(57)【要約】  本明細書では、梅の花抽出物を有効成分として含む組成物であって、微塵によって発現量に影響を受ける皮膚細胞内遺伝子であるＩＬ−３６Ｇ（ＮＭ＿０１９６１８の発現量を正常レベルに調節する、微塵による皮膚損傷ケア用組成物が開示される。前記微塵による皮膚損傷ケア用組成物を用いることで、微塵によって変化する遺伝子発現量を正常レベルに戻して皮膚細胞の損傷をケアすることができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅の花抽出物を有効成分として含む、微塵による皮膚損傷ケア用組成物。
【請求項２】
前記梅の花抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ６の無水又は含水低級アルコール、アセトン、ブチレングリコール、エチルアセテート、ジエチルアセテート、ジエチルエーテル、ベンゼン、クロロホルム、及びヘキサンからなる群より選択されたいずれか一つ以上の抽出溶媒で抽出されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記梅の花抽出物は、組成物の総重量に対して０．０００００１〜３０重量％の範囲で含まれた、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
当該組成物は、ＩＬ−３６Ｇ（ＮＭ＿０１９６１８）の発現を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
当該組成物は、角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）に適用される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記微塵は、粒子の大きさが２．５μｍ以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記梅の花抽出物は、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
当該組成物は、化粧料組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
当該組成物は、薬学的組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
当該組成物は、健康機能食品組成物である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、微塵による皮膚細胞損傷をケアする組成物が開示される。より詳しくは、正常状態の皮膚細胞と比べ、微塵によって発現程度が変化する皮膚細胞遺伝子であるバイオマーカーなどを有意に変化させて皮膚細胞損傷をケアする、梅の花（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ  ｆｌｏｗｅｒ）抽出物を含む組成物が開示される。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外部環境に直接的に露出する身体部位であって、我々の身体の重要な器官を保護する保護膜の役割を果たすだけでなく、水分の蒸発を調節し、外部感染から身を保護する役割を果たす。しかしながら、いくら外部からのウイルスの侵入を防ぐ皮膚であっても、過度な紫外線や汚染物質などに露出すると、皮膚刺激を誘発するようになり、特に強い風や砂塵を伴う黄砂によって損傷を受けるようになる。
【０００３】
黄砂は、中国やモンゴルなどの内陸に位置した砂漠で小さな砂や黄土が上空に巻き上げられて上層風に乗って遠くまで運ばれ、地上に落下する現象である。我が国でも毎年春期になると黄砂が周期的に発生する。黄砂は有機物と無機物の複合体であって、発生時期や場所によって物理的特性や構成成分が非常に多様であり、生物学的に影響を与え得る金属成分も含んでいる。黄砂のようなサイズの大きい粒子は主に発源地や周辺に留まり、その中の粒子サイズの小さい細塵が我が国まで運ばれてきており、該細塵を吸い込むと、下部気管支及び肺のガス交換部分にまで沈着して呼吸器系に損傷を生じさせ得ると報告されたことがある。また、黄砂や細塵の多い地域に住む人々の皮膚では皮膚細胞の損傷が増大するのが観察されたことがある。
【０００４】
ＩＬ−３６Ｇは、微塵による皮膚細胞損傷などによって生じる乾癬などにおける有用なバイオマーカーであることが知られており、Ｓ１００  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａ７、Ａ８、及びＡ９のようなバイオマーカーとは異なり、ＩＬ−３６Ｇは、乾癬性炎症（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）に特異性を持っており、ＡＤ、ＣＥ、及びＬＰのような他の炎症性皮膚疾患ではその発現が弱いと知られている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kim、H.J. et al., “Transcriptome analysis of airborne PM2.5-induced detrimental effects on human keratinocytes”, Toxicology Letters 273, 26-35, 2017
【非特許文献２】AM D’Erme et al., “IL-36c(IL-1F9)Is a Biomarker for Psoriasis Skin Lesions”, Journal of Investigative Dermatology, Volume 135, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者等は、微塵が皮膚に有害な影響を及ぼし、かかる影響によって皮膚細胞遺伝子の発現にも影響を及ぼすことで皮膚細胞損傷などのような症状が発現するようになるということを見出した。
【０００７】
したがって、一側面において、本発明は、微塵による皮膚細胞の損傷ケア用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、一側面において、本発明は、梅の花抽出物を有効成分として含む組成物であって、微塵によって発現量に影響を受ける皮膚細胞内遺伝子であるＩＬ−３６Ｇ（ＮＭ＿０１９６１８）の発現量を正常レベルに調節する微塵による皮膚損傷ケア用組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
一側面において、本発明によって提供される微塵による皮膚損傷ケア用組成物を用いることで、微塵によって変化する遺伝子発現量を正常レベルで戻して皮膚細胞の損傷をケアすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】微塵抽出液の処理による細胞生存率を示した図であり、ここで、ＡＤＳＰはアジアダストストーム粒子（Ａｓｉａｎ  ｄｕｓｔ  ｓｔｏｒｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）であって黄砂を示し、ＰＭ１０（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  １０）は粒子の大きさが１０μｍである微塵を示し、ＰＭ２．５（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ２．５）は粒子の大きさが２．５μｍである微塵を示し、グラフｘ軸の値は微塵水溶性抽出液の濃度（μｇ／ｍｌ）であって、それぞれ０μｇ／ｍｌ、６．３μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び２００μｇ／ｍｌを示す。
【図２】ＰＭ２．５の微塵によって刺激された皮膚細胞内でＩＬ−３６Ｇ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が増加し、梅の花抽出物の処理によって正常レベルに戻ることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１２】
梅は、バラ科サクラ属の落葉高木であって、中国が原産地で日本や中国、韓国などに分布する。花を梅花と呼び、その実を梅の実と呼ぶ。梅の木は高さ５〜１０ｍでその樹皮は黄色を帯びた白色、緑色を帯びた白色、赤色などを呈しており、複数本の小さい枝には細かい毛が生えているものもあり、細かい毛がないものもある。韓国の中部地方では梅の花（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ  ｆｌｏｗｅｒ）が４月に葉より先に咲き、その色は淡い白色または赤色を帯び、香りを放つ。がく片は５枚であって丸い模様であり、花びらは複数枚で広いたまごを逆立ちしたような模様をしている。葉は互い違いに生え、たまご模様であるか広いたまご模様をしており、長さ４〜１０ｃｍである。その縁はギザギザとなっており両面に毛が生えており、葉の柄に線がある。梅の実は球状の核果であって、緑色から７月に直径２〜３ｃｍの大きさの黄色に熟し毛がびっしり生え、酸味が強く果肉から離れ難い。
【００１３】
使用用途や花色、花びらの模様に応じて種々の品種に分けられ、その使用用途によっては花梅と実梅に分類し、花梅は、さらに野生に近い品種である野梅系、野生種から変化した変種である赤色花の咲く緋梅系、そして杏との雑種である豊後系に分けられる。花びらの色にて分類すると、白色の花を咲かせる白梅と赤色の花を咲かせる紅梅に分けられ、白梅のうちでも、花びらは白色であるががくが緑色である白梅を緑鍔梅と分類する。花びらの模様によっては、花びらが５枚だけ咲くものを一重咲き梅、５枚の内部に花びらが重ねられて咲くものは八重咲き梅と分類する。
【００１４】
本発明の一側面において、前記微塵による皮膚損傷ケア用組成物は、梅の花抽出物を有効成分として含んでいてよい。
【００１５】
一側面において、前記梅の花は、乾燥及び粉砕されたものであってよい。
【００１６】
本発明の一側面において、前記梅の花を特定の抽出溶媒で抽出して梅の花抽出物を調製してよい。
【００１７】
本発明の一側面である、前記梅の花抽出物は、梅の花を水又は有機溶媒で抽出して調製されたものであってよい。具体的に、梅の花を水、Ｃ１〜Ｃ６の無水又は含水低級アルコール、アセトン、ブチレングリコール、エチルアセテート、ジエチルアセテート、ジエチルエーテル、ベンゼン、クロロホルム、及びヘキサンからなる群より選択されたいずれか一つ以上の抽出溶媒で抽出して調製されたものであってよい。
【００１８】
一側面において、前記梅の花抽出物は、常温抽出されたものであってよい。
【００１９】
一側面において、前記梅の花抽出物は、前記抽出溶媒で抽出されてから、ろ過、濃縮、分離、又は乾燥過程の一つ以上を更に経て得られたものであってよい。特に、前記梅の花抽出物は、１回以上のろ過過程を経たものであってよく、一実施例において、２回のろ過過程を経る。
【００２０】
一実施例において、前記分離過程は、遠心分離過程を含んでよい。
【００２１】
具体的に、前記抽出は、水、Ｃ１〜Ｃ６の無水又は含水低級アルコール、アセトン、及びブチレングリコールを含む極性溶媒、及びエチルアセテート、ジエチルアセテート、ジエチルエーテル、ベンゼン、クロロホルム、及びヘキサンを含む低極性溶媒のいずれか一つ以上を溶媒として用いることであってよい。
【００２２】
より具体的に、前記溶媒は、５０〜９０％のエタノール水溶液であってよく、６０〜８０％又は６５〜７５％のエタノール水溶液であってよい。前記溶媒が５０〜９０％のエタノール水溶液である場合、梅の花から有効成分を効果的に抽出することができる。一実施例において、前記溶媒は、約７０％のエタノール水溶液であってよい。
【００２３】
一側面において、前記抽出物は、抽出後、冷却コンデンサ付きの蒸留装置で適正の温度に減圧濃縮されてよい。
【００２４】
なお、本発明に係る梅の花抽出物は、当該技術分野における通常の方法で抽出して得てよく、前述した方法によって限定されるものではない。
【００２５】
本発明の一観点である、組成物において、当該組成物は、梅の花抽出物を、組成物の総重量を基準に０．０００００１〜３０重量％の範囲で含んでいてよい。該含量が０．０００００１〜３０重量％の範囲である場合、梅の花抽出物が優れた微塵による皮膚損傷ケア効果を示した。
【００２６】
具体的に、０．００００００１重量％以上、０．００００００５重量％以上、０．００００００７重量％以上、０．００００００９重量％以上、０．０００００１重量％以上、０．０００００２重量％以上、０．０００００４重量％以上、０．０００００６重量％以上、０．０００００８重量％以上、０．００００１重量％以上、０．００００３重量％以上、０．００００５重量％以上、０．００００７重量％以上、０．００００９重量％以上、０．０００１重量％以上、０．０００３重量％以上、０．０００５重量％以上、０．０００７重量％以上、０．０００９重量％以上、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０.１重量％以上、１重量％以上、３重量％以上、５重量％以上、７重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１３重量％以上、１５重量％以上、１７重量％以上、１９重量％以上、２１重量％以上、２３重量％以上、２５重量％以上、２７重量％以上、２９重量％以上、３０重量％以上、３１重量％以上であってよく、且つ３２重量％以下、３１重量％以下、３０重量％以下、２９重量％以下、２８重量％以下、２６重量％以下、２４重量％以下、２２重量％以下、２０重量％以下、１８重量％以下、１６重量％以下、１４重量％以下、１２重量％以下、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、６重量％以下、４重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、０.１重量％以下、０．０９重量％以下、０．０４重量％以下、０．０１重量％以下、０．００６重量％以下、０．００１重量％以下、０．０００９重量％以下、０．０００７重量％以下、０．００００５重量％以下、０．００００３重量％以下、０．００００１重量％以下、０．０００００９重量％以下、０．０００００７重量％以下、０．０００００５重量％以下、０．０００００３重量％以下、０．０００００１重量％以下、０．００００００９重量％以下、０．００００００７重量％以下、０．００００００５重量％以下、０．００００００３重量％以下、０．００００００２重量％以下、０．００００００１重量％以下、０．０００００００９重量％以下であってよいが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明の他の側面は、前記組成物の微塵による皮膚損傷ケア用途を含む。
【００２８】
本発明の他の側面において、対象の微塵による皮膚損傷ケアのための方法であって、当該方法は、梅の花抽出物の有効量を、これを必要とする対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明の他の側面において、微塵による皮膚損傷ケアのための組成物を製造するに際する梅の花抽出物の用途を提供する。
【００３０】
本発明の他の側面において、微塵による皮膚損傷ケアのための梅の花抽出物を提供する。
【００３１】
本明細書で用いられる「微塵」とは、人間の目に見えない極めて小さな物質で大気中に長い間浮遊する又は飛びちる粒子状の物質のことを言い、粒径１０μｍ以下の物質のことを言う。特に粒径が２．５μｍ以下の粒子状の物質は「超微塵」と言い、本願発明において「微塵」は「超細塵」をも含むものと意図される。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ケア」とは、刺激から皮膚細胞を効果的に保護し、且つ前記刺激によって特定の遺伝子の発現量が変化することを抑制、防止又は復元することを言う。
【００３３】
一側面において、本発明は、微塵によって損傷された皮膚細胞で特定の遺伝子の発現量を正常レベルに調節することで、微塵による皮膚細胞の損傷を抑制する組成物を提供する。
【００３４】
具体的に、一側面において、本発明は、微塵によって発現量に影響を受ける皮膚細胞内遺伝子としては、ＩＬ−３６Ｇ（ＮＭ＿０１９６１８）を含む。前記ＩＬ−３６Ｇ（ＮＭ＿０１９６１８）は、微塵によって発現量が増加する遺伝子であるので、これらの遺伝子の発現量を抑制して正常レベルに調節することで皮膚細胞の損傷を抑制することができる（非特許文献１参照）。
【００３５】
本発明で用いられる、微塵によって発現量が増加する遺伝子は表１に提示されている。該表におけるＮａｍｅは、ＮＣＢＩのｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤを意味し、Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌは、公式遺伝子シンボルを意味し、Ｇｅｎｅ  ｔｉｔｌｅは、各遺伝子の名前を意味する。このような内容は、非特許文献１の記載から確認することができる。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
前記遺伝子又はタンパク質の発現量の分析は、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ＮＧＳ（Ｎｅｓｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；次世代塩基配列分析）、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、組織免疫染色、免疫沈降分析法などの当業界で公知の種々の分析方法を用いて分析されてよい。
【００３８】
微塵によって皮膚細胞の損傷が生じ、このときに炎症が誘導されて皮膚細胞の損傷がさらに生じるようになる。このような皮膚細胞損傷の悪循環を梅の花抽出物がケアすることで皮膚状態を改善できるようになる。
【００３９】
本発明の一観点である、前記組成物は、化粧料組成物であってよく、薬学的組成物であってよく、健康機能食品組成物であってよい。
【００４０】
前記化粧料組成物は、例えば、各種クリーム、ローション各種クリーム、ローション、スキンローションなどのような化粧品類と、クレンジング、洗顔剤、せっけん、美容液などがある。
【００４１】
一側面において、本発明に係る前記梅の花抽出物を含有する組成物が添加された化粧料は、溶液、乳化物、粘性型混合物などの形状をとってよい。
【００４２】
すなわち、一側面において、本発明の化粧料は、その剤形において特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、エッセンス、パック、ゲル、パウダー、メーキャップベース、ファウンデーション、ローション、軟膏、パッチ、美容液、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、クレンジングウォーター、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、せっけん、染毛剤、スプレーなどのような剤形が挙げられる。
【００４３】
各剤形の化粧料組成物において、前記梅の花抽出物以外の他の成分は、その他の化粧料の剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよい。
【００４４】
また、一側面において、本発明に係る化粧料は、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質、及び海草エキスからなる群より選択された組成物を含んでいてよい。
【００４５】
一側面において、本発明に係る化粧料には、前記必須成分とともに必要に応じて通常化粧料に配合される他の成分を配合してもよい。
【００４６】
その他添加してもよい配合成分としては、乳脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００４７】
また、その他添加してもよい配合成分はこれらに限定されるものではなく、且つ、前記いずれの成分も本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で配合可能である。
【００４８】
一側面において、本発明に係る梅の花抽出物を含む薬学的組成物は、当該薬学組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含んでいてよい。
【００４９】
前記梅の花抽出物を含む薬学的組成物は、その剤形として、それぞれ通常の方法に従い錠剤、カプセル、散剤、又はシロップなどの経口剤、若しくは軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、又はスプレーなどの外用剤などを含む薬剤学的製剤に適合した如何なるものに剤形化してよい。
【００５０】
一般に、前記薬学的組成物によって投与される有効成分の実投与量は、症状の重症度、選択された投与経路、対象の年齢、性別、体重、及び健康状態などの種々の関連因子に鑑みて決定されるべきであると理解されてよい。一般に、有効成分の投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜３０００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。
【００５１】
本発明の一観点である健康機能食品組成物において、健康食品は、日常食事で欠乏されやすい栄養素や人体に有用な機能を持つ原料や成分（機能性原料）を用いて製造したものであって、人体の正常な機能を維持したり生理機能活性化を通じて健康を維持し改善したりする食品を意味するものであってよいが、これに制限されない。前記健康食品は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤などの形態で製造、加工されてよいが、これらに限定されず、法律に則っていかなる形態でも製造、加工されてよい。
【００５２】
具体的に、健康飲料組成物は、指示された割合にて必須成分として前記化合物を含有する以外に、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように各種の香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有していてよい。天然炭水化物の例としては、モノサッカライド、ポリサッカライド、シクロデキストリンなどのような通常的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を用いてよい。
【００５３】
一般に、前記健康機能食品組成物によって投与される有効成分の実投与量は、症状の重症度、選択された投与経路、対象の年齢、性別、体重、及び健康状態などの種々の関連因子に鑑みて決定されるべきであると理解されてよい。一般に、有効成分の投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日〜６ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明に対する理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲が下記の例によって制限されるものではない。
【００５５】
［実施例１］梅の花抽出物の製造
梅の花を、精製水とエタノールとを３：７の割合で混合した抽出溶媒、すなわち、７０％エタノールを抽出溶媒として常温抽出した。常温抽出後に１次ろ過を施して抽出物に含まれていた固相の材料を除去し、次いで、抽出物を濃縮してエタノールを除去した後、これを分離及び精製した。そして、遠心分離及び２次ろ過後に乾燥して、梅の花抽出物を得た。
【００５６】
［実施例２］微塵の捕集及び抽出
微塵の捕集は、ローボリウムエアサンプラー（Ｓｅｎｓｉｄｙｎｅ、Ｇｉｌｌｉａｎ、Ｌｏｗ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ａｉｒ  Ｓａｍｐｌｅｒ、ＦＬ、Ｕ.Ｓ.ａ.）を利用し、フィルタパック（Ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｃｋ）は測定日毎の午前１０時前後にフィルタとデニューダを取り替えて約２４時間試料を採取した。２８日間に亘ってソウル市の風下地域（韓国京畿道竜仁市處仁區所在、韓国外国語大学校外国学総合研究センター生活館６階屋上）で毎日微塵を捕集し、測定時間は真空ポンプのオンと同時にタイマーを作動させ、真空ポンプのオフ時にタイマーの時間を記録した。採取流量は１６．７Ｌ／ｍｉｎとし、測定開始時の流量計（Ｍｏｄｅｌ  ４１４３、ＴＳＩ  Ｉｎｃ.）で流量を測定し、測定の終了時に再度流量を測定した。フィルタパック（ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｃｋ）に組み込まれるＴｅｆｌｏｎフィルタは、試料採取の前と後に重さを測定した。Ｔｅｆｌｏｎフィルタの重さを測定する前に２４時間に亘って相対湿度４０％のデシケーター（ＮＩＫＫＯ、Ｊａｐａｎ）に恒量させてから、小数点５桁が表示される電子秤（ＤＶＧ２１５ＣＤ、Ｏｈａｕｓ）で重さを２回測定してその平均値を記録した。試料を採取した後も、重さを測定する前にデシケーターで２４時間に亘って恒量させてから重さを２回測定し、採取前に測定した重さと比較して質量濃度を算出した。微塵の抽出は、Ｔｅｆｌｏｎフィルタを１ｍＬのエタノールに濡らしてから１４ｍＬのＤＷを入れてフィルタのエアロゾル捕集面が水面に当接するようにした状態で蓋を閉じた後に超音波洗浄器で３０分間超音波を与えて行った。ろ過段階で水分による誤差を最小化するために乾燥器（ｄｅｃｉｃａｔｏｒ）で４８時間フィルタの水分を完全に除去した後、０．１ｍｇまで測定可能な超精密秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＣＯＭＰＡＮＹ社製）を利用してフィルタの重さを秤量し、フィルタの抽出前と後の重さを秤量した。
【００５７】
［実施例３］（正常ヒト）角質形成細胞株の培養
（正常ヒト）角質形成細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）は、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ、Ｉｎｃ.、米国メリーランド州ウォーカーズビル所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液はロンザ社の指針書に従った。５００ｍｌのＫＢＭ−２（ＫＢＭＴＭ−２、ＣＣ−３１０３）培地にＫＧＭ−２ブレットキットＣＣ−４１５２（ＫＧＭ  ＴＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ、ＣＣ−４１５２）（成分：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ））、ヒト上皮成長因子（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｈＥＧＦ）、インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、及びゲンタマイシン硫酸塩＋アムホフェリシン−Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏｆｅｒｉｃｉｎ−Ｂ：ＧＡ−１０００））を添加したＫＧＭ−２ブレットキットＣＣ−３１０７（ＫＧＭ  ＴＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ、ＣＣ−３１０７）を用いた。
【００５８】
［実施例４］（正常ヒト）角質形成細胞株への微塵の処理及び細胞毒性の測定
微塵処理による細胞毒性の有無を確認するために、Ｍｏｓｓｍａｎら（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.  Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５、５５-６３、１９８３）の方法で（正常ヒト）角質形成細胞株を用いたＭＴＴ実験を行った。
【００５９】
具体的に、２４−ウェルプレートを用い、前記実施例３で採取して得た直径２．５μｍの微塵を精製水に分散させて微塵分散液を製造した後、実施例４の細胞培養条件下、２．５×１０５ウェル細胞数の条件で培養した細胞に前記微塵分散液を処理して２４時間培養した後、ＭＴＴ（３−４,５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａ  ｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）５ｍｇ／ｍｌを混合し、３７℃で３時間さらに培養した。次いで、培地を除去し、形成されたホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ  ｃｒｙｓｔａｌ）をＤＭＳＯ  ５００μｌに溶解した。該溶解物を９６−ウェルプレートに移して分注（ａｌｉｑｕｏｔ）し、吸光度５４０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。測定結果は図１に示した。
【００６０】
図１に示したように、前記細胞株において２．５μｍ以下の微塵を分散させた分散液による細胞毒性に対して８０％の生存率を示す濃度（ＩＣ２０）値は、２．５μｍ以下の微塵水溶性抽出液の場合に１２．５μｇ／ｍｌであった。
【００６１】
［実施例５］次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による微塵の細胞遺伝子変化の確認
ＲＮＡ−塩基配列データ処理及び分析のために、Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.（２０１２）によって開発された一般的な分析段階を参照した。ＦａｓｔＱＣ（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を用いてＲＮＡ−ｓｅｑデータ品質を確認し、ＦＡＳＴＸ（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）を用いて、正確度が落ちるベース及びアダプタ配列を除去した。次いで、Ｔｏｐｈａｔ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.、２００９）とヒトゲノム（ｈｇ１９）を用いてアラインメントを行い、各サンプルのデータ量をＲＳｅＱＣと再命名されたＥＶＥＲ−ｓｅｑを用いて確認した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.、２０１２）。また、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを用いて転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の発現レベルを定量し、微塵分散液処理サンプルと正常サンプルとの転写レベルを比較した（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.、２０１０）。ＦＤＲ  ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５に、≧２．０  ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅの厳しいカットオフを適用して、直径２．５μｍの微塵の分散液の処理時の有意な発現差を示す遺伝子を決定した。測定結果は、下記の表２及び図２に示されている。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
［実施例６］リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量
実施例２で抽出した直径２．５μｍの微塵を実施例３で培養したヒト正常角質皮膚細胞に対し細胞培養培地１ｍｌに１２．５μｇの量で処理し、下記の表３に表した遺伝子のプライマー（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ(登録商標)  Ｐｒｉｍｅｒｓ）で相対的ｍＲＮＡ発現量を測定した。梅の葉抽出物は実施例２で製造したものを用いた。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
培地に梅の花抽出物を２０ｐｐｍの濃度で処理してから２４時間経過後、培養液を除去し、２ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で細胞を洗浄した後、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細胞内のＲＮＡを分離した。分離したＲＮＡをキアゲン社製のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｔ、ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）でもう１回精製した後、エジュラント社製のバイオアナライザ２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロゲン社製の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを前記表３のプライマーを用いたリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ：ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって定量的に分析した。遺伝子の発現パターンの変化をアプライドバイオシステム社製のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて細胞の遺伝子変化をリアルタイムＰＣＲで評価し、その結果を［図２］に示した。用いたＱ−ＲＴ−ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲはいずれもライフテクノロジーから配布する標準プロトコールに従って行い、具体的に、９５℃で２０秒間処理した後、９５℃で３秒及び６０℃で３０秒を処理する工程を４０周期行った。
【００６６】
図２に示したように、微塵によって刺激された皮膚細胞で発現量が増加又は減少する遺伝子が存在し、梅の葉抽出物の処理によってインターロイキン３６ガンマ（ＩＬ−３６Ｇ）遺伝子の発現量が減少することを確認することができた。
【００６７】
したがって、梅の葉抽出物は、微塵による刺激から皮膚細胞を効果的に保護し、且つ前記刺激によって前述した特定の遺伝子の発現量が変化することを抑制又は防止して、正常レベルの発現量を有し得るようにすることができることが分かる。
【００６８】
以下、本発明に係る組成物の剤形例を説明するが、化粧料組成物、薬学的組成物及び健康機能食品組成物は種々の剤形への応用が可能であり、これらは本発明を限定するためのものではなく単に本発明を具体的に説明するためのものである。
【００６９】
［剤形例１］錠剤
本発明の実施例に係る梅の葉抽出物１００ｍｇ、ラクトース４００ｍｇ、とうもろこし澱粉４００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常の錠剤の製造方法に従い打錠して錠剤を製造した。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
［剤形例２］カプセル剤
本発明の実施例に係る梅の葉抽出物１００ｍｇ、ラクトース４００ｍｇ、とうもろこし澱粉４００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常のカプセル剤の製造方法に従いゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
［剤形例３］顆粒剤
本発明の実施例に係る梅の葉抽出物５０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を用いて顆粒に成形した後、分包に充填した。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
［剤形例４］せっけん
【００７６】
【表７】
2020534318.tif 000009
【００７７】
［剤形例５］ローション
【００７８】
【表８】
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【００７９】
［剤形例６］クリーム
【００８０】
【表９】
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【００８１】
［剤形例７］軟膏
【００８２】
【表１０】
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【００８３】
［剤形例８］美容液の製造
【００８４】
【表１１】
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【００８５】
［剤形例９］健康食品
【００８６】
【表１２】
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【００８７】
［剤形例１０］健康飲料
【００８８】
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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