(57)【要約】  本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を作製する方法及びそのような方法に使用するための乳酸菌に関する。本発明はまた、そのような方法によって作製されるＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からのイソチオシアネート含有製品に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からのイソチオシアネート含有製品の調製方法であって、
ｉ）前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を前処理し、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善することと、
ｉｉ）ステップｉ）で得られる前記材料を乳酸菌で発酵させ、前記イソチオシアネート含有製品を形成することと
を含む、前記調製方法。
【請求項２】
前記前処理が、以下：
ｉ）加熱、
ｉｉ）浸漬、
ｉｉｉ）マイクロ波処理、
ｉｖ）高周波音波（超音波）への曝露、または
ｖ）パルス電界処理
のうち１つ以上を含み、
前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の温度が、前処理中に約７５℃を超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前処理が、内因性ミロシナーゼ活性を維持しながら、エピチオ特異タンパク質（ＥＳＰ）活性を減少させる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前処理が、前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を加熱して浸漬することを含み、前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の前記温度が、前処理中に約７５℃を超えない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
加熱が浸漬する前に行われるか、または加熱及び浸漬が同時に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前処理が、前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５０℃〜約７０℃の温度に加熱し、続いて浸漬することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料が、密封パッケージ中で加熱される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料が、前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約２ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記イソチオシアネート含有製品が、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０倍多くイソチオシアネートを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記イソチオシアネート含有製品が、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約２倍を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｉｉ）からの前記イソチオシアネート含有製品を、ｐＨが約４．４以下となるまで酸性化することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ及びＷｅｉｓｓｅｌｌａから選択される属のうち１つ以上から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記乳酸菌が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ及びＰｅｄｉｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉのうち１つ以上から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記乳酸菌がブロッコリーから単離されたものであり、及び／または前記乳酸菌が、ミロシナーゼ活性を欠いている、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳酸菌が、
ｉ）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、
ｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ、
ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、
ｖ）ｉ）及びｉｉ）の組合せ、
ｖｉ）ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の組合せ、ならびに
ｖｉｉ）ｉ）、ｉｉ）及びｉｖ）の組合せ
から選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが、２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１及び／または２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記乳酸菌が、
ｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５
のうち１つ以上または全てから選択される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
発酵が約１０時間〜約１７日間である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
発酵が約１０〜約２４時間である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
発酵が約２２℃〜約３４℃である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
発酵が約３０℃である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
存在する場合、発酵が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＬｉｓｔｅｒｉａのうち１つ以上または全ての数を減少させる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記イソチオシアネートが、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間は安定している、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記イソチオシアネート含有製品が、以下の特徴：
ｉ）約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間は、酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性があること、
ｉｉ）少なくとも１０8ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含むこと、ならびに
ｉｉｉ）イソチオシアネート生物活性誘導体を含むこと
のうち１つ以上または全てを有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記グルコシノレートが、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチル）、シニグリン（２−プロペニル）、グルコナピン（３−ブテニル）、グルコブラシカナピン（４−ペンテニル）、プロゴイトリン（２（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−ブテニル）、エピプロゴイトリン（２（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−ブテニル）、グルコナポレイフェリン（２−ヒドロキシ−４−ペンテニル）、グルコイベルビリン（３−メチルチオプロピル）、グルコエルシン（４−メチルチオブチル）、デヒドロエルシン（４−メチルチオ−３−ブテニル）、グルコイベリン（３−メチルスルフィニルプロピル）、グルコラフェニン（４−メチルスルフィニル−３−ブテニル）、グルコアリシン（５−メチルスルフィニルペンテニル）、グルコエリソリン（３−メチルスルホニルブチル、４−メルカプトブチル）、グルコブラシシン（３−インドリルメチル）、４−ヒドロキシグルコブラシシン（４−ヒドロキシ−３−インドリルメチル）、４−メトキシグルコブラシシン（４−メトキシ−３−インドリルメチル）、ネオグルコブラシシン（１−メトキシ−３−インドリルメチル）、グルコトロパエオリン（ベンジル）、及びグルコナスツルチイン２−フェニルエチルのうち１つ以上から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記グルコシノレートが、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチル）及びグルコブラシシンのうち１つまたは両方から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記イソチオシアネートがスルフォラファンである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記イソチオシアネート生物活性誘導体が、イベリン、アリルイソチオシアネート、インドール−３−カルビノール、メトキシ−インドール−３−カルビノール、アスコルビゲン及びネオアスコルビゲンのうち１つ以上または全てから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記イソチオシアネートがスルフォラファンであり、前記イソチオシアネート含有製品が、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも３００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも４００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも４５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも７００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記イソチオシアネート含有製品が、約２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅが、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｂａｌｅａｒｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｅｌｏｎｇａｔｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｈｉｌａｒｉｏｎｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｒｉｎｏｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｅｐｔｉｃｅｐｓ及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉから選択される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅが、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料が、葉、茎、花、房、種子及び根のうち１つ以上から選択される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からのイソチオシアネート含有製品の調製方法であって、
ｉ）前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を前処理し、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善することと、
ｉｉ）ステップｉ）で得られる前記材料を酸性化し、前記イソチオシアネート含有製品を形成することと
を含む、前記調製方法。
【請求項３５】
酸性化が、前記ｐＨを約４．４以下まで下げることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ブロッコリー材料からのイソチオシアネート含有製品の調製方法であって、前記材料を乳酸菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍで発酵させて、前記イソチオシアネート含有製品を形成することを含み、前記方法が、前記ブロッコリー材料を前処理して、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善することを場合により含む、前記調製方法。
【請求項３７】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からのイソチオシアネート含有製品の調製方法であって、前記材料を、ブロッコリーから単離した乳酸菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍで発酵させて、前記イソチオシアネート含有製品を形成することを含み、前記方法が、前記Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を前処理して、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善することを場合により含む、前記調製方法。
【請求項３８】
前記Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが、２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１及び／または２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２である、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記乳酸菌が、
ｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５
のうち１つ以上または全てから選択される、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
発酵または酸性化後、前記イソチオシアネート含有製品が、微生物を不活性化するために後処理される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記イソチオシアネート含有製品が、高圧処理または熱処理で後処理される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５
から選択される、乳酸菌の単離株。
【請求項４３】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株であって、ＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩで切断される場合、ＢＦ１またはＢＦ２と同一のＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩフィンガープリントを生成するゲノムＤＮＡを含む、前記単離株あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株であって、ＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩで切断される場合、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４またはＢ５と同一のＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩフィンガープリントを生成するゲノムＤＮＡを含む、前記単離株。
【請求項４４】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株であって、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１８または１９に列挙される多型のうち１つ以上または全てを含む、前記単離株、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株であって、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される１つ以上または全ての多型を含む、前記単離株。
【請求項４５】
イソチオシアネート含有製品またはプロバイオティックを作製するためのスターター培養物であって、
ｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５
のうち１つ以上または全てから選択される乳酸菌を含む、前記スターター培養物。
【請求項４６】
前記スターター培養物が、少なくとも約１０8ｃｆｕ／ｍＬの濃度で乳酸菌を含む、請求項４４に記載のスターター培養物。
【請求項４７】
プロバイオティック組成物であって、
ｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、前記Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５
のうち１つ以上または全てから選択される乳酸菌を含む、前記プロバイオティック組成物。
【請求項４８】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法によって得られるか、または得ることができるイソチオシアネート含有製品。
【請求項４９】
イソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品であって、前記浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０倍多くイソチオシアネートを含む、前記イソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品。
【請求項５０】
イソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品であって、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの前記予想される最大収量の少なくとも約２倍を含む、前記イソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品。
【請求項５１】
前記イソチオシアネート含有製品が、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも３００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも４００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも４５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも７００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む、請求項４８または請求項４９に記載のイソチオシアネート含有製品。
【請求項５２】
前記イソチオシアネート含有製品が、以下の特徴：
ｉ）約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間は安定していること、
ｉｉ）約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間は、酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性があること、ならびに
ｉｉｉ）少なくとも１０7ＣＦＵ／ｇのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを含むこと
のうち１つ以上または全てを有する、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載のイソチオシアネート含有製品。
【請求項５３】
前記製品が、栄養補助食品、サプリメント及び食品成分から選択される、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載のイソチオシアネート含有製品。
【請求項５４】
前記製品がプロバイオティックである、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のイソチオシアネート含有製品。
【請求項５５】
前記製品が粉末形態である、請求項４７〜５３のいずれか１項に記載のイソチオシアネート含有製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を作製する方法及びそのような方法に使用するための乳酸菌に関する。本発明はまた、そのような方法によって作製されるＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からのイソチオシアネート含有製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科のメンバーは、酵素ミロシナーゼによってイソチオシアネートに変換され得るグルコシノレートを豊富に含み、イソチオシアネートは、いくつかのがんの種類に対して有益な効果を有することが指摘されている（Ｍｏｋｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｃａｐｕａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０１６）。例えば、スルフォラファンは、２型糖尿病を有する肥満患者で肝糖産生を減少させて、糖コントロールを改善することが見出されている（Ａｘｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。しかしながら、多くのＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科メンバーは収穫後に非常に傷みやすく、製品が十分に保存されていない場合は、栄養素の質及び量が急速に低下してしまう。
【０００３】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、多くの場合に保存期間を長くするために加工され、このことが栄養素の損失を招き得る。より長い保存期間を得るための主な方法は、熱処理、冷凍、改変及び制御された雰囲気での貯蔵ならびに化学組成に望ましくない変化をもたらすことにもなる化学保存料の添加を含む。
【０００４】
これらのプロセスは、グルコシノレートの損失を招き得るか、またはグルコシノレートをイソチオシアネートに変換する酵素ミロシナーゼの能力を減少させ得る。例えば、従来のブロッコリーの加工／保存には、リポキシゲナーゼなどの品質を低下させる酵素を不活性化するために、凍結前のブランチングを含む。ペルオキシダーゼの不活性化が、ブランチングの妥当性の指標として一般的に使用される。ペルオキシダーゼの不活性化の条件がミロシナーゼの不活性化につながり、それゆえ、得られる製品はイソチオシアネートを欠くことになる（Ｄｏｓｚ  ａｎｄ  Ｊｅｆｆｅｒｙ，２０１３）。
【０００５】
したがって、イソチオシアネートなどの植物栄養素を含むＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品を作製する改良された方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を調製する方法を開発した。
【０００７】
一態様では、本発明は、以下を含む、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を調製する方法を提供する：
ｉ）Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を前処理し、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善すること、
ｉｉ）ステップｉ）で得られる材料を乳酸菌で発酵させ、イソチオシアネート含有製品を形成すること。
【０００８】
一実施形態では、前処理は、以下：
ｉ）加熱、
ｉｉ）浸漬、
ｉｉｉ）マイクロ波処理、
ｉｖ）高周波音波（超音波）への曝露、または
ｖ）パルス電界処理
のうち１つ以上を含み、
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の温度が、前処理中に約７５℃を超えない。
【０００９】
一実施形態では、前処理は、内因性ミロシナーゼ活性を維持しながら、エピチオ特異タンパク質（ＥＳＰ）活性を減少させる。
【００１０】
一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を加熱して浸漬することを含み、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の温度が、前処理中に約７５℃を超えない。一実施形態では、加熱は浸漬する前に行われるか、または加熱及び浸漬が同時に行われる。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５０℃〜約７０℃の温度に加熱し、続いて浸漬することを含む。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約２ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中で加熱される。
【００１１】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０倍多くイソチオシアネートを含む。
【００１２】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１２倍多くイソチオシアネートを含む。
【００１３】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１４倍多くイソチオシアネートを含む。
【００１４】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１６倍多くイソチオシアネートを含む。
【００１５】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約２倍を含む。
【００１６】
一実施形態では、乳酸菌はブロッコリーから単離されたものであり、及び／または乳酸菌は、ミロシナーゼ活性を欠いている。
【００１７】
一態様では、本発明は、以下を含む、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を調製する方法を提供する：
ｉ）Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を前処理し、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善すること、及び
ｉｉ）ステップｉ）で得られる材料を酸性化し、イソチオシアネート含有製品を形成すること。
【００１８】
一態様では、本発明は、ブロッコリー材料からイソチオシアネート含有製品を調製する方法を提供し、材料を乳酸菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍで発酵させて、イソチオシアネート含有製品を形成することを含み、この方法は、ブロッコリー材料を前処理して、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善することを場合により含む。
【００１９】
一態様では、本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を調製する方法を提供し、材料を、ブロッコリーから単離した乳酸菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍで発酵させて、イソチオシアネート含有製品を形成することを含み、この方法は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を前処理して、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善することを場合により含む。
【００２０】
一態様では、本発明は、以下から選択される乳酸菌の単離株を提供する：
ｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、及び
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２。
【００２１】
一態様では、本発明は、以下から選択される乳酸菌の単離株を提供する：
ｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５。
【００２２】
一態様では、本発明は、以下のうち１つ以上または全てから選択される乳酸菌を含む、イソチオシアネート含有製品またはプロバイオティックを作製するためのスターター培養物を提供する：
ｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５。
【００２３】
一実施形態では、スターター培養物は、少なくとも約１０8ｃｆｕ／ｍＬの濃度で乳酸菌を含む。
【００２４】
一態様では、本発明は、以下のうち１つ以上または全てから選択される乳酸菌を含むプロバイオティック組成物を提供する：
ｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５。
【００２５】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるような方法によって得られるイソチオシアネート含有製品を提供する。
【００２６】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるような方法によって得ることができるイソチオシアネート含有製品を提供する。
【００２７】
一態様では、本発明は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０倍多くイソチオシアネートを含むイソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品を提供する。
【００２８】
一態様では、本発明は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約１０倍〜約１６倍多くイソチオシアネートを含むイソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品を提供する。
【００２９】
一態様では、本発明は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約２倍を含むイソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品を提供する。
【００３０】
一態様では、本発明は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の約２倍〜約４倍を含むイソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品を提供する。
【００３１】
一態様では、本発明は、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含むイソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品を提供する。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも３００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、少なくとも４００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも４５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも７００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも５０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも６０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ、または少なくとも７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む、イソチオシアネート含有製品を提供する。
【００３３】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを含む。
【００３４】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、以下の特徴のうち１つ以上または全てを有する：
ｉ）約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間は安定している、
ｉｉ）約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間は、酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性がある、ならびに
ｉｉｉ）少なくとも１０7ＣＦＵ／ｇのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを含む。
【００３５】
本明細書におけるいかなる実施形態も、別段の具体的な記載がない限り、任意の他の実施形態にも準用すると見なされることとする。例えば、当業者であれば理解することになるように、本発明の方法に関する上で概略を述べた乳酸菌の例は、本発明の製品に等しく適用される。
【００３６】
本発明は、例証の目的のために意図されるにすぎない、本明細書に記載される具体的な実施形態によって、範囲を限定されるものではない。機能的に均等な生成物、組成物、及び方法は明確に、本明細書に記載される本発明の範囲内にある。
【００３７】
本明細書全体を通じて、別途具体的定めのない限り、または文脈上そうでないとする要求がない限り、単一のステップ、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）、ステップの群または組成物の群への言及は、１つ及び複数の（すなわち１つ以上の）それらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群を包含するように受け取られるものとする。
【００３８】
本発明は、これ以降、次の非限定的な実施例を用いて、及び添付の図を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ａは、グルコラファニンからスルフォラファン及びスルフォラファンニトリルへの加水分解経路を示す。Ｂは、ブロッコリーピューレ中のスルフォラファン含量（ｍｇ／ｋｇ、ＤＷ）に対する浸漬及び発酵の効果を示す。Ｃは、貯蔵中のブロッコリーピューレの乳酸菌含量（ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇｍ）に対する発酵の効果を示す。
【図２】Ａは、４℃及び２５℃（ＲＴ）で保存されたブロッコリーピューレ中のスルフォラファンの安定性に対する発酵の影響を示す。Ｂは、ブロッコリーマトリックス中におけるグルコラファニンのスルフォラファンへの変換に対する熱処理条件の影響。
【図３】Ａは、生ブロッコリーの総フェノール含量（ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇ  ＤＷ）ならびに発酵ならびに２５℃及び４℃での貯蔵中におけるそれぞれの総フェノール含量変化を示す。Ｂは、生ブロッコリーのＯＲＡＣ（酸素ラジカル吸収能）抗酸化能（μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ  ＤＷ）ならびに発酵ならびに２５℃及び４℃での貯蔵中におけるそれぞれのＯＲＡＣ変化を示す。
【図４】乳酸菌株の異なる組合せについて、ｐＨが４．４以下に到達するまでにかかった発酵時間を示す。
【図５】Ａは、密封バッグを用いたブロッコリーの異なる熱処理条件下でのスルフォラファン収量（μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）を示す。Ｂは、水中に直接浸漬させたブロッコリーの異なる熱処理条件下でのスルフォラファン収量（μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）を示す。
【図６】処理直後ならびに４℃及び２５℃での貯蔵中におけるスルフォラファン収量（μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）に対する、浸漬、予熱及び発酵の併用効果と、浸漬及び予熱のみ、ならびに浸漬、予熱及び化学的酸性化との比較効果を示す。試料を、密封パック中において６５℃で３分間前処理した。
【図７】グルコラファニン含量に対する発酵及び貯蔵の影響を示す。グルコラファニン含量は、生試料と比較して、２５℃及び４℃で保存された発酵試料中で減少する。
【図８】生及び発酵ブロッコリーピューレのポリフェノール代謝産物プロファイルの差を示すＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。
【図９】ＰＬＳ−ＤＡによって同定される発酵及び非発酵試料を区別する重要な特徴。右側のボックスは、各群における各々の代謝産物の相対濃度を示す。
【図１０】ノンターゲットＬＣ−ＭＳ分析に基づくブロッコリーピューレの代謝産物プロファイルに対する乳酸発酵の効果を示す。これは、発酵によってポリフェノール配糖体及びグルコシノレートなどの結合した植物性化学物質が放出され、それらのバイオアクセシビリティが向上することを実証している。
【図１１】ノンターゲットＬＣ−ＭＳ分析に基づいて、発酵後に有意な（ｐ＜０．０５）倍率変化を有する代謝産物を示すボルケーノプロットを示す。有意な倍率変化を有する上位５０の代謝産物及びそれらの個々の倍率変化を表８に列挙する。
【図１２】ターゲットＬＣ−ＭＳ分析に基づくブロッコリーポリフェノールに対する乳酸発酵の効果を示す。クロロゲン酸では６．６倍の変化が観察され（２．４〜１５．８μｇ／ｍｇ）、シナピン酸では２３．８倍の増加が観察され（３．６〜８６．６μｇ／ｍｇ）、ケンフェロールでは１０．５倍の増加（１２．７〜１３４．６μｇ／ｍｇ）及びｐ−クマル酸では０．４８倍の減少が観察される。
【図１３】パルスフィールドゲル電気泳動で得られたＢＦ１及びＢＦ２のゲノムＤＮＡからのＳｍａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素消化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
一般的技術及び定義
別段の具体的な規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味（例えば、酵素、発酵、接種）を有すると見なされることとする。
【００４１】
「及び／または」という用語、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」あるいは「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解されることとし、両方の意味またはいずれかの意味を明白に支持するものを提供すると見なされることとする。
【００４２】
本明細書を通じて、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、既定された要素、整数またはステップ、または要素群、整数群またはステップ群を包含するが、いかなる他の要素、整数またはステップ、または要素群、整数群またはステップ群をも排除することを意味するものではないことが理解されよう。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、反対の記載がない限り、指定値の＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、さらにより好ましくは＋／−１％を指す。
【００４４】
「アレル」とは、細胞内、個々の植物内または集団内の遺伝子配列（遺伝子など）の１つの特定形態を指し、その特定形態は、遺伝子配列内の少なくとも１つ、及びしばしば２つ以上のバリアント部位の配列中における同じ遺伝子の他の形態とは異なる。異なるアレル間で異なるこれらのバリアント部位の配列は、「分散」、「多型」、または「変異」と称される。
【００４５】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ
当業者であれば、本明細書に記載されるような方法が、グルコシノレート（複数可）を含む任意のＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料からイソチオシアネート含有製品を作製するのに好適であると理解することになる。本明細書で使用される場合、「Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ」は、一般的にカラシ、アブラナ科植物またはキャベツ科と称されるＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科のメンバーを指す。当業者は、材料が２種以上のＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅに由来し得ると理解することになる。
【００４６】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、Ｂｒａｓｓｉｃａ属またはＣａｒｄａｍｉｎｅ属から選択される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｂａｌｅａｒｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｅｌｏｎｇａｔｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｈｉｌａｒｉｏｎｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｒｉｎｏｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｅｐｔｉｃｅｐｓ、及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉから選択される。
【００４７】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａである。
【００４８】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｏｌｅｒａｃｅａ（ヤセイカンラン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｃａｐｉｔａｔｅ（キャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ亜種ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（チンゲンサイ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ亜種ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ（ハクサイ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ（ルタバガ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ変種ｒａｐａ（カブ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ａｌｂｏｇｌａｂｒａ（カイラン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｖｉｒｉｄｉｓ（カラードグリーン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｌｏｎｇａｔａ（ジャージーキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ａｃｅｐｈａｌａ（ハボタン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｓａｂｅｌｌｉｃａ（ケール）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｐａｌｍｉｆｏｌｉａ（カーボロネロ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｒａｍｏｓｅ（パーペチュアルケール（ｐｅｒｐｅｔｕａｌ  ｋａｌｅ））、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｍｅｄｕｌｌｏｓａ（マローキャベツ（ｍａｒｒｏｗ  ｃａｂｂａｇｅ））、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｃｏｓｔａｔａ（トロンジューダケール（ｔｒｏｎｃｈｕｄａ  ｋａｌｅ））、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｇｅｍｍｉｆｅｒａ（メキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｇｏｎｇｙｌｏｄｅｓ（コールラビ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｉｔａｌｉｃａ（ブロッコリー）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｂｏｔｒｙｔｉｓ（カリフラワー、ロマネスコ、ブロッコリージトルボレ（ｂｒｏｃｃｏｌｉ  ｄｉ  ｔｏｒｂｏｌｅ））、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｂｏｔｒｙｔｉｓ×ｉｔａｌｉｃａ（ブロッコフラワー）、及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｉｔａｌｉｃａ×ａｌｂｏｇｌａｂｒａ（スティックセニョール）から選択される。
【００４９】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ変種ｉｔａｌｉｃａ（ブロッコリー）である。
【００５０】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、Ｃａｒｄａｍｉｎｅ  ｈｉｒｓｕｔａ（タネツケバナ）、Ｉｂｅｒｉｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（マガリバナ）、Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ（ノハラガラシ）、Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ（西洋ワサビ）、Ｐｒｉｎｇｌｅａ  ａｎｔｉｓｃｏｒｂｕｔｉｃａ（ケルゲレンキャベツ）、Ｔｈｌａｓｐｉ  ａｒｖｅｎｓｅ（グンバイナズナ）、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ亜種ｓａｔｉｖｕｓ（ダイコン）、Ｅｒｕｃａ  ｓａｔｉｖａ（ロケット）、Ａｎａｓｔａｔｉｃａ  ｈｉｅｒｏｃｈｕｎｔｉｃａ（ジェリコのバラ）、Ｃｒａｍｂｅ  ｍａｒｉｔｉｍａ（ハマナ）、Ｃａｋｉｌｅ  ｍａｒｉｔｉｍａ（シーロケット（ｓｅａ  ｒｏｃｋｅｔ））、Ｃａｐｓｅｌｌａ  ｂｕｒｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ（ナズナ）、スイートアリッサム、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（オランダガラシ）、Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ（シロガラシ）、Ｅｒｏｐｈｉｌａ  ｖｅｒｎａ（ウィットローグラス（ｗｈｉｔｌｏｗ  ｇｒａｓｓ））、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ（ノダイコン）、Ｉｓａｔｉｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ（ホソバタイセイ）、及びＮａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌｕｍ（イエロークレス（ｙｅｌｌｏｗ  ｃｒｅｓｓ））から選択される。
【００５１】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、高レベルの１種以上のグルコシノレート（複数可）を有する。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、高レベルの１種以上のグルコシノレート（複数可）を有するように選択的に交配されている。一実施形態では、「高レベル」のグルコシノレートは、対応するＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ中におけるＶｅｒｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）の表２に示されるものよりも高いレベルのグルコシノレートを含み得る。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、３４００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、４０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、５０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、８０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、１０，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、１２，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、１５，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、１８，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、２０，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、２５，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、高レベルのグルコシノレートは、３０，０００μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量よりも高いレベルのグルコシノレートである。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、高レベルの１種以上のグルコシノレート（複数可）を有するように遺伝子改変されているか、または生物的もしくは非生物的ストレスに供されている。当業者は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅが、当業者に既知の任意の方法によって改変され得ると理解することになる。
【００５２】
一実施形態では、グルコシノレートは、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチル）である。一実施形態では、グルコシノレートは、グルコブラシシン（３−インドリルメチル）である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料」は、グルコシノレートを含むＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅの任意の一部を指し、これとしては、葉、茎、花、房、種子、及び根またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
当業者であれば、本明細書に記載されるような方法が、異なる体積、例えば、これらに限定されないが、少なくとも３０ｋｇ、または少なくとも５０ｋｇ、または少なくとも８０ｋｇ、または少なくとも１００ｋｇ、または少なくとも１，０００ｋｇ、または少なくとも２，０００ｋｇ、または少なくとも５，０００ｋｇ、または少なくとも８，０００ｋｇ、または少なくとも１０，０００ｋｇ、または少なくとも１５，０００ｋｇ、または少なくとも２０，０００ｋｇのＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を用いる使用に好適であると理解することになる。
【００５５】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、洗浄されている。本明細書で使用される場合、「洗浄」は、目に見える土及び汚染を除去する。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、殺菌されている。本明細書で使用される場合、「殺菌される」とは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料上の病原体の減少を指す。
【００５６】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅは、他の植物材料と混合される。一実施形態では、他の植物材料は、野菜または果実の材料である。一実施形態では、野菜は、ニンジンまたはビートルートである。
【００５７】
グルコシノレート
本明細書で使用される場合、「グルコシノレート」は、少なくともＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科に見られる二次代謝産物を指し、それらは、Ｈａｌｋｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）に記載されているように、硫黄原子を介して（Ｚ）−Ｎ−ヒドロキシイミノサルフェートエステルと、アミノ酸に由来する多様なＲ基に連結されたβ−Ｄ−グルコピラノース残基からなる化学構造を共有する。グルコシノレートの例は、Ｈａｌｋｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）及びＡｇｅｒｂｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）に提供されている。グルコシノレートの加水分解によって、イソチオシアネート、ニトリル、エピチオニトリル、チオシアネート及びオキサゾリジン−２−チオンが生成され得る（図１Ａ）。多くのグルコシノレートは、害虫及び疾患に対する植物の防御機構という役割を果たしている。
【００５８】
グルコシノレートは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ中の貯蔵部位に保存される。本明細書で使用される場合、「貯蔵部位」は、グルコシノレートが存在し、ミロシナーゼが存在していないＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ内の部位である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ミロシナーゼ」は、「チオグルコシダーゼ」、「シニグラーゼ」、または「シニグリナーゼ」とも称され、チオ結合グルコースを切断し得る植物防御機構に関与する酵素のファミリー（ＥＣ３．２．１．１４７）を指す。ミロシナーゼは、グルコシノレートの加水分解を触媒し、イソチオシアネートの生成をもたらす。ミロシナーゼは、ミロシン細胞と呼ばれる特定の異型細胞の液胞中にミロシン粒として保存されることもあるが、タンパク粒または液胞中で、及び膜に結合する傾向がある細胞質酵素としても報告されている。したがって、一実施形態では、ミロシナーゼはＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ中のミロシン細胞内に保存されている。
【００６０】
一実施形態では、本明細書に記載されるような前処理は、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を改善する。本明細書で使用されるような「接近を改善する」または「接近が改善される」とは、イソチオシアネートの生成を可能にするミロシナーゼ酵素に対するグルコシノレートの利用可能性を増加させることを指す。一実施形態では、接近は、グルコシノレート貯蔵部位からのグルコシノレートの放出によって改善される。一実施形態では、グルコシノレート貯蔵部位は、機械的に破裂する（すなわち、浸漬によって）か、または酵素的に分解される。一実施形態では、グルコシノレートは、１種以上の多糖分解酵素、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及び／またはグリコシダーゼの活性によってグルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、接近は、グルコシノレート貯蔵部位へのミロシナーゼの進入を可能にすることによって改善される。一実施形態では、接近は、ミロシン細胞からのミロシナーゼの放出によって改善される。一実施形態では、約１０％〜約９０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約２０％〜約８０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約３０％〜約７０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約４０％〜約６０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約４５％〜約５５％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約１０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約２０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約３０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約４０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約５０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約６０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約７０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約８０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。一実施形態では、約９０％のグルコシノレートが、グルコシノレート貯蔵部位から放出される。
【００６１】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、脂肪族、インドールまたは芳香族グルコシノレートから選択される１種以上のグルコシノレート（複数可）を含む。
【００６２】
一実施形態では、脂肪族グルコシノレートは、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチルまたはグルコラファニン）、シニグリン（２−プロペニル）、グルコナピン（３−ブテニル）、グルコブラシカナピン（４−ペンテニル）、プロゴイトリン（２（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−ブテニル）、エピプロゴイトリン（２（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−ブテニル）、グルコナポレイフェリン（２−ヒドロキシ−４−ペンテニル）、グルコイベルビリン（３−メチルチオプロピル）、グルコエルシン（４−メチルチオブチル）、デヒドロエルシン（４−メチルチオ−３−ブテニル）、グルコイベリン（３−メチルスルフィニルプロピル）、グルコラフェニン（４−メチルスルフィニル−３−ブテニル）、グルコアリシン（５−メチルスルフィニルペンテニル）、及びグルコエリソリン（３−メチルスルホニルブチル、４−メルカプトブチル）のうち１つ以上から選択される。
【００６３】
一実施形態では、インドールグルコシノレートは、グルコブラシシン（３−インドリルメチル）、４−ヒドロキシグルコブラシシン（４−ヒドロキシ−３−インドリルメチル）、４−メトキシグルコブラシシン（４−メトキシ−３−インドリルメチル）、及びネオグルコブラシシン（１−メトキシ−３−インドリルメチル）のうち１つ以上から選択される。
【００６４】
一実施形態では、インドールグルコシノレートは、グルコトロパエオリン（ベンジル）及びグルコナスツルチイン（２−フェニルエチル）のうち１つ以上から選択される。
【００６５】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、ベンジルグルコシノレート、アリルグルコシノレート及び４−メチルスルフィニルブチルから選択される１つ以上のグルコシノレート（複数可）を含む。一実施形態では、グルコシノレートは、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチル）である。一実施形態では、グルコシノレートは、グルコブラシシン（３−インドリルメチル）である。
【００６６】
一実施形態では、本明細書に記載されるような前処理は、前処理前のＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を増加させる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「抽出可能なグルコシノレート含量」は、イソチオシアネートに変換するための、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中で接近可能なグルコシノレートのレベルを指す。ニトリル及び他の化合物への変換を除くと、１モルのグルコシノレートからの、イソチオシアネートの予想される最大収量は、１モルのイソチオシアネートである（１モルのグルコシノレートは、最大で１モルのイソチオシアネート、１モルのグルコース及び１モルの硫酸イオンに変換され得る）。したがって、一例では、市販のブロッコリー品種の抽出可能なグルコラファニン含量が、３４００μｍｏｌグルコラファニン／ｋｇ  ｄｗであると、市販のブロッコリー品種からの、スルフォラファンの予想される最大収量は、３４００μｍｏｌスルフォラファン／ｋｇ  ｄｗである。
【００６８】
イソチオシアネート
本明細書で使用される場合、「イソチオシアネート」は、一般構造Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓを有する硫黄含有植物性化学物質を指し、これらはグルコシノレートに対するミロシナーゼ活性からの生成物及びその生物活性誘導体である。一実施形態では、イソチオシアネートは、スルフォラファン（１−イソチオシアネート−４−メチルスルフィニルブタン）である。一実施形態では、イソチオシアネートは、アリルイソチオシアネート（３−イソチオシアネート−１−プロペン）である。一実施形態では、イソチオシアネートは、ベンジルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、フェネチルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、３−ブテニルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、５−ビニル−１，３−オキサゾリジン−２−チオンである。一実施形態では、イソチオシアネートは、３−（メチルチオ）プロピルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、３−（メチルスルフィニル）−プロピルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、４−（メチルチオ）−ブチルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、１−メトキシインドール−３−カルビノールイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートは、２−フェニルエチルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネートはイベリンである。
【００６９】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、１つ以上のイソチオシアネート生物活性誘導体（複数可）またはそのオリゴマーをさらに含む。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、本明細書に記載されるようなイソチオシアネートのいずれかの誘導体である。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、スルフォラファンの誘導体である。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、イベリンである。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、アリルイソチオシアネートである。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、インドール−３−カルビノールである。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、メトキシ−インドール−３−カルビノールである。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、アスコルビゲンである。一実施形態では、イソチオシアネート生物活性誘導体は、ネオアスコルビゲンである。
【００７０】
前処理
本明細書で使用される場合、「前処理」または「前処理すること」は、グルコシノレート貯蔵部位からグルコシノレートを放出する、もしくはその放出に役立つ、及び／またはミロシナーゼがＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中のグルコシノレート貯蔵部位に進入することを可能にする。一実施形態では、前処理は、グルコシノレートのミロシナーゼへの曝露を増加させ、ミロシナーゼがグルコシノレートをイソチオシアネートに変換することを可能にする。
【００７１】
一実施形態では、前処理は、内因性ミロシナーゼ活性を維持しながら、エピチオ特異タンパク質（ＥＳＰ）を減少させる。本明細書で使用される場合、「エピチオ特異タンパク質」または「ＥＳＰ」は、ミロシナーゼ活性をニトリルの生成に向けて、かつイソチオシアネート生成から遠ざけるように誘導するタンパク質を指す。ＥＳＰの産生（ｍＲＮＡもしくはタンパク質）または活性を減少させる、または阻害することは、イソチオシアネートの生成を増加させ得る。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「エピチオ特異タンパク質を減少させる」とは、ＥＳＰのタンパク質産生または活性を減少させることを指す。一実施形態では、ＥＳＰを減少させることは、ＥＳＰを高温で不活性化（例えば、変性）することを含む。一実施形態では、ＥＳＰは、約５０℃〜約８０℃の温度で変性する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「内因性ミロシナーゼ活性を維持すること」とは、未処理対照と比較してミロシナーゼ活性を有意に減少させないことを意味する。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約５％以上減少しない。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約１０％以上減少しない。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約１５％以上減少しない。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約２０％以上減少しない。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約３０％以上減少しない。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約４０％以上減少しない。一実施形態では、内因性ミロシナーゼ活性は、約５０％以上減少しない。
【００７４】
一実施形態では、前処理は、以下：ｉ）加熱、ｉｉ）浸漬、ｉｉｉ）マイクロ波処理、ｉｖ）高周波音波（超音波）への曝露、またはｖ）パルス電界処理のうち１つ以上を含み、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の温度が、前処理中に約７５℃を超えない。
【００７５】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、燃料ベースの加熱システム、電気ベースの加熱システム（すなわち、オーブンもしくはオーム加熱）、高周波加熱、高圧熱処理または蒸気ベースの加熱システム（蒸気の間接もしくは直接適用）で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中で（例えば、レトルトパウチ中で）加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、オーブン、水浴、バイオリアクター、ストーブ、ウォーターブランチャー、またはスチームブランチャーで加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、高圧熱的加熱を介して加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、オーム加熱を介する。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、高周波加熱を介する。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、水中でブランチングされる。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、高圧熱処理を介して加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、高圧熱処理のために密封パッケージ中に置かれる。
【００７６】
一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５０℃〜約７０℃に加熱することを含む。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５０℃〜約６５℃に加熱することを含む。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５０℃〜約６０℃に加熱することを含む。一実施形態では、加熱は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５５℃〜約７０℃に加熱することを含む。一実施形態では、加熱は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約６０℃〜約７０℃に加熱することを含む。一実施形態では、加熱は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約６５℃〜約７０℃に加熱することを含む。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約３０秒間加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約１分間加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約２分間加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約３分間加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約４分間加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約５分間加熱される。
【００７７】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約１分間、約６０℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約２分間、約６０℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約３分間、約６０℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約４分間、約６５℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約１分間、約６５℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約２分間、約６５℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約３分間、約６５℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、密封パッケージ中において約４分間、約６５℃で加熱される。
【００７８】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、水中において約１分間、約６０℃で加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、水中において約２分間、約６０℃で加熱される。
【００７９】
一実施形態では、加熱は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を蒸すことを含む。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を蒸すことを含む。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約５０℃〜約７０℃の温度まで蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約６０℃〜約７０℃の温度まで蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約３０秒間蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約１分間蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約２分間蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約３分間蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約４分間蒸される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約５分間蒸される。
【００８０】
一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を浸漬することを含む。本明細書で使用される場合、「浸漬すること」、「浸漬した」または「浸漬する」とは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料をより小さな細片まで破壊することを指す。一実施形態では、浸漬は、ミロシナーゼがその基質であるグルコシノレートに接近できるように、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約３０％〜約９０％の細胞を脱コンパートメント化することを含む。一実施形態では、浸漬は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約４０％〜約９０％の細胞を脱コンパートメント化することを含む。一実施形態では、浸漬は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約５０％〜約９０％の細胞を脱コンパートメント化することを含む。一実施形態では、浸漬は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約６０％〜約９０％の細胞を脱コンパートメント化することを含む。一実施形態では、浸漬は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約７０％〜約９０％の細胞を脱コンパートメント化することを含む。当業者は、細胞の脱コンパートメント化が、細胞壁を壊して開き、細胞内の細胞小器官のコンパートメント化を破壊することを含むと理解することになる。
【００８１】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、ブレンダー、グラインダーまたはパルバライザーで浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約２ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約１ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約０．５ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約０．２５ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約０．１ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約０．０５ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約０．０２５ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の少なくとも約８０％が約０．０１ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の約５０％〜約９０％が約２ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の約６０％〜約８０％が約２ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の約５０％〜約９０％が約１ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の約６０％〜約８０％が約１ｍｍ以下のサイズとなるように浸漬される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、浸漬中に約５０℃〜約７０℃の温度まで加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、浸漬中に約５５℃〜約７０℃の温度まで加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、浸漬中に約６０℃〜約７０℃の温度まで加熱される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、浸漬中に約６５℃〜約７０℃の温度まで加熱される。
【００８２】
一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を加熱すること及び浸漬することを含む。一実施形態では、前処理はピューレを作製する。本明細書で使用される場合、「ピューレ」は、クリーム状のペーストまたは液体の稠度まで混合されたＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を指す。
【００８３】
当業者は、「マイクロ波処理する」または「マイクロ波処理すること」が、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料などの物質にマイクロ波照射を通過させることによってその物質を加熱すると理解することになる。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料をマイクロ波処理することを含む。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、家庭用マイクロ波または工業用マイクロ波で前処理される。一実施形態では、工業用マイクロ波は、連続マイクロ波システムであり、例えば、ＭＩＰ  １１  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｏｏｋｉｎｇ  Ｏｖｅｎ（Ｆｅｒｒｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であるが、これに限定されない。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料をマイクロ波処理することを含む。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、約０．９〜約２．４５ＧＨｚでマイクロ波処理される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約３０秒間、または少なくとも約１分間、または少なくとも約２分間、または少なくとも約３分間マイクロ波処理される。
【００８４】
一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を低〜中周波の超音波に曝露することを含む。一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を、熱超音波処理（約３０℃〜約６０℃の熱を有する低〜中周波超音波）を用いて曝露することを含む。一実施形態では、超音波は、工業規模の超音波処理装置を用いて生成される。一実施形態では、超音波処理装置は、連続式またはバッチ式の超音波処理装置である。一実施形態では、超音波処理装置は、例えば、ＵＩＰ５００ｈｄまたはＵＩＰ４０００（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であるが、これに限定されない。一実施形態では、超音波は、約２０ｋＨｚ〜約６００ｋＨｚの周波数のものである。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、少なくとも約３０秒間、または少なくとも約１分間、または少なくとも約２分間、または少なくとも約３分間、または約５分間音波に曝露される。
【００８５】
一実施形態では、前処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料をパルス電界処理に曝露することを含む。パルス電界処理は、高電圧短パルスの印加を含む非熱処理技術である。パルスは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の細胞のエレクトロポレーションを誘導し、ミロシナーゼのグルコシノレートへの接近を増強する。一実施形態では、パルス電界処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約４０〜約７０℃の温度に加熱する。一実施形態では、パルス電界処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約５０℃〜約７０℃の温度に加熱する。一実施形態では、パルス電界処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約６０℃〜約７０℃の温度に加熱する。一実施形態では、パルス電界処理は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料を約２０〜約８０ｋＶの電圧パルスで処理することを含む。一実施形態では、前処理によって、約１０％〜約９０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約２０％〜約８０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約３０％〜約７０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約４０％〜約６０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約１０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約２０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約３０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約４０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約５０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約６０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約７０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約８０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、前処理によって、約９０％のグルコシノレートがイソチオシアネートに変換される。
【００８６】
発酵
当業者は、本明細書に記載されるような発酵法が、任意の乳酸菌の使用を含み得ると理解することになる。本明細書で使用される場合、「発酵」は、乳酸菌によるＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の生化学的分解を指す。一実施形態では、乳酸菌を用いた発酵は、外来乳酸菌の添加を使用して実施される。本明細書で使用される場合、「乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」または「乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」は、炭水化物発酵の最終生成物として乳酸を生成する細菌であり、これらとしては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ属及びＷｅｉｓｓｅｌｌａ属に由来する細菌を含むものが挙げられ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、乳酸菌は、ミロシナーゼ活性を含む。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に由来する。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に由来する。
【００８７】
一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ及びＰｅｄｉｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉのうち１つ以上から選択される。
【００８８】
一実施形態では、乳酸菌は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、ブロッコリーから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、ブロッコリーの葉から単離された。一実施形態では、乳酸菌は、ブロッコリーの茎から単離された。一実施形態では、乳酸菌は、ブロッコリーピューレから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、オーストラリア産ブロッコリーから単離された。
【００８９】
一実施形態では、乳酸菌は、ミロシナーゼ活性を欠いている。
【００９０】
一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓである。
【００９１】
一実施形態では、乳酸菌は、ｉ）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ、ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ｖ）ｉ）及びｉｉ）の組合せ、ｖｉ）ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の組合せ、ならびにｖｉｉ）ｉ）、ｉｉ）及びｉｖ）の組合せから選択される。
【００９２】
一実施形態では、乳酸菌は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓである。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓは、ＡＴＣＣ８２９３である。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓは、ＢＦ１及び／またはＢＦ２である。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓは、ミロシナーゼ活性を欠いている。
【００９３】
一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、ミロシナーゼ活性を欠いている。
【００９４】
一実施形態では、乳酸菌の約５０％はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓであり、乳酸菌の約５０％はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種である。
【００９５】
一実施形態では、乳酸菌の約５０％はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓであり、乳酸菌の約５０％はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである。
【００９６】
一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５のうち１つ以上または全てから選択される。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、Ｂ１である。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、Ｂ２である。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、Ｂ３である。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、Ｂ４である。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、Ｂ５である。
【００９７】
一実施形態では、発酵は、ＢＦ１、ＢＦ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５から選択される少なくとも２株、または少なくとも３株、または少なくとも４株、または少なくとも５株、または少なくとも６株の乳酸菌の存在下で行われる。
【００９８】
一実施形態では、乳酸菌は、改変を欠く対照菌と比較して高レベルのミロシナーゼ活性を生成するように改変された組換え菌である。当業者は、組換え乳酸菌が、当業者に既知の任意の技術によって作製されると理解することになる。
【００９９】
一実施形態では、乳酸菌は、例えば、これらに限定されないが、熱ストレス、寒冷ストレス、亜致死超音波、例えば、約２０〜約２０００ＭＨｚ、高圧、動的高圧またはパルス電界からストレスを受けて、ストレスを受けていない対照乳酸菌と比較して、ミロシナーゼ活性及び多糖分解酵素の活性を増加させる。一実施形態では、熱ストレスは、約４０℃超〜約７５℃まで細菌を加熱することを含む。一実施形態では、熱ストレスは、約４５℃超〜約６５℃まで細菌を加熱することを含む。一実施形態では、熱ストレスは、約４５℃超〜約５５℃まで細菌を加熱することを含む。一実施形態では、寒冷ストレスは、約０℃〜約８℃の温度まで細菌を冷やすことを含む。一実施形態では、寒冷ストレスは、約２℃〜約６℃の温度まで細菌を冷やすことを含む。一実施形態では、寒冷ストレスは、約４℃の温度まで細菌を冷やすことを含む。
【０１００】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０5ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０6ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０7ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０8ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、前処理されている。
【０１０１】
一実施形態では、発酵は、約２０℃〜約３４℃である。一実施形態では、発酵は、約２２℃〜約３４℃である。一実施形態では、発酵は、約２４℃〜約３４℃である。一実施形態では、発酵は、約２４℃〜約３０℃である。一実施形態では、発酵は、約３４℃〜約３４℃である。一実施形態では、発酵は約２５℃である。一実施形態では、発酵は約３０℃である。一実施形態では、発酵は約３４℃である。
【０１０２】
一実施形態では、発酵は、約８時間〜約１７日間である。一実施形態では、発酵は、約８時間〜約１４日間である。一実施形態では、発酵は、約８時間〜約７日間である。一実施形態では、発酵は、約８時間〜約５日間である。一実施形態では、発酵は、約８時間〜約４日間である。一実施形態では、発酵は、約８時間〜約３日間である。一実施形態では、発酵は、約８時間〜約３０時間である。一実施形態では、発酵は、約８〜約２４時間である。一実施形態では、発酵は、約１０時間〜約２４時間である。一実施形態では、発酵は約１０日間である。一実施形態では、発酵は約９日間である。一実施形態では、発酵は約８日間である。一実施形態では、発酵は約７日間である。一実施形態では、発酵は約４日間である。一実施形態では、発酵は約６日間である。一実施形態では、発酵は約５日間である。一実施形態では、発酵は約７２時間である。一実施形態では、発酵は約６０時間である。一実施形態では、発酵は約４５時間である。一実施形態では、発酵は約３０時間である。一実施形態では、発酵は約２４時間である。一実施形態では、発酵は約２０時間である。一実施形態では、発酵は約１８時間である。一実施形態では、発酵は約１５時間である。一実施形態では、発酵は約１６時間である。一実施形態では、発酵は約１４時間である。一実施形態では、発酵は約１２時間である。一実施形態では、発酵は約１０時間である。一実施形態では、発酵は約８時間である。一実施形態では、発酵培養物は攪拌される。一実施形態では、攪拌は間欠的である。一実施形態では、攪拌は連続的である。特に好ましい実施形態では、発酵は、間欠的に攪拌しながら１５時間である。特に好ましい実施形態では、発酵は、間欠的に攪拌しながら２４時間である。
【０１０３】
一実施形態では、発酵反応は、組成物が約４．５〜約３．８のｐＨに到達する場合に完了する。一実施形態では、発酵反応は、組成物が約４．５〜約３．６のｐＨに到達する場合に完了する。一実施形態では、発酵反応は、組成物が約４．５〜約４．０４のｐＨに到達する場合に完了する。一実施形態では、発酵反応は、組成物が約４．３〜約４．０４のｐＨに到達する場合に完了する。一実施形態では、発酵反応は、組成物が４．５以下、または４．４以下、または４．３以下、または４．０４以下、または３．８以下のｐＨに到達する場合に完了する。一実施形態では、発酵反応は、組成物が４．５以下のｐＨに到達する場合に完了する。一実施形態では、発酵反応は、組成物が４．４以下のｐＨに到達する場合に完了する。
【０１０４】
一実施形態では、存在する場合、発酵は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＬｉｓｔｅｒｉａのうち１つ以上または全ての数を減少させる。一実施形態では、存在する場合、発酵は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＬｉｓｔｅｒｉａのうち１つ以上または全てのＣＦＵ／ｇを減少させる。
【０１０５】
一実施形態では、塩は、発酵培養物に一切添加されない。
【０１０６】
一実施形態では、発酵は、前処理したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を約１００％〜約５００％増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を約２００％〜約４５０％増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を約２５０％〜約４５０％増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を約３００％〜約４００％増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を約３００％増加させる。一実施形態では、発酵は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中の抽出可能なグルコシノレート含量と比較して、抽出可能なグルコシノレート含量を約４００％増加させる。一実施形態では、グルコシノレートは、グルコラファニンである。
【０１０７】
酸性化
前処理した材料は、製品の微生物安全性及び安定性（微生物分解に対する感受性）を改善し、製品中のイソチオシアネートの安定性を向上させるために酸性化され得る。酸性化は、有機酸、例えば、これらに限定されないが、乳酸、酢酸、アスコルビン酸、及びクエン酸などの添加によって達成され得る。一実施形態では、酸性化は、グルコノデルタラクトンを添加して達成され得る。一実施形態では、酸性化は、ｐＨを約４．４〜約３．４のｐＨまで下げることを含む。一実施形態では、酸性化は、ｐＨを４．５、または４．４、または４．２、または４、または３．８、または３．６、または３．４以下のｐＨまで下げることを含む。一実施形態では、酸性化は、ｐＨを４．４以下のｐＨまで下げることを含む。
【０１０８】
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅに由来するイソチオシアネート含有製品
本明細書に記載されるようなＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅに由来するイソチオシアネート含有製品は、本明細書に記載されるような方法によって作製され得る。本明細書に記載されるような方法を使用して作製されるイソチオシアネート含有製品が、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料または（本明細書に記載されるような前処理をせずに）発酵のみに供したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、高レベルのイソチオシアネート、例えば、スルフォラファンを含有すると、当業者には理解されることになる。例えば、市販のブロッコリー品種からの浸漬ブロッコリーは、約８００μｍｏｌ／Ｋｇ  ｄｗ（約１４９．８ｍｇ／Ｋｇ  ｄｗ）のスルフォラファン濃度を有し、発酵浸漬ブロッコリーは、約１６００μｍｏｌ／Ｋｇ  ｄｗ（約２７８．８ｍｇ／Ｋｇ  ｄｗ）のスルフォラファン濃度を有し、本明細書に記載されるような方法を使用して作製される前処理した発酵ブロッコリーは、約１３１００μｍｏｌ／Ｋｇ  ｄｗ（約２３１８．７ｍｇ／Ｋｇ  ｄｗ）のスルフォラファン濃度を有する。
【０１０９】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約４倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約８倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１２倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１４倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１７倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約４倍〜約１７倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約４倍〜約１６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約８倍〜約１６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約１０倍〜約１６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約１２倍〜約１６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約１４倍〜約１６倍多くイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネートは、スルフォラファンである。
【０１１０】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品中に存在するイソチオシアネートのレベルは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の抽出可能なグルコシノレート含量から予想されるものよりも高い。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約１倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約２倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約３倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約３．８倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の少なくとも約４倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の約１倍〜約４倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の約１倍〜約３．８倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の約２倍〜約３．８倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコシノレート含量に基づく、イソチオシアネートの予想される最大収量の約２倍〜約３倍を含む。
【０１１１】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品中に存在するスルフォラファンのレベルは、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料の抽出可能なグルコラファニン含量から予想されるものよりも高い。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の少なくとも約１倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の少なくとも約２倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の少なくとも約３倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の少なくとも約３．８倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の少なくとも約４倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の約１倍〜約４倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の約１倍〜約３．８倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の約１倍〜約３倍を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、抽出可能なグルコラファニン含量に基づく、スルフォラファンの予想される最大収量の約２倍〜約３倍を含む。
【０１１２】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約５００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗ〜約７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネート〜約７０００ｍｇ／ｋｇのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２３００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。
【０１１３】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約２５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約３００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約３５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約４００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約４５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約５００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約５５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約６５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約７００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約５０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約６０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネートを含む。
【０１１４】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１５０ｍｇ／ｋｇのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約２５０ｍｇ／ｋｇのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約３００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約３５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約４００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約４５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約５００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約５５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約６００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約６５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約７００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０００ｍｇ／ｋｇのスルフォラファンｄｗを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約２０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約３０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約４０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約５０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約６０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約７０００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのスルフォラファンを含む。
【０１１５】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約５％多く総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０％多く総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１５％多く総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約２０％多く総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約４％多くタンパク質を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約６％多くタンパク質を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約８％多くタンパク質を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０％多くタンパク質を含む。
【０１１６】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約１０％少なく炭水化物を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約２０％少なく炭水化物を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約３０％少なく炭水化物を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約４０％少なく炭水化物を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約４５％少なく炭水化物を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、少なくとも約４８％少なく炭水化物を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料よりも、約１０％〜約４８％少なく炭水化物を含む。
【０１１７】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較してポリフェノール配糖体のレベル増加を含む。一実施形態では、ポリフェノール配糖体は、アントシアニン配糖体である。一実施形態では、ポリフェノール配糖体は、フェノール酸配糖体である。一実施形態では、ポリフェノール配糖体は、フェノール酸である。
【０１１８】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較してグルコシノレートのレベル増加を含む。一実施形態では、グルコシノレートは、グルコラファニンである。一実施形態では、グルコラファニンは、少なくとも約２５倍に増加する。一実施形態では、グルコシノレートは、グルコブラシシンである。一実施形態では、グルコブラシシンは２６倍増加する。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、インドール−３−カルビノールを含む。一実施形態では、インドール−３カルビノールは、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較して、イソチオシアネート含有製品中で少なくとも約２倍増加する。一実施形態では、インドール−３−カルビノールは、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較して、イソチオシアネート含有製品中で少なくとも約３倍増加する。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、アスコルビゲンを含む。一実施形態では、アスコルビゲンは、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較して、イソチオシアネート含有製品中で少なくとも約２倍増加する。一実施形態では、アスコルビゲンは、浸漬したＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較して、イソチオシアネート含有製品中で少なくとも約３倍増加する。
【０１１９】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較して、フェルラ酸、シリング酸、フェニル乳酸、クロロゲン酸、ルチン、シナピン酸、シリング酸メチル、ヘスペレチン、ケルセチン及びケンフェロールのうち１つ以上のレベル増加を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較してクロロゲン酸のレベル増加を含む。一実施形態では、クロロゲン酸は、約６．６倍増加する。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較してシナピン酸のレベル増加を含む。一実施形態では、シナピン酸は、約２３．８倍増加する。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較してケンフェロールのレベル増加を含む。一実施形態では、ケンフェロールは、約１０．５倍増加する。
【０１２０】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料と比較して、プロトカテク酸、没食子酸、４，ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、２，３ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−クマル酸、ケイ皮酸、カテキン、ロスマリン酸、コーヒー酸のうち１つ以上のレベル減少を含む。
【０１２１】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約４０％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約５０％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約６０％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約７０％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約８０％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約９０％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約９５％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約９７％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約９８％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約９９％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約１００％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約４０％〜約１００％が、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートに変換される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料中に存在するグルコシノレートの約４０％〜約８０％が、イソチオシアネート含有Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品中のイソチオシアネートに変換される。
【０１２２】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートは、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも３週間、または少なくとも４週間、または少なくとも６週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１０週間、または少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間は安定している。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートは、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間は安定している。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートは、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも８週間は安定している。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品中のイソチオシアネートは、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも１２週間は安定している。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「安定している」とは、４℃で６週間保存される場合にイソチオシアネート濃度が全く減少しないこと、またはほんのわずかしか減少しないことを指す。一実施形態では、わずかな減少とは、約１％〜約３０％のイソチオシアネート濃度の減少を指す。一実施形態では、わずかな減少とは、約５％以下のイソチオシアネート濃度の減少を指す。一実施形態では、わずかな減少とは、約１０％以下のイソチオシアネート濃度の減少を指す。一実施形態では、わずかな減少とは、約１５％以下のイソチオシアネート濃度の減少を指す。一実施形態では、わずかな減少とは、約２０％以下のイソチオシアネート濃度の減少を指す。一実施形態では、わずかな減少とは、約３０％以下のイソチオシアネート濃度の減少を指す。イソチオシアネート分析は、当業者に既知の任意の方法によって、例えば、スルフォラファンについては実施例１に示されるような方法によって実施され得る。
【０１２４】
一実施形態では、イソチオシアネートは、スルフォラファンである。
【０１２５】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも３週間、または少なくとも４週間、または少なくとも６週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１０週間、または少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間は酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性がある。
【０１２６】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも４週間は酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性がある。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも８週間は酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性がある。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、少なくとも１２週間は酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して耐性がある。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、酵母、カビ及び／または大腸菌の増殖に対して「耐性がある」とは、＜１Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの酵母、カビ及び／または大腸菌が、実施例１に記載される方法を使用した上に列挙される期間後に試料中で検出可能であることを意味する。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２０ｇ／１００ｇｄｗ〜約３２ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２０ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２５ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２８ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２９ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約３０ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約３２ｇ／１００ｇｄｗの総繊維を含む。
【０１２８】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１４０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗ〜約１９０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１４０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１５０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１６０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１７０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１８０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１８６９５μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１９０００μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能を含む。
【０１２９】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１７５０ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗ〜約２６００ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１７５０ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２０００ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２１００ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２２００ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２３００ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２３６０ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量を含む。
【０１３０】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約０．９％〜約１．１％乳酸当量の総滴定酸度を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約１．１％乳酸当量の総滴定酸度を含む。
【０１３１】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２３ｇ／１００ｇｄｗ〜約３９ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２３ｇ／１００ｇｄｗ〜約３０ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２５ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２７ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２８ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約２９ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約３０ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、約３２ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量を含む。
【０１３２】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ  ｄｗのイソチオシアネート及び以下のうち１つ以上または全てを含む。
【０１３３】
ｉ）約２９〜約３６ｇ／１００ｇｄｗの総繊維、
ｉｉ）約１５０００〜約１８６９５μｍｏｌ  ＴＥ／１００ｇｄｗのＯＲＡＣ抗酸化能、
ｉｉｉ）約２３１０〜約２６００ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇｄｗの総ポリフェノール含量、
ｉｖ）約０．９〜約１．１％乳酸当量の総滴定酸度、
ｖ）約２７〜約３９ｇ／１００ｇｄｗの総タンパク質含量、ならびに
ｖｉ）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ。
【０１３４】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、ブロッコリーから作製される。
【０１３５】
本明細書に記載されるようなＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ製品は、対象中でのグルコシノレート含有製品の消化中に、イソチオシアネート含有製品中に存在するグルコシノレートのイソチオシアネートへの変換を助け得る（すなわち、菌がプロバイオティックとして機能する）生乳酸菌を含み得る。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓである。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種である。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである。
【０１３６】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０2ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０2ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０5ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０6ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０7ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０8ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、少なくとも約１０9ＣＦＵ／ｇの濃度で乳酸菌を含む。
【０１３７】
一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも１０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも２０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも３０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも４０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも５０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも６０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも７０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも８０日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも８５日間存在する。一実施形態では、生乳酸菌は、約４℃〜約２５℃で保存される場合、イソチオシアネート含有製品中に少なくとも９０日間存在する。
【０１３８】
一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種である。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである。一実施形態では、乳酸菌は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓである。一実施形態では、細菌は、少なくとも約１０7ＣＦＵ／ｇの濃度で存在する。
【０１３９】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、乳酸菌によって産生される１種以上のバクテリオシン（複数可）を含む。一実施形態では、バクテリオシンは、クラスＩバクテリオシンである。一実施形態では、バクテリオシンは、クラスＩＩバクテリオシンである。一実施形態では、バクテリオシンは、クラスＩＩＩバクテリオシンである。乳酸菌によって産生されるバクテリオシンの例は、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓｉｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）に見出され得る。
【０１４０】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、食品である。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、栄養補助食品である。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、サプリメントである。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、食品成分である。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、プロバイオティックである。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、動物飼料である。動物は、魚または家畜などの水生動物であり得る。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、殺虫剤である。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、薬用化粧品である。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、局所的に製剤化される。
【０１４１】
一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、固体、液体、ピューレまたは粉末である。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、発酵後に乾燥させて粉末となる。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、発酵後に凍結乾燥される。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、発酵後、ＷＯ２００５０３０２２９に記載されるようにマイクロカプセル化される。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、丸剤として製剤化される。
【０１４２】
後処理
一実施形態では、発酵または酸性化後、イソチオシアネート含有製品は、例えば、製品の分解に寄与する微生物または摂取される場合の病原体を不活性化するために後処理され得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「後処理」または「後処理すること」は、微生物を不活性化するための、発酵後の本明細書に記載されるようなイソチオシアネート含有製品の処理を指す。本明細書で使用される場合、「微生物」は、イソチオシアネート含有製品の分解または腐敗をもたらし得る細菌、ウイルス、真菌または真核生物の活性を指す。本明細書で使用される場合、微生物「を不活性化する」またはその「不活性化」は、生存可能な微生物を約１〜約７ｌｏｇ減少させることを指す。一実施形態では、生存可能な微生物は、約１〜６ｌｏｇ減少する。一実施形態では、生存可能な微生物は、約２〜６ｌｏｇ減少する。一実施形態では、生存可能な微生物は、約３〜６ｌｏｇ減少する。
【０１４４】
当業者は、後処理が、微生物を不活性化する任意の方法、例えば、熱処理、ＵＶ処理、超音波処理、パルス電界処理または高圧処理を含む方法であり得ると理解することになる。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、熱処理で後処理される。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、高圧処理で後処理される。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、後処理中に密封パッケージ内にある。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、高圧処理中に密封パッケージ内にある。一実施形態では、イソチオシアネート含有製品は、熱処理中に密封パッケージ内にある。一実施形態では、高圧処理は、イソチオシアネート含有製品を約３００〜約６００ＭＰａの静水圧で処理することを含む。一実施形態では、高圧処理は、イソチオシアネート含有製品を約３５０〜約５５０ＭＰａの静水圧で処理することを含む。一実施形態では、高圧処理は、イソチオシアネート含有製品を約３００〜約４００ＭＰａの静水圧で処理することを含む。一実施形態では、熱処理は、試料を約６０℃〜約１２１℃の温度に加熱することを含む。一実施形態では、熱処理は、試料を約６５℃〜約１００℃の温度に加熱することを含む。一実施形態では、熱処理は、試料を約６５℃〜約８０℃の温度に加熱することを含む。一実施形態では、熱処理は、試料を約６５℃〜約７５℃の温度に加熱することを含む。
【０１４５】
単離株及びスターター培養物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるような方法及び製品における使用に好適な乳酸菌の単離株を提供する。
【０１４６】
一実施形態では、本発明は、以下から選択される乳酸菌の単離株を提供する：
ｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は、ＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩで切断される場合、ＢＦ１またはＢＦ２と同一のＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩフィンガープリントを生成するゲノムＤＮＡを含むＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株を提供する。ＢＦ１及びＢＦ２のＳｍａＩ及びＮｏｔＩフィンガープリントを、図１３に示す。
【０１４８】
一実施形態では、本発明は、ＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩで切断される場合、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４またはＢ５と同一のＳｍａＩ及び／またはＮｏｔＩフィンガープリントを生成するゲノムＤＮＡを含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。
【０１４９】
一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１８または１９に列挙される多型のうち１つ以上または全てを含むＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株を提供する。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１８または１９に列挙される多型のうち５つ以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１８または１９に列挙される多型のうち１０以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１８または１９に列挙される多型のうち１５以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１８または１９に列挙される多型のうち１９以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち２０以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち３０以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち５０以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち８０以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち１００以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち１５０以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち２００以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち３００以上を含む。一実施形態では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの単離株は、ＡＴＣＣ８２９３とは異なる、表１９に列挙される多型のうち４００以上を含む。
【０１５０】
一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される１つ以上または全ての多型を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち５つ以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち１０以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち１５以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち２０以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち２５以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち３０以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち３５以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ８０１４とは異なる、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に列挙される多型のうち４０以上を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの単離株を提供する。
【０１５１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるような単離株のうち１つ以上を含む乳酸菌を含む、イソチオシアネート含有製品またはプロバイオティックを作製するためのスターター培養物を提供する。本明細書で使用される場合、「スターター培養物」は、発酵を目的とした生きた微生物の培養物である。一実施形態では、本発明は、以下のうち１つ以上または全てから選択される乳酸菌を含む、イソチオシアネート含有製品またはプロバイオティックを作製するためのスターター培養物を提供する：
ｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託されたＢＦ１、
ｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、
ｉｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託されたＢ１、
ｉｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託されたＢ２、
ｖ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託されたＢ３、
ｖｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託されたＢ４、及び
ｖｉｉ）２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託されたＢ５。
【０１５２】
一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０5ＣＦＵ／ｇのスターター培養物を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０6ＣＦＵ／ｇのスターター培養物を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０7ＣＦＵ／ｇのスターター培養物を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０8ＣＦＵ／ｇのスターター培養物を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、少なくとも約１０10ＣＦＵ／ｇのスターター培養物を接種される。一実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ材料は、本明細書に記載されるような、約１０5ＣＦＵ／ｇ〜約１０10ＣＦＵ／ｇのスターター培養物を接種される。
【０１５３】
プロバイオティクス
一実施形態では、本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅから単離される乳酸菌のうち１つ以上を含むプロバイオティックを提供する。本明細書で使用される場合、「プロバイオティック」は、適切な量で投与される場合に宿主に健康上の利益を与える生きた微生物を指す。一実施形態では、乳酸菌は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、ブロッコリーから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、オーストラリア産ブロッコリーから単離された。一実施形態では、乳酸菌は、ｉ）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ、ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ｖ）ｉ）及びｉｉ）の組合せ、ｖｉ）ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の組合せ、ならびにｖｉｉ）ｉ）、ｉｉ）及びｉｖ）の組合せから選択される。一実施形態では、乳酸菌は、ＢＦ１、ＢＦ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５のうち１つ以上または全てから選択される。一実施形態では、乳酸菌はＢ１である。一実施形態では、乳酸菌はＢ２である。一実施形態では、乳酸菌はＢ３である。一実施形態では、乳酸菌はＢ４である。一実施形態では、乳酸菌はＢ５である。一実施形態では、プロバイオティックは、カプセル剤、錠剤、粉末または液体である。一実施形態では、プロバイオティックは、ＷＯ２００５０３０２２９に記載されるようにマイクロカプセル化される。
【実施例】
【０１５４】
実施例１−方法
化学物質及び試薬
ＨＰＬＣグレードのメタノール、リン酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び塩酸（ＨＣｌ）を、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。フォーリン−チオカルト試薬、炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3）、没食子酸、フルオレセインナトリウム塩及びリン酸水素二カリウムを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。リン酸二水素ナトリウム、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（トロロックス）、２，２０−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）を、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｄｆｅｒｎ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。
【０１５５】
乳酸菌
発酵中に使用した乳酸菌は、以下のうち１つ以上から選択した：
ＬＰ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ８０１４、
ＬＧＧ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＡＴＣＣ５３１０３、
Ｂ１：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３１の下で寄託された、ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、
Ｂ２：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３２の下で寄託された、ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、
Ｂ３：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３３の下で寄託された、ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、
Ｂ４：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３４の下で寄託された、ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、
Ｂ５：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３５の下で寄託された、ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、
ＢＦ１：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７２９の下で寄託された、ブロッコリーピューレから単離したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、
ＢＦ２：２０１７年９月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡｕｓｔｒａｌｉａにＶ１７／０２１７３０の下で寄託されたＢＦ２、ブロッコリーピューレから単離したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、
ＢＰ：プールしたＢＦ１、ＢＦ２、ならびに
ＬＡＢ：プールしたＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５。
【０１５６】
ＢＦ１及びＢＦ２を、１６ｓ−ＲＮＡ配列からＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓとして同定した（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、データは示さず）。Ｂ１〜Ｂ５を、１６Ｓ−ＲＮＡ配列に基づいてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍとして同定した。全ての分離株の識別情報を、全ゲノム配列解析によって確認した。
【０１５７】
ブロッコリー及びブロッコリーピューレからの乳酸菌の単離
上記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５を、ブロッコリーの葉及び茎から単離した。葉及び茎を水で洗浄し、ストマッカーを使用してペプトン加生理食塩水でホモジナイズした。浸漬溶液を段階希釈し、Ｄｅ  Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）寒天上に塗り広げた。このプレートを、推定的な中温性乳酸菌を単離するために、嫌気条件下で４８〜７２時間３７℃でインキュベートした。ＭＲＳプレート上での異なるコロニー形態に基づいて、コロニーを単離してＭＲＳブロス中で培養し、染色法及び生化学的特性評価技術を使用してスクリーニングし、グリセロールを用いて−８０℃で凍結保存した。分離株を、ＡＧＲＦで１６ｓ  ＲＮＡシーケンシングを使用して種レベルで同定した。
【０１５８】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのＢＦ１及びＢＦ２の単離については、ブロッコリーの葉からの単離について上に記載した懸濁液ではなく、ブロッコリー房のピューレを段階希釈後に使用した。
【０１５９】
スターター培養物の調製
乳酸菌株Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍをブロッコリーから単離し、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｌｔｄによって同定した。初代培養物を得るために、−８０℃で保存した乳酸菌培養物を１０ｍＬのＭＲＳブロス（Ｏｘｏｉｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中に接種し、３０℃で２４時間インキュベートして、８ｌｏｇコロニー形成単位／ミリリットル（ＣＦＵ／ｍＬ）の初期バイオマスを得た。２ｍＬの各一次接種菌を２００ｍＬのＭＲＳブロス中に接種し、２４時間３０℃でインキュベートした。培養物を遠心分離によって２０００ｇで１５分間４℃で回収し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ培養物を合わせて混合し、全てのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ培養物を合わせて混合した。２つの培養懸濁液を１０ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍｌに希釈して同じ体積比率で混合し、ブロッコリー発酵のための混合スターター培養物として使用するまで−８０℃でグリセロールを用いて保存した。
【０１６０】
発酵法
ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ種Ｉｔａｌｉｃ、３０ｋｇ）の房を樹冠からおよそ２ｃｍ切断し、より小さな細片まで細断して、ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔブレンダーを使用し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて３：２の比率で１分間浸漬した。ブロッコリースラリーを十分に混合し、ねじ蓋付きの滅菌プラスチックボトル（２００ｍＬ）中に入れた。ブロッコリーピューレの各ボトル（２００ｍＬ）に、８ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの初期濃度で調製したスターター培養物を接種した。発酵実験を、ｐＨ値が約４．０に到達するまで（４日目）、４８本のボトルで並行して３０℃で実施した。発酵段階が完了した後、３つの試料を０日目の貯蔵試料として取り出し、他方の試料を貯蔵実験のために２つのロットに分けた：一方のロットを冷蔵庫（４℃）で保存し、別のロットは２５℃の恒温室で保存した。試料を、微生物学的、物理化学的及び植物化学的分析のために１２週間にわたって定期的に採取した。発酵ブロッコリーピューレを、均質化後に−２０℃で保存した生ブロッコリーピューレと比較し、ピューレ試料をＬＡＢで接種せずに発酵試料と同じ期間インキュベートした。
【０１６１】
試料採取
時間経過実験では、試料採取を、２５℃及び４℃で保存した試料についてそれぞれ１０日目、２０日目、３０日目、４０日目、５０日目、６０日目、７０日目、８０日目、及び９０日目、ならびに１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目及び８４日目に実施した。試料採取を、表面上で測定した色及び発酵ボトルの開封直後に測定したｐＨを用いて３回反復して実施した。その後、微生物学的分析及び滴定酸度分析のために試料を採取した。残存する材料を２つの部分に分け、第１部分を冷凍して凍結乾燥し、微粉となるまで粉砕してデシケーター中でさらなる分析のために保存し、第２部分を冷凍して、グルコラファニン及びスルフォラファン分析まで−２０℃で保存した。
【０１６２】
微生物学的分析
微生物分析では、３つの異なる培地を使用して、異なる微生物に関してＣＦＵ／ｇブロッコリーピューレを測定し、それらは、ＤｅＭａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）寒天上での全乳酸菌のプレートカウント、バイオレットレッド胆汁グルコース寒天（ＶＲＢＧＡ）上での全腸内細菌のプレートカウント、ならびにポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）上での酵母及びカビのプレートカウントであった。各試料について、滅菌ペプトン生理食塩水希釈剤中でブロッコリー懸濁液の段階希釈を行い、０．１ｍＬの希釈物を寒天プレート上に２回反復して播種した。２５℃で７２時間の好気的インキュベーション後（ＰＤＡ）、３７℃で２４時間の好気的インキュベーション後（ＶＲＢＧＡ）、及び３０℃で７２時間の嫌気的インキュベーション後（ＭＲＳ）、それぞれＣＦＵを計数した。
【０１６３】
ｐＨ及び滴定酸度の決定
ｐＨ値を、ブロッコリーピューレを含有する発酵ボトル中においてｐＨメーター（ＰＨＭ２４０、ＭｅｔｅｒＬａｂ）によって直接決定した。ブロッコリー試料の滴定酸度（ＴＡ）を、自動滴定装置（Ｔｉｔｒａｌａｂ  ８５４  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｍａｎａｇｅｒ、Ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。簡潔に述べると、希釈したブロッコリーピューレ（１０ｍＬ）を、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して終点ｐＨ＝８．１まで滴定し、得られた結果を以下の式に従って試料１リットルあたりの乳酸のグラム当量として表した：
【数１】
2020534850.tif 000002
式中、ｖはＮａＯＨの滴定体積である。乳酸の酸因子は、０．００９である。
【０１６４】
総タンパク質及び色分析
ブロッコリー試料の総タンパク質含量を、全窒素含量に６．２５を乗じたものとして決定した。ブロッコリーの全窒素含量を、ＬＥＣＯ  ＴｒｕＭａｃ装置（ＬＥＣＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）を用いたデュマ燃焼法を使用して分析した。発酵ブロッコリー試料の色指数（Ｌ、ａ、ｂ）を、色彩色差計ＣＲ−２００三刺激比色計（Ｍｉｎｏｌｔａ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して決定した。得られた色値を、明度／暗度（Ｌ*として）、赤色度／緑色度（ａ*）及び黄色度／青色度（ｂ*）として表した。色差の合計（ΔＥ）を以下の式に従って算出した：
【数２】
2020534850.tif 000003
式中、Ｌ0、ａ0、ｂ0は、新鮮な非発酵ブロッコリーの色値である。
【０１６５】
総ポリフェノール含量の決定
総フェノール含量（ＴＰＣ）を、フォーリン−チオカルト比色法（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，１９６５）を修正して使用し、分光光度法により測定した。簡潔に述べると、５０ｍｇのブロッコリー粉末を、１０ｍＬの酸性化（１％ＨＣｌ）メタノール／水（７０：３０、ｖ／ｖ）溶液中に懸濁し、超音波浴（ＩＤＫ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で８分間抽出した。抽出物を１６時間４℃で保存し、０．２μＭフィルターで濾過して、分析まで４℃で保存した。１ｍＬの０．２Ｎフォーリン−チオカルト試薬、８００μＬの炭酸ナトリウム水溶液（７．５％ｐ／ｖ）及び１８０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑグレード水を抽出物（２０μＬ）に添加した。暗所において３７℃で１時間インキュベートした後、吸光度を、分光光度計（ＵＶ−１７００  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｐｅｃ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を使用して７６５ｎｍで３回反復して測定した。没食子酸を標準物質として使用し、ＴＰＣを、既知濃度の没食子酸を使用して作成した検量線に基づいて、生体重１００ｇあたりの没食子酸当量（ＧＡＥ）をｍｇ単位（ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇ  ＦＷ）で表した。
【０１６６】
酸素ラジカル吸収能アッセイ
凍結乾燥ブロッコリー粉末（１０ｍｇ）を、抽出溶媒である１０ｍＬのメタノール／水（８０：２０、ｖ／ｖ）中に懸濁させた。このスラリーを、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｍｕｌｔｉ−Ｒｅａｘ（Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）上において６５０ｒｐｍで、室温で１時間抽出した。次いで、それを２５，０００ｇで１５分間４℃で遠心分離し、上清を収集して、７５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で１００×希釈した後、分析用に準備した。ＯＲＡＣ分析を、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）によって報告された手順に従い、わずかな修正を加えて実施した。アッセイを、不透明９６ウェルプレート（黒色オプティカルボトム、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で実施した。アッセイ反応物は、８１．６ｎＭのフルオレセイン、１５３ｍＭのＡＡＰＨ、異なる濃度（１００、５０、２５、１２．５、及び６．２５μＭ）のトロロックス標準物質、ならびにブランクとして７５ｍＭリン酸緩衝液を含んでいた。反応物を以下の順番で添加した：２５μＬの希釈試料、２５μＬの７５ｍＭリン酸緩衝液、２５μＬのトロロックス標準物質及び１５０μＬのフルオレセインのいずれか。フルオレセイン添加後、プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、次いでＡＡＰＨ（２５μＬ）を添加した。ＡＡＰＨの添加直後に、プレートを蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に置き、蛍光を、本来の蛍光の５％未満に減少するまで３分ごとに測定した。ＯＲＡＣ値を曲線下面積（ＡＵＣ）として算出し、ブロッコリーの乾燥重量１グラムあたりのトロロックス当量（ＴＥ）のマイクロモル（μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ  ＤＷ）として表した。各試料を３回反復してアッセイした。
【０１６７】
スルフォラファン分析
ブロッコリーマトリックスからのスルフォラファンの抽出を、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）の方法に従って、一部修正を加えて実施した。簡潔に述べると、凍結ブロッコリー（２ｇ）を２ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水と混合し、１分間ボルテックスした。次いで、２０ｍＬの酢酸エチルをスラリーに添加し、続いて５分間超音波処理して、２０分間４℃で振盪した。次いで、スラリーを１５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集した。次いで、さらに１５ｍＬの酢酸エチルを沈殿物に添加し、二次抽出を実施した。各試料からのプールした抽出物を、真空遠心脱水機（ＳＣ２５０ＥＸＰ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて室温で蒸発乾固し、分析するまで−２０℃で保存した。スルフォラファンの濃度を、Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して決定し、これはバイナリーソルベントデリバリーマネージャー及びサンプルマネージャーを備えている。クロマトグラフィー分離を、２．１×５０ｍｍ、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８クロマトグラフィーカラム上で実施した。移動相Ａ及びＢは、それぞれ０．１％ギ酸ｍｉｌｌｉｑ水溶液及び０．１％ギ酸アセトニトリル溶液であった。グラジエント溶出系は、移動相Ａ（０．１％ギ酸ｍｉｌｌｉｑ水溶液）及びＢ（０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）からなり、次のグラジエント：０〜２分、１０％Ｂ、２〜５分、２０％Ｂ、５〜１０分、１０％Ｂを使用して分離を達成した。カラム温度を３０℃で一定に維持した。流速は０．３５０ｍＬ／分であって、注入量は５μＬであった。
【０１６８】
分析前に、全試料を１ｍＬの３０％アセトニトリル中に溶解し、０．２２μｍメンブレンフィルター（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に通して濾過した。各ピークの同定は、既知標準物質の保持時間及びクロマトグラフィーに基づいた。各化合物の濃度を検量線に従って算出し、その結果をブロッコリー１キログラムＤＷあたりのマイクロモル（μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）として表した。
【０１６９】
グルコラファニン分析
生または発酵ブロッコリーからのグルコラファニンの抽出を、Ｃａｉ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（２０１６）の方法に従って、一部修正を加えて実施した。したがって、２ｇの冷凍ブロッコリーピューレに１０ｍＬの煮沸Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を添加し、混合物を沸騰水浴中で５分間インキュベートした。次いでそれを冷却し、１５０００×ｇで１５分間遠心分離して上清を収集した。沈殿物を８ｍＬの沸騰水で再度抽出した。各試料からのプールした抽出物を、真空遠心脱水機（Ｓｐｅｅｄｖａｃ  ＳＣ２５０ＥＸＰ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて３℃で蒸発乾固し、分析するまで−２０℃で保存した。グルコラファニンの濃度を、フォトダイオードアレイ検出器２９９８を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ機器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して定量した。ＨＰＬＣカラム−Ｌｕｎａ（登録商標）３μＭ親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）２００Å（１００×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、２５℃のカラム温度で分析のために使用した。移動相は、アセトニトリル／水（８５：１５、ｖ／ｖ）の３０ｍＭギ酸アンモニウム（溶液Ａ）及びアセトニトリル（溶液Ｂ）を含むものからなり、次のイソクラティックフロープログラム：溶液Ａ７０％、溶液Ｂ３０％を用いた。他のクロマトグラフィー条件は、２．０ｍＬ／分の一定流速、１００μＬの注入量、８分の実行時間、及び２３５ｎｍの検出波長を含んでいた。分析前に、全試料を１ｍＬの溶媒Ａ中に溶解し、０．２２μｍメンブレンフィルター（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に通して濾過した。各ピークの同定は、既知グルコラファニン標準物質の保持時間及びクロマトグラフィーに基づいた。グルコラファニンの濃度を、検量線を使用して算出し、その結果をブロッコリー１キログラムＤＷあたりのマイクロモルグルコラファニン（μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）として表した。
【０１７０】
統計分析
全ての実験を３回反復して実施し、結果を平均値として表した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用して、平均値間での差の有意性を０．０５の有意水準（ｐ＜０．０５）で評価した。統計分析を、統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ  １６．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【０１７１】
実施例２−乳酸菌発酵ブロッコリー房の微生物分析
ブロッコリーピューレの発酵を、実施例１の発酵の節に記載した通りに実施した。全乳酸菌数は、表１に示した通り、接種したブロッコリーと比較して生ブロッコリーの方が低かった。発酵の４日後に、試料のｐＨが４．０４に到達したため発酵を停止し、貯蔵実験前の発酵試料を０日目試料と見なした。表１及び図１Ｃから明らかなように、０日目試料の全乳酸菌数は、生ブロッコリーと比較して有意に増加していた（８ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ）。最初の２週間の貯蔵中、全乳酸菌の生菌数は、２５℃及び４℃（表１及び表２）の両方で保存した試料について、９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの最高値まで増加した。２５℃での貯蔵中、全乳酸菌数は１０日目に９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇまで増加し、貯蔵中にゆっくりと減少して５０日目までに５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇとなり、７０日目以降はほぼ検出不可能なレベルまでさらに減少した。対照的に、４℃で保存した試料中のＬＡＢ数は、８４日間の貯蔵後であっても高値（６ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ）のままであった。
【０１７２】
【表１】
2020534850.tif 000004
【０１７３】
【表２】
2020534850.tif 000005
【０１７４】
生ブロッコリー試料中の酵母及びカビの総数は、２ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇであった。生ブロッコリー中のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ数は、３ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇであった。真菌、カビ及び腸内細菌は、発酵後または両温度条件での貯蔵後の発酵試料上では一切検出されなかった。発酵後及び貯蔵中に病原菌及び腐敗菌は一切検出されなかった。結果は、発酵プロセスによって、病原性の可能性があるｅｎｅｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅならびに腐敗酵母及びカビが検出不可能なレベルである安全かつ安定した製品がもたらされ、これは４℃で保存した場合に高レベルの全乳酸菌を維持していたことを示している。４℃で約３か月後、約１０6ＣＦＵ／ｇの乳酸菌が存在する。
【０１７５】
実施例３−乳酸菌発酵ブロッコリー房の貯蔵後におけるｐＨ及び滴定酸度の評価
生ブロッコリー、発酵ブロッコリーならびに２５℃及び４℃で貯蔵した後の発酵ブロッコリーのｐＨ及び滴定酸度（ＴＡ）を、実施例１に記載した通りに分析した。ＴＡの決定を使用して、発酵中に乳酸菌が産生する主な酸である乳酸及び酢酸の量を推定した。発酵中、乳酸菌が産生する酸は試料のｐＨを低下させる。表１に示す通り、０日目試料ではＴＡが１０．７ｇ／Ｌまで上昇した。２５℃で保存した場合、１０日後の貯蔵中にｐＨは３．８７まで低下し、それに加えてＴＡの値が１４．４ｇ／Ｌに到達し、有意に増加した（ｐ＜０．０５、表１を参照のこと）。結果は、貯蔵初期の数日間は乳酸菌が消費し、さらに酸を産生するための基質がまだ存在していたことを示している。ｐＨ及びＴＡ値のいずれも、残りの貯蔵期間中に有意に変化することはなかった（表１）。
【０１７６】
温度を４℃に低下させると、低温では乳酸菌の活性が低下するため、保存試料中のｐＨ及びＴＡの低下率が減少した（表２を参照のこと）。４℃でほぼ３か月間貯蔵した後、ｐＨは３．８５、ＴＡ値は１３．７ｇ／Ｌであった。
【０１７７】
実施例４−グルコラファニンのスルフォラファンへの変換に対するブロッコリーの浸漬及び発酵の評価
ブロッコリーの房を小さな細片まで切断し、３：２のブロッコリー：水の比率で水と混合し、混合物を、ブレンダーを使用してピューレに浸漬した。ピューレ試料（２００ｇｍ）を滅菌プラスチックボトル中に分取した。試料に、オーストラリア産ブロッコリーから単離した乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のプールした培養物を１０8ＣＦＵ／ｇｍで接種した。試料を、ｐＨが約４．０に低下するまで３０℃に維持した水浴中でインキュベートし、これは発酵の４日後に達成した。対照非接種試料を、浸漬後直ちに凍結した。非接種対照試料の第２セットに、微生物の増殖を阻害するために安息香酸ナトリウムを添加し、この試料を接種試料の発酵が完了するまで、接種試料と共に３０℃で４日間インキュベートした。実験を３回反復して実施した。全試料を、スルフォラファン及びグルコラファニン分析まで凍結保存した。図１Ｂ及び表３に示す通り、浸漬に続いて発酵させると、浸漬及びインキュベーションのみの場合と比較して、スルフォラファン収量が増加した。
【０１７８】
【表３】
2020534850.tif 000006
【０１７９】
実施例５−乳酸菌発酵ブロッコリー房の貯蔵後における総タンパク質含量及び色の評価
発酵後の乳酸発酵ブロッコリー房の総タンパク質含量及び色を、方法の節で上に記載した通りに評価した。生ブロッコリー（２６．９±０．０３）と比較して、発酵ブロッコリーの総タンパク質含量は有意に増加した（２９．６±０．８ｍｇ／ｇ、ｐ＜０．０５）。このことは、試料に接種した乳酸菌の数が多く、発酵中に乳酸菌が増殖し、乳酸菌によるタンパク質合成が行われたことに起因し得た。総タンパク質含量は、２５℃及び４℃の両方での貯蔵中も安定したままであり（表１及び表２）、試料間で有意差はなかった。
【０１８０】
ブロッコリー試料の色値（Ｌ、ａ、ｂ）及び全色差（ΔＥ）を表１及び表２にまとめている。表１及び表２に提示した通り、色パラメータ及び全色差値（ΔＥ）における有意差を、生試料と発酵試料との間で記録した。Ｌ*値（明度）は有意に変化しなかったのに対して、ａ*値（緑色度）及びｂ*値（黄色度）は、ブロッコリーピューレの発酵後に減少した。ａ*値及びｂ*値の減少は、クロロフィルなどの色素化合物の分解に起因する可能性があり、これは低ｐＨ下でフェオフィチンに変換されることによる。０日目試料の高いΔＥ値（１２．５）は、ブロッコリーピューレの色が発酵後に著しく変化したことを示し、これは目視で確認できた。貯蔵中（表１及び表２）、２５℃及び４℃のいずれの試料でもΔＥ値に有意な変化は一切なかった。
【０１８１】
ＬＡＢ＋ＢＰ（ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのＢＦ１、ＢＦ２）を用いた発酵後のブロッコリーは、ＬＡＢのみ（ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５））を用いた発酵ブロッコリーと比較して、より鮮やかで、より色の濃い緑色を呈し、生の浸漬ブロッコリーにより類似した色を呈していた。
【０１８２】
実施例６−発酵ブロッコリー房における総フェノール含量及び乳酸菌の抗酸化活性の変化
発酵後の乳酸発酵ブロッコリー房の総フェノール含量（ＴＰＣ）及び抗酸化活性を、方法の節で上に記載した通りに評価した。生ブロッコリーのＴＰＣは、１２７．６±１２．４ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇ生体重（図３Ａ）であった。０日目のＴＰＣ値は、生ブロッコリーと比較して２３６．９±２３．４ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇ（ｐ＜０．０５）まで有意に増加した。２５℃及び４℃で保存した試料間で、貯蔵後のＴＰＣに有意差は一切なかった（図３Ａ）。２５℃で保存した場合、発酵ブロッコリーのＴＰＣ値は、１０日目に２４６．２±１９．３ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇ、及び９０日目に２４８．１±２５．０ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇであった。４℃で保存した場合、ＴＰＣ値は、１４日間及び８４日間でそれぞれ、２７４．１±２０．２及び２６７．２±３．３ｍｇ  ＧＡＥ／１００ｇであった。
【０１８３】
ＯＲＡＣ値で表される試料の抗酸化活性を図３Ｂに示す。生試料のＯＲＡＣ値は、１１０．１±０．０５μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであった。発酵により、生ブロッコリーと比較した場合、ＯＲＡＣ値は１８６．９±３．３μｍｏｌ  ＴＥ／ｇまで約７０％有意に上昇した。この結果は、抗酸化化合物が発酵中に増加した可能性を示唆していて、発酵後のＴＰＣの変化と一致していた。
【０１８４】
貯蔵中、発酵ブロッコリーの抗酸化活性は、有意に変化しなかった。図３Ｂに示す通り、２５℃で保存した場合、１０日目及び９０日目のＯＲＡＣ値は、それぞれ１７３．０±１４．４及び１５０±５．５μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであった。４℃で保存した試料についても同様の結果が得られた。ＯＲＡＣ値は、貯蔵開始時に１７２．０±１５．５μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであって、貯蔵後には最大値（１８８．７±１２．９μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）まで上昇した。
【０１８５】
実施例７−乳酸菌の異なる組合せに関する発酵時間の評価
浸漬ブロッコリーを、方法の節で上に記載した通り、ブロッコリー対水の比率を３：２、浸漬時間を１分として調製した。ブロッコリー材料に、１０7ＣＦＵ／ｇまたは１０8ＣＦＵ／ｇのいずれかで、ＬＧＧ、ＬＡＢ（オーストラリア産ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５））、ＬＡＢ＋ＬＰ（ブロッコリーから単離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種ＡＴＣＣ８０１４）、ＢＰ（ブロッコリーから単離したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ＬＡＢ＋ＢＰ（方法の節で記載したような２つの群の混合物）のうち１つを接種し、２５℃、３０℃または３４℃のいずれかで発酵させ、目標ｐＨの４．４に到達するようにした。図４に示す通り、ブロッコリー及び／またはブロッコリーピューレから単離した乳酸菌の添加によって、約４日間発酵させた後、ＬＡＢ＋ＢＰの組合せでｐＨが４．４に到達し、発酵にかかる時間が大幅に減少した。発酵ブロッコリー製品の例示的な組成を表４に示す。
【０１８６】
【表４】
2020534850.tif 000007
【０１８７】
実施例８：発酵ブロッコリーのスルフォラファン含量に対する貯蔵の影響
図２Ａは、発酵ブロッコリーピューレのスルフォラファン含量に対する４℃及び２５℃での貯蔵の影響を示している。図２Ａに見ることができる通り、２５℃で保存した試料のスルフォラファン含量は、２０日間の貯蔵後に７７０．７±３４．９μｍｏｌ／ｋｇまで劇的に減少し（５２％の損失）、続いて残りの貯蔵期間中は緩やかに低下して、合計で６９．５％の損失に到達した。興味深いことに、発酵ブロッコリー試料を４℃で貯蔵した最初の２週間は、スルフォラファン含量に統計的に有意な変化を一切観察しなかった。その後の２週間で約２３．７％の有意な減少が発生し、続いて残りの貯蔵期間中は緩やかに低下した。貯蔵終了時（８４日目）、スルフォラファン含量は、４℃で保存した試料中で１０１２．９±５７．６μｍｏｌ／ｋｇであって、０日目試料と比較して合計で約３７．４％のスルフォラファン損失となった。最初の２週間の貯蔵中におけるスルフォラファン含量は、４℃で保存した試料中では、同じ期間にわたってグルコラファニン含量の若干の減少を観察したため、スルフォラファンの生成及び分解が同時に行われたことに起因して恐らく維持されていた。
【０１８８】
実施例９：グルコラファニン含量に対する発酵及び貯蔵の影響
図７は、４℃及び２５℃での貯蔵中におけるグルコラファニン含量及びその安定性に対する浸漬及び発酵の影響を示している。生ブロッコリーのグルコラファニン含量は、３４２３．７±３９．７μｍｏｌ／ｋｇ（図７）であって、発酵後、グルコラファニン含量は７１２．４±６４．２μｍｏｌ／ｋｇ（０日目試料）まで急激に減少した。グルコラファニンは無傷の組織中では比較的安定しているため、この場合の分解は、発酵中の浸漬組織中における酵素−基質相互作用の増加によるミロシナーゼ触媒加水分解に起因し得る。グルコラファニンの急激な減少の期間は、発酵期間と一致していた。
【０１８９】
２５℃及び４℃での貯蔵中の発酵試料では、グルコラファニン含量の有意な変化を一切観察しなかった。しかしながら、２５℃で保存した試料では、わずかに高いグルコラファニン含量を観察した。このことは、４℃で保存した試料（２回目の時点ではｐＨ４．０４）と比較して、２５℃で保存した試料（２回目の時点ではｐＨ３．８７）のｐＨの急速な低下に関連し得た。グルコラファニンのミロシナーゼ触媒加水分解に最適なｐＨは、５から６の範囲であり、ｐＨ３．０で最も低い値まで低下する（Ｄｏｓｚ＆Ｊｅｆｆｅｒｙ，２０１３）。４℃で保存した試料の相対的に高いｐＨが、２５℃と比較して４℃での貯蔵中に、グルコラファニンの分解がわずかに高いことに寄与した可能性がある。
【０１９０】
実施例１０−ブロッコリーマトリックス中におけるグルコラファニンのスルフォラファンへの変換を最大化するための熱処理条件の評価
レトルトパウチ中に充填したブロッコリーの房を、６０℃〜８０℃の範囲の温度で、０〜５分間の処理時間で熱処理に供した。処理は、実験温度よりも５℃高く維持した水浴中で実験温度まで予熱し、続いて実験温度で維持した第２水浴中でインキュベートすることを含んだ。熱処理後、試料を氷水で冷却し、上に記載したように２：３の水対ブロッコリー比率で添加した水で浸漬した。浸漬した試料を１時間３０℃でインキュベートし、スルフォラファン分析まで凍結保存した。結果を図２Ｂ及び表５に示す。表５に示す通り、試料を６０℃、６５℃または８０℃で予熱し、続いて浸漬すると、予熱せずに浸漬した生ブロッコリーの房と比較して、スルフォラファン収量が増加した。
【０１９１】
【表５】
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【０１９２】
実施例１１−ブロッコリーのスルフォラファン含量に対する乳酸菌発酵前の予熱の評価
本試験では、エピチオ特異タンパク質（ＥＳＰ）の不活性化を目的としたブロッコリー房の若干の予熱処理を、乳酸菌と組み合わせた場合にブロッコリーピューレのスルフォラファン含量に与える影響を評価した。
【０１９３】
材料
ブロッコリー（品種「Ｖｉｐｅｒ」）を、地域のスーパーマーケット（Ｃｏｌｅｓ，Ｗｅｒｒｉｂｅｅ  Ｓｏｕｔｈ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。ＤｅＭａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）ブロス（１８２３４７７、ＣＭ０３５９、Ｏｘｏｉｄ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。ＤＬ−スルフォラファンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入した。他の全ての化学試薬及び生化学試薬は分析グレード以上であり、地域の化学物質供給業者から購入した。
【０１９４】
スルフォラファン収量の最大化を目的とした若干の予熱条件を最適化するための実験
ブロッコリーの房を、頭からおよそ２ｃｍ未満で切断し、各３０ｇの無作為に混合したブロッコリー房を予熱実験に使用した。２種類の予熱実験、すなわち、パック内処理及び直接の水ブランチングを実施した。パック内実験の場合では、ブロッコリーの房をレトルトパウチ（Ｃａｓｐａｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）中に充填し、密封して６０℃、６５℃及び８０℃に維持した恒温水バッチ中において様々な時点で予熱した。最も遅い加熱点でのブロッコリー試料の温度を、温度計を使用して測定した。時間０を、中心温度が指定の実験温度に到達した時間として定義した。処理時間は、６０℃及び６５℃では０分、１分、３分、及び５分ならびに８０℃では０分、１分、２分、３分とした。直接の水ブランチング実験では、ブロッコリーの房を、恒温水槽で加熱したガラスビーカー内のＭｉｌｌｉ−Ｑ水に浸漬させた。直接の水ブランチング実験を、６０℃及び６５℃で実施した。ブロッコリー試料の温度を、温度計を使用して連続的に測定し、最も遅い加熱点の温度が、上に記載したような指定の実験温度に達した時点でタイミングを開始した。全ての熱処理実験を３回反復して実施した。非加熱ブロッコリー房を対照として使用した。熱処理の直後に、試料を氷水で冷却し、キッチンスケールのｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔブレンダー（Ｎｕｔｒｉｂｕｌｌｅｔ  ｐｒｏ  ９００  ｓｅｒｉｅｓ，ＬＬＣ，ＵＳＡ）を使用して、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いてブロッコリー３対水２の比率で１分間ホモジナイズした。ホモジナイズした試料を暗所で４時間２５℃でインキュベートし、グルコラファニンの酵素加水分解を可能にした。インキュベーション後、全ての試料をスルフォラファン分析まで−２０℃で凍結した。
【０１９５】
スターター培養物の調製
実施例１の方法で記載したようにブロッコリーから単離したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（ＢＦ１、ＢＦ２）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５）のプールした培養物を発酵実験に使用した。−８０℃で保存した乳酸菌保存培養物を、１０ｍＬのＭＲＳブロス（Ｏｘｏｉｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中に接種し、３０℃で２４時間インキュベートすることによって活性化し、一次接種菌を得た。２ｍＬの一次培養物を２００ｍＬのＭＲＳブロス中に接種し、二次培養物を得た。２４時間のインキュベーション後、６つの二次培養物を遠心分離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、培養物の各々を１０ｌｏｇコロニー形成単位／ミリリットル（ＣＦＵ／ｍＬ）の濃度でＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に再懸濁させ、１００ｇｍのブロッコリーピューレ試料中に８ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの初期バイオマスを得た。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ培養物を、Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ培養物と１：１の割合で混合してからブロッコリーピューレ試料中に接種した。
【０１９６】
試料調製
ブロッコリーの房を樹冠からおよそ２ｃｍ未満で切断し、２つのロット、すなわち、熱処理したもの及び未処理のものに分けた。上に記載したような実験結果に基づいて選択した最適条件での熱処理後、試料を氷水で冷却して細断し、キッチンスケールのｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔブレンダー（Ｎｕｔｒｉｂｕｌｌｅｔ  ｐｒｏ  ９００  ｓｅｒｉｅｓ，ＬＬＣ，ＵＳＡ）を使用して、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて３：２の比率で１分間ホモジナイズした。未処理ブロッコリーも同様の方法でホモジナイズした。ブロッコリーピューレを、十分に混合した後、さらなる実験のために、ねじ蓋付きの滅菌プラスチック容器（１００ｍＬ）（Ｔｅｃｈｎｏｐｌａｓｔ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中に分取した。
【０１９７】
発酵
ブロッコリーピューレ試料（予熱した未処理のもの）に、本実施例で上に記載したように調製したＬＡＢ培養物を接種した。ブロッコリー房の予熱を実験結果に基づいて６５℃で３分間パック内で実施し、予熱条件を最適化した。グルコラファニンのスルフォラファンへの変換に対して、発酵せずに酸性化した場合の影響を評価するために、グルコノデルタラクトン（ＧＤＬ）を使用して、予熱した未処理ブロッコリーピューレで酸性化実験を実施し、発酵ブロッコリーピューレのｐＨを得た。さらに処理を行っていない予熱したブロッコリーピューレ及び未処理ブロッコリーピューレを対照として使用した。
【０１９８】
発酵実験では、各ブロッコリーピューレ試料に、８ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの初期レベルで調製したスターター培養物を接種した。発酵実験を、１５時間のインキュベーション後にｐＨが約４．０に到達するまで３０℃で実施した。発酵が完了したら、各発酵群のうち３つの試料（０日目試料）を取得し、分析まで−２０℃で保存した。残りの発酵物を、貯蔵試験のために２つのロットに無作為に分けた：１４日間の貯蔵後に試料のスルフォラファン安定性を評価するために、１つのロットを冷蔵条件（４℃）下で保存し、第２ロットを２５℃で保存した。同様に、未処理ブロッコリーピューレ、予熱したブロッコリーピューレ及び予熱したＧＤＬ処理ブロッコリーピューレも、ゼロの時点で試料採取し、１４日間の貯蔵試験のために２５℃及び４℃で保存した。１４日間の貯蔵後、全ての試料をスルフォラファン分析まで−２０℃で凍結保存した。
【０１９９】
スルフォラファン分析及び統計分析
実施例１に記載した通りに実施した。
【０２００】
スルフォラファン収量を改善するための熱処理条件の最適化
３つの異なる温度（６０℃、６５℃及び８０℃）で、様々な処理時間（６０℃または６５℃では０分、１分、３分及び５分、８０℃では０分、１分、２分及び３分）での、パック内加熱したブロッコリー房のスルフォラファン形成に対する熱処理の影響を図５Ａに示す。結果は、生ブロッコリーと比較して、熱処理した試料の全てでスルフォラファン収量が増加したことを示した。時間０は、それらの中心が実験温度に到達するまで加熱した試料を示す。
【０２０１】
図５Ａに示す通り、充填ブロッコリー試料を６０℃で０分、１分、３分、及び５分間加熱した場合、スルフォラファン収量が増加した。これらの試料中のスルフォラファン濃度は、それぞれ２３４３．５±１２４．１、２６６１．５±１０．９、２７８０．９±２７０．８、及び３１４７．７±１４８．０μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷであった。他方では、ブロッコリーを６５℃で処理した場合、スルフォラファン収量は最初に処理時間と共に増加し、３５８５．９±１１９．２（０分）から最高値の３９８３．４±３０．５μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ（３分）となった。処理時間をさらに長くすると収量が低下し、５分の処理時間後には３６２０．１±２４０．７μｍｏｌ／ｋｇの最低値を観察した。６０℃及び６５℃での処理とは対照的に、８０℃で処理した試料では、処理時間が長くなるとスルフォラファン収量の一定の減少を観察し、０分、１分、２分及び３分の処理後にそれぞれ１４５１．５±４３．５、１４４６．８±１７．５、１０４３．１±９４．２、及び９８１．２±３５．１μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷのスルフォラファン収量であった。概して、ブロッコリーのパック内処理については、スルフォラファンの最高収量（３９８３．４±３０．５μｍｏｌ／ｋｇ）を６５℃で３分間予熱した試料で得て、これは生ブロッコリー（８１７．５±９．３μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）よりも約５倍高い。対照的に、ブロッコリーを水中で直接加熱すると、図５Ｂに示した通り、一般にスルフォラファンの収量はパック内処理と比較して低かった。６０℃での直接の水ブランチングでは、スルフォラファン収量は処理時間と共に１６９８．００±１２１．９μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ（０分）から２８３３．３±１１８．６μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ（１分）まで増加し、次いで６０℃での５分間の処理では２３４５．８±５７．７μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷの最低値まで徐々に減少した。試料を６５℃でブランチングした場合、６０℃と比較してスルフォラファン収量の急激な低下を観察した。６５℃で５分間熱処理した後のブロッコリーのスルフォラファン収量は５０３．７±２３．８μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷであって、これは生ブロッコリーで得られた値よりもさらに低かった。その理由とは、グルコラファニンがブランチング水中に浸出し、スルフォラファンの収量が低下したためであり得た。直接の水ブランチングでは、スルフォラファン収量を最大化するための最適処理温度は、パック内処理での６５℃と比較して６０℃であった。
【０２０２】
本試験では、スルフォラファン収量は、パック内で３分間６５℃で処理したブロッコリー房で得られたものが最も高かったため、この条件が、ミロシナーゼ活性を十分に維持しながらＥＳＰをより大幅に不活性化することを促し、スルフォラファンへの最適な変換をもたらすことを示していた。この条件下では、ブロッコリー試料のグルコラファニン含量を３４２３．７±３９．７μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷであると決定したため、１対１の変換と仮定すれば、抽出可能なグルコラファニンの多くがスルフォラファンに変換されると思われる。
【０２０３】
熱処理したブロッコリーを発酵させることで、生ブロッコリーの抽出可能なグルコラファニンのレベルから予想したものよりも高いレベルのスルフォラファンが得られたという所見は、熱処理によってグルコラファニンのミロシナーゼへの接近性が高まり、未処理ブロッコリー中に存在するグルコラファニンの定量可能な量に基づいて予想したものよりも高いスルフォラファン収量が得られた可能性を示唆している。
【０２０４】
水中で直接ブランチングしたブロッコリー房では、得られたスルフォラファン収量が少なく、これはグルコラファニンが水溶性であるため、ブランチング水中に浸出していることが原因である可能性が高かった。ブロッコリーの房を水中で直接加熱した場合、ブロッコリーの房をパック内において６５℃で３分間熱処理した場合と比較して、６０℃で１分間加熱することによって、最大量のスルフォラファンを得たことに注目することも興味深い。このことは、６５℃ではブランチング水中への浸出率が高く、６５℃でＥＳＰを高いレベルで不活性化する効果を相殺したことに起因する可能性がある。
【０２０５】
スルフォラファン収量に対するＬＡＢ発酵及び化学的酸性化の影響
ブロッコリーの房を、パック内において上で選択した最適な処理条件（６５℃、３分間）で予熱した。次いで、試料に、乳酸菌による発酵または酸性化剤（ＧＤＬ）を使用した酸性化のいずれかを行った。前処理実験と一致して、ブロッコリーのスルフォラファン値は、熱処理後に有意に増加し（ｐ＜０．０５）、生ブロッコリー及び予熱したブロッコリーのスルフォラファン収量は、それぞれ８０６．２±７．０μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ及び３５３６．０±１３６．９μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷであった。発酵前に予熱した、この分離バッチのブロッコリーで得られた３５３６μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷの値は、異なるバッチのブロッコリーを使用した場合に得られたものと同程度であり、３９８３μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷが得られたことから、バッチ間のばらつきはわずかであることを示した。
【０２０６】
表６に示す通り、発酵後、ブロッコリー試料のスルフォラファン含量は、発酵前のブロッコリーの処理に応じて変動した。発酵後の生ブロッコリーピューレのスルフォラファン含量（１６１７．４±１０．２μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）は、生ブロッコリーピューレのスルフォラファン含量のおよそ２倍であった。ブロッコリーをピューレにする前に予熱すると、発酵後にスルフォラファン含量の大幅な増加をもたらした。予熱した発酵ブロッコリーのスルフォラファン含量（１３１２１．３±４４０．８μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）は、生の発酵ブロッコリーピューレの約８倍であった。予熱と発酵を組み合わせた処理後に観察したスルフォラファン収量は、生ブロッコリー試料中におけるグルコラファニンの定量可能な量（３４２３．７±３９．７μｍｏｌ／ｋｇ）に基づいて予想したものよりもはるかに高い。予熱及び発酵を組み合わせたプロセスによって、予熱プロセスによるＥＳＰの不活性化に加えて、変換を目的としたグルコラファニンの放出及び接近性が向上していると思われる。微生物の細胞壁分解酵素と作用し合う予熱プロセスは、細胞コンパートメントの破壊及び生ブロッコリー中では抽出不可能または接近不可能であった、マトリックス内の結合グルコシノレートの放出を向上させた可能性がある。いくつかの乳酸株は、細胞壁構造を分解することができるセルラーゼ及びペクチナーゼなどの多糖分解酵素を産生し、壁に結合した成分の放出を増強する。
【０２０７】
対照的に、ＧＤＬによる予熱したブロッコリーピューレの化学的酸性化は、予熱及び予熱発酵試料と比較してスルフォラファンの含量が有意に低かった（ｐ＜０．０５）（表６）。ＧＤＬ酸性化試料のスルフォラファン含量は２１６９．４±１７６．０μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷであって、これは予熱したブロッコリー試料（３５３６．０±１３６．９μｍｏｌ／ｋｇ  ＤＷ）よりも４０％低い（Ｐ＜０．０５）。酸性化中にｐＨ４．０４まで急速に減少したことで、ＧＤＬ試料中におけるグルコラファニンのスルフォラファンへの変換が減少した可能性があると考えられる。グルコシノレートの変換はｐＨに大きく依存し、酸性ｐＨはニトリルへの変換に有利に働くことが周知である（Ｌａｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２０８】
予熱した発酵試料の場合、酸性化が＞１５時間にわたって徐々に行われて、６５℃で３分間予熱した後、ＥＳＰの活性が著しく低下すると予想されることから、主にスルフォラファンへのグルコラファニンの変換を可能にしている。
【０２０９】
貯蔵中のスルフォラファン含量の変化
全ての試料のスルフォラファン濃度は、２５℃で１４日間貯蔵した後に低下した（表６及び図６を参照のこと）。興味深いことに、４℃で１４日間貯蔵中の発酵試料を除いて、全ての試料でスルフォラファン含量の増加を観察した。生ピューレのスルフォラファン含量は、４℃で貯蔵中にほぼ２倍となった。同様に、予熱した試料のスルフォラファン含量が約２．６倍増加したのに対して、予熱したＧＤＬ試料のスルフォラファン含量は約２．３倍増加し、このことは、貯蔵中にグルコラファニンがマトリックスから連続的に放出され、スルフォラファンへのさらなる変換及び濃度の増加を可能にし、貯蔵中のスルフォラファン分解の結果を相殺していることを示唆している。予熱発酵試料に関しては、両方の温度での貯蔵中にスルフォラファン含量の減少を観察した。全ての接近可能なグルコラファニンが、発酵中にスルフォラファンへと大量に変換された可能性があるため、貯蔵中にそれ以上の変換は一切生じず、温度に応じて程度は異なるが、むしろ分解が行われた。そのため、４℃での貯蔵中では、わずかな低下（約６％）を観察したのみであったのに対して、２５℃での貯蔵中では約７０％の低下であった。
【０２１０】
本試験は、乳酸菌発酵と作用し合う予熱によって、ブロッコリーベースの製品のスルフォラファン含量が著しく向上することを示した。ブロッコリーの房を６５℃で３分間パック内予熱処理し、続いて浸漬及び発酵を行うと、生ブロッコリーピューレと比較して、スルフォラファンの収量が約１６倍も高くなった。この条件下で予熱すると、ブロッコリーピューレのスルフォラファン収量が、未処理ブロッコリーの８０６μｍｏｌ／ＫｇＤＷ（乾燥重量）から３５３６μｍｏｌ／ＫｇＤＷに増加し、このことは、処理が、グルコラファニンのスルフォラファンへの変換に十分なミロシナーゼ活性を維持しながら、ＥＳＰを実質的に阻害することを示していた。直接の水ブランチング中における最適な予熱条件は６０℃で１分間であって、２８３３μｍｏｌ／ＫｇＤＷのスルフォラファン収量をもたらした。直接ブランチング中の収量が低いのは、水溶性グルコラファニンがブランチング培地中に浸出することに起因し得る。ブロッコリー房のパック内予熱（６５℃／３分）を乳酸菌発酵と組み合わせることで、スルフォラファン含量が１３１２１μｍｏｌ／ＫｇＤＷまでさらに向上し、これは生ブロッコリーと比較して約１６倍の増加である。グルコノデルタラクトンによるブロッコリーピューレの酸性化と組み合わせたパック内予熱（６５℃、３分）の化学的酸性化は、２１６９μｍｏｌ／ＫｇＤＷのスルフォラファン収量をもたらし、これは予熱のみよりも低い。予熱発酵ピューレのスルフォラファン含量は、４℃での２週間の貯蔵中も安定したままであった（約９４％保持）。
【０２１１】
【表６】
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【０２１２】
実施例１２−ブロッコリーのポリフェノールプロファイルに対する乳酸菌発酵の効果
ブロッコリー試料のポリフェノール代謝産物に対する発酵の効果を決定するために、生及び発酵ブロッコリーピューレ試料のターゲット液ｃクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に基づくメタボローム解析を実施した。得られた多変量データを、Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ  ３．０，Ｘｉａ  ａｎｄ  Ｗｉｓｈａｒｔ，２０１６）を使用して分析した。発酵は、ブロッコリー試料の代謝産物プロファイルに有意な変化をもたらした。データの部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）は、発酵試料と非発酵試料とのポリフェノールプロファイルにおいて明らかな区別を示す（図８）。
【０２１３】
２つの群間の差に関与すると同定した上位１５の代謝産物を、図９に示す。それらはフェノール酸及びフェノールアグリコンであり、それらのフェノール酸エステル及びフェノール配糖体前駆体と比較して、高い生物活性及びバイオアベイラビリティを有する。これらの代謝産物の多くの濃度は発酵後に大幅な増加を示し、これは、ブロッコリーピューレのポリフェノールプロファイルに対して発酵の有益な効果を示していた。いくつかの代謝産物の倍率変化を表７に示す。
【０２１４】
発酵後、シナピン酸及びケンフェロールでそれぞれ２４倍及び１６倍の大幅な増加を観察した。同様に、発酵はクロロゲン酸及びフェニル乳酸で８倍の増加を誘導した。ヘスペレチン、ケルセチン、シリング酸メチル及びシリング酸の濃度も、発酵後に著しく増加した。アグリコン、例えば、ケンフェロール、ヘスペレチン及びケルセチンなどの濃度増加は、微生物グリコシダーゼの活性によるそれらの配糖体前駆体の変換に起因し得る。シナピン酸などのフェノール酸の濃度増加は、微生物エステラーゼの活性によるブロッコリー中でのフェノール酸エステルの変換に起因し得た。発酵後、コーヒー酸及び没食子酸では若干の減少を観察した。微生物デカルボキシラーゼの活性によって、コーヒー酸が対応するビニルカテコールに、没食子酸がピロガロールに変換され、このことが、それらの濃度減少に関与している可能性がある（Ｆｉｌａｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｇｕｚｍａｎ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２１５】
【表７】
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【０２１６】
実施例１３−試料のターゲット及びノンターゲットＬＣ＿ＭＳ分析による、ブロッコリーの乳酸菌発酵によって産生される代謝産物の同定
発酵及び非発酵ブロッコリーピューレ試料を凍結して凍結乾燥した。試料（各々１００ｍｇの凍結乾燥粉末）を、１ｍｌの氷冷メタノール及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水（５０：５０、ｖ：ｖ）に１００ｍｇ／ｍｌのカフェインを内部標準物質として含んだものを使用して抽出した。次いで、試料を２分間ボルテックスしてから、３０分間超音波処理した（４０Ｈｚ）。次いで、試料を２０，０００ｒｐｍで、４℃で３０分間遠心分離し、上清を清浄なシラン処理ＬＣ−ＭＳバイアルに移した。試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４１０  ＬＣ−ＱＱＱ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に１．４μｌを注入することによって分析した。分析を、逆相Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＤ、２．１×５０ｍｍ、１．８ｕｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して実施し、３０℃のカラム温度及び０．３ｍｌ／分の流速を用いた。移動相を、９５：５（Ａ：Ｂ）で１分間イソクラティックに操作し、次いで１：９９（Ａ：Ｂ）に切り換えてさらに１２分間操作してから、９５：５（Ａ：Ｂ）に戻してさらに２分間操作し、合計１５分間の実行時間で行った。移動相「Ａ」は１００％Ｈ2Ｏ及び０．１％ギ酸からなり、移動相「Ｂ」は７５％アセトニトリル、２５％イソプロパノール及び０．１％ギ酸を含有していた。ＭＳは、５０〜１０００ｍ／ｚの質量範囲でデータを収集していた。化合物の定性的同定を、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＭＳＩ）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｏｒｋｇｒｏｕｐに従い、Ｍａｓｓｂａｎｋ及びＭＥＴＬＩＮを含む、いくつかのオンラインＬＣ−ＭＳ代謝産物データベースを使用して実施した。概して、機器条件は、ポジティブエレクトロスプレー（＋ＥＳＩ）及びネガティブエレクトロスプレー（−ＥＳＩ）モードの両方で同様であった。スキャン時間は５００、ソース温度は３５０℃で維持し、ガス流量は１２Ｌ／分、ネブライザー圧力は３５ｐｓｉであった。
【０２１７】
ノンターゲット分析における化合物の同定には、基準を＞９０％の一致率に設定した。一致率が７０〜８９％の間に低下した場合、化合物を括弧で識別する（例えば、化合物が７０〜８９％の間であった場合、それらに「＜名称＞」として注釈をつける）。７０％未満の一致はいずれも除去した。全体で、約１０００〜１５００の同定すべき特徴が存在し、多くは一致が不十分であった（除去した）か、またはベースラインからのＳ／Ｎ比が１０倍未満であった。そのため、使用した化合物／ピークは実際のピークであって、ＩＤはかなり確かなものである（すなわち、＞７０％）。
【０２１８】
ノンターゲットＬＣ−ＭＳメタボロミクス研究は、アントシアニン配糖体、フェノール酸配糖体、フェノール酸を含むある特定のポリフェノール配糖体の２〜３６０倍の増加、グルコラファニンが２７倍増加している一部グルコシノレートの５〜６０倍の増加ならびにインドール−３カルビノール及びアスコルビゲンの約３〜４倍の増加を示した。結果を表８にまとめ、図１０及び図１１のボルケーノプロットに示す。発酵後に増加した上位５０の代謝産物は、いくつかのポリフェノール配糖体及びグルコシノレートを含み、プロセスがそれらの抽出性及びバイオアクセシビリティを向上させていることを示している。
【０２１９】
【表８−１】
2020534850.tif 000011
【表８−２】
2020534850.tif 000012
【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
2020534850.tif 000020
【０２２０】
ブロッコリー試料のポリフェノール代謝産物に対する発酵の効果を決定するために、生及び発酵ブロッコリーピューレ試料のターゲット液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に基づくメタボローム解析を実施した。統計分析を、前処理せずに実施した。発酵は、ブロッコリー試料の代謝産物プロファイルに有意な変化をもたらした。
【０２２１】
ターゲットＬＣ−ＭＳ分析では、ポリフェノール標準物質を代謝産物の同定及び定量に使用した。クロロゲン酸、フェルラ酸、シリング酸、フェニル乳酸、ルチン、シナピン酸、シリング酸メチル、ヘスペレチン、ケルセチン及びケンフェロールの増加を発酵ブロッコリーで確認した（図１２）。プロトカテク酸、没食子酸、４，ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、２，３ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−クマル酸、ケイ皮酸、カテキン、ロスマリン酸、コーヒー酸の減少を発酵ブロッコリーで確認した（図１２）。注目すべきは、クロロゲン酸では６．６倍の変化（２．４〜１５．８μｇ／ｍｇ）、シナピン酸では２３．８倍の増加（３．６〜８６．６μｇ／ｍｇ）、ケンフェロールでは１０．５倍の増加（１２．７〜１３４．６μｇ／ｍｇ）及びｐ−クマル酸では０．４８倍の減少が発酵試料で生じたことである（図１２）。
【０２２２】
実施例１４−意図的に導入した微生物の増殖を阻害するためのブロッコリー発酵培養物の評価
負荷試験を、ブロッコリー発酵培養物が、関心事である食品調製で多くの場合に観察される、意図的に導入した微生物の増殖を阻害する能力を評価するために実施した。
【０２２３】
Ｌａｂ培養物／スターター培養物
発酵物中の試料が１０8ＣＦＵ／ｇｍとなるような、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、ＢＦ１及びＢＦ２を含む、１０ｍｌの１０10ｃｆｕ／ｍＬの接種菌。
【０２２４】
病原体培養物
Ｅ．ｃｏｌｉ分離株ＦＳＡＷ  １３１０、ＦＳＡＷ  １３１１、ＦＳＡＷ  １３１２、ＦＳＡＷ  １３１３及びＦＳＡＷ  １３１４を、ＮＢ（栄養ブロス）中で１〜４×１０8ｃｆｕ／ｍＬまで、３７℃で一晩静置して別々に増殖させた。培養物を組み合わせ（各々１ｍＬ）、組み合わせた培養物を最初の２つの希釈物ではＭＲＤ（最大回収希釈剤）を用いて、及び最後の２つの希釈物は水を用いて１０4に希釈した。
【０２２５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株Ｓ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ  １０２３、Ｓ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  １２３４、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １６５７（ＰＴ１３５）、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １０１３（ＰＴ９）及びＳ．Ｖｉｒｃｈｏｗ  １５６３を、ＮＢ中で１〜４×１０8ｃｆｕ／ｍＬまで、３７℃で一晩静置して別々に増殖させた。培養物を組み合わせ（各々１ｍＬ）、組み合わせた培養物を最初の２つの希釈物ではＭＲＤを用いて、及び最後の２つの希釈物は水を用いて１０4に希釈した。
【０２２６】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ分離株Ｌｍ２９８７（７４９７）、Ｌｍ２９６５（７４７５）、Ｌｍ２９３９（７４４９）、Ｌｍ２９９４（７５３７）及びＬｍ２６１９（７５１４）を、１０ｍＬのＢＨＩ（ブレインハートインフュージョンブロス）中で、３７℃で一晩攪拌下において別々に増殖させた。次いで、全ての培養物を組み合わせ（各々１ｍＬ）、このカクテルを最初の２つ（１／１０）の希釈物ではＭＲＤを使用して、及び最後の２つの希釈物は滅菌脱イオン水を使用して希釈した。
【０２２７】
Ｂ．ｃｅｒｕｓ芽胞群を、分離株Ｂ３０７８、Ｂ２６０３、２６０１、７５７１及び７６２６から調製した。
【０２２８】
方法
ブロッコリーピューレを、接種菌を調製する前に調製し、ブロッコリー：滅菌水道水を３：２（９００ｇのブロッコリー：６００ｇの水）とした。ブロッコリーの頭部を水道水ですすぎ、茎を８０％エタノールで殺菌したまな板の上で滅菌ナイフを用いてブロッコリーから切断した。ブロッコリーの房（９００ｇ）を小さな細片まで切断した。４５０ｇのブロッコリー片を、６００ｇの水全部と共にＴｈｅｒｍｏｍｉｘボウルに入れた。半透明のＴｈｅｒｍｏｍｉｘカップ／蓋を８０％エタノールで殺菌し、蓋の穴の上に置いた。ブロッコリーを速度４で１分間細断した。２番目の４５０ｇのブロッコリー片をＴｈｅｒｍｏｍｉｘボウルに添加し、速度４で１分間細断した。内容物をさらに５分間、速度１０（最高）で細断した。実際にピューレが十分滑らかになったことを確認した後、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘボウルを冷却室中に置き、内容物を３０分間冷却した。この後、ボウルをインキュベーター内に入れ、３０℃に平衡化した。その間に、スターター培養物及び病原体培養物（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を調製した。１０ｍＬのＬＡＢ培養物及び７．５ｍＬの１０−４希釈負荷微生物カクテル（１０4ｃｆｕ／ｍＬの水中培養物）を、ブロッコリーピューレに添加した（１０5のＢ．ｃｅｒｅｕｓ）。培養物を混合する前に、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ蓋の大きな穴上にホイルを被せて押さえた。培養物を最高速度で１分間ピューレに混合した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘの熱設定をオフに切り換え、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘを３０℃のインキュベーター内に置き、午前１０時４５分に発酵を開始した。ｐＨ及び温度の測定を、ピューレを１分間速度４．５で混合してから７時間後（作業時間の終了）まで毎時間行った。ｐＨメーターを校正し、８０％エタノールを使用して殺菌した。温度プローブも、８０％エタノールで測定前に殺菌した。
【０２２９】
負荷微生物の増殖を、生ブロッコリーの選択培地ＭＲＳ、ＤＲＢＸ及びＮＡ＋Ｓ上での増殖について、発酵前（Ｔ０）ならびに発酵開始から４時間後（Ｔ４）及び２２時間後（Ｔ２２）に計数することによって評価した。
【０２３０】
結果
酵母及びカビは４時間で有意に減少し、発酵終了時（Ｔ２２）には検出されなかった。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、発酵終了時（Ｔ２２）に全く検出されなかった。Ｌｉｓｔｅｒｉａは発酵終了時に少数検出し、開始時の接種菌は１０3ｃｆｕ／ｍＬをちょうど超えていた。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ芽胞は、全体的に発酵の影響を受けなかったが、発芽しなかった。負荷試験の結果は、発明者らがブロッコリーから単離した乳酸菌株が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＥ．ｃｏｌｉを完全に不活性化し、最も酸耐性のあるＬｉｓｔｅｒｉａ株の増殖を阻害できることを示している。それらはまた、Ｂ．ｃｅｒｕｓ芽胞の芽胞形成も阻害できる。
表９．Ｅ．ｃｏｌｉを用いた微生物負荷試験の例。Ｅ．ｃｏｌｉ（５つのＥ．ｃｏｌｉ株ＥＣ１６０５、ＥＣ１６０６、ＥＣ１６０７、ＥＣ１６０８の混合物）を、浸漬ブロッコリー（３：２のブロッコリー−水比率）発酵物に接種し（２．２×１０２ＣＦＵ／ｇｍ）、発酵スターター（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、ＢＦ１、ＢＦ２の混合物）がＥ．ｃｏｌｉの増殖を阻害するかどうかを評価した。実験を３回反復した。発酵を３０℃で２２時間、ｐＨが４．０未満となるまで実施した。
【０２３１】
【表９】
2020534850.tif 000021
【０２３２】
表１０．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを用いた微生物負荷試験の例。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（５つの株Ｓ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ  １０２３、Ｓ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  １２３４、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １６５７（ＰＴ１３５）、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １０１３（ＰＴ９）、Ｓ．Ｖｉｒｃｈｏｗ  １６２３の混合物）を、浸漬ブロッコリー（３：２のブロッコリー−水比率）発酵物に接種し（１．１×１０３）、発酵スターター（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、ＢＦ１、ＢＦ２の混合物）がＳａｌｍｏｎｅｌｌａの増殖を阻害するかどうかを評価した。実験を３回反復した。発酵を３０℃で２２時間、ｐＨが４．０未満となるまで実施した。
【０２３３】
【表１０】
2020534850.tif 000022
【０２３４】
表１１．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを用いた微生物負荷試験の例。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（５つの株Ｌｍ２９８７（７４９７）、Ｌｍ２９６５（７４７５）、Ｌｍ２９３９（７４４９）、Ｌｍ２９９４（７５３７）、Ｌｍ２９１９（７５１４）の混合物）を、浸漬ブロッコリー（３：２のブロッコリー−水比率）発酵物に接種し（１．９×１０３）、発酵スターター（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、ＢＦ１、ＢＦ２の混合物）が耐酸性Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖を阻害するかどうかを評価した。実験を３回反復し、発酵終了時の最終的なＬｉｓｔｅｒｉａ数は、＜１０（未検出）〜１．１×１０2ＣＦＵ／ｇｍの範囲であった。発酵を３０℃で２２時間、ｐＨが４．０未満となるまで実施した。
【０２３５】
【表１１】
2020534850.tif 000023
【０２３６】
表１２．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓを用いた微生物負荷試験の例。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ（５つの株Ｂ３０７８、Ｂ２６０３、Ｂ２６０１、Ｂ７５７１、Ｂ７６２６の混合物）を、浸漬ブロッコリー（３：２のブロッコリー−水比率）発酵物に接種し（１．９×１０３）、発酵スターター（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、ＢＦ１、ＢＦ２の混合物）が耐酸性Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖を阻害するかどうかを評価した。実験を３回反復した。発酵を３０℃で２２時間、ｐＨが４．０未満となるまで実施した。
【０２３７】
【表１２】
2020534850.tif 000024
【０２３８】
実施例１５−Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｌｏｉｄｅｓ分離株のパルスフィールドゲル電気泳動
野菜由来のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓを、Ｃｈａｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｍａｓｓｏ（２０１５）に記載されるようなパルスフィールドゲル電気泳動に修正を加えて使用し、ＳｍａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素消化で評価した。
【０２３９】
方法：
１日目
評価した分離株を１０ｍＬのＭＲＳブロスに接種し、３０℃のインキュベーター中で一晩インキュベートした（１６時間）。
【０２４０】
２日目
分離株を３５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを混合して５ｍＬの脱イオン水で洗浄し、３５００ｇで１０分間遠心分離して上清を廃棄した。ペレットを５ｍＬのＴＥＳ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  サッカロース）と混合し、ボルテックスした。次に試料を３５００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。７００μＬの溶解液（リゾチームを１０ｍｇ／ｍＬで含むＴＥ緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、通常通り滅菌））をペレットに添加し、混合して５６℃で２時間インキュベートして細菌を溶解した。次に、７００μＬのアガロース（５０μＬのＥＤＴＡ／１００ｍＬを含む１％ＳｅａＣｈｅｍ  Ｇｏｌｄアガロース）を細胞混合物に添加し、混合してプラグモールド中に分注し、２ｍＬの除タンパク（６６０μＬのプロテイナーゼＫ緩衝液、１１μＬのプロテイナーゼＫ）溶液を１試料分ずつ全プラグに添加して管内に置き、５５℃で一晩インキュベートした。
【０２４１】
３日目
次に、プラグを１００ｍＬの滅菌脱イオン水中において５５℃で加熱し、除タンパク溶液を除去してプラグを１５ｍＬの遠心管に移し、４ｍＬの滅菌脱イオン水で洗浄して１０分間室温で５５℃に加熱し、続いて４ｍＬのＴＥ緩衝液を用いて１０分間室温で４回洗浄した。
【０２４２】
制限消化
２ｍｍ切り取ったプラグを、１００μＬの１×制限緩衝液を入れたｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅ内に入れ、２０分間室温でインキュベートし、制限緩衝液を除去して制限緩衝液中の４０〜１００μＬのＳｍａＩ（２０Ｕ）またはＮｏｔＩと置き換え、４時間最適温度（２５℃）でインキュベートした。
【０２４３】
４日目
制限断片の分離
１ｍＬの０．５×ＴＢＥ緩衝液を各管に入れ、少なくとも１５分間静置して反応を停止させ、バクテリオファージλＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）をＴＢＥ緩衝液中でインキュベートした。緩衝液を除去してスライスをコーム上に乗せ、５レーンごとにラダーを用いた。１．０％超高純度ＤＮＡグレードアガロース（パルスフィールド認定アガロース）を０．５×ＴＢＥ泳動用緩衝液中で調製した。
【０２４４】
電気泳動条件
緩衝液を１４℃に維持した（ｍｏｄｅｌ  １０００  Ｍｉｎｉ−ｃｈｉｌｌｅｒ、ＢｉｏＲａｄ）。ＢｉｏＲａｄ「Ｃｈｅｆ  Ｍａｐｐｅｒ（商標）」で、Ｔｗｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ａｕｔｏ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍではなく）を選択する。パルス時間を２〜２５秒に直線的に傾斜させた（「ａ」が表示されたらエンターキーを押す）。勾配６Ｖ／ｃｍ（電圧）、交差角度１２０°、泳動時間２４時間。
【０２４５】
５日目
ゲルを約３０分間ＧｅｌＲｅｄで染色し、脱色して可視化した。
【０２４６】
結果
ＢＦ１の制限フィンガープリントは異なってはいたが、ニンジンから単離したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに類似していた（図１３）。ＢＦ２の制限フィンガープリントは、評価した全てのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ株とは異なっていた（図１３）。
【０２４７】
実施例１６−Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ分離株のバリアント分析
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ分離株（Ｂ１〜Ｂ５）のＳＮＰ分析では、Ｂ１  Ｐｒｏｋｋａ  ｇｂｋをＳｎｉｐｐｙ  ＳＮＰ分析−標準方法の参照として使用した。単一比較を、各株のリードデータを使用して実施した。Ｂ１リードを対照として実行した。
【０２４８】
コマンド例は以下の通りであった：
ｓｎｉｐｐｙ  −−ｃｐｕｓ  ２４  −−ｏｕｔｄｉｒ  Ｂ５  −−ｒｅｆ  Ｂ１＿Ｓ１ｍｏｄ．ｇｂｋ  −−ｐｅ１  Ｂ５＿Ｓ１７＿Ｌ００１＿Ｒ１＿００１．ｆａｓｔｑ．ｇｚ  −−ｐｅ２  Ｂ５＿Ｓ１７＿Ｌ００１＿Ｒ２＿００１．ｆａｓｔｑ．ｇｚ
【０２４９】
個別比較及びコアを、Ｂ１  ｇｂｋを参照として使用して算出した。
ｓｎｉｐｐｙ−ｃｏｒｅ  −−ｐｒｅｆｉｘ  ｃｏｒｅ  Ｂ１  Ｂ２  Ｂ３  Ｂ４  Ｂ５
【０２５０】
比較もまた、Ｂ１と、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ８０１４（ＳＲＲ１５５２６１３）のＳＲＡからダウンロードした参照株のリードデータとの間で実施した。ダウンロードを、標準方法を使用して、プリフェッチ及び−ｓｒａｔｏｏｌｋｉｔ．２．９．２−ｗｉｎ６４を使用したｆａｓｔｑへの変換を用いて実施した。類似のアプローチを、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ分離株ＢＦ１及びＢＦ２と、参照としてのＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３との比較に使用した。
【０２５１】
結果
バリアント（４１）を、Ｂ１とＡＴＣＣ８０１４との間で観察した（表１３）。バリアント（１〜４）を、Ｂ１と他のＢ分離株Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５との間で観察した（表１４〜１７）。ＢＦ１及びＢＦ２は、互いに大きく異なる。バリアント（１９）を、ＢＦ１とＡＴＣＣ８２９３との間で観察した（表１８）。バリアント（約７０００）を、ＢＦ２とＡＴＣＣ８２９３との間で観察した。４５９の複合バリアントを、ＢＦ２とＡＴＣＣ８２９３との間で同定し、それを表１９にまとめている。
【０２５２】
【表１３−１】
2020534850.tif 000025
【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
2020534850.tif 000030
【０２５３】
【表１４】
2020534850.tif 000031
【０２５４】
【表１５】
2020534850.tif 000032
【０２５５】
【表１６】
2020534850.tif 000033
【０２５６】
【表１７】
2020534850.tif 000034
【０２５７】
【表１８−１】
2020534850.tif 000035
【表１８−２】
2020534850.tif 000036
【０２５８】
【表１９−１】
2020534850.tif 000037
【表１９−２】
2020534850.tif 000038
【表１９−３】
2020534850.tif 000039
【表１９−４】
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【表１９−５】
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【表１９−６】
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【表１９−７】
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【表１９−８】
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【表１９−９】
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【表１９−１０】
2020534850.tif 000046
【表１９−１１】
2020534850.tif 000047
【表１９−１２】
2020534850.tif 000048
【表１９−１３】
2020534850.tif 000049
【表１９−１４】
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【表１９−１５】
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【表１９−１６】
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【表１９−１７】
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【表１９−１８】
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【表１９−１９】
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【表１９−２０】
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【表１９−２１】
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【表１９−２２】
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【表１９−２３】
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【表１９−２４】
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【表１９−２５】
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【表１９−２６】
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【表１９−２７】
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【表１９−２８】
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【表１９−２９】
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【表１９−３０】
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【表１９−３１】
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【表１９−３２】
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【表１９−３３】
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【表１９−３４】
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【表１９−３５】
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【表１９−３６】
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【表１９−３７】
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【表１９−３８】
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【表１９−３９】
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【表１９−４０】
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【表１９−４１】
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【表１９−４２】
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【表１９−４３】
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【表１９−４４】
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【表１９−４５】
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【表１９−４６】
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【表１９−４７】
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【表１９−４８】
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【表１９−４９】
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【表１９−５０】
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【表１９−５１】
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【表１９−５２】
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【表１９−５３】
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【表１９−５４】
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【表１９−５５】
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【表１９−５６】
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【表１９−５７】
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【表１９−５８】
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【表１９−５９】
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【表１９−６０】
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【表１９−６１】
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【０２５９】
当業者であれば、広範に説明される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変形及び／または修正が特定の実施形態に示されるように本発明に加えられてもよいことを理解する。したがって、本実施形態は、あらゆる点で説明するものであり、限定するものと見なされるべきではない。
【０２６０】
本出願は、２０１７年９月２８日出願の「Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ」と題した豪州仮出願第２０１７９０３９４４号の優先権を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２６１】
本明細書で論じられ、かつ／または参照される全ての出版物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６２】
本明細書に包含される文献、行為、材料、デバイス、品物等のいずれの考察も、単に本発明に前後関係を提供するためである。本出願のそれぞれの特許請求の主張の優先日前に存在したため、これらの事柄のいずれかもしくは全てが先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明の関連分野で共通の一般的知識であったと承認するもと見なされるべきではない。
【０２６３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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