(57)【要約】  本発明は、抗酸化活性および美白活性を有しているペプチドのファミリー、当該ペプチドを含んでいる化粧料組成物、ならびに、当該ペプチドまたは当該化粧料組成物の化粧用の使用および方法、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のペプチド、それらの化粧料として許容される異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体、ならびにそれらの混合物：
Ｒ１−Ｘｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｙｎ−Ｒ２      （Ｉ）
式中、
Ｘは、脂肪族非極性側鎖を有しているアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＴｈｒから選択され；
ＡＡ２は、芳香族アミノ酸の群から選択され；
ＡＡ３は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒから選択され；
ＡＡ４は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択され；
Ｙは、脂肪族非極性側鎖を有しているアミノ酸の群から選択され；
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０および１から選択され；
Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換の環状脂肪族、置換または非置換の複素環、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、およびＲ５−ＣＯ−から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換の環状脂肪族、置換または非置換の複素環、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、−ＮＲ３Ｒ４、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換の環状脂肪族、置換または非置換の複素環、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから選択される。
【請求項２】
上記アミノ酸がＬアミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
上記ｍが１であり、上記ＸがＬｅｕであることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
上記ｎが１であり、上記ＹがＡｌａであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
上記Ｒ１がフェルラ酸であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
上記Ｒ１がアセチルであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
上記Ｒ２がＨまたはＮＨ２であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
上記式（Ｉ）のペプチドは、下記のいずれかであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド：
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号２−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号３−Ｒ２）；または、
Ｒ１−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号４−Ｒ２）。
【請求項９】
上記式（Ｉ）のペプチドは、下記のいずれかであることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド：
Ａｃ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２）；
フェルラ酸−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２）；または、
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２）。
【請求項１０】
上記式（Ｉ）のペプチドは、下記のいずれかであることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド：
Ａｃ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２）；または、
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２）。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチドを含んでいる、化粧料組成物。
【請求項１２】
上記ペプチドを、０．１％〜０．０００１％（ｍ／ｖ）含んでいることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧料組成物。
【請求項１３】
皮膚における酸化ストレスを予防、低減または除去するための、および／または、対象の皮膚を美白するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１１または１２に記載の化粧料組成物の、化粧料としての使用。
【請求項１４】
皮膚における酸化ストレスを予防、低減または除去するための、および／または、対象の皮膚を美白するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１１または１２に記載の化粧料組成物の、化粧用の使用(cosmetic use)。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１１または１２に記載の組成物の使用を含むことを特徴とする、対象の皮膚における酸化ストレスを予防、低減または除去する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１１または１２に記載の化粧料組成物の使用を含むことを特徴とする、対象の皮膚を美白する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料の分野に関する。より正確には、本発明は、抗酸化活性および／または美白活性を有しているペプチドおよび組成物に関し、さらに、化粧料の分野におけるその方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康で若々しい外観の皮膚を維持するために、内因性および環境性ストレッサーによって引き起こされる皮膚の不具合およびダメージを、防止、低減または除去することに対する関心が人々の間で高まっている。このことにより、皮膚の不具合が出現する原因や、皮膚の不具合を防止または軽減できる化合物および組成物の探索に対する関心が高まっている。
【０００３】
酸化および酸化ストレスは、おそらく、皮膚の老化および皮膚のダメージに最も有害な原因である。これによって、皮膚の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）が分解され、他の炎症プロセスが引き起こされる（Bickers, D.R. Athar, M., Oxidative Stress in the Pathogenesis of Skin Disease, J. Inv. Dermatology, 2006; 126: 2565-2575）。酸化および酸化ストレスの要因は様々であり、以下のようなものによって誘導されうる。例えば、生理学的な老化に起因する内因性の要因によって。また、より重要であることには、汚染、喫煙、（ＵＶ照射の影響による）光老化、または老化に明らかに寄与する他の環境要因などの環境要因によって（Farage, M.A., Miller, K.W., Elsner, P., Maibach, H.I., Intrinsic and extrinsic factors in skin ageing: a review. Int J Cosmet Sci, 2008; 30: 87-95）。今日では、外部要因に起因する酸化が、皮膚の老化およびトラブルを加速させる主な原因となっている（例えば、汚染：オゾンの減少、温室効果ガスのレベルはこれまで以上に高くなっており、人為的に発生する粒子状物質による健康への悪影響はより頻繁になっている）。
【０００４】
中でも、酸化および酸化ストレスは、酸素由来のラジカルおよび炎症を引き起こす。そしてこれらは、例えば、以下のような事柄をもたらす。
【０００５】
（１）細胞および細胞内にある脂質二重膜の多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡ）の過酸化。これにより、流動性が減少したり、機能を喪失したり、時には細胞死に至ったりすることもある。マロンジアルデヒド（以下、ＭＤＡ）は、脂質の過酸化から生じる、主な脂質ヒドロペルオキシド由来の二官能性求電子物質の一種である。この物質は、デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡ）に共有結合して、細胞の代謝および統合に重大なダメージを与える付加体を生じさせる。
【０００６】
（２）糖化。これは、還元糖とタンパク質、脂質または核酸との間の非酵素反応であり、上述の要因によって促進される。糖と遊離アミノ基との反応に由来するSchiff塩基およびAmadori産物は、ペプチドまたはタンパク質の他の残基と不可逆的に反応して、タンパク質付加体または架橋を形成することがある。あるいは、さらなる酸化反応を経て、高度糖化最終産物を生じることもある。
【０００７】
（３）ＤＮＡへの他のダメージ。既述した通り、ＤＮＡは非常に酸化されやすい。糖リン酸骨格も核酸塩基も、酸化剤の直接的な標的となる。特にグアニン（Ｇ）は、種々の酸化物により酸化されやすい（ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、一重項酸素（１Ｏ２）、過酸化亜硝酸（ＯＮＯＯ−）誘導体など）。Ｇの一般的な酸化型は８−オキソグアニンであり、遺伝毒性および変異原性の病変に関与している。
【０００８】
（４）色素沈着症。色素沈着は、酸化ストレスの増加に関連する複数の因子に起因する場合がある（ＵＶ照射、炎症、ホルモン変化、ライフスタイル式、環境汚染物質など）。最後の例に関して、芳香族炭化水素受容体（以下、ＡｈＲ）は非常に興味深い。というのも、ＡｈＲは、メラニン生成経路の酵素をコードしている遺伝子の発現を調節することにより色素を形成する役割を果たすことが報告されているのである（Jux, B., Kadow, S., Luecke, S., Rannug, A., Krutmann, J. and Esser, C., The Aryl Hydrocarbon Receptor Mediates UVB Radiation-Induced Skin Tanning, J. of Inv. Dermatology, 131 (2011) 203-210）。その結果、汚染物質（タバコの煙に含まれるものなど）によってＡｈＲが活性化され、色素沈着症を引き起こす（Nakamura, M., Ueda, Y., Hayashi, M., Kato, H., Furuhashi, T. and Morita, A., Tobacco smoke-induced skin pigmentation is mediated by the aryl hydrocarbon receptor, Experimental Dermatology, 22 (2013) 554-563）。
【０００９】
これらの望ましくない老化プロセスと対抗するために、多くの戦略や化合物が開発されてきた。その例には、局所的な抗酸化物質（植物抽出物に含まれているビタミン、レチノイド、フラボノイドなど）、抗炎症活性物質（Pillai, S., Oresajo, C., Hayward, J. Ultraviolet radiation and skin ageing: roles of reactive oxygen spices, inflammation and protease activation, and strategies for prevention of inflammation induced matrix degradation - a review, Int J Cosmet Sci, 2005; 27:17-34）が挙げられる。しかし、これらの化合物のいくつかは、これらの外部因子の一つだけにしか作用できなかったり、日光への曝露に耐えられなかったりする。そのため、皮膚に対する完全な効果を得るために、複数の製品を使用する必要がある。
【００１０】
皮膚の美白活性のために抗酸化物質を使用すること背景にある考えには、「ＵＶ照射による酸化効果は、メラニン生成の活性化に寄与している」という仮説がある。ＵＶ照射は、皮膚中で活性酸素種（ＲＯＳ）を生成することがある。ＲＯＳは、チロシナーゼを活性化することによって、メラニン生成を誘導しうる。また、酸化還元物質は、銅（チロシナーゼの活性中心にある）やｏ−キノンと相互作用して、メラニン中間体の酸化重合を妨げることによって、皮膚の色素沈着に影響を及ぼすことがある。さらに、抗酸化物質は、既に存在しているメラニンの直接的な光酸化を低減することができる。
【００１１】
この抗酸化機構の他に、皮膚における色素沈着のレベルを低下させるための他の戦略がいくつか存在する。既存の美白成分の多くは、メラニン細胞に対するチロシナーゼ阻害効果を有しており、メラニンの総生成量を減少させる（例えば、コウジ酸、アルブチン）。他のものには、メラニン細胞からケラチン細胞へとメラニンを移動させる効果がある（例えば、ニコチンアミド、ダイズ）。あるいは、皮膚の剥離を促進して、過剰なメラニン含有量を除去する効果がある（Gillbro JM, Olsson MJ. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents--existing and new approaches. Int J Cosmet Sci. 2011 Jun;33(3):210-21）。ヒト線維芽細胞またはケラチン細胞とメラニン細胞との間のパラクリン伝達もまた、皮膚の色素沈着に寄与している（Imokawa G, Yada Y, Morisaki N, Kimura Biological characterization of human fibroblast-derived mitogenic factors for human melanocytes. M.Biochem J. 1998 Mar 15;330 (Pt 3):1235-9; Hirobe T, Keratinocytes regulate the function of melanocytes, Dermatologica Sinica, 2014; 32(4)）。したがって、可溶性因子（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ、ＫＩＴリガンドとしても知られる）、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、エンドセリン（ＥＤＮ１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、Dickkopf関連タンパク質１（ＤＫＫ１またはＴＰ５３））の調節もまた、皮膚美白剤の研究における目的である。
【００１２】
したがって、化粧料の分野において応用できる、広汎な抗酸化活性および／または美白活性を有している物質または有効成分の発見が望まれている。これによって、環境による酸化ストレス（例えば、汚染、ＵＶ照射）の結果として生じる皮膚の不具合を予防または治療したり、皮膚の好ましくない色素沈着を治療したり、老化または光老化による皮膚の不具合を予防または治療したりするのである。
【発明の概要】
【００１３】
本特許の発明者らは、大規模かつ網羅的な研究の結果、驚くべきことに、広汎なの抗酸化活性および／または美白活性を有しているペプチドのファミリーを見出した。すなわち、従来技術において存在する、上述の課題および要望を解決するペプチドを見出したのである。
【００１４】
本発明に係るペプチドは、酸化ストレスに関連する皮膚の不具合の予防、低減および／または治療において、優れた活性を有している（これらのペプチドは、高い抗酸化活性を示した）。このような皮膚の不具合には、皮膚の色艶、色素沈着性の変質（例えば、シミまたは日光性ホクロ）、シワ、皮膚のハリ、色味および弾力の低下などがある。これらは、例えば、コラーゲン量または弾性繊維量の減少、細胞外マトリクス、または構造性脂質の損傷、ＤＮＡのダメージ、皮膚が弱くなること、炎症反応の増加、などに起因する。また、最後の活性に関しては、本発明のペプチドは、皮膚を明るくしたり、美白したりするために使用できる。すなわち、本発明のペプチドは、皮膚に均一な色彩を与え、さらに、酸化ストレス由来の炎症反応が原因となる、皮膚の色彩および／または色味において望ましくないシミ、色素沈着および／または異常を低減したり、これらに抵抗したりする。
【００１５】
したがって、第１の実施形態において、本発明は、抗酸化活性、ホワイトニング活性および／または美白活性を示す、一群のペプチドに関する。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、上記ペプチドの１種類またはそれらの組合せを含んでいる、組成物に関する。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の、化粧料としての使用に関する。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、（i）皮膚における酸化ストレスを予防、低減および／または除去するための、および／または、（ii）皮膚を美白するための、本発明のペプチドまたは組成物の化粧用の使用(cosmetic use)に関する。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の使用を含むことを特徴とする、対象の皮膚における酸化ストレスを低減する方法に関する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のペプチドまたは組成物の使用を含むことを特徴とする、対象の皮膚を美白する方法に関する。
【００２１】
本明細書において用いられるとき、用語「非環状脂肪族基」およびその複数形は、現在の技術水準においてこの用語に与えられている一般的な意味を有している。したがって、これらの用語は、例えば、直鎖状または分岐状のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を表す（ただし、これらに限定されない）。
【００２２】
本明細書において用いられるとき、用語「アルキル基」およびその複数形は、１〜２４個の炭素原子を有している、飽和した直鎖基または分岐基を表す。炭素原子の数は、好ましくは１〜１６個であり、より好ましくは１〜１４個であり、より一層好ましくは１〜１２個であり、より一層好ましくは１個、２個、３個、４個、５個または６個である。アルキル基は、単結合を介して分子の他の部分と結合している。アルキル基の例としては、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、ラウリル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミル、２−エチルヘキシル、２−メチルブチル、５−メチルヘキシル、および類似の基が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。アルキル基は、１つ以上の置換基によって、任意で置換されていてもよい。置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００２３】
本明細書において用いられるとき、用語「アルケニル基」およびその複数形は、２〜２４個この炭素原子を有している、直鎖基または分岐基を表す。炭素原子の数は、好ましくは２〜１６個であり、より好ましくは２〜１４個であり、より一層好ましくは２〜１２個であり、より一層好ましくは２個、３個、４個、５個または６個である。アルケニル基は、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有しており、好ましくは１個、２個または３個の炭素−炭素二重結合を有している。アルケニル基は、共役していてもよいし、非共役であってもよい。アルケニル基は、単結合を介して分子の他の部分と結合している。アルケニル基の例としては、ビニル、オレイル、リノレイル、および類似の基が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。アルケニル基は、１つ以上の置換基によって、任意で置換されていてもよい。置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００２４】
本明細書において用いられるとき、用語「アルキニル基」およびその複数形は、２〜２４個の炭素原子を有している、直鎖基または分岐基を表す。炭素原子の数は、好ましくは２〜１６個であり、より好ましくは２〜１４個であり、より一層好ましくは２〜１２個であり、より一層好ましくは２個、３個、４個、５個または６個である。アルキニル基は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有しており、好ましくは１個、２個または３個の炭素−炭素三重結合を有している。アルキニル基は、共役していてもよいし、非共役であってもよい。アルキニル基の例としては、エチニル基、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、ペンチニル（１−ペンチニルなど）、および類似の基が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。アルキニル基は、１つ以上の置換基によって、任意で置換されていてもよい。置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００２５】
本明細書において用いられるとき、用語「環状脂肪族基」およびその複数形は、現在の技術水準においてこの用語に与えられている一般的な意味を有している。したがって、これらの用語は、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはシクロアルキニル基を表すために用いられる（ただし、これらに限定されない）。
【００２６】
本明細書において用いられるとき、用語「シクロアルキル」およびその複数形は、３〜２４個の炭素原子を有している、飽和した単環または多環の脂肪族基を表す。炭素原子の数は、好ましくは３〜１６個であり、より好ましくは３〜１４個であり、より一層好ましくは３〜１２個であり、より一層好ましくは３個、４個、５個または６個である。シクロアルキルは、単結合を介して分子の他の部分に結合している。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、メチルシクロヘキシル、ジメチルシクロヘキシル、オクタヒドロインデン、デカヒドロナフタレン、ドデカヒドロ−フェナレン、アダマンチル、および類似の基が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。シクロアルキルは、１つ以上の基によって、任意で置換されていてもよい。このような基の例としては、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書において用いられるとき、用語「シクロアルケニル」およびその複数形は、５〜２４個の炭素原子を有している、非芳香族性の単環または多環の脂肪族基を表す。炭素原子の数は、好ましくは５〜１６個であり、より好ましくは５〜１４個であり、より一層好ましくは５〜１２個であり、より一層好ましくは５個または６個である。シクロアルケニルは、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有しており、好ましくは１個、２個または３個の炭素−炭素二重結合を有している。シクロアルケニルは、共役していてもよいし、非共役であってもよい。シクロアルケニルは、単結合を介して分子の他の部分に結合している。シクロアルケニルの例としては、シクロペント−１−エン−１−イル基、および類似の基が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。シクロアルケニルは、１つ以上の基によって、任意で置換されていてもよい。このような基の例としては、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどが挙げられる。
【００２８】
本明細書において用いられるとき、用語「シクロアルキニル」およびその複数形は、８〜２４個の炭素原子を有している、非芳香族性の単環または多環の脂肪族基を表す。炭素原子の数は、好ましくは８〜１６個であり、より好ましくは８〜１４個であり、より一層好ましくは８〜１２個であり、より一層好ましくは８個または９個である。シクロアルキニルは、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有しており、好ましくは１個、２個または３個の炭素−炭素三重結合を有ている。シクロアルキニルは、共役していてもよいし、非共役であってもよい。シクロアルキニルは、単結合を介して分子の他の部分に結合している。シクロアルキニルの例としては、シクロオクト−２−イン−１−イル基、および類似の基が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。シクロアルキニル基は、１つ以上の基によって、任意で置換されていてもよい。このような基の例としては、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどが挙げられる。
【００２９】
本明細書において用いられるとき、用語「アリール基」およびその複数形は、６〜３０個の炭素原子を有している、芳香族基を表す。炭素原子の数は、好ましくは６〜１８個であり、より好ましくは６〜１０個であり、より一層好ましくは６個または１０個である。アリール基は、１個、２個、３個または４個の芳香環を有しており、当該芳香環は炭素−炭素結合によって結合されているか、または縮合している。アリール基は、単結合を介して分子の他の部分に結合している。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルまたはアントラニルが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。アリール基は、１つ以上の置換基によって、任意で置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００３０】
本明細書において用いられるとき、用語「アラルキル基」およびその複数形は、７〜２４個の炭素原子を有している、芳香族基で置換されたアルキル基を表す。アラルキル基の例としては、−（ＣＨ２）１−６−フェニル、−（ＣＨ２）１−６−（１−ナフチル）、−（ＣＨ２）１−６−（２−ナフチル）、−（ＣＨ２）１−６−ＣＨ（フェニル）２、または類似の基が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。アラルキル基は、１つ以上の置換基によって任意で置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００３１】
本明細書において用いられるとき、用語「複素環基」およびその複数形は、３〜１０員の複素環または炭化水素環を表す。このとき、１個以上の環原子は炭素とは異なる元素であり、好ましくは１個、２個または３個の環原子は炭素とは異なる元素である（窒素、酸素、硫黄など）。複素環基は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。本発明の目的のため、複素環は、環系、単環系、二環系または三環系であってよく、これらは縮合環系を含んでいてもよい。複素環ラジカルにおいて、窒素、炭素または硫黄原子は、任意で酸化されていてもよい。窒素原子は、任意で四級化していてもよい。複素環ラジカルは、部分的に飽和していてもよいし、完全に飽和していてもよいし、芳香物であってもよい。より好ましくは、用語「複素環」用語は、５員環または６員環に関する。複素環基は、１つ以上の置換基によって、任意で置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００３２】
本明細書において用いられるとき、用語「ヘテロアリールアルキル基」およびその複数形は、置換または非置換の芳香族複素環基で置換されたアルキル基を表す。上記のアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有している。上記の芳香族複素環基は、２〜２４個の炭素原子と、１〜３個の炭素ではない原子を有している。ヘテロアリールアルキル基の例としては、−（ＣＨ２）１−６−イミダゾリル、−（ＣＨ２）１−６−トリアゾリル、−（ＣＨ２）１−６−チエニル、−（ＣＨ２）１−６−フリル、−（ＣＨ２）１−６−ピロリジニル、および類似の基が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。ヘテロアリールアルキル基は、１つ以上の置換基によって任意で置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオが挙げられる。
【００３３】
本明細書において用いられるとき、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を表す。また、これらのアニオンは、ハロゲン化物と呼ぶ。
【００３４】
本明細書において用いられるとき、用語「誘導体」およびその複数形は、化粧料として許容される化合物と、化粧料として許容できない誘導体との両方を表す。前者は、化粧料の調製に使用できる所定の化合物の誘導体である。後者が「誘導体」に含まれるのは、化粧料として許容できる誘導体の調製に有用である場合があるためである。
【００３５】
本明細書において用いられるとき、用語「塩」およびその複数形は、現在の技術水準において公知である任意の種類の塩を表す。このような塩の例としては、ハロゲン化物塩、ヒドロキシ酸塩（オキシ酸塩、酸性塩、塩基性塩および複塩など）、ヒドロキソ塩、混合塩、オキシ塩または他の水和塩を表す。が挙げられる。この用語には、化粧料として許容される塩と、化粧料として許容できない塩の両方が含まれる。後者は、化粧料として許容される塩の調製に有用である場合があるためである。
【００３６】
本明細書において用いられるとき、用語「異性体」およびその複数形は、光学異性体、エナンチオマー、立体異性体またはジアステレオ異性体を表す。個々のエナンチオマーまたはジアステレオ異性体、ならびにそれらの混合物は、現在の技術水準で知られている従来技術によって分離できる。
【００３７】
本明細書において用いられるとき、用語「溶媒和物」およびその複数形は、現在の技術水準で公知である任意の溶媒和物を表す（極性、無極性または両親媒性の溶媒和物など）。溶媒和物には、化粧料として許容できる任意の溶媒和物が含まれる。溶媒和物を所定の対象に対して（直接的または間接的に）投与または適用すると、所定の化合物（本発明のペプチド）が提供される。好ましくは、溶媒和物は、水和物、アルコールとの溶媒和物（メタノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールなどとの溶媒和物）、エステルとの溶媒和物（酢酸エチルなどとの溶媒和物）、エーテルとの溶媒和物（メチルエーテル、エチルエーテルまたはＴＨＦ（テトラヒドロフラン）などとの溶媒和物）、またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）との溶媒和物である。より好ましくは、溶媒和物は、水和物またはアルコールとの溶媒和物（エタノールなどとの溶媒和物）である。
【００３８】
さらに、本明細書において用いられるとき、用語「アミノ酸」およびその複数形には、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸と、コードされないアミノ酸とが含まれる（当該アミノ酸が天然であるか否かにかかわらず。また、当該アミノ酸がＤ−アミノ酸であるかＬ−アミノ酸であるかにかかわらず）。コードされないアミノ酸の例としては、シトルリン、オルニチン、サルコシン、デスモシン、ノルバリン、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、４−クロロフェニルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、シクロセリン、カルニチン、システイン、ペニシラミン、ピログルタミン酸、チエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、アロイソロイシン、アロトレオニン、イソニペコチン酸、イソセリン、フェニルグリシン、スタチン、β−アラニン、ノルロイシン、Ｎ−メチルアミノ酸、α−アミノ酸およびβ−アミノ酸、ならびに、それらの誘導体が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。非天然アミノ酸の一覧は、現在の技術水準において公知である（例えば、"Unusual amino acids in peptide synthesis" by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USAを参照）。
【００３９】
上述した通り、第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）のペプチド、それらの化粧料として許容される異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体、ならびにそれらの混合物に関する。
Ｒ１−Ｘｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｙｎ−Ｒ２      （Ｉ）。
【００４０】
式中、
Ｘは、脂肪族非極性側鎖を有しているアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＴｈｒから選択され；
ＡＡ２は、芳香族アミノ酸の群から選択され；
ＡＡ３は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒから選択され；
ＡＡ４は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択され；
Ｙは、脂肪族非極性側鎖を有しているアミノ酸の群から選択され；
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０および１から選択され；
Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換の環状脂肪族、置換または非置換の複素環、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキル、およびＲ５−ＣＯ−から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換の環状脂肪族、置換または非置換の複素環、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、−ＮＲ３Ｒ４、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換の環状脂肪族、置換または非置換の複素環、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから選択される。
【００４１】
本発明のペプチドにおいて使用されているアミノ酸、または本発明のペプチド中に存在するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその組合せであることが意図される。好適な実施形態において、本発明のペプチドにおいて使用されているアミノ酸、または本発明のペプチド中に存在するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。
【００４２】
好ましくは、上記の異性体は、立体異性体である。上記立体異性体は、エナンチオマーまたはジアステレオ異性体であることが意図される。したがって、本発明の好適な実施形態において、ペプチドは、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、純粋なエナンチオマー、または純粋なジアステレオ異性体である。
【００４３】
好適な実施形態において、ｍは１であり、ＸはＬｅｕである。
【００４４】
他の好適な実施形態において、ｎは１であり、ＹはＡｌａである。
【００４５】
したがって、さらに好適な実施形態において、ｍは１であり、ＸはＬｅｕであり、ｎは１であり、ＹはＡｌａである。
【００４６】
他の好適な実施形態において、ｍおよびｎは０である。
【００４７】
一実施形態において、ＡＡ２は、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅから選択される。
【００４８】
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、アセチル（以下、Ａｃ）、パルミトイル、ミリストイル、アゼラオイル、カフェオイル、アゼライン酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、リポ酸、酒石酸、ｐクマル酸、カフェー酸またはフェルラ酸である。より好ましくは、Ｒ１は、Ａｃ、パルミトイル、アゼライン酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、リポ酸、酒石酸、ｐクマル酸、カフェー酸またはフェルラ酸である。より好ましくは、Ｒ１は、パルミトイル、フェルラ酸またはＡｃである。より好ましくは、Ｒ１は、フェルラ酸またはＡｃである。より一層好ましくは、Ｒ１は、フェルラ酸である。
【００４９】
また、好ましくは、Ｒ２は、ＨまたはＮＨ２である。より好ましくは、Ｒ２は、ＮＨ２である。
【００５０】
したがって、最も好適な実施形態において、Ｒ１はＡｃであり、Ｒ２はＨまたはＮＨ２であり、より好ましくはＮＨ２である。
【００５１】
他の最も好適な実施形態において、Ｒ１はフェルラ酸であり、Ｒ２はＨまたはＮＨ２であり、より好ましくはＮＨ２である。
【００５２】
他の好適な実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号２−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号３−Ｒ２）；または、
Ｒ１−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号４−Ｒ２）。
【００５３】
より好ましくは、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ａｃ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｒ２（Ａｃ−配列番号１−Ｒ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（Ａｃ−配列番号２−Ｒ２）；
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｒ２（Ａｃ−配列番号３−Ｒ２）；または、
パルミトイル−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（パルミトイル−配列番号４−Ｒ２）。
【００５４】
より一層好ましくは、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ａｃ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２）；または、
パルミトイル−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（パルミトイル−配列番号４−ＮＨ２）。
【００５５】
他の好適な実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１−Ｒ２）；または、
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号２−Ｒ２）。
【００５６】
最も好適な実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ａｃ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２）；または、
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２）。
【００５７】
さらに好適な実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号１）；または、
Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号２）。
【００５８】
他の好適な実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３）。
【００５９】
より好ましくは、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号３−Ｒ２）。
【００６０】
より一層好ましくは、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２）。
【００６１】
また、好適な実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、以下である。
フェルラ酸−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ２（フェルラ酸−配列番号２−Ｒ２）。
【００６２】
この実施形態において、式（Ｉ）のペプチドは、より好ましくは以下である。
フェルラ酸−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２）。
【００６３】
本発明のペプチドの活性は、抗酸化活性および美白活性である（下記実施例において実証されている）。このことが示すところによると、上記ペプチドおよびそれを含んでいる組成物は、酸化および／または酸化ストレスによって生じる皮膚の不具合の予防、低減または除去する化粧料に好適である。このような皮膚の不具合の例としては、（i）環境による酸化ストレス（汚染またはＵＶ照射など）の結果として現れる皮膚の不具合、（ii）老化または光老化によって生じる、皮膚への望ましくない色素沈着または皮膚の不具合（例えば、皮膚の色艶、および／または、皮膚の色味および弾力の低下）、などが挙げられる。
【００６４】
第２の態様において、本発明は、本発明のペプチドを含んでいる組成物に関する（本明細書中に開示されている通り）。
【００６５】
本発明の好適な実施形態において、組成物は、上述の化粧料活性（抗酸化活性および美白活性）を与える化粧料組成物である。
【００６６】
本発明の化粧料組成物は、本発明のペプチドの１種類、または、本発明のペプチドの組合せもしくは混合物を含んでいることが意図される。
【００６７】
一実施形態において、上記に開示した化粧料組成物は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せを、０．１％〜０．０００１％（質量／体積、すなわちｍｇ／ｍＬ）含んでいる。より好ましくは、上記組成物は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組合せを、０．１％〜０．００１％（ｍ／ｖ）含んでいる。
【００６８】
また、本発明の化粧料組成物は、現在の技術水準においてで通常に使用されている、さらなる化粧料成分をも含んでいることが意図される。このような化粧成分の例としては、補剤（安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色料、香料など）、担体、および／または、他の化粧料における有効成分が挙げられる。
【００６９】
上記さらなる化粧料成分は、組成物の他の成分（特に、本発明の組成物に含まれている本発明のペプチド）に対して、物理的および化学的に適合性を有していなければならない。同様に、上記さらなる化粧料成分の性質は、本発明の化合物の利益を許容できないほど変化させるものであってはならない。上記さらなる化粧料成分は、合成物であってもよいし、天然由来であってもよい。例えば、植物性抽出物であってもよく、生物の発酵作用に由来していてもよい（例えば、CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Eleventh Edition (2006)を参照）。
【００７０】
上述のさらなる化粧料成分には、皮膚および／または毛髪をケアおよび／または洗浄するための組成物において、通常に使用される成分が含まれることが意図される。このような成分の例としては、他のメラニン合成阻害剤、他のホワイトニング剤または脱色剤、抗老化剤、ＮＯ−合成酵素阻害剤、抗酸化物質、抗大気汚染剤および／またはフリーラジカル捕捉剤、抗糖化剤、乳化剤、エモリエント剤、有機溶媒、液体噴射剤、スキンコンディショナー（湿潤剤、保湿物質、α−ヒドロキシ酸、保湿剤、ビタミンなど）、色素または着色料、染料、ゲル化ポリマー、増粘剤、界面活性剤、柔軟剤、抗シワ剤、目の下のたるみを減少または除去できる薬品、角質除去剤、抗菌剤、抗真菌剤、殺菌剤、真皮または表皮における巨大分子合成を促進する薬剤および／またはその分解を防止または阻害できる薬剤（コラーゲン合成促進剤、エラスチン合成促進剤、ラミニン合成促進剤、コラーゲン分解阻害剤、エラスチン分解阻害剤、線維芽細胞増殖促進剤、ケラチン細胞増殖促進剤、ケラチン細胞分化促進剤、脂質および角質層成分（セラミド、脂肪酸など）の合成促進剤など）、皮膚弛緩剤、グリコサミノグリカン合成促進剤、ＤＮＡ修復剤、ＤＮＡ保護剤、プロテアソーム活性促進剤、抗掻痒剤、敏感皮膚の治療剤、再形成剤(reaffirming agents)、引き締め剤、皮脂産生調節剤、脂質分解促進剤、抗セルライト剤、鎮静剤、抗炎症剤、毛細血管の循環または微細循環に作用する薬品、細胞代謝に作用する薬品、真皮−表皮の接合を強化する薬品、防腐剤、香料、キレート剤、植物抽出物、精油、海洋性抽出物、生物発酵プロセスに由来する薬品、鉱物塩、細胞抽出物、および／または、太陽光フィルター（紫外線Ａおよび紫外線Ｂに対して活性な、有機または無機の光保護剤）が挙げられる。
【００７１】
したがって、一実施形態において、本発明の化粧料組成物は、他の化粧料有効成分または物質をも含んでいる。これらは、上述した本発明のペプチドの化粧料活性と、類似または異なる化粧料活性を発揮しうるものである。
【００７２】
好適な実施形態において、本発明の化粧料組成物は、太陽光フィルターまたはその組合せ（ＵＶＡおよび／またはＵＶＢの照射遮断剤）を含んでいる。これによって、（i）色素沈着を防止したり、（ii）太陽光への露出から（または、太陽光への露出によって誘発される日焼けから）皮膚を保護したり、あるいは、（iii）本発明のペプチドまたは組成物の効果を増大させて、皮膚中のメラニン量を減少させ、脱色作用をもたらしたりする。太陽光フィルターの例としては、ｐ−アミノ安息香酸誘導体、ベンジリデンカンファー誘導体、ケイ皮酸誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾイミダゾール誘導体、ベンゾフェノン誘導体、トリアジン誘導体、サリチル酸誘導体、ジベンゾイルメタン誘導体、β，β−ジフェニルアクリレート誘導体、および、ナノ顔料（酸化チタンナノ顔料、酸化鉄ナノ顔料、酸化亜鉛ナノ顔料、酸化ジルコニウムナノ顔料、酸化セリウムナノ顔料など）が挙げられる。
【００７３】
また、本発明の化粧料組成物は、脱色処置における効果をより大きくする目的で、角質除去剤またはその組合せを含んでいることが意図される。これにより、皮膚の剥離を促進することができる角質除去剤の例としては、α−ヒドロキシ酸（特に、グリコール酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸および／またはマンデル酸など）、β−ヒドロキシ酸（サリチル酸およびその誘導体など）、尿素およびその誘導体、レスベラトロールおよびその誘導体、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびその誘導体、ジャスモン酸およびその誘導体、ケイ皮酸、ゲンチシン酸、オリゴフコース、エンジュ抽出物、洗浄剤および／または酵素（スチライン、パパイア抽出物、ブロメライン、パイナップル抽出物、カボチャ抽出物および／またはサツマイモ抽出物など）が挙げられる。
【００７４】
さらに、本発明の化粧料組成物は、現在の技術水準で通常使用される任意の形態として製剤化されていてよい。このような製剤の例としては、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バー、ペンシルが挙げられる。これらの製剤には、「洗い流さない製剤」および「洗い流す製剤」が含まれる。また、現在の技術水準において公知の手段によって、本発明の化粧料組成物を様々な種類の固形部品に組み込むことができる（ウェットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチ、フェイスマスクなど）。あるいは、本発明の化粧料組成物を、様々な種類の化粧製品に組み込むことができる（コンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、化粧落としローションなど）。
【００７５】
また、本発明の化粧料組成物または本発明のペプチド（いずれも本明細書に記載）は、有効成分をよりよく浸透させるために、化粧料の持続的放出システムおよび／または担体と組み合わせることもできることが意図される。これらの例としては、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子などに加えて、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、ミクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセル、ナノカプセルなど、さらには、マイクロエマルション、ナノエマルションが挙げられる。
【００７６】
好適な実施形態において、本発明の化粧料組成物は、対象の（より好ましくはヒトの）顔および／または身体への局所適用に適しているか、局所適用に適合させてある。
【００７７】
第３の態様において、本発明は、対象の皮膚における酸化ストレスを予防、低減または除去するための、および／または、対象の皮膚を美白するための、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の化粧料としての使用に関する。
【００７８】
一実施形態において、化粧料としての上記使用は、酸化および／または酸化ストレスによって生じる皮膚の不具合を予防、低減または除去することである。より好ましくは、上記使用は、（i）環境による酸化ストレス（汚染またはＵＶ照射など）の結果として現れる皮膚の不具合、（ii）老化または光老化によって生じる、皮膚への望ましくない色素沈着または皮膚の不具合、を予防、低減または除去することである。
【００７９】
好適な実施形態において、このような皮膚の不具合は、皮膚の色艶、色素沈着性の変質（加齢性のシミ、日光性ホクロなど）、シワ、および／または、皮膚の色味および弾力の低下である。これらの不具合は、例えば、例えば、細胞外マトリクス構造の減少、皮膚が弱くなること、および／または、炎症反応の増加に起因する（Baumann, L., Skin ageing and its treatment, J. Pathol., 2007; 211:241-251）。
【００８０】
したがって、好適な実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の化粧料としての上述の使用は、皮膚の老化および／または光老化の徴候を、予防、低減または除去することである。
【００８１】
他の好適な実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の化粧料としての使用は、色素沈着性の変質を予防、低減または除去するために利用される。
【００８２】
また、好適な実施形態において、対象はヒトである。
【００８３】
上述した本発明の化粧料としての使用においては、本発明のペプチドまたは組成物を、１つ以上のさらなる有効成分および／または組成物と組合せて利用することが意図される。上記１つ以上の有効成分および／または組成物は、本発明のペプチドまたは組成物に先立って利用してもよいし、同時に利用してもよいし、後に利用してもよい。
【００８４】
好適な実施形態において、上述した本発明の使用では、本発明のペプチドおよび／または化粧料組成物を、対象の（より好ましくはヒトの）顔および／または身体に局所適用する。
【００８５】
第４の態様において、本発明は、対象の皮膚における酸化ストレスを予防、低減または除去するための、および／または、対象の皮膚を美白するための、上記した本発明のペプチドまたは化粧料組成物の化粧用の使用(cosmetic use)に関する。
【００８６】
酸化ストレスの予防、低減または除去、および／または、皮膚の美白によって、環境の酸化ストレス（例えば、汚染またはＵＶ照射）の結果として現れる皮膚の不具合を、予防、低減または除去することができる。このような皮膚の不具合の例としては、皮膚の色艶、色素沈着性の変質（加齢性のシミ、日光性ホクロなど）、シワ、および／または、皮膚の色味および弾力の低下が挙げられる。これらの不具合は、例えば、例えば、細胞外マトリクス構造の減少、皮膚が弱くなること、および／または、炎症反応の増加に起因する（Baumann, L., Skin ageing and its treatment, J. Pathol., 2007; 211:241-251）。
【００８７】
したがって、好適な実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物の化粧用の使用は、皮膚の老化および／または光老化の徴候を予防、低減または除去することである。
【００８８】
他の好適な実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物の化粧用の使用は、色素沈着性の変質を予防、低減または除去するために利用される。
【００８９】
また、好適な実施形態において、対象はヒトである。
【００９０】
上述した本発明の化粧用の使用においては、本発明のペプチドまたは組成物を、１つ以上のさらなる有効成分および／または組成物と組合せて利用することが意図される。上記１つ以上の有効成分および／または組成物は、本発明のペプチドまたは組成物に先立って利用してもよいし、同時に利用してもよいし、後に利用してもよい。
【００９１】
好適な実施形態において、上述した本発明の化粧用の使用では、本発明のペプチドおよび／または化粧料組成物を、対象の（より好ましくはヒトの）顔および／または身体に局所適用する。
【００９２】
第５の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の使用を含むことを特徴とする、対象の皮膚における酸化ストレスを予防、低減または除去する方法に関する。
【００９３】
好適な実施形態において、対象はヒトである。
【００９４】
本発明のペプチドまたは組成物は、人体の皮膚の部位に直接適用することにより、本発明の方法において使用されることが意図される。好適な実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バーまたはペンシルの形態で適用される。これらの形態には、「洗い流さない製剤」および「洗い流す製剤」が含まれる。上述したように、現在の技術水準において公知の手段によって、本発明のペプチドまたは組成物を様々な種類の固形部品に組み込めることも意図される（ウェットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチ、フェイスマスクなど）。あるいは、本発明のペプチドまたは組成物を、様々な種類の化粧製品に組み込めることも意図される（コンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、化粧落としローションなど）。したがって、本発明の方法における、任意の上記形態で使用されることも意図される。
【００９５】
上述したように、上記に開示されている方法は、化粧効果を有している化粧方法である。
【００９６】
本発明の方法において、皮膚における酸化ストレスの予防、低減または除去には、上述の活性、効果および／または使用が含まれる。
【００９７】
上述した本発明の方法においては、本発明のペプチドまたは組成物を、１つ以上のさらなる有効成分および／または組成物と組合せて利用することが意図される。上記１つ以上の有効成分および／または組成物は、本発明のペプチドまたは組成物に先立って利用してもよいし、同時に利用してもよいし、後に利用してもよい。
【００９８】
好適な実施形態において、上述した本発明の方法では、本発明のペプチドおよび／または化粧料組成物を、対象の（より好ましくはヒトの）顔および／または身体に局所適用する。
【００９９】
最後の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の使用を含むことを特徴とする、対象の皮膚を美白する方法に関する。
【０１００】
好適な実施形態において、対象はヒトである。
【０１０１】
本発明のペプチドまたは組成物は、人体の皮膚の部位に直接適用することにより、本発明の方法において使用されることが意図される。好適な実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バーまたはペンシルの形態で適用される。これらの形態には、「洗い流さない製剤」および「洗い流す製剤」が含まれる。上述したように、現在の技術水準において公知の手段によって、本発明のペプチドまたは組成物を様々な種類の固形部品に組み込めることも意図される（ウェットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチ、フェイスマスクなど）。あるいは、本発明のペプチドまたは組成物を、様々な種類の化粧製品に組み込めることも意図される（コンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、化粧落としローションなど）。したがって、本発明の方法における、任意の上記形態で使用されることも意図される。
【０１０２】
上述したように、上記に開示されている方法は、化粧効果を有している化粧方法である。
【０１０３】
本発明の方法において、皮膚における酸化ストレスの予防、低減または除去には、上述の効果および／または使用が含まれる。
【０１０４】
上述した本発明の方法においては、本発明のペプチドまたは組成物を、１つ以上のさらなる有効成分および／または組成物と組合せて利用することが意図される。上記１つ以上の有効成分および／または組成物は、本発明のペプチドまたは組成物に先立って利用してもよいし、同時に利用してもよいし、後に利用してもよい。
【０１０５】
好適な実施形態において、上述した本発明の方法では、本発明のペプチドおよび／または化粧料組成物を、対象の（より好ましくはヒトの）顔および／または身体に局所適用する。
【０１０６】
既述の通り、本発明のペプチドは（それゆえ、本発明の化粧料組成物も）、広い条件下で抗酸化活性および／または美白活性を示すため、広範な上記活性を示す。したがって、広い条件下における酸化または酸化ストレスによって生じる皮膚の不具合を、予防、低減または除去するための化粧用における使用に、上記ペプチドおよびそれらを含んでいる組成物は適している。
【０１０７】
より良い理解のために、以下では、添付の図面を参照しながら本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの図面は、例示のために提供されており、説明のために参照されるのであって、非限定的な例示である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】図１は、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２、およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の抗酸化力を、トロロックスに換算した形態で示す（実施例９を参照）。図１Ａは、試験した３種類の濃度において、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した際のトロロックスへの換算値を示す。グラフはｘ軸を左から右に、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験した３種類の濃度に対応する、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２で処理した際のトロロックスへの換算値を示す。グラフはｘ軸を左から右に、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ。
【図１Ｃ】図１Ｃは、試験した３種類の濃度に対応する、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２で処理した際のトロロックスへの換算値を示す。グラフはｘ軸を左から右に、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ。
【図１Ｄ】図１Ｄは、試験した３種類の濃度に対応する、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２で処理した際のトロロックスへの換算値を示す。グラフはｘ軸を左から右に、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ。
【図１Ｅ】アッセイのポジティヴ・コントロールとして、アスコルビン酸２−グルコシド（以下、ＡＡ−２Ｇ）およびアスコルビルリン酸マグネシウム（以下、ＭＡＰ）を試験した。図１Ｅは、試験した３種類の濃度に対応する、ＡＡ−２Ｇで処理した際のトロロックスへの換算値を示す。グラフはｘ軸を左から右に、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ。
【図１Ｆ】図１Ｆは、試験した３種類の濃度に対応する、ＭＡＰで処理した際のトロロックスへの換算値を示す。グラフはｘ軸を左から右に、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬ。図１Ａ〜Ｆにおいて、ｙ軸はトロロックスへの換算値（μＭ）を示す。
【図２】図２は、４種類の濃度におけるフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の抗酸化活性と、２種類の濃度における参照化合物（アスコルビン酸）の抗酸化活性と、を示す。２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（以下、ＤＰＰＨ）アッセイによって評価した。また、対照試料に基づいて標準化した（実施例１０で説明している）。グラフはｘ軸を左から右に、対照（ペプチド無添加）、アスコルビン酸（３０μＭ、６０μＭ）、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（濃度：０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）に対応している。ｙ軸は、対照条件（ペプチド無添加）に対する抗酸化活性（ＤＰＰＨの還元に対する割合）を示す。
【図３Ａ】図３は、対照試料に基づいて標準化した脂質の過酸化の割合を示す（実施例１１で説明している）。対照試料中の脂質の過酸化の割合を１００％として、他の試料と比較した。図３Ａは、試験した３種類の濃度において、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した際の脂質の過酸化の割合の結果を示す。図３Ａ中、グラフはｘ軸を左から右に、対照、および処理したＡｃ−配列番号１−ＮＨ２の濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）に対応する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験した３種類の濃度に対応する、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２で処理した際の脂質の過酸化の割合の結果を示す。図３Ｂ中、グラフはｘ軸を左から右に、対照、および処理したＡｃ−配列番号２−ＮＨ２の濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）に対応する。図３ＡおよびＢのいずれも、ｙ軸は、ポジティヴ・コントロールの試料において測定された脂質の過酸化に対する脂質の過酸化の割合を示す。
【図４Ａ】図４は、ポジティヴ・コントロールの試料（１００μＭの過酸化水素のみで処理。実施例１２で説明する）と比較した、過酸化水素によって誘導される活性酸素種の割合を示す。ポジティヴ・コントロールの試料中の活性酸素種の割合を１００％として、他の試料と比較した。図４Ａは、試験した３種類の濃度における、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した際の活性酸素種の割合の結果を示す。図４Ａ中、グラフはｘ軸を左から右に、基準状態（未処理細胞）、ポジティヴ・コントロール、酸化のネガティヴ・コントロール（１ｍＭのアスコルビン酸で処理した試料）、および処理したＡｃ−配列番号１−ＮＨ２の濃度（０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ）に対応する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験した４種類の濃度に対応する、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２で処理した際の活性酸素種の割合の結果を示す。図４Ｂ中、グラフはｘ軸を左から右に、基準状態（未処理細胞）、ポジティヴ・コントロール、ネガティヴ・コントロール（１ｍＭのアスコルビン酸で処理した試料）、および処理したＡｃ−配列番号２−ＮＨ２の濃度（０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）に対応する。図４ＡおよびＢのいずれも、ｙ軸は、ポジティヴ・コントロールの試料において測定された活性酸素種に対する活性酸素種の割合を示す。
【図５】図５は、対照試料（３００μＭの重金属のみで処理した試料。実施例１３で説明する）と比較したときの、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した際の重金属により誘導される高度糖化最終産物の割合を示す。対照試料中の高度糖化最終産物の割合を１００％として、他の試料と比較した。ｘ軸は、試験した試料を示す。左から右に、基準状態（未処理細胞）、ポジティヴ・コントロール、試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号１−ＮＨ２（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）に対応する。ｙ軸は、対照試料において測定された高度糖化最終産物に対する、高度糖化最終産物の割合を示す。
【図６】図６は、対照試料（合成煙のみで処理した試料。実施例１４で説明する）と比較した、合成煙によって誘導されるＤＮＡ酸化からの保護を示す。この目的のために図６では、ＤＮＡ酸化物の測定として、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の処理した際の８−ヒドロキシデオキシグアノシンの割合を示している。対照試料と比較しているか、あるいは対照試料の値で標準化している（試料の割合を１００％として、他の試料と比較した）。ｘ軸は、左から右に、基準状態（未処理細胞）、ポジティヴ・コントロール、および試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号１−ＮＨ２（０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）を示す。ｙ軸は、対照試料において測定された８−ヒドロキシデオキシグアノシンに対する、８−ヒドロキシデオキシグアノシンの割合を示す。
【図７】図７は、対照試料（合成煙のみで処理した試料。実施例１４で説明する）と比較した、合成煙によって誘導される脂質酸化からの保護を示す。この目的のために図７では、脂質酸化の測定として、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した際のＭＤＡの割合を示している。対照試料と比較している（試料の割合を１００％として、他の試料と比較した）。ｘ軸は、左から右に、基準状態（未処理細胞）、対照、および試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号１−ＮＨ２（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）を示す。ｙ軸は、対照試料において測定されたＭＤＡに対する、ＭＤＡの割合を示す。
【図８】図８は、濃度：０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチドで処理した後のＨＥＫａ細胞の遺伝子発現プロファイルににおける、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の影響を示す。遺伝子発現レベルの変化を、基準状態（未処理細胞）に対する正または負の倍数変化として表している。ｙ軸のバーは、上から下に、ＣＹＰ２Ｒ１（Vitamin D 25-hydroxylase）、ＮＦＥ２Ｌ２（Nuclear factor-like 2）、ＨＭＯＸ１（Heme oxygenase-1）、ＧＳＴＰ１（Glutathione S-transferase P）、ＧＳＳ（Glutathione synthetase）、ＧＰＸ１（Glutathione peroxidase）、ＴＲＸ（Thioredoxin）を表す。ｘ軸は、基準状態に対する倍数変化を表す。負の倍数変化は、対応する遺伝子が下方制御されていることを意味する。正の倍数変化は、対応する遺伝子が上方制御されていることを意味する。
【図９Ａ】図９は、ヒト皮膚の体外移植組織における、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の抗酸化および抗汚染効果を示す。図９ＡおよびＢは、ヒト皮膚の体外移植組織において、ＡｈＲ（図９Ａ）およびヘムオキシゲナーゼ（図９Ｂ。以下、ＨＯ−１）によって占められている表皮表面の割合を示す。これに先立って、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した（または未処理）。また、汚染物質の混合物（重金属および炭化水素）に曝露した後における割合を示している。一方、図９Ｃは、汚染物質に曝露していない体外移植組織（ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理または未処理）における、ＨＯ−１によって占められている表皮表面の割合を示す。図９ＡおよびＢについて、ｘ軸は、左から右に、汚染物質の混合物に曝露した未処理の体外移植組織、汚染物質の混合物に曝露した体外移植組織（ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理）、を示す。図９Ｃについて、ｘ軸は、左から右に、未処理の体外移植組織、およびＡｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した体外移植組織を示す。ｙ軸は、ＡｈＲ（図９Ａ）およびＨＯ−１（図９ＢおよびＣ）によって占められている表面の割合を示す。図９ＡおよびＢでは、未処理で汚染物質の混合物に曝露した体外移植組織において得られた値を１００％とした。図９Ｃでは、未処理かつ曝露されていない体外移植組織において得られた値を１００％とした。
【図９Ｂ】図９Ａを参照。
【図９Ｃ】図９Ａを参照。
【図１０】図１０は、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の美白効果を示す。この目的のために、図１０では、基準状態（未処理細胞）における１細胞あたりのメラニンと比較した、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２で処理した際の１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態を１００％として、他の試料と比較した）。２種類の濃度のコウジ酸を、ポジティヴ・コントロールとして使用した。ｘ軸は、左から右に、基準状態、１０μＭのコウジ酸、５０μＭのコウジ酸、および試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号１−ＮＨ２（０．０１ｍｇ／ｍＬ（１７．７μＭ）、０．０５ｍｇ／ｍＬ（８８．５μＭ）、０．１ｍｇ／ｍＬ（１７７．１μＭ））を示す。ｙ軸は、１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態における値を１００％とする）。
【図１１】図１１は、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２の美白効果を示す。この目的のために、図１１では、基準状態（未処理細胞）における１細胞あたりのメラニンと比較した、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２で処理した際の１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態を１００％として、他の試料と比較した）。２種類の濃度のコウジ酸を、ポジティヴ・コントロールとして使用した。ｘ軸は、左から右に、基準状態、１０μＭのコウジ酸、５０μＭのコウジ酸、および試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号２−ＮＨ２（０．０１ｍｇ／ｍＬ（１５．２μＭ）、０．０５ｍｇ／ｍＬ（７６μＭ）、０．１ｍｇ／ｍＬ（１５２μＭ））を示す。ｙ軸は、１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態における値を１００％とする）。
【図１２】図１２は、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２の美白効果を示す。この目的のために、図１２では、基準状態（未処理細胞）における１細胞あたりのメラニンと比較した、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２で処理した際の１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態を１００％として、他の試料と比較した）。コウジ酸をポジティヴ・コントロールとして使用した。ｘ軸は、左から右に、基準状態、７０μＭのコウジ酸、および試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号３−ＮＨ２（０．０１ｍｇ／ｍＬ（１１．５μＭ）、０．０５ｍｇ／ｍＬ（５７．５μＭ）、０．１ｍｇ／ｍＬ（１１５μＭ））を示す。ｙ軸は、１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態における値を１００％とする）。
【図１３】図１３は、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の美白効果を示す。この目的のために、図１３では、基準状態（未処理細胞）における１細胞あたりのメラニンと比較した、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２で処理した際の１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態を１００％として、他の試料と比較した）。コウジ酸をポジティヴ・コントロールとして使用した。ｘ軸は、左から右に、基準状態、７０μＭのコウジ酸、および試験した３種類の濃度のフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（０．００５ｍｇ／ｍＬ（６．３μＭ）、０．０１ｍｇ／ｍＬ（１２．６μＭ）、０．０５ｍｇ／ｍＬ（６３μＭ））を示す。ｙ軸は、１細胞あたりのメラニンの割合を示す（基準状態における値を１００％とする）。
【図１４】図１４は、ペプチド  Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２の、in tuboにおけるマッシュルームチロシナーゼ活性に対する阻害効果を示す。基準（未処理細胞）と比較したマッシュルームチロシナーゼの阻害の割合として、結果を示す。コウジ酸をポジティヴ・コントロールとして使用した。ｘ軸は、左から右に、基準状態、４００μＭのコウジ酸、８００μＭのコウジ酸、および試験した３種類の濃度のＡｃ−配列番号３−ＮＨ２（０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を示す。ｙ軸は、マッシュルームチロシナーゼの活性の割合を示す（基準状態における値を１００％とする）。
【図１５】図１５は、ペプチド  フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の、in tuboにおけるマッシュルームチロシナーゼ活性に対する阻害効果を示す。基準（未処理細胞）と比較したマッシュルームチロシナーゼの阻害の割合として、結果を示す。コウジ酸をポジティヴ・コントロールとして使用した。ｘ軸は、左から右に、基準状態、４００μＭのコウジ酸、８００μＭのコウジ酸、および試験した３種類の濃度のフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を示す。ｙ軸は、マッシュルームチロシナーゼの活性の割合を示す（基準状態における値を１００％とする）。
【図１６Ａ】図１６は、ＨＥＭｎ細胞の遺伝子発現プロファイルに対する、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２の影響を示す。それぞれ、０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度で処理した後、１１日後（図１６Ａ）および２４時間後（図１６Ｂ）の値である。遺伝子発現レベルの変化を、基準対照（未処理細胞）に対する正または負の倍数変化として表している。図１６Ａに関して、ｙ軸のバーは、上から下に、ＣＯＸ−１（Cyclooxigenase-1）、ＭＩＴＦ（Melanogenesis associated transcription factor）、ＭＣ１Ｒ（Melanocortin-1 receptor）、ＭＬＡＮ−Ａ（Melanoma antigen recognized by T-cells）、Ｃ−ＫＩＴ（Protoongogen receptor tyrosine kinase KIT）、ＰＭＥＬ１７（Pre-melanosome protein）、ＤＣＴ−ＴＹＲＰ２（Dopachrome tautomerase）、ＴＹＲＰ−１（Tyrosinase related protein 1）、ＴＹＲ（Tyrosinase）を表す。図１６Ｂにおいて、ｙ軸のバーは、上から下に、ＢＬＯＣ−１（Biogenesis of lysosome-related organelles complex-1）、ＭＩＴＦ（Melanogenesis associated transcription factor）、ＭＣ１Ｒ（Melanocortin-1 receptor）、ＭＬＡＮ−Ａ（Melanoma antigen recognized by T-cells）、Ｃ−ＫＩＴ（Protoongogen receptor tyrosine kinase KIT）、ＰＭＥＬ１７（Pre-melanosome protein）、ＤＣＴ−ＴＹＲＰ２（Dopachrome tautomerase）、ＴＹＲＰ−１（Tyrosinase related protein 1）およびＴＹＲ（Tyrosinase）を表す。ｘ軸は、基準対照に対する倍数変化を表す。負の倍数変化は、対応する遺伝子が下方制御されていることを意味する。正の倍数変化は、対応する遺伝子が上方制御されていることを意味する。
【図１６Ｂ】図１６Ａを参照。
【図１７】図１７は、ＨＥＭｎ細胞の遺伝子発現プロファイルに対する、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の影響を示す。０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度で処理した後、１１日後の値である。遺伝子発現レベルの変化を、基準対照（未処理細胞）に対する正または負の倍数変化として表している。ｙ軸のバーは、上から下に、ＶＤＲ（Vitamin D receptor）、ＰＭＥＬ１７（Pre-melanosome protein）およびＤＣＴ−ＴＹＲＰ２（Dopachrome tautomerase）を表す。ｘ軸は、基準対照に対する倍数変化を表す。負の倍数変化は、対応する遺伝子が下方制御されていることを意味する。正の倍数変化は、対応する遺伝子が上方制御されていることを意味する。
【図１８】図１８は、ＨＥＫａ細胞の遺伝子発現プロファイルに対する、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２の影響を示す。０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度で処理した後、２４時間後の値である。遺伝子発現レベルの変化を、基準対照（未処理細胞）に対する正または負の倍数変化として表している。ｙ軸のバーは、上から下に、ＫＩＴＬＧ（KIT ligand）、ＴＰ５３（Tumor protein p53）、ＤＫＫ（Dickkopf-related protein 1）およびＮＧＦ（Nerve growth factor）を表す。ｘ軸は、基準対照に対する倍数変化を表す。負の倍数変化は、対応する遺伝子が下方制御されていることを意味する。正の倍数変化は、対応する遺伝子が上方制御されていることを意味する。
【図１９】図１９は、ＨＥＫａ細胞の遺伝子発現プロファイルに対する、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の影響を示す。０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度で処理した後、２４時間後の値である。遺伝子発現レベルの変化を、基準対照（未処理細胞）に対する正または負の倍数変化として表している。ｙ軸のバーは、上から下に、ＫＩＴＬＧ（KIT ligand）、ＰＯＭＣ（Pro-opiomelanocortin）、ＥＤＮ１（Endothelin-1）およびＮＧＦ（Nerve growth factor）を表す。ｘ軸は、基準対照に対する倍数変化を表す。負の倍数変化は、対応する遺伝子が下方制御されていることを意味する。正の倍数変化は、対応する遺伝子が上方制御されていることを意味する。
【実施例】
【０１０９】
〔略語〕
アミノ酸に使用する略語は、１９８３年のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法に関する合同委員会の勧告（Eur. J. Biochem. (1984) 138：937に概説）に従う。
【０１１０】
２−ＣＩＴｒｔ：２−クロロトリチル
Ａｃ：アセチル
Ａｒｇ：アルギニン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ
Ｃ末端：カルボキシ末端
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＣＤＩ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＤＰＰＨ：２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル
ｅｑｕｉｖ：当量
ＥＳＩ−ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｇｌｕ：グルタミン酸
ＨＤＦａ：ヒト皮膚線維芽細胞（成人）
ＨＥＫａ：ヒト表皮ケラチン細胞（成人）
ＨＥＭｎ：ヒト表皮メラニン細胞（新生児）
Ｈｉｓ：ヒスチジン
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィ
Ｉｌｅ：イソロイシン
ＩＮＣＩ：化粧品原料国際命名法
ＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｌｙｓ：リシン
Ｍｅ：メチル
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｎ末端：アミノ末端
Ｐａｌｍ：パルミトイル
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
ＲＮＡ：リボ核酸
ＲＴ：室温
Ｓｅｒ：セリン
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｈｒ：トレオニン
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル（またはトリチル）
Ｔｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリン
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル。
【０１１１】
実施例に含まれる化学合成の手順に関して、全ての合成プロセスは、多孔質ポリエチレン製ディスクを装着したポリプロピレン製シリンジ、または、多孔質プレートを装着したPyrex（登録商標）反応器中で異なった。全ての試薬および溶媒は合成用の品質であり、追加処理を施さずに使用した。溶媒および可溶性試薬は、吸引により除去した。Ｆｍｏｃ基は、ピペリジン−ＤＭＦ（２：８、ｖ／ｖ）で除去した。１×１分以上、２×１０分、樹脂１ｇあたり５ｍＬ（Lloyd Williams P. et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC, 1997, Boca Raton (Fla., USA)）。脱保護段階、カップリング段階、および再度の脱保護段階の間における洗浄は、ＤＭＦ（３×１分）およびＤＣＭ（３×１分）で行った。このときの溶媒の量は、樹脂１ｇあたり１０ｍＬであった。カップリング反応における溶媒の量は、樹脂１ｇあたり３ｍＬであった。カップリングの制御は、ニンヒドリン試験によって行った（Kaiser E. et al., Anal. Biochem., 1970, 34: 595598）。全ての合成反応および洗浄はＲＴで行った。
【０１１２】
〔実施例１  本発明のペプチドの合成および調製〕
［Ｆｍｏｃ−Ｘｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｙｎ−Ｒ２−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ−樹脂の作製］
（式中、ＡＡ１は、−Ｌ−Ａｓｐ−、または−Ｌ−Ｇｌｕ−；ＡＡ２は、−Ｌ−Ｔｙｒ−、−Ｌ−Ｔｒｐ−、または−Ｌ−Ｐｈｅ−；ＡＡ３は、−Ｌ−Ｌｙｓ−、または−Ｌ−Ａｒｇ−；ＡＡ４は、−Ｌ−Ｖａｌ−、−Ｌ−Ｉｌｅ−、または−Ｌ−Ｌｅｕ−；ｎおよびｍは０）。
【０１１３】
重量を標準化した。４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ樹脂（０．５２ｍｍｏｌ／ｇで官能化されている）を、一般的なプロトコルに従ってピペリジン−ＤＭＦで処理して、Ｆｍｏｃ基を除去した。２．５５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ、２．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、または２．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下にて、脱保護された樹脂上に組み込んだ。このとき、ＤＭＦを溶媒に使用し、反応時間は１時間であった。
【０１１４】
次に、一般的な方法で樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して、次のアミノ酸をカップリングさせた。上述のプロトコルに従って、３．５１ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または４．８７ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、３．４５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、３．９５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または２．９１ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、３．０９ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ、または３．１９ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を連続的にカップリングさせた。それぞれのカップリングは、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下にて行った。既述したように、各アミノ酸の付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基を脱保護処理した。
【０１１５】
合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間を５回）、真空下にて乾燥させた。
【０１１６】
［Ｆｍｏｃ−Ｘｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｙｎ−Ｒ２−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ−樹脂の作製］
（式中、Ｘは、−Ｌ−Ｌｅｕ−；ＡＡ１は、−Ｌ−Ｈｉｓ−、または−Ｌ−Ｔｈｒ−；ＡＡ２は、−Ｌ−Ｔｙｒ−、−Ｌ−Ｔｒｐ−、または−Ｌ−Ｐｈｅ−；ＡＡ３は、−Ｌ−Ｔｙｌ−、−Ｌ−Ｔｒｐ−、または−Ｌ−Ｐｈｅ−；ＡＡ４は、−Ｌ−Ｌｙｓ−、または−Ｌ−Ａｒｇ−；Ｙは、Ｌ−Ａｌａ−；ｎおよびｍは、１）。
【０１１７】
重量を標準化した。４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ樹脂（０．５２ｍｍｏｌ／ｇで官能化されている）を、一般的なプロトコルに従ってピペリジン−ＤＭＦで処理して、Ｆｍｏｃ基を除去した。２．３４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下にて、脱保護された樹脂上に組み込んだ。このとき、ＤＭＦを溶媒に使用し、反応時間は１時間であった。
【０１１８】
次に、一般的な方法で樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して、次のアミノ酸をカップリングさせた。上述のプロトコルに従って、３．５１ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または４．８７ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、３．４５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、３．９５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または２．９１ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、３．４５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、３．９５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または２．９１ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、４．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、または２．９８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、２．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。それぞれのカップリングは、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下にて行った。既述したように、各アミノ酸の付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基を脱保護処理した。
【０１１９】
合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間を５回）、真空下にて乾燥させた。
【０１２０】
［Ｆｍｏｃ−Ｘｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｙｎ−Ｒ２−Ｏ−２−ＣｌＴｒｔ−樹脂の作製］
（式中、ＡＡ１は、−Ｌ−Ａｓｐ−、または−Ｌ−Ｇｌｕ−；ＡＡ２は、−Ｌ−Ｔｙｒ−、−Ｌ−Ｔｒｐ−、または−Ｌ−Ｐｈｅ−；ＡＡ３は、−Ｌ−Ｌｙｓ−、または−Ｌ−Ａｒｇ−；ＡＡ４は、−Ｌ−Ｖａｌ−、−Ｌ−Ｉｌｅ−、または−Ｌ−Ｌｅｕ−；ｎおよびｍは、０）。
【０１２１】
重量は標準化されている。（i）１．７７ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、１．７７ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、または１．７０ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ（５ｍｍｏｌ；１当量）と、（ii）約３０ｍＬのＤＣＭに溶解させた０．８５ｍＬのＤＩＥＡ（５ｍｍｏｌ；１当量）と、の混合物を、乾燥させた２−クロロトリチル樹脂（３．８ｇ；５ｍｍｏｌ）にカップリングさせた。これを５分間撹拌した後、１．７ｍＬのＤＩＥＡ（１０ｍｍｏｌ；２当量）加えた。混合物を４０分間反応させた。残留している塩化物基は、ＭｅＯＨで処理することによりブロックした。
【０１２２】
次に、一般的な方法で樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して、次のアミノ酸をカップリングさせた。上述のプロトコルに従って、７．０２ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または９．７４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、６．９０ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、７．９０ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、または５．８２ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。これに続いて、６．１８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ、または６．３８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１５ｍｍｏｌ；３当量）をカップリングさせた。それぞれのカップリングは、２．０３ｇのＨＯＢｔ（１５ｍｍｏｌ；３当量）および２．３ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（１５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下にて行った。
【０１２３】
合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間を５回）、真空下にて乾燥させた。
【０１２４】
上述の合成手順と、必要なアミノ酸の選択とを用いて、以下の配列を合成した。
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号１）；および、
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３）。
【０１２５】
また、合成手順に適宜変更を加えて、以下の配列も合成した。
Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号２）；および、
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号４）。
【０１２６】
〔実施例２  実施例１で合成したペプチドのＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去〕
ペプチジル樹脂のＮ端末Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで脱保護した。１×１分の後、２×１０分（Lloyd Williams P. et al. (1997) "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins" CRC, Boca Raton (Fla., USA)）。このペプチジル樹脂を、ＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下にて乾燥させた。
【０１２７】
〔実施例３  実施例２で得たペプチジル樹脂に、Ｒ１としてアセチル基を導入する工程〕
実施例２で得たペプチジル樹脂１ｍｍｏｌ（１当量）を、２５当量のＤＩＥＡの存在下にて、２５当量の無水酢酸で処理した。溶媒としては、５ｍＬのＤＭＦを用いた。３０分間反応させた後、ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下にて乾燥させた。
【０１２８】
〔実施例４  実施例２で得たペプチジル樹脂に、Ｒ１としてパルミトイル基を導入する工程〕
ＤＭＦ（１ｍＬ）中に予め溶解させた１０当量のパルミチン酸を、１０当量のＨＯＢｔおよび１０当量のＤＩＰＣＤＩの存在下にて、実施例２で得た１ｍｍｏｌ（１当量）のペプチジル樹脂に組み込んだ。一晩（約１５時間）反応させた後、樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）、ＭｅＯＨ（５×１分）で洗浄し、真空下にて乾燥させた。
【０１２９】
〔実施例５  実施例２で得たペプチジル樹脂に、Ｒ１としてフェルラ酸を導入する工程〕
ＤＭＦ（１ｍＬ）中に予め溶解させた１０当量のフェルラ酸を、１０当量のＨＯＢｔおよび１０当量のＤＩＰＣＤＩの存在下にて、実施例２で得た１ｍｍｏｌ（１当量）のペプチジル樹脂に組み込んだ。約３〜４時間反応させた後、樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）、ＭｅＯＨ（５×１分）で洗浄し、真空下にて乾燥させた。
【０１３０】
〔実施例６  実施例２、３、４および５で得たペプチジル樹脂をポリマー支持体から切断する工程〕
重量を標準化した。実施例２、３、４または５で得た２００ｍｇの乾燥させたペプチジル樹脂を、撹拌しながら室温にて２時間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９０：５：５）で処理した。濾液を集め、５０ｍＬ（８〜１０倍）の冷ジエチルエーテルで沈澱させた。エーテルを含んでいる溶液を、減圧下および室温下にて蒸発乾固した。沈澱物をＨ２Ｏ中の５０％  ＭｅＣＮに再溶解させて、凍結乾燥させた。
【０１３１】
〔実施例７  実施例６で合成・調製したペプチドのキャラクタリゼーション〕
島津製の装置（Kyoto, Japan）によって、実施例５で得たペプチドをＨＰＬＣ分析した。逆相カラム（150x4.6 mm, XBridge Peptide BEH C18, 3.5μm, Waters, USA）を用いた。勾配は、ＭｅＣＮ（＋０．０３６％  ＴＦＡ）−Ｈ２Ｏ（＋０．０４５％  ＴＦＡ）とした。流速は、１．２５ｍＬ／分とした。検出は、２２０ｎｍで行った。全てのペプチドの純度は、８０％超であった。得られたペプチドの同一性を、Water ZQ 4000検出器によるＥＳＩ−ＭＳによって確認した。移動相にはＭｅＯＨを使用し、流速は０．２ｍＬ／分とした。
【０１３２】
〔実施例８  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２を含んでいる顔用化粧料組成物の調製〕
下記表１の通りに、顔用化粧料組成物を調製した。まず、フェーズＡの成分を、適当な容器内で溶解させ、混合物を７０〜７５℃で加熱した。フェーズＢの成分を別の容器で混合し、混合物を７０〜７５℃で加熱した。次に、フェーズＣ（TEGOLON 12-10 (INCI: Nylon-12)）をフェーズＢにゆっくりと加えた。この工程は、フェーズＣが完全に溶解するまで撹拌しながら行った。混合物を７０〜７５℃で加熱した。次に、タービンで撹拌しながら、フェーズＡの溶液をフェーズＢおよびＣの混合物に加えて、乳化させた。次に、均一なエマルションになるまで撹拌を続けながら、フェーズＤを混合物にゆっくりと加えた。最後に、化合物Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２を含んでいる市販の製剤（INCI: Water (Aqua), Glycerin, Caprylyl Glycol, Ac-SEQ ID NO: 1-NH2）を、約３０℃の混合物に、撹拌を続けながらゆっくりと加えた。
【０１３３】
【表１】
2020508974.tif 000002
【０１３４】
〔実施例９  トロロックスに換算した抗酸化能（以下、ＴＥＡＣ）〕
ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２、およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２を、実施例１〜６に従って合成し、本実施例において使用した。
【０１３５】
ここでは、ＴＥＡＣアッセイを利用した。このアッセイは、標準（ビタミンＥアナログのトロロックス）と比較した、所与の物質の抗酸化能を測定する。
【０１３６】
ＡＢＴＳ脱色アッセイによって抗酸化能を測定した。このアッセイでは、ＡＢＴＳを過硫酸カリウムで酸化させて、２，２’−アジノビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）のラジカルモノカチオン（ＡＢＴＳ＊＋）を生成させる。この事前に形成されたラジカルモノカチオンを、抗酸化物質（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２、またはフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２）の存在下にて還元する。ＡＢＴＳ・＋は青緑色であり、６５０ｎｍ、７３４ｎｍおよび８２０ｎｍに吸収ピークを有している。試料中の抗酸化物質がＡＢＴＳ・＋を還元すると、当該抗酸化物質の濃度および抗酸化能に比例して発色が抑制される。吸光度の定量にはPolarstar Omega製の装置（BMG Labtech）を利用し、７３４ｎｍを測定した。
【０１３７】
本試験で得られた結果を、図１にまとめる。要約すると以下の通りであった。Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２では、トロロックスへの換算値は、０．０１ｍｇ／ｍＬで１５μＭ、０．０５ｍｇ／ｍＬで２４μＭ、０．１ｍｇ／ｍＬで９４μＭであった。Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２では、トロロックスへの換算値は、０．０５ｍｇ／ｍＬで２２μＭ、０．１ｍｇ／ｍＬで４９μＭ、０．５ｍｇ／ｍＬで１３０μＭであった。Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２では、トロロックスへの換算値は、０．０１ｍｇ／ｍＬで２８μＭ、０．０５ｍｇ／ｍＬで５９μＭ、０．１ｍｇ／ｍＬで７４μＭであった。フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２では、トロロックスへの換算値は、０．０１ｍｇ／ｍＬで５９μＭ、０．０５ｍｇ／ｍＬで１１２μＭ、０．１ｍｇ／ｍＬで１１３μＭであった。この結果が示すところによると、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の抗酸化力は、濃度：０．０５ｍｇ／ｍＬ以下においてはＡＡ−２Ｇよりも高く、同じ濃度においてＭＡＰに等しい（トロロックスへの換算値として）。また、より高濃度で試験したＡｃ−配列番号２−ＮＨ２は、ＡＡ‐２ＧおよびＭＡＰよりも高い抗酸化力を示した。
【０１３８】
同図に示された結果からわかるところによると、試験した４種類のペプチドは高い抗酸化力を示した。最も高い試験濃度では、トロロックスに換算して、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は９４μＭ、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２は１３０μＭ、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２は７４μＭ、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２は１１３μＭであった。現在の技術水準における他の抗酸化物質（レスベラトロールなど）の抗酸化能は、０．０２ｍｇ／ｍＬにおいて２９μＭ（トロロックス換算）であった。この抗酸化能は、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２と比較して著しく低い。
【０１３９】
〔実施例１０  抗酸化活性の評価〕
ペプチド  フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の抗酸化活性を、捕捉アッセイによってin tuboにて評価した。
【０１４０】
安定なＤＰＰＨフリーラジカルを捕捉する能力は、抗酸化活性の尺度として表すことができる。
【０１４１】
このアッセイでは、抗酸化／還元化合物によって、紫色の試薬（ＤＰＰＨ）のラジカルを、対応する淡黄色のヒドラジンに還元した。水素供与性の抗酸化物質による紫色の試薬のラジカルの還元を、長波長帯（５１５〜５２０ｎｍ）における光学密度の低下によってモニタリングした。
【０１４２】
要約すると、種々の濃度のフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（主に、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を、３００μＭのＤＰＰＨ（ＭｅＯＨ中）と共に、３組ずつインキュベートした。また、捕捉活性の評価におけるポジティヴ・コントロールとして、３０μＭおよび６０μＭのアスコルビン酸でもアッセイを行った。穏やかに振盪しながら室温にて３０分間インキュベートした後、５２０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーMultiskan FC（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）で測定した。この吸光度は、反応混合物中に残留している（捕捉されていない）ＤＰＰＨの量に、正に比例する。吸光度の値を、対照（未処理ウェル）に基づいて標準化した（対照を１００％とした）。それぞれの処理に関して、対応する活性のパーセンテージを算出した。
【０１４３】
図２に示すように、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２は、顕著な抗酸化活性を示した。この活性は、試験した濃度のうち高濃度の範囲においては、用量に応答した。すなわち、０．０５ｍｇ／ｍＬでは４８．３％、０．１ｍｇ／ｍＬでは７２．９％、０．５ｍｇ／ｍＬでは９０．６％のＤＰＰＨを還元した。この化合物の０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬにおける抗酸化活性は、それぞれ、アスコルビン酸の３０μＭ（３１．３％）および６０μＭ（６７．６％）における抗酸化活性と同等であった。
【０１４４】
〔実施例１１  チオバルビツール酸反応物質（以下、ＴＢＡＲＳ）アッセイ〕
実施例１〜３および６に従って合成した、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２およびＡｃ−配列番号２−ＮＨ２を、本実施例に使用した。
【０１４５】
ＴＢＡＲＳは生物試料中に天然に存在し、酸化ストレスによって増加する。このアッセイでは、ＭＤＡの検出によって脂質の過酸化レベルを測定する。ＭＤＡは、多価不飽和脂肪酸脂質の過酸化物が分解した結果として生じる化合物であり、細胞および組織における酸化ストレスの指標である。
【０１４６】
卵黄由来の小型単層ベシクル（以下、ＳＵＶ）を調製し、分析する化合物と共にインキュベートした（ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２またはＡｃ−配列番号２−ＮＨ２、および対応する対照）。次に、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（以下、ＡＡＰＨ）を加えて、ＳＵＶの酸化を誘導した（ＳＵＶは、種々の分子を酸化できるフリーラジカルである）。次に、ブチルヒドロキシトルエン（以下、ＢＨＴ）で酸化反応を停止させた（ＢＨＴは、抗酸化特性を有している親油性有機化合物である）。最後に、５３０ｎｍの蛍光によってＭＤＡを検出・定量するためにチオバルビツール酸（以下、ＴＢＡ）を加えた。蛍光の定量は、Cytation 3（Biotek）で行った。
【０１４７】
このアッセイから得られた結果を図３にまとめる。
【０１４８】
２種類のペプチドについては、試験した全ての濃度において、統計的に有意に脂質の過酸化を阻害することが観察された。
【０１４９】
〔実施例１２  過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）によって誘導される酸化ストレスに対する保護効果の、in vitroにおける評価〕
実施例１〜３および６に従って合成したＡｃ−配列番号１−ＮＨ２およびＡｃ−配列番号２−ＮＨ２を、過酸化水素によって誘導される酸化ストレスに対する保護能に関して試験した。
【０１５０】
初代ヒト表皮ケラチン細胞を、同じ培地を注入したブラック９６ウェルプレートに播種した。４８時間後、分析される種々の化合物（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、またはＡｃ−配列番号２−ＮＨ２）によって、３７℃にて３時間処理した。あるいは、抗酸化物質の対照として、アスコルビン酸で処理した。インキュベート後、細胞に蛍光プローブを結合させた（４５分間）。次に、Ｈ２Ｏ２を加えた（３０分間）。最後に、蛍光を測定した（励起光：４８５ｎｍ／発光：５２０ｎｍ）。
【０１５１】
得られた結果を図４にまとめる。
【０１５２】
同図から直接わかるところによると、いずれのペプチドも過酸化水素の酸化活性を阻害する。このことは、上述のペプチドのいずれか一方で処理すると、試料中から検出される活性酸素種が減少することに表れている。注目すべきことに、試験した全ての濃度において、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２とよりも高い活性を示した。
【０１５３】
〔実施例１３  重金属によって誘導される糖化に対する保護効果の、in vitroにおける評価（高度糖化最終産物の調節）〕
実施例１〜３および６に従って合成したペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２を、重金属によって誘導される糖化物に対する保護能力に関して試験した。
【０１５４】
初代ヒト表皮ケラチン細胞を、標準培地を注入した９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、重金属（Ｆｅ、ＰｂおよびＣｒの混合物が含まれる）およびペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２によって、同時に処理した（４８時間）。高度糖化最終産物（ＡＧＥ産物）のレベルを、競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（４５０ｎｍにおける吸光度）。
【０１５５】
このアッセイで得られた結果を、図５にまとめる。
【０１５６】
図５からわかるように、試験した全ての濃度におおいて、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、高度糖化最終産物の量を統計的に有意に減少させた。この減少の程度は、基準状態で観察されるレベルに近いレベルにまで及んだ（重金属で処理されていない対照試料における量もしくはレベル、または、処理した試料の重金属での処理前における量もしくはレベル）。
【０１５７】
〔実施例１４  合成煙によって誘導されるＤＮＡの酸化および脂質の酸化に対する保護効果の、in vitroにおける評価（８−ヒドロキシ−２’‐デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の調節）〕
実施例１〜３および６に従って合成したペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の抗酸化活性を、試料を合成煙で試料を処理することによって分析した。
【０１５８】
初代ヒト表皮ケラチン細胞を、標準培地を注入した９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、合成煙および分析する化合物（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２）で同時に処理した（４８時間）。この合成煙には、煙草の煙のうち、粒子相（例えば、カドミウムおよびニコチン）および蒸気相（例えば、ホルムアルデヒド（以下、ＦＡ）およびエチルカルバマート）から選択された化合物が含まれている。
【０１５９】
処理後、細胞を溶解し、細胞ホモジネートにおけるＤＮＡの酸化を分析した。この分析は、競合的ＥＬＩＳＡアッセイによる８−ＯＨｄＧのレベルを測定することによって行った（４５０ｎｍにおける吸光度）。
【０１６０】
さらに、処理後、脂質の酸化を細胞内のＭＤＡのレベルによって分析した。ＭＤＡのレベルは、ＭＤＡとＮ−メチル−２−フェニルインドール（以下、ＮＭＰＩ）との間の反応により測定した（この反応によって、５８６ｎｍに吸光ピークを有している安定な青色発色団が生じる）。
【０１６１】
このアッセイの結果を、図６および７に示す。
【０１６２】
両図からわかるところによると、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、ＤＮＡの酸化および脂質の酸化から細胞を保護することができる。実際に、これらの２つのパラメータ関する挙動は類似していた。すなわち、試験した濃度のうち低い濃度範囲においては、上記のパラメータは僅かしか低下しなかった（統計的に有意でない）。一方、試験した濃度のうちの他の２種類においては、より高い、統計的に有意な効果を示した。この効果は、ＤＮＡの酸化からの保護の場合には、ほとんど完全に合成煙の影響を抑制するものであった。すなわち、０．１ｍｇ／ｍＬで処理した試料におけるレベルは、基準状態（未処理の対照試料）において観察されたレベルと同等であった。
【０１６３】
〔実施例１５  抗酸化遺伝子の発現の調節〕
Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２による遺伝子発現の調節を、ＨＥＫａ細胞においてin vitroにて評価した。
【０１６４】
要約すると、ＨＥＫａ細胞を２組の６ウェルプレートに播種した（密度：４×１０５細胞／ウェル）。この細胞を、標準培養条件（３７℃、湿度：９５％、５％ＣＯ２）にて、２４時間維持した。次に、細胞毒性を示さない濃度のＡｃ−配列番号１−ＮＨ２（０．０５ｍｇ／ｍＬ）で、細胞をさらに２４時間処理した。
【０１６５】
未処理細胞を基準対照として使用した。次に、ＲＮＡを抽出するために細胞を溶解させた。ＲＮＡを抽出する際には、市販のＲＮＡ精製キット（RNeasy mini kit; Qiagen; Netherlands）を製造者の説明書に従って用いた。次に、ＲＮＡをナノドロップによって定量して濃度を調節し、逆転写させてｃＤＮＡを得た。この際には、市販のキット（High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit; Thermofisher Scientific, USA）を利用した。得られたｃＤＮＡを、ＲＴｑＰＣＲ（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）に課した。ＲＴｑＰＣＲには、Taqman technologyおよび一群のプローブを用いた。これらのプローブは、メラニン生成およびＨＥＭｎ−ＨＥＫａとＨＥＭｎ−ＨＤＦａとの伝達に関連する特定の遺伝子を標的とするように設計されている。
【０１６６】
この実施例の結果を、図８にまとめる。
【０１６７】
この図からわかるところによると、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓ−配列番号１−ＮＨ２で処理することによって、重要な抗酸化遺伝子が上方制御される。倍数変化は以下の通りであった。ＣＹＰ２Ｒ１（１．４４）、ＮＦＥ２Ｌ２（１．２３）、ＨＭＯＸ１（１．４８）、ＧＳＴＰ１（１．１３）、ＧＳＳ（１．１０）、ＧＰＸ１（１．２２）、ＴＲＸ（１．３４）。したがって、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、当該ペプチドに固有の高い抗酸化活性を示すだけでない（実施例９を参照）。このペプチドはさらに、重要な抗酸化遺伝子（ＮＦＥ２Ｌ２、ＨＭＯＸ−１など）の発現を増加させることによって、複数のストレッサー（重金属および煙草の煙など）から、いくつかの生物学的構造（タンパク質、脂質、ＤＮＡなど）を保護することができる。
【０１６８】
〔実施例１６  ヒト皮膚の体外移植組織における、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の抗酸化能および抗汚染能〕
ヒトの生体体外移植組織における汚染攻撃に対するペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の保護効果を、全体的な形態と、ＡｈＲおよびＨＯ−１の免疫染色とによって評価した。これらの因子はいずれも、抗酸化反応に関連していることから、酸化ストレスのマーカーとして知られている（Esser C., Bargen I., Weighardt H., Haarmann-Stemmann T., Krutmann J., Functions of the aryl hydrocarbon receptor in the skin, Semin Immunopathol (2013) 35:677-691; Kohen R., Nyska A., Oxidation of Biological Systems: Oxidative Stress Phenomena, Antioxidants, Redox Reactions, and Methods for Their Quantification, Toxicologic Pathology (2002) vol 30, no 6, 620-650）。
【０１６９】
要約すると、４９歳の白人女性に由来するヒト皮膚の体外移植組織を、制御された条件下で培養した。平均径が１１ｍｍ（±１ｍｍ）である皮膚の体外移植組織を２１個用意し、３７℃、湿潤、５％ＣＯ２雰囲気下にて、ＢＥＭ培地中で生存させた。この体外移植組織を、５群に割り振った（体外移植組織の対照（時間＝０）、対照群、上述のペプチドで処理した体外移植組織、汚染物質で処理した体外移植組織、汚染物質および上述のペプチドで処理した体外移植組織）。実施例８に従ってＡｃ−配列番号１−ＮＨ２を含んでいる組成物を調製し、０日目、１日目、３日目および４日目に局所適用した。未処理の体外移植組織を対照として使用した（この体外移植組織は、いかなる処理も施していない）。その後、各条件において、体外移植組織の半分を汚染混合物（ベンゼン、キシレン、トルエン、重金属および炭化水素を含有している）に曝露した。体外移植組織の曝露は、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２での処理から３時間後に、Pollubox（登録商標）システム（BIO-EC, Longjumeau, France）を用いて行い、１．５時間続けた。０日目および５日目に、組織学的分析のために試料を処理した。全体的な形態の観察は、パラフィン化した切片を、Masson's trichrome, Goldner variantに従って染色後に行った。ＡｈＲ免疫染色は、パラフィン化した切片に対して、モノクローナル抗ＡｈＲ抗体（Thermoscientific, ref. MA1-514, clone RPT1, MA, USA）を用いて行った。ＨＯ−１免疫染色には、モノクローナル抗ＨＯ−１抗体（Novus biologicals, ref. NBP1-97507, CO, USA）を用いた。最後に、Cell^Dソフトウェア（Olympus, Tokyo, Japan）を用いて、画像分析および定量を行った。
【０１７０】
この試験の結果を、図９にまとめる。これによると、ヒト皮膚の体外移植組織におけるペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の抗酸化効果（ＡｈＲおよびＨＯ−１の量）がわかる（この体外移植組織は、製剤中の上記ペプチドによって処理されている）。
【０１７１】
図９Ｃからわかるように、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２の抗酸化作用が確認された。このことは、ＨＯ−１の発現を増加させる効果（酸化ダメージおよび酸化ストレスを防止する）から直接的にわかる。最終製剤中のペプチドによって皮膚の体外移植組織を処理した後のＨＯ−１のレベルは（汚染物質への暴露なし）、未処理および未暴露の体外移植組織と比較して、６９％の有意な増加を示した（図９Ｃ）。
【０１７２】
図９Ａおよび図９Ｂに見られるように、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、体外移植組織が必要とする抗酸化反応を減少させることにより、抗汚染活性および抗酸化活性を示す。このことは、汚染物質に曝露しペプチドで処理しないものにおける発現レベルと比較して、ＡｈＲ（１６％）およびＨＯ−１（２３％）が減少していることによって、容易に確認できる。この理由は以下の通りである。すなわち、本発明のペプチド（この場合はＡｃ−配列番号１−ＮＨ２）での前処理によって抗酸化反応を誘導し、任意の将来の（または後に来る）の酸化傷害に体外移植組織を備えさせる。その結果、酸化傷害が到達したり酸化障害を受けたりするときに（この場合は、細胞の汚染物質への曝露）、細胞は、より少ない抗酸化応答しか必要としない。このとき、既に準備されている抗酸化機構が、酸化傷害に対して使用または消費される（例えば、図９Ｃを参照）。
【０１７３】
したがって、本発明のペプチドは、酸化ストレスおよびその影響の防止に有効である。
【０１７４】
特に興味深いことに、遺伝子レベルでも皮膚の体外移植組織でも検出されている酵素であるＨＯ−１またはＨＭＯＸ−１は、ＮＦＥ２Ｌ２（smart data gene panelにおいても検出される）を介して活性化される酵素であることが知られている。ＮＦＥ２Ｌ２は抗酸化スイッチとして知られており、それ自体が抗酸化応答因子（ＡＲＥ）に結合する転写因子である。また、ＡＲＥは、強力な抗酸化酵素をコードしている一連の遺伝子の転写を開始する、エンハンサーＤＮＡ配列である（Nguyen, T., Nioi, P., and Pickett, C.B., The Nrf2-Antioxidant Response Element Signaling Pathway and Its Activation by Oxidative Stress, J. Biol. Chem., 284 (2009) 13291-13295）。ヒト皮膚の体外移植組織において見られたように、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、汚染物質の暴露後に誘導されるＡｈＲの発現を増加させる調節因子としても作用する。したがって、Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２は、ＡｈＲの活性化と一体になって酸化ダメージを防止する。また、これに引き続く色素沈着症も防止する（このことは、in vitroにおけるメラニン合成の阻害によってみられる）。
【０１７５】
実施例９〜１６に示された結果によって実証されているのは、本発明のペプチド（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２など）が強力な抗酸化活性を有しているだけでなく、当該活性が広範にわたることである。すなわち、試験した全ての酸化条件において、また試験した全てのパラメータにおいて、上記ペプチドは顕著かつ重大な活性を示した。
【０１７６】
したがって、これらの実験結果は、化粧料組成物または方法に上記ペプチドを利用して、酸化および酸化ストレスに関連する皮膚の不具合を防止、低減および／または除去することの実現可能性を実証している。このような皮膚の不具合の例としては、皮膚の色艶、色素沈着性の変質、または他の加齢もしくは環境に関連する皮膚の不具合が挙げられる。これは、分析した活性が酸化ストレスに直接的に関わるものだからである（Gkogkolou P, Boehm M, Advanced glycation end products Key players in skin aging?, Dermatoendocrinol., 2012 Jul 1; 4(3): 259-270; Sciskalska M, Zalewska M, Grzelak A, and Milnerowicz H, The Influence of the Occupational Exposure to Heavy Metals and Tobacco Smoke on the Selected Oxidative Stress Markers in Smelters, Biol Trace Elem Res., 2014; 159(1-3): 59-68; Tchounwou PB, Yedjou CG, Patlolla AK, and Sutton DJ, Heavy Metals Toxicity and the Environment, EXS., 2012; 101: 133-164; Aflanie I, Effect of Heavy Metal on Malondialdehyde and Advanced Oxidation Protein Produtcs Concentration: A Focus on Arsenic, Cadmium, and Mercury, Journal of Medical and Bioengineering Vol. 4, No. 4, August 2015; van der Vaart H, Postma DS, Timens W, ten Hacken NH, Acute effects of cigarette smoke on inflammation and oxidative stress: a review, Thorax., 2004 Aug;59(8):713-21; and Danielsen PH1, Moeller P, Jensen KA, Sharma AK, Wallin H, Bossi R, Autrup H, Moelhave L, Ravanat JL, Briede JJ, de Kok TM, Loft S, Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines, Chem Res Toxicol., 2011 Feb 18;24(2):168-84）。
【０１７７】
〔実施例１７  美白活性の検討〕
実施例１〜６に従って合成したペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２を、本実施例に使用した。
【０１７８】
初代ヒト表皮メラニン細胞を、６ウェルプレート中にて４日間インキュベートした。次に、分析対象の化合物で７日間処理した（ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２、またはフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２）。処理の後、細胞を破砕して、４５０ｎｍにおける吸光度によって細胞内のメラニン含有量を定量した（Multiskan FC（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を使用）。
【０１７９】
この実施例で得られた結果を、図１０〜１３にまとめる。
【０１８０】
図１０および１１に示される結果から容易にわかるところによると、コウジ酸（美白活性の参照化合物）と比較したときに、ペプチド  Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２およびＡｃ−配列番号２−ＮＨ２はいずれも、試験した全ての濃度において、顕著に高い美白活性またはホワイトニング活性を有していた。活性の増加幅は、２種類の濃度のコウジ酸が示した活性の、２倍から４倍以上であった。さらに注目に値することには、本発明のペプチドは、低い濃度であっても、コウジ酸に対して非常に高い美白活性を示す。低濃度（１７．７μＭのＡｃ−配列番号１−ＮＨ２および１５．２μＭのＡｃ−配列番号２−ＮＨ２）と、５０μＭのコウジ酸とを比較して参照。
【０１８１】
図１２および１３に見られるように、ペプチド  Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２もまた、メラニン含有量を顕著に減少させた。Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２の場合、メラニン含有量は、ポジティヴ・コントロール（コウジ酸で処理）よりは高かった（０．１ｍｇ／ｍＬにおいて最大４９．３％）。しかし、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の場合は、ポジティヴ・コントロールと同等であった（０．０５ｍｇ／ｍＬにおいて３６％の減少）。
【０１８２】
〔実施例１８  チロシナーゼ活性の評価〕
ペプチド  Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２のチロシナーゼ活性阻害能を、in tuboにて評価した。
【０１８３】
要約すると、種々の濃度のＡｃ−配列番号３−ＮＨ２およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ）、ならびに、ポジティヴ・コントロールのコウジ酸（４００μＭ、８００μＭ）を、組換えマッシュルームチロシナーゼと共に、３０分間インキュベートした。インキュベート後、Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４ジヒドロキシフェニルアラニン、ＰＢＳ中で２．５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。室温にて２時間反応させた後、４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーMultiskan FC（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて測定した。この吸光度は、反応混合物中のドーパクロムの量に正比例する。
【０１８４】
吸光度の値を、未処理のウェル（対照）に対して標準化した。対照を１００％として、各試験条件の活性の割合を得た。
【０１８５】
結果を、図１４および１５にまとめる。
【０１８６】
図１４の結果が示すところによると、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＡｃ−配列番号３−ＮＨ２での処理した後には、チロシナーゼ活性が有意に低下する（それぞれ低下幅は、３０．６％、５８．１％）。これは、８００μＭのコウジ酸に近い割合に達している。同様に、フェリル酸−配列番号２−ＮＨ２は、用量に応答してチロシナーゼ活性を低下させた。減少幅は、０．０５ｍｇ／ｍＬにおいて１２％、０．１ｍｇ／ｍＬにおいて４６．５％、０．５ｍｇ／ｍＬにおいて７１％であった（図１５参照）。
【０１８７】
〔実施例１９  メラニン生成経路の遺伝子発現の調節〕
Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２およびフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２ペプチドによる遺伝子発現の調節を、２種類の異なる細胞型（ＨＥＭｎおよびＨＥＫａ）において、in vitroにて評価した。
【０１８８】
要約すると、ＨＥＫａ細胞を、２組の６ウェルプレートに播種した（密度：４×１０５細胞／ウェル）。この細胞を、標準培養条件（３７℃、湿度：９５％、５％ＣＯ２）にて、２４時間インキュベートした。次に、細胞毒性を示さない濃度のＡｃ−配列番号３−ＮＨ２（０．１ｍｇ／ｍＬ）またはフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（０．０５ｍｇ／ｍＬ）で、細胞をさらに２４時間処理した。
【０１８９】
ＨＥＭｎ細胞の場合は、細胞を１２日間培養した（０〜１１日目。１１日目に処理）。このときの培養条件は、標準培養条件（３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２）であった。そして、４〜１１日目に、細胞毒性を示さない濃度のＡｃ−配列番号３−ＮＨ２（０．１ｍｇ／ｍＬ）またはフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（０．０５ｍｇ／ｍＬ）で処理した。
【０１９０】
さらに、ＨＥＭｎ細胞を、標準培養条件（３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２）にて２４時間培養した。その後、細胞毒性を示さない濃度のＡｃ−配列番号３−ＮＨ２（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、さらに２４時間処理した。
【０１９１】
未処理細胞を基準対照として使用した。次に、ＲＮＡを抽出するために細胞を溶解させた。ＲＮＡを抽出する際には、市販のＲＮＡ精製キット（RNeasy mini kit, Qiagen, Netherlands）を製造者の説明書に従って用いた。次に、ＲＮＡをナノドロップによって定量して濃度を調節し、逆転写させてｃＤＮＡを得た。この際には、市販のキット（High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit, Thermofisher Scientific, USA）を利用した。得られたｃＤＮＡを、ＲＴｑＰＣＲ（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）に課した。ＲＴｑＰＣＲには、Taqman technologyおよび一群のプローブを用いた。これらのプローブは、メラニン生成およびＨＥＭｎ−ＨＥＫａとＨＥＭｎ−ＨＤＦａとの伝達に関連する特定の遺伝子を標的とするように設計されている。
【０１９２】
この実施例の結果を、図１６〜１９にまとめる（ＨＥＭｎにおける調節：図１６および１７、ＨＥＫａにおける調節：図１８および１９）。
【０１９３】
上記図１６が示すところによると、０．１ｍｇ／ｍＬのＡｃ−配列番号３−ＮＨ２で処理することによって（１１日間の処理）、メラニン生成経路に関わるいくつかの遺伝子が下方制御される（図１６）。倍数の変化は以下の通りであった。ＣＯＸ−１（−１．５１）、ＭＩＴＦ（−１．４８）、ＭＣ１Ｒ（−１．２８）、ＭＬＡＮ−Ａ（−１．８８）、Ｃ−ＫＩＴ（−１．７８）、ＰＭＥＬ１７（−２．３０）、ＤＣＴ−ＴＹＲＰ２（−１．４０）、ＴＹＲＰ−１（−１．６４）、ＴＹＲ（−１．６６）。処理時間を２４時間とした場合でも、遺伝子発現を下方制御する傾向が見られた。
【０１９４】
フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２の場合には、ＶＤＲ遺伝子が上方制御されており（１．４８倍の変化）、ＰＭＥＬ１７およびＤＣＴ−ＴＹＲＰ２の発現は僅かに下方制御されていた（図１７）。
【０１９５】
図１８および１９は、ＨＥＭｎ−ＨＥＫａ伝達およびメラニン生成因子の放出に関する遺伝子の調節を示す。ＨＥＫａ細胞を、０．１ｍｇ／ｍＬのＡｃ−配列番号３−ＮＨ２で２４時間処理すると、ＫＩＴＬＧ、ＴＰ５３およびＮＧＦが下方制御され、ＤＫＫ−１が上方制御された（図１８）。低濃度のフェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２（０．０５ｍｇ／ｍＬ）は、ＫＩＴＬＧ、ＰＯＭＣ、ＥＤＮ１およびＮＧＦを下方制御した（図１９）。
【０１９６】
上記の結果は、本発明のペプチド（Ａｃ−配列番号１−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号２−ＮＨ２、Ａｃ−配列番号３−ＮＨ２、フェルラ酸−配列番号２−ＮＨ２など）を、皮膚を明るくする（または美白する）化粧料組成物または方法に使用することの、実現可能性を実証している。
【図１Ａ】
2020508974.tif 000003
【図１Ｂ】
2020508974.tif 000004
【図１Ｃ】
2020508974.tif 000005
【図１Ｄ】
2020508974.tif 000006
【図１Ｅ】
2020508974.tif 000007
【図１Ｆ】
2020508974.tif 000008
【図２】
2020508974.tif 000009
【図３Ａ】
2020508974.tif 000010
【図３Ｂ】
2020508974.tif 000011
【図４Ａ】
2020508974.tif 000012
【図４Ｂ】
2020508974.tif 000013
【図５】
2020508974.tif 000014
【図６】
2020508974.tif 000015
【図７】
2020508974.tif 000016
【図８】
2020508974.tif 000017
【図９Ａ】
2020508974.tif 000018
【図９Ｂ】
2020508974.tif 000019
【図９Ｃ】
2020508974.tif 000020
【図１０】
2020508974.tif 000021
【図１１】
2020508974.tif 000022
【図１２】
2020508974.tif 000023
【図１３】
2020508974.tif 000024
【図１４】
2020508974.tif 000025
【図１５】
2020508974.tif 000026
【図１６Ａ】
2020508974.tif 000027
【図１６Ｂ】
2020508974.tif 000028
【図１７】
2020508974.tif 000029
【図１８】
2020508974.tif 000030
【図１９】
2020508974.tif 000031
【配列表】
2020508974000001.app
【国際調査報告】
2020508974.tif 000032
2020508974.tif 000033