(57)【要約】本発明は、ＢＴＮ２に特異性を有する抗体、及び、特にがんの治療のためのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトブチロフィリン−２（ＢＴＮ２）に特異性を有する抗体であって、以下の機能：
ｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの生成を阻害する、
ｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、
ｉｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する、
の少なくとも１つを有することを特徴とする抗体。
【請求項２】
ヒトブチロフィリン−２Ａ１（ＢＴＮ２Ａ１）及びヒトブチロフィリン−２Ａ２（ＢＴＮ２Ａ２）の両方に特異性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＢＴＮ２Ａ２への結合に関して以下の参照マウス抗体：
ｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３１の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ４．１５；
ｉｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３２の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ５．２８；
ｉｉｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３３の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ７．２８；
ｉｖ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３４の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ７．４８；
ｖ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３５の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ８．１５；又は、
ｖｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３６の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ８．１６、
の少なくとも１つと競合する、請求項１に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項４】
ｉ．配列番号３〜８それぞれのｍＡｂ  ４．１５のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
ｉｉ．配列番号１１〜１６それぞれのｍＡｂ  ５．２８のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
ｉｉｉ．配列番号１９〜２４それぞれのｍＡｂ  ７．２８のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
ｉｖ．配列番号２７〜３２それぞれのｍＡｂ  ７．４８のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
ｖ．配列番号３５〜４０それぞれのｍＡｂ  ８．１５のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；又は
ｖｉ．配列番号４３〜４８それぞれのｍＡｂ  ８．１６のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３、
のいずれかを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ２抗体。
【請求項５】
ｉ．ＶＨ領域が配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号１０と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
ｉｉ．ＶＨ領域が配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
ｉｉｉ．ＶＨ領域が配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号２６と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
ｉｖ．ＶＨ領域が配列番号３３と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号３４と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
ｖ．ＶＨ領域が配列番号４１と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号４２と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；又は、
ｖｉ．ＶＨ領域が配列番号４９と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号５０と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖、
のいずれかを含む抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項６】
ヒトＣＤ２７７と交差反応しないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項７】
アゴニスト抗ＣＤ２７７抗体ｍＡｂ  ２０．１の存在下でＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項８】
ヒト、キメラ又はヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１１】
療法で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項１２】
関節リウマチ（ＲＡ）、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、無形成性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性の白血球減少、特発性血小板減少性紫斑病、雄不妊症、混合結合組織疾患、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、強直人間症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎及びヴェーゲナー肉芽腫症からなる群の間で選択される障害の治療で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２抗体及び少なくとも薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＴＮ２に特異性を有する抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球は、体を病原体から守ることに関与する免疫系の細胞である。従来のＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋ＣＴＬ及びＮＫ細胞に加えて、他の非従来型のＴ細胞、特に、γδＴ細胞は、ＮＫ及びＴ細胞と同じ感度及び細胞溶解力を提示する。Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞は循環γδＴ細胞の主なサブセットであり、ヒト末梢Ｔ細胞の１〜１０％を占める。
【０００３】
Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞は、免疫防御の重要なエフェクターである。それらは、病原体に感染したか又は異常な細胞を直接的に溶解する。さらに、それらは、樹状細胞（ＤＣ）成熟並びにアイソタイプスイッチング及び免疫グロブリン生成を誘導することによって免疫応答を調節する。免疫系のこの重要な細胞プラットホームは、表面受容体、ケモカイン及びサイトカインによって厳密に調節される。Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞は、ホスホアゴニスト（ＰＡｇ）と呼ばれる非ペプチド性リン酸化イソプレノイド経路代謝産物によって活性化される。
【０００４】
Ｔ細胞の初回刺激は、専門細胞の関与及び走化性サイトカインの分泌によってモジュレートされる。今日では、我々は、Ｔ細胞活性化は２つの相乗事象の結果であることを知っている。最初は、Ｔ細胞の受容体（ＴＣＲ）と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面の処理された抗原にコンジュゲートした主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の間の相互作用である。第２の事象は、Ｂ７分子を含む同時刺激抗原非依存性シグナルである。同時刺激シグナルの欠如は、アネルギー、すなわちＴ細胞増殖、サイトカイン分泌及び細胞傷害性活性の阻害を誘導する。これらの経路の研究は、自己免疫性又はリンパ組織増殖性障害などの病理学的事象の誘発に関する識見を提供することができる。
【０００５】
ブチロフィリンは、ブチロフィリン（ＢＴＮ）、ＢＴＮ様（ＢＴＮＬ）を含む膜貫通タンパク質のファミリー、並びに上皮内Ｔ細胞（ＳＫＩＮＴ）タンパク質の選択及び維持を構成する（Ａｒｎｅｔｔ及びＶｉｎｅｙ、２０１４年）。それらの細胞外部分は、Ｂ７共刺激分子の対応するドメインに相同性を示すＩｇＶ及びＩｇＣ２ドメインを含有し（Ａｒｎｅｔｔ及びＶｉｎｅｙ、２０１４年）、したがって、ブチロフィリンは拡張されたＢ７又はＩｇスーパーファミリーのメンバーであると考えられる。
【０００６】
同定された最初のブチロフィリンであるＢＴＮ１Ａ１は、乳脂小球の形成、分泌及び安定化のために必要とされる（ｏｇｇら、２００４年）。次に、Ｂ７遺伝子並びにＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子は、共通する先祖遺伝子を有する可能性があり、Ｔ細胞活性化などの類似の機能に関与するタンパク質をコードしているかもしれないことが提案された（Ｒｈｏｄｅｓら、２００１年）
【０００７】
その後、ブチロフィリンが免疫系において多様な役割を演ずることをますます多くの証拠が示唆した。保存されたファミリーメンバーに含まれないマウスＳＫＩＮＴ１及びヒトＢＴＮ３Ａ１に関して、最も良く機能が解明されている。ＳＫＩＮＴ１は、マウスＶγ５＋Ｖδ１＋Ｔ細胞の胸腺分化を促進する（Ｂｏｙｄｅｎら、２００８年）。
【０００８】
ＢＴＮ２サブファミリーは、ヒトにおいてＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２及び偽遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３を含む。ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２タンパク質アイソフォームは、ＩｇＶ及びＩｇＣ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３に関して特徴的な細胞内ドメインＢ３０．２を提示するが、ＢＴＮ３Ａ２はそうでない。マウスでは、ＢＴＮ２Ａ２はヒトＢＴＮ２Ａ２遺伝子の単一コピー遺伝子及びオルソログである。組換えヒトＢＴＮ２Ａ１−Ｆｃタンパク質は、ＢＴＮ２Ａ１の特定の糖型が樹状細胞（ＤＣ）の上で見出されるレクチン分子、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合することを明らかにした。腫瘍細胞によって発現されるとき、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＢＴＮ２Ａ１の結合はタンパク質の高いマンノースグリコシル化に依存する（Ｍａｌｃｈｅｒｅｋら、２００７年）。しかし、今日まで、ヒトＢＴＮ２Ａ１／Ａ２に関して明確な機能は同定されていないが、組換えＦｃタンパク質を使用してマウスにおいて多少の実験が実行されている。
【０００９】
Ｓｍｉｔｈら、２０１０年は、組換えマウスのＢＴＮ２Ａ２−Ｆｃ及びＢＴＮ１Ａ１−Ｆｃが活性化Ｔ細胞に結合することを示し、これらの細胞の上での１つ又は複数の受容体の存在を示唆した。ＭＯＧ−Ｆｃタンパク質でなく、固定化ＢＴＮ２Ａ２−Ｆｃ又はＢＴＮ２Ａ１−Ｆｃタンパク質は、抗ＣＤ３によって活性化されるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖を阻害した。マウスのＢＴＮ１Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２は、Ｔ細胞代謝、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇ分泌も阻害した。
【００１０】
Ａｍｍａｎら、２０１３年は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激されるＣＤ３＋一次マウスＴ細胞へのマウスＢＴＮ２Ａ２−Ｆｃの結合は、増殖する細胞の数及び細胞周期への細胞の進入を低減することを見出した。抗ＣＤ３刺激Ｔ細胞へのＢＴＮ２Ａ２−Ｆｃの結合は、ＣＤ３ε、Ｚａｐ７０及び以降のＥｒｋ１／２活性化を阻害した。マウスのＢＴＮ２Ａ２−Ｆｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦｏｘｐ３発現及びＴｒｅｇ分化も誘導する。
【００１１】
Ｓａｒｔｅｒら、２０１６年は、Ｂｔｎ２ａ２−／−マウスが強化されたエフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答示し、ＣＤ４＋調節Ｔ細胞誘導を害し、抗腫瘍応答を強化し、実験的な自己免疫性脳脊髄炎を悪化させることを示した。
【００１２】
今日まで、自己免疫性疾患の治療及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）における移植拒絶反応の予防は、重大な副作用を有するか又は必ずしも有効でない免疫抑制剤に依存する。したがって、新しい免疫抑制剤が所望される。
【００１３】
今日まで、自己免疫性疾患の治療及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）における移植拒絶反応の予防は、単に免疫抑制剤に依存する。しかし、そのような免疫抑制剤は、必ずしも有効であるとは限らず、及び／又は重大な副作用を有する可能性がある。
【００１４】
したがって、それを必要とする患者における免疫応答を阻害する新しい抑制剤及び／又は方法を同定する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示は、ＢＴＮ２に特異性を有する抗体及びその使用に関する。
特に、ＢＴＮ２（例えば、ヒトＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２ポリペプチド）に結合して、以下の特性：
抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αの生成を阻害する、及び／又は
抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は
抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する
の少なくとも１つを示す抗体が本明細書に開示される。
【００１６】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体は、ヒトブチロフィリン−２Ａ１（ＢＴＮ２Ａ１）及びヒトブチロフィリン−２Ａ２（ＢＴＮ２Ａ２）の両方に特異性を有する。
【００１７】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体は、以下の参照マウス抗体の少なくとも１つとＢＴＮ２Ａ２への結合に関して競合する：
ｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３１の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ４．１５；
ｉｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３２の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ５．２８；
ｉｉｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３３の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ７．２８；
ｉｖ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３４の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ７．４８；
ｖ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３５の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ８．１５；又は、
ｖｉ．ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３６の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができるｍＡｂ  ８．１６．
【００１８】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体は、以下のいずれかを含む：
ｉ．抗体ｍＡｂ  ４．１５の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ４．１５はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３１の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｉｉ．抗体ｍＡｂ  ５．２８の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ５．２８はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３２の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｉｉｉ．抗体ｍＡｂ  ７．２８の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ７．２８はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３３の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｉｖ．抗体ｍＡｂ  ７．４８の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ７．４８はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３４の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｖ．抗体ｍＡｂ  ８．１５の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ８．１５はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３５の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；又は、
ｖｉ．抗体ｍＡｂ  ８．１６の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ８．１６はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３６の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖。
【００１９】
他の具体的な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２抗体は、
（ｉ）配列番号３〜８それぞれのｍＡｂ  ４．１５のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１１〜１６それぞれのｍＡｂ  ５．２８のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１９〜２４それぞれのｍＡｂ  ７．２８のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号２７〜３２それぞれのｍＡｂ  ７．４８のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；又は、
（ｖ）配列番号３５〜４０それぞれのｍＡｂ  ８．１５のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号４３〜４８それぞれのｍＡｂ  ８．１６のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３
のいずれかを含む。
【００２０】
以前の実施形態と組み合わせることができる他の具体的な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２抗体は、
（ｉ）ＶＨ領域が配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号１０と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
（ｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
（ｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号２６と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
（ｉｖ）ＶＨ領域が配列番号３３と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号３４と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；
（ｖ）ＶＨ領域が配列番号４１と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号４２と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖；又は、
（ｖｉ）ＶＨ領域が配列番号４９と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖及びＶＬ領域が配列番号５０と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖
のいずれかを含む抗体である。
【００２１】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体はヒトＣＤ２７７と交差反応をしない、特に、抗ＢＴＮ２抗体はヒトＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２及びＢＴＮ３Ａ３のいずれか１つと交差反応をしない。
【００２２】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体は、アゴニスト抗ＣＤ２７７抗体ｍＡｂ２０．１の存在下で活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解性機能を阻害する。
【００２３】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体は、例えば、標的細胞株（すなわち、Ｄａｕｄｉ細胞株）との共培養、及び／又はホスホアゴニスト（ＰＡｇ）、及び／又はホスホアゴニスト（ＰＡｇ）の生成を誘導する薬剤によって活性化される、活性化Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解性機能を阻害する。
【００２４】
具体的な実施形態では、前記抗ＢＴＮ２抗体は、ヒト、キメラ又はヒト化抗体である。
【００２５】
本開示の別の態様は、上記の抗ＢＴＮ２抗体のいずれかの重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子に関する。
【００２６】
本開示は、特に上記の抗ＢＴＮ２抗体のいずれか１つの製造で使用するための、そのような核酸を含む宿主細胞にも関係する。
【００２７】
本開示の別の態様は、療法で、例えば自己免疫性及び炎症性障害並びに移植拒絶反応を治療するための方法で使用するための、上で規定される抗ＢＴＮ２抗体に関する。
【００２８】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象において自己免疫性及び炎症性障害並びに移植拒絶反応を治療する方法であって、対象に上で規定される抗ＢＴＮ２抗体の治療的有効量を投与することを含む方法に関する。
【００２９】
一般的に、前記自己免疫性及び炎症性障害は、以下からなる群から選択される：関節リウマチ（ＲＡ）、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、無形成性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性の白血球減少、特発性血小板減少性紫斑病、雄不妊症、混合結合組織疾患、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、強直人間症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎及びヴェーゲナー肉芽腫症。
【００３０】
本開示は、上で規定される抗ＢＴＮ２抗体を含む医薬組成物にも関する。
【００３１】
本開示は、対象において免疫応答を阻害する方法であって、本明細書に開示される抗ＢＴＮ２抗体の有効量を対象に投与することを含む方法もさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
定義
本明細書で使用されるように、用語「ＢＴＮ２」は、当技術分野での一般的な意味を有し、配列番号１のＢＴＮ２Ａ１又は配列番号２のＢＴＮ２Ａ２のいずれかを含むヒトＢＴＮ２ポリペプチドを指す。
配列番号１：ＢＴＮ２Ａアイソフォーム１前駆体（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））：
ＭＥＳＡＡＡＬＨＦＳＲＰＡＳＬＬＬＬＬＬＳＬＣＡＬＶＳＡＱＦＩＶＶＧＰＴＤＰＩＬＡＴＶＧＥＮＴＴＬＲＣＨＬＳＰＥＫＮＡＥＤＭＥＶＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹＫＧＧＲＥＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＴＴＦＶＳＫＤＩＳＲＧＳＶＡＬＶＩＨＮＩＴＡＱＥＮＧＴＹＲＣＹＦＱＥＧＲＳＹＤＥＡＩＬＨＬＶＶＡＧＬＧＳＫＰＬＩＳＭＲＧＨＥＤＧＧＩＲＬＥＣＩＳＲＧＷＹＰＫＰＬＴＶＷＲＤＰＹＧＧＶＡＰＡＬＫＥＶＳＭＰＤＡＤＧＬＦＭＶＴＴＡＶＩＩＲＤＫＳＶＲＮＭＳＣＳＩＮＮＴＬＬＧＱＫＫＥＳＶＩＦＩＰＥＳＦＭＰＳＶＳＰＣＡＶＡＬＰＩＩＶＶＩＬＭＩＰＩＡＶＣＩＹＷＩＮＫＬＱＫＥＫＫＩＬＳＧＥＫＥＦＥＲＥＴＲＥＩＡＬＫＥＬＥＫＥＲＶＱＫＥＥＥＬＱＶＫＥＫＬＱＥＥＬＲＷＲＲＴＦＬＨＡＶＤＶＶＬＤＰＤＴＡＨＰＤＬＦＬＳＥＤＲＲＳＶＲＲＣＰＦＲＨＬＧＥＳＶＰＤＮＰＥＲＦＤＳＱＰＣＶＬＧＲＥＳＦＡＳＧＫＨＹＷＥＶＥＶＥＮＶＩＥＷＴＶＧＶＣＲＤＳＶＥＲＫＧＥＶＬＬＩＰＱＮＧＦＷＴＬＥＭＨＫＧＱＹＲＡＶＳＳＰＤＲＩＬＰＬＫＥＳＬＣＲＶＧＶＦＬＤＹＥＡＧＤＶＳＦＹＮＭＲＤＲＳＨＩＹＴＣＰＲＳＡＦＳＶＰＶＲＰＦＦＲＬＧＣＥＤＳＰＩＦＩＣＰＡＬＴＧＡＮＧＶＴＶＰＥＥＧＬＴＬＨＲＶＧＴＨＱＳＬ
【００３３】
配列番号２：ＢＴＮ２Ａアイソフォーム２前駆体（ヒト）：
ＭＥＰＡＡＡＬＨＦＳＬＰＡＳＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＳＬＣＡＬＶＳＡＱＦＴＶＶＧＰＡＮＰＩＬＡＭＶＧＥＮＴＴＬＲＣＨＬＳＰＥＫＮＡＥＤＭＥＶＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹＫＧＧＲＥＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＩＴＦＶＳＫＤＩＮＲＧＳＶＡＬＶＩＨＮＶＴＡＱＥＮＧＩＹＲＣＹＦＱＥＧＲＳＹＤＥＡＩＬＲＬＶＶＡＧＬＧＳＫＰＬＩＥＩＫＡＱＥＤＧＳＩＷＬＥＣＩＳＧＧＷＹＰＥＰＬＴＶＷＲＤＰＹＧＥＶＶＰＡＬＫＥＶＳＩＡＤＡＤＧＬＦＭＶＴＴＡＶＩＩＲＤＫＹＶＲＮＶＳＣＳＶＮＮＴＬＬＧＱＥＫＥＴＶＩＦＩＰＥＳＦＭＰＳＡＳＰＷＭＶＡＬＡＶＩＬＴＡＳＰＷＭＶＳＭＴＶＩＬＡＶＦＩＩＦＭＡＶＳＩＣＣＩＫＫＬＱＲＥＫＫＩＬＳＧＥＫＫＶＥＱＥＥＫＥＩＡＱＱＬＱＥＥＬＲＷＲＲＴＦＬＨＡＡＤＶＶＬＤＰＤＴＡＨＰＥＬＦＬＳＥＤＲＲＳＶＲＲＧＰＹＲＱＲＶＰＤＮＰＥＲＦＤＳＱＰＣＶＬＧＷＥＳＦＡＳＧＫＨＹＷＥＶＥＶＥＮＶＭＶＷＴＶＧＶＣＲＨＳＶＥＲＫＧＥＶＬＬＩＰＱＮＧＦＷＴＬＥＭＦＧＮＱＹＲＡＬＳＳＰＥＲＩＬＰＬＫＥＳＬＣＲＶＧＶＦＬＤＹＥＡＧＤＶＳＦＹＮＭＲＤＲＳＨＩＹＴＣＰＲＳＡＦＴＶＰＶＲＰＦＦＲＬＧＳＤＤＳＰＩＦＩＣＰＡＬＴＧＡＳＧＶＭＶＰＥＥＧＬＫＬＨＲＶＧＴＨＱＳＬ
【００３４】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明では同等に使用される。
【００３５】
本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合性部位を含有する分子を指す。このように、用語抗体は、完全な抗体分子だけでなく、抗体断片並びに抗体及び抗体断片のバリアント（誘導体を含む）も包含する。
【００３６】
自然抗体では、２本の重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結し、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結する。２種類の軽鎖、ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（又は、アイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ。各鎖は、異なった配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、ＣＨと総称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域は、抗原への結合性認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動度、補体結合及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。
【００３７】
Ｆｖ断片は免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変性又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からのものである残基で構成される。時折、非超可変性又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、抗体結合部位に参加することができるか、又は全体のドメイン構造に、したがって結合部位に影響することができる。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ指定される３つのＣＤＲを各々有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖のＶ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを一般的に含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されるアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖及び重鎖の可変領域は、以下の順序の４つのフレームワーク領域及び３つのＣＤＲを一般的に含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００３８】
抗体可変ドメイン中の残基は、従来通りにＫａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以降、「Ｋａｂａｔら」）に示される。この番号付けシステムが、本明細書で使用される。Ｋａｂａｔの残基呼称は、ＳＥＱ  ＩＤ配列におけるアミノ酸残基の直線的番号付けと必ずしも直接的に対応しない。実際の直線的アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワークであるか又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかにかかわらず、構造成分の短縮又はそれへの挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けより少ないか又は追加のアミノ酸を含有することができる。所与の抗体のための残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、「標準」のＫａｂａｔ番号付け配列との抗体配列中の相同性残基の整列によって決定することができる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基３１〜３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、残基５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）及び残基９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、残基５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）及び残基８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）に位置する。
【００３９】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片、より詳細には本明細書に開示される抗体の抗原結合性ドメインを含む任意のタンパク質である。抗体断片には、限定されずに、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及びダイアボディが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「特異性」は、ＢＴＮ２などの抗原の上に提示されるエピトープに検出可能的に結合する抗体の能力を指す。一部の実施形態では、それは、細胞株、例えば例に記載されるＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ２に、実施例及び図１において決定される通り、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満、さらにより好ましくは１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する抗体又はタンパク質を指すものである。一部の実施形態では、それは、例に記載されるＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームがノックアウトされた細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ１に、好ましくは１μｇ／ｍｌ未満、例えば０．１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する抗体又はタンパク質を指すものである；及び／又は、それは、例に記載されるＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームがノックアウトされた細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ２に、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、例えば１μｇ／ｍｌ未満又は０．０２μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する抗体又はタンパク質を指すものである。他の実施形態では、それは、抗原組換えポリペプチドに、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下又は１０ｐＭ以下のＫＤで結合する。
【００４１】
「ＢＴＮ２以外の抗原と交差反応する」抗体は、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下又は１００ｐＭ以下のＫＤでその抗原に結合する抗体を指すものである。「特定の抗原と交差反応しない」抗体は、１００ｎＭ以上のＫＤ、又は１μＭ以上のＫＤ、又は１０μＭ以上のＫＤでその抗原に結合する抗体を指すものである。ある特定の実施形態では、抗原と交差反応しないそのような抗体は、標準の結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して事実上検出不能な結合を示す。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に存在しない抗体を指す（例えば、ＢＴＮ２に特異的に結合する単離された抗体には、ＢＴＮ２以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的に存在しない）。しかし、ＢＴＮ２に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からの関連ＢＴＮ２分子などの他の抗原との交差反応性を有することがある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないかもしれない。
【００４３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を提示する。
【００４４】
語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異性を有する抗体」は、本明細書において用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
【００４５】
本明細書で使用されるように、用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すものであり、用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、本明細書で使用するように特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すものである。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）で表される解離定数を指すものである。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。ｍＡｂのＫＤ値を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８年）、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９２、１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９〜６０１（１９８３）に見出すことができ、これらの参考文献は参照により本明細書に完全に組み込まれる。抗体のＫＤを決定する方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、又はバイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００４７】
特異性は、例えば、他の無関係な分子への非特異的結合に対する特異抗原への結合における、親和性／結合力の約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０，０００：１又はそれ以上の比によってさらに示すことができる（この場合、特異抗原はＢＴＮ２ポリペプチドである）。本明細書で使用される用語「親和性」は、抗体のエピトープへの結合の強度を意味する。
【００４８】
一態様では、本開示は、以下の特性：
ｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの生成を阻害する、及び／又は
ｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する
の少なくとも１つを有することを特徴とするＢＴＮ２に特異性を有する抗体に関する。
【００４９】
そのような有利な特性を有する本開示の抗ＢＴＮ２抗体は、実施例に記載の細胞アッセイ、特にＤａｕｄｉ細胞株でのＣＤ１０７脱顆粒アッセイを使用して抗ＢＴＮ２抗体の間でスクリーニングすることができる。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「ＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成を阻害する」は、対照の活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞（対照としてＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａを有する）と比較したとき、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞による少なくともＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成のかなりの減少が観察されることを意味し、前記Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞は、標的細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞株）との共培養又はホスホアゴニスト（ｐＡｇ）のいずれかによって活性化される。一般的に、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞によるＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成の阻害は、ＩＦＮγ又はＴＮＦαに対する抗体による細胞内標識による細胞アッセイ及びフローサイトメトリーで測定することができる。そのようなアッセイは、下の例においてより詳細に記載される。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する」は、対照の活性化ヒトＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞（対照としてＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａを有する）と比較したとき、活性化ヒトＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能のかなりの低下が観察されることを意味し、前記ヒトＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞は、標的細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞株）との共培養又はホスホアゴニスト（ｐＡｇ）のいずれかによって活性化される。一般的に、例えばアゴニスト抗体ｍＡｂ２０．１の存在下での活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能の阻害は、標準の細胞株に対するγδ  Ｔ細胞脱顆粒の誘導の阻害、及び陽性の脱顆粒γδ  Ｔ細胞を検出するための脱顆粒マーカーとしてのＣＤ１０７の測定によって測定することができる。そのようなアッセイは、下の例においてより詳細に記載される。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する」は、対照としてＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａによって活性化されたＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞による増殖と比較したとき、活性化されたＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖のかなりの低下が観察されることを意味し、前記Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞は、標的細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞株）との共培養又はホスホアゴニスト（ｐＡｇ）のいずれかによって活性化される。一般的に、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ又はセルトレースバイオレット染色による細胞アッセイ及びフローサイトメトリーで測定することができる。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を以下の参照抗体の少なくとも１つと実質的に同等以上のレベルに阻害する：下に記載されるｍＡｂ  ４．１５、ｍＡｂ  ５．２８、ｍＡｂ  ７．２８、ｍＡｂ  ７．４８、ｍＡｂ  ８．１５及びｍＡｂ  ８．１６。他の具体的な実施形態では、抗ＢＴＮ２抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ  Ｔ細胞の細胞溶解機能をｍＡｂ  １０３．２と少なくとも同等以上のレベルに阻害し、前記ｍＡｂ  １０３．２は国際公開第２０１２／０８０３５１に開示される。
【００５４】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞による少なくともＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成を以下の参照抗体の少なくとも１つと実質的に同等以上のレベルに阻害する：以下に記載されるｍＡｂ  ４．１５、ｍＡｂ  ５．２８、ｍＡｂ  ７．２８、ｍＡｂ  ７．４８、ｍＡｂ  ８．１５及びｍＡｂ  ８．１６。他の具体的な実施形態では、抗ＢＴＮ２抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能をｍＡｂ  １０３．２と少なくとも同等以上のレベルに阻害し、前記ｍＡｂ  １０３．２は国際公開第２０１２／０８０３５１に開示される。
【００５５】
具体的な実施形態では、本開示による抗ＢＴＮ２抗体は、それらがアゴニスト抗ＣＤ２７７抗体ｍＡｂ２０．１の存在下でさえも活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害することをさらに特徴とする。
【００５６】
抗ＣＤ２７７抗体ｍＡｂ  ２０．１は国際公開第２０１２／０８０３５１に開示され、この抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を増加させる。一般的に、ｍＡｂ２０．１の存在下での活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能の阻害は、例えばＤａｕｄｉ細胞株を標準の細胞株として、及びＣＤ１０７を陽性の脱顆粒γδ  Ｔ細胞を検出するための脱顆粒マーカーとして使用し、並びにｍＡｂ２０．１を例えば１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した、標準の細胞株に対するγδ  Ｔ細胞脱顆粒の誘導の阻害の測定によって測定することができる。そのようなアッセイも、下の例においてより詳細に記載される。
【００５７】
参照抗体ｍＡｂ  １〜６
本発明の抗体には、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約の条項に従って２０１７年９月１４日に下の表１に記載のそれぞれの寄託番号の下でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅｓ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたハイブリドーマによって生成される、参照マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６が含まれる：
【００５８】
【表１】
2020536581.tif 000002
【００５９】
本発明は、上記の参照抗体のいずれか１つのそれぞれのＶＨ及びＶＬ領域を含む任意の抗体にさらに関する。
【００６０】
本発明は、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３１、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３２、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３３、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３４、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３５又はＣＮＣＭ  Ｉ−５２３６の下でＣＮＣＭにおいてアクセス可能なハイブリドーマにさらに関する。
【００６１】
本発明の他の抗体には、アミノ酸の欠失、挿入又は置換によって突然変異しているが、上記の参照抗体のいずれか１つのＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５又は１００パーセントの同一性をＣＤＲ領域に有するアミノ酸を有するものが含まれる。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、参照ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のうちの１つに対応する６つのＣＤＲ領域と１００％同一である６つのＣＤＲ領域を有する、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のいずれか１つの突然変異体であり、ここで、前記突然変異体抗体は、対応する参照抗体の対応するフレームワーク領域と比較したとき、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４領域で１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸がアミノ酸の欠失、挿入又は置換によって突然変異している変異体アミノ酸配列を含む。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明の抗ＢＴＮ２抗体、好ましくはヒト化抗ＢＴＮ２は、
ｉ．抗体ｍＡｂ  ４．１５の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ４．１５はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３１の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｉｉ．抗体ｍＡｂ  ５．２８の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ５．２８はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３２の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｉｉｉ．抗体ｍＡｂ  ７．２８の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ７．２８はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３３の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｉｖ．抗体ｍＡｂ  ７．４８の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ７．４８はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３４の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；
ｖ．抗体ｍＡｂ  ８．１５の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ８．１５はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３５の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖；又は、
ｖｉ．抗体ｍＡｂ  ８．１６の６つのＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖であって、前記ｍＡｂ  ８．１６はＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３６の下で寄託されているハイブリドーマによって得ることができる、重鎖及び軽鎖、
のいずれかを含む。
【００６４】
したがって、本開示の抗体は、単離され、下の表２に記載されるそれらの可変重鎖及び軽鎖アミノ酸配列によって構造的に特徴付けられるマウス抗ＢＴＮ２抗体も含む：
【００６５】
【表２】
2020536581.tif 000003
【００６６】
ＩｇＧ４、ＩｇＧ１及びそれらの変異体バージョンの定常アイソタイプ領域の対応するアミノ酸及びヌクレオチドコード配列は、当技術分野で周知である。
【００６７】
本開示による一部の抗体のＶＨ  ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＨ  ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＨ  ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３とも呼ばれる）のアミノ酸配列の例を、表３に示す。
【００６８】
表３では、本開示の一部の抗体のＣＤＲ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ、Ｌｅｓｋ  ＡＭ．１９８７年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６、９０１〜９１７）を使用して表される。
【００６９】
読取りの容易さのために、ＣＤＲ領域は、以下、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３とそれぞれ呼ばれる。
【００７０】
【表３】
2020536581.tif 000004
【００７１】
具体的な実施形態では、本開示による単離された抗ＢＴＮ２抗体は：
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、配列番号４のＨＣＤＲ２、配列番号５のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、及び配列番号６のＬＣＤＲ１、配列番号７のＬＣＤＲ２、配列番号８のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２、配列番号１３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、及び配列番号１４のＬＣＤＲ１、配列番号１５のＬＣＤＲ２、配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１９のＨＣＤＲ１、配列番号２０のＨＣＤＲ２、配列番号２１のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、及び配列番号２２のＬＣＤＲ１、配列番号２３のＬＣＤＲ２、配列番号２４のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２７のＨＣＤＲ１、配列番号２８のＨＣＤＲ２、配列番号２９のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、及び配列番号３０のＬＣＤＲ１、配列番号３１のＬＣＤＲ２、配列番号３２のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号３５のＨＣＤＲ１、配列番号３６のＨＣＤＲ２、配列番号３７のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、及び配列番号３８のＬＣＤＲ１、配列番号３９のＬＣＤＲ２、配列番号４０のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；又は、
（ｆ）配列番号４３のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２、配列番号４５のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、及び配列番号４６のＬＣＤＲ１、配列番号４７のＬＣＤＲ２、配列番号４８のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド、
のいずれかを含み、ここで、前記抗ＢＴＮ２抗体はＢＴＮ２に特異性を有する。
【００７２】
他の具体的な実施形態では、本開示による単離された抗ＢＴＮ２抗体は、
（ａ）配列番号９のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド及び配列番号１０のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１７のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド及び配列番号１８のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２５のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド及び配列番号２６のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号３３のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド及び配列番号３４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号４１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド及び配列番号４２のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；又は
（ｆ）配列番号４９のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド及び配列番号５０のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
のいずれかを含み、ここで、前記抗ＢＴＮ２抗体はＢＴＮ２に特異性を有する。
【００７３】
機能的バリアント抗体
さらに別の実施形態では、本発明の機能的バリアント抗体は、上に、特に表１、２及び３に記載の抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の対応するアミノ酸配列に相同又は好ましくは同一である、完全長重鎖及び軽鎖アミノ酸配列；又は可変領域重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、又は６つ全てのＣＤＲ領域アミノ酸配列を有し、ここで、そのような機能的バリアント抗体は、元のｍＡｂ１〜ｍＡｂ６抗体の所望の機能的特性を保持する。
【００７４】
本発明のモノクローナル抗体との関連で使用されるＶＬ、ＶＨ又はＣＤＲの機能的バリアントは、抗体が、親抗体（すなわち、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６抗体のいずれか１つ）の親和性／結合力及び／又は特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％）を保持することをなお可能にし、一部の場合には、本発明のそのようなモノクローナル抗体は、親抗体より大きな親和性、選択性及び／又は特異性で会合することができる。
【００７５】
元のｍＡｂ１〜ｍＡｂ６抗体の所望の機能的特性は、以下からなる群から選択することができる：
ｉ．抗体はＢＴＮ２に特異性を有し、特に抗体は、例に記載の通りに、細胞株、例えばヒトＢＴＮ２Ａ２を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２に、実施例及び図１で決定される通り、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満、さらにより好ましくは１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する、
ｉｉ．抗体は、例に記載されるＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームがノックアウトされた細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ１に、好ましくは１μｇ／ｍｌ未満、例えば０．１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する；
ｉｉｉ．抗体は、例に記載されるＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームがノックアウトされた細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ２に、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、例えば１μｇ／ｍｌ未満又は０．０２μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する；
ｉｖ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞のＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成を阻害する、
ｖ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は
ｖｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する。
【００７６】
例えば、本発明は、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の機能的バリアント抗体であって、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の少なくとも１つの抗体の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５又は１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ２に特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性：
ｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞のＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成を阻害する、
ｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する
の少なくとも１つを示す、機能的バリアント抗体に関する。
【００７７】
本発明は、表２に特に示すように、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６抗体のいずれか１つの対応する重鎖及び軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、又は少なくとも９５％又は１００％同一である重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の機能的バリアント抗体であって、この機能的バリアント抗体はＢＴＮ２に特異的に結合し、以下の機能的特性：
ｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞のＩＦＮγ又はＴＮＦαの生成を阻害する、
ｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する
の少なくとも１つを示す、機能的バリアント抗体にさらに関する。
【００７８】
様々な実施形態では、抗体は、上記の所望の機能的特性のうちの１つ又は２つを提示することができる。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であってもよい。好ましくは、抗体又はタンパク質はヒト化ヒト抗体、より好ましくはヒト化サイレント抗体である。
【００７９】
本明細書で使用されるように、用語「サイレント」抗体は、標的細胞の細胞溶解を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性アッセイで測定されるＡＤＣＣ活性を全く又は少ししか示さない抗体を指す。
【００８０】
一実施形態では、用語「ＡＤＣＣ活性を全く又は少ししか」は、サイレント抗体が、対応する野生型（サイレントでない）抗体で、例えば野生型ヒトＩｇＧ１抗体で観察されるＡＤＣＣ活性の５０％未満、例えば１０％未満であるＡＤＣＣ活性を示すことを意味する。好ましくは、対照Ｆａｂ抗体と比較して、サイレント抗体によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性アッセイでは検出可能なＡＤＣＣ活性は観察されない。
【００８１】
サイレントなエフェクター機能は、抗体のＦｃ定常部分における突然変異によって得ることができ、当技術分野で記載されている：Ｓｔｒｏｈｌ  ２００９年（ＬＡＬＡ  ＆  Ｎ２９７Ａ）；Ｂａｕｄｉｎｏ  ２００８年、Ｄ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（２００８）：６６６４〜６９、Ｓｔｒｏｈｌ、ＣＯ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０（２００９）：６８５〜９１）。サイレントＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列の位置２３４、２３５及び／又は３３１（ＥＵ番号付け）でＡＤＣＣを低減する突然変異を含む。別のサイレントＩｇＧ１抗体はＮ２９７Ａ突然変異を含み、これは、無グリコシル化又は非グリコシル化抗体をもたらす。
【００８２】
ＣＤＲバリアントの配列は、ほとんど保存的な置換を通して親抗体配列のＣＤＲ配列から異なることがある（例えば、表３に示すように）；例えば、バリアントの中の置換のうちの少なくとも１０個、例えば少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２又は１つは、保存的アミノ酸残基の置き換えである。本発明との関連で、保存的置換は、以下の通りに考えられるアミノ酸のクラスの中での置換と規定することができる：
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ及びＭ
シクロアルケニル関連の残基Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹ
疎水性の残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹ
負電荷の残基Ｄ及びＥ
極性の残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴ
正電荷の残基Ｈ、Ｋ及びＲ
小さい残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＶ
非常に小さい残基Ａ、Ｇ及びＳ
ターンに関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ及びフォーメーションに関与する残基Ｔ
フレキシブル残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ及びＲ
【００８３】
より保存的な置換グループ分けには、以下のものが含まれる：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミン。疎水性親水性／親水性特性及び残基重量／サイズに関する保存も、ｍＡｂ１〜６のいずれか１つのＣＤＲと比較して、バリアントＣＤＲにおいて実質的に保持されている。タンパク質にインタラクティブ生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次に他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとのタンパク質の相互作用を規定することが認められている。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指数が割り当てられており、これらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。類似の残基の保持は、さらに、又は代わりに、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準の設定ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップ＝１１及び伸長ギャップ＝１を使用するＮＣＢＩを通して利用可能なＢＬＡＳＴ２．２．８）の使用によって決定される、類似性スコアによって測定することもできる。適するバリアントは、親ペプチドと少なくとも約７０％の同一性を一般的に示す。本発明により、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。本発明により、第２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が第２のアミノ酸配列と５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６；５７；５８；５９；６０；６１；６２；６３；６４；６５；６６；６７；６８；６９；７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。
【００８４】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、キメラ抗体、一般的にキメラマウス／ヒト抗体である。用語「キメラ抗体」は、非ヒト動物に由来する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含むモノクローナル抗体を指す。
【００８５】
非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物を使用することができる。特に、前記マウス／ヒトキメラ抗体は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６参照抗体のいずれか１つのＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００８６】
一部の実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。具体的な実施形態では、例えば表３に示すように、本発明の抗体は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６参照抗体のいずれか１つの６つのＣＤＲを含むヒト化抗体である。本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク領域（ＦＲ）が、親免疫グロブリンのそれ（例えばマウスのＣＤＲ）と比較して異なる種（例えばヒト種）のドナー免疫グロブリンからのＦＲを含むように改変された抗体を指す。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖからなる群から選択される。本明細書で使用されるように、用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片を表し、ここでは、プロテアーゼ、パパインでＩｇＧを処理することによって得られる断片の中で、Ｈ鎖のＮ末端側の半分及びＬ鎖全体がジスルフィド結合を通して一緒に結合している。用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片を指し、これは、プロテアーゼ、ペプシンでＩｇＧを処理することによって得られる断片の中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を通して結合しているＦａｂよりわずかに大きい。用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片を表し、これは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、これは、ペプチドコードリンカーによって連結されるＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合から通常発現される。本発明のヒトｓｃＦｖ断片は、好ましくは遺伝子組換え技術を使用して適当な高次構造に保持されるＣＤＲを含む。
【００８８】
変異体アミノ酸配列を有する機能的バリアント抗体は、コード核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介突然変異誘発）によって、その後、本明細書に記載される機能アッセイを使用して、保持される機能（すなわち、上に示す機能）についてコードされる改変抗体を試験することによって得ることができる。
【００８９】
ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のいずれか１つを交差ブロックする及び／又はｍＡｂ１〜ｍＡｂ６と同じエピトープに結合する抗体
本明細書に開示される参照抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の類似の有利な特性を有するさらなる抗体は、標準のＢＴＮ２結合アッセイにおいて、上記の参照抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のいずれか１つと統計的に有意な様式で交差競合する（例えば、その結合を競合的に阻害する）それらの能力に基づいて同定することができる。
【００９０】
試験抗体は、例えば、ファージディスプレイ技術を例えば使用してヒト組換え抗体ライブラリーから、又はＢＴＮ２抗原で免疫化されたヒト可変領域抗体を発現するトランスジェニックマウスから、ＢＴＮ２へのそれらの結合親和性について先ずスクリーニングすることができる。
【００９１】
ヒトＢＴＮ２への本発明の抗体の結合と交差競合するか又はそれを阻害する試験抗体の能力は、その試験抗体がヒトＢＴＮ２への結合についてその抗体と競合することができることを実証する；そのような抗体は、非限定的な理論により、ヒトＢＴＮ２（例えば、ＢＴＮ２Ａ２及び／又はＢＴＮ２Ａ１）の上の、それが競合する抗体と同じであるか又は関連した（例えば、構造的に類似の、又は空間的に近位の）エピトープに結合することができる。
【００９２】
ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６参照抗体のうちの１つと同じエピトープに結合するその能力について抗ＢＴＮ２抗体をスクリーニングするために、例えば、ヒトＢＴＮ２Ａ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、又はＢＴＮ２若しくはＢＴＮ３の全てのアイソフォームがノックアウトされ、ヒトＢＴＮ２Ａ２若しくはヒトＢＴＮ２Ａ１を発現する（例に記載の通りに）ＨＥＫ２９３細胞を、４℃で３０分間、参照抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のうちの１つの飽和濃度（１０μｇ／ｍｌ）で染色する。２回の洗浄の後、試験抗ＢＴＮ２  ｍＡｂの異なる用量を、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６参照抗体のいずれか１つとのそれらの競合能力について試験する（４℃で３０分）。参照抗体と同じ結合部位について競合するｍＡｂは、そのような参照抗体の存在下でＢＴＮ２を認識することができない。データは、平均蛍光強度で表すことができる。
【００９３】
選択された抗体は、特に活性化Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞に対する阻害特性に関して、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の有利な特性についてさらに試験することができる。
【００９４】
したがって、一実施形態では、本発明は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の少なくとも１つの抗体をＢＴＮ２に結合することから交差ブロックするか又はそれによって交差ブロックされる、単離された抗体であって、前記抗体は：
ｉ．ＢＴＮ２に特異性を有し、特に抗体は、例に記載の通りに、細胞株、例えばヒトＢＴＮ２Ａ２を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２に、実施例及び図１で決定される通り、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満、さらにより好ましくは１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する、
ｉｉ．抗体は、例に記載されるＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームがノックアウトされた細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ１に、好ましくは１μｇ／ｍｌ未満、例えば０．１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する；
ｉｉｉ．抗体は、例に記載されるＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームがノックアウトされた細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞株において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ２に、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、例えば１μｇ／ｍｌ未満又は０．０２μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で結合する；
ｉｖ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞によるＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの生成を阻害する、
ｖ．抗体は、活性化Ｖγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は
ｖｉ．抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を阻害する、
単離された抗体を提供する。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗ＢＴＮ２抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６の少なくとも１つと同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のいずれか１つと同じであるヒトＢＴＮ２上のエピトープに結合する単複の交差ブロック抗体は、キメラ、ヒト化又はヒトの組換え抗体である。
【００９７】
モノクローナル抗体を生成するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体は、単独の又は組み合わせた、当技術分野で公知の任意の技術、例えば、限定されずに、任意の化学的、生物学的、遺伝子的又は酵素的技術によって生成される。一般的に、所望の配列のアミノ酸配列を知ることによって、当業者は、ポリペプチドの生成のための標準の技術によって前記抗体を容易に生成することができる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは市販されているペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、によって製造されたものなど）を製造業者の説明書に従って使用して合成することができる。或いは、本発明の抗体は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列の発現ベクターへの組込み、及びそのようなベクターの、所望の抗体を発現し、周知の技術を使用してそこからそれらを後に単離することができる好適な真核生物又は原核生物の宿主への導入の後に、ＤＮＡ発現生成物として得ることができる。
【００９８】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明による抗体をコードする核酸分子に関する。より詳細には、核酸分子は、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。より詳細には、核酸分子は、参照抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６のいずれか１つの重鎖可変領域（ＶＨ領域）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする対応する核酸と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有するＶＨ又はＶＬコード領域を含む。
【００９９】
一般的に、前記核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、それらは、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターなどの任意の適するベクターに含まれてもよい。本明細書で使用されるように、用語「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、宿主を形質転換させ、導入される配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するように、それによってＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができるビヒクルを意味する。したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、対象への投与の後の前記抗体の発現を引き起こすか又は誘導するために、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含むことができる。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーター及びエンハンサーの例には、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター及びエンハンサーなどが含まれる。ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入して発現させることができる限り、動物細胞のために任意の発現ベクターを使用することができる。適するベクターの例には、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１ベータｄ２−４などが含まれる。プラスミドの他の例には、複製開始点を含む複製プラスミド、又は組込みプラスミド、例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが含まれる。ウイルスベクターの他の例には、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターが含まれる。そのような組換えウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えば、トランスフェクションパッケージング細胞によって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスによる一時的なトランスフェクションによって生成することができる。ウイルスパッケージング細胞の一般的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等が含まれる。そのような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号、国際公開第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開第９４／１９４７８号に見出すことができる。
【０１００】
本発明のさらなる目的は、上記の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクトされたか、感染したか、又は形質転換された宿主細胞に関する。本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、宿主細胞が導入される遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、一般的に導入される遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を生成するように、宿主細胞への「外来の」（すなわち、外因性又は細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されるＤＮＡ又はＲＮＡを受けて発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【０１０１】
本発明の核酸は、適する発現系で本発明の抗体を生成するために使用することができる。用語「発現系」は、例えばベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡをコードするタンパク質の発現のための、適する条件下の宿主細胞及び適合するベクターを意味する。一般的な発現系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳類宿主細胞及びベクターを含む。宿主細胞の他の例には、限定されずに、原核生物の細胞（例えば細菌）及び真核生物の細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）が含まれる。具体例には、大腸菌、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母、哺乳動物細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）、並びに一次の又は確立された哺乳動物細胞培養（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から生成される）が含まれる。例には、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠損しているＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇら；１９８０年）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ）なども含まれる。
【０１０２】
本発明は、本発明による抗体を発現する組換え宿主細胞を生成する方法にも関し、前記方法は以下のステップを含む：（ｉ）上記の組換え核酸又はベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでコンピテント宿主細胞に導入するステップ、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで培養するステップ、及び（ｉｉｉ）任意選択で、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択するステップ。そのような組換え宿主細胞は、本発明の抗体の生成のために使用することができる。
【０１０３】
本発明の抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地から適切に分離される。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明のヒトキメラ抗体は、前述の通りＶＬ及びＶＨドメインをコードする核配列を得、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにそれらを挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって生成することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それはヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であってもよいが、ＩｇＧクラスのそれらが好適であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのＩｇＧクラスに属しているサブクラスのいずれか１つを使用することもできる。さらに、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それは、Ｉｇに属する任意の領域であってもよく、カッパクラス又はラムダクラスのそれらを使用することができる。キメラ抗体の生成方法は、当技術分野で周知である従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ら（１９８４）並びに特許文書米国特許第５，２０２，２３８号；及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照）。
【０１０５】
本発明のヒト化抗体は、前述の通りＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得、それらを、（ｉ）ヒト抗体のそれと同一の重鎖定常領域及び重鎖可変フレームワーク領域、並びに（ｉｉ）ヒト抗体のそれと同一の軽鎖定常領域及び軽鎖可変フレームワーク領域、をコードする遺伝子を有する発現ベクターに挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを適する細胞株に導入することによって遺伝子を発現させることによって生成することができる。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクターに存在するタイプ、又は両遺伝子が同じベクターに存在するタイプ（タンデムタイプ）であってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、細胞株への導入の容易さ、及び細胞株における抗体Ｈ及びＬ鎖の発現レベルの間の平衡に関しては、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例には、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などが含まれる。
【０１０６】
従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術に基づいて抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら１９８８年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ．ら１９８５年を参照）。抗体は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、ＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又はリサーフェイシング（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭら（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ  ＭＡ．ら（１９９４））、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。そのような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３及び国際公開第９６／０２５７６号を参照）。
【０１０７】
本発明のＦａｂは、ＡＭＨと特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、パパインによって処理することによって得ることができる。さらに、Ｆａｂは、原核生物の発現系又は真核生物の発現系のためのベクターの中に抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを挿入し、ベクターを原核生物又は真核生物（適宜）に導入してＦａｂを発現させることによって生成することができる。
【０１０８】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＡＭＨと特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、ペプシンによって処理して得ることができる。さらに、Ｆ（ａｂ’）２は、下記のＦａｂ’を結合チオエーテル結合又はジスルフィド結合を通して結合することによって生成することができる。
【０１０９】
本発明のＦａｂ’は、ＡＭＨと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトールによって処理して得ることができる。さらに、Ｆａｂ’は、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクターの中に抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを挿入し、ベクターを原核生物又は真核生物（適宜）に導入してその発現を実行することによって生成することができる。
【０１１０】
本発明のｓｃＦｖは、前述の通りＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクターの中にＤＮＡを挿入し、次に発現ベクターを原核生物又は真核生物（適宜）に導入してｓｃＦｖを発現させることによって生成することができる。
【０１１１】
ヒト化ｓｃＦｖ断片を作製するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用することができ、周知の技術は、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択すること、及び公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖ断片フレームワークの上へそれらを接ぐことを含む（例えば、国際公開第９８／４５３２２号；国際公開第８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第０１７３４９４号を参照）。
【０１１２】
本発明の工学操作抗体には、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬの中のフレームワーク残基に改変が加えられたものがさらに含まれる。一般的に、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために加えられる。例えば、１つのアプローチは、１つ又は複数のフレームワーク残基を対応する生殖細胞株配列に「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、その抗体が由来する生殖細胞株配列と異なるフレームワーク残基を含有することができる。抗体のフレームワーク配列を抗体が由来する生殖細胞株配列と比較することによって、そのような残基を同定することができる。それらの生殖細胞株構成にフレームワーク領域配列を戻すために、体細胞突然変異を、例えば部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖細胞株配列に「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異」した抗体も、本発明に包含されるものである。フレームワーク改変の別のタイプは、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低減するために、フレームワーク領域中の、又は１つ若しくは複数のＣＤＲ領域の中の１つ又は複数の残基さえも突然変異させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【０１１３】
Ｆｃ工学操作
本発明の抗体は、上記の態様の機能的若しくは構造的フィーチャーのうちの１つ若しくは複数によって、又は選択される機能的及び構造的フィーチャーの任意の組合せによって特徴付けることができる。
【０１１４】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプであってもよい。アイソタイプの選択は、ＡＤＣＣサイレンシングなどの所望のエフェクター機能によって一般的に導かれる。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、カッパ又はラムダ、のいずれも使用することができる。所望により、本発明の抗体のクラスは、公知の方法によってスイッチすることができる。一般的なクラススイッチング技術は、１つのＩｇＧサブクラスを別のものに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換するために使用することができる。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療的使用のために、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングによって変更することができる。一部の実施形態では、本発明の抗体は完全長抗体である。一部の実施形態では、完全長抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、完全長抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態では、ＢＴＮ２特異的ＩｇＧ４抗体は、安定化されたＩｇＧ４抗体である。好適な安定化されたＩｇＧ４抗体の例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の中の、上記のＫａｂａｔらにおけるようにＥＵインデックスで示される４０９位のアルギニンが、リシン、トレオニン、メチオニン又はロイシン、好ましくはリシンによって置換される（国際公開第２００６０３３３８６に記載される）、及び／又はヒンジ領域がＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む抗体である。他の好適な安定化されたＩｇＧ４抗体は、国際公開第２００８１４５１４２に開示される。
【０１１５】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない。用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖の、例えば、ヒトガンマ重鎖のアミノ酸（ａａ）約２３０からａａ約４５０のＣ末端断片、又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合α、δ、ε及びμ）におけるその対応物配列、又はその天然に存在するアロタイプを指す。特に明記しない限り、免疫グロブリンのための一般的に容認されたＫａｂａｔアミノ酸番号付けが、この開示全体で使用される（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照）。一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することが可能なＦｃドメインを含まない。一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを欠いている（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを欠いている）か、又はＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、単鎖抗体断片又は複数の異なる抗体断片を含む多重特異的抗体からなるか又はそれを含む。一部の実施形態では、本発明の抗体は、毒性部分に連結していない。一部の実施形態では、抗体が変化したＣ２ｑ結合及び／又は低減若しくは消滅した補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１つ又は複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載される。
【０１１６】
本発明によって企図される、本明細書の抗体の別の改変は、ペグ化である。抗体は、例えば抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化することができる。抗体をペグ化するには、１つ又は複数のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に付着する条件下で、抗体又はその断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と一般的に反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似した反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって実行することができる。本明細書で使用されるように、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれも、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを包含するものである。一部の実施形態では、ペグ化される抗体は、無グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号及びＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照。
【０１１７】
本発明によって企図される抗体の別の改変は、生じる分子の半減期を増加させるための、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン又はその断片とのコンジュゲート又はタンパク質融合である。
【０１１８】
一部の実施形態では、本発明は、多重特異的抗体も提供する。本発明の多重特異的抗体分子のための例示的なフォーマットには、限定されずに、（ｉ）化学的ヘテロコンジュゲーションによって架橋された２つの抗体、１つはＢＴＮ２に特異性を有し、もう１つは第２の抗原に特異性を有する；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一の抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域、例えば、余分のペプチドリンカーによって縦に連結される２つのｓｃＦｖを含む単鎖抗体；（ｉｖ）各軽鎖及び重鎖が短いペプチド連結を通して縦に並んでいる２つの可変ドメインを含有する二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（Ｗｕら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ、典拠：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（ｖ）化学的に連結された二重特異的（Ｆａｂ’）２断片；（ｖｉ）標的抗原の各々のための２つの結合部位を有する四価の二重特異的抗体をもたらす、２つの単鎖ダイアボディの融合であるＴａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）多価分子をもたらすダイアボディとのｓｃＦｖの組合せであるフレキシボディ；（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼＡの「二量体化及びドッキングドメイン」に基づくいわゆる「ドック及びロック」分子であって、Ｆａｂに適用したとき、異なるＦａｂ断片に連結される２つの同一のＦａｂ断片からなる三価二重特異的結合タンパク質を与えることができる、分子；（ｉｘ）例えばヒトＦａｂ腕の両末端に融合している２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるＳｃｏｒｐｉｏｎ分子；及び（ｘ）ダイアボディが含まれる。二重特異的抗体のための別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を促進する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。そのような分子は、公知の技術、例えば、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電気的にマッチさせた（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｏｍａｉｎボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）及びＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）技術として知られるものを使用して調製することができる。一部の実施形態では、二重特異的抗体は、一般的にＤｕｏＢｏｄｙ技術を使用して制御されたＦａｂ腕交換を通して得られるか又は得ることができる、重鎖及び軽鎖。制御されたＦａｂ腕交換により二重特異的抗体を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、国際公開第２００８１１９３５３及び国際公開第２０１１１３１７４６（両方ともＧｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓによる）に記載されている。国際公開第２００８１１９３５３に記載される、１つの例示的な方法では、二重特異的抗体は、還元条件下のインキュベーションの後に、両方ともＩｇＧ４様ＣＨ３領域を含む２つの単一特異的抗体の間での「Ｆａｂ腕」又は「��分子」交換（重鎖及び付着軽鎖のスワッピング）によって形成される。結果として生じる生成物は、異なる配列を含むことができる２つのＦａｂ腕を有する、二重特異的抗体である。国際公開第２０１１１３１７４６に記載される、別の例示的な方法では、本発明の二重特異的抗体は、第１及び第２抗体の少なくとも１つが本発明の抗体である、以下のステップを含む方法によって調製される：ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供するステップであって、前記Ｆｃ領域は第１のＣＨ３領域を含むステップ；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供するステップであって、前記Ｆｃ領域は第２のＣＨ３領域を含み；前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域の間のヘテロダイマー相互作用が前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモダイマー相互作用の各々より強力であるようなものであるステップ；ｃ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に還元条件下でインキュベートするステップ；並びに、ｄ）前記二重特異的抗体を得るステップであって、第１の抗体は本発明の抗体であり、第２の抗体は異なる結合特異性を有するか又はその逆であるステップ。還元条件は、例えば２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンから選択される還元剤を例えば加えることによって提供することができる。ステップｄ）は、例えば脱塩することによる例えば還元剤の除去によって、条件を非還元性に又はより低い還元性になるように回復することをさらに含むことができる。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、少数のかなり保存的な非対称の突然変異だけを含み、そのため、前記第１及び第２のＣＨ３領域の間のヘテロダイマー相互作用は前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモダイマー相互作用の各々より強力である。これらの相互作用及びそれらをどのように達成することができるかに関するさらなる詳細は、ここに参照により完全に組み込まれる、国際公開第２０１１１３１７４６に提供される。以下のものは、任意選択で片方又は両方のＦｃ領域がＩｇＧｌアイソタイプである、そのような非対称の突然変異の組合せの例示的な実施形態である。
【０１１９】
発明の使用及び方法
本発明の抗体又はタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、様々な障害を治療、予防又は診断するために、培養、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、又は対象、例えばｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞に投与することができる。
【０１２０】
本方法は、ＢＴＮ２関連の障害及び／又は自己免疫性、炎症性障害、及び移植拒絶反応を治療、予防又は診断するために特に好適である。
【０１２１】
本開示は、炎症性状態、自己免疫性疾患及び臓器又は組織移植拒絶反応の治療で使用するための医薬を製造する方法にも関係し、前記医薬は、以前のセクションに記載の通りに、本開示の抗ＢＴＮ２抗体を含む。
【０１２２】
本明細書で使用されるように、「ＢＴＮ２関連の障害」は、異常なＢＴＮ２Ａ１若しくはＢＴＮ２Ａ２レベルに関連するか若しくはそれによって特徴付けられる状態、及び／又はヒト血液細胞におけるＢＴＮ２Ａ１及び／若しくはＢＴＮ２Ａ２によって誘導されるシグナル伝達活性を、例えば、活性化Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞のＩＦＮγ若しくはＴＮＦαの生成及び／又は活性化Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解性機能を阻害することによってモジュレートすることによって治療することができる疾患若しくは状態を含む。これらには、炎症性状態、自己免疫性疾患及び臓器又は組織移植拒絶反応が含まれる。
【０１２３】
治療することができる自己免疫性疾患の例には、限定されずに、関節リウマチ（ＲＡ）、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、無形成性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性の白血球減少、特発性血小板減少性紫斑病、雄不妊症、混合結合組織疾患、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、強直人間症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎及びヴェーゲナー肉芽腫症が含まれる。
【０１２４】
本発明の抗体は、唯一の有効成分として、又は、他の薬物、例えば上で指摘した疾患の治療又は予防のための、例えば免疫抑制若しくは免疫調節剤又は他の抗炎症剤と併用して、例えばアジュバントとして、又は組合せにより投与することができる。
【０１２５】
本発明の目的は、対象において免疫応答を阻害する、特にそれを必要とする対象においてＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解特性を阻害する方法であって、本発明の抗体の治療的有効量を対象に投与することを含む方法に関する。
【０１２６】
本明細書で使用されるように、用語「処置」又は「処置する」は、疾患になる危険があるか又は疾患になったことが疑われる対象、並びに病気であるか又は疾患若しくは医学的状態を患っていると診断された対象の処置を含む、予防的又は予防上の処置並びに治療的又は疾患改変処置の両方を指し、臨床上の再発の抑制を含む。処置は、障害若しくは再発障害の１つ又は複数の症状の予防、治癒、その発症の遅延、重症度の軽減若しくは改善のために、又はそのような処置の不在下で予想されるものを越える対象の生存期間の延長のために、医学的障害を有するか又は最終的に障害を得るかもしれない対象に投与することができる。「治療レジメン」は、病気の処置パターン、例えば、療法の間に使用される投与パターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含むことができる。語句「導入レジメン」又は「導入期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に対象に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは（一部又は完全に）「負荷レジメン」を用いることができ、負荷レジメンは、維持レジメンの間に医師が用いるより大きな用量の薬物を投与すること、維持レジメンの間に医師が薬物を投与するより頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含むことができる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、例えば対象を長期間（数カ月又は数年）寛解状態に保つために、病気の処置の間に対象の維持のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンでは、連続療法（例えば、定期的間隔、例えば毎週、毎月、毎年等に薬物を投与する）又は間欠療法（例えば、断続処置、間欠処置、再発時の処置、又は特定の所定基準［例えば、疾患徴候等］の達成後の処置）を用いることができる。
【０１２７】
本明細書で使用されるように、用語「治療的有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な、投薬量及び期間における有効な量を指す。本発明の抗体の治療的有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重、並びに個体で所望の応答を導き出す本発明の抗体の能力などの因子によって異なってもよい。さらに、治療的有効量は、抗体又は抗体部分のいかなる毒性又は有害効果よりも治療的に有益な効果が上回るものである。本発明の抗体のための効率的な投薬量及び投薬レジメンは、処置すべき疾患又は状態に依存し、当業者が決定することができる。当技術分野の医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師は、医薬組成物で用いられる本発明の抗体の投与を、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものより低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適する用量は、特定の投薬レジメンにより治療効果をもたらすのに有効な最低用量である化合物の量になる。そのような有効用量は、上記の因子に一般的に依存する。例えば、治療的使用のための治療的有効量は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定することができる。一般的に、自己免疫性障害を治療する化合物の能力は、例えば、自己免疫性障害の治療における効能を予測する動物モデル系において評価することができる。或いは、組成物のこの特性は、当業者に公知であるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって免疫応答の誘導を阻害する化合物の能力を調べることによって評価することができる。治療的化合物の治療的有効量は、対象において免疫又は炎症性応答を低下させることができるか、さもなければ症状を改善することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度及び選択される特定の組成物又は投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができるだろう。本発明の抗体の治療的有効量の例示的で非限定的な範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５、例えば約０．３、約１、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇである。本発明の抗体の治療的有効量の例示的で非限定的な範囲は、０．０２〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０２〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜３ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜２ｍｇ／ｋｇである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下であってもよく、例えば、標的部位の近位に投与されてもよい。治療及び使用の上の方法における投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように構成される。例えば、単一のボーラスを投与することができるか、いくつかの分割用量を経時的に投与することができるか、又は治療状況の緊急性によって指示される通りに用量をそれ相応に低減若しくは増加させることができる。一部の実施形態では、治療の効能は、療法の間、例えば予め規定された時点でモニタリングされる。一部の実施形態では、効能は、疾患領域の可視化によって、又は本明細書にさらに記載される他の診断方法により、例えば本発���の標識抗体、本発明の抗体から誘導される断片若しくはミニ抗体を使用して、例えば１つ又は複数のＰＥＴ−ＣＴスキャンを実行することによってモニタリングすることができる。所望により、医薬組成物の有効日用量を、任意選択で単位剤形により、１日を通して適当な間隔で別々に投与される、２、３、４、５、６又はそれより多くの下位用量として投与してもよい。一部の実施形態では、いかなる望ましくない副作用も最小にするために、本発明のヒトモノクローナル抗体は、長期にわたる、例えば２４時間を超える遅い連続注入によって投与される。本発明の抗体の有効用量は、週ごと、隔週又は３週ごとの投与期間を使用して投与することもできる。投与期間は、例えば、８週、１２週に、又は臨床上の進行が確立されるまで制限することができる。非限定的な例として、本発明による治療は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０日目のうちの少なくとも１日に、或いは、治療開始後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０週目のうちの少なくとも１つの週に、本発明の抗体の１日につき約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の日投薬量で、又は、単一用量若しくは２４、１２、８、６、４若しくは２時間おきの分割用量を使用したその任意の組合せで、又はその任意の組合せで提供することができる。
【０１２８】
一般的に、本発明の抗体は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形で対象に投与される。これらの組成物において使用することができる薬学的に許容される担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及びラノリンが限定されずに含まれる。患者への投与で使用するために、組成物は患者への投与のために製剤化される。本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入噴霧剤により、局所的、直腸、経鼻的、口腔内、経膣的、又は植え込まれたレザバーを通して投与することができる。本明細書で使用されるものには、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術が含まれる。本発明の組成物の無菌の注射可能な形態は、水性又は油性の懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、適する分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して公知の技術によって製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のように、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液及び等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒として従来用いられている。この目的のために、合成のモノ−又はジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油又はヒマシ油のように、注射剤の調製において有益である。これらの油溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース又は乳剤及び懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤において一般的に使用される類似の分散剤を含有することもできる。他の一般的に使用される界面活性剤、例えば薬学的に許容される固体、液体又は他の剤形の製造において一般的に使用されるＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ及び他の乳化剤又は生物学的利用能エンハンサーを、製剤目的のために使用することもできる。本発明の組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液又は溶液を限定されずに含む任意の経口的に許容される剤形で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤も一般的に添加される。カプセル剤形での経口投与のために、有益な希釈剤には、例えばラクトースが含まれる。水性懸濁液が経口使用のために要求される場合、有効成分は乳化剤及び懸濁剤と組み合わされる。所望により、ある特定の甘味料、香料又は着色剤を添加することもできる。或いは、本発明の組成物は、直腸投与のために坐薬の形で投与することができる。これらは、室温で固体であるが直腸温度で液体であり、したがって直腸の中で融解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって調製することができる。そのような材料には、カカオバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。本発明の組成物は、特に治療の標的が、目、皮膚又は下部腸管の疾患を含め、局所適用によって容易にアクセス可能な領域又は臓器を含む場合、局所的に投与することもできる。これらの領域又は臓器の各々のために、好適な局所製剤が容易に調製される。局所適用のために、組成物は、１つ又は複数の担体に懸濁又は溶解される活性構成成分を含有する好適な軟膏に製剤化することができる。本発明の化合物の局所投与のための担体には、限定されずに、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋及び水が含まれる。或いは、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体に懸濁又は溶解される活性構成成分を含有する、好適なローション又はクリームに製剤化することができる。好適な担体には、限定されずに、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が含まれる。下部腸管のための局所適用は、直腸座薬製剤（上を参照）又は好適な浣腸製剤で実行することができる。パッチを使用することもできる。本発明の組成物は、経鼻エアゾール又は吸入によって投与することもできる。そのような組成物は医薬製剤分野で周知の技術により調製され、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、生物学的利用能を強化する吸収促進剤、フルオロカーボン及び／又は他の従来の可溶化若しくは分散剤を用いる生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【０１２９】
例えば、本発明の医薬組成物に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアル中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。生産品は、ＩＶ投与のために、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び無菌注射用水で製剤化される。ｐＨは、６．５に調整される。本発明の医薬組成物中の抗体のための例示的な好適な投薬量範囲は、約１ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２であってもよい。しかし、これらのスケジュールは例示的であり、臨床治験において決定されなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性及び耐容性を考慮して最適なスケジュール及びレジメンを構成することができることが理解される。注射（例えば、筋肉内、ｉ．ｖ．）のための本発明の医薬組成物は、無菌の緩衝水（例えば、筋肉内の場合１ｍｌ）、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、より好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗ＢＴＮ２抗体を含有するように調製することができるかもしれない。
【０１３０】
本発明は、以下の図面及び実施例でさらに例示される。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上のＢＴＮ２  ｍＡｂの結合を示す図。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＢＴＮ２Ａ２−Ｆｌａｇプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後に、ＢＴＮ２Ａ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ａ）及びトランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｂ）を、４℃で２０分間、精製されたマウス抗ヒトＢＴＮ２  ｍＡｂで染色した。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体は、トランスフェクションのための陽性対照の役目をする。２回の洗浄の後、細胞を４℃で２０分間、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＰＥと、及び細胞生存度のためのマーカーとインキュベートした。細胞をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）の上で得、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。
【図２】ＢＴＮ２は、がん細胞株の上で発現されることを示す図。固形腫瘍（Ａ）又は造血悪性腫瘍（Ｂ）から導かれたがん細胞株を、４℃で２０分間、精製されたＢＴＮ２（８．１６）ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で染色した。２回の洗浄の後、細胞を４℃で２０分間、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＰＥと、及び細胞生存度のためのマーカーとインキュベートした。細胞をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）の上で得、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。細胞株を、以下から誘導した：前立腺がん（ＰＣ３、ＤＵ１４５ＬＮＣａＰ）、メラノーマ（Ｇｅｒｌａｃｈ）、膵臓がん（Ｌ−ＩＰＣ、Ｐａｎｃ−１、Ｍｉａ−ＰＡＣＡ−２）、結腸直腸がん（Ｃａｃｏ−２）、Ｈｅｌａ（子宮頸がん）、腎臓がん（Ａ４９８）、肺がん（Ａ５４９）、乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ３）、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ）、非ホジキンリンパ腫（ＲＬ）、慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２）、急性骨髄性白血病（Ｕ９３７）。
【図３】ＢＴＮ２  ｍＡｂは、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害することを示す図。６人の健康なドナーのＰＢＭＣから、γδ−Ｔ細胞を増大させた（材料及び方法を参照）。精製されたγδ−Ｔ細胞を、ＩＬ−２（２００ＵＩ／ｍｌ）の中で一晩刺激した。次に、γδ−Ｔ細胞を、抗ＢＴＮ２（４．１５、５．２８、７．２８、７．４８、８．１５、８．１６、８．３３）ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の有る無しで、抗ＣＤ１０７ａ及び抗ＣＤ１０７２抗体及びＧｏｌｇｉｓｔｏｐと一緒に、Ｄａｕｄｉ標的細胞株と３７℃で共培養した（１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比）。４時間後、細胞を収集し、固定し、透過性にし、次に細胞内ｍＡｂ（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図は、（Ａ）γδ−Ｔ細胞の脱顆粒、及び炎症性サイトカイン（Ｂ）ＴＮＦ−α、（Ｃ）ＩＦＮ−γの生成を示す。下の破線は、Ｄａｕｄｉ細胞株に対するγδ−Ｔ細胞の基礎的細胞溶解機能を表す。
【図４】ＢＴＮ２  ｍＡｂは、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能に及ぼす抗ＣＤ２７７（２０．１）ｍＡｂのアゴニスト効果を阻害することを示す図。精製されたγδ−Ｔ細胞を、ＩＬ−２（２００ＵＩ／ｍｌ）の中で一晩刺激した。次に、γδ−Ｔ細胞を、抗ＣＤ２７７  ２０．１ｍＡｂと組み合わせて又は組み合わせずに、抗ＢＴＮ２（４．１５、５．２８、７．２８、７．４８、８．１５、８．１６、８．３３）ｍＡｂの有る無しで、抗ＣＤ１０７ａ及び抗ＣＤ１０７２抗体及びＧｏｌｇｉｓｔｏｐと一緒に、Ｄａｕｄｉ標的細胞株と３７℃で共培養した（１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比）。４時間後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。図は、γδ−Ｔ細胞の間でのＣＤ１０７（脱顆粒マーカー）陽性細胞の百分率を示す。下の破線は、Ｄａｕｄｉ細胞株に対するγδ−Ｔ細胞の基礎的脱顆粒を表す。上の破線は、抗ＣＤ２７７  ２０．１抗体で観察された中間の脱顆粒を表す。
【図５】ＢＴＮ２  ｍＡｂは、ＣＤ２７７アイソフォーム（ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞と交差反応しないことを示す図。ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞及びトランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、精製されたマウス抗ヒトＢＴＮ２  ｍＡｂによって、又はマウス抗ヒトＣＤ２７７  ２０．１ｍＡｂによって、又はアイソタイプ対照ＩｇＧ１によって、４℃で２０分間染色した。抗Ｆｌａｇは、トランスフェクションのための陽性対照の役目をする。２回の洗浄の後、細胞を４℃で２０分間、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＰＥと、及び細胞生存度のためのマーカーとインキュベートした。細胞をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）の上で得、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。
【実施例】
【０１３２】
材料及び方法
細胞培養
地元の血液銀行（ＥＦＳ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された健康なボランティアドナー（ＨＶ）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、密度勾配（Ｅｕｒｏｂｉｏ）によって単離した。
【０１３３】
バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉをアメリカ基準株保存機構から得、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した（０．５×１０６／ｍＬ）。
【０１３４】
γδ−Ｔ細胞の増大
エフェクターγδ−Ｔ細胞を、前述の通り確立した。０日目に、ＨＶからのＰＢＭＣを、Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ（Ｓｉｇｍａ、１μＭ）及びｒｈＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、２００ＩＵ／ｍＬ）で刺激した。５日目からｒｈＩＬ−２を２日ごとに更新し、細胞を１５日間１．１５×１０６／ｍＬに保った。最終日に、γδＴ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した。８０％を超えるγδＴ細胞に到達した細胞培養だけを、機能試験において使用するために選択した。精製されたγδ−Ｔ細胞は、使用時までに解凍した。
【０１３５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成
マウス抗ヒトＢＴＮ２抗体（ＩｇＧ１アイソタイプによるクローン４．１５、５．２８、７．２８、７．４８、８．１５、８．１６、８．３３）及びマウス抗ヒトＣＤ２７７（別名ＢＴＮ３Ａ；ＩｇＧ１アイソタイプによるクローン２０．１）を、細胞培養上清から精製した。
【０１３６】
フローサイトメトリー
ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での分析の前に、ＰＢＭＣ、精製されたγδ−Ｔ細胞又は腫瘍細胞株を指定されたｍＡｂとインキュベートした。γδ−Ｔ細胞脱顆粒アッセイのために使用した抗体は、以下の通りであった：抗ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１０７ｂ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ３−ＰｅＶｉｏ７００（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗Ｔｇｄ−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、生／死  近ＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。腫瘍細胞株の上でのＢＴＮ２発現のスクリーニングのために使用した抗体は、以下の通りであった：精製された抗ＢＴＮ２（クローン８．１６、１０μｇ／ｍｌ）、ＦｃＲブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ヤギ抗マウス−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、生／死  近ＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。
【０１３７】
γδ−Ｔ細胞での機能的アッセイ
ＨＶからの精製されたγδ−Ｔ細胞を、ＩＬ−２（２００ＵＩ／ｍｌ）の中で一晩培養した。次に、γδ−Ｔ細胞をＤａｕｄｉ標的細胞株と３７℃で共培養し（１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比）、抗ＢＴＮ２（４．１５、５．２８、７．２８、７．４８、８．１５、８．１６、８．３３）ｍＡｂ及び／又は抗ＣＤ２７７  ２０．１ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の有る無しで、ホスホアゴニスト（Ｐａｇ）による活性化の有る無しで、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及び可溶性抗ＣＤ１０７（ａ＆ｂ）−ＦＩＴＣの存在下で細胞傷害試験を４時間アッセイで実行した。４時間後、細胞を収集し、固定し、透過性にし、次に細胞内ｍＡｂ（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）で染色した。最後に、細胞をＰＢＳ２％パラホルムアルデヒドに再懸濁させ、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で即座に分析した。γδ−Ｔ細胞の細胞溶解性機能の程度は、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂ（脱顆粒）に陽性の細胞の百分率及び／又は炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）の生成に基づいて測定した。
【０１３８】
ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２発現細胞での抗ＢＴＮ２  ｍＡｂの結合試験
ＢＴＮ３及びＢＴＮ２の全てのアイソフォームのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介欠失を有するＨＥＫ−２９３Ｆ細胞（２９３Ｆ  ＢＴＮ３／ＢＴＮ２  ＫＯ）を作製し（データ示さず）、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２  ＣＦＰ（Ｎｔｅｒ）融合タンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３−Ｚｅｏ−ＢＴＮ２Ａ１−ＣＦＰ又はｐｃＤＮＡ３−Ｚｅｏ−ＢＴＮ２Ａ２−ＣＦＰで独立してトランスフェクトした。
【０１３９】
フローサイトメトリー
トランスフェクションの２４時間後に、細胞（５×１０４／試料）を収集し、４℃で３０分間、５０μＬの染色緩衝液（ＤＰＢＳ１Ｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１％ＦＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の中の全ての７つの精製された抗ヒトＢＴＮ２  ｍＡｂの示された濃度（２０μｇ／ｍＬから６４ｐｇ／ｍＬまで２倍希釈）により２反復で染色した。染色のためのアイソタイプ対照として、マウスＩｇＧ１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の等濃度を使用した。次に、２００μＬの染色緩衝液で細胞を２回洗浄し、暗所において４℃で３０分間、染色緩衝液中の１：２００希釈のヤギ抗マウスＩｇ−ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートした。最後に、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、その後製造業者の説明書に従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して固定した。各試料のためにＣＦＰ陽性の集団内のＰＥチャネルでの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＣｙｔｏｆｌｅｘ  ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で調査し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０．４．２ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ  ２００６−２０１８）で分析した。
【０１４０】
統計
ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２でトランスフェクトした２９３Ｆ  ＢＴＮ３／ＢＴＮ２  ＫＯ細胞での精製された抗ヒトＢＴＮ２  ｍＡｂのＥＣ５０は、可変勾配モデルに従う非線形回帰の後のｌｏｇ（用量）応答曲線に基づいて決定した。これらの分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して実行した。
【０１４１】
γδ−Ｔ細胞の増殖
抗ＴＣＲγδミクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なドナーのＰＢＭＣからγδ−Ｔ細胞を単離した。フローサイトメトリーによって調査したγδ−Ｔ細胞の純度は、８０％より高かった。３７℃で２０分間、γδ−Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットで標識した。次に、Ｐａｇの有る無しで、及び抗ＢＴＮ２抗体（１０μｇ／ｍｌ）の有る無しで、５．１０５のＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識細胞を２００ＵＩ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で９６ウェル丸底プレートの中で培養した。培養の５日後に、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈を、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でのフローサイトメトリーによって評価した。
【０１４２】
統計
結果は、中央値±ＳＥＭで表す。統計分析は、スピアマン相関、ウィルコクソン検定及びマン−ホイットニーｔ検定を使用して実行した。ｐ値＜０．０５は、有意であると考えた。分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを使用して実行した。
【０１４３】
結果
参照抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ７の同定
参照抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ７は、以下の通りに得られた：
マウスを、ＢＴＮ２Ａ１−Ｆｃ抗原で免疫化した。マウスの脾細胞を収集し、骨髄腫と融合してハイブリドーマを得た。ＢＴＮ２と最も高い親和性を有する抗体を生成するハイブリドーマをスクリーニング及び単離し、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ７をそれぞれ生成することができる、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３１、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３２、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３３、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３４、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３５、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３６及びＣＮＣＭ  Ｉ−５２３７の下で寄託されたハイブリドーマを与えた。
【０１４４】
本開示による抗体のための比較対照の役目をするｍＡｂ７（ｍＡｂ８．３３）を生成するハイブリドーマは、２０１７年９月１４日に、ブダペスト条約の条項に従ってＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅｓ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された。
【０１４５】
ｍＡｂ  ８．３３のための寄託されたハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２３７を有する。
【０１４６】
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上のｍＡｂ１〜６の結合
図１のグラフは、ヒトＢＴＮ２Ａ２（図１Ａ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞又はトランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３Ｆ細胞（図１Ｂ）の上での、マウス抗ヒトＢＴＮ２  ｍＡｂの親和性の滴定曲線を示す。
【０１４７】
各抗体のＥＣ５０を、下の表に示す。試験した全ての抗体は、フローサイトメトリーにより、ＢＴＮ２Ａ２に結合しないｍＡｂ  ８．３３（ｍＡｂ７）以外は、ＨＥＫ細胞の上のＢＴＮ２Ａ２を認識して結合することができた。
【０１４８】
【表４】
2020536581.tif 000005
【０１４９】
ＢＴＮ２ポリペプチドは、がん細胞株の上で発現される。
【０１５０】
腫瘍細胞株をｍＡｂ６（マウス抗ヒトＢＴＮ２  ｍＡｂ８．１６）と、次に二次ヤギ抗マウス−ＰＥとインキュベートした。図Ａに示すように、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞脱顆粒アッセイで使用された標準細胞株であるＤａｕｄｉ細胞株（バーキットリンパ腫）を含めて、固形腫瘍又は造血悪性腫瘍から導かれた一団の腫瘍細胞株の上でＢＴＮ２タンパク質の広い発現が観察された。
【０１５１】
ｍＡｂ１〜６は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する。
【０１５２】
健康なドナーのＰＢＭＣから、精製されたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を増大させた。Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を、Ｄａｕｄｉ標的細胞と共培養した。図３に示すように、抗ＢＴＮ２  ｍＡｂ１〜６の添加は、ＣＤ１０７脱顆粒として測定したときにＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能の阻害、及びＤａｕｄｉ標的細胞株に対する炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）の生成につながる。
【０１５３】
フローサイトメトリーによりＢＴＮ２Ａ２に結合しない対照抗体ｍＡｂ７（ｍＡｂ８．３３）は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞脱顆粒（細胞溶解機能）にも炎症性サイトカインの生成にも効果を及ぼさない。
【０１５４】
抗ＣＤ２７７  ２０．１アゴニスト抗体はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞脱顆粒の活性化抗体の対照例の役目をし、抗ＣＤ２７７  １０３．２アンタゴニスト抗体はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞脱顆粒の阻害抗体の対照例の役目をする。
【０１５５】
ｍＡｂ１〜６は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能に及ぼす抗ＣＤ２７７（２０．１）ｍＡｂのアゴニスト効果を阻害する。
【０１５６】
我々は、（国際公開第２０１２／０８０３５１に開示されるように）及びＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の脱顆粒を増加させることが知られている、アゴニスト抗ＣＤ２７７  ２０．１ｍＡｂの存在下での抗ＢＴＮ２  ｍＡｂ１〜６の組合せの効果も試験した。
【０１５７】
図４に示すように、ｍＡｂ  １、２及び４（それぞれ、抗ＢＴＮ２  ｍＡｂ  ４．１５、５．２８、７．４８）は、驚くべきことに、Ｄａｕｄｉ標的細胞株に対するＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能に及ぼす抗ＣＤ２７７  ２０．１抗体のアゴニスト効果を阻害する。
【０１５８】
ｍＡｂ  ５及び６（それぞれ、抗ＢＴＮ２  ８．１５、８．１６）は、Ｄａｕｄｉ標的細胞株に対するＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能に及ぼす抗ＣＤ２７７  ２０．１抗体のアゴニスト効果を部分的に阻害する。
【０１５９】
ｍＡｂ３（抗ＢＴＮ２  ７．２８）及びｍＡｂ７（抗ＢＴＮ２  ８．３３）は、Ｄａｕｄｉ標的細胞株に対するＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能に及ぼす抗ＣＤ２７７  ２０．１抗体のアゴニスト効果の有意な阻害を示さない。
【０１６０】
アンタゴニスト１０３．２及びアゴニスト２０．１抗ＣＤ２７７の組合せは対照の役目をする：上述のように、アンタゴニスト１０３．２抗体は、Ｄａｕｄｉ標的細胞株に対するＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能に及ぼす２０．１抗体のアゴニスト効果を阻害する。
【０１６１】
ｍＡｂ  １〜６（及び、対照ｍＡｂ  ７）の特徴付けの結果は、以下要約される：
【０１６２】
【表５】
2020536581.tif 000006
ｍＡｂ１〜６は、ＣＤ２７７アイソフォーム（ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞と交差反応しない。
【０１６３】
ＣＤ２７７のアイソフォーム（ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３）のいずれか１つでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上のＢＴＮ２  ｍＡｂの結合は、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３Ｆ細胞で観察されたものと類似している（図５を参照）。抗ＢＴＮ２ｍＡｂは、ＣＤ２７７のアイソフォームの１つと交差反応しないと結論付けることができる。
【０１６４】
ｍＡｂ１〜６は、ヒトＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２アイソフォームと結合特異性を有する。
【０１６５】
ＢＴＮ３／ＢＴＮ２  ＫＯ  ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上でのｍＡｂ  １〜６の結合。
【０１６６】
ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２の上の各抗体のＥＣ５０は、下の表に示す。フローサイトメトリーで染色を示さないｍＡｂ８．３３（ｍＡｂ７）を除いて、試験した全ての抗ＢＴＮ２抗体は、両アイソフォームに結合することができた。
【０１６７】
【表６】
2020536581.tif 000007
【０１６８】
【表７】
2020536581.tif 000008
【０１６９】
【表８】
2020536581.tif 000009
【０１７０】
【表９】
2020536581.tif 000010
【０１７１】
【表１０】
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【０１７２】
【表１１】
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【０１７３】
【表１２】
2020536581.tif 000013
【０１７４】
【表１３】
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【０１７５】
【表１４】
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【０１７６】
【表１５】
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【０１７７】
【表１６】
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【０１７８】
【表１７】
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【０１７９】
【表１８】
2020536581.tif 000019
【０１８０】
【表１９】
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【０１８１】
【表２０】
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【０１８２】
【表２１】
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【０１８３】
【表２２】
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【０１８４】
【表２３】
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【０１８５】
【表２４】
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【０１８６】
【表２５】
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【０１８７】
参考文献：
本出願全体で、様々な参考文献が本発明が関係する分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、これにより参照により本開示に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020536581.tif 000033
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