたは複数の短いリンカー配列を用いて組み合わされる。一部の事例では、リンカー配列は、１〜５０個の塩基を含む。たとえば、配列番号３１は、配列番号１の配列の直後の追加の１９ｂｐのゲノム配列（配列番号３３）とともに、配列番号１および２３〜２９の配列を含む。配列番号３２もまた、これらの１９ｂｐを含むが、配列番号１の配列は含まない。他の例では、組み合わせた細胞型選択的制御エレメントは、クローニングプラスミドまたは制限酵素認識部位に由来する、通常は５０ｂｐを下回る、２０ｂｐを下回る、１５ｂｐを下回る、または１０ｂｐを下回る短い配列を含み得る。
【００８２】
一部の事例では、制御エレメントは、非コーディングＤＮＡ配列に由来し得る。一部の事例では、非コーディングＤＮＡに由来する制御エレメントは、遺伝子、たとえば、上流の配列、イントロン、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびに／または下流の領域と会合されている。他の事例では、非コーディングＤＮＡ配列に由来する制御エレメントは、遺伝子と会合されていない。一部の事例では、制御エレメントは、コーディング配列に由来する。一部の事例では、制御エレメントが由来するゲノム領域は、作動可能に連結される導入遺伝子が由来するゲノム領域とは異なる。一部の事例では、ＲＥは、導入遺伝子が由来するゲノム領域または位置（たとえば、導入遺伝子の天然に存在するかまたは内因性バージョン）に対して、遠位のゲノム領域または位置に由来する。
【００８３】
一態様では、制御エレメントは、遺伝子発現、たとえば、標的細胞における発現の選択性をモジュレートする、任意の非コーディング配列である。一部の事例では、標的細胞は、ＰＶニューロンである。一部の事例では、制御エレメントは、転写開始部位の上流のゲノム配列、５’ＵＴＲ配列、エクソン配列、イントロン配列、または３’ＵＴＲ配列に由来する。一部の事例では、ヒト由来の制御エレメントは、ヒト由来のイントロン配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、エンハンサーを含み、プロモーターと併せて発現カセットにおけるその存在は、エンハンサーなしのプロモーターによる同じ導入遺伝子の発現と比較して、標的細胞型（たとえば、ＰＶニューロン）における作動可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させる。一部の事例では、エンハンサーは、転写機序、転写後機序、または両方のいずれかを通じて、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させる。一部の事例では、制御エレメントは、エンハンサー配列、プロモーター配列、またはエンハンサーおよびプロモーター配列の組合せを含む。一部の事例では、制御エレメントは、ヒト由来のエンハンサー配列、ヒト由来のプロモーター配列、ヒト由来のイントロン配列、および／またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む。
【００８４】
一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜２２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号２３〜２９、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号３０〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号３０〜３２の配列、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００８５】
一部の事例では、制御エレメントは、非ヒトＤＮＡ配列、またはヒトおよび非ヒトゲノム配列の両方に由来する。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントまたはその部分は、哺乳動物ゲノム配列に相同である。一部の事例では、制御エレメントは、哺乳動物ゲノム配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一部の事例では、制御エレメントは、マウスゲノム配列に由来する。一部の事例では、制御エレメントまたはその断片は、マウスゲノム配列または非ヒト哺乳動物ゲノム配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を上回る同一性を有する。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜３３、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかを含み得る。
【００８６】
一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、短い。一部の事例では、制御エレメントのサイズは、導入遺伝子および１つまたは複数の制御エレメントを組み合わせたサイズが、ベクターのクローニング能力を上回ることがないように、ベクター、たとえば、ウイルスベクターまたはｒＡＡＶのクローニング能力と適合性がある。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、最大約２０５０ｂｐ、２０００ｂｐ、１９００ｂｐ、１８００ｂｐ、１７００ｂｐ、１６００ｂｐ、１５００ｂｐ、１４００ｂｐ、１３００ｂｐ、１２００ｂｐ、１１００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、または１００ｂｐの長さを有する。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、約２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１０１０ｂｐ、１０２０ｂｐ、１０３０ｂｐ、１０４０ｂｐ、１０５０ｂｐ、１０６０ｂｐ、１０７０ｂｐ、１０８０ｂｐ、１０９０ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、または２０００ｂｐ以下の全長を有する。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、約１００ｂｐ〜１１００ｂｐ、１００ｂｐ〜１０００ｂｐ、１００ｂｐ〜９００ｂｐ、２００ｂｐ〜９００ｂｐ、２００ｂｐ〜８００ｂｐ、３００ｂｐ〜６００ｂｐ、４００ｂｐ〜８００ｂｐ、５００ｂｐ〜６００ｂｐ、または６００ｂｐ〜９００ｂｐの長さを有する。一部の事例では、制御エレメントは、約４００〜６００ｂｐ、４００〜６００ｂｐ、４００〜７００ｂｐ、４００〜８００ｂｐ、４００〜９００ｂｐ、４００〜１０００ｂｐ、または４００〜１５００ｂｐである。一部の事例では、制御エレメントは、約５００〜６００ｂｐ、５００〜７００ｂｐ、５００〜８００ｂｐ、５００〜９００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、または５００〜１５００ｂｐである。一部の事例では、２つまたはそれを上回る制御エレメントを組み合わせて、１３００〜２５００ｂｐ、１３００〜２０６０ｂｐ、約１３５０ｂｐ、約２０５０ｂｐ、または約１８８０ｂｐのより大きな細胞型選択的制御エレメントが形成される。
【００８７】
一部の事例では、２つまたはそれを上回る細胞型選択的制御エレメントを、組み合わせることができる。たとえば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれよりも多くの細胞型選択的制御エレメントを、組み合わせることができる。たとえば、配列番号３０は、７つの制御エレメント、すなわち、配列番号２３〜２９から得られた配列を含み、これらのすべては、ヒトゲノム配列に由来する。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、ＰＶニューロン選択的制御エレメントを指す。
【００８８】
一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントを、２回またはそれを上回って反復させて、同様に細胞型選択的であるか、または強化された細胞型選択特性を有する、組み合わされた制御エレメントを作製する。一部の事例では、異なる細胞型選択性を有する２つまたはそれを上回る制御エレメントを組み合わせる。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントを、非選択的制御エレメント、たとえば、高度な遺伝子発現を発動させる非選択的エンハンサーエレメントと組み合わせる。たとえば、標的細胞に対する高い選択性を有するプロモーター制御エレメントを、高効率の発現を有する制御エレメントと組み合わせることができる。一部の事例では、１つまたは複数の細胞型選択的制御エレメントを、１つまたは複数の高効率制御エレメントと組み合わせる。たとえば、配列番号１〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を、構成的プロモーター、たとえば、ＧＡＤ２プロモーター、ヒトシナプシンプロモーター、ｍｉｎＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックス、スーパーコアプロモーター、もしくはＥＦ１αプロモーター、またはこれらの組合せと組み合わせることができる。
【００８９】
一部の態様では、本開示は、１つまたは複数の非標的細胞型、たとえば、興奮性細胞および／または非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞を含むがこれらに限定されない非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比べて、標的細胞型、たとえば、ＰＶニューロンにおける選択的な遺伝子発現をもたらすように、任意の遺伝子療法に付加することができる制御エレメントの一覧を提供する。
【００９０】
一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントを、他の制御エレメント、たとえば、高発現プロモーターまたはｍＲＮＡ安定性を増加させる配列と組み合わせることができる。一部の事例では、１つまたは複数の細胞型選択的制御エレメントを、ヒト、非ヒト、または非哺乳動物配列、たとえば、ｈＳｙｎ１プロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ポリＡシグナル（たとえば、ＳＶ４０ポリＡシグナル）、または転写後制御エレメント、たとえば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）と組み合わせる。
【００９１】
一部の事例では、組み合わせる制御エレメントは、異なる種に由来し得る。組み合わせる制御エレメントは、種内の異なるゲノム領域に由来し得る。一部の事例では、制御エレメントは、遠位ゲノム配列に由来する、たとえば、通常または天然には、互いにまたは目的の細胞型と関連しない配列が、組み合わされる。一部の事例では、組み合わされた制御エレメントを作製するために使用される個々の制御エレメントは、異なるヒト染色体に由来し得る。
【００９２】
一態様では、本開示の制御エレメントは、配列番号１〜３２、またはそれらの組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかの機能性断片を含む。そのような機能性断片は、制御エレメントを有さない同様の発現カセットまたはベクターと比較した場合に、発現カセットまたはベクター内の導入遺伝子の発現を増加させることができる。そのような機能性断片は、断片を導入遺伝子に作動可能に連結した場合に、機能性断片を有さない同様のベクターまたはカセットと比較して、細胞型選択的な発現を増加させるエンハンサーとして機能し得る。断片は、好ましくは、長さが３０、４０、５０、または６０ｂｐを上回る。
【００９３】
一部の事例では、本開示のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは任意の制御エレメントは、配列番号１〜３２、（ｉｉ）配列番号１〜３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のうちのいずれかの配列の機能性断片、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および／もしくは（ｉｉｉ）のうちのいずれかの配列の組合せのうちのいずれか１つを含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。一部の事例では、配列番号１〜２９、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの２つまたはそれよりも多くが、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比較してＰＶ細胞における、または非標的細胞型と比較して任意の標的細胞型における、導入遺伝子の発現を選択的に増加させるための制御エレメントとして使用される。一部の事例では、機能性断片は、１つまたは複数の非標的細胞型と比べて、標的細胞型における選択的な発現をもたらすものである。
【００９４】
一部の事例では、制御エレメントの２つまたはそれを上回るコピー、たとえば、配列番号１〜２９、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つの、２つまたはそれを上回るコピーを、標的細胞における選択的な発現を強化するために使用することができる。
【００９５】
他の事例では、配列番号１〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数は、標的細胞における選択的な発現をさらに増加させるために、別の制御エレメント、たとえば、プロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結される。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを付加して、非標的細胞と比較して、標的細胞における遺伝子療法による発現を改善または増加させることによって、任意の遺伝子療法を強化することができる。一部の事例では、標的細胞は、パルブアルブミンを発現する、ＰＶニューロンまたはＧＡＢＡ作動性細胞である。
【００９６】
一部の態様では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数）は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または５つを上回る非標的細胞型と比べて、標的細胞型に対する細胞型選択性を示す。一部の事例では、制御エレメントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは５つを上回る非標的サブタイプ、または細胞のすべての他の公知のサブタイプと比べて、標的細胞サブタイプにおける選択的な発現または優先的な発現を発動させる。たとえば、ＧＡＢＡ作動性細胞は、ＰＶ細胞を含め、異なるサブタイプを含む。一部の事例では、標的細胞型は、ＰＶ細胞である。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または５つを上回る非標的細胞型と比べて、ＰＶ細胞に選択的である。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、すべての他の公知のＣＮＳ細胞型と比べて、ＰＶ細胞に選択的である。
【００９７】
一部の事例では、配列番号１〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を、配列番号１〜３２、またはそれらの断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。一部の事例では、そのような組み合わされた制御エレメントは、１〜５０個のヌクレオチドのリンカーを使用して、連結されている。一部の事例では、そのような組み合わされた制御エレメントは、連結されていない。
【００９８】
一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、任意の導入遺伝子（たとえば、レポーター導入遺伝子または治療用導入遺伝子）に作動可能に連結されると、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された場合にＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、もしくは非選択的制御エレメント（たとえば、配列番号３４、またはその断片、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）によって発動されるか、または制御エレメントを有さない同じ構築物によって発動される発現よりも、統計学的に有意に高いレベルで、少なくとも１つの標的細胞型における選択的な発現または優先的な発現を発動させる。一部の事例では、統計学的に有意に高いとは、制御エレメントが、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された場合のＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、もしくは非選択的制御エレメントによる発現レベル、または制御エレメントを有さない同じ構築物による発現レベルの、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００倍であるレベルで、標的細胞型における選択的な発現を発動させることを意味する。一部の事例では、そのような細胞型選択的な発現は、本明細書に記載される共局在アッセイを使用してアッセイされる。一部の事例では、標的細胞型は、パルブアルブミン細胞である。一部の事例では、そのような共局在アッセイは、抗ＰＶ抗体を使用して行われる。一部の事例では、そのような共局在アッセイは、本明細書に開示されるＰＶ−Ｃｒｅマウスを使用して行われる。一部の事例では、非選択的制御エレメントは、配列番号３４、またはその断片、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。
【００９９】
発現カセット
「発現カセット」および「核酸カセット」という用語は、ポリヌクレオチド分子または核酸配列を指して、互換可能に使用される。一部の事例では、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、本明細書に開示される１つまたは複数の細胞型選択的制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、本明細書に開示される１つまたは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、プロモーターをさらに含む。一部の事例では、発現カセットは、配列番号１〜３２のうちの１つもしくは複数の配列、および／またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、発現カセットは、配列番号１〜３２、（ｉｉ）配列番号１〜３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のうちのいずれかの配列の機能性断片、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および／もしくは（ｉｉｉ）のうちのいずれかの配列の組合せのうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。一部の事例では、制御エレメントは、発現カセットにおいて、導入遺伝子の上流に位置する。一部の事例では、制御エレメントは、発現カセットにおいて、導入遺伝子の下流に位置する。一部の事例では、発現カセットは、プロモーター、たとえば、ｈＳｙｎ１プロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ポリＡシグナル（たとえば、ＳＶ４０ポリＡシグナル）、または転写後制御エレメント、たとえば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。
【０１００】
一部の態様では、本明細書に記載される１つまたは複数の制御エレメントは、発現カセットにおいて、導入遺伝子に作動可能に連結されている。一部の事例では、遺伝子療法剤は、標的組織または細胞型、たとえば、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現をもたらすために、１つもしくはそれを上回る、２つもしくはそれを上回る、３つもしくはそれを上回る、４つもしくはそれを上回る、または５つもしくはそれを上回る本開示の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含む、発現カセットを含む。一部の事例では、発現カセットは、導入遺伝子、たとえば、レポーター遺伝子、ｅＧＦＰ、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントを含む。
【０１０１】
一部の事例では、発現カセットは、遺伝子療法を介する送達に適合される。一部の事例では、発現カセットは、直鎖状または環状の構築物である。一部の事例では、発現カセットは、プラスミド、ベクター、ウイルスベクター、またはｒＡＡＶの一部である。
【０１０２】
一部の事例では、遺伝子療法剤（gene  therapy）は、それを必要とする被験体のＣＮＳに直接的に、または注射および／もしくは注入によって全身的に、投与される。一部の事例では、そのような被験体は、ハプロ不全または遺伝的変異、たとえば、以下の遺伝子：ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１のうちのいずれか１つにおけるハプロ不全または変異と関連する疾患または状態と診断されている。一部の事例では、被験体は、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんの危険性があるか、またはそれらを有する。一部の事例では、そのような遺伝子療法剤は、ウイルスまたはウイルスベクター、たとえば、ｒＡＡＶを使用して、送達される。一部の事例では、ＣＮＳ細胞に対する指向性および／または血液脳関門を越える能力を有するＡＡＶ血清型、たとえば、ＡＡＶ９またはそのバリアントが使用される。
【０１０３】
一部の事例では、発現カセットにおいて、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜３２、またはその断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数）は、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比較して、または対照エレメント、たとえば、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、もしくは非選択的制御エレメント（たとえば、配列番号３４、もしくはその機能性断片、もしくはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）と比較して、ＰＶ細胞における選択的な遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子を発現するすべての細胞のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＶニューロンである状態をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、ＣＮＳ内のＰＶニューロンの天然の分布に予測されるものよりも、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、７．５倍、８倍、９倍、または１０倍高い、ＰＶニューロンにおける選択的な遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、ＰＶ細胞における選択的な発現を発動させ、ここで、導入遺伝子を発現するＰＶ細胞の割合は、ＣＮＳ内の予測されるＰＶ細胞の分布よりも、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、もしくは少なくとも１０倍高いか、または導入遺伝子を、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または配列番号３４の配列、もしくはその機能性断片、もしくはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する非選択的制御エレメントに作動可能に連結した場合、および免疫組織化学的共局在アッセイにおいて測定した場合の、ＰＶ細胞における発現よりも、少なくとも１〜５％、５％〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、もしくは９０〜９５％高い、割合である。一部の事例では、発現カセットにおける制御エレメント、または発現カセットにおけるそのような制御エレメントの使用は、ＰＶ細胞、またはＣＮＳ内のＰＶ細胞、またはＰＶニューロンにおける選択的な遺伝子発現をもたらし、ここで、導入遺伝子を発現する細胞のうちの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、ＰＶ陽性である。
【０１０４】
一部の事例では、発現カセットまたは遺伝子療法剤は、１つもしくはそれを上回る、２つもしくはそれを上回る、３つもしくはそれを上回る、４つもしくはそれを上回る、５つもしくはそれを上回る、６つもしくはそれを上回る、７つもしくはそれを上回る、８つもしくはそれを上回る、９つもしくはそれを上回る、または１０個もしくはそれを上回る、表１に記載される制御エレメント、たとえば、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１０５】
一部の事例では、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントは、発現カセットにおいて、任意の導入遺伝子に作動可能に連結されている。一部の事例では、発現カセットは、遺伝子療法剤である。一部の事例では、発現カセットは、ベクターまたはプラスミド、たとえば、ウイルスベクターまたはｒＡＡＶベクターの一部である。一部の事例では、発現カセットは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶＤＪ、またはそれらのバリアントもしくはハイブリッドの一部である。一部の事例では、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＡＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質（たとえば、内因性遺伝子の転写モジュレーター）、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。一部の事例では、そのような制御エレメントは、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型と比較して、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現を増加させる。一部の事例では、そのような制御エレメントは、標的細胞型、たとえば、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の発現を選択的に増加させる。一部の事例では、標的細胞型は、ＰＶ細胞である。
【０１０６】
体細胞の遺伝子療法に関して、本明細書に企図される技法としては、ウイルスベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルパー依存性アデノウイルス系、ハイブリッドアデノウイルス系、単純ヘルペス、ポックスウイルス、レンチウイルス、およびエプスタイン・バーウイルス）を介した送達、ならびに非ウイルス系、たとえば、物理系（ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ衝突、電気穿孔、流体力学、超音波、およびマグネトフェクション）、ならびに化学系（カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマー、および脂質ポリマー）が挙げられる。
【０１０７】
ベクターまたはウイルス発現ベクターのクローニング能力は、大きな導入遺伝子の発現にとって、特に問題である。たとえば、ＡＡＶベクターは、典型的に、約４．８ｋｂのパッケージング能力を有し、レンチウイルスは、典型的に、約８ｋｂの能力を有し、アデノウイルスは、典型的に、約７．５ｋｂの能力を有し、アルファウイルスは、典型的に、約７．５ｋｂの能力を有する。一部のウイルスは、より大きなパッケージング能力を有し得、たとえば、ヘルペスウイルスは、３０ｋｂを上回る能力を有し得、ワクシニアは、約２５ｋｂの能力を有し得る。遺伝子療法にＡＡＶを使用する利点としては、病原性が低いこと、宿主ゲノムに組み込まれる頻度が非常に低いこと、ならびに分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力が挙げられる。
【０１０８】
ある特定のウイルスベクターのサイズに関する制約に対処するため、またはウイルスベクターからの発現を改善するために、本開示は、長さが２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、または１１０ｂｐよりも短いが、少なくとも１０ｂｐ、５０ｂｐ、または１００ｂｐである、制御エレメントの使用を企図する。一部の事例では、組み合わされた制御エレメントのサイズは、約２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１４００ｂｐ、１３００ｂｐ、１２００ｂｐ、１１００ｂｐ、または１０００ｂｐである。一部の事例では、それぞれの組み合わされた制御エレメントは、約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、または２５００ｂｐの全長を有する。一部の事例では、組み合わされたＲＥのサイズは、約２００ｂｐ〜３０００ｂｐ、２００ｂｐ〜２５００ｂｐ、２００ｂｐ〜２１００ｂｐ、５００ｂｐ〜２５００ｂｐ、１０００ｂｐ〜２５００ｂｐ、１５００ｂｐ〜２５００ｂｐ、１５００ｂ〜２０００ｂｐ、または２０００ｂｐ〜２５００ｂｐの全長を有する。
【０１０９】
一部の事例では、本開示の制御エレメントは、好ましくは、（ｉ）目的の細胞型、たとえば、ＰＶ細胞において発現を選択的に発動させるもの、（ｉｉ）ヒト由来の配列を含むもの、および（ｉｉｉ）２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、または１ｋｂよりも小さいものである。
【０１１０】
発現カセットもまた、本明細書において企図され、これは、環状または直鎖状の核酸分子であり得る。一部の事例では、発現カセットは、ベクター（たとえば、発現ベクター）において、細胞（たとえば、標的細胞もしくは細胞型および／または非標的細胞型を含む複数の異なる細胞または細胞型）に送達される。ベクターは、発現カセットおよび／または導入遺伝子を細胞のゲノムに組み込むベクターの能力に言及して、組込みベクターであっても非組込みベクターであってもよい。組込みベクターであっても非組込みベクターであっても、制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを送達するために使用することができる。ベクターの例としては、（ａ）非ウイルスベクター、たとえば、直鎖状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター；人工染色体、たとえば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）；エピソームベクター；トランスポゾン（たとえば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）、ならびに（ｂ）ウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびＡＡＶベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは、ある特定の標的細胞または組織に対する高い感染性および／または指向性を含め、核酸の送達に関していくつかの利点を有する。一部の事例では、ウイルスは、本明細書に記載されるように、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントを含む核酸分子または発現カセットを送達するために使用される。
【０１１１】
ウイルス遺伝子療法ベクターまたは遺伝子送達ベクターの好ましい特徴としては、再生可能であり、高い力価で安定に繁殖および精製する能力、標的化された送達を媒介する能力（たとえば、ベクターが他の場所に広く散らばることも標的外送達も伴うことなく、目的の組織または臓器に特異的に導入遺伝子を送達する能力）、ならびに有害な副作用または標的外作用を誘導することなく、遺伝子の送達および／または導入遺伝子の発現を媒介する能力が挙げられる。可能性のある有害な副作用を回避するために、標的化された発現または組織／細胞型選択的な発現は、細胞型選択的制御エレメント、たとえば、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数、エンハンサー、プロモーター、安定性エレメント、ＵＴＲ、またはこれらの組合せの制御下に、導入遺伝子を置くことによって、達成することができる。たとえば、ウイルスベクターを含むウイルス粒子は、多数の異なる細胞型に感染するように設計することができるが、導入遺伝子の発現は、目的の細胞型（たとえば、ＰＶニューロン）において強化および／または最適化され、導入遺伝子の発現は、他の非標的細胞型（たとえば、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞）において低減および／または最小化される。異なる細胞型における導入遺伝子の差次的発現は、１つまたは複数の細胞型に選択的な異なる転写因子または制御エレメントを使用して、制御、工学的に操作、または操作することができる。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメント、たとえば、プロモーターもしくはエンハンサー、またはそれらの組合せは、導入遺伝子の組織または細胞選択的な発現を発動させるために、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、遺伝子療法剤またはベクターにおいて使用される１つまたは複数の制御エレメントは、細胞型選択的な様式で、遺伝子発現を発動させる、すなわち、標的細胞、細胞型、もしくは組織における選択的な遺伝子発現をもたらす、かつ／または１つもしくは複数の（たとえば、少なくとも１つ、２つ、３つ、もしくは４つの）標的外細胞もしくは細胞型における遺伝子発現を発動させない。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントは、標的細胞、細胞型、または組織における導入遺伝子の選択的な発現を強化し、一方で、１つまたは複数の制御エレメントは、標的外細胞、細胞型、もしくは組織における導入遺伝子の発現を抑制するか、または１つもしくは複数の標的外細胞、細胞型、もしくは組織における有意に低い、僅少な、もしくは統計学的に低い、遺伝子発現をもたらす。
【０１１２】
非病原性パルボウイルスであるＡＡＶのいくつかの血清型が、遺伝子送達の目的で工学的に操作されており、そのうちのいくつかは、ある特定の組織または細胞型に対する指向性を有することが公知である。様々な遺伝子療法適用に使用されるウイルスは、被験体または宿主において、複製欠損となるか、または低い毒性および低い病原性を有するように、工学的に操作され得る。そのようなウイルスに基づくベクターは、ウイルスゲノムからコーディング領域のすべてまたは一部を欠失させ、ベクターゲノムをウイルスキャプシドにパッケージングすることまたはベクター核酸（たとえば、ＤＮＡ）の宿主クロマチンへの組込みなどの機能に必要とされる配列（たとえば、末端逆位反復配列）をインタクトなまま残すことによって、得ることができる。導入遺伝子を含む発現カセットは、たとえば、ウイルス骨格、たとえば、ウイルス遺伝子が欠如した修飾または工学的に操作されたウイルス骨格にクローニングすることができ、追加のベクター（たとえば、パッケージングベクター）と併せて使用することができ、これらは、たとえば、コトランスフェクションを行うと、組換えウイルスベクター粒子を産生することができる。一部の事例では、血液脳関門を越えることができるか、またはＣＮＳの細胞に感染することができる、ＡＡＶ血清型が、好ましい。一部の事例では、ＡＡＶ９またはそのバリアントが、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＰＶ選択的制御エレメントを含む本開示の発現カセットを送達するために使用される。
【０１１３】
本明細書に記載されるように、遺伝子療法、たとえば、ｒＡＡＶを使用して、本開示の発現カセットを送達することの１つの利点は、そのような療法が、より標的化された持続的な治療効果を長時間にわたり提供できることである。加えて、ウイルス遺伝子療法は、非標的細胞型または組織よりも、目的の細胞型または組織に対して指向性を有するように工学的に操作することができる。たとえば、ウイルス遺伝子療法は、ＣＮＳ内の１つまたは複数の領域、組織、または細胞型（たとえば、ＰＶ細胞）に、感染し、ペイロードまたは治療剤、たとえば、転写モジュレーターまたは導入遺伝子を送達しながら、標的外組織または細胞型（たとえば、非ＣＮＳ組織または細胞型、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞）に対して最小限の作用を有するように、工学的に操作することができる。一部の事例では、ウイルス遺伝子療法は、血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達し、かつ／またはＣＮＳ内の特定の領域もしくは組織（たとえば、海馬）、またはＣＮＳ内の細胞型、たとえば、ＰＶ細胞を標的とするように、工学的に操作することができる。
【０１１４】
一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントおよび導入遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞、細胞型、または組織に送達するために使用されるＡＡＶベクターもしくはＡＡＶウイルス粒子、またはビリオンは、好ましくは、複製欠損性である。一部の事例では、ＡＡＶウイルスは、ヘルパー因子の存在下においてのみ複製し、ビリオンを生成することができるように、工学的に操作または遺伝子修飾される。
【０１１５】
一部の事例では、発現カセットは、ＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）による送達のために設計される。一部の事例では、発現カセットは、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達される。一部の事例では、より大きな導入遺伝子、すなわち、ＡＡＶのクローニング能力を上回る遺伝子は、好ましくは、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達される。
【０１１６】
本明細書に記載される組成物および方法において使用されるＡＡＶは、ハイブリッドまたはキメラのＡＡＶ血清型を含む、任意の血清型のものであり得る（たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶＤＪ）。一部の事例では、ＡＡＶは、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比較してＰＶニューロンに選択的である１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を送達および／または発現させるために使用される。一部の事例では、ＣＮＳ細胞に対して高い指向性を有し、かつ／または血液脳関門を越える、ＡＡＶが、使用される。一部の事例では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶＤＪを使用して、本明細書に記載される発現カセットを送達する。
【０１１７】
一部の事例では、発現カセットは、遺伝子におけるハプロ不全と関連する疾患または状態においてなど、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現が不十分であることが判明している導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、電位依存性イオンチャネル（たとえば、ナトリウムイオンチャネルもしくはカリウムイオンチャネル）、神経伝達物質制御因子、またはそれらのサブユニットもしくは機能性断片である。一部の態様では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、イオンチャネル、神経伝達物質制御因子、またはイオンチャネルもしくは神経伝達物質制御因子のサブユニットである。一部の事例では、導入遺伝子は、１つまたは複数の亜鉛フィンガーを含むＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓファミリータンパク質、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（もしくはｄＣａｓ９）、ｄＣａｓファミリータンパク質、または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）のドメインを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ９を含む。
【０１１８】
一部の態様では、導入遺伝子は、電位依存性イオンチャネルまたはそのサブユニット、たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、もしくはＫＶ３．３、またはそれらの機能性断片もしくはバリアントである。一部の事例では、導入遺伝子は、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットである。一部の事例では、導入遺伝子は、ナトリウムイオンチャネルのベータサブユニットである。一部の態様では、神経伝達物質制御因子は、ＳＴＸＢＰ１またはその機能性断片もしくはバリアントである。
【０１１９】
一部の態様では、発現カセットは、ウイルスベクター、たとえば、ＡＡＶとして送達される。一部の態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＤＪ、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である。一部の態様では、本開示の発現カセットを含む遺伝子療法剤は、それを必要とする被験体（たとえば、ヒト患者、哺乳動物、トランスジェニック動物、または動物モデル）に投与される。一部の事例では、それを必要とする被験体は、アルツハイマー病、ドラベ症候群、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんの症状を有するか、これらと診断されているか、またはこれらを発症する危険性がある。一部の事例では、それを必要とする被験体は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１のうちのいずれか１つまたは複数において、不十分な遺伝子発現または変異を有する。
【０１２０】
一部の事例では、遺伝子療法剤、たとえば、ｒＡＡＶ９は、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントを含む、発現カセットを送達するために使用され、ここで、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらの機能性断片、またはＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、もしくはそれらの機能性断片のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列である。一部の事例では、導入遺伝子は、以下の表２に提供されるように、配列番号３７〜４３、またはそれらの機能性断片のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１２１】
一部の事例では、導入遺伝子は、配列番号３６〜４３、またはそれらの機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、発現カセットにおいて、配列番号３６〜４３、またはそれらの機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つに作動可能に連結されている。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１２２】
一部の事例では、１つまたは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントは、配列番号１〜３２の配列、それらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を含む配列を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。一部の事例では、そのような遺伝子療法は、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、ドラベ症候群、および／またはアルツハイマー病を処置するために使用される。一部の事例では、そのような遺伝子療法は、ドラベ症候群および／またはアルツハイマー病と関連するてんかんおよび／またはけいれんを処置するために使用される。一部の事例では、本明細書に記載される遺伝子療法剤を使用した処置により、けいれんの頻度および／または期間の低減がもたらされる。一部の事例では、本明細書に記載される遺伝子療法剤を使用した処置により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能性ナトリウムウイオンチャネル、機能性カリウムイオンチャネル、または機能性神経伝達物質制御因子の形成の増加がもたらされる。
【０１２３】
一部の事例では、ＡＡＶ血清型１、８、および／もしくは９、またはそれらのハイブリッドを、ＰＶ細胞における選択的な発現を標的とするために、本明細書に記載される発現カセットとともに使用することができる。一部の事例では、ＡＡＶによる送達のために設計される発現カセットは、５’ＩＴＲ、１つまたは複数の細胞型選択的制御エレメント、必要に応じてエンハンサー、必要に応じてミニマルプロモーター、導入遺伝子、必要に応じて１つまたは複数のイントロン、必要に応じてポリＡシグナル、および３’ＩＴＲを含む。一部の事例では、発現カセットは、５’ＩＴＲ、２つの細胞型選択的ＲＥ、基本プロモーター、導入遺伝子、１つまたは複数の転写後ＲＮＡ制御エレメント、および３’ＩＴＲを含み得る。
【０１２４】
例示的なＡＡＶ発現カセットは、図７に図示されている。一部の事例では、発現カセットは、５’ＡＡＶ  ＩＴＲ、エンハンサー（たとえば、ＰＶ細胞選択的なエンハンサーまたは１つもしくは複数の組み合わされた制御エレメント）、プロモーター（たとえば、１つまたは複数のＰＶ細胞選択的プロモーターまたは制御エレメント）、導入遺伝子（たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、またはＤＮＡ結合タンパク質）、転写後制御エレメント、および３’ＡＡＶ  ＩＴＲを含む。プロモーターは、ＰＶ細胞選択的であってもよく、または構成的プロモーターであってもよい。一部の事例では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子、たとえば、ｅＧＦＰ、ＲＦＰ、または蛍光マーカーのコーディング配列である。他の事例では、導入遺伝子は、遺伝子発現をモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質である。
【０１２５】
一部の事例では、導入遺伝子は、治療用導入遺伝子、たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、もしくはＤＮＡ結合タンパク質、または機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のコーディング配列である。転写後制御エレメントは、ｍＲＮＡからのタンパク質の発現またはＲＮＡの安定性に影響を及ぼす任意の配列、たとえば、イントロン、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、またはウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメントであり得る。一部の事例では、転写後制御エレメントは、２つまたはそれを上回る転写後制御エレメントの組合せである。
【０１２６】
発現カセットは、最適化された治療用レトロウイルスベクター、たとえば、レンチウイルスベクターによる送達用に設計することができる。レトロウイルスベクターは、左端（５’）ＬＴＲ；ウイルス、少なくとも１つの細胞型選択的制御エレメント、必要に応じてレンチウイルス逆転応答エレメント（ＲＲＥ）のパッケージングおよび／または核内移行を補助する配列；必要に応じてプロモーターまたはその活性部分；１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子；必要に応じてインシュレーター；ならびに右端（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、レンチウイルスベクターであり得る。
【０１２７】
一部の事例では、発現カセットは、本明細書に開示される１つまたは複数の細胞型選択的制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、組み合わされた２つまたはそれを上回る制御エレメントを含む。一部の例では、発現カセットは、組み合わされていない２つまたはそれを上回る制御エレメント、たとえば、導入遺伝子の上流のプロモーターおよび導入遺伝子の下流に位置するエンハンサーまたは安定性エレメントを含む。
【０１２８】
一部の事例では、発現カセットは、目的の細胞型における選択的活性を有する推定上の細胞型選択的制御エレメント、たとえば、推定上のＰＶ細胞選択的制御エレメントを含む。推定上の制御エレメントを含む発現カセットを、ウイルスベクターにパッケージングし、動物モデルにトランスフェクトして、推定上の細胞型選択的制御エレメントの活性を評価することができる。一部の事例では、推定上の細胞型選択的制御エレメントは、推定上の細胞型選択的制御エレメントを含むベクターを、標的細胞または細胞型を含む複数の細胞または細胞型に送達し、次いで、推定上の制御エレメントの細胞型選択的活性を、対照の制御エレメント、たとえば、構成的プロモーターもしくは制御エレメント、またはこれまでに知られている制御エレメントと比較することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて評価することができる。
【０１２９】
一部の事例では、選択的な発現は、治療用部分または導入遺伝子を、目的の細胞型（または目的の組織型）、たとえば、ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおいて、選択的に発現させるために使用される。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された細胞型選択的制御エレメントを含むベクターは、１つもしくは複数の（たとえば、少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくは５つの）他の細胞、細胞型、組織、もしくは組織型と比較して、目的の細胞型における導入遺伝子の選択的な発現の増加をもたらすか、または１つもしくは複数の細胞もしくは細胞型、たとえば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非標的細胞型と比較して、目的の細胞型における導入遺伝子の優先的な発現をもたらす。
【０１３０】
任意の公知の技法を使用して、制御エレメントおよび導入遺伝子、または制御エレメントおよび導入遺伝子を含む組成物を、目的の細胞（または標的細胞もしくは細胞型）に送達して、細胞型選択的な様式で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおける導入遺伝子の発現をもたらすか、または誘導することができる。
【０１３１】
本開示の細胞型選択的制御エレメントを含む発現カセットは、１つまたは複数の導入遺伝子をさらに含む。導入遺伝子は、タンパク質コーディング遺伝子であり得る。一部の事例では、発現カセットは、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、不在もしくは欠陥のある遺伝子を置き換えるか、または細胞内のタンパク質の発現欠損を補うことができる。導入遺伝子は、細胞シグナル伝達経路に関与し得る。一部の事例では、導入遺伝子は、野生型タンパク質、その機能性断片、強化された治療特性、たとえば、強化された活性を有するバリアントまたは変異体タンパク質をコードし得る。一部の事例では、導入遺伝子は、１つまたは亜鉛フィンガーまたはｄＣａｓ９のドメインを含むＤＮＡ結合タンパク質、イオンチャネル、たとえば、カリウムイオンチャネルもしくはナトリウムイオンチャネルまたはそれらのサブユニット、神経伝達物質因子または神経伝達物質制御因子をコードし得る。一部の事例では、導入遺伝子は、イオンチャネルサブユニット、そのバリアント、または変異体をコードし得る。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ９を含む。
【０１３２】
本明細書に開示される制御エレメントは、発現ベクターまたはカセット内の任意の位置に位置することができる。たとえば、制御エレメントは、エンハンサーの上流、エンハンサーの下流であるが、プロモーターの上流、導入遺伝子の５’ＵＴＲ内、導入遺伝子のイントロン内、導入遺伝子の３’ＵＴＲ内、または導入遺伝子の下流に位置し得る。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、作動可能に連結された導入遺伝子の上流または下流に位置する。
【０１３３】
一部の例では、本開示の制御エレメントは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、標的細胞型（たとえば、ＰＶ細胞）において、少なくとも０．５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、または３ＩＵ／ｍｌであるレベルで、作動可能に連結された導入遺伝子の選択的な発現をもたらす。一部の事例では、導入遺伝子の発現を増加させる制御エレメントの能力は、マウスにおいて評価することができ、その場合、マウス全体での導入遺伝子の発現の総量および／または導入遺伝子の発現を有する細胞型もしくは組織型の総数が、測定される。
【０１３４】
発現カセットまたはベクターの活性を評価するとき、活性または発現は、単位用量当たりの活性もしくは発現レベルとして表すことができるか、または細胞、マウス、もしくは被験体に投与もしくは送達された発現カセットもしくはベクターの用量に対して正規化され得る。一部の事例では、導入遺伝子の発現または活性は、制御エレメントありまたはなしでの様々な発現ベクターまたはカセットにわたる比較を可能にするために、使用されたプラスミドもしくはＤＮＡの量に対して正規化されるか（たとえば、１マウス当たりのμｇ／ｋｇ）、またはウイルス粒子の量に対して正規化される（たとえば、１マウスもしくは被験体当たりのゲノムコピーの量／ｋｇに対して正規化される）。たとえば、マウスにおける制御エレメントの活性を評価する場合、アッセイしたＰＶ細胞における選択的な発現または活性は、１マウス当たり、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは１０を上回るか、または７２０μｇの発現ベクター、カセット、またはプラスミドの用量に対して、正規化され得る。一部の事例では、発現レベルまたは活性は、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ｇｃ／ｋｇの、１マウス当たりの本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットを含むウイルス粒子に対して、正規化され得る。
【０１３５】
一部の態様では、発現カセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または５つを上回る非標的細胞型と比べて、標的細胞型における導入遺伝子の細胞型選択的な発現、または優先的な発現をもたらすように、導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数）を含む。一部の事例では、発現カセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは５つを上回る非標的サブタイプ、またはすべての他の公知の細胞サブタイプと比べて、標的細胞サブタイプにおける細胞型選択的な発現または優先的な発現をもたらすように、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１、またはそれらの機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子（たとえば、内因性ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．２、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１）をモジュレートする、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、配列番号３６〜４３、またはそれらの機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである。一部の事例では、導入遺伝子は、転写モジュレーターである。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、Ｃａｓファミリータンパク質、Ｃａｓ９、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。一部の事例では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子または蛍光マーカーである。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットは、ウイルスベクターに含まれる。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットは、ｒＡＡＶ、たとえば、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶＤＪにパッケージングされる。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットは、遺伝子療法剤として細胞に送達される。一部の事例では、本明細書に開示される遺伝子療法剤は、被験体、好ましくはヒトまたは哺乳動物に、送達される。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットは、神経学的状態または疾患、たとえば、てんかん、神経変性疾患、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、ドラベ症候群、またはアルツハイマー病を処置するために使用される。
【０１３６】
一部の事例では、発現カセット（たとえば、遺伝子療法剤、ウイルスベクター、ベクター、またはプラスミド）は、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の事例では、そのような組み合わされた制御エレメントは、１〜５０個のヌクレオチドのリンカーを使用して、連結されている。一部の事例では、そのような組み合わされた制御エレメントは、連結されていない。一部の事例では、２つまたはそれを上回る制御エレメントは、プロモーターの上流および／または下流に位置する。一部の事例では、２つまたはそれを上回る制御エレメントは、導入遺伝子の上流および／または下流に位置する。
【０１３７】
一部の事例では、発現カセットは、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含み、任意の導入遺伝子（たとえば、レポーター導入遺伝子または治療用導入遺伝子）に作動可能に連結されると、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された場合にＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター、もしくは非選択的制御エレメントによって発動されるか、または制御エレメントを有さない同じ構築物によって発動される発現よりも、統計学的に有意に高いレベルで、少なくとも１つの標的細胞型における選択的な発現または優先的な発現を発動させる。一部の事例では、統計学的に有意に高いとは、制御エレメントが、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された場合の標的細胞型におけるＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター、もしくは非選択的制御エレメントによる発現レベル、または制御エレメントを有さない同じ構築物による発現レベルの、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００倍であるレベルで、標的細胞型における選択的な発現を発動させることを意味する。一部の事例では、そのような細胞型選択的な発現は、本明細書に記載される共局在アッセイを使用してアッセイされる。
【０１３８】
他の態様では、本明細書に開示される任意の導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含む、発現カセットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または５つを上回る非標的細胞型または非標的サブタイプと比べて、標的細胞型における導入遺伝子の選択的な発現または優先的な発現をもたらす。
【０１３９】
一部の事例では、標的細胞型は、ＰＶ細胞である。一部の事例では、非標的細胞サブタイプは、本明細書に開示される非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性サブタイプのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つである。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントを含む発現カセットは、すべての非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞またはすべての非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比べて、ＰＶ細胞に選択的である。一部の事例では、細胞型選択性は、本明細書に開示される共局在アッセイに従って測定される。一部の事例では、細胞型選択性は、標的細胞型においてＣｒｅを発現するマウスを使用して、測定される。
【０１４０】
パルブアルブミン（ＰＶ）ニューロン
ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＣＮＳにおける主要な抑制性神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する。ＧＡＢＡは、神経系全体の神経興奮性を低減させるのに重要である。ＧＡＢＡは、特定の膜貫通受容体に結合し、膜の分極を負に変化させるイオンチャネルの開口をもたらすことによって、抑制性シナプスとして作用する。これは、一般に、細胞の過分極をもたらし、活動電位をトリガーするのに必要なシグナルを増加させる。ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおける欠陥は、興奮性シグナル伝達と抑制性シグナル伝達との間の不均衡をもたらし得、ドラベ症候群、てんかん、神経変性、タウオパチー、およびアルツハイマー病を含む、多数の神経学的疾患に関係付けられている。関係している他の神経学的状態または疾患としては、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、および／または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）が挙げられる。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。
【０１４１】
パルブアルブミンは、カルシウム結合タンパク質であり、これは、体性感覚皮質における全ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの約４０％に発現される。ＣＮＳ内で、ＰＶ細胞は、一般に、ＧＡＢＡ作動性細胞と考えられている。また、様々な研究により、ＰＶ、ＳＯＭ、ＣＲ、ＣＣＫ、ＮＰＹ、ＶＩＰ、またはそれらの組合せを発現する細胞を含め、ＧＡＢＡ作動性細胞が細胞の異なるサブタイプを含むことが特定されている。
【０１４２】
ＰＶニューロンは、特に、様々な神経学的疾患または状態、たとえば、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、および／またはけいれんに関連している。一部の事例では、ＰＶニューロン関連の神経学的状態または疾患は、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。様々な態様では、標的細胞は、ＣＮＳ内のＰＶ細胞、またはＰＶを発現するＧＡＢＡ作動性細胞である。
【０１４３】
様々な態様では、ＰＶを発現する介在ニューロンはまた、バスケット細胞とも称され、これは、細胞体のサイズ（たとえば、大型バスケット細胞、小型バスケット細胞、およびネストバスケット細胞）、ならびに樹状突起および軸索走行によって、さらに細分割することができる。生理学的には、ＰＶを発現するバスケット細胞は、適応がほとんどない高頻度の活動電位（ＡＰ）の連続を特徴とする高速スパイク（ＦＳ）であることが多い。ＰＶバスケットニューロンが、興奮性錐体ニューロンの細胞体および近位樹状突起を支配するというのは、広く許容されている。ＦＳのＰＶを発現するバスケットニューロンを通じて媒介される、フィードフォワード抑制は、視床皮質、複数層にわたる（translaminar）、および領域間（interareal）の回路を含む、複数の皮質ネットワークにおいて見出すことができる。ＦＳ  ＰＶバスケットニューロンは、隣接する興奮性錐体ニューロンを強力に抑制する。共通の興奮性入力を共有するＰＶバスケットニューロンおよび錐体ニューロンが、相互に接続される傾向にあることが、示されている（フィードバック抑制）。これらの接続は、興奮性ニューロンが、興奮性発動に応答してスパイクを生成し得る、正確な時間ウインドウを制御するように機能し得る。加えて、ＦＳ  ＰＶバスケットニューロンに対する視床皮質および皮質内の興奮性入力は、高頻度の刺激によって低下され、これにより、活動依存性フィードフォワード抑制が媒介される。ＰＶを発現するバスケット細胞はまた、他のバスケット細胞を含め、他の介在ニューロンを支配し、ギャップ結合を通じて互いに電気的に結合されている。この特性が、皮質ネットワークの同調およびオシレーションの生成および維持に役立ち得ることが、提案されている。
【０１４４】
一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの非ＰＶ発現ニューロンと比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現に関する選択性の増加をもたらす。一部の事例では、非ＰＶ細胞は、すべての非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞を含む。一部の事例では、非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性ニューロンとしては、カルレチニン（ＣＲ）、ソマトスタチン（ＳＯＭ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ＣＲ＋ＳＯＭ、ＣＲ＋神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ＣＲ＋血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）、ＳＯＭ＋ＮＰＹ、ＳＯＭ＋ＶＩＰ、ＶＩＰ＋コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ＣＣＫ＋ＮＰＹ、ＣＲ＋ＳＯＭ＋ＮＰＹ、およびＣＲ＋ＳＯＭ＋ＶＩＰを発現する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
一部の事例では、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または非細胞型選択的な様式で遺伝子発現を発動させる非選択的制御エレメントのうちのいずれか１つを、ＰＶ選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される任意の細胞型選択的制御エレメントとの比較に使用することができる。一部の事例では、ＣＡＧまたはＥＦ１α対照に作動可能に連結された遺伝子の発現を上回るレベルで、ＰＶ細胞における選択的な発現をもたらす制御エレメントは、ＰＶ細胞に対する選択性を示す。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または非選択的制御エレメント（たとえば、配列番号３４、またはその機能性断片、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）に作動可能に連結された導入遺伝子による、共局在アッセイにおいて測定した場合のＰＶ発現レベルよりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い、ＰＶ細胞における選択的な遺伝子発現を示す。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、または非選択的制御エレメント（たとえば、配列番号３４、またはその機能性断片、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）の下における、本明細書に記載される共局在アッセイにおいて測定した場合の発現レベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍である、ＰＶ細胞における選択的な遺伝子発現を示す。
【０１４６】
好ましい事例では、本明細書に記載される１つまたは複数の制御エレメントは、少なくとも１つの他のＣＮＳ細胞型（たとえば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの非ＰＶ細胞、または２つもしくはそれを上回る、３つもしくはそれを上回る、または４つもしくはそれを上回る非ＰＶ細胞および／または非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性ニューロン）と比べて、ＧＡＢＡ作動性細胞、たとえば、パルブアルブミンを発現するＧＡＢＡ作動性細胞における導入遺伝子の発現を、選択的に発動させる。
【０１４７】
一部の事例では、標的細胞型は、パルブアルブミンを発現するＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはＰＶ細胞である。
【０１４８】
脳における細胞の部分集団内で導入遺伝子を選択的に発現させる１つの手段は、細胞型選択的制御エレメント、または脳における細胞の部分集団、たとえば、ＰＶ細胞において選択的な（もしくは選択的な活性を有する）制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含むウイルスベクターを使用することである。ウイルスベクターは、特定の細胞型に対する選択性を伴わずに高い感染性を有するように選択することができ、一方で、制御エレメントは、選択性をもたらす。たとえば、細胞型選択的制御エレメントは、ＰＶニューロンにおいて導入遺伝子の発現を発動させ得、他のニューロンにおいては発動させない。
【０１４９】
一部の事例では、本開示は、ＰＶニューロンにおける発現を選択的に発動させる制御エレメント（すなわち、ＰＶ細胞選択的制御エレメント）の使用に関する。
【０１５０】
ＧＡＢＡ作動性細胞は、ガンマアミノ酪酸を産生する、抑制性ニューロンである。ＧＡＢＡ作動性細胞は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ２（ＧＡＤ２）の発現によって特定することができる。ＧＡＢＡ作動性細胞の他のマーカーとしては、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴ、ＰＶ、およびＶＩＰが挙げられる。
【０１５１】
一部の事例では、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞は、興奮性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、星状細胞、小膠細胞、運動ニューロン、または血管細胞である。一部の事例では、非ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴ、およびＶＩＰのうちの１つまたは複数を発現しない細胞である。一部の事例では、非ＰＶニューロンは、パルブアルブミンを発現しない、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。一部の事例では、他のＣＮＳ細胞とは、ＰＶ、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴ、およびＶＩＰのうちの任意のものを発現したことがない、ＣＮＳ細胞型を指す。
【０１５２】
一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または５つを上回る非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型と比べて、ＰＶ発現細胞に選択的である。一部の事例では、非ＰＶ細胞型には、非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞が含まれる。一部の事例では、目的の細胞型は、ＰＶ細胞である。一部の事例では、ＰＶ細胞に選択的なＲＥは、ＰＶ細胞選択的制御エレメントと称される。
【０１５３】
一部の事例では、本明細書に開示されるＰＶ細胞選択的制御エレメントは、配列番号１〜３２の配列、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１５４】
一部の事例では、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントは、制御エレメントがない場合の発現と比較して、ＰＶ発現細胞における導入遺伝子の発現を、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれを上回って増加させるために使用される。一部の事例では、発現カセット内のＲＥは、制御エレメントがない場合の発現と比較して、遺伝子の発現を、少なくとも１．５％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、もしくは５０％、または１．５％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％を上回って増加させる。一部の事例では、組成物およびその使用の方法は、制御エレメントがない場合のレベルと比較して、または非選択的制御エレメント（たとえば、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター、または配列番号３４、もしくはその機能性断片、もしくはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）と比較して、導入遺伝子の発現、たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＣＮＣ１（ＫＶ３．１としても知られている）、ＫＣＮＣ３（ＫＶ３．３としても知られている）、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片、またはそれらのタンパク質の発現に、１０〜５００％の増加をもたらす１つまたは複数の制御エレメントを含む、発現カセットを含む。一部の事例では、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＣＮＣ１、ＫＣＮＣ３、およびＳＴＸＢＰ１のうちのいずれか１つの遺伝子の発現および／またはタンパク質のレベルの増加は、発現カセットまたは制御エレメントがない場合のレベルと比較して、１．５〜５％、５％〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜１００％、１００〜１５０％、１５０〜２００％、２５０〜３００％、３００〜３５０％、３５０〜４００％、４００〜４５０％、４５０〜５００％、または１．５〜２０％、２０％〜５０％、５０％〜１００％、１００〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、または４００〜５００％である。一部の事例では、そのような遺伝子またはタンパク質の発現は、対照（たとえば、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、もしくは非選択的制御エレメント）、または非細胞型選択的制御エレメント（たとえば、配列番号３４、もしくはその機能性断片、もしくはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列）を含む発現カセットと比較して、ＰＶ細胞に選択的である。
【０１５５】
一部の事例では、ＰＶ細胞における発現の選択性は、ＰＶおよびｅＧＦＰ（１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子）の両方を発現する細胞の数を、ｅＧＦＰを発現する細胞の総数で除し、１００を乗じて百分率に変換することによって、計算することができる。本明細書に記載されるＰＶ細胞選択的制御エレメントは、ＰＶ細胞における発現に高度に選択的であり得る。たとえば、ＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される１つもしくは複数の制御エレメントは、ＰＶニューロンに対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約９９％を上回る選択性を呈し得る。
【０１５６】
一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される任意の制御エレメントは、対照の制御エレメント、たとえば、ＥＦ１αまたはこれまでに知られている制御エレメントよりも統計学的に高いレベルで、ＰＶニューロンにおいて導入遺伝子を発現する選択性をもたらす。一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントと、対照の制御エレメントとの間の統計学的差は、本明細書に記載される方法のうちのいずれか１つ、たとえば、共局在アッセイによって判定した場合、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または２倍を上回る差、または５倍、１０倍、もしくは２０倍を上回る差である。
【０１５７】
本開示は、ＰＶ細胞に選択的である制御エレメントを含む。これらのＰＶ細胞選択的ＲＥまたは任意の細胞型選択的ＲＥは、好ましくは、短く、好ましくは、約１１００塩基対、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐを下回る、または約１１０ｂｐを下回る。ＰＶ細胞選択的ＲＥまたは任意の細胞型選択的ＲＥは、１０５０ｂｐ〜１００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、または５００ｂｐ〜１０５０ｂｐであり得る。ＰＶ細胞選択的制御エレメントの一部の例は、配列番号１〜３２によって提供されるか、またはそれらの機能性断片もしくは組合せである。本開示によって企図される他のＰＶ細胞選択的制御エレメントとしては、本明細書に記載されるこれらの配列のいずれかまたは本明細書に記載される配列のうちの１つの一部もしくは断片に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列が挙げられる。
【０１５８】
一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される任意の制御エレメントは、本明細書に記載される配列または本明細書に記載される配列の断片に対して、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を上回る同一性を有する。一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントは、本明細書に記載される配列またはその機能性断片の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％に対して、少なくとも約８０％の同一性を有する。
【０１５９】
一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントは、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数に対して、少なくとも８０％の同一性を含む。一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントは、配列番号１〜２２の配列の５０％またはそれよりも多くに対して、９０％の同一性を有する。一部の事例では、ＰＶ選択的制御エレメントは、配列番号１〜３２のうちのいずれかの機能性断片またはそれらの組合せである。一部の事例では、機能性断片は、ＰＶ細胞において導入遺伝子を選択的に発現することができ、ＰＶ細胞における少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を上回る発現選択性を有する。
【０１６０】
一部の事例では、本開示の２つもしくはそれを上回るＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される任意の２つもしくはそれを上回る制御エレメントを組み合わせて、組合せの制御エレメントが形成される。一部の事例では、２つもしくはそれを上回る、３つもしくはそれを上回る、４つもしくはそれを上回る、５つもしくはそれを上回る、６つもしくはそれを上回る、７つもしくはそれを上回る、８つもしくはそれを上回る、９つもしくはそれを上回る、または１０個もしくはそれを上回るＰＶ細胞選択的制御エレメント、または本明細書に開示される複数の制御エレメントが、組み合わされる。たとえば、配列番号３１は、配列番号１および２３〜２９の組合せである。別の例として、配列番号３２は、配列番号８および配列番号２３〜２９の組合せである。一部の事例では、２つまたはそれを上回るＰＶ選択的制御エレメントの断片を組み合わせて、組合せの制御エレメントを形成することができる。たとえば、配列番号１の５０％を、配列番号８の３０％および配列番号３０の９０％と組み合わせて、組合せの制御エレメントを形成することができる。
【０１６１】
一部の事例では、本開示の１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメント、または本明細書に開示される任意の１つもしくは複数の制御エレメントは、１つまたは複数の他のＣＮＳ細胞型と比較して、ＰＶニューロンにおいて、作動可能に連結された導入遺伝子を選択的に発現する。この選択的な発現は、検出可能なレベルの連結した導入遺伝子を発現するＰＶニューロンの数を、導入遺伝子を発現する非ＰＶニューロンの数を含め、導入遺伝子を発現する細胞の総数に対する割合として計数することによって、定量化することができる。換言すると、特定の細胞型または標的細胞におけるＰＶ制御エレメントの選択性は、導入遺伝子を発現する非標的細胞型の数（または導入遺伝子を発現する細胞の総数）に対する、制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を発現するＰＶニューロン（または標的細胞）の数を測定および／または比較することによって、判定することができる。
【０１６２】
一部の事例では、ＰＶ細胞選択的制御エレメントは、ＰＶニューロン、ＣＮＳ内のＰＶニューロン、またはＰＶも発現するＧＡＢＡ作動性ニューロンに対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約９９％を上回る選択性を呈し得る。一部の事例では、本開示の１つまたは複数の制御エレメントは、ＣＡＧもしくはＥＦ１αもしくは非細胞型選択的エレメントと比較して、または非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比較して、またはＣＮＳ内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、もしくは少なくとも５つの他の非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性ニューロンサブタイプと比較して、ＰＶニューロンに対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約９９％を上回る選択性を呈し得る。
【０１６３】
一部の事例では、ＰＶ選択的制御エレメントは、対照の制御エレメント、たとえば、ＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、およびＣＢＡ）、非選択的制御エレメント、またはこれまでに知られている制御エレメントよりも統計学的に高いレベルで、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の発現に選択性をもたらす。一部の事例では、ＰＶ細胞選択的ＲＥと、対照のエレメントとの間の統計学的差は、本明細書に記載される方法のうちのいずれか１つによって判定した場合、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または２倍を上回る差、または５倍、１０倍、もしくは２０倍を上回る差である。一部の事例では、ＰＶにおける選択性は、本明細書に記載される共局在アッセイを使用して測定される。
【０１６４】
一部の態様では、本明細書に記載される細胞型選択的制御エレメントは、他のＣＮＳ細胞型と比較して、ＣＮＳ細胞型における導入遺伝子の発現を選択的にモジュレートするのに有用である。たとえば、本明細書に記載される細胞型選択的制御エレメントは、他の種類のニューロンを含め、他のＣＮＳ細胞と比べて、ＰＶ細胞における導入遺伝子の発現を選択的にモジュレートするのに有用であり得る。遺伝子療法については、標的細胞型における導入遺伝子の選択的な発現および／または非標的細胞型における導入遺伝子の最小限の発現が、所望され得る。意図されない細胞型（たとえば、非標的細胞型）における導入遺伝子の発現は、被験体に有害効果をもたらし得る。意図されない細胞型における導入遺伝子の発現は、意図される細胞型における導入遺伝子の治療効果を妨害し得る。たとえば、ＰＶ細胞における発現が意図される導入遺伝子は、グルタミン作動性ニューロンにおいて発現されると、被験体にとって負の作用を有し得る。本明細書に記載される細胞型選択的制御エレメントは、導入遺伝子の適切な発現を確実にし、かつ／または遺伝子療法の標的外作用を低減させるために、発現カセットにおいて使用することができる。
【０１６５】
本明細書における細胞型選択的制御エレメントは、遺伝子発現カセットにおいて使用することができ、ここで、それらは、１つまたは複数の導入遺伝子に作動可能に連結されている。そのような遺伝子発現カセットは、導入遺伝子を、発現のための細胞に送達するために使用される。発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書に記載される細胞型選択的制御エレメント、細胞型選択的制御エレメントの組合せ、または本明細書に記載される細胞型選択的制御エレメントの断片を含み得る。
【０１６６】
好ましくは、本明細書における発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の細胞型選択的制御エレメントを含み、これにより、これら２つは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてその内因的な状況で一緒に機能することがない。たとえば、ナトリウムイオンチャネルベータサブユニットの導入遺伝子、たとえば、ＳＣＮ１Ｂを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同じ状況で機能することがないか、またはＳＣＮ１Ｂの発現を内因的に検出可能に発動させることがない、１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結させることができる。同様に、核酸カセットは、内因的もしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同じ状況で機能することがないか、または同じオープンリーディングフレーム内にないか、または同じヒト染色体上にないか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＳＴＸＢＰ１の発現を検出可能に発動させることがない、制御エレメントに作動可能に連結された、神経伝達物質制御因子、たとえば、ＳＴＸＢＰ１を含み得る。一部の事例では、細胞型選択的制御エレメントは、導入遺伝子に連結され、ここで、細胞型選択的制御エレメントは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて導入遺伝子に対応する内因性遺伝子を制御しない。
【０１６７】
一部の態様では、本明細書に開示される細胞型選択的制御エレメントは、導入遺伝子に対応する天然の遺伝子の遺伝子座とは異なるヒト染色体遺伝子座から単離された配列に由来する。したがって、一部の事例では、発現カセットは、同じカセットにおける導入遺伝子に対応する染色体とは異なる染色体に由来する配列を有する細胞型選択的制御エレメントを含む。他の事例では、発現カセットにおいて作動可能に連結されている本開示の制御エレメントおよび導入遺伝子は、ヒトゲノムにおいて２０ｋｂを上回って離れて位置しているかまたは遠位ゲノム位置にある配列に由来する。２つまたはそれを上回るヒト由来の制御エレメントが、発現カセットにおいて用いられる場合、２つもしくはそれを上回る制御エレメントは、ヒトゲノムにおいて５ｋｂを上回って離れて、１０ｋｂを上回って離れて、１５ｋｂを上回って離れて、もしくは２０ｋｂを上回って離れて位置している配列を有し得るか、または２つもしくは複数の制御エレメントは、ゲノムにおいて天然には互いに相互作用しない。
【０１６８】
一部の事例では、ＰＶ選択的制御エレメントを含む発現カセットは、ｈＳｙｎ１またはＧＡＤ２プロモーター配列に由来する公知の配列を除外し得る。一部の事例では、ＰＶ選択的制御エレメントは、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＳＹＮ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴ、およびＶＩＰプロモーターのうちのいずれか１つの全長プロモーター配列を含まない。一部の事例では、ＰＶ選択的制御エレメントは、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＳＹＮ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴ、およびＶＩＰのプロモーターまたはこれらのうちの１つもしくは複数に由来する配列の５００を上回る連続的な塩基対を含まない。一部の事例では、ＰＶ選択的制御エレメントは、ＧＡＤ２、ＳＹＮ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴ、およびＶＩＰのうちのいずれか１つの転写開始部位の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、または１０ｋｂ以内にある配列を含まない。
【０１６９】
一部の事例では、導入遺伝子は、目的とされる特定の細胞型と関連する疾患を処置するのに有用である。一部の事例では、目的の細胞型は、ニューロン、抑制性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、またはＰＶニューロンである。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１のうちのいずれか１つまたは複数である。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子の発現をモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質（たとえば、内因性遺伝子の発現をモジュレートする転写活性化因子または転写抑制因子）である。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、Ｃａｓファミリータンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子または検出可能なマーカー、たとえば、ｅＧＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、またはＲＦＰである。一部の事例では、導入遺伝子は、Ｃａｓタンパク質、たとえば、Ｃａｓ９である。
【０１７０】
ＰＶニューロン細胞と関連する状態を処置するのに有用な導入遺伝子は、ベクター、核酸カセット、または本明細書に記載される方法に組み込まれ得る。本明細書において使用される導入遺伝子は、一般に、イントロンを含まないか、または１つを上回るイントロンを含まない。導入遺伝子は、ゲノム配列ではなく、ｃＤＮＡ配列から得ることができる。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性イントロンのうちの一部またはすべてを含み得る。一部の例では、そのような導入遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインまたはイオンチャネルをコードする。本開示の発現カセットにおいてコードすることができるＤＮＡ結合ドメインの例としては、亜鉛フィンガー、Ｃａｓ９、Ｃａｓファミリータンパク質、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓファミリータンパク質、または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）が挙げられる。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ９を含む。一部の事例では、導入遺伝子は、イオンチャネルもしくは膜タンパク質のサブユニットもしくは成分、または本明細書に開示される神経学的状態もしくは疾患と関連する遺伝子である。本開示の発現カセットにおいて使用することができるイオンチャネル導入遺伝子の例としては、電位依存性およびリガンド依存性のイオンチャネルが挙げられる。電位依存性イオンチャネルとしては、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、カリウムチャネル、およびプロトンチャネルが挙げられる。一部の事例では、導入遺伝子は、電位依存性ナトリウムチャネルのサブユニットをコードする。電位依存性ナトリウムチャネルのサブユニットの例としては、ＳＣＮ１Ｂ（ＮＭ＿００１０３７．４）、ＳＣＮ１Ａ（ＮＭ＿００１１６５９６３．１）、およびＳＣＮ２Ｂ（ＮＭ＿００４５８８．４）が挙げられる。
【０１７１】
一部の事例では、導入遺伝子は、電位依存性カリウムチャネルのサブユニットをコードする。電位依存性ナトリウムチャネルのサブユニットの例としては、ＫＣＮＣ１（ＮＭ＿００１１１２７４１．１）およびＫＣＮＣ３（ＮＭ＿００４９７７．２）が挙げられる。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、それらのバリアントおよび機能性断片のうちのいずれか１つまたは複数である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、それらのバリアントまたは機能性断片のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列である。一部の事例では、そのような配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される。
【０１７２】
一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットは、配列番号３７〜４３、またはそれらの機能性断片もしくはバリアント、または配列番号３７〜４３に対応するＧｅｎＢａｎｋ配列のうちのいずれか１つをコードする配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶ選択的制御エレメントまたは本開示の１つもしくは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットは、（ｉ）配列番号３７〜４３の配列、または（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列に従う配列を有する導入遺伝子を含む。
【０１７３】
一部の例では、導入遺伝子は、神経伝達物質制御因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である。神経伝達物質制御因子は、ＣＮＳにおける神経伝達物質の産生または放出を制御することに関与し得る。たとえば、神経伝達物質制御因子は、神経伝達物質を放出するように、シナプス融合を補助し得る。神経伝達物質制御因子の例は、ＳＴＸＢＰ１（ＮＭ＿００１０３２２２１．３）、またはその機能性断片、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。導入遺伝子はまた、神経伝達物質制御因子のサブユニットであってもよい。
【０１７４】
一部の事例では、本開示の発現カセットは、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ、ＰＶ選択的エンハンサー、ＰＶ選択的プロモーター、または１つもしくは複数のＰＶ選択的プロモーターおよびエンハンサーの組合せ、ＳＣＮ１ＢのｃＤＮＡ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨポリＡシグナル、ＰＶ選択的制御エレメント、ならびにＡＡＶ２  ３’ＩＴＲを含み得る。１つの例では、発現カセットは、ＡｍｐＲプロモーター、およびＡｍｐＲコーディング配列、細菌性複製起点、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、配列番号８、配列番号２３〜２９、導入遺伝子（コーディング配列、ＷＰＲＥ、ヒト成長ホルモンポリＡシグナル、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ならびにｆ１起点を含む。
【０１７５】
別の例として、本開示の発現カセットは、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写活性化因子、ＷＰＲＥ、ｈＧＨポリＡシグナル、制御エレメント、およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲを含み得る。一部の事例では、発現カセットは、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ、プロモーター、イントロンエレメント、転写修飾因子、合成ポリＡ、およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲを含む。一部の事例では、本開示の発現カセットは、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ、ＰＶ選択的エンハンサー、ＰＶ選択的プロモーター、ＳＣＮ１ＡまたはＳＣＮ１Ｂの転写活性化因子をコードする配列、ＷＰＲＥ、ｈＧＨポリＡシグナル、ＰＶ選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される制御エレメントのうちのいずれか、およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲを含み得る。
【０１７６】
本開示の１つまたは複数の制御エレメントを含む発現カセットは、病態を処置するために使用することができる。一部の事例では、本開示の制御エレメントを含む発現カセットは、神経学的状態または神経変性状態を処置するために使用される。神経学的状態は、公知の遺伝的事象によって引き起こされ得るか、または未知の原因を有し得る。
【０１７７】
神経学的状態は、ＰＶニューロンと関連する疾患であり得る。神経学的状態は、抑制性ニューロン、たとえば、ＰＶニューロンと関連する疾患であり得る。ＰＶニューロンと関連する疾患または状態は、導入遺伝子および１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に記載される制御エレメントのうちのいずれかを有する発現カセットを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞に送達することによって、処置することができる。一部の態様では、１つもしくは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される制御エレメントのうちのいずれかに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットは、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性障害、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんを処置するために使用することができる。一部の事例では、本開示の発現カセットは、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、ドラベ症候群、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、および／または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）を処置するために使用される。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。
【０１７８】
ドラベ症候群の症例の大半は、ＳＣＮ１Ａおよび／またはＳＣＮ２Ａ遺伝子における変異と関連している。ＳＣＮ１Ａにおける変異または異常はまた、けいれん障害、てんかん、自閉症、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、遺伝性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、およびある特定の抗けいれん医薬の有効性と関連付けられている。たとえば、ＳＣＮ１ＡにおけるＩＣＳ５Ｎ＋５Ｇ＞Ａ変異は、抗けいれん薬のフェニトインおよびカルバマゼピンの最大安全量（用量）と関連している。
【０１７９】
一部のアルツハイマー病患者において、ニューロンの興奮性に影響を及ぼし得る多数のペプチドおよびプロテアーゼが関与するアミロイドβ（Ａβ）の産生は、けいれんおよびＰＶニューロンにおけるＮａｖ１．１ナトリウムチャネルの下方制御を引き起こす。
【０１８０】
ＳＣＮ１ＡまたはＮａｖ１．１における機能喪失の変異に起因するものなど、ＰＶニューロンの機能不全と関連する疾患としては、ドラベ症候群、大田原症候群、てんかん、早期幼児てんかん性脳症６（ＥＩＥＥ６）、家族性熱性けいれん３Ａ（ＦＥＢ３Ａ）、全般的な強直間代性けいれんを伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥＧＴＣ）、家族性片麻痺性片頭痛３（ＦＨＭ３）、パナイトポーラス症候群、家族性心房細動１３（ＡＴＦＢ１３）、全般性てんかん熱性けいれんプラス１型（ｇｅｆｓ＋１型）、ブルガダ症候群、非特異性心臓伝導障害、全般性てんかん熱性けいれんプラス、良性家族性幼児けいれん、早期幼児てんかん性脳症１１（ＥＩＥＥ１１）、良性家族性幼児てんかん、神経変性、タウオパチー、およびアルツハイマー病が挙げられる。一部の事例では、神経学的状態は、ドラベ症候群である。ドラベ症候群は、ＳＣＮ１Ａおよび／またはＳＣＮ２Ａ遺伝子における変異と関連している。一部の事例では、本開示の１つまたは複数の制御エレメントは、ＰＶニューロンと関連する神経学的状態または疾患、たとえば、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、ドラベ症候群、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）を処置するために、遺伝子療法剤または発現カセットにおいて使用される。一部の事例では、本開示の１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、ＰＶニューロン選択的制御エレメント）は、ドラベ症候群および／またはアルツハイマー病を処置するために（たとえば、発現カセット、ベクター、または遺伝子療法剤において）、使用される。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。
【０１８１】
本開示の方法および組成物は、疾患、たとえば、神経学的または神経変性疾患と診断されている被験体を処置するために使用することができる。被験体は、ある形態のてんかんを患う患者であり得る。一部の事例では、被験体は、ドラベ症候群を有する患者である。被験体は、神経変性疾患を患う患者、たとえば、アルツハイマー病を有する患者であり得る。一部の事例では、てんかん、脳症、および／またはけいれんは、ＳＣＮ８Ａにおける遺伝的変異と関連している。一部の事例では、ＳＣＮ８Ａにおける遺伝的変異により、てんかん症候群、たとえば、ドラベ症候群が発生し得る。一部の事例では、ＳＴＸＢＰ１における遺伝的変異は、反復性けいれんを特徴とする、てんかんを伴う脳症と関連している。
【０１８２】
一部の事例では、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物で処置される被験体は、イオンチャネルまたは神経伝達物質制御因子（たとえば、シンタキシン結合タンパク質）における変異または遺伝子異常と診断されたものである。そのような変異の例としては、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＣＮＣ１、ＫＣＮＣ３、および／もしくはＳＴＸＢＰ１、またはそれらの組合せにおける変異が含まれる。本明細書に記載される細胞型選択的制御エレメントを含む発現カセットは、特定の細胞型と関連する症状を伴う疾患を処置または予防するために、被験体に送達することができる。たとえば、１つまたは複数のＰＶ細胞選択的制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットは、ＰＶニューロンと関連する症状を有するかまたはそれと関連する症状を発症する危険性がある被験体に、送達される。
【０１８３】
一部の事例では、処置は、ドラベ症候群を有するかまたはそれを発症する危険性がある被験体に、施され得る。ドラベ症候群と関連する症状としては、けいれん、記憶欠損、発達遅延、筋緊張不良、および／または認知問題が挙げられる。本開示の発現カセットでの処置により、１つまたは複数の症状の改善、たとえば、けいれんの回数、期間、および／または強度における低減がもたらされ得る。本明細書に記載される遺伝子療法剤を、ドラベ症候群を発症する危険性がある被験体に投与することにより、１つまたは複数の症状の発症を予防するか、または症状の進行を遅延させることができる。
【０１８４】
別の例では、処置は、アルツハイマー病を患う被験体に施され得る。アルツハイマー病と関連する症状としては、短期記憶喪失、認知困難、けいれん、ならびに言語、実行機能、知覚（失認症）、および運動の実行（失行症）の困難が挙げられる。本開示の発現カセットでの処置により、１つまたは複数のアルツハイマー病の症状の改善、たとえば、記憶喪失の進行の低減、または１つもしくは複数の症状の予防がもたらされ得る。一部の事例では、処置は、高ガンマパワーの脳活動の補正をもたらし得る。処置は、けいれんの頻度および／もしくはけいれんの重症度の減少、または高ガンマパワーの活動の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、もしくは７０％の減少をもたらし得る。一部の事例では、処置は、認知機能における改善をもたらし得る。学習および／または記憶は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１００％を上回って、改善され得る。
【０１８５】
本開示の方法および組成物は、疾患を発症する危険性がある被験体を処置するために使用することができる。被験体は、疾患、たとえば、神経学的疾患、またはてんかん、けいれん、および／もしくは脳症と関連する疾患の素因を有することが判明していてもよい。被験体は、遺伝的事象に起因して、または公知の危険因子に起因して、ある疾患の素因を有し得る。たとえば、被験体は、ドラベ症候群と関連している、ＳＣＮ１Ａにおける変異を有し得る。一部の事例では、被験体は、被験体の年齢に起因して、アルツハイマー病などの疾患の素因を有し得る。
【０１８６】
処置は、症状の減少または停止をもたらし得る。たとえば、処置は、学習、記憶、認知機能、および／もしくは運動機能を改善し得る、けいれんの頻度および／もしくは期間を低減させ得る、ならびに／または温度感受性を低減させ得る（もしくはけいれんをトリガーする温度閾値を上昇させ得る）。
【０１８７】
一部の事例では、本明細書に開示される遺伝子療法剤または発現カセットの標的細胞型は、ＰＶ細胞である。一部の事例では、非標的細胞サブタイプは、本明細書に開示される非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性サブタイプのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つである。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントを含む発現カセットは、すべての非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比べて、ＰＶ細胞に選択的である。一部の事例では、細胞型選択性は、本明細書に開示される共局在アッセイに従って測定される。一部の事例では、細胞型選択性は、標的細胞型においてＣｒｅを発現するマウスを使用して、測定される。
【０１８８】
一部の事例では、処置は、被験体にとって有害な反応をもたらさない。ＰＶ選択的制御エレメントを含む遺伝子療法での処置は、被験体において、非選択的制御エレメントに連結された同じ導入遺伝子を含む類似の遺伝子療法剤での処置よりも少ないかまたは重症度の低い、有害反応を引き起こし得る。
【０１８９】
様々な態様では、本明細書に開示される任意の発現カセットは、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんのうちのいずれか１つまたは複数を処置するために、遺伝子療法剤（たとえば、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ９遺伝子療法剤）に適合され得るか、またはそれにおいて使用され得る。一部の事例では、遺伝子療法剤は、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くを含む。一部の事例では、遺伝子療法剤は、本開示の発現カセットを含む。一部の事例では、遺伝子療法剤は、制御エレメントが、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された場合にＣＡＧもしくはＥＦ１αもしくは非選択的制御エレメントによって発動されるか、または制御エレメントを有さない同じ構築物によって発動される発現よりも、統計学的に有意に高いレベルで、少なくとも１つの標的細胞型における選択的な発現または優先的な発現を発動させるように、任意の導入遺伝子（たとえば、レポーター導入遺伝子または治療用導入遺伝子）に作動可能に連結された、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、統計学的に有意に高いとは、制御エレメントが、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された場合の標的細胞型におけるＣＡＧ、ＥＦ１α、構成的プロモーター、もしくは非選択的制御エレメントによる発現レベルまたは制御エレメントを有さない同じ構築物による発現レベルの、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００倍であるレベルで、標的細胞型における選択的な発現を発動させることを意味する。一部の事例では、そのような細胞型選択的な発現は、本明細書に記載される共局在アッセイを使用してアッセイされる。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、およびそれらの機能性断片のうちのいずれか１つまたは複数である。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子、たとえば、転写モジュレーター、転写活性化因子、または転写抑制因子の発現をモジュレートする、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ切断ドメインもしくはヌクレアーゼドメインが不活性化されているＤＮＡ切断タンパ��質（たとえば、ヌクレアーゼ、制限酵素、リコンビナーゼなど）、たとえば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）、不活性化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、もしくはヌクレアーゼ不活性化亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写モジュレートドメイン（たとえば、転写活性化因子または抑制因子ドメイン）に連結されている。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。一部の事例では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子または検出可能なマーカー、たとえば、ｅＧＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、またはＲＦＰである。一部の事例では、導入遺伝子は、Ｃａｓタンパク質、たとえば、Ｃａｓ９である。
【０１９０】
一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、神経学的状態または疾患を処置するために使用される。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、神経学的状態または疾患を処置するために使用され、ここで、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、およびそれらの機能性断片のうちのいずれか１つまたは複数である。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、ドラベ症候群を処置するために使用される。一部の態様では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、アルツハイマー病を処置するために使用される。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、ドラベ症候群および／またはアルツハイマー病と関連するてんかんおよび／またはけいれんの症状を処置するために使用される。一部の事例では、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんのうちのいずれか１つを処置することは、本開示の遺伝子療法剤を、それを必要とする被験体の細胞に送達または投与することを含む。一部の事例では、それを必要とする被験体は、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、および／またはけいれんのうちのいずれか１つの危険性があるかまたはそれを有する。一部の事例では、被験体は、小児または未成年である。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、ドラベ症候群と診断されたかまたはそれを発症する危険性がある幼児、小児、または未成年を処置するために使用される。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法剤は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１のうちのいずれか１つまたは複数における変異または遺伝子欠陥を含む被験体を処置するために使用される。
【０１９１】
一部の態様では、本開示は、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんのうちのいずれか１つを処置する方法であって、遺伝子療法剤を、被験体の細胞に投与することを含み、遺伝子療法剤が、本明細書に開示される発現カセットを含む、方法を提供する。一部の事例では、そのような発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含み、ここで、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、およびそれらの機能性断片のうちのいずれか１つである。一部の事例では、導入遺伝子は、ナトリウムイオンチャネルまたはカリウムイオンチャネルのサブユニットである。一部の事例では、導入遺伝子は、シンタキシン結合タンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、転写モジュレーター、たとえば、転写活性化因子または転写抑制因子である。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子（たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、またはＳＴＸＢＰ１）の発現をモジュレートする、転写モジュレーターである。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。一部の事例では、導入遺伝子は、Ｃａｓタンパク質、たとえば、Ｃａｓ９である。
【０１９２】
他の態様では、本開示は、ドラベ症候群、アルツハイマー病、てんかん、神経変性、タウオパチー、ニューロン興奮性低下、および／またはけいれんを処置するために設計された、任意の遺伝子療法剤を、遺伝子療法剤の細胞型選択性を改善するように本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを付加することによって修飾するための方法を提供する。一部の事例では、遺伝子療法剤は、ｒＡＡＶ遺伝子療法剤である。
【０１９３】
一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットでの処置は、けいれんの期間および／または頻度、たとえば、ドラベ症候群と関連するけいれんを、未処置対照と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低減する。
【０１９４】
一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットでの処置は、高ガンマパワーの活動（たとえば、アルツハイマー病と関連する高ガンマパワーの活動）を、未処置対照と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低減する。
【０１９５】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の非標的細胞型と比べて、標的細胞型における選択的な発現、たとえば、１つまたは複数の非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型と比べて、ＣＮＳ内のＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントを含む、本開示の核酸カセットを提供する。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、（ｉ）配列番号１〜３２の配列、（ｉｉ）それらの機能性断片もしくは組合せ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、配列同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴを使用して測定することができる。一部の事例では、制御エレメントのうちの少なくとも１つは、ヒト由来である。一部の事例では、制御エレメントのうちの少なくとも１つは、非ヒト哺乳動物に由来する。一部の事例では、制御エレメントは、天然に存在しない。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、ＣＡＧまたはＥＦ１αまたは非選択的制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子の発現よりも高い、ＰＶ細胞における発現の選択性をもたらす。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１、またはこれらの機能性断片、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数である。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子（たとえば、内因性遺伝子、たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１）の発現をモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質、たとえば、転写モジュレーター、転写活性化因子、または転写抑制因子である。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質、たとえば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。一部の事例では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子または検出可能なマーカー、たとえば、ｅＧＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、またはＲＦＰである。一部の事例では、導入遺伝子は、Ｃａｓタンパク質、たとえば、Ｃａｓ９である。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、ＣＡＧまたはＥＦ１αまたは非選択的制御エレメントのものと比較して、少なくとも０．５倍、少なくとも０．６倍、少なくとも０．７倍、少なくとも０．８倍、少なくとも０．９倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍であるレベルで、ＰＶ細胞における選択的な発現をもたらす。一部の事例では、差の倍数は、１つまたは複数の制御エレメントにより得られたｅＧＦＰ＋、ＰＶ＋細胞の割合と、非選択的制御エレメントにより得られたものとの間の差の倍数を指す。一部の事例では、共局在アッセイは、実施例５において後述されるように、免疫組織化学的アッセイである。一部の事例では、共局在アッセイは、市販の抗ＰＶ抗体を使用して行われる。一部の事例では、導入遺伝子は、イオンチャネルサブユニット、神経伝達物質制御因子、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片をコードする。一部の事例では、イオンチャネルサブユニットは、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットもしくはベータサブユニット、またはカリウムイオンチャネルのサブユニットである。一部の事例では、導入遺伝子は、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、もしくはＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである。一部の事例では、神経伝達物質制御因子は、（ｉ）ＳＴＸＢＰ１、（ｉｉ）その機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列である。一部の事例では、制御エレメントおよび作動可能に連結される導入遺伝子は、異なる染色体上に位置する。一部の事例では、組み合わされた制御エレメントは、サイズが２．５ｋｂを下回る、１．５ｋｂを下回る、１ｋｂを下回る、または５００ｂｐを下回る。一部の事例では、非ＰＶ細胞は、興奮性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、星状細胞、小膠細胞、または運動ニューロンを含むがこれらに限定されない、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の事例では、核酸カセットは、直鎖状構築物である。一部の事例では、核酸カセットは、ベクターである。一部の事例では、核酸カセットは、プラスミドである。一部の事例では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の事例では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である。一部の事例では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の事例では、制御エレメントは、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＳＹＮ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５／６、ＳＳＴ、ＰＶ、および／またはＶＩＰの転写開始部位の１０ｋｂ以内に由来する、６００ｂｐを下回る連続的な配列を含む。
【０１９６】
本明細書に開示される様々な実施形態では、制御エレメントは、２０５０ｂｐ、２０００ｂｐ、１９００ｂｐ、１８００ｂｐ、１７００ｂｐ、１６００ｂｐ、１５００ｂｐ、１４００ｂｐ、１３００ｂｐ、１２００ｂｐ、１１００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、９０ｂｐ、８０ｂｐ、７０ｂｐ、６０ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、または５ｂｐを下回る。本明細書に開示される様々な実施形態では、発現カセットは、従来的なウイルスベクター、たとえば、ＡＡＶにおける典型的な導入遺伝子のサイズよりも大きな導入遺伝子を含む。一部の態様では、本明細書に開示される任意の実施形態の発現カセットは、少なくとも１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、または８ｋｂである導入遺伝子を含む。一部の態様では、本明細書に開示される任意の実施形態は、サイズが１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４ｋｂを上回る導入遺伝子を含む、発現カセット（たとえば、ＡＡＶ）を含む。一部の態様では、本明細書に開示される任意の実施形態は、１つまたは複数の異種核酸配列またはエレメントをさらに含み得る。
【０１９７】
一態様では、神経学的障害または状態を処置することを必要とする被験体において神経学的障害または状態を処置する方法は、治療有効量の、本明細書に記載される核酸カセットを送達するステップを含む。別の態様では、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的な発現を増加させる方法は、細胞を、本明細書に記載される核酸カセットと接触させるステップを含む。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の方法は、神経学的状態または疾患、たとえば、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、ドラベ症候群、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）を処置するために使用される。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の方法は、ドラベ症候群を処置するために使用することができる。本明細書に開示される任意の実施形態の方法は、アルツハイマー病を処置するために使用することができる。一部の事例では、本開示の方法および／または組成物は、けいれんおよび／もしくはてんかんと関連する、ならびに／またはＰＶニューロンが関係している、任意の神経学的状態または疾患を処置するために使用することができる。
【０１９８】
一態様では、本明細書に記載される神経学的状態は、遺伝子療法剤、好ましくは、共局在アッセイによって判定した場合に、１つの組織型または細胞型において、別のもの、たとえば、ＰＶニューロンと比べて優先的な発現をもたらすもので、処置される。一部の事例では、遺伝子療法剤は、ＡＡＶである。
【０１９９】
一態様では、任意の導入遺伝子の発現を、ＣＮＳ内のＰＶニューロンに標的化する方法は、ＰＶニューロン選択的制御エレメントのうちの１つまたは複数を、導入遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜３２、または配列番号１〜３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片のうちの１つまたは複数の配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、共局在アッセイによって測定した場合に、ＣＡＧまたはＥＦ１αまたは非選択的制御エレメントを導入遺伝子に作動可能に連結させた場合と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、導入遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１、ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらの機能性断片である。一部の事例では、制御エレメントおよび導入遺伝子は、ＡＡＶに含まれる。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。
【０２００】
一態様では、神経学的状態または障害を処置することを必要とする被験体において神経学的状態または障害を処置する方法は、細胞を、１つまたは複数の非ＰＶ  ＣＮＳ細胞と比べて、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数の制御エレメントを含む核酸カセットと接触させるステップを含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜３２、またはそれらの機能性断片もしくは組合せ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、導入遺伝子は、電位依存性イオンチャネルサブユニット、またはそのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、サブユニットは、ナトリウムイオンチャネルのベータサブユニットである。一部の事例では、サブユニットは、ナトリウムイオンチャネルのアルファサブユニットである。一部の事例では、サブユニットは、カリウムイオンチャネルのものである。一部の事例では、導入遺伝子は、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＤＮＡ結合タンパク質、もしくはＳＴＸＢＰ１、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである。一部の事例では、神経学的状態または障害は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、およびＫＶ３．３のうちのいずれかにおけるハプロ不全または変異と関連する。一部の事例では、神経学的状態または障害は、ドラベ症候群である。一部の事例では、神経学的状態または障害は、アルツハイマー病である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、精神障害（たとえば、統合失調症、強迫性障害、依存症、うつ、不安症、精神病）、自閉症スペクトラム障害（たとえば、脆弱Ｘ染色体症候群、レット症候群）、てんかん（たとえば、慢性外傷性脳症、全般性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症）、または神経変性（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病）である。一部の事例では、神経学的状態または疾患は、任意のけいれんおよび／またはてんかんに関連する状態または疾患であり、ＰＶニューロンが関係している。一部の事例では、核酸カセットは、共局在アッセイによって測定した場合に、ＣＡＧまたはＥＦ１αまたは非選択的制御エレメントを導入遺伝子に作動可能に連結させた場合と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍であるレベルで、ＰＶニューロンにおける選択的な発現をもたらす。一部の事例では、核酸カセットは、ＡＡＶである。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。
【０２０１】
一態様では、ドラベ症候群を処置する方法は、細胞を、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）それらの機能性断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである導入遺伝子を含む、ＡＡＶと接触させるステップを含む。一部の事例では、ＡＡＶは、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つもしくは複数のＰＶニューロン選択的制御エレメントまたは本明細書に開示される制御エレメントのうちのいずれかを、さらに含む。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、独立して、配列番号１〜３２のいずれか１つを含む配列、またはそれらの任意の機能性断片もしくは組合せ、または配列番号１〜３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を含む配列を含む。
【０２０２】
別の態様では、アルツハイマー病を処置する方法は、細胞を、（ｉ）ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、およびＳＴＸＢＰ１、（ｉｉ）それらの機能性断片、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つである導入遺伝子を含む、ＡＡＶと接触させるステップを含む。一部の事例では、ＡＡＶは、導入遺伝子に作動可能に連結された、１つまたは複数のＰＶニューロン選択的制御エレメントをさらに含む。一部の事例では、制御エレメントのそれぞれは、独立して、配列番号１〜３２のいずれか１つを含む配列、またはそれらの任意の機能性断片もしくは組合せ、または配列番号１〜３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を含む配列を含む。
【実施例】
【０２０３】
これらの実施例は、例示的な目的のみで提供され、本明細書において提供される特許請求の範囲を限定するためのものではない。
【０２０４】
（実施例１）
推定上のＰＶ選択的制御エレメントの特定
ＰＶ細胞に対して選択的な推定上の制御エレメントを特定およびスクリーニングするために、親和性精製を使用して、たとえば、抗ＧＦＰ抗体または抗Ｍｙｃ抗体およびプロテインＧコーティング磁気ビーズを使用して、Ｒ２６−ＣＡＧ−ＬＳＬ−Ｓｕｎ１−ｓｆＧＦＰ−ＭｙｃノックインマウスからＰＶ細胞を採取することができる。ＰＶ細胞は、抗ＰＶ抗体で被覆したビーズまたは親和性精製マトリクスを使用して濃縮することができる。核を次いでＰＶ細胞から単離する。核ＲＮＡは、核から精製され、ｃＤＮＡに変換され、そしてＮｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（Ｎｕｇｅｎ  ７１０２）で増幅し、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を使用してシーケンシングすることができる。ゲノムＤＮＡは、核から精製され、断片化され、そしてメチルＣ−ｓｅｑライブラリーを作成するために使用することができ、このライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００を使用してシーケンシングすることができる。ＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリーを作成するために、ビーズに結合した核を、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＦＣ−１２１−１０３０）を使用して転位させる。９〜１２サイクルのＰＣＲ増幅の後、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を使用してシーケンシングする。ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーを作成するために、小球菌ヌクレアーゼを使用してＰＶ細胞の核をモノヌクレオソームに消化し、その後、クロマチンの塩抽出、ならびにネイティブＣｈＩＰおよびライブラリーの構築を行い、これを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を使用してシーケンシングすることができる。これらのライブラリーをシーケンシングした後、配列をマッピングして、ＰＶ細胞における、ＣＧリッチ領域での低メチル化、ヒストン修飾、転写因子結合部位、ならびに高度に発現した転写因子に関連するパターンにおける、相関およびパターンを特定する。上記の複数のアッセイおよび／またはライブラリーから得られるオーバーラップする特徴および相関は、推定上のＰＶ選択的制御エレメントである候補配列を特定するための収束的証拠を提供する。推定上のＰＶ選択的制御エレメントは、以下の実施例５において記載される共局在アッセイを使用して、さらに試験することができる。推定上のＰＶ選択的制御エレメントはまた、Ｂ６  ＰＶ−Ｃｒｅマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において試験することができ、このマウスは、以下の実施例２において記載されるように、パルブアルブミンの発現においてＣｒｅリコンビナーゼを発現するＢ６  ＰＶ−Ｃｒｅノックインマウスである。制御エレメントのＰＶ選択性を検証した後、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または５つより多くの非ＰＶ細胞よりもＰＶ細胞に対して選択的に発現を標的化するために、制御エレメントを導入遺伝子に作動可能に連結させることができる。
【０２０５】
（実施例２）
ＰＶ−ＣｒｅマウスにおけるＰＶニューロンに対する選択性
ＰＶニューロンに対する選択性は、蛍光イメージングを使用して判定することができる。（ｉ）対照プロモーター（ＥＦ１ａ）、または（ｉｉ）上記の実施例１で特定されたＰＶ選択的ＲＥ、または（ｉｉｉ）配列番号１〜３２から選択されるＰＶ選択的ＲＥに作動可能に連結しているｅＧＦＰを含むＡＡＶ９ベクター、およびＣｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏを含むＡＡＶ９ベクターを、Ｂ６  ＰＶ−Ｃｒｅマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に共注射する。ＰＶ−Ｃｒｅは、内因性Ｐｖａｌｂの発現を妨害することなく、パルブアルブミン発現ニューロン（脳における介在ニューロン、および後根神経節における固有受容性の求心性感覚ニューロンなど）においてＣｒｅリコンビナーゼを発現する、ノックインマウスである。
【０２０６】
マウスに、１．５μＬのＡＡＶ９ベクター（５１２から１１３ｇｃ／ｍｌ）を背側および腹側の海馬に０．３μＬ／分の速度で側部に注入し、注射後に４分間の休止期間を設ける。マウスは注射のために麻酔する。動物を、背側海馬（ＡＰ−２．０ｍｍ、側部±１．５、ＤＶ−硬膜から１．４ｍｍ）および腹側海馬（ＡＰ−３．１ｍｍ、側部±２．８、ＤＶ−硬膜から３．８ｍｍ）について以下の座標を使用して、定位フレーム（Ｋｏｐｆ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）内に置く。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（モデル番号８０３０８、対応する３０ｇａの先の丸い針を有する１０μＬのシリンジ）を定位マイクロマニピュレータと共に使用して、穿頭孔を指定し、ドリルで穴を開けることができる。ドリルは、骨を突き破るためのみに使用される。ドリルで穴を開けた後、注入カニューレを、脳の中へ、注射のための所望の位置の深さまで下げ、たとえば、注射容積は１．５μＬであり、注射速度は０．３μＬ／分である。注入の前に、針を１分間平衡させる。送達が完了したら、針を４分間放置し、次いで、およそ１分間かけて引き出す。すべての注入が完了したら、皮膚の切開を縫合糸で閉じ、外科手術後の鎮痛剤を投与する。処置したマウスは、残りの研究のために１日に１回健康チェックを行い、週に１回秤量して、体重をモニタリングする。
【０２０７】
組織の回収のために、マウスを、イソフルランの過剰投与によって安楽死させ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）をかん流させる。海馬を含む脳組織の切片を摘出し、４℃の４％ＰＦＡ中に少なくとも１２時間置く。脳組織を次いで、４℃の３０％ショ糖（リン酸緩衝生理食塩水中）中で、組織が試験管の底に沈むまで脱水する。脳組織をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ中に包埋して、クライオスタット内で切片化する。切片化した脳組織を、抗ＲＦＰポリクローナルウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ）および抗ｅＧＦＰポリクローナルニワトリ抗体（Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）での標準的な免疫組織化学的手順を使用して、ｅＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏについて染色する。蛍光顕微鏡イメージングを使用して、細胞を可視化する。ｅＧＦＰ、すなわち緑色蛍光は、すべての遺伝子発現に対応する。ｔｄＴｏｍａｔｏからの赤色蛍光は、ＰＶ＋細胞に対応する。黄色または白色の細胞として可視化され得る２つの蛍光シグナルのオーバーラップは、ｅＧＦＰ導入遺伝子を発現するＰＶ＋細胞に相当する。ＰＶ選択的制御エレメントを含むＡＡＶ９ベクターは、対照プロモーター（ＥＦ１ａ）と比較して、より多くの数の、ｅＧＦＰ＋およびＰＶ＋である細胞をもたらすことが予想される。たとえば、ＰＶ選択的ＲＥ（たとえば、配列番号１〜３２、または実施例１で特定される推定上のＲＥ）のいずれか１つを含むＡＡＶ９を注射したマウスから得た細胞の蛍光イメージングは、より多くの数の、ＰＶ＋でもあるｅＧＦＰ＋細胞を示すことが予想される。ＰＶ細胞に対する選択性は、ＰＶ＋でもあるすべてのｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして定量することができる。
【０２０８】
（実施例３）
ドラベマウスモデルにおけるてんかん発作の低減
Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊマウスを、Ｄｒａｖｅｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎから、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを介して入手した。これらのマウスは、ドラベ症候群に関連する変異を、ＳＣＮ１Ａのエキソン２４に含む（１７８３位でのＡからＶ）。このマウスはまた、ｆｌｏｘｅｄエキソン２４と野生型配列とを含む。遺伝子操作されていない場合、このマウス株は、ＳＣＮ１ＡのＷＴ対立遺伝子の２つのコピーを発現する。しかし、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＡＡＶが送達されると、ＡＡＶによって標的化されるいかなる細胞も、変異体対立遺伝子の１つのコピーを発現するように切り替わる。変異体ＳＣＮ１Ａサブユニットが発現すると、マウスは１０日以内に自発てんかん発作を発症する。
【０２０９】
Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊマウスおよび対照Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、実施例２におけるように、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＣＲＥリコンビナーゼを発現するＡＡＶ、および、ｅＧＦＰ（配列番号３６）またはＳＣＮ１Ｂ（配列番号３７）のいずれかの発現をもたらすＰＶ細胞選択的な制御エレメントである配列番号３２を含むＡＡＶを注射した。４回のすべての注入が完了したら、直ちに遠隔測定法による移植を行った（Ｆ２０−ＥＥＴ、Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。脳皮質電図のデータを、外科手術の１０日後から１４日間連続してモニタリングした。脳皮質電図のデータを分析し、すべてのてんかん発作事象を記録し、日付、開始時刻、終了時刻、てんかん発作の時間の長さ、および重症度スコアの注釈を付けた。図１は、治療後１４日間にわたり１２時間の枠でのてんかん発作の頻度を示す。ＳＣＮ１Ｂで処理したマウスは、対照動物と比較して、てんかん発作の頻度が低い傾向を示した。
【０２１０】
この観察は、ナトリウムイオンチャネルのベータユニット、たとえばＳＣＮ１Ｂが、ナトリウムイオンチャネルの輸送および組み立てに寄与し得るという考え、ならびに、ＰＶニューロンにおけるベータユニット選択性の発現の増大が、Ｎａｖ１．１チャネルの輸送および組み立ての増大をもたらし得、こうして、ＳＣＮ１Ｂ遺伝子療法で処置したマウスにおいて、てんかん発作の頻度および時間の長さが減少する傾向をもたらすという考えと一致した。
【０２１１】
（実施例４）
マウスモデルにおけるアルツハイマー病の処置
ＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓで飼育されたメスＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよびＷＴマウスを研究で使用した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、共にＴｈｙ１プロモーターの制御下の、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異（６７０Ｇ−Ｔおよび６７１Ａ−Ｃ）を有するアミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびＬ１６６Ｐ変異を含むＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１（ＰＳＥＮ１）の両方について、ヒト導入遺伝子を含む。これらのマウスは、アミロイド斑および記憶障害を含む、アルツハイマー病の症候を発症する。これらのマウスについてのさらなる記載は、Raddeら、２００６年（Radde、Rebeccaら、「Aβ42-driven  cerebral  amyloidosis  in  transgenic  mice  reveals  early  and  robust  pathology.」EMBO  reports  ７．９巻（２００６年）：９４０〜９４６頁）で見ることができる。
【０２１２】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスを、アルツハイマー病の症候に対する、ＲＥの制御下でのＳＣＮ１Ｂでの処置の効果を判定するためのモデルとして使用した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび非トランスジェニック対照に、共に配列番号３２の制御下の、ｅＧＦＰを発現する対照ベクターまたはＳＣＮ１Ｂを発現する処置ベクターのいずれかを注射し、実施例３におけるようにＥＥＴトランスミッターを移植した。脳の活動を、外科手術の４週間後に２４時間にわたり評価した。脳皮質電図のデータを自動分析し、様々な周波数帯でのパワーレベルを比較した。図２は、非トランスジェニック対照（ＷＴ）、ＡＰＰ／ＰＳ１、およびＳＣＮ１Ｂで処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける高ガンマパワー（５０〜１００Ｈｚ）を示す。増大した高ガンマパワーの活動は、アルツハイマー病患者およびてんかん患者におけるてんかん発作に関連している。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、対照マウスよりも高いレベルの高ガンマパワーの活動を示した。しかし、処置マウスではこの増大は存在せず、このことは、ベクターでの処置が効果的であることを示している。
【０２１３】
（実施例５）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウスにおけるＰＶニューロンに対する選択性
本明細書において開示される様々なＲＥの選択性を、免疫組織化学的方法を使用して、ＰＶニューロンにおける選択的遺伝子発現について試験した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウス系統を、ＰＶ免疫組織化学的アッセイに使用した。ＡＡＶ９構築物において、発現カセットは、制御エレメント（配列番号１もしくは配列番号８）またはＣＡＧプロモーターに作動可能に連結しているレポーター導入遺伝子ｅＧＦＰを含む。
【０２１４】
Ｐｕｐの全身注入：生後１日目のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、３１Ｇ針を備えた３００Ｕのインスリンシリンジを使用して、ＡＡ９ベクター（１Ｅ１２から３Ｅ１２）を、顔面静脈注射によって注入した。組織の回収のために、マウスを、注入の２１日後に、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与（ｉ．ｐ．）によって安楽死させ、ヘパリン添加した（２．５ＩＵ／ｍｌ）生理食塩水をかん流させ、その後、４％ホルムアルデヒドをかん流させた。脳を取り出し、続いて、摂氏４度で２４〜４８時間にわたり、４％ホルムアルデヒド中に浸して固定した。脳を次いで、３０％ショ糖を含有するＰＢＳ中に置き、摂氏４度で（約２〜３日間）沈めさせた。沈めたら、個々の大脳半球を、正中線の正面を下に向けて、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ中で凍結した。凍結した脳をクライオスタットで矢状切片に処理し、ＰＢＳ中に自由に浮遊させた。切片を、標準的な免疫組織化学的手順を使用して、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ  Ｌａｂ、ＧＦＰ−１０２０）およびマウス抗ＰＶ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ３０８８）で、ｅＧＦＰおよびパルブアルブミン（ＰＶ）について染色した。
【０２１５】
成体の全身注入：４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ｅＧＦＰを発現する６０μＬのＡＡＶ９ベクター（４．９１３から１１４ｇｃ／ｍｌ）を、尾静脈注射によって注入した。組織の回収のために、マウスを、注入の２１日後に、イソフルランの過剰投与によって安楽死させ、全脳を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、そして、氷冷した４％ホルムアルデヒドを含む別個の５ｍｌの試験管内に置いた。組織を摂氏４度で一晩固定した。翌日、脳を、３０％ショ糖を含有するＰＢＳ中に置き、摂氏４度で沈めさせた。沈めたら、個々の大脳半球を、正中線の正面を下に向けて、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ中で凍結した。凍結した脳をクライオスタットで矢状切片に処理し、ＰＢＳ中に自由に浮遊させた。切片を、標準的な免疫組織化学的手順を使用して、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ  Ｌａｂ、ＧＦＰ−１０２０）およびマウス抗ＰＶ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ３０８８）で、ＥＧＦＰおよびパルブアルブミン（ＰＶ）について染色した。
【０２１６】
免疫組織化学的プロトコル：免疫組織化学を使用して、抗ＰＶ抗体を使用してｅＧＦＰシグナルおよびＰＶシグナルの共局在を分析し、ここで、シグナルの重複画像は、最上部のパネルの画像（組合せ画像）において白色または薄い灰色のスポットとして示され、代表的な重複画像を矢印によって示した。ｅＧＦＰおよびＰＶの蛍光の重複は、ＰＶ細胞における発現の指標である。このような実験は、ＰＶ細胞における発現の選択的な発現を判定するために使用することができる。免疫組織化学的実験を行うために、各マウスから得た組織をブロック緩衝溶液（１×ＰＢＳ中に３％ＢＳＡ、３％ＮＧＳ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）で１時間、室温でブロックした。組織を次いで、ブロック緩衝液中で一次抗体と一晩、４Ｃでインキュベートし、それぞれ５分間の間隔をあけて、１ｍＬの１×ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、組織を、ブロック緩衝液中で二次抗体と１時間、室温でインキュベートし、その後、各回につき１ｍＬの１×ＰＢＳで、５分間の間隔をあけて、３回洗浄した。組織を、ＰＢＳ緩衝液中のＤＡＰＩ（１：１０００）と５分間インキュベートし、１ｍＬの１×ＰＢＳで２回洗浄した。組織をスライドに載せ、イメージングし、蛍光顕微鏡を使用して分析した。画像を、Ｖｅｃｔｒａ３イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して撮影し、ｅＧＦＰおよびＰＶ染色の共標識について、高度な画像分析ソフトウェアであるｉｎｆｏｒｍ−Ｔｉｓｓｕｅ  ｆｉｎｄｅｒを使用して定量したか、または手動でスコア付けした。少なくとも８０のＧＦＰ陽性細胞を各パネルで計数し、その後、共局在のパーセンテージを判定した。
【０２１７】
図３Ａ〜３Ｃは、ＡＡＶ９を全身注射した後の子犬で行った免疫組織化学的実験の結果を示す。図４Ａ〜４Ｃは、ＡＡＶ９を注射した後の成体マウスで行った類似の免疫組織化学的実験の結果を示す。
【０２１８】
図３Ａは、ＡＡＶ９を全身注射した後の子犬で行った免疫組織化学的実験の重複画像を示す。図３Ｂは、ＰＶ細胞の選択性が、ＣＡＧプロモーターの制御下での、ｅＧＦＰ発現と比較した、ＰＶ＋でもあるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして測定された、免疫組織化学的実験の共局在の定量を示す。
【０２１９】
図４Ａは、ＡＡＶ９を全身注射した後の成体マウスで行った免疫組織化学的実験の重複画像を示す。図４Ｂは、ＰＶ細胞の選択性が、ＥＦ１αの制御下での、ｅＧＦＰ発現と比較した、ＰＶ＋でもあるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして測定された、免疫組織化学的実験の共局在の定量を示す。
【０２２０】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンがＣＮＳの約２０％を構成し、その一方で、ＰＶ細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロンの約４０％を構成することが推定され、このことは、ＰＶ細胞がＣＮＳの全ニューロンのおよそ８％を占めることを意味する。Pelkey,  KAら、２０１７年、およびLee,  S.ら、２０１０年を参照されたい。したがって、非選択的制御エレメント（たとえば、ＣＡＧ、ＥＦ１α、または構成的プロモーター）によって標識された細胞の約８％がＰＶ陽性であるか、またはこの範囲内にあることが予想される。したがって、８％を超える、ＰＶ細胞における発現は、ＰＶ細胞における選択性が増大していることの指標である。特に、制御エレメントである配列番号８を含むＡＡＶ９注射の結果、細胞の約６０％がＰＶ陽性となり、これは、ＰＶ細胞の分布によって予想されるものよりも７．５倍高かった。
【０２２１】
ＡＡＶＤＪウイルスベクターを、制御エレメントに作動可能に連結しているｅＧＦＰをＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウスに送達するために使用したことを除いて、上記と類似の免疫組織化学的実験を行って、配列番号３４の配列を有する非選択的制御エレメントと比較した、追加の制御エレメントである配列番号２〜７および９〜２２の選択的な発現を判定した。このようなＡＡＶＤＪウイルスを、成体マウスの海馬のＣＮＳに直接注射した。少なくとも８０のＧＦＰ陽性細胞を各実験で計数し、その後、共局在または選択性のパーセンテージを、ＰＶ陽性でもあるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして計算した。図５Ａ〜５Ｆは、ＰＶ陽性でもあるｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして測定される、また、非選択的制御エレメントである配列番号３４のシグナルと比較した共局在または選択性を判定するために使用される蛍光イメージングを示す。マーカーについて陽性であった細胞は、画像において白色／灰色の細胞として表されている。組合せ画像は、対応するｅＧＦＰ画像と抗ＰＶ画像との間のオーバーラップを示す。ｅＧＦＰおよびＰＶの両方について陽性であった細胞は、組合せ画像において白色／薄い灰色の細胞として表されている。図６は、ＰＶ＋でもあるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして測定される、共局在分析の定量を示す。
【０２２２】
（実施例６）
様々なマウス系統におけるドラベ症候群の処置
本明細書において記載される発現カセットを使用する、ドラベ症候群および／またはその症候の処置は、上記のＢ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊ、Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａ、およびＳｃｎ１ａ−Ｒ１４７０Ｘマウス系統などの様々なマウス系統において試験することができる。これらのマウス系統は、ドラベ症候群についての確立されたマウスモデルである。Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統およびＳｃｎ１ａ−Ｒ１４７０Ｘマウス系統は、ＣＲＥリコンビナーゼを必要としない。
【０２２３】
Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能；Hawkinsら、Scientific  Reports、７巻：１５３２７頁（２０１７年）において記載されている）は、ＳＣＮ１Ａの第１のコーディングエキソンの欠失を含む。ＳＣＮ１Ａノックアウト対立遺伝子についてホモ接合性のマウスは、震え、運動失調、てんかん発作、および生後１６日目までの死亡を特徴とする。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドについてのヘテロ接合型マウスは、自発てんかん発作を発症し、数週間以内に死亡する。このようなマウス株は、てんかんおよびドラベ症候群の処置の安全性および有効性を研究するために使用することができる。さらなる情報については、Millerら、Genes  Brain  Behav.  ２０１４年２月、１３巻（２号）：１６３〜７２頁を参照されたい。
【０２２４】
Ｓｃｎ１ａ−Ｒ１４７０Ｘマウスは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエキソン２１内に未成熟停止コドンであるＲ１４０７Ｘを有するノックインマウスである。同一の変異が、３人の関連しないＳＭＥＩ患者において病原性変異として確認されている。Ｓｃｎ１ａＲＸ／ＲＸ子犬は、生後１２〜１６日での強直間代性および間代性のてんかん発作、ならびに律動的なれん動、ならびに不随意の筋収縮を含む、生後１２日での再発性の自発てんかん発作を特徴とする。さらなる情報については、Ogiwaraら、Journal  of  Neuroscience、２００７年５月３０日、２７巻（２２号）５９０３〜５９１４頁を参照されたい。
【０２２５】
ＡＡＶ遺伝子療法およびこのような遺伝子療法を使用する処置などの、本明細書において記載される組成物を試験するために、上記の各マウス株のドラベマウス、および対照マウス（たとえば、野生型マウス、またはその株についての未処置ドラベマウス）に、ｅＧＦＰもしくは別のレポーター遺伝子のいずれか、またはＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、もしくはＳＣＮ２Ｂなどの本明細書において開示される導入遺伝子に作動可能に連結している本明細書において記載される１つもしくは複数のＰＶ選択的ＲＥ（たとえば、配列番号１〜３２）を含む発現カセット、または配列番号３７〜３９のいずれか、またはそのバリアントもしくは機能性断片、を発現するＡＡＶを注射する（たとえば、腹腔内注射によって投与する）。ＡＡＶを注射した後、マウスの生存を経時的にモニタリングする。すべてのマウスを、全体的健康（たとえば、体重、水分補給、毛繕い、および運動性）について１日に１回モニタリングし、死亡を記録した。遠隔測定による移植を、ＡＡＶ注射の直後に行うことができる（Ｆ２０−ＥＥＴ、Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。脳皮質電図のデータを、外科手術の１０日後から少なくとも１４日間連続して記録およびモニタリングすることができる。すべてのてんかん発作事象を、ＡＡＶ処置後少なくとも１４日間にわたって、日付、開始時刻、終了時刻、時間の長さ、および重症度スコアの注釈を付けて記録することができる。ｅＧＦＰ対照または未処置対照と比較した、上記のＡＡＶで処置した後のてんかん発作の頻度および／または時間の長さの低減は、ドラベ症候群の症候および／または重症度の低減における遺伝子療法の有効性の指標である。
【０２２６】
マウスをＡＡＶで処置した後、導入遺伝子（たとえば、ＳＣＮ１Ａ；ＳＣＮ１Ｂ；ＳＣＮ２Ｂ；内因性ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、もしくはＳＣＮ２Ｂをモジュレートする転写活性化因子などのＤＮＡ結合タンパク質；配列番号３７〜３９のいずれか；またはその任意のバリアントもしくは機能性断片）の発現レベルを、ＡＡＶ処置がＰＶ細胞における遺伝子発現を増大させ得ることを示すために、様々なＰＣＲ法および／またはシーケンシング法を使用して経時的にモニタリングすることができる。ノーザンブロット分析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子の発現を分析するために使用することができる。タンパク質から発現されるタンパク質のレベルもまた、導入遺伝子の発現の増大がｉｎ  ｖｉｖｏでの対応するタンパク質の増大と相関することを示すために、処置後にモニタリングすることができる。タンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学、免疫蛍光組織化学、および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含む様々な方法を使用してアッセイすることができるが、これらに限定されない。機能的な電位開口型のナトリウムイオンチャネルの形成もまた、電流クランプ分析を使用してアッセイすることができる。
【０２２７】
熱中症によって誘発されるてんかん発作を、野生型マウスおよび／または未処置ドラベマウスと、本明細書において記載される発現カセット（たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂなどの本開示の導入遺伝子に作動可能に連結している１つもしくは複数の本開示のＲＥ、その機能性断片、または内因性ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、もしくはＳＣＮ２ＢをモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質を含む発現カセット）を含むＡＡＶ遺伝子療法で処置したドラベマウスとを比較するために、評価することができる。このような実験において、深部体温をＲＥＴ−３直腸温度プローブ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）でモニタリングし、Ｐａｒｔｌｏｗ１１６０＋コントローラ（Ｗｅｓｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、ＵＫ）で再設定された齧歯動物温度制御器（ＴＣＡＴ−２ＤＦ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）に接続された赤外線電球によって制御する。体温を、最初の間代性のひきつけが発生するまで、２分毎に０．５℃ずつ上昇させる。未処置ドラベマウスと比較して、ＡＡＶ遺伝子療法で処置したドラベマウスは、最初の間代性のひきつけが発生する前には、より高い閾値温度を有すること、および／または、試験した最高温度で依然としててんかん発作を有さないマウスの割合がより大きいことが予想される。
【０２２８】
発現カセットを含むＡＡＶの様々な用量をマウスに投与して、各遺伝子療法処置の安全性および有効性プロファイルを判定することもできる。これらの前臨床研究はまた、ドラベ症候群の処置に使用するための遺伝子療法の最適用量の情報を提供することもできる。
【０２２９】
（実施例７）
マウスにおけるアルツハイマー病の処置
ＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓで飼育され、アルツハイマー病の確立されたマウスモデルである、メスＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスを使用して、１つまたは複数のＰＶ選択的ＲＥを含むアルツハイマー病の処置における本明細書において記載される組成物の安全性および有効性を研究することができる。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、実施例４において上記で説明されている。
【０２３０】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび非トランスジェニック対照に、ｅＧＦＰを発現する対照ＡＡＶベクター、あるいは、本明細書において開示される１つもしくは複数のＰＶ選択的ＲＥ、たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、ＳＴＸＢＰ１などの、アルツハイマー病において欠損しているかもしくは損なわれている導入遺伝子に作動可能に連結している配列番号１〜３２、内因性遺伝子（たとえば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＮＣ２Ａ、ＳＮＣ８Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＫＶ３．１、ＫＶ３．３、もしくはＳＴＸＢＰ１）をモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質、または配列番号３７〜４３のいずれか１つ、またはその機能性断片を含む、処置ＡＡＶベクターのいずれかを注射する。
【０２３１】
ＡＡＶを注射した後、マウスの生存を経時的にモニタリングする。すべてのマウスを、全体的健康（たとえば、体重、水分補給、毛繕い、および運動性）について１日に１回モニタリングし、死亡を記録した。ＡＡＶを注射した後、マウスに、上記の実施例３において記載したようなＥＥＴトランスミッターも移植する。脳の活動を、外科手術後少なくとも４週間にわたり、２４時間にわたって記録およびモニタリングすることができる。脳皮質電図のデータを自動的に分析することができ、様々な周波数帯（５０〜１００Ｈｚ）でのパワーレベルを、様々な群、すなわち、ＷＴマウス、未処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウス、および上記のＡＡＶ遺伝子療法で各々処置したＡＡＶ処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウス間で比較することができる。増大した高ガンマパワーの活動は、アルツハイマー病患者およびてんかん患者におけるてんかん発作と関連する。したがって、未処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、対照マウスよりも高いレベルの高ガンマパワーの活動を示すことが予想されるが、その一方で、この増大は、処置マウスでは存在しないかまたは低減することが予想され、このことは、ＡＡＶ遺伝子療法での処置が効果的であることを示している。
【０２３２】
マウスをＡＡＶで処置した後、導入遺伝子の発現レベルを、ＡＡＶ処置が導入遺伝子の内因性発現の増大をもたらし得ることを示すために、様々なＰＣＲ法および／またはシーケンシング法を使用して経時的にモニタリングすることができる。ノーザンブロット分析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現を分析するために使用することができる。導入遺伝子から発現されるタンパク質のレベルもまた、遺伝子発現の増大がタンパク質レベルの増大と相関することを示すために、処置後にモニタリングすることができる。タンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学、および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含む様々な方法を使用してアッセイすることができるが、これらに限定されない。機能的な電位開口型のナトリウムまたはカリウムイオンチャネルの形成もまた、電流クランプ分析を使用してアッセイすることができる。
【０２３３】
発現カセットを含むＡＡＶの様々な用量をマウスに投与して、各遺伝子療法処置の安全性および有効性プロファイルを判定することもできる。これらの前臨床研究はまた、アルツハイマー病の処置に使用するための遺伝子療法の最適用量の情報を提供することもできる。
【図１】
2020515292.tif 000017
【図２】
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【図３Ａ】
2020515292.tif 000019
【図３Ｂ】
2020515292.tif 000020
【図４Ａ】
2020515292.tif 000021
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2020515292.tif 000023
【図５Ｂ】
2020515292.tif 000024
【図５Ｃ】
2020515292.tif 000025
【図５Ｄ】
2020515292.tif 000026
【図５Ｅ】
2020515292.tif 000027
【図５Ｆ】
2020515292.tif 000028
【図６】
2020515292.tif 000029
【図７】
2020515292.tif 000030
【配列表】
2020515292000001.app
【国際調査報告】
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2020515292.tif 000032
2020515292.tif 000033
2020515292.tif 000034
2020515292.tif 000035