(57)【要約】本発明は、腫瘍を治療するための方法に関する。特に、本発明は腫瘍を治療するための電離放射線と組み合わせたナノ粒子の新規な使用を提供し、ナノ粒子の組み合わせ効果は、腫瘍細胞の老化および／または共食いを誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象における腫瘍を治療する方法において使用するためのナノ粒子であって、該方法は、
ａ．有効量のナノ粒子の懸濁液を、治療を必要とする対象の腫瘍に投与するステップであって、前記ナノ粒子は４０を超える、好ましくは５０を超える原子番号Ｚの元素を含み、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満、例えば１〜５ｎｍの平均流体力学的直径を有する、投与するステップと、
ｂ．前記ナノ粒子を含む前記腫瘍を、効率的な線量の電離放射線に曝露するステップと、を含み、
前記電離放射線と前記ナノ粒子との組み合わせ効果は、照射された腫瘍細胞に老化および／または細胞共食いを誘導する、ナノ粒子。
【請求項２】
前記腫瘍が少なくとも３Ｇｙ、好ましくは３Ｇｙ〜９Ｇｙ、より好ましくは５〜７Ｇｙの分割当たりの電離放射線の線量に曝露され、総線量が好ましくは最大１０分割で投与される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記方法が前記ステップａおよびｂの前に、
i．対象の腫瘍におけるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性を決定するステップと、
ii．得られた発現値または活性を対応するコントロール値と比較するステップと、
iii．ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性がコントロール値と実質的に同一またはそれより高い腫瘍を有する対象の中から対象を選択するステップと、をさらに含む、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記方法がＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性のエンハンサーまたはモジュレーター剤を、電離放射線への曝露ステップの前に、またはそれに付随して、またはその後に投与するステップをさらに含む、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項５】
治療ステップの前に、腫瘍におけるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性を決定するステップをさらに含む、請求項１、２または４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記電離放射線と前記ナノ粒子との組み合わせ効果が、前記腫瘍細胞に対する、ＮＯＸ５活性によって媒介される免疫応答を誘導する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
電離放射線への暴露ステップの前、またはそれに付随して、またはその後に、免疫治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記免疫治療薬が、ＰＤ１／ＰＤＬ１阻害剤およびＣＴＬＡ４阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤の中から選択される、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
治療される腫瘍が、アポトーシスを誘導する化学療法治療に抵抗性であることが示されている腫瘍の中から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
非照射細胞が、隣接する照射された細胞の細胞共食いによってさらに殺される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
腫瘍細胞中の老化細胞の数が、ナノ粒子の存在なしに、同じ電離放射線の曝露によって誘導された老化細胞の数と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の倍率で治療後に増加する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
細胞共食いが、ナノ粒子の存在なしに、同じ電離放射線への曝露によって観察される細胞共食いと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の倍率で増強される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記電離放射線に曝露される腫瘍の体積が、治療される腫瘍の総体積よりも小さく、例えば、少なくとも（体積で）１０％小さく、または少なくとも（体積で）２０％小さい、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記方法が、前記電離放射線に曝露された領域の外側に位置する腫瘍の治療をさらに可能にする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、高Ｚ元素として希土類金属、好ましくはガドリニウムを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、高Ｚ元素のキレート、例えば希土類元素のキレートを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、
・ポリオルガノシロキサン、
・前記ポリオルガノシロキサンに共有結合したキレート、
・前記キレートによって錯体化された高Ｚ元素を含む、請求項１６に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍を治療するための方法に関する。特に、本発明は腫瘍を治療するための電離放射線と組み合わせたナノ粒子の新規な使用を提供し、ナノ粒子の組み合わせ効果は、腫瘍細胞の老化および／または共食いを誘導する。
【背景技術】
【０００２】
放射線治療（放射線療法としても知られている）は、最も使用されている抗腫瘍戦略の１つである。全癌患者の半数以上は電離放射線（ＩＲ）単独または外科療法または化学療法１との併用で治療される。医学物理学で実現された最近の進歩（低／高エネルギー放射線の発達、単、低または多分割照射計画の実施および使用線量率の多様化を伴う）および革新的な医学技術の開発（三次元放射線療法（３Ｄ−ＣＲＴ）、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、定位放射線手術（ＳＲＳ）および機能的イメージングなど）は放射線療法２の最も一般的な副作用である周囲の健康な組織を避けながら、腫瘍に対する放射線の効率的な線量をより良好に照射することに寄与する。ナノ医療（放射性同位元素標識ナノ粒子または金属ナノ粒子など）のいくつかの用途は腫瘍部位において放射線量をより良く伝達するイメージング剤または造影剤として、および／または腫瘍における線量沈着の増強および副作用を低減するための放射線増感剤として、ナノマテリアルを用いることでこの治療指数を改善するために開発されている３，４，５，６，７。どの組織でも吸収される放射線量は、材料の相対原子番号の二乗（Ｚ２）に関係している（Ｚが原子番号）８ことを考慮して、高Ｚ原子（金またはガドリニウムなど）を含むナノ粒子が放射線治療を改善する可能性について広く研究されている。電離放射線への曝露下で、重金属ベースのナノ粒子は、腫瘍への総線量率堆積を改善し、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を誘導し、多くの腫瘍（例えば、黒色腫、神経膠芽腫、乳房および肺癌を含む）に細胞損傷を引き起こす光子およびオージェ電子を産生する９，１０，１１。いくつかの前臨床動物モデルは、腫瘍増殖を減少させるための電離放射線と重金属ベースナノの粒子との組み合わせの能力を明らかにしたにもかかわらず、電離放射線との組み合わせにおいて抗癌治療におけるナノ粒子の使用を改善する必要性が依然として存在する。
【０００３】
本開示において、本発明者らは高Ｚ元素含有ナノ粒子、特にガドリニウム系ナノ粒子（gadolinium-based nanoparticle：ＧｄＢＮ）と電離放射線との組み合わせが、細胞老化および非細胞自律機構による死の両方を誘導する能力を調査した。本発明者らは、ＧｄＢＮの存在下での癌細胞の照射が、照射された癌細胞の老化を受ける能力を強化することを明らかにした。並行して、本発明者らは照射された癌細胞がまた、共食い活性（cannibalistic activity）を示し、そして生きた細胞飲み込み後に、照射されたおよび照射されていない隣接癌細胞の両方を排除することを観察した。本発明者らはさらに、ＧｄＢＮの存在下での癌細胞の照射によって誘導される生物学的効果に関与するシグナル伝達経路を解明し、ＧｄＢＮの存在下での照射後に、癌細胞の増殖が老化誘導および細胞共食い誘導の両方によって損なわれ得ることを明らかにし、前記誘導はＮＯＸ５およびＲＯＣＫ１活性によって媒介されることを明らかにした。これらの発見は、ナノ粒子と電離放射線とを組み合わせた最適化された抗癌治療のための新しい洞察を開いた。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の第１の態様は治療を必要とする対象における腫瘍を処置する方法であって、該方法は
ａ．有効量のナノ粒子の懸濁液を、治療を必要とする対象の腫瘍に投与するステップであって、前記ナノ粒子は４０を超える、好ましくは５０を超える原子Ｚ番号の元素を含み、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満、例えば１〜５ｎｍの平均流体力学的直径を有する、投与するステップと、
ｂ．前記ナノ粒子を含む前記腫瘍を、効率的な線量の電離放射線に曝露するステップと、を含み、
前記電離放射線と前記ナノ粒子との組み合わせ効果は、照射された腫瘍細胞に老化および／または細胞共食いを誘導する方法に関する。
【０００５】
特定の実施形態では、前記腫瘍が少なくとも３Ｇｙ、例えば３Ｇｙ〜９Ｇｙ、または５〜７Ｇｙの電離放射線の分割当たりの線量に曝露される。先の実施形態のより特定の実施では、電離放射線の総線量が１０分割以下で、例えば連続３〜８週間以内に投与される。
【０００６】
１つの特定の実施形態において、この方法は治療ステップの前に、腫瘍におけるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性を決定するステップをさらに包含する。典型的には、治療される対象は、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性または発現レベルがコントロール値より高いか、または少なくとも実質的に同じである腫瘍を有する対象の中から選択される。
【０００７】
特定の実施形態において、この方法は腫瘍におけるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性を増加させるために、電離放射線への曝露ステップの前、またはそれに付随して、またはその後に、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性のエンハンサーまたはモジュレーター剤を投与するステップをさらに包含する。
【０００８】
好ましい実施形態では、電離放射線とナノ粒子との組み合わせ効果は腫瘍細胞に対する、ＮＯＸ５活性によって介される免疫応答を誘導する。
【０００９】
特定の実施形態において、この方法は電離放射線およびナノ粒子の組み合わせ効果によって誘導される免疫応答に加えて、または相乗的に、腫瘍細胞に対する免疫応答をさらに増強するために、電離放射線への曝露ステップの前、またはそれに付随して、またはその後に、免疫治療剤を投与するステップをさらに含む。典型的には、前記免疫治療剤がＰＤ１／ＰＤＬ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤の中から選択され得る。
【００１０】
特定の実施形態において、治療される対象は、アポトーシスを誘導する化学療法治療に抵抗性の腫瘍を有する対象の中から選択される。
【００１１】
特定の実施形態において、この方法は腫瘍細胞中に老化誘導剤を投与するステップをさらに含み、これは、電離放射線とナノ粒子との組み合わせ効果によって誘導される老化に加えて、または相乗的に、腫瘍細胞中の老化をさらに増強する。典型的には、致死量以下の化学療法剤を老化誘導剤として投与することができる。
【００１２】
上記の治療方法において、非照射細胞は、隣接する照射された細胞の細胞共食いによってさらに殺され得る。
【００１３】
特定の実施形態では、老化が、ナノ粒子の存在なしで、同じ電離放射線への曝露によって誘導される老化と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の倍率で増強される。
【００１４】
同様に、特定の実施形態では、細胞共食いは、ナノ粒子の存在なしで、同じ電離放射線への曝露によって誘導される細胞共食いと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の倍率で増強される。
【００１５】
特定の実施形態では、電離放射線に曝露される腫瘍の体積が、治療される腫瘍の総体積よりも小さく、例えば、少なくとも（体積で）１０％小さく、または少なくとも（体積で）２０％小さく、または少なくとも（体積で）３０％小さく、または少なくとも（体積で）４０％小さく、または少なくとも（体積で）５０％小さい。
【００１６】
この方法はさらに、電離放射線に曝露された領域の外側に位置する腫瘍の治療を可能にし得る。
【００１７】
好ましい実施形態では、前記電離放射線がＸ線またはγ線放射線である。
【００１８】
好ましい実施形態では、前記ナノ粒子が高Ｚ元素として希土類金属、好ましくはガドリニウムを含む。例えば、照射時、腫瘍中の高Ｚ元素（例えばガドリニウム）濃度は、０，１〜１０μｇの高Ｚ元素ｇ−１の間でよい。
【００１９】
さらに好ましい実施形態では、前記ナノ粒子が高Ｚ元素、例えば希土類元素のキレートを含む。
【００２０】
典型的には、前記ナノ粒子が
・ポリオルガノシロキサン、
・前記ポリオルガノシロキサンに共有結合したキレート、
・キレートによって錯体化された高Ｚ元素、例えば希土類元素
を含むことができる。
【００２１】
先の実施形態において、前記キレートは、有利にはＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡＢＡ、ＤＯＴＡＧＡからなる群から選択され得る。例えば、前記希土類元素のキレートはガドリニウムのキレートであり、好ましくは、ＤＯＴＡＧＡキレート化Ｇｄ３＋である。より具体的にはナノ粒子当たりの高Ｚ元素（例えば、希土類元素）の比率、例えば、ナノ粒子当たりのガドリニウムの比率は３〜１００、好ましくは５〜２０であり得る。
【００２２】
特定の実施形態では、ナノ粒子を静脈内に投与することができる。例えば、１回の投与で１５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのナノ粒子を、対象に静脈内注射することができる。
【００２３】
特定の実施形態では、ナノ粒子が０．１ｍｇ／ｌから１ｇ／ｌの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｌから１００ｍｇ／ｌの間に含まれる濃度で腫瘍の照射領域に存在する。
【００２４】
本発明の別の態様は、治療を必要とする対象における腫瘍細胞の老化および／または細胞共食いおよび／または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は
ａ．有効量のナノ粒子の懸濁液を、治療を必要とする対象の腫瘍に投与するステップであって、前記ナノ粒子は５０より大きい原子番号Ｚを有する元素を含み、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満の平均直径を有する、投与するステップと、
ｂ．ナノ粒子を含む該腫瘍を効率的な線量の電離放射線に曝露するステップと、を含み、
ｃ．ここで、電離放射線およびナノ粒子の組み合わせ効果は、照射された腫瘍細胞に対して老化および／または細胞共食いを誘導し、かつ／または該腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２５】
本発明の別の態様は、上記で定義した治療方法で使用するためのナノ粒子の懸濁液に関する。特に、本発明は治療を必要とする対象における腫瘍を治療する方法において使用するためのナノ粒子の懸濁液に関し、該方法は
ａ．有効量のナノ粒子の懸濁液を、治療を必要とする対象の腫瘍に投与するステップであって、該ナノ粒子は４０を超える、好ましくは５０を超える原子番号Ｚの元素を含み、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満、例えば１〜５ｎｍの平均流体力学的直径を有する、投与するステップと、
ｂ．該ナノ粒子を含む該腫瘍を効率的な線量の電離放射線に曝露するステップと、を含み、
該電離放射線と該ナノ粒子との組み合わせ効果は、照射された腫瘍細胞に老化および／または細胞共食いを誘導する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ガドリニウム系ナノ粒子（ＧｄＢＮ）は、電離放射線誘導老化に対して癌細胞を感作する。（ａ，ｂ）１．２ｍＭガドリニウム系ナノ粒子（ＧｄＢＮ＋ＸＲ）の存在下（または非存在下）での６グレイ（Ｇｙ）Ｘ線（X-ray：ＸＲ）によるＨＣＴ１１６細胞の照射後に観察されたＳＡ−β−Ｇａｌ活性の顕微鏡写真および頻度を、４８時間の治療後に示す（スケールバー＝１０μｍ）（ｎ＝３）。（ｃ，ｄ）蛍光顕微鏡写真およびｐ２１の頻度も示す（スケールバー＝１０μｍ）（ｎ＝３）。（ｅ）２４時間治療後のｐ２１発現のイムノブロット検出を示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。イムノブロットは、３つの独立した実験の代表である。（ｆ−ｈ）１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６グレイのＸ−ραψσ（ＸＲ）を照射したＨＣＴ１１６細胞の細胞周期分布を、２４時間または４８時間の培養後に分析した。細胞周期分析の定量データを示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｉ）１．２ｍＭガドリニウム系ナノ粒子の存在下（または非存在下）で６グレイＸ線（ＸＲ）を照射し、２４時間後に分析したｐ５３＋／＋、ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／＋およびｐ５３Ｒ２４８Ｗ／−ＨＣＴ１１６細胞上のｐ２１発現のイムノブロット検出である。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。イムノブロットは、３つの独立した実験の代表である。（ｊ）１．２ｍＭガドリニウム系ナノ粒子の存在下（または非存在下）で６グレイＸ線（ＸＲ）によるｐ５３＋／＋、ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／＋およびｐ５３Ｒ２４８Ｗ／−ＨＣＴ１１６細胞の照射後に検出されたＳＡ−β−Ｇａｌ活性の頻度（ＧｄＢＮ＋ＸＲ）。ＳＡ−β−Ｇａｌ活性の測定は、照射の４８時間後に行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。統計的有意性を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図２】共焦点蛍光顕微鏡によるＧｄＢＮ＋ＸＲ誘導非細胞自律死モダリティの検出。（ａ）ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞をＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲで治療した後に、細胞共食いを検出するために使用される実験手順。（ｂ，ｃ）未治療（緑）ＣＭＦＤＡ標識ＨＣＴ１１６細胞と、示された濃度のガドリニウム系ナノ粒子（ＧｄＢＮ）の存在下（または非存在下）で異なる線量のＸ−ραψσを照射された（赤）ＣＭＴＭＲ標識ＨＣＴ１１６細胞との、２４時間共培養後に共焦点蛍光顕微鏡法によって検出された共食い細胞の顕微鏡写真および頻度を示す。共食い細胞の代表的な共焦点画像を（ｂ）（スケールバー＝１０μｍ）に示す。共食い細胞の頻度は（ｃ）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）にある。（ｄ）未治療（緑）ＣＭＦＤＡ標識ＨＣＴ１１６細胞と、１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６グレイのＸ線（ＸＲ）または６グレイのγ線（γ−Ｒａｙ：γＲ）を照射した（赤）ＣＭＴＭＲ標識ＨＣＴ１１６細胞との、２４時間共培養後に共焦点蛍光顕微鏡法によって検出された共食い細胞の頻度を示す。（ｅ）Ｒ（Ｇ）、Ｒ（Ｒ）、Ｇ（Ｒ）またはＧ（Ｇ）を示す共食い細胞の頻度が決定され、示されている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｆ−ｊ）ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞を、治療せず（コントロール）（ｆ）、１．２ｍＭのＧｄＢＮで治療し（ｇ）、１．２ｍＭのＧｄＢＮ存在下で６グレイのＸ線を照射した６グレイのＸ線（ＸＲ）で照射し（ｈ）（ＧｄＢＮ＋ＸＲ）、２４時間後にＤｉＯＣ６（３）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で共染色し、アポトーシスと壊死関連パラメータを評価した。代表的なドットプロットを（ｆ−ｉ）に示し、定量データを（ｊ）に示す。（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。統計的有意性を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図３】ＲＯＣＫ１の活性化は、ＸＲ−およびＧｄＢＮ＋ＸＲ−媒介細胞共食いに必要である。（ａ）ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞に１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６グレイのＸ線（ＸＲ）を照射した後に検出されたカスパーゼ−３（ＣＡＳＰ３ａ）のタンパク質分解切断の代表的なイムノブロットを示す。治療の２４時間後にイムノブロットを行った。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した（ｎ＝３）。（ｂ）１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で、６グレイのＸ線（ＸＲ）で照射され、治療の２４時間後に３０μＭのＹ２７６３２で２４時間培養されたヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞のＭＬＣ２またはＭＬＣ２Ｓ１９＊の代表的なイムノブロットを示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した（ｎ＝３）。（ｃ）３０μＭのＹ２７６３２または１００μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（ｎ＝３）の非存在下または存在下で、コントロール、ＸＲ−またはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療ＨＣＴ１１６細胞の２４時間ホモタイプ培養後の共焦点顕微鏡法によって、共食い細胞の割合を決定した。（ｄ）ＲＯＣＫ１枯渇コントロール、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療ＨＣＴ１１６細胞（およびコントロール細胞）と標的ＨＣＴ１１６細胞（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）との２４時間ヘテロタイプ培養後に検出された共食い細胞の割合。（ｅ）コントロール、ＸＲ−またはＧｄＢＮ＋ＸＲ−治療ＨＣＴ１１６細胞とＲＯＣＫ１を枯渇させた、またはさせなかった標的ＨＣＴ１１６細胞との２４時間ヘテロタイプ培養後に検出された共食い細胞の割合（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｆ）コントロール、ＸＲおよびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療ＨＣＴ１１６細胞における４８時間ＲＯＣＫ１枯渇の代表的なイムノブロットを示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した（ｎ＝３）。統計的有意性を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１および＊＊＊＊またはδδδδはｐ＜０．０００１を表す。
【図４】組み合わせたＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に観察された、飲み込まれた細胞の分解および共食い細胞における老化の検出である。（ａ−ｃ）１００μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下（または非存在下）における、コントロール、ＸＲ−またはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療ＨＣＴ１１６細胞の４８時間均質培養後の単細胞および共食い細胞上で検出された標的細胞劣化（ａ，ｄ）、ｐ２１発現（ｂ，ｅ）およびＳＡ−β−Ｇａｌ＋活性（ａ、ｃ，ｆ，ｇ）を示す。共培養の前に、治療した細胞を（赤）ＣＭＴＭＲプローブで標識した。矢印は、標的細胞分解（ａ）、ｐ２１発現および共食い細胞におけるＳＡ−β−Ｇａｌ活性（ｃ）を示す（スケールバー＝１０μｍ）。（ｄ−ｇ）における頻度は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示される。統計的有意性を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊またはδδはｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。図４ｇにおいて、δδは、ＸＲ治療共食い細胞とＧｄＢＮ＋ＸＲ治療共食い細胞との間の統計的有意性を示す。
【図５】ＧｄＢＮ＋ＸＲ誘導老化および細胞共食いは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５）依存性ＲＯＳ産生を必要とする。（ａ）未治療ＨＣＴ１１６細胞と、１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６ＧｙのＸ−ραψσを照射したＨＣＴ１１６細胞との２４時間共培養後のＲＯＳ産生を示す単細胞および共食い細胞の代表的な顕微鏡写真および頻度を示す。ＲＯＳ産生は、（ａ）において、蛍光顕微鏡（スケールバー＝１０μｍ）を用いた非蛍光Ｈ２ＤＣＦＤＡプローブの緑蛍光ＤＣＦ＋プローブへの転換の検出により、明らかにされる。ＤＣＦ＋染色を示した単細胞および共食い細胞の頻度は（ｂ）（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）にある。（ｃ）ＨＣＴ１１６細胞を１．２ｍＭのＧｄＢＮ、６ＧｙのＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲで治療した後に検出されたｐ２１発現に対する１０μＭのＭｎＴＢＡＰおよび１００μＭのＮＡＣの効果を、イムノブロットを用いて決定した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。（ｄ）特異的ｓｉＲＮＡのプールの４８時間形質導入後のＮＯＸ５ノックダウンの確認。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。（ｅ−ｈ）未治療ＨＣＴ１１６細胞と、１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６ＧｙのＸ−ραψσを照射した（または照射しなかった）ＨＣＴ１１６細胞との２４時間または４８時間の共培養後に検出された、ＲＯＳ産生（ｅ）、ｐ２１発現（ｆ）、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性（ｇ）および細胞共食い（ｈ）に対するＮＯＸ５枯渇の効果を、蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡によって決定した。ＲＯＳ産生（ＤＣＦ＋）、ｐ２１発現、ＳＡ−β−Ｇａｌ＋活性および共食い活性を示す単一細胞および／または共食い細胞の頻度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｉ）未治療ＨＣＴ１１６細胞と、１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６ＧｙのＸ−ραψσを照射した（または照射しなかった）ｐ５３＋／＋、ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／＋またはｐ５３Ｒ２４８Ｗ／−ＨＣＴ１１６細胞との２４時間共培養後に検出された細胞共食いに対するｐ５３不活性化の効果を、蛍光顕微鏡によって決定した。単一細胞および／または共食い細胞の頻度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。統計的有意性を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図６】電離放射線およびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療によって媒介される腫瘍抑制に対するＮＯＸ５不活性化の効果を示す。（ａ）ｓｈコントロールおよびｓｈＮＯＸ５  ＨＣＴ１１６細胞で検出されたΝＯＸ５  ｍＲＮＡの相対的発現。（ｂ，ｃ）１．２ｍＭのＧｄＢＮ、６ＧｙＸ線（ＸＲ）または１．２ｍＭのＧｄＢＮおよび６ＧｙＸ線（ＧｄＢＮ＋ＸＲ）で治療したかまたは治療していないｓｈコントロールＨＣＴ１１６細胞（ｂ）およびｓｈＮＯＸ５  ＨＣＴ１１６細胞（ｃ）の腫瘍増殖を測定し、示した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は治療を必要とする対象において腫瘍を治療する方法に関し、該方法は
ａ．有効量のナノ粒子の懸濁液を、治療を必要とする対象の腫瘍に投与するステップであって、該ナノ粒子は４０より大きい、好ましくは５０より大きい原子番号Ｚを有する元素を含み、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満、例えば１〜５ｎｍの平均流体力学的直径を有する、投与するステップと、
ｂ．該ナノ粒子を含む該腫瘍を、効率的な線量の電離放射線に曝露ステップと、を含む、
本明細書で使用されるように、用語「治療する」または「治療」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の結果としては１つ以上の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の広がりの予防、疾患進行の遅延または緩慢、疾患の逆転、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が挙げられ得るが、これらに限定されない。特に、腫瘍の治療に関して、用語「治療」は、腫瘍の増殖の阻害、または腫瘍のサイズの縮小を指し得る。
【００２８】
本発明による方法で使用されるナノ粒子
本発明は、腫瘍細胞に対する老化および／または細胞共食いおよび／または免疫応答を誘導するための、特定のナノ粒子と電離放射線との組み合わせ効果の、本発明者らによって実証された驚くべき利点に由来する。
【００２９】
本発明の方法の有利な効果は、特にナノ粒子の２つの好ましい特徴に関連する：
ナノ粒子は、放射線増感剤として作用する高Ｚ元素、例えば、４０より大きい、例えば５０より大きい原子番号Ｚを有する元素を含有する。特定の実施形態では前記高Ｚ元素が重金属の中から選択され、より好ましくはＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｚｒ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｌａ、Ｎｄ、Ｐｒ、Ｌｕ、Ｙｂ、Ｂｉ、Ｈｆ、Ｈｏ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｉｎ、およびＧｄ、ならびにそれらの混合物の中から選択される。
【００３０】
ナノ粒子は、好ましくは非常に小さい平均流体力学的直径を有する。例えば１〜１０ｎｍ、さらにより好ましくは１〜５ｎｍ、または例えば１〜５ｎｍ、典型的には約３ｎｍの平均直径を有するナノ粒子は腫瘍におけるこれらのナノ粒子の優れた分布を可能にし、迅速な腎臓排泄（したがって低い毒性）が有利に選択される。
【００３１】
ナノ粒子のサイズ分布は例えば、ＰＣＳ（Photon Correlation Spectroscopy）に基づくMalvern Zetasizer Nano−S粒子サイザーなどの市販の粒子サイザーを使用して測定される。この分布は、平均流体力学的直径によって特徴付けられる。
【００３２】
本発明の目的のために、用語「平均流体力学的直径」または「平均直径」は、粒子の直径の調和平均を意味することが意図される。このパラメータを測定する方法は、標準ＩＳＯ  １３３２１：１９９６にも記載されている。
【００３３】
好ましい実施形態では、ナノ粒子が高Ｚ元素に加えて、生体適合性コーティングをさらに含む。このような生体適合性のために適切な薬剤は生体適合性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、生体ポリマー、多糖類、またはポリシロキサン）を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
ナノ粒子は例えば、画像誘導放射線療法において、イメージング剤または造影剤としても有利に使用することができる。用語「造影剤」は特定の解剖学的構造（例えば、特定の組織または器官）または病理学的解剖学的構造（例えば、腫瘍）を、隣接または非病理学的構造に関して可視化することを可能にする、コントラストを人工的に増加させる目的で、医用画像化において使用される任意の製品または組成物を意味することが意図される。用語「造影剤」は隣接または非病理学的構造に関して、特定の解剖学的構造（例えば、特定の組織または器官）または病理学的解剖学的構造（例えば、腫瘍）を可視化することを可能にする信号を生成する目的で、医用画像化において使用される任意の製品または組成物を意味することが意図される。イメージング剤または造影剤がどのように作用するかの原理は、使用される造影技術に依存する。
【００３５】
有利には、本発明の治療方法におけるナノ粒子の使用と、ＭＲＩによる生体内での検出とを組み合わせることが可能であり、このことは、例えば、本発明に開示されるような治療的治療のモニタリングを可能にする。
【００３６】
好ましくは少なくとも５０重量％のガドリニウム（Ｇｄ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ビスマス（Ｂｉ）またはホルミウム（Ｈｏ）、またはそれらの混合物、例えば少なくとも５０重量％のガドリニウムを含むランタニドのみが、ナノ粒子中の高Ｚ元素として選択される。
【００３７】
一変形例によれば、ランタニドを含む部分が、周辺部に、ＭＲＩ信号を引き起こすランタニド、例えば、ガドリニウムを含み、かつ少なくとも１つの高Ｚ元素（例えば、Ｂｉ）を中央部分に含むナノ粒子が使用される。したがって、非常に高い原子番号を有する放射線吸収性高Ｚ金属は、ナノ粒子のコアの中心に位置し得る。
【００３８】
特定の一実施形態では、本発明に従って使用することができるナノ粒子がＴ１  ＭＲＩ撮像のための少なくとも１つの造影剤と、以下の撮像技術のうちの１つに適した少なくとも１つの他のイメージング剤または造影剤とを含むことを特徴とする：
−ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴシンチグラフィー、
−可視域または近赤外域の蛍光、
−Ｘ線トモデンシトメトリー。
【００３９】
好ましくは、ナノ粒子は、１粒子当たりの緩和度ｒ１が５０〜５０００ｍＭ−１．ｓ−１（３７℃および１．４Ｔ）であり、かつ／またはＧｄ重量比率が少なくとも５％、例えば５％〜５０％の間であるように選択される。
【００４０】
１つの特定の実施形態において、非常に小さい流体力学的直径、例えば１〜１０ｎｍ、好ましくは１〜５ｎｍを有する前記ナノ粒子は高Ｚ元素のキレート、例えば希土類元素のキレート、より好ましくはガドリニウムまたはビスマスのキレートを含むナノ粒子である。
【００４１】
好ましくは先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、前記ナノ粒子が、
・ポリオルガノシロキサン、
・前記ポリオルガノシロキサンに共有結合したキレート、
・キレートによって錯体化された高Ｚ元素を含む。
【００４２】
好ましくは先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、前記キレートがＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡＧＡ、およびＤＴＰＡＢＡ、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４３】
先の実施形態と好ましくは組み合わせることができる特定の実施形態では、希土類元素の前記キレートがガドリニウムおよび／またはビスマスのキレート、好ましくはＤＴＰＡまたはＤＯＴＡＧＡキレート化Ｇｄ３＋および／またはＢｉである。
【００４４】
特定の好ましい実施形態では、ナノ粒子当たりの高Ｚ元素の比率、例えばナノ粒子当たりの希土類元素、例えばガドリニウム（任意選択でＤＯＴＡＧＡでキレート化された）の比率は３〜１００、好ましくは５〜２０、典型的には約１０である。
【００４５】
シンチグラフィーによる撮像のために、ナノ粒子はシンチグラフィーに使用することができる放射性同位元素をさらに含み得、この放射性同位元素は、好ましくは、Ｉｎ、Ｔｃ、Ｇａ、Ｃｕ、Ｚｒ、ＹまたはＬｕの放射性同位元素、例えば、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、９０Ｙまたは１７７Ｌｕからなる群から選択される。
【００４６】
近赤外範囲の蛍光について、ナノ粒子は、Ｎｄ、ＹｂまたはＥｒから選択されるランタニドをさらに含んでもよい。
【００４７】
可視範囲の蛍光のために、ナノ粒子は、ＥｕまたはＴｂから選択されるランタニドをさらに含み得る。
【００４８】
近赤外範囲の蛍光について、ナノ粒子は、シアニン５．５、シアニン７、アレクサ６８０、アレクサ７００、アレクサ７５０、アレクサ７９０、Ｂｏｄｉｐｙから選択される有機フルオロフォアをさらに含んでもよい。
【００４９】
特定の実施形態では、ハイブリッドナノ粒子はコア−シェル型である。希土類酸化物および任意に官能化されたポリオルガノシロキサンマトリックスからなるコアに基づくコア−シェル型のナノ粒子が知られている（特に、ＷＯ  ２００５／０８８３１４、ＷＯ  ２００９／０５３６４４を参照されたい）。
【００５０】
ナノ粒子はさらに、特定の組織へのナノ粒子の標的化を可能にする分子で官能化されてもよい。前記薬剤は共有結合によってナノ粒子に結合させることができ、または非共有結合によって、例えば、カプセル化もしくは親水性／疎水性相互作用によって、またはキレート剤を使用して捕捉することができる。
【００５１】
１つの特定の実施形態では、以下を含むハイブリッドナノ粒子が使用される：
−ポリオルガノシロキサン（ＰＯＳ）マトリックスであって、希土類カチオンＭｎ＋を含み、ｎは２〜４の間の整数であり、任意に部分的に金属酸化物および／またはオキシ水酸化物の形態であって、任意にドープカチオンＤｍ＋と会合し、ｍは２〜６の間の整数であり、Ｄは好ましくはＭ以外の希土類金属、アクチニドおよび／または遷移元素である、ＰＯＳマトリックス；
−共有結合−Ｓｉ−Ｃ−を介してＰＯＳに共有結合したキレート、
−Ｍｎ＋カチオン、および適切な場合にはキレートによって錯体化されているＤｍ＋カチオン；
適切な場合には、ナノ粒子の標的のための標的分子であって、前記標的分子がＰＯＳまたはキレートにグラフトされている。
【００５２】
コア−シェル型の構造の場合、ＰＯＳマトリックスは、金属カチオンベースのコアを取り囲む表面層を形成する。その厚さは、０．５〜１０ｎｍの範囲とすることができ、総体積の２５％〜７５％に相当することができる。
【００５３】
ＰＯＳマトリックスは外部媒体に対するコアの保護（特に、加水分解に対する保護）として作用し、造影剤の特性（例えば、ルミネセンス）を最適化する。それはまた、キレート化剤および標的分子のグラフト化を介して、ナノ粒子の官能化を可能にする。
【００５４】
有利には、キレートが以下の製品から選択される：
−ポリアミノポリカルボン酸およびその誘導体の群の製品、さらにより好ましくは、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡＧＡ、ＤＴＰＡＢＡおよびそれらの混合物を含む下位群の製品；
−ポルフィリン、塩素、１，１０−フェナントロリン、ビピリジン、テルピリジン、シクラム、トリアザシクロノナン、これらの誘導体およびこれらの混合物を含む群の製品。
【００５５】
Ｍがランタニド、例えばＧｄである場合、キレートは、有利にはランタニド錯体化特性を有するもの、特に錯体化定数ｌｏｇ（ＫＣ１）が１５より大きいもの、好ましくは２０より大きいものから選択される。ランタニド錯体化キレート剤の好ましい例としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、または１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、またはそれらの誘導体、および１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，グルタル酸無水物−４，７，１０−三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ）のユニットを含むものを挙げることができる。
【００５６】
さらに、意図される用途に応じて、ナノ粒子は任意選択で、別の希土類またはアクチニド金属カチオン、例えば、ランタニド、または少なくとも１つがＥｕおよびＴｂから選択される、２つの異なるランタニドでドーピングされる。
【００５７】
「コアフリー」超微細粒子
特に好適な具体例では特にその非常に小さいサイズおよび剛性構造のために、本発明に従って使用することができるナノ粒子は以下のステップを含むトップダウン合成経路によって得られる：
−金属（Ｍ）酸化物コアを得るステップであって、Ｍは希土類、アクチニドおよび遷移元素の群から選択される高Ｚ元素である、Ｍ酸化物コアを得るステップと、
−例えばゾルゲルプロセスを介して、Ｍ酸化物コアの周りにポリシロキサンシェルを加えるステップと、
−キレート化剤をＰＯＳシェルにグラフト化し、キレート化剤を−Ｓｉ−Ｃ共有結合によって前記ＰＯＳシェルに結合させることにより、コア−シェル前駆体ナノ粒子を得るステップと、
−コア−シェル前駆体ナノ粒子を水溶液中で精製および移動させるステップと、を含み、
グラフト化剤はステップｄで金属（Ｍ）酸化物コアを溶解し、カチオン形態の（Ｍ）を錯体化するのに十分な量であるため、それによって、得られるハイブリッドナノ粒子の平均流体力学的直径が、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満、例えば１〜５ｎｍの間に低減する。
【００５８】
上記の様式に従って得られたこれらのナノ粒子は、少なくとも１つのコーティングによってカプセル化された金属酸化物のコアを含まない。これらのナノ粒子の合成に関するさらなる詳細は、次のセクションで与えられる。
【００５９】
このトップダウン合成法は、典型的には１〜５ｎｍの観察されるサイズをもたらす。使用されるタームは、超微細ナノ粒子である。
【００６０】
これらの「超微細」または「コアフリー」ナノ粒子は任意選択で、標的分子、特に、以下の段落に記載されるように肺組織を標的とする分子にグラフトされる。
【００６１】
これらの超微細ナノ粒子の別の特徴は、物体の硬質性、および注入後の粒子の全体的な幾何学的形状を維持することである。この強い三次元剛性はポリシロキサンマトリックスによって提供され、ここで、ケイ素の大部分は酸素架橋によって３個または４個の他のケイ素原子に結合される。この剛性と小さいサイズとの組み合わせは市販の化合物（例えば、Ｇｄ−ＤＯＴＡベースの複合体）と比較して、中間周波数（２０〜６０ＭＨｚ）に対するこれらのナノ粒子の緩和度を増加させることを可能にするが、また、新世代の高磁場ＭＲＩに存在する１００ＭＨｚを超える周波数に対しても、緩和度を増加させることを可能にする。
【００６２】
好ましくは、本発明の方法で使用するナノ粒子が５ｍＭ−１．ｓ−１（３７℃）（Ｍｎ＋イオン）、優先的に１０ｍＭ−１．ｓ−１（３７℃）（Ｍｎ＋イオン）を超えるＭｎ＋イオン当たりの緩和度ｒ１を、２０ＭＨｚの周波数で有する。例えば、ナノ粒子は５０〜５０００ｍＭ−１．ｓ−１のナノ粒子当たりの緩和度ｒ１を有する。さらにより良好には、これらのナノ粒子が６０ＭＨｚでのＭｎ＋イオンあたりの緩和率ｒ１を有し、これは２０ＭＨｚでのＭｎ＋イオンあたりの緩和率ｒ１以上である。ここで考慮される緩和率ｒ１はＭｎ＋（例えば、ガドリニウム）イオン当たりの緩和率である。ｒ１は次式から抽出される：１／Ｔ１＝［１／Ｔ１］水＋ｒ１［Ｍｎ＋］。
【００６３】
これらの超微細ナノ粒子に関するさらなる詳細、それらを合成するためのプロセス、およびそれらの使用は、参照により組み込まれる特許出願ＷＯ  ２０１１／１３５１０１に記載されている。
【００６４】
本発明による使用のためのナノ粒子の好ましい実施形態を得るためのプロセス
一般に、当業者は、本発明に従って使用されるナノ粒子を容易に製造することができるだろう。より具体的には、以下の要素に留意されたい：
ランタニド酸化物またはオキシ水酸化物のコアに基づくコア−シェル型のナノ粒子については、例えば、P. Perriat et al., J. Coll. Int. Sci, 2004, 273, 191; O. Tillement et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5076 and P. Perriat et al., J. Phys. Chem. C, 2009, 113, 4038に記載されているように、溶媒としてアルコールを使用する製造プロセスが使用される。
【００６５】
ＰＯＳマトリックスについては、Stoeber（Stoeber、W； JColloid Interf Sci 1968、26、62）によって開始されたものに由来するいくつかの技術を使用することができ、Louisら（Louis et al、2005、Chemistry of Materials、17、1673-1682）または国際出願ＷＯ  ２００５／０８８３１４に記載されているようなコーティングに使用されるプロセスを使用することもできる。
【００６６】
実際には、超微細ナノ粒子の合成が例えば、Mignot et al Chem. Eur. J. 2013, 19, 6122-6136に記載されている：典型的に、コア／シェルタイプの前駆体ナノ粒子はランタニドオキサイドコア（変性ポリオールルート経由）およびポリシロキサンシェル（ゾル／ゲル経由）で形成される。この物体が例えば、約１０ｎｍ（優先的に５ナノメートル）の流体力学的直径を有する。従って、非常に小さなサイズ（１０ｎｍ未満に調整可能）の酸化ランタニドコアは、以下の刊行物に記載されている処理の１つによってアルコール中で製造することができる：P. Perriat et al., J. Coll. Int. Sci, 2004, 273, 191; O. Tillement et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5076 and P. Perriat et al., J. Phys. Chem. C, 2009, 113, 4038。
【００６７】
これらのコアは例えば、以下の刊行物に記載されるプロトコルに従って、ポリシロキサンの層でコーティングされ得る：C. Louis et al., Chem. Mat., 2005, 17, 1673 and O. Tillement et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5076。
【００６８】
意図する金属カチオンに特異的なキレート剤（例えば、Ｇｄ３＋用のＤＯＴＡＧＡ）をポリシロキサンの表面にグラフトする；その一部を層の内側に挿入することもできるが、ポリシロキサンの形成の制御は複雑であり、単純な外部グラフトはこれらの非常に小さなサイズで、グラフトの充分な割合を与える。
【００６９】
ナノ粒子は、適切な大きさの細孔を含む膜上で、透析法またはタンジェンシャルフィルトレーション法の手段によって、合成残留物から分離される。
【００７０】
コアは溶解によって（例えば、ｐＨを変更することによって、または水溶液中に錯体化分子を導入することによって）破壊される。次に、コアのこの破壊はポリシロキサン層の散乱を可能にし（遅い腐食または崩壊のメカニズムによる）、これは、最終的に、複雑な形態を有するポリシロキサン物体を得ることを可能にし、その特徴的な寸法はポリシロキサン層の厚さのオーダーであり、すなわち、これまでに製造された物体よりもはるかに小さい。
【００７１】
したがって、コアを除去することにより、直径約５ナノメートルの粒子サイズから約３ナノメートルのサイズに低下させることが可能になる。さらに、この操作は同じサイズであるが表面にのみＭ（例えば、ガドリニウム）を含む理論的ポリシロキサンナノ粒子と比較して、ｎｍ３当たりのＭ（例えば、ガドリニウム）の数を増加させることを可能にする。ナノ粒子サイズについてのＭの数は、ＥＤＸによって測定されるＭ／Ｓｉ原子比によって評価することができる。
【００７２】
標的分子は例えば、Montalbetti, C.A.G.N, Falque B. Tetrahedron 2005, 61, 10827-10852に記載されているように、ナノ粒子の有機成分上のペプチド結合を用いて、これらのナノ粒子上にグラフトさせることができる。
【００７３】
Jewett, J.C.；Bertozzi, C.R. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1272-1279の「クリックケミストリー」を使用し、以下のタイプの基が関与するカップリング法を使用することもできる：
−Ｎ３、−ＣＮ、−Ｃ≡ＣＨ、または次のいずれかの基：
【００７４】
【化１】
2020525467.tif 000002
１つの特定の実施形態では、本発明によるナノ粒子が酸官能基を有するキレート化剤、例えばＤＯＴＡまたはＤＯＴＡＧＡを含む。ナノ粒子の酸官能基は例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロスクシンイミド）を用いて、適切な量の標的分子の存在下で活性化される。次いで、このようにグラフトされたナノ粒子は、例えばタンジェンシャルフィルトレーションによって精製される。
【００７５】
治療対象
本発明による方法は、患者の腫瘍、例えばヒト患者の腫瘍を治療することを意図する。
【００７６】
本明細書中で互換的に使用される用語「患者」および「対象」は動物界の任意のメンバー、好ましくは哺乳類、またはヒト（例えば、腫瘍を有する対象を含む）を指す。
【００７７】
特定の実施形態では、治療方法が悪性固形腫瘍、特に脳腫瘍（原発性および二次性神経膠芽腫）、骨盤悪性腫瘍（子宮頸部、前立腺、肛門直腸および結腸直腸癌）、肝癌（原発性および二次性）、頭頸部癌、肺癌、エオソファガス癌、乳癌、膵癌の治療を対象とする。
【００７８】
本発明者らは、ナノ粒子と電離放射線との組み合わせ効果による細胞共食いおよび／または老化の有利な誘導がＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性によって媒介されることを特定した。実際、試験された癌細胞株においてインビトロでＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性を阻害する場合、細胞共食いおよび／または老化の誘導は観察されない。
【００７９】
従って、このような治療を必要とする患者は、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性の高い発現レベルを有する腫瘍を有する患者の中から有利に選択され得る。これらの患者は治療される前記腫瘍細胞に対する老化および／または細胞共食いを誘導するために、ナノ粒子と電離放射線とを組み合わせた治療に対する良好な応答者であると予測される。
【００８０】
本明細書で使用される「ＮＯＸ５」という用語は、スーパーオキシドを生成するＮＡＤＰＨオキシダーゼ５、好ましくはヒトＮＯＸ５を指す。Ｎｏｘ５はｃ−ａｂｌと相互作用し、スーパーオキシド産生はｃ−ａｂｌのリン酸化をもたらし、一方ｃ−ａｂｌキナーゼ活性の阻害はＮｏｘ５スーパーオキシド産生を阻害する。ＮＯＸ５は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ中の参照Ｑ９６ＰＨ１によって同定されるタンパク質配列を有する。
【００８１】
本明細書中で使用される「ＲＯＣＫ１」という用語は、Ｒｈｏ関連コイル−コイル含有タンパク質キナーゼ１を指し、これは、ＧＴＰ結合形態のＲｈｏに結合した場合に活性化されるタンパク質セリン／トレオニンキナーゼである。ＲＯＣＫ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ中の参照Ｑ１３４６４によって同定されるタンパク質配列を有する。
【００８２】
「ＮＯＸ５またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性」に言及する場合、それは、本明細書中では遺伝子の発現レベル（ｍＲＮＡ発現など）および／または対応するタンパク質発現および／または対応するタンパク質活性（酵素活性）のいずれかを指す。
【００８３】
従って、１つの好ましい実施形態において、治療の方法は、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性を決定するステップを包含する。患者は例えば、患者の腫瘍におけるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現レベルまたは活性が、コントロール値と実質的に同一であるか、またはそれより高い場合、本発明の治療に対する良好な応答者であると予測される。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、より高い発現レベルまたは活性は、コントロール値と比較して、このような発現レベルまたは活性の統計的に有意な増加、好ましくはコントロール値の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％の増加を意味する。
【００８５】
本明細書で使用される「良好な応答者」という用語は、患者が例えば、コントロール値に対応するＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１の発現レベルまたは活性を有する患者と比較して、治療に対するより良好な応答の恩恵を受ける可能性が高いことを意味する。
【００８６】
したがって、本発明の方法は、（ａ）前記患者の腫瘍から得られた生検または腫瘍細胞において、予測バイオマーカーとしてのＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１の発現を決定するステップと、（ｂ）得られた発現値を対応するコントロール値と比較するステップと、を含む。
【００８７】
前記コントロール値は例えば、応答性患者および／または低応答性患者の対応する腫瘍におけるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現の正規化（相対）平均値の平均値であってもよい。
【００８８】
前記コントロール値はまた、本発明の方法に使用される定量化方法および予測バイオマーカーに応じて、定型的な実験によって決定することもできる。
【００８９】
例えば、前記コントロール値は低応答患者について観察された発現レベル値に対応し、発現レベル値がコントロール値より統計的に高い場合、患者は応答者であると予測される。
【００９０】
あるいは、前記コントロール値が応答性患者について観察された発現レベル値に対応し、発現レベル値がコントロール値（閾値）と統計的に異ならないか、またはさらに高い場合、患者は応答者であると予測される。
【００９１】
さらに代替的に、前記コントロール値は、患者の非腫瘍組織において観察されるＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１発現の正規化（相対）平均値の平均値に対応する。
【００９２】
比較ステップは手動で実行されてもよいし、コンピュータ支援で実行されてもよい。
【００９３】
予測バイオマーカーＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１の発現は、対象の腫瘍の生物学的サンプル中のこのような予測バイオマーカーの遺伝子またはタンパク質発現を決定することによって定量され得る。定量は、少なくとも既知のコントロール量に対して相対的な特定量を決定するために、（例えば、バイオマーカーの量をコントロールと既知量のバイオマーカーと比較し、そのコントロールと比較して「より高い」または「より低い」量を検出することによって）相対的であってもよく、またはより精密であってもよい。
【００９４】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかで任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たすことができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは重合後に、例えば標識成分との結合によって、さらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
【００９５】
「遺伝子」とは、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドをいい、転写および翻訳後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる。ポリヌクレオチド配列は、それらが関連する遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード配列を同定するために使用され得る。より大きなフラグメント配列を単離する方法は、当業者に公知である。「遺伝子発現」、「遺伝子産物」または「発現」は本明細書中で交換可能に使用され、遺伝子が転写および翻訳される場合に生成される核酸またはアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、バイオマーカーのｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列；バイオマーカー遺伝子発現、バイオマーカータンパク質発現、バイオマーカーｍＲＮＡ発現；バイオマーカータンパク質の機能的効果、バイオマーカー遺伝子の機能的効果、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、遺伝子またはｍＲＮＡ活性を指す。
【００９６】
特定の実施形態において、「発現レベル」、「遺伝子発現」、「遺伝子産物」または「発現」は、ｍＲＮＡ発現、ｃＤＮＡ発現、タンパク質転写およびタンパク質発現を示す。
【００９７】
「ポリペプチド」という用語は「タンパク質」という用語と交換可能に使用され、その最も広い意味では２つ以上のサブユニットアミノ酸の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。
【００９８】
そのような定量化方法は代替的に、前記予測バイオマーカーの対応するｍＲＮＡの定量化を包含する、前記予測バイオマーカーの対応する遺伝子発現レベルの検出および定量化を含んでもよく、これは例えば、リアルタイム定量ＰＣＲを実施することによって、またＤＮＡマイクロアレイ、すなわち、規定された位置で、前記予測バイオマーカーの増幅されたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする核酸が結合される基板を使用することによって行われる。
【００９９】
典型的には特定の実施形態において、患者の生物学的サンプルから得られた転写ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）の混合物は逆転写および定量的増幅に供される。前記ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡは、ＤＮＡマイクロアレイへのストリンジェントなハイブリダイゼーションまたはノーザンブロットのいずれかによるインビトロ技術によって検出され得る。
【０１００】
いずれの場合においても、このような検出および定量アッセイの一般原理は、予測バイオマーカーおよびプローブが相互作用および結合することを可能にするのに十分な適切な状態および時間の間、予測バイオマーカーおよびプローブを含み得るサンプルまたは反応混合物を調製することを含み、したがって、反応混合物中で検出（および定量）され得る複合体を形成する。
【０１０１】
バイオマーカーのこれらの検出および／または定量アッセイは、様々な方法で行うことができる。特定のアッセイおよびその構成要素に対する適切な条件は、当業者に周知である。
【０１０２】
特定の実施形態において、予測バイオマーカーｍＲＮＡのレベルは、当該分野で公知の方法を使用して、生物学的サンプル中のインビトロ形式の両方によって決定され得る。
【０１０３】
特定の方法としてはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲまたはノーザンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
バイオマーカーの発現レベルはまた、予測バイオマーカーのうちの少なくとも１つのタンパク質発現またはタンパク質産物を試験することによって決定され得る。タンパク質レベルを決定することは、患者から得られたサンプル中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に認識し、結合する抗体間で生じる任意の免疫特異的結合の量を測定すること、およびこれを、コントロールサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの免疫特異的結合の量と比較することを含む。バイオマーカーのタンパク質発現量は、コントロール発現と比較した場合、増加または減少させることができる。
【０１０５】
このような生物学的サンプル中のタンパク質発現レベルを検出するための種々の方法が当該分野で公知であり、種々のイムノアッセイ方法が挙げられる。それらはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリーアッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素またはラジオアイソトープ標識を使用する）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、イムノ蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、共焦点顕微鏡法、酵素アッセイ、表面プラズモン共鳴およびＰＡＧＥ−ＳＤＳを含むが、これらに限定されない。ＮＯＸ５またはＲＯＣＫ１  ｅｌｉｓａキットは市販されている。
【０１０６】
あるいは、適切な酵素アッセイを使用して、ＮＯＸ１および／またはＲＯＣＫ１活性の酵素活性が、予測バイオマーカーとして測定され得る。ｒｏｃｋ１キナーゼアッセイは例えば、ＰＲＯＭＥＧＡ（ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）キナーゼアッセイ）から入手可能である。
【０１０７】
ナノ粒子の治療対象への投与
本発明の方法は、有効量のナノ粒子の懸濁液を対象の腫瘍に投与するステップを含む。
【０１０８】
ナノ粒子は、ローカル経路（腫瘍内経路（ＩＴ）、動脈内経路（ＩＡ））、皮下経路、静脈内経路（ＩＶ）、皮内経路、気道経路（吸入）、腹腔内経路、筋肉内経路、髄腔内経路、眼内経路、または経口経路などの様々な可能な経路を使用して対象に投与することができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、ナノ粒子は静脈内に投与され、ナノ粒子は、受動的標的化によって、例えば、増強された透過性および保持効果によって、腫瘍に有利に標的化される。
【０１１０】
ナノ粒子の反復注射または投与は、必要に応じて行うことができる。
【０１１１】
一実施形態において、ナノ粒子は、腫瘍の照射時に、腫瘍中の高Ｚ元素（例えば、ガドリニウム）濃度が０，１〜１０μｇの高Ｚ元素ｇ−１の間になる量で、患者に投与される。
【０１１２】
特定の実施形態では、１回の投与で、１５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのナノ粒子（例えば、ガドリニウムのキレートを有するコアレス超微細ナノ粒子）が、対象に静脈内注射される。
【０１１３】
特定の実施形態では、ナノ粒子が０．１ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｌの濃度で腫瘍の照射領域に存在するように、ナノ粒子を患者の腫瘍に投与する。
【０１１４】
老化および／または細胞共食いの誘導の効果は、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性によって媒介されるので、患者にＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性のエンハンサーまたはモジュレーター剤をさらに投与することが有利であり得る。
【０１１５】
したがって、治療方法の特定の実施形態では、治療方法が、電離放射線への曝露ステップの前、またはそれに付随して、またはその後に、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性のエンハンサーまたはモジュレーター剤を投与するステップをさらに含む。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性のエンハンサー剤はインビボで、例えば、患者の腫瘍組織において、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性を増加させることができる化合物もしくは薬物または化合物もしくは薬物の組み合わせを指す。このようなエンハンサー剤は例えば、それぞれＮＯＸ５またはＲＯＣＫ１のシグナル伝達経路の下流で作用する、ＮＯＸ５のオキシダーゼ活性またはＲＯＣＫ１のキナーゼ活性の直接的な活性化因子または間接的なエンハンサーであり得る。
【０１１７】
ＮＯＸ５のこのようなエンハンサー剤の例には、シプラチン、カルシウム流入物、ホルボールミリステートアセテート、アンギオテンシンＩＩおよびエンドセリン−１が含まれる。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性のモジュレーター剤はインビボで、例えば、患者の腫瘍組織において、ＮＯＸ５および／またはＲＯＣＫ１活性を増加、減少、または消失させることができる化合物もしくは薬物、または化合物もしくは薬物の組み合わせを指す。このようなモジュレーター剤は例えば、それぞれＮＯＸ５またはＲＯＣＫ１のシグナル伝達経路の下流で作用する、ＮＯＸ５のオキシダーゼ活性またはＲＯＣＫ１のキナーゼ活性の直接的なアクチベーターまたは阻害剤、または間接的なエンハンサーまたは阻害剤であり得る。
【０１１９】
本発明者らはさらに、組み合わせ効果、すなわち電離放射線およびナノ粒子が、腫瘍細胞に対して、ＮＯＸ５活性によって媒介される免疫応答を誘導し得ることを見出した。このような応答は、照射された腫瘍の細胞、または患者内の他の腫瘍細胞に向けられ得る。
【０１２０】
したがって、例えば、治療方法を免疫治療処置と組み合わせることによって、このような免疫応答を増加させることが有利であり得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法が電離放射線およびナノ粒子の組み合わせ効果によって誘導される免疫応答に加えて、または相乗的に、免疫応答をさらに強化するために、電離放射線への曝露ステップの前、またはそれに付随して、またはその後に、免疫治療剤を投与するステップをさらに含む。
【０１２１】
典型的には、前記免疫治療薬が免疫チェックポイント阻害剤の中から選択される。免疫チェックポイント阻害剤は例えば、Parldoll DM Nat Rev Cancer 12(2012):252-264 and Herrera FG et al CA Cancer J Clin. 67(2017):65-85. doi: 10.3322/caac.21358に記載される。これらには例えば、ＰＤ１／ＰＤＬ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、より具体的には抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ４抗体が含まれる。
【０１２２】
本発明者らの主な発見の１つは、ナノ粒子と電離放射線との組み合わせ効果がアポトーシスに関連しない機構（非細胞自律細胞死機構）によって腫瘍の細胞死を誘導することである。したがって、本発明の治療方法は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する通常の化学療法治療に耐性であることが示されている腫瘍を治療するのに特に適している。このような通常の化学療法処置には、特にシスプラチナおよび誘導体、５フルオルウラシル、タキサン、およびＥＧＦｒ阻害剤が含まれる。
【０１２３】
本発明の治療方法は、老化誘導剤を投与するステップをさらに含んでもよい。そのような老化誘導剤は、有利には電離放射線とナノ粒子との組み合わせ効果によって誘導される老化に加えて、または相乗的に、老化を増強することができる。特定の実施形態では、前記老化誘導剤が、老化を誘導することが知られている化学療法剤の中から選択され、この化学療法剤は、限定するものではないが、以下を含む：
アクチノマイシン、オールトランスレチノイン、酸アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレアミン、ダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ヴァラフェニブ、ビンブラスチン、ヴィンクリスチン、ヴィンデシン。
【０１２４】
腫瘍を電離放射線に曝露する
本明細書中に記載されるナノ粒子は、放射線療法が古典的な治療であるか、または最も適切な治療であるか、または適応され得る腫瘍を治療するために使用される。
【０１２５】
放射線療法または放射線療法は、悪性細胞を制御するための癌治療の一部としての、放射線、すなわち電離放射線の医学的使用である。それは、緩和的処置として、または治療的処置として使用される。放射線療法は、様々なタイプの癌を治療するための重要な標準療法として受け入れられている。
【０１２６】
本明細書中で使用される場合、「放射線療法」という用語は、電離放射線に対応する照射による腫瘍学的性質の疾患の処置のために使用される。電離放射線は治療されるエリア（標的組織）内の細胞を、それらの遺伝物質を損傷することによって損傷または破壊するエネルギーを堆積し、これらの細胞が増殖し続けることを不可能にする。
【０１２７】
特定の実施形態では本発明の方法がナノ粒子を含む腫瘍を効率的な線量の電離放射線に曝露することを含み、前記電離放射線は光子、例えばＸ線である。それらが有するエネルギーの量に依存して、光線は、身体の表面またはより深くの癌細胞を破壊するために使用され得る。Ｘ線ビームのエネルギーが高ければ高いほど、Ｘ線はより深く標的組織に入ることができる。線形加速器およびベータトロンは、ますます大きなエネルギーのＸ線を生成する。放射線（Ｘ線など）を癌部位に集束させるための機械の使用は、外部ビーム放射線療法と呼ばれる。
【０１２８】
本発明による治療方法の代替実施形態では、ガンマ線が使用される。ガンマ線は特定の元素（例えば、ラジウム、ウラン、およびコバルト６０）が分解または崩壊するときに、放射線を放出することにつれて、自然に生成される。
【０１２９】
電離放射線は、典型的には２ｋｅＶ〜２５０００ｋｅＶ、特に２ｋｅＶ〜６０００ｋｅＶ（すなわち６ＭｅＶ）または２ｋｅＶ〜１５００ｋｅＶ（例えばコバルト６０源）である。
【０１３０】
放射線治療分野の当業者は、疾患の性質および患者の体質に応じて、適切な投薬および適用スケジュールを決定する方法を知っている。特に、当業者は、用量制限毒性（ＤＬＴ）をどのように評価するか、およびそれに応じて最大耐量（ＭＴＤ）をどのように決定するかを知っている。
【０１３１】
光子放射線療法で使用される放射線の量は、グレイ（Ｇｙ）で測定され、治療される癌の種類および段階に応じて変化する。治癒例では、固体上皮腫瘍の典型的な線量は６０〜８０Ｇｙの範囲である。放射線腫瘍医は、患者が化学療法を受けているかどうか、患者の合併症、放射線療法が手術の前または後に施行されているかどうか、および手術の成功の程度を含めて、線量を選択する際に多くの他の因子を考慮している。
【０１３２】
総線量は、典型的には分割される（経時的に広がる）。量およびスケジュール（電離放射線の計画および送達、分割投与、分割送達スキーマ、総投与単独、または他の抗癌剤との組み合わせなど）は、任意の疾患／解剖学的部位／疾患段階の患者設定／年齢について定義され、任意の特定の状況についてのケアの標準を構成する。
【０１３３】
成人のための典型的な従来の分割スケジュールは、１日当たり１．８〜２Ｇｙ、週当たり５日、例えば連続５〜８週間であり得る。
【０１３４】
高線量の電離放射線で得られる本方法によるナノ粒子と電離放射線との組み合わせ効果を考慮すると、１つの特定の実施形態では、患者の腫瘍に曝露される電離放射線の線量が有利には低分割される。例えば、少なくとも３Ｇｙ、例えば３Ｇｙ〜９Ｇｙ、または５〜７Ｇｙの分割当たりの線量を患者の腫瘍に曝露し、放射線総線量を少数の分割（典型的には、必然的ではないが、１０分割以下）で送達する。
【０１３５】
本発明者らは、ナノ粒子と放射線療法とを組み合わせた治療が、照射されていない腫瘍細胞に対しても、特に細胞老化、細胞共食いおよび／またはそのような細胞に対する免疫応答の誘導を介して、効果を誘導することを可能にすることを確立した。
【０１３６】
したがって、有利な効果によれば、この治療は、典型的にはナノ粒子の存在なしで、同じ電離放射線への曝露によって誘導される老化と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の倍率で老化の増強を可能にし得る。
【０１３７】
したがって、有利な効果によれば、この治療は、典型的にはナノ粒子の存在なしで、同じ電離放射線への曝露によって誘導される細胞共食いと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の倍率で細胞共食いの増強を可能にすることもできる。
【０１３８】
したがって、一実施形態では、電離放射線に曝露される腫瘍の体積が治療される総体積よりも小さく、例えば、少なくとも（体積で）１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％小さい。
【０１３９】
さらに、特定の実施形態において、この方法は、電離放射線に曝露された領域の外側に位置する腫瘍の治療を可能にする。
【０１４０】
ナノ粒子は例えば、放射線療法の最初の照射の投与の前に、治療されるべき腫瘍を有する対象に、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間投与され得る。
【０１４１】
本発明の方法の他の側面および利点は、例示のみの目的で与えられる以下の例において明らかになるであろう。
【実施例】
【０１４２】
材料および方法
細胞、試薬およびガドリニウム系ナノ粒子
大腸癌（ｐ５３＋／＋、ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／＋およびｐ５３Ｒ２４８／−）ＨＣＴ１１６細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｕｌｔｅｃ  ＧｍｂＨ）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加したＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で維持した。ヒト大腸癌変異体ＨＣＴ１１６ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／−、ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／＋およびＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋を、Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ  Ｂｏｕｒｄｏｎから入手した。ベンジルオキシカルボキシル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は、Ｂａｃｈｅｍから入手した。ＲＯＣＫ１阻害剤（Ｙ２７６３２）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）はＳｉｇｍａ製であり、マンガン（ＩＩＩ）−テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリン（ＭｎＴＢＡＰ）はＭｅｒｃｋ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製であった。ガドリニウム系ナノ粒子（ＧｄＢＮ）は、ＮＨ  ＴｈｅｒＡｇｕｉｘから入手した。
【０１４３】
ＲＮＡ介在性干渉
ＲＯＣＫ１に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ−１  ＲＯＣＫ１：５’  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＣＵＡ  Ｕ３’；  ｓｉＲＮＡ−２  ＲＯＣＫ１：５’  ＧＧＡ  ＡＵＣ  ＣＡＧ  ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＡＣＡ  ３’）およびコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１  Ｃｏ．：５’  ＧＣＣ  ＧＧＵ  ＡＵＧ  ＣＣＧ  ＧＵＵＵ  ＡＡＧ  Ｕ  ３’）をＳｉｇｍａから入手した。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＮＯＸ５  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＮＯＸ５）（Ｄ−０１０１９５−０５）は、４個のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１：５’  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＵＧＵ  ＵＣＣ  ＡＧＡ  ３’；  ｓｉＲＮＡ−２：５’  ＣＵＡ  ＵＡＧ  ＡＣＣ  ＵＧＧ  ＵＧＡ  ＣＵＡ  ３’；  ｓｉＲＮＡ−３：５’  ＧＣＵ  ＡＵ  Ｕ  ＧＧＧ  ＣＵＡ  ＧＧＵ  Ａ  ３’およびｓｉＲＮＡ−４：５’  ＣＣＵ  Ｕ  ＣＵＵＧ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＧＡＵ  ３’）を含む。コントロールｓｉＧＥＮＯＭＥ非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−２  Ｃｏ．として示される）は、４つのオン標的プラス非標的ｓｉＲＮＡのプールである（D-0012206-13-05）。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＮＯＸ５  ｓｉＲＮＡおよびｓｉＧＥＮＯＭＥ非標的ｓｉＲＮＡ  Ｐｏｏｌ＃１は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。ＲＮＡ干渉のために、ＨＣＴ１１６細胞を、ｓｉＲＮＡ形質導入の４８時間前に播種した（６ウェルプレート中で５．０×１０５細胞／２ｍＬ／ウェル）。次いで、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ｍａｘ（＃13778150、Life technologies）を製造者の指示に従って使用して１０ｎＭのｓｉＲＮＡで形質導入し、その後の実験の前に３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１４４】
照射
ＨＣＴ１１６細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃で１時間、示された濃度のＧｄＢＮと共にインキュベートした。次に、Ｘ線照射器（１Ｇｙ／ｍｉｎ，２００ｋｅＶ，１５ｍＡ，２ｍｍ銅厚、X-RAD 320、Precision X-Ray）またはγａｍｍａ線照射器（IBL-637，Ｃｓ１３７，１Ｇｙ／ｍｉｎ，gamma CIS-BioInternational、IBA、Saclay、France）で細胞を照射した。その後の実験のために、照射後の指示された時点で細胞を回収した。
【０１４５】
免疫蛍光法とフローサイトメトリーメーター
細胞共食いは既報１３の通り決定した。簡単に述べると、処理細胞を１０μＭの５−（および６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（Cell Tracker Orange CMTMR、Invitrogen）で染色し、未処理細胞を１０μＭの５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（Cell tracker Green CMFDA、Invitrogen）で染色した。次いで、細胞を、ＲＯＣＫの薬理学的阻害剤Ｙ２７６３２（３０μＭ、ＴＯＣＲＩＳ）またはｐａｎカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ、Calbiochem）の存在下で、示された時間共培養する。単一および共食い細胞上でのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１の特異的細胞下染色のために、細胞を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Sigma）中で透過性にし、５％  ＦＣＳ−ＰＢＳと共に１時間インキュベートした。ヒトｐ２１に対するウサギ抗体（form Cell Signaling Technology、＃2947）を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中での免疫検出に使用し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのアレクサ４８８蛍光色素に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧで明らかにした。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Invitrogen）で対比染色し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０での蛍光共焦点顕微鏡により、または６３×対物レンズを用いたＬＥＩＣＡ  ＤＭｉ８での蛍光顕微鏡により分析した。フローサイトメトリーによる細胞死の誘導を検出するために、細胞を３７℃および５％のＣＯ２で３０分間、４０ｎＭの３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニン、ＤＩＯＣ６（３）、および２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Invitrogen、分子プローブ、OR、USA）で染色した。サイトフルオロメトリー測定をＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ（Millipore EMD）で行い、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Millipore）により分析した。細胞周期分布は既報１４に従い、１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Invitrogen）で評価した。ＬＳＲ  ＩＩ（商標）フローサイトメーター（Becton-Dickinson）を用いて、細胞蛍光を定量した。蛍光ヒストグラムをＫａｌｕｚａソフトウェアバージョン１．５で分析した。
【０１４６】
老化関連β−ガラクトシダーゼの検出
所定の時間に、細胞を固定し、既報１３の通り、老化β−ガラクトシダーゼ染色キット（Cell signaling technologies）を用いて染色した。
【０１４７】
イムノブロット
全細胞溶解物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡフリー阻害剤、Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を補充した溶解緩衝液（０．１％のＮＰ４０；２００ｍＭのＨＥＰＥＳ；１００ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％グリセロール最終濃度）中で調製した。タンパク質抽出物を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA、USA）を用いて定量した。タンパク質抽出物（２０〜４０μｇ）を４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に流し、４℃でニトロセルロース膜上に移した。ブロッキング後、膜を、製造業者の説明書に従って、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした：ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１（Cell signaling ＃2947）；ＮＯＸ−５（Abcam＃191010）；切断カスパーゼ−３（Cell signaling ＃9664）；ＭＬＣ２Ｓ１９＊（Cell signaling ＃3671）またはＭＬＣ２（Cell signaling ＃8505）。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ（Southern Biotechnology）抗体を１時間インキュベートし、直接化学発光画像スキャニング（G：BOX Syngene）を用いて増強化学発光プライム検出（Amersham、GE−Healthcare）で明らかにした。ＧＡＰＤＨ（＃MAB374、EMD Millipore）をローディングコントロールとして使用した。
【０１４８】
ＲＯＳ産生の検出
細胞をカバーガラス皿（World Precision Instruments）に播種した。細胞内ＲＯＳレベルを、蛍光プローブ（２，７−ジクロロヒドロ−フルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ））を用いて、製造者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って評価した。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭｉ８、６３ｘ対物レンズを使用）によって分析した。
【０１４９】
ＲＮＡ干渉
ＮＯＸ５サイレンスＨＣＴ１１６クローンを、ＧＩＰＺレンチウイルスベクター中で発現されたＮＯＸ５遺伝子に対する３つの特定小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のプールを用いて行った。ＮＯＸ５に特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈ１ＮＯＸ５（クローンＩＤ、Ｖ３ＬＨＳ  ３５３９６４：５’  ＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＡＴＣＣＡ３’；ｓｈ２ＮＯＸ５（クローンＩＤ、Ｖ２ＬＨＳ  １３６０６９）：５’  ＴＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＧＴＧＧＣ３’；ｓｈ３ＮＯＸ５（クローンＩＤ、Ｖ２ＬＨＳ  １３６０６８）：５’  ＡＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧ３’）およびコントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ：５’  ＧＣＣＧＧＧＵＡＧＣＣＧＵＧＵＵＡＡＧＵ３’）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。コントロールクローンは、非サイレンシングＧＩＰＺコントロールレンチウイルスベクター（クローンＩＤ：ＲＨＳ４３４６、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて実施した。
【０１５０】
定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＮＯＸ５  ｍＲＮＡの検出には、ＮＯＸ５遺伝子（Hs00225846_m1）およびＧＡＰＤＨ（Hs02758991_g1）の予め設計されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプローブ（正規化のため）を使用した。これらのプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手したｐｒｅｍａｄｅ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ発現ミックスに含まれた。結果を周期しきい値法（ＣＴ）で分析し、それぞれの試料を内因性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量に対して正規化した。
【０１５１】
免疫不全マウスにおける腫瘍増殖
ＮＯＸ５を枯渇させた（ｓｈＮＯＸ５）またはさせなかった（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）ヒト結腸直腸ＨＣＴ１１６細胞を、３７℃で１時間、１．２ｍＭのＧｄＢＮで前処理し、単一線量が６ＧｙのＸ線（ＸＲ）で１回照射した。次に、２．５  １０６  ｓｈＣｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＮＯＸ５  ＨＣＴ１１６細胞を６週齢のスイスヌードマウス（Charles River Laboratories）に移植し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。実験は、無作為化されず、ＥＵ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ６３／２０１０に従って実施され、Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｍｐｕｓ（CEEA IRCIV/IGR ｎ°26）のＥｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０１５２】
統計解析
サンプルサイズを予め決定するための統計的方法は使用されなかった。統計的有意性は、一方向ＡＮＯＶＡ試験を用いて決定した。統計的に有意な値は、図の説明で報告される。全ての実験は、独立して少なくとも３回行った。データは、平均±ＳＥＭとして表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０ｂ（GraphPad Software）を用いて統計解析を行った。
【０１５３】
結果
ガドリニウム系ナノ粒子と電離放射線との組み合わせは、細胞老化を誘導する
我々が以前に報告したように１３，１４、癌細胞は、細胞老化と同時に誘導される可能性のある別個の致死モダリティ（ＮＣＡＤまたはＣＡＤ死を含む）を介して電離放射線後に排除される。ガドリニウム系ナノ粒子の存在下での癌細胞の照射の生物学的効果を決定するために、本発明者らは最初に、癌細胞の老化を誘導するこの治療の能力を分析した。従って、ヒト結腸直腸ＨＣＴ１１６細胞を、１．２ｍＭのガドリニウム系ナノ粒子（ＧｄＢＮ）で１時間前処理し、次いで、単一線量が６ＧｙのＸ線（ＸＲ）で１回照射した。２日後、細胞質老化関連β−ガラクトシダーゼ（senescence-associated β−galactosidase：ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性、サイクリン依存性キナーゼ阻害蛋白質ｐ２１の発現、および処理ＨＣＴ１１６細胞の細胞周期進行を分析した。我々は、ＨＣＴ１１６細胞をＸＲで処理した後、コントロールと比較してＳＡ−β−Ｇａｌ＋細胞の頻度の有意な増加を検出し、また、ＧｄＢＮ＋ＸＲの組合せがＸＲで処理した後に検出されるＳＡ−β−Ｇａｌ＋細胞の数を有意に増加させることに特に注意を払った（図１ａおよび１ｂ）。これらの結果は蛍光顕微鏡（図１ｃおよび１ｄ）およびウェスタンブロット（図１ｅ）によってｐ２１の発現の増加を検出することによって確認され、ガドリニウム含有粒子と電離放射線との組み合わせが、ＸＲ後の老化の誘導に対して癌細胞を感作することを実証する。並行して、本発明者らはまた、フローサイトメトリーを使用して、６Ｇｙ単独で、または１．２ｍＭのＧｄＢＮと組み合わせて照射され、そして２４時間および４８時間培養されたＨＣＴ１１６細胞の細胞周期分布を分析した。コントロールＨＣＴ１１６細胞と比較して、ＸＲ単独またはＧｄＢＮ＋ＸＲで処理したＨＣＴ１１６細胞のＧ２／Ｍ期における有意な蓄積が、２４時間のインキュベーション後に検出されたが、４８時間のインキュベーション後には検出されなかった（図１ｆ〜１ｈ）。これらの結果は、本発明者らがＸＲとＧｄＢＮとを結び付けた後に検出したｐ２１発現の有意な増加と一致する（図１ｄおよび１ｅ）。転写因子ｐ５３が、ｐ２１発現の制御を介して、細胞老化１５，１６の誘導中の長期Ｇ２停止を引き起こす可能性を考慮して、野生型（ｐ５３＋／＋）、ｐ５３に対して変異または／および転写不活性化された（ｐ５３Ｒ２４８Ｗ／＋またはｐ５３Ｒ２４８Ｗ／−）ＨＣＴ１１６細胞を、６Ｇｙ単独または１．２ｍＭのＧｄＢＮとの併用で照射し、ｐ２１発現およびＳＡ−β−Ｇａｌ活性について４８時間後に分析した。予測されたように、本発明者らは、ｐ２１発現（図１ｆ）およびＳＡ−β−Ｇａｌ活性（図１ｇ）がＸＲおよびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に有意に減少することを観察し、ｐ５３の転写活動がＸＲ−またはＸＲ＋ＧｄＢＮ−誘導細胞老化の両方に必要であることを示した。まとめると、これらの結果は、ガドリニウム含有ナノ粒子の存在下での癌細胞の放射線治療が細胞老化の誘導を通して照射された癌細胞の排除に有利であることを実証する。
【０１５４】
ガドリニウム系ナノ粒子は、照射された癌細胞の細胞共食いに有利である
ＧｄＢＮおよびＸＲを用いた癌細胞の組み合わせ治療によって誘導される致死プロセスをさらに特定するために、本発明者らは、細胞自律および非細胞自律死を誘導するこの治療の能力を決定した。この文脈において、既報１３，１４の通り、我々は最初に、５−（および−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ）、赤）蛍光バイタルプローブで標識化された未処理ＨＣＴ１１６細胞と、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ、緑）蛍光バイタルプローブで標識化された等原性ＨＣＴ１１６細胞との間で、共培養を実施し、示された濃度のＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で、異なる線量で照射した。２４時間の共培養後、ＣＭＦＤＡ＋細胞およびＣＭＴＭＲ＋細胞の細胞運命を、細胞飲み込みについて分析した。共焦点解析の結果、照射（ＸＲ）またはＧｄＢＮ＋ＸＲ処理ＣＭＴＭＲ＋ＨＣＴ１１６細胞と未処理ＣＭＦＤＡ＋ＨＣＴ１１６細胞との共培養中（図２ｂ）、細胞飲み込みが検出された。このプロセスは線量依存的に起こり（図２ｃ）、癌細胞をγ線照射した場合にも観察される（図２ｄ）。細胞の飲み込みに関与する生物学的機構をさらに特徴付けるために、本発明者らは、細胞侵入または細胞共食い作用機構のいずれかを誘導するこれらの治療の能力を試験した。蛍光顕微鏡を用いて、我々は、照射（ＸＲ）およびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療ＣＭＴＭＲ＋ＨＣＴ１１６細胞が、隣接（ＣＭＦＤＡ＋またはＣＭＴＭＲ＋）ＨＣＴ１１６細胞が受けた治療とは無関係に、隣接（ＣＭＦＤＡ＋またはＣＭＴＭＲ＋）ＨＣＴ１１６細胞を内在化することを観察した（図２ｅ）。本発明者らは、照射された細胞と比較して、ＧｄＢＮ＋ＸＲ治療細胞の共食い活性の有意な増加に注目し、癌細胞のＧｄＢＮおよびＸＲの組み合わせ治療が、照射細胞の共食い活性を示す能力を増加させることを明らかにした。これらの実験と並行して、本発明者らはまた、照射された細胞が他のＣＡＤモダリティ（例えば、アポトーシスおよび壊死）を同時に受ける能力を評価した。処理細胞のミトコンドリア膜および細胞膜の透過性を（フローサイトメトリーによる３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージドおよびヨウ化プロピジウム（ＤｉＯＣ６（３）／ＩＰ）染色の同時検出を介して）分析することにより、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ処理に反応して検出した細胞共食いがアポトーシスまたは壊死の有意な誘導なしに誘導されることを観察した（図２ｆ−２ｊ）。まとめると、これらの結果はガドリニウム含有ナノ粒子で癌細胞を治療した後に、照射された細胞の細胞共食いを増強することができるという事実を強調している。
【０１５５】
ＲＯＣＫ１キナーゼの活性化は、ＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に検出される生きた細胞飲み込みに必要である
上記の細胞共食いに関与する分子メカニズムを正確にするために、本発明者らは、次いで、隣接癌細胞の生きた細胞飲み込みに関連するシグナル伝達経路を研究した。本発明者らは最初に、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に観察された細胞飲み込みが、（ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後のカスパーゼ−３のプロアポトーシス切断の非存在によって明らかにされるように（図３ａ））細胞死誘導の非存在下で生じ、そしてｐａｎカスパーゼ阻害剤である、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによって阻害されなかったことを明らかにし（図３ｃ）、このプロセスが、死んだ細胞のアポトーシス取り込みに依存せず、そして生きた癌細胞の内在化を可能にすることを示した。さらに、本発明者らは、ＨＣＴ１１６細胞のＧｄＢＮ、ＸＲでの治療、またはＧｄＢＮおよびＸＲでの併用治療が（セリン１９（ＭＬＣ２Ｓ１９＊）上のミオシン軽鎖２のリン酸化によって明らかにされるように）キナーゼＲＯＣＫ１を活性化することを示した（図３ｂ）。本発明者らは、ＧｄＢＮの存在下または非存在下での癌細胞の照射後にＭＬＣ２Ｓ１９＊の有意な増加したリン酸化を観察し（図３ｃ）、ＲＯＣＫ１の活性化がＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に検出された隣接癌細胞の取り込みに必要であり得ることを示した。ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ媒介細胞飲み込み中のＲＯＣＫ−１依存性シグナル伝達経路の寄与を決定するために、１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６Ｇｙを照射したＨＣＴ１１６細胞の共培養にＲＯＣＫ１の薬理学的阻害剤（Ｙ２７６３２）を添加し、２４時間の共培養後の細胞共食いの頻度を決定した。本発明者らは、Ｙ２７６３２によるＲＯＣＫ１の薬理学的阻害（図３ｂで明らかにされるように）が６Ｇｙ単独照射後、および１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下でのＨＣＴ１１６細胞の照射後に検出される細胞共食いを阻害し（図３ｃ）、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に検出される細胞共食いにＲＯＣＫ１の生物学的活性が必要であることを明らかにした。次いで、我々は、飲み込まれた（標的）細胞または飲み込んだ（共食い）細胞のいずれかで特異的な２つの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でＲＯＣＫ１を枯渇させることによって、ＧｄＢＮ＋ＸＲ誘導細胞共食いに対するキナーゼＲＯＣＫ１の寄与をより良く定義した。我々は、双方の相互作用細胞上のＲＯＣＫ１の枯渇がＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に検出される細胞共食いの頻度を減少させたことを観察し（図３ｄおよび３ｅ）、キナーゼＲＯＣＫ１がＧｄＢＮ＋ＸＲ媒介細胞共食いの誘導の間、飲み込まれた標的細胞および飲み込んだ共食い細胞の両方において中心的な役割を果たすことを示した。
【０１５６】
飲み込まれた細胞の分解は、共食い細胞の老化と正に相関する
ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に検出された飲み込まれた細胞および共食い細胞の両方の運命を決定するために、蛍光顕微鏡により、１．２ｍＭのＧｄＢＮの存在下（または非存在下）で６Ｇｙで照射されたＨＣＴ１１６細胞の２４時間共培養後に観察された、飲み込まれたＨＣＴ１１６細胞の核におけるクロマチン凝縮および核断片化の存在を決定した。本発明者らは、照射のみの後、またはＧｄＢＮの存在下での癌細胞の照射後に検出された全ての飲み込まれた細胞が標的細胞分解の徴候を示したことを観察した（図４ａおよび４ｄ）。興味深いことに、本発明者らはｐａｎカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋが標的細胞分解を抑制できなかったことを実証し（図４ｄ）、カスパーゼの活性化はＸ線照射またはＸ線照射とＧｄＢＮとの組み合わせによって誘導される細胞共食いの実行に必要ではないことを示した。さらに、ＸＲ−またはＧｄＢＮ＋ＸＲ誘導共食い細胞はｐ２１発現（図４ｂおよび４ｅ）およびＳＡ−β−Ｇａｌ＋活性（図４ｃおよび４ｆ）の増大を示すことも明らかにし、ＸＲ−またはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後、共食い細胞がエンテセンス（entescence）を受け得るか、あるいは単一老化細胞が隣接細胞を内在化し得ることを示した。エンテセンスの誘導または老化細胞の共食い活性の活性化がＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に検出された共食い活性と関連するかどうかを決定するために、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後にＳＡ−β−Ｇａｌ＋活性を示した単細胞および共食い細胞の頻度を測定した。ＳＡ−β−Ｇａｌ＋細胞の大部分は単細胞であることが観察され（図４ｇ）、細胞共食いは、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲで治療された癌細胞の細胞自律的老化の誘導後に起こるようことを示唆している。
【０１５７】
ＧｄＢＮ＋ＸＲ媒介老化および細胞共食いは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５）依存性ＲＯＳ産生によって制御される
活性酸素種（ＲＯＳ）産生が電離放射線後の老化誘導に関与する主要な細胞ストレスの１つであることを考慮して１７、ＸＲおよびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後のＲＯＳ産生を分析した。蛍光顕微鏡を用いて非蛍光色素２，７−ジクロロヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）の蛍光２，７−ジクロロヒドロフルオレセイン（ＤＣＦ）への転換を検出することにより、ＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療後に得られた単細胞および共食い細胞のＲＯＳ生成能を測定した。本発明者らは、これらの治療が単一細胞および共食い細胞の両方においてＲＯＳの産生を誘導したことを観察した（図５ａおよび５ｂ）。さらに、ＲＯＳ産生を鈍らせることが知られている抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）模倣Ｍｎ（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）（ＭｎＴＢＡＰ）は１８、ＸＲ単独またはΓδＢＮ＋ＸＲ併用によるＨＣＴ１１６細胞の治療後に検出される細胞老化（ｐ２１発現の検出によって明らかにされるように（図５ｃ））を低下させることを明らかにした。これらの結果は、ＲＯＳ産生がＸＲおよびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療に関連する老化および細胞共食いの誘導に重要な役割を果たすことを実証した。
【０１５８】
ＲＯＳ産生の主要な細胞内源であるＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）がこれらのプロセスを１９，２０調節するかどうかを決定するために、我々は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５）−照射されたヒト初代線維芽細胞２１の死滅に関与しているＮＡＤＰＨオキシダーゼ−がＲＯＳの産生に関与している可能性があるかどうかを決定した。そこで、我々は、ＸＲまたはΓδＢＮ＋ΞΡでＨＣＴ１１６細胞を処理した後に検出される、ＲＯＳ産生、ｐ２１発現、ＳＡ−β−ガラクトシダーゼ活性、および細胞共食いに対するＮＯＸ５枯渇の効果を評価した（図５ａ−５ｈ）。我々は、特異的な低分子干渉ＲＮＡによるＮＯＸ５の枯渇がＲＯＳ産生を鈍化させ（図５ｄおよび５ｅ）、ｐ２１発現を減少させ（図５ｆ）、ＳＡ−β−Ｇａｌ＋活性を低下させ（図５ｇ）、ＸＲおよびΓδＢＮ＋ΞΡ治療後に検出される細胞共食いを損なう（図５ｈ）ことを実証した。結論として、これらの結果は、ＮＯＸ５依存性ＲＯＳ産生がＸＲまたはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療での癌細胞の治療後に検出される老化および細胞共食いの誘導に必要であることを示す。
【０１５９】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５）不活性化は、ＸＲおよびＧｄＢＮ＋ＸＲ治療によって誘導される腫瘍抑制を増強する
腫瘍増殖に対するＮＯＸ５不活性化の影響を特徴付けるために、短いヘアピンＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により枯渇した（ｓｈＮＯＸ５）または枯渇していない（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）ヒト結腸直腸ＨＣＴ１１６細胞（図６ａ）を、３７℃で１時間、１．２ｍＭのＧｄＢＮで前処理し、次いで、単一線量が６ＧｙのＸ線（ＸＲ）で１回照射した。腫瘍細胞をＢａｌｂ／ｃ  Ｎｕｄｅマウスに皮下注射し、腫瘍増殖を評価した。我々は、ＧｄＢＮ治療マウスまたはコントロールマウスと比較して、電離放射線が癌細胞移植後の腫瘍の増殖を損なうことを観察し、ガドリニウム系粒子と電離放射線（ＧｄＢＮ＋ＸＲ）との組み合わせが、腫瘍増殖を停止させるＸＲの能力を増強することを確認した（図６ｂ）。我々はまた、ＮＯＸ５の不活性化が、ＮＯＸ５を枯渇させたコントロール、ＧｄＢＮ治療、ＸＲ治療またはＧｄＢＮ＋ＸＲ治療ＨＣＴ１１６細胞の移植後に得られた腫瘍の増殖を強く損なうことを観察した（図６ｃ）。これらの結果は、ＮＯＸ５が腫瘍移植またはＧｄＢＮ単独での治療によって、およびＸＲ単独またはＧｄＢＮ＋ＸＲの腫瘍抑制活性によって誘導される細胞ストレスに対して癌細胞を保護することを示す。全体として、これらの結果は、ＧｄＢＮ＋ＸＲとＮＯＸ５不活性化との組み合わせが放射線治療の効率を強く改善することを実証する。
【０１６０】
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【図１】
2020525467.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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