(57)【要約】がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法であって、該変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己ＡＰＣを誘導することと；該患者の自己Ｔ細胞を、該変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する該自己ＡＰＣと共培養することと；該自己Ｔ細胞を選択することとを含む方法が開示される。また、細胞の集団を調製する関連方法、細胞の集団、医薬組成物、及びがんを治療又は予防する方法も開示される。【選択図】図１
2020534839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法であって、
少なくとも１つの変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導することと；
前記患者の自己Ｔ細胞を、前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する前記自己ＡＰＣと共培養することと；
（ａ）前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する前記自己ＡＰＣと共培養され、かつ（ｂ）前記患者が発現する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の枠の中で提示される前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する前記自己Ｔ細胞を選択して、前記がん特異的ｐ５３変異によってコードされている前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する単離されたＴ細胞を提供することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように前記患者の自己ＡＰＣを誘導することが、前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むペプチド、又はペプチドのプールであって、前記プールにおける各ペプチドが異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むプールをＡＰＣにパルスすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチド又はペプチドのプールが、配列番号２〜１３の１つ以上の変異型ｐ５３ペプチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように前記患者の自己ＡＰＣを誘導することが、前記変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を前記ＡＰＣに導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記自己ＡＰＣに導入される前記ヌクレオチド配列が、タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトであり、各ミニ遺伝子がｐ５３遺伝子を含み、各ｐ５３遺伝子が、変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているがん特異的ｐ５３変異を含み、前記ＴＭＧコンストラクトにおける各ｐ５３遺伝子が、異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＭＧコンストラクトが、配列番号２〜１３の１つ以上の変異型ｐ５３ペプチドをコードしている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＭＧコンストラクトが、配列番号１４のアミノ酸配列をコードしている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する前記自己Ｔ細胞を選択することが、前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する前記自己Ｔ細胞を選択的に成長させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する前記自己Ｔ細胞を選択することが、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、並びにＣＤ１０７ａのうちのいずれか１つ以上を発現するＴ細胞を選択することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する前記自己Ｔ細胞を選択することが、（ｉ）ネガティブコントロールによって分泌される１つ以上のサイトカインの量と比較して、前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するＡＰＣと共培養した際に、より多量の前記１つ以上のサイトカインを分泌するか、又は（ｉｉ）前記１つ以上のサイトカインを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、前記変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するＡＰＣと共培養した際に、１つ以上のサイトカインを分泌するＴ細胞の数が少なくとも２倍であるＴ細胞を選択することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上のサイトカインが、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２２を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離することと；
選択された自己Ｔ細胞から、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を単離することであって、前記ＴＣＲ又はその抗原結合部分が、前記がん特異的ｐ５３変異によってコードされている前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有することと、
を含む方法。
【請求項１２】
がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法であって、
請求項１１に記載の方法に従ってＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離することと、
単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に導入して、前記ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞を得ることと、
を含む方法。
【請求項１３】
がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を調製する方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従ってＴ細胞を単離することと、
選択された自己Ｔ細胞の数を拡大して、前記がん特異的ｐ５３変異によってコードされている前記変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を得ることと、
を含む方法。
【請求項１４】
その細胞の数を拡大することが、選択された細胞をフィーダーＰＢＭＣ、インターロイキン（ＩＬ）−２、及びＯＫＴ３の抗体と共に培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って調製された、単離された細胞の集団。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離された細胞の集団と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
患者におけるがんの治療又は予防において使用するための、請求項１５に記載の単離された細胞の集団又は請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記がんが、上皮がんである、請求項１７に従って使用するための単離された細胞の集団又は医薬組成物。
【請求項１９】
前記がんが、胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんである、請求項１７に従って使用するための単離された細胞の集団又は医薬組成物。
【請求項２０】
前記単離された細胞の集団が、前記患者にとって自己である、請求項１７〜１９のいずれか一項に従って使用するための、単離された細胞の集団又は前記単離された細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項２１】
前記単離された細胞の集団が、前記患者にとって同種である、請求項１７〜１９のいずれか一項に従って使用するための、単離された細胞の集団又は前記単離された細胞の集団を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年９月２９日出願の米国仮特許出願第６２／５６５，４６４号の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究及び開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、国立がん研究所によって、プロジェクト番号ＺＩＡＢＣ０１０９８４の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された文献の参照による援用
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：２０１８年９月１４日付の「７４０１７５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の６８７，６１６バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００４】
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者において正の臨床応答を生じさせることができる。それにもかかわらず、がん及び他の疾患の広範な治療においてＡＣＴの使用を成功させるには障害が残っている。例えば、がん抗原を特異的に認識するＴ細胞を同定及び／又は患者から単離することが困難である場合がある。従って、がん反応性Ｔ細胞を得るための改善された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法であって、少なくとも１つの変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導することと；該患者の自己Ｔ細胞を、該変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する該自己ＡＰＣと共培養することと；（ａ）該変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する該自己ＡＰＣと共培養され、かつ（ｂ）該患者が発現する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の枠の中で提示される該変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択して、該がん特異的ｐ５３変異によってコードされている該変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する単離されたＴ細胞を提供することと、を含む方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかに従って、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離することと；選択された自己Ｔ細胞から、該ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を単離することであって、該ＴＣＲ又はその抗原結合部分が、該がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有することと、を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の更に別の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかに従ってＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離することと、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に導入して、該ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を調製する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかに従ってＴ細胞を単離することと、選択された自己Ｔ細胞の数を拡大して、該特異的ｐ５３変異によってコードされている該変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を得ることと、を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の更なる実施形態は、関連する細胞の集団、医薬組成物、及びがんを治療又は予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】エフェクタ細胞と標的細胞との共培養後に測定された２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。エフェクタ細胞は、ＴＩＬ断片Ｆ１２、患者４１４１由来の輸液バッグＴＩＬ（Ｒｘ１）、ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲ形質導入細胞、又は患者４１９６由来のモック形質導入Ｔ細胞であった。標的細胞は、（１）無関係（ＩＲＲ；左の斜線付きの灰色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３ｗｔ−ＴＭＧ；右の斜線付きの灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；左の斜線付きの黒色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列（ＬＰ−ｐ５３−ｗｔ−Ｒ１７５；右の斜線付きの黒色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ（ＬＰ−ｐ５３−ｍｕｔ−Ｒ１７５Ｈ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ＡＰＣ（患者４１４１にとって自己）であった。Ｔ細胞のみ（標的無し；白色の棒）がネガティブコントロールであり、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）及びイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）がポジティブコントロール（格子模様の棒）であった。
【図２】（１）無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；横線付きの黒色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；左の斜線付きの黒色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２７３配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２７３−ＷＴ；左の斜線付きの灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２７３Ｈ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２７３Ｈ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４１３０由来のＴＩＬ断片（Ｆ１４、Ｆ２０、又はＦ２４）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図３】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜６、Ｆ９、Ｆ１３〜２３、ｎ＝１８）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図４】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１３〜Ｆ２３、ｎ＝１８）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図５】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１３〜Ｆ２３、ｎ＝１８）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。
【図６】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１３〜２３、ｎ＝１８）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図７】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１３〜Ｆ２３、ｎ＝１８）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図８】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１３〜Ｆ２３、ｎ＝１８）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。
【図９】（１）無関係（ＩＲＲ；左の斜線付きの白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；左の斜線付きの灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；右の斜線付きの白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｇ２４５配列（ＬＰ−ｐ５３−ｗｔ−Ｇ２４５；右の斜線付きの灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｇ２４５Ｓ（ＬＰ−ｐ５３−ｍｕｔ−Ｇ２４５Ｓ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした、同種（ＤＲＢ３＊０１：０１：０１又はＤＲＢ３＊０２：０２：０１）ＡＰＣと、患者４１２７由来のＴＩＬとを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図１０】（１）無関係（ＩＲＲ；左の斜線付きの白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；左の斜線付きの灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；右の斜線付きの白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｇ２４５配列（ＬＰ−ｐ５３−ｗｔ−Ｇ２４５；右の斜線付きの灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｇ２４５Ｓ（ＬＰ−ｐ５３−ｍｕｔ−Ｇ２４５Ｓ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした、同種（ＤＲＢ３＊０１：０１：０１又はＤＲＢ３＊０２：０２：０１）ＡＰＣと、４１２７−ＴＣＲ１を発現しているＴ細胞とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図１１】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧ（ＴＭＧ）をエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２７３由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図１２】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２７３のＴＩＬ断片Ｆ１〜Ｆ２４（ｎ＝２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図１３】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２７３由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図１４】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２７３由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図１５】（１）無関係（ＩＲＲ；右の斜線付きの黒色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ｗｔ−ＴＭＧ；左の斜線付きの黒色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０−ＷＴ；横線付きの黒色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４１４９由来の自己ＰＢＬ（４１４９−ＴＣＲａ２ｂ１又は４１４９−ＴＣＲａ２ｂ２を転移）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）及びイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）がポジティブコントロールであった（灰色の棒）。
【図１６】（１）無関係（ＩＲＲ；右の斜線付きの黒色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ｗｔ−ＴＭＧ；左の斜線付きの黒色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０−ＷＴ；横線付きの黒色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、ＴＣＲ（４１４９−ＴＣＲａ２ｂ１又は４１４９−ＴＣＲａ２ｂ２）を転移させた患者４１４９由来の自己ＰＢＬとを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。ＰＭＡ及びＩｏｎｏがポジティブコントロールであった（灰色の棒）。
【図１７】表１０のペプチドのうちの１つをパルスした自己ＤＣと、患者４１４９由来のＴＩＬとを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋Ｔ細胞の％）を示すグラフである。
【図１８】個々のＨＬＡアリル＋／−ＴＭＧをコトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞と、４１４９−ＴＣＲａ２ｂ２転移Ｔ細胞とを共培養した後のＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ＴＭＧをトランスフェクトしていない細胞に、ｐ５３Ｙ２２０Ｃ  １５ｍｅｒペプチドをパルスした。パルスした標的細胞を網掛け棒によって示す。ＴＭＧをトランスフェクトした標的細胞を、網掛け無しの棒によって示す。
【図１９】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２１３由来のＴＩＬ断片（Ｆ２及びＦ２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。
【図２０】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２１３由来のＣＤ４＋Ｔ細胞とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。ＩＦＮ−γの分泌を白色の棒によって示す。４−１ＢＢの発現を黒色の棒によって示す。
【図２１】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図２２】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図２３】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図２４】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。
【図２５】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２６６由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図２６】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２６６由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。
【図２７】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２６６由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図２８】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２６６由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。
【図２９】患者４２６６由来の個々のＨＬＡアリルをコトランスフェクトし、ペプチド無し（白色の棒）、ＤＭＳＯ（ペプチドビヒクル；灰色の棒）、ＷＴｐ５３−Ｒ２４８ペプチド（灰色の斜線付きの棒）、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗペプチド（黒色の棒）をパルスしたＣｏｓ７細胞と、患者４２６６由来のＴＩＬとを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図３０】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；灰色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（斜線付きの灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ（黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、モック（ＴＣＲ無し）、４２６６−ＴＣＲ１、４２６６−ＴＣＲ２、４２６６−ＴＣＲ３、又は４２６６−ＴＣＲ４を発現しているＴ細胞とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。培地のみ（白色の棒）並びにＰＭＡ及びイオノマイシン（格子模様の棒）が、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。
【図３１】患者４２６６から摘出され、次いで、免疫無防備状態のマウスで連続継代された異種移植腫瘍断片から樹立された腫瘍細胞（ＴＣ）株（ＴＣ＃４２６６）と、モック（ＴＣＲ無し）又はｐ５３−Ｒ２４８Ｗ特異的ＴＣＲ（４２６６−ＴＣＲ２、４２６６−ＴＣＲ３、又は４２６６−ＴＣＲ４）を発現しているＴ細胞とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。ＴＣ＃４２６６細胞を、何も無しで（黒色の棒）、Ｗ６／３２汎ＨＬＡクラスＩ特異的遮断抗体（右の灰色の斜線付き棒）、ＩＶＡ１２汎ＨＬＡクラスＩＩ特異的遮断抗体（灰色の棒）、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗペプチド（左の灰色の斜線付き棒）のいずれかと共にインキュベートした。培地のみ（ＴＣ無し；白色の棒）並びにＰＭＡ及びイオノマイシン（灰色の格子模様の棒）が、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。
【図３２】９種のｐ５３スプライスバリアントのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＳＰ｜Ｐ０４６３７｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−２｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５３５）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−３｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５３６）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−４｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５３７）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−５｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５３８）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−６｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５３９）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−７｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５４０）；ＳＰ｜Ｐ０４６３７−８｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５４１）；及びＳＰ｜Ｐ０４６３７−９｜Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ（配列番号５４２）。
【図３３】無関係の変異（灰色の棒）、ＷＴｐ５３配列（灰色の斜線付きの棒）、又はｐ５３−Ｒ２４８Ｗを含む変異型ｐ５３配列（黒色の棒）をコードしているＴＭＧをトランスフェクトした自己ＡＰＣと、患者４２７３由来のＴＩＬとを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）を示すグラフである。培地のみ（白色の棒）並びにＰＭＡ及びイオノマイシン（格子模様の棒）が、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。
【図３４】ＷＴ（白色の丸）又はｐ５３−Ｒ２４８Ｗネオエピトープ由来の変異型（黒色の四角）に対応する２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２７３由来のＴＩＬとを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。ＤＭＳＯがペプチドビヒクルであった。
【図３５】１４アミノ酸が重複しているｐ５３−Ｒ２４８Ｗネオエピトープ由来の１５アミノ酸ペプチド（太線部がアミノ酸置換）をパルスした自己ＡＰＣと、患者４２７３由来のＴＩＬとを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。ＤＭＳＯがペプチドビヒクルであり、培地のみ（Ｔ細胞のみ）並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが対照であった。２５アミノ酸ペプチド（ｗｔ  ｐ５３−Ｒ２４８及び変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ）が、１５アミノ酸ペプチドに対する更なる対照であった。ペプチドは、ＹＭＣＮＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲＰ（配列番号５９２）；ＭＣＮＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲＰＩ（配列番号５９３）；ＣＮＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲＰＩＬ（配列番号５９４）；ＮＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲＰＩＬＴ（配列番号５９５）；ＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩ（配列番号５９６）；ＳＣＭＧＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩＩ（配列番号５９７）；ＣＭＧＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩＩＴ（配列番号５９８）；ＭＧＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩＩＴＬ（配列番号５９９）；ＧＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥ（配列番号６００）；ＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥＤ（配列番号６０１）；及びＭＮＷＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥＤＳ（配列番号６０２）である。
【図３６】それぞれｐ５３−Ｒ２４８Ｗネオ抗原の有り無しで、患者４２７３由来の個々のＨＬＡアリルとＷＴ（白色の棒）又は変異型（黒色の棒）ＴＰ５３  ＴＭＧのいずれかとをコトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞を、患者４２７３由来のＴＩＬと共培養した後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図３７】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；灰色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列（斜線付きの灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ（黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、モック（ＴＣＲ無し）又は４２７３−ＴＣＲ１ａ２を発現しているＴ細胞とを共培養した後に測定された、２×１０４個の細胞あたりのＩＦＮ−γスポット数を示すグラフである。培地のみ（白色の棒）並びにＰＭＡ及びイオノマイシン（格子模様の棒）が、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。
【図３８】（１）無関係（ＩＲＲ；左の斜線付きの灰色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３ｗｔ−ＴＭＧ；右の斜線付きの灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；左の斜線付きの黒色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列（ＬＰ−ｐ５３−ｗｔ−Ｒ１７５；右の斜線付きの黒色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ（ＬＰ−ｐ５３−ｍｕｔ−Ｒ１７５Ｈ；黒色の棒）の配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣ（未成熟ＤＣ）と、患者４２５２由来のＴＩＬ断片Ｆ１、Ｆ３、Ｆ７、又はＦ１９とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。Ｔ細胞のみ（標的無し；白色の棒）がネガティブコントロールであり、ＰＭＡ及びＩｏｎｏがポジティブコントロールであった（格子模様の棒）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。線によって示される群間でスチューデントのｔ検定を実施した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３９】（１）無関係（ＩＲＲ；左の斜線付きの灰色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３ｗｔ−ＴＭＧ；右の斜線付きの灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧ；灰色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；左の斜線付きの黒色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２８２配列（ＬＰ−ｐ５３−ｗｔ−Ｒ２８２；右の斜線付きの黒色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２８２Ｗ（ＬＰ−ｐ５３−ｍｕｔ−Ｒ２８２Ｗ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣ（未成熟ＤＣ）と、患者４２７０由来のＴＩＬ断片Ｆ１３又はＦ１６とを共培養した後に測定された、２×１０４個の細胞あたりのＩＦＮ−γスポット数を示すグラフである。Ｔ細胞のみ（標的無し；白色の棒）がネガティブコントロールであり、ＰＭＡ及びＩｏｎｏがポジティブコントロールであった（格子模様の棒）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図４０】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３−ＷＴ；灰色の棒）、又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２８５由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜２４、ｎ＝１８）とを共培養した後に測定された、２×１０４個の細胞あたりのＩＦＮ−γスポット数を示すグラフである。
【図４１】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ１７５−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２８５由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝１８）とを共培養した後に測定された、２×１０４個の細胞あたりのＩＦＮ−γスポット数を示すグラフである。
【図４２】無関係（ＩＲＲ；白色の棒）、ＷＴｐ５３（ｐ５３ＷＴ；灰色の棒）又は変異型ｐ５３（ｐ５３−ＭＵＴ；黒色の棒）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと、患者４２８５由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝１８）とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図４３】ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；白色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ１７５−ＷＴ；灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ（ＬＰ−ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ−ＭＵＴ；黒色の棒）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２８５由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝１８）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図４４】シーケンスした１４１の上皮がんにおける指定のｐ５３コドンに位置する各ミスセンスｐ５３変異の全体変異頻度（％）を示すグラフである。
【図４５】無関係の変異（ＴＭＧ−ＩＲＲ）、ＷＴｐ５３配列（ＴＰ５３−ｗｔ−ＴＭＧ）、又はＲ１７５Ｈを含む変異型ｐ５３配列（ＴＰ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧ）をコードしているＴＭＧをトランスフェクトした自己ＡＰＣと、患者４１４１由来のＴＩＬ（断片培養物１２）とを共培養した後に測定された、４−１ＢＢ陽性細胞の百分率（ＣＤ８＋の％）（右のｙ軸；黒色の棒）及びＩＦＮ−γ（２×１０４個の細胞あたりのスポット）（左のｙ軸；斜線付きの棒）を示すグラフである。培地のみ並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。
【図４６】指定のＨＬＡアリル及び追加の遺伝子無し（ＨＬＡのみ；白色の棒）、ＷＴ  ＴＰ５３  ＴＭＧ（灰色の斜線付きの棒）、又はｐ５３−Ｒ１７５Ｈ配列を含有する変異型（黒色の棒）ＴＰ５３  ＴＭＧをコトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞と、患者４１４１由来のＴＩＬ（断片培養物１２）とを共培養した後に測定された、２×１０４個のエフェクタ細胞あたりのＩＦＮ−γ陽性スポット数を示すグラフである。
【図４７】モック（ＴＣＲ無し）又は４１４１−ＴＣＲ１ａ２を発現しているＴ細胞をＴ２腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を発現）と共培養した後に測定されたＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ；灰色の棒）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５ペプチド（斜線付きの灰色の棒）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈペプチド（黒色の棒）から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）されたペプチドを、Ｔ２細胞にパルスした。培地のみ（白色の棒）並びにＰＭＡ及びイオノマイシン（格子模様の棒）が、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図４８】操作されていない（網掛け無しの棒）又は完全長ｐ５３−Ｒ１７５Ｈタンパク質を過剰発現するようにされた（網掛け棒）Ｓａｏｓ２細胞（ｐ５３−ＮＵＬＬ及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋）と、４１４１−ＴＣＲ１ａ２を発現しているＴ細胞とを共培養した後の、指定のマーカーのうちの１つの発現について陽性である細胞の百分率を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。統計解析のために２つの細胞株間で各サイトカインについてスチューデントの両側ｔ検定を実施した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４９】（１）無関係（ＴＭＧ−ＩＲＲ）、ＷＴｐ５３（ＴＭＧ−ｐ５３−ＷＴ）、又は変異型ｐ５３（ＴＭＧ−ｐ５３−ＭＵＴ）の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０−ＷＴ）若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（ＬＰ−ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ−ＭＵＴ）配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、ＴＩＬ（患者４２５９由来の断片培養物６）とを共培養した後に検出された、ＣＤ４＋４−１ＢＢ陽性細胞の百分率を示すグラフである。
【図５０】漸減濃度の、ＷＴｐ５３配列（白色の丸）又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ（黒色の四角）に対応する２５アミノ酸ペプチドを３７℃で２時間パルスした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬ断片培養物（６番）とを共培養した後に検出されたＣＤ４＋４−１ＢＢ陽性細胞の百分率を示すグラフである。
【図５１】ＤＭＳＯ、ＷＴｐ５３−Ｙ２２０ペプチド、又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、患者４２５９由来のＴＩＬとを共培養した後に検出されたＣＤ４＋４−１ＢＢ陽性細胞の百分率を示すグラフである。
【図５２】患者４２５９由来の指定のＨＬＡアリルをコトランスフェクトし、ＤＭＳＯ（白色の棒）又はｐ５３−Ｙ２２０Ｃペプチド（黒色の棒）をパルスしたＣｏｓ７細胞と、患者４２５９由来のＴＩＬ断片培養物６番とを共培養した後に検出された、４−１ＢＢ陽性細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図５３】モック（ＴＣＲ無し；白色の棒）又はｐ５３−Ｙ２２０Ｃ特異的ＴＣＲ（４２５９−Ｆ６−ＴＣＲ；黒色の棒）を発現しているエフェクタＴ細胞（１０５個）と、ＴＣ＃４２５９標的細胞（ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１：０１を内因的に発現している）とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率を示すグラフである。ＴＣ＃４２５９細胞を、何も無しで、Ｗ６／３２汎ＨＬＡクラスＩ特異的遮断抗体、ＩＶＡ１２汎ＨＬＡクラスＩＩ特異的遮断抗体、又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃペプチドと共にインキュベートした。培地のみ（ＴＣ無し）並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。統計解析のために指定の通りの群間でスチューデントの両側ｔ検定を実施した（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５４】指定のＨＬＡアリルをトランスフェクトし、ＤＭＳＯ（ペプチドビヒクル；灰色及び黒色の斜線付きの棒）又は変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈペプチド（灰色、格子模様付き、及び黒色の棒）をパルスしたＣｏｓ７細胞と、ＴＩＬ断片培養物４２８５−Ｆ６、４２８５−Ｆ９、及び４２８５−Ｆ１０とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【図５５】漸減濃度の、ＷＴ（白色の丸及び四角）又は変異型（黒色の丸及び四角）ｐ５３−Ｒ１７５Ｈの配列に対応する２５又は１５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと、４２８５−ＴＣＲ１を転移させたＴ細胞とを共培養した後に検出された４−１ＢＢ＋細胞の百分率（ＣＤ４＋の％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
腫瘍タンパク質Ｐ５３（「ＴＰ５３」又は「ｐ５３」とも称される）は、例えば、細胞分裂を制御することによって腫瘍抑制因子として作用する。ｐ５３タンパク質は、細胞の核内に位置し、そこでＤＮＡに直接結合する。ＤＮＡが損傷を受けると、ｐ５３タンパク質は、ＤＮＡを修復するか又は損傷を受けた細胞をアポトーシスさせるかの決定に関与する。ＤＮＡを修復することができる場合、ｐ５３は他の遺伝子を活性化させて損傷を修復する。ＤＮＡを修復することができない場合、ｐ５３タンパク質は、細胞が分裂するのを阻止し、該細胞にシグナルを伝達してアポトーシスさせる。変異型の又は損傷を受けたＤＮＡを有する細胞の分裂を停止させることによって、ｐ５３は腫瘍の発達を阻止するのに役立つ。野生型（ＷＴ）完全長ｐ５３は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
ｐ５３タンパク質における変異によって、ｐ５３タンパク質の腫瘍抑制因子機能が低下するか又は失われることがある。あるいは又は更に、ｐ５３変異は、ドミナントネガティブ方式で野生型ｐ５３に干渉することによる機能獲得型変異であり得る。変異型ｐ５３タンパク質は、様々なヒトがん、例えば、胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんのいずれかで発現し得る。
【００１３】
本発明の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされているｐ５３変異型アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法を提供する。ｐ５３の変異は、本明細書では、完全長ＷＴｐ５３（配列番号１）のアミノ酸配列を参照することによって定義される。従って、ｐ５３の変異は、本明細書では、特定の位置に存在するアミノ酸残基、続いて、位置番号、続いて、検討中の特定の変異において該残基に置き換わったアミノ酸を参照することによって記載される。例えば、位置が配列番号１によって定義される場合、用語「Ｒ１７５」とは、配列番号１の１７５位に存在するアルギニンを指し、「Ｒ１７５Ｈ」は、配列番号１の１７５位に存在するアルギニンがヒスチジンに置き換わっていることを示し、一方、「Ｇ２４５Ｓ」は、配列番号１の２４５位に存在するグリシンがセリンに置き換わっていることを示す。Ｐ５３は、９種の公知のスプライスバリアントを有する。本明細書に記載のｐ５３変異は、９種のｐ５３スプライスバリアントの全てにわたって保存されている。９種のｐ５３スプライスバリアントのアラインメントを図３２に示す。従って、本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、９種のｐ５３スプライスバリアントのいずれかによってコードされている本明細書に記載の任意の変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有し得る。位置が配列番号１によって定義される場合、ｐ５３の特定のスプライスバリアントのアミノ酸配列の実際の位置は、配列番号１の対応する位置に対して定義され、配列番号１によって定義される位置は、特定のスプライスバリアントにおける実際の位置とは異なる場合がある。従って、例えば、スプライスバリアントにおける実際の位置が異なる場合もあるという理解の下、変異とは、配列番号１の３９３アミノ酸の配列の指定の位置に対応するｐ５３の特定のスプライスバリアントのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の置換を指す。
【００１４】
本発明の実施形態は、多くの利点のうちのいずれか１つ以上を提供することができる。変異型ｐ５３は、がん細胞で発現し、正常非がん細胞では発現しない。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、有利には、例えば毒性を最小化又は排除することによって、正常非がん細胞の破壊を最小化又は排除すると同時に、がん細胞の破壊を標的とし、それによって、低減すると考えられる。更に、本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、有利には、例えば化学療法、外科手術、又は放射線照射等の他の種類の治療には応答しない変異型ｐ５３陽性がんを成功裏に治療又は予防することができる。更に、本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、変異型ｐ５３を高い結合活性で（ｈｉｇｈｌｙ  ａｖｉｄ）認識することができ、これによって、操作されていない腫瘍細胞（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−γで処理されていない、変異型ｐ５３及び適用可能なＨＬＡ分子の一方又は両方をコードしているベクターをトランスフェクトしていない、ｐ５３変異を有するｐ５３ペプチドをパルスしていない、又はこれらの組み合わせの腫瘍細胞）を認識する能力が付与され得る。全ての腫瘍のおよそ半分はｐ５３に変異を有し、そのうちの約半分はミスセンス変異であり、該ミスセンス変異のうちの約３０％は、以下の「ホットスポット」残基に生じる：Ｒ１７５Ｈ、Ｙ２２０Ｃ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｌ、Ｒ２７３Ｈ、及びＲ２８２Ｗ。更に、血縁関係のないヒトの腫瘍において、ｐ５３で同じ「ホットスポット」変異（例えば、Ｒ１７５Ｈ、Ｙ２２０Ｃ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｌ、又はＲ２８２Ｗ）が頻繁に生じる（累積的に、ｐ５３ミスセンス変異の約３０％）。従って、本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、免疫療法による治療の適格性を有する可能性のある患者の数を増加させることができる。
【００１５】
本発明の方法は、がん変異反応性Ｔ細胞を単離する従来の方法と比較して、より迅速、より集中的、そして、より特異的であり得る。このような従来の方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２１８０４２号及び同第２０１７／０２２４８００号に記載の通り（以後「従来のスクリーニング方法」）、患者で発現するがん特異的変異（例えば、ネオ抗原）を含有する遺伝子（複数可）を同定した後に、同定された遺伝子（複数可）によってコードされているがん特異的変異を含むペプチドを提示する患者の自己抗原提示細胞と患者の自己Ｔ細胞とを共培養することを含む。本発明の方法を用いると、ｐ５３変異が患者の腫瘍で同定されたら、患者の腫瘍における他の変異の知見とは関係なく患者のＴ細胞を試験することができるように、ｐ５３変異を含むペプチド及びタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）を生成し、ストックし、患者をスクリーニングする前に検証することができる。これによって、方法を実行するのに必要な時間を短縮することができ、これは、末期病状にある患者を評価するときに特に有利であり得る。例えば、本発明の方法の期間は、例えば、従来のスクリーニング方法よりも約３〜約６週間短くできる。また、本発明の方法は、他の競合変異の非存在下におけるｐ５３変異応答に高度に集中した研究を提供し得る。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、患者の変異に由来するＴＭＧ（ｐ５３以外のタンパク質における変異を有する）におけるペプチド又は競合ペプチドのプールは、変異型ｐ５３ペプチドに干渉することができ、Ｔ細胞応答をマスクすることができると考えられる。本発明の方法は１つの遺伝子ｐ５３だけに集中するので、本発明の方法は、どのネオ抗原がＴ細胞応答を生じさせたかを判定するためにペプチドプール又はＴＭＧにおけるネオ抗原を解析することを伴う従来のスクリーニング方法と比較して、ｐ５３変異特異的なＴ細胞及びＴＣＲを同定する試みにおいて速度及び効率を増大させることができる。本発明の方法は、有利には、自己又は同種の療法に有用なＴ細胞及び／又はＴＣＲを生成することができる。ｐ５３変異に集中することによって、ハイスループットの従来のスクリーニング方法では強度が弱くなる（ｄｉｌｕｔｅｄ）可能性がある低頻度応答を同定することが可能になり得、本発明の方法でなければ数十〜数百のネオ抗原をスクリーニングする煩雑さの中で失われるであろうＴ細胞及びＴＣＲを同定することが可能になる。本発明の方法は、患者が対応する変異又は更には腫瘍を有しているかどうかの知見とは関係なく、患者におけるＴ細胞応答を試験するのに有用であり得る。本発明の方法は、規定のＨＬＡハプロタイプ及び予測されるｐ５３変異結合を有する患者のスクリーニングに有用であり得るが、この種のコホートのスクリーニングには限定されない。
【００１６】
がん特異的ｐ５３変異は、変異型ｐ５３アミノ酸配列（「非サイレント変異」とも称される）をコードしており、がん細胞では発現するが、正常非がん細胞では発現しないｐ５３遺伝子における任意の変異であり得る。がん特異的ｐ５３変異の非限定的な例としては、ミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失、重複、フレームシフト、及び反復伸長の変異が挙げられる。好ましい実施形態では、ｐ５３変異はミスセンス変異である。
【００１７】
本発明の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列は、配列番号１の１７５位、２２０位、２４５位、２４８位、２４９位、２７３位、又は２８２位に変異を有するヒトｐ５３アミノ酸配列を含む。ｐ５３変異は、任意のミスセンス変異であってよい。従って、配列番号１の１７５位、２２０位、２４５位、２４８位、２４９位、２７３位、又は２８２位における変異は、配列番号１の１７５位、２２０位、２４５位、２４８位、２４９位、２７３位、又は２８２位に存在するネイティブ（ＷＴ）アミノ酸残基の、検討中の特定の位置に存在するネイティブ（ＷＴ）アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基による置換であってよい。本発明の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列は、以下のヒトｐ５３変異のうちの１つを有するヒトｐ５３アミノ酸配列を含む：Ｒ１７５Ｈ、Ｙ２２０Ｃ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｌ、又はＲ２８２Ｗ。例えば、変異型ｐ５３アミノ酸配列は、配列番号２〜１３からなる群から選択される変異型ｐ５３アミノ酸配列を含み得る。
【００１８】
該方法は、少なくとも１つの変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように、患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導することを含み得る。ＡＰＣは、その細胞表面上で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合しているタンパク質のペプチド断片を提示する任意の細胞を含み得る。ＡＰＣは、例えば、マクロファージ、ＤＣ、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球、及びＴ細胞のうちのいずれか１つ以上を含み得る。好ましくは、ＡＰＣはＤＣである。患者由来の自己ＡＰＣを使用することによって、本発明の方法は、有利には、患者が発現するＭＨＣ分子の枠の中で提示されるがん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を同定することができる。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲの分子が挙げられるがこれらに限定されない、患者で発現する任意のＭＨＣ分子であってよい。本発明の方法は、有利には、例えば、わずかな選択されたＭＨＣクラスＩアリルに対してのみ有用であり得、ｐ５３変異反応性Ｔ細胞を選択するための試薬（例えば、ＭＨＣテトラマーの不完全なセット）の入手可能性の制限によって制約を受け得るＭＨＣ分子又は変異型ｐ５３アミノ酸配列を同定するためのエピトープ予測アルゴリズムを使用することなく、患者が発現する任意のＭＨＣ分子の枠の中で提示される変異型ｐ５３アミノ酸配列を同定することができる。従って、本発明の実施形態では、本発明の方法は、有利には、患者が発現する任意のＭＨＣ分子の枠の中で変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するようにＡＰＣを誘導し、任意の特定のＭＨＣ分子には限定されない。好ましくは、自己ＡＰＣは、抗原陰性自己ＡＰＣである。
【００１９】
少なくとも１つの変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己ＡＰＣを誘導することは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して実行することができる。本発明の実施形態では、少なくとも１つの変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己ＡＰＣを誘導することは、１つ以下の変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドのプールであって、該プールにおける各ペプチドが異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むプールを自己ＡＰＣにパルスすることを含む。これに関して、ＡＰＣがペプチド（複数可）を内部に移行させ、ＭＨＣ分子に結合している変異型ｐ５３アミノ酸配列（複数可）を細胞膜上で提示するように、変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドのプールと共に自己ＡＰＣを培養してよい。ＡＰＣにパルスする方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｓｏｌｈｅｉｍ（Ｅｄ．），Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，（２０１０）に記載されている。ＡＰＣにパルスするために使用されるペプチド（複数可）は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸（複数可）を含み得る。ペプチド（複数可）は、変異型アミノ酸（複数可）のカルボキシル側及びアミノ側のそれぞれに、ｐ５３遺伝子によってコードされている内因性ｐ５３タンパク質由来の任意の好適な数の連続アミノ酸を更に含み得る。変異のそれぞれの側に隣接する内因性ｐ５３タンパク質由来の連続アミノ酸の数は限定されず、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲であってよい。好ましくは、ペプチド（複数可）は、変異型アミノ酸（複数可）のそれぞれの側に、内因性ｐ５３タンパク質由来の約１２の連続アミノ酸を含む。実施形態では、ペプチド又はペプチドのプールは、配列番号２〜１３の変異型ｐ５３ペプチドのうちの１つ以上を含む（表１）。
【００２０】
本発明の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己ＡＰＣを誘導することは、変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列をＡＰＣに導入することを含む。ＡＰＣが、変異型ｐ５３アミノ酸を発現し、ＭＨＣ分子に結合している変異型ｐ５３アミノ酸をその細胞膜上で提示するように、ヌクレオチド配列をＡＰＣに導入する。変異型ｐ５３アミノ酸をコードしているヌクレオチド配列は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。ヌクレオチド配列のＡＰＣへの導入は、例えば、Ｓｏｌｈｅｉｍら、前記に記載されている通り、当技術分野において公知の様々な異なる方法のいずれかで実施してよい。ヌクレオチド配列をＡＰＣに導入するのに有用な技術の非限定的な例としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。実施形態では、該方法は、それぞれが異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしている１つを超えるヌクレオチド配列を調製し、各ヌクレオチド配列を自己ＡＰＣの異なる集団に導入することを含み得る。これに関して、各集団が異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列を発現し、提示する自己ＡＰＣの複数の集団を得ることができる。
【００２１】
実施形態では、該方法は、１つを超える変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を導入することを含み得る。これに関して、本発明の実施形態では、自己ＡＰＣに導入されるヌクレオチド配列は、各ミニ遺伝子がｐ５３遺伝子を含み、各ｐ５３遺伝子が、異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているがん特異的ｐ５３変異を含む、タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトである。各ミニ遺伝子は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、内因性ｐ５３タンパク質由来の任意の好適な数の連続アミノ酸とｐ５３変異のそれぞれの側で隣接している１つのｐ５３変異をコードしていてよい。コンストラクトにおけるミニ遺伝子の数は限定されず、例えば、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、若しくはそれ以上、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲を含み得る。本発明の実施形態では、ＴＭＧコンストラクトは、配列番号２〜１３の１つ以上の変異型ｐ５３ペプチドをコードしている。例えば、ＴＭＧコンストラクトは、配列番号１４のアミノ酸配列をコードしていてよい。ＡＰＣは、ＴＭＧコンストラクトによってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列を発現し、ＭＨＣ分子に結合している変異型ｐ５３アミノ酸配列を細胞膜上で提示する。実施形態では、該方法は、各コンストラクトが異なるセットの変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしている１つを超えるＴＭＧコンストラクトを調製し、各ＴＭＧコンストラクトを自己ＡＰＣの異なる集団に導入することを含み得る。これに関して、各集団が異なるＴＭＧコンストラクトによってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列を発現し、提示する、自己ＡＰＣの複数の集団を得ることができる。
【００２２】
該方法は、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共に患者の自己Ｔ細胞を培養することを含み得る。Ｔ細胞は、腫瘍、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは流体が挙げられるがこれらに限定されない、患者における多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、末梢血Ｔ細胞、メモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の両方であってよい。該方法は、自己Ｔ細胞がＡＰＣによって提示される変異型ｐ５３アミノ酸配列に特異的に結合し、免疫学的に認識するように、ＡＰＣによって提示される変異型ｐ５３アミノ酸配列にＴ細胞が遭遇するように、自己Ｔ細胞及び自己ＡＰＣを共培養することを含み得る。本発明の実施形態では、自己Ｔ細胞を自己ＡＰＣと直接接触して共培養する。
【００２３】
該方法は、（ａ）変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養され、かつ（ｂ）患者が発現するＭＨＣ分子の枠の中で提示される変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することを含み得る。語句「抗原特異性」とは、本明細書で使用するとき、自己Ｔ細胞が、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に特異的に結合し、免疫学的に認識できることを意味する。該選択は、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を同定し、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有しないＴ細胞からそれを分離することを含み得る。変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞の選択は、任意の好適な方法で実施してよい。本発明の実施形態では、該方法は、自己Ｔ細胞を選択する前に、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２若しくはＩＬ−１５等のＴ細胞成長因子と共培養することによって又は本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、自己Ｔ細胞の数を拡大することを含む。本発明の実施形態では、該方法は、自己Ｔ細胞を選択する前に、例えばＩＬ−２又はＩＬ−１５等のＴ細胞成長因子を用いて自己Ｔ細胞の数を拡大することを含まない。
【００２４】
例えば、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するＡＰＣと自己Ｔ細胞を共培養した際、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞は、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を同定するために使用することができる様々なＴ細胞活性化マーカーのうちのいずれか１つ以上を発現し得る。このようなＴ細胞活性化マーカーとしては、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、並びにＣＤ１０７ａを挙げることができるが、これらに限定されない。従って、本発明の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞の選択は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、並びにＣＤ１０７ａのうちのいずれか１つ以上を発現するＴ細胞を選択することを含む。例えば、Ｔｕｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０（２）：３３１−４３（２０１３）及びＧｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２４（５）：２２４６−５９（２０１４）に記載の通り、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）又は磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）等の当技術分野において公知の様々な技術のいずれかを使用して、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞を該マーカーの発現に基づいてソートすることができる。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞の選択は、（ｉ）ネガティブコントロールによって分泌される１つ以上のサイトカインの量と比較して、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するＡＰＣと共培養した際に、より多量の１つ以上のサイトカインを分泌するか、又は（ｉｉ）１つ以上のサイトカインを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するＡＰＣと共培養した際に、１つ以上のサイトカインを分泌するＴ細胞の数が少なくとも２倍であるＴ細胞を選択することを含む。１つ以上のサイトカインは、Ｔ細胞によるその分泌がＴ細胞の活性化に特徴的である任意のサイトカインを含み得る（例えば、変異型ｐ５３アミノ酸配列に特異的に結合し、免疫学的に認識するＴ細胞によって発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ））。その分泌がＴ細胞の活性化に特徴的であるサイトカインの非限定的な例としては、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２２が挙げられる。
【００２６】
例えば、ネガティブコントロールによって分泌されるＩＦＮ−γの量と比較して、（ａ）ある濃度（例えば、約０．０５ｎｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、例えば、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬ）の変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むペプチドをパルスした抗原陰性ＡＰＣ又は（ｂ）変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣと共培養した際に、Ｔ細胞が少なくとも２倍のＩＦＮ−γを分泌する場合、自己Ｔ細胞が変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ネガティブコントロールは、例えば、（ａ）同濃度の無関係のペプチド（例えば、野生型アミノ酸配列、又は変異型ｐ５３アミノ酸配列に由来する異なる配列を有する幾つかの他のペプチド）をパルスした抗原陰性ＡＰＣ又は（ｂ）無関係のペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣと共培養した（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の）自己Ｔ細胞であってよい。また、ネガティブコントロール、例えば上記ネガティブコントロールと比較して、より高濃度の変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むペプチドをパルスした抗原陰性ＡＰＣと共培養した際にＴ細胞がより多量のＩＦＮ−γを分泌した場合も、自己Ｔ細胞が変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して「抗原特異性」を有している可能性がある。ＩＦＮ−γ分泌は、当技術分野において公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。
【００２７】
あるいは又は更に、ＩＦＮ−γを分泌するネガティブＴ細胞の数と比較して、（ａ）ある濃度の変異型ｐ５３アミノ酸配列を含むペプチドをパルスした抗原陰性ＡＰＣ又は（ｂ）変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣと共培養した際に、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数が少なくとも２倍であった場合、自己Ｔ細胞が変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ペプチドの濃度及びネガティブコントロールは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。ＩＦＮ−γを分泌する細胞の数は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定することができる。
【００２８】
あるいは又は更に、同じ標的細胞と共培養したネガティブコントロールＴ細胞についてＥＬＩＳＰＯＴによって検出されたスポット数と比較して、（ａ）低濃度の変異型ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異型ｐ５３を発現するように変異型ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、Ｔ細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴによって少なくとも２倍のスポットが検出された場合、自己Ｔ細胞が変異型ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ペプチドの濃度及びネガティブコントロールは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。
【００２９】
あるいは又は更に、（ａ）低濃度の変異型ｐ５３ペプチドをパルスした抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異型ｐ５３を発現するように変異型ｐ５３をコードしているヌクレオチド配列を導入した抗原陰性適用可能なＨＬＡ分子陽性の標的細胞と共培養した際に、ＴＣＲを発現しているＴ細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴによって約５０個を超えるスポットが検出された場合、自己Ｔ細胞が変異型ｐ５３に対して「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ペプチドの濃度は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。
【００３０】
変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞は、（１）本明細書に記載の任意の１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する及び（２）本明細書に記載の１つ以上のサイトカインをより多量に分泌するの両方である場合もあるが、本発明の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞が、より多量の１つ以上のサイトカインを分泌することなく任意の１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現することもあり、任意の１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現することなくより多量の１つ以上のサイトカインを分泌することもある。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞の選択は、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択的に成長させることを含む。これに関して、該方法は、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有しないＴ細胞よりも、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の成長を好むように、自己Ｔ細胞を自己ＡＰＣと共培養することを含み得る。従って、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有しないＴ細胞と比較して、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞をより高い比率で有するＴ細胞の集団が提供される。
【００３２】
本発明の実施形態では、該方法は、患者から腫瘍の複数の断片を入手することと、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと該複数の断片のそれぞれに由来する自己Ｔ細胞とを別々に共培養することと、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対する抗原特異性について、複数の断片のそれぞれに由来するＴ細胞を別々に評価することと、を更に含む。
【００３３】
複数の変異型ｐ５３アミノ酸配列（例えば、ＴＭＧコンストラクトによってコードされている複数の変異型ｐ５３アミノ酸配列、又は自己ＡＰＣにパルスしたペプチドのプールにおける複数の変異型ｐ５３アミノ酸配列）を発現している自己ＡＰＣとＴ細胞を共培養する本発明の実施形態では、自己Ｔ細胞の選択は、複数の変異型ｐ５３アミノ酸配列のそれぞれに対する抗原特異性について自己Ｔ細胞を別々に評価することを更に含み得る。例えば、本発明の方法は、（例えば、コンストラクトによってコードされている（又はプールに含まれている）異なる変異型ｐ５３アミノ酸配列をそれぞれ提示する別々のＡＰＣ集団を提供することによって）、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、コンストラクトによってコードされている（又はプールに含まれている）各変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己ＡＰＣを別々に誘導することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、各変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣの異なる集団と患者の自己Ｔ細胞とを別々に共培養することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、（ａ）変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養され、かつ（ｂ）患者が発現するＭＨＣ分子の枠の中で提示される変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を別々に選択することを更に含み得る。これに関して、該方法は、複数の変異型ｐ５３アミノ酸配列をコードしているＴＭＧコンストラクトによってコードされている（又はプールに含まれている）変異型ｐ５３アミノ酸配列のどれが、（例えば、排除のプロセスによって）自己Ｔ細胞によって免疫学的に認識されるかを判定することを含み得る。
【００３４】
本発明の実施形態では、該方法は、選択された自己Ｔ細胞の数を拡大して、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を得ることを更に含む。選択された細胞の数の拡大は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号、同第８，３８３，０９９号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２−４２（２００３）、及びＲｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９−２０１（１９９０）に記載されている通り、当技術分野において公知の多数の方法のいずれかによって実現することができる。実施態様では、Ｔ細胞数の拡大は、該Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、放射線照射された同種ＰＢＭＣ）と共に培養することによって実行される。これに関して、本発明の方法は、有利には、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する多数のＴ細胞を生成することができる。
【００３５】
本発明の方法によって単離されるＴ細胞は、養子細胞療法のために細胞を調製するのに有用であり得る。これに関して、本発明の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を調製する方法であって、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りＴ細胞を単離することと、選択された自己Ｔ細胞の数を拡大して、がん特異的変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の集団を得ることとを含む方法を提供する。選択された細胞の数の拡大は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り実施してよい。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合部分を単離する方法を提供する。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離することを含み得る。
【００３７】
該方法は、選択されたＴ細胞から、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を単離することを更に含み得る。本発明の実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を単離する前に、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する選択されたＴ細胞の数を拡大してよい。選択された細胞の数の拡大は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り実施してよい。本発明の別の実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を単離する前に、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する選択されたＴ細胞の数を拡大させない。例えば、ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、単一細胞から単離され得る。
【００３８】
ＴＣＲの「抗原結合部分」とは、本明細書で使用するとき、該抗原結合部分が本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り変異型ｐ５３アミノ酸配列に特異的に結合する限り、該抗原結合部分がその一部であるＴＣＲの連続アミノ酸を含む任意の部分を指す。用語「抗原結合部分」は、ＴＣＲの任意の部分又は断片であって、該部分又は断片がその一部であるＴＣＲ（親ＴＣＲ）の生物活性を保持している部分又は断片を指す。抗原結合部分は、例えば、親ＴＣＲと比較して同様の程度、同一程度、又はより高程度、変異型ｐ５３アミノ酸配列に特異的に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防する能力を保持しているＴＣＲの部分を包含する。親ＴＣＲに関連して、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％、又はそれ以上を構成し得る。
【００３９】
抗原結合部分は、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の抗原結合部分、例えば、ＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む部分を含み得る。本発明の実施形態では、抗原結合部分は、α鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１α）、α鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２α）、α鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）、β鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１β）、β鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２β）、β鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）、又はこれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗原結合部分は、ＴＣＲのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及びＣＤＲ３αのアミノ酸配列；ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βのアミノ酸配列；又はＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βの全てのアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明の実施形態では、抗原結合部分は、例えば、上記ＣＤＲ領域の組み合わせを含むＴＣＲの可変領域を含み得る。これに関して、抗原結合部分は、ＴＣＲのα鎖の可変領域（Ｖα）のアミノ酸配列、β鎖の可変領域（Ｖβ）のアミノ酸配列、又はＶα及びＶβの両方のアミノ酸配列を含み得る。
【００４１】
本発明の実施形態では、抗原結合部分は、可変領域と定常領域との組み合わせを含み得る。これに関して、抗原結合部分は、ＴＣＲのα鎖若しくはβ鎖、又はα鎖及びβ鎖の両方の全長を含み得る。
【００４２】
選択されたＴ細胞からのＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列の単離は、当技術分野において公知の任意の好適な方法で実施してよい。例えば、該方法は、選択されたＴ細胞からＲＮＡを単離し、例えば、ＴＣＲ−α及び−β鎖定常プライマーを使用するｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の確立された分子クローニング技術及び試薬を使用して、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をシーケンスすることを含み得る。あるいは又は更に、ＴＣＲ核酸配列を単離するのに有用な技術及びシステムとしては、例えば、単一細胞逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、バイオインフォマティックリコンストラクション、限界希釈クローニング、ＦＬＵＩＤＩＧＭシステム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、対合頻度を使用するＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のディープシーケンシング、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）製のＴＣＲα鎖及びβ鎖対を同定するためのＰＡＩＲＳＥＱ法、並びにこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００４３】
本発明の実施形態では、該方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；４ｔｈ  Ｅｄ．（２０１２）に記載されている、確立された分子クローニング技術を使用して、ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を組み換え発現ベクターにクローニングすることを含み得る。本明細書における目的のために、用語「組み換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含み、宿主細胞内で該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下でベクターを該細胞と接触させたときに、該細胞に該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させる、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。しかし、ベクターの一部が天然に存在していてもよい。組み換え発現ベクターは、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））及びＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない任意の種類のヌクレオチドを含んでいてよく、該ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、合成されても天然源から部分的に入手されてもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよい。組み換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然には存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含んでいてよい。好ましくは、天然には存在しないか又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写も複製も妨げない。
【００４４】
組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等、伝播及び増殖用、若しくは発現用、又は両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、トランスポゾン／トランスポゼース、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターを使用してもよい。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。
【００４５】
本発明の方法によって単離されるＴＣＲ又はその抗原結合部分は、養子細胞療法のために細胞を調製するのに有用であり得る。これに関して、本発明の実施形態は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞の集団を調製する方法であって、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りＴＣＲ又はその抗原結合部分を単離することと、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を宿主細胞に導入して、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する細胞を得ることと、を含む方法を提供する。
【００４６】
単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列（例えば、組み換え発現ベクター）を宿主細胞に導入することは、例えば、Ｇｒｅｅｎら、前記に記載の通り、当技術分野において公知の様々な異なる方法のいずれかにおいて実施してよい。ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するのに有用な技術の非限定的な例としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、転移、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
【００４７】
ＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列が導入される宿主細胞は、組み換え発現ベクターを含有することができる任意の種類の細胞であってよい。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、又は藻類であってもよく、原核細胞、例えば、細菌又は原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、すなわち、生物、例えばヒトから直接単離された細胞であってよい。宿主細胞は、接着細胞又は懸濁細胞、すなわち、懸濁液中で成長する細胞であってよい。好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組み換え発現ベクターを増幅又は複製する目的の場合、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、例えばＤＨ５α細胞である。ＴＣＲ又はその抗原結合部分を生成する目的の場合、宿主細胞は、好ましくは、哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。宿主細胞は、任意の細胞型であってよく、任意の種類の組織に由来していてよく、任意の発生段階であってよいが、宿主細胞は、好ましくは、ＰＢＬ又はＰＢＭＣである。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。
【００４８】
本発明の実施形態では、ＰＢＭＣはＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよい。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、あまり分化していない「若い」Ｔ細胞は、より分化した「古い」Ｔ細胞と比較してより優れたインビボにおける残留性、増殖、及び抗腫瘍活性のうちのいずれか１つ以上に関連し得ると考えられる。従って、本発明の方法は、有利には、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を同定及び単離し、「古い」Ｔ細胞（例えば、患者の腫瘍におけるエフェクタ細胞）と比較してより優れたインビボにおける残留性、増殖、及び抗腫瘍活性のうちのいずれか１つ以上を提供し得る「若い」Ｔ細胞に、該ＴＣＲ又はその抗原結合部分を導入することができる。
【００４９】
本発明の実施形態では、本発明の方法は、反復性（「ホットスポット」とも称される）がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲ又はその抗原結合部分を同定及び単離する。これに関して、該方法は、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を、患者にとって同種である宿主細胞に導入することを含み得る。例えば、該方法は、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を、その腫瘍が同じＭＨＣ分子の枠の中で同じｐ５３変異を発現する別の患者由来の宿主細胞に導入することを含み得る。
【００５０】
本発明の実施形態では、該方法は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する宿主細胞の数を拡大することを更に含み得る。宿主細胞の数は、例えば、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通り拡大することができる。これに関して、本発明の方法は、有利には、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する多数のＴ細胞を生成することができる。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の方法のいずれかに従って調製された、単離された細胞の集団を提供する。細胞の集団は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有しない少なくとも１つの他の細胞、例えばＰＢＭＣ、又はＴ細胞以外の細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を含む不均質な集団であってよい。あるいは、細胞の集団は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を主に含む（例えば、から本質的になる）、実質的に均質な集団であってもよい。また、該集団は、該集団の全ての細胞が単一のＴ細胞のクローンであり、その結果、該集団の全ての細胞が、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、細胞のクローン集団であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載の通り、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を含むクローン集団である。本発明の実施形態では、該細胞の集団の約１％〜約１００％、例えば、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲が、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を含む。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、変異型ｐ５３アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を高い比率で含む細胞の集団は、有利には、Ｔ細胞の機能、例えば、がん細胞の破壊を標的とする及び／又はがんを治療若しくは予防するＴ細胞の能力を妨げる可能性のある無関係の細胞をより低い比率で有し得ると考えられる。
【００５２】
本発明の細胞の集団は、組成物、例えば、医薬組成物に製剤化してもよい。これに関して、本発明は、本発明の細胞の集団のいずれかと、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、別の薬学的活性剤（複数可）又は薬物（複数可）、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等の化学療法剤と組み合わせて、本発明の細胞の集団を含んでいてもよい。
【００５３】
好ましくは、担体は、薬学的に許容し得る担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の具体的な本発明の細胞の集団に従来使用されているもののいずれかであってよい。このような薬学的に許容し得る担体は、当業者に周知であり、公的に容易に入手可能である。薬学的に許容し得る担体は、使用条件下で有害な副作用も毒性も有しないものであることが好ましい。
【００５４】
担体の選択は、具体的な本発明の細胞の集団によって、並びに本発明の細胞の集団を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、腫瘍内、くも膜下腔内、又は腹腔内に投与するためのもののいずれかを含み得る。１つを超える経路を使用して本発明の細胞の集団を投与してもよく、特定の例では、特定の経路が別の経路よりも即時かつより有効な応答を提供し得る。
【００５５】
好ましくは、本発明の細胞の集団は、例えば静脈内に注射することによって投与される。本発明の細胞の集団が投与されるとき、注射用の細胞のための薬学的に許容し得る担体としては、任意の等張担体、例えば、通常生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／Ｌ  ＮａＣｌ、又は水１リットルあたり約９．０ｇ  ＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％デキストロース、又は乳酸リンゲル液を挙げることができる。実施形態では、薬学的に許容し得る担体にヒト血清アルブミンを補給する。
【００５６】
本発明の細胞の集団及び医薬組成物を、がんを治療又は予防する方法で使用できることが想到される。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明のＴ細胞は、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に特異的に結合すると考えられ、その結果、該細胞が発現するＴＣＲは、変異型ｐ５３アミノ酸配列を発現している標的細胞に対する免疫応答を媒介することができる。これに関して、本発明の実施形態は、哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法であって、該哺乳類におけるがんを治療又は予防するのに有効な量の本明細書に記載の医薬組成物又は細胞の集団のいずれかを該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
用語「治療する」及び「予防する」、並びにそれから派生する語は、本明細書で使用するとき、必ずしも１００％、すなわち、完全な治療又は予防を意味するものではない。どちらかといえば、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳類における任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されるがんの１つ以上の病態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、がん又はその症状若しくは病態の発生を遅らせることを包含し得る。
【００５８】
本発明の目的のために、投与される本発明の細胞の集団又は医薬組成物の量又は用量（例えば、本発明の細胞の集団を投与するときには細胞数）は、適切な時間枠にわたって哺乳類において効果、例えば治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明の細胞の集団又は医薬組成物の用量は、投与時点から約２時間以上、例えば、１２〜２４時間又はそれ以上の期間、がん特異的ｐ５３変異によってコードされている変異型ｐ５３アミノ酸配列に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態では、期間は更に長くてもよい。用量は、投与される具体的な本発明の細胞の集団又は医薬組成物の有効性及び哺乳類（例えば、ヒト）の状態、並びに治療される哺乳類（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【００５９】
投与される用量を決定するための多くのアッセイが、当技術分野において公知である。本発明の目的のために、それぞれ異なる用量のＴ細胞を与えた哺乳類のセット間で、所与の用量のＴ細胞を哺乳類に投与した際に標的細胞が溶解するか又は該Ｔ細胞によってＩＦＮ−γが分泌される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳類に投与する開始用量を決定することができる。特定の用量を投与した際に標的細胞が溶解する又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
【００６０】
本発明の細胞の集団又は医薬組成物の用量は、具体的な本発明の細胞の集団又は医薬組成物の投与に付随する可能性のある任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。典型的には、主治医が、様々な要因、例えば、年齢、体重、全体的な健康状態、食生活、性別、投与される本発明の細胞の集団又は医薬組成物、投与経路、及び治療される病態の重篤度を考慮して、各個々の患者を治療するための本発明の細胞の集団又は医薬組成物の投与量を決定する。
【００６１】
本発明の細胞の集団を投与する実施形態では、注入１回あたりに投与される細胞数は、例えば、１００万個〜１０００億個の細胞の範囲で変動し得るが、この例示的な範囲を下回る又は上回る量も本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の日用量は、約１００万個〜約１５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、約６００億個の細胞、約８００億個の細胞、約１０００億個の細胞、約１２００億個の細胞、約１３００億個の細胞、約１５００億個の細胞、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）、好ましくは、約１０００万個〜約１３００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、約１０００億個の細胞、約１１００億個の細胞、約１２００億個の細胞、約１３００億個の細胞、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）、より好ましくは、約１億個の細胞〜約１３００億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、約１０００億個の細胞、約１１００億個の細胞、約１２００億個の細胞、約１３００億個の細胞、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）であり得る。
【００６２】
細胞の集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳類にとって同種又は自己である細胞であってよい。好ましくは、細胞は、哺乳類にとって自己である。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、哺乳類におけるがんの治療又は予防において使用するための、本明細書に記載の単離された細胞の集団又は医薬組成物のいずれかを提供する。
【００６４】
本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、網、及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん、並びに膀胱がんのいずれかを含む任意のがんであってよい。好ましい実施形態では、がんは、変異型ｐ５３を発現するがんである。がんは、配列番号１の１７５位、２２０位、２４５位、２４８位、２４９位、２７３位、又は２８２位のうちの１つ以上に変異を有するｐ５３を発現し得る。がんは、以下のヒトｐ５３変異のうちの１つ以上を有するｐ５３を発現し得る：Ｒ１７５Ｈ、Ｙ２２０Ｃ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｌ、又はＲ２８２Ｗ。好ましくは、該がんは、上皮がん、又は胆管がん、黒色腫、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、子宮頸がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、又は膀胱がんである。
【００６５】
本発明の方法において言及される哺乳類は、任意の哺乳類であってよい。本明細書で使用するとき、用語「哺乳類」とは、げっ歯目の哺乳類、例えばマウス及びハムスター、並びにウサギ目の哺乳類、例えばウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳類を指す。哺乳類は、ネコ及びイヌを含む食肉目の哺乳類であることが好ましい。好ましくは、哺乳類は、ウシ及びブタを含む偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目の哺乳類である。好ましくは、哺乳類は、霊長目、サル目（Ｃｅｂｏｉｄｓ又はＳｉｍｏｉｄｓ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の哺乳類である。より好ましい哺乳類は、ヒトである。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、無論、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００６７】
表１〜３に記載のアミノ酸配列を、以下の実施例に記載する実験で使用した。
【００６８】
【表１】
2020534839.tif 000003
【００６９】
表１のペプチドの野生型バージョンを表２に記載する。
【００７０】
【表２】
2020534839.tif 000004
【００７１】
【表３】
2020534839.tif 000005
【００７２】
実施例１
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４１４１における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。また、この実施例は、患者４１４１からのＴＣＲの単離及び特異的反応性を示す。
【００７３】
患者４１４１について、図１及び４５〜４８に記載の通り実験を実施した。ＴＩＬ断片Ｆ１２、及び患者４１４１由来の輸液バッグＴＩＬ（Ｒｘ１）、及びｐ５３−Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲ、又は患者４１９６由来のモック形質導入Ｔ細胞をエフェクタとして使用した。Ｔ細胞エフェクタと、（１）無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ＡＰＣ（患者４１４１にとって自己）とを共培養した。Ｔ細胞のみ（標的無し）がネガティブコントロールであり、ＰＭＡ及びＩｏｎｏがポジティブコントロールであった（格子模様の棒）。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図１に示す。
【００７４】
無関係の変異、ＷＴｐ５３配列、又はＲ１７５Ｈを含む変異型ｐ５３配列をコードしているＴＭＧを自己ＡＰＣにトランスフェクトした。培地のみ並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。次の日、患者４１４１由来のＴＩＬ（断片培養物１２）を、ＴＭＧをトランスフェクトしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γの分泌を評価した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４−ＣＤ８＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図４５に示す。
【００７５】
Ｃｏｓ７細胞（２．５×１０４個／ウェル）を、平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。次の日、患者４１４１由来の個々のＨＬＡアリル、及び追加の遺伝子無し、ＷＴ  ＴＰ５３  ＴＭＧ、又はｐ５３−Ｒ１７５Ｈ配列を含有する変異型ＴＰ５３  ＴＭＧのいずれかを細胞にコトランスフェクトした。次の日、患者４１４１由来のｐ５３−Ｒ１７５Ｈに対して特異性を有するＴＩＬ（断片培養物１２）を、トランスフェクトされたＣｏｓ７細胞と共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図４６に示す。
【００７６】
モック（ＴＣＲ無し）又は４１４１−ＴＣＲ１ａ２を発現しているＴ細胞を、Ｔ２腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を発現している）と共培養した。ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５ペプチドＨＭＴＥＶＶＲＲＣ（配列番号５３２）若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５ＨペプチドＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号５３０）から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）されたペプチドを３７℃で２時間Ｔ２細胞にパルスした。培地のみ並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図４７に示す。
【００７７】
４１４１−ＴＣＲ１ａ２を発現しているＴ細胞を、３７℃で一晩、Ｓａｏｓ２細胞（ｐ５３−ＮＵＬＬ及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋）と共培養したが、この細胞は、操作されていないか又は完全長ｐ５３−Ｒ１７５Ｈタンパク質を過剰発現するようにされていた。Ｔ細胞内のサイトカインを捕捉するために、分泌の阻害因子（モネンシン及びブレフェルジンＡ）を共培養物に添加した。６時間共培養した後、細胞を固定し、透過処理し、次いで、ＩＬ−２、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を染色した。フローサイトメトリーを使用して、リンパ球ゲートに基づいて共培養物を分析した。結果を図４８に示す。
【００７８】
患者４１４１から単離されたＴＣＲ４１４１−ＴＣＲ１ａ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４６７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４６８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４６９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４７０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４７１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４７２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４７３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４７４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４７５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４７６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【００７９】
がん反応性Ｔ細胞を下記の通り同定した。ＴＣＲを下記の通り単離した。
ＴＣＲの名称：４１４１−ＴＣＲ１ａ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ１７５Ｈ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４１４１輸液バッグＴＩＬとｐ５３ｍｕｔＴＭＧとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ、次いで、アルファ鎖のためのＴＡ  ＴＯＰＯクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【００８０】
【化１】
2020534839.tif 000006
【００８１】
患者４１４１由来の４１４１−ＴＣＲ１ａ２についての統計値を以下の表４に記載する。
【００８２】
【表４】
2020534839.tif 000007
【００８３】
実施例２
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４１３０における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。
【００８４】
患者４１３０について、図２に記載の通り実験を実施した。患者４１３０由来のＴＩＬ断片（Ｆ１４、Ｆ２０、及びＦ２４）を、（１）無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２７３配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２７３Ｈ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図２に示す。
【００８５】
実施例３
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２５９における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。また、この実施例は、患者４２５９から単離されたＴＣＲの単離及び特異的反応性を示す。
【００８６】
患者４２５９について、図３〜８及び４９〜５３に記載の通り実験を実施した。患者４２５９由来のＴＩＬ断片（ｎ＝１８）を、無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図３に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図４〜５に示す。
【００８７】
患者４２５９由来のＴＩＬ断片（ｎ＝１８）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図６に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図７〜８に示す。
【００８８】
患者４２５９由来のＴＩＬ断片培養物（６番）を、（１）無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図４９に示す。
【００８９】
漸減濃度の、ＷＴｐ５３−Ｙ２２０又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃの配列に対応する２５アミノ酸ペプチドを、３７℃で２時間自己ＡＰＣにパルスした。患者４２５９由来のＴＩＬ断片培養物（６番）を、ペプチドをパルスしたＡＰＣと共培養した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現をアッセイした。結果を図５０に示す。
【００９０】
自己抗原提示細胞に、ＤＭＳＯ、ＷＴｐ５３−Ｙ２２０ペプチドＲＮＴＦＲＨＳＶＶＶＰＹＥ（配列番号５３３）、又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０ＣペプチドＲＮＴＦＲＨＳＶＶＶＰＣＥ（配列番号５３４）を３７℃で２時間パルスした。過剰のペプチドを洗い流した。ｐ５３−Ｙ２２０Ｃに対して特異性を有する患者４２５９由来のＴＩＬ（断片培養物６）を、ペプチドをパルストしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図５１に示す。
【００９１】
Ｃｏｓ７細胞（２．５×１０４個／ウェル）を、平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。次の日、患者４２５９由来の個々のＨＬＡアリルを細胞にコトランスフェクトした。次の日、ＤＭＳＯ又はｐ５３−Ｙ２２０ＣペプチドＲＮＴＦＲＨＳＶＶＶＰＣＥ（配列番号５３４）を、トランスフェクトしたＣｏｓ７細胞に２時間パルスした。過剰のペプチドを洗い流した。患者４２５９由来のＴＩＬ断片培養物６番を添加した（１０５細胞／ウェル）。共培養物を３７℃で一晩インキュベートした。リンパ球→生細胞→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ８−ＣＤ４＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現をアッセイした。結果を図５２に示す。
【００９２】
ＷＴｐ５３−Ｙ２２０又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃの配列に対応する２５アミノ酸ペプチドを、３７℃で２時間、患者４２５９にとって自己のＡＰＣにパルスした。過剰のペプチドを洗い流した。４２５９−Ｆ６−ＴＣＲを発現しているＴ細胞を、ペプチドをパルスしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。導入されたＴＣＲをマウスＴＣＲベータ（ｍＴＣＲ）によって測定した。結果を表５に示す。
【００９３】
【表５】
2020534839.tif 000008
【００９４】
患者４２５９から摘出した異種移植腫瘍断片から腫瘍細胞（ＴＣ）株を樹立し、次いで、免疫無防備状態のマウスで連続継代した（ＴＣ＃４２５９）。ＴＣ＃４２５９を、モック（ＴＣＲ無し）又はｐ５３−Ｙ２２０Ｃ特異的ＴＣＲ（４２５９−Ｆ６−ＴＣＲ）を発現しているＴ細胞（１０５個）と３７℃で一晩共培養した。ＴＣ＃４２５９細胞を、何も無しで、Ｗ６／３２汎ＨＬＡクラスＩ特異的遮断抗体、ＩＶＡ１２汎ＨＬＡクラスＩＩ特異的遮断抗体、又は変異型ｐ５３−Ｙ２２０ＣペプチドＲＮＴＦＲＨＳＶＶＶＰＣＥ（配列番号５３４）と共に３７℃で２時間インキュベートした。抗体を、最終濃度５μｇ／ｍＬで共培養物中において維持した。ペプチドを１０μｇ／ｍＬでインキュベートし、インキュベート後に過剰のペプチドを洗浄した。培地のみ（ＴＣ無し）並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図５３に示す。
【００９５】
患者４２５９から単離されたＴＣＲ４２５９−Ｆ６−ＴＣＲの配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４７７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４７８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４７９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４８０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４８１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４８２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４８３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４８４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４８５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４８６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【００９６】
がん反応性Ｔ細胞を下記の通り同定した。ＴＣＲを下記の通り単離した。
ＴＣＲの名称：４２５９−Ｆ６−ＴＣＲ
ｐ５３変異の認識：Ｙ２２０Ｃ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２５９−Ｆ６とｐ５３−Ｙ２２０Ｃペプチドとを共培養、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：８１．１％（４４対のうち３６回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【００９７】
【化２】
2020534839.tif 000009
【００９８】
患者４２５９由来の４２５９−Ｆ６−ＴＣＲについての統計値を以下の表６に記載する。
【００９９】
【表６】
2020534839.tif 000010
【０１００】
実施例４
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４１２７における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。
【０１０１】
患者４１２７について、図９〜１０に記載の通り実験を実施した。患者４１２７由来のＴＩＬを、（１）無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｇ２４５配列若しくは変異型ｐ５３−Ｇ２４５Ｓ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした同種（ＤＲＢ３＊０１：０１：０１又はＤＲＢ３＊０２：０２：０１）ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図９に示す。
【０１０２】
ｐ５３−Ｇ２４５Ｓに特異的な４１２７−ＴＣＲ１を発現しているＴ細胞を、（１）無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｇ２４５配列若しくは変異型ｐ５３−Ｇ２４５Ｓ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした同種（ＤＲＢ３＊０１：０１：０１又はＤＲＢ３＊０２：０２：０１）ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図１０に示す。
【０１０３】
実施例５
（ｉ）少なくとも１つの変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示するように患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導し、（ｉｉ）患者の自己Ｔ細胞を、変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養し、（ｉｉｉ）（ａ）変異型ｐ５３アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養した自己Ｔ細胞を選択することによって、２７人の患者由来のＴ細胞をスクリーニングした。このスクリーニング方法を使用したＴ細胞によるｐ５３「ホットスポット」変異に対する応答の概要を表７に提供する。
【０１０４】
【表７】
2020534839.tif 000011
【０１０５】
実施例６
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２７３における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。また、この実施例は、患者４２７３からの２つの抗変異型ｐ５３ＴＣＲの単離を示す。
【０１０６】
患者４２７３について、図１１〜１４及び３３〜３７に記載の通り実験を実施した。患者４２７３由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図１１に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図１２に示す。
【０１０７】
患者４２７３由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図１３に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図１４に示す。
【０１０８】
患者４２７３については、Ｆ１５が最も反応性の高い断片であり、ＬＰ及びＴＭＧに対するＦ１５による応答は同等であり、主にＣＤ４  Ｔ細胞によるものであった。従って、４２７３−Ｆ１５を、Ｒ２４８Ｗ  ＬＰをパルスしたＡＰＣと共培養し、次の日、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞を、９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに１細胞／ウェルで単一細胞としてソートした。ＰＣＲプレートは、各ウェルにＲＴ−ＰＣＲ溶液を有し、これは、同じ溶液中でＴＣＲのアルファ及びベータＣＤＲ３領域を増幅するものである。次いで、プレートのウェルを２枚の９６ウェルＰＣＲプレートに分け、２回目のＰＣＲラウンドを実施して、別個の反応としてＣＤＲ３アルファ又はＣＤＲ３ベータのいずれかを増幅させる。各ウェルからのＰＣＲ産物（各ウェルにマッピングされた合計１９２のＰＣＲ産物−アルファ又はベータ）をＳａｎｇｅｒシーケンシングによってシーケンスする。ヌクレオチド配列をＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＴｃＲ）、ＩｇＢｌａｓｔ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｉｇｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＣＭＤ＝Ｗｅｂ＆ＳＥＡＲＣＨ＿ＴＹＰＥ＝ＴＣＲ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｉｇｔａｂ）に入力し、Ｅｘｐａｓｙ（ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）によって翻訳する。可変ファミリーを決定し、ＣＤＲ３及び翻訳された配列からの接合点（Ｊ又はＤＪ）に融合させる。可変配列をマウス定常配列に融合させ、再構成されたＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータをフリン−柔軟性−Ｐ２Ａ（ＲＡＫＲ−ＳＧＳＧ−ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号２６）によって連結させる。次いで、配列からＤＮＡをデノボ合成し、発現ベクター（ガンマ−レトロウイルス又はＳＬＥＥＰＩＮＧ  ＢＥＡＵＴＹ（ＳＢ）トランスポゾン（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））にクローニングする。次いで、標準的なウイルス形質導入又は非ウイルス転移のプロトコルを使用してＴ細胞にＴＣＲを発現させ、マウス化ＴＣＲを発現しているＴ細胞（マウスＴＣＲベータ定常鎖によって検出）を推定ペプチドに対して試験する。
【０１０９】
無関係の変異、ＷＴｐ５３配列、又はｐ５３−Ｒ２４８Ｗを含む変異型ｐ５３配列をコードしているＴＭＧを自己ＡＰＣにトランスフェクトした。培地のみ並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。患者４２７３由来のＴＩＬ（断片培養物８及び１５）を、ＴＭＧをトランスフェクトしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図３３に示す。
【０１１０】
ＷＴ又は変異型のｐ５３−Ｒ２４８Ｗネオエピトープに対応する２５アミノ酸ペプチドを自己ＡＰＣに３７℃で２時間パルスした。ｐ５３−Ｒ２４８Ｗに対して特異性を有する患者４２７３由来のＴＩＬ（断片培養物１５）を、ペプチドをパルストしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。ＤＭＳＯがペプチドビヒクルであった。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図３４に示す。
【０１１１】
１４アミノ酸が重複しているｐ５３−Ｒ２４８Ｗネオエピトープ由来の１５アミノ酸ペプチドを自己ＡＰＣにパルスした。ｐ５３−Ｒ２４８Ｗに対して特異性を有する患者４２７３由来のＴＩＬ（断片培養物１５）を、ペプチドをパルストしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。ＤＭＳＯがペプチドビヒクルであり、培地のみ（Ｔ細胞のみ）並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが対照であった。２５アミノ酸ペプチド（ｗｔ  ｐ５３−Ｒ２４８及び変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ）が、１５アミノ酸ペプチドに対する更なる対照であった。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４＋ＣＤ８−にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図３５に示す。
【０１１２】
Ｃｏｓ７細胞（２．５×１０４個／ウェル）を、平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。次の日、それぞれｐ５３−Ｒ２４８Ｗネオ抗原の有り無しで、患者４２７３由来の個々のＨＬＡアリルとＷＴ又は変異型のいずれかのＴＰ５３  ＴＭＧとを細胞にコトランスフェクトした。次の日、患者４２７３由来のｐ５３−Ｒ２４８Ｗに対して特異性を有するＴＩＬ（断片培養物１５）を、トランスフェクトされたＣｏｓ７細胞と３７℃で一晩共培養した。ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図３６に示す。
【０１１３】
モック（ＴＣＲ無し）又は４２７３−ＴＣＲ１ａ２を発現しているＴ細胞を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。培地のみ並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図３７に示す。
【０１１４】
患者４２７３から単離されたＴＣＲ４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４３７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４３８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４３９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４４０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４４１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４４２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４４３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４４４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４４５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４４６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
ＴＣＲの名称：４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｗ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
【０１１５】
【化３】
2020534839.tif 000012
【０１１６】
患者４２７３から単離されたＴＣＲ４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４４７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４４８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４４９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４５０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４５１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４５２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４５３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４５４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４５５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４５６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
ＴＣＲの名称：４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｗ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
【０１１７】
【化４】
2020534839.tif 000013
【０１１８】
患者４２７３のＴＣＲについての統計値を以下の表８に記載する。表８中、変異型ｐ５３タンパク質（ＴＭＧ又はペプチド）と共培養した後、全９６ウェルを４１ＢＢ＋Ｔ細胞でソートした。８０．２％の対合頻度で、７７ウェルが増殖性対（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｐａｉｒｓ）を有していた（すなわち、（１）配列を有し、（２）該配列中に終止コドンを有していなかった）。これら対のうち４３が、４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ１を作製するためのＣＤＲ３Ａ／ＣＤＲ３Ｂの組み合わせであった（増殖性対の５５．８％）。これら対のうち３０が、４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ２を作製するためのＣＤＲ３Ａ／ＣＤＲ３Ｂの組み合わせであった（増殖性対の３９％）。まとめると、４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ１のＣＤＲ３Ａ及びＣＤＲ３Ｂは、９６ウェルのうち、それぞれ５０回及び８３回みられた。まとめると、４２７３−ＴＰ５３−Ｒ２４８Ｗ−ＴＣＲ１ａ２のＣＤＲ３Ａ及びＣＤＲ３Ｂは、９６ウェルのうち、それぞれ３３回及び８３回みられた。
【０１１９】
【表８】
2020534839.tif 000014
【０１２０】
実施例７
この実施例は、患者４１４９における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す。また、この実施例は、患者４１４９からの１つの抗変異型ｐ５３ＴＣＲの単離を示す。
【０１２１】
患者４１４９について、図１５〜１８に記載の通り実験を実施した。Ｔｒａｎ法を使用してＴＣＲを見出した。次いで、ＴＣＲを使用して、「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」法を検証した。
【０１２２】
ＴＣＲ（４１４９−ＴＣＲａ２ｂ１又は４１４９−ＴＣＲａ２ｂ２）を患者４１４９由来の自己ＰＢＬに転移させ、（１）無関係、ＷＴｐ５３、若しくは変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｙ２２０配列若しくは変異型ｐ５３−Ｙ２２０Ｃ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。ＰＭＡ及びイオノマイシンの組み合わせがポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図１５に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４＋ｍＴＣＲ＋（ＴＣＲ転移Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図１６に示す。
【０１２３】
ＴＣＲＡＤディープシーケンシング及びＴＣＲＢディープシーケンシングによってＣＤ４＋４−１ＢＢ＋細胞の百分率も求めた。結果を表９に示す。
【０１２４】
【表９】
2020534839.tif 000015
【０１２５】
４１４９−Ｆ１１によって認識される推定ｐ５３Ｙ２２０Ｃ最小エピトープのマッピング：自己ＤＣにペプチドをパルスし（１０μｇ／ｍＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−４中で一晩静置した。５００ＣＵ／ｍＬ  ＩＬ−２中で２〜３日間ＴＩＬを静置した。２×１０４個のＴＩＬ及び１０５個の標的細胞を３７℃で一晩共培養した。ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γを測定した。結果を表１０に示す。リンパ球＼ＰＩ（陰性）ＣＤ３＋＼ＣＤ３＋ＣＤ４＋にゲートをかけたＦＡＣＳによって４−１ＢＢ発現を測定した。結果を図１７に示す。
【０１２６】
【表１０】
2020534839.tif 000016
【０１２７】
Ｃｏｓ７細胞（２．５×１０４個／ウェル）を、平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。２０時間後、ＴＭＧの有り無しで、細胞に個々のＨＬＡアリルをコトランスフェクトした。２０時間後、並行して自己ＤＣ細胞にＴＭＧをトランスフェクトした。全てのＨＬＡクラスＩＩアリルを、ＴＭＧの有り無しで１セットのウェルにコトランスフェクトした。ＴＭＧをトランスフェクトしていない細胞に、１０μｇ／ｍＬのｐ５３−Ｙ２２０Ｃ  １５−ｍｅｒペプチドを３７℃で２〜３時間パルスした。洗浄後、２回目のＲＥＰの１４日目の４１４９−ＴＣＲａ２ｂ２が転移したＴ細胞（１０５個）をウェルに添加し、３７℃で一晩共培養した。ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果を図１８に示す。ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ：ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ／による予測（表１１）。
【０１２８】
【表１１】
2020534839.tif 000017
【０１２９】
ＮＣＩ  ＨＬＡデータベースではＤＲＢ型患者３７１９人のうちの１３６７人（３７％）、そして、ＮＣＩ−ＳＢでは子宮内膜及び卵巣のがん患者９人のうちの５人（５６％）でＤＲＢ３＊０２発現が検出された。報告されているＤＲＢ３＊０２アリルの頻度は、非常に高い。
【０１３０】
患者４１４９から単離されたＴＣＲ４１４９ＴＣＲａ２ｂ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号５７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号５８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号５９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号６０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号６１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号６２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号６３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号６４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号６５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号６６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１３１】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。米国特許出願公開第２０１７／０２２４８００号に記載の方法（「Ｔｒａｎ法」）によって、この患者のｐ５３反応性細胞を同定した。
ＴＣＲの名称：４１４９ＴＣＲａ２ｂ２
ｐ５３変異の認識：Ｙ２２０Ｃ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニングを検証するために使用（後者を与える）
ＴＣＲを同定するための共培養：４１４９−Ｆ１１ＴＩＬ断片とｐ５３−Ｙ２２０Ｃロングペプチドとを共培養、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：対合頻度。ＣＤ４＋４１ＢＢ＋でソートしたＴ細胞をＲＥＰで拡大し、得られたＴ細胞培養物を、Ａｄａｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＴＣＲＡＤ（アルファ）及びＴＣＲＢ（ベータ）ディープシーケンシングに供した。合計４つのＴＣＲのマトリクスにおいて上２つのＴＣＲアルファを上２つのＴＣＲベータと対合させた。２番目のＴＣＲアルファ及び２番目のＴＣＲベータは、反応性ＴＣＲであり、従って、ＴＣＲａ２ｂ２と命名された。
全てのＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：以下の通り
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１３２】
【化５】
2020534839.tif 000018
【０１３３】
患者４１４９のＴＣＲ４１４９ＴＣＲａ２ｂ２についての統計値を以下の表１２に記載する。
【０１３４】
【表１２】
2020534839.tif 000019
【０１３５】
実施例８
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２１３における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。また、この実施例は、患者４２１３からの１２の抗変異型ｐ５３ＴＣＲの単離を示す。
【０１３６】
患者４２１３について、図１９〜２０に記載の通り実験を実施した。
【０１３７】
患者４２１３由来のＴＩＬ断片（Ｆ２及びＦ２４）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図１９に示す。ＣＤ８＋４−１ＢＢ＋Ｔ細胞を９６ウェルプレートのウェルにソートした。単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを使用してＴＣＲを同定した。
【０１３８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、患者４２１３の末梢血リンパ球に由来していた。ＣＤ４＋Ｔ細胞培養物を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γの分泌を評価した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図２０に示す。ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞を９６ウェルプレートのウェルにソートした。単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを使用してＴＣＲを同定した。
【０１３９】
患者４２１３から単離された４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３１７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３１８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３１９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３２０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３２１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３２２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３２３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３２４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３２５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３２６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１４０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２１３−Ｆ２とＲ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：８．３％（２４対のうち２回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１４１】
【化６】
2020534839.tif 000020
【０１４２】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ１についての統計値を以下の表１３に記載する。
【０１４３】
【表１３】
2020534839.tif 000021
【０１４４】
患者４２１３から単離された４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３２７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３２８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３２９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３３０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３３１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３３２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３３３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３３４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３３５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３３６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１４５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２１３−Ｆ２とＲ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：１２．５％（２４対のうち３回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１４６】
【化７】
2020534839.tif 000022
【０１４７】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ２についての統計値を以下の表１４に記載する。
【０１４８】
【表１４】
2020534839.tif 000023
【０１４９】
患者４２１３から単離された４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ３の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３３７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３３８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３３９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３４０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３４１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３４２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３４３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３４４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３４５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３４６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１５０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ３
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２１３−Ｆ２とＲ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：７０．８％（２４対のうち１７回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１５１】
【化８】
2020534839.tif 000024
【０１５２】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−Ｆ２−ＴＣＲ３についての統計値を以下の表１５に記載する。
【０１５３】
【表１５】
2020534839.tif 000025
【０１５４】
患者４２１３から単離された４２１３−Ｆ２４−ＴＣＲａ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３４７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３４８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３４９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３５０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３５１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３５２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３５３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３５４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３５５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３５６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１５５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−Ｆ２４−ＴＣＲａ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２１３−Ｆ２４とＲ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：１５．９％（４４対のうち７回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１５６】
【化９】
2020534839.tif 000026
【０１５７】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−Ｆ２４−ＴＣＲａ１についての統計値を以下の表１６に記載する。
【０１５８】
【表１６】
2020534839.tif 000027
【０１５９】
患者４２１３から単離された４２１３−Ｆ２４−ＴＣＲａ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３５７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３５８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３５９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３６０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３６１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３６２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３６３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３６４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３６５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３６６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１６０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−Ｆ２４−ＴＣＲａ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２１３−Ｆ２４とＲ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：８４．１％（４４対のうち３７回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１６１】
【化１０】
2020534839.tif 000028
【０１６２】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−Ｆ２４−ＴＣＲａ２についての統計値を以下の表１７に記載する。
【０１６３】
【表１７】
2020534839.tif 000029
【０１６４】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３６７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３６８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３６９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３７０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３７１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３７２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３７３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３７４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３７５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３７６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１６５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：９．５％（６３対のうち６回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１６６】
【化１１】
2020534839.tif 000030
【０１６７】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ１についての統計値を以下の表１８に記載する。
【０１６８】
【表１８】
2020534839.tif 000031
【０１６９】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３７７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３７８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３７９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３８０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３８１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３８２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３８３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３８４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３８５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３８６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１７０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：７．９％（６３対のうち５回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１７１】
【化１２】
2020534839.tif 000032
【０１７２】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ２についての統計値を以下の表１９に記載する。
【０１７３】
【表１９】
2020534839.tif 000033
【０１７４】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ３の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３８７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３８８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３８９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号３９０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号３９１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号３９２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号３９３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号３９４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号３９５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号３９６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１７５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ３
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：６．３％（６３対のうち４回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１７６】
【化１３】
2020534839.tif 000034
【０１７７】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ３についての統計値を以下の表２０に記載する。
【０１７８】
【表２０】
2020534839.tif 000035
【０１７９】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号３９７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号３９８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号３９９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４００）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４０１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４０２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４０３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４０４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４０５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４０６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１８０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：３．２％（６３対のうち２回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１８１】
【化１４】
2020534839.tif 000036
【０１８２】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ１についての統計値を以下の表２１に記載する。
【０１８３】
【表２１】
2020534839.tif 000037
【０１８４】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４０７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４０８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４０９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４１０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４１１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４１２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４１３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４１４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４１５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４１６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１８５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：３．２％（６３対のうち２回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１８６】
【化１５】
2020534839.tif 000038
【０１８７】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ２についての統計値を以下の表２２に記載する。
【０１８８】
【表２２】
2020534839.tif 000039
【０１８９】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ３の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４１７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４１８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４１９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４２０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４２１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４２２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４２３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４２４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４２５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４２６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１９０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ３
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：４．８％（６３対のうち３回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１９１】
【化１６】
2020534839.tif 000040
【０１９２】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ３についての統計値を以下の表２３に記載する。
【０１９３】
【表２３】
2020534839.tif 000041
【０１９４】
患者４２１３から単離された４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ４の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４２７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４２８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４２９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４３０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４３１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４３２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４３３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４３４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４３５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４３６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０１９５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ４
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：Ｒ２４８Ｑロングペプチドによるインビトロ感作後のＣＤ４＋メモリＴ細胞を、Ｒ２４８Ｑロングペプチドと共培養し、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした。
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：３．２％（６３対のうち２回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０１９６】
【化１７】
2020534839.tif 000042
【０１９７】
患者４２１３のＴＣＲ４２１３−ＰＢＬ−ＴＣＲ４ａ４についての統計値を以下の表２４に記載する。
【０１９８】
【表２４】
2020534839.tif 000043
【０１９９】
実施例９
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２６８における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。また、この実施例は、患者４２６８からの５つの抗変異型ｐ５３ＴＣＲの単離を示す。
【０２００】
患者４２６８について、図２１〜２４に記載の通り実験を実施した。
【０２０１】
患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図２１に示す。
【０２０２】
患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図２２に示す。
【０２０３】
患者４２６８由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はｗｔ  ｐ５３−Ｒ２４８配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｑ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図２３〜２４に示す。ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした後のＴＣＲの源は、ＴＩＬ断片Ｆ１８及びＦ１９であった。ＣＤ８＋４−１ＢＢ＋Ｔ細胞をソートした後のＴＣＲの源は、ＴＩＬ断片Ｆ７、Ｆ８、及びＦ１５であった。
【０２０４】
患者４２６８から単離された４２６８−ＴＣＲ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１３７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１３８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１３９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１４０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１４１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１４２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１４３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１４４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１４５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１４６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２０５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６８−ＴＣＲ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６８−Ｆ７及び４２６８−Ｆ８とｐ５３−Ｒ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：７８．７％（６１対のうち４８回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２０６】
【化１８】
2020534839.tif 000044
【０２０７】
患者４２６８のＴＣＲ４２６８−ＴＣＲ１についての統計値を以下の表２５に記載する。
【０２０８】
【表２５】
2020534839.tif 000045
【０２０９】
患者４２６８から単離された４２６８−ＴＣＲ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１４７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１４８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１４９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１５０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１５１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１５２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１５３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１５４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１５５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１５６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２１０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６８−ＴＣＲ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６８−Ｆ７及び４２６８−Ｆ８とｐ５３−Ｒ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：６．６％（６１対のうち４回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２１１】
【化１９】
2020534839.tif 000046
【０２１２】
患者４２６８のＴＣＲ４２６８−ＴＣＲ２についての統計値を以下の表２６に記載する。
【０２１３】
【表２６】
2020534839.tif 000047
【０２１４】
患者４２６８から単離された４２６８−ＴＣＲ３の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１５７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１５８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１５９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１６０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１６１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１６２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１６３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１６４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１６５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１６６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２１５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６８−ＴＣＲ３
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６８−Ｆ１５とｐ５３−Ｒ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：８８．６％（３５対のうち３１回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２１６】
【化２０】
2020534839.tif 000048
【０２１７】
患者４２６８のＴＣＲ４２６８−ＴＣＲ３についての統計値を以下の表２７に記載する。
【０２１８】
【表２７】
2020534839.tif 000049
【０２１９】
患者４２６８から単離された４２６８−ＴＣＲ４の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１６７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１６８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１６９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１７０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１７１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１７２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１７３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１７４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１７５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１７６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２２０】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６８−ＴＣＲ４
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６８−Ｆ１８とｐ５３−Ｒ２４８Ｑロングペプチドとを共培養、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：９５．２％（４２対のうち４０回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２２１】
【化２１】
2020534839.tif 000050
【０２２２】
患者４２６８のＴＣＲ４２６８−ＴＣＲ４についての統計値を以下の表２８に記載する。
【０２２３】
【表２８】
2020534839.tif 000051
【０２２４】
患者４２６８から単離された４２６８−ＴＣＲ５の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１７７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１７８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１７９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１８０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１８１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１８２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１８３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１８４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１８５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１８６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２２５】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６８−ＴＣＲ５
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｑ
方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６８−Ｆ１９とｐ５３−ｍｕｔ−ＴＭＧとの共培養、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：１１．８％（１７対のうち２回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２２６】
【化２２】
2020534839.tif 000052
【０２２７】
患者４２６８のＴＣＲ４２６８−ＴＣＲ５についての統計値を以下の表２９に記載する。
【０２２８】
【表２９】
2020534839.tif 000053
【０２２９】
実施例１０
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２６６における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。また、この実施例は、患者４２６６からの４つの抗変異型ｐ５３ＴＣＲの単離を示す。
【０２３０】
患者４２６６について、図２５〜３１に記載の通り実験を実施した。
【０２３１】
患者４２６６由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図２５に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図２６に示す。
【０２３２】
患者４２６６由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２４、ｎ＝２４）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図２７に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図２８に示す。
【０２３３】
Ｃｏｓ７細胞（２．５×１０４個／ウェル）を、平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。次の日、患者４２６６由来の個々のＨＬＡアリルを細胞にコトランスフェクトした。次の日、ペプチド無し、ＤＭＳＯ、ＷＴｐ５３−Ｒ２４８ペプチドＳＳＣＭＧＧＭＮＲＲ（配列番号５９０）又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８ＷペプチドＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲ（配列番号５９１）を１μｇ／ｍＬで、細胞に３７℃で２時間パルスした。患者４２６６由来のＴＩＬ培養物（１０５個）をウェルに添加し、３７℃で一晩共培養した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４−ＣＤ８＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図２９に示す。
【０２３４】
モック（ＴＣＲ無し）、４２６６−ＴＩＬから同定されたｐ５３−Ｒ２４８Ｗに対して推定特異性を有する４２６６−ＴＣＲ１、４２６６−ＴＣＲ２、４２６６−ＴＣＲ３、又は４２６６−ＴＣＲ４を発現しているＴ細胞を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２４８配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｗ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。培地のみ並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩実施した。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４−ＣＤ８＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図３０に示す。
【０２３５】
患者４２６６から摘出した異種移植腫瘍断片から腫瘍細胞（ＴＣ）株を樹立し、次いで、免疫無防備状態のマウスで連続継代した（ＴＣ＃４２６６）。モック（ＴＣＲ無し）又はｐ５３−Ｒ２４８Ｗ特異的ＴＣＲ（４２６６−ＴＣＲ２、４２６６−ＴＣＲ３、又は４２６６−ＴＣＲ４）を発現しているＴ細胞（１０５個）とＴＣ＃４２６６を３７℃で一晩共培養した。ＴＣ＃４２６６細胞を、何も無しで、Ｗ６／３２汎ＨＬＡクラスＩ特異的遮断抗体、ＩＶＡ１２汎ＨＬＡクラスＩＩ特異的遮断抗体、又は変異型ｐ５３−Ｒ２４８ＷペプチドＳＳＣＭＧＧＭＮＷＲ（配列番号５９１）と共に３７℃で２時間インキュベートした。抗体を、最終濃度５μｇ／ｍＬで共培養物中において維持した。ペプチドを１μｇ／ｍＬでインキュベートし、インキュベート後に過剰のペプチドを洗浄した。培地のみ（ＴＣ無し）並びにＰＭＡ及びイオノマイシンが、それぞれ、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールであった。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ４−ＣＤ８＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図３１に示す。
【０２３６】
患者４２６６から単離された４２６６−ＴＣＲ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号９７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号９８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号９９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１００）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１０１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１０２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１０３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１０４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１０５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１０６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２３７】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６６−ＴＣＲ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｗ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６６−Ｆ１、４２６６−Ｆ３、４２６６−Ｆ５、及び４２６６−Ｆ６とｐ５３ｍｕｔＴＭＧ又はＲ２４８Ｗロングペプチドとの共培養（両共培養物は同じＴＣＲを検出）、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：１７．０％（５３対のうち９回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２３８】
【化２３】
2020534839.tif 000054
【０２３９】
患者４２６６のＴＣＲ４２６６−ＴＣＲ１についての統計値を以下の表３０に記載する。
【０２４０】
【表３０】
2020534839.tif 000055
【０２４１】
患者４２６６から単離された４２６６−ＴＣＲ２の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１０７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１０８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１０９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１１０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１１１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１１２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１１３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１１４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１１５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１１６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２４２】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６６−ＴＣＲ２
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｗ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６６−Ｆ１、４２６６−Ｆ３、４２６６−Ｆ５、及び４２６６−Ｆ６とｐ５３ｍｕｔＴＭＧ又はＲ２４８Ｗロングペプチドとの共培養（両共培養物は同じＴＣＲを検出）、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：２４．５％（５３対のうち１３回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２４３】
【化２４】
2020534839.tif 000056
【０２４４】
患者４２６６のＴＣＲ４２６６−ＴＣＲ２についての統計値を以下の表３１に記載する。
【０２４５】
【表３１】
2020534839.tif 000057
【０２４６】
患者４２６６から単離された４２６６−ＴＣＲ３の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１１７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１１８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１１９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１２０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１２１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１２２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１２３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１２４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１２５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１２６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２４７】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６６−ＴＣＲ３
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｗ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６６−Ｆ１、４２６６−Ｆ３、４２６６−Ｆ５、及び４２６６−Ｆ６とｐ５３ｍｕｔＴＭＧ又はＲ２４８Ｗロングペプチドとの共培養（両共培養物は同じＴＣＲを検出）、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：３４．０％（５３対のうち１８回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２４８】
【化２５】
2020534839.tif 000058
【０２４９】
患者４２６６のＴＣＲ４２６６−ＴＣＲ３についての統計値を以下の表３２に記載する。
【０２５０】
【表３２】
2020534839.tif 000059
【０２５１】
患者４２６６から単離された４２６６−ＴＣＲ４の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号１２７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号１２８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号１２９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号１３０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号１３１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号１３２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号１３３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号１３４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号１３５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号１３６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２５２】
以下に記載するスクリーニング方法を使用して、がん反応性Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲを単離するために使用した方法を以下に記載する。
ＴＣＲの名称：４２６６−ＴＣＲ４
ｐ５３変異の認識：Ｒ２４８Ｗ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２６６−Ｆ１、４２６６−Ｆ３、４２６６−Ｆ５、及び４２６６−Ｆ６とｐ５３ｍｕｔＴＭＧ又はＲ２４８Ｗロングペプチドとの共培養（両共培養物は同じＴＣＲを検出）、ＣＤ８＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：９．４％（５３対のうち５回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２５３】
【化２６】
2020534839.tif 000060
【０２５４】
患者４２６６のＴＣＲ４２６６−ＴＣＲ４についての統計値を以下の表３３に記載する。
【０２５５】
【表３３】
2020534839.tif 000061
【０２５６】
実施例１１
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２５２における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。
【０２５７】
患者４２５２のＴＩＬ断片Ｆ１、Ｆ３、Ｆ７、及びＦ１９をエフェクタとして使用した。Ｔ細胞エフェクタと、（１）無関係、ＷＴｐ５３又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣ（未成熟ＤＣ）とを共培養した。Ｔ細胞のみ（標的無し）がネガティブコントロールであり、ＰＭＡ及びＩｏｎｏがポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩実施した。フローサイトメトリーによって、ＣＤ３＋ＣＤ８−ＣＤ４＋Ｔ細胞における４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図３８に示す。
【０２５８】
実施例１２
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２７０における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。
【０２５９】
患者４２７０のＴＩＬ断片Ｆ１３及びＦ１６をエフェクタとして使用した。Ｔ細胞エフェクタと、（１）無関係、ＷＴｐ５３又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした、あるいは（２）ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ２８２配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ２８２Ｗ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣ（未成熟ＤＣ）とを共培養した。Ｔ細胞のみがネガティブコントロールであり、ＰＭＡ及びＩｏｎｏがポジティブコントロールであった。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図３９に示す。
【０２６０】
実施例１３
この実施例は、自己Ｔ細胞内で変異型ｐ５３を発現するように誘導された自己ＡＰＣを共培養することによる患者４２８５における抗変異型ｐ５３Ｔ細胞の同定を示す（「ｐ５３ホットスポット変異ユニバーサルスクリーニング」）。
【０２６１】
患者４２８５由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２２及びＦ２４、ｎ＝１８）を、無関係、ＷＴｐ５３、又は変異型ｐ５３の配列から構成されたＴＭＧをエレクトロポレーションした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図４０に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図４２に示す。
【０２６２】
患者４２８５由来のＴＩＬ断片（Ｆ１〜Ｆ２２及びＦ２４、ｎ＝１８）を、ペプチドビヒクル（ＤＭＳＯ）、又はＷＴｐ５３−Ｒ１７５配列若しくは変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ配列から構成された精製（ＨＰＬＣによって＞９５％）された２５アミノ酸ペプチドをパルスした自己ＡＰＣと共培養した。共培養は３７℃で一晩実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を図４１に示す。リンパ球→生細胞（ＰＩ陰性）→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現を評価した。結果を図４３に示す。
【０２６３】
１４アミノ酸が重複しているｐ５３−Ｒ１７５Ｈ配列由来の１５−アミノ酸ペプチド（表３４における下線付きアミノ酸置換）を自己ＡＰＣにパルスした。ｐ５３−Ｒ１７５Ｈに対して特異性を有する患者４２８５由来のＴＩＬ（断片培養物１０、６、及び９）を、ペプチドをパルストしたＡＰＣと３７℃で一晩共培養した。ＤＭＳＯがペプチドビヒクルであった。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＩＦＮ−γの分泌を評価した。結果を表３４に示す。
【０２６４】
【表３４】
2020534839.tif 000062
【０２６５】
Ｃｏｓ７細胞（２．５×１０４個／ウェル）を、平底９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。次の日、患者４２８５由来の個々のＨＬＡアリルを細胞にコトランスフェクトした。次の日、ＤＭＳＯ又は変異型ｐ５３−Ｒ１７５ＨペプチドＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧ（配列番号２）を１０μｇ／ｍＬで、細胞に３７℃で２時間パルスした。患者４２８５由来のｐ５３−Ｒ１７５Ｈに対して特異性を有する、選択されたＴＩＬ断片培養物（４２８５−Ｆ６、４２８５−Ｆ９、及び４２８５−Ｆ１０）を、トランスフェクトされたＣｏｓ７細胞と３７℃で一晩共培養した。リンパ球→生細胞→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ８−ＣＤ４＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現をアッセイした。結果を図５４に示す。
【０２６６】
漸減濃度の、ＷＴ又は変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈの配列に対応する２５又は１５アミノ酸ペプチドを、自己ＡＰＣに３７℃で２時間パルスした。患者４２８５由来４２８５−ＴＣＲ１を転移させたＴ細胞を、３７℃で一晩、ペプチドをパルスしたＡＰＣと共培養した。リンパ球→生細胞→ＣＤ３＋（Ｔ細胞）→ＣＤ８−ＣＤ４＋にゲートをかけた後、フローサイトメトリーによって４−１ＢＢの発現をアッセイした。結果を図５５に示す。
【０２６７】
患者４２８５から単離された４２８５−ＴＣＲ１の配列を以下に記載する。アミノ末端から始めて、１番目の下線領域はＣＤＲ１アルファ（配列番号４８７）であり、２番目の下線領域はＣＤＲ２アルファ（配列番号４８８）であり、３番目の下線領域はＣＤＲ３アルファ（配列番号４８９）であり、４番目の下線領域はＣＤＲ１ベータ（配列番号４９０）であり、５番目の下線領域はＣＤＲ２ベータ（配列番号４９１）であり、６番目の下線領域はＣＤＲ３ベータ（配列番号４９２）である。太字領域は、リンカー（配列番号２６）である。アミノ末端から始めて、１番目のイタリック体領域はアルファ鎖定常領域（配列番号２３）であり、２番目のイタリック体領域はベータ鎖定常領域（配列番号２５）である。アルファ鎖可変領域（配列番号４９３）は、アミノ末端から始まり、アルファ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。ベータ鎖可変領域（配列番号４９４）は、リンカーの直後に始まり、ベータ鎖定常領域の始まる直前に終わる配列を含む。完全長アルファ鎖（配列番号４９５）は、アミノ末端から始まり、リンカーの始まる直前に終わる配列を含む。完全長ベータ鎖（配列番号４９６）は、リンカーの直後に始まり、カルボキシル末端で終わる配列を含む。
【０２６８】
がん反応性Ｔ細胞を下記の通り同定した。ＴＣＲを下記の通り単離した。
ＴＣＲの名称：４２８５−ＴＣＲ１
ｐ５３変異の認識：Ｒ１７５Ｈ
スクリーニング方法：ｐ５３「ホットスポット」変異ユニバーサルスクリーニング
ＴＣＲを同定するための共培養：４２８５−Ｆ６とｐ５３−Ｒ１７５Ｈペプチドとを共培養、ＣＤ４＋４１ＢＢ＋Ｔ細胞をソート
ＴＣＲを同定するための方法：単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
全ての対合ＴＣＲのうちのＴＣＲの存在量：８１．８％（４４対のうち３６回観察）
ＴＣＲの配向：アルファ−ベータ
発現ベクター：ＳＢトランスポゾン
【０２６９】
【化２７】
2020534839.tif 000063
【０２７０】
患者４２８５由来の４２８５−ＴＣＲ１についての統計値を表３５に記載する。
【０２７１】
【表３５】
2020534839.tif 000064
【０２７２】
実施例１４
この実施例は、Ｔ細胞によるｐ５３「ホットスポット」変異に対する応答の概要を示す。
【０２７３】
Ｔ細胞によるｐ５３「ホットスポット」変異に対する応答の概要を表３６に提供する。表３６の１〜１５番は、後ろ向き研究であった。表３６の１６〜３３番は、前向き研究であった。
【０２７４】
【表３６】
2020534839.tif 000065
【０２７５】
実施例１５
この実施例は、ｐ５３変異反応性ＴＩＬによる患者の治療を示す。
【０２７６】
ｐ５３変異反応性ＴＩＬによる患者の治療の概要を表３７に提供する。
【０２７７】
【表３７】
2020534839.tif 000066
【０２７８】
実施例１６
この実施例は、シーケンスした全ての腫瘍における各ミスセンスｐ５３変異の全体頻度を示す。
【０２７９】
サンプルを以下の通り取得した：１４１人のがん患者から腫瘍及びＰＢＬを収集した。ＴＩＬを腫瘍から成長させた。腫瘍サンプルをエクソーム及びトランスクリプトームのシーケンシングに供した。Ｔｐ５３変異を同定した。１５０個の腫瘍のうち、３０％がＷＴｐ５３を発現し、７０％が変異型ｐ５３を発現していた。変異型ｐ５３を発現していた１２２個の腫瘍サンプルのうち、７３％がミスセンス変異を発現し、１３％が終止コドン獲得型（ｓｔｏｐ−ｇａｉｎ）変異を発現し、１１％がフレームシフト変異を発現し、３％が挿入欠失変異を発現していた。
【０２８０】
シーケンスした全ての腫瘍における各ミスセンスｐ５３変異の全体頻度を図４４に示す。
【０２８１】
実施例１７
この実施例は、実施例１〜１５のＴＣＲの反応性の概要を示す。
【０２８２】
表３８のＴＣＲを単離し、Ｔ細胞で発現させ、関連する抗原に対して試験した。結果の概要を表３８に示す。
【０２８３】
【表３８】
2020534839.tif 000067
【０２８４】
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって組み入れられると示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２８５】
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストの後の用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、特に主張しない限り、単に本発明をより深く解明することを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０２８６】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む、本明細書に記載される。好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法によって認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される発明主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。
【図１】
2020534839.tif 000068
【図２】
2020534839.tif 000069
【図３】
2020534839.tif 000070
【図４】
2020534839.tif 000071
【図５】
2020534839.tif 000072
【図６】
2020534839.tif 000073
【図７】
2020534839.tif 000074
【図８】
2020534839.tif 000075
【図９】
2020534839.tif 000076
【図１０】
2020534839.tif 000077
【図１１】
2020534839.tif 000078
【図１２】
2020534839.tif 000079
【図１３】
2020534839.tif 000080
【図１４】
2020534839.tif 000081
【図１５】
2020534839.tif 000082
【図１６】
2020534839.tif 000083
【図１７】
2020534839.tif 000084
【図１８】
2020534839.tif 000085
【図１９】
2020534839.tif 000086
【図２０】
2020534839.tif 000087
【図２１】
2020534839.tif 000088
【図２２】
2020534839.tif 000089
【図２３】
2020534839.tif 000090
【図２４】
2020534839.tif 000091
【図２５】
2020534839.tif 000092
【図２６】
2020534839.tif 000093
【図２７】
2020534839.tif 000094
【図２８】
2020534839.tif 000095
【図２９】
2020534839.tif 000096
【図３０】
2020534839.tif 000097
【図３１】
2020534839.tif 000098
【図３２】
2020534839.tif 000099
【図３３】
2020534839.tif 000100
【図３４】
2020534839.tif 000101
【図３５】
2020534839.tif 000102
【図３６】
2020534839.tif 000103
【図３７】
2020534839.tif 000104
【図３８】
2020534839.tif 000105
【図３９】
2020534839.tif 000106
【図４０】
2020534839.tif 000107
【図４１】
2020534839.tif 000108
【図４２】
2020534839.tif 000109
【図４３】
2020534839.tif 000110
【図４４】
2020534839.tif 000111
【図４５】
2020534839.tif 000112
【図４６】
2020534839.tif 000113
【図４７】
2020534839.tif 000114
【図４８】
2020534839.tif 000115
【図４９】
2020534839.tif 000116
【図５０】
2020534839.tif 000117
【図５１】
2020534839.tif 000118
【図５２】
2020534839.tif 000119
【図５３】
2020534839.tif 000120
【図５４】
2020534839.tif 000121
【図５５】
2020534839.tif 000122
【配列表】
2020534839000001.app
【国際調査報告】
2020534839.tif 000123
2020534839.tif 000124
2020534839.tif 000125