(57)【要約】  本発明は、とりわけ、癌及び炎症性疾患などの疾患の治療で使用される、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＩＧＨＴベースのキメラタンパク質を含む、組成物及び方法に関する。【選択図】図２２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造のキメラタンパク質であって、式中、
（ａ）が、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、膜貫通タンパク質はＴＩＧＩＴであり、
（ｂ）が、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ
（ｃ）が、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、膜貫通タンパク質は４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＬＩＧＨＴから選択され、
前記リンカーが、前記第１のドメインと前記第２のドメインを連結しかつ必要に応じて１以上の結合リンカーを含み、そのような結合リンカーは配列番号４９〜９５から選択される、
キメラタンパク質。
【請求項２】
前記第２のドメインが、４−１ＢＢＬである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記第２のドメインが、ＧＩＴＲＬである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記第２のドメインが、ＴＬ１Ａである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記第２のドメインが、ＬＩＧＨＴである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造のキメラタンパク質であって、式中、
（ａ）が、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、膜貫通タンパク質はＰＤ−１、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、及びＴＩＧＩＴから選択され、
（ｂ）が、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり、かつ
（ｃ）が、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、膜貫通タンパク質はＬＩＧＨＴであり、
前記リンカーが、前記第１のドメインと前記第２のドメインを連結しかつ必要に応じて１以上の結合リンカーを含み、そのような結合リンカーは配列番号４９〜９５から選択される、
キメラタンパク質。
【請求項７】
前記第１のドメインが、ＰＤ−１である、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記第１のドメインが、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）である、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記第１のドメインが、ＴＩＧＩＴである、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記リンカーが、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されるポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーが、ＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｆｃドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４に由来する、請求項１１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記リンカーが、配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１又は請求項１２に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記リンカーが、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１又は請求項１２に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記リンカーが、１以上の結合リンカーを含み、そのような結合リンカーは配列番号４９〜９５から独立して選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記リンカーが、２以上の結合リンカーを含み各結合リンカーは配列番号４９〜９５からそれぞれ独立して選択され、１つの結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｆｃ  ドメインに対しＮ末端でありかつ別の結合リンカーが、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｆｃ  ドメインに対しＣ末端である、請求項１５に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記キメラタンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
前記キメラタンパク質が、細胞間で安定なシナプスを形成できる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
前記細胞間で安定なシナプスが、腫瘍縮小に有利である空間的配向を提供する、請求項１８に記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
前記空間的配向が、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を位置づけかつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされるもの以外の負のシグナルを含む、負のシグナルの送達から腫瘍細胞を立体的に防ぐ、請求項１８又は請求項１９に記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
そのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメインのいずれか又は両方の結合が、遅いオフ速度（Ｋｏｆｆ）で生じ、それが受容体とそのリガンドの長い相互作用を提供する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２２】
前記長い相互作用が、持続的な負シグナルマスキング効果を提供する、請求項２１に記載のキメラタンパク質。
【請求項２３】
前記長い相互作用が、より長い正のシグナル効果を送達する、請求項２１又は請求項２２に記載のキメラタンパク質。
【請求項２４】
前記より長い正のシグナル効果が、抗腫瘍効果のためにエフェクター細胞が十分に刺激されることを可能にする、請求項２３に記載のキメラタンパク質。
【請求項２５】
前記長い相互作用が、Ｔ細胞増殖を提供しかつ抗腫瘍攻撃を可能にする、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２６】
前記長い相互作用が、刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２７】
前記刺激シグナルが、サイトカインである、請求項２６に記載のキメラタンパク質。
【請求項２８】
前記キメラタンパク質が、配列番号１４、１７、又は２０の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項２９】
前記キメラタンパク質が、配列番号５、８、又は１１のうちの１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質の治療有効量を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項３２に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
患者の免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする対象に請求項３２に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記患者のＴ細胞が、活性化される、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が、腫瘍を有しかつ１以上の腫瘍細胞が、免疫抑制シグナルを伝達することを防止される、請求項３３〜請求項３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
それを必要とする対象に医薬組成物の有効量を投与することを含む癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、前記医薬組成物が、
（ａ）膜貫通タンパク質がＴＩＧＩＴである、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカー、並びに
（ｃ）膜貫通タンパク質が４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＬＩＧＨＴから選択される、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメイン
を含むキメラタンパク質を含む、方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象に医薬組成物の有効量を投与することを含む癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、前記医薬組成物が、
（ａ）膜貫通タンパク質がＰＤ−１、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、及びＴＩＧＩＴから選択される、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカー、並びに
（ｃ）膜貫通タンパク質がＬＩＧＨＴである、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメイン
を含むキメラタンパク質を含む、方法。
【請求項３９】
前記対象のＴ細胞が、前記キメラタンパク質の第２のドメインに結合される時に活性化されかつ、
（ａ）１以上の腫瘍細胞が、前記キメラタンパク質の第１のドメインに結合される時に免疫抑制シグナルの伝達を防止され、
（ｂ）前記対象の末梢血中の定量化可能なサイトカイン応答が、達成され、かつ／又は
（ｃ）腫瘍成長が、Ｉ型若しくはＩＩ型タンパク質、又はそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体に対する抗体で治療された対象と比較してそれを必要とする対象において低下される、
請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＴＬ１Ａの１以上のシグナル伝達を刺激しかつ抗原提示細胞を活性化する、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、未治療対象又はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質、若しくはそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体に対する抗体で治療された対象と比較して調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量又は活性を低下させる、請求項３３〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、未治療対象又はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質、若しくはそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体に対する抗体で治療された対象と比較して前記対象の流入領域リンパ節においてエフェクターＴ細胞のプライミングを増加させる、請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、未治療対象又はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質、若しくはそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体に対する抗体で治療された対象と比較して免疫抑制細胞の全体的な減少及びより炎症性の腫瘍環境へのシフトを引き起こす、請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
医薬としての使用のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項４５】
癌の治療での使用のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項４６】
炎症性疾患の治療での使用のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項４７】
薬剤の製造における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１７年２月２７日出願の米国仮出願第６２／４６４，００２号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に送信されたテキストファイルの説明
本出願は配列リストを含有する。配列リストは、「ＳＨＫ−００１ＰＣ１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」というタイトルのＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送信された。配列リストは１４１，６１３バイトのサイズであり、２０１８年２月２７日頃に作成された。配列リストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、とりわけ、癌及び自己免疫のための免疫療法などの疾患の治療で使用されるキメラタンパク質を含む組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
免疫システムは、疾患を引き起こし得る外部実体に対する身体の応答の中枢である。しかしながら、多くの癌は、例えば、免疫阻害シグナルを送達又は伝達することにより、免疫系を避けるメカニズムを発達させている。そのため、例えば、免疫阻害シグナルを逆転させ抗癌免疫応答を刺激する、複数の機能を備えた治療法を開発する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
したがって、様々な態様において、本発明は、癌免疫療法に有用である組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は、部分的には、免疫活性化又は共刺激シグナルを提供しながら免疫阻害シグナルを逆転又は抑制する特定のキメラタンパク質に関する。とりわけ、重要なことに、本発明は、理論に縛られることなく、１以上のジスルフィド結合を含むリンカー領域における安定化に基づいて、安定で生成可能な多量体状態を維持できる改善されたキメラタンパク質を提供する。したがって、本組成物及び方法は、二重特異性薬剤の生成における様々な欠陥を克服する。
【０００６】
いくつかの態様において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端：の一般構造のものであり、式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含む。
【０００７】
例えば、実施形態において、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）由来である。
【０００８】
実施形態において、キメラタンパク質は、（Ｉ）Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端：の一般構造のものであり、式中、（ａ）は、膜貫通タンパク質がＴＩＧＩＴであるＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４由来であるヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、膜貫通タンパク質は４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）、ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）、及びＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）から選択され、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含む。
【０００９】
例えば、実施形態において、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、ＬＩＧＨＴ由来である。
【００１０】
いくつかの態様において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端：の一般構造のものであり、式中、（ａ）は膜貫通タンパク質がＰＤ−１、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、及びＴＩＧＩＴである、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４由来であるヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）は貫通タンパク質がＬＩＧＨＴである、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、癌又は炎症性疾患を治療する方法であって、前述のキメラタンパク質の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。実施形態において、対象のＴ細胞はキメラタンパク質の第２のドメインに結合される時に活性化され、（ａ）１以上の腫瘍細胞はキメラタンパク質の第１のドメインに結合される時に免疫抑制シグナルの伝達を防止され、（ｂ）対象の末梢血中の定量化可能なサイトカイン応答が達成され、かつ／又は（ｃ）それを必要とする対象において腫瘍成長はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質に対する抗体、又はそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体で治療された対象と比較して低下される。実施形態において、本方法は、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＴＬ１Ａの１以上のシグナル伝達を刺激し、抗原提示細胞を活性化する。実施形態において、本方法は、未治療の対象、又はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質に対する抗体、又はそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体で治療された対象と比較して、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量又は活性を低下させる。実施形態において、本方法は、未治療の対象、又はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質に対する抗体、又はそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体で治療された対象と比較して、対象の流入領域リンパ節におけるエフェクターＴ細胞のプライミングを増加させる。実施形態において、本方法は、免疫抑制細胞の全体的な減少を引き起こし、未治療の対象、又はＩ型若しくはＩＩ型タンパク質に対する抗体、又はそれらのそれぞれのリガンド若しくは受容体で治療された対象と比較して、より炎症性の腫瘍環境に向かうシフトを引き起こす。
【００１２】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを取り除きリンカー配列を用いて隣接させて（図１Ｂ）Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインの各々が単一キメラタンパク質中で外側に向かう単一キメラタンパク質を作製する、Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質（図１Ａ及び図１Ｃ）を工学処理する方法の模式図を示す。図１Ｂは、各タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの除去によるＩ型とＩＩ型膜タンパク質の連結を示し、各タンパク質由来の遊離細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はリンカー配列により接合されている。この図のＥＣＤは、典型的には細胞膜の外側に局在する候補Ｉ型又はＩＩ型タンパク質の全アミノ酸配列、又は意図された受容体若しくはリガンドへの結合を保持するその任意の部分を含み得る。図１Ｄは、Ｉ型膜タンパク質の細胞外ドメインが構築物の「左」側に面しＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインが構築物の「右」側に面する、線形構築物中の隣接細胞外ドメインを示す。
【図２】図２Ａは、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を例に用いて、腫瘍細胞がその細胞表面上でＰＤ−Ｌ１を発現し得、これはＴ細胞により発現されるＰＤ−１に結合できる（図２Ｂ）ことを示す。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化を抑制する。ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインに結合したＰＤ−１の細胞外ドメインを含むキメラタンパク質は、腫瘍細胞の表面上でＰＤ−Ｌ１に結合し、Ｔ細胞の表面上でＰＤ−１への結合を防止し得る（図２Ｃ）。キメラタンパク質は次いで、腫瘍細胞の表面から「ぶら下がる」ことができ、キメラタンパク質のＯＸ４０Ｌ部分は次いで、Ｔ細胞の表面上で発現されるＯＸ４０に結合し得る。これは、共刺激ＯＸ４０Ｌシグナルとの阻害性ＰＤ−Ｌ１シグナルの置換をもたらして、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強する。図２Ｄは、腫瘍細胞とＴ細胞の間のキメラタンパク質によって形成されたシナプスを示す。図２Ａ〜図２Ｃは、それによりＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がその標的分子に結合して細胞間のシナプスを作り出す、機構を示す。そのため、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、それにより本発明のキメラタンパク質が作動する機構の例である。
【図３Ａ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したマウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図３Ｂ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。いずれの場合も、各ドメインの特定の検出は、抗ＴＩＧＩＴ、抗Ｆｃ及び抗ＯＸ４０Ｌブロットによって示される。
【図４Ａ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左上）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ１５５／ＰＶＲ−Ｈｉｓ（右上）、ｍＯＸ４０Ｌに対する抗体で捕捉及び検出されるＯＸ４０−Ｈｉｓ（左下）、並びに組換えＣＤ１５５で捕捉及び検出されるＯＸ４０−Ｆｃ（右下）、で行われるマウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図４Ｂ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左上）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ１５５／ＰＶＲ−Ｈｉｓ（右上）、ｍＯＸ４０Ｌに対する抗体で捕捉及び検出されるＯＸ４０−Ｈｉｓ（左下）、並びに組換えＣＤ１５５、ＣＤ１１２若しくはＣＤ１１３タンパク質で捕捉及び検出されるＯＸ４０−Ｆｃ（右下）、で行われるヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図５Ａ】ヒトＰＶＲ（ＣＨＯＫ１／ＰＶＲ）を過剰発現するように作製した細胞株を示し、それらはＴＩＧＩＴ含有構築物を介する結合を検出するために使用できる（図５Ａでは、未染色及びアイソタイプが重なっている）。
【図５Ｂ】ネクチン−２（ＣＨＯＫ１／ネクチン２）を過剰発現するように作製した細胞株を示し、それらはＴＩＧＩＴ含有構築物を介する結合を検出するために使用できる
【図５Ｃ】ネクチン３（ＣＨＯＫ１／ネクチン３）を過剰発現するように作製した細胞株を示し、それらはＴＩＧＩＴ含有構築物を介する結合を検出するために使用できる（図５Ｃでは、未染色、アイソタイプ及び検出Ａｂが重なっている）。
【図６】マウスＰＶＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（左上）、ＰＶＲ欠く親ＣＨＯ−Ｋ１細胞（左下）又はマウスＯＸ４０を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞への、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を示すグラフである。
【図７】約６，０００個のヒト膜タンパク質を含有するマイクロアレイから特定されたヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合パートナーを示す結果の表である。いずれの場合も、各候補分子に対して予想される結合パートナーをスクリーニングによって特定した。他のヒトタンパク質への非特異的結合の証拠はなく、ガレクチン−１への結合は、全てのＦｃ含有融合タンパク質についてのスクリーニングで見られる。
【図８Ａ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したマウスｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図８Ｂ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図９Ａ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左上）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ４７−Ｈｉｓ（右上）、ｍＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるｍＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（左下）、並びにＳＩＲＰαに対する抗体で捕捉及び検出されるＬＴＢＲ  Ｈｉｓ＋ＧＳＴ（右下）、で行われるマウスｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図９Ｂ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左上）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ４７−Ｈｉｓ（右上）、ヒトＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるヒトＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（左下）、並びにＳＩＲＰαに対する抗体で捕捉及び検出されるＬＴＢＲ  Ｈｉｓ＋ＧＳＴ（右下）、で行われるヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１０Ａ】マウスＣＤ４７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（左）又はマウスＬＴｂＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（右）へのマウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を示すグラフである。
【図１０Ｂ】マウスＣＤ４７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞へのヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を示すグラフである（検出Ａｂのみの対照ピークは左端、残りのピークは濃度を増加させることにより左から右に分布する（すなわち、２５０が右端））。
【図１１Ａ】ＣＤ４７特異的抗体（クローンＣＣ２Ｃ６又はＣＣ９００００２）と比較して、カニクイザル赤血球に対するヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの結合を示すグラフである、左上。各処置後のカニクイザル赤血球の溶解が、左下の滴定曲線上に示され、例示的プレートが右側に示される。トリトン−Ｘを、カニクイザル赤血球の溶解を引き起こす陽性対照として使用した（参考までに、上部パネルでは、Ｘ軸ポイント２ｎＭで、曲線は上から下に、抗ＣＤ４７／ＩｇＧ−ＡＰＣ、抗ＣＤ４７−ＦＩＴＣ、ＳＩＲＰα−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びＳＩＲＰα−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌであり、下部パネルでは、Ｘ軸ポイント２で、曲線は上から下に、トリトン−Ｘ１００、抗ＣＤ４７（ＣＣ２Ｃ６）及び抗ＣＤ４７（ＣＣ９００２）、ＳＩＲＰα−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びＳＩＲＰα−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌであり、全て重複している）。
【図１１Ｂ】ＣＤ４７特異的抗体（クローンＣＣ２Ｃ６又はＣＣ９００００２）と比較した、３人の異なる血液ドナーの各々からのヒト赤血球への、ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの結合を示すグラフである。
【図１１Ｃ】各治療後のヒト赤血球の溶解が左の滴定曲線上に示され、例示的プレートが右側に示される。トリトン−Ｘを、カニクイザル赤血球の溶解を引き起こす陽性対照として使用した。データは、３人の赤血球ドナーについて示される。
【図１２Ａ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１２Ｂ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１３Ａ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左）、ｍＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるｍＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（中央）、並びにｍＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるｍＰＤ−Ｌ１（右）、で行われるマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１３Ｂ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左）、ビオチン化ｈＬＩＧＨＴで捕捉及び検出されるｈＬＴＢＲ−Ｆｃ  Ｈｉｓ（中央）、並びにｈＬＴＢＲ−Ｈｉｓ／６ｘ  Ｈｉｓ−ＨＲＰで捕捉及び検出されるｈＰＤＬ１−Ｆｃ（右）、で行われるヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１４Ａ】マウスＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（左）又はマウスＬＴｂＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞への、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を示すグラフである。
【図１４Ｂ】ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞へのヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を示すグラフである。
【図１５Ａ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したマウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１５Ｂ】Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１６Ａ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左）、Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出されるＣＤ１５５／ＰＶＲ（中央）、及びｍＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるｍＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（右）、で行われるマウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１６Ｂ】以下の条件下：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（左）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ１５５−Ｈｉｓ（中央）、並びにｈＬＴＢＲ−Ｈｉｓ／６ｘ  Ｈｉｓ−ＨＲＰで捕捉及び検出されるｈＣＤ１５５−Ｆｃ（右）、で行われるヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１７】マウスＰＶＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（左）又はマウスＬＴｂＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（右）へのマウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を示すグラフである
【図１８Ａ】ヒトＬＴｂＲへのヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を実証する、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集された結合親和性測定を示すグラフである（全てのパネル、上から下へ：３０、１０、３．３、０）。
【図１８Ｂ】濃度の範囲（上から下に：５００ｎＭのＡＲＣ×ＰＤ−Ｌ１、５００ｎＭのＡＲＣ×ＰＤ−Ｌ２、１６６ｎＭのＡＲＣ×ＰＤ−Ｌ１、１６６ｎＭのＡＲＣ×ＰＤ−Ｌ２、５６ｎＭのＡＲＣ×ＰＤ−Ｌ１、５６ｎＭのＡＲＣ×ＰＤ−Ｌ２、ＡＲＣなし）にわたる組換えヒトＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２へのヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を実証する、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集された結合親和性測定である。
【図１９Ａ】片面ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質対照と比較して、組換えヒトＣＤ１５５／ＰＶＲへのヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を実証する、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集された結合親和性測定を示すグラフである（上から下へ：ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ）。
【図１９Ｂ】片面ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ対照、又は２つのＣＤ４７特異的抗体対照の１つと比較して、組換えヒトＣＤ４７へのヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を実証する、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集された結合親和性測定である（上から下へ：ＳＩＲＰａ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４７  ＣＣ２Ｃ６、及びＳＩＲＰ−Ｆｃ）。
【図１９Ｃ】片面ＰＤ−１−Ｆｃ対照又は抗ＰＤ−Ｌ１対照（アテゾリズマブ）と比較して、組換えヒトＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を実証する、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集された結合親和性測定である（上から下へ：ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、抗ＰＤＬ１、及びＰＤ−１−Ｆｃ）。
【図１９Ｄ】片面ＬＩＧＨＴ−Ｆｃ融合タンパク質対照又は抗ＬＴｂＲ抗体と比較して、組換えヒトＬＴｂＲへのヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの結合を実証する、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集された結合親和性測定である（上から下へ：ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、Ｓｉｒｐ１ａ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、抗ＬＴｂＲ、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びＬＩＧＨＴ−Ｆｃ）。
【図２０Ａ】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって活性化されるマウス末梢血白血球に対する、様々な抗体、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。図２０ＡはＩＬ２分泌をアッセイする。図２０Ａ及び図２０Ｂについては、ＳＥＢの各濃度の条件の順序は、左から右に、説明の上から下に記載の条件を反映する（例えば、α−ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４））は説明の上から３番目にあり、したがって、グラフの左から３番目であり、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（１０ｎＭ）は、説明の下から３番目であり、したがって、グラフの右から３番目、などである）。
【図２０Ｂ】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって活性化されるマウス末梢血白血球に対する、様々な抗体、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。図２０ＢはＴＮＦα分泌をアッセイする。図２０Ａ及び図２０Ｂについては、ＳＥＢの各濃度の条件の順序は、左から右に、説明の上から下に記載の条件を反映する（例えば、α−ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４））は説明の上から３番目にあり、したがって、グラフの左から３番目であり、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（１０ｎＭ）は、説明の下から３番目であり、したがって、グラフの右から３番目、などである）。
【図２０Ｃ】複数のスーパー抗原（ＳＥＢ）濃度にわたるデータのコンパイルを示す（再び、ＳＥＢの各濃度の条件の順序は、左から右に、説明の上から下に記載の条件を反映する）。
【図２１Ａ】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって活性化されるヒト末梢血白血球に対する、様々な抗体、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ａ）、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（図２１Ｂ）、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ｃ）キメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。
【図２１Ｂ】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって活性化されるヒト末梢血白血球に対する、様々な抗体、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ａ）、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（図２１Ｂ）、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ｃ）キメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。
【図２１Ｃ】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって活性化されるヒト末梢血白血球に対する、様々な抗体、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ａ）、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（図２１Ｂ）、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ｃ）キメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。
【図２２Ａ】ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＰＤ−１又はＴＩＧＩＴとＯＸ４０の組み合わせに対するモノクローナル抗体と比較した、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の抗腫瘍有効性を実証するインビボ腫瘍研究の結果を示す。ＣＴ２６腫瘍を、示されたレジメンでの治療前にＢａｌｂ／ｃマウスに移植した。図２２Ａは、各グループの腫瘍接種後４０日にわたる腫瘍サイズの進化を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂにおいて、処置条件を文字で識別する。
【図２２Ｂ】ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＰＤ−１又はＴＩＧＩＴとＯＸ４０の組み合わせに対するモノクローナル抗体と比較した、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の抗腫瘍有効性を実証するインビボ腫瘍研究の結果を示す。ＣＴ２６腫瘍を、示されたレジメンでの治療前にＢａｌｂ／ｃマウスに移植した。図２２Ｂは、腫瘍接種後４０日までのマウスの全生存率を示し、完全な腫瘍拒絶動物の数を、埋め込んだ表に示す。図２２Ａ及び図２２Ｂにおいて、処置条件を文字で識別する。
【図２３】理論に縛られることなく、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の４つの可能性のある構成を示す。
【図２４】非還元条件下、還元条件下、並びに還元条件かつその後のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）による処理下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図２５】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のクロマトグラフを示す。
【図２６】非還元条件下（「−」）又は還元条件下（「＋」）で泳動したＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２７】Ｆｃドメインを欠くＰＤ−１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のネイティブ（非ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２８】理論に縛られることなく、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成する方法についてのモデルを示す。
【図２９Ａ−２９Ｑ】ウェスタンブロット分析による、異なる結合リンカー配列を有するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。異なる結合リンカーの配列を、以下の「実施例」の節に提供する。具体的には、融合構築物の各個々のドメインを、α−ＰＤ−１、α−Ｆｃ、又はα−ＯＸ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。各図において、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料、例えば、対照を、全ブロットのレーン１にロードした（β−メルカプトエタノール又はＰＮＧアーゼなし）。レーン２の試料を還元剤β−メルカプトエタノールで処理し、レーン３の試料をＰＮＧアーゼで処理した。
【図３０】タンパク質の中央Ｆｃ領域に対するＥＬＩＳＡベースの捕捉及び検出アッセイによる、異なる結合リンカー配列を有するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。異なる結合リンカー配列を有する各ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（＃１〜＃１７）のタンパク質濃度を決定した。
【図３１Ａ−３１Ｐ】ＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０に対するＦＡＣＳ分析による、異なる結合リンカー配列を有するＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のフローサイトメトリープロファイルを示す。ＥＣ５０値を、異なる結合リンカー配列を有する各ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質（＃２〜＃１７−リンカーアイデンティティについては以下の実施例のＸ軸ラベル及びチャートを参照されたい）について計算した。
【図３２】例示的なモジュラーリンカーに組み合わせることができるリンカー及びＦｃリンカーの結合を示す表である。示される例示的なモジュラーリンカーは、本明細書に記載のいずれかのＩ型及びＩＩ型タンパク質並びに／又は本明細書に記載のＩ型及びＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインと組み合わせて、本発明のキメラタンパク質を形成できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は、部分的には、これらのタンパク質の配向（例えば、Ｉ型対ＩＩ型）を利用し、したがって、例えば、癌の治療において免疫阻害シグナルをマスキングし免疫刺激シグナルに置き換えることを含む、免疫刺激及び／又は免疫阻害シグナルの送達を可能にする様式で、キメラタンパク質が、免疫調節膜貫通タンパク質の細胞外領域又はエフェクター領域から工学処理され得るという発見に基づいており、具体的には、ＬＩＧＨＴ及び／又はＴＩＧＩＴベースのキメラタンパク質は、医療で使用される。
【００１５】
キメラタンパク質
いくつかの態様において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造のものであり、式中、（ａ）はＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を有するリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）はＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含み、第１及び第２の細胞外ドメインの１つが免疫阻害シグナルであり、第１及び第２の細胞外ドメインの１つが免疫刺激シグナルである。
【００１６】
実施形態において、キメラタンパク質は、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に記載の細胞外ドメインを有する単一のポリペプチドを指す。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、細胞中で単一単位として翻訳される。実施形態において、キメラタンパク質は、複数のポリペプチド、例えばインビトロで（例えば、本明細書に記載の１以上の合成リンカーを用いて）、連結されて単一単位をもたらす本明細書に記載の複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質、を指す。
【００１７】
実施形態において、キメラタンパク質は１つのポリペプチドとして化学合成されるか、又は各ドメインが別々に化学合成され、次いで組み合わされ得る。実施形態において、キメラタンパク質の一部は翻訳され、一部は化学合成される。
【００１８】
実施形態において、細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用できる膜貫通タンパク質の一部を指す。実施形態において、細胞外ドメインは、リガンド又は受容体に結合し細胞にシグナルを効果的に伝達するのに十分な膜貫通タンパク質の一部を指す。実施形態において、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にある膜貫通タンパク質の全アミノ酸配列である。実施形態において、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にある膜貫通タンパク質のアミノ酸配列のその一部であり、当技術分野で知られる方法（例えば、インビトロリガンド結合及び／又は細胞活性化アッセイ）を用いてアッセイされ得るように、シグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要とされる。
【００１９】
実施形態において、免疫阻害シグナルは、免疫応答を減少又は排除するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減少又は排除し得る。通常の生理的条件下で、阻害シグナルは、自己耐性の維持（例えば、自己免疫の予防）において、及び免疫系が病原性感染に応答しているときに組織を損傷から保護するためにも有用である。例えば、限定されないが、免疫阻害シグナルは、そのような阻害シグナルが遮断される場合に、細胞増殖、サイトカイン産生、細胞死滅活性又は食作用活性の増加を検出することによって特定され得る。
【００２０】
実施形態において、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の状況では、そのようなシグナルは抗腫瘍免疫を増強し得る。例えば、限定されないが、免疫刺激シグナルは、白血球の増殖、サイトカイン産生、死滅活性又は食作用活性を直接刺激することによって特定され得る。具体的な例は、受容体アゴニスト抗体を用いるか、又はそのような受容体のリガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＴＬ１Ａ、それぞれ）をコードするキメラタンパク質を用いる、ＯＸ４０、ＬＴｂＲ、４−１ＢＢ又はＴＮＦＲＳＦ２５などのＴＮＦスーパーファミリー受容体の直接刺激を含む。これらの受容体のいずれか１つからの刺激は、個々のＴ細胞サブセットの増殖及びサイトカイン産生を直接刺激し得る。別の例は、そのような免疫抑制細胞の活性を阻害する受容体を介した免疫抑制細胞の直接刺激を含む。これは、例えば、従来のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制する制御性Ｔ細胞の能力を低下させるＧＩＴＲアゴニスト抗体又はＧＩＴＲＬ含有キメラタンパク質でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の刺激を含む。別の例において、これは、ＣＤ４０アゴニスト抗体又はＣＤ４０Ｌ含有キメラタンパク質を用いる抗原提示細胞の表面上のＣＤ４０の刺激を含み、Ｂ７又はＴＮＦスーパーファミリー中のものを含む、適切な天然の共刺激分子の状況で抗原を提示するそれらの細胞の増強した能力を含む抗原提示細胞の活性化をもたらす。別の例では、これは、ＬＩＧＨＴ含有キメラタンパク質を用いるリンパ球又は間質細胞の表面上でのＬＴＢＲの刺激を含み、必要に応じて腫瘍内で、免疫応答をさらに刺激するリンパ球細胞の活性化及び／又は炎症促進性サイトカイン若しくはケモカインの産生をもたらす。
【００２１】
膜タンパク質は典型的には、細胞外ドメイン、１つ又は一連の膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなる。理論に縛られることなく、膜タンパク質の細胞外ドメインは、可溶性若しくは膜結合の受容体又はリガンドと相互作用するのに関与する。理論に縛られることなく、膜貫通ドメイン（複数可）は、タンパク質を原形質膜に局在化するのに関与する。理論に縛られることなく、膜タンパク質の細胞内ドメインは、細胞外の環境と細胞内応答を調整するために細胞シグナル伝達分子との相互作用を調整するのに関与する（逆もまた然り）。２種類の１回膜貫通タンパク質、細胞外アミノ末端と細胞内カルボキシ末端（Ｉ型）を有するもの、並びに細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端（ＩＩ型）を有するもの、が存在する。Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の両方は、受容体又はリガンドのいずれかであり得る。Ｉ型膜タンパク質については、タンパク質のアミノ末端は細胞外に面し、したがって、細胞外環境で他の結合パートナー（リガンド又は受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含有する。ＩＩ型膜タンパク質については、タンパク質のカルボキシ末端は細胞外に面し、したがって、細胞外環境で他の結合パートナー（リガンド又は受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含有する。そのため、これらの２種類のタンパク質は、互いに反対の向きを有する。
【００２２】
Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の外向きのドメインは反対であるため、分子の「外側向き」ドメインも互いに反対方向にあるように、Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを連結することが可能である（図１Ｄ）。生じる構築物はしたがって、リンカー配列を用いて分子の「右」側のＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインに連結される、分子の「左」側にあるＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインからなる。この構築物は、これらの３つの断片（Ｉ型タンパク質の細胞外ドメイン、続いてリンカー配列、続いてＩＩ型タンパク質の細胞外ドメイン）をベクター（プラスミド、ウイルス又はその他）にクローニングすることによって生成でき、完全配列のアミノ末端は、Ｉ型タンパク質を含有する分子の「左」側に相当し、完全配列のカルボキシ末端は、ＩＩ型タンパク質を含有する分子の「右」側に相当した。したがって、実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、そのように工学処理される。
【００２３】
実施形態において、細胞外ドメインは、その受容体のリガンドによるシグナル伝達を競合的に阻害する可溶性タンパク質を生成するために使用され得る。実施形態において、細胞外ドメインは、人工シグナル伝達を提供するために使用され得る。
【００２４】
実施形態において、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、免疫阻害シグナルである。実施形態において、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、免疫刺激シグナルである。
【００２５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。
【００２６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、ＳＬＡＭＦ４、ＩＬ−２  Ｒ  α、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＬ−２  Ｒ  β、ＡＬＣＡＭ、ＢＴＬＡ、Ｂ７−１、ＩＬ−４  Ｒ、Ｂ７−Ｈ３、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＬ−６  Ｒ、ＩＬ−７  Ｒα、ＩＬ−１０Ｒ  α、ＩＬ−ｌ０  Ｒ  β、ＩＬ−１２  Ｒ  β  １、ＩＬ−１２  Ｒ  β  ２、ＣＤ２、ＩＬ−１３  Ｒ  α  １、ＩＬ−１３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＩＬＴ２／ＣＤＳ５ｊ、ＩＬＴ３／ＣＤＳ５ｋ、ＩＬＴ４／ＣＤＳ５ｄ、ＩＬＴ５／ＣＤＳ５ａ、ルテグリン（ｌｕｔｅｇｒｉｎ）  α  ４／ＣＤ４９ｄ、ＣＤＳ、インテグリン  α  Ｅ／ＣＤ１０３、ＣＤ６、インテグリン  α  Ｍ／ＣＤ  １１  ｂ、ＣＤＳ、インテグリン  α  Ｘ／ＣＤ１１ｃ、インテグリン  β  ２／ＣＤＩＳ、ＫＩＲ／ＣＤ１５Ｓ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＣＤ２Ｓ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦＳ、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５Ｓｄ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ４５、ＬＡＩＲ２、ＣＤＳ３、ロイコトリエン  Ｂ４−Ｒ１、ＣＤＳ４／ＳＬＡＭＦ５、ＮＣＡＭ−Ｌ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＮＴ−４、ＣＤ６９、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、共通（Ｃｏｍｍｏｎ）γ鎖／ＩＬ−２  Ｒ  γ、オステオポンチン、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ−１、ＣＲＴＡＭ、ＰＳＧＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、Ｌ−セレクチン、ＳＩＲＰ  β  １、ＳＬＡＭ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＤＮＡＭ−１、チモポエチン、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＴＩＭ−１、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−２、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＩＭ−３、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＩＭ−４、Ｆｃγ  ＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＴＩＭ−６、ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、グラニュリシン、ＴＮＦ  ＲＩＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＩＬ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦｌＯＡ、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＴＲＡＩＬＲ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＩＦＮ−γＲ１、ＴＲＡＩＬＲ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＩＦＮ−γ  Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＩＬ−１  Ｒ１、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）及びＴＳＬＰ  Ｒの細胞外ドメイン（該当する場合）を含むヒト白血球に存在する１以上の分子を標的にするように工学処理され得る。
【００２７】
制御性Ｔ細胞の活性化は、共刺激シグナル及び共阻害シグナルによって決定的に影響される。共刺激分子の２つの主要なファミリーは、Ｂ７及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーを含む。これらの分子は、それぞれＣＤ２８又はＴＮＦ受容体ファミリーに属するＴ細胞上の受容体に結合する。多くの明確に定義された共阻害剤及びその受容体は、Ｂ７及びＣＤ２８ファミリーに属する。
【００２８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えばＴＩＧＩＴを含む、免疫阻害に関与する１以上の分子を標的とするように工学処理され得る。
【００２９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えばＴＩＧＩＴを含む、免疫阻害剤の細胞外ドメインを含む。
【００３０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害特性を有するＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害シグナルの伝達を妨害、阻止、低減、及び／又は阻害するように工学処理される。
【００３１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）である免疫刺激シグナルの細胞外ドメインを含む。
【００３２】
実施形態において、キメラタンパク質は、その同族受容体への阻害シグナルリガンド（例えば、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、ネクチン−２、ネクチン−３及び／又はネクチン−４へのＴＩＧＩＴ）の結合をシミュレート（ｓｉｍｕｌａｔｅ）するが、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ又は他の白血球）への阻害シグナル伝達を阻害する。
【００３３】
実施形態において、キメラタンパク質は、限定されないが、腫瘍細胞の免疫阻害シグナルをマスキングしながら、Ｔ細胞に免疫刺激を送達できる、免疫阻害受容体細胞外ドメイン及び免疫刺激リガンド細胞外ドメインを含む。実施形態において、キメラタンパク質は、Ｔ細胞活性化の最終結果を有するシグナルを送達する。
【００３４】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害シグナルの受容体のＥＣＤである免疫阻害シグナルを含み、これは免疫阻害シグナルの同族リガンドを保有する腫瘍細胞に作用する。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫刺激シグナルのリガンドのＥＣＤである免疫刺激シグナルを含み、これは免疫刺激シグナルの同族受容体を保有するＴ細胞に作用する。実施形態において、キメラタンパク質は、（ｉ）免疫阻害シグナルの受容体であり、免疫阻害シグナルの同族リガンドを保有する腫瘍細胞に作用する免疫阻害シグナルと、（ｉｉ）免疫刺激シグナルのリガンドであり、免疫刺激シグナルの同族受容体を保有するＴ細胞に作用する免疫刺激シグナルの両方を含む。
【００３５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｈｏｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１５：１４；５６１−５８５に記載の免疫調節剤の１以上の細胞外ドメインを含む。
【００３６】
実施形態において、キメラタンパク質は、マウスリガンド（複数可）／受容体（複数可）に結合できる。
【００３７】
実施形態において、キメラタンパク質は、ヒトリガンド（複数可）／受容体（複数可）に結合できる。
【００３８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激特性を有するＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態において、キメラタンパク質は、免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／又は刺激するように工学処理される。
【００３９】
例えば、実施形態において、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、ＴＩＧＩＴ由来である。
【００４０】
ＴＩＧＩＴは、免疫グロブリン及び免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを含有するＴ細胞上で発現される免疫受容体である、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）様タンパク質である。そのようなものとして、ＴＩＧＩＴは、免疫系の適応アームと自然アームの両方を標的とする機会を提供する、Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方に対する阻害性免疫チェックポイントとして機能する。
【００４１】
ＴＩＧＩＴは、ＮＫ細胞並びに活性化された記憶及び調節性Ｔ細胞のサブセット上で、特に、二次リンパ器官内の濾胞ヘルパーＴ細胞上で発現される。ＣＤ１５５／ＰＶＲは、ＩＦＮ−γによって内皮細胞上で上方制御され、未熟な胸腺細胞、リンパ節樹状細胞、並びに上皮及び神経起源の腫瘍細胞上で高度に発現される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤを含む）は、直上に記載の細胞のいずれかを調節する（例えば、免疫シナプスの状況で）。
【００４２】
ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、ネクチン−２、ネクチン−３及びネクチン−４を結合する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤを含む）は、ＣＤ１５５／ＰＶＲへのＴＩＧＩＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を低減又は妨害する）。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤを含む）は、ネクチン−２へのＴＩＧＩＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を低減又は妨害する）。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤを含む）は、ネクチン−３へのＴＩＧＩＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を低減又は妨害する）。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤを含む）は、ネクチン−４へのＴＩＧＩＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を低減又は妨害する）。
【００４３】
実施形態において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端の一般構造のものであり、式中、（ａ）は膜貫通タンパク質がＴＩＧＩＴである、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４由来であるヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む）、かつ（ｃ）は膜貫通タンパク質が４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＬＩＧＨＴから選択される、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含む。
【００４４】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインを含み、以下の免疫刺激剤：ＴＩＧＩＴ／ＯＸ−４０Ｌ；ＴＩＧＩＴ／４−１ＢＢＬ、ＴＩＧＩＴ／ＬＩＧＨＴ；ＴＩＧＩＴ／ＧＩＴＲＬ；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ７０；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ３０Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ４０Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１３７Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＴＬ１Ａ；及びＴＩＧＩＴ／ＯＸ４０Ｌとペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａであり、その中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す。
【００４５】
例えば、実施形態において、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、ＬＩＧＨＴ由来である。
【００４６】
リンフォトキシンに相同的な実体であり、誘導性であり、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）／腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連２の単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄと競合できるＬＩＧＨＴ（ＨＶＥＭ−Ｌ、ＴＮＦＳＦ１４、又はＣＤ２５８）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。それは、２９ｋＤａのＩＩ型膜貫通タンパク質であり、活性化されたＴ細胞及びＤＣ上でホモ三量体として発現され、３つの受容体、すなわち、ＨＶＥＭ、ＬＴ−β受容体（ＬＴβＲ、ＴＮＦＲＳＦ３）及びデコイ受容体３（ＤｃＲ３）を有する。理論に縛られることなく、別々の細胞発現パターンを有する３つの受容体は、活性化されたＤＣ、Ｔ及びＢ細胞、ＮＫ細胞、単球、及び内皮細胞上で検出されるＬＩＧＨＴ；ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＣＤ２７０）；濾胞性ＤＣ及び間質細胞上で見出されＬＩＧＨＴを結合するＬＴβＲ；並びに多発性骨髄腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などの多様な癌細胞で検出される可溶性実体のデコイ受容体３（ＤｃＲ３）、と相互作用することが知られている。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、これらの３つの受容体の１以上とＬＩＧＨＴの相互作用を妨害する又は減少させることができる。
【００４７】
ＬＩＧＨＴは、ＬＴＢＲ、及び潜在的にＨＶＥＭ及びＤｃＲ３を結合する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＬＩＧＨＴ  ＥＣＤを含む）は、ＬＴＢＲへのＬＩＧＨＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を増加又は促進する）。ＬＴＢＲは、リンパ球ではなく、内臓細胞、リンパ系細胞、及び他の間質細胞、上皮細胞及び骨髄細胞により発現される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＬＩＧＨＴ  ＥＣＤを含む）は、内臓細胞、リンパ系細胞、及び他の間質細胞、上皮細胞及び骨髄細胞の１以上を調節する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＬＩＧＨＴ  ＥＣＤを含む）は、ＨＶＥＭへのＬＩＧＨＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を増加又は促進する）。実施形態において、本発明のキメラタンパク質（例えば、ＬＩＧＨＴ  ＥＣＤを含む）は、ＤｃＲ３へのＬＩＧＨＴの結合を調節する（例えば、結合若しくはシグナル伝達を増加又は促進する）。
【００４８】
実施形態において、キメラタンパク質は、Ｎ末端−（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端：の一般構造のものであり、式中、（ａ）は膜貫通タンパク質がＰＤ−１、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、及びＴＩＧＩＴから選択される、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）はジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーであり（限定されないが、ヒトＩｇＧ４由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含み）、かつ（ｃ）は膜貫通タンパク質がＬＩＧＨＴである、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは第１のドメインと第２のドメインを連結し、必要に応じて本明細書に記載の１以上の結合リンカーを含む。
【００４９】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫刺激剤ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを含み、以下の免疫阻害剤：ＰＤ−１／ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）／ＬＩＧＨＴ、及びＴＩＧＩＴ／ＬＩＧＨＴとペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴであり、その中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含む、リンカーを表す。
【００５０】
実施形態において、キメラタンパク質は、免疫阻害剤の細胞外ドメインを含み、免疫刺激剤とペアになる。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約５ｎＭ、例えば、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、若しくは約５ｎＭのＫＤで同族受容体又はリガンドに結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約５ｎＭ〜約１５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１０．５ｎＭ、約１１ｎＭ、約１１．５ｎＭ、約１２ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１３．５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１４．５ｎＭ、若しくは約１５ｎＭのＫＤで同族受容体又はリガンドに結合する。
【００５１】
実施形態において、キメラタンパク質は、増強した安定性及びタンパク質半減期を示す。実施形態において、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎに結合する。実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、又は約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。実施形態において、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）と実質的に結合しない。
【００５２】
実施形態において、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の１以上を対象に投与することにより癌及び／又は炎症性疾患（例えば、本明細書の別の場所に記載の任意の１つ）を治療する方法であって、キメラタンパク質中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す、方法が提供される。実施形態において、本方法は、例えば、再発を防止し得る記憶応答を生じさせる。実施形態において、本方法は、必要に応じて持続的な負のシグナルマスキング効果及び／又はより長い正のシグナル効果を提供するために、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にするために、例えば遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）でのそれらのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメイン成分の結合に起因する、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの１以上の持続的な治療効果を含む。
【００５３】
実施形態において、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の１以上を対象に投与することにより癌又は炎症性疾患（例えば、本明細書の別の場所に記載のものの任意の１つ）を治療する方法であって、キメラタンパク質中のＦｃは、抗体のＦｃドメインの少なくとも一部を含みジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含むリンカーを表す、方法が提供される。実施形態において、本方法は、例えば、再発を防止できる記憶応答を生じさせる。実施形態において、本方法は、必要に応じて持続的な負のシグナルマスキング効果及び／又はより長い正のシグナル効果を提供するために、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にするために、例えば、遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）での細胞外ドメイン成分のそれらのそれぞれの結合パートナーへの結合による、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの１以上の持続的な治療効果を含む。
【００５４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の細胞外ドメインの変異体を含み、例えば、開示される細胞外ドメイン、例えば、ヒト細胞外ドメイン、例えば、配列番号２、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３１、３７、又は４１の１以上のいずれかの既知のアミノ酸配列又は核酸配列と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００５５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００５６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００５７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）を含む。
【００５８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。
【００５９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（配列番号２）及びＰＤ−１の細胞外ドメイン（配列番号４）を含む。
【００６０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（配列番号２）及びＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）を含む。
【００６１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（配列番号２）及びＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメイン（配列番号７）を含む。
【００６２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号４６、４７、又は４８）を含む。
【００６３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号４６、４７、又は４８）を含み、この配列には、ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４９）、ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号５０）、ＩＥＧＲＭＤ  配列番号５２から選択される少なくとも１つの結合リンカーが隣接する（必要に応じて、ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４９）又はＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号５０）がＮ末端でありＩＥＧＲＭＤ  配列番号５２の１つがＣ末端である）。
【００６４】
実施形態において、キメラタンパク質は、図３２に示すモジュラーリンカーを含む。
【００６５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン及びＰＤ−１の細胞外ドメインを含む（このＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラは配列番号５である）。
【００６６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン及びＴＩＧＩＴの細胞外ドメインを含む（このＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラは配列番号１１である）。
【００６７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをリンカーとして用いて、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン及びＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメインを含む（このＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラは配列番号８である）。
【００６８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）を含む。
【００６９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン（配列番号１３）を含む。
【００７０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（配列番号１６）を含む。
【００７１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＬ１Ａの細胞外ドメイン（配列番号１９）を含む。
【００７２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００７３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号２２）を含む。
【００７４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）及び４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン（配列番号１３）を含む
【００７５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）及びＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（配列番号１６）を含む。
【００７６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）及びＴＬ１Ａの細胞外ドメイン（配列番号１９）を含む。
【００７７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）及びＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（配列番号２）を含む。
【００７８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１０）及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（配列番号２２）を含む。
【００７９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号４６、４７、又は４８）を含む。
【００８０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号４６、４７、又は４８）を含み、この配列には、ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４９）、ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号５０）、ＩＥＧＲＭＤ  配列番号５２から選択される少なくとも１つの結合リンカーが隣接する（必要に応じてＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４９）又はＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号５０）がＮ末端でありＩＥＧＲＭＤ  配列番号５２の１つがＣ末端である）。
【００８１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン及び４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを含む（このＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬキメラは配列番号１４である）。
【００８２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン及びＧＩＴＲＬの細胞外ドメインを含む（このＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬキメラは配列番号１７である）。
【００８３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン及びＴＬ１Ａの細胞外ドメインを含む（このＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａキメラは配列番号２０である）。
【００８４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン及びＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを含む（このＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラは配列番号１１である）。
【００８５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、リンカーとしてヒトＩｇＧ４抗体配列からのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いて、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む（このＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラは配列番号２３である）。
【００８６】
実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書で特定される別の配列からの細胞外ドメインと組み合わせた、本明細書で特定される配列からの細胞外ドメインを含んでよい。例えば、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａキメラタンパク質の配列は、上に開示された配列番号１０のＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン及び上に開示された配列番号１９のＴＬ１Ａの細胞外ドメインを含み得た。
【００８７】
実施形態において、追加のキメラタンパク質：ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＦａｓＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ及び追加のキメラタンパク質を用いる方法（例えば、癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において）。４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１２、２６、３０、１５、１８、及び４０を含む。４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１３、２７、３１、１６、１９、及び４１である。
【００８８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の変異体であり得、例えば、本発明のキメラタンパク質は、本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３、４２、４３、４４、又は４５の１以上と少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有し得る。
【００８９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表１に列挙したヒトＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表２に列挙したヒトＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表１に列挙したＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の表２に列挙したＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はその機能断片を含む。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４５９８の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に記載のタンパク質配列のいずれかと比較して１以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み得る。実施形態において、１以上のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠損、及び切り詰めから独立して選択され得る。
【００９１】
実施形態において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、かつ保存的及び／又は非保存的置換を含み得る。
【００９２】
「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、大きさ、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関与するアミノ酸残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。２０個の天然アミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸のグループ：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅにグループ化できる。
【００９３】
本明細書で使用する「保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループの同じグループ内にリストされた別のアミノ酸とのアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド中に１つの負電荷を保持する。加えて、グリシン及びプロリンは、α−ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。
【００９４】
本明細書で使用する「非保存的置換」は、上に示す６つの標準的なアミノ酸のグループ（１）〜（６）の異なるグループにリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【００９５】
実施形態において、置換はまた、非古典的アミノ酸（例えば、一般的に、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノベンゾイン酸（ＰＡＢＡ））、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、及びアミノ酸類似体）を含み得る。
【００９６】
変異はまた、コドン縮重を考慮することを含む、遺伝コードを参照することによってキメラタンパク質のヌクレオチド配列に行われ得る。
【００９７】
実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステイン残基を含む。本明細書の他の場所で説明するように、ジスルフィド結合を形成できるそのような少なくとも１つのシステイン残基は、理論に縛られることなく、キメラタンパク質の適切な多量体状態を維持し効率的な生成を可能にすることに関与する。
【００９８】
実施形態において、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来し得るか、又は例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｃｈｉｌｉら、（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２）：１５３−１６７，Ｃｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載の実験的リンカーである。実施形態において、リンカーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９及びＣｒａｓｔｏら，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３０９−３１２に記載のものなどのリンカー設計データベース及びコンピュータプログラムを用いて設計され得る。
【００９９】
実施形態において、リンカーはＰＥＧなどの合成リンカーである。
【０１００】
実施形態において、リンカーはポリペプチドである。実施形態において、リンカーは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、又は約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、又は約２アミノ酸長未満であり得る。実施形態において、リンカーは柔軟である。別の実施形態において、リンカーは硬い。
【０１０１】
実施形態において、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）を含む。
【０１０２】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内で自由に移動することを可能にする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列と長さの両方が変化する。例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で変化する。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６〜２３１を包含し、それが自由に柔軟であるため、Ｆａｂ断片は、それらの対称の軸を中心に回転し２つの重鎖間のジスルフィド架橋の第１を中心とする球内を移動できる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２のアミノ酸残基及び４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠き、比較的短く、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された硬いポリプロリン二重らせんを含有する。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、その特有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスと異なり、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的離れており、分子により高い柔軟性を与える。ＩｇＧ３中の伸長したヒンジはまた、他のサブクラスと比較してより高いその分子量に関与する。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１及びＩｇＧ２の柔軟性の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順序で減少すると報告されている。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体化（Ｓ２２８Ｐを含む）又はＦｃＲｎ結合を増強するための１以上の変異を含有し得る。
【０１０３】
結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、さらに３つの領域：上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域に機能的に細分化できる。Ｓｈｉｎら，１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域は、ＣＨ１のカルボキシル末端〜動きを制限するヒンジ中の第１の残基のアミノ酸、一般に２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基、を含む。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド架橋を含有し、下部ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインのアミノ末端を結合し、ＣＨ２中の残基を含む。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、ジスルフィド結合形成によって二量体化すると、ピボットとして作用すると考えられる環状オクタペプチドを生じ、そのため柔軟性を与える、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含有する。実施形態において、本リンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の１つ、又は２つ、又は３つを含む。ヒンジ領域はまた、炭水化物結合のための部位のいくつかの構造的に別個の種類を含む、１以上のグリコシル化部位を含有し得る。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸のセグメント内に５つのグリコシル化部位を含有し、分泌性免疫グロブリンに有利な性質と考えられる、腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの耐性を付与する。実施形態において、本発明のリンカーは、１以上のグリコシル化部位を含む。
【０１０４】
実施形態において、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、及びＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。実施形態において、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増加及び結合の増強を示す。実施形態において、Ｆｃドメインは、親和性を増加させＦｃＲｎへの結合を増強する１以上の変異を含む。理論に縛られることなく、ＦｃＲｎに対する親和性の増加及び結合の増強は、本発明のキメラタンパク質のインビボ半減期を増加させると考えられる。
【０１０５】
実施形態において、Ｆｃドメインリンカーは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３又は４３４（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での１以上のアミノ酸置換、又はそれらの等価物を含有する。実施形態において、アミノ酸残基２５０におけるアミノ酸置換はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５４におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基２５６におけるアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はスレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換は、スレオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３０９におけるアミノ酸置換は、プロリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３１１におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８５におけるアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン又はグリシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８６におけるアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、又はメチオニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８７におけるアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、又はアラニンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基３８９におけるアミノ酸置換は、プロリン、セリン又はアスパラギンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４１６におけるアミノ酸置換は、ロイシンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換は、セリンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３３におけるアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、又はグルタミンとの置換である。実施形態において、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、又はチロシンとの置換である。
【０１０６】
実施形態において、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、又は４３６（参照により明示的に本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））のＫａｂａｔ番号付けに従う）での置換などの１以上の変異を含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異又はＹＴＥ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異又はＫＦＨ変異を含む。さらなる実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＹＴＥ変異とＫＦＨ変異を含む。
【０１０７】
実施形態において、本発明の改変されたヒト化抗体は、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４１６、４２８、４３３、４３４、及び４３５における１以上の変異を含有するＩｇＧ定常領域を含む。例示的変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｒ４１６Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａを含む。実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異又はＬＳ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異又はＱＬ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異又はＡＡＡ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異又はＩＨＨ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、組み合わせでＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異とＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。
【０１０８】
ＩｇＧ定常領域における追加の例示的変異は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｂｉｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７−６１５３，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４−２４，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１−８０，Ｋｏら，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）  ５１４：６４２−６４５，Ｇｒｅｖｙｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７−５０８，及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載される。
【０１０９】
実施形態において、リンカーは、配列番号４６、又は配列番号４６と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、安定性及び／又は半減期を増加させるために、変異が配列番号４６に行われる。例えば、実施形態において、リンカーは、配列番号４７、又は配列番号４７と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。実施形態において、リンカーは、配列番号４８、又は配列番号４８と少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
理論に縛られることなく、キメラタンパク質中のＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーを含めることは、不溶性で及び、おそらく非機能的なタンパク質コンカテマー及び／又は凝集体の形成を回避するのに役立つ。これは、キメラタンパク質間でジスルフィド結合を形成できるＦｃドメイン中のシステインの存在に部分的に起因する。
【０１１１】
例示的なＦｃ安定化変異体はＳ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本リンカーは、これらの変異体の１、又は２、又は３、又は４、又は５個を含み得る。
【０１１２】
さらに、１以上の結合リンカーは、リンカー中のＦｃドメイン（例えば、配列番号４６、配列番号４７、又は配列番号４８、又はそれらと少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するものの１つ）と細胞外ドメインを連結するために使用され得る。例えば、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーを連結し得る。必要に応じて、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又はそれらの変異体の任意の１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーの間に置かれる。必要に応じて、配列番号４９〜９５、又はそれらの変異体の任意の１つは、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のＦｃドメインの間に位置する。実施形態において、キメラタンパク質は、Ｆｃドメインの前に１つの結合リンカー及びＦｃドメインの後ろに第２の結合リンカーを含み、そのため、キメラタンパク質は、以下の構造：ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２、を含み得る。
【０１１３】
実施形態において、第１及び第２の結合リンカーは異なっていてよく、又はそれらは同じであってよい。
【０１１４】
例示的なリンカーのアミノ酸配列は、以下の表１に提供される。
【０１１５】
【表１】
2020508068.tif 000003
2020508068.tif 000004
【０１１６】
さらなる例示的な結合リンカーは、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号７０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号７０〜７３）、（Ｇｌｙ）８（配列番号７９）、（Ｇｌｙ）６（配列番号８０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号８１〜８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号８４〜配列番号８７）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号８８）、ＰＡＰＡＰ（配列番号８９）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号５７）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９１）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕである）を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
実施形態において、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、約９８％、又は約９９％、又は約１００％のグリシン及びセリン）で構成される。例えば、実施形態において、結合リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎは、約１〜約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８（それぞれ配列番号７０〜配列番号７７）である。実施形態において、結合リンカー配列はＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７８）である。追加の例示的な結合リンカーは、配列ＬＥ、（Ｇｌｙ）８（配列番号７９）、（Ｇｌｙ）６（配列番号８０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号８１〜８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号８４〜配列番号８７）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号８８）、ＰＡＰＡＰ（配列番号８９）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９１）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕである）を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。実施形態において、結合リンカーはＧＧＳである。
【０１１８】
実施形態において、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号９２）、ＧＳＥＳＧ（配列番号９３）、ＧＳＥＧＳ（配列番号９４）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号９５）、及び４アミノ酸ごとの間隔でＧ、Ｓ、及びＥがランダムに配置される結合リンカーの１以上である。
【０１１９】
実施形態において、キメラタンパク質は、図３２に示すモジュラーリンカーを含む。
【０１２０】
実施形態において、リンカーは、限定されないが、高度に柔軟を含む、柔軟であり得る。実施形態において、リンカーは、硬くてよく、限定されないが、硬いアルファらせんを含む。
【０１２１】
実施形態において、リンカーは機能的であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明のキメラタンパク質の折りたたみ及び／又は安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、かつ／又は生理活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、特定の細胞型又は位置にキメラタンパク質を標的化するように機能し得る。
【０１２２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫活性化（例えば、腫瘍に対して）を促進でき、かつそれを促進することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害を抑制でき（例えば、腫瘍が生き残ることを可能にする）、かつそれを抑制することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、構築物のキメラ性質によって提供されるシグナル伝達の近接性に起因する免疫活性化の改善及び／又は免疫阻害の抑制の改善を提供する。
【０１２３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫応答の増幅を調節すること、例えば、エフェクター出力のレベルを調節できるか、又はそれを調節することを含む方法で使用できる。実施形態において、例えば、癌の治療に使用される場合、本発明のキメラタンパク質は、サイトカインの生成、増殖又は標的殺傷能力のレベルの増加を刺激することを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞応答の増幅を増加させる免疫阻害と比較して、免疫刺激の程度を変える。
【０１２４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、実施形態において、腫瘍細胞の表面上の阻害リガンドをマスクしその免疫阻害リガンドを免疫刺激リガンドに置き換えることができるか、又はそれをマスクし置き換えることを含む方法で使用される。したがって、本発明のキメラタンパク質は、実施形態において、阻害性免疫シグナルを低下させること若しくは除去すること、かつ／又は免疫刺激シグナルを増加すること若しくは活性化することができるか、又は阻害性免疫シグナルを低下させ若しくは除去するかつ／又は免疫刺激シグナルを増加することを含む方法で使用される。例えば、阻害シグナルを保有する（ひいては、免疫応答を回避する）腫瘍細胞は、次いで腫瘍細胞を攻撃できるＴ細胞上で結合する正のシグナルと置換され得る。したがって、実施形態において、阻害性免疫シグナルは、本発明の構築物によってマスクされ、刺激性免疫シグナルが活性化される。そのような有益な特性は、本発明のキメラタンパク質の単一構築アプローチによって増強される。例えば、シグナル置換をほぼ同時に行うことができ、シグナル置換は臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍微小環境）で局所的であるよう調整される。さらなる実施形態は、例えば、とりわけ（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＴＬ１Ａの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインなどの他のキメラタンパク質構築物に同じ原理を適用する。
【０１２５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激受容体／リガンド対の結合を刺激若しくは増強できるか、又はそれを刺激若しくは増強することを含む方法で使用される。例示的なＴ細胞共刺激受容体及びそのリガンドは、ＯＸ−４０：ＯＸ４０−Ｌ、ＣＤ２７：ＣＤ７０、ＣＤ３０：ＣＤ３０−Ｌ、ＣＤ４０：ＣＤ４０−Ｌ；ＣＤ１３７：ＣＤ１３７−Ｌ、ＨＶＥＭ：ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ：ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２５：ＴＬ１Ａ、ＤＲ５：ＴＲＡＩＬ、及びＢＴＬＡ：ＨＶＥＭを含む。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害受容体／リガンド対の結合を阻害するか若しくは低下させることができるか、又はそれを阻害するか低下させることを含む方法で使用される。例示的なＴ細胞共阻害受容体及びそれらのリガンドは、例えば、とりわけ、ＣＴＬＡ−４：ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ：ＨＶＥＭ、ＴＩＭ−３：ガレクチン−９／ホスファチジルセリン、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５又はＣＤ１１２、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）／ＣＤ４７、Ｂ７Ｈ３Ｒ／Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４Ｒ／Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２４４／ＣＤ４８、ＴＭＩＧＤ２／ＨＨＬＡ２を含む。
【０１２６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２並びに／又はＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２とのＰＤ−１の結合を阻止し、低下し並びに／又は阻害する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＴＬＡ−４の活性並びに／若しくはＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１以上とのＣＴＬＡ−４の結合を阻止し、低下し並びに／又は阻害する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲリガンドの１以上とのＧＩＴＲの結合を増加させ、かつ／又は刺激する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０及び／又はＯＸ４０リガンドの１以上とのＯＸ４０の結合を増加させ、かつ／又は刺激する。
【０１２７】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫調節を増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激できるか、又はそれを増強し、回復し、促進し、かつ／又は刺激することを含む方法で使用される。実施形態において、本明細書に記載の本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含むが、これらに限定されない腫瘍細胞に対する１以上の免疫細胞の活性又は活性化を回復し、促進し及び／又は刺激する。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、非限定的な例として、生存促進シグナル；オートクリン又はパラクリン成長シグナル；ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ、ＪＡＫ、ＡＫＴ若しくはＰＩ３Ｋ媒介性シグナル；抗アポトーシスシグナル；並びに／又は炎症性サイトカイン生成若しくはＴ細胞移動若しくはＴ細胞腫瘍浸潤の１以上を促進しかつ／又はそれに必要なシグナルを含む、１以上のＴ細胞固有シグナルを活性化し及び／又は刺激することを含み、Ｔ細胞の活性及び／若しくは活性化を増強し、回復し、促進し並びに／又は刺激する。
【０１２８】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍若しくは腫瘍微小環境中へのＴ細胞（限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１以上）の１以上の増加を引き起こすことができるか、又はそれを引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍及び／若しくは腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の動員を阻害でき、かつ／又は動員の減少を引き起こすことができ、又はそれらの動員を阻害するかつ／又は動員の減少を引き起こすことを含む方法で使用される。実施形態において、本療法は、Ｍ１マクロファージを優先するように腫瘍部位及び／又はＴＭＥでＭ１対Ｍ２マクロファージの比率を変更し得る。
【０１２９】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に記載の有効量のキメラタンパク質を対象に投与することを含む、Ｔ細胞の不活性化及び／若しくは腫瘍に対する免疫耐性を阻害する並びに／又は低下させることができ、かつそれを阻害する並びに／又は低下させることを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２の１以上を含むが、これらに限定されない様々なサイトカインの血清レベルを増加させることができる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、治療対象の血清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦα又はＩＦＮγを増強できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質の投与は、ＴＮＦα分泌を増強できる。特定の実施形態において、本発明のキメラタンパク質の投与は、白血球によるスーパー抗原媒介性ＴＮＦα分泌を増強できる。そのようなサイトカイン応答の検出は、示されたキメラタンパク質について最適な投与レジメンを決定するための方法を提供し得る。
【０１３０】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を阻害し、阻止し及び／若しくは低下させるか；又は腫瘍促進性Ｔ細胞の細胞死を刺激し、誘導し、及び／若しくは増加させる。Ｔ細胞枯渇は、増殖機能及びエフェクター機能の進行性喪失を特徴とするＴ細胞機能障害の状態であり、クローン欠失に至る。したがって、腫瘍促進性Ｔ細胞は、多くの慢性感染症及び癌の間に生じるＴ細胞機能障害の状態を指す。この機能不全は、不十分な増殖機能及び／又はエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現及び機能性エフェクター又は記憶Ｔ細胞の転写状態とは異なる転写状態によって定義される。枯渇は、感染症及び腫瘍の最適な制御を妨げる。加えて、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を開始できるＴ細胞を指す。例示的な腫瘍促進性Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ、１以上のチェックポイント阻害受容体を発現するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞を含むが、これらに限定されない。チェックポイント阻害受容体は、制御されない免疫応答を防止又は阻害する免疫細胞上で発現する受容体を指す。
【０１３１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させることができ、それを含む方法で使用できる。例示的なエフェクターＴ細胞は、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）；ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；エフェクター記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋、ＣＣＲ７低）；中央記憶Ｔ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋；又はＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋）；ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ６２Ｌ−）及び後期エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ２７−ＣＤ６２Ｌ−）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）を含むＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）；ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（低／−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（−）ＣＤ２５（−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞記憶エフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋及びＣＣＲ５＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−１２Ｒ＋、ＩＦＮγＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋及びＣＣＲ８＋；又はαβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−４Ｒ＋、ＩＬ−３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ−１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）；ＴＨ９  エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβ  ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ−１Ｒ＋）；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（−）エフェクターＴ細胞；並びにＩＬ−２、ＩＬ−４及び／又はＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞を含む。例示的な制御性Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５高制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ−３＋ＰＤ−１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌセレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢ低制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、ＢＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパータイプ３（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型の調節細胞（ＮＫＴｒｅｇ）、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８−制御性Ｔ細胞及び／又はＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ガレクチン−１、ＩＦＮ−γ及び／又はＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞を含む。
【０１３２】
実施形態において、キメラタンパク質は、例えば、再発を防止するか、又は再負荷から動物を保護できる可能性がある記憶応答をもたらす。そのため、キメラタンパク質で処置された動物は後に、キメラタンパク質での初期の治療後に再負荷された場合に、腫瘍細胞を攻撃し、かつ／又は腫瘍の発症を防ぐことができる。したがって、本発明のキメラタンパク質は、活性腫瘍破壊と、再発を防止できる記憶応答をプログラミングするのに不可欠である腫瘍抗原の免疫認識の両方を刺激する。
【０１３３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的にエフェクターＴ細胞を刺激でき、かつそれを刺激することを含む方法で使用できる。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間又は約９６時間又は約１週間又は約２週間以下の間、一過的に制御性Ｔ細胞を枯渇させること又は阻害することができ、かつそれを枯渇させること又は阻害することを含む方法で使用できる。実施形態において、エフェクターＴ細胞の一過性刺激及び／又は制御性Ｔ細胞の一過性枯渇若しくは阻害は実質的に、患者の血流において、又は、例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、非リンパ組織などのリンパ組織を含む特定の組織／位置において、又は腫瘍微小環境において生じる。
【０１３４】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、使用の容易さ及び生成の容易さを含む利点を提供する。これは、２つの異なる免疫療法剤が、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスを可能にする１つの生成物に組み合わされるためである。加えて、２つの別々の薬剤の代わりの単一薬剤の投与は、より容易な投与及びより多くの患者のコンプライアンスを可能にする。また、例えば、多数のジスルフィド結合及びグリコシル化などの翻訳後修飾を含有する大きな多量体タンパク質であるモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のキメラタンパク質は、製造するのにより容易であり費用効率がより良い。
【０１３５】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、分泌可能で完全に機能する単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞中で生成可能である。
【０１３６】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は予期せず、遅いオフ速度（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）でそれらのそれぞれの結合パートナーへの細胞外ドメイン成分の結合を提供する。実施形態において、これは、受容体のリガンドへの予想外に長い相互作用を提供し、その逆も同様である。そのような効果は、持続的な負のシグナルマスキング効果を可能にする。また、実施形態において、これは、より長い正のシグナル効果を提供し、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果のために十分に刺激されることを可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、Ｔ細胞増殖を提供し、抗腫瘍攻撃を可能にするのに十分なシグナル伝達を可能にする。さらなる例として、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、例えば、サイトカインなどの刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする。
【０１３７】
本発明の薬剤によって促進される細胞（例えば、負のシグナルを有する腫瘍細胞及び腫瘍を攻撃する可能性のあるＴ細胞）の安定なシナプスは、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を位置付けることかつ／又は本発明のキメラタンパク質によってマスクされたものを超える負のシグナルを含む、負のシグナルを腫瘍細胞が送達するのを立体的に防ぐことなどの、腫瘍の縮小を優先する空間的な向きを提供する。
【０１３８】
実施形態において、これは、キメラタンパク質の血清ｔ１／２と比較して、より長いオンターゲット（例えば、腫瘍内）半減期（ｔ１／２）を提供する。そのような性質は、キメラタンパク質の全身分布に関連し得る、オフターゲット毒性を低下させる利点の組み合わせを有し得る。
【０１３９】
実施形態において、本薬剤は、ＴＩＧＩＴを介してシグナルを遮断することによりＮＫ細胞並びに／又は活性化された記憶及び／若しくは調節性Ｔ細胞のサブセット、並びに／又はヘルパーＴ細胞の阻害を防止並びに／又は破壊することによって、例えば抗腫瘍的な様式で、特定の免疫細胞が機能するのを可能にし、かつ必要に応じて、４−１ＢＢＬ、及び／又はＧＩＴＲＬ、及び／又はＴＬ１Ａ、及び／又はＬＩＧＨＴベースの刺激シグナル伝達を介してさらなる免疫応答をもたらす。
【０１４０】
実施形態において、本薬剤は、例えば内臓細胞及び／若しくはリンパ系細胞及び／若しくは他の間質細胞及び／若しくは上皮細胞及び／若しくは骨髄細胞上で、刺激性ＬＩＧＨＴベースのシグナル伝達を刺激及び／又は増加させることによって、例えば抗腫瘍的様式で、特定の免疫細胞が機能するのを可能にし、かつ必要に応じて、ＰＤ−１、及び／若しくはＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、及び／若しくはＴＩＧＩＴベースの阻害シグナル伝達の阻止又は低下によりさらなる免疫応答をもたらす。
【０１４１】
また、実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用の改善を可能にする相乗的な治療効果を提供する。
【０１４２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、オフサイト及び／又は全身の毒性を低下させる可能性を提供する。
【０１４３】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、現在の免疫療法、例えば、本明細書に記載のチェックポイント分子に対する抗体と比べ、低減された副作用、例えば、ＧＩ合併症を提供する。例示的なＧＩ合併症は、腹痛、食欲不振、自己免疫効果、便秘、けいれん、脱水、下痢、摂食問題、疲労、鼓腸、腹水（ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｄｏｍｅｎ）又は腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、消化管（ＧＩ）腸内毒素症、ＧＩ粘膜炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｄ及びＩＢＳ−Ｃ）、吐き気、痛み、便又は尿の変化、潰瘍性大腸炎、嘔吐、保持液からの体重増加、及び／又は衰弱を含む。
【０１４４】
疾患；治療方法、及び患者選択
実施形態において、本発明は、癌及び／又は腫瘍、例えば、癌及び／若しくは腫瘍の治療又は予防に関する。本明細書の他の場所に記載するように、癌の治療は、実施形態において、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するように本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを伴い得る。
【０１４５】
癌又は腫瘍は、身体の器官及びシステムの正常な機能を妨げる細胞の制御不能な増殖並びに／又は異常に増加した細胞生存率並びに／又はアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに休眠腫瘍又は微小転移が含まれる。免疫系によって妨げられない異常増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。癌は、原発性癌又は転移性癌であり得る。原発性癌は、臨床的に検出可能になる原発部位の癌細胞の領域であり、原発性腫瘍であり得る。対照的に、転移性癌は、ある器官又は部分から別の非隣接器官又は部分への疾患の広がりであり得る。転移性癌は、局所的な領域の周囲の正常組織に浸透及び浸潤する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされ得、新しい腫瘍を形成し、それは局所的な転移であり得る。癌はまた、リンパ及び／又は血管の壁を貫通する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされる可能性があり、その後、癌細胞は、体内の他の部位及び組織に血流を介して循環できる（それによって循環腫瘍細胞である）。癌は、リンパ性の又は血行性の広がりなどのプロセスに起因し得る。癌はまた、別の部位で停止し、血管又は壁を通って再浸透し、増殖し続け、最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。癌は、この新しい腫瘍であり得、それは転移性（又は続発性）腫瘍であり得る。
【０１４６】
癌は、転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得、それは続発性又は転移性腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍中のものと同様であり得る。一例として、乳癌又は結腸癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は、肝臓に存在する間、異常な肝細胞からではなく、異常な乳房又は結腸細胞から構成される。肝臓中の腫瘍はそのため、肝臓癌ではなく、転移性乳癌又は転移性結腸癌であり得る。
【０１４７】
癌は、任意の組織からの起源を有し得る。癌は、黒色腫、結腸、乳房、又は前立腺に由来し、そのため、それぞれ、元は皮膚、結腸、乳房、又は前立腺であった細胞から構成され得る。癌はまた、血液学的悪性腫瘍であり得、それは白血病又はリンパ腫であり得る。癌は、肝臓、肺、膀胱、又は腸などの組織に侵入し得る。
【０１４８】
本発明の代表的な癌及び／又は腫瘍は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腸骨の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化管癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；肝腫；上皮内新生物；腎臓癌又は腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺の扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞種；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮又は子宮内膜癌；尿系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低グレード／濾胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレードの拡散性ＮＨＬ；高グレードの免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードのリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレードの小さい非正円形細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びウォルデンストロームのマクログロブリン血症；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他の癌腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
実施形態において、キメラタンパク質は、治療−難治性癌を有する対象を治療するために使用される。実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の免疫調節剤に難治性である対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、キメラタンパク質は、治療の１２週間程度後に、治療に対する応答、或いはさらに進行を示さない対象を治療するために使用される。例えば、実施形態において、対象は、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２剤に難治性であり、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及び／又はＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）難治性患者を含む。例えば、実施形態において、対象は、抗ＣＴＬＡ−４剤に対して難治性であり、例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）難治性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、実施形態において、本発明は、１以上の免疫調節剤の単剤療法を含む、様々な治療に応答しない患者を救済する癌治療の方法を提供する。
【０１５０】
実施形態において、本発明は、腫瘍微小環境内の細胞又は組織を標的とするキメラタンパク質を提供する。実施形態において、腫瘍微小環境内の細胞又は組織は、キメラタンパク質の１以上の標的又は結合パートナーを発現する。腫瘍微小環境は、そこに腫瘍が存在する細胞、分泌タンパク質、生理的低分子、及び血管を含む細胞環境を指す。実施形態において、腫瘍微小環境内の細胞又は組織は、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；並びに腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞の１以上である。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は癌細胞を標的とする。実施形態において、癌細胞は、キメラタンパク質の標的又は結合パートナーの１以上を発現する。
【０１５１】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＧＩＴを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ１５５／ＰＶＲを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ネクチン−２を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ネクチン−３を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ネクチン−４を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。
【０１５２】
実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＬＴＢＲを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＨＶＥＭを発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＤｃＲ３を発現する細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。
【０１５３】
実施形態において、本方法は、追加の薬剤に難治性である患者にキメラタンパク質での治療を提供し、そのような「追加の薬剤」は本明細書の他の場所に記載されており、本明細書に記載の様々な化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
実施形態において、キメラタンパク質は、１以上の炎症性の疾患又は状態を治療する、調節する又は予防するために使用される。炎症性疾患の非限定的な例は、にきび、急性炎症、アレルギー性鼻炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、常染色体劣性痙性失調症、気管支拡張症、セリアック病、慢性胆嚢炎、慢性炎症、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、家族性好酸球増加症（ｆｅ）、糸球体腎炎、グリセロールキナーゼ欠乏症、化膿性汗腺炎、過敏症、炎症、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、間質性膀胱炎、喉頭炎症性疾患、リー症候群、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、眼炎症性疾患、耳炎、疼痛、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、呼吸器疾患、再狭窄、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、珪肺症及び他の肺炎、移植拒絶反応、結核、及び血管炎を含む。
【０１５５】
実施形態において、炎症性疾患は、多発性硬化症、糖尿病、ループス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、強皮症、グッドパスチャー症候群、ウェーゲナー肉芽腫症、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛、メニエール症候群；移植拒絶反応（例えば、同種移植片拒絶の予防）悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、及び他の自己免疫疾患などの自己免疫の疾患又は状態である。
【０１５６】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、細胞内病原体を排除するために使用される。いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、１以上の感染症を治療するために使用される。実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ及びＨＣＶを含む）、寄生虫感染症（例えば、マラリアを含む）、及び細菌感染症を治療する方法に使用される。実施形態において、感染症は、免疫抑制を誘発する。例えば、ＨＩＶ感染症は、感染した対象において免疫抑制をもたらす場合が多い。したがって、本明細書の他の場所に記載されるように、そのような感染症の治療は、実施形態において、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するように、本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを含み得る。或いは、本発明は、免疫活性化を誘導する感染症を治療するための方法を提供する。例えば、腸内蠕虫感染症は、慢性免疫活性化と関連している。これらの実施形態において、そのような感染症の治療は、免疫刺激よりも免疫阻害を優先するように、本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを含み得る。
【０１５７】
実施形態において、本発明は、限定されないが、例えば、気道の、パピローマウイルス感染の、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染の、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の、及び肝炎ウイルスによる感染などの内臓のウイルス感染の急性又は慢性のウイルス感染を含むウイルス感染を治療する方法を提供する。実施形態において、ウイルス感染は、フラビウイルス科のウイルスによって引き起こされる。実施形態において、フラビウイルス科のウイルスは、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルスから選択される。実施形態において、ウイルス感染は、ピコルナビリダ科のウイルス、例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、オルトミクソウイルス科のメンバー、例えば、インフルエンザウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、レトロウイルス科のメンバー、例えば、レンチウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、パラミクソウイルス科のメンバー、例えば、呼吸器多核体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス、及びヒトメタニューモウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、ブニヤウイルス科のメンバー、例えば、ハンタウイルスによって引き起こされる。実施形態において、ウイルス感染は、レオウイルス科のメンバー、例えば、ロタウイルスによって引き起こされる。
【０１５８】
実施形態において、本発明は、原虫又は蠕虫感染症などの寄生虫感染症を治療する方法を提供する。実施形態において、寄生虫感染は原虫寄生虫によるものである。実施形態において、オリチツィアブ（ｏｒｉｔｉｚｉａｂ）寄生虫は、腸原生動物、組織原生動物、又は血液原虫から選択される。例示的な原虫寄生虫は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリジウム・ムリス（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍｕｒｉｓ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｃｒｕｓｉ）、メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、ドノヴァン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・オーバル（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、及びヒストモナス・メレアグリジス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を含むが、これらに限定されない。実施形態において、寄生虫感染は、線虫などの蠕虫性寄生虫（例えば、双器綱）によるものである。実施形態において、寄生虫は、双線綱（例えば、鞭虫、回虫、蟯虫、ズビニ鉤虫、アメリカ鉤虫、糞線虫、バンクロフト糸状虫、メジナ虫）から選択される。実施形態において、寄生虫は、吸虫（例えば、住血吸虫、肝吸虫、腸吸虫、及び肺吸虫）から選択される。実施形態において、寄生虫は、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、異形吸虫（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ）、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）から選択される。実施形態において、寄生虫は、条虫類（例えば、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、小形条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）から選択される。
【０１５９】
実施形態において、本発明は、細菌感染症を治療する方法を提供する。実施形態において、細菌感染は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性及び／又は嫌気性細菌によるものである。実施形態において、細菌は、ブドウ球菌、乳酸菌、連鎖球菌、八連球菌、大腸菌、エンテロバクター、クレブシエラ、シュードモナス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、プロテウス、カンピロバクター、シトロバクター、ニセリア（Ｎｉｓｓｅｒｉａ）、バチルス、バクテロイド、ペプトコッカス、クロストリジウム、サルモネラ菌、シゲラ、セラティア、ヘモフィルス、ブルセラ及び他の生物から選択されるが、これらに限定されない。実施形態において、細菌は、緑膿菌、蛍光菌、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリジェンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、大腸菌、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  Ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スチュアーティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ヘモリティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリティカ（��ｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア・インターメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・ヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ブランハメラ・カタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、キンゲラ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス３４５２Ａ相同性グループ、バクテロイデス・ブルガータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・オバルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｌｕｓ）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・エガーシー（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、バクテロイデス・スプランクニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、��核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ群β溶血連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・ヒカス亜種ヒカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｙｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、又はスタフィロコッカス・サッカロリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）から選択されるが、これらに限定されない。
【０１６０】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、１以上の自己免疫疾患又は障害を治療するために使用される。実施形態において、自己免疫疾患又は障害の治療は、免疫刺激よりも免疫阻害を優先するように、本発明のキメラタンパク質で免疫系を調節することを含み得る。本発明のキメラタンパク質で治療可能な例示的自己免疫疾患又は障害は、体自体の抗原が免疫応答の標的となるもの、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、サルコイドーシス、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、乾癬、過敏反応（例えば、アレルギー、花粉症、喘息、及び急性水腫は、Ｉ型過敏反応を引き起こす）、並びに血管炎を含む。
【０１６１】
さらに別の態様において、本発明は、限定されないが、本明細書の他の場所に記載の疾患又は障害及び炎症性疾患又は障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植拒絶反応、及びＴ細胞増殖障害などのＴ細胞媒介性疾患及び障害を治療並びに予防する方法に関する。
【０１６２】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、Ｔ細胞を活性化する方法において、例えば、免疫刺激シグナルを有する細胞外ドメインを介して使用される。
【０１６３】
いくつかの態様において、本発明のキメラ薬剤は、免疫抑制シグナルの細胞伝達を防止する方法において使用される。
【０１６４】
併用療法及びコンジュゲーション
実施形態において、本発明は、対象に追加の薬剤を投与することをさらに含むキメラタンパク質及び方法を提供する。実施形態において、本発明は、共投与及び／又は共製剤化に関する。本明細書に記載の組成物はいずれも、共製剤化及び／又は共投与され得る。
【０１６５】
実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、別の薬剤と共投与された場合に相乗的に作用し、そのような薬剤が単剤療法として使用される場合に一般的に使用される用量よりも低い用量で投与される。実施形態において、本明細書で参照される任意の薬剤は、本明細書に記載のキメラタンパク質のいずれかと組み合わせて使用され得る。
【０１６６】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例は、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコーン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ  １−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン系抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））を参照されたい；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロン酸塩などのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質（ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎ）エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシンドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどの���リン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２、２’、２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（例えば、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール  パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、アブラクサン  クレモフォールを含まない、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びタキソテール  ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ジェムザール  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン  ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサル、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵ及びロイコボリンとのイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤  ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、細胞増殖を低下させるエル���チニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）及びＶＥＧＦ−Ａ）並びに上記のいずれかの医薬として許容される塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されない。加えて、本治療方法は、放射線の使用をさらに含んでよい。加えて、本治療方法は、光力学療法の使用をさらに含んでよい。
【０１６７】
実施形態において、限定されないが、癌適用を含み、本発明の追加の薬剤は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（テセントリク、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ））、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及び／又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と４−１ＢＢリガンドの１以上の結合を増加及び／又は刺激する薬剤（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体）、並びにＣＴＬＡ−４の活性及び／又はＣＴＬＡ−４と、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１以上の結合及び／又はＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を阻止、低減及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）から選択される１以上の免疫調節剤である。
【０１６８】
実施形態において、限定されないが、感染性疾患適用を含み、本発明は、追加の薬剤としての抗感染剤に関する。実施形態において、抗感染剤は、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、及びホスカルネットを含むがこれらに限定されない抗ウイルス剤である。実施形態において、抗感染剤は、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テキン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、及びメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；及びカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、及びメロペネム）を含むがこれらに限定されない抗菌剤である。実施形態において、抗感染剤は、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、キニン、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメーター（ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）／ルメファントリン、アトバコン（ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）／プログアニル及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、ピランテルパモ酸塩、及びアルベンダゾールを含む。
【０１６９】
実施形態において、限定されないが、自己免疫適用を含み、追加の薬剤は、免疫抑制剤である。実施形態において、免疫抑制剤は、ステロイド系抗炎症剤又は非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に、副腎コルチコステロイド及びその合成類似体は、当技術分野で周知である。本発明に有用なコルチコステロイドの例は、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、ベータ−メチルベタメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンベンゾエート、ベタメタゾンジプロピオン酸、ベタメタゾンバレレート、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾンジアセテート、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステル類のバランス、クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸塩を含むが、これらに限定されない。本発明で使用され得る（ＮＳＡＩＤＳ）は、サリチル酸、アセチルサリチル酸、メチルサリチル酸、グリコールサリチル酸、サリチルアミド（ｓａｌｉｃｙｌｍｉｄｅ）、ベンジル−２，５−ジアセトキシベンゾイン酸、イブプロフェン、スリンダク（ｆｕｌｉｎｄａｃ）、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、及びインドメタシンを含むが、これらに限定されない。実施形態において、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン（Ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ）、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレート、及び小さな生物学的薬剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞分裂阻害剤であり得る。
【０１７０】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、修飾される誘導体、すなわち、共有結合が組成物の活性を防止しないような、組成物への任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定されないが、誘導体は、特に、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質溶解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾された組成物を含む。多数の化学修飾のいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。さらに他の実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、例示的な実施形態において、毒素、化学療法剤、放射性同位体、及びアポトーシス若しくは細胞死を引き起こす薬剤を含む、細胞傷害性薬剤をさらに含む。そのような薬剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートされ得る。
【０１７１】
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はしたがって、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質などの検出可能な部分、及び化学発光部分、又は、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、サイトトキシン、細胞傷害性薬剤、及び放射性物質などの機能的部分を付加するために翻訳後に修飾され得る。
【０１７２】
製剤
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される塩を形成するために、無機酸若しくは有機酸と反応できる十分に基本的な官能基、又は無機塩基若しくは有機塩基と反応できるカルボキシシル基を保有できる。医薬として許容される酸添加塩は、当技術分野で周知の医薬として許容される酸から形成される。そのような塩は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）並びに医薬塩のハンドブック；性質、選択、及び使用（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編集），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される医薬として許容される塩を含む。
【０１７３】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、医薬として許容される塩の形態である。
【０１７４】
また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、医薬として許容される担体又はビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与できる。そのような組成物は、必要に応じて、適切な投与のための形態を提供するように、適量の医薬として許容される賦形剤を含んでよい。医薬用賦形剤は、水並びにピーナッツ油、大豆油、鉱物油、及びゴマ油などの、石油、動物、野菜、又は合成起源のものを含む油類などの、液体であり得る。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、及び尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用できる。一実施形態において、医薬として許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。水は、本明細書に記載の任意の薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液がまた、特に注射可能な溶液のために、液体賦形剤として使用できる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールなども含む。本明細書に記載の任意の薬剤は、必要に応じて、微量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含んでよい。
【０１７５】
実施形態において、本明細書に記載の組成物は、生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、及びＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない）に再懸濁される。
【０１７６】
実施形態において、キメラタンパク質は、半減期を延長するか、又はそうでなければ、薬物力学的及び薬物動態学的性質を改善するために別の薬剤とコンジュゲート並びに／又は融合され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、及びトランスフェリンなどの１以上と融合又はコンジュゲートされ得る。実施形態において、個々のキメラタンパク質のそれぞれは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５〜２３９に記載の薬剤の１以上に融合される。
【０１７７】
投与、投薬、及び治療レジメン
本発明は、記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を様々な製剤中に含む。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、溶液、懸濁液、エマルション、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適する任意の他の形態をとり得る。タンパク質配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ構築物も使用され得る。一実施形態において、組成物は、カプセルの形態にある（例えば、米国特許第５、６９８、１５５号を参照されたい）。適切な医薬賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集，第１９版、１９９５）に記載されている。
【０１７８】
適宜、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、可溶化剤も含んでよい。また、薬剤は、当技術分野で公知の適切なビヒクル又は送達装置により送達できる。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクル又は送達装置で共送できる。投与のための組成物は、必要に応じて、注射部位での痛みを軽減するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含んでよい。
【０１７９】
本発明のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を含む製剤は、単位剤形で都合よく提示され、薬学の当技術分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。そのような方法は、一般に、１以上の付属成分を構成する担体と治療薬を結合させる工程を含む。典型的には、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、又はその両方と治療薬を均一かつ密接に結合させ、必要に応じて、所望の製剤の剤形に生成物を形成する（例えば、湿式又は乾燥造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で公知の従来の方法を用いて打錠する）ことによって調製される。
【０１８０】
一実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。
【０１８１】
投与経路は、例えば、皮内、筋肉内、経皮内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入による投与、又は局所的に、特に、耳、鼻、目、若しくは皮膚への投与を含む。実施形態において、投与は、経口又は非経口注射によってなされる。ほとんどの場合、投与は、血流への本明細書に記載の任意の薬剤の放出をもたらす。
【０１８２】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、経口投与できる。そのようなキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）はまた、任意の他の便利な経路によって、例えば、静脈内注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与でき、かつ別の生物学的活性剤と共に投与できる。投与は、全身的又は局所的であり得る。様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、投与のために使用できる。
【０１８３】
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。一実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍に近位に位置する他の免疫細胞を含む腫瘍細胞を取り囲み、かつ／若しくは腫瘍細胞に栄養を与える、例えば、細胞、分子、細胞外マトリックス並びに／又は血管）又はリンパ節に投与され、かつ／又は腫瘍微小環境若しくはリンパ節を標的とする。実施形態において、例えば、癌の治療において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、腫瘍内に投与される。
【０１８４】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ（ＯＰＤＩＶＯ）、キイトルーダ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ヤーボイ（ＹＥＲＶＯＹ）及びテセントリク（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）の１以上での治療）に見られる副作用よりも少ない副作用をもたらす二重効果を可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、低血圧、大腸炎、肝炎、肺炎、発疹、及びリウマチ性疾患などの、皮膚、消化管、腎臓、末梢神経系及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、目、膵臓、及び内分泌系を含む様々な組織並びに器官に影響を与える一般的に観察される免疫関連有害事象を低減又は予防する。また、本発明の局所投与、例えば腫瘍内投与は、標準的な全身投与、例えば、従来の免疫療法（例えば、オプジーボ、キイトルーダ、ヤーボイ、及びテセントリクの１以上での治療）で使用されるようなＩＶ注入で見られる有害事象を未然に防ぐ。
【０１８５】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内への注射並びに注入）に適する剤形は、例えば、溶液、懸濁液、分散剤、及びエマルションなどを含む。それらはまた、使用直前に無菌注射培地に溶解又は懸濁できる無菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造され得る。それらは、例えば、当技術分野で公知の懸濁剤又は分散剤を含有し得る。
【０１８６】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量並びに投薬スケジュールは、治療される疾患、対象の全体的な健康、及び投与する医師の裁量を含むが、これらに限定されない様々なパラメータに依存し得る。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、それを必要とする対象への追加の薬剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）か、追加の薬剤の投与と同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与できる。実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質及び追加の薬剤は、１分間間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与される。
【０１８７】
実施形態において、本発明は、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質及び適応免疫応答を誘導する別のキメラタンパク質の共投与に関する。そのような実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。例えば、キメラタンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満の間隔、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態において、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質及び適応応答を誘発するキメラタンパク質は、１週間間隔で投与されるか、又は隔週で投与される（すなわち、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与は、その１週間後に、適応免疫応答などを誘発するキメラタンパク質などの投与を伴う）。
【０１８８】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投薬量は、病態の重症度、病態が治療又は予防されるか否か、並びに治療される対象の年齢、体重、及び健康を含むいくつかの要因に依存し得る。さらに、特定の対象についての薬物ゲノムの（薬物動態、薬理力学的又は治療の有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響の）情報が、使用される投薬量に影響を与える可能性がある。また、正確な個々の投薬量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む様々な要因に依存して、幾分か調節できる。投薬量のいくつかのバリエーションが予想される。
【０１８９】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の非経口注射による投与について、投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、１日あたり約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日あたり約３ｍｇ〜約５ｍｇであり得る。一般に、経口又は非経口投与の場合、本明細書に記載の任意の薬剤の投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は１日あたり約２００〜約１，２００ｍｇ（例えば、１日あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）であり得る。
【０１９０】
実施形態において、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、治療あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は治療あたり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は治療あたり約２００〜約１，２００ｍｇ（例えば、治療あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）の投薬量での非経口注射によるものである。
【０１９１】
実施形態において、キメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の適切な投薬量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、その間の全ての値と範囲を含む約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．２ｍｇ／ｋｇ体重、約１．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．４ｍｇ／ｋｇ体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６ｍｇ／ｋｇ体重、約１．７ｍｇ／ｋｇ体重、約１．８ｍｇ／ｋｇ体重、約１．９ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約４ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約６ｍｇ／ｋｇ体重、約７ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重、約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１９２】
別の実施形態において、送達は、小胞中で、特にリポソーム中であり得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら，感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ），Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ及びＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照されたい）。
【０１９３】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、制御放出手段若しくは持続放出手段によるか、又は当業者に周知の送達装置によって投与できる。例は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第３、８４５、７７０号、同第３、９１６、８９９号、同第３、５３６、８０９号、同第３、５９８、１２３号、同第４、００８、７１９号、同第５、６７４、５３３号、同第５、０５９、５９５号、同第５、５９１、７６７号、同第５、１２０、５４８号、同第５、０７３、５４３号、同第５、６３９、４７６号、同第５、３５４、５５６号、及び同第５、７３３、５５６号に記載のものを含むが、これらに限定されない。そのような剤形は、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、微小球、又はそれらの組み合わせを用いる１以上の活性成分の制御放出又は持続放出を提供するのに有用であり得る。活性成分の制御放出又は持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、光の適切な波長による刺激、酵素の濃度又は利用可能性、水の濃度又は利用可能性、又は他の生理学的条件若しくは化合物を含むがこれらに限定されない、様々な条件によって刺激できる。
【０１９４】
別の実施形態において、ポリマー材料を使用できる（制御放出の医学的用途（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ），Ｌａｎｇｅｒ及びＷＩｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；制御される薬物バイオアベイラビリティ、医薬品の設計と性能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ），Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。
【０１９５】
別の実施形態において、制御放出システムは、治療される標的領域の近くに配置でき、したがって、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、上記のＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２巻，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説で説明されている他の制御放出システムが使用され得る。
【０１９６】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の投与は、独立して、１日に１〜４回、又は月に１〜４回、又は年に１〜６回、又は２年、３年、４年若しくは５年に１回であり得る。投与は、１日又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であり得、さらには対象の寿命の間であり得る。
【０１９７】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）を利用する投薬量レジメンは、対象の種類、種、年齢、体重、性別及び病状；治療される病態の重症度；投与経路；対象の腎機能又は肝機能；個人の薬理ゲノミクス構造；及び使用される本発明の特定の化合物を含む様々な要因に従って選択できる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、毎日の単回用量で投与でき、又は総１日投薬量は、１日２回、３回又は４回の分割用量で投与できる。また、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）は、投薬量レジメン全体を通して断続的ではなく、連続的に投与できる。
【０１９８】
細胞及び核酸
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。実施形態において、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。実施形態において、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
【０１９９】
原核生物ベクターと真核生物ベクターの両方が、キメラタンパク質の発現に使用できる。原核生物ベクターは、大腸菌配列に基づく構築物を含む（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，６０：５１２−５３８を参照されたい）。大腸菌での発現に使用できる調節領域の非限定的な例は、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７及びλＰＬを含む。原核生物発現ベクターの非限定的な例は、λｇｔ１１などのλｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈら，「ＤＮＡクローニング技術（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｉ巻：実用的なアプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編），ｐｐ．４９−７８，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０，１８５：６０−８９）を含み得る。しかしながら、原核生物宿主ベクター系は、哺乳動物細胞の翻訳後処理の多くを行うことができない。そのため、真核生物宿主ベクター系が、特に有用であり得る。様々な調節領域を、哺乳動物宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現に使用できる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞に有用であり得る誘導性プロモーターは、限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子に関連するプロモーター、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，４９：２７３５−４２；及びＴａｙｌｏｒら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，１０：１６５−７５を参照されたい）。ヒートショックプロモーター又はストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現を促進するのに有利であり得る。
【０２００】
実施形態において、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である、発現制御領域、若しくはその補体に作動可能に連結されたキメラタンパク質（及び／若しくは追加の薬剤）又はその補体をコードする核酸を含む。発現制御領域は、発現ベクターで形質転換されたヒト細胞でブロッキング剤及び／又は刺激剤が生成されるように、作動可能に連結されたブロッキング剤及び／又は刺激剤をコードする核酸の発現を促進できる。
【０２０１】
発現制御領域は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を与える、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（本明細書でエレメントと呼ばれることもある）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞中で作動可能に連結されたコード核酸を発現できる。実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態において、細胞は非腫瘍細胞である。実施形態において、発現制御領域は、作動可能に連結された核酸に調節可能な発現を与える。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結された核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、多くの場合、誘導性と呼ばれる。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、多くの場合、抑制可能と呼ばれる。典型的には、そのようなエレメントによって与えられる増減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増減が大きくなる。
【０２０２】
実施形態において、本発明は、合図に応答して一過的に高レベルの発現をもたらすことができる誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近くにある場合、そのような発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）用の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換細胞を適切な合図に暴露することによって高レベルの薬剤を一過的に生成するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域は、低分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。特定の例は、例えば、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５、９８９、９１０号、同第５、９３５、９３４号、同第６、０１５、７０９号、及び同第６、００４、９４１号の中で見つけることができる。
【０２０３】
発現制御領域及び遺伝子座制御領域は、天然のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの全長プロモーター配列、並びに全長若しくは非バリアンド機能の全て又は一部を保持するサブ配列又はポリヌクレオチドバリアントを含む。本明細書で使用する用語「機能的」及びその文法的異形は、核酸配列、サブ配列又は断片を参照して使用される場合に、配列が天然核酸配列（例えば、非バリアント又は非改変配列）の１以上の機能を有することを意味する。
【０２０４】
本明細書で使用する「作動可能な連結」は、それらが意図される様式で機能することを可能にすると説明される構成成分の物理的な並置を指す。核酸との作動可能な連結における発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。典型的には、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端（すなわち「上流」）付近に並置される。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン）に配置できる。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離（例えば、核酸から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、又はそれより多くのヌクレオチド）に配置できる。発現制御エレメントの具体的な例はプロモーターであり、それは転写される配列の５’側に通常は位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、それは転写される配列の５’側若しくは３’側又は転写される配列内に配置できる。
【０２０５】
ヒト細胞で機能する発現系は、当技術分野で周知であり、かつウイルス系を含む。一般的に、ヒト細胞中で機能的なプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合しｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）転写を開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端に通常位置する、転写開始領域及び典型的には、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流に典型的に位置する、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用できる。ウイルス遺伝子は高度に発現される場合が多く広い宿主範囲を有するので、プロモーターとして特に使用されるのは、哺乳動物ウイルスゲノム由来のプロモーターである。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターを含む。
【０２０６】
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そのため、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネータ及びポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。イントロンも、発現構築物中に含まれ得る。
【０２０７】
生存細胞に核酸を導入するために利用可能な様々な技術がある。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適する技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーベースのシステム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。インビボ遺伝子導入に関しては、リポソーム；キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクルを含むいくつかの技術及び試薬を用いてもよい。ウイルスベクターも、インビボ形質導入に適する。場合によっては、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又はリガンドなどの、標的剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型を指向するカプシドタンパク質又はその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質を標的化し、かつ／又はその取り込みを促進するために使用され得る。受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。
【０２０８】
適宜、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達作用因子を用いることもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１−３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２−３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋら，ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３を参照されたい）。これらは、リコンビナーゼ及びトランスポサーゼを含む。例は、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６，１９８１）、ｌａｍｂｄａ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３−５４５，１９７４），Ｆｌｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ら，Ｃｅｌｌ，２９：２２７−２３４，１９８２），Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０−６１８，１９９０），ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）、マリナーファミリーのトランスポサーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋら、上記）、及びＡＡＶ、レトロウイルスなどのウイルスを組み込むための構成成分、並びにレトロウイルス又はレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する構成成分を有するアンチウイルス（Ｋｏｏｔｓｔｒａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３）を含む。加えて、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を挿入するために使用され得る。
【０２０９】
一態様において、本発明は、ウイルスベクターであるキメラタンパク質（及び／又は追加の薬剤）の発現用の発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが公知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１  １７，１２２，２００３を参照されたい）。例示的なウイルスベクターは、アンチウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものを含むが、他のウイルスベクターも使用され得る。インビボ使用の場合、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターは、αウイルス及びアデノウイルスなどの使用に適する。αウイルスの例示的な種類は、シンドビスウイルス、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）を含む。インビトロ使用の場合、レトロウイルス、ＡＡＶ、及びアンチウイルスなどの、宿主ゲノムに組み込むウイルスベクターが適する。実施形態において、本発明は、インビボでヒト細胞を形質導入する方法であって、インビボで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む、方法を提供する。
【０２１０】
実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【０２１１】
発現ベクターは、本発明のキメラタンパク質を生成するための宿主細胞に導入できる。細胞は、例えば、インビトロで培養されるか、又は遺伝子操作され得る。有用な哺乳動物宿主細胞は、限定されないが、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞を含む（例えば、「遺伝子導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」１９９０、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．を参照されたい）。これらは、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３、２９３−ＥＢＮＡ、又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，７７：４２１６）；ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８０，２３：２４３−２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）を含む。本明細書に記載のキメラタンパク質を発現させるための例示的癌細胞型は、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びそのオブアルブミン形質移入体、Ｅ．Ｇ７、マウス黒色腫細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、及びヒト小細胞肺癌細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７を含む。
【０２１２】
宿主細胞は、健康なヒト、癌患者、及び感染症患者を含む健常又は罹患している患者、民間研究室預託、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの公共の培養物コレクション、又は商業サプライヤーから入手できる。
【０２１３】
インビトロ、エクソビボ、及び／又はインビボで本発明のキメラタンパク質の生成に使用できる細胞は、限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に、造血幹細胞又は前駆細胞（例えば、骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などを含む。細胞型の選択は、治療若しくは予防される腫瘍の種類又は感染症に依存し、当業者が決定できる。
【０２１４】
Ｆｃ含有高分子（モノクローナル抗体など）の生成及び精製は、生成物間のわずかな改変を伴う標準化されたプロセスとなっている。例えば、多くのＦｃ含有高分子は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（若しくはその変異体）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（若しくはその変異体）又は場合によっては、細菌による方法又は合成方法によって生成される。生成後、ＨＥＫ細胞又はＣＨＯ細胞によって分泌されるＦｃ含有高分子は、プロテインＡカラムへの結合を通じて精製され、その後、様々な方法を用いて「完璧に」される。一般的に言えば、精製されたＦｃ含有高分子は、ある期間液体形態で保存され、長期間凍結されるか、又は場合によっては、凍結乾燥される。実施形態において、本明細書で企図されるキメラタンパク質の生成は、従来のＦｃ含有高分子と比較して特有の特徴を有し得る。ある例において、キメラタンパク質は、特定のクロマトグラフィー樹脂を用いるか、又はプロテインＡ捕捉に依存しないクロマトグラフィー法を用いて精製され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、オリゴマー状態で、又は複数のオリゴマー状態で精製され、特定の方法を用いて特定のオリゴマー状態について濃縮され得る。理論に縛られることなく、これらの方法は、特定の塩濃度、ｐＨ及び添加剤組成物を含む特定の緩衝液による処理を含み得る。他の例では、そのような方法は、１つのオリゴマー状態を別のオリゴマー状態よりも優先する処理を含み得る。本明細書で得られるキメラタンパク質は、当技術分野で特定される方法を用いて、さらに「完璧に」され得る。実施形態において、キメラタンパク質は、非常に安定であり、広範囲のｐＨの曝露（ｐＨ３〜１２）に耐えることができ、多数の凍結／解凍ストレス（３回超の凍結／解凍サイクル）に耐えることができ、高温（４０℃で２週間超）での延長したインキュベーションに耐えることができる。実施形態において、キメラタンパク質は、そのようなストレス条件下での分解、脱アミド化などの証拠なしに、無傷のままでいると示される。
【０２１５】
対象及び／又は動物
実施形態において、対象及び／又は動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又はサル、チンパンジー、若しくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。実施形態において、対象及び／又は動物は、例えば、ゼブラフィッシュなどの非哺乳動物である。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光タグ付き細胞（例えば、ＧＦＰを有する）を含み得る。実施形態において、対象及び／又は動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
【０２１６】
実施形態において、対象及び／又は動物は、ヒトである。実施形態において、ヒトは小児のヒトである。実施形態において、ヒトは、成人のヒトである。実施形態において、ヒトは、老人のヒトである。実施形態において、ヒトは、患者と呼ばれ得る。
【０２１７】
ある実施形態において、ヒトは、生後約０ヶ月〜約６ヶ月、生後約６ヶ月〜約１２ヶ月、生後約６ヶ月〜約１８ヶ月、生後約１８ヶ月〜約３６ヶ月、約１歳〜約５歳、約５歳〜約１０歳、約１０歳〜約１５歳、約１５歳〜約２０歳、約２０歳〜約２５歳、約２５歳〜約３０歳、約３０歳〜約３５歳、約３５歳〜約４０歳、約４０歳〜約４５歳、約４５歳〜約５０歳、約５０歳〜約５５歳、約５５歳〜約６０歳、約６０歳〜約６５歳、約６５歳〜約７０歳、約７０歳〜約７５歳、約７５歳〜約８０歳、約８０歳〜約８５歳、約８５歳〜約９０歳、約９０歳〜約９５歳、又は約９５歳〜約１００歳の範囲の年齢を有する。
【０２１８】
実施形態において、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学での使用に関する。特定の実施形態において、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態において、非ヒト動物は家畜動物である。
【０２１９】
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化できるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形で含む。一実施形態において、単位剤形は、殺菌できる予め充填された注射器などの容器であり、本明細書に記載の任意の薬剤及び医薬として許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する。キットは、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を説明するラベル又は印刷された説明書をさらに含んでよい。キットはまた、蓋スペキュラム、局所麻酔薬、及び投与場所のための洗浄剤を含み得る。キットはまた、本明細書に記載の１以上の追加の薬剤をさらに含んでよい。一実施形態において、キットは、本明細書に記載のものなどの、有効量の本発明の組成物及び有効量の別の組成物を含有する容器を含む。
【０２２０】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０２２１】
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明される。
【０２２２】
実施例
実施例１：ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
この実施例で、ＴＩＧＩＴ及びＯＸ４０Ｌドメインを含むキメラタンパク質を生化学的及び機能的に特徴付けた。
【０２２３】
マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質及びヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を調製した。それらの概略図を図３Ａと図３Ｂの上部に示す。ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ及びｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ及びｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のウェスタンブロットは、非還元レーンに優勢な二量体バンドの存在を示し（図３Ａ及び図３Ｂ、各ブロットのレーン２）、これは還元剤のβ−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図３Ａ及び図３Ｂ、レーン３各ブロット）。図３Ａ及び３Ｂの、各ブロットのレーン３に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）及びエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で単量体として泳動した。
【０２２４】
ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質及びｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の結合能力を次いでアッセイした。各キメラタンパク質について、以下の条件：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（図４Ａ及び図４Ｂ、左上）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ１５５／ＰＶＲ−Ｈｉｓ（図４Ａ及び図４Ｂ、右上）、並びにｍＯＸ４０Ｌに対する抗体で捕捉及び検出されるＯＸ４０−Ｈｉｓ（図４Ａ及び図４Ｂ、左下）、でＥＬＩＳＡを行った。ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、組換えＣＤ１５５で捕捉及び検出されたＯＸ４０−Ｆｃであり（図４Ａ、右下、「デュアルＥＬＩＳＡ」）、ｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、組換えＣＤ１５５、ＣＤ１１２又はＣＤ１１３タンパク質で捕捉及び検出されたＯＸ４０−Ｆｃであった（図４Ａ、右下、「デュアルＥＬＩＳＡ」）。これらのデータは、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質及びｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がそれらの標的のそれぞれを結合し、両方の標的を同時に結合できることを示す。
【０２２５】
追加の分析を行って、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が生細胞の表面上で標的を結合できるかどうかを決定した。ヒトＰＶＲ（すなわち、ＣＨＯＫ１／ＰＶＲ）を過剰発現する細胞株を作製した。これらの細胞は、細胞膜結合ＰＶＲへのＴＩＧＩＴ含有構築物の結合を検出するのに有用である。図５Ａを参照されたい。ネクチン−２を過剰発現する細胞株を作製した（すなわち、ＣＨＯＫ１／ネクチン２）。これらの細胞は、細胞膜結合ネクチン−２へのＴＩＧＩＴ含有構築物の結合を検出するのに有用である。図５Ｂを参照されたい。ネクチン−３を過剰発現する細胞株を作製した（すなわち、ＣＨＯＫ１／ネクチン−３）。これらの細胞は、細胞膜結合ネクチン−３へのＴＩＧＩＴ含有構築物の結合を検出するのに有用である。図５Ｃを参照されたい。ｍＯＸ４０を過剰発現する別の細胞株を調製した（すなわち、ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０）。細胞株の各々は、チャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯＫ１）に基づいた。
【０２２６】
ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質又はｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を、親細胞株及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。図６（左下及び右下）に示すように、かつ予想されるように、キメラタンパク質は、キメラタンパク質のいずれの濃度でも親細胞株を結合しなかった。しかしながら、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＣＨＯＫ１／ＰＶＲ工学処理細胞株を濃度依存的に結合した。このデータに基づいて、ＥＣ５０値は４．６３４ｎＭと計算された。図６（左上）を参照されたい。対照的に、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌはいずれの工学処理細胞株にも結合しなかった。ＣＨＯＫ１／ＰＶＲ工学処理細胞株と同様に、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質も、ＣＨＯＫ１−ｍＯＸ４０工学処理細胞株を濃度依存的に結合した。このデータに基づいて、ＥＣ５０値は１．７ｎＭと計算された。図６（右）を参照されたい。これらのデータは、キメラタンパク質の異なる成分が生細胞上でそのそれぞれの受容体／リガンドに結合できることを示す。
【０２２７】
次に、ｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのさらなる結合パートナーを特定するために、マイクロアレイスクリーニングを実施した。図７は、マイクロアレイ（約６，０００個のヒトの膜タンパク質を含有する）から特定されたｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合パートナーを示す結果の表である。ｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの各予想される結合パートナーを、スクリーニングによって特定した。他のヒトタンパク質への非特異的結合の証拠はなく、ガレクチン−１への結合は、全てのＦｃ含有融合タンパク質のスクリーニングで見られる。
【０２２８】
実施例２：ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の特徴付け
この実施例において、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）ドメインを含むキメラタンパク質を生化学的及び機能的に特徴付けた。
【０２２９】
マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を調製した。それらの概略図を図８Ａ及び図８Ｂの上部に示す。ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットは、非還元レーンに優勢な二量体バンドの存在を示し（図８Ａ及び図８Ｂ、各ブロットのレーン２）、これは還元剤のβ−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図８Ａ及び図８Ｂ、レーン３各ブロット）。図８Ａ及び８Ｂの、各ブロットのレーン３に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）及びエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で単量体として泳動した。
【０２３０】
ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の結合能力を次いでアッセイした。各キメラタンパク質について、以下の条件：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（図９Ａ及び図９Ｂ、左上）、ＩｇＧで捕捉及び検出されるＣＤ４７−Ｈｉｓ（図９Ａ及び図９Ｂ、右上）、マウスＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるマウスＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（図９Ａ、左下）又はヒトＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるヒトＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（図９Ｂ、左下）、並びにＳＩＲＰαに対する抗体で捕捉及び検出されるＬＴＢＲ  Ｈｉｓ＋ＧＳＴ（図９Ａ及び図９Ｂ、右下、「デュアルＥＬＩＳＡ」）、でＥＬＩＳＡを行った。これらのデータは、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質は、それらの標的のそれぞれを結合し、両方の標的を同時に結合できることを示す。
【０２３１】
追加の分析を行って、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質が生細胞の表面上でその標的を結合できるかどうかを決定した。マウスＣＤ４７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１０Ａ、左）又はマウスＬＴｂＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１０Ａ、右）を調製した。
【０２３２】
ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、親細胞株及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。図１０Ａ（左）に示すように、かつ予想されるように、キメラタンパク質は、キメラタンパク質のいずれの濃度でも親細胞株を結合しなかった。しかしながら、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、ｍＣＤ４７工学処理細胞株（図１０Ａ、左）及びｍＬＴｂＲ工学処理細胞株（図１０Ａ、右）を濃度依存的に結合した。このデータに基づいて、ＣＤ４７のＥＣ５０値は１８ｎＭ及びｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）のＥＣ５０値は２４ｎＭと計算された。さらに、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質をｍＣＤ４７過剰発現細胞株とインキュベートした。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、ｍＣＤ４７工学処理細胞株（図１０Ｂ）を濃度依存的に結合した。このデータに基づいて、ＥＣ５０値は５７ｎＭと計算された。これらのデータは、キメラタンパク質の異なる成分は各々、生細胞上でそのそれぞれの受容体／リガンドを結合できることを示す。
【０２３３】
ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質が赤血球に結合できず、それによって溶血をもたらすかを次いで試験した。ここで、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０、又はＣＤ４７特異的抗体（クローンＣＣ２Ｃ６又はＣＣ９００００２）を、カニクイザル赤血球（ＲＢＣ；図１１Ａ、左上及び左下）又はヒトＲＢＣ（図１１Ｂ及び図１１Ｃ、全てのパネル）と接触させた。トリトン−Ｘでの処理（陽性対照として）と比較した場合、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴもｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０も、カニクイザルＲＢＣの顕著な溶血を引き起こさなかった（図１１Ａ、左下）。例示的なプレートを示す（図１１Ａ、右）。ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴも、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０も、ヒトＲＢＣに顕著に結合しなかった（図１１Ｂ、全パネル）。トリトン−Ｘでの処理（陽性対照として）と比較した場合、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ又はｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０は、ほぼ検出不可能なレベルのヒトＲＢＣの溶解を引き起こした（図１１Ｃ、全パネル）。例示的なプレートを示す（図１１Ｃ、右）。これらのデータは、ｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＣＤ４０は、望ましくない副作用としてヒトＲＢＣの溶血を引き起こさないことを示す。
【０２３４】
実施例３：ＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の特徴付け
この実施例において、ＬＩＧＨＴ及びＰＤ−１ドメインを含むキメラタンパク質を生化学的及び機能的に特徴付けた。
【０２３５】
マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を調製した。それらの概略図を図１２Ａ及び図１２Ｂの上部に示す。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットは、非還元レーンに優勢な二量体バンドの存在を示し（図１２Ａ及び図１２Ｂ、各ブロットのレーン２）、これは還元剤のβ−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図１２Ａ及び図１２Ｂ、レーン３各ブロット）。図１２Ａ及び１２Ｂの、各ブロットのレーン３に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）及びエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で単量体として泳動した。
【０２３６】
ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の結合能力を次いでアッセイした。各キメラタンパク質について、以下の条件：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（図１３Ａ及び図１３Ｂ、左上）、マウスＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるマウスＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（図１３Ａ、右上）又はビオチン化ヒトＬＩＧＨＴで捕捉及び検出されるヒトＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（図１３Ｂ、右上）、並びにｍＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるｍＰＤ−Ｌ１（図１３Ａ、左下；「デュアルＥＬＩＳＡ」）又はｈＬＴＢＲ−Ｈｉｓ／６×Ｈｉｓ−ＨＲＰで捕捉及び検出されるｈＰＤＬ１−Ｆｃ（図１３Ａ、左下；「デュアルＥＬＩＳＡ」）、でＥＬＩＳＡを行った。これらのデータは、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質とｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質は、それらの標的のそれぞれを結合し、両方の標的を同時に結合できることが示される。
【０２３７】
追加の分析を行って、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質（図１４Ａ）又はヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質（図１４Ａ）が生細胞の表面上で標的を結合できるかどうかを決定した。マウスｍＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１４Ａ、左）、マウスＬＴｂＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１４Ａ、右）及びヒトｍＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１４Ｂ、左）を調製した。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、親細胞株及び過剰発現細胞株と２時間インキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによるキメラタンパク質結合の検出のための抗体で染色した。図１４Ａ（左及び右）に示すように、かつ予想されるように、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質は、親細胞株をキメラタンパク質のいずれの濃度でも結合しなかった。しかしながら、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、ｍＰＤ−Ｌ１工学処理細胞株（図１４Ａ、左）及びｍＬＴｂＲ工学細胞株（図１４Ａ、右）を濃度依存的に結合した。さらに、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、ｈＰＤ−Ｌ１過剰発現細胞株とインキュベートした。ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、ｈＰＤ−Ｌ１工学処理細胞株を濃度依存的に結合した（図１４Ｂ）。このデータに基づいて、ＥＣ５０値は４８ｎＭと計算された。これらのデータは、キメラタンパク質の異なる成分が生細胞上でそのそれぞれの受容体／リガンドを結合できることを示す。
【０２３８】
実施例４：ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の特徴付け
この実施例において、ＴＩＧＩＴ及びＬＩＧＨＴドメインを含むキメラタンパク質を生化学的及び機能的に特徴付けた。
【０２３９】
マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を調製した。それらの概略図を図１５Ａ及び図１５Ｂの上部に示す。ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、Ｎ＋Ｏ脱グリコシル化酵素による処理後、及び／又は沸騰後に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のウェスタンブロットは、非還元レーンに優勢な二量体バンドの存在を示し（図１５Ａ及び図１５Ｂ、各ブロットのレーン２）、これは、還元剤のβ−メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図１５Ａ及び図１５Ｂ、レーン３各ブロット）。図１５Ａ及び１５Ｂの、各ブロットのレーン３に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β−メルカプトエタノール）及びエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）の両方の存在下で単量体として泳動した。
【０２４０】
ｍＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びｈＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の結合能力を次いでアッセイした。各キメラタンパク質について、以下の条件：Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出される重鎖＋軽鎖（図１６Ａ及び図１６Ｂ、左上）、Ｆｃ−ＨＲＰで捕捉及び検出されるＣＤ１５５／ＰＶＲ（図１６Ａ、右上）又は捕捉及び検出されるＣＤ１５５−Ｈｉｓ（図１６Ｂ、右上）、並びにｍＬＩＧＨＴに対する抗体で捕捉及び検出されるｍＬＴＢＲ−Ｈｉｓ（図１６Ａ、左下）又はｈＬＴＢＲ−Ｈｉｓ／６×Ｈｉｓ−ＨＲＰで捕捉及び検出されるｈＣＤ１５５−Ｆｃ（図１６Ｂ、左下；「デュアルＥＬＩＳＡ」）、でＥＬＩＳＡを行った。これらのデータは、ｍＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質及びｈＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質は、それらの標的のそれぞれを結合し、少なくともｈＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、両方の標的を同時に結合できることを示す。
【０２４１】
追加の分析を行って、マウスＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質（図１７）が生細胞の表面上でその標的を結合できるかどうかを決定した。
【０２４２】
ｍＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質又はｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を、マウスＰＶＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞若しくはマウスネクチン−２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１７、左上）、マウスＬＴｂＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１７Ａ、右）、又は親ＣＨＯ−Ｋ１細胞（図１７、右下及び左下）とインキュベートした。
【０２４３】
図１７（左下）に示すように、かつ予想されるように、ｍＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質もｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質も、最高濃度でのキメラタンパク質を除いて、親細胞株を結合しなかった。しかしながら、ｍＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、ｍＰＶＲ工学処理細胞株を濃度依存的に結合した。このデータに基づいて、ＥＣ５０値は２１４．９ｎＭと計算された（図１７、左上）。ｍＴＩＧＩＴ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴはまた、ｍＬＴｂＲ工学処理細胞株を濃度依存的に結合した。このデータに基づいて、ＥＣ５０値は１１ｎＭと計算された（図１７、右）。これらのデータは、キメラタンパク質の異なる成分が生細胞上でそのそれぞれの受容体／リガンドを結合できることを示す。
【０２４４】
実施例５：キメラタンパク質のさらなる特徴付け
この実施例において、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質を用いて、さらなる実験を行った。
【０２４５】
ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの、ヒトＬＴｂＲに対する結合親和性測定を、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法により収集した（図１８Ａ、全パネルを参照されたい）。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの組換えヒトＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対する結合親和性測定を、濃度の範囲にわたってＯｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法により収集した（図１８Ｂを参照されたい）。
【０２４６】
ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの、組換えヒトＣＤ１５５／ＰＶＲへの（片面ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質対照と比較した）結合親和性測定を、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法により収集した（図１９Ａを参照されたい）。ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの、組換えヒトＣＤ４７への（片面ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ対照、又は２つのＣＤ４７特異的抗体対照の１つと比較した）結合親和性測定を、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法によって収集した（図１９Ｂを参照されたい）。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの組換えヒトＰＤ−Ｌ１への（片面ＰＤ−１−Ｆｃ対照又は抗ＰＤ−Ｌ１対照：アテゾリズマブと比較した）結合親和性測定を、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法により収集した（図１９Ｃを参照されたい）。ヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの、組換えヒトＬＴｂＲへの（片面ＬＩＧＨＴ−Ｆｃ融合タンパク質対照又は抗ＬＴｂＲ抗体と比較した）結合親和性測定を、Ｏｃｔｅｔシステムを用いるバイオレイヤー干渉法により収集した（図１９Ｄを参照されたい）。
【０２４７】
ＬＩＧＨＴドメイン含有キメラタンパク質又はＴＩＧＩＴドメイン含有キメラタンパク質の機能性を、スーパー抗原サイトカイン放出アッセイで決定した。ここで、漸増濃度のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いて、様々な試験剤の存在下でヒト末梢血白血球を活性化した。培養上清中に分泌されるＩＬ−２（図２０Ａ）又はＴＮＦα（図２０Ｂ）の量を、抑制性シグナル伝達事象を阻止する又は免疫活性化シグナルを共刺激する試験剤の能力の機能的読み出しとして監視した。
【０２４８】
図２０Ａ及び図２０Ｂは、ＳＥＢによって活性化されるマウス末梢血白血球に対する様々な抗体、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。図２０Ｃは、複数のスーパー抗原（ＳＥＢ）濃度にわたるデータのコンパイルを示す。図２０Ａ及び図２０Ｃに示すように、５０及び２００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを投与した場合、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの３つの濃度（１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２５０ｎＭ）のそれぞれが、全抗体対照よりもＩＬ２の顕著により多い分泌をもたらした。図２０Ｂに示すように、５０及び２００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを投与した場合、１００ｎｍ又は２５０ｎｍの濃度で、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、全抗体対照よりもＴＮＦαの顕著により多い分泌をもたらし、２００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを投与した場合、全３つの濃度のｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴは、全抗体対照よりもＴＮＦαの顕著により多い分泌をもたらした。
【０２４９】
また、図２１Ａから図２１Ｃは、ＳＥＢによって活性化されるヒト末梢血白血球に対する様々な抗体、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ａ）、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（図２１Ｂ）、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びヒトＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ（図２１Ｃ）キメラタンパク質の効果を実証するスーパー抗原サイトカイン放出アッセイを示す。
【０２５０】
したがって、上記のデータは、本明細書に記載のＬＩＧＨＴドメイン含有キメラタンパク質及びＴＩＧＩＴドメイン含有キメラタンパク質が、その３つの結合パートナーの各々を結合できることを実証する。それらは、インビトロで初代ヒト白血球細胞を機能的に活性化する。
【０２５１】
実施例６：キメラタンパク質での治療による腫瘍殺傷の改善と生存率の向上
マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、マウスＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を、ＣＴ２６マウス大腸腫瘍モデルを用いて分析した。１組の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を接種した。腫瘍が直径４〜５ｍｍに達すると、マウスをｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、及びｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質又は抗ＴＩＧＩＴ、抗ＣＤ４７、抗ＯＸ４０、若しくは抗ＰＤ−１抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＯＸ４０抗体の組み合わせで処置した。
【０２５２】
図２２Ａに示すように、各処置群の腫瘍成長を評価した（左及び右のパネル）。具体的には、未処置マウスは腫瘍を迅速に発症し、抗体又は複数の抗体での処置が腫瘍の発症をわずかに遅らせるように思われた。これに対して、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質でのマウスの処置は、腫瘍の成長を顕著に阻害し、かつ／又は腫瘍の発症を遅らせた。
【０２５３】
腫瘍接種後４０日目までのマウスの全生存率も評価した。未処置マウスの全ては、腫瘍接種後２０日以内に死亡し、２５％を超える４０日の生存率を有した抗体又は複数の抗体で処置したマウスはなかった。図２２Ｂ、左パネルを参照されたい。重要なことに、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質で処置した全てのマウスは、腫瘍接種後４０日を過ぎても生存した。図２２Ｂ、右パネルを参照されたい。
【０２５４】
これらのデータは、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質でのインビボ処置が、腫瘍成長を阻害し、生存率を向上させることを示す。
【０２５５】
実施例７：キメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与の特徴付け
この実施例において、本発明のキメラタンパク質の機能性へのリンカー中のＦｃドメインの寄与をアッセイした。ここで、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをＦｃ含有キメラタンパク質のモデルとして用いた。そのため、以下に示すデータは、本発明のキメラタンパク質に関連する。
【０２５６】
天然状態では、ＰＤ−１は単量体として存在し、一方でＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用により二量体化する傾向がある。Ｆｃドメインは、ジスルフィド結合を介して、例えば、それらのシステイン残基（複数可）を介して互いに結合する。まとめると、いくつかの分子間相互作用は、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの四次構造に寄与し得る。少なくとも、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの４つの潜在的な構造があり、キメラタンパク質は単量体、二量体、三量体、又は六量体として存在する。図２３を参照されたい。
【０２５７】
キメラタンパク質の単量体及び二量体の構造の存在を、キメラタンパク質を還元条件及び非還元条件に暴露し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動することによって試験した。非還元条件下（還元：「−」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２００ｋＤａの位置に移動した。ここで、ウェスタンブロットを、ＰＤ−１、Ｆｃ、又はＯＸ４０Ｌに対する抗体でプローブし、それぞれ、図２４の左、真ん中、及び右のブロットに示した。キメラタンパク質の予測単量体分子量は５７．６ｋＤａであるので、２００ｋＤａ種は、少なくとも二量体であると予想された。しかしながら、ジスルフィド結合（例えば、Ｆｃドメイン間の）を還元する還元条件下（還元：「＋」）では、キメラタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１００ｋＤａの位置に移動した。１００ｋＤａ種は予想よりも大きかったので、余分な質量はグリコシル化によるものと予測された。最後に、キメラタンパク質をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ「＋」）で処理し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。これらの条件下で、キメラタンパク質は約５７．６ｋＤａの位置に移動した。これらのデータは、キメラタンパク質がグリコシル化され、少なくとも二量体として天然に存在することを示唆しており、二量体化は、例えば、それらのシステイン残基（複数可）を介するＦｃドメイン間のジスルフィド結合に起因する可能性が高い。
【０２５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル法は、高電荷及び／又は大きな分子量のタンパク質の分子量を正確に予測しない。そのため、キメラタンパク質を次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて特徴付けた。負電荷ＳＤＳがペプチド間の電荷ベースの相互作用を低下させるＳＤＳ−ＰＡＧＥとは異なり、ＳＥＣは界面活性剤又は還元剤を使用しない。ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をＳＥＣにかけると、約２００ｋＤａ付近にピークはなかった。これは、天然では、キメラタンパク質は二量体として存在しないことを示唆する。代わりに、６７０ｋＤａを超えるサイズを有するピークが検出された。図２５を参照されたい。このデータ及び以前のデータは、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質がその天然状態で六量体として存在することを示唆する。
【０２５９】
上に示したように、非還元条件下又は還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動すると、試料及び／又は泳動緩衝液中のＳＤＳは、還元剤の有無にかかわらず、六量体のＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質をそれぞれ優勢な二量体又は単量体に変換する。図２６（左ゲル）を参照されたい。ＳＤＳを欠くネイティブＰＡＧＥで泳動すると、還元剤の非存在下で、キメラタンパク質は六量体として存在する。しかしながら、還元剤（ジスルフィド結合を還元する）の存在下で、ネイティブＰＡＧＥで泳動すると、キメラタンパク質は予想よりも重く移動した。図２６に示すように（右ゲル、レーン２）、キメラタンパク質は、実質的に、ローディングウェルから移動できなかった。このデータは、キメラタンパク質が、より高次のタンパク質にオリゴマー化されることを示唆する。そのため、キメラタンパク質において、ジスルフィド結合は、より高次のオリゴマー化を制御するのに重要であると思われる。
【０２６０】
これをさらに確認するために、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質、例えば「ＰＤ−１−Ｎｏ Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ」を構築した。そのようなキメラタンパク質は、前述のキメラタンパク質中のＦｃドメイン間で生じるジスルフィド結合を有しない。図２７に示すように、Ｆｃドメインを欠くキメラタンパク質をネイティブＰＡＧＥで泳動すると、どのタンパク質もそのローディングウェルから実質的に移動しなかったことから、再び、「Ｆｃを含まない」キメラタンパク質は、多数のタンパク質を含むコンカテマー様複合体を形成したことを示唆する。そのため、キメラタンパク質中のＦｃドメインの除去は、タンパク質凝集体の形成をもたらす。これらのデータは、例えば、異なるキメラタンパク質上のＦｃドメイン間の、ジスルフィド結合が、キメラタンパク質を安定化しかつ、それらがより高次のタンパク質／コンカテマーとしてではなく、六量体としてそれぞれ存在することを保証することを示す。言い換えれば、Ｆｃドメインは驚くべきことに、キメラタンパク質複合体に秩序をもたらす。レーン１〜４はそれぞれ、ＰＤ−１−Ｎｏ Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを２．５μｇ、ＰＤ−１−Ｎｏ Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを５μｇ、ＰＤ−１−Ｎｏ Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを２．５μｇ、及びＰＤ−１−Ｎｏ Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを５μｇ含む。
【０２６１】
図２８に示すのは、上記のデータをまとめ、本発明のキメラタンパク質から六量体及びコンカテマーが形成される方法を示すモデルである。例示的なキメラタンパク質（ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）は、自然に六量体を形成する（ＯＸ４０Ｌドメイン間の静電相互作用とＦｃドメインによる二量体化による）。しかしながら、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質について還元条件下で、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合の制御効果が存在せず、かつＰＤ−１−ＮｏＦｃ−ＯＸ４０Ｌ中にＦｃドメインが存在しないために、これらの後者のキメラタンパク質はコンカテマーを形成する。
【０２６２】
さらに、Ｆｃドメイン（本明細書に記載の）がフィコリン（キメラタンパク質間のジスルフィド結合に必要なシステイン残基を欠く）と置換されたキメラタンパク質を構築した。Ｆｃを含まないキメラタンパク質及びＦｃを含みネイティブＰＡＧＥで還元剤の存在下で泳動したキメラタンパク質（両方ともゲル中に移動しない凝集体を形成した）と同様に、フィコリンを含むキメラタンパク質もまた、高次格子を形成するように見え、ゲル中に移動しなかった。これらのデータは、ジスルフィド結合が本発明のキメラタンパク質の適切な折りたたみ及び機能にとって重要であるという結論を強化する。
【０２６３】
最後に、キメラタンパク質を、コイル状Ｆｃドメイン（ＣＣＤＦｃ）を用いて調製した。機能評価において、ほとんどの精製タンパク質は送達されなかった。
【０２６４】
したがって、キメラタンパク質のリンカー中にＦｃドメインを含めること（これはキメラタンパク質間のジスルフィド結合を形成できる）は、不溶性で、おそらく非機能的なタンパク質コンカテマー及び／又は凝集体の形成を回避するのに役立つ。
【０２６５】
実施例８：キメラタンパク質用の異なる結合リンカー配列の特徴付け
様々な特徴（長さ、溶解度、電荷及び柔軟性）を有する異なる特有の結合リンカー配列（１７種のリンカー）を特定した。構築物を次いで、それらの１７種の結合リンカー配列の各々を「リンカー２」の位置に組み込んで合成した。キメラタンパク質の構成は、ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃ−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２である。
【０２６６】
それらの１７種の構築物の生成レベルをＣＨＯ細胞で試験した。以下の表に、異なる結合リンカー配列、それらの結合リンカーの特徴、生成レベル（Ａ２８０による）、及びＦＡＣＳ分析に基づくＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０への結合値（ＥＣ５０）のまとめを提供する。特定の結合リンカー配列間の生成レベル及び活性のいくつかのバリエーションを決定した。
【０２６７】
【表２】
2020508068.tif 000005
2020508068.tif 000006
【０２６８】
ウェスタンブロット分析による異なる結合リンカー配列（１７種のリンカー）を有するＰＤ−１−ＩｇＧ４−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを、図２９Ａ〜図２９Ｑに示す。具体的には、融合構築物の各個々のドメインを、抗ＰＤ−１、抗Ｆｃ、又は抗ＯＸ４０Ｌ抗体を用いてプローブした。結果は、各キメラタンパク質間で同様の性能を示し、候補結合リンカー配列の全てが機能的であることを示唆した。
【０２６９】
さらに、異なるリンカー配列を有する各精製タンパク質を、ＥＬＩＳＡアッセイ（図３０）、及び細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ（図３１Ａ〜図３１Ｐ）におけるＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０への結合によっても特徴付けた。
【０２７０】
実施例９：他のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインを含む追加のＴＩＧＩＴ含有キメラタンパク質の生成
この実施例で、本発明の追加のキメラタンパク質を記載する。このような追加のキメラタンパク質を、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の作製方法と同様に、例えば、詳細な説明で上に記載のように、かつ：本出願の優先権の文書：米国特許第６２／４６４，００２号のように作製した。
【０２７１】
これらの追加のキメラタンパク質は、一般式：ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２を有し、式中、ＥＣＤ  １はＴＩＧＩＴの細胞外ドメインであり、ＥＣＤ  ２はＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、又はＬＩＧＨＴ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインである。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬを含む。これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。例示的な結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２は、上の表１に記載される。キメラタンパク質を形成するのに有用で、かつ特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図３２に示す。
【０２７２】
或いは、追加のキメラタンパク質は、一般式：Ｎ末端  −（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端（式中、（ａ）はＴＩＧＩＴであり、（ｂ）はＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーであり、（ｃ）はＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、又はＬＩＧＨＴ以外のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインである）を有する融合タンパク質である。例示的なＩＩ型タンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬを含む。例示的なリンカーを、上の表１に記載する。キメラタンパク質を形成するのに有用で、特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図３２に示す。
【０２７３】
４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１２、２６、３０、１５、１８、及び４０を含む。４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１３、２７、３１、１６、１９、及び４１を含む。ＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は配列番号９を含み、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインは、配列番号１０を含む。キメラタンパク質は、上記配列の変異体、例えば、上記の配列と少なくとも約９５％の同一性を含み得る。
【０２７４】
したがって、本発明は、以下の追加のキメラタンパク質及び追加のキメラタンパク質を用いる方法（例えば、癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において）をさらに含む：ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＦａｓＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ。
【０２７５】
追加のキメラタンパク質を、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴを特徴付けるのに必要というよりむしろ追加のキメラタンパク質に特異的である試薬（例えば、結合パートナー、組換え標的細胞、及び癌細胞型／腫瘍型）と共にであるが、実施例１〜８の中のＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴについて上記のように特徴付ける。そのため、例としてＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ及びＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを使用して、実施例１と同様のＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−４−１ＢＢＬの特徴付けを、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌに必要な抗ＴＩＧＩＴ、抗Ｆｃ、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体よりむしろ抗ＴＩＧＩＴ、抗Ｆｃ、及び抗４−１ＢＢＬ抗体を用いて行うことができる。
【０２７６】
ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質でのように、追加のキメラタンパク質は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、及びＴＲＡＩＬの１つの受容体／リガンドの活性化を介してＴＩＧＩＴを遮断すること（これは免疫阻害性シグナル伝達を阻害する）かつ免疫刺激シグナルの伝達を増強する、増加する、及び／又は刺激することによる癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において有効である。さらに、追加のキメラタンパク質は、複数の抗体、例えば、ブロッキング抗体及び４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＴＲＡＩＬの１つの受容体／リガンドに対するアゴニスト抗体を含む治療から生じる、毒性及びそれに起因する望ましくない副作用、例えば、ＧＩ合併症なしに、癌及び／又は炎症性疾患を治療するのに有効である。
【０２７７】
実施例１０：他のＩ型タンパク質の細胞外ドメインを含む追加のＬＩＧＨＴ含有キメラタンパク質の生成
この実施例で、本発明の追加のキメラタンパク質を記載する。このような追加のキメラタンパク質を、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質の作製方法と同様に、例えば、詳細な説明で上に記載されるように、かつ本出願の優先権の文書：米国特許第６２／４６４，００２号のように作製した。
【０２７８】
これらの追加のキメラタンパク質は、一般式：ＥＣＤ  １−結合リンカー１−Ｆｃドメイン−結合リンカー２−ＥＣＤ  ２を有し、式中、ＥＣＤ  １はＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＴＩＧＩＴ、又はＰＤ−１以外のＩ型タンパク質の細胞外ドメインであり、ＥＣＤ  ２はＬＩＧＨＴの細胞外ドメインである。例示的なＩ型タンパク質は、ＴＩＭ３及びＢＴＬＡを含む。これらのキメラタンパク質は、結合リンカーの一方又は両方を欠く場合がある。例示的な結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２は、上の表１に記載される。キメラタンパク質を形成するのに有用で、かつ特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図３２に示す。
【０２７９】
或いは、追加のキメラタンパク質は、一般式：Ｎ末端  −（ａ）−（ｂ）−（ｃ）−Ｃ末端（式中、（ａ）はＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＴＩＧＩＴ、又はＰＤ−１以外のＩ型タンパク質の細胞外ドメインであり、（ｂ）はＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーであり、（ｃ）はＬＩＧＨＴの細胞外ドメインである）を有する融合タンパク質である。例示的なＩ型タンパク質は、ＴＩＭ３及びＢＴＬＡを含む。例示的なリンカーを、上の表１に記載する。キメラタンパク質を形成するのに有用で、特異的結合リンカー１、Ｆｃドメイン、及び結合リンカー２を含むモジュラーリンカーを、図３２に示す。
【０２８０】
ＴＩＭ３及びＢＴＬＡのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３６及び２４を含む。ＴＩＭ３及びＢＴＬＡの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３７及び２５を含む。ＬＩＧＨＴのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインは配列番号２を含む。キメラタンパク質は、上記配列の変異体、例えば、上記の配列と少なくとも約９５％の同一性を含み得る。
【０２８１】
したがって、本発明は、（例えば、癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において）以下の追加のキメラタンパク質及び追加のキメラタンパク質を用いる方法をさらに含む：ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びＢＴＬＡ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ。追加のキメラタンパク質を、ＴＩＭ３−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ及びＢＴＬＡ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴを特徴付けるのに必要というよりむしろ追加のキメラタンパク質に特異的である試薬（例えば、結合パートナー、組換え標的細胞、及び癌細胞型／腫瘍型）と共にであるが、実施例１〜８の中のＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴについて上記のように特徴付ける。例として、実施例２と同様のＴＩＭ３−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴの特徴付けを、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴに必要な抗ＬＩＧＨＴ、抗Ｆｃ、及び抗ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）抗体よりむしろ、抗ＬＩＧＨＴ、抗Ｆｃ、及び抗ＴＩＭ３抗体を用いて行うことができる。
【０２８２】
ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴ、又はＰＤ−１−Ｆｃ−ＬＩＧＨＴキメラタンパク質でのように、追加のキメラタンパク質は、ＬＩＧＨＴによる受容体／リガンドの活性化を介してＴＩＭ３及びＬＩＧＨＴを遮断すること（これは免疫阻害性シグナル伝達を阻害する）かつ免疫刺激シグナルの伝達を増強し、増加し、及び／又は刺激することによる癌の治療及び／又は炎症性疾患の治療において有効である。さらに、追加のキメラタンパク質は、複数の抗体、例えば、ブロッキング抗体及びＴＩＭ３及びＬＩＧＨＴの１つの受容体／リガンドに対するアゴニスト抗体を含む治療から生じる、毒性及びそれに起因する望ましくない副作用、例えば、ＧＩ合併症なしに、癌及び／又は炎症性疾患を治療するのに有効である。
【０２８３】
等価物
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解され、本出願は、一般的に、本発明の原理に従い、かつ本開示からのそのような逸脱を含めて、本発明が関連する技術の中で公知又は慣習的な慣行に入り、かつ本明細書で前述し、かつ以下の添付の特許請求の範囲の中の本質的な特徴に適用され得るので、本発明の任意のバリエーション、用途、又は適応を包含することが意図される。
【０２８４】
当業者は、日常的な実験を超えることをせずに、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態に対して多数の等価物を認識するか、又は確定できる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０２８５】
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８６】
本明細書で説明する出版物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本明細書において、本発明が前の発明によってそのような出版物に先行する権利がないことを認めるものは何もない。
【０２８７】
本明細書で使用する全ての見出しは、単なる構成のためのものであり、いかなる方法においても開示を制限することを意図しない。任意の個々の節の内容は、全ての節に等しく適用され得る。
【０２８８】
等価物
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解され、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、かつ本開示からのそのような逸脱を含めて、本発明が関連する技術の中で公知又は慣習的な慣行に入り、かつ本明細書で前述し、かつ以下の添付の特許請求の範囲の中の本質的な特徴に適用され得るので、本発明の任意のバリエーション、用途、又は適応を包含することが意図される。
【０２８９】
当業者は、日常的な実験を超えることなく、本明細書に特異的に記載される特定の実施形態と等価な多くのものを認識するか、又は確認できる。そのような等価物は、以下の請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2020508068.tif 000007
【図２−１】
2020508068.tif 000008
【図２−２】
2020508068.tif 000009
【図３Ａ】
2020508068.tif 000010
【図３Ｂ】
2020508068.tif 000011
【図４Ａ】
2020508068.tif 000012
【図４Ｂ】
2020508068.tif 000013
【図５Ａ】
2020508068.tif 000014
【図５Ｂ】
2020508068.tif 000015
【図５Ｃ】
2020508068.tif 000016
【図６】
2020508068.tif 000017
【図７】
2020508068.tif 000018
【図８Ａ】
2020508068.tif 000019
【図８Ｂ】
2020508068.tif 000020
【図９Ａ】
2020508068.tif 000021
【図９Ｂ】
2020508068.tif 000022
【図１０Ａ】
2020508068.tif 000023
【図１０Ｂ】
2020508068.tif 000024
【図１１Ａ】
2020508068.tif 000025
【図１１Ｂ】
2020508068.tif 000026
【図１１Ｃ】
2020508068.tif 000027
【図１２Ａ】
2020508068.tif 000028
【図１２Ｂ】
2020508068.tif 000029
【図１３Ａ】
2020508068.tif 000030
【図１３Ｂ】
2020508068.tif 000031
【図１４Ａ】
2020508068.tif 000032
【図１４Ｂ】
2020508068.tif 000033
【図１５Ａ】
2020508068.tif 000034
【図１５Ｂ】
2020508068.tif 000035
【図１６Ａ】
2020508068.tif 000036
【図１６Ｂ】
2020508068.tif 000037
【図１７】
2020508068.tif 000038
【図１８Ａ】
2020508068.tif 000039
【図１８Ｂ】
2020508068.tif 000040
【図１９Ａ】
2020508068.tif 000041
【図１９Ｂ】
2020508068.tif 000042
【図１９Ｃ】
2020508068.tif 000043
【図１９Ｄ】
2020508068.tif 000044
【図２０Ａ】
2020508068.tif 000045
【図２０Ｂ】
2020508068.tif 000046
【図２０Ｃ】
2020508068.tif 000047
【図２１Ａ】
2020508068.tif 000048
【図２１Ｂ】
2020508068.tif 000049
【図２１Ｃ】
2020508068.tif 000050
【図２２Ａ】
2020508068.tif 000051
【図２２Ｂ】
2020508068.tif 000052
【図２３】
2020508068.tif 000053
【図２４】
2020508068.tif 000054
【図２５】
2020508068.tif 000055
【図２６】
2020508068.tif 000056
【図２７】
2020508068.tif 000057
【図２８】
2020508068.tif 000058
【図２９−１】
2020508068.tif 000059
【図２９−２】
2020508068.tif 000060
【図２９−３】
2020508068.tif 000061
【図２９−４】
2020508068.tif 000062
【図２９−５】
2020508068.tif 000063
【図３０】
2020508068.tif 000064
【図３１Ａ】
2020508068.tif 000065
【図３１Ｂ】
2020508068.tif 000066
【図３１Ｃ】
2020508068.tif 000067
【図３１Ｄ】
2020508068.tif 000068
【図３１Ｅ】
2020508068.tif 000069
【図３１Ｆ】
2020508068.tif 000070
【図３１Ｇ】
2020508068.tif 000071
【図３１Ｈ】
2020508068.tif 000072
【図３１Ｉ】
2020508068.tif 000073
【図３１Ｊ】
2020508068.tif 000074
【図３１Ｋ】
2020508068.tif 000075
【図３１Ｌ】
2020508068.tif 000076
【図３１Ｍ】
2020508068.tif 000077
【図３１Ｎ】
2020508068.tif 000078
【図３１Ｏ】
2020508068.tif 000079
【図３１Ｐ】
2020508068.tif 000080
【図３２】
2020508068.tif 000081
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月24日(2019.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020508068000001.app
【国際調査報告】
2020508068.tif 000082
2020508068.tif 000083
2020508068.tif 000084
2020508068.tif 000085
2020508068.tif 000086