(57)【要約】  本発明は、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅させる培養システムとその方法、造血幹細胞、造血前駆細胞に関連するものである。この培養システムに、幹細胞の増幅に適する基礎培地と、JNKシグナル伝達の抑制剤が含まれる。本発明が提供する培養システムは、体外で造血幹細胞を増幅させることができる。その効果は明らかで、CD 34+CD 45 RA-の造血幹細胞を100倍近くまで増幅させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の増幅に適する基礎培地と、JNKシグナル伝達の抑制剤を含むことを特徴とする造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅させる培養システム。
【請求項２】
JNKシグナル伝達の抑制剤は、JNK 1抑制剤・JNK 2抑制剤・JNK 3抑制剤のうちの1つ又は幾つかから選択されることを特徴とする請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
JNKシグナル伝達の抑制剤は、SP600125・AS601245・AEG-3482のうちの1つ又は幾つかから選択されることを特徴とする請求項１に記載の培養システム。
【請求項４】
JNKシグナル伝達の抑制剤は、次のJNK-IN-1からJNK-IN-12のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の培養システム。
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【請求項５】
基礎培地に基礎培地stemspanが1〜100 ml、組換えヒト幹細胞因子が10-500 ng/ml、Flat 3リガンドが10-100 ng/ml、組換えヒトトロンボポエチンが5-100 ng/ml、低密度リポタンパク質が2-10μg/ml、JNKシグナル伝達抑制剤が0.5-10μM含まれることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の培養システム。
【請求項６】
JNKシグナル伝達抑制剤が存在する状況で、体外で造血幹細胞及び/或いは造血前駆細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅させる方法。
【請求項７】
JNKシグナル伝達の抑制剤が、JNK 1抑制剤・JNK 2抑制剤・JNK 3抑制剤のうちの1つ又は幾つかから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
JNKシグナル伝達の抑制剤が、SP600125・AS601245・AEG-3482のうちの1つ又は幾つかから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
JNKシグナル伝達の抑制剤が、次のJNK-IN-1からJNK-IN-12のいずれかであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
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【請求項１０】
基礎培地stemspanと組換えヒト幹細胞因子、Flat 3リガンド、組換えヒトトロンボポエチン、低密度リポタンパク質の添加が伴うことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞が、骨髄、肝臓、脾臓、末梢血か臍帯血に由来することを特徴とする請求項６〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜５の何れか一項に記載の培養システムによる増幅で得られるか、請求項６〜１０の何れか一項に記載の方法による増幅で得られることを特徴とする一種の造血幹細胞。
【請求項１３】
請求項１〜５の何れか一項に記載の培養システムによる増幅で得られるか、請求項６〜１０の何れか一項に記載の方法による増幅で得られることを特徴とする一種の造血前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にバイオテクノロジーと医学分野に関連し、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅させる培養システムとその方法と、造血幹細胞と造血前駆細胞と具体的に関連する。
【０００２】
発明の背景
造血幹細胞は、自己複製能と多分化能を有し、体内で長期(最低4ヶ月)的に血液再生を行える血液幹細胞である。造血前駆細胞は造血幹細胞と比べ、再生機能が弱く、体内での再生を長期的に維持することができず、2ヶ月以内に再生した細胞が徐々になくなるのは普通である。1961年、科学者はマウス体内での脾臓結節法で、初めて造血幹細胞の存在を証明した。その後、アメリカのWeissmanといった幾つもの研究所は、造血幹細胞の表面マーカーに対する研究と機能検証で、人々の造血幹細胞に対する認識を深めさせた。現在、CD 34+CD 45 RA-を表面マーカーとする細胞には、造血幹・前駆細胞(造血幹細胞と造血前駆細胞)がたくさん含まれていると初歩的に判断できる。CD 34+CD 38-CD 90+CD 45 RA-CD 49 f+をマーカーとする細胞は、長期的な血液再生機能を持つ造血幹細胞(LT-HSC)だと考えられている。
【０００３】
白血病といった血液疾患の臨床治療において、造血幹細胞の移植は一番効果的な方法だが、骨髄ドナーを探すのが難しいといった原因で、約40%の患者は治療を受けられずにいる。臍帯血に含まれる造血幹細胞には免疫原性が低いといった多くの利点はあるものの、その数には限りがある。そのため、如何にして臍帯血由来の造血幹細胞を体外で効果的に増幅させることには、大きな科学的研究と臨床応用の価値がある。
【０００４】
N末端キナーゼ(c-Jun N-terminal kinase，JNK)一族は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(mitogen-activated protein kinase，MAPK)というスーパーファミリーの一員である。現在、哺乳類動物細胞で発見したコードがJNKの遺伝子に、jnk1、jnk2、jnk3が含まれている。それに対応してJNK1とJNK2というコード番号で表す物の範囲は広いが、JNK3は主に神経系統に使われている。JNKを中枢とするJNKシグナル伝達経路は、MAPK(mitogen-activated protein kinase、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ)経路の重要な分枝の1つで、1991年に発見されて以来、科学者で幅広い注目を集めたが、MAPK経路の別の亜型であるP 38とERKと比べると、それに関する研究は少なかった。JNKシグナル伝達経路は、細胞分化や細胞死、ストレス反応といった多くの細胞制御において重要な役割を果たしている。大量の実験結果により、JNKシグナル伝達経路は多くの疾患と深い関わりを持っていることが分かった。そのため、JNKシグナル伝達の抑制は、多くの疾患にとって治療手段の1つとなっている。JNKシグナル伝達抑制剤は、主に様々ながん細胞の研究に用いられている。報告によると、JNK抑制剤はモデルマウスの膀胱がんと肺がんの細胞増殖を抑制することができた上、腫瘍が明らかに小さくなっていくと観測できるそうだ。更に、JNKシグナル伝達抑制剤は、多能性幹細胞の自己複製と分化を制御することにおいても重要な役割を果たしている。2014年、Jacob Hanna研究所は、(JNK抑制剤であるSP 600125を含む)低分子化合物を使い、多能性幹細胞をより原始的な状態に保って、キメラ胚の融合能力を高めたとNature誌が報じた。だが、今の所、低分子のJNK抑制剤を使ってヒト造血幹細胞を増幅させるという類の研究はまだ報告されていない。
【０００５】
低分子化合物は、分子量1000以下の天然分子の産物か人工合成の化合物であり、一定の生物機能を備えている。低分子には、細胞膜への浸透力が高く、合成が簡単で、細胞のゲノムを壊さないといった利点があるため、臨床研究で大変注目されている。プリン誘導体であるSteemRegenin(SR 1)化合物は、体外で造血幹・前駆細胞を大量に増幅させられる機能が2010年に発見された初めての低分子物質である。SR 1はAHRシグナル伝達を抑制することで、CD 34＋細胞を増幅させ、免疫力を持たないマウスの体内で体外由来の造血細胞は17倍増幅したという検査結果が出た。2014年、カナダの研究チームは、低分子のハイスループットスクリーニングを使った結果、ピリミジンインドール分子であるUM 171がLT-HSCを効果的に増幅させられることと、血液再生機能も6ヶ月まで保つことが分かり、臍帯血の造血幹細胞の臨床応用の価値と範囲を広げた。だが，低分子化合物が作用する標的が多くて、その作用のシグナル伝達経路が単一でないため、その臨床応用の規模が制限されてしまう可能性がある。
【０００６】
発明の内容
本発明の目的は、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞の培養システムとその方法、造血幹細胞と造血前駆細胞を提供することである。
【０００７】
本発明は、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅させる培養システムを提供する。その特徴は、幹細胞の増幅に適する基礎培地と、JNKシグナル伝達抑制剤が含まれることである。そのJNKシグナル伝達抑制剤は、低分子化合物が好ましい。
【０００８】
好ましい選択として、前述の培養システムに使われるJNKシグナル伝達抑制剤は、JNK 1抑制剤・JNK 2抑制剤・JNK 3抑制剤のうちの1つ又は幾つかから選ばれる。
【０００９】
好ましい選択として、前述の培養システムに使われるJNKシグナル伝達抑制剤は、SP600125・AS601245・AEG-3482のうちの1つ又は幾つかから選ばれる。
【００１０】
その中、SP600125の化学構造式は次のようになっている。
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【００１１】
AS601245の化学構造式は次のようになっている。
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【００１２】
AEG-3482の化学構造式は次のようになっている。
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【００１３】
または、好ましい選択として、前述の培養システムに使われるJNKシグナル伝達抑制剤は、次のJNK-IN-1からJNK-IN-12のいずれかから選ばれる。
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【００１４】
上記のJNKシグナル伝達抑制剤は、Tinghu Zhang達の論文(CHN.Chem Biol.2012 Januar 27；19(1)：140-154)に基づいて構築される。
【００１５】
更に、好ましい選択として、前述の培養システムの基礎培地に、基礎培地stemspanが1〜100 ml、組換えヒト幹細胞因子(SCF)が10-500 ng/ml含まれること、Flat 3リガンド(FL)が10-100 ng/ml含まれ、ベストは50-100 ng/mlであること、組換えヒトトロンボポエチン(TPO)が5-100 ng/ml、低密度リポタンパク質(LDL)が2-10μg/ml含まれること、JNKシグナル伝達抑制剤が0.5-10μM含まれ、ベストは0.5-5μM含まれることである。
【００１６】
また、本発明は造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅させる方法をも提供する。その方法では、JNKシグナル伝達抑制剤が存在する状況で、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を体外で培養する。
【００１７】
好ましい選択として、前述の方法に使われるJNKシグナル伝達抑制剤は、JNK 1抑制剤・JNK 2抑制剤・JNK 3抑制剤のうちの1つ又は幾つかから選ばれる。
【００１８】
好ましい選択として、前述の方法に使われるJNKシグナル伝達抑制剤は、SP600125・AS601245・AEG-3482のうちの1つ又は幾つかから選ばれる。
【００１９】
好ましい選択として、前述の方法に使われるJNKシグナル伝達抑制剤は、次のJNK-IN-1からJNK-IN-12のいずれかから選ばれる。
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【００２０】
または、好ましい選択として、前述の方法には基礎培地stemspanと組換え・ヒト・幹細胞因子、Flat 3リガンド、組換えヒトトロンボポエチン、低密度リポタンパク質の添加が伴うことである。
【００２１】
更に、好ましい選択として、前述の方法に使われる造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞は、骨髄、肝臓、脾臓、末梢血か臍帯血に由来することである。
【００２２】
本発明では、造血幹細胞をも提供する。その造血幹細胞は、上記の培養システムか上記の方法による増幅で得られ、具体的には、臍帯血由来のCD 34＋細胞が上記の培養システムか上記の方法による増幅で作られる造血幹細胞である。
【００２３】
本発明では、造血前駆細胞をも提供する。その造血前駆細胞は、上記の培養システムか上記の方法による増幅で得られ、具体的には、臍帯血由来のCD 34＋細胞が上記の培養システムか上記の方法による増幅で作られる造血前駆細胞である。
【００２４】
本発明が提供する培養システムは、体外で造血幹細胞を増幅させることができる。その効果は明らかで、CD 34+CD 45 RA-の造血幹細胞を100倍近くまで増幅させることができる。
【００２５】
本発明が提供する培養システムとその増幅方法で、明確な標的を持つ低分子化合物を使うため、臨床使用はより安全になる。
【００２６】
本発明が提供する培養システムで増幅させた造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞は、より良い体内再生機能を有し、低分子化合物を加えていなかった試料と比べ、体内再生効果は10倍高められている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1は実施例1で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図２】図2は実施例1の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図３】図3は実施例1の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【図４】図4は実施例2で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図５】図5は実施例2の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図６】図6は実施例2の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【図７】図7は実施例3で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図８】図8は実施例3の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図９】図9は実施例3の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【図１０】図10は実施例4で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図１１】図11は実施例4の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図１２】図12は実施例4の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【図１３】図13は実施例5で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図１４】図14は実施例5の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図１５】図15は実施例5の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【図１６】図16は実施例6で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図１７】図17は実施例6の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図１８】図18は実施例6の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【図１９】図19は実施例7で、培養して7日目に測定されたCD 34＋CD 45 RA−細胞が初代培養細胞に対する増幅倍数。
【図２０】図20は実施例7の体内移植実験における骨髄の再生比率。
【図２１】図21は実施例7の体内移植実験における末梢血の再生比率。
【００２８】
図面の印について。DMSOは対照用試料で、Y 1は実験用試料である。
【００２９】
具体的実施態様
これから、本発明のプロセスとその様々な利点をよく理解して頂けるよう、図面と実施例を合わせて、本発明の具体的実施態様をより詳しく説明するが、これから述べる具体的実施態様と実施例は、説明し易いためであって、本発明に対する制限ではない。
【００３０】
分かりやすくするために、これからは具体的実施例を以て本発明を詳しく説明する。ここで強調したいのは、これらの説明は単に例示説明であって、本発明の範囲を制限するものにはならない。本説明に基づけば、本発明に存在する多くの変化と変更は、この分野に携わる技術者にとって明白なこととなる。
【００３１】
また、本発明で公開された文献資料を引用したのは、本発明をより明確に説明するためである。それらの文献の全文は本説明の参考資料であり、本説明において繰り返して述べられたようなものである。
【００３２】
これからは実施例により、本発明について更なる説明を行う。実施例で用いられる技術について特に説明のない場合、この分野の技術者なら熟知している従来の方法や市販の一般機器、試薬であるため、「クローン分子実験指南書(第3版)」(科学出版社)や「微生物学実験(第4版)」(高等教育出版社)、当該機器や試薬メーカーの説明書をご参照ください。
基礎培地stemspanの製造元は、STMCELL社である。
低分子は、Tocris社やsellecker社といった幾つものバイオ系試薬会社によって作られる。
【００３３】
材料は会社が提供した臍帯血の廃棄物に由来する。磁気細胞分離システム(MACS)によって選別された臍帯血由来のCD 34＋細胞は、次の実施例で初代培養細胞になる。
【００３４】
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【００３５】
実施例1
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００３６】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はSP 600125を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００３７】
培養して7日目に、CD 34+CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図1にように、その実験群であるCD 34＋CD 45 RA−の増幅倍数は約15倍で、対照群であるCD 34＋CD 45 RA−の増幅倍数は約5倍になっている。
【００３８】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図2と図3のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約50%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約5%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約20%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の約4倍以上になる。
【００３９】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００４０】
実施例2
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００４１】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はSP 600125を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００４２】
培養して7日目に、CD 34＋CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図4に示すように、実験群のCD 34＋CD 45 RA−細胞の増幅量は、対照群の2.5倍になっている。
【００４３】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図5と図6のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約70%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約9%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約15%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の6倍以上になる。
【００４４】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００４５】
実施例3
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００４６】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はSP 600125を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００４７】
培養して7日目に、CD 34＋CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図7にように、実験群のCD 34＋CD 45 RA−細胞の増幅量は、対照群の2倍になっている。
【００４８】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図8と図9のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約40%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約4%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約10%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の約4倍以上になる。
【００４９】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００５０】
実施例4
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００５１】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はAEG-3482を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００５２】
培養して7日目に、CD 34＋CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図10にように、実験群のCD 34＋CD 45 RA−細胞の増幅量は、対照群の2.3倍になっている。
【００５３】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図11と図12のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約35%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約3.5%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約15%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1.5%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の約2.5倍以上になる。
【００５４】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００５５】
実施例5
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００５６】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はJNK-IN-7を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００５７】
培養して7日目に、CD 34＋CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図13にように、実験群のCD 34＋CD 45 RA−細胞の増幅量は、対照群の2.5倍になっている。
【００５８】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図14と図15のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約58%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約8.5%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約17%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1.5%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の約5倍以上になる。
【００５９】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００６０】
実施例6
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００６１】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はJNK-IN-11を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００６２】
培養して7日目に、CD 34＋CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図16にように、実験群のCD 34＋CD 45 RA−細胞の増幅量は、対照群の2.89倍になっている。
【００６３】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図17と図18のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約78%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約12.5%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約15%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1.5%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の約8倍以上になる。
【００６４】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００６５】
実施例7
本実施例では、本発明の培養システムによって培養されたCD34+細胞を使う。
【００６６】
表1の培養条件で培養するCD 34＋細胞を、実験群(低分子はSP600125を使う)と対照群(低分子をDMSOに換える。DSMO：培地の体積比を1：10000にする)に分け、37℃且つ二酸化炭素濃度が5%の細胞培養器に入れ、2日ごとに液体を半量交換する。
【００６７】
培養して7日目に、CD 34＋CD 45 RA−細胞の比率を測定し、増幅倍数を計算した結果、図19にように、実験群のCD 34＋CD 45 RA−細胞の増幅量は、対照群の2.3倍になっている。
【００６８】
培養して7日目に、体内移植実験を実施する。実験群と対照群の増幅されたCD 34＋細胞をそれぞれ免疫欠陥のマウスに骨髄移植する。組ごとに8匹のマウスに、1匹ごとに増幅後のCD 34＋細胞を5000個接種する。4ヶ月後に免疫欠陥のマウスの末梢血と骨髄中のヒト由来細胞の再生比を測定した結果、図20と図21のように、実験群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率(CD 45＋細胞)は約58%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約7.5%まで達した。対照群のマウスの骨髄で再生されたヒト由来血細胞の比率は約16%まで達し、末梢血で再生されたヒト由来血細胞は約1.2%まで達した。総合的に比較すると、実験群の再生効果は対照群の約5.5倍以上になる。
【００６９】
上記の実験をもって、本発明の培養システムを使えば、造血幹細胞を効率的に増幅させることができ、この培養システムによって体外培養された造血幹細胞は、より高い体内再生機能を持つことが証明された。
【００７０】
最後に、上記の実施例は単に本発明を説明するためのものであり、決して実験方法を制限するものではなく、この分野の一般技術者なら、上述の実施例をもとに、それと異なった変化や変動をさせることが可能であり、ここでその実験方法をすべて例に挙げる必要もなければ、できる筈もなく、明らかにこれによって導き出された変化や変動も、本発明の権利範囲の中にあるということを言っておかなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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