(57)【要約】  本開示は、本明細書でミトケトシンと呼ばれる、ＡＣＡＴ１／２およびＯＸＣＴ１／２の少なくとも１つと結合しミトコンドリアのＡＴＰ産生を阻害する化合物に関する。ミトコンドリア阻害特性および抗癌特性について化合物をスクリーニングする方法が開示される。また、ミトケトシンを使用して癌、細菌感染症、および病原性酵母を予防または治療する方法、ならびにミトケトシンを使用して抗加齢効果を提供する方法も記載される。具体的なミトケトシン化合物も開示される。【選択図】図２
2020525009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトケトシン。
【請求項２】
一般式：
【化１】
2020525009.tif 000016
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項３】
一般式：
【化２】
2020525009.tif 000017
またはその医薬上許容される塩を含み、Ｚは、エチルピペリジンまたはエチルピロリジンとして定義される、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項４】
一般式：
【化３】
2020525009.tif 000018
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項５】
一般式：
【化４】
2020525009.tif 000019
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項６】
一般的なファーマコフォア：
【化５】
2020525009.tif 000020
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項７】
一般的なファーマコフォア：
【化６】
2020525009.tif 000021
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項８】
一般式：
【化７】
2020525009.tif 000022
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項９】
一般式：
【化８】
2020525009.tif 000023
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１０】
一般式：
【化９】
2020525009.tif 000024
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１１】
一般式：
【化１０】
2020525009.tif 000025
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１２】
一般式：
【化１１】
2020525009.tif 000026
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１３】
一般式：
【化１２】
2020525009.tif 000027
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１４】
一般式：
【化１３】
2020525009.tif 000028
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１５】
一般式：
【化１４】
2020525009.tif 000029
またはその医薬上許容される塩を含む、請求項１に記載のミトケトシン。
【請求項１６】
抗加齢活性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項１７】
放射線増感活性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項１８】
光増感活性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項１９】
癌細胞を化学療法薬に対して増感させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項２０】
癌細胞を天然物質に対して増感させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項２１】
癌細胞をカロリー制限に対して増感させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項２２】
ＯＸＣＴ１と結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項２３】
ＡＣＡＴ１と結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項２４】
ＯＸＣＴ１／２およびＡＣＡＴ１／２の少なくとも１つと結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシン。
【請求項２５】
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に医薬上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシンおよび医薬上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
微生物感染症を治療する方法であって、それを必要とする患者に医薬上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシンおよび医薬上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
加齢に伴う状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に医薬上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミトケトシンおよび医薬上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
少なくとも１種のミトケトシンを有効成分として含有する、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
少なくとも１種のミトケトシンを有効成分として含有する、細菌感染症を治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
少なくとも１種のミトケトシンを有効成分として含有する、病原性酵母感染症を治療するための医薬組成物。
【請求項３１】
少なくとも１種のミトケトシンを有効成分として含有する、加齢を治療するための医薬組成物。
【請求項３２】
仮想ハイスループットスクリーニングおよび表現型薬物スクリーニングを使用してミトケトシンを同定する方法であって;
仮想ハイスループットスクリーニングを使用してミトコンドリアケトン再利用酵素を標的とするミトケトシンを同定すること；
前記ミトケトシンを合成すること；および
前記ミトケトシンをミトコンドリア阻害活性について試験すること
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ミトケトシンはＯＸＣＴ１と結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ミトケトシンはＡＣＡＴ１と結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記表現型薬物スクリーニングはｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物スクリーニングである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記表現型薬物スクリーニングはＡＴＰ枯渇アッセイを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記表現型薬物スクリーニングは細胞外酸性化速度アッセイを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記表現型薬物スクリーニングは酸素消費速度アッセイを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記ミトケトシンを抗癌活性について試験することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
試験される前記抗癌活性はマンモスフィア形成である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
試験される前記抗癌活性は細胞遊走である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ミトケトシンを抗微生物活性について試験することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ミトコンドリア補助基質を投与することをさらに含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ミトコンドリア補助基質は、グルコース、ピルベート、ラクテート、脂肪酸およびアセチル−カルニチンの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ミトケトシン(mitoketoscins)−ＡＣＡＴ１／２およびＯＸＣＴ１／２の少なくとも１つと結合しミトコンドリアのＡＴＰ産生を阻害する非発癌性化合物、ならびにミトケトシンを同定するための方法、この阻害薬を使用して癌幹細胞を標的とし、細菌および病原性酵母を標的とし、抗加齢効果を提供する方法、および１種以上のミトケトシンを有効成分として含有する、癌、細菌感染症、酵母感染症、および加齢を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究者らは新しい抗癌治療の開発に取り組んでいる。従来の癌療法（例えば、照射、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、および５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗物質）は、細胞増殖およびＤＮＡ複製に関与する細胞機構に干渉することにより、増殖の速い癌細胞を選択的に検出し、根絶しようとした。他の癌療法は、増殖の速い癌細胞上の変異腫瘍抗原に選択的に結合する免疫療法（例えば、モノクローナル抗体）を使用した。残念なことに、腫瘍は、これらの療法の後に同じまたは異なる部位で再発することが多く、このことは全ての癌細胞が根絶されたわけではないことを示している。再発は、化学療法薬の投与量の不足および／または療法に耐性のある癌クローンの出現による可能性がある。従って、新規な癌治療戦略が必要である。
【０００３】
ケトン（３−ヒドロキシブチレート、アセトアセテートおよびアセトン）は高エネルギーミトコンドリア燃料であり、それらはカロリー制限、絶食、および／または飢餓の期間中に肝細胞によって自然に生成される。栄養枯渇中に、血中に分泌されたケトン体は次に脳に向けられ、そこでニューロンは、ケトン体がエネルギー源として効果的に再利用され得るようにケトン体を変換してアセチル−ＣｏＡに戻す。このケトン再利用プロセスに最も重要な２つのニューロン酵素はＯＸＣＴ１／２およびＡＣＡＴ１／２であり、それはこれらがケトン体からアセチル−ＣｏＡへの変換に直接関与しているためである。 Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｕｔｓｃｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１７；  １４（１）：１１−３１。
【０００４】
本発明者らは、ヒト腫瘍にも同様の「ケトンシャトル」が存在し、それによって、ケトン体生成癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）が、隣接するヒト乳癌細胞のミトコンドリアによる再利用のためにケトン体を局所的に産生することを示した。Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｕｔｓｃｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２０１２；  １１（２１）：３９５６−６３。この「代謝カップリング」仮説のさらなる裏付けとして、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞におけるＡＣＡＴ１／２またはＯＸＣＴ１／２の組換え過剰発現は腫瘍成長および肺転移を促進するのに確かに十分であることを見出した。これらのデータは、ケトン体再利用が腫瘍の進行および転移の推進を助け得るという遺伝学的証拠を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
前述の背景技術を考慮して、酵素ＡＣＡＴ１／２およびＯＸＣＴ１／２は本物の代謝関連癌遺伝子であり得るように思われる。従って、本開示の目的は、ケトン再利用が多くの癌の増殖および維持において重要な役割を果たすことを実証することである。また、本開示の目的は、ＡＣＡＴ１／２およびＯＸＣＴ１／２の少なくとも１つと結合しミトコンドリアのＡＴＰ産生を阻害する非発癌性化合物であるミトケトシンを同定するための方法を提示することである。また、本開示の目的は、抗癌特性および抗生物質特性を有するミトケトシンを同定することである。また、本開示の目的は、抗加齢特性を有するミトケトシンを同定することである。また、本開示の目的は、放射線増感剤および光増感剤として働くミトケトシンである。用語「ミトケトシン」とは、ＡＣＡＴ１／２およびＯＸＣＴ１／２の少なくとも１つと結合しミトコンドリアのＡＴＰ産生を阻害する非発癌性化合物を広く指す。従って、これらの化合物は、ケトン再利用に関与し抗癌特性および抗生物質特性を有するミトコンドリア酵素を標的とするように設計されている。これらの化合物は、ＯＸＣＴ１／２およびＡＣＡＴ１／２の活性触媒部位の一方または両方と結合してミトコンドリア機能を阻害する。本開示はさらに、ミトケトシンを同定する方法、そのようなミトケトシンを作製する方法、および治療目的のためにミトケトシンを使用する方法に関する。
【０００６】
ミトケトシンは、ミトコンドリア阻害特性を考えると、同様に、細菌および病原性酵母を標的とし、抗加齢効果を提供し、放射線増感剤および／または光増感剤として機能し、癌細胞塊および癌幹細胞を化学療法薬、医薬品、および／または他の天然物質に対して増感させるために使用し得る。
【０００７】
ミトケトシンは、仮想ハイスループットｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングの収束的アプローチとその後のミトコンドリア阻害についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証により同定され得る。ミトケトシンは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ薬物設計と表現型薬物スクリーニングとを組み合わせることにより、迅速に開発される可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本アプローチの実施形態による創薬戦略を概説する概略図を示す。
【図２】表現型薬物スクリーニングに従って同定された８つの候補ミトケトシン化合物１〜８の化学構造を示す。
【図３Ａ】ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成に対する候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図３Ｂ】ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成に対する候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図３Ｃ】ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成に対する候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図３Ｄ】ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成に対する候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図３Ｅ】ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成に対する候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図３Ｆ】ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成に対する候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図４Ａ】ＭＣＦ７細胞におけるＡＴＰ枯渇に対する候補ミトケトシン化合物２の効果を示す。
【図４Ｂ】ＭＣＦ７細胞におけるＡＴＰ枯渇に対する候補ミトケトシン化合物８の効果を示す。
【図４Ｃ】ＭＣＦ７細胞におけるＡＴＰ枯渇に対する候補ミトケトシン化合物６の効果を示す。
【図４Ｄ】ＭＣＦ７細胞におけるＡＴＰ枯渇に対する候補ミトケトシン化合物３の効果を示す。
【図５Ａ】ＭＣＦ７細胞における基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対する候補ミトケトシン化合物２の効果を示す。
【図５Ｂ】ＭＣＦ７細胞における基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対する候補ミトケトシン化合物８の効果を示す。
【図６Ａ】ＭＣＦ７細胞における基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対する候補ミトケトシン化合物６の効果を示す。
【図６Ｂ】ＭＣＦ７細胞における基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対する候補ミトケトシン化合物３の効果を示す。
【図７Ａ】ＭＣＦ７細胞における好気性解糖に対する５つの候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図７Ｂ】ＭＣＦ７細胞における経時的細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）に対する５つの候補ミトケトシン化合物の効果を示す。
【図８Ａ】候補ミトケトシン化合物２のドッキング画像を示す。
【図８Ｂ】候補ミトケトシン化合物８のドッキング画像を示す。
【図８Ｃ】候補ミトケトシン化合物３のドッキング画像を示す。
【図８Ｄ】候補ミトケトシン化合物６のドッキング画像を示す。
【図９】ＯＸＣＴ１およびＡＣＡＴ１がＡＴＰ産生を推進するためにどのように機能するかを概説する概略図を示す
【図１０Ａ】ＣＳＣ増殖を阻害するための４つの候補ミトケトシン化合物およびそれぞれのＩＣ−５０を示す。
【図１０Ｂ】天然に存在するＡＣＡＴ１阻害薬であるアレコリンの化学構造を示す。
【図１１Ａ】２つの候補ミトケトシン化合物の構造を比較している。
【図１１Ｂ】２つの候補ミトケトシン化合物のファーマコフォアを示す。
【図１２Ａ】補酵素Ａ（ＣｏＡ）の構造を示す。
【図１２Ｂ】ＣｏＡの構造と２つの候補ミトケトシン化合物とを比較している。
【図１３】本アプローチの実施形態によるミトケトシンの潜在的副作用を改善するためのミトコンドリア基質による追跡治療戦略を概説する概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下の説明は、本アプローチの実施形態を、本アプローチの実施を可能にするに十分詳細に示している。本アプローチを、これらの具体的な実施形態を参照して説明しているが、本アプローチは異なる形態で具体化することができることを理解すべきであり、この説明は、添付の特許請求の範囲を本明細書に示される具体的な実施形態に限定するものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を十分かつ完全なものとし、本アプローチの範囲を当業者に余すところなく伝えるように提供される。
【００１０】
ミトコンドリア代謝は、癌から細菌性および真菌性感染症、老化までに及ぶ複数の苦痛を治療するための未開発の入口である。機能的ミトコンドリアは癌幹細胞の増殖に必要である。癌細胞でのミトコンドリア代謝を阻害するとこれらの細胞の増殖が妨げられる。従って、ミトコンドリア燃料としてのケトン体の再利用を標的とするミトコンドリア阻害薬は、新しい種類の抗癌治療法となる。これらの化合物はまた、ミトコンドリアタンパク質翻訳を阻害し得るため、細菌および病原性酵母の両方を標的とする広域スペクトル抗生物質として機能し得る。研究では、ミトコンドリア阻害薬が抗加齢特性を有することが示されており、それゆえ、ミトケトシンは抗加齢効果も与える可能性がある。
【００１１】
ＯＸＣＴ１／２およびＡＣＡＴ１／２の少なくとも１つと結合する新規ミトコンドリアＡＴＰ産生阻害薬−ミトケトシン−は、仮想ハイスループットスクリーニングの収束的アプローチとその後のミトコンドリア阻害についてのｉｎ  ｖｉｖｏ検証により同定され得る。図１は、本明細書に開示されるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ薬物スクリーニングおよび表現型薬物スクリーニングを使用することによりミトケトシンを同定するための方法の概観である。ブタＯＸＣＴ１およびヒトＡＣＡＴ１タンパク質の三次元構造の全てまたは一部は、仮想ハイスループットスクリーニング（ｖＨＴＳ）（すなわち、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ薬物スクリーニング）により、これらのタンパク質と結合する新規化合物を同定する工程Ｓ１０１で使用され得る。このスクリーニングは、分子ライブラリーを横断して実施し得る。例えば、初期調査の間、本発明者らは、３０，０００種の小分子化合物のコレクションを、ＣｏＡと共有結合したブタ心臓由来スクシニル−ＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＤＢコード  ３ＯＸＯ）と、またはヒトミトコンドリアアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＰＤＢコード  ２Ｆ２Ｓ）のＣｏＡ結合部位と、どこかで結合すると予想される化合物についてスクリーニングした。最初のｖＨＴＳでは、ｅＨｉＴＳスクリーニングプログラムなどの様々なスクリーニングプログラムを使用して、どちらかのタンパク質に対して強い結合親和性を有する化合物のサブセットを同定することができる。例えば、本発明者らは、ｅＨｉＴＳを使用して、予測された結合親和性に基づいて、最初のライブラリーから上位１，０００位に入る化合物を同定した。ｅＨｉＴＳは、重度の立体衝突を回避する立体構造および位置の探索空間部分を体系的に含むスクリーニング方法であり、仮想ハイスループットスクリーニングに適切な速度で精度の高いドッキングポーズを生成する。
【００１２】
当業者ならば、必要とされる結合親和性を有する化合物のサブセットを同定するための方法を選択または開発し得ることを理解されたい。ドッキングを効率的に実行するために、タンパク質構造全体に対応する一連のクリップファイルが準備され、各化合物は各クリップファイルに連続してドッキングされ得る。上位化合物のコンセンサススコアリングは、ｅＨｉＴＳスクリーニングから予測された各化合物の同じ一般的な結合部位に基づいて、ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ４．２を使用して実行され得る。予測された結合親和性のさらなる分析および目視検査は、例えばＳＰＲＯＵＴなどのデノボ設計プログラムを含む複数の方法を使用して実施され得る。ＳＰＲＯＵＴに関する情報については、参照によりその全体が組み込まれるＬａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．６６６：６５１−６５７（２００３）を参照。最初のライブラリーのサイズおよび結果に応じて、表現型薬物スクリーニングのために複数の化合物が選択され得る。例えば、本発明者らは、工程Ｓ１０３での表現型薬物スクリーニングのためにこれらの分析工程で結果が良好な２２７種の化合物を選択した。ＯＸＣＴ１に基づく表現型スクリーニングのために８４種の化合物が選択され、ＡＣＡＴ１に基づく表現型スクリーニングのために１４３種の化合物が選択された。
【００１３】
表現型薬物スクリーニングＳ１０３は、選択された細胞株で選択された化合物のミトコンドリア阻害を試験することにより達成され得る。例えば、ＡＴＰ枯渇アッセイを使用し得る。本発明者らは、選択された２２７種の化合物をＭＣＦ７ヒト乳癌細胞においてＡＴＰ枯渇を機能的に誘導する能力について試験した。細胞のＡＴＰのおよそ８５％は通常ミトコンドリアのＯＸＰＨＯＳによって生成されるため、ＡＴＰ枯渇はミトコンドリア阻害の代用マーカーである。当業者ならばミトコンドリア阻害の他の代用物を採用し得ることを理解されたい。しかしながら、発明者らが採用したＡＴＰ枯渇アッセイでは、ＭＣＦ７細胞（６，０００細胞／ウェル）を黒色透明底９６ウェルプレートに播種し、処理前に一晩インキュベートした。ｖＨＴＳによって同定された２２７種の化合物を、平板培養したＭＣＦ７細胞に２０μＭの濃度で適用し、ＡＴＰ枯渇についてスクリーニングした。その後、ＡＴＰ枯渇効果を示す化合物をより低い濃度（１０μＭ）で再スクリーニングして、ＡＴＰ枯渇を最も強く誘導した上位８位までの化合物を同定した。７２時間のインキュベーション後に化合物を試験し、実験は２反復で行った。処理後、ウェルから培地を吸引し、Ｃａ2+およびＭｇ2+を補給した温リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でプレートを洗浄した。次に、細胞を、ヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ）染色溶液（１０μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄して、細胞生存率を推定した。３５５／４６０ｎｍの励起／発光波長を使用して蛍光をプレートリーダーで読み取った。次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施して、所定の化合物で処理した全く同じウェルでの代謝活性（ＡＴＰ含量）を測定した。アッセイは製造業者の実施要綱に従って実施した。蛍光強度（ヘキスト染色）および発光強度（ＡＴＰ含量）をビヒクル単独で処理した対照に対して正規化し、比較のために対照百分率として表示した。８種の試験化合物は全て、生細胞でのＡＴＰレベルを大幅に激減させた。当業者ならば同じまたは類似のＡＴＰ枯渇アッセイを選択して採用し、そのようなアッセイを変更し得るし、またはＡＴＰ枯渇アッセイを、選択された化合物をミトコンドリア阻害についてスクリーニングするための別の方法論（例えば、酸素消費アッセイ）に置き換え得ることを理解されたい。
【００１４】
本アプローチは、細胞生存率を確認する方法を含む。当業者は、特定の実施形態に好適な細胞生存率を確認するための１つ以上の方法を選択し得る。本発明者らは、最初に、細胞タンパク質含有量の測定に基づくスルホローダミン（ＳＲＢ）アッセイを使用した。９６ウェルプレートで７２時間処理した後、細胞を冷蔵室にて１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で１時間固定し、室温で一晩乾燥させた。次に、細胞をＳＲＢとともに１５分間インキュベートし、１％酢酸で２回洗浄し、少なくとも１時間風乾した。最後に、タンパク質に結合した色素を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８溶液に溶解し、プレートリーダーを使用して５４０ｎｍで読み取った。ＳＲＢアッセイを使用して、本発明者らは、さらなる分析のために顕著な細胞毒性なくＡＴＰレベルを激減させる化合物だけを選択した。顕著な細胞毒性は、プレート上に依然として存在する細胞が３０％未満であることと定義された。当然のことながら、他の細胞生存率確認方法論を採用する実施形態により、さらなる分析のために、当技術分野で公知であり得る他の考慮事項に基づいて化合物を選択してもよい。
【００１５】
本アプローチは、工程Ｓ１０５において機能的検証の方法をさらに含み、その間に、ミトコンドリア阻害薬としての化合物の機能が確認され得る。例えば、代謝フラックス解析、マンモスフィアアッセイ、生存率アッセイ、および抗生物質（抗菌および／または抗真菌）活性を含む複数の方法を機能的検証のために使用し得る。例えば、本発明者らは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックス（ＸＦ９６）アナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＭＣＦ７細胞についての細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）およびリアルタイム酸素消費速度（ＯＣＲ）を決定した。ＭＣＦ７細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを補給したＤＭＥＭ中で維持した。ウェルあたり５，０００個の細胞をＸＦ９６ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ2加湿雰囲気中、３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を、様々な濃度で顕著な細胞毒性なくＡＴＰ枯渇を示す選択された化合物（またはビヒクル単独）で処理した。７２時間の処理後、細胞を、予温したＸＦアッセイ培地（ＯＣＲ測定用、ＸＦアッセイ培地に、１０ｍＭグルコース、１ｍＭピルベート、２ｍＭＬ−グルタミンを補給し、ｐＨ７．４に調整した）で洗浄した。細胞は、非ＣＯ2インキュベーター内で１７５μＬ／ウェルのＸＦアッセイ培地中、３７℃で１時間維持した。インキュベーション中、２５μＬの、８０ｍＭグルコース、９μＭオリゴマイシン、１Ｍ  ２−デオキシグルコースのＸＦアッセイ培地溶液（ＥＣＡＲ測定用）および２５μＬの１０μＭオリゴマイシン、９μＭ  ＦＣＣＰ、１０μＭ  ロテノン、１０μＭアンチマイシンＡのＸＦアッセイ培地溶液（ＯＣＲ測定用）をＸＦｅ−９６センサーカートリッジの注入ポートに入れた。実験中、この装置が所定の時点でこれらの阻害薬をウェルに注入したが、ＥＣＡＲ／ＯＣＲは連続的に測定された。ＥＣＡＲおよびＯＣＲの測定値は、タンパク質含有量によって正規化された（スルホローダミンＢアッセイ使用）。データセットは、一元配置分散分析およびスチューデントｔ検定計算を使用して、ＸＦｅ−９６ソフトウェアにより分析した。全ての実験を三反復で実施し、結果により、本明細書に記載のミトケトシン化合物のミトコンドリア阻害効果が確認された。機能的検証については数多くの方法が知られており、当業者ならば検証の必要性に応じて１つ以上を選択し得る（例えば、ミトコンドリア機能を測定または概算する他のアッセイ）ことを理解されたい。
【００１６】
要約すると、本アプローチは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ薬物スクリーニングおよび表現型薬物スクリーニングを使用して、潜在的なミトケトシンを同定する方法を含み得る。この方法論を使用して同定された新規化合物は、抗癌活性（例えば、マンモスフィア形成および細胞遊走を阻害する能力）について試験され、抗微生物活性を調査するために、異なる細菌および／または酵母株でさらに試験され得る。図１は、本アプローチの実施形態による薬物スクリーニングおよび検証のための一般的な方法を要約しているが、当業者ならば本アプローチから逸脱することなく本明細書に開示される具体的な例から逸脱可能であることを理解されたい。
【００１７】
本アプローチは、抗癌特性を有するミトケトシンの同定につながり、本アプローチの実施形態は、これらの化合物の１種以上の形態、ならびにこれらの化合物の１種以上の有効量を含む医薬組成物、およびこれらの化合物の１種以上を使用する様々な治療方法をとり得る。本発明者らの最初のスクリーニングおよび検証に基づき、図２の同定された化合物は、抗癌特性を有するため、ミトケトシンである。従って、本発明者らの研究を考慮して、これらのミトケトシンは臨床試験の候補である。図２の同定されたミトケトシンは、網羅的ではなく、本明細書に記載の新規方法論を使用してこれまでに同定された化合物にすぎないことを理解されたい。当業者においては、特定の療法での各化合物の治療上有効な量は、当技術分野で公知の簡単な手順の適用により決定し得ることを理解されたい。
【００１８】
いくつかの実施形態は、１種以上のミトケトシンの形態をとり得る。この実施形態は、癌、細菌感染症、および／または病原性酵母感染症を治療するための医薬組成物に含められ得る。例えば、ミトケトシンは、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）であり得る。
【００１９】
【化１】
2020525009.tif 000003
【００２０】
式中、Ｚは、エチルピペリジンまたはエチルピロリジンとして定義される。
【００２１】
【化２】
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【００２２】
別の例として、ミトケトシンは、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）であり得る：
【００２３】
【化３】
2020525009.tif 000005
【００２４】
式中、各Ｒは、同じでも異なってもよく、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択される。
【００２５】
別の例として、ミトケトシンは、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）であり得る。
【００２６】
【化４】
2020525009.tif 000006
【００２７】
さらなる例として、ミトケトシンは、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）であり得る：
【００２８】
【化５】
2020525009.tif 000007
【００２９】
式中、各Ｒは、同じでも異なってもよく、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、および安息香酸系誘導体からなる群から選択される。
【００３０】
別の例として、ミトケトシンは、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）であり得る：
【００３１】
【化６】
2020525009.tif 000008
【００３２】
式中、各Ｒは、同じでも異なってもよく、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、および安息香酸系誘導体からなる群から選択される。
【００３３】
ミトケトシンの別の例は、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）である。
【００３４】
【化７】
2020525009.tif 000009
【００３５】
ミトケトシンのさらなる例は、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）である。
【００３６】
【化８】
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【００３７】
ミトケトシンの追加例は、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）である：
【００３８】
【化９】
2020525009.tif 000011
【００３９】
式中、各Ｒは、同じでも異なってもよく、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択される。
【００４０】
ミトケトシンの別の例は、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）である：
【００４１】
【化１０】
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【００４２】
式中、各Ｒは、同じでも異なってもよく、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択される。
【００４３】
ミトケトシンのさらなる例は、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）である。
【００４４】
【化１１】
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【００４５】
ミトケトシンの別の例は、以下の構造を有する一般的なファーマコフォア（またはその塩）である：
【００４６】
【化１２】
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【００４７】
式中、各Ｒは、同じでも異なってもよく、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択される。ミトケトシンは、治療的使用のために、個別にまたは１種以上の特定のミトケトシンと組み合わせて、および／または他の治療法の効力を高める他の物質と組み合わせて選択され得ると理解されるべきである。治療薬は、１つ以上の既知の方法を使用して調製し得る通常の医薬組成物の形態で使用し得る。例えば、医薬組成物は、当技術分野で公知の希釈液または賦形剤、例えば、１つ以上の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤などを使用して調製し得る。治療目的に応じて、様々なタイプの投与単位形態を選択し得る。医薬組成物のための形態の例としては、限定されるものではないが、錠剤、丸剤、粉末、液体、懸濁液、エマルション、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（溶液および懸濁液）、局所クリーム、および当技術分野で公知であり得る他の形態が挙げられる。錠剤形態の医薬組成物を成形するために、既知の任意の賦形剤、例えば、ラクトース、白砂糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、シクロデキストリン、結晶性セルロース、ケイ酸などの担体；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、シェラック(shelac)、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤などを使用し得る。加えて、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天粉末、コンブ粉末(laminalia powder)、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸のモノグリセリド、デンプン、ラクトースなどの崩壊剤を使用し得る。白砂糖、ステアリン、ココナツバター、硬化油などの崩壊抑制剤；四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤を使用し得る。グリセリン、デンプン、および当技術分野で公知の他のものなどの湿潤剤を使用し得る。例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイト、コロイドケイ酸などの吸着剤を使用し得る。精製タルク、ステアレート、ホウ酸粉末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤を使用し得る。錠剤が望ましい場合、錠剤を通常のコーティング材料でさらにコーティングして、糖衣錠、ゼラチンフィルムコーティング錠、腸溶コーティング錠、フィルムコーティング錠、二層錠剤、および多層錠剤として錠剤を作製し得る。局所投与に適した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、泡沫、スプレー、エアゾール、またはオイルとして調剤し得る。そのような医薬組成物は、限定されるものではないが、保存剤、薬物浸透を促進する溶媒、共溶媒、皮膚軟化剤、噴射剤、粘度調整剤（ゲル化剤）、界面活性剤、および担体を含む従来の添加剤を含み得る。
【００４８】
本アプローチは、いくつかの実施形態において、化合物、特にミトケトシンを、抗癌特性について試験する方法を含み得る。上述のように、ｖＨＴＳおよび計算化学を使用して、候補ミトコンドリア阻害薬を同定し得る。これらの候補は、特定の抗癌特性について試験し得る。例えば、本発明者らは、ＭＣＦ７細胞におけるマンモスフィア形成を阻害する能力について、７種の候補化合物を同時に比較した。図３は、試験した６種の化合物がマンモスフィア形成を阻害したことを実証している。化合物２および８（それぞれ図３Ａおよび３Ｂ）は、２５μＭの濃度で癌幹細胞活性の尺度であるマンモスフィア数の減少において最も強力な２つの候補であった。化合物６および３も有効であった（それぞれ図３Ｃおよび３Ｄ）が、一方、化合物５および１（それぞれ図３Ｅおよび３Ｆ）はマンモスフィア成長の阻害薬としての作用が弱かった。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
表１は、７種の候補化合物についてのマンモスフィア形成阻害結果を要約したものである。表１は、７種の化合物が１０〜１７０μＭの半数阻害濃度（ＩＣ−５０）でマンモスフィア形成を阻害したことを示している。化合物１〜４は、ＯＸＣＴ１スクリーニングから同定され、化合物５、６、および８は、ＡＣＡＴ１スクリーニングから同定された。
【００５１】
本アプローチは、いくつかの実施形態において、ミトケトシン化合物の機能検証の方法を含み得る。例えば、本発明者らは、酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を定量的に測定するＳｅａｈｏｒｓｅアナライザーを使用して４種の候補の機能的検証を評価した。ＯＣＲはＯＸＰＨＯＳの代用マーカーであり、ＥＣＡＲは解糖およびＬ−ラクテート生産の代用マーカーである。
【００５２】
本発明者らの結果により、化合物２、３、６、および８が全て、ＭＣＦ７細胞におけるミトコンドリアの酸素消費を用量依存的に阻害したことが実証された。図４Ａおよび４Ｂは、化合物２および８が、５μＭほどの低い用量でもミトコンドリア呼吸を大幅に減少させたことを示している。化合物６および３も強力な阻害薬であった（図４Ｃおよび４Ｄ）。図５および６で示されるように、これらの化合物が基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、および最大呼吸を用量依存的に(dosed dependently)減少させた。図７は、４種の化合物が、対照と比較して解糖を大幅に阻害した様子を示している。
【００５３】
本アプローチのいくつかの実施形態は、マンモスフィア形成に対する化合物の効果を考慮することにより、化合物を抗癌特性について試験することを含み得る。当業者は、本アプローチから逸脱することなく、特定の細胞株に対する候補ミトコンドリア阻害薬の効果を評価するために、当技術分野で公知の他の方法を使用し得ることを理解されたい。また、阻害薬は癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的とするため、当業者は他の癌タイプに対する候補ミトコンドリア阻害薬の効果を評価し得ることも理解されたい。ＣＳＣは、ほとんどの癌タイプで保存されたまたは類似の特徴を示す。
【００５４】
図８Ａ〜８Ｄは化合物２、８、３、および６の分子モデリングを示している。分子モデリングの目標は、化合物と既知の三次元構造との主要な（predominant）結合様式を予測することである。図８Ａおよび８Ｃはそれぞれ、ＯＸＣＴ１の３Ｄ結晶構造内のスクシニル−ＣｏＡ結合部位での化合物２および３の分子ドッキングを示している。図８Ａおよび８Ｃの比較は、少なくとも１つのアミノ酸、ＡＳＮ−３７３が、化合物２および３の両方と直接結合すると予測されることを示している。図８Ｂおよび８Ｄはそれぞれ、ＡＣＡＴ１の３Ｄ結晶構造内のＣｏＡ結合部位での化合物８および６の分子ドッキングを示している。図８Ｂおよび８Ｄの比較は、少なくとも２つのアミノ酸、ＬＥＵ−１８４およびＨＩＳ-１９２が、化合物８および６の両方と直接結合すると予測されることを示している。これらの予測された主要な（dominant）結合様式は、さらなるリード最適化にとって非常に貴重であり得る。
【００５５】
ケトン体はミトコンドリア燃料として機能的に作用し、これが腫瘍成長および転移を積極的に推進し得る。これに関連して、図９に要約されているように、ＯＸＣＴ１およびＡＣＡＴ１は、ケトン再利用に関与する２つのミトコンドリアタンパク質である。本発明者らは、癌細胞が再利用ケトン体をアセチル−ＣｏＡに変えるのを防ぐためにＯＸＣＴ１およびＡＣＡＴ１を分子標的とした。このアセチル−ＣｏＡは、通常、ミトコンドリアのＡＴＰ産生を推進するＴＣＡ回路に入る。
【００５６】
図１０Ａで示されるように、ＯＸＣＴ１スクリーニングのトップヒット（化合物２）およびＡＣＡＴ１スクリーニングのヒット（化合物８）は、比較的重要でない官能性側基を除いて類似の化学構造を有する。図１１Ｂで示されるように、基礎となる「化学的足場」すなわちファーマコフォアは、両方の小分子で同じである。化合物２および８の構造は、図１２で、補酵素Ａの分子構造とも比較され、構造の類似性が実証された。
【００５７】
図１１Ａで示されるように、ＯＸＣＴ１スクリーニングからの２つの化合物（化合物３および４）は、互いに構造的に類似している。しかしながら、観察されたＩＣ−５０値に基づき、化合物３は、ＣＳＣ増殖を標的とする能力において化合物４よりもほぼ４倍強力である。これらの２つの分子を構造的に区別する独特の化学基（図１１Ａでは矢印で強調表示）が、ＣＳＣ増殖の阻害について観察された観察されたＩＣ−５０の違いに関与している可能性がある。
【００５８】
最近の研究によりアレコリンが潜在的なＡＣＡＴ１阻害薬として同定されたため、これらの研究により癌遺伝子としてのＡＣＡＴ１の役割の追加証拠が提供される。Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｒｍｕｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０１６，  ６４（５）：８５６−８５７。アレコリンは、ビンロウ（ビンロウジュ(Areca catechu)）の果実であるビンロウジに含まれるニコチン酸ベースのアルカロイドである。アレコリンは抗腫瘍活性を示し、ＡＣＡＴ１を標的とする薬物が抗癌剤として価値がある可能性があることがさらに検証された。しかしながら、本発明者らは、ＣＳＣを標的とする能力を評価しなかった。アレコリンは、非常に小さな分子であるため（化合物６および３との比較については図１０Ｂに示す）、効力を高めるために医薬品化学によりそれを大幅に変更する必要があり得る。アレコリンは、発癌性があることが知られている化合物であるため、ミトケトシンではない。
【００５９】
正常なケトン代謝は、生物飢餓および／または著しい栄養枯渇の条件下で起こるが、この調節はヒト腫瘍では失われ、癌細胞ではケトン代謝は構成的に起こるように思われる。通常の食事条件下でヒト腫瘍におけるケトン代謝を標的とすることは、代謝性副作用が最小限であると予測される。それにもかかわらず、ケトン阻害薬の潜在的な副作用は、図１３に示すように、グルコース、ピルベート、ラクテート、脂肪酸および／またはアセチル−カルニチンなどの他のミトコンドリア補助基質での追跡治療からなる「救済」工程を含むことにより大幅に改善または「制御」することができた。滅菌Ｄ−グルコースおよびＬ−ラクテート静注液（Ｄ５Ｗ、Ｄ５ＮＳ、乳酸加リンゲル液）は、他の臨床的および治療的適応のために病院ですでに日常的に使用されており、従って、追跡治療は臨床的に実現可能である。
【００６０】
本発明者らは、癌細胞において急性ＡＴＰ枯渇を誘導する化合物は、これらの細胞を放射線、紫外線、化学療法薬、天然物質、および／またはカロリー制限に対して増感させ得ることを示した。本明細書で議論されるミトケトシンにより、ＡＴＰ枯渇効果が実証された。これらの予備段階の結果に基づいて、ミトケトシンは、放射線増感剤および／または光増感剤としても使用し得る。放射線増感剤および／または光増感剤としての使用は、限定されるものではないが、当技術分野で公知の他の癌治療方法を含む他の治療ベクター、および本明細書に開示されるミトコンドリア生合成阻害による癌治療と組み合わせ得る。同様に、ミトケトシンを使用して、癌細胞塊および癌幹細胞を、化学療法薬、医薬品、および／または他の天然物質、例えば栄養補助食品、ならびにカロリー制限に対して機能的に増感させ得る。
【００６１】
抗癌および抗生物作用に加えて、本アプローチにより同定され得るミトコンドリア阻害薬は、哺乳類の老化プロセスを遅らせる可能性を有する。ミトコンドリアタンパク質翻訳の遺伝的阻害は、有益な副作用、特に老化プロセスを遅らせモデル生物の寿命を延ばすという副作用を有することが示されている。Ｍｒｐｓ５（ミトリボソームタンパク質）の低い定常状態レベルは長いネズミ寿命との機能的相関が強く、最大２５０日という大幅な寿命の延長がもたらされる。加えて、Ｃ．エレガンス(C. elegans)におけるＭｒｐｓ５の選択的ノックダウンは、寿命を劇的に延ばす。Ｍｒｐｓ５ノックダウン線虫は、ミトコンドリア呼吸およびＡＴＰ産生の大幅な減少を示す。同様に、ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ、ならびにいくつかのＴＣＡ回路酵素の線虫ホモログのノックダウンは全て、寿命を確実に延ばし、機構としてＯＸＰＨＯＳ活性の低下およびＡＴＰレベルの低下をさらに暗示した。最後に、ミトコンドリア生合成の薬理学的阻害（ドキシサイクリンのオフターゲット効果を使用）もＣ．エレガンスの寿命を大幅に延長する。従って、ミトケトシンは、老化プロセスを治療的に標的とし、寿命を延ばすために使用し得る。
【００６２】
ミトケトシンはまた、癌細胞の薬剤耐性を最小限に抑えかつ／または解除するためにも使用し得る。薬剤耐性は、少なくとも部分的には、癌細胞のミトコンドリア機能の増加に基づいていると考えられている。具体的には、タモキシフェンなどの内分泌療法に対する耐性を示す癌細胞は、ミトコンドリア機能が増加していると予想される。ミトケトシンは、ミトコンドリアの機能を阻害するため、癌細胞の薬剤耐性の低下、場合によっては、解除において有用であり得る。
【００６３】
本明細書の発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明を限定することを意図しない。発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数形も含むものとする。本発明は、以下の詳細な説明の考察から明らかになるように、数多くの選択肢、変更、および等価物を含む。
【００６４】
「第１」、「第２」、「第３」、「ａ）」、「ｂ）」、および「ｃ）」などの用語は、本明細書において、本発明の様々な要素を記載するために使用され得るが、これらの用語に限定されるものではないと理解される。これらの用語は、本発明のある要素を別の要素と区別するために使用されるにすぎない。従って、以下で論じる第１の要素は要素態様と呼ばれることがあり、同様に、本発明の教示から逸脱することなく第３の要素と呼ばれることがある。従って、「第１」、「第２」、「第３」、「ａ）」、「ｂ）」、および「ｃ）」などの用語は、必ずしも関連要素に順序または他の序列を与えることを意図せず、識別のために使用されているにすぎない。操作（または工程）の順序は、特許請求の範囲に記載されている順番に限定されない。
【００６５】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されているものなどの用語は、本出願および関連技術の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義されていない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないと理解される。本明細書の発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明を限定することを意図しない。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全内容が参照により組み込まれる。用語に矛盾がある場合には本明細書に従う。
【００６６】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」とは、関連する記載項目の１以上のありとあらゆる可能な組合せと、選択的に解釈される場合（「または」）の組み合わせない項目とを指し、それらを包含する。
【００６７】
文脈がそうではないことを意味しない限り、本明細書に記載の発明の様々な特徴をいずれの組合せで使用してもよいことが特に意図される。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態で、本明細書に記載のいずれの特徴または特徴の組合せも除外または省略可能であると考えられる。説明のために、本明細書に複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと述べられている場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組合せを省略および放棄可能であることが特に意図される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、移行句「から本質的になる」（および文法的変形）は、特許請求された発明の列挙された材料または工程「および基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。従って、用語「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、「含む」と同等であると解釈されるべきではない。
【００６９】
用語「約」は、本明細書で使用される場合、例えば、量または濃度などの測定可能な値を指す場合、±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の指定量の変動を包含することを意味する。測定可能な値について本明細書で与えられる範囲は、任意の他の範囲および／またはその中の個別の値を含み得る。
【００７０】
従って、本発明の特定の実施形態を説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明は、以下に特許請求されるその趣旨または範囲から逸脱することなく多くの明らかなその変形が可能であるため、上記の説明に記載された特定の詳細によって限定されるものではないと理解されるべきである。
【図１】
2020525009.tif 000030
【図２】
2020525009.tif 000031
【図３Ａ】
2020525009.tif 000032
【図３Ｂ】
2020525009.tif 000033
【図３Ｃ】
2020525009.tif 000034
【図３Ｄ】
2020525009.tif 000035
【図３Ｅ】
2020525009.tif 000036
【図３Ｆ】
2020525009.tif 000037
【図４Ａ】
2020525009.tif 000038
【図４Ｂ】
2020525009.tif 000039
【図４Ｃ】
2020525009.tif 000040
【図４Ｄ】
2020525009.tif 000041
【図５Ａ】
2020525009.tif 000042
【図５Ｂ】
2020525009.tif 000043
【図６Ａ】
2020525009.tif 000044
【図６Ｂ】
2020525009.tif 000045
【図７Ａ】
2020525009.tif 000046
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2020525009.tif 000048
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2020525009.tif 000050
【図８Ｄ】
2020525009.tif 000051
【図９】
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【図１０Ａ】
2020525009.tif 000053
【図１０Ｂ】
2020525009.tif 000054
【図１１Ａ】
2020525009.tif 000055
【図１１Ｂ】
2020525009.tif 000056
【図１２Ａ】
2020525009.tif 000057
【図１２Ｂ】
2020525009.tif 000058
【図１３】
2020525009.tif 000059
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月18日(2019.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
仮想ハイスループットスクリーニングおよび表現型薬物スクリーニングを使用してミトケトシンを同定する方法であって;
仮想ハイスループットスクリーニングを使用してミトコンドリアケトン再利用酵素を標的とするミトケトシンを同定すること；
前記ミトケトシンを合成すること；および
前記ミトケトシンをミトコンドリア阻害活性について試験すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記ミトケトシンはＯＸＣＴ１と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミトケトシンはＡＣＡＴ１と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表現型薬物スクリーニングはｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物スクリーニングである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記表現型薬物スクリーニングはＡＴＰ枯渇アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記表現型薬物スクリーニングは細胞外酸性化速度アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記表現型薬物スクリーニングは酸素消費速度アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ミトケトシンを抗癌活性について試験することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験される前記抗癌活性はマンモスフィア形成である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試験される前記抗癌活性は細胞遊走である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミトケトシンを抗微生物活性について試験することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
一般式：
【化１】
2020525009.tif 000060
を含むミトケトシンであって、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン。
【請求項１３】
Ｒはフッ素を含む、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項１４】
抗加齢活性を有する、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項１５】
放射線増感活性および光増感活性の少なくとも１つを有する、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項１６】
抗微生物活性を有する、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項１７】
癌幹細胞を化学療法薬に対して増感させる、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項１８】
癌幹細胞を天然物質に対して増感させる、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項１９】
癌幹細胞をカロリー制限に対して増感させる、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項２０】
ＯＸＣＴ１、ＯＸＣＴ２、ＡＣＡＴ１、およびＡＣＡＴ２の少なくとも１つと結合する、請求項１２に記載のミトケトシン。
【請求項２１】
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に
医薬上有効な量の一般式：
【化２】
2020525009.tif 000061
を含むミトケトシンであり、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン；および
医薬上許容される担体
を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
Ｒはフッ素を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
微生物感染症を治療する方法であって、それを必要とする患者に
医薬上有効な量の一般式：
【化３】
2020525009.tif 000062
を含むミトケトシンであり、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン；および
医薬上許容される担体
を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
Ｒはフッ素を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
加齢に伴う状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に
医薬上有効な量の一般式：
【化４】
2020525009.tif 000063
を含むミトケトシンであり、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン；および
医薬上許容される担体
を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
Ｒはフッ素を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物であって、有効成分として、
一般式：
【化５】
2020525009.tif 000064
を含むミトケトシンであり、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン；および
医薬上許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
Ｒはフッ素を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
一般式：
【化６】
2020525009.tif 000065
を含むミトケトシンであって、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン。
【請求項３０】
Ｒはフッ素を含む、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３１】
抗加齢活性を有する、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３２】
放射線増感活性を有する、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３３】
光増感活性を有する、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３４】
癌幹細胞を化学療法薬に対して増感させる、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３５】
癌幹細胞を天然物質に対して増感させる、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３６】
癌幹細胞をカロリー制限に対して増感させる、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３７】
ＯＸＣＴ１、ＯＸＣＴ２、ＡＣＡＴ１、およびＡＣＡＴ２の少なくとも１つと結合する、請求項２９に記載のミトケトシン。
【請求項３８】
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に
医薬上有効な量の一般式：
【化７】
2020525009.tif 000066
を含むミトケトシンであり、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン；および
医薬上許容される担体
を投与することを含む、方法。
【請求項３９】
Ｒはフッ素を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
グルコース、ピルベート、ラクテート、脂肪酸およびアセチル−カルニチンの少なくとも１つを含むミトコンドリア補助基質を投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
医薬組成物であって、有効成分として、
一般式：
【化８】
2020525009.tif 000067
を含むミトケトシンであり、式中、Ｒは、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環状アルカン、アルカン系誘導体、アルケン、環状アルケン、アルケン系誘導体、アルキン、アルキン系誘導体、ケトン、ケトン系誘導体、アルデヒド、アルデヒド系誘導体、カルボン酸、カルボン酸系誘導体、エーテル、エーテル系誘導体、エステルおよびエステル系誘導体、アミン、アミノ系誘導体、アミド、アミド系誘導体、単環式または多環式アレーン、ヘテロアレーン、アレーン系誘導体、ヘテロアレーン系誘導体、フェノール、フェノール系誘導体、安息香酸、ならびに安息香酸系誘導体からなる群から選択され得る、ミトケトシン；および
医薬上許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
Ｒはフッ素を含む、請求項４１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2020525009.tif 000068
2020525009.tif 000069
2020525009.tif 000070