(57)【要約】  本発明は、界面活性剤を含む、酵素的合成反応のための水性反応混合物を対象とする。反応混合物中の界面活性剤は、酵素反応の安定性および収率を増加させる。さらに、前記水性反応混合物を使用して酵素反応を実行するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、前記酵素の基質および界面活性剤を含む水性反応混合物であって、前記界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化１】
2020515237.tif 000032
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化２】
2020515237.tif 000033
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化３】
2020515237.tif 000034
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される、水性反応混合物。
【請求項２】
Ｒ１が、共有結合または連結基を介してコア構造の酸素原子に付着しており、かつ末端Ｃ１〜４−アルキル基を任意選択で含む、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基である、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
前記連結基が、前記コア構造および前記ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基へのエステル連結を形成するジカルボン酸である、請求項２に記載の反応混合物。
【請求項４】
前記連結基が、２〜２０個の炭素原子を有するジカルボン酸、例えば、コハク酸またはセバシン酸である、請求項３に記載の反応混合物。
【請求項５】
前記末端Ｃ１〜４−アルキル基が、メチルである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６】
前記ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基が、ポリ（エチレングリコール）基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７】
前記ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基が、約２５０〜２５００ｇ／ｍｏｌ、特に、約５００〜１５００ｇ／ｍｏｌ、例えば、約５５０ｇ／ｍｏｌ、約７５０ｇ／ｍｏｌまたは約１０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項８】
Ｒ５が、メチルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項９】
Ｒ４が、メチルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１０】
Ｒ２およびＲ３が、独立に、水素またはメチルである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１１】
（ｉ）前記界面活性剤が、式（Ｉ）を有し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、全てメチルであるか；または
（ｉｉ）前記界面活性剤が、式（ＩＩ）を有し、Ｒ４およびＲ５が、メチルであるか；または
（ｉｉｉ）前記界面活性剤が、式（ＩＩＩ）を有し、Ｒ２が、水素であり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、メチルである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１２】
Ｒ６が、分岐状または直鎖状、特に、分岐状である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１３】
（ｉ）前記界面活性剤が、式（Ｉ）を有し、Ｒ６が、Ｃ８〜２５−アルキルもしくはＣ８〜２５−アルケニル、特に、Ｃ１４〜１８−アルキルもしくはＣ１４〜１８−アルケニルであるか；または
（ｉｉ）前記界面活性剤が、式（ＩＩ）を有し、Ｒ６が、Ｃ５〜２０−アルキルもしくはＣ５〜２０−アルケニル、特に、Ｃ８〜１２−アルキルもしくはＣ８〜１２−アルケニルであるか；または
（ｉｉｉ）前記界面活性剤が、式（ＩＩＩ）を有し、Ｒ６が、Ｃ３０〜８０−アルキルもしくはＣ３０〜８０−アルケニル、特に、Ｃ４５〜５５−アルキルもしくはＣ４５〜５５−アルケニルである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１４】
（ｉ）前記界面活性剤が、式（Ｉ）を有し、Ｒ６が、Ｃ１６−アルキルもしくはＣ１６−アルケニル、特に、４，８，１２−トリメチルトリデシルもしくは４，８，１２−トリメチル−３，７，１１−トリデカトリエニルであり、
（ｉｉ）前記界面活性剤が、式（ＩＩ）を有し、Ｒ６が、Ｃ１０−アルキル、特に、５−エチル−６−メチルヘプタン−２−イルであるか；または
（ｉｉｉ）前記界面活性剤が、式（ＩＩＩ）を有し、Ｒ６が、Ｃ５０−アルケニル、特に、３，７，１１，１５，１９，２３，２７，３１，３５，３９−デカメチルテトラコンタ−２，６，１０，１４，１８，２２，２６，３０，３４，３８−デカエニルである、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、式（Ｉ）を有し、特に、ビタミンＥに由来する化合物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１６】
前記界面活性剤が、Ｄ−α−トコフェロールポリ（エチレングリコール）スクシネート、特に、ＴＰＧＳ−７５０−Ｍ、ＴＰＧＳ−１０００、ＰＴＳ（ＰＥＧ−６００／セバシン酸のアルファ−トコフェロールをベースとするジエステル）である、請求項１５に記載の反応混合物。
【請求項１７】
前記界面活性剤が、式（ＩＩ）を有し、特に、ユビキノールに由来する化合物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１８】
前記界面活性剤が、ポリエチレングリコールユビキノールスクシネート（ＰＱＳ）、特に、ｍＰＥＧ、例えば、ｍＰＥＧ２０００を含むＰＱＳである、請求項１７に記載の反応混合物。
【請求項１９】
前記界面活性剤が、式（ＩＩ）を有し、特に、β−シトステロールに由来する化合物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２０】
前記界面活性剤が、β−シトステロールメトキシエチレングリコールスクシネート（Ｎｏｋ）、特に、ｍＰＥＧ、例えば、ｍＰＥＧ５５０を含むＮｏｋである、請求項１９に記載の反応混合物。
【請求項２１】
前記酵素が、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、およびエステラーゼからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２２】
前記酵素が、ケトレダクターゼ、エンレダクターゼ、トランスアミナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２３】
酵素反応を実行するのに必要とされる補酵素または補因子をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２４】
前記補酵素または補因子が、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤおよびピリドキサールモノリン酸エステルからなる群から選択される、請求項２３に記載の反応混合物。
【請求項２５】
前記酵素が、ケトレダクターゼであり、前記基質が、ケトンであり、前記補因子が、ＮＡＤＰである、請求項２３に記載の反応混合物。
【請求項２６】
前記酵素が、エンレダクターゼであり、前記基質が、炭素−炭素二重結合を含む化合物であり、前記補因子が、ＮＡＤである、請求項２３に記載の反応混合物。
【請求項２７】
前記酵素が、トランスアミナーゼであり、前記基質が、ケトンであり、前記補因子が、ピリドキサールモノリン酸エステルである、請求項２３に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記反応混合物中の前記界面活性剤の濃度が、その臨界ミセル濃度超である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項２９】
前記反応混合物中の前記界面活性剤の濃度が、少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）、特に、少なくとも０．０２％（ｗ／ｗ）、特に、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）または少なくとも１％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記反応混合物中の前記界面活性剤の濃度が、０．１％〜１０％（ｗ／ｗ）、特に、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）、特に、０．７５％〜３％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約２％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記酵素が、前記基質の量の０．１％〜５０％、特に、０．５％〜３５％、特に、１％〜２０％の範囲の量で存在する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３２】
緩衝液をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３３】
前記緩衝液が、ＴＲＩＳ、リン酸、クエン酸、酢酸およびアンモニアからなる群から選択される、請求項３２に記載の反応混合物。
【請求項３４】
前記酵素反応に適したｐＨ値を有する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３５】
前記ｐＨ値が、４．０〜１０．０、特に、６．０〜８．０、特に、６．５〜７．５の範囲、例えば、約７．０である、請求項３４に記載の反応混合物。
【請求項３６】
工業規模のものである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３７】
前記反応混合物の容量が、少なくとも１０ｌ、好ましくは、少なくとも１００ｌまたは少なくとも１０００ｌである、請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項３８】
酵素反応を実行する方法であって、
（ａ）請求項１〜３７のいずれか一項に記載の反応混合物を提供するステップと、
（ｂ）前記酵素反応が進行することを可能とするステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
前記反応が、８０℃もしくはそれ未満の温度にて実行される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記反応が、１０℃〜５０℃、特に、２０℃〜４５℃の範囲の温度にて実行される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記反応混合物中のｐＨが、前記反応の間に少なくとも１．０、特に、少なくとも２．０だけ変化する、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
酵素反応の収率を増加させるための界面活性剤の使用であって、前記界面活性剤を酵素および前記酵素の基質を含む水性混合物に加えることを含み、ここで、前記界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化４】
2020515237.tif 000035
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化５】
2020515237.tif 000036
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化６】
2020515237.tif 000037
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される、使用。
【請求項４３】
酵素反応の安定性を増加させるための界面活性剤の使用であって、前記界面活性剤を酵素および前記酵素の基質を含む水性混合物に加えることを含み、ここで、前記界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化７】
2020515237.tif 000038
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化８】
2020515237.tif 000039
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化９】
2020515237.tif 000040
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される、使用。
【請求項４４】
前記反応混合物が、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の反応混合物である、請求項４２または４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的合成反応のための改善された反応媒体を対象とする。反応媒体は、通常の界面活性剤と比較して化学反応の反応物および生成物の溶媒和を増進し、かつ酵素の活性を増加させる特定の界面活性剤を含む。特定の界面活性剤の使用は、改善された収率およびよりロバストな酵素反応をもたらす。したがって、本発明は、酵素および界面活性剤を含む反応混合物、ならびに前記反応混合物を使用して酵素反応を実行する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
次第に厳しくなる環境的制約を満足させる有機化学における新規な触媒による合成法は、製薬工業および化学工業にとって非常に需要がある。さらに、新規な触媒手順は、分子および生物医学研究の標的となりつつある新進のクラスの有機化合物を生成するために必要である。酵素によって触媒される化学転換は、伝統的な（非生物学的）有機合成に対する実行可能な代替手段として、およびある特定の面倒な合成の問題に対する好都合な解決方法として今や広範に認識されている。
【０００３】
酵素反応は一般に、水性媒体中で実行される。しかし、合成化学工業における多くの目的の基質および生成物は疎水性であり、部分的にのみ水溶性である。溶解性を改善するために、有機溶媒を反応混合物に加えることが多い。これらの有機溶媒は、他方、多くの酵素の安定性および実行のために有害である。さらに、いくつかの有機溶媒は、環境のために有害である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、疎水性基質および生成物の溶媒和を可能とするが、酵素反応の安定性および収率を妨げない酵素的合成反応のための反応媒体を提供することが当技術分野で必要とされている。
【０００５】
触媒反応体として酵素を使用した化学合成反応の実行は、特定の界面活性剤を反応混合物に加えることによって増加させることができるという知見に、本発明は基づいている。界面活性剤を酵素的合成反応において使用して、反応の反応物および生成物の溶媒和を増加し得る。しかし、これらの界面活性剤は、酵素の活性および安定性に悪影響を与える。ビタミンＥに由来する界面活性剤、例えば、ＴＰＧＳ−７５０−Ｍの使用は、通常の界面活性剤または共溶媒と比較して、酵素反応の実行を大いに増進することを本発明者らは今や見出した。またより低い温度にて反応の収率は増加し、反応は、好ましくない条件、例えば、低いｐＨ値でさえ行われる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様において、本発明は、酵素、酵素の基質および界面活性剤を含む水性反応混合物を提供し、ここで、界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化１】
2020515237.tif 000002
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化２】
2020515237.tif 000003
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化３】
2020515237.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、
（ａ）本発明の第１の態様による反応混合物を提供するステップと、
（ｂ）酵素反応が進行することを可能とするステップと
を含む、酵素反応を実行する方法を提供する。
【０００８】
第３の態様において、本発明は、界面活性剤を酵素および酵素の基質を含む水性混合物に加えることを含む、酵素反応の収率および／または安定性を増加させるための界面活性剤の使用を提供し、ここで、界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化４】
2020515237.tif 000005
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化５】
2020515237.tif 000006
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化６】
2020515237.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【０００９】
上記の態様は、合わせることができる。本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者には明らかであろう。しかし、本出願の好ましい実施形態を示す、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および具体例は、例示としてのみ示すことを理解すべきである。開示した本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正は、下記を読むことから当業者には容易に明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、第１の態様において、酵素、酵素の基質および界面活性剤を含む反応混合物を提供し、ここで、界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化７】
2020515237.tif 000008
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化８】
2020515237.tif 000009
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化９】
2020515237.tif 000010
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の技術は、反応を触媒するために酵素を使用する全ての化学反応に適している。これは特に、酵素反応を使用した有機化合物の合成のために使用することができる。本反応混合物中で使用するための適切な酵素は、例えば、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ（シンターゼ）、イソメラーゼおよびリガーゼ（シンテターゼ）を含む。オキシドレダクターゼは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝Ｃ結合の還元、Ｃ＝Ｏ基の還元的アミノ化、ならびにＣ−Ｈ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ−Ｎ、およびＣ−Ｏ結合の酸化を触媒し得る。トランスフェラーゼは、官能基、例えば、アミノ、アシル、ホスホリル、メチル、グリコシル、ニトロ、および硫黄含有基を１つの化合物から別の化合物に移すことができる。ヒドロラーゼは、エステル、アミド、ラクトン、ラクタム、エポキシド、ニトリル、および他の基の加水分解、ならびにこのような官能基を形成するそれぞれの逆反応を触媒することができる。シンターゼとまた称されるリアーゼは、二重結合、例えば、Ｃ＝Ｃ、Ｃ＝Ｎ、およびＣ＝Ｏへの小分子の添加を触媒し得る。イソメラーゼは、ラセミ化、エピマー化、および転位反応を含めて、異性体の転換（異性化）を触媒し得る。シンテターゼとまた称されるリガーゼは、エネルギー源としてＡＴＰを使用して、複合化合物（リアーゼと類似した）を形成し得る。特定の実施形態では、酵素は、ケトレダクターゼ、エンレダクターゼ、トランスアミナーゼ、デヒドロゲナーゼ、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアミノ酸デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、エステラーゼおよびフェニルアラニンアンモニアリアーゼからなる群から選択される。酵素の具体例は、ケトレダクターゼ、エンレダクターゼおよびアラニントランスアミナーゼを含む。
【００１２】
酵素は、反応を実行するのに適した濃度で、例えば、基質の量に対して約０．０１％〜約１００％の量で反応混合物中に存在する。特に、酵素は、基質の量に対して、約０．１％〜約７５％、約０．５％〜約５０％、約１％〜約４０％、約２％〜約３０％、約４％〜約２５％または約５％〜約２０％の量で存在し得る。「量」は、この点において、化合物の重量または化合物のモル量を指す。
【００１３】
特定の実施形態では、水性反応混合物は、補因子および／または補酵素をさらに含む。補因子／補酵素の存在およびタイプは、実行される酵素反応によって決まる。例示的な補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、およびピリドキサールモノリン酸エステルを含む。これらの補因子を使用して、酵素反応のためのプロトン、電子および／またはアミン基を提供し得る。ＮＡＤ、ＮＡＤＰおよびＦＡＤは、イオン（例えば、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋）またはプロトン化（例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）として水性反応混合物中に存在し得る。
【００１４】
補因子は、水性反応混合物中に化学量論量で存在し得る。特に、補因子のモル量は、基質のモル量と少なくとも同じ量であり得る。他の実施形態では、補因子の量は、基質の量より低く、特に、基質の量に対して約０．０１％〜約２０％、約０．０５％〜約１５％、約０．１％〜約１０％、約０．２５％〜約７．５％、または約０．５％〜約５％の範囲である。「量」は、この点において、化合物の重量または化合物のモル量を指す。これらの実施形態では、好ましくは、補因子は、必要に応じて、反応の間に再生される。例えば、反応混合物は、任意選択で補因子を再生させるそのそれぞれの基質と共に、さらなる酵素を含み得る。例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＰまたはＦＡＤが補因子として使用される場合、水性反応混合物は、デヒドロゲナーゼ、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼ、およびそれぞれの基質、例えば、アルコールまたはグルコースをさらに含み得る。
【００１５】
他の実施形態では、補因子は、目的の反応をまた触媒する酵素によって再生し得る。これらの実施形態では、この酵素の第２の基質は、水性反応混合物において、特に、目的の基質より有意に高い量で、例えば、目的の基質に関して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍のモル過剰で存在し得る。例えば、トランスアミナーゼ反応のために、水性反応混合物は、アミン化合物、例えば、補因子を再生するためのイソプロピルアミン、例えば、ピリドキサールモノリン酸エステルを含み得る。
【００１６】
特定の実施形態では、酵素は、ケトレダクターゼであり、基質は、ケトンであり、補因子は、ＮＡＤＰである。別の実施形態では、酵素は、エンレダクターゼであり、基質は、炭素−炭素二重結合を含む化合物であり、補因子は、ＮＡＤである。別の実施形態では、酵素は、トランスアミナーゼであり、基質は、ケトンであり、補因子は、ピリドキサールモノリン酸エステルである。
【００１７】
水性反応混合物中の界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化１０】
2020515237.tif 000011
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化１１】
2020515237.tif 000012
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化１２】
2020515237.tif 000013
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【００１８】
水性反応混合物中の界面活性剤は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）による任意の界面活性剤でよい。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、１０，０００ｇ／ｍｏｌもしくはそれ未満、特に、７，５００ｇ／ｍｏｌもしくはそれ未満、５，０００ｇ／ｍｏｌもしくはそれ未満、３，０００ｇ／ｍｏｌもしくはそれ未満、２，５００ｇ／ｍｏｌもしくはそれ未満、またはそれどころか２，０００ｇ／ｍｏｌもしくはそれ未満の分子量を有する。
【００１９】
特に、界面活性剤は、化学反応を妨げるべきではない。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。界面活性剤は一般に両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。親水性部分は、残基Ｒ１によって主に形成され、疎水性部分は、残基Ｒ６によって主に形成される。特定の実施形態では、界面活性剤は、界面活性剤−水の混合物中でミセルを形成することができる。
【００２０】
界面活性剤は、残基Ｒ１中にポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含む。このポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基は特に、ポリ（エチレングリコール）基またはポリ（プロピレングリコール）基、特に、ポリ（エチレングリコール）基である。ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基はまた、異なるポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基の混合物、例えば、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）の混合物からなり得る。Ｒ１は特に、ポリ（Ｃ２〜３−アルキレングリコール）基を含む。ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基、特に、ポリ（エチレングリコール）基は、約１００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、特に、約２００〜約５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、特に、約２５０〜２５００ｇ／ｍｏｌ、約４００〜約２，０００ｇ／ｍｏｌまたは約５００〜１５００ｇ／ｍｏｌの範囲、例えば、約５５０ｇ／ｍｏｌ、約７５０ｇ／ｍｏｌまたは約１０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有し得る。
【００２１】
残基Ｒ１のポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基は、共有結合または連結基を介してコア構造の酸素原子に付着し得る。連結基は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を酸素原子に付着させるのに適した任意の化学的リンカーでよい。特に、連結基は、コア構造およびポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基へのエステル連結を形成するジカルボン酸であり得る。例示的な連結基は、２〜２０個の炭素原子を有するジカルボン酸、例えば、コハク酸、セバシン酸、マロン酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸およびフマル酸を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基の端部に付着している末端基をさらに含む。この末端基は特に、エーテル、エステルまたはアミド連結を介してポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基に付着している。末端基は特に、Ｃ１〜１６アルキルまたはアルケニル基、特に、Ｃ１〜８アルキル基、例えば、Ｃ１〜４アルキル基である。ある特定の実施形態では、末端基は、エーテル連結を介してポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基に付着しているメチル基である。
【００２３】
特定の実施形態では、Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基、本明細書に記載のような連結基および末端基からなる。
【００２４】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、特に、水素、メチルまたはエチル、特に、水素またはメチル。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は、メチルである。さらなる実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素またはメチルである。特定の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は、メチルであり、Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素またはメチルである。界面活性剤が式（Ｉ）を有するある特定の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、全てメチルである。界面活性剤が式（ＩＩ）を有するある特定の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は、全てメチルである。界面活性剤が式（ＩＩＩ）を有するある特定の実施形態では、Ｒ２は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、メチルである。
【００２５】
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである。Ｒ６は、直鎖状または分岐状であり得、芳香族基を含めた環式基を含有し得る。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、環式基または芳香族基を含有しない。特に、Ｒ６は、分岐状である。
【００２６】
界面活性剤が式（Ｉ）を有する実施形態では、Ｒ６は、Ｃ５〜３０−アルキルまたはＣ５〜３０−アルケニル、特に、Ｃ８〜２５−アルキルまたはＣ８〜２５−アルケニル、特に、Ｃ１０〜２０−アルキルまたはＣ１０〜２０−アルケニル、好ましくは、Ｃ１４〜１８−アルキルまたはＣ１４〜１８−アルケニルであり得る。アルケニル基は、１個もしくは複数の炭素−炭素二重結合、特に、１個、２個、３個、４個または５個の二重結合、例えば、２個または３個、特に、３個を含み得る。特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｃ１６−アルキルまたはＣ１６−アルケニル、特に、４，８，１２−トリメチルトリデシルまたは４，８，１２−トリメチル−３，７，１１−トリデカトリエニルである。ある特定の実施形態では、炭素原子を担持するＲ５およびＲ６は、Ｒ配座である。
【００２７】
界面活性剤が式（ＩＩ）を有する実施形態では、Ｒ６は、Ｃ５〜２０−アルキルまたはＣ５〜２０−アルケニル、特に、Ｃ６〜１８−アルキルまたはＣ６〜１８−アルケニル、特に、Ｃ７〜１５−アルキルまたはＣ７〜１５−アルケニル、好ましくは、Ｃ８〜１２−アルキルまたはＣ８〜１２−アルケニルであり得る。特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｃ１０−アルキル、特に、５−エチル−６−メチルヘプタン−２−イルである。
【００２８】
界面活性剤が式（ＩＩＩ）を有する実施形態では、Ｒ６は、Ｃ３０〜８０−アルキルまたはＣ３０〜８０−アルケニル、特に、Ｃ３５〜７０−アルキルまたはＣ３５〜７０−アルケニル、特に、Ｃ４０〜６０−アルキルまたはＣ４０〜６０−アルケニル、好ましくは、Ｃ４５〜５５−アルキルまたはＣ４５〜５５−アルケニルであり得る。アルケニル基は、１個もしくは複数の炭素−炭素二重結合、特に、５個、８個または１０個の二重結合、特に、１０個を含み得る。特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｃ５０−アルケニル、特に、３，７，１１，１５，１９，２３，２７，３１，３５，３９−デカメチルテトラコンタ−２，６，１０，１４，１８，２２，２６，３０，３４，３８−デカエニルである。
【００２９】
界面活性剤が式（Ｉ）を有する実施形態では、界面活性剤は特に、ビタミンＥ、特に、トコフェロール、特に、α−トコフェロールに由来する。界面活性剤のある特定の例は、トコフェロールポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、特に、ＤＬ−α−トコフェロールポリエチレングリコールスクシネート、例えば、ＴＰＧＳ−７５０−Ｍ、ＴＰＧＳ−１０００、ＴＰＧＳ−１５００、ＴＰＧＳ−４００、ＴＰＧＳ−１１００−Ｍ、ＴＰＧＳ−２０００、ＴＰＧＳ−８６０−オレエート、ＴＰＧＳ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−１１００およびＴＰＧＳ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−７０−ブチル、およびＤＬ−α−トコフェロールポリプロピレングリコールスクシネート、例えば、ＴＰＰＧ−１０００およびＴＰＰＧ−１０００−ブチル；およびセバシン酸のポリエチレングリコールα−トコフェロールジエステル（ＰＴＳ）、例えば、ＰＴＳ−６００を含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、ＴＰＧＳ−７５０−Ｍ、ＴＰＧＳ−１０００およびＰＴＳからなる群、特に、ＴＰＧＳ−７５０−Ｍから選択される。
【００３０】
界面活性剤が式（ＩＩ）を有する実施形態では、界面活性剤は特に、ユビキノールに由来する。界面活性剤のある特定の例は、ポリエチレングリコールユビキノールスクシネート（ＰＱＳ）、特に、ｍＰＥＧ、例えば、ｍＰＥＧ２０００を含むＰＱＳを含む。
【００３１】
界面活性剤が式（ＩＩＩ）を有する実施形態では、界面活性剤は特に、シトステロール、特に、β−シトステロールに由来する。界面活性剤のある特定の例は、β−シトステロールメトキシエチレングリコールスクシネート（Ｎｏｋ）、特に、ｍＰＥＧ、例えば、ｍＰＥＧ５５０を含むＮｏｋを含む。
【００３２】
水性反応混合物中の界面活性剤の濃度は特に、少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）、特に、少なくとも０．０２％（ｗ／ｗ）、特に、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）または少なくとも１％（ｗ／ｗ）である。特定の実施形態では、水性反応混合物中の界面活性剤の濃度は、０．０１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲、特に、０．０２〜１５％（ｗ／ｗ）の範囲、０．１〜１０％（ｗ／ｗ）、０．２〜７．５％（ｗ／ｗ）または０．５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲、特に、０．７５〜３％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約１％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）または約２％（ｗ／ｗ）である。特定の実施形態では、界面活性剤−水の混合物中の界面活性剤の濃度は、その臨界ミセル濃度超である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、水性反応混合物は、緩衝液をさらに含む。緩衝液は特に、反応混合物のｐＨを中性ｐＨまたは概ね中性ｐＨに保持するのに適しているべきである。特に、緩衝液は、ＴＲＩＳ、リン酸、クエン酸、酢酸およびアンモニアからなる群から選択される。水性反応混合物は好ましくは、酵素が活性および安定であり、かつ／または酵素反応に適している、ｐＨを有する。ある特定の実施形態では、ｐＨ値は、４．０〜１０．０、特に、６．０〜８．０、特に、６．５〜７．５の範囲、例えば、約７．０である。
【００３４】
反応混合物中の基質は、酵素反応を実行するのに適した任意の基質であり得る。基質は特に、反応混合物中で実行される酵素反応のタイプによって決まる。反応混合物はまた、複数の基質、例えば、２つの基質または３つの基質を含み得る。特定の実施形態では、酵素反応の基質および／または生成物は、水混和性ではないか、または部分的にのみ水混和性である。特に、部分的にのみ水混和性である化合物は、２０ｇ／ｌもしくはそれ未満、特に、１０ｇ／ｌもしくはそれ未満、または５ｇ／ｌもしくはそれ未満の濃度でのみ室温にて、水と混和性である。基質は、化学反応を実行するのに実現可能な任意の濃度で使用することができる。特に、基質は、高濃度で使用される。例えば、反応混合物中の基質の濃度は、少なくとも０．１Ｍ、特に、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．１Ｍ、少なくとも１．２Ｍ、少なくとも１．３Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも１．７Ｍ、または少なくとも２．０Ｍである。当業者は、適切な基質およびそれらの濃度を選択することができる。
【００３５】
ある特定の実施形態では、水性反応混合物は、共溶媒をさらに含み得る。共溶媒は特に、有機溶媒またはさらなる界面活性剤またはこれらの混合物であり得る。
【００３６】
有機溶媒は、任意の有機溶媒であり得る。好ましくは、これは、酵素反応を妨害または阻害すべきでない。ある特定の実施形態では、有機溶媒は、水混和性であるか、または部分的に水混和性である。有機溶媒は特に、非プロトン性有機溶媒である。有機溶媒の適切な例は、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびその誘導体、例えば、メチルテトラヒドロフラン、ピリジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、特に、約１００ｇ／ｍｏｌ〜約２０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００およびＰＥＧ２０００、その誘導体、例えば、モノもしくはジアルキルＰＥＧ、特に、モノもしくはジメチルＰＥＧ、モノもしくはジエチルＰＥＧおよびモノもしくはジプロピルＰＥＧを含む。さらなる例は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、トルエン、およびアルコール、例えば、Ｃ１〜１０脂肪族アルコール、特に、２−ブチルアルコールを含む。ある特定の実施形態では、反応混合物中の有機溶媒の量は、０．１％〜５０％（ｖ／ｖ）、特に、１％〜４０％（ｖ／ｖ）、２％〜３０％（ｖ／ｖ）、４％〜２５％（ｖ／ｖ）または５％〜２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。
【００３７】
さらなる界面活性剤は、任意の界面活性剤であり得る。好ましくは、これは、酵素反応を妨害または阻害すべきでない。ある特定の実施形態では、界面活性剤の親水性部分は、ポリアルキレングリコール部分、特に、ポリエチレングリコール部分またはポリプロピレングリコール部分を含む。ポリアルキレン部分、特に、ポリエチレングリコール部分は、約１００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の、特に、約３００〜約３，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の、特に、約４００〜約２，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有し得る。ポリアルキレングリコール部分を含むさらなる界面活性剤のある特定の例は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；ポリエチレングリコールアルキルエーテル、例えば、Ｂｒｉｊ界面活性剤、特に、Ｂｒｉｊ３０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５２、Ｂｒｉｊ５６、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７２、Ｂｒｉｊ７６、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９２、Ｂｒｉｊ９６、Ｂｒｉｊ９８、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ａ６、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ａ２５およびＴｈｅｓｉｔ；ポリエチレングリコールエステル、例えば、ポリエチレングリコール（１５）−ヒドロキシステアレート（Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ１５）；ポリソルベートまたはＴｗｅｅｎとしてまた公知のポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５およびポリソルベート１２０；コレステリルＰＥＧスクシネート、例えば、コレステリルＰＥＧ１０００スクシネート；（デオキシ）コール酸ＰＥＧ、例えば、コール酸ＰＥＧ１０００およびデオキシコール酸ＰＥＧ１０００；クロマノールポリエチレングリコールスクシネート、例えば、Ｃｈｒｏｍ−４００およびＣｈｒｏｍ−１０００；ならびにＰＥＧの他の誘導体、例えば、Ｃ４−アゾ−ＰＥＧ；臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）；相間移動界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム；ならびにオクタン酸および他の長いアルキル鎖酸、特に、Ｃ６〜２０アルキル鎖酸を含む。水性反応混合物中のさらなる界面活性剤の濃度は特に、０．１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、さらなる界面活性剤の濃度は、０．５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲、特に、０．８〜４％（ｗ／ｗ）、１〜３％（ｗ／ｗ）または１．５〜２．５％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約２％（ｗ／ｗ）である。
【００３８】
本技術は、例えば、非常に大きなスケールまたは非常に小さなスケールで、反応混合物中の高い基質濃度が望ましい用途のために特に有用である。一実施形態では、反応混合物は、工業規模のものである。これは、例えば、少なくとも１ｌ、特に、少なくとも１０ｌ、少なくとも１００ｌ、または少なくとも１０００ｌの容量を有し得る。別の実施形態では、反応混合物は、マイクロスケールのものである。これは、例えば、１０ｍｌもしくはそれ未満、特に、１ｍｌもしくはそれ未満、１００μｌもしくはそれ未満、１０μｌもしくはそれ未満、または１μｌもしくはそれ未満の容量を有し得る。
【００３９】
反応混合物は、化学反応を実行するためのチャージまたはバッチ混合物である。ある特定の実施形態では、反応混合物は、酵素反応の任意の生成物を含まないか、または酵素反応の残留量のみの任意の生成物を含む。他の実施形態では、これはまた、酵素反応のかなりの量の生成物を含有し得る。
【００４０】
第２の態様において、本発明は、
（ａ）本明細書に記載のような水性反応混合物を提供するステップと、
（ｂ）酵素反応が進行することを可能とするステップと
を含む、酵素反応を実行する方法を提供する。
【００４１】
反応混合物は特に、酵素、酵素の基質および界面活性剤を含み、ここで、界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化１３】
2020515237.tif 000014
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化１４】
2020515237.tif 000015
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化１５】
2020515237.tif 000016
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【００４２】
水性反応混合物は特に、これらの組合せを含めた、本明細書に記載されているフィーチャ、実施形態および実施例のいずれかを示し得る。
【００４３】
酵素反応は、反応を触媒するための酵素を使用して実行することができる任意の化学反応であり得る。特に、有機化学合成反応は、例えば、少なくとも部分的に疎水性の化合物と共に実行することができる。例示的な化学反応は、還元反応、酸化反応、アミノ化反応、ニトロソ化反応、加水分解反応、エステル化反応およびアミド化反応、例えば、アシル化を含む。水性反応混合物中の酵素および基質は、特定の化学反応に適している。特に、酵素および基質は、酵素反応が所望の通り進行するように、特に選択される。適切な酵素および基質は、本明細書に記載されている。
【００４４】
ある特定の実施形態では、酵素反応は、ステップ（ｂ）において酵素反応を実行するのに適した反応条件で進行することができる。特に、反応条件は、８０℃もしくはそれ未満、特に、６０℃もしくはそれ未満、４５℃もしくはそれ未満、または４０℃もしくはそれ未満の温度を含む。特に、酵素反応は、１０℃〜５０℃、特に、２０℃〜４５℃または２５℃〜４０℃の範囲の温度で実行される。例えば、酵素反応は、約３７℃にて、約３０℃にて、または概ね室温にて進行することが可能となり得る。特定の実施形態では、反応混合物は、酵素反応の過程においてかき混ぜられ、特に、撹拌される。
【００４５】
さらに、反応条件は特に、４．０〜１０．０、特に、５．０〜９．５、５．５〜９．０、６．０〜８．５または６．５〜８．０の範囲のｐＨ値を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨは、所望のｐＨ値の、特に、＋／−１．０ｐＨ単位の範囲内、特に、＋／−０．５ｐＨ単位内に、酵素反応の間に一定に保持される。しかし、他の実施形態では、ｐＨ値は、１．０ｐＨ単位超、特に、１．５ｐＨ単位超またはそれどころか２．０ｐＨ単位超だけ変化することができる。本明細書に記載のような水性反応混合物は酵素を安定化させることができ、その結果、ｐＨにおける変動は酵素反応に有意に影響を与えない。
【００４６】
酵素反応を実行する方法は、酵素反応の生成物を単離するさらなるステップを含み得る。特に、このステップは、酵素反応の完了の後に実行される。生成物は特に、水性反応混合物の他の構成要素の１つもしくは複数、特に、本質的に全てから分離される。例えば、生成物は、残存する基質、副生成物、酵素、界面活性剤、補酵素、補因子および／または有機溶媒から分離される。生成物の単離は、例えば、溶媒の蒸発、凝集または結晶化および濾過、相分離、クロマトグラフィー分離などを含めた当技術分野で公知の手段および技術によって達成し得る。
【００４７】
本発明は、水性反応混合物中の基質および生成物の溶解性を改善させ、酵素の安定性を増進させる。それによって、酵素反応の収率は増加し、酵素反応によって得られる望まれない副生成物の量は低減する。これを考慮して、本発明は、さらなる態様では、界面活性剤を酵素および酵素の基質を含む水性混合物に加えることを含む、酵素反応の収率を増加させるための界面活性剤の使用を提供し、ここで、界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化１６】
2020515237.tif 000017
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化１７】
2020515237.tif 000018
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化１８】
2020515237.tif 000019
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、界面活性剤を酵素および酵素の基質を含む水性混合物に加えることを含む、酵素反応の安定性を増加させるための界面活性剤の使用を提供し、ここで、界面活性剤は、
（ｉ）下記の式Ｉを有する界面活性剤：
【化１９】
2020515237.tif 000020
（ｉｉ）下記の式ＩＩを有する界面活性剤：
【化２０】
2020515237.tif 000021
および
（ｉｉｉ）下記の式ＩＩＩを有する界面活性剤：
【化２１】
2020515237.tif 000022
（式中、
Ｒ１は、ポリ（Ｃ１〜４−アルキレングリコール）基を含み、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素またはＣ１〜４−アルキルであり、
Ｒ６は、Ｃ５〜８０−アルキルまたはＣ５〜８０−アルケニルである）
からなる群から選択される。
【００４９】
酵素反応の増加した安定性は特に、反応混合物中の酵素の増加した安定性を含む。
【００５０】
酵素反応を実行する方法および水性反応混合物についての、これらの組合せを含めた、本明細書に記載されている実施形態、フィーチャおよび実施例は同様に、酵素反応の収率および／または安定性を増加させるための界面活性剤の使用に適用される。
【００５１】
表現「含む」はまた、本明細書において使用する場合、その文字どおりの意味に加えて、表現「から本質的になる」および「からなる」を含み、特に指す。このように、表現「含む」は、特に列挙した要素を「含む」主題が、さらなる要素を包含し得、かつ／または実際に包含する実施形態、ならびに特に列挙した要素を「含む」主題が、さらなる要素を含まない実施形態を指す。同様に、表現「有する」は、また、表現「から本質的になる」および「からなる」を含み、かつこれらを特に指す、表現「含む」であると理解される。
【００５２】
本明細書に記載されている数値範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書において提供する見出しは、明細書を全体として参照することにより読むことができる本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。一実施形態によれば、方法の場合は、ある特定のステップを含むと本明細書に記載されている主題は、または組成物の場合は、ある特定の成分を含むと本明細書に記載されている主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載されている特定の態様および実施形態を選択し、合わせることが好ましく、特定の実施形態のそれぞれの組合せから生じる特定の主題はまた、本開示に属する。
【００５３】
図の説明
図１は、異なる反応媒体中の反応動態の比較を示す。反応条件：各バイアル中に、列挙したような共溶媒系中の２０ｍｇのケトン１、５ｍｇのＫＲＥＤ−ＥＷ１２４、５ｍｇのＧＤＨ、２ｍｇのＮＡＤＰ、２５ｍｇのグルコース、２ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。ｐＨ＝７、温度＝３０℃。反応混合物のＨＰＬＣ分析は、指定の時間に行った。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ケトレダクターゼを使用したベンジル（Ｒ）−４−ヒドロキシ−２−（４−（メトキシカルボニル）フェニル）ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
界面活性剤は、有益な効果を伴う酵素活性をモジュレートし、例えば、反応物の溶解性を増加させ、反応選択性を増進することにおいて、生体触媒作用において適用されてきた。イオン性液体、ＳＤＳおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘを含めたいくつかの界面活性剤は広範囲の生体内変化において利用されてきたが、Ｌｉｐｓｈｕｔｚ研究室において開発された代替の界面活性剤としてのＴＰＧＳ−７５０−Ｍは、生体触媒作用において調査されてこなかった。スキーム１において示すようなケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）によって媒介される反応の調査の間に、出発ケトン１および生成物アルコール２の両方の難溶解性は、この不均一反応のための適切な反応媒体を探索するためにかなりの努力を必要とした。
【化２２】
2020515237.tif 000023
【００５５】
最初に、水溶液中のＴＰＧＳ、ＰＥＧ４００およびＤＭＳＯを含めたいくつかの共溶媒系を、上記の反応のための平行スクリーニング条件下で用いた。図１において示すように、２．５時間以内の反応の第１相の間に、ＴＰＧＳは、１０％の変換差異を伴ってＰＥＧ４００およびＤＭＳＯより良好に実行した。反応がさらに進行すると、反応は、ＴＰＧＳ中で有意により速く、６時間以内のＰＥＧ４００およびＤＭＳＯ中の反応と比較して、概ね４０％の変換差異が観察された。２２時間後、反応はＴＰＧＳ（１００％）中で本質的に完全な変換となり、一方、ＰＥＧ４００およびＤＭＳＯ中の反応は、それぞれ、８２％および８６％の変換で停止した。この現象は、ＰＥＧ４００およびＤＭＳＯ系の両方の有機溶媒添加物中のケトレダクターゼのより低い安定性を反映した。
【００５６】
スクリーニング結果を考慮して、本発明者らは、グラムスケールで反応をさらに最適化した。特に、本発明者らは、ＴＰＧＳおよびＤＭＳＯ系の実行を比較した。このように、反応を、４０℃にて５ｗ％の酵素添加量を使用して、それぞれ、２％ＴＰＧＳおよび１５％ＤＭＳＯ水溶液中で行った。反応は、ＴＰＧＳ系中で１８時間後に９３％の変換に達し、一方、ＤＭＳＯ系中で２０時間後により低い８０％の変換であった。より重要なことに、反応は続き、ＴＰＧＳ中でさらに２５時間後に９８．８％の変換に達した。しかし、反応をＤＭＳＯ中の９８．６％の変換までに推進するために、さらなる２重量％の酵素を加えなければならない（エントリー１、表１）。この観察は、ＤＭＳＯと比較して、ＴＰＧＳ中で酵素のより活性での安定な性質を明らかに示した。別の興味深い観察は、ｐＨ４．７下でのＴＰＧＳの反応系中の２４時間の酵素の偶発的な曝露、および７へのｐＨの再調節の後で、酵素が、さらに同じ活性を伴って反応を触媒するのに十分にまだ活性であることであった（エントリー２、表１）。優れた安定性は、ＴＰＧＳおよびタンパク質の間の分子間相互作用によって可能となり、酵素の触媒活性部位は、水性反応媒体から保護される。
【００５７】
【表１】
2020515237.tif 000024
【００５８】
最後に、ＴＰＧＳ中の反応は、スケールアップにより適しており、化合物１は、溶液の事前形成、または粒径を低減させるための粉砕を伴わずに、固体形態で加えることができる。典型的な実験手順は、以下の通りである。緩衝水中のＴＰＧＳ−７５０−Ｍの脱気した２重量％溶液（３４ｍＬ、１０ｖ；７４ｍＬの２重量％のＴＰＧＳ−７５０−Ｍ水溶液、１．６ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏおよび０．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏから調製したストック溶液）に、ｐＨ／ＯＲＰコントローラーを備えた機械的撹拌反応器において室温にてグルコース（３．２ｇ、１８ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。懸濁液を室温にて２０分間撹拌し、このように得られた混合物に、ＮＡＤＰ（５９ｍｇ、６８％純度）、ＧＤＨ（３３ｍｇ）およびケトレダクターゼ（０．１６ｇ、５重量％の基質１）を逐次的に加えた。次いで、基質１（３．３ｇ、９ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応混合物のｐＨを、１ＭのＮａＯＨ水溶液を室温にて加えることによって６．８〜７．２に調節した。このように得られた反応混合物を４０℃に加熱し、ＨＰＬＣによって決定するように反応の完了まで４０℃にて４３時間撹拌した。反応が進行すると、生成物２は反応混合物から沈殿し、懸濁液を形成した。このように得られた懸濁液を４０℃にて濾過し、このように得られた湿ったケークを水で洗浄し、乾燥させ、生成物２をオフホワイト色の固体（２．８ｇ、純度９７％、収率８５％）として得た。
【化２３】
2020515237.tif 000025
【００５９】
結論として、優れた反応動態およびプロセスのロバストネスを含めた、ケトレダクターゼによって媒介される生体内変化における添加物としてのＴＰＧＳの有益な効果が示された。ＴＰＧＳ中の根底にある酵素安定性によって、広範囲の生体触媒による転換に適用されるとき、同様の利点が見出される。
【００６０】
実施例２
ケトレダクターゼを使用した（Ｒ）−５−フルオロ−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシエチル）−４Ｈ−クロメン−４−オンの合成
【化２４】
2020515237.tif 000026
反応混合物：
２０ｍｇの基質３
酵素ケトレダクターゼＫＲＥＤ−ＥＷ−１０９（量：表２を参照されたい）
２０ｍｇのＤ−グルコース
０．４ｍｇ（２％（ｍ／ｍ））のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
０．２ｍｇ（１％（ｍ／ｍ））のＮＡＤＰ
０．１ＭのＰＢＳ（量：表２を参照されたい）
０．１ＭのＰＢＳ中の２％ＴＰＧＳ−７５０−Ｍ（ｍ／ｍ）（量：表２を参照されたい）
ＤＭＳＯ（量：表２を参照されたい）
反応条件：ｐＨ７．０、３０℃
【００６１】
【表２】
2020515237.tif 000027
【００６２】
実施例３
ケトレダクターゼを使用した１−フェニルエタノールの合成
【化２５】
2020515237.tif 000028
反応混合物：
２０μｌのアセトフェノン
酵素ケトレダクターゼＫＲＥＤ−ＥＷ−１２４（量：表３を参照されたい）
２０ｍｇのＤ−グルコース
０．４ｍｇ（２％（ｍ／ｍ））のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
０．２ｍｇ（１％（ｍ／ｍ））のＮＡＤＰ
０．１ＭのＰＢＳ（量：表３を参照されたい）
０．１ＭのＰＢＳ中の２％ＴＰＧＳ−７５０−Ｍ（ｍ／ｍ）（量：表３を参照されたい）
ＤＭＳＯ（量：表３を参照されたい）
反応条件：ｐＨ７．０、３０℃
【００６３】
【表３】
2020515237.tif 000029
【００６４】
実施例４
エンレダクターゼを使用した（Ｓ）−３−（３−ブロモピリジン−４−イル）−５−メチルシクロヘキサン−１−オンの合成
【化２６】
2020515237.tif 000030
反応混合物：
２０μｌの基質５
酵素エンレダクターゼＥＮＥ０１２（量：表４を参照されたい）
２０ｍｇのＤ−グルコース
０．４ｍｇ（２％（ｍ／ｍ））のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
０．２ｍｇ（１％（ｍ／ｍ））のＮＡＤ
０．１ＭのＰＢＳ（量：表４を参照されたい）
０．１ＭのＰＢＳ中の２％ＴＰＧＳ−７５０−Ｍ（ｍ／ｍ）（量：表４を参照されたい）
トルエン（量：表４を参照されたい）
反応条件：ｐＨ７．０、３０℃
【００６５】
【表４】
2020515237.tif 000031
【国際調査報告】
2020515237.tif 000041
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