(57)【要約】  マクロファージによるoxLDL取込みの効果的な阻害により、特に、マクロファージスカベンジャー受容体の発現を減少させることによるマクロファージによるoxLDL取込みの効果的な阻害により泡沫細胞形成過程を阻害するためのオレアセインの使用が開示される。本発明により作製される、オレアセインを含む医薬調製物は、アテローム性動脈硬化症の治療及び/又は予防における使用、特に、初期のアテローム性動脈硬化病変の予防における使用が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
泡沫細胞形成過程のin vivo阻害における及び/又はマクロファージ細胞中の脂質沈着物形成の阻害における使用のためのオレアセイン。
【請求項２】
マクロファージによるoxLDLの取込みを阻害することを目的とすることを特徴とする、請求項1に記載の使用のためのオレアセイン。
【請求項３】
マクロファージスカベンジャー受容体の発現を減少させることを目的とすることを特徴とする、請求項1に記載の使用のためのオレアセイン。
【請求項４】
CD36、LOX-1及びSRA(CD204)から選択されるマクロファージスカベンジャー受容体の発現を減少させることを目的とすることを特徴とする、請求項1に記載の使用のためのオレアセイン。
【請求項５】
アテローム性動脈硬化症の治療及び/又は予防における使用を目的とすることを特徴とする、請求項1に記載の使用のためのオレアセイン。
【請求項６】
初期の動脈硬化病変(arteriosclerotic lesions)の予防における使用を目的とすることを特徴とする、請求項1に記載の使用のためのオレアセイン。
【請求項７】
セイヨウイボタ(リグストルム・ブルガレL.)から作製されることを特徴とする、請求項1に記載の使用のためのオレアセイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、マクロファージによるoxLDL取込みの効果的な阻害により、特に、マクロファージスカベンジャー受容体の発現減少の結果としてのマクロファージによるoxLDL取込みの効果的な阻害により泡沫細胞形成過程を阻害するためのオレアセインの使用である。本発明により作製される、オレアセインを含む医薬調製物は、アテローム性動脈硬化症の治療及び/又は予防における使用、特に、初期のアテローム性動脈硬化病変(atherosclerotic lesions)の予防における使用が可能である。
【背景技術】
【０００２】
オレアセインは式1の化合物であり、文献では3,4-DHPEA-EDAとも呼ばれ、エレン酸(elenoic acid)のジアルデヒド誘導体(dialdehydic derivative)でエステル化された3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール(ヒドロキシチロソール)である。
【０００３】
【化１】
2020536964.tif 000002
【０００４】
Czerwinska M.ら、EAS 2012、abstract book、2012-05-29、1108頁は、ミエロペルオキシダーゼ放出(MPO)にオレアセインが及ぼす効果について、選抜された細胞群、すなわち健康な志願者の末梢血から単離された好中球を使用してin vitroで行った試験の結果を開示している。更に、血液から単離された好中球からのMPO放出にオレアセインが及ぼす効果は、Czerwinska M.ら、Food Chemistry、第131巻、第3号、2011-09-20、940〜947頁から知られる。結果は、酸化的損傷に対するオレアセインの保護効果を示している。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症は、内皮機能不全及び慢性炎症に基づく症候群である。単球、マクロファージ、及び変性した低密度リポタンパク質(LDL)、主として酸化した画分(oxLDL)は、アテローム性動脈硬化症の発症機序において主要な役割を果たすと考えられている。oxLDLによる内皮細胞(EC)の損傷は一連の炎症促進反応を惹起し、その結果、接着分子(ICAM-1、VCAM-1)及び化学誘引物質(M-CSF、MCP-1)が活性化する。これにより、血管の内膜に向けた単球の遊走が増加する。血管の内膜で単球はマクロファージに転換し、これがoxLDLを取り込んで泡沫細胞に転換する。泡沫細胞は、アテローム性動脈硬化プラークの主要構造成分であり、アテローム性動脈硬化症の進行において重要な役割を果たす。アテローム性動脈硬化症が進行すると、脳卒中及び/又は心筋梗塞を引き起こして死に至る。
【０００６】
マクロファージ細胞によるoxLDL結合が取込み過程に先行して生じるが、これにはスカベンジャー受容体(SR)が関わっている。スカベンジャー受容体はタンパク質であり、ヒトの全身の生理学的及び病理学的過程において重要な役割を果たす。スカベンジャー受容体の機能は、変性リポタンパク質、ポリアニオン、及び、アポトーシス又は壊死段階にある細胞と結合することである。SRには、SR-AからSR-Gまでの7つのクラスがある。脂質沈着物(lipid deposits)の蓄積(泡沫細胞)には、主として、クラスAのSRA(CD204)受容体、クラスBのCD36受容体、及びクラスEのLOX-1受容体(レクチン様oxLDL受容体)が関与している。
【０００７】
ポーランド国特許出願P.399962号では、アテローム性動脈硬化プラーク中に存在する細胞によるMMP-9発現阻害のための、及びアテローム性動脈硬化プラーク安定化のための、特に、アテローム性動脈硬化プラークの崩壊の結果生じる疾患、特に、虚血性脳卒中、心筋回折(myocardial diffraction)及び虚血性心疾患を含む群から選択される疾患の治療及び予防のための、オレアセインを含む調製物を製造するためのリグストルム・ブルガレL.(Ligustrum vulgare L.)の使用が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ポーランド国特許出願P.399962号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Czerwinska M.ら、EAS 2012、abstract book、2012-05-29、1108頁
【非特許文献２】Czerwinska M.ら、Food Chemistry、第131巻、第3号、2011-09-20、940〜947頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、特に、マクロファージスカベンジャー受容体の発現減少の結果もたらされる、マクロファージによるoxLDL取込みの効果的な阻害により泡沫細胞形成過程を阻害するために使用し得る調製物を提供することである。そのような調製物であれば、アテローム性動脈硬化症の治療及び予防のために、特に、初期のアテローム性動脈硬化症ステージの予防のために使用できよう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、本明細書に記載の目的は、本発明において実現される。
【００１２】
本発明の目的は、泡沫細胞形成過程のin-vivo阻害における使用のための、及び/又はマクロファージ中の脂質沈着物形成の阻害における使用のためのオレアセインであり、好ましくは、特に、マクロファージ上でのスカベンジャー受容体の発現減少の結果としてのマクロファージによるoxLDL取込みの効果的な阻害によるものである、オレアセインである。好ましくは、オレアセインは、CD36、LOX-1及びSRA(CD204)から選択されるスカベンジャー受容体の発現を減少させる。好ましくは、オレアセインは、アテローム性動脈硬化症の治療又は予防における使用、特に、初期のアテローム性動脈硬化ステージの予防における使用を目的とする。
【００１３】
好ましくは、セイヨウイボタ(common privet)(リグストルム・ブルガレL.)から誘導されたオレアセイン、特に、特許出願P.399962号に開示されている方法によって単離されたオレアセインを使用する。
【００１４】
ヒトのアテローム性動脈硬化プラークの安定化へのオレアセインの潜在的な寄与は、すでに示されている(特許出願P.399962号)。本発明は、オレアセインが、アテローム性動脈硬化プラーク形成に先行する過程の阻害により初期のアテローム性動脈硬化病変の予防においても使用できることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本出願の実施例において得られた結果を示す図である。
【図２】本出願の実施例において得られた結果を示す図である。
【図３】本出願の実施例において得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１６】
セイヨウイボタ(リグストルム・ブルガレL.)の葉由来のオレアセインの調製
オレアセインは、モクセイ科(Oleacea family)の種々の植物、すなわちオリーブの樹(オレア・エウロペアL.(Olea europea L.))及びセイヨウイボタ(リグストルム・ブルガレL.)から、特にセイヨウイボタの葉から得ることができる。セイヨウイボタ(リグストルム・ブルガレL.)は、欧州でよく見られる鑑賞植物で、生け垣にしばしば使用される。セイヨウイボタの葉由来のオレアセインは、特許出願P.399962号で開示されている方法を用いて単離した。
【００１７】
単離には、挽いた原料400gを使用した。最初の段階では、超音波洗浄器を用い、30℃の蒸留水で各回30分間として4回、セイヨウイボタの葉を抽出した。抽出は、原料:溶媒比1:10で実施した。水性抽出物を脱脂綿に通して濾過し、プールした。得られた水性抽出物を凍結乾燥により濃縮して、最終体積を約1Lにした。抽出物を更に精製し、且つ所望の化合物の単離過程の効率性を高める目的で、酢酸エチルではなくジエチルエーテルを使用した。過去の分析で示されているように、酢酸エチルで調製された抽出物はより多くの化学化合物を含有し、そのことが、オレアセイン単離過程における困難の元になっている。次いで、濃縮した水性抽出物を、溶媒:抽出物比1:1にてジエチルエーテルでの抽出に5回供した。エーテル抽出物は、rotavapourを用い減圧下35℃にて濃縮した。約5gのエーテル抽出物が得られた。このエーテル抽出物を、シリカゲルカラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーによる分離(PF-30 SIHP/80G PuriFlash)に供した。条件は、クロロホルムと酢酸エチルの混合物(85:15)を使用し、イソクラティックモードで60分間(20mL/分)とした。合計9個の画分が得られ、画分3及び画分4を更なる分離のために選抜した。画分3及び画分4を、シリカゲルカラムを用いた更なる分離(PF-30 SIHP/80G PuriFlash)に供した。条件は、トルエン、酢酸メチル及びメタノールの混合物(84:11:5)を使用し、イソクラティックモードで60分間(20mL/分)とした。合計5個の画分が得られた。画分3をSephadexカラム上にロードし、クロロホルムとメタノールの混合物(9:1)を使用して、この画分からオレアセインを単離した。合計1.289gの化合物が得られた。この化合物の同一性を、NMR及びHPLC-DAD-MS/MS法により確認した。
【実施例２】
【００１８】
アテローム性動脈硬化症の進行中にヒトマクロファージ由来の泡沫細胞形成を阻害する化合物としてのオレアセイン。
すべての実験は、ヒト末梢血から単離されたマクロファージ細胞を用いて行った。マクロファージをoxLDLと濃度20μmol/L及び50μmol/Lのオレアセインとで72時間インキュベートした。用いたオレアセイン用量は、マクロファージ細胞に対して細胞毒性を示さなかった。スカベンジャー受容体の発現は、フローサイトメーターを用いて決定した。マクロファージ(泡沫細胞)における脂質沈着物の可視化は、周知のオイルレッドO染色法を用いて行った。
【００１９】
得られた結果を図1に示す。泡沫細胞におけるスカベンジャー受容体、すなわちSRA(A)、CD36(B)及びLOX-1(C)の発現にオレアセインが及ぼす効果は、フローサイトメーターを用いて決定し、ヒストグラムとして示した。ヒストグラム中、「M1」の表示は、SRA受容体、CD36受容体及びLOX-1受容体がoxLDLでのマクロファージ刺激下において最大に発現していることを示している。対照:刺激を与えていない細胞、OC:オレアセイン(50μmol/L)でインキュベートした細胞、OC+oxLDL:オレアセイン(50μmol/L)とoxLDL(50μg/mL)とでインキュベートした細胞、oxLDL:oxLDL(50μg/mL)で刺激した細胞であり刺激対照。
【００２０】
泡沫細胞におけるスカベンジャー受容体、すなわちCD36、SRA及びLOX-1の発現にオレアセインが及ぼす効果を評価する実験の結果を図2に要約する。以下の記号を使用した。#:統計的有意性(*:p<0.05、**:p<0.001)は、濃度50μg/mLでoxLDL刺激した細胞(刺激対照)に対して決定した。OC20+oxLDL:20μmol/Lのオレアセインと50μg/mLのoxLDLとでインキュベートしたマクロファージ細胞、OC50+oxLDL:50μmol/Lのオレアセインと50μg/mLのoxLDLとでインキュベートしたマクロファージ細胞。
【００２１】
結論として、得られた結果は、オレアセインがマクロファージスカベンジャー受容体の発現を有意に減少させたことを証明するものである。実証されたオレアセイン活性は、使用した用量に依存していた。受容体活性の最大の減少率はCD36について報告され(約23%〜約84%、p<0.001)、最小の減少率はLOX-1について認められた(約8%〜約25%、p<0.05)。これに対し、SRAについては、受容体活性の減少率は約20%及び約75%(p<0.05、p<0.001)と報告された。
【００２２】
更に、マクロファージ泡沫細胞において観察された脂質沈着物をオイルレッドOを用いて可視化した画像を図3に示す。この画像は、蛍光顕微鏡Nikon TS100Fを使用して取得した。D:対照であり刺激を与えていない細胞、E:オレアセイン(50μmol/L)でインキュベートした細胞、F:oxLDL(50μg/ml)で刺激した細胞であり刺激対照、G:オレアセイン(50μmol/L)とoxLDL(50μg/mL)とでインキュベートした細胞。
【００２３】
これまでのところ、オレアセインは、泡沫細胞及び脂質沈着物の形成に対する阻害効果を有することが示されている唯一の天然物質である。
【図１】
2020536964.tif 000003
【図２】
2020536964.tif 000004
【図３】
2020536964.tif 000005
【国際調査報告】
2020536964.tif 000006
2020536964.tif 000007