(57)【要約】  鳥の卵における雄のヒヨコ胚の致死表現型を誘導可能な様式で誘発するための第１の核酸配列と、前記致死表現型をもたらすための前記第１の核酸配列を前記鳥の細胞の染色体に向けるための第２の核酸配列と、を含むＤＮＡ編集剤が開示されている。ＤＮＡ編集剤の使用も開示されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥の卵における雄のヒヨコ胚の致死表現型を誘導可能な様式で誘発するための第１の核酸配列と、前記致死表現型をもたらすための前記第１の核酸配列を前記鳥の細胞のＺ染色体に向けるための第２の核酸配列と、を含むＤＮＡ編集剤。
【請求項２】
前記第１の核酸配列が、致死性タンパク質の発現を制御するスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された前記致死性タンパク質をコードし、前記スイッチがインデューサーによって調節される、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項３】
前記致死性タンパク質が、毒素、アポトーシス促進タンパク質、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤、ＢＭＰアンタゴニストおよびＦＧＦアンタゴニストからなる群から選択される、請求項２に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項４】
単一分子である、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項５】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が非同一分子に含まれる、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項６】
前記第１の核酸配列が、エンドヌクレアーゼタンパク質の発現を制御するスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたゲノム編集を実行できるエンドヌクレアーゼ酵素をコードし、前記スイッチがインデューサーによって調節される、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項７】
前記第２の核酸配列が、
（ｉ）前記鳥の前記Ｚ染色体における標的遺伝子座に隣接する５’領域に実質的に相同である左相同性アーム（ＬＨＡ）ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）前記鳥の前記Ｚ染色体における前記標的遺伝子座に隣接する３’領域に実質的に相同である右相同性アーム（ＲＨＡ）ヌクレオチド配列と、を含む、請求項４に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項８】
前記インデューサーが、熱、超音波、電磁エネルギーおよび化学物質からなる群から選択される、請求項２または６に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項９】
前記スイッチが、前記インデューサーの存在下で結合して活性酵素を形成するスプリットリコンビナーゼ酵素を含む、請求項２または６に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１０】
前記スイッチが誘導性プロモーターを含む、請求項２または６に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１１】
前記エンドヌクレアーゼ酵素がＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である、請求項６に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１２】
前記鳥の必須遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列が、前記スイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている、請求項１１に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１３】
前記必須遺伝子がＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＦＧＦＲ１からなる群から選択される、請求項１２に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびカスパーゼ９からなる群から選択される、請求項１１に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１５】
レポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１６】
前記インデューサーが電磁エネルギーである、請求項２または６に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１７】
前記電磁エネルギーが可視光の成分である、請求項１６に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１８】
前記可視光の成分が青色光である、請求項１７に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項１９】
前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびウズラからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＤＮＡ編集剤。
【請求項２０】
鳥の細胞のＺ染色体に安定に組み込まれた外因性ポリヌクレオチドを含む前記鳥の細胞を含む細胞集団であって、前記外因性ポリヌクレオチドは、前記鳥の雄の子孫において致死表現型を誘発するためのものである、細胞集団。
【請求項２１】
前記誘発は誘導可能な様式でもたらされる、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２２】
前記細胞は始原生殖細胞（ＰＧＣ）を含む、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２３】
前記細胞は配偶子を含む、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２４】
前記ＰＧＣは、生殖腺ＰＧＣ、血液ＰＧＣおよび生殖三日月環ＰＧＣからなる群から選択される、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２５】
請求項２０または２４に記載の細胞集団を含むキメラ鳥。
【請求項２６】
キメラ鳥を生成する方法であって、請求項２２に記載の細胞集団をレシピエント鳥胚に、前記細胞集団の前記ＰＧＣの少なくとも１つが前記レシピエント鳥胚の生殖腺に定着することを可能にするのに十分な条件下で投与し、これによってキメラ鳥を生成することを含む、方法。
【請求項２７】
前記投与に続いて前記キメラ鳥をインキュベートして孵化させることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記キメラ鳥を性的成熟まで飼育することをさらに含み、前記キメラ鳥はドナーＰＧＣに由来する配偶子を産生する、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記投与がｉｎ−ｏｖｏ注射によるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞集団が、前記レシピエント鳥と同じ鳥類種に由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞集団が、前記レシピエント鳥とは異なる鳥類種に由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記レシピエント胚がＥｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｃｈａｖステージ分類システムによるおよそステージＩＸとＨａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによるおよそステージ３０との間にあるときに、前記細胞集団が投与される、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記レシピエント胚がＨａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによるステージ１４後にあるときに、前記細胞集団が投与される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法に従って生成されるキメラ鳥。
【請求項３５】
請求項３４に記載のキメラ鳥の配偶子を使用して生成されるトランスジェニックトリ。
【請求項３６】
鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす方法であって、外因性ポリヌクレオチドが前記鳥のＺ染色体に安定して組み込まれ、前記外因性ポリヌクレオチドは前記鳥の雄の子孫において致死表現型を誘導可能な様式で誘発するためのものであり、
前記方法は、前記致死表現型を誘発するインデューサーに前記卵をさらし、これによって鳥の前記受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らすことを含む、方法。
【請求項３７】
ＤＮＡ編集システムであって、
（ｉ）リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された鳥の卵において致死表現型を誘発するための第１の核酸配列と、前記致死表現型をもたらすための前記第１の核酸配列を前記鳥の細胞のＺ染色体に向けるための配列と、を含む第１の薬剤と、
（ｉｉ）リコンビナーゼ酵素をコードする第２の核酸配列と、前記第２の核酸配列を前記鳥の細胞のＺ染色体に向けるための配列と、を含む第２の薬剤と、を含む、ＤＮＡ編集システム。
【請求項３８】
前記第１の核酸配列が、致死性タンパク質またはゲノム編集を実行できるエンドヌクレアーゼ酵素をコードする、請求項３７に記載のＤＮＡ編集システム。
【請求項３９】
前記第１の核酸配列または前記第２の核酸配列をＸ染色体に向けるための前記配列が、
（ｉ）前記鳥の前記Ｚ染色体における標的遺伝子座に隣接する５’領域に実質的に相同である左相同性アーム（ＬＨＡ）ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）前記鳥の前記Ｚ染色体における前記標的遺伝子座に隣接する３’領域に実質的に相同である右相同性アーム（ＲＨＡ）ヌクレオチド配列と、を含む、請求項３７に記載のＤＮＡ編集システム。
【請求項４０】
鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす方法であって、
雌鳥を雄鳥と交配させることであって、リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記雄鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれ、前記外因性ポリヌクレオチドは、鳥の卵の致死表現型を誘発するためのものであり、リコンビナーゼ酵素をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドは、前記雌鳥のＺ染色体に安定して組み込まれているか、または、
リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記雌鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれ、前記外因性ポリヌクレオチドは、鳥の卵の致死表現型を誘発するためのものであり、リコンビナーゼ酵素をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドは前記雄鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれていて、
これによって、鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす、交配させること、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、生存不能な雄のヒヨコ胚を含む卵を産むゲノム編集された鳥に関する。
【背景技術】
【０００２】
性別分離は、すべての鳥類種の生産にとって重要な側面であるが、特に、ブロイラーおよび本質的にはすべての産卵鶏ならびに七面鳥の生産にとって重要な側面である。ブロイラーおよび七面鳥については、性別分離は、両方の性別のニーズに応じてより適切な管理および給餌を可能にし、現在ほとんどの場合に行われているユニセックスの飼育とは少し異なる。本質的に、食卓卵の産卵鶏となる雌鶏のすべての商業的孵化場は群れの性別分離を使用する。雄のニワトリは孵化場で殺処分されるが、雌のニワトリには明らかに卵の生産が定められている。
【０００３】
現在、家禽を性別判定するのに利用可能な３つの方法がある。日齢のヒヨコは、肛門／排泄腔雄雌鑑別方法、または羽毛雄雌鑑別方法のいずれかによって性別鑑別できる。または、二次性徴が明らかになるまで雄および雌のヒヨコを一緒に飼育し、その後、ヒヨコを性別に基づいて分離することができる。肛門／排泄腔雄雌鑑別は、性に関連する解剖学的構造の外観に基づく性の視覚的識別に依存している。羽毛雄雌鑑別は、雄のヒヨコと雌のヒヨコとで異なる羽毛の特徴、例えば、綿毛の色模様、および／または翼の羽毛の速い／遅い成長速度に基づく。第３の方法は、例えば、雄においてとさかおよび肉垂が雌のものよりも大きくなる、自然な二次性徴の現れに依存する。
【０００４】
日齢のヒヨコの肛門／排泄腔性別決定は難しく、費用がかかる。鳥の性別を識別するには、高度に熟練した人員が必要である。実行するのはより容易であるが、羽毛雌雄鑑別は、鳥の特定の遺伝的交雑に限定されるという欠点がある。二次性徴による雌雄鑑別は実行するのに最も容易な方法であるが、孵化後の最初の数週間は両方の性別の鳥を一緒に飼育する必要があり、給餌コストおよび給餌切り替え考慮のために、孵化場にとって雄雌鑑別の費用に比べてより高くなり得るという欠点がある。
【０００５】
最も重要なことに、一方では肉の生産および他方では卵の生産の最適化を高めるため、卵の生産のために最適化されたニワトリ種の雄の若鶏は、もはや肉の生産には適切でないまたは経済的に魅力的ではない。したがって、米国および欧州では、ガス中毒処理、感電処理または破砕処理のみによって、５億羽以上の雄のヒヨコが毎年処分されている。これは経済的な問題だけでなく、益々倫理的な問題にもなりつつある。
【０００６】
明らかに、商業的孵化場産業は、高度に熟練した個人に依存しない、鳥がまだ卵の中にいる間に鳥を選別することを可能にする方法を必要としている。
【０００７】
Ｏｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，［Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：２３９８０（２０１６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ２３９８０］は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するニワトリ始原生殖細胞における標的変異誘発を教示している。
【０００８】
Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，［ＰＮＡＳ，２０１２，ｐ．１４６６−１４７２］は、ｐｉｇｇｙＢａｃおよびＴｏｌ２トランスポゾンを使用する始原生殖細胞の遺伝子組換えまたは生殖細胞系伝達を教示している。
【０００９】
米国特許出願第２００６／００９５９８０号は、雌ではなく雄であるより高い確率を有する子孫を生成するために雌鳥の内因性始原生殖細胞の数を操作することを教示している。
【００１０】
追加の背景技術として、ＷＯ２０１７／０９４０１５が挙げられる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、鳥の卵における雄のヒヨコ胚の致死表現型を誘導可能な様式で誘発するための第１の核酸配列、および致死表現型を影響させるための第１の核酸配列を鳥の細胞のＺ染色体に向けるための第２の核酸配列を含むＤＮＡ編集剤が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、細胞のＺ染色体に安定的に組み込まれた外因性ポリヌクレオチドを含む鳥の細胞を含む細胞集団が提供され、外因性ポリヌクレオチドは鳥の雄の子孫に致死表現型を誘発するためのものである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載の方法に従って生成されるキメラ鳥が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載のキメラ鳥の配偶子を使用して生成されるトランスジェニックトリが提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす方法であって、外因性ポリヌクレオチドは、鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれ、外因性ポリヌクレオチドは、鳥の雄の子孫に致死表現型を誘導可能な様式で誘発するためのものであり、本方法は、致死表現型を誘発するインデューサーに卵をさらし、それによって鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす、方法が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載の細胞集団を含むキメラ鳥が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載の細胞集団をレシピエント鳥胚に、細胞集団の始原生殖細胞（ＰＧＣ）の少なくとも１つがレシピエント鳥胚の生殖腺に定着することを可能にするのに十分な条件下で投与し、これによってキメラ鳥を生成することを含む、キメラ鳥を生成する方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ＤＮＡ編集システムであって、
（ｉ）リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された鳥の卵において致死表現型を誘発するための第１の核酸配列と、前記致死表現型を影響させるための前記第１の核酸配列をＺ染色体に向けるための配列と、を含む第１の薬剤と、
（ｉｉ）リコンビナーゼ酵素をコードする第２の核酸配列と、前記第２の核酸配列を鳥の細胞のＺ染色体に向けるための配列と、を含む第２の薬剤と、を含む、ＤＮＡ編集システムが提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす方法であって、
雌鳥を雄鳥と交配させることであって、リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記雄鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれ、前記外因性ポリヌクレオチドは、鳥の卵の致死表現型を誘発するためのものであり、リコンビナーゼ酵素をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドは、前記雌鳥のＺ染色体に安定して組み込まれているか、または、
リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された前記第１の外因性ポリヌクレオチドは、前記雌鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれ、前記外因性ポリヌクレオチドは、鳥の卵の致死表現型を誘発するためのものであり、リコンビナーゼ酵素をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドは前記雄鳥のＺ染色体に安定的に組み込まれていて、
それによって、鳥の受精卵から孵化する雄のヒヨコの数を減らす、交配させること、を含む、方法が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、誘発は誘導可能な様式でもたらされる。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の核酸配列は、致死性タンパク質の発現を制御するスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される致死性タンパク質をコードし、スイッチはインデューサーによって調節される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、致死性タンパク質は、毒素、アポトーシス促進タンパク質、ＢＭＰアンタゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤およびＦＧＦアンタゴニストからなる群から選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は単一分子である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、非同一分子に含まれる。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の核酸配列は、エンドヌクレアーゼタンパク質の発現を制御するスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されるゲノム編集を実行できるエンドヌクレアーゼ酵素をコードし、スイッチはインデューサーによって調節される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第２の核酸配列は、
（ｉ）鳥のＺ染色体における標的遺伝子座に隣接する５’領域に実質的に相同である左相同性アーム（ＬＨＡ）ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）鳥のＺ染色体における標的遺伝子座に隣接する３’領域に実質的に相同である右相同性アーム（ＲＨＡ）ヌクレオチド配列と、を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、インデューサーは、熱、超音波、電磁エネルギーおよび化学物質からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、スイッチは、インデューサーの存在下で結合して活性酵素を形成するスプリットリコンビナーゼ酵素を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、スイッチは誘導性プロモーターを含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、エンドヌクレアーゼ酵素はＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、鳥の必須遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ヌクレオチド配列はスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、必須遺伝子は、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＦＧＦＲ１からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびカスパーゼ９からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、レポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、インデューサーは電磁エネルギーである。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、電磁エネルギーは可視光の成分である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、可視光の成分は青色光である。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、鳥は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびウズラからなる群から選択される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は始原生殖細胞（ＰＧＣ）を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は配偶子を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＧＣは、生殖腺ＰＧＣ、血液ＰＧＣおよび生殖三日月環ＰＧＣからなる群から選択される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、投与に続いてキメラ鳥をインキュベートして孵化させることをさらに含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、キメラ鳥を性的成熟まで飼育することをさらに含み、キメラ鳥はドナーＰＧＣに由来する配偶子を産生する。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与はｉｎ−ｏｖｏでの注入による。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞集団は、レシピエント鳥と同じ鳥類種に由来する。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞集団は、レシピエント鳥とは異なる鳥類種に由来する。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、レシピエント胚がＥｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｃｈａｖステージ分類システムによるおよそステージＩＸとＨａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによるおよそステージ３０との間にあるときに、細胞集団が投与される。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、レシピエント胚がＨａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによるステージ１４後にあるときに、細胞集団が投与される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の核酸配列は、致死性タンパク質またはゲノム編集を実行することができるエンドヌクレアーゼ酵素をコードする。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記第１のまたは前記第２の核酸配列をＸ染色体に向けるための配列は、
（ｉ）鳥のＺ染色体における標的遺伝子座に隣接する５’領域に実質的に相同である左相同性アーム（ＬＨＡ）ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）鳥のＺ染色体における前記標的遺伝子座に隣接する３’領域に実質的に相同である右相同性アーム（ＲＨＡ）ヌクレオチド配列と、を含む。
【００５１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が係る当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合には、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本明細書では、本発明のいくつかの実施形態を、単なる例として、添付の図面を参照して説明する。ここで図面を特に詳細に参照すると、示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的な記述の目的のためであることが強調されている。これに関して、図面と共に行われる説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
【００５３】
【図１】雌レイヤーヒヨコのみが孵化する光遺伝学的誘導性ニワトリ系統の生成を示す図である。野生型の雄鶏（ＺＺ）を遺伝子改変雌鶏（ZW）と交配することにより、すべての雌の受精卵は野生型のＺＷ染色体を担持し、Ｚ染色体はＷＴ雄鶏に由来する。すべての雄の受精卵は、赤色ラベル付けされたZが雌鶏のゲノムに由来するZZ染色体を担持する。これが標的となる染色体である。受精卵への青色光照明時に、この染色体の光遺伝学的システムは、活性になって、産卵直後に初期の胚死亡を引き起こす死亡機構を活性化する。青色光照明の影響を受けない雌は、成体に成長し、食用の無精卵を産む。
【図２】青色光照明によって遺伝子発現を制御する戦略を示す。２つの融合タンパク質、すなわち、ＣｒｅのＮ末端をもつＣｒｙ２（Ｃｒｙ２−Ｃｒｅ−Ｎ末端）およびＣｒｅのＣ末端と融合するＣＩＢＮ（ＣＩＢＮ−Ｃｒｅ−Ｃ末端）が作成される。青色光照明がないと、Ｃｒｅは不活性である。青色光照明時に、ＣＲＹ２およびＣＩＢＮはヘテロダイマーを形成し、Ｃｒｅの２つの部分が一緒になって活性Ｃｒｅ酵素１１を形成する。
【図３】Ｚ染色体上の相同性アームを示す。Ｈｉｎｔ１遺伝子座の下流のゲノム領域（緑色の矢印）が描かれている。それぞれの５’および３’アームならびにＨＡ−１およびＨＡ−２が赤で示されている。アームを増幅するためのプライマーが黄色の矢印で示されている。相同性アームの間にある両方のＤＮＡ鎖には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に特異的かつ適切な非常にユニークな配列がある（緑色のボックス）。図の下部は、２つの相同性アーム間の領域を詳細に示している。  配列番号１で示す配列を示している。
【図４Ａ】本発明の実施形態によるターゲティングベクターを示す。ターゲティングベクターには３つの主要な要素が含まれている。第１は、挿入カセット全体に隣接する相同組換え（ＨＲ）のための５’および３’相同性アーム（ＨＡ、淡い青色）、第２は、光誘導システム、この場合はＣＲＹ２−ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ、および第３は、致死遺伝子カセット。（Ａ）自己切断ペプチドＰ２Ａ（紫色のボックス）によって分離されたＣＲＹ２−ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ遺伝子（赤色のボックス）の発現を駆動する５’ＨＡおよびそれに続くｐＧＫプロモーター（濃い青色のボックス）を含む単一ターゲティングベクター戦略の構造。この要素の後に、ｐＧＫプロモーターを含む致死遺伝子カセットが続き、その後にＬｏｘＰ（黄色の丸）ＳＴＯＰ（赤い八角形）ＬｏｘＰ部位（ＬＳＬ）が続き、その後に致死誘導遺伝子が続く。このカセットの後には３’ＨＡ（淡い青色のボックス）が続く。光誘導時に、ＣＲＹ２−ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ−ＣｒｅＣが二量体化して、活性型のＣｒｅを形成する。その後、後者はＬＳＬ要素を切除し、したがって、致死誘導遺伝子の発現を可能にし、このベクターを担持するすべての胚の死亡に繋がる。（Ｂ）Ａの代替アプローチであり、ＬＳＩ要素を使用することに代えて、Ｄｉｏ−ｌｏｘ反転戦略が使用される（黄色の三角形）。Ｄｉｏ−ｌｏｘ部位間に、ＧＦＰに続いてポリアデニル化部位＃１（ＰＡ１、灰色のボックス）に後続するＧＦＰ、および逆方向の異なるポリアデニル化部位＃２（ＰＡ２）が後続する致死遺伝子が導入される。この場合、光活性化の前に、ｐＧＫプロモーターがＧＦＰの発現を駆動する。光活性化時に、Ｄｉｏ−ｌｏｘ部位間のカセットが反転し、致死遺伝子はここで発現する正方向にある一方、ＧＦＰはここで逆方向になり、もはや活性ではなくなる。Ｃ）ＡまたはＢの代替アプローチ。Ｃｒｅの活性化後に、ＬＳＬは除去され、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡは発現される。これは、必須遺伝子のコーディング領域におけるミスセンス変異の導入、ゆえに、胚の致死性の誘導に繋がる。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図５Ａ】ＰＧＣ株の導出と特性評価。Ａ、ＰＧＣの培養。Ｂ、左、異なる多能性マーカーおよび生殖細胞マーカーのｍＲＮＡ発現。右、雌ＰＧＣ（左、リボソームＳ１８およびＷ染色体の２つのＰＣＲ産物）および雄ＰＧＣ（右、リボソームＳ１８のみ）の性別識別の代表的な特性評価。Ｃ、ＳＳＥＡ１抗原のＰＧＣ抗体染色。Ｄ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用したプラスミドをコードするｐＣＡＧＧ−ＧＦＰによるＰＧＣのトランスフェクション。Ｅ、プラスミドをコードするｐＣＡＧＧ−ＧＦＰによるエレクトロポレーションを使用したＰＧＣトランスフェクション。Ｆ、胚の生殖腺（精巣）、ＧＦＰ発現培養ＰＧＣの移植から１０日後。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【図６Ａ】ＣＲＩＳＰＲ媒介ターゲティングのためのｓｇＲＮＡ部位の設計。最適なＣＲＩＳＰＲターゲティング部位の設計のためのＺ染色体上のゲノム領域の表現。１２個の上位のｓｇＲＮＡ配列が提示され（ガイド＃１〜＃１２）、反対の向きに部分的に重なり合ったそのうちのガイド＃１および＃３が選択された。ガイド＃１の潜在的なオフターゲットを示している。以下の表１は、図６Ｂに示すガイドＲＮＡの配列を示している。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。表１
【表１】
2020536580.tif 000003
図６Ｃに示すガイド＃１の潜在的なオフターゲットの上位１０個の検索結果の配列を表２にまとめている。
表２
【表２】
2020536580.tif 000004
【図７Ａ】エンドヌクレアーゼアッセイを用いたＣＲＩＳＰＲ活性の検証。Ａ．アニールされたＷＴ  ３２０ｂｐ  ＰＣＲ産物およびＣＲＩＳＰＲ１の予測切断部位で示された比率での変異産物を使用したエンドヌクレアーゼアッセイのポジティブコントロール。Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ１プラスミドをトランスフェクションした１２個のコロニーに関するエンドヌクレアーゼアッセイ。Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ３プラスミドをトランスフェクションした１２個のコロニーに関するエンドヌクレアーゼアッセイ。ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３の２つの予測される切断部位の間には１２ｂｐの距離があることに留意されたい。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８Ａ】ＤＮＡ配列決定を使用したＣＲＩＳＰＲ活性の検証。Ａ．ＣＲＩＳＰＲ１の予測される切断部位のＷＴゲノム領域のＤＮＡクロマトグラムは、ネガティブコントロールとしての正常な配列を示している。Ｂ．ポジティブコントロールとして、予測される切断部位の後にダブルピーク（青色の矢印）の出現を示すＷＴおよび人工変異ＰＣＲ産物の混合物の配列。Ｃ．正常な配列を示す陰性コロニーの配列決定。Ｄ．ＣＲＩＳＰＲ１切断部位に続くダブルピークの出現を示す陽性コロニーの配列（青色の矢印）。配列ＡＧＡＴＡＡＣＧＴ（配列番号６５）が描かれている。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【図９】Ｚ染色体へのゲノム組み込みのためのターゲティングベクターの構築。Ａ−ゲノムＤＮＡを、プライマーＰ１およびＰ２を用いたＰＣＲ反応についてのテンプレートとして使用した。この領域には、５’ＨＡおよび３’ＨＡが含まれ、ＣＲＩＳＰＲ部位を含む領域に隣接している。Ｂ−ＨＩＮＴＺ遺伝子座の下流に位置する約３ｋｂの産物をシャトルベクターｐＪｅｔ１．２に連結した。このプラスミドを、プライマーＰ３およびＰ４を用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用した。これらのプライマーは、ｐＣＡＧＧ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片（Ｄ）の同等の領域に対応する拡張配列（色分けされた波括弧で区画されている）を有する。Ｃ−線状化された産物−ギブソン反応時にｐＣＡＧＧ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットの末端に結合する配列が隣接する、ＣＲＩＳＰＲ部位含有領域を除く２つの相同性アームを含むベクター。Ｄ−ｐＣＡＧＧ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを、プライマーＰ５およびＰ６を用いたＰＣＲ反応についてのテンプレートとして使用した。これらのプライマーは、相同性アームの端にある同等の領域に対応する拡張配列（色分けされた波括弧で区画されている）を含む。Ｅ−相同性アームの末端に結合する配列が隣接する線状化された挿入カセット。ギブソンアセンブリ反応１０を用いて、ベクターとインサートを一緒に繋ぎ合わせて、最終的なターゲティングベクタープラスミドを作成した。Ｆ−ターゲティングベクター。
【図１０Ａ】ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドのＰＧＣへのコトランスフェクション。Ａ．ＣＲＩＳＰＲ１およびＨＲターゲティングベクタープラスミドを用いたＰＧＣへのリポフェクション媒介コトランスフェクション。Ｂ．Ｇ−４１８選択の２週間後、耐性ＰＧＣの９９％以上がＧＦＰに対して陽性であった。Ｃ．宿主胚への標的化ＰＧＣの注入の１０日後、多数の細胞が生殖腺（精巣）に局在していることがわかった。Ｄ．生殖腺を解剖し、抗ＧＦＰ抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡（緑色でＧＦＰ抗体染色、青色で４’、６ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した核）を使用してスキャンした。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１１Ａ】ＦＡＣＳ選別ＰＧＣにおけるＨＲ組み込みのＰＣＲ検証。Ａ．Ｇ−４１８耐性ＰＧＣのＦＡＣＳ選別。ＦＡＣＳゲーティングは、９６ウェルプレートでプールまたは個々の細胞として選別された特異（ｓｉｎ）ＧＦＰ陽性細胞を選別するように設計された。Ｂ．ＰＣＲ分析に対して、５’組み込み部位（Ｐ７およびＰ８）および３’組み込み部位（Ｐ９およびＰ１０）についての２セットのプライマーを設計した。Ｃ．プールした細胞から抽出したゲノムＤＮＡを、ネガティブコントロールとして機能するＰＣＲおよびＷＴ  ＤＮＡのためのテンプレートとして使用した。予測された１．６ｋｂおよび１．８ｋｂのバンドは、それぞれ５’および３’領域での適切なＨＲ組み込みについて明らかであった。Ｄ．単一細胞ＦＡＣＳ選別ＰＧＣに由来する雄および雌細胞コロニーから抽出されたゲノムＤＮＡを、ネガティブコントロールとして機能するＰＣＲおよびＷＴ  ＤＮＡのためのテンプレートとして使用した。予測された１．６ｋｂおよび１．８ｋｂのバンドは、それぞれ５’および３’領域での適切なＨＲ組み込みについて明らかであった。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１２Ａ】ＨＲ組み込みのサザンブロット解析。Ａ−ＷＴ対立遺伝子、およびＨＲ組み込みを受けた対立遺伝子についてのサザンブロット解析において予想されるＢｇｌＩＩ切断産物の模式図。５’、３’組み込み部位およびｎｅｏに使用されるプローブは、黄色の四角としてマークされている。各ＤＮＡプローブについてＢｇｌｌｌ消化後の予測される産物サイズを記載している。Ｂ−ＰＣＲによるｄｉｇ標識されたプローブの調製。標識プローブ（＋）または未標識（−）をアガロースゲルで解析した。ｄｉｇ標識された産物は実際のサイズよりも高くシフトされて、ｄｉｇ標識されたヌクレオチドの組み込みが確認された。プローブを増幅するために使用されたプライマーのセットが示されている。Ｃ−雄由来ＰＧＣのプールされかつ純粋なコロニーから抽出されたＤＮＡの５’および３’プローブを用いたサザンブロット解析。ネガティブコントロールとして機能するＨＲの前の元の株から抽出されたＷＴ  ＤＮＡ。Ｄ−雌由来ＰＧＣ上で５’およびＮｅｏプローブを用いたサザンブロット解析。両方の場合に単一の７．５ｋｂバンドが明らかであり、適切なＨＲが発生し、ターゲティングベクターの単一コピーのみが組み込まれたことが示された。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＥＫ２９３細胞の光遺伝学的システムの検証。ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびＰＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰプラスミドを用いたトリプルトランスフェクション。トランスフェクションの２４時間後、コントロール細胞を暗所に保ちながら、実験群の細胞を１５秒間の青色光照明にさらした（上段）。照明後（下段）、細胞をさらに２４時間インキュベートした。これらの細胞では、ＧＦＰ発現が明らかであり、青色光照明時のＣｒｅ酵素の活性化が確認された。
【図１４】エレクトロポレーション前に５４〜６０時間インキュベートされた、ヒヨコ胚におけるｉｎ−ｏｖｏでの光遺伝学的システムの検証。ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびＰＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰプラスミドを用いたニワトリ胚へのトリプルエレクトロポレーション。エレクトロポレーションの１２時間後、コントロール胚を暗所に維持しながら、実験群の胚を１５秒間ｉｎ−ｏｖｏで青色光照明にさらした（上段）。照明後（下段）、両方の群由来の胚をさらに１２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＧＦＰ発現細胞は照明された群で明確に現れ、ｉｎ−ｏｖｏでのニワトリ胚における青色光照明時に光遺伝学的システムおよびＣｒｅ酵素の活性化が確認された。
【図１５】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。光遺伝子プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮをテンプレートとして使用して、それぞれＰ４０〜Ｐ４１およびＰ４２〜Ｐ４３プライマーを使用して光遺伝子融合タンパク質を増幅した（１５Ａ）。２つの産物は、プライマーＰ４１およびＰ４２において導入されたＰ２Ａ部位で重複配列を共有する。これにより、１サイクルのオーバーハング延出ＰＣＲが可能になり、２つのフラグメント（１５Ｂ）を結合させて、ｐＪｅｔ１．２シャトルベクター（１５Ｃ）に連結された１つにした。それぞれＳｍａｌおよびＮｈｅｌ制限部位を有するテールを含むプライマーＰ４４およびＰ４５を使用して、１５Ｄでの産物が生成された。この産物を、適切な制限酵素を使用して消化し、同じ酵素（１５Ｆ）で消化したｐＣＡＧＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１５Ｅ）に連結した。
【図１６】ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅプラスミドの活性の検証。ｐＣＡＧＧ−ＯｐｔｏｇｅｎｅおよびｐＢ−ＲＡＧＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを用いたコトランスフェクション。トランスフェクションの２４時間後、ネガティブコントロール群を暗所に保ったまま（上段）、実験群の細胞を１５秒間青光照明にさらした（下段）。照明後（下段）、細胞をさらに２４時間インキュベートした。これらの細胞では、ｍＣｈｅｒｒｙの発現が明白であり（白色の矢印）、青色光照明時にｐＣＡＧＧ−ＯｐｔｏｇｅｎｅプラスミドによるＣｒｅ酵素の活性化が確認された。
【図１７】ｉｎ−ｏｖｏでのｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅプラスミドを使用した単一ベクター戦略の検証。ステージ１４〜１６Ｈ＆Ｈでのニワトリ胚を、ｐＣＡＧＧ−ＯｐｔｏｇｅｎｅおよびｐＢ−ＲＡＧＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを用いてコエレクトロポレーションした。後者のプラスミドは、光遺伝子システムの活性のためのレポーター遺伝子として機能する。エレクトロポレーションの１２時間後、コントロール胚を暗所に保ったまま（上段）、実験群の胚（下段）をｉｎ−ｏｖｏで青色光照明に１５秒間さらした。胚をさらに１２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＧＦＰ発現細胞は両方の群で明らかであり、成功裏のエレクトロポレーションが示されたが、照明群のみにおいてはｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞が明らかであり、ｉｎ−ｏｖｏでのニワトリ胚における青色光照明時に光遺伝学的システムおよびＣｒｅ酵素の活性化が確認された。
【図１８】ｐＧＫプロモーターの下でのＤＴＡの発現は、ｉｎ−ｏｖｏでのタンパク質合成を阻害する。ステージ１４〜１６Ｈ＆Ｈ胚を、ｐＧＫ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（上段）またはｐＧＫ−ＤＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（下段）発現ベクターのどちらかを用いてエレクトロポレーションした。ネガティブコントロールの胚は、通常のタンパク質合成を示すＧＦＰ（上段、矢印）を広く発現する。ＤＴＡ発現細胞はＧＦＰ発現を示さず（下段）、これらの胚でのタンパク質合成が阻害されることを示している。ＧＦＰのみ、明視野のみ、および明視野画像に重ねられたＧＦＰを表示している。
【図１９Ａ】本発明の追加の実施形態によるターゲティングベクターを示す。これらのベクターでは、活性化酵素（Ｃｒｅなど）は致死遺伝子カセットから分離されている。図１９Ａでは、活性化酵素を母雌鶏のゲノムに挿入し、不活性致死カセットを雄鶏のＺ染色体に挿入し、ここで、Ｚ染色体はこの対立遺伝子のホモ接合体である。この場合、雄胚における致死性の活性化は、光誘導を必要とせずに２つのトランスジェニック親を交配することにより行われる。すべての雄におけるＣｒｅは母体Ｚ染色体におけるＬＳＬを除去し、これによって致死遺伝子を発現させることを可能にするが、雌胚は不活性な致死カセットを保持し、ゆえに、影響を受けない。あるいは、母雌鶏のＺ染色体は、正しい方向のＦＬＰリコンビナーゼを、それに続いてＣＡＧＧプロモーターによって駆動される逆方向の致死遺伝子を含むＤｉｏ−Ｌｏｘフリッピングカセットにより標的化される（図１９Ｂ）。雄鶏、再度の、ＦＲＴ部位が隣接するＣＡＧＧ−Ｃｒｅカセットにより標的化されるＺ染色体のホモ接合体。２つの交配時に、雄胚は父のＺ染色体上に位置するＣｒｅを発現し、Ｄｉｏ−Ｌｏｘカセットは反転し、致死遺伝子は活性になり、これによって雄胚の胚致死に繋がる。この交配による雌胚の接合体には、卵形成中に産生されたＦＬＰリコンビナーゼ酵素の母体の寄与が含まれている。この母体タンパク質は、Ｚ染色体からＣＡＧＧ−Ｃｒｅカセットを除去し、Ｚ染色体上にＦＲＴの「瘢痕」のみにより雌胚を生きた状態にしておく。
【図１９Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、生存不能な雄のヒヨコ胚を含む卵を産むゲノム編集された鳥に関する。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示されている詳細に必ずしも限定されるものではないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行することができる。
【００５６】
性別分離は、すべての鳥類種の生産にとって重要な側面であるが、特に、ブロイラーおよび本質的にはすべての産卵鶏ならびに七面鳥の生産にとって重要な側面である。ブロイラーおよび七面鳥については、性別分離は両方の性別のニーズに応じてより適切な管理と給餌を可能にし、これは、現在ほとんどの場合に行われているユニセックス飼育とは少し異なる。本質的に、食卓卵の産卵鶏となる雌鶏のすべての商業的孵化場は群れの性別分離を使用する。雄のニワトリは孵化場で殺処分されるが、雌のニワトリは明らかに卵の生産を運命づけられている。
【００５７】
本発明者らは現在、世界中で数十億匹の雄のヒヨコの大量の処分の必要性を排除する方法を構想してきた。具体的には、本発明者らは、繁殖群の「母」が受精卵を産み、そこから雌の産卵鶏のみが孵化する一方、受精後すぐに雄の胚が発生しなくなる鶏種を生成する方法を考案した。したがって、雄のヒヨコを処分する必要性がなくなり、また、貴重なインキュベーションスペースの５０％が節約される。重要なのは、産卵鶏、および消費者にとっての最終製品である無精卵の両方が、あらゆる面で、産業界で現在生産されている産卵鶏および食物としての卵と同一（すなわち、非遺伝子改変）になる。
【００５８】
本発明を実施に移すまでの間に、本発明者らは、ＣＡＧＧプロモーターの下でＮｅｏおよびＧＦＰ遺伝子に隣接するＨＡを含むターゲティングベクターを設計し、ＰＣＲ（図１１Ａ〜Ｄ）およびサザンブロット（図１２Ａ〜Ｄ）の両方を使用して検証されたようにターゲティングベクターがＺ染色体に対して適切なＨＲを受けることを示した。さらに、ｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクター上で構築された光遺伝子システムの単一ベクター戦略は、生きているヒヨコ胚でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ−ｏｖｏの両方で活性であることがわかった（図１４）。最後に、ニワトリ胚におけるＤＴＡの発現は、タンパク質合成の阻害をもたらした（図１８）。
【００５９】
したがって、本発明の第１の態様によれば、鳥の卵における雄のヒヨコ胚の致死表現型を誘導可能な様式で誘発するための第１の核酸配列、および致死表現型をもたらすための第１の核酸配列を鳥の細胞のＺ染色体に向けるための第２の核酸配列を含むＤＮＡ編集剤が提供される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「鳥」および「鳥類種」という用語は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウを含むが、これらに限定されない、あらゆる鳥類を指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「卵」という用語は、生きている胚性鳥を含む鳥類の卵を指す。したがって、「卵」という用語は、受精した鳥類の卵を、一実施形態では、正常な胚形成を受けることができる鳥類の胚を含む卵を指すことを意図している。
【００６２】
ＤＮＡ編集剤（単一の核酸構築物または核酸構築物の組み合わせに含まれる）は、鳥の細胞のＺ染色体に第１の核酸配列のほぼ安定した組み込みをもたらす配列を標的化することを含む。ＤＮＡ編集剤は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されてもよい。
【００６３】
標的配列は、第１の核酸配列が細胞の任意の他の染色体ではなく、Ｚ染色体に特異的に組み込まれるように選択される。さらに、標的配列は、第１の核酸配列を染色体に組み込むためにどの方法に依存しているかによって選択される。核酸配列を染色体に組み込む方法は、当該技術分野において周知であり［例えば、Ｍｅｎｋｅ  Ｄ．Ｇｅｎｅｓｉｓ（２０１３）５１、−６１８；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８−１２９２、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００８）１０５：５８０９−５８１４、国際特許出願第ＷＯ２０１４／０８５５９３号、同第ＷＯ２００９／０７１３３４号および同第ＷＯ２０１１／１４６１２１号、米国特許第８７７１９４５号、同第８５８６５２６号、同第６７７４２７９号ならびに米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００６／００１４２６４号を参照されたく、それらの内容は、それらの全体が参照により組み込まれている］、標的化された相同組換え、部位特異的リコンビナーゼ、および操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集を含む。ＰＢトランスポザーゼも考えられる。対象の遺伝子に核酸変異を導入するための薬剤は、一般に入手可能なソースから設計され得るか、または、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ、ＡｄｄｇｅｎｅおよびＳａｎｇａｍｏから商業的に入手され得る。
【００６４】
一実施形態では、ＤＮＡ編集剤は、細胞のＺ染色体に第１の核酸配列を挿入する自発的な相同組換えに依存している。この実施形態では、ＤＮＡ編集剤は、標的配列として機能する相同性アームを含む。
【００６５】
ＤＮＡ編集剤は、ＨＤＲを介した特異的組み込みを容易にする組み込み部位として機能する、Ｚ染色体内の標的遺伝子座に含まれる少なくとも１つの核酸配列に対して、相同的である、または約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性もしくは同一性を示す２つのアームにより挟まれていてもよい。
【００６６】
相同性アームは、Ｚ染色体上に存在するゲノム配列に対応する。好ましくは、ゲノム配列は、転写活性のある遺伝子の下流（例えば、Ｈｉｎｔ１遺伝子の下流）にある。相同性アームは、典型的には、少なくとも５００ヌクレオチド長さ、例えば、５００〜３０００ヌクレオチド長さである。通常、必要な相同性アームのサイズは、これらのアームにより挟まれたカセットの長さに依存する。カセットが小さければ小さいほど、短いアームを必要とし、逆もまた同様である。相同組換えは自然に発生し得る。別の考えられる標的はＩｓｌ１（遺伝子ＩＤ３６９３８３）であり、これは、胚発生の初期段階から開始して発現する染色体Ｚ上にもある。
【００６７】
以下は、本発明の特定の実施形態に従って、ＤＮＡ編集剤によって使用されて、第１の核酸配列をＺ染色体に組み込んでもよい様々な追加の例示的な方法についての説明であり、およびこの目的を達成するために必要な標的配列についての説明である。
【００６８】
操作されたエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集、すなわち、本アプローチは、人工的に操作されたヌクレアーゼを使用して、ゲノムにおける望ましい場所（すなわち、Ｚ染色体）で特異的二本鎖切断を切断および生成し、それらは、次いで、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞内因性プロセスによって修復されるリバースジェネティクス法を指す。ＮＨＥＪは、二本鎖切断でＤＮＡ端を直接連結する一方、ＨＤＲは、切断点で欠損ＤＮＡ配列を再生するためのテンプレートとして相同配列を利用する。特異的ヌクレオチド修飾をゲノムＤＮＡに導入するために、望ましい配列を含むＤＮＡ修復テンプレートは、ＨＤＲ時に存在する必要がある。ほとんどの制限酵素はＤＮＡ上の少ない塩基対をそれらの標的として認識して、ゲノムにおける多くの場所で認識される塩基対の組み合わせが望ましい場所に限定されない複数の切断をもたらすことが見つかる可能性がかなり高いため、従来の制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノム編集を実行することはできない。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖または二本鎖切断を生成するために、現在までいくつかの別個のクラスのヌクレアーゼが発見され、バイオエンジニアリングされてきた。これらは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。
【００６９】
メガヌクレアーゼ−メガヌクレアーゼは一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーを１つまたは２つを有することによって特徴付けられる。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存されている構造要素、ひいてはＤＮＡ認識配列の特異性および触媒活性に関して互いに大きく分離されている。メガヌクレアーゼは一般に微生物種に見られ、かなり長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するというユニークな特性を有し、したがって、望ましい場所での切断のためにそれらを自然にかなり特異的にする。これを利用して、ゲノム編集で部位特異的二本鎖切断を行うことができる。当業者はこれらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、そのような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、変異誘発法およびハイスループットスクリーニング法を使用して、ユニークな配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を生成した。例えば、様々なメガヌクレアーゼが融合されて、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作成される。また、メガヌクレアーゼのアミノ酸と相互作用するＤＮＡは、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するために変更され得る（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３−９７５、米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、または同第８，１６３，５１４号に記載されている方法を使用して設計することができ、これらの各々の内容は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、部位特異的切断特性を有するメガヌクレアーゼは、商業的に利用可能な技術、例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＤｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）を使用して得ることができる。
【００７０】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ−２つの別個の操作されたヌクレアーゼのクラス、すなわち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は両方とも、標的化二本鎖切断の生成に効果的であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍａｈｆｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００７１】
基本的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ制限エンドヌクレアーゼ技術は、特異的ＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ一連のジンクフィンガードメインまたはＴＡＬＥ反復配列）に連結された非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位および切断部位が互いに分離されている制限酵素が選択される。切断部分は分離され、次にＤＮＡ結合ドメインに連結され、それにより、望ましい配列に対してかなり高い特異性を有するエンドヌクレアーゼを得る。そのような特性を有する例示的な制限酵素はＦｏｋｌである。さらに、Ｆｏｋｌは、ヌクレアーゼ活性をもたせるために二量体化が必要であるという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーがユニークなＤＮＡ配列を認識するために特異性が飛躍的に増加することを意味する。この効果を高めるために、ヘテロ二量体としてのみ機能し、かつ触媒活性が高くなったＦｏｋｌヌクレアーゼが操作された。ヘテロダイマー機能性ヌクレアーゼは、望ましくないホモダイマー活性の可能性を回避し、したがって、二本鎖切断の特異性を高める。
【００７２】
したがって、例えば、特異的部位を標的化するために、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮはヌクレアーゼ対として構築され、対の各メンバーは標的化部位で隣接配列を結合するように設計されている。細胞内における一過性発現時に、ヌクレアーゼはそれらの標的部位に結合し、Ｆｏｋｌドメインヘテロ二量体化して二本鎖切断を生成する。非相同端連結（ＮＨＥＪ）経路を介したこれらの二本鎖切断の修復は、ほとんどの場合、小さい欠失または小さい配列挿入であるインデルをもたらす。ＮＨＥＪによって行われる各修復は一意であるため、単一のヌクレアーゼの対を使用すると、標的部位において異なる欠失の範囲を有する対立遺伝子のシリーズが生成される。欠失は、通常、長さが数塩基対〜数百塩基対の範囲であるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって細胞培養においてより大きい欠失を成功裏に生成した（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらに、標的化領域に対する相同性を有するＤＮＡの断片がヌクレアーゼ対と共に導入されるとき、二本鎖切断が相同組換え修復を介して修復されて、特定の修飾が生成され得る（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００７３】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似した特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼの違いは、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ上のＴＡＬＥＮに依存する。ペプチドドメインを認識するこれらのＤＮＡの両方は、それらがタンパク質の組み合わせにおいて自然に見られるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、通常、３ｂｐ離れた反復配列において見られ、タンパク質と相互作用する様々な核酸の種々の組み合わせにおいて見られる。一方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間に１対１の認識率を有する反復配列において見られる。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥの両方は反復パターンで発生するため、様々な組み合わせを試して、様々な配列特異性を生成することができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作成するためのアプローチとして、例えば、特に、モジュラーアセンブリ（トリプレット配列と相関するジンクフィンガーが必要な配列をカバーするために一列に付着する）、ＯＰＥＮ（ペプチドの組み合わせ対細菌システムの最終標的の高ストリンジェンシー選択が後続するペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から商業的に設計および入手することもできる。
【００７４】
ＴＡＬＥＮを設計および取得する方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３−１４８、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９−５３に記載されている。Ｍｏｊｏ  Ｈａｎｄという名前の最近開発されたＷｅｂベースのプログラムが、ゲノム編集アプリケーション用のＴＡＬおよびＴＡＬＥＮ構築物を設計するためにＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃによって紹介された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇを介してアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から商業的に設計および入手することもできる。
【００７５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム−多くの細菌および古細菌は、侵入するファージおよびプラスミドの核酸を分解することができる内因性ＲＮＡベースの適応免疫システムを含んでいる。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を産生するクラスター化されて規則的に間隔を空けて配置された短い回文配列の反復（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子、およびタンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子からなる。ＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルスおよびプラスミドに対する相同性の短区間を含み、Ｃａｓヌクレアーゼに対応する病原体の相補的核酸を分解させるためのガイドとして機能する。化膿レンサ球菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究は、３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、共に、配列特異的ヌクレアーゼ活性、すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対する相同性の２０塩基対を含むｃｒＲＮＡ、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６−８２１）のために十分であることを示した。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合からなる合成キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡに対して相補的であるＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示できることが、さらに示された。また、合成ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９の一過性発現が使用されて、様々な異なる種の標的二本鎖ブレーキを生成できることも示された（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ，ｂ、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００７６】
ゲノム編集用のＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムは、２つの異なる成分、すなわち、ｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。
【００７７】
ｇＲＮＡは、典型的には、単一キメラ転写物においてＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にｃｒＲＮＡを連結する標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）および内因性細菌ＲＮＡの組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補的ゲノムＤＮＡとの間の塩基対によって標的配列に対して補充される。Ｃａｓ９の結合を成功させるためには、ゲノム標的配列はまた、標的配列の直後に適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含まれる必要がある。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合は、Ｃａｓ９が二本鎖切断を引き起こすＤＮＡの両方の鎖を切断することができるように、ゲノム標的配列に対してＣａｓ９を局在化する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生成される二本鎖ブレーキは、相同組換えまたはＮＨＥＪを起こすことができる。
【００７８】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、各々が異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能的ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。これらのドメインの両方が活性な場合、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡの二本鎖切断を引き起こす。
【００７９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きな利点は、合成ｇＲＮＡを簡単に作成する能力と結合されたこのシステムの高効率が、複数の遺伝子を同時に標的化できることである。さらに、変異を持つ細胞の大部分は、標的化遺伝子に二対立変異を示す。
【００８０】
ただし、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との塩基対相互作用の明らかな柔軟性が、標的配列に対する不完全な一致がＣａｓ９によって切断されることを可能にする。
【００８１】
単一不活性触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−のいずれかを含むＣａｓ９酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性なヌクレアーゼドメインが１つしかないため、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの１つの鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作成する。一本鎖切断またはニックは、通常、完全な相補ＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用して、ＨＤＲ経路を介して迅速に修復される。ただし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近位の反対側のストランドニックは、「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムとしばしば呼ばれる二重鎖切断として扱われる。ダブルニックは、遺伝子標的に対する望ましい効果に応じて、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかによって修復され得る。したがって、特異性と低減されたオフターゲット効果が重要な場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して、近接してかつゲノムＤＮＡの反対側のストランド上に標的配列を有する２つのｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作成することにより、いずれかのｇＲＮＡを単独としてオフターゲット効果が低減し、ゲノムＤＮＡを変更しないニックをもたらす。
【００８２】
２つの不活性な触媒ドメイン（死亡Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９）を含むＣａｓ９酵素の改変バージョンは、ヌクレアーゼ活性はないが、ｇＲＮＡの特異性に基づいてＤＮＡに結合することは依然として可能である。ｄＣａｓ９は、既知の調節ドメインに不活性な酵素を融合することにより、ＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用されて、遺伝子発現を活性化または抑制することができる。例えば、ゲノムＤＮＡのターゲット配列へのｄＣａｓ９単独の結合は、遺伝子転写を妨げ得る。
【００８３】
Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｌａｂのＣＲＩＳＰＲ設計ツール、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｏｕｔｒｏｓ  ｌａｂのＴａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム内の特異的Ｃａｓ９標的を識別するための柔軟なアルゴリズムおよびＣＲＩＳＰＲ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒなどの様々な種における様々な遺伝子についてのバイオインフォマティクスで決定されたユニークなｇＲＮＡのリストだけでなく、標的配列を選択および設計するのに役立つ公開利用可能ツールが数多くある。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するには、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方を標的細胞において発現させる必要がある。挿入ベクターは、単一プラスミド上に両方のカセットを含み得るか、または、カセットは２つの別々のプラスミドから発現される。Ａｄｄｇｅｎｅのｐｘ３３０プラスミドなどのＣＲＩＳＰＲプラスミドは一般に入手可能である。さらに、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、標的細胞、およびｇＲＮＡと複合体をなす組換えＣａｓ９タンパク質に対して挿入され得る（すなわち、ＲＮＰ複合体を細胞に挿入し得る）。
【００８５】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラットフォームを使用するゲノム編集−このゲノム編集プラットフォームは、生哺乳類細胞のゲノムにおけるＤＮＡ配列の挿入、欠失または置換を可能にするｒＡＡＶベクターに基づく。ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）分子であり、陽性または陰性のいずれかであり、約４．７ｋｂの長さである。これらの一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、高い導入率を有し、ゲノムにおいて二本鎖ＤＮＡ切断がない場合に内因性相同組換えを促進する特異な特性を有する。当業者は、所望のゲノム遺伝子座を標的とし、細胞内の粗大および／または微細内因性遺伝子変化の両方を行うためのｒＡＡＶベクターを設計することができる。ｒＡＡＶゲノム編集は、一対立遺伝子を標的とし、オフターゲットゲノム変化をもたらさないという利点を有する。ｒＡＡＶゲノム編集技術、例えばＨｏｒｉｚｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のｒＡＡＶ  ＧＥＮＥＳＩＳ（商標）システムが市販されている。
【００８６】
有効性を認定し、かつ配列変化を検出する方法は、当該技術分野で周知であり、ＤＮＡ配列決定、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、ならびにＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、プライマー拡張、サザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロット解析などのハイブリダイゼーションアッセイを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
特定の遺伝子における配列変化は、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動法、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析などの免疫検出アッセイならびに免疫組織染色を使用して、タンパク質レベルで決定することもできる。
【００８８】
ＤＮＡ編集剤は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、ヒト成長ホルモン、およびその他の分泌型酵素レポーターを含むが、これらに限定されない、その存在または活性のいずれかによって容易に検出可能であるレポータータンパク質をコードする場合もある。一般に、レポーター遺伝子は、宿主細胞によって産生されないポリペプチドをコードし、細胞の分析、例えば、細胞の直接蛍光分析、放射性同位体分析または分光測光分析によって、通常はシグナル分析のために細胞を殺すことを必要とせずに、検出可能である。特定の例では、レポーター遺伝子は、酵素をコードし、定性的、定量的、または半定量的機能または転写活性化によって検出可能である宿主細胞の蛍光特性における変化を生成する。例示的な酵素には、エステラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ（組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼ）、および当業者に周知のまたは将来開発される適切な発色性または蛍光性基質によって機能が検出できる他の酵素が含まれる。
【００８９】
さらに、当業者は、構築物との相同組換え事象を受けた形質転換細胞を効率的に選択するための陽性および／または陰性選択マーカーを含むＤＮＡ編集剤を容易に設計することができる。陽性選択は、外来ＤＮＡを取り込んだクローンの集団を濃縮する手段を提供する。そのような陽性マーカーの非限定的な例には、グルタミンシンテターゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ならびにネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンＳ耐性カセットなどの抗生物質耐性を付与するマーカーが含まれる。マーカー配列（例えば、陽性マーカー）のランダムな組み込みおよび／または脱離に対して陰性選択マーカーを選択する必要がある。このような陰性マーカーの非限定的な例には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を細胞毒性ヌクレオシドアナログに変換する単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＰＴ）が含まれる。
【００９０】
相同組換えを促進するために、ＳＣＲ７ピラジンなどのＮＨＥＪの化学阻害剤を使用して、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集介在ＨＲ効率を高め得る。上述のように、本発明のこの態様のＤＮＡ編集剤は、鳥の卵から孵化する雄のヒヨコの致死表現型を誘導可能な様式で誘発するための第１の核酸配列を含む。
【００９１】
好ましくは、雄の胚は、ステージＸ−ＸＩＩＩ  ＥＧ＆Ｋとして知られる初期の胞胚形成期を過ぎた卵において生存しない（Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ａｎｄ  Ｋｏｃｈａｖ、１９７６）。
【００９２】
一実施形態において、第１の核酸配列は、致死性タンパク質の発現を制御するスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された致死性タンパク質をコードしてもよく、スイッチはインデューサーにより調節される。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「致死性タンパク質」という用語は、鳥類の胚（例えば、雄の胚）に対して致死的であり、したがって、卵からの生きた雄の鳥の孵化を防止するタンパク質を指す。
【００９４】
致死性タンパク質の例には、毒素、細胞傷害タンパク質、アポトーシス促進タンパク質、ＢＭＰアンタゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤およびＦＧＦアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明によって企図される例示的な毒素には、シュードモナス外毒素（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＵ６３１２４）、ジフテリア毒素（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ７０４８６）およびリシン毒素（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＥＦ２７７３４）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
例示的な細胞傷害タンパク質には、インターロイキン２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ００２２７）、ＣＤ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０７７６６）、ＣＤ１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５６０．５）、インターロイキン４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５８０．１）およびインターロイキン１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２２３０１）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
本発明によって企図される例示的なアポトーシス促進タンパク質には、哺乳動物細胞においてもアポトーシスを誘導することが知られているショウジョウバエのＲｅａｐｅｒおよびＧｒｉｍ［ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｊ．Ｖ  ＆  Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｒｅａｐｅｒ  ａｎｄ  ｇｒｉｍ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｃＩＡＰ）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２４００９−１５（１９９８）］およびＣＡＳＰ３などのアポトーシスを活性化するタンパク質［Ｊｕｌｉｅｎ，Ｏ．  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．（２０１７）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄ．２０１７．４４］が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
他の企図される致死性タンパク質は、原腸形成の初期段階で発現されるＮ−カドヘリンなどの初期胚形成の基本的な段階を妨げるものである。この接着分子のドミナントネガティブ型の発現は、初期の胚死亡をもたらす。
【００９９】
追加の致死性タンパク質は、ＢＭＰおよびＦＧＦ経路などの重要なシグナル伝達経路を妨げる。ＢＭＰ４拮抗薬、例えば、ノギンの過剰発現は、胚形成プロセスを停止し、初期の胚死亡をもたらす。
【０１００】
別の実施形態では、第１の核酸配列は、エンドヌクレアーゼタンパク質の発現を制御するスイッチをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたゲノム編集を実行できるエンドヌクレアーゼ酵素をコードしてもよく、スイッチはインデューサーによって調節される。
【０１０１】
エンドヌクレアーゼタンパク質の例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクターヌクレアーゼのような転写アクチベーター（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが含まれ、これらの各々について、本明細書の上記に記載されている。
【０１０２】
この実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼを標的にして、胚の生存に不可欠である遺伝子を破壊する標的配列（またはガイド配列）をさらに含む。このようにして、致死表現型が胚においてもたらされ、生きている（雄の）ヒヨコは卵から孵化できない。
【０１０３】
破壊される可能性のある必須遺伝子の例には、ＢＭＰＲ１Ａ（遺伝子ＩＤ：３９６３０８）、ＢＭＰ２（遺伝子ＩＤ：３７８７７９）、ＢＭＰ４（遺伝子ＩＤ：３９６１６５）およびＦＧＦＲ１（遺伝子ＩＤ：３９６５１６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明のこの態様のＤＮＡ編集剤は、典型的には、操作可能に連結されて、致死性タンパク質またはエンドヌクレアーゼ酵素の発現を駆動するプロモーターを含む。
【０１０５】
ＤＮＡ編集剤に使用されてもよいプロモーターの例には、レンチウイルスのＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）、およびｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのようなＣＡＧプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
致死性タンパク質またはエンドヌクレアーゼ酵素の発現を制御するプロモーターおよび他の配列は、雄のヒヨコ胚において致死性表現型をもたらすようにタンパク質の十分な発現が存在するように選択される。
【０１０７】
ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼまたは致死性タンパク質をコードするかどうかに拘わらず、これらのエフェクタータンパク質の発現は、ＤＮＡ編集剤に含まれる（例えば、コードされる）スイッチによって調節される。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「スイッチ」という用語は、協調して作用して変化に影響を与える単一の成分または成分のセットを指し、その機能の活性化、抑制、促進または終了などの生物学的機能のすべての側面を包含する。一実施形態では、スイッチは、遺伝子調節に使用される誘導可能および抑制可能システムに関連する。一般に、遺伝子発現を可能にする何らかの分子またはエネルギー形態（インデューサーと呼ばれる）が存在しない限り、誘導システムはオフになる場合がある。この分子は「発現を誘導する」と言われている。これが起こる方法は、制御機構および細胞の種類の違いに依存する。抑制システムは、遺伝子発現を抑制する何らかの分子またはエネルギー形態（コリプレッサーと呼ばれる）の存在下以外はオンである。この分子は「発現を抑制する」と言われている。これが起こる方法は、制御機構および細胞の種類の違いに依存する。
【０１０９】
本明細書で使用される「誘導性」という用語は、関与する分子機構に拘わらず、スイッチのすべての側面を包含してもよい。したがって、本発明が理解するスイッチには、抗生物質ベースの誘導システム、電磁エネルギーベースの誘導システム、小分子ベースの誘導システム、核受容体ベースの誘導システムおよびホルモンベースの誘導システムが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導システム、光誘導システム、アブシジン酸（ＡＢＡ）誘導システム、クメートリプレッサー／オペレーターシステム、４０ＨＴ／エストロゲン誘導システム、エクジソンベースの誘導システムまたはＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導システムであってもよい。
【０１１０】
インデューサーは鳥の卵に浸透できる必要があることが理解されるであろう。さらに、インデューサー自体は、卵の内部の胚の発生に対して毒性であったり、または発生を変化させたりしてはならない。
【０１１１】
本発明によって企図される例示的なインデューサーには、熱、超音波、電磁エネルギーおよび化学物質が含まれるが、これらに限定されない。インデューサーは、産卵前の雌鶏の体内部での産卵のプロセス中に卵に送達されてもよい。
【０１１２】
特定の実施形態によれば、スイッチは、電磁エネルギー（例えば、可視光の成分）を使用して誘導される。可視光の成分は、４５０ｎｍ〜７００ｎｍまたは４５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の波長、すなわち青色光を有してもよい。青色光は、少なくとも０．２ｍＷ／ｃｍ２または少なくとも４ｍＷ／ｃｍ２の強度を有してもよい。
【０１１３】
可視光の成分は、６２０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長、すなわち赤色光を有してもよい。
【０１１４】
任意の順序および任意の組み合わせでの可視光の単一または複数の適用が考えられる。可視光は、単一もしくは複数の連続的な適用として、またはパルス（パルス送達）として送達されてもよい。
【０１１５】
そのような光遺伝学的スイッチの例は、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｆｅｂ；３９６（２）：１４５−５２．ｄｏｉ：１０．１５１５／ｈｓｚ−２０１４−０１９９、Ｍｏｔｔａ  Ｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ｍａｒ；１０（３）：１９６−２０２、およびＷＯ２０１４／０１８４２３に記載されていて、各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
一実施形態では、スイッチは、インデューサーを使用してスイッチがオンにされたときに発現されるエフェクター分子の発現を駆動する。エフェクター分子の発現を駆動するための例示的なプロモーターには、レンチウイルスのＰＧＫプロモーター、ｐＣＡＧＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１−ａプロモーター、およびヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
特定の実施形態によれば、エフェクター分子は部位特異的リコンビナーゼである。
【０１１８】
例示的な光遺伝学的スイッチを図４Ａ−Ｃに示し、これらの各々は、シロイヌナズナ由来の感光性二量体化タンパク質ドメインであるクリプトクロム２（ＣＲＹ２）およびＣＩＢ１、ならびにエフェクター分子としての部位特異的リコンビナーゼを利用する。ＣＲＹ２はＣｒｅリコンビナーゼの一方の半分に対してインフレームで融合されるが、ＣＩＢ１はＣｒｅリコンビナーゼの他方の半分、すなわちスプリットリコンビナーゼ酵素に対してインフレームで融合される。したがって、インデューサーが提供される（青色光が照射される）とき、ＣＲＹ２およびＣＩＢ１は、部位特異的組換えを実行できる機能的Ｃｒｅリコンビナーゼを産生して、ヘテロ二量体化する。
【０１１９】
部位特異的組換えについて、本明細書の以下でさらに説明する。
【０１２０】
部位特異的リコンビナーゼ−Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼおよび酵母サッカロミセスセレビシエ由来のＦｌｐリコンビナーゼは、各々がユニークな３４塩基対ＤＮＡ配列（それぞれ「Ｌｏｘ」および「ＦＲＴ」と呼ばれる）を認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、Ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位のいずれかに隣接する配列は、それぞれＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼの発現時に部位特異的組換えを介して容易に除去することができる。
【０１２１】
さらに、考えられるリコンビナーゼ認識部位には、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ５１７１、Ｌｏｘ２２７２、ｍ２、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ６６、ＦＲＴ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、ＦＲＴ（ＬＥ）、ＦＲＴ（ＲＥ）、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
例えば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対逆方向反復配列が隣接する非対称の８塩基対スペーサー領域で構成されている。Ｃｒｅは、１３塩基対の逆方向反復配列に結合し、スペーサー領域内で鎖の切断および再連結を触媒することにより、３４塩基対のｌｏｘ  ＤＮＡ配列を再結合する。スペーサー領域でＣｒｅによって作られた千鳥状ＤＮＡ切断は、６塩基対によって分離されて、同じ重複領域を有する組換え部位のみが再結合することを保証する相同性センサとして機能する重複領域を与える。
【０１２３】
基本的に、部位特異的リコンビナーゼシステムは、相同組換え後の選択カセットの除去のための手段を提供する。このシステムはまた、一時的にまたは組織特異的に不活性化または活性化できる条件変更された対立遺伝子の生成を可能にする。注目すべきことに、ＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼは、３４塩基対のＬｏｘまたはＦＲＴの「瘢痕」を残す。残っているＬｏｘまたはＦＲＴ部位は通常、改変された遺伝子座のイントロンまたは３’ＵＴＲに残されていて、現在の証拠は、これらの部位が通常遺伝子機能を著しく妨害しないことを示唆している。
【０１２４】
したがって、Ｃｒｅ／ＬｏｘおよびＦｌｐ／ＦＲＴ組換えには、対象の変異を含む３’および５’相同性アームを有するターゲティングベクター、２つのＬｏｘまたはＦＲＴ配列、および通常２つのＬｏｘまたはＦＲＴ配列間に配置された選択可能なカセットの導入が含まれる。陽性選択が適用され、標的化変異を含む相同組換えが特定される。陰性選択と組み合わせたＣｒｅまたはＦｌｐの一時的な発現は、選択カセットの切除をもたらし、カセットが欠損した細胞を選択する。最終的な標的化対立遺伝子には、外因性配列のＬｏｘまたはＦＲＴ瘢痕が含まれる。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えを使用する例示的なターゲティングベクターを図４ＡおよびＣに示す。Ｆｌｐ／ＦＲＴ組換えを使用する例示的なターゲティングベクターを図４Ｂに示す。
【０１２５】
他のエネルギー活性化の方法、特に、同様の効果を有する電界エネルギーおよび／または超音波が考えられる。必要に応じて、スイッチのタンパク質対形成は、別のエネルギー源による最大の効果のために変更および／または修正される。
【０１２６】
電界エネルギーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で約１ボルト／ｃｍ〜約１０キロボルト／ｃｍの１つ以上の電気パルスを使用して、実質的に当技術分野で説明されているように投与されることが好ましい。パルスに代えて、またはパルスに加えて、電界が連続的に送達されてもよい。電気パルスは、１〜５００ミリ秒間、好ましくは１〜１００ミリ秒間印加することができる。電界は、約５分間連続的にまたはパルス状に印加されてもよい。本明細書で使用される場合、「電界エネルギー」は、細胞がさらされる電気エネルギーである。好ましくは、電界は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で約１ボルト／ｃｍ〜約１０キロボルト／ｃｍまたはそれ以上の強度を有する（ＷＯ９７／４９４５０を参照されたい）。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「電界」という用語は、可変容量および電圧で１つ以上のパルスを含み、指数関数的および／または方形波および／または変調波および／または変調方形波を含む。電界および電気への言及は、細胞の環境における電位差の存在への言及を含むようにとられるべきである。そのような環境は、当該技術分野で知られているように、静電気、交流（ＡＣ）、直流（ＤＣ）などによって設定されてもよい。電界は、均一、不均一、またはそうでなくてもよく、時間依存的に強度および／または方向が変化してもよい。
【０１２８】
電界の単一または複数の印加、および超音波の単一または複数の印加も、任意の順序および任意の組み合わせで可能である。超音波および／または電場は、単一または複数の連続的な印加として、またはパルス（パルス送達）として送達されてもよい。
【０１２９】
特に、活性化酵素（すなわち、Ｃｒｅなどのリコンビナーゼ酵素）が致死性遺伝子カセットから分離される代替アプローチを使用することができる。この場合、活性化酵素は雄もしくは雌の鳥のどちらかのゲノムに挿入され、不活性な致死性カセットは鳥の対応する性別のＺ染色体に挿入される。この場合、雄の胚の致死性の活性化は、２つのトランスジェニック親を交配するだけで実行される。
【０１３０】
したがって、本発明の別の態様によれば、
（ｉ）リコンビナーゼ認識部位に操作可能に連結された鳥の卵において致死表現型を誘発するための第１の核酸配列と、前記致死表現型をもたらすための前記第１の核酸配列を鳥の細胞のＺ染色体に向けるための配列と、を含む第１の薬剤と、
（ｉｉ）リコンビナーゼ酵素をコードする第２の核酸配列と、前記第２の核酸配列を鳥の細胞のＺ染色体に向けるための配列と、を含む第２の薬剤と、を含む、ＤＮＡ編集システムが提供される。
【０１３１】
本発明のＤＮＡ編集剤およびシステムはまた、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、分泌胎盤アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、ヒト成長ホルモン、およびその他の分泌酵素レポーターを含むがこれらに限定されないその存在または活性のどちらかによって容易に検出可能なレポーターポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含んでもよい。一般に、レポーター遺伝子は、宿主細胞によって産生されないポリペプチドをコードし、細胞の分析、例えば、細胞の直接蛍光分析、放射性同位体分析または分光測光分析によって、通常はシグナル分析のために細胞を殺すことを必要とせずに、検出可能である。特定の例では、レポーター遺伝子は、酵素をコードし、定性的、定量的、または半定量的機能または転写活性化によって検出可能な、宿主細胞の蛍光特性における変化を生成する。例示的な酵素には、エステラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ（組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼ）、および当業者に周知のまたは将来開発される適切な発色性または蛍光性基質によって機能が検出できる他の酵素が含まれる。レポーター遺伝子は、構築物のＺ染色体への成功裏の組み込みについてレポートしてもよい。
【０１３２】
ＤＮＡ編集剤の他の成分には、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔ  ５，Ａｒｔｉｃｌｅ  １６２７３（２０１５））、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むが、これらに限定されない２Ａなどの自己切断ペプチドが含まれる。
【０１３３】
ＤＮＡ編集剤は、ウイルスベクター（単一のベクターまたは複数のベクターを使用する）で構築されてもよい。そのようなベクターは、一般に、遺伝子導入および遺伝子治療用途で使用される。異なるウイルスベクターシステムには、独自の長所と短所がある。本発明の第１の核酸配列をＺ染色体に組み込むために使用してもよいウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されず、以下に詳細を説明する。特定の実施形態によれば、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【０１３４】
レトロウイルス構築物などのウイルス構築物には、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座定義要素、またはオルタナティブスプライシング、核ＲＮＡ輸出、もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を制御する他の要素が含まれる。そのようなベクター構築物には、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲ）またはその一部、および、ウイルス構築物に既に存在しない限り、使用されるウイルスに適したプラスおよびマイナス鎖プライマー結合部位も含まれる。さらに、そのような構築物は、典型的には、それが配置されている宿主細胞からペプチドを分泌するためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列または本発明のいくつかの実施形態のポリペプチド変異体のシグナル配列である。任意に、構築物は、ポリアデニル化を指示するシグナル、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列も含んでもよい。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起源、および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。カチオン性脂質、ポリリジン、デンドリマーなど、非ウイルス性の他のベクターを使用できる。
【０１３５】
好ましくは、ＤＮＡ編集剤のタンパク質をコードするコドンは「最適化された」コドンであり、すなわち、コドンは、例えば、インフルエンザウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンの代わりに、例えば、鳥類の高発現遺伝子に頻繁に現れるものである。そのようなコドン使用は、鳥類細胞におけるタンパク質の効率的な発現を提供する。コドンの使用パターンは、多くの種の高発現遺伝子についての文献で知られている（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９９６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９８、ＭｃＥｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【０１３６】
前述のように、ＤＮＡ編集剤（またはシステム）は、生存可能な雌の子孫のみを生成でき、生存可能な雄の子孫を生成できない雌のニワトリの生成のために使用される。
【０１３７】
最初のステップとして、ＤＮＡ編集剤が鳥の始原生殖細胞に、または鳥の精子細胞に直接導入される。
【０１３８】
対象の核酸をレシピエント細胞に導入するアプローチが知られていて、リポフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質転換およびマイクロプロジェクション技術などを含む。
【０１３９】
したがって、本発明の別の態様によれば、細胞のＺ染色体に安定に組み込まれた外因性ポリヌクレオチドを含む鳥の細胞（例えば、始原生殖細胞または配偶子）を含む細胞集団が提供され、外因性ポリヌクレオチドは、鳥の雄の子孫（鳥の雌の子孫ではない）に致死表現型を誘発する（例えば、誘導可能な様式で）ためのものである。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「始原生殖細胞」および「ＰＧＣ」という用語は、初期胚に存在し、成鳥において半数体配偶子（すなわち、精子および卵子）に分化／発達させることができる二倍体細胞を指す。始原生殖細胞は、生殖隆起、発達中の生殖腺、血液、および胚の三日月を含むが、これらに限定されない、当業者に周知であるように、異なる発達段階および発達中の鳥類胚における様々な部位から単離することができる。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  ２１：４９５−９、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  １９：１４３−９，１９９５、Ａｌｌｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６５：３０−７，１９９４、Ｓｗｉｆｔ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５：４８３−５１６、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／０６５３３号を参照されたい。生殖隆起は、当業者に周知の発達中の胚の部分である。例えば、Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４５：１３０−１４１，１９９６、Ｌａｖｏｉｒ，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  ｄｅｖ  ３７：４１３−４２４，１９９４を参照されたい。典型的には、ＰＧＣは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）技術で積極的に染色される。いくつかの種では、抗ＳＳＥＡ抗体を使用して、ＰＧＣを特定できる（ＳＳＥＡ抗原を表示しないＰＧＣの１つの顕著な例外はシチメンチョウである）。フィコール密度勾配遠心分離を使用した血液からのＰＧＣの濃縮を含むＰＧＣの単離および精製のための様々な技術が当該技術分野で知られている（Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  ９６：５２１−５２８，１９９２）。
【０１４１】
ＰＧＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は、ニワトリおよびウシ血清、馴化培地、フィーダー細胞、ＦＧＦ２などの成長因子を含む培地を使用して可能である（ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：７６６−７６９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０４８３１），Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５：ｅ１２９６８．ｄｏｉ：１０．１３７／ｊｏｕｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１２９６８、ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５：ｅ１５５１８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１５５１８）。最近、ＦＧＦ、インスリンおよびＴＧＦ−βシグナル伝達経路を活性化する成長因子を含むフィーダー代替培地を使用してＰＧＣを増殖できることが示された（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ５：１１７１−１１８２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１５．１０．００８）。さらに、この報告では、鳥血清に存在する鉄担持タンパク質の代替としてオボトランスフェリンを使用すると、ＰＧＣの無フィーダー増殖および無血清増殖が可能になり、細胞は高い増殖率を維持した。
【０１４２】
原始生殖細胞（ＰＧＣ）は、任意の適切な技術によって本開示の主題を実施するために提供および処方され、所望に応じて使用前に保存、凍結、培養などされ得る。例えば、原始生殖細胞は、適切な胚形成期にドナー胚から収集され得る。鳥類の発達の段階は、２つの技術的に認知されたステージ分類システム、すなわち、発達の前原始線条段階に言及するのにローマ数字を使用するＥｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｃｈａｖシステム（ＥＧ＆Ｋ：Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｃｈａｖ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４９：３２１−３２７，１９７６を参照されたい）、および産卵後段階に言及するのにアラビア数字を使用するＨａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システム（Ｈ＆Ｈ：例えば、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  ８８：４９−９２，１９５１を参照されたい）のうちの１つで本明細書では記載している。特に明記しない限り、本明細書で記載している段階は、Ｈ＆Ｈステージ分類システムによる段階である。
【０１４３】
例えば、ＰＧＣは、ステージ３０を介して、ステージ４または胚の三日月ステージで分離され得、細胞は血液、生殖隆起、または後のステージにおける生殖腺から収集される。始原生殖細胞は、一般に、体細胞の二倍のサイズであり、サイズに基づいて体細胞から容易に区別および分離される。雄（または同型配偶子）の始原生殖細胞（ＺＺ）は、特定のドナーから生殖細胞を収集し、そのドナーから他の細胞をタイピングするなど、任意の適切な技術によって異型配偶子始原生殖細胞（Ｚｗ）と区別され得、収集された細胞はタイピングされた細胞と同じ染色体型である。
【０１４４】
ＰＧＣの使用に対する代替は、本明細書に開示されているＤＮＡ編集剤を使用した精子の直接トランスフェクションであり、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ２６：３３１−３４７，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１２４８−０１６−０００３−０を参照されたい。
【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで編集されたＰＧＣからキメラ鳥を生成するために、外因性編集細胞は、その内因性ＰＧＣが生殖隆起に移動する段階で、代理宿主胚に静脈注射される。「ドナー」ＰＧＣは、代理宿主胚と同じ種または異なる種を有してもよい。編集された「ドナー」ＰＧＣは、生存可能なままである必要があり、一実施形態では、それらが形成する生殖腺に定着し、編集された染色体を、生殖細胞系列を通じて伝達する場合、内因性ＰＧＣを打ち負かす。ドナーＰＧＣに利点を提供するために、内因性ＰＧＣの数を化学的または遺伝的アブレーションによって減らすことができる（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ  ３：１０３５−１０４９．ｄｏｉ：１０．１１１１／ａｎｄｒ．１２１０７）。代理胚の胚盤葉を乳化ブスルファンにさらすと、ドナーＰＧＣの生殖細胞系列伝達が９０％超に増加することが示されているが、ＰＧＣを培養または凍結保存した場合、この率は大幅に低下する（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  ２０：９００−９０７．ｄｏｉ：１０．１０７１／ＲＤ０８１３８、Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ａｎｉｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ．１５３：５０−６１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｉｒｅｐｒｏｓｃｉ．２０１４．１２．００３）。天然ＰＧＣに対する編集されたＰＧＣの比率を歪める他の方法は、米国特許出願第２００６／００９５９８０号に記載されている。
【０１４６】
任意に、ＰＧＣは、当該技術分野で知られている成体生殖腺に移植してもよく、例えば、Ｔｒｅｆｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，Ｏｃｔ  ２７；７（１）／：１４２４６  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８−０１７−１４４７５−ｗを参照されたい。
【０１４７】
遺伝的に改変された細胞（例えば、ＰＧＣ）は、細胞を解離（例えば、機械的解離により）し、細胞を薬学的に許容可能な担体（リン酸緩衝食塩水など）と密接に混和することにより、他の鳥に投与するために処方され得る。始原生殖細胞は、一実施形態では、生殖腺始原生殖細胞であり、別の実施形態では、血液始原生殖細胞（「生殖腺」または「血液」は元の胚ドナーにおける起源の組織を指す）である。投与される始原生殖細胞は、異型配偶子（Ｚｗ）または同型配偶子（ＺＺ）であり得る。ＰＧＣは、生理学的に許容される担体、一実施形態では約６から約８または８．５のｐＨで、所望の効果を達成するのに適した量で投与することができる（例えば、胚あたり１００から３０，０００ＰＧＣ）。ＰＧＣは、他の成分または細胞を含まずに投与され得、または他の細胞および成分は、ＰＧＣとともに投与され得る。
【０１４８】
始原生殖細胞のｉｎ−ｏｖｏでのレシピエント動物への投与は、ＰＧＣが発生中の生殖腺になおも移動し得ることができる任意の適切な時点で実施することができる。一実施形態では、投与は、Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｃｈａｖ（ＥＧ＆Ｋ）ステージ分類システムによるおよそステージＩＸから胚発生のＨａｍｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによるおよそステージ３０まで、別の実施形態では、ステージ１５において、行われる。ニワトリの場合、投与の時期は、したがって、胚発生の１、２、３、または４日間であり、一実施形態では、２日目〜２．５日目である。投与は、通常、羊膜（胚を含む）、卵黄嚢などによって規定される領域など、任意の適切な標的部位への注入による。一実施形態では、注入は胚自体（胚体壁を含む）に行われ、代替の実施形態では、胚への血管内または体腔内注入を使用し得る。他の実施形態では、注入は心臓に行われる。本明細書で開示されている主題の方法は、ｉｎ−ｏｖｏでレシピエント鳥の事前の滅菌により（例えば、ガンマ線またはＸ線照射によるブスルファンを使用する化学処理によって）実行し得る。本明細書で使用される場合、「滅菌」という用語は、内因性ＰＧＣに由来する配偶子を部分的にまたは完全に産生し得ないことを指す。ドナー配偶子がそのようなレシピエントから収集されるとき、それらはドナーおよびレシピエントの配偶子との混合物として収集され得る。この混合物を直接使用し得るか、この混合物をさらに処理して、その中のドナー配偶子の割合を高め得る。
【０１４９】
始原生殖細胞のｉｎ−ｏｖｏ投与は、任意の適切な技術により、手動でまたは自動化された方法で実行され得る。一実施形態では、ｉｎ−ｏｖｏ投与は注入により行われる。ｉｎ−ｏｖｏ投与の機構は重要ではないが、処理が孵化率を過度に低下させないように、胚の組織および器官またはそれを取り囲む胚体外膜を過度に損傷してはならない機構である。約１８〜２６ゲージの針を取り付けた皮下注射器が目的に適している。直径約２０〜５０ミクロンの開口部を備えたガラス製の先鋭的引き抜きピペットを使用してもよい。発生の正確なステージと胚の位置に応じて、１インチ針は、ヒヨコの上にある流体またはヒヨコ自体の中のいずれかで終端する。針の損傷または鈍化を防止するために、針を挿入する前に、シェルにパンチでまたはドリルで下穴を開けることができる。必要に応じて、卵をワックスなどの実質的に細菌不浸透性シーリング材料でシールして、その後の望ましくない細菌の侵入を防ぐことができる。鳥類の胚に対する高速注入システムは、本明細書で開示されている主題を実施するのに特に適していると想定される。本明細書に開示されている方法を実施するように適合されるそのような装置すべてが、本明細書に記載されている始原生殖細胞の処方を含む注射器を含み、注射器は、卵内の適切な場所に装置によって担持された卵を注入するように位置決めされる。さらに、卵の注射後に卵における穴をシーリングするために、注入装置に動作可能に接続されたシーリング装置を設けることができる。別の実施形態では、ガラス製引き抜きマイクロピペットを使用して、ＰＧＳｃを卵内の適切な場所に導入することができ、例えば、血流内に、静脈または動脈に、または直接心臓内に直接導入することができる。
【０１５０】
卵に改変されたＰＧＣが注入されると、キメラ胚はインキュベートされて孵化する。それは性的成熟まで飼育され、キメラ鳥はドナーＰＧＣに由来する配偶子を産生する。
【０１５１】
次に、キメラ由来（または、本明細書での上記の記載のように直接遺伝子操作された材料由来）の配偶子（卵または精子）を使用して、ファウンダーニワトリ（Ｆ１）を飼育する。当該技術分野で既知の分子生物学の技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはサザンブロット）を使用して、生殖細胞系列伝達を確認してもよい。Ｆ１ニワトリを戻し交配して、ホモ接合ＺＺキャリア雄とキャリア雌を生成し得る（Ｆ２）。
【０１５２】
ファウンダーニワトリ由来配偶子−Ｆ２を、次いで、使用して、繁殖コロニーを拡大できる。コロニーは、通常、性的成熟まで成長される。これらの群れから得られる受精卵は、致死表現型を誘発するインデューサー（例えば、青色光照明）への暴露により、雄の初期胚死亡について試験されてもよい。誘導後、卵を孵化させ（例えば、８日間で）、スクリーニングして（例えば、ライトキャンドリングによって）、初期胚死亡を検出する。
【０１５３】
本出願から満了する特許の存続期間中に、多くの関連するＤＮＡ編集ツールが開発され、ＤＮＡ編集剤という用語の範囲は、そのような新しい技術すべてを先験的に含むことを意図している。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は±１０％を指す。
【０１５５】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」およびそれらの活用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）が限定されない」ことを意味する。
【０１５６】
「からなる」という用語は、「含むおよび限定される」ことを意味する。
【０１５７】
「本質的にからなる」という用語は、追加の成分、ステップおよび／または部品が請求項に記載されている構成、方法、または構造の基本的なおよび新規の特性を実質的に変更しない場合のみ構成、方法または構造が追加の成分、ステップおよび／または部品を含んでもよいことを意味する。
【０１５８】
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含んでもよい。
【０１５９】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解される必要がある。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、および、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の広さに拘わりなく適用される。
【０１６０】
本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内に任意の引用された数字（小数または整数）を含むことを意味する。第１に示された数字と第２に示された数字との「間の範囲」は、および第１に示された数字「から」第２に示された数字「までの範囲」の表現は、本明細書では交換可能に使用され、第１の示された数字および第２に示された数字ならびにそれらの間の小数および整数のすべてを含むことを意味する。
【０１６１】
本明細書で使用する「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学、医学の実務家により既知の、または、化学、薬理学、生物学、生化学、医学の実務家による既知の方法、手段、技術、および手順から容易に開発される方法、手段、技術、および手順を含むが、これらに限定されない、所定のタスクを達成するための方法、手段、技術、および手順を指す。
【０１６２】
明確にするために別個の実施形態についてのコンテキストで説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態についてのコンテキストで説明されている本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで、または本発明の任意の他の記載されている実施形態において適切であるとして提供されてもよい。様々な実施形態についてのコンテキストで説明されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素を備えずに動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。
【０１６３】
上記に記載され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様については、以下の実施例で実験的裏付けが見出される。
【実施例】
【０１６４】
ここで、上記の記載と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例示する以下の実施例を参照する。
【０１６５】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載されている方法、“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  ＣｏｌｉｇａｎＪ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたく、利用可能な免疫測定法については特許および科学文献に広範に亘って記載されていて、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、および同第５，２８１，５２１号、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、これらのすべてが、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は本明細書全体を通して提供されている。それらにおける手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。それらに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
ワークフロー
ゲノム改変ニワトリ系統の生成は多段階のプロセスである。最終製品は、産業界で今日使用されているレイヤーと、ゲノムの内容に関して完全に同一の雌のレイヤー鶏系統である。同様に、食品に使用される無精卵である最終製品は同一であり、図１を参照されたい。
【０１６７】
ワークフローは、５つの主要なステップからなる。
１．ニワトリの始原生殖細胞（ＰＧＣ）系列の生成と培養。
２．培養されたＰＧＣのゲノム改変。
３．改変されたＰＧＣの胚への移植、および潜在的な担体についてスクリーニングされるキメラニワトリの生産。
４．キメラから得られた遺伝物質からのファウンダーニワトリの繁殖。
５．ファウンダーニワトリのコロニーのファウンダーの群れへの拡大、および生殖細胞系伝達の再検証。
【０１６８】
材料および方法
ＰＧＣ培地：トリＰＧＣ培地は、１２．０ｍＭグルコース、２．０ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１．２ｍＭピルベート（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＢ−２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘヌクレオシド（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、０．２％オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍｇ／ｍｌナトリウムヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、ＣａＣｌ２  ０．１５ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、１ｘＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ニワトリＤＭＥＭ中０．２％ニワトリ血清（Ｓｉｇｍａ）からなる。次の成長因子、ヒトアクチビンＡを２５ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ヒトＦＧＦ２を４ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、オボトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を使用前に追加した。ＡｋｏＤＭＥＭは、グルコース、ピルベートおよびビタミンを含む希釈培地を指す。
【０１６９】
ＰＧＣ株誘導：ＰＧＣ株は、ステージ１５〜１６（Ｈ＆Ｈ）胚から分離された約１．０〜３．０μＬの血液を４８ウェルプレート内の３００μＬ培地に入れることによって得られた。培地は２日ごとに交換された。総細胞数が１ｘ１０５に達したとき、培地の総量を２日ごとに入れ替え、細胞を２〜４ｘ１０５細胞／ｍｌの培地で増殖させた。細胞を１０％ＤＭＳＯを含むＰＧＣ培地で凍結し、温度を徐々に−８０℃まで下げて、１〜３日間保存し、液体窒素に移した。
【０１７０】
性別判定およびＰＧＣ株の特徴付け：各ＰＧＣ株は、性別、ＰＧＣマーカーのｍＲＮＡ発現、および既知のＰＧＣマーカーＳＳＥＡ１４のタンパク質発現について特徴付けられた。ドナー胚由来のＤＮＡを分離し、将来の参照のために保管した。性別については、２〜４ｘ１０５ＰＧＣ細胞由来のＤＮＡを収集し、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を含むテールバッファー（１０２−Ｔ、Ｖｉａｇｅｎ）に再懸濁し、５５℃で３時間インキュベートした。プロテイナーゼＫは８５℃で４５分間不活性化された。制御６として雌染色体（Ｐ１７、Ｐ１８）およびリボソームＳ１８（Ｐ１９、Ｐ２０）を標的とするＷ染色体からのプライマーを用いて、性別判定のためのＰＣＲを実施した。遺伝子発現解析のために、ＴＲＩＺＯＬ試薬を使用してＲＮＡを精製し、逆転写ＰＣＲ反応（ＧｏＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によるｃＤＮＡライブラリー生成のために、１μｇのＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡは、それぞれＤａｚｌ、Ｓｏｘ２、ｃＰｏｕＶ、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃＶＨプライマー、Ｐ２１−Ｐ２２、Ｐ２３−Ｐ２４、Ｐ２５−Ｐ２６、Ｐ２７−Ｐ２８、Ｐ２９−Ｐ３０、Ｐ３１−Ｐ３２を使用することにより、ＰＣＲのテンプレートとして役立った。
【０１７１】
抗ＳＳＥＡ１抗体を用いた免疫組織染色：細胞を収集し、４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ０．１％トリトン中の５％ヤギ正常血清でブロックし、ブロッキングバッファー中抗ＳＳＥＡ１抗体（ＤＳＨＢ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｂａｎｋ１３）の１：１００希釈で一晩染色した。二次抗体が１時間加えられた（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、分子プローブ）ＰＢＳ０．１％トリトンで３０分間細胞を洗浄した後、細胞をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、封入剤（Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔ、ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で封入し、カバーした。
【０１７２】
ＰＧＣのトランスフェクション、選択およびＦＡＣＳ選別において、ＰＧＣのプラスミドトランスフェクションは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して行われた。リポフェクションについては、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００を使用した。ＮＥＡＡ、ピルベート、ビタミン、ＣａＣｌ２および成長因子（アクチビンＡ、ｈＦＧＦ、およびオボトランスフェリン）を含むＡｋｏＤＭＥＭ内の９６ウェルプレートに３〜５ｘ１０５個の細胞を播種した。１００ｎｇのプラスミドおよび０．２５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を別々に２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ｍｉｘで希釈し、２０分間インキュベートし、細胞にピペッティングした。エレクトロポレーションについては、５ｘ１０５個または１．５ｘ１０６個の細胞をＡｋｏＤＭＥＭで洗浄し、ネオンエレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において１０００Ｖ、１２ｍｓ、３パルスでエレクトロポレーションを行い、抗生物質を含まないＰＧＣ培地でそれぞれ９６ウェルプレートまたは４８ウェルプレートに即時に播種した。培地を１〜３時間後に交換した。２５〜１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いた選択を、７２時間後に２〜４週間開始した。選択に続いて、細胞を個別に手動で、またはＦＡＣＳ選別により分離した。ＦＡＣＳ選別については、穏やかな細胞のピペッティングを行い、細胞をＰＧＣ培地で選別した。陽性ＧＦＰ細胞が、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いて新しい９６ウェルプレートにウェルごとに１つの細胞として選別され、またはプールされた。（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ、米国）を使用して、ＦＡＣＳ分析を行った。）
【０１７３】
プラスミド調製：
ＣＲＩＳＰＲプラスミドのクローニング：ＣＲＩＳＰＲ配列は、ＣＲＩＳＰＲ設計ツール、Ｚｈａｎｇ  ｌａｂ，ＭＩＴ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃｒｉｓｐｒ（ｄｏｔ）ｍｉｔ（ｄｏｔ）ｅｄｕ）９使用して設計された。ｐｘ３３０−ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４２２３０から改変された）１４をＢｂｓＩ制限酵素を使用して切断し、ＣＲＩＳＰＲ部位挿入のための骨格として使用して、ｓｇＲＮＡを形成した。［ｍｅｄｉａｄｏｔａｄｄｇｅｎｅｄｏｔｏｒｇ／ｃｍｓ／ｆｉｌｅｒ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｅ６／５ａ／ｅ６５ａ９ｅｆ８−ｃ８ａｃ−４ｆ８８−９８ｄａ−３ｂ７ｄ７９６０３９４ｃ／ｚｈａｎｇ−ｌａｂ−ｇｅｎｅｒａｌ−ｃｌｏｎｉｎｇ−ｐｒｏｔｏｃｏｌｄｏｔｐｄｆおよびＣｏｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｊａｎ  ３．１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３  ＰｕｂＭｅｄ  ２３２８７７１８］に記載されているように、ｓｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ部位、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ１、ＣＲＩＳＰＲ３のオリゴ（それぞれオリゴＰ３４−Ｐ３５およびＰ３６−Ｐ３７）を９５℃で３０秒間変性させ、ゆっくりアニールし、ＢｂｓＩ切断プラスミドに結合し、大腸菌に形質転換し、精製し、配列検証した。
【０１７４】
ｐＪｅｔ−ＨＡｓプラスミドのクローニング：５’ＨＡおよび３’ＨＡの両方を含むＺ染色体上のＨＩＮＴＺ遺伝子座に対して下流のゲノム領域を、ＰＣＲ（Ｋａｐａ、Ｒｏｃｈｅ）を使用して、Ｐ１およびＰ２プライマーでＰＧＣ  ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、製造業者のプロトコルに従ってｐＪｅｔ１．２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合させた。
【０１７５】
ターゲティングベクターの構築：ｐＣＡＧＧ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ−ＧＦＰプラスミドが、Ｐ５−Ｐ６プライマーを使用して、ＰＣＲについてのテンプレートとして使用されて、インサートｐＣＡＧＧ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ−ＧＦＰを増幅した。ｐＪｅｔ−ＨＡｓプラスミドが、Ｐ３−Ｐ４プライマーを使用して、ＰＣＲについてのテンプレートとして使用されて、５’ＨＡおよび３’ＨＡを含むベクターを増幅した（図３）。ギブソン集合反応は、それぞれ０．０３ｐｍ、０．０６ｐｍの線状化された産物を取る精製されたベクターおよびインサートＰＣＲ産物に対して行われた。ギブソンアセンブリ反応１０産物をプラスミド調製のために大腸菌に形質転換して、配列検証した。
【０１７６】
ｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの構築
ｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターを生成するために、光遺伝子プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ１１をテンプレートとして使用して、Ｐ４０−Ｐ４１およびＰ４２−Ｐ４３プライマーを使用して光遺伝子を増幅し、それぞれ１．３ｋｂおよび２．１ｋｂ産物を得た。これらの２つの産物は、プライマーＰ４１およびＰ４２に導入されたＰ２Ａ部位で重複配列を共有する。シングルサイクルオーバーハング延出ＰＣＲを使用して、２つの断片を結合させて、アガロースゲルから洗浄された単一の３．５ｋｂ産物にした。この産物を、それぞれＳｍａｌおよびＮｈｅｌ制限部位を有する尾部を含むプライマーＰ４４およびＰ４５を使用して、ＰＣＲについてのテンプルとして使用されたｐＪｅｔ１．２シャトルベクターに連結させた。この産物を、適切な制限酵素を使用して消化し、ベクターとして機能するＳｍａＩおよびＮｈｅＩ消化ｐＣＡＧＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドに連結させる連結のためのインサートとして使用した。連結産物を大腸菌に形質転換し、増殖したプラスミドを配列検証した。
【０１７７】
ｐＧＫ−ＤＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの構築
ｐＧＫ−ＤＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを生成するために、発現ベクターｐＳＫ  ＢＳ−ＰＧＫ−ＤＴＡを、それぞれＸｍａＩおよびＮｈｅＩ制限部位についての拡張配列を含むプライマーＰ４６およびＰ４７を用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用した。０．６５ｋｂ産物をそれぞれの酵素で消化し、連結のためのベクターとして機能するｐＧＫ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドにおいてＸｍａＩ−ＮｈｅＩ相補部位への連結のためのインサートとして使用された。連結産物を大腸菌に形質転換し、増殖したプラスミドを配列検証した。
【０１７８】
Ｉｎ−ｏｖｏエレクトロポレーション：Ｉｎ−ｏｖｏエレクトロポレーションは、以前に記載されたように基本的に行われた７。受精卵を３７．８℃で５６〜６０時間インキュベートし、卵殻に窓を開け、直径２〜１０μｇ／μｌの濃度のプラスミドＤＮＡを、直径１０〜１５μｍの開口を有する鋭利なマイクロピペットを使用して神経管に注入した。ＥＣＭ  ８３０方形波エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ）を使用して、２５Ｖ、３０ミリ秒の３つのパルスが送出された。エレクトロポレーション後、卵殻をパラフィルムでシールし、胚を分析までさらにインキュベートした。
【０１７９】
エンドヌクレアーゼアッセイ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用して、ＰＧＣにＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、個々のＧＦＰ陽性細胞を９６ウェルプレートに分離し、培養して純粋なコロニーを形成した。ＤＮＡを回収し、ＣＲＩＳＰＲ部位に隣接する３５０ｂｐ領域をＰ３８−Ｐ３９プライマーでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は９５℃で変性し、ゆっくりアニールし、Ｔ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で１時間インキュベートした。較正目的で、かつポジティブコントロールとして、３５０ｂｐ  ＰＣＲ産物をｐＪｅｔ１．２にサブクローニングし、部位特異的変異誘発を使用してＣＲＩＳＰＲ部位を変異させた。導入された変異は、ＷＴ配列ＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＡＣＧＴｇＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＴ（配列番号２）をＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＡＣＧＴａａｔＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＴ（配列番号３）に置き換えた。この人為的変異は、エンドヌクレアーゼアッセイ（図７Ａ）およびコントロールシーケンシング（図８Ｂ）の両方に対するポジティブコントロールとして機能した。
【０１８０】
サザンブロットアッセイ：５’ＨＡ、３’ＨＡおよびＮｅｏ遺伝子プローブのＤｉｇラベリングを、ＤＩＧ  ＤＮＡラベリングミックス（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、それぞれプライマーＰ１３−Ｐ１４、Ｐ１５−Ｐ１６およびＰ１１−Ｐ１２用いたＰＣＲ増幅（Ｌｏｎｇａｍｐ、ＮＥＢ）により調製した。１５μｇのゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて３７℃で一晩消化した。ＤＮＡ断片を、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（２０Ｖ、１２時間）での電気泳動により分離し、正に帯電したナイロン膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後、各側で２５４ｎｍに設定されたＵＶ光を３分間使用して湿潤膜を架橋し、次いで２ＸＳＳＣでリンスした。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ−Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、膜を４２℃で２時間プレハイブリダイズさせた。プローブ（５０ｎｇ／ｍｌ）を５分間で９５℃まで加熱することによって変性させ、即座に氷に浸漬させた。変性されたプローブを、１０ｍｌの温かいＤＩＧ  Ｅａｓｙ−Ｈｙｂ溶液に加えて、４２℃で１２時間ハイブリダイズさせた。膜を室温で０．１％ＳＤＳの２ＸＳＳＣ中で撹拌させながら１０分間２回洗浄し、次いで０．１％ＳＤＳの０．２ＸＳＳＣ中で撹拌させながら６５℃で３０分間３回洗浄した。さらなる洗浄およびブロッキングが、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、かつそれらのプロトコルに従って行われた。ＤＩＧラベリングが、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用する化学ルミネッセンス反応が後続する抗ジゴキシゲニン−ＡＰ抗体１：１００００（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出された。Ｇ：ＢＯＸ  ｇｅｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して画像を撮影した。
【０１８１】
胚へのＰＧＣ注入およびホールマウント染色：産卵されたばかりの卵を、３７．８℃、湿度５５％で５８〜６２時間、先端を上に向けた状態でインキュベートした。インキュベーション後、卵殻に４〜８ｍｍの窓を開け、約３０〜４０μｍの開口を有する鋭利なマイクロピペットを使用して、３０００〜８０００のＰＧＣを血流に注入した。窓を白い卵膜で覆い、さらにパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）またはＬｅｕｋｏｐｌａｓｔ（ＢＳＮ  ｍｅｄｉｃａｌ  ＧｍｂＨ）テープでシールした。胚を、孵化するまでインキュベートした。注入された胚のいくつかの生殖腺が分離され、ホールマウントＧＦＰ染色のために取られた。生殖腺を、４％ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳ１％Ｔｒｉｔｏｎにおいて５％ロバ正常血清でブロックしたＰＢＳで２時間洗浄し、マウス抗ＳＳＥＡ１抗体１３またはウサギ抗ＧＦＰ抗体１：５００（Ａｂｃａｍ）の１：２０希釈のブロッキングバッファー中で一晩染色した。ＰＢＳ１％ｔｒｉｔｏｎで２時間洗浄した後、二次ロバ抗マウスｃｙ３抗体１：５００（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または二次ａｌｅｘａ４８８抗ウサギ抗体１：５００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキングバッファー中に３時間添加した。組織をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、グリセロール中に取り付け、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＴＣＳ  ＳＰＥ、ヴェッツラー、ドイツ）で撮像した。
表３−プライマーのリスト
【表３−１】
2020536580.tif 000005
【表３−２】
2020536580.tif 000006
【０１８２】
プラスミド配列
１．ｐＸ３３０−ＧＦＰ（配列番号５０）
２．ＣＲＩＳＰＲ１（配列番号５１）
３．ＣＲＩＳＰＲ３（配列番号５２）
４．ｐＪｅｔ−Ｈａｓ（配列番号５３）
５．ｐＣＡＧＧ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（配列番号５４）
６．ターゲティングベクター（配列番号５５）
７．ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ（配列番号５６）
８．ｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ（配列番号５７）
９．ｐＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰ（配列番号５８）
１０．ｐＣＡＧＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（配列番号５９）
１１．ｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅｓ（配列番号６０）
１２．ｐＢ−ＲＡＧＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号６１）
１３．ｐＳＫ  ＢＳ−ＰＧＫ−ＤＴＡ（配列番号６２）
１４．ｐＧＫ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（配列番号６３）
１５．ｐＧＫ−ＤＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（配列番号６４）
【０１８３】
結果
ＰＧＣ株の誘導および特性評価
胚発生の初期段階時、産卵直後および原腸形成の開始前に、ＰＧＣは胚外中胚葉層の前部の胚の生殖三日月環領域に対して吻側に移動する。この移動は、体細胞がそうであるように、ＰＧＣを分化プロセスを経ることから「保護」すると考えられている。細胞が血流を介して胚に戻り、生殖腺を誘発する生殖隆起に定着することは、約２．５日間のインキュベーション（ステージ１４〜１７  Ｈ＆Ｈ１）の後、血管暗域（Ａｒｅａ  Ｏｐａｃａ  Ｖａｓｃｕｌｏｓａ）、血液および心拍の形成までない。これらの段階で、直径約４０〜６０μｍの開口を有するマイクロピペットを使用して、胚の血管系から１〜３μｌの血液を採取し、４８ウェルプレート内のＰＧＣ培地に移した。ＰＧＣ培地は、ＰＧＣの速い分裂（２０〜２４時間の細胞周期）を可能にする一方、フィーダーのない条件下で未分化状態を維持する。培養において２〜３週間後、血液細胞は分解して消失した２。別の１〜２週間以内に、培養されたＰＧＣは週密的になった（図５Ａ）。これらの細胞は、遺伝子改変のためにさらに培養され得、または後者の改変のためにうまく凍結および解凍され得る。培養中のニワトリＰＧＣは、形態学的特徴、タンパク質およびｍＲＮＡ発現パターンを使用して、かつ、最終的には段階が一致するレシピエント胚３〜５の血管系に注入されたときのそれらの生殖腺移動の能力によって、文献で広範囲に特徴付けられた。これらの特性は、生成されたＰＧＣ細胞培養物において調べられて、それらが良好に確立されたＰＧＣ機能を保持していることを示した。形態的には、ＰＧＣは、大きい核を含む直径約１５〜２０μｍの大きくて、わずかに粒状化した細胞である。ＰＧＣは全能性細胞であり、したがって、ｃＰｏｕＶ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＮａｎｏｇ、ならび２つのユニークな生殖細胞マーカー、すなわち、ｃＶＨおよびＤＡＺＬなどの多能性マーカーを発現する。各ＰＧＣ株について、ポジティブコントロールとしてのリボソームＳ１８（Ｐ１９〜Ｐ２０、２５６ｂｐの産物のサイズ）についてのプライマー、および雌を特定するＷ染色体のプライマー（Ｐ１７〜Ｐ１８、４１５ｂｐの産物のサイズ）を使用して、性別判定のためにＤＮＡを抽出した（図５Ｂ）６。さらに、ＰＧＣは膜ＳＳＥＡ−１抗原４を発現する（図５Ｃ）。
【０１８４】
ＰＧＣの１０個の株が、レイヤーおよびブロイラー、すなわち、雄の株および雌の株の両方から確立された。プラスミドのトランスフェクションは、負に帯電したＤＮＡと相互作用するカチオン性脂質トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して実行され、細胞への浸透を可能にする。ＧＦＰをプラスミド（ｐＣＡＧＧ−ＧＦＰ７）をコードするＧＦＰでトランスフェクトすることにより、約１５〜２０％のトランスフェクション効率が得られた（図５Ｄ）。さらに、エレクトロポレーションを使用したＰＧＣのトランスフェクション効率は、最大９０％のより高い効率が得られた（図５Ｅ）。培養されたＰＧＣが生殖腺にうまく定着することを実証するために、ＧＦＰ発現ＰＧＣをステージ１４〜１６  Ｈ＆Ｈの血流に注入し、胚を１０日間インキュベートした。胚を解剖し、ＧＦＰ陽性細胞を生殖腺において特定した（図５Ｆ）。
【０１８５】
Ｚ染色体上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的の設計
Ｚ染色体へのＤＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９および相同組換えプロセスを使用して行われた。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムはＺ染色体の特定の部位でＤＮＡを直接切断するが、相同組換えプロセスを使用した内因性修復システムにより、正確な場所への所望のＤＮＡの標的化挿入が可能になる。この目的のために、Ｚ染色体上の挿入部位に対応する相同性アームを含むターゲティングベクタープラスミドの構築が必要である。コード遺伝子ＨＩＮＴＺの下流のＺ染色体におけるＤＮＡ挿入のための部位を選択した。ＣＲＩＳＰＲシステムの使用により、多くの研究で直接ＤＮＡ挿入イベントを改善することが示された。その目的のために広く使用されているｐｘ３３０プラスミドには、ｓｇＲＮＡ部位およびＣａｓ９酵素８が含まれる。ｓｇＲＮＡ部位は、Ｃａｓ９酵素を標的部位に向け、特定のゲノム標的化ＤＳＤＢに繋がるユニークな配列が含まれている。ＣＲＩＳＰＲ設計エンジンツールを使用して、ｓｇＲＮＡについての一意の配列を図６Ａに示すように特定した。スコアに応じた上位１２個のガイドを図６Ｂおよび表１に示す。
【０１８６】
２０個のヌクレオチド配列−ガイド＃１および＃３は、従来の二次構造の類似性により、および不一致の程度によりスコア化されたニワトリゲノム内の可能なオフターゲット部位をチェックすることにより、選択された。ガイド＃１についての潜在的なオフターゲットの検索の上位１０個の結果を図６Ｃおよび表２に示す。特に、上位６個のオフターゲットには４つの不一致があり、このガイドの特異性が強調されている。
【０１８７】
Ｃａｓ−９のｃ末端に融合したインフレームＧＦＰを含む改変ｐｘ３３０プラスミドを切断することにより、ＤＮＡ配列挿入を行った。ｓｇＲＮＡ配列を含むアニールされたプライマーは、上述のようにＢｂｓＩ制限酵素に連結された。（図６Ｂ）。連結産物を大腸菌に形質転換し、プラスミドを精製し、ｓｇＲＮＡの挿入を配列決定によって検証した。
【０１８８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの活性検証
フィーダーのない培地でＰＧＣを増殖させることにより、単一細胞に由来する純粋なコロニーが得られ、それによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの効率の特性化が可能になる。このため、ＰＧＣはｐＸ３３０−ＧＦＰ−ＣＲＩＳＰＲ１およびｐＸ３３０−ＧＦＰ−ＣＲＩＳＰＲ３プラスミドのいずれかがトランスフェクトされ、クローンコロニーが成長された。ＧＦＰを発現する単一細胞に由来するコロニーから全ゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼアッセイにより分析し、配列決定した。エンドヌクレアーゼアッセイのために、ポジティブコントロールが設計された。このコントロールは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性の予測部位に変異が挿入された３２０ｂｐ  ＰＣＲ産物であった。この産物を、それぞれ変異体：ＷＴの異なる比率１：１５、１：７、１：１で類似の長さのＷＴ産物と混合し、アニールした混合物をエンドヌクレアーゼ活性にさらした（図７Ａ）。１３６ｂｐおよび１８４ｂｐの予測されたサイズでの２つの短いバンドは、１：７および１：１の比率で明確に見え、アッセイが適切に機能していることを示した。同様に、ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３プラスミドのいずれかでトランスフェクトされた１２個のコロニーから得られたゲノムＤＮＡで同じアッセイを実施した（図７Ｂ、Ｃ）。１２個のコロニーのうちの９個で、予測されたサイズの明確なダブレットが観察された。これは、ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３プラスミドの両方が、予測された部位でＤＳＤＢを効率的に生成することを示している。
【０１８９】
配列解析については、エンドヌクレアーゼアッセイのために使用されたＰＣＲ産物（図７Ａ〜Ｃ）も配列決定された（図８Ａ〜Ｄ）。ＷＴネガティブコントロールの配列決定により、ＣＲＩＳＰＲ１の予測される切断部位が明らかになった（図８Ａ）。ポジティブコントロールとして、ＷＴと人工的に変異された産物との混合物を配列決定することにより、予測される切断部位の直後のＤＮＡクロマトグラムにおける二重ピークの出現が明らかになった（青色矢印、図８Ｂ）。トランスフェクトされたコロニーの同じゲノム領域の同様の配列決定により、陰性コロニー（図８Ｃ）および陽性コロニー（図８Ｄの青色矢印）の両方が明らかになり、後者は事例の＞７０％であった。
【０１９０】
ゲノム組み込みのためのターゲティングベクターの構築
ＨＲを使用して、Ｚ染色体への標的化ゲノム組み込みを実証するために、ターゲティングベクターを設計した（図９Ａ〜Ｆ）。ベクターには、ｐＣＡＧＧプロモーターに続いて、ネオマイシン選択遺伝子、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＧＦＰおよびウサギベータグロビンポリアデニル化部位が含まれる。このカセットには、それぞれ５’末端および３’末端に約１．５ｋｂの相同性アームが隣接していた。このベクターを生成するために、両方の相同性アームを含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を、プライマーＰ１およびＰ２を使用して増幅し、シャトルベクターｐｊｅｔ１．２に連結した。この断片の完全な配列決定は、ニワトリのゲノム配列と同一であることがわかった。このプラスミドｐＪｅｔ−ＨＡｓをテンプレートとして使用して、ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ部位を間に含む２３ｂｐ配列を除く２つの分離した相同性アームを含む線状化ＰＣＲ産物を生成した。増幅は、ｐＣＡＧＧ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットの端に対応する５’末端に配列を含むＰ３およびＰ４プライマーを使用して行なわれた。この線状ＰＣＲ産物は「ベクター」と呼ばれる。ｐＣＡＧＧ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを、テンプレートとして使用して線状ＰＣＲ産物を生成した。この断片は、それぞれ５’ＨＡおよび３’ＨＡ末端の３’および５’末端に対応する配列を含むプライマーＰ５およびＰ６を使用して増幅された。この産物は「インサート」と呼ばれる。ベクターおよびインサートをギブソンアセンブリ反応１０を使用して縫い合わせて、最終的なターゲティングベクターを作成した。
【０１９１】
ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドを使用したＺ染色体への相同組換え。
単一の細胞から純粋なＰＧＣコロニーを得る能力は、ＰＣＲおよびサザンブロットなどの方法を使用して、適切に挿入されたＨＲを受けた陽性コロニーの特定を可能にする。ＰＧＣトランスフェクションについては、５〜１０％（図１０Ａ）のトランスフェクション効率を有するリポフェクションまたは＞４０％の効率を有するエレクトロポレーションを使用した。トランスフェクションを、２つのプラスミド、ターゲティングベクターおよび上記の２つのＣＲＩＳＰＲの１つ（ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３）を用いて実行した。トランスフェクション後、細胞を回収するために２４時間放置し、選択のためにＧ−４１８含有培地に移した。選択した２週間後、Ｇ−４１８耐性細胞のみが生存し、そのうちの９９％以上がＧＦＰ陽性であった（図１０Ｂ）。細胞が生殖腺に定着する能力を保持していることを確認するために、図１Ｆ（図８Ｃ）について上記で説明したように、その細胞を宿主胚に注入した。生殖腺は、抗ＧＦＰ抗体で免疫染色され、生殖腺におけるＧＦＰ陽性ＰＧＣ細胞のコロニー形成を共焦点顕微鏡を使用して検証した（図１０Ｄ）。
【０１９２】
Ｇ−４１８耐性のＧＦＰ陽性細胞は、潜在的に不均一な集団からなる。したがって、ＨＲ組み込みを検証し、純粋な均質集団を得るために、９６ウェルプレートへのＦＡＣＳ選別を使用して、単一のＧＦＰ陽性細胞を分離した（図１１Ａ）。純粋なコロニーを飼育し、ＰＣＲおよびサザンブロット解析のためにゲノムＤＮＡを抽出した。並行して、プールされたＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ選別した。ＰＣＲ解析のために、２セットのプライマーを設計した。第１には、５’ＨＡに対して上流の順方向Ｐ７およびＣＡＧＧプロモーターからの逆方向Ｐ８（産物のサイズ１．６ｋｂ）、第２には、ウサギベータグロビンポリアデニル化部位からの順方向Ｐ９および３’ＨＡに対して下流の逆方向Ｐ１０（産物の長さ１．８ｋｂ、図１１Ｂ）である。プールされた細胞（図１１Ｃ）および純粋なコロニー（図１１Ｄ）の両方で、５’および３’について予想される産物が検出され、これらの細胞で適切なＨＲ組み込みが生じたことが示された。
【０１９３】
適切なＨＲ組み込みをさらに検証し、ターゲティングベクターの単一のコピーのみがゲノムに組み込まれていることを確認するために、サザンブロット解析を行った。雄および雌のドナーからの２つのＰＧＣ細胞株を解析した。注目すべきことに、雌の株はＺ染色体の単一のコピーのみを有する。３つのｄｉｇラベル化ＤＮＡプローブを設計した（図１２Ａおよび図１２Ｂの黄色ボックス）。それぞれ５００ｂｐの長さのプライマーＰ１１−Ｐ１２およびＰ１３−Ｐ１４を使用して増幅された最初の２つのプローブは、それぞれ５’および３’ＨＡの上流および下流に位置する。７０４ｂｐの長さのプライマーＰ１５〜Ｐ１６を使用して増幅された３番目のプローブは、ターゲティングベクター内部のＮｅｏ遺伝子を検出するように設計されているため、ベクターの単一のコピーのみが組み込まれたことを確認できる。Ｂｇｌｌｌ制限酵素を使用して、解析のためにゲノムＤＮＡを切断した。互いに約６．５ｋｂ離れた２つの制限部位は、それぞれ５’および３’プローブの上流および下流のＷＴ染色体上に位置する。追加のＢｇｌｌｌ部位はターゲティングベクター内に位置し、予測される７．５ｋｂおよび３．３ｋｂの断片を得て、適切なＨＲ組み込みを特定する。雄のＰＧＣ株から抽出されたゲノムＤＮＡのサザンブロット解析の結果は、それぞれ５’および３’部位について、予測された大きさ、すなわち、ＷＴ対立遺伝子に対して６．５ｋｂおよび正しいＨＲ組み込みを受けた対立遺伝子に対して７．５ｋｂおよび３．３ｋｂの２つのバンドを明らかにした。これは、プールされた細胞からのＤＮＡおよび純粋なコロニーの両方について確認された（図１２Ｃ）。雌のＰＧＣ細胞株についても同様の解析を行った。この場合、５’組み込み部位の予測されるサイズの７．５ｋｂで単一のバンドが見つかった。雌ゲノムにはＺ染色体の単一のコピーのみが含まれているため、ＷＴ対立遺伝子（６．５ｋｂ）は検出されなかった。Ｎｅｏ遺伝子をプローブすると、７．５ｋｂの予測されるサイズの単一のバンドが明らかになり、ターゲティングベクターの単一コピーのみがゲノムに組み込まれていることが確認された（図１２Ｄ）。
【０１９４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびニワトリ胚におけるＨＥＫ２９３細胞における光遺伝学的システムの検証
ｉｎ−ｏｖｏ。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ−ｏｖｏのニワトリ胚における誘導システムの活性を検証するために、３つのプラスミド、すなわち、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびレポーターＰＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３細胞（図１３）およびヒヨコ胚（図１４）にトランスフェクトした。最初の２つの光遺伝子プラスミドは、成功裏のトランスフェクションを確認するレポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙをコードする。ＰＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰ抑制ベクターには、ＧＦＰコーディング領域の上流のＬｏｘＰ部位に隣接する複数の停止コドン配列が含まれている。Ｃｒｅ活性化時に、ＳＴＯＰコドンが除去され、したがって、ＧＦＰを発現させることが可能になる。ネガティブコントロールではＨＥＫ２９３細胞はトリプルトランスフェクションされ、暗所で維持されるが、ＧＦＰ陽性細胞は存在しなかった（図１３、上段）。トランスフェクションの２４時間後に青色光照明にさらされた細胞では、多くの細胞がＧＦＰを発現し（図１３、下段）、これらの細胞の光遺伝学的システムの活性化を確認した。
【０１９５】
ｉｎ−ｏｖｏでの光遺伝学的システムの活性を検証するために、ステージ１６  Ｈ＆Ｈでのニワトリ胚神経管へのエレクトロポレーションによりｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびＰＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰプラスミドを用いたトリプルトランスフェクションを行った。エレクトロポレーションの１２時間後、ネガティブコントロール胚を暗所に保ちながら、実験群の胚に１５秒間の青色光照射を行った。胚をさらなる１２時間インキュベートし、蛍光ステレオスコープでＧＦＰ発現を確認した（図１４）。暗所に保たれた胚では（図１４、上段）、ｍＣｈｅｒｒｙのみが発現されて、成功裏のエレクトロポレーションを確認したが、実験群の胚では、ＧＦＰ陽性細胞が明確に現れ（図９、下段）、光誘導性Ｃｒｅが活性化されたことが確認された。
【０１９６】
光遺伝子プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣは、ニワトリ細胞においては好ましくないＣＭＶプロモーター１１を使用して遺伝子の発現を駆動する。これを克服し、２つのベクターを単一のベクターに結合するために、本発明者らは、ニワトリ細胞においてはかなり活性があるＣＡＧＧプロモーターの下で、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって、続いてＩＲＥＧ−ＧＦＰによって連結されたＣＩＢＮ−ＣｒｅＣおよびＣｒｙ２−ＣｒｅＮの発現を駆動するプラスミドベクターを設計した。ｐＣＡＧＧ−ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ−Ｐ２Ａ−Ｃｒｙ２−ＣｒｅＮ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの合成は、Ｋｅｎｎｅｄｙら１１に記載されている元の光遺伝子プラスミドの修飾に基づいていた。これらのプラスミドの各々は、ｍＣｈｅｒｒｙに続いて、ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ（Ｃｒｅ酵素のＣ末端に融合したＣＩＢ１の切り取り形）またはＣＲＹ２−ＣｒｅＮ（Ｃｒｅ酵素のＮ末端に融合したクリプトクロム２、図１５Ａ）のどちらかを有するＩＲＥＳ配列をコードする。次のクローニングの目標は、ＣＡＧＧプロモーターの下で、２つの融合光遺伝子を自己切断ペプチドＰ２Ａを、続いてＩＲＥＳ−ＧＦＰを結合することであった。このため、ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣプラスミドをＰ４０およびＰ４１プライマーを用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用し、ＣＲＹ２−ＣｒｅＮプラスミドをＰ４２およびＰ４３プライマーを用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用した（図１５Ａ）。特に、Ｐ２Ａ切断部位を含むプライマーＰ４１およびＰ４２は、１サイクルのオーバーハング延出ＰＣＲによって２つの産物をマージできるオーバーラップ配列を共有する（図１５Ｂ）。ＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ−Ｐ２Ａ−ＣＲＹ２−ＣｒｅＮを含むこの産物を、配列検証したシャトルベクターｐＪｅｔ１．２に連結した（図１５Ｃ）。このプラスミドは、それぞれ５’および３’末端にＳｍａＩおよびＮｈｅＩ制限部位を産物に付加したプライマーＰ４４およびＰ４５を用いたＰＣＲについてのテンプレートとして機能した（図１５Ｄ）。この産物を制限酵素で消化し、同じ酵素を使用して切断したｐＣＡＧＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドに連結した（図１５Ｅ）。この連結産物は、ＣＡＧＧプロモーター、続いてＣＩＢＮ−ＣｒｅＣ、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド、ＣＲＹ２−ＣｒｅＮ、ＩＲＥＳ、ＧＦＰおよびウサギベータグロビンポリアデニル化サイト（本明細書ではｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅと呼ばれる）を含み、配列検証された（図１５Ｆ）。
【０１９７】
ｎ−ｖｉｔｒｏでｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの活性を検証するために、成功裏のトランスフェクションのためのレポーターとしてＧＦＰを発現するプラスミドを、ｐＢ−ＲＡＧＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いてＨＥＫ２９３にコトランスフェクションを行った。上記のＰＢ−ＲＡＧＥ−ＧＦＰベクター（図１３）と同様に、ｐＢ−ＲＡＧＥ−ｍＣｈｅｒｒｙには、ｍＣｈｅｒｒｙコーディング領域の上流のＬｏｘＰ部位が隣接する複数の停止コドン配列が含まれている。Ｃｒｅ活性化時に、ＳＴＯＰコドンは除去されるため、ｍＣｈｅｒｒｙを発現させることが可能である（図１６）。コトランスフェクションを行い、かつ暗所に保ったＨＥＫ２９３細胞においては、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が存在しない（図１６、上段）一方、青色光照明にさらされた細胞においては、多くの細胞が、ｍＣｈｅｒｒｙを発現し（図１６、下段）、ｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅの単一ベクター戦略がシステムの光遺伝子性を保持していることが確認された。
【０１９８】
ｉｎ−ｏｖｏの生きているヒヨコ胚におけるｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの活性を検証するために、ｐＢ−ＲＡＧＥ−ｍＣｈｅｒｒｙと一緒にステージ１４〜１６Ｈ＆Ｈヒヨコ胚にエレクトロポレーションによってプラスミドにコトランスフェクションを行った。エレクトロポレーションの１２時間後、ネガティブコントロール群の卵を暗所に保ち、実験群の胚を１５秒間青色光にさらした（図１７）。両方の群をさらなる１２時間インキュベートし、蛍光ステレオスコープで検査した。インキュベーション後、両群において高レベルのＧＦＰ発現が明らかになり、成功裏のエレクトロポレーションが示された。ただし、光にさらされた群においてのみ（図１７、下段）、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性発現細胞が特定されて、ｐＣＡＧＧ−Ｏｐｔｏｇｅｎｅの単一ベクター戦略を使用した光遺伝子システムが光誘導可能な様式で活性化されたことが示された。
【０１９９】
ヒヨコ胚の致死性の誘導
毒素を使用して死亡を引き起こす実現可能性を示すために、ネガティブ選択マーカーとして一般に使用されるＤＴＡのコーディング領域１２を、ｐＧＫプロモーターおよびそれに続くＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｐＧＫ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を含む発現ベクターにクローニングした。このプラスミドはネガティブコントロールとしても機能した。ＤＴＡコーディング領域は、細胞における発現時に細胞死に繋がるタンパク質合成を阻害するｐＧＫ−ＤＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを誘発するＩＲＥＳ配列の上流にクローニングされた。
【０２００】
ニワトリ胚におけるＤＴＡ発現の影響を試験するために、ステージ１４〜１６Ｈ＆Ｈ胚を、ネガティブコントロールとしてのｐＧＫ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはｐＧＫ−ＤＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１２時間後、胚を蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現について解析した（図１８）。コントロール胚においてはＧＦＰが神経管内で広範に発現したが（図１８）、胚を発現するＤＴＡにおいてはＧＦＰ発現は検出されず、これらの細胞においてはタンパク質合成がブロックされたことが示された。
【０２０１】
本発明をその特定の実施形態に関連して説明したが、多くの代替、修正、および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内にあるそのような代替、修正、および変形のすべてを包含することが意図されている。
【０２０２】
本明細書で言及されているすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または識別は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクション見出しが使用されている限り、それらは必ず限定するものとして解釈されるべきではない。
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１１．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ｂｌｕｅ−ｌｉｇｈｔ？ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，９７３−９７５（２０１０）．
１２．Ｌｕ，Ｑ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｍｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ／ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １０９，７５−８６（２００２）．
１３．Ｓｏｌｔｅｒ，Ｄ．  ＆  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｂ．Ｂ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＳＳＥＡ−１）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，５５６５−９（１９７８）．
１４．Ｍａｓｈｉｋｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｎｔｏ  ｚｙｇｏｔｅｓ．Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．５６，１２２−９（２０１４）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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