(57)【要約】  本発明は、密封された小容積中でマイクロウェル分析を行うための方法、システム、およびキットを提供する。本発明のマイクロウェルは、マイクロウェルの幾何学的形状とビーズの幾何学的形状とのペアリングによって密封され、ビーズの直径はマイクロウェルの底の直径よりも大きい。ビーズをマイクロウェルに導入することによって、嵌め込まれたビーズの底と対象のマイクロウェルの底との間の分析空間内にサンプルを密封する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける生物活性を分析するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマイクロウェルを含んでいる基板を設ける工程であって、上記マイクロウェルは１つの頂部と１つの底とを含んでいる工程と、
ｂ）上記マイクロウェルにサンプルを導入する工程と、
ｃ）上記マイクロウェルにビーズを導入する工程であって、上記マイクロウェルにビーズを導入することによって、上記ビーズと上記マイクロウェルの上記底との間の空間に上記サンプルを封入する工程と、
ｄ）上記空間における上記サンプルの上記生物活性を分析する工程、とを含んでいる方法。
【請求項２】
上記ビーズの直径は、上記マイクロウェルの上記底の直径よりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、またはこれらを組み合わせた形状の断面を有している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記マイクロウェルは、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される形状を有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記マイクロウェルは、錐台の形状である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記基板は、複数の上記マイクロウェルを含んでいるアレイである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記アレイは、１から１００，０００，０００個の間のマイクロウェルを含んでいる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記頂部の幅よりも大きいか、同じか、または小さい幅を有している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記マイクロウェルの上記頂部の幅は、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記マイクロウェルの上記頂部は、約５０μｍ〜約１３０μｍの幅を有している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記マイクロウェルの上記底は、約５μｍ〜約３０μｍの幅を有している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記空間は、約０．１ｐＬ〜約１００ｐＬの容積を有している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記マイクロウェルにビーズを導入することによって、上記ビーズの外周部を上記マイクロウェルの壁と接触させ、それによって上記サンプルを上記空間に封入する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記ビーズの少なくとも一部は、上記マイクロウェルの上記頂部より上に突出している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記一部は、上記ビーズの体積の半分を超えない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記ビーズは、約２０μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
上記ビーズは、液体キャリアに懸濁されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
上記ビーズは、上記液体キャリアよりも高い密度を有している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記ビーズは磁性である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
上記サンプルの上記生物活性を分析することは、上記サンプルにおける生体分子の存在または量を検出することを含んでいる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
上記生体分子は、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、アミノ酸、炭水化物、オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記生体分子はＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記ＲＮＡはｍＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記ビーズは、上記生体分子と結合可能なリガンドを含んでいる、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
上記リガンドは、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記サンプルは、１つまたは複数の細胞である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
１つの細胞と１つのビーズとが上記マイクロウェルに導入される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
複数の細胞と１つのビーズとが上記マイクロウェルに導入される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記サンプルにおける上記生物活性を分析する前に、上記１つまたは複数の細胞を溶解することをさらに含んでいる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
上記生体分子は、上記生体分子の存在または量を検出する前に、上記１つまたは複数の細胞から上記空間に分泌される、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
上記１つまたは複数の細胞は、上記サンプルにおける上記生体分子の存在または量を検出する前に、上記１つまたは複数の細胞が上記空間に上記生体分子を分泌するのに十分な条件下で培養される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記基板は複数の上記マイクロウェルを含んでおり、上記ビーズを導入することは、１つのビーズを複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入することを含んでいる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
上記ビーズを導入することは、液体キャリアに懸濁された複数の上記ビーズに上記基板を接触させることを含んでいる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記サンプルを導入することは、１つ以上の細胞を複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入することを含んでいる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
サンプルにおける生成物の存在を特定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマイクロウェルを含んでいる基板を設ける工程であって、上記マイクロウェルは１つの頂部と１つの底とを有しており、上記マイクロウェルの上記頂部は上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している工程と、
ｂ）上記マイクロウェルにサンプルを導入する工程と、
ｃ）上記マイクロウェルにビーズを導入する工程であって、上記ビーズは上記生成物と結合するリガンドを含んでおり、上記マイクロウェルにビーズを導入することによって、上記ビーズと上記マイクロウェルの上記底との間の空間に上記サンプルを封入する工程と、
ｄ）上記リガンドが上記生成物と結合するのに十分な条件の下で上記ビーズと共に上記サンプルを培養する工程と、
ｅ）上記生成物の上記リガンドへの結合を検出する工程であって、それによって上記サンプルにおける上記生成物の存在を特定する工程と、を含んでいる方法。
【請求項３６】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、またはこれらを組み合わせた形状の断面を有している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記マイクロウェルは、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される形状を有している、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記マイクロウェルは、錐台の形状である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
上記基板は、複数の上記マイクロウェルを含んでいるアレイである、請求項３５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
上記アレイは、１から１００，０００，０００個の間のマイクロウェルを含んでいる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記頂部の幅よりも大きいか、同じか、または小さい幅を有している、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
上記マイクロウェルの上記頂部は、約５０μｍ〜約１３０μｍの幅を有している、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
上記マイクロウェルの上記底は、約５μｍ〜約３０μｍの幅を有している、請求項３５〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
上記空間は、約０．１ｐＬ〜約１００ｐＬの容積を有している、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
上記マイクロウェルにビーズを導入することによって、上記ビーズの外周部を上記マイクロウェルの壁と接触させ、それによって上記サンプルを上記空間に封入する、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
上記ビーズの少なくとも一部は、上記マイクロウェルの上記頂部より上に突出している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記一部は、上記ビーズの体積の半分を超えない、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上記ビーズは、約２０μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項３５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
上記ビーズは、液体キャリアに懸濁されている、請求項３５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
上記ビーズは、上記液体キャリアよりも高い密度を有している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記ビーズは磁性である、請求項３５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
上記リガンドは、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
上記生成物は、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、アミノ酸、炭水化物、オリゴヌクレオチド、ウイルス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
上記オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
上記オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
上記サンプルは１つまたは複数の細胞である、請求項３５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
１つの細胞と１つのビーズとが上記マイクロウェルに導入される、請求項３５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
複数の細胞と１つのビーズとが上記マイクロウェルに導入される、請求項３５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
上記検出する工程の前に、上記１つまたは複数の細胞を溶解することをさらに含んでいる、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
上記生成物を検出することにより細胞内生成物を検出する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
上記生成物は、上記検出する工程の前に、上記１つまたは複数の細胞から上記空間に分泌される、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
上記１つまたは複数の細胞は、上記検出する工程の前に、上記１つまたは複数の細胞が上記生成物を上記空間に分泌するのに十分な条件の下で培養される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上記基板は複数の上記マイクロウェルを含んでおり、上記ビーズを導入することは、１つのビーズを複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入することを含んでいる、請求項３５〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
上記ビーズを導入することは、液体キャリアに懸濁された複数の上記ビーズを含む組成物に上記基板を接触させることを含んでいる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
上記サンプルを導入することは、１つ以上の細胞を複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入することを含んでいる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
サンプルにおける被検物質の存在を特定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマイクロウェルを含んでいる基板を設ける工程であって、上記マイクロウェルは、１つの頂部と１つの底とを有している工程と、
ｂ）上記マイクロウェルに上記サンプルを導入する工程と、
ｃ）上記マイクロウェルに、上記被検物質と結合可能なリガンドを含んでいるビーズを導入する工程であって、上記マイクロウェルに上記ビーズを導入することによって、上記ビーズと上記マイクロウェルの上記底との間の空間に上記サンプルを封入する工程と、
ｄ）上記リガンドが上記被検物質と結合するのに十分な条件の下で上記サンプルを培養する工程と、
ｅ）上記リガンドの上記被検物質への結合を検出する工程であって、それによって上記サンプルにおける上記被検物質の存在を特定する工程と、を含んでいる方法。
【請求項６８】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、またはこれらを組み合わせた形状の断面を有している、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
上記マイクロウェルの上記頂部は、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
上記マイクロウェルは、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される形状を有している、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
上記マイクロウェルは、錐台の形状である、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
上記基板は、複数の上記マイクロウェルを含んでいるアレイである、請求項６７〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
上記アレイは、１から約１００，０００，０００個の間のマイクロウェルを含んでいる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記頂部の幅よりも大きいか、同じか、または小さい幅を有している、請求項６７〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
上記マイクロウェルの上記頂部は、約５０μｍ〜約１３０μｍの幅を有している、請求項６７〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
上記マイクロウェルの上記底は、約５μｍ〜約３０μｍの幅を有している、請求項６７〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
上記空間は、約０．１ｐＬ〜約１００ｐＬの容積を有している、請求項６７〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
上記マイクロウェルにビーズを導入することによって、上記ビーズの外周部を上記マイクロウェルの壁と接触させ、それによって上記サンプルを上記空間に封入する、請求項６７〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
上記ビーズの少なくとも一部は、上記マイクロウェルの上記頂部より上に突出している、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
上記一部は、上記ビーズの体積の半分を超えない、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
上記ビーズは、約２０μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項６７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
上記ビーズは、液体キャリアに懸濁されている、請求項６７〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
上記ビーズは、上記液体キャリアよりも高い密度を有している、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
上記ビーズは磁性である、請求項６７〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
上記リガンドは、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６７〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
上記被検物質は、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、アミノ酸、炭水化物、オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６７〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
上記被検物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項６７〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
上記被検物質は、ｍＲＮＡである、請求項６７〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
上記サンプルは、１つまたは複数の細胞である、請求項６７〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
１つの細胞と１つのビーズとが上記マイクロウェルに導入される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
複数の細胞と１つのビーズとが上記マイクロウェルに導入される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
上記検出する工程の前に、上記１つまたは複数の細胞を溶解することをさらに含んでいる、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
上記被検物質を検出することにより細胞内の被検物質を検出する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
上記被検物質は、上記検出する工程の前に、上記１つまたは複数の細胞から上記空間に分泌される、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
上記１つまたは複数の細胞は、上記検出する工程の前に、上記１つまたは複数の細胞が上記被検物質を上記空間に分泌するのに十分な条件の下で培養される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
上記基板は複数の上記マイクロウェルを含んでおり、上記ビーズを導入することは、１つのビーズを複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入することを含んでいる、請求項６７〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
上記ビーズを導入することは、液体キャリアに懸濁された複数の上記ビーズに上記基板を接触させることを含んでいる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
上記サンプルを導入することは、１つ以上の細胞を複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入することを含んでいる、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
アッセイを行うためのキットであって、
ａ）少なくとも１つのマイクロウェルを含む基板であって、上記マイクロウェルは、１つの頂部と１つの底とを有している基板と、
ｂ）少なくとも１つのビーズであって、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有しているビーズと、を備えているキット。
【請求項１０１】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、またはこれらを組み合わせた形状の断面を有している、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
上記マイクロウェルの上記頂部は、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項１００または１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
上記マイクロウェルは、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、またはこれらの組み合わせの形状を有している、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０４】
上記マイクロウェルは、錐台である、請求項１００〜１０３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０５】
上記基板は、複数の上記マイクロウェルを含んでいるアレイである、請求項１００〜１０４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０６】
上記アレイは、１から１００，０００，０００個の間のマイクロウェルを含んでいる、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記頂部の幅よりも大きいか、同じか、または小さい幅を有している、請求項１００〜１０６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０８】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項１００〜１０７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０９】
上記マイクロウェルの上記頂部は、約５０μｍ〜約１３０μｍの幅を有している、請求項１００〜１０８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１０】
上記マイクロウェルの上記底は、約５μｍ〜約３０μｍの幅を有している、請求項１００〜１０９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１１】
上記ビーズは、約２０μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項１００〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１２】
上記ビーズは、液体キャリアに懸濁されている、請求項１００〜１１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１３】
上記ビーズは、上記液体キャリアよりも高い密度を有している、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
上記ビーズは磁性である、請求項１００〜１１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１５】
上記ビーズはリガンドを含んでいる、請求項１００〜１１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１６】
上記リガンドは、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１５に記載のキット。
【請求項１１７】
溶解剤をさらに備えている、請求項１００〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１８】
細胞のサンプルにおける個々の細胞の生物活性を決定するための方法であって、
ａ）複数のマイクロウェルを含んでいるアレイを設ける工程であって、各マイクロウェルは１つの頂部と１つの底とを含んでおり、上記マイクロウェルの上記頂部は上記マイクロウェルの上記底よりも幅広である工程と、
ｂ）ビーズライブラリを設ける工程であって、上記ビーズライブラリは、複数のビーズを含んでおり、上記ビーズのそれぞれは（ｉ）各ビーズに特有の細胞特定マーカーと（ｉｉ）生体分子を結合するリガンドとを含んでいる少なくとも１つの部分を含んでいる工程と、
ｃ）上記アレイに複数の細胞を含む細胞サンプルを導入する工程であって、上記アレイに上記細胞サンプルを導入することによって、１つの細胞を複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部における１つのマイクロウェルに導入する工程と、
ｄ）上記ビーズライブラリを上記アレイに導入する工程であって、上記ビーズライブラリを上記アレイに導入することによって、１つのビーズを複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部に導入し、それによって上記１つのビーズと上記マイクロウェルの上記底との間の空間に上記１つの細胞を封入する工程と、
ｅ）上記リガンドが上記生体分子に結合するのに十分な条件の下で上記１つの細胞と上記１つのビーズとを培養する工程と、
ｆ）上記リガンドの上記生体分子への結合を検出し、且つ上記結合を上記特有の細胞特定マーカーと相関させる工程であって、それによって上記１つの細胞の生物活性を決定する工程と、を含んでいる方法。
【請求項１１９】
上記マイクロウェルに上記１つのビーズを導入することによって、上記ビーズの外周部を上記マイクロウェルの壁と接触させ、それによって上記１つの細胞を上記空間に封入する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
上記１つのビーズの少なくとも一部は、上記マイクロウェルの上記頂部より上に突出している、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
上記一部は、上記１つのビーズの体積の半分を超えない、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
上記ビーズライブラリにおける上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項１１８〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
上記マイクロウェルの上記頂部は、約５０μｍ〜約１３０μｍの幅を有している、請求項１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
上記マイクロウェルの上記底は、約５μｍ〜約３０μｍの幅を有している、請求項１１８〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、またはこれらを組み合わせた形状の断面を有している、請求項１１８〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
上記マイクロウェルは、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される形状を有している、請求項１１８〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
上記マイクロウェルは錐台の形状である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
上記空間は、約０．１ｐＬ〜約１００ｐＬの容積を有している、請求項１１８〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
上記ビーズライブラリにおける各ビーズは複数の部分を含んでおり、各部分は（ｉ）各ビーズに特有の細胞特定マーカーと、（ｉｉ）上記生体分子と結合するリガンドと、（ｉｉｉ）各部分に特有のリガンド指標マーカーとを含んでおり、
上記検出する工程は、上記複数の部分の各リガンドへの上記生体分子の結合を検出することと、上記結合を上記特有の細胞特定マーカーおよび各リガンド指標マーカーと相関させ、それによって上記１つの細胞の生物活性を特定することと、を含んでいる、請求項１１８〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
上記生体分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１１８〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
上記生体分子は、ｍＲＮＡである、請求項１１８〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
上記リガンドは、オリゴヌクレオチドである、請求項１１８〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
各部分はオリゴヌクレオチドを含んでおり、当該オリゴヌクレオチドは、上記細胞特定マーカー、上記リガンド、および上記リガンド指標マーカーをコードしている、請求項１１８〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
上記１つの細胞は、上記培養する工程の前に溶解される、請求項１１８〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
上記培養する工程は、上記１つの細胞が上記生体分子を分泌するのに十分な条件に上記１つの細胞を曝露することを含んでいる、請求項１１８〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
上記アレイは、少なくとも１００個の上記マイクロウェルを含んでいる、請求項１１８〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
上記ビーズライブラリにおける上記ビーズは、約２０μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項１１８〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
上記ビーズライブラリは液体キャリアに懸濁されている、請求項１１８〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
上記ビーズライブラリにおける上記ビーズは、上記液体キャリアよりも高い密度を有している、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
上記ビーズライブラリにおける上記ビーズは磁性である、請求項１１８〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
１つのビーズと１つの細胞とを含んでいる複数の上記マイクロウェルの一部は、約１０〜約９０％の間である、請求項１１８〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
細胞のサンプルにおける個々の細胞中の標的核酸の出現数を決定するための方法であって、
ａ）複数のマイクロウェルを含んでいるアレイを設ける工程であって、各マイクロウェルは１つの頂部と１つの底とを含み、上記マイクロウェルの上記頂部は、上記マイクロウェルの上記底よりも幅広である工程と、
ｂ）上記マイクロウェルの上記底より幅広の複数のビーズを含んでいるビーズライブラリを設ける工程であって、上記ビーズは上記標的核酸とハイブリダイズ可能な複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含んでおり、上記捕捉オリゴヌクレオチドの各々は、（ｉ）各ビーズに特有のオリゴヌクレオチド細胞マーカー部と、（ｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチドの各々に特有のオリゴヌクレオチド標識部と、を含んでいる工程と、
ｃ）上記アレイに上記ビーズライブラリと、複数の細胞を含んでいる細胞サンプルとを導入する工程であって、上記アレイに上記ビーズライブラリと上記細胞サンプルとを導入することによって１つの細胞と１つのビーズとを複数の上記マイクロウェルの少なくとも一部における１つのマイクロウェルに導入し、上記１つのビーズは上記１つのビーズと上記マイクロウェルの上記底との間の空間に上記１つの細胞を封入する工程と、
ｄ）上記１つの細胞に上記標的核酸を放出させて、上記１つの細胞から放出された上記標的核酸を上記１つのビーズ上の上記捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズさせる工程と、
ｅ）複数のオリゴヌクレオチド結合体を作製するための反応を行う工程であって、各結合体は、上記少なくとも１つのハイブリダイズされた標的核酸と、上記細胞マーカー部に相補的なオリゴヌクレオチドと、上記標識部に相補的なオリゴヌクレオチドとを含んでいる工程と、
ｆ）上記複数のオリゴヌクレオチド結合体を増幅する工程と、
ｇ）上記標的核酸を各細胞マーカー部および各標識部と相関させることによって、上記複数のオリゴヌクレオチド結合体における上記標的核酸の出現数を決定する工程、とを含んでいる方法。
【請求項１４３】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、またはこれらを組み合わせた形状の断面を有している、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
上記マイクロウェルの上記頂部は、上記マイクロウェルの上記底の幅よりも大きい幅を有している、請求項１４２または１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
上記マイクロウェルは、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される形状を有している、請求項１４２〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
上記マイクロウェルは、錐台の形状である、請求項１４２〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
上記アレイは、１から１００，０００，０００個の間のマイクロウェルを含んでいる、請求項１４２〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
上記ビーズは、上記マイクロウェルの上記頂部の幅よりも大きいか、同じか、または小さい幅を有している、請求項１４２〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
上記マイクロウェルの上記頂部は、約５０μｍ〜約１３０μｍの幅を有している、請求項１４２〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
上記マイクロウェルの上記底は、約５μｍ〜約３０μｍの幅を有している、請求項１４２〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
上記空間は、約０．１ｐＬ〜約１００ｐＬの容積を有している、請求項１４２〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
上記アレイに上記ビーズライブラリを導入することによって、上記１つのビーズの外周部を上記マイクロウェルの壁と接触させ、それによって上記１つの細胞を上記空間に封入する、請求項１４２〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
上記１つのビーズの少なくとも一部は、上記マイクロウェルの上記頂部より上に突出している、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
上記一部は、上記１つのビーズの体積の半分を超えない、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
上記複数のビーズは、約２０μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項１４２〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
上記複数のビーズは液体キャリアに懸濁されている、請求項１４２〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
上記複数のビーズは、上記液体キャリアよりも高い密度を有している、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
上記複数のビーズは磁性である、請求項１４２〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
上記１つの細胞に上記標的核酸を放出させることは、上記１つの細胞を溶解することを含んでいる、請求項１４２〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
上記標的核酸は細胞内核酸である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
上記標的核酸は、上記ハイブリダイズさせる工程の前に、上記１つの細胞から分泌される、請求項１４２〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
上記１つの細胞に上記標的核酸を放出させることは、上記１つの細胞が上記標的核酸を分泌するのに十分な条件の下で上記１つの細胞を培養することを含んでいる、請求項１６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の参照］
本出願は２０１７年３月２１日に出願された仮出願第６２／４７４，２８３号の優先権を主張し、その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、マイクロウェル分析のためのアッセイに関する。より詳細には、本発明は、生体試料を小容積中で分析するための密封型マイクロウェルアッセイを提供することに関する。
【０００３】
［背景］
生物学的アッセイのためのマイクロウェルアレイが、かねてから使用されてきた。マイクロウェルアレイの適用の１つは、単一の細胞の発現プロフィールの決定である。例えば、Ｆａｎらによる米国特許出願公開第２０１６／０２８９６６９号は、単一細胞発現プロフィール分析のためのマイクロウェルベースの装置およびシステムであって、細胞の生物学的活性について分析を行う前に、単一の細胞、および単一のリガンドでコーティングされたビーズをマイクロウェルに導入し、マイクロウェルの底に沈降させる装置およびシステムを開示している。しかしながら、マイクロウェルは、分析が行われている間、非密封状態のままである。
【０００４】
Ｆａｎらの装置およびシステムには、多くの不具合がある。第１に、マイクロウェルの非密封状態は、マイクロウェル間の標的生体分子の非制御交換を可能にし、その結果、マイクロウェルの交差汚染および単一細胞分析の精度の低下をもたらす。ＹｕａｎとＳｉｍｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６、Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  ３３８８３  （２０１６））によって示されるように、この問題は、マイクロウェルを水と混ざらない油の層で覆うことによって軽減することができるが、その結果、アッセイはより複雑になる。最近の刊行物（Ｇｉｅｒａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７年４月；１４（４）：３９５−３９８）に記載されているマイクロウェルベースのアッセイは、半透膜の使用によって密封マイクロウェル構成を提供することを試みている。しかしながら、このアプローチも、そのマイクロウェル技術の適用においてさらなる工程を必要とすることによって、マイクロウェル分析を複雑にする。第２に、ビーズおよび細胞が互いに隣接して置かれるマイクロウェル構成では、細胞の内容物が放出される培地の体積が、細胞の体積と比較して比較的大きく、その結果、放出された生体分子の実質的な希釈をもたらし、したがって、ビーズ上のリガンドへの結合効率の低下をもたらす。この制限も、マイクロウェルの密封に対する半透膜ベースのアプローチに固有である。第３に、ビーズと細胞をマイクロウェルの底に互いに隣接して置く場合、マイクロウェル構成において、１つのビーズを１つの細胞に厳密にペアリングさせることは困難である。第４に、ビーズと細胞との間の距離は、通常、アレイ中のマイクロウェル間で変化し、その結果、標的生体分子とビーズとの間の結合効率においてさらなるマイクロウェル間のばらつきを生じる。したがって、単一細胞分析のためのマイクロウェルベースのアッセイを含む、現代のマイクロウェルベースのアッセイの精度、使用の容易さ、および効率を改善する必要性がある。
【０００５】
［概要］
本発明は、マイクロウェルベースのアッセイの精度および効率を高めるためのシステム、方法、装置およびキットを提供する。本発明は、マイクロウェルとビーズとの新規の幾何学的なペアリングによってマイクロウェルにおける小容積内にサンプルを封入することによって、マイクロウェル分析の精度および効率を向上させる。この幾何学的なペアリングには、多くの利点がある。第１に、サンプルを封入することにより、隣接するマイクロウェル間の材料の交差汚染が防止される。第２に、マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングによってサンプルを封入することにより、サンプルを保持する培地の実効体積を減少させることができ、したがって、サンプルの濃度、したがって、リガンド結合効率を増加させることができる。第３に、マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングは、１つのビーズのみが１つのマイクロウェルに入ることを可能にし、したがって、１つのマイクロウェル中の１つの細胞が２つ以上のビーズとペアリングされるといった状況を防止することができる。最後に、マイクロウェル中の細胞に対するビーズの位置は、高度に一致したままである。
【０００６】
［図面の簡単な説明］
図１は、本発明のマイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【０００７】
図２は、本発明の錐台形状のマイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【０００８】
図３は、本発明の多角形状のマイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【０００９】
図４は、本発明の錐台形状の多角形マイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【００１０】
図５は、本発明のマイクロウェルの非限定的な実施形態の寸法を示す。
【００１１】
図６は、マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【００１２】
図７は、マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【００１３】
図８Ａは、ビーズの相対寸法を示す。
【００１４】
図８Ｂは、ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングの実施形態を示し、ビーズの、マイクロウェルの頂部より上方に位置する部分の高さは、ビーズの半径に等しい。
【００１５】
図８Ｃは、ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングの実施形態を示し、ビーズの、マイクロウェルの頂部より上方に位置する部分の高さは、ビーズの半径よりも小さい。
【００１６】
図８Ｄは、ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングの実施形態を示し、ビーズの、マイクロウェルの頂部より上方に位置する部分の高さは、ビーズの半径よりも大きい。
【００１７】
図９は、本発明の官能化ビーズの非限定的な実施形態の構成を示す。
【００１８】
図１０は、単一細胞発現分析を実施するための方法の非限定的な実施形態のための一般的なプロセス図を示す。
【００１９】
図１１は、実施例２に関連して使用される本発明のマイクロウェルの実施形態の模式図を示す。
【００２０】
図１２は、実施例２から得られた実験および数値シミュレーションの結果を示すグラフである。種々のパラメータが時間の関数としてプロットされている：実験開始時の濃度に正規化された、蛍光に比例するフルオレセインの濃度（丸）；固体ビーズを用い、ビーズと円錐形側壁との間に０．０５μｍの間隙を設けた数値シミュレーションからのフルオレセインの濃度（太い曲線）；多孔質ビーズを用い、ビーズ内部の実効拡散係数が０．０６２μｍ２／ｓである数値シミュレーションからのフルオレセインの濃度（細い曲線）。
【００２１】
［詳細な説明］
本発明は、マイクロウェル分析の効率および精度を改善することに関する。より詳細には、本発明は、マイクロウェル分析の効率および精度を改善するためのシステム、方法、装置およびキットに関する。
【００２２】
既存のマイクロウェルシステムは、アレイ内の個々のマイクロウェル内のサンプルを効率的かつ正確に分析する能力に関して深刻な制限を受ける。これらの制限は、一部には、アレイ内の個々のマイクロウェル内にサンプルを封入するための手段がないことに起因する。密封機能性の欠如は、標的の被検物質があるウェルから別のウェルへと拡散または流動することを可能にし、サンプルの分析を危うくする交差汚染を招く。この欠点は、Ｆａｎらの米国特許出願公開第２０１６／０２８９６６９に開示されているシステムおよび方法におけるような、単一細胞発現プロフィール分析を行う文脈において特に問題となり得る。幸いにも、本発明者は、マイクロウェル分析におけるこれらの制限が、サンプルを小さい分析空間内に効果的に密封することができるマイクロウェルの幾何学的形状およびビーズの幾何学的形状の新規の組み合わせによって解消され得ることを認識した。
【００２３】
本発明者は驚くべきことに、ビーズの表面がマイクロウェルの壁と接触し、それによってマイクロウェルとビーズの間の界面で封を形成するように、１つのマイクロウェルの幾何学的形状を１つのビーズの幾何学的形状とペアリングさせることによって、マイクロウェル内の密封された分析空間を形成することができることを発見した。密封された分析空間は、現代のマイクロウェル分析に対して多くの利点をもたらす。分析空間の密封は、個々のマイクロウェルからの、および個々のマイクロウェルへの、標的の被検物質の出入りを防止するか、または少なくとも阻害する。これにより、アレイ内の隣接するマイクロウェルの交差汚染を防止することによって、アッセイ精度を改善する。いくつかの実施形態では、マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングは、１つのビーズのみが１つのマイクロウェルに入ることを可能にし、したがって、１つのマイクロウェル中の１つの細胞が２つ以上のビーズとペアリングされるといった状況を防止することができる。
【００２４】
本発明の少なくともいくつかの実施形態では、密封された分析空間は、ビーズの幅がマイクロウェルの底の幅よりも大きくなるように、マイクロウェルの幾何学的形状とビーズの幾何学的形状とをペアリングすることによって達成される。したがって、本発明で使用するためのマイクロウェルは、マイクロウェルの頂部（すなわち、開口部）がマイクロウェルの底の幅よりも大きい幅を有する任意の幾何学的形状をとることができる。マイクロウェルに適した幾何学的形状としては、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。マイクロウェルに適した形状としては、図１に示すものが挙げられるが、これに限定されるものではない。マイクロウェルは、錐台の形状であり得る。マイクロウェルは、逆角錐、円筒、多面体、逆円錐、半球、またはこれらの組み合わせの形状を有する錐台の形態をとることができる。マイクロウェルに適した錐台形状としては、図２に示すものが挙げられるが、これに限定されない。マイクロウェルは、逆円錐の形状であり得る。マイクロウェルは、逆円錐台の形状であり得る。マイクロウェルは、円錐で終わる円筒の形状であり得る。マイクロウェルは、円錐台で終わる円筒の形状であり得る。マイクロウェルは、逆角錐で終わる円筒の形状であり得る。マイクロウェルは、逆角錐台で終わる円筒の形状であり得る。マイクロウェルは、閉じた底を有するより小さい円筒で終わる円筒の形状であり得る。マイクロウェルは、円筒よりも小さい直径を有する半球で終わる円筒の形状であり得る。マイクロウェルの頂部、および結合する側面は、円形、楕円形、または多角形の横断面を有し得る。マイクロウェルの頂部、および結合する側面は、三角形、四角形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、または十角形の横断面を有することができる。多角形の横断面を有する適切なマイクロウェルとしては、図３および図４に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の少なくとも１つの態様は、マイクロウェルの寸法に関する。マイクロウェルの相対寸法の非限定的な説明を図５に示す。マイクロウェルは、マイクロウェルの頂部からマイクロウェルの底内面まで及ぶ深さＤ１を有し得る。深さＤ１は、約５μｍから約３００μｍの間であり得る。本明細書においては、用語「約」は、この用語が併用された値であって、記載された値、または、記載された値の最大３０％（プラスまたはマイナス）、最大２５％、最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大９％、最大８％、最大７％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、または、最大１％異なる値を指し得る。深さＤ１は、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも３５μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも４５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも６０μｍ、少なくとも７０μｍ、少なくとも８０μｍ、少なくとも９０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１１０μｍ、少なくとも１２０μｍ、少なくとも１３０μｍ、少なくとも１４０μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも１６０μｍ、少なくとも１７０μｍ、少なくとも１８０μｍ、少なくとも１９０μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２１０μｍ、少なくとも２２０μｍ、少なくとも２３０μｍ、少なくとも２４０μｍ、少なくとも２５０μｍ、少なくとも２６０μｍ、少なくとも２７０μｍ、少なくとも２８０μｍ、少なくとも２９０μｍ、または少なくとも３００μｍであり得る。深さＤ１は、最大５μｍ、最大１０μｍ、最大１５μｍ、最大２０μｍ、最大２５μｍ、最大３０μｍ、最大３５μｍ、最大４０μｍ、最大４５μｍ、最大５０μｍ、最大６０μｍ、最大７０μｍ、最大８０μｍ、最大９０μｍ、最大１００μｍ、最大１１０μｍ、最大１２０μｍ、最大１３０μｍ、最大１４０μｍ、最大１５０μｍ、最大１６０μｍ、最大１７０μｍ、最大１８０μｍ、最大１９０μｍ、最大２００μｍ、最大２１０μｍ、最大２２０μｍ、最大２３０μｍ、最大２４０μｍ、最大２５０μｍ、最大２６０μｍ、最大２７０μｍ、最大２８０μｍ、最大２９０μｍ、または最大３００μｍであり得る。
【００２６】
いくつかの好ましい実施形態では、マイクロウェルの頂部（すなわち、開口部）の幅はマイクロウェルの底の幅よりも比例して大きい。図５を参照すると、マイクロウェルの頂部は約３０μｍから２００μｍの間の幅（すなわち、直径）Ｄ２を有し得る。マイクロウェルの底は約５μｍから５０μｍの間の幅（例えば、直径）Ｄ３を有し得る。幅Ｄ２は、少なくとも３０μｍ、少なくとも３５μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも４５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも５５μｍ、少なくとも６０μｍ、少なくとも６５μｍ、少なくとも７０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも８０μｍ、少なくとも８５μｍ、少なくとも９０μｍ、少なくとも９５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１１０μｍ、少なくとも１２０μｍ、少なくとも１３０μｍ、少なくとも１４０μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも１６０μｍ、少なくとも１７０μｍ、少なくとも１８０μｍ、少なくとも１９０μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２１０μｍ、少なくとも２２０μｍ、少なくとも２３０μｍ、少なくとも２４０μｍ、少なくとも２５０μｍ、少なくとも２６０μｍ、少なくとも２７０μｍ、少なくとも２８０μｍ、少なくとも２９０μｍ、少なくとも３００μｍ、または、少なくとも、これらの具体的に示された幅のうちの１つに介在する幅であり得る。幅Ｄ２は、最大３０μｍ、最大３５μｍ、最大４０μｍ、最大４５μｍ、最大５０μｍ、最大５５μｍ、最大６０μｍ、最大６５μｍ、最大７０μｍ、最大７５μｍ、最大８０μｍ、最大８５μｍ、最大９０μｍ、最大９５μｍ、最大１００μｍ、最大１１０μｍ、最大１２０μｍ、最大１３０μｍ、最大１４０μｍ、最大１５０μｍ、最大１６０μｍ、最大１７０μｍ、最大１８０μｍ、最大１９０μｍ、最大２００μｍ、最大２１０μｍ、最大２２０μｍ、最大２３０μｍ、最大２４０μｍ、最大２５０μｍ、最大２６０μｍ、最大２７０μｍ、最大２８０μｍ、最大２９０μｍ、最大３００μｍ、または、最大で、これらの具体的に示された幅のうちの１つに介在する幅であり得る。幅Ｄ３は、少なくとも５μｍ、少なくとも６μｍ、少なくとも７μｍ、少なくとも８μｍ、少なくとも９μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも１１μｍ、少なくとも１２μｍ、少なくとも１３μｍ、少なくとも１４μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも１６μｍ、少なくとも１７μｍ、少なくとも１８μｍ、少なくとも１９μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも２１μｍ、少なくとも２２μｍ、少なくとも２３μｍ、少なくとも２４μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも２６μｍ、少なくとも２７μｍ、少なくとも２８μｍ、少なくとも２９μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも３５μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも４５μｍ、少なくとも５０μｍ、または、少なくとも、これらの具体的に示された幅のうちの１つに介在する幅であり得る。幅Ｄ３は、最大５μｍ、最大６μｍ、最大７μｍ、最大８μｍ、最大９μｍ最大、最大１０μｍ、最大１１μｍ、最大１２μｍ、最大１３μｍ、最大１４μｍ、最大１５μｍ、最大１６μｍ、最大１７μｍ、最大１８μｍ、最大１９μｍ、最大２０μｍ、最大２１μｍ、最大２２μｍ、最大２３μｍ、最大２４μｍ、最大２５μｍ、最大２６μｍ、最大２７μｍ、最大２８μｍ、最大２９μｍ、最大３０μｍ、最大���５μｍ、最大４０μｍ、最大４５μｍ、最大５０μｍ、または、最大で、これらの具体的に示された幅のうちの１つに介在する幅であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、幅Ｄ３は１５μｍである。マイクロウェルの頂部における幅Ｄ２に対するマイクロウェルの底における幅Ｄ３の比率は、約０．９９から０．０５の間であり得る。幅Ｄ２に対する幅Ｄ３の比率は、最大０．９９、最大０．９５、最大０．９０、最大０．８５、最大０．８０、最大０．７５、最大０．７０、最大０．６５、最大０．６０、最大０．５５、最大０．５０、最大０．４５、最大０．４０、最大０．３５、最大０．３０、最大０．２５、最大０．２０、最大０．１５、最大０．１０、最大０．０５、または、最大で、これらの具体的に列挙された比率の間の任意の比率であり得る。マイクロウェルの頂部における幅Ｄ２は、マイクロウェルの底における幅Ｄ３の約１倍から約１０倍であり得る。幅Ｄ２は、Ｄ３の少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または、少なくとも１０倍の幅であり得る。
【００２７】
図５には円錐台が示されているが、当業者は、マイクロウェルの頂部における幅がマイクロウェルの底における幅よりも比例して大きい任意の幾何学的形状で、本発明を実施することが可能であると理解するであろう。本発明で使用するためのマイクロウェルは、マイクロウェルをそれらの用途に使用することを可能にする任意の容積を有し得る。マイクロウェルは、約０．１ピコリットルから約１００，０００ピコリットルの範囲の容積を有し得る。いくつかの実施形態では、各マイクロウェルは約１４４ピコリットルの容積を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、マイクロウェルの壁を傾斜させてもよく、正の抜き勾配がウェルの頂部でより大きな開口部を生じさせる。いくつかの実施形態では、壁は少なくとも１度、少なくとも２度、少なくとも３度、少なくとも４度、少なくとも５度、少なくとも６度、少なくとも７度、少なくとも８度、少なくとも９度、少なくとも１０度、少なくとも１１度、少なくとも１２度、少なくとも１３度、少なくとも１４度、または少なくとも１５度以上、正または負に傾斜してもよい。いくつかの実施形態では、壁は、最大で１度、最大で２度、最大で３度、最大で４度、最大で５度、最大で６度、最大で７度、最大で８度、最大で９度、最大で１０度、最大で１１度、最大で１２度、最大で１３度、最大で１５度、または、最大で１５度以上、正または負に傾斜してもよい。したがって、これらの実施形態では、マイクロウェルの頂部は、マイクロウェルの底とは異なる直径（または平均直径）を有することができる。いくつかの好ましい実施形態では、壁は約１０度から約３０度の範囲の正の抜き勾配で傾斜している。いくつかの実施形態では、マイクロウェルの開口角度が平均抜き勾配よりも２倍大きい。マイクロウェルの開口角度は、約０度から約６０度の間であり得る。開口角度は、最大６０度、最大５５度、最大５０度、最大４５度、最大４０度、最大３５度、最大３０度、最大２５度、最大２０度、最大１５度、最大１０度、最大５度、最大１度、または、最大で、これらの具体的に列挙された角度の間の任意の開口角度であり得る。開口角度は、最大、約１０度、約１１度、約１２度、約１３度、約１４度、約１５度、約１６度、約１７度、約１８度、約１９度、約２０度、約２１度、約２２度、約２３度、約２４度、約２５度、約２６度、約２７度、約２８度、約２９度、約３０度、約３１度、約３２度、約３３度、約３４度、約３５度、約３６度、約３７度、約３８度、約３９度、約４０度、約４１度、約４２度、約４３度、約４４度、約４５度、約４６度、約４７度、約４８度、約４９度、約５０度、約５１度、約５２度、約５３度、約５４度、約５５度、約５６度、約５７度、約５８度、約５９度、または約６０度であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、開口角度は３４度または３５度である。
【００２９】
本発明の少なくとも１つの態様は、マイクロウェルとペアリングされるビーズの幾何学的形状に関する。ビーズは、球形または略球形であり得る。ビーズは、微小球であり得る。ビーズは約１０μｍから約１００μｍの間の幅（すなわち、直径）を有し得る。ビーズ幅は、少なくとも１０μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも３５μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも４５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも５５μｍ、少なくとも６０μｍ、少なくとも６５μｍ、少なくとも７０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも８０μｍ、少なくとも８５μｍ、少なくとも９０μｍ、少なくとも９５μｍ、少なくとも１００μｍ、または、少なくとも、これら具体的な幅の間の幅であり得る。ビーズは、最大１０μｍ、最大１５μｍ、最大２０μｍ、最大２５μｍ、最大３０μｍ、最大３５μｍ、最大４０μｍ、最大４５μｍ、最大５０μｍ、最大５５μｍ、最大６０μｍ、最大６５μｍ、最大７０μｍ、最大７５μｍ、最大８０μｍ、最大８５μｍ、最大９０μｍ、最大９５μｍ、最大１００μｍの幅、または、最大で、これら具体的な幅の間の幅までの幅を有し得る。マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングのために、ビーズの幅に対するマイクロウェルの底の幅の比率は、ビーズの幅がマイクロウェルの底の幅よりも比例して大きい任意の比率であり得る。ビーズの幅に対するマイクロウェルの底の幅の比率は、約０．０５から約０．９９であり得る。いくつかの実施形態では、ビーズの幅に対するマイクロウェルの底の幅の比率は、最大で０．９９、最大で０．９５、最大で０．９、最大で０．８、最大で０．７、最大で０．６、最大で０．５、最大で０．４、最大で０．３、最大で０．２、最大で０．１、または最大で０．０５である。当業者であれば、この比率は、０．３７のような、本明細書に列挙されたものの間の任意の比率であり得ることを理解するのであろう。当業者はさらに、本明細書にて示されたビーズ幅は、複数のビーズが意図される場合には、平均ビーズ直径を表し得ることを理解するであろう。
【００３０】
本発明で使用するためのビーズは、ポリメチルメタクリレート、エポキシ、シリコン、溶融シリカ、ガラス、ポリマー、金属、アルミナ、エラストマー、ポリジメチルシロキサン、アガロース、およびヒドロゲルからなる群から選択される材料、またはこれらの任意の組み合わせから作製され得る。本発明での使用に適したビーズの例としては、ストレプトアビジン結合ビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、ガラスビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体結合ビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、タンパク質Ａ結合ビーズ、タンパク質Ｇ結合ビーズ、タンパク質Ａ／Ｇ結合ビーズ、タンパク質Ｌ結合ビーズ、オリゴｄＴ結合ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。ビーズは、ポリメチルメタクリレート微小球であり得る。ビーズは、約１ｇ／ｃｍ３から約４ｇ／ｃｍ３の間の密度を有し得る。ビーズは、最大２ｇ／ｃｍ３、最大３ｇ／ｃｍ３、最大４ｇ／ｃｍ３、または、最大で、具体的に列挙された密度の間の任意の密度を有し得る。ビーズは、少なくとも１ｇ／ｃｍ３、少なくとも２ｇ／ｃｍ３、少なくとも３ｇ／ｃｍ３、少なくとも４ｇ／ｃｍ３の密度、または、少なくとも、これらの具体的に列挙された密度の間の任意の密度を有し得る。１つの蛍光光チャネルまたは複数の光チャネルにおいてビーズを蛍光にするために、ビーズを量子ドットまたは蛍光色素と結合（例えば、含浸）させてもよい。ビーズは磁性であってもよい。ビーズを常磁性または強磁性にするために、ビーズを酸化鉄または酸化クロムと結合させてもよい。ビーズは官能化されていてもよい。ビーズに関して使用される場合、用語「官能化（functionalized）」および「官能性（functional）」などは、標的の被検物質を捕捉するために、少なくとも１つのリガンドをその表面に有しているビーズを指す。リガンドは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせであり得る。ビーズは、非球形であってもよく、例えば、楕円形の縦断面および円形の横断面を有する楕円形であってもよい。
【００３１】
図６は、ビーズ１０２の底がマイクロウェル１０１の底から距離Ｄ４離れた状態でマイクロウェル１０１がビーズ１０２と接触した、マイクロウェルの幾何学的形状とビーズの幾何学的形状のペアリングの非限定的な実施形態を示す。図６に示す実施形態では、ビーズ１０２がビーズ１０２の外周部でマイクロウェル１０１の頂部と接触して界面１０５を形成するように、ビーズ１０２は、マイクロウェル１０１の開口部における幅Ｄ２と同じか、またはほぼ同じ幅Ｄ５を有する。ビーズ１０２が界面１０５でマイクロウェル１０１と接触していることで、ビーズ１０２の底は、マイクロウェルの底の上方に距離Ｄ４離れて位置している。ビーズ１０２がマイクロウェル１０１と接触していることで、分析空間１０４が界面１０５とマイクロウェル１０１の底との間の領域に形成される。界面１０５は、分析空間１０４からの被検物質の出入りを防止するか、または少なくとも阻止することができる。
【００３２】
ビーズの幾何学的形状とマイクロウェルの幾何学的形状の特定のペアリングを図６に示しているが、当業者は、ビーズの幅がマイクロウェルの底の幅よりも大きければ、他の幾何学的なペアリングが可能であると、理解するであろう。例えば、分析空間により小さい容積を作り出すために、分析空間内のサンプルにビーズをより近接させるために、および／または、マイクロウェル内のビーズがより大きな固着強度を有するために、マイクロウェル内にビーズをより深く嵌め込むことが望ましい場合がある。したがって、ビーズとマイクロウェルとの幾何学的なペアリングは、ビーズが、マイクロウェルの底よりも大きいが、マイクロウェルの開口部の幅よりも小さい幅を有するようなものであってもよい。このような実施形態の非限定的な一例を図７に示す。
【００３３】
図７に示すように、ビーズ１０２は、マイクロウェル１０１の頂部（すなわち、開口部）における幅Ｄ２よりも小さいが、マイクロウェルの底の幅よりも依然として大きい幅Ｄ５を有していてもよい。ビーズの幅Ｄ５がマイクロウェルの開口部の幅Ｄ２より小さいため、ビーズ１０２は、マイクロウェル１０１の頂部から距離Ｄ６離れて界面１０５でマイクロウェル１０１の壁に接触している。ビーズ１０２が界面１０５でマイクロウェル１０１の壁と接触することによって、界面１０５とマイクロウェル１０１の底との間の領域内に分析空間１０４を形成する。界面１０５は、マイクロウェル１０１の頂部から距離Ｄ６離れて形成されているので、分析空間１０４は、ビーズがマイクロウェルの頂部に界面を形成する実施形態、例えば、図６に示される実施形態よりも小さい相対容積を有する。本発明の非限定的な実施形態では、マイクロウェル１０１は、逆円錐形状の錐台の形態をとっており、深さＤ１は約５０μｍであり、マイクロウェルの頂部における幅Ｄ２は約５０μｍであり、マイクロウェルの底における幅Ｄ３は約１５μｍであり、ビーズ幅Ｄ５は約３０μｍであり、分析空間１０４の容積は約２ｐＬから約４ｐＬである。本発明の別の非限定的な実施形態では、マイクロウェル１０１は、逆円錐形状の錐台の形態をとっており、深さＤ１は約７５μｍであり、マイクロウェルの頂部における幅Ｄ２は約５０μｍであり、マイクロウェルの底における幅Ｄ３は約１５μｍであり、ビーズ幅Ｄ５は約３０μｍである。
【００３４】
マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングはマイクロウェルの底とマイクロウェル内に嵌め込まれたビーズの底との間の距離が所望の距離となるように調節され得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、当業者は、官能化ビーズの表面にあるリガンドを細胞に近接させるように、分析される細胞の平均直径に基づいて、マイクロウェルの底と嵌め込まれたビーズの底との間の距離を調節することを望む場合がある。同様に、当業者は、反応混合物内の被検物質の濃度を増加させるために、分析空間の容積を減少させることを望む場合がある。図６および図７を参照すると、マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングは、ビーズ１０２の底と、分析空間１０４内に収容され、マイクロウェル１０１の底にある細胞１０６の上面との間の距離が所望の距離となるように設計することができる。ビーズ１０２の底と細胞１０６との間の距離は、約１μｍから約３０μｍの間であり得る。ビーズ１０２の底と細胞１０６との間の距離は、少なくとも１μｍ、少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも２５μｍ、または少なくとも３０μｍとすることができる。マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングは、同様に、ビーズの底とマイクロウェルの底との間の空間について所望の容積が得られるように選択され得る。さらに図６および図７を参照すると、マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングは、約０．１ｐＬから約１００ｐＬの間の容積を有する分析空間１０４を設けるように選択することができる。マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングは、少なくとも０．１ｐＬ、少なくとも０．５ｐＬ、少なくとも１ｐＬ、少なくとも５ｐＬ、少なくとも１０ｐＬ、少なくとも１５ｐＬ、少なくとも２０ｐＬ、少なくとも３０ｐＬ、少なくとも４０ｐＬ、少なくとも５０ｐＬ、少なくとも６０ｐＬ、少なくとも７０ｐＬ、少なくとも８０ｐＬ、少なくとも９０ｐＬ、少なくとも１００ｐＬの容積、または、少なくとも、これらの具体的に列挙された容積の間の任意の容積を有する分析空間１０４を設けるように選択され得る。マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングは、最大０．１ｐＬ、最大０．５ｐＬ、最大１ｐＬ、最大５ｐＬ、最大１０ｐＬ、最大１５ｐＬ、最大２０ｐＬ、最大３０ｐＬ、最大４０ｐＬ、最大５０ｐＬ、最大６０ｐＬ、最大７０ｐＬ、最大８０ｐＬ、最大９０ｐＬ、最大１００ｐＬの容積、または、最大で、これらの具体的に列挙された容積の間の任意の容積を有する分析空間１０４を設けるように選択され得る。
【００３５】
図６および図７を参照すると、距離Ｄ４は、距離Ｄ４がマイクロウェルの深さＤ１の０．０５％から９９％の間を含むように、マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングを変えることによって調節することができる。距離Ｄ４は、深さＤ１の少なくとも９９％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも９％、少なくとも８％、少なくとも７％、少なくとも６％、少なくとも５％、少なくとも４％、少なくとも３％、少なくとも２％、少なくとも１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．２％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．１０％、または少なくとも０．５％であり得る。距離Ｄ４は、深さＤ１の最大９９％、最大９０％、最大８５％、最大８０％、最大７５％、最大７０％、最大６５％、最大６０％、最大５５％、最大５０％、最大４５％、最大４０％、最大３５％、最大３０％、最大２５％、最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大９％、最大８％、最大７％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、最大０．５％、最大０．２５％、最大０．２％、最大０．１５％、最大０．１０％、または最大０．５％であり得る。
【００３６】
マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングは、ビーズ表面の所望の周辺部でビーズとマイクロウェルとが接触するように設計することができる。周辺部は、球形ビーズの周辺部（すなわち、外面）であり得る。幾何学的なペアリングによって、マイクロウェルの壁とビーズの周辺部とが接触し、マイクロウェルの壁と接触するビーズ周辺部の幅（例えば、直径）はビーズの幅（例えば、直径）以下である。マイクロウェルの壁と接触するビーズの周辺部は、ビーズがマイクロウェルの壁と接触する水平面におけるビーズの円周に等しいことが理解されるであろう。ビーズの幅と、マイクロウェルの壁と接触するビーズ周辺部の幅との間の比率は、最大１．０、最大０．９、最大０．８、最大０．７、最大０．６、最大０．５、最大０．４、最大０．３、最大０．２、最大０．１、または、最大で、これらの具体的に列挙された比率の間の任意の比率であり得る。マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングによって、ビーズの周辺部とマイクロウェルの頂部（すなわち、開口部）におけるマイクロウェルの壁とが接触し得る。マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングによって、ビーズの周辺部と、マイクロウェルの頂部より下のマイクロウェルの壁とが接触し得る。幾何学的なペアリングによって、ビーズの少なくとも一部がマイクロウェルの頂部より上に突出するように、ビーズの周辺部とマイクロウェルの壁とが接触し得る。ビーズの、マイクロウェルの頂部より上に突出する部分の高さは、ビーズの半径よりも大きくても、等しくても、小さくてもよい。ビーズの、マイクロウェルの頂部より上に突出する部分の高さと、ビーズの半径との間の比率は、最大２．０、最大１．９、最大１．８、最大１．７、最大１．６、最大１．５、最大１．４、最大１．３、最大１．２、最大１．１、最大１．０、最大０．９、最大０．８、最大０．７、最大０．６、最大０．５、最大０．４、最大０．３、最大０．２、最大０．１、または、最大で、これらの具体的に列挙した比率の間の任意の比率であり得る。ビーズの、マイクロウェルの頂部より上に突出する部分は、ビーズの体積の最大１００％、ビーズの体積の最大９０％、ビーズの体積の最大８０％、ビーズの体積の最大７０％、ビーズの体積の最大６０％、ビーズの体積の最大５０％、ビーズの体積の最大４０％、ビーズの体積の最大３０％、ビーズの体積の最大２０％、ビーズの体積の最大１０％、ビーズの体積の最大５％、ビーズの体積の最大１％、または、最大で、これらの具体的に列挙された割合の間の任意の割合の体積であり得る。ビーズとマイクロウェルとの幾何学的なペアリングによって、ビーズの頂部がマイクロウェルの頂部を画定する平面よりも下に位置するように、ビーズの周辺部とマイクロウェルの壁とが接触し得る。
【００３７】
マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングについていくつかの非限定的な実施形態を図８Ｂから８Ｄに示す。図８Ａは、直径Ｄおよび半径Ｒを有するビーズの相対寸法を示す。図８Ｂは、マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングを示し、ビーズの、マイクロウェル１０１の頂部（すなわち、上部水平面）より上に突出する部分の高さＹが半径Ｒと等しい状態を示す。図８Ｃは、マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングを示し、マイクロウェル１０１の頂部より上に突出する部分の高さＹが半径Ｒよりも小さい状態を示す。図８Ｃを参照すると、高さＹと半径Ｒとの間の比率は、最大１．０、最大０．９、最大０．８、最大０．７、最大０．６、最大０．５、最大０．４、最大０．３、最大０．２、最大０．１、または、最大で、これらの具体的に列挙された比率の間の任意の比率であり得る。図８Ｄは、マイクロウェル１０１とビーズ１０２との幾何学的なペアリングを示し、マイクロウェル１０１の頂部より上に突出する部分の高さＹが半径Ｒよりも大きい状態を示す。図８Ｄを参照すると、高さＹと半径Ｒとの間の比率は、最大２．０、最大１．９、最大１．８、最大１．７、最大１．６、最大１．５、最大１．４、最大１．３、最大１．２、最大１．１、または、最大で、これらの具体的に列挙された比率の間の任意の比率であり得る。
【００３８】
図８Ｂから８Ｄは本発明の非限定的な態様をさらに示し、ビーズとマイクロウェルとの幾何学的なペアリングが、マイクロウェルの壁と、ビーズの中央とビーズの底との間の所望の周辺部とが物理的に接触するように設計され得る態様を示す。図８Ｂに示すように、ビーズ１０２は、界面Ｐでマイクロウェル１０１と接触しており、界面Ｐの幅（すなわち、マイクロウェルの壁と接触しているビーズの両側にわたる距離）は、ビーズ１０２の直径Ｄに等しい。図示されていないが、当業者は、図８Ｂから８Ｄがマイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングの側面図を示し、マイクロウェル１０１の壁と接触するビーズ１０２の周辺部（すなわち、円周）に沿って界面Ｐが形成されていると理解するであろう。図８Ｃおよび８Ｄは、界面Ｐの幅がビーズ１０２の直径Ｄよりも小さい実施形態を示す。界面Ｐの幅は、ビーズ１０２の直径Ｄに等しいか、または、それより小さくすることができる。界面Ｐの幅の直径Ｄに対する比率は、最大１．０、最大０．９、最大０．８、最大０．７、最大０．６、最大０．５、最大０．４、最大０．３、最大０．２、最大０．１、または、最大で、これらの具体的に列挙された比率の間の任意の比率であり得る。ある好ましい実施形態では、界面Ｐの幅の直径Ｄに対する比率は、最大１．０、最大０．９、最大０．８、最大０．７、最大０．６、最大０．５、最大０．４、最大０．３、最大０．２、最大０．１、または、最大で、これらの具体的に列挙された比率の間の任意の比率であり得、（ｉ）マイクロウェル１０１の頂部より上に突出している部分Ｙがない、または（ｉｉ）部分Ｙの高さが半径Ｒよりも小さい。このような構成は以下を達成するために望ましい：マイクロウェル内にビーズをよりぴったりと嵌め込むことによって、ブラウン運動および／または流体のマイクロウェルの頂部を超える対流によってマイクロウェルからビーズが外れることを阻止する；界面Ｐから始まり下方へ延伸するビーズの下半分の表面と、マイクロウェル１０１の底との間の領域によって画定される分析空間の容積をより小さくする；および／または、ビーズ１０２の底をマイクロウェル１０１の底におけるサンプル（例えば、細胞）により近接させる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングは、１つのマイクロウェルが１つのビーズのみを収容するようになっている。この単一ビーズ―マイクロウェル機能は、固定されたビーズの頂部が、図６、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄに示されるように、マイクロウェルの頂部（すなわち、開口部）よりも上に突出する（すなわち、Ｙ＞０である正の突出部を有する）実施形態において達成され得る。このような構成によって、第２のビーズがマイクロウェルへ入ることを防ぐことができる。単一ビーズ―マイクロウェル機能は、マイクロウェルの頂部とビーズの頂部との間の距離が十分に小さいときに、図７に示されるように、嵌め込まれたビーズの何れの部分もマイクロウェルの開口部よりも上に突出しない実施形態においても達成され得る。このような実施形態では、第２のビーズがマイクロウェルに入る、または、載るが、この第２のビーズを、例えば、穏やかな対流によって簡単に取り外すことができるような深さで、１つのビーズがマイクロウェル内に固定されている。単一ビーズ―マイクロウェル構成は、ビーズに結合したリガンドが２つ以上の細胞から得られるという誤った印象を与える、１つの細胞と複数のビーズとの相互作用を妨げるため、単一細胞発現分析に有益であり得る。
【００４０】
本発明の少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなマイクロウェルが複数個、基板内に形成され、マイクロウェルアレイが提供される。いくつかの実施形態では、基板は１００〜１００，０００，０００個のマイクロウェルを含む。いくつかの実施形態では、基板は１００〜５０，０００，０００個のマイクロウェルを含む。いくつかの実施形態では、基板は最大１００，０００，０００個のマイクロウェルを含む。いくつかの実施形態では、基板は最大５０，０００，０００個のマイクロウェルを含む。いくつかの実施形態では、基板は１０，０００〜２００，０００個のマイクロウェルを含む。基板は、シリコン、溶融シリカ、ガラス、ポリマー、金属、エラストマー、ポリジメチルシロキサン、アガロース、およびヒドロゲルからなる群から選択される材料、またはこれらの任意の組み合わせから作製され得る。当業者は、本明細書に開示されるマイクロウェルが複数個、マイクロウェルアレイを形成するために基板に組み込まれる場合、本明細書に記載されるマイクロウェルの寸法はそのような複数のマイクロウェルの平均の（averageまたはmean）寸法を指し得ると理解するであろう。
【００４１】
本発明は、サンプルにおける生物活性を分析するための方法、およびサンプルに被検物質が存在することを特定するための方法を提供する。本方法は、少なくとも１つのマイクロウェルを含む基板を設け、マイクロウェルにサンプルを導入し、基板上に少なくとも１つのビーズを導入することによって実施することができる。マイクロウェルの幾何学的形状とビーズの幾何学的形状は、ビーズを基板上に導入すると、ビーズがマイクロウェル内に嵌め込まれ、マイクロウェルの壁に接触して、ビーズとマイクロウェルの底との間の空間内にサンプルを封入する界面を形成するように、ペアリングされ得る。基板は、本明細書に開示されるようなマイクロウェルのアレイであり得る。マイクロウェルは、本明細書に開示されるマイクロウェルのうちの１つ以上であり得る。ビーズは、本明細書に開示されるビーズであり得る。
【００４２】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、サンプルの生物活性を分析するための方法を提供する。サンプルの生物活性を分析することは、サンプルにおける１つ以上の被検物質の有無を検出することを含み得る。サンプルの生物活性を分析することは、サンプルにおける１つ以上の被検物質の量を決定することを含み得る。被検物質は生体分子であり得、サンプルの活性を分析することは、サンプルにおける１つ以上の生体分子の有無を特定することを含む。被検物質は生体分子であってもよく、サンプルの活性を分析することは、サンプルにおける１つ以上の生体分子の量を決定することを含む。用語「生成物」および「被検物質」は、本明細書中では同義で用いられ、分析しようとする物質（すなわち、標的物質）を指す。被検物質は、生体分子であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「生体分子」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡ）を含む）、多糖、オリゴ糖、脂質、抗体（例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチド抗体）、細胞受容体、低重量分子（例えば、ホルモン、リガンド、シグナル伝達物質、低重量有機分子など）、およびこれらの複合分子、などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生体分子はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、サンプルの生物活性を決定することは、サンプルにおける少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのコピー数を決定することを含む。いくつかの実施形態では、サンプルの生物活性を決定することは、サンプルにおける少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのコピー数を決定することを含み、サンプルは細胞である。いくつかの実施形態では、被検物質は、細胞、ウイルス、オルガネラ、または組織の一部であり得る。いくつかの実施形態では、被検物質は、複数の細胞、複数のウイルス、複数のオルガネラ、または複数の組織標本であり得る。
【００４３】
ビーズは、ビーズが液体キャリアに懸濁された懸濁液として、基板（すなわち、マイクロウェルアレイ）上に導入され得る。懸濁液がマイクロウェルアレイ上に導入されると個々のビーズが個々のマイクロウェルに沈降するように、ビーズは液体キャリアよりも大きな密度を有し得る。基板上に導入されるビーズの数は、アレイにおけるマイクロウェルの数よりも比例して多くても、等しくても、または比例して少なくてもよい。マイクロウェルアレイ上に導入されるビーズの数を、マイクロウェルの数よりも少なくして、マイクロウェル内に固定されていないビーズの数を制限してもよい。基板上に導入されるビーズの数を、基板におけるマイクロウェルの数よりも多くして、ビーズが固定されていないマイクロウェルの数を最小限にしてもよい。ビーズは、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、または１．５：１のビーズ対マイクロウェル比で基板上に導入され得る。本明細書中に記載されるように、ビーズとマイクロウェルの幾何学的なペアリングは、アレイにおける個々のマイクロウェル内に１つのビーズを導入することを容易にすることができる。固定されたビーズの少なくとも一部がマイクロウェルの頂部より上に突出する実施形態では、ビーズの、マイクロウェルより上に突出する部分が、他のビーズがマイクロウェルに入ることを防止し得る。ビーズの上面がマイクロウェルの頂部の平面より下にある実施形態では、第２のビーズが、マイクロウェルに既に固定されているビーズの頂部に載り得る。それにもかかわらず、この第２のビーズを保持する力は十分に弱いため、固定されたビーズを取り外すことなく、固定されたビーズの頂部上の位置から第２のビーズを取り除くためには、対流から生じるような最低限の撹拌しか必要とされない。
【００４４】
サンプルは、１つまたは複数の細胞であり得る。サンプルは、複数のクローン細胞、または複数の混合細胞であり得る。本発明の開示された方法、システム、およびキットによる分析に適したサンプルは、複数の細胞を含む任意のサンプル（例えば、細胞培養物、血液サンプル、細胞外基質が消化または溶解されて個々の細胞を懸濁液に放出した組織サンプルなど）を含む。複数の細胞は、１つのサンプル、または、２つ以上のサンプルの組み合わせから得られてもよく、同一タイプの複数の細胞、または、混合タイプの複数の細胞を含んでいてもよい。細胞は、哺乳類細胞であり得る。細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、またはモルモットの細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、他のタイプの動物、植物、真菌、細菌、または原生生物の細胞である。細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞が基板内の個々のマイクロウェルに導入される確率が低くなる濃度で、細胞は基板上に導入される。個々のマイクロウェルに１つ以下の細胞を導入することは、基板中のマイクロウェルの数より少ない数の細胞を含む細胞懸濁液を基板上に導入することによって実現できる。いくつかの好ましい実施形態では、細胞懸濁液の濃度は、基板に導入するために用いられる細胞懸濁液が基板内のマイクロウェルの数の約１／１０の数の細胞を含むように調節される。基板上に導入される細胞懸濁液は、基板内に含まれるマイクロウェルの数の約１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、または１／１０を含み得る。いくつかの実施形態では、導入は、細胞の２０％以下が他の細胞と共にマイクロウェル中にあるように細胞を導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入は、細胞の１５％以下が他の細胞と共にマイクロウェル中にあるように細胞を導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入は、細胞の１０％以下が他の細胞と共にマイクロウェル中にあるように細胞を導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入は、細胞の５％以下が他の細胞と共にマイクロウェル中にあるように細胞を導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入は、細胞の１％以下が他の細胞と共にマイクロウェル中にあるように細胞を導入することを含む。１つのマイクロウェルに所定の数の細胞を認める確率は、典型的にはポアソン統計によって左右される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、被検物質の存在を特定する方法を提供する。被検物質は、１つ以上の生体分子であり得る。生体分子は、オリゴヌクレオチド分子、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子などであり得る。いくつかの実施形態では、生体分子は、ペプチドまたはタンパク質であり得る。生体分子は、抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチド、および／または受容体ポリペプチド鎖（例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖およびベータ鎖）であり得る。被検物質は、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、アミノ酸、炭水化物、オリゴヌクレオチド、ウイルス、エキソソーム、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００４７】
少なくともいくつかの実施形態では、ビーズは、１つ以上の被検物質を捕捉する（すなわち、１つ以上の被検物質に結合する）１つ以上のリガンドを有する。ビーズは、種々のな標的の被検物質を捕捉するための種々のリガンドのコピーを１つ以上有し得る。リガンドは、共有結合手段または非共有結合手段によってビーズに結合され得る。リガンドは、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせであり得る。ビーズは、単一細胞発現分析を行うための１つ以上のヌクレオチドを含み得る。単一細胞発現分析のためのビーズは、（ｉ）複数のビーズのうち各ビーズに特有の細胞特定マーカー、および（ｉｉ）目的の生体分子（すなわち、被検物質）と結合する少なくとも１つのリガンドを含み得る。単一細胞発現分析のためのビーズは、各部分が（ｉ）複数のビーズのうち各ビーズに特有の細胞特定マーカー、（ｉｉ）目的の生体分子（すなわち、被検物質）と結合するリガンド、および（ｉｉｉ）各部分に特有のリガンド指標マーカーを含む部分を含み得る。単一細胞発現分析のためのビーズは、標的核酸にハイブリダイズ可能な複数の捕捉リガンドを含み得る。ここで、捕捉オリゴヌクレオチドの各々は、（ｉ）各ビーズに特有のオリゴヌクレオチド細胞マーカーと（ｉｉ）各捕捉オリゴヌクレオチドに特有のオリゴヌクレオチド標識部とを含む。本発明の方法、システムおよびキットに従って単一細胞発現分析を行うのに適したビーズ部分は、米国特許出願公開第２０１６／０２８９６６９号に開示されているものを含むが、これらに限定されず、その全内容は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。単一細胞発現分析を行うためのビーズの１つの非限定的な実施形態を図９に示す。
【００４８】
いくつかの実施形態では、被検物質は、細胞がビーズとマイクロウェルの底との間の分析空間に封入された後に、細胞から分泌される。細胞は、細胞が被検物質を分析空間に分泌するのに十分な条件の下で培養してもよい。分泌された被検物質は、生体分子であり得る。分泌された被検物質は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ｍＲＮＡ、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、抗体、またはアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、被検物質は切断（例えば、酵素的切断）によって細胞から放出され得る。いくつかの実施形態では、サンプル内の細胞がビーズとマイクロウェルの底との間に封入された後、かつ、分析を行う前に溶解されてもよい。細胞溶解は、被検物質が細胞内生体分子であるアッセイにおいて実施されてもよい。細胞溶解は、化学的または生化学的手段によって、浸透圧衝撃によって、または熱溶解、機械的溶解、または光学的溶解によって行われ得る。いくつかの実施形態では、例えば、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉ硫酸ドデシル、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＮＰ−４０）、有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトン）、またはこれらの組み合わせを含む細胞溶解緩衝液を添加することによって細胞を溶解してもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞のサンプルにおける個々の細胞中の標的核酸の出現数を決定するための方法を提供する。この方法は細胞のサンプルを、複数のマイクロウェルを含むアレイ上に導入し、ビーズライブラリをアレイ上に導入することによって行われ得る。マイクロウェルの幾何学的形状とライブラリー中のビーズの幾何学的形状とは、ビーズの幅がマイクロウェルの底の幅よりも大きくなるようにペアリングされる。ビーズの幾何学的形状とマイクロウェルの幾何学的形状とは、本明細書に具体的に開示されるようにペアリングされ得る。ビーズとマイクロウェルとの幾何学的なペアリングのために、ビーズをマイクロウェルへ導入することによって、マイクロウェル内の個々の細胞を、個々のビーズの底とマイクロウェルの底との間の空間における容積中に封入することとなる。ビーズライブラリ中のビーズは、少なくとも１つの標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための複数のオリゴヌクレオチドリガンドを含み得る。オリゴヌクレオチドリガンドは、（ｉ）各ビーズに特有のオリゴヌクレオチド細胞マーカーと（ｉｉ）オリゴヌクレオチドリガンドの各出現に特有のオリゴヌクレオチド標識とに結合され得る。オリゴヌクレオチドリガンドを含むビーズの１つの非限定的な実施形態を図９に示す。
【００５０】
個々の細胞がマイクロウェルに導入され、ビーズの底とマイクロウェルの底との間の空間に封入されると、個々の細胞は、細胞が１つ以上の標的オリゴヌクレオチドを分泌するのに十分な条件の下で培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ビーズの底とマイクロウェルの底との間の空間における小容積中に標的オリゴヌクレオチドを放出するように溶解される。標的オリゴヌクレオチドがビーズの底とマイクロウェルの底との間の空間にあることによって、標的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドリガンドにハイブリダイズすることができる。標的オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドリガンドにハイブリダイズされたビーズを回収する。いくつかの実施形態では、ビーズは磁性であり、磁石を使用して回収される。いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズよりも高い密度を有する緩衝溶液を用いてマイクロウェルからビーズを取り外すことによって回収される。ビーズの回収後、ハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドを増幅し、（ｉ）ハイブリダイズされた標的核酸と（ｉｉ）オリゴヌクレオチド細胞マーカーに相補的なオリゴヌクレオチドと（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド標識とを含む複数のオリゴヌクレオチド結合体を作製する。次いで、増幅したオリゴヌクレオチド結合体を使用して、細胞サンプル内の個々の細胞によって発現された標的オリゴヌクレオチドの出現数を決定する。オリゴヌクレオチド結合体を増幅し、それらを個々の細胞によって発現される標的オリゴヌクレオチドの出現数と相関させる方法は、以下の参考文献に開示されており、その全内容は全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許出願公開第２０１６／０２８９６６９号；ＢｏｓｅらによるＧｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１６：１２０；および、ＦａｎらによるＳｃｉｅｎｃｅ（２０１５）Ｖｏｌ３４７、Ｉｓｓｕｅ６２２２、Ｐ．１２５８３６７−１。
【００５１】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、１つのサンプルを１つのマイクロウェルに導入するための方法を提供する。この方法は、本明細書中に開示されるようにビーズとマイクロウェルとを幾何学的にペアリングすること、サンプルをマイクロウェルに導入すること、およびビーズをマイクロウェルに導入することによって実施され得る。ここで、ビーズをマイクロウェルに導入することによって、ビーズの周辺部をマイクロウェルの壁に接触させ、それによって、ビーズをマイクロウェル内に固定し、そして固定されたビーズの底とマイクロウェルの底との間の空間内にサンプルを封入する。次いで、サンプルは、１つ以上の被検物質の存在について分析され得る。この分析は、被検物質の出現数および／または濃度を決定することを含む。サンプルは、その生物活性についてアッセイされ得る。ビーズは、複数のマイクロウェルを含む基板上に導入された複数のビーズに含まれ得る。
【００５２】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、サンプルの生物活性を分析するためのキットを提供する。このキットは、サンプル中の１つ以上の被検物質の存在および／または量を決定するために使用され得る。キットは、本明細書に開示されるように幾何学的にペアリングされるマイクロウェルとビーズとを含み得る。これにより、ビーズをマイクロウェルに導入することによって、ビーズの周辺部をマイクロウェルの壁に接触させ、それによって、マイクロウェルの底とビーズの底部の表面との間に、ビーズの周辺部とマイクロウェルの壁との間に形成される界面から下方に、密閉された空間を作り出す。キットは、基板内に複数のビーズおよび複数のマイクロウェルを含んでいてもよい。複数のビーズは、液体キャリア内に懸濁させることができる。ビーズは、本明細書中に開示されるように、目的の被検物質（例えば、生体分子）と結合するリガンドに結合され得る。キットは、複数のビーズと、複数のビーズを含む懸濁液を生成するための別個の液体キャリアとを含み得る。ビーズは、本明細書中に開示されるように、標的の被検物質を捕捉するための１つ以上のリガンドを含み得る。キットは、１つ以上のリガンドと、リガンドをビーズに結合させるための試薬とを含み得る。キットおよびその個々の構成要素は、容器、ラップ（例えば、シュリンクラップ）、バッグ、または他の適切なパッケージ内に載置され得、そして、サンプル内に含まれる１つ以上の被検物質の存在および／または量を検出することを含む、サンプルの生物活性を分析するための説明書を含み得る。
【００５３】
［実施例１−マイクロウェル分析］
多角錐台または円錐台の形状を有し、底の直径が１０〜５０μｍ、頂部の直径が５０〜１３０μｍ、および高さが３０〜１５０μｍであるマイクロウェルのアレイを使用する。マイクロウェルを培地で満たし、細胞の懸濁液をアレイ上に導入する。細胞は、典型的にはマイクロウェルに対して１：１０の比率で導入されるが、アレイの領域にわたって可能な限り均一に細胞を分布させる努力がなされる。細胞は、マイクロウェルの底に沈降するのに十分な時間を与えられる。その後、１０〜１００μｍの範囲のほぼ均一な直径を有するビーズの懸濁液を、典型的には１．１：１〜１．５：１のビーズ対マイクロウェル比でマイクロウェルアレイ上に導入する。ビーズの表面は、典型的にはオリゴヌクレオチドまたは抗体で官能化されており、細胞によって放出された分子と結合する。ビーズがマイクロウェル中に沈降するのに十分な時間を与え、ビーズをアレイにできるだけ均一に広げる努力をし、すべてのマイクロウェル中にビーズが存在することを確認する。次のステップは、アッセイのタイプによって異なる。目的が細胞内容物を捕捉することである場合、マイクロウェル中の細胞を溶解し、細胞から放出された分子がビーズに結合するように十分な時間を与える。目的が生細胞によって分泌される分子を捕捉することである場合、培養中の細胞の任意の刺激によって、これらの分子をビーズ上に捕捉するように十分な培養時間を与える。最後に、ビーズ上に捕捉された分子の分析は、マイクロウェルアレイの内側または外側のいずれかで行われる。
【００５４】
［実施例２−マイクロウェル密封の実証］
ビーズで円錐形マイクロウェルを密封することの実用性を、図１１に示すような、底の直径が１４０μｍであり、深さが２００μｍであり、および開口角度が３４度である円錐台の形状を有するマイクロウェルのアレイを用いて実験で試験した。ビーズは２２５μｍの直径を有し、ヒドロゲルから作製された。マイクロウェルをフルオレセイン（分子量３３２、水中拡散係数４２５μｍ２／ｓの小分子蛍光色素）の溶液で５ｍｍの深さまで満たした。ビーズの懸濁液をマイクロウェル上に導入し、ビーズを沈降させ、マイクロウェル中に落下させた。マイクロウェル中の培地を、緩衝液の吸引および分注を繰り返すことによって、普通の緩衝液に交換した。数回繰り返した後、ビーズのないマイクロウェルでは検出可能な蛍光はなかったが、ビーズのあるマイクロウェルではビーズの下の培地は強い蛍光を維持し、ビーズの下のフルオレセインの存在を示した（図１２参照）。次に、２つの隣接するマイクロウェル中のビーズの下のフルオレセインの蛍光を、時間の関数として蛍光ビデオ顕微鏡下で測定した。実験開始時の平均レベルに正規化した、２つのマイクロウェルの中央領域からの蛍光の平均レベル（バックグラウンド蛍光を差し引いた後）を、様々な時点でプロットした（図１２参照）。結果は、ビーズの下の蛍光が９０分後までにその初期レベルの５０％まで減衰したことを示し、これは、ビーズの下からのフルオレセインの溶出が遅く、ビーズがマイクロウェルをしっかりと密封していることを示した。
【００５５】
ビーズによるマイクロウェルの密封性をより定量的に推定するため、マイクロウェル中のビーズの下からのフルオレセインの拡散を、Ｃｏｍｓｏｌ中で数値的にシミュレートした。直径が２２５μｍの固体ビーズの場合であって、ビーズと、実験におけるような形状および寸法を有するマイクロウェルの円錐形側壁との間に０．０５μｍの間隙がある場合、シミュレーションは、ビーズの下のフルオレセインの濃度が、実験において観察された減衰時間よりも１５倍短い時間である６分後までに５０％まで減衰することを予測した（太い曲線、図１２）。したがって、実験で観察されたマイクロウェルの密封は、ビーズと側壁との間に０．０５μｍの間隙がある場合よりもはるかに効率的であった。一方、実験データは、内部におけるフルオレセインの実効拡散係数が０．０６２μｍ２／ｓである多孔質ビーズによってマイクロウェルが密封されている（間隙がない）場合の数値シミュレーションの予測と一致した（図１２の細いカーブ）。この数値は、水中のフルオレセインの拡散係数より７，０００低く、ビーズのヒドロゲル材料中のフルオレセインの実験的に測定された拡散係数と一致する。したがって、数値シミュレーションの結果は、ヒドロゲルビーズがマイクロウェルをしっかりと密封したことを確認した。
【００５６】
［実施例３−円錐形マイクロウェルおよびマイクロウェルの幾何学的形状とビーズの幾何学的形状とのペアリングのいくつかの利点の実証］
マイクロウェルを円錐形状に構成することにより、１つのビーズのみが各マイクロウェルに入るようにすることができる。１０，０００を超える単分散ビーズを含む円錐形マイクロウェルアレイの試験では、２つ以上のビーズがマイクロウェルに入ったことは観察されなかった。
【００５７】
さらに、ビーズは、円錐形マイクロウェル内にあるとき、円錐形の側壁に支えられ、マイクロウェルの底の上方に、明確に画定された短い距離だけ離れて配置される。マイクロウェルのパラメータおよびビーズの直径を適切に選択すると、ビーズの底とマイクロウェルの底の上にある細胞（１つまたは複数）との間の培地の体積を、ビーズと細胞（１つまたは複数）との間の望ましくない物理的接触を回避しながら、最小限にまで減少させることができる。この特徴は、本発明のマイクロウェルを、細胞によって放出された分子、または、溶解された細胞から放出された分子と、ビーズによって保持された分子とのハイブリダイゼーションを含むアッセイに好都合なものにする。ハイブリダイゼーションは、最小限の容積内で、細胞によって（または細胞から）放出された比例的に高い濃度の分子と起こるため、標的分子のビーズへの効率的かつ迅速な結合が達成され得る。
【００５８】
この原理の実証として、底が直径１５μｍ、深さが最大６０μｍ、および、開口角度が３４度のマイクロウェルを作製し、単分散の直径が３０μｍのビーズをマイクロウェルアレイ上に導入した。ビーズとマイクロウェルの底との間の培地の体積は５ｐＬ未満であり、一方、ビーズの底はマイクロウェルの底から１０μｍよりも上方にあり、これにより、ビーズとマイクロウェルの底の細胞との間に実質的なクリアランスを設けた。比較として、単一細胞ＲＮＡシークエンシングに使用される、Ｇｉｅｒａｈｎら（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７年４月；１４（４）：３９５−３９８）によって教示されるように半透膜によって覆われたマイクロウェルアレイにおいて、（ハイブリダイゼーションが起こるように設計された）マイクロウェル中の培地の体積は最大５０ｐＬであった。これは１０倍大きい体積であり、細胞によって（または細胞から）放出される分子の濃度は１０倍低く、実質的に遅く、効率の低いハイブリダイゼーションとなると予想される体積である。さらに、液滴ベースのアッセイにおいて、細胞およびビーズは、典型的には体積が１〜２ｎＬの培地の液滴中に閉じ込められ、これによって、細胞から放出される分子の濃度が、本発明のマイクロウェル構成の態様における濃度よりも少なくとも２桁低くなる。
【００５９】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願がその全体が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されたのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中の用語と、組み込まれた参考文献中の用語との間に矛盾がある場合には、本明細書中の用語が考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明のマイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【図２】本発明の錐台形状のマイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【図３】本発明の多角形状のマイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【図４】本発明の錐台形状の多角形マイクロウェルのいくつかの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【図５】本発明のマイクロウェルの非限定的な実施形態の寸法を示す。
【図６】マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【図７】マイクロウェルとビーズとの幾何学的なペアリングの非限定的な実施形態の斜視図を示す。
【図８Ａ】ビーズの相対寸法を示す。
【図８Ｂ】ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングの実施形態を示し、ビーズの、マイクロウェルの頂部より上方に位置する部分の高さは、ビーズの半径に等しい。
【図８Ｃ】ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングの実施形態を示し、ビーズの、マイクロウェルの頂部より上方に位置する部分の高さは、ビーズの半径よりも小さい。
【図８Ｄ】ビーズとマイクロウェルとの間の幾何学的なペアリングの実施形態を示し、ビーズの、マイクロウェルの頂部より上方に位置する部分の高さは、ビーズの半径よりも大きい。
【図９】本発明の官能化ビーズの非限定的な実施形態の構成を示す。
【図１０】単一細胞発現分析を実施するための方法の非限定的な実施形態のための一般的なプロセス図を示す。
【図１１】実施例２に関連して使用される本発明のマイクロウェルの実施形態の模式図を示す。
【図１２】実施例２から得られた実験および数値シミュレーションの結果を示すグラフである。種々のパラメータが時間の関数としてプロットされている：実験開始時の濃度に正規化された、蛍光に比例するフルオレセインの濃度（丸）；固体ビーズを用い、ビーズと円錐形側壁との間に０．０５μｍの間隙を設けた数値シミュレーションからのフルオレセインの濃度（太い曲線）；多孔質ビーズを用い、ビーズ内部の実効拡散係数が０．０６２μｍ２／ｓである数値シミュレーションからのフルオレセインの濃度（細い曲線）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月9日(2020.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイを行うためのキットであって、
ａ）少なくとも１つのマイクロウェルを含む基板であって、上記マイクロウェルは、１つの開口部と１つの底とを有している基板と、
ｂ）少なくとも１つのビーズであって、上記マイクロウェルの上記底よりも幅広であるビーズと、を備えているキット。
【請求項２】
上記マイクロウェルの上記開口部は、上記マイクロウェルの上記底よりも幅広である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
上記マイクロウェルは、円形、多角形、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される水平断面形状を有している、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
上記マイクロウェルは、円筒、多面体、逆円錐、逆角錐、半球、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される形状を有している、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
上記マイクロウェルは、錐台の形状である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
上記マイクロウェルは、逆円錐の形状を有している、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
上記基板は、複数の上記マイクロウェルを含んでいるアレイである、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
上記開口部の幅は、約４０μｍ〜約１３０μｍである、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
上記底の幅は、約５μｍ〜約３０μｍである、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
上記ビーズは、約１５μｍ〜約１００μｍの幅を有している、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
上記ビーズはリガンドを含んでいる、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
上記リガンドは、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
上記キットは複数のビーズを備えており、上記ビーズの各々は、標的の被検物質を捕捉するためのリガンドと、上記複数のビーズにおける各ビーズに特有の標識とを含んでいる、請求項１に記載のキット。
【請求項１４】
上記キットは複数のビーズを備えており、上記ビーズは、（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするためのリガンド部と、（ｉｉ）各ビーズに特有の標識部と、（ｉｉｉ）上記リガンド部に特有の標識部とを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでいる、請求項１に記載のキット。
【請求項１５】
上記ビーズの幾何学的形状と上記マイクロウェルの幾何学的形状とは、上記ビーズが上記マイクロウェル内に嵌め込まれると上記ビーズの表面が上記マイクロウェルの壁と接触し、それによって上記ビーズと上記壁との界面に封を形成するようにペアリングされている、請求項１に記載のキット。
【請求項１６】
上記ビーズは磁性である、請求項１に記載のキット。
【請求項１７】
サンプルにおける被検物質の存在を特定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマイクロウェルを含んでいる基板を設ける工程と、
ｂ）上記マイクロウェルにサンプルを導入する工程と、
ｃ）上記マイクロウェルを、標的の被検物質と結合可能なリガンドを含んでいるビーズと接触させる工程であって、上記マイクロウェルを上記ビーズと接触させることによって、上記マイクロウェル内に上記サンプルを封入する工程と、
ｄ）上記リガンドが上記被検物質と結合するのに十分な条件の下で上記サンプルを培養する工程と、
ｅ）上記リガンドの上記被検物質への結合を検出する工程であって、それによって上記サンプルにおける上記被検物質の存在を特定する工程と、を含んでいる方法。
【請求項１８】
上記被検物質は、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、アミノ酸、炭水化物、核酸、ウイルス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記被検物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記サンプルは１つまたは複数の細胞を含み、上記リガンドの上記被検物質への結合を検出することによって、上記１つまたは複数の細胞によって分泌または放出された生体分子を特定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）上記基板は複数のマイクロウェルを含み、（ｉｉ）上記サンプルを導入することは、１つまたは複数の細胞を上記マイクロウェルに導入することを含み、且つ（ｉｉｉ）上記マイクロウェルを複数のビーズと接触させ、上記マイクロウェルを上記ビーズと接触させることにより、上記１つまたは複数の細胞を上記マイクロウェル内に封入する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
上記被検物質は少なくとも１つの生体分子を含んでいる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記ビーズは少なくとも１つのリガンドを含んでおり、
上記検出は、（ｉ）上記リガンドの上記生体分子への結合を検出することを含んでおり、且つ（ｉｉ）上記１つまたは複数の細胞による少なくとも１つの生体分子の分泌または放出を特定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記ビーズは複数の種々のリガンドを含んでおり、
上記検出は、（ｉ）上記リガンドの複数の種々の生体分子への結合を検出することを含んでおり、且つ（ｉｉ）上記１つまたは複数の細胞によって分泌または放出された生体分子のプロファイルを提供する、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2020515871.tif 000018
2020515871.tif 000019
2020515871.tif 000020