(57)【要約】本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積及び／または放出を特徴とする病態の治療に有用な改変型ＤＮａｓｅタンパク質（ＤＮａｓｅ１様３及びＤＮａｓｅ１を含む）を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ＮＥＴが関与する血管閉塞を予防または治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書中に示すように、ＮＥＴは、血管閉塞の非標準的なメカニズムに関与しており、フィブリンまたは血小板に非依存的である。【選択図】図１Ａ
2020534865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２により定義される酵素に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２と比較して：変異ＤＮＡ結合部位または変異クロマチン結合部位、グリコシル化部位、核局在化シグナルの不活性化、及びＣ末端テールの全部または一部の欠失から選択される１つ以上の改変を有するＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）バリアント。
【請求項２】
前記Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントが、配列番号２の野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質に比べて、タンパク質安定性の増大、プロテアーゼ耐性の増大、バイオアベイラビリティの増大、循環中の半減期の増大、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系でのより高い産生レベル、及び／または実質的に同等またはより良好なＤＮＡ及び／またはクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性を有する、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項３】
前記バリアントを、タンパク質または担体部分に融合または結合させる、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項４】
前記バリアントが、ＮＸ（Ｔ／Ｓ）の１つ以上のグリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項５】
前記グリコシル化コンセンサス配列が、配列番号２の対応するアミノ酸位置に対して、Ｄ３８Ｎ置換及びＮ４０ＴまたはＮ４０Ｓ置換、及び／またはＡ１２７Ｎ置換及びＶ１２９ＴまたはＶ１２９Ｓ置換を含有する、請求項４に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項６】
前記バリアントが、不活性化核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項７】
配列番号２のＮＬＳ１及び／またはＮＬＳ２の全部または一部の欠失によりＮＬＳを不活性化する、請求項６に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項８】
ＮＬＳ１及び／またはＮＬＳ２内のアミノ酸の置換及び／または欠失によりＮＬＳを不活性化する、請求項６に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項９】
配列番号２のＮＬＳ２を欠失させる、請求項８に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１０】
配列番号３３によって定義される前記Ｃ末端テールの全部または一部の欠失、及び／または前記Ｃ末端テールのアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１１】
前記バリアントが、ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）由来の少なくとも１つのビルディングブロック置換を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１２】
前記バリアントが：配列番号２の、Ｍ１＿Ａ２０ｄｅｌｉｎｓＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ、Ｍ２１＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＬＫＩＡＡ、Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ、Ｅ３３＿Ｓ３４ｄｅｌｉｎｓＥＴ、Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ、Ｋ４７＿Ｋ５０ｄｅｌｉｎｓＱＩＬＳ、Ｃ５２Ｙ、Ｉ５４＿Ｍ５８ｄｅｌｉｎｓＩＡＬＶＱ、Ｉ６０＿Ｋ６１ｄｅｌｉｎｓＶＲ、Ｓ６３＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＳＨＬＴＡＶＧＫ、Ｍ７２＿Ｋ７４ｄｅｌｉｎｓＬＤＮ、Ｒ７７＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤＴ、Ｎ８６Ｈ、Ｖ８８＿Ｉ８９ｄｅｌｉｎｓＶＶ、Ｓ９１＿Ｒ９２ｄｅｌｉｎｓＥＰ、Ｎ９６＿Ｔ９７ｄｅｌｉｎｓＮＳ、Ｑ１０１Ｒ、Ａ１０３Ｌ、Ｌ１０５Ｖ、Ｋ１０７＿Ｌ１１０ｄｅｌｉｎｓＲＰＤＱ、Ｖ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＡＶＤＳ、Ｈ１１８Ｙ、Ｈ１２０Ｄ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ、Ｖ１２９Ｔ、Ｓ１３１Ｎ、１３５Ｆ＿１３６ＶｄｅｌｉｎｓＡＩ、Ｗ１３８Ｒ、Ｑ１４０＿Ｈ１４３ｄｅｌｉｎｓＦＳＲＦ、Ａ１４５＿Ｄ１４８ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ、Ｖ１５０Ａ、Ｉ１５２Ａ、Ｔ１５６＿Ｔ１５７ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｅ１５９＿Ｓ１６１ｄｅｌｉｎｓＧＤＡ、Ｋ１６３Ａ、Ｅ１６７Ａ、Ｖ１６９＿Ｅ１７０ｄｅｌｉｎｓＹＤ、Ｔ１７３Ｌ、Ｋ１７６＿Ｒ１７８ｄｅｌｉｎｓＱＥＫ、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｎ１８３＿Ｆ１８６ｄｅｌｉｎｓＤＶＭＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２０３＿Ｎ２０４ｄｅｌｉｎｓＳＳ、Ｒ２０８Ｗ、Ｄ２１０Ｓ、Ｒ２１２Ｔ、Ｖ２１４Ｑ、Ｇ２１８Ｐ、Ｑ２２０＿Ｅ２２１ｄｅｌｉｎｓＳＡ、Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ、Ｎ２３０Ｈ、Ｌ２３８＿Ｒ２３９ｄｅｌｉｎｓＶＡ、Ｑ２４１＿Ｓ２４６ｄｅｌｉｎｓＭＬＬＲＧＡ、Ｋ２５０Ｄ、Ｎ２５２＿Ｖ２５４ｄｅｌｉｎｓＡＬＰ、Ｄ２５６Ｎ、Ｋ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｋ２６２Ｇ、Ｔ２６４＿Ｅ２６７ｄｅｌｉｎｓＳＤＱＬ、Ｌ２６９＿Ｖ２７１ｄｅｌｉｎｓＱＡＩ、Ｆ２７５Ｙ、Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ、及びＱ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫから選択される１つ以上のビルディングブロック置換を有する、請求項１１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１３】
配列番号２に関して、以下のアミノ酸改変：Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫを含む、請求項１１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１４】
配列番号２に関して、以下のアミノ酸改変：Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩを含む、請求項１１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１５】
配列番号２に関して、以下のアミノ酸改変：Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ／Ｖ１２９Ｔ／Ｓ１３１Ｎを含む、請求項１１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１６】
配列番号２に関して、Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ、Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ、及びＹ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ／Ｖ１２９Ｔ／Ｓ１３１Ｎから選択される２つまたは３つの改変を含む、請求項１１に記載のＤ１Ｌ３バリアント。
【請求項１７】
配列番号２のアミノ酸配列の酵素に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、ヒトＤＮａｓｅ１由来の少なくとも１つのビルディングブロック置換を含む、ＤＮａｓｅ酵素。
【請求項１８】
前記酵素が、ビルディングブロック置換Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫを含み、場合により配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項１９】
前記酵素が、配列番号２に関して、以下の改変：Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ／Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ／Ｖ１２９Ｔ／Ｓ１３１Ｎを含み、及び場合により配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項２０】
配列番号２の酵素に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むＤＮａｓｅ酵素であって、前記酵素が、配列番号２の３８位及び／または１２７位に対応する位置にアスパラギンの置換を有し、前記Ｎ３８及び／またはＮ１２７のアスパラギンがグリコシル化されている、前記ＤＮａｓｅ酵素。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ３バリアントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＤ１Ｌ３バリアント、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、または請求項２２に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
局所、非経口、または肺投与用に製剤化したＤ１Ｌ３バリアントを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内、経口、舌下、肺、または経皮用に製剤化した、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
非哺乳類発現系において産生するＤ１Ｌ３バリアントを含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記非哺乳類発現系がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが、配列番号２の野生型ヒトＤ１Ｌ３のシグナルペプチドを含むＤ１Ｌ３バリアントをコードする、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＤＮａｓｅ１タンパク質もしくはそのバリアント、ＤＮａｓｅ１タンパク質もしくはそのバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチド、または前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
Ｄ１Ｌ３バリアント及びＤＮａｓｅ１タンパク質またはそのバリアントを、１００：１〜１：１００の比（ｍ／ｍ）で含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記比が１０：１〜１：１０であり、場合により約１：１である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
配列番号１の酵素に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号１に関して：１つ以上の変異ＤＮＡ結合部位または変異クロマチン結合部位、変異アクチン結合部位、変異グリコシル化部位、核局在化シグナルの付加、配列番号２の野生型Ｄ１Ｌ３型タンパク質のＣ末端テールに少なくとも５０％の配列同一性を有するＣ末端テールの付加；及び／または半減期延長部分へのＮ末端またはＣ末端融合から選択される１つ以上の改変、を有するＤＮａｓｅ１（Ｄ１）バリアント。
【請求項３４】
配列番号１において、１Ｍ＿Ｓ２２ｄｅｌｉｎｓＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ、Ｌ２３＿Ａ２７ｄｅｌｉｎｓＭＲＩＣＳ、Ｉ３０＿Ｔ３２ｄｅｌｉｎｓＶＲＳ、Ｅ３５＿Ｔ３６ｄｅｌｉｎｓＥＳ、Ｍ３８＿Ｉ４７ｄｅｌｉｎｓＱＥＤＫＮＡＭＤＶＩ、Ｑ４９＿Ｓ５２ｄｅｌｉｎｓＫＶＩＫ、Ｙ５４Ｃ、Ｉ５６＿Ｑ６０ｄｅｌｉｎｓＩＩＬＶＭ、Ｖ６２＿Ｒ６３ｄｅｌｉｎｓＩＫ、Ｓ６５＿Ｋ７２ｄｅｌｉｎｓＳＮＮＲＩＣＰＩ、Ｌ７４＿Ｎ７６ｄｅｌｉｎｓＭＥＫ、Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ、Ｈ８６Ｎ、Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ、Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ、Ｎ９６＿Ｓ９７ｄｅｌｉｎｓＮＴ、Ｒ１０１Ｑ、Ｌ１０３Ａ、Ｖ１０５Ｌ、Ｒ１０７＿Ｑ１１０ｄｅｌｉｎｓＫＥＫＬ、Ａ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＶＫＲＳ、Ｙ１１８Ｈ、Ｄ１２０Ｈ、Ｇ１２２＿Ｎ１２８ｄｅｌｉｎｓＹＱＤＧＤＡ、Ｔ１３０Ｓ、Ｎ１３２Ｓ、Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ、Ｒ１３９Ｗ、Ｆ１４１＿Ｆ１４４ｄｅｌｉｎｓＱＳＰＨ、Ｅ１４６＿Ｅ１４９ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ、Ａ１５１Ｖ、Ｖ１５３Ｉ、Ａ１５７＿Ａ１５８ｄｅｌｉｎｓＴＴ、Ｇ１６０＿Ａ１６２ｄｅｌｉｎｓＥＴＳ、Ａ１６４Ｋ、Ａ１６８Ｅ、Ｙ１７０＿Ｄ１７１ｄｅｌｉｎｓＶＥ、Ｌ１７４Ｔ、Ｑ１７７＿Ｋ１７９ｄｅｌｉｎｓＫＨＲ、Ｇ１８１＿Ｌ１８２ｄｅｌｉｎｓＫＡ、Ｄ１８４＿Ｌ１８７ｄｅｌｉｎｓＮＦＩＦ、Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ、Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ、Ｗ２０９Ｒ、Ｓ２１１Ｄ、Ｔ２１３Ｒ、Ｑ２１５Ｖ、Ｐ２１９Ｇ、Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ、Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳ、Ｈ２３０Ｎ、Ｖ２３８＿Ａ２３９ｄｅｌｉｎｓＬＲ、Ｍ２４１＿Ａ２４６ｄｅｌｉｎｓＱＥＩＶＳＳ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５２＿Ｐ２５４ｄｅｌｉｎｓＮＳＶ、Ｎ２５６Ｄ、Ａ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＫＡ、Ｇ２６２Ｋ、Ｓ２６４＿Ｌ２６７ｄｅｌｉｎｓＴＥＥＥ、Ｑ２６９＿Ｉ２７１ｄｅｌｉｎｓＬＤＶ、Ｙ２７５Ｆ、Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ、及びＫ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳから選択される１つ以上のビルディングブロック置換を含む、請求項３３に記載のＤ１バリアント。
【請求項３５】
配列番号１に関して以下の改変：Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴを含む、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
【請求項３６】
配列番号１に関して以下の改変：Ｈ８６Ｎ／Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ／Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲを含む、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
【請求項３７】
配列番号１に関して以下の改変：Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶを含む、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
【請求項３８】
配列番号１に関して以下の改変：
Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ／Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ／Ｗ２０９Ｒ／Ｓ２１１Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ｑ２１５Ｖ／Ｐ２１９Ｇ／Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥを含む、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
【請求項３９】
配列番号１に関して以下の改変：Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳを含む、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
【請求項４０】
配列番号１に関して以下の改変：
Ｙ２７５Ｆ／Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ／Ｋ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳを含む、請求項３４に記載のＤ１バリアント。
【請求項４１】
配列番号１の酵素に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、１つ以上のアルギニン及び／またはリジン残基の置換、挿入、または付加を含むＤＮａｓｅ酵素であって、前記ＤＮａｓｅ酵素が、配列番号１の酵素に比べてクロマチン分解活性が増加している、前記ＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４２】
前記１つ以上のアルギニン及び／またはリジン残基が、配列番号１の、３１、４１、４９、５２、６８、７６、７９、８１、９２、１０９、１１４、１１５、１６４、１７７、１８１、２００、２０１、２０４、２０９、２１３、２２７、２３９、２５０、２５９、２６２、及び２８０の位置に対応する位置における置換から選択されるアミノ酸置換である、請求項４１に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４３】
２つ以上のアルギニン及び／またはリジン残基の置換及び／または挿入を含む、請求項４１に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４４】
３つ以上のアルギニン及び／またはリジン残基の置換及び／または挿入を含む、請求項４３に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４５】
配列番号１の３１、４９、７６、９２、１０９、１６４、１７７、２０１、２０４、及び２１３位に対応する１つ以上の位置にアルギニンまたはリジンを含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４６】
配列番号１の３１、４９、７９、及び２０９位に対応する位置にアルギニンまたはリジンを含む、請求項４１に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４７】
配列番号１の３１、４９、７９、１７７、２０９、２６２位に対応する位置にアルギニンまたはリジンを含む、請求項４１に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４８】
配列番号１の３１及び２２７位に対応する位置にリジンまたはアルギニン残基を含む、請求項４１に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項４９】
前記酵素が、配列番号１の１６４位に対応する位置にリジンまたはアルギニンを有する、請求項４１に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５０】
配列番号１に関して１３６位にアミノ酸置換を含み、場合によりそれがＡ１３６Ｆである、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５１】
Ｑ３１Ｒ、Ａ４１Ｋ、Ｑ４９Ｒ、Ｓ５２Ｋ、Ｔ６８Ｒ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｄ８０＿Ａ８１ｉｎｓＲ、Ａ８１Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｒ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｇ１８１Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ２３９Ｒ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５９Ｋ、Ｇ２６２Ｋ、及びＫ２８０Ｍから選択される１つ以上のアミノ酸改変を含み、場合によりアクチン耐性をもたらす改変を有する、請求項４２に記載のＤＮａｓｅ酵素であって、前記アクチン耐性をもたらす改変が、場合により、配列番号１に関してＡ１３６Ｆである、前記ＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５２】
酵素が、Ｑ３１ＲまたはＴ２２７Ｋの置換を含む場合、前記酵素が、Ｑ３１Ｒ、Ａ４１Ｋ、Ｑ４９Ｒ、Ｓ５２Ｋ、Ｔ６８Ｒ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｄ８０＿Ａ８１ｉｎｓＲ、Ａ８１Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｒ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｇ１８１Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ２３９Ｒ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５９Ｋ、Ｇ２６２Ｋ、及びＫ２８０Ｍから選択される少なくとも２つのアミノ酸改変を含む、請求項４２に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５３】
配列番号１に関してアミノ酸置換Ｑ３１Ｒ及びＴ２２７Ｋを含む、請求項５２に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５４】
配列番号１に関してアミノ酸置換Ａ１６４Ｋを含む、請求項５１記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５５】
Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、及びＧ２６２Ｋから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５６】
以下のアミノ酸置換：Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ａ１６４Ｋ、及びＷ２０９Ｒを含む、請求項５５に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５７】
以下のアミノ酸置換：Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ａ１３６Ｆ、Ｑ１７７Ｋ、Ｗ２０９Ｒ、Ｇ２６２Ｋを含む、請求項５５に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５８】
以下のアミノ酸置換：Ｑ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、及びＡ１３６Ｆを含む、請求項４８に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項５９】
以下のアミノ酸置換：Ａ１６４Ｋ及びＡ１３６Ｆを含む、請求項４９に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６０】
前記酵素が、配列番号１に関してＮ４０Ｓ置換及び／またはＮ１２８Ｓ置換を含むグリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項４１〜５９のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６１】
配列番号１に関して、アミノ酸置換Ｑ３１Ｒ、Ｎ４０Ｓ、Ａ１３６Ｆ、Ｎ１２８Ｓ、及びＴ２２７Ｋを含む、請求項６０に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６２】
前記酵素が、配列番号１の酵素に対して少なくとも９０％同一であるか、または配列番号１の酵素に対して少なくとも約９５％同一であるか、または配列番号１の酵素に対して少なくとも約９７％同一である、請求項４１〜６１のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６３】
配列番号１の酵素に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列由来の少なくとも１つのビルディングブロック置換を含むＤＮａｓｅ酵素であって、前記ＤＮａｓｅ酵素が、配列番号１のＤＮａｓｅ酵素に比べてクロマチン分解活性が増加している、前記ＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６４】
前記酵素が、配列番号２由来の少なくとも２つの隣接するビルディングブロック置換を含む、請求項６３に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６５】
前記酵素が、ビルディングブロック置換Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴを含み、場合により配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６６】
前記酵素が、ビルディングブロック置換Ｈ８６Ｎ／Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ／Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲを含み、場合により配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６７】
前記酵素が、ビルディングブロック置換Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶを含み、場合により配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６８】
前記酵素が、ビルディングブロック置換Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ／Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ／Ｗ２０９Ｒ／Ｓ２１１Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ｑ２１５Ｖ／Ｐ２１９Ｇ／Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥを含み、場合により配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項６９】
前記酵素が、ビルディングブロック置換Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳを含み、場合により配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項７０】
ビルディングブロック置換Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ，Ｈ８６Ｎ／Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ／Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ，Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ，Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ／Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ／Ｗ２０９Ｒ／Ｓ２１１Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ｑ２１５Ｖ／Ｐ２１９Ｇ／Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ，Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳを含み、場合により配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項７１】
ビルディングブロック置換Ｙ２７５Ｆ／Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ／Ｋ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳを含む、請求項４１〜７０のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項７２】
前記酵素が：配列番号１の酵素と比較してタンパク質フリーＤＮＡに対する同様またはより高い親和性、配列番号１の酵素と比較してより高いクロマチン分解活性、配列番号１の酵素と比較してアクチンによる阻害に耐性のある酵素活性、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の特性を示す、請求項４１〜７１のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素。
【請求項７３】
配列番号１５に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＤＮａｓｅ酵素。
【請求項７４】
請求項４１〜７３のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７６】
請求項７５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７７】
請求項４１〜７３のいずれか１項に記載の酵素、請求項７４に記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項７５に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項７８】
非経口または肺投与用に製剤化したＤＮａｓｅ酵素を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内、経口、舌下、肺、局所、または経皮投与用に製剤化した、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
前記酵素を、チャイニーズハムスター卵巣細胞において産生する、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記酵素がグリコシル化されておらず、前記酵素を非哺乳類発現系で産生する、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
前記非哺乳類発現系が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが、配列番号１のシグナルペプチドとともに酵素をコードする、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
ＤＮａｓｅ１様３タンパク質（Ｄ１Ｌ３）またはそのバリアントをさらに含む、請求項７７〜８３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象の治療方法であって、前記方法が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の治療有効量のＤ１Ｌ３バリアント、または請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素、または請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３３〜４０のいずれか１項に記載のＤ１バリアント、または請求項４１〜７３のいずれか１項に記載のＤＮａｓｅ酵素、または請求項７７〜８４のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項８６】
治療に際して、前記対象が、細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を示す、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記対象が、慢性または急性炎症性障害を有する、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象が、急性または慢性感染症を有する、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８９】
対象が、ＮＥＴを含む血管閉塞を有するか、またはそのリスクがある、請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象が、慢性好中球増加症（例えば、好中球数の増加）、好中球凝集及び白血球停滞、血栓症及び血管閉塞（例えば、鎌状赤血球症）、虚血再灌流障害（例えば、腸軸捻転、精巣捻転、四肢虚血再灌流、重要臓器虚血再灌流、臓器移植）、外科的及び外傷性組織損傷、急性または慢性炎症反応または疾患、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、関節リウマチ、血管炎、全身性硬化症）、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓溶解療法を含む静脈血栓塞栓症）、代謝性疾患（例えば、糖尿病）、全身性炎症（例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、及び血栓性微小血管障害（ＴＭＡ））、気道の炎症性疾患（例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、喫煙性肺損傷、輸血関連急性肺損傷（ＴＲＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び喘息、無気肺、気管支炎、膿胸）、腎炎症性疾患（急性腎障害（ＡＫＩ）及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む急性及び慢性腎疾患、移植組織に関連する炎症性疾患（例えば、移植片対宿主病）ならびにがん（例えば、白血病、腫瘍転移、及び固形腫瘍）を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記タンパク質または組成物を、静脈内、動脈内、関節内、筋肉内、皮下、局所、または肺投与により投与する、請求項８５〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象が、管系における管閉塞を有するか、またはそのリスクがある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記管系が、胆管、涙管、乳管、胆嚢管、肝管、射精管、耳下腺管、顎下腺管、大舌下腺管、バルトリン管、中脳水道、膵臓、乳腺、輸精管、尿管、膀胱、胆嚢、及び肝臓である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記対象が、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を有する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＤＮａｓｅ酵素を、静脈内、動脈内、または腹腔内投与により投与する、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記対象が、原発性硬化性胆管炎を有する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記対象が、内皮表面（例えば、術後癒着）、皮膚（例えば、創傷／瘢痕、潰瘍）、または滑膜関節（例えば、痛風、関節炎）に蓄積するＮＥＴを有するか、またはそのリスクがある、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
前記対象が、侵襲的医療処置を受けたことがあるか、または受けており、術後癒着のリスクがある、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＤＮａｓｅ療法を手術中に投与し、術後癒着の形成を予防または阻害する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＤＮａｓｅ療法を、皮膚に局所的に投与して、創傷及び／または瘢痕を予防または治療する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＤＮａｓｅ療法を、滑膜関節に投与して、痛風及び関節炎を予防または治療する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記対象が、血栓症、脳卒中、敗血症、肺損傷、アテローム性動脈硬化症、ウイルス感染症、鎌状赤血球症、心筋梗塞、耳感染症、創傷治癒、肝損傷、心内膜炎、肝臓感染症、膵炎、原発性移植片機能不全、四肢虚血再灌流障害、腎臓損傷、血液凝固、ミョウバン誘発炎症、肝腎損傷、胸水滲出、血胸、胆管内血餅、肺炎後貧血、潰瘍、耳鼻咽喉病態、口腔感染症、軽傷、副鼻腔炎、術後鼻形成術、不妊、膀胱カテーテル、創傷洗浄、皮膚反応検査、肺炎球菌性髄膜炎、痛風、下肢潰瘍、嚢胞性線維症、カルテゲナー症候群、喘息、肺葉無気肺、慢性気管支炎、気管支拡張症、ループス、原発性線毛機能不全、細気管支炎、膿胸、胸膜感染症、がん、ドライアイ疾患、下気道感染症、慢性血腫、アルツハイマー病、及び閉塞性肺疾患を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０３】
前記対象が、冠動脈疾患をさらに示す、請求項８５〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対象が、嚢胞性線維症を有する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記対象由来の血液、血漿、または血清のＮＥＴ分解活性をモニタリングすることを含む、請求項８５〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
ＮＥＴが関与する血管内閉塞を示すか、またはそのリスクがある対象の治療方法であって、前記方法が、治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント、及び／または治療有効量のＤ１またはそのバリアントを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１０７】
前記対象に、配列番号２により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を投与する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記酵素が、配列番号２により定義される酵素のアミノ酸配列を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント、及び／または治療有効量のＤ１またはそのバリアントを投与することを含む、管系における管閉塞を有するか、または管閉塞のリスクがある対象の治療方法。
【請求項１１０】
前記対象に、配列番号２により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素、及び／または配列番号１により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を投与する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記酵素が、配列番号２によって定義される酵素のアミノ酸配列を含み、及び／または配列番号１によって定義される酵素のアミノ酸配列を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記管系が、胆管、涙管、乳管、胆嚢管、肝管、射精管、耳下腺管、顎下腺管、大舌下腺管、バルトリン管、中脳水道、膵臓、乳腺、輸精管、尿管、膀胱、胆嚢、及び肝臓である、請求項１０９〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対象が、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を有する、請求項１０９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＤＮａｓｅ酵素を、静脈内、動脈内、または腹腔内投与によって投与する、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象が、原発性硬化性胆管炎を有する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象の治療方法であって、前記方法が、治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント及びＤ１またはそのバリアントを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１１７】
前記Ｄ１Ｌ３またはそのバリアント、及び前記Ｄ１またはそのバリアントを、単一の医薬組成物または別個の医薬組成物で投与し、Ｄ１Ｌ３またはそのバリアントとＤ１またはそのバリアントの比が、場合により、質量で１００：１〜１：１００、質量で１０：１〜１：１０の範囲であり、場合により約１：１である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
治療に際して、前記対象が、細胞外ＤＮＡ分解、細胞外クロマチン分解、細胞外トラップ（ＥＴ）分解及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を示す、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対象が、慢性または急性炎症性障害を有する、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記対象が、急性または慢性感染症を有する、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記対象が、ＮＥＴを含む血管閉塞を有するか、またはそのリスクがある、請求項１１６〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記対象が、慢性好中球増加症（例えば、好中球数の増加）、慢性好中球増加症（例えば、好中球数の増加）、好中球凝集及び白血球停滞、血栓症及び血管閉塞（例えば、鎌状赤血球症）、虚血再灌流障害（例えば、腸軸捻転、精巣捻転、四肢虚血再灌流、重要臓器虚血再灌流、臓器移植）、外科的及び外傷性組織損傷、急性または慢性炎症反応または疾患、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、関節リウマチ、血管炎、全身性硬化症）、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓溶解療法を含む静脈血栓塞栓症）、代謝性疾患（例えば、糖尿病）、全身性炎症（例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、及び血栓性微小血管障害（ＴＭＡ））、気道の炎症性疾患（例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、喫煙性肺損傷、輸血関連急性肺損傷（ＴＲＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び喘息、無気肺、気管支炎、膿胸）、腎炎症性疾患（急性腎障害（ＡＫＩ）及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む急性及び慢性腎疾患、移植組織に関連する炎症性疾患（例えば、移植片対宿主病）ならびにがん（例えば、白血病、腫瘍転移、及び固形腫瘍）を有する、請求項１１６〜１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記Ｄ１Ｌ３またはそのバリアント及び前記Ｄ１またはそのバリアントのそれぞれを、静脈内、動脈内、関節内、筋肉内、皮下、局所、及び肺投与から独立して選択される経路によって投与する、請求項１１６〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記対象が、管系における管閉塞を有するか、またはそのリスクがある、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記管系が、胆管、涙管、乳管、胆嚢管、肝管、射精管、耳下腺管、顎下腺管、大舌下腺管、バルトリン管、中脳水道、膵臓、乳腺、輸精管、尿管、膀胱、胆嚢、及び肝臓である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記対象が、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を有する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＤＮａｓｅ酵素を、静脈内、動脈内、または腹腔内投与により投与される単一の組成物として投与する、請求項１２４〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記対象が、原発性硬化性胆管炎を有する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記対象が、内皮表面、皮膚、または滑膜関節にＮＥＴが蓄積するか、蓄積するリスクがある、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記対象が、侵襲的医療処置を受けたことがあるか、または受けており、術後癒着のリスクがある、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＤＮａｓｅ療法を手術中に投与し、術後癒着の形成を予防または阻害する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＤＮａｓｅ療法を皮膚に局所的に投与して、創傷及び／または瘢痕を予防または治療する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ＤＮａｓｅ療法を滑膜関節に投与して、痛風及び関節炎を予防または治療する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
前記対象が、血栓症、脳卒中、敗血症、肺損傷、アテローム性動脈硬化症、ウイルス感染症、鎌状赤血球症、心筋梗塞、耳感染症、創傷治癒、肝損傷、心内膜炎、肝臓感染症、膵炎、原発性移植片機能不全、四肢虚血再灌流障害、腎臓損傷、血液凝固、ミョウバン誘発炎症、肝腎損傷、胸水滲出、血胸、胆管内血餅、肺炎後貧血、潰瘍、耳鼻咽喉病態、口腔感染症、軽傷、副鼻腔炎、術後鼻形成術、不妊、膀胱カテーテル、創傷洗浄、皮膚反応検査、肺炎球菌性髄膜炎、痛風、下肢潰瘍、嚢胞性線維症、カルテゲナー症候群、喘息、肺葉無気肺、慢性気管支炎、気管支拡張症、ループス、原発性線毛機能不全、細気管支炎、膿胸、胸膜感染症、がん、ドライアイ疾患、下気道感染症、慢性血腫、アルツハイマー病、及び閉塞性肺疾患を有する、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記対象が、冠動脈疾患をさらに示す、請求項１１６〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記対象が、嚢胞性線維症を有する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記対象由来の血液、血漿、または血清のＮＥＴ分解活性をモニタリングすることを含む、請求項１１６〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
ＮＥＴが関与する血管内閉塞を示すか、または血管内閉塞のリスクがある対象の治療方法であって、前記方法が、治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント、及び／または治療有効量のＤ１またはそのバリアントを投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１３９】
前記対象に、配列番号２により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を投与する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記酵素が、配列番号２によって定義される酵素のアミノ酸配列を含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント、及び／または治療有効量のＤ１またはそのバリアントを投与することを含む、管系において管閉塞を有するか、または管閉塞のリスクがある対象の治療方法。
【請求項１４２】
前記対象に、配列番号２によって定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素、及び／または配列番号１によって定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を投与する、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記酵素が、配列番号２によって定義される酵素のアミノ酸配列、及び／または配列番号１によって定義される酵素のアミノ酸配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記管系が、胆管、涙管、乳管、胆嚢管、肝管、射精管、耳下腺管、顎下腺管、大舌下腺管、バルトリン管、中脳水道、膵臓、乳腺、輸精管、尿管、膀胱、胆嚢、及び肝臓である、請求項１４１〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記対象が、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を有する、請求項１４１〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＤＮａｓｅ酵素を、静脈内、動脈内、または腹腔内投与により投与する、請求項１４１〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記対象が、原発性硬化性胆管炎を有する、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積を低下させるための医薬組成物の作製方法であって：ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１様３活性が欠損した遺伝子改変マウスを提供し、異種ＧＣＳＦポリヌクレオチドを発現させるか、または微生物化合物で繰り返し刺激し、前記遺伝子改変マウスにＮＥＴを蓄積させ；候補ＮＥＴ阻害剤または候補ＤＮａｓｅ酵素を投与し；ＮＥＴの蓄積を低下させるＮＥＴ阻害剤またはＤＮａｓｅ酵素を選択し；そして、ヒト患者への投与のためにＮＥＴ阻害剤またはＤＮａｓｅ酵素を製剤化することを含む、前記作製方法。
【請求項１４９】
前記組成物を、非経口投与または肺投与用に製剤化する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
静脈内、動脈内、関節内、筋肉内、皮下、局所、または肺投与用に製剤化する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記遺伝子改変マウスが、肝細胞において異種Ｇ−ＣＳＦポリヌクレオチドを発現する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５２】
ヒトＤ１、ヒトＤ１Ｌ３、またはそのバリアントから選択されるＤＮａｓｅ酵素の組換え産生方法であって：天然シグナルペプチドとともに前記ＤＮａｓｅ酵素をコードするＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を培養し；前記ＤＮａｓｅを培地から回収することを含む、前記組換え産生方法。
【請求項１５３】
前記ＤＮａｓｅ酵素が、配列番号２の酵素に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヒトＤ１Ｌ３またはそのバリアントである、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＤＮａｓｅ酵素がヒトＤ１Ｌ３である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
ＤＮａｓｅ酵素改変のための方法であって：
ドナー及びレシピエントＤＮａｓｅ酵素のタンパク質−タンパク質アライメントを提供し；
転移のための可変アミノ酸配列を同定し、その場合、前記可変アミノ酸は前記ドナー及びレシピエントＤＮａｓｅ酵素の１つ以上の保存アミノ酸に隣接し；前記レシピエントＤＮａｓｅの前記可変アミノ酸を、前記ドナーＤＮａｓｅの前記可変アミノ酸で置換して、キメラＤＮａｓｅを作成し；前記キメラＤＮａｓｅを組換え産生することを含む、前記方法。
【請求項１５６】
前記ＤＮａｓｅ酵素が、ヒトＤ１、配列番号３８により定義されるヒトＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）、配列番号３９により定義されるヒトＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）、及びヒトＤ１Ｌ３から選択される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ビルディングブロック置換が、少なくとも２つのアミノ酸、または少なくとも３つのアミノ酸、または少なくとも４つのアミノ酸、または少なくとも５つのアミノ酸を有する、請求項１５５または１５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１７年１２月２８日に出願された米国出願第６２／６１１，１６６号及び２０１７年８月１８日に出願された米国出願第６２／５４７，２２０号の利益及び優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、侵入してくる微生物を制御し、損傷した組織を治癒するために不可欠な宿主反応である。制御されない持続的な炎症は、過剰な炎症性疾患で組織損傷を引き起こす。好中球は、急性炎症の主要な白血球である。感染中、好中球は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）、毒性ヒストンで装飾されたＤＮＡフィラメントの格子、及び細菌を固定化して中和する酵素を生成する。宿主保護におけるＮＥＴの関連性は、細胞外ＤＮａｓｅがいくつかの病原菌の毒性因子として機能するという事実によって示されている。しかしながら、不適切に放出されたＮＥＴは、細胞毒性、炎症誘発性、及び血栓形成活性のために、宿主細胞に害を及ぼし得る。実際、ＮＥＴは、炎症性または虚血性の臓器損傷に頻繁に関連しており、ＤＮａｓｅの治療的注入は様々な動物モデルにおいて宿主の損傷を制限している。
【０００３】
他の白血球、すなわち単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、及びマスト細胞もＥＴを放出することから、細胞外トラップ（ＥＴ）形成は好中球に限定されるものではない。さらに、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）細胞を含むがん細胞、及び損傷した内皮細胞は、ＥＴ様の特徴を有するＤＮＡフィラメントを露出させ得る。
【０００４】
炎症のエピソード中の組織損傷を制限するために、宿主がどのようにｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴを分解するかはよくわかっていない。血清中のＤＮａｓｅ１（Ｄ１）は、ＮＥＴのＤＮＡバックボーンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで消化することが示されている。循環中のＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）など、細胞外微粒子関連クロマチンを消化することができる他の細胞外ＤＮａｓｅが同定されている。
【０００５】
Ｄ１及びＤ１Ｌ３は、ＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）及びＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）とともに、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリー、すなわち、ヒトにおいて発現し、ＮＥＴ関連疾患の薬物候補となる、相同的な分泌性ＤＮａｓｅ酵素の一群、を形成する。しかしながら、これらの酵素の物理的、酵素的、薬物動態学的特性は、治療には理想的ではない。
【０００６】
本発明は、急性炎症性エピソード中のＮＥＴの放出に起因し得る血管閉塞を予防するかまたは治療することを含む療法のための、ＤＮａｓｅ１様３及びＤＮａｓｅ１を含む改変型ＤＮａｓｅを提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積及び／または放出を特徴とする病態の治療に有用な改変型ＤＮａｓｅタンパク質（ＤＮａｓｅ１様３及びＤＮａｓｅ１を含む）を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ＮＥＴが関与する血管閉塞を予防または治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書中に示すように、ＮＥＴは、血管閉塞の非標準的なメカニズムに関与しており、フィブリン及び血小板に非依存的である。
【０００８】
いくつかの態様では、本発明は、例えば対象におけるＮＥＴ蓄積を低減または予防するための治療により適した物理的、薬力学的、及び／または酵素的特性を有するように改変したＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３酵素は製造上の利点を有し、治療用途に適した組換え酵素の産生を提供する。様々な実施形態において、本発明は、１つ以上のグリコシル化、核局在化シグナルの不活性化、及び／またはＣ末端テールの全体もしくは一部の欠失をもたらす１つ以上のアミノ酸変化を有する組換えＤ１Ｌ３バリアントを提供する。
【０００９】
様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質に比べて、タンパク質安定性の増加、プロテアーゼによる阻害に対する耐性の増加、バイオアベイラビリティの増加、及び実質的に同じまたはより良好なＤＮＡ及び／またはクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの）を有する。様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３バリアントは、野生型Ｄ１Ｌ３（例えば、配列番号２）に比べて以下の特性の１つ以上を含む：同等または実質的に同等の（またはより高い）タンパク質フリーＤＮＡ（裸のＤＮＡ）分解活性、同等または実質的に同等の（またはより高い）染色体ＤＮＡ（クロマチン）分解活性、プロテアーゼ耐性、循環半減期の増加、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞及び／またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）でのより高い産生レベル。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、本明細書中でビルディングブロック置換として記載する、ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１）からの１つ以上のブロック置換を含む。
【００１１】
いくつかの態様では、本発明は、例えば対象におけるＮＥＴ蓄積を低減または予防するための療法により適した物理的、薬力学的、及び／または酵素的特性を有するように改変したＤＮａｓｅ１（Ｄ１）バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ１酵素は製造上の利点を有し、治療用途に適した組換え酵素の産生を提供する。様々な実施形態において、改変型Ｄ１バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列の成熟酵素に対して少なくとも８０％同一であり、変異型ＤＮＡ結合部位、変異型クロマチン結合部位、変異型アクチン結合部位、変異型グリコシル化部位、核局在シグナルの付加（例えば、Ｄ１Ｌ３のＮＬＳ１またはＮＬＳ２との類似性または同一性）、及び／またはＤ１Ｌ３のＣ末端テールと同様または同一のＣ末端ドメインのうちの１つ以上をもたらす１つ以上のアミノ酸置換、付加（挿入を含む）、または欠失を含むアミノ酸配列を有する。
【００１２】
様々な実施形態において、Ｄ１バリアントを、野生型酵素に関連する以下の特徴のうちの１つ以上を含むように改変する：同等またはより高いタンパク質フリーＤＮＡ（裸のＤＮＡ）分解活性、より高い染色体ＤＮＡ（クロマチン）分解活性、同様または向上したプロテアーゼ耐性、アクチン耐性、血液から尿及び／または胆汁への同様または向上した浸透、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞及び／またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるより高い産生レベル。
【００１３】
本明細書に記載のＤ１バリアントは、カチオン性残基の付加を含む点変異の組み合わせを有していてもよく、及び／またはＤ１Ｌ３（配列番号２）からの１つ以上のブロック置換を含んでいてもよい。そのようなブロック置換は、本明細書に記載され、「ビルディングブロック置換」と呼ばれる。
【００１４】
いくつかの態様では、本発明は、Ｄ１Ｌ３及び／またはＤ１バリアント、またはそれをコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。様々な実施形態において、組成物を、非経口投与または肺投与用に製剤化する。いくつかの実施形態では、組成物を、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、筋肉内、局所、または皮下投与用に製剤化する。いくつかの実施形態では、組成物は、それぞれ場合により本明細書に記載する改変型バリアントであるＤ１Ｌ３及びＤ１の両方を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｄ１及びＤ１Ｌ３の両方に由来するブロック配列を含むキメラタンパク質を含む。Ｄ１とＤ１Ｌ３との間の例示的なブロック置換を図３１に示す。
【００１５】
さらに他の態様では、本発明は、キメラ配列を生成することによる、ＤＮａｓｅ酵素改変のためのプロセスを提供する。例えば、これらの態様において、本方法は、ドナー及びレシピエントＤＮａｓｅ酵素のタンパク質−タンパク質アライメントを提供し；転移のための可変アミノ酸配列（「ビルディングブロック」）を同定することを含む。１つまたは複数の可変アミノ酸は、ドナー及びレシピエントＤＮａｓｅ酵素の１つ以上の保存アミノ酸に隣接している（ビルディングブロックの上流及び下流）。これらのビルディングブロックを、レシピエントタンパク質とドナータンパク質の間で交換することができる。次いで、キメラ酵素を組換え産生する。
【００１６】
さらに他の態様では、本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積を低減または予防するための医薬組成物の製造方法を提供する。これらの実施形態では、本発明は、Ｄ１及びＤ１Ｌ３活性、ならびにＧ−ＣＳＦポリヌクレオチドの異種発現（例えば、肝細胞内の）、または持続的な内在性Ｇ−ＣＳＦ発現の誘導（例えば、微生物化合物の反復投与による）を欠損した遺伝子改変型マウスを使用する。このマウスモデルはＮＥＴを蓄積し、ＮＥＴ関連性の血管閉塞を急速に発症する。これらの実施形態では、本発明は、候補ＮＥＴ阻害剤または候補ＤＮａｓｅ酵素（本開示によるＤ１Ｌ３またはＤ１バリアントを含む）を遺伝子改変型マウスに投与し、ＮＥＴの蓄積を減少させるＮＥＴ阻害剤またはＤＮａｓｅ酵素を選択することを含む。選択した阻害剤または酵素を、ヒト患者への投与用に製剤化する。
【００１７】
いくつかの態様では、本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象の治療方法を提供する。方法は、本開示による治療有効量のＤ１Ｌ３及び／またはＤ１、及び／またはそのバリアントを投与することを含む。Ｄ１Ｌ３またはＤ１バリアントは、組換えタンパク質、またはいくつかの実施形態ではコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはいくつかの実施形態ではそれを含むベクターを含む医薬組成物として投与してもよい。
【００１８】
様々な実施形態において、本発明は、ＮＥＴの存在または蓄積を特徴とする疾患または病態の治療に関する。そのような疾患または病態として、慢性好中球増加症（例えば、好中球数の増加）、好中球凝集及び白血球停滞、血栓症及び血管閉塞（例えば、鎌状赤血球症）、虚血再灌流障害（例えば、腸軸捻転、精巣捻転、四肢虚血再灌流、重要臓器虚血再灌流、臓器移植）、外科的及び外傷性組織損傷、急性または慢性炎症反応または疾患、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、関節リウマチ、血管炎、全身性硬化症）、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓溶解療法を含む静脈血栓塞栓症）、代謝性疾患（例えば、糖尿病）、全身性炎症（例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、及び血栓性微小血管障害（ＴＭＡ））、気道の炎症性疾患（例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、喫煙性肺損傷、輸血関連急性肺損傷（ＴＲＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び喘息、無気肺、気管支炎、膿胸）、腎炎症性疾患（急性腎障害（ＡＫＩ）及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む急性及び慢性腎疾患、移植組織に関連する炎症性疾患（例えば、移植片対宿主病）ならびにがん（例えば、白血病、腫瘍転移、及び固形腫瘍）に関連する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、対象は、管系における管閉塞を有するか、またはそのリスクがある。管系または管系を含む器官または組織の非限定的な例として、胆管、涙管、乳管、胆嚢管、肝管、射精管、耳下腺管、顎下腺管、大舌下腺管、バルトリン管、中脳水道、膵臓、乳腺、輸精管、尿管、膀胱、胆嚢、及び肝臓が挙げられる。したがって、本発明は、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を有する対象の治療に有用である。
【００２０】
他の実施形態では、対象は、内皮表面（例えば、術後癒着）、皮膚（例えば、創傷／瘢痕、潰瘍）、または滑膜関節（例えば、痛風、関節炎）に蓄積するＮＥＴを有するか、またはそのリスクがある。例えば、ＮＥＴは、例えば侵襲的な医療処置後の術後癒着に寄与する。本発明を手術中に投与して、術後癒着の形成を予防または抑制することができる。いくつかの場合では、本明細書中で概説するＤ１、Ｄ１Ｌ３（そのバリアントを含む）、またはＤ１とＤ１Ｌ３の組み合わせ（もしくはそのバリアント）を皮膚に局所投与して、創傷及び／または瘢痕を予防または治療することができる。他の例では、本明細書中で概説するＤ１、Ｄ１Ｌ３、もしくはバリアント、またはそれらの組み合わせを滑膜関節に投与して、痛風及び関節炎を予防または治療することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＥＴを含む血管閉塞を有するか、またはそのリスクがある。
【００２２】
様々な実施形態において、本発明は、Ｄ１及びストレプトドルナーゼを含むＤＮａｓｅ酵素で治療可能な疾患の治療に関する。そのような疾患または病態として、血栓症、脳卒中、敗血症、肺損傷、アテローム性動脈硬化症、ウイルス感染症、鎌状赤血球症、心筋梗塞、耳感染症、創傷治癒、肝損傷、心内膜炎、肝臓感染症、膵炎、原発性移植片機能不全、四肢虚血再灌流障害、腎臓損傷、血液凝固、ミョウバン誘発炎症、肝腎損傷、胸水滲出、血胸、胆管内血餅、肺炎後貧血、潰瘍、耳鼻咽喉病態、口腔感染症、軽傷、副鼻腔炎、術後鼻形成術、不妊、膀胱カテーテル、創傷洗浄、皮膚反応検査、肺炎球菌性髄膜炎、痛風、下肢潰瘍、嚢胞性線維症、カルテゲナー症候群、喘息、肺葉無気肺、慢性気管支炎、気管支拡張症、ループス、原発性線毛機能不全、細気管支炎、膿胸、胸膜感染症、がん、ドライアイ疾患、下気道感染症、慢性血腫、アルツハイマー病、及び閉塞性肺疾患が挙げられる。
【００２３】
さらに他の実施形態では、本発明は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの非哺乳類発現系を使用した、Ｄ１もしくはＤ１Ｌ３、またはそのバリアントの組換え産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、宿主細胞からの分泌を可能にする天然のシグナルペプチドを有するＤＮａｓｅ酵素をコードする。
【００２４】
本発明の他の目的、実施形態及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】循環中のＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＴを分解することを示すとともに、ＷＴ、ＤＮａｓｅ１−／−（Ｄ１−／−）、ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−（Ｄ１Ｌ３−／−）、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−）マウス由来の血清のＤＮＡ分解活性を特徴付けている。図１Ａは、ザイモグラフィーアッセイＤＰＺ及びＳＲＥＤによるＤＮａｓｅ１（Ｄ１）、ＤＮａｓｅ１ｌ３（Ｄ１Ｌ３）、及び総ＤＮａｓｅ活性の検出を提供する。図１Ｂは画像を示し、図１Ｃは、記載する遺伝子型由来の血清の存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるＮＥＴのＤＮＡ染色の定量化を示す（Ｎ＝６）。スケールバー：５０μｍ。図１Ｄは、ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）、ＤＮａｓｅ１ｌ３（Ｄ１Ｌ３）を含むプラスミド、または対照プラスミド（Ｃｔｒｌ）を安定的に発現するＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウス由来の血清のＤＰＺ及びＳＲＥＤ分析を示す。図１Ｅは画像を示し、図１Ｆは、緩衝液、またはＤ１、Ｄ１Ｌ３、もしくはＣｔｒｌを発現するＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウスの血清の存在下でインキュベートした後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるＮＥＴのＤＮＡ染色の定量化を示す（Ｎ＝５）。スケールバー：５０μｍ。画像は２つ以上の独立した実験の代表例である。統計：（図１Ｃ及び図１Ｆ）一元配置分散分析とその後のボンフェローニの多重比較事後検定。他の全群に対して、§Ｐ＜０．００１。
【図２】慢性好中球増加症に抵抗するためにＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３が必要であることを示す。Ｇ−ＣＳＦ発現プラスミド（ＣＳＦ３）の注入により慢性好中球増加症を誘発した。対照には空のプラスミド（Ｃｔｒｌ）を与えた。図２Ａは、２週間後のＷＴマウス及び対照の血中好中球数を示す（Ｎ＝３〜６）。図２Ｂは、１週間後のＷＴマウスの血液塗抹のＤＮＡ染色におけるＮＥＴ様構造（矢印）を示す（Ｎ＝３）。スケールバー：２０μｍ。図２Ｃは、ＷＴ（Ｎ＝７）、ＤＮａｓｅ１−／−（Ｄ１−／−、Ｎ＝６）、ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−（Ｄ１Ｌ３−／−、Ｎ＝６）、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−、Ｎ＝６）及び対照（Ｃｔｒｌ、Ｎ＝４）の生存率を示す。図２Ｄは、ＣＳＦ３と、ＤＮａｓｅ１（ＣＳＦ３／Ｄ１、Ｎ＝５）、ＤＮａｓｅ１ｌ３（ＣＳＦ３／Ｄ１Ｌ３、Ｎ＝６）、及び対照（ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ、Ｎ＝４）とを共発現するＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウスの生存率を示す。図２Ｅ〜２Ｉは、慢性好中球増加症時の死亡率を特徴付けている（Ｎ＝４）。図２Ｅは、末梢体温の変化を示す。図２Ｆは、血漿及び尿の写真を示す。図２Ｇは、血液中のヘモグロビンの濃度を示す。図２Ｈは、血液塗抹の画像を示す。矢印は破砕赤血球を指す。スケールバー：２０μｍ。図２Ｉは、血漿中のＬＤＨ濃度を示す。ＵＴ：未処置マウス（Ｎ＝５〜６）。画像は３匹以上のマウスの代表例である。統計：（図２Ａ、２Ｈ、２Ｉ）一元配置分散分析及び（図２Ｅ）二元配置分散分析と、その後のボンフェローニの多重比較事後検定、（図２Ｂ）スチューデントｔ検定、（図２Ｃ、２Ｄ）対数順位検定；他の全群またはベースライン（ＢＬ）に対して、＃Ｐ＜０．０１、§Ｐ＜０．００１。
【図３】ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３が慢性好中球増加症時のＮＥＴ血餅による血管閉塞を予防することを示す。ＣＳＦ３と、ＤＮａｓｅ１（ＣＳＦ３／Ｄ１、Ｎ＝４）、ＤＮａｓｅ１ｌ３（ＣＳＦ３／Ｄ１Ｌ３、Ｎ＝４）、または対照プラスミド（ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ、Ｎ＝４）とを共発現するＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−）の組織学的分析。図３Ａは、肺のヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を示す。スケールバー：５００μｍ（概略）、２５μｍ（詳細）。図３Ｂは、視野（ＦＯＶ）あたりのヘマトキシリン陽性血餅によって閉塞された肺の血管の定量化を示す。未処置のＷＴマウス（ＵＴＷＴ、Ｎ＝４）、未処置のＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウス（ＵＴ；Ｎ＝４）。図３Ｃは、好中球マーカーのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）及びクロマチンに対する閉塞血管の免疫染色を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、フィブリン、及びＤＮＡの免疫染色を示す。３種類のＮＥＴ血餅を検出した（α、ｖＷＦ＋／フィブリン−；β、ｖＷＦ＋／フィブリン＋；γ、ｖＷＦ−／フィブリン−）。図３Ｆは、ＮＥＴ血餅のｖＷＦとフィブリンの定量化を示す。データは平均±ＳＤとして示し、ｎ＝１０８である。図３Ｇは、ＩｇＧ（Ｎ＝４）、抗血小板ＩｇＧ（Ｎ＝５）、及びダビガトラン（Ｎ＝５）で処置した、ＣＳＦ３を発現するＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウスの生存率を示す。スケールバー：５０μｍ。画像は３匹以上のマウスの代表例である。（図３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ）点線は血管壁を示す。統計：（図３Ｂ）一元配置分散分析とその後のボンフェローニの多重比較事後検定；他の全群に対して、§Ｐ＜０．００１、（図３Ｇ）対数順位検定；ＩｇＧに対する抗血小板ＩｇＧまたはダビガトランのＰ＞０．０５。
【図４】敗血症における宿主損傷に対し、ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３が保護することを示す。ＷＴマウス（Ｎ＝５）、ならびにＤＮａｓｅ１（Ｄ１、Ｎ＝７）、ＤＮａｓｅ１ｌ３（Ｄ１Ｌ３、Ｎ＝８）、または対照プラスミド（Ｃｔｒｌ、Ｎ＝１１）を発現するＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−）複合欠損マウスを、リポ多糖及び熱殺菌したＥ．ｃｏｌｉで処置して敗血症を誘発した。図４Ａは、敗血症マウスの生存時間を示す。図４Ｂは、血液中のヘモグロビン濃度を示す。図４Ｃは、血漿及び尿の写真を示す。図４Ｄは、血漿中のＬＤＨ濃度を示す。図４Ｅは、視野（ＦＯＶ）あたりの血液中の破砕赤血球の定量化を示す。図４Ｆは、ＦＯＶあたりの肺の閉塞血管の定量化を示す。図４Ｇは、肺のヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を示す。矢印は閉塞した血管を指す。スケールバー：５００μｍ。図４Ｈ及び４Ｉは、部分的に及び完全に閉塞した血管のＨ＆Ｅ染色を示す。矢印は、細胞間空間を覆うＮＥＴを指す。挿入図は概略図である。スケールバー：５０μｍ。統計：（図４Ａ）対数順位検定；他の全群に対して、＃Ｐ＜０．０１、（図４Ｂ〜４Ｆ）一元配置分散分析とその後のボンフェローニの多重比較事後検定；§Ｐ＜０．００１、＃Ｐ＜０．０１。
【図５】慢性好中球増加症のマウスモデルを示す。４週齢のＷＴマウスにＣＳＦ３発現プラスミド（ＣＳＦ３）または空の対照プラスミド（Ｃｔｒｌ）を注射した。図５Ａは、血漿中のＧ−ＣＳＦレベルを示す（Ｎ＝３〜６）。ＢＬ：ベースライン、注射前；Ｃｔｒｌ：ＣＳＦ３を含まない対照プラスミドを２週間発現させたマウス（Ｎ＝４〜５）。図５Ｂは、肺、腎臓、及び肝臓の好中球エラスターゼの免疫染色を示す。スケールバー：２００μｍ。図５Ｃは、脾臓の写真及び重量を示す（Ｎ＝５〜６）。スケールバー：１ｃｍ。図５Ｄは、記載する時間におけるマウスの体重を示す（Ｎ＝３〜５）。図５Ｅは、注射の２週間後のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、及びクレアチニンの全血及び血漿レベルにおける好中球数を示す。画像は３匹以上のマウスの代表例である。統計：（図５Ａ、５Ｃ）一元配置分散分析と（図５Ｄ）、その後のボンフェローニの多重比較事後検定、及び（図５Ｅ）スチューデントｔ検定；（図５Ａ）ＢＬ、または（図５Ｃ）ＵＴに対して、＃Ｐ＜０．０１、§Ｐ＜０．００１。
【図６】慢性好中球増加症時のＮＥＴ血餅の形成ならびに肝臓及び腎臓の臓器損傷をＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３が予防することを示す。対照プラスミド（ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ、Ｎ＝４）のＣＳＦ３と、ＤＮａｓｅ１（ＣＳＦ３／Ｄ１、Ｎ＝４）、またはＤＮａｓｅ１ｌ３（ＣＳＦ３／Ｄ１Ｌ３、Ｎ＝４）とを共発現するＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−）の解析。対照には、未処置のＷＴマウス（ＵＴＷＴ、Ｎ＝４）及び未処置のＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウス（ＵＴ；Ｎ＝４）が含まれる。図６Ａは、アラニン及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ、ＡＳＴ）の血漿中レベルを示す。図６Ｂは、血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンの血漿中レベルを示す。図６Ｃは、切片ごとの肝臓及び視野（ＦＯＶ）あたりの腎臓における血管内ヘマトキシリンに富む血餅の定量化を示す。図６Ｄは、肝臓と腎臓のＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバー：５００μｍ（概略）、５０μｍ（詳細）。画像は３匹以上のマウスの代表例である。統計：（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）一元配置分散分析とその後のボンフェローニの多重比較事後検定；他の全群に対して、＃Ｐ＜０．０１、§Ｐ＜０．００１。
【図７】ヘマトキシリン陽性血餅がＮＥＴからなることを示す。図３Ａ〜３Ｇに示す慢性好中球増加症（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−＋ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ）を有するＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−）由来の肺の分析。図７Ａは、ＤＮＡ及び連続肺切片のクロマチンに対するヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色を示す。スケールバー：２００μｍ。図７Ｂは、クロマチン、ＣＲＡＭＰ（カテリン関連抗菌ペプチド）、及びＤＮＡの閉塞血管の免疫染色を示す。スケールバー：５０μｍ。図７Ｃは、クロマチン、シトルリン化ヒストン３（ｃｉｔＨ３）、及びＤＮＡの閉塞血管の免疫染色を示す。スケールバー：５０μｍ。画像は３匹以上のマウスの代表例である。
【図８】ヒトＮＥＴがｉｎ  ｖｉｔｒｏで血餅を形成することを示す。図８Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＡ活性化ヒト好中球によって生成されたＮＥＴ血餅（矢印）の写真を示す。未処置の好中球（ＵＴ）または組換えヒトＤＮａｓｅ１（ＰＭＡ＋Ｄ１）の存在下で活性化させた好中球を対照として用いた。スケールバー：５ｍｍ。図８Ｂは、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＮＥＴ血餅のクロマチン及び好中球マーカーであるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の免疫染色を示す。スケールバー：２００μｍ。画像は３つ以上の独立した実験の代表例である。
【図９】ＮＥＴ分解がＳＴＥＣ−ＨＵＳの疾患活性と相関していることを示す。図９Ａは画像を示し、図９Ｂは、緩衝液、正常な健康なドナー由来の血漿（Ｎ＝７）、または急性疾患病態（Ａｃｕｔｅ）及び寛解（Ｒｅｍ．）において回収した１１名のＳＴＥＣ−ＨＵＳ患者の血漿の存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＮＥＴのＤＮＡ染色の定量化を示す。スケールバー：５０μｍ。統計：一元配置分散分析とその後のボンフェローニの多重比較事後検定；他の全群に対して、§Ｐ＜０．００１。
【図１０】剖検報告書（ＡＲＤＳ、急性呼吸促迫症候群）に示されるように、患者数、死因など、試験した様々な患者由来のヒト組織の分類記載の表を示す。患者の性別及び年齢。分析した組織のタイプ。組織を３段階の手順で分析した：第一に、ヘマトキシリン及びエオシン染色におけるヘマトキシリンに富む血餅／凝集体の同定；第二に、クロマチン及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の免疫染色による、ヘマトキシリンが豊富な血餅におけるＮＥＴの同定；第三に、肺構造内のＮＥＴ血餅の局在の同定。
【図１１】ヒトＮＥＴがｉｎ  ｓｉｔｕで血餅を形成することを示す。敗血症の２名の患者から剖検で採取した肺組織（図１０の患者＃６及び＃７）。図１１Ａは、患者＃６由来の肺組織における２つのヘマトキシリンに富む血管内血餅のＨ＆Ｅ染色を示す。図１１Ｂは、パネルＡに示す左の血管のクロマチン及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の連続切片の免疫染色を示す。図１１Ｃは、患者＃７由来の肺組織のＨ＆Ｅ染色血管を示し、ヘマトキシリンに富む血管内血餅を示す。図１１Ｄは、クロマチン及びＭＰＯの連続切片の免疫染色を示す。矢印はＮＥＴの血餅を指し示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１２】敗血症マウスのＮＥＴ血餅が血管を閉塞させることを示す。敗血症ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスの完全に閉塞した血管の、ＤＮＡ、クロマチン、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する免疫染色。ＮＥＴのＤＮＡ及びクロマチン染色（矢印）は、核染色（アスタリスク）よりも暗く見え、細胞間スペースを覆っている。スケールバー：１０μｍ。
【図１３】ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１ｌ３が別個のメカニズムによってＮＥＴを劣化させることを示す。図１３Ａは、ＷＴ、ＤＮａｓｅ１−／−（Ｄ１−／−）、ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−（Ｄ１Ｌ３−／−）、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−）の血清存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＰＦＡ固定ＮＥＴのＤＮＡ染色を示す。データは３つ以上の独立した実験の代表例である。スケールバー：５０μｍ。図１３Ｂは、ＷＴ、Ｄ１−／−、Ｄ１Ｌ３−／−、及びＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウス由来の血清存在下でのインキュベーション後にＰＦＡ固定ＮＥＴから放出された無細胞ＤＮＡ断片の濃度を示す。図１３Ｃは、ビヒクル、組換えマウスＤＮａｓｅ１（ｒｍＤ１）、または組換えマウスＤＮａｓｅ１ｌ３（ｒｍＤ１Ｌ３）存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された非固定化ＮＥＴのＤＮＡ染色を示す。図１３Ｄは、ビヒクル、ｒｍＤ１、またはｒｍＤ１Ｌ３存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された非固定化ＮＥＴから放出された無細胞ＤＮＡ断片の濃度を示す。図１３Ｅは、ビヒクル、ｒｍＤ１、またはｒｍＤ１Ｌ３存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＰＦＡ固定化ＮＥＴのＤＮＡ染色を示す。図１３Ｆは、ビヒクル、ｒｍＤ１、またはｒｍＤ１Ｌ３存在下でのインキュベーション後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＰＦＡ固定化ＮＥＴから放出された無細胞ＤＮＡ断片の濃度を示す。一元配置分散分析とその後のボンフェローニの多重比較事後検定による統計；§Ｐ＜０．０００１。
【図１４】ヒト及びマウスの循環中のＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３活性を示す。図１４Ａ〜図１４Ｅは、ＳＲＥＤにより定量化したヒト及びマウス血漿中のＤＮａｓｅ活性を示す。図１４Ａは、ヒトＤＮａｓｅ１に対するポリクローナル抗体（α−ｈＤＮａｓｅ１）を、正常な健康なドナー（ＮＨＤ）由来の血漿に添加することにより、濃度依存的にＤＮＡ分解活性が遮断されるが、ＩｇＧでは遮断されないことを示す（ＩｇＧに対して、＊：ｐ＜０．０５）。図１４Ｂは、２００μｇ／ｍｌのα−ｈＤＮａｓｅ１、及びＤＮａｓｅ１ｌ３の阻害剤であるヘパリンを添加した血漿が、２００μｇ／ｍｌのα−ｈＤＮａｓｅ１を添加した血漿中の残留ＤＮａｓｅ活性を遮断することを示す（ＮＨＤに対して＊：ｐ＜０．０５）。図１４Ｃ〜図１４Ｅは、マウス及びＮＨＤ由来の血漿の連続希釈におけるＤＮａｓｅ活性の比較を示す。図１４Ｃは、ＷＴマウスの総ＤＮａｓｅ活性がＮＨＤよりもおよそ１０倍高いことを示す。図１４Ｄは、ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス由来の血漿中のＤＮａｓｅ１活性が、５００μｇ／ｍｌヘパリンを添加したヒト血漿よりもおよそ１０倍高いことを示す。（Ｅ  ＤＮａｓｅ１−／−マウスの血漿中のＤＮａｓｅ１ｌ３活性は、２００μｇ／ｍｌのα−ｈＤＮａｓｅ１を添加したヒト血漿に比べておよそ１０倍高い。（Ｆ、Ｇ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＥＴ分解を図１４Ｆ及び図１４Ｇに示す。図１４Ｆは、ＮＨＤ由来血漿単独または２００μｇ／ｍｌのα−ｈＤＮａｓｅ１を添加した血漿、ＴＭＡ患者由来の血漿、ならびにＷＴ、ＤＮａｓｅ１−／−、及びＤＫＯマウス由来の血漿の存在下でインキュベートした活性化好中球を示す（スケールバー：２００μｍ）。図１４Ｇは、記載する供給源由来の血漿の存在下でインキュベートした活性化好中球の上清中の無細胞ＤＮＡを示す（ＮＨＤに対して、§：ｐ＜０．００１）。ヒト血漿中のＤＮａｓｅ１ｌ３はＮＥＴを分解させるのに十分ではないため、ヒト血漿によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＥＴ分解はＤＮａｓｅ１に依存する。
【図１５】ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅｌ３−／−マウスの代替系統における慢性好中球増加症の致死的経過を示す。ＤＮａｓｅ１−／−マウスの代替系統（実施例１の方法を参照）をＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスと交雑させて、複合欠損症のマウスを作製した。図１５Ａは、ＷＴ（Ｎ＝９）、ＤＮａｓｅ１−／−（Ｄ１−／−、Ｎ＝５）、及びＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス（Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−、Ｎ＝５）における好中球増加症の生存曲線を示す。ＣＳＦ３発現プラスミド（ＣＳＦ３）の注入によって慢性好中球増加症を誘発した。図１５Ｂは、肺切片のヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を示す。矢印は、Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウスのヘマトキシリン陽性血餅を指し示す。スケールバー：５００μｍ。図１５Ｃは、ＣＳＦ３と、対照プラスミド（ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ、Ｎ＝６）、ＤＮａｓｅ１（ＣＳＦ３／Ｄ１、Ｎ＝５）、またはＤＮａｓｅ１ｌ３（ＣＳＦ３／Ｄ１Ｌ３、Ｎ＝６）とを共発現するＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウスの生存率を示す。統計：対数順位検定；§Ｐ＜０．００１。
【図１６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１Ｌ３の機能亢進性バリアントを同定するためのスクリーニングアプローチを示す。図１６Ａは、野生型ＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｉ、Ｄ１Ｌ３）、野生型ＤＮａｓｅ１（ＩＩ、Ｄ１）、及びそれらのバリアントを含むＤＮａｓｅのライブラリーを示す。Ｄ１及びＤ１Ｌ３バリアントは、Ｄ１Ｌ３からＤ１（ＩＩＩ、Ｄ１Ｖ）に、及びＤ１からＤ１Ｌ３（ＩＶ、Ｄ１Ｌ３Ｖ）にアミノ酸を転移させることによって設計した。ＤＮａｓｅ活性は、基質として高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ及びクロマチンの分解を用いて試験した。図１６Ｂでは、ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｄ１、０．０００５ｎｇ）。Ｄ１はｄｓＤＮＡをＤ１Ｌ３に比べておよそ１００倍効率的に分解する。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。Ｄ１Ｌ３はクロマチンをＤ１に比べておよそ１００倍効率的に分解する。１０：１または１：１（ｍ／ｍ）の比率では、クロマチンの分解においてＤ１とＤ１Ｌ３は相乗効果を示す。
【図１７】ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。シグナルペプチド、保存アミノ酸、Ｄ１Ｌ３の可変領域における追加のアルギニン及びリジン残基、ならびにＤ１Ｌ３のＣ末端テールを強調表示する。配列のルーラーは、アミノ酸の位置を示す。
【図１８】ＤＮａｓｅ１Ｌ３のみに存在するアルギニン残基及びリジン残基のリストを示す。ＤＮａｓｅ１における対応するアミノ酸及びＤＮａｓｅ１におけるアミノ酸置換を示す。括弧内の数字は、シグナルペプチドを含まない成熟タンパク質におけるアミノ酸位置である。Ｄ１Ｌ３のＣ末端テールに位置するアルギニン及びリジン残基を、レーン２９〜３７に示す。本出願では、可能性のある３７のＤＮａｓｅ１バリアントのうち２２を試験した。
【図１９】図１８に記載した単一のアルギニン及びリジンアミノ酸置換を有するＤＮａｓｅ１バリアントの特徴付けを示す。ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。クロマチン分解活性の増加を引き起こすアミノ酸置換を青色で強調表示する。そのような効果を有さないサンプルを水色で示す。
【図２０】ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１）、マウスＤＮａｓｅ１（配列番号３）、ラットＤＮａｓｅ１（配列番号４）、及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。配列のルーラーは、アミノ酸の位置を示す。シグナルペプチドは、灰色で強調表示する。マウス／ラットＤＮａｓｅ１及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３には存在するが、ヒトＤＮａｓｅ１には存在しないカチオン性アミノ酸残基（アルギニン：Ｒ、リジン：Ｋ）を強調表示する。マウスＤＮａｓｅ１において、そのような４つのＲ／Ｋ残基を示す（Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｗ２０９Ｒ）。ラットＤＮａｓｅ１には、２つの追加のＲ／Ｋ残基（Ｑ１７７Ｋ、Ｇ２６２Ｋ）が含まれる。
【図２１】マウスとヒトのＤＮａｓｅ１の比較を示す。（図２１Ａ）ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示す。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。マウスＤＮａｓｅ１（ｍＤ１）及びヒトＤＮａｓｅ１（Ｄ１）は、同様のレベルのｄｓＤＮＡ分解活性を示す。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。マウスＤＮａｓｅ１（ｍＤ１）は、ヒトＤＮａｓｅ１（Ｄ１）に比べてより高いクロマチン分解活性を示す。（図２１Ｂ）ヒトＤＮａｓｅ１による遺伝子治療は、ＮＥＴによる致死的な血管閉塞からの部分的な保護のみを提供する。血管内ＮＥＴ形成を併発する慢性好中球増加症を、Ｇ−ＣＳＦをコードするＣｓｆ３の肝発現によって誘発した。データは、Ｃｓｆ３発現Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスの生存曲線を示す。動物に、Ｃｓｆ３と空の対照ベクター（Ｃｔｒｌ、Ｎ＝６）、Ｃｓｆ３とヒトＤＮａｓｅ１の混合物（ｈＤｎａｓｅ１、Ｎ＝１２）、及びＣｓｆ３とマウスＤＮａｓｅ１（ｍＤｎａｓｅ１、Ｎ＝５）を注射した。対数順位検定を用いてＰ値を計算した。
【図２２】ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのげっ歯類様ヒトＤＮａｓｅ１バリアントの特徴付けを示す。（図２０Ａ）げっ歯類様ＤＮａｓｅ１バリアントによる遺伝子治療は、ＮＥＴによる致死的な血管閉塞からの完全な保護を提供する。血管内ＮＥＴ形成を併発する慢性好中球増加症を、Ｇ−ＣＳＦをコードするＣｓｆ３の肝発現によって誘発した。データは、Ｃｓｆ３発現Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスの生存曲線を示す。図２１に示すように、動物に、Ｃｓｆ３と空の対照ベクター（Ｃｔｒｌ、Ｎ＝６）、Ｃｓｆ３とヒトＤＮａｓｅ１の混合物（ｈＤｎａｓｅ１、Ｎ＝１２）を注射した。第３群のＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスには、Ｃｓｆ３と、４つのアミノ酸変異Ｑ３１Ｒ／Ｑ４９Ｋ／Ｑ７９Ｒ／Ｗ２０９Ｒ（Ｑ３１Ｒ／Ｑ４９Ｋ／Ｑ７９Ｒ／Ｗ２０９Ｒ、Ｎ＝６）を含むマウス様ＤＮａｓｅ１バリアントをコードする遺伝子を注射した。第４群のＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスには、Ｃｓｆ３と、６つのアミノ酸変異Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｑ１７７Ｋ、Ｗ２０９Ｒ、及びＧ２６２Ｋ（Ｑ３１Ｒ／Ｑ４９Ｋ／Ｑ７９Ｒ／Ｑ１７７Ｋ／Ｗ２０９Ｒ／Ｇ２６２Ｋ、Ｎ＝６）を含むラット様ＤＮａｓｅ１バリアントをコードする遺伝子を注射した。対数順位検定を用いてＰ値を計算した。（図２２Ｂ）ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。ヒトＤＮａｓｅ１のマウス様バリアント（Ｑ３１Ｒ／Ｑ４９Ｋ／Ｑ７９Ｒ／Ｗ２０９Ｒ）、及びヒトＤＮａｓｅ１のラット様バリアント（Ｑ３１Ｒ／Ｑ４９Ｋ／Ｑ７９Ｒ／Ｑ１７７Ｋ／Ｗ２０９Ｒ／Ｇ２６２Ｋ）は同様のｄｓＤＮＡ分解活性を示すが、クロマチン分解活性は野生型ヒトＤＮａｓｅ１よりも高い。
【図２３】ヒトＤＮａｓｅ１（Ｄ１、配列番号１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３、配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。配列のルーラーは、アミノ酸の位置を示す。公開されている変異を有するＤ１のアミノ酸を強調表示する。ヒトＤ１Ｌ３には、ヒトＤＮａｓｅ１の機能獲得に関連する３つの変異（Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆ）と、活性の増加に関連しない４つの変異が含まれる。
【図２４】変異Ｑ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、及び／またはＡ１３６Ｆを有するＤＮａｓｅ１バリアント（Ｄ１Ｖ）の特徴付けを示す。（図２４Ａ）トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清を分析した。野生型ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）及びＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を対照として用いた。ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。３つのアミノ酸変異Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆを特徴とするＤ１Ｖは、Ｄ１、及びＱ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ１３６Ｆ、またはＱ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋを特徴とするＤ１Ｖと同様のｄｓＤＮＡ分解活性を有するが、クロマチン分解能力は高い。（図２４Ｂ）機能亢進性Ｄ１Ｖによる遺伝子治療は、ＮＥＴによる致死的な血管閉塞からの完全な部分的保護を提供する。血管内ＮＥＴ形成を併発する慢性好中球増加症を、Ｇ−ＣＳＦをコードするＣｓｆ３の肝発現によって誘発した。データは、Ｃｓｆ３発現Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスの生存曲線を示す。図２１に示すように、動物に、Ｃｓｆ３と空の対照ベクター（Ｃｔｒｌ、Ｎ＝６）、Ｃｓｆ３とヒトＤＮａｓｅ１の混合物（ｈＤｎａｓｅ１、Ｎ＝１２）を注射した。さらに、Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスの群に、Ｃｓｆ３と、三重アミノ酸変異Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆ（Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆ、Ｎ＝６）を含む、ヒトＤｎａｓｅ１バリアントでコードしている遺伝子を注射した。対数順位検定を用いてＰ値を計算した。
【図２５】野生型ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）と変異Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆを特徴とするＤＮａｓｅ１バリアント（Ｄ１Ｖ）の比較を示す。精製したタンパク質を指定量で分析した。ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、０ｎｇ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。変異Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆを特徴とするＤＮａｓｅ１バリアントは、野生型ＤＮａｓｅ１に比べておよそ１０〜２０倍効率的にクロマチンを分解する。
【図２６】アミノ酸変異Ａ１６４Ｋ、Ａ１３６Ｆ、及びＡ１６４Ｋ／Ａ１３６Ｆを有するＤＮａｓｅ１バリアント（Ｄ１Ｖ）と、野生型ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）及び野生型（Ｄ１Ｌ３）との比較を示す。トランスフェクトしたＨＥＫ細胞の培養上清を分析した。ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。Ａ１３６Ｆ／Ａ１６４Ｋを特徴とするＤＮａｓｅ１バリアントは、クロマチンを最も効率的に分解する。
【図２７】変異Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫを有するＤＮａｓｅ１バリアントの開発を示す。（図２７Ａ）ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号２）のアミノ酸配列アライメント。配列のルーラーは、アミノ酸の位置を示す。ＤＮａｓｅ１Ｌ３の重要なアルギニン残基を強調表示する。ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１Ｌ３の間の共有アミノ酸を強調表示しているが、これらはＤＮａｓｅ１のアミノ酸配列ＡＴＰをＤＮａｓｅ１Ｌ３のＶＫＫＳに置き換えるアンカーとして機能する。（図２７Ｂ）ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。ゲルに、野生型ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）、変異Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ、Ｔ２２７Ｋ、及びＡ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳを特徴とするＤＮａｓｅ１バリアント（Ｄ１Ｖ）をロードした。Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫは、ｄｓＤＮＡ分解活性の低下と相関するが、Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳは相関しない。
【図２８】ヒトＤＮａｓｅ１［４ＡＷＮ］の構造を示す。Ｎ末端βシート及びＣ末端βシートならびにＤ１タンパク質ファミリーのメンバー間で保存されているモチーフＳ２７２／Ｄ２７３／Ｈ２７４を強調表示する。
【図２９】相同タンパク質のビルディングブロック改変の概念を示す。この技術は、保存された単一または複数の可変アミノ酸に隣接する単一または複数の可変アミノ酸を、ドナー及びレシピエントタンパク質間で転移させる。
【図３０】マウス（配列番号３及び３４）、ラット（配列番号４及び３５）、チンパンジー（配列番号３６及び３７）、及びヒト（配列番号１及び２）のＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１Ｌ３のアミノ酸配列アライメントを示す。Ｎ末端シグナルペプチドと保存アミノ酸を強調表示する。可変アミノ酸は強調表示されておらず、これらはＤＮａｓｅ１からＤＮａｓｅ１Ｌ３へ、またはその逆へ転移させることができるビルディングブロックとして機能する。略語：ＡＡ、アミノ酸。
【図３１Ａ】ヒトＤＮａｓｅ１（Ｄ１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）のビルディングブロックのリストを示す。Ｄ１及びＤ１Ｌ３における保存アミノ酸を示し、これらは、それぞれＮアンカー及びＣアンカーとして機能する。ビルディングブロックは、Ｄ１及びＤ１Ｌ３中の可変アミノ酸である。Ｄ１Ｌ３からＤ１へビルディングブロックを転移させる変異を示す。
【図３１Ｂ】ヒトＤＮａｓｅ１（Ｄ１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）のビルディングブロックのリストを示す。Ｄ１Ｌ３のＮアンカー及びＣアンカーを示す。Ｄ１からＤ１Ｌ３へビルディングブロックを転移させる変異を記載する。ＡＡ：アミノ酸。
【図３２】相同タンパク質のビルディングブロック改変の応用法を示す。応用法は、最初のスクリーニング工程として、相同なドナー及びレシピエントタンパク質間のビルディングブロックのクラスターの転移を用いる。追加のオプション工程は、個々のビルディングブロックの転送と、その後の個々のアミノ酸の転移である。最終工程（図示せず）では、複数のアミノ酸、ビルディングブロック、及びビルディングブロッククラスターを組み合わせて、キメラ酵素を変性させてもよい。
【図３３】ＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）由来のビルディングブロックを特徴とするＤＮａｓｅ１バリアント（Ｄ１Ｖ）の特徴付けを示す。ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示した（例えば、Ｃｔｒｌ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。クロマチン分解活性の増加を引き起こすビルディングブロックの置換を、濃い陰影で強調表示する。そのような効果を有さないサンプルを明るい陰影で示す。ビルディングブロック１１、１２〜１４、２６、４１〜４８、及び４９の組み合わせを特徴とするＤＮａｓｅ１バリアントは、野生型ＤＮａｓｅ１Ｌ３と同様のクロマチン分解活性を示す。
【図３４】野生型ＤＮａｓｅ１Ｌ３のＣ末端テールを含まないＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアントの開発を示す。図３４Ａは、ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。配列のルーラーは、アミノ酸の位置を示す。ＤＮａｓｅ１Ｌ３のＣ末端を強調表示し、その核局在化シグナルを長方形で囲む。ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１Ｌ３の間の共有アミノ酸を示す。保存されたＳＤＨモチーフの後に位置するアミノ酸は、ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１Ｌ３の間のビルディングブロッククラスター６０〜６２で交換された。図３４Ｂは、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示すザイモグラフィーを示す。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。野生型ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）、Ｄ１由来のＢＢクラスター６０〜６２を特徴とするＤＮａｓｅ１バリアント（Ｄ１Ｖ）、Ｄ１由来のＢＢクラスター６０〜６２を特徴とするＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（Ｄ１Ｌ３Ｖ）をゲルにロードし、また、２つの変異（Ｋ３０１Ａ、Ｋ３０３Ａ）を有するＤ１Ｌ３Ｖを作製してＮＬＳ２を不活性化した。Ｄ１由来のＢＢクラスター６０〜６２を含むＤ１Ｌ３Ｖは、野生型Ｄ１Ｌ３よりも高いクロマチン分解活性を示した。
【図３５】グリコシル化ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（Ｄ１Ｌ３Ｖ）の開発を示す。図３５Ａは、ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１）及びヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。配列のルーラーは、アミノ酸の位置を示す。ＤＮａｓｅ１のグリコシル化モチーフＮ４０−Ｘ−Ｔ４２及びＮ１２８−Ｘ−Ｔ１３０を強調表示する。この部位は、ビルディングブロック（ＢＢ）４及びビルディングブロッククラスター（ＢＢ）２３〜２５の一部である。ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１Ｌ３の間の関連する共有アミノ酸を強調表示する。（図３５Ｂ）ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｃｔｒｌ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。野生型ＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３）、Ｄ１のＢＢ  ４を特徴とするＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（Ｄ１Ｌ３Ｖ）、及びＤ１のＢＢクラスター２３〜２５を特徴とするＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（Ｄ１Ｌ３Ｖ）をゲルにロードした。Ｄ１Ｌ３に対する抗体を用いたウェスタンブロット（ＷＢ）により、Ｄ１Ｌ３Ｖがより大きなタンパク質の量の増加を示したことが検出された。両方のグリコシル化ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（Ｄ１Ｌ３Ｖ）は、クロマチンを分解する能力を保持していた。
【図３６】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＥＴに対するＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号２）及びそのバリアント（配列番号１７）の治療効果を示す。図３６Ａは、ヘマトキシリンが豊富なマウス心臓及び心室内ＮＥＴの密な血餅のＨ＆Ｅ染色を示す。図３６Ｂは、ＮＥＴの誘発から始まり、ＮＥＴによる血管閉塞及び死に至るタイムラインを示す。血尿と低体温は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＥＴ血餅の外部徴候である。（図３６Ｃ）実験計画の概要：Ｃｓｆ３をＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−で発現させて、ＮＥＴの血管血餅を誘発した。血尿及び低体温を示したマウスを、ビヒクル（Ｎ＝３）、ドルナーゼα（Ｄ１、Ｎ＝３）、精製ＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｄ１Ｌ３、Ｎ＝３）、または精製ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（配列番号１７、Ｄ１Ｌ３Ｖ、Ｎ＝３）の注射により無作為化した。３０分後、肺及び血清を採取した。Ｄ１Ｌ３またはＤ１Ｌ３Ｖによる治療は、肺のＮＥＴによる血管閉塞を有意に減少させ（図３６Ｄ）、血清中のＤＮＡレベルを増加させた（図３６Ｅ）が、生理食塩水またはＤ１では変化がなかった。図３６Ｆは、Ｄ１Ｌ３療法を受けたマウスの血清中のオリゴヌクレオソームを示す。Ｄ１Ｌ３Ｖを投与したマウスは、より小さいモノヌクレオソーム及びジヌクレオソームを示した。Ｄ１療法を受けたマウスの血清由来のＤＮＡ単離物は、様々なサイズのかすかなＤＮＡスメアを示し、一方、ビヒクルを注射したマウスの血清からはＤＮＡを単離することができなかった。
【図３７】虚血再灌流（ＩＲ）損傷のラットモデルにおけるＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（配列番号１７）の治療効果を示す。（図３７Ａ）実験計画の概要：雄の野生型ラットの１つの精巣を精巣捻転に供した。手順は、虚血性組織損傷を引き起こす。マウスを無作為化した。精巣を減捻した後、ビヒクル（Ｎ＝６）、ドルナーゼα（Ｄ１、Ｎ＝６）、または精製ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（配列番号１７、Ｄ１Ｌ３Ｖ、Ｎ＝６）を注射した。未処置及び虚血精巣を７日後に採取した。図３７Ｂは、Ｄ１Ｌ３Ｖによる治療により虚血精巣の萎縮が有意に減少したが、生理食塩水またはＤ１では減少しなかったことを示す。図３７Ｃは、巨視的な組織損傷を定量化した。すべての未処置の精巣は茶色がかっており、血管が発達しており、健康な組織であることを示している（Ｃｔｒｌ、スコア：０）。精巣捻転とその後の再灌流損傷させた組織は白みがかって見えた（ＩＲ、スコア：４）。Ｄ１Ｌ３Ｖによる治療は、組織損傷を実質的に軽減し、４／６の精巣は損傷の徴候を示さなかったが、生理食塩水またはＤ１では軽減されなかった。スケールバー：１ｃｍ。
【図３８】ＤＮａｓｅ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、及びそのバリアントの発現レベルを示す。（図３８Ａ）野生型ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）、そのバリアント（Ｄ１Ｖ、配列番号７）、野生型Ｄ１Ｌ３、及びそのバリアント（Ｄ１Ｌ３Ｖ、配列番号１７）を産生するＣＨＯ細胞の安定したプールを、バイオリアクター内で培養した。サンプルを定期的に採取し、ウエスタンブロットで分析した。Ｄ１及びＤ１Ｖの発現が検出されたが、Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３Ｖのレベルは低かった。（図３８Ｂ）Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３Ｖのロバストな発現をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて達成した。（図３８Ｃ）ザイモグラフィーにより、ｄｓＤＮＡ分解活性を黒丸として示した。ｄｓＤＮＡ分解活性は直径と相関する。活性のないサンプルは、ローディングウェルを小さな黒い斑点として示す（例えば、Ｄ１Ｌ３、０．０００５ｎｇ）。消化されたクロマチンから分離されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）は、高分子量ＤＮＡからより低分子の、すなわち低分子量ＤＮＡへのシフトを示し、これはクロマチン分解活性と相関している。Ｄ１Ｌ３Ｖは、クロマチンをＤ１Ｌ３よりもおよそ１０倍効率的に分解する。
【図３９】本開示による特定のＤＮａｓｅバリアントを示す。シグナルペプチドを含むＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１Ｌ３のアミノ酸変異、ならびにシグナルペプチドを含まない成熟タンパク質を記載する。ビルディングブロック改変を用いて生成した変異には「＋」のマークを付記し、ビルディングブロックを括弧内に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の蓄積及び／または放出を特徴とする病態の治療に有用な、改変型ＤＮａｓｅタンパク質、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーのメンバー（ＤＮａｓｅ１様３及びＤＮａｓｅ１を含む）を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ＮＥＴが関与する血管閉塞を予防または治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書中に示すように、ＮＥＴは、血管閉塞の非標準的なメカニズムに関与しており、フィブリン及び血小板に非依存的である。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「好中球細胞外トラップ」または「ＮＥＴ」とは、好中球、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、マスト細胞、がん細胞、損傷細胞（例えば、損傷内皮細胞）などを含むがこれらに限定されない細胞によって形成される細胞外ＤＮＡを含む任意の細胞外トラップ（「ＥＴ」）を指す。文脈がそうでないことを示していない限り、本明細書中では用語ＮＥＴとＥＴは同じ意味で用いられる。
【００２８】
ヒト及びマウスの循環中に見出される２つの細胞外ＤＮａｓｅ酵素、ＤＮａｓｅ１（Ｄ１）及びＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）が存在する。これらの酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴを分解する能力及びメカニズムを欠いている可能性があり、ヒト及びマウスにおいて比較的低濃度で見出される。天然酵素は、組換え療法、特に全身療法に理想的な物理的、酵素的、及び／または薬力学的特性を有していない。
【００２９】
Ｄ１及びＤ１Ｌ３は、ＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）及びＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）とともに、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーに属する。Ｄ１及びＤ１Ｌ３は、ヒト、霊長類、及びげっ歯類を含む様々な種で発現する。ヒトとマウスでは、Ｄ１とＤ１Ｌ３は、４９〜５２％のタンパク質類似性を示す。しかしながら、それらの相同性にもかかわらず、Ｄ１とＤ１Ｌ３は細胞起源、阻害剤に対する感受性、及び基質親和性が異なる。Ｄ１はタンパク質フリーＤＮＡ（例えば、細菌ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）を優先的に切断するが、Ｄ１Ｌ３は真核細胞の核で一般的に認められるＤＮＡとヒストンの複合体であるクロマチンを標的とする。Ｄ１活性は単量体アクチンと結合すると阻害され、生理的塩濃度に高感受性である。さらに、Ｄ１はＮ４０（シグナルペプチドを含まない成熟酵素のＮ１８に対応）及びＮ１２８（Ｎ１０６）でグリコシル化され、これにより酵素は血清プロテアーゼによる不活性化に耐性を示す。対照的に、Ｄ１Ｌ３はグリコシル化部位及びアクチン結合部位を欠いており、それぞれ、いくつかのプロテアーゼに対する感受性とアクチンに対する耐性を引き起こす。
【００３０】
いくつかの態様では、本発明は、例えば対象におけるＮＥＴ蓄積を低減または予防するための治療により適した物理的、薬力学的、及び／または酵素的特性を有するように改変したＤ１Ｌ３バリアントを提供する。様々な実施形態において、本発明は、以下を含む組換えＤ１Ｌ３タンパク質バリアントを提供する：１つ以上のグリコシル化、基質親和性の増加をもたらす１つ以上のアミノ酸変化、核局在化シグナルの不活性化、Ｃ末端テールの全部または一部の欠失、ペグ化、及びキャリアタンパク質または部分への融合。様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２の野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質に比べて、タンパク質安定性の増加、プロテアーゼ耐性の増加、バイオアベイラビリティの増加、循環中の半減期の増加、及び／または実質的に同等またはより良好なＤＮＡ及び／またはクロマチン及び／またはＮＥＴ分解活性、より高い産生レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞及び／またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を有する。
【００３１】
様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列で定義される酵素に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、本明細書に記載の配列番号２に対して１つ以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２により定義されるＤＮａｓｅ酵素に対して、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、野生型ＤＮａｓｅ酵素との配列同一性に言及する場合、及び特に明記しない限り、配列はシグナルペプチドを欠く成熟酵素を指す。さらに、特に明記しない限り、アミノ酸位置には、明確にするために、シグナルペプチドを含む完全な翻訳ＤＮａｓｅ配列について付番されている。したがって、例えば、配列番号２の酵素に対する配列同一性への言及は、Ｎ末端にＭ２１を有する成熟酵素との同一性の割合を指す。同様に、配列番号１の酵素（ヒトＤ１）に対する配列同一性への言及は、Ｎ末端にＬ２３を有する成熟酵素との同一性の割合を指す。
【００３３】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性の割合は、当技術分野で公知の配列アライメントを介して決定することができる。そのようなアライメントは、いくつかの当技術分野で公知のアルゴリズム、例えば、カーリンとアルトシュルの数学アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＤＧ＆Ｇｉｂｓｏｎ，ＴＪ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−８０）を用いて実施することができる。例示的なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーターを用いる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、組換えＤ１Ｌ３タンパク質バリアントは、１つ以上のグリコシル化コンセンサス配列、例えばＮＸ（Ｔ／Ｓ）を含む。ヒト野生型酵素（配列番号２）は、コンセンサスグリコシル化配列を含んでいない。しかしながら、グリコシル化コンセンサス配列をＤ１Ｌ３に組み込むと、酵素活性に実質的な影響を与えることなく、グリコシル化（及びプロテアーゼ耐性）を付与することができる。いくつかの実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列は、野生型配列（例えば、配列番号２）からの、Ｄ３８Ｎ置換及びＮ４０ＴまたはＮ４０Ｓ置換、及び／またはＡ１２７Ｎ置換及びＶ１２９ＴまたはＶ１２９Ｓ置換を含む。いくつかの実施形態では、組換えＤ１Ｌ３酵素は、１つ、２つ、３つ、または４つのグリコシル化部位を有する。コンセンサス配列は、その酵素活性に影響を与えない位置でタンパク質に導入することができ、いくつかの実施形態では、酵素の構造を維持するために重要な酵素部分の近くに位置する（例えば、アミノ酸２５〜２８９、及びいくつかの実施形態では、アミノ酸２４〜１５０）。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２により定義される酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮａｓｅ酵素を提供し、その場合、酵素は、配列番号２の３８位及び／または１２７位に対応する位置にアスパラギンの置換を有し、Ｎ３８及び／またはＮ１２７はグリコシル化される。いくつかの実施形態では、３８位及び／または１２７位での置換を、本明細書に記載の配列番号１からのビルディングブロック置換により行う。
【００３６】
様々な実施形態において、１つ以上のグリコシル化を有するＤ１Ｌ３バリアントは、野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質（配列番号２）に比べて、血清プロテアーゼ分解に対する耐性の増加及び／または血清半減期の増加を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）の不活性化を含む。Ｄ１Ｌ３には、２つの核局在部位（ＮＬＳ１、ＮＬＳ２）があり、どちらもアポトーシス中に酵素を核に向かわせる。実際、Ｄ１Ｌ３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の核ＤＮＡの断片化に必要である。ＮＬＳ１は、Ｎ末端の近くに位置する（配列番号２に関して、約アミノ酸８０〜９６位）。ＮＬＳ２（配列番号２に関して、アミノ酸２９１〜３０４位）は、Ｃ末端テール（配列番号２に関して、アミノ酸２８３〜３０５位）の内部に組み込まれており、Ｄ１Ｌ３に固有であり、Ｄ１には存在しない。Ｃ末端テールは、Ｄ１Ｌ３が異なる細胞外ＤＮＡ基質、すなわち脂質封入ＤＮＡ及びアポトーシス小体内のクロマチンを分解するために必要であると考えられる。脂質はトランスフェクション中にＤＮＡを封入する。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ、タンパク質フリーＤＮＡ、及びカチオン性脂質が、標的細胞の細胞膜を貫通する複合体を形成する。Ｄ１Ｌ３はトランスフェクションを妨害するが、この機能にはＣ末端が重要である。Ｄ１Ｌ３の生理学的基質は、アポトーシス細胞由来のクロマチンで満たされた細胞外脂質小胞であるアポトーシス小体である。Ｃ末端テールにより、Ｄ１Ｌ３はアポトーシス小体の脂質膜を貫通し、クロマチン充填物を分解することができる。Ｃ末端テールはまた、脂質フリーの細胞外クロマチンのＤ１Ｌ３による分解にも必要であると考えられている。したがって、Ｄ１Ｌ３に固有の分子的特徴であるＣ末端テールは、Ｄ１とＤ１Ｌ３の別個の基質親和性に関与していると思われる。
【００３８】
１つ以上のＮＬＳの不活性化は、循環中の酵素のアベイラビリティ及び／または活性を高める。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ不活性化を、ＮＬＳ１及び／またはＮＬＳ２の全部または一部の欠失により行う。いくつかの実施形態では、ＮＬＳを、ＮＬＳ１及び／またはＮＬＳ２内のアミノ酸の置換及び／または欠失により不活性化する。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ２を完全にまたは部分的に欠失させる。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、Ｃ末端テールの全部または一部の欠失、及び／またはＣ末端テールの１つ以上のアミノ酸の置換を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、ＮＬＳ１ドメインに、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加（例えば、挿入）、または欠失を含む。ＮＬＳ２ドメインまたはその部分を欠失させてもよい。特定の実施形態では、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、Ｃ末端テールドメインに、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。Ｃ末端テールドメインまたはその部分を欠失させてもよい。様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、Ｃ末端テールドメインに位置するＮＬＳ２ドメインに、１つ以上、例えば１、２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントにおいて、ＮＬＳ２ドメインまたはその部分を欠失させることができる。
【００４０】
様々な態様において、本発明は、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーメンバーなどのタンパク質ファミリーの２つのメンバー間の「ビルディングブロック」と呼ばれる単一アミノ酸または複数の隣接アミノ酸の転移に基づくタンパク質改変技術を提供し、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーメンバーの酵素的に活性なバリアント（Ｄ１及びＤ１Ｌ３のバリアントを含む）を生成する。「ビルディングブロック」は、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーの２つ以上のメンバー間で可変であるアミノ酸によって画定される。これらの可変アミノ酸には、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーの２つ以上のメンバーの間で保存されているアミノ酸が隣接している（「アンカー」）。保存された単一アミノ酸または複数の連続アミノ酸（「アンカー」）の間に可変の単一アミノ酸または複数の連続アミノ酸（「ビルディングブロック」）を移植することにより、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーのメンバー間でそれらを交換する。
【００４１】
本アプローチは、本明細書において「ビルディングブロックタンパク質改変」と呼ばれる。３つ以上のアミノ酸を転移させる場合、最大１／３のアミノ酸をさらに置換してもよい。例えば、３つまたは６つのアミノ酸をビルディングブロックとして転移させる場合、それぞれ１つまたは最大２つの残基をさらに置換させてもよい。いくつかの実施形態では、４つ以上のアミノ酸をビルディングブロック置換として転移させ、転移させるアミノ酸の最大２５％を、例えば保存的または非保存的アミノ酸改変でさらに置換する。例えば、４、８、または１２個のアミノ酸を転移させる場合、１、２、または３個のアミノ酸を（それぞれ）ビルディングブロック置換でさらに置換してもよい。
【００４２】
様々な態様（上記の実施形態に関連するものを含む）では、Ｄ１Ｌ３バリアントはＤ１からの少なくとも１つのビルディングブロック置換を含む。図３１は、Ｄ１とＤ１Ｌ３の間の６２個のビルディングブロック置換を示す。
【００４３】
Ｄ１からの例示的なビルディングブロック置換には、以下のうちの１つ以上が含まれる：
配列番号２の１〜２０（ＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ）を配列番号１由来の１〜２２（ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ）に置換；配列番号２の２１〜２５（ＭＲＩＣＳ）を配列番号１由来の２３〜２７（ＬＫＩＡＡ）に置換；配列番号２の２８〜３０（ＶＲＳ）を配列番号１由来の３０〜３２（ＩＱＴ）に置換；配列番号２の３３〜３４（ＥＳ）を配列番号１由来の３５〜３６（ＥＴ）に置換；配列番号２の３６〜４５（ＱＥＤＫＮＡＭＤＶＩ）を配列番号１由来の３８〜４７（ＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ）に置換；配列番号２の４７〜５１（ＫＶＩＫ）を配列番号１由来の４９〜５３（ＱＩＬＳ）に置換；配列番号２の５２（Ｃ）を配列番号１由来の５４（Ｙ）に置換；配列番号２の５４〜５８（ＩＩＬＶＭ）を配列番号１由来の５６〜６０（ＩＡＬＶＱ）に置換；配列番号２の６０〜６１（ＩＫ）を配列番号１由来の６２〜６３（ＶＲ）に置換；配列番号２の６３〜７０（ＳＮＮＲＩＣＰＩ）を配列番号１由来の６５〜７２（ＳＨＬＴＡＶＧＫ）に置換；配列番号２の７２〜７４（ＭＥＫ）を配列番号１由来の７４〜７６（ＬＤＮ）に置換；配列番号２の７７〜８４（ＲＮＳＲＲＧＩＴ）を配列番号１由来の７９〜８４（ＱＤＡＰＤＴ）に置換；配列番号２の８６（Ｎ）を配列番号１由来の８６（Ｈ）に置換；配列番号２の８８〜８９（ＶＩ）を配列番号１由来の８８〜８９（ＶＶ）に置換；配列番号２の９１〜９２（ＳＲ）を配列番号１由来の９１〜９２（ＥＰ）に置換；配列番号２の９６〜９７（ＮＴ）を配列番号１由来の９６〜９７（ＮＳ）に置換；配列番号２の１０１（Ｑ）を配列番号１由来の１０１（Ｒ）に置換；配列番号２の１０３（Ａ）を配列番号１由来の１０３（Ｌ）に置換；配列番号２の１０５（Ｌ）を配列番号１由来の１０５（Ｖ）に置換；配列番号２の１０７〜１１０（ＫＥＫＬ）を配列番号１由来の１０７〜１１０（ＲＰＤＱ）に置換；配列番号２の１１３〜１１６（ＶＫＲＳ）を配列番号１由来の１１３〜１１６（ＡＶＤＳ）に置換；配列番号２の１１８（Ｈ）を配列番号１由来の１１８（Ｙ）に置換；配列番号２の１２０（Ｈ）を配列番号１由来の１２０（Ｄ）に置換；配列番号２の１２２〜１２７（ＹＱＤＧＤＡ）を配列番号１由来の１２２〜１２８（ＧＣＥＰＣＧＮ）に置換；配列番号２の１２９（Ｖ）を配列番号１由来の１３０（Ｔ）に置換；配列番号２の１３１（Ｓ）を配列番号１由来の１３２（Ｎ）に置換；配列番号２の１３５〜１３６（ＦＶ）を配列番号１由来の１３６〜１３７（ＡＩＶ）に置換；配列番号２の１３８（Ｗ）を配列番号１由来の１３９（Ｒ）に置換；配列番号２の１４０〜１４３（ＱＳＰＨ）を配列番号１由来の１４１〜１４４（ＦＳＲＦ）に置換；配列番号２の１４５〜１４８（ＡＶＫＤ）を配列番号１由来の１４６〜１４９（ＥＶＲＥ）に置換；配列番号２の１５０（Ｖ）を配列番号１由来の１５１（Ａ）に置換；配列番号２の１５２（Ｉ）を配列番号１由来の１５３（Ｖ）に置換；配列番号２の１５６〜１５７（ＴＴ）を配列番号１由来の１５７〜１５８（ＡＡ）に置換；配列番号２の１５９〜１６１（ＥＴＳ）を配列番号１由来の１６０〜１６２（ＧＤＡ）に置換；配列番号２の１６３（Ｋ）を配列番号１由来の１６４（Ａ）に置換；配列番号２の１６７（Ｅ）を配列番号１由来の１６８（Ａ）に置換；配列番号２の１６９〜１７０（ＶＥ）を配列番号１由来の１７０〜１７１（ＹＤ）に置換；配列番号２の１７３（Ｔ）を配列番号１由来の１７４（Ｌ）に置換；配列番号２の１７６〜１７８（ＫＨＲ）を配列番号１由来の１７７〜１７９（ＱＥＫ）に置換；配列番号２の１８０〜１８１（ＫＡ）を配列番号１由来の１８１〜１８２（ＧＬ）に置換；配列番号２の１８３〜１８６（ＮＦＩＦ）を配列番号１由来の１８４〜１８７（ＤＶＭＬ）に置換；配列番号２の１９８〜２０１（ＰＫＫＡ）を配列番号１由来の１９９〜２０２（ＲＰＳＱ）に置換；配列番号２の２０３〜２０４（ＫＮ）を配列番号１由来の２０４〜２０５（ＳＳ）に置換；配列番号２の２０８（Ｒ）を配列番号１由来の２０９（Ｗ）に置換；配列番号２の２１０（Ｄ）を配列番号１由来の２１１（Ｓ）に置換；配列番号２の２１２（Ｒ）を配列番号１由来の２１３（Ｔ）に置換；配列番号２の２１４（Ｖ）を配列番号１由来の２１５（Ｑ）に置換；配列番号２の２１８（Ｇ）を配列番号１由来の２１９（Ｐ）に置換；配列番号２の２２０〜２２１（ＱＥ）を配列番号１由来の２２１〜２２２（ＳＡ）に置換；配列番号２の２２５〜２２８（ＶＫＫＳ）を配列番号１由来の２２６〜２２８（ＡＴＰ）に置換；配列番号２の２３０（Ｎ）を配列番号１由来の２３０（Ｈ）に置換；配列番号２の２３８〜２４０（ＬＲＧ）を配列番号１由来の２３８〜２４０（ＶＡＧ）に置換；配列番号２の２４１〜２４６（ＱＥＩＶＳＳ）を配列番号１由来の２４１〜２４６（ＭＬＬＲＧＡ）に置換；配列番号２の２５０（Ｋ）を配列番号１由来の２５０（Ｄ）に置換；配列番号２の２５２〜２５４（ＮＳＶ）を配列番号１由来の２５２〜２５４（ＡＬＰ）に置換；配列番号２の２５６（Ｄ）を配列番号１由来の２５６（Ｎ）に置換；配列番号２の２５９〜２６０（ＫＡ）を配列番号１由来の２５９〜２６０（ＡＡ）に置換；配列番号２の２６２（Ｋ）を配列番号１由来の２６２（Ｇ）に置換；配列番号２の２６４〜２６７（ＴＥＥＥ）を配列番号１由来の２６４〜２６７（ＳＤＱＬ）に置換；配列番号２の２６９〜２７１（ＬＤＶ）を配列番号１由来の２６９〜２７１（ＱＡＩ）に置換；配列番号２由来の２７５（Ｆ）を配列番号１由来の２７５（Ｙ）に置換；配列番号２の２７９〜２８０（ＦＫ）を配列番号１由来の２７９〜２８０（ＶＭ）に置換；及び配列番号２の２８２〜３０５（ＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ）を配列番号１由来の２８２（Ｋ）に置換。
【００４４】
Ｄ１からのこれらのビルディングブロック置換は、以下の変異の１つ以上を特徴とするＤ１Ｌ３のバリアントをもたらす：Ｍ１＿Ａ２０ｄｅｌｉｎｓＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ、Ｍ２１＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＬＫＩＡＡ、Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ、Ｅ３３＿Ｓ３４ｄｅｌｉｎｓＥＴ、Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ、Ｋ４７＿Ｋ５０ｄｅｌｉｎｓＱＩＬＳ、Ｃ５２Ｙ、Ｉ５４＿Ｍ５８ｄｅｌｉｎｓＩＡＬＶＱ、Ｉ６０＿Ｋ６１ｄｅｌｉｎｓＶＲ、Ｓ６３＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＳＨＬＴＡＶＧＫ、Ｍ７２＿Ｋ７４ｄｅｌｉｎｓＬＤＮ、Ｒ７７＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤＴ、Ｎ８６Ｈ、Ｖ８８＿Ｉ８９ｄｅｌｉｎｓＶＶ、Ｓ９１＿Ｒ９２ｄｅｌｉｎｓＥＰ、Ｎ９６＿Ｔ９７ｄｅｌｉｎｓＮＳ、Ｑ１０１Ｒ、Ａ１０３Ｌ、Ｌ１０５Ｖ、Ｋ１０７＿Ｌ１１０ｄｅｌｉｎｓＲＰＤＱ、Ｖ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＡＶＤＳ、Ｈ１１８Ｙ、Ｈ１２０Ｄ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ、Ｖ１２９Ｔ、Ｓ１３１Ｎ、１３５Ｆ＿１３６ＶｄｅｌｉｎｓＡＩ、Ｗ１３８Ｒ、Ｑ１４０＿Ｈ１４３ｄｅｌｉｎｓＦＳＲＦ、Ａ１４５＿Ｄ１４８ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ、Ｖ１５０Ａ、Ｉ１５２Ａ、Ｔ１５６＿Ｔ１５７ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｅ１５９＿Ｓ１６１ｄｅｌｉｎｓＧＤＡ、Ｋ１６３Ａ、Ｅ１６７Ａ、Ｖ１６９＿Ｅ１７０ｄｅｌｉｎｓＹＤ、Ｔ１７３Ｌ、Ｋ１７６＿Ｒ１７８ｄｅｌｉｎｓＱＥＫ、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｎ１８３＿Ｆ１８６ｄｅｌｉｎｓＤＶＭＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２０３＿Ｎ２０４ｄｅｌｉｎｓＳＳ、Ｒ２０８Ｗ、Ｄ２１０Ｓ、Ｒ２１２Ｔ、Ｖ２１４Ｑ、Ｇ２１８Ｐ、Ｑ２２０＿Ｅ２２１ｄｅｌｉｎｓＳＡ、Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ、Ｎ２３０Ｈ、Ｌ２３８＿Ｒ２３９ｄｅｌｉｎｓＶＡ、Ｑ２４１＿Ｓ２４６ｄｅｌｉｎｓＭＬＬＲＧＡ、Ｋ２５０Ｄ、Ｎ２５２＿Ｖ２５４ｄｅｌｉｎｓＡＬＰ、Ｄ２５６Ｎ、Ｋ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｋ２６２Ｇ、Ｔ２６４＿Ｅ２６７ｄｅｌｉｎｓＳＤＱＬ、Ｌ２６９＿Ｖ２７１ｄｅｌｉｎｓＱＡＩ、Ｆ２７５Ｙ、Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ、Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ。
【００４５】
用語「ｄｅｌｉｎｓ」とは、欠失部位にアミノ酸またはアミノ酸の配列が挿入された、記載する２つのアミノ酸の間の欠失を指す。例えば、表記Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲは、Ｅ９１からＰ９２のアミノ酸を欠失させ、アミノ酸ＳＲを欠失部位に挿入することを意味する（例えば、得られるアミノ酸配列はＳ９１及びＲ９２となる）。
【００４６】
用語「ｉｎｓ」とは、記載する２つのアミノ酸間のアミノ酸の挿入を指す。例えば、表記Ｅ９１＿Ｐ９２ｉｎｓＳＲは、Ｅ９１とＰ９２の間にアミノ酸ＳＲを挿入し、配列Ｅ９１、Ｓ９２、Ｒ９３、及びＰ９４が生じることを意味する。
【００４７】
１つの酵素における複数の突然変異は、「／」によって分離され、例えば、Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６ＦまたはＲ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ／Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ／Ｗ２０９Ｒ／Ｓ２１１Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ｑ２１５Ｖ／Ｐ２１９Ｇ／Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、１つ以上の隣接するビルディングブロック置換を含む。例えば、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２に関して、変異Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ（配列番号１７）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２に関して、変異Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ（配列番号１９）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２に関して、変異Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ／Ｖ１２９Ｔ／Ｓ１３１Ｎ（配列番号２０）を含み得る。
【００４９】
例示的な実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号２に関する変異：Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ／Ｖ１２９Ｔ／Ｓ１３１Ｎ、Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫから選択される２つまたは３つの置換を含む。
【００５０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２によって定義される酵素のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列由来の少なくとも１つのビルディングブロック置換を含むＤＮａｓｅ酵素を提供する。配列番号１と２の間のビルディングブロック置換を図３１に図示し、付番する。例えば、いくつかの実施形態では、酵素は、変異Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫを含み、場合により配列番号１７のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、酵素は、変異Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ、Ｖ１２９Ｔ、またはＳ１３１Ｎ、及び場合により配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
例示的なＤ１Ｌ３バリアントとして、配列番号１７〜２０のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１７〜２０のいずれかに比べて、１〜１０（例えば、１〜５）のアミノ酸挿入、欠失、または置換を有する誘導体を含む。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、相同ＤＮａｓｅ（例えば、Ｄ１由来）からの１つ以上の追加のブロックアミノ酸置換を含む。そのようなブロック置換は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個のアミノ酸を置き換え得る。いくつかの実施形態では、ブロック置換は、２〜２０アミノ酸、例えば３〜１５アミノ酸、または３〜１０アミノ酸を、相同ＤＮａｓｅ由来の同等のビルディングブロックで置き換える。
【００５２】
Ｄ１Ｌ３タンパク質の改変型バリアントは、ヒトＤ１Ｌ３のアミノ酸配列（配列番号２）に１つ以上の追加のアミノ酸置換、付加（挿入）、欠失、または切除を含み得る。アミノ酸置換には、保存的及び／または非保存的置換が含まれ得る。
【００５３】
例えば、「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。２０種類の天然アミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類することができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。「保存的置換」は、上記の６つの標準アミノ酸群の同じ群内に記載する別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＡｓｐからＧｌｕへの交換は、そのように改変したポリペプチド中の１つの負電荷を保持する。さらに、グリシン及びプロリンは、α−ヘリックスを破壊する能力に基づいて相互に置換し得る。本明細書中で使用する場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸から、上記の６つの標準アミノ酸群（１）〜（６）の異なる群に記載する別のアミノ酸への交換として定義される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＤＩＬ３タンパク質バリアントは、アルブミン、トランスフェリン、Ｆｃ、またはエラスチン様タンパク質などの半減期延長部分へのＮ末端またはＣ末端の融合を含む。参照によりその全体を本明細書に援用するＵＳ９，４５８，２１８を参照されたい。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域によってＤ１Ｌ３を二量体化させる。例えば、本明細書に記載の改変型酵素は、Ｆｃ融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンのヒンジならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）も含み得る。他の場合では、改変型Ｄ１Ｌ３タンパク質を、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンまたはその断片に融合させる。参照によりその全体を本明細書に援用するＷＯ２０１５／０６６５５０；ＵＳ９，２２１，８９６を参照されたい。アルブミンは、改変型Ｄ１タンパク質のＮ末端またはＣ末端で結合することができ、場合によりアミノ酸リンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃヒンジ領域によってＤ１Ｌ３とＤ１を結合して二量体化し、ＮＥＴを分解するための相乗的機能特性を有する二量体分子を作成する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組換えＤ１Ｌ３タンパク質バリアントは、１つ以上の位置またはＣ末端でコンジュゲートし得る１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。いくつかの実施形態では、その位置の天然アミノ酸を、親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸に置換し、その親水性部分のペプチドへの結合を促進する。他の実施形態では、親水性基を含むように改変したアミノ酸をペプチドのＣ末端に付加する。ＰＥＧ鎖（複数可）は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲の分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ鎖（複数可）は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００５６】
様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３タンパク質バリアントは、野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質に比べて、タンパク質安定性の増加、血清のアベイラビリティの増加、及び実質的に同等またはより良好なＮＥＴ分解活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定）を有する。様々な実施形態において、Ｄ１Ｌ３バリアントは、野生型Ｄ１Ｌ３に比べて、以下の特性の１つ以上を含む：より高いタンパク質フリーＤＮＡ（裸のＤＮＡ）分解活性、同等または実質的に同等（例えば、少なくとも５０％）の染色体ＤＮＡ分解活性、プロテアーゼ耐性、半減期の延長、及びより高い産生レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞及び／またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）。
【００５７】
ＤＮＡ断片化は、ゲル電気泳動及びＤＮａｓｅ活性アッセイなどの当業者に公知の方法を使用して測定することができる。ＮＥＴ、ＮＥＴ分解、及びＤＮＡ断片化活性の定量化方法は、例えば、Ｈａｋｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０１０，１０７（２１）：９８１３−９８１８；Ｎａｐｉｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２００５，３８９：３５５−３６４．  Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００７，１７６（２）：２３１−２４１，Ｓｉｓｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ，２０１６，１６６：８８−１０１、及びＪｉｍｅｎｅｚ−Ａｌｃａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２０１５，１３，７３２−７４２に記載されている。
【００５８】
いくつかの態様では、本発明は、例えば対象におけるＮＥＴ蓄積を低減または予防するための治療により適した物理的、薬力学的、及び／または酵素的特性を有するように改変したＤＮａｓｅ１（Ｄ１）バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、バリアントは組換え発現に適しており、それにより大きな製造上の利点を提供する。様々な実施形態において、改変型Ｄ１バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列によって定義される成熟酵素に対して少なくとも８０％同一であり、１つ以上の変異ＤＮＡ結合部位、クロマチン結合部位の付加、変異アクチン結合部位、グリコシル化部位の変異、核局在化シグナルの付加（例えば、Ｄ１Ｌ３のＮＬＳ１またはＮＬＳ２と類似性または同一性を有する）、及び／またはＤ１Ｌ３のＣ末端テールと同様のＣ末端ドメインを生じる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を有するアミノ酸配列を有する。Ｄ１バリアントは、本明細書に記載するように、配列番号１により定義される酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、配列番号１に関して１つ以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３バリアントは、配列番号１の酵素に対して、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００５９】
様々な実施形態において、Ｄ１バリアントは、ヒトＤ１のアミノ酸配列（配列番号１）に１つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失、または切除を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、記載する保存的及び／または非保存的置換を含み得る。例えば、Ｄ１バリアントは、配列番号１の酵素に関して、１〜２０個（または１〜１０個、または１〜５個）のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、相同ＤＮａｓｅ（例えば、Ｄ１Ｌ３由来の）からの１つ以上の追加のブロックアミノ酸置換を含む。そのようなブロック置換は、相同ＤＮａｓｅ由来の１〜２４アミノ酸、例えば３〜１５アミノ酸、または３〜１０アミノ酸をそれぞれ置換し得る。いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、相同ＤＮａｓｅ（例えば、Ｄ１Ｌ３）由来の２〜５個のブロック置換を含む。いくつかの実施形態では、２つまたは３つの連続したビルディングブロック置換を転移させる。
【００６１】
様々な実施形態において、Ｄ１バリアントを、野生型酵素に比べて以下の特徴の１つ以上を含むように改変する：実質的に同等またはより高いタンパク質フリーＤＮＡ（裸のＤＮＡ）分解活性（例えば、少なくとも５０％以上）、より高い染色体ＤＮＡ分解活性、同様または向上したプロテアーゼ耐性、アクチン耐性、血清半減期の延長、血液から尿または胆汁への浸透の向上、またはそのような特性の組み合わせ。
【００６２】
いくつかの実施形態では、改変型Ｄ１酵素は、野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質のＣ末端ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸２８３〜３０５）に対して、少なくとも５０％（または少なくとも７０％、８０％、９０％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｄ１酵素は、野生型Ｄ１Ｌ３のＮＬＳ１（配列番号２のアミノ酸３５〜５１）に対して、少なくとも５０％または少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、野生型Ｄ１Ｌ３タンパク質の核局在化シグナル２（ＮＬＳ２）（配列番号２のアミノ酸２９６〜３０４）に対して実質的な配列同一性を有するＮＬＳ２を有する。
【００６４】
様々な態様において、組換えＤ１バリアントは、以下から選択される１つ以上のビルディングブロック置換を含む：配列番号１由来の１〜２２（ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ）を配列番号２由来の１〜２０（ＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬ  ＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ）に置換；配列番号１由来の２３〜２７（ＬＫＩＡＡ）を配列番号２由来の２１〜２５（ＭＲＩＣＳ）に置換；配列番号１由来の３０〜３２（ＩＱＴ）を配列番号２由来の２８〜３０（ＶＲＳ）に置換；配列番号１由来の３５〜３６（ＥＴ）を配列番号２由来の３３〜３４（ＥＳ）に置換；配列番号１由来の３８〜４７（ＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ）を配列番号２由来の３６〜４５（ＱＥＤＫＮＡＭＤＶＩ）に置換；配列番号１由来の４９〜５２（ＱＩＬＳ）を配列番号２由来の４７〜５０（ＫＶＩＫ）に置換；配列番号１由来の５４（Ｙ）を配列番号２由来の５２（Ｃ）に置換；配列番号１由来の５６〜６０（ＩＡＬＶＱ）を配列番号２由来の５４〜５８（ＩＩＬＶＭ）に置換；配列番号１由来の６２〜６３（ＶＲ）を配列番号２由来の６０〜６１（ＩＫ）に置換；配列番号１由来の６５〜７２（ＳＨＬＴＡＶＧＫ）を配列番号２由来の６３〜７０（ＳＮＮＲＩＣＰＩ）に置換；配列番号１由来の７４〜７６（ＬＤＮ）を配列番号２由来の７２〜７４（ＭＥＫ）に置換；配列番号１由来の７９〜８４（ＱＤＡＰＤＴ）を配列番号２由来の７７〜８４（ＲＮＳＲＲＧＩＴ）に置換；配列番号１由来の８６（Ｈ）を配列番号２由来の８６（Ｎ）に置換；配列番号１由来の８８〜８９（ＶＶ）を配列番号２由来の８８〜８９（ＶＩ）に置換；配列番号１由来の９１〜９２（ＥＰ）を配列番号２由来の９１〜９２（ＳＲ）に置換；配列番号１由来の９６〜９７（ＮＳ）を配列番号２由来の９６〜９７（ＮＴ）に置換；配列番号１由来の１０１（Ｒ）を配列番号２由来の１０１（Ｑ）に置換；配列番号１由来の１０３（Ｌ）を配列番号２由来の１０３（Ａ）に置換；配列番号１由来の１０５（Ｖ）を配列番号２由来の１０５（Ｌ）に置換；配列番号１由来の１０７〜１１０（ＲＰＤＱ）を配列番号２由来の１０７〜１１０（ＫＥＫＬ）に置換；配列番号１由来の１１３〜１１６（ＡＶＤＳ）を配列番号２由来の１１３〜１１６（ＶＫＲＳ）に置換；配列番号１由来の１１８（Ｙ）を配列番号２由来の１１８（Ｈ）に置換、配列番号１由来の１２０（Ｄ）を配列番号２由来の１２０（Ｈ）に置換；配列番号１由来の１２２〜１２８（ＧＣＥＰＣＧＮ）を配列番号２由来の１２２〜１２７（ＹＱＤＧＤＡ）に置換、配列番号１由来の１３０（ＴＦ）を配列番号２由来の１２９（Ｖ）に置換；配列番号１由来の１３２（Ｎ）を配列番号２由来の１３１（Ｓ）に置換；配列番号１由来の１３６〜１３７（ＡＩ）を配列番号２由来の１３５〜１３６（ＦＶ）に置換；配列番号１由来の１３９（Ｒ）を配列番号２由来の１３８（Ｗ）に置換；配列番号１由来の１４１〜１４４（ＦＳＲＦ）を配列番号２由来の１４０〜１４３（ＱＳＰＨ）に置換；配列番号１由来の１４６〜１４９（ＥＶＲＥ）を配列番号２由来の１４５〜１４８（ＡＶＫＤ）に置換；配列番号１由来の１５１（Ａ）を配列番号２由来の１５０（Ｖ）に置換；配列番号１由来の１５３（Ｖ）を配列番号２由来の１５２（Ｉ）���置換；配列番号１由来の１５７〜１５８（ＡＡ）を配列番号２由来の１５６〜１５７（ＴＴ）に置換；配列番号１由来の１６０〜１６２（ＧＤＡ）を配列番号２由来の１５９〜１６１（ＥＴＳ）に置換；配列番号１由来の１６４（Ａ）を配列番号２由来の１６３（Ｋ）に置換；配列番号１由来の１６８（Ａ）を配列番号２由来の１６７（Ｅ）に置換；配列番号１由来の１７０〜１７１（ＹＤ）を配列番号２由来の１６９〜１７１（ＶＥ）に置換；配列番号１由来の１７４（Ｌ）を配列番号２由来の１７３（Ｔ）に置換；配列番号１由来の１７７〜１７９（ＱＥＫ）を配列番号２由来の１７６〜１７８（ＫＨＲ）に置換；配列番号１由来の１８１〜１８２（ＧＬ）を配列番号２由来の１８０〜１８１（ＫＡ）に置換；配列番号１由来の１８４〜１８７（ＤＶＭＬ）を配列番号２由来の１８３〜１８７（ＮＦＩＦ）に置換；配列番号１由来の１９９〜２０２（ＲＰＳＱ）を配列番号２由来の１９８〜２０１（ＰＫＫＡ）に置換；配列番号１由来の２０４〜２０５（ＳＳ）を配列番号２由来の２０３〜２０４（ＫＮ）に置換；配列番号１由来の２０９（Ｗ）を配列番号２由来の２０８（Ｒ）に置換；配列番号１由来の２１１（Ｓ）を配列番号２由来の２１０（Ｄ）に置換；配列番号１由来の２１３（Ｔ）を配列番号２由来の２１２（Ｒ）に置換；配列番号１由来の２１５（Ｑ）を配列番号２由来の２１４（Ｖ）に置換；配列番号１由来の２１９（Ｐ）を配列番号２由来の２１８（Ｇ）に置換；配列番号１由来の２２１〜２２２（ＳＡ）を配列番号２由来の２２０〜２２１（ＱＥ）に置換；配列番号１由来の２２６〜２２８（ＡＴＰ）を配列番号２由来の２２５〜２２８（ＶＫＫＳ）に置換；配列番号１由来の２３０（Ｈ）を配列番号２由来の２３０（Ｎ）に置換；配列番号１由来の２３８〜２３９（ＶＡ）を配列番号２由来の２３８〜２３９（ＬＲ）に置換；配列番号１由来の２４１〜２４６（ＭＬＬＲＧＡ）を配列番号２由来の２４１〜２４６（ＱＥＩＶＳＳ）に置換；配列番号１由来の２５０〜２５１（Ｄ）を配列番号２由来の２５０〜２５１（Ｋ）に置換；配列番号１由来の２５２〜２５４（ＡＬＰ）を配列番号２由来の２５２〜２５４（ＮＳＶ）に置換；配列番号１由来の２５６（Ｎ）を配列番号２由来の２５６（Ｄ）に置換；配列番号１由来の２５９〜２６０（ＡＡ）を配列番号２由来の２５９〜２６０（ＫＡ）に置換；配列番号１由来の２６２（Ｇ）を配列番号２由来の２６２（Ｋ）に置換；配列番号１由来の２６４〜２６７（ＳＤＱ）を配列番号２由来の２６４〜２６７（ＴＥＥＥ）に置換；配列番号１由来の２６９〜２７１（ＱＡＩ）を配列番号２由来の２６９〜２７１（ＬＤＶ）に置換；配列番号１由来の２７５（Ｙ）を配列番号２由来の２７５（Ｆ）に置換；配列番号１由来の２７９〜２８０（ＶＭ）を配列番号２由来の２７９〜２８０（ＦＫ）に置換；及び配列番号１由来の２８２（Ｋ）を配列番号２由来の２８２〜３０５（ＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ）に置換。
【００６５】
Ｄ１Ｌ３からのビルディングブロック置換は、以下の変異の１つ以上を特徴とするＤ１のバリアントをもたらす：１Ｍ＿Ｓ２２ｄｅｌｉｎｓＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ、Ｌ２３＿Ａ２７ｄｅｌｉｎｓＭＲＩＣＳ、Ｉ３０＿Ｔ３２ｄｅｌｉｎｓＶＲＳ、Ｅ３５＿Ｔ３６ｄｅｌｉｎｓＥＳ、Ｍ３８＿Ｉ４７ｄｅｌｉｎｓＱＥＤＫＮＡＭＤＶＩ、Ｑ４９＿Ｓ５２ｄｅｌｉｎｓＫＶＩＫ、Ｙ５４Ｃ、Ｉ５６＿Ｑ６０ｄｅｌｉｎｓＩＩＬＶＭ、Ｖ６２＿Ｒ６３ｄｅｌｉｎｓＩＫ、Ｓ６５＿Ｋ７２ｄｅｌｉｎｓＳＮＮＲＩＣＰＩ、Ｌ７４＿Ｎ７６ｄｅｌｉｎｓＭＥＫ、Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ、Ｈ８６Ｎ、Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ、Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ、Ｎ９６＿Ｓ９７ｄｅｌｉｎｓＮＴ、Ｒ１０１Ｑ、Ｌ１０３Ａ、Ｖ１０５Ｌ、Ｒ１０７＿Ｑ１１０ｄｅｌｉｎｓＫＥＫＬ、Ａ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＶＫＲＳ、Ｙ１１８Ｈ、Ｄ１２０Ｈ、Ｇ１２２＿Ｎ１２８ｄｅｌｉｎｓＹＱＤＧＤＡ、Ｔ１３０Ｓ、Ｎ１３２Ｓ、Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ、Ｒ１３９Ｗ、Ｆ１４１＿Ｆ１４４ｄｅｌｉｎｓＱＳＰＨ、Ｅ１４６＿Ｅ１４９ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ、Ａ１５１Ｖ、Ｖ１５３Ｉ、Ａ１５７＿Ａ１５８ｄｅｌｉｎｓＴＴ、Ｇ１６０＿Ａ１６２ｄｅｌｉｎｓＥＴＳ、Ａ１６４Ｋ、Ａ１６８Ｅ、Ｙ１７０＿Ｄ１７１ｄｅｌｉｎｓＶＥ、Ｌ１７４Ｔ、Ｑ１７７＿Ｋ１７９ｄｅｌｉｎｓＫＨＲ、Ｇ１８１＿Ｌ１８２ｄｅｌｉｎｓＫＡ、Ｄ１８４＿Ｌ１８７ｄｅｌｉｎｓＮＦＩＦ、Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ、Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ、Ｗ２０９Ｒ、Ｓ２１１Ｄ、Ｔ２１３Ｒ、Ｑ２１５Ｖ、Ｐ２１９Ｇ、Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ、Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳ、Ｈ２３０Ｎ、Ｖ２３８＿Ａ２３９ｄｅｌｉｎｓＬＲ、Ｍ２４１＿Ａ２４６ｄｅｌｉｎｓＱＥＩＶＳＳ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５２＿Ｐ２５４ｄｅｌｉｎｓＮＳＶ、Ｎ２５６Ｄ、Ａ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＫＡ、Ｇ２６２Ｋ、Ｓ２６４＿Ｌ２６７ｄｅｌｉｎｓＴＥＥＥ、Ｑ２６９＿Ｉ２７１ｄｅｌｉｎｓＬＤＶ、Ｙ２７５Ｆ、Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ、Ｋ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ。
【００６６】
いくつかの実施形態では、組換えＤ１バリアントは、配列番号１に関して以下の改変を含む：Ｙ２７５Ｆ、Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ、及びＫ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ（配列番号１６）。そのようなバリアントは、Ｃ末端テールを含み、ＤＮＡ−脂質複合体に対してより高い親和性を示す。
【００６７】
いくつかの実施形態では、組換えＤ１バリアントは、配列番号１に関して以下のアミノ酸改変を含む：Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ（例えば、配列番号１０）；Ｈ８６Ｎ、及び／または、Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ、及び／またはＥ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ（例えば、３つすべてを含む配列番号１１）；Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ（例えば、配列番号１２）；Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ、及び／またはＳ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ、及び／またはＷ２０９Ｒ、及び／またはＳ２１１Ｄ、及び／またはＴ２１３Ｒ、及び／またはＱ２１５Ｖ、及び／またはＰ２１９Ｇ、及び／またはＳ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ（例えば、８つすべてを含む配列番号１３）；及びＡ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳ（例えば、配列番号１４）。
【００６８】
Ｄ１バリアントが置換Ｈ８６Ｎを含むいくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも１つのさらなる改変、例えば、本明細書に記載のビルディングブロック置換または他の点変異（例えば、アクチンに対する耐性をもたらすカチオン性アミノ酸の付加または置換）を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、以下の配列番号１に関する変異をもたらす少なくとも２つの隣接する連続的なビルディングブロック置換を含む：Ｈ８６Ｎ／Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ（例えば、配列番号１１）；Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ／Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ／Ｗ２０９Ｒ／Ｓ２１１Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ｑ２１５Ｖ／Ｐ２１９Ｇ／Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ（例えば、配列番号１３）；Ｙ２７５Ｆ／Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ／Ｋ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ（配列番号１６）。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１によって定義される酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列由来の少なくとも１つのビルディングブロック置換を含むＤＮａｓｅ酵素を提供し、その場合、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１のＤＮａｓｅ酵素に比べてクロマチン分解活性が増加している。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号２由来の少なくとも２つの隣接するビルディングブロック置換を含む。Ｄ１（配列番号１）とＤ１Ｌ３（配列番号２）との間のビルディングブロック置換を図３１に示す。
【００７１】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴを含み、場合により配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ｈ８６Ｎ／Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ／Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲを含み、場合により配列番号１１のアミノ酸配列を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶを含み、場合により配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ、及び／またはＳ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ、及び／またはＷ２０９Ｒ、及び／またはＳ２１１Ｄ、及び／またはＴ２１３Ｒ、及び／またはＱ２１５Ｖ、及び／またはＰ２１９Ｇ、及び／またはＳ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥのうちの２つ以上を含み、場合により配列番号１３のアミノ酸配列（８つすべてを含む）を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳを含み、場合により配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ、及び／またはＨ８６Ｎ、及び／またはＶ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ、及び／またはＥ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ、及び／またはＡ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ、及び／またはＲ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ、及び／またはＳ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ、及び／またはＷ２０９Ｒ、及び／またはＳ２１１Ｄ、及び／またはＴ２１３Ｒ、及び／またはＱ２１５Ｖ、及び／またはＰ２１９Ｇ、及び／またはＳ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ、及び／またはＡ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳのうちの２つ以上を含み、場合により配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関して以下の改変：Ｙ２７５Ｆ、及び／またはＶ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ、及び／またはＫ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳのうちの２つ以上を含み、場合により配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【００７８】
例示的なＤ１バリアントとして、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のいずれか１つに対して１〜１０（例えば、１〜５）のアミノ酸挿入、欠失、または置換を有する誘導体を含む。いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、相同ＤＮａｓｅ（例えば、Ｄ１Ｌ３）由来の１つ以上の追加のブロックアミノ酸置換を含む。そのようなブロック置換は、Ｄ１バリアントの２〜２０個のアミノ酸、例えば３〜１５個のアミノ酸、または３〜１０個のアミノ酸を、相同ＤＮａｓｅ由来のビルディングブロックアミノ酸（例えば、Ｄ１Ｌ３、配列番号２）に置き換える。Ｄ１とＤ１Ｌ３との間のビルディングブロック置換を図３１に示す。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１５に対して少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７９】
様々な実施形態において、酵素は：配列番号１の酵素と同様またはより高いタンパク質フリーＤＮＡへの親和性、配列番号１の酵素に比べてより高いクロマチン分解活性、配列番号１の酵素に比べてアクチンによる阻害に耐性を有する酵素活性、及びその組み合わせから選択される１つ以上の特性を示す。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントは、Ｄ１Ｌ３について記載するように、アルブミン、トランスフェリン、Ｆｃ、またはエラスチン様タンパク質などの半減期延長部分へのＮ末端またはＣ末端融合を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域によってＤ１酵素を二量体化する。
【００８１】
様々な実施形態において、Ｄ１バリアントは：同等またはより高いタンパク質フリーＤＮＡ（裸のＤＮＡ）分解活性、より高い染色体ＤＮＡ（クロマチン）分解活性、同様または向上したプロテアーゼ耐性、アクチン耐性、同様または向上した血液から尿及び／または胆汁への浸透、及びより高い産生レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞及び／またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ならびにそれらの組み合わせから選択される１つ以上の特性を示す。
【００８２】
様々な実施形態において、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１により定義される酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、１つ以上のアルギニン及び／またはリジン残基の置換、挿入、または付加を含み、その場合、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１の酵素に比べてクロマチン分解活性が増加している。いくつかの実施形態では、１つ以上のアルギニン及び／またはリジン残基は、配列番号１の３１、４１、４９、５２、６８、７６、７９、８１、９２、１０９、１１４、１１５、１６４、１７７、１８１、２００、２０１、２０４、２０９、２１３、２２７、２３９、２５０、２５９、２６２、及び２８０位に対応する位置での置換から選択されるアミノ酸置換である。これらの位置での例示的な改変として、Ｑ３１Ｒ、Ａ４１Ｋ、Ｑ４９Ｒ、Ｓ５２Ｋ、Ｔ６８Ｒ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｄ８０＿Ａ８１ｉｎｓＲ、Ａ８１Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｒ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｇ１８１Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ２３９Ｒ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５９Ｋ、Ｇ２６２Ｋ、及びＫ２８０Ｍが挙げられる。様々な実施形態において、酵素は、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つのアルギニン及び／またはリジン残基の置換及び／または挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１の３１、４９、７６、７９、９２、１０９、１６４、１７７、２００、２０１、２０４、２０９、２１３、及び２６２位に対応する１つ以上の位置にアルギニンまたはリジンを含み、それらは、場合により、Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｒ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、及びＧ２６２Ｋから選択される。これらの位置／置換は、独立して、クロマチンを分解する活性などのより良好な活性を提供することができる。
【００８３】
様々な実施形態において、酵素がＱ３１ＲまたはＴ２２７Ｋの置換を含む場合、酵素は、Ｑ３１Ｒ、Ａ４１Ｋ、Ｑ４９Ｒ、Ｓ５２Ｋ、Ｔ６８Ｒ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｄ８０＿Ａ８１ｉｎｓＲ、Ａ８１Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｒ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｇ１８１Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ２３９Ｒ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５９Ｋ、Ｇ２６２Ｋ、及びＫ２８０Ｍから選択される少なくとも２つのアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換には、配列番号１に関してＱ３１Ｒ及びＴ２２７Ｋが含まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１の３１、４９、７９、及び２０９位に対応する位置にアルギニンまたはリジンを有し、場合により以下のアミノ酸置換を含み得る：Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、及びＷ２０９Ｒ。これらの位置は、マウスＤ１ではアルギニンまたはリジンを保持するが、野生型ヒトＤ１においては保持しておらず、クロマチン分解活性をヒトＤ１に転移させることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１の３１、４９、７９、１７７、２０９、及び２６２位に対応する位置にアルギニンまたはリジンを有し、場合によりアミノ酸置換Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ａ１３６Ｆ、Ｑ１７７Ｋ、Ｗ２０９Ｒ、Ｇ２６２Ｋを含み得る。これらの位置のうち４つは、ラットＤ１ではアルギニンまたはリジンを保持するが、野生型ヒトＤ１においては保持しておらず、共同でクロマチン分解活性をヒトＤ１に転移させることができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１の３１及び２２７位に対応する位置にリジンまたはアルギニン残基を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１の１６４位に対応する位置にリジンまたはアルギニンを有し、これは場合によりリジン（Ａ１６４Ｋ）である。
【００８８】
様々な実施形態において、改変型Ｄ１タンパク質は、アクチン結合部位（例えば、Ａ１３６の置換、例えばＡ１３６Ｆ）に１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、付加、及び欠失）を含み、それによりアクチン結合を妨害するかまたは予防する。そのように、改変型Ｄ１タンパク質は、アクチン耐性または実質的にアクチン耐性であり得る。Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９３，ｐｐ８２２５−８２２９（１９９６）を参照のこと。したがって、様々な実施形態において、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１に関して１３６位にアミノ酸置換を含み、これは場合によりＡ１３６Ｆである。アクチン耐性を提供するＤ１への変異、例えば、１３６位での変異（例えば、Ａ１３６Ｆ、またはこの位置での別のかさ高い、疎水性、環状または芳香族アミノ酸の置換）を、カチオン性残基の付加またはビルディングブロック置換を含む本明細書に記載の他の変異と組み合わせてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントはアクチン阻害に耐性があり、クロマチンを分解することができる。例えば、Ｄ１バリアントは、配列番号１に関して以下のアミノ酸置換：Ｑ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、及びＡ１３６Ｆを含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、以下のアミノ酸置換：Ａ１６４Ｋ及びＡ１３６Ｆを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１に関してＮ４０Ｓ置換及び／またはＮ１２８Ｓ置換を含むグリコシル化コンセンサス配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に関してアミノ酸置換：Ｑ３１Ｒ、Ｎ４０Ｓ、Ａ１３６Ｆ、Ｎ１２８Ｓ、及びＴ２２７Ｋを含む。
【００９１】
様々な実施形態において、Ｄ１バリアントは、グリコシル化部位に１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、付加、挿入、及び欠失）を含み、それにより脂質封入ＤＮＡに対する親和性を増加させる。そのため、改変型Ｄ１タンパク質は、トランスフェクション反応において脂質封入ＤＮＡを分解することができる。Ｗｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６，３５−４２（２００２）参照。
【００９２】
様々な実施形態において、Ｄ１バリアントは、グリコシル化されているか、または、特に、長い循環半減期が必要とされない場合ではグリコシル化されていなくてもよい。本明細書に記載のアミノ酸の変化は、グリコシル化または非グリコシル化バリアントに関して行うことができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントはアクチン阻害に耐性であり、脂質小胞内のクロマチンを分解することができる。例示的なＤ１バリアントは、配列番号１に従って付番したアミノ酸で：Ｑ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ１３６Ｆ、Ｎ４０ＤまたはＮ４０Ａ、及びＮ１２８ＤまたはＮ１２８Ｓから選択される１つ以上のアミノ酸改変を含む。そのようなバリアントはグリコシル化部位を欠いている場合があり、これは製造の観点からは有利である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ｄ１バリアントはアクチン阻害に耐性であり、脂質小胞内のクロマチンを分解することができ、配列番号１に関してアミノ酸改変Ｑ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ１３６Ｆ、Ｎ４０Ｄ、及びＮ１２８Ｄを含む。
【００９５】
Ｄ１に対する他の改変は、その開示全体を参照により本明細書に援用するＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３，１１７０１−１１７０８及びＵＳ２０１４／０１９９３２９に記載されている通りであり得る。
【００９６】
改変型Ｄ１バリアントは、野生型Ｄ１タンパク質（配列番号１）に比べて、血清半減期を増加、すなわち延長させることができる。いくつかの実施形態では、改変型Ｄ１は、Ｆｃ融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンのヒンジ領域、及び／またはＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、改変型Ｄ１を、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンまたはその断片に融合する。アルブミンは、場合によりアミノ酸リンカーを介して、改変型Ｄ１酵素のＮ末端またはＣ末端に結合させることができる。
【００９７】
いくつかの態様では、本発明は、組換えＤ１Ｌ３及び／またはＤ１バリアント、またはそれをコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。様々な実施形態において、組換えＤ１Ｌ３タンパク質バリアントを、非経口投与または肺投与用に製剤化する。いくつかの実施形態では、組成物を、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、筋肉内、局所、もしくは皮下投与、または本明細書に記載の他の経路用に製剤化する。いくつかの実施形態では、組成物は、それぞれ場合により本明細書に記載の改変型バリアントであるＤ１Ｌ３及びＤ１の両方を含む。いくつかの実施形態では、組換えＤ１Ｌ３バリアント及び組換えＤ１バリアントを、非経口投与または肺投与用に製剤化する。
【００９８】
用語「薬学的に許容される担体」には、成分の生物学的活性の有効性を妨げず、それを投与する患者に対して毒性がない任意の担体が含まれるが、これらに限定されない。適切な医薬担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳剤などの乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。そのような担体は、従来の方法で製剤化することができ、適切な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。また、これらの組成物に、防腐剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含ませてもよい。様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含ませることにより、微生物の作用を確実に予防してもよい。
【００９９】
投与経路として、例えば：皮内、筋肉内、腹腔内、関節内、静脈内、皮下、動脈内、経口、舌下、肺、または経皮が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は、経口的に、または非経口注射もしくは注入により行う。いくつかの実施形態では、投与経路は、点眼薬または洗口剤としてなど、局所的である。
【０１００】
さらに他の態様では、本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）蓄積を低減または予防するための医薬組成物の製造方法を提供する。これらの実施形態では、本発明は、Ｄ１及びＤ１Ｌ３活性を欠く遺伝子改変マウス、ならびにＧ−ＣＳＦポリヌクレオチドの異種発現（例えば、肝細胞内の）または持続的な内在性Ｇ−ＣＳＦ発現の誘導（例えば、微生物化合物の反復投与による）を用いる。このマウスモデルはＮＥＴを蓄積し、ＮＥＴ関連の血管閉塞を急速に発症する。これらの実施形態では、本発明は、候補ＮＥＴ阻害剤または候補ＤＮａｓｅ酵素（本開示によるＤ１Ｌ３またはＤ１バリアントを含む）を遺伝子改変マウスに投与し、ＮＥＴの蓄積を減少させるＮＥＴ阻害剤またはＤＮａｓｅ酵素を選択することを含む。選択された阻害剤または酵素を、ヒト患者への投与のために製剤化する（記載するように）。
【０１０１】
当業者であれば、ダブルノックアウトＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスを生成するための標準的な方法を認識している。詳細な説明は、例えば欧州出願第ＥＰ１７１５２５２８．０に見出すことができる。
【０１０２】
いくつかの態様では、本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）分解を必要とする対象の治療方法を提供する。方法は、本開示に従って治療有効量のＤ１Ｌ３及び／またはＤ１（Ｄ１Ｌ３及びＤ１の併用療法のためのものを含む、本明細書に記載のバリアント、またはいくつかの実施形態では１つ以上の野生型酵素を含み得る）を投与することを含む。Ｄ１Ｌ３またはＤ１は、組換えタンパク質を含むか、またはいくつかの実施形態では、コードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれを含むベクターを含む医薬組成物として投与してもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント及びＤ１またはそのバリアントを投与することを含む。Ｄ１Ｌ３またはそのバリアント、及びＤ１またはそのバリアントは、単一の医薬組成物または別個の医薬組成物で投与してもよい。いくつかの実施形態では、Ｄ１Ｌ３またはそのバリアントとＤ１またはそのバリアントの比は、質量で１００：１〜１：１００、または質量で１０：１〜１：１０の範囲であり、場合により約１：１である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＥＴ分解の不全及び／またはＮＥＴ蓄積の異常を示す。いくつかの実施形態では、対象は、慢性または急性炎症性障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、急性または慢性感染症を有する。
【０１０５】
様々な実施形態において、本発明は、ＮＥＴの存在または蓄積を特徴とする疾患または病態の治療に関する。そのような疾患または病態として、慢性好中球増加症（例えば、好中球数の増加）、好中球凝集及び白血球停滞、血栓症及び血管閉塞（例えば、鎌状赤血球症）、虚血再灌流障害（例えば、腸軸捻転、精巣捻転、四肢虚血再灌流、重要臓器虚血再灌流、臓器移植）、外科的及び外傷性組織損傷、急性または慢性炎症反応または疾患、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、関節リウマチ、血管炎、全身性硬化症）、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓溶解療法を含む静脈血栓塞栓症）、代謝性疾患（例えば、糖尿病）、全身性炎症（例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、及び血栓性微小血管障害（ＴＭＡ））、気道の炎症性疾患（例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、喫煙性肺損傷、輸血関連急性肺損傷（ＴＲＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び喘息、無気肺、気管支炎、膿胸）、腎炎症性疾患（急性腎障害（ＡＫＩ）及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む急性及び慢性腎疾患、移植組織に関連する炎症性疾患（例えば、移植片対宿主病）ならびにがん（例えば、白血病、腫瘍転移、及び固形腫瘍）に関連する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、対象は、管系を閉塞するＮＥＴを有するか、またはそのリスクがある。本発明は、膵炎、胆管炎、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を治療するために対象に投与することができる。そのような実施形態では、方法は、治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント、及び／または治療有効量のＤ１またはそのバリアントを投与することを含む。例えば、対象に、配列番号２により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素、及び配列番号１により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素を投与してもよい。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号２により定義される酵素のアミノ酸配列及び配列番号１により定義される酵素のアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、管系は、胆管、涙管、乳管、胆嚢管、肝管、射精管、耳下腺管、顎下腺管、大舌下腺管、バルトリン管、中脳水道、膵臓、乳腺、輸精管、尿管、膀胱、胆嚢、及び肝臓である。例えば、対象は、膵炎、胆管炎（例えば、原発性硬化性胆管炎）、結膜炎、乳腺炎、ドライアイ疾患、輸精管の閉塞、または腎疾患を有している場合がある。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、静脈内、動脈内、または腹腔内投与により投与する。様々な実施形態において、ＤＮａｓｅは、例えば静脈内に投与する場合、様々な管系において、例えば胆汁液中で酵素的に活性な形態で存在する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、対象は、内皮表面（例えば、術後癒着）、皮膚（例えば、創傷／瘢痕）、または滑膜関節（例えば、痛風及び関節炎）に蓄積するＮＥＴを有するか、またはそのリスクがある。本発明を対象に投与して、限定するものではないが術後癒着などの内皮表面上のＮＥＴの蓄積を特徴とする病態を治療することができる。様々な実施形態において、本発明を対象に投与して、限定するものではないが創傷及び瘢痕などの皮膚上のＮＥＴの蓄積を特徴とする病態を治療することができる。特定の実施形態では、本発明を対象に投与して、限定するものではないが痛風及び関節炎などの滑膜関節におけるＮＥＴの蓄積を特徴とする病態を治療することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＥＴを含む血管閉塞を有するか、またはそのリスクがある。そのような実施形態では、方法は、治療有効量のＤ１Ｌ３またはそのバリアント、及び／または治療有効量のＤ１またはそのバリアントを投与することを含む。例えば、対象に、配列番号２により定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素を投与してもよい。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号２によって定義される酵素のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、対象に、配列番号１によって定義される酵素に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素、例えば、配列番号１によって定義される酵素をさらに投与する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、対象は、参照によりその全体を本明細書に援用するＷＯ２０１６／１１８４７６及びＵＳ９，６４２，８２２に記載されるようなＮＥＴに関連する病態を有する。
【０１１１】
様々な実施形態において、対象は、Ｄ１及びストレプトドルナーゼを含む野生型ＤＮａｓｅで治療するか、または治療された疾患を有する。そのような疾患または病態として、血栓症、脳卒中、敗血症、肺損傷、アテローム性動脈硬化症、ウイルス感染症、鎌状赤血球症、心筋梗塞、耳感染症、創傷治癒、肝損傷、心内膜炎、肝臓感染症、膵炎、原発性移植片機能不全、四肢虚血再灌流障害、腎臓損傷、血液凝固、ミョウバン誘発炎症、肝腎損傷、胸水滲出、血胸、胆管内血餅、肺炎後貧血、潰瘍、耳鼻咽喉病態、口腔感染症、軽傷、副鼻腔炎、術後鼻形成術、不妊、膀胱カテーテル、創傷洗浄、皮膚反応検査、肺炎球菌性髄膜炎、痛風、下肢潰瘍、嚢胞性線維症、カルテゲナー症候群、喘息、肺葉無気肺、慢性気管支炎、気管支拡張症、ループス、原発性線毛機能不全、細気管支炎、膿胸、胸膜感染症、がん、ドライアイ疾患、下気道感染症、慢性血腫、アルツハイマー病、及び閉塞性肺疾患が挙げられる。
【０１１２】
特定の実施形態では、本発明は、Ｄ１の欠損、Ｄ１Ｌ３の欠損、ならびにＤ１及びＤ１Ｌ３の欠損を特徴とする疾患または病態の治療に関する。いくつかの場合では、対象はＤｎａｓｅ１及び／またはＤｎａｓｅ１ｌ３遺伝子に変異を有する。そのような対象はまた、自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ、全身性硬化症）または炎症性疾患を有し得る。いくつかの場合では、対象は、後天性のＤ１阻害剤（例えば、抗ＤＮａｓｅ１抗体及びアクチン）及び／またはＤ１Ｌ３（例えば、抗ＤＮａｓｅ１ｌ３抗体）を有する。そのような対象はまた、自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ、全身性硬化症）または炎症性疾患（例えば、敗血症及び虚血再灌流損傷）を有し得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、対象は嚢胞性線維症を有しており、ＤＮａｓｅ組成物を肺送達により投与する。
【０１１４】
様々な実施形態において、例えば、対象がＮＥＴ関連血管閉塞のリスクがあるか、またはＮＥＴ関連血管閉塞の症状を示す場合、タンパク質または組成物（例えば、Ｄ１Ｌ３、Ｄ１、または本明細書に記載のバリアントを含むＤ１Ｌ３もしくはＤ１のバリアントを含む）を、静脈内、筋肉内、皮下、または動脈内に投与してもよい。
【０１１５】
様々な実施形態において、血液、血漿、または血清のＮＥＴ分解活性について対象をモニタリングする。例えば、対象を、約１週間〜約４週間モニタリングし、ＮＥＴによる血管閉塞もしくは管閉塞、またはＮＥＴに関連した臓器損傷のリスクを低減する。いくつかの実施形態では、必要に応じて、対象に１週間〜１か月（または１〜２週間）にわたって１〜４回投与して、急性感染または炎症事象時の血管内ＮＥＴ蓄積（ＮＥＴ関連血管内閉塞を含む）を予防または低減してもよい。他の実施形態では、対象に、１時間〜１か月（または１〜２週間）にわたって継続的に注入してもよい。いくつかの場合では、敗血症、脳卒中、または心筋梗塞などの重篤な疾患の場合、対象に、毎日少なくとも１回、例えば（限定するものではないが）、１、２、３、４回またはそれ以上の注入を与えてもよい。
【０１１６】
ＮＥＴ関連疾患または病態の治療は、Ｄ１バリアント、Ｄ１Ｌ３バリアント、またはＤ１バリアントとＤ１Ｌ３バリアントを含む併用の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＤ１タンパク質の２つ以上のバリアントを投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＤ１Ｌ３タンパク質の２つ以上のバリアントを投与する。
【０１１７】
本発明のＤ１タンパク質バリアント及びＤ１Ｌ３タンパク質バリアントは、予防療法として、例えば、疾患または病態の１つ以上の症状の発症前に投与することができる。
【０１１８】
本明細書中で使用する場合、「治療」または「治療すること」または「治療する」とは、望ましくない生理学的病態、障害もしくは疾患を遅らせる（軽減する）か、または有益もしくは望ましい臨床結果を得ることを目的とした治療処置を指す。有益または望ましい臨床結果として、症状の緩和；病態、障害または疾患の程度の減弱；病態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、無増悪）；病態、障害または疾患の発症の遅延または進行の遅延；病態、障害または病状の改善；及び検出可能か検出不能かに関わらず、病態、障害または疾患の寛解（部分的または全体的）、または増強もしくは改善が挙げられるが、これらに限定されない。治療には、過剰なレベルの副作用を伴わずに臨床的に有意な応答を誘発することが含まれる。他の実施形態では、「治療」または「治療すること」または「治療する」とは、予防措置を指し、その場合、例えば、疾患の素因がある個人（例えば、ループスなどの疾患の遺伝マーカーを保有している個人）における望ましくない生理学的病態、障害もしくは疾患の発症を遅らせるか、または重篤度を軽減することを目的とする。
【０１１９】
本発明の方法において、治療は、疾患または病態に関して陽性の治療反応を提供するために使用する。「陽性の治療反応」とは、疾患または病態の改善、及び／または疾患または病態に関連する症状の改善を意味する。例えば、陽性の治療反応とは、疾患における以下の改善の１つ以上を指す：（１）好中球細胞外トラップの減少；（２）血管内血餅の減少；（３）管血餅の減少；（４）滑膜関節におけるＮＥＴの蓄積の減少；（５）好中球細胞外トラップの分解の増加；（６）細胞外のタンパク質フリーＤＮＡの分解の増加；（７）細胞外染色体ＤＮＡまたはタンパク質結合ＤＮＡの分解の増加；（８）自己抗体の存在下での好中球細胞外トラップの分解の増加；（９）組織／臓器の炎症の減少；（１０）組織／臓器の損傷の減少；（１１）組織／臓器の萎縮の減少；（１２）患者の生存率の増加；及び（１３）疾患または病態に関連する１つ以上の症状の軽減。
【０１２０】
所与の疾患または病態における陽性の治療反応は、その疾患または病態に特有の標準化された応答基準によって判定することができる。磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検査、超音波検査、組織学、及び循環中のＮＥＴのカウントなどのスクリーニング技術を使用して、血管閉塞の変化及びＮＥＴの存在について臨床反応を評価することができる。これらの陽性の治療反応に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善という有益な効果を経験する場合がある。
【０１２１】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、治療状況の緊急性によって示されるように、単一のボーラスを投与してもよく、数回に分けた用量を経時的に投与してもよく、用量を比例的に増減してもよい。非経口組成物は、投与の容易さ及び用量の均一性のために単位剤形で製剤化してもよい。本明細書中で使用する単位剤形は、治療する対象に対する単位用量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体を伴って所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。
【０１２２】
様々な実施形態において、本発明は、遺伝子治療に用途を見出し得る、本明細書に記載の野生型またはＤ１Ｌ３もしくはＤ１バリアントをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。遺伝子治療は、Ｄ１Ｌ３及び／またはＤ１の遺伝的欠損（例えば、有害な変異）などの慢性疾患に有用であり得る。様々な実施形態において、発現ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。様々な実施形態において、発現ベクターは哺乳類発現ベクターである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞（例えば、原核生物、真核生物、または哺乳類細胞）内で機能する発現制御領域、またはその相補領域に作動可能に連結したタンパク質バリアントをコードする核酸を含む。発現制御領域は、遮断薬及び／または刺激薬をコードする核酸の発現を駆動することができ、その結果、発現ベクターで形質転換したヒト細胞内で遮断薬及び／または刺激薬が産生される。
【０１２４】
発現制御領域は、作動可能に連結した核酸の発現に影響を及ぼすプロモーター及びエンハンサーなどの調節性ポリヌクレオチド（本明細書中ではエレメントと呼ばれることもある）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞内で作動可能に連結したコード核酸を発現することができる。一実施形態では、発現制御領域は、作動可能に連結した核酸に調節可能な発現を付与する。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結した核酸の発現を増加または減少させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、多くの場合、誘導性と呼ばれる。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、多くの場合、抑制性と呼ばれる。通常、そのようなエレメントによってもたらされる増加または減少の量は、存在するシグナルの量に比例する；シグナル量が多いほど、発現の増加または減少は大きくなる。
【０１２５】
ヒト細胞内で機能する発現系は当技術分野で周知であり、ウイルス系が含まれる。一般的に、ヒト細胞内で機能するプロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’）のコード配列のｍＲＮＡへの転写を開始させることができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域、及び通常、転写開始部位から２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに、正しい位置でＲＮＡ合成を開始するようにさせると考えられている。プロモーターはまた、通常、ＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００塩基対内に通常位置する上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含む。上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれの方向にも作用することができる。プロモーターとして特に有用なのは哺乳類ウイルス遺伝子由来プロモーターであるが、これはウイルス遺伝子が、多くの場合に高度に発現し、広い宿主範囲を有するためである。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターが挙げられる。
【０１２６】
適切な場合、例えば組み込み配列などの遺伝子送達剤も使用することができる。多数の組み込み配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１−３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２−３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３参照）。これらには、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼが含まれる。例として、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６，１９８１）、ｌａｍｂｄａ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３−５４５，１９７４）、ＦＩｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７−２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０−６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８，２００４）、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、マリナーファミリーのトランスポザーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、及びＡＡＶ、レトロウイルスなどのウイルスを組み込むための構成要素、ならびにレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する構成要素を有する抗ウイルス（Ｋｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３）が挙げられる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含む、直接及び標的化遺伝子組み込み戦略を使用して、キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を挿入してもよい。
【０１２７】
引用する全参考文献を、参照により明示的にその全体を本明細書に援用する。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：宿主ＤＮａｓｅは、好中球細胞外トラップによる血管閉塞を予防する
血小板及びフィブリンの血餅は、止血及び血栓症の血管を閉塞する。本明細書において、活性化好中球によって放出される抗菌ＤＮＡ繊維である好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）に基づく血管閉塞の非標準的なメカニズムを報告する。２つのＤＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１様３が、マウスの炎症のエピソード中に、循環中でＮＥＴを分解することを示す。両方のＤＮａｓｅが存在しない場合、血管内ＮＥＴは血餅を形成し、これは血管を閉塞させ、臓器損傷を引き起こす。重度の細菌感染症の患者における血管閉塞は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＮＥＴ分解の欠損及び血管内ＮＥＴ血餅の形成に関連している。ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１様３は独立して発現し、したがって炎症におけるＮＥＴの有害な影響に対する二重の宿主保護を提供する。
【０１２９】
炎症は、侵入する微生物を制御し、損傷した組織を治癒するために不可欠な宿主応答である（１）。制御されない持続的な炎症は、過剰な炎症性障害で組織損傷を引き起こす。好中球は、急性炎症における主要な白血球である。感染中に、好中球は細胞外トラップ（ＮＥＴ）、毒性ヒストンで装飾されたＤＮＡフィラメントの格子ならびに細菌を固定化及び中和する酵素を生成する（２）。宿主保護におけるＮＥＴの関連性は、細胞外ＤＮａｓｅがいくつかの病原性細菌において病原性因子として機能するという事実によって説明される（３、４）。しかしながら、不適切に放出されるＮＥＴは、それらの細胞毒性、炎症誘発性、及び血栓形成促進活性により、宿主細胞に害を及ぼし得る（５〜７）。実際、ＮＥＴは炎症性または虚血性の臓器損傷に頻繁に関連付けられており、ＤＮａｓｅの治療的注入は様々な動物モデルの宿主損傷を制限する（８、９）。
【０１３０】
炎症のエピソード中の組織損傷を制限するために、宿主がｉｎ  ｖｉｖｏでどのようにＮＥＴを分解するかはよくわかっていない。以前の研究では、血清中のＤＮａｓｅ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＴのＤＮＡバックボーンを消化することが示されている（１０）。ザイモグラフィーによって野生型マウス由来の血清を分析し、２つの酵素的に活性なＤＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１様３  ［（ＤＮａｓｅ１ｌ３）（図１Ａ）を検出した。両方の酵素はＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーのメンバーであるが、その起源と基質親和性が異なる。ＤＮａｓｅ１は非造血組織で発現し、タンパク質フリーＤＮＡを優先的に切断する（１１，１２）。ＤＮａｓｅγとしても知られるＤＮａｓｅ１ｌ３は、免疫細胞によって分泌され、ヌクレオソームなどのＤＮＡ−タンパク質複合体を標的とする（１１，１３）。ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１ｌ３の複合欠損により血清中のＤＮＡ分解活性を欠くマウスを作成した（図１Ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＮＥＴは、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−血清への曝露後にインタクトなままであったが、一方、野生型、ＤＮａｓｅ１−／−、及びＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス由来の血清はＮＥＴを分解した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。肝細胞特異的発現プラスミドをハイドロダイナミックな遺伝子送達と組み合わせて用いて、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスの肝臓においてＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３のｃＤＮＡを安定的に発現させた。両方の酵素が分泌タンパク質シグナル配列を含むことを考えると（１１）、このアプローチは循環中のＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３の活性を回復させ（図１Ｄ）、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウス由来の血清がＮＥＴを分解する能力を回復させた（図１Ｅ及び図１Ｆ）。まとめると、これらのデータは、独立して発現する２つの宿主酵素ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＴを分解することを示す。
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＥＴ分解に対するＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３の必要性を試験するために、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）により、野生型、ＤＮａｓｅ１−／−、ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−及びＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスを慢性的に刺激することを目的とした。Ｇ−ＣＳＦは、急性炎症の特徴である好中球増加を引き起こし、好中球の亜集団を刺激して、ｅｘ  ｖｉｖｏでＮＥＴを自発的に放出する（１４）。Ｇ−ＣＳＦをコードするＣＳＦ３のｃＤＮＡを肝細胞特異的発現プラスミドにクローニングした。ＣＳＦ３−プラスミドを野生型マウスにハイドロダイナミックインジェクションすると、血漿中のＧ−ＣＳＦレベルが慢性的に上昇した（図５Ａ）。その結果、好中球の血球数は着実に増加し、血液塗抹において自発的に形成されたＮＥＴが検出された（図２Ａ及び図２Ｂ）。さらに、重要臓器及び脾腫における常在性好中球の数の増加が観察された（図５Ｂ及び図５Ｃ）。重要なことに、ＣＳＦ３を注射した野生型マウスは正常に成長し、臓器損傷を発症せず、苦痛または異常行動の肉眼的徴候を示さなかった（図５Ｄ及び図５Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＮＥＴ形成を併発する慢性好中球増加症が野生型マウスにおいて十分に忍容されることを示唆している。
【０１３２】
次に、本発明者らは、ＤＮａｓｅ１−／−、ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−、及びＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスの肝臓においてＣＳＦ３を安定的に発現させた。ＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３の単一の欠損を有するマウスは苦痛の徴候を示さなかった（未記載）が、複合欠損を有するすべてのマウスはＣＳＦ３注射後６日以内に死亡した（図２Ｃ）。ＣＳＦ３を欠く対照プラスミドを投与したＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスは、異常を示すことなく生存した（図２Ｃ、未記載）。ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスにおいてＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３をＣＳＦ３と共発現させて、好中球及びＮＥＴを誘導し、同時に循環中のＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３を復元させた。いずれかのＤＮａｓｅの発現は、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスが苦痛の徴候を示すことなく生存するのに十分であった（図２Ｄ）。ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３を欠く対照プラスミドとＣＳＦ３を共発現するＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスは、遺伝子送達後５日以内に死亡した（図２Ｄ）。これらのマウスの致死に対し、急速に進行する低体温症が先行していたが、これは、転帰前の８時間以内の末梢体温の強い低下として示された（図２Ｅ）。低体温は、赤みを帯びた血漿及び尿によって示される溶血性貧血及び血中ヘモグロビンの減少を伴っていた（図２Ｆ及び図２Ｇ）。血液塗抹中の豊富な破砕赤血球は、溶血性貧血が赤血球の断片化によって引き起こされたことを示した（図２Ｈ）。さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、肝臓トランスアミナーゼ、ならびに腎損傷マーカーの血中尿素窒素及びクレアチニンの血漿レベルの上昇が検出され、複数の臓器損傷が示された（図２Ｉ、図６Ａ、及び図６Ｂ）。ＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３とＣＳＦ３の共発現は、体温及び赤血球及び臓器の完全性を維持した（図２Ｅ〜図２Ｉ；図６Ａ及び図６Ｂ）。結論として、これらのデータは、ＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３のいずれかが慢性好中球増加症時の宿主損傷を予防するために必要であることを示している。
【０１３３】
慢性好中球増加症のＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスの組織学的分析により、赤血球が封入された血管内ヘマトキシリン陽性血餅が示されたが（図３Ａ及びＢ；図６Ｃ及び図６Ｄ）、これは、肺、肝臓、及び腎臓の血管を完全または部分的に閉塞する。循環中のＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３の発現は、これらの血管閉塞を予防した。ヘマトキシリン陽性血餅は、個々の白血球核の濃い紫色の染色で散発的に点在する豊富な薄紫色の染色パターンを示し、脱凝縮したＤＮＡが主要な血餅成分であることが示唆された（図３Ａ）。核の崩壊と密に詰まったクロマチンのアンフォールディングがＮＥＴ形成の特徴であることから（１５）、ＮＥＴマーカーのヘマトキシリン陽性血餅を染色した。蛍光二本鎖ＤＮＡインターカレーター色素及びクロマチンに対する抗体による強固な染色が観察された（図７Ａ）。脱凝縮したクロマチンと、好中球顆粒由来酵素であるミエロペルオキシダーゼ、抗菌性カテリシジンペプチド、及びＮＥＴ代替マーカーであるシトルリン化ヒストンとの共局在化により、血餅がＮＥＴからなることが確認された（図３Ｃ、図７Ｂ及び図７Ｃ）。標準的な血栓の成分を同定するために、フィブリン、ならびに血小板の分泌小胞及び血管内皮に格納されているタンパク質であるフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）のＮＥＴ血餅を染色した。ＮＥＴ血餅は、ｖＷＦ及びフィブリン含量が非常に不均一であった（図３Ｄ及び図３Ｅ）。ＮＥＴ血餅の断面は平均して４６％がｖＷＦで覆われていたが、ＮＥＴ血餅の９％はｖＷＦを染色しなかった（図３Ｅ及び図３Ｆ）。フィブリンはほとんど存在せず、閉塞血管の２３％未満で検出されただけであった（図３Ｅ）。これらのデータは、ＮＥＴがｉｎ  ｖｉｔｒｏで血小板と赤血球を固定化するためのフィブリン非依存的な足場として機能するという発見と一致する（６）。いくつかの血餅にｖＷＦとフィブリンが存在しないことは、ＮＥＴが血管閉塞にとって十分であり得ることを示唆している。この考えを裏付けるために、純粋な好中球からｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＴ血餅を生成することを目指した。細胞をせん断力にさらして血流を模倣しながら、血液から好中球を分離し、ＮＥＴ形成を誘発した。このセットアップでは、肉眼で見ることができるＤＮａｓｅ感受性の血餅（図８Ａ）が観察されたが、これはマウスの血管内のＮＥＴ血餅の外観（図８Ｂ）に似ていた。ＣＳＦ３を発現するＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスにおいて、血小板を循環から枯渇させ、トロンビンを薬理学的に阻害してフィブリン形成を遮断した。ＤＮａｓｅ１−またはＤＮａｓｅ１ｌ３−発現とは異なり、抗血栓治療はどちらもこれらの動物の死亡を予防することができなかった（図３Ｈ）。まとめると、データは、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスの慢性好中球増加症時に、ＮＥＴ血餅が血管を閉塞するのに十分であることを示唆している。
【０１３４】
ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスにおけるＮＥＴ血餅の形成は、血管閉塞による破砕赤血球、溶血性貧血、及び臓器不全を含む、患者における感染誘発性血栓性微小血管症（ＴＭＡ）及び播種性血管内凝固の特徴と関連している。志賀毒素産生性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［ＳＴＥＣ−ＨＵＳ，（１６）］の感染による溶血性尿毒症症候群のＴＭＡ患者由来の血漿を分析した。これらの患者における高頻度の合併症は、敗血症と敗血症性ショックであった（１７）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＮＥＴは、急性疾患状態の患者から採取した血漿への曝露後もインタクトなままであったが、一方、寛解状態の患者由来の血漿はＮＥＴを分解した（図９Ａ及び図９Ｂ）。このデータは、ＮＥＴ分解における一時的で後天的な欠損を示しているため、以前の報告を拡張するものとなる（１８，１９）。注目すべきことに、ＳＴＥＣ−ＨＵＳ患者は、ＮＥＴ分解を潜在的に回復させるＤＮａｓｅの供給源である健康なドナー由来の血漿の注入を含むレジメンで効果的に治療された（１７）。
【０１３５】
ＮＥＴの大きな凝集体は、患者の滑液及び膵管で形成されると報告されている（２１、２２）が、他の組織ではまだ記載されていない。したがって、重度の炎症性疾患の患者におけるＮＥＴの血管内凝集体を特定することを目的とした。急性呼吸促迫症候群及び／または敗血症の患者から剖検で採取した肺組織をスクリーニングした（図１０）。２名の敗血症患者の血管においてヘマトキシリン陽性血餅を検出した（図１１Ａ及び図１１Ｃ）。両方の場合において、血餅はクロマチン及びＭＰＯからなっていたが（図１１Ｂ及び図１１Ｄ）、このことはＮＥＴがヒト敗血症において血管内血餅を形成することができることを示している。
【０１３６】
敗血症は、マウスにおける血管内ＮＥＴ形成の強力かつ急速なトリガーである（７）。したがって、ＮＥＴ分解の欠損が疾患を悪化させ得るという仮説を立てた。実際、ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１ｌ３の複合欠損を有するマウスは、低用量リポ多糖及び熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉに高感受性であったが、野生型マウスではそうではなかったことが観察された（図４Ａ）。好中球ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスと同様に、敗血性ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスの血液分析は、溶血性貧血及び血尿（図４Ｂ及び図４Ｃ）とともに、血液塗抹における血漿ＬＤＨ及び破砕赤血球のレベルの増加（図４Ｄ及び図４Ｅ）を示した。さらに、肺内において豊富な部分的または完全に閉塞した血管を検出した（図４Ｆ及び図４Ｇ）。部分的に閉塞した血管の詳細な分析により、血管内腔内のＮＥＴ血餅が明らかになった（図４Ｈ）。完全に閉塞した血管内で、ＮＥＴ血餅は、封入された赤血球及び白血球で鬱血していた（図４Ｉ；図１２Ａ及び図１２Ｂ）。重要なことに、ＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスにおけるＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３の肝発現は、血管閉塞を予防し、野生型の表現型を回復させた。まとめると、これらのデータは、循環ＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３が敗血症におけるＮＥＴ血餅の形成及び宿主損傷を予防することを示している。
【０１３７】
まとめると、血小板及びフィブリンは止血性血餅及び病理学的血栓を形成するが（２３）、本発明者らのデータは、炎症状態における血管閉塞の非標準的なメカニズムとしてＮＥＴ血餅を導入する。フィブリン鎖と同様に、ＮＥＴは超大型で安定した分子である（６）。慢性好中球増加症または敗血症などに認められるような高濃度では、血管内ＮＥＴが血餅を形成する場合があり、これは血管を閉塞するのに十分な大きさであるため、赤血球及び臓器を損傷する。炎症中に血液と組織の完全性を維持するために、宿主は、血管内ＮＥＴに対する二重保護システムとしてＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１ｌ３を独立して発現する。しかしながら、これらの宿主因子の後天的及び遺伝的欠損は、ＮＥＴ分解を遅らせ、したがって疾患を促進し得る。後天的な欠損には、損傷した組織から外在化する単量体アクチンによるＤＮａｓｅ１阻害、及び血清プロテアーゼによるＤＮａｓｅ１ｌ３の不活性化が含まれ得る（１１）。ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３の変異は患者で同定されており、全身性自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関連している（２４，２５）。興味深いことに、ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３欠損マウスは、加齢とともに自発的にＳＬＥ様疾患を発症する（１３，２６）。ＮＥＴは著名な自己抗原からなり、ＳＬＥ患者由来の好中球はＮＥＴを放出する能力が増加している（２７）。クリアランス能力の低下は、ＮＥＴの半減期を増加させ、したがって自己免疫疾患を促進し得る（１０，２７）。結論として、宿主ＤＮａｓｅの欠損は、過剰な炎症性疾患におけるＮＥＴの有害な影響をもたらし得る。
【０１３８】
結果として、ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３を介したＮＥＴ分解は、炎症状態を患う患者に魅力的な治療機会を提供する。ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１ｌ３が同じかまたは別個のメカニズムによってＮＥＴを分解するかどうかを試験するために、固定液を使用してＮＥＴのタンパク質を架橋した。固定化したＮＥＴはＤＮａｓｅ１ｌ３−／−血清により効率的に分解されたが、ＤＮａｓｅ１−／−血清による分解には耐性があった（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。これらの結果に則して、組換えＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３へのＮＥＴの曝露により、両方のＤＮａｓｅがナイーブＮＥＴを分解し（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）、一方、固定化ＮＥＴはＤＮａｓｅ１ｌ３活性に耐性である（図１３Ｅ及び図１３Ｆ）ことが示された。まとめると、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、ＤＮａｓｅ１とＤＮａｓｅ１ｌ３が異なるメカニズムを介してＮＥＴを分解することを示唆している。
【０１３９】
最後に、循環におけるＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３の活性を、マウスとヒトとで比較した。ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３活性を識別するために、正常な健康なドナー（ＮＨＤ）由来の血漿中のＤＮａｓｅ１活性を遮断するヒトＤＮａｓｅ１（α−ｈＤＮａｓｅ１）に対する抗体を生成した（図１４Ａ）。ヘパリンはＤＮａｓｅ１ｌ３の公知の阻害剤であり、ＤＮａｓｅ１ｌ３によるＤＮＡ分解活性を遮断するために使用した（図１４Ｂ）。マウス血漿は、ヒト血漿よりもおよそ１０倍高い総ＤＮａｓｅ活性（図１４Ｃ）、ＤＮａｓｅ１活性（図１４Ｄ）、及びＤＮａｓｅ１ｌ３活性（図１４Ｅ）を示した。さらに、マウス血漿中のＤＮａｓｅ１ｌ３はＮＥＴを効率的に分解したが、ヒト血漿中のＤＮａｓｅ１ｌ３はそうではなかった（図１４Ｆ及び図１４Ｇ）。データは、ヒトの循環中におけるＤＮａｓｅ１ｌ３の濃度がＮＥＴを分解するのに十分でないことを示唆している。したがって、患者のＤＮａｓｅ１ｌ３を介したＮＥＴ分解を可能にすることは、炎症性疾患の新規かつ有望な治療戦略である。
【０１４０】
材料及び方法
患者の血漿
ドイツでの２０１１年のＳＴＥＣ−ＨＵＳアウトブレイク中に、患者からクエン酸血漿サンプルを採取した（１６）。本研究に含める基準は、ＳＴＥＣ／腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉもしくは血性下痢の陽性同定、血小板数≦１５０×１０９／Ｌもしくは１週間で≧２５％の減少、溶血のエビデンス（正常限界を上回るＬＤＨ、正常限界を下回るハプトグロビン、または破砕赤血球の存在）及び急性腎損傷ステージ≧１である。
【０１４１】
ヒト組織
ヒト組織を室温で一晩、５％リン酸緩衝ホルマリンで固定化した。すべての組織は、剖検で採取し、もともと診断目的で当社に提出されものであり、国家倫理原則に従って研究した。患者の死因を図１０に示す。
【０１４２】
マウス
すべてのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的バックグラウンドを有していた。以前に記載されたＤＮａｓｅ１−／−及びＤＮａｓｅ１様３−／−マウス（２６，２８）を交雑させてＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスを生成した。ＤＮａｓｅ１−／−マウスのこの系統は、ミトコンドリアシャペロンをコードするＤＮａｓｅ１重複遺伝子Ｔｒａｐ１／Ｈｓｐ７５にオフターゲット変異を含むことが最近報告された（２９）。したがって、対照実験のためにＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスを生成するための代替ＤＮａｓｅ１−／−系統（３０）を含めた（図１５Ａ〜図１５Ｃ）。
【０１４３】
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動ザイモグラフィー（ＤＰＺ）によるＤＮａｓｅ１の検出
以前に記載したように、修正を加えてＤＰＺを実行した（１９）。簡潔に述べると、ＤＮＡを含まない４％（ｖ／ｖ）スタッキングゲルと、２００μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡを含む１０％（ｖ／ｖ）分離ゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルを調製した。ＤＮａｓｅ１を検出するために、０．５μｌのマウス血清を１４．５μｌの水と５μｌのＳＤＳゲル充填緩衝液（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ）と混合した。混合物を５分間煮沸し、ゲルにロードした。電気泳動は、トリス／グリシン電気泳動緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ８．７）を使用して１２０Ｖで実施した。電気泳動後、５％（ｗ／ｖ）粉乳、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むリフォールディング緩衝液中でゲルを３７℃で一晩インキュベートして、タンパク質をリフォールディングした。ゲルを、粉乳を含まないリフォールディング緩衝液に移し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＤＮＡを１×ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）で蛍光標識し、蛍光スキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ、ＢｉｏＲａｄ、ドイツ）を使用してゲルの蛍光画像を記録した。
【０１４４】
ＤＰＺによるＤＮａｓｅ１ｌ３の検出
ＤＮａｓｅ１ｌ３の検出のために、２μｌの血清を１２μｌの水、５μｌのＳＤＳゲルローディングバッファー、及び１μｌのβメルカプトエタノール（ＢＭＥ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。ＢＭＥはＤＮａｓｅ１のジスルフィド架橋を減少させ、その不活性化を引き起こす（１１）。混合物を５分間煮沸し、ゲルにローディングした。ＤＮａｓｅ１について記載したように電気泳動を実施した。ゲルを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８で５０℃、３０分間、２回洗浄することにより、ＳＤＳを除去した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＢＭＥ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むリフォールディングバッファー中で、タンパク質を３７℃、４８時間インキュベートすることによりリフォールディングさせた。次いで、ゲルを３ｍＭ  ＣａＣｌ２及び３ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加したリフォールディングバッファー中、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。ＤＮａｓｅ１ｌ３によるタンパク質フリーＤＮＡの効率的な分解を可能にするには、Ｍｎ２＋の添加が必要である（１１）。ＤＮａｓｅ１について記載したように、ＤＮＡを標識し、画像化した。
【０１４５】
単一放射状酵素拡散（ＳＲＥＤ）アッセイによる総ＤＮａｓｅ活性の検出
総ＤＮａｓｅ活性を測定するために、Ｍｎ２＋を含む緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び２×ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ）にサケ精巣由来の５５μｇ／ｍｌ  ＤＮＡを溶解させた。ＤＮＡ溶液を５０℃で１０分間加熱し、等量の２％ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合した。混合物をプラスチックトレイに注ぎ、固化するまで室温で保存した。２μｌのマウス血清を直径１．０ｍｍのウェルにロードした。ゲルを湿潤チャンバー内で３７℃、４時間インキュベートした。ゲルのＤＮＡ蛍光を蛍光スキャナーで記録した。
【０１４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＥＴ分解アッセイ
ＮＥＴ分解を、以前に記載されたように分析した（１９）。無血清ＤＭＥＭ中の精製ヒト好中球を、０．００１％ポリリジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした滅菌９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ドイツ）に、ウェルあたり５×１０４細胞の濃度で播種した。ＮＥＴ形成を誘発するために、好中球を、１００ｎＭホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、５％ＣＯ２及び加湿下、３７℃、４時間活性化した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、９６ウェルプレートを４℃で一晩保存した。ＮＥＴをＰＢＳで洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで５分間処置し、再度ＰＢＳで洗浄した。２価陽イオンを含むＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ＋；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の１０μＭ  ＰＰＡＣＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）を添加した１０％マウス血清または１０％クエン酸ヒト血漿の存在下でＮＥＴをインキュベートした。５％ＣＯ２及び加湿下、３７℃で３時間にわたってＮＥＴを分解可能とした。上清を廃棄し、ＰＢＳ中に２％ＰＦＡを加えて室温で１時間、ＮＥＴ分解を停止させた。ＰＦＡを廃棄し、ＰＢＳ中に２μＭの蛍光ＤＮＡ色素ＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、非分解ＮＥＴを蛍光標識した。蛍光染色したＮＥＴの画像は、倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）で取得した。プレートリーダー（励起：４８５ｎｍ；放射：５３５ｎｍ）で蛍光強度を記録するか、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して顕微鏡写真でＮＥＴの占有面積を測定することにより、非分解ＮＥＴを定量化した。
【０１４７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターの調製
ｐＬＩＶＥプラスミド（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，ＵＳＡ）を使用して、マウスにおいてタンパク質を発現させた。このベクターは、長期にわたって肝細胞特異的なタンパク質を発現させることができる。マウスＤＮａｓｅ１、ＤＮａｓｅ１ｌ３、及びＣＳＦ３を用いてｐＬＩＶＥプラスミドを生成した。マウスＤＮａｓｅ１については、ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１００６１）のＰＣＲを、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を含むプライマーペアＤＮａｓｅ１−Ｆ  ５’−ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号２７）及びＤＮａｓｅ１−Ｒ  ５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡ（配列番号２８）を用いて実施した。ＤＮａｓｅ１ｌ３については、ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０４７３５５）のＰＣＲを、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位を含むプライマーペアＤＮａｓｅ１ｌ３−Ｆ  ５’−ＧＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＴ（配列番号２９）及びＤＮａｓｅ１ｌ３−Ｒ  ５’−ＧＣＧＴＧＡＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＧＡＴＴＧ（配列番号３０）を用いて行った。両方のｃＤＮＡを、適切な酵素で事前に消化し、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツ）を使用して、ｐＬＩＶＥベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にクローニングした。ＤＮａｓｅ１ｌ３を含むｐＬＩＶＥベクターを、コンセンサスコザック配列と一致させ、タンパク質発現を最適化するために、ｍｕｔＤＮａｓｅ１ｌ３−Ｆ  ５’−ＡＧＴＣＧＡＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡ（配列番号３１）とそれに相補的なｍｕｔＤＮａｓｅ１１ｌ３−Ｒ  ５’−ＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＡＣＴ（配列番号３２）のプライマーペアを用いて部位特異的変異誘発に供した。ＣＳＦ３のｃＤＮＡを含むｐＬＩＶＥベクターの生成は外部委託した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ドイツ）。ＣＳＦ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ１２０７６１）のｃＤＮＡを、制限酵素部位ＳａｌＩとＸｈｏＩの間のＭＣＳに挿入した。生成されたすべてのベクターの配列は、二本鎖ＤＮＡ配列決定によって確認した。対照として、追加的なインサートを有さない親のｐＬＩＶＥプラスミドを使用した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用してすべてのプラスミドを精製し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、エンドトキシンの潜在的な混入物を除去した。
【０１４８】
マウスＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
他の場所に記載するＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３のｃＤＮＡを含むプラスミドを、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替品（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下、無血清条件でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞にトランスフェクトした。７２時間後、上清を回収し、５００×ｇで１０分間遠心分離し、滅菌濾過し、３Ｋカラム（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）を用いた超遠心分離により濃縮した。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子発現
ＤＮａｓｅ１、ＤＮａｓｅ１ｌ３、ＣＳＦ３を含むｐＬＩＶＥプラスミド、または空の対照プラスミドを、ハイドロダイナミックな尾静脈注射によりマウスに投与した。簡潔に述べると、５０μｇのプラスミドを、マウスの体重の１０％に相当する量の０．９％生理食塩水で希釈した。マウスをイソフルランで麻酔した後、尾静脈を介してプラスミド溶液を５〜８秒かけて静脈内注射した。稀な場合では、最初の２４時間以内にマウスが注射から完全に回復せず、これらの動物は研究から除外した。共発現研究のために、５０μｇのＣＳＦ３プラスミドを５０μｇの空の対照プラスミド、またはＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３を含むプラスミドと混合した。両方のプラスミドを含む溶液は、ハイドロダイナミックな尾静脈注射により投与した。
【０１５０】
慢性好中球増加症
４週齢または８〜１２週齢の雌マウスに、ＣＳＦ３を含むｐＬＩＶＥプラスミド５０μｇを注射して、Ｇ−ＣＳＦの過剰発現及び好中球増加症を誘発した。マウスを、注射後最初の１週間は８時間ごとにモニタリングし、その後は毎日モニタリングした。肛門周囲の温度を非接触赤外線温度計（Ｅｔｅｋｃｉｔｙ，ドイツ）で測定した。生存研究では、動物が苦痛の徴候を示した場合（自発運動がない、目を閉じる、時々喘ぐ）、マウスを安楽死させ、「非生存」と記録した。すべての場合において、これらの苦痛の徴候は、プラスミド注射前の体温に比べて≧４℃の体温の低下と定義される急速に進行する重度の低体温、及び血尿を伴っていた。非低体温マウスは苦痛の徴候を示さず、実験終了時に安楽死させた。臓器、血液、及び尿の採取物について、３つのＤ１／Ｄ１Ｌ３−／−マウスの４群を分析した。各群のマウスに、ＣＳＦ３と空の血漿、ＤＮａｓｅ１、またはＤＮａｓｅ１ｌ３の混合物を注射した。マウスの各群は、群の最初の動物が苦痛、重度の低体温、及び血尿の徴候を示した場合に、生体サンプル採取のために安楽死させた。この時点は「転帰」と定義され、注射後３〜６日以内に発生した。
【０１５１】
血小板枯渇
マウスに２μｇ／ｇの血小板除去抗体またはアイソタイプ対照抗体（いずれもＥｍｆｒｅｔ，ドイツ）を腹腔内注射した。この処置は、血小板の＞９５％を循環から枯渇させる。処置はＣＳＦ３の注射の２４時間後に開始し、実験が完了するまで４８時間ごとに繰り返した。
【０１５２】
トロンビン阻害
粉末ダビガトランエテキシレート（Ｐｒａｄａｘａ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，ドイツ）を４０ｍｇ／ｇの用量で通常の粉末（Ａｌｔｒｏｍｉｎ，ドイツ）と混合した。粉末を蒸留水と混合し、室温で乾燥させることによりペレットを調製した。ダビガトランの給餌は、ＣＳＦ３の注射の２４時間後に開始した。ダビガトラン食餌を１日間与えたＷＴマウスは、ダビガトランを含まない通常の食餌を与えたマウスに比べて、活性化部分トロンボプラスチン時間の６．４８±１．１９倍（平均±ＳＤ、Ｎ＝４）の増加を示した（スチューデントｔ検定；Ｐ＜０．００１）。
【０１５３】
敗血症のための細菌の調製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＸＥＮ１４，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養した。細菌を、４０００×ｇで１０分間遠心分離することによりペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、再懸濁した。１．５×１０９細菌／ｍｌのアリコートを７０℃で１５分間インキュベートして細菌を熱殺菌した。アリコートは、さらなる使用までの間、−２０℃で保存した。
【０１５４】
敗血症
８〜１５週齢の雄マウスに、０．９％生理食塩水中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）由来の１μｇ／ｇのＬＰＳを毎日３回腹腔内注射した。３回目のＬＰＳ注射に加えて、マウスには１．５×１０７熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉ／ｇの静脈注射を行った。表示されている生存時間は、Ｅ．ｃｏｌｉの注射後の時間を示している。安楽死の時点で血液と臓器を採取した。図４Ａ〜図４Ｉに示す完全な分析を行うには不十分な生体サンプルが２匹の動物から得られた（１×Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−＋Ｃｔｒｌ、１×Ｄ１／Ｄ１Ｌ３−／−＋Ｄ１Ｌ３）。動物が重度の苦痛の徴候（接触に対する無反応性）を示した場合、マウスを安楽死させ、「非生存」と記録した。すべての非生存マウスは血尿及び四肢蒼白を示した。熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉの静脈内注射の２４時間後、すべての生存マウスを安楽死させ、「生存」と記録した。
【０１５５】
マウスの血液、血漿、及び組織の採取
顎下穿刺または眼窩後洞によって血液を採取した。血液を２００μｌの血清チューブ（Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ；Ｓａｒｓｔｅｄｔ，ドイツ）及び２００μｌのＥＤＴＡチューブ（ＧＫ１５０、ＫＡＢＥ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，ドイツ）に回収した。３０００×ｇで１５分間遠心分離した後、血液の上清を採取して血漿を得た。血清は、血液を室温で１時間凝固させ、続いて３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより得た。血清及び血漿サンプルは、さらなる使用まで−２０℃で一定量に分けて保存した。臓器分析のために、ＰＢＳの心臓内注入によりマウスを灌流した。臓器を採取し、４℃、４％ＰＦＡで２４時間固定化した。固定化臓器をパラフィンに包埋した。
【０１５６】
血液及び血漿の分析
血漿中のＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、クレアチニン、及びＢＵＮを、標準化キット（Ｂｉｏｔｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、製造元の説明書に従って定量した。マウスＧ−ＣＳＦはＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ，英国）で定量した。ＥＤＴＡ血液中のヘモグロビンは、自動血球計数器（Ｉｄｅｘｘ  ＰｒｏＣｙｔｅ  Ｄｘ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって定量した。好中球をＦＡＣＳで定量するために、０．２μｇのフィコエリトリン標識抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ドイツ）及び０．５μｇのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＬｙ６Ｇ（１ＡＢ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ドイツ）の存在下で、全血を氷上で１５分間インキュベートした。次いで、血液を０．５ｍｌのＰＢＳで希釈し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）で分析した。ＥＤＴＡ抗凝固処置した血液の血液塗抹を、ポリリジンでコーティングしたスライド（Ｈｅｃｈｔ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ，ドイツ）上で調製した。風乾後、ドライアイス上で、１μＭ  ＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎを添加したメタノール中、１分間インキュベートするか、または市販のキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋｕｍ，ドイツ）を使用してギムザで染色した。
【０１５７】
免疫蛍光染色
パラフィン包埋切片を脱蝋し、再水和し、クエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ６）中で１００℃、２５分間抗原賦活化に供した。その後、切片を２．５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ，英国）で３０分間ブロッキングした後、マウスオンマウスブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて１時間インキュベートした。次いで、切片を、ＭＰＯ（Ａ０３９８，Ａｇｉｌｅｎｔ，ドイツ）、ＣＲＡＭＰ（ＰＡ−ＣＲＬＰ−１００，Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ，スウェーデン）、シトルリン化ヒストン３（ａｂ５１０３，Ａｂｃａｍ，英国）フィブリン［クローン５９Ｄ８］、またはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、及びＤＮＡの複合体に対する２μｇ／ｍｌの一次抗体の存在下で４℃、一晩インキュベートし、クロマチンを検出した（２）。切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とコンジュゲートした抗ウサギ及び抗マウスＩｇＧ抗体の存在下で１時間インキュベートした。洗浄後、ＤＮＡを１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩで２分間標識した。Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ（７０％エタノール中０．１％）存在下での２５分間のインキュベーションにより自己蛍光をクエンチし、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）で切片をマウントした。蛍光標識切片の画像は、倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）または共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ，ドイツ）で取得した。ＮＥＴ血餅の画像は、ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を使用して定量した。ＮＥＴ血餅のｖＷＦまたはフィブリン染色領域が３％未満である場合、陰性とみなした。
【０１５８】
免疫組織化学
抗原賦活化後、脱パラフィン切片を２．５％正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ）で３０分間ブロッキングした。切片を２μｇ／ｍｌの好中球エラスターゼに対する一次抗体（ａｂ６８６７２，Ａｂｃａｍ）の存在下で４℃、一晩インキュベートした。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＡＰキット（ＩｍｍＰＲＥＳＳ，Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、製造元の説明書に従って切片を染色した。切片をヘマラム（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）で対比染色し、Ｎｅｏ−Ｍｏｕｎｔ  ｍｅｄｉａ（Ｍｅｒｃｋ）を用いてマウントした。倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ，Ｚｅｉｓｓ）で染色切片の画像を取得した。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＥＴ血餅の生成
精製したヒト好中球を、２％ＢＳＡを添加したＤＭＥＭ中、３×１０７細胞／ｍｌで組織培養プレートに播種した。加湿及び回転条件（３００ｒｐｍ）下、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、細胞を０．１μＭ  ＰＭＡで活性化した。未刺激好中球、及び１０Ｕ／ｍｌ組換えヒトＤＮａｓｅ１（ドルナーゼα，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、ＰＭＡで活性化した好中球を対照として用いた。ＮＥＴ血餅を２％ＰＦＡで４℃、一晩固定化した。固定化したＮＥＴ血餅をパラフィンに包埋し、上記のようにＮＥＴについて切片を染色した。
【０１６０】
統計的評価
データは平均±標準偏差として示す。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＵＳＡ）を使用して実施し、スチューデントｔ検定、一元配置分散分析及び二元配置分散分析、それに続くボンフェローニの多重比較検定、及び対数順位検定を含んでいた。結果はＰ＜０．０５で有意とみなした。
【０１６１】
映像
慢性好中球増加症は、野生型マウスにおいて忍容される。生成した映像は、ＣＳＦ３発現プラスミド（ＣＳＦ３）またはＣＳＦ３を欠く対照プラスミド（Ｃｔｒｌ）の注射から１週間後の野生型マウスを示す。いずれの動物も正常な行動を示し、苦痛の徴候はない。
【０１６２】
慢性好中球増加症は、ＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１ｌ３を欠損するマウスに苦痛を引き起こす。この映像は、ＣＳＦ３と、対照プラスミド（ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ）、ＤＮａｓｅ１（ＣＳＦ３／Ｄ１）、またはＤＮａｓｅ１ｌ３（ＣＳＦ３／Ｄ１Ｌ３）とを同時発現するＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１ｌ３−／−マウスを示す。循環ＤＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１ｌ３を発現するマウスは、正常な行動を示す。循環ＤＮａｓｅ（ＣＳＦ３／Ｃｔｒｌ）を欠くマウスは、苦痛の徴候を示す（自発的な動きがない、目を閉じている、時々喘ぐ）。
参考文献
１．    Ｖ．  Ｋｕｍａｒ，  Ａ．  Ｋ．  Ａｂｂａｓ，  Ｎ．  Ｆａｕｓｔｏ，  Ｊ．  Ｃ．  Ａｓｔｅｒ，  Ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｉｎ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｃｏｔｒａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００９），  ｃｈａｐ．  ２．
２．    Ｖ．  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，  Ｕ．  Ｒｅｉｃｈａｒｄ，  Ｃ．  Ｇｏｏｓｍａｎｎ，  Ｂ．  Ｆａｕｌｅｒ，  Ｙ．  Ｕｈｌｅｍａｎｎ，  Ｄ．  Ｓ．  Ｗｅｉｓｓ，  Ｙ．  Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，  Ａ．  Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｋｉｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，  １５３２−１５３５  （２００４）．
３．    Ｐ．  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｋｅｎｎｅｔｔ，  Ｎ．  Ｘｉｏｎｇ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  ＰＡＤ４  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０７，  １８５３−１８６２  （２０１０）．
４．    Ｖ．  Ｔｈａｍｍａｖｏｎｇｓａ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｍｉｓｓｉａｋａｓ，  Ｏ．  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｄｅｇｒａｄｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３４２，  ８６３−８６６  （２０１３）．
５．    Ｓ．  Ｒ．  Ｃｌａｒｋ，  Ａ．  Ｃ．  Ｍａ，  Ｓ．  Ａ．  Ｔａｖｅｎｅｒ，  Ｂ．  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｚ．  Ｇｏｏｄａｒｚｉ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｋｅｌｌｙ，  Ｋ．  Ｄ．  Ｐａｔｅｌ，  Ｓ．  Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，  Ｅ．  ＭｃＡｖｏｙ，  Ｇ．  Ｄ．  Ｓｉｎｃｌａｉｒ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｋｅｙｓ，  Ｅ．  Ａｌｌｅｎ−Ｖｅｒｃｏｅ，  Ｒ．  Ｄｅｖｉｎｎｅｙ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｄｏｉｇ，  Ｆ．  Ｈ．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｐ．  Ｋｕｂｅｓ，  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＴＬＲ４  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｔｏ  ｅｎｓｎａｒｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｂｌｏｏｄ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １３，  ４６３−４６９  （２００７）．
６．    Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ａ．  Ｂｒｉｌｌ，  Ｄ．  Ｄｕｅｒｓｃｈｍｉｅｄ，  Ｄ．  Ｓｃｈａｔｚｂｅｒｇ，  Ｍ．  Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｍｙｅｒｓ，  Ｊｒ．，  Ｓ．  Ｋ．  Ｗｒｏｂｌｅｓｋｉ，  Ｔ．  Ｗ．  Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｈａｒｔｗｉｇ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｔｒａｐｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０７，  １５８８０−１５８８５  （２０１０）．
７．    Ａ．  Ｗａｒｎａｔｓｃｈ，  Ｍ．  Ｉｏａｎｎｏｕ，  Ｑ．  Ｗａｎｇ，  Ｖ．  Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｌｉｃｅｎｓｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９，  ３１６−３２０  （２０１５）．
８．    Ｂ．  Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，  Ｓ．  Ｍａｓｓｂｅｒｇ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３，  ３４−４５  （２０１３）．
９．    Ｓ．  Ｋ．  Ｊｏｒｃｈ，  Ｐ．  Ｋｕｂｅｓ，  Ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｉｎ  ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２３，  ２７９−２８７  （２０１７）．
１０．    Ａ．  Ｈａｋｋｉｍ，  Ｂ．Ｇ．  Ｆｕｒｎｒｏｈｒ，  Ｋ．  Ａｍａｎｎ，  Ｂ．  Ｌａｕｂｅ，  Ｕ．Ａ．  Ａｂｅｄ，  Ｖ．  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｒ．Ｅ．  Ｖｏｌｌ，  Ａ．  Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ．  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０７，  ９８１３−９８１８  （２０１０）．
１１．    Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ｓ．  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｊ．  Ｍｅｚｒｈａｂ，  Ｔ．  Ｋｌｏｃｋｌ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｍｕｒｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ−−ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮａｓｅ１  ａｎｄ  ＤＮａｓｅ１−ｌｉｋｅ  ３  （ＤＮａｓｅ１ｌ３）．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７６，  １０５９−１０７３  （２００９）．
１２．    Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ａ．  Ｒｉｃｋｅｎ，  Ｄ．  Ｅｕｌｉｔｚ，  Ｈ．  Ｋｎｏｏｐ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  １  ｇｅｎｅ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｎａｓｅ１  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３８０，  ９２９−９３７  （２００４）．
１３．    Ｖ．  Ｓｉｓｉｒａｋ，  Ｂ．  Ｓａｌｌｙ，  Ｖ．  Ｄ’Ａｇａｔｉ，  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｒｔｉｚ，  Ｚ．  Ｂ．  Ｏｚｃａｋａｒ，  Ｊ．  Ｄａｖｉｄ，  Ａ．  Ｒａｓｈｉｄｆａｒｒｏｋｈｉ，  Ａ．  Ｙｅｓｔｅ，  Ｃ．  Ｐａｎｅａ，  Ａ．  Ｓ．  Ｃｈｉｄａ，  Ｍ．  Ｂｏｇｕｎｏｖｉｃ，  Ｉｖａｎｏｖ，  ＩＩ，  Ｆ．  Ｊ．  Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ｉ．  Ｓａｎｚ，  Ｋ．  Ｂ．  Ｅｌｋｏｎ，  Ｍ．  Ｔｅｋｉｎ，  Ｆ．  Ｙａｌｃｉｎｋａｙａ，  Ｔ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｏｚｏ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｃｌａｎｃｙ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｂｕｙｏｎ，  Ｂ．  Ｒｅｉｚｉｓ，  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  １６６，  ８８−１０１  （２０１６）．
１４．    Ｍ．  Ｄｅｍｅｒｓ，  Ｄ．  Ｓ．  Ｋｒａｕｓｅ，  Ｄ．  Ｓｃｈａｔｚｂｅｒｇ，  Ｋ．  Ｍａｒｔｉｎｏｄ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，  Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ｄ．  Ｔ．  Ｓｃａｄｄｅｎ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒｓ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｔｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｔｒａｐｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０９，  １３０７６−１３０８１  （２０１２）．
１５．    Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ｕ．  Ａｂｅｄ，  Ｃ．  Ｇｏｏｓｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｈｕｒｗｉｔｚ，  Ｉ．  Ｓｃｈｕｌｚｅ，  Ｖ．  Ｗａｈｎ，  Ｙ．  Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，  Ｖ．  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，  Ａ．  Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ，  Ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １７６，  ２３１−２４１  （２００７）．
１６．    Ｃ．  Ｆｒａｎｋ，  Ｄ．  Ｗｅｒｂｅｒ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｃｒａｍｅｒ，  Ｍ．  Ａｓｋａｒ，  Ｍ．  Ｆａｂｅｒ，  Ｍ．  ａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，  Ｈ．  Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ａ．  Ｆｒｕｔｈ，  Ｒ．  Ｐｒａｇｅｒ，  Ａ．  Ｓｐｏｄｅ，  Ｍ．  Ｗａｄｌ，  Ａ．  Ｚｏｕｆａｌｙ，  Ｓ．  Ｊｏｒｄａｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｋｅｍｐｅｒ，  Ｐ．  Ｆｏｌｌｉｎ，  Ｌ．  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｌ．  Ａ．  Ｋｉｎｇ，  Ｂ．  Ｒｏｓｎｅｒ，  Ｕ．  Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，  Ｋ．  Ｓｔａｒｋ，  Ｇ．  Ｋｒａｕｓｅ，  ＨＵＳ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｔｅａｍ，  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  Ｓｈｉｇａ−ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ４  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６５，  １７７１−１７８０  （２０１１）．
１７．    Ｓ．  Ａ．  Ｂｒａｕｎｅ，  Ｄ．  Ｗｉｃｈｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｃ．  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｚ，  Ａ．  Ｎｉｅｒｈａｕｓ，  Ｈ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｔ．  Ｎ．  Ｍｅｙｅｒ，  Ｇ．  Ｐ．  Ｍｅｙｅｒ，  Ｍ．  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｊ．  Ｆｒｉｃｋｅ，  Ａ．  ｄｅ  Ｗｅｅｒｔｈ，  Ｗ．  Ｗ．  Ｈｏｅｐｋｅｒ，  Ｊ．  Ｆｉｅｈｌｅｒ，  Ｔ．  Ｍａｇｎｕｓ，  Ｃ．  Ｇｅｒｌｏｆｆ，  Ｕ．  Ｐａｎｚｅｒ，  Ｒ．  Ａ．  Ｓｔａｈｌ，  Ｋ．  Ｗｅｇｓｃｈｅｉｄｅｒ，  Ｓ．  Ｋｌｕｇｅ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ．  Ｍｅｄ．  ４１，  １７０２−１７１０  （２０１３）．
１８．    Ｍ．  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ａｌｃａｚａｒ，  Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ｒ．  Ｐａｎｄａ，  Ｅ．  Ｃ．  Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｊ．  Ａ．  Ｋｒｅｍｅｒ  Ｈｏｖｉｎｇａ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｓ．  Ｐｅｉｎｅ，  Ｔ．  Ｒｅｎｎｅ，  Ｂ．  Ｌａｍｍｌｅ，  Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＤＮａｓｅ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  １３，  ７３２−７４２  （２０１５）．
１９．    Ｊ．  Ｌｅｆｆｌｅｒ，  Ｚ．  Ｐｒｏｈａｓｚｋａ，  Ｂ．  Ｍｉｋｅｓ，  Ｇ．  Ｓｉｎｋｏｖｉｔｓ，  Ｋ．  Ｃｉａｃｍａ，  Ｐ．  Ｆａｒｋａｓ，  Ｍ．  Ｒｅｔｉ，  Ｋ．  Ｋｅｌｅｎ，  Ｇ．  Ｓ．  Ｒｅｕｓｚ，  Ａ．  Ｊ．  Ｓｚａｂｏ，  Ｍ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｂｌｏｍ，  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒａｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｊ．  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎ．  ９，  １２−２１  （２０１７）．
２０．    Ｍ．  Ｌｅｐｐｋｅｓ，  Ｃ．  Ｍａｕｅｒｏｄｅｒ，  Ｓ．  Ｈｉｒｔｈ，  Ｓ．  Ｎｏｗｅｃｋｉ，  Ｃ．  Ｇｕｎｔｈｅｒ，  Ｕ．  Ｂｉｌｌｍｅｉｅｒ，  Ｓ．  Ｐａｕｌｕｓ，  Ｍ．  Ｂｉｅｒｍａｎｎ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｍｕｎｏｚ，  Ｍ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｄ．  Ｗｉｌｄｎｅｒ，  Ａ．  Ｌ．  Ｃｒｏｘｆｏｒｄ，  Ａ．  Ｗａｉｓｍａｎ，  Ｋ．  Ｍｏｗｅｎ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｊｅｎｎｅ，  Ｖ．  Ｋｒｅｎｎ，  Ｊ．  Ｍａｙｅｒｌｅ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｌｅｒｃｈ，  Ｇ．  Ｓｃｈｅｔｔ，  Ｓ．  Ｗｉｒｔｚ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｍ．  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｃ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｃｃｌｕｄｅｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｅｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ７，  １０９７３  （２０１６）．
２１．    Ｃ．  Ｓｃｈａｕｅｒ，  Ｃ．  Ｊａｎｋｏ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｍｕｎｏｚ，  Ｙ．  Ｚｈａｏ，  Ｄ．  Ｋｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｂ．  Ｆｒｅｙ，  Ｍ．  Ｌｅｌｌ，  Ｂ．  Ｍａｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｒｅｃｈ，  Ｅ．  Ｎａｓｃｈｂｅｒｇｅｒ，  Ｒ．  Ｈｏｌｍｄａｈｌ，  Ｖ．  Ｋｒｅｎｎ，  Ｔ．  Ｈａｒｒｅｒ，  Ｉ．  Ｊｅｒｅｍｉｃ，  Ｒ．  Ｂｉｌｙｙ，  Ｇ．  Ｓｃｈｅｔｔ，  Ｍ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｌｉｍｉｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２０，  ５１１−  ５１７  （２０１４）．
２２．    Ｖ．  Ｋｕｍａｒ，  Ａ．  Ｋ．  Ａｂｂａｓ，  Ｎ．  Ｆａｕｓｔｏ，  Ｊ．  Ｃ．  Ａｓｔｅｒ，  Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ａｎｄ  ｓｈｏｃｋ．  Ｉｎ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｃｏｔｒａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００９），  ｃｈａｐ．  ４．
２３．    Ｍ．  Ａｌ−Ｍａｙｏｕｆ，  Ａ．  Ｓｕｎｋｅｒ，  Ｒ．  Ａｂｄｗａｎｉ，  Ｓ．Ａ．  Ａｂｒａｗｉ，  Ｆ．  Ａｌｍｕｒｓｈｅｄｉ，  Ｎ．  Ａｌｈａｓｈｍｉ，  Ａ．  Ａｌ  Ｓｏｎｂｕｌ，  Ｗ．  Ｓｅｗａｉｒｉ，  Ａ．  Ｑａｒｉ，  Ｅ．  Ａｂｄａｌｌａｈ，  Ｅ．，  Ｍ．  Ａｌ−Ｏｗａｉｎ，  Ｓ．  Ａｌ  Ｍｏｔｙｗｅｅ，  Ｈ．  Ａｌ−Ｒａｙｅｓ，  Ｍ．  Ｈａｓｈｅｍ，  Ｈ．  Ｋｈａｌａｋ，  Ｌ．  Ａｌ−Ｊｅｂａｌｉ，  Ｆ．  Ｓ．  Ａｌｋｕｒａｙａ．  Ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ＤＮＡＳＥ１Ｌ３  ｃａｕｓｅｓ  ａ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４３，  １１８６−１１８８  （２０１１）．
２４．    Ｋ．  Ｙａｓｕｔｏｍｏ，  Ｔ．  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｋａｇａｍｉ，  Ｈ．  Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，  Ｃ．  Ｈａｓｈｉｍｕｒａ，  Ｍ．  Ｕｒｕｓｈｉｈａｒａ，  Ｙ．  Ｋｕｒｏｄａ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡＳＥ１  ｉｎ  ｐｅｏｐｌｅ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２８，  ３１３−３１４  （２００１）．
２５．    Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ｈ．  Ｋａｒｓｕｎｋｙ，  Ｂ．  Ｚｅｖｎｉｋ，  Ｈ．  Ｓｔｅｐｈａｎ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｔ．  Ｍｏｒｏｙ，  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｉｎ  Ｄｎａｓｅ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５，  １７７−１８１  （２０００）．
２６．    Ｓ．  Ｇｕｐｔａ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｋａｐｌａｎ，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  ＮＥＴｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １２，  ４０２−４１３  （２０１６）．
２７．    Ｒ．  Ｍｉｚｕｔａ，  Ｓ．  Ａｒａｋｉ，  Ｍ．  Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｙ．  Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｓ．  Ｅｂａｒａ，  Ｄ．  Ｓｈｉｏｋａｗａ，  Ｋ．  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｓ．  Ｔａｎｕｍａ，  Ｄ．  Ｋｉｔａｍｕｒａ，  ＤＮａｓｅ  ｇａｍｍａ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，  ｅ８０２２３  （２０１３）．
２８．    Ｊ．  Ｒｏｓｓａｉｎｔ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈｅｒｔｅｒ，  Ｈ．  Ｖａｎ  Ａｋｅｎ，  Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ｙ．  Ｄｏｒｉｎｇ，  Ｃ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｏ．  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ，  Ａ．  Ｚａｒｂｏｃｋ，  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｉｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  １２３，  ２５７３−２５８４  （２０１４）．
２９．    Ａ．  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ｋ．  Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ，  Ａ．  Ａｙａｄｉ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｂａｔｔｅｙ，  Ｃ．  Ｂｅｌｌ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｂｉｒｌｉｎｇ，  Ｊ．  Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，  Ｓ．  Ｄ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ａ．  Ｂｕｒｇｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｂｕｌｔ，  Ｗ．  Ｂｕｓｈｅｌｌ，  Ｆ．  Ｓ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｃ．  Ｄｅｓａｉｎｔｅｓ，  Ｂ．  Ｄｏｅ，  Ａ．  Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，  Ｊ．  Ｔ．  Ｅｐｐｉｇ，  Ｒ．  Ｈ．  Ｆｉｎｎｅｌｌ，  Ｃ．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｍ．  Ｆｒａｙ，  Ｄ．  Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，  Ｒ．  Ｈ．  Ｆｒｉｅｄｅｌ，  Ｆ．  Ｇ．  Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，  Ｊ．  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｙ．  Ｈｅｒａｕｌｔ，  Ｇ．  Ｈｉｃｋｓ，  Ａ．  Ｈｏｒｌｅｉｎ，  Ｒ．  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，  Ｍ．  Ｈｒａｂｅ  ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ，  Ｄ．  Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ，  Ｖ．  Ｉｙｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｊ．  Ａ．  Ｋａｄｉｎ，  Ｃ．  Ｋａｌｏｆｆ，  Ｋ．  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｍ．  Ｋｏｕｔｓｏｕｒａｋｉｓ，  Ｋ．  Ｃ．  Ｌｌｏｙｄ，  Ｓ．  Ｍａｒｓｃｈａｌｌ，  Ｊ．  Ｍａｓｏｎ，  Ｃ．  ＭｃＫｅｒｌｉｅ，  Ｍ．  Ｐ．  ＭｃＬｅｏｄ，  Ｈ．  ｖｏｎ  Ｍｅｌｃｈｎｅｒ，  Ｍ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ａ．  Ｏ．  Ｍｕｊｉｃａ，  Ａ．  Ｎａｇｙ，  Ｍ．  Ｎｅｆｅｄｏｖ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｎｕｔｔｅｒ，  Ｇ．  Ｐａｖｌｏｖｉｃ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｐｏｌｌｏｃｋ，  Ｒ．  Ｒａｍｉｒｅｚ−  Ｓｏｌｉｓ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｒａｎｃｏｕｒｔ，  Ｍ．  Ｒａｓｐａ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｒｅｍａｃｌｅ，  Ｍ．  Ｒｉｎｇｗａｌｄ，  Ｂ．  Ｒｏｓｅｎ，  Ｎ．  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｊ．  Ｒｏｓｓａｎｔ，  Ｐ．  Ｒｕｉｚ  Ｎｏｐｐｉｎｇｅｒ，  Ｅ．  Ｒｙｄｅｒ，  Ｊ．  Ｚ．  Ｓｃｈｉｃｋ，  Ｆ．  Ｓｃｈｎｕｔｇｅｎ，  Ｐ．  Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，  Ｃ．  Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓｅｌｌｏｕｍ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｗ．  Ｃ．  Ｓｋａｒｎｅｓ，  Ｄ．  Ｓｍｅｄｌｅｙ，  Ｗ．  Ｌ．  Ｓｔａｎｆｏｒｄ，  Ａ．  Ｆ．  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｋ．  Ｓｔｏｎｅ，  Ｋ．  Ｓｗａｎ，  Ｈ．  Ｔａｄｅｐａｌｌｙ，  Ｌ．  Ｔｅｂｏｕｌ，  Ｇ．  Ｐ．  Ｔｏｃｃｈｉｎｉ−  Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ，  Ｄ．  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ａ．  Ｐ．  Ｗｅｓｔ，  Ｋ．  Ｙａｍａｍｕｒａ，  Ｙ．  Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，  Ｗ．  Ｗｕｒｓｔ，  Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ：  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ２３，  ５８０−５８６  （２０１２）．
【０１６３】
実施例２：治療のためのＤＮａｓｅ１Ｌ３及びバリアントの開発及び使用
序論
制御されない炎症は、過剰な病態を引き起こす（１）。好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）は、毒性タンパク質で装飾されたＤＮＡフィラメントである（２）。ＮＥＴは微生物感染から保護するが、過剰なＮＥＴ形成は炎症性疾患及び自己免疫疾患を引き起こし、悪化させる（３）。血液中に見出されるＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅ１（Ｄ１）は、ＮＥＴをｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで無害化するために広く使用されている。実際、嚢胞性線維症（ＣＦ）のＦＤＡ承認薬（ドルナーゼα）である組換えヒトＤ１の注入により、様々な疾患モデルにおいてＮＥＴの病理学的影響が予防されるが（３）、これは予防療法のためのＤ１の使用を支持するものである。
【０１６４】
ＤＮａｓｅ１様３は、ＮＥＴ関連疾患の新規薬物候補である
実施例１では、Ｄ１に加えて、ＤＮａｓｅ１様３（Ｄ１Ｌ３）もＮＥＴを分解することが明らかとなった。両方の酵素は、炎症反応中に血液と組織の恒常性を維持する。簡潔に述べると、本発明者らは、炎症状態の特徴である好中球増加症時に、無菌状態及び感染状態下で血管内にＮＥＴが生成されることを示した。Ｄ１及びＤ１Ｌ３はＮＥＴを切断するため、ＮＥＴのＤＮＡフィラメントが血管の血餅に凝集するのを予防する。Ｄ１及びＤ１Ｌ３が存在しない場合、ＮＥＴ血餅は血流を妨げ、臓器の損傷及び死を引き起こす。ＮＥＴ血餅は、血小板またはフィブリンとは独立して形成されるため、従来の抗血栓療法に耐性がある。したがって、本発明者らは、血管閉塞の新しいメカニズムとしてＮＥＴ血餅を発見し、また、ＮＥＴに対する新規予防療法であるＤ１Ｌ３を発見した（実施例１参照）。
【０１６５】
Ｄ１及びＤ１Ｌ３は、ＤＮａｓｅ１様１（Ｄ１Ｌ１）及びＤＮａｓｅ１様２（Ｄ１Ｌ２）とともにＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーに属する（４）。Ｄ１及びＤ１Ｌ３は、ヒト、霊長類、及びげっ歯類を含む様々な種において発現する。Ｄ１は主に消化管及び外分泌腺で発現し（５）、一方、造血細胞、すなわちマクロファージ及び樹状細胞はＤ１Ｌ３を産生する（６、７）。両方のＤＮａｓｅをマウス及びヒトの血清中に低濃度で見出したが（実施例１、図１４）、循環中のＤ１及びＤ１Ｌ３の起源は不明である（７、８）。Ｄ１は、タンパク質フリーＤＮＡ（例えば、細菌ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）を優先的に切断し、一方、Ｄ１Ｌ３は、真核細胞の核において一般的に見出されるＤＮＡとヒストンの複合体であるクロマチンを標的とする（７、９、１０）。Ｄ１活性は単量体アクチンへの結合に際して阻害され、生理的塩濃度に高感受性である（１１〜１３）。さらに、Ｄ１はＮ４０（シグナルペプチドを含まない成熟酵素のＮ１８に対応）及びＮ１２８（Ｎ１０６）においてグリコシル化されており、これにより酵素は血清プロテアーゼによる不活性化に対して耐性になる（９）。対照的に、Ｄ１Ｌ３は、グリコシル化部位及びアクチン結合部位を欠いており、それぞれ、いくつかのプロテアーゼに対する感受性及びアクチンに対する耐性を生じさせる（９）。
【０１６６】
Ｄ１は、消化管の体液及び尿中で最初に発見され、食物摂取由来のＤＮＡの消化に関与していた。本開示の過程で、全身投与したＤＮａｓｅ１（例えば、腹腔内または静脈内注射による）は循環中の半減期が比較的短く、酵素的に活性な形態で尿に、そして予想外に胆汁に分泌されることが観察された。胆汁液への分泌は、全身性ＤＮａｓｅ１療法を介して胆管の細胞外ＤＮＡ及び／またはＮＥＴを標的とする機会を広げる。
【０１６７】
Ｄ１Ｌ３は、プログラム細胞死に関して最初に記載された（１４）。Ｄ１Ｌ３は、２つの核局在化部位（ＮＬＳ１、ＮＬＳ２）を特徴とする。ＮＬＳ２は、Ｃ末端テール内に組み込まれ、Ｄ１Ｌ３に固有で、Ｄ１には存在しない。両方のＮＬＳは、アポトーシス中に酵素を核に向かわせる（１４）。実際、細胞内Ｄ１Ｌ３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアポトーシス細胞及びネクローシス細胞内の核ＤＮＡの断片化に必要である（１５）。Ｄ１Ｌ３は、細胞外ＤＮＡ、すなわちトランスフェクションで見出されるような脂質封入ＤＮＡ、及びアポトーシス小体内のクロマチンを分解するためにそのＣ末端テールを必要とする（７、１０）。トランスフェクションでは、ｃＤＮＡとカチオン性脂質が標的細胞の細胞膜を貫通する複合体を形成する。Ｄ１Ｌ３はトランスフェクションを妨害し、この機能にはＣ末端が重要である（１０）。アポトーシス細胞由来のクロマチンで満たされた脂質小胞であるアポトーシス小体は、Ｄ１Ｌ３の生理学的基質である（７）。本明細書では、Ｃ末端テールにより、Ｄ１Ｌ３はアポトーシス小体の脂質膜を貫通し、クロマチン充填物を分解することができる。重要なことに、Ｃ末端テールは、Ｄ１Ｌ３による脂質フリーの細胞外クロマチンの分解にも必要である（７）。Ｃ末端テールは、細胞外空間におけるＤ１Ｌ３の機能にとって重要であると考えられる。
【０１６８】
ｈＤ１は動物モデル、主にマウスのＮＥＴを効果的に標的とする一方で、それぞれＣＦ（１６）及び肺気腫（１７）の臨床試験において、治療効果を限定的に示すか、または全く示していない。ＣＦ（１８）においてＮＥＴが形成されることから、これは野生型ｈＤ１が患者においてＮＥＴを標的とするのに最適ではないことを示している。Ｄ１の治療上の限界を回避するために機能亢進性のバリアントを生成したが、それらの臨床的製造は困難である（１２）。特に、ＮＥＴ−ＤＮＡにはヒストンが含まれており、クロマチンのように構造的に構成されている（２）。したがって、ＮＥＴに対する最適な治療にはクロマチンの効率的な分解が必要であると推測された。
【０１６９】
肺気腫患者のｈＤ１と組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、アルテプラーゼ）の併用療法が記載されている（１７）。データは我々の仮説と一致しており、なぜならｔＰＡによりＤ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでクロマチンを分解することができるからである（１９）。参照により本明細書に援用するＵＳ９，６４２，８２２は、ＮＥＴの治療的標的化のためのｔＰＡ及びＤ１との併用療法をさらに開示している（２０）。しかしながら、ｔＰＡによる治療は一般的に、その線維素溶解活性のために出血リスクの増加と関連している（１７）。Ｄ１Ｌ３は、患者を出血のリスクにさらすことなく、ＮＥＴを標的とするためのより安全な戦略を提供し得るが、Ｄ１Ｌ３タンパク質を用いた療法はまだ検討されていない。
【０１７０】
アミノ酸転移によるＤＮａｓｅ１及びＤＮａｓｅ１様３バリアントの改変
本実施例では、細胞外クロマチン（ＮＥＴを含む）に対する治療用に改変したＤ１及びＤ１Ｌ３のバリアントを生成した。バリアントを設計するために、クロマチンを分解するヒトＤ１Ｌ３の能力は、ヒトＤ１には存在しない個々のアミノ酸及び／またはアミノ酸配列によってコードされると仮定した。さらに、これらの個々のアミノ酸及び／またはアミノ酸配列をヒトＤ１Ｌ３からＤ１に転移させると、クロマチン分解活性が増加した機能亢進性Ｄ１バリアントが生成すると推測した。同様に、酵素特性（例えば、グリコシル化）をＤ１からＤ１Ｌ３に転移させることができる。仮説を試験するために、従来のアミノ酸変異を採用し、新規ビルディングブロック（ＢＢ）技術を開発し、ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーのＤＮａｓｅのバリアントを改変した。
【０１７１】
Ｄ１及びＤ１Ｌ３のバリアントを産生するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を使用した［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ］。酵素活性は、高分子量（ＨＭＷ）−ＤＮＡの分解を読み取り値として用いて特徴決定した（図１６）。２種類のＨＭＷ−ＤＮＡを選択した：（ａ）サケ精巣から単離された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）。ＨＭＷ−ｄｓＤＮＡの分解はザイモグラフィーにより分析した；（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞から精製した核のクロマチン。その分解を分析するために、ＨＭＷ−クロマチンを最初にＤＮａｓｅバリアントとともにインキュベートし、続いてＤＮＡの単離及びアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）による可視化を行った。クロマチン分解は、低分子量（ＬＭＷ）−ＤＮＡによって検出された。この設定では、野生型ヒトＤ１（配列番号１）はｄｓＤＮＡを分解する活性が野生型Ｄ１Ｌ３（配列番号２）に比べておよそ１００倍高く、一方、野生型Ｄ１Ｌ３は野生型Ｄ１に比べておよそ１００倍効率的にクロマチンを分解する（図１６）。クロマチンの分解ではＤ１とＤ１Ｌ３の相乗効果が認められたが、ｄｓＤＮＡでは認められなかった。Ｄ１とＤ１Ｌ３を１０：１または１：１の比率で混合すると、各Ｄ１またはＤ１Ｌ３単独に比べてクロマチン分解の増加が観察された（図１６）。したがって、クロマチン及び／またはｄｓＤＮＡ分解活性の増加を示すＤ１及び／またはＤ１Ｌ３バリアントをスクリーニングした。
【０１７２】
Ｄ１タンパク質ファミリーのメンバーのためのｉｎ  ｖｉｖｏ発現系を使用して、血管内ＮＥＴを分解するために、選択されたＤ１及びＤ１Ｌ３バリアントをさらに試験した。参照によりその全体を本明細書に援用するＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０５１４４４参照されたい。この系は、２つの成分、（ａ）Ｄ１、Ｄ１Ｌ３、及びそのバリアントのｃＤＮＡを用いて肝細胞の安定したｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションをレシピエントマウスにおいて可能にする発現プラスミド、ならびに（ｂ）血清中のＤＮａｓｅ活性の欠如を特徴とするＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−欠損マウス、に基づく。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅ候補のｃＤＮＡを肝発現ベクターにクローニングする。次に、ベクターを、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードするマウスＣｓｆ３のｃＤＮＡとともに、Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−欠損マウスで共発現させる。Ｃｓｆ３の発現は、血管内のＮＥＴ形成を伴う好中球増加症を誘発し、これが血管内の未消化のＮＥＴの凝集及びＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスの死を引き起こす。薬物候補を同定するために、ＮＥＴを効率的に分解し、このモデルにおける罹患率及び死亡率を予防するＤ１、Ｄ１Ｌ３、及びそのバリアントをスクリーニングした。
【０１７３】
結果
従来のアミノ酸置換によるＤＮａｓｅ１バリアントの改変
本発明者らの中心的な仮説は、クロマチンを分解するヒトＤ１Ｌ３の能力は、Ｄ１に存在しないアミノ酸によって媒介されるというものである。配列アライメントにより、ヒトＤ１及びヒトＤ１Ｌ３のアミノ酸の４４％が同一であることが示された（図１７）。可変アミノ酸（５６％の非共有アミノ酸）のみを変異させて、Ｄ１及びＤＬ３バリアントを生成した。
【０１７４】
Ｄ１Ｌ３は、９．３５の等電点を有するカチオン性タンパク質であり、一方、Ｄ１及び他のメンバーは、より塩基性のタンパク質である。したがって、Ｄ１Ｌ３のカチオン性により、酵素がクロマチンを分解することができると推測した。配列アライメントにより、可変アミノ酸中の３７個のアルギニンまたはリジン残基を同定したが、これらはＤ１には存在しない（図１７）。これらのアミノ酸残基は、配列番号２に関して、アミノ酸位置２９（シグナルペプチドを含む位置９）、３９（９）、４７（７）、５０（３０）、６６（４６）、７４（５４）、７７（５７）、８０（６０）、８１（６１）、９２（７２）、１０９（８９）、１１４（９４）、１１５（９５）、１６３（１４３）、１７６（１５６）、１８０（１６０）、１９９（１７９）、２００（１８０）、２０３（１８３）、２０８（１８８）、２１２（１９２）、２２６（２０６）、２２７（２０７）、２３９（２１９）、２５０（２３０）、２５９（２３９）、２６２（２４２）、２８０（２６０）、２８５（２６５）、２９１（２７１）、２９２（２７２）、２９７（２７７）、２９８（２７８）、２９９（２７９）、３０１（２８１）、３０３（２８３）、３０４（２８４）に位置する。
【０１７５】
Ｄ１Ｌ３におけるこれらの追加のアルギニンまたはリジン残基の２６個は、Ｄ１（配列番号１）における以下のアミノ酸位置に対応する：３１（シグナルペプチドを含む９位）、４１（１９）、４９（４０）、５２（３０）、６８（４６）、７６（５４）、７９（５７）、８１（５９）、９２（７０）、１０９（８７）、１１４（９２）、１１５（９３）、１６４（１４２）、１７７（１５５）、１８１（１５９）、２００（１７８）、２０１（１７９）、２０４（１８２）、２０９（１８７）、２１３（１９１）、２２７（２０５）、２３９（２１７）、２５０（２２８）、２５９（２３７）、２６２（２４０）、及び２８０（２６０）。さらに、Ｄ１Ｌ３は、３か所のアルギニンまたはリジン残基挿入部位：Ｒ８０、Ｋ２２６、及び３つのアルギニン及び６つのリジン残基を特徴とするＣ末端テール（配列番号２のアミノ酸２８２位の後）を特徴とする。
【０１７６】
以下の変異を野生型Ｄ１に導入することにより、Ｄ１Ｌ３のコア体の一部であるアルギニン及びリジン残基をＤ１に転移させることを目的とし（図１８）：配列番号１に関して、Ｑ３１Ｒ、Ａ４１Ｋ、Ｑ４９Ｒ、Ｓ５２Ｋ、Ｔ６８Ｒ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｄ８０＿Ａ８１ｉｎｓＲ、Ａ８１Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｒ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｇ１８１Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｗ２０９Ｒ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ２３９Ｒ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５９Ｋ、Ｇ２６２Ｋ、及びＫ２８０Ｍ、そのようにしてＤ１の２８のバリアントを生成した。
【０１７７】
本実施例では、２８個のアミノ酸置換のうち２３個を含むＤ１バリアントを生成することができた。ＨＥＫ２９３細胞内でこれらのＤ１バリアントのｃＤＮＡを発現させ、培養上清中のｄｓＤＮＡ及びクロマチン分解活性を分析した。以下のアミノ酸改変がクロマチン分解活性を部分的に増加させることが観察されたが、ｄｓＤＮＡ分解には大きな差異が観察されなかった（図１９）：Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｎ７６Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｐ９２Ｒ、Ｄ１０９Ｋ、Ａ１６４Ｋ、Ｑ１７７Ｋ、Ｐ２００Ｋ、Ｓ２０１Ｋ、Ｓ２０４Ｒ、Ｔ２１３Ｒ。興味深いことに、ヒトＤ１のアミノ酸のそれぞれ７９％及び７８％を共有するマウス及びラットＤ１（配列番号４）は、Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、及びＱ７９Ｋを含む分析されたアミノ酸置換のいくつかを特徴とする（図２０）。マウスＤ１及びヒトＤ１を発現するＨＥＫ２９３細胞由来の上清の分析により、マウスＤ１は、ヒトＤ１に比べてクロマチン分解活性が増加していることが示された（図２１）。Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスに、Ｃｓｆ３と、マウスＤ１（ｍＤｎａｓｅ１、配列番号３）、ヒトＤ１（ｈＤｎａｓｅ１、配列番号１）、または空の対照プラスミド（Ｃｔｒｌ）の混合物を注射した。対照プラスミドを与えたマウスは７日以内に死亡したが、マウスＤ１の発現により少なくとも２８日間完全な保護がもたらされた（図２１）。予想に反して、ヒトＤ１を発現させても死からの部分的な保護を示すに止まり、動物の半数以上が１４日以内に死亡し（図２１）、ヒトＤ１がマウスＤ１に比べて血管内ＮＥＴの分解効率が低いことが示された。ヒトＤ１のＱ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、及びＷ２０９Ｒを変異させて、マウス様Ｄ１バリアント（配列番号５）を作成した。合計６つの変異（Ｑ３１Ｒ、Ｑ４９Ｋ、Ｑ７９Ｒ、Ｑ１７７Ｋ、Ｗ２０９Ｒ、Ｇ２６２Ｋ）を作成してラット様Ｄ１バリアント（配列番号６）を生成した。両方のげっ歯類様Ｄ１バリアントを肝細胞発現ベクターにクローニングし、Ｃｓｆ３とともにＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスに送達した。Ｄ１のマウス及びラット様バリアントを用いた遺伝子治療により、ＮＥＴを介した血管閉塞及び死に対する完全な保護が提供されることが観察された（図２２）。重要なことに、げっ歯類様ヒトＤ１バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、クロマチン分解活性の増加を示した（図２２）。まとめると、データは、（ａ）ヒトＤ１がｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴを分解する能力は限定的であり；（ｂ）複数のカチオン性アミノ酸をヒトＤ１Ｌ３からヒトＤ１に転移させると、機能亢進性バリアントが生成されることを示している。
【０１７８】
Ｄ１の機能亢進性バリアント（６、１２、１３、２１〜２９）を生成するためのいくつかの試みがなされてきた。野生型ヒトＤ１のアミノ酸２８２残基中８２残基を変化させる１８４の変異が見出された（図２３）。野生型のヒトＤ１及びヒトＤ１Ｌ３のアミノ酸配列のアライメントにより、野生型ヒトＤ１Ｌ３にすでに存在するヒトＤ１の３つの機能獲得型変異：Ｑ３１Ｒ（シグナルペプチドが存在しないＤ１のＱ９Ｒに対応）、Ｔ２２７Ｋ（Ｔ２０５Ｋ）、及びＡ１３６Ｆ（Ａ１１４Ｆ）が明らかになった（図２３）。変異Ｑ３１Ｒ及びＴ２２７Ｋは、ｈＤ１のＤＮＡ結合特性を変化させ、機能亢進性を引き起こし、一方、Ａ１３６Ｆは、単量体アクチンによる阻害に対する耐性を付与する（２１〜２４、２６、２９）。
【０１７９】
Ｑ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆ（配列番号７）の組み合わせを有する新規Ｄ１バリアントを設計し、その酵素活性を、野生型Ｄ１（配列番号１）、ならびにＱ３１Ｒ、Ｔ２２７Ｋ、Ａ１３６Ｆに単一の変異、またはＱ３１ＲとＴ２２７Ｋに複合変異を有するＤ１バリアント（配列番号８）と比較した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清中でのｄｓＤＮＡ及びクロマチン分解活性を特徴決定した。Ｑ３１Ｒ及びＴ２２７Ｋの単一または複合変異を有するＤ１バリアントでは、ｄｓＤＮＡ分解活性に大きな差異は観察されなかった（図２４）。興味深いことに、Ａ１３６Ｆ変異体及びＱ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆ複合変異において、クロマチンがそれぞれ部分的及び完全に分解された（図２４）。次に、Ｄ１のＱ３１Ｒ／Ｔ２２７Ｋ／Ａ１３６Ｆバリアントが、好中球のＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−におけるＮＥＴを介した致死的な血管閉塞を予防できるかどうかを試験した。ＤＮａｓｅを含まない対照プラスミドを投与したマウスはすべて死亡したが、Ｄ１バリアント（配列番号７）を発現するすべてのマウスは、苦痛の徴候を示すことなく実験の終了まで生存した（図２４）。精製タンパク質を使用して、三重のアミノ酸置換が、ｄｓＤＮＡ分解活性の検出可能な差異を伴わずに野生型Ｄ１に比べてクロマチン分解活性をおよそ１０〜２０倍増加させることが観察された（図２５）。核由来のクロマチン及びＮＥＴはアクチンを含有している（３０、３１）。データからは、Ｄ１バリアントによるクロマチン分解には、野生型Ｄ１Ｌ３に存在する２つの特徴であるカチオン性アミノ酸置換と、アクチン耐性を付与する変異が必要であることが示唆される。この考えをさらに裏付けるために、変異Ａ１６４Ｋ及びＡ１３６Ｆ（配列番号９）の組み合わせを特徴とするＤ１バリアントを生成した。実際、両方の変異を有するＤ１バリアントにおいてクロマチン分解活性の強い増加が観察され（図２６）、これは仮説を支持するものであった。
【０１８０】
ＤＮａｓｅ１タンパク質ファミリーメンバーのビルディングブロック改変の開発
Ｄ１Ｌ３は、追加のアミノ酸を含む３つの部位を特徴とする：Ｑ２８２（ＮＨ２−ＳＳＲＡＦＴＢＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ−ＣＯＯＨ）の後に始まるＣ末端テール（配列番号３３）、ならびにＳ７９／Ｒ８０及びＫ２２６の酵素内の２つの部位（図１７）。Ｄ１Ｌ３のＣ末端の２３アミノ酸は、Ｄ１のＣ末端に結合している（１０、２８）。ＤＮａｓｅ１の２２６位にアルギニン残基を挿入すると（Ａ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ）、ｄｓＤＮＡを分解する酵素活性が低下したＤ１バリアントが生成されたが、置換Ｔ２２７Ｋではそのような効果は観察されなかった（図２７）。したがって、Ｋ／Ｒ残基を挿入すると、Ｄ１機能が低下するリスクが伴う。荷電アミノ酸の挿入は、局所タンパク質構造に影響を与え得る。Ｄ１が１つのアミノ酸鎖を含む球状酵素であると考えると［図２８、（２７）］、そのような局所的な変化が酵素全体を不活性にし得ると考えられる。実際、Ｄ１アミノ酸配列全体にわたる多くの非保存的変異が酵素を不活性化する（１２、２５、２６）。単一のアルギニン及びリジン残基だけでなく、隣接するアミノ酸配列を移植することによる局所タンパク質構造の転移により、不活性化のリスクが低下すると仮定した。挿入のアンカーとして使用することができるＡ２２６＿Ｔ２２７ｉｎｓＫ付近の保存アミノ酸をＤ１及びＤ１Ｌ３内で検索した。本発明者らは、Ｎ末端及びＣ末端アンカーとして、Ｄ１のＤ２２３／Ｔ２２４／Ｔ２２５モチーフ及び保存されたＴ２２９をそれぞれ同定した（図２７）。Ｄ１（ＡＴＰ）内の３つのアミノ酸を、Ｄ１Ｌ３（Ｖ［Ｋ］ＫＳ）から、Ｋ２２６を含む４つのアミノ酸にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで置き換えた。ＨＥＫ２３９細胞において新規Ｄ１バリアント（Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳ）のｃＤＮＡを発現させることにより、野生型Ｄ１と比較した場合に同様のｄｓＤＮＡ分解活性を有する機能的に活性な酵素が明らかとなった（図２７）。データは、保存されたアミノ酸間の可変アミノ酸がＤ１とＤ１Ｌ３の間で交換可能であることを示唆している。
【０１８１】
本発明者らは、酵素特性をＤ１タンパク質ファミリーの１つのメンバーから別のメンバーに転移させるためのビルディングブロック技術を概念化した。以下の基本的な手順は、本技術の特徴である（図２９）：
（１）ドナー及びレシピエントＤＮａｓｅのタンパク質間アライメントを提供し、
（２）転移用の可変アミノ酸またはアミノ酸配列（ビルディングブロック）を同定し、
（３）それぞれビルディングブロック（アンカー）の上流と下流に位置するドナー及びレシピエントＤＮａｓｅの保存アミノ酸を同定し、
（４）レシピエントＤＮａｓｅのＣアンカーとＮアンカーの間のビルディングブロックをコードするｃＤＮＡを、ドナーＤＮａｓｅのアンカー間のｃＤＮＡと置き換え、
（５）キメラＤＮａｓｅのｃＤＮＡを合成し、その後、好ましくはドナー及びレシピエントＤＮａｓｅの両方を欠くレシピエント生物（例えば、ＣＨＯ細胞またはＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウス）内でｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ発現させる。
【０１８２】
ビルディングブロック技術によるＤＮａｓｅ１バリアントの改変
ヒト、マウス、ラット、及びチンパンジー由来のＤ１及びＤ１Ｌ３の複数種のアライメント（図３０）は、これらの種の間でＮ及びＣ末端アンカーが保存されていることを示した。これらのアンカーアミノ酸またはアミノ酸配列は、可変アミノ酸及びアミノ酸配列の６２個のビルディングブロックに隣接しており、これらには、上記の実験のＤ１（ＡＴＰ）及びＤ１Ｌ３（ＶＫＫＳ）のアミノ酸配列がビルディングブロック＃４９として含まれる（図３１）。
【０１８３】
これらのビルディングブロックをＤ１Ｌ３からＤ１に転移させると、以下の変異を有するＤ１バリアントが生成される（図３１）：１Ｍ＿Ｓ２２ｄｅｌｉｎｓＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ、Ｌ２３＿Ａ２７ｄｅｌｉｎｓＭＲＩＣＳ、Ｉ３０＿Ｔ３２ｄｅｌｉｎｓＶＲＳ、Ｅ３５＿Ｔ３６ｄｅｌｉｎｓＥＳ、Ｍ３８＿Ｉ４７ｄｅｌｉｎｓＱＥＤＫＮＡＭＤＶＩ、Ｑ４９＿Ｓ５２ｄｅｌｉｎｓＫＶＩＫ、Ｙ５４Ｃ、Ｉ５６＿Ｑ６０ｄｅｌｉｎｓＩＩＬＶＭ、Ｖ６２＿Ｒ６３ｄｅｌｉｎｓＩＫ、Ｓ６５＿Ｋ７２ｄｅｌｉｎｓＳＮＮＲＩＣＰＩ、Ｌ７４＿Ｎ７６ｄｅｌｉｎｓＭＥＫ、Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ、Ｈ８６Ｎ、Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ、Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ、Ｎ９６＿Ｓ９７ｄｅｌｉｎｓＮＴ、Ｒ１０１Ｑ、Ｌ１０３Ａ、Ｖ１０５Ｌ、Ｒ１０７＿Ｑ１１０ｄｅｌｉｎｓＫＥＫＬ、Ａ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＶＫＲＳ、Ｙ１１８Ｈ、Ｄ１２０Ｈ、Ｇ１２２＿Ｎ１２８ｄｅｌｉｎｓＹＱＤＧＤＡ、Ｔ１３０Ｓ、Ｎ１３２Ｓ、Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ、Ｒ１３９Ｗ、Ｆ１４１＿Ｆ１４４ｄｅｌｉｎｓＱＳＰＨ、Ｅ１４６＿Ｅ１４９ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ、Ａ１５１Ｖ、Ｖ１５３Ｉ、Ａ１５７＿Ａ１５８ｄｅｌｉｎｓＴＴ、Ｇ１６０＿Ａ１６２ｄｅｌｉｎｓＥＴＳ、Ａ１６４Ｋ、Ａ１６８Ｅ、Ｙ１７０＿Ｄ１７１ｄｅｌｉｎｓＶＥ、Ｌ１７４Ｔ、Ｑ１７７＿Ｋ１７９ｄｅｌｉｎｓＫＨＲ、Ｇ１８１＿Ｌ１８２ｄｅｌｉｎｓＫＡ、Ｄ１８４＿Ｌ１８７ｄｅｌｉｎｓＮＦＩＦ、Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ、Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ、Ｗ２０９Ｒ、Ｓ２１１Ｄ、Ｔ２１３Ｒ、Ｑ２１５Ｖ、Ｐ２１９Ｇ、Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ、Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳ、Ｈ２３０Ｎ、Ｖ２３８＿Ａ２３９ｄｅｌｉｎｓＬＲ、Ｍ２４１＿Ａ２４６ｄｅｌｉｎｓＱＥＩＶＳＳ、Ｄ２５０Ｋ、Ａ２５２＿Ｐ２５４ｄｅｌｉｎｓＮＳＶ、Ｎ２５６Ｄ、Ａ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＫＡ、Ｇ２６２Ｋ、Ｓ２６４＿Ｌ２６７ｄｅｌｉｎｓＴＥＥＥ、Ｑ２６９＿Ｉ２７１ｄｅｌｉｎｓＬＤＶ、Ｙ２７５Ｆ、Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ、及びＫ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ。
【０１８４】
ビルディングブロックをＤ１からＤ１Ｌ３に転移させる場合、以下のＤ１Ｌ３バリアントが生成される（図３１）：Ｍ１＿Ａ２０ｄｅｌｉｎｓＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ、Ｍ２１＿Ｓ２５ｄｅｌｉｎｓＬＫＩＡＡ、Ｖ２８＿Ｓ３０ｄｅｌｉｎｓＩＱＴ、Ｅ３３＿Ｓ３４ｄｅｌｉｎｓＥＴ、Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ、Ｋ４７＿Ｋ５０ｄｅｌｉｎｓＱＩＬＳ、Ｃ５２Ｙ、Ｉ５４＿Ｍ５８ｄｅｌｉｎｓＩＡＬＶＱ、Ｉ６０＿Ｋ６１ｄｅｌｉｎｓＶＲ、Ｓ６３＿Ｉ７０ｄｅｌｉｎｓＳＨＬＴＡＶＧＫ、Ｍ７２＿Ｋ７４ｄｅｌｉｎｓＬＤＮ、Ｒ７７＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＱＤＡＰＤＴ、Ｎ８６Ｈ、Ｖ８８＿Ｉ８９ｄｅｌｉｎｓＶＶ、Ｓ９１＿Ｒ９２ｄｅｌｉｎｓＥＰ、Ｎ９６＿Ｔ９７ｄｅｌｉｎｓＮＳ、Ｑ１０１Ｒ、Ａ１０３Ｌ、Ｌ１０５Ｖ、Ｋ１０７＿Ｌ１１０ｄｅｌｉｎｓＲＰＤＱ、Ｖ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＡＶＤＳ、Ｈ１１８Ｙ、Ｈ１２０Ｄ、Ｙ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ、Ｖ１２９Ｔ、Ｓ１３１Ｎ、１３５Ｆ＿１３６ＶｄｅｌｉｎｓＡＩ、Ｗ１３８Ｒ、Ｑ１４０＿Ｈ１４３ｄｅｌｉｎｓＦＳＲＦ、Ａ１４５＿Ｄ１４８ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ、Ｖ１５０Ａ、Ｉ１５２Ａ、Ｔ１５６＿Ｔ１５７ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｅ１５９＿Ｓ１６１ｄｅｌｉｎｓＧＤＡ、Ｋ１６３Ａ、Ｅ１６７Ａ、Ｖ１６９＿Ｅ１７０ｄｅｌｉｎｓＹＤ、Ｔ１７３Ｌ、Ｋ１７６＿Ｒ１７８ｄｅｌｉｎｓＱＥＫ、Ｋ１８０＿Ａ１８１ｄｅｌｉｎｓＧＬ、Ｎ１８３＿Ｆ１８６ｄｅｌｉｎｓＤＶＭＬ、Ｐ１９８＿Ａ２０１ｄｅｌｉｎｓＲＰＳＱ、Ｋ２０３＿Ｎ２０４ｄｅｌｉｎｓＳＳ、Ｒ２０８Ｗ、Ｄ２１０Ｓ、Ｒ２１２Ｔ、Ｖ２１４Ｑ、Ｇ２１８Ｐ、Ｑ２２０＿Ｅ２２１ｄｅｌｉｎｓＳＡ、Ｖ２２５＿Ｓ２２８ｄｅｌｉｎｓＡＴＰ、Ｎ２３０Ｈ、Ｌ２３８＿Ｒ２３９ｄｅｌｉｎｓＶＡ、Ｑ２４１＿Ｓ２４６ｄｅｌｉｎｓＭＬＬＲＧＡ、Ｋ２５０Ｄ、Ｎ２５２＿Ｖ２５４ｄｅｌｉｎｓＡＬＰ、Ｄ２５６Ｎ、Ｋ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＡＡ、Ｋ２６２Ｇ、Ｔ２６４＿Ｅ２６７ｄｅｌｉｎｓＳＤＱＬ、Ｌ２６９＿Ｖ２７１ｄｅｌｉｎｓＱＡＩ、Ｆ２７５Ｙ、Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ、及びＱ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ。
【０１８５】
次に、Ｄ１Ｌ３活性を有するＤ１バリアントを改変するための連続的なアプローチを概念化し、このアプローチは、複数の隣接するビルディングブロック（クラスター）の転移で始まり、個々のビルディングブロックの転移が続き、個々のアミノ酸、または複数のビルディングブロックの組み合わせを新規キメラ酵素に転移させることで終了する（図３２）。このアプローチは、最初のスクリーニングでＤ１−Ｄ１Ｌ３キメラの数を減少させる。
【０１８６】
本方法を試験するために、個々のビルディングブロックまたはＤ１Ｌ３由来のビルディングブロッククラスターのクラスターのいずれかを含む合計１９個のＤ１バリアントを設計した（図３１）。これらのＤ１バリアントは、以下のアミノ酸変異を特徴とする：１Ｍ＿Ｓ２２ｄｅｌｉｎｓＭＳＲＥＬＡＰＬＬＬＬＬＬＳＩＨＳＡＬＡ、Ｌ２３＿Ａ２７ｄｅｌｉｎｓＭＲＩＣＳ／Ｉ３０＿Ｔ３２ｄｅｌｉｎｓＶＲＳ／Ｅ３５＿Ｔ３６ｄｅｌｉｎｓＥＳ、Ｍ３８＿Ｉ４７ｄｅｌｉｎｓＱＥＤＫＮＡＭＤＶＩ、Ｑ４９＿Ｓ５２ｄｅｌｉｎｓＫＶＩＫ／Ｙ５４Ｃ／Ｉ５６＿Ｑ６０ｄｅｌｉｎｓＩＩＬＶＭ、Ｖ６２＿Ｒ６３ｄｅｌｉｎｓＩＫ／Ｓ６５＿Ｋ７２ｄｅｌｉｎｓＳＮＮＲＩＣＰＩ／Ｌ７４＿Ｎ７６ｄｅｌｉｎｓＭＥＫ、Ｑ７９＿Ｔ８４ｄｅｌｉｎｓＲＮＳＲＲＧＩＴ、Ｈ８６Ｎ／Ｖ８８＿Ｖ８９ｄｅｌｉｎｓＶＩ／Ｅ９１＿Ｐ９２ｄｅｌｉｎｓＳＲ、Ｎ９６＿Ｓ９７ｄｅｌｉｎｓＮＴ／Ｒ１０１Ｑ／Ｌ１０３Ａ／Ｖ１０５Ｌ、Ｒ１０７＿Ｑ１１０ｄｅｌｉｎｓＫＥＫＬ／Ａ１１３＿Ｓ１１６ｄｅｌｉｎｓＶＫＲＳ／Ｙ１１８Ｈ／Ｄ１２０Ｈ、Ｇ１２２＿Ｎ１２８ｄｅｌｉｎｓＹＱＤＧＤＡ／Ｔ１３０Ｓ／Ｎ１３２Ｓ、Ａ１３６＿Ｉ１３７ｄｅｌｉｎｓＦＶ、Ｒ１３９Ｗ／Ｆ１４１＿Ｆ１４４ｄｅｌｉｎｓＱＳＰＨ／Ｅ１４６＿Ｅ１４９ｄｅｌｉｎｓＡＶＫＤ／Ａ１５１Ｖ／Ｖ１５３Ｉ／Ａ１５７＿Ａ１５８ｄｅｌｉｎｓＴＴ／Ｇ１６０＿Ａ１６２ｄｅｌｉｎｓＥＴＳ／Ａ１６４Ｋ、Ａ１６８Ｅ／Ｙ１７０＿Ｄ１７１ｄｅｌｉｎｓＶＥ／Ｌ１７４Ｔ、Ｑ１７７＿Ｋ１７９ｄｅｌｉｎｓＫＨＲ／Ｇ１８１＿Ｌ１８２ｄｅｌｉｎｓＫＡ／Ｄ１８４＿Ｌ１８７ｄｅｌｉｎｓＮＦＩＦ、Ｒ１９９＿Ｑ２０２ｄｅｌｉｎｓＰＫＫＡ／Ｓ２０４＿Ｓ２０５ｄｅｌｉｎｓＫＮ／Ｗ２０９Ｒ／Ｓ２１１Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ｑ２１５Ｖ／Ｐ２１９Ｇ／Ｓ２２１＿Ａ２２２ｄｅｌｉｎｓＱＥ、Ａ２２６＿Ｐ２２８ｄｅｌｉｎｓＶＫＫＳ、Ｈ２３０Ｎ／Ｖ２３８＿Ａ２３９ｄｅｌｉｎｓＬＲ／Ｍ２４１＿Ａ２４６ｄｅｌｉｎｓＱＥＩＶＳＳ／Ｄ２５０Ｋ／Ａ２５２＿Ｐ２５４ｄｅｌｉｎｓＮＳＶ、Ｎ２５６Ｄ／Ａ２５９＿Ａ２６０ｄｅｌｉｎｓＫＡ／Ｇ２６２Ｋ／Ｓ２６４＿Ｌ２６７ｄｅｌｉｎｓＴＥＥＥ／Ｑ２６９＿Ｉ２７１ｄｅｌｉｎｓＬＤＶ、及びＹ２７５Ｆ／Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ／Ｋ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ。
【０１８７】
次に、ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞上清の分析により、すべてのサンプルによるｄｓＤＮＡ分解が示された（図３３）。さらに、Ｄ１Ｌ３からＤ１への、ビルディングブロック（ＢＢ）１１（配列番号１０参照）、ＢＢ１２〜１４（配列番号１１参照）、ＢＢ２６（配列番号１２参照）、ＢＢ４１〜４８（配列番号１３参照）、及びＢＢ４９（配列番号１４参照）の転移により、クロマチン分解活性が増加した酵素が得られた。これらのすべてのキメラ酵素は、野生型Ｄ１に比べてｄｓＤＮＡ基質を分解するのと同じかそれ以上の活性を示した。Ｄ１Ｌ３由来のビルディングブロック１１（配列番号２のＲＮＳＲＲＧＩ）及び４９（配列番号２のＶＫＫＳ）は、それぞれＲ８０／Ｒ８１及びＫ２２７を含み、これらはＤ１には存在しない。Ｄ１Ｌ３−ＢＢクラスター４１〜４８（配列番号２のＰＫＫＡＷＫＮＩＲＬＲＴＤＰＲＦＶＷＬＩＧＤＱＥ）は、そのＤ１における対応配列（ＲＰＳＱＷＳＳＩＲＬＷＴＳＰＴＦＱＷＬＩＰＤＳＡの配列番号１）と比較して５つの追加のアルギニン及びリジン残基を特徴とする。これらの追加のカチオン性アミノ酸が機能亢進性を担っている可能性がある。Ｄ１ビルディングブロック１２〜１４及び２６は、配列番号１のアミノ酸配列Ｈ８６〜Ｒ９５及びＡ１３６〜Ｖ１３８を含み、これは、Ｄ１阻害剤であるアクチンの結合に必要なアミノ酸残基を含む。したがって、これらのアミノ酸配列を、アクチンと相互作用しないＤ１Ｌ３由来のそれぞれのビルディングブロックで置き換えると、Ｄ１のアクチン耐性バリアントを生成する可能性がある。ＢＢ１１、１４、２６、４１〜１９を組み合わせて１つの新規Ｄ１バリアント（配列番号１５）にした。これらの機能獲得ＢＢの組み合わせにより、Ｄ１バリアントのクロマチン分解が野生型Ｄ１Ｌ３のレベルまで増加することが観察された（図３３）。したがって、ＢＢ技術は、機能亢進性Ｄ１バリアントを生成するためのロバストな方法を提供する。
【０１８８】
ビルディングブロック技術によるＤＮａｓｅ１様３バリアントの改変
Ｄ１Ｌ３のＢＢクラスター６０〜６２は、そのＣ末端テール由来のアミノ酸を含む（図３３）。テールはＬ２８１の後に始まり（図３４）、二分のＮＬＳを含むアミノ酸配列ＱＳＳＲＡＦＴＢＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ（配列番号３３）を有する。Ｄ１Ｌ３は、トランスフェクション試薬及びアポトーシス小体を含む脂質小胞内のＤＮＡを分解するためにＣ末端テールを必要とする（７、１０、２８）。さらに、Ｄ１Ｌ３による脂質フリー及び細胞フリーのクロマチンの分解にはＣ末端が必要である（７）。両方の調査結果は、Ｑ２８２の後のアミノ酸が欠失したＤ１Ｌ３バリアントに基づいているため、これらの基質の分解では不活性である。Ｗｉｌｂｅｒｔらは、Ｄ１Ｌ３のＣ末端延長部をＤ１のＣ末端に結合させ、脂質小胞内でのＤＮＡ分解能力をＤ１に転移させた（１０、２８）。本明細書において、ＢＢ技術を使用して、Ｃ末端をＤ１Ｌ３からＤ１へ、またはその逆に転移させた。Ｎアンカーとして、Ｄ１の末端βシートの前に位置する保存されたＳ２７２／Ｄ２７３／Ｈ２７４モチーフ（図２８）を使用し、Ｄ１とＤ１Ｌ３の間で末端の３つのビルディングブロックを交換した（図３４）。このアプローチにより、変異Ｙ２７５Ｆ／Ｖ２７９＿Ｍ２８０ｄｅｌｉｎｓＦＫ／Ｋ２８２ｄｅｌｉｎｓＱＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ（配列番号１６）によるＤ１Ｌ３のＣ末端延長部を特徴とするＤ１バリアント、及び変異Ｆ２７５Ｙ／Ｆ２７９＿Ｋ２８０ｄｅｌｉｎｓＶＭ／Ｑ２８２＿Ｓ３０５ｄｅｌｉｎｓＫ（配列番号１７）による短縮型ＤＩＬ３バリアントを生成した。ＨＥＫ２９３細胞内でバリアント及び野生型酵素の両方を発現させ、上清中のＤＮａｓｅ活性を特徴決定した。予想に反して、Ｄ１Ｌ３のＣ末端を有するＤ１バリアントはクロマチンを分解せず、一方、野生型酵素のＣ末端を欠くＤ１Ｌ３バリアントは依然としてクロマチンを切断することができることが観察された（図３４）。実際、このＤ１Ｌ３バリアントではクロマチン分解活性の増加が観察された。この発見を裏付けるために、Ｄ１Ｌ３の短縮型バリアントがｉｎ  ｖｉｖｏで存在するかどうかを試験し、その発現によって好中球Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−マウスのＮＥＴを介した致死性から保護されることを観察した（図３４）。結論として、Ｃ末端の欠失は、Ｄ１Ｌ３の機能を阻害せず、むしろ増加させ、脂質フリー及び細胞フリーのクロマチンを分解する。
【０１８９】
血清プロテアーゼ、特にプラスミンはＤ１Ｌ３を分解するが、Ｄ１は分解しない（９）。プロテアーゼ活性に対するＤ１Ｌ３の感受性は、診療での使用を制限するであろう。グリコシル化タンパク質は、プロテアーゼに対する保護の増加を示す（３２）。ソフトウェア解析を用いて、ヒト及びマウスＤ１Ｌ３のグリコシル化に関する公知のコンセンサス配列を同定することができなかった。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で観察されたように、ヒトＤ１のソフトウェア解析により２つのグリコシル化部位が明らかになった（９）。Ｄ１Ｌ３のグリコシル化バリアントは、血清プロテアーゼに対する耐性が向上しているため、循環中の半減期を延長し得ると仮定した。グリコシル化部位には、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓの最小限のコンセンサス配列が必要である。Ｄ１は、２つの公知のＮグリコシル化部位、Ｎ４０（シグナルペプチドを含まない場合、Ｎ１８）及びＮ１２８［（シグナルペプチドを含まない場合、Ｎ１０６、（９）］）を含む。Ｄ１グリコシル化部位Ｎ４０−Ｘ−Ｔ４２及びＮ１２８−Ｘ−Ｔ１３０のアミノ酸は、Ｄ１Ｌ３のＤ３８−Ｘ−Ｎ４０及びＡ１２７−Ｘ−Ｖ１２９に対応する。したがって、Ｄ１Ｌ３のグリコシル化バージョンは、アミノ酸変異Ｄ３８Ｎ、Ｎ４０Ｔ、Ａ１２７Ｎ、及びＶ１２９Ｔを特徴とする必要がある（配列番号１８参照）。これらのアミノ酸置換を挿入するために、従来の点変異を使用する代わりにＢＢ技術を使用して、ＢＢ４（配列番号１のＭＳＮＡＴＬＶＳＹ）内にあるＤ１グリコシル化部位Ｎ４０−Ｘ−Ｔ４２及びＢＢクラスター２３〜２５（配列番号１のＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＮ）内にあるＮ１２８−Ｘ−Ｔ１３０をＤ１からＤ１Ｌ３へ転移させた（図３５）。このようにして、それぞれ、変異Ｑ３６＿Ｉ４５ｄｅｌｉｎｓＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩ（配列番号１９）及びＹ１２２＿Ａ１２７ｄｅｌｉｎｓＧＣＥＰＣＧＮ／Ｖ１２９Ｔ／Ｓ１３１Ｎ（配列番号２０）を特徴とする２つの新規Ｄ１Ｌ３バリアントを生成した。これらのＤ１Ｌ３バリアント及びＷＴ酵素をＨＥＫ２９３細胞内で発現させた。次に、ＷＴ酵素のＣ末端テールのエピトープを標的とするポリクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロットにより上清を分析し、ＷＴ酵素及びＤ１Ｌ３バリアントを検出した。予想通り、Ｄ１Ｌ３バリアントは、ＷＴ酵素と比較した場合、おそらくグリコシル化により、より高い分子量のバンドを示した（図３５）。Ｎ４０またはＮ１２８においてグリコシル化されたＤ１Ｌ３バリアントは、クロマチン分解活性を保持していた（図３５）。結論として、データは、ＢＢ技術を使用してＤ１からＤ１Ｌ３へグリコシル化部位を転移させることができ、これにより、プロテアーゼ耐性が増加し、患者の半減期が延長されたＤ１Ｌ３バリアントを生成し得ることを示唆している。
【０１９０】
ＤＮａｓｅ１様３及びそのバリアントによる治療
最後に、Ｄ１Ｌ３の治療効果をｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ＮＥＴの血管血餅の組織学的分析は、クロマチンの密な凝集体を示し（図３６Ａ）、このことはＤ１のヒストンフリーの切断部位がｉｎ  ｖｉｖｏでは稀であることを示す。したがって、野生型Ｄ１Ｌ３を用いた急性療法は、野生型Ｄ１に比べて血管内ＮＥＴの分解に効果的であると仮定した。仮説を検証するために、Ｄｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−欠損マウスでＣｓｆ３を発現させて、ＮＥＴの血管血餅を誘発した。重要な点として、転帰に先行して、ＮＥＴによる血管閉塞を有するマウスは血尿及び低体温を発症するため、これにより非侵襲的に検出することができる。したがって、動物モデルにより、ＮＥＴを形成したマウスを同定し、したがって選択して、ＮＥＴに対する急性療法の薬物候補を試験することができる（図３６Ｂ）。本明細書において、ＮＥＴに対する急性療法用の、精製した野生型ヒトＤ１（ドルナーゼα；配列番号１）、野生型ヒトＤ１Ｌ３（配列番号２）、及び機能亢進性Ｄ１Ｌ３バリアント［Ｄ１Ｌ３Ｖ；（配列番号１７）］を試験した。Ｃｓｆ３をＤｎａｓｅ１−／−Ｄｎａｓｅ１ｌ３−／−欠損マウスに注射した。７２時間後、最初の個々の動物が低体温症及び血尿を発症し始めた。４℃以上の体温の低下と赤色尿の存在を選択基準として使用した。これらの表現型を発症したマウスを、異なる治療群に無作為化した。動物に、１ｍｇ／ｋｇのＤ１、Ｄ１Ｌ３、またはビヒクルを尾静脈から単回用量で静脈内注射した。３０分後、動物を安楽死させて、生体サンプル（血液及び臓器）を採取した。肺の脈管構造におけるＮＥＴ血餅の定量化により、ビヒクルまたはＤ１療法を受けているマウスにおいてＮＥＴが血管を閉塞したことが示された（図３６Ｄ）。重要な点として、Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３Ｖを注射したマウスは、ＮＥＴ血餅を全くまたはほとんど示さなかった（図３６Ｄ）。患者においては、循環ＤＮＡはモノヌクレオソームにおけるＤＮＡのサイズ［１８０塩基対、（３３）］を有しており、このことはそれがクロマチンの高分子量ＤＮＡの分解産物であることを示している。循環ＤＮＡは、血管内ＮＥＴ形成の代替マーカーとして一般的に使用されるが、損傷組織及び壊死組織にも由来し得る（３４）。蛍光ＤＮＡプローブを使用して血清中のＤＮＡを定量した。Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３Ｖの注射により、循環ＤＮＡレベルの強い増加が引き起こされたが、Ｄ１またはビヒクルでは引き起こされなかったことが観察された（図３６Ｅ）。循環ＤＮＡの単離及び可視化により、多量体の１８０塩基対断片が示され、Ｄ１Ｌ３療法を受けたマウスの血清中のモノ及びオリゴヌクレオソームの存在が示された（図３６Ｆ）。Ｄ１Ｌ３Ｖを投与したマウスは、モノヌクレオソーム及びジヌクレオソームのみを示した。データからは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤ１Ｌ３Ｖの機能亢進性が確認される。Ｄ１療法を受けたマウスの血清由来のＤＮＡ単離物は、様々なサイズのかすかなＤＮＡスメアを示したが、ビヒクルを注射したマウスの血清からはＤＮＡを単離することができなかった（図３６Ｆ）。したがって、Ｄ１Ｌ３は、予防のためだけでなく、ＮＥＴに関連する疾患の急性治療にも使用し得る。
【０１９１】
虚血再灌流損傷のモデルにおけるＤ１Ｌ３Ｖの治療用途をさらに調査した（図３７Ａ）。簡潔に述べると、雄の野生型ラットの１つの睾丸を、以前に本発明者らが記載したように精巣捻転に供した（３５）。この手順により、虚血性組織損傷が引き起こされる。睾丸の無作為化及び減捻の後、ラットにビヒクルドルナーゼα（Ｄ１、１ｍｇ／ｋｇ）、または精製ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアント（配列番号１７、Ｄ１Ｌ３Ｖ、１ｍｇ／ｋｇ）を毎日３回注射した。７日後、虚血性の精巣及び未処置の精巣を回収した。Ｄ１Ｌ３Ｖによる治療は、精巣萎縮を有意に減少させたが、生理食塩水またはＤ１では減少しなかった（図３７Ｂ）。さらに、Ｄ１Ｌ３Ｖによる治療は、組織損傷を実質的に減少させ、動物の大部分は損傷の徴候を示さなかったが、生理食塩水またはＤ１ではそうではなかった（図３７Ｃ）。まとめると、データからは、Ｄ１Ｌ３が虚血再灌流損傷に対する強力な治療法として同定される。
【０１９２】
ＤＮａｓｅ１バリアント、ＤＮａｓｅ１様３及びバリアントの薬物開発
すべてのタンパク質治療薬のほぼ７０％がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）を使用して製造されている（３６）。実際、野生型ＤＮａｓｅ１（ドルナーゼα）はＣＨＯ細胞において産生される。大きな利点にもかかわらず、ＣＨＯでの細胞株開発と大規模生産には、かなりの程度の変動性と、細胞増殖特性を予測またはモデル化するための信頼できる方法がないことから、依然として大きな課題が残されている（３６）。重要な点として、ＣＨＯ細胞はＤ１の機能亢進性バリアントを安定して産生することができなかったため、それらの臨床製造は妨げられていた（１２）。Ｄ１Ｌ３の製造特性は不明である。したがって、野生型Ｄ１（配列番号１）、機能亢進性Ｄ１バリアント（配列番号７）、野生型Ｄ１Ｌ３（配列番号２）、及び機能亢進性Ｄ１Ｌ３バリアント（配列番号１７）を産生する安定したＣＨＯ細胞株を開発した。細胞株をバイオリアクター内で培養したところ、野生型Ｄ１及びＤ１バリアントで安定したタンパク質発現が観察され、後者は、発現レベルが大幅に増加していたが（図３８）、このことはＣＨＯにおいて機能亢進性Ｄ１バリアントを産生する実行可能性を示している。予想に反して、野生型Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３バリアントは、わずかなタンパク質レベルが観察されたに止まり（図３８）、Ｄ１Ｌ３及びそのバリアントの臨床製造の主要な課題が指し示された。
【０１９３】
大規模バイオリアクターにおける細胞密度が高いため、細胞は資源を奪い合い、細胞ストレスを受けてアポトーシスと呼ばれる細胞死の増加がもたらされるが、これは、哺乳類を含む多細胞生物が使用する細胞死プログラムである（３７）。Ｄ１Ｌ３は、アポトーシス小体のＤＮＡを標的とする（７）。低レベルのＤ１Ｌ３は、これらのアポトーシス小胞による酵素の除去によるものと推測した。これらの制限を克服するために、確立され、ＦＤＡ承認済みで、一般的に安全であると認識されている（ＧＲＡＳ）生物であり、タンパク質分泌能力を有する微生物発現系Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて、Ｄ１、Ｄ１Ｌ３及びそれらのバリアントの産生を試験した（３８、３９）。このアプローチの重要な制限は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生されるタンパク質が多くの場合に過剰にグリコシル化され、免疫原性の増強をもたらし得ることである（４０）。Ｄ１Ｌ３とそのバリアントの組成物は、グリコシル化されておらず、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現に最適である。Ｄ１及びそのバリアントのグリコシル化部位をそれぞれＮ４０Ｓ及びＮ１２８Ｓで変異させ、脱グリコシル化タンパク質（配列番号２１、２３）を生成した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのタンパク質発現は、通常、目的のタンパク質を様々な起源の分泌性シグナルペプチドに結合することによって達成される。この工程を省略して免疫原性キメラタンパク質の生成を回避した。Ｄ１及び／またはＤ１Ｌ３の天然シグナルペプチドはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって認識されると推測した。コドン最適化を行った後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてｃＤＮＡ（配列番号２２、２４〜２６）を発現させた。Ｄ１及びＤ１バリアントの発現を達成した（未記載）。重要な点として、本アプローチはさらに、Ｄ１Ｌ３及びＤ１Ｌ３バリアントの発現を可能にし、後者は発現レベルの増加を示した（図３８）。タンパク質を精製し、Ｄ１Ｌ３の活性が増加していることを確認した（図３８）。結論として、データは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓなどの非哺乳類発現系を使用して、Ｄ１Ｌ３及びそのバリアントを臨床製造することができることを示唆している。
【０１９４】
考察
２つのＤＮＡ分解酵素は、実験モデル及び患者において治療的に広く使用されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種から分泌されるＤＮａｓｅであるストレプトドルナーゼは、皮膚の同種移植片、膀胱血餅、創傷壊死組織切除、髄膜炎の疾患モデルにおいて試験されている。ＤＮａｓｅ１（膵臓ＤＮａｓｅ１を含む）は、がん、嚢胞性線維症、ループス、血栓症、脳卒中、敗血症、肺損傷、アテローム性動脈硬化症、ウイルス感染症、鎌状赤血球症、心筋梗塞、耳感染症、創傷治癒、肝損傷、心内膜炎、肝臓感染症、膵炎、原発性移植片機能不全、四肢虚血再灌流障害、腎臓損傷、血液凝固、喘息、ミョウバン誘発炎症、肝腎損傷の実験モデルにおいて治療的に使用されている。ストレプトドルナーゼはまた、胸水滲出、血胸、胆管内血餅、肺炎後貧血、潰瘍、耳鼻咽喉病態、口腔感染症、軽傷、副鼻腔炎、術後鼻形成術、不妊症、膀胱カテーテル、創傷洗浄、皮膚反応検査を有する患者の治療にも使用されている。重要な点として、ＤＮａｓｅ１は、肺炎球菌髄膜炎、痛風、下肢潰瘍、嚢胞性線維症、カルテゲナー症候群、喘息、肺葉無気肺、慢性気管支炎、気管支拡張症、ループス、原発性線毛機能不全、細気管支炎、膿胸、胸膜感染症、がん、ドライアイ疾患、下気道感染症、慢性血腫、アルツハイマー病、及び閉塞性肺疾患を有する患者において治療的に試験されている。本実施例では、Ｄ１Ｌ３、そのバリアント、及びＤ１バリアントをＤＮａｓｅ療法の新規候補として同定した（図３９）。
【０１９５】
方法
クロマチン分解活性の検出
クロマチン分解活性を測定するために、サンプルを、ＨＥＫ２９３（反応あたり１，５００，０００〜３，０００，０００個）から単離した核、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤と混合した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートした後、サンプルを６５℃まで１０分間加熱した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＤＮＡの単離を行った。次いで、溶出液をアガロースゲルにロードし、ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。ゲルのＤＮＡ蛍光を蛍光スキャナーで記録した。
【０１９６】
さらなる方法は、実施例１に記載されている。
参考文献
１．Ｖ．  Ｋｕｍａｒ，  Ａ．  Ｋ．  Ａｂｂａｓ，  Ｎ．  Ｆａｕｓｔｏ，  Ｊ．  Ｃ．  Ａｓｔｅｒ，  ｉｎ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｃｏｔｒａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００９），    ｃｈａｐ．  ２．
２．Ｖ．  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｋｉｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）  ３０３，  １５３２−１５３５  （２００４）．
３．Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ａ．  Ｈａｋｋｉｍ，  Ｃ．  Ｆ．  Ｕｒｂａｎ，  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  Ｋ．  Ｌｅｙ，  Ｅｄ．  （Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ２０１８），    ｃｈａｐ．  ６．
４．Ｄ．  Ｓｈｉｏｋａｗａ，  Ｓ．  Ｔａｎｕｍａ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｆａｍｉｌｙ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮａｓｅ  ｇａｍｍａ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，  １４３−１５２  （２００１）．
５．Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ａ．  Ｒｉｃｋｅｎ，  Ｄ．  Ｅｕｌｉｔｚ，  Ｈ．  Ｋｎｏｏｐ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  １  ｇｅｎｅ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｎａｓｅ１  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８０，  ９２９−９３７  （２００４）．
６．Ｗ．  Ｆ．  Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＤＮａｓｅ  Ｉ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｇｅｎｅ  ２１５，  ２９１−３０１  （１９９８）．
７．Ｖ．  Ｓｉｓｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  １６６，  ８８−１０１  （２０１６）．
８．Ｍ．  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ａｌｃａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＤＮａｓｅ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ：  ＪＴＨ  １３，  ７３２−７４２  （２０１５）．
９．Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ｓ．  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｊ．  Ｍｅｚｒｈａｂ，  Ｔ．  Ｋｌｏｃｋｌ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｍｕｒｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ−−ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮａｓｅ１  ａｎｄ  ＤＮａｓｅ１−ｌｉｋｅ  ３  （ＤＮａｓｅ１ｌ３）．  ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７６，  １０５９−１０７３  （２００９）．
１０．Ａ．  Ｗｉｌｂｅｒ，  Ｍ．  Ｌｕ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ−ｌｉｋｅ  ＩＩＩ  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６，  ３５−４２  （２００２）．
１１．Ｗ．  Ｋａｂｓｃｈ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｄ．  Ｓｕｃｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｐａｉ，  Ｋ．  Ｃ．  Ｈｏｌｍｅｓ，  Ａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｎ：ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４７，  ３７−４４  （１９９０）．
１２．Ｃ．  Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｍｉｎｇ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ｈＤＮａｓｅ  Ｉ：  Ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ｓａｌｔ−  ａｎｄ  ａｃｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ３３，  ５２３−５３３  （２０１７）．
１３．Ｃ．  Ｑ．  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  １８３７４−１８３８１  （１９９８）．
１４．Ｄ．  Ｓｈｉｏｋａｗａ，  Ｙ．  Ｓｈｉｋａ，  Ｓ．  Ｔａｎｕｍａ，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ＤＮａｓｅ  ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｉｔｓ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＤＮａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７６，  ３７７−３８１  （２００３）．
１５．Ｒ．  Ｍｉｚｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮａｓｅ  ｇａｍｍａ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，  ｅ８０２２３  （２０１３）．
１６．Ｈ．  Ｊ．  Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  ｏｎ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｎｄ  ｏｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｔｈｅ  Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３１，  ６３７−６４２  （１９９４）．
１７．Ｎ．  Ｍ．  Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ＤＮａｓｅ  ｉｎ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５，  ５１８−５２６  （２０１１）．
１８．Ｖ．  Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｄ．  Ｓｔａａｂ，  Ａ．  Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｐｕｔｕｍ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ＤＮａｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２８５２６  （２０１１）．
１９．Ｍ．  Ｎａｐｉｒｅｉ，  Ｓ．  Ｗｕｌｆ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍａｎｎｈｅｒｚ，  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  Ｄｎａｓｅ１  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５０，  １８７３−１８８３  （２００４）．
２０．Ｄ．  Ｄ．  Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  （ＵＳ），  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  ２０１７），  ｖｏｌ．  ＵＳ  ９，６４２，８２２  Ｂ２．
２１．Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｃ．  Ｑ．  Ｐａｎ．  （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  ２００２），  ｖｏｌ．  ＵＳ  ６，３９１，６０７  Ｂ１．
２２．Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｃ．  Ｑ．  Ｐａｎ．  （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  ２００８），  ｖｏｌ．  ＵＳ  ７，４０７，７８５  Ｂ２．
２３．Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｓ．  Ｓｈａｋ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｕｌｍｅｒ．  （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  ２００１），  ｖｏｌ．  ＵＳ  ２００１／００４１３６０  Ａ１．
２４．Ｃ．  Ｑ．  Ｐａｎ，  Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｖａｒｉａｎｔｓ．  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，  ｌｅｎｇｔｈ，  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  １１７０１−１１７０８  （１９９８）．
２５．Ｃ．  Ｑ．  Ｐａｎ，  Ｄ．  Ｖ．  Ｓｉｎｉｃｒｏｐｉ，  Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍｕｔａｎｔｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６０，  ３０９−３２１  （２００１）．
２６．Ｃ．  Ｑ．  Ｐａｎ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｕｌｍｅｒ，  Ａ．  Ｈｅｒｚｋａ，  Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  ｃａｔａｌｙｓｉｓ，  ａｎｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，  ６２８−６３６  （１９９８）．
２７．Ｇ．  Ｐａｒｓｉｅｇｌａ，  Ｃ．  Ｎｏｇｕｅｒｅ，  Ｌ．  Ｓａｎｔｅｌｌ，  Ｒ．  Ａ．  Ｌａｚａｒｕｓ，  Ｙ．  Ｂｏｕｒｎｅ，  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｏｎｓ  ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ−ｌｉｋｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１，  １０２５０−１０２５８  （２０１２）．
２８．Ｍ．  Ｃ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ａ．  Ｗｉｌｂｅｒ．  （Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  ２００４），  ｖｏｌ．  ＵＳ  ２００４／０１３８１５６．
２９．Ｊ．  Ｓ．  Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３，  ８２２５−８２２９  （１９９６）．
３０．Ｂ．  Ｔ．  Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｄ．  Ｃ．  Ａｍｂｅｒｇ，  Ａｃｔｉｎ  ｕｐ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５，  ４１０−４１５  （２００４）．
３１．Ｃ．  Ｆ．  Ｕｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ，  ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ５，  ｅ１０００６３９  （２００９）．
３２．Ｄ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｎ．  Ｊ．  Ｏｌｄｈａｍ，  Ｂ．  Ｇ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｓｉｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３４４，  １５０８−１５１４  （２００９）．
３３．Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ｊ．  Ａ．  Ｋｒｅｍｅｒ  Ｈｏｖｉｎｇａ，  Ｄ．  Ｓｃｈａｔｚｂｅｒｇ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｂ．  Ｌａｍｍｌｅ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １２０，  １１５７−１１６４  （２０１２）．
３４．Ｍ．  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ａｌｃａｚａｒ，  Ｎ．  Ｋｉｍ，  Ｔ．  Ａ．  Ｆｕｃｈｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ：  Ｃａｕｓｅ  ｏｒ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ？  Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ４３，  ５５３−５６１  （２０１７）．
３５．Ｍ．  Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｂｙ  ＤＮａｓｅ１  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｄａｍａｇｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔｓ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １０９，  ２２３  ｅ２２１−２２３  ｅ２２７  （２０１７）．
３６．Ａ．  Ｄ．  Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ，  Ｓ．  Ｃ．  Ａｌｍｏ，  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８８，  ２５３−２６０  （２０１４）．
３７．Ｙ．  Ｋ．  Ｈａｎ，  Ｙ．  Ｇ．  Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ｙ．  Ｋｉｍ，  Ｇ．  Ｍ．  Ｌｅｅ，  Ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０５，  １１８７−１１９２  （２０１０）．
３８．Ｊ．  Ｌ．  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｃｒｅｇｇ，  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  ＦＥＭＳ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２４，  ４５−６６  （２０００）．
３９．Ｍ．  Ａｈｍａｄ，  Ｍ．  Ｈｉｒｚ，  Ｈ．  Ｐｉｃｈｌｅｒ，  Ｈ．  Ｓｃｈｗａｂ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：  ｒｅｃｅｎｔ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９８，  ５３０１−５３１７  （２０１４）．
４０．Ｒ．  Ｄａｌｙ，  Ｍ．  Ｔ．  Ｈｅａｒｎ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ：  ＪＭＲ  １８，  １１９−１３８  （２００５）．
野生型ＤＮａｓｅｓの配列
配列番号１
ヒトＤＮａｓｅ１（Ｐ２４８５５），アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000003
配列番号２
ヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｑ１３６０９），アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000004
配列番号３
マウスＤＮａｓｅ１（Ｐ４９１８３）：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000005
配列番号４
ラットＤＮａｓｅ１（Ｐ２１７０４），アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000006
配列番号３４
マウスＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｏ５５０７０）：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000007
配列番号３５
ラットＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｏ８９１０７）：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000008
配列番号３６
チンパンジーＤＮａｓｅ１（Ｈ２ＱＡＨ１）：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000009
配列番号３７
チンパンジーＤＮａｓｅ１Ｌ３（Ｈ２ＱＭＵ７）：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000010
配列番号３８
ヒトＤＮａｓｅ１様１（ＮＭ＿００６７３０（下線付き））：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000011
配列番号３９
ヒトＤＮａｓｅ１様２（ＮＭ＿００１３７４（下線付き））：アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000012
ヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３のＣ末端テール
配列番号３３
アミノ酸配列：
ＳＳＲＡＦＴＮＳＫＫＳＶＴＬＲＫＫＴＫＳＫＲＳ
ＤＮａｓｅ１バリアントの配列
配列番号５
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000013
配列番号６
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000014
配列番号７
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000015
配列番号８
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000016
配列番号９
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000017
配列番号１０
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000018
配列番号１１
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000019
配列番号１２
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000020
配列番号１３
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000021
配列番号１４
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000022
配列番号１５
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000023
配列番号１６
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000024
ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアントの配列
配列番号１７
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000025
配列番号１８
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000026
配列番号１９
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000027
配列番号２０
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000028
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで使用される配列
配列番号２１
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000029
配列番号２２
配列番号２１のコドン最適化ｃＤＮＡ（開始コドン（太字、下線付き），シグナルペプチド（下線付き））：
2020534865.tif 000030
配列番号２３
アミノ酸配列（シグナルペプチド（下線付き）；成熟タンパク質）：
2020534865.tif 000031
配列番号２４
配列番号２３のコドン最適化ｃＤＮＡ（開始コドン（太字、下線付き），シグナルペプチド（下線付き））：
2020534865.tif 000032
配列番号２５
配列番号２のコドン最適化ｃＤＮＡ（開始コドン（太字、下線付き），シグナルペプチド（下線付き））：
2020534865.tif 000033
配列番号２６
配列番号１７のコドン最適化ｃＤＮＡ（開始コドン（太字、下線付き），シグナルペプチド（下線付き））：
2020534865.tif 000034
【図１】
2020534865.tif 000035
【図２】
2020534865.tif 000036
【図３】
2020534865.tif 000037
【図４】
2020534865.tif 000038
【図５】
2020534865.tif 000039
【図６】
2020534865.tif 000040
【図７】
2020534865.tif 000041
【図８】
2020534865.tif 000042
【図９】
2020534865.tif 000043
【図１０】
2020534865.tif 000044
【図１１】
2020534865.tif 000045
【図１２】
2020534865.tif 000046
【図１３】
2020534865.tif 000047
【図１４】
2020534865.tif 000048
【図１５】
2020534865.tif 000049
【図１６】
2020534865.tif 000050
【図１７】
2020534865.tif 000051
【図１８】
2020534865.tif 000052
【図１９】
2020534865.tif 000053
【図２０】
2020534865.tif 000054
【図２１】
2020534865.tif 000055
【図２２】
2020534865.tif 000056
【図２３】
2020534865.tif 000057
【図２４】
2020534865.tif 000058
【図２５】
2020534865.tif 000059
【図２６】
2020534865.tif 000060
【図２７】
2020534865.tif 000061
【図２８】
2020534865.tif 000062
【図２９】
2020534865.tif 000063
【図３０−１】
2020534865.tif 000064
【図３０−２】
2020534865.tif 000065
【図３１Ａ−１】
2020534865.tif 000066
【図３１Ａ−２】
2020534865.tif 000067
【図３１Ｂ−１】
2020534865.tif 000068
【図３１Ｂ−２】
2020534865.tif 000069
【図３２】
2020534865.tif 000070
【図３３】
2020534865.tif 000071
【図３４】
2020534865.tif 000072
【図３５】
2020534865.tif 000073
【図３６】
2020534865.tif 000074
【図３７】
2020534865.tif 000075
【図３８】
2020534865.tif 000076
【図３９】
2020534865.tif 000077
【配列表】
2020534865000001.app
【国際調査報告】
2020534865.tif 000078
2020534865.tif 000079
2020534865.tif 000080
2020534865.tif 000081
2020534865.tif 000082