(57)【要約】  本発明は、ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な化学的に合成されたペプチド結合部分を含むターゲティングモジュール、そのターゲティングモジュールを含むキット、および共通キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターまたは細胞、ならびに癌、感染症および自己免疫障害の処置のための使用に関する。
2020525408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な化学的に合成されたペプチド結合部分と、タグとを含む、ターゲティングモジュールであって、前記タグが、タンパク質由来のペプチドであり、前記ターゲティングモジュールが、１０〜１２０個のアミノ酸を含むペプチドであり、前記化学的に合成されたペプチド結合部分が、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体、ソマトスタチンアンタゴニスト、ボンベシンおよびボンベシン類似体、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）およびＧＲＰ類似体、ニューロメジンＢおよびニューロメジンＢ類似体、血管作用性セクレチンファミリー、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）およびＭＳＨ類似体、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、ニューロテンシンおよびニューロテンシン類似体、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンファミリー、ニューロカイン、エキセンジンもしくはエキセナチド、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドおよびＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチド、ニューレグリンから選択され、または前記化学的に合成されたペプチド結合部分が、膜受容体に対する結合特異性を有する、ターゲティングモジュール。
【請求項２】
前記タグが、ヒトタンパク質由来のペプチドである、請求項１記載のターゲティングモジュール。
【請求項３】
前記タグが、ヒト核タンパク質由来のペプチドである、請求項１または２記載のターゲティングモジュール。
【請求項４】
前記化学的に合成されたペプチド結合部分が、ソマトスタチン、ボンベシン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、メラノタン２（α−Ｍ２）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、ニューロテンシン、ノイロペプチドＹ、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、サブスタンスＰ、エキセンジン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチドから選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載のターゲティングモジュール。
【請求項５】
前記化学的に合成されたペプチド結合部分が、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体、ソマトスタチンアンタゴニスト、ボンベシンおよびボンベシン類似体、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）およびＧＲＰ類似体、ニューロメジンＢおよびニューロメジンＢ類似体、血管作用性セクレチンファミリー、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）およびＭＳＨ類似体、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、ニューロテンシンおよびニューロテンシン類似体、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンファミリー、ニューロカイン、エキセンジンもしくはエキセナチド、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドおよびＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチド、ニューレグリンから選択される少なくとも２つのペプチドを含み、または前記化学的に合成されたペプチド結合部分が、膜受容体に対する結合特異性を有する、請求項１から４までのいずれか１項記載のターゲティングモジュール。
【請求項６】
前記化学的に合成されたペプチド結合部分および／もしくは前記タグが、Ｄ型アミノ酸、擬ペプチド結合（ｐｓｅｕｄｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）、アミノアルコール、非タンパク質原性アミノ酸、修飾された側鎖を有するアミノ酸を含み、かつ／または前記化学的に合成されたペプチド結合部分および／もしくは前記タグが、環状ペプチドである、請求項１から５までのいずれか１項記載のターゲティングモジュール。
【請求項７】
前記タグが、ヒト核Ｌａタンパク質由来のペプチドであり、好ましくは前記タグが、配列番号２５または配列番号２７によるヒト核Ｌａタンパク質由来の短鎖線状エピトープである、請求項１から６までのいずれか１項記載のターゲティングモジュール。
【請求項８】
配列番号２６、式（Ｉ）または式（ＩＩ）による請求項１から３まで記載のターゲティングモジュール。
【請求項９】
キレーターをさらに含む、請求項１から８までのいずれか１項記載のターゲティングモジュール。
【請求項１０】
癌、感染症、炎症性障害および自己免疫障害の処置における使用のための、請求項１から９までのいずれか１項記載のターゲティングモジュール。
【請求項１１】
ａ）請求項１から１０までのいずれか１項記載のターゲティングモジュールと、
ｂ）共通キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターまたは細胞と、
を含むキットであって、前記共通キメラ抗原受容体が３つのドメインを含み、
前記第一のドメインが、タグ結合ドメインであり、
前記第二のドメインが、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインであり、かつ
前記第三のドメインが、シグナル伝達ドメインであり、
タグ結合ドメインが、請求項１から１０まで記載のターゲティングモジュールの前記タグへ結合する、キット。
【請求項１２】
タグ結合ドメインが、ヒト核Ｌａタンパク質由来のタグへ結合し、好ましくは前記タグ結合ドメインが抗体または抗原結合フラグメントであり、前記タグ結合ドメインが、抗ＬａエピトープｓｃＦｖ、より好ましくは配列番号２１および２２または配列番号２３および２４による抗ＬａエピトープｓｃＦｖを構成する、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインが、ヒトＣＤ２８分子、ＣＤ８ａ鎖ＮＫ細胞受容体、好ましくはナチュラルキラー基ＮＫＧ２Ｄのヒンジおよび膜貫通ドメイン、または抗体の定常領域の部分、ならびにこれらの組み合わせから選択される、請求項１１または１２記載のキット。
【請求項１４】
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤＡＰ１０およびＣＤ２７、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ３鎖の細胞質領域、ＤＡＰ１２および活性化Ｆｃ受容体の細胞質領域から選択される、請求項１１から１３までのいずれか１項記載のキット。
【請求項１５】
前記核酸が、配列番号１７、１８、１９または２０によるアミノ酸配列を有する共通キメラ抗原受容体のためにコードする配列番号１、９、１３または１６である、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のキット。
【請求項１６】
請求項１１から１５までのいずれか１項記載のキットを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
癌、感染症、炎症性障害および自己免疫障害の処置における使用のための、請求項１１から１５までのいずれか１項記載のキットまたは請求項１６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な化学的に合成されたペプチド結合部分を含むターゲティングモジュール、そのターゲティングモジュールを含むキット、および共通キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターまたは細胞、ならびに癌、感染症および自己免疫障害の処置のための使用に関する。
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原特異性を提供する結合部分と、免疫受容体に由来する１つまたはいくつかのシグナル伝達鎖とからなる人工の受容体である（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。これら２つの主なＣＡＲドメインは、細胞の原形質膜内でＣＡＲをつなぎ留める膜貫通ドメインを含む連結ペプチド鎖によって接続されている。免疫細胞、特にＴリンパ球およびＮＫリンパ球は、それらの原形質膜内へと挿入されたＣＡＲを発現するよう遺伝子改変されることができる。このようなＣＡＲ修飾免疫細胞がＣＡＲ結合部分の適切な標的を発現するまたは当標的で修飾されている他の細胞または組織構造に遭遇した場合、ＣＡＲ結合部分を標的抗原へ結合する際に、ＣＡＲ改変免疫細胞は標的へ架橋結合する。架橋結合は、ＣＡＲシグナル伝達鎖を介してシグナル経路の誘導をもたらし、このことは、ＣＡＲが生着した免疫細胞の生物学的特性を変化させることになる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作された免疫細胞の養子移入は現在、それがなければ治癒不可能な悪性疾患、感染性疾患または自己免疫疾患の処置のための非常に有望な治療選択肢と見なされている。初回臨床試験は、この処置戦略の安全性および実現可能性をいずれも実証した（Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。しかしながら、従来のＣＡＲ技術は、いくつかの決定的な安全性の問題を付帯する。従来のＣＡＲを用いて操作されたＴ細胞の免疫応答は、患者への注入後に制御することが困難であり、特に健常組織における予期せぬ標的遺伝子発現は、健常細胞に対する操作されたＴ細胞の免疫反応を誘発することがあり、このことは重大な副作用の原因となる可能性がある（Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。従来のＣＡＲ技術の別の欠点は、単一の抗原に再ターゲッティングする操作されたＴ細胞の制限である。このような単一治療アプローチは、処置の間に標的抗原を喪失した腫瘍回避バリアントの発生についての危険性を強調する。数か月後の従来のＣＡＲ  Ｔ細胞療法の下での腫瘍回避バリアントの出現は、臨床試験中にすでに観察された（Ｇｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００３】
国際公開第２０１２０８２８４１号は、細胞関連障害、例えば、癌を処置する共通抗タグキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞および方法を開示している。さらに、国際公開第２０１３０４４２２５号は、多種多数の抗原のターゲティングのためのＴ細胞によって発現した共通免疫受容体を開示している。いずれの方法も、共通抗タグ免疫受容体を発現する改変されたＴ細胞の使用を説明している。これらのＴ細胞は、これらのＴ細胞の表面抗原を結合しかつ個々のタグを担持するモジュールをさらに適用することによって、疾患関連細胞表面抗原に再度向かうことができる。欠点は、おそらく免疫原性でありかつそれゆえ患者を危険にさらしかつ処置の効能に負に影響する外来性タグを用いる、遺伝子改変されたＴ細胞のリダイレクションである。
【０００４】
あるいは、欧州特許出願公開第２９９０４１６号明細書は、核タンパク質に基づく内在性タグを用いる安全かつ効率的な様式で多様な障害に対するリダイレクションを可能にする遺伝子改変された免疫細胞、特にＴ細胞およびＮＫ細胞に基づく療法を開示している。特に、欧州特許出願公開第２９９０４１６号明細書は、共通キメラ抗原受容体（ＵｎｉＣＡＲ）をコードする核酸、およびある特定のヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部分と何らかのヒト核タンパク質に由来するタグとから構成されたターゲティングモジュール、ならびに哺乳類動物における免疫応答を刺激するための当核酸および当ターゲティングモジュールの使用を開示している。従来のＣＡＲとは対照的に、共通ＣＡＲにおけるｓｃＦｖは、細胞表面抗原を認識しないが、ヒト核タンパク質に由来する短鎖非免疫原性ペプチドモチーフを認識する。したがって、ＵｎｉＣＡＲを発現するよう操作されたＴ細胞は、このＵｎｉＣＡＲ標的が未処置の細胞の表面上では生理学的条件下で利用可能ではないので、再度注入した後に不活性のままである（図１）。ターゲティングモジュールは、抗体フラグメント（すなわち、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）、リガンド、または可溶性受容体を含む組換えタンパク質に基づいている。
【０００５】
開示された方法の欠点は、非常に複雑な生成および精製の手順であり、当手順は臨床等級のターゲティングモジュールを得るために確立されかつ実行される必要がある。当手順には、原核細胞培養物または哺乳類動物細胞培養物における組換え発現、精製のための複雑な多段階クロマトグラフィー手順、および品質管理のための熟達した分析パネルが含まれる。その上、ターゲティングモジュールの安定性はしばしば限定されており、長期保存条件は有利ではない。
【０００６】
第一の態様において、本発明は、臨床等級レベルにおいて容易に、迅速にかつ経済的に製造される特異的なターゲティングモジュールを提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、改善された医薬特性および改善された安定性を有する特異的なターゲティングモジュールを提供する。
【０００８】
本発明の実施形態は、ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な化学的に合成されたペプチド結合部分と、何らかのタンパク質に由来するペプチドであるタグとを含むターゲティングモジュールに関し、当ターゲティングモジュールは、１０〜１２０個のアミノ酸を含むペプチドである。
【０００９】
実施形態において、線状ペプチドエピトープは、免疫原性についての危険性を最小限にするために、ヒトタンパク質に由来する。
【００１０】
さらなる実施形態において、線状ペプチドエピトープは、免疫原性についての危険性を最小限にするために、かつＵｎｉＣＡＲ発現免疫細胞のオフターゲット活性を防止するために、ヒト核タンパク質に由来する。核ヒトタンパク質のペプチドは、細胞表面上に提示されないことになり、したがって、ＵｎｉＣＡＲグラフト免疫細胞は、ターゲティングモジュールの非存在下で活性化されることができない（図１）。
【００１１】
有利なことに、本発明によるターゲティングモジュールは、容易に合成可能である。さらに有利なことに、本発明によるターゲティングモジュールは、共通キメラ抗原受容体（ＵｎｉＣＡＲ）へ、およびヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体へ結合することができる。
【００１２】
本発明によるターゲティングモジュールは、遺伝子改変された免疫細胞がその標的、特に細胞表面タンパク質または細胞外構造に到達することができる分子である。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「化学的に合成された」という用語は、化学合成による、特に、第一のアミノ酸のカルボキシル基が第二のアミノ酸のアミノ基とカップリングすることによるペプチドの生成の方法を称する。実施形態において、化学合成は、液相合成または固相合成から選択される。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「特異的」という用語は、ペプチドまたはタンパク質が標的へまたは標的の群へもっぱら結合する能力を称する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体」という用語は、細胞表面タンパク質または細胞外構造を称する。本明細書で使用する場合、「タンパク質複合体」という用語は、２つ以上の会合したタンパク質鎖からなる群を称する。
【００１６】
Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的なペプチド、およびヒト腫瘍細胞内で過剰発現した対応する受容体のタイプまたはサブタイプを開示している（Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「タグ」という用語は、ペプチドまたはタンパク質を特異的な原子、イオンまたは分子へ結合することができるよう、当ペプチドまたはタンパク質へ付着したペプチド配列を称する。
【００１８】
本発明によるヒトタンパク質は、ヒト生体内で認められるタンパク質である。
【００１９】
本発明による核タンパク質は、細胞核内で認められるタンパク質である。
【００２０】
さらなる実施形態において、ターゲティングモジュールは、化学的に合成される。
【００２１】
本発明によると、化学的に合成されたペプチド結合部分は、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体、ソマトスタチンアンタゴニスト、ボンベシンおよびボンベシン類似体、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）およびＧＲＰ類似体、ニューロメジンＢおよびニューロメジンＢ類似体、血管作用性セクレチンファミリー、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）およびＭＳＨ類似体、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、ニューロテンシンおよびニューロテンシン類似体、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンファミリー、ニューロカイン、エキセンジンもしくはエキセナチド、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチド、ニューレグリンから選択され、または化学的に合成されたペプチド結合部分は、膜受容体に対する結合特異性を有する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「類似体」という用語は、ペプチドと少なくとも７５％の同一性を有する、好ましくはペプチドと少なくとも８０％の同一性を有する、ペプチドと少なくとも８５％の同一性を有するのが特に好ましいアミノ酸配列を呈する化合物を称する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「アンタゴニスト」という用語は、シグナル伝達カスケードを惹起することなくペプチド受容体を結合する化合物を称する。
【００２４】
Ｍｅｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒａｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．およびＫａｌｔｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ソマトスタチン類似体、特にオクトレオチド、オクトレオタートおよびランレオチドならびにそれらのソマトスタチン受容体結合を説明している（Ｍｅｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｒａｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｋａｌｔｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。実施形態において、ソマトスタチン類似体は、オクトレオチド、オクトレオタートまたはランレオチドである。
【００２５】
Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１は、ソマトスタチンアンタゴニスト、特にｐＮＯ２−Ｐｈｅ−ｃ（ＤＣｙｓ−Ｔｙｒ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ）ＤＴｙｒＮＨ２（ＢＡＳＳ）およびそのソマトスタチン受容体結合を説明している（Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００２６】
Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．は、ボンベシン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＢおよびそれらの類似体を説明している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。さらに、Ｏｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ボンベシン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＢおよびそれらの類似体、特にボンベシン類似体であるアリテシンを説明している（Ｏｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【００２７】
Ｈｅｓｓｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．およびＲａｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００は、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）およびＶＩＰ受容体に対するそれらの結合を説明している（Ｈｅｓｓｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｒａｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００２８】
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、α−ＭＳＨ類似体およびそれらの受容体結合を説明している（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。実施形態において、ＭＳＨ類似体は、環状α−ＭＳＨ、メラノタンＩまたはメラノタンＩＩから選択される。
【００２９】
Ｆｒｏｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．およびＫｏｌｅｎｃ−Ｐｅｉｔｌ  ｅｔ  ａｌ．は、ＤＯＴＡ結合コレシストキニン（ＣＣＫ）２およびガストリンならびにそれらの受容体結合を説明している（Ｆｒｏｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｋｏｌｅｎｃ−Ｐｅｉｔｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００３０】
ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｕｃｈｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ニューロテンシン類似体、特にＤＯＴＡおよびＤＴＰＡ結合ニューロテンシン類似体、ならびにニューロテンシンのカルボキシ末端のヘキサペプチド類似体を説明している（ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【００３１】
Ｒｅｕｂｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ノイロペプチドＹ（ＮＰＹ）およびノイロペプチドＹ類似体の作用ならびに癌におけるそれらの受容体結合を説明している（Ｒｅｕｂｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【００３２】
Ｎａｇｙ  ａｎｄ  ＳｃｈａｌｌｙおよびＰｏｐｏｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および細胞毒性ＬＨＲＨ複合体、ならびに癌療法のための特異的な標的としてのそれらの受容体を説明している（Ｎａｇｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｌｌｙ  ２００５、Ｐｏｐｏｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【００３３】
Ｂｅａｕｊｏｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、タキキニンまたはノイロキニンをそれぞれ、特にサブスタンスＰ、ノイロキニンＡおよびＢ（ＮＫＡおよびＮＫＢ）ならびにノイロペプチドＹおよびＫ（ＮＰＹおよびＮＰＫ）ならびにそれらの受容体を説明している（Ｂｅａｕｊｏｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００３４】
Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．は、エキセンジン３、エキセンジン４、それらの複合体、およびグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体に対するそれらの結合を説明している（Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｂｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【００３５】
Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｃｒｉｓｔｏｆｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．およびＤｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．は、ａｖβ３インテグリンの結合のためのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド複合体を説明している（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｄｅｃｒｉｓｔｏｆｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００３６】
Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドおよびＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチド、これらのペプチドとの複合体、ならびに癌細胞に対するこれらの複合体の結合を説明している（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【００３７】
実施形態において、膜受容体に対する結合特異性を有するペプチドは、分化クラスター（ＣＤ）分子、サイトカイン受容体およびケモカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体ファミリーメンバー、表皮成長因子受容体ファミリーのメンバー、エフリン受容体ファミリーのメンバー、いわゆる前立腺特異的抗原、胚性抗原および癌胎児性抗原、血管内皮成長因子受容体ファミリーのメンバー、ムチンタンパク質ファミリーのメンバー、葉酸結合タンパク質および受容体、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、上皮糖タンパク質（ＥＧＰ）ファミリーのメンバー、ジシアロガングリオシド、炭酸アンヒドラーゼファミリーのメンバー、ならびに炭水化物抗原ファミリーのメンバー、レクチン、レクチン様分子、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバー、ケラチンファミリーのメンバーならびに膜受容体の変異体から選択される膜受容体に対する結合特異性を有する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、細胞外領域において少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する膜受容体を称する。
【００３９】
好ましい実施形態において、膜受容体に対する結合特異性を有するペプチドは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８４、ＣＤ２２３、ＣＤ２６９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２７９およびＣＤ３６６から選択される膜受容体、インターロイキン受容体、特に好ましいＩＬ−８Ｒα（ＣＸＣＲ１）、ＩＬ−８Ｒβ（ＣＸＣＲ２）、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１１Ｒβ、ＩＬ−１３Ｒα１および２、ＣＸＣＲ４；ｃ−Ｍｅｔ、形質転換成長因子β受容体、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４およびこれらの変異体、エフリン受容体、特に好ましいＥｐｈＡ１−１０またはＥｐｈＢ１−６；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、胚抗原（例えば、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ））、胎児アセチルコリン受容体）、癌胎児性抗原（ｏｎｃｏ−ｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）、腫瘍特異的グリカン（例えば、セリン結合もしくはトレオニン結合Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはシアリルＴｎのような誘導体）；ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３、ニューロピリン１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ムチン、特に好ましいＭＵＣ１、ＭＵＣ１６またはＭＵＣ１８；濾胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体、ＮＫＧ２Ｄ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子、特に好ましいＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＰＢ）１、ＵＬＰＢ２、ＵＬＰＢ３、リボ核酸輸送体１（Ｒａｅ−１）ファミリーメンバーまたは組織適合性６０（Ｈ−６０）；シャペロンおよび熱ショックタンパク質、特に好ましい熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０または７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）；ＥＧＰ−２またはＥＧＰ−４、ジアシアロガングリオシド２（ＧＤ２）またはＧＤ３、炭酸アンヒドラーゼ９（ＣＡＩＸ）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ−１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシス抗原１（ＡＰＯ−１、Ｆａｓ、ＣＤ９５）、ノッチリガンド（例えば、デルタ様１および４）、ケラチンファミリーのメンバーまたはインテグリン、特に好ましいａｖβ３またはａｖβ５、アミノペプチダーゼＡ，アミノペプチダーゼＮまたは神経／膠抗原２（ＮＧ２）に対する結合特異性を有する。
【００４０】
Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、インターロイキン８（ＩＬ−８）およびＩＬ−８類似体ならびに好中球上にある特異的膜受容体に対するそれらの結合能を説明している（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）。
【００４１】
Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．は、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）およびＩＬ−１１類似体、ならびに例えば、腫瘍細胞の表面上にあるＩＬ−１１受容体に対するそれらの結合能を説明している（Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【００４２】
Ｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．は、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２に特異的に結合するペプチドを説明している（Ｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【００４３】
Ｈａｎａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対する阻害剤としての１４残基ペプチドの設計、そのペプチドのＤＴＰＡ複合体の合成、およびその受容体結合を説明している（Ｈａｎａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。さらに、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は、短鎖ペプチドに基づく非常に選択的なＣＸＣＲ４アンタゴニストの発生を説明している（Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。Ｌａｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、受容体結合ペプチド、特に腫瘍細胞上で過剰発現するターゲティング受容体を説明している。Ｌａｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＫＫペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＣＸＣＲ４結合ペプチド、およびガストリン放出ペプチド受容体ターゲティングペプチド（ＢＮ、ＧＲＰおよびＢＮ類似体）を開示している（Ｌａｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【００４４】
Ｂｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．は、ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドｃＭＢＰ２、および特に腫瘍細胞上での受容体への適切な結合ペプチドを選択する方法を説明している（Ｂｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【００４５】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、ｅｒｂＢ２結合ペプチド（ＬＴＶＳＰＷＹ）の複合体を説明している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７ａ）。
【００４６】
Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．およびＳｔａｑｕｉｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト癌細胞を標的とするためのエフリン受容体ＥｐｈＡ５に対するペプチドリガンドを説明している（Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｓｔａｑｕｉｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【００４７】
Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｆｓｈａｒ−Ｏｒｏｍｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を結合するペプチドを説明している（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ａｆｓｈａｒ−Ｏｒｏｍｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。さらに、国際公開第２０１０／１０８１２５号および国際公開第２０１５／０５５３１８号は、ＰＳＭＡ結合ペプチドを開示している。
【００４８】
Ｄｅ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．は、受容体ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ様受容体結合を示すペプチドの設計および合成を説明している（Ｄｅ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。Ｍｉｃｈａｌｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．は、すべてのＶＥＧＦＲへ結合するペプチドを説明している（Ｍｉｃｈａｌｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００４９】
Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ニューロピリン１へ結合するペプチドを説明している（Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００５０】
Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）の細胞外ドメインへ結合する１４マーの大環状ペプチドを説明している（Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【００５１】
Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０は、ＥＧＦＲへ結合するペプチドを説明している（Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【００５２】
Ｓｔａｑｕｉｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８は、ＭＵＣ１８のホモフィリック相互作用を模倣する、ＭＵＣ１８へ結合するＭＵＣ１８由来の９マーおよび１０マーのペプチドを説明する（Ｓｔａｑｕｉｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【００５３】
Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．は、ストレス応答シャペロンＧＲＰ７８結合ペプチドモチーフ、および腫瘍細胞を標的とするためのＧＲＰ７８結合モチーフを含む合成キメラペプチドを説明しており（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＳＰ９０へ結合するペプチドを説明している（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００５４】
Ｋａｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．は、受容体へ結合する合成ペプチドの設計、特に腫瘍壊死因子受容体ファミリーＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体）、ＴＮＦＲ１またはＦａｓ（アポトーシス抗原１、ＡＰＯ−１、ＣＤ９５）の合成ペプチド結合メンバーの設計および合成のための方法を説明している（Ｋａｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００５５】
Ｓｏｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．は、１２マーおよび１０マーの２つのペプチド、ならびにケラチンファミリーのメンバーであるケラチン１を結合する当ペプチドの複合体を説明している（Ｓｏｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【００５６】
Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．は、αｖβ５結合ペプチドを説明している（Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【００５７】
Ｍａｒｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．は、アミノペプチダーゼＡを標的とするペプチドを説明している（Ｍａｒｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＮＧＲペプチドタグを介したアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）への薬剤のターゲティングを説明している（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００５８】
Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．は、血管新生に関してＮＧ２を標的とするペプチドを説明している（Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【００５９】
好ましくは、膜受容体に対する結合特異性を有するペプチドは、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３、２００８、２０１０）、Ｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｎａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔａｑｕｉｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８、２０１５）、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｆｓｈａｒ−Ｏｒｏｍｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｈａｌｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋａｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｏｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．またはＢｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．によって開示されている群から選択される。
【００６０】
好ましい実施形態において、化学的に合成されたペプチド結合部分は、ソマトスタチン、ボンベシン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、メラノタン２（α−Ｍ２）、コレシストキニン（ＣＣＫ）もしくはガストリン、ニューロテンシン、ノイロペプチドＹ、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、サブスタンスＰ、エキセンジン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドまたはＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチドから選択される。
【００６１】
実施形態において、ターゲティングモジュールは、１３〜８５個のアミノ酸、特に好ましい２０〜６０個のアミノ酸を含むペプチドである。
【００６２】
実施形態において、化学的に合成されたペプチド結合部分は、３〜７５個のアミノ酸、好ましい１０〜５０個のアミノ酸を有するペプチドである。
【００６３】
さらなる実施形態において、化学的に合成されたペプチド結合部分は、１個のペプチド（単一特異的）、２個、３個またはそれより多数のペプチド（二重特異的および多重特異的）を含む。
【００６４】
さらなる実施形態において、化学的に合成されたペプチド結合部分は、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体、ソマトスタチンアンタゴニスト、ボンベシンおよびボンベシン類似体、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）およびＧＲＰ類似体、ニューロメジンＢおよびニューロメジンＢ類似体、血管作用性セクレチンファミリー、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）およびＭＳＨ類似体、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、ニューロテンシンおよびニューロテンシン類似体、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンファミリー、ニューロカイン、エキセンジンもしくはエキセナチド、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドおよびＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）ペプチド、ニューレグリンまたは膜受容体への結合特異性を有するペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含む。
【００６５】
少なくとも２つのペプチドを有する化学的に合成されたペプチド結合部分についての例としては、同じ細胞表面タンパク質（例えば、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１３ＲＡ２、ＥｒｂＢ２、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲまたはＧＤ２）へ結合する２つの異なるペプチドの組み合わせ、ＰＳＭＡ結合ペプチドとＶＥＧＦＲ−２、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１１ＲまたはＭＵＣ１へ結合するペプチドとの組み合わせ、ＧＤ２およびＣＤ９０へ結合するペプチドの組み合わせ、またはメラノタンＩおよびＩＩ、これらの類似体もしくは環状ペプチドの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６６】
さらなる実施形態において、化学的に合成されたペプチド結合部分および／もしくはタグは、Ｄ型アミノ酸、擬ペプチド結合、アミノアルコール、非タンパク質原性アミノ酸、修飾された側鎖を有するアミノ酸を含み、ならびに／または化学的に合成されたペプチド結合部分および／もしくはタグは環状ペプチドである。
【００６７】
本発明によると、タグは、抗体または他の結合ドメインが利用可能である何らかのタンパク質に由来するペプチドである。
【００６８】
さらなる実施形態において、タグは、抗体または他の結合ドメインが利用可能である何らかのヒトタンパク質に由来するペプチドである。
【００６９】
さらなる実施形態において、タグは、抗体または他の結合ドメインが利用可能であるヒト核タンパク質に由来するペプチドである。
【００７０】
本発明は、癌または自己免疫疾患の症例における治療用途および／または診断用途のための薬剤を調製するための本発明による標的モジュールの使用をさらに含む。
【００７１】
本発明は、本発明による標的モジュールの投与による癌、感染性疾患、炎症性疾患または自己免疫疾患に罹患しているヒトの処置のための方法も包含する。
【００７２】
治療適用のために、薬理学的有効量の本発明による標的モジュールを含有する無菌医薬組成物は、上述の病気を処置するために患者へ投与される。
【００７３】
本発明は、次の図面および実施形態に本発明を制限することなく、当図面および実施形態の助力でより詳細に説明されることになる。
【００７４】
本発明は次に、次の非限定的な図面および例によってさらに説明されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＵｎｉＣＡＲプラットフォームのモジュール組成物のスキーム、および標的細胞、例えばスキーム中にあるような腫瘍細胞の表面上にある標的構造への標的特異的ペプチドターゲティングモジュール（ｐＴＭ）の結合によるＵｎｉＣＡＲプラットフォームの作用様式を示す。
【図２】図２は、３つのドメインを有する共通キメラ抗原受容体（ＵｎｉＣＡＲ）のスキームを示し、この中で、第一のドメインはタグ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ抗タグ）であり、第二のドメインは細胞外ヒンジ（ＥＣＤ）および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）であり、第三のドメインはシグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）であり、任意の第四のドメインは、受容体の細胞外部分における短鎖ペプチドリンカーである（非表示）。
【図３】図３は、５’長鎖末端リピート（５’ＬＴＲ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、パッケージングシグナル（Ψ）、逆応答要素（ＲＲＥ）、中枢ポリプリン路／中枢末端配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）、ヒト伸長因子１アルファプロモーター（ＰＥＦ１α）、多重クローン化部位（ＭＣＳ）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、最適化ヒトコドン（ＺｓＧｒｅｅｎ１）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、３’長鎖末端リピート（３’ＬＴＲ）、複製起点（ｐＵＣ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、β−ラクタマーゼを有するベクターｐＬＶＸ−ＥＦ１アルファＵｎｉＣＡＲ２８／ζ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｇｒｏｕｐ）を示す。
【図４】図４は、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター（ＣＭＶｅｎｈ）、スプライシングドナー（ＳＤ）、スプライシングアクセプター（ＳＡ）、群特異抗原（Ｇａｇ）、プロテアーゼタンパク質をコードする前駆体タンパク質（Ｐｒｏ）、逆転写酵素およびインテグラーゼをコードするタンパク質（ＰｏＩ）、逆応答因子（ＲＲＥ）、アンピシリン（Ａｍｐ）を有する、群特異抗原（ｇａｇ）およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードするプラスミドｐｓＰＡＸ２を示す。
【図５】図５は、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター（ＣＭＶ）、ベータグロビンイントロン（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｔｒｏｒ）、ベータグロビンポリアデノシン尾部（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐＡ）を有するエンベロープのためにコードするプラスミドｐＭＤ２．Ｇを示す。
【図６】図６は、ＰＳＭＡ特異的ペプチドターゲティングモジュール（ＴＭ−ｐＰＳＭＡ）の存在下で、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現する標的細胞（ＰＳＭＡを発現するよう遺伝子操作されたＯＣＩ−ＡＭＬ３）に向けてＵｎｉＣＡＲを発現するよう遺伝子操作されたヒト未処置Ｔ細胞のペプチドターゲティングモジュール用量依存的細胞毒性活性を示す。２４時間および４８時間のインキュベーション時間後に標的細胞のみを用いた対照試料と比較した溶解を示す。アロ反応性の対照のために、ＵｎｉＣＡＲ−ＴをＴＭ−ｐＰＳＭＡの非存在下で標的細胞とともにインキュベートした（細胞のみ）。
【図７】図７は、ペプチドターゲティングモジュールによる標的細胞に対する免疫シナプスの確立の際にＵｎｉＣＡＲを発現するよう遺伝子操作されたヒト未処置Ｔ細胞のＴ細胞特異的サイトカイン（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンガンマＩＦＮ−γ、インターロイキン２ＩＬ−２、および腫瘍壊死因子アルファＴＮＦ□）のペプチドターゲティングモジュール用量依存的分泌を示す。
【図８】図８は、ペプチドターゲティングモジュールによる標的細胞への免疫シナプスの確立の際に活性化マーカーＣＤ２５表面発現によって決定されるようにＵｎｉＣＡＲを発現するよう遺伝子操作されたヒト未処置Ｔ細胞のペプチドターゲティングモジュール用量依存的活性化を示す。
【図９】図９は、グルタミン酸−尿素−リジンモチーフの後に、単一のキレーター（すなわち、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＨＢＥＤ）キレーター）または芳香族アミノ酸もしくはその複合体であるＺ、およびＬａ５Ｂ９エピトープへ接続された２つ以上のリピートのリンカー（すなわち、ＰＥＧリンカー）であるＯを結合するＰＳＭＡへ結合する本発明によるターゲティングモジュールを図示する。
【図１０】図１０は、グルタミン酸−尿素−リジンモチーフの後に、単一のキレーター（すなわち、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＨＢＥＤ）キレーター）であるＺまたは芳香族アミノ酸もしくはその複合体であるＺ、およびＬａ７Ｂ６エピトープへ接続された２つ以上のリピートのリンカー（すなわち、ＰＥＧリンカー）であるＯを結合するＰＳＭＡへ結合する本発明によるターゲティングモジュールを図示する。
【００７６】
好ましい実施形態において、タグは、ヒト核Ｌａタンパク質由来のペプチドである。実施形態において、ヒト核Ｌａタンパク質由来のペプチドは、モノクローナル抗Ｌａ抗体５Ｂ９または７Ｂ６によって認識される短鎖線状エピトープから選択される。好ましくは、タグは、配列番号２５によるヒト核Ｌａタンパク質（Ｅ５Ｂ９）由来の、または配列番号２７によるＥ７Ｂ６由来の短鎖線状エピトープである。
【００７７】
さらなる実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、少なくとも１つの追加のリガンドをさらに含む。追加のリガンドは、標的抗原結合には関与しない。実施形態において、少なくとも１つの追加のリガンドは、ターゲティングモジュールのＮ末端もしくはＣ末端へ融合した同時刺激リガンドまたはサイトカインから選択され、好ましくは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２７またはＩＬ−２、ＩＬ−７，ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩｌ−２１の細胞外ドメインである。さらなる実施形態において、少なくとも１つの追加のリガンドは、標的細胞および隣接細胞の中で細胞死を誘導する化合物から選択される。
【００７８】
さらなる実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、キレーターをさらに含む。本明細書で使用する場合、「キレーター」という用語は、１つの金属イオンと２つ以上の別個の配位結合を形成する化合物を称する。実施形態において、キレーターは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）、６−ヒドラジノプリジン（Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｐｒｉｄｉｎｅ）−３−カルボン酸（Ｈｙｎｉｃ）、ヒドロキシベンジルエチレンジアミン（ＨＢＥＤ）、Ｎ，Ｎ’−ビス［２−ヒドロキシ−５−（カルボキシエチル）ベンジル］エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ−ＣＣ）または２−（３−（１−カルボキシ−５−［（６−フルオロ−ピリジン−３−カルボニル）−アミノ］−ペンチル）−ウレイド）−ペンタン二酸（ＤＣＦＰｙＬ）から選択される。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、Ｃ末端にキレーターを含む。
【００８０】
実施形態において、キレーターを含む本発明によるターゲティングモジュールは、金属または金属イオン、好ましくは放射性核種をさらに含む。「放射性核種」という用語は、不安定にする過剰な核エネルギーを有する原子を称する。実施形態において、放射性核種は、５１Ｃｒ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１３３Ｘｅ、１５３Ｓｍ、１６９Ｅｒ、１８６Ｒｅ、２０１Ｔｌまたは２２４Ｒａから選択される。
【００８１】
実施形態において、キレーターを含む本発明によるターゲティングモジュールは、放射性標識した化合物の調製のために使用される。
【００８２】
実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、ＰＳＭＡへ結合し、グルタミン酸−尿素−リジンモチーフの後に短鎖リンカーおよびＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＨＢＥＤ）キレーターを結合するＰＳＭＡを含む、式（Ｉ）による構造を有する。ＰＥＧリンカーは、キレーターの後にＬａ５Ｂ９エピトープが続いているものへ接続される。
【００８３】
【化１】
2020525408.tif 000003
【００８４】
実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、ＰＳＭＡへ結合し、グルタミン酸−尿素−リジンモチーフの後に短鎖リンカーおよびＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＨＢＥＤ）キレーターを結合するＰＳＭＡを含む、式（ＩＩ）による構造を有する。
【００８５】
【化２】
2020525408.tif 000004
【００８６】
実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、ＩＬ１３ＲＡ２へ結合し、ＩＬ１３ＲＡ２結合モチーフの後にリンカーおよびＬａ５Ｂ９エピトープが続くものを含む、配列番号２６による構造を有する。
【００８７】
ターゲティングモジュールの生成
ペプチドターゲティングモジュール（ｐＴＭ）は、ある特定のヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部分と、ＵｎｉＣＡＲの結合部分によって認識されるタグという２つのドメインを含む。ｐＴＭは、当業者に公知の技術によって製造されることができる。これらの技術には、ポリペプチド鎖の人工的な合成または固相および液相の化学合成が含まれるが、それらに限定されない。
【００８８】
一態様において、ｐＴＭは、単一の、２つのまたは複数の液相の化学合成手順において合成されてもよい。第一の工程として、１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミンヒドロクロリド（Ｆｍｏｃ−ＴＯＴＡ＊ＨＣｌ）リンカー分子を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解し、２−クロロトリチルポリスチレン樹脂（２−クロロトリチルＰＳ）へとロードされる。それにより、Ｆｍｏｃ−ＴＯＴＡ＊ＨＣｌは、さらなる加工のためにその樹脂へ共有結合する。２−クロロトリチルクロリド樹脂の未反応の２つのクロロトリチルクロリドを遮断するために、ＤＣＭ中のメタノールおよびＤＩＰＥＡからなるキャッピング溶液を使用することができる。その後、最終的な分子中でリンカーとして後に機能する共有結合構造４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミン（ＴＯＴＡ）をそのフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基から、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンを用いて脱保護する。次に、フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）戦略を使用して、固定したＴＯＴＡへアミノ酸を順次付加することができる。単一のアミノ酸は、対応する保護基によって保護される。カップリングは、ＤＭＣ／Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびエチル２−シアノ−２−ヒドロキシイミノ）アセタート（Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ）を用いて、またはＢｏｃ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン（ジシクロヘキシルアンモニウム）塩（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ＊ＤＣＨＡ）およびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）をカップリング試薬として用いて行うことができる。このように、２〜１００で長さが変わるアミノ酸鎖を生成することができる。ＴＯＴＡリンカーを有する構築したペプチドは、ジメチルカルボナート（ＤＣＭ）中のヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を用いて樹脂から開裂する。側鎖の保護基およびＮ末端ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）は影響されない。ＤＣＭは、溶媒として用いられる。
【００８９】
ＨＰＬＣ処理を用いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）対イオンを酢酸対イオンと置き換えた後、最終的な凍結乾燥を行う。
【００９０】
最終生成物は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、精製することができる。特に、逆相ＨＰＬＣは役立つことができる。共通の精製緩衝液はＴＦＡである。あるいはまたはそれに加えて、イオン交換クロマトグラフィーを適用して、最終的なペプチド生成物を精製することができる。
【００９１】
さらなる実施形態において、本発明によるターゲティングモジュールは、癌、感染症、炎症性障害および自己免疫障害の処置において使用される。
【００９２】
さらなる態様において、本発明は、
ａ）本発明による少なくとも１つのターゲティングモジュールと
ｂ）共通キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターまたは細胞と
を含むキットをさらに含み、この中で、共通キメラ抗原受容体は、３つのドメインを含み、この中で、
第一のドメインは、タグ結合ドメインであり、
第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインであり、かつ
第三のドメインは、シグナル伝達ドメインであり、
この中で、タグ結合ドメインは、本発明によるターゲティングモジュールのタグへ結合する。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「共通キメラ抗原受容体」という用語は、人工のキメラ融合タンパク質、特にタグ結合ドメインと、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含む受容体を称する（図２）。ドメインは、異なる源に由来することができ、それゆえ、受容体はキメラと呼ばれる。有利なことに、受容体は、タグ結合ドメインを用いて、異なるターゲティングモジュールへ結合することができ、それゆえ共通である。
【００９４】
有利なことに、共通キメラ抗原受容体（ＵｎｉＣＡＲ）をコードする核酸を含む細胞は、ＵｎｉＣＡＲを発現し、これは、ターゲティングモジュールのタグに対する結合特異性を有し、このターゲティングモジュールが次に、細胞表面タンパク質または細胞外構造へ結合する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質の残余部分から独立して存在することができかつ機能することができるタンパク質配列の一部を称する。
【００９６】
実施形態において、キットは、本発明による少なくとも２つのターゲティングモジュールを含み、この中で、少なくとも２つのターゲティングモジュールは、ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な異なる化学的に合成されたペプチド結合部分と、同じタグとを含み、この中で、タグは、ヒト核タンパク質に由来するペプチドである。
【００９７】
実施形態において、キットは、本発明による１〜５個のターゲティングモジュール、好ましくは１〜３個のターゲティングモジュールを含む。
【００９８】
実施形態において、タグ結合ドメインは、ＵｎｉＣＡＲを含むポリペプチドのアミノ末端に存在する。有利なことに、アミノ末端にタグ結合ドメインを配置することで、タグ結合ドメインは、標的細胞へ結合したタグ付きのターゲティングモジュールへアクセスすることができるようになる。
【００９９】
さらなる実施形態において、タグ結合ドメインは、抗体または抗原結合フラグメントである。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、Ｆａｂの可変領域を介して抗原を結合するタンパク質を称する。フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントは、抗原へ結合する抗体上にある領域である。Ｆａｂフラグメントは、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成されている。本明細書で使用する場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体の軽鎖または重鎖の少なくとも可変ドメインを含むタンパク質を称する。実施形態において、抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリによって生成されるフラグメントから選択される。
【０１００】
実施形態において、タグ結合ドメインは、動物種から、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、またはネコなどの哺乳類動物から得られる。好ましくは、タグ結合ドメインは、ヒトまたはヒト化抗体である。
【０１０１】
実施形態において、タグ結合ドメインは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であり、この中で、非ヒト抗体の抗原結合領域は、組換えＤＮＡ技術によってヒト抗体のフレームワーク内へと転移する。
【０１０２】
実施形態において、選択されたタグへの抗体は、特定のタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性特性を保有する何らかの部分、フラグメントまたはオリゴペプチドを用いた注射を経て、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトを含むがこれらに限定されない種々の宿主の免疫化によって産生されることができる。
【０１０３】
実施形態において、タグ結合ドメインは、ヒト核Ｌａタンパク質由来のタグへ結合し、好ましくは、タグ結合ドメインは、抗体または抗原結合フラグメントであり、この中で、タグ結合ドメインは、抗ＬａエピトープｓｃＦｖ、より好ましくは、配列番号２１および２２または２３および２４による抗ＬａエピトープｓｃＦｖを構成する。
【０１０４】
有利なことに、タグは、生理学的条件下で未処置のタンパク質の脈絡で対応するタグ結合ドメインによって接近されることができずかつ結合することができない、核抗原由来のペプチド配列である。さらに有利なことに、タグは免疫原性ではない。このことは、サイトカインストームまたはサイトカイン放出シンドローム（ＣＲＳ）と種々に称される、毒性レベルのサイトカインの放出のような、ＵｎｉＣＡＲ発現免疫細胞による制御されていないオンターゲットオフサイトの毒性の危険性を最小限にする。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」という用語は、共有結合した抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを含む人工の抗原結合フラグメントを称する。実施形態において、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、１０〜２５個のアミノ酸からなる短鎖ペプチドによって共有結合している。さらなる実施形態において、短鎖ペプチドは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結させており、またはこの逆も真である。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「細胞外ヒンジ」という用語は、ＵｎｉＣＡＲがその特定のタグへの最適な結合のために細胞の表面から突出することができる、タグ結合ドメインおよび膜貫通ドメインを接続する可撓性ペプチド配列を称する。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、膜内で熱力学的に安定であり、それゆえＵｎｉＣＡＲを細胞の細胞膜内へとつなぎ留めるペプチド配列を称する。
【０１０８】
さらなる実施形態において、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８分子のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａ鎖、ＮＫ細胞受容体、好ましくはナチュラルキラー基ＮＫＧ２Ｄ、または抗体の定常領域の一部、ならびにこれらの組み合わせから選択される。本明細書で使用する場合、「これらの組み合わせ」という用語は、異なるヒンジおよび膜貫通ドメインの組み合わせを称する。
【０１０９】
Ｐｉｎｔｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｐｉｎｔｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４およびＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６は、ＣＡＲにおけるヒトＣＤ２８分子のヒンジおよび膜貫通ドメインの使用を説明している（Ｐｉｎｔｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｐｉｎｔｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６）。
【０１１０】
Ｃａｒｐｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＡＲにおけるヒトＣＤ８α分子のヒンジおよび膜貫通ドメインの使用を説明している（Ｃａｒｐｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０１１１】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６は、ＣＡＲにおけるＮＫＧ２Ｄのヒンジおよび膜貫通ドメインの使用を説明している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【０１１２】
Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ） の定常領域の部分のヒンジおよび膜貫通ドメインの使用を説明している（Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７ｂ）。Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩｇＧ４の定常領域のヒンジドメインの使用を説明している。
【０１１３】
細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインの組み合わせの例は、ＣＤ２８細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ８アルファ細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８と組み合わされたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４定常領域、またはＣＤ１３７膜貫通ドメインであるがこれらに限定されない。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、ヒト細胞表面のタンパク質またはタンパク質複合体（標的細胞）へのＵｎｉＣＡＲを発現する細胞（エフェクター細胞）の架橋によって、細胞内へとシグナルを伝達するアミノ酸配列を称する。エフェクターと標的細胞との間の架橋は、本発明によるターゲティングモジュールによって仲介される。
【０１１５】
さらなる実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤＡＰ１０およびＣＤ２７の細胞質領域、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ３鎖の細胞質領域、ＤＡＰ１２および活性化Ｆｃ受容体から選択される。
【０１１６】
Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．およびＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＡＲにおけるシグナル伝達ドメインとしてのＣＤ２８の細胞質領域の使用を説明している（Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【０１１７】
Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＦｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．は、シグナル伝達ドメインとしてのＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞質領域の使用を説明している（Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０１１８】
Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｏｍｂａｃｈ  ａｎｄ  Ａｂｋｅｎ  ２０１１およびＨｏｍｂａｃｈ  ａｎｄ  Ａｂｋｅｎ  ２０１３は、ＣＡＲにおけるシグナル伝達ドメインとしてのＣＤ１３４（ＯＸ４０）の細胞質領域の使用を説明している（Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｈｏｍｂａｃｈ  ａｎｄ  Ａｂｋｅｎ  ２０１１、Ｈｏｍｂａｃｈ  ａｎｄ  Ａｂｋｅｎ  ２０１３）。
【０１１９】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、シグナル伝達ドメインとしてのＤＡＰ１０の使用を説明している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【０１２０】
Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＡＲにおけるシグナル伝達ドメインとしてのプログラム細胞死１（ＰＤ−１）および細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）の使用を説明している（Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０１２１】
Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．およびＧａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＡＲにおけるシグナル伝達ドメインとしての細胞質領域ＣＤ３鎖、特にＣＤ３Ｃζ鎖の使用を説明している（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｇａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【０１２２】
Ｔｏｅｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＡＲにおけるシグナル伝達ドメインとしてのＤＡＰ１２の使用を説明している（Ｔｏｅｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０１２３】
Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．およびＫｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．は、シグナル伝達ドメインとしての活性化Ｆｃ受容体、特にＦｃイプシロン受容体γ鎖の使用を説明している（Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【０１２４】
実施形態において、共通キメラ抗原受容体は、特に好ましくはＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤＡＰ１０およびＣＤ２７の細胞質領域、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ３鎖の細胞質領域、ＤＡＰ１２ならびに活性化Ｆｃ受容体から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、好ましくは２つ、３つ、４つまたはそれより多数のシグナル伝達ドメインを含む。
【０１２５】
さらなる実施形態において、配列番号１によるＵｎｉＣＡＲ０１と称される共通キメラ抗原受容体をコードする核酸が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ−２ｍリーダーペプチド、配列番号３による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号４による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号５による変異した結合モチーフを有するヒトＣＤ２８細胞外部分と、配列番号６によるＣＤ２８膜貫通ドメインと、配列番号７による変異したインターナリゼーションモチーフを含むヒトＣＤ２８細胞内部分とを含む配列番号５〜７によるヒトＣＤ２８部分、および配列番号８によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。
【０１２６】
配列番号１による核酸のタンパク質発現の生成物は、配列番号１７において得ることができる。
【０１２７】
配列番号３によるヒト化抗Ｌａ５Ｂ９可変領域重鎖の核酸配列は、配列番号２１によるタンパク質をコードするのに対し、配列番号４によるヒト化抗Ｌａ５Ｂ９可変領域軽鎖は、配列番号２２によるタンパク質のためにコードする。
【０１２８】
さらなる実施形態において、配列番号９によるＵｎｉＣＡＲ０２と称される共通キメラ抗原受容体をコードする核酸配列が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ−２ｍリーダーペプチド、配列番号３による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号４による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号１０および１１によるヒトＣＤ８アルファ鎖の細胞外ヒンジおよび膜貫通領域、配列番号１２によるヒトＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに配列番号８によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。
【０１２９】
配列番号９による単離された核酸配列のタンパク質発現の生成物は、配列番号１８において得ることができる。
【０１３０】
配列番号１３によるＵｎｉＣＡＲ０３と称される共通キメラ抗原受容体をコードする核酸が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ−２ｍリーダーペプチド、配列番号１４による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号１５による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号５による変異した結合モチーフを有するヒトＣＤ２８細胞外部分と、配列番号６によるＣＤ２８膜貫通ドメインと、配列番号７による変異したインターナリゼーションモチーフを含むヒトＣＤ２８細胞内部分、および配列番号８によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。
【０１３１】
配列番号１３による核酸のタンパク質発現の生成物は、配列番号１９において得ることができる。
【０１３２】
配列番号１４によるヒト化抗７Ｂ６可変領域重鎖の核酸配列は、配列番号２３によるタンパク質のためにコードするのに対し、配列番号１５によるヒト化抗７Ｂ６可変領域軽鎖は、配列番号２４によるタンパク質のためにコードする。
【０１３３】
さらなる実施形態において、配列番号１６によるＵｎｉＣＡＲ０４と称される逆向きの共通キメラ抗原受容体をコードする核酸が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ−２ｍリーダーペプチド、配列番号１４による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号１５による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号１０および１１によるヒトＣＤ８アルファ鎖の細胞外ヒンジおよび膜貫通領域、配列番号１２によるヒトＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに配列番号８によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。
【０１３４】
配列番号１６による単離された核酸配列のタンパク質発現の生成物は、配列番号２０において得ることができる。
【０１３５】
さらなる実施形態において、共通キメラ抗原受容体は、第四のドメインを含み、この中で、第四のドメインは、受容体の細胞外部分における短鎖ペプチドリンカーである。
【０１３６】
さらなる実施形態において、第四のドメインは、第四のドメインへ特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍａｂ）のための線状エピトープを形成する。実施形態において、第四のドメインは、少なくとも１つの線状エピトープを含む。
【０１３７】
さらなる実施形態において、第四のドメインは、タグ結合ドメイン内に、タグ結合ドメインと細胞外ヒンジドメインまたは細胞外ヒンジドメインの統合部分との間に配置される。
【０１３８】
有利なことに、第四のドメインをＵｎｉＣＡＲ移植した免疫細胞は、試験管内または生体内のいずれかで移植されていない免疫細胞と比較して、優先的に増殖しかつより長期に永続するよう特異的に刺激されることができる。さらに有利なことに、第四のドメインは、混合した細胞集団からＵｎｉＣＡＲ移植免疫細胞を精製し、またはＵｎｉＣＡＲ移植免疫細胞仲介性免疫応答を減衰させ、かつＵｎｉＣＡＲ移植免疫細胞を生体内で除去するために使用することもできる。
【０１３９】
さらなる実施形態において、共通キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドを含む。有利なことに、このシグナルペプチドは、エフェクター細胞の細胞表面上での発現を可能にする。実施形態において、シグナルペプチドは、タグ結合ドメインの正面にあるＵｎｉＣＡＲ核酸配列のＮ末端にある。実施形態において、シグナルペプチドは、翻訳と同時または翻訳後のいずれかで分泌経路へのタンパク質を標的にして、免疫原性反応を回避するためにＣＤ２８、ＣＤ８アルファ、ＩＬ−２またはヒト起源の抗体の重鎖もしくは軽鎖のようなタンパク質由来のリーダーペプチドから選択される。
【０１４０】
さらなる実施形態において、この核酸は、ｃＤＮＡである。ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）という用語は、逆転写酵素という酵素によって触媒される反応において、一本鎖ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡから合成される二本鎖ＤＮＡを称する。
【０１４１】
実施形態において、細胞は、処置されることになっている疾患および当疾患を処置するために利用可能な手段に応じて、自家細胞、同系細胞または同種異系細胞から選択される。実施形態において、細胞は、調節性Ｔ細胞を含むＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージなど、細胞溶解活性、食作用活性または免疫抑制活性を有する免疫細胞から選択される。好ましい実施形態において、細胞は、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞または幹細胞記憶Ｔ細胞もしくは中央記憶Ｔ細胞のようなＴ細胞の部分集団、細胞毒性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞を含むＴ細胞、あるいはＮＫ細胞から選択される。一態様において、エフェクター細胞は、ある特定のＨＬＡ背景に由来しており、自家系または同種異系において利用される。エフェクター細胞は、処置中の対象の腫瘍の外殖片または処置中の対象の腫瘍内細胞からを含む、何らかの源から単離することができる。実施形態において、エフェクター細胞は、個々の細胞がＵｎｉＣＡＲを発現する遺伝子操作の前または後の多能性幹細胞または多分化能幹細胞または始原細胞からの試験管内分化によって作製されてもよい。以下において、「エフェクター細胞」という用語は、その細胞表面上でＵｎｉＣＡＲを発現するよう遺伝的に変更された上述の何らかの種類の免疫細胞を称する。
【０１４２】
ＵｎｉＣＡＲ細胞の作製
免疫細胞は、種々の方法によってＵｎｉＣＡＲを発現するよう遺伝子操作することができる。ＵｎｉＣＡＲをコードするポリヌクレオチドベクターおよび遺伝子操作された免疫細胞内でのＵｎｉＣＡＲの発現を確実にするすべての必要な要素は、免疫細胞内へと移入される。ベクターの移入は、電気穿孔法、または核酸のトランスフェクション、またはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、泡沫状ウイルスもしくはレンチウイルスのウイルス遺伝子移入のようなウイルスベクター系の助力によって実施することができる。
【０１４３】
レンチウイルス遺伝子移入は、選択されたＵｎｉＣＡＲのためにコードするレンチウイルスベクターをまず構築することによる免疫細胞内でのＵｎｉＣＡＲの安定した発現のために適用される。レンチウイルスベクターは、ベクターのレンチウイルス部分がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する、かつＭＳＣ／ＩＲＥＳ／ＺｘＧｒｅｅｎＩ部分がＵｎｉＣＡＲコンストラクトによって置き換えられた、図３に示すようなｐＬＶＸ−ＥＦ１アルファＵｎｉＣＡＲ２８／ζ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｇｒｏｕｐ）である。
【０１４４】
レンチウイルス粒子は、ＵｎｉＣＡＲをコードするレンチウイルスベクタープラスミドを用いたヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＣＣ６３５）細胞の一過性トランスフェクションならびに図４において図示するような群特異抗原（ｇａｇ）とポリメラーゼ（ｐｏｌ）とをコードするプラスミド（ｐｓＰＡＸ２）および図５において示すようなエンベロープのためにコードするプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）を用いた同時トランスフェクションによって作製される。ＭＤ２．Ｇというプラスミドは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）の糖タンパク質をコードする。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、広範な範囲の哺乳類動物細胞を形質導入するためにレンチウイルスベクターに対して使用される。異なるウイルス種由来の種々のエンベロープは、この目的のために利用することができる。レンチウイルスベクターは、両種指向性のマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）もしくは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧタンパク質、原型泡沫状ウイルス（ＰＦＶ）の改変されたエンベロープ、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）およびＭＬＶに由来するキメラエンベロープ糖タンパク質バリアントを用いてうまく偽型形成することができる。
【０１４５】
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に由来する上清は、トランスフェクションの２４〜９６時間後に収集され、ウイルス粒子は限外濾過または他の方法によって上清から濃縮される。免疫細胞のレンチウイルス形質導入のために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または単離されたＴ細胞は、ＣＤ３複合体に特異的なｍａｂ、例えば、いずれも溶液中に付与されるまたはプラスチック細胞培養ディッシュもしくは磁気ビーズへコーティングされるＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１というクローンを用いて活性化される。ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞の活性化は、単独でまたはインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１のような外来性組換えサイトカインとの組み合わせならびにこれらを用いた供給においてのいずれかで、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７に特異的なｍａｂまたはリガンドを用いて同時刺激経路を刺激することによってさらに増強される。濃縮されたまたは非濃縮のウイルス粒子は、単回投与または複数回投与として活性化するＣＤ３抗体および／または組換えサイトカインの初回投与の２４〜９６時間後にＰＢＭＣ培養物またはＴ細胞培養物へ添加される。
【０１４６】
Ｔ細胞の安定した形質導入は、ＵｎｉＣＡＲの表面発現、またはウイルス上清の最終投与の３日後からＵｎｉＣＡＲの第四のドメインに対して向けられるｍａｂの表面発現に対するタグ含有ターゲティングモジュールを用いた染色後の、測定されたフローサイトメトリーであってもよい。ＵｎｉＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、組換えサイトカインおよび活性化する抗ＣＤ３ｍａｂの供給下でそのＴ細胞を培養することによって、試験管内で増殖させることができる。
【０１４７】
ＵｎｉＣＡＲが任意の第四のドメイン、すなわちｍａｂに対する線状エピトープを形成するペプチド配列を有する場合、ＵｎｉＣＡＲを発現するよう遺伝子改変された免疫細胞は、第四のＵｎｉＣＡＲドメインへ結合しているｍａｂまたはその抗体フラグメントを、何らかの種類の培養ディッシュの表面へ、または１ビーズ：１〜４ＵｎｉＣＡＲ移植エフェクター細胞という規定の比で細胞培養物へ添加するビーズへコーティングすることによって、試験管内で特異的に増殖させることができる。ＵｎｉＣＡＲペプチドドメインに対する表面コーティングされたｍａｂの結合は、細胞表面に発現したＵｎｉＣＡＲの架橋および免疫シナプスの形成を誘導し、このことは、ＵｎｉＣＡＲのシグナルドメインによって特異的に惹起されるシグナル経路の活性化をもたらす。誘導されるシグナル経路に応じて、このことは、ＵｎｉＣＡＲ担持免疫細胞の増殖および活性化誘導細胞死に対する耐性の持続を増強すること、それゆえ混合集団におけるＵｎｉＣＡＲで遺伝子改変された免疫細胞の増加をもたらす可能性がある。
【０１４８】
ｍａｂについての線状エピトープを形成するペプチド配列である任意の第四のドメインは、混合集団から免疫細胞を発現するＵｎｉＣＡＲを濃縮および精製するためにさらに利用することができる。濃縮および精製は、細胞選別のためにＵｎｉＣＡＲ発現細胞を標識するかまたは細胞単離のために利用することができる小粒子へＵｎｉＣＡＲ発現免疫細胞を一過性に連結するかのいずれかのために、第四のＵｎｉＣＡＲドメインへ結合しているｍａｂまたはその抗体フラグメントの助力で実施される。一態様において、ＵｎｉＣＡＲ移植免疫細胞は、第四のドメインを認識するｍａｂとともにインキュベートされる。次に、任意の第四のドメインへ結合しているｍａｂの種特異的かつアイソタイプ特異的な重鎖および軽鎖に対して向かう抗体またはそのフラグメントと結合した磁気ビーズが添加される。したがって、ＵｎｉＣＡＲ発現免疫細胞および磁気ビーズが連結されて、磁場において捕捉され、かつ他の免疫細胞から分離される。
【０１４９】
本発明は、本発明によるキットを含む医薬組成物をさらに含む。
【０１５０】
医薬組成物は、好ましくは非経口的に投与され、特に好ましいのは静脈的である。実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与に適した形態で存在する。好ましくは、医薬組成物は、液剤、エマルション、または懸濁剤である。
【０１５１】
実施形態において、医薬組成物は、０．１μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのターゲティングモジュール、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのターゲティングモジュールを含む注射可能な緩衝液である。
【０１５２】
実施形態において、医薬組成物は、医薬として許容され得る希釈剤または担体をさらに含む。実施形態において、担体は、水、緩衝水、０．４％塩類溶液、０．３％グリシンまたは類似の溶媒である。実施形態において、緩衝水は、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０のｐＨ値のヒスチジン緩衝水、ｐＨ６．０のｐＨの特に好ましいヒスチジン緩衝水；またはコハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、もしくはリン酸カリウム緩衝水から選択される。実施形態において、緩衝液は、１ｍｍｏｌ／ｌ（ｍＭ）〜５００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、特に好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭを有する。実施形態において、担体は、塩化ナトリウムを、好ましくは０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で、特に好ましい１５０ｍＭで含む。実施形態において、医薬組成物は、安定剤を好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で特に好ましい５ｍＭ〜１０ｍＭでさらに含む。実施形態において、安定剤は、Ｌ−メチオニンである。
【０１５３】
実施形態において、医薬組成物は、医薬として許容され得る賦形剤をさらに含む。「医薬として許容され得る賦形剤」という用語は、適切な生理学的条件を提供する化合物、ならびに／またはｐＨ値および緩衝剤を調整するための薬剤、毒性を調整するための薬剤、ならびにこれらに類するものなど、安定性を高めるための化合物を称する。実施形態において、医薬として許容され得る賦形剤は、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび乳酸ナトリウムから選択される。
【０１５４】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、１回の投与当たり０．１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの薬用量、好ましくは１μｇ／体重ｋｇ〜１００μｇ／体重ｋｇの薬用量でターゲティングモジュールを含む。
【０１５５】
さらなる実施形態において、医薬組成物は無菌である。医薬組成物は、従来の周知の技術によって無菌化されている。
【０１５６】
実施形態において、本発明によるキットを含む医薬組成物は、対象への投与のために使用される。
【０１５７】
本発明は、癌、感染症および自己免疫障害の処置における使用のための、本発明によるキットまたは本発明による医薬組成物をさらに含む。「自己免疫障害」という用語は、体内で通常存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答を称する（自己免疫）。
【０１５８】
実施形態において、本発明によるキットまたは本発明による医薬組成物は、癌または自己免疫疾患の症例における治療用途および／または診断用途のために薬剤を調製するために使用される。
【０１５９】
本発明は、本発明によるキットまたは本発明による医薬組成物の投与による、癌または自己免疫疾患または炎症性疾患に罹患しているヒトの処置のための方法も包含する。治療適用のために、薬理学的有効量の本発明によるターゲティングモジュールと、共通キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターまたは細胞とを含む、本発明による無菌キットまたは本発明による医薬組成物は、上述の病気を処置するために患者へ投与される。
【０１６０】
実施形態において、本発明によるキットまたは本発明による医薬組成物は、哺乳類動物における共通キメラ抗原受容体により仲介される免疫応答を刺激するために使用される。
【０１６１】
哺乳類動物における共通キメラ抗原受容体により仲介される免疫応答を刺激するための方法であって、
・哺乳類動物へ共通キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む有効量のベクターまたは細胞を投与することであって、共通キメラ抗原受容体は、３つのドメインを含み、第一のドメインがタグ結合ドメインであり、第二のドメインが細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインであり、かつ第三のドメインがシグナル伝達ドメインであり、タグ結合ドメインがヒト核タンパク質由来のタグへ結合することと
・本発明によるターゲティングモジュールを投与することと
を含む方法であって、
ターゲティングモジュールが、共通キメラ抗原受容体を発現するエフェクター細胞の投与の前に、またはその投与と同時に、またはその投与の後に対象へ投与される。
【０１６２】
好ましい実施形態において、本発明によるキット、特に本発明によるターゲティングモジュールおよびベクターもしくは細胞、または医薬組成物は、ヒトへ投与される。
【０１６３】
さらなる実施形態において、近年説明された実施形態を組み合わせることができる。
【０１６４】
引用された非特許文献
【化３】
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【０１６５】
【化４】
2020525408.tif 000006
【０１６６】
【化５】
2020525408.tif 000007
【０１６７】
【化６】
2020525408.tif 000008
【０１６８】
【化７】
2020525408.tif 000009
【０１６９】
【化８】
2020525408.tif 000010
【０１７０】
【化９】
2020525408.tif 000011
【０１７１】
【化１０】
2020525408.tif 000012
【０１７２】
参照符号
１  タグ結合ドメインである第一のドメイン
２  細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインである第二のドメイン
３  シグナル伝達ドメインである第三のドメイン
４  短鎖ペプチドリンカーである任意の第四のドメイン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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