(57)【要約】本発明は、単離された微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１並びに、それらの微生物飼料添加剤としての使用を提供する。この菌株は、低い乾燥物含有量（≦２０％）で飼料の好気性下安定性を保証し、飼料の発酵を向上させ、飼料中の乳酸及び酢酸の濃度を増加させ、ｐＨを低下させ、それにより、飼料中の栄養素の損失を減少させるために使用される。サイレージ貯蔵における微生物の使用は、飼料中の腐敗微生物（腐敗菌）及び酵母の機能を抑制させる。これらの菌株は、発酵が困難な新鮮な材料から作られた飼料の保存期間を長くするために使用することが出来る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２０３  ＤＳＭ３２６５０。
【請求項２】
単離された微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２２８  ＤＳＭ３２６５１。
【請求項３】
凍結乾燥形態の請求項１又は２に記載の前記微生物株。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物株を１又は複数含む組成物。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物株を含む飼料。
【請求項６】
例えば、サイレージといった、発酵飼料である請求項５に記載の飼料。
【請求項７】
飼料添加剤としての請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物の使用。
【請求項８】
サイレージの好気性下の安定性をサポートする請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物の使用。
【請求項９】
サイレージが低乾燥物含有量（≦２０％）の飼料から作られたものである請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
飼料の発酵における請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物を１又は複数含む組成物であって、
飼料の発酵を加速させ、
飼料中の乳酸及び酢酸の濃度を増加させ、
ｐＨを低下させて、および、それにより、
飼料中の栄養素の損失を減少させる、組成物。
【請求項１２】
発酵されるべき飼料に請求項１〜３の何れか一項に記載の前記微生物を添加することによって、病原微生物の作用を抑制させ、且つ酵母の成長を阻害するための請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物の使用。
【請求項１３】
病原微生物が腸病原菌である請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物が、発酵されるべき飼料に添加される、飼料の保存を長くする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野に属し、飼料製造に適用される。本発明は、発酵の品質、および飼料の品質を増加させるための、微生物学的なサイレージ添加剤および飼料発酵におけるその使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
動物による飼料の消費まで収穫及び貯蔵された飼料からのサイレージの栄養含有量を維持することは必要である。サイレージは、高含水量の作物の制御された発酵によって生産された材料である（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
サイロ貯蔵は、植物ベースの動物飼料を嫌気性条件において乳酸発酵に置く貯蔵方法である（例えば、非特許文献２参照。）。サイレージの発酵は４個のステージに分けることが出来る。（１）収穫後のサイロ中の嫌気的ステージ、（２）発酵ステージ、（３）安定した貯蔵ステージ、（４）サイレージのアンロード（ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）ステージ、ここで、サイロが開けられ、サイレージは空気に暴露される。高い品質のサイレージを生産するために、サイロに貯蔵される材料は、正しい微生物発酵をしなければならない。発酵の成功は、葉植物の種類及び質にも依存し、サイロ貯蔵に使用する技術、気候、望ましくない微生物（クロストリジウム属、リステリア属、杆菌）及びカビ（酵母及び真菌）の発達、サイレージ貯蔵される材料の乾燥物含有量にも依存する。
【０００４】
サイレージの発酵は、複数の異なる化学的及び微生物学的プロセス並びにそれらの相互作用の複雑な組合せのため、飼料の自然発酵を制御することは困難である。
【０００５】
多くのサイレージは、２００．．．５００ｇ／ｋｇの乾物含量で生産される。そのようなレベルで、多くの植物酵素は、サイレージ貯蔵中に活性化されており、そして、多数の望ましい、及び望ましくない微生物、酵母、及び真菌は、そのような条件下、サイレージ中で成長することが出来る。したがって、全ての微生物の活動を制御することは、驚くべきチャレンジとなり、良く制御されたサイレージ貯蔵方法の手段によってのみ達成することが出来る（非特許文献３）。
【０００６】
制御されたサイロ貯蔵方法において、水溶性炭水化物は乳酸菌によって乳酸に発酵される。結果として、材料のｐＨレベルはサイロ貯蔵で下がり（サイロ貯蔵物は酸性である）、それにより、代わりに、腐敗微生物の活動を阻害する（非特許文献４）。サイレージの酸性のｐＨ４への低下が早ければ早いほど、酵素的及び微生物学的活動の停止も早くなり、飼料は安定化し、そして、より多くの栄養素が保存される。
【０００７】
サイレージの発酵の質は乳酸菌を含む添加剤により、顕著に向上し得ることが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
発酵及び、サイレージの保存ステージにおいて、栄養素の保存が重要であると同様に、サイロを開けたサイレージ中の栄養素を保存することも重要である。サイレージは、飼料を与えるときにサイロを開ける際、及び、サイロの不十分なカバーにより、両方の場合、酸素に暴露され得る。
【０００９】
空気に暴露されたいかなるサイレージは、遅かれ早かれ、好気性微生物により腐敗する。サイレージの好気性下の安定性は、サイレージ貯蔵されるサイレージ穀物、収穫時の成長フェイズ、発酵の生化学的及び微生物学的ファクター、サイレージ材料の物理的特徴、サイレージマネイジメントの構成、温度、および、サイレージ添加剤の選択に依存する。サイレージの好気性下安定性の指標は、サイレージが好気性下の腐敗（例えば、空気に曝露したときその品質を維持する時間の長さ）に抵抗できる時間の長さである。サイレージの好気性下安定性は、サイレージの温度が上昇する速度に基づいて推定される。サイレージは安定な時間が長ければ長いほど、例えば、それは、周囲温度が３℃以上、上がらないことが長いほど（２００８年４月２５日の欧州連合委員会の規制（ＥＣ）第４２９／２００８号；ＤＬＧ−Ｒｉｃｈｉｔｌｎｅｉｅｎｆｕｒ  ｄｉｅ  Ｐｒｕｆｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｓｉｌｉｅｒｍｉｔｔｅｎ  ａｕｆ  ＤＬＧ−Ｇｕｔｅｚｅｉｃｈｅｎ−Ｆａｇｈｉｇｋｅｉｔ，  ＤＬＧ  Ｏｋｔｏｂｅｒ ２０１３）、好気性下安定性及び、サイレージの品質は優れている。ほとんどの好気性下で腐敗しやすいサイレージにおいて、酸及び水溶性炭水化物の二酸化炭素と水への微生物による酸化で、温度は周囲温度を超えて上昇する。
【００１０】
サイレージの低いｐＨレベルは、嫌気性下の望ましくない微生物の成長を阻害するが、低いｐＨそれ自体は好気性下の腐敗を防止するために十分ではない。好気性条件下のサイレージの腐敗は、多くの場合は酵母（比較的低いｐＨにおいても成長することが出来る）で始まる。酵母は、広いｐＨ範囲（ｐＨ３．．．．．８）で成長できる。ほとんどの酵母の成長に好適なｐＨは、３．５．．．．６．５である。サイロを開いてサイレージが空気に曝露されるとき、酸及び、発酵中に形成された他の化合物は、好気性微生物、酵母及び真菌により酸化される。酵母の活動は、二酸化炭素を生産させる結果となり、サイレージを加熱させ、これは、代わりに、乾燥物減少の直接の原因になる（非特許文献１）。
【００１１】
酵母は、エネルギー源として、サイレージ中に含まれる残存糖を使う。しかし、彼らの第一の好みは乳酸である。結果として、高い乳酸含有量の良く発酵されたサイレージは、特に好気性下で腐敗になりやすい。酵母の活動は、サイレージのｐＨレベルを上昇させ、多くの他の好気性微生物及び真菌を活性化させる。良く発酵し、栄養価の高いサイレージ中の高い微生物活動は、サイレージの温度上昇により明らかになった
【００１２】
サイロを開くに際して、サイレージ中の乾燥物、酢酸及びプロピオン酸の含有量、及び酵母の数及び真菌の数はサイレージの好気性下安定性を決定する重要な要素である（非特許文献５）。乾燥物及び酵母に関する否定的な関係は、非常に高い濃度は、空気への暴露の際のサイレージ温度の急激な上昇になることを示した。酢酸及び酪酸は、一方で、これらの発酵産物の非常に高い濃度は、より安定なサイレージに関係している。
【００１３】
述べたように、サイレージの低いｐＨレベルは好気性下腐敗を生じさせる微生物に直接的な作用を有しない。しかし、サイレージの発酵中に生産された酸は、有用で重要である。酵母の成長は、非解離性短鎖脂肪酸により阻害される（非特許文献６）。非解離性酸分子は、受動拡散により微生物の細胞膜に侵入することが出来、Ｈ+イオンを放出する。これにより、細胞内のｐＨレベルを低下させ、細胞を死滅させる。サイレージ中の酸の拡散速度は、酸の解離係数（ｐＫａ）及び、サイレージのｐＨレベルに依存する（非特許文献７）。酢酸及びプロピオン酸は、乳酸よりも解離しにくい傾向であり、このことは、高い乳酸含有量の良好な発酵サイレージは好気性下で腐敗しやすいことを説明している。一方で、酢酸及びプロピオン酸は、酵母及び真菌の成長を効果的に阻害する。酪酸は同様の効果を有する。高い酪酸含有量のサイレージは、良好な好気性下安定性を有する。しかし、これは、腐敗を起こすクロストリジウム属の活動を示す。そのようなサイレージは、顕著な栄養損失を示し、そして、高い酪酸含有量は、動物の健康上の問題を引き起こす。サイレージ中のプロピオン酸の含有はまれで、少ない。サイレージ穀物中において、それを生産する微生物の濃度は低く、それらの競合性は弱い。
【００１４】
サイレージ中の酢酸含有量は、異種発酵の指標である。なぜなら、酢酸は、酵母に対して高い毒性があり、そのようなサイレージは、典型的に、非常に高い好気性下安定性を示す。
【００１５】
サイレージの理想的な発酵は、飼料の保存中及び、飼料を与えるためにサイロから飼料をアンロードする間、発酵損失を減少させ、且つ、十分な安定性を保証するものである。効果的なサイレージ添加剤及び、生産物の好適な構成及び、サイレージの使用は、これらの目的を達成するためにおいて、重要な役割を果たす。ほとんどのサイレージ添加剤は、サイロ貯蔵プロセス及び、サイロ貯蔵飼料の栄養価を向上させるため開発された。
【００１６】
しかし、迅速な発酵を保証し、且つ、サイレージの品質を向上させることに加えて、サイレージ添加剤は、腐敗（好気性下の腐敗も含む）生物の成長を阻害することも期待されている。サイレージの好気性下安定性を向上させるためにサイレージ添加剤を使用する主な理由は、サイレージの加熱、栄養素の損失、及び腐敗サイレージの消費による動物の体調低下を防止することである。
【００１７】
サイレージ添加剤はしばしば酵素を使用する。しかし、これらは、酵母又は真菌を阻害しない、非常に穏やかな好気性下安定性を有する酵素で調整されるサイレージを意味する。プロピオン酸、酢酸及び、安息香酸などのような有機酸は、サイレージの好気性下安定性を向上させるのに効果的である。これらは、いわゆる飼料の最終保全を達成するため多量又は、少量加えられる。後者の場合、酵母の活動は阻害されるが、しかし、最終保全は達成されず、そして、自然発酵に依存するサイレージ貯蔵は続く。アンモニアは、細菌、酵母、及び真菌に阻害効果があると報告されている。残念ながら、有機酸及び他の化合物は攻撃的であり、そして、これらの取り扱い及び保存に適用される厳密な安全性要件が、サイレージ装置に要求される。
【００１８】
乳酸菌に基づく生物学的サイレージ添加剤は、自然物であるとみなされている。これらの利点は、毒性の欠如、装置対する腐敗性欠如、環境リスクの欠如を含む。
【００１９】
乳酸菌によるサイレージのｐＨレベルを低下させるという目的は、発酵損失を最小限にすることである。乳酸菌は、グルコース代謝に基づいて、２つのグループ：同種発酵種及び異種発酵種に分けられる。同種発酵種は、１モルのグルコースから２モルの乳酸を生産するが、一方、異種発酵種は１モルの乳酸、１モルの二酸化炭素、及び１モルのエタノール又は酢酸を生産する。発酵プロセスの初期では、同種発酵種が大部分であるが、しかし、その後、環境がより酸性になると、異種発酵種が多くなる（非特許文献３）。
【００２０】
同種発酵乳酸菌に基づくサイレージ添加剤は、サイレージの発酵プロセスを向上させる。しかし、ほとんどのそのようなスターター菌は、酵母及び真菌の成長を阻害しない。そのようなサイレージ添加剤の使用で、サイレージの好気性下安定性は、サイレージ添加剤なしよりも低くなり、そして、サイレージの加熱リスクも増加させるかもしれない。
【００２１】
サイレージスターターは、プロピオン酸を生産する菌（例えば、プロピオン酸菌）を生産する。残念ながら、これは、サイレージの好気性下安定性を向上させない。なぜなら、これらの微生物は、典型的に酸耐性であり、そして、それらの成長は遅いからである。しかし、乳酸に加えて酢酸も多量生産するスターター（Ｌ．ブフネリ）は、サイレージの好気性下腐敗を生じさせる微生物（酵母、真菌など）を阻害する、つまり、彼らは好気性下のサイレージ安定性を向上させ、サイロを開けること又は空気への他の種類の暴露によるサイレージの腐敗を防止する。
【００２２】
サイロ貯蔵プロセス中における、異種発酵乳酸菌の添加は、ｐＨレベルを低下させ、乾燥物の損失を減少させる。さらに、これらの菌株のいくつかは、酵母及び真菌の成長に、強度の阻害効果を有し、それによって、サイレージの好気性下安定性が向上することが報告されている（非特許文献８）。しかし、遺伝的多様性種間の相違、つまり、菌特異的性質の発生、により、同じ種の異なる株は同じ性質を有しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｐ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｈｅｒｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｅ．１９９１．Ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｓｉｌａｇｅ．２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｈａｌｃｏｍｂｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｌｏｗ，Ｂｕｃｋｓ  ＵＫ，ｐ．３４０
【非特許文献２】Ｒｏｏｋｅ，Ｊ．，Ａ．ａｎｄ  Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｇ．，Ｄ．，２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｓｉｌｉｎｇ．Ｉｎ：Ｓｉｌａｇｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｄ．Ｒ．Ｂｕｘｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｍｕｃｋ，ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ．ｐｐ．９５−１３９
【非特許文献３】Ｍｕｃｋ，Ｒ．Ｅ．２０１０．Ｓｉｌａｇｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｄｄｉｔｉｖｅs．Ｒ．Ｂｒａｓ．Ｚｏｏｔｅｃ．ｖｏｌ．３９．Ｊｕｌｙ
【非特許文献４】Ｏｕｄｅ  Ｅｌｆｅｒｉｎｋ，Ｓ．Ｊ．Ｗ．Ｈ．，Ｄｒｉｅｈｕｉｓ，Ｆ．，Ｇｏｔｔｓｈａｌ，Ｊ，Ｃ．，Ｓｐｏｅｌｓｔｒａ，Ｓ．Ｆ．２０００．Ｓｉｌａｇｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．−Ｊｏｕｒｎａｌ  ＦＡＯ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｎｏ  １６１，ｐｐ  １７−３０
【非特許文献５】Ｏｈｙａｍａ，Ｙ．，Ｈａｒａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍａｓａｋｉ，Ｓ．（１９８０）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓ  ｓｉｌａｇｅｓ．Ｉｎ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．（ｅｄ．）Ｆｏｒａｇｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ８０ｓ．ＢＧＳ  Ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｎｏ．１１、ｐｐ２５７−２６１．ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ：Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）
【非特許文献６】Ｐａｈｌｏｗ，Ｇ．，Ｍｕｃｋ  Ｒ．Ｅ．，ＤｒｉｅｈｕｉｓＦ．，Ｏｕｄｅ  Ｅｌｆｅｒｉｎｋ  Ｓ．Ｊ．Ｗ．Ｈ．ａｎｄ  Ｓｐｏｅｌｓｔｒａ  Ｓ．Ｆ．（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ  ｏｆ  ｅｎｓｉｌｉｎｇ．Ｉｎ：ＢｕｘｔｏｎＤ．Ｒ．Ｍｕｃｋ  Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｊ．Ｈ．（ｅｄｓ．）Ｓｉｌａｇｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ３１−９３）．Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，ＵＳＡ：Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｐｕｂｕｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．４２、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ
【非特許文献７】Ｚｉｒｃｈｒｏｍ（２０１１）  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｂａｓｅｓ．Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ：http://ｗｗｗ.ｚｉｒｃｈｒｏｍ．ｃｏｍ／ｏｒｇａｎｉｃ．ｈｔｍ  （ａｃｃｅｓｓｅｄ  ３  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１１）
【非特許文献８】Ｊａｔｋａｕｓｋａｓ，Ｊ．，Ｖｒｏｔｎｉａｋｉｅｎｅ，Ｖ．，Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｌｕｎｄ，Ｂ．２０１３．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｉｌａｇｅ  ｉｎｃｕｌａｎｔｓ  ｏｎ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｇｌａｓｓ、  ｃｌｏｖｅｒ−ｇｒａｓｓ，ｌｕｃｅｒｎｅ  ａｎｄ  ｍａｉｚｅ  ｓｉｌａｇｅ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２：１３７−１４４
【非特許文献９】Ｈｕｔｔ  Ｐ．Ｓｈｃｈｅｐｔｏｖａ  Ｊ．  Ｌｏｉｖｕｋｅｎｅ  Ｋ．  Ｋｕｌｌｉｓａａｒ  Ｔ．Ｍｉｋｅｌｓａａｒ  Ｍ．Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ａｎｄ  ｂｉｏｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｎｔｒｏ−  ａｎｄ  ｕｒｏｐａｈｏｇｅｎｓ．  Ｊ  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００６；１００（６）：１３２４−３２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、飼料発酵の品質向上並び、サイレージの好気性下安定性及び保存期間を長くさせる、新規株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、単離された微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１、並びに、前記菌株を一つか、又は両方を含む飼料、飼料添加剤及び組成物を開示する。飼料は、発酵した飼料、例えばサイレージであり得る。飼料添加剤は、サイレージ添加剤であり得る。添加物の組成物中の他の成分として好適な賦形剤が包含されていてもよい。前記微生物は、凍結乾燥形態で使用することが出来る。
【００２６】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、例えば、低い（≦２０％）乾燥物含有量の飼料のような発酵するのが困難な飼料を含む、飼料の好気性下安定性を保証する。
【００２７】
本発明の次の目的は、飼料の発酵を加速化させること、乳酸の濃度を増加させること、ｐＨを低下させること、並びに、飼料中の栄養素の損失及び、飼料中のアンモニア窒素と酪酸の濃度を、減少させることである。
【００２８】
前記微生物（一緒に又は別々に）は、飼料の発酵、そして発酵を向上させるため、飼料中の乳酸及び酢酸の濃度を増加させるため、ｐＨを低下させるために使用され、それにより、飼料中の栄養素の損失を減少させる。
【００２９】
抗微生物特性の調査に基づいて、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、望ましくない微生物（病原微生物、酵母及び真菌）の成長及び作用を阻害する。前記腸病原菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・ファイカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、などである。
【００３０】
本発明は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１の一つか、又は両方を発酵中飼料に加える、飼料の保存を長くする方法にも関する。
【００３１】
上記菌株の一つを使用する場合は、発酵した飼料１ｇ当たり１×１０5〜１×１０6ＣＦＵ／ｇの比率で飼料に添加される。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（菌株の説明）
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、（サイレージ添加剤の使用なしに）エストニアで、自然にサイロ貯蔵された高品質のトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）サイレージから単離された。サイレージサンプル中の乳酸杆菌の定量的な含量を決定するために、ペプトン水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）中で少数希釈法を使用して溶液の懸濁液（濃度を漸減させて）を作製し、ＭＲＳ（ｄｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐ）寒天（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）に植え付け、これを微好気性環境（１０％  ＣＯ2）で、３７℃で４８時間インキュベートした（サーモスタット「ＭＣＯ−１８ＡＩＣ  ＵＶ」三洋電機（株）、日本）。発生したコロニーを記述し、計数し、微生物総数を決定した。微生物の形態を描写するために、グラム染色法を使用して標本を作製し、顕微鏡検査を行った。乳酸桿菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）に特有なコロニーおよび細胞の形態に基づいて、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株は単離された。続いて、暫定的および詳細な同定をしたが、これは後述される。
【００３３】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１の培養物の形態学的特徴は、ＭＲＳ寒天及び培養液（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）で成長させた後に決定された。
【００３４】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０は、単独で存在し、短鎖を有する、グラム陽性の桿菌様、非運動性で胞子を形成しない細菌である。ＭＲＳ培養液での培養中、細長い細胞で存在する。
【００３５】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、単独で存在し、短鎖を有する、グラム陽性の桿菌様、非運動性で胞子を形成しない細菌である。ＭＲＳ培養液での培養中、長く且つ細長い細胞で存在する。
【００３６】
（生理学的−生化学的特性）
ＭＲＳ培養液（４８〜７２時間）は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０を、微好気性下又は嫌気性下で培養するのに好適であり、その後、均質な混濁増殖（ｔｕｒｂｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ）が起こる。微好気性環境（１０％のＣＯ2）又は、嫌気性環境（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）における３７℃で４８時間の培養後、コロニーは、灰白色であり、１．５〜２ｍｍで、平坦であり、光沢を有し、透明で、表面がざらざらし、突起物がある。
【００３７】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０は、偏性異種発酵性であり、カタラーゼおよびオキシダーゼ陰性であり、アルギニンを加水分解し、グルコース発酵中で二酸化炭素を産生する。
【００３８】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株の最適な増殖温度は３７℃であり、この株はまた、１５℃では複製する。ある程度、４５℃でも複製し得ることが確認された。菌増殖のための最適なｐＨは、５．７〜６．２である。
【００３９】
ＭＲＳ培養液（４８〜７２時間）は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２２２８  ＤＳＭ３２６５１を、微好気性下で培養するのに好適であり、その後、均質な混濁増殖（ｔｕｒｂｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ）が起こる。微好気性環境（１０％のＣＯ2）又は、嫌気性環境（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）における３７℃で４８時間の培養後、コロニーは、灰白色であり、１．５〜２ｍｍで、平坦であり、光沢を有し、透明で、表面がざらざらし、突起物がある。
【００４０】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、偏性異種発酵性であり、カタラーゼおよびオキシダーゼ陰性であり、アルギニンを加水分解し、グルコース発酵中で二酸化炭素を産生する。
【００４１】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の最適な増殖温度は３７℃であり、この株はまた、１５℃では複製する。ある程度、４５℃でも複製し得ることが確認された。菌増殖のための最適なｐＨは、５．７〜６．２である。
【００４２】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０は、ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）を使用して、生化学活性に基づいて、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒ）と同定された。
【００４３】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）を使用して、生化学活性に基づいて、ラクトバチルス・ブフネリと同定された。
【００４４】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３は、２０１７年９月２５日に、ブダペスト条約に基づく「特許手続上の微生物の寄託」に従って、Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ及び、Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨのＤｅｕｔｓｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇに、番号ＤＳＭ３２６５０で寄託した。
ＤＳＭＺの住所：Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【００４５】
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２２８は、２０１７年９月２５日に、ブダペスト条約に基づく「特許手続上の微生物の寄託」に従って、Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ及び、Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨのＤｅｕｔｓｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇに、番号ＤＳＭ３２６５１で寄託した。
ＤＳＭＺの住所：Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【００４６】
（抗生物質耐性）
方法：ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１の抗生物質に対する感受性を、嫌気性条件下（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）、＋３７度、４８時間、ＶｅｔＭＩＣ  Ｌａｃｔ−１、ＶｅｔＭＩＣ  Ｌａｃｔ−２プレート（ＳＶＡ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で、ＩＳＯ１０９３２：２０１０基準に従って分析した。最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、ＥＦＳＡにより報告されているＭＩＣカットオフ値と比較した。
【００４７】
【表１】
2020534856.tif 000002
【００４８】
飼料添加剤として使用する細菌を評価に対して、菌株は、感受性又は抗菌性と分類することが出来る。
感受性（Ｓ）：特定の抗微生物のカットオフ値に等しいかまたはそれより低い濃度（Ｓ≦ｘｍｇ／Ｌ）のいずれかでその増殖が阻害される場合は、細菌株は感受性があると定義される。
【００４９】
耐性（Ｒ）：特定の抗微生物のカットオフ値より高い濃度（Ｒ＞ｘｍｇ／Ｌ）でその増殖が阻害されない場合は、細菌株は耐性があると定義される。
【００５０】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の抗生物質感受性の結果を、表１に示す。ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株は、ＥＦＳＴにより提案されている偏性異種発酵性のラクトバチルスに対して提案されているＭＩＣカットオフ値を超えていない。
【００５１】
株の機能特性
（多様な糖の存在下における増殖）
この実験の目的は、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株について、多様な糖の存在下の成長能力、および、培地の酸性化能力を調査することである。
【００５２】
方法：ＭＲＳ寒天上で培養されたラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１はマクファーランド  トビディティー標準Ｎｏ．５に従って（微生物１．５×１０9個／ｍｌ）でペプトン水に懸濁し、修正ＭＲＳ培養液（グルコース、フルクトース、トレハロース、キシロース又はマルトース、又はグルコース、フルクトース、トレハロース（比率、１：１：１）の混合物の何れかを含む、２０ｇ／Ｌ）に、最終濃度も２０ｇ／Ｌで、微生物１．５×１０6個／ｍｌの最終濃度で植え付けた。
【００５３】
懸濁液は、サーモスタット中、微好気性下（１０％ＣＯ2）又は嫌気性下（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）、２５℃で２４、４８および７２時間、インキュベートした。嫌気性環境下では、培地は、予め２４時間に減少させた。両株の可能な数を登録した。収率、世代番号（ｎ）、及び成長速度（Ｖ）は以下のように計算した。
【００５４】
収率＝ｌｏｇＮ1−ｌｏｇＮ0、ここで、Ｎ1は与えられた時間の細胞濃度、Ｎ0は初期細胞濃度。
ｎ＝ｌｏｇＮ1−ｌｏｇＮ0／ｌｏｇ２、ここで、Ｎ1は与えられた時間の細胞濃度、Ｎ0は初期細胞濃度。
Ｖ＝ｌｏｇＮ1−ｌｏｇＮ0／０．３０１ｘｔ、ｗ、Ｎ1は与えられた時間の細胞濃度、Ｎ0は初期細胞濃度、ｔは特定の時期の時間（ｈ）。
【００５５】
グルコース、フルクトース、キシロース又は、グルコース、フルクトース及びトレハロースの混合物を含む培養培地中、微生物培養における最初の２４時間中、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株の成長は、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の成長よりも一世代早かった（表２）。
【００５６】
【表２】
2020534856.tif 000003
【００５７】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株と比べると、最初の２４時間の嫌気性培養中において、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株は、フルクトース又は、グルコース、フルクトース及びトレハロースの混合物を含む培地において、平均２世代早く、４８時間以内の嫌気性培養中において、グルコースを含む培地において３世代早く、フルクトース及びキシロースを含む培地において、約１．５世代早かった（表３）。
【００５８】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株はゆっくり成長し、フルクトース又はキシロースを含む培地、及び、グルコース、フルクトース及びトレハロースの混合物を含む培地において、４８時間の培養後、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株を上回ることが出来る。
【００５９】
【表３】
2020534856.tif 000004
【実施例】
【００６０】
（実施例１）有機酸及びアルコールのプロファイル
この実験の目的は、微好気性下及び嫌気性下の培養中におけるラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の有機酸及びアルコールのプロファイルを決定することである。
【００６１】
方法：ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８のＭＲＳ寒天（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）で培養した２４時間後の培養物を、マクファーランド  トビディティー標準Ｎｏ．５に従って（微生物１．５×１０9個／ｍｌ）でペプトン水に懸濁し、微生物１．５×１０6個／ｍｌの最終濃度でＭＲＳ培養液（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）に植え付け、微好気性下（１０％ＣＯ2）及び嫌気性下（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）、サーモスタット中、２５℃で２４、４８および７２時間、インキュベートした。
【００６２】
有機酸及びアルコールのプロファイルは、ガスクロマトグラフ６８９０ＡキャピラリーカラムＣＰ−Ｗａｘ５２ＣＢ（３０ｍ×０．２５ｍｍ０．２５μｍ）で、ガスクロマトグラフィーにより決定された。カラム温度プログラム７５度１分保持。１０度／分で１１５度へ３分保持。２０度／分で１９０度へ５分保持。検出器（ＦＩＤ）２８０度。
【００６３】
有機酸は、島津プロミネンスＨＰＬＣシステムで、液体クロマトグラフィーにより決定された。サンプルは、ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン交換カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）で分離した。カラム温度は、６０度で維持され、流速は０．６ｍｌ／分であり、有機酸は２１０ｎｍでＰＤＡ検出器により検出した。分析時間は２６分であった。
【００６４】
有機酸及びアルコールのプロファイルにおいて、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の菌株に特異的な特徴は明らかとなった（表４）。ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０は、微好気性下及び嫌気性下の両方で、培養中、エタノール、酢酸、及び乳酸を顕著に強く生産した。ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、嫌気性環境下でピルビン酸を生産することが出来た（表４）。
【００６５】
最初の２４時間の微好気性下及び嫌気性下の培養中、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株は、培養培地中に当初存在したクエン酸の約９９．５％および９７．８％をそれぞれ使用した。
【００６６】
嫌気性下の培養中、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株は、培養培地中に当初存在したクエン酸の約４．８％を消費した。ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株とは異なり、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株は、７２時間の微好気性下培養中に、５．９％のクエン酸を生産した。
【００６７】
【表４】
2020534856.tif 000005
【００６８】
（実施例２）トーウモロコシ植物の上精中の有機酸及びアルコールのプロファイル
この実験の目的は、植物材料発酵中におけるラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の有機酸及びアルコールのプロファイルを決定することである。
【００６９】
方法：野菜成長ステージ（Ｖ６−Ｖ８）にあるトーモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）植物２２６ｇを、砕き、水を加えて、実験室ブレンダーＢａｇｍｉｘｅｒ４００（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で６分間、ホモゲナイズし、ろ過し、遠心分離（周囲温度で、５０００ｒｐｍで１０分）し、１２１度で５分間滅菌した。
【００７０】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１のＭＲＳ寒天（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）で培養した２４時間後の培養物を、マクファーランド  トビディティー標準Ｎｏ．５に従って（微生物１．５×１０9個／ｍｌ）でペプトン水に懸濁し、微生物１．５×１０6個／ｍｌの最終濃度で、トーウモロコシ植物の上精中に植え付け、微好気性下（１０％ＣＯ2）及び嫌気性下（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）、サーモスタット中、２５℃で２４、４８および７２時間、インキュベートした。
【００７１】
有機酸及びアルコールのプロファイルは、ガスクロマトグラフ６８９０ＡキャピラリーカラムＣＰ−Ｗａｘ５２ＣＢ（３０ｍｘ×０．２５ｍｍ０．２５μｍ）で、ガスクロマトグラフィーにより決定された。カラム温度プログラム７５度１分保持。１０度／分で１１５度へ３分保持。２０度／分で１９０度へ５分保持。検出器（ＦＩＤ）２８０度。
【００７２】
有機酸は、島津プロミネンスＨＰＬＣシステムで、液体クロマトグラフィーによりにより決定された。サンプルは、ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン交換カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）で分離した。カラムの温度は、６０度で維持され、流速は０．６ｍｌ／分であり、有機酸は２１０ｎｍでＰＤＡ検出器により検出した。分析時間は２６分であった。
【００７３】
【表５】
2020534856.tif 000006
【００７４】
植物材料の発酵テストにおいて、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０は、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１と比較して、エタノール及び乳酸のより強い生産を証明した（表５）。
【００７５】
（実施例３）病原菌に対する抗微生物活性
この実験の目的は、２５度、微好気性下及び嫌気性下の培養中におけるラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の腸病原菌に対する抗微生物活性をテストすることである。
【００７６】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の病原菌に対する抗微生物活性を評価するために、ｓｔｒｅａｋ−ｌｉｎｅ 手法を使用した（非特許文献９）。
【００７７】
標的微生物上の成長阻害を決定するために、成長−フリーゾーンをミリメーター単位で測定した。計算平均及び標準誤差をＨｕｔｔら（2006）と類似の方法により、サンプル（表６）の結果に基づいて計算し、同じものに基づいて、対立する活性（ｍｍ）を評価した。
【００７８】
【表６】
2020534856.tif 000007
【００７９】
微好気的環境下、両株は、同程度の強度の抗微生物活性を示した（表６）。嫌気性環境下、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０は、テストされた腸病原菌に対して若干高い阻害効果を有している。
【００８０】
（実施例４）抗真菌活性
この実験の目的は、寒天ウェル-拡散（ディフュージョン）法を使用して、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株上精のトーウモロコシサイレージ由来の酵母に対する効果を評価することである。
【００８１】
４８時間、ラクトバチルスの培養物懸濁液を、マクファーランド  トビディティー標準Ｎｏ．５に従って（微生物１．５×１０9個／ｍｌ）ペプトン水中に調製し、ＭＲＳ寒天（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）培養物中に、最終濃度で微生物１．５×１０6個／ｍｌとなるように植え付け、微好気性下（１０％ＣＯ2）及び嫌気性下（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）、２５℃で４８および７２時間、インキュベートした。微生物細胞は、遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分）により除去した。上清はろ過により滅菌し、凍結乾燥により濃縮した。凍結乾燥上清は１０ｍＭ酢酸で１０倍に再懸濁された。トーウモロコシサイレージから単離した６株の野生型酵母（Candida 種）は、ＰＣＡ（Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔ  Ａｇｅｒ，  Ｌｉｏｆｉｌｃｈｅｍ  ｓｒｌ，  Ｉｔａｌｙ）培地上に均一に植えられた。６ｍｍ直径のウェルは、無菌で寒天切断がされ、そして、このウェルに１００μｌの上精サンプルを加えた。２５度で培養後、抗真菌作用を以下のように記録した。
【００８２】
抑制なし；+  弱い抑制、酵母の成長が妨害；++  強い抑制、検出できる透明ゾーンを有して酵母の成長抑制；+++  非常に強い抑制、広い透明ゾーンを有して酵母の成長抑制
【００８３】
ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１により生産された抗微生物化合物は、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０により生産されたものより、植物由来の酵母の成長をより強く阻害する。ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、４８時間の培養中に既に、酵母成長阻害化合物を生産し、ウェルの周りの寒天培地上に広く透明な成長阻害ゾーンを作り出すが、ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株の上精は酵母の成長を妨害するに過ぎない。
【００８４】
（実施例５）植物材料の発酵中における成長ダイナミックス
この実験の目的は、植物材料の発酵中におけるラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の効果を評価することである。
【００８５】
方法：野菜成長ステージ（Ｖ６−Ｖ８）にあるトーモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）植物２２６ｇを、砕き、水を加えて、実験室ブレンダーＢａｇｍｉｘｅｒ４００（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で、６分間、ホモゲナイズし、ろ過し、室温、５０００ｒｐｍで１０分、遠心分離し、１２１度で５分滅菌した。
【００８６】
マクファーランド  トビディティー標準Ｎｏ．５に従って（微生物１．５×１０9個／ｍｌ）ラクトバチルスの４８時間培養懸濁物をペプトン水中に調製し、微生物１．５×１０6個／ｍｌの最終濃度で、ＭＲＳ（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｉｔａｌｙ）培養液に植え付け、微好気性下（１０％ＣＯ2）及び嫌気性下（ＣＯ2／Ｎ2／Ｈ2：５／９０／５％）、２５℃で４８および７２時間、インキュベートした。
【００８７】
両株の可能な数を登録した。収率、世代番号（ｎ）、及び成長速度（Ｖ）は以下のように計算した。
収率＝ｌｏｇＮ1−ｌｏｇＮ0、ここで、Ｎ1は与えられた時間の細胞濃度、Ｎ0は初期細胞濃度。
ｎ＝ｌｏｇＮ1−ｌｏｇＮ0／ｌｏｇ２、ここで、Ｎ1は与えられた時間の細胞濃度、Ｎ0は初期細胞濃度。
Ｖ＝ｌｏｇＮ1−ｌｏｇＮ0／０．３０１ｘｔ、ｗ、Ｎ1は与えられた時間の細胞濃度、Ｎ0は初期細胞濃度、ｔは特定の時期の時間（ｈ）。
【００８８】
【表７】
2020534856.tif 000008
【００８９】
最初の２４時間の微生物の培養中、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０株は、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株よりも４世代早く、そして、４８時間において、２．４倍速かった（表７）。
【００９０】
（実施例６）
サイレージ添加剤、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１の容易に発酵する新鮮な材料に対する効果の探索
【００９１】
この探索の目的は、トーモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ、トーモロコシ種「Cathy」）サイレージ（乾燥物含有量≧３０％）の好気性下安定性及び発酵品質へのサイレージ添加剤、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株の効果を決定することである。
【００９２】
サイレージトライアルは、成熟度がドウ（dough）ステージの新規に粉砕したトーモロコシで１，５ｌラボスケール−サイロで実施された。
【００９３】
以下の探索が行われた。９０日目のｐＨ値及び、発酵品質
好気性下の安定性に対する２つのテストが行われた。最初のテストは、２回のエアーストレス（２８日目と４２日目に：２４時間）を有する４９日の貯蔵期間後に行われた。好気性下の安定性に対するテストは、約２０度の温度制御された室内で行われた。温度は、ＰＳ−ＥＳ Ｄａｔａ  ｌｏｇｇｉｎｇシステムで４時間毎に記録された。
新鮮な材料の化学組成は、表８に示す。
【００９４】
【表８】
2020534856.tif 000009
【００９５】
Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１を適用したものは、未処理のものと比較して、酢酸及び１，２−プロパンジオールの顕著な増加をもたらした（表９）。
【００９６】
【表９】
2020534856.tif 000010
【００９７】
４９日の保存期間後に行われた好気性下安定性テストは、好気性下安定性が、未処理のものと比較して、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１で処理されたサイレージは、略２〜２．５日の顕著な向上を示した（コントロール:３．９日に対して、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０：６．３日、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１：５．８日）。
【００９８】
９０日までの保存期間の延長は、両方とも、未処理コントロールが７．９日で、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０処理に対して１０．６日であり、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１サイレージに対して、１１．４日であるという好気性下安定性の増加の結果となった。Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０に対する３日より少ない差異、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１に対する３日より多い差異は、統計学的に有意であることが分かった。
【００９９】
（実施例７）
サイレージ添加剤、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１の発酵が困難な新鮮な材料に対する効果の探索
【０１００】
この実験の目的は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、ラクトバチルス・ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１を使用した、新規に粉砕した、低い乾燥物含有量（≦２０％）の全トーモロコシ植物（Ｚｅａ  ｍａｙｓ、トーモロコシ種「Dorka」）から作られたサイレージの発酵品質及び好気性下安定性を評価することである。
【０１０１】
Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株を、水溶液の形態で、サイロ貯蔵される植物材料（飼料）の１ｇ当たり１×１０5ＣＦＵの濃度でサイロ貯蔵材料に加えた。全てのテスト種類（コントロールサイレージ、乳酸サイレージ細菌株Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１で作られたサイレージ、サイレージ添加物なしに作られたコントロールサイレージ、を５複製して調製した。全てのテストサイレージは、９０日のサイレージ貯蔵後、開けた。
【０１０２】
新鮮な材料の化学組成を表１０に示す。
Ｈｏｎｉｇ  （Ｈｏｎｉｇ，  Ｈ．，１９９０：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｉｎ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｂａｃ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ，  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ）に記載の方法に従って、９０日の保存後、サイレージの好気性下安定性をテストした。サイレージは、幾何中心で測定された温度が、周囲温度を３度超えると好気的に不安定になると考えられる。温度の長期間変化は、９日（２１７時間）にわたり測定された。周囲温度及び、テストサイレージ、Ｃｏｍｅｔ温度データＬｏｇｇｅｒ S0141装置を使用して、１時間おきに記録した。サイレージサンプルは、良く確立された方法（ＡＯＡＣ，  ２００５．  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  １８th  ｅｄ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）を使用して、分析した。
【０１０３】
乾燥物含有量を測定するために、サイレージサンプルは、１３０度で、サーモスタット中で一定重量になるまで乾燥した。粗製灰分を決定するために、サイレージサンプルを、ｍｕｆｆｌｅ  ｆｕｒｎａｃｅ中、５５０度にて６時間焼成した。タンパク質含有量は、Ｋｊｅｌｔｅｃ（商標）２３００分析器、その後、ケルダール法(Ｎｘ６．２５)を使用して測定した。粗製ファイバーは、Ｗ．Ｈｅｎｎｅｂｅｒｇ及び、Ｆ．Ｓｔｏｈａｍｍ法に従って決定した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａガスクロマトグラフィーを、サイレージ中の酸及びエタノール含有量を決定するために使用した。全窒素中のアンモニア窒素の比率は、Ｋｊｅｌｔｅｃ（商標）２３００分析器により確定した。サイレージの酸性は、Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＨＩ２２１０  ｐＨメーターを使用して決定した。
【０１０４】
【表１０】
2020534856.tif 000011
【０１０５】
全てのサイレージの乾燥物の含有量は、≦１８％で残存した（表１１）。しかし、トーモロコシ種「Dorka」からのサイレージ及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０又は、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１で処理されたサイレージは良好な発酵特性を示した（表１１）。全てのサイレージで、乳酸が大部分を占めた。Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０で処理したサイレージは、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１で作られたサイレージ及びコントロールと比較して、高い酢酸濃度及び、１，２−プロパンジオール濃度を有した。エタノール含有量は、全てのサイレージにおいて低かった（４．１〜８．６ｇ／ｋｇの範囲）。
【０１０６】
【表１１】
2020534856.tif 000012
【０１０７】
サイロ貯蔵材料の発酵品質および、トーモロコシサイレージの微生物指標を表１１に示す。サイロ貯蔵材料中の真菌の量は比較的高く、クロストリジウム属（chostridia）及び酵母は、検出レベルよりも低かった。Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０又は、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株で処理したサイレージサンプルは、非常に高い濃度の乳酸菌（＞８．０ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｇサイレージ）を含み、そして、加えた菌株は内在する乳酸菌よりも多数を占めた。未処理のコントロールサイレージ中の乳酸菌の量は、４．５６ｌｏｇ10ＣＦＵ／ｇサイレージであった。
【０１０８】
【表１２】
2020534856.tif 000013
【０１０９】
好気性下安定性テストにおいて、未処理サイレージの５回複製の中４回は温度上昇した。コントロールサイレージの平均好気性下安定性は、１４９時間（つまり、６．２日）になった。Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１で処理したサイレージは、テストの終了まで（つまり、２１７時間（つまり、９．０４日））、好気的に安定であった。このように、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１株で新鮮な材料を処理することにより、サイレージの好気性下安定性を、２．８４日増加させた。
【０１１０】
結論として、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１は、発酵が困難な新鮮な材料から作られたサイレージにおいて、驚くべきことに、非常に強い成長を示した。Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ ２０３  ＤＳＭ３２６５０及び、Ｌ．ブフネリ  ＢｉｏＣＣ  ２２８  ＤＳＭ３２６５１の使用は、低い乾燥物（≦２０％）のサイロ貯蔵材料から作られたサイレージの乳酸及び酢酸含有量を増加させ、微生物及び酵母の活性を阻害し、それにより、加熱からサイレージを防止し、それにより、サイロを開けるに際のサイレージの好気性下安定性の向上を確保し、そして、したがって、サイレージの保存期間を長くさせる。
【国際調査報告】
2020534856.tif 000014
2020534856.tif 000015
2020534856.tif 000016