(57)【要約】  本発明は、核酸、特に外因性遺伝子を発現しない複製可能な核酸とカチオン性生体材料とにより形成される複合体を主に有効成分として含む腫瘍ワクチンを提供する。本発明による腫瘍ワクチン中の核酸およびカチオン性生体材料は、腫瘍細胞の直接死滅、ならびに腫瘍等に対する身体の自然免疫応答および適応免疫応答の誘導において相乗的相互作用を有する。
2020525455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡとカチオン性生体材料とによって形成された複合体を含み、前記ＤＮＡが５０〜１００００ｂｐの長さを有し、前記カチオン性生体材料がカチオン性脂質材料またはカチオン性ポリマーの少なくとも１つである、腫瘍ワクチン。
【請求項２】
前記ＤＮＡが１００〜６０００ｂｐの長さを有することを特徴とする、請求項１に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項３】
前記ＤＮＡが線状ＤＮＡまたは環状ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１または２に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項４】
前記線状ＤＮＡがミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ断片であることを特徴とする、請求項３に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項５】
前記環状ＤＮＡがプラスミドであることを特徴とする、請求項３に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項６】
前記プラスミドが、ｐＭＶＡ、ｐＭＶＡ−１、ｐＶＡＸ１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１８の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項７】
前記プラスミドが、レプリコン、耐性遺伝子およびプラスミド骨格配列を含むが、外因性遺伝子を発現できない複製可能なプラスミドであることを特徴とする、請求項５に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項８】
レプリコン、耐性遺伝子およびプラスミド骨格配列を含むが外因性遺伝子を発現できない前記複製可能なプラスミドがｐＭＶＡプラスミドであり、そのヌクレオチド配列が配列番号１として表されるか、またはそのヌクレオチド配列が配列番号１として表される配列と少なくとも９０％相同であることを特徴とする、請求項７に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項９】
レプリコン、耐性遺伝子およびプラスミド骨格配列を含むが外因性遺伝子を発現できない前記複製可能なプラスミドがｐＭＶＡ−１プラスミドであり、そのヌクレオチド配列が配列番号２として表されるか、またはそのヌクレオチド配列が配列番号２として表される配列と少なくとも９０％相同であることを特徴とする、請求項７に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１０】
前記プラスミドに他のＤＮＡがロードされていることを特徴とする、請求項５に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１１】
前記他のＤＮＡが５０〜３０００ｂｐの長さを有することを特徴とする、請求項１０に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１２】
前記他のＤＮＡが１００〜２５００ｂｐの長さを有することを特徴とする、請求項１１に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１３】
前記他のＤＮＡがミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ断片であることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１４】
前記ミトコンドリアＤＮＡ断片が、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５として表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、またはそのヌクレオチド配列が配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５として表される配列と少なくとも９０％相同のＤＮＡ断片の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１５】
前記プラスミドが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号１１として表されるヌクレオチド配列を有するプラスミド、またはそのヌクレオチド配列が配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号１１として表される配列と少なくとも９０％相同のプラスミドの少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが酸化ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１７】
前記酸化ＤＮＡが、照射または酸化剤による処理によりインビトロで形成されることを特徴とする、請求項１６に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１８】
前記照射が、紫外線、ガンマ線またはＸ線の照射の少なくとも１つであり、前記酸化剤が、酸素、オゾン、Ｆ２、Ｃｌ２、Ｂｒ２、硝酸塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、ＨＮＯ３、ＫＭｎＯ４、ＮａＣｌＯ、ＣｒＯ３、Ｈ２Ｏ２、ＰｂＯ２、ＮａＢｉＯ３、ＸｅＦ２、Ｃｅ４＋またはＰｄＣｌ２の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１７に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１９】
前記カチオン性脂質材料が、カチオン性脂質またはカチオン性脂質とヘルパー脂質とにより形成される複合体であることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２０】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２１】
前記ヘルパー脂質が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）またはジオレオイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２２】
それによって形成される複合体中の前記カチオン性脂質と前記ヘルパー脂質との質量比が１：０．１〜１：１０であることを特徴とする、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２３】
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、多糖類、ポリアミド−アミンＰＡＭＡＭまたはイミダゾール基を含むポリマーの少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２４】
前記ポリエチレンイミンの分子量が２〜３０ｋＤであることを特徴とする、請求項２３に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２５】
前記ポリエチレンイミンがＰＥＩ２ｋＤ、ＰＥＩ５ｋＤまたはＰＥＩ２５ｋＤであることを特徴とする、請求項２４に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２６】
前記多糖類が、キトサン、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはキトサン第四級アンモニウム塩の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２７】
前記多糖類の分子量が３０〜５０ｋＤであることを特徴とする、請求項２６に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２８】
それにより形成される複合体中のＤＮＡとカチオン性生体材料との質量比が１：１〜１：１００であることを特徴とする、請求項１から２７のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項２９】
前記ＤＮＡと前記カチオン性生体材料との質量比が１：１〜１：５０であることを特徴とする、請求項２８に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が１〜２，０００ｎｍの粒径を有することを特徴とする、請求項１から２９のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が５０〜１０００ｎｍの粒径を有することを特徴とする、請求項３０に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が１〜１５０ｍＶの電位を有することを特徴とする、請求項１から３１のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項３３】
ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が５〜１００ｍＶの電位を有することを特徴とする、請求項３２に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチンと、薬学的に許容される賦形剤または補助成分とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
前記賦形剤または補助成分が、希釈剤、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、保護剤、吸着担体または滑沢剤のうちの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
腫瘍ワクチンを調製する方法であって、（１）ＤＮＡおよびカチオン性生体材料を調製するステップ、ならびに（２）ステップ（１）の前記ＤＮＡと前記カチオン性生体材料とを混合し、前記混合物を放置して前記腫瘍ワクチンを得るステップ、を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３４または３５に記載の医薬組成物を調製する方法であって、（１）ＤＮＡおよびカチオン性生体材料を調製するステップ、（２）ステップ（１）のＤＮＡとカチオン性生体材料とを混合し、前記ＤＮＡと前記カチオン性生体材料との混合の前および/またはその間および/または後に、薬学的に許容される賦形剤または補助成分を添加して医薬組成物を調製するステップ、を含む方法。
【請求項３８】
前記賦形剤または補助成分が、希釈剤、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、保護剤、吸着担体または滑沢剤のうちの少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチンまたは請求項３４もしくは３５に記載の医薬組成物と、腫瘍を治療するための少なくとも１つの他の薬物とを含む医療キット。
【請求項４０】
前記腫瘍を治療するための他の薬物が、化学療法薬または免疫応答調節剤の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項３９に記載の医療キット。
【請求項４１】
前記免疫応答調節剤が、サイトカイン、クラスＩＩ  ＨＬＡタンパク質結合アクセサリー分子、ＣＤ４０アゴニスト、チェックポイント受容体アンタゴニスト、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３アゴニストまたはＣＤ４０Ｌアゴニストの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項４０に記載の医療キット。
【請求項４２】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチンまたは請求項３４もしくは３５に記載の医薬組成物と、腫瘍抗原とを含む抗腫瘍薬。
【請求項４３】
前記腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原、アポトーシス腫瘍細胞または壊死腫瘍細胞の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項４２に記載の抗腫瘍薬。
【請求項４４】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチンおよび請求項３４または３５に記載の医薬組成物の、腫瘍を治療および／または予防するための薬物の製造における使用。
【請求項４５】
前記腫瘍が、子宮頸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、鼻咽頭がん、胃がん、膵臓がん、食道がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肉腫またはリンパ腫から選択されることを特徴とする、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の腫瘍ワクチンまたは請求項３４もしくは３５に記載の医薬組成物と、腫瘍を治療するための少なくとも１つの他の薬物との、腫瘍を治療または予防するための薬物の調製における使用。
【請求項４７】
前記腫瘍を治療するための他の薬物が、化学療法薬または免疫応答調節剤の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記免疫応答調節剤が、サイトカイン、クラスＩＩ  ＨＬＡタンパク質結合アクセサリー分子、ＣＤ４０アゴニスト、チェックポイント受容体アンタゴニスト、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３アゴニストまたはＣＤ４０Ｌアゴニストの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項４７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学の分野に属し、特に新規腫瘍ワクチン、その調製方法および腫瘍の治療および／または予防におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の分子生物学、免疫学、および細胞生物学などのフロンティアサイエンスに基づいて、現代のバイオテクノロジーおよびその製品は、腫瘍の予防および治療のための腫瘍生物療法、ヒト免疫細胞の再構築を促進して、免疫細胞の数を増加させることによる人体の免疫機能の直接回復および改善、がん細胞に対する人体の免疫の強化、ならびに腫瘍細胞の発生、成長、分化、浸潤、転移および再発などの一連の過程を妨げることによる腫瘍治療の目的の達成に使用される。腫瘍生物療法は、外科手術、放射線療法および化学療法に続く４番目の主要な腫瘍療法となり、主に腫瘍免疫療法（抗体療法、腫瘍ワクチン療法、養子細胞免疫療法およびサイトカイン療法を含む）、腫瘍遺伝子療法、抗血管新生療法および分子標的療法などを含む。
【０００３】
腫瘍ワクチン療法は、常に腫瘍生物療法の最新の研究分野の１つである。その原理は、患者自身の免疫系を活性化し、腫瘍抗原に対する特異的な細胞性免疫および体液性免疫応答を生成して、腫瘍を制御または死滅させるように身体を誘導することにより、がん細胞の成長、転移および再発を阻害することである。腫瘍ワクチン療法には、腫瘍細胞ワクチン、腫瘍ポリペプチドワクチン、腫瘍に対する遺伝子工学ワクチン、腫瘍核酸ワクチンおよび抗イディオタイプ抗体ワクチンなどが含まれる。ヌクレオチドとしてのＤＮＡは一般に、病原性がなく、免疫原性が低いため、体内に進入した後に免疫応答を生成するように身体を誘導しないので、現在当技術分野で言及されている「腫瘍ＤＮＡワクチン」は、一般的に腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原、ならびに身体を刺激して特異的および非特異的な免疫応答を生成するように、身体に注入されて宿主細胞において対応する腫瘍抗原を発現する、プラスミドベクターに組み込まれた免疫刺激因子の発現遺伝子を指す。腫瘍ＤＮＡワクチンは安全かつ効果的であり、大量に調製および精製することが容易であり、宿主細胞ゲノムに組み込むことが困難であるため、腫瘍免疫療法で大きな注目を集めている。
【０００４】
臨床研究により、上記の腫瘍ＤＮＡワクチンが腫瘍患者を活性化して臨床試験において経時的に抗原特異的抗腫瘍免疫応答を生成させ得ることが示されているが、この腫瘍ＤＮＡワクチンが、腫瘍患者を誘導して永続的かつ効率的な抗腫瘍免疫応答を生成することは現在のところ稀であり、腫瘍の予防または治療の永続的な効果を得ることは困難である。その結果、腫瘍ＤＮＡワクチンの免疫原性を改善し、腫瘍患者の身体を持続的かつ効率的な抗腫瘍免疫応答を生成するように誘導し、腫瘍の予防または治療のより満足のいく効果を得る方法は、早急に解決すべき技術的問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
裸のＤＮＡは細胞に直接進入しにくく、細胞内のヌクレアーゼによって分解されやすいため、ＤＮＡワクチンはトランスフェクション効率が低く、腫瘍の治療中の免疫原性が非常に弱く、身体の抗腫瘍免疫応答を活性化することは容易ではない。カチオン性生体材料は、薬物送達システムとして使用される。ウイルスベクターと比較して、カチオン性脂質には、簡単かつ迅速な合成および大量生産という利点がある。内部に含まれる正電荷により、カチオン性脂質は負に帯電したＤＮＡと静電結合を介して容易に複合体を形成し、インビボでの分解からＤＮＡを保護することができる。形成された複合体は、エンドサイトーシスまたは食作用を介して細胞に取り込まれる。しかし、研究により、遺伝子のトランスフェクション中にアポトーシスが発生し得ることが示されている。
【０００６】
カチオン性生体材料は、腫瘍ＤＮＡワクチンのアジュバントとしても使用することができる。ＤＮＡとカチオン性生体材料とにより形成される複合体は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって貪食され、したがってＤＮＡワクチンの免疫原性を強化する。複合体の表面の正電荷は、注射部位でのＤＮＡワクチンの滞留時間の延長、抗原提示の増加、およびインビボでの細胞性免疫の刺激時間の延長に役立ち得る。しかし、腫瘍治療用の腫瘍ＤＮＡワクチンを調製するための薬物送達システムとして使用される場合、カチオン性生体材料はしばしば組織細胞の急性細胞壊死を引き起こし、全身投与後に損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を開始し、したがって体内で一連の炎症反応を誘導し、肝毒性や肺毒性などの組織の毒性傷害を引き起こしやすい。このような要因は、現在の腫瘍ＤＮＡワクチン療法における薬物送達システムとしてのカチオン性生体材料の臨床応用を制限する。したがって、カチオン性生体材料の利点を効果的に活用して薬物送達システムを開発し、インビボでの薬物の生物学的利用能および標的化を改善し、その毒性副作用を低減する方法は、カチオン性ナノ薬物送達システムの開発で取り組むべき緊急の課題である。
【０００７】
本発明者の以前の研究（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）２５：２３７−２５３．）によれば、カチオン性生体材料は腫瘍細胞膜上の  Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰ酵素のＯＢＳ部位に結合することができ、それにより腫瘍細胞のＮａ＋濃度が増加し、腫瘍細胞壊死を直接引き起こし、細胞内ミトコンドリアおよび他の関連抗原ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）を放出する。ミトコンドリアＤＮＡは豊富なＣｐＧ構造を有し、ＲＯＳによる酸化の後、ＴＬＲ９シグナル伝達経路、すなわちＴＬＲ９−ＭｙＤ８８経路を活性化することができ、したがって自然免疫応答を誘導し、炎症細胞の活性化および凝集をもたらし、好中球を刺激してより多くの炎症因子を放出して免疫応答を強化する。したがって、カチオン性ナノキャリアは、新しい細胞壊死の機序、すなわちＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰ酵素を介した損傷経路により腫瘍細胞の壊死を直接誘導することができ、これは以前に研究されたＲＩＰ１またはＭＬＫＬで制御される細胞壊死経路とは異なる。さらに、カチオン性ナノキャリアの局所注入は、腫瘍細胞からの抗原の放出を引き起こし、腫瘍に対する免疫細胞の免疫応答を活性化することもできる。
【０００８】
さらに、リソソームによって開始されるアポトーシスの新しい理論として、Ｔｅｒｍａｎらによって提案されたリソソーム−ミトコンドリア軸理論は、酸化ストレス、電離放射線およびリソソーム標的薬の刺激下で、リソソーム膜（ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性が増加し、リソソーム中の加水分解酵素が細胞質内に放出され、放出されたホスホリパーゼ加水分解酵素による直接的ミトコンドリア損傷が、または加水分解酵素により活性化されるアポトーシス促進タンパク質（例えば、Ｂｉｄ）による間接的ミトコンドリア損傷が生じ、最終的にミトコンドリアでのシトクロムｃの放出およびＣａｓｅｐｓｅの活性化につながり、したがってアポトーシスを誘発することを示唆している。さらに、複数の研究により、腫瘍細胞は正常細胞よりもリソソーム膜の安定性が傷つきやすいことが示されている。
【０００９】
ＤＮＡワクチン、カチオン性生体材料、およびリソソームにより開始されるアポトーシスの機序が研究されているが、外因性遺伝子を発現する能力を持たない複製可能なＤＮＡ断片（ｐＭＶＡプラスミドおよびｐＭＶＡ−１プラスミド）が、カチオン性生体材料と一緒に、腫瘍ワクチンとして相乗的抗腫瘍効果を有する複合体を形成するという報告は存在しない。また、酸化ＤＮＡ断片が、カチオン性生体材料と一緒に、腫瘍ワクチンとしてより強力な抗腫瘍効果を有する複合体を形成するという報告も存在しない。
【００１０】
先行技術の弱点から出発して、本発明は、外因性遺伝子を発現しない複製可能なＤＮＡ断片とカチオン性生体材料とによって形成される、抗腫瘍相乗効果を有するＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を提供することを目的とする。この複合体は、腫瘍を直接死滅させるだけでなく、腫瘍に対する身体の自然免疫応答および適応免疫応答を活性化することができ、長期記憶免疫を生成することができる。したがって、この複合体は、腫瘍ワクチンとして単独で使用することも、または他の腫瘍治療法と併用して、異なる種類の腫瘍を治療することもできる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、以下の技術的解決策により達成される：
【００１２】
本発明は、腫瘍ワクチンを提供する。腫瘍ワクチンの成分は、ＤＮＡとカチオン性生体材料とにより形成される複合体で構成される。
【００１３】
さらに、腫瘍ワクチン中のＤＮＡは５０〜１００００ｂｐの長さを有する。
【００１４】
好ましくは、腫瘍ワクチン中のＤＮＡは１００〜６０００ｂｐの長さを有する。
【００１５】
ここで、腫瘍ワクチン中のＤＮＡは線状ＤＮＡまたは環状ＤＮＡである。
【００１６】
さらに、腫瘍ワクチン中の線状ＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ断片である。
【００１７】
ここで、腫瘍ワクチン中の環状ＤＮＡはプラスミドである。
【００１８】
さらに、腫瘍ワクチン中のプラスミドは、ｐＭＶＡ、ｐＭＶＡ−１、ｐＶＡＸ１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１８の少なくとも１つから選択される。
【００１９】
ここで、腫瘍ワクチン中のプラスミドは、レプリコン、耐性遺伝子およびプラスミド骨格配列を含む複製可能なプラスミドであるが、外因性遺伝子を発現することはできない。
【００２０】
ここで、レプリコン、耐性遺伝子およびプラスミド骨格配列を含むが外因性遺伝子を発現できない複製可能なプラスミドはｐＭＶＡプラスミドであり、そのヌクレオチド配列は配列番号１として表されるか、またはそのヌクレオチド配列は配列番号１として表される配列と少なくとも９０％相同である。
【００２１】
ここで、レプリコン、耐性遺伝子およびプラスミド骨格配列を含むが外因性遺伝子を発現できない複製可能なプラスミドはｐＭＶＡ−１プラスミドであり、そのヌクレオチド配列は配列番号２として表されるか、またはそのヌクレオチド配列は配列番号２として表される配列と少なくとも９０％相同である。
【００２２】
ｐＭＶＡプラスミドのヌクレオチド配列は、配列番号１として表される。ｐＭＶＡプラスミドは、再構成後に形成される最も基本的な構造単位を有する複製可能なプラスミドであり、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点配列およびプラスミド骨格配列を含む（図１として表される）。ｐＭＶＡプラスミドは外因性遺伝子を発現できず、大腸菌中で遺伝子を複製およびスクリーニングすることができる。さらに重要なことに、プラスミドは腫瘍細胞で酸化されて酸化ＤＮＡを形成するのに有益である。したがって、このプラスミドはより強い抗腫瘍活性を有し、大規模生産に適している。
【００２３】
ｐＭＶＡ−１プラスミドのヌクレオチド配列は、配列番号２として表される。ｐＭＶＡ−１プラスミドは、特定のヌクレオチド部位におけるｐＭＶＡプラスミドの塩基突然変異または欠失により得られる。ｐＭＶＡ−１プラスミドのベクターは、ｐＭＶＡプラスミドの効力を有し、ｐＭＶＡ−１プラスミドの収量は、ｐＭＶＡプラスミドの収量よりも多い。したがって、ｐＭＶＡ−１プラスミドは大規模生産に有利であり、生産コストを効果的に削減することができる。
【００２４】
さらに、腫瘍ワクチン中のプラスミドには他のＤＮＡがロードされている。
【００２５】
ここで、腫瘍ワクチン中の他のＤＮＡは５０〜３０００ｂｐの長さを有する。
【００２６】
好ましくは、腫瘍ワクチン中の他のＤＮＡは１００〜２５００ｂｐの長さを有する。
【００２７】
ここで、腫瘍ワクチン中の他のＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ断片である。
【００２８】
さらに、腫瘍ワクチン中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５として表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、またはそのヌクレオチド配列が配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５として表される配列と少なくとも９０％相同のＤＮＡ断片の少なくとも１つから選択される。ｍｔＤＮＡまたはｍｔＤＮＡ断片はＣｐＧモチーフが豊富であり、ＴＬＲ９経路またはＳＴＩＮＧ経路のアゴニストとして使用して、腫瘍に対する自然免疫応答を活性化することができる。
【００２９】
さらに、腫瘍ワクチン中のプラスミドは、ｍｔＤＮＡと共に運ばれるｐＭＶＡプラスミドまたはｍｔＤＮＡと共に運ばれるｐＭＶＡ−１プラスミド、例えば、配列番号６として表されるｐＭＶＡ−２プラスミド、配列番号７として表されるｐＭＶＡ−３プラスミド、配列番号８として表されるｐＭＶＡプラスミド−４、配列番号９として表されるｐＭＶＡ−５プラスミド、配列番号１０として表されるｐＭＶＡ−６プラスミドおよび配列番号１１として表されるｐＭＶＡ−７プラスミド、またはそのヌクレオチド配列が配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号１１として表される配列と少なくとも９０％相同であるプラスミドのうちの少なくとも１つであることが好ましい。
【００３０】
腫瘍ワクチン中のＤＮＡはさらに、インビトロでの酸化により形成される酸化ＤＮＡからも選択することができる。好ましくは、酸化ＤＮＡは酸化プラスミドである。
【００３１】
ここで、腫瘍ワクチンにおけるインビトロでの酸化としては、限定するものではないが、照射またはさまざまな酸化剤の使用が挙げられる。照射には紫外線、Ｘ線、ガンマ線などの放射線が含まれ、酸化剤には酸素、オゾン、Ｆ２、Ｃｌ２、Ｂｒ２、硝酸塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、ＨＮＯ３、ＫＭｎＯ４、ＮａＣｌＯ、ＣｒＯ３、Ｈ２Ｏ２、ＰｂＯ２、ＮａＢｉＯ３、ＸｅＦ２、Ｃｅ４＋、ＰｄＣｌ２などが含まれる。
【００３２】
ここで、腫瘍ワクチン中のカチオン性生体材料は、カチオン性脂質材料またはカチオン性ポリマーの少なくとも１つから選択される。
【００３３】
さらに、腫瘍ワクチン中のカチオン性脂質材料は、カチオン性脂質またはカチオン性脂質とヘルパー脂質とにより形成される複合体である。
【００３４】
ここで、腫瘍ワクチン中のカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）の少なくとも１つから選択される。
【００３５】
ここで、腫瘍ワクチン中のヘルパー脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）またはジオレオイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の少なくとも１つから選択される。
【００３６】
さらに、腫瘍ワクチンでは、形成される複合体中のカチオン性脂質とヘルパー脂質との質量比は１：０．１〜１：１０である。
【００３７】
ここで、腫瘍ワクチン中のカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン、多糖類、ポリアミド−アミンＰＡＭＡＭ、またはイミダゾール基を含むポリマーの少なくとも１つから選択される。
【００３８】
ここで、腫瘍ワクチン中のポリエチレンイミンの分子量は２〜３０ｋＤである。
【００３９】
ここで、腫瘍ワクチン中のポリエチレンイミンはＰＥＩ２ｋＤ、ＰＥＩ５ｋＤまたはＰＥＩ２５ｋＤである。
【００４０】
ここで、腫瘍ワクチン中の多糖類は、キトサン、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはキトサン第四級アンモニウム塩の少なくとも１つから選択される。
【００４１】
ここで、腫瘍ワクチン中の多糖類の分子量は３０〜５０ｋＤである。
【００４２】
キトサンは、天然に豊富なアミノ多糖類およびキチンの誘導体であり、優れた生体適合性、生分解性および非毒性特性を備えている。
【００４３】
カチオン性ポリマーは中性条件下でプロトン化されていない−ＮＨ２を含むため、このようなポリマーはリソソーム酸性条件下でスポンジプロトン効果を有し、リソソーム膜を破裂させ、腫瘍細胞の死滅を誘導し、がん細胞からの免疫原性分子の放出を促進して、それにより、腫瘍に対する身体の特異的免疫応答を強化する。
【００４４】
要約すると、本発明によるカチオン性生体材料は、インビボでのＤＮＡの送達に適しており、圧縮された安定なＤＮＡを細胞にトランスフェクトおよび輸送するのに特に適している。負に帯電したＤＮＡは静電相互作用によりカチオン性生体材料と結合し得るため、ＤＮＡリン酸基はカチオン性生体材料と融合し、それによって運ばれる負電荷のほとんどまたはすべてが中和された後、構造が再配列され、ＤＮＡが圧縮される。他方、カチオン性生体材料は、インビボでのＤＮＡの輸送を改善することができ、皮下または腹腔内注射に特に適しており、血清の安定性、ＤＮＡの取り込み効率および放出を改善する。より重要なことには、本発明によるカチオン性生体材料は、腫瘍細胞の壊死、したがって、そのような細胞から細胞内ミトコンドリア、腫瘍関連抗原およびＲＯＳの放出を直接誘導することができる。さらに、腫瘍壊死は腫瘍細胞の免疫原性を強化し、それにより腫瘍に対する身体の特異的免疫応答を活性化することができる。さらに、カチオン性生体材料は、一次自然免疫応答または再強化された自然免疫応答による適応免疫応答の誘導および維持も支援し、カチオン性生体材料の保存安定性も向上する。
【００４５】
腫瘍ワクチンでは、形成される複合体中のＤＮＡとカチオン性生体材料との質量比は１：１〜１：１００である。
【００４６】
好ましくは、形成される複合体中のＤＮＡとカチオン性生体材料との質量比は１：１〜１：５０である。
【００４７】
ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、１〜２，０００ｎｍの粒径を有する。
【００４８】
好ましくは、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、５０〜１０００ｎｍの粒径を有する。
【００４９】
腫瘍ワクチンでは、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は１〜１５０ｍＶの電位を有する。
【００５０】
好ましくは、腫瘍ワクチンでは、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は５〜１００ｍＶの電位を有する。
【００５１】
ここで、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、腫瘍に対する身体の免疫応答を誘導する相乗効果を有し、その性能は以下のとおりである：カチオン性生体材料は、一方ではプラスミドＤＮＡの細胞トランスフェクション率を促進し、他方では、免疫アジュバント効果を有する。カチオン性生体材料は、がん細胞を直接死滅させることができ、腫瘍細胞膜上のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅのＯＢＳ部位に結合することにより腫瘍細胞中のＮａ＋濃度を増加させ、腫瘍細胞壊死ならびにミトコンドリアおよび他の関連抗原および活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞からの放出をもたらし得る。腫瘍細胞中のｍｔＤＮＡは、ＲＯＳの酸化後にＳＴＩＮＧまたはＴＬＲ９シグナル伝達経路を活性化する非メチル化ＣｐＧモチーフが豊富であり、それにより自然免疫応答を誘導し、炎症細胞を活性化および凝集させ、好中球から炎症因子、例えばＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのより多くの放出を刺激する。第３の態様では、カチオン性生体材料は腫瘍細胞の壊死を誘導し、したがってそのような細胞から腫瘍抗原が放出される。放出された腫瘍抗原はＤＣ細胞でプロセシングされ、その表面に提示され、したがってＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の特異的殺腫瘍活性をさらに活性化および凝集させる。
【００５２】
ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、エンドサイトーシスによって腫瘍細胞に進入後、腫瘍細胞においてＲＯＳの有意な増加を引き起こし得る。ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体がＲＯＳによって酸化された後、ｍｔＤＮＡまたはプラスミドを含むその中のＤＮＡは酸化ＤＮＡを形成し得る。酸化ＤＮＡがリソソームによって貪食され、リソソームの酸性勾配の著しい変化、つまり、リソソーム膜の透過性の変化を引き起こすことにより、リソソーム破裂および大量のリソソームタンパク質分解酵素（カテプシンなど）の放出をもたらす。加水分解酵素が細胞質に放出され、腫瘍細胞のミトコンドリアのミトコンドリア膜電位の低下を引き起こし、ミトコンドリアの損傷をもたらし、さらにカスパーゼを活性化して、それにより腫瘍細胞のアポトーシスおよび腫瘍細胞の壊死を含む腫瘍細胞死を誘導する
【００５３】
したがって、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、腫瘍細胞死の協調誘導において重要な役割を果たすが、カチオン性生体材料またはＤＮＡを単独で使用してもそのような有意な効果は有さない。
【００５４】
ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体はＤＣ細胞の成熟も相乗的に促進し、酸化ＤＮＡはＤＣ細胞の細胞質のｃＧＡＳに結合してｃＧＭＰ（環状ＧＭＰ−ＡＭＰ、環状グアノシン一リン酸−アデノシン一リン酸）を形成する。ｃＧＭＰは、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）タンパク質を効果的に活性化し、ＤＣ細胞をＩＦＮ−βおよび他の炎症因子（ＩＬ−１βおよびＩＬ−６など）を放出するように誘導し、それにより腫瘍に対するＳＴＩＮＧシグナル伝達経路（ｃＧＡＳ−２’３’ｃＧＡＭＰ−ＳＴＩＮＧ−ＴＢＫ−ＩＲＦ３）の自然免疫応答を誘発する。ＤＣ細胞の成熟を相乗的に促進しながら、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は腫瘍微小環境を変化させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的腫瘍死滅活性を誘導する。
【００５５】
さらに、ＤＮＡは、酸化プラスミドなど、インビトロでの酸化により形成される酸化ＤＮＡから選択されてもよい。酸化ＤＮＡは、腫瘍ワクチンとしてカチオン性生体材料と複合体を形成し、この腫瘍ワクチンはＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体よりも強力な相乗的抗腫瘍効果を有する。
【００５６】
インビトロでの酸化は、放射線照射または酸化剤での処理によって実施され得る。放射線照射は、紫外線、ガンマ線およびＸ線を含む、ＤＮＡを酸化し得る光線で実施することができる。ＤＮＡを処理するための酸化剤には、インビトロでＤＮＡを酸化するために使用される酸素、オゾン、Ｆ２、Ｃｌ２、Ｂｒ２、硝酸塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、ＨＮＯ３、ＫＭｎＯ４、ＮａＣｌＯ、ＣｒＯ３、Ｈ２Ｏ２、ＰｂＯ２、ＮａＢｉＯ３、ＸｅＦ２、Ｃｅ４＋およびＰｄＣｌ２などの多くのタイプがある。
【００５７】
本発明はまた、腫瘍ワクチンおよび薬学的に許容される賦形剤または補助成分を含む薬学的組成物を提供する。
【００５８】
ここで、医薬組成物中の賦形剤または補助成分は、希釈剤、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、保護剤、吸着担体または滑沢剤のうちの少なくとも１つである。
【００５９】
本発明はまた、腫瘍ワクチンを調製する方法であって、（１）ＤＮＡおよびカチオン性生体材料を調製するステップ、ならびに（２）ステップ（１）のＤＮＡとカチオン性生体材料とを混合し、前記混合物を放置してＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を得るステップ、を含む方法を提供する。
【００６０】
腫瘍ワクチン中のＤＮＡの調製は、プラスミドベクターを構築する方法、または他のＤＮＡをロードしたプラスミドを構築する方法を含む。
【００６１】
ここで、腫瘍ワクチン中のプラスミドベクターを構築する方法は、ｐＭＶＡまたはｐＭＶＡ−１のプラスミドベクターを構築する方法を含む。
【００６２】
ｐＭＶＡのプラスミドベクターを構築する方法は、以下のステップを含む：
全遺伝子合成によって、ｐＵＣ複製起点、カナマイシン遺伝子および２つのプラスミド骨格配列を含む１９７８ｂｐ配列を合成するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号１として表されるｐＭＶＡのプラスミドベクターを得るステップ。
【００６３】
ｐＭＶＡ−１のプラスミドベクターを構築する方法は、以下のステップを含む：
ｐＭＶＡのプラスミドベクターを構築する方法に基づいて、ｐＭＶＡのベクターの複数のヌクレオチド部位で部位特異的突然変異誘発または欠失を実施して、ｐＭＶＡ−１のプラスミドベクターのヌクレオチド配列が配列番号２として表される、突然変異によって最適化されたｐＭＶＡ−１プラスミドを得るステップ。
【００６４】
ここで、腫瘍ワクチン中に他のＤＮＡプラスミドを構築する方法は、ｍｔＤＮＡ断片をｐＭＶＡプラスミドベクターにロードしてｐＭＶＡ−２、ｐＭＶＡ−３およびｐＭＶＡ−４を調製するステップを含む。
【００６５】
ここで、ｐＭＶＡ−２プラスミドを構築する方法は以下のステップを含む：
ｐＭＶＡの環化の前に、配列番号３として表されるヌクレオチド配列と併せて線形配列について全遺伝子合成を実行するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号６として表され、部位３３〜１５２のヌクレオチド配列が配列番号３として表されるｐＭＶＡ−２プラスミドを得るステップ。
【００６６】
ｐＭＶＡ−３プラスミドを構築する方法は以下のステップを含む：
ｐＭＶＡの環化の前に、配列番号４として表されるヌクレオチド配列と併せて線形配列について全遺伝子合成を実行するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号７として表され、部位３３〜６３２のヌクレオチド配列が配列番号４として表されるｐＭＶＡ−３プラスミドを得るステップ。
【００６７】
ｐＭＶＡ−４プラスミドを構築する方法は以下のステップを含む：
ｐＭＶＡの環化の前に、配列番号５として表されるヌクレオチド配列と併せて線形配列について全遺伝子合成を実行するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号８として表され、部位３３〜２０３２のヌクレオチド配列が配列番号５として表されるｐＭＶＡ−４プラスミドを得るステップ。
【００６８】
ここで、腫瘍ワクチン中で他のＤＮＡと共に運ばれるプラスミドを構築する方法は、ｍｔＤＮＡをｐＭＶＡ−１プラスミドベクターにロードしてプラスミドｐＭＶＡ−５、ｐＭＶＡ−６およびｐＭＶＡ−７を調製するステップを含む。
【００６９】
ここで、ｐＭＶＡ−５プラスミドを構築する方法は以下のステップを含む：
ｐＭＶＡ−１の環化の前に、配列番号３として表されるｍｔＤＮＡ断片のヌクレオチド配列１と併せて線形配列について全遺伝子合成を実行するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号９として表され、部位３３〜１５２のヌクレオチド配列が挿入された配列番号３として表されるヌクレオチド配列であるｐＭＶＡ−５プラスミドを得るステップ。
【００７０】
ｐＭＶＡ−６プラスミドを構築する方法は以下のステップを含む：
ｐＭＶＡ−１の環化の前に、配列番号４として表されるｍｔＤＮＡ断片のヌクレオチド配列２と併せて線形配列について全遺伝子合成を実行するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号１０として表され、部位３３〜６３２のヌクレオチド配列が挿入された配列番号４として表されるヌクレオチド配列であるｐＭＶＡ−６プラスミドを得るステップ。
【００７１】
ｐＭＶＡ−７プラスミドを構築する方法は以下のステップを含む：
ｐＭＶＡ−１の環化の前に、配列番号５として表されるｍｔＤＮＡ断片のヌクレオチド配列３と併せて線形配列について全遺伝子合成を実行するステップ、ならびに次いで連結および環化して、ヌクレオチド配列が配列番号１１として表され、部位３３〜２０３２のヌクレオチド配列が挿入された配列番号５として表されるヌクレオチド配列であるｐＭＶＡ−７プラスミドを得るステップ。
【００７２】
腫瘍ワクチン中のカチオン性生体材料の調製は、カチオン性脂質を調製する方法、またはカチオン性脂質とヘルパー脂質とを複合体として調製する方法を含み、
（１）発熱物質非含有カチオン性脂質または発熱物質非含有補助脂質を混合し、無水エタノールを加え、加熱および撹拌して溶解するステップ、
（２）ステップ（１）の混合溶液を溶液の体積の１／３まで回転蒸発させ、一定の体積まで水を加えるステップ、
（３４）ステップ（２）で得られた溶液を高圧ホモジナイザーおよび押出機に通し、カチオン性脂質またはカチオン性脂質とヘルパー脂質とにより形成される複合体を得るステップ。
【００７３】
ステップ（１）では、カチオン性脂質とヘルパー脂質との質量比は１：０．１〜１：１０であり、カチオン性脂質は好ましくはＤＯＴＡＰであり、補助脂質は好ましくはコレステロールであり、および加熱温度は５０℃である。
【００７４】
ステップ（２）の回転蒸発温度は３０〜６０℃、好ましくは４０℃であり、真空圧力は０．０８〜０．１ＭＰａ、好ましくは０．０９ＭＰａである。
【００７５】
ステップ（４）では、高圧ホモジナイザーの圧力は７００〜８００バールで、回数は３〜１０回、押出機の温度は５０℃、押出フィルムは１００ｎｍで回数は１〜２回であり、得られたカチオン性脂質またはカチオン性脂質と補助脂質とによって形成される複合体の粒径は８０〜１５０ｎｍであり、ＰＤＩは０．３未満である。
【００７６】
腫瘍ワクチン中のカチオン性生体材料の調製は、ＰＥＩの調製方法：ＰＥＩ（２５ｋＤ）の水への溶解を含む。
【００７７】
腫瘍ワクチンまたは医薬組成物中のカチオン性生体材料の調製は、キトサンの調製方法：水または希酸への中分子量キトサン（３０〜５０ｋＤ）の溶解を含む。
【００７８】
本発明はまた、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を調製する方法を提供し、さらに、腫瘍を治療するためのワクチンとしてＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を調製する方法であって、
調製したカチオン性生体材料とＤＮＡとを滅菌条件下で混合し、前記混合物を０．５〜１時間放置してＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を形成するステップを含み、
調製されたＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が５００ｎｍ未満の平均粒径および１００ｍＶ未満の電位を有することにより、腫瘍細胞への前記複合体のトランスフェクションを促進する方法を提供する。さらに、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、腫瘍細胞を酸化ストレス反応に相乗的に誘導し、リソソーム経路によって抗腫瘍効果を直接発揮し、身体の免疫応答の抗腫瘍活性を相乗的に強化することができる。
【００７９】
本発明はまた、医薬組成物を調製する方法であって、（１）ＤＮＡおよびカチオン性生体材料を調製するステップ、（２）ステップ（１）のＤＮＡとカチオン性生体材料とを混合し、前記ＤＮＡとカチオン性生体材料との混合の前および／またはその間および／または後に、薬学的に許容される賦形剤または補助成分を添加して医薬組成物を調製するステップ、を含む方法を提供する。
【００８０】
ここで、賦形剤または補助成分は、希釈剤、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、保護剤、吸着担体または滑沢剤の少なくとも１つである。
【００８１】
本発明はまた、腫瘍ワクチンまたは医薬組成物と、腫瘍を治療するための少なくとも１つの他の薬物とを含む医療キットを提供する。
【００８２】
ここで、医療キット内の腫瘍を治療するための他の薬物は、化学療法薬または免疫応答調節剤の少なくとも１つから選択される。
【００８３】
ここで、医療キット内の免疫応答調節剤は、サイトカイン、クラスＩＩ  ＨＬＡタンパク質結合アクセサリー分子、ＣＤ４０アゴニスト、チェックポイント受容体アンタゴニスト、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３アゴニストまたはＣＤ４０Ｌアゴニストの少なくとも１つである。
【００８４】
本発明はまた、腫瘍ワクチンまたは医薬組成物と腫瘍抗原とを含む抗腫瘍薬を提供する。
【００８５】
ここで、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原、アポトーシス腫瘍細胞または壊死腫瘍細胞の少なくとも１つから選択される。
【００８６】
一方、本発明はまた、腫瘍の治療および／または予防のための薬物の調製における腫瘍ワクチンまたは医薬組成物の使用を提供する。
【００８７】
ここで、腫瘍は、子宮頸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、鼻咽頭がん、胃がん、膵臓がん、食道がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肉腫またはリンパ腫から選択される。
【００８８】
一方、本発明はまた、腫瘍を治療または予防するための薬物の調製における、腫瘍ワクチンまたは医薬組成物と、腫瘍を治療するための少なくとも１つの他の薬物との薬物併用を提供する。
【００８９】
ここで、使用される腫瘍を治療するための他の薬物は、化学療法薬または免疫応答調節剤の少なくとも１つから選択される。
【００９０】
ここで、免疫応答調節剤は、サイトカイン、クラスＩＩ  ＨＬＡタンパク質結合アクセサリー分子、ＣＤ４０アゴニスト、チェックポイント受容体アンタゴニスト、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３アゴニストまたはＣＤ４０Ｌアゴニストの少なくとも１つである
【００９１】
さらに、本発明は、腫瘍を治療する方法も提供する。この方法は、腫瘍ワクチン、医薬組成物、キットまたは抗腫瘍薬の少なくとも１つの治療有効量を、腫瘍を有する哺乳動物に投与するステップを含む。
【００９２】
ここで、この方法における哺乳動物は、マウス、イヌ、サルまたは人間である。
【００９３】
ここで、この方法における腫瘍は、子宮頸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、鼻咽頭がん、胃がん、膵臓がん、食道がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肉腫またはリンパ腫から選択される。
【００９４】
ここで、この方法では腫瘍ワクチン、医薬組成物、治療キットまたは抗腫瘍薬の投与には注射が使用される。
【００９５】
ここで、この方法における注射は、皮下単一点注射、皮下多点注射、静脈内注射、腫瘍周囲注射、腫瘍内注射、胸腔内注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、リンパ管または外リンパ注射または筋肉内注射の少なくとも１つである。注射は、具体的状況に応じて単独で使用することも、または必要に応じて併用することもできる。
【００９６】
ここで、腫瘍を有する哺乳動物を治療するための腫瘍ワクチンまたは医薬組成物の使用は、担腫瘍動物において自然免疫応答および適応免疫応答を含む抗腫瘍免疫応答を活性化し、それにより腫瘍成長を阻害する目的を達成することを含む。さらに、腫瘍ワクチンまたは医薬組成物で治療される担腫瘍動物の記憶免疫細胞は、腫瘍細胞の成長、転移、再発を効果的に抑制し、そのような細胞が腫瘍細胞に再び攻撃されると、動物の身体の免疫寛容を破り、それにより、長期の抗腫瘍免疫療法効果を達成することができる。腫瘍ワクチンまたは医薬組成物で腫瘍を治療する方法では、投与されるＤＮＡの有効用量は１〜５０μｇ／ｋｇであり、ＤＮＡとカチオン性生体材料との質量比は１：１〜１：１００、好ましくは１：１〜１：５０である。
【００９７】
ここで、本方法において腫瘍を治療するための少なくとも１つの他の薬物は、腫瘍を治療する過程で投与される。
【００９８】
ここで、本方法で腫瘍を治療するための他の薬剤は腫瘍抗原である。
【００９９】
ここで、本方法における腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原、アポトーシス腫瘍細胞、または壊死腫瘍細胞のうちの少なくとも１つから選択される。
【０１００】
腫瘍細胞としては、子宮頸がん細胞、卵巣がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、肉腫細胞、鼻咽頭がん腫細胞、肺がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、食道がん細胞、肝がん細胞、前立腺細胞、腎臓がん細胞、膀胱がん細胞または皮膚がん細胞が挙げられる。
【０１０１】
ここで、放射線療法もまた腫瘍の治療に使用することができる。
【０１０２】
本発明の有益な効果は以下のとおりである：
【０１０３】
１．本発明は、外因性遺伝子を発現できないが、大腸菌中で遺伝子を複製およびスクリーニングすることができるプラスミド、例えば、ｍｔＤＮＡ断片とともに運ばれるｐＭＶＡプラスミドおよびプラスミド（ｐＭＶＡ−２、ｐＭＶＡ−３およびｐＭＶＡ−４）のベクター、ならびにｍｔＤＮＡ断片とともに運ばれるｐＭＶＡ−１プラスミドおよびプラスミド（ｐＭＶＡ−５、ｐＭＶＡ−６およびｐＭＶＡ−７）のベクターを再構成した。さらに重要なことには、これらのプラスミドは、腫瘍細胞中で酸化され、より強力な抗腫瘍活性を有し、大規模生産により都合のよい酸化ＤＮＡの形成に有利である。
【０１０４】
２．ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体を主要な有効成分として用いることで、腫瘍ワクチンはリソソーム破裂によって抗腫瘍相乗効果を直接発揮することができる。
本発明は、ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体が腫瘍細胞によって細胞質にエンドサイトーシスされた後、腫瘍細胞が大量のＲＯＳを生成し、ＲＯＳにより複合体が酸化されることによって形成された酸化ＤＮＡがリソソーム膜（ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性（リソソーム膜（Ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性、ＬＭＰ）を促進し、カテプシンがリソソーム腔からサイトゾルに放出され、リソソーム不安定性を引き起こす一連のカスケード反応を誘発することを創造的に発見した、加えて、ＬＭＰはさらに腫瘍細胞のミトコンドリア外膜透過性（ＭＯＭＰ）への罹患を引き起し、シトクロムｃが腫瘍細胞の細胞質に放出され、それによって古典的なカスパーゼアポトーシス経路を活性化して、最終的に腫瘍細胞を死に至らしめた。
【０１０５】
３．ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体を主な有効成分として用いることで、腫瘍ワクチンは抗腫瘍免疫応答を活性化する相乗効果も有する。
本発明はまた、インビトロ細胞活性アッセイおよびインビボ薬力学的実験により、カチオン性生体材料とＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）とを混合することにより形成されるＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体が、カチオン性生体材料およびプラスミドＤＮＡの個別使用と比較して抗腫瘍免疫応答に対して相乗効果を有することも創造的に見出した：
ａ．インビトロ実験では、ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体の腫瘍細胞へのトランスフェクションにより腫瘍細胞中のＲＯＳが有意に増加し、ＲＯＳがＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を酸化することにより形成される酸化ＤＮＡがＳＴＩＮＧ経路を活性化し、ＤＣ細胞の成熟を刺激し、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−１βが分泌され、それにより腫瘍に対する自然免疫応答が開始されることが示された。
ｂ．インビボ実験では、ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体の注入後、腫瘍細胞が壊死し、ＤＮＡが酸化され、腫瘍細胞においてリソソーム溶解が発生し、腫瘍部位で自然免疫細胞（好中球）増加し、免疫抑制因子および血管新生因子の発現が減少したことが示された。同時に、腫瘍組織の周囲のＤＣ細胞が腫瘍抗原および酸化プラスミドＤＮＡを貪食し、多数のＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球が浸潤していることが検出され、複合体が身体の適応免疫応答を活性化したことが示された。
ｃ．ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体を主要な有効成分として使用して、腫瘍を有するモデルマウスを治療するための腫瘍ワクチンを調製すると、前記複合体は、腫瘍消失マウスが腫瘍細胞による二度目の攻撃を受けた際に長期の抗腫瘍免疫を有していた。
したがって、本発明によるＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、腫瘍細胞壊死を直接誘導する相乗効果を有し、腫瘍細胞からの自己抗原および酸化ＤＮＡの放出、ＳＴＩＮＧ経路の開始、および炎症細胞によって引き起こされる自然免疫応答の活性化を相乗的に引き起こす。さらに、この複合体はＤＣ細胞の成熟を促進し、身体が腫瘍に対する適応免疫応答を生じるように誘導する。
【０１０６】
４．ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体を主要な有効成分とする腫瘍ワクチンは、成分が単純で品質管理が容易であるという利点を有する：
技術的解決策に関与する腫瘍ワクチンは、カチオン性生体物質とＤＮＡとで構成される。腫瘍ワクチンは成分が単純であり、容易な品質管理に供され、大規模生産に適しているため、生産コストが大幅に削減される。
【０１０７】
５．ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体を主要な有効成分とする腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞抗原のアジュバントとして使用でき、したがって腫瘍細胞抗原の免疫応答をさらに強化し、さまざまな種類の腫瘍治療に適用することができる。
【０１０８】
６．実験により、ＤＮＡ（ｐＭＶＡなど）／カチオン性生体材料複合体を主要な有効成分として含む腫瘍ワクチンは、さまざまな腫瘍の治療および併用治療に適用でき、幅広い応用の可能性があることが示されている。
技術的解決策によるワクチンは、子宮頸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、鼻咽頭がん、結腸がん、リンパ腫および肉腫を含むさまざまな腫瘍の治療に使用でき、放射線療法および／または化学療法と組み合わせることも、または腫瘍の治療のための免疫抑制剤と組み合わせることもできる。ワクチンには幅広い適応症、柔軟な治療法、幅広い応用の可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】プラスミドベクター構築マップである：  Ａ：ｐＭＶＡプラスミド構築マップ、カナマイシン耐性遺伝子（Ｎｏ．２０５〜９９９ｂｐ）、ｐＵＣ複製起点配列（Ｎｏ．１３０９〜１９７２ｂｐ）およびプラスミド骨格配列（Ｎｏ．１〜２０４ｂｐ、Ｎｏ．１０００〜１３０８ｂｐおよびＮｏ．１９７３〜１９７８ｂｐ）を含み、合計１９７８ｂｐ（配列番号１に示す）。  Ｂ：ｐＭＶＡ−１プラスミド構築マップ、カナマイシン耐性遺伝子（Ｎｏ．２０５〜９９９ｂｐ）、ｐＵＣ複製起点配列（Ｎｏ．１３０８〜１９７１ｂｐ）およびプラスミド骨格配列（Ｎｏ．１〜２０４  ｂｐ、Ｎｏ．１０００〜１３０７ｂｐおよびＮｏ．１９７２〜１９７７ｂｐ）を含み、合計１９７７ｂｐ（配列番号２に示す）。
【図２】アガロースゲル電気泳動により検証された、ＮｃｏＥ  Ｉ酵素およびＥｃｏ７２  Ｉ酵素によるｐＭＶＡプラスミドの酵素消化の結果であり、閉ループプラスミド（すなわち、ｐＭＶＡ−１プラスミド）の分子量は、ＮｃｏＥ  Ｉ酵素およびＥｃｏ７２  Ｉ酵素による酵素消化後のプラスミド断片の分子量、約２０００ｂｐと一致している。
【図３】質量比の異なるＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体のアガロースゲル電気泳動による検出図である。
【図４】インビトロでＡ５４９細胞活性を阻害する質量比の異なるｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の検出図であり、図中、●は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が１：１のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を表し、■は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が６：１のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を表し、▲は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が１０：１のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を表し、▼は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が１５：１のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を表し、◆は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が２０：１のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を表す。
【図５】インビトロでＡ５４９細胞活性を阻害する質量比の異なるｐＭＶＡ１／ＰＥＩ２５Ｄ複合体の検出図であり、図中、●はＰＥＩ２５ＫＤ：ｐＭＶＡ−１の質量比が１：１のｐＭＶＡ−１／ＰＥＩ２５ＫＤ複合体を表し、▼は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が１０：１のｐＭＶＡ−１／ＰＥＩ２５ＫＤ複合体を表し、◆は、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比が２０：１のｐＭＶＡ−１／ＰＥＩ２５ＫＤ複合体を表す。
【図６】インビトロでＡ５４９細胞活性を阻害する質量比の異なるｐＭＶＡ−１／キトサン複合体の検出図であり、図中、●はキトサン：ｐＭＶＡ−１の質量比が１：１のｐＭＶＡ−１／キトサン複合体を表し、▼は、キトサン：ｐＭＶＡ−１の質量比が１０：１のｐＭＶＡ−１／キトサン複合体を表し、◆は、キトサン：ｐＭＶＡ−１の質量比が２０：１のｐＭＶＡ−１／キトサン複合体を表す。
【図７】ＰＩ−ＡｎｎｅｘｉｎＶアッセイにより検出されたｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体により共誘導された腫瘍アポトーシスの蛍光顕微鏡写真である。Ａ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によって共誘導されたＡ５４９アポトーシスの蛍光顕微鏡写真、Ｂ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によって共誘導されたＣＴ２６アポトーシスの蛍光顕微鏡写真。それぞれＰＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で２４時間処理した後、Ａ５４９細胞とＣＴ２６細胞との両方で有意なＰＩ陽性およびアネキシンＶ陽性の結果が示されたが、対照群では有意なＰＩ陽性およびアネキシンＶ陽性細胞は見い出されなかった。
【図８】フローサイトメトリーによって決定された、さまざまなサンプルで処理した腫瘍細胞のアポトーシス細胞の数である。Ａ：フローサイトメトリーによって決定された各群のアポトーシスＡ５４９細胞の統計チャート。Ｂ：フローサイトメトリーによって決定された各群のアポトーシスＣＴ２６細胞の統計チャート。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊ｐ＜０．０５であり、ブランク対照群（対照）、ｐＭＶＡプラスミド対照群（ＰＭＶＡ）、ＤＯＴＡＰカチオン性リポソーム群（ＤＯＴＡＰ）およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体処理群（ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）を含む。
【図９】フローサイトメトリーによって決定されたＡ５４９細胞中のＲＯＳレベルの統計チャートである。図中、Ｃｏｎｔブランク対照群：培地のみをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ対照群：ｐＭＶＡ−１プラスミドをＡ５４９細胞に添加；ＤＯＴＡＰ対照群：ＤＯＴＡＰをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ処理群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をＡ５４９細胞に添加；ＮＡＣ陰性対照群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が機能する前に５ｍＭ  ＮＡＣにより前処理；Ｈ２Ｏ２陽性対照群：２００μＭのＨ２Ｏ２をＡ５４９細胞に添加。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１０】酸化ｐＭＶＡ−１プラスミドとＤＯＴＡＰカチオン性脂質とによって形成されたｏｘ−ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体のＡ５４９アポトーシスに対する効果を表す図である。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１１】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体により共誘導される腫瘍アポトーシスが、腫瘍細胞の酸化ストレスに関連していることを示す図である。フローサイトメトリーを実行して、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＰ複合体を加える前にＮＡＣで前処理したＡ５４９細胞の死亡率を決定する。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１２】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がＡ５４９細胞と０．５時間および３時間反応した後の、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体のＡ５４９細胞への進入およびリソソーム酸性度勾配喪失の共誘導の蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】それぞれ１時間、３時間、６時間および９時間、異なるサンプルに曝露したＡ５４９細胞のリソソームにおける、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄの蛍光強度の変化のフローサイトメトリーによる定量的測定である。各群のＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄの蛍光強度が低下したＡ５４９細胞のパーセンテージを、統計的に分析した。図中、ブランク対照群：培地のみをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ対照群：ｐＭＶＡ−１プラスミドをＡ５４９細胞に添加；ＤＯＴＡＰ対照群：ＤＯＴＡＰをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ処理群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をＡ５４９細胞に添加。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１４】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によって共誘導された、Ａ５４９細胞のリソソーム膜（ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性増加の蛍光写真である。Ａ：ＦＩＴＣ−デキストラン細胞内局在法により決定された、Ａ５４９細胞のリソソーム膜（ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性の増加；Ｂ．カテプシンＢ細胞内局在化法により決定された、Ａ５４９細胞のリソソームの加水分解酵素の細胞質への放出。図中、ブランク対照群：培地のみをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ対照群：ｐＭＶＡ−１プラスミドをＡ５４９細胞に添加；ＤＯＴＡＰ対照群：ＤＯＴＡＰをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ処理群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をＡ５４９細胞に添加。
【図１５】ＴＭＲＭ蛍光マーカー法による腫瘍細胞のミトコンドリア膜電位の変化の測定を示す図である。Ａ：フローサイトメトリーにより決定されたミトコンドリア膜電位脱分極を伴うＡ５４９細胞のパーセンテージ；Ｂ：フローサイトメトリーにより決定されたミトコンドリア膜電位脱分極を伴うＣＴ２６細胞のパーセンテージ。図中、ブランク対照群：培地のみをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ対照群：ｐＭＶＡ−１プラスミドをＡ５４９細胞に添加；ＤＯＴＡＰ対照群：ＤＯＴＡＰをＡ５４９細胞に添加；ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ処理群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をＡ５４９細胞に添加。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１６】、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によって誘導されるＡ５４９細胞におけるカスパーゼプロテアーゼの活性化を示す図である。すべての結果は、平均相対発現±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１７】ＤＣ細胞の抗原取り込みに対する、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体および腫瘍細胞の刺激の阻害効果を示す図である。ＦＩＴＣ−デキストランが、ＤＣ細胞により取り込まれるモデル抗原であった。ＤＣ細胞の食作用能力を、ＣＤ１１ｃ陽性ＤＣ細胞のＦＩＴＣ平均蛍光強度を決定することにより判断して、それによりＤＣが成熟するように誘導されたかどうかを分析した。＊Ｐ＜０．０５である。図中、対照群（対照）：培地のみをＢＭＤＣ細胞に添加；ＰＭＶＡ群：ｐＭＶＡ−１プラスミドのみをＢＭＤＣ細胞に添加；ＤＯＴＡＰ群：ＤＯＴＡＰカチオン性脂質のみをＢＭＤＣ細胞に添加；ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体のみをＢＭＤＣ細胞に添加；腫瘍群：ＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加；腫瘍＋ＰＭＶＡ群：ｐＭＶＡ−１プラスミドベクターで処理したＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加；腫瘍＋ＤＯＴＡＰ群：ＤＯＴＡＰカチオン性脂質で処理したＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加；腫瘍＋ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加。
【図１８】フローサイトメトリーにより決定された、ＣＴ２６細胞による刺激後のサイトカイン分泌ＢＭＤＣ細胞のパーセンテージの統計分析を示す図である。Ａ：ＩＦＮ−βを分泌するＢＭＤＣのパーセンテージ；Ｂ：ＩＬ−１βを分泌するＢＭＤＣのパーセンテージ。すべての結果は、平均パーセンテージ±ＳＤとして表され、＊Ｐ＜０．０５である。図中、対照群：培地のみをＢＭＤＣ細胞に添加、腫瘍群：ＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加、腫瘍＋ＰＭＶＡ群：ｐＭＶＡ−１プラスミドベクターで処理したＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加、腫瘍＋ＤＯＴＡＰ群：ＤＯＴＡＰカチオン性脂質で処理したＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加、腫瘍＋ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＣＴ２６細胞をＢＭＤＣ細胞に添加。
【図１９】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、子宮頸がんの腹膜転移を伴うヌードマウスモデルにおいて腫瘍成長を有意に阻害したことを示す図である。Ａ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群のヌードマウスの体重は、他の治療群の体重よりも有意に低かった；Ｂ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群のヌードマウスの腹水量は、他の群の腹水量よりも有意に少なかった；Ｃ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群のヌードマウスの結節数は、他の群の結節数よりも有意に少なかった；Ｄ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群のヌードマウスの腫瘍重量は、他の群の腫瘍重量よりも有意に低かった。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０】フローサイトメトリーにより決定された、子宮頸がんの腹膜転移を伴うヌードマウスモデルの腹水におけるアポトーシス細胞のパーセンテージの統計分析チャートである。
【図２１】ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体が、卵巣がんの腹膜転移を伴うモデルマウスにおいて腫瘍成長を阻害したことを示す図である。Ａ：ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体群のマウスの腹水量は、他の群の腹水量よりも有意に少なかった；Ｂ：ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体群のマウスの腫瘍重量は他の群の腫瘍重量よりも有意に低かった；Ｃ：ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体群のマウスの腹水中のがん細胞の数は、他の群のそれよりも有意に少なかった。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２２】プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体が、ＣＴ２６の腹膜転移を伴うモデルマウスにおいて腫瘍成長を阻害したことを示す図である。Ａ：治療群においてプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体により自然に死亡したマウスの数は、他の対照群よりも有意に少なかった（Ｐ＜０．０１またはＰ＜０．０５）；Ｂ：ｐＭＶＡ−３／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの腫瘍重量は、他の群の腫瘍重量よりも有意に低かった；Ｃ：ｐＭＶＡ−３／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの腹水量は、他の群の腹水量よりも有意に少なかった；Ｄ：ｐＭＶＡ−３／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの腹水中のがん細胞の数は、他の群のそれよりも有意に少なかった；Ｅ：ｐＭＶＡ−３／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの腫瘍小結節の数は、他の群のそれよりも有意に低かった。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図２３】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、マウスにおいて肉腫の成長を有意に阻害したことを示す図である。ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの無腫瘍率は９０％であり、ＮＳ群の１％、ＤＯＴＡＰ群の２０％、およびｐＭＶＡ−１群の２０％よりも有意に高かった。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２４】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、ヒト鼻咽頭がん腫細胞を伴う皮下モデルマウスにおいて腫瘍成長を有意に阻害したことを示す図である。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２５】ｐＶＭＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、ＣＴ２６の腹膜転移を伴うモデルマウスにおいて腫瘍成長を阻害したことを示す図である。Ａ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群と正常群の間にマウスの体重に有意差はなかった。Ｂ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの腹水量は、陰性対照群、ｐＭＶＡ−１群およびＤＯＴＡＰ群よりも有意に少なかった。Ｃ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの生存期間は、陰性対照群、ｐＭＶＡ−１群およびＤＯＴＡＰ群の生存期間よりも有意に長かった。Ｄ：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの腫瘍重量は、陰性対照群、ｐＭＶＡ−１群およびＤＯＴＡＰ群よりも有意に低かった。＊ｐ＜０．０５。
【図２６】ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、ＣＴ２６の腹膜転移を伴うモデルマウスを治療した後、マウスに全身性抗腫瘍記憶免疫応答を誘導できることを示す図である。同じタイプおよび異なるタイプの腫瘍細胞を含む腫瘍細胞をさらに刺激すると、記憶Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞によって分泌される大量の免疫サイトカインを介して腫瘍細胞の成長を阻害し、腫瘍の免疫寛容を破ることができる。Ａ：マウスに初めてＣＴ２６細胞を腹腔内接種し、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で治療したマウスがＣＴ２６細胞により再び攻撃された後（ＤＯＴＡＰ＋皮下にＣＴ２６を２回接種した群）、ＣＴ２６細胞を腹腔内接種しなかったマウスまたはｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で治療しなかったが、ＣＴ２６細胞によって攻撃された（皮下接種されたＣＴ２６対照群）と比較して腫瘍量は有意に減少した。Ｂ：マウスに初めてＣＴ２６細胞を腹腔内接種し、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で治療したマウスが４Ｔ１細胞により攻撃された後（ＤＯＴＡＰ＋皮下に４Ｔ１を２回接種した群）、ＣＴ２６細胞を腹腔内接種しなかったマウスまたはｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で治療しなかったが、４Ｔ１細胞によって攻撃された（皮下接種された４Ｔ１対照群）と比較して腫瘍量は有意に減少した。
【図２７】シスプラチンと組み合わせたｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、Ｕ１４を皮下接種したマウスモデルにおいて腫瘍細胞の成長を有意に阻害したことを示す図である。＊Ｐ＜０．０５。図中、ＮＳ群：１０％スクロースのみを注射、ＤＯＴＡＰ群：ＤＯＴＡＰのみを注射、ｐＭＶＡ１群：ｐＭＶＡ−１プラスミドのみを注射、シスプラチン：シスプラチンのみを注射、ＬＰ群：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を注射、ＬＰ＋シスプラチン群：シスプラチンと組み合わせてｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を注射。
【図２８】放射線療法と組み合わせたｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、皮下Ｕ１４を伴うマウスモデルにおいて腫瘍細胞の成長を有意に阻害したことを示す図である。＊Ｐ＜０．０５。
【図２９】ｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ複合体をアジュバントとして使用し、アポトーシスまたは壊死ＣＴ２６細胞と混合して腫瘍細胞ワクチンを調製すると、このワクチンが担腫瘍マウスの生存期間を有意に延長し、良好な抗腫瘍効果を有したことを示す図である。図中、ＮＳ：生理食塩水群；ＮＥＣＲＯ：壊死ＣＴ２６細胞と混合したｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ複合体により調製された壊死腫瘍細胞ワクチン群；ＡＰＯＰ：アポトーシスＣＴ２６細胞と混合したｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ複合体により調製されたアポトーシス細胞ワクチン群。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
技術用語の解釈
１．ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）：単一細胞中に約数千のコピーを有する閉ループ二本鎖ＤＮＡ分子。ｍｔＤＮＡには、１３の呼吸鎖ポリペプチド、２２のｔＲＮＡおよび２のｒＲＮＡをコードする３７の遺伝子と、遺伝子複製および転写調節配列を含む非コード領域「Ｄループ」とが含まれる。
【０１１１】
２．リソソーム膜（ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性（ＬＭＰ）：
リソソーム膜（ｌｙｓｏｓｏｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）透過性がどのように発生するかはまだ議論の余地があるが、ＬＭＰインデューサーにはＲＯＳ、脂質、ナノ粒子が含まれる。
【０１１２】
（１）ＲＯＳ：
高レベルの酸化ストレス下では、リソソームはカタラーゼまたはグルタチオンペルオキシダーゼの非存在により過酸化水素を分解できず、大量の過酸化水素がリソソーム膜に分散され、リソソームに豊富な二価鉄イオンを誘導して過酸化水素をヒドロキシルラジカルに触媒し、したがってＬＭＰを誘発する。
【０１１３】
（２）脂質：
一部の脂質および脂質代謝産物はリソソームであるため、ＬＭＰを誘発することができる。
【０１１４】
（３）ナノ粒子：ナノ粒子は、リソソームにおいて凝集し、リソソーム膜を破壊し、ＬＭＰ経路を介してアポトーシスを誘導する。
【０１１５】
３．細胞死
正常な組織では、「正常な」細胞死が頻繁に起こり、これは、組織の機能および形態を維持するために必要である。細胞死の方法には通常、壊死、アポトーシスおよびプログラム細胞死（ＰＣＤ）が含まれまる。
【０１１６】
アポトーシスは、ＰＣＤの最も一般的で周知の形態であり、一般に、細胞内システインプロテアーゼである活性化カスパーゼによって行われる。したがって、アポトーシスは開始機序の観点からカスパーゼ依存性とカスパーゼ非依存性に分類することができる。アポトーシス細胞の典型的な形態変化には、クロマチン凝縮、核断片化、ＤＮＡラダーリング、小疱形成および細胞質断片化（アポトーシス小体）が含まれる。細胞膜はアポトーシスの際に破壊されない。分解された細胞成分はカプセル化されてアポトーシス小体を形成し、最終的に異食作用を介して隣接細胞の食細胞またはリソソームによって除去される。したがって、アポトーシスの際に死細胞の周囲に炎症反応はない。
【０１１７】
壊死は、細胞が化学的要因（例えば、強酸、強アルカリおよび毒性物質）、物理的要因（例えば、熱および放射線）および生物学的要因（例えば、病原体）の影響を受け、細胞死を引き起こす現象である。壊死細胞の形態変化は、主に２つの病理学的過程：酵素消化およびタンパク質変性によって引き起こされる。壊死の初期段階では、ミトコンドリアと細胞質の小胞体が膨張して崩壊し、構造的な脂肪滴が遊離して空胞化し、タンパク質粒子が増加し、核が収縮または破壊する。細胞内タンパク質の変性、凝固または断片化、および好塩基性核タンパク質の分解により、細胞質は強く好酸球性になる。その後、壊死細胞が溶解し、細胞構造が完全に消失する。最後に、細胞膜と細胞小器官が破裂し、ＤＮＡが分解し、細胞の内容物が流出し、周囲の組織の炎症反応を引き起こす。壊死細胞の残留断片は、マクロファージによって貪食されるか、またはＤＣ細胞の活性化および成熟を誘導する。
【０１１８】
４．ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路
ＥＲＩＳ／ＭＹＰＳ／ＭＩＴＡとしても知られるＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）は、ＴＭＥＭ１７３遺伝子によってコードされる多機能アダプタータンパク質である。ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路（ｃＧＡＳ−２’３’ｃＧＡＭＰ−ＳＴＩＮＧ−ＴＢＫ１−ＩＲＦ３）は免疫系の重要な経路であり、異常な供給源からの細胞質二本鎖ＤＮＡを認識し、自然免疫を発達させる。ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、身体の自発的な抗腫瘍免疫応答および放射線療法により誘導される抗腫瘍免疫応答において重要な役割を果たす。腫瘍由来の二本鎖ＤＮＡは腫瘍微小環境においてＤＣによって取り込まれ、ｃＧＡＳを活性化してＡＴＰおよびＧＴＰをさらに触媒し、ＳＴＩＮＧと結合してＳＴＩＮＧタンパク質の立体構造を変化させる２’３’ｃＧＡＭＰを合成し、活性化されたＳＴＩＮＧは、ＴＢＫ１、ＩＫＫ、Ｔ３Ｋ１およびＩＫＫを動員してＳＴＩＮＧと相互作用し、その後リン酸化される。リン酸化ＴＢＫ１はＩＲＦ３を動員し、リン酸化ＩＫＫはＮＦ−κβを動員し、その後、ＩＲＦ３およびＮＦ−κβはリン酸化後に重要な転写因子として核に入り、下流遺伝子の発現を調節して、Ｉ型インターフェロンおよびＴｈｌサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−γ）の分泌を促進する。一方、ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性化は、ＡＰＣ（例えば、ＣＤ８α＋／ＣＤ１０３＋ＤＣ）の成熟および活性化を促進し、ＡＰＣの腫瘍関連抗原提示を促進して、ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的抗腫瘍免疫応答を開始する。
【０１１９】
５．自然免疫：非特異的免疫とも呼ばれ、系統発生および進化の過程で徐々に形成される自然免疫防御機能を指し、病原体の侵入に対する身体の防御の第一線を形成する。自然免疫は、広範囲にわたる免疫化で安定して遺伝され得るが、特異的ではない。自然免疫系は、抗原と最初に接触すると免疫効果を発現するが、免疫記憶は有さない。
【０１２０】
例えば、自然免疫系は、微生物およびその産物の刺激により活性化される。マクロファージ、ＤＣ細胞、好中球などの免疫細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、微生物固有の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、興奮性自然免疫応答を活性化し、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２など）を分泌して、炎症反応を媒介する。
【０１２１】
自然免疫細胞によって発現されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）は、異なるＰＡＭＡを認識することによって活性化され、異なるサイトカインを発現するため、ナイーブＴ細胞を異なるＴ細胞に分化するように誘導して、適応免疫応答のタイプを決定する。したがって、自然免疫応答は、適応免疫応答のタイプと強度を調節するか、またはそれに影響を与えることができ、適応免疫応答の維持とその効果の発揮もまた自然免疫によって支援および関与されなければならない。
【０１２２】
６．ＣｐＧモチーフ：免疫刺激配列（ＩＳＳ）とも呼ばれ、非メチル化シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）をコアとして含む配列のタイプを指す。ＴＬＲ９の天然リガンドとして、ＣｐＧモチーフはさまざまな免疫細胞を活性化できる強力な非特異的免疫刺激ＤＮＡ配列である。ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡは、自然免疫細胞によってエンドサイトーシスされ、細胞内ＴＬＲ９によって認識され、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６ならびに下流のＮＦ−ｋＢおよびＭＡＰＫ経路を活性化し、さまざまな転写因子をもたらし、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１型サイトカインの発現を誘導し、したがって、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進する。Ｔｈ１細胞から分泌されるＩＦＮ−γはさらにＮＫ細胞およびマクロファージの活性化を誘導し、Ｂリンパ球の分裂、増殖、および抗体産生を促進し、したがって宿主の細胞性免疫と液性免疫を総合的に強化する。
【０１２３】
真核細胞のｍｔＤＮＡは細菌の環状ゲノムに由来し、ＰＲＲでＰＡＭＰとして作用し得る非メチル化ＣｐＧモチーフを大量に含む。酸化ストレスなどのミトコンドリア機能障害の場合、大量の活性酸素種（ＲＯＳ）が生成される。ｍｔＤＮＡは、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を活性化する刺激としてミトコンドリアから細胞質に放出され、好中球Ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２など）およびケモカインを産生するように誘導し、したがって適応免疫応答を誘発し、ナイーブＴ細胞がＴｈ１細胞に分化するように誘導して、大量のＩＦＮ−γを放出する。
【０１２４】
７．適応免疫応答：特異的免疫応答とも呼ばれ、抗原に刺激されて一連の生物学的効果が誘発された後、インビボで特異的ＴおよびＢ細胞が、活性化、増殖およびエフェクター細胞に分化する過程を指す。適応免疫応答は、特異性、記憶および寛容によって特徴付けられる。
【０１２５】
適応免疫応答の最初の段階は抗原認識である。抗原提示細胞による取り込み、プロセシングおよび処理後、抗原は抗原提示細胞上のＭＨＣ分子とＭＨＣ複合体を形成し、ナイーブＴ細胞またはナイーブＢ細胞表面受容体（ＴＣＲまたはＢＣＲ）によって特異的に認識される。抗原提示細胞には、ＤＣ細胞、マクロファージおよび好中球が含まれる。
【０１２６】
第二段階は、ナイーブＴ細胞またはナイーブＢ細胞の増殖および分化段階である。Ｔ／Ｂ細胞は抗原を特異的に認識し、活性化の最初のシグナルを生成する。Ｔ／Ｂ細胞は、抗原提示細胞の表面上のさまざまな接着分子と相互作用して、Ｔ細胞またはＢ細胞の活性化のための第２のシグナル（すなわち、共刺激シグナル）を提供する。第３のシグナルとして、活性化された抗原提示細胞およびＴ細胞によって生成された複数のリンフォカインは、オートクリンおよびパラクリン作用を通じてリンパ球の増殖および分化に関与し、最終的にエフェクターＴ細胞または形質細胞を形成する。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を介して感染細胞を死滅させ、Ｔｈ１細胞を介してマクロファージを活性化して、一緒に細胞性免疫を構成することである。さらに、Ｂ細胞はＴｈ２細胞によって活性化されてさまざまな種類の抗体を産生し、それにより液性免疫応答を活性化する。
【０１２７】
第３段階は、免疫エフェクター細胞とエフェクター分子（サイトカインと抗体）とが連携して非自己抗原を除去し、身体を正常な生理学的状態に保つエフェクター段階である。
【０１２８】
８．記憶免疫応答：免疫記憶は適応免疫の重要な特徴であり、すなわち、身体は初回の感作をもたらす抗原に再度曝露されると、応答速度と強度が増した二次反応を示す。免疫記憶の鍵は、記憶リンパ球の形成および維持である。保護免疫記憶応答の誘導には、記憶Ｂリンパ球によって媒介される液性免疫応答および記憶Ｔリンパ球によって媒介される細胞性免疫応答が含まれる。
【０１２９】
抗原刺激により、一次応答で産生される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が決定される。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の約５％が記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞に形質転換される。記憶Ｔ細胞（Ｔｍ）は、抗原に再度刺激された後、エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）に急速に成熟し、初期段階で大量のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する。
【０１３０】
抗原によって初めて刺激されたナイーブＴ細胞と比較して、記憶Ｔ細胞は以下の利点を有する：（１）記憶Ｔ細胞は、同じ抗原に再びさらされると、より強い増殖能力、サイトカイン分泌能力、およびＣＴＬ活性を提示することができる。（２）同じ抗原による記憶Ｔ細胞の再活性化には、一次応答よりも低い閾値が必要である。（３）記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の維持には、抗原の継続的な刺激は必要なく、自己再生能力を有すると一般に考えられている。（４）再活性化された記憶Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５などの多数のサイトカインを放出し、Ｔ細胞による腫瘍の死滅を促進する。（５）記憶Ｔ細胞は、二次リンパ器官にホーミングすることなく、迅速かつ強力な免疫応答を伴うエフェクター細胞を産生することができる。
【０１３１】
９．ＤＮＡ／カチオン性脂質材料：
本発明のカチオン性脂質は、その表面に正電荷を有し、負に帯電したＤＮＡとの静電相互作用によりＤＮＡ／カチオン性脂質材料を容易に形成する。一般的に、形成されたＤＮＡ／カチオン性脂質材料の表面の正電荷は、静電相互作用によって負に帯電した細胞表面に吸着され、細胞膜との融合またはエンドサイトーシスによりＤＮＡが細胞内に移行して、封入体を形成するか、またはリソソームに進入する。カチオン性脂質の作用下で、細胞膜上のアニオン性脂質は、膜の不安定化により元のバランスを失い、複合体内に拡散し、カチオン性脂質のカチオンと中性イオン対を形成するため、元々リポソームと結合していたＤＮＡが解離して細胞質に進入することができる。
【０１３２】
１０．プラスミド
当該技術分野のプラスミドは、一般に、細胞内の非細胞染色体または核領域に付着することにより自律的に複製できる元の環状ＤＮＡ分子を指す。
【０１３３】
本発明は、外因性遺伝子を発現できない複製可能な環状ＤＮＡ分子のタイプを再構築し、これは新しいプラスミドタイプに属することに留意すべきである。本発明により構築されたプラスミドは、カチオン性生体材料と複合体を形成した後、腫瘍細胞に進入することができる。その結果、腫瘍細胞のＲＯＳが明らかに増加し、プラスミド／カチオン性生体材料複合体のプラスミドがＲＯＳによって酸化されて酸化ＤＮＡが形成され、腫瘍細胞のリソソームが破裂して、これにより一方では腫瘍細胞の壊死を直接媒介することができ、他方では抗腫瘍免疫応答を活性化することができる。さらに、本発明により構築されたプラスミド／カチオン性生体材料複合体中のプラスミドは、インビトロで様々な報告された手段によって事前にＤＮＡを酸化して、体内に進入させて抗腫瘍効果を強化することもできる。
【０１３４】
１１．ＤＮＡの酸化と酸化的損傷
ＤＮＡはしばしば、光線、強い酸化剤、強酸および強塩基、ならびに内因性ＲＯＳなどを含む物理化学的要因などの、さまざまな要因によってインビボおよびインビトロで刺激され、フリーラジカルの攻撃下でＤＮＡの酸化が生じる。酸化は、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）、ＤＮＡ一本鎖切断、塩基または塩基対の除去または置換など、ＤＮＡに酸化的損傷をしばしば引き起こす。
【０１３５】
発明の詳細な説明
本発明の技術的スキームを、好ましい実施形態と併せて以下でさらに例示する。本発明の医薬製剤を調製するためのいくつかの一般的な分子生物学的操作および一般的な手順は、本発明の明細書を当技術分野における関連機器および試薬の使用に関する既存の教科書、マニュアル、および説明書組み合わせて読むことに基づいて当業者によって完了できることに留意すべきである。
【実施例】
【０１３６】
本発明を、実施例および図面と組み合わせて以下にさらに詳細に説明するが、本発明の実施形態はこれらに限定されない。
【０１３７】
実施例１；ｐＭＶＡおよびｐＭＶＡ−１プラスミドの構築および発現
（１）ｐＭＶＡプラスミドの構築および発現
ｐＵＣ複製起点配列およびカナマイシン遺伝子ならびに２つのプラスミド骨格配列を含む１９７８ｂｐヌクレオチド配列を、全遺伝子合成により合成し、これを配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するｐＭＶＡプラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡプラスミドの構造を図１Ａに示した。
【０１３８】
アガロースゲル電気泳動を酵素消化検証のために実施し、実験結果を図２に示した。
【０１３９】
構築されたｐＭＶＡプラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて発現させた。
【０１４０】
（２）ｐＭＶＡ−１プラスミドの構築および発現
構築されたｐＭＶＡプラスミドを塩基部位特異的突然変異誘発または欠失に供し、合計１９７７ｂｐを有するｐＭＶＡ−１プラスミドを得た。突然変異部位は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の塩基２、３、４、４１および１９５０を含み、欠失部位は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の塩基１０７５であった。ｐＭＶＡ−１プラスミドベクターのヌクレオチド配列を、配列番号２に示した。ｐＭＶＡ−１プラスミドの構造を図１Ｂに示した。
【０１４１】
構築されたｐＭＶＡ−１プラスミドを大腸菌ＤＨ５ａにおいて発現させ、収量はｐＭＶＡプラスミドの収量よりも有意に高かった。
【０１４２】
実施例２；ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）標的配列のスクリーニング
配列番号３、４および５に示されるｍｔＤＮＡを含む５０〜３０００ｂｐのｍｔＤＮＡを選択した。ｍｔＤＮＡまたはｍｔＤＮＡ断片はＣｐＧモチーフに富んでおり、したがってＴＬＲ９経路またはＳＴＩＮＧ経路のアゴニストとして使用することができる。腫瘍細胞が酸化ストレス下にある場合、選択されたｍｔＤＮＡ標的配列は、体の抗腫瘍自然免疫応答を効果的に活性化することができる。
【０１４３】
実施例３；プラスミドの構築および発現
（１）ｐＭＶＡ−２プラスミドの構築および増幅
実施例２でスクリーニングした配列番号３に示されるｍｔＤＮＡヌクレオチド配列１と実施例１のｐＭＶＡの環化前の線形配列とを遺伝子合成し、次いで合計で２０９８ｂｐを有するｐＭＶＡ−２プラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡ−２プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号６に示し、部位３３〜１５２のヌクレオチド配列を配列番号３に示した。
【０１４４】
構築されたｐＭＶＡ−２プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて増幅させた。
【０１４５】
（２）ｐＭＶＡ−３プラスミドの構築および増幅
実施例２でスクリーニングした配列番号４に示されるｍｔＤＮＡヌクレオチド配列２と実施例１のｐＭＶＡの環化前の線形配列とを遺伝子合成し、次いで合計で２５７８ｂｐを有するｐＭＶＡ−３プラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡ−３プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号７に示し、部位３３〜６３２のヌクレオチド配列を配列番号４に示した。
【０１４６】
構築されたｐＭＶＡ−３プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて増幅させた。
【０１４７】
（３）ｐＭＶＡ−４プラスミドの構築および増幅
実施例２でスクリーニングした配列番号５に示されるｍｔＤＮＡヌクレオチド配列３と実施例１のｐＭＶＡの環化前の線形配列とを遺伝子合成し、次いで合計で３９７８ｂｐを有するｐＭＶＡ−４プラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡ−４プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号８に示し、部位３３〜２０３２のヌクレオチド配列を配列番号５に示した。
【０１４８】
構築されたｐＭＶＡ−４プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて増幅させた。
【０１４９】
（４）ｐＭＶＡ−５プラスミドの構築および増幅
実施例２でスクリーニングした配列番号３に示されるｍｔＤＮＡ断片のヌクレオチド配列１と実施例１のｐＭＶＡ−１の環化前の線形配列とを遺伝子合成し、次いでｐＭＶＡ−５プラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡ−５プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号９に示し、部位３３〜１５２のヌクレオチド配列は、配列番号３に示される挿入ヌクレオチド配列であった。
【０１５０】
構築されたｐＭＶＡ−５プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて増幅させた。
【０１５１】
（５）ｐＭＶＡ−６プラスミドの構築および増幅
実施例２でスクリーニングした配列番号４に示されるｍｔＤＮＡ断片のヌクレオチド配列２とｐＭＶＡ−１の環化前の線形配列とを遺伝子合成し、次いでｐＭＶＡ−６プラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡ−６プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号１０に示し、部位３３〜６３２のヌクレオチド配列は、配列番号４に示される挿入ヌクレオチド配列であった。
【０１５２】
構築されたｐＭＶＡ−６プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて増幅させた。
【０１５３】
（６）ｐＭＶＡ−７プラスミドの構築および増幅
実施例２でスクリーニングした配列番号５に示されるｍｔＤＮＡ断片のヌクレオチド配列３と実施例１のｐＭＶＡ−１の環化前の線形配列とを遺伝子合成し、次いでｐＭＶＡ−７プラスミドに連結および環化した。ｐＭＶＡ−７プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、部位３３〜２０３２のヌクレオチド配列は、配列番号５に示される挿入ヌクレオチド配列であった。
【０１５４】
構築されたｐＭＶＡ−７プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａにおいて増幅させた。
【０１５５】
実施例４；カチオン性生体材料の調製
１．カチオン性脂質材料（ＤＯＴＡＰ／ＣＨＯＬ複合体またはＤＯＴＡＰ）の調製方法
（１）表１に示すように、秤量した非加熱ＤＯＴＡＰと非加熱コレステロール（ＣＨＯＬ）とを混合し、次いで１〜１．５Ｌの無水エタノール溶液を加えて、撹拌しながら５０℃に加熱して脂質を完全に溶解した混合溶液を得た。
【０１５６】
（２）ステップ（１）の混合溶液を４０℃、０．０８ＭＰａにおいて、溶液の容量の１／３まで回転蒸発させ、次いで水で一定容量に希釈した。
【０１５７】
（３）ステップ（２）で得られた溶液を、高圧ホモジナイザーで７００〜８００ｂａｒの圧力で３〜１０回均質化し、５０℃の押出機（１００ｎｍフィルム）から１〜２回押し出して、粒径１００〜１５０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．３のカチオン性脂質材料（ＤＯＴＡＰ／ＣＨＯＬ複合体またはＤＯＴＡＰ）を得た。
【０１５８】
表１  異なる質量比で配合されたＤＯＴＡＰおよびＣＨＯＬ
【表１】
2020525455.tif 000003
【０１５９】
２．ＰＥＩポリマーの調製方法
ＰＥＩ２５ｋＤを、蒸留水で６ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬの溶液に調製した。
【０１６０】
３．キトサンの調製方法
中分子量キトサンを希酸に溶解して、６ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。
【０１６１】
実施例５；ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体の調製
スクリーニングしたｍｔＤＮＡまたはその断片および構築したプラスミドベクターまたはプラスミドと、実施例４で調製したカチオン性生体材料とを、表２〜４に示されたさまざまな濃度で、それぞれ等量で無菌混合して混合溶液を得、次いでこの溶液を０．５時間放置してＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体を形成させた。
【０１６２】
表２  異なる質量比のＤＮＡ／カチオン性脂質材料
【表２】
2020525455.tif 000004
【０１６３】
表３  異なる質量比のＤＮＡ／ＰＥＩ２５ｋＤ複合体
【表３】
2020525455.tif 000005
【０１６４】
表４  異なる質量比のＤＮＡ／キトサン複合体
【表４】
2020525455.tif 000006
【０１６５】
実施例６；ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体の特徴付け
１．ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体の粒子サイズおよび電位の決定：
（１）ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体サンプルの調製：
滅菌蒸留水を、実施例５で調製した異なる質量比のＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体に加え、高速振動下で複合体を溶解し、室温で放置して混合溶液を得た。
【０１６６】
（２）ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体の粒子サイズおよび電位の決定
ステップ（１）で調製したＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体サンプルをＭａｌｖｅｒｌ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳのサンプル皿に添加し、次いでこのサンプル皿を試験セルに入れ、平衡時間１分に設定して各サンプルについて並行して３群のデータを試験して、複合体サンプルの平均粒子サイズおよびゼータ電位を得た。試験結果を表５〜７に示した。
【０１６７】
表５  異なる質量比のＤＮＡ／カチオン性脂質材料の粒子サイズおよび電位
【表５】
2020525455.tif 000007
【０１６８】
表６  異なる質量比のＤＮＡ／ＰＥＩ２５ｋＤ複合体の粒子サイズおよび電位
【表６】
2020525455.tif 000008
【０１６９】
表７  異なる質量比のＤＮＡ／キトサン複合体の粒子サイズおよび電位
【表７】
2020525455.tif 000009
【０１７０】
実施例７；アガロースゲル電気泳動による、異なる質量比のＤＮＡ／カチオン性脂質材料複合体の決定
（１）１％アガロースゲルの調製：アガロースを秤量して三角フラスコに入れ、１×ＴＡＥを加え、アガロースを電子レンジで加熱し、アガロースが完全に溶けるまで煮沸してから、ＤＮＡ色素Ｇｏｌｄｅｎ  Ｖｉｅｗを加え、三角フラスコをよく振って、１．０％アガロースゲル溶液を調製した。
【０１７１】
（２）ゲルスラブの調製：ゲルスラブを調製後、ステップ（１）で調製したアガロースゲルを６５℃に冷却し、ガラス板の内側の溝に注いで均一なゲル層を形成し、これを、ゲルが完全に凝固するまで室温において静置し、ゲルおよび内側の溝を電気泳動タンクに入れた。次に、ゲルスラブの１〜２ｍｍ上まで１×ＴＡＥ電気泳動バッファーを加えた。
【０１７２】
（３）サンプルのローディング：ＤＯＴＡＰ：ＤＮＡの質量比が１：１、６：１、１０：１、１５：１および２０：１のＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合サンプルをそれぞれローディングバッファーと混合し、ステップ（２）で調製したゲル孔に加えた。
【０１７３】
（４）電気泳動：サンプルをロードした後、電気泳動のためにゲルスラブに直ちに通電させた。ブロモフェノールブルーがゲルスラブの下端から約１ｃｍの位置に移動したら、電気泳動を停止させた。
【０１７４】
（５）ゲルイメージングシステムを、写真撮影および保存に使用した。
図３に示すように、アガロースゲル電気泳動による異なる質量比のＤＮＡ／カチオン性脂質材料複合体の判定により、ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体のＤＯＴＡＰ：ＤＮＡ質量比がそれぞれ１：１、６：１、１０：１、１５：１および２０：１の場合、アガロースゲル電気泳動の作用下でＤＮＡが効果的に保持され得ることが示された。
【０１７５】
実施例８；ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＡ５４９細胞の活性のＣＣＫ８法による決定
（１）細胞プレート培養
対数増殖期のＡ５４９細胞を、１０％ＦＢＳ−１６４０で５×１０４細胞／ｍｌに希釈して細胞懸濁液に調製し、希釈液を得た後、この希釈液を９６ウェル細胞培養プレートに１００μｌ／ウェルの割合で接種し、５％ＣＯ２で３７．０℃において２４時間インキュベートした。細胞付着後、細胞を無血清１６４０培地で２４時間飢餓状態にした。
【０１７６】
（２）被験サンプルの調製
異なる質量比（ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１質量比がそれぞれ１：１、６：１、１０：１、１５：１および２０：１）で混合することにより調製したｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を１６４０培地で２００μｇ／ｍｌに希釈し、合計９希釈勾配で３倍に希釈して、異なるＤＯＴＡＰ濃度の試験サンプルを調製した。
【０１７７】
（３）サンプルローディング
９６ウェルプレートの１６４０培地を吸い上げた後、ステップ（２）の試験サンプルおよび対照サンプルを、各勾配について平行して３つの勾配、合計で９勾配で添加した。最後の行は、細胞ブランク対照およびブランク対照として使用した。サンプルを５％ＣＯ２で３７．０℃において４８時間インキュベートした。
【０１７８】
（４）ＣＣＫ−８による細胞活性の決定
ＣＣＫ−８および１６４０培地を１：１の比率で混合し、ステップ（３）の９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルの比率で添加し、５％ＣＯ２で３７．０℃において２時間インキュベートして、マイクロプレートリーダーによりＯＤ４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０１７９】
（５）データ分析
ステップ（４）で決定した吸光度と試験されるサンプルの濃度勾配を、水平「Ｓ」曲線である４パラメータ曲線に適合させ、適合曲線に従って阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１８０】
図４に示すように、異なる質量比のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体はインビトロでＡ５４９腫瘍細胞の活性を阻害し、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比がそれぞれ１：１、６：１、１０：１、１５：１および２０：１のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、Ａ５４９細胞の成長活性を効果的に阻害できたことを示した。
【０１８１】
実施例９；Ａ５４９細胞によるｐＭＶＡ−１／ＰＥＩ２５ｋＤ複合体の生物活性の決定
（１）細胞プレート培養
方法は、実施例８と同じであった。
【０１８２】
（２）被験サンプルの調製
異なる質量比（ＰＥＩ２５ｋＤ：ｐＭＶＡ−１の質量比およびキトサン：ｐＭＶＡ−１の質量比がそれぞれ１：１、１０：１および２０：１）で混合することにより調製した複合体を１６４０培地で２００μｇ／ｍｌに希釈し、合計９希釈勾配で３倍に希釈して、異なるＰＥＩ２５ｋＤ濃度の試験サンプルを調製した。
【０１８３】
（３）サンプルローディング
方法は、実施例８と同じであった。
【０１８４】
（４）ＣＣＫ−８による細胞活性の決定
方法は、実施例８と同じであった。
【０１８５】
（５）データ分析
方法は、実施例８と同じであった。
【０１８６】
図５に示すように、異なる質量比のｐＭＶＡ−１／ＰＥＩ２５ｋＤ複合体はインビトロでＡ５４９腫瘍細胞の活性を阻害し、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比がそれぞれ１：１、１０：１および２０：１のｐＭＶＡ−１／ＰＥＩ２５ｋＤ複合体が、Ａ５４９細胞の成長活性を効果的に阻害できたことを示した。
【０１８７】
ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を腫瘍ワクチンに調製し、担腫瘍マウスの治療に適用したところ、担腫瘍マウスの抗腫瘍免疫応答を効果的に誘導し、腫瘍細胞の成長を阻害した。
【０１８８】
実施例１０；Ａ５４９細胞によるｐＭＶＡ−１／キトサン複合体の生物活性の決定
（１）細胞プレート培養
方法は、実施例８と同じであった。
【０１８９】
（２）被験サンプルの調製
実施例９と同じ方法で、異なるキトサン濃度の試験サンプルをそれぞれ調製した。
【０１９０】
（３）サンプルローディング
方法は、実施例８と同じであった。
【０１９１】
（４）ＣＣＫ−８による細胞活性の決定
方法は、実施例８と同じであった。
【０１９２】
（５）データ分析
方法は、実施例８と同じであった。
【０１９３】
図６に示すように、異なる質量比のｐＭＶＡ−１／キトサン複合体はインビトロでＡ５４９腫瘍細胞の活性を阻害し、ＤＯＴＡＰ：ｐＭＶＡ−１の質量比がそれぞれ１：１、１０：１、および２０：１のｐＭＶＡ−１／キトサン複合体が、Ａ５４９細胞の成長活性を効果的に阻害できたことを示した。
【０１９４】
ＤＮＡ／キトサン複合体を腫瘍ワクチンに調製し、担腫瘍マウスの治療に適用したところ、担腫瘍マウスの抗腫瘍免疫応答を効果的に誘導し、腫瘍細胞の成長を阻害した。
【０１９５】
実施例１１；腫瘍細胞死を相乗的に誘導するｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の実験
１．ＰＩ−アネキシンＶによるＡ５４９細胞死試験
（１）Ａ５４９細胞のプレートへの接種：
対数増殖期のＡ５４９細胞を単一細胞懸濁液に調製し、約１×１０５細胞／ウェルずつ６ウェルプレートに接種した。次に、２ｍｌの培地を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃において２４〜３６時間培養した。
【０１９６】
（２）スパイクサンプルの調製：
ａ．５ｍｇ／ｍｌのｐＭＶＡ−１プラスミドベクター溶液を１００μｌの１６４０無血清培地に加えて、ｐＭＶＡ−１プラスミドベクター対照群を調製した；
ｂ．１ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰカチオン性脂質を１００μｌの１６４０無血清培地に溶解して、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質対照群を調製した；
ｃ実施例５で調製した質量比１：６のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体を１００μｌの１６４０無血清培地に溶解して、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体実験群を調製した。
【０１９７】
（３）スパイクサンプルによるＡ５４９細胞の処理：
ステップ（１）の６ウェルプレートから、各ウェルの培地が９００μｌに達するまで、培地の一部をピペットで取った。実験群のｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体（ｐＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）（ステップ（２）で調製）、ならびに対照群のｐＭＶＡ−１プラスミドベクター（ＰＭＶＡ）およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ）を、ステップ（１）で培養したＡ５４９細胞にそれぞれ加え、総容量を１ｍｌにした。同時に、培地のみを含むブランク対照群を作製し、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃において２４時間インキュベートした。
【０１９８】
（４）ＰＩ−アネキシンＶ染色マーカー
ステップ（３）の異なるサンプルで処理したＡ５４９細胞をＰＢＳで２回洗浄し、アポトーシスキット（アネキシンＶ−ＰＩアッセイキット、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）の結合バッファー５００μＬを各ウェルに添加し、１０μｌのＰＩおよび１０μｌのアネキシンＶを染色のために加え、次いで暗所で１５分間室温においてインキュベートした。
【０１９９】
（５）蛍光顕微鏡下での観察：
ステップ（４）のＰＩとアネキシンＶとで染色した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その後、画像を保存した。
【０２００】
（６）ＰＩ−アネキシンＶによるＡ５４９細胞死の試験結果：
図７Ａに示すように、Ａ５４９細胞をｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で２４時間処理した後、多数のＰＩ陽性およびアネキシンＶ陽性細胞が存在したが、ｐＭＶＡ−１プラスミドベクター群およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群（両方とも対照群であった）は、明らかなＰＩ取り込みおよびアネキシンＶ標識陽性細胞を示さなかった。実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がＡ５４９細胞死を相乗的に誘導できることを示している。
【０２０１】
２．ＰＩ−アネキシンＶによるＣＴ２６細胞死試験
（１）実験方法：１と同じ。
【０２０２】
（２）ＰＩ−アネキシンＶによるＣＴ２６細胞死の試験結果：
図７Ｂに示すように、ＣＴ２６細胞をｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で２４時間処理した後、多数のＰＩ陽性およびアネキシンＶ陽性細胞が存在したが、ｐＭＶＡ−１プラスミドベクター群およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群（両方とも対照群であった）は、明らかなＰＩ取り込みおよび明らかなアネキシンＶ標識陽性細胞を示さなかった。実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がＣＴ２６細胞死を相乗的に誘導できることを示している。
【０２０３】
３  フローサイトメトリーによるＡ５４９細胞死試験
（１）Ａ５４９細胞のプレートへの接種：
方法は１（１）と同じであった。
【０２０４】
（２）スパイクサンプルの調製：
方法は１（２）と同じであり、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質の濃度はそれぞれ４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌおよび３２μｇ／ｍｌであり、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の濃度はＤＯＴＡＰカチオン性脂質の濃度によって表した。
【０２０５】
（３）スパイクサンプルによるＡ５４９細胞の処理：
方法は１（３）と同じであった。
【０２０６】
（４）フローサイトメトリーによるＡ５４９細胞死の定量試験
ａ．ステップ（３）の異なるサンプルで処理したＡ５４９細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１×結合バッファーで再懸濁して、１×１０６細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁液を調製した；
ｂ．ステップａで調製したＡ５４９細胞懸濁液１００μｌをフロー試験管にピペットにより入れた；
ｃ．５μｌのＦＩＴＣアネキシンＶと５μｌのＰＩとをステップｂのフロー試験管に加え、穏やかに混合し、室温で暗所において１５分間インキュベートした；
ｄ．４００μｌの１×結合バッファーをステップｃのフロー試験管に加え、フローサイトメトリーにより試験した。
【０２０７】
（５）フローサイトメトリーによるＡ５４９細胞死の定量試験結果：
培地のみが添加されたブランク対照群と比較して、Ａ５４９細胞由来のアネキシンＶ単一陽性細胞、ＰＩ単一陽性細胞およびＰＩ／アネキシンＶ二重陽性細胞は、ｐＭＶＡ−１プラスミドベクター群（ＰＭＶＡ）およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群（ＤＯＴＡＰ）（両方とも対照群であった）では有意に増加しなかった。しかし、ＰＩの取り込みとアネキシンＶは、実験群、すなわちｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡ複合体群（ｐＭＶＡ／ＤＯＴＡ）で有意に増加し、ブランク対照群および対照群と比較して、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の濃度の増加と共に細胞死のパーセンテージが増加し、有意な用量依存関係を示していた。図８Ａに示すように、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の濃度が４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌおよび３２μｇ／ｍｌの場合、全死細胞（壊死細胞およびアポトーシス細胞を含む）のパーセンテージはそれぞれ１．６８％、２１．６３％、５７．２２％および６５．３７％であった。
【０２０８】
４  フローサイトメトリーによるＣＴ２６細胞死試験
（１）実験方法：３と同じであり、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質の濃度はそれぞれ２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌおよび１６μｇ／ｍｌであり、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の濃度はＤＯＴＡＰカチオン性脂質の濃度によって表した。
【０２０９】
（２）フローサイトメトリーによるＣＴ２６細胞死の試験結果：
図８Ｂに示すように、ＣＴ２６細胞の実験結果はＡ５４９細胞の実験結果と同様であることが観察された、すなわち、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は腫瘍細胞の死を相乗的に誘導することができた。
【０２１０】
実験結果は、ｐＭＶＡ−１プラスミドもＤＯＴＡＰカチオン性脂質も、腫瘍細胞に別々に作用する場合、腫瘍細胞のアポトーシスまたは壊死を引き起こさないが、ｐＭＶＡ−１プラスミドとＤＯＴＡＰカチオン性脂質とによって形成されるｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が腫瘍細胞に作用する場合、腫瘍細胞死を誘導することができ、アポトーシスまたは壊死の過程は、血清の非存在下でＤＯＴＡＰカチオン性脂質単独によって引き起こされる腫瘍細胞の急速な死とは異なり、緩慢な死の過程であることを示している。
【０２１１】
実施例１２；Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ蛍光分子プローブ法により検出された、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体により相乗的に誘導された腫瘍細胞中のＲＯＳレベルの増加
（１）サンプルローディング：Ａ５４９細胞を培地（ブランク対照群）、ｐＭＶＡ−１プラスミド（対照群ＰＭＶＡ）、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質（対照群ＤＯＴＡＰ）およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体（実験群ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）でそれぞれ３時間処理した。次いで、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の作用の前に、５ｍＭ  ＮＡＣによる前処理のために陰性対照群（ＮＡＣ）を作製し、Ａ５４９細胞に２００μＭのＨ２Ｏ２を添加して陽性対照群（Ｈ２Ｏ２）を作製した。
【０２１２】
（２）ステップ（１）の異なる群のＡ５４９細胞を収集し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、滅菌ＰＢＳに再懸濁した；
【０２１３】
（３）１０Ｍ  ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ蛍光プローブ（Ｓｉｇｍａ製）をステップ（２）で調製した再懸濁細胞に加え、３７℃において０．５時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄して再懸濁した；
【０２１４】
（４）ステップ（３）で再懸濁した細胞をフローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）で試験し、試験結果をＮｏｖｏｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアによって分析した。
【０２１５】
（５）実験結果：
図９に示すように、ブランク対照群、ＰＭＶＡ対照群、ＤＯＴＡＰ群と比較して、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＡ５４９細胞の細胞内ＲＯＳレベルは有意に増加した（＊Ｐ＜０．０５）が、Ａ５４９細胞をｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理する前に５ｍＭ  ＮＡＣで前処理すると、陰性対照群は細胞内ＲＯＳレベルの有意な低下を示し、陽性対照群は、２００μＭ  Ｈ２Ｏ２で処理した細胞中のＲＯＳレベルの有意な増加を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【０２１６】
したがって、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、Ａ５４９細胞中のＲＯＳレベルの有意な増加を相乗的に誘導することができる。
【０２１７】
実施例１３；腫瘍細胞のＲＯＳ増加を相乗的に誘導するｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体のメカニズム研究
【０２１８】
実施例１２は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がＡ５４９細胞中のＲＯＳレベルの増加を相乗的に誘導できることを証明している。腫瘍細胞死に対するｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体のプラスミド酸化の効果を調べるために、ｐＭＶＡ−１プラスミドを１０００ｍＪ／ｃｍ２ＵＶ照射により酸化させ、次いでＤＯＴＡＰカチオン性脂質と複合体を形成させてＡ５４９細胞に作用させた。図１０に示すように、Ａ５４９細胞をｏｘ−ＰＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で２４時間処理した場合、Ａ５４９細胞死の数はｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群と比較して有意に増加した。
【０２１９】
実験結果は、腫瘍細胞に対するｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の破壊が、腫瘍細胞におけるｐＭＶＡ−１プラスミドの酸化ストレスに関連していることを示している。
【０２２０】
実施例１４
ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体による腫瘍細胞死の相乗的誘導は、腫瘍細胞の酸化ストレスに関連している。
【０２２１】
実施例１２は、抗酸化剤としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）が、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体により誘導される腫瘍細胞中のＲＯＳレベルの増加を効果的に阻害できることを証明している。ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体による腫瘍細胞死の相乗的誘導が腫瘍細胞の酸化ストレスに関連するかどうかをさらに検証するために、フローサイトメトリーを使用して、実施例１２においてｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＰ複合体を加える前にＮＡＣで前処理したＡ５４９細胞の死亡率を試験した。図１１に示すように、Ａ５４９細胞は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＰ複合体で処理する前にＮＡＣで前処理されているため、死亡率を有意に低下させることができ、これにより、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体による腫瘍細胞死の相乗的誘導が腫瘍細胞における酸化ストレスの発生に関連していることがさらに証明される。
【０２２２】
実施例１５
ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は腫瘍細胞のリソソーム破裂を相乗的に誘発する
【０２２３】
１  ＹＯＹＯ１蛍光プローブ法によるＡ５４９細胞へのｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の進入試験
（１）ＹＯＹＯ１色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）によるｐＭＶＡ−１プラスミドの蛍光標識：
ａ．ＹＯＹＯ１作動液の調製：ＹＯＹＯ１ストック溶液を１６４０無血清培地を用いて体積比１：２００で希釈した；
ｂ．ｐＭＶＡ−１プラスミドをステップ（１）で調製したＹＯＹＯ１作動液に体積比１：４０で加え、３７℃において１時間インキュベートした。
【０２２４】
（２）ＹＯＹＯ１蛍光標識ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によるＡ５４９細胞の処理：
ａ．ステップ１で調製したＹＯＹＯ１蛍光標識ｐＭＶＡ−１プラスミドをＤＯＴＡＰカチオン性脂質と混合して複合体を形成した；
ｂ．ステップａで調製したＹＯＹＯ１蛍光標識ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をＡ５４９細胞に加え、２つの対照群、すなわちＹＯＹＯ１蛍光標識ｐＭＶＡ−１プラスミド群（ＰＭＶＡ）とＤＯＴＡＰカチオン性脂質群（ＤＯＴＡＰ）、ならびに細胞培養液のみを含むブランク対照群を作製した。
【０２２５】
２  Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ蛍光プローブ法に基づき、Ａ５４９細胞においてｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によって相乗的に誘導されたリソソーム酸性度勾配の喪失試験
（１）Ｌｙｓｏｔｒａｃｈｅｒ  Ｒｅｄ作動液の調製：Ｌｙｓｏｔｒａｃｈｅｒ  Ｒｅｄストック溶液を細胞培養液に体積比１：２００００で加え、３７℃においてインキュベートした。
【０２２６】
（２）Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ製）によるＡ５４９細胞のリソソームの蛍光標識：
ａ．ステップ１のＡ５４９細胞培養液を除去し、ステップ（１）で調製したＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ染色作動液を細胞に加え、３７℃において１時間インキュベートした；
ｂ．ステップａのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ染色作動液を除去し、新鮮な細胞培養液を加えて、蛍光顕微鏡下で０．５時間および３時間の蛍光細胞画像をそれぞれ観察および収集した；
ｃ．ステップｂのＡ５４９細胞を収集し、フローサイトメトリーにより蛍光細胞の数を定量的に試験した。
【０２２７】
３  ＦＩＴＣ−デキストラン細胞局在化法に基づく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体により相乗的に誘導されたＡ５４９細胞のリソソーム膜透過性増加の試験
（１）Ａ５４９細胞のプレートへの接種：対数増殖期のＡ５４９細胞を細胞懸濁液に調製し、約１×１０５細胞／ウェルずつ６ウェルプレートに接種した。次に、２ｍｌの培地を各ウェルに加え、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃において一晩培養した。
【０２２８】
（２）最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ製）をステップ（１）の細胞培地に添加し、３７℃において４時間暗所でインキュベートした。
【０２２９】
（３）ステップ（２）の細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、１６４０培地を加え、Ａ５４９細胞を培地（ブランク対照群）、ｐＭＶＡ−１プラスミド（対照群ＰＭＶＡ）、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質（対照群ＤＯＴＡＰ）およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体（実験群ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）でそれぞれ処理して、３７℃において３時間暗所でインキュベートした。
【０２３０】
（４）ステップ（３）の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間安定化し、ＰＢＳで２回洗浄し、密封した。蛍光細胞を共焦点顕微鏡で観察し、画像を保存した。
【０２３１】
４  カテプシンＢ細胞内局在化法に基づく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体により相乗的に誘導されたＡ５４９細胞のリソソーム膜透過性増加の試験
（１）Ａ５４９細胞のプレートへの接種：丸型滅菌細胞スライドを６ウェルプレートの底に置き、Ａ５４９細胞を１×１０５細胞／ウェルずつ６ウェルプレートに接種し、２  ｍｌの培地を各ウェルに加えて、一晩インキュベートした。
【０２３２】
（２）培地（ブランク対照群）、ｐＭＶＡ−１プラスミド（対照群ＰＭＶＡ）、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質（対照群ＤＯＴＡＰ）およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体（実験群ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）をステップ（１）で培養したＡ５４９細胞に加え、３７℃において３時間インキュベートした。
【０２３３】
（３）ステップ（２）で異なる群で処理したＡ５４９細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷メタノールで３分間安定化させ、ＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳの０．３％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳＴで２０分間密封した。
【０２３４】
（４）ステップ（３）の細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ヒトカテプシンＢ抗体（Ａｂｃａｍ製）を比率１：３００で希釈した。室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで各回５分間３回洗浄し、１：１０００の蛍光二次抗体を加え、暗所で１時間室温においてインキュベートした。
【０２３５】
（５）ステップ（４）の細胞をＰＢＳで３回洗浄し、フィルムを超純水で洗浄して過剰な水を除去し、抗蛍光消光剤で密封し、６時間保存処理した。共焦点顕微鏡で蛍光細胞を観察し、画像を保存した。
【０２３６】
５  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体によって相乗的に誘導された腫瘍細胞のリソソーム破裂の実験結果。
（１）ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体はＡ５４９細胞に進入し、細胞内のリソソーム酸性度勾配の喪失を相乗的に誘導する
Ａ５４９細胞を、ＹＯＹＯ１蛍光プローブ標識ｐＭＶＡ−１プラスミドとＤＯＴＡＰカチオン性脂質とによって形成された複合体で処理し、これは、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体のトレーサーとして使用できる。次に、Ａ５４９細胞のリソソームをＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄで標識し、蛍光顕微鏡下で０．５時間および３時間の蛍光細胞画像をそれぞれ収集した。図１２に示すように、ブランク対照群のＡ５４９細胞はＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  の蛍光強度が高かった。しかし、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で０．５時間処理した後、Ａ５４９細胞は細胞膜および細胞質端でＹＯＹＯ１標識ｐＭＶＡ−１プラスミドを示し始め、リソソームのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光強度はわずかに減少した。これらの細胞をｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で３時間処理すると、大量のＹＯＹＯ１標識ｐＭＶＡ−１プラスミドが細胞質に進入し、リソソームのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光強度が有意に低下し、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰが複合体はＡ５４９細胞に進入し、リソソームの酸性度勾配の変化を誘導したことを示した。
【０２３７】
（２）フローサイトメトリーに基づく、異なる群のＡ５４９細胞のリソソームにおけるＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光強度の定量試験
図１３に示すように、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光強度は、ブランク対照群、ｐＭＶＡ−１プラスミド群およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群の細胞をそれぞれ１時間、３時間、６時間および９時間処理した後、有意に変化しなかった。ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群では、１８．４９％のＡ５４９細胞のＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ蛍光強度が処理後１時間で低下し、７６．１８％のＡ５４９細胞の蛍光強度は処理後３時間で低下した。
【０２３８】
実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が腫瘍細胞に進入し、腫瘍細胞のリソソーム酸性度勾配の不均衡を相乗的に誘導し、さらに、細胞が複合体で経時的に処理されると、リソソーム酸性度勾配の喪失程度が徐々に増加し、リソソームが徐々に溶解することを示している。腫瘍細胞のリソソーム酸性度勾配の喪失は、複合体が効果を発した１時間後に発生し、細胞が複合体で３時間処理されたときに最大に達する。
【０２３９】
（３）ＦＩＴＣ−デキストラン細胞局在化法により試験した、Ａ５４９細胞のリソソーム膜透過性変化の実験結果
ＦＩＴＣ−デキストランは、エンドサイトーシスを介してリソソームに進入可能な２０ｋＤデキストランである。Ａ５４９細胞を１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストランに３時間曝露し、異なる群のサンプルで処理し、蛍光細胞を共焦点顕微鏡下で観察した。図１４Ａに示すように、Ａ５４９細胞の細胞質のＦＩＴＣ−デキストランを、ブランク対照群（対照）、ｐＭＶＡ−１プラスミド群（ＰＭＶＡ）およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群（ＤＯＴＡＰ）で点状に分布しており、ＦＩＴＣ−デキストランはｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群（ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）で分散して分布しており、リソソーム膜透過性（ＬＭＰ）の増加を示していた。
【０２４０】
（４）カテプシンＢ細胞内局在法に基づく、Ａ５４９細胞のリソソーム膜透過性の変化によりリソソームから放出されるカテプシンＢの実験結果
リソソームの膜透過性が変化した場合、リソソーム中の加水分解酵素は細胞質に移行する。したがって、リソソーム膜透過性の増加をさらに証明するために、リソソーム中のカテプシンＢを免疫蛍光染色して、追跡した。図１４Ｂに示すように、Ａ５４９細胞の細胞質中のカテプシンＢは、ブランク対照群と対照群のｐＭＶＡ−１プラスミド群（ＰＭＶＡ）およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群（ＤＯＴＡＰ）で点状に分布しており、細胞質中のカテプシンＢおよび核は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群（ＰＭＶＡ−ＤＯＴＡＰ）では分散して分布しており、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がＡ５４９細胞のリソソーム膜透過性の増加を相乗的に誘導して、リソソームの加水分解酵素を細胞質に放出できることを示している。
【０２４１】
実験結果は、腫瘍細胞の進入後、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が細胞のリソソーム膜透過性の増加を相乗的に誘導し、リソソームの破裂を促進し、リソソームの加水分解酵素を細胞質に放出できることを示している。
【０２４２】
実施例１６
ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、腫瘍細胞のミトコンドリア膜電位の低下を相乗的に誘発する
（１）腫瘍細胞のプレートへの接種：対数増殖期のＡ５４９細胞およびＣＴ２６細胞をそれぞれ細胞懸濁液に調製し、１×１０５細胞／ウェルずつ６ウェルプレートに接種し、２ｍｌの培地を各ウェルに加え、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃において一晩培養した。
【０２４３】
（２）腫瘍細胞に作用させるための異なるサンプルの添加：ｐＭＶＡ−１プラスミド、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をそれぞれステップ（１）で培養した腫瘍細胞に添加し、３７℃において１５時間、１８時間、２１時間および２４時間インキュベートした。
【０２４４】
（３）ＴＭＲＭ染色作動液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）の調製：ＴＭＲＭ母液を比率１：１０００００でＰＢＳにより希釈し、ＴＭＲＭ染色作動液を得た。
【０２４５】
（４）ステップ（２）の細胞培養液を廃棄し、予熱したステップ（３）で調製したＴＭＲＭ染色作業液をホールプレートの壁に沿って添加し、３７℃において暗所で２０分間インキュベートした。
【０２４６】
（５）ステップ（４）の腫瘍細胞を収集し、異なるサンプルにより異なる時間で処理し、ミトコンドリア膜電位変化のある腫瘍細胞をフローサイトメトリーで分析した。
電位差測定蛍光プローブとしてテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）が細胞に進入し、細胞ラクトナーゼによって切断されてテトラメチルローダミンを生成して、ミトコンドリアに進入後に強い蛍光を示した。ミトコンドリア膜チャネルの孔が開いていると、テトラメチルローダミンがミトコンドリアから細胞質に放出され、その蛍光強度も有意に低下した。したがって、ミトコンドリア膜チャネル孔の開いた状態は、腫瘍細胞のミトコンドリアの蛍光強度の変化を試することにより検証することができる。
【０２４７】
図１５Ａに示すように、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＡ５４９細胞の３１．７３％、４１．８０％、５１．７６％および５５．０３％は、それぞれ１５時間、１８時間、２１時間、２４時間でミトコンドリア膜電位の低下を示し、一方、ブランク対照群ならびに対照群（ｐＭＶＡ−１プラスミド群およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群）のＡ５４９細胞のミトコンドリア膜電位は有意に変化しなかった。図１５Ｂに示すように、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＣＴ２６細胞の１５．９５％、３５．８５％、５０．１８％および５２．１８％は、それぞれ１５時間、１８時間、２１時間および２４時間でミトコンドリア膜電位の低下を示し、一方、ブランク対照群ならびに対照群のＣＴ２６細胞のミトコンドリア膜電位は有意に変化しなかった。
【０２４８】
実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が腫瘍細胞のリソソーム破裂を相乗的に誘導した後、腫瘍細胞のミトコンドリア膜電位の脱分極を引き起こし、それによりミトコンドリア膜チャネル孔を開き、ミトコンドリア透過性を有意に変化させ、ミトコンドリア内容物を細胞質内に放出するできることを示している。
【０２４９】
実施例１７
ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は腫瘍細胞においてカスパーゼプロテアーゼ活性化を誘導する
（１）Ａ５４９細胞のプレートへの接種：対数増殖期のＡ５４９細胞を細胞懸濁液に調製し、１×１０５細胞／ウェルずつ６ウェルプレートに接種し、２ｍｌの培地を各ウェルに加え、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃において一晩培養した。
【０２５０】
（２）サンプルローディング：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体をステップ（１）で１２時間および２４時間培養したＡ５４９細胞に添加し、ブランク対照群を作製した。
【０２５１】
（３）試験サンプルの調製：ステップ（２）で得られた細胞培養液をピペット操作し、ステップ（２）で得られたＡ５４９細胞を収集し、ピペットで細胞培養液を懸濁する。６００ｇおよび４℃における５分間の遠心分離により細胞を収集し、上清を抜き取りし、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、上清を再度抜き取り、溶解物を加え、再懸濁して沈殿させ、氷浴で１５分間溶解する。次に、上清を氷浴で予冷した遠心管に移す。
【０２５２】
（４）ステップ（３）に記載のサンプルを少量採取し、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定する。
【０２５３】
（５）上記ステップ（３）で調製した試験サンプル中のカスパーゼ３、カスパーゼ８およびカスパーゼ９の酵素活性の検出：
ａ．適切な量の基質を取り出し、後の使用のために氷浴に置く。
ｂ．表８に示すように、反応系を作製する。
ｃ．ステップａの基質をステップｂの反応系に加え、均一に混合し、３７℃において６０〜１２０分間インキュベートして、明らかな発色のＡ４０５を測定した。
ｄ．サンプル中のカスパーゼ３、カスパーゼ８およびカスパーゼ９によって触媒されるｐＮＡの吸光度は、サンプルのＡ４０５からブランク対照のＡ４０５を差し引くことにより得た。サンプルでの触媒作用により生成されたｐＮＡの量は、標準曲線と比較することによって計算した。
ｅ．試験サンプルのタンパク質濃度をステップ（３）のブラッドフォード法に従って試験し、サンプルの単位重量あたりのタンパク質に含まれるカスパーゼの酵素活性単位を計算した。
【表８】
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【０２５４】
システインを必要とするアスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）は、細胞アポトーシスの過程で重要な役割を果たすプロテアーゼファミリーである。図１６に示すように、ブランク対照群と比較して、カスパーゼ３、カスパーゼ８およびカスパーゼ９はすべて有意に増加し、細胞をｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で１２時間および２４時間処理した後、時間依存的であった。
【０２５５】
実施例１８；ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は抗腫瘍自然免疫応答を相乗的に誘導する
（１）マウス骨髄前駆細胞からの骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の分離および培養
ａ．骨髄細胞をマウスの大腿骨と脛骨から採取し、ふるいにかけ、遠心管に収集し、２８０ｇで室温において５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【０２５６】
ｂ．ステップａに記載の細胞に１０ｍｌの赤血球溶解物を加え、室温で３分間静置し、２８０ｇで室温において５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【０２５７】
ｃ．ステップｂに記載の骨髄細胞をＰＲＭＩ−１６４０培地で２回洗浄し、２８０ｇで室温において１０分間遠心分離し、生細胞数を測定し、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地により細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌに調整した。
【０２５８】
ｄ．ステップｃで、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＧＭ−ＣＳを添加し、４ｍｌ／ウェルの細胞懸濁液を６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞コロニーがプレートの底で成長したら、培地をピペットで取り、培地で１回洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む１６４０完全培地を各ウェルに加えた。
【０２５９】
ｅ．ステップｄで分離した細胞、すなわちＢＭＤＣを収集し、２８０ｇで室温において５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む１６４０完全培養液に懸濁し、細胞を使用のために１×１０６細胞／ｍｌずつ６ウェルプレートに接種した。
【０２６０】
（２）フローサイトメトリーに基づく、ＢＭＤＣによるＦＩＴＣ−デキストラン取り込み試験
ａ．ステップ１で培養したＢＭＤＣを収集し、培地、ｐＭＶＡ−１プラスミド、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体でそれぞれ２４時間処理した。ＣＴ２６細胞刺激ＤＣ群（ＣＴ２６細胞、ｐＭＶＡ−１プラスミドで処理したＣＴ２６細胞、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質で処理したＣＴ２６細胞、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＣＴ２６細胞を含む）を作製し、２４時間インキュベートした。
【０２６１】
ｂ．ステップａに記載の細胞を１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルずつ２４ウェルプレートに入れ、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストランを加え、３７℃において１時間インキュベートした。
【０２６２】
ｃ．ステップｂに記載の細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞を染色するために抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥおよび抗ＣＤ１１ｃ−Ｐｅｒｃｐ５．５を加えた。細胞をＰＢＳで洗浄し、再懸濁し、試験のために暗所で４℃において維持した。
【０２６３】
ｄ．フローサイトメトリーに基づく、ＢＭＤＣの蛍光強度の試験および分析。
【０２６４】
（３）フローサイトメトリーに基づく、ＢＭＤＣによって分泌されるサイトカインの試験
ａ．ステップ１で６日目まで培養したＢＭＤＣを収集した。培地、ＣＴ２６細胞、３時間ｐＭＶＡ−１プラスミドで処理したＣＴ２６細胞、３時間ＤＯＴＡＰ脂質で処理したＣＴ２６細胞および３時間ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＣＴ２６細胞を添加し、２４時間インキュベートした。
【０２６５】
ｂ．ステップａに記載の細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥおよび抗ＣＤ１１ｃ−Ｐｅｒｃｐ５．５抗体をフローチューブに添加し、４℃において３０分間暗所でインキュベートした。
【０２６６】
ｃ．ステップｂのＢＭＤＣをＰＢＳで２回洗浄し、間接標識細胞間サイトカイン抗体を染色し、各チューブに１μｌの抗体を加え、４℃において一晩インキュベートした。
【０２６７】
ｄ．ステップｃで染色およびインキュベートしたＢＭＤＣをＰＢＳで２回洗浄し、間接標識蛍光二次抗体および直接標識抗体を染色し、室温において３０分間暗所でインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＭＤＣのＩＦＮ−βおよびＩＬ−１βの分泌を試験して、フローサイトメトリーで分析した。
【０２６８】
ＤＣの成熟は、抗原の取り込み能力の低下と正の相関がある。したがって、ＤＣが成熟するように誘導されるかどうかは、その抗原取り込み能力を試験することによって判断できる。ＤＣの抗原取り込み能力は、ＤＣ食作用のモデル抗原としてＦＩＴＣ−デキストランを採用し、ＣＤ１１ｃ陽性ＤＣのＦＩＴＣ平均蛍光強度を試験することにより判断する。図１７に示すように、ｐＭＶＡ−１プラスミドまたはＤＯＴＡＰカチオン性脂質のみで処理されたＤＣは、ブランク対照群と同様のＦＩＴＣ平均蛍光強度値を有する。ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理されたＤＣ、ＣＴ２６細胞で刺激されたＤＣ、ならびにｐＭＶＡ−１プラスミド、ＤＯＴＡＰカチオン性脂質およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体でそれぞれ処理されたＣＴ２６細胞で刺激されたＤＣについては、ＦＩＴＣ平均蛍光強度が有意に低下した。実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体および腫瘍細胞の刺激がＤＣの抗原取り込みを阻害し、ＤＣの成熟を促進できることを示している。
【０２６９】
図１８は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したＣＴ２６細胞がインビトロで培養されたＢＭＤＣを刺激してサイトカインを分泌させ得るかどうかに関する実験結果を提供している。ブランク対照群、ｐＭＶＡ−１プラスミド群およびＤＯＴＡＰカチオン性脂質群の比較に基づいて、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理されたＣＴ２６細胞によりＢＭＤＣが刺激された後、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−１βの分泌が有意に増加した。実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理された腫瘍細胞がＳＴＩＮＧ経路を効果的に活性化し、ＤＣを誘導して腫瘍細胞を死滅させるサイトカインを分泌させ得ることを示している。
【０２７０】
実験データは、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がＤＣの成熟を直接誘導できるだけでなく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理された腫瘍細胞が抗腫瘍サイトカインを分泌するＤＣの機能をよりよく活性化して自然免疫応答を実行できることを示している。
【０２７１】
実施例１９；ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体で処理した、異なるマウス腫瘍モデルに関する実験
１  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、子宮頸がんの腹部転移を伴うヌードマウスの腫瘍成長を阻害できる
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌ヌードマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したヒト子宮頸がんＨｅｌａ細胞を細胞懸濁液に調製し、子宮頸がんの腹部転移を伴うヌードマウスを腹腔内注射によりモデル化した。各ヌードマウスに注射した細胞数は１×１０７個であり、注射系は各ヌードマウスについて２００μｌであった。
【０２７２】
モデル化に成功したヌードマウスを、表９に記載のような４つの群、すなわち生理食塩水群（ＮＳ）、ＤＯＴＡＰ群（空のベクター群）、ｐＭＶＡ−１群（空の薬物群）、およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群（治療群）にランダムに分割した。Ｈｅｌａ細胞の接種後３日目に、各実験群を表９に従って３日ごとに個々に腹腔内投与し、各実験群の体重を記録した。４回、つまり１２日の腹腔内投与後、対照群（ｐＭＶＡ−１）のヌードマウスが１匹死亡し、治療群を除く他の３群すべてのヌードマウスには明らかな腹水が存在し、すべてのヌードマウスが死亡した。ヌードマウスの腹水を採取して、その体積を測定し、がん細胞の数を数えた。腹水中のアポトーシス細胞をフローサイトメトリーで試験し、腹水細胞をギムザ染色により観察した。腫瘍を摘出し、その重量を測定した。腫瘍、組織および臓器をパラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学試験を行った。
【０２７３】
表９  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理した、子宮頸がんの腹部転移を伴うヌードマウスの群分けおよび投与量
【表９】
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【０２７４】
図１９は以下の実験結果を提供している：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ治療群のヌードマウスの体重（図１９Ａ）、腹水量（図１９Ｂ）、腫瘍小結節の数（図１９Ｃ）および腫瘍重量（図１９Ｄ）が、他の対照群よりも有意に低い（Ｐ＜０．０１）。図２０に示すように、治療群の腹水に中のアポトーシス細胞のパーセンテージは、他の対照群のそれよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。さらに、腫瘍組織切片のＨＥ染色の結果は、治療群の腫瘍組織に大量の炎症細胞浸潤があり、他の対照群には炎症細胞浸潤が全くまたはほとんどなかったことを示した。腹水中の細胞のギムザ染色により、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、対照群と比較して、ヌードマウスの腹腔内の腫瘍細胞および赤血球の生成を有意に阻害したことが明らかとなった。ヌードマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓のＨＥ染色により、ヌードマウスの各群に治療関連の組織病変がないことが示された。したがって、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体がより高い生物学的安全性を有し得ると考えられる。
【０２７５】
したがって、対照群と比較して、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、自然免疫応答を介して子宮頸がん細胞のアポトーシスを直接誘導し、子宮頸がん細胞の成長を有意に阻害することができる。
【０２７６】
２  プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は、卵巣がんの腹部転移を伴うヌードマウスの腫瘍成長を阻害できる。
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を細胞懸濁液に調製し、腹部腫瘍のあるマウスを腹腔内注射によりモデル化した。各マウスに注射した細胞数は１×１０７個であり、注射系は各マウスについて２００μｌであった。
【０２７７】
モデル化に成功したヌードマウスを、表１０に記載のような８つの群にランダムに分割した。腹腔内投与は、腫瘍接種の２日後に以下のように開始した：プラスミドＤＮＡ群の対照群の各マウスには１０μｇのプラスミド；ＤＯＴＡＰ群の対照群の各マウスには１００μｇのＤＯＴＡＰ；治療群の各マウスには１０μｇのＤＮＡおよび１００μｇのＤＯＴＡＰ  （プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体群）、すなわちプラスミドＤＮＡとＤＯＴＡＰとの質量比は１：１０であった。その後、マウスに３日ごとに投与した。すべてのマウスを、腫瘍の接種後３５日目に殺し、投与は合計で１０回であった。
【０２７８】
表１０  プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で治療した子宮頸がんの腹部転移を伴うヌードマウスの群分けおよび投与量
【表１０】
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【０２７９】
１０回の腹腔内投与後、陰性対照群のマウス１匹のみが自然に死亡し、他の実験群ではすべてのマウスを殺した。マウスの腹水を採取して、その体積を測定し、そこにあるがん細胞の量を数えた。
【０２８０】
図２１は以下の実験結果を提供している：３つの治療群でプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰを投与したヌードマウスの腹水量（図２１Ａ）、腫瘍重量（図２１Ｂ）および腹水のがん細胞の数（図２１Ｃ）が他の対照群よりも有意に低い（ｐ＜０．０１）。
【０２８１】
したがって、対照群と比較して、治療群のプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は、自然免疫応答を介して卵巣がん細胞のアポトーシスを直接誘導し、卵巣がん細胞の成長を有意に阻害することができる。
【０２８２】
３  プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は、ＣＴ２６腹部転移を伴うマウスの腫瘍成長を阻害できる
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したマウス結腸がん細胞株ＣＴ２６を細胞懸濁液に調製し、腹部腫瘍のあるマウスを腹腔内注射によりモデル化した。各マウスに注射した細胞数は１×１０６個であり、注射系は各マウスについて１００μｌであった。
【０２８３】
モデル化に成功したマウスを、表１１に記載のように群に分割した。それらに、腫瘍接種後５日目に以下のように腹腔内投与した：プラスミドＤＮＡ群の対照群の各マウスには１０μｇのＤＮＡ；ＤＯＴＡＰ対照群の各マウスには１００μｇのＤＯＴＡＰ；プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体群の治療群の各マウスには１０μｇのＤＮＡおよび１００μｇのＤＯＴＡＰ、すなわちプラスミドＤＮＡとＤＯＴＡＰとの質量比は１：１０であった。その後、３日ごとに合計５回投与した。
【０２８４】
表１１  プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で治療したＣＴ２６結腸がんの腹部転移を伴うモデルマウスの群分けおよび投与量
【表１１】
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【０２８５】
マウスに５回腹腔内投与し、各群の２匹のマウスを３回目の投与後２日目、すなわち腫瘍接種後１３日目に殺した。４回目の投与後１日目、すなわち腫瘍接種後１５日目に、各群の３匹のマウスを殺した。５回目の投与後４日目、すなわち腫瘍の接種後２１日目に、各群の５匹のマウスを殺した。マウスの腹水を採取して、その体積を測定し、腹水のがん細胞の数を数えた。腹水中のアポトーシス細胞をフローサイトメトリーで試験した。腫瘍を摘出し、重量測定した。腫瘍、組織および臓器をパラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学試験を行った。残りのマウスは自然死させ、無腫瘍統計を実施した。
【０２８６】
図２２は、以下の実験結果を提供している：３つのプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの自然死の数は、他の対照群のそれよりも有意に低かった（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）（図２２Ａ）；ｐＭＶＡ−３／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの腫瘍重量（図２２Ｂ）、腹水量（図２２Ｃ）、腹水のがん細胞数（図２２Ｄ）および腫瘍小結節数（図２２Ｅ）が他の対照群のそれよりも有意に低かった（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）。
【０２８７】
したがって、対照群と比較して、治療群のプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は結腸直腸がんＣＴ２６細胞の増殖を阻害する。
【０２８８】
４  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、マウスの肉腫の成長を阻害できる。
６〜８週齢のＫＭマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したマウス肉腫細胞株Ｓ１８０を細胞懸濁液に調製し、マウス皮下腫瘍を各マウスの右腋窩への皮下注射によりモデル化した。各マウスに注射した細胞数は１×１０７個であり、注射系は各マウスについて２００μｌであった。
【０２８９】
Ｓ１８０肉腫細胞の接種後５日目に、腫瘍を触診できた場合、４０匹の担腫瘍マウスを表１２に従ってランダムに４つの群に分割した：すなわち、陰性対照群（ＮＳ）、ＤＯＴＡＰ対照群、ｐＭＶＡ−１対照群および治療群ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群。次に、表１２に従ってマウスに皮下投与した：ｐＭＶＡ−１対照群の各マウスには２．５μｇのプラスミドｐＭＶＡ−１；ＤＯＴＡＰ対照群の各マウスには２５μｇのＤＯＴＡＰ；ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群の治療群の各マウスに対しては２．５μｇのＤＮＡおよび２５μｇのＤＯＴＡＰ、すなわち、プラスミドＤＮＡとＤＯＴＡＰとの質量比は１：１０であった。その後、３日ごとに合計５回投与した。マウスを殺し、腫瘍接種の２１日後にマウスの無腫瘍率を数えた。
【０２９０】
表１２  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理した、Ｓ１８０肉腫細胞を伴うマウスの皮下モデルの群分けおよび投与量
【表１２】
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【０２９１】
図２３に示すように、実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの無腫瘍率が９０％であることを示しており、これは他の対照群のそれよりも有意に高く、ＮＳ群の無腫瘍率は１％であり、ＤＯＴＡＰ群およびｐＭＶＡ−１群のそれは２０％である。
【０２９２】
ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、マウスの肉腫の成長を有意に阻害できることがわかる。
【０２９３】
５  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、マウスの上咽頭がんの成長を阻害できる。
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したヒト鼻咽頭がん腫細胞株ＣＮＥ−２を細胞懸濁液に調製し、マウス皮下腫瘍を各マウスの右腋窩への皮下注射によりモデル化した。各マウスに注射した細胞数は１×１０７個であり、注射系は各マウスについて２００μｌであった。
【０２９４】
モデル化に成功したヌードマウスを、表１３に記載のように４つの群にランダムに分割した。腫瘍接種後５日目に以下のように皮下投与した：ｐＭＶＡ−１群の対照群の各マウスには４μｇのプラスミド；ＤＯＴＡＰ対照群の各マウスには４０μｇのＤＯＴＡＰ；ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群の治療群の各マウスには４μｇプラスミドＤＮＡおよび４０μｇのＤＯＴＡＰ、すなわちプラスミドＤＮＡとＤＯＴＡＰとの質量比は１：１０であった。その後、マウスに３日ごとに投与し、腫瘍接種後２１日目にすべてのマウスを殺し、各群のマウスの腫瘍体積を５回投与後に測定した。
【０２９５】
表１３  ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で治療した、ＣＮＥ−２細胞を伴う皮下モデルマウスの群分けおよび投与量
【表１３】
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【０２９６】
図２４に示すように、実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの腫瘍体積が他の対照群の腫瘍体積よりも有意に低いことを示しており、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、ヒト鼻咽頭がん腫細胞の皮下モデルマウスの腫瘍成長を有意に阻害できることを示している。
【０２９７】
６  ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体によって活性化された、ＣＴ２６腹部転移を伴うマウスの長期免疫応答
実験（１）：プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で処理された、ＣＴ２６の腹部転移を伴うモデルマウス
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したマウス結腸直腸がん細胞株ＣＴ２６を細胞懸濁液に調製し、腹腔内注射によりマウス腹部腫瘍をモデル化した。各マウスに注射した細胞数は２×１０５個であり、注射系は各マウスについて１００μｌであった。
【０２９８】
表１４に記載のように、モデル化に成功したマウスを以下のように群に分割した：正常群には腫瘍細胞の接種も薬物の投与も行わなかった；未治療群には、薬物の代わりにＣＴ２６細胞を腹腔内接種した；ＮＳ群には腫瘍細胞を腹腔内接種し、生理食塩水を投与した。腫瘍の接種後、３日目にマウスに以下のように腹腔内投与した：プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体群の治療群の各マウスには１５μｇのプラスミドＤＮＡおよび７５μｇのＤＯＴＡＰ、すなわち、プラスミドＤＮＡとＤＯＴＡＰとの質量比は１：５であった。その後、３日ごとに合計９回投与した。
【０２９９】
表１４  プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で処理した、ＣＴ２６結腸直腸がんの腹部転移を伴うモデルマウスの群分けおよび投与量
【表１４】
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【０３００】
マウスに合計で９回投与し、自然に死亡させた。各実験群のマウスの自然死日を記録し、各実験群のマウスの体重および生存時間を計数した。腹水量を計数し、腫瘍を摘出し、重量を測定した。
【０３０１】
図２５に示すように、実験結果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ治療群のマウスの体重が正常群のマウスの体重と有意な差がないことを示しており、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体にはマウスに対する明らかな毒性がないことを示しており（図２５ａ）；さらに、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの平均腹水量は０．３ｍｌであり、これは陰性対照群のマウスの平均腹水量１．９１ｍｌ、ｐＭＶＡ−１群のマウスの平均腹水量の２．２２ｍｌ、およびＤＯＴＡＰ群のマウスの平均腹水量の３．１１ｍｌよりも有意に低かった。（図２５Ｂ）。陰性対照群、ｐＭＶＡ−１群およびＤＯＴＡＰ群はすべて腫瘍細胞接種後５４、５７および３９日目に死亡し、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの一部は腫瘍細胞接種後７８日目に生存していた。ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの生存期間は、他の実験群の生存期間よりも有意に長かった（図２５Ｃ）。マウスが死亡した後、腹部腫瘍を採取して重量を測定した。マウスの平均腫瘍重量は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群で２．９２ｇ、陰性対照群で７．９１ｇ、ｐＭＶＡ−１群で７．３５ｇ、ならびにＤＯＴＡＰ群で８．２３ｇであった。ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群のマウスの腫瘍重量は、陰性対照群、ｐＭＶＡ−１群およびＤＯＴＡＰ群と比較して有意に低下していた（図２５Ｄ）。
【０３０２】
したがって、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体はインビボで腫瘍細胞の成長を有意に阻害できることがわかる。
【０３０３】
実験（２）：プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で治療後の、ＣＴ２６の腹部転移を伴うモデルマウスの、腫瘍細胞再刺激に対する長期免疫応答
上記の実験（１）の場合、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰの治療群の２７匹のマウスの腹部腫瘍は、９回の投与後に完全に排除されており、この２７匹のマウスを表１５に記載のように再度群分けした。さらに、正常群の同じ一群の１４匹のマウスを選択し、表１５に従って群分けした。上記の実験（１）では、９回目の投与後２日目に、表１５の群分け条件に従って、１×１０６個の結腸直腸がん細胞ＣＴ２６および１×１０６個のマウス乳がん細胞４Ｔ１をそれぞれマウスに皮下接種した。各群のマウスの皮下腫瘍体積を３日ごとに測定した。腫瘍体積は、以下の式に従って計算した：Ｖ＝ａ×ｂ２×０．５２、式中、ａは腫瘍の長径であり、ｂは腫瘍の短径である。
【０３０４】
表１５  長期免疫応答実験群および腫瘍細胞の皮下接種
【表１５】
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【０３０５】
上記の実験（１）および（２）によれば、ＣＴ２６の腹部転移を有するモデルマウスの抗ＣＴ２６結腸直腸がん効果は、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で処理後、９０％超であった。ＣＴ２６皮下腫瘍および４Ｔ１皮下腫瘍の成長を観察するために、治療群のマウスに結腸がんＣＴ２６細胞および乳がん４Ｔ１細胞をそれぞれ皮下接種した。正常マウスの同じ一群（正常群）を２つの群に分割し、対照群と同じ腫瘍をそれぞれ接種した。実験結果を図２６に示す。
【０３０６】
（１）マウスをプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で処理した後、マウスのＣＴ２６皮下腫瘍の成長は有意に阻害され、ＣＴ２６皮下腫瘍実験群のマウスはほとんど無腫瘍となり（図２６Ａ）、治療群のマウスの生存期間は、対照群のマウスと比較して有意に長かった。
【０３０７】
（２）プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で治療したマウスの４Ｔ１皮下腫瘍は、対照群の４Ｔ１皮下腫瘍よりも緩慢に成長した（図２６Ｂ）。
【０３０８】
さらに、腫瘍組織の分析により、ＣＴ２６皮下腫瘍および４Ｔ１皮下腫瘍組織に、主にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球である大量のリンパ球の浸潤が存在することが示され、これは対照群よりも少なく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が、身体の抗腫瘍適応免疫応答を有意に改善できることを示している。この実験はさらに、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体で治療したマウスの脾臓ＮＫ細胞活性およびＣＴＬ腫瘍死滅活性が、対照群のそれよりも高かったことを示していた。
【０３０９】
上記の実験結果は、ＣＴ２６の腹部転移を伴うモデルマウスの場合、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体が治療マウスの全身性抗腫瘍記憶免疫応答をもたらし得ることを示している。同じタイプおよび異なるタイプの腫瘍細胞を含む腫瘍細胞によって再刺激された後、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は記憶Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞によって分泌される大量の免疫サイトカインを介して腫瘍細胞の成長を阻害し、腫瘍の免疫寛容を破ることができる。
【０３１０】
実施例２０；マウスＵ１４皮下モデルを治療するための、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と化学療法との併用
６〜８週齢のＣ５７雌マウスを飼育した。対数増殖期まで培養したマウス子宮頸がん細胞株Ｕ１４を細胞懸濁液に調製し、細胞密度は２×１０７／ｍｌであった。実験動物の右背中に、１００μｌ／マウスの注射系を皮下注射した。腫瘍が触診可能になったら（腫瘍体積が約４ｍｍ×４ｍｍ×３ｍｍ、すなわち接種後５日目）、マウスをランダムに６つの群に分割し、表１６の群分けおよび処理スキームに従って３日ごとに合計８回投与した。腫瘍体積を３日ごとに測定した。８回の投与後、マウスを殺し、皮下腫瘍を試験のために解剖した。
【０３１１】
表１６  ＰＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と化学療法との併用で治療したマウスＵ１４皮下モデルの群分けおよび治療スキーム
【表１６】
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【０３１２】
ここで、投与量は１００μｌ／マウスであり、ＤＤＰは週１回腹腔内投与する。ＤＤＰはシスプラチンであり、ＬＰはｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体である。
【０３１３】
図２７に示すように、実験結果は、シスプラチン群、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体とシスプラチンとの併用治療群で、腫瘍の成長が緩慢であることを示している。特に、併用治療群は最も緩慢な腫瘍成長を示し、上記の３つの群の腫瘍体積はＮＳ群、ＤＯＴＡＰ群およびｐＭＶＡ−１群よりも有意に低い。さらに、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体とシスプラチンとの併用治療群は、シスプラチン群およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群の単独よりも腫瘍体積が有意に小さい。
【０３１４】
腫瘍組織の分析により、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群、およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体とシスプラチンとの併用治療群で多数のリンパ球浸潤が観察されることが示されており、このような浸潤は化学療法群、ＤＯＴＡＰ群、ｐＭＶＡ−１群およびＮＳ群ではあまり一般的ではなく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体とシスプラチンとの併用治療が、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の抗腫瘍適応免疫応答をさらに強化できることを示している。
【０３１５】
したがって、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、身体の抗腫瘍免疫応答を有意に改善し、化学療法の抗腫瘍効果を強化することができる。それら両方の併用により腫瘍の成長が有意に阻害され、併用治療の抗腫瘍効果はシスプラチン単独の抗腫瘍効果よりも優れている。
【０３１６】
実施例２１；ヌードマウスのＨｅｌａ皮下モデルを治療するための、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と放射線療法との併用
６〜８週齢のヌードマウスを飼育した。対数増殖期まで培養したヒト子宮頸がん細胞株Ｈｅｌａを細胞懸濁液に調製し、細胞密度は１×１０７／ｍｌであった。実験動物の右背中に、１００μｌ／マウスの注射系を皮下注射した。腫瘍を触診可能になったら（腫瘍体積が約５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ、すなわち接種後７日目）、マウスをランダムに４つの群に分割した。具体的な投与計画については、表１７を参照されたい。接種の７日目に、マウスに以下のように投与した：併用治療群およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ群には、それぞれ１００μｌのプラスミドｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体（１０μｇのプラスミドｐＭＶＡ−１と１００μｇのＤＯＴＡＰにより形成される複合体）を腫瘍内注射し、ＮＳ群には１００μｌの生理食塩水を注射した。両方とも、週に２回、合計５回、複数の点に腫瘍内注射した。放射線療法群と併用治療群とは、初回用量の２４時間後（すなわち接種後８日目）に、放射線療法ごとに２Ｇｙ、線量率（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）２００ｃＧｙ／分、深さ皮膚表面（ｓｋｉｎ  ｓｏｕｒｃｅ）から２ｍｍで２日ごとに合計３回の放射線療法を受けた。５回の腫瘍内投与後、腫瘍体積を測定し、マウスを殺し、腫瘍組織を試験のために採取した。
【０３１７】
表１７  放射線療法とｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体との併用で治療した、ヌードマウスのＨｅｌａ皮下モデルの群分けおよび治療計画
【表１７】
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【０３１８】
図２８に示すように、実験結果は、放射線療法群、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群、およびｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と放射線療法との併用治療群の腫瘍体積がＮＳ群のそれよりも有意に低いことを示している。さらに、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と放射線療法との併用治療群の腫瘍体積は、放射線療法群単独の腫瘍体積よりも有意に低い。
【０３１９】
さらに、腫瘍組織の分析により、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と放射線療法との併用治療群で多数のリンパ球浸潤が観察されることが示されており、このような浸潤は放射線療法群およびＮＳ群ではあまり一般的ではなく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と化学療法との併用治療が、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の抗腫瘍適応免疫応答をさらに強化できることを示している。
【０３２０】
したがって、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、身体の抗腫瘍免疫応答を有意に改善し、放射線療法の抗腫瘍効果を強化することができる。それら両方の併用により腫瘍の成長が有意に阻害され、併用治療の抗腫瘍効果は放射線療法単独の抗腫瘍効果よりも優れている。
【０３２１】
ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と免疫応答調節因子との併用による腫瘍治療のインビボ実験では、本発明者らは実施例２０および２１と同様の実験結果を見出した：ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体は、腫瘍に対する身体の免疫応答を有意に改善し、免疫調節剤（例えば、サイトカイン、クラスＩＩ  ＨＬＡタンパク質結合ヘルパー分子、ＣＤ４０アゴニスト、チェックポイント受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｓｔａｔ３）、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３アゴニスト、ＣＤ４０Ｌアゴニストなど）の抗腫瘍効果を強化することができる。それら両方の併用により腫瘍成長が有意に阻害され、併用治療の抗腫瘍効果は免疫応答調節剤単独による治療の抗腫瘍効果よりも優れている。
【０３２２】
実施例２２；ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体をアジュバントとして組込むことにより調製した腫瘍細胞ワクチンの抗腫瘍効果
（１）ＣＴ２６結腸がん細胞インサイツワクチンの調製：
ａ．ｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ複合体の調製：実施例３を参照
【０３２３】
ｂ．アポトーシスおよび壊死ＣＴ２６結腸がん細胞の調製：
対数増殖期まで培養したＣＴ２６結腸がん細胞を１×１０６細胞／ウェルずつ６ウェルプレートに接種し、細胞が壁に付着するまで３７℃および５％ＣＯ２において培養した。次に、２００ｎｇ／ｍｌを含むアクチノマイシンＤ培地を添加し、１２時間培養してアポトーシスを誘導した。アポトーシス細胞懸濁液を収集した後、５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣと１０μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ製）を加え、混合し、室温において１５分間暗所でインキュベートし、フローサイトメーターによりアポトーシスについて試験して、後の使用のために濃縮および希釈した。
【０３２４】
さらに、対数増殖期のＣＴ２６細胞を、加熱法、すなわち５６℃の水浴で１時間により、壊死腫瘍細胞に調製した。細胞の壊死形態を顕微鏡下で観察した。細胞死率は、トリパンブルー色素排除によって試験した。壊死腫瘍細胞の懸濁液を収集し、等量の０．４％トリパンブルーと混合し、５〜１５分間放置した。
【０３２５】
ｃ．ＣＴ２６結腸がん細胞ワクチンの調製：
ｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ複合体をワクチンとして使用し、壊死またはアポトーシスのＣＴ２６結腸がん細胞と混合して、ＣＴ２６細胞ワクチンを調製した。
【０３２６】
（２）マウス結腸がんＣＴ２６腹部モデルにおけるＣＴ２６結腸がん細胞ワクチンの抗腫瘍効果の評価
【０３２７】
マウスに、１×１０６ＣＴ２６細胞／マウスずつ腹腔内注射した。注射後３日目からマウスに腹腔内投与し、これらを生理食塩水群（ＮＳ）、ｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ壊死細胞ワクチン群（ＮＥＣＲＯ）およびｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰアポトーシス細胞ワクチン群（ＡＰＯＰ）に分割した。マウスに週一回腹腔内投与した。マウスの生存期間を記録した。
【０３２８】
図２９に示すように、ワクチン群（ＮＥＣＲＯおよびＡＰＯＰを含む）のマウスの生存期間は、生理食塩水群（ＮＳ）のマウスと比較して有意に延長された。特に、３０日のＮＳ群の生存率は０であったが、８０日のＮＥＣＲＯ群およびＡＰＯＰ群の生存率はそれぞれ４０％と８０％であった。ｐＶＡＸ１／ＤＯＴＡＰ複合体は、壊死またはアポトーシス腫瘍細胞の免疫原性を有意に改善でき、それらを混合して調製した腫瘍細胞ワクチンは優れた抗腫瘍効果を有する。
【０３２９】
上記の実験結果は、ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が腫瘍細胞ワクチンのアジュバントとして使用でき、壊死／アポトーシス細胞ワクチンの免疫応答を有意に改善して、身体の抗腫瘍を活性化し、腫瘍成長の効果的阻害および生存期間の延長という目的を達成する。
【０３３０】
上記の実施例は、外因性遺伝子を発現しない複製可能なＤＮＡとカチオン性生体材料とによって形成される本発明のＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体、またはインビトロでのこれらのＤＮＡの酸化により形成される酸化ＤＮＡとカチオン性生体材料とにより形成される酸化ＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体が、腫瘍ワクチンまたは腫瘍細胞ワクチンのアジュバントとして腫瘍を直接死滅させるために相乗的な役割を果たすことができ、さらに身体の自然免疫応答および適応反応の抗腫瘍効果を相乗的に活性化し、抗腫瘍長期記憶免疫を生成して腫瘍免疫寛容を破るように身体を誘導できることを示している。したがって、本発明のＤＮＡ／カチオン性生体材料複合体は、単独で、または異なるタイプの腫瘍を治療するための他の腫瘍治療方法と併用して、腫瘍ワクチンとして使用することができる。
【０３３１】
上記の実施形態は、本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態が上記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の精神および原理から逸脱することなく行われる他の変更、修正、置換、組み合わせ、および単純化は、本発明と同等の代替方法であり、本発明の保護範囲に含まれるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月21日(2020.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
表２  異なる質量比のＤＮＡ／カチオン性脂質材料
【表２】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
表３  異なる質量比のＤＮＡ／ＰＥＩ２５ｋＤ複合体
【表３】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
表４  異なる質量比のＤＮＡ／キトサン複合体
【表４】
2020525455.tif 000065
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１９】
さらに、腫瘍組織の分析により、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体群、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と放射線療法との併用治療群で多数のリンパ球浸潤が観察されることが示されており、このような浸潤は放射線療法群およびＮＳ群ではあまり一般的ではなく、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体と放射線療法との併用治療が、ｐＭＶＡ−１／ＤＯＴＡＰ複合体の抗腫瘍適応免疫応答をさらに強化できることを示している。
【国際調査報告】
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