(57)【要約】  本発明は、有利な特性を有する新規の抗体可変領域の組み合わせに関する。
2020535799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む抗体、またはその機能的断片：
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、ここで：
（ｉ）前記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して；または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％の配列同一性を示す；および
（ｉｉ）前記ＬＦＷ４は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列であり、ここで特に、前記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列を有する、可変軽鎖；
ならびに、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、
ここで前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域、または配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％の配列同一性を示す、可変重鎖。
【請求項２】
前記可変重鎖は、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列、または配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列、または配列番号２１に記載のＶＨ４配列、または配列番号２６に記載のＶＨ４mut配列から得られたＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含み、ここで特に、前記可変重鎖は以下を含む、請求項１に記載の抗体、またはその機能的断片：
（ａ）配列番号２に記載のＨＦＷ１、配列番号３に記載のＨＦＷ２、配列番号４に記載のＨＦＷ３、および配列番号５に記載のＨＦＷ４；または
（ｂ）配列番号７に記載のＨＦＷ１、配列番号８に記載のＨＦＷ２、配列番号９に記載のＨＦＷ３、および配列番号１０に記載のＨＦＷ４；または
（ｃ）配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４；または
（ｄ）配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４。
【請求項３】
前記可変軽鎖は、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた、または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域を含み、ここで特に可変軽鎖は以下を含む、請求項１または２に記載の抗体、またはその機能的断片：
（ａ）配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、および配列番号４４に記載のＬＦＷ３；または
（ｂ）配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３。
【請求項４】
前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を示し、前記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を示し、特に
ここで前記可変重鎖は、配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、および配列番号４４に記載のＬＦＷ３を含む、または
ここで前記可変重鎖は、配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、および配列番号４４に記載のＬＦＷ３を含む、
請求項１に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項５】
前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を示し、前記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を示し、特に
ここで前記可変重鎖は、配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３を含む、または
ここで前記可変重鎖は、配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３を含む、
請求項１に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項６】
前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示し、前記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示し、特に
ここで前記可変重鎖は、配列番号２に記載のＨＦＷ１、配列番号３に記載のＨＦＷ２、配列番号４に記載のＨＦＷ３、および配列番号５に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、および配列番号４４に記載のＬＦＷ３を含む、または
ここで前記可変重鎖は、配列番号７に記載のＨＦＷ１、配列番号８に記載のＨＦＷ２、配列番号９に記載のＨＦＷ３、および配列番号１０に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、および配列番号４４に記載のＬＦＷ３を含む、
請求項１に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項７】
前記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示し、前記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性の配列同一性を示し、特に
ここで前記可変重鎖は、配列番号２に記載のＨＦＷ１、配列番号３に記載のＨＦＷ２、配列番号４に記載のＨＦＷ３、および配列番号５に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３を含む、または
ここで前記可変重鎖は、配列番号７に記載のＨＦＷ１、配列番号８に記載のＨＦＷ２、配列番号９に記載のＨＦＷ３、および配列番号１０に記載のＨＦＷ４を含み；前記可変軽鎖は、配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３を含む、
請求項１に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項８】
前記ＣＤＲ領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、
（ｉ）対象抗原に対する特異性を有する親の非ヒト抗体由来、特に親のウサギ抗体または親のげっ歯類抗体由来、特に親のマウスまたはラット抗体由来のＣＤＲ領域  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）ＶΚドメインを含む親のヒトまたはヒト化抗体由来の、特に治療用に承認された、または市販されている抗体由来のＣＤＲ領域  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＣＤＲ領域由来の、ＣＤＲ領域  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、特に一つまたは複数の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＣＤＲ領域の最適化により得られるＣＤＲ領域；ならびに
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）に記載の一つまたは複数のＣＤＲ領域に置換されるＣＤＲ領域、
から独立して選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片、および任意に薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片をコードする、核酸配列または核酸配列のコレクション。
【請求項１１】
請求項１０の核酸配列または核酸配列のコレクションを含むベクターまたはベクターのコレクション。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸配列もしくは核酸配列のコレクション、または請求項１１に記載のベクターもしくはベクターのコレクションを発現する工程を含む、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片を産生する方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、非ヒト抗体、特にウサギまたはげっ歯類抗体をヒト化する方法：
（ａ）一つまたは複数の工程で、前記非ヒト抗体の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ、および可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲをコードする核酸配列を、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、ただしここで前記非ヒト抗体の少なくともＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３がクローニングされ、任意でＶＨ  ＣＤＲ２および／またはＶＬ  ＣＤＲ１、特にＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１の両方のクローニングをさらに含み、任意でＶＨ  ＣＤＲ１および／またはＶＬ  ＣＤＲ２、特にＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２の両方のクローニングをさらに含む、
任意で以下の一つまたは複数の工程をさらに含む：
（ａａ）非ヒト動物、特にウサギまたはげっ歯類の、目的の抗原による免疫化；および
（ａｂ）少なくとも一つの目的の抗体の分離
任意で以下の一つまたは複数の工程をさらに含む：
（ａｃ）特に経口活性化セルソーティングを使用した目的の抗原と相互作用する、親和性成熟記憶Ｂ細胞のクローン単離；
（ａｄ）単一Ｂ細胞クローンの不死化を必要としない共培養システムでの単一Ｂ細胞の培養；
（ａｅ）目的の抗原に結合する少なくとも一つの抗体を同定するための、細胞ベースのＥＬＩＳＡでのＢ細胞培養上清のスクリーニング；および／または
（ａｆ）ヒト抗体ＶＨドメインをコードする核酸配列への、少なくとも一つの抗体のＶＨ  ＣＤＲのクローニング。
特に、
ここで、前記非ヒト抗体のフレームワーク領域は、ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、ＶＨ４（配列番号２１）、およびＶＨ４mut（配列番号２６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）およびＶΚ３（配列番号５１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する、または
ここで前記非ヒト抗体のフレームワーク領域は、以下に対してともに最高の相同性を有する
（ｉ）ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）、ＶΚ２（配列番号４６）、ＶΚ３（配列番号５１）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせのフレームワーク領域；または
（ｉｉ）ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ４（配列番号２１）、ＶＨ４mut（配列番号２６）、ＶＨ５（配列番号３１）、およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域、または
ここで、前記非ヒト抗体のフレームワーク領域は、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号７９）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する。
【請求項１４】
目的の親抗体を最適化する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）一つまたは複数の工程で、前記親抗体のＶＨ  ＣＤＲ、およびＶＬ  ＣＤＲをコードする核酸配列を、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、ただしここで前記親抗体の少なくともＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３がクローニングされ、任意でＶＨ  ＣＤＲ２および／またはＶＬ  ＣＤＲ１、特にＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１の両方のクローニングをさらに含み、任意でＶＨ  ＣＤＲ１および／またはＶＬ  ＣＤＲ２、特にＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２の両方のクローニングをさらに含む、
特に、
ここで、前記親抗体のフレームワーク領域は、全体的に、ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、ＶＨ４（配列番号２１）、およびＶＨ４mut（配列番号２６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）およびＶΚ３（配列番号５１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する、または
ここで、前記親抗体のフレームワーク領域は、全体的に、以下に対してともに最高の相同性を有する
（ｉ）ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）、ＶΚ２（配列番号４６）、ＶΚ３（配列番号５１）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせのフレームワーク領域；または
（ｉｉ）ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ４（配列番号２１）、ＶＨ４mut（配列番号２６）、ＶＨ５（配列番号３１）、およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域、または
ここで、前記親抗体のフレームワーク領域は、全体的に、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号７９）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する。
【請求項１５】
抗体、またはその機能的断片の多様なコレクションを生成する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）一つまたは複数の工程で、ＶＨ  ＣＤＲおよび／またはＶＬ  ＣＤＲの一つまたは複数の多様なコレクションをコードする核酸配列の、一つまたは複数の多様なコレクションを、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、任意にここでＶＨ  ＣＤＲ３の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションがクローニングされ、任意にここでＶＬ  ＣＤＲ３の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションがクローニングされ、
特に
ここで、ＶＨ  ＣＤＲ２の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクション、および／またはＶＬ  ＣＤＲ１の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションがクローニングされ、特にＶＨ  ＣＤＲ２の多様なコレクションおよびＶＬ  ＣＤＲ１の多様なコレクションの両方がクローニングされる、
ここで、ＶＨ  ＣＤＲ２の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクション、および／またはＶＬ  ＣＤＲ１の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションがクローニングされ、特にＶＨ  ＣＤＲ２の多様なコレクションおよびＶＬ  ＣＤＲ１の多様なコレクションの両方がクローニングされる、および／または
ここで、ＶＨ  ＣＤＲ１の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクション、および／またはＶＬ  ＣＤＲ２の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションがクローニングされ、特にＶＨ  ＣＤＲ１の多様なコレクションおよびＶＬ  ＣＤＲ２の多様なコレクションの両方がクローニングされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有利な特性を有する新規の抗体可変領域の組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ヒト抗体重鎖ドメイン、およびキメラヒト抗体軽鎖フレームワークとの新規な組み合わせに関し、ＶΚ由来のフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩ、およびＶλ由来のフレームワーク領域ＩＶを含み、有利な特性、たとえば高い安定性、凝集傾向の低下、および改善された結合親和性を有する。
【０００３】
最初のモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６（１９７５）  ４９５−７）の開発以来の過去４０年で、抗体は研究、診断、および治療目的のための生体分子のますます重要なクラスになってきた。当初、抗体は、対応する目的の抗原で動物を免疫化することによって排他的に得られた。非ヒト起源の抗体は研究および診断に使用できるが、治療アプローチでは、人体は非ヒト抗体を異物として認識し、非ヒト抗体原薬に対する免疫応答を引き起こし、効果を低下または無効にさせる場合がある。したがって、非ヒト抗体の免疫原性を低くするための組換え法が提起された。
【０００４】
非ヒトｍＡｂを免疫原性の低い治療薬に変換する最初の試みは、動物（たとえば、げっ歯類）可変ドメイン、およびヒト定常領域からなるキメラ抗体の操作を必要とした（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、（１９８４）  ６４３−６４６）。さらなるアプローチは、ヒト可変ドメインスキャフォールド内に相補性決定領域（ＣＤＲ）を導入することによる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１（１９８６）  ５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）  ３２３−７）、または可変ドメインを表面再処理（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）することによる（Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．ＮＡＴｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１（１９９４）  ９６９−９７３）、げっ歯類ｍＡｂのヒト化を目的とした。
【０００５】
ＣＤＲのループ移植（ｌｏｏｐ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）によるヒト化のために、ヒトアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークとの相同性に基づいて（たとえば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（１９９６）  ８９５−９０４；国際公開第２００８／１４４７５７号（ウサギ用））、または好適な安定性プロファイル（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４（２００４）  １８４−１９９）に基づいて選択される。後者の概念は、ウサギ抗体のユニバーサル可変ドメインフレームワークへのヒト化に利用されている（米国特許第８，１９３，２３５号）。
【０００６】
任意の選択されたアプローチにより得られるｍＡｂまたは機能的断片は、理想的には、ドナーｍＡｂの所望の薬力学的特性を保持しながら、薬らしい生物物理学的特性、および最小限の免疫原性を示す。ｍＡｂ、またはその機能的断片の生物物理学的特性に関して、凝集の傾向は、主に以下の３つの理由から、治療用分子の開発可能性に対する大きな懸念事項であった：
【０００７】
第一に、タンパク質凝集体は、一般に、抗薬物抗体の形成をもたらし、最終的に薬物中和抗体をもたらす宿主における免疫反応を誘発する高い可能性を示す（Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８７（２０１２）  ２５２６６−２５２７９）。
【０００８】
第二に、凝集体は、その除去のための努力の増大により、製造歩留まりに影響を与える（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８ （２００６）、 Ａｒｔｉｃｌｅ ６６）。
【０００９】
第三に、オフターゲット効果が観察される場合がある。オリゴマー形成に関する懸念は、これらの場合のオリゴマー形成は、オフターゲット効果をもたらす可能性がある、多価結合特性を有するタンパク質集塊をもたらすため、標的および構築物あたり１つの原子価のみを有する二重特異性（または多重特異性）抗体フォーマットを含む、一価結合が好適な用途ではさらに顕著である。そのような非特異的活性の例は、二重特異性抗体フォーマットの単一のＣＤ３ε結合ドメインを有する構築物の使用である。そのようなフォーマットは、たとえば、がん抗原に対するその２つの結合ドメインの１つ、および細胞傷害性Ｔ細胞を動員するその２つ目のＣＤ３ε結合ドメインと結合し得る。ＣＤ３εを介したシグナル伝達を誘導するには、一価ＣＤ３ε結合部分の架橋が必要であるため、Ｔ細胞は標的細胞の表面に結合した複数の二重特異性構築物に関与している場合にのみ刺激され、−したがって架橋分子の特性を取り入れ、−がん細胞のみに特異的なＴ細胞応答をもたらすだろう。それどころか、そのような構築物のオリゴマーは、架橋二重特異性抗体の特性を示し、したがって、がん細胞に結合していなくても細胞傷害性Ｔ細胞を活性化し、それによりＴ細胞の全身活性化をもたらす。Ｔ細胞のそのような非特異的かつ全身的な活性化は、サイトカインレベルの上昇をもたらし、有害作用を引き起こす可能性がある。
【００１０】
抗体の安定性は、生産、精製、貯蔵寿命に加えて、そして結果として、抗体治療薬の商品コストにとって非常に重要である。これらのパラメーターの一つまたは複数のわずかな改善でさえ、抗体薬の研究開発が商業的に実行可能かどうかの問題と非常に関連性がある。
【００１１】
さらに、クローニング、発現、および精製の方法が標準化されうるので、信頼性があり普遍的に適用可能なアクセプターフレームワークは、非ヒト抗体をヒト化するロバストな方法を可能にするのに有益である。
【００１２】
非ヒトｍＡｂのヒト化に関する上記の基準を満たすために、公開された方法論は、非ヒト相補性決定領域の生着のためのアクセプタースキャフォールドとしてのヒトコンセンサス可変ドメインフレームワーク配列の使用を提案している。タンパク質の各アミノ酸位置について、タンパク質の安定性に寄与する残基が進化中の生殖系列配列のプールに豊富であるという仮定に基づいて、結果として生じるヒト化可変ドメインがそれぞれの可変ドメインファミリーのヒト生殖系列配列に近いほど、安定性が高いと予想されると、一般に理解される。この概念は、Ｓｔｅｉｐｅによって記述され（Ｓｔｅｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２４０（１９９４）  １８８−９２）、Ｗｏｅｒｎによってレビューされたが（Ｗｏｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３０５（２００１）  ９８９−１０１０）、広く受け入れられており、そして幅広いアプリケーションを見出している。非限定的な例は、（ａ）非ヒト抗体のヒト化のためのコンセンサス配列可変ドメインの使用（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．ＮＡＴｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９（１９９２）  ４２８５−４２８９）；（ｂ）安定した標的結合抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング用のＣＤＲライブラリーを構築するためのコンセンサス配列可変ドメインの使用（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２９６（２０００）  ５７−８６）；および（ｃ）非コンセンサス残基をコンセンサス残基に交換することにより、抗体可変ドメインの安定性を改良する知識ベースのアプローチ（Ｓｔｅｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、  ２４０（１９９４）、  １８８−９２）である。
【００１３】
さらに、異なる可変ドメインファミリーの安定性は、最も安定な可変重ドメインであるＶＨ３で示される。重要なことに、可変軽鎖ドメインの場合、ＶΚファミリーがＶλファミリーより好適である（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、  ３２５  （２００３）  ５３１−５３）。具体的には、ＶＨ３、およびＶΚ１のヒトコンセンサス配列は、好ましい生物物理学的特性を有し（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、  ３２５  （２００３）  ５３１−５３）、非ヒト起源の抗体のヒト化のために特に好適である（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．ＮＡＴｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９  （１９９２）  ４２８５−４２８９.で使用）。
【００１４】
これに沿って、ヒトＶκ１−ＶＨ３コンセンサスフレームワークｈｕ−４Ｄ５がげっ歯類およびウサギ抗体のヒト化に使用された、いくつかの刊行物がある（Ｒａｄｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５（２０００）  １３６６８−１３６７６；国際公開第２００５／０１６９５０号；国際公開第２００８／００４８３４号）。あるいは、ｈｕ−４Ｄ５と同じファミリーに属するＶＨおよびＶＬ配列の組み合わせは、元々は組換えクローン化免疫レパートリーから得られたもので、ウサギ由来の安定したヒト化単鎖（ｓｃＦｖ）断片を生成するために使用されている（米国特許第８，２９３，２３５号；Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８５（２０１０）  ９０５４−９０６６）。
【００１５】
そのようなフレームワークをさらに最適化するために、ＶΚ軽鎖からのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩおよびＶλ軽鎖からのフレームワーク領域ＩＶを含む、キメラヒト抗体軽鎖ドメインは、有利な特性、たとえば高い安定性および凝集傾向の低下を有することが同定された（国際公開第２０１４／２０６５６１号）。
【００１６】
しかし、特定のウサギ抗体については、ＶΚ１／ＶＨ３の組み合わせの使用は、ドナーフレームワーク位置の生着を必要とするヒト化可変ドメインの抗原結合親和性の著しい減少と関連していた。ウサギ可変ドメインに対するＶΚ１／ＶＨ３の組み合わせの全体的な相同性は最大に見えるが、他の組み合わせがウサギＣＤＲの生着をよりよくサポートするであろうことを排除することはできない。
【００１７】
したがって、非ヒト抗体からヒト化抗体原薬を得る問題に対処するための多くの試みが既になされているという事実にもかかわらず、有利な特性、たとえば高い安定性、凝集傾向の低下、および改善された結合親和性を有する新規のヒト抗体ドメイン、または抗体ドメインの組み合わせを開発する大きな満たされていないニーズが依然として残っている。ここで、ヒト抗体フレームワークは、可能な限り免疫原性配列を作成するリスクを減らすために、天然に存在する配列と比較した場合、できるだけ少ない突然変異を含み、理想的には突然変異を含まない。そのような安定したヒトフレームワークは、たとえばループ移植により、または単に親抗体および安定したフレームワークの間で安定性寄与成分を交換することにより、完全ヒト抗体またはその断片を安定化するために使用することもできる。
【００１８】
本発明により提供されるこの問題の解決策、すなわち、ＶΚからのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩおよびＶλからのフレームワーク領域ＩＶを含む、有利な特性、たとえば高い安定性、凝集傾向の低下、および改善された結合親和性を有する、ＶＨドメインおよびキメラヒト抗体軽鎖ドメインの新規な組み合わせは、従来技術ではこれまでに達成も示唆もされていない。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、ＶΚからのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩおよびＶλからのフレームワーク領域ＩＶを含む、有利な特性、たとえば高い安定性、凝集傾向の低下、最小限の免疫原性、および改善された結合親和性を有する、特定のＶＨドメインおよび特定のキメラヒト抗体軽鎖ドメインの新規な組み合わせに関する。
【００２０】
したがって、第一の態様では、本発明は、以下を含む抗体またはその機能的断片に関する：
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、ここで：
（ｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して；または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す；および
（ｉｉ）上記ＬＦＷ４は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列である、可変軽鎖；
ならびに、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、
ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８２％の配列同一性、または配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも７５％の配列同一性を示す、可変重鎖。
【００２１】
代替の態様では、本発明は、以下を含む抗体またはその機能的断片に関する：
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、ここで：
（ｉｉｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して；または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す；および
（ｉｖ）上記ＬＦＷ４は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列である、可変軽鎖；
ならびに、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、
ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、または配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは９５％の配列同一性を示す、可変重鎖。
【００２２】
第二の態様では、本発明は、本発明の抗体、またはその機能的断片、および任意に薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
第三の態様では、本発明は、本発明の抗体、またはその機能的断片をコードする、核酸配列または核酸配列のコレクションに関する。
【００２４】
第四の態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸配列のコレクションを含むベクターまたはベクターのコレクションに関する。
【００２５】
第五の態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸配列のコレクション、または本発明のベクターまたはベクターのコレクションを含む、宿主細胞、具体的には発現宿主細胞に関する。
【００２６】
第六の態様では、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列のコレクション、または本発明のベクターもしくはベクターのコレクション、または本発明の宿主細胞、具体的には発現宿主細胞を発現する工程を含む、本発明の抗体、またはその機能的断片を産生する方法に関する。
【００２７】
第七の態様では、本発明は、以下の工程を含む、非ヒト抗体、具体的にはウサギまたはげっ歯類抗体をヒト化する方法に関する。
（ａ）一つまたは複数の工程で、上記非ヒト抗体の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ、および可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲをコードする核酸配列を、本発明に記載の抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、ただしここで上記非ヒト抗体の少なくともＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３がクローニングされる。
【００２８】
第八の態様では、本発明は、目的の親抗体を最適化する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）一つまたは複数の工程で、上記親抗体のＶＨ  ＣＤＲ、およびＶＬ  ＣＤＲをコードする核酸配列を、本発明に記載の抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、ただしここで上記親抗体の少なくともＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３がクローニングされる。
【００２９】
第九の態様では、本発明は、抗体、またはその機能的断片の多様なコレクションを生成する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）一つまたは複数の工程で、ＶＨ  ＣＤＲおよび／またはＶＬ  ＣＤＲの一つまたは複数の多様なコレクションをコードする核酸配列の、一つまたは複数の多様なコレクションを、本発明に記載の抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、λキャップされた（λ−ｃａｐｐｅｄ；上半分）またはキャップされていない（ｕｎｃａｐｐｅｄ；すなわちＶｋフレームワークＩＶを含む；下半分、灰色）、ＶΚ１、ＶΚ２、及びＶΚ３コンセンサス可変軽鎖がＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、およびＶＨ６コンセンサス可変重鎖ドメインと組み合わされて、この研究で調査された４２のコンストラクトにつながることを示している。
【図２】図２は、キャップされていない（灰色のバー）対照物と比較した、キャップされた（白いバー）フレームワークバリアントの発現収率を示す。
【図３】図３は、ｐＨ値が３．５〜７．５の範囲で０．１５  ＭのＮａＣｌを含む、５つのリン酸塩−クエン酸塩緩衝液で測定された、キャップされたフレームワークバリアント（白い棒）およびキャップされていないフレームワーク対象物（灰色の棒）の示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によって決定された平均熱変性温度（Ｔｍ）を示す。
【図４Ａ】図４は、キャップされたバリアント（白い棒）およびキャップされていないバリアント（グレーの棒）の、３７℃および１０  ｍｇ／ｍＬで２週間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣにより測定された正規化された（初期モノマー含有量に対する）モノマー含有量の比較を示す。（図４Ａ）。キャップされたバリアントＶΚ１／ＶＨ３の参照サンプルは、キャップされていないバリアントと比較して、モノマー含量の減少が３９％少ないことを示した。下線付きの値は、インキュベーション中のキャップされていない対照物と比較して、参照ＶΚ１／ＶＨ３生殖細胞系の組み合わせよりもモノマー損失が少ないフレームワークの組み合わせを示す。キャップされたフレームワークバリアント（白い棒）およびキャップされていないフレームワークバリアント（灰色の棒）のモノマー含有率（％）を図４Ｂに示す。いくつかのフレームワークは、基準線（ＶΚ１／ＶＨ３）で示されるように、参照よりもモノマー含有量の損失が少ないことを示す。
【図４Ｂ】図４は、キャップされたバリアント（白い棒）およびキャップされていないバリアント（グレーの棒）の、３７℃および１０  ｍｇ／ｍＬで２週間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣにより測定された正規化された（初期モノマー含有量に対する）モノマー含有量の比較を示す。（図４Ａ）。キャップされたバリアントＶΚ１／ＶＨ３の参照サンプルは、キャップされていないバリアントと比較して、モノマー含量の減少が３９％少ないことを示した。下線付きの値は、インキュベーション中のキャップされていない対照物と比較して、参照ＶΚ１／ＶＨ３生殖細胞系の組み合わせよりもモノマー損失が少ないフレームワークの組み合わせを示す。キャップされたフレームワークバリアント（白い棒）およびキャップされていないフレームワークバリアント（灰色の棒）のモノマー含有率（％）を図４Ｂに示す。いくつかのフレームワークは、基準線（ＶΚ１／ＶＨ３）で示されるように、参照よりもモノマー含有量の損失が少ないことを示す。
【図５】図５は、キャップされたフレームワークバリアント（白い棒）およびキャップされていないフレームワーク対照物（灰色の棒）について、３７℃で２週間１０  ｍｇ／ｍＬで保存した場合のＴＮＦ特異的制御分子のモノマー含量の絶対％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本開示は、ＶΚからのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩおよびＶλからのフレームワーク領域ＩＶを含む、有利な特性、たとえば高い安定性、凝集傾向の低下、最小限の免疫原性、および改善された結合親和性を有する、特定のＶＨドメインおよび特定のキメラヒト抗体軽鎖ドメインの新規な組み合わせを含む、抗体およびその断片に関する。驚くべきことに、ヒト化コンセンサス（ｉ）ＶΚ１またはＶΚ３からのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩ、および（ｉｉ）Ｖλからのフレームワーク領域ＩＶ、および（ｉｉｉ）特異性および抗原結合親和性を完全に保持しながら、ＶΚ１／ＶＨ３（キャップされた、またはキャップされていない）と比較して、少なくとも同等または優れた生物物理特性を示す、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、またはＶＨ４重鎖ドメイン、のコンビナトリアルペア（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐａｉｒ）を含むヒト可変ＶＬ／ＶＨコンセンサスフレームワークの組み合わせが見出された。本発明者らはさらに、ＶＨ４の特定のフレームワーク位置（Ｔ２４ＫおよびＴ８４Ｓ）に２つの突然変異を導入すると、生物物理学的特性が改善されるだけでなく、親和性も改善されることを実証した。さらに、本発明者らは、最適なＶＨおよびＶＬフレームワークの組み合わせの選択に加えて、ＶＬコンセンサスドメインへの特定のλキャップ（ｓｋ１７、配列番号６３）の組み込みも、それぞれの抗体またはその機能的断片の生物物理学的特性のさらなる改善につながることを初めて実証した。驚いたことに、ｓｋ１７を含む抗体の保存性と熱安定性が向上するだけでなく、親和性も向上することが見出された。
【００３２】
したがって、第一の態様では、本発明は、以下を含む抗体またはその機能的断片に関する：
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、ここで：
（ｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して；または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す；および
（ｉｉ）上記ＬＦＷ４は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列である、可変軽鎖；
ならびに、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、
ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８２％の配列同一性、または配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも７５％の配列同一性を示す、可変重鎖。
【００３３】
本開示によれば、配列番号４１によるＶΚ１配列から取られたフレームワーク領域は、それぞれ配列番号４２、４３、４４および４５で示されるＬＦＷ１’、ＬＦＷ２’、ＬＦＷ３’およびＬＦＷ４’である。配列番号５１によるＶΚ３配列から取られたフレームワーク領域は、それぞれ配列番号５２、５３、５４および５５で示されるＬＦＷ１’、ＬＦＷ２’、ＬＦＷ３’およびＬＦＷ４’である。配列番号２１によるＶＨ４配列から取られたフレームワーク領域は、それぞれ配列番号２２、２３、２４および２５で示されるＬＦＷ１’、ＬＦＷ２’、ＬＦＷ３’およびＬＦＷ４’である。配列番号２６によるＶＨ４配列から取られたフレームワーク領域は、それぞれ配列番号２７、２８、２９および３０で示されるＬＦＷ１’、ＬＦＷ２’、ＬＦＷ３’およびＬＦＷ４’である。配列番号１によるＶＨ１Ａ配列から取られたフレームワーク領域は、それぞれ配列番号２、３、４および５で示されるＬＦＷ１’、ＬＦＷ２’、ＬＦＷ３’およびＬＦＷ４’である。配列番号６によるＶＨ１Ａ配列から取られたフレームワーク領域は、それぞれ配列番号７、８、９および１０で示されるＬＦＷ１’、ＬＦＷ２’、ＬＦＷ３’およびＬＦＷ４’である。
【００３４】
そのような態様の特定の実施形態では、ＨＦＷ４領域は、（ｉ）ヒト重鎖生殖系列Ｊセグメントに含まれる配列、または（ｉｉ）再編成されたヒトＶＨ配列に含まれる配列を有する。特定の実施形態では、ＨＦＷ４配列はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ、またはＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳに対して少なくとも７０%、少なくとも８０%、または少なくとも９０%の配列同一性を示す配列である。
【００３５】
代替の態様では、本発明は、以下を含む抗体またはその機能的断片に関する：
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、ここで：
（ｖ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して；または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す；および
（ｖｉ）上記ＬＦＷ４は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列である、可変軽鎖；
ならびに、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、
ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、または配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは９５％の配列同一性を示す、可変重鎖。
【００３６】
一つの実施形態では、本発明は、以下を含む抗体またはその機能的断片に関する：
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示し、ここで：
（ｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して；または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、たとえば少なくとも９７％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも８６％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示す；および
（ｉｉ）上記ＬＦＷ４は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列である、可変軽鎖；
ならびに、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示し、
ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって
（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の相同性を示す；または
（ｉｉ）配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９６％の相同性を示す；または
（ｉｉｉ）配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の相同性を示す、可変重鎖。
【００３７】
特定のそのような実施形態では、ＨＦＷ４領域は、（ｉ）ヒト重鎖生殖系列Ｊセグメントに含まれる配列、または（ｉｉ）再編成されたヒトＶＨ配列に含まれる配列を有する。特定の実施形態では、ＨＦＷ４配列はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ、またはＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を示す配列である。
【００３８】
代替の実施形態では、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって以下を示す。
（ｉｖ）配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の相同性を示す；または
（ｖ）配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９６％の相同性を示す；または
（ｖｉ）配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、ならびに任意に、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を示す。
【００３９】
本発明の文脈において、用語「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＹまたはＩｇＤ（またはそのサブクラス）に属するタンパク質として定義される「免疫グロブリン」（Ｉｇ）の同義語として使用され、そして従来から知られているすべての抗体を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）、および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化できる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ、および４つのＦＷからなる：ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−ＦＷ４。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。
【００４０】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体、またはその組換えバリアントの少なくとも一部を指し、用語「機能的断片」または「機能的抗体断片」は、機能抗体断片の標的、たとえば抗原への認識および特異的結合を付与するのに十分な、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、たとえばインタクトな抗体の抗原決定可変領域を含む抗体断片を指す。機能的抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、線形抗体、単一ドメイン抗体、たとえばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、および抗体断片、たとえば２つ以上の、たとえばヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメント、または２つ以上の、たとえば連結された抗体の２つの分離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合フラグメントを含む二価フラグメントから形成された多重特異性分子が含まれるが、これらに限定されない。抗体断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込むこともできる（例：Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６，  ２００５）。抗体断片は、ポリペプチド、たとえばフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）に基づいてスキャフォールドに移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載した米国特許第６，７０３，１９９号を参照）。抗体の「抗原結合領域」または「抗原結合ドメイン」は通常、抗体の一つまたは複数の超可変領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域に見られる。ただし、可変の「フレームワーク」領域も、ＣＤＲのスキャフォールドを提供する等して、抗原結合にも重要な役割を果たす。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例：エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。用語「抗体」には、たとえば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、またはキメラ抗体が含まれる。抗体は、任意のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
【００４１】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、  ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム)、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、  （１９９７）  ＪＭＢ  ２７３、  ９２７−９４８  （「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ、  Ｍ.−Ｐ．、  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２−１３６（１９９９）；  Ｌｅｆｒａｎｃ、  Ｍ.−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５−７７（２００３） （「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）によって記載されたもの、を含む、多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定された境界を有するアミノ酸配列である。たとえば、古典的な形式の場合、Ｋａｂａｔでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基に３１−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、および９５−１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられる；および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基には、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、および８９−９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基に２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５２−５６（ＨＣＤＲ２）、および９５−１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられる；および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸残基には、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、および８９− ９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲはヒトＶＨのアミノ酸残基２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、および９５−１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬのアミノ酸残基２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、および８９−９７（ＬＣＤＲ３）で構成される。ＩＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基には約２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５１−５７（ＨＣＤＲ２）および９３−１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基には約２７−３２（ＬＣＤＲ１）、５０−５２（ＬＣＤＲ２）、および８９−９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられる（「Ｋａｂａｔ」によるナンバリング）。ＩＭＧＴでは、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを使用して抗体のＣＤＲを決定できる。
【００４２】
本発明の文脈において、特に言及しない限り、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎにより提案されたナンバリングシステムが使用される（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９  （２００１）  ６５７−６７０）。さらに、以下の残基がＣＤＲとして定義される（ＡＨｏのナンバリングスキームによる）：ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１とも呼ばれる）：Ｌ２４−Ｌ４２；  ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ−Ｌ２とも呼ばれる）：Ｌ５８−Ｌ７２；  ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｌ３とも呼ばれる）：Ｌ１０７−Ｌ１３８；  ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１とも呼ばれる）：Ｈ２７−Ｈ４２；  ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ−Ｈ２とも呼ばれる）：Ｈ５７−Ｈ７６；  ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３とも呼ばれる）：Ｈ１０８−Ｈ１３８。明確にするために、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリングシステムは、異なるＶＨおよびＶＬサブファミリーの両方、および特にＣＤＲで天然に存在する抗体に見られる長さの多様性を考慮し、配列にギャップを設けている。したがって、通常、所定の抗体可変ドメインでは、１〜１４９位のすべてがアミノ酸残基で占められているわけではない。明確にするために、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリングシステムによるフレームワーク領域は次のとおりである：可変軽鎖の場合、ＬＦＷ１（またはＶＬフレームワーク領域Ｉ）：Ｌ１−Ｌ２３；  ＬＦＷ２（またはＶＬフレームワーク領域ＩＩ）：Ｌ４３−Ｌ５７；  ＬＦＷ３（またはＶＬフレームワーク領域ＩＩＩ）：Ｌ７３−Ｌ１０６；およびＬＦＷ４（またはＶＬフレームワーク領域ＩＶ）：Ｌ１３９−Ｌ１４９；  そして、可変重鎖の場合、ＨＦＷ１（またはＶＨフレームワーク領域Ｉ）：Ｌ１−Ｌ２６；  ＨＦＷ２（またはＶＨフレームワーク領域ＩＩ）：Ｌ４３−Ｌ５６；  ＨＦＷ３（またはＶＨフレームワーク領域ＩＩＩ）：Ｌ７７−Ｌ１０７；およびＨＦＷ４（またはＶＨフレームワーク領域ＩＶ）：Ｌ１３９−Ｌ１４９。
【００４３】
好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸残基４〜１４９および可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸残基５〜１４４（それぞれの場合、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３〜１４９およびＶＨの４〜１４６を含み、そして特に好ましくは完全なＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１〜１４９およびＶＨの１〜１４９）である。フレームワーク領域およびＣＤＲを表７に示す。本発明で使用するための免疫グロブリンの好適なクラスはＩｇＧである。本発明の「機能的断片」には、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ断片、ＦｖおよびｓｃＦｖのドメインが含まれる。Ｆ（ａｂ’）2またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化または完全に除去するように設計されている。本発明の抗体またはその機能的断片は、段落［００８３］から［００８７］にさらに記載されているように、二機能性または多機能性構築物の一部であってもよい。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「ＶＨ」（可変重鎖）、「ＶΚ」および「Ｖλ」は、配列同一性および相同性に従ってグループ化される抗体重鎖および軽鎖配列のファミリーを指す。たとえば、相同性検索マトリックス、たとえばＢＬＯＳＵＭ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ｇ．、  Ｐｒｏｃ．  ＮＡＴｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９  （１９９２）  １０９１５−１０９１９）を使用した配列相同性の決定方法、および相同性による配列のグループ化は、当業者に周知である。たとえば、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、およびＶＨ２〜ＶＨ６のＶＨ、ＶΚ１〜ＶΚ４のＶΚ、およびＶλ１〜Ｖλ３のVλをグループ化する、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６  （２０００）  ５７−８６に示すように、ＶＨ、ＶΚ、およびＶλの異なるサブファミリーを識別できる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、抗体ＶΚ鎖、Ｖλ鎖、およびＶＨ鎖は、それぞれ生殖系列Κ鎖ＶおよびＪセグメント、生殖系列λ鎖ＶおよびＪセグメント、および重鎖Ｖ、ＤおよびＪセグメントのランダムな再配置の結果である。所与の抗体可変鎖がどのサブファミリーに属するかは、対応するＶセグメントによって、そして特にフレームワーク領域ＦＷ１〜ＦＷ３によって決定される。したがって、フレームワーク領域ＨＦＷ１〜ＨＦＷ３の特定のセットのみによって本願において特徴付けられる、任意のＶＨ配列は、任意のＨＦＷ４配列、たとえば重鎖生殖細胞系Ｊセグメントの１つからとられたＨＦＷ４配列、または再配置されたＶＨ配列からとられたＨＦＷ４配列と組み合わせることができる。特定の実施形態では、ＨＦＷ４配列はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００４５】
好適には、本発明の抗体または機能的断片は、単離された抗体またはその機能的断片である。本明細書で使用される用語「単離抗体」は、その起源または操作により、（ｉ）発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞に存在する、または（ｉｉ）自然界で結合しているもの以外のタンパク質または他の化学成分に結合している、または（ｉｉｉ）天然では発生しない、ポリペプチド、またはそのタンパク質を意味する。「単離された」とは、さらに以下のタンパク質を意味する：（ｉ）化学的に合成された；または、（ｉｉ）宿主細胞内で発現され、そしてゲルクロマトグラフィー等により、関連タンパク質から生成される。用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体も指す（たとえば、ＩＬ２３Ｒに特異的に結合する単離抗体は、ＩＬ２３Ｒ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ＩＬ２３Ｒに特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、たとえば他の種のＩＬ２３Ｒ分子と交差反応する可能性がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質、および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００４６】
「親和性」は、単一の結合部位または分子、たとえば抗体またはその機能的断片と、その結合パートナー、たとえば抗原との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用する「結合親和性」は、結合ペアのメンバー間の１：１相互作用、たとえば単一抗体結合ドメインとその抗原の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般に、親和性は解離定数（ＫD）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。
【００４７】
以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列関係を記述するために使用される：「配列同一性」または「配列同一性の割合」、および「配列相同性」または「配列相同性の割合」。本明細書で使用される用語「配列同一性」は、２つのポリペプチド配列間で同一であるアミノ酸残基の最大数を計算することにより決定され、ここで最大の程度の配列重複を許容するためにギャップおよび／または挿入が考慮されうる。たとえば、完全に同一の２つの１００ｍｅｒポリペプチドの配列同一性は１００％である。それらが１つの変異で異なる場合、つまり１つのポリペプチドが１つのアミノ酸の欠失を含む場合、配列同一性は９９％である（１００の位置のうち９９が同一である）。換言すると、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ（ｔｈｅ  ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）上で最適にアラインメントした２つの配列を比較し、一致する位置の数を得るために、両方の配列で同一の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、そして結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることで計算される。「配列相同性」とは、２つの配列を比較するときの類似の度合いである。必要または望ましい場合、比較のための配列の最適なアラインメントは、たとえば、スミスとウォーターマンの局地的相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１））、ニードルマンとブンシュの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−５３  （１９７０））、ペアソンとリップマンの相同性検索法（Ｐｒｏｃ．  ＮＡＴｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４−４８  （１９８８））、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）（一般的には、オースベルらのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  ４ｔｈ  ｅｄ．、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）を参照）によって導くことができる。本明細書で特に断りのない限り、本明細書で言及される配列相同性の程度は、デイホフＰＡＭ行列の利用によって決定される（Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ、  Ｒ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ、  Ｂ．Ｃ．  Ｏｒｃｕｔｔ：  Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、  ｐａｇｅｓ  ３４５−３５２；  ｉｎ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、  １９７９）。
【００４８】
一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％の配列同一性を示す。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す。
【００４９】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の配列相同性、好ましくは少なくとも９３％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示す。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は、一緒になって配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列相同性、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の相同性を示す。
【００５０】
一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列相同性、好ましくは少なくとも９３％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示す。
【００５１】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示す。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性を示す。
【００５２】
別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示す。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示す。一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示し、ここで上記可変重鎖は、２つの変異Ｔ２４ＫおよびＴ８４Ｓ（配列番号２６を参照）を含む。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示し、ここで上記可変重鎖は、２つの変異Ｔ２４ＫおよびＴ８４Ｓ（配列番号２６を参照）を含む。別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示し、ここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示し、ここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２６に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示し、好ましくはここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２６に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示し、好ましくはここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。
【００５４】
一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示す。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示す。さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示し、ここで上記可変重鎖は、２つの変異Ｔ２４ＫおよびＴ８４Ｓ（配列番号２６を参照）を含む。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示し、ここで上記可変重鎖は、２つの変異Ｔ２４ＫおよびＴ８４Ｓ（配列番号２６を参照）を含む。別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示し、ここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示し、ここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。
【００５５】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号２６に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％の配列相同性、たとえば少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、好ましくはここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。あるいは、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、配列番号２６に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも９０％の配列相同性、たとえば少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、好ましくはここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）。
【００５６】
一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性を示す。
【００５７】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８６％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性を示す。
【００５８】
別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性を示す。
【００５９】
さらなる実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８６％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示す。
【００６０】
一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＬＦＷ４を含む可変軽鎖を含み、ここで上記ＬＦＷ４領域は、配列番号６３と少なくとも９０％同一であるＶλベースの配列である。好適には、上記ＬＦＷ４領域は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列である。好適な実施形態では、上記ＬＦＷ４領域は、配列番号６３に記載の配列である。
【００６１】
好適には、抗体重鎖および軽鎖のＬＦＷ４領域の両方がＣｙｓ変異を含む場合、鎖間ジスルフィド結合の形成により、対応する抗体の生物物理学的特性をさらに改善する。特定の実施形態では、抗体重鎖はＣｙｓ変異Ｇ５１Ｃ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）を含む。特定の実施形態では、上記ＬＦＷ４領域は配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列である。一つの実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、以下を含む：
（ａ）配列番号７９、または配列番号８０に記載のＬＦＷ４を含む可変軽鎖；ならびに、
（ｂ）ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖であって、ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は、一緒になって（ｉ）配列番号２６に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性；または（ｉｉ）配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７%の配列同一性；または（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５%の配列同一性；を示し、ここで上記可変重鎖は、ＡＨｏ位置５１にシステインを含む（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによるナンバリング）、可変重鎖。
【００６２】
上記（ｂ）に示された実施形態の実施形態では、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は、一緒になって配列番号２１、配列番号２６、配列番号１、および配列番号６のＶＨ配列の対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列相同性を示す。
【００６３】
好適な実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は、一緒になって配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す。そのような好適な実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は、一緒になって配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８６％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示す。
【００６４】
好適な実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は、一緒になって配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８１％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す。そのような好適な実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変軽鎖を含み、ここで上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は、一緒になって配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８６％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示す。
【００６５】
好適な実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列、配列番号２１に記載のＶＨ４配列、または配列番号２６に記載のＶＨ４mut配列から得られたＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域を含む可変重鎖を含む。好適には、本発明の抗体の可変重鎖は以下を含む：
（ａ）配列番号２に記載のＨＦＷ１、配列番号３に記載のＨＦＷ２、配列番号４に記載のＨＦＷ３、および配列番号５に記載のＨＦＷ４；または
（ｂ）配列番号７に記載のＨＦＷ１、配列番号８に記載のＨＦＷ２、配列番号９に記載のＨＦＷ３、および配列番号１０に記載のＨＦＷ４；または
（ｃ）配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４；または
（ｄ）配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４。
【００６６】
好適な実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた、または配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域を含む可変軽鎖を含む。好適には、本発明の抗体の可変軽鎖は、以下を含む：
（ａ）配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、および配列番号４４に記載のＬＦＷ３；または
（ｂ）配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３。
【００６７】
特定の実施形態では、上記抗体またはその機能的断片は、以下に示すフレームワーク配列を有する：
（ａ）上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、たとえば少なくとも９３％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に、
（ｉ）ここで可変重鎖は配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４を含み、そして可変軽鎖は配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｉｉ）ここで可変重鎖は配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含み、そして可変軽鎖は配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｂ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、たとえば少なくとも９３％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９５％、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷは、Ｖλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
（ｉ）ここで可変重鎖は配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４を含み、そして可変軽鎖は配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｉｉ）ここで可変重鎖は配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含み、そして可変軽鎖は配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｃ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％、および任意で少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性の配列相同性を示し、そしてここで上記可変重鎖はＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含み、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４はＶλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
ここで上記可変重鎖は配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含み；上記可変軽鎖は、配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｄ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも８４％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、たとえば少なくとも９３％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９３％の配列相同性を示し、そしてここで上記可変重鎖はＡＨｏ位置２４にリジン、ＡＨｏ位置８４にセリンを含み、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９５％、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４はＶλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
ここで上記可変重鎖は配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含み；上記可変軽鎖は、配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｅ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％の配列相同性、たとえば少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４はＶλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
上記可変重鎖は配列番号２に記載のＨＦＷ１、配列番号３に記載のＨＦＷ２、配列番号４に記載のＨＦＷ３、および配列番号５に記載のＨＦＷ４を含み、そして上記可変軽鎖は配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｆ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％の配列相同性、たとえば少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９５％、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４はＶλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
上記可変重鎖は配列番号２に記載のＨＦＷ１、配列番号３に記載のＨＦＷ２、配列番号４に記載のＨＦＷ３、および配列番号５に記載のＨＦＷ４を含み、そして上記可変軽鎖は配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｇ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号４１に記載のＶΚ１配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４はＶλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
上記可変重鎖は配列番号７に記載のＨＦＷ１、配列番号８に記載のＨＦＷ２、配列番号９に記載のＨＦＷ３、および配列番号１０に記載のＨＦＷ４を含み、そして上記可変軽鎖は配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む；または
（ｈ）ここで、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５１に記載のＶΚ３配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、および任意で少なくとも８６％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９６％の配列相同性を示し、そしてここで上記ＬＦＷ４はＶλベースの配列であり、配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３、配列番号７９、または配列番号８０に記載の配列であり、より好ましくは上記ＬＦＷ４は配列番号６３に記載の配列であり；
特に：
上記可変重鎖は配列番号７に記載のＨＦＷ１、配列番号８に記載のＨＦＷ２、配列番号９に記載のＨＦＷ３、および配列番号１０に記載のＨＦＷ４を含み、そして上記可変軽鎖は配列番号５２に記載のＬＦＷ１、配列番号５３に記載のＬＦＷ２、および配列番号５４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む。
【００６８】
上記（ａ）〜（ｈ）に示された実施形態の代替実施形態では、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、それぞれのＶＨ配列の対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性を示し、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、たとえば少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示す。
【００６９】
好適には、本発明の抗体、またはその機能的断片は、以下を含む。
（ａ）可変軽鎖、
ここで、可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＬＦＷ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＷ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＷ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＷ４を含み、ここで各ＬＦＷは軽鎖フレームワーク領域を示し、および各ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を示す、
（ｂ）可変重鎖、
ここで、可変重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までの領域ＨＦＷ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＷ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＷ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＷ４を含み、ここで各ＨＦＷは重鎖フレームワーク領域を示し、および各ＨＣＤＲは重鎖相補性決定領域を示す、
そしてここで：
（ｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列および配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９３％の配列同一性、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも９５％の配列相同性を示し、そしてここで
●上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し；そして
●上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、かつ配列番号６３と少なくとも９０％同一であり；そして
●上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す；または
（ｉｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列および配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも９２％の配列相同性を示し、そしてここで
●上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し；そして
●上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、かつ配列番号６３と少なくとも９０％同一であり；そして
●上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す；または
（ｉｉｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列および配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも７５％の配列同一性、たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列相同性を示し、そしてここで
●上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号５７に記載のＶΚ１／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し；そして
●上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、かつ配列番号６３と少なくとも９０％同一であり；そして
●上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す；または
（ｉｖ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列および配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８５％の配列同一性、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも８０％の配列相同性、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列相同性を示し、そしてここで
●上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し；そして
●上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、かつ配列番号６３と少なくとも９０％同一であり；そして
●上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号１に記載のＶＨ１Ａ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す；または
（ｖ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列および配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも９０％の配列同一性、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％の配列相同性、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列相同性を示し、そしてここで
●上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し；そして
●上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、かつ配列番号６３と少なくとも９０％同一であり；そして
●上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６に記載のＶＨ１Ｂ配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す；または
（ｖｉ）上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列および配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性、たとえば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性、および任意で少なくとも７５％の配列相同性、たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列相同性を示し、そしてここで
●上記ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、およびＬＦＷ３領域は一緒になって、配列番号６１に記載のＶΚ３／ｓｋ１７配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し；そして
●上記ＬＦＷ４は、Ｖλベースの配列であり、かつ配列番号６３と少なくとも９０％同一であり；そして
●上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、およびＨＦＷ４領域は一緒になって、配列番号２１に記載のＶＨ４配列から得られた対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性を示す
【００７０】
上記（ｉ）〜（ｖｉ）に示された実施形態の代替実施形態では、上記ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、およびＨＦＷ３領域は一緒になって、それぞれのＶＨ配列の対応するフレームワーク領域に対して、少なくとも８２％、たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列同一性を示し、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、および任意で少なくとも９０％、たとえば少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を示す。
【００７１】
好適な実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は、配列番号２２に記載のＨＦＷ１、配列番号２３に記載のＨＦＷ２、配列番号２４に記載のＨＦＷ３、および配列番号２５に記載のＨＦＷ４を含む可変重鎖；ならびに配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む可変軽鎖を含む。より好適な実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片は、配列番号２７に記載のＨＦＷ１、配列番号２８に記載のＨＦＷ２、配列番号２９に記載のＨＦＷ３、および配列番号３０に記載のＨＦＷ４を含む可変重鎖；ならびに配列番号４２に記載のＬＦＷ１、配列番号４３に記載のＬＦＷ２、配列番号４４に記載のＬＦＷ３、および配列番号６３に記載のＬＦＷ４を含む可変軽鎖を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明の抗体またはその機能的断片、具体的にはＶΚ１  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ１Ａ、ＶΚ１  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ１Ｂ、ＶΚ１  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ４、ＶΚ１  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ４mut、ＶΚ３  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ１Ａ、ＶΚ３  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ１Ｂ、ＶΚ３  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ４、およびＶΚ３  λキャップ（λ−ｃａｐｐｅｄ）／ＶＨ４mutのリストから選択される抗体またはその機能的断片は、以下の特性を有する：
ｐＨ３．５〜７．５の範囲で０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５つのリン酸−クエン酸緩衝液において前述の示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）（Ｅｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ，  ９（１）  （２０１７），  ６８−８４；  Ｎｉｅｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２（９）  （２００７）  ２２１２−２２２１）によって決定される、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片抗体）抗体フォーマット（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ）で発現した場合、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、または少なくとも９０℃を超える熱変性温度（Ｔｍ）の平均中点（ａｖｅｒａｇｅ  ｍｉｄｐｏｉｎｔ）を有する。ｓｃＦｖコンストラクトの熱変性の遷移の中点は、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）ｏｒａｎｇｅを使用した示差走査蛍光分析によって決定される。関連する賦形剤条件のサンプルは、関連する緩衝液で調製したストック賦形剤を添加することにより、最終タンパク質濃度５０  μｇ  ｍｌ-1で調製する。バッファースカウティング（ｂｕｆｆｅｒ  ｓｃｏｕｔｉｎｇ）実験では、サンプルを総容量１００  μｌに最終濃度５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを含むさまざま名ｐＨ値（ｐＨ３．４、４．４、５．４、６．４、および７．２）の最終ｓｃＦｖバッファーで希釈する。未知のサンプルとともに、ｓｃＦｖ  ＤＳＦリファレンスを内部コントロールとして測定する。２５マイクロリットルの調製済みサンプルを、３連で白壁の（white-walled）ＡＢ遺伝子ＰＣＲプレートに添加する。アッセイは、サーマルサイクラーとして使用されるｑＰＣＲマシンで実行され、蛍光発光はソフトウェアのカスタム色素キャリブレーションルーチンを使用して検出される。試験サンプルを含むＰＣＲプレートは、２５℃から９６℃まで１℃ずつ温度上昇し、温度が上昇するたびに３０秒休止する。合計アッセイ時間は約２時間である。曲線の変曲点を計算するために数学的な二次微分法を使用して、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍによってＴｍを計算する。報告されたＴｍは、３つの測定値の平均である。
【００７３】
好適な実施形態では、上記抗体またはその機能的断片は、少なくとも６５℃、好ましくは少なくとも６９℃を超える熱変性温度（Ｔｍ）の平均中点を有する。タンパク質は、ＳＥ−ＨＰＬＣによりオリゴマー化に関して、５０  ｍＭクエン酸−リン酸ｐＨ  ６．４、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌで３７℃で１４日間保存する過程で分析される。研究の前に、サンプルは１０  ｇ  ｌ-1に濃縮し、ｄ０タイムポイントを決定する。モノマー含有量は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−４０２．５−４Ｆカラムでサンプルを分離し、得られたクロマトグラムを評価することにより定量化される。タンパク質モノマーの相対割合の計算では、モノマーピークの面積を、サンプルマトリックスに起因しないピークの総面積で除算する。好適な実施形態では、上記抗体またはその機能的断片は、濃度１０  ｇ  ｌ-1で５０  ｍＭクエン酸−リン酸ｐＨ  ６．４、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌで３７℃で２週間保存した場合、１５％、１２％、１０％、７％、５％、または２％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満のモノマー含有量の損失を示す
【００７４】
特定の実施形態では、上記相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は一緒になって目的の標的に対し特異的であるか、または目的の標的に対する特異性を有するドナー抗体からの対応する相補性決定領域で置き換えることができるプレースホルダー領域（ｐｌａｃｅｈｏｌｄｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ）である。
【００７５】
本発明の一つの実施形態では、上記ＣＤＲドメインＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ｉ）目的の抗原に対する特異性を有する、親の非ヒト抗体、具体的には親ウサギ抗体由来または親げっ歯類抗体、具体的には親マウスまたはラット抗体由来のＣＤＲドメインＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３；  （ｉｉ）親ヒトまたはヒト化抗体、具体的には治療用に承認されたまたは市販の抗体由来のＣＤＲドメインＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３；  （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）によるＣＤＲドメイン、具体的には（ｉ）または（ｉｉ）による一つまたは複数のＣＤＲドメインの最適化によって得られるＣＤＲドメインから得られるＣＤＲドメインＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３；  および（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）による一つまたは複数のＣＤＲドメインによって置き換えられるＣＤＲドメインから独立して選択される。（ｉｖ）の場合、それぞれの可変ドメインの使用目的に適合するＣＤＲ配列として任意の配列を使用できる。たとえば、上記ＣＤＲ配列を含む抗体可変ドメインが、上記ＣＤＲ配列の意図される置換の前に発現されなければならない場合、十分に発現された抗体可変ドメイン由来のＣＤＲが選択され得る。式を実行する必要がない（ｎｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈａｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ）場合は、目的の置換手順と互換性のある任意の配列を使用できる。プレースホルダーＣＤＲとしての機能により、このような状況では、上記ＣＤＲ配列によって実際の抗原結合をサポートする必要はない。
【００７６】
特定の実施形態では、抗体またはその機能的断片は、目的の標的に対する結合特異性を有する。そのようなものとして、本発明の抗体または機能的断片は、目的の標的に対して一緒になって特異的である相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。
【００７７】
本明細書で使用される場合、上記相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それらが所与の目的の標的（ｇｉｖｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、たとえば抗原に特異的に結合する能力を一緒に保持する場合、一緒になって目的の標的に特異的である。本明細書で使用される用語「特異的に結合する」または「結合特異性」は、上記相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む個々の抗体が１つの抗原決定基と反応し、異なる抗原決定基と反応しない能力を指す。抗体の結合親和性は、単一の抗原決定基および抗体の間の反応の強さである。特に、用語「上記相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は一緒になって所与の目的の標的に特異的である」は、所与の目的の標的に対して産生され、および／または選択される相補性決定領域を指し、そしてそれらは上記目的の標的を認識する能力を一緒に保持する。本明細書で使用する用語「認識する」は、対応する目的の標的、特に上記目的の標的の立体構造エピトープを見出して相互作用する（たとえば、結合、ブロック、阻害、拮抗、刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ））を指す。
【００７８】
本明細書で使用する場合、結合分子は、そのような結合分子がそのような標的生体分子と一つまたは複数の参照分子を識別することができる場合、結合特異性は絶対的なものではなく、相対的な性質であるため、標的、たとえばヒトＩＬ２３Ｒ等に「特異的である（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ／ｆｏｒ）」、「特異的に認識する」、または「特異的に結合する」。その最も一般的な形態（および定義された参照が言及されていない場合）で、「特異的結合」は、たとえば、当該分野で公知の特異性アッセイ方法に従って決定されるように、目的の生体分子と無関係の生体分子を識別する結合分子の能力を指す。そのような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験、およびペプチドスキャンを含むがこれらに限定されない。たとえば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。スコア付けは、標準的な発色（たとえば、西洋ワサビペルオキシド（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）を伴う二次抗体および過酸化水素を伴うテトラメチルベンジジン）によって実施することができる。特定のウェルにおける反応を、たとえば４５０ｎｍで、光学密度によってスコア付けする。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、約０．１ＯＤであり得；典型的な陽性反応は、約１ＯＤであり得る。これは、陽性と陰性のスコアの比率が、１０倍以上であり得ることを意味する。さらなる例では、バックグラウンドとシグナルとの少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍の差が特異的結合を示す、ＳＰＲアッセイを実施することができる。一般的に、結合特異性の決定は、単一の基準生体分子ではなく、約３〜５種類の無関係の生体分子、たとえば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン等のセットを使用して実施される。
【００７９】
しかしながら、「特異結合」はまた、標的生体分子と、参照点として使用される一つまたは複数の関連する生体分子とを識別する結合分子の能力を指してもよい。さらに、「特異結合」は、結合分子がその標的抗原の異なる部分、たとえば標的生体分子の異なるドメイン、領域、もしくはエピトープ、または標的生体分子の一つまたは複数の重要なアミノ酸残基またはアミノ酸残基のストレッチを識別する能力に関してもよい。
【００８０】
本発明の文脈において、用語「エピトープ」は、標的生体分子と結合分子との間の特異的結合に必要な所与の標的生体分子の部分を指す。エピトープは連続的、すなわち標的生体分子に存在する隣接構造要素によって形成されるか、または非連続的、すなわち、たとえば標的としてのタンパク質のアミノ酸配列の、標的生体分子の一次配列の異なる位置にあるが、たとえば体液で標的生体分子が採用する、三次元構造に近接した構造要素によって形成され得る。
【００８１】
本発明の一つの実施形態では、単離された抗体またはその機能的断片は、ＩｇＧ抗体、ＦａｂおよびｓｃＦｖ断片から選択される。好適には、本発明の抗体またはその機能的断片はｓｃＦｖ抗体断片である。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが標的結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む（たとえば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，  Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４），  ｐｐ．  ２６９−３１５を参照）。
【００８２】
特定の実施形態では、上記機能的断片は、配列番号６４または配列番号６５、好ましくは配列番６４に記載のリンカーを含むｓｃＦｖフォーマットである。
【００８３】
本発明の別の特定の実施形態では、単離された抗体またはその機能的断片は、
一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；タンデム  ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ；  Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ；  Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１）、三重特異性抗体、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体（ｄｉ−ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合物、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合物、たとえばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端と結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端と結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端と結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖および軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）、ならびにノブ・イントゥ・ホール抗体（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ）（ＫｉＨｓ）（ＫｉＨ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）、ＭＡＴＣＨ（国際公開第２０１６／０２０２４５７号；Ｅｇａｎ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｍＡｂｓ  ９  （２０１７）  ６８−８４に記載されている）、およびデュオボディ（デュオボディ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）（ＭＡｂｓ．  ２０１７  Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２−２１２．  ｄｏｉ：  １０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６８３０７）を非限定的な例として含む、任意の好適な多重特異性、たとえば二重特異性の、当技術分野で知られているフォーマットから選択される抗体フォーマットである、多重特異性構築物、たとえば二重特異性構築物または多価構築物、たとえば二価構築物である。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、特に二重特異性単量体ｓｃＤｂは、本明細書で使用するために特に好適である。
【００８４】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内のＶＬに結合したＶＨを含む。同一の鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアリングして２つの抗原結合部位を生み出す。ダイアボディは二価または二重特異性であってもよい。ダイアボディは、たとえば、欧州特許第４０４０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００８５】
二重特異性ｓｃＤｂ、特に二重特異性単量体ｓｃＤｂは、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＬＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＨＢまたはＶＬＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＨＢの順にリンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３によって結合された、２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又はその断片および可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）またはその断片を特に含み、ここで、ＶＬＡおよびＶＨＡドメインは第一の抗原に対する抗原結合部位を共に形成し、ＶＬＢおよびＶＨＢは第二の抗原に対する抗原結合部位を共に形成する。
【００８６】
リンカーＬ１は具体的には２〜１０アミノ酸のペプチドであり、さらに具体的には３〜７アミノ酸、そして最も具体的には５アミノ酸のペプチドであり、Ｌ３リンカーは具体的には１〜１０アミノ酸のペプチドであり、より具体的には２〜７アミノ酸、そして最も具体的には５アミノ酸のペプチドである。中間のリンカーＬ２は具体的には１０〜４０アミノ酸のペプチドであり、さらに具体的には１５〜３０アミノ酸、最も具体的には２０〜２５アミノ酸のペプチドである。
【００８７】
本発明の一つの実施形態では、単離された抗体またはその機能的断片は、国際公開第２０１６／０２０２４５７号；  Ｅｇａｎ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｍＡｂｓ  ９  （２０１７）  ６８−８４に記載されるＭＡＴＣＨフォーマットの多特異的および／または多価の抗体である。
【００８８】
本発明の二重特異性、二価、多重特異性および／または多価構築物は、当技術分野で公知の任意の便利な抗体製造方法を使用して産生することができる（たとえば、二重特異性構築物の産生に関してはＦｉｓｃｈｅｒ，  Ｎ．  ＆  Ｌｅｇｅｒ，  Ｏ．，  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２００７）３−１４；二重特異性ダイアボディおよびタンデムｓｃＦｖに関してはＨｏｒｎｉｇ，  Ｎ．  ＆  Ｆａｅｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ａ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９０７（２０１２）７１３−７２７、および国際公開第９９／５７１５０号を参照）。本発明の二重特異性構築物の調製のための好適な方法の具体例は、とりわけ、ジェンマブ（Ｇｅｎｍａｂ）（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １１０  （２０１３）５１４５−５１５０参照）およびメラス（Ｍｅｒｕｓ）（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６  （２０１０）７４１−７５０参照）の技術をさらに含む。機能的抗体Ｆｃ部を含む二重特異性抗体の産生方法もまた、当該技術分野において知られている（たとえば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ８６  （１９９４）１２７−１３４）；およびＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １２１  （１９８６）  ２１０−２２８参照）。
【００８９】
それらの方法は、モノクローナル抗体の生成、たとえば、ハイブリドーマ技術を用いて所望の抗原で免疫されているマウス由来の脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合する方法（たとえばＹｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｕｎｉｔ  ２．５，  ２００６参照）、または、組換え抗体技術（レパートリークローニングまたはファージディスプレイ／酵母ディスプレイ）（たとえばＣｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８９  （２０００）１−８参照）、および既知の分子クローニング手法を用いて二重特異性構築物を生み出すための、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインもしくはそれらの断片または一部の組み合わせを典型的に含む。
【００９０】
第二の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片、および任意で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００９１】
語句「薬学的に許容される」は、理にかなった医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症のない、合理的な利益/リスク比に見合った、ヒトまたは動物の組織との接触での使用に好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００９２】
本開示による医薬組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、補助的な免疫増強剤、たとえばアジュバントおよびサイトカイン、および任意で他の治療剤をさらにルーチン的に含んでもよい。組成物はまた、抗酸化剤、および／または防腐剤を含んでもよい。抗酸化剤として、チオール誘導体（たとえば、チオグリセロール、システイン、アセチルシステイン、シスチン、ジチオエリスリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオスレイトール、グルタチオン）、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、亜硫酸塩（たとえば、硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、アセトン重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム）およびノルジヒドログアヤレチン酸が挙げられる。好適な防腐剤は、たとえば、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、および塩化セチルピリジニウムであり得る。
【００９３】
本明細書で提供される特定の実施形態では、上記抗体またはその機能的断片は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換え体、コンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡ配列のたとえば合成を介した作成、遺伝子操作、またはヒト免疫グロブリンをコードする配列、たとえばヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体等の組換え手段によって単離、調製、発現、または作成することができる。
【００９４】
したがって、第三の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片をコードする核酸配列または核酸配列のコレクションに関する。
【００９５】
第四の態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸配列のコレクションを含むベクターまたはベクターのコレクションに関する。用語「ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞における組換え発現のための本発明の抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、最も一般的にはＤＮＡプラスミドを意味する。ベクターは細胞内で複製できる場合とできない場合がある。本明細書に記載の抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖、またはその断片をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当技術分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えDNA技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。
【００９６】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に導入することができ、次いで、得られた細胞を従来の技術によって培養して、本明細書に記載の抗体またはその断片を産生することができる。したがって、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列のコレクション、または本発明のベクターもしくはベクターのコレクションを含む宿主細胞、特に発現宿主細胞に関する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本発明の抗体またはその断片の可変重鎖および可変軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、２つの異なるベクター、上記抗体の可変重鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター、および上記抗体の可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクター、またはその断片を含む。他の実施形態では、第一の宿主細胞は、上記抗体の可変重鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクターを含み、第二の宿主細胞は、上記抗体の可変軽鎖またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。
【００９７】
第六の態様では、本発明は、本発明の核酸配列もしくは核酸配列のコレクション、または本発明のベクターもしくはベクターのコレクションを発現させる工程、または本発明の宿主細胞、特に発現宿主細胞を含む、本発明の抗体またはその機能的断片を産生する方法に関する。
【００９８】
第七の態様では、本発明は、非ヒト抗体、具体的にはウサギまたはげっ歯類抗体をヒト化する方法に関し、以下のステップを含む：
（ａ）一つまたは複数の工程で、前記非ヒト抗体の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ、および可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲをコードする核酸配列を、抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、ただしここで上記非ヒト抗体の少なくともＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３がクローニングされる。
【００９９】
ウサギ抗体またはげっ歯類抗体のヒト化の方法は、当業者に周知である（たとえば、Ｂｏｒｒａｓ，  ｌｏｃ．  ｃｉｔ．；  Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０２−０２８１ｆｊｅ，２００２年１０月１８日オンライン公開；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｍｏｄｅｌｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（２）：  ｅ９０７２．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００９０７２参照）。ウサギまたはげっ歯類の免疫化は、目的の抗原それ自体、たとえばタンパク質、またはペプチドまたはタンパク質抗原の場合、目的のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、たとえばプラスミドを用いたウサギのＤＮＡ免疫化によって実施することができる。
【０１００】
特定の実施形態では、方法は、ＶＨ  ＣＤＲ２および／またはＶＬ  ＣＤＲ１領域のクローニングをさらに含む。特定の実施形態では、方法は、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１領域の両方のクローニングを含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、方法は、ＶＨ  ＣＤＲ１および／またはＶＬ  ＣＤＲ２領域のクローニングをさらに含む。特定の実施形態では、方法は、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２領域の両方のクローニングを含む。
【０１０２】
特定の実施形態では、方法は、以下の一つまたは複数の工程をさらに含む：
（ａａ）非ヒト動物、特にウサギまたはげっ歯類の、目的の抗原による免疫化；および
（ａｂ）少なくとも一つの目的の抗体の分離。
【０１０３】
特定の実施形態では、方法は、以下の一つまたは複数の工程をさらに含む：
（ａｃ）特に経口活性化セルソーティングを使用した、目的の抗原と相互作用する、親和性成熟記憶Ｂ細胞のクローン単離；
（ａｄ）単一Ｂ細胞クローンの不死化を必要としない共培養システムでの単一Ｂ細胞の培養；
（ａｅ）目的の抗原に結合する少なくとも一つの抗体を同定するための、細胞ベースのＥＬＩＳＡでのＢ細胞培養上清のスクリーニング；および／または
（ａｆ）ヒト抗体ＶＨドメインをコードする核酸配列への、少なくとも一つの抗体のＶＨ  ＣＤＲのクローニング。
【０１０４】
一つの実施形態では、上記非ヒト抗体のフレームワーク領域は、ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、およびＶＨ４（配列番号２１）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）およびＶΚ３（配列番号５１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する。別の実施形態では、上記非ヒト抗体のフレームワーク領域は、（ｉ）ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）、ＶΚ２（配列番号４６）、ＶΚ３（配列番号５１）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせのフレームワーク領域；または（ｉｉ）ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ４（配列番号２１）、ＶＨ５（配列番号３１）、およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせのフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する。
【０１０５】
特定の実施形態では、上記非ヒト抗体のフレームワーク領域は、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する。
【０１０６】
第八の実施形態では、本発明は、目的の親抗体を最適化する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）一つまたは複数の工程で、上記親抗体のＶＨ  ＣＤＲ、およびＶＬ  ＣＤＲをコードする核酸配列を、本発明による抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする、ただしここで上記親抗体の少なくともＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３がクローニングされる。
【０１０７】
特定の実施形態では、方法はＶＨ  ＣＤＲ２および／またはＶＬ  ＣＤＲ１領域のクローニングをさらに含む。特定の実施形態では、方法は、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１領域の両方のクローニングを含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、方法はＶＨ  ＣＤＲ１および／またはＶＬ  ＣＤＲ２領域のクローニングをさらに含む。特定の実施形態では、方法は、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２領域の両方のクローニングを含む。
【０１０９】
一つの実施形態では、上記親抗体のフレームワーク領域は、全体的に、ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、およびＶＨ４（配列番号２１）、から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）およびＶΚ３（配列番号５１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対して最高の相同性を有する。別の実施形態では、上記親抗体のフレームワーク領域は、全体的に、（ｉ）ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ１（配列番号４１）、ＶΚ２（配列番号４６）、ＶΚ３（配列番号５１）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせのフレームワーク領域；または（ｉｉ）ＶＨ１Ａ（配列番号１）、ＶＨ１Ｂ（配列番号６）、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ４（配列番号２１）、ＶＨ５（配列番号３１）、およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対して最高の相同性を有する。
【０１１０】
特定の実施形態では、上記親抗体のフレームワーク領域は、全体的に、ＶＨ２（配列番号１１）、ＶＨ３（配列番号１６）、ＶＨ５（配列番号３１）およびＶＨ６（配列番号３６）から選択されるヒトＶＨファミリー、ならびにＶΚ２（配列番号４６）およびＶΚ４（配列番号８１）から選択されるヒトＶＬファミリーの組み合わせの対応するフレームワーク領域に対してともに最高の相同性を有する。
【０１１１】
第九の態様では、本発明は、抗体、またはその機能的断片の多様なコレクションを生成する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）一つまたは複数の工程で、ＶＨ  ＣＤＲおよび／またはＶＬ  ＣＤＲの一つまたは複数の多様なコレクションをコードする核酸配列の、一つまたは複数の多様なコレクションを、本発明による抗体またはその機能的断片をコードする一つまたは複数の核酸配列にクローニングする。
【０１１２】
特定の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ３の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションをクローニングする。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ３の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションをクローニングする。
【０１１４】
特定の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ２の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクション、および／またはＶＬ  ＣＤＲ１の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションをクローニングする。特定の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ２の多様なコレクション、およびＶＬ  ＣＤＲ１領域の多様なコレクションの両方をクローニングする。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ１の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクション、および／またはＶＬ  ＣＤＲ２の多様なコレクションをコードする核酸配列の多様なコレクションをクローニングする。特定の実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ１の多様なコレクション、およびＶＬ  ＣＤＲ２の多様なコレクションの両方をクローニングする。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明を例示するものである。
実施例１：
【０１１７】
この研究は、特異性および抗原結合親和性を完全に保持しながら、ＶΚ１／ＶＨ３と比較して類似またはさらに優れた生物物理特性を示すヒト化コンセンサスＶＬおよびＶＨドメインのコンビナトリアルペアからなるヒト可変ＶＬ／ＶＨコンセンサスフレームワークの組み合わせを同定する目的で実施された。タンパク質の安定性に寄与する残基が生殖系列配列のプールで進化中に濃縮されたという仮定に基づいて（Ｓｔｅｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２４０  （１９９４）  １８８−９２）、コンセンサス生殖系列配列が使用された。これにより、凝集（Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２８７  （２０１２）  ２５２６６−７９）およびアクセプターフレームワーク内の非ヒトフレームワーク残基がフレームワーク領域を非ヒト化し、ヒトＴ細胞エピトープの出現を増加させる可能性があるため、免疫原性反応のリスクが軽減される。ＶΚ／ＶＨ（ＶΚ１、ＶΚ２、ＶΚ３、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６）の順列に加えて、Ｎｕｍａｂの安定化技術（いわゆるλキャップ）をすべてのＶΚドメインに適用して、非ＶΚ１／ＶＨ３フレームワークの組み合わせに対する潜在的な安定化の寄与、および生産収率と抗原結合親和性への潜在的な影響を評価した。λキャップ技術は、ＶΚファミリーコンセンサス可変軽領域のフレームワーク領域ＩＶをＶλファミリー生殖系列配列（λキャップ）に置換することを伴う。
【０１１８】
安定性に関して、λキャップされていないＶΚ１／ＶＨ３コンセンサスｓｃＦｖと比較したλキャップされたΚ１／ＶＨ３コンセンサスｓｃＦｖの優位性が以前に実証されている（国際公開第２０１４／２０６５６１号）。
【０１１９】
ウサギ抗体可変ドメインのヒト化および安定化のための最も適切なヒトアクセプター抗体可変領域スキャフォールドを同定するために、ＶΚ１、ＶΚ２、およびＶΚ３のＶΚファミリー軽鎖コンセンサス配列、およびすべてのヒトＶＨコンセンサス配列（ＶＨ１Ａ、１Ｂ、２、３、４、５、および６）、および異なるヒト生殖細胞系λ型軽鎖フレームワークＩＶ配列（λキャップ、具体的には配列番号６２）の組み合わせの試験を始めた。このために、ヒトインターロイキン−２３受容体（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合するウサギＣＤＲセット（配列番号６６から配列番号７１）を、図１（上半分）に示すすべてのコンセンサスフレームワークの組み合わせに移植し、異なるコンセンサスアクセプターフレームワークのみの特性に基づいてヒト化ｓｃＦｖ断片の直接比較を可能にした。さらに、フレームワーク領域ＩＶのカッパからラムダへの置換を欠く制御分子（キャップされていない）を、各ＶＬ／ＶＨの組み合わせ（図１、下半分）で生成し、それぞれのキャップ付きバリアントと対比する。次に、結果を代替のウサギＣＤＲセットで確証した。驚いたことに、特定の非ＶΚ１／ＶＨ３の組み合わせは、発現量、変性温度、および/またはλキャップ由来のモノマー安定性がＶΚ１／ＶＨ３スキャフォールドよりも多く得られた。いくつかのＶΚ／ＶＨ３の組み合わせおよびλキャップは、熱変性およびモノマー安定性の点で、λキャップされたＶΚ１／ＶＨ３の組み合わせよりも明らかに優れていたが、それは従来技術の観点からは予想外である。さらに、安定性を最適化し、抗原結合親和性を維持するためのラムダキャップとして使用するための好適なラムダ生殖細胞系列配列を同定した。
【０１２０】
結果：
第一の工程において、新たに合成されたＶＬおよびＶＨ遺伝子配列は、ドメインシャフリングによって最近発現ベクターにクローニングされ、大腸菌において順調に発現された。すべての構築物は、ＶＬ−ＶＨドメイン配向、およびドメイン間に２０アミノ酸のグリシン−セリン（Ｇ4Ｓ）4−リンカー（配列番号６４）を有するｓｃＦｖフォーマットで発現された。ＳｃＦｖ分子は、適切な精製戦略（プロテインＬアフィニティクロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィー）を使用して精製され、すべての構築物のモノマー含有量は９５％を超えていたため、以降の分析に使用されるすべてのｓｃＦｖの質は最初に同等だった。全体的に、生物物理学的特性（凝集および熱安定性）と機能的特性（ＳＰＲ）を比較すると、完全コンセンサス構築物は、λキャップされた対照物よりもかなり一貫して劣った特性を示した。フレームワーク領域ＩＶをＶλ生殖細胞系列配列（λ−キャップ）およびＶＨ（１−６）コンセンサスドメインで完全に置換したＶΚ（１−３）を含むｓｃＦｖ分子は、対応する完全なコンセンサス（キャップされていない）分子と比較して、一般に好ましい安定性プロファイルをもたらすことを見出した。具体的には、λキャップされたscFvバリアントは、異なる生殖系列ファミリー全体で、生産性、熱変性の中点、およびさまざまな温度での貯蔵中の単量体状態の安定性の点で大部分は優れていた。
【０１２１】
以下において、いくつかの実施例がより詳細に議論される。
【０１２２】
実施例２：ｓｃＦｖ構築物の生物物理学的データの決定
発現量：
Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ  ９  （２０１７）６８−８４に記載されているように、一般的な条件を使用して一本鎖可変断片が生成された。発現は大腸菌で行われ、抗体断片が封入体に蓄積し、その後、（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ  ９  （２０１７）６８−８４）に記載されているように、可溶化され、一般的なリフォールディング緩衝液でリフォールディングされた。すべての分子の発現培養液１リットルあたりの収量を図２に示す。最も驚くべきことに、これらの結果は、２つの例外（ＶΚ２／ＶＨ５およびＶΚ３／ＶＨ４）を除いて、それぞれのキャップされていない対照物（灰色の棒）と比較して、λキャップされたスキャフォールド（白い棒）の一貫して向上した生産性を示す。
【０１２３】
２つの分子（ＶΚ２／ＶＨ１ＢおよびＶΚ２／ＶＨ２）の産生は、それらの軽鎖のλキャッピングによってのみ可能になり、キャッピングされていない完全なコンセンサスバリアントはまったく産生可能ではなかった。さらに、フレームワークの組み合わせを含むＶＨ３は、同じサブファミリーのＶΚ鎖（ＶΚ１、ＶΚ２、ＶΚ３）を共有する分子の群内で最高の収量を示す。ＶΚ１/ＶＨ３の組み合わせとは別に、ＶΚ１/ＶＨ４、ＶΚ２/ＶＨ４、およびＶΚ３/ＶＨ１Ｂの組み合わせは、同一の軽鎖フレームワークを共有するそれぞれの群内でλキャッピング時に収量が最大に増加するため、フレームワーク領域ＩＶをＶλ生殖系列で置換することで最も恩恵を受けた。
【０１２４】
熱安定性
熱変性（Ｔｍ）の中点は、ｐＨ３．５〜７．５の範囲で０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５つのリン酸−クエン酸緩衝液において前述の示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によってすべての分子について決定された（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ  ９  （２０１７）６８−８４；  Ｎｉｅｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２（９）  （２００７）  ２２１２−２２２１）によって決定された。前述の示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）（Ｅｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ，  ９（１）  （２０１７），  ６８−８４；  Ｎｉｅｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２（９）  （２００７）  ２２１２−２２２１）によって決定される、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片抗体）抗体フォーマット（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ）で発現した場合、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、または少なくとも９０℃を超える熱変性温度（Ｔｍ）の平均中点（ａｖｅｒａｇｅ  ｍｉｄｐｏｉｎｔ）を有する。図３は、標準偏差を含む、測定されたｐＨ範囲にわたる平均ｐＨのデータを示す。ラムダキャップされたｓｃＦｖバリアント（白い棒）は、キャップされていないバリアントよりも平均Ｔｍが著しく高いＶΚ３/ＶＨ５の組み合わせを除き、キャップされていない（灰色の棒）バリアントよりも一貫して高い平均融解温度を示す。驚くべきことに、いくつかの低発現フレームワークの組み合わせは、特にラムダキャップ（例：ＶΚ３／ＶＨ４）と一緒に非常に高い熱安定性を示すため、熱変性の中点は分子の発現量と相関しないようである。ＶΚ１およびＶΚ３軽鎖、ならびにＶＨ１Ａ、ＶＨ１ＢおよびＶＨ４可変重鎖のすべての組み合わせにより、ＶΚ１/ＶＨ３よりも高い変性温度を有する可変領域が得られる。ＶΚ１／ＶＨ４は最高の融解温度を示し、ＶΚ２／ＶＨ５およびＶΚ３／ＶＨ１Ｂはキャッピング時にＴｍの最高の相対的増加を示す。
【０１２５】
貯蔵安定性
産生可能なすべての分子を用いて、３７℃で１０  ｍｇ／ｍＬの濃度での２週間の貯蔵安定性試験を実施した。ラムダキャップされたバリアントの保存後の単量体含有量を、キャップされていないバリアントと比較した。すべての組み合わせを通じて、軽鎖キャッピングにより、キャップされていない完全コンセンサスｓｃＦｖと比較して、３７℃で２週間保管した後、単量体含量が３２％（ＶΚ１／ＶＨ１Ｂ）から５７％（ＶΚ３／ＶＨ１Ａ）の間で顕著に増加した。３つのフレームワークの組み合わせの生成は、λキャップで軽鎖を安定化することによってのみ可能になった。これは、この研究に十分な量のキャップされていない対照物を産生できなかった（ＶΚ２／ＶＨ１Ｂ、ＶΚ２／ＶＨ６）、または研究開始前に定量的に沈殿できなかったためである（ＶΚ３／ＶＨ６）。ＶΚ２／ＶＨ２の組み合わせは、この研究に十分な量で産生できなかった。
【０１２６】
驚くべきことに、ラムダキャップされたＶκ１／ＶＨ３参照分子に対してベンチマークされた場合、多くのＶＬ−ＶＨ生殖系列の組み合わせは、参照（丸で囲んだ値）よりもキャッピング時に単量体含有量の顕著な増加を示す。また、一部の組み合わせでは、３７℃で２週間保管した場合に単量体含有量の損失が少なくなり、それゆえ参照組み合わせよりも全体的に安定していると見なすことができる。これは、ラムダキャップの組み合わせＶΚ１／ＶＨ１Ａ、ＶΚ１／ＶＨ４、ＶΚ１／ＶＨ５、ＶΚ２／ＶＨ１Ａ、ＶΚ２／ＶＨ１Ｂ、ＶΚ２／ＶＨ３、ＶΚ２／ＶＨ５、ＶΚ３／ＶＨ１Ａ、ＶΚ３／ＶＨ１Ｂ、ＶΚ３／ＶＨ４、およびＶΚ３／ＶＨ５の場合である。
【０１２７】
親和性測定
ヒト化ウサギ可変ドメインの機能的特徴付けのために、ＩＬ２３Ｒに対するそれぞれのｓｃＦｖの親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。驚くべきことに、ほとんどの分子は、ＣＤＲとして独占的に（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）期待されていなかった高い抗原結合親和性を保持しており、ドナーフレームワーク残基は、人間のアクセプタースキャフォールドに移植されていなかった。
【０１２８】
さらに、キャッピングされたおよびキャッピングされていないバリアントは、キャップされたバリアントに対して少なくとも類似の親和性またはわずかな全体的な利点さえ示すので、軽鎖キャッピングは標的親和性に悪影響を及ぼさないと結論付けることができる。キャッピングされたバリアントとキャッピングされていないバリアントを比較した場合、および同じ軽鎖ドメインを共有するそれぞれの分子内では、抗体と標的の相互作用の速度論は類似している。ＶΚ３構築物のオフレート値（ｋd）のみがわずかに高い変動性を示し、ＶΚ３／ＶＨ１ＡおよびＶΚ３／ＶＨ５は、それらのＶΚ１またはＶΚ２対照物よりもわずかに速いオフレートを示す。ＶΚ１／ＶＨ３は、他のすべての分子よりもわずかに遅いオフレートを示す。これは、全体的な最良の解離定数にも反映される。ただし、一部の組み合わせでは、オンレートが高速になることでオフレートの欠点が補われ（例：ＶΚ１／ＶＨ４）、ＶＨ３を含むｓｃＦｖと本質的に同じ全体的な親和性が得られる。表１は、この研究で調査したすべてのキャップされたフレームワークとキャップされていないフレームワークの組み合わせのヒトＩＬ２３Ｒに対する親和性をまとめたものである。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
表２は、ヒトＩＬ２３Ｒ特異的ｓｃＦｖ断片で取得されたすべてのデータを要約する。各フレームワークバリアントは、４つの異なるカテゴリ（収量、平均Ｔｍ、単量体含有量の損失、およびＫD）で、キャップされていない（フルコンセンサス）の対照物と比較され、増分が計算された。太字の値は、ＶΚ１/ＶＨ３リファレンスと比較して、それぞれのフレームワークの組み合わせの性能が優れていることを示す。
【０１３１】
実施例３：ＴＮＦ特異的分子による確認試験
Ｖκ１／ＶＨ４およびＶκ３／ＶＨ４  ＩＬ２３Ｒ特異的分子の顕著な全体的な性能に基づいて、これらのフレームワークの組み合わせは、ウサギ抗ヒトＴＮＦ  ＣＤＲ（配列番号７２から配列番号７７）の単純移植（ｓｉｍｐｌｅ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）による、直接的なヒト化に特に有用であるとして選択された。この研究の目的は、ＩＬ２３Ｒ特異的ＣＤＲ（配列番号６６から配列番号７１）で得られた結果を確認することであった。対照確認試験のリファレンスとして、ＶΚ１／ＶＨ３、およびＶΚ３／ＶＨ３フレームワークの組み合わせを同一の抗ＴＮＦ  ＣＤＲセットの移植に使用した。
【０１３２】
【表２】
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【０１３３】
選択された（ヒトＩＬ２３Ｒ  ＣＤＲ移植）フレームワークの組み合わせ、すなわちＶΚ１／ＶＨ３、ＶΚ１／ＶＨ４、ＶΚ３／ＶＨ３、およびＶΚ３／ＶＨ４の結果は、これらのフレームワークへのヒトＴＮＦ特異的ＣＤＲの移植により確認された。さらに、ＶΚ１／ＶＨ４フレームワークベースの分子の変異バリアントは、特定のフレームワーク位置（ＶＨ４の２／８１）でコンセンサス配列から分岐するアミノ酸を含み、この研究に含まれていた。
【０１３４】
ＶＨ４フレームワークの組み合わせへのＣＤＲ移植によって親和性が影響されないというＩＬ２３Ｒ特異的ＣＤＲに対して上記で観察された傾向を確認すると、ＴＮＦ特異的ＣＤＲに関して、キャップされたＶκ１／ＶＨ４コンセンサス分子は、キャップされたＶΚ１／ＶＨ３コンセンサス分子よりもさらに高い親和性を示した。さらに、ＶΚ１／ＶＨ４のヒトＴＮＦへの親和性は、特定のフレームワーク位置（Ｔ２４ＫおよびＴ８４Ｓ；配列番号７８）に２つの変異を導入することでさらに向上できた。
【０１３５】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、配列番号２６に記載のＶＨ４mut配列を含む抗体またはその機能的断片に関する。
【０１３６】
重要なことには（表３を参照）、両方のＶΚ１／ＶＨ４分子（変異していないコンセンサスＦＷでさえ）は、ＶΚ１／ＶＨ３バリアントよりもヒトＴＮＦに対してより高い親和性を示す。したがって、このフレームワークは、ＣＤＲセットの移植によるウサギ抗体の直接的なヒト化に特に好適であり、現在の技術水準（ＶΚ１／ＶＨ３）よりも優れているようである。
【０１３７】
ＶＨ３ドメインを含む分子が対応するＶＨ４含有分子よりも良好な生産性を示すので、ＴＮＦ特異的分子の産生収量を比較すると、ＩＬ２３Ｒ特異的分子について以前に得られたデータが確認される（表４）。ただし、ｓｃＦｖの生成の一般的なプロセス（特にリフォールディングプロセス）は元々ＶΚ１／ＶＨ３フレームワークベースの分子用に開発されたため、生産性の結果にバイアスがかかり、ＶＬ／ＶＨフレームワークの組み合わせを含むＶＨ３に有利になる可能性がある。フレームワークの組み合わせを含むＶＨ４の生産収率は、適応した生産プロセスを使用してさらに最適化できるようである。
【０１３８】
ＴＮＦ特異的分子を用いた貯蔵安定性試験は、本研究で使用される対照分子（ＶΚ１／ＶＨ３コンセンサス）の単量体含有量と比較した場合、ストレス条件での２週間の貯蔵後の単量体含有量がすべてのキャップされた分子について再び明らかに優れているので、以前に認められたλキャップの安定化効果を確認する。全体として、ＶＨ４を含む分子の安定性は、ＶＨ３を含む分子に匹敵し、ＶΚ３／ＶＨ４フレームワークの組み合わせが最も安定している（図５を参照）。
【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
実施例４：Ｓｋ１２対Ｓｋ１７  λ−キャップ
上記のように、最適なＶＬおよびＶＨフレームワークの組み合わせの選択に加えて、ＶＬコンセンサスドメインへのλキャップの組み込みも、それぞれのｓｃＦｖ分子の生物物理学的特性の大幅な改善をもたらす。ラムダ型軽鎖のＦＷ領域４のさまざまな生殖系列配列も、λキャップとして使用すると異なる特性をもたらす可能性が高いようである。異なるラムダ型のＦＷ  ４領域を比較するとき、上記の研究および国際公開第２０１４／２０６５６１号で使用したものとは異なるＴＮＦ特異的ＣＤＲのセットを含むＶΚ１／ＶＨ３フレームワークの組み合わせに照らして、配列ｓｋ１７（配列番号６３）が特に安定している（表５）ことを特定した。２つの分子は、それらのλキャップの配列のみが異なり、ｓｋ１２（配列番号６２）およびｓｋ１７（配列番号６３）と命名された。貯蔵安定性および熱安定性の点で、ｓｋ１７λキャップ含有分子はｓｋ１２λキャップ含有分子よりも優れている。
【０１４２】
ｓｋ１７がｓｋ１２よりも優れていることのさらなるエビデンスを表６に示す。同一のＩＬ１７特異的ウサギＣＤＲループを、４つの異なるＶκ１保有フレームワークの組み合わせに移植した。構築物１〜３は、ｓｋ１７λキャップおよび異なる可変重鎖（対応してＶＨ１Ａ、ＶＨ４またはＶＨ１Ｂ）を有する同一のＶΚ１を含み、構築物４は、ｓｋ１２λキャップおよびＶＨ３重鎖を有するＶΚ１軽鎖を含む。すべてのｓｋ１７を有する分子は、標的結合親和性の点で、現在の最高水準の技術（ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ）のＶΚ１（ｓｋ１２）／ＶＨ３フレームワークの組み合わせ（構築物４）を有する分子よりも優れていた。さらに、ＶΚ１／ＶＨ４（構築物２）を有する分子は、ＤＳＦ測定で測定される熱変性の中点が大幅に上昇するため、優れた熱安定性を示す。したがって、ｓｋ１７はラムダキャッピングによる安定化に特に役立つようである。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更形態が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０１４６】
それぞれの特許法の下で可能な範囲で、本明細書に引用されるすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【０１４８】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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