(57)【要約】  水性組成物を用いた誘発により植物に対して病原体に対する防除をもたらすための工程であって、その活性剤が食用真菌（カラカサタケ、ヒラタケ属、ボタンマッシュルーム）から抽出される。アルカリ抽出を行い、次いで酵素による加水分解を行い、１００ｋＤａ未満の分画を得る。この工程は、このようにして得られた組成物を植物の地上部に噴霧することからなり；それによって、これが、ブドウ、果樹、野菜作物及び穀類などの植物の隠花植物病害を食い止めるように作用する。
2020500209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
農学的に有用な植物又は観賞用植物における誘発によって病原体に対する防御を付与するのに適した方法であって、前記植物の地上部の少なくとも一部を水性組成物で処理することからなり、その必須活性剤が真菌からの抽出により得られ、前記組成物の活性剤が以下により得られることを特徴とする方法：
ａ）食用の巨視的な真菌（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｕｎｇｉ）の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和すること；
ｂ）ろ過した抽出物を希釈し、それを１０〜６５℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解を、６５℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止すること；
ｃ）得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、１００ｋＤａ未満の分子量の活性分画を単離すること。
【請求項２】
アルカリ抽出段階が、ｐＨが１０を超えるアルカリ性水溶液中で５〜１５重量部のキノコ粉末の懸濁液を撹拌下で維持しながら、２０〜１００℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルカリ抽出段階により得られる溶液の中和が有機又は無機酸を用いて行われ、得られた沈殿物が除去されることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
液相から酸性塩（単数又は複数）及び単純糖を分離するために、アルカリ性抽出物の中和後に得られる生成物に対してろ過を数回行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
グリコシダーゼを用いて行われる酵素による加水分解を撹拌しながら２４時間維持することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アルカリ抽出に供される食用真菌が、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
処理しようとする植物の地上部に４〜８のｐＨを有する組成物を噴霧することによる処理からなり、活性剤の濃度が１．５〜４重量％であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、その乾燥物質に対して５〜１５重量％のタンパク質含量を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、乾燥物質に対して６０〜８０重量％の全糖含量を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、３８〜５０％グルコース、１８〜２８％ガラクトース、２０〜３０％マンノース及び０．５〜４％グルコサミン及び／又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、その乾燥物質に対して３５〜４５重量％のグルカンを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、３０〜５０重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きい乾燥物質を含有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
同時に又は逐次的に又は交互に施用される従来の植物衛生剤による処理済み植物の地上部の処理に関連することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
真菌性病害、特にブドウ、果樹、野菜作物及び穀類の病害によって形成される群から選択されるもの、及び特にべと病（プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））、ウドンコ病（エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ））、ブドウの灰色かび病（ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ））、ジャガイモの葉枯れ病（フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ））、黄サビ病（プチニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ））、セプトリア葉枯病（セプトリア種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐ．））、コムギのフザリウム赤かび病（フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ））及びリンゴ黒星病（ベンチュリア・イナクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ））に対する予防処理を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
初期生長期及び／又は成体及び生殖生長期に実施されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
反復される時間間隔により、必要な頻度で、好ましくは８〜１５日ごとに、実施されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、
ａ）食用の巨視的な真菌（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｕｎｇｉ）の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和し；
ｂ）ろ過した抽出物を希釈し、それを１０〜６５℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解が、６５℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止され；
ｃ）得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、１００ｋＤａ未満の分子量の活性分画を単離すること
により得られることを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
アルカリ抽出段階が、ｐＨが１０を超えるアルカリ性水溶液中で５〜１５重量部のキノコ粉末の懸濁液の撹拌を維持しながら、２０〜１００℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
アルカリ抽出段階により得られる溶液の中和が有機又は無機酸を用いて行われ、得られた沈殿物が除去されることを特徴とする、請求項１７又は１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
液相から酸性塩（単数又は複数）及び単純糖を分離するために、アルカリ性抽出物の中和後に得られる生成物に対してろ過を数回行うことを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
グリコシダーゼを用いて行われる酵素による加水分解を撹拌しながら２４時間維持することを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
アルカリ抽出に供される食用真菌が、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種であることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
活性剤のその濃度が１５０〜４００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
その乾燥物質に対して５〜１５重量％のタンパク質含量を含むことを特徴とする、請求項１７〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
その乾燥物質に対して６０〜８０重量％の総糖含量を含むことを特徴とする、請求項１７〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
３８〜５０％グルコース、１８〜２８％ガラクトース、２０〜３０％マンノース及び０．５〜４％グルコサミン及び／又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有することを特徴とする、請求項１７〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
その乾燥物質に対して３５〜４５重量％のグルカンを含有することを特徴とする、請求項１７〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
３０〜５０重量％の、分子質量が１０ｋＤａよりも大きい乾燥物質を含有することを特徴とする、請求項１７〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
少なくとも１つの相溶性の処方剤を含有することを特徴とする、請求項１７〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
殺真菌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、殺虫剤及び生物的防除剤からなる群から選択される少なくとも１つの抗植物病原性剤を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
同時施用のための植物に対する少なくとも１つの栄養素を含有することを特徴とする、請求項１７〜２９のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、農学的に有用である種類の植物の自然防御能を刺激するための方法である。これらには、特に、ブドウの木、果樹、例えばリンゴの木など、野菜植物、特にトマト及びジャガイモ、又は穀類、例えばコムギなどが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
植物の自然防御能の刺激は非常に現実的な問題であり、依然として多くの研究の主題となっている。実際に、植物は生理的又は代謝的反応を発現し、ウイルス、細菌、真菌又は昆虫などの病原体による攻撃の際にそれら自身を防御するようにさせることが可能である。これらの自然防御能にはいくつかのタイプ：
−植物細胞壁の木化を刺激することによって既存の細胞障壁を強化すること；
−ファイトアレキシンなどの抗生物質活性を有する化合物の植物による合成；
−キチナーゼ又はグルカナーゼなどの病原体の細胞壁を攻撃し得る酵素タンパク質の合成
がある。
【０００３】
これらの自然防御能は、低濃度であっても、分子を誘発することによって惹起され得る。これらの誘発物としては、例えば、オリゴ糖、特にオリゴガラクツロン酸、オリゴグルカン又はオリゴキチンが挙げられる。これらの分子は、病原体による攻撃という状況下で産生され得、攻撃された植物の自然防御能を刺激することによってこれが反応するシグナルとして、攻撃された植物によって認識される。
【０００４】
例えばスプレーの形態の誘発物の溶液の外からの供給もまた、処理された植物の自然防御能を刺激し得、したがってこれらの病原体によって引き起こされる病害の症状を軽減し得る。
【０００５】
国際公開第２００７／０４２５５７号パンフレットは、植物、特にブドウ、トマト及びジャガイモの自然防御能を刺激し、このようにして、植物病害、特にウドンコ病及びべと病の防除を可能にすることを目的とした植物保護組成物に関する。本願は、植物病原性又は非病原性真菌の菌株によって分泌されるか、又はそれから得られる少なくとも１つのオリゴ糖を有効成分として含有することを特徴とする組成物を記載する。それにもかかわらず、本願に記載の唯一の真菌は植物病原性真菌である。
【０００６】
国際公開第２００４／０８２３８１号パンフレットは、単子葉植物（穀類）及び双子葉植物（ブドウ、タバコ、ジャガイモ及びトマト）の自然防御能の刺激のための方法を記載しており、ここでは、ペントサンの群の生成物の少なくとも１つの有効量が組成物の形態で処理植物の葉又は種子に施用され、この群の生成物の少なくとも１つの濃度が５０ｍｇ／Ｌ〜５０００ｍｇ／Ｌとなっている。この方法は、場合によっては加水分解されたアラビノキシラン及びキシランを使用するが、本願の出願人は、処理される植物の保護に対する効率が低い、このタイプの誘発物を回避することを望む。
【０００７】
国際公開第２００４／０８２３８０号パンフレットは、単子葉植物及び双子葉植物、特にブドウ、ジャガイモ及びトマトの自然防御能を増強及び刺激するための方法を記載する。記載の方法で使用される活性成分は細菌作用から得られるキサンタンであり、さらに出願人は病原生物を含む供給源からの誘発物を回避することを望む。
【０００８】
国際公開第１９９９／０５３７６１号パンフレットは、誘発化合物の単独使用によって得られる、病原体に対する植物防御の反応を増幅する（増強させる）ための１つ以上の抗真菌及び／又は抗菌及び／又は抗ウイルス化合物の使用を記載する。抗真菌及び／又は抗菌及び／又は抗ウイルス化合物（前述の特許では「Ｂ化合物」と呼ばれ、増強剤として使用）は、例えば亜リン酸誘導体であり得る一方、誘発化合物（前述の特許で「Ａ化合物」と呼ばれる）は、例えば、藻類又は酵母から抽出され得るオリゴ糖又はオリゴペクチンであり得る。この文書において、誘発物Ａのために使用しようとする化合物に関して与えられるリストは、非植物毒性生成物を挙げるが；出願人は、化合物Ｂが、合成化合物であることに加えて、植物毒性を示し得、それらが除外される場合、非植物毒性誘発物について報告される結果が実際に達成されると推定するに足る根拠はないと考える。
【０００９】
上述の先行技術の全文書において、処理しようとする植物の防御の改善は、対照と比較して確実に得られる。しかし、本願の出願人は、活性成分の植物毒性がないことを望むので、記載の方法は不十分であり、植物病原性真菌又は合成殺真菌剤によって、さらなる処理の必要性は低減されないと考える。
【００１０】
国際公開第９７４５０１８号パンフレットは、植物において植物病原性微生物に対する耐性を誘導するための作用物質に関する。この物質は、植物の非病原性微生物由来のバイオマス抽出物である。記載される一態様において、この物質は、発酵方法の結果生じるバイオテクノロジー廃棄物に由来する真菌バイオマス成分であり；この物質はキノコであり得る。しかし、出願人は、使用される組成物が微生物バイオマスからのものであるので、この文書は本出願によって包含される本発明の先行技術には関連しないと考える。
【００１１】
欧州特許第１００１６７８号明細書を生み出した国際公開第９９−０３３４６号パンフレットは、農学的に有用な植物において後天性の全身抵抗性を付与する方法、すなわち病原体に対する免疫、植物が病原体と接触するときの自然防御能の増強により生じる免疫を記載しており；この方法では、病原体との接触前に、３〜２５０個の糖単位（ｓａｃｃｈａｒｉｎｉｃ  ｕｎｉｔ）から構成されるオリゴ−β−１，３−グルカンを含む液体組成物で植物を、特に葉面処理により、処理する。オリゴ−β−１，３−グルカン中の液体組成物の濃度は、オリゴ−β−１，３−グルカンが誘発物として作用する濃度、すなわちそれが防御反応を直接誘発する濃度よりも低い。オリゴ−β−１，３−グルカンは様々な真菌から抽出され得ることが述べられ、そのリストは上述の欧州特許第１００１６７８号明細書で提供される（４頁５４行目〜５頁４行目の一節を参照）。例１は、使用されるβ−１，３−グルカンが細菌から抽出されることを示し；例２は、原料が海藻であることを示し；例３は、原料がザイモサンであることを示し；例４は、β−１，３−グルカンがリケナンであることを示しており、これは真菌セトラリア・イスランディカ（Ｃｅｔｒａｒｉａ  ｉｓｌａｎｄｉｃａ）から抽出される加水分解物である。しかし、本願の出願人は、藻類又は微生物の抽出物よりもむしろ巨視的な真菌（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｕｎｇｉ）の非植物毒性抽出物の優先的使用を提案する。さらに、肉眼で見えるキノコの細胞壁の分子組織が、β−１，６−グルカンを通じてβ−１，３−グルカンに結合したマンノプロテインが見られる骨格構造を形成する多数の層を含むことは当業者にとって公知であり；この複雑な骨格構造は、前記構造の最深のβ−１，３−グルカンに共有結合した少量のキチンによって増強される（特に、刊行物Ｇ．Ｊ．Ｓｍｉｔｓ，Ｈ．Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｄｅ，Ｆ．Ｍ．Ｋｌｉｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １４７，７８１−７９４，２００１を参照）。したがって、本願の出願人は、これらの異なる分子ファミリー間で効果を誘発する相乗効果を利用するために、革新的な方法で、供給源として真菌を使用することを通じて、オリゴグルカン及びオリゴ−キチン／オリゴ−キトサン複合体（刊行物Ｙ．Ｄｅｓａｋｉ，Ｉ．Ｏｔｏｍｏ，Ｎ．Ｓｈｉｂｕｙａ；Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７５，Ｉｓｓ．２，３６２−３６３，２０１１）及び／又はマンノプロテイン（刊行物Ｃ．Ｗ．Ｂａｓｓ，Ｋ．Ｂｏｃｋ，Ｔ．Ｂｏｌｉｅｒ；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７，１３５．１５，１０２５８−１０２６５．１９９２）の使用を提案する。
【００１２】
先行技術はまた、植物衛生及び生物肥料生成物としてキシログルカンポリマー及びオリゴマーの使用を提案する国際公開第０２／２６０３７号パンフレット；植物、特にブドウ、トマト及びジャガイモの自然防御能を刺激し、このようにして植物病害と闘うことを可能にすることを目的とした植物医薬品用途のための組成物を提案する国際公開第２００７／０４２５５７号パンフレット；１−３−β−グルカン構造を含有する多糖類の部分的加水分解を扱う、雑誌での出版物であるＯ．Ｌ．Ｏｚｅｒｅｔｓｋｏｖｓｋａｙａ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇ．Ｒｏｍｅｎｓｋａｙａ，題名「Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｎｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ」，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．５，ＷＰＩ／Ｄｅｒｗｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（ｗｅｅｋ  ９０−３３８５１２）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ）及び最後に、題名「Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ」の刊行物「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ」，ｖｏｌ．７，ｎｏ．１−２，２００５，２２１−２３６頁も含む。
【発明の概要】
【００１３】
したがって、出願人の目的は、植物の自然防御能を刺激する新しい方法及び、特にトマト、ジャガイモ、ブドウ、コムギ及びリンゴの木のための能動的方法を提案することである。本発明による方法は、未処理対照と比較して防御の改善をもたらし、行うべき連続処理の数を減少させ；使用しようとする組成物は、非植物毒性生成物を生じさせる方法によって得られ、この組成物の使用は、合成殺真菌剤によるさらなる処理の必要性を減少させるか、又はさらには抑制することにつながる。
【００１４】
この組成物は、カラカサタケ、ヒラタケ又はボタンマッシュルームから得られ；したがって、これは、原材料として使用される真菌から抽出される一連の生成物全体、及び特に先行技術の研究により予想され得るようにβ−１，３−グルカン、を含む。本発明により得られる組成物は、存在する様々な生成物の特定の処方に対応し、それによって、処理しようとする植物へのその施用時に、β−１，３−グルカンのみの以前の使用に従い得られる結果よりも優れた結果を得ることが可能になる。トマトで行われた試験では、本発明による方法によって得られた組成物で処理した後に防御活性の３５％の上昇が示され；ジャガイモでの試験では、未処理対照と比較して、葉枯れ病による葉の染みの４０％の減少が示された。ブドウに対して行われた試験では、未処理対照と比較して、本発明による処理後に防御活性の１００％の上昇が示される。これにより、本方法の関心及び特許性が実証され、本発明による新規組成物の実践が提案される。
【００１５】
本発明による方法で使用される組成物に関して、あくまでも目安として、これに限定されることなく、予備的に、本発明による組成物は一般に、乾燥物質に対して約１０％のタンパク質レベル、乾燥物質に対して約７５％の総糖レベル及び約７０〜７６モル％グルコース、約１３モル％ガラクトース及び約１１モル％マンノースの単糖組成を含むことを示すことが可能であり；一方で、β−グルカンのそのレベルは一般に、乾燥物質に対して約５４％であり、一方でその多糖分画は、乾燥抽出物の約４０〜７５％であり、この分画は、１０ｋＤａよりも大きい分子量を有する。これらの特徴全てによって、本発明による方法によって使用される組成物を植物に施用するときに、新規であり特に興味深い処理結果を得ることが可能になる。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、農学的に有用な植物又は観賞用植物における誘発によって病原体に対する防御を付与するのに適した方法であり、この方法は、植物の地上部の少なくとも一部を水性組成物で処理することからなり、その必須活性剤が真菌からの抽出により得られ、組成物の活性剤が、
ａ）巨視的な真菌（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｕｎｇｉ）の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和し；
ｂ）ろ過した抽出物を希釈し、それを１０〜６５℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解が、６５℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止させられ；
ｃ）得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、１００ｋＤａ未満の分子量の活性分画を単離すること
によって得られることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】根のＰＡＬ活性
【図１Ｂ】地上部のＰＡＬ活性
【図１Ｃ】根のペルオキシダーゼ活性
【図１Ｄ】地上部ペルオキシダーゼ活性
【図２】「Ｔｗｅｅｎ」の商品名で販売される界面活性剤の０．５重量％水溶液（対照）で、カラカサタケの抽出物での何れかで処理し、次いでボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）を植菌したトマト植物の葉における防御反応に関連する遺伝子（ＰＡＬ：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、ＰＲ１、ＰＲ２及びＰＲ３：病原性関連）の発現を示す。
【図３】ヒラタケの抽出物で前処理（Ｊ＝０）し、次いでＨ２Ｏ２で処理した（Ｊ＝１）リンゴの木の葉のレベルでの防御反応に関連する遺伝子の発現を示す。データは参照遺伝子（チューブリン、アクチンなど）の発現に対する比率として表す。
【図４】カラカサタケ抽出物を噴霧することにより処理するか又は処理せず（対照）、次いでボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）を植菌したブドウ葉におけるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びペルオキシダーゼ活性を示す。データは未処理対照に対する％で表す。
【図５】カラカサタケの抽出物で前処理したか、又は前処理しなかったジャガイモ植物の葉上に出現するスポット数を示す（２０１４年７月４日に計数）。
【図６】ヒラタケ抽出物で処理した（又は未処理）、ならびにボルドー混合物（ヒラタケ抽出物／Ｃｕ）と交互に処理した後のブドウにおける発病ブドウ表面（％）を示す。
【図７】ヒラタケ抽出物で、ならびに上記の「Ｔｈｉｏｖｉｔ」製品（ヒラタケ抽出物／Ｓ）と交互に処理した（又は未処理）ブドウ（シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）ブドウ品種）におけるウドンコ病によって攻撃されたブドウ表面（％）を示し、有効性を対照に対する％で表し、図７に添付の表で示す。
【図８】症状のある小穂としての植菌の１０日後の症状の記録。
【図９】定量的ＰＣＲによって決定された１０ｎｇの全ゲノムＤＮＡ（植物＋真菌）に対するＦ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ゲノムＤＮＡのｎｇで表される真菌バイオマスの定量を示す。
【図１０Ａ】ヒラタケ抽出物（ドット模様のバー）又はボタンマッシュルーム抽出物（斜線模様のバー）で前処理し、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を植菌し、次いで植菌４８時間後に回収したＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）穂における、ＰＡＬ遺伝子の相対的発現を示す。
【図１０Ｂ】ヒラタケ抽出物（ドット模様のバー）又はボタンマッシュルーム抽出物（斜線模様のバー）で前処理し、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を植菌し、次いで植菌４８時間後に回収したＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）穂における、ＰＲ９遺伝子の相対的発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一態様によれば、本発明による方法は、１０より高いｐＨを有するアルカリ水溶液中で５〜１５重量部のキノコ粉末の懸濁液を撹拌下で維持しながら、アルカリ抽出段階が２０〜１００℃の温度で行われ；アルカリ抽出段階により得られた溶液の中和を有機又は無機酸で行い得、得られた沈殿物を除去し；液相から酸性塩及び単純糖を分離するために、アルカリ抽出物の中和後に得られた生成物を数回のろ過に供し得ることを特徴とする。
【００１９】
本発明による方法の一態様において、グリコシダーゼを用いて行われる酵素による加水分解を、撹拌しながら２４時間維持する。
【００２０】
本発明による方法の一態様において、アルカリ抽出に供される食用真菌は、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種である。
【００２１】
本発明による方法の一態様において、処理しようとする植物の地上部に４〜８のｐＨを有する組成物を噴霧し、このとき活性剤の濃度は１．５〜４重量％である。
【００２２】
本発明による方法の一態様において、処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物は、その乾燥物質に対して５〜１５重量％のタンパク質含有量を含む。
【００２３】
本発明による方法の一態様において、処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物は、その乾燥物質に対して６０〜８０重量％の総糖含有量を含む。
【００２４】
本発明による方法の一態様において、処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物は、３８〜５０％グルコース、１８〜２８％ガラクトース、２０〜３０％マンノース及び０．５〜４％グルコサミン及び／又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有する。
【００２５】
本発明による方法の一態様において、処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物は、その乾燥物質に対して３５〜４５重量％のグルカンを含有する。
【００２６】
本発明による方法の一態様において、処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物は、３０〜５０重量％の、分子質量が１０ｋＤａより大きい乾燥物質を含有する。
【００２７】
本発明による方法の一態様において、本方法は、同時に又は逐次的に又は交互に施用される従来の植物衛生剤による処理済み植物の地上部の処理に関連する。
【００２８】
本発明による方法の一態様において、本方法は、真菌性病害、特にブドウ、果樹、野菜作物及び穀類の病害によって形成される群から選択されるもの、及び特にべと病（プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））、ウドンコ病（エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ））、ブドウの灰色かび病（ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ））、ジャガイモの葉枯れ病（フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ））、黄サビ病（プチニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ））、セプトリア葉枯病（セプトリア種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐ．））、コムギのフザリウム赤かび病（フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ））及びリンゴ黒星病（ベンチュリア・イナクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ））に対する予防処理を構成する。
【００２９】
本発明による方法の一態様において、導入は、初期生長期及び／又は成体及び生殖生長期に行われる。
【００３０】
本発明による方法の一態様において、導入は、反復時間間隔で、必要なだけ頻繁に、好ましくは８〜１５日ごとに行われる。
【００３１】
本発明の目的は、既に定められる方法を実施するための組成物であって、
ａ）食用の巨視的な真菌（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｕｎｇｉ）の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和し；
ｂ）ろ過した抽出物を希釈し、それを１０〜６５℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解が、６５℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止させられ；
ｃ）得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、１００ｋＤａ未満の分子量の活性分画を単離することにより
それが得られることを特徴とする、組成物でもある。
【００３２】
好ましい態様において、本発明による組成物は、ｐＨが１０を超えるアルカリ性水溶液中で５〜１５重量部のキノコ粉末の懸濁液の撹拌を維持しながら、２０〜１００℃の温度でアルカリ抽出段階が行われることを特徴とする。
【００３３】
本発明による組成物の一態様において、液相から酸性塩及び単純糖を分離するために、アルカリ性抽出物の中和後に得られる生成物に対してろ過を数回行う。
【００３４】
一態様において、本発明による組成物は、撹拌しながら２４時間、グリコシダーゼを用いて酵素による加水分解を行うことにより得られる。
【００３５】
本発明による組成物の一態様において、アルカリ抽出に供される食用真菌は、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種である。
【００３６】
本発明による組成物の一態様において、活性剤の組成物濃度は１５０〜４００ｍｇ／Ｌである。
【００３７】
一態様において、本発明による組成物は、その乾燥物質に対して５〜１５重量％のタンパク質含量を含む。
【００３８】
一態様において、本発明による組成物は、その乾燥物質に対して６０〜８０重量％の総糖含量を含む。
【００３９】
一態様において、本発明による組成物は、３８〜５０％グルコース、１８〜２８％ガラクトース、２０〜３０％マンノース及び０．５〜４％グルコサミン及び／又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有する。
【００４０】
一態様において、本発明による組成物は、その乾燥物質に対して３５〜４５重量％のグルカンを含有する。
【００４１】
一態様において、本発明による組成物は、３０〜５０重量％の、分子質量が１０ｋＤａより大きい乾燥物質を含有する。
【００４２】
一態様において、本発明による組成物は、少なくとも１つの相溶性の処方物質を含有する。
【００４３】
一態様において、本発明による組成物は、殺真菌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、殺虫剤及び生物的防除剤からなる群から選択される少なくとも１つの抗植物病原性剤を含む。
【００４４】
一態様において、本発明による組成物は、植物に対する同時施用のための少なくとも１つの栄養素を含有する。
【００４５】
本発明の態様及び実施を説明するために、本発明による３つの組成物の乾燥抽出物の３つの製造例及び本発明による処理方法の実施の７つの例を以下に示す。これらの例は、言うまでもなく、純粋に例示的で非限定的な目的のために提供される。
【００４６】
例
例１
０．１％の水素化ホウ素ナトリウムを添加した１リットルの８％水酸化ナトリウム中で、１００ｇの乾燥させ、細かく粉砕したカラカサタケ（＜１ｍｍ）を取り入れる。懸濁液を室温で２４時間撹拌する。氷酢酸溶液を添加することによって、培地をｐＨ６．５にする。グルカナーゼを０．１％ｗ／Ｖの速度で添加し、混合物を室温で２０時間撹拌する。加水分解物を遠心分離し、次いでろ過する。次いで、１００ｋＤａ多孔膜を備えたＭＩＬＬＩＰＯＲＥにより市販されるＰｅｌｌｉｃｏｎミニタイプの接線限外ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）システムにおいて溶液を限外ろ過する。次いで、得られた透過物を１ｋＤａの膜限外ろ過に供して、溶液を脱塩する。溶液を濃縮し、凍結乾燥を行う。このようにして、加水分解物ＥＸ１を構成する７ｇのベージュ色粉末を得る。
【００４７】
例２
原材料はキノコ、プレウロツス・オストレアスツ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  Ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）の茎からなる。乾燥させ、細かく粉砕した（＜１ｍｍ）２００ｇのヒラタケの柄を、０．１％水素化ホウ素ナトリウムの存在下で２Ｌの８％水酸化ナトリウム中に分散させる。機械的に撹拌しながら、室温で２４時間抽出を行う。遠心分離により、ＮａＯＨ／ＮａＢＨ４中の不溶性分画を除去する。次いで、得られた上清を氷酢酸で中和する。選択した酵素系は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のβ−グルカナーゼであり、０．１％ｗ／Ｖで抽出物に添加する。全体を室温で３時間維持する。１００℃で１０分間の変性後、培地を遠心分離する。得られた抽出物をろ過により清澄化する。得られたろ液を０．１μｍ多孔膜上で、次いで１００ｋＤａ膜上で、１バールの圧力で精密ろ過する。使用する系は、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥにより市販されるＰｅｌｌｉｃｏｎミニタイプの接線限外ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）システムである。
【００４８】
この透過液に対して２ｂａｒの圧力で１ｋＤａ膜上で限外ろ過を行い、溶液の脱塩を行う。これにより保持液が得られ、次いでこれを凍結乾燥する。ＥＸ２抽出物を構成する１５ｇのベージュ色の粉末が得られる。
【００４９】
例３
原材料はボタンマッシュルームである。１００ｇの、乾燥させ細かく粉砕したキノコ（＜１ｍｍ）を、０．１％水素化ホウ素ナトリウムの存在下で、１．５Ｌの８％水酸化ナトリウム中で分散させる。磁気撹拌しながら、室温で２４時間抽出を行う。次いで培地を酢酸で中和する。遠心分離後、上清を１ｋＤａで限外ろ過する。β−グルカナーゼを０．１ｗ／Ｖで抽出物に添加する。混合物を室温で２４時間撹拌する。１００℃で１０分間の変性後、培地を遠心分離する。この透過液に対して１ｋＤａの膜上で限外ろ過を行う。これにより保持液が得られ、次いでこれを凍結乾燥する。ＥＸ３抽出物を構成する１ｇのベージュ色の粉末が得られる。
【００５０】
例４
ヒラタケＥＸ２の抽出物によるトマト防御の刺激を示す研究（図１Ａ〜１Ｄを参照）
−ガラス下で育成されるマルマンデトマト植物を二葉期で使用する（ＢＢＣＨ  １２  １０２）。対照バッチは１２個の鉢に分配された２４個の植物からなり；処理したバッチについても同様である。
−ｔ＝０に、流出するまで葉面散布を行うことにより、０．４ｇ／Ｌの濃度で調製したヒラタケＥＸ２の抽出物で各植物を処理する。
−７日間にわたり毎日、植物を回収し、次いで根及び地上部に分ける。タンパク質を適切な緩衝液中で抽出し、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）及びペルオキシダーゼの酵素活性を対応する抽出物中で測定する。これらの活性は植物の防御のマーカーであり：ＰＡＬはファイトアレキシンの生合成に関与し、一方でペルオキシダーゼは植物細胞の壁を構成するリグニンの形成に関与する。
−比酵素活性は、未処理対照植物に対する、処理植物について得られた値のパーセンテージの形で表す。
【００５１】
図１は、ヒラタケ抽出物を噴霧したトマト植物の根及び地上部におけるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びペルオキシダーゼ活性の放出を示す。データは未処理対照に対する％で表す。図１Ａ〜１Ｄで与えられる説明は以下のとおりである。
図１Ａ：根のＰＡＬ活性
図１Ｂ：地上部のＰＡＬ活性
図１Ｃ：根のペルオキシダーゼ活性
図１Ｄ：地上部ペルオキシダーゼ活性
【００５２】
図１Ａ〜１Ｄは、抽出物の施用後１〜２日の間に、根部及び地上部の両方でＰＡＬ活性の上昇が観察されることを示し、このことから、ヒラタケ抽出物の全身性誘発作用が示唆される。ペルオキシダーゼ活性に関しては、活性上昇が３〜７日の間により強く現れ、このことから、この場合にはより遅い全身性反応が示唆される。
【００５３】
例５
ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）の存在下でのカラカサタケ抽出物によるトマトにおける防御の刺激を示す試験（図２参照）
−ガラス下で栽培されるマルマンデトマト植物を二葉期で使用する（ＢＢＣＨ  １２  １０２）。植物の各バッチは、３個の鉢に分配される６個の植物からなる。
−ｔ＝０に、流出するまで葉面散布を行うことにより、０．４ｇ／Ｌの溶液の形態でカラカサタケＥＸ１の抽出物で各植物を処理する。操作はｔ＝２日及びｔ＝５日に再開する。対照植物を、同じ周期であるが、０．５重量％の「Ｔｗｅｅｎ」の商標下で販売される界面活性剤の水溶液で処理する。
−ｔ＝７日に、植物に病原性真菌（ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｒｉｔｔａｎｙからのＵＢＯＣＣ−Ａ−１０１１００株）を植菌する。０．５重量％の「Ｔｗｅｅｎ」の商標で販売される界面活性剤の水溶液中の分生子の懸濁液（分生子約１０５個／ｍＬ）を、液滴（１００μＬ／植物）を規則的に分布させた形態でいくつかの葉の上に沈着させる。
−ｔ＝１４日に、各植物から葉片を採取することによって植物を回収し、これを−８０℃で凍結する。葉の試料からＲＮＡを抽出する。
−既知及び選択された遺伝子に特異的な分子プローブを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅技術によって、防御遺伝子の発現レベルを定量する。
−これらの遺伝子は、ＰＡＬをコードするもの及び病態形成のいくつかのタンパク質（ＰＲタンパク質）に対応する：ＰＲ１（植物の全身性反応のタンパク質マーカー）、ＰＲ２（グルカナーゼ型タンパク質）及びＰＲ３（キチナーゼ型タンパク質）。
−構成遺伝子であるチューブリンの発現レベルを参照することによって、遺伝子発現レベルを定量する。結果は、防御工程に関する遺伝子の発現レベルとチューブリンの発現レベルとの間の比として表す。
【００５４】
図２は、「Ｔｗｅｅｎ」の商品名で販売される界面活性剤の０．５重量％水溶液（対照）で、カラカサタケの抽出物での何れかで処理し、次いでボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）を植菌したトマト植物の葉における防御反応に関連する遺伝子（ＰＡＬ：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、ＰＲ１、ＰＲ２及びＰＲ３：病原性関連）の発現を示す。データはチューブリンの遺伝子の発現に対する比として表す。
【００５５】
病原体が存在するため、対照は防御遺伝子、特にＰＡＬ及びＰＲ１の活性化を示す（ＰＲ３及びＰＲ２はあまり強く活性化されない）（図２）。しかし、カラカサタケ抽出物での前処理によって、試験する４個の防御遺伝子、特に植物の全身性反応に関連するものとして記載されるＰＲ１のより強い発現が引き起こされる。したがって、自然防御能の刺激活性がこの抽出物に対して良好に証明される。
【００５６】
例６
ヒラタケの抽出物によるリンゴの木における防御の刺激を示す試験（図３参照）
−リンゴの木（マルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ゴールデン・デリシャス（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ）品種）は発芽からガラス下（２０〜２５℃、自然周期）で得た。それらを４〜６葉期で使用し、試験手順ごとに３０本の植物のブロックに配置する。
−各ブロックに対して流出するまで葉面散布処理を行う。
ヒラタケ抽出物は、０．７ｇ／Ｌ乾燥物質の濃度で施用する。
−病原体による攻撃を模倣するために過酸化水素を噴霧することによって、「＋Ｈ２０２ブロック」により示されるブロックをＪ＝１（Ｊは日を意味する）に処理する（国際公開第２０１１／１６１３８８号パンフレット）。Ｊ＝３に、植物から葉片を採取する（手順１回あたり葉片１０片）。液体窒素中で凍結した後、ＲＮＡを抽出し、防御遺伝子（表１で列挙）の発現をｑＰＦＤ（登録商標）ツール（前述の特許）を用いて定量的ＰＣＲにより測定する。
−相対的発現レベルは、いわゆる２−ΔΔＣｔ法を用いて計算した：それらは、３つの参照遺伝子（ＴｕＡ、アクチン、ＧＡＰＤＨ）の相対的発現の幾何平均によって正規化した、ＷＡＴＥＲ対照に対する相対的発現である。これらの相対的発現をｌｏｇ２に変換して、遺伝子の誘導及び抑制に同じ重みを与える。
【００５７】
【表１】
2020500209.tif 000003
【００５８】
図３は、ヒラタケの抽出物で前処理（Ｊ＝０）し、次いでＨ２Ｏ２で処理した（Ｊ＝１）リンゴの木の葉のレベルでの防御反応に関連する遺伝子の発現を示す。データは参照遺伝子（チューブリン、アクチンなど）の発現に対する比率として表す。
【００５９】
ヒラタケ抽出物による前処理は、異なる防御経路（フェニルプロパノイドの経路、酸化ストレス、ホルモンシグナル伝達など）に関連する多くの遺伝子の発現を刺激し、これにより、病原体の存在下での防御反応の上昇における抽出物の誘発物効果が確認される。
【００６０】
例７
ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）の存在下でのカラカサタケ抽出物によるブドウにおける防御の刺激を示す試験（図４参照）
−苗床からの幼若ブドウ植物（カベルネ・ソーヴィニョン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）ブドウ品種）をガラス下（２０〜２５℃、自然光周期）で生育させる。これらは、６枚のよく発達した葉がある少なくとも１本の枝が形成されたときに使用する（ＢＢＣＨ１６期）。
−ｔ＝０で、地上部の新芽に対してカラカサタケ抽出物の葉面散布処理を行う（スプレッドリーフ（ｓｐｒｅａｄ  ｌｅａｆ）１枚あたり２００μＬの０．４ｇ／Ｌ水溶液（乾燥物質）を１回散布）。操作はｔ＝２日及びｔ＝５日に再開する。対照は処理しない。
−ｔ＝７日に、植物全てに病原性真菌（ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｒｉｔｔａｎｙからのＵＢＯＣＣ−Ａ−１０１１００菌株）を植菌する。液滴（１０００μＬ／植物）を規則的に分布させた形態で、「Ｔｗｅｅｎ」の商標で販売される界面活性剤の０．５重量％の水溶液中の分生子の懸濁液（分生子およそ１０５個／ｍＬ）を数枚の葉に沈着させる。
−ｔ＝１４日に、処理し、植菌した葉を回収し、対応する抽出物中のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）及びペルオキシダーゼ酵素活性を測定するために、適切な緩衝液中でタンパク質を抽出する。
−比酵素活性は、未処理対照植物に対する、処理植物について得られた値のパーセンテージとして表す。
【００６１】
図４は、カラカサタケ抽出物を噴霧することにより処理するか又は処理せず（対照）、次いでボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）を植菌したブドウ葉におけるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びペルオキシダーゼ活性を示す。データは未処理対照に対する％で表す。
【００６２】
カラカサタケの抽出物によるブドウの前処理後に、ＰＡＬ及びペルオキシダーゼ酵素活性の強い刺激が観察され；これらの活性は、ＰＡＬについては２５％上昇し、ペルオキシダーゼについては５倍になる。
【００６３】
例８
露地試験におけるジャガイモ葉枯れ病症状の軽減に対するカラカサタケ抽出物の有効性
−葉枯れ病（フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ））に対するカラカサタケ抽出物防御の有効性を判定するために、Ａｕｃｈｙ−ｌｅｓ−Ｍｉｎｅｓ（６２，Ｆｒａｎｃｅ）で２０１４年にジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、Ｄｉｔｔａ変異株）に対して野外試験を行った。植え付けは２０１４年４月１８日に行った。
−実験プロットにおいて、処置条件あたり４個のマイクロプロットを統計学的に分布させた。
−カラカサタケの抽出物を用いて５回の処理を行った：６月１１日（４０ｃｍ期）、２０１４年６月１８日（ＢＢＣＨ６０期）、２０１４年６月２５日（ＢＢＣＨ７０期）及び２０１４年７月９日（ＢＢＣＨ７４期）。
−試験開始時には、葉枯れ病の圧力が顕著であり、合成殺真菌剤ジタンの施用が必要であった（２０１４年６月１日、５ｃｍ期〜２０１４年６月７日、２０ｃｍ期）。
−次いで、その後の病害発生に対してあまり好ましくない気象条件を考慮して、プロットの２回の人工汚染を行った：１回目は、大量の廃棄物からの汚染葉からの胞子の懸濁によるものであり（２０１４年５月３０日）、２回目は、２０１４年６月２日の実験室（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ，Ｌｏｏｓ  ｅｎ  Ｇｏｈｅｌｌｅ）からの植菌によるものであった。これらの２回の汚染により、プロット上で得ようとする葉枯れ病の均一な圧力が得られた。
【００６４】
図５で与えられる記録は、ＢＢＣＨ７０期で７月４日に行い、中央列での１個の植物あたりの平均スポット数に対応した。
【００６５】
図５は、カラカサタケの抽出物で前処理したか、又は前処理しなかったジャガイモ植物の葉上に出現するスポット数を示す（２０１４年７月４日に計数）。この試験は、葉枯れ病（フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ））による汚染後に露地で行った。カラカサタケ抽出物での前処理（１ヘクタールあたり３５ｇの乾燥抽出物に相当するものの施用）は、葉枯れ病に付随する症状を軽減する。葉のスポット数は平均３９％減少する。したがって、カラカサタケの抽出物は、葉枯れ病の平均圧力の場合、露地でその有効性を示した。
【００６６】
例９
露地試験中のブドウのべと病（プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））の症状の軽減に対するヒラタケ抽出物の有効性（図６参照）。
【００６７】
単独で、又はあるいはボルドー混合物（ＢＢ）と一緒に（７５０ｇ  Ｃｕ／ｈａ）、べと病（プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））に対する防御としてのヒラタケ抽出物の有効性を判定するために、２０１５年中にＶｉｌｌｅｌｏｎｇｕｅ  ｄｅｌｓ  ｍｏｎｔｓ（６６，Ｆｒａｎｃｅ）で、ブドウ（ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）黒ブドウ）に対して露地試験を行った。
−実験プロット上で、処理条件あたり４個のマイクロプロットを統計学的に分布させ；試験は、５月１７日に、各基本プロットの第１の株に限定された人工的汚染での管理条件下で行われ、全体的な湿度は規則的な散水により維持した。
−２０１５年５月１２日〜２０１５年７月６日の間に２００Ｌ／ｈａの用量で行った処理を表２で示す。対照は処理せず；「銅」処理は、ボルドー混合物を２０１５年５月１２日〜２０１５年７月６日の間に７５０ｇＣｕ／ｈａと同等の用量で施用することからなる（合計７回施用）。ヒラタケ抽出物ＥＸ２を、単独で、又はボルドー混合物（ヒラタケ抽出物／Ｃｕ）と交互に、の何れかで、３５ｇ／ｈａの水溶液の形態で施用する。銅処理が７回ではなく３回施用される同じ用量でのボルドー混合物に基づく処理の有効性を評価することを目的とした手順もまた評価した（Ｃｕ１／２）。
【００６８】
表２は、様々な手順（野外ブドウ／ウドンコ病試験）に対する処理計画を示す。
ＢＢ：ボルドー混合物；Ｐｌｅ：ヒラタケ抽出物；−：未処理
【表２】
2020500209.tif 000004
【００６９】
図６で示される記録は７月２０日に８１期（成熟開始）で行った。発病の頻度は、病害が起こった房のパーセンテージによって推定される。
【００７０】
図６は、ヒラタケ抽出物で処理した（又は未処理）、ならびにボルドー混合物（ヒラタケ抽出物／Ｃｕ）と交互に処理した後のブドウにおける発病ブドウ表面（％）を示す。この試験は、べと病（パスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））による汚染後に露地で行った。を図面に添付する表で対照の％で表される有効性を示す。
【００７１】
このように、ヒラタケの抽出物は、白カビによる発病の症状を軽減させる。５７％の効率は、ここで殺真菌剤として使用される銅処理の効率（８９％）ほど高くはない。しかし、交互処理（ヒラタケ抽出物／銅）は有効性レベルがより高く（８２％）：したがって、それにより、殺真菌剤の使用を減少させることを可能にする有効な作物保護溶液を提案することが可能になる。銅と交互にヒラタケ抽出物を施用すると、効率レベルは１／２銅用量よりもはるかに高くなる（８２％）ことが示され、かくして、ヒラタケの抽出物による植物の防御の刺激が確認された。
【００７２】
例１０
野外試験中のブドウにおけるウドンコ病（エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ））に関連する症状の軽減に対するヒラタケ抽出物の有効性（図７参照）。
【００７３】
単独で、又はＴｈｉｏｖｉｔ（８ｋｇ／ｈａ）と交互に、ウドンコ病（エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ））に対する防御におけるヒラタケ抽出物ＥＸ２の有効性を判定するために、Ａｌｅｎｙａ（６６，Ｆｒａｎｃｅ）で２０１５年に、ブドウ（ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）ブドウ品種）に対して露地試験を行った。
−実験プロットにおいて、処置条件あたり４個のマイクロプロットを統計学的に分布させた。
−ウドンコ病は、葉上で非常に離散した相（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｐｈａｓｅ）の後、房上で比較的遅く現れた。６月２５日の最初の計数（ＢＢＣＨ７７生長期）時に、未処理対照プロットでの病害の正確なレベルが、７０．５０％の頻度及び３０．２５％の強度の発病であることが分かった。７月２３日の２回目の計数（ＢＢＣＨ８５生長期）では、頻度が７７．５０％、強度が４０．６０％の発病が観察された。
−２０１５年４月１７日〜２０１５年６月２６日の間に１８０Ｌ／ｈａの用量で処理を行い、処理を表３で与える。対照は処理を受けない。「イオウ」処理は、商品名「Ｔｈｉｏｖｉｔ」で販売される製品を８／ｋｇ／ｈａと同等の用量で、２０１５年４月１４日〜２０１５年６月２６日に施用することからなる（合計８回施用）。ヒラタケ抽出物ＥＸ２を、単独で、又は上述の「Ｔｈｉｏｖｉｔ」（ヒラタケ抽出物／イオウ）と交互に、の何れかで、３５ｇ／ｈａ溶液の形態で施用する。イオウ処理と同じ用量であるが７回ではなく４回施用した上述の製品「Ｔｈｉｏｖｉｔ」に基づく処理の有効性を評価することを目的とした手順もまた評価した（Ｓ１／２）。
【００７４】
様々な手順を以下の表３で示す。
【表３】
2020500209.tif 000005
【００７５】
図７は、ヒラタケ抽出物で、ならびに上記の「Ｔｈｉｏｖｉｔ」製品（ヒラタケ抽出物／Ｓ）と交互に処理した（又は未処理）ブドウ（シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）ブドウ品種）におけるウドンコ病によって攻撃されたブドウ表面（％）を示し、有効性を対照に対する％で表し、図７に添付の表で示す。
【００７６】
ヒラタケ抽出物はウドンコ病発病の症状を軽減させる。６５％の有効率は、ここで殺真菌剤として使用されるイオウ処理の有効率（９２％）ほど高くはない。しかし、交互処理（ヒラタケ抽出物／イオウ）有効性レベルはより高く（９６％）：したがって、それにより、殺真菌剤の使用の減少を可能にする有効な作物保護溶液を提案することが可能になる。イオウと交互にヒラタケ抽出物を施用すると、有効性レベルはイオウの１／２用量（８７％）よりもはるかに高くなる（９６％）ことが示され、かくして、ヒラタケの抽出物による植物の防御の刺激が確認された。
【００７７】
したがって、ウドンコ病又はべと病を防除するために、殺真菌剤／ヒラタケ抽出物の交互プログラムは、露地で生育するブドウの安全な管理に十分なレベルの防除を示した。
【００７８】
例１１
フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）存在下でのブラキポディウム・ディスタチオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）に対するヒラタケ抽出物及びボタンマッシュルーム抽出物による防御の刺激を示す試験
【００７９】
モデル温帯穀類植物、ブラキポディウム・ディスタチオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）をガラス下で生育させ、播種の４週間後にこの試験のために使用した。１反復あたり１０体の植物のバッチを構成し、２回の生物学的反復を行った。
【００８０】
前処理は、第０、２及び５日に、全ての穂において、例２及び３のヒラタケ抽出物及びボタンマッシュルーム抽出物を流出するまで０．３５ｇ／Ｌの濃度で噴霧することによって施用することから構成される。フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の植菌は第７日（＝開花中期（ｍｉｄ−ａｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｔａｇｅ）、ＢＢＣＨ６５）に胞子１０５個／ｍＬ胞子懸濁液を全ての穂に噴霧することにより実施した。
【００８１】
植物の採取は、ｔ＝０、ｔ＝２４時間又はｔ＝４８時間に行う。いくつかの分析を実行する：
植菌の第１０日後にフザリウム萎凋の症状が観察された。
真菌バイオマスを定量し、定量的ＰＣＲによって決定された１０ｎｇの全ゲノムＤＮＡ（植物＋真菌）に対するＦ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ゲノムＤＮＡのｎｇで表した。標準範囲を参照することにより、真菌ゲノムＤＮＡの量を決定するために、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＴＵＢ２遺伝子の特異的プライマーを使用した。
【００８２】
２つのＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）防御遺伝子の発現を追跡した：フェニルアラニン−アンモニアリアーゼ（フェニルプロパノイド生合成経路における第１の酵素）をコードするＰＡＬ遺伝子及び病原性関連タンパク質（ＰＲ）をコードするＰＲ９遺伝子。２つの参照遺伝子、ＡＣＴ７及びＵＢＣ１８を使用した。Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の菌株ＰＨ−１を植菌した、対照の穂に対するヒラタケ又はボタンマッシュルームの抽出物で予め処理した穂において、これら２つの遺伝子の発現を決定した。
【００８３】
症状のある小穂としての植菌の１０日後の症状の記録を図８で示す。フラワーキャビティ−（ｆｌｏｗｅｒ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）の５０％以上がフザリウム萎凋病の症状を示す場合、小穂を症状が出ているとみなす。対照は未処理の穂であり；Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の植菌前にヒラタケ又はボタンマッシュルームの抽出物で穂を処理する。
【００８４】
結果から、キノコ抽出物で処理した植物におけるフザリウム萎凋病の症状の顕著な軽減が示される。このように、ヒラタケ及びボタンマッシュルームの抽出物により、それぞれ７７％及び９４．７％、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）によるＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）感染に対する保護がもたらされる。
【００８５】
図９は、定量的ＰＣＲによって決定された１０ｎｇの全ゲノムＤＮＡ（植物＋真菌）に対するＦ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ゲノムＤＮＡのｎｇで表される真菌バイオマスの定量を示す。標準範囲を参照することにより、真菌ゲノムＤＮＡの量を決定するために、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＴＵＢ２遺伝子の特異的プライマーを使用した。星印は、対照の有意に異なる値を示す（スチューデントのｔ検定、ｐ値＜０．０５）。
【００８６】
異なる穂上でのＦ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）バイオマスの定量から、未処理対照との比較により、２つの抽出物のそれぞれで前処理した穂上の同量の全ゲノムＤＮＡ（植物＋真菌）内で無視できる量の真菌ゲノムＤＮＡが示される（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
【００８７】
図１０Ａ及び１０Ｂは、ヒラタケ抽出物（ドット模様のバー）又はボタンマッシュルーム抽出物（斜線模様のバー）で前処理し、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を植菌し、次いで植菌４８時間後に回収したＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）穂における、ＰＡＬ（Ａ）及びＰＲ９（Ｂ）遺伝子の相対的発現を示す。ΔΔＣｔ法を使用して、抽出物で予め処理しなかったＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）穂に対して相対的発現を決定した。構成的に発現されるＢ．ディスタチオン（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）の２つの参照遺伝子：ＡＣＴ７及びＵＢＣ１８を使用した。
【００８８】
結果から、前処理していない穂よりも、ヒラタケ及びボタンマッシュルームの抽出物で処理した穂において、ＰＡＬ及びＰＲ９遺伝子の相対的発現が、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）による植菌の４８時間後により多く誘導されることが示される（図１０Ａ及び１０Ｂ）。実際に、ＰＡＬ遺伝子の発現は、ヒラタケ抽出物の施用後には５．２倍多く、ボタンマッシュルーム抽出物の施用後にはほぼ３．５倍多く誘導される。結果は、未処理の穂と比較して、誘導がヒラタケ及びボタンマッシュルームの抽出物の施用後にそれぞれ１０．２及び１５．４倍増加するＰＲ９遺伝子についてさらにより顕著である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月13日(2019.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下により得られる活性剤を含む水性組成物：
−食用の巨視的な真菌（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｕｎｇｉ）の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで、得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和すること；
−ろ過した抽出物を希釈し、次に１０〜６５℃にてグリコシダーゼで酵素により加水分解し、このようにして行われる加水分解を、６５℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止すること；
−得られた加水分解物をろ過して、１００ｋＤａ未満の分子量の活性分画を単離すること。
【請求項２】
アルカリ抽出段階が、ｐＨが１０を超えるアルカリ性水溶液中で５〜１５重量部のキノコ粉末の懸濁液を撹拌下で維持しながら、２０〜１００℃の温度で行われ；
アルカリ抽出段階により得られる溶液の中和が有機又は無機酸を用いて行われ、得られた沈殿物が除去され；
液相から酸性塩（単数又は複数）及び単純糖を分離するために、アルカリ抽出物の中和後に得られる生成物に対してろ過を数回行うことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グリコシダーゼを用いて行われる酵素による加水分解を撹拌しながら２４時間まで維持することを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
アルカリ抽出に供される食用真菌が、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
活性剤の濃度が１．５〜４．０重量％であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
以下を特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の組成物：
−その乾燥物質に対して５〜１５重量％のタンパク質含量を含み；
−その乾燥物質に対して６０〜８０重量％の総糖含量を含み；
−３８〜５０％のグルコース、１８〜２８％のガラクトース、２０〜３０％のマンノース及び０．５〜４％のグルコサミン及び／又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有し；
−その乾燥物質に対して３５〜４５重量％のグルカンを含み；
−３０〜５０重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きい乾燥物質を含む。
【請求項７】
少なくとも１つの相溶性の処方剤を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
殺真菌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、殺虫剤及び生物的防除剤からなる群から選択される少なくとも１つの抗植物病原性剤を含むことを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
同時施用のための植物に対する少なくとも１つの栄養素を含有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の水性組成物で植物の地上部の少なくとも一部を処理することからなることを特徴とする、農学的に有用な植物又は観賞用植物における誘発によって病原体に対する保護を付与するために適した方法。
【請求項１１】
処理しようとする植物の地上部に４〜８のｐＨを有する組成物を噴霧することによる処置からなり、活性剤の濃度が１５０〜４００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
同時に又は逐次的に又は交互に施用される従来の植物衛生剤により処理しようとする植物の地上部の処理に関連することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
真菌性病害、特にブドウ、果樹、野菜作物及び穀類の病害によって形成される群から選択されるもの、及び特にべと病（プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ））、ウドンコ病（エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ））、ブドウの灰色かび病（ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ））、ジャガイモの葉枯れ病（フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ））、黄サビ病（プチニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ））、セプトリア葉枯病（セプトリア種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐ．））、コムギのフザリウム赤かび病（フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ））及びリンゴ黒星病（ベンチュリア・イナクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ））に対する予防処理であることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
初期生長期及び／又は成体及び生殖生長期に実施されることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
反復される時間間隔により、必要な頻度で、好ましくは８〜１５日ごとに、実施されることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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