(57)【要約】改変されたプロバイオティクス、その医薬組成物、ならびに障害を調節および治療する方法が開示される。【選択図】なし
2020525012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする１つ以上の遺伝子を含み、かつ１つ以上のファージゲノムを更に含む細菌であって、前記１つ以上のファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む、細菌。
【請求項２】
１つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記１つ以上のファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む、細菌。
【請求項３】
非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子を更に含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
非天然Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む、請求項１または２に記載の細菌。
【請求項５】
前記１つ以上のファージゲノムは、前記プロバイオティクス細菌の自然状態において存在する、請求項１〜４の何れかに記載の細菌。
【請求項６】
前記１つ以上のファージゲノムは、１つ以上の溶原性ファージをコードする、請求項１〜５の何れかに記載の細菌。
【請求項７】
前記１つ以上のファージゲノムは、１つ以上の欠陥ファージまたはクリプティックファージをコードする、請求項１〜５の何れかに記載の細菌。
【請求項８】
前記１つ以上のファージゲノムは、１つ以上のサテライトファージをコードする、請求項１〜５の何れかに記載の細菌。
【請求項９】
前記１つ以上のファージゲノムは、１つ以上のテリオオシン（ｔａｉｌｉｏｃｉｎ）または遺伝子導入剤をコードする、請求項１〜５の何れかに記載の細菌。
【請求項１０】
前記１つ以上の突然変異が以下から選択される、請求項１〜９の何れかに記載の細菌：
ａ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の欠失；
ｂ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入；
ｃ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の置換；
ｄ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の逆位；および
ｅ．ａ、ｂ、ｃ、およびｄの２つ以上の組み合わせ。
【請求項１１】
前記１つ以上のファージ遺伝子における前記１つ以上の突然変異は欠失である、請求項１〜１０の何れかに記載の細菌。
【請求項１２】
前記１つ以上のファージ遺伝子における前記１つ以上の突然変異は挿入である、請求項１〜１０の何れかに記載の細菌。
【請求項１３】
前記１つ以上のファージ遺伝子における前記１つ以上の突然変異は置換である、請求項１〜１０の何れかに記載の細菌。
【請求項１４】
前記１つ以上のファージ遺伝子における前記１つ以上の突然変異は逆位である、請求項１〜１０の何れかに記載の細菌。
【請求項１５】
前記１つ以上の突然変異は、１つ以上の欠失、１つ以上の挿入、１つ以上の置換、および１つ以上の逆位から選択される２つ以上の突然変異の組み合わせである、請求項１〜１０の何れかに記載の細菌。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れかに記載の細菌であって、前記１つ以上の突然変異は、前記１つ以上のファージゲノム中に前記１つ以上の標的化突然変異を有さない同じ細菌と比較して、前記細菌からのファージ粒子の放出を低減または防止する、細菌。
【請求項１７】
プロバイオティクス細菌である、請求項１〜１６の何れかに記載の細菌。
【請求項１８】
バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項１〜１７の何れかに記載の細菌。
【請求項１９】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｎｉｓｓｌｅである、請求項１〜１８の何れかに記載の細菌。
【請求項２０】
前記１つ以上のファージゲノムは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ１ゲノム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ２ゲノムおよび大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの１つ以上から選択される、請求項１〜１９の何れかに記載の細菌。
【請求項２１】
前記ファージゲノムは、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ１ゲノムである、請求項１〜２０の何れかに記載の細菌。
【請求項２２】
前記ファージゲノムは、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ２ゲノムである、請求項１〜２０の何れかに記載の細菌。
【請求項２３】
前記ファージゲノムは、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムである、請求項１〜２０の何れかに記載の細菌。
【請求項２４】
前記突然変異は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む、請求項２３に記載の細菌：
ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【請求項２５】
前記突然変異は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む、請求項２３または２４に記載の細菌：
ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５。
【請求項２６】
前記突然変異は、以下の完全な欠失または部分的な欠失を含む、請求項２３〜２５の何れかに記載の細菌：
ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５。
【請求項２７】
前記欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である、請求項２６に記載の細菌。
【請求項２８】
前記欠失は配列番号１３０を含む、請求項２７に記載の細菌。
【請求項２９】
前記欠失は配列番号１３０からなる、請求項２８に記載の細菌。
【請求項３０】
１つ以上の追加の遺伝子改変を含む、請求項１〜２９の何れかに記載の細菌。
【請求項３１】
前記１つ以上の追加の遺伝子改変は、１つ以上の内因性遺伝子における１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜３０の何れかに記載の細菌。
【請求項３２】
前記１つ以上の内因性遺伝子における前記突然変異は点突然変異である、請求項３１に記載の細菌。
【請求項３３】
前記１つ以上の内因性遺伝子における前記突然変異は欠失である、請求項３１に記載の細菌。
【請求項３４】
前記１つ以上の追加の遺伝子改変は、１つ以上の非天然遺伝子の追加を含む、請求項１〜３３の何れかに記載の細菌。
【請求項３５】
前記１つ以上の非天然遺伝子は染色体上に存在する、請求項１〜３４の何れかに記載の細菌。
【請求項３６】
前記１つ以上の非天然遺伝子はプラスミド上に存在する、請求項１〜３４の何れかに記載の細菌。
【請求項３７】
前記１つ以上の非天然遺伝子は、１つ以上のエフェクター分子の産生のための１つ以上の生合成酵素をコードする、請求項１〜３６の何れかに記載の細菌。
【請求項３８】
前記１つ以上の非天然遺伝子は、１つ以上のエフェクター分子をコードする、請求項１〜３６の何れかに記載の細菌。
【請求項３９】
前記１つ以上の非天然遺伝子は、１つ以上の毒性代謝産物の消費のための１つ以上の酵素をコードする、請求項１〜３６の何れかに記載の細菌。
【請求項４０】
前記１つ以上の非天然遺伝子は、毒性代謝産物の取り込みのための１つ以上のトランスポーターをコードする、請求項１〜３６の何れかに記載の細菌。
【請求項４１】
前記１つ以上の非天然遺伝子は、代謝産物のエクスポートのための１つ以上のエクスポーターをコードする、請求項１〜３６の何れかに記載の細菌。
【請求項４２】
少なくとも１つの非天然遺伝子は、直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記誘導性プロモーターは、自然の中では前記非天然遺伝子に関連していない、請求項１〜４１の何れかに記載の細菌。
【請求項４３】
少なくとも１つの非天然遺伝子は、直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結され、
前記誘導性プロモーターは、化学的誘導物質および／または栄養性誘導物質により誘導される、請求項４２に記載の細菌。
【請求項４４】
前記化学的誘導物質および／または栄養性誘導物質は、アラビノース、ＩＰＴＧ、テトラサイクリン、およびラムノースから選択される、請求項４３に記載の細菌。
【請求項４５】
少なくとも１つの非天然遺伝子は、直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結され、
前記誘導性プロモーターは、哺乳動物の消化管において見出される外因性環境条件により誘導される、請求項４２に記載の細菌。
【請求項４６】
少なくとも１つの非天然遺伝子は、直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結され、
前記誘導性プロモーターは、腫瘍において見出される外因性環境条件により誘導される、請求項４２に記載の細菌。
【請求項４７】
少なくとも１つの非天然遺伝子は、直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結され、
前記誘導性プロモーターは、低酸素条件下または嫌気性条件下で誘導される、請求項４２に記載の細菌。
【請求項４８】
前記プロモーターはＦＮＲ応答性プロモーターである、請求項４７に記載の細菌。
【請求項４９】
前記ＰＭＥはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）である、請求項２に記載の細菌。
【請求項５０】
前記ＰＡＬは、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）に由来する（ＰＡＬ１）か、またはフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）に由来する（ＰＡＬ３）、請求項４９に記載の細菌。
【請求項５１】
前記フェニルアラニントランスポーターはＰｈｅＰである、請求項３に記載の細菌。
【請求項５２】
請求項１〜５１の何れかに記載の細菌であって、前記細菌が哺乳動物の消化管内に存在する場合に補完される遺伝子の栄養要求株である、細菌。
【請求項５３】
哺乳動物の消化管はヒトの消化管である、請求項５２に記載の細菌。
【請求項５４】
ジアミノピメリン酸の栄養要求株、またはチミジン生合成経路中の酵素の栄養要求株である、請求項１〜５３の何れかに記載の細菌。
【請求項５５】
抗生物質耐性を更に含む、請求項１〜５４に記載の細菌。
【請求項５６】
請求項１〜５５の何れかに記載の細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。
【請求項５７】
経口投与用に製剤化された、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
以下を含む、遺伝子操作された細菌：
ａ．フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの非天然コピー；
ｂ．フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピー；
ｃ．前記ＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピー；
ｄ．Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１つのコピー；
ｅ．栄養要求性を生成するためのＴｈｙＡおよびＤａｐＡの１つ以上における突然変異；
ここで、前記細菌は１つ以上のファージゲノムを含み、かつ前記１つ以上のファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子は１つ以上の突然変異を含む。
【請求項５９】
請求項５８に記載の遺伝子操作された細菌であって、
ａ．前記高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする前記内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の前記２つの追加コピーは、前記哺乳動物の消化管において見出される外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され；
ｂ．フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の前記３つのコピーは、前記哺乳動物の消化管において見出される外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され；
ｃ．ＰＡＬをコードする前記遺伝子の前記２つの追加コピーは、化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され；
ｅ．プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の前記１つのコピーは、化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され；
ｆ．ＴｈｙＡおよびＤａｐＡの１つ以上における前記突然変異は、前記ＤａｐＡ遺伝子における突然変異である、遺伝子操作された細菌。
【請求項６０】
請求項５９に記載の遺伝子操作された細菌であって、
ａ．前記高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする前記内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の前記２つの追加コピーは、嫌気性誘導性プロモーターに作動可能に連結され；
ｂ．フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の前記３つのコピーは、嫌気性誘導性プロモーターに作動可能に連結され；
ｃ．ＰＡＬをコードする前記遺伝子の前記２つの追加コピーは、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターに作動可能に連結され；
ｄ．プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の前記１つのコピーは、アラビノース誘導性プロモーターに作動可能に連結され；および
ｅ．ＴｈｙＡおよびＤａｐＡの１つ以上における前記突然変異は、前記ｄａｐＡ遺伝子の欠失である、遺伝子操作された細菌。
【請求項６１】
請求項６０に記載の遺伝子操作された細菌であって、
ａ．前記高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする前記内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の前記２つの追加コピーは、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結され；および
ｂ．フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の前記３つのコピーは、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結される、遺伝子操作された細菌。
【請求項６２】
プロバイオティクス細菌である、請求項５８〜６１の何れかに記載の細菌。
【請求項６３】
バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項５８〜６１の何れかに記載の細菌。
【請求項６４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｎｉｓｓｌｅである、請求項５８〜６３の何れかに記載の細菌。
【請求項６５】
請求項６４に記載の遺伝子操作された細菌であって、
ａ．前記高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする前記内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の前記２つの追加コピーは、前記ｌａｃＺおよび前記ａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で前記染色体に挿入され；
ｂ．フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の前記３つのコピーは、前記ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座で前記染色体に挿入され；
ｃ．ＰＡＬをコードする前記遺伝子の前記２つの追加コピーは、前記ｅｘｏ／ｃｅａおよび前記ｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座で挿入され；および
ｄ．Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１つのコピーは、前記アラビノース遺伝子座に挿入され、ＬＡＡＤは前記天然アラビノースプロモーター下にある、遺伝子操作された細菌。
【請求項６６】
前記１つ以上のファージゲノムは、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ１ゲノム、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ２ゲノムおよび前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの１つ以上から選択される、請求項６５に記載の細菌。
【請求項６７】
前記ファージゲノムは、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムである、請求項６６に記載の細菌。
【請求項６８】
前記突然変異は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む、請求項６７に記載の細菌：
ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【請求項６９】
前記突然変異は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む、請求項６８に記載の細菌：
ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５。
【請求項７０】
前記欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である、請求項６９に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項７１】
前記欠失は配列番号１３０を含む、請求項７０に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項７２】
前記欠失は配列番号１３０からなる、請求項７１に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項７３】
請求項５８〜７２の何れかに記載の細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は参照により、２０１７年６月２１日に出願された米国仮出願第６２／５２３，２２５号、２０１７年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／５５２，７８５号、２０１７年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／５５２，８２９号、２０１８年１月５日に出願された米国仮出願第６２／６１４，２１３号、２０１８年１月３１日に出願された米国仮出願第６２／６２４，２９９号、および２０１７年６月２１日に出願された米国仮出願第６２／５２３，２０２号を組み込み、これらのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス細菌が、例えばクローン疾患および炎症性腸症候群のような胃腸障害を含む、消化管に関連する様々な疾患または障害の処置または予防に有用であることを示唆する科学的エビデンスが増えている。より近年、遺伝子操作された細菌は胃腸疾患のための潜在的な新しい治療方法処置様式として出現し、そしてまた、細菌治療の分野を、代謝性疾患、炎症性疾患、およびガンを含む多数の他の適応症に開いた。遺伝子操作された細菌の１つの利点は、１つ以上の疾患メカニズムを特異的に標的とすることができることである。例えば、胃腸障害のために、細菌は例えば、国際公開第２０１６１４１１０８号パンフレットに記載されるように、破壊された消化管障壁の治癒を補助する抗炎症剤または薬剤、例えば、酪酸短鎖の発現のための遺伝子を含むように操作され得る。遺伝子操作された細菌はまた、限定されるものではないが、代謝またはＩＥＭにおける先天性誤差から生じる稀な代謝障害を含む、種々の代謝障害のための処置な様式として考慮され得る。例えば、国際公開第２０１６０９０３４３号パンフレットに記載されるように、細菌はフェニルアラニンを代謝し、それによって胃腸管内の過剰なフェニルアラニンを消費する１つ以上の酵素を発現することによって、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するように遺伝子改変されている。
【０００３】
バクテリオファージは世界で最も一般的な生物学的実体であり、グラム陽性およびグラム陰性の両方の大多数の細菌種が細菌染色体中にいわゆるプロファージとして組み込まれる１つ以上のＤＮＡバクテリオファージを含むことが十分に実証されている（Ｃｌｏｋｉｅら、Ｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．２０１１  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１（１）：３１−４５）。
【０００４】
ＤＮＡファージは、溶解性であっても、温和であってもよい。溶解ファージは細菌細胞に感染し、次いで、子孫ファージの合成をプログラムし、これは、次いで、溶解細胞から放出される。逆に、テンペレートＤＮＡファージは組み込まれたファージＤＮＡ（すなわち、プロファージ）が宿主のゲノムと協調して複製され、任意の宿主損傷ファージ遺伝子が発現されない、それらの宿主細菌との安定な関係を確立する。しかし、バクテリオファージ粒子はインタクトプロファージを含む細胞から、誘導と呼ばれる処理によって放出され得、その処理の間に、溶解成長に必要なプロファージ遺伝子が作動し、子孫ファージ粒子が産生され、細胞の溶解を通して細胞から放出される（Ｃａｓｊｅｎｓ、Ｐｒｏｐｈａｇｅｓ、および細菌ゲノミクスにおいて概説されている：これまでに学んだこと？；  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；４９（２）：２７７−３００）。いくつかの場合において、誘導は、プロファージを保有する細菌の小画分または大画分において、自然にかつランダムに起こり得る。他の場合には、特定の、しばしば定義されていない環境シグナルが多くの細胞において特定のプロファージの同時誘導を引き起こし、細菌細胞の死を引き起こし得る。
【０００５】
全てのプロファージが溶解サイクルを受ける能力を有するわけではない。非機能的、すなわち、欠陥または潜在的プロファージは突然変異崩壊および／または何千もの細菌複製サイクルに必須の１つ以上の遺伝子の損失の試験結果として、多くの細菌において高いレベルの豊富さを生じることができる（Ｂｏｂａｙら、Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ。２０１４  Ａｕｇ  １９；  １１１（３３）：  １２１２７−１２１３２、およびその中の参考文献）。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明が１つ以上のファージゲノムを含む細菌を提供し、ここで、１つ以上のファージゲノムは欠損している。いくつかの実施形態では本発明が１つ以上のファージゲノムを含む細菌を提供し、ここで、１つ以上のファージゲノムは溶解ファージが産生されないように欠損している。いくつかの実施形態では、本発明が１つ以上のファージ遺伝子が発現されない点で１つ以上のファージゲノムが欠損している、１つ以上のファージゲノムを含む細菌を提供する。いくつかの実施形態では本発明が１つ以上のファージゲノムを含む細菌を提供し、ここで、１つ以上のファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子は１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージゲノムがプロバイオティクス細菌の自然状態で存在する。いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上の溶原性ファージをコードする。いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上の欠陥またはクリプティックファージまたはサテライトファージをコードする。いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上のテリオオシンまたは遺伝子導入剤をコードする。
【０００７】
本開示のいくつかの実施形態では、１つ以上のファージゲノムが変異される。このような突然変異は、１つ以上のファージ遺伝子の一部または完全な配列の１つ以上の欠失を含み得る。あるいは、この突然変異が１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入を含み得る。別の実施形態では、突然変異が１つ以上のファージ遺伝子の一部または完全な配列の１つ以上の置換を含んでもよい。別の実施形態では、突然変異がファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部または完全な配列の１つ以上の逆位を含む。さらに、この突然変異は、１つ以上の欠失、挿入、置換または逆位の任意の組合せを含み得る。特定の実施形態では、１つ以上の突然変異が１つ以上のファージゲノム中に１つ以上の標的突然変異を有さない同じ細菌と比較して、細菌からのファージ粒子の産生および放出を減少または予防する。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。このようなプロバイオティクス細菌の非限定的な例としては、バクテロイデス属，ビフィドバクテリウム属，クロストリジウム属，エシェリヒア属，ラクトバチルス属およびラクトコッカス属が挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌は大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅである。いくつかの実施形態では、変異したファージゲノムが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ１ゲノム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ２ゲノムおよび／または大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムである。一実施形態では、変異ファージゲノムが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムである。一実施形態では、突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０から選択される１つまたは複数の遺伝子に位置するか、またはそれらを含む。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では突然変異、例えば、１つ以上の欠失はＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、���ＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５から選択される１つ以上の遺伝子に位置するか、またはそれらを含む。本明細書に開示される細菌および薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物。
【０００８】
いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上のエフェクター分子の発現のための１つ以上の回路をさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明が高フェニルアラニン血症を低減するための組成物および治療方法に関する。いくつかの実施形態では、組成物がフェニルアラニン代謝酵素を発現することができる遺伝子操作された細菌を含む。例えば、を参照されたい。ＷＯ２０１７０８７５８０  Ａ１（その含有量は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。フェニルアラニンは、食品タンパク質において主に見出される必須アミノ酸である。典型的に、少量がタンパク質合成のために利用され、残りは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）および補因子テトラヒドロビオプテリンを必要とする酵素経路においてチロシンにヒドロキシル化される。高フェニルアラニン血症は、有毒であり、脳障害を引き起こす可能性がある、過剰なレベルのフェニルアラニンに関連する疾患の群である。原発性高フェニルアラニン血症は、ＰＡＨ遺伝子の突然変異および／または補因子代謝の遮断によって生じるＰＡＨ活性の欠損によって引き起こされる。
【００１０】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、ＰＡＨ遺伝子の突然変異によって引き起こされる高フェニルアラニン血症の重症型である。ＰＫＵは、世界中で最も一般的な先天性代謝異常（３，０００人の出生のうちで１人）として位置付けられている常染色体性劣性遺伝病であり、米国において約１３，０００人の患者に影響を及ぼしている。４００超の異なるＰＡＨ遺伝子突然変異が同定されている（Ｈｏｅｋｓら、２００９年）。血液中のフェニルアラニン（ｐｈｅ）の蓄積は、小児および成人の中枢神経系に深刻な損傷を引き起こす可能性がある。新生児で未治療の場合、ＰＫＵは不可逆的な脳損傷を引き起こす可能性がある。ＰＫＵの治療は現在、食事からフェニルアラニンを完全に排除することを含む。タンパク質のほとんどの天然源は、必須アミノ酸であり成長に必要なフェニルアラニンを含有する。これは、ＰＫＵの患者が、成長のためにちょうど十分なフェニルアラニンを供給するアミノ酸サプリメントとともに、医療食品とｐｈｅフリータンパク質サプリメントに依存していることを意味する。この食事療法は患者にとっては困難であり、生活の質に影響を与える。
【００１１】
現在のＰＫＵ療法は、タンパク質制限からなる大幅に変更された食事を必要とする。一般的に、出生時からの治療により、脳障害および精神遅滞は低減する（Ｈｏｅｋｓら、２００９年；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。しかしながら、タンパク質制限食は注意深くモニターされなければならず、必須アミノ酸およびビタミンが食事中に補われなければならない。さらに、低タンパク質食品を利用することは、それらが、変更されていない対応物であるそれらの高タンパク質よりコストがかかるので課題がある（Ｖｏｃｋｌｅｙら、２０１４年）。ＰＫＵを有する小児において、低フェニルアラニン食を続けることで成長遅延が一般的である（Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅら、２００３年）。成人において、骨粗鬆症、母性ＰＫＵ、およびビタミン欠乏症などの新たな問題が発生する場合がある（Ｈｏｅｋｓら、２００９年）。血液脳関門を自由に通過することができる血液中の過剰なレベルのフェニルアラニンは、神経学的障害、行動障害（例えば、過敏症、疲労）、および／または身体症状（例えば、痙攣、皮膚発疹、カビ臭物体）の原因となる可能性もある。国際的ガイドラインは生涯にわたる食事によるフェニルアラニン制限を推奨しているが、これは困難であり、非現実的であると広範に見なされており（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）、「ＰＫＵを伴う生活に対して最大の課題を克服するために継続的な努力−生涯にわたる低ｐｈｅ食の遵守が必要とされる」（Ｍａｃｌｅｏｄら、２０１０年）。
【００１２】
残留ＰＡＨ活性を有する患者のサブセットにおいて、補因子テトラヒドロビオプテリン（ＴＨＢ、ＢＨ４、Ｋｕｖａｎ、またはサプロプテリンとも称される）の経口投与が、血中フェニルアラニンレベルを低下させるために食事制限と一緒に使用され得る。しかしながら、補因子療法はコストがかかり、フェニルケトン尿症の軽症型に適しているだけである。Ｋｕｖａｎの年間コストは、例えば、患者１人当たり５７，０００ドルほどの高さになる場合がある。さらに、Ｋｕｖａｎの副作用には、胃炎および重度のアレルギー反応（例えば、喘鳴、立ちくらみ、吐き気、皮膚の潮紅）が含まれ得る。
【００１３】
酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）は、フェニルアラニンを無毒なレベルのアンモニアおよびｔｒａｎｓケイ皮酸に代謝することができる。ＰＡＨと異なり、ＰＡＬは、フェニルアラニンを代謝するためにＴＨＢ補因子活性を必要としない。ＰＡＬを使用した経口酵素療法の研究が行われているが、「ＰＡＬは手頃なコストにて十分な量で利用できないので、ヒトおよび動物でさえも研究は継続されなかった」（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。組換えＰＡＬ（ＰＥＧ−ＰＡＬ）のペグ化形態もまた、注射可能な治療形態として開発中である。しかしながら、ＰＥＧ−ＰＡＬを投与されたほとんどの対象は、注射部位反応に悩まされ、および／またはこの治療用酵素に対する抗体が発生した（Ｌｏｎｇｏら、２０１４年）。したがって、ＰＫＵを含む、高フェニルアラニン血症に関連する疾患のための、効果があり、信頼性があり、および／または長期間の処置に対する重要で満たされていない著しい必要性が存在している。より多くの天然タンパク質の消費を可能にしながら、患者の血中Ｐｈｅレベルを制御する処置に対する満たされていない必要性が存在している。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードして発現する遺伝子操作された細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼおよび／またはフェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸デアミナーゼをコードして発現し、高フェニルアラニン血症を低減することができる遺伝子操作された細菌を提供する。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）酵素は、フェニルアラニンを無毒なレベルのアンモニアおよびトランス−ケイ皮酸（ｔｒａｎｓｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）に代謝することができる。ＰＡＨとは異なり、ＰＡＬはフェニルアラニンを代謝するためにＴＨＢ補因子活性を必要としない。Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）は、フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化を触媒して、フェニルピルベート、ならびに微量のアンモニアおよび過酸化水素を生成する。フェニルピルビン酸（ＰＰＡ）は、医薬品、食品、および化学工業において広範に使用されており、ＰＰＡは、多くのキラル薬および食品添加物の製造における未加工の中間体であるＤ−フェニルアラニンを合成するための出発物質である。したがって、ＬＡＡＤは工業的ＰＰＡ産生の観点から研究されている（Ｈｏｕら、２０１５年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」）。フェニルピルベートは、血液脳関門を横切ることができず（Ｓｔｅｅｌｅ、Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．１９８６年６月；４５（７）：２０６０〜４頁；「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．」、この変換はＰＫＵの神経学的表現型を制御する際に有用であることを示している。
【００１５】
特定の態様では、本発明が哺乳動物中の高フェニルアラニン血症を減少させることができる遺伝子操作された細菌に関する。特定の態様では、本明細書に開示される組成物および方法が高フェニルアラニン血症（例えば、フェニルケトン尿症）に関連する疾患を処置するために使用され得る。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は非病原性であり、フェニルアラニンの毒性レベルを減少させるために消化管に導入することができる。特定の実施形態ではフェニルアラニンアンモニアリアーゼおよび／またはフェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸デアミナーゼが遺伝子操作された細菌によって安定に産生され、および／または遺伝子操作された細菌はｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定に維持される。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンの取り込みを増大させるためのフェニルアラニントランスポーター遺伝子をさらに含む。遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害を調節本発明治療する方法も提供する。
【００１６】
遺伝子操作された細菌はまた、バイオセイフティーおよび／または生物学的封じ込め、例えば、死滅スイッチ、遺伝子ガードシステムおよび／または栄養要求性に関連する１つ以上の遺伝子配列を含み得る。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、抗生物質耐性遺伝子を含み得る。これらのいずれの遺伝子配列の発現も、本明細書に開示されている任意のプロモーター系のような様々なプロモーター系を用いて調節することができ、当該プロモーター系は、１つ以上の異なる遺伝子を調節するために同じプロモーターを使用することを含むことができ、異なる遺伝子を調節するために同じプロモーターの異なるコピーを使用することを含むことができ、および／または異なる遺伝子の発現を調節するために異なるプロモーターを組み合わせて使用することを含むことができる。遺伝子発現を制御するために異なる調節系またはプロモーター系を使用することによって、柔軟性（例えば、異なる環境条件下で遺伝子発現を差異的に制御する能力および／または遺伝子発現を時間的に制御する能力）がもたらされ、また遺伝子発現を「微調整」する能力がもたらされ、これら調節のいずれかまたはすべてが遺伝子発現および／または細菌の増殖を最適化するのに役立ち得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、細菌が疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、任意の１つ以上のエフェクター分子を低酸素条件で発現することができる。いくつかの実施形態では、任意の１つ以上の回路が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が（１）当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡまたはｄａｐＢ栄養要求性などの１つまたは複数の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの１つまたは複数の死滅スイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知のトランスポーターなどの生体分子または基材をインポートするための１つまたは複数のトランスポーター、（５）本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの１つまたは複数の分泌回路、および（６）そのような追加回路の１つまたは複数の組み合わせのうちの１つまたは複数をさらに含む。１つ以上の疾患または障害の処置、予防または治療のための細菌および方法の組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａは、ＰＨＡＳＴ  ＡｎａｌｙｓｉｓからのＥｃＮゲノム（ＣＰ００７７９９．１）上の予測ファージの箇所の概略を示す。３つの高スコアのインタクトファージをファージ１〜３と標識する。ファージ１（ＰＨＡＳＴスコア１１０）は長さ１８．８ｋｂであり、ＥｃＮゲノム内の配位２４１，５６３〜２６０，４４１から伸びる。ファージ２（ＰＨＡＳＴスコア１５０）は長さ５２．４ｋｂであり、１，３２５，８８３〜１，３７８，２８７に及ぶ。ファージ３（ＰＨＡＳＴスコア１５０）は５９ｋｂの長さであり、３，４０５，１０１〜３，４１８，１８０にわたる。また、ＰＨＡＳＴアルゴリズムによって「不完全」または「疑わしい」と命名された、いくつかの低スコアファージが同定されたが、これらはファージの主要成分のすべてを含まず、したがって、部分的ファージまたは偽陽性予測を表すことができた。略語：ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７；ＰＨＡＳＴ＝ファージ・サーチ・ツール・ソフトウェア（Ｐｈａｇｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）；ｋｂ＝キロ塩基。図１Ｂは、ＰＨＡＳＴＥＲスコアリングに従って、Ｎｉｓｓｌｅゲノム中の５つの推定プロファージ（３つの無傷、１つの不完全、および１つの疑わしい）を記載する表を描写する。
【図２】図２は、本明細書中で「ファージ１」と呼ばれ、ファージのすべての主要成分を含む、ファーストツールを使用した、Ｎｉｓｓｌｅにおける３つの高スコアファージのうちの１つを示す概略図を示す。推定遺伝子をＨｙｐ＝仮説的、ＰＬＰ＝タンパク質のような他のファージ、Ｏｔｈ＝Ｏｔｈｅｒ、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼと標識する。
【図３】図３は、本明細書において「ファージ２」と呼ばれ、ファージのすべての主要成分を含む、ファーストツールを使用した、Ｎｉｓｓｌｅにおける３つの高スコアファージのうちの１つを示す概略図を示す。推定遺伝子はＨｙｐ＝仮説的、ＰＬＰ＝タンパク質のような他のファージ、Ｏｔｈ＝Ｏｔｈｅｒ、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼ、Ｌｙｓ＝Ｌｙｓｉｓ、Ｔｅｒ＝ターミナーゼ、Ｃｏａ＝Ｃｏａｔ、Ｓｈａ＝尾部シャフト、Ｆｉｂ＝尾部繊維と標識される。
【図４】図４は、本明細書において「ファージ３」と呼ばれ、ファージのすべての主要成分を含む、ファーストツールを使用した、Ｎｉｓｓｌｅにおける３つの高スコアファージのうちの１つを示す概略図を示す。推定遺伝子はＨｙｐ＝仮説的、ＰＬＰ＝タンパク質のような他のファージ、Ｏｔｈ＝Ｏｔｈｅｒ、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼ、Ｌｙｓ＝Ｌｙｓｉｓ、Ｔｅｒ＝ターミナーゼ、Ｃｏａ＝Ｃｏａｔ、Ｓｈａ＝尾部シャフト、Ｆｉｂ＝尾部繊維と標識される。
【図５】図５Ａは、Ｐｈａｓｔツールを用いて同定された２つのより低いスコアの「不完全」または「疑わしい」ファージの最初を示す。推定遺伝子をＨｙｐ＝仮説的、ＰＬＰ＝タンパク質のような他のファージ、Ｏｔｈ＝Ｏｔｈｅｒ、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼ、ｉｎｔ＝インテグラーゼ、Ａｔｔ＝付着部位と標識する。図５Ｂは、Ｐｈａｓｔツールを用いて同定された２つのより低いスコアの「不完全」または「疑わしい」ファージの２番目を示す。推定遺伝子は、Ｈｙｐ＝仮説的、ＰＬＰ＝タンパク質のような他のファージ、Ｏｔｈ＝他のファージと標識される。
【図６】図６は、予測されたＮｉｓｓｌｅファージ３配列（５９，０５６ｂｐ）の概略図を示す。
【図７】図７は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で用いられているファージ３ゲノム内のファージ３欠失の概念図である。
【図８】図８は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で構成されるノックアウト・欠失からなる４９，４９６ｂｐのファージ３シークエンスを示す模式図を示したものである。
【図９】図９はＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で削除されたように、ファージを無効にするために削除できるファージのセクションの概略を示している。
【図１０】図１０は、他の大腸菌株において配列に整列する４３ｋｂファージ３配列内の部分領域を示す概略図を示す。ファージ３として同定された配列を、ＮＣＢＩからダウンロードした５６９１の大腸菌および赤痢菌ゲノムアセンブリと比較した。左の列には、分析において陽性であった大腸菌ゲノムの受託番号が列挙されている。図の上部には、配列の開始からのｋｂの数に従ったＤＮＡ配列の座標がある。系統は、ファージ３のＤＮＡ配列と整列する各特異的大腸菌ゲノム由来の配列を示す。略語：Ｅｃｏｌｉ＝エシェリヒア属ｃｏｌｉ；ｋｂ＝キロ塩基；  ＮＣＢＩ＝Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸。
【図１１】図１１は、他の大腸菌株において配列に整列する４３ｋｂファージ３配列内の部分領域を示す概略図を示す。斜線の枠内の領域を、ファージ３ノックアウトストラテジーにおける欠失のための部位として選択した。
【図１２】図１２は、Ｒｅｆｓｅｑからの２８７個の大腸菌ゲノムのセットにわたる、予測される「無傷」ファージの数の分布を示す棒グラフを示す。Ｒｅｆｓｅｑデータベースを、公開された完成大腸菌ゲノム中に存在するインタクトファージの数について分析した。ヒストグラムは非正規分布を示すが、ほとんどすべての大腸菌ゲノムがインタクトプロファージを含み、発表された完成大腸菌ゲノムの大部分がＥｃＮよりも多くのインタクトプロファージを含むことは明らかである。略語：Ｅｃｏｌｉ＝エシェリヒア属ｃｏｌｉ；ＥｃＮ＝エシェリヒア属ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７；Ｒｅｆｓｅｑ＝基準配列。
【図１３】図１３は、ファージ特異的ＰＣＲプライマーを検証するＤＮＡゲル電気泳動検討を示す。ＥｃＮゲノムＤＮＡに一対するファージ１、２および３ならびにｒｐｏＢについてのＰＣＲプライマー一対の性能を示す。略語：ｂｐ＝塩基類対；ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ；ｒｐｏＢ＝細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット。
【図１４】図１４は、ＡＴＣＣ１３７０６プラークプラグから増幅されたＥｃＮプロファージ領域を示すＤＮＡゲル電気泳動検討を示す。略語：ｂｐ＝塩基類対；ＥｃＮ＝エシェリヒア属ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７；ｒｐｏＢ＝細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット。
【図１５】図１５は、ＳＣフェニーラニン注射の４時間後のベースラインに対する血中フェニーラニン濃度を、株ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０とＳＹＮ−ＰＫＵ７０８とで比較したものである。マウスにフェニルアラニンを０．１ｍｇ／ｇ体重で皮下注射により単回投与した。Ｐｈｅ攻撃の１、２および３時間後に、細菌（または水）を経口強制経口投与する（３００ｕｌ／用量、合計３Ｘｅ１０  ｃｆｕ／マウス）によってマウスに投与した。ｄｅｌｔａＰｈｅ  ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ７０８の減少率は、それぞれ２９％および４０％と計算された。
【図１６】図１６は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるＴＣＡ製造（図１６Ａ）とフェニルピルビン酸製造（図１６Ｂ）を示す折れ線グラフである。いずれも、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフェニルアラニンの劣化の尺度である。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中で、好気的（非誘導状態）または嫌気的（ＩＰＴＧおよびアラビノースの添加（誘導状態）のいずれかで増殖させることによって調製した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、フェニルアラニンの存在下での活性化ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のインキュベーションが経時的なＴＣＡおよびＰＰの産生をもたらし、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がフェニルアラニンを代謝することができることを実証している。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅまたはファージ非含有株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（これはファージ非含有ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０である）のいずれかで強制経口投与されたマウスにおけるフェニルアラニンレベルおよび馬尿酸塩回収の変化を示す。マウスにフェニルアラニン（０．１ｍｇ／ｇ体重）を皮下注射により単回投与した。Ｐｈｅ攻撃の１、２および３時間後に、細菌（または水分は示さず）を経口強制経口投与する（３×２５０ｕｌ）によってマウスに投与した。全血を、各時点で顎下出血を介して収集し、フェニルアラニンレベルについて分析した。代謝ケージングにおける尿収集は１ｓｔの細菌照射量の直後に開始し、研究の間、収集し続け、馬尿酸量について分析した。
【図１８】図１８Ａと図１８Ｂは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の示された量の処理を行った動物から採取した尿からフェニーラニンレベルの変化を示した図１８Ａと図１８Ｂである。簡単に述べると、動物を代謝ケージに移し（ケージ当たり３匹のマウス、基当たり２匹のケージ）、皮下注射によりフェニルアラニンの単回用量を投与した（体重１グラム当たり０．１ｍｇ）。Ｐｈｅ攻撃の１、２および３時間後に、細菌を、１×１０１１、５×１０１０、２．５×１０１０、１．２５×１０１０、６．２５×１０９、または３．１３×１０９細胞の照射量で経口強制経口投与することによりマウスに投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１を、１×１０ＯＢ細胞の最高用量で対照群（ｎ＝９）に強制経口投与した。尿を、Ｐｈｅ攻撃の４時間後まで、全ての動物から収集した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２およびＳＹＮ−ＰＫＵ９０１処置マウスの両方について、最高用量群（１×１０１１細胞）でのＴ＝０時間およびＴ＝４時間での顎下出血により、血清Ｐｈｅの変化を測定するために血を採取した。
【図１９】図１９は、ファージ含有株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３とファージ非含有株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１との間のｉｎ  ｖｉｖｏ競合研究の結果を示すグラフを示す。３日間、毎日同量（細胞約３×１０９）のマイスを実施した。実施例に記載されるように、毎日、糞便ペレットを収集し、そしてＣＦＵを、２つの株の異なった抗生物質耐性に基づいて、平板培養アッセイ中で決定した。結果は、Ｎｉｓｓｌｅ  ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１３のファージフリーＰＫＵ株とＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１株との間で、輸送またはコロニー形成に大きな差がないことを示す。
【図２０】図２０は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の投与前後の様々な時間における２匹のブタの胸部フェニルピルビン酸の測定値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、非ヒト霊長類における経口経シンナメートの尿中馬尿酸への転換率を示すグラフである。ＮＨＰ（ｎ＝６）にＣ−ｔｒａｎｓ−シンナミン酸１３（１３Ｃ−ＴＣＡ）を経口投与し、６時間かけて尿を採取した。１３Ｃ−馬尿酸（１３Ｃ−ＨＡ）をマススペクトロスコピーによって測定した。投与された１３Ｃ−ＴＣＡの機能として回収されたｕｒｉｎａｒｙＯＢＣ−ＨＡの割合を算出し、その後の実験でＨＡ回復の正規化因子として用いた。この因子はＨＡに変換されないか、または不完全な尿収集に失われるＴＣＡを説明し、したがって、株活性のより正確な説明を可能にする。-
【図２２】図２２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるプロファイリングおよび有効性を示すグラフを示す。図２２Ａにおいて、絶食ＮＨＰ（ｎ＝６）に、５ｇのペプチド（左側）または模擬攻撃（右側）単独（黒色バー）または５×１０１１細胞のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ストライプバー）を投与し、尿を６時間収集した。正規化されたＨＡ回収率は、平均±標準偏差として示される。図２２Ａで実施した研究の間にＳＹＮ−ＰＫＵを受けた動物にも、ペプチドまたは模擬チャレンジの１時間後に１３Ｃ−フェニルアラニンの照射量を静脈内（ＩＶ）投与した（図２２Ｂ）。正常化した尿中１３Ｃ−ＨＡ（これは、静脈内投与された１３Ｃ−Ｐｈｅにのみ由来し得る）がペプチドチャレンジを受けた動物において見出され、そして黒色の棒として表示される。絶食したままの動物では、尿素ＯＢＣ−ＨＡは回収されなかった。図２２Ｃにおいて、絶食ＮＨＰは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の投与の有無にかかわらず、経口投与量のｄ５−フェニルアラニン（ｄ５−Ｐｈｅ）を投与された。破線は投与されたｄ５−Ｐｈｅの量を表す。ｄ５−馬尿酸（ｄ５−ＨＡ）は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ストリップバー）を受け取った動物にのみ見出された。データは、平均正規化ｄ５−ＨＡ回収率±標準偏差（ｎ＝６）を表す。血清ｄ５−Ｐｈｅを、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（明るい灰色の線）または模擬投与（暗い灰色の線）を受けたＮＨＰにおいて測定した（図２２Ｄ）。データは、平均ｄ  ５−Ｐｈｅ濃度±標準偏差（ｎ＝６）を表している。図２２ＥではＮＨＰは単独でｄ５−Ｐｈｅを受け取ったか、またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の５×１０１１セルを受け取った。６時間かけて採血し、血清ｄ５−Ｐｈｅの曲線下面積を計算した。データは、ＡＵＣ±９０％信頼水準の上限および下限をそれぞれ示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、非ヒト霊長類の血清におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２特異的代謝産物検出を示すグラフを示す。ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳを用いて、ｄ５‐ＨＡ（図２３Ａ）とｄ５‐ＴＣＡ（図２３Ｂ）の血清濃度を、ｄ５‐ＰｈｅとＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２を経口投与した非ヒト霊長類で測定した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の非存在下でｄ５−Ｐｈｅを投与した場合、検出可能なｄ５−ＨＡまたはｄ５−ＴＣＡは検出されなかった（データ示さず）。これらの代謝産物の存在は、これらの動物におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２特異的活性を実証する。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＮＨＰにおけるトランス−シナメートの尿中馬尿酸への転換を示す。
【図２５】図２５は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が健康な非ヒト主体（ＮＨＰ）で経口投与された場合、Ｐｈｅを代謝することを示すグラフである。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２との強制経口投与することは、無線標識Ｐｈｅと一緒にタンパク質攻撃の投与時に観察される血球量の急上昇を減少させる。
【図２６】図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、および図２６ＤはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２とタンパク質食との単回投与時の、非ヒト霊長類におけるＰｈｅのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２用量依存的変換および血漿バイオマーカーの産生を示すグラフであり、ＮＨＰモデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有意な活性および有効性を示す。絶食ＮＨＰ（１用量群あたりｎ＝５）に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の指示用量（ＣＦＵ）で５ｇペプチドボーラスを投与した。尿を６時間かけて採取し、０、０．５、１、２、４、および６時間目に血清を採取した。図２６Ａは、平均±標準偏差として示される投与群からの正規化尿中ＨＡ回収を示すグラフを示す。図２６Ｂおよび図２６Ｃは、血清ＨＡの濃度について計算されたＡＵＣを示すグラフを示す。白色バーは、平均ＡＵＣ±標準偏差を表す。図２６Ｄは、示された時点で決定された血清フェニル濃度を示すグラフを示す。用量反応において投与された３つの最高用量は、これらの３つの用量が血清フェニルＡＵＣの有意な減少を示したので、無細胞制御と比較して示される（ｐ  ＜０．０５）。
【図２７】図２７Ａ、図２７Ｂ、および図２７Ｃは、ＮＨＰ中のカゼイン（図２７Ａ）ＴＣＡレベル（図２７Ｂ）および馬尿酸（図２７Ｃ）からのＰｈｅのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２用量依存的変換を示すグラフを示す。血中代謝産物を６時間収集した。
【図２８】図２８はタンパク質摂取量の増加をもたらすＮＨＰにおけるＰｈｅのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２変換を示すグラフであり、これは、ＰＫＵ患者におけるタンパク質摂取量の２．５倍の増加に対応する。
【図２９】図２９は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の体外活動を示すグラフである。１×１０８活性細胞を、ＰＡＬ（濃い青棒、左ｙ軸）とＬＡＡＤ（水色棒、右ｙ軸）活動に対して５０ｍＭ  Ｐｈｅアッセイ緩衝液で解析した。細胞を、Ｌ−アラビノース（＋ａｒａ）、ＩＰＴＧ（＋ＩＰＴＧ）または嫌気性チャンバー（−Ｏ２）中で予め誘導し、ＴＣＡおよびＰＰの速度を、経時的なＴＣＡおよびＰＰ製造の直鎖状回帰式によって計算した。このグラフは、３つの生物学的複製物の平均値および標準偏差を示す。
【図３０】図３０は、ｄａｐＡ欠失がＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の体外成長に及ぼす影響を示すグラフである。ｄａｐＡ遺伝子中に突然変異を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ）およびＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２の成長を特徴づけるために、両方の株を、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ；１００μｇ／ｍＬ）を含む（＋）または含まない（−）ＬＢ中、３７℃で９６０分間、一定振盪しながらインキュベートした。ＯＤ６００を１０分毎に測定して、経時的な細胞増殖を評価した。３つの生物学的反復および２つの技術的反復の平均を、各時点についてプロットする。データは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が成長媒体に外生的なＤＡＰを加えないと成長外因性のないことを示している。
【図３１】図３１Ａ及び図３１Ｂは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のペプチドに対するＰＡＬ活性を示したグラフである。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をバイオリアクター中で増殖させ、ＰＡＬおよびＬＡＡＤ活性について誘導した。活性化細胞を、遊離Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅの形態の５０ｍＭ  Ｐｈｅを含むＰｈｅアッセイ培地中、または５ｇ／Ｌペプトン中、またはトリプトン中、３７℃で６０分間インキュベートした。産生したトランス‐シナメート（図３１Ａ）またはフェニルピルビン酸（図３１Ｂ）の総濃度をＬＣ‐ＭＳ／ＭＳにより経時的に測定し、ＴＣＡおよびＰＰ産生速度を直鎖状回帰により計算した。全ての基材で有意なＰＡＬ活性が観察された。遊離Ｐｈｅを基材として使用した場合にのみＬＡＡＤ活性が観察され、複合基材ペプトンまたはトリプトンを使用した場合には活性がより少なかった。このグラフは、３つの生物学的複製物の平均値および標準偏差を示す。
【図３２】図３２は、種々の濃度のジアミノピメレート中のジアミノピメレート栄養要求株であるＳＹＮ７６６の増殖特性を示すグラフである。ＳＹＮ７６６（Ｅｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、ΔｄａｐＡ）を、一定の振盪下、３７℃で９６０分間、減少する濃度のＤＡＰを含む増殖培地中でインキュベートした。ＯＤ６００は経時的な細胞増殖を評価するために、１０分毎に測定した。３つの生物学的反復の平均を、各時点についてプロットする。
【図３３】図３３は、ジアミノピメラートを含まないＬＢ増殖培地におけるＥｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅの種々の株の増殖特性を示すグラフを示す。ＤＡＰの非存在下でのＥｃＮの種々の改変株の増殖特性を特徴付けるために、培養物を、ＤＡＰを含まないＬＢ中、３７℃で９６０分間、一定の振盪下でインキュベートした。ＯＤ６００を１０分毎に測定して、経時的な細胞増殖を評価した。３つの生物学的反復および２つの技術的反復の平均を、各時点についてプロットする。
【図３４】図３４は、１００μｇ／ｍＬのジアミノピメラートを含むＬＢ増殖培地中のＥｃＮの種々の株の増殖特性を示すグラフを示す。ＤＡＰの存在下でのＥｃＮの種々の改変株の増殖特性を特徴付けるために、それらを１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを含む増殖培地中、３７℃で９６０分間、絶えず振盪しながらインキュベートした。ＯＤ６００を１０分毎に測定して、経時的な細胞増殖を評価した。３つの生物学的反復の平均を、各時点についてプロットする。
【図３５】図３５Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥｃＮ生存および輸送に対するＤＡＰ栄養要求性およびＰｈｅ分解活性の影響を示す。図３５Ａは、第１群マウス（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１／ＳＹＮ７６６）における糞便クリアランスに対するＤＡＰ栄養要求性の効果を示す。図３５Ｂは、第２群マウス（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１／ＳＹＮ３２８２）における糞便クリアランスに対するＰｈｅ分解のための遺伝子工学の効果を示す。図３５Ｃが第３群マウス（ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１／ＳＹＮ３２８２）における糞便クリアランスに対するＰｈｅ分解およびＤＡＰ栄養要求性のための遺伝子工学の効果を示す。混合用量の細菌をＣ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した（ｎ＝５）。投与された細菌の数を決定するために、４回ずつＣＦＵカウントのために用量を平板培養した。それぞれの時点で、糞便を収集し、ホモジナイズし、抗生物質選択培地上での細菌ＣＦＵ判定のために平板培養した。各時点について、データは５つの糞便サンプル±標準偏差の平均ＣＦＵ／ｍｇカウントを表し、付録に別段の記載がない限り、投与した最初のＣＦＵの割合として各株について正規化した。この規格化は、Ｔ＝０で投与されたそれぞれの株の実際のＣＦＵの変動でさえ、群内の２つの株の間の生存／クリアランスの直接的な比較を可能にする。
【図３６】図３６Ａ〜Ｆは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥｃＮ輸送およびクリアランスに対するＤＡＰ栄養要求性およびＰｈｅ分解活性の影響を示す。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１をＣ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した（９×１０９ＣＦＵ／用量、ｎ＝３／時点）。指示された時間に、胃（Ａ）、上部小腸（Ｂ）、中小腸（Ｃ）、下部小腸（Ｄ）、盲腸（Ｅ）および結腸（Ｆ）からの流出液を回収し、ＣＦＵカウントのために平板培養した。ＣＦＵ判定は、抗生物質選択培地上での微量希釈によって行った。各時点について、データは、３流出液サンプル±標準偏差から決定されたＣＦＵを表す。投与４８時間後にいずれのサンプルにおいてもＣＦＵは測定されず、完全な細菌クリアランスを示した。
【図３７】図３７は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２ゲノムの概略図を示す。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるゲノム改変部位の位置を示し、ｋｂｐ指定は、０／５．４Ｍｂ参照マーカーに対する染色体位置を示す。染色体複製起点を赤色の線で示す。緑色のテキストボックスはＰｈｅＰ遺伝子挿入を示し、紫色のテキストボックスはＰＡＬ遺伝子挿入を示し、橙色のテキストボックスはＬＡＡＤ遺伝子挿入を示し、Δ記号を有する灰色のテキストボックスはｄａｐＡおよびΦ欠失の位置を示す。括弧内のイタリック体化された遺伝子名は、挿入された遺伝子を取り囲む上流および下流の遺伝子を指す。
【図３８】図３８はタンパク質給食を伴うＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２無照射量製剤にＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を無照射量投入したときの、ヒト以外のバイオマーカーにおけるＰｈｅの変化および血漿バイオマーカーの製造を図示したものであり、ＮＨＰモデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の著しい活動と有効性を示している。絶食ＮＨＰ（用量群あたりｎ＝５）に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の指示用量（ＣＦＵ）で５ｇのペプチドボーラスを投与した。血漿を、投与後０、０．５、１、２、４、および６時間目に収集した。各点、投与後の時点で血漿で測定されたＨＡ濃度を表す。標準偏差は、各点における縦棒として示されている。
【図３９】図３９は、非ヒト霊長類の胃腸管内のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の特徴付けを示す。カニノモルグスサルに、５．５グラムのペプトン、５ｍＬの０．３６Ｍ  重炭酸ナトリウム、２５ｍｇ／ｋｇのＤ５−フェニルアラニン、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１を投与し、投与後０．５時間または２時間のいずれか後に安楽死させた。安息後、組織サンプルを胃腸管の様々な部から収集し、分析して、各部中のフェおよびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の密度を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１つの態様では、本開示は内因性ファージを含み、そしてファージ配列に対する１つ以上の改変を含む細菌を提供する。いくつかの実施形態では、改変はプロファージ配列の特性を変化させる。このような突然変異は、１つ以上のファージ遺伝子の１つ以上の部分的または完全な欠失、１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入、ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の１つ以上の部分的または完全な置換；１つ以上のファージ遺伝子の１つ以上の逆位、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２０】
本発明は、１つ以上のバクテリオファージまたはプロファージを天然に含む、障害の処置のための新規な細菌を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上のファージのゲノムに対する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変がファージまたはプロファージを不活性にする。いくつかの実施形態では、これらの細菌が１つ以上のエフェクター分子の発現または産生のための１つ以上の遺伝子を含むように、さらに遺伝的に改変される。障害の処置のための新規な治療におけるこれらの遺伝子操作された細菌の製造および使用のための方法が提供される。
【００２１】
一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージがそのファージ中の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに内因性であるファージであり、その天然の状態で細菌中に存在する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が１つ以上のエフェクター（例えば、ＰＭＥ）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子およびＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、ＰｈｅＰ）およびＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、ＰｈｅＰ）およびＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、ＰｈｅＰ）、ＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子、およびＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子を含む。前述の実施形態のいずれかにおいて、フェニルアラニンを摂取するための遺伝子操作された細菌物は、その元の状態に対して１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性バクテリオファージゲノム。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。
【００２３】
バクテリオファージは世界で最も一般的な生物学的実体であり、グラム陽性およびグラム陰性の両方の大多数の細菌種が細菌染色体中にいわゆるプロファージとして組み込まれる１つ以上のＤＮＡバクテリオファージを含むことが十分に実証されている（Ｃｌｏｋｉｅら、Ｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．２０１１  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；  １（１）：３１−４５）。例えば、大腸菌株の研究では、分析された２７の大腸菌株から５１の異なる機能株が放出され、１０７の大腸菌株のうち８３の機能株（Ｃａｓｊｅｎｓ、プロファージ、および細菌ゲノム）が放出された：これまでに得られたもの；  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００３  Ｊｕｌ  ４９（２）：２７７−３００；  Ｏｓａｗａら、大沢ら、Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ−ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７株の流動性失調症エシェリヒア属からのＳｈｉｇａトキシン転換相の遺伝子変形；Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００１）４９：５６５−５７４、およびＳｃｈｉｃｋｌｍａｉｅｒら、一般化された振動端子に重点を置いた、サルモネラおよびエシェリヒア属ｃｏｌｉの天然分離株間のプロファージの周波数に関する比較研究）。Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  （１９９８）  ７３：  ４９−５４）。
【００２４】
図１２に示すように、ほとんどすべての大腸菌ゲノムはインタクトプロファージを含み、公開された完成大腸菌ゲノムの大部分はＥｃＮよりも多くのインタクトプロファージを含む。略語：  Ｅｃｏｌｉ  ＝エシェリヒア属ｃｏｌｉ；  ＥｃＮ  ＝エシェリヒア属ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７；  Ｒｅｆｓｅｑ  ＝  基準配列。
【００２５】
グラム陽性菌の中で、Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ、クロストリジウム属ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、ラクトコッカス属ｌａｃｔｉｓ、および多くの他のものゲノムは主にインタクトプロファージを含むことが示されている（Ｋｕｎｓｔら、１９９７；  Ｂｏｌｏｔｉｎら、Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２００１）  ３９０：  ２４９−２５６、Ｎｏｌｌｉｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ。Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  （２００１）  １８３：  ４８２３−４８３８；  Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍラクトコッカス属ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．ラクチスＩＬ１４０３。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  （２００１）１１：  ７３１−７５３）。
【００２６】
ＤＮＡファージは、溶解性であっても、温和であってもよい。溶解ファージは細菌細胞に感染し、次いで、子孫ファージの合成をプログラムし、これは、次いで、溶解細胞から放出される。逆に、テンペレートＤＮＡファージは組み込まれたファージＤＮＡ（すなわち、プロファージ）が宿主のゲノムと協調して複製され、任意の宿主損傷ファージ遺伝子が発現されない、それらの宿主細菌との安定な関係を確立する。しかし、バクテリオファージ粒子はインタクトプロファージを含む細胞から、誘導と呼ばれる処理によって放出され得、その処理の間に、溶解成長に必要なプロファージ遺伝子が作動し、子孫ファージ粒子が産生され、細胞の溶解を通して細胞から放出される（Ｃａｓｊｅｎｓ、Ｐｒｏｐｈａｇｅｓ、および細菌ゲノミクスにおいて概説されている：これまでに学んだこと？；  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；４９（２）：２７７−３００）。誘導はいくつかの場合において、プロファージを保有する細菌の小分率または大分率において自発的かつランダムに起こり得るか、または特異的な、しばしば定義されていない環境シグナルは多くの細胞において特定のプロファージの同時誘導を引き起こし得、細菌細胞の死を引き起こし得る。いくつかの場合において、プロファージ配列の存在はまた、いくつかの細菌がファージなしでは有さない特性（例えば、抗生物質耐性、種々の環境条件下で存在する能力、改善された密着性、病原性、または促進された水平遺伝子導入）を有することを可能にし得る（Ｃａｓｊｅｎｓら、２００１）。
【００２７】
全てのプロファージが溶解サイクルを受ける能力を有するわけではない。非機能的、すなわち、欠陥または潜在的プロファージは突然変異崩壊および／または何千もの細菌複製サイクルに必須の１つ以上の遺伝子の損失の試験結果として、多くの細菌において高いレベルの豊富さを生じることができる（Ｂｏｂａｙら、Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ。２０１４  Ａｕｇ  １９；  １１１（３３）：  １２１２７−１２１３２、およびその中の参考文献）。注目すべきは欠損プロファージはまた、多くの場合、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の予防、またはバクテリオシンを含む、宿主に好都合な機能性を提供し得る多くの遺伝子を含み、これは例えば、他の隣接する細菌種の増殖抑制を介する栄養素の競合において有用であり得る。
【００２８】
ファージは、多くの方法で大腸菌における遺伝子発現および適合性に正の影響を及ぼすことができる。暗号ファージ、溶原性ファージ、および溶解ファージは宿主に、有害な環境条件下での生存を促進する複数の利益を提供することが示されている。例えば、ファージによって細菌に導入された遺伝子配列は、異なる栄養素または異なるニッチへの適応、または競合株を排除する能力の増加に関連付けられている。休止状態のプロファージはまた、別の、例えば溶解性のファージとの重複感染を予防することが示されている。
【００２９】
いくつかの研究は、内因性ファージが特定の炭素源において細菌の増殖能に影響を及ぼすことを示している。ラムダに加えて、活性Ｍｕ、Ｐ１およびＰ２プロファージならびに潜在的プロファージＣＰ４−５７は、グルコース制限および他の成長条件下で成長を増大させる（Ｅｄｌｉｎ、Ｇ．、Ｌｉｎ、Ｌ＆  Ｂｉｔｎｅｒ、ＲＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｆｉｔｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｐ１、Ｐ２、ａｎｄ  Ｍｕ  Ｌｙｓｏｇｅｎｓ  ｏｆエシェリヒア属ｃｏｌｉ．ＪＶｉｒｏｌ．２１、５６０−５６４  （１９７７）；  Ｅｄｌｉｎ、Ｇ．、Ｌｉｎ、Ｌ＆  Ｋｕｄｍａｒ、Ｒλ  ｌｙｓｏｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｅｃｏｌｉ）。Ｎａｔｕｒｅ  ２５５、７３５−７３７  （１９７５）；  Ｗａｎｇ、Ｘ．、Ｋｉｍ、Ｙ＆  Ｗｏｏｄ、ＴＫＣｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ＣＰ４−５７  ｐｒｏｐｈａｇｅ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｉｎエシェリヒア属ｃｏｌｉ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ．ＩＳＭＥ  Ｊ．３，１１６４−１１７９（２００９）。別の研究では、λが大腸菌ゲノムに組み込まれると、不十分な炭素源での増殖能が停止することが示された。この場合、代謝の制限は、細菌に生存利益を付与し得る。グルコースが乏しい環境で細菌の増殖を遅らせることは、細菌が免疫系による検出を逃れるのを助け、生存の機会を増加させるかもしれない。
【００３０】
他の生存特性も同様に影響され得る。Ｗａｎｇらは、９つの潜在的プロファージのすべてを欠く単一のＥｃｏｌｉ株を作製した。この研究において、これらのプロファージは浸透圧、酸化および酸ストレスに耐えるために、種々の条件下での増殖を増加させるために、リンおよび窒素利用を増強するために、およびバイオフィルム形成に影響を及ぼすために有益であることが示された（Ｗａｎｇら、Ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｒｏｐｈａｇｅｓ  ｈｅｌｐ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｃｏｐ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｅｒｓｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ；  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｓ１１４６）。病原性細菌プロファージにおいて、いくつかの研究は、獲得が病原体の毒性の変化と関連することを示唆している。
【００３１】
従って、当業者は改変（例えば、内因性プロファージの部分または全体の突然変異または欠失）が細菌適応度を変化させ得る（例えば、ネガティブに影響し得る）ことを予想し得る。さらに、内因性プロファージはこのエフェクターを産生し得る遺伝子操作された細菌において、エフェクター活性を変化させ得る（例えば、ネガティブに影響し得る）と仮定し得る。これは特に、内因性プロファージが特定の株亜型の全ての試験片に存在する場合に株−これはプロファージ配列を含む細菌がプロファージを欠く細菌の形成と進化的に競合することができたことを示す。
【００３２】
本開示でさらに記述されているように、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのプロファージが特定されたが、これは一定の条件下で分析が可能であり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの全試験片に存在する。驚くべきことに、細菌の適応度、滞留時間、および活性の試験は内因性ファージ中の突然変異または欠失を含む細菌が本質的に同じ、例えば、少なくとも同程度の大きさであることを示した。
【００３３】
同様のアッセイ条件下では、菌株間でＰｈｅ分解活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）に識別可能な差異はなかった。例えば、類似のアッセイ条件下では、Ｐｈｅ消費が２つの株の間で同じ大きさ内である（例えば、図１５および図１７Ａを参照のこと）。ファージを含む株とファージを含まない株との間のｉｎ  ｖｉｖｏ競合研究はＮｉｓｓｌｅのファージを含まないＰＫＵ株の間の輸送またはコロニー形成に識別可能な差異がないことを示す（例えば、図１９を参照のこと）。
【００３４】
従って、ファージゲノム中のいくつかの実施形態では１つ以上の改変（例えば、突然変異または欠失）、または本明細書中に記載される他の改変は改変または遺伝子操作された細菌の細菌適合性を変化させない。いくつかの実施形態では１つ以上のファージ改変（例えば、突然変異または欠失または本明細書中に記載される他の改変）を含む操作された細菌はファージ突然変異の非存在下で、対応する同質遺伝子株と本質的に同一または少なくとも類似の細菌適合性を有する。さらなる実施形態において、ファージのゲノムにおける１つ以上の改変（例えば、突然変異または欠失）または本明細書中に記載される他の改変はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、エフェクターを産生可能な操作された細菌の株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ未変性の（例えば、突然変異または欠失または本明細書中に記載される他の未変性の）を含む非未変性のまたは遺伝子操作された細菌はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較した場合、本質的に同一または少なくとも類似の細菌株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を有する。
【００３５】
さらに、ファージゲノム中のいくつかの実施形態では、１つ以上の改変（例えば、突然変異または欠失）または本明細書中に記載される他の改変は操作された細菌の細菌適合性を変更させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ改変（例えば、突然変異または欠失）または本明細書中に記載される他の改変を含む操作された細菌はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、改変された（例えば、減少または増加した）細菌適合性を有する。いくつかの実施形態では、ファージのゲノムにおいて本明細書中に記載される１つ以上の変更（例えば、突然変異または欠失）または他の変更はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、エフェクターを産生可能な細菌の株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を変更（例えば、減少または増加）する。１つ以上のファージ改変（例えば、突然変異または欠失）または本明細書中に記載される他の改変を含むいくつかの実施形態では、未改変または遺伝子操作された細菌がファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株として、細菌株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を改変（例えば、減少または増加）した。
【００３６】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ３中に１つまたは突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のファージ３遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入物が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置するか、またはそれらを含む。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。一実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態において、配列番���１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【００３７】
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残りの部分を考慮して、および当業者によって理解されるように読まれるべきである。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。さらなる定義が詳細な説明の全体を通して記載されている。
【００３８】
「高フェニルアラニン血症（Ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ）」、「高フェニルアラニン血症（ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉｃ）」、および「過剰なフェニルアラニン」は、体内の増加したまたは異常に高い濃度のフェニルアラニンを指すために本明細書において交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬ、または少なくとも２５ｍｇ／ｄＬの血中フェニルアラニンレベルである。本明細書において使用される場合、高フェニルアラニン血症に関連する疾患には、限定されないが、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、および瀬川病が含まれる。罹患者は、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長、小頭症、振戦、四肢痙攣、および／または低色素沈着を患う可能性がある（Ｌｅｏｎａｒｄ  ２００６年）。高フェニルアラニン血症はまた、他の状態、例えば肝疾患に続発する可能性がある。
【００３９】
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」および「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンをｔｒａｎｓ−ケイ皮酸およびアンモニアに変換または処理するフェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）を指すために使用される。ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸は、毒性が低く、哺乳動物における肝臓酵素によって、尿中に分泌される馬尿酸に変換される。ＰＡＬは、過剰のフェニルアラニンを代謝するための酵素ＰＡＨの代わりになり得る。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは原核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。代替の実施形態では、ＰＡＬは真核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む、細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、アナベナ・バリアビリスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書において「ＰＡＬ１」と称される（Ｍｏｆｆｉｔｔら、２００７年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、フォトラブダス・ルミネセンスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書において「ＰＡＬ３」と称される（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、酵母種、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９８５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、植物種、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｗａｎｎｅｒら、１９９５年）。ＰＡＬの任意の適切なヌクレオチドおよびアミノ酸配列、またはその機能的断片が使用され得る。
【００４０】
「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」および「ＰＡＨ」は、補因子テトラヒドロビオプテリンと併せてヒト体内でチロシンを作製するためにフェニルアラニンの芳香族側鎖のヒドロキシル化を触媒する酵素を指すために使用される。ＰＡＨをコードするヒト遺伝子は、２２位と２４．２位との間の第１２染色体の長（ｑ）腕に位置する。ＰＡＨのアミノ酸配列は哺乳動物の間で高度に保存されている。ヒトおよび哺乳動物ＰＡＨについての核酸配列は周知であり、広く利用可能である。ＰＡＨについての完全長ヒトｃＤＮＡ配列は１９８５年に報告された（Ｋｗｏｋら、１９８５年）。ＰＡＨの活性断片もまた周知である（例えば、Ｋｏｂｅら、１９９７年）。
【００４１】
「Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ」および「ＬＡＡＤ」は、それらのそれぞれのケト酸、アンモニア、および過酸化水素を生成するためにＬ−アミノ酸の立体特異的酸化的脱アミノ化を触媒する酵素を指すために使用される。例えば、ＬＡＡＤはフェニルアラニンのフェニルピルベートへの変換を触媒する。多数のＬＡＡＤ酵素が当該分野において公知であり、それらの多くは、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、およびモルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などの細菌、または毒液に由来する。ＬＡＡＤはフェニルアラニン分解の速い反応速度を特徴とする（Ｈｏｕら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」）。大部分の真核生物および原核生物のＬ−アミノ酸デアミナーゼは細胞外であるが、プロテウス種ＬＡＡＤは、酵素活性が存在する周辺質間隙に外側で面している細胞膜（内膜）に局在している。この局在化の結果として、内膜を通る細胞質へのフェニルアラニン輸送は、プロテウス属ＬＡＡＤにより媒介されるフェニルアラニン分解に必要とされない。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を通して周辺質に容易に取り込まれ、基質の利用可能性を改善するトランスポーターの必要性を取り除く。
【００４２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌種は、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＬＡＡＤは、周辺質間隙に面しており、周辺質間隙において触媒活性を生じる細胞膜に局在している。
【００４３】
「フェニルアラニン代謝酵素」または「ＰＭＥ」は、フェニルアラニンを分解することができる酵素を指すために使用される。当該技術分野において公知の任意のフェニルアラニン代謝酵素は、遺伝子操作された細菌によってコードされ得る。ＰＭＥには、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。
【００４４】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、ＬＡＡＤおよびＰＡＬはさらなる補因子を全く必要としない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＰＭＥは補因子を必要とする。いくつかの実施形態では、この補因子は、遺伝子操作された細菌の投与と同時または連続して提供される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は補因子を産生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はアミノトランスフェラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＰＭＥは補因子を必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子の必要性がないことは、酵素によるフェニルアラニン分解の速度が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるＰＭＥはＰＡＬである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるＰＭＥはＬＡＡＤである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＭＥの組合せをコードする。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥの触媒活性は酸素レベルに依存する。いくつかの実施形態では、ＰＭＥは微好気的条件下で触媒的に活性である。非限定的な例として、ＬＡＡＤ触媒活性は酸素に依存する。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは微好気的条件などの低酸素条件下で活性である。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＭＥは、例えば結腸に見出されるような非常に低いレベルの酸素で、または酸素の非存在下で機能する。非限定的な例として、ＰＡＬ活性は酸素の存在に依存しない。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「エフェクター」または「エフェクター分子」は、所望の機能を発揮する代謝産物またはポリぺポリペプチドのような分子を指し得る。エフェクターは、単一の遺伝子によってコードされ得る。例えば、単一の遺伝子は、分泌またはディスプレイされるポリペプチドをコードし得る。あるいは、エフェクターが複数の遺伝子（例えば、酪酸）を必要とする生合成経路によって合成され得る。生合成経路内の多数の遺伝子によってコードされるポリペプチド（例えば、所望の特性を有する代謝産物を合成する）はまた、エフェクターと呼ばれ得る。同様に、例えば、毒性代謝産物の分解のために、異化経路内の多数の遺伝子によってコードされるポリペプチドはまた、エフェクターと呼ばれ得る。これらのエフェクター分子はまた、「治療方法代謝産物」、「治療分子」または「治療用ポリペプチド」と呼ばれ得る。本明細書においてエフェクターと互換的に使用される他の用語は、「目的のポリペプチド」または「目的のポリペプチド」、「目的のタンパク質」、「目的のタンパク質」である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「ペイロード」は、細菌のような遺伝子操作された微生物によって産生される目的の１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドをいう。いくつかの実施形態では、ペイロードが遺伝子または多数の遺伝子またはオペロンによってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードを含む１つ以上の遺伝子および／またはオペロンが微生物に対して内因性である。いくつかの実施形態では、ペイロードの１つ以上の要素が異なった微生物および／または生物に由来する。いくつかの実施形態では、ペイロードは治療用ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の生合成のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の代謝、異化、または分解のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の輸入のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の輸出のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは調節分子、例えばＦＮＲのような転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードがプロモーターまたはリプレッサーなどの調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ペイロード発現がＦＮＲＳなどの誘導性プロモーターから駆動される。いくつかの実施形態では、ペイロード発現が構成的プロモーターから駆動される。いくつかの実施形態では、ペイロードが死滅スイッチのようなリプレッサー要素を含む。代わりの実施形態ではペイロードが生合成経路または生化学的経路によって産生され、ここで、生合成経路または生化学的経路は必要に応じて、微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は２つ以上のペイロードを含む。
【００４８】
本発明は、とりわけ、その遺伝子操作された細菌，医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害を調節および治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が非天然フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子を含み、哺乳動物中でフェニルアラニンをプロセシングおよび還元することができる。いくつかの実施形態では、本操作された細菌がフェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌がＬＡＡＤをコードする遺伝子を含んでいてもよい。操作された細菌はまた、バイオセイフティーおよび／または生物学的封じ込めに関連する１つ以上の遺伝子配列（例えば、キルスイッチ、遺伝子ガードシステム、および／または栄養要求性）を含み得る。これらの遺伝子配列の発現は種々のプロモーター系（例えば、本明細書中に開示されるプロモーター系のいずれか）を使用して調節され得、このプロモーターは、１つ以上の異なる遺伝子を調節するための同じプロモーターであり得るか、異なる遺伝子を調節するための同じプロモーターの異なる複製であり得るか、または異なる遺伝子の発現を調節するために組み合わせて使用される異なるプロモーターの使用を含み得る。遺伝子発現を制御するための異なる調節系またはプロモーター系の使用は柔軟性（例えば、異なる環境条件下で遺伝子発現を差次的に制御する能力、および／または遺伝子発現を時間的に差次的に制御する能力）を提供し、また、遺伝子発現を「微調整」する能力を提供し、そのいずれかまたは全ては、遺伝子発現および／または細菌の成長を最適化するのに役立ち得る。これらの細菌を含む遺伝子操作された細菌および医薬組成物はＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する条件を治療および／または予防するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用することができる。特定の態様では、遺伝子操作された細菌を含む組成物が高フェニルアラニン血症に関連する障害を治療および／または予防するために、本発明の方法において使用され得る。
【００４９】
エフェクター分子はまた、抗癌分子を含む。「抗癌分子」は遺伝子操作された微生物（例えば、操作された細菌または操作された腫瘍溶解ウィルス）によって産生される１つ以上の目的の治療方法物質または薬物をいい、これらは、細胞増殖または増殖を減少および／または阻害し得る。いくつかの実施形態では、抗癌分子が癌を調節または治療するのに有効な治療分子である。いくつかの実施形態では、抗癌分子が遺伝子によってコードされる治療分子である。代わりの実施形態では抗癌分子が生化学的または生合成経路によって産生される治療分子であり、ここで、生合成経路または生化学的経路は必要に応じて、微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された微生物が２つ以上の抗癌分子を産生し得る。抗癌分子の非限定的な例には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤＬ−１抗体）、細胞傷害剤（例えば、Ｃｌｙ  Ａ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ?α）、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激性分子（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２１、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、抗原および抗体（例えば、腫瘍抗原、ＣｔｘＢ?ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍抗原、ＲＡＦ１に対する抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＸＲ４／ＣＸＣＬ１２、抗ＧＬＰ１、抗ガレクチン１、抗ガレクチン３）が含まれる。抗Ｔｉｅ２、抗ＣＤ４７、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体、ＤＮＡ転移ベクトル  例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン−１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２、および酵素（例えば、大腸菌ＣＤ、ＨＳＶ−ＴＫ）。いくつかの実施形態では、抗癌分子がＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答または抑制、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、細菌またはウイルスが例えば、バクトフェクションによって、哺乳動物細胞にＤＮＡを移入するためのベクトルとして使用され得る（Ｂｅｒｎａｒｄｅｓら、２０１３）。
【００５０】
エフェクター分子の非限定的な例には、「抗炎症性分子」および／または「消化管バリア機能向上剤分子」が含まれる。抗炎症性分子および／または消化管バリア機能向上剤分子としては短鎖脂肪酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２および類似体、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）、エラフィン（ペプチダーゼインヒビター３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、トリプトファン、ＰＧＤ  ２、およびキヌレン酸、インドール代謝産物、ならびに本明細書中に開示される他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。このような分子には、炎症促進性分子を阻害する化合物、例えば、一本鎖可変抗体（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、および／またはケモカイン（例：ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２）が含まれる。このような分子はまた、本明細書中に記載されるように、ＡＨＲアゴニスト（例えば、ＩＬ−２２製造（例えば、インドール酢酸、インドール−３−アルデヒド、およびインドール）を生じる）およびＰＸＲアゴニスト（例えば、ＩＰＡ）を含む。そのような分子には、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ブチレート）、ＧＰＲ４１および／またはＧＰＲ４３の活性化因子（例えば、ブチレートおよび／またはプロピオン酸、または／または酢酸）、ＧＰＲ１０９Ａの活性化因子（例えば、ブチレート）、ＮＦ−ｋａｐｐａＢシグナル阻害剤（例えば、ブチレート）、ＰＰＡＲガンマの調節因子（例えば、ブチレート）、ＡＭＰＫシグナルの活性化因子（例えば、酢酸）、ＧＬＰ−１秘密の調節因子も含まれる。このような分子はまた、ヒドロキシルラジカル捕捉剤および酸化防止剤（例えば、ＩＰＡ）を含む。分子には、主に消炎鎮痛剤、例えばＩＬ−１０、または主に消化管バリア機能増強剤、例えばＧＬＰ−２がある。分子は、抗炎症および消化管バリア機能増強の両方であり得る。抗炎症および／または消化管バリア機能向上剤分子は単一の遺伝子によってコードされてもよく、例えば、エラフィンはＰＩ３遺伝子によってコードされる。あるいは、抗炎症および／または消化管バリア機能向上剤分子が多数の遺伝子、例えば酪酸塩を必要とする生合成経路によって合成されてもよい。
【００５１】
エフェクター分子には、代謝性エフェクター分子も含まれる。「代謝エフェクター分子」および／または「満腹エフェクター分子」にはｎ−アシルホチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）、ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）、グレリン受容体アンタゴニスト、ペプチドＹＹ３−３６、コレシストキニン（ＣＣＫ）ファミリー分子、ＣＣＫ３３、ＣＣＫ８、ボンベシンファミリー分子、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＢ（Ｐ）、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アミリン、ソマトスタチン、オキシントモジュリン、膵臓ペプチド、短鎖脂肪酸、酪酸、酢酸、セロトニン受容体アゴニストが含まれるが、これらに限定されない。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ヌクレオチドリボシド（ＮＲ）、ニコチンアミド、およびニコチン酸（ＮＡ）。このような分子はまた、代謝疾患を促進する分子を阻害する化合物（例えば、一本鎖可変抗体（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）もしくはグレリン受容体を阻害するｓｈＲＮＡ）を含み得る。代謝および／または満腹エフェクター分子は単一の遺伝子によってコードされ得、例えば、グルカゴン様ペプチド１は、ＧＬＰ−１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、トリプトファンの製造または異化のための１つ以上の回路および／またはその代謝産物の１つを含む遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌物が１つ以上の代謝エフェクター分子および／または満腹エフェクター分子の発現のための遺伝子配列をさらに含む。
【００５２】
エフェクター分子の他の非限定的な例は係属中の同時所有国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００（出願０５／２５）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願０１／２０１７）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３（出願０２／０４／２０１６）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３（出願０２／１０／２０１７）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２（出願０７／２９／０１６）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１（出願０８／３１／２０１６）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８（出願０６／１０／１６）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２（出願１２／２８／２０１６）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２（出願０５／１３）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（これらの含有量は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
特定の実施形態では、新たなまたは改善されたエフェクター（例えば、ＰＭＥ）は、当該分野において公知または本明細書に記載される方法に従って同定され得、遺伝子操作された細菌によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素は、ウイルス、原核生物または真核生物から単離された野生型酵素である。いくつかの実施形態では、酵素配列は、安定性または触媒活性などの酵素の１つまたは複数の特異的性質を増加させるようにさらに改変または突然変異されている。
【００５４】
「フェニルアラニン代謝産物」とは、フェニルアラニンの分解の結果として生成される代謝産物を指す。代謝産物は、基質としてフェニルアラニンを使用して酵素によってフェニルアラニンから直接的に、またはフェニルアラニン代謝産物基質に対して作用する、代謝経路の下流の異なる酵素によって間接的に生成されてもよい。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＭＥをコードする遺伝子操作された細菌によって産生される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＡＨ活性から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＰＡＨから直接的または間接的に生じる。いくつかの実施形態では、代謝産物はチロシンである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、不完全なＰＡＨ活性に起因してＰＫＵ患者の血液または尿中に蓄積する。このようなＰＫＵ代謝産物の非限定的な例は、フェニルピルビン酸およびフェニル−乳酸である。他の例には、フェニルアセテート、フェニルエチルアミン、およびフェニルアセチルグルタミンが含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＡＬ作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＰＡＬから直接的または間接的に生じる。このようなＰＡＬ代謝産物の非限定的な例は、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸および馬尿酸である。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＬＡＡＤ作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＬＡＡＤから直接的または間接的に生じる。このようなＬＡＡＤ代謝産物の例は、フェニルピルベートおよびフェニル乳酸である。
【００５７】
「フェニルアラニントランスポーター」は、フェニルアラニンを細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために使用される（例えば、Ｐｉら、１９９１年を参照のこと）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において、ｐｈｅＰ遺伝子は、フェニルアラニン輸送を担う高親和性フェニルアラニン特異的パーミアーゼをコードする（Ｐｉら、１９９８年）。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、限定されないが、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、および大腸菌を含む、細菌種に由来するｐｈｅＰ遺伝子によってコードされる。他のフェニルアラニントランスポーターには、ａｒｏＰ遺伝子によってコードされ、高親和性でフェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うアーゲネラル（Ａａｇｅｎｅｒａｌ）アミノ酸パーミアーゼが含まれる。さらに、低レベルのフェニルアラニン輸送活性は、ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系は、２つの周辺質結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ−Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分であるＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するａｒｏＰ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、ＬＩＶ結合タンパク質およびＬＳ結合タンパク質ならびに細菌種に由来するＬｉｖＨＭＧＦ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰ、ａｒｏＰ、およびＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系から選択される１種より多いフェニルアラニントランスポーターを含む。
【００５８】
「フェニルアラニン」および「Ｐｈｅ」は、式Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨを有するアミノ酸を指すために使用される。フェニルアラニンは、チロシン、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンの前駆体である。Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、食品タンパク質中に主に見出されるフェニルアラニンの形態である。立体異性体Ｄ−フェニルアラニンは食品タンパク質中により少ない量で見出され、ＤＬ−フェニルアラニンは両方の形態の組合せである。フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤＬ−フェニルアラニンのうちの１つまたは複数を指すことができる。
【００５９】
本明細書で使用される「トランスポーター」という用語は、アミノ酸、ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチドなど）、毒素、代謝産物、基質、および他の生体分子などの分子を細胞外環境から微生物内へインポートする（ｉｍｐｏｒｔ）ためのメカニズム（例えば、タンパク質、タンパク質、またはタンパク質複合体）を指すことを意味する。
【００６０】
「作動可能に連結している」とは、核酸配列、例えばｃｉｓで作用する核酸配列の発現を可能にするように調節領域配列に結合している、例えばＰＡＬをコードする遺伝子を指す。調節領域は、目的の遺伝子の転写を誘導することができ、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含んでもよい核酸である。
【００６１】
「誘導可能なプロモーター」とは、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結している調節領域を指し、遺伝子の発現は前記調節領域の誘導因子の存在下で増加する。
【００６２】
「直接的に誘導可能なプロモーター」とは、エフェクター分子（例えば、ＰＡＬなどのフェニルアラニン代謝酵素）をコードする遺伝子に作動可能に連結している調節領域を指し、前記調節領域の誘導因子の存在下で、前記エフェクター分子が発現される。「間接的に誘導可能なプロモーター」とは、２つ以上の調節領域、例えば、第１の分子、例えば、エフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結している第２の調節領域を調節できる、転写調節因子をコードする遺伝子に作動可能に連結している第１の調節領域を含む調節系を指す。第１の調節領域の誘導因子の存在下で、第２の調節領域は活性化または抑制され得、それによってエフェクター分子の発現を活性化または抑制する。直接的に誘導可能なプロモーターおよび間接的に誘導可能なプロモーターの両方は、「誘導可能なプロモーター」に包含される。
【００６３】
「外因性環境条件」または「環境条件」とは、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される設定または状況を指す。前記語句は、操作された微生物に対して外部であるが、宿主対象環境に対して内因性または天然である環境条件を指すことを意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、無傷微生物細胞に対して外部または外因性である環境条件を指すために交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の上部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の下部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素、微好気的、または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件とは、健康または疾患状態における哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在を指す。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である分子または代謝産物である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織特異的または疾患特異的代謝産物または分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物はｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は酸素レベルを検知できる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路が異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「外因性環境条件」または「環境条件」はまた、操作された微生物の外部の設定または状況または環境条件のことを指し、微生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件に関連する。「外因性環境条件」はまた、生物の成長、生産、および製造中の条件を指す場合がある。そのような条件には、好気性培養条件、嫌気性培養条件、低酸素培養条件および設定酸素濃度下における他の条件も含まれる。そのような条件にはまた、培養液中のテトラサイクリン、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノースなどの化学的および／または栄養性誘導物質の存在も含まれる。そのような条件にはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に微生物が増殖される温度も含まれる。例えば、特定のプロモーター系を使用すると、ある温度はペイロードの発現を許容するが、他の温度は許容しない。酸素レベル、温度および培地組成は、そのような外因性環境条件に影響を与える。そのような条件は、増殖速度、ペイロード（例えば、ＰＡＬまたはＬＡＡＤなどのＰＭＥ）の誘導速度、トランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）の誘導速度、ならびに菌株生産中の当該株の全体的な生存能力および代謝活性に影響を与える。
【００６５】
「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」とは、１つまたは複数の酸素レベル感受性転写因子が結合できる核酸配列を指し、対応する転写因子の結合および／または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。
【００６６】
酸素レベル依存性転写因子の例には、限定されないが、ＦＮＲ、ＡＮＲ、およびＤＮＲが含まれる。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーター、およびＤＮＲ応答性プロモーターは当該分野において公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００３年を参照のこと）。非限定的な例は表１に示される。
【００６７】
非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、環境酸素が低いかまたは全くない条件下で高度に発現することが知られている、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅフマレートおよび硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来した（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、Ｎｉｓｓｌｅにおいて天然に見出される包括的転写調節因子ＦＮＲによって嫌気的および／または低酸素条件下で活性化される。嫌気的および／または低酸素条件下で、ＦＮＲは二量体を形成し、その制御下で特異的遺伝子のプロモーターにおける特異的配列に結合し、それによってそれらの発現を活性化する。しかしながら、好気的条件下で、酸素はＦＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性型に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターはタンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本出願において、ＦＮＲＳ、ｆｎｒＳ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびプロモーターＰｆｎｒＳを示す他のそのような関連した指定として交換可能に使用される。
【００６８】
［表１］転写因子ならびに応答遺伝子および調節領域の例
【表１】
2020525012.tif 000003
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「調節可能な調節領域」は転写因子の直接的または間接的な制御下にあり、そして誘導物質のレベルに対して遺伝子発現を活性化し、抑制し、抑制解除し、またはそわなければ制御することができる核酸配列をいう。いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域はプロモーター配列を含む。誘導物質はＲＮＳ、または本明細書で説明される他の誘導物質とすることができ、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ−応答性調節領域、または本明細書で説明される他の応答性調節領域とすることができる。調節可能な調節領域は１つ以上のペイロードの製造のための遺伝子配列または遺伝子カセット（例えば、ブチロゲンまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列）に作動可能に連結され得る。例えば、１つの具体的な実施形態において、調節可能な調節領域はＲＮＳ−抑制解除調節領域であり、ＲＮＳが存在する場合、ＲＮＳ感知転写因子は、もはや調節領域に結合および／または抑制せず、それによって、作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現を可能にする。この場合、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ量と比較して、遺伝子または遺伝子カセッテの発現を抑制解除する。各々の遺伝子または遺伝子カセットは、少なくとも１つのＲＮＳを感知し得る転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域に作動可能に連結され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、外因性環境条件は反応性酸素種の有無である。他の実施形態では、外因性環境条件が反応性窒素種（ＲＮＳ）の有無である。いくつかの実施形態では，外因性環境条件は炎症反応に関与する生物学的分子、例えば、消化管の炎症障害に存在する分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件または信号が組み換え細菌細胞が存在する周囲に自然に存在するか、または自然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性環境条件または信号が例えば、生物学的状態の産生または除去および／または生物学的分子の投与または除去によって、人工的に産生される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、外因性環境条件および／またはシグナルが誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件および／またはシグナルが哺乳動物の消化管内に自然には存在しない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターが本発明の医薬組成物と組合せて投与される分子または代謝産物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ任意の生物学的分子によって刺激される。いくつかの実施形態でに、外因性環境条件および／または信号を、本発明の組み換え細菌細胞を含む培養培地に添加する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件が哺乳動物の消化管内に天然に存在する（例えば、低酸素もしくは嫌気性条件、または炎症反応に関与する生物学的分子）。いくつかの実施形態では、外因性環境条件（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）への曝露の喪失はプロモーター（例えば、消化管の外部の好気性環境）を誘導するための外因性環境条件が存在しないので、誘導性プロモーターの活性を阻害する。本明細書において使用される場合、「非天然」核酸配列とは、通常、細菌に存在しない核酸配列、例えば内因性配列の追加のコピー、または細菌の異なる種、株、もしくは亜株由来の配列などの異種配列、または同じ亜型の細菌由来の非改変配列と比較して改変および／もしくは突然変異されている配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は合成の天然に存在しない配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年を参照のこと）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットにおける１つもしくは複数の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列はプラスミドまたは染色体上に存在し得る。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーが細菌に存在してもよく、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの１つまたは複数のコピーは、突然変異されてもよいか、または別様で本明細書に記載されるように変化されてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、コピー数を高めるために、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むように同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はエフェクター分子（例えば、ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含み、当該遺伝子は天然では当該遺伝子に関連していない直接的または間接的に誘導可能なプロモーター、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結しているＦＮＲプロモーター、または第２のエフェクター分子に作動可能に連結しているＰａｒａＢＡＤプロモーター、に作動可能に連結している。
【００７２】
「構成的プロモーター」とは、その制御下および／またはそれが作動可能に連結しているコード配列または遺伝子の連続的な転写を促進することができるプロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは当該分野において周知であり、限定されないが、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（国際遺伝子操作機構（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ）（ｉＧＥＭ）標準生物学的パーツ登録所（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ）名称ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧヒートショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸検知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０））、構成的バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３））、構成的バチルス・サブティリスσＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サルモネラ由来のＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ由来のＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、バクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））、およびそれらの機能的断片が含まれる。
【００７３】
「消化管」とは、食物の移動および消化、栄養素の吸収、ならびに老廃物の排出を担う器官、腺、管、および系を指す。ヒトにおいて、消化管は、口から始まり肛門で終わり、食道、胃、小腸、および大腸をさらに含む、胃腸（ＧＩ）管を含む。消化管はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などの副器官および腺を含む。上部胃腸管は、食道、胃、および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち空腸および回腸、ならびに大腸の全て、すなわち盲腸、結腸、直腸、および肛門管を含む。細菌は、消化管全体にわたって、例えば胃腸管において、特に腸において見出され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、消化管内で活性である（例えば、１つ以上のペイロード（例：ＰＭＥ）を発現する）。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、大腸において活性である（例えば、１つ以上のペイロード（例：ＰＭＥ）を発現する）。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、小腸において活性である（例えば、１つ以上のペイロード（例：ＰＭＥ）を発現する）。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、小腸および大腸において活性である。理論に縛られることは望まないが、フェニルアラニンの分解は、小腸においてアミノ酸吸収、例えばフェニルアラニン吸収が起こるので、小腸において非常に有効である。フェニルアラニンの血液への取り込みの防止または低減により、Ｐｈｅレベルの上昇およびその結果生じるＰｈｅの毒性を回避することができる。さらに、腸と身体との間の広範な腸内循環は、ＰＫＵにおける全身性フェニルアラニンの除去を可能にし得る（例えば、Ｃｈａｎｇらによって、ＰＫＵのラットモデルにおいて記載されている（Ｃｈａｎｇら、「Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｒａｌ  ｅｎｚｙｍｅ−ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  ａｓ  ｉｎ  ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ；  Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５年；  ２３巻（１）：１−２１頁））。血液由来のフェニルアラニンは小腸内に循環し（例えば、図１５参照）、当該部位で活性な細菌によって除去され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は小腸を通過する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は小腸または大腸に定着する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は結腸に定着する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は消化管に定着しない。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「低酸素」は、大気中に存在する酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度より低い酸素のレベル、量、または濃度を指すことを意味する（例えば、＜２１％Ｏ２；  ＜１６０ｔｏｒｒＯ２））。したがって、用語「低酸素条件（複数可）」または「低酸素環境」は、大気中に存在する酸素よりも低い酸素レベルを含む条件または環境を指す。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳類の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位Ｓ状結腸、直腸および肛門管に見出される酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度を指すこと意味する。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、０〜６０ｍｍＨｇのＯ２（０〜６０ｔｏｒｒのＯ２）（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０ｍｍＨｇのＯ２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加を含む（例えば、０．２ｍｍＨｇ、０．５ｍｍＨｇのＯ２、０．７５ｍｍＨｇのＯ２、１．２５ｍｍＨｇのＯ２、２．１７５ｍｍＨｇのＯ２、３．４５ｍｍＨｇのＯ２、３．７５ｍｍＨｇのＯ２、４．５ｍｍＨｇのＯ２、６．８ｍｍＨｇのＯ２、１１．３５ｍｍＨｇのＯ２、４６．３ｍｍＨｇのＯ２、５８．７５ｍｍＨｇなどが含まれるが、これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。）。いくつかの実施形態において、「低酸素」とは、約６０ｍｍＨｇ以下のＯ２（例えば、０〜約６０ｍｍＨｇのＯ２）を指す。「低酸素」という用語はまた、０〜６０ｍｍＨｇの間（０ｍｍＨｇと６０ｍｍＨｇを含めて）のＯ２のレベル、量、または濃度の範囲、例えば、０〜５ｍｍＨｇ  Ｏ２、＜１．５ｍｍＨｇ  Ｏ２、６〜１０ｍｍＨｇ、＜８ｍｍＨｇ、４７〜６０ｍｍＨｇなどを指すことができるが、これらの例示的範囲は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。例えば、Ａｌｂｅｎｂｅｒｇら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４７巻（５）：１０５５−１０６３頁（２０１４年）；Ｂｅｒｇｏｆｓｋｙら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、４１巻（１１）：１９７１−１９８０頁（１９６２年）；Ｃｒｏｍｐｔｏｎら、Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．、４３巻：４７３−４７８頁（１９６５年）；Ｈｅら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９６巻：４５８６−４５９１頁（１９９９年）；ＭｃＫｅｏｗｎ、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｒａｄｉｏｌ．、８７巻：２０１３０６７６（２０１４年）（ｄｏｉ：１０．１２５９／ｂｒｊ．２０１３０６７６）を参照されたい。前記の各文献では、様々な種の哺乳動物の消化管内に見出される酸素レベルが議論されており、これらの文献はそれぞれ全体とし本明細書に取り込まれる。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳動物の消化管以外の器官または組織、例えば尿生殖路、腫瘍組織などに見出される酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を意味し、当該器官または組織では、酸素は低下したレベル、例えば、低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃ）または無酸素（ａｎｏｘｉｃ）レベルで存在する。いくつかの実施形態では、「低酸素」とは、部分的に好気性、半好気性（ｓｅｍｉ  ａｅｒｏｂｉｃ）、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、超好気性（ｎａｎｏａｅｒｏｂｉｃ）、微酸素性（ｍｉｃｒｏｏｘｉｃ）、低酸素性（ｈｙｐｏｘｉｃ）、無酸素性（ａｎｏｘｉｃ）および／または嫌気性条件に存在する酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を意味する。例えば、表Ａは、様々な器官および組織に存在する酸素量をまとめたものである。いくつかの実施形態では、酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度は、液体中に存在する遊離の非化合物の酸素（Ｏ２）のレベルを指す溶存酸素（「ＤＯ」）の量として表され、典型的には、ミリグラムパーリッター（ｍｇ／Ｌ）、百万分率（ｐｐｍ；  １ｍｇ／Ｌ＝１ｐｐｍ）またはマイクロモル（ｕｍｏｌｅ）（１μｍｏｌ  Ｏ２＝０．０２２３９１ｍｇ／Ｌ  Ｏ２）で報告されている。Ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ、Ｉｎｃ．、  “Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ”、環境測定の基礎、２０１３年１１月１９日、ｗｗｗ．ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ．ｃｏｍ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ−ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ／ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ／ｗａｔｅｒ−ｑｕａｌｉｔｙ／ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ−ｏｘｙｇｅｎ／＞。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、約６．０ｍｇ／Ｌ  ＤＯ以下の酸素（Ｏ２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、例えば６．０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、または０ｍｇ／Ｌ、ならびにそれらの小数、例えば、３．２５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌおよび０．１ｍｇ／Ｌ  ＤＯである。これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。液体または溶液中の酸素レベルは、空気飽和のパーセンテージまたは酸素飽和のパーセンテージとして報告され得る（溶液中の溶存酸素（Ｏ２）濃度と、安定な平衡下で一定の温度、圧力、および塩濃度の溶液についての最大溶存酸素量との比）。酸素の産生物または消費物を含まず、十分に酸素を供給された溶液（例えば、混合および／または撹拌された溶液）は、１００％空気飽和である。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、４０％以下の空気飽和、例えば、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、および０％空気飽和を指すことを意味し、それらの任意およびす���ての小数の増加（例えば、３０．２５％、２２．７０％、１５．５％、７．７％、５．０％、２．８％、２．０％、１．６５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％  ０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）ならびに０〜４０％の間（０％と４０％を含めて）の酸素飽和レベルの任意の範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜１０％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％など）が含まれる。ここに列挙した例示的な小数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定されることを意味するものではない。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、９％以下の酸素飽和、例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０％のＯ２飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加（例えば、６．５％、５．０％、２．２％、１．７％、１．４％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）ならびに０〜９％の間（０％と９％を含めて）の酸素飽和レベルの任意の範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜８％、５〜７％、０．３〜４．２％のＯ２など）が含まれる。ここに列挙した例示的な少数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定的であることを意味するものではない。
【００７６】
［表Ａ］腸の酸素圧
【表２】
2020525012.tif 000004
【００７７】
いくつかの実施形態では本明細書中に記載されるプロモーターが培養容器（例えば、フラスコまたは発酵槽または他の適切な培養容器）中の状態によって直接的または間接的に誘導され、ここで、株はｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に増殖または維持される。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に株の培養の間に提供されるこのような条件の非限定的な例としては、低酸素、嫌気性、微好気性、または好気性条件、他の定義された酸素レベル（例えば、以下に例示されるもの）、アラビノースの存在、ＩＰＴＧ、ラムノースの存在、または本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知の他の化学的および／または栄養性誘導物質が挙げられる。いくつかの実施形態では、培養容器内の条件が一定の酸素量、例えば、１％〜１０％の酸素、１０％〜２０％の酸素、２０％〜３０％の酸素、３０％〜４０％の酸素、４０％〜５０％の酸素、６０％〜７０％の酸素、７０％〜８０％の酸素、８０％〜９０％の酸素、９０％〜１００％の酸素、および本明細書に記載されるような他の酸素量に設定され、この時点で、プロモーターが直接的または間接的に誘導される。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば核酸配列を指すことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝学的配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝学的配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、また、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝学的配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列を含むことを意味する。
【００７９】
「微生物」とは、典型的に単細胞からなる微視的、超微視的、または超顕微鏡的なサイズの生物または微生物を指す。微生物の例には、細菌、酵母、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、および原生動物が含まれる。いくつかの態様では、微生物は、目的の１つまたは複数の治療分子またはタンパク質を産生するように操作される（「操作された微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境、例えば消化管から特定の代謝産物または他の化合物を吸収し、異化するように操作される。特定の態様では、微生物は、特定の有益な代謝産物または他の化合物（合成または天然に存在する）を合成し、それらをその環境中へ放出するように操作される。特定の実施形態では、操作された微生物は操作された細菌である。特定の実施形態では、操作された微生物は操作されたウイルスである。
【００８０】
「非病原性細菌」とは、宿主において疾患または有害な反応を引き起こすことができない細菌を指す。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例には、限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテイロデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビ細菌属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・サブティリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、およびサッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）が含まれる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。天然の病原性細菌は、病原性を低減または取り除くように遺伝子操作されてもよい。
【００８１】
「プロバイオティクス」は、適量の微生物を含有する宿主生物に対して健康の利点を与えることができる、生きている非病原性の微生物、例えば細菌を指すために使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、株、および／または亜型は、現在、プロバイオティクスとして認識されている。プロバイオティクス細菌の例には、限定されないが、ビフィド細菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクスは細菌のバリアントまたは突然変異株であってもよい（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原性細菌は、所望の生物学的特性、例えば生存率を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、非天然遺伝子物質、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子を保有する細菌宿主細胞を指すために使用され、その非天然遺伝子物質が保持され、発現され、および／または増殖されるように、それは宿主ゲノム内に組み込まれるか、または自己複製染色体外プラスミド上で増殖する。安定な細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば培地中、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば消化管内で生存および／または増殖できる。例えば、安定な細菌は、ＰＡＬ遺伝子を保有するプラスミドまたは染色体が宿主細胞中で安定に維持される、エフェクター分子（例えば、ＰＡＬ）をコードする遺伝子を含む遺伝子組換え細菌であってもよく、それによりエフェクターは宿主細胞中で発現され得、宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生存および／または増殖できる。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、ＰＡＬ遺伝子の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、ＰＡＬ遺伝子またはＰＡＨ遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「モジュレートする」および「治療する」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害、および／もしくは状態、またはそれらのうちの少なくとも１つの識別できる症状の改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、必ずしも患者によって識別できるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、物理的（例えば、識別できる症状の安定化）、生理的（例えば、物理的パラメータの安定化）のいずれかまたは両方で、疾患、障害、および／または状態の進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、疾患、障害、および／もしくは状態の進行を遅らせること、またはそれらの進行を反転させることを指す。疾患、障害、または状態の治療には、基礎疾患の除去を必ずしも包含することなく、関連する症状を軽減または除去することが含まれる場合がある。例えば、原発性高フェニルアラニン血症は、治療法が知られていない先天的な遺伝子変異によって引き起こされる。高フェニルアラニン血症は、他の状態、例えば肝疾患に続発することもある。高フェニルアラニン血症の治療には、過剰なフェニルアラニンおよび／または関連する症状の軽減または除去が含まれる可能性があり、必ずしも基礎疾患の除去は含まれない。本明細書において使用される場合、「予防する」およびその同語源語は、発症を遅延させること、あるいは所与の疾患、障害および／もしくは状態またはそのような疾患、障害、および／もしくは状態に関連した症状に罹るリスクを低減させることを指す。
【００８４】
治療を必要とするものは、特定の医学的疾患を既に有する個体、および疾患を有するリスクがあるか、または最終的に疾患に罹り得る個体を含んでもよい。治療の必要性は、例えば、疾患の発生、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の治療に対する受容の可能性に関連する１つまたは複数のリスク因子の存在によって評価される。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および／または賦形剤などの他の成分との本発明の遺伝子操作された細菌の調製物を指す。
【００８６】
交換可能に使用されてもよい「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与される細菌性化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。助剤はこれらの語句に含まれる。
【００８７】
「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性な物質を指す。例には、限定されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が含まれる。
【００８８】
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発症の予防、遅延、または状態の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、重症度を治療し、予防し、低減させ、発症を遅延させ、および／または疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発生のリスクを低減させるのに十分であり得る。治療有効量、および投与の治療有効頻度は、当該分野において公知であり、以下に説明される方法によって決定され得る。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「抗体」は１つ以上の特定の結合特異性を有する抗体およびその断片の全てのバリエーションを包含することを意味する。したがって、用語「抗体」または「抗体」は全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、一本鎖抗体（ｓｄＡＢ、ＶＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ、ダイアボディ、およびミニボディを含むことを意味する。抗体は２つ以上の結合特異性、例えば、二重特異性を有することができる。用語「抗体」はいわゆる抗体模倣物を含むことも意味する。抗体模倣物は抗原に特異的に結合することができるが、抗体関連構造を有さない、単一アミノ酸鎖分子であり得る低分子、例えば、３〜３０ｋＤａを指す。抗体模倣物にはＡｆｆｉｂｏｄｙ分子（タンパク質ＡのＺドメイン）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（ガンマ−Ｂ結晶）、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ、Ａｆｆｉｍｅｒｓ（シスタチン）、Ａｆｆｉｔｉｎｓ（Ｓａｃ７ｄ）（硫黄酸アルダリウス種々）、Ａｌｐｈａｂｏｄｙｓ（三重らせんコイルドコイル）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（リポカリン）、Ａｖｉｍｅｒｓ（様々なメンブランレセプターのドメイン）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリンリピートモチーフ）、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（ＦｙｎのＳＨ３ドメイン）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、様々なプロテアーゼインヒビターのＫｕｎｉｔｚドメイン、およびＭｏｎｏｂｏｄｉｅｓが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様では、「抗体」または「抗体」という語が単鎖抗体、単一領域抗体、およびラクダ抗体を指すことを意味する。癌およびさらなる抗癌抗体の処置における抗体の有用性は例えば、その全体が参考として援用される、Ｓｃｏｔｔら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ治療ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｐｒｉｌ  ２０１２  Ｖｏｌｕｍｅ  １２に見出され得る。
【００９０】
「一本鎖抗体」または「一本鎖抗体」は、典型的には免疫グロブリンの重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、および任意選択で、ジスルフィド結合などのリンカーまたは結合を含むペプチドを指す。一本鎖抗体は、従来の抗体に見られる一定Ｆｃ領域を欠く。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体が天然に存在する一本鎖抗体、例えばラクダ抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体が合成、操作、または改変された一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体がリンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。いくつかの態様では一本鎖抗体は「ｓｃＦｖ抗体」であり得、これは例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（その含有量はその全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるように、任意に、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）（任意の定常領域なし）の可変領域の融合タンパク質をいう。Ｆｖ断片は抗体の結合部位を保持する最小の断片であり、その結合部位は、元の抗体の特異性をいくつかの態様では維持することができる。一本鎖抗体の製造のための技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。ｓｃＦｖのＶｈおよびＶＬ配列は、ＶＬのＣ末端に接続するＶＨのＮ末端を介して、またはＶＬのＮ末端に接続するＶＨのＣ末端を介して接続することができる。ＳｃＦｖ断片は、いずれかの末端で他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインに区別なく融合され得る独立したフォールディングエンティティである。様々な長さのリンカーを使用して、ＶｈおよびＶＬ配列を連結することができ、リンカーは、グリシンリッチ（柔軟性を提供する）およびセリンまたはトレオニンリッチ（溶解性を増加させる）であり得る。短リンカーは、２つのドメインの関連を妨げ、多量体（ダイアボディ、トライボディなど）をもたらす可能性がある。長いリンカーはタンパク質分解または弱いドメイン協会を生じ得る（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１１に記載される）。１５〜２０アミノ酸または１８〜２０アミノ酸の長さのリンカーが最も頻繁に使用される。他の柔軟なリンカーを含むリンカーのさらなる非限定的な例はチェンら、２０１３（Ａｄｖ薬物Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｏｃｔ  １５；  ６５（１０）：  １３５７−１３６９．Ｆｕｓｉｏｎ）に記載されているタンパク質リンカー：特性、設計および機能性（これらの内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。柔軟なリンカーはまた、グリジンおよびセリンのような小さなまたは極性のアミノ酸に富むが、柔軟性を維持するためにトレオニンおよびアラニンのような追加のアミノ酸、ならびに溶解性を改善するためにリジンおよびグルタミン酸のような極性のアミノ酸を含み得る。例示的なリンカーとしては（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、ＫＥＳＧＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤおよびＥＧＫＳＳＧＳＥＳＫＳＴ、（Ｇｌｙ）８、ならびにＧｌｙおよびＳｅｒリッチフレキシブルリンカー、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「単鎖抗体」はまた、ラク��抗体および他の重鎖抗体を含む単一ドメイン抗体、ナノボディを含む軽鎖抗体、ならびにヒト、マウスまたは他の種に由来する単一ドメインＶＨまたはＶＬドメインを含む。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体は、ラクダ、ラマ、またはアルパカに由来するラクダ科動物の足場を有するドメイン抗原結合単位を含む。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能的抗体を産生する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合ユニットとして独立して機能する。その結合面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみを含む。ラクダ類抗体は、従来の抗体のものに匹敵する結合親和性を達成することができる。カスメリド足場にベース抗体は、当該分野で周知の方法を使用して産生され得る。軟骨魚はまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原レセプター」）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。あるいは、ヒトまたはマウス由来のＩｇＧ由来の二量体可変ドメインがモノマーに分割され得る。ナノボディは、軽鎖に由来する一本鎖抗体である。「単鎖抗体」という語はまた、抗体模倣物を指す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、操作された微生物によって発現される抗体は二重特異性である。特定の実施形態では二重特異性抗体分子がｓｃＦｖまたはその断片を含み、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、ｓｃＦｖまたはその断片は第２のエピトープに対する結合特異性を有する。抗原結合断片または抗体部分には、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なったエピトープ、単一結合ドメイン（ｄＡｂ）、およびミニボディを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体が含まれる。単量体単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は細菌および哺乳動物細胞において容易に組み立てられ、生理学的条件下で改善された安定性を示す（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２００１およびその中の参考文献；タンパク質Ｅｎｇ．（２００１）１４（１０）：８１５−８２３（単量体および二量体二重特異性単鎖ダイアボディの発現のための最適化されたリンカー配列を記載する）。
【００９２】
「単離された」ポリペプチドもしくは断片，バリアント、またはそれらの誘導体は、その天然環境にないポリペプチドをいう。特別な水準の純化は必要とされない。細菌細胞または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は任意の好適な技術によって分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと考えられる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は組換えＤＮＡ技術によって産生された、すなわち、細胞、微生物または哺乳動物から産生され、ポリペプチドをコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質またはペプチドは、典型的にはグリカンを含まない。前記のポリペプチドの断片，誘導体，類似体またはバリアント、およびそれらの任意の組合せもまた、ポリペプチドとして含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は元のペプチドのアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つ以上の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片としては、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が挙げられる。断片はまた、本明細書中に記載される任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的に活性な断片を含む。バリアントは、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは、当該分野で公知の突然変異誘発法的な方法を使用して産生され得る。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド（単数）」および「ポリペプチド（複数）」を含み、アミド結合（すなわちペプチド結合）によって直線状に連結しているアミノ酸モノマーからなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を指し、特定の長さの産生物を指すわけではない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用されてもよい。「ジペプチド」という用語は、２つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「トリペプチド」という用語は、３つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含む、ポリペプチドの発現後改変の産生物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来してもよいか、または組換え技術によって産生されてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作された細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有してもよいが、必ずしもこのような構造を有する必要はない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれたと称され、定義された三次元構造を保有しないが、多数の異なる立体配座を採用できるポリペプチドは折り畳まれていないと称される。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指してもよいか、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列から選択される配列に対応するアミノ酸配列を指してもよい。
【００９４】
ポリペプチドはまた、融合タンパク質も含む。本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、元のペプチドまたは元のペプチドと十分に類似する配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術から生じる。融合タンパク質は、その融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と類似した構造機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）、および／または類似した調節機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）、および／または類似した生化学機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）および／または免疫学的活性（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）を有してもよい。「誘導体」は、限定されないが、２０個の標準的なアミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含む。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、ｅｄ．、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８年）、およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「十分に類似する」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列と比較して十分または最低限の数の同一または等価のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書において定義される。好ましくは、バリアントは本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。このようなバリアントは、一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列がそれぞれ異なるペプチドを含む。それらは天然に存在するバリアントおよび人工的に設計されたバリアントであってもよい。
【００９６】
本明細書において使用される場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書において使用される場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的なリンカーが本明細書に記載される。さらなる例示的なリンカーは米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に提供されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「コドン最適化配列」という用語は、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。コドンの最適化には、限定されないが、発現宿主生物のコドンの選好性に適合するように、コード配列についてのコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。「コドン最適化された」という用語は、核酸分子によってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するために、当該核酸分子の遺伝子またはコード領域においてコドンを改変することを指す。このような最適化には、少なくとも１つ、または２つ以上、または相当な数のコドンを、宿主生物の遺伝子においてより頻繁に使用されている１つ以上のコドンで置換することが含まれる。「コドン最適化配列」とは、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。いくつかの実施形態において、転写および／または翻訳の改善は、転写および／または翻訳のレベルを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、転写および／または翻訳の改善は、転写および／または翻訳のレベルを低下させることを含む。いくつかの実施形態では、目的の構築物からの発現レベルを微調整するために、コドン最適化が用いられる。コドンの最適化には、発現宿主生物のコドン選好性に適合するように、コード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれるが、これに限定されない。多くの生物は、成長ポリペプチド鎖において特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンを使用するためのバイアスまたは選好性を示す。コドンの選好性またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用頻度の差異は、遺伝暗号の縮重によって許容され、多くの生物の間で文書により十分に立証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次に、そのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいた所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「分泌系」または「分泌タンパク質」という用語は、目的のタンパク質または治療タンパク質を微生物、例えば細菌細胞質から分泌または排出することができる天然または非天然の分泌機構を指す。分泌系は、単一タンパク質を含んでもよいか、または複合体、例えばＨｌｙＢＤにおいて構築される２つ以上のタンパク質を含んでもよい。グラム陰性細菌についての分泌系の非限定的な例には、改変されたＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、種々の単一膜分泌系が含まれる。グラム陽性細菌についての分泌系の非限定的な例には、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系が含まれる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、目的のタンパク質または治療タンパク質を特異的分泌系へ誘導するためのＲＮＡまたはペプチド起源のいずれかの「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌系は、操作した細菌から目的のタンパク質を分泌する前にこのタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌（ａｕｔｏ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）において、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然のＳｅｃ系によって細胞質から周辺質区画への「パッセンジャー」ペプチドの転位の際に除去される。さらに、自己分泌因子が外膜を横切って移行すると、Ｃ末端分泌タグは、自己触媒的またはプロテアーゼによって触媒されるいずれかの、例えばＯｍｐＴ切断によって除去され得、それによって目的のタンパク質を細胞外環境に放出する。
【００９９】
本明細書において使用される場合、「トランスポーター」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、毒素、代謝産物、基質などを細胞外環境から微生物へ取り込むための機構、例えばタンパク質（複数可）を指すことを意味する。例えば、ＰｈｅＰなどフェニルアラニントランスポーターはフェニルアラニンを微生物に取り込む。
【０１００】
エフェクターはまた、免疫チェックポイントインヒビターを含む。「免疫チェックポイントインヒビター」または「免疫チェックポイント」は１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に減少させ、阻害し、妨害し、または調節する分子をいう。免疫チェックポイントタンパク質はＴ細胞の活性化または機能を調節し、当技術分野で知られている。非限定的な例としては、ＣＴＬＡ−４およびその配位子ＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＰＤ−１およびその配位子ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質はＴ細胞応答の同時刺激または阻害相互作用に関与し、自己寛容および生理学的免疫反応を調節および維持する。例えばＣＴＬＡ−４阻害剤を使用する全身性免疫療法は免疫調節を変化させ、免疫機能不全を誘発し、日和見的自己免疫障害をもたらし得る（例えば、Ｋｏｎｇら、２０１４を参照のこと）。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された微生物（例えば、操作された細菌もしくはファージ）、または生物学的分子を「阻害する」分子は対照（例えば、同じ条件下での同じ亜型の未処理対照または未改変微生物）と比較して、その生物学的分子の生物学的活性、生物学的機能、および／または数を減少、減少、または排除し得る細菌またはウイルスまたは分子をいう。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された微生物（例えば、生物学的分子を「活性化する」または「刺激する」操作された細菌またはファージ分子）は対照（例えば、同じ条件下で、同じ亜型の未処理対照または未改変微生物）と比較して、その生物学的分子の生物学的活性、生物学的機能、および／または数量を活性化、増加、増強、または促進することができる細菌またはファージ分子をいう。
【０１０３】
用語「ファージ」および「バクテリオファージ」は本明細書では互換的に使用される。両方の用語が細菌に感染し、細菌内で複製するウイルスを指す。本明細書で使用される「ファージ」またはバクテリオファージは集合的に、プロファージ、溶原性、休眠性、温帯性、無傷、欠陥、潜在性、およびサテライトファージ、ファージテールバクテリオシン、テリオオシン、および遺伝子導入剤を指す。
【０１０４】
本明細書で用いる「プロファージ」という用語はバクテリオファージのゲノム物質を意味し、宿主細胞のレプリコンに組み込まれ、宿主と共に複製する。プロファージは特異的に活性化されるとファージを産生することができる。場合によってはプロファージはファージを産生することができないか、またはそうしたことがない（すなわち、欠陥プロファージまたは潜在的プロファージ）場合によっては、プロファージはサテライトファージも意味する。「プロファージ」および「内因性ファージ」という用語が本明細書では互換的に用いられる。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「溶原性ファージ」または「溶原バクテリオファージ」または「プロファージ」は細菌宿主のＤＮＡ内に存在し、そして細菌複製サイクルおよび細胞分裂の間に宿主と共に複製するファージをいうために、互換的に使用される。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、細菌もしくは生物の「自然状態」または細菌の「自然状態」という用語は遺伝子工学によって改変されていない生物を指し、場合によっては、細菌もしくは生物の「自然状態」または細菌の「自然状態」という用語が定義されたエレメントに関して改変された同質遺伝子株と比較して、遺伝子工学によって改変されていない生物を指す。そのようなものとして、細菌は１つの規定された要素に関してはその自然状態にあり得るが、別の規定された要素に関してはその自然状態にはあり得ない。いくつかの実施形態では、細菌がその天然または天然の同じまたは異なったファージまたはプロファージの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態ではすなわち、その天然または天然の状態において、１つ以上の同じまたは異なった型のファージまたはプロファージを含む細菌は操作された株のための前駆体株に役立つ。従って、例えば、前駆体または親株がその天然の内因性ファージまたはプロファージを含む場合、同じ１つ以上の内因性ファージまたはプロファージが遺伝子操作された細菌中に存在してもよい。そのようなものとして、遺伝子操作された細菌はまた、その自然状態（ここで、ファージは、その自然状態にある規定された元素である）でプロファージを含む。
【０１０７】
「内因性ファージ」または「内因性プロファージ」はまた、細菌（およびその親株）の自然状態で存在するファージをいう。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「ファージノックアウト」または「不活化ファージ」は、ファージ粒子をもはや産生および／またはパッケージングすることができないか、または野生型ファージ配列より少ないファージ粒子を産生するように改変されたファージをいう。いくつかの実施形態では、不活化ファージまたはファージノックアウトとはその溶原化状態におけるテンペレートファージの不活化、すなわちプロファージの不活化をいう。このような改変はファージにおける突然変異をいい；このような突然変異がファージゲノム内の１つ以上の位置（例えば、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子内）における、挿入、欠失（ファージゲノムの部分的または完全な欠失）、置換、逆位を含む。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「同質遺伝子」細菌株は遺伝的に同一であるか、または規定された変化を含むが、他の点では同一である細菌株をいう。例えば、同質遺伝子突然変異体は、典型的には１つまたは複数の既知の遺伝子またはタンパク質中に定義された突然変異を含むことを除いて、同一である２つの株を指す。そのようなものとして、ファージフリーまたはファージ少ない株は、誘導され得、そして細菌細胞からファージ粒子を放出し得るプロファージを含む対応する同質遺伝子株を有する。
【０１１０】
本明細書中で使用されるように、形容詞「ファージフリー」、「ファージフリー」および「ファージレス」は１つ以上のプロファージ（そのうちの１つ以上が改変されている）を含む細菌または株を特徴付けるために、互換的に使用される。この改変は、プロファージの誘導またはファージ粒子の放出能力の喪失をもたらし得る。あるいは、改変が改変を伴わない同質遺伝子株と比較して、より効率的でないか、またはより頻繁でない誘導、またはより効率的でないか、またはより頻繁でないファージ放出を生じ得る。ファージを誘導および放出する能力は、本明細書中に記載されるようなプラークアッセイを使用して測定され得る。
【０１１１】
本明細書中で使用される「溶原菌」という用語は溶菌に必要なファージ遺伝子が発現されない、溶原サイクルにあるプロファージを含む細菌を指す。
【０１１２】
本明細書で使用されるファージ誘導とは、溶原性プロファージのライフサイクルの一部をいい、そこで溶解性ファージ遺伝子が活性化され、ファージ粒子が産生され、溶解が起こる。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、誘導という用語は溶原性感染の増殖性感染への変換をいい、すなわち、誘導されたプロファージは、ファージ粒子の産生および放出を開始する。誘導はしばしば、細菌ＤＮＡへの損傷によって刺激され、そして細菌染色体からのプロファージの切除を含み得るか、または含まないかもしれない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、治療、予防、管理、重症度の低下、改善、障害、疾患または状態の治療に有用である。いくつかの実施形態では、障害は自己免疫障害である。本明細書で使用される「自己免疫障害」には、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性脳脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性ｔｉｃａ麻疹、軸索および神経神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発多巣性オストミエリスト（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＧＡ腎症、ＩｇＧＡ腎炎、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、苔癬硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（全身性エリテマトーデス）、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ミュシャ・ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼性瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回盲部リウマチ性眼炎、神経失調症、脳炎、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ症候群、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型自己免疫性多発性腺症候群、多発性筋痛症、心筋症、心筋炎症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊ｏｄｅ性膿皮症、純粋な赤血球無形成、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性関節炎、後発性多発性軟骨炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子と精巣の自己免疫、硬直した人の症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スサック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、障害は移植片対宿主病である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、疾患は代謝疾患である。本明細書中で使用される場合、「代謝性疾患」は１型糖尿病；２型糖尿病；メタボリックシンドローム；Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｅｌ症候群；Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群；非アルコール性脂肪性肝疾患；結節性骨異栄養因子（ＢＤＮＦ）欠損；単心性１（ＳＩＭ１）欠損；レプチン受容体欠損；プロオピラノコルチン（ＰＯＭＣ）欠損；プロタンパク質スブチリシン／ケキシン１型（ＰＣＳＫ１）欠損；Ｓｒｃ相同性２Ｂ１（ＳＨ２Ｂ１）欠損；プロホルモン変換酵素１／３欠損；メラノコルチン−４−受容体（ＭＣ４Ｒ）欠損；ウィルムス腫瘍、アニリジア、尿生殖器異常を含むが、これらに限定されない。副甲状腺機能低下症（ＷＡＧＲ）症候群；偽Ｘ症候群；Ｂｏｒｊｅｓｏｎ−Ｆｏｒｓｍａｎｎ−Ｌｅｈｍａｎｎ症候群；Ａｌｓｔｒｏｍ症候群；Ｃｏｈｅｎ症候群；および尺骨乳房症候群。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、障害はがんである。「癌」または「癌性」は調節されていない細胞増殖を特徴とする生理学的状態を指すために使用され、いくつかの実施形態では癌は腫瘍を指す。「腫瘍」が任意の腫瘍性細胞増殖もしくは増殖、または任意の前癌性もしくは癌性の細胞もしくは組織を指すために使用される。腫瘍は悪性であっても良性であってもよい。癌の種類には副腎癌、副腎皮質癌、虫垂癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳癌（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫）、細気管支腫瘍、乳癌、頸部癌、直腸癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、下咽頭癌が含まれるが、これらに限定されない。急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝癌、リンパ腫（エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫など）、悪性中皮腫、多発性骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻腔がん、神経芽細胞腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞がん、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、甲状腺がん、異常小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｈｏｍマクログロブリン血症、およびＷｉｌｍｓ腫瘍。がん処置の副作用には日和見自己免疫障害、全身毒性、貧血、食欲不振、ブラダ内層の刺激、出血および打撲傷（血小板減少症）、味覚または臭いの変化、便秘、下痢、口渇、嚥下障害、浮腫、疲労、脱毛（脱毛症）、感染症、不妊症、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、歯崩壊、尿路感染症、および／または記憶部および濃度に関する問題が含まれ得るが、これらに限定されない（米国国立がん研究所）。いくつかの実施形態では、障害は高アンモニア血症障害である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では障害が高アンモニア血症、尿素環障害、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、マプレシルアップ尿疾患、イソ吉草酸血症、高オキサリア、フェニルケトン尿素を含むが、これらに限定されない稀な疾患である。
【０１１８】
上述の障害のうちの１つ以上の処置、予防、管理、改善のための例示的な回路は係属中の同時所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００、出願０５／２５／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、出願０１／１１／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３、出願０２／０４／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３、出願０２／１０／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２、出願０７／２９／０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１、出願０８／３１／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８、出願０６／１０／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２に記載されている。２０１６年１２月２８日出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２、２０１６年１１月１６日出願、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２。その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確に反対であることが示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１２０】
「および／または」という語句は、列挙における要素の間で使用される場合、（１）単一の列挙された要素のみが存在すること、または（２）列挙の１つより多い要素が存在することのいずれかを意味することを意図する。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、その選択が、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣであってもよいことを示す。「および／または」という語句は、列挙における要素の「少なくとも１つ」または「１つもしくは複数」と交換可能に使用されてもよい。
【０１２１】
細菌
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される細菌が内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、細菌がその天然または天然のバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、ファージが特定の細菌の全ての分離中に存在する。いくつかの実施形態では、ファージが同じ種、株、または亜株の細菌中に存在する。いくつかの実施形態では、ファージはインタクトプロファージである。いくつかの実施形態では、ファージは欠陥プロファージである。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージが溶解サイクルに入ることを不可能にする。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が溶解サイクルを受けるファージの能力に影響を及ぼし、例えば、溶解段階を受け得る所与の集団における細菌の頻度を減少させるか、または数を減少させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージが他の細菌に感染するのを防止する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が細菌の適応度を変更させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がエフェクター機能を変更させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が細菌の適応度を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がエフェクター機能を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が大規模製造を含む、細菌が製造または生産される工程を改善する。これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌はそわなければ、その自然状態であり得る。あるいはこれらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は１つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子配列を含むようにさらに遺伝子操作され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異ファージを含む細菌を細菌シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）として使用することができ、それに遺伝子回路が追加または改変される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、細菌は非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は共生細菌である。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、病原性を低減させるか、または取り除くように改変または突然変異された天然の病原性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。例示的な細菌には、限定されないが、バチルス属、バクテイロデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビ細菌属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、大腸菌、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、サッカロミセス属、およびスタフィロコッカス属、例えば、バチルス・コアグランス、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・サブティリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる。特定の実施形態では、細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・サブティリス、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、細菌は、最も特徴付けられたプロバイオティクスの１つに進化している腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のグラム陰性細菌である、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。その株はその完全な無害により特徴付けられ（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）、ＧＲＡＳ（一般に安全と認識されている（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ））状態を有する（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、下線は筆者による）。ゲノムシークエンシングにより、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが重要なビルレンス因子（例えば、大腸菌α−溶血素、Ｐ−線毛付着因子）を欠失していることが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）。さらに、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは病原性接着因子を保有せず、腸毒素または細胞毒素を全く産生せず、侵襲性ではなく、尿路病原性ではないことが示されている（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。早くも１９１７年に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、治療的使用のために、Ｍｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる医薬用カプセルにパッケージ化された。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの治療効果および安全性は納得できるように証明されていることは一般に認められている（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本開示の細菌または腫瘍標的細菌。腫瘍標的細菌は、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された２０１７年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
当業者は、本明細書に開示される遺伝子組換えが、細菌の他の種、株、および亜型に適合され得ることを理解する。さらに、１つまたは複数の異なる種由来の遺伝子が互いに導入されてもよく、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス由来のＰＡＬ遺伝子は大腸菌において発現され得（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）、原核生物および真核生物のフェニルアラニンアンモニアリアーゼは配列相同性を共有することが知られている（ＸｉａｎｇおよびＭｏｏｒｅ、２００５年）。
【０１２７】
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書中に開示されるか、または当技術分野で公知であり、本開示に従って使用され得る細菌種のいずれかは、１つ以上の内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ファージゲノムに対する改変がファージゲノム内に１つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、改変はファージゲノム中の１つ以上の欠失である。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が欠失される。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、改変がファージゲノムにおける１つ以上の挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載の抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ファージゲノム中の１つ以上の遺伝子が交互の遺伝子配列で置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子の配列全体が逆転している。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子の部分配列が逆転される。
【０１２８】
非改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管もしくは血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）、または投与後数時間もしくは数日の死滅スイッチ（ｋｉｌｌ  ｓｗｉｔｃｈ）の活性化によって破壊され得る。このように、遺伝子操作された細菌は継続的な投与を必要とする場合がある。いくつかの実施形態では、滞留時間はヒト対象について計算される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌について計算され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６８を参照のこと）。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬをコードする遺伝子を含み、ＰＡＬ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然ＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＰＡＬ遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＰＡＬ遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に開示される任意の１つ以上のプロモーターである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨをコードする遺伝子を含み、ＰＡＨ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のＰＡＨ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＰＡＨ遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＰＡＨ遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは本明細書に開示される任意の１つ以上のプロモーターである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤをコードする遺伝子を含み、ＬＡＡＤ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＬＡＡＤ遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＬＡＡＤ遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは本明細書に開示される任意の１つ以上のプロモーターである。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする天然遺伝子のさらなるコピーを含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。代替の実施形態では、細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子を含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。両方の実施形態は、「非天然」フェニルアラニントランスポーターという用語に包含される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然ではｐｈｅＰ遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、同じプロモーターは、ＰｈｅＰおよびＰＡＬおよび／またはＰＡＨおよび／またはＬＡＡＤの発現を制御する。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰの発現を制御するプロモーターは、ＰＡＬおよび／またはＰＡＨおよび／またはＬＡＡＤの発現を制御するプロモーターとは異なる。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰの発現を制御するプロモーターは、本明細書に開示される任意の１つ以上のプロモーターである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬ、ＰＡＨ、ＬＡＡＤ、および／またはｐｈｅＰに作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の大腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的条件および／または低酸素条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、アラビノースへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラムノースまたは当業者に既知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質への曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、外因性の環境温度によって直接的または間接的に制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧまたは他のｌａｃＩ結合性化合物への曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラムノースへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度の上昇によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度の低下によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。そのような分子はテトラサイクリンまたはＩＰＴＧまたはアラビノースまたは当業者に既知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質であり得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される。菌株の培養中に提供されるこのような条件の非限定的な例には、低酸素、嫌気性、微好気性もしくは好気性条件、他の一定の酸素レベル（以下に例示されるものなど）、アラビノースの存在、ＩＰＴＧ、ラムノースまたは本明細書に記載されているか当技術分野で公知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質の存在が含まれる。いくつかの実施形態では、培養容器中の条件は特定の酸素レベル、例えば、酸素１％〜１０％、酸素１０％〜２０％、酸素２０％〜３０％、酸素３０％〜４０％、酸素４０〜５０％、酸素６０〜７０％、酸素７０〜８０％、酸素８０〜９０％、酸素９０〜１００％、および本明細書に記載される他の酸素レベルに設定され、その設定点においてプロモーターは直接的または間接的に誘導される。
【０１３５】
バクテリオファージ
いくつかの実施形態では、本発明の細菌が１つ以上の溶原性、休眠性、温帯性、インタクト、欠陥、潜在性、またはサテライトファージ、またはバクテリオシン／ファージテールまたは遺伝子導入剤を、それらの自然状態で含む。いくつかの実施形態では、プロファージまたはバクテリオファージが目的の特定の細菌の全ての分離に存在する。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上のこのようなバクテリオファージを含む親株の遺伝子操作された誘導体である。従って、本発明のこのような細菌は、それらの自然状態であってもよく、または１つ以上のエフェクター分子の式または製造のための回路を含むようにさらに遺伝的に改変されていてもよい。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、細菌は、バクテリオファージの特性または挙動を変化させるプロファージまたはバクテリオファージゲノム内の１つ以上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がプロファージが溶解処理に入るかまたはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを妨げる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、減少または増大させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化、例えば減少または増大させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させない（例えば、減少または増大させない）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させない、例えば減少させない、または増大させない。
【０１３７】
ファージゲノムの大きさは、最小ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃファージＬ５（２，４３５ｂｐ）、〜１１．５  ｋｂｐ（例えば、マイコプラズマファージＰ１）、〜２１ｋｂｐ（例えば、ラクトコッカス属ファージｃ２）、および〜３０ｋｂｐ（例えば、パスツレラファージＦ１０８）から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍファージＧのほぼ５００  ｋｂｐのゲノム（ＨａｔｆｕｌｌおよびＨｅｎｄｒｉｘ；  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓおよびそれらのゲノム、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０１１年１０月１日；１（４）：２９８〜３０３、およびその中の参考文献）まで、非常に多様である。ファージゲノムは、１０個未満の遺伝子から数百個までの遺伝子をコードすることができる。細菌プラスミドに組み込まれるファージのいくつかの例も存在するが（Ｌｉｔｔｌｅ、Ｌｏｙｓｏｇｅｎｙ、Ｐｒｏｐｈａｇｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｉｎ：  Ｗａｌｄｏｒ  ＭＫ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＤＩ、Ａｄｈｙａ  Ｓ、ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｇｅｓ  Ｔｈｅｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ病因ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００５  ｐｐ．３７−５４。場合によっては、ファージは常に細菌宿主染色体内の同じ位置に位置し、この位置は各ファージに特異的であり、すなわち、異なるファージは異なる位置に位置する。他のファージは、それらが多数の異なる場所で組み込まれ得るという点で、より許容性である。
【０１３８】
従って、本開示の細菌は、長さが変化し得る１つ以上のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１ｂｐ〜１０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、細菌が長さが少なくとも約１ｂｐ〜１０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１０ｋｂ〜２０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約２０ｋｂ〜３０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約３０ｋｂ〜４０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約３０ｋｂ〜４０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約４０ｋｂ〜５０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約５０ｋｂ〜６０ｋｂの長さの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約６０ｋｂ〜７０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約７０ｋｂ〜８０ｋｂの長さの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約８０ｋｂ〜９０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約９０ｋｂ〜１００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１００ｋｂ〜１２０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１２０ｋｂ〜１４０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１４０ｋｂ〜１６０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１６０ｋｂ〜１８０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１８０ｋｂ〜２００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約２００ｋｂ〜１８０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約１６０ｋｂ〜２５０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約２５０ｋｂ〜３００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約３００ｋｂ〜３５０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約３５０ｋｂ〜４００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約４００ｋｂ〜５００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約５００ｋｂ〜１０００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが１０００ｋｂを超えるバクテリオファージゲノムを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌が１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を含む１つ以上のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１〜５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約５〜１０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１０〜１５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１５〜２０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約２０〜２５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約２５〜３０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約３０〜３５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約３５〜４０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約４０〜４５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約４５〜５０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約５０〜５５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約５５〜６０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約６０〜６５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約６５〜７０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約７０〜７５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約７５〜８０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約８０〜８５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約８５〜９０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約９０〜９５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約９５〜１００個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１００〜１１５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１１５〜１２０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１２０〜１２５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１２５〜１３０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１３０〜１３５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１３５〜１４０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１４０〜１４５個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１４５〜１５０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１５０〜１６０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１６０〜１７０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１７０〜１８０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１８０〜１９０個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約１９０〜２００個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約２００〜３００個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が約３００を超える遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ファージが特定の種における細菌宿主染色体内の同じ箇所または箇所に常にまたはほとんど常に箇所する。いくつかの実施形態では、ファージが特定の種における宿主染色体内の種々の位置に組み込まれて見出される。いくつかの実施形態では、ファージはプラスミド上に位置する。
【０１４１】
プロファージ配列の存在はまた、ファージなしの同質遺伝子株には存在しない細菌に特定の特性を付与し得る。例えば、プロファージは、いくつかの場合において、細菌が抗生物質耐性を獲得すること、新しい環境ニッチに存在すること、密着性を改善すること、または病原性になることを可能にし得る。加えて、溶解処理を通じて、ある細菌からのＤＮＡは別の細菌において拾い上げられ、放出されることができ、したがって、ファージは、遺伝子導入のための溶媒として機能する。
【０１４２】
従って、いくつかの実施形態では、細菌が細菌に抗生物質耐性を与えるファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌が細菌にさらなる適合性を与えるファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌が細菌に新しい環境で増殖することができるファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌が宿主遺伝物質を同じ種または異なった種の別の細菌に移すことができるファージを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、プロファージが欠陥プロファージまたは潜在的プロファージであり得る。欠陥プロファージもはや溶解サイクルを経ることができない。クリプティックプロファージは、溶解サイクルを受けることができないか、または溶解サイクルを決して受けていないかもしれない。細菌ゲノムのプロファージの完全なレパートリーの機能的研究は、プロファージの大部分があるレベルで欠損していることを示唆する：切除、ビリオン形成、溶解、または感染能力（Ｂｏｂａｙら、２０１４）。不完全なまたは潜在的なプロファージは、突然変異の減衰および／または何千もの細菌複製サイクルにわたる溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子の喪失の試験結果として、多くの細菌において高いレベルの豊富さを生じる。（Ｂｏｂａｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）．注目すべきは欠損プロファージはまた、宿主に適応的または好都合な機能性を提供し得る多くの遺伝子（例えば、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の防止のための機構、またはバクテリオシンを含む）をしばしば含み、これは例えば、他の隣接する細菌種の増殖抑制を介する栄養素の競合において有用であり得る。例えば、いくつかの欠陥プロファージはＥｃｏｌｉ  Ｋ?１２（例えば、Ｒａｃ、ｅ１４、ＤＬＰ１２、およびＱＩＮ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（例えば、１８６およびＳＫＩＮ）において特徴付けられている（Ｃａｓｊｅｎｓ、２００１、およびその中の参考文献）。これらのファージの各々は、いくつかの機能的遺伝子を保有する。例えば、Ｒａｃは、ＲｅｃＥ相同組換え系をコードする。
【０１４４】
従って、いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上の欠陥または潜在的なプロファージを含む。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子は相同組換え機能を付与する。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子がさらなる感染を予防する機能を付与する。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子はバクテリオシンを与える。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子が炭素利用を増加させること、浸透圧、酸化および酸ストレスに対する耐性を改善すること、種々の条件下での増殖を増加させること、リンおよび窒素利用を増強すること、またはバイオフィルム形成に影響を及ぼすことによって、有害な条件下での増殖を促進する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上のサテライトファージゲノムを含む。サテライトファージは、それ自体の構造タンパク質遺伝子を保有しておらず、他の特異的ファージの構造タンパク質によるカプセル化のための構成であるゲノムを有する（６およびＫｌｕｇバクテリオファージＰ４：プロファージＰ２、ウイルス学、第５１巻、第２号、１９７３年２月、３２７〜３４４頁のようなヘルパーに依存するサテライトウイルス）。従って、いくつかの実施形態では、細菌がそれ自身の構造遺伝子を持たないファージゲノムを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上のテリオオシンを含む。多くの細菌（グラム陽性およびグラム陰性の両方）は、ファージ頭部を伴わずに機能的であるファージ尾部に似た様々な粒子を産生し（テリオオシンと呼ばれる）、その多くはバクテリオシン特性を有することが示されている（ＧｈｅｑｕｉｒｅおよびＭｏｔ、Ｔｈｅ  Ｔａｉｌｏｃｉｎ  Ｔａｌｅ：  Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｏｆｆ  Ｐｈａｇｅ；  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１０に概説されている。ファージ尾部様バクテリオシンは、収縮性ファージ尾部様（Ｒ型）および非収縮性であるが柔軟性ファミリー（Ｆ型）の２つの異なるファミリーに分類される。従って、いくつかの実施形態では、細菌がバクテリオシンまたは他の有益な特性を付与する１つ以上のテリオオシンを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上の遺伝子導入剤を含む。遺伝子導入剤（ＧＴＡ）は、いくつかの細菌ゲノムによってコードされるファージ様元素である。ＧＴＡはファージに似ているが、典型的なファージを規定する顕著な能力を欠き、宿主細胞ＤＮＡのランダム断片をパッケージングし、次いでそれらを同じ種の他の細菌に水平に移す（ラングら、遺伝子導入剤：ファージ様遺伝子交換エレメント、ナットレブミクロビオール、２０１２年６月１１日；１０（７）：４７２−４８２に概説されている）。そこでは、ＤＮＡが相同組換えによって、常在する同族染色体領域を置換することができる。しかしながら、粒子の大部分はＧＴＡをコードする遺伝子を有していないので、これらの粒子はウイルスとして増殖することができない。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、細菌が１つ以上の糸状ビリオンを含む。糸状ビリオンはｄｓＤＮＡプロファージとして組み込まれる（Ｍａｒｖｉｎ  ＤＡら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ、Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ａｐｒ；１１４（２）：８０−１２２に概説されている）。
【０１４９】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、１つ以上の酵素およびトランスポーターを発現する（例えば、フェニルアラニンの摂取のための）本明細書中に記載される遺伝子操作された細菌は、内因性プロファージまたはバクテリオファージゲノム内に１つ以上の改変または突然変異を含む。これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させ得る。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。プロファージは、実験的または計算的のいずれかで同定され得る。実験的アプローチは、宿主細菌をＵＶ光または他のＤＮＡ損傷条件に曝露することによって、宿主細菌にファージ粒子を放出させることを含む。しかしながら、いくつかの場合において、プロファージが誘導される条件は未知であり、従って、斑アッセイ中にプラークが存在しないことは、プロファージが存在しないことを必ずしも証明しない。さらに、このアプローチは生存可能なファージの存在のみを示し得るが、欠陥プロファージを明らかにしない。このように、ゲノム配列データからのプロファージのコンピューターによる同定は、最も好ましい経路となっている。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がエフェクター機能に本質的に影響を及ぼさず、エフェクター機能は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株のエフェクター機能と本質的に同じである。表Ｈは、プロバイオティクス細菌の非限定的な例、およびファスタースコアリングによって決定される細菌ゲノムに含まれる可能性のあるバクテリオファージの数の一覧を提供する。表Ｉは、クロストリジウム株および電位ファージゲノムの一覧を提供する。ファースターは、生物（ｈｔｔｐ：／／Ｐｈａｓｔｅｒ．ｃａ／）中のファージ配列をバイオインフォマティックに同定するためのウェブサーバーである。ＰＨＡＳＴＥＲスコアリングは、ＰＨＡＳＴＥＲ．ｃａおよびＺｈｏｕら（「ＰＨＡＳＴ：  Ａ  Ｆａｓｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（ｓｕｐｐｌ  ２）：  Ｗ３４７−Ｗ３５２）およびＡｒｎｄｔら（Ａｒｎｄｔら（２０１６）ｐｈａｓｔｅｒ：ｐｈａｓｔｅｒ：ＰＨＡＳＴファージ検索ツールのより良好でより速いバージョン）に詳細に記載されている。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２０１６  Ｍａｙ  ３）．。要約すると、提供された細菌ゲノム配列内のプロファージ領域（無傷、疑わしい、または不完全なものとして）をスコア化するために、異なる基準で３つの方法を適用する。第１の方法において、ファースターによって同定された特定のファージ生物の数が領域のＣＤＳの総数の１００％以上である場合、領域は、総スコア１５０でマークされる。１００％未満の場合、方法２および３が使用される。第２法では提供された細菌ゲノム配列中のファースターによって同定された特定のファージ生物の数が領域のＣＤＳの総数の５０％を超える場合、そのファージ生物はその領域についての主要な電位ファージとみなされ、領域のタンパク質の総数中のこの表中のそのファージ生物の総数の割合が計算され、次いで１００倍され、領域の長さ中のそのファージ生物の長さの割合が計算され、次いで５０倍される（ファージヘッドのカプセル化能力が考慮される）。方法３では、特定のファージ関連キーワード（「キャプシド」、「ヘッド」、「インテグラーゼ」、「プレート」、「テール」、「ファイバー」、「コート」、「トランスポザーゼ」、「ポータル」、「ターミナーゼ」、「プロテアーゼ」または「ライシン」など）のいずれかが存在する場合、見つかったキーワードごとに得点を１０だけ増加させる。領域のサイズが３０Ｋｂより大きい場合、スコアは１０だけ増加される。その領域に少なくとも４０タンパク質が存在する場合、得点は１０だけ増加される。ファージ関連タンパク質および仮想タンパク質の全てが、この地域におけるタンパク質の総数の７０％を超える場合、得点は１０増加する。方法２の合計スコアを方法３の合計スコアと比較し、大きい方を領域の合計スコアとして選択する。領域の合計スコアが７０未満である場合、それは不完全とマークされ、７０〜９０の間である場合、疑わしいとマークされ、９０を超える場合、それは無傷とマークされる。
【０１５１】
［表Ｈ］一般的なプロバイオティクスの適合株
【表３】
2020525012.tif 000005
【０１５２】
［表Ｉ］クロストリジウム株
【表４】
2020525012.tif 000006
【０１５３】
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載の細菌は、存在するプロファージまたはバクテリオファージゲノム内に１つ以上の改変または突然変異を含む。これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がプロファージが溶解処理に入るかまたはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを妨げる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、減少または増大させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化、例えば減少または増大させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させない（例えば、減少または増大させない）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させない、例えば減少させない、または増大させない。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がフェニルアラニン消費を改善する。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン消費が未変性のファージを含む同質遺伝子株において観察されるレベルに類似したままである。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、細菌が少なくとも約１〜２、少なくとも約２〜３、少なくとも約３〜４、少なくとも約４〜５、少なくとも約５〜６、少なくとも約６〜７、少なくとも約７〜８、少なくとも８〜９、少なくとも９〜１０、少なくとも１０〜１１、少なくとも１１〜１２、少なくとも１３〜１４、少なくとも１３〜１４、少なくとも１４〜１５、少なくとも１５〜１６、少なくとも１７〜１８、少なくとも１７〜１８、少なくとも１９〜２０、少なくとも１９〜２０、少なくとも２０〜２１、少なくとも２１〜２２、少なくとも２２〜２３、少なくとも２３〜２４、少なくとも２４〜２５、少なくとも２５〜２６、少なくとも２６〜２７、少なくとも２７〜２８、少なくとも２８を含む。少なくとも約３０〜約２９、少なくとも約３０〜約３１、少なくとも約３０〜約３１、少なくとも約３２〜約３３、少なくとも約３４〜約３５、少なくとも約３６〜約３７、少なくとも約３８〜３９、少なくとも約３９〜４０、少なくとも約４０〜約４１、少なくとも４１〜４２、少なくとも約４３〜４４、少なくとも約４３〜４４、少なくとも約４５〜４６、少なくとも約４６〜４７、少なくとも約４７〜４８、少なくとも約４７〜４８、少なくとも約４９〜５０、少なくとも約４９〜５０、少なくとも約５０〜５１、少なくとも約５１〜５２、少なくとも約５２〜５３、少なくとも約５３〜５４、少なくとも約５４〜５５、少なくとも約５５〜５６、少なくとも約５６〜５７、少なくとも約５９〜５８、少なくとも約６０〜５９、少なくとも約６１〜６０、少なくとも約６３、少なくとも約６４〜６３、少なくとも約６４〜６５、少なくとも約６６〜６７、少なくとも約６７〜６８、少なくとも約６９〜７０、少なくとも約６９〜７０、少なくとも約７０〜７１、少なくとも約７２〜７３、少なくとも約７２〜７４、少なくとも約７４〜７５、少なくとも約７６〜７７、少なくとも約７６〜７７、少なくとも約７７〜７８、少なくとも約７７〜７８、少なくとも約７８〜７９、少なくとも約７９〜８０、少なくとも約８０〜８１、少なくとも約８１〜８２、少なくとも約８２〜８３、少なくとも約８３〜８４、少なくとも約８４〜８５、少なくとも約８４〜８５、少なくとも約８６〜８７、少なくとも約８６〜８７、少なくとも約８８〜８９、少なくとも約８８〜８９、少なくとも約８８〜８９、少なくとも約８９〜９０、少なくとも約９０〜９１、少なくとも約９１〜９２、少なくとも約９２〜９３、少なくとも約９３〜９４、少なくとも約９４〜９５、少なくとも約９５〜９６、少なくとも約９６〜９７、少なくとも約９７〜９８、少なくとも約９８〜９９、少なくとも約９９〜１００、または存在するプロファージまたはバクテリオファージゲノムに対する少なくとも約１００以上の改変または変異。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がエフェクター機能、例えばフェニルアラニン消費を改善する。いくつかの実施形態ではエフェクター機能、例えば、フェニルアラニン消費は未変性のファージを含む同質遺伝子株において観察されるものと同様のままである。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を有さない同質遺伝子株と比較して、プロファージ溶解過程の進入または終了を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がプロファージ溶解処理の進入または終了を完全に妨げる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変なしの同質遺伝子株と比較して、プロファージ溶解処理の進入または終了を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％減少させる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変なしの同質遺伝子株と比較して、同一または異なる型の他の細菌に、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１０〜２０倍、少なくとも約２０〜３０倍、少なくとも約３０〜４０倍、少なくとも約４０〜５０倍、少なくとも約５０〜６０倍、少なくとも約６０〜７０倍、少なくとも約７０〜８０倍、少なくとも約８０〜９０倍、少なくとも約９０〜１００倍、または少なくとも約１００〜１０００倍感染することを、ファージが少なくとも約１〜２倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１０〜２０倍、少なくとも約２０〜３０倍、少なくとも約３０〜４０倍、少なくとも約５０〜６０倍、少なくとも約６０〜７０倍、少なくとも約７０〜８０倍、。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを完全に防止する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なる型の他の細菌に、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％感染することを防止する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、変更または突然変異がファージ変更を伴わない同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、または少なくとも約１００〜１０００倍、変更または変更（例えば、減少または増加）する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を伴わない同質遺伝子株と比較して、ファージ改変を伴わない同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、例えば、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％変更または増加させる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、または少なくとも約１００〜１０００倍、例えば減少または増大させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を伴わない同質遺伝子株に対して、例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％変化させる（例えば、減少または増大させる）。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、この突然変異がファージゲノム配列内に１つ以上の欠失を含む。本明細書中で使用される場合、「欠失」はポリヌクレオチド配列からの１つ以上のヌクレオチドの除去を意味する。いくつかの実施形態では突然変異がファージゲノム配列への１つ以上の挿入を含む。本明細書中で使用される場合、「挿入」はポリヌクレオチド配列への１つ以上のヌクレオチドの付加を意味する。いくつかの実施形態では抗生物質カセットがファージゲノム配列内の１つ以上の位置に挿入され得る。いくつかの実施形態では突然変異がファージゲノム配列内の１つ以上の置換を含む。本明細書中で使用される場合、「置換」はポリヌクレオチド配列内の１つ以上のヌクレオチドを同数のヌクレオチドで置換することを意味する。いくつかの実施形態では突然変異がファージゲノム配列内の１つ以上の逆位を含む。本明細書中で使用される場合、「逆位」は２つ以上のヌクレオチドを含むセグメントがポリヌクレオチド配列内で末端から末端へ逆にされる場合を意味する。いくつかの実施形態では、逆位は特異的フリッパーゼによって支配され得る。複数のレベルの制御を含む例示的な回路は本明細書に例示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時所有の係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３９４３４にも記載されている。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の改変が１つ以上のファージゲノム遺伝子内の２つ以上の挿入、欠失、置換、または逆位の組み合わせである。
【０１６５】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のフレームシフト突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、フレームシフト突然変異（フレーミングエラーまたはリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れないＤＮＡ配列中の多数のヌクレオチドのインデル（挿入または欠失）によって引き起こされる遺伝子突然変異をいう。欠失または挿入が起こる配列が早ければ早いほど、タンパク質はより変化する。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のミスセンス突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、ミスセンス突然変異とは、単一の塩基類対の変化が得られるタンパク質における種々のアミノ酸の置換を引き起こす場合をいう。このアミノ酸置換は、影響を有さないか、またはタンパク質を非機能性にし得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のナンセンス突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、ナンセンス突然変異は遺伝暗号によって特定される２０個のアミノ酸のうちの１つに対応するセンスコドンが鎖終結コドンに変化し、それによって目的のポリぺプチドが切断される突然変異をいう。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の改変が１つ以上のファージゲノム遺伝子内の２つ以上のフレームシフト、ナンセンスまたはミスセンス突然変異の組み合わせである。いくつかの実施形態では、改変されたバクテリオファージが細菌染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、改変されたバクテリオファージが細菌プラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、プラスミドを改変する。いくつかの実施形態では、プラスミドを完全に除去する。いくつかの実施形態では、ファージまたはプロファージが特定の種のすべての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、プロファージが特定の門、目、サブ目、ファミリー、クラス、サブクラス属、種、サブ種、またはクレードのすべての分離株に存在する。
【０１６７】
突然変異
いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐを含む。ファージゲノムの少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約７５，０００〜８０，０００ｂｐ、ファージの少なくとも約８５，０００〜９０，０００  ｂｐ  ファージゲノムの少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、又はファージゲノムの少なくとも約２００，０００ｂｐ以上である。１つの特定の実施形態において、９６８７ｂｐのファージゲノムが変異される。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドが散在している。いくつ��の実施形態では、変異ヌクレオチドは連続している。いくつかの実施形態では、少なくとも約０．１〜約２％、少なくとも約１〜約２％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約５〜約６％、少なくとも約７〜約６％、少なくとも約７〜約８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜約１０％、少なくとも約１１〜約１２％、少なくとも約１３〜約１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜約１６，１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、  ファージゲノムの少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が変異される。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％が変異している。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が変異される。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１％〜２％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％である。少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２５％〜約２６％、少なくとも約２５％〜約２５％、少なくとも約２８％〜約２９％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３２％〜約３３％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％少なくとも約４５％〜約４６％、少なくとも約４５％〜約４９％、少なくとも約５０％〜約５０％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５３％〜約５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、約６９％〜７０％、少なくとも約７２％〜７１％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％ファージゲノム内の遺伝子の少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９２％〜９０％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に変異している。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がファージゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異はファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、突然変異は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では最適な突然変異、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、突然変異に適し得る。いくつかの実施形態では調節エレメント（例えば、プロモーター）は変異される。いくつかの実施形態では、コード配列が変異される。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、突然変異が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がヘッドストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がテールストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がカラーストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が外被構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がファージインサーションに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ包装体に関与するポリペプチドをコードする９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子をコードするポリペプチド、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ包装体、およびそれらの組み合わせ内に位置するか、またはそれらを包含する、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８。いくつかの実施形態では、突然変異がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
【０１７６】
欠失
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の欠失は、ファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２０，０００〜２０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐを含む。ファージゲノムの少なくとも約７０，０００−７５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約８０，０００−８５，０００ｂｐ、ファージの少なくとも約８５，０００−９０，０００ｂｐファージゲノムの少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約９５，０００〜１００，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、またはファージゲノムの２００，０００ｂｐを超える。１つの特定の実施形態において、９６８７ｂｐのファージゲノムが欠失される。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドは連続している。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、少なくとも約０．１〜約２％、少なくとも約１〜約２％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約５〜約６％、少なくとも約７〜約６％、少なくとも約７〜約８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜約１０％、少なくとも約１１〜約１２％、少なくとも約１３〜約１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜約１６，１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、ファージゲノムの少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が欠失される。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％が欠失している。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子がファージゲノム内で部分的にまたは完全に欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が完全に欠失され、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失される。一実施形態では、ファージゲノム内に１つの欠失が存在し、欠失の末端の１つまたは２つの遺伝子が部分的に欠失され、残りの遺伝子が完全に欠失される。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣り合っている。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、少なくとも約１％〜２％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％である。少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２５％〜約２６％、少なくとも約２５％〜約２５％、少なくとも約２８％〜約２９％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３２％〜約３３％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％少なくとも約４５％〜約４６％、少なくとも約４５％〜約４９％、少なくとも約５０％〜約５０％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５３％〜約５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、約６９％〜７０％、少なくとも約７２％〜７１％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％ファージゲノム内の遺伝子の少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９２％〜９０％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に欠失している。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がファージゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失はファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、欠失は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では最適な欠失、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、欠失に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが欠失している。いくつかの実施形態では、コード配列が欠失される。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、欠失が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がヘッドストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がテールストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失がカラーストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が外被構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がファージインサーションに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、欠失がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
【０１８６】
挿入
いくつかの実施形態では、挿入はファージゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、挿入をファージゲノムの調節領域に挿入する。いくつかの実施形態では、挿入物が１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約１〜５００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約５００〜１０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約２０００〜３０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約３０００〜４０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約４０００〜５０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入は、長さが少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約２０，０００〜２０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約７５，０００〜８０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約８０，０００〜８５，０００ｂｐを含む。少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐ、少なくとも約９５，０００〜１００，０００ｂｐ、少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐの長さ、  長さが少なくとも約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、長さ���少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、または長さが少なくとも約２００，０００ｂｐを超える。１つの特定の実施形態において、９６８７ｂｐ長さが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ内に位置する。ファージゲノムの少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約７５，０００〜８０，０００ｂｐ、少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、又はファージゲノムの少なくとも約２００，０００ｂｐ以上。１つの特定の実施形態において、９６８７ｂｐのファージゲノムが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約７〜６％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１１〜１１％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１５〜１４％、少なくとも約１５〜１６〜１７％、少なくとも約１８〜１７％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約３〜２４％内に位置するファージゲノムの２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が挿入を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が挿入を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が挿入を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がファージゲノムの中央に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、そして挿入は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では最適な挿入のための、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、挿入に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが挿入される。いくつかの実施形態では、コード配列が挿入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入された領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、挿入が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がヘッドストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がテールストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がカラーストラクチャーのポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が外被構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージインサーションに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
【０１９６】
逆位
いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの調節領域に反転される。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ、少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、少なくとも約８０，０００〜８５，０００ｂｐ、少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐ、少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、少なくとも約９５，０００〜１００，０００ｂｐを含む。少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、または少なくとも約２００，０００ｂｐ以上。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐが逆方向である。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ内に位置する。ファージゲノムの少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約７５，０００〜８０，０００ｂｐ、少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、又はファージゲノムの少なくとも約２００，０００ｂｐ以上。１つの特定の実施形態では、ファージゲノムの９６８７ｂｐが逆転している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、逆位は、少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約７〜６％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１１〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１５〜１４％、少なくとも約１５〜１６〜１７％、少なくとも約１８〜１７％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約３〜２４％内に位置する  ファージゲノムの２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が逆転している。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が逆位を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が逆位を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が逆位を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位がファージゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位はファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、逆位は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では最適な逆位、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、逆位に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節要素は逆になっている。いくつかの実施形態では、コード配列は反転している。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆方向領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、逆位が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がファージ逆位に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、反転が少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、逆位がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
【０２０６】
置換
いくつかの実施形態では、この置換はファージゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、置換はファージゲノムの調節領域に置換される。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の置換は、少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ、少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、少なくとも約８０，０００〜８５，０００ｂｐ、少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐ、少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、少なくとも約９５，０００〜１００，０００ｂｐを含む。少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、または少なくとも約２００，０００ｂｐ以上。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ内に位置する。ファージゲノムの少なくとも約７０，０００−７５，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約７５，０００−８０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約８５，０００−９０，０００  ｂｐ  ファージゲノムの少なくとも約９０，０００〜９５，０００，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約９５，０００〜１００，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、ファージゲノムの少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、またはファージゲノムの少なくとも約２００，０００ｂｐ��上。１つの特定の実施形態において、９６８７ｂｐのファージゲノムが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、置換は、少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約７〜６％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１１〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１８〜１７％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、ファージゲノムの２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が置換されている。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。．いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が置換を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が置換を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、置換は散在した位置のうちの１つ以上に位置する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では最適な置換のための、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、置換に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが置換されている。いくつかの実施形態では、コード配列が置換される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、置換が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージ置換に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換のうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせである。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードするヒンジ内に位置する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノム内のいずれかまたはそれ以上の宿主タンパク質内に位置する。
【０２１６】
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ中のファージ
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が操作された大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）である。本明細書中の実施例により詳細に記載されるように、日常的な試験手順は、エシェリヒア属ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（Ｅｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ；  Ｅｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）および関連する操作された誘導体からのバクテリオファージ製造を同定した。バクテリオファージの供給源を決定するために、Ｅｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅのゲノムの共同バイオインフォマティクス評価、および遺伝子操作された誘導体を実施して、プロファージのエビデンスについて株のゲノム配列を分析し、機能的ファージを産生する可能性について任意の同定されたプロファージ元素を評価し、任意の機能的ファージ元素を、細菌ゲノム配列の中で同定された他の公知のファージと比較し、そしてプロファージ元素が他の配列決定されたエシェリヒア属ｃｏｌｉ（Ｅｃｏｌｉ）ゲノムにおいて見出される周波数を評価した。評価ツールは、ファージ予測ソフトウェア（ＰＨＡＳＴおよびＰＨＡＳＴＥＲ）、ＳＰＡｄｅｓゲノムアセンブラソフトウェア、大きな参照ゲノム（ＢＷＡ  ＭＥＭ）に対する低分岐配列をマッピングするためのソフトウェア、ゲノム配列アラインメントソフトウェア（ＭＵＭｍｅｒ）、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）非冗長データベースを含んだ。評価結果は、分析された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された誘導体が３つのプロファージ元素（図１）を含み、３つのうちの２つ（ファージ２およびファージ３）がインタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含むことを示す（図２、図３および図４）。２つの他の可能なファージ元素（図５Ａおよび図５Ｂ）もまた同定された。注目すべきことに、操作された株は親Ｅｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅにおいて同定されなかったさらなるファージ元素を全く含まず、このことはこれらの株によって産生されるプラーク形成ユニットがこれらの内因性ファージの１つに由来することを示す。本明細書中に記載されるさらなる分析は、ファージ３をプラーク形成ファージ（ファージ３）として同定した。興味深いことに、ファージ３はほぼ６０００の配列決定された大腸菌ゲノムの集合の中で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに独特であるが、他の推定プロファージ元素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノム中に見出される。実施例においてより詳細に記載されるように、ファージ３は誘導性であるが、他のファージのいずれも誘導性ではなく、誘導に際して細菌溶解を生じることが見出された。
【０２１７】
プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、配列決定された大腸菌ゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均数と比較して、比較的少数のプロファージ配列を含む。このように、操作された株におけるプロファージの存在はこの種の自然状態の一部であり、そして分析された操作された株のプロファージの特徴は、前駆体株、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅと一致した。
【０２１８】
表Ｄは、ファージ３のゲノム内に含まれる遺伝子を列挙する。表Ｅ．ファージ３の配列を提供する。表Ｆは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３に含まれる遺伝子の配列を提供する。表Ｇは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３のゲノムによってコードされるポリペプチドの配列を提供する。
【０２１９】
［表Ｄ］ファージ３ゲノム
【表５−１】
2020525012.tif 000007
【表５−２】
2020525012.tif 000008
【表５−３】
2020525012.tif 000009
【表５−４】
2020525012.tif 000010
【表５−５】
2020525012.tif 000011
【表５−６】
2020525012.tif 000012
【表５−７】
2020525012.tif 000013
【０２２０】
［表Ｅ］ファージ３ゲノム配列
【表６−１】
2020525012.tif 000014
【表６−２】
2020525012.tif 000015
【表６−３】
2020525012.tif 000016
【表６−４】
2020525012.tif 000017
【表６−５】
2020525012.tif 000018
【表６−６】
2020525012.tif 000019
【表６−７】
2020525012.tif 000020
【表６−８】
2020525012.tif 000021
【表６−９】
2020525012.tif 000022
【表６−１０】
2020525012.tif 000023
【表６−１１】
2020525012.tif 000024
【表６−１２】
2020525012.tif 000025
【０２２１】
［表Ｆ］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのファージ３に含まれる遺伝子の配列
【表７−１】
2020525012.tif 000026
【表７−２】
2020525012.tif 000027
【表７−３】
2020525012.tif 000028
【表７−４】
2020525012.tif 000029
【表７−５】
2020525012.tif 000030
【表７−６】
2020525012.tif 000031
【表７−７】
2020525012.tif 000032
【表７−８】
2020525012.tif 000033
【表７−９】
2020525012.tif 000034
【表７−１０】
2020525012.tif 000035
【表７−１１】
2020525012.tif 000036
【表７−１２】
2020525012.tif 000037
【表７−１３】
2020525012.tif 000038
【表７−１４】
2020525012.tif 000039
【表７−１５】
2020525012.tif 000040
【表７−１６】
2020525012.tif 000041
【表７−１７】
2020525012.tif 000042
【表７−１８】
2020525012.tif 000043
【０２２２】
［表Ｇ］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３のゲノムによってコードされるポリペプチド配列
【表８−１】
2020525012.tif 000044
【表８−２】
2020525012.tif 000045
【表８−３】
2020525012.tif 000046
【表８−４】
2020525012.tif 000047
【表８−５】
2020525012.tif 000048
【表８−６】
2020525012.tif 000049
【表８−７】
2020525012.tif 000050
【表８−８】
2020525012.tif 000051
【表８−９】
2020525012.tif 000052
【０２２３】
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は、大腸菌のＮｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つ以上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変がファージ３の特性または挙動を変化させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ３が溶解処理に入るか、または溶解処理を完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ３の溶解処理への進入能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを妨げる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、増大または減少させる）。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変更、例えば増大または減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を改善する。いくつかの実施形態では改変または突然変異がエフェクター機能に本質的に影響を及ぼさず、エフェクター機能は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株のエフェクター機能と本質的に同じである。いくつかの実施形態では、エフェクター回路が最初にゲノム中に操作され、次いでファージが改変される。いくつかの実施形態では、改変されたファージ３を有する新しい筐体がエフェクター機能の操作の前に生成される。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、細菌が少なくとも約１〜２、少なくとも約２〜３、少なくとも約３〜４、少なくとも約４〜５、少なくとも約５〜６、少なくとも約６〜７、少なくとも約７〜８、少なくとも８〜９、少なくとも９〜１０、少なくとも１０〜１１、少なくとも１１〜１２、少なくとも１３〜１４、少なくとも１３〜１４、少なくとも１４〜１５、少なくとも１５〜１６、少なくとも１７〜１８、少なくとも１７〜１８、少なくとも１９〜２０、少なくとも１９〜２０、少なくとも２０〜２１、少なくとも２１〜２２、少なくとも２２〜２３、少なくとも２３〜２４、少なくとも２４〜２５、少なくとも２５〜２６、少なくとも２６〜２７、少なくとも２７〜２８、少なくとも２８を含む。少なくとも約３０〜約２９、少なくとも約３０〜約３１、少なくとも約３０〜約３１、少なくとも約３２〜約３３、少なくとも約３４〜約３５、少なくとも約３６〜約３７、少なくとも約３８〜３９、少なくとも約３９〜４０、少なくとも約４０〜約４１、少なくとも４１〜４２、少なくとも約４３〜４４、少なくとも約４３〜４４、少なくとも約４５〜４６、少なくとも約４６〜４７、少なくとも約４７〜４８、少なくとも約４７〜４８、少なくとも約４９〜５０、少なくとも約４９〜５０、少なくとも約５０〜５１、少なくとも約５１〜５２、少なくとも約５２〜５３、少なくとも約５３〜５４、少なくとも約５４〜５５、少なくとも約５５〜５６、少なくとも約５６〜５７、少なくとも約５９〜５８、少なくとも約６０〜５９、少なくとも約６１〜６０、少なくとも約６３、少なくとも約６４〜６３、少なくとも約６４〜６５、少なくとも約６６〜６７、少なくとも約６７〜６８、少なくとも約６９〜７０、少なくとも約６９〜７０、少なくとも約７０〜７１、少なくとも約７２〜７３、少なくとも約７２〜７４、少なくとも約７４〜７５、少なくとも約７６〜７７、少なくとも約７６〜７７、少なくとも約７７〜７８、少なくとも約７７〜７８、少なくとも約７８〜７９、少なくとも約７９〜８０、少なくとも約８０〜８１、少なくとも約８１〜８２、少なくとも約８２〜８３、少なくとも約８３〜８４、少なくとも約８４〜８５、少なくとも約８４〜８５、少なくとも約８６〜８７、少なくとも約８６〜８７、少なくとも約８８〜８９、少なくとも約８８〜８９、少なくとも約８９〜９０、少なくとも約９０〜９１、少なくとも約９１〜９２、少なくとも約９２〜９３、少なくとも約９３〜９４、少なくとも約９４〜９５、少なくとも約９５〜９６、少なくとも約９６〜９７、少なくとも約９７〜９８、少なくとも約９８〜９９、少なくとも約９９〜１００、または少なくとも約１００以上の改変または変異。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ３溶解過程の進入または終了を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ３溶解処理の進入または終了を完全に減少させる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ３溶解処理の進入または終了を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％減少させる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが同じまたは異なった他の細菌に、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍感染することを防止する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が同じまたは異なった型の他の細菌に完全に感染することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が同じまたは異なる型の他の細菌に、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％感染することを防止する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、変更または突然変異がファージ変更を有さない同じ同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍変化させ、増加させ、または減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を有さない同じ同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％変更、増加または低減させる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、変更または突然変異がファージ変更を有さない同じ同質遺伝子株と比較して、所望のエフェクター機能（例えば、遺伝子操作された細菌の）を、例えば、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍、変化させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を伴わない同質遺伝子系統と比較して、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能、例えば、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％を改変する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内に１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列への１つ以上の挿入を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質カセットが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つ以上の位置に挿入され得る。いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内に１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内に１つ以上の逆位を含む。いくつかの実施形態では、逆位は特異的フリッパーゼによって支配され得る。複数のレベルの制御を含む例示的な回路は本明細書に例示されており、また、同時所有の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３９４３４にも記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の改変が１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム遺伝子内の２つ以上の挿入、欠失、置換、または逆位の組み合わせである。
【０２３３】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のフレームシフト突然変異を生じ得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のミスセンス突然変異を生じ得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のナンセンス突然変異を生じ得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の改変が１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム遺伝子内の２つ以上のフレームシフト、ナンセンスまたはミスセンス突然変異の組み合わせである。
【０２３５】
突然変異
いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約１〜５００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約５００〜１０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約２０００〜３０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約３０００〜４０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約４０００〜５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを変異させる。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、変異ヌクレオチドは連続している。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも約０．１〜約２％、少なくとも約１〜約２％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約５〜約６％、少なくとも約７〜約６％、少なくとも約７〜約８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜約１０％、少なくとも約１１〜約１２％、少なくとも約１３〜約１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜約１６，１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が変異される。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの９０〜１００％が変異している。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が変異される。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１％〜２％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％である。少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２５％〜約２６％、少なくとも約２５％〜約２５％、少なくとも約２８％〜約２９％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３２％〜約３３％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％少なくとも約４５％〜約４６％、少なくとも約４５％〜約４９％、少なくとも約５０％〜約５０％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５３％〜約５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、約６９％〜７０％、少なくとも約７２％〜７１％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の遺伝子の少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９２％〜９０％、少なくとも約９１％〜９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に変異している。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、突然変異は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、突然変異が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がヘッドタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がカラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が外被タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がファージインサーションに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子に位置しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入に関与するポリペプチドをコードする９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子をコードするポリペプチド、およびそれらの組み合わせを少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９。いくつかの実施形態では、この突然変異がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置し、それらを包含しない。
【０２４４】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０００５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１００９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１００に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２００を含むか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２００に配置されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３００に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５に位置する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター膜成分、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼＶ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ、ＤＮＡ切断再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンＤＮＡメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される１つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、機能不明ドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２のような蛋白質機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、１つ以上のマイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが変異される。
【０２４７】
一実施形態では、突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分突然変異である。具体的な一実施形態では、突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分突然変異である。１つの具体的な実施形態では、突然変異がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分突然変異との完全な突然変異である。一実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから変異される。一実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから変異される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０２４８】
欠失
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約１〜５００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約５００〜１０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約２０００〜３０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約３０００〜４０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約４０００〜５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の欠失は、少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが欠失される。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドは連続している。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、少なくとも約０．１〜約２％、少なくとも約１〜約２％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約３〜約４％、少なくとも約５〜約６％、少なくとも約７〜約６％、少なくとも約７〜約８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜約１０％、少なくとも約１１〜約１２％、少なくとも約１３〜約１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜約１６，１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％が欠失している。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内で部分的にまたは完全に欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が完全に欠失され、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失される。一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つの欠失が存在し、欠失の末端の１つまたは２つの遺伝子が部分的に欠失され、残りの遺伝子が完全に欠失される。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣り合っている。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態において、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１％〜２％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％である。少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２４％〜約２５％、少なくとも約２５％〜約２６％、少なくとも約２５％〜約２５％、少なくとも約２８％〜約２９％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３０％〜約３１％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３２％〜約３３％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％少なくとも約４５％〜約４６％、少なくとも約４５％〜約４９％、少なくとも約５０％〜約５０％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５１％〜約５２％、少なくとも約５３％〜約５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、約６９％〜７０％、少なくとも約７２％〜７１％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の遺伝子の少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９２％〜９０％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に欠失している。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、欠失は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０２５４】
いくつかの実施形態では最適な欠失、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌、例えば他の大腸菌株における他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３における相同な保存領域はこれらが保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、欠失に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが欠失している。いくつかの実施形態では、コード配列が欠失される。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、欠失が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のヘッドタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のテールタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のカラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の外被タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、欠失がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
【０２５９】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０１、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００６５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３００に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５に位置する。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の欠失が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５に位置する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター膜成分、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼＶ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ、ＤＮＡ切断再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンＤＮＡメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される１つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、機能不明ドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２のような蛋白質機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、１つ以上のマイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが欠失される。
【０２６２】
１つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが欠失される。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。一実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０２６３】
挿入
いくつかの実施形態では、挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、挿入を、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの調節領域に挿入する。いくつかの実施形態では、挿入されたポリヌクレオチドが１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約１〜５００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約５００〜１０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約１０００〜２０００年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約２０００〜３０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約３０００〜４０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約４０００〜５０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約２０，０００〜２０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、長さが少なくとも約７５，０００〜８０，０００ｂｐ、長さが少なくとも約８０，０００〜８５，０００ｂｐを含む。少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐ、少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐの長さ約１１０，０００〜１２０，０００ｂｐの長さ、少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐの長さ、少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐの長さ、少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐの長さ、少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐの長さ、または少なくとも約２００，０００ｂｐ以上の長さ。１つの特定の実施形態において、少なくとも約９６８７ｂｐの長さが挿入される。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ内に位置する。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約７〜６％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１１〜１１％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１５〜１４％、少なくとも約１５〜１６〜１７％、少なくとも約１８〜１７％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約３〜２４％内に位置する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が挿入される。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が挿入を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が挿入を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が挿入を含む。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、そして挿入は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０２６８】
いくつかの実施形態では最適な挿入、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、挿入に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが挿入される。いくつかの実施形態では、コード配列が挿入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入された領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、挿入が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がヘッドタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がカラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が外被タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージインサーションに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
【０２７３】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０００５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００５０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００５５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１００９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入がＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５に配置される。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター膜成分、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼＶ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ、ＤＮＡ切断再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンＤＮＡメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される１つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、機能不明ドメイン（ＤＵＦ４２２２）；  ＤＮＡリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２のような蛋白質機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、１つ以上のマイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、１つ以上の挿入を含む。１つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、１つ以上の挿入を含む。
【０２７６】
一実施形態では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数が挿入を含む。
【０２７７】
逆位
いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、逆位を大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの調節領域に逆さまにする。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、少なくとも約１５，０００〜２０，０００ｂｐ、少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ、少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、または少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐを含む。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐが逆方向である。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、大大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ内に位置する。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、逆位は、少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約７〜６％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１１〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１５〜１４％、少なくとも約１５〜１６〜１７％、少なくとも約１８〜１７％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約３〜２４％内に位置する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が逆転している。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が逆位を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が逆位を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が逆位を含む。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、逆位は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では最適な逆位、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、逆位に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節要素は逆になっている。いくつかの実施形態では、コード配列は反転している。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆方向領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、逆位が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がヘッドタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異がカラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異が外被タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がファージ逆位に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、反転が少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、逆位がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
【０２８７】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、逆位は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０１、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００６５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３００に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５に位置する。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の逆位が（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５に位置する。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター膜成分、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼＶ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ、ＤＮＡ切断再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンＤＮＡメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される１つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、機能不明ドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２のような蛋白質機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、１つ以上のマイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは反転される。１つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは反転される。
【０２９０】
一実施形態では、逆位がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分逆位である。具体的な一実施形態では、逆位がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分逆位である。１つの具体的な実施形態では、逆位がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分逆位との完全な逆位である。一実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから反転される。一実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから反転される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０２９１】
置換
いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの調節領域に置換される。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１０００〜２０００年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の置換は、少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、少なくとも約４０，０００〜４５，０００ｂｐ、少なくとも約５０，０００〜５５，０００ｂｐ、少なくとも約６０，０００〜６５，０００ｂｐ、少なくとも約６５，０００〜７０，０００ｂｐ、少なくとも約７０，０００〜７５，０００ｂｐ、少なくとも約８０，０００〜８５，０００ｂｐ、少なくとも約８５，０００〜９０，０００ｂｐ、少なくとも約９０，０００〜９５，０００ｂｐ、少なくとも約９５，０００〜１００，０００ｂｐを含む。少なくとも約１００，０００〜１１０，０００ｂｐ、少なくとも約１２０，０００〜１３０，０００ｂｐ、少なくとも約１３０，０００〜１４０，０００ｂｐ、少なくとも約１４０，０００〜１５０，０００ｂｐ、少なくとも約１５０，０００〜２００，０００ｂｐ、または少なくとも約２００，０００ｂｐ以上。１つの特定の実施形態では、９６８７ｂｐが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５，０００〜６，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６，０００〜７，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７，０００〜８，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８，０００〜９，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９，０００〜１０，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０，０００〜１５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０，０００〜２５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５，０００〜３０，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０，０００〜３５，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３５，０００〜４０，０００ｂｐ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４５，０００〜５０，０００ｂｐ内に位置する。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５，０００〜６０，０００ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが１つの特定の実施形態において、９６８７ｂｐの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、置換は、少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約７〜６％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１１〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１８〜１７％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が置換されている。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が置換を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が置換を含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの開始または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの末端または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、そして置換は散在した位置の１つ以上に位置する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では最適な置換のための、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、置換に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが置換されている。いくつかの実施形態では、コード配列が置換される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換領域が溶解サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、置換が溶解遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換が構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の平板タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がバクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のポータルタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のインベルターゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のトランスポザーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のプライマーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージ置換に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が付着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がパッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換のうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせである。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
【０３００】
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
【０３０１】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０００５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００５０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００５５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１００９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３００に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５に配置される。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター膜成分、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼＶ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ、ＤＮＡ切断再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンＤＮＡメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される１つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、機能不明ドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２のような蛋白質機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、１つ以上のマイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、１つ以上の置換を含む。１つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質Ｕ、テールタンパク質、ＤＮＡ破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、キャプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、１つ以上の置換を含む。
【０３０４】
一実施形態では、置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全置換または部分置換である。特定の一実施形態では、置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な置換である。特定の一実施形態では、置換がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全置換、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分置換である。一実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから置換される。一実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから置換される。
【０３０５】
エフェクター分子およびペイロード発現の調節
いくつかの実施形態では、変異した内因性ファージを含む細菌細胞がペイロードをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体をさらに含み、その結果、ペイロードは宿主細胞において発現され得、そして宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培地において）および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、腫瘍微小環境において）生存および／または増殖し得る。いくつかの実施形態では、細菌セルが２つ以上の別個のペイロードまたはオペロン、例えば、２つ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞が３つ以上の異なるトランスポーターまたはオペロン、例えば、３つ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞が少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。
【０３０６】
一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含み、高フェニルアラニン血症を低減させることができる。
【０３０７】
フェニルアラニン代謝酵素の例には、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、ＬＡＡＤおよびＰＡＬは追加の補因子を全く必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子を必要としないことは、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素によるフェニルアラニン分解が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は１つ以上のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ；ＥＣ４．３．１．２４）は、Ｌ−フェニルアラニンをアンモニアおよびｔｒａｎｓ−ケイ皮酸に変換する反応を触媒する酵素である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｌ−Ｐｈｅに特異的であり、Ｌ−チロシンにはより低い程度で特異的である。ＰＡＬによって触媒される反応は、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸およびアンモニアを生じるためのＬ−フェニルアラニンの自然発生する、非酸化的脱アミノ化である。哺乳動物酵素（ＰＡＨ）と異なり、ＰＡＬは単量体であり、補因子を必要としない（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７年；８５：２７３〜８２頁．  Ａ  ｍｏｄｅｒｎ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ）。微生物において、それは、微生物が唯一の炭素および窒素源としてＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）を利用することを可能にする異化作用の役割を有する。一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＰＡＬ遺伝子を含む。ＰＡＬは、フェニルアラニンを非毒性レベルのｔｒａｎｓケイ皮酸およびアンモニアに変換することができる。ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸（ＴＣＡ）は、ＴＣＡ代謝産物である安息香酸および馬尿酸にさらに変換され得る（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００７年６月；４２（６）：８１１〜７頁；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ，ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｎｄ  ｈｉｐｐｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＧＣ−ＭＳ  ａｎａｌｙｓｉｓ）。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス、シュードモナス・アエルギノーザ、フォトラブダス・ルミネセンス、アナベナ・バリアビリス、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスを含む、細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はフォトラブダス・ルミネセンスである。いくつかの実施形態では、細菌種は、アナベナ・バリアビリスである。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、真核生物種、例えば、酵母種、植物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。複数の異なるＰＡＬタンパク質が当該分野において公知である。遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、ＰＡＬを含む遺伝子操作された細菌は、ＰＫＵを含む、高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アナベナ・バリアビリスＰＡＬ（「ＰＡＬ１」）を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フォトラブダス・ルミネセンスＰＡＬ（「ＰＡＬ３」）を発現する。目的のＰＡＬ配列の非限定的な例は表２に示される。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドおよび１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。ＬＡＡＤは、イミノ酸中間体を介してアンモニアおよび過酸化水素の産生と共に、立体特異的酸化、すなわち酸素を消費する、Ｌ−アミノ酸のα−ケト酸への脱アミノ化を触媒する。ＬＡＡＤは、ヘビ毒、および多くの細菌（Ｂｉｆｕｌｃｏら、２０１３年）、具体的にはプロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌の細胞膜に見出される。ＬＡＡＤ（ＥＣ  １．４．３．２）は二量体構造を有するフラビン酵素である。各サブユニットは、非共有結合フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子）を含有し、外部補因子を全く必要としない。プロテウス・ミラビリスは２種類のＬＡＡＤを含有する（ＤｕｅｒｒｅおよびＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ  １９７５年）。１つは広範な基質特異性を有し、脂肪族および芳香族Ｌ−アミノ酸のケト酸、典型的にはＬ−フェニルアラニンへの酸化を触媒する（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３５３８３．１）（Ｂａｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１年、５１、１２９〜１３５頁；「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」）。他の種類は塩基性Ｌ−アミノ酸に対して主に作用する（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６６９８１９．１）。細菌、真菌、および植物源由来のＬＡＡＤは、窒素源としてＬ−アミノ酸（すなわち、酵素活性によって産生されたアンモニア）の利用に関与するように見える。ほとんどの真核生物および原核生物のＬ−アミノ酸デアミナーゼは、膜結合型であるプロテウス種ＬＡＡＤ由来を除いて、細胞外に分泌される。プロテウス・ミラビリスにおいて、ＬＡＡＤは、酵素活性が存在する周辺質間隙に外側で面している細胞膜に位置することが報告されている（Ｐｅｌｍｏｎｔ  Ｊら、（１９７２年）「Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ５４：１３５９〜１３７４頁）。
【０３１１】
一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ遺伝子を含む。ＬＡＡＤはフェニルアラニンを非毒性レベルのフェニルピルベートに変換することができ、そのフェニルピルベートはまた、例えば肝臓酵素によってフェニルラクテートにさらに分解され得る。フェニルピルベートは血液脳関門を横切ることができず、ＬＡＡＤにより、別の潜在的に有毒な代謝産物の蓄積を可能にせずに脳内のフェニルアラニンのレベルを低減させることができる。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリスである。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ブルガリスである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はプロテウス・ミラビリスＬＡＡＤ酵素ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３５３８３．１を発現する。目的のＬＡＡＤ配列の非限定的な例は表２に示される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ酵素はヘビ毒に由来する。本発明によれば、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤ遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、ＬＡＡＤを含む遺伝子操作された細菌は、ＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は天然に存在するような野生型酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は野生型配列に対する突然変異を含む酵素をコードする。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の触媒活性を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表２に列挙されたタンパク質の１つまたは複数をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１〜８のいずれかの配列を含むポリペプチドの１つまたは複数をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１〜８の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、突然変異を含む、表２の１つまたは複数の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＰＡＨをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＰＡＨをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＰＡＬをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＰＡＬをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＬＡＡＤをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＬＡＡＤをコードする。所望の特性を有する酵素をスクリーニングする方法は、当該分野において公知であり、本明細書に記載される。
【０３１３】
［表２］フェニルアラニン代謝酵素の配列
【表９−１】
2020525012.tif 000053
【表９−２】
2020525012.tif 000054
【表９−３】
2020525012.tif 000055
【０３１４】
ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、またはＰＡＨ遺伝子（群）は、遺伝子操作された細菌におけるプラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子配列（群）は１つ以上の構成的プロモーター（複数可）の制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、本明細書に記載されているような外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物の存在下などの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、低酸素、微好気的、または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、ＰＭＥ遺伝子、例えばＰＡＬ遺伝子の発現は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的環境下で活性される。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は哺乳動物の消化管内のような低酸素または嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は、胃、十二指腸および回腸を含むがそれらに限定されない近位の腸内において見出されるような酸素が供給された状態、低酸素状態、または微好気性状態によって直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＭＥポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は、哺乳動物の消化管内に天然に存在する環境因子によって直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管内に天然には存在しない環境因子、例えばアラビノースまたはＩＰＴＧによって直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、炎症状態下で哺乳類の消化管内に天然に存在する環境因子によって直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は同一プロモーターまたは同一プロモーターの異なるコピーの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は異なるプロモーターの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該ＰＡＬ遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該ＬＡＡＤ遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該ＬＡＡＤ遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該ＰＡＬ遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含むことができ、当該遺伝子配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあることができ、Ｐａｌおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子配列を制御するプロモーターと同じまたは異なるプロモーターであることができる。
【０３１６】
他の実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは複数のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；すなわち、１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列が誘導性プロモーターの制御化で発現し、当該誘導性プロモーターは、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器内における細菌増殖中に、細菌の培養物中に与えられる特定の分子もしくは代謝産物、温度、酸素レベル、または他のパラメータに応答する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは複数のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、低酸素または嫌気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは複数のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は好気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは複数のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、微好気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは複数のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、アラビノースの存在下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは複数のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列はＩＰＴＧの存在下で発現される。
【０３１７】
ペイロード（および／または目的のポリペプチドおよび／または目的のタンパク質および／または治療用ポリペプチドおよび／または治療方法タンパク質および／または治療用ペプチドおよび／またはエフェクターおよび／またはエフェクター分子）は、本明細書に記載の代謝産物のいずれか、および／またはこのようなエフェクター分子の作製または異化のための酵素として機能する酵素またはポリペプチドのいずれかを含む。エフェクター分子およびペイロードには抗癌分子、免疫調節因子，消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症分子、満腹分子または神経調節エフェクターが含まれるが、これらに限定されない。ペイロードの非限定的な例は係属中の同時所有国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００、出願０５／２５／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、出願０１／１１／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３、出願０２／０４／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３、出願０２／１０／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２、出願０７／２９／０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１、出願０８／３１／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８、出願０６／１０／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２、出願１２／２８／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（これらの含有量は参照により本明細書に援用される）。
【０３１８】
本明細書中で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的の遺伝子配列」という語は抗癌分子、免疫調節因子，消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症分子、満腹分子またはエフェクター、本明細書中に記載される神経調節分子、例えば、キヌレニナーゼ、トリプトファン産生酵素、トリプトファン分解酵素、１つ以上のキヌレニン産生酵素、セロトニンまたはメラトニン産生または分解酵素、インドール代謝産物産生または分解酵素（本明細書中に記載される）ＫＰ代謝産物産生または分解酵素をコードする任意のまたは複数の遺伝子配列および／または遺伝子カセット、ならびに１つ以上のエフェクター分子およびペイロードをコードする任意のまたは複数の遺伝子配列または遺伝子カセットを含むが、これらに限定されない。関心のある追加の遺伝子の非限定的な例は、係属中の同時所有国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００、出願０５／２５／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、出願０１／１１／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３、出願０２／０４／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３、出願０２／１０／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２、出願０７／２９／０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１、出願０８／３１／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８、出願０６／１０／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２全体を参照する。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が同じペイロード遺伝子の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、そして直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書中に記載される別の化学物質もしくは栄養性誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、そして直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、そして構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体中に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書中に記載される別の化学物質もしくは栄養性誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上のペイロードを含み、その全てが染色体上に存在する。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌が２つ以上のペイロードを含み、その全ては１つ以上の同じまたは異なったプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上のペイロードを含み、そのうちのいくつかは染色体上に存在し、そのうちのいくつかは１つ以上の同じまたは異なったプラスミド上に存在する。
【０３２２】
上記の核酸の実施形態のいずれかにおいて、目的のポリぺポリペプチドの組み合わせを産生するための１つ以上のペイロードは、１つ以上の直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードが外因性環境条件（例えば、消化管、腫瘍微小環境、または他の組織特異的条件において見出される条件）下で誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードが消化管、腫瘍微小環境、または他の特異的条件において見出される代謝産物によって誘導される、直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペイロードが低酸素または嫌気性条件下でを誘発する直接的または間接的な誘導性プロモーターに動作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードが本明細書中に記載されるように、炎症性条件下で誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーター（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードが免疫抑制条件下（例えば、本明細書中に記載されるように、腫瘍または他の特異的組織において見出されるよう）で誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では２つ以上の遺伝子配列が化学物質または栄養性誘導物質への曝露によって誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーターに連結され、これはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で存在しても存在しなくてもよく、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件（株培養、増殖、産生など）、例えばテトラサイクリンまたはアラビノース、または本明細書中に記載される他のもの間に存在してもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のペイロードはすべて構成的プロモーターにリンクされる。
【０３２３】
非限定的な例では、遺伝子操作された細菌が２つのペイロードを含むことができ、そのうちの１つは構成的プロモーターにリンクされ、そのうちの１つは直接または間接的に誘導性プロモーターにリンクされる。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌が３つのペイロードを含むことができ、そのうちの１つは構成的プロモーターにリンクされ、そのうちの１つは直接的または間接的に誘導性プロモーターにリンクされ、そのうちの１つは第２の別の直接的または間接的に誘導性プロモーターにリンクされる。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、プロモーターが本明細書中に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ状態（例えば、消化管）で誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが本明細書中に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件（例えば、種々の細胞培養および／または細胞製造条件）下で誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ条件（例えば、本明細書中に記載されるような消化管）下、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件（例えば、本明細書中に記載されるような種々の細胞培養および／または細胞産生および／または製造条件）下で誘導される。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターが外因性環境条件（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件下）によって直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターが外因性環境条件（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／または作製／製造条件下）によって間接的に誘導される。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、プロモーターが哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが腫瘍および／または哺乳動物の小腸の低酸素環境に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが低酸素または嫌気性条件（例えば、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物の消化管の環境）によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが腫瘍、特定の組織、または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。
【０３２７】
ＦＮＲ依存性調節
遺伝子操作された細菌は目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み、ここで、この遺伝子または遺伝子カセットは、外因性環境条件によって制御される直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では誘導性プロモーターは酸素レベル依存性プロモーターであり、目的のポリぺプチドは低酸素、微好気性、または嫌気性条件において発現される。例えば、低酸素状態において、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写因子によって活性化され、それによって、目的のポリぺプチドの作製を駆動する。
【０３２８】
細菌は、酸素レベルを検知することができる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路は異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。酸素レベル依存性プロモーターは、１つまたは複数の酸素レベル検知転写因子が結合できる核酸配列であり、対応する転写因子の結合および／または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性プロモーターの制御下でペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。より具体的な態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素環境または嫌気性環境、例えば、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物の消化管の環境、および／または他の特定の組織などで活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下でペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。
【０３２９】
特定の実施形態では、細菌細胞がフマル酸および硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。大腸菌では、ＦＮＲが好気性代謝から嫌気性代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７）。嫌気性では、嫌気性増殖への適応に関与する数百の遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気状態では、ＦＮＲは酸素によって二量体化することが妨げられ、不活性である。ＦＮＲ応答性プロモーターは以下の表３に列挙されるＦＮＲ応答性プロモーターを含むが、これに限定されない。下線を引いた配列は予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングのために使用される制限部位である。
【０３３０】
ＦＮＲプロモーター配列は当該分野で公知であり、そして任意の本発明ＦＮＲプロモーター配列が、遺伝子操作された細菌において使用され得る。任意の適切なＦＮＲプロモーターは、任意の適切なペイロードと組み合わされてもよい。
【０３３１】
［表３］ＦＮＲプロモーター配列
【表１０−１】
2020525012.tif 000056
【表１０−２】
2020525012.tif 000057
【表１０−３】
2020525012.tif 000058
【０３３２】
非限定的なＦＮＲプロモーター配列は、ＦＮＲ応答性プロモーター配列を含む例示的な調節領域配列の核酸配列を示す表３に提供される。下線を引いた配列は予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングのために使用される制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌が配列番号：１Ａ、配列番号：２Ａ、配列番号：３Ａ、配列番号：４Ａ、配列番号：５Ａ、配列番号：６Ａ、配列番号：７Ａ、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号：８Ａ）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号：９Ａ）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号：１０Ａ）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号：１１Ａ）、強力なリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号：１２Ａ）、強力なリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号：１３Ａ）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導された小ＲＮＡ遺伝子（配列番号：１４ＡまたはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号：１５Ａ）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号：１６Ａ）、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号：１７Ａ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターが配列番号１Ａ〜１７Ａのいずれか１つの配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、複数別個の核酸配列が遺伝子操作された細菌に挿入される。代わりの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が代替酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７））の制御下で発現されるペイロード（例えば、ＰＭＥ（例えば、ＰＡＬ））をコードする遺伝子を含む。これらの実施形態において、ペイロード遺伝子の発現は低酸素または嫌気性環境（例えば、消化管）において特に活性化される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現が当該分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化することおよび／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることによって、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物の消化管はヒト哺乳動物の消化管である。
【０３３４】
任意の適切なＦＮＲプロモーターは、任意の適切なＰＡＬと組み合わせることができる。非限定的なＦＮＲプロモーター配列は、表３に提供され、そして非限定的なＰＡＬ配列もまた、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態では本発明の遺伝子操作された細菌がＷＯ２０１７０８７５８０に開示される以下の配列番号のうちの１つ以上を含み、その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される：配列番号９、配列番号１０、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号１１）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１２）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号１３）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号１４）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｙｄｆＺプロモーター（配列番号１６）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導された低分子ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号９またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号１７）、ｃｒｐ結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号１８）、およびｃｒｐ結合部位に融合されたｆｎｒＳ（配列番号１９）のうちの１つ以上を含む。
【０３３５】
別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元の嫌気的調節転写調節因子（ＡＮＲ）の嫌気性調節の制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）において、ＡＮＲは、「酸素制限または嫌気的条件下で誘導可能な生理学的機能の発現に必要とされる」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年；Ｓａｗｅｒｓ  １９９１年）。シュードモナス・アエルギノーザＡＮＲは大腸菌ＦＮＲと相同であり、「コンセンサスＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）はＡＮＲおよびＦＮＲによって効率的に認識された」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気的状態において、ＡＮＲは嫌気的増殖に対する適応を担う多数の遺伝子を活性化する。好気的状態において、ＡＮＲは不活性である。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、およびシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）の全てはＡＮＲの機能的類似体を有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９１年）。ＡＮＲによって調節されるプロモーター、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモーターは当該分野において公知である（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年を参照のこと）。
【０３３６】
ＦＮＲファミリーはまた、「シュードモナス・アエルギノーザの嫌気的硝酸塩呼吸」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）のためにＡＮＲと併せて必要とされる転写調節因子である、異化型硝酸塩呼吸調節因子（ＤＮＲ）（Ａｒａｉら、１９９５年）も含む。特定の遺伝子について、ＦＮＲ結合モチーフは、「おそらくＤＮＲによってのみ認識される」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）。外因性環境条件および対応する調節領域によって制御される任意の適切な転写調節因子が使用され得る。非限定的な例には、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／Ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／Ｃ、およびＡｉｒＳＲが含まれ、その他は当該分野において公知である。
【０３３７】
他の実施形態では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列（例えば、ＰＡＬなどのＰＭＥ）は、転写活性化因子、例えばＣＲＰについての結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。ＣＲＰ（環状ＡＭＰ受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質すなわちＣＡＰ）は、グルコースなどの急速に代謝可能な炭水化物が存在する場合、あまり有益ではない炭素源の取り込み、代謝、および同化を担う遺伝子を抑制することによって細菌において主要な調節的役割を果たす（Ｗｕら、２０１５年）。グルコースに対するこの選好性は、グルコース抑制、および炭素カタボライト抑制と呼ばれている（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８年；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８年）。いくつかの実施形態では、ペイロード分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、ＣＲＰ結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ペイロードのための１つまたは複数の遺伝子配列は、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲプロモーターによって制御される。これらの実施形態では、環状ＡＭＰは、グルコースが環境中に存在しない場合にＣＲＰに結合する。この結合により、ＣＲＰの立体配座変化が引き起こされ、ＣＲＰがその結合部位に強く結合することを可能にする。次いで、ＣＲＰ結合は、直接的タンパク質間相互作用を介してＦＮＲプロモーターに対してＲＮＡポリメラーゼを動員することにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下で、環状ＡＭＰはＣＲＰに結合せず、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写が抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子についての結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）は、例えば、グルコースをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地に添加することによって十分な量のグルコースが存在する場合に、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが嫌気的条件下で発現されないこと確実にするために使用される。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が細菌の種々の種、株、または亜株由来の酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が細菌の種々の種、株、または亜株由来の酸素レベル感知転写因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が細菌の異なった種、株、または亜株からの酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種酸素量依存性転写調節因子および／またはプロモーターは同じ条件下での細菌中の天然遺伝子およびプロモーターと比較して、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、低酸素または嫌気性環境中でペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列）の転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素量依存性転写調節因子がＮｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は無傷のままであり、野生型活性を保持する。代わりの実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または変異させて、野生型活性を減少または排除する。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が野生型酸素量依存性転写調節因子（例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ）、および同じ亜型の細菌由来の野生型プロモーターと比較して変異した対応するプロモーターを含む。変異プロモーターは同じ条件下で野生型プロモーターと比較して、低酸素または嫌気性環境において、野生型転写調節因子への結合を増強し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、ペイロードをコードする遺伝子）の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が野生型酸素量依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲプロモーター）、および同じ亜型の細菌由来の野生型転写調節因子と比較して変異した対応する転写調節因子を含む。変異転写調節因子は同じ条件下で野生型転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気性環境において、野生型プロモーターへの結合を増強し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、ペイロードをコードする遺伝子）の転写を増加させる。特定の実施形態では、変異体酸素レベル依存性転写調節因子が二量化およびＦＮＲ活性を増強するアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、（２００６）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子および対応するプロモーターの両方を、低酸素条件中のペイロードの発現を増大させるために、同じ亜型の細菌由来の野生型配列に対して変異させる。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、細菌細胞が酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子（例えば、ＦＮＲ遺伝子）の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が種々のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が同じプラスミド上に存在する。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が種々の染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が同じ染色体上に存在する。場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることが有益であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現がペイロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現がペイロードの発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびペイロードがプロモーター領域から分岐して転写される。
【０３４２】
酸素レベル非依存性誘導性プロモーター
ＦＮＲＳ２４Ｙを含むシステムなどの酸素レベル非依存性誘導性プロモーターシステムはＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願、ＷＯ２０１７０８７５８０として公開）に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０３４３】
酸素レベルに応答して誘導されるプロモーターに加えて、ＰＭＥ遺伝子および／またはＰｈｅトランスポーター遺伝子は、反応性窒素種の存在下または反応性酸素種の存在下などの炎症状態に応答して誘導されるプロモーターによって調節することができる。そのような誘導性プロモーターの例は共同出願中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５０８３６、２０１６年９月８日に提出されたものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０３４４】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、酸素独立プロモーターの制御下で１つ以上のＰＭＥおよび／または１つ以上のｐｈｅトランスポーターを含む遺伝子操作された細菌物は、１つ以上のバクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。
【０３４５】
いくつかの実施形態ではのいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が１つ以上の大腸菌を含み、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０から選択される１つ以上の遺伝子を含む。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。ファージ３ゲノム。一実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０３４６】
ＲＮＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的に操作されたウイルスが誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、炎症状態によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態において、ペイロードを産生するための遺伝子は炎症性環境（例えば、反応性窒素種またはＲＮＳプロモーター）において活性化される炎症性依存性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも１つの反応性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。好適なＲＮＳ誘導性プロモーター（例えば、反応性窒素種によって誘導可能）は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願１１／１６／２０１６）に記載され、ＷＯ２０１７０８７５８０（公開ＷＯ２０１７／１２３６７５）として公開され、その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０３４７】
ＲＯＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルスが誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞障害の条件下で活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態において、ペイロードを産生するための遺伝子は細胞または組織損傷が存在する環境（例えば、反応性酸素種またはＲＯＳプロモーター）において活性化される細胞損傷依存性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも１つの反応性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。適当なＲＯＳ誘導性プロモーター、例えば、反応性酸素種による誘導性は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、出願０１／１１／２０１７、ＷＯ２０１７／１２３６７５、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２、出願−５／１３／２０１６、ＷＯ２０１６１８３５３１として公開され、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９、出願１１／１６／２０１６として公開され、ＷＯ２０１７０８７５８０として公開されている。
【０３４８】
［表１７］例示的なＯｘｙＲにより調節される調節領域のヌクレオチド配列
【表１１】
2020525012.tif 000059
【０３４９】
いくつかの実施形態では、調節領域配列が配列番号１８Ｃ、配列番号１９Ｃ、配列番号２０Ｃ、および／または配列番号２１Ｃの配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
【０３５０】
プロピオナートおよび他のプロモーター
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が環境（例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物の消化管）における特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される１つ以上のペイロード遺伝子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。例えば、短鎖脂肪酸プロピオネートは消化管に局在する主要な微生物発酵代謝産物である（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら、２０１１）。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセッテがプロピオン酸誘導性プロモーターの制御下にある。より具体的な実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセッテが哺乳動物の消化管中のプロピオン酸の存在によって活性化されるプロピオン酸誘導性プロモーターの制御下にある。健康および／または疾患で哺乳動物の消化管中に見出される任意の分子または代謝産物が、ペイロード発現を誘導するために使用され得る。誘導物質の非限定的な例としては、プロピオン酸塩、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血中凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋肉、および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニア、およびマンガンが挙げられる。代わりの実施形態では、治療用ポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが糖アラビノースの存在下で活性化されるｐＡｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットがプラスミド上に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが染色体中に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットがプラスミド上に存在し、そして腫瘍および／または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが染色体上に存在し、そして腫瘍および／または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが染色体上に存在し、そしてテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットがプラスミド上に存在し、そしてテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、遺伝子発現が当該分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることによって、さらに最適化される。ＲＢＳの微調整および最適化のためのバイオインフォマティクスツールは、当技術分野で知られている。
【０３５３】
本明細書中上記（および本明細書中の他の場所）に記載される実施形態のいずれかにおいて、操作された細菌は、本明細書中に議論されるプロモーターのいずれかの制御下で、１つ以上の遺伝子配列をコードする遺伝子配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が目的のポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、その結果、この遺伝子または遺伝子カセットは宿主細胞において発現され得、そしてこの宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培地において）および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、消化管または腫瘍微小環境において）生存および／または成長し得る。いくつかの実施形態では、細菌が目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの多数のコピーを含み得る。ペイロードを産生するためのいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセッテが低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドが発現の安定性を増加させるために有効であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドが非誘導条件下で漏出発現を減少させるのに有効であり得る。目的のポリぺプチドを産生するためのいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットが高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドが遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるのに役立ち得る。目的のポリぺプチドを産生するためのいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットが染色体上で発現される。
【０３５４】
他の誘導性プロモーター
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、そして１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子が染色体中に存在し、そして１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、細菌細胞が目的のポリペプチドをコードする、１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能な、１つ以上の遺伝子配列を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、その結果、目的のポリペプチドが宿主細胞中で発現され得、そして宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培地中で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、腫瘍中で、または消化管中で）生存および／または成長し得る。いくつかの実施形態では細菌細胞が目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列の２つ以上の異なるコピーを含み、これはプロモーター誘導性の１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって制御される。いくつかの実施形態ではこの遺伝子操作された細菌が目的のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列の多数のコピーを含み、これは１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能なプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列がプラスミド上に存在し、そして１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能な直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列が染色体上に存在し、そして直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列が１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される目的のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列がプラスミド上に存在し、そして１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって直接的または間接的に誘導可能なプロモーターａに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、細菌細胞が目的のポリペプチドが宿主細胞において発現され得るように、１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、そして宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培養条件下で、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、消化管または腫瘍微小環境において）生存および／または増殖することができる。いくつかの実施形態では細菌細胞が目的のポリぺプチドの産生のための２つ以上の遺伝子配列を含み、そのうちの１つ以上は１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される、目的のポリぺポリペプチドの産生のための同じ遺伝子配列の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態ではこの遺伝子操作された細菌が目的のポリペプチドの製造のための種々の遺伝子配列の多数のコピーを含み、そのうちの１つ以上は１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの製造のための遺伝子配列がプラスミド上に存在し、そして１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの製造のための遺伝子配列が染色体中に存在し、そして１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上の異なるＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は同じＰＡＬ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気条的件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、ＩＰＴＧまたは別のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、ＩＰＴＧまたは別のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤが宿主細胞において発現され得、宿主細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば培地中、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば消化管中で生存および／または増殖できるように、ＬＡＡＤ遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上の異なるＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は同じＬＡＡＤ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導可能であるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、ＩＰＴＧまたは他のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、ＩＰＴＧまたは他のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。
【０３６０】
ＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ）を含む細菌のこれらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列をさらに含むことができ、当該Ｐｈｅトランスポーター遺伝子配列はプラスミドまたは染色体上に存在することができる。当該プラスミドまたは染色体は、ＰＭＥ遺伝子の存在するものとは、同一または異なりることができる。Ｐｈｅトランスポーター遺伝子配列は、ＰＭＲ遺伝子配列と同一または異なるプロモーターの制御下にあり得る。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ、および異なる細菌種由来の対応するプロモーターを含む。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばＰＡＬまたはＰＡＨの転写を、低酸素または嫌気的環境において、同じ条件下の細菌における天然の転写調節因子およびプロモーターと比較して増加させる。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばＰＡＬまたはＰＡＨの転写を、低酸素または嫌気的環境において、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して増加させる。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばＰＡＬまたはＰＡＨの転写を、低酸素または嫌気的環境において、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して増加させる。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、酸素レベル検知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は同じ染色体上に存在する。
【０３６３】
一実施形態において、ＬＡＡＤ発現は、ＰａｒａＢＡＤｐｒｏｍｏｔｅｒの制御下にある。一実施形態では、ＬＡＡＤ発現が好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態において、ＰＡＬ発現は、ＰａｒａＢＡＤｐｒｏｍｏｔｅｒの制御下にある。一実施形態では、ＰＡＬ発現が好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態ではＰＡＬ発現が嫌気性または低酸素条件下で起こり、ＬＡＤＤ発現は好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態において、ＰＡＬ発現は嫌気性または低酸素条件下で生じ、ＬＡＤＤ発現はＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下である。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチド（例えば、ＰＡＬおよびＬＡＡＤ遺伝子）を産生するための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットが存在し、そして各々の遺伝子は種々のプロモーター（例えば、この段落および本明細書中の他の箇所において議論されるプロモーターのいずれか）の制御下で発現される。
【０３６５】
いくつかの実施形態では１つ以上のＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子）はアラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では１つ以上のＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子）はＩＰＴＧまたは他のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では１つ以上のＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子）はラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では１つ以上のＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子）は非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターが１つ以上の栄養および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性プロモーターが目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために有益であるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが１つ以上の抗癌、満腹、消化管障壁向上剤、免疫調節および／または神経調節分子および／または目的の他のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のポリペプチドおよび／または目的の他のポリペプチドの発現がｉｎ  ｖｉｖｏで１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが遺伝子操作された細菌と同時投与される化学物質および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。
【０３６８】
目的の１つ以上のポリペプチドおよび／または目的の他のポリペプチドのいくつかの実施形態では、発現はｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または製造の間に、化学的および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導される１つ以上のプロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、化学物質および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが発現を誘導し、そして投与の前に目的のポリペプチドおよび／または他の目的のポリペプチドを細菌にプレロードするために、細菌培養物中に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、化学物質および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導される培養物を好気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、化学物質および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
【０３６９】
アラビノース代謝の遺伝子は、ＰＡｒａＢＡＤプロモーターによって制御される１つのオペロン、ＡｒａＢＡＤにおいて組織化される。ＰＡｒａＢＡＤ（またはＰａｒａ）プロモーターは、誘導性発現系の基準を適切に満たす。ＰＡｒａＢＡＤは多くの他の系よりも、ペイロード遺伝子発現の厳密な制御を示すが、これはおそらく、誘導物質およびリプレッサーの両方として機能するＡｒａＣの二重調節のためである。さらに、ＰａｒａＢＡＤベースの発現のレベルは、幅広いＬ−アラビノース濃度にわたって、微調整する発現レベルの積載量に調節することができる。しかし、サブ飽和Ｌ−アラビノース濃度に曝露された細胞集団は誘導細胞および非誘導細胞の２つの亜集団に分けられ、これは、Ｌ−アラビノーストランスポーターの利用能における個々の細胞間の差異によって決定される（Ｚｈａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｒａｂｉｎｏｓｅ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ誘導物質Ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ；  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２年８月、第７８巻、第１６  ５８３１−５８３８号）。あるいは、ＰａｒａＢａｄからの誘導性発現が本明細書中に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化を通して制御または微調整され得る。
【０３７０】
一実施形態において、目的の１つ以上のポリペプチド（例えば、１つ以上の治療用ポリペプチド）の発現は、１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために有益であるか、またはその間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏで１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターがアラビノースなどの遺伝子操作された細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて発現を誘導し、投与前に細菌にペイロード（例えば、アラビノース）をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、アラビノースによって誘導される培養物を好気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、アラビノースによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
【０３７３】
一実施形態において、アラビノース誘導性プロモーターは第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では２つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、アラビノース誘導性プロモーターは第１のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第２のプロモーターは第２のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件が２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器（例えば、アラビノースおよびＩＰＴＧ）中での培養物の調製の間）であり得る。別の非限定的な例では、第１の誘導条件が例えばアラビノース存在を含む培養条件であってもよく、第２の誘導条件はｉｎ  ｖｉｖｏ条件であってもよい。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアラビノースプロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質がアラビノースオペロンにノックインされ、そして天然のアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２３の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性構築物が目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写されるＡｒａＣをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２４の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２５の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がラムノース誘導系を介して誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。遺伝子ｒｈａＢＡＤは、ｒｈａＰ  ＢＡＤプロモーターによって制御される１つのオペロンに組織化される。ｒｈａＰ  ＢＡＤプロモーターは２つの活性化因子、ＲｈａＳおよびＲｈａＲによって調節され、対応する遺伝子はｒｈａＢＡＤの逆方向に分岐転写される１つの転写ユニットに属する。Ｌ−ラムノースの存在下で、ＲｈａＲはｒｈａＰ  ＲＳプロモーターに結合し、ＲｈａＲおよびＲｈａＳの産生を活性化する。次いで、ＲｈａＳはＬ−ラムノースと共にｒｈａＰ  ＢＡＤおよびｒｈａＰ  Ｔプロモーターに結合し、構造遺伝子の転写を活性化する。アラビノースシステムとは対照的に、アラビノースシステムではＡｒａＣが提供され、遺伝子配列において多様に転写されるが、染色体から発現される量は多コピープラスミド上でさえ転写を活性化するのに充分であるため、ラムノース発現システムにおいて調節タンパク質をより大量に発現させる必要はない。従って、ｒｈａＰ  ＢＡＤプロモーターのみが、発現されるべき遺伝子の上流にクローニングされる。ｒｈａＢＡＤ転写の完全な誘導はまた、カタボリット抑止の重要な調節因子であるＣＲＰ−ｃＡＭＰ複合体の拘束を必要とする。あるいは、ｒｈａＢＡＤからの誘導性発現が本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化によって制御または微調整することができる。一実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。一実施形態では、積載量の発現がラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために有益であるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏで１つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが、遺伝子操作された細菌と同時投与される分子（例えば、ラムノース）によって直接的または間接的に誘導される。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて発現を誘導し、投与前に細菌にペイロード（例えば、ラムノース）をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ラムノースによって誘導される培養物が無菌的に増殖される。いくつかの実施形態では、ラムノースによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
【０３８０】
一実施形態において、ラムノース誘導性プロモーターは第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では２つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、ラムノース誘導性プロモーターは第１のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第２のプロモーターは第２のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件が２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器（例えば、ラムノースおよびアラビノース）中での培養物の調製の間）であり得る。別の非限定的な例では第１の誘導条件が例えば、ラムノース存在を含む培養条件であってもよく、第２の誘導条件はｉｎ  ｖｉｖｏ条件であってもよい。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のラムノースプロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質および／または転写調節因子（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の発現を駆動する。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２６の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導系またはＬａｃプロモーターからの転写を誘導する他の化合物を介して誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。ＩＰＴＧは、ｌａｃオペロンの転写を活性化するラクトース代謝産物であるアロラクトースの分子模倣物である。アロラクトースとは対照的に、ＩＰＴＧ中の硫黄原子は非加水劣化性化学ブロンドを産生し、これは、ＩＰＴＧの劣化を防止し、濃度を一定に保つことを可能にする。ＩＰＴＧはｌａｃリプレッサーに結合し、アロステリック様式でｌａｃオペレーターから四量体リプレッサー（ｌａｃＩ）を放出し、それによってｌａｃオペロン中の遺伝子の転写を可能にする。ＩＰＴＧは大腸菌によって代謝されないので、その濃度は一定のままであり、Ｌａｃプロモーター制御の発現速度は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で厳密に制御される。ＩＰＴＧ吸気は、他の輸送経路も関与するので、ラクトース透過酵素の動作に依存しない。ＰＬａｃからの誘導性発現は本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化によって制御または微調整することができる。ＬａｃＩを不活性化する他の化合物を、同様の様式でＩＰＴＧの代わりに使用することができる。
【０３８４】
一実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターが目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために有益であるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏで１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが、遺伝子操作された細菌と共投与される分子、例えばＩＰＴＧによって直接的または間接的に誘導される。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて発現を誘導し、投与前に細菌にペイロード（例えば、ＩＰＴＧ）をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧによって誘導される培養物を、無菌的に増殖させる。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
【０３８７】
一実施形態において、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では２つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは第１のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第２のプロモーターは第２のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件が２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器（例えば、アラビノースおよびＩＰＴＧ）中での培養物の調製の間）であり得る。別の非限定的な例では第１の誘導条件が例えば、ＩＰＴＧ存在を含む培養条件であってもよく、第２の誘導条件はｉｎ  ｖｉｖｏ条件であってもよい。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２７の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性構築物が目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写されるｌａｃＩをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２８の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号２９の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がテトラサイクリン誘導系を介して誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。開発された最初のシステムＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（テトラサイクリン−応答性プロモーターによる哺乳動物細胞における遺伝子発現の厳密な制御Ｇｏｓｓｅｎ  ＭおよびＢｕｊａｒｄ  Ｈ．ＰＮＡＳ，１９９２  Ｊｕｎ  １５；８９（１２）：５５４７−５１）は、テトラサイクリンオフとして知られている：テトラサイクリンの存在下ではｔｅｔ−誘導性プロモーターからの発現が減少する。単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６（ビリオンタンパク質１６）のＣ‐端子領域とｔｅｔＲを融合させることにより、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）を作製した。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡのｔｅｔＲ部はｔｅｔプロモーターのｔｅｔＯ配列に結合し、活性化領域は式を促進する。テトラサイクリンの存在下では、テトラサイクリンはｔｅｔＲに結合し、ｔＴＡがｔｅｔＯ配列に結合するのを妨げる。次に、リバースＴｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）が開発され、抑制よりもむしろ誘導のためにテトラサイクリンの存在に依存するようになった。新しいトランスアクチベーターｒｔＴＡ（逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター）を、ｒＴｅｔＲをＶＰ１６と融合させることによって作製した。システム上のテトラサイクリンはｒｔＴＡ依存システムとしても知られている。
【０３９１】
一実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために有益であるか、またはその間に誘導される。いくつかの実施形態では目的の１つ以上のタンパク質および／または転写調節因子（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の式はｉｎ  ｖｉｖｏで１つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが、遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えばテトラサイクリンによって直接的または間接的に誘導される。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて式を誘導し、投与前に細菌にペイロード（例えば、テトラサイクリン）をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリンによって誘導される培養物を、無菌的に増殖させる。いくつかの実施形態では、テトラサイクリンによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
【０３９３】
一実施形態において、テトラサイクリン誘導性プロモーターは第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では２つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、テトラサイクリン誘導性プロモーターは第１のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第２のプロモーターは第２のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件が２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器（例えば、テトラサイクリンおよびＩＰＴＧ）中での培養物の調製の間）であり得る。別の非限定的な例では第１の誘導条件が例えば、テトラサイクリンの存在を含む培養条件であってもよく、第２の誘導条件はｉｎ  ｖｉｖｏ条件であってもよい。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のテトラサイクリンプロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号３４の太字配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む（プロモーターは太字である）。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性構築物が目的の１つ以上のタンパク質（単数または複数）いくつかの実施形態ではと同じプロモーターから分岐転写されるＡｒａＣをコードする遺伝子をさらに含み、遺伝子操作された細菌は表１８のイタリック体（斜体リプレッサーは斜体）において配列番号３４の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８のイタリック体中の配列番号３４の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む（テットリプレッサーはイタリック体中にある）。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がその式が温度感受性機構によって制御される１つ以上の遺伝子配列を含む。サーモレギュレーターは外部化学物質または特殊培地を使用しない強力な転写制御のために好都合である（例えば、Ｎｅｍａｎｉら、酵素−プロドラッグ治療のためのマイクロカプセル化大腸菌におけるシトシンデアミナーゼ式を誘導した；Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｊｕｎ  １０；  ２０３：  ３２−４０、およびその参考文献を参照のこと）突然変異ｃＩ８５７リプレッサーならびにｐＬおよび／またはｐＲファージλプロモーターを使用する熱磁気タンパク質式は、組換え細菌株を操作するために使用されている。λプロモーターの下流にクローン化された目的の遺伝子は、次いで、バクテリオファージλの変異体熱不安定性ｃＩ８５７リプレッサーによって効率的に調節され得る。３７℃未満の温度では、ｃＩ８５７はｐＲプロモーターのｏＬまたはｏＲ領域に結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を遮断する。より高い温度では、機能的ｃＩ８５７量体は不安定化され、ｏＬまたはｏＲ  ＤＮＡ配列への結合が阻止され、ｍＲＮＡ転写が開始される。例示的な構築物はＷＯ２０１７０８７５８０の図８８Ａに示され、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰａｒａＢａｄからの誘導性発現は本明細書中に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化を通して制御され得るか、またはさらに微調整され得る。
【０３９７】
一実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために有益であるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏで１つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが遺伝子操作された細菌と共投与される分子（例えば、温度）によって直接的または間接的に誘導される。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または株の製造の間に、１つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、関心のある１つまたは複数のタンパク質の産生を遮断することが好都合であり得る。これは、より低い温度（例えば、３０℃）で株を成長させることによって、温度調節されたシステムにおいて行うことができる。次いで、温度を３７℃および／または４２℃に上昇させることによって、発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では，温度調節プロモーターは培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、３７℃〜４２℃の間の温度によって誘導される培養物を、無菌的に増殖させる。いくつかの実施形態では、３７℃〜４２℃の間の温度によって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
【０３９９】
一実施形態において、温度調節プロモーターは第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では２つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、温度調節プロモーターは第１のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第２のプロモーターは第２のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件が２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器（例えば、温度調節およびアラビノース）における培養物の調製の間）であり得る。別の非限定的な例では第１の誘導条件が培養条件、例えば、許容温度であってもよく、第２の誘導条件はｉｎ  ｖｉｖｏ条件であってもよい。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の温度調節プロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
【０４００】
いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは本明細書中に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では，温度調節プロモーターは細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号３０の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、温度調節された構築物が目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写される、変異ｃＩ８５７リプレッサーをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号３１の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号３３の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がＰｓｓＢプロモーターによって駆動されるシステムを介して間接的に誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。Ｐｓｓｂプロモーターは好気性条件下では活性であり、嫌気性条件下では遮断される。
【０４０３】
このプロモーターは、好気性条件下で目的の遺伝子を発現するために使用され得る。このプロモーターはまた、嫌気性条件でのみ発現されるように、遺伝子産物の発現を厳密に制御するために使用され得る。このケースでは、酸素誘導ＰｓｓＢプロモーターが目的の遺伝子の発現を抑制するリプレッサーの発現を誘導する。結果として、目的の遺伝子はリプレッサーの非存在下（すなわち、嫌気性条件中）でのみ発現される。この戦略は、改善された微調整およびより厳格な制御のための追加レベルの制御という利点を有する。ＷＯ２０１７０８７５８０の図８９ＡはＰｓｓＢプロモーターの遺伝子構成の概略図を示しており、その全内容は参照により本明細書中に援用される。
【０４０４】
一実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のＰｓｓＢプロモーターの制御下で発現されるリプレッサーによって間接的に調節される。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターの誘導が目的の１つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターの誘導がｉｎ  ｖｉｖｏ投与前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、調製、または株の製造の間に、目的の１つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターの誘導のための条件が培養、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で提供され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の１つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の１つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
【０４０７】
別の非限定的な例において、このストラテジーは例えば、条件的栄養要求株を作製するために、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡの発現を制御するために使用され得る。ｄａｐＡまたはＴｈｙＡの染色体コピーをノックアウトする。嫌気性条件では、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡが発現し、株はｄａｐまたはチミジンの非存在下で増殖することができる。好気的条件下では、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡの式は遮断され、株はｄａｐまたはチミジンの非存在下では増殖できない。このようなストラテジーは例えば、嫌気性条件（例えば、腫瘍微小環境の消化管および／または条件）下での細菌の生存を可能にするが、好気性条件下での生存を予防するために使用され得る（バイオセイフティースイッチ）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表１８の配列番号３５の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０４０８】
誘導性プロモーターからの発現に有用な配列を表１８に列挙する。
【０４０９】
［表１８］誘導性プロモーター構築物の配列
【表１２−１】
2020525012.tif 000060
【表１２−２】
2020525012.tif 000061
【表１２−３】
2020525012.tif 000062
【０４１０】
構成的プロモーター
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、そして構成的プロモーターに作動可能に連結される。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが本明細書に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件、例えば、腫瘍微小環境の消化管および／または条件下で活性である。いくつかの実施形態では、このプロモーターが本明細書に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件（例えば、種々の細胞培養および／または細胞製造条件）下で活性である。いくつかの実施形態では、この構成的プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ条件（例えば、本明細書中に記載されるような腫瘍微小環境の消化管および／または条件）下、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件（例えば、本明細書中に記載されるような種々の細胞培養および／または細胞産生および／または製造条件）下で活性である。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結される構成的プロモーターが種々の外因性環境条件（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件下）において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが哺乳動物の消化管に特異的な、および／または腫瘍微小環境の状態に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが哺乳動物の消化管の環境および／または腫瘍微小環境の状態のような低酸素または嫌気性条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが腫瘍微小環境の哺乳動物の消化管および／または状態に特異的な分子または代謝産物の存在下で活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターがｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、細胞産生および／または製造条件の間に存在する分子または代謝産物または他の条件の存在下で活性である。
【０４１３】
細菌の構成的プロモーターは当技術分野で公知であり、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（２０１７年１月１１日出願）に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【０４１４】
リボソーム結合部位
いくつかの実施形態では、リボソーム結合部位が付加され、スイッチアウトされ（ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｏｕｔ）、または置換される。いくつかのリボソーム結合部位を試験することによって、発現レベルを所望のレベルに微調整することができる。ＲＢＳの非限定的な例は標準的な生物学的部分のレジストリに列挙されており、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【０４１５】
株培養中のペイロードの誘導
培養中のペイロードの誘導は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（ＷＯ２０１６１８３５３１として公開）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開）に記載されており、それぞれの全内容は参照により本明細書に援用される。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、投与の前に、目的の式および／またはペイロード活性のペイロードまたはタンパク質を予め誘導することが望ましい。このような関心対象のペイロードまたはタンパク質は、分泌物を意図したエフェクターであってもよく、またはエフェクターを産生するために代謝反応を触媒する酵素であってもよい。他の実施形態において、目的のタンパク質は、有害な代謝産物を異化する酵素である。このような状況では、株には関心のある活ペイロードまたはタンパク質が事前にロードされる。このような場合、本発明の遺伝子操作された細菌はｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の前に、細胞増殖、増殖、純化、発酵、および／または産生の間の細菌培養において提供される条件下で、目的の１つ以上のタンパク質を発現する。このような培養条件は例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化，剤型、および／または製造の間に使用される、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器中で提供され得る。本明細書中で使用される場合、用語「細菌培養」または細菌細胞培養」または「培養」は細胞増殖、細胞膨張、回収、純化、発酵、および／または製造を含むいくつかの産生プロセスの間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持または増殖される細菌細胞または微生物をいい、本明細書中で使用される場合、用語「発酵」は、規定された条件下での細菌の増殖、増殖、および維持をいう。発酵は、誘導物質、栄養素の存在下、定義された温度などで、嫌気性または低酸素または酸素化条件を含む多くの細胞培養条件下で起こり得る。
【０４１７】
培養条件は高細胞密度（高バイオマス）降伏を維持しながら、細胞の最適な活性および生存率を達成するように選択される。酸素レベル（例えば、低酸素、微好気性、好気性）、培地の温度、および栄養素および／または種々の増殖培地、培地中に提供される化学的および／または栄養性誘導物質および他の成分を含む、最適な活性、高収率および高生存率を達成するために、多数の細胞培養条件および操作パラメータをモニターし、調節する。
【０４１８】
いくつかの実施形態では目的の１つ以上のタンパク質が直接的または間接的に誘導され、一方、株はｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために増殖される。理論に束縛されることを望まないが、プレ誘導は例えば、消化管または腫瘍において、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を増強し得る。特定の消化管区画内の細菌の滞留時間が比較的短い場合、細菌は、完全なｉｎ  ｖｉｖｏ誘発能に達することなく小腸を通過し得る。対照的に、株が予め誘導され、そして予め負荷されている場合、株は既に完全に活性であり、細菌が腸に到達することにつれて、より大きな活性をより迅速に可能にする。エルゴ、輸送時間は「浪費」されず、この場合、この株は最適に活性ではない。細菌が腸を通って移動し続けるにつれて、ｉｎ  ｖｉｖｏ誘導は消化管の環境条件下（例えば、低酸素、または消化管代謝産物の存在下）で起こる。同様に、腫瘍標的化または他の細菌が予め誘導され、そしてプレロードされる場合、これは、本明細書中に記載されるように、全身投与または腫瘍内注射のいずれかによって、細菌が消化管または腫瘍に到達することにつれて、より迅速に、より大きな活性を可能にし得る。消化管または腫瘍に入ると、ｉｎ  ｖｉｖｏ誘発が例えば、腫瘍微小環境の条件下で起こる。
【０４１９】
一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に誘導される。一実施形態では、いくつかの目的のタンパク質の発現は、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に誘導される。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、これらの株はｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株増殖の間、いかなるプレ誘導プロトコールもなしに投与される。
【０４２１】
嫌気性誘導
いくつかの実施形態では、細胞が培養において嫌気性または低酸素条件下で誘導される。このような場合、細胞は一定のＯＤ（例えば、０．１〜１０の範囲内のＯＤ）に達するまで（例えば、１．５〜３時間）成長され、一定の密度（例えば、１×１０８〜１×１０１１の範囲）および指数関数的成長を示し、次いで、約３〜５時間、嫌気性または低酸素状態にスイッチされる。いくつかの実施形態では、株は嫌気性または低酸素条件下で誘導され、例えば、ＦＮＲプロモーター活性を誘導し、１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下で１つ以上のペイロードおよび／またはトランスポーターの発現を駆動する。
【０４２２】
一実施形態において、１つ以上のペイロードの発現は１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、そして嫌気性または低酸素条件下での、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に誘導される。一実施形態において、いくつかの目的のタンパク質の発現は１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、そして嫌気性または低酸素条件下での、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に誘導される。
【０４２３】
理論に束縛されることを望むものではないが、ＦＮＲプロモーターの制御下で１つ以上のペイロードを含む株はこれらのプロモーターからのペイロードの発現を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、嫌気性または低酸素培養条件下で、およびｉｎ  ｖｉｖｏで、腫瘍微小環境の消化管および／または条件において見出される低酸素条件下で可能にし得る。
【０４２４】
関心対象のペイロードに連結されたいくつかの実施形態では、プロモーターはアラビノース、クミン酸塩、およびサリチル酸塩、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンによって誘導可能であり得、ならびに／または他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質は化学薬品および／もしくは栄養性誘導物質の存在下で、嫌気性または低酸素条件下で誘導され得る。特に、株は遺伝子配列の組合せを含み得、そのいくつかはＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他は化学的および／または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、株は１つ以上のペイロード遺伝子配列および／または１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下、ならびに本明細書中に記載される１つ以上の構成的プロモーターの制御下の１つ以上のペイロード遺伝子配列を含み得る。
【０４２５】
好気性誘導
いくつかの実施形態では、好気性条件下で株を調製し、プレロードし、プレ誘導することが望ましい。これは、より効率的な増殖および生存を可能にし、そしていくつかの場合において、毒性代謝産物の蓄積を減少させる。このような場合、細胞は一定のＯＤ（例えば、０．１〜１０の範囲内のＯＤ）に達するまで（例えば、１．５〜３時間）成長させられ、これは、一定の密度（例えば、１×１０８〜１×１０１１の範囲）および指数関数的成長を示し、次いで、誘導物質の付加または他の手段（例えば、許容温度へのシフト）を介して、約３〜５時間誘導される。
【０４２６】
アラビノース、クミン酸塩、およびサリチル酸塩、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、および／または本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の他の化学的および／または栄養性誘導物質によって誘導可能ないくつかの実施形態では、プロモーターは細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に、化学的および／または栄養性誘導物質の存在下で好気性条件下で誘導することができる。一実施形態において、１つ以上のペイロードの発現は化学的および／または栄養性誘導物質によって調節される１つ以上のプロモーターの制御下にあり、そして好気性条件下での細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型および／または産生の間に誘導される。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された株は、好気性培養条件下で誘導される遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、これらの株は、腫瘍微小環境の消化管および／または状態におけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの株は、腫瘍微小環境の消化管および／または状態におけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含まない。
【０４２８】
微好気性誘導
いくつかの実施形態では生存率、増殖、および活性は微好気性条件下で細菌株を予め誘導することによって最適化される。いくつかの実施形態では、微好気性条件が最適な増殖、活性および生存率条件と、誘導のための最適条件との間の「残部をとる」のに最も適しており、特に、１つ以上のペイロードの発現が嫌気性および／または低酸素プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）によって駆動される場合である。このような場合、細胞は例えば、一定のＯＤ、例えば、０．１〜１０の範囲内のＯＤに達するまで（例えば、１．５〜３時間）成長され、これは、一定の密度（例えば、１×１０８〜１×１０１１の範囲）および指数関数的成長を示し、次いで、誘導物質の付加または他の手段（例えば、許容温度へのシフト）を介して、約３〜５時間誘導される。
【０４２９】
一実施形態において、１つ以上のペイロードの発現は１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、そして微好気性条件下での細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に誘導される。
【０４３０】
理論に束縛されることを望むものではないが、ＦＮＲプロモーターの制御下で１つ以上のペイロードを含む株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、微好気性培養条件下で、およびｉｎ  ｖｉｖｏで、腫瘍微小環境の消化管および／または条件において見出される低酸素条件下で、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にし得る。
【０４３１】
アラビノース、クミン酸塩、およびサリチル酸塩、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、および／または他の化学的および／または栄養性誘導物質によって誘導可能ないくつかの実施形態では、プロモーターは、化学物質および／または栄養性誘導物質の存在下で微好気性条件下で誘導することができる。特に、株は遺伝子配列の組合せを含み得、そのいくつかはＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他は化学的および／または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、株は１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にある１つ以上のペイロード遺伝子配列、および本明細書中に記載される１つ以上の構成的プロモーターの制御下にある１つ以上のペイロード遺伝子配列を含み得る。
【０４３２】
一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は化学的および／または栄養性誘導物質によって調節される１つ以上のプロモーターの制御下にあり、そして微好気性条件下での細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および／または産生の間に誘導される。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、投与の前に、対象式および／またはペイロード活性のペイロードまたはタンパク質を予め誘導することが望ましい。このような関心対象のペイロードまたはタンパク質は、分泌物を意図したエフェクターであってもよく、またはエフェクターを産生するために代謝反応を触媒する酵素であってもよい。他の実施形態において、目的のタンパク質は、有害な代謝産物を異化する酵素である。このような状況では、株には活性ペイロードが予めロードされている
【０４３４】
生体分子輸送能力が強化された細菌株の産生
それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度、および小さいゲノムのために、微生物は、短縮された時間スケールでユニークな表現型に進化され得る。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、選択圧下で微生物を継代して、好ましい表現型を有する株を進化させるプロセスである。最も一般的にはこれは炭素／エネルギー源の利用を増大させるために、または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）に株を適応させるために適用され、それによって、炭素基材上でまたは応力のもとでより増殖可能な突然変異株は集団中のあまり適応されていない株よりも競合し、最終的には集団を支配するようになる。
【０４３５】
この同じ処理は、栄養要求株を作成することによって、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求株は必須代謝産物を合成することができない株であり、従って、増殖するために培地中に提供される代謝産物を有さなければならない。この筋書きでは栄養要求株を作成し、代謝産物の量を減少させて継代することによって、得られる優性株はこの必須代謝産物をより得て組み込むことができなければならない。
【０４３６】
例えば、アミノ酸を産生するための生合成経路が破壊される場合、該アミノ酸の高親和性捕捉が可能な株は、ＡＬＥを介して進化され得る。第１に、株は、成長を支持するための最小濃度が確立されるまで、栄養要求性アミノ酸の種々の濃度で成長される。次いで、この株をその濃度で継代し、そして規則的な間隔で、より低い濃度のアミノ酸に希釈する。時間が経つにつれて、アミノ酸に対して最も競合的な細胞（成長を制限する濃度で）が集団を支配するようになる。これらの株は、おそらく、それらのアミノ酸トランスポーターにおいて突然変異を有し、必須アミノ酸および限定アミノ酸を移入する増大した能を生じる。
【０４３７】
同様に、アミノ酸を形成するために上流代謝産物を使用することができない栄養要求株を使用することによって、上流代謝産物をより効率的に取り込むことができるだけでなく、代謝産物を必須の下流代謝産物に変換することもできる株を進化させることができる。これらの株はまた、上流代謝産物の輸入を増加させるために突然変異進化するが、下流酵素の式または反応速度を増加させるか、または競合的基材利用経路を減少させる突然変異も含み得る。
【０４３８】
先の実施例では、微生物に固有の代謝産物を、突然変異栄養要求性を介して必須にし、選択を、内因性代謝産物の増殖制限補充と共に適用した。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型は、それらの消費を必須化合物の産生に結びつけることによって進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生し得る異なる生物由来の遺伝子が単離される場合、この遺伝子は、組換え的に導入され得、そして異種宿主において発現され得る。この新しい宿主株は、今や、以前は代謝不能であった基材から必須栄養素を合成することができる。これにより、すぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求株を作製し、組換え酵素の同時発現を伴う非天然化合物の増殖制限量を選択することによって、同様のＡＬＥ法を適用することができる。これは、非天然基材の運搬、異種酵素の発現および活性、ならびに下流の天然酵素の発現および活性の突然変異をもたらす。この処理における重要な要件は、非天然代謝産物の摂取を、成長に不可欠な代謝産物の産生に結びつけることができることであることを強調すべきである。
【０４３９】
選択メカニズムの塩基類が確立され、最低レベルの補充が確立されると、実際のＡＬＥ実験を進めることができる。このプロセスを通して、いくつかのパラメータを慎重に監視しなければならない。培養物を指数増殖期に維持し、彩度／固定相到達させないことが大切である。これは、各継代の間に増殖速度をチェックし、その後の希釈をそれに応じて調節しなければならないことを意味する。増殖速度が希釈が大きくなる程度まで改善される場合、栄養要求性補給の濃度は増殖速度が遅くなるように減少されるべきであり、選択圧は増加され、そして希釈は、継代の間に亜集団を大きく偏らせるほど重篤ではない。さらに、規則的な間隔で、細胞を希釈し、固体培地上で増殖させ、そして個々のクローンを試験して、ＡＬＥ培養物において観察される成長速度表現型を確認すべきである。
【０４４０】
ＡＬＥ実験をいつ停止するかを予測するには、注意が必要である。進化を指向することの成果は実験を通して「スクリーニングされた」突然変異の数に直接的に結びついており、突然変異は一般に、ＤＮＡレプリケーションの間の誤差の機能であるので、累積細胞分裂（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全変異体の代理として作用する。以前の研究は、種々の炭素源上での成長のための有利な表現型が約１０１１．２のＣＣＤ１において単離され得ることを示した。この速度は、ＤＮＡ複製エラーの増加を引き起こすＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような化学的変異原を培養物に添加することによって加速することができる。しかし、継代を続けると、成長速度がわずかに向上されるか、または向上されない場合、集団はある適応度最大値に収束し、ＡＬＥ実験を停止することができる。
【０４４１】
ＡＬＥ実験の終わりに、細胞を希釈し、固体培地上で単離し、培養フラスコの成長表現型と一致する成長表現型についてアッセイすべきである。次いで、選択されたものからの最良のパフォーマーを、ゲノムＤＮＡのために調製し、そして全ゲノム配列決定のために送る。改善された表現型を提供することができるが、サイレント突然変異（利益を提供しないが、所望の表現型を損なわないもの）も含むことができる、ゲノム周辺に生じる突然変異を明らかにする配列決定。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異原の存在下で進化した培養物では、有意により多くのサイレントな背景技術突然変異が存在するのであろう。現在の状態で最良の性能の株に満足した場合、ユーザは、その株を用いたアプリケーションに進むことができる。さもなければ、寄与突然変異は、ゲノムエンジニアリング技術によって親株に突然変異を再導入することによって、進化した株からデコンボリューションされ得る。Ｓｅｅ  Ｌｅｅ、Ｄ．−Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ、ＡＭ．、Ｂａｒｒｅｔｔ、ＣＬ＆  Ｐａｌｓｓｏｎ、ＢＯ．Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  Ｔｉｍｅｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆエシェリヒア属ｃｏｌｉ．。ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２６１７２  （２０１１）。
【０４４２】
代謝産物輸送
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。トランスポーターは細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、遺伝子操作された細菌において発現本発明改変され得る。そのようなトランスポーターの非限定的な例は係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６５に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【０４４３】
このようなトランスポーターは、代謝産物を細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌中のトランスポーターをコードする遺伝子は改変されていない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がトランスポーター遺伝子の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が非天然トランスポーター遺伝子の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌がその天然プロモーターによって制御されるトランスポーター遺伝子、誘導性プロモーター、天然プロモーターよりも強いプロモーター（例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター）、または構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターが製造中の条件下または他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で誘導される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子の発現が、１つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子の発現が、１つ以上のエフェクター分子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子および１つ以上のエフェクター分子が、プロモーター領域から多様に転写される。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、天然のトランスポーター遺伝子を突然変異誘発し、輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異誘発されたトランスポーター遺伝子を単離し、遺伝子操作された細菌に挿入する（例えば、Ｐｉら、１９９６；Ｐｉら、１９９８を参照）。
【０４４５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍低減させるために、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生し、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、尿中の馬尿酸を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍増加させる。特定の非改変細菌は、感知できるレベルのフェニルアラニンの馬尿酸へのプロセシングを有さないであろう。これらの細菌の遺伝子組換え型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのＰＡＬ媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。
【０４４６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細菌培養条件下などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生し、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、培地中のトランス−ケイ皮酸を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍増加させる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液採取および質量分析によって測定され得る。いくつかの実施形態では、ケイ皮酸はＰＡＬ活性を評価するために当該分野において公知の方法によって測定される。ケイ皮酸産生はフェニルアラニン分解と直接的に相関し、いくつかの実施形態では、ケイ皮酸は、株活性についての代替のバイオマーカーとして使用され得る（図１６Ｂ）。ケイ皮酸は肝酵素によって馬尿酸にさらに分解され得、両方は実施例２４〜２６に記載されるように測定され得る。本明細書に示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴＣＡは速やかに馬尿酸に変化され、その後馬尿酸は尿中に蓄積される。したがって、血液中および特に尿中の馬尿酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるフェニルアラニン分解の遥かに優れたバイオマーカーになり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ発現は当該分野において公知の方法、例えば血中のフェニルアラニンレベルの測定によって測定される。馬尿酸は本明細書の実施例、および当該分野おいて公知の方法で測定され得る。
【０４４７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍低減させるためにＬＡＡＤを産生する。特定の非組換え細菌は感知できるレベルのフェニルアラニンプロセシングを有さない。これらの細菌の遺伝子組換え型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのＬＡＡＤ媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液採取および質量分析によって測定され得る。ＬＡＡＤにより生成した分解産物であるピルビン酸およびフェニルピルベートは、実施例２４〜２６に記載されるように質量分析を使用して測定され得、ＬＡＡＤ活性のさらなる読み出し情報として使用され得る。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの細菌培養条件下などの外因性環境条件下で、２以上のＰＭＥ、例えばＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤを産生し、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、血中のフェニルアラニンを減少および／または培地中のトランス−ケイ皮酸を増加させる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含み得る。
【０４４９】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、低コピープラスミド上で発現される。
【０４５０】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のトランスポーターをコードする遺伝子はプラスミド上または染色体内に位置し、発現は本明細書に開示されるプロモーターのいずれかによって調節され得る。
【０４５１】
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与を直接的または間接的に誘導する１つまたは複数のトランスポーターをコードします。たとえば、外因性ｉｎ  ｖｉｖｏ環境（例えば、消化管）の特定の分子または代謝物に反応する条件である誘導性プロモーターの制御下で発現する。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは非誘導条件下で発現の漏れを減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ発現を増加させるのに有用であり得、それによってフェニルアラニンの代謝を増加させ、高フェニルアラニン血症を低減させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現されるＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨを含む遺伝子操作された細菌は、異種ｐｈｅＰおよび天然ｐｈｅＰのさらなるコピーの非存在下で、低コピープラスミド上で発現される同じＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨを含む遺伝子操作された細菌と比較してフェニルアラニン代謝を増加させないか、またはフェニルアラニンレベルを減少させない。高および低コピープラスミド上の同じＰＭＥ遺伝子（群）、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子（群）を含む遺伝子操作された細菌が生成された。例えば、高コピープラスミドおよび低コピープラスミド上のＰＡＬ１またはＰＡＬ３のいずれかが生成され、各々は代謝され、フェニルアラニンを同様のレベルまで低減させた（図１５）。したがって、いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝の律速段階はフェニルアラニン利用可能性である（例えば、図１６を参照のこと）。これらの実施形態では、細胞へのフェニルアラニン輸送を増加させ、それによってフェニルアラニン代謝を向上させることが有益であり得る。ｐｈｅＰと併せて、低コピーＰＡＬプラスミドでさえ、試験試料からＰｈｅをほぼ完全に除去することができる（例えば、図１６Ａを参照のこと）。さらに、ｐｈｅＰを組み込んでいるいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン代謝を維持しながらＰＡＬ発現の安定性を向上させ、形質転換した細菌上の負の選択圧を低減させるために、併用して低コピーＰＡＬ発現プラスミドを使用することがさらに有益であり得る。代替の実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは高コピープラスミドと併用して使用される。
【０４５３】
いくつかの実施形態では、トランスポーターはフェニルアラニン分解を増加させることができない。例えば、プロテウス・ミラビリスＬＡＡＤは、酵素触媒作用が周辺質で発生する細胞膜に局在する。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を容易に横切ることができる。したがって、遺伝子操作された細菌がＬＡＡＤを発現する実施形態では、トランスポーターは、フェニルアラニン代謝を必要としなくてもよいか、または改善しなくてもよい。
【０４５４】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥ（複数可）、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現はＰＭＥの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は、遺伝子操作された細菌における１つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位が使用されてもよい（例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６６を参照のこと）。挿入部位は、ゲノム内、例えば、（栄養要求株を作製するために）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間などの、意図しない転写のリスクを低減させるために分岐プロモーターの間のいずれの場所にあってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤの１個より多いコピー、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多いコピーが、遺伝子操作された細菌における１つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。ＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーは、同じＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーまたは異なるＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーであってもよい。
【０４５５】
例示的な構築物は以下の表４〜１３に示される。表４は、染色体への挿入のためのＰｈｅＰおよびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２１Ｂ）を示し、ｐｈｅＰ配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表５は、高コピープラスミド上でＰＡＬ１およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２２Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表６は、高コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２３Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表７は、高コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２４Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表８は、高コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２５Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表９は、低コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２６Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表１０は、低コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２７Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表１１は、低コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２８Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表１２は、低コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２９Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表１３は、ｐｈｅＰをコードする遺伝子、ＴｅｔＲをコードする遺伝子、および染色体への挿入のためのＴｅｔプロモーター配列を含む例示的な構築物の配列（配列番号３０Ｂ）を示し、ｐｈｅＰ配列には下線を引き、ＴｅｔＲ配列は四角で囲い、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。
【０４５６】
［表４］
【表１３】
2020525012.tif 000063
【０４５７】
［表５］
【表１４−１】
2020525012.tif 000064
【表１４−２】
2020525012.tif 000065
【０４５８】
［表６］
【表１５−１】
2020525012.tif 000066
【表１５−２】
2020525012.tif 000067
【０４５９】
［表７］
【表１６−１】
2020525012.tif 000068
【表１６−２】
2020525012.tif 000069
【０４６０】
［表８］
【表１７−１】
2020525012.tif 000070
【表１７−２】
2020525012.tif 000071
【表１７−３】
2020525012.tif 000072
【０４６１】
［表９］
【表１８−１】
2020525012.tif 000073
【表１８−２】
2020525012.tif 000074
【表１８−３】
2020525012.tif 000075
【０４６２】
［表１０］
【表１９−１】
2020525012.tif 000076
【表１９−２】
2020525012.tif 000077
【表１９−３】
2020525012.tif 000078
【０４６３】
［表１１］
【表２０−１】
2020525012.tif 000079
【表２０−２】
2020525012.tif 000080
【表２０−３】
2020525012.tif 000081
【０４６４】
［表１２］
【表２１−１】
2020525012.tif 000082
【表２１−２】
2020525012.tif 000083
【表２１−３】
2020525012.tif 000084
【０４６５】
［表１３］
【表２２】
2020525012.tif 000085
【０４６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は配列番号２１Ｂ〜３０Ｂのいずれかのうちの１つまたは複数の配列を含む遺伝子配列を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２１Ｂ〜３０Ｂの配列のうちのいずれかと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の配列を含む遺伝子配列を含有する。
【０４６７】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のＰＭＥをコードする１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージが、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は欠失、挿入、置換および逆位を含み、そして１つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置し得るか、またはそれを包含し得る。
【０４６８】
一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが１つまたは複数のＰＭＥを含む遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージがその天然の状態で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに内因性であるファージである。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が１つ以上の大腸菌を含む。Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ３中に１つまたは突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のファージ３遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０から選択される１つ以上の遺伝子を含む。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が１つまたは複数のＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完成または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ���１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０４７０】
酸素消費酵素
ＬＡＡＤの触媒活性は酸素に依存し、従って、腸（例えば、結腸）における嫌気性および／または低酸素環境において活性でないかもしれない。酸素は、胃腸管のより近位の区画に存在する。
【０４７１】
健康なマウスで測定した酸素圧を表１７Ａに示す。Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ。１９９９  Ａｐｒ  １３；９６（８）：４５８６−９１；「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ＥＰＲ  ｉｍａｇｉｎｇ」の全内容が、参照により本明細書に援用される。近位から先端の位胃腸管への顕著な酸素勾配。胃腸管に沿って観察された酸素勾配は、プロセスの組合せによって説明することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、食品は嚥下されると、最初に環境室内大気の酸素圧と平衡化される。胃およびその後の小腸への通過時に、酸素レベルは、酸素が粘膜メンブランを横切って拡散することにつれて低下し得る。酸素の毛管量（すなわち、５〜１０ｔｏｒｒ；参考文献９）との徐々の平衡化処理が起こり得る。結腸に移行すると、その重度の細菌コロニー形成と共に、酸素化のさらなる減少が生じる。最後に、遠位結腸ディスプレイの管腔は予想通り、この部位における嫌気性菌の存在量に基づいて低酸素症を顕著にした。
【０４７２】
［表１７Ａ］胃腸管区画における酸素圧
【表２３】
2020525012.tif 000086
【０４７３】
図２５Ｂに示すように、ＬＡＡＤ活性は好気性条件下よりも低いレベルではあるが、微好気性条件下で保持される（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。したがって、ＬＡＡＤは、胃、十二指腸、空腸、および回腸のような腸のより近位の領域において活性であり得る。本発明の一部として、遺伝子操作された細菌によって発現されるＬＡＡＤは好都合にはＰＡＬとは別の区画において活性であり得、これはＦＮＲプロモーターの制御下にある場合、結腸において発現され得ることが意図される。１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌は２つの酵素を発現し、これらは異なる酸素要求性を有し、および／または異なる酸素条件下で誘導され、その結果、ＰＭＥは胃腸系全体にわたって発現され、そして活性である。例えば、酸素の存在に依存する第１の酵素（例えば、ＬＡＡＤ）は構成的または誘導性プロモーター（例えば、パラＢＡＤ）の制御下で、胃、十二指腸および回腸の１つ以上において発現され、そして第２の酵素（例えば、ＰＡＬ）は、ＦＮＲプロモーターの制御下で、結腸において発現される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬが小腸において見出される条件下、例えば、ＦＮＲプロモーター、構成的プロモーターの制御下、または本明細書中に記載される別の誘導性プロモーター下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤがｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に予め誘導され、腸の近位部分において発現され、活性である。いくつかの実施形態では、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤがｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に（好気的または嫌気的に、または本明細書に記載されるように、化学的および／または栄養性誘導物質の有無にかかわらず）予め誘導され、腸の遠位部分において発現され、活性である。
【０４７４】
酸素制限条件下でＬＡＡＤ活性をさらに増加させるために、いくつかの戦略を用いることができる。例えば、大量の酸素を消費する他の酵素の活性は、減少または消失され得る。そのような酵素の１つは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼである。大腸菌は２つのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ｎｕｏおよびｎｄｈ２を有し、これらの酵素の両方のノックアウトが酸素消費を８０％減少させることが示されている。いくつかの実施形態では、限界酸素を保存するために、すなわち、ＬＡＡＤを発現する遺伝子操作された細菌において、より低い外因性の酸素条件下でＬＡＡＤが機能することを可能にするために、さらなる手段が講じられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、酸素消費に関与する１つ以上の遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、大腸菌ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの一方または両方がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはヌーである。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはｎｄｈ２である。いくつかの実施形態ではヌーとｎｄｈ２はノックアウトされる。ｃｙｄＢ（高親和性端子オキシダーゼのサブユニット）、ｃｙｄＤ（チトクロームＤを作るのに必要な酵素）、およびｃｙｏＡＢＣ（低親和性チトクロームオキシダーゼのサブユニット）のような呼吸鎖中の酵素を含む、大腸菌の酸素代謝に関与する他の酵素もノックアウトされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がｃｙｄＢ、ｃｙｄＤ、およびｃｙｏＡＢＣから選択される１つ以上の遺伝子においてノックアウト突然変異／欠失を保有する。
【０４７５】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥが発現され、胃内で活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、十二指腸において発現され、そして活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、空腸において発現され、そして活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、回腸において発現され、そして活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、結腸において発現され、そして活性を示す。
【０４７６】
フェニルアラニン輸送
細菌がＰＭＥをコードする遺伝子を含むいくつかの実施形態では、当該細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含み得る。フェニルアラニントランスポーターは、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現または改変され得る。
【０４７７】
ＰｈｅＰは、細菌細胞にフェニルアラニンを輸送できる膜輸送タンパク質である（例えば、Ｐｉら、１９９１年を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は天然のｐｈｅＰ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は非天然のｐｈｅＰ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、その天然のプロモーター、誘導可能なプロモーター、天然のプロモーターより強力なプロモーター、例えばＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるｐｈｅＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子およびフェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子のそれぞれの発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌中の天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、そして天然ｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーがＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するものとは別の誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム中に挿入される。代わりの実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌種由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーがＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で、ゲノムに挿入される。
【０４７９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌中の天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、そして天然ｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーがプラスミド上の細菌中に存在し、そしてＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＭＥの発現を制御するものとは異なった誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。代わりの実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが細菌中のプラスミド上に存在し、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０４８０】
いくつかの実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子を突然変異させ、フェニルアラニン輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異ｐｈｅＰを選択する。本明細書中に記載されるフェニルアラニントランスポーターの改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０４８１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されていない；天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーを、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、またはＰＡＬの発現を制御するものとは別の誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムに挿入する。別の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーがＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーはプラスミド上の細菌に存在し、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なった誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。別の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーがプラスミド上の細菌に存在し、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０４８２】
他の実施形態では、１つまたは複数のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子がプラスミド上または染色体内に位置してもよく、遺伝子発現はＰＭＥ遺伝子を調節するプロモーターと同じであっても異なっていてもよい、本明細書に開示されるプロモーターのいずれかによって調節されてもよい。
【０４８３】
エシェリヒア属大腸菌は、芳香族アミノ酸の集積のための５つの異なる輸送系（ＡｒｏＰ、Ｍｔｒ、ＰｈｅＰ、ＴｎａＢ、およびＴｙｒＰ）を有することが報告されている。フェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を、芳香族Ｐ遺伝子によってコードされる全般的なアミノ酸パーミアーゼが高親和性で輸送し、フェニルアラニン輸入のライオンシェアの原因であるＰｈｅＰと一緒に考えられている。さらに、芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株（ΔａｒｏＰ  ΔｐｈｅΔｍｔｒ  Δｔｎａ  ΔｔｙｒＰ）でフェニルアラニンの低濃度蓄積が観察され、２つのペリプラズム結合タンパク質、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ‐システム）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびにメンブラン成分であるＬｉｖＨＭＧＦ（Ｋｏｙａｎａｇｉら、およびその参考文献；エシェリヒア属ｃｏｌｉ  Ｋ‐１２における第３フェニルアラニントランスポーターとしてのＬＩＶ‐Ｉ／ＬＳ系の同定）からなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターであるＬＩＶ‐Ｉ／ＬＳ系の活性が追跡された。
【０４８４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はａｒｏＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｒｏＰ遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのａｒｏＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーはプラスミド上の細菌または染色体中に存在し、ＰＭＥの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターまたはａｒａＢＡＤプロモーター、ＰＭＥの発現を制御するものとは別の誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。別の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｒｏＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然ａｒｏＰ遺伝子のコピーがプラスミド上または染色体中の細菌に存在し、ＰＭＥの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターまたはＡｒａＢＡＤプロモーター、またはＰＭＥの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０４８５】
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌が同じまたは異なった誘導性または構成的プロモーターの制御下で、ＡｒｏＰおよびＰｈｅＰを含む。
【０４８６】
いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は染色体上に発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現がｐｈｅＰの発現の安定性を増加させるために有効であり得る。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子が遺伝子操作された細菌中の１つ以上の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔの１つ以上で細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位が使用され得る（例えば、その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６６を参照）。挿入部位はゲノムのどこにあってもよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求株を作り出すため）のような生存および／または成長に必要な遺伝子；ゲノム複製部位付近のようなゲノムの活性領域；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間のような意図しない転写の危険性を減少させるための分岐プロモーターの間にあってもよい。
【０４８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に直接的または間接的に前もって誘導される、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前の株の産生の間に、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器中の細菌の培養物中に提供される特異的分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする。
【０４８８】
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌がｉｎ  ｖｉｖｏ投与で直接的または間接的に誘導される、例えば、外因性のｉｎ  ｖｉｖｏ環境、例えば、消化管において応答性条件または特異的分子もしくは代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、プロモーターが消化管特異的分子または低酸素状態によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株が化学物質および／または栄養性誘導物質と組合せて投与される。
【０４８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が多数の作用機構および／または１つ以上の栄養要求性を含む。特定の実施形態では、細菌が染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｍａｌｌＥ／Ｋ、ｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＰ／Ｔ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、ｃｅａ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーターの管轄下にある５個のＰＡＬ（例えば、ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３）と、染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｌａｃＺ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーターの制御下にあるフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１個のコピー（例えば、ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）から構成されるように遺伝子組換えが行われる。より具体的な態様において、細菌は、カナマイシン耐性遺伝子、およびｔｈｙＡ遺伝子が欠失および／または無関係の遺伝子で置換されているｔｈｙＡ栄養要求性をさらに含むように遺伝子操作される。
【０４９０】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のフェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。
【０４９１】
いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子ならびにフェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子は、プロモーター領域から多岐に転写される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の各々の発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。
【０４９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、天然のｐｈｅＰ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーが、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌種由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。
【０４９３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、天然のｐｈｅＰ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーが、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌種由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
【０４９４】
いくつかの実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は突然変異誘発され、フェニルアラニン輸送の増加を示す突然変異体が選択され、突然変異したｐｈｅＰ。本明細書に記載のフェニルアラニン輸送体の改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０４９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、１つまたは複数のさらなるコピーの天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ｐｈｅＰ遺伝子が、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内に挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、１つまたは複数のさらなるコピーの天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ｐｈｅＰ遺伝子は、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
【０４９６】
他の実施形態では、１つ以上のＰｈｅトランスポーター（複数可）をコードする遺伝子（群）は、プラスミドまたは染色体に位置することができ、その遺伝子発現は本明細書に開示される任意のプロモーターによって制御されることができ、そのプロモーターはＰＭＥ遺伝子（群）を調節するプロモーターと同一または異なることができる。
【０４９７】
大腸菌は、芳香族アミノ酸を蓄積するための５つの異なる輸送系（ＡｒｏＰ、Ｍｔｒ、ＰｈｅＰ、ＴｎａＢ、およびＴｙｒＰ）を有することが報告されている。ａｒｏＰ遺伝子によってコードされる一般的なアミノ酸ペルメアーゼは、フェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を高親和性で輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの大部分を担うと考えられている。さらに、フェニルアラニンの低レベルの蓄積が芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株（ΔａｒｏＰ  ΔｐｈｅＰ  Δｍｔｒ  Δｔｎａ  ΔｔｙｒＰ）において観察され、ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系は、２つの周辺質結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ−Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分、ＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである（Ｋｏｙａｎａｇｉら、およびその中の参考文献；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）。
【０４９８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はａｒｏＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のａｒｏＰ遺伝子は改変されず、天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ａｒｏＰ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーが、プラスミド上または染色体中で、ＰＭＥの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはａｒａＢＡＤプロモーター、ＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のａｒｏＰ遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然のａｒｏＰ遺伝子のコピーは、プラスミド上または染色体中で、ＰＭＥの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターもしくはＡｒａＢＡＤプロモーター、またはＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
【０４９９】
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じまたは異なる誘導可能なまたは構成的プロモーターの制御下で、ＡｒｏＰおよびＰｈｅＰを含む。
【０５００】
いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現はｐｈｅＰの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は遺伝子操作された細菌における１つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノム内に挿入される。任意の適切な挿入部位が使用されてもよい（例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６６を参照のこと）。挿入部位は、ゲノム内、例えば、（栄養要求株を作製するために）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間などの、意図しない転写のリスクを低減させるために分岐プロモーターの間のいずれの場所にあってもよい。
【０５０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードし、当該Ｐｈｅトランスポーターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に直接または間接的にプレ誘導される（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の株の生産中に、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器中の培養液に供給される特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現する）。
【０５０２】
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードし、当該Ｐｈｅトランスポーターはｉｎ  ｖｉｖｏ投与、直接的または間接的に誘導される（例えば、外因性ｉｎ  ｖｉｖｏ環境（例えば、消化管）における応答条件であり、または特異的分子もしくは代謝産物に対する誘導性プロモーターの制御下で発現する。）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、消化管に特異的な分子または低酸素状態によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株は、化学的および／または栄養性誘導物質と組み合わせて投与される。
【０５０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は複数の作用機構および／または１つもしくは複数の栄養要求性を含む。特定の実施形態では、細菌は、染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＰ／Ｔ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａ）において挿入される酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３）の制御下でＰＡＬの５つのコピー、および染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｌａｃＺ）において挿入される酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）の制御下でフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１つのコピーを含むように遺伝子操作される。より特定の態様では、細菌は、カナマイシン耐性遺伝子、およびｔｈｙＡ栄養要求性をさらに含むように遺伝子操作され、ｔｈｙＡ遺伝子は欠失され、および／または非関連遺伝子と置き換えられる。
【０５０４】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のフェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。
【０５０５】
一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが、遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージがその天然の状態で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに内因性であるファージである。
【０５０６】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ３において１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が１つ以上の欠失を含む。
【０５０７】
多数の作用機構
本発明のいくつかの実施形態では、ＥｃＮのゲノムに対する改変がジアミノピメラート栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管中に見出される低酸素条件下でフェニルアラニン劣化を増強するために行われた。これらの遺伝子操作された細菌は、内因性ＥｃＮファージ３に対する１つ以上の改変をさらに含む。
【０５０８】
いくつかの実施形態では、細菌が多数の作用機構（ＭｏＡ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増強するため）、または複数の異なった機能を実行する回路を含むように遺伝子操作される。挿入部位の例としてはＷＯ２０１７０８７５８０の図６６に示されるｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ、ｄａｐＡ、およびｃｅａ、ならびにその他が挙げられるが、これらに限定されず、これらの含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子操作された細菌は４つの異なった挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺに挿入されたペイロードの４つのコピーを含むことができる。遺伝子操作された細菌はまた、４つの異なる挿入部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａ）に挿入された同一または異なるペイロードの４つのコピー、ならびに異なる挿入部位（例えば、ｌａｃＺ）に挿入された第３の同一または異なる遺伝子の１つのコピーを含み得る（ＷＯ２０１７０８７５８０の図１３Ｂ、その含有量は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。あるいは、遺伝子操作された細菌が３つの異なった挿入部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺ）に挿入されたペイロードの３つのコピーを含み得る。
【０５０９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が、疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子もしくは代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、記載された回路のいずれか１つ以上をＩｎ低酸素条件で発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の１つ以上を発現することができ、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基材をインポートするための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加の回路のうちの１つ以上の組合せ。
【０５１０】
いくつかの実施形態ではペイロードを産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、細菌は同じ条件下での同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍高いレベルで基質を代謝する。
【０５１１】
これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、突然変異がファージゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位である。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が逆転している。いくつかの実施形態では部分または１つ以上のファージ遺伝子が逆転している。
【０５１２】
一実施形態では、本明細書中に記載される大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細菌は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に、１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０１、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、���ＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５１３】
株培養中のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーターの誘導
本明細書中に記載されるＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーターの誘導および前誘導のために、ＰＣＴ／ＷＯ２０１７／０８７５８０  Ａ１に記載されるように、プロトコールおよび戦略が使用され、その全内容は参照により本明細書中に明確に援用される。
【０５１４】
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は製造条件下（例えば、好気性、嫌気性、低酸素、または微好気性）で誘導される１つ以上のＰＭＥおよび／または１つ以上のトランスポーターを含み、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。
【０５１５】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ３中に１つまたは突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。１つの特定の実施形態では、欠失が、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５１６】
プレ誘導の測定
【０５１７】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰの発現が誘導されるそのような培養条件によって、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、またはベースラインレベルと比較して、培地中のフェニルアラニンが少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍減少する。いくつかの実施形態では、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰの発現が誘導されるそのような培養条件によって、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、またはベースラインレベルと比較して、培地中におけるトランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）の生産が少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍になる。
【０５１８】
いくつかの実施形態では、細菌培養物中のケイ皮酸の蓄積は、当該分野で公知であり本明細書に記載の方法によって測定される。ケイ皮酸産生は、フェニルアラニン分解と直接相関し、いくつかの実施形態では、ケイ皮酸は、株の増殖、生産および製造中の株活性の指標として使用され得る。したがって、フェニルアラニンの減少および／またはＴＣＡの産生の測定は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前の治療株の誘導を測定および監視し、微調整するために使用され得る。
【０５１９】
ファージ３
【０５２０】
４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺに挿入されたＰＡＬ
遺伝子操作された細菌はまた、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａにおいて挿入されたＰＡＬの４つのコピー、ならびに異なる組み込み部位、例えば、ｌａｃＺにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１つのコピーを含んでもよい（図１３Ｂ）。あるいは、遺伝子操作された細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺにおいて挿入されたＰＡＬの３つのコピー、ならびに３つの異なる挿入部位、例えば、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびａｒａＣ／ＢＡＤにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の３つのコピーを含んでもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、ＥｃＮ内因性ファージ３に対する１つまたは複数の突然変異または改変をさらに含む。
【０５２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）野生型または（安定性または代謝活性を増加させるための）突然変異型においてフェニルアラニンを分解するためＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ、（２）野生型または（安定性または代謝活性を増加させるための）突然変異型においてフェニルアラニンを取り込むためのトランスポーターＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、（３）分泌および細胞外フェニルアラニン分解のためのＰＡＬ、ＰＡＨ、ＬＡＡＤ、および／またはＰｈｅＰ、（４）本明細書に記載されているような分泌機構の成分、（５）栄養要求性、例えば、デルタＴｈｙＡおよび／またはデルタｄａｐＡ、（６）限定されないが、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含む抗生物質耐性、（７）本明細書に記載されているように酸素代謝に関与する遺伝子の突然変異／欠失ならびに（８）内因性Ｎｉｓｓｌｅフェニルアラニン合成経路の遺伝子の突然変異／欠失（例えば、Ｐｈｅ栄養要求性についてデルタＰｈｅＡ）、（９）１つまたは複数のバイオセイフティーシステム構築物および／または死滅スイッチ、（１０）１つ以上の他の調節因子、例えばＦＮＲＳ２４Ｙ、（１１）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つまたは複数の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０５２２】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、フェニルアラニンの消費のための遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において突然変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。
【０５２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ、例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３おいて１つまたは複数の突然変異を含む。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する１つ以上の欠失を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。１つの特定の実施形態において、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列はファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５２４】
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばＰＭＥ、Ｐｈｅトランスポーターおよび／または転写調節因子を産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの分解およびＴＣＡの生成の両方を、同一条件下の同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍高いレベルで行う。
【０５２５】
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばＰＭＥ、Ｐｈｅトランスポーターおよび／または転写調節因子を産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの分解および馬尿酸の生成の両方を、同一条件下の同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍高いレベルで行う。
【０５２６】
いくつかの実施形態において、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えばＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、直接的または間接的に外因性環境条件によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、低酸素もしくは嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、当該ＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の発現は、哺乳動物の消化管内の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。本明細書に記載される例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、アラビノース、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、ラムノース、ならびに他の化学的および／または栄養性誘導物質が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のこのような誘導性プロモーターは、本明細書に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の前に菌株が調製される際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で誘導される。例示的な誘導性プロモーターの例には限定されないが、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、およびＰＴｅｔＲプロモーター、Ｐｌａｃプロモーター、ｒｈａＰ  ＢＡＤ（ラムノース）プロモーターが含まれ、その各々について本明細書で詳細に記述する。誘導性プロモーターは、以下により詳細に記載される。
【０５２７】
１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、細菌細胞内の染色体に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内の染色体に位置し、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする１つ以上の遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内のプラスミド上に位置し、別種の細菌由来の少なくとも１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする少なくとも１つの遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の天然コピーが染色体に位置し、別種の細菌由来の１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする１つ以上の遺伝子が細菌細胞の染色体に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は低コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は高コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも１つのＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の発現を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、上記の遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の内在性遺伝子における改変、突然変異、および／または欠失の１つ以上をさらに含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つまたは複数の遺伝子において変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つまたは複数のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つまたは複数のバクテリオファージ遺伝子を包含し得る。
【０５２８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３において１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する１つ以上の欠失を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の１つ以上の完全または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５２９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株がＦＮＲ駆動ＰＡＬ３（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる））およびＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２（その内容全体が参照により本明細書に援用される））の３つの染色体挿入を含む。この株は、天然のパラプロモーター（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６４、その内容全体が参照により本明細書に援用される）によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたＬＡＡＤの１コピーをさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０７である。
【０５３０】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株がＦＮＲ駆動ＰＡＬ３（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８（その内容全体が参照により本明細書に援用される））およびＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２（その内容全体が参照により本明細書に援用される））の３つの染色体挿入を含む。この株は、天然のパラプロモーター（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６４、その内容全体が参照により本明細書に援用される）によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１つの複製をさらに含む。ｄａｐＡ遺伝子が欠失しているｄａｐＡ栄養要求性を含むようにゲノムをさらに操作する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１２である。
【０５３１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はＦＮＲ駆動ＰＡＬ３（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８（その内容全体が参照により本明細書に援用される））およびＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２（その内容全体が参照により本明細書に援用される））の３つの染色体挿入を有する細菌染色体を含む。この株はさらに、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１コピー、および同じ挿入部位に挿入されたＬＡＡＤの１コピー（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ−ＬＡＡＤ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号７３（その内容全体が参照により本明細書に援用される））を含み、これは、内因性アラビノースプロモーターからのバイシストロニックメッセージとして転写される。ｄａｐＡ遺伝子が欠失しているｄａｐＡ栄養要求性を含むようにゲノムをさらに操作する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０８である。
【０５３２】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はＦＮＲ駆動ＰＡＬ３（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８（その内容全体が参照により本明細書に援用される））およびＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２（その内容全体が参照により本明細書に援用される））の３つの染色体挿入を有する細菌染色体を含む。この株はさらに、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１コピー、および同じ挿入部位に挿入されたＬＡＡＤの１コピー（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ−ＬＡＡＤ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号７３（その内容全体が参照により本明細書に援用される））を含み、これは、内因性アラビノースプロモーターからのバイシストロニックメッセージとして転写される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１１である。
【０５３３】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はＦＮＲ駆動ＰＡＬ３（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えばＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８（その内容全体が参照により本明細書に援用される））の３つの染色体挿入、およびＦＮＲ駆動ｐｈｅＰ（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えばＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２（その内容全体が参照により本明細書に援用される）の２つのコピーを含む細菌染色体を含む。この株は天然のパラプロモーター（Ｐａｒａ：：ＬＡＡＤ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号４０（その内容全体が参照により本明細書に援用される））によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたＬＡＡＤの１コピーをさらに含む。ｄａｐＡ遺伝子が欠失しているｄａｐＡ栄養要求性を含むようにゲノムをさらに操作する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０９である。
【０５３４】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はＦＮＲ駆動ＰＡＬ３（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えばＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８（その内容全体が参照により本明細書に援用される））の３つの染色体挿入、およびＦＮＲ駆動ｐｈｅＰ（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えばＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２（その内容全体が参照により本明細書に援用される）の２つのコピーを含む細菌染色体を含む。この株は天然のパラプロモーター（Ｐａｒａ：：ＬＡＡＤ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号４０（その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される））によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたＬＡＡＤの１つのコピーをさらに含む。ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０はＩＰＴＧ誘導性ＰＡＬ３の２つのコピー（２×ＬａｃＩＰＡＬ、ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号７４（その内容全体が参照により本明細書に援用される））、ｄａｐＡ栄養要求性をさらに含み、そして全ての抗生物質耐性が治癒される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０である。
【０５３５】
これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載され、ＷＯ２０１７０８７５８０の図４７に示される遺伝子操作されたものいずれかは、その内容全体が本明細書に参考として援用され、本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例ではＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的または完全に欠失される。
【０５３６】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌が（野生型遺伝子に加えて）２追加コピーのＰｈｅＰを含む。これは、ＰｈｅＰ遺伝子の１つが突然変異を獲得するケースにおいて、冗長性を提供する。一実施形態では、ＰｈｅＰ遺伝子はｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌに挿入される。一実施形態では、ＰｈｅＰの２つのコピーがＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＰＡＬ３の３つのコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐｌに挿入されたＰＡＬ３の３つのコピーを含む。一実施形態では、ＰＡＬ３の３つのコピーの発現がＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がアラビノースオペロンに挿入されたＬＡＡＤの１つの複製を含む。一実施形態では、ＬＡＡＤが内因性パラバッドプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が栄養要求性、例えばｄｅｌｔａＴｈｙＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が抗生物質耐性および栄養要求性（例えば、ｄｅｌｔａＴｈｙＡ）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が栄養要求性、例えばｄｅｌｔａＴｈｙＡを含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が抗生物質耐性も栄養要求性も含まない（例えば、ｄｅｌｔａＴｈｙＡ）。
【０５３７】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＰＡＬの３コピー、例えばＰＡＬ３、ＰｈｅＰの２コピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１コピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＰＡＬの３コピー、例えばＰＡＬ３、ＰｈｅＰの２コピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１コピー、および栄養要求性、例えばδＴｈｙＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ、２コピーのＰｈｅＰ（内因性ＰｈｅＰに加えて）、および１コピーのＬＡＡＤ、および抗生物質耐性遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ、２コピーのＰｈｅＰ（内因性ＰｈｅＰに加えて）、および１コピーのＬＡＡＤ、ならびに抗生物質耐性遺伝子および栄養要求性、例えばδＴｈｙＡを含む。
【０５３８】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラＢＡＤプロモーターの制御下にある）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラバッドプロモーターの制御下にある）、および抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラバッドプロモーターの制御下にある）、および栄養要求性、例えばδｄａｐＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＰＡＬの３つのコピー（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、ＰｈｅＰの２つのコピー（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性パラバッドプロモーターの制御下にある）、ならびに抗生物質耐性および栄養要求性、例えばΔｄａｐＡを含む。
【０５３９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入される）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入される）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入されている）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入されている）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入されている）を含み、さらに抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入される）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入される）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される）を含み、栄養要求性、例えば、ΔｄａｐＡをさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が３コピーのＰＡＬ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入されている）、２コピーのＰｈｅＰ（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入されている）、および１コピーのＬＡＡＤ（内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入されている）を含み、抗生物質耐性および栄養要求性、例えばΔｄａｐＡをさらに含む。
【０５４０】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５である。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５が抗生物質耐性をさらに含む。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５が栄養要求性、例えばｄｅｌｔａＴｈｙＡをさらに含む。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５が抗生物質耐性および栄養要求性、例えばｄｅｌｔａＴｈｙＡをさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載される遺伝子操作された任意のものは、本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例ではＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的または完全に欠失される。
【０５４１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドを含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００１である。
【０５４２】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドを含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００２である。
【０５４３】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドを含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ-ＰＫＵ１００３である。
【０５４４】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００４である。
【０５４５】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００５である。
【０５４６】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００６である。
【０５４７】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００７である。
【０５４８】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００８である。
【０５４９】
一実施形態では、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物（その全内容が参照により本明細書に援用される）の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００９である。
【０５５０】
一実施形態では、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物（その全内容が参照により本明細書に援用される）の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１０である。
【０５５１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参考として本明細書中に援用される）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドを含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１１である。
【０５５２】
一実施形態では、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物（その全内容が参照により本明細書に援用される）の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、その全内容が参照により本明細書に援用される（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８、その全内容が参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１２である。
【０５５３】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参照により本明細書に援用される）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１３である。
【０５５４】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参照により本明細書に援用される）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１４である。
【０５５５】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参照により本明細書に援用される）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１５である。
【０５５６】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参照により本明細書に援用される）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１６である。
【０５５７】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１７である。
【０５５８】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１８である。
【０５５９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、当該株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０１９である。
【０５６０】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２０である。
【０５６１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２１である。
【０５６２】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドを含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２２である。
【０５６３】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２３である。
【０５６４】
一実施形態では遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物とを含み、その含有量はその全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドを含み、ｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される（その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２４である。
【０５６５】
一実施形態では、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物（その含有量がその全体が本明細書中に参考として援用される）の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はその全体が基準により本明細書に組み込まれる（ＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５、その含有量はその全体が基準により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２５である。
【０５６６】
一実施形態では、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物（その含有量がその全体が本明細書中に参考として援用される）の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックされる（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる（その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。１つの実施形態において、当該株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２６である。
【０５６７】
１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参考として本明細書中に援用される）。この株はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる（ＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。１つの実施形態において、当該株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２７である。
【０５６８】
一実施形態では、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物（その含有量がその全体が本明細書中に参考として援用される）の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックされる（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる（ＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６、その含有量はその全体が参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２８である。
【０５６９】
１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参考として本明細書中に援用される）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その全体が基準により本明細書に組み込まれる（その含有量はその全体が基準により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。１つの実施形態において、当該株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２９である。
【０５７０】
１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックされる（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参考として本明細書中に援用される）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドを含み、その含有量はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に援用される（その含有量はその全体が参照により本明細書に援用される、ＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０３０である。
【０５７１】
１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参考として本明細書中に援用される）。この株はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる（その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０３２である。
【０５７２】
１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックされる（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的プロム１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）参考として本明細書中に援用される）。この株はさらに、ＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドを含み、その含有量はｂｌａ遺伝子がＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる（その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７０８７５８０のＬａｃＩ  Ｆｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０３２である。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＩＰＳ系を含む本明細書に記載の遺伝子操作された任意のものは、本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含む。
【０５７３】
これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例ではＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的または完全に削除される。
【０５７４】
前述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に、１つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０１、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯ���ＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５７５】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下に）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＨの１つまたは複数のコピーおよびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＨの１つまたは複数のコピーおよびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ＰＡＨの１つまたは複数のコピー、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ＰＡＨの１つまたは複数のコピー、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれるＰＭＥおよび／またはトランスポーターと組み合わせて、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、配置されたＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの３つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの３つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣ
ＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。
【０５７６】
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に、１つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０１、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。比一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩ���＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）プロテウス・ミラビリス由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子；
ｄ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；
ｅ）抗生物質耐性；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５７８】
前述の実施形態のいずれにおいても、ファージ３の突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。比一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は���ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５７９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）プロテウス・ミラビリス由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子；
ｄ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；および
ｅ）１つ以上の改変または突然変異（例えば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５８０】
前述の実施形態のいずれにおいても、ファージ３の突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。比一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は���ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５８１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）プロテウス・ミラビリス由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子；
ｄ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；および
ｅ）１つ以上の改変または突然変異（例えば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５８２】
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ���ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５８３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）化学物質または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）パルプの表現を誘発する化学的誘導物質と同一または異なった、化学的誘導物質によって誘発されるプロモーターの規制上の制御のもとに、プロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコード化する１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５８４】
前述の実施形態のいずれにおいても、ファージ３の突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の���列は、ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）化学物質または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）パルプの表現を誘発する化学的誘導物質と同一または異なった、化学的誘導物質によって誘発されるプロモーターの規制上の制御のもとに、プロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコード化する１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５８６】
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ���ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）外因性環境条件で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３コピー；
ｃ）化学物質または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２コピー；
ｄ）化学的誘導物質によって誘発されるプロモーターの規制上のプロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードした遺伝子のうち、パルの表現を誘発する化学的誘導物質と同一または異なったもの１個；
ｅ）栄養要求性を生成するための内因性ｄａｐＡの１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５８８】
前述の実施形態のいくつかにおいて、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファ���ジ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下でフォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｔａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）アラビノース−誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子ＡｒａＣの調節制御下でプロテウス・ミラビリスに由来するＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５９０】
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ���ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５９１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下でフォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｔａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）アラビノース−誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子ＡｒａＣの調節制御下でプロテウス・ミラビリスに由来するＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）を生成するための内因性遺伝子の１つ以上の欠失；および
ｆ）１つ以上の改変または突然変異（例えば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位）。
【０５９２】
上記の実施形態のいくつかにおいて、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファ���ジ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５９３】
１つの具体的な実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素の各々を含む：
ａ）嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）およびｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で染色体に挿入された嫌気性応答性転写活性化因子の調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座の染色体に挿入されたＰｆｎｒＳとＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする３コピー；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｌａｃ）とラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩ（ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座に挿入）の調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピー；
ｄ）アラビノース−誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子（ＡｒａＣ）の調節制御下でプロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１部、天然アラビノースプロモーター下でＬＡＡＤ；
ｅ）ジアミノピメラート栄養要求株を作製するために４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（欠失、挿入、置換、逆位など）。
【０５９４】
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５から選択される１つ以上の遺伝子に位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ���ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０５９５】
１つの具体的な実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素の各々を含む：
ａ）嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）およびｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で染色体に挿入された嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）ＰｆｎｒＳとＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３コピーを、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座の染色体に挿入した；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピーは、ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座に挿入される；
ｄ）アラビノース−誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子（ＡｒａＣ）の調節制御下でプロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）を符号化し、天然アラビノースプロモーター下でＬＡＡＤを有する遺伝子の１部；
ｅ）４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードしてジアミノピメラート栄養要求株を産生するｄａｐＡ遺伝子の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の領域のＡ欠失であって、欠失領域は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、および部分的ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を含む。
【０５９６】
１つの具体的な実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素の各々を含む：
ａ）嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）およびｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で染色体に挿入された嫌気性応答性転写活性化因子の調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座の染色体に挿入されたＰｆｎｒＳとＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする３コピー；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｌａｃ）とラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩ（ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座に挿入）の調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピー；
ｄ）アラビノース−誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子（ＡｒａＣ）の調節制御下でプロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１部、天然アラビノースプロモーター下でＬＡＡＤ；
ｅ）４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードしてジアミノピメラート栄養要求株を産生するｄａｐＡ遺伝子の欠失；および
ｇ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の領域の欠失（欠失領域は配列番号１３０からなる）。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである。いくつかの実施形態では、この株はＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２と同じ改変である。いくつかの実施形態では、この株はＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２である。
【０５９７】
表１４は、本開示の遺伝子操作された細菌の非限定的な例を含む。特定の実施形態では、表１４の遺伝子操作された細菌は分泌のためのＰＭＥをさらに含む。
【０５９８】
［表１４］本開示の実施形態の非限定的な例
【表２４−１】
2020525012.tif 000087
【表２４−２】
2020525012.tif 000088
【表２４−３】
2020525012.tif 000089
【０５９９】
遺伝子操作された生物、例えば操作された細菌または操作されたＯＶが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌分子、消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症性分子、神経調節性分子、ｓａｔｉｅｔｙエフェクター、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、または微生物から分泌されることを目的としたその他の分子を産生する本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構、および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。
【０６００】
【表２５】
2020525012.tif 000090
【０６０１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝するための１つ以上のＰＭＥを、分泌のための１つ以上のＰＭＥと組合せて含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝するための１つ以上のＰＭＥと、分泌のための１つ以上のＰＭＥと組み合わされたフェニルアラニントランスポーターとを含む。１つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンを代謝するための１つ以上のＰＭＥおよび分泌のための１つ以上のＰＭＥと組み合わされたフェニルアラニントランスポーターを含み、そしてまた、栄養要求性および／または抗生物質耐性を含む。本明細書に記載される分泌系は、多数の作用機構との遺伝子操作された細菌においてＰＭＥを分泌するために利用される。
【０６０２】
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に、１つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０１、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯ���ＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。
【０６０３】
分泌
遺伝子操作された微生物がタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌、免疫調節、ＤＮＡ、ＲＮＡ、微生物から分泌されることを意図した小分子または他の分子を産生する、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境において細菌細胞質から抗癌分子を分泌することができる天然の分泌機構または非天然の分泌機構をさらに含む。多くの細菌は細菌細胞外被を横切って基質を輸送するために高度な分泌系に進化している。小分子、タンパク質、およびＤＮＡなどの基質は、細胞外間隙または周辺質（消化管内腔または他の間隙など）内に放出され得、標的細胞内に注入され得るか、または細菌膜に付随され得る。
【０６０５】
グラム陰性細菌において、分泌機構は内膜および外膜の一方または両方に及んでもよい。
【０６０６】
タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外間隙に移行するために、ポリペプチドは最初に細胞内で翻訳され、内膜を横切って動員され、最終的に外膜を横切って動員されなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−特に真核生物起源のもの−は、三次および四次構造を安定化させるためにジスルフィド結合を含有する。外膜を横切ってポリペプチドを移行させるために、これらの結合は周辺質シャペロンの支援を受けて酸化周辺質区画内で正確に形成することができるが、ジスルフィド結合は還元されなければならず、タンパク質は再び折り畳まれなくなる。
【０６０７】
グラム陰性およびグラム陽性細菌からの異種ポリペプチド、例えば、エフェクター分子の分泌のための適切な分泌系は、係属中の同時所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００、出願０５／２５／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、出願０１／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３、出願０２／０４／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３、出願０２／１０／２０１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２、出願０７／２９／０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１、出願０８／３１／２０１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８、出願０６／１０／１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０６０８】
表面ディスプレイ
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または微生物が細菌および／または微生物の表面上に固定または提示される、本明細書に記載される目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子および／または遺伝子カセットをコードする。細菌および／または微生物にディスプレイまたは固定されるペイロード分子の例は本明細書中に記載されるペイロード分子または他のエフェクターのいずれかであり、そして酵素（例えば、ＰＭＥまたはキヌレニナーゼ）、抗体（例えば、ｓｃＦｖ断片）、および腫瘍特異的抗原またはネオ抗原を含むが、これらに限定されない。
【０６０９】
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の表面上の異種ポリペプチド、例えばエフェクター分子の表面ディスプレイに適したシステムは、国際公開第２０１７／１２３６７５号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０６１０】
必須遺伝子および栄養要求株
本明細書において使用される場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞増殖および／または生存に必要とされる遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は当業者に周知であり、遺伝子の指向性欠失ならびに／またはランダム突然変異誘発およびスクリーニングによって同定され得る。（例えば、ＺｈａｎｇおよびＬｉｎ、「ＤＥＧ  ５．０，ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００９年；３７：Ｄ４５５−Ｄ４５８ならびにＧｅｒｄｅｓら、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００６年；１７（５）：４４８〜４５６頁を参照のこと、それらの各々の全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる）。
【０６１１】
「必須遺伝子」は、生物が生存している状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、改変、または除去により、栄養要求株になる本開示の遺伝子操作された細菌が得られ得る。栄養要求性の改変は、細菌がその必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子を欠いているため、生存または増殖に必須の外部から加えられた栄養素の非存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかもまた、細胞生存および／または増殖に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む。一実施形態では、必須遺伝子はＤＮＡ合成遺伝子、例えばｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、例えばｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、限定されないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含む、細胞生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子が標的化されてもよい。表１８Ａは、栄養要求性株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を列挙する。これらには、限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
【０６１２】
［表１８Ａ］栄養要求株の産生に有用な細菌遺伝子の非限定的な例
【表２６】
2020525012.tif 000091
【０６１３】
表１９Ａは、経管栄養の２４時間後および４８時間後に検出したときのマウスの消化管における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す。これらの栄養要求株は、大腸菌のＮｉｓｓｌｅ株ではないＢＷ２５１１３を使用して生成された。
【０６１４】
［表１９Ａ］マウス消化管におけるアミノ酸栄養要求株の生存
【表２７】
2020525012.tif 000092
【０６１５】
例えば、チミンは細菌細胞増殖に必要とされる核酸であり、その非存在下では、細菌は細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成における第１段階を触媒する酵素である、チミジル酸シンテターゼをコードする（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失し、および／または非関連遺伝子と置き換えられているｔｈｙＡ栄養要求株である。ｔｈｙＡ栄養要求株は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを添加することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いチミンレベルの存在下で十分な量のチミンが存在する場合にのみ増殖できる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物の消化管に存在する場合に相補される遺伝子の栄養要求性である。十分な量のチミンがないと、ｔｈｙＡ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０６１６】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌細胞壁成長に必要とされる（Ｍｅａｄｏｗら、１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかは、ｄａｐＤが欠失し、および／または非関連遺伝子と置き換えられているｄａｐＤ栄養要求株である。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＡＰを増殖培地に添加することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いＤＡＰレベルの存在下で、十分な量のＤＡＰが存在する場合にのみｄａｐＤ栄養要求株は増殖できる。十分な量のＤＡＰがないと、ｄａｐＤ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０６１７】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ｕｒａＡが欠失し、および／または非関連遺伝子と置き換えられているｕｒａＡ栄養要求株である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよびその後の代謝を促進する膜結合性トランスポーターであるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９５年）。ｕｒａＡ栄養要求株は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にウラシルを添加することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いウラシルレベルの存在下で十分な量のウラシルが存在する場合にのみ増殖できる。十分な量のウラシルがないと、ｕｒａＡ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌が、栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０６１８】
複合的な集団において、細菌がＤＮＡを共有することは可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は、ゲノム欠失を修復し、栄養要求株を恒久的に救出する非栄養要求性株からＤＮＡを受け取ることができる。したがって、１つより多い栄養要求株で細菌株を操作することにより、栄養要求性を救出するのに十分な時間、ＤＮＡ転移が発生する可能性を大きく減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要な２つ以上の遺伝子の欠失または突然変異を含む。
【０６１９】
必須遺伝子の他の例には、限定されないが、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に公知である。
【０６２０】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する１つまたは複数の必須遺伝子において突然変異を有する合成栄養要求株である（ＬｏｐｅｚおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ  ２０１５年；４（１２）：１２７９〜１２８６頁、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる）。
【０６２１】
いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は必須遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃのうちの１つまたは複数を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌのうちの１つまたは複数を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇのうちの１つまたは複数を含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃのうちの１つまたは複数を含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇのうちの１つまたは複数を含むａｄｋである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
【０６２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はリガンドによって相補される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはＬ−ヒスチジンメチルエステルによって相補される。ｄｎａＮにおける突然変異（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、または２−アミノベンゾチアゾールによって相補される。ｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって相補される。ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって相補される。ａｄｋにおける突然変異（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって相補される。
【０６２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、それをリガンドに対して栄養要求性にする１つより多い突然変異必須遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は２つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）およびｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む。他の実施形態では、細菌細胞は３つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）、およびｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む。
【０６２４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、必須遺伝子が、ＷＯ２０１７０８７５８０の図８５〜８６に示されるアラビノース系を使用して置き換えられている条件付き栄養要求株である。
【０６２５】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路も含む。例えば、遺伝子操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要とされる必須遺伝子、例えばＤＮＡ合成遺伝子、例えばｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、例えばｄａｐＡおよび／またはアミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡもしくはＭｅｔＡにおける欠失または突然変異を含んでもよく、また、環境条件および／もしくはシグナル（記載されるアラビノース系など）に応答して発現される１つもしくは複数の転写活性化因子によって調節されるか、または外因性環境条件および／もしくはシグナル（本明細書に記載されるリコンビナーゼ系など）を検知すると発現される１つもしくは複数のリコンビナーゼによって調節される毒素遺伝子も含んでもよい。他の実施形態は、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ、２０１５年；４（３）：３０７〜３１６頁に記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路、ならびに条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティー系も含む（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のバイオセイフティープラスミドと組み合わせて細菌染色体に組み込まれた１つ以上のＡＩＰＳ構築物を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、プラスミド複製開始タンパク質がトランスで提供される（すなわち、染色体に組み込まれたバイオセイフティー構築物によってコードされる）条件付き複製起点（ＣＯＲ）を含む。いくつかの実施形態において、染色体に組み込まれた構築物は、栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ栄養要求性）が生じるように宿主にさらに導入され、当該栄養要求性は、バイオセイフティープラスミド構築物から発現する遺伝子産物によって補充される。いくつかの実施形態では、バイオセイフティープラスミドは広域スペクトル毒素（例えば、Ｋｉｓ）をさらにコードするが、組み込みバイオセイフティー構築物は抗毒素（例えば、抗Ｋｉｓ）をコードし、両方の構築物を含む細菌細胞ではプラスミド増殖が可能になる。理論に縛られることを望むものではないが、この機構は、プラスミドＤＮＡ自体が野生型細菌によって維持されることを不利にすることによって、プラスミド散布を選択しないように機能する。そのようなバイオセイフティーシステムの非限定的な例が、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａ、図６１Ｂ、図６１Ｃ、および図６１Ｄに示されている。
【０６２６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８１、８２、８３、８４、８５またはその機能的断片のＤＮＡ配列に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な染色体に挿入されたバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８６、８７、８８またはその機能的断片のポリペプチド配列に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なポリぺチド配列をコードする染色体に挿入されたバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。
【０６２７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８９、９０、９１、９２、９３、９４またはその機能的断片のＤＮＡ配列に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な染色体ベースのバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８９、９０、９１、９２、９３、９４またはその機能的断片のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なポリペプチド配列をコードする染色体ベースのバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。
【０６２８】
いくつかの実施形態では本遺伝子操作された細菌がＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３６、３７、７４、９５、９６、９８、９９、１００、１１３のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるプラスミドベースのバイオセイフティー構築物ペイロード核酸配列を含み、その内容はその全体が本明細書中に参考として援用される。いくつかの実施形態では本遺伝子操作された細菌がＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３６、３７、７４、９５、９６、９８、９９、１００、１１３のＤＮＡ配列によって符号化されるポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードするプラスミドベースのバイオセイフティー構築物ペイロード核酸配列を含み、その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＰＡＬの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＰＡＬの１つ以上のコピーおよびＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＰＡＬの１つ以上のコピーおよびＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＬＡＡＤの１つ以上のコピーおよびＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がＰＡＬの１つ以上のコピーおよびＰｈｅＰの１つ以上のコピーおよびＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン異化プラスミドペイロード（すなわち、ＰＡＬ、ＰｈｅＰ、および／またはＬＡＡＤ）は本明細書中に記載されるような１つ以上の構成的または誘導性プロモーター（例えば、低酸素、アラビノース、ＩＰＴＧ誘導性、またはそれらの組合せ）の制御下にある。いくつかの実施形態では、このプロモーターはプレ誘導に有効である。いくつかの実施形態では、本プロモーターはｉｎ  ｖｉｖｏ活性化に有効である。いくつかの実施形態では、本プロモーターがプレ誘導およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性に有効である。いくつかの実施形態では、この構築物は２つ以上のプロモーターから構築物されており、その中には導入前に役立つものもあり、中には生体活性に役立つものもある。
【０６２９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの異化のためのペイロード構築物を含むプラスミドベースのバイオセイフティー構築物核酸配列（染色体ベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーおよびＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーおよびＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピーおよびＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーおよびＰｈｅＰの１つ以上のコピーおよびＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン異化プラスミドペイロード（すなわち、ＰＡＬ、ＰｈｅＰ、および／またはＬＡＡＤ）は、本明細書に記載の１つ以上の構成的または誘導性プロモーター（例えば、低酸素、アラビノース、ＩＰＴＧ誘導性、またはそれらの組み合わせ）の制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、プレ誘導およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性に有用である。いくつかの実施形態では、構築物は２つ以上のプロモーターを含み、当該プロモーターの一部はプレ誘導に有用であり、一部はｉｎ  ｖｉｖｏ活性に有用である。
【０６３０】
これらの実施形態のいずれかにおいて、栄養要求性を含む遺伝子操作された細菌は、内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ファージゲノムに対する改変がファージゲノム内の１つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が逆転している。１つ以上のファージ遺伝子のいくつかの実施形態では部分は逆転している。
【０６３１】
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、そして１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ３中に１つまたは突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のファージ３遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０から選択される１つ以上の遺伝子を含む。ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００  ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失がＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０と、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失との完全な欠失である。１つの実施形態において、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。１つの実施形態において、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠���される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の遺伝子を含む１つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、本遺伝子操作された細菌が疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、Ｉｎ低酸素条件で、任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の１つ以上を発現することができ、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基材をインポートするための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加の回路のうちの１つ以上の組合せ。
【０６３２】
Ｐｈｅ栄養要求性の付加はまた、フェニルアラニン分解速度を増加させるための有用性も有することができる。例えば、ｐｈｅＡ遺伝子の欠失により、フェニルアラニン栄養要求性がもたらされる。内因性細菌のフェニルアラニン産生の停止によって、環境からの取り込みの増加を促すことができ、また、環境から取り込まれたフェニルアラニンの分解の増加ももたらすことができる。
【０６３３】
遺伝子調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するための多層遺伝子調節回路を含む。適切な多層遺伝子調節回路は、国際公開第２０１６／２１０３７８号として公開され、２０１６年６月２４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４３４に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。遺伝子調節回路は、抗癌分子を産生したり、栄養要求性をレスキューする変異細菌をスクリーニングするのに有用である。特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択する方法を提供する。
【０６３４】
宿主−プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、宿主−プラスミド相互依存性を生じるように改変されているプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、抗生物質非依存性プラスミドシステム（ＡＩＰＳ）である（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。これらおよび他のシステムおよびプラットフォームは、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された２０１７年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０６３５】
死滅スイッチ
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、死滅スイッチを含む。死滅スイッチは、外部刺激に応答して遺伝子操作された細菌を能動的に死滅させることを意図する。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、死滅スイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘導する環境における特定の要因によって誘発される。適切な死滅スイッチは、ＷＯ２０１６２１０３７３として公開された２０１６年６月２４日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３９４２７に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０６３６】
医薬組成物および製剤
本発明の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばＰＫＵを治療、管理、改善、および／または予防するために使用され得る。単独で、または予防剤、治療剤、および／もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を含む本発明の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子組換えを含むように操作された細菌の１つの種、株、または亜型を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子組換えを含むように各々操作された細菌の２つ以上の種、株、および／または亜型を含む。
【０６３７】
本明細書に記載される医薬組成物は、製剤学的用途のための組成物への活性成分の処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当該分野において公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティングされてもよいか、またはコーティングされなくてもよい、錠剤、粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、または粉剤を形成するように錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、造粒、粉状化、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に供される。適切な製剤は投与経路に依存する。
【０６３８】
本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液体、カプセル、サシェ、硬質カプセル、軟質カプセル、錠剤、腸溶コーティング錠剤、懸濁粉末、顆粒、または経口投与用のマトリクス持続放出製剤）で、および任意の適切な種類の投与（例えば、経口、局所、注射、即時放出、パルス放出、遅延放出、または持続放出）のための医薬組成物に製剤化され得る。遺伝子操作された細菌についての適切な投薬量は、約１０５〜１０１２細菌、例えば約１０５細菌、約１０６細菌、約１０７細菌、約１０８細菌、約１０９細菌、約１０１０細菌、約１０１１細菌、または約１０１１細菌の範囲であり得る。組成物は、１日に１回もしくは複数回、１週に１回もしくは複数回、１カ月に１回もしくは複数回投与されてもよい。組成物は、食事の前、間、または後に投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は現在の食事とともに投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べた後に投与される。
【０６３９】
遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、緩衝剤、界面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、限定されないが、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤の付加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、重炭酸ナトリウム溶液、例えば１モルの重炭酸ナトリウム溶液（例えば胃などの酸性細胞環境を緩衝するため）中で製剤化され得る。遺伝子操作された細菌は中性または塩形態として投与および製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンと形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンと形成される塩が含まれる。
【０６４０】
本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は、局所的に投与されてもよく、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、噴霧、エアロゾル、溶液、エマルションの形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化されてもよい。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと。一実施形態では、噴霧可能ではない局所剤形に関して、局所適用に適合し、水より大きい動粘性係数を有する担体または１つもしくは複数の賦形剤を含む、粘性から半固体または固体形態が利用される。適切な製剤には、限定されないが、滅菌され得るか、または種々の特性、例えば浸透圧に影響を与える助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、バッファー、または塩）と混合され得る、溶液、懸濁剤、エマルション、クリーム、軟膏、粉剤、塗布薬、膏薬などが含まれる。他の適切な局所剤形には、噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれ、固体または液体不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状推進剤）と共に混合物中またはスクイーズボトル内に充填される。保湿剤または保水剤もまた、医薬組成物および剤形に加えられてもよい。このようなさらなる成分の例は当業者に周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は衛生製品として製剤化されてもよい。例えば、衛生製品は、抗菌製剤、または発酵ブロスなどの発酵製品であってもよい。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであってもよい。
【０６４１】
本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は、経口投与され、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化されてもよい。経口用途のための医薬組成物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体賦形剤を使用し、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、所望の場合、適切な助剤を加えた後に顆粒の混合物を処理して作製され得る。適切な賦形剤には、限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーが含まれる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤もまた、添加されてもよい。
【０６４２】
錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；錠剤崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤と共に従来の手段によって調製されてもよい。錠剤は当該分野において周知の方法によってコーティングされ得る。コーティングシェルが存在してもよく、一般的な膜には、限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸−ポリリシン−アルギン酸（ＡＰＡ）、アルギン酸−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギン酸（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルメタクリレート（ｈｙｄｒｏｙｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、封入シリカ、硫酸セルロース／アルギ酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ジェラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ−無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶コーティングポリマーが含まれる。
【０６４３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管または消化管の特定の領域、例えば大腸に放出するために腸溶コーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）、および５．５〜６．５（結腸）である。いくつかの疾患では、ｐＨプロファイルは変更されてもよい。いくつかの実施形態では、コーティングは放出部位を特定するために特定のｐＨ環境で分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは異なるｐＨレベルにて分解される。
【０６４４】
経口投与用の液体調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁剤、または乾燥製剤の形態を取ることができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝塩、香味料、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。経口投与用の調製物は、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に製剤化され得る。
【０６４５】
一実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、小児対象への投与に適した組成物に製剤化され得る。当該分野において周知のように、子供は、異なる胃内容排出速度、ｐＨ、胃腸透過性など含む、多くの態様において成人と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら、２０１４年）。さらに、小児の製剤許容性ならびに投与経路および味覚特質などの好みが、許容される小児の服薬順守を達成するのに重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、飲み込みやすいもしくは溶解可能な剤形、または香味料、甘味料、もしくは味覚遮断剤を加えた組成物などの、より口当たりの良い組成物を含んでもよい。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物はまた、成人への投与にも適していてもよい。
【０６４６】
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤または溶液として復元するための粉末、分散性／発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、アイスキャンディー、トローチ、チューインガム、経口薄片、口腔内崩壊錠、サシェ、軟質ゼラチンカプセル、散剤経口粉末、または顆粒を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、キャンディー弾力性、所望のかみごたえのある稠度（ｃｈｅｗｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）、およびより長い保存期間を与える、ゼラチンベースから作製されたグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーはまた、甘味料または香味料を含んでもよい。
【０６４７】
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は香味料を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「香味料」は、製剤に明確な味および香りを与える物質（液体または固体）である。香味料はまた、製剤の嗜好性を改善するのにも役立つ。香味料には、限定されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。
【０６４８】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与されてもよい。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハーなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外によって化合物を投与するために、その不活性化を阻止するために物質で化合物をコーティングするか、または物質と共に化合物を同時投与することが必要な場合がある。
【０６４９】
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食べられる製品、例えば食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酢乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−果物ジュース、果物ジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児用食品（乳児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキ、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生細菌細胞を含有する調製物中に組み合わされる。別の実施形態では、食品は飲料である。一実施形態では、飲料は、果物ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は当該分野において周知である。例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および米国特許出願公開第２０１５／０２３８５４５号を参照のこと。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品に注入され、噴霧され、または振りかけられる。
【０６５０】
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングされているか、またはコーティングされていない、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、または微小錠剤によって、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃バイパス投与、または結腸内投与用に製剤化される。医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、またはエマルションであってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含有してもよい。
【０６５１】
本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、鼻腔内投与されてもよく、エアロゾル形態、噴霧、ミストで、または液滴の形態で製剤化されてもよく、便宜上、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧提示の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾル投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入具または注入器における使用のための（例えば、ゼラチンの）カプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有して製剤化されてもよい。
【０６５２】
遺伝子操作された細菌は、デポー製剤として投与され、製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、移植または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、もしくは点滴を含む、注射によって投与されてもよい。例えば、組成物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化されてもよい。
【０６５３】
いくつかの実施形態では、単回剤形の薬学的に許容される組成物が本明細書に開示される。単回剤形は液体または固体形態であってもよい。単回剤形は、改変せずに患者に直接投与されてもよいか、または投与前に希釈もしくは復元されてもよい。特定の実施形態では、単回剤形は、複数の錠剤、カプセル、丸薬などを含む経口用量を含む、ボーラス形態、例えば、単回注射、単回経口用量で投与されてもよい。代替の実施形態では、単回剤形は、例えば点滴によって一定の期間にわたって投与されてもよい。
【０６５４】
医薬組成物の単回剤形は、医薬組成物をより少ない一定量、単回投与容器、単回投与液体形態、または腸溶コーティングされてもよいか、もしくはコーティングされていなくてもよい、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、もしくは粉末などの単回投与固体形態に分けることによって調製されてもよい。固体形態の単回用量は、患者に投与する前に液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって復元されてもよい。
【０６５５】
他の実施形態では、組成物は制御放出または持続放出系において送達され得る。一実施形態では、ポンプが制御または持続放出を達成するために使用されてもよい。別の実施形態では、ポリマー材料が本開示の治療の制御または持続放出を達成するために使用されてもよい（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照のこと）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例には、限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコライド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、保管時に安定であり、滅菌され、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出系は予防または治療標的に近接して配置されてもよく、それによって全身用量の一部しか必要とされない。当業者に公知の任意の適切な技術が使用されてもよい。
【０６５６】
投薬レジメンは治療応答を提供するように調節されてもよい。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、治療の時間的経過（数日から数カ月から数年）、および疾患の改善時期を含む、いくつかの要因に依存し得る。例えば、単一ボーラスが一度に投与されてもよく、いくつかの分割用量が所定の期間にわたって投与されてもよく、または用量は、治療状況によって示されるように減少もしくは増加されてもよい。投薬量についての仕様は活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果によって決定される。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度によって変わり得る。任意の特定の対象について、特定の投薬レジメンは、個々の必要性および治療を行う医師の専門的判断に従って経時的に調節されてもよい。本明細書において提供される化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬剤的手順によって決定され得る。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、およびＩＣ５０が決定され得、毒性と治療効果との間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）が治療指数として計算され得る。有毒な副作用を示す組成物が、副作用を低減させるために潜在的な損傷を最小化するための注意深い変更を行って使用されてもよい。投薬は最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための広範な投薬量を決定する際に使用され得る。
【０６５７】
成分は、別個に、または例えば、活性剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの密閉容器中の乾燥した凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、単位剤形で一緒に混合されて供給される。投与様式が注射による場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。
【０６５８】
医薬組成物は薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器にパッケージ化されてもよい。一実施形態では、医薬組成物の１つまたは複数は、密閉容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与のために適切な濃度に（例えば水または生理食塩水を用いて）復元され得る。一実施形態では、予防もしくは治療剤または医薬組成物の１つまたは複数は、２℃から８℃の間で保存された密閉容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、復元後、１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される。凍結乾燥剤形のために原則として０〜１０％のスクロース（最適には０．５〜１．０％）の抗凍結剤が含まれてもよい。他の適切な抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニン（それらのいずれも０〜０．０５％の濃度で含まれてもよい）、ならびにポリソルベート−８０（最適には０．００５〜０．０１％の濃度で含まれる）が含まれる。さらなる界面活性剤には、限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。医薬組成物は注射溶液として調製されてもよく、吸収または分散を増加させるために使用されるアジュバント、例えばヒアルロニダーゼなどの、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含んでもよい。
【０６５９】
治療方法
本発明の別の態様は、本明細書に開示された操作された細菌を含む組成物物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明がそれを必要とする被験体に、内因性または天然ファージゲノム中に改変を含む操作された細菌を含む組成物を投与することを含む、疾患の治療法を提供する。
【０６６０】
本発明の別の態様は、高フェニルアラニン血症に関連する高フェニルアラニン血症または症状に関連する疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明が高フェニルアラニン血症に関連する高フェニルアラニン血症または症状に関連する疾患を治療するための方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に開示される操作された細菌を含む組成物物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明が１つまたは複数のＰＭＥ、例えばＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤをコードする遺伝子配列を含む操作された細菌を含む組成物物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、高フェニルアラニン血症に関連する高フェニルアラニン血症または症状に関連する疾患を治療するための一方法を提供する。いくつかの実施形態では、この操作された細菌が内因性または天然のファージゲノムにおける改変を含み得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が１つ以上のエフェクター分子（例えば、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤおよび／または１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列）をコードする１つ以上の遺伝子を含む１つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、本遺伝子操作された細菌が疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、Ｉｎ低酸素条件で、任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の１つ以上を発現することができ、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基材をインポートするための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加の回路のうちの１つ以上の組合せ。これらの実施形態のいずれかにおいて、内因性ファージゲノムに対する改変は、ファージゲノム内の１つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が逆転している。１つ以上のファージ遺伝子のいくつかの実施形態では部分は逆転している。
【０６６１】
いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する症状の治療方法を提供し、それを必要とする対象に操作された細菌を含む組成物を投与することを含み、操作された細菌は、１つ以上のＰＭＥ（例えば、ＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ）をコードする遺伝子配列、ならびに必要に応じて１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列を含む。上記の１つ以上のＰＭＥをコードする遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にあり、上記の１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にあり、誘導性プロモーターは、例えば、本明細書に記載のいずれかの誘導性プロモーターである。遺伝子配列は、同一または異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ（例えば、ＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、細菌は、以下の１つ以上を含み得る：１つ以上の栄養要求性、１つ以上の死滅スイッチ、遺伝子ガードコンポーネント、および／または抗生物質耐性。いくつかの実施形態では、挿入は、本明細書に記載の抗生物質カセットを含む。
【０６６２】
いくつかの実施形態では、疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、自己免疫疾患、癌、腫瘍、代謝性疾患（２型糖尿病、肥満、肝性脳症、非アルコール性脂肪肝、および付随疾患または関連疾患）、瀬川病およびまれな代謝障害からなる群から選択される。そのようなまれな代謝障害の非限定的な例は、メープルシロップ尿症、イソベレリン酸血症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症、および高アンモニア血症を含む。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症はその他の疾患、例えば、肝疾患に続発する。いくつかの実施形態では、本発明は、限定はしないが、神経障害、知能障害、脳症、てんかん、湿疹、成長障害（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ）、小頭症、振戦、四肢痙縮および／または色素沈着低下を含む、これらの疾患に関連する１つまたは複数の症状（複数可）を低減、回復させるか、または排除するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療する対象は、ヒト患者である。
【０６６３】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代謝産物の蓄積に関連する疾患または障害（例えば、ＰＫＵなどの高フェニルアラニン血症）を治療するために、食餌中の代謝産物を代謝することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達する。その他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時には送達しない。研究によって、小腸への膵分泌およびその他の腺分泌物は、高レベルのタンパク質、酵素およびポリペプチドを含有し、これらの異化反応の結果として産生されるアミノ酸は「腸管再循環」として知られるプロセスで血中に再吸収されることが示された（Ｃｈａｎｇ、２００７年；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ等、１９９９年）。したがって、小腸内の高いフェニルアラニンレベルは部分的には食物摂取とは無関係である可能性があり、ＰＡＬによる分解に利用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および食物タンパク質は、絶食またはフェニルアラニン制限食の期間後に送達する。これらの実施形態では、高フェニルアラニン血症に罹患している患者は、実質的に通常の食事またはフェニルアラニンを含まない食事よりも制限の少ない食事を再開することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、高フェニルアラニン血症、例えば、ＰＫＵに関連する疾患を治療するために、他の原料、例えば、血液からフェニルアラニンを代謝することができる。これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達する必要はなく、例えば、血液から消化管までフェニルアラニン勾配が生成され、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝し、高フェニルアラニン血症を低減させる。
【０６６４】
この方法は、本明細書で記載した細菌の少なくとも１種の遺伝子操作された種、株、またはサブタイプを含む医薬組成物を調製し、この医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、液体懸濁液で経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ジェルカップで凍結乾燥し、経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、栄養チューブまたは胃シャントによって投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、直腸内、例えば、浣腸剤によって投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、局所的、小腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および／または結腸内に投与する。
【０６６５】
特定の実施形態では、本明細書で記載した医薬組成物は、特定の代謝産物または他のタイプのバイオマーカー分子または対象の障害に関連するもしくはその原因となる分子のレベルを低減させるために投与される。いくつかの実施形態では、本発明の開示の方法は、対象のフェニルアラニンレベルを未治療または対照の対象のレベルと比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超低減させる。いくつかの実施形態では、低減は医薬組成物の投与前後の対象のフェニルアラニンレベルを比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症を治療または回復させる方法は、状態または障害の１つまたは複数の症状を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ超改善させる。
【０６６６】
医薬組成物の投与前、投与中、および投与後に、被験体中の障害（例えば、フェニルアルニン）に関連する、またはその原因となる一定の代謝産物または他の型のバイオマーカー分子または分子のレベルを、生物学的サンプル（例えば、血、血清，血漿，尿、腹膜液、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜擦過物、組織から収集されたサンプル、および／または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管のうちの１つ以上の内容物から収集されたサンプル）中で測定し得る。いくつかの実施形態では、この方法が一定の代謝産物（例えば、フェニルアラニン）または他の型のバイオマーカー分子または障害に関連するかまたはその原因となる分子のレベルを減少させるための、本発明の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法が代謝産物または他の種の分子を被験体中の検出不能なレベルまで減少させるための、本組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法が代謝産物または他の種の分子の濃度を、検出不可能なレベルまで、または処置前の被験体のレベルの約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、または８０％未満まで減少させるための本発明の組成物の投与を包含し得る。
【０６６７】
被験体内の回路の導入に応じて遺伝子操作された細菌の投与に応じて蓄積する代謝産物または他の種の分子の量は生物学的サンプル（例えば、血、血清，血漿，尿、腹膜液、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜擦過物、組織から収集されたサンプル、および／または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管のうちの１つ以上の内容物から収集されたサンプル）において測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法が一定の代謝産物または他の型のバイオマーカー分子または障害に関連するかまたはその原因となる分子のレベルを減少させ、そして遺伝子操作された細菌の投与の結果として蓄積する代謝産物または他の型の分子のレベルの増加を生じるための、本発明の組成物の投与を包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法が１つの代謝産物または他の種の分子を被験体中の検出不可能なレベルまで減少させ、同時にかつ比例して別の代謝産物または他の種の分子のレベルを増大させるための、本発明の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法が本発明の組成物の投与を含み得、代謝産物または他の種の分子の濃度を、処置前の代謝産物の被験体量の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％まで、または１００％まで上昇させる。このような増加は例えば、尿、血中、糞便中、または腫瘍中で測定され得る。
【０６６８】
いくつかの実施形態では、馬尿酸の産生量およびその蓄積速度を測定することによって、哺乳動物被験体（例えば、動物モデルまたはヒト）の尿中において、ＰＡＬを発現する遺伝子操作された細菌の活性（例えば、フェニルアラニン分解活性）を検出することができる。馬尿酸はＰＡＬ特異的な分解産物であり、ヒト尿中に通常は低濃度で存在する。馬尿酸は、ＰＡＬ経路を介したフェニルアラニンの代謝の最終産物である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、フェニルアラニンのケイ皮酸への変換を媒介する。ケイ皮酸は消化管内で産生されると、吸収されて肝臓で速やかに馬尿酸に変換され、肝臓で排出される（Ｈｏｓｋｉｎｓ  ＪＡおよびＧｒａｙ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｇｅｓｔｅｄ  ｃｉｎｎａｍａｔｅ  ａｎｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｈｉｐｐｕｒａｔｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｊ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｃｈｅｍ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８２年２月；  ３５巻（２）：２７５−８２頁）。フェニルアラニンは１：１の比で馬尿酸に変換される。すなわち１モルのＰｈｅが１モルの馬尿酸に変換される。したがって、尿中の馬尿酸レベルの変化は、前記のメカニズムを利用する療法の効果の非侵襲的尺度として使用することができる。
【０６６９】
したがって、馬尿酸は、ＰＡＬベースのレジメンを受けている患者において、食事の順守および治療効果をモニタリングを可能にするバイオマーカーとして機能する可能性を有する。患者の管理において、馬尿酸は、血液Ｐｈｅレベル測定の補助として使用することができる。また、馬尿酸は尿バイオマーカーであるため、特に子供のタンパク質摂取量を調整するうえで、利点を有しうる−成長に基づいてニーズが変化するため、困難でありうる。
【０６７０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、被験体の尿中の馬尿酸レベルを未処置またはコントロールの被験体のレベルと比べて、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、増加させる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物の投与前後の被験体における馬尿酸レベルを比較することによって、当該増加量を測定する。
【０６７１】
このセクションでは、「ＰＡＬベースの薬物」という用語は、ＰＡＬ活性を有する任意の薬物、ポリペプチド、生物学的または治療レジメン、例えばＰＥＧ−ＰＡＬ、Ｋｕｖａｎ、本開示の細菌（例えば、ＰＡＬおよび場合によってはＰｈｅＰトランスポーターをコードする細菌）を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、本開示は、被験体、例えば哺乳動物被験体にＰＡＬベースの薬物を投与し、ＰＡＬ活性の尺度として被験体において産生される馬尿酸量を測定することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＬ活性を測定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、被験体、例えば哺乳動物被験体にＰＡＬベースの薬物を投与し、ＰＡＬ治療活性の尺度として被験体において産生される馬尿酸量を測定することによって、ＰＡＬベースの薬物の治療活性をモニタリングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、被験体、例えば哺乳動物被験体にＰＡＬベースの薬物を投与し、ＰＡＬ活性を決定するために被験体において産生される馬尿酸量を測定して、被験体におけるＰＡＬ活性を増加または減少させるために薬物の投薬量を調整（例えば、増加または減少）することによって、ＰＡＬベースの薬物の用量を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する被験体のタンパク質摂取および／または食事を調整する方法を提供し、被験体へのＰＡＬベースの薬物の投与、被験体の馬尿酸産生量の測定、被験体におけるＰＡＬ活性を増加または減少させるために被験体のタンパク質摂取を調整すること、もしくは被験体の食事を調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する被験体のタンパク質摂取および／または食事療法に対する遵守を確認するための方法を提供し、被験体へのＰＡＬベースの薬物投与、被験体の馬尿酸産生量の測定、およびＰＡＬ被験におけるＰＡＬ活性の測定を含む。
【０６７２】
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態において、血液中のフェニルアラニンレベルおよび尿中の馬尿酸レベルの両方が被験体においてモニターされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニンの分解速度を決定するために、血液中のフェニルアラニンおよび尿中の馬尿酸を複数の時点で測定する。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸レベルを用いて、動物モデルにおけるＰＡＬ活性または株活性を評価する。
【０６７３】
いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、作用の機構を証明するために株に使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を、単独または血中フェニルアラニン測定と組み合わせて、株におけるＰＡＬ活性およびＬＡＡＤ活性を区別するためのツールとして使用し、全株活性に対する各酵素の寄与を決定することができる。
【０６７４】
いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて使用して、動物モデルおよびヒト被験体における安全性を評価する。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を、単独または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、所望の薬理学的効果および安全性のための用量応答および最適レジメンの評価に使用する。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、有効性および／または毒性の代替エンドポイントとして使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて使用して、治療菌株を含むレジメンに対する患者の応答を予測する。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、薬物療法に応答する可能性のある特定の患者集団の同定のために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独または血中フェニルアラニン測定と組み合わせて、特定の有害作用を回避するために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせると、患者選択に有用である。
【０６７５】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬを発現する治療用ＰＫＵ株の投与を含むレジメンで、ＰＫＵ患者のタンパク質摂取／食事を調節するための１つの方法として、尿中の馬尿酸測定を、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて使用する。
【０６７６】
いくつかの実施形態では、単独または血液フェニルアラニン測定と組み合わせた馬尿酸の尿レベルの測定を用いて、組換えＰＡＬの活性を測定および／またはモニターする。いくつかの実施形態において、馬尿酸の尿レベルの測定は、組換えペグ化ＰＡＬ（Ｐｅｇ−ＰＡＬ）の活性を測定および／またはモニターするために使用される。いくつかの実施形態では、単独または血液フェニルアラニン測定と組み合わせた馬尿酸の尿レベルの測定は、本明細書に記載されている治療菌株と組み合わせて投与される組換えＰＡＬの活性を測定および／またはモニターするために使用される。
【０６７７】
いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、他のバイオマーカー、例えば臨床安全性バイオマーカーと併用される。いくつかの実施形態では、特定の代謝産物または他の種類の分子の増加および／または減少の測定は、他のバイオマーカー、例えば臨床安全バイオマーカーの測定と組み合わせて使用される。そのような安全性マーカーの非限定的な例には、身体検査、バイタルサイン、および心電図（ＥＣＧ）が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の肝臓安全性試験、例えば血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）およびビリルビンが含まれる。このようなバイオセイフティーマーカーには、腎臓安全性試験、例えば当該分野で公知のもの、例えば血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清クレアチニン、糸球体濾過率（ＧＦＲ）、クレアチニンクリアランス、血清電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物および重炭酸塩）、および徹底的な尿分析（色、ｐＨ、比重、グルコース、タンパク質、ケトン体、および血液、白血球、外観の顕微鏡検査）、ならびにシスタチン−ｃ、β２−ミクログロブリン、尿酸、クラスタリン、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、および腎臓損傷分子−１（ＫＩＭ−１）が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の血液学的安全性バイオマーカー、例えば、全血球数、全ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、平均赤血球体積、平均細胞ヘモグロビン、赤血球分布幅％、平均細胞ヘモグロビン濃度、総白血球数、特定の白血球数（好中球、リンパ球、好塩基球、好酸球および単球）および血小板が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の骨安全性マーカー、例えば、血清カルシウムおよび無機リン酸が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の基本代謝安全性バイオマーカー、例えば、血糖、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）が含まれる。当該分野で公知の他の特異的安全性バイオマーカーには、例えば、血清免疫グロブリンレベル、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロキシン、テストステロン、インスリン、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）およびそのアイソザイム、心臓トロポニン（ｃＴｎ）、およびメトヘモグロビンが含まれる。
【０６７８】
いくつかの実施形態において、ＬＡＡＤを発現する遺伝子操作された細菌の活性は、糞便中で特異的に検出され、他の大腸菌株と区別することができる。この目的のために、フェニルアラニンデアミナーゼ試験「フェニルアラニンアガースラント（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｇａｒ  Ｓｌａｎｔ）」を使用することができる。微生物がフェニルアラニンを消費して、フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換できるかどうかを決定するために、フェニルアラニンアガーが用いられる。フェニルアラニンアガー上に試料を含むチューブに試験化学物質を添加すると、フェニルピルビン酸が緑色化合物に変換され、検査が陽性であることを示す。野生型大腸菌は、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸を産生可能な酵素をコードしないので、フェニルピルビン酸を産生せず、他の大腸菌株との区別が可能である。そのため、野生型大腸菌は、フェニルピルビン酸を産生しない。遺伝子操作された細菌は、当該分野で公知のＰＣＲベースの検査によって、フェニルピルビン酸を産生することができる他の細菌種と区別することができる。例えば、種に特異的な配列を増幅することができる。例えば、様々な細菌の保存領域を増幅するユニバーサルＰＣＲは、検体のスクリーニングにおいて病原体を検出するのに理想的である。この目的のために、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存領域を、ユニバーサルＰＣＲの標的遺伝子として使用することができる；１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は種特異的領域を含み、当該領域によって多数の細菌種を区別することができる。
【０６７９】
いくつかの実施形態では、フェニルアラニンデアミナーゼ試験を使用して、糞便サンプル中の遺伝子操作された細菌を検出することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌を他の細菌種と区別するためにＰＣＲに基づく試験を行うことができる。
【０６８０】
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰを産生するための遺伝子、遺伝子（複数可）または遺伝子カセットのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出および／または定量化するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用する。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計および使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロードＲＮＡを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱および冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に加熱および冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に加熱および冷却する。いくつかの実施形態において、蓄積アンプリコンは、ｑＰＣＲの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについて少なくとも１つのＣＴ結果が生成され、当該ＣＴ結果はペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。
【０６８１】
いくつかの実施形態では、ペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および／または定量化するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用する。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計および使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）、例えばＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰおよび／またはＦＮＲＳ２４Ｙ、ｍＲＮＡを含有し得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを用いてサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱および冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に加熱および冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に加熱および冷却する。いくつかの実施形態において、蓄積アンプリコンは、ｑＰＣＲの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１つのＣＴ結果が生成され、当該ＣＴ結果は、ペイロード、例えばＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰおよび／またはＦＮＲＳ２４ＹのｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。
【０６８２】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、内因性または天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が本明細書に記載されるように改変された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである。いくつかの実施形態では、ファージ３は、改変のためにもはや溶解サイクルを受けることができない。いくつかの実施形態では、溶解サイクルは、改変により減少するか、または頻度が低くなる。遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管内もしくは血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ等、２００９年）、または死滅スイッチの活性化によって、投与の数時間または数日後に破壊されることがある。したがって、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与してもよい。マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｉｓｓｌｅの滞留期間の長さを図６８に示す。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は投与後の数時間以内または数日以内に破壊されず、消化管で増殖して定着することができ
る。
【０６８３】
本発明の方法は、医薬組成物を単独で、または１つまたは複数の治療薬とさらに組み合わせて投与することを含むことができる。高フェニルアラニン血症の治療のためのいくつかの実施形態では、医薬組成物は、補因子テトラヒドロビオプテリン（例えば、クバン／サプロプテリン）、大型中性アミノ酸（例えば、チロシン、トリプトファン）、グリコマクロペプチド、プロバイオテック（例えば、ＶＳＬ３）、酵素（例えば、ペグ化ＰＡＬ）、および／またはフェニルケトン尿症の治療で使用されるその他の薬剤（Ａｌ  ＨａｆｉｄおよびＣｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ、２０１５年）と併せて投与され得る。参照によりその全内容が援用されるＷＯ２０１７０８７５８０  Ａ１を参照のこと。
【０６８４】
１つまたは複数のさらなる治療薬の選択において肝心なことは、薬剤（複数可）が本発明の遺伝子操作された細菌と適合すること、例えば、薬剤（複数可）が細菌を妨害したり、死滅させたりしてはならないことである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は食物と一緒に投与する。他の実施形態では、医薬組成物は食物を食べる前後に投与する。医薬組成物は、１つまたは複数の食事の改善、例えば、低フェニルアラニン食と組み合わせて投与することができる。医薬組成物の投与量および投与頻度は、疾患の症状の重症度および進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効用量および／または投与頻度は、治療する臨床医が選択することができる。本発明の方法にはまた、本明細書で記載した医薬組成物を含むキットが含まれる。キットには、限定はしないが、使用説明書、その他の試薬、例えば、標識、さらなる治療薬、対象における障害に関連する代謝産物または他の種類の分子のレベルを測定するための装置または材料、投与用に本発明の医薬組成物を調製するための装置またはその他の材料および対象に投与するための装置またはその他の材料を含む、１つまたは複数のその他の構成要素を含めることができる。使用説明書には、例えば、障害を有する患者における推奨投与量および／または投与形式などの治療的応用のための指導を含めることができる。キットはさらに、１つまたは複数の別々の医薬品調製物において、少なくとも１つのさらなる治療薬、および／または適切ならば製剤化された本発明の１つまたは複数の遺伝子操作されたさらなる細菌株を含有することができる。
【０６８５】
いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物を対象に投与するために使用する。いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物を単独で、または１つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて対象に投与するために使用する。いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物の対象への投与前、投与中、投与後の対象における代謝産物または他の種類の分子のレベルを測定するために使用する。特定の実施形態では、キットは、代謝産物または他の種類の分子のレベルが増加するか、または異常に高いとき、医薬組成物を単独で、または１つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与および／または再投与するために使用する。高フェニルアラニン血症に関連するいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬまたは少なくとも２５ｍｇ／ｄＬの血中フェニルアラニンレベルである。
【０６８６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１５から約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１５から約２μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．６から約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．２から約２．６７μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。
【０６８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１５から約０．６μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．２２から約０．９μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．３から約１．２１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．５４から約２．１６μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１．１３から約４．５３μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１．８４から約７．３８μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１．６１から約６．４３μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約２から約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。
【０６８８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１から約１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１から約２μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約２から約３μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約３から約４μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約４から約５μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約５から約６μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約６から約７μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約７から約８μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。
【０６８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は０．１５μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間未満の標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間超の標的低減速度を実現する。
【０６９０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１７８ｍｇと２３８２ｍｇとの間の標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は１．０８ｍｍｏｌから１４．４２ｍｍｏｌの標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、低減は１．０８ｍｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、低減は１４．４２ｍｍｏｌ超である。
【０６９１】
いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、古典的ＰＫＵフェニルアラニンレベルをベースにしている。いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、軽度ＰＫＵで認められたフェニルアラニンレベルをベースにしている。いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、軽度高フェニルアラニン血症で認められたフェニルアラニンレベルをベースにしている。
【０６９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌の投与により、（部分的または完全な）食事の自由化が可能になる（図２８を参照）。
【０６９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療
本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば動物モデルにおいて評価することができる。疾患または状態の任意の適切な動物モデルが使用され得る。いくつかの実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。例えば、参照によりその全内容が援用されるＷＯ２０１７／０８７５８０  Ａ１を参照。
【０６９４】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌の投与から生じる任意の潜在的な毒性を決定するために、薬物動態学試験および薬力学試験を、非ヒト霊長類において実施することができる。そのような研究の非限定的な例を、実施例３０および３１に記載する。
【０６９５】
スクリーニング方法
【０６９６】
本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子操作株は、例えば、エフェクターの活性を増加させる（例えば、ＰＭＥ酵素活性を増加させる）か、または株が代謝産物を取り込む能力を増加（例えば、フェニルアラニン取り込み能力の増加）させるために、スクリーニング方法および選択方法を使用することによって改善することができる。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、エフェクター活性が改善した細菌株を生成するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、代謝産物の取り込み能力が改善した細菌株を生成するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングによって、エフェクター活性が改善し、基質取り込みも増強された細菌株を同定することができる。使用することができるスクリーニング方法の非限定的例は、本明細書に記載されている。
【０６９７】
生体分子を輸送する能力が増強した細菌株の作製
いくつかの実施形態では、ＡＬＥ法は、フェニルアラニン取り込みが改善した遺伝子操作された細菌を同定するために使用することができる。
【０６９８】
ＰＭＥ活性を改善するための特異的なスクリーニング
遺伝子選択を使用するスクリーニングは、遺伝子操作された細菌におけるフェニルアラニン消費を改善するために実行する。毒性のあるフェニルアラニン類似体は、細胞タンパク質に組み込まれることによって作用（ＭＯＡ）機構を発揮し、細胞死をもたらす。パラログｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびオルソログｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンなどのこれらの化合物は、活性が増加したＰＡＬ酵素を選択するための非標的アプローチに有用である。これらの毒性化合物は、細胞タンパク質に取り込まれるよりもＰＡＬによって非毒性代謝物に代謝され得ると仮定すると、フェニルアラニン分解活性が改善した遺伝子操作された細菌は、高レベルのこれらの化合物に耐性があり、これに基づいてスクリーニングし、選択することができる。
【０６９９】
参考文献
Ａｌ  Ｈａｆｉｄ  Ｎ，  Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ  Ｊ．    Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．    Ｔｒａｎｓｌ  Ｐｅｄｉａｔｒ．  ２０１５  Ｏｃｔ；４（４）：３０４−３１７．    ＰＭＩＤ：  ２６８３５３９２；
Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００４  Ａｐｒ  ９；４０（３）：２２３−２２９．  ＰＭＩＤ：  １５０３９０９８；
Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｒａｃｉｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２：  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒａＡ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ．    Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９５  Ａｐｒ；１７７（８）：２００８−２０１３．  ＰＭＩＤ：  ７７２１６９３；
Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｒ  ａｎｄ  ｎｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＣＲＰ／ＦＮＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，  ＤＮＲ，  ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ＡＮＲ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １９９５  Ａｕｇ  ２８；３７１（１）：７３−７６．  ＰＭＩＤ：  ７６６４８８７；
Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．    ２０１２  Ｏｃｔ  ５；３３８（６１０３）：１２０−１２３．  ＰＭＩＤ：  ２２９０３５２１；
Ｃａｌｌｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｃｋｉｎｇ，  Ｔｕｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．    ２０１０；２７（３６）：１５８９８−１５９０３．  ＰＭＩＤ：  ２０７１３７０８；
Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＤＮＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｈａｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００９  Ｓｅｐ；１５５（Ｐｔ  ９）：２８３８−２８４４．  ＰＭＩＤ：  １９４７７９０２；
Ｃｈａｎｇ，  ｅｄ．  （２００７）  “Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｅｆｅｃｔｓ．”  Ｉｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，  Ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ／Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ｐｐ．  １４７−１５９；
Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ８６０２．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９７１  Ｍａｙ；６６（２）：１６１−１６９．  ＰＭＩＤ：  ４９９９０７３；
Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１０  Ｊｕｎ  ２２；１０７（２５）：１１５３７−１１５４２．    ＰＭＩＤ：  ２０５３４５２２；
Ｄａｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１５  Ｍａｙ  ２７；７（２８９）：２８９ｒａ８４．  ＰＭＩＤ：  ２６０１９２２０；
Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ．  Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．    ２００８  Ａｐｒ；１１（２）：８７−９３．  ＰＭＩＤ：  １８３５９２６９；
Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ  ＣＮＣＭ  Ｉ−７４５  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４  Ｎｏｖ；１４（１１）：１５９３−１６０９．  ＰＭＩＤ：  ２４９９５６７５；
Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．  Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ．  ２００３；２６（１）：１−１１．  ＰＭＩＤ：  １２８７２８３４；
Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８９  Ｊｕｌ；３（７）：８６９−８７８．  ＰＭＩＤ：  ２６７７６０２；
Ｅｓｔｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＵＰ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９８  Ａｕｇ  １８；９５（１７）：９７６１−９７６６．  ＰＭＩＤ：  ９７０７５４９；
Ｇａｌｉｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＦＮＲ−ｌｉｋｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９１  Ｍａｒ；１７３（５）：１５９８−１６０６．  ＰＭＩＤ：  １９００２７７；
Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｇｇｌｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０００；４０３：３３９−３４２．  ＰＭＩＤ：  １０６５９８５７；
Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００６  Ｏｃｔ；１７（５）：４４８−４５６．  ＰＭＩＤ：  １６９７８８５５；
Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８５  Ｊａｎ；１６１（１）：３１４−３２０．  ＰＭＩＤ：  ２９８１８０５；
Ｇｏｒｋｅ  Ｂ，  Ｓｔｕｌｋｅ  Ｊ．  Ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ：  ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８  Ａｕｇ；６（８）：６１３−６２４．  ＰＭＩＤ：  １８６２８７６９；
Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ＤＮＲ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｉｔｒｉｔｅ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １９９８  Ｓｅｐ  １５；１６６（２）：２１３−２１７．  ＰＭＩＤ：  ９７７０２７６；
Ｈｏｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｕｌｔ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．  Ｎｅｔｈ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００９  Ｊａｎ；６７（１）：２−７．  ＰＭＩＤ：  １９１５５５４０；
Ｈｏｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｎｉｔｒｏｕｓ−ｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９３  Ｎｏｖ  １５；２１８（１）：４９−５７．  ＰＭＩＤ：  ８２４３４７６；
Ｈｏｓｓｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ａｓ  ａ  ｈｅａｌｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ．  Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ．  ２０１１  Ｍａｙ；６９（５）：２４５−２５８．  ＰＭＩＤ：  ２１５２１２２７；
Ｉｓａｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｔｉｍｕｌｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２０１１  Ｊａｎ  ２０；１２：５１．  ＰＭＩＤ：  ２１２５１２５５；
Ｉｖａｎｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．    Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．  ２０１４  Ａｕｇ；１３４（２）：３６１−３７２．    ＰＭＩＤ：  ２５０２２７３９；Ｋｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １９９７  Ｊｕｎ；  ６（６）：１３５２−１３５７．  ＰＭＩＤ：  ９１９４１９８；
Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８５  Ｊａｎ  ２９；  ２４（３）：５５６−５６１．  ＰＭＩＤ：  ２９８６６７８；
Ｌｅｏｎａｒｄ  ＪＶ  （２００６）．  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．    Ｉｎｂｏｒｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ  （ｐｐ．  ２６３−２７２）．    Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｍｅｄｉｚｉｎ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；
Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  １  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｒＡｖＰＡＬ−ＰＥＧ  ｉｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．  Ｌａｎｃｅｔ．  ２０１４  Ｊｕｌ  ５；  ３８４（９９３７）：３７−４４；
Ｌｏｐｅｚ  Ｇ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＣ．  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ．  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．  ２０１５  Ｄｅｃ  １８；４（１２）：１２７９−１２８６．  ＰＭＩＤ：  ２６０７２９８７；
Ｍａｃｌｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．  Ａｎｎ  Ｎｅｓｔｌｅ  Ｅｎｇ．  ２０１０  Ｊｕｎ；６８（２）：５８−６９．  ＰＭＩＤ：  ２２４７５８６９；
Ｍｅａｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９５９  Ｊｕｌ；７２（３）：３９６−４００．  ＰＭＩＤ：  １６７４８７９６；
Ｍｉｌｌｅｒ  （１９７２）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；
Ｍｏｆｆｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅｓ：  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００７  Ｊａｎ  ３０；４６（４）：１００４−１０１２．  ＰＭＩＤ：  １７２４０９８４；
Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＮＲ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００６  Ｎｏｖ  ３；２８１（４４）：３３２６８−３３２７５．  ＰＭＩＤ：  １６９５９７６４；
Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００６  Ａｕｇ  １１；３１３（５７８８）：８４８−５１．  ＰＭＩＤ：  １６９０２１４２；
Ｏｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｔｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．  ２０１２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５０１−５０９．  ＰＭＩＤ：  ２２８９５０８５；
Ｐｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅＰ  ｇｅｎｅ，  ｗｈｉｃｈ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９１  Ｊｕｎ；１７３（１２）：３６２２−３６２９．  ＰＭＩＤ：  １７１１０２４；
Ｐｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９６  Ｍａｙ；１７８（９）：２６５０−２６５５．  ＰＭＩＤ：  ８６２６３３４；
Ｐｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｐｒｏｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９８  Ｎｏｖ；１８０（２１）：５５１５−５５１９．  ＰＭＩＤ：  ９７９１０９８；
Ｐｕｒｃｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｃｈａｏｓ．  ２０１３  Ｊｕｎ；２３（２）：０２５１１２．  ＰＭＩＤ：  ２３８２２５１０；
Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｒ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １９９７  Ｎｏｖ  １５；１５６（２）：２２７−２３２．  ＰＭＩＤ：  ９５１３２７０；
Ｒｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１４  Ｏｃｔ  １０；１８７：１０６−１０７．  ＰＭＩＤ：  ２５０９３９３６；
Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ．  １９９９  Ａｕｇ  ２１；３５４（９１７９）：６３５−６３９．  ＰＭＩＤ：  １０４６６６６５；
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （２０１２），  ２２ｎｄ  ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ．
Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．    Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ＦＮＲ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ａｕｇ  ８；２７８（３２）：２９８３７−２９８５５．  ＰＭＩＤ：  １２７５４２２０；
Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９９  Ｍａｒ  ２；９６（５）：２３３９−２３４４．  ＰＭＩＤ：  １００５１６４３；
Ｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍａｚＥＦ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｍｏｄｕｌｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ  ｄｅａｔｈ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２００３  Ｍａｒ；１８５（６）：１８０３−１８０７．  ＰＭＩＤ：  １２６１８４４３；
Ｓａｗｅｒｓ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＦＮＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９１  Ｊｕｎ；５（６）：１４６９−１４８１．  ＰＭＩＤ：  １７８７７９７；
Ｓｃｈｕｌｔｚ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  ２００８  Ｊｕｌ；１４（７）：１０１２−１０１８．  ＰＭＩＤ：  １８２４０２７８；
Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  −  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  ２００９；２１：１２２−１５８；
Ｔｒｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｒ  ａｎｄ  Ｄｎｒ  ｒｅｇｕｌｏｎｓ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｊｕｎ；１２（６）：１７１９−１７３３．  ＰＭＩＤ：  ２０５５３５５２；
Ｕｋｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｅａｋｙ  ｇｕｔ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２００７  Ｄｅｃ  １２；２（１２）：ｅ１３０８．  ＰＭＩＤ：  １８０７４０３１；
Ｕｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９７  Ｊｕｌ  ４；１３２０（３）：２１７−２３４．  ＰＭＩＤ：  ９２３０９１９；
Ｖｏｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．  ２０１４  Ｆｅｂ；１６（２）：１８８−２００．  ＰＭＩＤ：  ２４３８５０７４；
Ｗａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９５  Ｊａｎ；２７（２）：３２７−３３８．  ＰＭＩＤ：  ７８８８６２２；
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｓｔｌＡ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＴＴ０１．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００５  Ａｕｇ；１５１（Ｐｔ  ８）：２５４３−２５５０．  ＰＭＩＤ：  １６０７９３３３．
Ｗｉｎｔｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ＡＮＲ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｎｄ  ＦＮＲ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈａｖｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｂｕｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９６  Ｍａｒ；１４２  （Ｐｔ  ３）：６８５−６９３．  ＰＭＩＤ：  ８８６８４４４；
Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ．  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．  ２０１５  Ｍａｒ  ２０；４（３）：３０７−３１６．  ＰＭＩＤ：  ２４８４７６７３；
Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｆｏＸ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  （ｃＡＭＰ）  ａｎｄ  ｃＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏｓ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１５  Ｏｃｔ  ７；５：１４９２１．  ＰＭＩＤ：  ２６４４２５９８；
Ｘｉａｎｇ  Ｌ，  Ｍｏｏｒｅ  ＢＳ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２００５  Ｊｕｎ；１８７（１２）：４２８６−４２８９．  ＰＭＩＤ：  １５９３７１９１；
Ｚｈａｎｇ  Ｒ，  Ｌｉｎ  Ｙ．  ＤＥＧ  ５．０，  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００９  Ｊａｎ；３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４５５−Ｄ４５８．  ＰＭＩＤ：  １８９７４１７８；
Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ａｎｒ，  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｆｎｒ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９１  Ｊｕｎ；５（６）：１４８３−１４９０．  ＰＭＩＤ：  １７８７７９８．
【実施例】
【０７００】
実施例３．代謝産物の測定
以下の実施例は、本開示の実施形態の例である。当業者ならば、本開示の趣旨または範囲を変化させることなく実施することができる数々の改変および変更を認識するだろう。このような改変および変更は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、決して本開示を限定しない。
【０７０１】
フェニルアラニンの定量化（塩化ダンシル誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のフェニルアラニンレベルの定量化を必要とする、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイについては、共同所有の係属中の２０１６年５月１３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９に記載されているように、塩化ダンシル誘導体化プロトコールが用いられた。上記文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０７０２】
トランス−ケイ皮酸の定量（トリフルオロエチルアミン誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のトランス−ケイ皮酸レベルの定量を必要とする本明細書で記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、トリフルオロエチルアミン誘導体化プロトコールを、共同所有の保留中のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように使用した。
【０７０３】
フェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸の定量（２−ヒドラジノキノリン誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のフェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸レベルの定量を必要とする本明細書で記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、２−ヒドラジノキノリン誘導体化プロトコールを、共同所有の保留中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように使用した。
【０７０４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる血漿および尿中の馬尿酸、トランス−ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびフェニルピルビン酸の定量化
馬尿酸、トランス−ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる尿のフェニルピルビン酸定量は、共同所有の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される）に記載されるように測定された。
【０７０５】
ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願）の実施例１〜５５は種々のＰｈｅ消費株の構築および活性を記載しており、これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される。
【０７０６】
実施例２７．ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０はフェニルアラニンを消費し、非毒性代謝産物トランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）およびフェニルピルビン酸（ＰＰ）に変換することによって高フェニルアラニン血症を治療するように設計された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（ＥｃＮ）（参考文献）に由来する操作された細菌である。これは腸で見出されるフェニルアラニンを遮断し、分解することによって作用し、これは血液中へのフェニルアラニンの流入を減少させる。ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０は、ヒト消化管の微好気性（低酸素）環境におけるフェニルアラニンの劣化を可能にする一連の遺伝子操作によって作製された。ジアミノピメラート栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管中に見出される低酸素条件下でフェニルアラニン劣化を増強するために、ＥｃＮのゲノムに以下の改変を行った：
ａ）嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下での高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピーの挿入
ｂ）ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下でのフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３コピーの挿入
ｃ）合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下でのＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピーの挿入
ｄ）アラビノース−誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子ＡｒａＣの調節制御下でのプロテウス・ミラビリス由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の挿入
ｅ）ジアミノピメラート栄養要求株を作製するための４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリネートシンターゼをコードするｄａｐＡジーンの欠失
【０７０７】
ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０は、ヒト消化管の微好気性（低酸素）環境におけるフェニルアラニンの劣化を可能にするように設計された一連の遺伝子操作においてＥｃＮから誘導された。高親和性フェニルアラニントランスポーターであるＰｈｅＰをコードする内因性遺伝子の２つの追加コピーのゲノム挿入を、ＥｃＮ染色体内で行った。このトランスポーターは、環境フェニルアラニンの細菌細胞への取り込みを可能にする。さらに、生物フォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子の３コピーを染色体に組み込んだ。ＰＡＬは、フェニルアラニンの非毒性製品トランス−ケイ皮酸への変換を触媒する。ＰｈｅＰおよびＰＡＬをコードする遺伝子を、嫌気性−誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下に置いた。これらの調節成分は、フェニルアラニン劣化マシーナリーがヒト消化管の無酸素環境において産生されることを確実にする。合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびＬａｃＩ転写リプレッサーの制御下で、ＰＡＬをコードする追加コピー遺伝子をＮｉｓｓｌｅ染色体に挿入した。これらのコピーは、ラクトースまたはラクトース類似体が転写抑制を緩和するために使用される場合、式のために誘導され得、そして薬物物質の製造の間のフェニルアラニン分解活性の誘導のために利用されることが想定される。このように、ＬａｃＩ仲介誘導による初期歪効力はＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０投与に際しては即座に活動を可能にし、ＰｆｎｒＳ仲介誘導は、投与後の非効率性導入を可能にする。ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０におけるフェニルアラニン分解の第二経路を、酸素の存在下でフェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換する生物プロテウス・ミラビリス由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼ（Ｉ）をコードする遺伝子の染色体挿入を通して導入した。この遺伝子は薬物物質の産生中にアラビノースに反応してＡｒａＣによって誘導されるＬＡＡＤの発現を可能にするように、内因性ＮｉｓｓｌｅａｒａＣ遺伝子の下流に挿入された。ＰＡＬおよびＬＡＡＤの活性は添加剤であることが示されている。ＬＡＡＤの介在物は、近位胃腸管においてより豊富に見出されると予想される利用可能な酸素を利用する機構である。
【０７０８】
ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０はまた、細菌増殖に必須の４‐ヒドロキシ‐テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするジアミノピメラート（ｄａｐＡ）遺伝子の欠失で改変した。この欠失により、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０はジアミノピメラートを合成することができなくなり、それにより、株が外因的にジアミノピメラートを補充されない限り、細菌の細胞壁の適切な産生が妨げられる。外部の製造目的のために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０はまた、フェーズ粒子の表現能力を除去するその内生的固有速度の一部（ＶＩＩ）を欠失して修正された。本稿では、内産生分の一部の欠失を構成する株をＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２と呼ぶ。
【０７０９】
ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０に関連するシーケンスおよび追加の詳細は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（２０１６年５月１３日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願）に記載されており、これら各々の全内容は参照により本明細書に援用される。
【０７１０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を測定するために、一晩培養物をＬＢで１：１００に希釈し、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で増殖させた。増殖１．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、細菌をペレットにして、ＰＢＳで洗浄し、アッセイ緩衝液（０．５％グルコース、８．４％炭酸水素ナトリウムおよびＰｈｅ４ｍＭを含むＭ９最少培地）に再懸濁した。３０分から９０分のフェニルアラニン分解速度（すなわち、アッセイ溶液の消失）またはケイ皮酸塩蓄積を１ｅ９細胞に正規化した。表５９は、全株の正規化した速度を示し、遺伝子操作されたプラスミドを保有する株および染色体挿入を含む遺伝子操作された株の非限定的例の遺伝子型および活性について記載している。
【０７１１】
［表５９］遺伝子操作されたプラスミドの保有株および染色体挿入を含む遺伝子操作された株の遺伝子型および活性
【表２８−１】
2020525012.tif 000093
【表２８−２】
2020525012.tif 000094
【表２８−３】
2020525012.tif 000095
【表２８−４】
2020525012.tif 000096
【表２９−１】
2020525012.tif 000097
【表２９−２】
2020525012.tif 000098
【表２９−３】
2020525012.tif 000099
［表７７］バイオセイフティーシステム構築物および配列成分
【表３０−１】
2020525012.tif 000100
【表３０−２】
2020525012.tif 000101
【表３０−３】
2020525012.tif 000102
【表３０−４】
2020525012.tif 000103
【０７１２】
Ｉ．  実施例５５．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７およびその操作された派生物のプロファージバイオインフォマティクス分析
Ａ．概要
目的：日常的な試験手順により、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）および関連する操作された派生物からのバクテリオファージ産生が同定された。バクテリオファージの供給源を決定するために、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのゲノムの共同バイオインフォマティクス評価、およびプロファージのエビデンスについて株のゲノム配列を分析するため、機能的ファージを産生する可能性について同定されたプロファージ元素を評価するため、細菌ゲノム配列の中で同定された他の既知のファージと任意の機能的ファージ元素を比較するため、およびプロファージ元素が他の配列決定されたエシェリヒア属ｃｏｌｉ（Ｅｃｏｌｉ）ゲノム中で見出される周波数を評価するために、操作された誘導体が行われた。
【０７１３】
実験手順
１．バイオ分析方法
ａ．ファージ予測
ファージ予測ソフトウェア（ＰＨＡＳＴ）（Ｚｈｏｕら、「ＰＨＡＳＴ：  Ａ  Ｆａｓｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（ｓｕｐｐｌ  ２）：  Ｗ３４７−Ｗ３５２）を使用して、公開され公に入手可能な大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＺ＿ＣＰ００７７９９．１）（Ｒｅｉｓｔｅｒら、グラム陰性プロバイオティクス大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７の完全ゲノム配列；Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  １０月１０日；１８７：１０６−７）内、ならびにＤＳＭ  ６６０１、ロット番号Ｊｕｌ９１（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に由来する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの単一増殖から作製された研究セルバンクであるＳＹＮ００１−大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７内でプロファージを検索した。
【０７１４】
ｂ．ＤＮＡシークエンシングおよびアセンブリ
遺伝子操作された株のゲノム配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＤＮＡシーケンサーを用いて外部資源（ＧＥＮＥＷＩＺ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）によって生成された。ファージ配列の配列を調べるために、まず、デフォルトパラメーターを用いてゲノムアセンブラーソフトウェア（ＳＰＡｄｅｓ）バージョン３．９．１を用いてゲノム配列決定読み取りを組み立てる必要があった（Ｎｕｒｋら、Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｎｉ−ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＭＤＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ；  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ；  ２０（１０）：７１４−３７。５００ヌクレオチド未満の長さを有する足場を廃棄した。
【０７１５】
ｃ．遺伝子操作された株に特異的な可能性のある配列領域の同定
元の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株には存在しない可能性がある配列を同定するために、大型リファレンスゲノム（ＢＷＡ  ＭＥＭ）に対して低発散配列をマッピングするためのソフトウェア（ＬｉおよびＤｕｒｂｉｎ、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いた高速かつ正確なショートリードアラインメント；  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９  Ｊｕｌ  １５；２５（１４）：１７５４−６０）を用いて、原料リードデータを３つのリファレンスゲノムのそれぞれにアラインメントした。３つの参考ゲノムは公開された配列および公的に入手可能な大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＺ＿ＣＰ００７７９９．１）（Ｒｅｉｓｔｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｒａｍ−ｎｅ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅプロバイオティクス大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７；  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  １０月１０日；  １８７：  １０６−７）、Ｇｅｎｅｗｉｚによって配列決定された大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムのＳＹＮ００１（野生型大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）版、および操作された株を作製するために使用された特異的な操作工程から生じる変化と共にＳＹＮ００１の配列に基づいた操作された株のゲノムについての予想される配列であった。操作された株の予想される配列に対応しない配列に焦点を当てるために、読み取りを各参照に整列させ、そしてソフトウェアＳａｍｔｏｏｌｓ（Ｌｉら、Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ；  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９  Ａｕｇ  １５；２５（１６）：２０７８−９）に従って各参照に別々に整列させた読み取りを廃棄し、そして各参照ゲノムに整列しなかった残りの読み取りをさらに分析した。同じプロセスを使用して、操作された株におけるユニークな配列を同定した。
【０７１６】
３つの参考文献の各々にマッピングされなかった読み取りは、ゲノムアセンブラソフトウェアＳＰＡｄｅｓバージョン３．９．１を用いて、デフォルトパラメーターでアセンブルした（Ｎｕｒｋら、Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｎｉ−ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＭＤＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ；  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ；  ２０（１０）：７１４−。これらの組み立てられた足場は、Ｂｌａｓｔツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｏｃｔ  ５；  ２１５（３）：  ４０３−１０）を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）中の非冗長データベースと比較することによって、ファージ関連配列の存在をチェックするために。
【０７１７】
これらの結果を検証するために、ゲノム配列アラインメントソフトウェア（ＭＵＭｍｅｒ）（Ｄｅｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｆａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２  Ｊｕｎ  １；  ３０（１１）：  ２４７８−８３）を用いて、遺伝子操作された株のアセンブリ全体と公的に入手可能なＣＰ００７７９９．１参照ゲノムとの間で全ゲノムアラインメントを行った。これらのアラインメントは、参照アセンブリにマッピングされなかった新しいアセンブリから独特の配列を同定した。Ｂｌａｓｔツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｏｃｔ  ５；  ２１５（３）：  ４０３−１０）を用いて、ＮＣＢＩ中の非冗長データベースとユニーク配列を再び比較し、ファージ関連配列の存在をチェックした。このアプローチの結果、３つの電位ファージが同定された。
【０７１８】
ｄ．他のゲノムにおけるファージ３とのマッチングの検索
ＰＨＡＳＴバイオインフォマティックツールによって同定されたファージ３配列の大きさをさらに精緻化するために、ファージ３配列のコア領域を、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるファージ３の５９キロ塩基（ｋｂ）領域を、ファージ３を含まない大腸菌ＢＷ２５１１３の密接に関連するゲノムに整列させることによって決定した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来の５９ｋｂファージ３配列の左側および右側末端の領域は宿主染色体（非ファージ）配列に対応すると思われる大腸菌ＢＷ２５１１３中の遺伝子のゲノム構成と一致したが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来のファージ３配列の中央の４３ｋｂ領域はＥｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３中には発明、Ｅｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３中に存在する２つの宿主染色体遺伝子間の挿入として現れた。従って、このアラインメントにより、４３ｋｂのコアファージ３領域が観察され、これは大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに独特であり、ファージ３の真の限界を含むようであった。次いで、この４３ｋｂのコアファージ３配列を、ＭＵＭｍｅｒアラインメントソフトウェアＤＥｌｃｈｅｒら、大規模ゲノムアラインメントおよび比較のための高速アルゴリズム；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓを使用して、ＮＣＢＩからダウンロードされた５６９１大腸菌および赤痢菌アセンブリの包括的な組に対してアラインメントについて比較した。２００２  Ｊｕｎ  １；３０（１１）：２４７８−８３）。大腸菌外のファージ３のインスタンスを同定するために、４３ｋｂのコアファージ３全体を、ブラストツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｏｃｔ  ５；２１５（３）：４０３−１０）を用いて非冗長ＮＣＢＩデータベースと比較した。
【０７１９】
他のゲノムにおけるファージ３への部分的ヒットがより大きなファージ元素の一部であるかどうかを決定するために、ファージ３への部分的マッチングを有する足場を他のゲノムから抽出し、そしてＰＨＡＳＴ（Ｚｈｏｕら、「ＰＨＡＳＴ：  Ａ  Ｆａｓｔ  ｐｈａｇｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）、３９（ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｗ３４７−Ｗ３５２）を使用して、これらの領域内のプロファージの存在を予測した。
【０７２０】
ｅ．大腸菌の大規模ファージ予測
任意の型のプロファージが配列決定されたＥｃｏｌｉ株の間で見出される周波数を評価するために、ＰＨＡＳＴ（ＰＨＡＳＴＥＲ）Ａｒｎｄｔ  Ｄ．ら、ＰＨＡＳＴＥＲ：ＰＨＡＳＴＥＲの新たに公開されたより効率的なバージョン：ＰＨＡＳＴファージ検索ツールのより良好でより速いバージョン。核酸研究所。４４，  Ｗ１６−Ｗ２１（２０１６）を使用して、大腸菌ゲノムの大きなセット内の任意のプロファージ元素の存在を検索した。ファージ予測アルゴリズムの精度は、高品質ゲノムの使用に依存するので、２８７の高品質参照配列（Ｒｅｆｓｅｑ）大腸菌ゲノムのセットを、この検索のために使用した。
【０７２１】
Ｂ．結果
１．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのファージ含有量
３つの高い信頼性の予測されるプロファージ配列が、本明細書中でファージ１、ファージ２、およびファージ３と呼ばれる大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムの各バージョン内に見出された（図１）。これらの高スコアファージの３つすべてを、ＰＨＡＳＴによって「インタクト」ファージと命名し、これらがファージの主要成分のすべてを含むことを示した（図１）。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ファージ３）における最も長い予測ファージは全部で６８タンパク質を含み、ファージ尾部、頭部、ポータル，ターミナーゼ、リシン、カプシド、およびインテグラーゼを含み、これらはすべて無傷であるよう。ファージ２は全部で６９タンパク質を含み、ファージトランスポザーゼ、溶解、ターミナーゼ、頭部、ポータル、カプシド、および尾部タンパク質を含む。ファージ２の詳細な調査はｉｎｔ／ｘｉｓ遺伝子対が可動性遺伝要素によって破壊されていること、およびｃＩリプレッサーが別々のＤＮＡ結合ペプチドおよび感知ペプチドに断片化されていることを明らかにし、これはこのファージの誘導を妨げると予想される。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ、ファージ１で予測されるインタクトファージの最短は全部で３２タンパク質を含み、溶解およびトランスポザーゼ官能を含む。しかしながら、ファージ１と呼ばれる推定上のプロファージ元素内に多くの構造遺伝子が存在しないことから、生存可能なファージ粒子を放出するその可能性が疑問視される。ファージ１〜３の特徴を表８４に要約する。
【０７２２】
ｉ．  ［表８４］推定ファージの特徴の概要
【表３１】
2020525012.tif 000104
【０７２３】
２．操作された株は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅと同じファージ含有量を有する
操作された株の組み立てられたゲノム内で、ＰＨＡＳＴは、元の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムにおいて予測されたのと同じファージ含有量を予測した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ内で「インタクト」ファージとして同定された３つのファージの全ても、操作された株のゲノム内で同定された（ファージ１〜３）。
【０７２４】
３．操作された株は追加のプロファージエレメントを含有しない
操作された株の生の配列決定読み取りの大部分は、参照ゲノムにマッピングされ、操作された株ゲノムに独特であった配列は非常に少なかった。少量のユニークな配列内にファージ配列の証拠はなかった。組み立てた場合、これらの独特の配列は各々が長さ＜２ｋｂを有し、既知のファージ配列と類似性がない３つの足場のみをもたらした。この結果は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ参照ゲノムに対する完全な操作された株アセンブリの全ゲノムアラインメントを実施し、そして参照にマッピングされなかった操作された株内の領域を同定することによって確認された。この手順を用いて、２つの同じ短い配列を同定した。これらの短い配列のいずれも、任意の公知のファージ配列といかなる類似性も有さなかった。操作された株に特有のこれらの非常に短い配列は、ファージではなく、サンプル中の疑似ＤＮＡを表すよう。
【０７２５】
４．ファージ３は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに特異的である
実験室研究により、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅによって放出されたプラーク形成ファージ粒子、および操作された株は、ファージ３（ＳＹＮ−１７．００２）のみに由来することが決定された。従って、他の大腸菌ゲノムにおけるファージ３（プロファージとして）の存在の評価を行った。ＮＣＢＩからダウンロードした５６９１のＥｃｏｌｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａゲノムアセンブリの広範なデータセット内で、全長ファージ３は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいてのみ見出された。ファージ３の全長を１００％の同一性でカバーする２つの全長、４３ｋｂの一致のみが存在し、これらの両方は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムの異なるバージョン（ＧＣＡ＿０００３３３２１５．１およびＧＣＡ＿０００７１４５９５．１）に対応し、データセット内の他のＥｃｏｌｉゲノムにおいて、５つの追加の長い部分一致（１４−２０ｋｂ、９７−９９．６％の同一性を有する）、および４つの他のより短い部分一致（５−１０ｋｂ、９５−９８％の同一性）が存在した（図１０）。同じ集合体の複数足場の間で分割された、いくつかの他のより短い断片も同定された。部分的なマッチングはファージ３の別領域にマッピングされ、図１０に示される。
【０７２６】
他のゲノムにおいてこれらの部分的な一致を含む足場を抽出し、そしてファージ３に対する各々の部分的な一致が、ファージ３に対して他の類似性を有さない他のゲノム内のより長いプロファージの断片を含むことを決定するために使用した。これらの領域は常に、他のゲノムにおけるより長く高スコアの「完全である」ファージ予測の一部であり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの外側のこれらのファージは「ハイブリッド」ファージに対応し、配列の一部はファージ３に一致し、残りはファージ３とは異なるファージ配列に対応する。これらの結果は、大腸菌中に存在する最も近い関連ファージがファージ３  ＤＮＡ配列とそれらのゲノムの約半分までを共有することを示す。大腸菌以外では、いくつかの部分的な一致がより遠くに関連したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（長さ１０〜１８ｋｂ）内で同定され、９６〜９７％の同一性を有した。
【０７２７】
５．大腸菌全体の予測ファージの分布
ファージは、大腸菌において非常に一般的である。Ｒｅｆｓｅｑデータベース中の大腸菌ゲノムのほとんど全ては、ＰＨＡＳＴＥＲファージ予測ソフトウェアツールを用いて評価されるように、少なくとも１つの「無傷の」高スコアファージを含み、いくつかは２０までを有する（図１２）。大腸菌ゲノム中の予測ファージの平均数は６．４であり、これは、ＰＨＡＳＴＥＲによって大腸菌Ｎｉｓｓｌｅについて予測された数よりも実質的に高い。このより新しいファージ予測ツールを使用して、２つのより長いファージのみが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいて同定される（これらは本明細書中でファージ２およびファージ３と呼ばれる）。従って、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、ほとんどの他の大腸菌よりも実質的に少ない予測ファージを有する。
【０７２８】
Ｃ．結論
バイオインフォマティクス分析の結論は以下の通りである：第１に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された誘導体は３つの候補プロファージ元素を含み、３つのうちの２つ（ファージ２およびファージ３）は、インタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含む。さらに、ファージ３はほとんど６０００の配列決定された大腸菌ゲノムのコレクションの中で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに独特であるが、他の推定プロファージ元素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノムにおいて見出される。第４に、プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、配列決定された大腸菌ゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均と比較して、比較的少数を含有する。これらのデータは大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの操作株におけるプロファージの存在がこの種の自然状態の結果であり、そして分析されたこのような操作株のプロファージの特徴が前駆体株大腸菌Ｎｉｓｓｌｅと一致したという結論を支持する。
【０７２９】
実施例５６．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび遺伝子操作された派生物からのバクテリオファージの検出および特性評価のための一般的なプロトコール
【０７３０】
エシェリヒア属ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）および工学処理された誘導体試験は、確認されたバクテリオファージプラークアッセイ中のファージ３の低量存在について陽性であった。バクテリオファージプラークアッセイを行って、バクテリオファージの存在およびレベルを決定した。要するに、一晩増殖させた試験細菌の培養物からの上澄み液をファージ感受性指標株と混合し、バクテリオファージの存在を示すプラークの産生を検出するために軟寒天中で平板培養した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを、バイオインフォマティクス分析において同定された３つの異なる内因性プロファージを検出するために設計し、ファージ特異的ＤＮＡの存在についてプラークを評価するために使用した。
【０７３１】
Ｄ．実験手順
１．ファージ試験プロトコール：マイトマイシンＣ誘導データ解析を使用した大腸菌の細菌ウイルスのプラークアッセイ
マイトマイシンＣファージ誘発法（ＳＴＭ−Ｖ７０８法、エシェリヒア属ｃｏｌｉ（大腸菌）由来の細菌ウイルスのプラークアッセイ）を用いて、ファージの産生について細胞株を分析した。Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ  ＲＬに記載されているように、マイトマイシンＣ誘導を使用する。バクテリオファージＸ１７４の純化および特性。Ｊ．  分子。Ｂｉｏｌ．。１９５９；  １：３７−４２、ａｎｄ  Ｃｌｏｗｅｓ、ＲＣ  ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ、ＷＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ  １９６８（これらの各々の含有量は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。簡単に述べると、サンプル（細胞膨張を支持するためにチミジンを補充した培地を適宜用いて）および対照細胞を一晩増殖させた。サンプル，ポジティブコントロール（大腸菌、ＥＭＧ  ２：  Ｋ（ラムダ）、ＡＴＣＣ  ２３７１６、または当量）およびネガティブコントロール（大腸菌、ＡＴＣＣ  １３７０６、または当量）の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上澄み液をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べた。マイトマイシンＣを、最終濃度２μｇ／ｍＬで、残りのサンプル、陽性および陰性細菌培養物に添加した。次いで、培養物を３７±２℃に置き、ポジティブコントロール中で溶解が起こるまで（〜４．５時間）、３００〜４００ｒｐｍで振盪した。それぞれの培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上澄み液の０．１ｍｌアリコートをバクテリオファージの存在について調べた。これを達成するために、上澄み液をファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ  １３７０６と混合し、０．７％アガロース溶液と混合し、そしてローンとして溶解性ブロスカンテン培地（ＬＢ）上にプレーティングした。プラークがポジティブコントロール中に存在し、プラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であるとみなした。
【０７３２】
２．特定のバクテリオファージのＰＣＲ検出
ａ．ファージ特異的ＰＣＲプライマーの選択
オリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの３つの推定プロファージ領域のそれぞれに対して特異性を有するように設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ）から注文した。プライマーはＮｉｓｓｌｅゲノムを注意深く調べた後に選択し、ファージ特異的タンパク質をコードすると予想される独特の領域内に完全に結合するように設計した（表８５）。
【０７３３】
［表８５］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ用のファージ特異的プライマーおよびコントロールプライマー
【表３２】
2020525012.tif 000105
【０７３４】
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムおよび関連株内で見出されるが、３つのファージ元素の外側に位置する必須細菌特異的遺伝子であるｒｐｏＢに特異的に結合するオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーのさらなる一対を設計した。ｒｐｏＢに結合したプライマセットは、ゲノムＤＮＡ調製物の質およびＰＣＲプロトコールの有効性の両方のポジティブコントロールとして役立った。さらに、ファージＤＮＡはｒｐｏＢ遺伝子を含むべきではなく、したがって、これらのプライマーはまた、ファージ−プラークピッキング技術の純度のためのコントロールとして役立った。２５回のＰＣＲ反応サイクルが対応するファージによって産生されたプラークについての特異的ファージＰＣＲプライマー対を有する強力なバンドを産生するのに十分であったが、２５回のサイクルを有する同じプラークＤＮＡを使用して、ｒｐｏＢプライマーでは弱いバンドのみが観察されたか、またはしばしばバンドが観察されなかったことが決定された（データは示さず）。このため、プラークサンプルのＰＣＲ解析を２５サイクル行った。
【０７３５】
ａ．ＰＣＲ反応条件およびプライマー特異性の確認
上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に対してＰＣＲを行い、ファージ１、２、および３ならびにｒｐｏＢ宿主ゲノム制御について予想されるＰＣＲ産物が産生されたかどうかを決定した。ファージ陰性株ＡＴＣＣ  １３７０６はＰＣＲ反応のネガティブコントロールとして働いた。ＰＣＲ反応のためのｇＤＮＡ鋳型を調製するために、大腸菌ＮｉｓｓｌｅをＬＢ培地中で３７±２℃で増殖させ、２５０回転／分（ｒｐｍ）で一晩振盪した。１００μＬの固定相培養物を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに添加し、＞２０，０００×ｇ（１５，０００ｒｐｍ）で微量遠心分離機中で３０秒間回転させた。上澄み液を除去し、セルペレットを１００μＬの滅菌水に再懸濁した。この１００μＬの懸濁液を０．２ｍｌのさらさら壁管に移し、エッペンドルフマスターサイクラープロサーモサイクラー中で９８℃で１０分間加熱した。得られた溶液は、ＰＣＲ反応に適したｇＤＮＡを含んでいた。ＤＮＡヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてＭｙＴａｑ（商標）Ｒｅｄ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＤＮＡ増幅を支持し、ＤＮＡ鋳型として大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｇＤＮＡを用い、表８６の条件に従って混合した。ポリメラーゼ連鎖反応を、表８７に記載されるように、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏサーモサイクラーにおいて行った。ＰＣＲの完了後、５μＬの反応物またはＤＮＡ標準（１ｋＢ＋ラダー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、電気泳動による分離およびＳｙｎｇｅｎｅ紫外線（ＵＶ）トランスイルミネーターを使用する可視化のために、０．８％アガロースゲル上にロードした。
【０７３６】
［表８６］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅから推定プロファージ領域を増幅するＰＣＲの調合
【表３３】
2020525012.tif 000106
【０７３７】
［表８７］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅからプロファージ領域を増幅するためのＰＣＲ反応サイクル
【表３４】
2020525012.tif 000107
【０７３８】
バクテリオファージ力価アッセイは、有効な方法を用いて行った。ＰＣＲ解析は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来する数え上げ可能なバクテリオファージプラーク（適用可能な場合）または操作された株を含む、得られたファージ力価プレートの上澄み液について行った。プラークを生成したファージの同一性をＰＣＲによって決定した。個々のプラークの寒天プラグを、２μＬピペットチップを用いて培養プレートから除去した。各プラグを０．５ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁した。プラグ再懸濁液を１５秒間ボルテックスし、次いで１μＬをＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ反応に添加した。ファージ特異的ＰＣＲ反応を、ＤＮＡヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてＭｙＴａｑ（商標）Ｒｅｄ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて実施し、ＤＮＡ増幅を支持し、ＤＮＡ鋳型としてプラグ再懸濁液を用い、表５の条件に従って混合した。上記の表８５からのプライマーの各組を、大腸菌ＮｉｓｓｌｅおよびＡＴＣＣ１３７０６ｇＤＮＡを陽性およびネガティブコントロールとして用いて、３つの推定ファージの各々を同定するために別々のＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応は表８９の条件に従って行い、プラーク中に存在する任意の残留宿主染色体ＤＮＡの増幅を防止するために、限られたサイクル数（２５サイクル）で行った。ＰＣＲの完了後、５μＬの反応物またはＤＮＡ標準（１ｋＢ＋ラダー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、電気泳動による分離およびＳｙｎｇｅｎｅ  ＵＶトランスイルミネーターを用いた可視化のために、０．８％アガロースゲル上にロードした。
【０７３９】
［表８８］プラークプラグから大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ特異的ファージを増幅するためのＰＣＲ反応条件
【表３５】
2020525012.tif 000108
【０７４０】
［表８９］プラークプラグからプロファージ領域を増幅するためのＰＣＲ反応サイクル
【表３６】
2020525012.tif 000109
【０７４１】
実施例５７．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよびファージ存在のためのＭｕｔａｆｌｏｒのテスト
４．ファージ試験データの要約
いくつかのサンプル中のファージの存在を検出するための独立した分析を行った。分析は、微生物および細胞培養物のドイツコレクションからの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのセルバンクサンプル（本明細書中ではＳＹＮ００１と呼ぶ）、および大腸菌Ｎｉｓｓｌｅを含有するムタフロアのカプセルが非誘導および誘導（マイトマイシンＣ処置）条件下で低濃度のファージを可変的に発現することを示した（表９０）。
【０７４２】
興味深いことに、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株は、いずれの条件においてもファージを示さないＣＴＭロットによって見られるように、常に誘導性であるとは限らない。さらに、誘導性大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細胞（ＭｕｔａｆｌｏｒおよびＳＹＮ００１）が検出可能なファージを発現する場合でさえ、その量は、他の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株についての誘導されていないまたは誘導された条件下で見られる最大量に類似する。対照的に、バクテリオファージラムダプロファージを含む大腸菌Ｋ−１２株であるポジティブコントロール株ＡＴＣＣ２３７１６，２は、誘発後に大腸菌Ｎｉｓｓｌｅまたはその誘導体よりも５〜６桁多いファージを産生した。これは、まだ理解されていない理由のために、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株の誘導能の明らかな欠如を実証する。
【０７４３】
［表９０］ファージプラークアッセイ試験結果の概要
【表３７】
2020525012.tif 000110
【０７４４】
５．大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡに対するファージ特異的プライマーの検証
ＰＣＲ分析法がプラーク産生ファージを同定し得ることを検証するために、プロファージ１、２、３または宿主ｒｐｏＢ遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ｇＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行った（表８５）。ここでは示されていないが、指標株ＡＴＣＣ１３７０６に対する同じプライマーを用いた同様の分析はファージプライマーについてのバンドおよびｒｐｏＢについてのわずかなバンドを与えず、これは３つの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅプロファージを欠くが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子といくらかの配列類似性を有するｒｐｏＢ遺伝子を含むこの株と一致する。各プライマーセットはアガロースゲル電気泳動によって判断されるように、正しいサイズの単一のＤＮＡ製品を産生し、これは、図１３に示される。この試験結果に基づいて、これらのプライマー対を使用して、異なるファージの存在について、表９０に要約される分析からの個々のプラーク由来のファージＤＮＡを評価した。
【０７４５】
６．ファージ１、２、および３の存在に関する個々のプラークの分析
プラークアッセイからの計数可能なプラークを有するプレートを、ＰＣＲ解析によって分析した。ポリメラーゼ連鎖反応分析を、プロファージ１、２、３または宿主ｒｐｏＢ遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、計数可能なプラークを有するプレートからの１０個のプラークに対して行い、プラークを作製したファージの同一性を決定した。いくつかの場合において、明らかに列挙可能なプラークを有するプレートは１０未満のプラークを含み、この場合、全てのプラークが使用された。しかしながら、少なくとも６つのプラークを全ての分析について試験した。実行されたすべてのＰＣＲ反応において、プロファージ３に特異的なプライマーのみがＰＣＲ産物を産生し、これは、表９０に列挙される各試験株およびバッチについてのすべての場合において真実であった。このデータの代表的なゲル分析を図１４に示す；図１４の左側のパネルは、大腸菌のアッセイから採取された個々のプラークプラグについて可視化された代表的な組のＰＣＲ反応を示す。右側のパネルは大腸菌ＮｉｓｓｌｅまたはＡＴＣＣ１３７０６（ＣＲＬファージアッセイで使用されるファージ陰性指標株）のいずれか由来のｇＤＮＡを使用し、常在性プロファージ３を含まない対照試験を示す。この後者の発見は、ファージプラークＰＣＲ分析において観察された陽性結果がＡＴＣＣ１３７０６プレーティング株における配列との交差反応の結果ではないことを確認する。
【０７４６】
Ｅ．結論
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージエレメントが評価された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株およびＭｕｔａｆｌｏｒ株に存在することを実証する。これは、発現可能なプロファージが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに存在することを示す。非誘導状態では、大腸菌ＮｉｓｓｌｅおよびＭｕｔａｆｌｏｒが検出可能なプラークを全くまたは低レベルで産生しない。すべての場合に産生されたファージ量は、ポジティブコントロール株ＡＴＣＣ２３７１６よりも５〜６桁低かった。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析に基づいて、ＰＣＲアッセイを開発し、これらの株において同定された３つの内因性プロファージ元素のいずれかが活性ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定した。結果はこのプロファージゲノムがファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ１３７０６（これはファージ３配列を天然には含まない）上に形成されたプラークから独特に増幅されたので、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ試験結果のプラークは本明細書中でファージ３と呼ばれる、バイオインフォマティックに同定された３つのプロファージ元素のうちの１つのみに試験結果することを示す。総合すると、これらのデータはファージ３が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株でファージ産生に観察可能な差異がないようという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のＭｕｔａｆｌｏｒカプセルを含む、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに天然のプロファージ元素の試験結果であることを確立する。
【０７４７】
１．結果および結論の要約
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージ元素が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに内因性であることを実証する。検証されたプラークアッセイによって決定された、試験された株によってファージ粒子が産生された頻度は同様の低水準で定量的にであり、これは、一般に発現可能なプロファージが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに存在することを示している。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析（実施例５５）に基づいて、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅで同定された３つの内因性プロファージエレメントのいずれかがプラーク形成ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定するために、ＰＣＲアッセイを開発した。結果は、プラークが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅから発現される場合、バイオインフォマティックに同定された３つのプロファージエレメントのうちの１つのみ、プロファージ３から生じることを示す。このプロファージゲノムは、ファージ感受性エシェリヒア属ｃｏｌｉ（大腸菌）株ＡＴＣＣ１３７０６（これはプロファージ３配列を天然には含まない）上に形成されたプラークからのＰＣＲによって独特に増幅された。総合すると、これらのデータはプロファージ３が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株でファージ産生に観察可能な差異がないようという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のＭｕｔａｆｌｏｒを含む、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに天然のプロファージエレメントの試験結果であることを確立する。
【０７４８】
実施例５８．ＳＹＮ００１、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０３３、およびＳＹＮ−ＰＫＵ１０３４のファージテスト
本研究では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのプラークアッセイ、およびフェニルアラニン消費回避回路、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０３３およびＳＹＮ−ＰＫＵ１０３４を含む技術系株を用いて、株が生産するフェーズレベルを決定した。表９１は、本研究で使用した株の説明を提供する。
【０７４９】
［表９１］株についての説明
【表３８】
2020525012.tif 000111
【０７５０】
各株を、対数期にマイトマイシンＣの有無、および定置夜間からマイトマイシンＣの有無で試験した。ＣＦＵカウントを測定した後、上澄み液をプラークアッセイのために処理して、細胞当たりに産生されるプラークの量を測定した。
【０７５１】
以下の試験株を、ＬＢ（ＤＡＰ  １００ｕｇ／ｍＬを必要に応じて含む）、１４ｍＬの培養管中、３７℃で２５０ｒｐｍで振盪しながら３ｍＬ中で一晩増殖させた：ＳＹＮ０１（Ｎｉｓｓｌｅ）；ＡＴＣ１３７０６（ネガティブコントロール）；ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０；ＳＹＮ−ＰＫＵ１０３３、およびＳＹＮ−ＰＫＵ１０３４。ＡＴＣＣ１３７０６のさらなる２０ｍＬ培養物を、感受性プラークインジケーター株として使用するために、１２５ｍＬバッフル付きフラスコ（３７Ｃ、２５０ｒｐｍ）中でＬＢ中で増殖させた。これらの一晩培養物を使用して、１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中で１：１００希釈（ＤＡＰ  １００ｕｇ／ｍＬ、適切な場合）で、ＬＢ中の１０ｍＬ培養物に２連で接種した。各株について、一方のフラスコは２ｕｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを含み、他方の培養物を対数期非誘導対照として使用した。全てのフラスコを３７℃の振盪（２５０ｒｐｍ）で４．５時間増殖させた。次に、培養物および静止した誘導されない一晩の培養物を、９６ウェルプレート中のＰＢＳ中で１０倍希釈し、そして細胞数の判定のためにプレーティングした。１０−３から１０−８希釈に及ぶスポット希釈物１０ｕｌを、各株について、１プレートあたり（ＬＢプレート−ＤＡＰ  １００ｕｇ／ｍＬ、適切な場合）、２連で平板培養した。
【０７５２】
細胞を計数した後、それぞれの培養物からの１ｍＬ（１株あたり３培養物）を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、５０ｕＬのクロロホルムを添加した。チューブを１５〜３０秒間ボルテックスし、細胞をマイクロ遠心分離機中で最大速度で２分間スピンダウンした。
【０７５３】
上澄み液を、ウェル当たり１８０ｕＬのＬＢを含む９６ウェルプレート中で希釈した。それぞれの株について２００ｕＬの純上澄み液を第１のウェルに添加し、マルチチャネルピペットを用いて１０倍希釈を行った。感受性対照株を調製するために、１０ｍＬのＡＴＣＣ１３７０６を１５ｍＬファルコン管中で４０００×ｇでスピンダウンし、上澄み液をデカントし、細胞を等容量の１０ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁した。
【０７５４】
１００ｕｌのＡＴＣＣ１３７０６細胞懸濁液を含む１４ｍｌの培養管を、適切な株および上澄み液の希釈のために調製した。ニート上澄み液および上澄み液希釈液をチューブに添加し、細胞／上澄み液混合物を最低５分間インキュベートした。
【０７５５】
インキュベーション後、酵母抽出物を欠くＬＢ培地中の７ｇ／Ｌ寒天からなる液体トップ寒天３ｍＬを試験管に添加し、混合物を適切に標識されたＬＢプレート上に直ちに均一に注いだ。プレートを乾燥させた後、それらを３７℃の静的インキュベーターに移動させ、反転させ、一晩インキュベートした。プラーク数を表９２に示す。
【０７５６】
［表９２］プラーク数
【表３９】
2020525012.tif 000112
【０７５７】
コロニー計数は２ｕｇ／ｍＬのマイトマイシンＣがすべてのＮｉｓｓｌｅ株について完全に致死的であったが、２μｇ／ｍＬが細胞の約９０％を死滅させたＡＴＣＣ１３７０６については致死的ではなかったことを示した。
【０７５８】
ファージ３に特異的なプライマーを用いてファージ３ＤＮＡが存在することを確認するために、ＰＣＲ分析を行った（示さず）。
【０７５９】
実施例５９．抗生物質カセットの染色体挿入を使用した大腸菌Ｎｉｓｓｌｅからのファージ産生の非活性化
バイオインフォマティックアプローチは、活性ファージを含むと推定されるゲノムの３つの領域を同定するのに役立った（実施例５５を参照のこと）。活性ファージは塩基類２，０３５，８６７と２，０７９，１７７の間のゲノム座に由来することを示した。
【０７６０】
Ｆ．ノックアウトプライマー設計
ファージを不活性化するために、λレッド組換えを用いて、９，６８７塩基類対欠失を作製した。λレッド組み換えは、バクテリオファージλ由来の組換え酵素を用いて、隣接相同性によって指向される大腸菌の染色体に特注ＤＮＡ片を挿入する手法である。まず、プラスミドｐＫＤ３からフリッパーゼ認識部位（ＦＲＴ）に隣接するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を増幅するためにプライマーを設計し、合成した（表９３）。Ｎｉｓｓｌｅに導入されると、このカセットは抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を提供する。さらに、これらのプライマーは、抗生物質カセットをファージ遺伝子座に導くゲノムに対して６０塩基類対のホモロジーを含む。Ｐｈａｇｅ３  ＫＯ  ＦＷＤおよびＰｈａｇｅ３  ＫＯ  ＲＥＶプライマーを使用して、１１７８塩基類対直鎖状ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、これをＰＣＲ精製した。得られたＤＮＡ鋳型を組換えに使用した。
【０７６１】
［表９３］ファージ３の不活性化に使用されるプライマー
【表４０】
2020525012.tif 000113
【０７６２】
Ｇ．λレッドシステムの導入
ファージの欠失のためのＮｉｓｓｌｅ株を調製するために、最初に、ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ宿主株に形質転換することによって、ラムダレッド系を導入した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細胞をＬＢ媒体中で一晩増殖させた。一晩培養物を５ｍｌのＬＢ媒体で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを４℃に予備冷却し、大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を０．５ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を０．１ｍｌの４℃水中に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、無菌の冷却したキュベットにピペットで移した。乾燥キュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気脈拍を適用した。室温のＳＯＣ培地１ｍｌを直ちに加え、培養管に移し、３０℃で１時間インキュベートした。細胞を選択培地プレート上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。
【０７６３】
Ｈ．Ｎｉｓｓｌｅ中のファージのλレッド不活性化
組み換え構築物を、ｐＫＤ４６を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換して、ファージ配列を欠失させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを４℃に予備冷却し、一晩培養物をカルベニシリンを含有する５ｍＬのＬＢ媒体で１：１００に希釈し、ＯＤ６００＝０．１に達するまで増殖させた。次に、０．０５ｍＬの１００×Ｌ−アラビノースストック溶液を添加して、ｐＫＤ４６λレッド発現を誘導した。培養物を、ＯＤ６００＝０．４〜０．６に達するまで増殖させた。次いで、大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を０．５ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を０．１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定し、０．５μｇの組み換え構築物を細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌冷却キュベットにピペットで移した。乾燥キュベットをサンプル室に入れ、電気パルスを施し、１ｍｌの室温ＳＯＣ培地を即座に加え、混合物を培養管に移植し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上に広げ、一晩インキュベートした。
【０７６４】
Ｉ．突然変異の検証
突然変異の存在をコロニーＰＣＲによって確認した。コロニーをピペットチップで拾い上げ、ピペットで上下させることによって２０μｌの冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。３μｌの懸濁液を、後の使用のために適切な抗生物質を含むインデックスプレート上にピペットで移した。インデックスプレートを３７℃で一晩成長させた。ＰＣＲマスターミックスを、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０．６μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．４μｌの５０ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４、６．０μｌの１０×向上剤、および３．０μｌのｄｄＨ２Ｏ（ＰＣＲ反応当たり１５μｌのマスターミックス）を使用して作製した。ＣＡＴ遺伝子（１００μＭストック）または挿入されたＣＡＴ遺伝子（１００μＭストック）に隣接するゲノム配列に固有のプライマー２μＬをｄｄＨ２Ｏ１６μＬに混合することによって、１０μＭプライマーミックスを作製した。使用したプライマーの配列を表９４に示す。各２０μｌの反応について、１５μＬのＰＣＲマスターミックス、２．０μＬのコロニー懸濁液（鋳型）、２．０μＬのプライマーミックス、および１．０μＬのＰｆｘ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＤＮＡ  ＰｏｌをＰＣＲチューブ中で混合した。ＰＣＲサーモサイクラーを以下のようにプログラムし、ステップ２〜４を３４回繰り返した：１）９４℃で５：００分、２）９４℃で０：１５分、３）５５℃で０：３０分、４）６８℃で２：００分、５）６８℃で７：００分、次いで４℃に冷却し、ＰＣＲ産物を、１０μＬの各アンプリコンおよび２．５μＬの５×色素を使用するゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲ産物は、ＣＡＴ遺伝子がゲノムに挿入された場合にのみ形成される（それによって、ファージを欠失および不活性化する）。
【０７６５】
［表９４］ファージ３の欠失を確認するためのプライマー
【表４１】
2020525012.tif 000114
【０７６６】
Ｊ．変異体からの抗生物質耐性の除去
抗生物質耐性遺伝子をプラスミドｐＣＰ２０で除去した。プラスミドｐＣＰ２０は、ＦＲＴ部位を組み換えてＣＡＴ遺伝子を除去するフリッパーゼリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドである。欠失ファージ配列を有する株を、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで、３７℃で抗生物質を含有するＬＢ媒体中で増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを４℃に予備冷却し、細胞を２，０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を０．５ｍｌの４℃水中に再懸濁した。細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を０．１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定し、１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、無菌の冷却したキュベットにピペットで移した。乾燥キュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気脈拍を適用した。室温のＳＯＣ培地１ｍｌを直ちに加え、培養管に移し、３０℃で１〜３時間インキュベートした。次に、２００μＬの細胞をカルベニシリンプレート上に広げ、２００μＬの細胞をクロラムフェニコールプレート上に広げ、両方を３７℃で一晩増殖させた。カルベニシリンプレートは、ｐＣＰ２０を有する細胞を含む。細胞を一晩インキュベートし、十分なＯＤ６００まで一晩増殖しなかったコロニーをさらに２４時間インキュベートした。クロラムフェニコールプレートは、エレクトロポレーションで生き残った細胞の多くの指標を提供する。カルベニシリンプレートからの形質転換体を４３℃で非選択的に精製し、一晩増殖させた。
【０７６７】
精製した形質転換体を、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールに対する感受性について試験した。４３℃で増殖させたプレートからコロニーを採取し、１０μＬのＬＢ媒体に再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を３つのプレートの各々にピペットで移した：１）３７℃でインキュベートしたクロラムフェニコールを含むＬＢプレート（これは、宿主株のゲノム中のＣＡＴ遺伝子の有無について試験する）；２）３０℃でインキュベートしたカルベニシリンを含むＬＢプレート（これはｐＣＰ２０プラスミド由来のβ−ラクタマーゼ（ＣａｒｂＲ）遺伝子の有無について試験する）；および３）３７℃でインキュベートした抗生物質を含まないＬＢプレート（コロニーについてクロラムフェニコールまたはカルベニシリンプレート上で成長が観察されない場合、ＣＡＴ遺伝子およびｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われ、そしてコロニーをさらなる分析のために保存した）。保存されたコロニーをＬＢプレート上に再リークして単一コロニーを得、３７℃で一晩増殖させた。ファージ配列の欠失はゲノムのファージ遺伝子座領域を配列決定することによって、より重要なことには、プラーク形成の非存在を表現型的に検証することによって確認した（本質的に、実施例５７または５８に記載され、実施例６０に記載されるようなプロトコールに従って）。
【０７６８】
表９５は、ファージ不活性化のために除かれた大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３の部分を列挙する。
【０７６９】
［表９５］ファージ３から除かれた配列
【表４２−１】
2020525012.tif 000115
【表４２−２】
2020525012.tif 000116
【表４２−３】
2020525012.tif 000117
【０７７０】
表Ｅは、欠失によって不活性化されたファージ３遺伝子を列挙する。
【０７７１】
［表Ｅ］欠失によって不活性化されたファージ３遺伝子
【表４３】
2020525012.tif 000118
【０７７２】
表Ｆは、欠失を含むファージ３の配列を示す。
【０７７３】
［表Ｆ］欠失を有するファージ３配列
【表４４−１】
2020525012.tif 000119
【表４４−２】
2020525012.tif 000120
【表４４−３】
2020525012.tif 000121
【表４４−４】
2020525012.tif 000122
【表４４−５】
2020525012.tif 000123
【表４４−６】
2020525012.tif 000124
【表４４−７】
2020525012.tif 000125
【表４４−８】
2020525012.tif 000126
【表４４−９】
2020525012.tif 000127
【表４４−１０】
2020525012.tif 000128
【表４４−１１】
2020525012.tif 000129
【０７７４】
実施例５９に記載されるように、ｐＫＤ３に対する４０ｂｐのオーバーハングおよび相同性を有するプライマーを使用して、ファージゲノムの１０ｋＢ領域を標的とするノックアウトを作製した（λレッド組換え、続いてクロラムフェニコール耐性についての選択）。得られた４つのクローン化を選択した。ファージ３ゲノムにおけるクロラムフェニコールカセットの挿入の存在についてスクリーニングするためのプライマーを使用して、予想される２００ｂｐのバンドが、４つのクローン化すべてについて見られ、ファージ３ゲノムに特異的なポジティブな挿入を示した。
【０７７５】
同じ４つのクロラムフェニコール耐性コロニーを、１４ｍＬの培養管中の１ｍＬのＬＢに再懸濁した。チューブを３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。細胞が対数期初期に達したとき、培養物を２つの５００ｕｌアリコートに分割し；一方のアリコートをマイトマイシンＣ（２ｕｇ／ｍＬ）で処理し；他方を未処理のままにした。３．５時間後、４００ｕｌのそれぞれの培養物を除去し、２０ｕｌのクロロホルムを添加した。サンプルを１５秒間ボルテックスし、最大速度で１分間遠心分離機で遠心分離した。表９６は、カウントされたプラークの数を示す。ＳＹＮ−９０２は、ｐＫＤ４６プラスミドを含む野生型Ｎｉｓｓｌｅである。
【０７７６】
ｉ．  ［表９６］プラーク数
【表４５】
2020525012.tif 000130
【０７７７】
結論として、ノックアウト株のいずれにおいてもプラークは観察されなかったが、ポジティブコントロールは多数のプラークを産生した。これらの結果は、野生型大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ中のファージ３の１０ｋｂ内部領域の欠失が、マイトマイシンＣ処理後のプラーク形成を防ぐことを示している。
【０７７８】
実施例６１：ファージ３ノックアウト株におけるファージ検出アッセイ（野生型ＮｉｓｓｌｅおよびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４）
この研究は、野生型ＮｉｓｓｌｅおよびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４でのファージ３ノックアウトが、プラークアッセイにおいて陰性試験をもたらすかどうかを試験するために実施された。
【０７７９】
［表９７］株についての説明
【表４６】
2020525012.tif 000131
【０７８０】
本研究では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ０１）、ＳＹＮ‐９０３（Ｎｉｓｓｌｅバックグラウンドにおけるファージ３ノックアウト）、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐１０３４ｄ「ｐｈｉ」３（陰性株におけるファージ３ノックアウト）、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０（ポジティブコントロール）、およびＡＴＣＣ１３７０６（ネガティブコントロール）からの上澄み液をファージの存在について試験した。
【０７８１】
一方の末端のクロラムフェニコール（ｃｍ）カセットおよび他方のファージ３に特異的なプライマーセットを使用するＰＣＲ分析は、クローン化ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４ファージ３ＫＯがクロラムフェニコールカセットの正確な挿入について陽性であることを以前に示した（データ示さず）。ＣＭカセットの挿入は、実施例５９で上述したように行った。
【０７８２】
ファージテストのために、菌株（ＳＹＮ０１（Ｎｉｓｓｌｅ）、ＡＴＣ１３７０６（ネガティブコントロール）、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３３、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４、ＡＴＣＣ１３７０６（感受性プラークインジケーター菌株）を、ＬＢ（必要に応じてＤＡＰ  １００ｕｇ／ｍＬを含む）、３ｍＬ中、２５０ｒｐｍで３７℃で振盪しながら１４ｍＬの培養管中で一晩増殖させた。酵母抽出物を欠くＬＢ培地中の７ｇ／Ｌ寒天からなる上部寒天を調製し、融解し、４５℃に保って液体を維持する。
【０７８３】
一晩培養物を使用して、１：１００希釈で１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中で、１０  ＬＢにＤＡＰ  １００ｕｇ／ｍＬを適切な場合に接種した。各試験株を、２つの１０ｍＬ培養物に接種した：ファージを誘導するために２ｕｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを有する１つのフラスコ、および対数期非誘導対照としての第２のフラスコ。全てのフラスコを３７℃の振盪（２５０ｒｐｍ）で増殖させた。全ての培養物を４．５時間増殖させ、９６ウェルプレート中のＰＢＳ中で１０倍に希釈し、そして細胞数の判定のためにプレートした。１０−３から１０−８の希釈物に及ぶスポット希釈物（１０ｕｌ）を、各株について、１プレートあたり（ＬＢプレート−ＤＡＰ１００ｕｇ／ｍＬ、適切な場合）、２連で平板培養した。
【０７８４】
細胞計数の終了後、それぞれの培養物から１ｍＬ（１株あたり３培養物）を取り出し、１．５ｍＬのエッペンドルフに入れ、５０ｕＬのクロロホルムを添加し、チューブを１５〜３０秒間ボルテックスした。細胞を、マイクロ遠心分離機中で２分間、最大速度で遠心分離した。一方、９６ウェルプレートを、柱２〜５および８〜１１においてウェル当たり１８０ｕＬのＬＢを含むように調製した。この平板中で上澄み液の希釈を行った。それぞれの株について２００ｕＬのニート上澄み液を、サンプル１〜８については縦列１に、サンプル９〜１５については縦列７に添加した。縦列２〜５および８〜１１からのマルチチャネルピペットを用いて１０倍希釈を行った。
【０７８５】
感受性対照株を調製するために、１０ｍＬのＡＴＣＣ１３７０６を１５ｍＬのファルコン管中で４０００×ｇでスピンダウンし、上澄み液をデカントし、細胞を等容量の１０ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁した。１４ｍｌの培養管を設定し、適宜株について標識し、上澄み液の希釈液を添加した。各チューブに、１００ｕｌのＡＴＣＣ１３７０６細胞懸濁液を添加した。ニート上澄み液およびその希釈液を適切なチューブに加え、細胞／上澄み液混合物を最低５分間インキュベートした。
【０７８６】
インキュベーション後、３ｍＬの上部寒天を試験管に添加し、混合物を直ちに（注ぐことによって）標識ＬＢプレート上に広げた。プレートを乾燥させ、次いで３７℃の静的インキュベーターに移動させ、反転させ、そして一晩インキュベートした。結果を表９８７に示す。
【０７８７】
［表９８］プラーク数
【表４７】
2020525012.tif 000132
【０７８８】
上記表に見られるように、ファージ３はプラーク形成に関与し、ファージ染色体内の中央遺伝子の欠失はプラークの形成を阻害することができる。肉眼的観察は、ファージ配列の欠失によって引き起こされるいかなる種類の成長欠陥も示唆しなかった。
【０７８９】
実施例６２：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３５、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３６のファージテスト
この研究は抗生物質カセットがプラスミド背景技術から除去された種々のフェニルアラニン株におけるファージ産生を評価し、このカセットの除去がファージ粒子の再形成を可能にしないことを確認するために行われた。
【０７９０】
また、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０のファージ３ノックアウト版もテストされたが、それでもまだｃｍカセットが含まれていた。表９９は、この研究で使用した株および関連する背景技術株を記載する。
【０７９１】
［表９９］株についての説明
【表４８】
2020525012.tif 000133
【０７９２】
ＡＴＣＣ１３７０６コントロール、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３５、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３６の培養物を、３７℃で振盪する１４ｍＬチューブ中の３ｍＬ培養物で一晩増殖させた。次に、マイトマイシンＣ（２μｇ／ｍＬ）を含む新しい培地に細胞を希釈した。本質的に実施例５８に記載されるように、プラークアッセイを実施した。プラーク数を表１００に示す。
【０７９３】
［表１００］プラーク数
【表４９】
2020525012.tif 000134
【０７９４】
これらの結果から、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０におけるフェーズ３のノックアウトは、上澄み液からｐｆｕをもたらさなかったことが示された。プラスミド株におけるファージ３ノックアウトからのカセットの治癒はまた、上澄み液におけるｐｆｕ形成をもたらさなかった。
【０７９５】
実施例６３：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の産生および分析
フェニルアラニン消費株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０について、フェーズ３がノックアウトされクロラムフェニコールカセットが切断されたバージョンを解析した。まず、プラーク形成をプラークアッセイで評価した。次に、この株のトランスケイ皮酸産生能をＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０と比較し、ファージの除去がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフェニルアラニン消費活性の変化を引き起こすかどうかを決定した。関連するＰｈｅ分解領域のサンガー配列決定を行って、フェニルアラニン消費回路を確認した。
【０７９６】
まず、クロラムフェニコールカセットを硬化させるために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１（デルタファージ３：：ｃｍ挿入によるＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０３）をｐＣＰ２０で形質転換し、４種類のカルベニシリン耐性形質転換体を選択して解析した。クロラムフェニコールカセットの除去を最初にＰＣＲによって確認した。これらの形質転換体を４２℃で一晩成長させてｐＣＰ２０プラスミドを硬化させ、次いでＬＢプレート（成長がないことを確実にするための対照としてのプレーンＬＢプレート、プラスミドおよびＬＢクロラムフェニコールの喪失を確認するためのＬＢプラスカルベニシリン、および染色体Ｃｍカセットの除去を確認するためのＬＢクロラムフェニコール、ならびに株が成長するＬＢ  Ｄａｐ（ｄａｐ栄養要求性））上に画線した。細胞をまた、Ｐｈｅ寒天上に画線し、そしてスポットした塩化第二鉄を、ＬＡＡＤ活性がなお存在することを確実にするためにした。４つのクローン化はすべて直ちに深緑色に変わり、ＬＡＡＤ陽性の試験結果を示した。１つのクローン化をさらなる分析のために維持し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２と命名した。
【０７９７】
次に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を、ネガティブコントロールとしてＡＴＣＣ１３７０６およびポジティブコントロールとしてＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０を用いてファージ試験のために調製した。プラックアッセイは、本質的に実施例５８に記載したように実施した。Ｐｈａｇｅ試験の結果、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２からアンデュースおよびミトマイシンＣが誘発した上澄み液にはプラークがないことが示された（データは示されていない）。
【０７９８】
次に、フラスコをＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性を試験するために調製した。活性は、ＩＰＴＧ誘導ありまたはなし（好気的）、および嫌気性誘導ありで試験した。このアッセイを実施するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物を、１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中の１０ｍＬ培養物中で１：１００に逆希釈した（接種した３つのフラスコ、それぞれの条件について１）。細胞を１時間４０分間増殖させ、その時点で細胞は対数期初期に入った。一方のフラスコは触れずに残り、他方は１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを受け、第３のフラスコは９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、および５％Ｈ２を供給する嫌気性チャンバーに移動した。細胞を４．５時間誘導させた。次いで、本明細書の他の箇所に記載されるように、標準プロトコールに従って、ＴＣＡ製造アッセイを行った。本質的に、５０ｍＭフェニルアラニンを含むアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。２９０ｎｍでの吸光度によるトランス−ケイ皮酸定量化のために、アリコートをセルアッセイから２０分毎に１．５時間除去した。
【０７９９】
表１０１に見られるように、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＩＰＴＧおよび嫌気性誘導の両方が観察された。
【０８００】
［表１０１］Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性測定
【表５０】
2020525012.tif 000135
【０８０１】
すべてのサンプルはサンガーシークエンシングに送られ、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２中のすべてのＰｈｅ分解関連領域の配列が正確であることが確認された。
【０８０２】
結論として、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、ミトマイシンＣを用いて非誘導または誘発された上澄み液を用いた場合、ＡＴＣＣ１３７０６に対するプラーク形成ユニット（ｐｆｕｓ）を生産しておらず、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２には抗生物質マーカーは含まれず、遺伝子も含まれない。これはまた、ＩＰＴＧおよび嫌気性誘導の両方を伴うフェニルアラニン分解活性を有する。フェニルアラニン劣化に関与する全ての関連領域を配列決定した。従って、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、ファージを産生しないことを除いて、ＳＹＮ２６１９に対して機能的に当量であるよう。
【０８０３】
実施例６４：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性測定
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物からの１：１００逆希釈を、１．５時間対数期初期まで増殖させた後、本明細書に記載されるように、誘導のために１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．１％アラビノースの存在下で４時間嫌気性チャンバーに移した。活性アッセイを行うために、１ｅ８細胞を再懸濁し、アッセイ緩衝液（０．５％ブドウ糖、５０ｍＭ  Ｐｈｅ、および５０ｍＭ  フェニルアラニンを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含むＭ９培地）中でインキュベートした。上澄み液サンプルを経時的に採取し、ＴＣＡ（ＰＡＬの製品）を２９０ｎｍでの吸光度によって測定して、ＴＣＡ産生／ＰＡＬ活性の速度を決定した。フェニルピルビン酸は、本明細書に記載のＬＣＭＳ法を用いて測定した。結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。
【０８０４】
実施例６５：Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性分析−フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の腸循環モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対するＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０からのファージ３欠失の影響
Ｉｎ  ｖｉｖｏで馬尿酸を産生するＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性を評価する。本研究では、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をフラスコ中で増殖させ、嫌気的に誘導し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が馬尿酸を産生し、血清Ｐｈｅを減少させる機能に対するファージ欠失の影響を、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０株を含む同質遺伝子ファージとのｉｎ  ｖｉｖｏでの比較を通して評価する。
【０８０５】
ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物をそれぞれ用いて、５００ｍＬのＬＢを含む４つの２ＬフラスコにＤＡＰ１００ｕｇ／ｍＬを接種する。これらの培養物を１時間４５分間増殖させ、次いで、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、および５％Ｈ２を４時間供給する嫌気性チャンバーに移す。次いで、細胞を４６００ＸＧで１２分間遠心分離し、１０ｍＬの製剤バッファー（グリセロール：１５％（ｖ／ｖ）、ショ糖：１０％（ｗ／ｖ）（１００ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ：  １０ｍＭ（２．１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ：  ２５ｍＭ（１．４６ｇ／Ｌ））に再懸濁する。数個の４０  ｕｌアリコートを取り出し、細胞計数および活性測定に使用する。活動は、実質的に例６３に記載されているように決定され、それぞれＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２について測定される。生存率は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のセロメーターカウントにより測定した。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ、８ｅ１０  ｃｆｕ／ｍｌ）を対照として使用する。細胞をＰＢＳで１０ｍＬにし、次いで１Ｍ重炭酸塩と９：１で混合して、４ｅ１０細胞の毎日の強制経口投与する（３×３００ｕｌ照射量）のための調製において、１００ｍＭ重炭酸塩の最終濃度を達成する。
【０８０６】
ファージ正ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０対同質遺伝子ファージレス株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を比較するために、株をｉｎ  ｅｎｕ２マウスに投与する。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１を対照として投与する。６〜１８週齢以内のＣＲＬ（ＧＥＭＳ）由来の雌型ＢＴＢＲ−Ｐａｈ  ｅｎｕ２マウス（２０〜３５ｇ）を、少なくとも２日間設備に順応させる。動物をフェニルアラニン欠乏食餌（Ｔｅｋｌａｄ  ＴＤ．９７１５２）に置き、試験開始の少なくとも２日前に、０．５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ）および５％ショ糖／Ｌ（Ｓｉｇｍａ）のフェニルアラニン富化水を与える。フェニルアラニン富化水を研究期間中除去し、通常の水で置き換える。
【０８０７】
検討の日に、マウスを重量に従って以下のように処置群に無作為化したする：群１：Ｈ２Ｏ（ｎ＝９）；群２：ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝９）；群３：ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０（ｎ＝９）；群４：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ｎ＝９）。ベースラインフェニルアラニンレベルを決定するために、顎下皮膚穿刺によって血中サンプルを収集する。次いで、マウスに、平均基重量に従って、重量１グラム当たり０．１ｍｇのフェニルアラニンの単回用量を皮下注射によって投与する。Ｐｈｅ攻撃の１、２および３時間後に、細菌（または水）を経口強制経口投与する（３×３００ｕｌ）によってマウスに投与する。動物から採血し、Ｐｈｅ攻撃の４時間後まで、すべての動物から尿を収集する。採血後２０分以内に遠心分離機（４℃で１０分間２０００ｇ）で血漿するまで、血中サンプルを氷上に保持する。次いで、血漿を、ＭＳ分析のために９６ウェルプレートに移す。尿を５ｍＬチューブに集め、体積を記録した後、馬尿酸解析のためにサンプルをＭＳに移す。
【０８０８】
実施例６６：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与時のｉｎ  ｖｉｖｏ血清Ｐｈｅおよび馬尿酸の測定
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。研究のための細胞を調製するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２一晩培養物をそれぞれ使用して、５００ｍＬのＬＢを含有する４つの２ＬフラスコにＤＡＰ１００ｕｇ／ｍＬを接種した。これらの培養物を１時間４５分間増殖させ、次いで、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、および５％Ｈ２を４時間供給する嫌気性チャンバーに移した。次いで、細胞を４６００ＸＧで１２分間遠心分離し、１０ｍＬの製剤バッファー（グリセロール：１５％（ｖ／ｖ）、ショ糖：１０％（ｗ／ｖ）（１００ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ：１０ｍＭ（２．１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ：２５ｍＭ（１．４６ｇ／Ｌ））に再懸濁した。数個の４０ｕｌアリコートを取り出し、細胞計数および活性測定に使用した。生存率は、セロメーターカウント（４連）６．９４ｅ１０  ｃｆｕ／ｍｌ（＋／５．７８ｅ９）によって測定した。
【０８０９】
活性は、プレートベースのアッセイを用いて決定した。簡単に述べると、１×１０８  ｃｆｕ（セロメーターにより測定）を、微量遠心管中の１ｍＬの予め温めたアッセイ緩衝液（０．５％ブドウ糖、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、および５０ｍＭフェニルアラニンを含む１×Ｍ９最小培地）に添加し、短時間ボルテックスし、直ちに３７℃のヒートブロックまたは恒温水槽中に置いて静置インキュベーションした（ｔ＝０）。アッセイ緩衝液中に再懸濁した細胞からの上澄み液サンプルを、２９０ｎｍの吸光度で分光光度計を用いて、いくつかの時点にわたりＴＣＡの存在量について分析した。ＴＣＡ検出のための正確なＯＢｗｉｎｄｏｗは、比較的狭い濃度範囲で生じる。この理由から、上澄み液サンプルを希釈して、吸光度計測値が検知のための直鎖状領域に入ることを確実にした。測定値をＴＣＡ検量線と比較した。活性は、２．７２ｕｍｏｌ／ｈｒ／１ｅ９  ｃｆｕ（＋／−０．１５ｕｍｏｌ／ｈｒ／１ｅ９  ｃｆｕ）であると決定された。
【０８１０】
検討の４日前（すなわち、４〜１日目）から始めて、Ｐａｈ  ＥＮＵ２／２マウス（〜１１〜１５週齢）を、０．５ｇ／Ｌのフェニルアラニンを補充したフェニルアラニンを含まない固形飼料および水上で維持した。研究当日、マウスを重量に従って以下のように処置群に無作為化した：群１：ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝９）；群２：群２：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ｎ＝９）。ベースラインフェニルアラニンレベルを決定するために、顎下皮膚穿刺によって血中サンプルを収集した。次いで、マウスに、平均基重量に従って、重量１グラム当たり０．１ｍｇのフェニルアラニンの単回用量を皮下注射によって投与した。Ｐｈｅ攻撃の１、２および３時間後に、細菌（または水）を経口強制経口投与する（３×２５０ｕｌ）によってマウスに投与した。全血を、各時点で顎下出血を介して収集した。代謝ケージングにおける尿収集は１ｓｔの細菌照射量の直後に開始し、検討の期間（４時間）にわたって収集し続けた。
【０８１１】
採血後２０分以内に遠心分離機（４℃で１０分間２０００ｇ）で血漿するまで、血中サンプルを氷上に保持した。次いで、血漿を、ＭＳ解析のために９６ウェルプレートに移した。尿を５ｍＬチューブに集め、体積を記録した後、分析のためにサンプルをＭＳに移した。結果を図１７Ａおよび図１７Ｂに示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０と同様の様式で、Ｐｈｅ射出後のフェニルアラニンの変化の減少を引き起こし、馬尿酸を産生することを示す。
【０８１２】
実施例６７：フェニルケトン尿症のＥＮＵ２マウスモデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性
本研究の目的は、経口ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２投与後の尿中馬尿酸（ＨＡ）、トランス‐シンナメート（ＴＣＡ）およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の産生により測定した、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のＥＮＵ２マウスモデルにおけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）分解プロバイオティクスＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２の用量依存性ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を調べることであった。ＰＫＵに関するＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性は、血漿ＴＣＡおよびＨＡの出現と関連して、食事性Ｐｈｅ吸気とは無関係にＰａｈ  ｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウスにおいて経口投与されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が血漿Ｐｈｅ量を低下させる能力によって測定され、また、皮下（ＳＱ）注射によるＰｈｅ投与後の血漿におけるこれらの代謝産物を測定することによっても評価された。
【０８１３】
最初の試験では、Ｐｈｅ欠乏食で維持した雌型Ｐａｈｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウスの重量を測定し、次に重量別に無作為に２処置群に割り付けた（それぞれｎ＝９）。血液（抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン）を、顎下出血（Ｔ＝０時間）を介して各マウスから得た。次いで、マウスにＰｈｅ（０．１ｍｇ／ｇ）のＳＱ射出を行い、尿収集のために代謝ケージ（３匹／ケージ）に直ちに入れた。Ｐｈｅ注射の１、２、および３時間後に、マウスに、振盪フラスコ（５×１０１０細胞総投与量、３時間毎の強制経口投与するに均等に分割）中で増殖させ、前もって誘導した制御ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（群１）またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（群２）細胞のいずれかを強制経口投与した。注射の４時間後に、血漿（抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン）を顎下出血によって得、そして尿を収集した。液クロマトグラフィー‐タンデムマススペクトロスコピー（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ）を用いて、血漿および尿中のＰｈｅ、ＴＣＡおよびＨＡの濃度を測定した。
【０８１４】
この研究は、マウスを強制飼養するために使用されるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２試験品を、薬物物質のスケールアップを意図したものと同様の方法を使用して、バイオリアクター中で増殖させ、活性化したことを除いて、実施例６５に記載の研究と同様に実施した。Ｐｈｅ欠乏食で維持された雌型ＥＮＵ２マウス（ｎ＝６３）を秤量し、次いで重量により７処置群に無作為化した（それぞれｎ＝９）。次いで、マウスにＰｈｅ（０．１ｍｇ／ｇ）をＳＱ注射し、尿収集のために即座に代謝ケージに入れた。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を、Ｐｈｅ注射の１、２、および３時間後に６用量群に強制経口投与した（ｎ＝９／用量群を３匹のマウス／ケージの３つの代謝ケージに分割）。投与群には、１×１０１１、５×１０１０、２．５×１０１０、１．２５×１０１０、６．２５×１０９、または全部で３．１３×１０９細胞を、３時間毎の強制経口投与するにわたって等しく分割して与えた。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１を、１×１０ＯＢ細胞の最高用量で対照群（ｎ＝９）に強制経口投与した。尿を４時間かけて収集した。血漿（抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２およびＳＹＮ−ＰＫＵ９０１処置マウスの両方について、最高用量群（１×１０１１細胞）でのＴ＝０時間およびＴ＝４時間での顎下出血により、血漿のＰｈｅ変化の判定のために得られた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、血漿および尿中Ｐｈｅ、ＨＡ，ＴＣＡを測定した。定量的ＬＣ?ＭＳ／ＭＳ法は、血漿または尿中のフェニルピルビン酸を測定するのに利用方法なかった。
【０８１５】
結果を図１７Ａおよび図１８Ｂに示す。最初の研究ではＳＱ  Ｐｈｅ射出（０．１ｍｇ／ｇ）後、血漿Ｐｈｅ増加は同用量の対照株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較して、５×１０１０  ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２細胞の経口用量を受けたＥＮＵ２マウスにおいて有意に鈍化した（３７．７％減少、ｐ  ＝  ０．０００２）。試験の０〜４時間の試料採取期間中に排泄された尿中ＨＡの量は、尿中ＨＡ濃度に収集された尿の体積を乗じることによって決定した。尿中ＨＡ濃度は対照株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１で処置したマウスにおいて定量下限（ＢＬＬＯＱ；＜０．０４ｍＭ）未満であったが、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を投与したマウスにおける濃度は高く（６．５９〜７．９７ｍＭの範囲）、４時間にわたって測定可能なＨＡ排泄（１０．２４±０．５９μｍｏｌ）をもたらした。ＴＣＡおよびＨＡはいずれのマウスの血漿でもＴ＝０では観察されなかったが、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を投与した群では投与４時間後に検出された。ＴＣＡおよびＨＡはいずれの時点でも対照株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１で処置したマウスの血漿において測定不能であり、ＴＣＡの増加がＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性によるものであることを示し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２機能を実証した。尿中Ｐｈｅ，ＴＣＡ濃度はいずれのサンプルもＢＬＬＯＱであった。
【０８１６】
第２の研究では、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をバイオリアクター中で、薬物物質のスケールアップに使用した方法と同様の条件下で増殖させた場合にも、有効性が観察された。ＥＮＵ２マウスにおけるＳＱ  Ｐｈｅ注射（０．１ｍｇ／ｇ）後、血漿Ｐｈｅ増加は、等照射量のＳＹＮ−ＰＫＵ９０１細胞と比較して、１×１０１１  ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２細胞の経口照射量を受けた群において有意に鈍化した（２９．３％減少、ｐ＝０．０２）。さらに、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を線量依存的に処置したポートフォリオにおいて、尿ＨＡ排泄の上昇が観察された（１５．６１±０．８１±９．８１±２．１１，４．５２±１．７，２．９７±０．５５，１．２４±０．２３，０．８６±０．２５μｍｏｌのＨＡを、それぞれ１×１０１１、５×１０１０、２．５×１０１０，１．２５×１０１０，６．２５×１０９または３．１３×１０９のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の各細胞を施用したポートフォリオに排除した）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２に使用した最高用量である１×１０ＯＢＳＹＮ−ＰＫＵ９０１細胞で処置したマウスは、大量のＨＡ（０．０８±０．０２μｍｏｌ）を排泄しなかった。最初の研究と同様に、ＴＣＡおよびＨＡはＴ＝０でいずれのマウスの血漿でも観察されなかったが、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を受けた群では投与後４時間で検出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１を受けた動物では検出されなかった。尿中のＨＡ排泄は投与されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２細胞の量とよく相関し、代謝産物ＨＡがｉｎ  ｖｉｖｏＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性の有望なバイオマーカーであることを示した。
【０８１７】
結論として、これらのデータはＥＮＵ２マウスモデルにおいて、血漿ＴＣＡおよびＨＡの環流を増加させ、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性を大幅に増加させることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＰｈｅ代謝活性を実証する。検討の第２の部分は、薬物物質のスケールアップを意図した処理を用いてバイオリアクター中で増殖させたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がｉｎ  ｖｉｖｏで活性であることを示した。この実験では血漿Ｐｈｅレベルが経口投与された対照株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と共にＰｈｅのＳＱ注射を与えられたマウスにおいて増加した；しかし、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を経口投与されたマウスはＳＱ  Ｐｈｅ注射後の血漿Ｐｈｅ濃度において有意に鈍いスパイクを有した。重要なことに、この結果は全身循環Ｐｈｅが腸内再循環を介して腸に到達し、続いて胃腸管（ＧＩ）管において経口投与されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２によって分解されることを示す。この試験は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がタンパク質の食餌摂取とは無関係に、独立循環フェニル量を低下させることができることを実証した
【０８１８】
実施例６８：ファージ含有フェニルアラニン消費株とファージフリーフェニルアラニン消費株との間のｉｎ  ｖｉｖｏにおける生存率の比較
フェニルアラニン株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０を含むファージとそのファージ非含有対応物ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２との間の生存率、輸送またはコロニー形成の電位差を同定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ競合試験を実施し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０対同質遺伝子ファージレスＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２株の競合指数が生成された。ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０もＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２も抗生物質カセットを有していないため、本研究では抗生物質耐性未硬化の顕著な株を用いた。ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０については、クロラムフェニコール／カナマイシン（ｃｍ／ｋａｎ）標識株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３を使用した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２については、クロラムフェニコール（ｃｍ）標識株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１を使用した。表１０２は、この研究に関連する株を列挙する。
【０８１９】
［表１０２］株についての説明
【表５１】
2020525012.tif 000136
【０８２０】
簡潔に言えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の翌日物培養液を用いて、５００ｍＬのバフレッドフラスク中の１００ｍＬのＬＢ（同じくＤＡＰ  １００ｕｇ／ｍｌおよび適切な抗生物質を含む）を接種した。培養物を６時間増殖させ、その時点で、収集のために４０００×ｇの遠心分離機中で１５分間遠心分離した。上澄み液を廃棄した。細胞を約７ｍｌの製剤バッファー（グリセロール：１５％（ｖ／ｖ）、ショ糖：１０％（ｗ／ｖ）（１００ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ：１０ｍＭ（２．１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ：２５ｍＭ（１．４６ｇ／Ｌ））に再懸濁した。細胞を６５０ｕＬアリコートにアリコートし、−８０℃で凍結した。より小さなアリコートを、細胞プレーティングおよび生存率判定のために除去した。セロメーターを用いて、生存率は非常に高く、細胞数は株間でかなり同等であることが示された。
【０８２１】
入力（強制経口投与する）および出力（糞便）が一貫して比較され得るように、この研究（入力を含む）についての全ての細胞カウントを平板培養によって得た。２つの６５０ｕＬアリコートを氷上で解凍し、１：１で混合し、重炭酸ナトリウム中で希釈し（９部の細胞：１部の１Ｍ重炭酸塩（１４４μＬ））、次いで、ｋａｎ／ｃｍおよびｃｍ上で定量するために４連で播種した（１０倍の１０ｕＬスポット播種による−８−＞−１０希釈から）。
【０８２２】
第１日目に、野生型Ｂ６（ｎ＝６）のネズミに２００μｌ細胞（各株約３Ｘ１０£９）を注入した。糞便ペレットを、強制経口投与する６時間前および６時間後に収集した。２日目および３日目に、マウスに２００μｌ細胞を強制経口投与し、糞便ペレットを強制経口投与する６時間前および６時間後に収集した。４日目および５日目に、糞便ペレットを回収した。
【０８２３】
毎日、収集した糞ペレットを、１ｍｌのＰＢＳを含むチューブ中で秤量し、ホモジナイズした。糞ペレット中のＮｉｓｓｌｅのＣＦＵを測定するために、ホモジナイズした糞ペレットを連続希釈し、それぞれのサンプルを、クロラムフェニコールを含有するＬＢプレートおよびカナマイシンを含有するプレート上にプレートした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。糞便中の２系統の量を決定するために、全組換えＮｉｓｓｌｅをｃｍ版にカウントし、ｋａｎ版上で得られたＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３の数を総量から差し引いてＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１ＣＦＵ数を決定した。
【０８２４】
結果を図１９に示し、競合指数（ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３投入量／ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１排出量）を表１０３に示す。
【０８２５】
［表１０３］排出量の競合指数
【表５２】
2020525012.tif 000137
【０８２６】
結果は、Ｎｉｓｓｌｅ  ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３のファージフリーＰＫＵ株とＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１との間に輸送または定着において大きな差がないことを示している。
【０８２７】
実施例６９：大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来の株についての一般的なバクテリオファージ試験プロトコール
以下の手順は、ＥｃＮプロファージ／ファージ中に見出されるＤＮＡ配列を検出する。プライマーが欠失したプロファージの領域の外側で増幅してＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の細菌株を生成するので、それはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＥｃＮゲノム内のファージおよびプロファージＤＮＡを増幅する。
【０８２８】
バリデートされたバクテリオファージ（ファージ）方法、ＧＰ−Ｖ７０８、マイトマイシンＣ誘導を用いた大腸菌由来の細菌ウイルスのプラークアッセイは、プラークアッセイを用いてファージの存在を測定する。試験は、検出されたファージが内因性ＥｃＮプロファージ由来であり、汚染ファージまたは外来剤由来ではないことを確認する。
【０８２９】
プラークアッセイは、３７±２℃で１０ｍＭチミジンを補充した濃縮媒体中で増殖させ、２００〜３００ｒｐｍで一晩振盪する、凍結サンプル、陰性および陽性細菌培養物のループフルまたはスクレープで開始する。サンプル，ポジティブコントロール（大腸菌、ＥＭＧ  ２：Ｋ［λ］、ＡＴＣＣ  ２３７１６、または当量）およびネガティブコントロール（大腸菌、ＡＴＣＣ  １３７０６、または当量）の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上澄み液をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べる。マイトマイシンＣを、最終濃度２μｇ／ｍＬで、残りのサンプル、陽性および陰性細菌培養物に添加する。次いで、培養物を３７±２℃に置き、溶解がポジティブコントロール中で起こるまで（〜４．５時間）、３００〜４００ｒｐｍで振盪する。それぞれの培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上澄み液の０．１ｍｌアリコートをバクテリオファージの存在について試験する。これを達成するために、上澄み液をファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ  １３７０６と混合し、０．７％アガロース溶液と混合し、ローンとしてＬＢ寒天上にプレーティングする。プラークがポジティブコントロール中に存在し、プラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であると考えられる。
【０８３０】
列挙可能なプラークを含む目的の株を含むプレートを、エンドポイントＰＣＲによって同一性試験して、プラークが内因性ＥｃＮプロファージから生成されたファージ由来であることを確認する。これは、最初に２μＬのピペットチップで個々のプラークの寒天プラグを作製し、それぞれのプラグを０．５ｍｌのイオン交換水に再懸濁することによって達成される。プラグ再懸濁液を１５秒間ボルテックスし、１μＬをＰＣＲのための鋳型として使用する。ネガティブコントロールとして、同じプレートからの寒天栓を、プラークを含まない領域から作製する。利用可能な場合には、１サンプルあたり全部で１０個のプラークを試験する。１サンプルにつき１０個未満のプラークを形成する場合には、全てのプラークを分析する。１サンプルにつき１個のネガティブコントロール栓を試験する。さらなるコントロールとして、ＥｃＮおよびＡＴＣＣ１３７０６の純粋なブロス培養物を、２００〜３００ＲＰＭで振盪しながら、３７±２℃で濃縮媒体中で一晩増殖させる。１００μＬの定置培養物を０．２ｍｌのさらさらウォールチューブに添加し、エッペンドルフマスターサイクラープロサーモサイクラー中で９８℃で１０分間加熱して、ＰＣＲのための鋳型として使用するゲノム溶解物を調製する。
【０８３１】
それぞれのＰＣＲアッセイの鋳型として使用した全サンプルおよび制御は、以下の通りであった：
ａ．サンプル：計数可能な平板から採取した１０個までの再懸濁プラーク１μＬ
ｂ．ネガティブコントロール：計数可能なサンプル板から非プラーク領域から採取した１個のプラグ１μＬ
ｃ．ネガティブコントロール：大腸菌、ＡＴＣＣ  １３７０６、または当量株（プラークインジケーター株）の溶解静置培養物から１μＬ
ｄ．ポジティブコントロール：目的の細胞株の溶解した定置培養物から１μＬ
【０８３２】
ＰＣＲを用いてＥｃＮ特異的ファージ領域を増幅し、続いてゲル電気泳動により反応の終点でＰＣＲ増幅断片を検知する。ＥｃＮ特異的ファージの増幅に使用したプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ）を表１０４に示す。プライマーはＥｃＮファージを注意深い検査した後に選択し、ＥｃＮ特異的ファージ内の領域を増幅したが、プラーク検出に使用されるファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ１３７０６内のゲノムＤＮＡ内のいずれの領域にも結合しなかった。
【０８３３】
［表１０４］ＥｃＮ−ファージ特異的ＰＣＲプライマー
【表５３】
2020525012.tif 000138
【０８３４】
反応は、エッペンドルフマスターサイクラープロＰＣＲマシン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ）を使用して、０．２ｍＬ薄壁チューブで実行される。
【０８３５】
［表１０５］ＰＣＲマスターミックスの調製
【表５４】
2020525012.tif 000139
【０８３６】
ＰＣＲマスターミックス１９μＬを各０．２ｍＬのＰＣＲチューブに加えた後、１μＬのＰＣＲテンプレートを個々のチューブに加える。チューブに蓋をし、ＰＣＲマシンに設置し、表１０６のパラメータに従って反応サイクルを実行する。
【０８３７】
［表１０６］ＰＣＲ反応サイクル
【表５５】
2020525012.tif 000140
【０８３８】
それぞれの規格、サンプル、または制御反応の５μＬを、電解による分離とＳｙｎｇｅｎｅ  ＵＶトランジュミネータを使用した可視化のために、０．８％のアガロセゲルにロードする。増幅されたバンドのおおよその大きさはＥｃＮ特異的ファージの存在について３５０塩基対であるが、ネガティブコントロールはバンドを全く産生しない。
【０８３９】
実施例７０：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２毒性試験
ＧＬＰ毒性試験の投与期間は、ＢＩＤ投与（１日２回）の雄および雌ＣＤ−１マウスにおいて２８日間である。照射量は、１×１０９、１×１０１０、および１×１０１１  ＣＦＵのおよその範囲をカバーする。最高濃度は、実現可能な最大用量である。マウスを、試験品関連死亡率、臨床観察、体重、血液学、臨床化学、ならびに肉眼的および顕微鏡的病理について評価する。投与を中止した後、マウスから糞便サンプルを数日間採取し、ｑＰＣＲ分析を用いてＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２  ＤＮＡの存在を検定し、経時的なＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の低下を決定する。血液はまた、ｑＰＣＲを使用して、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２  ＤＮＡの存在について評価される。２８日間のマウスＧＬＰ毒性試験の設計を表１０７に概説する。
【０８４０】
［表１０７］２８日齢マウスのＧＬＰ毒性試験のデザイン
【表５６−１】
2020525012.tif 000141
【表５６−２】
2020525012.tif 000142
【表５６−３】
2020525012.tif 000143
【０８４１】
実施例７１：豚モデルにおける胃フェニルピルビン酸の評価
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の投与前および投与後の様々な時点での２匹のブタ（十二指腸カニューレを有していた）における胃フェニルピルビン酸のレベル。
【０８４２】
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の投与の２日前に、２匹のブタに、タンパク質シェイク／リンゴジュースを含む流動食を２日間与えた。０日目に、ブタを麻酔し、挿管し、約２５０ｍｌ（〜５０ｇ）のペプトン、３×１０ｅ１２細菌（３０ｍｌ中のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１）＋２４ｍｌの１Ｍ重炭酸塩面一（２ｇ）をＴ＝０で注入した。
【０８４３】
次に、１ｍｌの胃サンプルをＴ＝０、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分にかけた。サンプルをすぐに遠心分離し、上澄み液を凍結させ、沈殿を有する管を４℃に置いた。さらに、１ｍｌの血中サンプルを、Ｔ＝０、３０分、６０分、９０分、ａｍｄ１２０分で採取し、ヘパリン処理したチューブに収集し、スピンし、血漿収集し、そして凍結した。できれば、尿を集め、凍結した。結果を図２０に示し、ＬＡＡＤが胃で活性であることを示す。
【０８４４】
実施例７２：非ヒト霊長類における経口トランス−ケイ皮酸の尿中馬尿酸への変換効率
【０８４５】
次に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性および有効性の研究を、ヒトに対してより関連性のある代謝およびＧＩ生理機能を有する翻訳モデルで絶食した健康な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に拡張した。６匹のカニクイザル（２．５〜４ｋｇ）のコホートを使用した。ＰＫＵ表現型ではないが、健康なＮＨＰ生理は健康なヒトにおいて最初に行われる可能性が高い将来の臨床研究に情報を与えるのに有用である。
【０８４６】
本明細書中に記載される全てのＮＨＰ研究は、動物福祉法規則（連邦規則コード、第９号）、検討動物福祉局からの検討動物のヒトのケアおよび使用に関する公衆衛生サービスポリシー、および国立研究評議会からの検討動物のケアおよび使用に関するガイドの全ての適用可能なセクションに従って、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ、ＭＡ）で実施された。２〜５歳の６人の男性ＮＨＰ被験者（２．５〜４ｋｇ）を使用し、国際的な霊長類認定固形飼料（ＰＭＩ栄養、５０４８）で維持した。被験体を一晩（１６時間）絶食させた後、全ての研究を開始した。すべての研究について、投薬の直前に、動物を個々のケージに分け、尿の収集を補助するために、それぞれのケージの底部に角度のついたパンを挿入した。全ての経口投与のために、経口胃管を使用した。
【０８４７】
第１に、サルにおける経口投与されたＴＣＡの尿中ＨＡへの変換効率を、その後の実験で使用するための正規化因子の計算のために測定した。各ＮＨＰに、１２０ｍＭ重炭酸ナトリウムに溶解した肉由来のペプトン（５００ｇ／Ｌ；Ｓｉｇｍａ，７０１７４）１０ｍＬおよび１３Ｃ−水（１２．５ｍｇ／ｍＬ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｌａｂ、ＣＬＭ−７４９８−ＰＫ）１５ｍＬを経口投与し、続いて２ｍＬ水洗した。このようにして、ＳＹＮ−ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏＰＡＬ／Ｐｈｅ分解活性を、尿中ＨＡ回復から推測することができた。同位体標識１３Ｃ−ＴＣＡを経口投与し、ウリナリ１３Ｃ−ＨＡを測定した。経口投与された１３Ｃ−ＴＣＡの平均４１．９±１０．３％が、ウリナリ１３Ｃ−ＨＡとして回収された（図２１）。
【０８４８】
実施例７３：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のプロファイリングおよび有効性
非ヒト霊長類モデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性が評価された。
【０８４９】
本明細書中に記載される全ての研究において、動物を個々のケージに分離し、そして投薬の直前に尿の収集を補助するために、角度の付いた皿を各々のケージの底部に挿入した。全ての経口投与のために、経口胃管を使用した。
【０８５０】
ＮＨＰは、肉からのペプトン１０ｍＬ（５００ｇ／ｍＬ）または水を模擬として経口投与した。次に、ＮＨＰを１０ｍｌのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を製剤バッファー（以前はバイオ反応器で活性化し氷を融解）または製剤バッファー単独でモックとして注射した。最後に、ＮＨＰに５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて２ｍＬの水でフラッシュした。適用可能な場合、投薬レジメンの１時間後、動物に１２．５ｍＬの１３Ｃ−Ｐｈｅ（２０ｍｇ／ｍＬ）を静脈内注射した。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。適用可能な場合、動物に、模擬タンパク質投与後、３．５ｍＬのｄ５−Ｐｈｅ（２０ｍｇ／ｍＬ；ＣＤＮ同位体、Ｄ−１５８９）を与えた。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物を体積測定のためにメスシリンダーに注いだ。全てのサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃で保存した。
【０８５１】
曲線下面積（ＡＵＣ）を、ＲおよびＰＫＮＣＡ包装体（Ｄｅｎｎｙ  Ｗ、ＤＳ．、およびＢｕｃｋｅｒｉｄｇｅ  Ｃ．．．Ｓｉｍｐｌｅ、ａｕｔｏｍａｔｉｃ、ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｔｈｅ  ＰＫＮＣＡ  Ｒ包装体．Ｊ  Ｐｈａｒｍｋ  ＰｈａｒｍＤ  ４２．１、１１−１０７、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０９２８−０１５−９４３２−２（２０１５））を用いて直鎖状台形法で計算し、ＡＵＣを記述するモデルをｒｓｔａｎａｒｍ包装体で推定した。ｄ５−ＰｈｅについてのＡＵＣ０−ｌａｓｔは、直鎖状−ｕｐ／ログ−ｄｏｗｎ方法で計算した。標識したＰｈｅ  ＡＵＣの平均および信頼できる間隔および処置差を、処置（溶媒または細胞）に対する固定効果および動物当たりのランダム効果を有する階層的ベイズモデルを用いて計算した。
【０８５２】
バイオリアクターにおける菌株の成長と誘導のために、不滅ループを用いて５００ｍｌのＵｌｔｒａ−ｙｉｅｌｄ（登録商標）フラスク（Ｔｈｏｍｓｏｎ）において、５０ｍｌのＦＭ２媒体（補足表２）の中の細胞を接合した。細胞を、ＯＤ６００ｏｆ  〜５に達するまで、３５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させ、その時点で、３０ｍＬの培養物を使用して、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＦｌｏｗ  １１５バイオリアクター（〜０．０２の開始ＯＤ６００）中の４ＬのＦＭ２に接種した。発酵槽は撹拌、大気、および酸素補給を用いて６０％溶存酸素に制御し、水酸化アンモニウムを用いてｐＨ７に制御した。約１．５のＯＤ  ６００で、細胞を低酸素環境（１０％溶存酸素）の産生およびＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加により活性化した。ＯＤ６００ｏｆ  〜２０で、Ｌ−アラビノース（０．１５％最終濃度）を添加し、細胞をさらに１時間増殖させた。４，５００×Ｇで３０分間、４℃で遠心分離することによって細胞を回収し、製剤バッファーに再懸濁し、試験当日まで−８０℃で保存した。
【０８５３】
まず、絶食サルにＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与の有無にかかわらず５ｇのペプチドチャレンジを投与し、尿中ＨＡを測定した。全ての動物は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で処置した場合、細胞投与なしのベースラインレベルと比較して有意なＨＡ応答を示した（図２２Ａ、左側）。興味深いことに、有意なＨＡは、ペプチドチャレンジを与えなかった絶食サルにおいて回収され（図２２Ａ、右側）、霊長類胃腸管がＰｈｅのリザーバであり得ることを示唆する。先の両方の実験（図２２Ａ）において、サルにおける腸内再循環の過程を調べるために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を受けた被験体にも、ペプチドチャレンジの１時間後に１３Ｃ−Ｐｈｅを静脈内注射し、１３Ｃ−ＨＡを尿中で測定した（図２２Ｂ）。Ｎｏ  １３Ｃ−ＨＡはペプチドを投与されていない群で検出されたが、１３Ｃ−ＨＡはペプチドチャレンジを投与された群で検出され、腸内再循環が霊長類で起こり、タンパク質摂取と関連し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２によって消費され得るＰｈｅを提供することができることを実証した。
【０８５４】
最終検討では、サルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の血清Ｐｈｅ低下能を測定した。しかし、健康な被験体（非ＰＫＵ）では高濃度のタンパク質が血清フェニル量をわずかに上昇させることさえ必要とされるので、これは困難である（体重によると、サルで使用される５ｇのペプチドチャレンジは通常の成人男性では〜１００ｇの攻撃に等しい）。ベースラインＰｈｅレベルおよび機能的ＰＡＨ酵素による血清ポストペプチドチャレンジにおけるその低ダイナミックレスポンスは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２による血清Ｐｈｅ低下の検知を難読化する。これらの理由から、経口重水素化Ｐｈｅ（ｄ５−Ｐｈｅ）攻撃を行った。ｄ５−Ｐｈｅの投与平均（７０ｍｇ）は典型的な食事中に存在しうる平均と質平均し、〜３０ｇのタンパク質に含まれるＰｈｅの体重に等しく、典型的な食事中に存在しうる平均と質平均する（Ｌａｙｍａｎ、ＤＫＤｉｅｔａｒｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、成人のタンパク質の必要性についての新たな理解を反映すべきである。Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ（Ｌｏｎｄ）６、１２、ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３−７０７５−６−１２  （２００９））。予想通り、ベースラインｄ５−Ｐｈｅは尿および血清では検出できなかったが、その投与後に血中で検出することができた（図２２ＣおよびＤ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与後、尿における正規化ｄ  ５−ＨＡ回収は、投与されたｄ  ５−Ｐｈｅの大部分がｄ  ５−ＨＡに代謝されたことを実証した（図２２Ｃ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２−特異的代謝産物ｄ  ５−ＨＡおよびｄ  ５−ＴＣＡも血清で検出された（図２３ＡおよびＢ）最も重要なことは、血清ｄ  ５−Ｐｈｅの上昇がＳＹＮ−ＰＫＵ投与時に著しく鈍化し（図２２Ｂ）、血清ｄ  ５−ＰｈｅのＡＵＣの著しい有意な低下と同時に認められたことである（図２２Ｃ；５８％低下、９０％信頼水準２９．４〜５７．８％）。
【０８５５】
サルの胃腸管における高安静時Ｐｈｅ量はまた、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を受けたがペプチドチャレンジを受けなかった絶食動物において観察された有意なＨＡ回収から推測することができる。腸内再循環はサルにも存在することが示されたが、非ＰＫＵ背景での作業が難しく、これらの動物において容易にサンプル腸溶出液できないことはこの過程の機構的塩基類を理解するためにより多くの作業を行わなければならないことを示している。それにもかかわらず、基材のリザーバの維持は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の治療方法的有用性を増大させ、ＰＫＵ患者における食事による治療方法投与の時期に課される制約を少なくすることができる。
【０８５６】
実施例７４：非ヒト霊長類でのＰｈｅ発現におけるＬＡＡＤの評価
ＬＡＡＤ発現の有効性およびＰｈｅのＰＡＬ代謝に対する負の効果の決定が評価された。
【０８５７】
Ｔ＝０で、尿パンを空にし、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇ、および経口強制経口投与する細菌１０ｍＬを経口投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１（５×１０１１ＣＦＵ）経口強制経口投与する株をＮＨＰ１−３に投与した。ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１（５×１０１１ＣＦＵ）をＮＨＰ４‐６に投与した。両方の株を、製剤バッファー（バイオリアクター中で活性化して以前に増殖させ、氷上で解凍した）または模擬物として製剤バッファー単独に懸濁した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて５ｍＬの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。結果を図２４Ａおよび図２４Ｂに示すが、ＬＡＡＤの発現がＰｈｅのＰＡＬ代謝に対して負の効果を有さなかったことが確認される。
【０８５８】
実施例７５：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）による経口トレーサ試験
経口トレーサ試験を行って、活性をさらに特徴づけた。Ｔ＝０で、尿パンを空にし、ＮＨＰに、１１ｍＬ、４ｍＬのＤ５−フェニルアラニン（２０ｍｇ／ｍＬ）、および１０ｍＬの細菌（５．２×１０１１  ＣＦＵ  ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１）中の肉由来のペプトン５．５ｇの経口強制経口投与するのを投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて２ｍＬの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。図２５は、投与時の血中Ｐｈｅレベルの大きなスパイクを示す。
【０８５９】
経口トレーサ研究対照については、Ｔ＝０で、尿パンを空にし、ＮＨＰに、１１ｍＬ、４ｍＬのＤ５−フェニルアラニン（２０ｍｇ／ｍＬ）、および１０ｍＬの製剤バッファー中の肉由来のペプトン５．５ｇの経口強制経口投与するのを投与した。同時に、全てのＮＨＰに５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて２ｍＬの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。
【０８６０】
図２５の結果は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を用いた経口強制経口投与する投与がＰｈｅを効果的に代謝し、対照投与量において観察される血中Ｐｈｅレベルの急上昇を減少させることを示す。
【０８６１】
実施例７６：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の用量依存的応答
４件の研究により、タンパク質に富む食事の後のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の単回投与後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＰｈｅの用量依存的変換および血漿バイオマーカーｔ−桂皮酸（ＴＣＡ）および馬尿酸（ＨＡ）の産生の成功が確認された。
【０８６２】
試験１：Ｔ＝０で、尿パンを空にし、１０個のＮＨＰに、１１ｍｌの水中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５に、４ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（３．６×１０１１ＣＦＵ）の経口強制経口投与するのを投与した。ＮＨＰ６〜１０に、４ｍＬの製剤バッファー、２ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（１．８×１０１１ＣＦＵ）の経口強制経口投与するのを投与し、続いて６ｍＬの製剤バッファーの経口強制経口投与するのを投与した。同時に、ＮＨＰ  １〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて５ｍＬの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。
【０８６３】
試験２：１０個のＮＨＰに、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５を８ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（７．２×１０１１ＣＦＵ）菌株で強制飼養した。ＮＨＰ６〜１０に、１ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（９．０×１０１０ＣＦＵ）を強制経口投与し、続いて７ｍＬの製剤バッファーを投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０の全てに５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。
【０８６４】
試験３：１０個のＮＨＰに、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５を、製剤バッファー（２．３×１０１０ＣＦＵ）で希釈した８ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で強制飼養した。ＮＨＰ６〜１０を、製剤バッファー（４．５×１０１０ＣＦＵ）で希釈した８ｍｌの希釈ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で強制経口投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて５ｍＬの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。ＮＨＰの１〜１０人すべてが前夜絶食した。
【０８６５】
試験４：１０個のＮＨＰを、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５を、８ｍｌの希釈ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（３．３×１０ＯＢＣＦＵ）で強制経口投与した。ＮＨＰ６〜１０を、８ｍＬの希釈ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（１．１×１０ＯＢＣＦＵ）で強制経口投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与し、続いて５ｍＬの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。ＮＨＰの１〜１０人すべてが前夜絶食した。
【０８６６】
結果を図に示す。１１７Ａ、１１７Ｂ、１１７Ｃ、および１１７Ｄは、Ｐｈｅ代謝が９×１０ＯＢＣＦＵ以上の用量で明らかであったことを示す。さらに、Ｐｈｅの用量依存的変換およびバイオマーカーＴＣＡおよび馬尿酸の産生が観察された。
【０８６７】
実施例７７：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を有する非ヒト霊長類におけるカゼイン試験
Ｐｈｅ、ＴＣＡ、およびＨＡ消費を発現させるために、ペプトン（小ペプチドで構成される）をカゼイン（全タンパク質）で置換することの有効性が評価された。
【０８６８】
Ｔ＝０で、尿パンを空にし、ＮＨＰに２８ｍｌのカゼイン（４．５ｇ）／ビオカーボネート／Ｄ５−フェニルアラニン（２５ｍｇ；８ｍｇ／ｋｇ）の経口強制経口投与する物を投与した。ＮＨＰ１〜５にはさらに、３．５ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（５×１０１１ＣＦＵ）の経口強制経口投与するのを投与し、ＮＨＰ６〜１０には、経口強制経口投与するのを介して３．５ｍＬの製剤バッファーを投与した。同時に、ＮＨＰを２ｍＬの水でフラッシュして投与した。動物を静脈穿刺により０、０．５、１、２、４および６時間で採血した。投与６時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。結果を図に示す。１１８Ａ−１１８Ｃ。
【０８６９】
この研究からの試験結果は、本開示の遺伝子操作された細菌株が天然に消化されるＰｈｅを消費し得、そしてＤ５−Ｐｈｅ消費の際に制御において観察される血液Ｐｈｅにおけるスパイクを予防し得ることを実証する。
【０８７０】
実施例７８：Ｐｈｅ代謝は臨床的に重要である
非ヒト霊長類における開示された研究は、Ｐｈｅ代謝の関連性、およびＰＫＵ患者の食事に及ぼし得る深刻な影響を実証する。医学研究所は、フェニルアラニンが８０〜９０ｍｇ／ｇ全タンパク質であると推定される食事基準摂取量を確立した。ヒトに対するタンパク質の再推奨摂取量は５０ｇ（２０００カロリー食）である。無制限のアメリカの食事は、タンパク質全体（男性）約１００ｇと雌型（雌型）約７０ｇを提供する。従って、無制限の食餌は、約６〜９ｇのフェニルアラニンを提供する。
【０８７１】
ＰＫＵが４歳を超える患者に推奨されるフェニルアラニン消費は２００〜１１００ｍｇ（Ｖｏｃｋｌｅｙ、ｅｔ  ａｌ．２０１４、その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）であるか、または約＜１０ｇタンパク質／日である。上記の研究に基づいて、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の最高投与量は患者において１日当たり３回の５×１０１１用量に外挿することができる（ＮＨＰにおける尿中ＨＡの３５％回収を仮定する）。前記投与量は、ヒトにおける約２５ｇの食品タンパク質摂取（７０ｋｇのヒトでは２５ｍｇ／ｋｇ＝１．７ｇ）を支持するＰｈｅの毎日の代謝を予測する。したがって、Ｐｈｅの照射量は、ＰＫＵ患者が無制限の食事後に２４時間で受けるＰｈｅ摂取量の約２５％である（図２８）。これは、１日の推奨タンパク質摂取量の〜５０％に相当する（アメリカのＲＤＡ参照；制限のないアメリカの食事が全タンパク質の平均約１００ｇ（男性）と７０ｇ（雌型）を提供すると仮定）。ＰＫＵ患者については、これはタンパク質取り込みの２．５倍の増大をもたらし、その結果、ＰＫＵ患者の食事および生活様式が自由になる。
【０８７２】
いくつかの実施形態では本発明の細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は１日当たりの食品タンパク質摂取量を１０ｇ以上、約１０ｇ〜約３０ｇ、約１０ｇ〜約２５ｇ、約１０ｇ〜約２０ｇ、約１０ｇ〜約１５ｇに増大させることができる。いくつかの実施形態では本発明の細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は１日当たりの食品タンパク質摂取量を約１５ｇ、約２０ｇ、または約２５ｇに増大させることができる。
【０８７３】
いくつかの実施形態では本発明の遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約２．５倍に増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約２．０倍に増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者はいくつかの実施形態では約１．５倍だけ毎日のタンパク質摂取を増加させることができ、遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は約１．０倍だけ毎日のタンパク質摂取を増加させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取を約３倍、３．５倍、または４倍増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取を約５０％増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取を約５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜１００％増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、および９０％〜１００％増大させることができる。
【０８７４】
実施例７９：様々な濃度のジアミノピメリン酸における大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７のＤＡＰ栄養要求株であるＳＹＮ７６６の増殖の特性評価
細菌の増殖および分裂に必要なＤＡＰの最小量を決定するために、ＥｃＮのＤＡＰ栄養要求株であるＳＹＮ７６６の増殖が、ある範囲のＤＡＰ濃度でのインキュベーションによって特性評価された。
【０８７５】
全ての細菌培養を、≦−６５℃で保存したグリセロールストックから開始した。細菌を、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを補充したＬＢ培養液中で、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら、１４ｍＬの培養管中で一晩増殖させた。次いで、一晩培養物を、種々のＤＡＰ濃度を有する１００μＬのＬＢを含有する９６ウェルプレートのウェル中で１：１００に希釈した。
【０８７６】
全ての実験において、９６ウェルプレートをパラフィルムで密封し、Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）Ｎｅｏ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で分析した。プレートを振盪しながら３７℃で９６０分間インキュベートし、ＯＤ６００を１０分毎に測定した。
【０８７７】
データをＧｅｎ５（登録商標）ソフトウェアバージョン２．０６（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で収集し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌにエクスポートして平均および標準誤差を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理した。
【０８７８】
ＳＹＮ７６６（ＥｃＮのＤＡＰ栄養要求株）を分析して、成長に必要なＤＡＰの濃度を決定した；データを図３２に示す。５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度のＤＡＰを有する液体培地において、ＳＹＮ７６６は約１のＯＤ６００ｏｆで固定相に入る前に、３５０分間指数関数的に増殖した。２５μｇ／ｍＬのＤＡＰ濃度で、細胞は２００分間増殖し、ＯＤ６００ｏｆ  ０．１５に達した後、減少した。成長は６００分後に再開し、約０．８の最終ＯＤ６００ｏｆに達し、これはＤＡＰ濃度が少なくとも５０μｇ／ｍＬである場合よりも有意に少ない総細胞質量であった。６μｇ／ｍＬおよび１２μｇ／ｍＬのＤＡＰでは、ＳＹＮ７６６が約１８０分間指数関数的に増殖し、その後、実験の残部の間、減少するＯＯＢＢを示した。ＤＡＰ濃度が６μｇ／ｍＬ未満であった場合、ＳＹＮ７６６は実験の残部の間、減少するＯＯＢＢを示す前に、約１００分間成長を示した。
【０８７９】
実施例８０：ジアミノピメリン酸を含まないＬＢ増殖培地における大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の様々な株の増殖の特性評価
ＤＡＰを含まない培地中で種々の改変ＥｃＮ株を増殖させ、ＤＡＰ栄養要求株および原栄養生物の増殖特性を確認した。実施例７９に記載したものと同様の成長条件を使用した。フェニルアラニンを消費するように改変されたＥｃＮの種々の株を、ＤＡＰの非存在下および存在下で増殖するそれらの能力について分析した。結果を図３３に示す。非栄養要求性株、ＳＹＮ００１、ＳＹＮ‐ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ３２８２は、約１．２のＯＤ６００で固定相に入る前に約４００分間指数関数的に増殖した。同様の条件下で、ＤＡＰ栄養要求株、ＳＹＮ７６６、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は最初の９０分間、約０．０１０の接種ＯＤ６００内に留まり、その後、低下を示し始め、約０．００５のＯＤ６００で実験を終了した。これは、ｄａｐＡの欠失がＤＡＰの外部供給源の非存在下で成長の停止を生じることを示す。ＳＹＮ３２８２におけるＰｈｅ劣化に関与する遺伝子の存在は、野生型株と比較して成長に影響を及ぼさなかった。ＤＡＰ栄養要求性とＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１およびＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２におけるＰｈｅ劣化に関与する遺伝子との組合せは、ＤＡＰ栄養要求性単独で観察された成長障害に影響を及ぼさなかった（ＳＹＮ７６６）。これらの試験結果は、ＤＡＰ栄養要求性がこれらの操作された株の増殖および生存を調節する主要な要因であることを示す。
【０８８０】
実施例８１：１００μｇ／ｍＬジアミノピメリン酸を含むＬＢ増殖培地での大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の様々な株の増殖の特性評価
【０８８１】
ＥｃＮの種々の改変株を、実施例７９に記載されるものと同一の増殖条件を使用して、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを含む培地中で増殖させた。実施例８０の結果とは対照的に、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを補充したＬＢ中で増殖させた場合、試験したＥｃＮ株の全てが同等の増殖を示した（図３４参照）。非栄養要求性株ＳＹＮ００１、ＳＹＮ‐ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ３２８２ならびに栄養要求性株ＳＹＮ７６６、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１およびＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２は、約１．４のＯＤ６００で定常期に入る前に約４００分間指数関数的に増殖した。
【０８８２】
実施例８２：経口投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける操作された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の糞便排泄とクリアランス
【０８８３】
本試験の主な目的は、野生型ＥｃＮと꿦莼臣龁볯ꆼ볯蒠ꓩ膦뇦Ꞁ臣袂臣込臣龁臣낼뷯薽裥ꎧ듦Ꞁ苣ꮐ苣ꪠ臣麳뻤銎돦꺁该讅苣몱껥馁苣鎁臣ꞁ臣ꎁ臣芀鳦钠ꧧꮁ裥ꢔ臣龁볯莽볯ꪠ臣꾁胣躇铧讞볯뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯覼胣꒼볯낼ꃦ誤ꛨ花ꃦ袼볯림볯鞼볯隼볯膀볯袽뷯蚈꟨뮴胦銂苣벃菣馁苣袂臣ꮁ臩鶼귥趓뷤鞁臣ꪠ볯뎼볯꺼볯銼볯銼볯膀臣袂臣꒼볯낼ꃦ誤ꛨ花胦誁苣뎁볯袽뷯蚈꟨뮴胦꺁룤릖苣覜臣讂ꃦ袼볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼볯貁郥뺁苣龁胣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯꾁蟨誺胥鲣ꃦ뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯꺁믤蚐臣芁苣貁胣뢁諦릟鳥誸臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ藨薆껥ꦉ臣袂臣龔觧蒵맧궸臣隻臣꺾铧ꦉ迥讁苣颍鯩馁苣鎁臣銂迥붃臣馁苣꾂菣ꦃ菣閃苣讃苣벃菣邀胦ꮂ苣莃菣銂郥肂胣뎼볯꺼볯銼볯銼臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯ꢁ郥肸臣芁苣貁胣꒼볯낼ꃦ誤ꛨ花胦銂鳦鞁臣蒁臣蒁胣鎁臣龁苣ꮁ胣貛黥ꎼ볯鞼볯겼볯隼菣Ꚃ苣銂꟧辇臣膀蟩辇臣袂臣ꚁ볯ꚇ뷧꒾臣ꆄ뷤몂賥鞁臣袼臣貂臣貂뷯鶼볯覼胣鶁苣麁苣꺁뻧꾁胣蒴볯쎓醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲙猯灵ꎼ볯떼볯ꪠ볯銼볯邼볎볯込藧蒰蟩覼臣銼臣꺁럦袐迨ꪠ苣ꮐ苣颍鯥貵迥閊룤銂迥醁苣芀볯ꆼ볯蒠ꓩ膦뇦Ꞁ臣놽鿩銂ꓦ躨臣讂臣膂臣꒾볯ꮁ볯림볯銈볯ꮼ볯馼볯醼臣袂臣뎼볯꺼볯隼볯銂諦躸臣膀볯袽뷯蚈꟨뮴胦꺁뷥뾟苣鲤꣨馁苣龁苣ꮁ뻧銼臣뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯誁苣뎁볯림볯鎼볯颼볯銂諦躸臣膀볯ꆼ볯蒠ꓩ膦뇦Ꞁ臣袂臣낼뷯薽裥ꎧ듦Ꞁ臣ꆸ雦꺁뷤ꢔ諥鲞苣鲤꣨馁苣龁苣ꮁ뻧鎼臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯誁苣뎁볯림볯鎼볯颼볯銂諦躸臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†諦躸觥ꮁ胣麳뻤떂菣鞃菣銂胣뒼볯邼臣讀胣꺁菣Ꚃ苣讁苣躏鯩鞁胣랂菣ꊂ菣꺾蟩貸蟩뎹鷦릟ꓩꮁ苣ꎁ臣ꚇ郧鞁臣膀뻧薆臣閊룤閁苣讂듧貏ꃦꮁ臣蒁臣뢁諦蒚臣겼볯銯ꓥ뎹鷦誸臣膀苣鞁臣貂臣膀铧颭볯ꚼ볯꺁菣벃苣ꦃ苣뎃뿦ꚺ苣몱껥鞁臣芀곦蒁臣膀듧貏铧辇苣膀볯鶼볯芙雩꺁돧뾾迥蚛臣뒛뻥ꮁ諦躸臣龁胣螌껥閁苣龁駦릂臣麳뻤銂迥蚛臣讂臣膂臣膀鯥躏迥붃臣麳뻤떂菣鞃菣貁铧龔臣貂苣뺁臣膀臣貂臣貂臣麃苣릂苣辰臣ꪁꧧ꺁菣骃菣袃菣莃菣鲃菣꾂苣궸臣颍鯩鞁臣芀苣뎃菣ꮃ苣銼뷯貽臣ꢂ菣骃菣覃菣閃菣ꖃ菣隃臣뮧臣龁胣超鳩꺁볯邼裥ꖻ蛥ꮁ苣뎃菣ꮃ臣ꎔ铧閁苣ꪁ臣ꎁ臣뒠郥膀臣꺁駦릂苣蚈黦讁苣꒙ꓥ鞁臣芀諦躸뻥钼胣隼胣颼胣銼볯膀볯邼胣誁苣뎁볯颼駦鎖鯧ꮁ胣蒐菣Ꚃ苣讁苣麳뻤骃菣莃菣銂鯥躏臣膀꟧辇臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†꟧辇臣龁돧뾾菣것菣袃臣ꚇ郧꺁臣膂臣膀볯趽뷯꺁볯ꊼ볯銂臣貂臣貂臣떂菣鞃菣ꮁ럦ꂊ臣膀뷤蒁跦ꚁ菣것菣袃菣릂菣ꮃ볯ꮼ뷯趽뷯貽뷯膀볯钼볯閼볯醼裢醼볯邼볯銂触開闦銲賥ꮁ뷤ꢔ臣龁胣ꆬ臣膀苣뎃菣ꮃ苣肜ꯩ龀뫥ꞁ볯邼胣銼볯銧雩鲃菣蚃菣꾂苣鞁臣芀볯邼볎볯꺁뻥辇룥袇뛦銂뷤ꢔ臣ꚁ胣떂菣鞃菣銂볯膡臣辂臣ꎁ臣醼볯醼볯ꮁ룥袇臣龁胣鎁苣覂臣貸蟩늶볯邼볎볯誁苣뎁鳦貸蟩뾾菣ꊃ苣趃菣袃苣膀臩螈臣뢁諦겼볯ꮂ菣蚃菣鞃菣벃菣誸臣鞃菣벃菣鞁臣芀룥袇觧銂胣鞊铧ꦉ돨뺁臣꾁볯ꆼ볯袼臩螈臣뒠郥膀볯림볯銈볯ꮼ볯馼볯醼볯릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃볯邼볯캐螽볯趽볯鮼볯림볯鎼볯颼볯鶼苣궃菣ꂃ菣Ꞃ菣뎂菣ꮃ볯邼볎뷯込뷯겼볯뎼볯꺼볯隼볯込볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼볯꾂菣ꦃ菣閃苣讃苣벃菣鎼볯캐螽볯趽볯誁苣뎁볯ꆼ볯醼볯邼볎뷯込뷯겼볯銂ꏨ薅臣龁볯ꊼ꿥ꦤ룤ꮁ菣것菣袃臣龁胣鞃菣벃菣銂볯鞼蓢ꞁ룤ꦙ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣ꆬ臣ꖗ臣뎂菣讃菣銂触開臣ꮂ苣뎃菣鞁臣芀菣것菣袃苣鎼볯莄뇂볯莄臣肸駦ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣뎂菣讃菣銂胣醰臣辁臣节볯邼胥ꞁ臣讂臣銼볯邼胥ꖻ룤꺁胥薀臣뎂菣讃菣銂郥肂룥袇뛦궸臣讉该ꞁ꣨낕臣龁胣肜뗧蒚臣ꎼ볯떼闦꾁胣ꎼ볯떼볯麳뻤鮃菣뢂菣벃菣趽볯꺁꣨鞮臣龁苣ꮁ苣Ꚃ菣袃臣貂臣뎂菣讃菣낕苣鞹臣龁룥袇뿤낕苣ꢔ臣龁胩鞮臣袂臣ꚁ뇦骮臣龁胣ꎼ볯떼볯趽뷯麳뻤꺁껧몇臣龁苣ꮁ胣鎁臣낕胥銂돧뾾菣것菣袃臣ꪳ蟩ꞁ觥ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꆬ臣膀臣貂苣꺁郥ꪳ臩鶼귥ꪦ臣钯볨鞁臣膀铦覤볯莽볯ꪠ臣誁臣讂ꫧ뚄ꓥ낕볯趓뷤꺁諥鲞볯节臣芁苣낁볯銂ꧨ鎨臣龁胣蒐駦릂臣銎돦閁苣龁郥ꪠ臣辇苣膀鳦鶈臣ꞅ냥辇臣誁臣讂臣꺁ꃦ꺁볯ꚼ볯꺁闦ꞁ觥ꎁ臣芀臣꺁ꛨ베賥銂铧蒁臣膀ꃧ뚩뻧薆臣銼臣꺁ꃦ銂胣銎돦誁苣뎁苣ꪃ苣ꦃ菣릂该讅臣ꒁ臣ꚁ鯧ꖎ髧ꮁ꿦莼臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†뗧鲞苣뎛볯閼볯鲀볯閼볯ꮁꓧ馁胣麃苣릂臣蒁臣貂臣ꒁ臣ꚁ苣膀諦躸觥袼볯鶼볯芙雩覼臣麳뻤떂菣鞃菣ꮁ臣蒁臣뢁諦릟鳥誸臣ꎼ볯떼臣鲤蟥閁苣骁胣閊룤貾臣鲤蟥閁苣龁볯ꚼ볯꾁볯莽볯놔鷦ꪠ臣략鯥鞁胣麃苣꾂菣鎃苣벃菣讁苣꺁菨꾙諦鎡裦랕臣략鯥鞁臣蒁臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁胣鎼鿥馁臣ꚁ臣誁臣ꚁ胣내迨꺁臣릁臣꺁迨ꪠ臣閊룤貾볯芙雩ꞁ돧뾾臣肜ꯩ辇臣钁臣膀뗧芙髧ꮁ鷧龮臣鮸냥鞁臣芀볯钼駦鎖臣ꞁ臣膀돧뾾룤꺁듧貏闦꾁胣ꢅ臣꺁ꃦꮁ臣蒁臣鎼胣钼ꇦ躽룤鞁臣芀볯邼駦鎖臣ꞁ臣膀뻧醼臣袂臣鎼臣覂臣醰臣辁臣节볯릌臣麃苣릂胣ꪁ苣뎁臣꒾볯꺁臣릁臣꺁菣Ꚃ苣꾁胣麳뻤궸臣鲤蟥꾏菨ꪁ볯莽볯놔鷦내迨銂郥뺁臣讁臣龁胣钼볯芙雩뺁臣ꮁ胣ꢅ臣꺁볯莽볯놔鷦내迨貁돧뾾臣覂駩뮎臣貂臣芀臣릁臣꺁듧貏臣ꒁ臣ꚁ郥颧臣袶ꓥ龀뫥貁ꛨ龯臣貂臣꺁臣膀铦覤볯莽볯ꪠ臣誁臣讂軦蒳臣開藦ꮁ飦覂臣ꪁ럥꾁臣辁胣꒼볯낼ꃦ誤ꛨ花胦袼볯림볯鞼볯隼胣醼鿥覼胣낼뷯薽裥ꎧ듦Ꞁ볯뎼볯꺼볯銼볯銼胣銼鿥覼胣誁苣뎁臣貂苣꺁뗧袐臣袼볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼胣鎼鿥覼臣蒁臣貂苣膀蟩龔黥뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯ꪠ臣钯볨鞁臣膀菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ臣誁臣ꚁ藨꺁볨膀駦鎖臣龁臣ꪠ臣龔귥ꮁ鳦辄臣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞胣ꎼ볯鞼볯겼볯隼菣Ꚃ苣꺁돧뾾臣覂臣내迨꺁뛦놤臣膀볯꺁ꃦ誤ꛨ花胦誁苣뎁볯뺁臣꾁볯袽뷯蚈꟨뮴胦ꮁ苣ꎁ臣覤賥鞁臣讁臣龁胣貵迥閊룤閁苣龁볯莽볯놔鷦내迨ꪠ臣馁臣ꚁ胣몁볤邭黥ꮁ臣讁苣覂臣膀볯颼駦鎖믤薆臣麃苣릂臣麳뻤讁苣銎駩閁苣膀볯莽볯誁苣뎁臣꺁ꫨ躰뷤꾁闩龜雩龔귥ꞁ臣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ蚔臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤颼볯骼臥랺臣麃苣릂臣誁臣讂ꓥ뢅迨꺼뷯鎽뷯貽뷯醼볯醼볯꺁듦龔觧뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯誁苣뎁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣覽뷯₎隽뷯隽뷯ꞁ臣龔귥ઘ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雨蚐귥蒚ꃧ뚩臣꺛髧꾁胣貛볯閼볯ꊼ볯込볯麃苣릂臣誁臣ꚁ胣貐룤꺁苣ꊂ菣躃菣ꆃ菣벃菣袼볯ꆼ볯覼ꃦ誤ꛨ花胦誁苣뎁菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃볯낼뷯薽볯ꎊ賥膦듧銂郥覜臣讂볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣ꎻ郧ꪠ臣芁苣몁볤邭鏦鲽볯莽볯颪냥鎽볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣钯볨鞁臣膀苣랂苣ꪃ菣ꊂ뇥莽뷯貽뷯₉꺼뷯鎽뷯貽뷯袼볯莽볯覼蟩龔黥ꪠ볯림볯銈볯ꮼ볯馼볯醼臣龔귥膀菨뢅껧袼볯ꦼ볯蚈藩뺁臣꾁껥ꢅ苣ꪃ苣ꦃ菣릂臣ꞁ臣芙雩꺁럥銂ꧨꆾ臣讂臣ꢁ臣芁臣龁胣뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯뺁臣꾁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣馼韃볯邼볯ꎼ볯떼臣颍鯥貵迥閊룤貾臣貛黥ꎼ볯鞼볯겼볯隼菣Ꚃ苣꺁ꓨ낕볯ꦼ苣낂菣뎃菣ꮁ臣蒁臣膀볯颼駦鎖臣辂臣讂苣궃菣벃뷥邈跥趽볯ꎼ볯떼볯銂闦袁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀볯ꦼ裥莸胣뢼胩誁苣뎁苣ꪃ苣ꦃ菣릂该讅苣겸껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣钠ꧧꮁ裥ꢔ臣龁볯莽볯ꪠ臣膀蟩龔黥뎂菣袃菣벃菣ꞁ臣讂볯림볯銈볯ꮼ볯馼볯醼胣誁苣뎁볯袽뷯蚈꟨뮴胦誁苣뎁볯ꆼ볯蒠ꓩ膦뇦Ꞁ苣뎂菣覃臣讂苣蚁臣몁볤邭鏦鲽臣貂臣ꪠ臣芁苣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯銂郥鎂臣蒁臣芀볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣ꢇ뫥馀ꏨꪠ볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣ꎻ郧ꞁ臣讂臣膀铧ꦉ귥蒚뗧钹臣覂臣뢁諦鞃菣벃菣ꎂ菣낂苣꾏菨ꮁ臣讂苣궃菣ꂃ菣Ꞃ菣뎂菣ꮃ胨Ꞁ苣뮂菣袃苣ꮐ苣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 貛黥ꎼ볯鞼볯겼볯隼菣Ꚃ苣꺁蟩辇苣겸껥鞁胣趇蟩ꮁ苣ꎁ臣醼볯ꚇ뷧꒾볯鶁苣麁苣躽볯鎼볯誁苣뎁苣뎃菣궃菣ꮃ뻧袼뷯鶼볯覼臣ꆄ뷤몂賥鞁臣芀苣뎃菣궃菣ꮃ뻧袼볯鶼볯覼臣麃苣릂苣膀苧뢅苣릂ꫧ꾁胣骶臣ꚁꃩꢃ蓨벇臣袂苣ꂱ껦鞁臣芀菨膀냥뢅볯뎼볯覼胣늛藨膀臣袂臣邵藨銂돦辄럦辁裥꒙臣龁胣뎼볯銂臣覂臣鎼臣꺁귧鞁臣랕臣꺁苣꾂苣ꞃ菣袼룤ꢃ胣궸雩膀臣袂臣许菩覼臣蚈觥鞁臣芀臣貂臣貂臣鎇駥ꢃ苣랰蛥ꪃ菣뢅럧鶡铧蚐ꏩꦡ냦袼볯ꊼ볯覼볯躼볯趽볯ꞁ菣ꦃ菣랂菣鞁胣膵蟥늶苣ꖈ胣꺁볯躼볯趽볯꺁苣莃菣뎃菣ꮃ菣膃菣벃菣ꮁ鯩膂臣芀볯ꊼ볯込뗦몇뛦떂菣鞃菣銂꟧辇臣膀臩麊鿥난룤ꞁ臣ꎀ뛧貸蟩궒꣧ꮁ苣ꎁ臣ꂊ럥馁苣뺁臣랰룤ꞁ뛧膌臣ꚁ胣鶁苣麁苣꺁藨몌裥꺁뗦몇뛦궸臣龔귥ꎼ볯떼苣몱껥鞁臣芀볯邼볯趽볯趇苧뢅菣袃菣Ꚃ菣銂郥肂觥讞臣꾁胣ꚇ뷧꒾臣開觧ꮁ볯쎙醼볯馼볯ꚼ볯꺁볯림볯銈볯ꮼ볯馼볯醼볯隼뻧覼臣龁臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯袼볯꒾볯銂뗧ꎏ諦躸臣龁胣閊룤貾볯躼볯閼胣邼볯閼胣醼胣钼胣銼볯膀臣袂臣钼볯芙雩ꞁ胣뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯銈臣袂臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯銈蟥꺽뻧銂뇥몮臣膀뗧钹苣뺯藧꒾臣貐臣颧볥ꞁ蟥蚐臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꚼ볯込뷯겼苣袨껧馁苣龁苣ꮁ胣鶁苣麁苣꺁꟧辇臣龁뗦몇뛦떂菣鞃菣醼볯캐겼苣膀믦貏볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣궸臣낼볯뎼룤ꞁ껥붖臣龁볯邼胥꺾蟩貸蟩뮳裥ꞁ뷤ꢔ臣龁胣貸蟩鞁臣蒁臣蒁뗦몇뛦誁苣뎁룥袇뛦꺁볯邼볎볯銂胣鞊铧ꦉ돨뺁臣꾁볯ꆼ볯銂럦ꂊ臣龁볯ꊼ苣겂菣뎹鷦誸臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣讂볯뎼볯꺼裢낼볯떼볯邼볯鶼苣袃菣鞃菣麃苣랂菣鎼볯邼볎뷯込뷯겼볯뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯ₑ鶼苣궃菣ꂃ菣Ꞃ菣뎂菣ꮃ볯邼볎뷯込뷯겼臣袂臣꒼볯낼볯邼볯캐螽볯趽볯覼胣鞃菣벃菣銂볯鞼蓢ꞁ룤ꦙ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣ꆬ臣ꖗ臣뎂菣讃菣銂触開臣ꮂ苣뎃菣鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯떼裥骮臣龁苣ꮁ胣袨闦꾁胣醰臣辁臣节볯邼胥ꞁ臣讂臣銼볯邼胥ꖻ룤꺁胥薀臣뎂菣讃菣銂郥覜臣讂룥袇뛦궸臣뎂菣讃菣銂触開臣袨闦馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣躏鯩鞁臣芀鳦躽룥袇볯ꪜ룥袇뗦몇뛦꺁맥뾝鿥誤볯ꞁ臣뾁苣궃菣벃臣뎦꿥閁苣龁ꃥ袐胣醼볯ꪜ뫦ꞁ臣ꎁ臣节胣馁臣ꚁ臣뎂菣讃菣銂꣨낕臣膀苣뎂苣隌臣龁胣肜뗧蒚臣ꎼ볯떼苣Ꚃ菣袃臣膀苣Ꚃ菣袃臣貂臣뎂菣讃菣꺁闦誁苣뎁迥蚛臣貂臣膵蟥늶臣鎽ꧧ꺁룤릖苣鞹臣龁룥袇뿤낕苣뾽铧馁苣蚀꣨鞮臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 뎛볯隼볯鲀볯꺁ꧨ鎨뗧鲞苣芏藧芀듧貏苣躸臣ꪁ臣ꎁ臣麃苣릂臣膵蟥늶苣뎃菣ꮃ胣뢁諦릟鳥誸臣ꎼ볯떼臣鲤蟥閁苣骁胣閊룤貾臣膵蟥늶臣誁臣ꚁꓦ몇臣貂臣ꎼ볯떼臣ꖼ뷯꺼铧ꖝꃦꮁ뗨ꂛ臣膀뻥龔觧ꊏ臣覂臣貃駦肊ꇨ邈闩ꮁ뗨ꂛ臣ꪁ臣鎁臣銂껥벨臣龁胣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯뺁臣꾁볯림볯銈볯ꮼ볯馼볯醼볯뚈뻥覼臣蒁臣貂臣銂諦躸臣龁菣Ꚃ苣꺁菨膀룤ꢃ냥뢅胣궸냥뢅胣许菩辰藨膀鯧뢅臣袂臣邵藨讁苣鞾苣貂臣膵蟥늶臣誁臣ꚁ胣貵駦蒚臣龔귥螎臣袂臣袶賥ꆮ裥莸臣膀鳦鶈臣銼볯芙雩ꮁ苣龁臣ꚁ鷩뢸臣麡볤鞁臣蒁臣芀諦躸볯颼駦鎖뻥ꮁ臣骁苣꺁듧貏臣ꒁ臣ꚁ苣ꎼ볯떼臣讦蟥閁苣骁胣鎁臣芙苧뺁臣ꮁ껥ꢅ臣꾂菣ꊂ菣뎃苣銂ꓧ鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 邵ꯨꢁ臣ꚁ胣뎼볯꺼胢낼볯떼胢銼볯邼볯꺁볯ꆼ볯蒠ꓩ膦뇦Ꞁ臣袂臣込臣龁臣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣蚈꟨뮴胦꾁胣뎼볯꺼胢낼볯떼볯邼볯뎂菣袃菣벃菣ꪠ臣钯볨鞁臣膀볯閼볯ꊼ볯込볯麃苣릂臣莃藨ꆮ臣覂臣龔귥膀뛦隌껧蚈룥뺁臣꾁苣ꪃ苣ꦃ菣릂껥邈臣ꞁ臣龜雩銂ꓥ隌臣鮁臣讁臣龁胣钼볯芙雩ꖻ蛥ꮁ뗧ꎏ諦躸臣貂臣馁臣ꚁ臣ꖼ뷯꺼铧ꖝꃦ꺁껥ꢅ臣꾂菣ꊂ菣뎃苣꾁胣ꖼ뷯꺼臣袂臣鶁臣뺴铧ꦉ臣랕鳦鎖铧颭臣趁臣讁臣龁臣ꢁ苣몤铥馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯钼볯邃苣ꪂ菣ꊂ苣뾂菣ꞁꋥ隮臣龁ꓥ뢅迨꺁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼ꃦꮁ臣醁苣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣꺁菣ꦃ菣릂裢놂苣꺚藩誁苣뎁菣Ꞃ菣ꮃ菣ꮃ菣뎃藩뢁臣蚈꟨ણ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꒂ苣ꪃ苣꾂苣벃룤ꞁꋥ隮臣鮁듦Ꞁ賥閁臣龁铦覤苣랂苣ꪃ菣ꊂ뇥Ꞥ藨貏볯覽뷯鎽뷯薽†볯馼볯鞼볯ꖼ뷯꺼볯뎼볯꺼胢낼볯떼胢銼볯邼볯ꪠ臣誁臣讂菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃볯낼뷯薽볯꺁믤鶬铧ꦉ菣ꦃ菣릂胢랂菣ꆃ菣袃볯뒼볯ꆼ볯誁苣뎁菣Ꞃ菣ꮃ菣ꮃ菣뎃藩袼볯낼볯뢁臣ꊻ迦銂胣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣ꊂ菣ꊃ菣ꊂ菣ꊂ菣벂볯낼볯겼볯誁苣뎁볯邀苣龃菣뢅菣ꊂ菣誃菣벂볯겼볯ꆼ볯覼듦Ꞁ臣몰뫥ꢁ臣ꚁ뇦骮臣龁胣閁苣ꪁ苣꺛髧ꮁ臣膀菣ꒂ苣ꪃ苣꾂苣벃듦Ꞁ賥뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯貁볯袽뷯ꎊ賥꺁鿥邝臣鞁臣낼뷯薽郥覜菣鞃菣覃臣龁臣ꢅ苣뎃菣꾂돨꺁ꓨ袐럦袐觧銂뷤ꢔ뿨ꂊ臣讁臣蚁臣銂뇦骮臣讂臣ꢁ臣ꮐ臣貂臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 閃苣讃菣놂菣뎃냥螗볯낼볯떼볯꺁닦芙雦閳蟥꺽苣辄鯥鞁臣낼뷯薽裥ꎧꃦꞁ臣讂볯莽볯놔鷦ꪠ볯림볯邀볯ꮼ볯邀볯邼볯銼苣膀볯림볯邀볯ꮼ볯邀볯邼볯銼臣릂苣벃菣ꊂ菣鞃臣ꢔ臣覂苣讂臣ꢁ苣辄鯥鞁臣ꖷ꣧ꮁ뻥蒁胣邃苣ꪂ菣ꊂ苣뾂菣궸臣鞢껦閁臣膀듦Ꞁ賥鞁臣芀볯겼苣놂菣ꮃ臣龮雦閁苣龁臣꺁雦閳臣膀鿥誤觧꺁鋦貋胩ꚺ臣뚈뻥ꮁ苣ꎁ臣钁裦閁苣龁뷤뚺귥뢅듧袼볯꾼볯낒ꋥ꺁铧龔苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣躽볯꾼臣膀볯ꆼ볯誁苣뎁ꯩꪦ鋥Ꞁ菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃菣ꦃ菣릂菣벃苣벃胣낼뷯薽볯銂苣벃菣馁苣몁볤邭臣鎟觨鎽臣蒵臣벾臣貂臣뎂菣벃臣몙迧銂듦Ꞁ賥鞁臣芀뷤꒼볯뢁臣趙룤貾胣ꒂ苣鞃菣钃菣캫銈볯銈볯銈菣ꪂ苣ꦃ苣袃菣ꦃ菣랂菣袼볯낼볯Ꞽ볯ₛ醼뷯궼볯銂럦ꂊ臣ꚁ볯ꆼ볯꺁뿨ꂊ苣钃菣꺁駧뺏苣뮴胦隌臣膀볯銈苣ꦃ菣躃菣릂볯肜뗧莿뫥邼볯醼볯薼볯銂럦ꂊ臣ꚁ볯ꆼ볯꒼臣몙迧銂듦Ꞁ賥鞁臣芀ꯩ蚯뫥邈闩貾胣내菨銂鯩궸臣鮁胣낂菣뮂菣벃菣馃菣릂臣붣觥邃菣閃苣벃룤ꚉ볯閼蓢ꞁ蟥邵臣鮁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 醼韃볯邼볯뮴胦隌듧麃苣膀볯邼뷯궼†볯袽뷯膀볯袽뷯銈볯銽뷯膀볯袽뷯銈볯貽뷯銈볯貽뷯膀볯袽뷯銈볯膽뷯膀볯袽뷯銈볯貽뷯膀臣龁臣Ꞽ뷯馽裢낼뷯薽菣鞃菣覃苣ꮐ苣ꊂ菣뮂苣릟鳥궸臣膀臣龁臣覂胣袃菣鞃菣뎃胣뺁臣꾁藥ꮂ苣ꒂ菣鮴뷤놔鷦꺁볯邼뷯込볯꺁菣鞃菣뎃룤ꞁ胣鎼볯莄臣붥냦蒚臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣誸뻦뾁뛦떂菣鞃菣銂볯邼裥誁苣뎁볯邼裥ꞁ駩뮎臣膀볯袽뷯膀볯ꎼ볯膀臣袂臣낼볯꺁뿦ꚺ苣겼볯₣궼볯込볯뎼臣袂臣ꚁ뇦骮臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鯥鎼볯ꆼ臣袂臣ꊼ臣ꚩ꣩邵黦銂迥ꞅ볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣誁臣讂볯ꆼ볯誁苣뎁볯ꆼ볯꒼듦Ꞁ臣ꆸ雦꾁臩ꊛ볯袽뷯銂鿥邝臣鞁臣뾽铧鞁臣뒠郥ꮁ뷯躽†뷯覽뷯銽뷯ꞁꓦ몇臣貂뻥讂臣膀迦鮾臣貂臣몟鷦貁볯袽뷯ꮐ鳦骃菣膃菣꺁뷥邈臣ꪁ臣龁ꃥ袐臣꺁臣낼볯겼듦Ꞁ臣뎦꿥閁苣膀볯ꆼ볯꒼臣낼뷯薽臣隻臣鮾뗧邺苣誂苣誁鯩ꊂ菣躃藩ꮁ苣꾂苣릂臣讂臣ꢁ臣袂苣꾉ꗥꞁ臣誂뻥讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁胣ꪜ뛦隌苣벂苣뎃苣뎃菣꾂돨銂鿥邝臣鞁臣뾽铧鞁臣뒠郥膀볯ꆼ볯뺁臣꾁볯ꆼ볯꒼듦Ꞁ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣螃菣뾂臣邃苣ꪂ菣ꊂ苣뾂菣궸臣鞢껦閁臣龁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣낼볯겼臣袂臣겼볯ꆼ볯₤낼뷯蚈꟨貵럨꺁룤릖臣鞢껦誁苣뎁듦Ꞁ賥貁迥붃臣芁苣鎁臣銂껥벨臣膀볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣袂苣颫臣鎽ꧧꞁ듦Ꞁ賥閁苣龁菣ꦃ觧겖觧꺁铧龔臣鎾臣鎁臣銂ꓧ蚔臣讂胣閁苣ꮁ胣몓매開觧莃藨ꆮ臣誁臣讂귦뢸臣袶賥ꚇ郧꺁雩ꮁ臩ꊛ볯袽뷯ꮁ諥袁臣ꎔ铧閁苣讂苣蚁볯袽뷯ꮐ鳦骃菣膃菣꺁ꓨ袐럦袐觧꾁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣낼볯겼裦蚈臣袂臣ꚁ믤鶬臣貂苣貁胣겼볯ꆼ볯邈裥ꮁ苣ꎁ臣꾁믤鶬臣貂臣蒁臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤颼볯骼臥랺臣麝菣袃鳩랕ꇩꮁ臣醁苣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯꺁铧辇뿥钭ꧨ鎨戼㹲 ꖁ뫥ꪁ鯩ꮂ菣꾂苣뚂菣ꮁ臣醁苣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯꺁菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃믤鶬듦Ꞁ臣膀볯躼볯쎓醼볯馼胣鞼볯銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯㲑猯灵뎂菣讃菣ꊽ裦颍뷤袼볯ꚼ볯覼臣蒯鯥꺁諦躸蟩것菣ꮃ臣꺁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣閊룤貾臣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣袼볯袽뷯覼臣것菣ꮃ臣袂臣股볦誁苣뎁냥ꮁ臣醁苣鶁臣ꎻ골ꎔ觧銂룦骮臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ觧뒾믤醁苣貂臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 겜ꃧ뚩臣꾁胣ꖁ뫥ꪁ鯩ꮂ菣꾂苣뚂菣袼볯躼볯鲀볯躼볯讽뷯覼苣肸駦뚵ꏩ閁臣龁胣閊룤趉臣膀ꇨ뾼苣뎃菣ꮃ볯颃菣ꪃ菣覼苣ꢔ臣ꚁ胣麝꣦颭볯袽뷯誁苣뎁菣Ꚃ菣许뗦ꎻ골ꎔ觧꺁菣벃苣ꦃ苣뎃苣몢ꯧ鞁臣芀该ꦉ臣膀뗧ꎏ볥뚈뗧ꎏ諦躸臣讂臣ꢁ臣袂苣膀볯醼뷯겼臣骃菣袃菣袼볯躼볯螽볯膀볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼볯鎼볯鎼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰馼⼼畳㹰胣鞼볯銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯㲑猯灵ꎼ볯떼볯ꞅ냥辇臣蒯鯥꺁藧蒰蟩覼胣誁苣뎁볯趽볯꺁볯躼볯隼볯趇苧뢅菣袃菣Ꚃ菣꺁胩骶뫦늶苣閊룤鞁臣芀諦躸볯躼볯膀볯膀볯膀볯誁苣뎁볯芙雩貾臣股볦銂軦随臣膀裥邞臣ꞁ蟥邵臣龁胣钠ꧧ꒾臣鎖臣躏鯩鞁臣股볦떂菣鞃菣銂胣늶뷤꾂菣麃菣낂菣閃苣벃裢뾂菣螃菣麃苣릂菣꾂菣궃菣袃菣벃볯겼볯銈볯뎼볯궼볯覼苣ꢔ臣ꚁ胣閃苣讃菣膀菣Ꞃ菣ꮃ菣ꮃ菣뎃藩袼볯낼볯膀菣ꦃ菣릂裢놂苣꺚藩袼볯ꎼ볯覼胣誁苣뎁菣莃菣钃菣벃菣벃菣袼볯ꆼ볯꺁귥ꢜ臣ꒁ臣ꚁ裥邞臣龁胣閊룤貾볯芙雩ꮁ苣龁臣ꚁ냥銂迥蚛臣膀뷤趩苣겸껥鞁胣閼뷯겼臣ꊂ菣뎂菣袃苣趇뗧鞁胣겼볯銈볯뎼볯궼볯蚈黦뺁臣鶿귥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꖁ뫥ꪁ苣ꮃ臣꺁菣鞃菣뎃臣閊룤꾁胣閊룤貾듧醼駦鎖臣钃菣꾂臣钁臣讂ꇨ뾼菣Ꞃ菣ꮃ뿦ꚺ臣ꖀ룤螘苣节臣覂臣龁볯뎛볯隼볯芏藧覼胣閼볯閼뷯꺁菣鞃菣뎃苣閊룤鞁臣ꖁ뫥ꪁ苣ꮃ臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯銂뗧ꎏ諦躸臣讂臣膀臣꺁볯袽뷯릂菣ꒂ苣貁裩隌臣龁胣낼뷯薽臣ꢅ꿧늛볯股볦莿뫥ꮁ껥ꢅ臣ꢔ蟩钯뻤馁苣辂臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣肸裨ꮁ볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼諦躸뻧ꞁ臣릉臣馼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯㲐猯灵ꎼ볯떼믤誸臣ꢔ蟩ꞁ뷤讁臣龁胣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯閊룤貾臣낼뷯薽臣躽룤ꢁ郥芙臣膀볯ꎼ볯꺁ꇨ뾼뿦ꚺ볯낼뷯薽臣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣ꊂ菣ꊃ菣ꊂ菣ꊂ菣벂믤鶬臣뒛軦ꎔ觧膀鯥銼볯ꎼ迥ꞅ볯誁苣뎁볯ꆼ볯뒼볯ꆼ臣ꎻ골ꎔ觧膀鯥銼볯ꊼ臣袂臣뎛볯颼迥ꞅ볯꾁铧辇뻤颭髧ꮁꋥꂊ臣龁볯鞁臣鞁胣肜ꯩꢔ蟩袼뷤ꢔ蟩꾁룦骮臣貂臣讁臣龁볯ꞁ蟥꺽臣貂臣떂菣ꮁ臣蒁臣膀볯낼볯낼뷯薽臣겼裢ꊂ菣躃藩螃苣龃菣벃苣ꎻ골꺁鯧ꖎ铧ꦉ볯꺁ꓦ몇迥붃臣股볦莿뫥꾁臣讁臣龁胣겦냥뢅臣뾰룤ꮁ胦龀臣銎돦閁苣讂臣ꢁ臣ꖟ苣貂臣誁苣膀ꇨ뾼臣뒼볯ꆼ臣袂臣ꢼ볯莿뫥꺁ꋥꂊ臣肸蟨鞁胣뾰룤ꢼ볯銎돦꾁胣肸裨蒚臣ꢔ蟩鶾귥蒚臣鞢諥鞁臣袼鯥銼볯ꆼ苣芏藧꺁臣ꢁ胣肜ꯩꢔ蟩꺁苣ꮃ臣뾰臣誁臣ꚁ볯낼臣鲤蟥閁苣ꪁ臣ꎁ臣覼胣ં䐼噉邀볯馼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†臣貂苣꺁ꃧ뚩臣膀볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣蒛苣讃苣ꒂ苣ꮃ臣誁臣ꚁ볯袽뷯銂믤鶬臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣龮꣨馁苣芀볯낼臣膀鳦颫諦躸蟩ꞁ蟥꺽臣龁苣ꮃ臣股볦誁苣뎁냥ꞁ臣鲤蟥閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀볯芙雩ꮁ苣龁苣뾰룤ꢼ볯銎돦꺁铧辇뻤颭髧鞢諥ꢁ郥颧臣膀菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃믤鶬铧ꦉ볯ꎼ볯誁苣뎁볯ꆼ臣股볦莿뫥꺁铧辇뻤颭髧鞢諥貁臣ꎁ臣芀臣꺁臣ꢁ臣膀볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯銼臣誁臣讂볯ꒁ臣낼뷯薽裥ꎧ藩ꂴ臣鎖臣膀볯ꆼ볯貁苣ꮃ臣誁臣讂볯袽뷯ꎻ골꺁ꓥꢃ裥銂详ꎁ臣誁苣膀臣꺁菣螃菣ꮁ臣蒁臣겼볯ꆼ볯讁苣꺁꿥躸臣뮁臣鎂臣뺁臣꾁藥辁臣蒁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣閁苣ꮁ胣鎁臣钠ꧧ꾁胣ꢼ볯誁苣뎁볯ꎼ볯貁냥ꖝ臣ꢇ뫥钠ꧧꮁ臣蒁臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯뮴胦꺁菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣ꢁ臣ꚁ뷦ꢜ髧ꮁ뷥讫臣鞾苣鎁臣銂ꓧ馁胣ં䐼噉邀볯馼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤颼볯骼鷩銃菣誜闩麡臣誁臣讂볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣莃藨ꆮ觧Ꞁꧨꆾ戼㹲 ꖁ뫥ꪁ苣讃苣ꒂ苣ꮃ臣莃藨ꆮ臣颧胣ꪁ苣낂菣뎃菣薆臣꺁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣ꎻ골뮴胦誁苣뎁苣궃菣벃뷥邈苣릉뻥颻臣讂臣膂臣膀볯ꒁ臣钠ꧧ銂ꇨꎁ臣芀곧醼臣钠ꧧꞁ臣膀该ꦉ苣膀臣貂臣貂볯릌臣貛臣銼鿥ꮁ裥醁胣閼볯閼苣ꦃ菣꺁菣鞃菣뎃胣閼뷯겼臣邼볯鎼볯궼蟩궂藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣銼볯趽뷯込뷯螽臣꒼볯銈菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃胣誁苣뎁볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼臣龁臣隃菣뎃苣뺯藧꺁臣骁苣讁苣閊룤鞁臣芀諦躸臣銼駦鎖뻥膀该ꦉ苣覮ꗦ뮭臣鮁胣떂菣鞃菣銂迥蚛臣龁胣견볯꺁ꃧ뚩臣꾁胣鎼賥꺁鯩떂菣꺁볯꒾臣膀볯躼볯낂菣ꂃ臣骃菣袃菣膀볯趽볯꺁볯躼볯隼볯趇苧뢅菣袃菣Ꚃ菣膀볯閼뷯螽볯讽뷯꺁볯閼裢閃苣讃菣ꊂ菣讃菣膀臣袂臣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯銂諦躸臣膀该ꦉ苣覮ꗦ뮭臣鮁胣閊룤貾볯躼볯芙雩ꮁ苣뎃菣ꮃ迥蚛臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†룤릖臣钠ꧧꮁ臣蒁臣膀该ꦉ臣膀볯ꖗ鯧ꮁ跥肸臣貵迥랼裥貵迥閊룤馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣ꚩ꣩膓볯许ꇨ銂迥ꞅ臣鎁臣覼苣閊룤鞁臣芀苣ꎃ菣鞃苣鞁臣내迨膃菣벃菣銂胣蒐铧辇諦躸臣趉臣鎼鯥趏믨閁臣龁胣閊雨ꒉ黥꾁胣鞃菣릂菣莃苣랂菣뎃苣ꮁ迥誂믤醁苣貂臣뾽臣ꢍ臣ꮂ菣벃菣ꮃ苣ꢔ臣ꚁ뗧ꎏ볥뚈뗧ꎏ諦躸臣讂臣ꢁ臣袂苣閊룤閁苣龁胣閊룤貾胣랼裥貵迥閊룤馁苣ꆮ苣閼뷯貽臣開觧ꢔꏩ首냦ꞁ臣馁臣膀该ꦉ臣莃臣궸臣ꖅ苣龁胣鶁苣麁苣꺁该ꦉ臣꾂菣벃菣뎃苣랼裥貵迥閊룤馁苣ꆮ苣閊룤鞁臣芀諦躸臣肜裥꺁韦銂볯ꖗ鯧ꢁ臣龁胣開觧꾁胣ꢔ蟩閊룤꺁臣膂臣肸駦蒚臣颋鷦閁苣膀軩馝臣貂臣讁臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨鏥誁苣뎁苣뎃菣궃菣ꮃ鏥꺁郥骮戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㐴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 붣觥邃菣閃苣벃臣袂臣꒼볯銈菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃볯銼볯趽뷯込뷯겼볯꾁뷤ꢔ臣讂臣ꞁ볯莄臣궶賦閁苣膀뷤ꢔ臣讂駦릂臣ꊂ菣뎂菣袃臣随苣몇臣貂胣閊雨趉臣醰臣辁臣节볯邼裥鎖껥ꦸ臣ꞁ룦膂苣貂臣芀蟩궂藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯邼볯鎼볯궼볯꾁胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ뿤颭臣袂臣閊룤閁苣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣ꢡ臣몤臣貂臣蒁苣꺁臣膀郥꒾臣開觧ꮁ뷤ꢔ臣貂苣ꢔ蟩誁苣뎁菣뢂菣뎃臣芁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 龮꣩螃苣ꒂ菣㲳牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㐱㰵愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯馼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯躼볯螽臣骃菣袃菣꺁藧蒰蟩꾁볯ꖗ뷥龁苣醼볯邼뷯꺁苣뎃菣꾂돨銂뛦뮲臣讂藥讞髧ꪁ볯邼뷯螽臣讀뷤ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ臣誂胣겜駧躘胨覂臣膀臣貂苣랂菣ꖃ菣벃菣鞁臣膀뗧貤뻥꺁ꇨ궸臣낼뷯薽臣袂臣뾰룤꺁볯袽뷯꺁믤鶬铧ꦉ苣겸껥馁苣鎁臣貁臣趁苣袂臣ꮁ臣龁胣銼볯趽뷯込뷯螽臣꒼볯銈菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃臣貵迥閊룤辇苣뢁諦鞁臣貁胣鎁苣꾁臣꺁菣馃菣ꞁ諦躸臣龁ꃥ袐胣麃苣릂臣뾰룤ꮁ룦骮迥붃臣것菣ꮃ臣꒼볯銈ꛩ뾰藩銂룤袁苣讁苣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯馼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†룤릖臣钠ꧧꮁ臣蒁臣膀该ꦉ苣肸駦뚵ꏩ閁臣膀諦躸觥꺁볯ꖗ鯧ꮁ뷤趇苣겸껥鞁臣芀諦鶇鯥ꒉ臣鞁臣颃菣ꪃ菣銂铧蒁臣Ꞥ藨馝蓨讁苣股룤떂菣鞃菣袼볯趽뷯覼苣ꆎ迥鞁胣覲ꃧ鞁臣Ꚃ苣莃菣ꊂ苣릂룤ꮁ뷧蒁臣貾胣ꂁ뿥蚈鯩鞁臣芀臩莿裥ꊛ뻥膀뻥覂苣龁ꇨ뾼苣蚈鯩鞁胣銼臣꺁苣ꪃ苣벃菣ꮁ꟧鞁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣뎍뫥ꮁ蟥邵臣鮁胣銈볯邼蓢ꮁ꣨骮臣龁菣ꪃ菣뚂菣ꮁ꟧鞁臣芀苣뎃菣ꮃ苣膀裥邞臣龁苣ꮁ裥꺁꣨馂臣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣뢼胩鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 開觧銂胣芸단꺁跧뮌귥蒚껥붥귦뚺뛦꺁胣貵髧ꮂ菣벃菣ꮃ苣莃菣ꊂ菣鞃苣뾽铧鞁臣膀냥馝蓨銂뻥馝蓨ꢳ냥ꮁ苣讂藧蒰蟩꺁볯芙雩貾볯꺎鷩ꪁ臣覼볯鲤꣨醼볯뺁臣꾁볯躼볯芙雩貾볯鲤꣨銼볯ꮁ껥붥귦閁臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨臣肜뗧讉ꃩ㲆牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㐱㰶愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯馼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†뗧钹臣ꆎ迥誁苣뎁뿤颭ꇨꞁ觧骮臣貂苣蒵맧꾁胣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ臣릁臣꺁该ꦉ臣覂迥蚛臣貂臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 蒵맧꺁軦随臣袂臣鶿귥㲘牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㐱㰷愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯馼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†藨鮗臣貾胣莃臣袂臣邵藨銂苣ꦃ菣鞃臣龁胣閁苣ꪁ苣꾂菣뎃菣銂뷤ꢔ臣ꚁ胣蒴볯邼뷯趽臣뮂苣ꆃ菣袃臣辰藨銂裥꒙臣龁胣醼볯趽볯꺁蛥薻迨龔郧龣ꇥ뒰苣莃臣ꢳ藥鞁胣薆껥ꦉ苣ꦷ苣讂臣膂臣麃菣떂菣뢂臣龁胣莃苣讖臣膀蛥릮觧銂꣦颭臣龁볯邼뷯겼苣讃苣ꮃ菣ꖃ菣隃臣銎蟥鞁胣鎽ꧧ銂꣨늌臣龁胣蒴볯趽볯꺁郥覜蟩銂裥邞꣨馂臣뮧臣膀迥蚛駦ꮁ菣것菣袃臣뮧臣龁胣议苣꺁菨薆껥ꦉ苣膀볯ꒁ臣낕臣讂苣ꪃ苣벃菣骼†볯趽볯膀볯躼볯趽볯袼蟥邵觥ꮁ苣鶃菣떂菣貁苣ꪃ苣궃菣ꮃ苣뮷諥鞁臣覼臣蚈鯩鞁胣议臣龁胣议苣꺁菨蒵맧袼藥鎽臣袂臣馨귨閁苣龁苣莃菣궃菣꾂菣莃苣ꮁ迥蚛臣貂臣覼苣膀蛥릮觧ꢁ藥ꮁ胣貐韦꺁껥超뻤袼냦誸臣趇뗧覼苣讻臣ꚁ裥邞雦궨臣몇跨閁苣讂臣ꞁ胣랰룤ꞁ蟥邵臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†냥뢅臣蒐듧鎼볯莽뷯뮂苣ꆃ菣袃臣醼볯趽볯꺁蛥薻迨龔郧龣ꇥ뒰苣ꢳ냥鞁胣薆껥ꦉ苣馨귨鞁臣閼볯趽볯蚆賩ꆮ臣躏鯩鞁胣鎽ꧧ銂꣨늌臣龁胣蒐苣낂菣뎃菣讁苣꺁듧醼뷯겼臣ꮐ鳦辇苣膀迥蚛駦ꮁ裥邞雦궨臣覂菣것菣袃臣뮧臣龁胣议苣꺁蛥릮觧銂볯ꒁ臣낕臣讂苣ꪃ苣벃菣骼볯趽볯膀볯躼볯趽볯袼蟥邵觥ꮁ苣鶃菣떂菣貁苣ꪃ苣궃菣ꮃ苣뮷諥鞁臣覼臣蚈鯩鞁胣议臣龁胣辰藨蒵맧螈觧袼꣦颭苣莃菣궃菣꾂ꋨꮁ鯩膂臣覼苣膀蛥릮觧ꢁ藥ꮁ胣貐韦꺁껥超뻤袼냦誸臣趇뗧覼苣讻臣ꚁ裥邞雦궨臣몇跨馁苣뺁臣랰룤ꞁ蟥邵臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼臣钠ꧧꞁ臣膀볯邼뷯겼믤许臣醿뷤邵藨薆껥ꦉ苣膀맦ꎁ臣랰룤ꮁ뛧膌臣貂臣꾂菣벃菣뎃苣膀뫤膂꟧辇臣貂臣겂菣릂鏧ꮁ迥蚛臣龁볯貸蟩鮁臣ꮁ볯芀듧醼뷯겼臣ꮐ鳦辇苣蚈黦궨若ꮁ꟧鞁胣躏鯩芙臣鞃菣벃菣ꮁ꟧鞁臣芀볯ꒁ臣낕臣讂苣ꪃ苣벃菣骼菣ꦃ苣ꊂ苣릂룤ꞁ蟥邵臣龁볯趽볯誁苣뎁볯躼볯趽볯袼蟥邵觥ꮁ苣鶃菣떂菣貁苣ꪃ苣궃菣ꮃ苣뮷諥鞁臣覼苣膀뫤膂郥骮臣龁菣ꖃ菣隃臣뮧臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣邵藨銂雩趁胣议苣꺁蛥릮觧銂駩뮎臣膀苣ꦃ苣뚓臣뮧臣龁볯閼볯趽볯ꪜ뫦貁믤趉臣躏鯩閁苣龁ꃥ袐볯芀뗧钹苣鞉귥ꞁ諦膌臣膀믦貏铧蚐ꏩꦡ냦銂郥肂맦鲺臣誂菩궸臣辩苣讁臣ꪃ菣릂臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣薸뷦ꪁ苣醃菣ꖃ菣銂铧蒁臣邵藨蒵맧銂详趁迥誂胣颲뛦銂꣦颭臣膀뫤膂꟧辇臣龁苣ꦃ苣뚓臣蚛苣龁胣颲뛦떂菣鞃菣銂胣ꎧ黦궨若ꮁ꟧馁臣ꞁ맦ꎁ臣랰룤ꮁ뿤膌臣龁胣蚃苣莃苣ꖃ苣뢂菣鞃菣莃苣邃菣낂臣蚛苣袼藥鎽볯膀郥ꖗ藩钁ꗦ薀볯랰룤ꞁ蟥邵볯銂믤鞁臣蚈黦붖꣨ꮁ蟥랍臣讂臣ꞁ냦誸臣趇뗧鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁ꃧ뚩臣꾁胣醼볯趽볯꺁蛥薻迨龔郧龣ꇥ뒰苣醿뷤邵藨ꮁ돦ꖅ臣膀蛥릮觧銂꣦颭臣龁볯邼뷯겼蛥邌껧ꮁ迥蚛臣膀뷤趩苣風賩鞁臣芀듧醼뷯겼臣ꮐ鳦辇苣蚈黦궨若ꮁ꟧鞁胣躏鯩芙臣鞃菣벃菣ꮁ꟧鞁臣芀껦誂臣薆껥ꦉ苣鎼臣꺁闧ꪁ苣ꊂ菣뎂菣袃臣蚈鯩鞁臣骼볯趽볯膀볯躼볯趽볯袼蟥邵觥ꮁ苣鶃菣떂菣貁苣ꪃ苣궃菣ꮃ苣뮷諥鞁臣覼胣誁苣뎁껦ꎁ臣芀ꓥ뢅뗧钹볯馨귨뢂菣鞃菣莃苣订臣蚛苣龁볯銂胣貐韦超臩궥胨袼냦誸臣趇뗧覼苣讻臣ꚁ胣ꖻ룤꺁뷤肉臣蚈黦붖꣨ꮁ蛥릮觧ꢁ藥ꮁ蟥랍臣讂臣ꞁ냦誸臣趇뗧鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 莃藨ꆮ臣鶁苣麁苣꺁菩蚈臣ꒁ臣ꚁ룦骮臣貂臣낼뷯薽蟩誁苣뎁볯ꚼ볯ꮂ苣뎃菣銂鯥鎼볯ꮁꓧ馁胣閊룤銼駦鎖뻥誁苣뎁諦躸볯躼볯芙雩貾臣蒁臣貂臣誁臣ꚁ苣膀菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃뿦ꚺ臣莃臣肜苣颫臣膀뛦隌껧궸臣ꆬ곧ꮁ뷤许臣龁胣閊룤銼駦鎖뻥ꮁ臣膀볯邼볯ꪜ뫦꺁菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃臣莃臣袂臣膍뫤螌藨ꞁꫨ膂苣貂臣芀諦躸蟩꺁볯芙雩貾胣뎼볯꺼裢낼볯떼裢銼볯邼볯꾁鯥뢅臣袂臣醿뷤邵藨ꮁ臣蒁臣뮸臣讦蟥閁苣膀臣鎁臣꾁鷩뢸臣醰臣蒁鿥邝臣ꦈ铧꾏菨ꞁ臣ꎁ臣芀臣貂臣膀볯림볯銈볯ꮼ볯銈볯邼볯醼듦Ꞁ臣몟鷦꺁裥ꢔ迥붃胦ꮁ苣ꎁ臣뚈駩閁苣膀臣龁臣ꎁ臣龣觧ꢁ藥ꮁ釦随臣貂苣릁臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤铥馁苣芀㰊䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㐱㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㐱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㔱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㔱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㔱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰〶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㘱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㘶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㘱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㠶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㘱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰〷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㈷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼裢醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼裢銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼裢鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㘷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼裢醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰〸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼裢銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼裢鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㈸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㠱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㐸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㠱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㠱㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㠱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㠱㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㄰㠹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰㤱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰〰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰〲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㈰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㐰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣超裥ꢡ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽⼮〲〲㈵〵㈱㈯〮〲㈵〵㈱⭅㄰⼵〲〲㈵〵㈱〰〰㄰愮灰㸢〲〲㈵〵㈱〰〰㄰愮灰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鮚ꫨ뮟ꃥ誑胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㘰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰〲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㠰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰〲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰〱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㔲㄰⸲楴≦㈾㈰㔰㔲㄰⸲楴쉦゠〰ㄲ㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㈵〵㈱琮晩㸢〲〲㈵〵㈱琮晩ꃂ〰㈰㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊戯摯㹹㰊栯浴㹬