(57)【要約】  本発明は、少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含む組成物を提供し、それらの抽出物は消化管で分泌されるホルモンレベルの変更を通じて食欲を減らしかつ満腹感を増やすため、減量期間におけるそれらの使用が特に望ましい。並行してかつ補完的な方式で、これらの組成物は、ＡＭＰＫセンサーならびに脂質酸化および除去経路を活性化することにより、脂肪組織細胞における脂質代謝に作用する。前記組成物は、ローゼルの花およびレモンバーベナの葉の水アルコール抽出により得られ、レモンバーベナの場合、７０ｖｏｌ％を超え１００ｖｏｌ％までの濃度のアルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはブタノール）を使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の脂肪組織または消化管から分泌される食欲関連ペプチドレベルの変更を通じて、食欲の低下および／または満腹感の増加により前記個体の食物摂取量の調節に使用するための組成物であって、前記組成物は、少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含み、前記アントシアニンを含有する抽出物は最低２５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物を含み、前記フェニルプロパノイドを含有する抽出物は最低５０ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物は、約１０ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物は、約３０ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は約６５ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物と、約３５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物とを含む、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は２５０〜１０００ｍｇの１日量で投与される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は５００ｍｇの１日量で投与される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
個体の体脂肪率低下につながる、個体のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼエネルギー（ＡＭＰＫ）センサーが仲介する脂質代謝修飾による前記個体の体重減少に使用するための組成物であって、前記組成物は少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含み、前記アントシアニンを含有する抽出物は最低２５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物を含み、前記フェニルプロパノイドを含有する抽出物は最低５０ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項８】
前記少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物は、約１０ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物は、約３０ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物を含む、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は約６５ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物と、約３５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物とを含む、請求項７〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は２５０〜１０００ｍｇの一日量で投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は５００ｍｇの一日量で投与される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含む組成物の製造方法であって、レモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）の水アルコール抽出と、ローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）の水アルコール抽出とを含むことを特徴とし、前記レモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）の水アルコール抽出は、４０〜８０℃の温度で２時間、７０ｖｏｌ％を超え、最大１００ｖｏｌ％のアルコール含有量で水に溶解しているアルコールを用いて実行される、方法。
【請求項１４】
前記アルコール含有量は約７０ｖｏｌ％である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重と食欲を管理するための、特に過体重または肥満の人が使用するための、栄養補助食品、機能性食品、医薬組成物、および動物への使用の技術分野に含まれる。特に、本発明は、２種のポリフェノール植物抽出物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、世界保健機構（ＷＨＯ）により、脂肪組織量の増加、内皮機能障害、脂質異常症、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、インスリン抵抗性を引き起こす、いくつかの代謝不均衡に関連する世界的な流行として認定されている。全体として、これらの不均衡は、メタボリックシンドロームという用語で世界的に知られている複雑な病状を構成する。
【０００３】
肥満は、脂肪組織に過剰な脂肪が増大する状態として定義され、これは健康上のリスクを意味し、インスリン抵抗性、高血圧症、脂質異常症の素因となる。肥満に関連する状態の発症を防ぐ唯一の選択肢は、カロリー摂取を制限し、身体活動を増やすことであると一般的に認められている。しかしながら、これらのライフスタイルの変更は、加齢が筋肉量の減少と安静時の代謝消費の減少に関連しているという事実のために実行可能ではない。
【０００４】
肥満は通常、健康的な食事、運動、心理的サポートを取り入れて、体重の減少とこの病状の効率的な代謝管理の具体的な目標を達成することを含む方法の組み合わせで治療される。しかしながら、治療中の個体は減量をやめて減らした体重を戻す傾向があるため、これらの方法は長期的に過体重集団の間で実施することは困難である。さらに、減量期間には、新しい代謝性要求への身体の適応が伴う。カロリーの摂取と消費の間にエネルギーの不均衡が生じ、それがグレリンの分泌を刺激して食欲を誘発し、より多くの食物摂取を引き起こすのと同時に、安静時の代謝率が低下し、エネルギー効率が向上する（活動の期間中のエネルギー消費が減少する）。長期的には、これが必然的に、体が消費するカロリーを減らし、その食欲を大幅に増加する傾向をもたらし、その結果、ダイエット前と同じかまたはそれより多い食物を消費するが、そのダイエット前と同じ速度では体がカロリーを燃焼できない、既知の「体重の戻り」が生じ、減らした体重分、またはそれよりも重い体重分を増やす結果となる。したがって、ダイエットおよび減量期間中の食欲の増加を回避し、肥満または過体重の治療での返りを防止または低減するためには、代謝を調節することが必要である。
【０００５】
肥満は非常に複雑な病態であり、低強度で慢性の炎症成分、代替のエネルギー代謝、酸化的不均衡などの、いくつかの要因が介在する。この複雑さは、体重と代謝の再調整が非常に遅いプロセスである理由の一部である。多くの場合、これが必然的に、肥満手術、薬物療法、栄養補助食品や栄養補給食品を用いる栄養介入などの、所望の減量を達成するための補完的な方法に対するリソースをもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肥満手術には、外科的介入と同じ欠点があり、手術中に死に至るケースさえある。薬物療法の欠点は「副作用」としてよく知られており、多かれ少なかれ重症化する可能性がある。加えて、多くの栄養補助食品または栄養補給食品があり、それらの減量、脂肪燃焼または食欲低下の効果が広く提唱されているが、それらの効果は科学的に証明されておらず、疑わしく、または最も優れている場合でも、プラセボまたは自己暗示の効果の結果である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、個体の脂肪組織または消化管から分泌される食欲関連ペプチドレベルの変更を通じて、食欲の低下および／または満腹感の増加により前記個体の食物摂取量の調節に使用するための組成物であって、前記組成物は、少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含むことを特徴とする、組成物を提供する。
【０００８】
前述の両方の抽出物を含む組成物は、満腹感または食欲の感覚を引き起こす腸内分泌ペプチドレベルでのその効果を通じて、満腹効果および食欲低下効果を引き起こすため、食物摂取量の調節に極めて効果的である。前記組成物により、体重管理または維持戦略の悪影響を低減することが可能である。例えば、減量期間中に食欲を低下させることが可能であるため、ダイエット中の個体が推奨量を超えて食物を摂取し始め、体重が戻り始める可能性を低減または阻止することができる。同様に、この組成物は体重維持戦略に非常に役立ち、望ましい体重が達成されると、この組成物は満腹感をより長く維持するのに役立つため、例えば、体重を維持する（または、必要に応じて、さらに体重を減らす）ために、所望のレベルでの食物摂取量の調節を達成することができる。
【０００９】
好ましくは、アントシアニンを少なくとも５ｗｔ％含有する前記抽出物は、アントシアニンを約１０ｗｔ％含む。
好ましくは、フェニルプロパノイドを少なくとも１５ｗｔ％含有する前記抽出物は、フェニルプロパノイドを約３０ｗｔ％含む。
アントシアニンとフェニルプロパノイドのこれらの濃度は、使用される前記組成物が細胞毒性でないことを保証する。
好ましくは、アントシアニンを含有する前記抽出物は、ローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物を含む。
好ましくは、フェニルプロパノイドを含有する前記抽出物は、レモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物を含む。
【００１０】
食欲に対するレモンバーベナとローゼルの効果は、最新技術では明確に定義されていない。それらは食欲増加効果と満腹減少効果を有すると考えている情報源があり、他の情報源ではそれらは食欲を減らして満腹感を高めると考えている。本明細書では、両方の抽出物を含む組成物が、食物摂取（食欲および満腹）に関与するペプチド、例えばグレリンおよびレプチンの発現を修飾する際に強力な効果を示し、それらは、等しい個別の用量のこれらの抽出物と比較して、非常に有意により大きな効果を生み出すことを証明することになる。別々に摂取された両方の抽出物のあいまいな効果を考えると、両方の抽出物を含む組成物を用いて得られた満腹効果および食欲減少効果は非常に驚くべきかつ予期せぬものである。
【００１１】
ローゼルはアントシアニンに富む植物であり、その抽出物は、フェニルプロパノイドに富む植物であるレモンバーベナの抽出物と組み合わされて、顕著な満腹効果および食欲減少効果を生み出す。
前記組成物は、最少で５０ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物と、最少で２５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物とを含み得る。
好ましくは、前記組成物は、約６５ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物と、約３５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物とを含む。
【００１２】
両方の抽出物のこのパーセンテージに起因して、両方の抽出物が等しい量で混合されている組成物に比べ、前記組成物はより大きなＡＭＰＫ活性化が介在する脂肪代謝活性化により大きな効果を示すことになる。
前記組成物は、１日当たり２５０〜１０００ｍｇの用量で投与することができる。
好ましくは、前記組成物は、１日当たり５００ｍｇの用量で投与される。
これらの用量は、個体の消化管および脂肪組織によって分泌される食欲関連ペプチドに対する効果を確実にし、その効果は食欲の低下および／または満腹感の増加につながり、これは食物摂取要求の低下に反映される。
【００１３】
本発明の第２の態様は、個体の体脂肪率の低下につながる、前記個体のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼエネルギー（ＡＭＰＫ）センサーが介在する脂質代謝修飾による前記個体の体重減少に使用するための組成物を提供し、前記組成物は、少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含むことを特徴とする。
【００１４】
前述の両方の抽出物を含む組成物は、前記ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼエネルギーセンサー（ＡＭＰＫ）の活性化を通じて脂質代謝の変化または増強による個体の体重減少に極めて効果的である。この組成物は、個体の脂肪組織量を減らすことができ、そして肥満または過体重であることと通常関連する他のパラメーターを改善できるため、肥満の治療に非常に有用である。
ＡＭＰＫは、細胞の恒常性を維持する上で非常に重要な役割を果たすセリン／スレオニンキナーゼである。その活性化は、脂肪分解や脂肪酸酸化などの異化経路の活性化と、脂質生成や糖生成などの同化経路の阻害とをもたらすことになる。
【００１５】
好ましくは、アントシアニンを少なくとも５ｗｔ％含有する前記抽出物は、アントシアニンを約１０ｗｔ％含む。
好ましくは、フェニルプロパノイドを少なくとも１５ｗｔ％含有する前記抽出物は、フェニルプロパノイドを約３０ｗｔ％含む。
アントシアニンとフェニルプロパノイドのこれらの濃度は、使用される組成物が細胞毒性でないことを保証する。
好ましくは、アントシアニンを含有する前記抽出物は、ローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物を含む。
好ましくは、フェニルプロパノイドを含有する前記抽出物は、レモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物を含む。
【００１６】
ローゼルアントシアニンは、レプチンと単球−１化学誘引物質タンパク質（ＭＣＰ−１）の分泌阻害による代謝ストレスにつながる炎症を軽減するのに特に効果であることが証明されている。これらは、脂肪組織および一般的な全身性炎症における非常在性マクロファージの移動を制御する重要なアディポカインである。また、ポリフェノール性のローゼル抽出物は、グルコースと脂質の恒常性に関与する遺伝子の発現を通じて高脂血症マウスの脂肪肝を予防する。高脂肪食マウスにおいて、ローゼルアントシアニンは血糖値の上昇とインスリン抵抗性の明らかな増加を抑制し、基礎代謝率（安静時）（ＢＭＲ）と密接に関連する呼吸数の増加も引き起こす。この同じ動物モデルでは、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳＮ）やステロール制御要素リガンドタンパク質（Ｓｒｅｂｐ−１ｃ）をコードする遺伝子などの脂質合成遺伝子の発現の減少も、同時に起こる肝性ＡＭＰＫ活性化と共に観察された。
【００１７】
前記肝性ＡＭＰＫ活性化はＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を誘導し、リン酸化によってその活性を直接増強することが知られており、そのリン酸化が次に生合成とミトコンドリア機能を増加させる。これは必然的に、脂肪の使用の際に、ほぼ確実に脂質生成阻害によって、およびミトコンドリア生合成レベルでの脂肪分解活性化の際に、ローゼルアントシアニンが作用することになる。これらの全てのプロセスは、細胞のエネルギー需要の増加、エネルギー消費の増強、および基礎代謝率の増加を反映する代謝状況に類似している。
【００１８】
一方、レモンバーベナ抽出物のフェニルプロパノイドとその主成分であるベルバスコシドは、上昇した血糖値によって誘導される代謝変化を高める。これらの効果には、ＰＰＡＲγ依存性の転写アディポネクチンのアップレギュレーションと強力なＡＭＰＫ活性化、ＲＮＡが発現するＰＰＡＲ−αのアップレギュレーションとＦＡＳＮのダウンレギュレーションが介在する。マウスで行われた実験は、特にトリグリセリドの除去において、脂質代謝の強化（コレステロールとトリグリセリド）を示す。
これは、前記脂質代謝と前記ＡＭＰＫ活性化において両方の抽出物由来のこれまで知られていなかった補完効果を示す。これは、実施例で説明されるように、前述の組成物が、肥満または過体重の人々の体重減少に予想外の非常に大きな効果があるという結論をもたらす。
【００１９】
前記組成物は、最少で５０ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物と、最少で２５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物とを含み得る。
好ましくは、前記組成物は、約６５ｗｔ％のレモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）抽出物と、約３５ｗｔ％のローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）抽出物とを含む。
両方の抽出物のこのパーセンテージに起因して、両方の抽出物が等量で混合されている組成物と比べ、前記組成物がより大きなＡＭＰＫ活性化が介在する脂質代謝活性化により大きな効果を示すことになる。
【００２０】
前記組成物は、１日当たり２５０〜１０００ｍｇの用量で投与することができる。
好ましくは、前記組成物は、１日当たり５００ｍｇの用量で投与される。
これらの用量は、ＡＭＰＫの活性化に大きな影響を与えることを確実にし、この活性化は脂質代謝の活性化につながり、結果として、体脂肪率の低下につながる。
【００２１】
より特定の実施形態では、本発明の組成物の投与は、非経口、経皮、経口、局所結腸内または膣の経路から選択される。
さらに特定の実施形態では、本発明の組成物は、水または適切なアルコールなどの従来の注射可能な液体アジュバントと組み合わせて非経口的に投与される。安定剤、可溶化剤および緩衝液などの注射用の従来の医薬アジュバントは、そのような注射可能な組成物に含まれていてもよい。さらにより特定の実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内、腹腔内または静脈内に投与される。
【００２２】
さらに特定の実施形態では、本発明の組成物は経口投与され、液体または固体の形態で１つまたは複数の生理学的に適合する賦形剤またはビヒクルを含む。これらの組成物は、生理学的に許容され得る結合剤、充填剤、潤滑剤および保湿剤などの従来の成分を含み得る。前記組成物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、ロゼンジ、油性または水性溶液、懸濁液、乳液、または使用前に水または他の適切な液体媒体でのその再構成に適した乾燥粉末形態における、即時または制御用の投与量のための、任意の適切な形状をとることができる。
【００２３】
本発明のさらにより特定の実施形態において、液体経口形態はまた、甘味剤、着香剤、保存剤および乳化剤などの添加剤を含み得る。経口投与用の非水性組成物は、例えば食用油を含有して処方することもできる。そのような液体組成物は、例えば、単一用量のソフトゼラチンカプセルに便利な方法でカプセル化することができる。
【００２４】
本発明のさらに特定の実施形態では、本発明の医薬組成物の投与量は、ヒトおよび動物については毎日であり、年齢、体重または病気の程度などに応じて変動し得る。人間を含む、動物の一日量は通常、１回または複数回の摂取中に投与される予定の物質の２５０ｍｇから１０００ｍｇまで変化し、好ましくは５００ｍｇである。
【００２５】
本発明の第３の態様は、少なくとも５ｗｔ％のアントシアニンを含有する抽出物と、少なくとも１５ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する抽出物とを含む組成物の製造方法であって、レモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）の水アルコール抽出と、ローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）の水アルコール抽出とを含むことを特徴とする製造方法を提供する。
この方法は、前記組成物の活性化合物が豊富な２つの天然資源を使用する。これらの植物の水アルコール抽出により、顕著な収率と経済的実現可能性を備えた必要な活性化合物の含有量を得ることが可能になる。
【００２６】
前記レモンバーベナの水アルコール抽出は、アルコール含有量が７０ｖｏｌ％を超え、最大１００ｖｏｌ％までのエタノールのアルコール水溶液を使用して、４０〜８０℃の温度で２時間実行することができる。
好ましくは、水溶液中の前記エタノールは、約７０ｖｏｌ％のアルコールを含む。
【００２７】
前記した抽出剤のこの組成および抽出条件は、過剰な水またはアルコールを蒸留する必要なしに、経済的に実現可能な条件で、フェニルプロパノイド化合物の取得、特にレモンバーベナの葉におけるベルバスコシドの取得を最大限に増加させる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、インスリン抵抗性肥大脂肪細胞におけるトリグリセリド蓄積のパーセンテージを示す図である。
【図２】図２は、ローゼル抽出物およびレモンバーベナ抽出物の異なる濃度で処理されたインスリン抵抗性肥大脂肪細胞のＡＭＰＫ活性化パーセンテージを示す図である。
【図３】図３は、２つの異なる比率の異なる濃度のレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物で処理したインスリン抵抗性肥大脂肪細胞のＡＭＰＫ活性化パーセンテージを示す図である。
【図４】図４は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量のレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物のそれぞれ６５：３５の重量比の混合物で処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスの、血中の総コレステロール、ＬＤＬコレステロール（悪玉）、ＨＤＬコレステロール（善玉）レベルを示す図である。
【図５】図５は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量のレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物のそれぞれで処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける食品効率比を示す図と表である。
【図６】図６は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量のレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物のそれぞれで処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける血糖値を示す図である。
【図７】図７は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける血中レプチンレベルを示す図である。
【図８】図８は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける脂肪組織レプチンレベルを示す図である。
【図９】図９は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける体脂肪重量を示す図である。
【図１０ａ】図１０ａは、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける腹部脂肪組織と肝臓の代謝マーカーを示す図である。
【図１０ｂ】図１０ｂは、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける腹部脂肪組織と肝臓の代謝マーカーを示す図である。
【図１０ｃ】図１０ｃは、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける腹部脂肪組織と肝臓の代謝マーカーを示す図である。
【図１０ｄ】図１０ｄは、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスにおける腹部脂肪組織と肝臓の代謝マーカーを示す図である。
【図１１】図１１は、高脂肪食を与えられ、かつレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物で別々に処置された、および２種の異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物でそれぞれ処置されたマウス、ならびに処置されていない高脂肪食を与えられたマウスおよび通常食を与えられたマウスの脂肪組織のタンパク量を決定するために実施されたウエスタンブロット分析の図である。
【図１２】図１２は、インビトロで培養された、非分化型（ＮＤ）および分化型（ＭＤＩ）の、かつ異なる用量のレモンバーベナ（ＬＶ）抽出物とローゼル（ＨＳ）抽出物で別々に処理された、および異なる用量でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物で処理された、不死化ヒト脂肪細胞の代謝マーカーに対応する遺伝子を示す図である。
【図１３】図１３は、レモンバーベナ抽出物およびローゼル抽出物を含む組成物で処理された肥大脂肪細胞における脂質含有量の減少、および前記脂肪細胞における前記ＡＭＰＫ活性化の平行した増加を示す図である。
【図１４】図１４は、レモンバーベナ抽出物の製造方法の概略図である。
【図１５】図１５は、本発明の一態様による組成物の製造方法の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２９】
実施例１
レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の比の決定。
３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞を、グルタミンが富化され、１０％のウシ血清と抗生物質（１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリン）を添加した、完全培地（１ｇ／Ｌの低グルコースを含有するＤＭＥＭ）とピルビン酸ナトリウムを含む９６ウェルプレートで培養した。
【００３０】
脂肪細胞の分化は、２日間の間に前記培地に脂肪生成剤（０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのＤＥＸおよび１μＭのインスリン）を添加することによって誘導された。４８時間ごとに培地を新しい培地と交換した。
前記脂肪細胞の表現型の変化を顕微鏡で観察した。全ての実験で、８〜１０日間のインキュベーションの後、９０％を超える細胞が成熟脂肪細胞であった。細胞肥大を誘導するために、前記脂肪細胞を高グルコース培地（２５ｍＭ）に曝露した。
細胞培養は、細胞培養用の空気層流フードとＣＯ２が５％の加湿雰囲気の３７℃のインキュベーターとを使用して、無菌状態で行った。
【００３１】
トリグリセリドの蓄積に対するおよび３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における細胞質ＡＭＰＫ活性化に対する前記抽出物と前記抽出物の組成物の影響を調べた。前記抽出物は、前記脂肪細胞が分化した後、前記プレートが分析されるまで添加された。前記抽出物は、あらかじめ培地を用いて調製され、それらを滅菌するために、０．２μｍのフィルターでろ過された。
【００３２】
２９日間分化した肥大脂肪細胞を、ローゼル抽出物（アントシアニンで約１０ｗｔ％）とレモンバーベナ抽出物（フェニルプロパノイドで約３０ｗｔ％）に別々に、および重量比５０：５０および６５：３５のレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の混合物に曝露した。前記抽出物を、脂肪細胞分化の２４日後に添加し、５０、２００、および５００μｇ／ｍＬで５日間インキュベートした。
【００３３】
これらの５日後、前記脂肪細胞の脂質含有量を、市販の反応物ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）を用いて、４８５ｎｍの励起波長と５７２ｎｍの発光波長でＢｉｏｔｅｋの細胞画像キャプチャーＣｙｔａｔｉｏｎ  ３を備えたマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して評価した。細胞毒性の欠如は、パープルクリスタル法で評価した。図１に、インスリン抵抗性肥大脂肪細胞に蓄積したトリグリセリドのパーセンテージを示すグラフを用いて、結果を示す。ＨＳは１０％アントシアニンのローゼル抽出物で処理された脂肪細胞を表し、ＬＶは３０％フェニルプロパノイドのレモンバーベナ抽出物で処理された脂肪細胞を表し、ＨＳ−ＬＶ（１：１）はレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の１対１の重量混合物で処理された脂肪細胞を表し、ＨＳ−ＬＶ（３６：６５）は、それぞれローゼル抽出物とレモンバーベナ抽出物の３５：６５の重量混合物で処理された脂肪細胞を表す。Ｐ値は以下のとおり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【００３４】
ＡＭＰＫおよびリン酸化（活性化）ＡＭＰＫレベルは、ＡＭＰＫおよびリン酸化ＡＭＰＫ抗体を使用した定量的免疫蛍光実験で測定した。さらに、核は反応物質Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識した。それらの細胞を標識した後、マルチモードのプレートリーダーを使用して、ＡＭＰＫ蛍光を４９０ｎｍの励起波長と５２０ｎｍの発光波長で定量し、リン酸化されたＡＭＰＫ蛍光を５９３ｎｍの励起波長と６１４ｎｍの発光波長で定量し、核蛍光を３５０ｎｍの励起波長と４６１ｎｍの発光波長で定量した。
【００３５】
結果を図２および３に示す。これらは、異なる用量のローゼル抽出物およびレモンバーベナ抽出物で別々に、および２つの異なる重量比で組み合わされて処理された、肥大したインスリン抵抗性脂肪細胞におけるＡＭＰＫ活性化パーセンテージを表す図を示す。最も多くのＡＭＰＫ活性化が、両方の抽出物をレモンバーベナ抽出物に対するローゼル抽出物でそれぞれ６５：３５の重量比で含む組成物のより高い用量で生じることがわかる。ｐ値は以下のとおり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。これは、対照の脂肪細胞（処理されていない脂肪細胞）との統計的に有意な差異を示す。省略記号は、図１と同じ意味である。
【００３６】
実施例２
レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物とを含む組成物で処置された肥満マウスにおける体脂肪、高脂血症、高血糖症および脂肪生成減少の評価。
インビボ実験を、８週間の間、高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられた正常なマウスで行った。総血中コレステロール、ならびにＨＤＬコレステロール（善玉コレステロールまたは高密度リポタンパク質）およびＬＤＬコレステロール（悪玉コレステロールまたは低密度リポタンパク質）を分析した。
【００３７】
結果を図４に示し、そこでは、Ｃ５７ｂｌ／６−Ｎｒは通常食のマウスに対応し、ＨＦＤ−ＣＴＬは高脂肪食のマウス（ＨＦＤ）に対応し、ＨＦＤ−ＬＶは約３０ｗｔ％のフェニルプロパノイドのレモンバーベナ抽出物を摂取する高脂肪食のマウスに対応し、ＨＦＤ−ＨＳは約１０ｗｔ％のアントシアニンのローゼル抽出物を摂取する高脂肪食のマウスに対応し、ＨＦＤ−ＭｅｔＡはそれぞれ６５：３５の重量比のレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の組成物を摂取する高脂肪食のマウスに対応する。
結果は、両方の抽出物の組成物を摂取するマウスは、総コレステロール値が低く、ＬＤＬの減少およびＨＤＬの増加と一致したことを示す。これらの値は、前記抽出物を別々に摂取した場合よりも低かった（対照ＨＦＤ−ＣＴＬに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【００３８】
マウスが摂取した食物量は、動物の体重に対して毎日分析を行った。この値は、食品効率比として知られている。量が少ないということは、その体量に関して食物摂取量が少ないことを意味する。結果は図５からわかる（対照ＨＦＤ−ＣＴＬに対して＊ｐ＜０．０１）。
高脂肪食のマウスが高血糖であることを考慮して、血糖値についても分析を行った。図６からわかるように（対照ＨＦＤ−ＣＴＬに対して＊ｐ＜０．０５）、最高濃度の抽出物の組成物を摂取するマウスは、通常食のマウスに近い、重要な血糖値の低下を示した唯一のマウスであった。
【００３９】
高脂肪食を摂取するマウスにおいて、レプチンホルモンレベルを分析した。具体的には、図７からわかるように、このようなホルモンの血中濃度を分析した（対照ＨＦＤ−ＣＴＬに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
高脂肪食のマウス（ＨＦＤ−ＣＴＬ）に対して、通常食（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ  Ｎｒ）の対照を比較すると、高脂肪食のマウスではレプチンの発現が有意に高いことが理解できる。レプチンは満腹を誘発するが、前記ホルモンの膜受容体は肥満の個体において高い耐性を有し、刺激されるために、そしてその結果、満腹を誘発するシグナルカスケードを活性化するためには、高いレプチンレベルが必要とされることが知られている。結果的に、高脂肪食のマウスで高いレプチン濃度が検出され、肥満が検出されると、このホルモンに対する耐性が確認される結果となる。
【００４０】
抽出物混合物の組成物の場合のみで、通常食のマウス、即ち、肥満していないマウスと同様のレベルを確認することができたが、テストされた抽出物または混合物（レモンバーベナ、ローゼル、またはそれらの混合物）のいずれかを摂取すると、血液中のレプチン発現が減少する。したがって、前記ホルモンへの抵抗性がなくなることを考えると、この混合物の組成物を摂取することは、レプチンの過剰発現を逆転させることができるため、ＨＦＤマウスが通常食のマウスと同様の満腹レベルを有することが可能となる。
これらのデータは、ＦＥＲで観察された結果と一致する。この場合、両方の抽出物の組成物を摂取したマウスは、それらの体重に対して摂取する食物量が少なかった。
【００４１】
同様の結果は、脂肪組織でのレプチン発現に関して図８で見ることができる。ここでは、抽出物の組成物を摂取するマウスにおいてのみ、脂肪組織でのレプチン発現が減少したことが理解でき（ＨＦＤ−ＣＴＬに対して＊ｐ＜０．０５）、通常食のマウスで観察されたレベルが達成される。これは、前記抽出物の組成物を摂取したマウスにおける可能なレプチン受容体感作によるものであり、結果として、より低いレプチン血中濃度で満腹感を引き起こすのには十分であった。
【００４２】
脂肪組織代謝に対するレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の組み合わせたおよび別々の効果について研究を行った。まず、マウスの脂肪組織の量を測定し、腹部、精巣上体、腎臓および腸の脂肪を分離して秤量した。
図９からわかるように、前記抽出物の組成物を摂取したマウスのみが、腹部、精巣上体および腸の脂肪量の有意な減少を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。これらの値は、以前にコメントした結果、即ち、これらのマウスは満腹制御により食物摂取量が少なくなり、結果的に、脂肪組織の減少により体重が減少することと一致する。
【００４３】
トリグリセリドと脂肪酸の蓄積または制御に関連して、体重に加えて、脂肪組織と肝臓の代謝マーカーについて研究を行った（「脂肪肝」として知られている、肝臓に脂肪組織の異常な蓄積がある過体重／肥満の場合において）。ＲＴ−ＰＣＲによって分析されたマーカーは、ＰＰＡＲγ、ＳＲＥＢＰ１（ＡＤＤ１）、Ｃ／ＥＢＰαおよびＡＭＰＫであった。
【００４４】
ＰＰＡＲγは、脂肪細胞だけでなく、結腸細胞やマクロファージにも見られる核膜受容体である。脂肪組織の場合、それらの機能は脂質生成と脂質捕捉を活性化することである。ＳＲＥＢＰ１ｃは、脂質の恒常性を制御し、これが低い場合、その活性化はコレステロール合成を誘導する。Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪生成ならびに通常の脂肪細胞機能を制御し、かつＰＰＡＲγ発現を制御する転写因子である。最終的に、ＡＭＰＫ（ＡＭＰキナーゼ）は、他の機能の中でも、脂質の捕捉、コレステロールの合成、脂質生成を阻害するが、その機能を実行するためには、前記タンパク質をリン酸化する必要がある（ｐ−ＡＭＰＫ）。
【００４５】
図１０ａから１０ｄのヒストグラムで理解できるように、ＰＰＡＲγ、ＳＲＥＢＰ１ｃ（ＡＤＤ１）の発現は、前記抽出物の組成物を摂取したマウスでのみ有意に減少し、肝臓においておよび腹部脂肪組織において研究された（＊ｐ＜０．０５）。Ｃ／ＥＢＰαに関しては、肝臓でのみ、レモンバーベナとローゼルによる発現減少効果も見られたが、前記抽出物の組成物は両方の分析された組織でこの因子発現を減少させた。これらの３つの遺伝子において、前記抽出物の組成物を摂取するマウスで得られた発現は、通常食を摂取した対照マウスで得られたものと同様であった。
【００４６】
一方、ＡＭＰＫ転写発現は、前記抽出物の組成物を摂取するマウスで増加した（肝臓では、ローゼルを摂取するマウスでも発現増加が見られたが、脂肪組織では見られなかった）。
この結果も、脂肪組織に存在するタンパク質量の分析を可能にするウエスタンブロット分析によって確認され、その結果を図１１に示す。省略記号は以下のように解釈される：Ｎは正常食のマウス、ＣＴは高脂肪食の処置されていないマウス、ＬＶは高脂肪食のレモンバーベナ抽出物で処置されたマウス、ＨＳは高脂肪食のローゼル抽出物で処置されたマウス、ＭＡ１は高脂肪食の、レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の６５：３５重量比の組成物で５０ｍｇ／ｋｇの用量で処置されたマウス、ＭＡ２は高脂肪食の、レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の６５：３５重量比の組成物で１００ｍｇ／ｋｇの用量で処置されたマウス。
【００４７】
ＡＭＰＫの活性型は、リン酸化されたＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ）である。図からわかるように、前記抽出物の組成物を摂取するマウスの脂肪組織は、より高濃度の活性タンパク質型のｐ−ＡＭＰＫを示す脂肪組織であった。
したがって、高脂肪食を８週間摂取したマウス（ＨＦＤ−ＣＴＬ）は、脂肪蓄積、脂肪生成、トリグリセリドおよびコレステロールの合成、脂肪生成に関与する遺伝子の活性化を示し、それは結果的に、通常食（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ  Ｎｒ）の対照マウスと比較して、体脂肪の含有量が高くなる。しかし、これらのマウスが前記抽出物の組成物を摂取すると、これらの遺伝子発現は、非肥満の通常食のマウスで観察されたものと同様の濃度に戻る。さらに、ｐ−ＡＭＰＫの活性化は、脂肪酸の代謝が増加するため、その分解が増加すると同時に、その貯蔵が減少することを示す。
【００４８】
マウスで実施したこれらのインビボの結果は、ヒト脂肪細胞の細胞株を使用したインビトロ研究で確認され、そこでは、いくつかの濃度の異なる成分がテストされ、１０日間インキュベートされた。マウスで研究されたものと同じ遺伝子を脂肪酸代謝について分析した。結果を図１２に示す（ＮＤ：未分化細胞培養物、ＭＤＩ：分化細胞培養物、ＬＶ：レモンバーベナ、ＨＢ：ローゼル、ＭＡ：ＬＶ抽出物およびＨＢ抽出物の組成物、１２５〜１０００：μｇ／ｍｌで示した成分濃度）。
【００４９】
ＰＰＡＲγ、ＳＲＥＢＰ１ｃ（ＡＤＤ１）、Ｃ／ＥＢＰαの場合、分化した脂肪細胞（ＭＤＩ）に関して、３つの研究された例で、具体的にレモンバーベナとローゼルの１ｍｇ／ｍｌ濃度で、および前記抽出物の組成物の０．５および１ｍｇ／ｍｌの濃度でもそれらの発現の減少が観察される。したがって、前記抽出物の組成物は、個々の抽出物と比較して、より低い濃度で使用して、前記転写物の抑制効果を誘導することができる。
【００５０】
ＡＭＰＫに関しては、０．５および１ｍｇ／ｍｌでの前記抽出物の組成物の場合に重要な発現増加を観察することができるが、個別の抽出物では、分化細胞培養物（ＭＤＩ）に関して統計的に有意な差を観察することはできない。
【００５１】
実施例３
６５：３５の重量比で、フェニルプロパノイドの含有量が３０ｗｔ％のレモンバーベナ抽出物とアントシアニンの含有量が１０ｗｔ％のローゼル抽出物とを含有する組成物を摂取することで、消化管および脂肪組織分泌ペプチドレベルを変化させることにより、食欲が低下しおよび／または満腹感が増加する。
３５〜７５歳の年齢で、体格指数が２５〜３５ｋｇ／ｍ２の５４人の女性が選択された。この研究は、スペインのエルチェのミゲルエルナンデス大学で行われた８週間のランダムな二重盲検プラセボ対照アッセイである。募集後、ボランティアらはプラセボ対照群Ｌ２（ｎ＝２６）または実験群Ｌ１（ｎ＝２８）にランダムに割り当てられた。
Ｌ１群のメンバー（平均年齢５１歳）は、レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物とを含有する組成物を１日に５００ｍｇの用量で服用した。
Ｌ２群のメンバー（平均年齢５１歳）は、微結晶セルロースを１日に５００ｍｇの用量で服用した。
【００５２】
プラセボと満腹効果のある組成物カプセルは、同じ大きさ、色、匂いおよび重量であった。前記ボランティアらは朝食の２０〜３０分前にカプセルを毎日２ヶ月間服用した。
前記ボランティアらは、バランスのとれた等カロリーの食事療法に従い、少なくとも１日３０分歩くことを求められた。
これらの要請の履行は、臨床訪問中または毎週の電話インタビューによって監視された。合計３人と４人の参加者がそれぞれＬ２群とＬ１群から除かれた。
【００５３】
前記研究中、いくつかのパラメーターを監視した。身体測定は、前記研究の開始時、前記研究の開始から１か月後および２か月後に行い、体重、身長、上腕三頭筋、上腕二頭筋、腹部の皮下脂肪測定、腕と腹部の周囲測定を含む。腹囲（ＡＣ）は、２つの異なる場所、剣状突起と臍部の間の正面の中間で胸郭の胸端と腸骨稜の間の側面の中間（ＡＣ１）および臍部（ＡＣ２）で測定した。体脂肪率は、ウェルトマン方程式を使用して腹部測定から得た。さらに、安静時の心拍数と、拡張期および収縮期の血圧を、研究の開始時、および１ヶ月後と２ヶ月後に測定した。
【００５４】
検証済みのアナログ視覚スケールテスト（ＶＡＳテスト）を使用して、空腹感、満腹感、膨満感、予想される食物摂取量、脂っこいもの、しょっぱいもの、甘いものまたは甘くないものを食べたいという欲求、および食事の風味評価を記録した。前記ＶＡＳテストは、安静時の前記研究の開始時、前記研究の１５、２０、４５、６０日後に完了した。彼女らの健康状態の主観的評価を補足する形で、ボランティアらは前記研究の開始時と終了時にＳＦ−３６アンケートに回答した。最後に、血液試料を、一晩の絶食後の研究の開始時、および３０日後および６０日後に前腕静脈から採取した。血漿を直ちに処理し、前記試料を−８０℃で保存した。
【００５５】
表１は、研究の開始時および研究中の身体測定パラメーターを示す。前記の二群間の統計的に有意な差は、研究の開始時には見ることができない。表１の結果は、レモンバーベナ抽出物およびローゼル抽出物の組成物を摂取した、前記Ｌ１群で２か月の研究を行った後、身体測定パラメーターの統計的に有意な改善を示し、具体的には、体脂肪率、上腕三頭筋の皮下脂肪、体重、および臀部の周囲（ＡＣ２）の改善を示す。これらの差異は、表２でより明確に理解できる。
【表１】
2020535222.tif 000002
【００５６】
【表２】
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【００５７】
表３に示したスコアによると、レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の組成物の消費により、２か月の研究期間を通じて一貫して空腹感が減少する。Ｌ１群の平均空腹スコアは１５日目の５．９２から６０日目の２．５８に減少した。一方、Ｌ２群では、平均空腹スコアはプラセボ群の１５日目の６．１８から６０日目の６．４１に増加した。質問４のスコアでも同様の傾向を見ることができる。
満腹感は、Ｌ１群の１５日目の５．０４値から６０日目の７．５８値まで増加したが、プラセボのＬ２群では、１５日目の４．８２値から６０日目の４．２２値まで減少した。質問３のスコアでも同様の傾向が見られた。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
一部の分析されたペプチド（ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、グレリンなど）は、食物摂取後に分泌されることを言及する必要がある。グレリンは食欲を刺激するが、ＧＬＰ−１とＰＹＹは満腹感を促進するために一緒に分泌される。血液試料が朝の朝食前に採取されたことを考慮すると、特定のペプチドレベルは基礎レベルに対応する。最初は、両方の群の基礎レベルは一致し、それらの間に統計的に有意な差は見られない。他のペプチドは、Ｌ１群で統計的に有意な差を示す。この状況では、インクレチンＧＬＰ−１はＬ１群で有意に増加したが、Ｌ２群では減少し、グレリンはＬ２群で増加し、Ｌ１群では一定に保たれていた。したがって、Ｌ１群のボランティアらはＬ２群のボランティアらよりも食欲が少なく、膨満感が高かった。
【００６１】
一方、脂肪組織で合成されかつ満腹感を生み出すレプチンは、Ｌ１群で有意に減少したが、Ｌ２群では変化が観察されなかった。レジスチンはＬ１群で有意に減少したが、Ｌ２群では変化は観察されなかった。Ｌ２群の血液試料のレプチンレベルの増加は、レプチン分泌に反応して満腹を引き起こす対応する受容体の抵抗性によって説明される。これは、対応する受容体が脱感作されたようであるが、Ｌ１群における正常な血中レプチンレベルは、対応する受容体がレプチンレベルに対して同じかそれより高い感度を維持することを示す。
【００６２】
一般的に、ホルモン（ペプチド）レベルのこれらの変化は、食欲と満腹に関する質問のスコアと、および以前に示した身体測定パラメーターの評価と正の相関がある。
【００６３】
実施例４
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼエネルギーセンサー活性化（ＡＭＰＫ）が介在する脂質代謝修飾による体重減少。
前記ポリフェノール化合物によるトリグリセリドの蓄積とＡＭＰＫの活性化を、３Ｔ３−Ｌ１の肥大性のインスリン抵抗性脂肪細胞モデルを用いた免疫蛍光法によって評価した。一方、プラセボまたは６５：３５の重量比でレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物をそれぞれ含有する栄養補助食品を１日に５００ｍｇ摂取したボランティアらでの二重盲検プラセボ対照臨床研究が実施され、５６人の過体重ボランティアらが２ヶ月の間参加した。身体測定パラメーターおよび生化学的パラメーターが測定された。
【００６４】
３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞を、１０％ウシ血清（ＣＳ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを添加した低グルコース培地（１ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ中で培養し、３７℃で５ｖｏｌ％ＣＯ２と９５ｖｏｌ％の空気加湿雰囲気中でインキュベートした。脂肪細胞の分化は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１μＭのインスリン、１μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）および０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を添加した高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）培養培地を使って４８時間誘導された。４８時間後、前記細胞をＦＢＳおよびインスリンを含む高グルコース培地中で維持し、培地を２日毎に交換し、２０日間のインキュベーション後に肥大脂肪細胞を得た。肥大脂肪細胞が得られた時点で、前記細胞をレモンバーベナ抽出物（フェニルプロパノイドで約３０ｗｔ％）とローゼル抽出物（アントシアニンで約１０ｗｔ％）をそれぞれ６５〜３５の重量比で、異なる濃度で７２時間処理した。前記抽出物は培地に溶解し、滅菌するために濾過した。
【００６５】
肥大脂肪細胞の脂質含有量は、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）反応物を使用して評価した。細胞上清を除去し、これらをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で注意深く洗浄した。続いて、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）を加え、前記細胞を室温で１５分間インキュベートした。トリグリセリドの蓄積は、マイクロプレートリーダーを使用して、４８５ｎｍの励起波長と５７２ｎｍの発光波長で測定した。
【００６６】
肥大脂肪細胞におけるＡＭＰＫ活性化の研究のために、Ｔｈｒ１７２においてリン酸化されたＡＭＰＫを免疫蛍光アッセイで定量化した（ｐＡＭＰＫ）。前記細胞を固定バッファーで固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スペイン）で透過処理し、４％ヤギ血清でブロックした。これが完了した時点で、前記細胞を４℃で一晩、Ａｌｐｈａ  １＋Ａｌｐｈａ  ２マウスＡＭＰＫモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国）およびウサギＡｌｐｈａ  １ホスホ−ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバーズ、マサチューセッツ州、米国）と共にインキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、前記細胞をＰＢＳで洗浄し、対応する各二次ポリクローナル抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＣＦ（商標）５９４および抗マウスＦＩＴＣ（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）と共に室温で６時間インキュベートした。ＡＭＰＫレベルを測定するために、５９３ｎｍの励起波長と６１４ｎｍの発光波長で、細胞画像キャプチャー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ３、Ｂｉｏｔｅｋ、スペイン）を備えたマルチモードのマイクロプレートリーダーを使用して細胞蛍光を測定した。前記ＡＭＰＫの活性化は、正規化されたＡＭＰＫと総ＡＭＰＫの間の比率として表す。結果を図１３に示す。ｐ値は００＊ｐ＜０．０５および＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【００６７】
無作為化された二重盲検プラセボ対照ヒト研究は８週間続けた。除外基準は、２００ｍｇ／ｄＬ未満の総コレステロールレベル、任意の肥満関連の病状の存在、コレステロールまたは高血圧の治療薬の使用、医薬品の抗酸化サプリメントの消費、アルコール中毒および授乳または妊娠中の女性であった。これらの基準に基づいて、３６歳から６９歳の年齢の５５人の健康な女性が、２５〜３４ｋｇ／ｍ２の体格指標を有し、電話による選択と彼女らの健康に関するインタビュー、ならびに生化学的評価および身体測定の評価に合格した。
【００６８】
前記研究に登録されると、ボランティアは無作為にプラセボ群（ｎ＝２６）にまたは実験群（ｎ＝２９）に割り当てられた。前記研究中、９人のボランティアがやめ、その内６人がプラセボ群で３人が実験群であり、合計４６人のボランティアらが研究を完了した。前記プラセボ群（平均年齢５１歳）に、２つのプラセボカプセルが与えられ、それぞれ４００ｍｇの微結晶セルロースを含み、前記実験群（平均年齢５２歳）には、２つのカプセルが与えられ、それぞれ２５０ｍｇのレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物の組成物と１５０ｍｇの賦形剤（微結晶性セルロース）を含んだ。したがって、前記実験群は研究下で前記組成物を１日５００ｍｇ摂取した。両方のカプセルタイプは同じ大きさ、色、匂い、および重量であった。前記ボランティアは、朝食の２０〜３０分前に２ヶ月間、１日２カプセルを服用した。選択訪問中に、人口統計学データとライフスタイル（年齢、食事、運動習慣、アルコールとタバコの消費）に関する情報を収集した。医師は前記ボランティアに、正常な水分補給を伴う等カロリーの食事療法に従い、少なくとも１日３０分は歩くように依頼した。前記研究の要請の履行は、２か月の研究期間中、訪問のたび、および毎週電話で確認した。パラメーター測定は、前記研究の開始時および研究の３０日後および６０日後に行った。
【００６９】
前記研究中、いくつかのパラメーターを監視した。身体測定は、前記研究の開始時、前記研究の開始から１か月後および２か月後に行い、体重、身長、上腕三頭筋、上腕二頭筋、腹部の皮下脂肪測定、および腕と腹部の周囲測定から構成された。腹囲（ＡＣ）は、２つの異なる場所、剣状突起と臍部の間の正面の中間で胸郭の胸端と腸骨稜の間の側面の中間（ＡＣ１）および臍部（ＡＣ２）で測定した。体脂肪率は、ウェルトマン方程式を使用して腹部測定から得た。
【００７０】
総グルコース、グリコシル化ヘモグロビンおよび脂質プロファイルを測定するために、絶食時の血液試料を採取した。前記脂質プロファイルには、トリグリセリド、総コレステロール、善玉コレステロール（高密度リポタンパク質）またはＨＤＬおよび悪玉コレステロール（低密度リポタンパク質）またはＬＤＬが含まれる。前記血液試料を分析して、セキュリティパラメーター、例えば血液学的パラメーター、電解質、クレアチニン、尿素、尿酸、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼおよびＣ反応性タンパク質を測定した。
さらに、安静時の心拍数と、拡張期および収縮期の血圧を、研究の開始時、およびの研究の１ヶ月後と２ヶ月後に測定した。
【００７１】
【表５ａ】
2020535222.tif 000006
【表５ｂ】
2020535222.tif 000007
【００７２】
図１３に示すように、レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物を含む組成物は、用量依存的な方式でｐＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ比の強力な増加を引き起こし、３５０μｇ／ｍＬの用量での対照実験で観察された増加と比較してこの増加は統計的に有意であるが、５００μｇ／ｍＬの用量では約１．５の増加が観察される。
両方の群の身体測定パラメーターは、前記研究の開始時に目立った差異を示していない。前記研究結果は、前記実験群において、特に体重、腹囲および体脂肪率において有意な向上を示す（表５ａおよび表５ｂを参照）。
【００７３】
前記実験群は前記プラセボ群よりも大きな体重減少を示し、これはｐ値＜０．０１で統計的に有意である。研究の２か月後に腹囲ＡＣ１とＡＣ２の両方が減少したが、研究の１か月後と２か月後、最も高い腹囲のみが前記プラセボ群と統計的に有意な差を示した。その結果、これらのデータを伴って、体脂肪率は両方の群で減少したが、前記実験群では、研究の２か月後に前記プラセボ群よりも統計的に有意に減少した、ｐ＜０．０１。さらに、上腕三頭筋の皮下脂肪測定値（ｐ＜０．０５）においてと体格指標（ｐ＜０．０１）においても統計的に有意な差異が観察された。
【００７４】
実施例５
本発明の一態様によるレモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物を含む組成物の製造方法。
前記レモンバーベナ抽出物とローゼル抽出物とを含む組成物は、非常に特異的に活性な化合物の組成、即ち、前記ローゼル抽出物中の少なくとも１０ｗｔ％のアントシアニンおよび前記レモンバーベナ抽出物中の少なくとも３０ｗｔ％のフェニルプロパノイドを含有する２種の抽出物の混合物であり、これらは、それぞれ３５：６５の重量比で混合すると、特に満腹感の制御に対して相乗作用を示す。
前記レモンバーベナ抽出物の製造方法は、アルコール水溶液で７０ｖｏｌ％を超えて１００ｖｏｌ％までの濃度のアルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはブタノール）を使用して、水アルコールで抽出するステップを含む（図１４）。
【００７５】
前記レモンバーベナ（Ｌｉｐｐｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）の葉は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してベルバスコシドの量を決定するために分析される。約３３０ｇのレモンバーベナの葉を、４Ｌの脱塩水で希釈したエタノール（７０ｖｏｌ％を超え、最大１００ｖｏｌ％のエタノール）中で抽出し、容器内で液体を撹拌し続け、２時間の間４０〜８０℃の温度で、蒸発させた溶媒を再循環するか、ヌッチェフィルター中で濾過する。２時間後、得られた溶液を濾過して前記葉および他の粒子を分離する。濾過した溶液を６０〜８０℃の温度で真空蒸留して、約１５〜３０％の固形分を含む濃縮水溶液を得る。この濃縮溶液を７０〜９０℃の温度で噴霧乾燥させて、フェニルプロパノイドの総重量が３０ｗｔ％以上の乾燥粉末抽出物を得る。収量は重量で１９から２１％である。
【００７６】
前記ローゼル抽出物を製造するために、その植物の花を選択して分析し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と紫外光検出でそれらのアントシアニン含有量を得る。５０ｖｏｌ％の脱イオン水で希釈した３．２Ｌのエタノールで３２０ｇの前記花を抽出し、反応器内で液体を撹拌し続け、２時間の間４０〜６０℃の温度で、蒸発させた溶媒を再循環するか、ヌッチェフィルター中で濾過する。２時間後、０．５ミクロンのポアフィルターで得られた溶液を濾過して前記花を分離する。濾過した溶液を５０〜７０℃の温度で真空蒸留して、得られた濃縮物を６２０Ｌになるまで希釈する。
【００７７】
得られた生成物を、ポリフェノールに適したポリマー吸着／脱着樹脂においてクロマトグラフィー精製ステップに供する。溶出液は精製された抽出物を液体の形で構成する。精製された液体を、３０〜５０ｗｔ％の固形分となるまで濃縮する。濃縮した溶解物を、７０〜８０℃の温度で噴霧乾燥し、アントシアニンを１０ｗｔ％以上含む乾燥粉末抽出物を得る。収率は５〜７ｗｔ％である。
前記レモンバーベナ抽出物と前記ローゼル抽出物を別々に製造した後、図１５に模式的に示すように、両方を篩過し、混合して、金属検出システムを通過させてから包装する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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