(57)【要約】本開示は、核酸試料を増幅および解析するための方法およびシステムを提供する。本開示は、改変された逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡ分子ならびにｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡライブラリーを調製するための方法を提供する。本開示は、低含量の細胞および／または単一細胞から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを増幅する方法を提供する。本開示はまた、細胞がストレス（例えば、ｃＤＮＡ解析のための上昇した温度）を経験せず、よってトランスクリプトームプロファイルを維持する、トランスクリプトーム解析の方法を提供する。
2020500035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法であって、
（ａ）プライマーを鋳型核酸分子にアニーリングし、これにより、アニーリングされた鋳型核酸分子を生成するステップと、
（ｂ）ヌクレオチドの存在下で、
ｉ．前記アニーリングされた鋳型核酸分子、
ｉｉ．１個または複数のアクセプター核酸分子、および
ｉｉｉ．改変された逆転写酵素であって、約１２℃〜約４２℃の温度で、多くとも約５％の誤り率で、ｉ）前記アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写し、ｉｉ）アクセプター核酸分子へと移動し、ｉｉｉ）前記アクセプター核酸分子の配列を逆転写することにより、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成する、改変された逆転写酵素
を混合するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記移動が、前記鋳型および前記アクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）および（ｂ）が、単一の容器内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の別個のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む不均一な複数の鋳型核酸分子において前記方法を行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の別個のリボ核酸分子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子が、多くとも約２時間で調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型核酸分子が、人為的に断片化されたＤＮＡ鋳型、自然に断片化されたＤＮＡ鋳型、人為的に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型、自然に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記改変された逆転写酵素が、１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で、前記アニーリングされた鋳型核酸分子を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記改変された逆転写酵素が、野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の改善された酵素特性が、前記野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、より高い熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、より高い比活性、より高い処理能力、より高い鎖置換、より高い端から端までの鋳型ジャンピング、より高い親和性およびより高い忠実度からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変された逆転写酵素が、Ｒ２逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変された逆転写酵素が、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも９０％同一性を有し、配列番号５２と比べて少なくとも１個の置換改変を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）および（ｂ）を行った後に、タグを前記鋳型核酸分子に付加し、これにより、複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグ付けされた複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を配列決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記改変された逆転写酵素が、タグをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タグが、ビオチン、アジド基、アセチレン基、Ｈｉｓ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｖ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ  Ｂ、ＨＰＣペプチドタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシン−タグからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を行い、これにより、１種または複数のアンプリコンを形成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）および（ｂ）および前記ＰＣＲ増幅反応が、同じ容器内で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＣＲ増幅が、前記逆転写酵素の不活性化に十分な温度で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記１種または複数のアクセプター核酸分子が、前記改変された逆転写酵素による前記逆転写を停止する改変されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
対象から１個または複数の鋳型核酸分子を含む試料を得るステップと、１種または複数のプライマーを前記１個または複数の鋳型核酸分子にアニーリングするステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、組織試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、１種または複数の無細胞核酸を含み、前記方法が、同じ容器内で（ａ）および（ｂ）の反応を行うステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、１個または複数の鋳型核酸分子を含む前記試料から少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるための前記ステップが、前記ｒＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるための前記ステップが、前記ｒＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブガイド型エンドヌクレアーゼ的切断を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記１種または複数の鋳型核酸分子が、少なくとも１種のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含み、前記方法が、１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、前記１種または複数の鋳型核酸分子から前記少なくとも１種のｔＲＮＡを枯渇させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子の精製の非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を含む混合物を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記精製するステップが、２種の精製ステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記２種の精製ステップが、ニッケルおよびヘパリン親和性精製ステップを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの前記１種または複数の鋳型核酸分子において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
１種または複数のランダムプライマーを前記鋳型核酸分子にアニーリングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記プライマーが、１種または複数のアダプター配列にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記鋳型核酸分子が、単一細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
相補デオキシリボ核酸分子を調製するための方法であって、
（ａ）１種または複数のプライマーをある量の鋳型核酸分子にアニーリングし、これにより、１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子を生成するステップと、
（ｂ）ヌクレオチドの存在下で、
ｉ．前記１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子、
ｉｉ．１種または複数のアクセプター核酸分子、および
ｉｉｉ．改変された逆転写酵素であって、単一の反応容器内でサーマルサイクリングを用いずに、アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写し、アクセプター核酸分子へと移動し、前記アクセプター核酸分子の配列を逆転写することにより、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成する、改変された逆転写酵素
を混合するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記移動が、前記鋳型および前記アクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子が、多くとも約２時間で調製される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記量の鋳型核酸分子が、人為的に断片化されたＤＮＡ鋳型、自然に断片化されたＤＮＡ鋳型、人為的に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型、自然に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記量の鋳型核酸分子が、１種または複数の無細胞核酸を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記改変された逆転写酵素が、野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記改善された酵素特性が、前記野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、より高い熱安定性、より高い比活性、より高い処理能力、より高い鎖置換、より高い端から端までの鋳型ジャンピング、より高い親和性およびより高い忠実度からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記改変された逆転写酵素が、Ｒ２逆転写酵素である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記改変された逆転写酵素が、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも９０％同一性を有し、配列番号５２と比べて少なくとも１個の置換改変を含有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
ステップａ）およびｂ）を行った後に、タグを前記量の鋳型核酸分子に付加し、これにより、複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を配列決定するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記改変された逆転写酵素が、タグをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記タグが、ビオチン、アジド基、アセチレン基、Ｈｉｓ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｖ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ  Ｂ、ＨＰＣペプチドタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシン−タグからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記１種または複数のアクセプター核酸分子が、前記改変された逆転写酵素による前記逆転写を停止する改変されたヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
対象から試料を得るステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料が、１種または複数の無細胞核酸を含み、前記方法が、同じ容器内で（ａ）および（ｂ）の反応を行うステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料が、組織試料である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、前記１種または複数の鋳型核酸分子から少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるための前記ステップが、前記ｒＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるための前記ステップが、前記ｒＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブガイド型エンドヌクレアーゼ的切断を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、前記量の鋳型核酸分子から少なくとも１種のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を枯渇させるステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５７】
前記１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子の精製の非存在下で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項５８】
前記複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を含む混合物を精製するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５９】
前記精製するステップが、２種の精製ステップを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記２種の精製ステップが、ニッケルおよびヘパリン親和性精製ステップを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記量の鋳型核酸分子が、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの前記１種または複数の鋳型核酸分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項６２】
前記１種または複数のプライマーが、１種または複数のランダムプライマーを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６３】
前記１種または複数のプライマーが、１種または複数のアダプター配列にハイブリダイズする、請求項３６に記載の方法。
【請求項６４】
前記量の鋳型核酸分子が、単一細胞に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項６５】
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも９０％同一性を有し、配列番号５２と比べて少なくとも１個の置換改変を含有するアミノ酸配列を含む、逆転写酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項６６】
Ｒ２逆転写酵素由来の１個または複数のドメインを含む、精製されたポリペプチドであって、多くとも約５％の誤り率で、鋳型核酸分子から１個または複数のコピーの相補デオキシリボ核酸分子を生成する、精製されたポリペプチド。
【請求項６７】
１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で前記鋳型核酸分子を逆転写する、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
約１２℃〜約４２℃の温度で前記鋳型核酸分子を逆転写する、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に表記されているアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
Ｒ２逆転写酵素由来の１個または複数のドメインを含む、天然に存在しない酵素であって、３時間未満の期間で、また、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７の精製された酵素と比較して、改善された安定性、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性、および忠実度からなる群から選択される少なくとも１種の酵素特性に関して１．０を超える性能指数で、相補デオキシリボ核酸産物を生成する、天然に存在しない酵素。
【請求項７１】
（ａ）ヌクレアーゼ複合体を複数の二本鎖核酸分子に付加するステップであって、前記ヌクレアーゼ複合体が、
ｉ．Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその機能的バリアント、および
ｉｉ．少なくとも１種の合成ガイドオリゴヌクレオチドであって、前記複数の二本鎖核酸分子における少なくとも１種の二本鎖核酸分子におけるリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはトランスファーリボ核酸（ｔＲＮＡ）領域に相補的な合成ガイドオリゴヌクレオチド
を含む、ステップと、
（ｂ）前記複合体に、少なくとも１種の二本鎖核酸分子の前記ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ領域を切断させ、これにより、少なくとも１種の切断された二本鎖核酸分子をもたらすステップと、
（ｃ）前記少なくとも１種の切断された二本鎖核酸分子またはその派生物を、核酸配列決定に付し、これにより、前記ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ領域を欠く前記少なくとも１種の二本鎖核酸分子の核酸配列を得るステップと
を含む方法。
【請求項７２】
前記合成ガイドオリゴヌクレオチドが、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）に相補的である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記合成ガイドオリゴヌクレオチドが、トランスファーリボ核酸（ｔＲＮＡ）に相補的である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
配列決定するステップに先立ち、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡに由来する配列を含む前記複数の二本鎖分子の変性を要求しない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数の二本鎖核酸分子が、ｃＤＮＡを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
核酸分子のコンカテマーを調製するための方法であって、
（ａ）複数の二本鎖核酸分子の末端をプロセシングするステップと、
（ｂ）第１の複数のアダプター分子を前記複数の二本鎖核酸分子に付加するステップであって、前記第１の複数のアダプター分子が、１種または複数のオーバーハング配列を含み、少なくとも２種のオーバーハング配列が、互いに相補的であり、これにより、第１の複数のアダプター接続二本鎖核酸分子をもたらす、ステップと、
（ｃ）プライマーの非存在下で、重合酵素を前記第１の複数のアダプター接続二本鎖核酸分子に付加し、それによって、前記重合酵素が、前記１種または複数のオーバーハング配列によって２種またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接することにより、アダプター接続二本鎖核酸コンカテマーの第１のセットを形成するステップと、
（ｄ）第２の複数のアダプター分子を前記第１のセットに付加するステップであって、前記第２の複数のアダプター分子が、１種または複数のオーバーハング配列を含み、少なくとも２種のオーバーハング配列が、互いに相補的であり、これにより、アダプター接続二本鎖核酸分子の第２のセットをもたらす、ステップと、
（ｅ）アダプター分子のセットを用いて（ａ）〜（ｃ）を反復して、所定の平均長を含むコンカテマーを得るステップと
を含む方法。
【請求項７７】
（ａ）の前記プロセシングするステップが、末端修復を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記重合酵素が、逆転写酵素である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記逆転写酵素が、Ｒ２逆転写酵素またはその機能的バリアントである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の複数のアダプター分子、前記第２の複数のアダプター分子またはその両方が、特有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記重合酵素が、ＰＣＲまたは等温増幅反応において２種またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の複数のアダプター分子、前記第２の複数のアダプター分子またはその両方が、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１１月１１日に出願された米国仮出願番号第６２／４２１，０２８号、および２０１７年３月２７に出願された米国仮出願番号第６２／４７７，２１１号の利益を主張しており、これら仮出願の各々の内容は、参考として本明細書中に全体が援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
生細胞における遺伝子発現の研究に使用される一般的技法は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子から相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を産生することである。この技法は、生細胞由来のＲＮＡを研究する手段を提供し、これにより、本質的に不安定なＲＮＡの直接的解析が回避される。ｃＤＮＡ合成における第１のステップとして、生物由来のＲＮＡ分子が、当該生物の細胞または組織の抽出物から単離される。オリゴｄＴ（デオキシ−チミジンヌクレオチドの短い配列）を利用した親和性クロマトグラフィー等の方法を使用した、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）単離後に、オリゴヌクレオチド配列が、単離されたｍＲＮＡ分子にアニールされ、鋳型としてＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを利用しつつ、逆転写酵素活性を有する酵素を利用して、ＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーを産生することができる。よって、ｍＲＮＡの逆転写は、多くの形態の遺伝子発現解析における肝要なステップである。一般に、プライマー伸長またはポリメラーゼ連鎖反応によるその後の解析のため、ｍＲＮＡはｃＤＮＡへと逆転写される。
【０００３】
逆転写酵素は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する。ＤＮＡ合成が、プライマーの３’ＯＨから開始されるように、ＲＮＡ鋳型の逆転写は、ＲＮＡ鋳型にアニールされるプライマー配列を要求し得る。室温では、逆転写酵素は、完全にマッチしたおよびミスマッチしたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの両方の形成を可能にし得る。一部の実例では、逆転写酵素は、そのような非特異的プライミング事象の結果として、大量の非特異的ｃＤＮＡ産物を産生し得る。非特異的逆転写の産物は、とりわけ、ｃＤＮＡ配列決定、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびアルカリアガロースゲル電気泳動等、その後のｃＤＮＡ解析に干渉し得る。非特異的逆転写酵素活性によって産生された非特異的ｃＤＮＡ鋳型は、リアルタイムＰＣＲ等の適用において特段の困難を示し得る。特に、そのような非特異的ｃＤＮＡ産物は、リアルタイムＰＣＲシグナルおよび産物の解析を複雑化しかねない偽シグナルを生じ得る。よって、非特異的逆転写酵素活性の低下は、ｃＤＮＡ合成のより優れた特異性をもたらすことができる。現在、逆転写の特異性を改善するための信頼のおけるかつ使用が容易な方法は存在しない。本開示は、上述および他の必要を満たす。
単一細胞からトランスクリプトームデータを得るためにいくつかのアプローチを使用することができる。先駆的なアプローチは、逆転写酵素と、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がオリゴｄＴランの５’末端に付着された、オリゴｄＴプライマーとを使用した。その結果得られたｃＤＮＡを複数コピーのＲＮＡへと転写し、次いでこれらを再びｃＤＮＡに変換した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻（３号）：２８３〜２８８頁（１９９６年））。この操作は多くの場合、ｃＤＮＡ分子をトランケートし、特に、相対的に長い転写物に関して、当初のｍＲＮＡの５’配列を失い、低含量（ＬＱ）の細胞から始める場合、複数ラウンドの加工を要求し、ｃＤＮＡトランケーションをさらに悪化させる。近年の改変（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２巻（３号）：６６６〜６７３頁（２０１２年））は、マルチプレックス解析を可能にするが、これは依然として、３’末端配列に偏っている。他の方法は、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に基づく（Ｌｉｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３巻：４５〜５５頁（１９９９年）、Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０巻（４号）：５１９〜５２５頁（２０１０年）、Ｇｏｎｚａｌｅｚら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．５巻（１２号）：ｅ１４４１８頁（２０１０年）、Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１巻（７号）：１１５０〜１１５９頁（２０１１年）、Ｉｓｌａｍら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１巻（７号）：１１６０〜１１６７頁（２０１１年）、Ｔａｎｇら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６巻（５号）：３７７〜３８２頁（２００９年）、Ｋｕｒｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４巻（５号）：ｅ４２頁（２００６年）、Ｑｉｕ  Ｓら、Ｆｒｏｎｔ  Ｇｅｎｅｔ．３巻：１２４頁（２０１２年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻（３号）：２８３〜２８８頁（１９９６年）
【非特許文献２】Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２巻（３号）：６６６〜６７３頁（２０１２年）
【非特許文献３】Ｌｉｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３巻：４５〜５５頁（１９９９年）
【非特許文献４】Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０巻（４号）：５１９〜５２５頁（２０１０年）
【非特許文献５】Ｇｏｎｚａｌｅｚら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．５巻（１２号）：ｅ１４４１８頁（２０１０年）
【非特許文献６】Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１巻（７号）：１１５０〜１１５９頁（２０１１年）
【非特許文献７】Ｉｓｌａｍら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１巻（７号）：１１６０〜１１６７頁（２０１１年）
【非特許文献８】Ｔａｎｇら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６巻（５号）：３７７〜３８２頁（２００９年）
【非特許文献９】Ｋｕｒｉｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４巻（５号）：ｅ４２頁（２００６年）
【非特許文献１０】Ｑｉｕ  Ｓら、Ｆｒｏｎｔ  Ｇｅｎｅｔ．３巻：１２４頁（２０１２年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要約
しかし、長いＰＣＲ反応が使用される場合であっても、ＤＮＡ鋳型（例えば、長いＤＮＡ鋳型）は識別されるため、これらのアプローチは、ｍＲＮＡに沿った配列の偏った表示を生じ得、ｍＲＮＡ（例えば、長いｍＲＮＡ）の完全配列を得ることができない可能性がある。
【０００６】
本開示は、低含量の細胞および／または単一細胞から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを増幅する方法を提供する。本開示はまた、細胞がストレス（例えば、ｃＤＮＡ解析のための上昇した温度）を経験せず、よってトランスクリプトームプロファイルを維持する、トランスクリプトーム解析の方法を提供する。
【０００７】
一実施形態では、本開示は、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法であって、
（ａ）プライマーを鋳型核酸分子にアニーリングし、これにより、アニーリングされた鋳型核酸分子を生成するステップと、
（ｂ）ヌクレオチドの存在下で、
ｉ．前記アニーリングされた鋳型核酸分子、
ｉｉ．１種または複数のアクセプター核酸分子、および
ｉｉｉ．改変された逆転写酵素であって、約１２℃〜約４２℃の温度で、多くとも約５％の誤り率で、ｉ）前記アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写し、ｉｉ）アクセプター核酸分子へと移動し、ｉｉｉ）前記アクセプター核酸分子の配列を逆転写することにより、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成する、改変された逆転写酵素
を混合するステップと
を含む方法に関する。
【０００８】
一部の実施形態では、移動は、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、単一の容器内で行われる。一部の実施形態では、本方法は、複数の別個のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む不均一な（ｈｅｔｅｒｅｇｏｎｅｏｕｓ）複数の鋳型核酸分子において本方法を行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、複数の別個のリボ核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子は、多くとも約２時間で調製される。一部の実施形態では、鋳型核酸分子は、人為的に断片化されたＤＮＡ鋳型、自然に断片化されたＤＮＡ鋳型、人為的に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型、自然に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【０００９】
一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で、前記アニーリングされた鋳型核酸分子を増幅する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の改善された酵素特性は、前記野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、より高い熱安定性、より高い比活性、より高い処理能力、より高い鎖置換、より高い端から端までの鋳型ジャンピング、より高い親和性およびより高い忠実度からなる群から選択される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、Ｒ２逆転写酵素である。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも約９０％同一性を有し、配列番号５２と比べて少なくとも１個の置換改変を含有する。
【００１０】
一部の実施形態では、本方法は、（ａ）および（ｂ）を行った後に、タグを鋳型核酸分子に付加し、これにより、複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、タグ付けされた複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、タグをさらに含む。一部の実施形態では、タグは、ビオチン、アジド基、アセチレン基、Ｈｉｓ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｖ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ  Ｂ、ＨＰＣペプチドタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシン−タグからなる群から選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を行い、これにより、１種または複数のアンプリコンを形成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）およびＰＣＲ増幅反応は、同じ容器内で行われる。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅は、逆転写酵素の不活性化に十分な温度で行われる。
【００１２】
一部の実施形態では、１種または複数のアクセプター核酸分子は、改変された逆転写酵素による逆転写を停止する改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本方法は、対象から１種または複数の鋳型核酸分子を含む試料を得るステップと、１種または複数のプライマーを前記１種または複数の鋳型核酸分子にアニーリングするステップとをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、組織試料である。一部の実施形態では、試料は、１種または複数の無細胞核酸を含み、本方法は、同じ容器内で（ａ）および（ｂ）の反応を行うステップをさらに含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本方法は、１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、１種または複数の鋳型核酸分子を含む試料から少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップは、ｒＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップは、ｒＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブガイド型エンドヌクレアーゼ的切断を含む。一部の実施形態では、１種または複数の鋳型核酸分子は、少なくとも１種のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含み、本方法は、１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、１種または複数の鋳型核酸分子から少なくとも１種のｔＲＮＡを枯渇させるステップをさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本方法は、１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子の精製の非存在下で行われる。一部の実施形態では、本方法は、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を含む混合物を精製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、精製するステップは、２種の精製ステップを含む。一部の実施形態では、２種の精製ステップは、ニッケルおよびヘパリン親和性精製ステップを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本方法は、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの１種または複数の鋳型核酸分子において行われる。一部の実施形態では、本方法は、１種または複数のランダムプライマーを鋳型核酸分子にアニーリングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、プライマーは、１種または複数のアダプター配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、鋳型核酸分子は、単一細胞に由来する。
【００１６】
一実施形態では、本開示は、相補デオキシリボ核酸分子を調製するための方法であって、
（ａ）１種または複数のプライマーをある量の鋳型核酸分子にアニーリングし、これにより、１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子を生成するステップと、
（ｂ）ヌクレオチドの存在下で、
ｉ．前記１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子、
ｉｉ．１種または複数のアクセプター核酸分子、および
ｉｉｉ．改変された逆転写酵素であって、単一の反応容器内でサーマルサイクリングを用いずに、アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写し、アクセプター核酸分子へと移動し、前記アクセプター核酸分子の配列を逆転写することにより、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成する、改変された逆転写酵素
を混合するステップと
を含む方法に関する。
【００１７】
一部の実施形態では、移動は、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない。一部の実施形態では、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子は、多くとも約２時間で調製される。一部の実施形態では、当該量の鋳型核酸分子は、人為的に断片化されたＤＮＡ鋳型、自然に断片化されたＤＮＡ鋳型、人為的に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型、自然に断片化されたリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、当該量の鋳型核酸分子は、１種または複数の無細胞核酸を含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、改善された酵素特性は、前記野生型の改変されていない逆転写酵素と比べて、より高い熱安定性、より高い比活性、より高い処理能力、より高い鎖置換、より高い端から端までの鋳型ジャンピング、より高い親和性およびより高い忠実度からなる群から選択される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、Ｒ２逆転写酵素である。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも９０％同一性を有し、配列番号５２と比べて少なくとも１個の置換改変を含有する。
【００１８】
一部の実施形態では、本方法は、（ａ）および（ｂ）を行った後に、当該量の鋳型核酸分子にタグを付加し、これにより、複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、タグを含む。一部の実施形態では、タグは、ビオチン、アジド基、アセチレン基、Ｈｉｓ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｖ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ  Ｂ、ＨＰＣペプチドタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシン−タグからなる群から選択される。一部の実施形態では、１種または複数のアクセプター核酸分子は、前記改変された逆転写酵素による逆転写を停止する改変されたヌクレオチドを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本方法は、対象から試料を得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、１種または複数の無細胞核酸を含み、本方法は、同じ容器内で（ａ）および（ｂ）の反応を行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、組織試料である。一部の実施形態では、本方法は、１種または複数のプライマーのアニーリングするステップに先立ち、１種または複数の鋳型核酸分子から少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップは、ｒＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップは、ｒＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブガイド型エンドヌクレアーゼ的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｉｔｉｃ）切断を含む。一部の実施形態では、当該量の鋳型核酸分子から少なくとも１種のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を枯渇させるステップは、１種または複数のプライマーのアニーリングに先立つ。
【００２０】
一部の実施形態では、本方法は、１種または複数のアニーリングされた鋳型核酸分子の精製の非存在下で行われる。一部の実施形態では、本方法は、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を含む混合物を精製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、精製するステップは、２種の精製ステップを含む。一部の実施形態では、２種の精製ステップは、ニッケルおよびヘパリン親和性精製ステップを含む。一部の実施形態では、当該量の鋳型核酸分子は、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの前記１種または複数の鋳型核酸分子である。一部の実施形態では、１種または複数のプライマーは、１種または複数のランダムプライマーを含む。一部の実施形態では、１種または複数のプライマーは、１種または複数のアダプター配列にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、当該量の鋳型核酸分子は、単一細胞に由来する。
【００２１】
一実施形態では、本開示は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも９０％同一性を有し、配列番号５２と比べて少なくとも１個の置換改変を含有するアミノ酸配列を含む、逆転写酵素活性を有するポリペプチドに関する。
【００２２】
一実施形態では、本開示は、Ｒ２逆転写酵素由来の１個または複数のドメインを含む、精製されたポリペプチドであって、多くとも約５％の誤り率で、鋳型核酸分子から１個または複数のコピーの相補デオキシリボ核酸分子を生成する、精製されたポリペプチドに関する。
【００２３】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で鋳型核酸分子を逆転写する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約１２℃〜約４２℃の温度で鋳型核酸分子を逆転写する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００２４】
一実施形態では、本開示は、Ｒ２逆転写酵素由来の１個または複数のドメインを含む、天然に存在しない酵素であって、約３時間未満の期間で、また、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７の精製された酵素と比較して、改善された安定性、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性、および忠実度からなる群から選択される少なくとも１種の酵素特性に関して１．０を超える性能指数で、相補デオキシリボ核酸産物を生成する、天然に存在しない酵素に関する。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｒ２逆転写酵素および／または天然に存在しない酵素および／またはポリペプチドは、少なくとも１個の突然変異および／または改変を有することができる。一部の実施形態では、Ｒ２および／または天然に存在しない酵素および／またはポリペプチドは、Ｃ９５２Ｓ、および／またはＣ９５６Ｓ、および／またはＣ９５２Ｓ、Ｃ９５６Ｓ（二重突然変異体）、および／またはＣ９６９Ｓ、および／またはＨ９７０Ｙ、および／またはＲ９７９Ｑ、および／またはＲ９７６Ｑ、および／またはＲ１０７１Ｓ、および／またはＲ３２８Ａ、および／またはＲ３２９Ａ、および／またはＱ３３６Ａ、および／またはＲ３２８Ａ、Ｒ３２９Ａ、Ｑ３３６Ａ（三重突然変異体）、および／またはＧ４２６Ａ、および／またはＤ４２８Ａ、および／またはＧ４２６Ａ、Ｄ４２８Ａ（二重突然変異体）突然変異、および／またはこれらのいずれかの組合せを含む。
【００２６】
一実施形態では、本開示は、
（ａ）ヌクレアーゼ複合体を複数の二本鎖核酸分子に付加するステップであって、前記ヌクレアーゼ複合体が、
ｉ．Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその機能的バリアント、および
ｉｉ．少なくとも１種の合成ガイドオリゴヌクレオチドであって、前記複数の二本鎖核酸分子における少なくとも１種の二本鎖核酸分子におけるリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）またはトランスファーリボ核酸（ｔＲＮＡ）領域に相補的な合成ガイドオリゴヌクレオチド
を含む、ステップと、
（ｂ）前記複合体に、少なくとも１種の二本鎖核酸分子の前記ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ領域を切断させ、これにより、少なくとも１種の切断された二本鎖核酸分子をもたらすステップと、
（ｃ）前記少なくとも１種の切断された二本鎖核酸分子またはその派生物を、核酸配列決定に付し、これにより、前記ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ領域を欠く前記少なくとも１種の二本鎖核酸分子の核酸配列を得るステップと
を含む方法に関する。
【００２７】
一部の実施形態では、合成ガイドオリゴヌクレオチドは、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）に相補的である。一部の実施形態では、合成ガイドオリゴヌクレオチドは、トランスファーリボ核酸（ｔＲＮＡ）に相補的である。一部の実施形態では、本方法は、配列決定するステップに先立ち、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡに由来する配列を含む複数の二本鎖分子の変性を要求しない。一部の実施形態では、複数の二本鎖核酸分子は、ｃＤＮＡを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本方法は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡに由来する配列を含む複数の二本鎖分子の変性を要求しない。一部の実施形態では、複数の二本鎖核酸分子は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡに由来する配列を含む。一部の実施形態では、二本鎖核酸分子は、ｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、所定の領域は、ｒＲＮＡの領域である。一部の実施形態では、所定の領域は、ｔＲＮＡの領域である。
【００２９】
一実施形態では、本開示は、核酸分子のコンカテマーを調製するための方法であって、
（ａ）複数の二本鎖核酸分子の末端をプロセシングするステップと、
（ｂ）第１の複数のアダプター分子を前記複数の二本鎖核酸分子に付加するステップであって、前記第１の複数のアダプター分子が、１種または複数のオーバーハング配列を含み、少なくとも２種のオーバーハング配列が、互いに相補的（ｃｏｍｐｌｅｎｔａｒｙ）であり、これにより、第１の複数のアダプター接続二本鎖核酸分子をもたらす、ステップと、
（ｃ）プライマーの非存在下で、重合酵素を前記第１の複数のアダプター接続二本鎖核酸分子に付加し、それによって、前記重合酵素が、前記１種または複数のオーバーハング配列によって２種またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接することにより、アダプター接続二本鎖核酸コンカテマーの第１のセットを形成するステップと、
（ｄ）第２の複数のアダプター分子を前記第１のセットに付加するステップであって、前記第２の複数のアダプター分子が、１種または複数のオーバーハング配列を含み、少なくとも２種のオーバーハング配列が、互いに相補的であり、これにより、アダプター接続二本鎖核酸分子の第２のセットをもたらす、ステップと、
（ｅ）アダプター分子のセットを用いて（ａ）〜（ｃ）を反復して、所定の平均長を含むコンカテマーを得るステップと
を含む方法に関する。
【００３０】
一部の実施形態では、（ａ）のプロセシングするステップは、末端修復を含む。一部の実施形態では、重合酵素は、逆転写酵素である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、Ｒ２逆転写酵素またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、第１の複数のアダプター分子、第２の複数のアダプター分子またはその両方は、特有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む。一部の実施形態では、重合酵素は、ＰＣＲまたは等温増幅反応において２種またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接する。一部の実施形態では、第１の複数のアダプター分子、第２の複数のアダプター分子またはその両方は、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、アダプターは、特有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む。一部の実施形態では、増幅するステップは、ＰＣＲまたは等温増幅によって行われる。一部の実施形態では、アダプターは、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。
【００３２】
本開示の利点として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：様々な配列技術と適合性である、ｃＤＮＡおよび核酸ライブラリー調製（例えば、単一細胞および／またはバルクライブラリー調製）のための効率的かつ単純な方法；単一細胞核酸（例えば、ＲＮＡ）配列決定およびバルク核酸（例えば、ＲＮＡ）配列決定に使用され得る高品質ライブラリー調製；改善された酵素特性を有する改変された逆転写酵素；核酸試料（例えば、ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）から核酸（例えば、ｃＤＮＡ）ライブラリーへの高い変換（例えば、効率および／または忠実度が）；低い非特異的産物収率；ならびに外界温度（例えば、３０℃）で核酸合成を行うことができるため、細胞がストレス（例えば、ｃＤＮＡ合成のために上昇した温度の必要なし）を経験しない、トランスクリプトーム解析。
【００３３】
本開示の利点は、ランダムもしくはマルチプライミングを使用して核酸（例えば、ｃＤＮＡ）ライブラリーを産生する、および／または少ない量（例えば、５００フェムトモル濃度）の断片化／分解された核酸分子（単数または複数）であっても、断片化／分解された核酸分子（単数または複数）（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ）からライブラリーを産生する能力も含む。本開示の利点は、断片を増幅し（例えば、完全断片の増幅）、配列決定のために完全断片の複数コピーを生成する、開示されている方法（例えば、改変された逆転写酵素を使用することによる）の能力も含む。現在利用できる方法は、断片をランダム位置で増幅させることができ、断片の区画を増幅することのみができるため、現在の方法に従った断片（単数または複数）の配列決定および同定は、少ない量では利用できない。本開示の利点は、単一ステップによるまたは２ステップ増幅プロトコールによる増幅も含み、よって、特異性および効率を増加させる。現在の方法は、低収率、低効率および／または低特異性をもたらし得る複数ステップ増幅を含む。本開示の方法の別の利点（ａｄａｖａｎｔａｇｅ）は、鋳型に対して相補的である必要がない核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の小片を使用してプライミングする性能である。本開示の別の利点は、室温でおよび／または約３０℃もの低さの温度で鋳型ジャンプする改変された酵素の能力である。本開示の別の利点は、３未満のステップで（図１）および／または４時間未満で試料からライブラリーを調製する能力である。この利点は、臨床研究および検査ならびに医療分野にとって特に重要である。本開示の別の利点は、鋳型ジャンピング、処理能力、鎖置換特性、酵素活性および／または忠実度を改善する、本明細書に開示されている方法（例えば、改変された逆転写酵素を使用することによる）の能力である。
【００３４】
本開示の追加的な態様および利点は、当業者には、本開示の単なる説明的実施形態が示され記載されている、次の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。了解できるであろうが、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明快な観点での改変が可能であり、これらは全て、本開示から逸脱するものではない。したがって、図面および記載は、制限的ではなく、本来説明的であると考慮するべきである。
参照による援用
【００３５】
本明細書で言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願およびＮＣＢＩ受託番号は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願またはＮＣＢＩ受託番号のそれぞれが、参照により組み込まれていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれている刊行物および特許、特許出願またはＮＣＢＩ受託番号が、本明細書に含有されている本開示と矛盾する場合、本明細書は、いかなるそのような矛盾する資料にも優先するおよび／またはその上位にあることが意図される。
【００３６】
本開示の新規の特色は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特色および利点のより良い理解は、本開示の原理が用いられる例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付随する図面（本明細書では同様に「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」および「図（ＦＩＧ．）」）を参照することによって、得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、従来の方法と本開示の方法との間の相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーの調製の間の差を例示する。図１はまた、リキッドバイオプシー試料から配列決定のための試料を調製する際、従来の方法に基づく場合と、本開示の方法に基づく場合との間の差を例示する。従来の方法は、約１〜２日かかるプロトコールおよび４〜５時間を超える直接関与時間を必要とするが、本開示の方法は、約２時間未満かかるプロトコールおよび約３０分未満の直接関与時間を必要とする。
【００３８】
【図２】図２は、本開示の方法に基づいてライブラリーを構築するためのワークフローを例示する。
【００３９】
【図３】図３は、ライブラリーを構築するためのワークフローを例示する。
【００４０】
【図４】図４は、ランダムプライマーを使用する、ライブラリーを構築するためのワークフローを例示する。
【００４１】
【図５Ａ】図５Ａは、断片化もしくは分解されたリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をＲＮＡプライミングと共に使用する、ライブラリーを構築するためのワークフローを例示する。
【００４２】
【図５Ｂ】図５Ｂは、断片化もしくは分解されたＲＮＡまたはＤＮＡをＲＮＡプライミングと共に使用する、ライブラリーを構築するためのワークフローの例（特異的プライマーを用いる方法）を例示する。
【００４３】
【図６Ａ】図６Ａは、断片化もしくは分解されたＲＮＡまたはＤＮＡをドナー複合体と共に使用する、ライブラリーを構築するためのワークフローを例示する。
【００４４】
【図６Ｂ】図６Ｂは、断片化もしくは分解されたＲＮＡまたはＤＮＡをドナー複合体と共に使用する、ライブラリーを構築するためのワークフローの例（特異的プライマーを用いる）を例示する。
【００４５】
【図７】図７は、Ｒ２逆転写酵素のＮ末端およびＣ末端トランケーションの概略表現を例示する。
【００４６】
【図８】図８は、選択された非長末端反復（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンを用いた配列解析、および２つの保存領域（領域−１および領域０）の上流におけるＮトランケーション部位の例を例示する。
【００４７】
【図９】図９は、選択された非ＬＴＲレトロトランスポゾンを用いた配列解析、ならびに２つの保存モチーフ８＊および９＊の下流におけるＣ末端トランケーション部位の例を例示する。
【００４８】
【図１０】図１０は、精製された野生型Ｒ２逆転写酵素およびＮ末端トランケート型Ｒ２逆転写酵素を示すゲルを例示する。
【００４９】
【図１１】図１１は、合成ＲＮＡを使用することにより、Ｒ２酵素およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素の活性および鋳型ジャンピング特性を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルを例示する。
【００５０】
【図１２Ａ】図１２Ａは、配列決定ライブラリー調製のためのワークフローを例示する。
【００５１】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、１ポット（例えば、単一の容器）での反応に基づくライブラリー調製のリアルタイムＰＣＲデータを例示する。
【００５２】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、アンプリコンを示すゲルを例示する。
【００５３】
【図１３】図１３は、異なる鋳型量を使用した１ポット（例えば、単一の容器）でのＲＮＡライブラリー調製を例示する。
【００５４】
【図１４】図１４は、異なる鋳型長を用いた１ポット（例えば、単一の容器）でのＲＮＡライブラリー調製を例示する。
【００５５】
【図１５】図１５は、酵素活性および鋳型ジャンピングが塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度に依存することを例示する。
【００５６】
【図１６Ａ】図１６Ａは、蛍光標識プライマー（フルオレセイン）に基づいて可視化されたニッケルおよび／またはヘパリン親和性精製後の酵素活性を例示する。
【００５７】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、Ｓｙｂｒ金染色に基づいて可視化されたニッケルおよび／またはヘパリン親和性精製後の鋳型ジャンピング特性を例示する。
【００５８】
【図１７】図１７は、ＤＮＡ鋳型の存在下におけるＲ２酵素活性および鋳型ジャンピング（レーン１：酵素なしの対照；レーン２：ＤＮＡ鋳型の存在下における０．０２３μｇ／μｌの酵素）を例示する。
【００５９】
【図１８Ａ】図１８Ａは、リキッドバイオプシーからのライブラリー調製物を配列決定するための本開示の方法のワークフローを例示する。
【００６０】
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＲＮＡプライミングアプローチおよびＲＮＡドナーアプローチの両方で、試料ＤＮＡ断片がＲ２酵素によって捕捉されたことを例示する。
【００６１】
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＲＮＡプライミングアプローチの使用により、試料ＤＮＡ断片（様々な濃度で）がＲ２酵素によって捕捉されたことを例示する。
【００６２】
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、ＲＮＡドナーアプローチの使用により、試料ＤＮＡ断片（様々な濃度で）がＲ２酵素によって捕捉されたことを例示する。
【００６３】
【図１９】図１９は、ＲＮＡドナーアプローチの使用により、試料ＤＮＡ断片が５００フェムトモル濃度と同程度に低い濃度で捕捉されたことを例示する。
【００６４】
【図２０】図２０は、リキッドバイオプシーの適用のために本開示の方法が使用され得ることを例示する。図２０は、本明細書に記載されている方法が、現在利用できる技術と比較して高い感度を示すことを開示している（例えば、本明細書に開示されている方法は、０．３ｐｇと同程度に低い、非常に低いＤＮＡ量に使用することができ、これは、現在利用できる方法よりも約１００〜１０００倍高い感度である）。データは、０．３ｐｇよりもさらに低い（例えば数桁低い）ＤＮＡ量を伴う適用の可能性も示す。
【００６５】
【図２１】図２１は、ＲＮＡ（例えばエキソソームＲＮＡ）および無細胞ＤＮＡの両方における突然変異を検出することを利用する、本開示の方法を例示する。この方法は、ＲＮＡおよび無細胞ＤＮＡを組み合わせることにより検出感度を増加させることによって、稀な突然変異または低頻度の突然変異（例えば、一部の突然変異対立遺伝子は、血漿１ｍＬ当たり１個未満のコピーで生じ得る）を検出するために使用することができる。この方法を使用して、例えば、体液（例えば血液）から単離された解析物を試験することができる。血漿などの体液は、様々な無細胞の核酸供給源を含有し得る。そのような無細胞の供給源は、循環無細胞のＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）および一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ））およびＲＮＡ（例えば細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）およびエキソソーム由来ＲＮＡ）であり得る。無細胞ＤＮＡは、断片化および／または分解の様々な段階（例えば異なる長さ）で存在し得る。細胞外ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を挙げることができるが、これらに限定されない。図２１はまた、同じかまたは異なる管（例えば同じＰＣＲ管）内に存在する無細胞ＤＮＡおよびＲＮＡを区別してタグ付けする、本開示の方法を例示する。タグ付けは、ＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型から発生した配列間の区別を可能にすることにより、配列決定後の解析を容易にする。図２１は、２つの異なる解析物、ＤＮＡおよびＲＮＡが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ポリＡポリメラーゼ、ならびに特異的なヌクレオチド基質のｄＣＴＰ（あるいはｄＧＴＰもしくはｄＴＴＰ）およびＡＴＰの存在下でポリテール付加されたことを示す。手短に言えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）の両方を含有する反応物をポリＡポリメラーゼ、ＴｄＴ、ｄＣＴＰ、およびＡＴＰと混合し、インキュベートした（図２１）。ポリＡポリメラーゼは、好ましい基質ＡＴＰを使用してＲＮＡを優先的に伸長させ、一方でＴｄＴは、好ましいデオキシ基質ｄＣＴＰを使用してＤＮＡを優先的に伸長させる。一般に反応は、両方の酵素（例えばポリＡポリメラーゼおよびＴｄＴ）を同時に用いて行ってよい、あるいは、一度に１種の酵素を用いて逐次行ってもよい。
【００６６】
【図２２Ａ】図２２Ａは、ストレプトアビジンに固定化したオリゴヌクレオチドが、特異的な鋳型の捕捉能および鋳型ジャンピング能の効率を改善するために使用され得ることを例示する。図２２Ａは、ストレプトアビジンに固定化したオリゴヌクレオチドが、特異的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ鋳型（単数または複数）に結合することを示す。この場合では、ストレプトアビジンに固定化したオリゴヌクレオチドを磁気ビーズに結合させる。特異的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ鋳型がストレプトアビジン−磁気ビーズ複合体に結合したら、鋳型を富化することができる。オリゴヌクレオチドはプライマーとして使用することができ、鋳型は酵素（例えばＲ２酵素）の存在下で転写することができる。
【００６７】
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドアクセプターの両方に結合したストレプトアビジンを含む複合体が、特異的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ鋳型（単数または複数）に結合することが可能であることを例示する。手短に言えば、特異的鋳型がオリゴヌクレオチドプライマーに結合し、次いで、プライマーは、酵素（例えばＲ２酵素）の存在下で伸長させられ得る。次いで、プライマー伸長は、アクセプターオリゴヌクレオチドと特異的鋳型との間の近接性により、鋳型ジャンピングを受ける。
【００６８】
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドアクセプター、および磁気ビーズに結合したストレプトアビジンを含む複合体が、特異的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ鋳型（単数または複数）に結合することが可能であることを例示する。この場合では、特異的鋳型をまず磁気ビーズで富化する。鋳型は次いで酵素（例えばＲ２酵素）の存在下でコピーされ、伸長した配列はさらに鋳型ジャンピングを受ける場合がある。
【００６９】
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、鋳型のコンカテマー化を例示する。一部の配列決定技術は長い配列決定リード長（約５００ｂｐ〜約５００００ｂｐ）を有するが、他は短い配列決定リード長（約５０ｂｐ〜約２５０ｂｐ）を有する。体液から単離された無細胞ＤＮＡおよびＲＮＡのほとんどは短い断片（約２０ｂｐ〜約２００ｂｐ）である。図２３Ａおよび２３Ｂに示される方法は、長い鋳型コンカテマーを形成することができるため、長い配列決定リード長を有する配列決定技術に特に適している。図２３Ａは、シグナル伝達配列によって分離された、いくつかの鋳型をコンカテマー化する方法を例示する。この方法では、短いｄｓＤＮＡ断片が、シグナル伝達配列によって分離された長いコンカテマーに変換される。図２３Ｂは、特異的なアダプターを両末端に含むコンカテマー化の最終産物を示す。アダプターの設計は、タグ付けされた分子をトレースすることを可能にし、かつデータ解析中のエラーを低減させるのにも役立つ固有の分子識別子配列（ＵＭＩ）を組み込んでいる。手短に言えば、２種またはそれよりも多いアダプターでｄｓＤＮＡ断片をライゲーションする。次いで、プライマーなしのＰＣＲ（あるいは等温増幅）を使用し、ライゲーションした断片を伸長させる。コンカテマーの長さまたは付着された鋳型の数は、例えば、改変されたヌクレオチドでアダプターをタグ付けすることによって（例えば、メチル化ヌクレオチドを導入することによって、またはｄＵＴＰを挿入することによって）、決定することができる。コンカテマーの長さは、改変／未改変アダプター間の比に基づいて調節することができる。アダプター配列は相同プライミングの場所として機能し得る（相同スポットにアニーリングすると、ｓｓＤＮＡ断片は鋳型およびプライマーとして機能する）。ＰＣＲにおける反応は、選択された数のサイクル（サイクルが多いほどコンカテマーが長くなる）または時間（等温増幅）を経る。次いで、反応を停止させ、長いｄｓＤＮＡコンカテマーを２つの固有のｄｓＤＮＡアダプターとライゲーションする。実施例１３も参照されたい。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、鋳型のコンカテマー化を例示する。一部の配列決定技術は長い配列決定リード長（約５００ｂｐ〜約５００００ｂｐ）を有するが、他は短い配列決定リード長（約５０ｂｐ〜約２５０ｂｐ）を有する。体液から単離された無細胞ＤＮＡおよびＲＮＡのほとんどは短い断片（約２０ｂｐ〜約２００ｂｐ）である。図２３Ａおよび２３Ｂに示される方法は、長い鋳型コンカテマーを形成することができるため、長い配列決定リード長を有する配列決定技術に特に適している。図２３Ａは、シグナル伝達配列によって分離された、いくつかの鋳型をコンカテマー化する方法を例示する。この方法では、短いｄｓＤＮＡ断片が、シグナル伝達配列によって分離された長いコンカテマーに変換される。図２３Ｂは、特異的なアダプターを両末端に含むコンカテマー化の最終産物を示す。アダプターの設計は、タグ付けされた分子をトレースすることを可能にし、かつデータ解析中のエラーを低減させるのにも役立つ固有の分子識別子配列（ＵＭＩ）を組み込んでいる。手短に言えば、２種またはそれよりも多いアダプターでｄｓＤＮＡ断片をライゲーションする。次いで、プライマーなしのＰＣＲ（あるいは等温増幅）を使用し、ライゲーションした断片を伸長させる。コンカテマーの長さまたは付着された鋳型の数は、例えば、改変されたヌクレオチドでアダプターをタグ付けすることによって（例えば、メチル化ヌクレオチドを導入することによって、またはｄＵＴＰを挿入することによって）、決定することができる。コンカテマーの長さは、改変／未改変アダプター間の比に基づいて調節することができる。アダプター配列は相同プライミングの場所として機能し得る（相同スポットにアニーリングすると、ｓｓＤＮＡ断片は鋳型およびプライマーとして機能する）。ＰＣＲにおける反応は、選択された数のサイクル（サイクルが多いほどコンカテマーが長くなる）または時間（等温増幅）を経る。次いで、反応を停止させ、長いｄｓＤＮＡコンカテマーを２つの固有のｄｓＤＮＡアダプターとライゲーションする。実施例１３も参照されたい。
【００７０】
【図２４Ａ】図２４Ａは、本開示の鋳型コンカテマー化のワークフローを例示する。
【００７１】
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、２００ｂｐのＤＮＡ断片のコンカテマー化を示すゲルを例示する。
【００７２】
【図２５】図２５は、逆転写酵素および第２の酵素または酵素活性（すなわちコンパニオン酵素）、例えばｓｓＤＮＡ  ３’−５’エキソヌクレアーゼまたは編集活性を有するポリメラーゼ（例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ）の存在下における概略的な反応を例示する。コンパニオン酵素の例としては、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、およびエキソヌクレアーゼＴが挙げられるが、これらに限定されない。コンパニオン酵素の機能または目的の１つは、遊離した未使用の伸長プライマーの余剰分を除去することである。遊離プライマーは、不要な産物に寄与し得る（例えば、遊離プライマーは、ジャンピングアクセプターとして機能する場合もあれば、非特異的プライマーとして使用される場合もある）。図２５は、ＲＮＡ鋳型へのプライマーのアニーリングから始まる反応スキームを示す（プライマーは、特定の配列に、またはポリＡテールに、または３’末端のポリテール付加の産物にアニーリングすることができる）。次いで、反応物を、酵素（例えばＲ２酵素）、編集活性を有するポリメラーゼ（例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ）、およびアクセプター鋳型（例えば、３’末端が保護されたアクセプター鋳型）と混合する。アクセプター鋳型は、それをエキソ消化から保護するための塩基を３’末端に含み得る。アクセプター鋳型を保護するために使用することのできるヌクレオチドの例としては、修飾ありまたはなしのリボヌクレオチド、チオホスフェート、およびヌクレオチド塩基が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、図２５に示されている反応は、例えば、エキソヌクレアーゼに対して適切な比のプライマーが使用されていれば、単一ステップで実行することができる。図２５に示されるように、アクセプター鋳型へのジャンピングが完了する前にＲ２逆転写酵素がＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖から解離すれば、産物は過伸長する（３’オーバーハング）。次いで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の平滑末端構造を再生させることができる。一般に、アクセプター鋳型へのジャンピングはマルチターンオーバー機構により完了することができ、したがって反応物の収率が増加する。
【００７３】
【図２６】図２６は、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒトレースデータを例示する。ライン１は、血漿由来の断片化されたＲＮＡ  ｓｅｑライブラリーを表し、ライン２は、血漿由来の断片化されていないＲＮＡ  ｓｅｑライブラリーを表す（実施例１５を参照されたい）。
【００７４】
【図２７】図２７および図２８は、無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）ライブラリーを生成する方法を例示する。
【図２８】図２７および図２８は、無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）ライブラリーを生成する方法を例示する。
【００７５】
【図２９】図２９は、ライブラリー調製：配列決定能を最大にするための、磁気ビーズまたは固体支持体に付着された相補的オリゴヌクレオチドを使用したリボソームＲＮＡおよび／またはトランスファーＲＮＡおよび／またはＰＣＲ産物の引き出しを例示する。
【００７６】
【図３０】図３０は、ライブラリー調製：配列決定能を最大にするための、リボソームＲＮＡおよび／またはトランスファーＲＮＡおよび／またはＰＣＲ産物のオリゴヌクレオチドガイド型分解を例示する。
【００７７】
【図３１】図３１は、全てのＲＮＡ種を同時に捕捉／標的化することができる本開示の技術を例示する。図３１は、本開示の方法に従って得られた無細胞ＲＮＡライブラリーを示す。グラフは、２０ｎｇの無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）から調製されたライブラリーのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定結果に対応する。２８３５７１７１リードを解析し、９１．９％がマッピングされた。捕捉された項目／解析物の例には、ｖａｕｌｔ  ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｒｐＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、マクロｌｎｃ  ＲＮＡ、ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ  ＲＮＡ、３’オーバーラッピング（３  ｐｒｉｍｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ｎｃＲＮＡ、ＤＮＡ、双方向性プロモーターｉｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ＭＴ＿ｔＲＮＡ、ＭＴ＿ｒＲＮＡ、リボザイム、ＬＴＲ、レトロポゾン、およびＳＩＮＥが含まれたが、これらに限定されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
詳細な説明
本開示の様々な実施形態を本明細書に示し記載してきたが、当業者にとっては、そのような実施形態が、単なる一例として提示されていることは明快であろう。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変形形態、変化および置換を想定することができる。本明細書に記載されている本開示の実施形態の様々な代替を用いることができることを理解されたい。
【００７９】
他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。矛盾が生じる場合、定義を含む本願が優先されるであろう。また、文脈によってそれ以外が要求されていなければ、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むものとする。特許または特許公開の特定セクションのみが参照により組み込まれていると示されているのでなければ、本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および他の参考文献は、あたかも個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参照により組み込まれていると特にかつ個々に示されているかの如く、あらゆる目的で、それらの全体を参照により組み込む。本開示をさらに定義するために、次の用語、略語および定義を提示する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、例えば、実臨床における濃縮物または溶液の作製に使用される典型的な測定および液体取扱い手順により；これらの手順における不注意による過誤により；組成物の作製または方法の実施に用いられる成分の製造、供給源または純度の差により；その他により起こり得る数的含量の変形形態を指す。用語「約」は、特定の初期混合物に起因する組成のために異なる平衡条件のせいで異なる量も包含する。用語「約」によって改変されるにしろ改変されないにしろ、特許請求の範囲は、含量の均等を含む。一部の実施形態では、用語「約」は、報告される数値の１０％以内または報告される数値の５％以内または報告される数値の２０％以内を意味する。
【００８１】
本開示の要素または構成成分に先行する不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、実例の数、すなわち、当該要素または構成成分の出現に関して非制限的であることが意図される。したがって、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解読するべきであり、当該要素または構成成分の単数形の語形は、数が単数形であると明快に企図されなければ、複数形も含む。
【００８２】
用語「アニールする」、「ハイブリダイズする」または「結合する」は、本明細書で互換的に使用して、１種または複数の一本鎖ポリヌクレオチド配列、セグメントまたは鎖を組み合わせて、これらに、塩基対形成による二本鎖分子を形成させることを指すことができる。２個の相補配列（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、相補塩基と水素結合を形成することによりアニールまたはハイブリダイズして、二本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二本鎖領域を産生することができる。
【００８３】
用語「対象」は、例えば、ヒト、ならびに霊長類、齧歯類、ウマ、イヌおよびネコ等の非ヒト哺乳動物を含む、本開示の方法から利益を得ることができるいずれかの動物となることができる。対象は、真核生物、霊長類等の哺乳動物、例えば、チンパンジーもしくはヒト、ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えば、モルモット、ラット、マウス；ウサギ；または鳥類；爬虫類；または魚類を限定することなく含む。本明細書に記載されている方法を使用した処置が特に意図される対象は、ヒトを含む。対象は、個体または患者となることができる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー伸長反応」は、二本鎖核酸の変性、変性された核酸の一方または両方の鎖へのプライマーの結合、続いて、プライマー（単数または複数）の延長を一般に指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「反応混合物」は、核酸増幅（例えば、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅）の完了に必要な試薬を含む組成物を一般に指し、そのような試薬の非限定的な例は、標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡに対する特異性を有するプライマーセット、ＲＮＡの逆転写から産生されたＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（例えば、ＲＮＡの逆転写のための）、適した緩衝剤（双性イオン緩衝剤を含む）、補助因子（例えば、二価および一価カチオン）、ｄＮＴＰ、および他の酵素（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ））等）を含む。一部の事例では、反応混合物は、１種または複数のレポーター剤を含むこともできる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「レポーター剤」は、その存在または非存在を使用して増幅産物の存在を検出することができる、検出可能シグナルを生じる組成物を一般に指す。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」は、その存在、量および／または配列、またはこれらの１種もしくは複数の変化の決定が望まれるヌクレオチド配列を有する、核酸分子の出発集団中の核酸分子を一般に指す。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのアナログを含む、いずれかの種類の核酸となることができる。
【００８８】
用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドの存在下、適した温度およびｐＨで全てが配置されると、その配列が鋳型分子の少なくとも部分の配列と相補的であるオリゴヌクレオチドがプライマーに連結されるように、鋳型オリゴヌクレオチドに対して伸長される能力によって特徴付けられる、精製された制限消化物のように天然に発生するまたは合成により産生されるオリゴヌクレオチドを指す。しかし、この様式で使用される単なる能力は、プライマーが鋳型に対して完全に伸長されることを要求せず、一部の実施形態では、プライマーは、少数の非鋳型化（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）ヌクレオチドの付加のための部位としてのみ使用される。少なくとも６ヌクレオチド長の長さを有するプライマー六量体等、プライマーを使用することができる。一部の実施形態では、プライマーは、蛍光標識されていてよい（例えば、５’−／５６ＦＡＭ／ＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＧＣ／３’）。一部の実施形態では、プライマーは、約６〜約１００ヌクレオチドの範囲内の長さを有する、または一部の実施形態では、約１０〜約７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、より大型のプライマーを使用することができる。一部の実施形態では、ランダムプライマーを使用することができる。一部の実施形態では、プライマーは、ランダムプライマーとなることができる。一部の実施形態では、１種または複数のプライマーは、１種または複数のランダムプライマーとなることができる。
【００８９】
用語「１種または複数のプライマー」は、いずれかの数のプライマーまたはランダムプライマーを含むことができる。例えば、「１種または複数のプライマー」は、少なくとも、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、２０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００種のプライマーまたはランダムプライマーを含むことができる。１種または複数のプライマーは、約１〜約２、約１〜約３、約１〜約４、約１〜約５、約１〜約６、約１〜約７、約１〜約８、約１〜約９、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約１〜約３５、約５〜約１５、約３〜約１０、約５〜約２０、約１０〜約５０、約３０〜約１００種または約１００種を超えるプライマーを含むことができる。１種または複数のプライマーは、いずれかの数のプライマーを含むことができる。例えば、１種または複数のプライマーは、少なくとも、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、２０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、３５００００、４０００００、４５００００、５０００００、５５００００、６０００００、６５００００、７０００００、７５００００、８０００００、８５００００、９０００００、９５００００、１００００００、１５０００００、２００００００、２５０００００、３００００００、３５０００００、４００００００、４５０００００、５００００００、５５０００００、６００００００、６５０００００、７００００００、７５０００００、８００００００、８５０００００、９００００００、９５０００００、または１０００００００種のプライマーを含むことができる。１種または複数のプライマーは、約１０〜約１００、約１００〜約１０００、約１０００〜約１０，０００、約１０，０００〜約１００，０００、約１００，０００〜約１，０００，０００または約１，０００，０００〜約１０，０００，０００種のプライマーを含むことができる。
【００９０】
用語「ランダムプライマー」は、本明細書で使用される場合、その中にランダム塩基配列を含有するプライマーを指し、ランダム塩基配列から部分的になるか全面的になるにかかわらず、プライマーを包含することが意図される。
【００９１】
一部の実施形態では、プライマーは、アダプター配列を含むことができる。一部の実施形態では、プライマーの５’テール配列は、標的にハイブリダイズしない配列（アダプター配列）を含む。アダプター配列は、異なる３’標的結合配列を有する種々のプライマーにおいて同じになるように選択することができる（すなわち、「ユニバーサル」５’テール配列）。これにより、単一のレポータープローブ配列が、いずれか所望の標的配列の検出に使用されることが可能になり、これは、標識によりレポータープローブの合成がより複雑になるという点において利点である。一部の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡプライマーを含むことができる。一部の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡプライマーを含むことができる。一部の実施形態では、プライマーは、Ｒ２  ＲＮＡプライマーを含むことができる。一部の実施形態では、プライマーは、１種または複数のランダムプライマーを含むことができる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語（ｔｅｍ）「アクセプター鋳型」は、「アクセプター核酸分子」と同義である。一部の実施形態では、アクセプター核酸（ｎｕｃｌｅｃｉ  ａｃｉｄ）は改変することができる。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子は、３’末端において改変して、例えば、これをＲＮＡプライマーと間違われることから保護することができる。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子の改変は、ジデオキシ３’末端を含むことができる。一部の実施形態では、改変は、リン酸化３’末端を含むことができる。一部の実施形態では、本開示の酵素もしくはＤＮＡポリメラーゼによる伸長が例えば阻害され得るため、またはリガーゼによるライゲーションが阻害され得るため、典型的にはその３’末端にヒドロキシル基を有するポリヌクレオチドまたはアクセプター核酸分子のリン酸化３’末端は、３’ブロックとして作用することができる。３’ブロックの別の非限定的な例として、ポリメラーゼ伸長に対する有効な遮断剤として機能することができる、ポリヌクレオチドの３’末端への３’Ｃ３スペーサー（３炭素スペーサー）の付加が挙げられる。Ｚｈｏｕら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、５０巻：１３２８〜１３３５頁（２００４年）。よって、３’末端は、例えば、Ｃ３スペーサー、リン酸、アミン基（ＮＨ２）、またはポリヌクレオチドの３’末端および別のヌクレオチドの間におけるその後のホスホジエステル結合の形成を阻害する他のいずれかの化学修飾の付加によって遮断することができる。
【００９３】
「オーバーハング配列」は、本明細書で使用される場合、二本鎖領域から伸長する、核酸の一本鎖領域を指す。
【００９４】
「単離された」ポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、その天然の環境から除去された、組換え技法を使用して産生された、または化学的にもしくは酵素により合成された、のいずれかであるポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、精製することもできる、すなわち、他のいずれかのポリヌクレオチドおよび関連する細胞産物または他の不純物を本質的に含まないことができる。
【００９５】
用語「ポリメラーゼ」は、本明細書で使用される場合、鋳型として別の鎖を使用して、個々のヌクレオチドを鎖へと一体に連結する酵素を指すことができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、編集能を有するポリメラーゼである。一部の実施形態では、編集能を有するポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、Ｐｈｉ２９、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、ＫＯＤ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＴとなることができる。ポリメラーゼの例として、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、逆転写酵素活性を有するポリペプチド、またはそれらのいずれかのバリアント、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変されたポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＰＨＩ  ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、クレノウ断片、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアント、改変された産物および派生物を挙げることができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、本開示の逆転写酵素または改変された逆転写酵素となることができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、単一サブユニットポリメラーゼである。ポリメラーゼは、高い処理能力、すなわち、核酸鋳型を放出することなく、核酸鋳型へとヌクレオチドを継続的に取り込むポリメラーゼの性能を有することができる。
【００９６】
用語「逆転写酵素」またはＲＴは、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの両方による酵素を指す。ＲＴは、逆転写酵素活性を有する（例えば、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡの合成を触媒する）酵素の群を指す。一般に、そのような酵素として、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド（ｒｅｔｒｏｐｌａｓｍｉｄ）逆転写酵素、レトロン（ｒｅｔｒｏｎ）逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素、およびそれらの突然変異体、バリアントまたは派生物が挙げられるがこれらに限定されない。非レトロウイルス逆転写酵素は、非末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素（ｔｒａｎｓｃｉｐｔａｓｅ）およびグループＩＩイントロン逆転写酵素を含む。さらなる細菌逆転写酵素は、非レトロウイルス逆転写酵素の多くのクラス（すなわち、とりわけレトロン、グループＩＩイントロンおよび多様性生成レトロエレメント）について記載する、Ｓｉｍｏｎ  ＤおよびＺｉｍｍｅｒｌｙ  Ｓ（２００８年）「Ａ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６巻（２２号）：７２１９〜７２２９頁、ならびにＫｏｊｉｍａ，  ＫＫおよびＫａｎｅｈｉｓａ，  Ｍ（２００８年）「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｓｕｒｖｅｙ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ」Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２５巻：１３９５〜１４０４頁によって記載されている。逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡへと転写するために主に使用されており、次いでこれを、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、多様なプライマー伸長反応、５’ＲＡＣＥ、化学修飾の検出、またはＲＮＡ鋳型を使用したＤＮＡの合成を要求する他の技法等、様々な増幅方法におけるさらなる操作または使用のためにベクターにクローニングすることができる。
レトロウイルス逆転写酵素
【００９７】
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する７８ｋＤａの単一サブユニットを含有する。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、十分に活性な形態で発現された（Ｐｒａｓａｄ，  Ｖ．  Ｒ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１３５頁（１９９３年）に概説）。
【００９８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素は、ｐ６６およびｐ５１サブユニットのヘテロ二量体であり、そのうち小さい方のサブユニットは、タンパク質分解性切断による大きい方のサブユニットに由来する。ｐ６６サブユニットは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈドメインの両方を有する一方、ｐ５１サブユニットは、ＤＮＡポリメラーゼドメインのみを有する。活性ＨＩＶ  ｐ６６／ｐ５１逆転写酵素もまた、Ｅ．ｃｏｌｉを含む多数の発現宿主においてクローニングおよび発現が成功した（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，  Ｓ．  Ｆ．  Ｊ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、１６３頁（１９９３年）に概説）。ＨＩＶ  ｐ６６／ｐ５１ヘテロ二量体内で、５１ｋＤサブユニットは触媒的に不活性であり、６６ｋＤサブユニットは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性の両方を有する（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，  Ｓ．  Ｆ．  Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０巻：３９０５頁（１９９１年）；Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，  Ｚ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻：３１７９頁（１９９２年））。
【００９９】
トリ肉腫・白血症ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素ファミリーのメンバーもまた、２個のサブユニット、アルファ（およそ６２ｋＤａ）およびベータ（およそ９４ｋＤａ）のヘテロ二量体であり、そのうちアルファサブユニットは、タンパク質分解性切断によるベータサブユニットに由来する（Ｐｒａｓａｄ，  Ｖ．  Ｒ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）、１３５頁に概説）。このファミリーのメンバーとして、とりわけ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ逆転写酵素、トリ骨髄細胞腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素および骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１００】
ＡＳＬＶ逆転写酵素は、２種の追加的な触媒的に活性な構造形態のＡｄおよびａで存在することができる（Ｈｉｚｉ，  Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ，  Ｗ．  Ｋ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５２巻：２２８１頁（１９７７年））。
【０１０１】
沈降解析は、アルファ／ベータおよびベータ／ベータ二量体の存在を示唆し、ａ形態は、単量体および二量体形態の間の平衡状態で存在することを示唆する（Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔ，  Ｄ．  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７０巻：２３０頁（１９７３年）；Ｈｉｚｉ，  Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ，  Ｗ．  Ｋ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５２巻：２２８１頁（１９７７年）；ならびにＳｏｌｔｉｓ，  Ｄ．  Ａ．およびＳｋａｌｋａ，  Ａ．  Ｍ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：３３７２頁（１９８８年））。ＡＳＬＶアルファ／ベータおよびベータ／ベータ逆転写酵素は、同じタンパク質複合体に３種の異なる活性：ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（インテグラーゼ）活性を含むレトロウイルス逆転写酵素の唯一の公知の例である（Ｓｋａｌｋａ，  Ａ．  Ｍ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）、１９３頁に概説）。ａ形態は、インテグラーゼドメインおよび活性を欠く。
【０１０２】
ＡＳＬＶ逆転写酵素の個々のサブユニットの様々な形態が、クローニングおよび発現された。そのようなものとして、ベータへと正常にタンパク質分解性にプロセシングされる９８ｋＤａ前駆体ポリペプチド、およびベータカルボキシ末端から除去される４ｋＤａポリペプチド（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｆ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６１巻：５３４頁（１９８７年）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．ら、Ｆｏｃｕｓ  １７巻：５３頁（１９９５年））、ならびに成熟ベータサブユニット（Ｗｅｉｓ，  Ｊ．  Ｈ．およびＳａｌｓｔｒｏｍ，  Ｊ．  Ｓ．、米国特許第４，６６３，２９０号（１９８７年）；ならびにＳｏｌｔｉｓ，  Ｄ．  Ａ．およびＳｋａｌｋａ，  Ａ．  Ｍ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：３３７２頁（１９８８年））が挙げられる（Ｗｅｒｎｅｒ  ＳおよびＷｏｈｒｌ  Ｂ．  Ｍ．、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７巻：４７４０〜４７４４頁（２０００年）；Ｗｅｒｎｅｒ  ＳおよびＷｏｈｒｌ  Ｂ．  Ｍ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４巻：３２４５〜３２５２頁（２０００年）；Ｗｅｒｎｅｒ  ＳおよびＷｏｈｒｌ  Ｂ．  Ｍ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７４巻：２６３２９〜２６３３６頁（１９９９年）も参照されたい）。ヘテロ二量体ＲＳＶアルファ／ベータ逆転写酵素も、クローニングされたＲＳＶベータ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞から精製された（Ｃｈｅｍｏｖ，  Ａ．  Ｐ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．２巻：４９頁（１９９１年））。
非レトロウイルス起源の逆転写酵素
【０１０３】
逆転写酵素は、レトロウイルス起源のものではない多数の可動遺伝エレメントから単離することもできる。そのような可動遺伝エレメントは、高等生物種のゲノムに常在しており、このような可動遺伝エレメントの生活環において機能的役割を果たす。可動遺伝エレメントは、逆転写酵素の遺伝子をコードすることが公知である（Ｈｏｗａｒｄ  Ｍ  Ｔｅｍｉｎ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ：  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｐａｒａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ，  ａｎｄ  Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．２巻（６号）：４５５〜４６８頁に概説）。そのようなエレメントとして、レトロトランスポゾンが挙げられるがこれに限定されない。レトロトランスポゾンは、非末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンおよびＬＴＲ可動エレメントを含む（例えば、ＴＹ３、ＴＹ５、非ＬＴＲ、ＬＩＮＥ−Ｌ１、Ｒ２、Ｒ１）（ＣｏｒｄａｕｘおよびＢａｔｚｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００９年１０月、１０巻、６９１〜７０３頁によって概説）。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「非ＬＴＲレトロトランスポゾン」は、逆転写酵素活性を保有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンによってコードされる天然に存在するタンパク質およびそのポリペプチド断片と共に、その逆転写酵素活性を増強するまたはそれに対する有害効果がない、のいずれかである１種または複数のアミノ酸置換を含有する、それらに由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。非ＬＴＲレトロトランスポゾンの好まれるクラスは、Ｒ２タンパク質またはポリペプチドである。よって、本明細書で使用される場合、「Ｒ２タンパク質またはＲ２酵素もしくはポリペプチド、またはそれらの機能的断片」は、逆転写酵素活性を保有するＲ２エレメントによってコードされる天然に存在するタンパク質およびそのポリペプチド断片と共に、その逆転写酵素活性を増強するまたはそれに対する有害効果がない、のいずれかである１種または複数のアミノ酸置換を含有する、それらに由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。
【０１０５】
ＲＴをコードする遺伝エレメントであるレトロエレメントは、ＬＴＲ含有レトロエレメントおよび非ＬＴＲ含有レトロエレメントと表示される２種の主要ファミリーに分けられる（Ｘｉｏｎｇ  Ｙ、Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ＴＨ（１９９０年）「Ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ＥＭＢＯ  Ｊ  ９巻：３３５３〜６２頁）。非ＬＴＲ−レトロエレメントは、レトロプラスミド、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、レトロンおよび可動グループＩＩイントロンを含む、ＲＴコードエレメントの多様なファミリーである。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、ポリメラーゼ「活性画分」という用語は、ポリメラーゼ活性を有する酵素の画分として定義される。例えば、逆転写酵素活性画分（ＲＴ活性画分）は、逆転写酵素活性を有する酵素の画分である。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」、「改変された」、「天然に存在しない」および「突然変異体」は同義であり、例えば、突然変異誘発等の組換えＤＮＡ技法を使用して創出された１種または複数のアミノ酸挿入、欠失、突然変異および置換によって、特に列挙されているポリペプチドまたは酵素とは異なるポリペプチドまたは酵素を指す。目的の活性を消失させることなく、いずれのアミノ酸残基を置き換える、付加するまたは欠失させることができるかに関する決定におけるガイダンスは、特定のポリペプチドの配列を、相同ポリペプチド、例えば、酵母または細菌の配列と比較し、高い相同性の領域（保存された領域）において為されるアミノ酸配列変化の数を最小化することにより、またはアミノ酸をコンセンサス配列により置き換えることにより見出すことができる。一部の実施形態では、用語「派生物」、「バリアント」、「改変された」、「天然に存在しない」および「突然変異体」は、互換的に使用される。
【０１０８】
本開示の突然変異体は、本明細書に記載および例証されている方法が挙げられるがこれに限定されない、いずれか適した方法に従って生成することができる。置換、挿入、欠失および／または側鎖改変等の突然変異は、部位指向性突然変異誘発を含むいずれか適した技法を使用して、目的の遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に導入することができる（Ｗｕ編、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年））。ラムダｒｅｄリコンビナーゼ方法を使用して、遺伝子を「ノックアウト」することができる（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７巻：６６４０〜６６４５頁（２０００年））。永続的な、マーカーを含まない、複数遺伝子破壊を創出することができる。天然に存在しないヌクレオチドおよびアミノ酸を使用することもできる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「ホモログ」は、機能的に均等な、すなわち、指定の配列識別番号のアミノ酸配列を有する酵素と同じ酵素活性を有するが、アミノ酸配列に限られた数のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を有することができる、タンパク質を指す。タンパク質の機能を維持するために、置換は、アミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸により置き換える、保存的置換となることができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、ホモログは、タンパク質に対応する配列番号のアミノ酸配列と少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の同一性を有するタンパク質を指す。配列同一性を決定するためのアルゴリズムは、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）を経由して利用できるＢＬＡＳＴを含む。配列は、相同性を示す程度まで同様であり、よって、同様または同一の機能であると決定することができる。
【０１１１】
各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドは、ランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発等の方法を使用して、本明細書に開示されているヌクレオチド配列で構成された酵素のＤＮＡに置換、欠失、挿入および／または付加を適切に導入することにより得ることができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０巻、６４８７頁（１９８２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００巻、４４８頁（１９８３年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、２００頁（１９９１年））。各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入し、発現させて、ホモログを得ることができる。
【０１１２】
用語「異種」は、参照されている種以外の供給源に由来する分子または活性を指す一方、「相同」は、宿主微生物に由来する分子または活性を指す。したがって、本開示のコード核酸の外因的発現は、異種または相同コード核酸のいずれか一方または両方を使用することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、真菌、または種々の他の生物のいずれかから選択することができ、改変されたまたは天然に存在しない酵素は、これらの中で生成され、これらは、宿主生物として使用することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、宿主は、特に制限されておらず、酵素活性（単数または複数）は、例えば、本明細書に記載されている方法を使用して、いずれか適した宿主生物に取り込まれてよい。一部の実施形態では、宿主は、細菌、酵母、藻類、ラン藻、真菌もしくは植物細胞またはこれらのいずれかの組合せから選択される。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、遺伝子操作に適した十分に特徴付けされた微生物であるため、特に有用な宿主生物である。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「酵素」は、生化学的反応を触媒することが可能な、細胞によって産生されるタンパク質を含む。さらに、文脈がそれ以外を指示しない限り、本明細書で使用される場合、「酵素」は、関連する触媒活性を保持するタンパク質断片を含み、関連する触媒活性を保持するように合成された人工酵素を含むことができる。
【０１１６】
本明細書に記載されている酵素のそれぞれは、当該酵素の活性と機能的に均等な活性を保持する限りにおいて、追加的なアミノ酸配列に取り付けることができる。上述の通り、各酵素またはそのホモログが、当該酵素の活性と機能的に均等な活性を保持する限りにおいて、（ポリ）ペプチド断片となることができることが理解される。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示の組成物、方法およびキットにおける使用のための酵素は、逆転写酵素活性を有するいずれかの酵素を含む。そのような酵素として、非レトロウイルス逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、Ｒ２逆転写酵素、ＬＴＲ−レトロトランスポゾン、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，  Ｒ．  Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：４８７〜４９１頁（１９８８年）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、およびそれらの突然変異体、断片、バリアントまたは派生物が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本開示における使用のための逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素および一般にＡＳＬＶ逆転写酵素等、レトロウイルス逆転写酵素を含む。突然変異体逆転写酵素は、例えば、部位指向性またはランダム突然変異誘発によって目的の逆転写酵素をコードする遺伝子（単数または複数）を突然変異させることにより得ることができる。そのような突然変異は、点突然変異、欠失突然変異、挿入性突然変異およびトランケーションを含むことができる。例えば、１種または複数の点突然変異（例えば、１種または複数のアミノ酸の、１種または複数の異なるアミノ酸による置換）を使用して、本開示における使用のための突然変異体逆転写酵素を構築することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、酵素は、低い誤り率で高い忠実度を示すように選択および／または操作される。ヌクレオチドポリメラーゼの忠実度は典型的に、誤り率、すなわち、広く公知であるワトソン・クリック塩基対形成の法則に反する様式でのヌクレオチドの取り込みの頻度として測定される。ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の忠実度または誤り率は、いずれか適したアッセイを使用して測定することができる。例えば、Ｌｕｎｄｂｕｒｇら、１９９１年、Ｇｅｎｅ、１０８巻：１〜６頁を参照されたい。用語「忠実度」は、重合の精度、または鋳型に相補的な核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を合成する際に、間違った基質（例えば、ヌクレオチド）から正しい基質を識別するポリメラーゼの能力を指すように使用することができる。酵素の忠実度が高いほど、酵素が、核酸合成の際に伸びている鎖にヌクレオチドを誤って取り込む程度は低くなる；すなわち、忠実度の増加または増強は、減少した誤り率（減少した誤取り込み率）を有するより忠実なポリメラーゼをもたらす。一部の実施形態では、誤取り込み誤り率は、多くとも約１０−２、１０−４、１０−６または１０−８である。
【０１１９】
一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素（例えば、天然に存在しないまたは改変された逆転写酵素、天然に存在しないまたは改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾン、天然に存在しないまたは改変されたＲ２逆転写酵素）または改変されたポリペプチドは、約５０％に等しいもしくはそれに満たない、約４５％に等しいもしくはそれに満たない、約４０％に等しいもしくはそれに満たない、約３５％に等しいもしくはそれに満たない、約３０％に等しいもしくはそれに満たない、約２５％に等しいもしくはそれに満たない、約２０％に等しいもしくはそれに満たない、約１５％に等しいもしくはそれに満たない、約１０％に等しいもしくはそれに満たない、約９％に等しいもしくはそれに満たない、約８％に等しいもしくはそれに満たない、約７％に等しいもしくはそれに満たない、約６％に等しいもしくはそれに満たない、約５％に等しいもしくはそれに満たない、約４％に等しいもしくはそれに満たない、約３％に等しいもしくはそれに満たない、約２％に等しいもしくはそれに満たない、約１％に等しいもしくはそれに満たない、約０．０１％に等しいもしくはそれに満たない、約０．００１％に等しいもしくはそれに満たない、約０．０００１％に等しいもしくはそれに満たない、約０．００００１％に等しいもしくはそれに満たない、約０．０００００１％に等しいもしくはそれに満たない、または約０．００００００１％に等しいもしくはそれに満たない誤取り込み誤り率を示す。
【０１２０】
一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素（例えば、天然に存在しないまたは改変された逆転写酵素、天然に存在しないまたは改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾン、天然に存在しないまたは改変されたＲ２逆転写酵素）または改変されたポリペプチドは、逆転写酵素活性を有する改変されていないもしくは天然に存在する酵素または改変されていないポリペプチドの多くとも約１００００分の１、多くとも約１５００分の１、多くとも約１０００分の１、多くとも約５００分の１、多くとも約１００分の１、多くとも約９５分の１、多くとも約９０分の１、多くとも約８５分の１、多くとも約８０分の１、多くとも約７５分の１、多くとも約７０分の１、多くとも約６５分の１、多くとも約６０分の１、多くとも約５５分の１、多くとも約５０分の１、多くとも約４５分の１、多くとも約４０分の１、多くとも約３５分の１、多くとも約３０分の１、多くとも約２５分の１、多くとも約２０分の１、多くとも約１５分の１、多くとも約１０分の１、多くとも約９分の１、多くとも約８分の１、多くとも約７分の１、多くとも約６分の１、多くとも約５分の１、多くとも約４分の１、多くとも約３分の１、多くとも約２分の１または多くとも約１分の１の誤り率で、鋳型に相補的な１種または複数の核酸（例えば、ｃＤＮＡ）分子を生成する。
【０１２１】
一部の実施形態では、配列決定誤り率は、１００，０００塩基につき約１に等しいまたはそれに満たないであろう。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の決定の誤り率は、１０塩基につき約１、２０塩基につき１、１００塩基につき３、１００塩基につき１、１０００塩基につき１および１０，０００塩基につき１に等しいまたはそれに満たない。
【０１２２】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用することができる。これらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのどちらか、その断片またはアナログである、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すことができる。次にポリヌクレオチドの非限定的な例を挙げる：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、トランスファー−メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、改変されたヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ポリマーのアセンブリ前または後にヌクレオチド構造に対する改変を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断されてよい。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションによる等、重合後にさらに改変することができる。本明細書に記載されている核酸は、ホスホジエステル結合を含有することができる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む）または核酸がデオキシリボおよびリボヌクレオチドのいずれかの組合せを含有するハイブリッド、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基のいずれかの組合せとなることができる。ポリヌクレオチドは、単数形の核酸と共に複数形の核酸を包含することが意図される。ポリヌクレオチドは、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡとなり得るいずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物となり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成され得る。
【０１２３】
リボソームＲＮＡは、試料における全ＲＮＡの８０％またはそれよりも多くの量を占めることができる。ｒＲＮＡは、ｍＲＮＡの定量的解析に有害に影響する場合があるため、多くの場合、ｒＲＮＡからｍＲＮＡを分離することが望ましい。ｍＲＮＡからｒＲＮＡを分離するアプローチの１つは、試料からｒＲＮＡを枯渇させることである。その一例は、オリゴヌクレオチド、例えば、真核生物ｒＲＮＡの場合は１７Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２８Ｓ  ｒＲＮＡ、または細菌ｒＲＮＡの場合は１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡに相同なオリゴヌクレオチドを使用した、ｒＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションである。オリゴヌクレオチドは、「捕捉」され得るように、また、試料からハイブリダイゼーション産物が除去されるように設計される。例えば、オリゴヌクレオチドは、カラムまたはビーズ等の表面に固定化することができる。ＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）およびＭＩＣＲＯＢＥｎｒｉｃｈ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）は、ｒＲＮＡの枯渇のための市販のキットの例である。試料からのｒＲＮＡの（ｏｒ）枯渇のための方法および組成物は、参照により組み込む米国特許出願第１０／０２９，３９７号に記載されている。大部分の真核生物ｍＲＮＡの３’末端におけるポリ（Ａ）テールを使用して、このポリ（Ａ）テールを欠くｒＲＮＡおよび他の非ｍＲＮＡ種からこのような分子を分離することができる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ｒＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる等、リボソームＲＮＡを枯渇させるステップを含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、少なくとも１種のｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドプローブガイド型エンドヌクレアーゼ的切断によって、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを枯渇させるステップを含む。一部の実施形態では、枯渇は、部分的または完全枯渇となることができる。一部の実施形態では、枯渇は、試料からのｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡの数の減少を含む。一部の実施形態では、本開示は、ｒＲＮＡおよび／またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を枯渇させる方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、１種または複数の鋳型核酸分子からの少なくとも１種のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の枯渇に関する。一部の実施形態では、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡの枯渇は、鋳型へのプライマー（例えば、１種または複数のプライマー）のアニーリングするステップに先立ち起こる。
【０１２４】
一実施形態では、本開示は、ライブラリー配列決定のための試料からリボソームおよび／またはトランスファーＲＮＡを枯渇させる方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、ＲＮＡを含む試料を提供するステップを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、部分的または十分な（完全）増幅を含む。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレアーゼおよび／またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドならびに少なくとも１種の特異的に設計されたガイドオリゴヌクレオチドを含む複合体を導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のガイドオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種のｒＲＮＡおよび／または少なくとも１種のｔＲＮＡに相補的な配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のガイドオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種のｄｓＤＮＡに相補的な少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡを切断し、これにより、試料からｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを枯渇させる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、またはポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９またはその機能的バリアントをコードする。一部の実施形態では、本方法は、ｄｓＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鎖へと変性させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、結合分子および少なくとも１種のｓｓＤＮＡ鎖に相補的な少なくとも１種の配列を含む少なくとも１種のオリゴヌクレオチド（例えば、特異的に設計されたオリゴヌクレオチド）を導入して、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種のｓｓＤＮＡ鎖のハイブリダイズされた複合体を形成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ハイブリダイズされた複合体を少なくとも１個の固体支持体に固定化するステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイズされた複合体の固定化は、ハイブリダイズされた複合体を、試料から除去させる。一部の実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジンを含む。一部の実施形態では、本方法は、結合分子および少なくとも１種のｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡに相補的な少なくとも１種の配列を含む少なくとも１種のオリゴヌクレオチド（例えば、特異的に設計されたオリゴヌクレオチド）を導入して、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種のｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを含む複合体を形成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、複合体を少なくとも１個の固体支持体に固定化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、複合体の固定化は、複合体を、試料から除去させる。一部の実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジンを含む。一部の実施形態では、結合分子は、ビオチンである。
【０１２５】
一部の実施形態では、本開示の方法のいずれかは、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断する。一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡの切断は、ライブラリー調製の中間産物である。一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡの切断は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ（コード配列）を含む。一部の実施形態では、オリゴガイド型核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｉｔｉｃ）切断は、ｄｓＤＮＡの変性を要求しなくてよいまたはこれを要求しない。一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡ変性を要求しないことは、本開示の著しい改善である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９、またはＣａｓ９もしくはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドである。
【０１２６】
一実施形態では、本開示は、ヌクレアーゼ複合体を複数の二本鎖核酸分子に付加するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその機能的バリアントおよび少なくとも１種の合成ガイドオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、合成ガイドオリゴヌクレオチドは、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）および／またはトランスファーリボ核酸（ｔＲＮＡ）領域に相補的である。一部の実施形態では、領域は、少なくとも１種の二本鎖核酸分子中にある。一部の実施形態では、本方法は、複合体に、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ領域を切断させるステップを含む。一部の実施形態では、領域は、少なくとも１種の二本鎖核酸分子中に存在する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１種の切断された二本鎖核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１種の切断された二本鎖核酸分子またはその派生物を配列決定（例えば、核酸配列決定）に付すステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ領域を欠く少なくとも１種の二本鎖核酸分子の核酸配列を配列決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ領域を含む少なくとも１種の二本鎖核酸分子の核酸配列を配列決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸配列の混合物を配列決定するステップを含み、この混合物は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ領域を含む少なくとも１種の二本鎖核酸分子、ならびにｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ領域を欠く少なくとも１種の二本鎖核酸分子を含む。
【０１２７】
一実施形態では、本開示は、無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）ライブラリーを産生する方法であって、ｃｆＤＮＡを含む試料を提供するステップと；ｃｆＤＮＡを変性させて、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）試料を産生するステップと；ヌクレオチドおよび／または触媒金属の存在下で、鋳型、プライマーおよび逆転写酵素を含む複合体をｓｓＤＮＡ試料に導入するステップであって、逆転写酵素が、鋳型上のプライマーを伸長し、その後、ｓｓＤＮＡ試料へと鋳型ジャンプして、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料を産生し、ｄｓＤＮＡが、鋳型およびｓｓＤＮＡの間に少なくとも１個のニックを含む、ステップと；３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを導入して、平滑末端および／または３’−オーバーハングを有するｄｓＤＮＡを生成するステップと；５’末端に一本鎖オーバーハングを有する核酸二重鎖を含む非対称性アダプターを導入するステップであって、非対称性アダプターが、ｄｓＤＮＡの５’末端にライゲーションされ、一本鎖オーバーハングが、少なくとも１種のポリメラーゼ連鎖反応（ｐｃｒ）増幅プライマーに相補的な配列を含む、ステップと；ｐｃｒ反応を行って、ｄｓＤＮＡの一方の鎖のみを増幅するステップとを含む方法に関する。
【０１２８】
一実施形態では、本開示は、無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）ライブラリーを産生する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡを含む試料を提供するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡを変性させて、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）試料を産生するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）をｓｓＤＮＡ試料に導入して、ポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）テールを生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、伸長不能ヌクレオチドを導入するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、プライマーおよび第１のアダプターを含む複合体をｓｓＤＮＡ試料のテールにアニーリングするステップを含む。一部の実施形態では、複合体は、テールに相補的な配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレオチドおよび／または触媒金属の存在下で、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）ならびにアクセプターおよび第２のアダプターを含む複合体を導入して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料を産生するステップを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、分解性ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、プライマーを伸長し、その後、複合体へと鋳型ジャンプして、伸長を続ける。一部の実施形態では、複合体は、逆転写酵素が複合体の末端に達して、別の複合体へとジャンプするのを防止するためのヌクレオチドブロックを含む。一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡは、当初の鎖およびコピー鎖を含む。一部の実施形態では、当初の鎖は、複合体およびｓｓＤＮＡの間に少なくとも１個のニックを含む。一部の実施形態では、コピー鎖は、少なくとも１個の分解性ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本方法は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを導入して、平滑末端もしくは３’−オーバーハングを有するｄｓＤＮＡを生成するステップ、および／またはＤＮＡリガーゼを導入して、少なくとも１個のニックをライゲーションするステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１種のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを導入して、少なくとも１個の分解性ヌクレオチドを分解するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、プライマー（例えば、少なくとも第１のプライマー、および／または少なくとも第１および第２のプライマー）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、当初の鎖を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、プライマー（例えば、第１のプライマー）は、第１のアダプターに相補的な配列を含み、第２のプライマーは、第２のアダプター（ａｄａｐａｔｅｒ）に相補的な配列を含む。
【０１２９】
一実施形態では、本開示は、配列決定のためのライブラリーを産生する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、無細胞リボ核酸（ｃｆＲＮＡ）を含む試料を提供するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を高温に付すステップを含む。一部の実施形態では、高温は、ＲＮＡ（例えば、ｃｆＲＮＡ）のトランスリン酸化を可能にするのに十分である。一部の実施形態では、本方法は、ホスファターゼを導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ホスファターゼは、ＲＮＡのリン酸部分を３’−ヒドロキシル基に変換することができる。一部の実施形態では、本方法は、アデノシン三リン酸およびポリメラーゼを導入して、ＲＮＡの３’−ヒドロキシル基にポリ（Ａ）テールを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレオチドの存在下で、プライマー、アクセプターおよび逆転写酵素を導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、プライマーは、ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含み、これにより、ポリ（Ａ）テールにアニーリングする。一部の実施形態では、逆転写酵素は、プライマーを伸長し、その後、アクセプターへと鋳型ジャンプして、伸長を続ける。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１個の固体支持体を導入して、過剰プライマーおよび非特異的プライマー産物を少なくとも１個の固体支持体に固定化し、これにより、試料から過剰プライマーおよび非特異的プライマー産物を除去するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行って、ＲＮＡを増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、等温増幅反応を使用するステップをさらに含む。
【０１３０】
一実施形態では、本開示は、配列決定のための核酸ライブラリーを調製するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、複数の核酸分子を得るステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、（例えば、複数の核酸分子における）少なくとも１種の核酸分子の非酵素的分子内トランスリン酸化を誘導するステップを含む。一部の実施形態では、非酵素的分子内トランスリン酸化は、温度を増加（例えば、複数の核酸分子の温度を増加）させることによって起こることができる。一部の実施形態では、非酵素的分子内トランスリン酸化および／または温度の増加は、遊離５’−リン酸部分を有する核酸分子をもたらす（例えば、複数の核酸分子は、遊離５’−リン酸部分を有することができる）。一部の実施形態では、本方法は、ホスファターゼを、遊離５’−リン酸部分を有する核酸分子に添加するステップを含む。一部の実施形態では、ホスファターゼは、遊離５’−リン酸部分の１個または複数をヒドロキシル基に変換する。一部の実施形態では、これにより、複数の核酸分子が、遊離ヒドロキシル基を有するようになる。一部の実施形態では、本方法は、複数の核酸分子およびポリメラーゼを混合するステップ（例えば、ある量のアデノシン三リン酸の存在下で）を含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、遊離ヒドロキシル基にポリ（Ａ）テールを生成する。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレオチドの存在下で、（ｉ）前記ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含む１種または複数のプライマー；（ｉｉ）１種または複数のアクセプター核酸分子；および（ｉｉｉ）改変された逆転写酵素を混合するステップを含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写し、アクセプター核酸分子へと移動し、前記アクセプター核酸分子の配列を逆転写することにより、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１個の固体支持体を添加するステップを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、過剰な、前記ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含む１種または複数のプライマーを固定化する。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行うステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、等温増幅を行うステップを含む。
【０１３１】
一実施形態では、本開示は、配列決定のためのライブラリーを産生する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１種の核酸分子（リボ核酸（例えば、ｃｆＲＮＡ）等）を含む試料を提供するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料（または核酸分子）を、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）のトランスリン酸化を可能にするのに十分な高温に付すステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、触媒金属（例えば、マグネシウム）および／またはポリアミンを添加するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ホスファターゼを導入して、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）のリン酸部分を３’−ヒドロキシル基に変換するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、アデノシン三リン酸およびポリメラーゼを導入して、ポリ（Ａ）テールを生成するステップを含む。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の３’−ヒドロキシル基に生成される。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレオチドの存在下で、プライマー、アクセプターおよび逆転写酵素を、試料または核酸分子に導入するステップを含む。一部の実施形態では、プライマーは、ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含み、これにより、ポリ（Ａ）テールにアニーリングする。一部の実施形態では、逆転写酵素は、プライマーを伸長し、その後、アクセプターへと鋳型ジャンプして、伸長を続ける。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１個の固体支持体を導入するステップを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、過剰プライマーおよび非特異的プライマー産物を固定化する。一部の実施形態では、過剰プライマーおよび非特異的プライマー産物は、試料／混合物から除去される。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行って、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、等温増幅反応をさらに含む。
【０１３２】
一実施形態では、本開示は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを枯渇させる方法、および／または増幅反応を行うことにより少なくとも１種の核酸分子を逆転写するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、少なくとも１種の核酸分子（ｍｏｌｅｃｕｌｔｅ）は、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡである。一部の実施形態では、増幅反応は、複数の二本鎖核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ）をもたらす。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼを含むポリペプチドおよび／またはガイドオリゴヌクレオチドを添加するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼを含むポリペプチドおよびガイドオリゴヌクレオチドを含む複合体を添加するステップを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼを含むポリペプチドは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、ガイドオリゴヌクレオチドは、核酸分子の領域に相補的である。一部の実施形態では、ガイドオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種の核酸分子（例えば、二本鎖核酸分子）における所定の領域に相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を切断の部位に方向付ける。一部の実施形態では、ヌクレアーゼおよびガイドオリゴヌクレオチドを含む複合体は、核酸分子の領域または所定の領域を切断する。一部の実施形態では、切断は、遺伝子で為される。一部の実施形態では、本方法は、切断された核酸分子（例えば、切断された二本鎖核酸分子）を配列決定するステップ（例えば、切断された核酸分子のライブラリーを配列決定するステップ）を含む。一部の実施形態では、二本鎖核酸分子は、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡおよびｔＲＮＡの両方に由来する配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の二本鎖核酸分子の所定の領域は、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはその両方（例えば、組合せ）の領域である。一部の実施形態では、所定の領域は、ｒＲＮＡの領域である。一部の実施形態では、所定の領域は、ｔＲＮＡの領域である。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子の変性を要求しない。一部の実施形態では、本方法は、複数の二本鎖核酸分子の変性を要求しない。一部の実施形態では、二本鎖核酸分子は、配列決定するステップに先立ちｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡに由来する配列を含む。一部の実施形態では、二本鎖核酸分子は、ｃＤＮＡを含む。
【０１３３】
一実施形態では、本開示は、核酸分子のコンカテマーを調製するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、複数の二本鎖核酸分子の末端をプロセシングするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、第１の複数のアダプター分子を複数の二本鎖核酸分子に付加するステップを含む。一部の実施形態では、第１の複数のアダプター分子は、１種または複数のオーバーハング配列を含む。一部の実施形態では、１種または複数のオーバーハング配列のうち少なくとも２種は、互いに相補的である。一部の実施形態では、本方法は、第１の複数のアダプター接続二本鎖核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本方法は、重合酵素を添加するステップ（例えば、ポリメラーゼ酵素を第１の複数のアダプター接続二本鎖核酸分子に添加するステップ）を含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼ酵素の添加は、プライマーの非存在下で為される。一部の実施形態では、本方法は、プライマーを添加するステップを含まない。一部の実施形態では、重合酵素は、アダプター接続二本鎖核酸コンカテマーの第１のセットを形成する。一部の実施形態では、アダプター接続二本鎖核酸コンカテマーの第１のセットの形成は、１種または複数のオーバーハング配列によって２種またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接することにより為される。一部の実施形態では、本方法は、第２の複数のアダプター分子を第１のセット（例えば、第１のアダプター分子）に付加するステップを含む。一部の実施形態では、第２の複数のアダプター分子は、１種または複数のオーバーハング配列を含む。一部の実施形態では、１種または複数のオーバーハング配列のうち少なくとも２種は、互いに相補的である。一部の実施形態では、本方法は、アダプター接続二本鎖核酸分子の第２のセットを提供する。一部の実施形態では、先の実施形態のうちいずれか１種は、アダプター分子のセットを用いて反復して、所定の平均長を含むコンカテマーを得ることができる。
【０１３４】
一実施形態では、本開示は、核酸分子のコンカテマーを調製するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１種の核酸分子および／または複数の二本鎖核酸分子を末端修復に付すステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１種または複数のアダプター分子を少なくとも１種の核酸分子および／または複数の二本鎖核酸分子に付加するステップを含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の核酸分子および／または複数の二本鎖核酸分子への少なくとも１種のまたは（第１の）複数のアダプター分子の付加は、ライゲーションを含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の核酸分子および／または複数の二本鎖核酸分子への少なくとも１種のまたは（第１の）複数のアダプター分子の付加は、逆転写酵素（例えば、Ｒ２逆転写酵素または改変された逆転写酵素）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種または複数のアダプター分子は、１種または複数のオーバーハング配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種のオーバーハング配列は、互いに相補的である（例えば、これにより、（第１の）複数のアダプター接続二本鎖核酸分子をもたらす）。一部の実施形態では、少なくとも１種または複数のアダプター分子は、核酸分子の３’末端に取り付ける／ライゲーションする配列（例えば、オーバーハング配列）、および／または核酸分子の５’末端に取り付ける／ライゲーションする配列（例えば、オーバーハング配列）を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、３’および５’末端の両方にアダプターを含む。一部の実施形態では、３’末端に結合するアダプターは、５’末端に結合するアダプターに相補的である。一部の実施形態では、アダプターの配列は、未知のものである。一部の実施形態では、アダプターの配列は、所定のものである。一部の実施形態では、アダプターは、鋳型および／またはプライマーとして機能する。一部の実施形態では、ある核酸分子の３’末端に結合するアダプターは、別の核酸分子の５’末端におけるアダプターに結合することができる。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ酵素を核酸分子に接続されたアダプターに添加するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼを（第１の）複数のアダプター接続二本鎖核酸分子に添加するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、プライマーの非存在下で添加される。一部の実施形態では、ポリメラーゼ酵素は、１種または複数のオーバーハング配列により２種またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接することにより、アダプター接続二本鎖核酸コンカテマーの第１のセットを形成する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、核酸分子に接続されたアダプターが、コンカテマーを形成することを可能にする。一部の実施形態では、本方法は、第２の複数のアダプター分子を第１のセットに付加するステップを含む。一部の実施形態では、第２の複数のアダプター分子は、１種または複数のオーバーハング配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種のオーバーハング配列は、互いに相補的である。一部の実施形態では、アダプター接続二本鎖核酸分子の第２のセットが形成される。一部の実施形態では、コンカテマーの長さまたは取り付けられる鋳型の数は、例えば、改変されたヌクレオチドによりアダプターをタグ付けすることにより（例えば、メチル化ヌクレオチドを導入することにより、またはｄＵＴＰを挿入することにより）決定することができる。一部の実施形態では、コンカテマーの長さは、改変された／改変されていないアダプター間の比に基づき調節することができる。一部の実施形態では、アダプター配列は、相同性プライミング位置として機能することができる（鋳型およびプライマーとして機能する相同性スポットｓｓＤＮＡ断片にアニールされる）。一部の実施形態では、本方法は、ＰＣＲまたは等温反応によってコンカテマーを増幅するステップを含む。一部の実施形態では、ＰＣＲにおける反応は、選択された数のサイクル（サイクルが多いほど、コンカテマーは長くなる）または時間（等温増幅）を行う。一部の実施形態では、反応は停止され、（長い）ｄｓＤＮＡコンカテマーは、２個の特有のｄｓＤＮＡアダプターとライゲーションされる。一部の実施形態では、コンカテマーの長さは、操作することができる。一部の実施形態では、コンカテマーの長さは、少なくともＰＣＲサイクルの数および／または時間の長さ（例えば、等温増幅では）に基づき、および／またはアダプターに存在する改変されたヌクレオチドに基づき決定することができる。一部の実施形態では、アダプターは、特有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼ酵素は、ＰＣＲまたは等温増幅反応において２個またはそれよりも多いアダプター接続二本鎖核酸分子を連接する。一部の実施形態では、アダプターは、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、対象から得られる生体試料由来の核酸が増幅される。一部の事例では、生体試料は、対象から直接的に得られる。一部の実施形態では、対象から直接的に得られる生体試料は、対象から得られた後にさらに加工された生体試料を指す。一部の実施形態では、対象から直接的に得られる生体試料は、さらなる加工のために対象からの生体試料の収集に使用されるいずれかのアプローチを除いて、対象から得られた後にさらに加工されていない生体試料を指す。例えば、血液は、対象の循環器系にアクセスし、対象から血液を除去し（例えば、針を介して）、除去された血液をレセプタクルに入れることにより、対象から直接的に得られる。血液試料がさらなる解析に有用となるように、レセプタクルは、試薬（例えば、抗凝固薬）を含むことができる。別の例では、スワブを使用して、対象の中咽頭表面における上皮細胞にアクセスすることができる。対象から生体試料を得た後に、生体試料を含有するスワブを液（例えば、緩衝剤）と接触させて、スワブから生体液を収集することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、生体試料は、精製されている。一部の実施形態では、生体試料は、精製されていない。一部の実施形態では、生体試料の核酸は、生体試料が管に提供されるときに抽出されていない。例えば、生体試料を管に提供するときに、生体試料におけるＲＮＡまたはＤＮＡは、生体試料から抽出されていなくてよい。一部の実施形態では、生体試料中に存在する標的核酸（例えば、標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡ）は、反応容器（例えば、管）への生体試料の提供に先立ち濃縮されていなくてよい。核酸を含むいずれか適した生体試料は、対象から得ることができる。
【０１３７】
本開示は、逆転写酵素活性を有する天然に存在するもしくは野生型もしくは改変されていない酵素（例えば、野生型逆転写酵素）または改変されていないポリペプチドと比較して改善された酵素特性を有する、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素（例えば、天然に存在しないまたは改変された逆転写酵素、改変された逆転写酵素）または改変されたポリペプチドに関する。一部の実施形態では、天然に存在しないまたは改変された酵素は、逆転写酵素活性を有する酵素である。一部の実施形態では、天然に存在しないまたは改変された酵素は、改変された逆転写酵素である。一部の実施形態では、天然に存在しないまたは改変された酵素は、改変された非レトロウイルス逆転写酵素である。一部の実施形態では、天然に存在しないまたは改変された酵素は、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンである。一部の実施形態では、天然に存在しないまたは改変された酵素は、改変されたＲ２逆転写酵素である。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、１塩基当たり少なくとも約８０％、１塩基当たり少なくとも約８５％、１塩基当たり少なくとも約８８％、１塩基当たり少なくとも約８９％、１塩基当たり少なくとも約９０％、１塩基当たり少なくとも約９１％、１塩基当たり少なくとも約９２％、１塩基当たり少なくとも約９３％、１塩基当たり少なくとも約９４％、１塩基当たり少なくとも約９５％、１塩基当たり少なくとも約９６％、１塩基当たり少なくとも約９７％、１塩基当たり少なくとも約９８％、１塩基当たり少なくとも約９９％、１塩基当たり少なくとも約９９．５％または１塩基当たり約１００％の処理能力で、鋳型核酸分子を増幅することができる。
【０１３８】
一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、約１２℃〜約４０℃の間の温度で測定される処理能力で、鋳型核酸分子を増幅することができるまたは増幅することが可能である。一部の実施形態では、温度は、約１０℃〜約３５℃の間、約１２℃〜約３０℃の間、約２５℃〜約４０℃の間または約１２℃〜約４２℃の間である。一部の実施形態では、温度は、約８℃〜約５０℃の間、約２℃〜約６０℃の間、約８℃〜約４２℃の間、約６℃〜約３２℃の間または約７℃〜約３５℃の間である。
【０１３９】
一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８０％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％；約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８９％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９０％；約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９１％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％；約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９５％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％；約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９９％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％；約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９９．５％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％；または約もしくは多くとも約４℃、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃または約もしくは多くとも約４２℃の温度における１塩基当たり約１００％；約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約１５℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約４５℃、約もしくは多くとも約５０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％の処理能力で、鋳型核酸分子を増幅することができるまたは増幅することが可能である。
【０１４０】
一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しないもしくは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８０％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８５％、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８８％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約８９％、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９０％、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９１％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９２％、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９３％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９４％、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９５％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９６％、多くとも約３５℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９７％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９８％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９９％、多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり少なくとも約９９．５％、または多くとも約４０℃の温度における１塩基当たり約１００％の処理能力で、鋳型核酸分子を増幅することができるまたは増幅することが可能である。
【０１４１】
一部の実施形態では、改善された酵素特性は、次のうち少なくとも１種から選択される：改善された安定性（例えば、改善された熱安定性）、改善された比活性、改善されたタンパク質発現、改善された精製、改善された処理能力、改善された鎖置換、改善された鋳型ジャンピング、改善されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性、および改善された忠実度。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しない酵素または改変された酵素または改変されたポリペプチドは、鋳型核酸分子を増幅する。一部の実施形態では、鋳型核酸分子を増幅する、逆転写酵素活性を有する天然に存在しない酵素または改変された酵素または改変されたポリペプチドは、少なくとも１種の酵素特性に関して、約１を超える、約２を超える、約３を超える、約４を超える、約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約６０を超える、約７０を超える、約８０を超える、約９０を超える、または約１００を超える性能指数を有する。一部の実施形態では、酵素特性および／または性能指数は、約５０℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約４２℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約４０℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３９℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３８℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３７℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３６℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３５℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３４℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３３℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３２℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３１℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約３０℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２９℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２８℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２７℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２６℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２５℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２３℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約２０℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約１５℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約１３℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約１２℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約１０℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約８℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下、約４℃に等しいまたはそれよりも低いまたはそれ以下の温度で行われる。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する天然に存在しない酵素または改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）または改変されたポリペプチドは、同じヌクレオチド基質に対する参照酵素または参照ポリペプチドの処理能力よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３７．５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約５０００％、または少なくとも約１００００％高い、所与のヌクレオチド基質に対する処理能力を示す。一部の実施形態では、天然に存在しない酵素は、天然に存在しない逆転写酵素である。一部の実施形態では、改変された酵素は、改変された逆転写酵素である。
【０１４２】
本開示は、そのプロトコールが、例えば、ＲＮＡ配列決定および／またはリキッドバイオプシーに使用される他の方法よりもはるかに実施が単純であり、はるかに短い持続時間を要求する、相当に少ない直接関与時間を要求するプロセスおよび／または方法に関する。一部の実施形態では、本開示の方法およびプロセスは、約２時間未満および／または約３０分間未満の直接関与時間であるプロトコールを含む。一部の実施形態では、プロトコールは、約２０時間未満、約１５時間未満、約１２時間未満、約１１時間未満、約１０時間未満、約９時間未満、約８時間未満、約７時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２．５時間未満、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満、または約３０分間未満である。一部の実施形態では、直接関与時間は、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２．５時間未満、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満、約５０分間未満、約４０分間未満、約３５分間未満、約３０分間未満、約２５分間未満、約２０分間未満、または約１５分間未満である。
【０１４３】
一部の実施形態では、核酸ライブラリーおよび／または相補ｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法は、多くとも約１時間、多くとも約２時間、多くとも約３時間、多くとも約４時間、多くとも約５時間、多くとも約７時間、多くとも約１０時間、多くとも約１５時間または多くとも約２０時間でライブラリーを調製するステップを含む。
【０１４４】
一実施形態では、本開示は、がんのための新規マーカーおよび突然変異の発見を可能にする方法およびプロセスに関する、および／または精密医療のためのアプローチを提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法およびプロセスは、＜０．１％のｃｔＤＮＡにおけるマイナー対立遺伝子を捕捉するための、より高い感度を提供する（利用できる現在の方法は、感度＞１％を有する）。一部の実施形態では、本開示の方法および／またはプロセスは、１ポット（例えば、単一の容器）、１ステッププロトコールを含み、ライブラリーは、約２時間に等しいまたはそれに満たない長さの時間で試料から調製される。図２を参照されたい。
【０１４５】
本開示は、改変された逆転写酵素を調製するための方法であって、次のステップのうち少なくとも１種を含む方法に関する：（ａ）逆転写酵素をコードする核酸配列をランダムまたは合理的突然変異誘発に付すステップ；（ｂ）逆転写酵素をコードする核酸配列をアミノ酸のトランケーションに付すステップ；（ｃ）逆転写酵素をコードする核酸配列を、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を含む変更に付すステップ；および（ｄ）逆転写酵素をコードする核酸配列を、タンパク質またはドメインとの融合に付すステップ。一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれか１種で得られる核酸配列は、宿主細胞において発現される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである。一部の実施形態では、本方法は、改変された逆転写酵素（単数または複数）を発現する宿主細胞をスクリーニングするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞（単数または複数）によって発現される改変された逆転写酵素（単数または複数）を調製するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されているいずれかの方法を含むいずれかの方法に従って改変された逆転写酵素（単数または複数）を精製するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本方法は、改変された逆転写酵素（単数または複数）の逆転写酵素活性を決定するステップ、逆転写酵素活性画分を推定するステップ、および／または安定性および／または頑強性を検査するステップを含むことができる。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素（単数または複数）の逆転写酵素活性を決定するステップ、逆転写酵素活性画分を推定するステップ、および／または安定性および／または頑強性を検査するステップは、逆転写酵素活性アッセイを使用して行われるまたは検査される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素（単数または複数）の逆転写酵素活性、逆転写酵素活性画分、および／または安定性および／または頑強性は、改変されていないまたは天然に存在する逆転写酵素と比較して増加／改善される。
【０１４６】
本開示は、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、プライマーを鋳型核酸分子にアニーリングし、これにより、アニーリングされた鋳型核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ヌクレオチドの存在下で、アニーリングされた鋳型核酸分子、１種または複数のアクセプター核酸分子および改変された逆転写酵素を混合するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成する。一部の実施形態では、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子は、多くとも約２時間で調製される。一部の実施形態では、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子は、改変された逆転写酵素に、アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写させることにより生成される。一部の実施形態では、次に、改変された逆転写酵素は、アクセプター核酸分子（例えば、１種または複数のアクセプター核酸分子）へと移動する。一部の実施形態では、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、約１２℃〜約４２℃の温度で、鋳型および／またはアクセプター核酸分子の配列を逆転写することができる。一部の実施形態では、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、約８℃〜約５０℃（例えば、約８℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約４８℃）の温度で、鋳型および／またはアクセプター核酸分子の配列を逆転写することができる。一部の実施形態では、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、多くとも約４℃、多くとも約８℃、多くとも約１５℃、多くとも約２０℃、多くとも約２５℃、多くとも約３０℃、多くとも約３５℃、多くとも約４０℃、多くとも約４５℃または多くとも約４８℃の温度で、鋳型および／またはアクセプター核酸分子の配列を逆転写することができる。一部の実施形態では、逆転写は、多くとも約５％の誤り率で起こる。一部の実施形態では、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、多くとも約４５％、多くとも約４０％、多くとも約３５％、多くとも約３０％、多くとも約２５％、多くとも約２０％、多くとも約１５％、多くとも約１０％、多くとも約８％、多くとも約７％、多くとも約６％、多くとも約５％、多くとも約４％、多くとも約３％、多くとも約２％または多くとも約１％の誤り率で、鋳型および／またはアクセプター核酸分子を逆転写することが可能である。一部の実施形態では、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存せずに、鋳型からアクセプター核酸分子へと移動することができる。一部の実施形態では、本方法は、単一の容器内で調製される。一部の実施形態では、鋳型核酸分子は、断片化されたＤＮＡ鋳型、断片化されたＲＮＡ鋳型、断片化されていないＤＮＡ鋳型、断片化されていないＲＮＡ鋳型またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法は、タグを鋳型核酸分子に付加し、これにより、複数のタグ付けされた連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応を行って、これにより、１種または複数のアンプリコンを形成するステップをさらに含む。
【０１４７】
本開示は、改変された逆転写酵素を使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法に関する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、天然に存在するまたは改変されていないまたは野生型酵素（例えば、野生型逆転写酵素）と比較して、改善された酵素特性を有する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、（ａ）プライマーを鋳型にアニーリングするステップと、（ｂ）鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、プライマーにアニーリングされた鋳型を、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子（例えば、アクセプターＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）と混合するステップとを含む（図３）。一部の実施形態では、酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、鋳型からアクセプター核酸分子へと移動することにより、連続したｃＤＮＡ分子を生成する。一部の実施形態では、鋳型ジャンピングは、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない。一部の実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時に為される。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）を含む（例えば、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、１ステップに統合される）。一部の実施形態では、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）の少なくとも一方は、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、単一の管（例えば、ステップ（ａ）および（ｂ）から同じ１本の管）内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。
【０１４８】
本開示は、配列決定のための核酸分子のコンカテマーを調製するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子を第１のアダプターとライゲーションするステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸増幅反応を行うことにより、ライゲーションされた核酸分子を増幅して、コンカテマーを形成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、増幅反応は、プライマーの非存在下で行われる。一部の実施形態では、本方法は、コンカテマーを第２のアダプターとライゲーションするステップをさらに含む。一部の実施形態では、アダプター（単数または複数）（第１および／または第２のアダプター）は、分子（例えば、核酸分子および／または鋳型および／またはプライマーおよび／またはアクセプター）の組換えまたは相同性に基づくアニーリングおよび伸長を可能にするように設計される。一部の実施形態では、核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅である。一部の実施形態では、第１のアダプターは、特有分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。一部の実施形態では、第１のアダプターは、プライマーとして機能する。一部の実施形態では、第１のアダプターは、一本鎖核酸を含む。一部の実施形態では、一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第２のアダプターは、二本鎖核酸を含む。一部の実施形態では、二本鎖核酸は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のアダプターは、第２のアダプターとは異なる。一部の実施形態では、第１のアダプターは、２種またはそれよりも多いアダプターを含む。一部の実施形態では、第２のアダプターは、２種またはそれよりも多いアダプターを含む。一部の実施形態では、核酸分子の両末端が、アダプターを含む。一部の実施形態では、核酸分子の一方の末端のみが、アダプターを含む。一部の実施形態では、核酸分子の３’および５’末端の両方が、アダプターを含む。
【０１４９】
本開示は、改変された逆転写酵素を使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法に関する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、天然に存在するまたは改変されていないまたは野生型酵素（例えば、野生型逆転写酵素）と比較して、改善された酵素特性を有する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、プライマー、鋳型、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子（例えば、アクセプターＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）を混合するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加（例えば、混合ステップへの）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、単一の管（例えば、混合ステップと同じ１本の管）内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管（単一の容器）内で行われる。
【０１５０】
一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、（ａ）１種または複数のプライマーを鋳型にアニーリングするステップと、（ｂ）鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、１種または複数のプライマーにアニーリングされた鋳型を、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子（例えば、アクセプターＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）と混合するステップとを含む（図４）。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。一部の実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時に為される。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）を含む（例えば、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、１ステップに統合される）。一部の実施形態では、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）の少なくとも一方は、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、単一の管（例えば、ステップ（ａ）および（ｂ）でまたはそれから使用された同じ１本の管）内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。
【０１５１】
一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、１種または複数のプライマー、鋳型、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子（例えば、アクセプターＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）を混合するステップを含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。一部の実施形態では、本方法は、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加（例えば、混合ステップへの）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、単一の管（例えば、混合ステップと同じ１本の管）内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。
【０１５２】
本開示は、核酸分子を調製するための方法であって、核酸分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、断片または分解された鋳型（例えば、核酸断片）、プライマー、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップを含む方法に関する（図５Ａおよび図５Ｂ）。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子は、改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマー伸長は、改変されたヌクレオチドで停止する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型、天然に存在するまたは改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡプライマーである。一部の実施形態では、プライマーは、操作されたプライマー（例えば、操作されたＲＮＡプライマー）である。一部の実施形態では、プライマーは、最適化されている。一部の実施形態では、プライマーは、最適化および／または操作されたプライマー（例えば、最適化および／または操作されたＲＮＡプライマー）である。一部の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡ  Ｒ２プライマーである。一部の実施形態では、核酸分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。一部の実施形態では、本開示の方法の混合ステップは、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、同じ単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。
【０１５３】
本開示は、核酸分子を調製するための方法であって、核酸分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、断片または分解された鋳型（例えば、核酸断片）、ドナー複合体、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップを含む方法に関する（図６Ａおよび図６Ｂ）。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子は、改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマー伸長は、改変されたヌクレオチドで停止する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または天然に存在するまたは改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、ドナー複合体は、鋳型およびプライマーを含む。一部の実施形態では、ドナー複合体は、ドナーＲ２複合体である。一部の実施形態では、ドナーＲ２複合体は、ＲＮＡ  Ｒ２プライマーを含む。一部の実施形態では、核酸分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。一部の実施形態では、本開示の方法の混合ステップは、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、同じ単一の管（例えば、核酸分子の調製に使用された同じ単一の管）内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。
【０１５４】
本開示は、改変された逆転写酵素を使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法に関する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法は、鋳型ジャンピングを使用する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、天然に存在するまたは野生型または改変されていない酵素（例えば、野生型逆転写酵素）と比較して、改善された酵素特性を有する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法は、（ａ）プライマーまたは１種もしくは複数のプライマーを鋳型にアニーリングするステップと、（ｂ）鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、プライマーにアニーリングされた鋳型、または１種もしくは複数のプライマーにアニーリングされた鋳型を、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子（例えば、アクセプターＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）と混合するステップとを含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法は、鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、プライマーまたは１種もしくは複数のプライマー、鋳型、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子（例えば、アクセプターＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）を混合するステップを含む。一部の実施形態では、酵素（例えば、改変された逆転写酵素）は、鋳型からアクセプター核酸分子へと移動することにより、連続したｃＤＮＡ分子を生成する。一部の実施形態では、鋳型ジャンピングは、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない。一部の実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時に為される。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）を含む（例えば、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、１ステップに統合される）。一部の実施形態では、混合ステップ、またはステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）の少なくとも一方は、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応は、単一の管（例えば、混合ステップでもしくはそれから、またはステップ（ａ）および（ｂ）でもしくはそれから使用された同じ１本の管）内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。
【０１５５】
本開示は、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡライブラリーを調製するための方法であって、核酸（例えば、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡ）分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、断片または分解された鋳型（例えば、核酸断片）、プライマー、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子は、改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマー伸長は、改変されたヌクレオチドで停止する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡ  Ｒ２プライマーである。一部の実施形態では、本方法は、核酸（例えば、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡ）分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／または核酸分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。
【０１５６】
本開示は、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡライブラリーを調製するための方法であって、核酸（例えば、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡ）分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の存在下で、断片または分解された鋳型（例えば、核酸断片）、ドナー複合体、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子は、改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマー伸長は、改変されたヌクレオチドで停止する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、ドナー複合体は、鋳型およびプライマーを含む。一部の実施形態では、ドナー複合体は、ドナーＲ２複合体である。一部の実施形態では、ドナーＲ２複合体は、ＲＮＡ  Ｒ２プライマーを含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸（例えば、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡ）分子を増幅して、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡライブラリーを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／または核酸分子を調製するための方法は、鋳型ジャンピングによって為される。
【０１５７】
一部の実施形態では、本開示の方法は、ドナー複合体を含むことができる。一部の実施形態では、ドナー複合体は、鋳型およびプライマーを含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、鋳型を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型は、断片化されたおよび／または分解された鋳型である。一部の実施形態では、鋳型は、断片化されていない。一部の実施形態では、鋳型は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組合せである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、鋳型は、ｍＲＮＡである。
【０１５８】
本開示は、配列決定のためのライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）対象から無細胞核酸を有する試料を得るステップと、（ｂ）改変された逆転写酵素、鋳型（例えば、核酸鋳型）、ヌクレオチド、アクセプター核酸分子および１種または複数のプライマーを、核酸に添加するステップとを含む方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、試料に由来する無細胞核酸（ｃｆ核酸）において増幅反応を実行して、複数のアンプリコンを産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、増幅反応は、３５回またはそれよりも少ない増幅サイクルを含む。一部の実施形態では、本方法は、配列決定のためのライブラリーを産生するステップを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、複数のアンプリコンを含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、鋳型ジャンピングが可能である、および／または野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである。
【０１５９】
本開示は、鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法であって、連続したｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、単一の管内で、プライマーまたは１種もしくは複数のプライマー、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鋳型、ヌクレオチド、改変された逆転写酵素、アクセプター核酸分子および触媒金属を混合するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、連続したｃＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡ鋳型および／またはアクセプター核酸分子に対して相補的である。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、連続したｃＤＮＡ分子が産生される。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、鋳型からアクセプター核酸分子への移動を起こす。
【０１６０】
本開示は、配列決定のためのライブラリーを調製するための方法であって、ライブラリーの生成に十分な条件下、単一の管内で、無細胞核酸、改変された逆転写酵素、鋳型、ヌクレオチド、アクセプター核酸分子、触媒金属および１種または複数のプライマーを混合するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、核酸分子は、未知の核酸配列を含む。一部の実施形態では、鋳型は、未知の核酸配列を含む。一部の実施形態では、鋳型からアクセプター核酸分子への移動は、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子は、プライマー伸長を停止させることができる改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）および／またはホルマリン固定パラフィン包埋ＤＮＡ（ＦＦＰＥ  ＤＮＡ）、またはこれらの組合せである。
【０１６２】
一部の実施形態では、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼは、本方法のいずれかのステップにおいてまたはそれに先立ち、および／または混合ステップが行われるのと同時に、本開示の方法に添加することができる。例えば、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼは、改変された逆転写酵素が反応に添加されるのと同時に添加することができる。ホットスタート熱安定性ポリメラーゼは、アクセプター核酸分子が添加されるのと同時に、および／または鋳型および／またはプライマーおよび／または逆転写酵素および／またはヌクレオチドが反応管に添加されるのと同時に添加することができる。一部の実施形態では、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼは、ＰＣＲ反応の開始に先立ち添加される。一部の実施形態では、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼは、ＲＴ反応に先立ちまたはそれと同時に添加される。一部の実施形態では、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼは、ホットスタートｔａｑポリメラーゼである。標的核酸の増幅は、ビーズ上で起こることができる。一部の実施形態では、増幅は、ビーズ上で起こらない。増幅は、等温増幅、例えば、等温線形増幅によることができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼの添加に先立ち反応が９５℃に例えば２分間加熱される、またはサイクル１における第１の加熱ステップまでポリメラーゼを不活性に維持することができる、ホットスタートＰＣＲを行うことができる。ホットスタートＰＣＲを使用して、非特異的増幅を最小化することができる。
【０１６３】
一部の実施形態では、本開示の方法は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本開示の方法の全ステップは、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、本方法（開始から完了まで）は、単一の管内で行われる。一部の実施形態では、ＲＴ反応に使用された同じ管が、ＰＣＲ増幅反応に使用される。
【０１６４】
一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅は、逆転写酵素の不活性化に十分な温度で行われる。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの活性化に十分な温度で行われる。
【０１６５】
本開示は、試料から無細胞核酸分子を増幅する方法に関する。一部の実施形態では、試料は、生体試料である。一部の実施形態では、無細胞核酸分子は、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）を含む核酸増幅に供される。一部の実施形態では、無細胞核酸分子は、指定の処理能力で核酸分子を増幅する条件下、逆転写酵素（例えば、改変された逆転写酵素）を含む核酸増幅に供される。一部の実施形態では、処理能力は、１塩基当たり少なくとも約８０％、１塩基当たり少なくとも約８１％、１塩基当たり少なくとも約８２％、１塩基当たり少なくとも約８３％、１塩基当たり少なくとも約８４％、１塩基当たり少なくとも約８５％、１塩基当たり少なくとも約８６％、１塩基当たり少なくとも約８７％、１塩基当たり少なくとも約８８％、１塩基当たり少なくとも約８９％、１塩基当たり少なくとも約９０％、１塩基当たり少なくとも約９１％、１塩基当たり少なくとも約９２％、１塩基当たり少なくとも約９３％、１塩基当たり少なくとも約９４％、１塩基当たり少なくとも約９５％、１塩基当たり少なくとも約９６％、１塩基当たり少なくとも約９７％、１塩基当たり少なくとも約９８％、１塩基当たり少なくとも約９９％、または１塩基当たり少なくとも約１００％のものである。一部の実施形態では、処理能力は、約または多くとも約または少なくとも約１２℃、約または多くとも約または少なくとも約１３℃、約または多くとも約または少なくとも約１４℃、約または多くとも約または少なくとも約１５℃、約または多くとも約または少なくとも約１６℃、約または多くとも約または少なくとも約１７℃、約または多くとも約または少なくとも約１８℃、約または多くとも約または少なくとも約１９℃、約または多くとも約または少なくとも約２０℃、約または多くとも約または少なくとも約２１℃、約または多くとも約または少なくとも約２２℃、約または多くとも約または少なくとも約２３℃、約または多くとも約または少なくとも約２４℃、約または多くとも約または少なくとも約２５℃、約または多くとも約または少なくとも約２６℃、約または多くとも約または少なくとも約２７℃、約または多くとも約または少なくとも約２８℃、約または多くとも約または少なくとも約２９℃、約または多くとも約または少なくとも約３０℃、約または多くとも約または少なくとも約３１℃、約または多くとも約または少なくとも約３２℃、約または多くとも約または少なくとも約３３℃、約または多くとも約または少なくとも約３４℃、約または多くとも約または少なくとも約３５℃、約または多くとも約または少なくとも約３６℃、約または多くとも約または少なくとも約３７℃、約または多くとも約または少なくとも約３８℃、約または多くとも約または少なくとも約３９℃、約または多くとも約または少なくとも約４０℃、約または多くとも約または少なくとも約４５℃、約または多くとも約または少なくとも約５０℃、約または多くとも約または少なくとも約６０℃、約または多くとも約または少なくとも約７０℃、約または多くとも約または少なくとも約８０℃、約または多くとも約または少なくとも約８℃の温度で行われる。一部の実施形態では、処理能力は、約または多くとも約または少なくとも約３０℃、約または多くとも約または少なくとも約１２℃、約または多くとも約または少なくとも約４５℃、約または多くとも約または少なくとも約３５℃の温度における、１塩基当たり少なくとも約８０％、１塩基当たり少なくとも約８１％、１塩基当たり少なくとも約８２％、１塩基当たり少なくとも約８３％、１塩基当たり少なくとも約８４％、１塩基当たり少なくとも約８５％、１塩基当たり少なくとも約８６％、１塩基当たり少なくとも約８７％、１塩基当たり少なくとも約８８％、１塩基当たり少なくとも約８９％、１塩基当たり少なくとも約９０％、１塩基当たり少なくとも約９１％、１塩基当たり少なくとも約９２％、１塩基当たり少なくとも約９３％、１塩基当たり少なくとも約９４％、１塩基当たり少なくとも約９５％、１塩基当たり少なくとも約９６％、１塩基当たり少なくとも約９７％、１塩基当たり少なくとも約９８％、１塩基当たり少なくとも約９９％または１塩基当たり少なくとも約１００％のものである。一部の実施形態では、逆転写酵素は、非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンである。一部の実施形態では、逆転写酵素は、Ｒ２逆転写酵素または改変されたＲ２逆転写酵素である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変されたＲ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンである。
【０１６６】
本開示は、複数の単一細胞から相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーおよび／またはＤＮＡライブラリーを調製するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、各単一細胞から核酸を放出させて、複数の個々の核酸試料を提供するステップを含む。一部の実施形態では、個々の核酸試料のそれぞれにおける核酸は、単一細胞に由来する。一部の実施形態では、本方法は、核酸鋳型を１種または複数のプライマーにアニーリングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡ分子の産生に有効な条件下、ヌクレオチドの存在下で、１種または複数のプライマーにアニーリングされた核酸鋳型を、アクセプター鋳型（またはアクセプター核酸分子）および改変された逆転写酵素と混合するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、鋳型ジャンピングが可能である、および／または野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡ分子および／またはＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡおよび／またはＤＮＡライブラリーを生成するステップをさらに含む。
【０１６７】
本開示は、核酸分子を検出する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子の生成に有効な条件下、核酸分子を含む試料を、アクセプター鋳型（またはアクセプター核酸分子）、改変された逆転写酵素、プライマーおよびヌクレオチドと混合するステップを含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む。一部の実施形態では、アクセプター鋳型（またはアクセプター核酸分子）は、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、改変されたヌクレオチドは、プライマー伸長を停止させることができる。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子を増幅するステップをさらに含む。
【０１６８】
本開示は、対象における疾患（例えば、がん）を検出、診断および／または予後判定する方法であって、（ａ）対象に由来する核酸試料（例えば、無細胞核酸試料）の配列情報を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）に由来する配列情報を使用して、試料における循環腫瘍核酸を検出するステップとを含む方法に関する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）に従って配列情報を得るステップは、１種または複数のアダプターの使用を含む。一部の実施形態では、１種または複数のアダプターは、分子バーコードを含む。アダプターは、１種または複数の末端改変を含むことができる。アダプターは、１個の５’リン酸を含むことができる。アダプターは、２個の５’リン酸を含むことができる。アダプターは、１個の３’ヒドロキシルを含むことができる。アダプターは、２個の３’ヒドロキシルを含むことができる。アダプターは、３’ヒドロキシルを欠くことができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、分子バーコードは、ランダマー（ｒａｎｄｏｍｅｒ）配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、総無細胞核酸の約０．７５％、０．５０％、０．２５％、０．１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％または０．００００１％、１％、１．７５％、１．５％、１．２５％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２２％、２５％、２７％、３０％、３２％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％未満のまたはこれに等しい無細胞核酸を検出することが可能である。一部の実施形態では、本方法は、総循環核酸の約０．７５％、０．５０％、０．２５％、０．１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％または０．００００１％、１％、１．７５％、１．５％、１．２５％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２２％、２５％、２７％、３０％、３２％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％未満のまたはこれに等しい循環腫瘍核酸を検出することが可能である。一部の実施形態では、本方法は、総無細胞核酸の１．７５％、１．５％、１．２５％、１％、０．７５％、０．５０％、０．２５％、０．１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％または０．００００１％未満のまたはこれに等しい循環腫瘍核酸（ｃｔ核酸）のパーセンテージを検出することが可能である。一部の実施形態では、配列情報は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００または３００種のゲノム領域に関する情報を含む。一部の実施形態では、配列情報は、部分的に全ての、大部分は全てのまたは全てのゲノム配列決定に関する情報を含む。一部の実施形態では、５０ｎｇもの低さの濃度のｃｆＤＮＡが、全ゲノム配列決定をもたらすことができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、本開示の方法を使用して、対象における疾患（例えば、がん）の存在を決定することができる。一部の実施形態では、対象におけるがんの存在の決定は、本明細書に記載されている方法のいずれかに従って、対象から試料を得て、試料における核酸分子（例えば、核酸断片）を検出することを含む。一部の実施形態では、対象における疾患（例えば、がん）の存在の決定は、核酸分子の増幅および／または配列決定を含む。一部の実施形態では、核酸分子の存在は、がんを示す。一部の実施形態では、核酸分子の存在は、出生前状態を示す。一部の実施形態では、核酸分子および／または鋳型は、未知の配列を含む。一部の実施形態では、試料は、生体試料である。一部の実施形態では、生体試料は、循環腫瘍ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、本開示の方法は、増幅プライマーによって生成されたアンプリコンを検出するステップを含み、アンプリコンの存在は、改変された逆転写酵素が試料中に存在するか否かを決定する。
【０１７２】
一部の実施形態では、本開示の方法は、核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）の存在または非存在に基づく出生前診断を提供するステップを含む。
【０１７３】
本開示は、核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）を産生するキットであって、１種または複数のプライマー、ヌクレオチド、少なくとも１種の改変された逆転写酵素、鋳型、および本開示に開示されている方法のいずれかを行うための使用説明書を含むキットに関する。一部の実施形態では、キットは、核酸の検出に使用することができ、核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ鋳型）、少なくとも１種の改変された逆転写酵素、ヌクレオチド、および本開示に開示されている方法のいずれかを行うための使用説明書を含む。一部の実施形態では、本キット内に存在するまたは本キットと共に使用されるべき改変された逆転写酵素は、約４℃、８℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５２℃、５５℃もしくは６０℃に等しいまたはそれ未満のまたはそれを超える温度で、活性を有する、および／または鋳型ジャンピングが可能である。一部の実施形態では、核酸および／または鋳型（例えば、核酸鋳型、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、約５０フェムトモル濃度もの低さの、約６０フェムトモル濃度もの低さの、約７０フェムトモル濃度もの低さの、約７５フェムトモル濃度もの低さの、約８０フェムトモル濃度もの低さの、約９０フェムトモル濃度もの低さの、約１００フェムトモル濃度もの低さの、約１２０フェムトモル濃度もの低さの、約１５０フェムトモル濃度もの低さの、約２００フェムトモル濃度もの低さの、約２５０フェムトモル濃度もの低さの、約３００フェムトモル濃度もの低さの、約３５０フェムトモル濃度もの低さの、約４００フェムトモル濃度もの低さの、約５００フェムトモル濃度もの低さの、約５５０フェムトモル濃度もの低さの、約６００フェムトモル濃度もの低さの、約７００フェムトモル濃度もの低さの、または約８００フェムトモル濃度もの低さの濃度で存在する。一部の実施形態では、キットは、１種もしくは複数のプライマー、および／またはプライマーにアニーリングされた鋳型を含むことができる。本開示はまた、改変された酵素、改変された逆転写酵素、または改変されたポリペプチドを産生するキットに関する。一部の実施形態では、本キットは、ＰＣＲステップ、および／またはＰＣＲに使用するための構成成分を含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、本開示は、核酸を検出するためのキットであって、鋳型、少なくとも１種の改変された逆転写酵素、ヌクレオチド、および本開示の方法を行うための使用説明書を含むキットに関する。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも約５０フェムトモル濃度、少なくとも約２０フェムトモル濃度、少なくとも約１００フェムトモル濃度、または約１０００フェムトモル濃度を超える濃度で存在する。
【０１７５】
本開示は、本明細書に開示されているいずれかの方法に関し、本方法は、増幅プライマーによって生成された少なくとも１種のアンプリコンを検出するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも１種のアンプリコンの存在は、試料における少なくとも１種の改変された逆転写酵素の存在を示す。
【０１７６】
一部の実施形態では、本開示の方法のいずれかは、精製ステップを含まない。一部の実施形態では、本開示の方法のいずれかは、少なくとも１種の精製ステップを含む。一部の実施形態では、本開示の方法のいずれかは、少なくとも２種の精製ステップを含む。一部の実施形態では、本開示の方法のいずれかは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０種の精製ステップを含む。
【０１７７】
本開示は、配列決定のためのライブラリーを調製するための方法に関する。
【０１７８】
一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、改変された非レトロウイルス逆転写酵素である。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンである。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、改変されたＲ２逆転写酵素である。
【０１７９】
一部の実施形態では、バリアントまたは改変された酵素または天然に存在しない酵素または改変されたポリペプチドは、改変されていない、野生型または天然に存在する酵素またはポリペプチドと比較して、改善された酵素特性を有する。一部の実施形態では、改善された酵素特性は、次のうち少なくとも１種から選択される：増加された安定性（例えば、増加された熱安定性）、増加された比活性、増加されたタンパク質発現、改善された精製、改善された処理能力、改善された鎖置換、増加された鋳型ジャンピング、および改善された忠実度。一部の実施形態では、安定性という用語は、熱的安定性、貯蔵安定性およびｐＨ安定性を含むことができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、比活性は、反応において使用されるタンパク質または酵素の総量と比べた、タンパク質または酵素の酵素活性の測定値（ユニット単位での）である。一部の実施形態では、比活性は、ｃＤＮＡ分子を産生する酵素の能力に基づき測定される。一部の実施形態では、比活性は、プライマー伸長反応に基づき決定されるＵ／ｍｇタンパク質単位で測定される。一部の実施形態では、変更または改善された特性は、性能指数（ＰＩ）によって特徴付けることができ、このＰＩは、野生型と比較した、または天然に存在する酵素もしくはタンパク質と比較した、バリアント、改変された酵素または天然に存在しない酵素の性能の比である。用語「性能指数（ＰＩ）」は、指定の性能特徴に関する、バリアントポリペプチドの親ポリペプチドに対する、または改変された酵素の改変されていない酵素（例えば、逆転写酵素）に対する、または天然に存在しない酵素の天然に存在する酵素に対する性能の比を指すことができる。一部の実施形態では、指定の性能または酵素特性の特徴として、安定性（例えば、熱安定性）、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、端から端までの（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）鋳型ジャンピング、および／または忠実度を挙げることができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＰＩは、約０．５を超えるが、他の実施形態では、ＰＩは、約１であるまたは約１を超える。一部の実施形態では、バリアントポリペプチド、改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）または天然に存在しない酵素は、１個または複数のアミノ酸位置に改変を含む。一部の実施形態では、改変された酵素または天然に存在しない酵素は、約０．１に等しいまたはこれを超える、約０．２に等しいまたはこれを超える、約０．３に等しいまたはこれを超える、約０．４に等しいまたはこれを超える、約０．５に等しいまたはこれを超える、約０．６に等しいまたはこれを超える、約０．７に等しいまたはこれを超える、約０．８に等しいまたはこれを超える、約０．９に等しいまたはこれを超える、約１に等しいまたはこれを超える、約１．２に等しいまたはこれを超える、約１．５に等しいまたはこれを超える、約２に等しいまたはこれを超える、約２．５に等しいまたはこれを超える、約３に等しいまたはこれを超える、約３．５に等しいまたはこれを超える、約４に等しいまたはこれを超える、約４．５に等しいまたはこれを超える、約５に等しいまたはこれを超える、約５．５に等しいまたはこれを超える、約６に等しいまたはこれを超える、約６．５に等しいまたはこれを超える、約７に等しいまたはこれを超える、約８に等しいまたはこれを超える、約９に等しいまたはこれを超える、約１０に等しいまたはこれを超える、約５０に等しいまたはこれを超える、約７５に等しいまたはこれを超える、約１００に等しいまたはこれを超える、約５００に等しいまたはこれを超える、約１０００に等しいまたはこれを超える性能指数（ＰＩ）を有する。一部の実施形態では、バリアントまたは改変された酵素は、約０．１〜約１、約０．５〜約１、約０．１〜約２、約１〜約２、約０．５〜約２、約０．５〜約１０、約１〜約１０、約０．１〜約１０、約１〜約５、約０．５〜約５、約０．５〜約２０、約０．３〜約２０、約５〜約１０、約１．５〜約１０、約１．５〜約５０、約１〜約５０、約１．５〜約１００、約１．５〜約７５、約４〜約１０、３〜約１０、約３〜約２５、約３〜約５０、約２〜約２０、約２〜約１００、約２〜約１０００、約１〜約１０００の性能指数（ＰＩ）を有する。一部の実施形態では、性能指数は、タンパク質発現に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、酵素特性を改善する少なくとも１種の特徴に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、精製に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、安定性（例えば、熱安定性）に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、比活性に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、処理能力に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、鎖置換に関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、鋳型ジャンピングに関して決定される。一部の実施形態では、性能指数は、忠実度に関して決定される。一部の実施形態では、酵素特性を改善する特徴は、増加された熱的安定性、増加された比活性、および増加されたタンパク質発現からなる群から選択される。一部の実施形態では、性能指数は、３０℃で行われる。一部の実施形態では、酵素特性は、３０℃で解析される。一部の実施形態では、酵素特性、安定性（例えば、熱安定性）、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピングおよび／または忠実度は、３０℃で行われる。一部の実施形態では、酵素特性を測定するための性能指数は、特異的な温度で行われる。一部の実施形態では、温度は、約２５℃〜約４２℃である。一部の実施形態では、温度は、約８℃〜約５０℃である。一部の実施形態では、酵素特性を測定するための性能指数は、約８℃〜約５０℃、約１２℃〜約４２℃、２５℃〜約４２℃、約２５℃〜約４０℃、約２８℃〜約３８℃、約３０℃〜約３８℃、約３５℃〜約３７℃、約２７℃〜約３８℃、約２７℃〜約３７℃、約２６℃〜約４２℃、約２５℃〜約３８℃、約２７℃〜約３８℃、約２９℃〜約３８℃、約２９℃〜約３２℃に及ぶ温度で遂行することができる。一部の実施形態では、酵素特性を測定するための性能指数は、約８℃に等しいまたはそれよりも低い、約１２℃に等しいまたはそれよりも低い、約２０℃に等しいまたはそれよりも低い、約４℃に等しいまたはそれよりも低い、約５５℃に等しいまたはそれよりも低い、約３７℃に等しいまたはそれよりも低い、約２５℃に等しいまたはそれよりも低い、約２８℃に等しいまたはそれよりも低い、約３０℃に等しいまたはそれよりも低い、約３２℃に等しいまたはそれよりも低い、約３４℃に等しいまたはそれよりも低い、約３５℃に等しいまたはそれよりも低い、約３６℃に等しいまたはそれよりも低い、約３３℃に等しいまたはそれよりも低い、約３１℃に等しいまたはそれよりも低い、約６０℃に等しいまたはそれよりも低い、約３８℃に等しいまたはそれよりも低い、約３９℃に等しいまたはそれよりも低い、約４０℃に等しいまたはそれよりも低い、約４１℃に等しいまたはそれよりも低い、約４２℃に等しいまたはそれよりも低い、約５０℃に等しいまたはそれよりも低い温度で遂行することができる。一部の実施形態では、温度は、約２５℃〜約８０℃に及び得る。
【０１８０】
一部の実施形態では、改変された酵素の比活性は、約５ユニット／ｍｇ〜約１４０，０００ユニット／ｍｇ、約５ユニット／ｍｇ〜約１２５，０００ユニット／ｍｇ、約５０ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約１００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約２５０ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約５００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約１０００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約５０００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約１０，０００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇ、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約７５，０００ユニット／ｍｇである。一部の実施形態では、比活性の範囲は、約２０，０００ユニット／ｍｇ〜約１４０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２０，０００ユニット／ｍｇ〜約１３０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２０，０００ユニット／ｍｇ〜約１２０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２０，０００ユニット／ｍｇ〜約１１０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２０，０００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２０，０００ユニット／ｍｇ〜約９０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約１４０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約１３０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約１２０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約１１０，０００ユニット／ｍｇの比活性、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約１００，０００ユニット／ｍｇの比活性、および約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約９０，０００ユニット／ｍｇの比活性を含む。一部の実施形態では、比活性範囲の下端は、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００および８０，０００ユニット／ｍｇから変動し得る。一部の実施形態では、範囲の上端は、１５０，０００、１４０，０００、１３０，０００、１２０，０００、１１０，０００、１００，０００および９０，０００ユニット／ｍｇから変動し得る。
【０１８１】
一部の実施形態では、試料は、生体試料である。一部の実施形態では、生体試料は、循環腫瘍ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。一部の実施形態では、核酸は、試料に由来する。一部の実施形態では、試料は、リキッドバイオプシー試料である。一部の実施形態では、試料は、ＲＮＡ試料となることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ試料は、ＰＣＲ、ライゲーション、トランスクリプトーム解析、マイクロアレイ解析、ノーザン解析およびｃＤＮＡライブラリー構築が挙げられるがこれらに限定されない、様々な目的のために使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、例えば、配列決定またはマイクロアレイ解析によるトランスクリプトーム解析に適した含量および品質で、低含量の細胞および／または単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを増幅するための方法を対象にする。
【０１８２】
一部の実施形態では、核酸および／または鋳型は、未知の配列のものである。一部の実施形態では、核酸および／または鋳型は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、内部プライミングを含む。一部の実施形態では、核酸は、断片化された核酸および／または分解された核酸となることができる。一部の実施形態では、鋳型は、断片化された鋳型および／または分解された鋳型となることができる。一部の実施形態では、核酸は、断片化されていない核酸および／または分解されていない核酸となることができる。一部の実施形態では、鋳型は、断片化されていない鋳型および／または分解されていない鋳型となることができる。一部の実施形態では、核酸および／または鋳型は、疾患を示す。一部の実施形態では、核酸および／または鋳型は、がんを示す。一部の実施形態では、核酸は、約０．０１マイクロモル濃度に等しいまたはそれに満たない。一部の実施形態では、核酸は、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの間である。一部の実施形態では、核酸は、約５００フェムトモル濃度に等しいまたはそれに満たない。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、単一細胞、培養された細胞、組織、ＲＮＡ転写に基づく増幅ＲＮＡ（ＴＴＲ増幅ＲＮＡまたは他のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ転写ＲＮＡ等）、ＲＮＡプロモーター駆動転写ＲＮＡ、ａＲＮＡ、ａＲＮＡ増幅ＲＮＡ、単一細胞ｍＲＮＡライブラリー、単離されたｍＲＮＡ、細胞内に含有されるＲＮＡ、およびＲＮＡ供給源の組合せからなる群から選択される供給源から得られる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、複数の固定された細胞から調製され、前記固定された細胞は、ＲＮＡ分解から保護され、また、酵素浸透のための透過処理に供される。一部の実施形態では、固定された細胞は、固定液処理された培養細胞、凍結された新鮮組織、固定液処理された新鮮組織、またはスライド上のパラフィン包埋組織から得られる。
【０１８４】
一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の産物となることができる、または細胞もしくは組織から単離されていてよい（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ、１９９５年）。本開示の実施において有用なＲＮＡを得る際の使用に適した細胞および組織は、動物細胞および植物細胞の両方を含むことができる。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む。ＲＮＡは、細菌等の原核細胞から単離することもできる。
【０１８５】
一部の実施形態では、鋳型は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである。一部の実施形態では、鋳型は、断片化された鋳型および／または分解された鋳型となることができる。一部の実施形態では、鋳型は、分解および／または断片化されていない。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、鋳型は、ＲＮＡ鋳型である。一部の実施形態では、鋳型は、ＤＮＡ鋳型である。一部の実施形態では、鋳型は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ鋳型である。一部の実施形態では、鋳型は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、いずれかの種類のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡのうち１種または複数）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１種類のＲＮＡの混合物を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡもしくは核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、Ｙ系（Ｙ−ｌｉｎｅ）ＤＮＡ、常染色体ＤＮＡ、リボソームＤＮＡまたはそれらの組合せの混合物を、またはそのうちの少なくとも１種を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型は、いずれかの長さのポリマーである。一部の実施形態では、鋳型は、約２０塩基〜約１００塩基、約３０塩基〜約５００塩基、約３０塩基〜約１０００塩基、約５０塩基〜約３００塩基、約１００塩基〜約６００塩基、約２００塩基〜約８００塩基、約２００塩基〜約６００塩基、約１００塩基〜約２０００塩基、約１００塩基〜約２５００塩基、約２００塩基〜約５０００塩基、約２００塩基〜約１０００塩基、約２００〜約１００００塩基である。一部の実施形態では、鋳型は、少なくとも約１０塩基、少なくとも約２０塩基、少なくとも約３０塩基、少なくとも約４０塩基、少なくとも約５０塩基、少なくとも約６０塩基、少なくとも約７０塩基、少なくとも約８０塩基、少なくとも約９０塩基、少なくとも約１００塩基、少なくとも約１５０塩基、少なくとも約２００塩基、少なくとも約２５０塩基、少なくとも約３００塩基、少なくとも約３５０塩基、少なくとも約４００塩基、少なくとも約４５０塩基、少なくとも約５００塩基、少なくとも約５５０塩基、少なくとも約６００塩基、少なくとも約６５０塩基、少なくとも約７００塩基、少なくとも約７５０塩基、少なくとも約８００塩基、少なくとも約８５０塩基、少なくとも約９００塩基、少なくとも約９５０塩基、少なくとも約１０００塩基、少なくとも約１１００塩基、少なくとも約１２００塩基、少なくとも約１３００塩基、少なくとも約１４００塩基、少なくとも約１５００塩基、少なくとも約１７００塩基、少なくとも約２０００塩基、少なくとも約２２００塩基、少なくとも約２５００塩基、少なくとも約２７００塩基、少なくとも約３０００、少なくとも約３５００塩基、少なくとも約４０００塩基、少なくとも約４５００塩基、少なくとも約５０００塩基、少なくとも約１０，０００塩基、または少なくとも約５０，０００塩基である。一部の実施形態では、鋳型は、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約３０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約４０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約６０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約７０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約８０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約９０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約３００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約３５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約４００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約４５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約５００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約５５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約６００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約６５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約７００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約７５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約８００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約８５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約９００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約９５０塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１０００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１１００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１２００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１３００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１４００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１５００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１７００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２０００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２２００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２５００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約２７００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約３０００、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約３５００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約４０００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約４５００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約５０００塩基、約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約１０，０００塩基、または約もしくは少なくとも約もしくは多くとも約５０，０００塩基である。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ鋳型（ｄｓＤＮＡ鋳型）または一本鎖ＤＮＡ鋳型（ｓｓＤＮＡ鋳型）となることができる。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ鋳型（ｄｓＲＮＡ鋳型）または一本鎖ＲＮＡ鋳型（ｓｓＲＮＡ鋳型）となることができる。
【０１８６】
一部の実施形態では、鋳型は、単一細胞に由来する。一部の実施形態では、鋳型は、複数の細胞に由来する。一部の実施形態では、鋳型は、低コピー数ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡの組合せを含む。一部の実施形態では、低コピー数は、約２５０ピコグラムに等しいまたはそれに満たない（例えば、１００ピコグラムの）、例えば、鋳型および／またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含有する試料を指す。一部の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、トランスファー−メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはこれらのいずれかの組合せのうち少なくとも１種を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型は、試料に由来する。一部の実施形態では、鋳型の総量は、試料における鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、反応混合物における鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、ワンポット（例えば、単一の容器）における鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、約１フェムトモル濃度（ｆＭ）〜約１００マイクロモル濃度、約４０フェムトモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００フェムトモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約０．１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００ピコモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００ナノモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約１ピコモル濃度、約４０フェムトモル濃度〜約１ナノモル濃度、約１フェムトモル濃度〜約１ピコモル濃度（ｐｉｃｏｌｏｍａｒ）、約０．０００１マイクロモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約０．０００１マイクロモル濃度〜約０．１マイクロモル濃度または約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭである。一部の実施形態では、鋳型の総量（ａｂｏｕｔ）は、約１０００マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１００マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１０マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２０００ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２００ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２０ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．２ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３０００ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３００ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３０ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．３ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０００フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１０フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い。
【０１８７】
一部の実施形態では、鋳型は、単一細胞、複数の細胞（例えば、培養された細胞）、組織、臓器または生物（例えば、細菌、酵母その他）から単離される核酸試料が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの目的の核酸試料に存在することができる。一部の実施形態では、核酸試料は、哺乳動物（例えば、ヒト、齧歯類（例えば、マウス）、または他のいずれかの目的の哺乳動物）の細胞（単数または複数）、組織、臓器および／またはその他から単離される。一部の実施形態では、核酸試料は、細菌、酵母、昆虫（例えば、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、両生類（例えば、カエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ））、ウイルス、植物または他のいずれかの非哺乳動物核酸試料供給源等、哺乳動物以外の供給源から単離される。
【０１８８】
一部の実施形態では、鋳型は、最適化される。一部の実施形態では、アクセプター鋳型またはアクセプター核酸分子は、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アクセプター鋳型またはアクセプター核酸分子は、鋳型ジャンピングおよび／または変換効率を改善するように操作される。一部の実施形態では、アクセプター鋳型またはアクセプター核酸分子は、３’末端において最適化される。一部の実施形態では、最適化は、二次構造形成および／またはヌクレオチド組成を防止する。
【０１８９】
一部の実施形態では、本開示に開示されている方法は、鋳型（例えば、ドナー鋳型）の最適化をさらに含むことができる。一部の実施形態では、鋳型の最適化は、鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）の５’キャップ構造を除去することができる薬剤と鋳型（例えば、ＲＮＡ）との接触を含む。一部の実施形態では、キャップ構造の除去は、薬剤によるキャップ構造の除去を可能にする条件下で行われる。一部の実施形態では、本開示に開示されている方法は、例えば、キャップ除去された鋳型の脱リン酸化をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、脱リン酸化を可能にする条件下、脱リン酸化剤をキャップ除去された鋳型に添加するステップをさらに含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、本開示のいずれかの方法は、鋳型の最適化をさらに含むことができる。一部の実施形態では、鋳型の最適化は、薬剤によるキャップ構造の除去を可能にする条件下における、鋳型の５’キャップ構造を除去する薬剤と鋳型を含む試料との接触を含む。一部の実施形態では、鋳型の最適化は、薬剤によるキャップ除去された鋳型の脱リン酸化を可能にする条件下における、脱リン酸化剤の添加をさらに含むことができる。一部の実施形態では、鋳型（例えば、ＲＮＡ分子）は、合成または単離後に脱リン酸化される。一部の実施形態では、脱リン酸化は、アルカリホスファターゼによる核酸（例えば、ＲＮＡ）分子の処理によって達成される。一部の実施形態では、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等、単離されたドナー鋳型は、単離後にキャップ除去および脱リン酸化される。核酸（例えば、ＲＮＡ）をキャップ除去する方法は、酵素による方法（タバコピロホスファターゼ等、ピロホスファターゼを使用することによる等）および化学的方法（過ヨウ素酸酸化およびベータ脱離等）の両方を含む。核酸（例えば、ＲＮＡ）の脱リン酸化のための方法は、アルカリホスファターゼを使用することができる。一部の実施形態では、単離されたｍＲＮＡは、キャップ除去（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼを使用）および脱リン酸化（例えば、アルカリホスファターゼを使用することによる）される。一部の実施形態では、ＲＮＡキャップ構造の除去は、ピロホスファターゼによるｍＲＮＡの酵素処理または化学的キャップ除去（例えば、過ヨウ素酸酸化およびベータ脱離による）のいずれかによる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タグにより改変される。
【０１９１】
一部の実施形態では、本開示の方法のいずれかは、ワンポット（例えば、単一の容器）内で遂行される。一部の実施形態では、反応は、ワンポット（例えば、単一の容器）内で遂行される。一部の実施形態では、反応は、ワンポット（例えば、単一の容器）反応である。
【０１９２】
一部の実施形態では、鋳型ジャンピングは、アクセプター核酸分子の濃度に依存する。
【０１９３】
一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、改変されたポリペプチドは、野生型、改変されていない対応物または天然に存在する酵素と比べて少なくとも１個の改変を含む。一部の実施形態では、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、野生型または改変されていない非ＬＴＲレトロトランスポゾンの少なくとも１個の改変を含む。一部の実施形態では、改変されたＲ２逆転写酵素は、野生型または改変されていないＲ２逆転写酵素の少なくとも１個の改変を含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、野生型または改変されていない逆転写酵素の少なくとも１個の改変を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、逆転写酵素活性を有する野生型または改変されていないポリペプチドの少なくとも１個の改変を含む。一部の実施形態では、改変は、少なくとも１個のトランケーション（例えば、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、および／またはＮおよびＣ末端トランケーション）を含む。一部の実施形態では、改変は、目的の位置におけるアミノ酸（単数または複数）の部位特異的取り込みおよび／または付加および／または欠失および／または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、野生型または改変されていない酵素またはポリペプチドと比べて、改変された酵素または改変されたポリペプチドの生物学的特性を増強する。一部の実施形態では、改変は、野生型または改変されていない酵素またはポリペプチドと比べて、改変された酵素またはポリペプチドの少なくとも１種の酵素特性を改善する。一部の実施形態では、改変（単数または複数）は、例えば、標識およびタンパク質半減期伸長剤のための、また、固体支持体の表面にバリアントを固着させる目的のための取り付けポイントとして機能する。一部の実施形態では、本開示は、改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）または改変されたポリペプチドを産生することが可能な細胞を産生する方法、および改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）または改変されたポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有するベクターを産生する方法に関係付けられる。一部の実施形態では、トランケーションは、２ステッププロセスに基づく。一部の実施形態では、トランケーションを選択するための第１のステップは、酵素またはタンパク質またはポリペプチドのクラスのドメインおよびモチーフ構造（単数または複数）および機能（単数または複数）の解析を含む。一部の実施形態では、酵素またはタンパク質またはポリペプチドは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、逆転写酵素、Ｒ２逆転写酵素、ＬＴＲレトロトランスポゾン、Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたはこれらのいずれかの組合せである。一部の実施形態では、酵素またはタンパク質またはポリペプチドは、異なる生物に由来する。一部の実施形態では、酵素またはタンパク質またはポリペプチドの全ドメインが存在する。一部の実施形態では、全ドメインが存在して、逆転写酵素活性を確実にする。一部の実施形態では、全ドメインが存在して、本開示に必須な特有の特性を確実にする。一部の実施形態では、逆転写酵素活性の原因となるドメインは、改変されない。一部の実施形態では、Ｒ２ドメインは、改変を含まない。一部の実施形態では、Ｒ２ドメインは、改変を含むことができる。一部の実施形態では、トランケートされたバリアントは、発現レベルを示す。一部の実施形態では、有望な発現レベルを示すトランケートされたバリアントは、配列において微調整（単数または複数）にさらに供される（ステップ２）。一部の実施形態では、配列における微調整（単数または複数）は、アミノ酸（単数または複数）の欠失、挿入および／または置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸（単数または複数）の欠失、挿入および／または置換は、１個またはいくつかのアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、アミノ酸（単数または複数）の欠失、挿入および／または置換は、発現および／または安定性（例えば、熱安定性）をさらに最適化する。
【０１９４】
一部の実施形態では、改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）、改変された逆転写酵素または改変されたポリペプチドは、野生型もしくは改変されていない酵素（例えば、野生型逆転写酵素）または野生型もしくは改変されていないポリペプチドと比べて、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションまたはその両方を有する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションまたはその両方を含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端およびＣ末端トランケーション（単数または複数）の組合せを含む。一部の実施形態では、改変された酵素は、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端およびＣ末端トランケーション（単数または複数）の組合せを含む。一部の実施形態では、改変されたポリペプチドは、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端およびＣ末端トランケーション（単数または複数）の組合せを含む。一部の実施形態では、トランケーションは、配列ＭＡＨＨＨＨＨＨＶＧＴＶＧＴＧＧＧＳＧＧＡＳＴＡＬを含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素、改変された酵素、改変されたポリペプチド、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変されたＲ２逆転写酵素は、約１００個未満のアミノ酸残基のトランケーションを含む。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素、改変された酵素、改変されたポリペプチド、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変されたＲ２逆転写酵素は、次のうち少なくとも一方を含む：（ａ）約４００個未満のアミノ酸残基のアミノ末端トランケーション、および（ｂ）約４００個未満のアミノ酸残基のカルボキシル末端トランケーション。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素、改変された酵素、改変されたポリペプチド、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変されたＲ２逆転写酵素は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方から最大で、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約５０、約７５、約１００、約１２０、約１５０、約１７５、約２００、約２２０、約２５０、約２７５、約２８０、約２９０、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約３８０、約３９０、約４００、または約４５０個のアミノ酸を欠く。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素、改変された酵素、改変されたポリペプチド、改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変されたＲ２逆転写酵素は、その代わりにまたはその上、最大で、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、もしくは約２５個のアミノ酸、約３０、約５０、約７５、約１００、約１２０、約１５０、約１７５、約２００、約２２０、約２５０、約２７５、約２８０、約２９０、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約３８０、約３９０、または総計約４５０個のアミノ酸の１個または複数の内部欠失を有することができる。一部の実施形態では、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションまたはその両方は、約１〜約５０個のアミノ酸、約１〜約２５、約１〜約７０、約１０〜約５０、約２０〜約３０、約１５〜約１００、約１〜約１５０、約１５〜約６０、約１５〜約４０、約１〜約１０、約１０〜３５、約５０〜約１００、約２０〜約１５０、約２００〜約３５０、約２５〜約３５０、約１５０〜約４００、約５０〜約４００、約５０〜約４５０、約２００〜約４００または約５０〜約３５０または約５０〜約４００個のアミノ酸の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、Ｎ末端トランケーションは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３２５、少なくとも約３５０、少なくとも約３７５または少なくとも約４００個のアミノ酸を除去する。一部の実施形態では、Ｃ末端トランケーションは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３２５、少なくとも約３５０、少なくとも約３７５または少なくとも約４００個のアミノ酸を除去する。一部の実施形態では、Ｎ末端トランケーションは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約９０、約９５、約１００、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２２０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５または約４００個のアミノ酸を欠く。一部の実施形態では、Ｃ末端トランケーションは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約９０、約９５、約１００、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２２０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５または約４００個のアミノ酸を欠く。一部の実施形態では、Ｎ末端トランケーションは、約５以下、約１０以下、約１５以下、約２０以下、約２５以下、約３０以下、約３５以下、約４０以下、約５０以下、約６０以下、約６５以下、約７０以下、約７５以下、約８０以下、約９０以下、約９５以下、約１００以下、約１２０以下、約１３０以下、約１４０以下、約１５０以下、約１７５以下、約２００以下、約２２０以下、約２５０以下、約２７５以下、約３００以下、約３２５以下、約３５０以下、約３７５以下または約４００個以下のアミノ酸を欠く。一部の実施形態では、Ｃ末端トランケーションは、約５以下、約１０以下、約１５以下、約２０以下、約２５以下、約３０以下、約３５以下、約４０以下、約５０以下、約６０以下、約６５以下、約７０以下、約７５以下、約８０以下、約９０以下、約９５以下、約１００以下、約１２０以下、約１３０以下、約１４０以下、約１５０以下、約１７５以下、約２００以下、約２２０以下、約２５０以下、約２７５以下、約３００以下、約３２５以下、約３５０以下、約３７５以下または約４００個以下のアミノ酸を欠く。一部の実施形態では、トランケーションは、少なくとも約、多くとも約、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００個のアミノ酸を除去するＮ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、トランケーションは、少なくとも約、多くとも約、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００個のアミノ酸を除去するＣ末端トランケーションを含む。一部の実施形態では、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションまたはその両方は、約５００個を超えるアミノ酸、約１０００個を超えるアミノ酸、約１５００個を超えるアミノ酸、約２０００個を超えるアミノ酸、約５０００個を超えるアミノ酸、約１００００個を超えるアミノ酸、約１０００００個を超えるアミノ酸、約１００００００個を超えるアミノ酸となることができる。
【０１９５】
一部の実施形態では、タンパク質または酵素の機能活性に影響を与える領域のトランケーションを操作することができる。一部の実施形態では、タンパク質または酵素の機能活性に影響を与えない領域のトランケーションを操作することができる。トランケーションは、約５未満、約１０未満、約１５未満、約２０未満、約２５未満、約３０未満、約３５未満、約４０未満、約４５未満、約５０未満、約６０未満、約７０未満、約８０未満、約９０未満、約１００未満、約１２５未満、約１５０未満、約２００未満、約２５０未満、約３００未満、約３５０未満、約４００個未満のまたはそれよりも多いアミノ酸のトランケーションを含むことができる。トランケーションは、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約６０を超える、約７０を超える、約８０を超える、約９０を超える、約１００を超える、約１２５を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約２５０を超える、約３００を超える、約３５０を超える、約４００個を超えるまたはそれよりも多いアミノ酸のトランケーションを含むことができる。トランケーションは、ポリペプチドまたは酵素の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８７％、約９０％、約９２％、約９５％または約１００％のトランケーションを含むことができる。
【０１９６】
一部の実施形態では、バリアントまたは改変された酵素または改変されたタンパク質は、アミノ酸位置に１種または複数の改変を含むことができる。一部の実施形態では、本開示のバリアント、突然変異体または改変されたポリペプチドまたは酵素は、対応する突然変異されていないもしくは改変されていないもしくは野生型ポリメラーゼと比較して、または１種もしくは複数のポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）と比較して、増加されたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性等、増加された活性を保有することができる。一部の実施形態では、活性の増加を有するポリメラーゼまたは逆転写酵素は、（１）対応する突然変異されていないもしくは野生型酵素；または（２）特定のポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素）もしくは特定の逆転写酵素もしくはポリメラーゼの群もしくは逆転写酵素の群と比較して、少なくとも約５％増加、少なくとも約１０％増加、少なくとも約２５％増加、少なくとも約３０％増加、少なくとも約５０％増加、少なくとも約１００％増加、少なくとも約１５０％増加、少なくとも約２００％増加、少なくとも約３００％増加、少なくとも約５００％増加、少なくとも約１，０００％増加、少なくとも約２，５００％増加または少なくとも約５，０００％増加を有する改変されたポリメラーゼまたは改変された逆転写酵素となることができる。一部の実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼまたは改変された逆転写酵素は、約５％〜約５，０００％、約５％〜約２，５００％、約５％〜約１０００％、約５％〜約５００％、約５％〜約２５０％、約５％〜約１００％、約５％〜約５０％、約５％〜約２５％、約２５％〜約５，０００％、約２５％〜約２，５００％、約２５％〜約１，０００％、約２５％〜約５００％、約２５％〜約２５０％、約２５％〜約１００％、約１００％〜約５，０００％、約１００％〜約２，５００％、約１００％〜約１０００％、約１００％〜約５００％、または約１００％〜約２５０％の活性の増加を有することができる。本開示の改変されたポリメラーゼまたは改変された逆転写酵素に関するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの増加は、（１）対応する改変されていないもしくは野生型酵素；または（２）特定のポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素）もしくは特定の逆転写酵素もしくはポリメラーゼの群もしくは逆転写酵素の群と比較した相対的活性に従って測定することもできる。一部の実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼまたは改変された逆転写酵素の活性が、（１）対応する突然変異されていないもしくは野生型酵素；または（２）特定のポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素）もしくは特定の逆転写酵素もしくはポリメラーゼの群もしくは逆転写酵素の群と比較される場合、そのような相対的活性の増加は、少なくとも約１．１、１．２、１．５、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００または２５，０００倍である。よって、本開示の改変されたポリメラーゼまたは改変された逆転写酵素は、約１．１倍〜約２５，０００倍、約１．１倍〜約１０，０００倍、約１．１倍〜約５，０００倍、約１．１倍〜約２，５００倍、約１．１倍〜約１，０００倍、約１．１倍〜約５００倍、約１．１倍〜約２５０倍、約１．１倍〜約５０倍、約１．１倍〜約２５倍、約１．１倍〜約１０倍、約１．１倍〜約５倍、約５倍〜約２５，０００倍、約５倍〜約５，０００倍、約５倍〜約１，０００倍、約５倍〜約５００倍、約５倍〜約１００倍、約５倍〜約５０倍、約５倍〜約２５倍、約５０倍〜約２５，０００倍、約５０倍〜約５，０００倍、約５０倍〜約１，０００倍、約５０倍〜約５００倍、約５０倍〜約１００倍、約１００倍〜約２５，０００倍、約１，０００倍〜約２５，０００倍、約４，０００倍〜約２５，０００倍、約１０，０００倍〜約２５，０００倍、約１５，０００倍〜約２５，０００倍、約１，０００倍〜約１０，０００倍、約２，５００倍〜約１０，０００倍、約５，０００倍〜約１０，０００倍、約７，５００倍〜約１０，０００倍、約１，０００倍〜約１５，０００倍、約２，５００倍〜約１５，０００倍、約５，０００倍〜約１５，０００倍、約７，５００倍〜約１５，０００倍、約１０，０００倍〜約１５，０００倍または約１２，５００倍〜約１５，０００倍の、増加されたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または増加されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することができる。
【０１９７】
一部の実施形態では、改変された酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、改変されていないまたは天然に存在する対応物と比べて、所与のヌクレオチド基質に対する変更された（例えば、増加または減少された）処理能力を示す。一部の実施形態では、改変された酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、同じヌクレオチド基質に対する参照酵素の処理能力の少なくとも約５％、１０％、２５％、３７．５％、５０％、７５％、１００％、１１０％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、７５０％、１，０００％、５，０００％または１０，０００％もの高さの、所与のヌクレオチド基質に対する処理能力を示す。一部の実施形態では、参照酵素は、改変された酵素の改変されていない対応物である。一部の実施形態では、参照酵素は、逆転写酵素である。一部の実施形態では、参照酵素は、非ＬＴＲレトロトランスポゾンである。一部の実施形態では、参照酵素は、ＬＴＲレトロトランスポゾンである。一部の実施形態では、参照酵素は、Ｒ２逆転写酵素である。一部の実施形態では、参照酵素またはポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、および／または配列番号４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｒ２は、少なくとも１個の突然変異および／または改変を含む。一部の実施形態では、Ｒ２は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｒ２および／または改変された酵素および／または改変された逆転写酵素は、Ｃ９５２Ｓ、および／またはＣ９５６Ｓ、および／またはＣ９５２Ｓ、Ｃ９５６Ｓ（二重突然変異体）、および／またはＣ９６９Ｓ、および／またはＨ９７０Ｙ、および／またはＲ９７９Ｑ、および／またはＲ９７６Ｑ、および／またはＲ１０７１Ｓ、および／またはＲ３２８Ａ、および／またはＲ３２９Ａ、および／またはＱ３３６Ａ、および／またはＲ３２８Ａ、Ｒ３２９Ａ、Ｑ３３６Ａ（三重突然変異体）、および／またはＧ４２６Ａ、および／またはＤ４２８Ａ、および／またはＧ４２６Ａ、Ｄ４２８Ａ（二重突然変異体）、および／またはこれらのいずれかの組合せから選択される（ただし、これらに限定されない）１種または複数のアミノ酸に突然変異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸位置は、配列番号５２に基づく。一部の実施形態では、アミノ酸位置は、野生型逆転写酵素に基づく。一部の実施形態では、アミノ酸位置は、野生型Ｒ２に基づく。一部の実施形態では、システインが突然変異される。一部の実施形態では、システインは、セリンに突然変異される。一部の実施形態では、アルギニンが突然変異される。一部の実施形態では、アルギニンは、セリンまたはグルタミンまたはアラニンに突然変異される。一部の実施形態では、アミノ酸は、アラニンに突然変異される。一部の実施形態では、グルタミンが、アラニンに突然変異される。一部の実施形態では、アスパラギン酸が、アラニンに突然変異される。一部の実施形態では、グリシンが、アラニンに突然変異される。一部の実施形態では、ヒスチジンが、チロシンに突然変異される。
【０１９８】
一部の実施形態では、本開示の逆転写酵素活性を有するバリアントまたは改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）または改変されたポリペプチドは、酵素特性を改善する少なくとも１種の変更された特徴を含む。一部の実施形態では、本開示の逆転写酵素活性を有するバリアントまたは改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）または改変されたポリペプチドは、本開示に開示されているアミノ酸配列に対して少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％配列同一性を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有するバリアントまたは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、表１におけるＧｅｎＢａｎｋ番号に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および／または少なくとも約９９％配列同一性を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有するバリアントまたは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、および／または配列番号４８に表記されているアミノ酸配列に対して少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および／または少なくとも約９９％配列同一性を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有するバリアントまたは改変された酵素または改変されたポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、および／または配列番号６７に表記されているアミノ酸配列に対して少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および／または少なくとも約９９％配列同一性を含む。表２を参照されたい。配列番号４９は、Ｒ２  ＲＴ  Ｃトランケーションの例であり、配列番号５０は、Ｒ２  ＲＴ  Ｎトランケーションの例であり、配列番号５１は、Ｒ２  ＲＴ  ＮおよびＣトランケーションの例であり、配列番号５２は、Ｒ２野生型の例である。配列番号５３〜６７は、単一、二重または三重突然変異を有するＲ２の例である（表２）。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、節足動物に由来する。一部の実施形態では、節足動物は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉである。
【表１−１】
2020500035.tif 000003
【表１−２】
2020500035.tif 000004
【表１−３】
2020500035.tif 000005
【表２−１】
2020500035.tif 000006
【表２−２】
2020500035.tif 000007
【表２−３】
2020500035.tif 000008
【表２−４】
2020500035.tif 000009
【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【０１９９】
一部の実施形態では、ポリペプチド、タンパク質、酵素、改変された酵素（例えば、改変された逆転写酵素）、改変されたポリペプチド、天然に存在しない酵素、またはバリアントは、限定されるものではないが、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、担体タンパク質、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せとの融合を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素または改変された逆転写酵素が、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、非ＬＴＲレトロトランスポゾンまたは改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンが、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、改変されたＬＴＲレトロトランスポゾンが、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、改変されたＲ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンが、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、改変されたＲ２逆転写酵素が、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素が、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、バリアントが、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有するポリペプチドが、タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せに融合している。
【０２００】
一部の実施形態では、融合ポリペプチド、タンパク質、酵素、改変された酵素（例えば改変された逆転写酵素）、改変されたポリペプチド、天然に存在しない酵素、またはそれらのバリアントは、安定性を増加させ（例えば、熱安定性を増加させ）、有効期間を延長し、活性画分（単数または複数）を増加させ、かつ／または、野生型の対応物、天然に存在する酵素、もしくは非融合ポリペプチド、タンパク質、酵素、またはそれらのバリアントと比較して精製を改善する。一部の実施形態では、改変された逆転写酵素は、融合パートナーまたは担体タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質、ドメイン、融合パートナー、標的配列、抗原決定基、またはそれらの任意の組合せの選択は、安定性の低減もしくは増加（例えば、熱安定性の増加）、有効期間の短縮もしくは延長、および／または発現レベルの低下もしくは上昇を引き起こす機構に基づく（Ｃｏｓｔａら、「Ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｆｈ８  ｓｙｓｔｅｍ．」Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１４年２月１９日；５：６３）。一部の実施形態では、融合タグは、そのパートナータンパク質の可溶性を向上させる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ミセル様構造を形成する。一部の実施形態では、ミセル様構造は、溶媒から隔絶および保護されているミスフォールディングもしくはアンフォールディングしたタンパク質である、ならびに／または、可溶性タンパク質ドメインが外側を向いている。一部の実施形態では、融合パートナーは、シャペロンを引き付ける。一部の実施形態では、融合タグは、そのパートナータンパク質をシャペロン媒介性フォールディング経路へ駆動する。一部の実施形態では、ＭＢＰおよび／またはＮ利用物質（ＮｕｓＡ：Ｎ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）が、この機構をもたらす２つの融合タグである。一部の実施形態では、融合パートナーは、内因性のシャペロン様活性を有する。一部の実施形態では、融合タグの疎水性パッチが、部分的にフォールディングしたパッセンジャータンパク質と相互作用し、自己凝集を防止し、適切なフォールディングを促進する。一部の実施形態では、可溶性エンハンサーパートナーが、その標的タンパク質のフォールディングにおいて受動的な役割を果たし、タンパク質凝集の機会を低減させ得る。一部の実施形態では、融合パートナー正味電荷。一部の実施形態では、高度に酸性の融合パートナーがタンパク質凝集を阻害する。一部の実施形態では、融合は、限定されるものではないが、Ｆｈ８、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＧＳＴ、ＳＥＴ、ＧＢ１、ＺＺ、ＨａｌｏＴａｇ、ＳＮＵＴ、Ｓｋｐ、Ｔ７ＰＫ、ＥｓｐＡ、Ｍｏｃｒ、エコチン、ＣａＢＰ、ＡｒｓＣ、ＩＦ２−ドメインＩ、発現タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｔａｇ）、ＩＦ２−ドメインＩの一部である発現タグ、ＲｐｏＡ、ＳｌｙＤ、Ｔｓｆ、ＲｐｏＳ、ＰｏｔＤ、Ｃｒｒ、ｍｓｙＢ、ｙｊｇＤ、ｒｐｏＤ、Ｈｉｓ６、またはそれらの任意の組合せとのものである。一部の実施形態では��融合は、タンパク質の可溶性および／または精製を向上させる。一部の実施形態では、Ｆｈ８は、効果的な可溶性エンハンサーパートナーおよび／または頑強な精製としての機能を果たし得る。一部の実施形態では、Ｆｈ８融合タグは、
【化１】
2020500035.tif 000017
を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、コドン最適化配列は、
【化２】
2020500035.tif 000018
を含む。一部の実施形態では、本開示の酵素もしくは改変された酵素（例えば改変された逆転写酵素）、またはタンパク質（例えば改変されたタンパク質）、またはポリペプチド（例えば改変されたポリペプチド）、またはバリアント、または産物、または核酸分子、またはｃＤＮＡ分子、または鋳型、またはアクセプター核酸分子、またはプライマー、またはＲＮＡ、またはＤＮＡ、または断片核酸、または分解された核酸は、１種または複数のタグを含み得る。一部の実施形態では、断片化もしくは分解されたＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらのバリアントが、１種または複数のタグを含み得る。一部の実施形態では、Ｒ２逆転写酵素、またはそのバリアントが、１種または複数のタグを含み得る。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらのバリアントが、１種または複数のタグを含み得る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子が、１種または複数のタグを含み得る。一部の実施形態では、タグは、本開示の酵素、またはタンパク質、またはポリペプチド、またはバリアント、または産物の単離が容易になるよう、固体支持体で捕捉され得る。一部の実施形態では、タグは、アビジンによって認識され得るビオチンであってよい。親和性タグは、複数のアビジン分子への結合が増加するように、複数のビオチン残基を含み得る。一部の実施形態では、タグは、銅（Ｉ）媒介性クリックケミストリー（Ｈ．  Ｃ．  ＫｏｌｂおよびＫ．  Ｂ．  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、２００３年、８巻（２４号）、１１２８〜１１３７頁を参照されたい）による捕捉を可能にする、アジド基またはアセチレン基などの官能基を含み得る。一部の実施形態では、タグは、固体支持体に結合した抗体によって捕捉され得る抗原を含み得る。一部の実施形態では、タグは、Ｈｉｓ−タグ、Ｈｉｓ６−タグ、カルモジュリン−タグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ（共有結合しているが解離可能なＮｏｒｐＤペプチド）、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｖ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、Ｂ、ＨＰＣ（プロテインＣの重鎖）ペプチドタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチン、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、チオレドキシン−タグ、およびそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、タグ付けされた分子を配列決定に付してもよい。
【０２０１】
一部の実施形態では、分子の任意の領域に分子バーコードを取り付けてもよい。例えば、分子バーコードは、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）の５’または３’末端に取り付けてもよい。例えば、分子バーコードの標的特異的領域は、分子の５’領域内のある配列と相補的である配列を含む。分子バーコードの標的特異的領域は、分子の３’領域内のある配列と相補的である配列を含んでいてもよい。一部の事例では、分子バーコードは、遺伝子または遺伝子産物内の領域に取り付けられる。例えば、ゲノムＤＮＡが断片化され、断片化されたＤＮＡに試料タグまたは分子識別子標識が取り付けられる。他の事例では、ＲＮＡ分子が代替的にスプライシングされ、代替的にスプライシングされたバリアントに分子バーコードが取り付けられる。別の例では、ポリヌクレオチドが消化され、消化されたポリヌクレオチドに分子バーコードが取り付けられる。別の例では、分子バーコードの標的特異的領域は、分子内のある配列と相補的である配列を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、本開示の方法は、ビオチン部分または別の親和性精製部分を、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組合せなどの核酸分子に導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、親和性精製タグ付き核酸分子を固体支持体に固定化することをさらに含む。一部の実施形態では、固体支持体は、アビジン、ストレプトアビジン、キチン、グルタチオンなどの親和性精製材料が結合したセファロース樹脂または磁気ビーズである。
【０２０３】
一部の実施形態では、本開示の酵素、またはタンパク質、またはポリペプチド、またはバリアント、または産物は、固体支持体に結合していてよい。一部の実施形態では、断片化もしくは分解された核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）、またはそれらのバリアントが、固体支持体に結合していてよい。一部の実施形態では、Ｒ２逆転写酵素、またはそのバリアントが、固体支持体に結合していてよい。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらのバリアントが、固体支持体に結合していてよい。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子が、固体支持体に結合していてよい。一部の実施形態では、固体支持体は、ガラス、プラスチック、ポーセレン、樹脂、セファロース、シリカ、または他の材料であり得る。一部の実施形態では、固体支持体は、実質的に平坦な基質であるプレート、ゲル、マイクロビーズ、磁気ビーズ、膜、または他の適した形状およびサイズであってよい。一部の実施形態では、マイクロビーズは、１０ｎｍ〜数ミリメートルの間の直径を有し得る。一部の実施形態では、固体支持体は、非多孔性であっても、様々な密度および孔径で多孔性であってもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片を固体支持体で捕捉してよく、不要なＤＮＡおよび／またはＲＮＡは洗い流してよい。一部の実施形態では、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片は、例えば制限酵素を使用することにより、固体支持体から遊離させてもよい。
【０２０４】
一部の実施形態では、固体支持体は標的核酸結合領域を含む場合があり、標的核酸結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴｄＴ配列、ランダムマルチマー、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、標的核酸またはその補体をさらに含む。一部の実施形態では、固体支持体は、生物のトランスクリプトームの転写物もしくはそれらの補体の約０．０１％〜約１００％、または生物のゲノムの遺伝子もしくはそれらの補体の約０．０１％〜約１００％を含む、複数の標的核酸またはそれらの補体を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドの細胞標識は、第１の標識連結配列によって第２のランダム配列に接続した第１のランダム配列を含み、複数のオリゴヌクレオチドの分子標識は、ランダム配列を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）固体支持体、ポリスチレン固体支持体、ガラス固体支持体、ポリプロピレン固体支持体、アガロース固体支持体、ゼラチン固体支持体、磁性固体支持体、プルロニック固体支持体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、リンカー官能基を含むリンカーを含み、固体支持体は、固体支持体官能基を含み、固体支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに接続している。一部の実施形態では、リンカー官能基および固体支持体官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組合せからなる群から個別に選択される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドの分子標識は、少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、融合パートナーは、酵素的切断、化学的切断により、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ切断戦略の使用により、その標的タンパク質から除去され得る。一部の実施形態では、タグ除去のためにプロテアーゼが使用され得る。一部の実施形態では、プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、アルファ−トロンビン、ウイルスプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、またはアミノペプチダーゼであり得る。一部の実施形態では、融合タグは、２種の精製ステップによって除去され得る。一部の実施形態では、最初の親和性精製ステップは、（例えば、融合タンパク質のＮ末端に位置するヒスチジンタグを介して）、タグを切断するために、エンドプロテアーゼ（例えば、ｈｉｓタグ付きプロテアーゼ）を含む溶液中に混合された、精製された融合タンパク質を含む。切断された標的タンパク質は、切断された融合タグおよび添加されたプロテアーゼが溶出試料において収集される第２の親和性精製ステップの後に、フロースルー試料において回収され得る。
【０２０６】
一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素（ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅ）、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／またはサーマルサイクリングなしで核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。一部の実施形態では、本開示の改変された逆転写酵素、改変された酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、約２５℃〜約４２℃、約１２℃〜約４２℃、約８℃〜約５０℃、約４℃〜約６０℃、約２７℃〜約３５℃、約２８℃〜約３３℃、約２９℃〜約３２℃、約３０℃〜約３７℃、約２６℃〜約３８℃、約３０℃〜約３７℃、約２５℃〜約３２℃、約２９℃〜約３１℃、約２７℃〜約３８℃、約２９℃〜約３８℃の範囲の温度で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸、ｃＤＮＡ分子を生成する。一部の実施形態では、本開示の天然に存在しない酵素、改変された逆転写酵素、改変された酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、約３０℃、または約３５℃、または約２５℃で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、約３８℃に等しいかもしくはそれ未満、約４２℃に等しいかもしくはそれ未満、約５０℃に等しいかもしくはそれ未満、約６０℃に等しいかもしくはそれ未満、約３５℃に等しいかもしくはそれ未満、約３０℃に等しいかもしくはそれ未満、約２８℃に等しいかもしくはそれ未満、約２５℃に等しいかもしくはそれ未満、約２０℃に等しいかもしくはそれ未満、約１２℃に等しいかもしくはそれ未満、約８℃に等しいかもしくはそれ未満、または約４℃に等しいかもしくはそれ未満の温度で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、約３６℃またはそれ未満の温度で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、室温で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、約もしくは多くとも約８℃、約もしくは多くとも約１２℃、約もしくは多くとも約２０℃、約もしくは多くとも約２５℃、約もしくは多くとも約２８℃、約もしくは多くとも約３０℃、約もしくは多くとも約３１℃、約もしくは多くとも約３２℃、約もしくは多くとも約３３℃、約もしくは多くとも約３４℃、約もしくは多くとも約３５℃、約もしくは多くとも約３６℃、約もしくは多くとも約３９℃、約もしくは多くとも約４０℃、約もしくは多くとも約４１℃、約もしくは多くとも約４２℃、約もしくは多くとも約５０℃、約もしくは多くとも約５５℃、約もしくは多くとも約６０℃の温度で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドは、約４２℃〜約８０℃の間、もしくは約３５℃〜約８０℃の間、もしくは約３０℃〜約５０℃の間、もしくは約８℃〜約５０℃の間、もしくは約１２℃〜約４２℃の間の任意の温度とおよそ等しい、またはそれ未満の温度で活性を示し、鋳型ジャンピングが可能であり、かつ／または核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）を生成する。
【０２０７】
一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、未改変または天然に存在する酵素と比べて、少なくとも１種の変更された特徴を有する。一部の実施形態では、変更された特徴により、改変された酵素、改変された逆転写酵素、天然に存在しない酵素、または逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチドが、サーマルサイクリングなしで鋳型核酸分子から核酸分子および／または相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成することが可能になる。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、１個または複数のコピーの核酸分子もしくはｃＤＮＡ分子を、多くとも約０．５％、多くとも約１％、多くとも約１．５％、多くとも約２％、多くとも約２．５％、多くとも約３％、多くとも約３．５％、多くとも約４％、多くとも約４．５％、多くとも約５％、多くとも約６％、多くとも約７％、多くとも約８％、多くとも約９％、多くとも約１０％、多くとも約１５％、多くとも約２０％、多くとも約２５％、多くとも約３０％、多くとも約４０％、多くとも約４５％、多くとも約５０％、多くとも約６０％、多くとも約６５％、多くとも約７０％、多くとも約７５％、または多くとも約８０％の誤り率で生成することができる。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、本明細書に開示されている配列のうちのいずれか１つのバリアントである。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、表１に提供される受託番号に対応する配列のうちのいずれか１つのバリアントである。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、配列番号１〜６７に提供される配列のうちのいずれか１つのバリアントである。一部の実施形態では、本開示の改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、または天然に存在しない酵素は、未改変または天然に存在する酵素と比べて酵素特性を改善する少なくとも１種の変更された特徴を有する。一部の実施形態では、酵素特性を改善する少なくとも１種の変更された特徴は、増加／改善された安定性（例えば増加／改善された熱安定性）、増加／改善された比活性、増加／改善されたタンパク質発現、増加／改善された精製、増加／改善された処理能力、増加／改善された鎖置換、増加／改善された鋳型ジャンピング、および増加／改善された忠実度のうちの少なくとも１つを含む。
【０２０８】
一実施形態では、本開示は、天然に存在しない酵素であって、鋳型核酸分子を、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）産物を生成するための逆転写と、約１２℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約４０℃で測定した場合に、１塩基当たり少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の処理能力におけるｃＤＮＡ産物の増幅とに供する、天然に存在しない酵素に関する。
【０２０９】
一部の実施形態では、天然に存在しない酵素は、少なくとも１種の酵素特性に関して約１．０を超える性能指数を有する。一部の実施形態では、酵素特性は、改善された安定性（例えば改善された熱安定性）、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性、および忠実度からなる群のうちの少なくとも１つである。
【０２１０】
一実施形態では、本開示は、天然に存在しない酵素であって、鋳型核酸分子を、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）産物、核酸産物を生成するための逆転写と、約３時間もしくはそれ未満の期間、ならびに／または、改善された安定性（例えば改善された熱安定性）、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性、および忠実度からなる群から選択される少なくとも１種の酵素特性に関して約１．０を超える性能指数におけるｃＤＮＡ産物の増幅とに供する、天然に存在しない酵素に関する。一部の実施形態では、温度は、約２５℃〜約４０℃（例えば約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、または約３７℃）である。一部の実施形態では、温度は、約８℃〜約５０℃（例えば約８℃、約２０℃、約４２℃、約４５℃、または約５０℃）である。
【０２１１】
一実施形態では、本開示は、天然に存在しない酵素であって、鋳型核酸分子を、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）産物を生成するための逆転写と、３時間もしくはそれ未満の期間（例えば２．５時間もしくはそれ未満、２時間もしくはそれ未満、１．５時間もしくはそれ未満、１時間もしくはそれ未満、または３０分間もしくはそれ未満）、ならびに／または、同じヌクレオチド基質に対する参照酵素の処理能力よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％高い所与のヌクレオチド基質に対する処理能力におけるｃＤＮＡ産物の増幅とに供する、天然に存在しない酵素に関する。
【０２１２】
一実施形態では、本開示は、天然に存在しない酵素であって、鋳型核酸分子を、核酸産物を生成するための逆転写と、３時間もしくはそれ未満の期間（例えば２．５時間もしくはそれ未満、２時間もしくはそれ未満、１．５時間もしくはそれ未満、１時間もしくはそれ未満、または３０分間もしくはそれ未満）、ならびに／または、同じヌクレオチド基質に対する参照酵素の処理能力よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％高い所与のヌクレオチド基質に対する処理能力における核酸産物の増幅とに供する、天然に存在しない酵素に関する。
【０２１３】
一実施形態では、本開示は、改変された逆転写酵素を使用した核酸増幅に核酸分子を供することを含む、核酸分子を増幅する方法を提供する。一部の実施形態では、逆転写酵素は、約４℃、約８℃、約１２℃、約３０℃、約２８℃、約２９℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃、約４２℃、約５０℃、または約４２℃を超える温度で、１塩基当たり少なくとも約８０％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の処理能力において、核酸分子を増幅することができる。
【０２１４】
一部の実施形態では、本開示の方法は、改変された逆転写酵素を使用して鋳型核酸分子を逆転写に付して、核酸分子を得ることをさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子は無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、鋳型核酸分子は無細胞核酸分子である。
【０２１５】
一部の実施形態では、プライマー伸長または延長反応を利用して増幅産物を生成する。プライマー伸長／延長反応は、ある変性時間の、ある変性温度における反応混合物のインキュベートと、ある延長時間の、ある延長温度における反応混合物のインキュベートとのサイクルを含み得る。
【０２１６】
標的核酸を増幅し、増幅産物を生成するためには、任意の種類の核酸増幅反応を使用してよい。さらに、核酸の増幅は、線形、指数関数的、またはそれらの組合せであってよい。増幅は、エマルジョンベースであってもよいし、またはエマルジョンベースでなくてもよい。核酸増幅法の非限定的な例としては、逆転写、プライマー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、非対称増幅、ローリングサークル増幅、および多置換増幅（ＭＤＡ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。一部の実施形態では、増幅産物はＤＮＡであり得る。標的ＲＮＡを増幅する場合、ＲＮＡの逆転写によってＤＮＡを得ることができ、その後、ＤＮＡの増幅を使用して、増幅されたＤＮＡ産物を生成することができる。増幅されたＤＮＡ産物は、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示し得る。ＤＮＡを増幅する場合、任意のＤＮＡ増幅を用いてよい。ＤＮＡ増幅法の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲの変化形（例えば、リアルタイムＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ダイヤルアウトＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ伸長ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。一部の場合では、ＤＮＡ増幅は線形である。一部の場合では、ＤＮＡ増幅は指数関数的である。一部の場合では、ＤＮＡ増幅は、増幅されたＤＮＡ産物の検出感度を改善することができるネステッドＰＣＲを用いて達成される。
【０２１７】
変性温度は、例えば、解析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の供給源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて異なり得る。一部の実施形態では、変性温度は約８０℃〜約１１０℃であり得る。一部の実施形態では、変性温度は約９０℃〜約１００℃であり得る。一部の実施形態では、変性温度は約９０℃〜約９７℃であり得る。一部の例では、変性温度は約９２℃〜約９５℃であり得る。さらに他の例では、変性温度は、約８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、または１００℃であり得る。
【０２１８】
変性時間は、例えば、解析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の供給源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて異なり得る。一部の実施形態では、変性時間は、約３００秒、２４０秒、１８０秒、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、もしくは１秒未満、またはそれと等しくてよい。例えば、変性時間は、約１８０秒、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以下であってよい。
【０２１９】
延長または伸長温度は、例えば、解析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の供給源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて異なり得る。一部の実施形態では、延長温度は約３０℃〜約８０℃であり得る。一部の実施形態では、延長温度は約３５℃〜約７２℃であり得る。一部の実施形態では、延長温度は約４５℃〜約６８℃であり得る。一部の実施形態では、延長温度は約３５℃〜約６５℃であり得る。一部の実施形態では、延長温度は約４０℃〜約６７℃であり得る。一部の実施形態では、延長温度は約５０℃〜約６８℃であり得る。一部の実施形態では、延長温度は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃であり得る。
【０２２０】
延長時間は、例えば、解析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の供給源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて異なり得る。一部の実施形態では、延長時間は、約３６０秒未満またはそれに等しいか、約３００秒、２４０秒、１８０秒、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、もしくは１秒未満またはそれに等しくてよい。一部の実施形態では、延長時間は、約１２０秒、９０秒、８０秒、７０秒、６５秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以下であってよい。
【０２２１】
一部の実施形態では、複数サイクルのプライマー伸長反応を実行することができる。任意の適した数のサイクルを実行してよい。一部の実施形態では、実行されるサイクルの数は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５サイクル未満であり得る。実行されるサイクルの数は、例えば、検出可能な増幅産物（例えば、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能な量の増幅されたＤＮＡ産物）を得るのに必要なサイクル数（例えば、サイクル閾値（Ｃｔ））に依存し得る。一部の実施形態では、検出可能な増幅産物（例えば、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能な量のＤＮＡ産物）を得るのに必要なサイクル数は、約１００サイクル、７５サイクル、７０サイクル、６５サイクル、６０サイクル、５５サイクル、５０サイクル、４０サイクル、３５サイクル、３０サイクル、２５サイクル、２０サイクル、１５サイクル、１０サイクル、８サイクル、７サイクル、５サイクル、もしくは４サイクル未満、または約１００サイクル、７５サイクル、７０サイクル、６５サイクル、６０サイクル、５５サイクル、５０サイクル、４０サイクル、３５サイクル、３０サイクル、２５サイクル、２０サイクル、１５サイクル、１０サイクル、８サイクル、７サイクル、５サイクル、もしくは４サイクルであり得る。さらに、一部の実施形態では、検出可能な量の増幅可能な産物（例えば、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能な量のＤＮＡ産物）は、１００、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１未満のサイクル閾値（Ｃｔ）で得られる場合がある。
【０２２２】
一部の実施形態では、増幅ステップ（例えば、プライマー増幅、鋳型増幅、核酸増幅）は、ＰＣＲステップを含む。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、変性ステップ、アニーリングステップ、および伸長ステップを含み得る。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、変性ステップおよび伸長ステップを含み得る。一部の実施形態では、ＰＣＲは、少なくとも約、または約、または多くとも約１サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約４サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約２０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約２５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約３０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約３５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約４０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約４５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約５０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約５５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約６０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約６５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約７０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約７５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約８０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約９０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約９５サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１００サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１１０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１２０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１３０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１４０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１５０サイクル、少なくとも約、または約、または多くとも約１６０を含む。一部の実施形態では、ＰＣＲは、約１０サイクル〜４０サイクル、約２０サイクル〜４０サイクル、約２０サイクル〜３８サイクル、約２０サイクル〜３５サイクル、約１０サイクル〜３５サイクル、約１０サイクル〜３０サイクル、約２５サイクル〜３０サイクル、約２０サイクル〜３０サイクル、約４サイクル〜８サイクル、または約２８サイクル〜３２サイクルを含む。一部の実施形態では、ＰＣＲサイクルを始める前に３分間９５℃に反応物を加熱する。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、９５℃で３秒間、および６２℃で２０秒間を含む。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、９５℃で３秒間、５４℃で１０秒間、および６４℃で２０秒間を含む。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、９５℃で３秒間、および６４℃で２０秒間を含む。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、９５℃で３秒間、および６２℃で６０秒間を含む。一部の実施形態では、各ＰＣＲサイクルは、９５℃で３秒間、５４℃で１０秒間、および６４℃で１０秒間を含む。一部の実施形態では、ＰＣＲは３０サイクルを含む。一部の実施形態では、ＰＣＲサイクルの完了後に６８℃に反応物を加熱する。一部の実施形態では、ＰＣＲサイクルの完了後、約１秒〜約５秒、約１秒〜約５分、約１分〜約５分、６８℃に反応物を加熱する。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＰＣＲ法は、少なくとも約５秒の長さ、少なくとも約６秒の長さ、少なくとも約７秒の長さ、少なくとも約８秒の長さ、少なくとも約９秒の長さ、少なくとも約１０秒の長さ、少なくとも約１１秒の長さ、少なくとも約１２秒の長さ、少なくとも約１３秒の長さ、少なくとも約１４秒の長さ、少なくとも約１５秒の長さ、少なくとも約２０秒の長さ、少なくとも約３０秒の長さ、少なくとも約４０秒の長さ、少なくとも約５０秒の長さ、少なくとも約６０秒の長さ、少なくとも約９０秒の長さ、少なくとも約１２０秒の長さ、少なくとも約１５０秒の長さ、少なくとも約１８０秒の長さ、少なくとも約２１０秒の長さ、少なくとも約２４０秒の長さ、少なくとも約２７０秒の長さ、少なくとも約３００秒の長さ、少なくとも約３３０秒の長さ、少なくとも約３６０秒の長さ、少なくとも約３９０秒の長さ、またはそれよりも長い伸長または延長ステップを含む。
【０２２３】
増幅によって増幅された標的核酸の存在を示す検出可能な量の増幅産物がもたらされる時間は、標的核酸が得られた生体試料、実行される特定の核酸増幅反応、および所望される増幅反応のサイクルの特定の数に応じて異なり得る。一部の実施形態では、標的核酸の増幅は、標的核酸の存在を示す検出可能な量の増幅産物を、１２０分もしくはそれ未満、９０分もしくはそれ未満、６０分もしくはそれ未満、５０分もしくはそれ未満、４５分もしくはそれ未満、４０分もしくはそれ未満、３５分もしくはそれ未満、３０分もしくはそれ未満、２５分もしくはそれ未満、２０分もしくはそれ未満、１５分もしくはそれ未満、１０分もしくはそれ未満、または５分もしくはそれ未満の期間でもたらし得る。
【０２２４】
一部の実施形態では、生体試料は、プライマー伸長反応の実行に先立って予熱され得る。生体試料が予熱される温度（例えば予熱温度）および時間（例えば予熱時間）は、例えば、解析される特定の生体試料に応じて異なり得る。一部の例では、生体試料は、約６０分、５０分、４０分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分、４５秒、３０秒、２０秒、１５秒、１０秒、または５秒以下の間、予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約８０℃〜約１１０℃の温度で予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約９０℃〜約１００℃の温度で予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約９０℃〜約９７℃の温度で予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約９２℃〜約９５℃の温度で予熱され得る。一部の実施形態では、生体試料は、約８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、または１００℃の温度で予熱され得る。
【０２２５】
一部の実施形態では、核酸増幅を実行するために必要な試薬は、存在または非存在が増幅産物の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすレポーター剤を含む場合もある。検出可能なシグナルの強度は、増幅産物の量に比例し得る。最初に増幅される標的核酸とは異なる種類の核酸から増幅産物が生成される一部の場合では、検出可能なシグナルの強度は、最初に増幅された標的核酸の量に比例し得る。例えば、逆転写から得られるＤＮＡの並行する逆転写および増幅によって標的ＲＮＡを増幅する場合、両方の反応に必要な試薬は、レポーター剤を含んでいてもよく、増幅されたＤＮＡ産物および／または増幅された標的ＲＮＡの存在を示す検出可能なシグナルをもたらし得る。検出可能なシグナルの強度は、増幅されたＤＮＡ産物および／または増幅された元の標的ＲＮＡの量に比例し得る。レポーター剤の使用により、ＤＮＡ増幅のためのリアルタイムＰＣＲを含むリアルタイム増幅法も可能になる。
【０２２６】
レポーター剤は、共有結合的もしくは非共有結合的連結または相互作用により、増幅産物を含む核酸と連結していてよい。非共有結合的連結または相互作用の非限定的な例としては、イオン性相互作用、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、水素結合、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、レポーター剤は、最初の反応物質に結合する場合があり、レポーター剤レベルの変化を使用して、増幅産物を検出することができる。一部の実施形態では、レポーター剤は、核酸増幅が進行して初めて検出可能（または検出不可能）になる場合がある。一部の実施形態では、光学活性色素（例えば蛍光色素）をレポーター剤として使用してよい。色素の非限定的な例としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨード（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ）、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ディスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミスラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジンおよびアクリジン、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモ二量体１および２、エチジウムモノアジド、およびＡＣＭＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、ヒドロキシスチルバミジン、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、−４１、−４２、−４３、−４４、−４５（ブルー）、ＳＹＴＯ−１３、−１６、−２４、−２１、−２３、−１２、−１１、−２０、−２２、−１５、−１４、−２５（グリーン）、ＳＹＴＯ−８１、−８０、−８２、−８３、−８４、−８５（オレンジ）、ＳＹＴＯ−６４、−１７、−５９、−６１、−６２、−６０、−６３（レッド）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−２、Ｃｙ−３、Ｃｙ−３．５、Ｃｙ−５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ−７、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｐｈａｒ−Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、７−ＡＡＤ、エチジウムホモ二量体Ｉ、エチジウム��モ二量体ＩＩ、エチジウムホモ二量体ＩＩＩ、臭化エチジウム、ウンベリフェロン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、蛍光ランタニド複合体、例えばユーロピウムおよびテルビウムを含むもの、カルボキシテトラクロロフルオレセイン、５および／または６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（または６−）ヨードアセトアミドフルオレセイン、５−｛［２（および３）−５−（アセチルメルカプト）−スクシニル］アミノ｝フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、５および／または６カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、７−アミノ−メチル−クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、８−メトキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩、３，６−ジスルホネート−４−アミノ−ナフタルイミド、フィコビリンタンパク質、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、および７９０色素、ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０、４０５、４８８、５５０、５９４、６３３、６５０、６８０、７５５、および８００色素、または他のフルオロフォアが挙げられる。
【０２２７】
一部の実施形態では、レポーター剤は、増幅産物とハイブリダイズさせると光学活性がある配列特異的オリゴヌクレオチドプローブであってよい。プローブの増幅産物に対する配列特異的結合のため、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって検出の特異性および感度を増加させることができる。プローブは、光学活性のレポーター剤（例えば色素）のいずれかに連結してよく、関連した色素の光学活性を遮断することができるクエンチャーを含んでいてもよい。レポーター剤として有用であり得るプローブの非限定的な例としては、ＴａｑＭａｎプローブ、ＴａｑＭａｎ  Ｔａｍａｒａプローブ、ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ、またはＬｉｏｎプローブが挙げられる。一部の実施形態では、レポーター剤は放射性種であり得る。放射性種の非限定的な例としては、１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。一部の実施形態では、レポーター剤は、検出可能なシグナルを発生させることができる酵素であり得る。検出可能なシグナルは、酵素の基質、または酵素が複数の基質を有する場合は特定の基質との酵素の活性によってもたらされ得る。レポーター剤として使用され得る酵素の非限定的な例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｉ２−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、およびルシフェラーゼが挙げられる。
【０２２８】
一部の実施形態では、増幅産物（例えば、増幅されたＤＮＡ産物、増幅されたＲＮＡ産物）が検出され得る。増幅されたＤＮＡを含む増幅産物の検出は、任意の適した検出法によって達成され得る。使用される特定の種類の検出法は、例えば、特定の増幅産物、増幅に使用される反応容器の種類、反応混合物中の他の試薬、レポーター剤が反応混合物中に含まれていたか否か、およびレポーター剤が使用された場合は、使用されたレポーター剤の特定の種類に依存し得る。検出法の非限定的な例としては、光学的検出、分光学的検出、静電気的検出、電気化学的検出などが挙げられる。光学的検出法としては、蛍光定量およびＵＶ−可視光吸収が挙げられるが、これらに限定されない。分光学的検出法としては、質量解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、および赤外分光法が挙げられるが、これらに限定されない。静電気的検出法としては、例えばゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルなどのゲルベースの技術が挙げられるが、これらに限定されない。電気化学的検出法としては、増幅産物の高速液体クロマトグラフィー分離後の増幅産物の電気化学的検出が挙げられるが、これに限定されない。
【０２２９】
一部の実施形態では、方法の要素を完了するために要求される時間は、方法の特定のステップに応じて異なり得る。一部の実施形態では、方法の要素を完了するための時間量は、約５分〜約１２０分であり得る。一部の実施形態では、方法の要素を完了するための時間量は、約５分〜約６０分であり得る。一部の実施形態では、方法の要素を完了するための時間量は、約５分〜約３０分であり得る。一部の実施形態では、方法の要素を完了するための時間量は、１２０分未満もしくはそれに等しい、９０分未満もしくはそれに等しい、７５分未満もしくはそれに等しい、６０分未満もしくはそれに等しい、４５分未満もしくはそれに等しい、４０分未満もしくはそれに等しい、３５分未満もしくはそれに等しい、３０分未満もしくはそれに等しい、２５分未満もしくはそれに等しい、２０分未満もしくはそれに等しい、１５分未満もしくはそれに等しい、１０分未満もしくはそれに等しい、または５分未満もしくはそれと等しくてよい。
【０２３０】
一部の実施形態では、反応物は、産物の産生、プライマー伸長、タンパク質発現、ＰＣＲ増幅、または鋳型ジャンピングに適したｐＨを有し得る。一部の実施形態では、反応物のｐＨは、約５〜約９、約６〜約９、約７〜約９、約８〜約９の範囲であり得る。一部の実施形態では、ｐＨの範囲は、約ｐＨ２〜約ｐＨ１０、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０、約ｐＨ２〜約ｐＨ８、約ｐＨ４〜約ｐＨ８、約ｐＨ５〜約ｐＨ８、約ｐＨ５〜約ｐＨ７、約ｐＨ６〜約ｐＨ１１、約ｐＨ６〜約ｐＨ１２、約ｐＨ５〜ｐＨ１３、約ｐＨ５〜約ｐＨ１４である。一部の実施形態では、ｐＨは、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、約１３、約１３．５、約１４である。
【０２３１】
一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、界面活性剤を含み得る。一部の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性および／または双性イオン性界面活性剤である。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−２１、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−３２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１６、Ｔｒｉｔｏｎ  ＧＲ−ＳＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１（ポリオキシエチレン分枝ノニルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−４４、Ｔｒｉｔｏｎ  ＲＷ−７５（ポリエチレングリコール２６０モノ（ヘキサデシル／オクタデシル）エーテルおよび１−オクタデカノール）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５１、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５（ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５還元型（ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（ポリエチレングリコール４−ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−７０５−７０；ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＴＷＥＥＮ  ２１（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＴＷＥＥＮ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ＴＷＥＥＮ  ６０（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート）、ＴＷＥＥＮ  ６１（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート）、ＴＷＥＥＮ  ６５（ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート）、ＴＷＥＥＮ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＴＷＥＥＮ  ８１（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＴＷＥＥＮ  ８５（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート）を含む任意の形態のＴＷＥＥＮ；Ｂｒｉｊ、Ｂｒｉｊ  ３０（ポリオキシエチレン４ラウリルエーテル）Ｂｒｉｊ  ３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ５２（ポリオキシエチレン２セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ５６（ポリオキシエチレン１０セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ５８（ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７２（ポリオキシエチレン２ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７６（ポリオキシエチレン１０ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７８（ポリオキシエチレン２０ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ９２（ポリオキシエチレン２オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ９７（ポリオキシエチレン１０オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ９８（ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ７００（ポリオキシエチレン１００ステアリルエーテル、オクチルチオグルコシド、マルトシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２３２】
一部の実施形態では、本開示に従って任意の分子を産生するための本明細書に開示されている任意の方法は、少なくとも１種の塩を含む。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＡｌＣｌ３、ＣｕＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＩｎＣｌ３、ＳｎＣｌ４、ＣｒＣｌ２、ＣｒＣｌ３、ＫＣｌ、ＮａＩ、ＫＩ、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）、ＴＥＡＣｌ（塩化テトラエチルアンモニウム）、ＫＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ、ＫＣＨ３ＣＯＯ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｃ５Ｈ８ＫＮＯ４、Ｃ５Ｈ８ＮＮａＯ４、ＣｓＣｌ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１種のメンバーである。一部の実施形態では、本開示に従って任意の分子を産生するための本明細書に開示されている任意の方法は、ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、分子またはライブラリーを産生するために十分な条件は、ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、反応物は、産物の産生に、プライマー伸長、タンパク質発現、ＰＣＲ増幅、または鋳型ジャンピングに適した塩濃度および／またはＮａＣｌを有し得る。一部の実施形態では、ＮａＣｌ濃度は、約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約６００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌ濃度は、少なくとも約、多くとも約、もしくは約５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約１００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約１５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約２００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約２５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約３００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約３５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約４００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約４５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約５００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約５５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは少なくとも約、多くとも約、もしくは約６００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約６５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約７００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約７５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約８００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約８５０ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約９００ｍＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約９５０ｍＭ、または少なくとも約、多くとも約、もしくは約１０００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、本開示の酵素またはポリペプチドの（例えば逆転写酵素の）酵素活性および／または鋳型ジャンピングを改善し得る。
【０２３３】
一部の実施形態では、反応物は、産物の産生に、プライマー伸長、タンパク質発現、ＰＣＲ増幅、または鋳型ジャンピングに適したヌクレオチド（例えばｄＮＴＰ）濃度を有し得る。一部の実施形態では、反応物中の総ｄＮＴＰ濃度は、約５０μＭ〜約１０００μＭ、約１００μＭ〜約５００μＭ、約２００μＭ〜約３００μＭ、約２００μＭ〜約６００μＭであり得る。一部の実施形態では、総ｄＮＴＰ濃度は、少なくとも約、多くとも約、もしくは約５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約１００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約１５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約２００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約２５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約３００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約３５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約４００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約４５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約５００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約５５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは少なくとも約、多くとも約、もしくは約６００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約６５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約７００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約７５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約８００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約８５０μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約９００μＭ、少なくとも約、多くとも約、もしくは約９５０μＭ、または少なくとも約、多くとも約、もしくは約１０００μＭである。一部の実施形態では、各ｄＮＴＰの総濃度は、少なくとも約、多くとも約、または約１μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約２μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約３μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約４μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約６μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約７μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約８μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約９μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約１０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約１５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約２０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約２５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約３０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約３５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約４０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約４５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約５０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約５５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約６０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約６５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約７０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約７５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約８０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約８５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約９０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約９５μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約１００μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約２５０μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約５００μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約１００���μＭ；少なくとも約、多くとも約、または約１００００μＭである。一部の実施形態では、各ｄＮＴＰの総濃度は、約２μＭ〜約５μＭ、約２μＭ〜約１０μＭ、約２μＭ〜約２０μＭ、約２μＭ〜約５０μＭ、約２μＭ〜約１００μＭ、約２μＭ〜約２５０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約２５０μＭ、約５μＭ〜約１０００μＭである。
【０２３４】
一部の実施形態では、各ｄＮＴＰの濃度は、１種または複数のｄＮＴＰの濃度と無関係、かつこれと異なっていてよい。一部の実施形態では、各ｄＮＴＰの濃度、例えば各ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＡＴＰの濃度は、少なくとも１種の他のｄＮＴＰの濃度と無関係、かつこれと異なっていてよい。一部の実施形態では、１種のｄＮＴＰ（例えばｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＡＴＰ）の濃度は、少なくとも１種の他のｄＮＴＰ（例えばｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＡＴＰ）と、少なくとも約、または多くとも約、または約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、２０倍、３５倍、５０倍、７５倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍異なっていてよい。
【０２３５】
一部の実施形態では、反応混合物はｐＨ調整剤を含む。目的のｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、塩酸、リン酸緩衝液、トリス緩衝剤、クエン酸緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、反応混合物のｐＨは、適切な量のｐＨ調整剤を添加することにより、所望の範囲に調整することができる。
【０２３６】
産物の産生に適した温度範囲は、用いられる特定のポリメラーゼ、用いられるいずれかの任意選択のプライマーの融解温度などの要因によって異なり得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼとしては、逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、Ｒ２逆転写酵素、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾン、逆転写酵素活性を有するポリペプチド、またはそれらの任意のバリアント、またはそれらの任意の組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２３７】
一部の実施形態では、産物を産生するのに十分な条件は、反応混合物を、約４℃〜約７２℃、約１６℃〜約７０℃、約３７℃〜約５０℃、約４０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４２℃、約２５℃〜約４２℃、約２５℃〜約３０℃、約２８℃〜約３２℃、約２９℃〜約３１℃の範囲の温度にすることを含む。一部の実施形態では、温度は、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、または約７５℃である。一部の実施形態では、温度は、約、または多くとも約４２℃である。一部の実施形態では、温度は、約、または多くとも約５０℃である。一部の実施形態では、温度は、約、または多くとも約３５℃である。一部の実施形態では、温度は、約、または多くとも約２５℃である。一部の実施形態では、温度は、約、または多くとも約３０℃である。一部の実施形態では、反応物は、約２０分〜約３時間、約３０分〜約１．５時間、約３０分〜約１時間、約３０分〜約２時間、約１時間〜約２時間、約１時間〜約１．５時間、約３０分〜約５時間、約１時間〜約３時間、約１時間〜約４時間、約１時間〜約５時間インキュベートされる。一部の実施形態では、反応物は、約１時間インキュベートされる。一部の実施形態では、反応物は、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、または約５時間インキュベートされる。一部の実施形態では、反応物は、少なくとも少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約２．５時間、少なくとも約３時間、少なくとも約３．５時間、少なくとも約４時間、少なくとも約４．５時間、または少なくとも約５時間インキュベートされる。一部の実施形態では、反応物は、約３０℃で約１時間、または約４２℃で約１時間インキュベートされる。一部の実施形態では、分子または核酸分子を生成するのに十分な条件は、約１分〜約５時間、約１２℃〜約４２℃の温度を含む。一部の実施形態では、分子または核酸分子を生成するのに十分な条件は、約１分〜約２４時間、約８℃〜約５０℃の温度を含む。
【０２３８】
一部の実施形態では、プライマーは、ある特定の長さになるように設計することができる。一部の実施形態では、プライマーは、約６〜約１００ヌクレオチド、約６〜約９０ヌクレオチド、約６〜約８０ヌクレオチド、約６〜約７０ヌクレオチド、約６〜約６０ヌクレオチド、約６〜約５０ヌクレオチド、約６〜約４０ヌクレオチド、約６〜約３０ヌクレオチド、約６〜約２０ヌクレオチド、または約６〜約１０ヌクレオチドの長さであってよい。一部の実施形態では、プライマーは、約２５〜約８０、約２５〜約７５、約２５〜約７０、約２５〜約６５、約２５〜約６０、約２５〜約５５、約２５〜約５０、約２５〜約４５、約２５〜約４０、約２５〜約３５、または約２５〜約３０塩基の長さであってよい。一部の実施形態では、プライマーは、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００塩基の長さであってよい。一部の実施形態では、プライマーは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００塩基の長さであってよい。一部の実施形態では、プライマーは、少なくとも約１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２３０、２５０、２７０、２９０、３００、３２０、３４０、３５０、３７０、４００、４２０、４５０、４７０、４９０、もしくは５００、または約１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２３０、２５０、２７０、２９０、３００、３２０、３４０、３５０、３７０、４００、４２０、４５０、４７０、４９０、もしくは５００以下、または約１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２３０、２５０、２７０、２９０、３００、３２０、３４０、３５０、３７０、４００、４２０、４５０、４７０、４９０、もしくは５００であり得る。
【０２３９】
一部の実施形態では、プライマーは、所与の融解温度（Ｔｍ）で標的にアニーリングするように設計することができる。一部の実施形態では、Ｔｍは、約２０℃〜約１００℃、約２０℃〜約９０℃、約２０℃〜約８０℃、約２０℃〜約７０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５０℃、約２０℃〜約４０℃、または約２０℃〜約３０℃であり得る。一部の実施形態では、Ｔｍは、少なくとも約、多くとも約、または約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、８３℃、８４℃、８５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、または１００℃であり得る。複数のプライマーを、ある範囲内、例えば、１５℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、または１℃に及ぶ範囲内のＴｍを有するように設計してもよい。同一のＴｍを有するように複数のプライマーを設計してもよい。
【０２４０】
一部の実施形態では、本開示の酵素、または改変された酵素（例えば改変された逆転写酵素）、またはタンパク質、またはポリペプチド、またはバリアント、またはＰＣＲ産物、またはｃＤＮＡ分子、または鋳型、または核酸分子、または任意の構成要素が精製され得る。一部の実施形態では、断片化または分解された核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）が精製され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素または改変された逆転写酵素が精製され得る。一部の実施形態では、Ｒ２逆転写酵素または改変されたＲ２逆転写酵素が精製され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、または逆転写酵素活性を有する改変された非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくは改変されたポリペプチドがさらに精製され得る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子が精製され得る。一部の実施形態では、鋳型が精製され得る。一部の実施形態では、アクセプター核酸分子が精製され得る。
【０２４１】
精製は、沈殿、超遠心分離；サイズ、電荷、疎水性、親和性、金属結合に基づくクロマトグラフィー法；ＨＰＬＣを含み得る。一部の実施形態では、精製はカラムクロマトグラフィーを含む。一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、サイズ排除（ＳＥＣ）、イオン交換（ＩＥＸ）、親和性クロマトグラフィー、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、Ｎｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用（ＨＩＣ）であり得る。一部の実施形態では、精製は、Ｈｉｓ−タグ親和性樹脂を含む。一部の実施形態では、精製は、１種のステップを含み得る。一部の実施形態では、精製は、２種のステップを含み得る。一部の実施形態では、２ステップの精製は、ニッケルおよびヘパリンを含む。一部の実施形態では、２ステップの精製は、ニッケルおよびヘパリンの親和性精製を含む。一部の実施形態では、２種の精製ステップは、１ステップの精製と比較してより高い活性および／または増加された鋳型ジャンピングを提供する。一部の実施形態では、精製はヘパリン親和性精製を含む。一部の実施形態では、精製は、親和性精製、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡシステムおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  ＦＰＬＣシステム）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ＢｅｃｋｍａｎおよびＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣ）を含み得る。一部の実施形態では、精製は、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＱ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、親和性精製（例えばＮｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲル濾過、逆相、ｃｅｒａｍｉｃ  ＨＹＰＥＲＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を含み得る。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば、クーマシー、銀染色）、イムノブロット、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、およびＥＬＩＳＡなどの解析法も含まれ、これらは、典型的にはタンパク質または酵素組成物の純度を測定するために、産生または精製プロセスの任意のステップ中に利用され得る。
【０２４２】
一部の実施形態では、２ステップ精製を使用して精製された酵素、タンパク質、ポリペプチド、Ｒ２逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、逆転写酵素、またはそれらのバリアント、またはそれらの産物の全体的活性は、１ステップ精製を使用した全体的活性よりも、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％高い。一部の実施形態では、精製された酵素、タンパク質、ポリペプチド、Ｒ２逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、逆転写酵素、またはそれらのバリアント、またはそれらの産物の全体的活性は、精製されていない酵素、タンパク質、ポリペプチド、Ｒ２逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、逆転写酵素、またはそれらのバリアント、またはそれらの産物の全体的活性よりも、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％高い。一部の実施形態では、精製された酵素、タンパク質、ポリペプチド、Ｒ２逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、逆転写酵素、改変された酵素、改変された逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する改変されたポリペプチド、またはそれらのバリアント、またはそれらの産物は、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約もしくは約５％、少なくとも約もしくは約１０％、少なくとも約もしくは約１５％、少なくとも約もしくは約２０％、少なくとも約もしくは約２５％、少なくとも約もしくは約３０％、少なくとも約もしくは約３５％、少なくとも約もしくは約４０％、少なくとも約もしくは約４５％、少なくとも約もしくは約５０％、少なくとも約もしくは約５５％、少なくとも約もしくは約６０％、少なくとも約もしくは約６１％、少なくとも約もしくは約６２％、少なくとも約もしくは約６３％、少なくとも約もしくは約６４％、少なくとも約もしくは約６５％、少なくとも約もしくは約６６％、少なくとも約もしくは約６７％、少なくとも約もしくは約６８％、少なくとも約もしくは約６９％、少なくとも約もしくは約７０％、少なくとも約もしくは約７１％、少なくとも約もしくは約７２％、少なくとも約もしくは約７３％、少なくとも約もしくは約７４％、少なくとも約もしくは約７５％、少なくとも約もしくは約７６％、少なくとも約もしくは約７７％、少なくとも約もしくは約７８％、少なくとも約もしくは約７９％、少なくとも約もしくは約８０％、少なくとも約もしくは約８１％、少なくとも約もしくは約８２％、少なくとも約もしくは約８３％、少なくとも約もしくは約８４％、少なくとも約もしくは約８５％、少なくとも約もしくは約８６％、少なくとも約もしくは約８７％、少なくとも約もしくは約８８％、少なくとも約もしくは約８９％、少なくとも約もしくは約９０％、少なくとも約もしくは約９１％、少なくとも約もしくは約９２％、少なくとも約もしくは約９３％、少なくとも約もしくは約９４％、少なくとも約もしくは約９５％、少なくとも約もしくは約９６％、少なくとも約もしくは約９７％、少なくとも約もしくは約９８％、または少なくとも約もしくは約９９％純粋である。
【０２４３】
一部の実施形態では、精製された酵素、タンパク質、ポリペプチド、Ｒ２逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、逆転写酵素、またはそれらのバリアント、またはそれらの産物は、精製されていない酵素、タンパク質、ポリペプチド、Ｒ２逆転写酵素、逆転写酵素活性を有する非ＬＴＲレトロトランスポゾンタンパク質もしくはポリペプチド、逆転写酵素、またはそれらのバリアント、またはそれらの産物よりも、少なくとも約もしくは約１回、少なくとも約もしくは約２回、少なくとも約もしくは約３回、少なくとも約もしくは約４回、少なくとも約もしくは約５回、少なくとも約もしくは約６回、少なくとも約もしくは約７回、少なくとも約もしくは約８回、少なくとも約もしくは約９回、少なくとも約もしくは約１０回、少なくとも約もしくは約１５回、少なくとも約もしくは約２０回、少なくとも約もしくは約２５回、少なくとも約もしくは約３０回、少なくとも約もしくは約４０回、少なくとも約もしくは約５０回、少なくとも約もしくは約７０回、少なくとも約もしくは約８０回、少なくとも約もしくは約９０回、少なくとも約もしくは約１００回、少なくとも約もしくは約１５０回、少なくとも約もしくは約２００回、少なくとも約もしくは約２５０回、少なくとも約もしくは約３００回、少なくとも約もしくは約３５０回、少なくとも約もしくは約４００回、少なくとも約もしくは約５００回、少なくとも約もしくは約７００回、少なくとも約もしくは約１０００回、少なくとも約もしくは約１００００回多い鋳型ジャンピング、および／または高い強度をもたらす。
無細胞ＤＮＡおよび循環腫瘍ＤＮＡ
【０２４４】
一部の実施形態では、循環腫瘍（ｃｔＤＮＡ）の含量を得ることは、ＰＣＲを含み得る。一部の実施形態では、ｃｔＤＮＡの含量を得ることは、デジタルＰＣＲを含み得る。一部の実施形態では、ｃｔＤＮＡの含量を得ることは、定量的ＰＣＲを含み得る。一部の実施形態では、ｃｔＤＮＡの含量を得ることは、ｃｔＤＮＡに関する配列決定情報を得ることを含み得る。配列決定情報は、１個または複数のゲノム領域に関する情報を含み得る。一部の実施形態では、ｃｔＤＮＡの含量を得ることは、アレイとのｃｔＤＮＡのハイブリダイゼーションを含み得る。
【０２４５】
無細胞ＤＮＡの含量を決定することは、無細胞ＤＮＡの絶対含量を決定することを含み得る。無細胞ＤＮＡの含量は、無細胞ＤＮＡに関する配列決定リードを計数することによって決定され得る。無細胞ＤＮＡの含量は、定量的ＰＣＲによって決定されてよい。
【０２４６】
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の含量を決定することは、ｃｆＤＮＡの分子バーコーディングによって行ってよい。ｃｆＤＮＡの分子バーコーディングは、ｃｆＤＮＡの１個または複数の末端にアダプターを取り付けることを含み得る。アダプターは、複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。アダプターは、１個または複数のデオキシリボヌクレオチドを含み得る。アダプターは、リボヌクレオチドを含み得る。アダプターは、一本鎖であってよい。アダプターは、二本鎖であってよい。アダプターは、二本鎖および一本鎖部分を含んでいてよい。例えば、アダプターはＹ型アダプターであってよい。アダプターは線形アダプターであってよい。アダプターは環状アダプターであってよい。アダプターは、分子バーコード、試料インデックス、プライマー配列、リンカー配列、またはそれらの組合せを含み得る。分子バーコードは、試料インデックスに隣接していてよい。分子バーコードは、プライマー配列に隣接していてよい。試料インデックスは、プライマー配列に隣接していてよい。リンカー配列は、分子バーコードを試料インデックスに接続させてよい。リンカー配列は、分子バーコードをプライマー配列に接続させてよい。リンカー配列は、試料インデックスをプライマー配列に接続させてよい。
【０２４７】
アダプターは、分子バーコードを含み得る。分子バーコードは、ランダム配列を含み得る。分子バーコードは、所定の配列を含み得る。２つまたはそれよりも多いアダプターが、２つまたはそれよりも多い異なる分子バーコードを含んでいてよい。分子バーコードは、二量体化を最低限に抑えるために最適化されていてよい。分子バーコードは、増幅または配列決定のエラーがあっても識別を可能にするように最適化されていてよい。例えば、第１の分子バーコードの増幅は、単一塩基エラーを導入し得る。第１の分子バーコードは、単一塩基より多くの他の分子バーコードとの差を含んでいてよい。したがって、単一塩基エラーを有する第１の分子バーコードは、依然として第１の分子バーコードとして識別され得る。分子バーコードは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、少なくとも３個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、少なくとも４個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、２０、１９、１８、１７、１６、または１５個未満のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、１０個未満のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、８個未満のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、６個未満のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、２〜１５個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、２〜１２個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、３〜１０個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、３〜８個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、４〜８個のヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、４〜６個のヌクレオチドを含み得る。
【０２４８】
アダプターは、試料インデックスを含み得る。試料インデックスは、ランダム配列を含み得る。試料インデックスは、所定の配列を含み得る。２つまたはそれよりも多いアダプターセットが、２つまたはそれよりも多い異なる試料インデックスを含んでいてよい。アダプターセット内のアダプターは、同一の試料インデックスを含んでいてよい。試料インデックスは、二量体化を最低限に抑えるために最適化されていてよい。試料インデックスは、増幅または配列決定のエラーがあっても識別を可能にするように最適化されていてよい。例えば、第１の試料インデックスの増幅は、単一塩基エラーを導入し得る。第１の試料インデックスは、単一塩基より多くの他の試料インデックスとの差を含んでいてよい。したがって、単一塩基エラーを有する第１の試料インデックスは、依然として第１の分子バーコードとして識別され得る。試料インデックスは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、少なくとも３個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、少なくとも４個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、２０、１９、１８、１７、１６、または１５個未満のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、１０個未満のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、８個未満のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、６個未満のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、２〜１５個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、２〜１２個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、３〜１０個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、３〜８個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、４〜８個のヌクレオチドを含み得る。試料インデックスは、４〜６個のヌクレオチドを含み得る。
【０２４９】
アダプターは、プライマー配列を含み得る。プライマー配列は、ＰＣＲプライマー配列であり得る。プライマー配列は、配列決定プライマーであってよい。
【０２５０】
アダプターは、ｃｆＤＮＡの一方の末端に取り付けてよい。アダプターは、ｃｆＤＮＡの両方の末端に取り付けてよい。アダプターは、一本鎖ｃｆＤＮＡの１個または複数の末端に取り付けてよい。アダプターは、二本鎖ｃｆＤＮＡの１個または複数の末端に取り付けてよい。
【０２５１】
アダプターは、ライゲーションによってｃｆＤＮＡに取り付けてよい。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションであってよい。ライゲーションは、粘着末端ライゲーションであってよい。アダプターは、プライマー伸長によってｃｆＤＮＡに取り付けてよい。アダプターは、逆転写によってｃｆＤＮＡに取り付けてよい。アダプターは、ハイブリダイゼーションによってｃｆＤＮＡに取り付けてよい。アダプターは、ｃｆＤＮＡに対して少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。あるいは、一部の事例では、アダプターは、ｃｆＤＮＡに対して相補的な配列を含まない。
【０２５２】
ｃｆ−ＤＮＡは、対象の腫瘍に由来してよい。ｃｆ−ＤＮＡは、対象の任意の試料に由来してよい。ｃｆ−ＤＮＡは、対象の任意の臓器に由来してよい。ｃｆ−ＤＮＡは、対象の任意の液体（例えば、血液、唾液、尿、および粘液）に由来してよい。方法は、ｃｆ−ＤＮＡの検出に基づいて対象のがんを検出することをさらに含み得る。
【０２５３】
一部の実施形態では、配列の存在または非存在は、ＤＮＡもしくはＲＮＡプロファイルと、またはがんと関連付けることができる。例えば、配列の存在または非存在は、単一細胞などの試料の転写プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、がんプロファイル、またはゲノム突然変異プロファイルと関連付けることができる。一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、がんプロファイリング、および／または状態進行のモニタリング、および／または以前および新しい突然変異の出現のモニタリングのために使用され得る。方法は、ｃｆ−ＤＮＡの検出に基づいて対象のがんを診断することをさらに含み得る。がんを診断することは、少なくとも約５０％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の感度を有し得る。がんを診断することは、少なくとも約５０％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の特異性を有し得る。方法は、ｃｆ−ＤＮＡの検出に基づいて対象のがんを予後判定することをさらに含み得る。がんを予後判定することは、少なくとも約５０％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の感度を有し得る。がんを予後判定することは、少なくとも約５０％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の特異性を有し得る。方法は、ｃｆ−ＤＮＡの検出に基づいて対象のための治療レジメンを決定することをさらに含み得る。方法は、ｃｆ−ＤＮＡの検出に基づいて対象に抗がん療法を施すことをさらに含み得る。方法は、配列決定情報に基づいて突然変異（例えば、特定の領域における突然変異）を検出することをさらに含み得る。がんを診断することは、突然変異の検出に基づき得る。少なくとも３つの突然変異の検出は、がんを示し得る。３つまたはそれよりも多い領域における１個または複数の突然変異の検出は、がんを示し得る。
酵素の突然変異
【０２５４】
一部の実施形態では、改変された酵素、または派生物およびバリアントが、ペプチドの合成中に、または産生後改変によって調製され得る。一部の実施形態では、改変された酵素、または派生物およびバリアントは、核酸の部位指向性突然変異誘発（例えば、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、ランダム突然変異誘発、または酵素的切断および／もしくはライゲーションによって産生され得る。一部の実施形態では、派生物およびバリアント、または改変された酵素は、ランダム突然変異誘発によって産生される。一部の実施形態では、合理的設計および／または突然変異誘発は、配列アライメント解析に基づく。一部の実施形態では、合理的設計／突然変異誘発は、定義済みかつ公知の酵素およびタンパク質を用いた配列アライメント解析に基づく。一部の実施形態では、配列アライメント解析は、限定されるものではないが、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、テロメラーゼ、グループＩＩイントロン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素（例えば、ＨＩＶ、ＭＭＬＶ）、およびウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、Ｒ２との相同性がある酵素および／またはエレメントを用いて行われる。
【０２５５】
一部の実施形態では、本開示のバリアントまたは改変された酵素は、以下を含むがそれらに限定されるものではないが、例えば、部位飽和突然変異誘発、スキャニング突然変異誘発、挿入突然変異誘発、欠失突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、部位指向性突然変異誘発、および指向性進化、ならびに様々な他のリコンビナトリアルアプローチによって産生され得る。改変された酵素、ポリヌクレオチド、およびタンパク質（例えばバリアント）を作製するための方法としては、ＤＮＡシャッフリング方法論、遺伝子の非相同組換えに基づく方法、例えばＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、７巻：２１３９〜４４頁［１９９９年］を参照されたい）、ＳＣＲＡＣＨＹ（Ｌｕｔｚら、９８巻：１１２４８〜５３頁［２００１年］を参照されたい）、ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒら、１９巻：４５６〜６０頁［２００１年］を参照されたい）、およびＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒら、２０巻：１０２４〜９頁［２００１年］；Ｂｉｔｔｋｅｒら、１０１巻：７０１１〜６頁［２００４年］を参照されたい）、ならびにランダムおよび標的化された突然変異、欠失、および／または挿入を挿入するためにオリゴヌクレオチドの使用に依拠する方法（Ｎｅｓｓら、２０巻：１２５１〜５頁［２００２年］；Ｃｏｃｏら、２０巻：１２４６〜５０頁［２００２年］；Ｚｈａら、４巻：３４〜９頁［２００３年］；Ｇｌａｓｅｒら、１４９巻：３９０３〜１３頁［１９９２年］を参照されたい）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または酵素は、組換えに先立ち、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム突然変異誘発に供することによって変更してよい。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または酵素は、ＤＮＡシャッフリング、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」と呼ぶ）によって産生され得る。ＤＮＡシャッフリングは、ポリヌクレオチド配列の変形形態を生成するように、相同または部位特異的組換えによって２つまたはそれよりも多いＤＮＡセグメントをアセンブルすることを含む。ＤＮＡシャッフリングは、本開示ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の活性をモジュレートするために用いることができ、そのような方法を使用して、変更された活性を有するポリペプチドを生成することができる。米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、および同第６，４４４，４６８号；ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻：７２４〜３３頁（１９９７年）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻（２号）：７６〜８２頁（１９９８年）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２８７巻：２６５〜７６頁（１９９９年）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａｓｃｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２４巻（２号）：３０８〜１３頁（１９９８年）を全般的に参照されたい��本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または酵素は、本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の１個または複数の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを含有し得る。一部の実施形態では、例えば、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）など、変異原性ＰＣＲに使用するためのキットを使用してよい。
【０２５６】
一部の実施形態では、バリアントタンパク質が親タンパク質と異なるか、または改変された酵素が、野生型または未改変の酵素および互いと少数のアミノ酸残基によって異なる。異なるアミノ酸残基の数は、１個または複数、好ましくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれよりも多いアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、バリアント間で異なるアミノ酸の数は、約１〜約１０の間である。一部の実施形態では、関連するタンパク質、特にバリアントタンパク質は、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を含む。さらに、本明細書で使用される場合、関連するタンパク質またはバリアントタンパク質は、別の関連するタンパク質または親タンパク質と顕著な領域（ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の数が異なるタンパク質を指す。例えば、一部の実施形態では、バリアントタンパク質は、親タンパク質と異なる約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の対応する顕著な領域を有する。
【０２５７】
一部の実施形態では、スクリーニング法には、液相などの従来のスクリーニング法、またはマイクロタイタープレートベースのアッセイが含まれ得る。液相アッセイのフォーマットは、多くの場合、ロボットによって操作される９６、３８４、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである。他のスクリーニング法としては、増殖選択（Ｓｎｕｓｔａｄら、１９８８年；Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９３年；Ｙａｎｏら、１９９８年）、細菌コロニーまたはファージプラークの比色スクリーニング（Ｋｕｒｉｔｚ、１９９９年）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現クローニング（Ｋｉｎｇら、１９９７年）、および細胞表面またはファージディスプレイ（Ｂｅｎｈａｒ、２００１年）が挙げられる。一部の実施形態では、スクリーニングアプローチは、酵母２ハイブリッド、ｎハイブリッド、リバース２ハイブリッド、リバースｎハイブリッド、スプリットツーハイブリッド、細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合ディスプレイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ、または任意の他のディスプレイ法から選択される方法であってよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、ファージディスプレイ法を使用してスクリーニングされる。
【０２５８】
鋳型ジャンプに由来する配列の解析：鋳型ジャンプ産物に対応するバンドをポリアクリルアミドゲルから切り取り、室温で数時間、酢酸ナトリウム（例えば、０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）、ＳＤＳ（例えば０．０３％）で溶出し、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿してよい。単離されたｃＤＮＡは、次いで、１種または複数のプライマーを使用したＰＣＲ増幅のための鋳型として使用してよい。次いで、ＰＣＲ産物をベクターに直接クローニングし（Ｂｕｒｋｅら、「Ｒ４，  ａ  ｎｏｎ−ＬＴＲ  Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻：４６２８〜４６３４頁（１９９５年））、個々のクローンを配列決定してよい。
キット
【０２５９】
本明細書に記載されている組成物はいずれも、キットに含まれていてよい。非限定的な例では、キットは、適した容器において、１種または複数のプライマーを含む。キットは、コンピューター可読媒体、例えば非一時的なコンピューター可読媒体を含むこともできる。キットは、プライマー伸長および増幅のための反応構成要素（例えば、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、緩衝剤）を含むこともできる。キットは、ライブラリー形成のための試薬（例えば、プライマー（プローブ）、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および酵素）を含み得る。キットは、ビーズ懸濁液などの精製のためのアプローチを含んでいてもよい。キットは、配列決定のための試薬、例えば蛍光標識ｄＮＴＰ、配列決定プライマーなどを含み得る。
【０２６０】
一部の実施形態では、キットの構成要素の一部は、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされ得る。キットの容器は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器を含むことができ、この中に構成要素が入れられ、適切に等分され得る。１つを超える構成要素がキット内にある場合、キットは、さらなる構成要素を別々に入れることができる第２、第３、または他のさらなる容器を含有していてもよい。容器には、構成要素の様々な組合せが含まれていてよい。一部の実施形態では、構成要素の様々な組合せがバイアルに含まれていてよい。本開示のキットは、商業的販売のために厳重な管理下にある構成要素を含有していてもよい。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出または吹き込み成形されたプラスチック容器を含み得る。
【０２６１】
キットの構成要素が１種または複数の液体溶液において提供される場合、液体溶液は、水溶液であってよい。キットの構成要素は、乾燥粉末（単数または複数）として提供されてもよい。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適した溶媒の添加によって再構成され得る。
【０２６２】
キットは、キット構成要素を用いるために加えて、キットに含まれていない任意の他の試薬の使用のための使用説明書を含むことができる。使用説明書は、実施され得る変形形態を含み得る。
【０２６３】
一部の実施形態では、試薬および材料には、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、適した緩衝剤または緩衝剤試薬、塩などが含まれ、一部の場合では、試薬には、特定の所望の細胞（単数または複数）の単離のための装置または試薬が含まれる。一部の実施形態では、個体から１個または複数の試料を抽出するのに適したキットには、１個または複数の装置がある。装置は、シリンジ、細針、メスなどであり得る。
【０２６４】
一部の実施形態では、キットは、鋳型（例えばＲＮＡ鋳型）からｃＤＮＡを調製するのに使用され得る。そのようなキットは、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製するために使用される別々の要素のうちの１つをそれぞれが含む１個または複数の容器、例えばバイアル、管などを受けるように区分された担体デバイスを含み得る。例えば、第１の容器が提供されてよく、その内容物は、液体溶液、粉末形態、もしくは凍結乾燥形態における逆転写酵素（例えば、非レトロウイルス逆転写酵素、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、Ｒ２逆転写酵素）またはそれらのバリアントを含む。さらに、任意の数のさらなる容器が提供されてよく、その内容物は、独立して、適した緩衝剤、個々にまたは集合的に適した溶液中のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）などのヌクレオチド合成のための基質、鋳型（例えば鋳型ＲＮＡ）、１種または複数のプライマー、およびアクセプター核酸分子（例えばアクセプターＲＮＡ）、ならびに任意選択で溶液中の末端トランスフェラーゼを含む。一部の実施形態では、キットは、断片もしくは分解された核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せ、１種もしくは複数のプライマー、アクセプター核酸分子（例えば、改変されたヌクレオチドを含むアクセプター核酸分子）、逆転写酵素（例えば、非レトロウイルス逆転写酵素、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、Ｒ２逆転写酵素）、またはそれらのバリアント、適した緩衝剤、デオキシヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）などのヌクレオチド合成のための基質を含み得る。上記の構成要素の任意の組合せを提供することができる。上記の構成要素のうちのいずれかは、キットから除外されてよい。一部の実施形態では、１種または複数のプライマーは、１種または複数のランダムプライマーであり得る。一部の実施形態では、構成要素のうちのいずれかは、個々に包装されていてよい。
標的分子
【０２６５】
一部の事例では、分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、分子は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子はポリアデニル化されていてよい。あるいは、ｍＲＮＡ分子はポリアデニル化されていない。あるいは、分子はＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡであってよい。ＤＮＡ分子は、エクソン、イントロン、非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、分子は、分子の一団である。
【０２６６】
一部の実施形態では、分子は、断片または分解された分子である。一部の実施形態では、断片または分解された分子は、断片ＤＮＡ、分解されたＤＮＡ、断片ＲＮＡ、分解されたＲＮＡ、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、分子は、鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せ）である。一部の実施形態では、分子は、核酸である。一部の実施形態では、分子の総量は、約１フェムトモル濃度（ｆＭ）〜約１００マイクロモル濃度、約４０フェムトモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００フェムトモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約０．１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００ピコモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００ナノモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約１ピコモル濃度、約４０フェムトモル濃度〜約１ナノモル濃度、約１フェムトモル濃度〜約１ピコモル濃度、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭである。一部の実施形態では、分子の総量は、約１０００マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５００マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５０マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約１００マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５０マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約１０マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約１マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．１マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０１マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．００１マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０００１マイクロモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２０００ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５００ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５０ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２００ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５０ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２０ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．２ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０１ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．００１ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０００１ナノモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約３０００ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５００ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５０ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約３００ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５０ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約３０ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約３ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．３ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０１ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．００１ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０００１ピコモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５０００フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５００フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５０フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約５０フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約２５フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約１０フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約１フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．１フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０１フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．００１フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い、約０．０００１フェムトモル濃度に等しいまたはそれよりも低い。
【０２６７】
本明細書に開示されている方法およびキットは、同一もしくはほぼ同一の分子および／または異なる分子の個々の出現を確率的に標識するために使用され得る。一部の事例では、本明細書に開示されている方法およびキットは、同一またはほぼ同一の分子（例えば、同一またはほぼ同一の配列を含む分子）を確率的に標識するために使用され得る。例えば、標識される分子は、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。ほぼ同一の分子は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満のヌクレオチドまたは塩基対だけ異なり得る。複数の試料のうちの１個または複数の試料中の複数の核酸は、２つまたはそれよりも多い同一の配列を含み得る。複数の試料のうちの１つまたは複数における全核酸の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％が、同じ配列を含んでいてよい。複数の試料のうちの１個または複数の試料中の複数の核酸は、少なくとも２つの異なる配列を含み得る。複数の試料のうちの１つまたは複数における全核酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が、少なくとも２つの異なる配列を含んでいてよい。一部の事例では、標識される分子は、互いのバリアントである。一部の実施形態では、標識される分子は、断片または分解された核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）である。一部の実施形態では、標識される分子は未知である。一部の実施形態では、標識される分子は、フェムトモル濃度範囲、ナノモル濃度範囲、マイクロモル濃度範囲、またはミリモル濃度範囲である。一部の実施形態では、標識される分子は、単一のヌクレオチド多型または他の種類の突然変異を含有し得る。一部の実施形態では、標識される分子はスプライスバリアントである。一部の実施形態では、少なくとも１個の分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の同一またはほぼ同一の分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の同一またはほぼ同一の分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも１５００、２，０００、２５００、３，０００、３５００、４，０００、４５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１００００個の同一またはほぼ同一の分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００個の同一またはほぼ同一の分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、１個または複数の分子が検出される。一部の実施形態では、１個または複数の分子が配列決定される。一部の実施形態では、フェムトモル濃度範囲で存在する１個または複数の未知の分子が、増幅され（例えば、ＰＣＲによって）、かつ／または標識され、かつ／または検出され、かつ／または配列決定される。一部の実施形態では、１個または複数の未知の分子は疾患を示す。一部の実施形態では、フェムトモル濃度範囲で存在する１個または複数の未知の分子は疾患を示す。一部の実施形態では、疾患はがんまたは腫瘍である。
【０２６８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法およびキットは、異なる分子を確率的に標識するために使用され得る。例えば、標識される分子は、約７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の配列同一性を含む。異なる分子は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれよりも多いヌクレオチドまたは塩基対だけ異なり得る。一部の事例では、少なくとも１個の分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なる分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の異なる分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００個の異なる分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、少なくとも１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、または１０００００個の異なる分子が確率的に標識される。一部の実施形態では、分子が配列決定される。
【０２６９】
一部の実施形態では、標識される異なる分子は、様々な濃度または量で試料中に存在し得る。例えば、１個の分子の濃度または量は、試料中の別の分子の濃度または量より多い場合がある。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１個の分子の濃度または量は、試料中の少なくとも１個の他の分子の濃度または量の、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００倍、またはそれを超える倍数である。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１個の分子の濃度または量は、試料中の少なくとも１個の他の分子の濃度または量よりも、少なくとも約１０００倍、またはそれを超える倍数である。一部の実施形態では、１個の分子の濃度または量は、試料中の別の分子の濃度または量より少ない。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１個の分子の濃度または量は、試料中の少なくとも１個の他の分子の濃度または量の、多くとも約１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、３５分の１、４０分の１、４５分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、もしくは１００分の１、またはそれを下回る分数である場合がある。一部の実施形態では、試料中の少なくとも１個の分子の濃度または量は、試料中の少なくとも１個の他の分子の濃度または量よりも、多くとも約１０００分の１、またはそれを下回る分数である場合がある。
【０２７０】
一部の実施形態では、標識される分子は、１個または複数の試料中にある。標識される分子は、２つまたはそれよりも多い試料中にあってよい。２つまたはそれよりも多い試料は、異なる量または濃度の標識される分子を含有し得る。一部の実施形態では、１個の試料中の１個の分子の濃度または量は、異なる試料中の同じ分子の濃度または量より多い場合がある。一部の実施形態では、血液試料は、尿試料よりも高い量の特定の分子を含有する場合がある。一部の実施形態では、単一の試料が、２つまたはそれよりも多いサブ試料に分割される。サブ試料は、異なる量または濃度の同じ分子を含有し得る。１個の試料中の少なくとも１個の分子の濃度または量は、別の試料中の同じ分子の濃度または量の、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００倍、またはそれを超える倍数である場合がある。一部の実施形態では、１個の試料中の１個の分子の濃度または量は、異なる試料中の同じ分子の濃度または量より少ない場合がある。例えば、皮膚組織試料は、肺組織試料よりも高い量の特定の分子を含有する場合がある。１個の試料中の少なくとも１個の分子の濃度または量は、別の試料中の同じ分子の濃度または量の、多くとも約１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、３５分の１、４０分の１、４５分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、もしくは１００分の１、またはそれを下回る分数である場合がある。
【０２７１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法およびキットは、２つまたはそれよりも多い試料からの１個または複数の分子の解析のために使用され得る。１個または複数の分子は、１種または複数のポリペプチドを含み得る。方法は、１種または複数の標識されたポリペプチドの同一性を決定することを含み得る。１種または複数の標識されたポリペプチドの同一性を決定することは、質量解析を含み得る。方法は、第１の試料の標識されたポリペプチドを、第２の試料の標識されたポリペプチドと組み合わせることをさらに含み得る。標識されたポリペプチドは、異なる標識されたポリペプチドの数の決定に先立って組み合わせてよい。方法は、第１の試料のタグ付きポリペプチドおよび第２の試料のタグ付きポリペプチドを組み合わせることをさらに含み得る。第１の試料のタグ付きポリペプチドおよび第２の試料のタグ付きポリペプチドは、複数の分子識別子標識との接触に先立って組み合わせてよい。異なる標識されたポリペプチドの数を決定することは、標識されたポリペプチドの少なくとも一部分を検出することを含み得る。標識されたポリペプチドの少なくとも一部分を検出することは、試料タグ、分子識別子標識、ポリペプチド、またはそれらの組合せの少なくとも一部分を検出することを含み得る。一部の実施形態では、検出可能なタグは、Ｌ−ＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む。
配列決定
【０２７２】
一部の実施形態では、異なる標識された核酸の数を決定することは、標識された核酸またはその任意の産物（例えば、標識されたアンプリコン、標識されたｃＤＮＡ分子）の配列を決定することを含み得る。一部の実施形態では、増幅された標的核酸を配列決定に付してよい。標識された核酸またはその任意の産物の配列を決定することは、配列決定反応を実行して、試料タグの少なくとも一部分、分子識別子標識、標識された核酸の少なくとも一部分、その補体、その逆補体、またはそれらの任意の組合せの配列を決定することを含み得る。一部の実施形態では、試料タグまたは試料タグの一部分のみが配列決定される。一部の実施形態では、分子識別子標識または分子識別子標識の一部分のみが配列決定される。
【０２７３】
標識された核酸またはその任意の産物の配列を決定することは、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（登録商標）単一分子配列決定、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ配列決定、Ｌｙｎｘ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＭａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）、４５４パイロシーケンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、イオン半導体配列決定、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＳＭＲＴ（登録商標）配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、およびＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのアプローチなどの配列決定法によって行うことができる。あるいは、標識された核酸またはその任意の産物の配列を決定することは、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより提供されているＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ、ＨｉＳｅｑ、およびＭｉＳｅｑ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ（登録商標））技術、例えばＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により提供されているＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステムおよびＳｏｌｅｘａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）により提供されているＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（登録商標）ＳｅｑｕｅｎｃｅｒなどのＴｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ（登録商標））技術を含むがこれらに限定されない配列決定プラットフォームを使用してよい。一部の実施形態では、配列決定反応は、固体もしくは半固体支持体上で、ゲル中で、エマルジョン中で、表面上で、ビーズ上で、液滴中で、連続フロー中で、希釈物中で、または１つもしくは複数の物理的に別々の体積で生じ得る。
【０２７４】
配列決定は、標識された核酸の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、もしくはそれよりも多いヌクレオチドまたは塩基対の配列決定を含み得る。一部の実施形態では、配列決定は、標識された核酸の少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、もしくはそれよりも多いヌクレオチドまたは塩基対の配列決定を含む。他の実施形態では、配列決定は、標識された核酸の少なくとも約１５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、もしくは１０，０００個、もしくはそれよりも多いヌクレオチドまたは塩基対の配列決定を含む。
【０２７５】
配列決定は、１ラン当たり少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはそれよりも多い配列決定リードを含み得る。一部の事例では、配列決定は、１ラン当たり少なくとも約１５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、もしくは１０，０００、またはそれよりも多い配列決定リードの配列決定を含む。配列決定は、１ラン当たり約１，６００，０００，０００未満またはそれに等しい配列決定リードを含み得る。配列決定は、１ラン当たり約２００，０００，０００未満またはそれに等しいリードを含み得る。
細胞
【０２７６】
本開示に記載されている細胞は、動物（例えば、ヒト、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、マウス）由来の細胞であってよい。一部の事例では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、ヒト胎児細胞であってよい。ヒト胎児細胞は、胎児を妊娠している母から得ることができる。細胞は、妊娠中の母由来の細胞であってよい。細胞は、脊椎動物、無脊椎動物、真菌、古細菌、または細菌由来の細胞であってよい。細胞は、多細胞組織（例えば、臓器（例えば、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、および胃）、胚盤胞）に由来してよい。細胞は、細胞培養物からの細胞であってよい。細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、ハイブリドーマ、幹細胞、未分化細胞、分化細胞、循環細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞などであってよい。
【０２７７】
本開示の方法において使用され得る循環疾患細胞としては、疾患もしくは状態の影響を受けるか、または感染病原体に感染する場合がある、全種類の循環細胞が挙げられる。循環細胞とは、体液中に存在する細胞を指す。循環細胞は、必ずしも全身または循環器系中を循環するとは限らない場合がある。例えば、循環細胞は、局所的に、例えば滑液中、または脳脊髄液中、またはリンパ液中に存在してよい。循環疾患細胞は、疾患もしくは状態の影響を受けているか、または感染病原体に感染している組織または臓器から脱離させてもよい。他の実施形態では、循環疾患細胞は、異なる種類の循環疾患細胞の混合物であり得る。
【０２７８】
一部の実施形態では、細胞は、がん性細胞である。がん細胞の非限定的な例としては、前立腺がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、脳がん細胞、および卵巣がん細胞を挙げることができる。一部の実施形態では、細胞は、がん由来である（例えば、循環腫瘍細胞）。がんの非限定的な例としては、腺腫、腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫、および線維肉腫を挙げることができる。
【０２７９】
一部の実施形態では、細胞は、稀少細胞である。稀少細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環上皮細胞（ＣＥＣ）、循環幹細胞（ＣＳＣ）、幹細胞、未分化幹細胞、がん幹細胞、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、胎児細胞、間葉系細胞、循環内皮細胞、循環子宮内膜細胞、栄養膜細胞、免疫系細胞（宿主または移植片）、結合組織細胞、細菌、真菌、または病原体（例えば、細菌または原虫）、微粒子、細胞断片、タンパク質および核酸、細胞小器官、他の細胞構成要素（例えば、ミトコンドリアおよび核）、ならびにウイルスであり得る。
【０２８０】
一部の実施形態では、細胞は、腫瘍由来である。一部の実施形態では、腫瘍は、良性または悪性である。腫瘍細胞は、転移細胞を含み得る。一部の実施形態では、細胞は、複数の異なる細胞型（例えば、異なる遺伝子型）を含む固形組織由来である。
試料
【０２８１】
一部の実施形態では、鋳型核酸、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む試料は、産物を産生するのに十分な量で反応混合物に組み合わせてよい。一部の実施形態では、試料は、反応混合物中のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの最終濃度が約１ｆｇ／μＬ〜約１０μｇ／μＬ、約１μｇ／μＬ〜約５μｇ／μＬ、約０．００１μｇ／μＬ〜約２．５μｇ／μＬ、約０．００５μｇ／μＬ〜約１μｇ／μＬ、約０．０１μｇ／μＬ〜約０．５μｇ／μＬ、約０．１μｇ／μＬ〜約０．２５μｇ／μＬになるように、反応混合物に組み合わせられる。一部の実施形態では、鋳型を含む試料は、単一細胞から単離される。一部の実施形態では、鋳型を含む試料は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００個、またはそれよりも多い細胞から単離される。
【０２８２】
一部の実施形態では、鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組合せである。一部の実施形態では、鋳型は、断片もしくは分解されたＤＮＡ、断片もしくは分解されたＲＮＡ、または断片もしくは分解されたＤＮＡおよび断片もしくは分解されたＲＮＡの組合せである。一部の実施形態では、鋳型の総量は、試料中の鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、反応混合物中の鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、ワンポットまたは単一の容器内の鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、ワンポットまたは単一の容器の反応物中の鋳型の総量である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、約１フェムトモル濃度（ｆＭ）〜約１００マイクロモル濃度、約０．０００１マイクロモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約０．０００１マイクロモル濃度〜約０．１マイクロモル濃度、約４０フェムトモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００フェムトモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約０．０１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約０．１マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００ピコモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００ナノモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約５００マイクロモル濃度、約５０フェムトモル濃度〜約１ピコモル濃度、約４０フェムトモル濃度〜約１ナノモル濃度、約１フェムトモル濃度〜約１ピコモル濃度である。一部の実施形態では、鋳型の総量は、約１０００マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１００マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１０マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１マイクロモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２０００ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２００ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２０ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．２ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１ナノモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３０００ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３００ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３０ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約３ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．３ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、０．００１ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１ピコモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０００フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５００フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５０フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約５０フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約２５フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１０フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．００１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い、約０．０００１フェムトモル濃度に等しいまたはそれ以上またはそれよりも低い。
【０２８３】
一部の実施形態では、試料は、対象から得られた生体試料から得ることができる。一部の実施形態では、試料は、循環腫瘍ＤＮＡ試料および／または組織試料を含む。一部の実施形態では、生体試料は、無細胞生体試料を含む。一部の実施形態では、生体試料は、循環腫瘍ＤＮＡ試料を含む。一部の実施形態では、生体試料は、生検試料を含む。一部の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。一部の実施形態では、生体試料は、リキッドバイオプシーを含む。一部の実施形態では、生体試料は、無細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、生体試料は、固体生体試料、例えば腫瘍試料であり得る。一部の実施形態では、対象由来の試料は、腫瘍由来の腫瘍細胞または核酸の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％を含み得る。固体生体試料は、ホルマリン溶液中での固定化の後にパラフィンに包埋することによって処理され得る（例えば、ＦＦＰＥ試料）。固体生体試料は、凍結することによって処理されてよい。あるいは、生体試料は、固定も凍結もしなくてもよい。固定されていない未凍結の試料は、核酸の保存のために構成された溶液中で保管され得る。固体生体試料は、任意選択で、均質化、超音波処理、フレンチプレス、Ｄｏｕｎｃｅ均質化（ｄｏｕｎｃｅ）、凍結／解凍に付してよく、その後に遠心分離を行ってよい。
【０２８４】
一部の実施形態では、試料は、液体生体試料であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、血液試料（例えば、全血、血漿、または血清）であり得る。全血試料は、Ｆｉｃｏｌｌ試薬の使用による細胞構成要素（例えば、血漿、血清）および細胞構成要素の分離に付してよい。一部の実施形態では、液体生体試料は、尿試料であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、外リンパ試料であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、糞便試料であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、唾液であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、精液であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、羊水であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、脳脊髄液であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、胆汁であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、汗であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、涙であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、痰であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、滑液であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、嘔吐物であり得る。一部の実施形態では、液体生体試料は、無細胞試料であり得る。一部の具体的な実施形態では、無細胞試料は、無細胞血漿試料であり得る。
【０２８５】
試料中のポリヌクレオチド（インプット核酸またはインプットと呼ばれる場合がある）は、ＤＮＡを含み得る。インプット核酸は、１種より多くの生物に由来する二本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または混合核酸などの複合ＤＮＡであり得る。試料中のポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含み得る。ＲＮＡを得て精製してよい。ＲＮＡとしては、精製または未精製形態のＲＮＡを挙げることができ、これは、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、レトロウイルス、低分子ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、無細胞ＲＮＡ、およびそれらの断片を含む。ノンコーディングＲＮＡすなわちｎｃＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、および長鎖ｎｃＲＮＡを含み得る。試料中のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡを含み得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから生成され得る。ｃＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。インプットＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡであってよい。インプットＤＮＡは、無細胞ＤＮＡであってよい。無細胞ＤＮＡは、例えば、血清または血漿試料から得ることができる。インプットＤＮＡは、１種より多くの個体または生物に由来してよい。インプットＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
【０２８６】
一部の実施形態では、試料は、一定期間にわたって収集することができる。試料は、規則的な時間間隔で収集してもよいし、不規則な時間間隔で間欠的に収集してもよい。異なる試料由来の核酸を比較して、例えば、状態または疾患の進行または再発をモニタリングすることができる。
【０２８７】
一部の事例では、試料は、コア生検によって収集され得る。一部の実施形態では、試料は、精製された核酸として収集され得る。そのような精製された試料の例には、例示的な例として、濾紙に付着した沈殿した核酸、フェノール−クロロホルム抽出物、キット精製（例えば、Ｑｕｉｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）など）によって精製された核酸、またはゲル精製された核酸が含まれ得る。
【０２８８】
本開示の試料は、動物（例えば、ヒト、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、マウス）由来の試料であってよい。一部の事例では、試料は、ヒト試料である。試料は、ヒト胎児試料であってよい。試料は、多細胞組織（例えば、臓器（例えば、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、および胃）、胚盤胞）に由来してよい。試料は、細胞培養物からの細胞であってよい。
【０２８９】
試料は、複数の細胞を含み得る。試料は、複数の同じ型の細胞を含み得る。試料は、複数の異なる型の細胞を含み得る。試料は、細胞周期および／または分化経路の同じポイントにある複数の細胞を含み得る。試料は、細胞周期および／または分化経路の異なるポイントにある複数の細胞を含み得る。試料は、複数の試料を含み得る。
【０２９０】
複数の試料は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個、またはそれよりも多い試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個、またはそれよりも多い試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００個の試料、９０００、または１０，０００個の試料、または１００，０００個の試料、または１，０００，０００個またはそれよりも多い試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０，０００個の試料を含み得る。
【０２９１】
第１の試料中の１種または複数の核酸は、第２の試料中の１種または複数の核酸と異なり得る。第１の試料中の１種または複数の核酸は、複数の試料中の１種または複数の核酸と異なり得る。１種または複数の核酸は、少なくとも約１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、１００，０００ヌクレオチド、１，０００，０００ヌクレオチドの長さを含み得る。
【０２９２】
第１の試料は、１個または複数の細胞を含んでいてよく、第２の試料は、１個または複数の細胞を含んでいてよい。第１の試料の１個または複数の細胞は、第２の試料の１個または複数の細胞と同じ細胞型であってよい。第１の試料の１個または複数の細胞は、複数の試料の１個または複数の異なる細胞と異なる細胞型であってよい。細胞型は、軟骨細胞、破骨細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、幹細胞、内皮細胞、または平滑筋細胞であり得る。細胞型は、免疫細胞型であってよい。免疫細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、樹状細胞、好中球、マクロファージ、または単球であり得る。
【０２９３】
複数の試料は、１個または複数の悪性細胞を含み得る。１個または複数の悪性細胞は、腫瘍、肉腫、または白血病に由来し得る。
【０２９４】
複数の試料は、少なくとも１種の体液を含み得る。体液は、血液、尿、リンパ液、唾液を含み得る。複数の試料は、少なくとも１種の血液試料を含み得る。
【０２９５】
複数の試料は、１種または複数の生体組織に由来する少なくとも１個の細胞を含み得る。１種または複数の生体組織は、骨、心臓、胸腺、動脈、血管、肺、筋肉、胃、腸、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、胆嚢、甲状腺、副腎、乳腺、卵巣、前立腺、精巣、皮膚、脂肪、眼、または脳であり得る。
【０２９６】
生体組織は、感染組織、疾患組織、悪性組織、石灰化組織、または健康な組織を含み得る。
【０２９７】
複数の試料は、１つまたは複数の供給源に由来してよい。複数の試料は、２つまたはそれよりも多い供給源に由来してよい。複数の試料は、１つまたは複数の対象に由来してよい。複数の試料は、２つまたはそれよりも多い対象に由来してよい。複数の試料は、同じ対象に由来してよい。１つまたは複数の対象は、同じ種に由来してよい。１つまたは複数の対象は、異なる種に由来してよい。１つまたは複数の対象は、健康であり得る。１つまたは複数の対象は、疾患、障害、または状態の影響を受けていてよい。複数の試料は、哺乳動物、細菌、ウイルス、真菌、または植物から選択される起源の細胞を含み得る。１個または複数の試料は、ヒト、ウマ、ウシ、ニワトリ、ブタ、ラット、マウス、サル、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ、魚、カエル、およびショウジョウバエに由来し得る。
【０２９８】
一部の実施形態では、複数の試料は、併行して得ることができる。複数の試料は、同時に得ることができる。複数の試料は、逐次的に得ることができる。複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから数年、１００年、１０年、５年、４年、３年、２年、または１年の間に得ることができる。１個または複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから約１年以内に得ることができる。１個または複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、４か月、３か月、２か月、または１か月以内に得ることができる。１個または複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから３０日、２８日、２６日、２４日、２１日、２０日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、または１日以内に得ることができる。１個または複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから約２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間以内に得ることができる。１個または複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから約６０秒、４５秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以内に得ることができる。１個または複数の試料は、１個または複数の異なる試料を得てから１秒未満以内に得ることができる。
【０２９９】
一部の実施形態では、本開示は、対象の疾患または状態のステータスまたはアウトカムを診断、モニタリング、および／または予後判定するための方法、キット、および組成物を提供する。概して、方法は、（ａ）１個または複数の試料由来の１個または複数の分子（例えば、断片化もしくは分解された核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）を標識して、１種または複数の標識された核酸を産生することと、（ｂ）１種または複数の標識された核酸を増幅することと、（ｃ）１種または複数の標識された核酸を検出および／または数量化することと、（ｄ）１種または複数の標識された核酸の検出および／または数量化に基づいて、対象の疾患または状態のステータスまたはアウトカムを診断、モニタリング、および／または予後判定することとを含む。一部の実施形態では、１種または複数の標識された核酸は、疾患、例えばがんを示す。一部の実施形態では、１種または複数の標識された核酸は、フェムトモル濃度範囲で存在する。方法は、治療レジメンを決定することをさらに含み得る。試料のうちの１つまたは複数は、疾患または状態を患う対象由来の１個または複数の試料を含み得る。１個または複数の試料は、健康な対象由来の１個または複数の試料を含み得る。１個または複数の試料は、対照由来の１個または複数の試料を含み得る。
【０３００】
疾患または状態をモニタリングすることは、治療レジメンをモニタリングすることをさらに含み得る。治療レジメンをモニタリングすることは、治療レジメンの有効性を決定することを含み得る。一部の事例では、治療レジメンをモニタリングすることは、治療レジメンを投与すること、終了すること、付加すること、または変更することを含む。治療レジメンを変更することは、治療レジメンの投与量、投薬頻度、または投与モードを増加または低減させることを含み得る。治療レジメンは、１種または複数の治療薬を含み得る。治療薬は、抗がん薬、抗ウイルス薬、抗細菌薬、抗病原体薬、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、標的配列の増幅は、生物のゲノムの少なくとも一部を含み得る。一部の実施形態では、生物のゲノムの少なくとも約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が増幅および／または解析され得る。
【０３０１】
一部の実施形態では、標的配列の増幅は、生物のトランスクリプトームの少なくとも一部を含み得る。一部の実施形態では、生物のトランスクリプトームの少なくとも約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が増幅および解析され得る。
【０３０２】
一部の実施形態では、酵素特性を改善する特徴は、増加された安定性（例えば増加された熱安定性）、増加された比活性、増加されたタンパク質発現、増加された処理能力、増加された鎖置換、増加された端から端までの鋳型ジャンピング、および増加された忠実度からなる群から選択される。
【実施例】
【０３０３】
以下の具体的な実施例は、例示的かつ非限定的である。本明細書に記載されている実施例は、先行するセクションに記載されている様々な実施形態に言及し、非限定的な裏付けを提供するものである。
（実施例１）
発現および精製
【０３０４】
小規模および中規模：改変されたＲ２非長末端反復（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンまたは改変されたＲ２逆転写酵素を担持した発現ベクターｐＥＴ−４５ｂを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。以下の表３は、本開示の改変されたＲ２酵素バリアントの２つの例であるＰ２およびＰ８バリアントを示す。発現のために、１００μＭカルベニシリン（Ｃｏｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含む２ｍｌのＬＢにおける予備培養物を準備し、室温で約８〜１２時間、一晩増殖させた。約８〜１２時間後、２００μＬの予備培養物を２５ｍＬの自己誘導発現培地Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に移し、室温で３６時間〜４８時間、シェーカーでインキュベートした。４〜８℃で１０分間、８０００×ｇの遠心分離によって細胞を採取した。バイオマスペレットを最低１時間、−２０℃で凍結させた。
【表３−１】
2020500035.tif 000019
【表３−２】
2020500035.tif 000020
【０３０５】
精製：ペレットを０．５ｍＬの溶解緩衝剤（バイオマスの１／６当たり０．５ｍＬの溶解緩衝剤）に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。溶解緩衝剤の組成：１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、２．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、３μＬプロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｒｏｃｈｅ）、５０μｇリゾチーム、０．５μＬ  ＤＮａｓｅＩ（２，０００ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ製）。インキュベーション後、ライセートを等体積（０．５ｍＬ）のＨｉｓ結合緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．７、１．５Ｍ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、０．０３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０ｍＭイミダゾール）と混合し、室温で約１０〜１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ライセートを約４℃〜約８℃の温度で約１５分間、１００００×ｇで遠心分離した。次いでペレットを、２５０μＬのＨｉｓ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｚｙｍｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈによるＨｉｓ−Ｓｐｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）と、製造元のプロトコールに従って混合した。結合ステップの後、Ｈｉｓ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを洗浄緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．７、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、０．０３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、および５０ｍＭイミダゾール）で３回洗浄した。Ｒ２逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、改変された酵素）を１５０μＬの溶出緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．７、３００ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、および２５０ｍＭイミダゾール）で溶出させ、直接使用したか、または３０％グリセロール中で凍結させた。このプロトコールは、突然変異誘発の発現および精製のためならびにスクリーニングのために調整することができる。例えば、同様のプロトコールをプレートフォーマットに合わせて調整することができる。例えば、２５ｍＬの代わりに２ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してよく、精製ステップは、ニッケル固定化樹脂を用いた９６ウェルスピンプレートを含んでよい。
【０３０６】
結果：精製後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、４〜１２％ポリアクリルアミド、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを使用して試料を解析した（図１０）。図１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、完全長の野生型Ｒ２およびトランケート型Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンを含有する試料を例示する。結果は、完全長の野生型Ｒ２では明らかな産物は観察されなかったが、トランケート型Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンでは著しい発現レベルが存在したことを示した。溶出した試料は、ＩＭＡＣでＨｉｓ−タグ親和性精製されたトランケート型Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンの高い収率を示した。図１０のレーンは次の通りである：Ｍはマーカーを示し、Ｐはペレット（不溶性）を示し、Ｓは上清（可溶性）を示し、Ｅは溶出した試料（Ｈｉｓ−タグ親和性精製されたＲ２）を示す。
（実施例２）
サロゲート／診断アッセイ
【０３０７】
逆転写酵素（ＲＴ）活性アッセイの例：アッセイを使用して、突然変異体（例えば、改変された酵素）の酵素活性、活性画分、安定性（例えば、熱安定性）、および頑強性を比較することができる。様々な鋳型／プライマーおよび酵素濃度を使用し、伸長したＤＮＡプライマーの画分を伸長していないＤＮＡプライマーの画分と比較することによるプライマー伸長アッセイに基づいて、ＲＴ活性および活性画分を推定した。伸長アッセイは、ＤＮＡトラップの添加ありおよびなしで実行した。プロトコール例：蛍光標識プライマーとアニーリングされた０．２μＭ鋳型／プライマーを、様々な濃度のＲ２  ＲＴ（鋳型／プライマーに対して０．１〜４倍）と共に室温で２０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション条件は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎを含んだ。伸長は、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ、最終）およびｄＮＴＰ（各２５μＭ、最終）、および任意選択でＤＮＡトラップ（未標識ＤＮＡオリゴ二重鎖３μＭ、最終、またはヘパリン）の添加によって開始した。トラップＤＮＡの添加は、ＲＴ活性画分を推定するのに役立つ。次いで反応物を１０分間インキュベートし、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ、最終）またはホルムアミド（５０％、最終）で停止させた。１５％  ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａを用いて反応の産物を解析した。使用した鋳型配列の一例は、ｒＣｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＡ  ｒＧｒＵｒＣ  ｒＡｒＧｒＵ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＵｒＣｒＡ  ｒＧｒＵｒＧ  ｒＣｒＣｒＡ  ｒＡｒＡｒＵ  ｒＧｒＣｒＣ  ｒＵｒＣｒＧ  ｒＵｒＣｒＡ  ｒＵｒＣであり、プライマーの一例は、／５６−ＦＡＭ／ＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＧＣである。
【０３０８】
端から端までの鋳型ジャンピングアッセイの例：一方の鋳型は蛍光標識プライマーにアニーリングされており（ドナー鋳型）、他方はプライマーを含まない（アクセプター核酸）、２つの鋳型を用いたプライマー伸長アッセイ。プロトコール例：蛍光標識プライマー（あるいは、反応の産物をＳｙｂｅｒ  Ｇｏｌｄで染色してよい）とアニーリングされた０．１μＭ鋳型／プライマーを、様々な濃度のＲ２  ＲＴ（鋳型／プライマーに対して０．１〜４倍）と共に室温で２０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション条件は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎを含んだ。伸長は、様々な濃度（約０．０１μＭ〜約５μＭの範囲）におけるＭｇＣｌ２（５ｍＭ、最終）、ｄＮＴＰ（各５０μＭ、最終）、およびアクセプター核酸の添加によって開始した。次いで反応物を３０分〜１時間インキュベートし、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ、最終）またはホルムアミド（５０％、最終）で停止させた。１５％  ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａを用いて反応の産物を解析した。鋳型：鋳型は、２種のプライマー（このうち１種はＴ７プロモーター配列（すなわち第１のプライマー）を含んだ）を用いたＰＣＲ反応で生成されたＤＮＡ鋳型に基づき、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成によって生成した。第２のプライマーは、ドナー鋳型／プライマープロトコールにおけるＤＮＡプライマーとしても使用した。次いで、１５％  ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａを用いて反応の産物を解析した。使用した材料の例：
【化３】
2020500035.tif 000021
【化４】
2020500035.tif 000022
【０３０９】
処理能力アッセイの例：処理能力アッセイは、１５％  ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａ、または１．２％アガロースゲル、または２％アガロースゲルを使用し、プライマー伸長および産物の形成に基づいて解析した。産物の長さの分布を濃度測定によって解析した。プロトコール例：蛍光標識プライマー（あるいは、反応の産物をＳｙｂｅｒ  Ｇｏｌｄで染色してよい）とアニーリングされた０．０５〜０．１μＭ鋳型／プライマーを、様々な濃度のＲ２  ＲＴ（鋳型／プライマーに対して０．１〜４倍）と共に室温で２０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション条件：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎ。伸長は、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ、最終）、ｄＮＴＰ（各５０μＭ、最終）、および任意選択でＤＮＡトラップ（未標識ＤＮＡオリゴ二重鎖３μＭ、最終）の添加によって開始した。次いで反応物を３０分〜１時間インキュベートし、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ、最終）またはホルムアミド（５０％、最終）で停止させた。鋳型：鋳型は、２種のプライマー（このうち１種はＴ７プロモーター配列を含んだ）を用いたＰＣＲ反応で生成されたＤＮＡ鋳型に基づき、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成によって生成した。第２のプライマーは、ドナー鋳型／プライマープロトコールにおけるＤＮＡプライマーとしても使用した。１５％  ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａ、または１．２％アガロースゲル、または２％アガロースゲルを用い、反応の産物を解析した。材料は：
【化５】
2020500035.tif 000023
、およびＲＮＡ鋳型（約６００ヌクレオチド）を含んだ。
【０３１０】
ランダムプライミングの例：いくつかのアダプター付きプライマーまたはアダプター付きランダムプライマーを有するより長いＲＮＡ鋳型；ＰＣＲ増幅後に産物解析を行い、産物の長さの分布を比較する（１種のプライマーは、鋳型の５’末端に対して特異的であり、第２のプライマーは、アダプター配列に対して相補的である）。
（実施例３）
合成ＲＮＡを使用した活性および鋳型ジャンピング実験
【０３１１】
改変されたＲ２酵素は、活性および鋳型ジャンピング特性を示した（図１１）。以下の表４に記載され、図１１に表されている実験は、反応が酵素を欠いた場合は活性がなかったこと（レーン２）、反応がアクセプター核酸を欠いた場合は伸長産物はあったが鋳型ジャンピングはなかったこと（レーン３）、および鋳型ジャンピングがアクセプター核酸の濃度に依存したこと（レーン４および５）を示した。レーン６は、酵素ＭＭＬＶは産物の伸長が可能だが、明らかな産物は観察されなかったことを示す（表４および図１１）。簡潔に述べると、反応物は、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｒ２緩衝剤またはＭＭＬＶ緩衝剤、０．４μＭ鋳型／プライマー、アクセプター核酸（０〜１μＭ）、改変されたＲ２酵素（０〜０．０２３μｇ／μｌ）またはＭＭＬＶ（２Ｕ／μｌ）、およびＨ２Ｏを含有した。Ｒ２酵素またはＲ２緩衝剤を含有した反応物は、３０℃で１時間インキュベートした（レーン２〜５）。ＭＭＬＶ酵素を含有した反応物は、４２℃で１時間インキュベートした（レーン６）。１５％  ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａゲルを使用して産物を解析した。
【表４】
2020500035.tif 000024
（実施例４）
１ポット（単一の容器）での反応
【０３１２】
この実験は、１ポット（単一の容器）でＲＮＡライブラリー（表５）を調製するための方法を明示するために設計した。この実験では、２００ｂｐのＲＮＡ分子を１ポット（単一の容器）での反応において捕捉するのに成功した。ワークフローの概略図を図３および図１２Ａに示す。この実験で使用した鋳型は、Ｔ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写プロトコールを使用して生成された２００塩基対の合成ＲＮＡ（ドナー鋳型）であった。対照は、酵素なしの対照、アクセプターなしの対照、アクセプターなしかつプライマー付きドナー鋳型なしの対照、およびＭＭＬＶを含んだ（表５）。この実験で使用した他の対照には、ＰＣＲ増幅中に１種のプライマーのみを使用したものが含まれた（図１２Ｂ、番号５および６）。
【０３１３】
簡潔に述べると、Ｒ２酵素反応物（ＲＴ反応物）は、Ｈ２Ｏ、Ｒ２緩衝剤、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．０２５μＭ  ２００ｂｐＲＮＡ／プライマー（プライマー付きドナー鋳型）、アクセプター核酸（０．１５μＭ）、および０．０２３μｇ／μｌのＲ２酵素（例えば、改変された逆転写酵素）を含んだ（表５、図１２Ｃレーン４）。他の反応物の詳細については表５を参照されたい。次いでＲ２反応物を３０℃で１時間インキュベートし、ＭＭＬＶ反応物を４２℃で１時間インキュベートした。次いで、反応物に、増幅プライマーおよびホットスタートポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬（表６）を追加した。簡潔に述べると、２．５μｌのＲＴ反応物（すなわち、表５の反応物５０μｌのうちの２．５μｌ）に、ＰＣＲ増幅に必要な構成要素を追加した。Ｒ２酵素のＰＣＲ増幅反応物は、Ｈ２Ｏ、ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴマスターミックス、各０．５μＭのＰ１８６プライマーおよびＰ１７０プライマー、ならびに鋳型（例えば、２．５μｌのＲＴ反応物）を含んだ。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、ならびに９５℃で３秒間および６２℃で２０秒間の３０サイクルであった。次いで、反応物を６８℃に上昇させた。この実験中、精製ステップは必要なかった（例えば、ＲＴ反応物は、ＰＣＲに先立って精製しなかった）。一部の事例では、最初のＲＴ反応物（またはＲ２反応物）をＰＣＲステップ中に１０倍に（例えば、２．５μｌのＲＴ反応物を２５μｌの総体積に）希釈した（表６を参照されたい）。一部の事例では、１０μｌのＲＴ反応物および９０μｌのＰＣＲ試薬を同じ管に添加してよい（よって、１ポットまたは単一の容器での反応）。図１２Ｂのゲルは、Ｒ２酵素反応物を使用して正しいサイズのアンプリコンが生成されたことを示す（レーン４）。他のレーンは、アンプリコンの形成を示さなかった（レーン１：ラダー、レーン２：酵素なしの対照、レーン３：ＭＭＬＶ対照、レーン５：アクセプターなしの対照、レーン６：ドナーなしの対照、およびレーン７：ラダー）。
【表５】
2020500035.tif 000025
【表６−１】
2020500035.tif 000026
【表６−２】
2020500035.tif 000027
（実施例５）
様々な鋳型量を使用した１ポット（単一の容器）でのＲＮＡライブラリー調製
【０３１４】
この実験は、様々な量の鋳型ＲＮＡを使用した１ポット（単一の容器）でＲＮＡライブラリー（表７）を調製するための方法を明示するために設計した。ワークフローの概略図を図３に示す。この実験で使用した鋳型は、６００塩基対の合成ＲＮＡ（ドナー鋳型）であった。この実験で使用したＲＮＡ鋳型量は、０μＭ、０．０００２５μＭ、０．００２５μＭ、および０．０２５μＭから変動した。簡潔に述べると、反応物は、Ｈ２Ｏ、Ｒ２緩衝剤またはＭＭＬＶ緩衝剤、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、プライマー付きの６００ｂｐ  ＲＮＡ鋳型（０μＭ、０．０００２５μＭ、０．００２５μＭ、および０．０２５μＭ）、アクセプター核酸分子（ＭＭＬＶ反応物のための６μＭのＰ１８１  ＴＳＯ）またはＲ２反応物のための０．１μＭのＰ１７３、および酵素（０．０２３μｇ／μｌの改変されたＲ２酵素または０．４Ｕ／μｌのＭＭＬＶ）を含んだ。Ｒ２反応物を３０℃で１時間インキュベートし（表７、番号１〜４）、ＭＭＬＶ反応物を４２℃で１時間インキュベートした（表７、番号５〜８）。次いで、反応物に、増幅プライマーおよびホットスタートポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬を追加した。ＰＣＲ条件は、Ｒ２反応物（反応物１〜４）については表８に、ＭＭＬＶ反応物（反応物５〜８）については表９に示す。Ｒ２反応物は、Ｈ２Ｏ、ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴマスターミックス、各０．５μＭのＰ１８６プライマーおよびＰ１７２プライマー、ならびに１Ｘ鋳型（２．５μｌのＲＴ反応物）を含んだ。ＭＭＬＶ反応物は、Ｈ２Ｏ、ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴマスターミックス、各０．５μＭのＰ１６１プライマーおよびＰ１７２プライマー、ならびに１Ｘ鋳型（２．５μｌのＲＴ反応物）を含んだ。簡潔に述べると、２．５μｌのＲＴ反応物を（例えば、クリーンアップなしで）、ＳＹＢＲＦＡＳＴマスターミックス、プライマー、およびＨ２Ｏを２５μｌの総体積で含むＰＣＲ構成要素と共にインキュベートした（ワンポット／管／単一の容器での反応）。Ｒ２反応物のＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、ならびに９５℃で３秒間、５４℃で１０秒間、および６４℃で２０秒間の３０サイクルであった。次いで、反応物を６８℃に上昇させた。ＭＭＬＶ反応物のＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、ならびに９５℃で３秒間および６４℃で２０秒間の３０サイクルであった。次いで、反応物を６８℃に上昇させた。この実験の過程において精製ステップは必要なかった。一部の事例では、ＰＣＲ中に、１０μｌのＲＴ反応物および９０μｌのＰＣＲ試薬を同じ管に添加し、１ポット（単一の容器）での反応物にすることにより、最初の反応物を１０倍に希釈してよい。リアルタイムＰＣＲを使用した結果は、６００塩基対ＲＮＡの様々な量における産物変換を示し、Ｒ２酵素がＭＭＬＶと比較して優れた変換効率を提示したことを示した（図１３）。この実験は、低い鋳型量（０．０００２５μＭ）においてでさえ、Ｒ２酵素はＲＮＡライブラリー調製が可能であったことを示した（図１３、番号４）。これは、単一細胞への適用に代表的である。この実験はまた、現在利用できる方法と比較して１０倍高い変換効率を示した。
【表７】
2020500035.tif 000028
【表８】
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【表９−１】
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【表９−２】
2020500035.tif 000031
（実施例６）
様々な鋳型長を使用した１ポット（単一の容器）でのＲＮＡライブラリー調製
【０３１５】
この実験は、様々な長さの鋳型ＲＮＡ（２００ｂｐ、６００ｂｐ、および２０００ｂｐ）を使用した１ポット（単一の容器）でＲＮＡライブラリーを調製するための方法を明示するために設計した。ワークフローの概略図を図３に示す。簡潔に述べると、反応物は、Ｈ２Ｏ、Ｒ２緩衝剤、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、プライマー付きのＲＮＡ（例えば、０．３μＭ（２００ｂｐ）、０．１２５μＭ（６００ｂｐ）、または０．０３μＭ（２０００ｂｐ））、０．１μＭのＰ１７３、および酵素（例えば、０．０２３μｇ／μｌの改変されたＲ２酵素；Ｐ２バリアント）を含んだ（表１０）。反応物を３０℃で１時間インキュベートした。次いでに反応物に、増幅プライマーおよびホットスタートポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬を追加した。ＰＣＲ増幅反応物は、Ｈ２Ｏ、ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴマスターミックス、各０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに２．５μｌの１０Ｘ鋳型（ＲＴ反応物）を含んだ（表１１）。鋳型なしの対照反応物のフォワードプライマーおよびリバースプライマーはそれぞれ、Ｐ１８６およびＰ１８３であった。２００ｂｐ  ＲＮＡ鋳型反応物のフォワードプライマーおよびリバースプライマーはそれぞれ、Ｐ１８６およびＰ１７０であった。６００ｂｐ  ＲＮＡ鋳型反応物のフォワードプライマーおよびリバースプライマーはそれぞれ、Ｐ１８６およびＰ１７２であった。２０００ｂｐ  ＲＮＡ鋳型反応物のフォワードプライマーおよびリバースプライマーはそれぞれ、Ｐ１８６およびＰ１８３であった。反応物のＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、ならびに９５℃で３秒間および６２℃で６０秒間の３０サイクルであった。次いで、反応物を６８℃に上昇させた。この実験の過程において精製ステップは必要なかった。ＰＣＲ中に、１０μｌのＲＴ反応物および９０μｌのＰＣＲ試薬を同じ管に添加し、１ポット（単一の容器）での反応物にすることにより、最初の反応物を１０倍に希釈してよい。リアルタイムＰＣＲを使用した結果は、ＲＮＡ鋳型の様々な長さにおける産物変換を示した（図１４）。この実験はまた、ＲＮＡ長の適合性も例示する。実験は、いくつかの転写物の長さとの適合性を示し、例えばＩｓｏ−ｓｅｑ、ＶＤＪなどの適用を可能にする。
【表１０−１】
2020500035.tif 000032
【表１０−２】
2020500035.tif 000033
【表１１−１】
2020500035.tif 000034
【表１１−２】
2020500035.tif 000035
（実施例７）
酵素活性および鋳型ジャンピングのためのＮａＣｌ濃度の最適化
【０３１６】
この実験は、ＮａＣｌ濃度に基づいて酵素活性および鋳型ジャンピングを最適化するように設計した。簡潔に述べると、反応物は、Ｈ２Ｏ、１０Ｘ  Ｒ２緩衝剤、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭのＲＮＡ鋳型とプライマー（Ｐ１７３およびＰ１７４）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、または８００ｍＭ）、および酵素（例えば、０μｇ／μｌまたは０．０２３μｇ／μｌの改変されたＲ２酵素（Ｐ２バリアントＲ２酵素））を含んだ。１０Ｘ  Ｒ２緩衝剤は、Ｈ２Ｏ、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５％  ｔｗｅｅｎ、および２５ｍＭ  ＤＴＴ（４２．５μｌ  Ｈ２Ｏ、５０μｌの１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５μｌの１０％  Ｔｗｅｅｎ、２．５μｌの１０００ｍＭ  ＤＴＴ）を含んだ。反応物を室温で約２時間インキュベートした。次いで、反応物に、０．５μＭの鋳型（Ｐ１７３）および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を追加し、室温で約１時間、続いて８０℃で約５分間インキュベートした。次いで反応物をゲル上で泳動させた（図１５）。結果は、この実験において、３００ｍＭのＮａＣｌが酵素活性および鋳型ジャンピングに最適であったことを示した（図１５）。
【表１２】
2020500035.tif 000036
（実施例８）
Ｒ２酵素（Ｐ２バリアント）の２ステップ精製は、より高い活性および鋳型ジャンピングをもたらした
【０３１７】
この実験は、異なる精製方法に基づいてＲ２酵素の活性および鋳型ジャンピング特性を最適化するように設計した。簡潔に述べると、反応物は、Ｈ２Ｏ、１０Ｘ  Ｒ２緩衝剤、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭのＲＮＡとプライマー（Ｐ１７３およびＰ１７４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、０．５μＭのＰ１７３、および酵素（１ステップ精製（ニッケルまたはヘパリン）では、０．０２３μｇ／μｌもしくは０．０４５μｇ／μｌのＰ２バリアントＲ２酵素、または２ステップ精製（ニッケルおよびヘパリン）では、０．００７５μｇ／μｌ、０．０２３μｇ／μｌ、もしくは０．０４８μｇ／μｌのＰ２バリアントＲ２酵素）を含んだ。反応物を室温で約２時間、続いて８０℃で約５分間インキュベートした。次いで反応物をゲル上で泳動させた（図１６Ａおよび１６Ｂ）。結果は、酵素をＮｉ−ＮＴＡニッケル親和性カラムに付し、続いてヘパリンセファロース親和性カラムでさらに精製した反応物が、１種の精製ステップのみ（ニッケル単独またはヘパリン単独）に供した反応物よりも高い活性および良好な鋳型ジャンピング能を示したことを示した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。
（実施例９）
ＤＮＡ鋳型は、Ｒ２酵素（Ｐ２バリアント）の活性および鋳型ジャンピングを可能にする
【０３１８】
この実験は、改変された逆転写酵素が、ＤＮＡ鋳型の存在下で活性および鋳型ジャンピング能を示したことを明示した（図１７）。手短に言えば、反応物は、Ｈ２Ｏ、５Ｘ  Ｒ２緩衝剤、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．４μＭのＤＮＡ鋳型とプライマー（Ｐ１８８およびＰ１８９）、０μＭまたは１．５μＭのＤＮＡ鋳型（Ｐ１８８）（図１７、それぞれレーン１および２）、および０μｇ／μｌまたは０．０２３μｇ／μｌの酵素（Ｐ２バリアントＲ２酵素）（図１７、それぞれレーン１および２）を含んだ。反応物を３０℃で約１時間、続いて８０℃で約１０分間インキュベートした。次いで反応物をゲル上で泳動させた（図１７）。配列：
【化６】
2020500035.tif 000037
（実施例１０）
ＤＮＡ断片は、Ｒ２酵素で捕捉およびタグ付けすることができる
【０３１９】
この実験は、本開示の方法を使用した１ポット（単一の容器）での反応において、２００ｂｐのＤＮＡ断片（ｃｆＤＮＡの典型的なサイズ）が捕捉およびタグ付けされたことを示した。この実験に関するいくつかの事実：配列の予備知識は要求されず、この実験により提供されたデータは、感度要件を満たした（典型的なリキッドバイオプシー試料は、約１０〜３０ｎｇの間のＤＮＡを有し、０．１％（約１０〜３０ｐｇ）の感度が要求される）。
【０３２０】
この実験は、ＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物の熱変性および急速冷却によって調製された２００ｂｐのＰＣＲ産物）を含有する１ポット（単一の容器）での反応物が、Ｒ２酵素（Ｐ８バリアントＲ２酵素）を使用して捕捉およびタグ付けされたことを示した。簡潔に述べると、この実験は、１）ＲＮＡプライミング（概略図は図５Ａおよび５Ｂに示されている）を用いたＤＮＡ断片の捕捉；および２）ＲＮＡドナー（概略図は図６Ａおよび６Ｂに示されている）を使用したＤＮＡ断片の捕捉という２つのアプローチを含んだ。簡潔に言えば、第１のアプローチ（ＲＮＡプライミング）による反応物は、Ｈ２Ｏ、５Ｘ  Ｒ２緩衝剤、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｂｐ  ＤＮＡ断片（０ｎｇ（ＤＮＡ鋳型なしの対照（ＮＴＣ））、１６０ｐｇ、３２ｐｇ、または６ｐｇのＤＮＡ鋳型）、酵素（例えば、０．０２３μｇ／μｌのＰ８バリアントＲ２酵素）、および０．５μＭのＰ１７３を含んだ。第２のアプローチ（ＲＮＡドナー）による反応物は、Ｈ２Ｏ、５Ｘ  Ｒ２緩衝剤、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｂｐ  ＤＮＡ断片（０ｎｇ（ＤＮＡ鋳型なしの対照（ＮＴＣ））、１６０ｐｇ、３２ｐｇ、または６ｐｇ）、酵素（例えば、０．０２３μｇ／μｌのＰ８バリアントＲ２酵素）、および０．２μＭ  ＲＮＡドナー（Ｐ１７３＋Ｐ１７４）を含んだ。次いで反応物を３０℃で約１時間インキュベートした。次いで、反応物を１：１０に希釈し、増幅プライマーおよびホットスタートポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬を追加した。第１のアプローチ（ＲＮＡプライミング）のＰＣＲ増幅反応物は、Ｈ２Ｏ、１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含む１Ｘ  ｔａｑマスターミックス、０．５μＭのＰ１６９、０．５μＭのＰ１８６、および１Ｘ鋳型（ＰＣＲのための１００μｌの総体積中１０μｌのＲＴ反応物）を含んだ。第２のアプローチ（ＲＮＡドナー）のＰＣＲ増幅反応物は、Ｈ２Ｏ、１Ｘ  ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎを含む１Ｘ  Ｔａｑマスターミックス、０．５μＭのＰ１６９、０．５μＭのＰ１８６、および１Ｘ鋳型（ＰＣＲのための１００μｌ総体積中１０μｌのＲＴ反応物）を含んだ。反応物のＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、ならびに９５℃で３秒間、５４℃で１０秒間、および６４℃で１０秒間の３０サイクルであった。次いで、反応物を２分間、６８℃に上昇させた。ＰＣＲ産物の長さをアクリルアミドゲル上で確認した。結果は、ＲＮＡプライミングまたはドナーＲＮＡ機構のいずれを使用しても、ＤＮＡ断片（約２００ｂｐ）がＤＮＡ配列の予備知識なしに捕捉されたことを示した。予想されたＰＣＲ産物は約２４０ｂｐであった。これは、ＲＮＡドナーに添加したＤＮＡ鋳型のおよそのサイズである（図１８Ｂ）。図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、および１８Ｄを参照されたい。
【表１７】
2020500035.tif 000038
（実施例１１）
Ｒ２酵素を使用したＤＮＡ鋳型の検出限界
【０３２１】
この実験では、５８ｂｐのＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｐ１８８）を捕捉するためのＲＮＡドナー戦略を使用し、ＤＮＡ鋳型の検出限界を解析した。手短に言えば、反応物は、Ｈ２Ｏ、５Ｘ  Ｒ２緩衝剤、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、ＤＮＡ断片／Ｐ１８８（０μＭ、０．５μＭ、０．０５μＭ、０．００５μＭ、０．０００５μＭ、０．００００５μＭ、０．０００００５μＭ、および０．００００００５μＭ）、酵素（例えば、０．０２３μｇ／μｌのＰ８バリアントＲ２酵素）、および０．４μＭのＲＮＡとアニーリングされたＤＮＡプライマー（Ｐ１７３／Ｐ１７４）を含んだ。次いで、反応物を３０℃で約１時間、８０℃で約１０分間インキュベートした。次いで、反応物を５倍希釈に付し、増幅プライマーおよびホットスタートポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬を追加した。ＰＣＲ増幅反応物は、Ｈ２Ｏ、ＳＹＢＲＦＡＳＴマスターミックス、０．２５μＭのＰ１８８、０．２５μＭのＰ１７４、および１Ｘ鋳型（２５μｌの総体積中２．５μｌのＲＴ反応物）を含んだ。反応物のＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、ならびに９５℃で３秒間、５４℃で１０秒間、および６４℃で１０秒間の３０サイクルであった。次いで、反応物を２分間、６８℃に上昇させた。図１９は、様々な量の鋳型ＤＮＡで良好なタイトレーションが観察されたが、鋳型なしの対照（０μＭ  ＤＮＡ）は２０回のＰＣＲサイクルでクリーンなままであったことを示す。タイトレーションは、低い濃度のＤＮＡ鋳型（５００フェムトモル濃度と同程度に低い濃度のＤＮＡ）について観察された。この実験は、高いＤＮＡ鋳型濃度において阻害効果があり得ることも示している。
【表１８】
2020500035.tif 000039
（実施例１２）
リキッドバイオプシーの適用のための感度ドライバー
【０３２２】
この実験は、ＤＮＡタイトレーションおよび最大０．３ｐｇのＤＮＡの感度を示す。０μｇ、０．３μｇ、３０ｎｇ、３ｎｇ、０．３ｎｇ、３０ｐｇ、３ｐｇ、または０．３ｐｇのＤＮＡ鋳型濃度を用い（図２０を参照されたい）、これまでに上記の実施例（例えば実施例１１）に記載したものと同様のプロトコールに従った。現在、次世代配列決定試料調製技術でこの感度能力を保持するものはない。この実験は、任意の現在利用できる方法よりも１００〜１０００倍高い感度を示す。データは、０．３ｐｇよりも数桁低いＤＮＡでの適用可能性を示す。
（実施例１３）
鋳型コンカテマー化
【０３２３】
この実験は、短いＤＮＡ断片をコンカテマーへと変換するための方法を明示するために設計した。コンカテマーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、またはそれよりも多いコピーの出発核酸を含有し得る。ワークフローの概略図を図２４Ａに示す。簡潔に述べると、鋳型調製のための最初のＰＣＲのプロトコールは、Ｈ２Ｏ、２Ｘ  Ｑ５マスターミックス、Ｐ３１６（０．５μＭ）、Ｐ３１７（０．５μＭ）、およびｐＵＣ１８（０．０５ｎｇ／μＬ）を含んだ。ＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒間、続いて９８℃で１０秒間、６６℃で１５秒間、および７２℃で１０秒間の３０サイクルであった。３０サイクルの終了時、反応物を２分間７２℃に保ち、次いで４℃に低下させた。アダプターアニーリング反応物は、Ｈ２Ｏ、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０（２０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、および２種のプライマー（各２５μＭ、（Ｐ３１２＋Ｐ３１３）または（Ｐ３１４＋Ｐ３１５）または（Ｐ３２０＋Ｐ３２１））を含んだ。反応物を９０℃で１分間インキュベートし、続いて２５℃に０．１℃／秒でランピングし（２０秒間）、次いで低下させて４℃に保った。第１のアダプターライゲーション反応物は、Ｈ２Ｏ（３０μＬ）、断片化されたＤＮＡ（２０μＬ）、末端修復およびＴテール付加緩衝剤（７μＬ）、ならびに末端修復およびＴテール付加酵素ミックス（３μＬ）を含んだ。反応物を２０℃で３０分間インキュベートし、次いで３０分間、６５℃に上昇させた。次いで、反応物（５０μＬ）に、２．５μＬの２０μＭアダプター（Ｐ３１２＋Ｐ３１３）、２．５μＬの２０μＭアダプター（Ｐ３１４＋Ｐ３１５）、ライゲーション緩衝剤（３０μＬ）、およびＤＮＡリガーゼ（１０μＬ）と一緒にＨ２Ｏ（５μＬ）を添加した。次いで反応物を室温で１５分間インキュベートし、続いて反応物のクリーンアップを行った。ＳＰＲＩビーズを添加し、反応物を溶出させた。アダプターライゲーションライブラリー（１０μＬ）をＨ２Ｏ（４０μＬ）および２Ｘ  Ｋａｐｐａ  ＨｉＦｉマスターミックス（５０μＬ）と共にインキュベートし、ＰＣＲ（９８℃で４５秒間；９８℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の５サイクル；７２℃で１分間；ならびに４℃で保持）に付した。このプロトコールは、サイクルの数を（例えば５サイクルから２５サイクルに）増加させるために改変することができる。第２のアダプターライゲーション反応は、第１のアダプターライゲーション反応について記載したものと同様のプロトコールを含む。差は、２．５μＬの２０μＭアダプター（Ｐ３１２＋Ｐ３１３）および２．５μＬの２０μＭアダプター（Ｐ３１４＋Ｐ３１５）の代わりに５μＬの２０μＭアダプター（Ｐ３２０＋Ｐ３２１）を使用したことである。図２４Ｂのゲルは、断片化されたＤＮＡ配列にアダプターが首尾よくライゲーションされたことを示し、鋳型コンカテマー化を示す。
【表１９−１】
2020500035.tif 000040
【表１９−２】
2020500035.tif 000041
（実施例１４）
３’−リン酸、２’−リン酸、および２’，３’−環状リン酸の除去後の改善された変換効率（ＲＮＡ試料から次世代シーケンス（ＮＧＳ）ライブラリー）。
【０３２４】
提唱または明示されている本開示の技術の一部は、ＲＮＡ試料の３’末端における遊離３’−ヒドロキシルを要求する。例えば、３’−ＯＨは、ポリメラーゼ（例えばポリＡポリメラーゼ）を用いるＲＮＡポリ（Ａ）テール付加のため、および／または末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いたＤＮＡポリテール付加のため、および／またはライゲーションのために要求される。内因性ＲＮＡは通常、３’−ヒドロキシルまたは２’，３’−環状リン酸もしくは３’−リン酸を含有する。３’−ヒドロキシルは、転写、ポリ（Ａ）テール合成、または酵素的切断（ＲＮａｓｅ  Ｈと同様の触媒機構を有する酵素）の産物であり得る。２’，３’−環状リン酸は、酵素的切断（ＲＮａｓｅ  Ａのような酵素）または自発的加水分解（非酵素的分子内トランスリン酸化）の産物であり得る。例えば、ＲＮＡは、分子内エステル転移反応によって切断され得る。
【０３２５】
２’，３’−環状リン酸は、自然なＲＮＡホスホジエステル結合の不安定性に起因して非常に一般的であり、自然に（無細胞ＲＮＡ分解）、または試料の処置もしくは保管の結果として生じ得る。２’，３’−環状リン酸または３’−リン酸を有するＲＮＡ試料はその後にポリテール付加またはライゲーションを行うことができないが、それは、遊離３’−ヒドロキシル基の存在が両方に要求されるからである。この理由から、２’，３’−環状リン酸または３’−リン酸を含むＲＮＡ試料を、ホスファターゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）酵素）で処置して、３’−ヒドロキシル基を生成することができる。ホスファターゼの他の例は、以下の表１３において開示される（Ｕｓｈａｔｉ  ＤａｓおよびＳｔｅｗａｒｔ  Ｓｈｕｍａｎ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＲＮＡ  ２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｅｎｄｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、４１巻、１号、３５５〜３６５頁）。
【表１３】
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【０３２６】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）酵素は、キナーゼおよびホスファターゼ両方の酵素活性を含む。したがって、Ｔ４  ＰＮＫを最適化するために、触媒的に必須のアミノ酸のうちの少なくとも１つを置換することにより、キナーゼ酵素活性を除去することができる。この結果、ホスファターゼが存在する唯一の酵素活性になる。キナーゼ活性を除去することは、例えばＡＴＰを使用したポリＡテール付加などの後続の反応に役立つ。ＡＴＰもキナーゼ基質であるためである。脱リン酸化を含む無細胞ＲＮＡ  ＮＧＳライブラリー調製プロトコールの例は、本明細書に開示されている。また、比較反応物（例えば、Ｔ４  ＰＮＫで処置されていない反応物）も本明細書に開示されている。結果は、ＮＧＳライブラリーにおいて捕捉されたＲＮＡ粒子の数の著しい３〜５倍の増加を示した（図２６のバイオアナライザートレースデータを参照されたい）。
【０３２７】
さらなる潜在的な利益：ＲＮＡ粒子を生成するために使用されるプロセスの種類に依存するＲＮＡ粒子の３’末端のユニークな特性により、配列決定ライブラリーに注目し、かつ／またはこれを操作することが可能になる。例えば、プロセス劣化に起因して生成されたＲＮＡ断片（例えば、２’，３’−環状リン酸を有する不完全なＲＮＡ断片）の配列決定が望まれない場合、試料をＴ４  ＰＮＫで処置することを避けることができる。このようにして、ライブラリーは、完全なｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ（３’−ヒドロキシル）を含むことになる。
（実施例１５）
ＲＮＡ試料の断片化は、ＮＧＳライブラリー調製ワークフローの一部である；酵素的および非酵素的方法（ｉｌｌｕｍｉｎａおよびｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔのようなリードの短い技術に関連する）。
【０３２８】
ｉｌｌｕｍｉｎａまたはｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔなどの主要なＤＮＡ配列決定技術は、配列決定リード長については限定されている（つまり、各個別のリードにおいて、限定された数の塩基が配列決定され得る）。両方の技術が最大約１００ｂｐ〜５００ｂｐのリード範囲を有するため、この範囲を著しく超えるライブラリーを使用することは非実用的である。無細胞ＲＮＡは通常約２０〜２０００塩基の範囲であり、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＲＮＡは約２０〜５００塩基の範囲であり、ｍＲＮＡは通常約２０００塩基である。実用的理由から、試料は断片化されるのが普通であるため、有効なライブラリーサイズは４００ｂｐ以下である。１０００ｂｐより長いライブラリー断片がロードされた試料は、より短い断片と比較して非常に非効率的である。本明細書では、酵素的と非酵素的との２種の大まかなＲＮＡ試料断片化方法を開示する。酵素的方法では、ＲＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、ＲＮａｓｅ  Ｕ２、ＲＮａｓｅ  Ｖ１、ＲＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  Ｌ、ＲＮａｓｅ  ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ  Ｖ、ダイサー、またはアルゴノート）を使用することができる。本明細書に開示されている非酵素的方法では、ＲＮＡの自然な化学的不安定性を利用する。ＲＮＡは、内部のトランスリン酸化の結果として自発的な非酵素的断片化を起こす場合がある。ＲＮＡのホスホジエステル結合の破壊は、様々な条件（例えば、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｐｂなどの金属、またはポリアミン、またはＰＶＰもしくはＰＥＧなどの補因子）によってもたらされる場合がある。トランスリン酸化速度の増加は、例えば、高いｐＨでまたは高い（より高い）温度で達成され得る。非酵素的加水分解は、優先的にはＵＡまたはＣＡの塩基間で、ＲＮＡ粒子の一本鎖部分で優先的に起こる。非酵素的方法を使用することの利点としては、単純性および信頼性（酵素活性または有効期間と無関係）、および後続ステップの大部分と適合する条件下で反応を実行することができるという事実が挙げられる。以下の表１６は、断片化プロトコールおよび非断片化プロトコールの両方のワークフローを示す。図２６は、断片化プロトコール（ライン１によって表されている）および非断片化プロトコール（ライン２によって表されている）に関するバイオアナライザートレースデータを示す。ライブラリーは、無細胞ＲＮＡ試料を使用して調製した。
【表１６−１】
2020500035.tif 000043
【表１６−２】
2020500035.tif 000044
【０３２９】
手短に言えば、非断片化プロトコールは、６．５μＬのＨ２Ｏ、２μＬの１０Ｘ  Ｔ４  ＰＮＫ緩衝剤、０．５μＬの１０Ｘ  ＲＮａｓｅ阻害剤、１μＬの１０Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＰＮＫ酵素、および１０μＬ試料（例えば、無細胞ＲＮＡ試料）を含んだ。反応物を３７℃で２０分間、７０℃で４分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。次いで、反応物に、３．２５μＬのＨ２Ｏ、１０μＬの５Ｘ  ２Ｄ  ＰＮＫ緩衝剤、１．２５μＬの１０Ｘ  ＲＮａｓｅ阻害剤、７．５μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ、および１．２５μＬの５Ｕ／μＬ  Ｅｃｏｌｉ  ＰｏｌｙＡ  Ｐｏｌを添加した。反応物を１６℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。次いで、反応物に、０．５μＬの１００Ｘ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ  Ｐ３３４プライマー、０．２５μＬの１００μＭ  Ｐ４２３  ＤＮＡ  ｔｅｒ  ａｃｃを添加した。反応物を７０℃で２分間インキュベートし、次いで氷上に２分間置いた。反応物に、１．２５μＬの１０Ｘ  ＲＮａｓｅ阻害剤、３．７５μＬのＰ２（例えば、１μｇ／μＬのＲ２バリアント（例えば、配列番号５０などのＲ２  ＲＴ  Ｎトランケーション））を添加した（合計５０μＬの反応物とした）。反応物を３４℃で１時間インキュベートし、プルダウンし、ｓｐｒｉ  １．６ｘ、次いで５０μＬ中で溶出させた。図２６、ライン２を参照されたい。一部の事例では、逆転写酵素もしくは改変された逆転写酵素、または逆転写酵素と同様の機能を有する酵素をＰ２の代わりに使用してよい。
【０３３０】
手短に言えば、断片化プロトコールは、１μＬの１０Ｘ緩衝剤Ａおよび９μＬの試料（例えば、無細胞ＲＮＡ試料）を含んだ。反応物を９４℃で４分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。反応物に、１４．７５μＬのＨ２Ｏ、３μＬの１０Ｘ緩衝剤Ｂ、０．７５μＬの１０Ｘ  ＲＮａｓｅ阻害剤、および１．５μＬの１０Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＰＮＫ酵素を添加した。反応物を３７℃で３０分間、７２℃で３分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。次いで、反応物に、５μＬの１０Ｘ緩衝剤Ｃ、１．２５μＬの１０Ｘ  ＲＮａｓｅ阻害剤、７．５μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ、および１．２５μＬの５Ｕ／μＬ  Ｅｃｏｌｉ  ＰｏｌｙＡ  Ｐｏｌを添加した。反応物を１６℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。次いで、反応物に、０．５μＬの１００Ｘ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ  Ｐ３３４プライマー、０．２５μＬの１００μＭ  Ｐ４２３  ＤＮＡ  ｔｅｒ  ａｃｃを添加した。反応物を７０℃で２分間インキュベートし、次いで氷上に２分間置いた。反応物に、１．２５μＬの１０Ｘ  ＲＮａｓｅ阻害剤および３．７５μＬのＰ２（例えば、１μｇ／μＬのＲ２バリアント（例えば、配列番号５０などのＲ２  ＲＴ  Ｎトランケーション））を添加した（合計５０μＬの反応物とした）。反応物を３４℃で１時間インキュベートし、プルダウンし、ｓｐｒｉ  １．６ｘ、次いで５０μＬ中で溶出させた。図２６、ライン１を参照されたい。一部の事例では、逆転写酵素もしくは改変された逆転写酵素、または逆転写酵素と同様の機能を有する酵素をＰ２の代わりに使用してよい。
【０３３１】
手短に言えば、５Ｘ  ２Ｄ  ＰＮＫ緩衝剤は、６４５μＬのＨ２Ｏ、１０μＬの１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３００μＬの５０００ｍＭ  ＮａＣｌ２、５μＬの１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μＬの１０％  ｔｗｅｅｎ、および１５μＬの１０００ｍＭ  ＤＴＴを含んだ。緩衝剤Ａストックは、６０μＬのＨ２Ｏ、１０μＬの１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、および３０μＬの１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。緩衝剤Ｂストックは、４５μＬのＨ２Ｏ、５０μＬの１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、および５μＬの１０００ｍＭ  ＤＴＴを含んだ。緩衝剤Ｃストックは、３６μＬのＨ２Ｏ、６０μＬの５０００ｍＭ  ＮａＣｌ２、２．５μＬの１０％  ｔｗｅｅｎ、および１．５μＬの１０００ｍＭ  ＤＴＴを含んだ。１０Ｘ  ＰＮＫ緩衝剤は、１５０μＬのＨ２Ｏ、７００μＬの１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００μＬのＭｇＣｌ２、および５０μＬの１０００ｍＭ  ＤＴＴを含んだ。１００Ｘ平衡ｄＮＴＰは、１００μＬのＨ２Ｏ、７５μＬの１００ｍＭ  ｄＡＴＰ、７５μＬの１００ｍＭのｄＴＴＰ、３７５μＬの１００ｍＭ  ｄＧＴＰ、および３７５μＬの１００ｍＭ  ｄＣＴＰを含んだ。５Ｘ  Ｒ２緩衝剤＋ｄＮＴＰは、４３０μＬのＨ２Ｏ、１５０μＬの１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３００μＬの５０００ｍＭ  ＮａＣｌ２、２５μＬの１０００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μＬの１０％  ｔｗｅｅｎ、２５μＬの１０００ｍＭ  ＤＴＴ、３．７５μＬの１００ｍＭ  ｄＡＴＰ、３．７５μＬの１００ｍＭのｄＴＴＰ、１８．７５μＬの１００ｍＭ  ｄＧＴＰ、および１８．７５μＬの１００ｍＭ  ｄＣＴＰを含んだ。ストレプトアビジン磁気ビーズは、ビオチン化されたオリゴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／３ＢｉｏＴＥＧ／で飽和した１６０μＬのストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ）を含んだ；ビーズは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ２に再懸濁した。使用したプライマー配列は：
【化７】
2020500035.tif 000045
であった。
（実施例１６）
頑強なＲ２  ＲＴジャンピング機構。
【０３３２】
Ｒ２  ＲＴジャンピングは非常に効率的な機構である。これは、鋳型スイッチング機構（例えば、ＭＭＬＶを使用する方法）と比較して、アクセプター−アダプター配列に対する感度がはるかに低い。この低い感度により、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定における配列決定アダプターの最適な利用が可能になる。この実験では、種々のアクセプターを試験した。結果は、ＲＮＡアクセプターとＤＮＡアクセプターとの間で同様の効率を示した。ＤＮＡアクセプターの使用により、より安価でより信頼でき、かつ／または安定な技術が可能になる。結果は、変換効率が、アクセプター配列の３’末端の影響を受けなかったことも示した。したがって、この機構により、アクセプター配列に関する柔軟性が可能になり、これは、ＲＮＡ試料およびＤＮＡ試料の両方に関連する。使用したアクセプターの例：
【化８】
2020500035.tif 000046
【化９】
2020500035.tif 000047
（実施例１７）
ポリＡテールの長さの制御、伸長不可能なヌクレオチドを用いる方法。
【０３３３】
ポリＡポリメラーゼは、ＲＮＡの３’末端にポリＡテールを生成するために頻繁に使用されているＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母由来のポリＡポリメラーゼ）である。ポリＡポリメラーゼは、ＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型を用いずにＲＮＡ鎖の生成（すなわち、ＲＮＡの３’末端の伸長）を可能にする酵素活性を有する。ポリＡポリメラーゼは、好ましくはポリＡテールを合成するが、ポリＡポリメラーゼは、他のリボヌクレオチド（例えば、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）との活性も有する。ポリＡテールの長さを制御することは、配列決定の質および収率にとって重要である。典型的に、ポリＡテールの長さを制御するためには、ＡＴＰ濃度ならびに反応時間および／または温度が使用される。ブロッキング（伸長不可能）ヌクレオチド（例えば、３’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰアナログ））の使用などの代替的方法を使用してよい。ブロッキングヌクレオチドの３’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸がＲＮＡ鎖アナログに組み込まれたら、３’ヒドロキシル基の欠如が理由で、これはさらに伸長することができない。様々な濃度のＡＴＰおよび３’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸を使用した。ポリＡテールの長さは、ＡＴＰおよび３’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸の濃度／比に基づいて制御され得ることが見出され、これは反応時間および／または酵素濃度とは無関係であった。この方法は、高スループットプロセスまたは自動化されたプロセスに適用した場合、重要なプロトコールの利点を提供する。
（実施例１８）
ｃｆＤＮＡライブラリーを生成する方法
【０３３４】
本明細書には、ｃｆＤＮＡライブラリーを生成する２つの方法を記載する。両方の方法を説明するのに役立つよう、プロトコールを２種の大まかなステップに分割した。第１のステップでは、Ｒ２酵素（２Ｄ  ＧｅｎｏｍｉｃｓのＲ２酵素および派生物）およびアクセサリー酵素を使用した。このステップの産物には、既知の配列を有する付着されたアダプターに挟まれた１本の元の試料鎖などの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が含まれる。このｄｓＤＮＡ粒子は、１本の元の試料鎖と、Ｒ２およびアクセサリー酵素によってコピーされるものとを含む。コピー鎖は、例えばウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素で処置すると分解され得るｄＵＴＰなどの分解性ヌクレオチドを含む。コピー鎖を除去する代替的方法としては、プライマー−アダプター配列内にｄＵＴＰを有すること、または非対称性アダプターを使用することが挙げられる。第２のステップでは、高忠実度の方法／酵素（例えば、プルーフリード活性を有する酵素）を使用して、アダプターが付着された元のＤＮＡ鎖をＰＣＲ増幅する。配列決定のために元の鎖を保持することの少なくとも１つの利点は、Ｒ２酵素などのエラーを補正しない酵素を使用してそれをコピーしながらエラーを導入することが避けられることである。よって、結果として得られるライブラリーの忠実度が損なわれない。
【０３３５】
方法１（図２７を参照されたい）：まず、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を変性して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）試料を産生する。これにより、ライゲーションベースの方法（両方の鎖が１つの最終産物に含まれる）と比較して、各鎖を別々に解析することが可能になる。各鎖を別々に解析することで、稀な突然変異を捕捉する機会がより多く生じる。プロトコールは、脱リン酸化ステップを含んでもよい（３’および５’末端）。次に、ＤＮＡまたはＲＮＡアダプターとアニーリングされたプライマーおよびＲ２ポリメラーゼを含むプライミング−ジャンピング複合体とｓｓＤＮＡを混合する。反応物は、ｄＮＴＰおよび触媒金属を含む。手短に言えば、Ｒ２はまずアダプター鋳型上のプライマーを伸長させ、次いでｓｓＤＮＡ試料へと鋳型ジャンプする。生成される産物は、アダプター鋳型とｓｓＤＮＡ試料との間に１個のニックを有するｄｓＤＮＡである。次のステップは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４  ｐｏｌ、Ｋｌｅｎｏｖ断片、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌ）を用いた末端修復である。ポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖置き換え能力を保有していてもよい。結果として得られる産物は、平滑末端または３’Ａ−オーバーハングを有するｄｓＤＮＡである。ニックは、全く新しい鎖に置き換えられる場合があり、ここで、伸長および置き換えは、元の試料鎖の３’ヒドロキシルによってプライミングされる。その一方で、ニックは、次のステップのライゲーション中に修復され得る。次のステップのライゲーションは、非対称性アダプターを含む。アダプターは、５’末端に１つの一本鎖オーバーハングを有するＤＮＡ二重鎖である。このオーバーハングは、ＰＣＲ増幅プライマーのうちの少なくとも１つに対して相補的な配列を含み、１本の鎖のみを増幅させる。あるいは、元のｓｓＤＮＡ鎖のみを単離させるために、３’オーバーハングおよび５’オーバーハングの両方を有するアダプター（Ｙ構造）をｄＵＴＰおよびＵＤＧ分解と組み合わせて使用してよい。次いで、ＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ増幅は、両方のアダプターに対して特異的なＤＮＡプライマーを含む。先行ステップの鎖のうちの１つ、元の試料ＤＮＡを含むものだけが増幅される。一部の実施形態では、元のｓｓＤＮＡ鎖の単離は、末端修復ステップと非対称性アダプターライゲーションステップとの間に起こる。
【０３３６】
方法２（図２８を参照されたい）：まず、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を変性して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）試料を産生する。プロトコールは、脱リン酸化ステップを含んでもよい（３’および５’末端）。次に、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の添加により、ポリＡまたはポリＣテールを生成する。ＴｄＴによって生成されるテールの長さは、ｄＡＴＰおよびインキュベーション時間または温度（ポリＡテール付加が選択された場合）の組合せに基づいて制御することができる。あるいは、ポリＡテールの長さは、伸長不可能なヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰまたは３’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸）に基づいて制御されてよい。ここで、反応物は、様々な比および濃度で使用されたｄＡＴＰおよび伸長不可能なアナログの両方を含む。次に、ＴｄＴを温度で死滅させることができ、ＤＮＡテール配列と相補的なプライマー−アダプターに試料をアニーリングすることができる。次いで、反応物をｄＮＴＰ（ｄＵＴＰを含む）、触媒金属、Ｒ２酵素、およびアクセプター−アダプターと混合する。Ｒ２酵素は、アニーリングされたプライマーを伸長させ、アクセプター−アダプターにジャンプして伸長を続ける。アクセプター−アダプターは、Ｒ２が鋳型を完了して別の鋳型にジャンプすることを防止するためのヌクレオチドブロックを含む。産物は、両側に５’オーバーハング、ｃｆＤＮＡ試料鎖とアクセプター−アダプターとの間にニックを有する二本鎖ＤＮＡである。次いで産物を、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ｐｏｌ、Ｋｌｅｎｏｖ断片、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）での末端修復およびニックライゲーションに供する。次いで、末端修復およびニックライゲーションの産物をＵＤＧ分解に供する。最後のステップは、両方のアダプターに対して特異的なＤＮＡプライマーを含むＰＣＲ増幅である。先行ステップの鎖のうちの１つ、元の試料ＤＮＡを含むものだけが増幅される。
（実施例１９）
ライブラリー調製、配列決定スループットを最大にするためのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の枯渇
【０３３７】
細胞中の全ＲＮＡのおよそ８０％がｒＲＮＡであり、１５％がｔＲＮＡである。リボソームＲＮＡが診断上の標的として機能することは稀である。したがって、これが理由で、配列決定ライブラリーからｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを除去／枯渇させることが慣例である。配列決定ライブラリー中のｒＲＮＡおよびｔＲＮＡの量は、ライブラリー調製の様々な段階で制御することができる。例えば、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡの枯渇は、早期段階の間、例えば、全ＲＮＡ単離の後（ＲＮＡレベル）、またはＰＣＲ増幅の後（ｄｓＤＮＡレベル）に行ってよい。本明細書には、１）磁気ビーズまたは固体支持体に付着された相補的オリゴヌクレオチドを使用したｒＲＮＡ／ｔＲＮＡまたはＰＣＲ産物の引き出し；および２）ｒＲＮＡ／ｔＲＮＡまたはＰＣＲ産物のオリゴヌクレオチドガイド型分解という、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを除去するための２つの大まかな方法を記載する。
【０３３８】
方法１：この方法では、増幅されたｄｓＤＮＡを変性し、戦略的に設計されたオリゴヌクレオチドのプールとハイブリダイズさせる。オリゴヌクレオチドは、ｒＤＮＡ配列を有する一方または両方のＤＮＡ鎖に対して相補的である。ブリッジ増幅では１種の極性のみが使用されるため、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーでは、１つの鎖のみが枯渇され得る（図２９を参照されたい）。各オリゴヌクレオチドは、ビオチン修飾を含む。リボソーム配列（ＤＮＡ断片を含む）は、ストレプトアビジン（ｓｔｒａｐｔｖｉｄｉｎ）固定化磁気ビーズまたは固体支持体を使用して枯渇／除去される。一部の場合では、稀で出現が少ない（ｌｏｗ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）配列の損失を軽減するために、ＰＣＲライブラリー増幅の後に枯渇を行う。枯渇は、ライブラリー調製の早期段階（例えば、ＲＮＡレベル）の間に行われてもよい。
【０３３９】
方法２：この方法では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、戦略的に設計されたガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドと複合する（Ｃａｒｏｌｉｎ  ＡｎｄｅｒｓおよびＭａｒｔｉｎ  Ｊｉｎｅｋ、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０１４年；５４６巻：１〜２０頁）。オリゴヌクレオチドは、リボソームＲＮＡに対して相補的な配列を有し得る。Ｃａｓ９とガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドの複合体は、ｄｓＤＮＡ（ＰＣＲ増幅後）およびｒＲＮＡ配列を特異的に結合し、単一または両方のＤＮＡ鎖のヌクレオチド鎖切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｉｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を触媒する（図３０を参照されたい）。
実施形態
【０３４０】
実施形態１．鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法であって、プライマーを鋳型にアニーリングするステップと、鋳型およびアクセプター核酸分子に相補的な連続したｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、プライマーにアニーリングされた鋳型を改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含み、連続したｃＤＮＡ分子の産生後に、改変された逆転写酵素が、鋳型からアクセプター核酸分子への移動を起こす、ステップとを含む方法。
【０３４１】
実施形態２．鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法であって、（ａ）１種または複数のプライマーを鋳型にアニーリングするステップと、（ｂ）鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、１種または複数のプライマーにアニーリングされた鋳型を改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップとを含む方法。
【０３４２】
実施形態３．鋳型ジャンピングを使用して核酸分子を調製するための方法であって、核酸分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、断片または分解された鋳型、プライマー、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップを含む方法。
【０３４３】
実施形態４．鋳型ジャンピングを使用して核酸分子を調製するための方法であって、核酸分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、断片または分解された鋳型、ドナー複合体、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップを含む方法。
【０３４４】
実施形態５．鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）１種または複数のプライマーを鋳型にアニーリングするステップと、（ｂ）鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的な連続したｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、１種または複数のプライマーにアニーリングされた鋳型をアクセプター核酸分子および改変された逆転写酵素と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含み、連続したｃＤＮＡ分子の産生後に、改変された逆転写酵素が、鋳型からアクセプター核酸分子への移動を起こす、ステップと、（ｃ）ｃＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３４５】
実施形態６．鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）ｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、断片化されたまたは分解された鋳型をプライマー、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｂ）ｃＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３４６】
実施形態７．鋳型ジャンピングを使用してデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）ＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、断片化されたまたは分解された鋳型をプライマー、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｂ）ＤＮＡ分子を増幅して、ＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３４７】
実施形態８．鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）ｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、断片化されたまたは分解された鋳型をドナー複合体、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｂ）ｃＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３４８】
実施形態９．鋳型ジャンピングを使用してデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）ＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、断片化されたまたは分解された鋳型をドナー複合体、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｂ）ＤＮＡ分子を増幅して、ＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３４９】
実施形態１０．配列決定のためのライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）対象から無細胞核酸を有する試料を得るステップと、（ｂ）改変された逆転写酵素、鋳型、ヌクレオチド、アクセプター核酸分子および１種または複数のプライマーを無細胞核酸に混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、鋳型ジャンピングすることが可能であり、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｃ）試料に由来する無細胞核酸（ｃｆ核酸）において増幅反応を実行して、複数のアンプリコンを産生するステップであって、増幅反応が、３５回またはそれよりも少ない増幅サイクルを含む、ステップと、（ｄ）配列決定のためのライブラリーを産生するステップであって、ライブラリーが、複数のアンプリコンを含む、ステップとを含む方法。
【０３５０】
実施形態１１．複数の単一細胞から相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）各単一細胞から核酸を放出させて、複数の個々の核酸試料を提供するステップであって、個々の核酸試料のそれぞれにおける核酸が、単一細胞に由来する、ステップと、（ｂ）核酸鋳型を１種または複数のプライマーにアニーリングするステップと、（ｃ）ｃＤＮＡ分子の産生に有効な条件下、ヌクレオチドの存在下で、１種または複数のプライマーにアニーリングされた核酸鋳型をアクセプター核酸分子および改変された逆転写酵素と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、鋳型ジャンピングすることが可能であり、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｄ）ｃＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３５１】
実施形態１２．複数の単一細胞からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）各単一細胞から核酸を放出させて、複数の個々の核酸試料を提供するステップであって、個々の核酸試料のそれぞれにおける核酸が、単一細胞に由来する、ステップと、（ｂ）核酸鋳型を１種または複数のプライマーにアニーリングするステップと、（ｃ）ＤＮＡ分子の産生に有効な条件下、ヌクレオチドの存在下で、１種または複数のプライマーにアニーリングされた核酸鋳型をアクセプター核酸分子および改変された逆転写酵素と混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、鋳型ジャンピングすることが可能であり、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｄ）ＤＮＡ分子を増幅して、ＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３５２】
実施形態１３．核酸分子を検出するための方法であって、（ａ）核酸分子の生成に有効な条件下、核酸分子を含む試料を、アクセプター核酸分子、改変された逆転写酵素、プライマーおよびヌクレオチドと混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、（ｂ）核酸分子を増幅するステップとを含む方法。
【０３５３】
実施形態１４．対象におけるがんの存在を決定するための方法であって、（ａ）対象から生体試料を得るステップと、（ｂ）実施形態１３に記載の生体試料における核酸分子を検出するステップと、（ｃ）核酸分子を配列決定するステップと、（ｄ）核酸分子の存在に基づき、対象ががんを患っていることを決定するステップとを含む方法。
【０３５４】
実施形態１５．鋳型ジャンピングを使用して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法であって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鋳型およびアクセプター核酸分子に相補的な連続したｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、単一の管内で、プライマーまたは１種もしくは複数のプライマー、ｍＲＮＡ鋳型、ヌクレオチド、改変された逆転写酵素、アクセプター核酸分子および触媒金属を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含み、連続したｃＤＮＡ分子の産生後に、改変された逆転写酵素が、鋳型からアクセプター核酸分子への移動を起こす、ステップを含む方法。
【０３５５】
実施形態１６．配列決定のためのライブラリーを調製するための方法であって、ライブラリーの生成に十分な条件下、単一の管内で、無細胞核酸、改変された逆転写酵素、鋳型、ヌクレオチド、アクセプター核酸分子、触媒金属および１種または複数のプライマーを混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップを含む方法。
【０３５６】
実施形態１７．配列決定のためのライブラリーの生成に十分な条件下でライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）対象から無細胞核酸を有する試料を得るステップと、（ｂ）改変された逆転写酵素、鋳型、ヌクレオチドおよび１種または複数のプライマーを無細胞核酸に混合するステップと、（ｃ）試料に由来する無細胞核酸（ｃｆ核酸）において増幅反応を実行して、複数のアンプリコンを産生するステップであって、増幅反応が、３５回またはそれよりも少ない増幅サイクルを含む、ステップと、（ｄ）配列決定のためのライブラリーを産生するステップであって、ライブラリーが、複数のアンプリコンを含む、ステップとを含む方法。
【０３５７】
実施形態１８．ｃＤＮＡ分子を調製するための方法であって、鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、プライマー、鋳型、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップを含む方法。
【０３５８】
実施形態１９．ｃＤＮＡ分子を調製するための方法であって、鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、１種または複数のプライマー、鋳型、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップを含む方法。
【０３５９】
実施形態２０．ｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法であって、鋳型および／またはアクセプター核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子の生成に十分な条件下、ヌクレオチドの存在下で、プライマーまたは１種もしくは複数のプライマー、鋳型、改変された逆転写酵素およびアクセプター核酸分子を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップと、ｃＤＮＡ分子を増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法。
【０３６０】
実施形態２１．核酸分子（例えば、アクセプター核酸分子または無細胞核酸分子）または鋳型が、未知の核酸配列を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６１】
実施形態２２．移動が、鋳型およびアクセプター核酸分子の間の配列同一性に依存しない、実施形態１、５および１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３６２】
実施形態２３．混合するステップが、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの添加を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６３】
実施形態２４．ホットスタート熱安定性ポリメラーゼが、ホットスタートｔａｑポリメラーゼである、実施形態２３に記載の方法。
【０３６４】
実施形態２５．単一の管（単一の容器）内で行われる、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６５】
実施形態２６．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を行うステップをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６６】
実施形態２７．ＰＣＲ増幅反応が、実施形態２５に記載の単一の管（単一の容器）と同じ単一の管（同じ容器）内で行われる、実施形態２６に記載の方法。
【０３６７】
実施形態２８．アクセプター核酸分子が、プライマー伸長を停止させる改変されたヌクレオチドを含む、実施形態１〜１６および１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６８】
実施形態２９．無細胞核酸が、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）またはホルマリン固定パラフィン包埋ＤＮＡ（ＦＦＰＥ  ＤＮＡ）である、実施形態１０、１６および１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３６９】
実施形態３０．ＰＣＲ増幅が、逆転写酵素の不活性化に十分な温度で行われる、実施形態２６に記載の方法。
【０３７０】
実施形態３１．ＰＣＲ増幅が、ホットスタート熱安定性ポリメラーゼの活性化に十分な温度で行われる、実施形態２６に記載の方法。
【０３７１】
実施形態３２．アクセプター核酸分子が、３’末端において改変されている、実施形態１〜１６および１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３７２】
実施形態３３．改変が、ジデオキシ３’末端および／またはリン酸化３’末端を含む、実施形態３２に記載の方法。
【０３７３】
実施形態３４．分子および／またはライブラリーが、多くとも約２時間で調製される、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の核酸分子および／またはライブラリー、または相補ｃＤＮＡ分子および／またはライブラリーを調製するための方法。
【０３７４】
実施形態３５．試料が、循環腫瘍ＤＮＡ試料または組織試料を含む、実施形態１０〜１４および１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３７５】
実施形態３６．核酸分子および／またはアクセプター核酸分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３７６】
実施形態３７．鋳型が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである、実施形態１〜１２および１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３７７】
実施形態３８．ドナー複合体が、鋳型およびプライマーを含む、実施形態４、８および９のいずれか１つに記載の方法。
【０３７８】
実施形態３９．鋳型が、断片化されたまたは分解された鋳型である、実施形態３７に記載の方法。
【０３７９】
実施形態４０．ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、実施形態３６および３７のいずれか１つに記載の方法。
【０３８０】
実施形態４１．リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を枯渇させるステップをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
実施形態４２．ｒＲＮＡを枯渇させるステップが、ｒＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む、実施形態４１に記載の方法。
【０３８２】
実施形態４３．核酸および／または鋳型が、試料に由来する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８３】
実施形態４４．試料が、リキッドバイオプシー試料である、実施形態１０〜１４、１７および４３のいずれか１つに記載の方法。
【０３８４】
実施形態４５．核酸および／または鋳型が、約０．０１マイクロモル濃度に等しいまたはそれに満たない、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８５】
実施形態４６．核酸および／または鋳型が、約５００フェムトモル濃度に等しいまたはそれに満たない、実施形態４５に記載の方法。
【０３８６】
実施形態４７．核酸および／または鋳型が、断片もしくは分解された核酸、断片化されたＤＮＡ、断片化されたＲＮＡ、またはこれらのいずれかの組合せである、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８７】
実施形態４８．核酸分子が、疾患を示す、実施形態１３に記載の方法。
【０３８８】
実施形態４９．疾患が、がんである、実施形態４８に記載の方法。
【０３８９】
実施形態５０．核酸分子の存在または非存在に基づく出生前診断を提供するステップをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９０】
実施形態５１．鋳型の最適化をさらに含む方法であって、最適化が、薬剤によるキャップ構造の除去を可能にする条件下、鋳型の５’キャップ構造を除去する薬剤と、鋳型を含む試料とを接触させ、これにより、キャップ除去された鋳型を形成するステップを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９１】
実施形態５２．薬剤によるキャップ除去された鋳型の脱リン酸化を可能にする条件下、脱リン酸化剤と試料とを接触させるステップをさらに含む、実施形態５１に記載の方法。
【０３９２】
実施形態５３．薬剤が、ピロホスファターゼである、実施形態５１に記載の方法。
【０３９３】
実施形態５４．薬剤が、アルカリホスファターゼである、実施形態５２に記載の方法。
【０３９４】
実施形態５５．プライマーが、蛍光標識されている、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９５】
実施形態５６．逆転写酵素が、非末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンである（例えば、改変された逆転写酵素が、非末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンである）、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９６】
実施形態５７．逆転写酵素が、Ｒ２逆転写酵素である（例えば、改変された逆転写酵素が、改変されたＲ２逆転写酵素である）、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９７】
実施形態５８．非ＬＴＲレトロトランスポゾンが、Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンである、実施形態５６に記載の方法。
【０３９８】
実施形態５９．鋳型ジャンピングが、アクセプター核酸分子の濃度に依存する、実施形態１〜１２および１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３９９】
実施形態６０．改善された酵素特性が、増加された安定性（例えば、増加された熱安定性）；増加された比活性；増加されたタンパク質発現；改善された精製；改善された処理能力；改善された鎖置換；改善された端から端までの鋳型ジャンピング；増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性；および増加された忠実度のうち少なくとも１種を含む、実施形態１〜１６および１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４００】
実施形態６１．改変された逆転写酵素が、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端およびＣ末端トランケーションを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０１】
実施形態６２．改変された逆転写酵素が、約５００個未満のアミノ酸残基のトランケーションを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０２】
実施形態６３．改変された逆転写酵素が、次の改変：（ａ）約４００個未満のアミノ酸残基のアミノ末端トランケーション、および（ｂ）約４００個未満のアミノ酸残基のカルボキシル末端トランケーションのうち１種または複数を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０３】
実施形態６４．改変された逆転写酵素が、タグをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０４】
実施形態６５．ｃＤＮＡ分子が、タグをさらに含む、実施形態１、２、５、６、８、１１、１５および１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０５】
実施形態６６．鋳型が、タグをさらに含む、実施形態１〜１２および１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０６】
実施形態６７．タグを含む改変された逆転写酵素、またはタグを含むｃＤＮＡ分子、またはタグを含む鋳型を配列決定するステップをさらに含む、実施形態６４〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０４０７】
実施形態６８．配列決定するステップが、全トランスクリプトーム解析を含む、実施形態６７に記載の方法。
【０４０８】
実施形態６９．タグが、ビオチン、アジド基、アセチレン基、Ｈｉｓ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｖ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、Ｂ、ＨＰＣペプチドタグ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ビオチン、ビオチンカルボキシル担体タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシン−タグからなる群から選択される少なくとも１種のメンバーである、実施形態６４〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０４０９】
実施形態７０．連続したｃＤＮＡ分子または核酸分子またはＤＮＡ分子を含む溶液を精製するステップをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４１０】
実施形態７１．精製の非存在下で行われる、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４１１】
実施形態７２．改変された逆転写酵素が、節足動物に由来する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４１２】
実施形態７３．節足動物が、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉである、実施形態７２に記載の方法。
【０４１３】
実施形態７４．改変された逆転写酵素が、精製されている、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４１４】
実施形態７５．改変された逆転写酵素が、少なくとも約８０％純粋である、実施形態７４に記載の方法。
【０４１５】
実施形態７６．溶液を精製するステップが、２種の精製ステップを含む、実施形態７０に記載の方法。
【０４１６】
実施形態７７．２種の精製ステップが、ニッケルおよびヘパリン親和性精製を含む、実施形態７６に記載の方法。
【０４１７】
実施形態７８．改変された逆転写酵素が、固定化された金属親和性クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｒｇｒａｐｈｙ）（ＩＭＡＣ）によって精製される、実施形態７４に記載の方法。
【０４１８】
実施形態７９．塩をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４１９】
実施形態８０．塩が、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＡｌＣｌ３、ＣｕＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＩｎＣｌ３、ＳｎＣｌ４、ＣｒＣｌ２、ＣｒＣｌ３、ＫＣｌ、ＮａＩ、ＫＩ、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）、ＴＥＡＣｌ（塩化テトラエチルアンモニウム）、ＫＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ、ＫＣＨ３ＣＯＯ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｃ５Ｈ８ＫＮＯ４、Ｃ５Ｈ８ＮＮａＯ４、ＣｓＣｌおよびこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のメンバーである、実施形態７９に記載の方法。
【０４２０】
実施形態８１．塩が、ＮａＣｌを含む、実施形態８０に記載の方法。
【０４２１】
実施形態８２．洗剤をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４２２】
実施形態８３．洗剤が、非イオン性および／または双性イオン性洗剤である、実施形態８２に記載の方法。
【０４２３】
実施形態８４．非イオン性洗剤が、ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−２１、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−３２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１６、Ｔｒｉｔｏｎ  ＧＲ−ＳＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１（ポリオキシエチレン分枝状ノニルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−４４、Ｔｒｉｔｏｎ  ＲＷ−７５（ポリエチレングリコール２６０モノ（ヘキサデシル（ｍｏｎｏＣｈｅｘａｄｅｃｙｌ）／オクタデシル）エーテルおよび１−オクタデカノール）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５１、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５（ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５還元型（ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（ポリエチレングリコール４−ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−７０５−７０、次のものを含むいずれかの形態のＴＷＥＥＮ：ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＴＷＥＥＮ  ２１（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＴＷＥＥＮ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ＴＷＥＥＮ  ６０（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート）、ＴＷＥＥＮ  ６１（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート）、ＴＷＥＥＮ  ６５（ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート）、ＴＷＥＥＮ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＴＷＥＥＮ  ８１（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＴＷＥＥＮ  ８５（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート）、Ｂｒｉｊ、Ｂｒｉｊ  ３０（ポリオキシエチレン４ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ５２（ポリオキシエチレン２セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ５６（ポリオキシエチレン１０セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ５８（ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７２（ポリオキシエチレン２ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７６（ポリオキシエチレン１０ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７８（ポリオキシエチレン２０ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ９２（ポリオキシエチレン２オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ９７（ポリオキシエチレン１０オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ９８（ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ７００（ポリオキシエチレン１００ステアリルエーテル）、オクチルチオグルコシド、マルトシドおよびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態８３に記載の方法。
【０４２４】
実施形態８５．塩または洗剤が、酵素活性または鋳型ジャンピングを改善する、実施形態７９〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０４２５】
実施形態８６．増幅ステップが、ＰＣＲを含む、実施形態５〜１３、１７および２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４２６】
実施形態８７．ＰＣＲが、少なくとも１種の増幅プライマーおよび／またはポリメラーゼを含む、実施形態８６に記載の方法。
【０４２７】
実施形態８８．ＰＣＲが、約４〜８サイクル、約１０〜４０サイクルまたは約１〜１５サイクルを含む、実施形態８７に記載の方法。
【０４２８】
実施形態８９．ＰＣＲが、約３０サイクルを含む、実施形態８６に記載の方法。
【０４２９】
実施形態９０．ポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼである、実施形態８７に記載の方法。
【０４３０】
実施形態９１．増幅プライマーによって生成されたアンプリコンを検出するステップをさらに含み、アンプリコンの存在が、改変された逆転写酵素が試料中に存在するか決定する、実施形態８６に記載の方法。
【０４３１】
実施形態９２．約１分間〜約５時間における約１２℃〜約４２℃の温度をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３２】
実施形態９３．ワンポット（単一の容器）反応として遂行される、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３３】
実施形態９４．鋳型が、約３０塩基対〜約１５０００塩基対の間である、実施形態１〜１２および１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３４】
実施形態９５．鋳型が、約２００塩基対または約６００塩基対である、実施形態９４に記載の方法。
【０４３５】
実施形態９６．鋳型が、約０．０００１マイクロモル濃度〜約０．１マイクロモル濃度の間である、実施形態１〜１２および１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３６】
実施形態９７．鋳型が、少なくとも約０．０００１マイクロモル濃度である、実施形態９６に記載の方法。
【０４３７】
実施形態９８．鋳型または断片化されたもしくは分解された鋳型が、少なくとも約５０フェムトモル濃度である、実施形態１〜１２および１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３８】
実施形態９９．アクセプター核酸分子が、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む、実施形態１〜１３、１５〜１６および１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３９】
実施形態１００．プライマーが、１種または複数のランダムプライマーを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４０】
実施形態１０１．プライマーが、Ｒ２  ＲＮＡプライマーを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４１】
実施形態１０２．プライマーが、アダプター配列をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４２】
実施形態１０３．改変された逆転写酵素が、Ｆｈ８、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＧＳＴ、ＳＥＴ、ＧＢ１、ＺＺ、ＨａｌｏＴａｇ、ＳＮＵＴ、Ｓｋｐ、Ｔ７ＰＫ、ＥｓｐＡ、Ｍｏｃｒ、Ｅｃｏｔｉｎ、ＣａＢＰ、ＡｒｓＣ、ＩＦ２−ドメインＩ、発現タグ、ＲｐｏＡ、ＳｌｙＤ、Ｔｓｆ、ＲｐｏＳ、ＰｏｔＤ、Ｃｒｒ、ｍｓｙＢ、ｙｊｇＤ、ｒｐｏＤまたはこれらのいずれかの組合せとの融合を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４３】
実施形態１０４．改変された逆転写酵素を調製するための方法であって、次のステップ：（ａ）逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列を、ランダムまたは合理的突然変異誘発に付すステップ；（ｂ）逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列を、アミノ酸のトランケーションに付すステップ；（ｃ）逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列を、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を含む変更に付すステップ；（ｄ）逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列を、タンパク質またはドメインとの融合に付すステップ；および（ｅ）逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列を、相同遺伝子ＤＮＡシャッフリングに付すステップ；のうち少なくとも１種を含み、ステップ（ａ）〜（ｅ）のうちいずれか１種において得られるＤＮＡ配列が、宿主細胞において発現され、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、方法。
【０４４４】
実施形態１０５．改変された逆転写酵素を発現する宿主細胞をスクリーニングするステップをさらに含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０４４５】
実施形態１０６．宿主細胞によって発現された改変された逆転写酵素を調製するステップをさらに含む、実施形態１０５に記載の方法。
【０４４６】
実施形態１０７．次の：逆転写酵素（ＲＴ）活性を決定するステップ、逆転写酵素活性画分（単数または複数）を推定するステップ、ならびに突然変異体の安定性および頑強性を検査するステップのうち少なくとも１種をさらに含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０４４７】
実施形態１０８．ＲＴ活性、ＲＴ活性画分（単数または複数）、または突然変異体の安定性および頑強性が、逆転写酵素活性アッセイによりモニタリングされる、実施形態１０７に記載の方法。
【０４４８】
実施形態１０９．逆転写酵素活性、および酵素特性を改善する少なくとも１種の変更された特徴を有する改変されたポリペプチドであって、表１に提示されている国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＧｅｎＢａｎｋデータベース受託番号に対応する配列のうちいずれか１種に対して少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変されたポリペプチド。
【０４４９】
実施形態１１０．逆転写酵素活性、および野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて少なくとも１種の変更された特徴を有する改変されたポリペプチドであって、この変更された特徴が、逆転写酵素が、（ｉ）サーマルサイクリングを用いずに、鋳型核酸分子から相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成し、（ｉｉ）多くとも約５％の誤り率で、ｃＤＮＡ分子の１個または複数のコピーを生成することを可能にし、改変されたポリペプチドが、表１に提示されている受託番号のうちいずれか１種に対応する配列のうちいずれか１種のトランケートされたバリアントである、改変されたポリペプチド。
【０４５０】
実施形態１１１．逆転写酵素活性、および酵素特性を改善する少なくとも１種の変更された特徴を有する改変されたポリペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に対して少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変されたポリペプチド。
【０４５１】
実施形態１１２．酵素特性を改善する特徴が、次の：増加された安定性；増加された比活性；増加されたタンパク質発現；改善された精製；改善された処理能力；改善された鎖置換；改善された鋳型ジャンピング；増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性；および増加された忠実度のうち少なくとも１種を含む、実施形態１０９〜１１１のいずれか１つに記載の改変されたポリペプチド。
【０４５２】
実施形態１１３．Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端およびＣ末端トランケーションを含む、実施形態１０９〜１１１のいずれか１つに記載の改変されたポリペプチド。
【０４５３】
実施形態１１４．約１００個未満のアミノ酸残基のトランケーションを含む、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つに記載の改変されたポリペプチド。
【０４５４】
実施形態１１５．次の改変：（ａ）約４００個未満のアミノ酸残基のアミノ末端トランケーション；および（ｂ）約４００個未満のアミノ酸残基のカルボキシル末端トランケーションのうち１種または複数を含む、実施形態１０９〜１１４のいずれか１つに記載の改変されたポリペプチド。
【０４５５】
実施形態１１６．融合パートナーまたは担体タンパク質を含む、実施形態１０９〜１１５のいずれか１つに記載の改変されたポリペプチド。
【０４５６】
実施形態１１７．Ｆｈ８、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＧＳＴ、ＳＥＴ、ＧＢ１、ＺＺ、ＨａｌｏＴａｇ、ＳＮＵＴ、Ｓｋｐ、Ｔ７ＰＫ、ＥｓｐＡ、Ｍｏｃｒ、Ｅｃｏｔｉｎ、ＣａＢＰ、ＡｒｓＣ、ＩＦ２−ドメインＩ、発現タグ、ＲｐｏＡ、ＳｌｙＤ、Ｔｓｆ、ＲｐｏＳ、ＰｏｔＤ、Ｃｒｒ、ｍｓｙＢ、ｙｊｇＤ、ｒｐｏＤまたはこれらのいずれかの組合せとの融合を含む、実施形態１１６に記載の改変されたポリペプチド。
【０４５７】
実施形態１１８．融合されたバリアントが、融合されていないポリペプチドと比較して、次の：増加された有効期間、増加された活性画分（単数または複数）および改善された精製のうち少なくとも１種を含む、実施形態１１６に記載の改変されたポリペプチド。
【０４５８】
実施形態１１９．３０℃で測定される場合に１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で、鋳型核酸分子を逆転写に付して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）産物を生成し、ｃＤＮＡ産物を増幅させる、天然に存在しない酵素。
【０４５９】
実施形態１２０．３０℃で測定される場合に１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で、鋳型核酸分子を逆転写に付して核酸産物を生成し、核酸産物を増幅させる、天然に存在しない酵素。
【０４６０】
実施形態１２１．少なくとも１種の酵素特性に関して１．０を超える性能指数を有する、実施形態１１９〜１２０に記載の天然に存在しない酵素。
【０４６１】
実施形態１２２．酵素特性が、改善された安定性、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性および忠実度からなる群から選択される、実施形態１２１に記載の天然に存在しない酵素。
【０４６２】
実施形態１２３．約１２℃〜約４２℃の温度で測定される場合に、改善された安定性、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性および忠実度からなる群から選択される少なくとも１種の酵素特性に関して１．０を超える性能指数で、３時間またはそれに満たない期間で、鋳型核酸分子を逆転写に付して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）産物を生成し、ｃＤＮＡ産物を増幅させる、天然に存在しない酵素。
【０４６３】
実施形態１２４．約１２℃〜約４２℃の温度で測定される場合に、改善された安定性、比活性、タンパク質発現、精製、処理能力、鎖置換、鋳型ジャンピング、増加されたＤＮＡ／ＲＮＡ親和性および忠実度からなる群から選択される少なくとも１種の酵素特性に関して１．０を超える性能指数で、３時間またはそれに満たない期間で、鋳型核酸分子を逆転写に付して核酸産物を生成し、核酸産物を増幅させる、天然に存在しない酵素。
【０４６４】
実施形態１２５．鋳型核酸分子が、無細胞核酸分子である、実施形態１２３〜１２４のいずれか１つに記載の天然に存在しない酵素。
【０４６５】
実施形態１２６．同じヌクレオチド基質に対する参照酵素の処理能力よりも少なくとも約５％高い所与のヌクレオチド基質に対する処理能力で、約３時間またはそれに満たない期間で、鋳型核酸分子を逆転写に付して相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）産物を生成し、ｃＤＮＡ産物を増幅させる、天然に存在しない酵素。
【０４６６】
実施形態１２７．同じヌクレオチド基質に対する参照酵素の処理能力よりも少なくとも約５％高い所与のヌクレオチド基質に対する処理能力で、約３時間またはそれに満たない期間で、鋳型核酸分子を逆転写に付して核酸産物を生成し、核酸産物を増幅させる、天然に存在しない酵素。
【０４６７】
実施形態１２８．核酸分子を増幅する方法であって、改変された逆転写酵素を使用した核酸増幅に核酸分子を付すステップを含み、逆転写酵素が、約３０℃にて１塩基当たり少なくとも約８０％の処理能力で核酸分子を増幅することが可能である、方法。
【０４６８】
実施形態１２９．改変された逆転写酵素を使用して、鋳型核酸分子を逆転写に付して、核酸分子を得るステップをさらに含む、実施形態１２８に記載の方法。
【０４６９】
実施形態１３０．核酸分子が、無細胞核酸分子である、実施形態１２８に記載の方法。
【０４７０】
実施形態１３１．プライマー、１種もしくは複数のプライマーまたはランダムプライマー、ヌクレオチド、少なくとも１種の改変された逆転写酵素、鋳型、および実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法を行うための使用説明書を含むキット。
【０４７１】
実施形態１３２．逆転写または核酸増幅活性を有し、約３０℃の温度で鋳型ジャンピングすることが可能な、改変された逆転写酵素を含む、実施形態１３１に記載のキット。
【０４７２】
実施形態１３３．核酸を検出するためのキットであって、鋳型、少なくとも１種の改変された逆転写酵素、ヌクレオチド、ならびに実施形態３〜４および１３のいずれか１つに記載の方法を行うための使用説明書を含み、核酸が、少なくとも約５０フェムトモル濃度の濃度で存在する、キット。
【０４７３】
実施形態１３４．それを必要とする対象におけるがんを検出、診断または予後判定する方法であって、（ａ）実施形態１０に記載の対象に由来する無細胞核酸試料の配列情報を得るステップと、（ｂ）（ａ）に由来する配列情報を使用して、無細胞核酸試料における腫瘍核酸を検出するステップであって、腫瘍核酸が、無細胞核酸試料中の総核酸分子の約２％未満のまたはこれに等しい濃度で検出される、ステップとを含む方法。
【０４７４】
実施形態１３５．腫瘍核酸が、無細胞核酸試料中の総核酸分子の約１．７５％未満のまたはこれに等しい濃度で検出される、実施形態１３４に記載の方法。
【０４７５】
実施形態１３６．配列情報が、少なくとも２種のゲノム領域に関係する情報を含む、実施形態１３４に記載の方法。
【０４７６】
実施形態１３７．ステップ（ａ）の配列情報を得るステップが、１種または複数のアダプターの使用を含む、実施形態１３４に記載の方法。
【０４７７】
実施形態１３８．１種または複数のアダプターが、ランダマー配列を含む分子バーコードを含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４７８】
実施形態１３９．がんの診断または予後判定が、少なくとも約５０％の感度を有する、実施形態１３４に記載の方法。
【０４７９】
実施形態１４０．がんの診断または予後判定が、少なくとも約５０％の特異性を有する、実施形態１３４に記載の方法。
【０４８０】
実施形態１４１．核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せである、実施形態１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０４８１】
実施形態１４２．配列決定のための核酸分子を調製するための方法であって、対象から無細胞核酸を有する試料を得るステップであって、無細胞核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む、ステップと、無細胞核酸をトランスフェラーゼまたはポリメラーゼのうち少なくとも一方、および少なくとも１種のヌクレオチド基質と混合するサブステップを含む、ポリテールを核酸に付加するステップと、プライマーを核酸のポリテールにアニールさせるのに十分な条件下、１種または複数のプライマーを混合するステップと、核酸の増幅に十分な条件下、改変された逆転写酵素を混合するステップであって、改変された逆転写酵素が、野生型または改変されていない逆転写酵素と比べて、少なくとも１種の改善された酵素特性を含む、ステップとを含む方法。
【０４８２】
実施形態１４３．（ｂ）が、トランスフェラーゼおよびポリメラーゼを含む、実施形態１４２に記載の方法。
【０４８３】
実施形態１４４．トランスフェラーゼが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を含む、実施形態１４２に記載の方法。
【０４８４】
実施形態１４５．ポリメラーゼが、ポリＡポリメラーゼを含む、実施形態１４２に記載の方法。
【０４８５】
実施形態１４６．ヌクレオチド基質が、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＡＴＰのうち少なくとも１種を含む、実施形態１４２に記載の方法。
【０４８６】
実施形態１４７．配列決定のための核酸分子を調製するための方法であって、無細胞核酸をオリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートと混合するステップであって、オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートが、核酸にアニーリングすることが可能である、ステップと、核酸を転写させるのに十分な条件下、核酸にアニーリングされたオリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートを、改変された逆転写酵素と混合するステップとを含む方法。
【０４８７】
実施形態１４８．オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートが、オリゴヌクレオチドプライマーを含む、実施形態１４７に記載の方法。
【０４８８】
実施形態１４９．オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートが、オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドアクセプターを含む、実施形態１４７に記載の方法。
【０４８９】
実施形態１５０．鋳型ジャンピングが可能となるように、オリゴヌクレオチドアクセプターが、アニーリングされた核酸に緊密に近接している、実施形態１４９に記載の方法。
【０４９０】
実施形態１５１．オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートが、磁気ビーズを含む、実施形態１４７〜１５０のいずれか１つに記載の方法。
【０４９１】
実施形態１５２．アニーリングされた核酸の濃縮をさらに含む、実施形態１５１に記載の方法。
【０４９２】
実施形態１５３．無細胞核酸が、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、細胞外ＲＮＡおよびエキソソーム由来のＲＮＡのうち少なくとも１種を含む、実施形態１４２〜１５２のいずれか１つに記載の方法。
【０４９３】
実施形態１５４．鋳型ジャンピングを使用して核酸分子を調製するための方法であって、（ａ）プライマーを核酸鋳型にアニーリングするステップと、（ｂ）核酸分子の生成に十分な条件下、プライマーにアニーリングされた鋳型を、改変された逆転写酵素、校正性能を有するポリメラーゼおよびアクセプター核酸分子と混合するステップとを含む方法。
【０４９４】
実施形態１５５．ステップ（ａ）および（ｂ）が、逐次に行われる、実施形態１５４に記載の方法。
【０４９５】
実施形態１５６．ステップ（ａ）および（ｂ）が、同時に行われる、実施形態１５４に記載の方法。
【０４９６】
実施形態１５７．逆転写酵素が、ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態１４２〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
【０４９７】
実施形態１５８．逆転写酵素が、非末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンである、実施形態１４２〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
【０４９８】
実施形態１５９．逆転写酵素が、Ｒ２逆転写酵素である、実施形態１４２〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
【０４９９】
実施形態１６０．非ＬＴＲレトロトランスポゾンが、Ｒ２非ＬＴＲレトロトランスポゾンである、実施形態１５８に記載の方法。
【０５００】
実施形態１６１．アクセプター核酸分子が、保護された３’末端を含む、実施形態１５４〜１６０のいずれか１つに記載の方法。
【０５０１】
実施形態１６２．編集能を有するポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、Ｐｈｉ２９、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、ＫＯＤ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＴのうち少なくとも１種を含む、実施形態１５４に記載の方法。
【０５０２】
実施形態１６３．配列決定のために核酸分子のコンカテマーを調製するための方法であって、核酸分子を第１のアダプターとライゲーションするステップと、プライマーの非存在下で核酸増幅反応を行うことによりライゲーションされた核酸分子を増幅して、コンカテマーを形成するステップと、コンカテマーを第２のアダプターとライゲーションするステップとを含む方法。
【０５０３】
実施形態１６４．核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅である、実施形態１６３に記載の方法。
【０５０４】
実施形態１６５．第１のアダプターが、特有分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０５】
実施形態１６６．第１のアダプターが、プライマーとして機能する、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０６】
実施形態１６７．第１のアダプターが、一本鎖核酸を含む、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０７】
実施形態１６８．一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、実施形態１６７に記載の方法。
【０５０８】
実施形態１６９．第２のアダプターが、二本鎖核酸を含む、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０９】
実施形態１７０．二本鎖核酸が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む、実施形態１６９に記載の方法。
【０５１０】
実施形態１７１．第１のアダプターが、第２のアダプターとは異なる、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５１１】
実施形態１７２．第１のアダプターが、２種またはそれよりも多いアダプターを含む、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５１２】
実施形態１７３．第２のアダプターが、２種またはそれよりも多いアダプターを含む、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０５１３】
実施形態１７４．核酸分子の両末端が、アダプターを含む、実施形態１６３のいずれか１つに記載の方法。
【０５１４】
実施形態１７５．核酸分子が、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、細胞外ＲＮＡおよびエキソソーム由来のＲＮＡのうち少なくとも１種を含む、実施形態１４２〜１７４のいずれか１つに記載の方法。
【０５１５】
実施形態１７６．アダプターが、ヌクレオチド改変を含む、実施形態１６３に記載の方法。
【０５１６】
実施形態１７７．ヌクレオチド改変が、メチル化ヌクレオチドを含む、実施形態１７６に記載の方法。
【０５１７】
実施形態１７８．ヌクレオチド改変が、ｄＵＴＰを含む、実施形態１７６に記載の方法。
【０５１８】
実施形態１７９．ライブラリー配列決定のための試料からリボソームおよび／またはトランスファーＲＮＡを枯渇させる方法であって、ＲＮＡを含む試料を提供するステップであって、ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、ステップと、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅）を行って、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換するステップであって、増幅反応が、部分的増幅反応または十分な／完全増幅反応である、ステップと、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドおよび少なくとも１種の特異的に設計されたガイドオリゴヌクレオチドを含む複合体を導入するステップであって、少なくとも１種のガイドオリゴヌクレオチドが、少なくとも１種のｄｓＤＮＡに相補的な少なくとも１種の配列を含み、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、ｄｓＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断する、ステップとを含む方法。
【０５１９】
実施形態１８０．ライブラリー配列決定のための試料からリボソームおよび／またはトランスファーＲＮＡを枯渇させる方法であって、ＲＮＡを含む試料を提供するステップであって、ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、ステップと、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅）を行って、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換するステップであって、増幅反応が、部分的増幅反応または十分な／完全増幅反応であるステップと、ｄｓＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鎖へと変性させるステップと、結合分子および少なくとも１種のｓｓＤＮＡ鎖に相補的な少なくとも１種の配列を含む少なくとも１種の特異的に設計されたオリゴヌクレオチドを導入して、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種のｓｓＤＮＡ鎖のハイブリダイズされた複合体を形成するステップと、ハイブリダイズされた複合体を少なくとも１個の固体支持体に固定化し、これにより、試料からハイブリダイズされた複合体を除去するステップとを含む方法。
【０５２０】
実施形態１８１．ライブラリー配列決定のための試料からリボソームおよび／またはトランスファーＲＮＡを枯渇させる方法であって、ＲＮＡを含む試料を提供するステップであって、ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、ステップと、結合分子および少なくとも１種のｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡに相補的な少なくとも１種の配列を含む少なくとも１種の特異的に設計されたオリゴヌクレオチドを導入して、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種のｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡを含む複合体を形成するステップと、複合体を少なくとも１個の固体支持体に固定化し、これにより、試料から複合体を除去するステップとを含む方法。
【０５２１】
実施形態１８２．結合分子が、ビオチンである、実施形態１８１〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
【０５２２】
実施形態１８３．少なくとも１個の固体支持体が、ストレプトアビジンである、実施形態１８１〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
【０５２３】
実施形態１８４．無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）ライブラリーを産生する方法であって、ｃｆＤＮＡを含む試料を提供するステップと、ｃｆＤＮＡを変性させて、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）試料を産生するステップと、ヌクレオチドおよび／または触媒金属の存在下で、鋳型、プライマーおよび逆転写酵素を含む複合体をｓｓＤＮＡ試料に導入するステップであって、逆転写酵素が、鋳型上のプライマーを伸長し、その後、ｓｓＤＮＡ試料へと鋳型ジャンプして、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料を産生し（例えば、二本鎖ＤＮＡが、コピー鎖および当初の鎖を含み（コピー鎖は、逆転写酵素による伸長に起因する鎖であり、当初の鎖は、試料に由来する））、ｄｓＤＮＡが、鋳型およびｓｓＤＮＡの間に少なくとも１個のニックを含む、ステップと、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを導入して、平滑末端および／または３’−オーバーハングを有するｄｓＤＮＡを生成するステップと、５’末端に一本鎖オーバーハングを有する核酸二重鎖を含む（非対称性）アダプターを導入するステップであって、（非対称性）アダプターが、ｄｓＤＮＡの５’末端にライゲーションされ、一本鎖オーバーハングが、少なくとも１種のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プライマーに相補的な配列を含む、ステップと、ＰＣＲ反応を行って、ｄｓＤＮＡの一方の鎖のみを増幅するステップ（さらに、ｄｓＤＮＡの一方の鎖が、当初のＤＮＡ鎖である）とを含む方法。
【０５２４】
実施形態１８５．ｄｓＤＮＡの一方の鎖（当初の鎖）が、ＰＣＲ増幅の忠実度を改善する、実施形態１８４に記載の方法。
【０５２５】
実施形態１８６．無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）ライブラリーを産生する方法であって、ｃｆＤＮＡを含む試料を提供するステップと、ｃｆＤＮＡを変性させて、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）試料を産生するステップと、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）（および任意選択で、伸長不能ヌクレオチド）をｓｓＤＮＡ試料に導入して、ポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）テールを生成するステップと、プライマーおよび第１のアダプターを含む複合体をｓｓＤＮＡ試料のテールにアニーリングするステップであって、複合体が、テールに相補的な配列を含む、ステップと、ヌクレオチドおよび／または触媒金属の存在下で、逆転写酵素ならびにアクセプターおよび第２のアダプターを含む複合体を導入して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料を産生するステップであって、ヌクレオチドが、分解性ヌクレオチドを含み、逆転写酵素が、プライマーを伸長し、その後、複合体へと鋳型ジャンプして、伸長を続け、複合体が、逆転写酵素が複合体の末端に達して、別の複合体へとジャンプするのを防止するためのヌクレオチドブロックを含み、ｄｓＤＮＡが、当初の鎖およびコピー鎖を含み、当初の鎖が、複合体およびｓｓＤＮＡの間に少なくとも１個のニックを含み、コピー鎖が、少なくとも１個の分解性ヌクレオチドを含む、ステップと、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを導入して、平滑末端または３’−オーバーハングを有するｄｓＤＮＡを生成し、ＤＮＡリガーゼを導入して、少なくとも１個のニックをライゲーションするステップと、少なくとも１種のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを導入して、少なくとも１個の分解性ヌクレオチドを分解して、コピー鎖を枯渇／除去／分解するステップと（これにより、当初の鎖のみが存在するようにする）、少なくとも第１のプライマーおよび／または少なくとも第２のプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、当初の鎖を増幅するステップであって、第１のプライマーが、第１のアダプターに相補的な配列を含み、第２のプライマーが、第２のアダプターに相補的な配列を含む、ステップとを含む方法。
【０５２６】
実施形態１８７．当初の鎖が、ＰＣＲ増幅の忠実度を改善する（すなわち、コピー鎖を除去し、当初の鎖のみをまたはその大部分を残すことが、ＰＣＲ増幅における忠実度を改善する）、実施形態１８６に記載の方法。
【０５２７】
実施形態１８８．配列決定のための核酸ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）複数の核酸分子を得るステップと、（ｂ）前記複数の核酸分子の温度を増加させることにより、前記複数の核酸分子における少なくとも１個の分子の非酵素的分子内トランスリン酸化を誘導し、これにより、遊離５’−リン酸部分を有する複数の核酸分子を提供するステップと、（ｃ）ホスファターゼを、前記遊離５’−リン酸部分を有する前記複数の核酸分子に添加し、それによって、ホスファターゼが、前記遊離５’−リン酸部分のうち１個または複数をヒドロキシル基に変換し、これにより、遊離ヒドロキシル基を有する複数の核酸分子を提供するステップと、（ｄ）ある量のアデノシン三リン酸の存在下で、ステップｃ）の産物およびポリメラーゼを混合し、それによって、前記ポリメラーゼが、遊離ヒドロキシル基を有する前記複数の核酸分子の少なくとも１個の分子からポリ（Ａ）テールを生成するステップと、（ｅ）ヌクレオチドの存在下で、（ｉ）前記ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含む１種または複数のプライマー；（ｉｉ）１種または複数のアクセプター核酸分子；および（ｉｉｉ）改変された逆転写酵素を混合し、それによって、前記改変された逆転写酵素が、アニーリングされた鋳型核酸分子の配列を逆転写し、アクセプター核酸分子へと移動し、前記アクセプター核酸分子の配列を逆転写することにより、複数の連続した相補デオキシリボ核酸分子を生成するステップと、（ｆ）少なくとも１個の固体支持体を（ｅ）の産物に添加し、それによって、前記固体支持体が、過剰な、前記ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含む前記１種または複数のプライマーを固定化するステップと、（ｇ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行うステップとを含む方法。
【０５２８】
実施形態１８９．配列決定のためのライブラリーを産生する方法であって、リボ核酸（例えば、ｃｆＲＮＡ）を含む試料を提供するステップと、試料を、ＲＮＡのトランスリン酸化を可能にするのに十分な高温に付すステップと（任意選択で、さらに、触媒金属（マグネシウム）および／またはポリアミンが、試料に導入される）、ホスファターゼを導入して、ＲＮＡのリン酸部分を３’−ヒドロキシル基に変換するステップと、アデノシン三リン酸およびポリメラーゼを導入して、ＲＮＡの３’−ヒドロキシル基にポリ（Ａ）テールを生成するステップと、ヌクレオチドの存在下で、プライマー、アクセプターおよび逆転写酵素を導入するステップであって、プライマーが、ポリ（Ａ）テールに相補的な配列を含み、これにより、ポリ（Ａ）テールにアニーリングし、逆転写酵素が、プライマーを伸長し、その後、アクセプターへと鋳型ジャンプして、伸長を続ける、ステップと、少なくとも１個の固体支持体を導入して、過剰プライマーおよび非特異的プライマー産物を少なくとも１個の固体支持体に固定化し、これにより、試料から過剰プライマーおよび非特異的プライマー産物を除去するステップと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行って、ＲＮＡを増幅するステップとを含む方法。
配列：
【化１０】
2020500035.tif 000048
【化１１】
2020500035.tif 000049
【化１２】
2020500035.tif 000050
【化１３】
2020500035.tif 000051
【化１４】
2020500035.tif 000052
【化１５】
2020500035.tif 000053
【化１６】
2020500035.tif 000054
【化１７】
2020500035.tif 000055
【化１８】
2020500035.tif 000056
【化１９】
2020500035.tif 000057
【化２０】
2020500035.tif 000058
【化２１】
2020500035.tif 000059
【化２２】
2020500035.tif 000060
【化２３】
2020500035.tif 000061
【化２４】
2020500035.tif 000062
【化２５】
2020500035.tif 000063
【化２６】
2020500035.tif 000064
【化２７】
2020500035.tif 000065
【化２８】
2020500035.tif 000066
【図１】
2020500035.tif 000067
【図２】
2020500035.tif 000068
【図３】
2020500035.tif 000069
【図４】
2020500035.tif 000070
【図５Ａ】
2020500035.tif 000071
【図５Ｂ】
2020500035.tif 000072
【図６Ａ】
2020500035.tif 000073
【図６Ｂ】
2020500035.tif 000074
【図７】
2020500035.tif 000075
【図８】
2020500035.tif 000076
【図９】
2020500035.tif 000077
【図１０】
2020500035.tif 000078
【図１１】
2020500035.tif 000079
【図１２Ａ】
2020500035.tif 000080
【図１２Ｂ】
2020500035.tif 000081
【図１２Ｃ】
2020500035.tif 000082
【図１３】
2020500035.tif 000083
【図１４】
2020500035.tif 000084
【図１５】
2020500035.tif 000085
【図１６Ａ】
2020500035.tif 000086
【図１６Ｂ】
2020500035.tif 000087
【図１７】
2020500035.tif 000088
【図１８Ａ】
2020500035.tif 000089
【図１８Ｂ】
2020500035.tif 000090
【図１８Ｃ】
2020500035.tif 000091
【図１８Ｄ】
2020500035.tif 000092
【図１９】
2020500035.tif 000093
【図２０】
2020500035.tif 000094
【図２１】
2020500035.tif 000095
【図２２Ａ】
2020500035.tif 000096
【図２２Ｂ】
2020500035.tif 000097
【図２２Ｃ】
2020500035.tif 000098
【図２３Ａ】
2020500035.tif 000099
【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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