(57)【要約】  その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、システムおよび方法。一つの例において、約２０Ｈｚ〜約６０Ｈｚ、より具体的には約４０Ｈｚの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが当該対象に非侵襲的に送達され、当該対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導する。特に様々な治療プロトコールおよび暴露プロトコールに従い、聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせは、（聴覚刺激単独または視覚刺激単独とは対照的に）内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）中のミクログリア反応を促進する。概して、聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせは、聴覚皮質、視覚皮質およびｍＰＦＣ中で拡張されたミクログリアクラスター形成反応を誘導する。【選択図】図７−７
2020536653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
Ａ）約２０Ｈｚ〜約６０Ｈｚの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせを前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導することを含む、方法。
【請求項２】
Ａ）において、前記聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａ）において、前記聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが、約４０Ｈｚの周波数を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ａ）が、聴覚皮質（ＡＣ）、視覚皮質（ＶＣ）、海馬（ＨＰＣ）および内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）から選択される少なくとも一つの皮質領域の５％以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ａ）が、ｍＰＦＣに約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ａ）が、
Ａ１）新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域中のミクログリア反応を増加させること、を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ａ１）が、
アミロイドプラークの２５マイクロメートル以内のミクログリア数を増加させること、
ミクログリアの細胞体の直径を増加させること、
ミクログリアの突起長を減少させること、および  
ミクログリア細胞数を増加させること、のうちの少なくとも一つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａ１）が、ミクログリアの細胞体の直径を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ａ１）が、ミクログリアの突起長を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ａ１）が、ミクログリアの細胞数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの皮質領域が、ｍＰＦＣを含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ａ１）が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ａ１）が、７日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ａ）が、
Ａ２）新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域中のアミロイドプラークを減少させることを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ａ２）が、プラークの大きさを少なくとも約５０％減少させることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａ２）が、プラーク数を少なくとも約５０％減少させることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも一つの皮質領域が、ｍＰＦＣを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ａ２）が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
Ａ２）が、７日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ａ）が、
Ａ３）新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域中のアミロイド−β（Ａβ）ペプチドの量を減少させることを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
Ａ３）が、前記Ａβペプチドの量を少なくとも５０％減少させることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ａ３）において、前記Ａβペプチドは、Ａβ１−４０ペプチドアイソフォームおよびＡβ１−４２ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む、請求項２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
Ａ３）において、前記Ａβペプチドは、可溶性Ａβペプチドおよび不溶性Ａβペプチドのうちの少なくとも一つを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの皮質領域が、ｍＰＦＣを含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ａ３）が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
Ａ３）が、７日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数で視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御すること、
電気音声シグナルを、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御すること、および
前記対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達することであって、前記組み合わせ刺激は、同期して並んだ前記視覚刺激と音刺激を含み、前記組み合わせ刺激は、前記対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導し、前記同期化ガンマ振動は、前記対象の認知機能の改善を生じさせること、を含む、方法。
【請求項２８】
前記視覚刺激は、１２．５ミリ秒の点灯と、次いで１２．５ミリ秒の消灯の反復を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記視覚刺激装置が、４０〜８０Ｗの電力を有する発光ダイオードである、請求項２７または２８のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記聴覚刺激が、約４％〜約８０％の負荷サイクルで４０Ｈｚで再生される１０ｋＨｚの音調を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記視覚刺激が、約１０％〜約８０％の負荷サイクルで１０秒間、４０Ｈｚで明滅される光を含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記視覚刺激および前記聴覚刺激が、同期化される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記視覚刺激および前記聴覚刺激が、−１８０〜０度または０〜１８０度位相がずれている、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記認知症が、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および加齢に伴う記憶障害のうちの少なくとも一つと関連している、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
Ａ）約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせを前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導することを含み、前記Ａ）が、
Ａ１）前記対象の内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）に周期的なスパイク反応を誘導すること、
Ａ２）前記ｍＰＦＣに約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導すること、および
Ａ３）前記ｍＰＦＣ中のミクログリア反応を増加させること、のうちの少なくとも一つを含む、方法。
【請求項３６】
Ａ）が、Ａ３）を含み、前記Ａ３）が、
アミロイドプラークの２５マイクロメートル以内のミクログリア数を増加させること、
ミクログリアの細胞体の直径を増加させること、
ミクログリアの突起長を減少させること、および  
ミクログリア細胞数を増加させること、のうちの少なくとも１つを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ａ３）が、ミクログリアの細胞体の直径を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ａ３）が、ミクログリアの突起長を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
Ａ３）が、ミクログリアの細胞数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
Ａ３）が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
Ａ３）が、７日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、以下の米国仮特許出願明細書のそれぞれに対する優先権を主張する。２０１７年１０月１０日に出願され、「ＮＥＵＲＯＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＣＯＭＢＩＮＥＤ  ＳＥＮＳＯＲＹ  ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ」（代理人整理番号  ＭＩＴＸ−９６９９／００ＵＳ）という表題の米国仮特許出願第６２／５７０，２５０号明細書；および２０１７年１０月１１日に出願され、「ＧＡＭＭＡ  ＥＮＴＲＡＩＮＭＥＮＴ  ＢＩＮＤＳ  ＨＩＧＨＥＲ  ＯＲＤＥＲ  ＢＲＡＩＮ  ＲＥＧＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＯＦＦＥＲＳ  ＮＥＵＲＯＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ」（代理人整理番号  ＭＩＴＸ−００７０／００ＵＳ）という表題の米国仮特許出願第６２／５７０，９２９号明細書。これらの各仮特許出願明細書は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援に関する表明
本発明は、国立衛生研究所により与えられたグラント番号ＲＦ１  ＡＧ０４７６６１に基づく米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶、見当識および論理的思考の低下を特徴とする進行性の神経変性疾患である。アルツハイマー病は、世界で最も普遍的な認知症であり、米国においては６５歳を超える人々のおよそ８人に１人が罹患し、第６位の死亡原因となっている。この進行性の神経変性障害の罹患率は、今後１０年間で４０％増加すると推定されている。
【０００４】
病理組織学的には、ＡＤはアミロイドプラークの蓄積が特徴であり、アミロイドプラークにはアミロイド−β（Ａβ）ペプチドと、タウタンパク質から生成される神経原線維変化（ＮＦＴ：ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）が含まれる。Ａβペプチドは３６〜４３アミノ酸のタンパク質であり、その正常な生理学的機能はまだ特定されていない。Ａβペプチドは、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１：β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  １）とγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ：ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の連続的なタンパク質切断によって形成される。Ｃ末端断片β（β−ＣＴＦ：Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  β）は、ＢＡＣＥ１によるＡＰＰのアミロイド生成切断の間に生成されるＡＰＰ誘導体であり、Ａβペプチド産生のもう一つの指標である。正常な状態では、可溶性のＡβペプチドが産生され、ニューロンによって分泌される。その後は脳脊髄液（ＣＳＦ：ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）経路を介して脳から除去される。しかしながらＡＤを有する対象では、Ａβペプチドは高次型へと凝集し、濃度依存性に可溶性のオリゴマーと不溶性のプラークを形成すると考えられる。この凝集は多くの神経毒性現象をもたらす可能性があり、当該現象としては脳代謝の混乱、神経炎症、機能的結合性の低下、シナプスとニューロンの喪失、および／またはＮＦＴの形成が挙げられる。
【０００５】
Ａβ濃度とニューロン活動の間の根本的な関連性が報告されている。第一に、ＡＰＰを過剰発現するトランスジェニック（Ｔｇ：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスから調製された器官型の海馬切片に、テトロドトキシンを用いた処置を行うと、ニューロン活動が低下し、その後にＡβレベルが低下した。次いでピクロトキシンで処置することで反対の作用−ニューロン活動の上昇−が観察された。ニューロン活動を使用したＡβペプチド濃度の動的調節と、インビボでの最終的なプラーク沈着も実証されている。ヒトＡＤ患者の神経画像撮影により、最も重度のプラーク沈着は「デフォルト−モードネットワーク」として知られる最も一貫して活動的な脳の領域に沿っている可能性が示されている。
【０００６】
現在ＡＤには治療法がなく、治療選択肢はＡＤの病態進行を阻害するものではなく、主には一時的な緩和であり、および／または複数の厄介な副作用がある場合がある。例えば、Ａβペプチドおよび／またはその前駆体を標的とする予防的、および／または治療的な戦略（例えば、Ａβの免疫療法ならびにβ−およびγ−セクレターゼの阻害）は臨床試験で毒性があり、および／またはＡＤ病変の減少に効果がなかった。アミロイドベータワクチン（例えば、バピニューズマブ（ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ））を含む臨床試験は、認知機能の利益が無く、失敗に終わった。ガンマ−セクレターゼ阻害剤（例えば、セマガセスタット（ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ））は臨床試験に失敗し、被験者の認知障害を悪化させた。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）およびリバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ））およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）−受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン（ｍｅｍａｎｔｉｎｅ））といった既存の薬剤でさえ、軽度の認知機能の利益を実証したのみである。
【発明の概要】
【０００７】
２０１６年１１月２３日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＶＥＮＴＩＮＧ，ＭＩＴＩＧＡＴＩＮＧ，ＡＮＤ／ＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＤＥＭＥＮＴＩＡ」という表題の米国特許出願第１５／３６０，６３７号（その全体の参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、視覚刺激または聴覚刺激を通して脳に同期化ガンマ振動を誘導することにより、一部の脳領域においてアミロイド負荷量の低下と形態変化が生じた。しかし発明者らは、学習と記憶、そして他の高次脳機能の大部分を担う複数の脳中枢に影響を与える多種回路性（ｃｉｒｃｕｉｔ−ｗｉｄｅ）の疾患に対処する、認知症およびアルツハイマー病の治療のためのシステムならびに方法が未だ必要とされていることを認識し、理解している。
【０００８】
前述の観点において、本開示は少なくとも部分的には、本明細書において概して「感覚刺激を使用したガンマエントレインメント」（ＧＥＮＵＳ：Ｇａｍｍａ  ＥＮｔｒａｉｎｍｅｎｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  ｓｔｉｍｕｌｉ）と呼称される様々な技術に従い、対象の脳にガンマ振動を誘導する聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせに関するものである。本明細書に開示されるように、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせ（例えば視覚ＧＥＮＵＳおよび聴覚ＧＥＮＵＳの組み合わせ）は予想外なことに、視覚ＧＥＮＵＳ単独または聴覚ＧＥＮＵＳ単独では観察されなかったポジティブな生理学的変化および行動学的変化を生じさせた。聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせから生じる脳へのポジティブな効果は、聴覚皮質（ＡＣ：ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｃｏｒｔｅｘ）および海馬（ＨＰＣ：ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）に限定されておらず、特に内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ：ｍｅｄｉａｌ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）におけるミクログリアのクラスター形成反応の誘導と、新皮質全体のアミロイド負荷量の減少へと拡張されていた。聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせの効果はさらに治療／暴露の短期間のフレームを超えて観察されている（週単位）。
【０００９】
一つの態様において、本開示は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、方法およびシステムを提供するものであり、当該方法は、当該対象に、約２０Ｈｚ〜約６０Ｈｚの周波数を有する聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせを非侵襲的に送達し、当該対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。一部の実施形態では、認知症は、ＡＤ、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および／または加齢に伴う認知低下に関連する。対象は、ヒトまたは動物であってもよい。
【００１０】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせ約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数、または約４０Ｈｚの周波数を有する。
【００１１】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達は、聴覚皮質（ＡＣ）、視覚皮質（ＶＣ）、海馬（ＨＰＣ）および内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）から選択される少なくとも一つの皮質領域の５％以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導する。一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、ｍＰＦＣにおいて約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ：ｌｏｃａｌ  ｆｉｅｌｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を誘導する。
【００１２】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、少なくとも一つの皮質領域においてミクログリア反応を増加させる。皮質領域は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、ｍＰＦＣにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
【００１３】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、アミロイドプラークの２５マイクロメートル以内のミクログリア数の増加、ミクログリアの細胞体の直径の増加、ミクログリアの突起長の減少、およびミクログリアの細胞数の増加、から選択される少なくとも一つの効果を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞体の直径における、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の増加を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの突起長における、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の減少を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞数における、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の増加を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
【００１５】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイドプラークの減少を含む。皮質領域は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、ｍＰＦＣにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
【００１６】
ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの大きさの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０％の減少を含む。ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの数の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０％の減少を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
【００１８】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイド−β（Ａβ）ペプチド量の減少を含む。皮質領域は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、ｍＰＦＣにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
【００１９】
ある実施形態では、Ａβペプチド量の減少は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０％の量の減少を含む。一部の実施形態では、Ａβペプチドは、Ａβ１  ４０ペプチドアイソフォームと、Ａβ１−４２ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む。一部の実施形態では、Ａβペプチドは、可溶性Ａβペプチドと、不溶性Ａβペプチドのうちの少なくとも一つを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
【００２１】
第二の態様において、本開示は、その必要のある対象における認知症またはアルツハイマー病の治療方法を提供し、当該方法は、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数の視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御する工程、電気音声シグナルを、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御する工程、および当該対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達する工程を含み、当該組み合わせ刺激は、同期して並んだ視覚刺激と音刺激を含み、当該組み合わせ刺激は、当該対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導する。同期化ガンマ振動は、当該対象において認知機能の改善を生じさせる。
【００２２】
一部の実施形態では、視覚刺激は、１２．５ミリ秒の点灯と、次いで１２．５ミリ秒の消灯の反復を含む。一部の実施形態では、光生成（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ）刺激装置は、４０〜８０Ｗの電力の発光ダイオードである。一部の実施形態では、聴覚刺激は、約４％〜約８０％の負荷サイクルで４０Ｈｚで再生される１０ｋＨｚの音調（ｔｏｎｅ）を含む。一部の実施形態では、視覚刺激は、約１０％〜約８０％の負荷サイクルで１０秒間、４０Ｈｚで明滅される光を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は同期化される。一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は、−１８０〜０度または０〜１８０度位相がずれている。
【００２４】
当然のことながら、前述の概念および以下でより詳細に考察する追加的概念のすべての組み合わせは（このような概念は相互に矛盾していないという前提で）、本明細書に開示する本発明の主題の一部であると考えられる。特に、本開示の最後に現れる、特許請求の範囲に記載する主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示する発明主題の一部であると考えられる。また当然のことながら、参照により組み込まれるあらゆる開示において明示的に用いられる用語には、本明細書に開示する特定の概念と最も一致する意味を与える必要がある。
【００２５】
以下の図表および詳細な記載を検討すると、他のシステム、プロセス、および特徴が当業者に明らかとなるであろう。このようなさらなるシステム、プロセス、および特徴すべてが、本記載内に含まれ、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
特許または出願ファイルには、色付きで作成された少なくとも一つの図面が包含されている。
【００２７】
当業者であれば、図面が主として例示的な目的であること、そして本明細書に記載する本発明の主題の範囲を制限することを意図していないことを理解するだろう。図面は必ずしも一定の比率ではなく、一部の例では、本明細書に開示する本発明の主題の様々な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために、図面内で誇張または拡大されて示されうる。図面では、同様の参照文字は概して、例えば同様の特徴（例えば、機能的に類似した、および／または構造的に類似した要素）を意味する。
【００２８】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｌは、４０Ｈｚの聴覚刺激が、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいて、スパイク活動を調節することを示す。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図１−５】同上。
【図１−６】同上。
【図１−７】同上。
【図１−８】同上。
【図１−９】同上。
【図１−１０】同上。
【図１−１１】同上。
【図１−１２】同上。
【図１−１３】同上。
【図１−１４】同上。
【図１−１５】同上。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｊは、聴覚ＧＥＮＵＳが、５ＸＦＡＤマウスにおいて、認知記憶および空間記憶のタスクを改善することを示す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図２−５】同上。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｉは、聴覚ＧＥＮＵＳが、５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよびＨＰＣにおいて、アミロイド負荷量を減少させることを示す。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【図３−５】同上。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｋは、聴覚ＧＥＮＵＳが、５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよびＣＡ１において、グリア反応を誘導することを示す。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図４−４】同上。
【図４−５】同上。
【図４−６】同上。
【図５−１】図５Ａ−５Ｆは、聴覚ＧＥＮＵＳが、アミロイド−脈管系の関連性を増加させることを示す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｉは、聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせが、ミクログリアによるクラスター形成性の表現型反応を誘導することを示す。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【図６−５】同上。
【図６−６】同上。
【図６−７】同上。
【図６−８】同上。
【図６−９】同上。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｊは、聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせが、ｍＰＦＣと新皮質において、アミロイド負荷量を減少させることを示す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図７−５】同上。
【図７−６】同上。
【図７−７】同上。
【図７−８】同上。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｒは、２０Ｈｚおよび８０Ｈｚの聴覚刺激が、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいて、活動を調節することを示す。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【図８−６】同上。
【図８−７】同上。
【図８−８】同上。
【図８−９】同上。
【図８−１０】同上。
【図８−１１】同上。
【図８−１２】同上。
【図８−１３】同上。
【図８−１４】同上。
【図８−１５】同上。
【図８−１６】同上。
【図８−１７】同上。
【図８−１８】同上。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｌは、聴覚ＧＥＮＵＳが、マウスの行動に影響を与えないことを示す。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【図９−５】同上。
【図９−６】同上。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｈは、聴覚ＧＥＮＵＳが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、プラーク負荷量を改善することを示す。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１０−５】同上。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｈは、聴覚ＧＥＮＵＳが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ミクログリア反応を誘導することを示す。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｌは、聴覚ＧＥＮＵＳが、Ｐ３０１Ｓマウスにおいて、リン酸化タウを減少させることを示す。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【図１２−６】同上。
【図１２−７】同上。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｕは、４０Ｈｚの聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせが、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいて、スパイク活動を調節することを示す。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１３−５】同上。
【図１３−６】同上。
【図１３−７】同上。
【図１３−８】同上。
【図１３−９】同上。
【図１３−１０】同上。
【図１３−１１】同上。
【図１３−１２】同上。
【図１３−１３】同上。
【図１３−１４】同上。
【図１３−１５】同上。
【図１３−１６】同上。
【図１３−１７】同上。
【図１３−１８】同上。
【図１３−１９】同上。
【図１３−２０】同上。
【図１３−２１】同上。
【図１４−１】図１４Ａ〜図１４Ｖは、１週間の聴覚ＧＥＮＵＳまたは視覚ＧＥＮＵＳのみでは、ｍＰＦＣの病変に影響を与えないことを示す。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１４−４】同上。
【図１４−５】同上。
【図１４−６】同上。
【図１４−７】同上。
【図１４−８】同上。
【図１４−９】同上。
【図１４−１０】同上。
【図１４−１１】同上。
【図１４−１２】同上。
【図１４−１３】同上。
【図１４−１４】同上。
【図１４−１５】同上。
【図１４−１６】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
聴覚および視覚の感覚刺激を使用したガンマエントレインメント（ＧＥＮＵＳ）の組み合わせは、予想外なことに、視覚ＧＥＮＵＳまたは聴覚ＧＥＮＵＳの単独では観察されなかったポジティブな生理学的および行動学的な変化を生じさせる。脳に対するポジティブな効果は、聴覚皮質（ＡＣ）および海馬（ＨＰＣ）に限定されておらず、むしろ内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）におけるミクログリアのクラスター形成反応の誘導と、新皮質全体のアミロイド負荷量の減少へと拡張されていた。聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせの効果はさらに短期間のフレームを超えて観察されている（週単位）。約１週間の聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせにより、大規模回路ネットワークに及ぶ脳領域においてアルツハイマー病（ＡＤ）の病変が改善される。特に聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせは、ＡＣ、視覚皮質（ＶＣ）、海馬小領域（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）ＣＡ１、およびｍＰＦＣにおいて、大規模なアミロイド負荷量の減少を生じさせる。聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせは、ミクログリアのクラスター形成反応と、内側前頭前皮質におけるアミロイドの減少を生じさせる。聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせは、新皮質全体でアミロイドプラークの広範な減少を生じさせる。
【００３０】
一つの態様において、本開示は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、方法およびシステムを提供するものであり、当該方法は、当該対象に、約２０Ｈｚ〜約６０Ｈｚの周波数を有する聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせを非侵襲的に送達し、当該対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。一部の実施形態では、認知症は、ＡＤ、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および／または加齢に伴う認知低下に関連する。対象は、ヒトまたは動物であってもよい。
【００３１】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせが約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数、または約４０Ｈｚの周波数を有する。
【００３２】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達は、聴覚皮質（ＡＣ）、視覚皮質（ＶＣ）、海馬（ＨＰＣ）および内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）から選択される少なくとも一つの皮質領域の５％以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導する。一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、ｍＰＦＣにおいて約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ：ｌｏｃａｌ  ｆｉｅｌｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を誘導する。
【００３３】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、少なくとも一つの皮質領域においてミクログリア反応を増加させる。皮質領域は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、ｍＰＦＣにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
【００３４】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、アミロイドプラークの２５マイクロメートル以内のミクログリア数の増加、ミクログリアの細胞体の直径の増加、ミクログリアの突起長の減少、およびミクログリアの細胞数の増加、から選択される少なくとも一つの効果を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞体の直径における、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の増加を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの突起長における、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の減少を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞数における、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の増加を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
【００３６】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイドプラークの減少を含む。皮質領域は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、ｍＰＦＣにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
【００３７】
ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの大きさの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０％の減少を含む。ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの数の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０％の減少を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
【００３９】
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣ、およびｍＰＦＣから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイド−β（Ａβ）ペプチド量の減少を含む。皮質領域は、新皮質、ＡＣ、ＶＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、ｍＰＦＣにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
【００４０】
ある実施形態では、Ａβペプチド量の減少は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０％の量の減少を含む。一部の実施形態では、Ａβペプチドは、Ａβ１  ４０ペプチドアイソフォームと、Ａβ１−４２ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む。一部の実施形態では、Ａβペプチドは、可溶性Ａβペプチドと、不溶性Ａβペプチドのうちの少なくとも一つを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
【００４２】
第二の態様において、本開示は、その必要のある対象における認知症またはアルツハイマー病の治療方法を提供し、当該方法は、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数の視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御する工程、電気音声シグナルを、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御する工程、および当該対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達する工程を含み、当該組み合わせ刺激は、同期して並んだ視覚刺激と音刺激を含み、当該組み合わせ刺激は、当該対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導する。同期化ガンマ振動は、当該対象において認知機能の改善を生じさせる。
【００４３】
一部の実施形態では、視覚刺激は、１２．５ミリ秒の点灯と、次いで１２．５ミリ秒の消灯の反復を含む。一部の実施形態では、光生成（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ）刺激装置は、４０〜８０Ｗの電力の発光ダイオードである。一部の実施形態では、聴覚刺激は、約４％〜約８０％の負荷サイクルで４０Ｈｚで再生される１０ｋＨｚの音調を含む。一部の実施形態では、視覚刺激は、約１０％〜約８０％の負荷サイクルで１０秒間、４０Ｈｚで明滅される光を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は同期化される。一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は、−１８０〜０度または０〜１８０度位相がずれている。本明細書において使用される場合、「位相」とは、聴覚刺激と視覚刺激の間の時間差を指し、度で表され、０度は、聴覚と視覚の同時刺激を意味し、−１８０度または＋１８０度とは、視覚刺激と聴覚刺激が交互であることを指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。一部の実施形態では、治療を必要とする対象には、既に疾患または状態を有する対象、ならびに疾患または状態を発現させる可能性がある対象、および目的が疾患もしくは状態の予防、遅延または軽減である対象が挙げられる。例えば一部の実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、方法およびシステムは、対象が遺伝的に発症しやすい疾患または状態、例えばＡＤを予防、遅延または軽減させるために採用されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、方法およびシステムは、対象がすでに診断されている疾患または状態、例えばＡＤの症状を治療、緩和、減少させるために、および／または進行を遅延させるために採用されてもよい。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、例えば齧歯類、ネコ科、イヌ科または霊長類などの哺乳動物を意味する。本発明の対象は、ヒトであることが好ましい。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、「約」が改変する客体の±１０パーセントを指す。
【００４８】
認知症とは、知的能力の減少および／または記憶障害を特徴とする障害である。認知症には例えばＡＤ、血管性認知症、レビー小体型認知症、ピック病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＡＩＤＳ認知症、加齢に伴う認知障害、および加齢に伴う記憶障害が含まれる。認知症は、神経学的および／または精神医学的な状態、例えば脳腫瘍、脳病変、てんかん、多発性硬化症、ダウン症、レット症候群、進行性核上性麻痺、前頭葉症候群、統合失調症および外傷性脳損傷などと関連していてもよい。
【００４９】
ＡＤは、先進国において最も頻度の高い神経変性疾患である。ＡＤは、アミロイドプラークの蓄積が組織病理学的な特徴であり、アミロイドプラークはＡβペプチドと、タウタンパク質から生成されるＮＦＴから構成される。臨床的には、ＡＤは、記憶力、機能、言語能力、判断および実行機能の減少を特徴とする進行性の認知障害と関連している。ＡＤは、その後期の段階で重度の行動症状が生じることが多い。
【００５０】
血管性認知症は、脳血管性認知症と呼称されることもあり、脳血管性疾患を指すこともある（例えば大脳半球の梗塞）。これらは通常、改善と段階的な悪化期間を伴う流動的な経過を有する。血管性認知症は、見当識障害、記憶力の衰え、および／もしくは判断力の衰えのうちの一つまたは複数を含み得る。血管性認知症は、別個の複合的な梗塞を原因とする場合があり、または他の血管性の原因、例えば全身性エリテマトーデスで見出される自己免疫性血管炎、例えばライム病などの感染性血管炎、再発性の脳出血、および／または脳卒中を原因とする場合もある。
【００５１】
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、進行性の神経変性障害である。ＦＴＤの対象は概して顕著な行動および性格の変化を呈し、多くの場合、言語障害が付随する。
【００５２】
レビー小体型認知症は、ＡＤと重複する特性を伴う認知症の発現、パーキンソン病の特徴の発現、および／または幻覚症状の早期発現のうちの一つまたは複数の症状を特徴とする。レビー小体型認知症は一般的に、日々の症状の重症度の変動を特徴とする。
【００５３】
一部の態様において、本開示は、対象において認知症を予防、緩和、および／または治療するための方法を提供するものであり、当該方法は、対象の脳において同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。一部の実施形態では、神経学的な疾患もしくは障害、または加齢に伴う衰退に苦しむ対象におけるガンマ振動の誘導は、当該疾患もしくは障害、または加齢に伴う衰退の結果としての、またはそれらに関連している、対象において混乱したガンマ振動リズムを回復させるよう作用する。
【００５４】
一部の実施形態では、ガンマ振動の誘導は、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のアイソフォームの生成を減少させる。一部の実施形態では、ガンマ振動の誘導は、対象の脳からのＡβ（例えばＡβ１−４０アイソフォームおよびＡβ１−４２アイソフォーム）のクリアランスを強化する。一部の実施形態では、ガンマ振動の誘導は、対象の脳においてＡβの蓄積を予防する。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、治療前の対象の脳内のＡβレベルと比較して、対象の脳内のＡβレベルを約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％以上減少させる。一部の実施形態では、対象の脳内のＡβレベルは、治療前の対象の脳内のＡβレベルと比較して少なくとも約５０％に減少する。
【００５５】
一部の実施形態では、対象の脳内のＡβレベルは、対象の脳内のＡＰＰ切断の低下を介して減少する。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、治療前の対象の脳内のＡＰＰ切断レベルと比較して、対象の脳内のＡＰＰ切断レベルを約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％以上減少させる。一部の実施形態では、対象の脳内のＡＰＰ切断レベルは、治療前の対象の脳内のＡＰＰ切断レベルと比較して少なくとも約５０％に減少する。一部の実施形態では、ＡＰＰ切断レベルは、対象の脳内のＣ末端断片β（β−ＣＴＦ）のレベルにより測定される。一部の実施形態では、脳内のＡＰＰ切断レベルは、例えばβおよび／またはγ−セクレターゼ活性の阻害レベルの上昇などによる、βおよび／またはγ−セクレターゼの阻害を介して減少する。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、対象の脳内のＡβプラークの凝集を減少させる。
【００５６】
一部の実施形態では、本発明方法は、対象の認知能力および／または記憶力を改善する。
【００５７】
別の態様では、本開示は、対象の脳内に、神経保護的プロファイルまたは神経保護的環境を誘導する工程を含み、当該工程は、当該対象の脳内に同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。例えば一部の実施形態では、神経保護的プロファイルは、神経保護的ミクログリア細胞プロファイルと関連している。さらなる実施形態では、神経保護的プロファイルは、Ｍ−ＣＳＦ経路の活性の増加により誘導され、またはこれと関連している。一部の実施形態では、神経保護的環境は、抗炎症性シグナル伝達経路と関連している。例えば一部の実施形態では、抗炎症性シグナル伝達経路は、抗炎症性ミクログリアシグナル伝達経路である。
【００５８】
一部の実施形態では、神経保護的プロファイルは、炎症促進性グリア細胞の活性の低下、または欠落と関連している。炎症促進性グリア細胞の活性は、ミクログリアのＭ１表現型と関連しており、反応性酸素種（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ）、神経分泌性タンパク質のクロモグラニンＡ、分泌性補因子シスタチンＣ、ＮＡＰＤＨオキシダーゼ、例えばｉＮＯＳなどの酸化窒素シンターゼ酵素、ＮＦ−ｋＢ依存性炎症性反応タンパク質、ならびに炎症促進性のサイトカインおよびケモカイン（例えばＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＦＮγ）の産生を含む。
【００５９】
対照的にミクログリアのＭ２表現型は、炎症の下方制御と、炎症誘導性損傷の回復と関連している。抗炎症性サイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、および／またはＴＧＦβ）、ならびに貪食活性増加は、Ｍ２表現型と関連している。したがって一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、ミクログリアにおいて神経保護的なＭ２表現型を惹起させる。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、対象の脳内の貪食活性を上昇させる。例えば一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、ミクログリアの貪食活性を上昇させ、Ａβのクリアランスを増加させる。
【００６０】
ガンマ振動は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚを含んでもよい。したがって一部の実施形態では、本開示は、対象において認知症を予防、緩和または治療するための方法を提供するものであり、当該方法は、対象の脳内に、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、または約３０Ｈｚ〜約６０Ｈｚ、または約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、または約４０Ｈｚのガンマ振動を誘導する工程を含む。ガンマ振動は、約４０Ｈｚであることが好ましい。
【００６１】
刺激は、対象の内部環境または外部環境における任意の検出可能な変化を含み得、少なくとも一つの脳領域内に直接または最終的にガンマ振動を誘導する。例えば刺激は、電磁放射線受容体（例えば光受容器、赤外線受容器、および／または紫外線受容器）、機械受容器（例えば機械的なストレスおよび／またはひずみ）、侵害受容器（すなわち疼痛）、音声受容器、電気受容器（例えば電界）、磁気受容器（例えば磁界）、水力受容器（ｈｙｄｒｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）、化学受容器、温度受容器、浸透圧受容器、および／または自己受容体（すなわち位置感覚）を刺激するよう設計されてもよい。受容器からの反応を惹起させるために必要とされる感覚の絶対閾値または最小量は、刺激および対象の種類に応じて変化し得る。一部の実施形態では、刺激は、個々の感受性に応じて適合される。
【００６２】
一部の実施形態では、ガンマ振動は、脳領域特異的な様式で誘導される。例えば一部の実施形態では、ガンマ振動は、海馬、視覚皮質、バレル皮質、聴覚皮質、またはそれらの組み合わせにおいて誘導される。一例として、一部の実施形態では、ガンマ振動は、点滅光を使用して視覚皮質に誘導され、他の実施形態では、ガンマ振動は、特定の周波数の聴覚刺激を使用して聴覚皮質に誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、視覚、聴覚、および／または他の刺激の組み合わせを使用して同時に複数の脳領域内に誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、バーチャルリアリティーシステムにおいて誘導される。
【００６３】
一部の実施形態では、対象は、無関係の刺激を受動的または能動的に妨害するチャンバーなど（例えば遮光またはノイズキャンセリング）の、ガンマ振動を誘導するよう構成された環境を介して刺激を受け取る。あるいは、またはさらに、対象は、例えば遮光またはノイズキャンセリングの側面を含むシステムを介して刺激を受け取ってもよい。一部の実施形態では、対象は、例えば刺激を送達するよう設計された眼鏡類といった刺激放出デバイスを介して視覚刺激を受け取る。デバイスは、他の光を遮断してもよい。一部の実施形態では、対象は、例えば刺激を送達するよう設計されたヘッドホンといった刺激放出デバイスを介して聴覚刺激を受け取る。デバイスは、他のノイズを相殺してもよい。
【００６４】
少なくとも一つの刺激放出用インタフェースに加えて、一部の実施形態は、少なくとも一つのプロセッサー（例えば刺激を生成する、刺激放出を制御する、刺激放出／結果を監視する、および／または刺激／結果に関するフィードバックを処理する）、少なくとも一つのメモリ（例えばプロセッサー実行可能な指令、少なくとも一つの刺激、刺激生成方針、フィードバック、および／または結果などを保存する）、少なくとも一つのコミュニケーションインタフェース（例えば対象、ヘルスケア提供者、介護者、臨床研究責任医師、データベース、監視アプリケーションなどと情報交換する）、および／または検出デバイス（例えばガンマ振動が誘導されたか、対象の感受性、認知機能、物理的または化学的変化、ストレス、安全性などを含む、刺激および／または対象に関するフィードバックを検出し、提供する）を含んでもよい。
【００６５】
一部の実施形態では、ガンマ振動は、例えば約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚの点滅光などの視覚刺激により誘導される。特定の実施形態では、ガンマ振動は、例えば約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの点滅光により誘導される。さらなる実施形態では、ガンマ振動は、例えば約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの点滅光により誘導される。さらなる実施形態では、ガンマ振動は、例えば約４０Ｈｚの点滅光により誘導される。一部の実施形態では、対象は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚの点滅光、または約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの点滅光、または約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの点滅光、または約４０Ｈｚの点滅光を受け取る（またはそうした点滅光を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした点滅光を発する遮光デバイスを着用する）。
【００６６】
一部の実施形態では、ガンマ振動は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、または約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、または約４０Ｈｚの周波数の音といった聴覚刺激により誘導される。一部の実施形態では、対象は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、または約４０Ｈｚの聴覚刺激を受け取る（またはそうした聴覚刺激を発するノイズキャンセリングデバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした聴覚刺激を発するノイズキャンセリングデバイスを着用する）。
【００６７】
一部の実施形態では、対象は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間以上、視覚刺激および／または聴覚刺激を受け取る（例えば、そうした刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する）。一部の実施形態では、対象は、約６時間以内、約５時間以内、約４時間以内、約３時間以内、約２時間以内、または約１時間以内の間、刺激を受け取る（例えば、そうした刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する）。一部の実施形態では、対象は、１時間未満の間、刺激を受け取る（例えば、そうした刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する）。
【００６８】
一部の実施形態では、対象は、本明細書に提供される方法を受ける。他の実施形態では、対象は、複数の別個のときに、本明細書に提供される方法を用いた治療を受ける。対象は、定期的なスケジュールで治療を受けてもよく、または症状が発生したとき、もしくは症状が悪化したときに治療を受けてもよい。一部の実施形態では、慢性的な治療が、可溶性Ａβペプチドおよび／または不溶性Ａβペプチド（すなわちプラーク）の減少に有効である場合がある。
【００６９】
一部の実施形態では、ガンマ振動は、細胞型特異的な様式で誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンで誘導される。ある種のニューロンを記載するために使用されるとき、「高速スパイク」（ＦＳ：ｆａｓｔ−ｓｐｉｋｉｎｇ）という用語は、長期間、スパイク周波数の適合またはスパイク高の減弱をほとんど伴わずに高頻度で放電するニューロンの能力を指す。したがってこれらのニューロンは、大幅な適応は伴わずに、持続的で高い周波数（例えば約１００Ｈｚまたは約１５０Ｈｚ以上）の放電を行うことができる。このＦＳニューロンの能力は、大部分が自身の高速遅延整流チャンネルの発現に起因し、別の言葉で言い換えれば、非常に素早く活性化と不活化を行うチャンネルの発現に起因する。
【００７０】
一つの態様において、刺激は、非侵襲性であってもよい。本明細書において使用される場合、「非侵襲性」という用語は、例えば組成物もしくはデバイスの注入または移殖といった、外科的介入または身体の操作を必要としないデバイス、方法およびシステムを指す。例えば刺激は、視覚（例えば明滅する光）、聴覚（例えば音の振動）、および／または触覚（力、振動または動きを伴う機械的刺激）であってもよい。
【００７１】
別の態様では、刺激は、侵襲性であってもよく、または少なくとも部分的に侵襲性であってもよい。例えば、視覚、聴覚および／または触覚の刺激は、組成物（例えば、光−感受性タンパク質）もしくはデバイス（例えば、統合光ファイバー光源または固体光源）の注入または移殖と組み合わされてもよい。
【００７２】
実験データ
【００７３】
本明細書に記載される本発明の主旨に関連する実験データは、様々な図面と併せて以下に記載される。最初に概要が、次いで詳細な説明がなされる。
【００７４】
図１Ａ  ＡＣにおける４０Ｈｚの聴覚刺激（各ペアの左のパネル）と、無作為刺激（各ペアの右のパネル）の間の二つの推定単一ユニットの発火頻度調節を示す。目盛りは、聴覚パルスを示す。光の棒は無作為分布型パルスを示す。ラスタープロットは、１０秒間、４０Ｈｚの聴覚刺激または無作為刺激に対する、推定単一ユニットの二つの例のスパイク反応を示す。
【００７５】
図１Ｂ  ＡＣにおける、刺激無し（刺激無しのラベル）、無作為刺激（無作為のラベル）および４０Ｈｚの聴覚刺激（４０Ｈｚ刺激のラベル）の条件に対する、すべての単一ユニット（５匹のマウスにおける９回の記録セッションで、ｎ＝２９２ユニット。刺激間の間隔を中心とした間隔割合：Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対無作為；二つの割合に対するｚ検定）の発火頻度ピーク間の間隔分布を示す。
【００７６】
図１Ｃ  ４０Ｈｚの聴覚刺激中の刺激発生と比較した発火頻度調節の例示的な極座標プロットを示す（左、０で刺激発生）、４０Ｈｚの聴覚刺激、無作為刺激および刺激無しの間の単一ユニット発火頻度調節のベクトル強度分布（中心、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝４ｘ１０−５４  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝２ｘ１０−１３  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定）、および単一ユニット発火頻度調節のレイリー統計値分布（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝５ｘ１０−６８  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝６ｘ１０−７２  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定；２６ユニットが、３０を超える４０Ｈｚ刺激ＲＳ値を有していた；１ユニットが３０を超える無作為刺激ＲＳ値を有していた）。
【００７７】
図１Ｄ  ＡＣでの刺激条件間の平均発火頻度値の分布を示す。
【００７８】
図１Ｅ  ＣＡ１に関して、図１Ａと同じ内容を示す。
【００７９】
図１Ｆ  ＣＡ１に関して、図１Ｂと同じ内容を示す（５匹のマウスにおける１０回の記録セッションで、ｎ＝３３８ユニット。Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対無作為刺激；二つの割合に対するｚ検定）。
【００８０】
図１Ｇ  ＣＡ１に関して、図１Ｃと同じ内容を示す。（中心、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝４ｘ１０−４０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝９ｘ１０−１１  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定；右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−７４  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝２ｘ１０−７３  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【００８１】
図１Ｈ  ＣＡ１に関して、図１Ｄと同じ内容を示す。
【００８２】
図１Ｉ  ｍＰＦＣに関して、図１Ａと同じ内容を示す。
【００８３】
図１Ｊ  ｍＰＦＣに関して、図１Ｂと同じ内容を示す（４匹のマウスにおける７回の記録セッションで、ｎ＝１１５ユニット。Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対無作為刺激；二つの割合に対するｚ検定）。
【００８４】
図１Ｋ  ｍＰＦＣに関して、図１Ｃと同じ内容を示す。（中心、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝２ｘ１０−２７４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝４ｘ１０−５  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定；右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−２８  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝５ｘ１０−３０  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【００８５】
図１Ｌ  ｍＰＦＣに関して、図１Ｄと同じ内容を示す。
【００８６】
図２Ａ  ５ＸＦＡＤ聴覚ＧＥＮＵＳマウスに対する行動実験のタイムラインを示す。
【００８７】
図２Ｂ  ５ＸＦＡＤ聴覚ＧＥＮＵＳマウスの新規の物体認識（ＮＯＲ）検査の認知インデックスを示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、円は「ｎ」を示す、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００８８】
図２Ｃ  新規の物体認知検査の間の平均速度（ｃｍ／秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００８９】
図２Ｄ  新規の物体認知検査の間に移動した総距離（ｃｍ）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９０】
図２Ｅ  ５ＸＦＡＤ聴覚ＧＥＮＵＳマウスの新規の物体位置（ＮＯＬ）検査の認知インデックスを示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９１】
図２Ｆ  新規の物体位置検査の間の平均速度（ｃｍ／秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９２】
図２Ｇ  新規の物体位置検査の間に移動した総距離（ｃｍ）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９３】
図２Ｈ  非刺激、無作為周波数刺激、および４０Ｈｚの聴覚刺激が行われた５ＸＦＡＤマウスのモリス水迷路における逃避潜時を示す（非刺激群でｎ＝２５匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝２８匹のマウス、無作為周波数群でｎ＝９匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、テューキーの多重比較検定を伴う二元ＡＮＯＶＡ）。
【００９４】
図２Ｉ  プローブトライアルの間に目標四分円で泳いで過ごした時間を示す（非刺激群でｎ＝２５匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝２８匹のマウス、無作為周波数群でｎ＝９匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９５】
図２Ｊ  プローブトライアルの間に交差したプラットフォーム数を示す（非刺激群でｎ＝２５匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝２８匹のマウス、無作為周波数群でｎ＝９匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９６】
図３Ａ  １日当たり１時間で７日間、４０Ｈｚ、８Ｈｚ、８０Ｈｚまたは無作為周波数の聴覚刺激を受けた後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおける聴覚皮質（ＡＣ）および海馬（ＨＰＣ）中の相対的可溶性Ａβ１−４２レベルを示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝１９匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝１９匹のマウス、８Ｈｚ群でｎ＝４匹のマウス、８０Ｈｚ群でｎ＝７匹のマウス、無作為周波数群でｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【００９７】
図３Ｂ  不溶性Ａβ１−４２に関して、図３Ａと同じ内容を示す。
【００９８】
図３Ｃ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣにおける、抗Ａβ（Ｄ５４Ｄ２、緑）抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す（１群当たりｎ＝７匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【００９９】
図３Ｄ  ＣＡ１に関して、図３Ｃと同じ内容を示す。
【０１００】
図３Ｅ  ＡＣおよびＣＡ１におけるＡβ陽性プラークの平均数を示す（１群当たりｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１０１】
図３Ｆ  ＡＣおよびＣＡ１におけるＡβ陽性プラークの平均面積を示す（１群当たりｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１０２】
図３Ｇ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣにおける、抗Ａβ（１２Ｆ４、赤）抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す（差し込み図、２０ｘ、スケールバー、５０μｍ）。
【０１０３】
図３Ｈ  ＣＡ１に関して、図３Ｇと同じ内容を示す。
【０１０４】
図３Ｉ  非刺激対照に対して正規化されたＡβ（１２Ｆ４）の平均強度値（１２Ｆ４抗体）を示す（１群当たりｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１０５】
図４Ａ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの５ＸＦＡＤマウスのＡＣにおける、抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１、緑）および抗Ａβ（１２Ｆ４、赤）抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【０１０６】
図４Ｂ  ＣＡ１に関して、図４Ａと同じ内容を示す。
【０１０７】
図４Ｃ  ＡＣおよびＣＡ１におけるＩｂａ１陽性のミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１０８】
図４Ｄ  非刺激対照群に対して正規化された、ＡＣおよびＣＡ１におけるＩｂａ１陽性のミクログリア細胞体の直径を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１０９】
図４Ｅ  非刺激対照群に対して正規化された、ＡＣおよびＣＡ１におけるＩｂａ１陽性のミクログリアの主要突起の平均の長さを示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１１０】
図４Ｆ  非刺激対照群に対して正規化された、ＡＣおよびＣＡ１におけるＩｂａ１陽性のミクログリアの平均突起分枝を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１１１】
図４Ｇ  ＡＣおよびＣＡ１におけるＩｂａ１陽性でＡβ陽性でもあるミクログリア細胞体の割合を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１１２】
図４Ｈ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの５ＸＦＡＤマウスのＡＣにおける、抗Ｓ１００Ｂ（ａｂ８６８、紫）および抗ＧＦＡＰ（ａｂ４６７４、灰色）抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【０１１３】
図４Ｉ  ＣＡ１に関して、図４Ｈと同じ内容を示す。
【０１１４】
図４Ｊ  ＡＣおよびＣＡ１におけるＳ１００Ｂ陽性の星状細胞数を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１１５】
図４Ｋ  ＧＦＡＰ陽性星状細胞に関して、図４Ｊと同じ内容を示す。
【０１１６】
図５Ａ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣにおける、レクチン染色（ＤＬ−１１７４、緑）を用いた免疫組織化学染色結果を示す（スケールバー、５０μｍ）。
【０１１７】
図５Ｂ  ＣＡ１に関して、図５Ａと同じ内容を示す。
【０１１８】
図５Ｃ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよびＣＡ１の血管の直径における倍数変化割合を示す。非刺激対照に対して正規化されている（１群当たりｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１１９】
図５Ｄ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣにおける、抗ＬＲＰ１（２８３２０、赤）、抗Ａβ（ＡＢ９２３４、緑）およびレクチン染色（ＤＬ−１１７４、灰色）を用いた免疫組織化学染色結果を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【０１２０】
図５Ｅ  ＣＡ１に関して、図５Ｄと同じ内容を示す。
【０１２１】
図５Ｆ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳ刺激を受けた後、または刺激無しの５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよびＣＡ１における、Ａβ−ＬＲＰ１の共局在の割合を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１２２】
図６Ａ  ４０Ｈｚの聴覚−視覚刺激の間の単一ユニットの発火頻度調節を示す（左、下）。ラスタープロットは、１０秒間、４０Ｈｚの聴覚刺激または無作為刺激に対する、推定単一ユニットの二つの例のスパイク反応を示す（左、上）。４０Ｈｚの聴覚−視覚刺激、無作為な聴覚−視覚刺激、および刺激無しの期間のベクトル強度分布（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝９ｘ１０−５９  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝１ｘ１０−１３  ４０Ｈｚ対無作為；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０１２３】
図６Ｂ  ＣＡ１に関して、図６Ａと同じ内容を示す。（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝６ｘ１０−４１  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝２ｘ１０−１１  ４０Ｈｚ対無作為、コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０１２４】
図６Ｃ  ｍＰＦＣに関して、図６Ａと同じ内容を示す。（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝２ｘ１０−２３  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝９ｘ１０−５  ４０Ｈｚ対無作為、コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０１２５】
図６Ｄ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおける抗Ｉｂａ１抗体（０１９−１９７４１）および抗Ａβ抗体（１２Ｆ４）のＩＭＡＲＩＳ（方法）を使用した免疫組織化学染色および３Ｄ再構成の結果を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、上差し込み図：アミロイドプラークを中心とした２５μｍ半径周囲のミクログリア数を定量するＩＭＡＲＩＳの使用例。プラークは、赤いドットとして示され、ミクログリアは緑のドット、そして白矢印はクラスターを指し示している。下差し込み図：ＡＣの拡大統合画像。スケールバー、２０μｍ）。
【０１２６】
図６Ｅ  組み合わせＧＥＮＵＳに関して、図６Ｄのように示す。
【０１２７】
図６Ｆ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、組み合わせＧＥＮＵＳ（Ａ＋Ｖ刺激）を受けた後の、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア細胞体直径を示す（無刺激対照群においてｎ＝６匹のマウス、組み合わせＧＥＮＵＳ群においてｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１２８】
図６Ｇ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、組み合わせＧＥＮＵＳを受けた後の、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア突起長を示す（無刺激対照群においてｎ＝６匹のマウス、組み合わせＧＥＮＵＳ群においてｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１２９】
図６Ｈ  １日当たり１時間で７日間、組み合わせＧＥＮＵＳを受けた後の、または刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の対象領域当たりのミクログリア数を示す（無刺激対照群においてｎ＝６匹のマウス、組み合わせＧＥＮＵＳ群においてｎ＝７匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１３０】
図６Ｉ  組み合わせＧＥＮＵＳを受けた後の、または刺激無しのＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中のプラークの２５μｍ半径周囲の平均ミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１３１】
図７Ａ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しの６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の抗Ａβプラーク抗体（Ｄ５４Ｄ２、緑）の免疫組織化学染色結果を示す（４０ｘ対物レンズを用いて撮影された画像、スケールバー、５０μｍ）。
【０１３２】
図７Ｂ  組み合わせＧＥＮＵＳに関して、図７Ａのように示す。
【０１３３】
図７Ｃ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、刺激無し、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８０Ｈｚ、および組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激を受けた後の、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１、ｍＰＦＣおよびＶＣ中の平均プラークコア面積を示す（１群当たりｎ＝１２匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１３４】
図７Ｄ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、刺激無し、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８０Ｈｚ、および組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激を受けた後の、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１、ｍＰＦＣおよびＶＣ中の平均プラーク数を示す（１群当たりｎ＝１２匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１３５】
図７Ｅ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８Ｈｚ、または組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激を受けた後の、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのｍＰＦＣ中の相対的可溶性Ａβ１−４２レベルを示す（１群当たりｎ＝４〜５匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１３６】
図７Ｆ  可溶性Ａβ１−４２に関して、図７Ｅのように示す（ｎ．ｓ．＝有意でない、＊Ｐ＜０．０５）。
【０１３７】
図７Ｇ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しの後の６ヵ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＳＨＩＥＬＤ処置された全脳（脳の２５μｍ切片の矢状面）の抗Ａβプラーク（Ｄ５４Ｄ２、白色）抗体の免疫組織化学染色の結果を示す（ライトシート顕微鏡、スケールバー、７００μｍ）。
【０１３８】
図７Ｈ  組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳに関して、図７Ｇのように示す。
【０１３９】
図７Ｉ  刺激無し、または組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳの後の平均皮質プラーク数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１４０】
図７Ｊ  組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳの後の平均皮質プラーク体積（μｍ３）を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１４１】
図８Ａ  聴覚皮質を検出するために使用された聴覚マッピング音調に対する平均ＬＦＰ反応を示す（左）。青色領域は、５０ミリ秒のマッピング音調が再生されたときを示す。クラスター化推定単一ユニットの例（右）。
【０１４２】
図８Ｂ  ４０Ｈｚの聴覚明滅刺激期間および無刺激期間に対するパワースペクトル密度（ＰＳＤ）反応を示す。記録日全体の平均および標準偏差（左）、全記録日の聴覚明滅に対するＡＣ中のパワースペクトルＬＦＰ反応（記録深度当たりの４０Ｈｚ聴覚明滅中の最も高い４０Ｈｚピークを伴う記録部位を示す。方法を参照のこと）（右）。
【０１４３】
図８Ｃ  ４０Ｈｚの聴覚刺激期間と無刺激期間のＡＣにおける単一ユニットの平均発火頻度（ＦＲ：ｆｉｒｉｎｇ  ｒａｔｅ）を示す（左）、ＡＣにおける単一ユニットの多重刺激条件間の平均発火頻度の差異は、０Ｈｚを中心として集中している（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  ４０Ｈｚ−刺激無し、その他すべてｎ．ｓ．；ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定）。
【０１４４】
図８Ｄ  ２０Ｈｚの聴覚明滅刺激に対する反応における推定単一ユニットの発火頻度調節を示す（左、下）、ラスタープロットは、１０秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す（左、上）。２０Ｈｚの聴覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布（右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ２０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０１４５】
図８Ｅ  ８０Ｈｚの聴覚明滅刺激に対する反応における、Ｄに示されるユニットと同一のユニットの発火頻度調節を示す（左、下）、ラスタープロットは、１０秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す（左、上）。８０Ｈｚの聴覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布（右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ８０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０１４６】
図８Ｆ  ２０Ｈｚおよび８０Ｈｚの聴覚刺激と、刺激無し条件のベクトル強度分布を示す（左、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝３ｘ１０−６１  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝３ｘ１０−６１  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定）、２０Ｈｚおよび８０Ｈｚの聴覚刺激と、刺激無し条件のレイリー統計分布（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝３ｘ１０−７３  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝１ｘ１０−６８  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定；５４ユニットが、３０を超える２０Ｈｚ刺激ＲＳ値を有していた；２８ユニットが、３０を超える８０Ｈｚ刺激ＲＳ値を有していた。
【０１４７】
図８Ｇ  ＣＡ１を検出するために使用された、海馬の特徴であるシータリズムの例を示す。
【０１４８】
図８Ｈ  ＣＡ１に関して、Ｂと同じ内容を示す。
【０１４９】
図８Ｉ  ＣＡ１に関して、Ｃと同じ内容を示す（右、ｎ．ｓ．；ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定）。
【０１５０】
図８Ｊ  ＣＡ１に関して、Ｄと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ２０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０１５１】
図８Ｋ  ＣＡ１に関して、Ｅと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ８０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０１５２】
図８Ｌ  ＣＡ１に関して、Ｆと同じ内容を示す。（左、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−４０  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝９ｘ１０−４５  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定；右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−７１  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝８ｘ１０−７３  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０１５３】
図８Ｍ  プローブ跡を示す組織検査画像と、ｍＰＦＣ中の記録位置を示す。赤色の矢印は記録位置を示す。
【０１５４】
図８Ｎ  ｍＰＦＣに関して、Ｂと同じ内容を示す。
【０１５５】
図８Ｏ  ｍＰＦＣに関して、Ｃと同じ内容を示す（右、ｎ．ｓ．；ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定）。
【０１５６】
図８Ｐ  ｍＰＦＣに関して、Ｄと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ２０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０１５７】
図８Ｑ  ｍＰＦＣに関して、Ｅと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ８０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０１５８】
図８Ｒ  ｍＰＦＣに関して、Ｆと同じ内容を示す。（左、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−２３  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝６ｘ１０−２４  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定；右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝２ｘ１０−１７  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝４ｘ１０−２６  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０１５９】
図９Ａ  刺激無し、４０Ｈｚ周波数、および無作為周波数で刺激された５ＸＦＡＤマウスがＮＯＲ検査中、慣れた物体および新規の物体を探索するのに費やした時間（秒）を示す（非刺激群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６０】
図９Ｂ  ＮＯＲ検査中、２０秒の総物体探索要件に達するまでにマウスが必要とした時間（分）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６１】
図９Ｃ  刺激無し、４０Ｈｚ周波数、および無作為周波数で刺激された５ＸＦＡＤマウスがＮＯＬ検査中、慣れた位置および新規の位置にある物体を探索するのに費やした時間（秒）を示す（非刺激群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６２】
図９Ｄ  ＮＯＬ検査中、２０秒の総物体探索要件に達するまでにマウスが必要とした時間（分）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６３】
図９Ｅ  馴化中の平均速度（ｃｍ／秒）を示す（（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６４】
図９Ｆ  馴化中に移動した総距離（ｃｍ）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６５】
図９Ｇ  馴化中に行動チャンバーの中心で費やした時間（秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６６】
図９Ｈ  馴化中に行動チャンバーの周辺で費やした時間（秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝２０匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２０匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６７】
図９Ｉ  モリス水迷路での平均遊泳速度（ｃｍ／秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝２５匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝２８匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝９、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６８】
図９Ｊ  １−時間の刺激無し、聴覚ＧＥＮＵＳまたは無作為周波数刺激の間の平均速度（ｃｍ／秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝６匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝６匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝６、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１６９】
図９Ｋ  １時間の刺激無し、聴覚ＧＥＮＵＳまたは無作為周波数刺激の間に移動した総距離（ｃｍ）を示す（刺激無し群においてｎ＝６匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝６匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝６、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１７０】
図９Ｌ  １時間の刺激無し、聴覚ＧＥＮＵＳまたは無作為周波数刺激の間、２ｃｍ／秒で費やされた時間（秒）を示す（刺激無し群においてｎ＝６匹のマウス、４０Ｈｚ群においてｎ＝６匹のマウス、無作為周波数群においてｎ＝６、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１７１】
図１０Ａ  １日当たり１時間で７日間、４０Ｈｚ、８Ｈｚ、８０Ｈｚまたは無作為周波数の聴覚刺激を受けた後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおける聴覚皮質（ＡＣ）および海馬（ＨＰＣ）中の相対的可溶性Ａβ１−４０レベルを示す。非刺激対照に対して正規化された（注意：８０Ｈｚおよび無作為周波数のＨＰＣサンプルのＥＬＩＳＡは上手くいかず、報告できなかった。非刺激群でｎ＝１９匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝１９匹のマウス、８Ｈｚ群でｎ＝４匹のマウス、８０Ｈｚ群でｎ＝７匹のマウス、無作為周波数群でｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．＝有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０１７２】
図１０Ｂ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の６カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける聴覚皮質（ＡＣ）および海馬（ＨＰＣ）中の相対的可溶性Ａβ１−４２レベルを示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝４匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝４匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７３】
図１０Ｃ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＣおよびＣＡ１（「対象領域」、ＲＯＩ：ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）中の平均プラーク数を示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝５匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７４】
図１０Ｄ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中の平均プラークコア面積を示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝５匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７５】
図１０Ｅ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＡβ（１２Ｆ４）平均強度値（１２Ｆ４抗体）を示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝５匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７６】
図１０Ｆ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後、刺激無しでの７日間の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中の平均プラーク数を示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝６匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７７】
図１０Ｇ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後、刺激無しでの７日間の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中の平均プラークコア面積を示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝６匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７８】
図１０Ｈ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後、刺激無しでの７日間の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＡβ（１２Ｆ４）平均強度値（１２Ｆ４抗体）を示す。非刺激対照に対して正規化された（非刺激群でｎ＝６匹のマウス、４０Ｈｚ群でｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１７９】
図１１Ａ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＩｂａ１陽性のミクログリア細胞体の直径を示す。非刺激対照に対して正規化された（１群当たりｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８０】
図１１Ｂ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＩｂａ１陽性の主要突起の平均長を示す。非刺激対照に対して正規化された（１群当たりｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８１】
図１１Ｃ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＩｂａ１陽性のミクログリア数を示す。非刺激対照に対して正規化された（１群当たりｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８２】
図１１Ｄ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後、刺激無しでの７日間の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＩｂａ１陽性のミクログリア細胞体の直径を示す。非刺激対照に対して正規化された（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８３】
図１１Ｅ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後、刺激無しでの７日間の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＩｂａ１陽性のミクログリアの主要突起の平均長を示す。非刺激対照に対して正規化された（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８４】
図１１Ｆ  １日当たり１時間で７日間、聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後、刺激無しでの７日間の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＣおよびＣＡ１中のＩｂａ１陽性のミクログリア数を示す。非刺激対照に対して正規化された（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８５】
図１１Ｇ  ６カ月齢の野生型マウスおよび５ＸＦＡＤマウスのＣＡ１における、抗ＧＦＡＰ抗体（ａｂ４６７４、赤色）およびレクチン染色（ＤＬ−１１７４、緑色）抗体を用いた、ＣＬＡＲＩＴＹ処置脳切片の免疫組織化学染色の結果を示す（１群当たりｎ＝５匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【０１８６】
図１１Ｈ  ６ヶ月齢の野生型マウスおよび５ＸＦＡＤマウスのＣＡ１における、ＧＦＡＰ陽性細胞数（対象画像当たりの数、ＩＭＡＲＩＳを使用）を示す（１群当たりｎ＝５匹のマウス、棒グラフ中に平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１８７】
図１２Ａ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後の６カ月齢のＰ３０１ＳマウスのＡＣにおける抗ｐタウ抗体（Ｔ１８１、赤色）を用いた免疫組織化学染色結果を示す（４０ｘ対物レンズを用いて撮影された画像、スケールバー、５０μｍ）。
【０１８８】
図１２Ｂ  ＣＡ１に関して、図１２Ａと同じ内容を示す。
【０１８９】
図１２Ｃ  非刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後のＰ３０１ＳマウスのＡＣおよびＣＡ１におけるｐタウ（Ｔ１８１）の相対強度レベルを示す（１群当たりｎ＝１０匹のマウス、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１９０】
図１２Ｄ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後の６カ月齢のＰ３０１ＳマウスのＡＣにおける抗ｐタウ抗体（Ｓ３９６、緑）を用いた免疫組織化学染色結果を示す（スケールバー、５０μｍ）。
【０１９１】
図１２Ｅ  ＣＡ１に関して、図１２Ｄと同じ内容を示す。
【０１９２】
図１２Ｆ  非刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後のＰ３０１ＳマウスのＡＣおよびＣＡ１におけるｐタウ（Ｓ３９６）の相対強度レベルを示す（１群当たりｎ＝１０匹のマウス、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１９３】
図１２Ｇ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後の６カ月齢のＰ３０１ＳマウスのＡＣにおけるｐタウ（Ｓ３９６）および総タウのレベルを示す代表的なウェスタンブロッティング結果を示す。
【０１９４】
図１２Ｈ  海馬に関して、図１２Ｇと同じ内容を示す。
【０１９５】
図１２Ｉ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後の６カ月齢のＰ３０１Ｓマウスの海馬におけるｐタウ（Ｔ１８１）および総タウのレベルを示す代表的なウェスタンブロッティング結果を示す。
【０１９６】
図１２Ｊ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後のＰ３０１ＳマウスのＡＣにおける総タウ（Ｇのウェスタンブロッティングより）に対して正規化された、ｐタウ（Ｓ３９６）の相対的免疫反応性を示す（１群当たりｎ＝３匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１９７】
図１２Ｋ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後のＰ３０１ＳマウスのＨＰＣにおける総タウ（Ｈのウェスタンブロッティングより）に対して正規化された、ｐタウ（Ｓ３９６）の相対的免疫反応性を示す（４０Ｈｚ群においてｎ＝２匹のマウス、非刺激群においてｎ＝３匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１９８】
図１２Ｌ  １日当たり１時間で７日間、刺激無しまたは聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後のＰ３０１Ｓマウスの海馬における総タウ（Ｉのウェスタンブロッティングより）に対して正規化された、ｐタウ（Ｔ１８１）の相対的免疫反応性を示す（４０Ｈｚ群においてｎ＝２匹のマウス、非刺激群においてｎ＝３匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０１９９】
図１３Ａ  ４０Ｈｚの聴覚−視覚明滅刺激期間および無刺激期間に対するパワースペクトル密度（ＰＳＤ）反応を示す。記録日全体の平均および標準偏差（左）、全記録日の聴覚−視覚明滅刺激に対するＡＣ中のパワースペクトルＬＦＰ反応（記録深度当たりの４０Ｈｚ聴覚−視覚明滅間の最も高い４０Ｈｚピークを伴う記録部位を示す。方法を参照のこと）（右）。
【０２００】
図１３Ｂ  聴覚−視覚無作為刺激に対する、図１３Ａに示される推定単一ユニットの以下の発火頻度調節を示す。上のラスタープロットは、１０秒の無作為刺激に対する単一ユニットのスパイクを示す（左）。ＡＣにおける聴覚−視覚刺激に対する発火頻度反応におけるピーク間の間隔分布（真ん中、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対無作為刺激；二つの割合に対するｚ−検定）、４０Ｈｚの聴覚−視覚刺激に対する単一ユニット反応のレイリー統計分布（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝２ｘ１０−７９  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝１ｘ１０−７２  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定；２０ユニットは３０を超える４０Ｈｚ刺激ＲＳ値を有していた。２ユニットは３０を超える無作為刺激ＲＳ値を有していた）。
【０２０１】
図１３Ｃ  すべての聴覚−視覚刺激条件中の単一ユニット平均発火頻度を示す。
【０２０２】
図１３Ｄ  ２０Ｈｚの聴覚−視覚明滅刺激に対する反応における推定単一ユニットの発火頻度調節を示す（左、下）、ラスタープロットは、１０秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す（左、上）。２０Ｈｚの聴覚−視覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布（右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ２０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２０３】
図１３Ｅ  ８０Ｈｚの聴覚−視覚明滅刺激に対する反応における、Ｄに示されるユニットと同一のユニットの発火頻度調節を示す（左、下）、ラスタープロットは、１０秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す（左、上）。８０Ｈｚの聴覚−視覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布（右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ８０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２０４】
図１３Ｆ  ２０Ｈｚおよび８０Ｈｚの聴覚刺激のベクトル強度分布は、刺激無し条件よりも高い（左、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、２ｘ１０−６３  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝１ｘ１０−５６  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定）、２０Ｈｚおよび８０Ｈｚの聴覚刺激のレイリー統計分布は、刺激無しよりも高い（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝Ｐ  ＝  １ｘ１０−８８  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝５ｘ１０−７２  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定；５０ユニットが、３０を超える２０Ｈｚ刺激ＲＳ値を有していた；１９ユニットが、３０を超える８０Ｈｚ刺激ＲＳ値を有していた。
【０２０５】
図１３Ｇ  複数の刺激条件間のＡＣにおける単一ユニットの平均発火頻度の差異は、０Ｈｚを中心として集中していることを示す（＊Ｐ＜０．０５  ２０Ｈｚ−８０Ｈｚ、＊Ｐ＜０．０５  ２０Ｈｚ−４０Ｈｚ、その他すべてｎ．ｓ．；ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定）。
【０２０６】
図１３Ｈ  ＣＡ１に関して、Ａと同じ内容を示す。
【０２０７】
図１３Ｉ  ＣＡ１に関して、Ｂと同じ内容を示す（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１×１０−７１  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝１ｘ１０−７１  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定。真ん中、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対無作為刺激；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２０８】
図１３Ｊ  ＣＡ１に関して、Ｃと同じ内容を示す。
【０２０９】
図１３Ｋ  ＣＡ１に関して、Ｄと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ２０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２１０】
図１３Ｌ  ＣＡ１に関して、Ｅと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ８０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２１１】
図１３Ｍ  ＣＡ１に関して、Ｆと同じ内容を示す。（左、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝８ｘ１０−４３  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝８ｘ１０−４０  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定；右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝２ｘ１０−７０  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝１ｘ１０−５７  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０２１２】
図１３Ｎ  ＣＡ１に関して、Ｇと同じ内容を示す（すべてｎ．ｓ．；ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定）。
【０２１３】
図１３Ｏ  ｍＰＦＣに関して、Ａと同じ内容を示す。
【０２１４】
図１３Ｐ  ｍＰＦＣに関して、Ｂと同じ内容を示す（右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝５ｘ１０−２３  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝３ｘ１０−２１  ４０Ｈｚ対無作為刺激；コルモゴロフ−スミルノフ検定。真ん中、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合：Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝０  ４０Ｈｚ対無作為刺激；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２１５】
図１３Ｑ  ｍＰＦＣに関して、Ｃと同じ内容を示す。
【０２１６】
図１３Ｒ  ｍＰＦＣに関して、Ｄと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ２０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２１７】
図１３Ｓ  ｍＰＦＣに関して、Ｅと同じ内容を示す（右、Ｐ＝０  ８０Ｈｚ対刺激無し；二つの割合に対するｚ−検定）。
【０２１８】
図１３Ｔ  ｍＰＦＣに関して、Ｆと同じ内容を示す。（左、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−２３  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝２ｘ１０−２５  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定；右、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝１ｘ１０−２３  ２０Ｈｚ対刺激無し、Ｐ＝８ｘ１０−２５  ８０Ｈｚ対刺激無し；コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【０２１９】
図１３Ｕ  ｍＰＦＣに関して、Ｇと同じ内容を示す（＊Ｐ＜０．０５  ４０Ｈｚ−刺激無し、その他すべてｎ．ｓ．；ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定）。
【０２２０】
図１４Ａ  １日当たり１時間で７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ刺激後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおける、抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１、緑）および抗Ａβ（１２Ｆ４、赤）抗体の免疫組織化学染色結果を示す（差し込み図倍率、１００ｘ；スケールバー、５０μｍ）。
【０２２１】
図１４Ｂ  １日当たり１時間で７日間の視覚ＧＥＮＵＳ刺激後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおける、抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１、緑）および抗Ａβ（１２Ｆ４、赤）抗体の免疫組織化学染色結果を示す（差し込み図倍率、１００ｘ；スケールバー、５０μｍ）。
【０２２２】
図１４Ｃ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア細胞体直径を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２３】
図１４Ｄ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア突起長を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２４】
図１４Ｅ  １日当たり１時間で７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の対象領域当たりのミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２５】
図１４Ｆ  聴覚ＧＥＮＵＳを受けた後の、または刺激無しのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中のプラークの２５μｍ半径周囲の平均ミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２６】
図１４Ｇ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の視覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア細胞体直径を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２７】
図１４Ｈ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の視覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア突起長を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２８】
図１４Ｉ  １日当たり１時間で７日間の視覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の対象領域当たりのミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２２９】
図１４Ｊ  視覚ＧＥＮＵＳを受けた後の、または刺激無しのＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中のプラークの２５μｍ半径周囲の平均ミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３０】
図１４Ｋ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８０Ｈｚ、または組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア細胞体直径を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３１】
図１４Ｌ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８０Ｈｚ、または組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均ミクログリア突起長を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３２】
図１４Ｍ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間の４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８０Ｈｚ、または組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の対象領域当たりのミクログリア数を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３３】
図１４Ｎ  １日当たり１時間で７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の抗Ａβプラーク（Ｄ５４Ｄ２、緑）抗体の免疫組織化学染色結果を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【０２３４】
図１４Ｏ  １日当たり１時間で７日間の視覚ＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の抗Ａβプラーク（Ｄ５４Ｄ２、緑）抗体の免疫組織化学染色結果を示す（１群当たりｎ＝６匹のマウス、スケールバー、５０μｍ）。
【０２３５】
図１４Ｐ  無刺激対照に対して正規化された、対象領域当たりの平均プラークコア面積を示す（１群当たりｎ＝６匹、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３６】
図１４Ｑ  無刺激対照に対して正規化された、聴覚ＧＥＮＵＳ後のＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均プラーク数を示す（１群当たりｎ＝６匹、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３７】
図１４Ｒ  無刺激対照に対して正規化された、対象領域当たりの平均プラークコア面積を示す（１群当たりｎ＝６匹、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３８】
図１４Ｓ  無刺激対照に対して正規化された、視覚ＧＥＮＵＳ後のＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の平均プラーク数を示す（１群当たりｎ＝６匹、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊Ｐ＜０．０５、独立２群のマン−ホイットニー検定）。
【０２３９】
図１４Ｔ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、無刺激、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８Ｈｚ、および組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激を受けた後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよびＨＰＣ中の相対的可溶性Ａβ１−４２レベルを示す（１群当たりｎ＝４〜５匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０２４０】
図１４Ｕ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、無刺激、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８Ｈｚ、および組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激を受けた後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよびＨＰＣ中の相対的不溶性Ａβ１−４２レベルを示す（１群当たりｎ＝４〜５匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０２４１】
図１４Ｖ  無刺激対照に対して正規化された、１日当たり１時間で７日間、刺激無し、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）ＧＥＮＵＳ、組み合わせ（Ａ＋Ｖ）８０Ｈｚ、および組み合わせ（Ａ＋Ｖ）無作為周波数刺激を受けた後の、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのＡＣ、ＣＡ１、およびｍＰＦＣ中のＡβ（１２Ｆ４）平均強度値（１２Ｆ４抗体）を示す（１群当たりｎ＝４〜５匹のマウス、棒グラフ中、平均ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ．ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル−ワリス検定）。
【０２４２】
４０Ｈｚの聴覚刺激が、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいて、スパイク活動を調節する
【０２４３】
本発明者らは最初に、聴覚音調刺激が、聴覚皮質（ＡＣ）、海馬小領域ＣＡ１、および内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）において、ＧＥＮＵＳを生じさせ得るかを決定した。本発明者らは、２０Ｈｚ、４０Ｈｚ、８０Ｈｚの音調列、または無作為に分散された音列（１ミリ秒の長さ、１０ｋＨｚの音調が、１２．５ミリ秒、２５ミリ秒、５０ミリ秒ごとに再生されるか、または平均２５ミリ秒の無作為な音調間の間隔で再生される。以下、「聴覚明滅刺激」と呼称される）を動物に提示した。音調提示の間、本発明者らは、球形のトレッドミルで走ったり休んだりしている３〜８カ月齢のオスの野生型（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ）マウスのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいて３２チャンネルのシリコンプローブを使用して電気生理学的記録を行った。ＡＣの位置を見つけるために、一連の５０ミリ秒の聴覚マッピング音調（以下、「マッピング刺激」と呼称される）が、音調開始から２０ミリ秒あたりで過渡ＬＦＰ反応が検出されるまで、様々な深度で再生された（図８Ａ）。ＣＡ１は、電気生理学的特徴に基づき位置決めされ、ｍＰＦＣ記録位置は、各動物で最後の記録が行われた後に組織構造から確認された（図８Ｇおよび８Ｍ）。
【０２４４】
標的領域に達した後、動物は、神経活動が記録される間、静寂時間と、聴覚明滅刺激時間を交互に提示された。２０Ｈｚ、４０Ｈｚ、８０Ｈｚ、および無作為聴覚明滅刺激の間を刺激ブロックが循環した。推定単一ユニットの発火頻度は、各音調のたびに周期的に増加および減少し、４０Ｈｚの聴覚明滅刺激へと同調していった（図１Ａ、１Ｅ、および１Ｉ、青色）。ユニットは無作為刺激によっても調節された。すべての無作為パルスが整列したとき、刺激後の発火頻度調節に変化が生じた。このことから、単一ユニットは、無作為刺激パルスに反応したことが示唆される。しかし無作為な聴覚音列は、周期的な発火調節を誘導しなかった（図１Ａ、１Ｅ、および１Ｉ、オレンジ）。位相の分布と振幅の両方で、同調は単一ユニット間で変化した。明滅刺激の間、刺激に応じてニューロンは発火したが、すべてのサイクルでは発火せず、しばしば幅広い位相で発火した（図１Ａ、１Ｅ、および１Ｉ）。聴覚明滅刺激の間の発火頻度のピーク間の間隔は、単一ユニットの大部分においておよそ２５ミリ秒であった（４０Ｈｚと同等）；ＡＣでは７５％、ＣＡ１では７９％、そしてｍＰＦＣでは７４％。（図１Ｂ、１Ｆ、および１Ｊ）。
【０２４５】
対照的に、音調がない基準期間中、および無作為音調の期間中、ピークの間の間隔は、広範な分布を有し、ＡＣ中の１１％未満の細胞、ＣＡ１中の１２％未満の細胞、およびｍＰＦＣ中の１６％未満の細胞がおよそ２５ミリ秒のピーク間隔を有していた（すなわち発火頻度は４０Ｈｚで調節されなかった。図１Ｂ、１Ｆ、および１Ｊ）。強度調節は、刺激位相に応じて単一ユニット発火頻度を検討し、そのベクトル強度（ＶＳ）を算出することで定量された（図１Ｃ、１Ｇ、および１Ｋ、左）。ベクトル強度値は、０〜１の範囲であり、０は均一な発火分布を表しており、刺激により調節されない（ＶＳ＝０）。１は特定の刺激位相に対してのみニューロンが発火する分布を表す（ＶＳ＝１）。４０Ｈｚの聴覚刺激に対する単一ユニット反応のベクトル強度分布は、ＡＣで０．００２〜１、ＨＰＣで０．０００５〜１、そしてＰＦＣで０．１〜０．６の範囲であり、刺激無し、ならびに無作為刺激よりも有意に高かった（図１Ｃ、１Ｇ、および１Ｋ、真ん中）。ベクトル強度は刺激による調節を測定するものであるため、無作為刺激ベクトル強度も、無刺激条件より有意に高かった。しかしベクトル強度は調節の周期性は定量化しない。無作為刺激が単一ユニット反応を惹起させいても、周期的な発火調節は誘導しなかった。
【０２４６】
同様に、４０Ｈｚの聴覚刺激中の単一ユニットに対するレイリー統計分布は、刺激無し、および無作為刺激対照よりも有意に高かった（図１Ｃ、１Ｇ、および１Ｋ、右）。単一ニューロンの平均発火頻度は、４０Ｈｚの聴覚明滅刺激と、刺激無し対照、無作為刺激、２０Ｈｚおよび８０Ｈｚの聴覚明滅刺激の間で類似していた（図１Ｄ、１Ｈ、および１Ｌ；図８Ｃ、１Ｉ、および１Ｏ、右）。ＡＣの局所電場電位は、聴覚明滅刺激中、４０Ｈｚで高いパワーを示したが、その効果は記録位置、記録セッションおよびマッピング音調に対する反応潜伏時間の間で変化していた（図８Ｂ、１Ｈ、および１Ｎ）。これらの研究結果から、４０Ｈｚの聴覚明滅刺激は、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいてＧＥＮＵＳを確実に誘導したことが示唆される。
【０２４７】
聴覚ＧＥＮＵＳは、５ＸＦＡＤマウスにおいて記憶力を改善する
【０２４８】
聴覚ＧＥＮＵＳは海馬ニューロン活動に影響を与えることができると仮定し、次に６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおける、海馬依存性の学習および記憶に対するその効果を評価した（図２Ａ）。本発明者らは、行動障害が最初に明白になるときである６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスを使用した。本発明者らは以下のすべての実験に対し、１週間の聴覚ＧＥＮＵＳを実施した：具体的にはマウスを静かなチャンバー内に置き、１時間／日で７日間、１ミリ秒の長さの１０ｋＨｚの聴覚音列に、４０Ｈｚの周波数（すなわち４０（１０ｋＨｚ）音調／秒）で暴露させた。本発明者らは行動チャンバーにマウスを馴らすことから始め、その２４時間後に新規の物体認知（ＮＯＲ）検査および新規の物体位置（ＮＯＬ）記憶力検査を行った。それらは特定の状況下で物体のアイデンティティと配置を記憶する能力を評価するものであり、ヒトＡＤ対象において影響を受けることが知られている行動である。これらの検査は、認知インデックスを使用して行動力を測定する。このインデックスは、それぞれ新規の物体、または新たな位置にある物体の探索に費やした時間の、探索の全期間に対する割合である。
【０２４９】
馴化中、聴覚ＧＥＮＵＳ群、無作為周波数群、そして非刺激群のいずれも平均速度、総距離、中心で過ごした時間、または周辺で過ごした時間において有意な変化は示さず、この３群は一般的な活動、または不安様行動において差異を示さなかったことが示唆される（図９Ｅ〜９Ｈ）。聴覚ＧＥＮＵＳ後、５ＸＦＡＤマウスは、物体タスクで６５．５０±１．４０％、位置記憶タスクで６１．４１±２．０％の有意に高い認知インデックスを示した。一方で非刺激対照群および無作為周波数対照群は二つの検査においてそれぞれ新規物体にも新たに動かされた物体にも選好を呈さなかった（図２Ｂおよび図２Ｅ）。この３群の間でタスク期間中の移動距離および平均速度に有意差はなかった。このことから、これら効果は活動における一般的な差異が原因ではなかったことが示唆される（図２Ｃ、２Ｄ、２Ｆ、および２Ｇ）。
【０２５０】
ＮＯＲ中に新しい物体と慣れた物体の探索に費やされた時間量が検証された。聴覚ＧＥＮＵＳ後のマウスは、新規物体で有意に高い時間量を費やし、一方で非刺激対照群および無作為周波数対照群は探索選好を呈さなかったことが観察された（図９Ａ）。同様に、聴覚ＧＥＮＵＳ後のマウスは、新たな位置にある物体（ＮＯＬ）で有意に高い時間量を費やし、一方で非刺激対照群および無作為周波数対照群は探索選好を呈さなかったことが観察された（図９Ｃ）。探索活動の差異を検証するための追加の対照測定値として、本発明者らは、物体タスク中、物体探索要件である２０秒に達するまでにマウスが費やした時間量（分）を測定した。本発明者らは、この３群間で物体探索要件に達するまでにかかった時間において有意差はなかったことを観察した（図９Ｂおよび９Ｄ）。
【０２５１】
海馬依存性行動に対する聴覚ＧＥＮＵＳの効果をさらに解析するために、本発明者らはモリス水迷路検査を実施した。この検査は、周辺状況の合図と関連付けて隠されたプラットフォームの位置を記憶する能力を測定する。マウスは連続するトライアルを通じて隠されたプラットフォームの位置を次第に学習し、プラットフォーム位置に関する空間記憶は、逃避潜時により測定される。逃避潜時は個々のマウスが隠されたプラットフォームを発見するのにかかった時間の量である。トレーニングフェーズの間、３群すべてが隠されたプラットフォームの位置の学習に成功できた。しかし聴覚ＧＥＮＵＳを受けた群の逃避潜時は一貫して、そして有意に、非刺激対照群および無作為周波数対照群の両方よりも短かった（図２Ｈ）。３群の間に、遊泳速度における有意差はなかった（図９Ｉ）。プローブトライアル中、または隠されたプラットフォームがタンクから取り除かれたとき、聴覚ＧＥＮＵＳを受けたマウスは、消えたプラットフォームがあった四分円の探索に有意に長い時間を費やし、以前のプラットフォーム位置の上で、非刺激対照群と無作為周波数対照群の両方と比較して多くの交差数を呈した（図２Ｉおよび２Ｊ）。
【０２５２】
最終的な行動測定として、本発明者らは、１時間の聴覚ＧＥＮＵＳ中、非刺激、または無作為周波数刺激中の５ＸＦＡＤマウスの活動を検証し、平均速度（ｃｍ／秒）と移動距離（ｃｍ）に有意差はなかったことを観察した（図９Ｊおよび９Ｋ）。「睡眠」状態または休止期間に差異があるかを調べるために、本発明者らは、１時間刺激群の間で、２ｃｍ／秒未満でマウスが費やした時間の量を測定した。本発明者らは、この３群の間に有意差はなかったことを観察した（図９Ｌ）。まとめると、これらの結果は、聴覚ＧＥＮＵＳが、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスの認知記憶および空間記憶を改善し得ることを示す。
【０２５３】
聴覚ＧＥＮＵＳが、５ＸＦＡＤマウスのＡＣおよび海馬において、アミロイド負荷量を減少させる
【０２５４】
認知機能に対し、聴覚ＧＥＮＵＳは有益な効果を有していたことから、本発明者らは、５ＸＦＡＤマウスにおいて基盤であるアミロイド病変が改変され得るかを調べることとした。過去に本発明者らは、もっと若い３カ月齢のマウスにおける、アミロイド負荷量に対する視覚ＧＥＮＵＳの改善効果を示している。本明細書では、６カ月齢のマウスに対する聴覚ＧＥＮＵＳの効果を詳細に研究することを目的としている。このマウスはさらに進行したＡＤの状態にあり、より多くのアミロイドプラーク負荷量を呈する。マウスを静かなチャンバー内に置き、４０Ｈｚ、８Ｈｚ、８０Ｈｚ、無作為周波数刺激を含む一連の異なる聴覚音調−列の周波数に暴露させるか、または刺激を与えなかった。７日間の刺激が完了して２４時間後、本発明者らは、ＡＣおよび全海馬（ＨＰＣ）中のアミロイド負荷量を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。４０Ｈｚの聴覚刺激後、本発明者らは、音調無し対照または追加の周波数対照と比較して、可溶性Ａβ１−４２レベルが、ＡＣにおいて５１．４８±４．９８％に減少し、ＨＰＣにおいて４６．８９±３．８９％に減少した一方で、ＡＣおよびＨＰＣ中の可溶性Ａβ１−４０レベルはそれぞれ２０．６５  ±３．２１％および３４．１５±  ４．８３％に減少したことを確認した（図３Ａおよび図１０Ａ）。同様に不溶性Ａβ１−４２レベルは、ＡＣにおいて３６．６８±３．２１％、ＨＰＣにおいて４３．８４±２．４２％に減少した（図３Ｂ）。不溶性Ａβ１−４０は聴覚ＧＥＮＵＳまたは無刺激対照の両方ともＥＬＩＳＡでは検出できなかった。
【０２５５】
本発明者らの結果は、観察されたアミロイドの減少は４０Ｈｚの刺激に特異的であり、８Ｈｚ、８０Ｈｚ、そして無作為周波数刺激のいずれも無刺激対照と比較してＡβレベルは有意に変化しないことを示す。これらの効果が他のＡＤマウスモデルにも適用できるかを決定するために、そして本発明者らの結果が、５ＸＦＡＤモデルに特異的なものであるかを決定するために、本発明者らは、６カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後のＡβレベルを検証した。このマウスは実証済みのＡＤモデルである。本発明者らは、可溶性Ａβ１−４２が無刺激対照と比較してＡＣにおいて４８．３９±３．５０％、そしてＨＰＣにおいて３５．５４±４．２７％に有意に減少していたことを見出した（図１０Ｂ）。
【０２５６】
次に本発明者らは、β−アミロイド特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；Ｄ５４Ｄ２）を使用した免疫組織化学分析で５ＸＦＡＤマウスモデル中のプラーク負荷量を検証した（図３Ｃおよび図３Ｄ）。プラーク数は、無刺激対照と比較して、７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後、ＡＣおよびＣＡ１のそれぞれで４５．７３±２．８１８％および５９．３０±２．０８３％に有意に減少した（図３Ｅ）。プラークの大きさもＡＣおよびＣＡ１のそれぞれで５４．３７±５．６０３％および４０．７０±５．３２１％に有意に減少した（図３Ｆ）。Ａβ１−４２特異的な免疫染色分析から、ＡＣおよびＣＡ１のそれぞれで４５．３５±０．０１１％および４３．２１±０．０２８５％のＡβ１−４２沈着の有意なな減少が示唆された（図３Ｇ〜３Ｉ）。４０Ｈｚ刺激後のプラーク負荷量の動態を検証するために、本発明者らは、β−アミロイド特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；Ｄ５４Ｄ２）を使用した免疫組織化学染色法を５ＸＦＡＤマウスで実施した。当該マウスは最初に１週間の聴覚ＧＥＮＵＳを与え、次の７日間は無刺激とした。平均プラーク数、プラーク面積およびアミロイド強度に若干の減少が観察されたが、有意な差ではなかった（図１０Ｆ〜１０Ｈを参照のこと）。別のＡＤモデルにおける聴覚ＧＥＮＵＳ後のプラーク負荷量を検証するために、本発明者らは、９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを使用した。６カ月齢のマウスでは顕著なプラーク発現を呈さないため９カ月齢を使用した。
【０２５７】
プラーク数は、ＡＣで５２．６５±７．５３％、ＣＡ１で６２．９０±１５．５％に有意に減少したことが観察された。プラークの大きさは、ＡＣで６７．９０±６．１８％、ＣＡ１で６４．０６±１５．２％に有意に減少した。Ａβ１−４２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社；１２Ｆ４）を使用したＡβ１−４２特異的免疫染色分析から、無刺激対照と比較してＡＣおよびＣＡ１のそれぞれでＡβ１−４２沈着に３８．７７±４．２１％および４７．６３±６．０８％の有意な減少が示唆された（図１０Ｃ〜１０Ｅ）。まとめるとこれらの結果から、聴覚ＧＥＮＵＳは、ＡＤマウスモデルにおいてＡＣおよびＣＡ１においてガンマ活動を同調させ、アミロイド負荷量を減少させ得ることが実証される。
【０２５８】
聴覚ＧＥＮＵＳは、５ＸＦＡＤマウスにおいてグリア反応および血管反応を誘導する
【０２５９】
ミクログリアがニューロン活動の変化の原因であり、ＡＤ病変で何らかの役割を果たしているとする証拠が蓄積されつつある（Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｓ，２００５，Ｍｏｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，２０１４，Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅ，２０１５）。ＡＣおよびＨＰＣでアミロイド負荷量を減少させる能力を鑑み、聴覚ＧＥＮＵＳが６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいてミクログリア反応の変化を刺激し得るかを検証した。ミクログリアは貪食を含む活性化状態中に細胞形態を変化させることが示されており（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、実際に本発明者らの過去の研究により、１時間の視覚ＧＥＮＵＳで、ＶＣの活性化と貪食活性の増加と合致したミクログリアの形態変化を誘導するのに充分であることが実証された（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ミクログリアマーカーのＩｂａ１に対する抗体を使用して（図４Ａおよび４Ｂ）、無刺激対照と比較し、聴覚ＧＥＮＵＳ群のＡＣおよびＣＡ１の両方でおよそ６０％多いミクログリアが観察された（図４Ｃ）。無刺激対照と比較して、聴覚ＧＥＮＵＳ後、ミクログリア細胞体面積がＡＣで７０．６０±４．７８％、ＣＡ１で１１７．１７±１０．４％まで増加した（図４Ｄ）。さらに本発明者らは無刺激対照と比較して、ミクログリア突起長が４６．４４±３．２％（ＡＣ）および５０．８７５．±４．８％（ＣＡ１）に減少し、突起分枝が３６．００±９．５％（ＡＣ）および１４３．８１３±２９．９％（ＣＡ１）まで増加したことを見出した（図４Ｅおよび４Ｆ）。ミクログリアのＡβ取り込みを評価するために、本発明者らは、Ｉｂａ１抗体およびＡβ１−４２に特異的なＡβ抗体（１２Ｆ４、方法を参照のこと）を用いて組織切片を共免疫染色することにより、ミクログリア内のＡβの共局在を測定した。ミクログリア細胞体がＡβと共局在しているミクログリアの割合は、無刺激対照と比較して、聴覚ＧＥＮＵＳ後にＡＣで５８．７５±１．２５％、ＣＡ１で６１．３３±３．７１％まで増加していることが観察された（図４Ｇ）。
【０２６０】
他のＡＤマウスモデルで聴覚ＧＥＮＵＳ後にミクログリア反応が発生するかを検証するために、本発明者らは、７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後の９カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスでミクログリアの形態を測定した。７日間の聴覚ＧＥＮＵＳ後の５ＸＦＡＤのミクログリアで見られた結果（図４Ａ〜４Ｇを参照）と類似して、無刺激対照と比較して、ＡＣおよびＣＡ１におけるミクログリア細胞体の直径および数の有意な増加、ならびに平均突起長の有意な減少が観察された（図１１Ａ〜１１Ｃ）。
【０２６１】
聴覚ＧＥＮＵＳ後の５ＸＦＡＤマウスにおけるミクログリア反応の長期的な効果を理解するために、本発明者らは、１週間の聴覚ＧＥＮＵＳ後に無刺激の７日を置き、ミクログリアの形態を検証した。アミロイド（図１０Ｆ〜１０Ｈ）と類似した傾向が観察された。具体的には、有意ではない聴覚皮質中のミクログリア細胞体直径の増加、平均突起長の減少、およびミクログリア数の増加である（図１１Ｄ〜１１Ｆを参照）。しかし非刺激対照と比較した場合、ＣＡ１のミクログリア数には有意な増加（４１．７０±６．７５％）が認められた。
【０２６２】
星状細胞は中枢神経系におけるもう一つの主要グリア細胞であり、ホメオスタシスの維持、シナプス刈り込み（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｒｕｎｉｎｇ）、老廃物のクリアランス、そして例えば脳血流の制御といった他の重要な生物プロセスに必須である（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｋｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。反応性様（ｒｅａｃｔｉｖｅ−ｌｉｋｅ）星状細胞は、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現する（Ｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１）。６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスとＷＴ同腹子の対照マウスの間に反応性星状細胞数の基準変化があるかを調べるために、本発明者らは１００μｍのＣＡ１脳切片にＣＬＡＲＩＴＹを実施し、ＧＦＡＰ抗体で染色した（図１１Ｇ）。５ＸＦＡＤマウスは、ＷＴ対照と比較した場合、ＧＦＡＰ陽性の星状細胞数が有意に少ないことが観察された（図１１Ｈ）。この結果は、他のＡＤトランスジェニックマウスモデルが、類似したグリア細胞の機能低下を有することを示す報告と一致している（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。聴覚ＧＥＮＵＳが星状細胞の反応性に影響を与え得るかを決定するために、本発明者らは、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスに１時間／日の聴覚ＧＥＮＵＳまたは無刺激対照のいずれかを７日間行い、その後、ＧＦＡＰに対する抗体、反応性様星状細胞で発現されていることが示されているもう一つのタンパク質であるＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ（Ｓ１００Ｂ）に対する抗体を使用して脳切片を免疫染色した（図４Ｈおよび４Ｉ）。ＧＦＡＰ陽性の星状細胞は、ＡＣおよびＣＡ１のそれぞれで２７．６６±０．９５４％および１８．１４±０．７９９％まで増加していた。Ｓ１００Ｂ陽性星状細胞は、ＡＣで２１．８３±１．０７％、ＣＡ１で１５．５７±０．８６９％（図４Ｊおよび４Ｋ）まで増加していた。聴覚ＧＥＮＵＳ後の星状細胞数において観察されたこの変化は、星状細胞生存数の潜在的な増加を示している。
【０２６３】
星状細胞は脳の脈管系ネットワークの制御に重要な役割を果たすことが知られており、ＡＤでこのネットワークが機能障害になると病変が悪化し得ることを示唆する証拠が蓄積されている。脳からのアミロイドのクリアランスは多面的であり、脈管系を介した様々なプロセス、例えばグリアリンパ系（ｇｌｙｍｐｈａｔｉｃ）システムを通した、およびエンドサイトーシス受容体リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１：ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）による輸送を介したプロセスが提唱されている。
【０２６４】
脈管系の潜在的な変化を調べるために、本発明者らは最初に血管内皮の効率的なマーカーであるトマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）を使用して、聴覚ＧＥＮＵＳ後の５ＸＦＡＤ脳切片を染色した（図５Ａおよび５Ｂ）。興味深いことに、無刺激対照と比較した聴覚ＧＥＮＵＳ後の血管の直径において、４９．７０±７．８０％（ＡＣ）および１０４．７０±１０．９６％（ＣＡ１）の増加が観察された（図５Ｃ）。さらにアミロイド−血管の相互作用が聴覚ＧＥＮＵＳ後に変化するかを探索した。聴覚ＧＥＮＵＳが、ＬＲＰ１とＡβの共局在に影響を与えうるかを、１時間／日で７日間の聴覚ＧＥＮＵＳに暴露されるか、または無刺激のいずれかの５ＸＦＡＤマウスの脳切片でＬＲＰ１とＡβを染色することにより検証した（図５Ｄおよび５Ｅ）。ＬＲＰ１は脈管系を介したＡβの輸送と全身からの排泄に重要な役割を果たすことが示されている（Ｓｔｏｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。無刺激対照では、８．１７±２．７０％（ＡＣ）および６．９７±１．７３％（ＣＡ１）のＡβとＬＲＰ１の共局在が観察された。一方で聴覚ＧＥＮＵＳ群では、ＡβとＬＲＰ１の共局在は、ＡＣおよびＣＡ１でそれぞれ１７．７１±２．７８％および１６．５０±３．９０％にまで有意に増加していた（図５Ｆ）。まとめると、聴覚ＧＥＮＵＳ後のＡＣおよびＣＡ１におけるＡβレベルの低下に対する一つの説明としては、ミクログリアを通したＡβクリアランスの増加と脈管系の変化による可能性があることが、これらの結果から示唆される。
【０２６５】
聴覚ＧＥＮＵＳは、ＡＣおよび海馬においてタウのリン酸化を減少させる
【０２６６】
ＡＤのもう一つの古典的な病理的特徴は、リン酸化タウ凝集体の蓄積である。ＡＤと関連した特定のアミノ酸残基でのタウのリン酸化が、その細胞骨格支持機能を変化させ、溶解度を低下させることが示されており、これが主要なニューロン損傷であると提唱されている。聴覚ＧＥＮＵＳが、別のＡＤ関連マウスモデルの病変に影響を与え得るかを調べるために、本発明者らはタウＰ３０１Ｓマウスを使用した。タウＰ３０１Ｓマウスは６カ月齢で空間学習と文脈学習の欠落を呈し始めるため、本発明者らは、６カ月齢のタウＰ３０１ＳマウスのＡＣおよびＨＰＣにおいて、聴覚ＧＥＮＵＳがリン酸化タウの減少を導き得るかを検証した。これらマウスの脳切片の免疫組織化学染色（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｄおよび１２Ｅ）から、聴覚ＧＥＮＵＳが、タウリン酸化を、スレオニン−１８１（Ｔ１８１）で３６．２０±２．８２８％（ＡＣ）および３８．７０±２．７３７％（ＣＡ１）まで減少させ、セリン−３９６（Ｓ３９６）で３７．９０±３．４６９％（ＡＣ）および４０．８０±４．５２８％（ＣＡ１）まで減少させた（図１２Ｃおよび１２Ｆ）ことが示される。ウェスタンブロット（ＷＢ）実験により、Ｓ３９６でのタウリン酸化の免疫組織化学染色結果が確認され、ＡＣおよび全海馬組織でそれぞれ、総タウと比較して３３．８３±０．２０％および４３．２０±１．５０％のリン酸化の減少が示された（図１２Ｇ、１２Ｈ、１２Ｊおよび１２Ｋ）。ＷＢ分析で、海馬でリン酸化Ｔ１８１タウの３４．５０±１．６１％の減少が示されたが、ＡＣでは差異は有意ではなかった（図１２Ｉおよび１２Ｌ）。まとめると、これらの結果から、聴覚ＧＥＮＵＳが、ＡＤ関連の過リン酸化エピトープのレベルを減少させ得ること、および聴覚ＧＥＮＵＳが、タウオパチーマウスモデルにおいて病変に影響を与え得ることが示される。
【０２６７】
聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせが、ミクログリアによるクラスター形成性の表現型反応を誘導することを示す
【０２６８】
これまでのところ本発明者らの研究結果により、聴覚ＧＥＮＵＳがアミロイドレベルを減少させ、皮質性感覚野と海馬においてグリア性および脈管性の変化を誘導し得ることが示された。これにより、聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせが、より大きな細胞効果を惹起させ得るかについて調査を行うこととした。４０Ｈｚの聴覚音調刺激と４０Ｈｚの光明滅の組み合わせが、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣのニューロン反応を同調させ得るかを最初に決定した。本発明者らは、３〜８カ月齢のオスの野生型（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ）マウスに、１ミリ秒のの長さの聴覚音調と１２．５ミリ秒の長さの光パルスを４０Ｈｚの周波数で提示しながら、３２チャンネルのシリコンプローブを使用して、動物が球状トレッドミル上で走ったり休息しているときのＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおけるニューロン活動を記録した。それぞれの音調期間と点灯期間で周期的にスパイクは増減し、聴覚−視覚刺激の組み合わせの間、４０Ｈｚへと同調した（図６Ａ〜６Ｃ、左）。ベクトル強度分布は、無作為刺激条件または無刺激条件よりも、４０Ｈｚの聴覚−視覚刺激中のほうが有意に高かった（図６Ａ〜６Ｃ、右）。したがってＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣ中の単一ニューロンのスパイクは、基準期間中よりも聴覚−視覚刺激期間中により顕著に４０Ｈｚに同調した。ＡＣ、ＨＰＣおよびｍＰＦＣ中の局所電場電位は、聴覚−視覚明滅刺激中、４０Ｈｚで高いパワーを示したが、その効果はｍＰＦＣ中では非常に小さかった（図１３Ａ、１３Ｈ、および１３Ｏ）。したがって４０Ｈｚの音調と光刺激が、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおいてＧＥＮＵＳを誘導した。
【０２６９】
局所電場電位（ＬＦＰ）反応および単一ユニット平均発火頻度において、聴覚刺激と、聴覚−視覚刺激の組み合わせの間の差異が、小さくはあるがｍＰＦＣにおいて観察された。組み合わせ刺激中、４０ＨｚでＬＦＰのパワーにわずかな上昇があったが、聴覚のみの刺激の間ではなかった（図８Ｎおよび図６Ｏ）。さらに組み合わせ刺激と基準の間の平均発火頻度差異の分布は、ゼロとは有意に異なるメジアンを有していたが、聴覚のみの刺激では、ゼロとは有意に異ならなかった（図８Ｏおよび図６Ｕ）。
【０２７０】
１時間／日で７日間の組み合わせＧＥＮＵＳ後、本発明者らは、ミクログリアの形態学的特徴と、ＡＣ、ＶＣおよびＣＡ１におけるＡβとの相互作用を検証した（図６Ｄおよび６Ｅ）。高次認知領域は複合的な様式の感覚刺激を処理することが知られているため、本発明者らは、組み合わせＧＥＮＵＳが、内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）でも同様にミクログリア効果を惹起させ得るかを検証した。ミクログリアは非刺激対照と比較して体細胞面積（ｓｏｍａ  ａｒｅａ）で有意な増加を呈したが、突起長は有意に減少したことが判明した（図６Ｆおよび６Ｇ）。ミクログリア数も、組み合わせＧＥＮＵＳの後にＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣで有意に増加している（図６Ｈ）。聴覚刺激または視覚刺激の単独群のミクログリア（図１４Ａ〜１４Ｄ、１４Ｇおよび１４Ｈ）は、ＡＣ、ＶＣ、およびＣＡ１において突起長の減少と体細胞面積の拡大を呈したが、ｍＰＦＣでは呈さなかった。
【０２７１】
視覚ＧＥＮＵＳとは対照的に、聴覚ＧＥＮＵＳは、ＣＡ１においてミクログリア数の有意な増加を示した。しかし聴覚ＧＥＮＵＳも視覚ＧＥＮＵＳも単独ではｍＰＦＣにおいてミクログリア数の有意な変化を惹起しなかった（図１４Ｅおよび１４Ｉ）。これらの研究結果から、１週間のＧＥＮＵＳの後、聴覚刺激単独または視覚刺激単独ではなく、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせのみがｍＰＦＣにおいてミクログリア反応を促進したことが示される。
【０２７２】
興味深いことに、組み合わせＧＥＮＵＳ群のミクログリアは、アミロイド沈着を取り囲む封入効果を呈することで活性に変化を示すと思われた。ミクログリア−Ａβのクラスター形成表現型をさらに解明するために、本発明者らは、組み合わせＧＥＮＵＳ後および無刺激対照の５ＸＦＡＤ脳切片から撮影されたＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣの画像からの三次元（３Ｄ）レンダリングを生成した（「図６Ｄおよび６Ｅ」の「３Ｄ再構成」カラムに示される）。ＩＭＡＲＩＳイメージングソフトウェア（方法を参照のこと）を使用して、本発明者らは、アミロイド沈着（赤色スポット）とミクログリア細胞（緑色スポット）の３Ｄ表面を生成し、アミロイド沈着の半径２５μｍ以内のミクログリアの近接性と数を定量した（右端差し込み図、図６Ｄおよび６Ｅ、組み合わせＧＥＮＵＳ後および無刺激対照のミクログリア−Ａβのクラスター形成表現型を示す映像例は、追加ビデオ１および２に提示される）。無刺激対照と比較して、組み合わせＧＥＮＵＳ後のアミロイドプラーク周囲の半径２５μｍを取り囲むミクログリアの数において、ＡＣで４８．８８±０．６５１％、ＶＣで３１．５６±１．１１％、およびｍＰＦＣで３８．６４±０．９５９％の有意な増加が観察された（図６Ｉ）。さらにＣＡ１においても３３．０５±２．６５％の有意ではない増加が観察された。ミクログリア−Ａβのクラスター形成表現型が、組み合わせＧＥＮＵＳ後に特異的な表現型であるかを検証するために、本発明者らは、聴覚ＧＥＮＵＳ単独または視覚ＧＥＮＵＳ単独後のアミロイド沈着の半径２５μｍ以内のミクログリアの数を分析した。ＧＥＮＵＳマウスと無刺激マウスの間に、１プラーク当たりのミクログリア数に有意差は観察されなかった（図１４Ｆおよび１４Ｊ）。
【０２７３】
次に本発明者らは、ＡＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおける７日間の４０Ｈｚの聴覚ＧＥＮＵＳ、組み合わせＧＥＮＵＳ、８０Ｈｚ、または無作為周波数刺激の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスのミクログリア反応の周波数特異性に取り組んだ。追加周波数および無刺激対照と比較して、４０Ｈｚの聴覚刺激および組み合わせＧＥＮＵＳの後、ＡＣおよびＣＡ１においてミクログリア細胞体の直径および数の有意な増加、ならびに平均突起長の有意な減少が観察された。
【０２７４】
４０Ｈｚの聴覚刺激、追加周波数および無刺激対照と比較して、組み合わせＧＥＮＵＳのみが、ｍＰＦＣにおいてミクログリア反応を生じさせた（図１４Ｋ〜１４Ｍ）。これらの結果から、組み合わせＧＥＮＵＳがニューロン活動の変化を通してミクログリア反応を強化することが示される。したがって、本発明者らは、組み合わせＧＥＮＵＳが、ＡＣ、ＶＣおよびｍＰＦＣにおいて拡張されたミクログリアクラスター形成反応を誘導すると結論づけた。
【０２７５】
聴覚単独または視覚単独ではなく、聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの並行が、ｍＰＦＣにおいてアミロイド負荷量を減少させる
【０２７６】
ＡＣ、ＶＣ、ＣＡ１およびｍＰＦＣにおけるミクログリア反応に関する研究結果から、組み合わせＧＥＮＵＳが、１時間刺激で７日後のそれら領域中のアミロイドレベルも変化させ得るかを調べることにした。抗Ａβ抗体（Ｄ５４Ｄ２）を使用した免疫組織化学解析から、無刺激対照と比較して、組み合わせＧＥＮＵＳ後のプラークの面積（ＡＣで５６．３４±６．３５％、ＶＣで７１．５０±６．５１％、およびＣＡ１で６９．７３±６．４８％）および数（ＡＣで５０．０２±３．７４％、ＶＣで５０．６０±１０．９％、およびＣＡ１で４８．８０±１１．１％）の減少が示された。驚くべきことにこれら結果から、無刺激対照と比較して、組み合わせＧＥＮＵＳ群においてｍＰＦＣ中のプラークの大きさの５９．６４±８．７１％の減少、およびプラーク数の２倍の減少が示された（図７Ａ〜７Ｄ）。聴覚ＧＥＮＵＳ単独および視覚ＧＥＮＵＳ単独のいずれも、ｍＰＦＣにおいてアミロイドプラーク染色の減少を惹起させることができず、組み合わせＧＥＮＵＳに特異的な反応であったことが示唆される（図１４Ｎ〜１４Ｓ）。視覚ＧＥＮＵＳは、ＣＡ１でもプラークの大きさまたは数に変化を示さなかった。聴覚ＧＥＮＵＳ単独処置および組み合わせＧＥＮＵＳ処置の両方とも、ＡＣおよびＨＰＣにおいて、Ａβ−ＥＬＩＳＡで測定した場合に可溶性Ａβ１−４２および不溶性Ａβ１−４２のレベル減少を示した。一方で、組み合わせ無作為明滅、８Ｈｚ、または８０Ｈｚの刺激は、ＡＣまたはＨＰＣにおいてアミロイドレベルに有意な効果を有していなかった（図１４Ｔおよび１４Ｕ）。
【０２７７】
次に様々な周波数の感覚刺激を用いて６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスを処置し、ｍＰＦＣ中のＡβの減少が、刺激のタイプ特異的（聴覚単独と組み合わせの比較）であるのか、または周波数特異的であるのかを決定した。Ａβ−ＥＬＩＳＡを使用してｍＰＦＣ中のアミロイドレベルの変化を測定したところ、組み合わせ８Ｈｚ、４０Ｈｚの聴覚刺激、組み合わせ無作為周波数刺激、または無刺激群の間では、可溶性または不溶性のＡβ１−４２に有意差は観察されなかった。対照的に組み合わせＧＥＮＵＳ群は、無刺激群と比較して、ｍＰＦＣ中で可溶性Ａβ１−４２の５９．５８±７．２６％の減少、および不溶性Ａβ１−４２の３４．１７±８．２０％の減少を示した（図７Ｅおよび７Ｆ）。
【０２７８】
さらにβ−アミロイド特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；Ｄ５４Ｄ２）を使用した免疫組織化学分析により、７日間の４０Ｈｚ聴覚ＧＥＮＵＳ、組み合わせＧＥＮＵＳ、８０Ｈｚまたは無作為周波数刺激の後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおけるプラーク負荷量を測定した。４０Ｈｚの聴覚刺激および組み合わせＧＥＮＵＳ後のＡＣおよびＣＡ１において、平均プラーク数の有意な減少が観察された。しかし、組み合わせＧＥＮＵＳのみが、追加周波数対照および無刺激対照と比較して、ｍＰＦＣ中のプラーク数の有意な減少を生じさせた（図７Ｃおよび７Ｄ）。Ａβ１−４２抗体を使用したＡβ１−４２特異的免疫染色解析から、４０Ｈｚの聴覚刺激および組み合わせＧＥＮＵＳの後のＡＣおよびＣＡ１における顕著なＡβの減少が示された。しかし組み合わせＧＥＮＵＳのみが、ｍＰＦＣにおける免疫染色強度の有意な減少を生じさせた（図１４Ｖ）。
【０２７９】
ｍＰＦＣにおけるアミロイド負荷量の減少から、組み合わせＧＥＮＵＳが、より広範囲の皮質領域に影響を与えることが提唱される。皮質全体のアミロイドプラーク存在量に対する、組み合わせＧＥＮＵＳの全体的な効果を決定するために、本発明者らは、１週間の組み合わせＧＥＮＵＳ後の６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて全脳ＳＨＩＥＬＤ処理（方法）を実施し、アミロイドプラークを免疫染色した（Ｄ５４Ｄ２抗体を使用）（図７Ｇおよび７Ｈ）。ライトシート顕微鏡を使用し、３Ｄでプラークを解析したところ、無刺激対照と比較して、新皮質中のプラークの総量および総数がそれぞれ３７％および３４％減少していたことが判明した（図７Ｉおよび７Ｊ、組み合わせＧＥＮＵＳ後、および無刺激対照のプラークが免疫染色された３Ｄ全脳ＳＨＩＥＬＤサンプルを示す映像例は、追加映像３および４に提示される）。まとめると、これらの結果から、組み合わせＧＥＮＵＳは、５ＸＦＡＤマウスモデルの新皮質全体のアミロイドプラーク負荷量を有意に減少させることが示される。
【０２８０】
方法
【０２８１】
動物
【０２８２】
すべての動物研究は、マサチューセッツ工科大学の比較医学部門の動物実験委員会およびジョージア工科大学の動物実験委員会の承認を受けた。マウスは標準的な１２時間の明／１２時間の暗のサイクルで、５匹以下の群で飼育された。すべての実験は、明サイクルの間に実施された。電気生理学実験はジョージア工科大学で実施され、オス（１〜３ヵ月齢）の野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスは１２時間の明／１２時間の暗の逆のサイクルで飼育され、すべての実験は暗サイクルの間に実施された。食物と水は制限なく提供された。
【０２８３】
手術手順
【０２８４】
すべての手術は、Ｉａｃｃａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６に記載されるとおりに実施された。簡潔に述べると、ヘッドプレートの配置手術前に、成体（２〜３ヶ月齢の）マウスをイソフルランで麻酔した。カスタムステンレス鋼ヘッドプレートは、歯科セメント（Ｃ＆Ｂ  Ｍｅｔａｂｏｎｄ社、パーケル）を使用して固定され、ＬＦＰ記録の標的開頭部位は、頭蓋骨上にマークされた（ｍｍ単位、前頂（ｂｒｅｇｍａ）から：ＣＡ１標的に対しては、−２．０前方／後方、±１．８内側／側方、聴覚皮質標的に対しては、−２．０〜−３．０前方／後方、±１．８内側／側方、そして前頭前野皮質標的に対しては、＋１．３〜＋１．４前方／後方、±１．０内側／側方）。開頭は後に３〜８カ月齢のマウスで実施された。最初の記録セッションの前に、歯科ドリルを用いて頭蓋骨を薄く削り、２７ゲージの針で穴をあけることで開頭部分（直径２００〜５００μｍ）が作製された。記録しない場合、滅菌シリコンエラストマー（Ｋｗｉｋ−Ｓｉｌ  ＷＰＩ）で開頭部分を密閉した。
【０２８５】
電気生理記録
【０２８６】
記録中、頭部が固定された動物は、空中浮動性の８インチ（約２０．３センチ）の球状トレッドミル上で走った。すべての動物は、時折甘いコンデンスミルク（１：２水希釈）を与えられながら、快適になるまでトレッドミル上で動くことをすでに学習していた。動物は最大で５時間、ボール上にいて、その間、走ったり休んだりの複数の期間があった。シングルシャンク３２チャンネルプローブ（ＮｅｕｒｏＮｅｘｕｓ社）が標的位置に進められた。記録部位は２５０μｍに及んだ。聴覚皮質記録については、プローブは、前頭面に沿って垂直線から４５度の角度で、３〜４．１５ｍｍの深さまで進められた。５、１０、１５および２０ｋＨｚの一連の５０ミリ秒の音調が提示され、平均ＬＦＰにおける聴覚反応を検出した。ＣＡ１記録については、プローブは、海馬錐体層の電気生理学的特徴（大きなシータ波と鋭い波紋、複数チャンネル上に１５０＋μＶスパイク）が観察されるまで、開頭部分を通して１．１４〜２．０５ｍｍの深さまで垂直に進められた。前頭前野皮質記録については、プローブは、前頭面から４９度の角度で、垂直線から２０度の角度で、１．４８〜２．１５ｍｍの深さまで進められた。同一の記録セッションの間に複数の深さでデータを収集した場合；新たな深さはマッピングされ、記録部位の位置が標的の位置に留まっていることが確認された（ＡＣについては５匹のマウスの９回のセッションで、ｎ＝９の深さ記録、ＣＡ１については５匹のマウスの１０回のセッションで、ｎ＝１２の深さ記録、ｍＰＦＣについては４匹のマウスの７回のセッションで、ｎ＝７の深さ記録）。データは、参照値としてグラウンドペレット（ｇｒｏｕｎｄ  ｐｅｌｌｅｔ）を使用し、Ｉｎｔａｎ  ＲＨＤ２０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して２０ｋＨｚのサンプリングレートで取得された。
【０２８７】
電気生理学的記録のための聴覚刺激および視覚刺激
【０２８８】
１０秒間の刺激ブロックと１０秒間の基準期間を交互において、動物に提示した。刺激ブロックは、２０Ｈｚ、４０Ｈｚ、８０Ｈｚまたは無作為刺激周波数（パルスは２５ミリ秒の平均間隔で、一様分布から決定された無作為化パルス間隔で送達された）の聴覚刺激のみ、または聴覚刺激と視覚刺激の間で循環された。刺激ブロックは交互に配置され、観察結果が、ニューロン反応の経時的な変化が原因ではないことを確認した。すべての聴覚パルスは、１ミリ秒の長さ、１０ｋＨｚの音調であった。すべての視覚パルスは、刺激周波数（２５ミリ秒、１２．５ミリ秒、または６．２５ミリ秒の長さ）の５０％負荷サイクルであった。組み合わせ刺激については、聴覚パルスと視覚パルスは、各パルスの開始に位置合わせされた。
【０２８９】
データ取得
【０２９０】
データは、Ｉｎｔａｎ  ＲＨＤ２０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して２０ｋＨｚのサンプリングレートで取得された。
【０２９１】
スパイク検出
【０２９２】
未処理トレースは３００〜６，０００Ｈｚの間でバンドパスフィルタ処理された。次いで、フィルター処理シグナルのメジアンに５倍の推定標準偏差を足した閾値（メジアン／０．６７５）によりスパイクが検出された。
【０２９３】
スパイクソーティングおよび単一ユニットの安定性
【０２９４】
スパイクの検出とソーティングは、ＭｏｕｎｔａｉｎＳｏｒｔ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｐｉｋｅ  ｓｏｒｔｉｎｇを使用して実施され、その後に波形と交差−相関曲線（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌｏｇｒａｍｓ）の目視検査に基づく人力キュレーションが行われた。人力キュレーションの前に、クオリティ閾値が適用され、１以上のピークＳＮＲを有し、１０％未満のノイズ重複、そして他のユニットから９５％超が単離され、綺麗に単離された単一ユニットが形成されたユニットのみが含まれた。記録中の単一ユニットが無くなる不安定期間を説明するために、安定性基準を適用し、安定期間（単一ユニットの発火頻度の突然の消失がない）のみを分析で検討した。各ユニットに対する発火頻度（ＦＲ）は、記録セッションの間にコンピューター計算された。発火頻度は、ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを使用し、低ＦＲと高ＦＲの二つの分布にクラスター化された。高ＦＲ平均の１０％よりも下回ったＦＲを有するユニットについてはさらなる解析を行い、ＦＲが低ＦＲ平均より２標準偏差高い、最も長い期間として規定される安定的記録期間を特定した。
【０２９５】
局所的電場電位
【０２９６】
ＬＦＰは、未処理トレースを２ｋＨｚにダウンサンプリングし、１〜３００Ｈｚにバンドパスフィルタを行うことで取得された。
【０２９７】
分析用記録部位
【０２９８】
ＡＣおよびＣＡ１のデータを複数のチャンネルで分析した。ＡＣでは、３２個のチャネルのうち、低いほうの１６個が、３７５μｍにわたり利用された。プローブの最も低いチャンネルを使用してＡＣの位置を決定し、高いほうの１６個は、主要対象領域ではないと決定された。ＣＡ１については、プローブ上のすべての機能チャンネルが２５０μｍにおよび解析された（２７／３２または３１／３２）。ＡＣおよびＣＡ１の両方で、プローブ上の最も高いチャンネルはパワースペクトル解析用のプローブ基準として使用された。同様の結果が、基準としてグラウンドを使用して取得された。
【０２９９】
前頭前野皮質の組織検査
【０３００】
各動物における最終のｍＰＦＣ記録中、プローブはＤｉｌでコーティングされ、標的深度に挿入された。マウスは、麻酔（イソフルラン）下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４％パラホルムアルデヒドで経心臓かん流され、脳は１ｘＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで一晩、ポストフィックス（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）された。Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１０００Ｓ  ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ社）を用いて１００μｍの厚さに脳を切片化した。１ｘＰＢＳ中、０．２％  １ｍＭｏｌ  ＤＡＰＩで切片を染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ標本培地を用いて顕微鏡スライド上に封入した。Ｚｅｎ  Ｂｌｕｅ  ２ソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立落射蛍光顕微鏡上で画像を取得した。
【０３０１】
パワースペクトル
【０３０２】
パワースペクトル密度解析は、Ｃｈｒｏｎｕｘ  ｔｏｏｌｂｏｘのマルチテーパ（ｍｕｌｔｉｔａｐｅｒ）法を使用して実施された（時間帯域積＝３、テーパ数＝５）。ＬＦＰトレースは、各刺激条件の１０秒トライアルに分割された。平均パワースペクトル密度は、これらトライアル全体で、頭蓋骨上の生理食塩水中のグラウンドペレットを基準とし、各動物に対してコンピューター計算された（同じ記録日および記録深度内で）。当初、パワースペクトル密度分析は、ＡＣ、ＣＡ１、およびｍＰＦＣのすべての記録部位に対して計算された。各記録深度から、４０Ｈｚの明滅刺激への反応で最も大きな４０Ｈｚピークを有するトレースが解析に含められた。提示データ中に示される深度あたりのトレースは、聴覚明滅刺激の反応で最も大きな４０Ｈｚピークを有していたものである。
【０３０３】
明滅刺激中の発火
【０３０４】
各刺激周波数に対する、単一ユニットの刺激周辺時間ヒストグラム（ＰＳＴＨ：ｐｅｒｉ−ｓｔｉｍｕｌｕｓ  ｔｉｍｅ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）には、四つの刺激サイクル
【数１】
2020536653.tif 000003
が含有され、１サイクルあたり１０ビンが伴う場合、刺激列全体のスパイクが示される。ＰＳＴＨは、各点灯パルスまたは各オーディオオンパルスの開始の前後の二つの刺激サイクルに対しスパイクをビニングすることで、すべての単一ユニットに対しコンピューター計算された。無刺激のヒストグラムは、無作為刺激条件と同様に無作為分布したパルス時間を使用して算出された。発火頻度は、１ビンあたりのスパイク数を、パルス総数およびビンサイズにより割ることで、各ビンでコンピューター計算された。刺激周波数に関連する発火頻度の周期性を定量するために、発火頻度ピーク間の時間間隔を、すべての単一ユニットヒストグラムに対して算出した。各ＰＳＴＨのピークは、一つの刺激間隔内の最大発火頻度とした。刺激による発火頻度調節を定量し、角度統計（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）をコンピューター計算するために、刺激周辺スパイク時間をラジアンに転換した:
【数２】
2020536653.tif 000004
ベクトル強度は、ＣｉｒｃＳｔａｔ  ｔｏｏｌｂｏｘの方法を使用してコンピューター計算された；レイリー統計値は、式ＲＳ＝２ｎＶＳ２を使用してコンピューター計算され、式中、ｎは、総スパイク数であり、ＶＳはベクトル強度である（Ｂｅｒｅｎｓ，２００９，Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３））。
【０３０５】
平均発火頻度
【０３０６】
各刺激条件に対し、各単一ユニットの平均発火頻度がコンピューター計算された。各ユニットに関し、安定的期間のみが、平均ＦＲ算出に貢献した（上述のスパイクソーティングおよび単一ユニットの安定性を参照のこと）。刺激条件間の平均発火頻度の差異は、そのユニットの各条件における平均ＦＲの差を取ることで、各ユニット内で計算された。
【０３０７】
４０Ｈｚの視覚明滅刺激プロトコール
【０３０８】
生化学分析および免疫組織化学分析のために、５ＸＦＡＤマウスを暗いチャンバー内に置き、発光ダイオード（ＬＥＤ）電球で照らし、以下の４刺激条件の内の一つの条件に曝した：暗、８Ｈｚ、４０Ｈｚ（１２．５ミリ秒の点灯、１２．５ミリ秒の消灯、６０Ｗ）、または無作為（平均２５ミリ秒の一様分布により決定された無作為な間隔で光のパルスが与えられる）の刺激を１時間で７日間。
【０３０９】
４０Ｈｚの聴覚音列刺激プロトコール
【０３１０】
生化学分析、免疫組織化学分析、または行動分析のために、５ＸＦＡＤマウス、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス、またはＰ３０１Ｓマウスを防音発泡体（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ社、５６９２Ｔ４９）で遮音された静かな室内の薄暗いチャンバー内に置いた。スピーカー（ＡＹＬ社、ＡＣ−４８０７３）は、チャンバー上のマウスから届かない位置に置かれた。マウスを、以下の五つの刺激条件の内の一つの刺激条件に曝した：音調無し、８Ｈｚの音調、４０Ｈｚの音調、８０Ｈｚの音調、または無作為に送達される音調（聴覚音調は、平均２５ミリ秒の一様分布により決定された無作為な間隔で送達される）の刺激。刺激条件様の音調は、１ミリ秒の期間で、６０ｄＢで送達された１０ｋＨｚの音調から構成された。電気生理学的記録については、プローブの設置後、室内の照明をオフにし、１０秒間の聴覚のみ刺激と、視覚−聴覚刺激を交互に、照明無しまたは音調無しの１０秒間をインターリーブして動物に提示した。聴覚のみ刺激については、１０ｋＨｚの音調が、４％の負荷サイクルで４０Ｈｚにて再生された。聴覚−視覚刺激については、聴覚刺激には、５０％の負荷サイクルで１０秒間、４０Ｈｚにて明滅する周囲光が伴った。刺激は２０分のセッションの間、この様式で提示され、セッションの間に１〜１０分間の停止時間があり、動物の行動がチェックされた。
【０３１１】
並行する４０Ｈｚの聴覚刺激および視覚刺激のプロトコール
【０３１２】
生化学的分析、免疫組織化学分析、または行動分析のために、５ＸＦＡＤマウスを暗いチャンバー内に置いてＬＥＤ電球で照らし、同時に聴覚音列に曝した。マウスは以下の四つの刺激の内の一つに曝された：暗／静、４０Ｈｚの光の明滅、４０Ｈｚの聴覚音列、４０Ｈｚの光の明滅と聴覚音調の並行、または無作為な光の明滅／音調の刺激。
【０３１３】
免疫組織化学法
【０３１４】
マウスは、麻酔（２：１のケタミン／キシラジン）下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４％パラホルムアルデヒドで経心臓かん流され、脳はＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで一晩、ポストフィックス（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）された。Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１０００Ｓ  ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ社）を用いて４０μｍの厚さに脳を切片化した。切片を透過処理し、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、１０％ロバ血清を含むＰＢＳ中で２時間、室温でブロッキングした。一次抗体を含有する、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１０％ロバ血清を含むＰＢＳ中で４℃で一晩、切片をインキュベートした。一次抗体は以下であった：抗β−アミロイド（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；Ｄ５４Ｄ２）、抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社；０１９−１９７４１）、抗グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（Ａｂｃａｍ社；ａｂ４６７４）、抗Ｓ１００Ｂ（Ａｂｃａｍ社；ａｂ８６８）、抗ＬＲＰ１（Ａｂｃａｍ社；２８３２０）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８標識Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社；ＤＬ−１１７４）、抗アミロイドオリゴマー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ社；ＡＢ９２３４）、抗ホスホ−タウ（Ｓｅｒ３９６）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；９６３２）、抗−ホスホ−タウ（Ｔｈｒ１８１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、１２８８５）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；Ｈ３５７０）。抗Ａβ抗体１２Ｆ４が使用された理由は、ＡＰＰと反応しないためである。それにより標識がＡβ特異的であるかを決定することができ、Ｉｂａ１との共標識が可能となる。抗アミロイドオリゴマー抗体のＡＢ９２３４は、ＬＲＰ１との共標識に使用した。翌日、脳切片を蛍光結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）とともに室温で２時間インキュベートし、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した。画像は、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０；Ｚｅｉｓｓ社）を使用し、全条件に対し同一設定、４０ｘの対物レンズで取得した。画像は、処置群に対し盲検化された実験担当者により、ＩｍａｇｅＪ  １．４２ｑを使用して定量された。各実験条件に対し、各動物からの二つの冠状切片を定量に使用した。図の説明中、別段の記載がない限り、スケールバーは５０μｍである。ＩｍａｇｅＪを使用して、Ｉｂａ１＋細胞体の直径を測定し、長さ測定のために突起を辿った。さらにＣｏｌｏｃ２プラグインを使用して、Ｉｂａ１とＡβの共局在を測定した。ミクログリア突起分枝は、Ｉｍａｒｉｓｘ６４  ８．１．２（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、スイス、チューリッヒ）を使用して定量された。ＩｍａｇｅＪの「粒子分析」機能を使用して、プラークの数と面積を計数した。少なくとも１０μｍの沈着が含まれ、対照群と実験群の両方に設定閾値を使用した。
【０３１５】
脈管系−Ａβの共局在性分析
【０３１６】
ＩｍａｒｉｓＣｏｌｏｃモジュールを使用して、二つの別個のソースチャンネル（すなわちレクチンとＡＢ、レクチンとＬＲＰ１）の間のシグナルの共局在を３Ｄで定量した。これらのソースチャンネルに閾値設定し、ノイズまたはバックグラウンドシグナルから生じる強度をマスクした。その後にＩｍａｒｉｓＣｏｌｏｃはソースチャンネルに対する閾値設定内に共局在するボクセルのみを含有する新たなチャンネルを作成し、関連統計解析に提示する。
【０３１７】
ミクログリア−Ａβのクラスター形成分析
【０３１８】
ＩＭＡＲＩＳを使用して、４０ｕＭ切片におけるアミロイドプラーク周辺のミクログリアのクラスター形成パターンを分析した。表面モジュールを利用して、１２Ｆ４シグナルに基づきプラーク（赤）を検出し、３Ｄレンダリングした。次いで、Ｉｂａ１陽性ミクログリアをスポットモジュールを使用して計数し、各細胞の細胞体に球を配置した（緑）。最後にＳｐｏｔｓ  Ｃｌｏｓｅ  Ｔｏ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ＸＴｅｎｓｉｏｎを実行して、規定の２５ｕＭ閾値よりも表面物体に近いスポットのサブセットを見出し、この範囲の外側にあるスポットを除外した。アルゴリズムは、当該スポットの中心から、３Ｄ空間内の表面物体の最も近いポイントまでの距離を測定する。それによりプラーク近傍のミクログリア凝集を定量することができる。
【０３１９】
脳切片におけるＣＬＡＲＩＴＹ免疫染色
【０３２０】
マウスを氷冷ＰＢＳ（１Ｘ）でかん流し、次いで氷冷した４％  ＰＦＡ、１％グルタルアルデヒドの１ｘＰＢＳ溶液でかん流した。脳を４％ＰＦＡ／１％グルタルアルデヒド溶液中で解剖し、４℃で７２時間、ポストフィックスした。不活化溶液（４％アクリルアミド、１Ｍグリシン、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の１Ｘ  ＰＢＳ溶液）中、室温で４８時間、脳をインキュベートすることにより固定を停止させた。１ｘＰＢＳで洗浄した後、脳を、１ｘＰＢＳ中、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ社  ＶＴ１００Ｓ）上で１００ｕＭの冠状切片へと切り出した。対象領域（すなわち聴覚皮質と海馬）を含有する切片をＡｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓを参照して選択し、クリアリング緩衝液（ｐＨ８．５−９．０、２００ｍＭ  ドデシル硫酸ナトリウム、２０ｍＭ  水酸化リチウム一水和物、４ｍＭ  ホウ酸のｄｄＨ２Ｏ溶液）中で２〜４時間、５５℃で振盪しながらインキュベートした。清浄化された切片を、３ｘ１５分間、１ｘＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／１ＸＰＢＳ）中で洗浄し、ブロッキング溶液（２％ウシ血清アルブミン／１ｘＰＢＳＴ）内にＲＴで一晩おいた。続いて、１ｘＰＢＳＴ中で１時間の洗浄を３回、ＲＴで振とうしながら行った。切片を弱結合緩衝液（ｐＨ８．５−９．０、３７．７５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．５３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０２％  アジ化ナトリウムのＰＢＳＴ溶液）中で１時間、ＲＴでインキュベートし、次いで１ｘ弱結合緩衝液中、３７℃で１２時間、１：１００に希釈された一次抗体へとトランスファーした。次いでリバーサル緩衝液（ｐＨ  ７．４、３７．７５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．５３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４の０．０２％  アジ化ナトリウムのＰＢＳＴ溶液）を分割量で１時間ごとに６時間かけて加えて、組織体積と一次抗体溶液を加えた体積と等しくする。１ｘＰＢＳＴ中、３ｘ１時間の洗浄の別セットを行い、その後、切片を１２時間、ＲＴで、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（１：２５０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、９４４０３）および二次抗体（１：１００）の１ｘＰＢＳ混合溶液中でインキュベートした。次いで切片を一晩、１ｘＰＢＳ中で洗浄し、ＲＩＭＳ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：７５ｇ  Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ、２０ｍＬの０．１Ｍ  リン酸緩衝液、６０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ）中で１時間、ＲＴでインキュベートして、封入した。脳切片は、ＲＩＭＳ中、カバースリップを用いて顕微鏡スライド上に封入された（ＶＷＲ  ＶｉｓｔａＶｉｓｉｏｎ、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＬＣ、ペンシルバニア州ラドナー）。
【０３２１】
画像は、付属のＺｅｎ  Ｂｌａｃｋ  ２．１ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社、ドイツ、イエナ）を用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ８８０顕微鏡上で取得された。Ｚ−スタック画像は、３Ｄ再構成に適した０．４〜０．５μｍの刻み幅、ピクセルドエル４．１ミリ秒、平均２、解像度１０２４ｘ１０２４で撮影された。Ｉｍａｒｉｓｘ６４  ８．３．１（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、スイス、チューリッヒ）を３−Ｄレンダリングと分析に使用した。
【０３２２】
マウス全脳の処理およびクリアリング
【０３２３】
５ＸＦＡＤマウスの脳をＳＨＩＥＬＤプロトコールに従って処理した。簡潔に述べると、５ＸＦＡＤマウスに、氷冷ＰＢＳを用いて経心臓かん流を行い、次いで２０ｍＬの４％ＰＦＡ含有ＳＨＩＥＬＤ−ＯＦＦ溶液でかん流した。脳を解剖し、同じ溶液中で２４時間、４℃でポストフィックスを行った。次いで脳を一晩、ＰＦＡを含まないＳＨＩＥＬＤ−ＯＦＦ溶液中、４℃でインキュベートした。次いで脳を２４時間、ＳＨＩＥＬＤ−ＯＮ溶液中、３７℃でインキュベートした。固定後、脳を、２００ｍＭ  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０ｍＭ  水酸化リチウム一水和物、４０ｍＭ  ホウ酸、ｐＨ８．５−９．０を含有するクリアリング水溶液中でインキュベートした。次いで脳を、確率論的エレクトロトランスポート（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５）に基づきＳｍａｒｔＣｌｅａｒ  Ｐｒｏ（ＬｉｆｅＣａｎｖａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使用して数日間、透明になるまでクリアリングを行った。
【０３２４】
透明化した全半球の免疫染色
【０３２５】
透明化した半球を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８が結合した１５ｕｌのβ−アミロイド抗体（ＣＳＴ社、＃５１３７４）で、改変確率論的エレクトロトランスポート法のｅＴＡＮＧＯ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５）を使用して、２日間にわたり染色した。
【０３２６】
ライトシート顕微鏡
【０３２７】
免疫染色されたサンプルを、ｈＰｒｏｔｏｓ（３ｇ  ジアトリゾ酸、５ｇ  Ｎ−メチル−ｄ−グルダミン、１２５ｇ  イオヘキソールの１０５ｍｌ  ＤＩ水溶液）とともにインキュベートして光学クリアリングを行い、次いでｈＰｒｏｔｏｓ中、２％低融点アガロースを使用してアクリルホルダーへと封入した。カスタムメイドのライトシート顕微鏡には、１０ｘＣＬＡＲＩＴＹ最適化対物レンズが備えられており、これを使用して、全半球を、ベータ−アミロイドの可視化には４８８チャンネル、自己蛍光には６４７チャンネルを使用して撮影した。
【０３２８】
透明化全脳の画像処理、プラーク検出、およびアトラスアライメント
【０３２９】
取得された画像データは、Ｍａｔｌａｂ中に実装されたオープンソースソフトウェアであるＣＩＤＲＥを使用して光量補正された。得られた処理画像は、Ｔｅｒａｓｔｉｔｃｈｅｒ  ｉｎ  Ｉｍａｒｉｓ（商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ（登録商標））を使用してまとめてステッチ（ｓｔｉｔｃｈ）され、３Ｄ視覚化に使用された。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して、代表的な切片ごとの２Ｄ視覚化が行われた。オープンソースのＣｌｅａｒＭａｐソフトウェア、カスタム細胞分類ニューロンネットワークモデル、および  Ｅｌａｓｔｉｘの組み合わせを使用して、自動プラーク検出を実施した。候補プラークは、ＣｌｅａｒＭａｐのスポット検出モジュールを用いて「スポット」として配置された。最初に、（２１，２１）の外径と内径のピクセルサイズを有するディスク構造エレメントを用いたグレースケール形態シルクハット（ｔｏｐ−ｈａｔ）変形を使用して、背景減算を切片ごとに行った。次に、データの局所最大値は、サイズ（７，７，４）のディスク構造エレメントで３Ｄ最大値フィルターを適用することによって検出される。これらの局所最大値は、強度閾値１００でフィルタリングされる。各スポットの中心位置に対応するピクセル容量も、シードポイントとしてスポット中心を用いた３Ｄ流域変形を使用して算出される。次いで、１０ミクロンの直径を有する球よりも小さい体積のプラーク候補はすべて除外された。真のプラークは、重畳ニューロンネットワーク（ＣＮＮ：ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）モデルを、Ｔｈｅａｎｏ（商標）バックエンドとともにＫｅｒａｓ（商標）中に実装された分類別プラーク／非プラーク分類子として使用して、候補プラークから識別された。ＣＮＮインプットは、候補プラーク中心を中心とする３２ｘ３２ピクセルの境界ボックスであり、アウトプットは、プラークおよび非プラークのカテゴリーを表す２エレメントのｏｎｅ−ｈｏｔベクトルである。アーキテクチャは、１２個の総重畳レイヤーから構成され、それぞれが整流された線形ユニット（ＲｅＬＵ：ｒｅｃｔｉｆｉｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｕｎｉｔ）のアクティブ化と、それに続くバッチ正規化を有している：６４  ２ｘ２カーネルの３個、１２８  ２ｘ２カーネルの３個、それに続いて１９２  ２ｘ２カーネルの３個、２５６  ２ｘ２カーネルの１個、２５６  １ｘ１カーネルの１個、そして２  １ｘ１カーネルの１個。２ｘ２のサブサンプリングは、第三、第六および第九の重畳レイヤーの後に実施される。０．５の比率を有するドロップアウト（Ｄｒｏｐｏｕｔ）は、最後の９個の重畳／バッチ正規化レイヤーの後に適用され、正則化される。最終重畳レイヤーの後、グローバル平均プーリング（ｇｌｏｂａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｐｏｏｌｉｎｇ）と、それに続くソフトマックスアクティブ化（ｓｏｆｔｍａｘ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）が適用され、最終のカテゴリカルベクトルが生成される。トレーニング中、カテゴリー横断的なエントロピー損失が、デフォルトパラメーターのＡｄａｍ最適化ツールとともに使用された。ＣＮＮは、Ｋｅｒａｓ（商標）Ｉｍａｇｅ  Ｄａｔａ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを使用し無作為な回転、せん断、および反転で増補された約１０，０００個の手動プラークアノテーションに対し、６４のバッチサイズを含む４００のエポックについてトレーニングされた。次いで得られたモデルを使用して、すべてのサンプルに対し、検出スポットからプラークを分類した。アトラスアライメントを実施するために、自己蛍光チャンネル画像を最初にアトラス解像度にダウンサンプルし、その後、Ｅｌａｓｔｉｘを使用してアフィン変換パラメーターおよびＢ−スプライン変換パラメーターを算出して、固定画像として再サンプリングされた自己蛍光画像、および移動画像としてアトラスを用いて３Ｄ画像登録を実施した。得られたアライメントパラメーターを、プラーク位置（ＣＮＮモデルからのアウトプット）に適用し、プラークをアトラス空間内に変換する。その後、各脳領域に関するプラークの数と量の情報を含むＣＳＶファイル（Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓに準拠したセグメント化）を生成する。
【０３３０】
ウェスタンブロット
【０３３１】
６カ月齢のオスの５ＸＦＡＤマウスから海馬および聴覚皮質を解剖し、溶解物を調製した。組織を１ｍｌ  ＲＩＰＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ）緩衝液中で、ハンドホモジナイザー（Ｓｉｇｍａ社）を用いてホモジナイズし、氷上で１５分間、インキュベートして、４℃で３０分間、回転させた。細胞残渣は１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離を行うことで単離され、廃棄された。溶解物はナノドロップを使用して定量され、２５μｇのタンパク質を１０％アクリルアミドゲルにローディングした。タンパク質は、アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１００Ｖで１２０分間トランスファーされた。膜は、ＴＢＳ：Ｔｗｅｅｎで希釈されたウシ血清アルブミン（５％  ｗ／ｖ）を使用してブロッキングされた。膜を、１次抗体中で一晩、４℃でインキュベートされ、２次抗体中で９０分間、室温でインキュベートされた。一次抗体は抗ホスホ−タウ（Ｓｅｒ３９６）および抗ホスホ−タウ（Ｔｈｒ１８１）であった。二次抗体は、ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ二次抗体であった。シグナル強度は、ＩｍａｇｅＪ  １．４６ａを使用して定量され、総タウ  Ｔａｕ５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；ＡＨＢ００４２）の値に正規化された。
【０３３２】
ＥＬＩＳＡ
【０３３３】
主要な聴覚皮質、内側前頭前皮質、および海馬は、６カ月齢の５ＸＦＡＤオスマウスから単離され、これにＡβ４２またはＡβ４０  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をメーカーの指示に従い使用して  、Ａβ測定を行った。不溶性ＡβはＥＬＩＳＡ測定前に５Ｍ  グアニジン／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で処理した。
【０３３４】
行動実験
【０３３５】
新規物体の認識
【０３３６】
新規物体認識（ＮＯＲ）タスクは、過去に記載されているとおり（Ｌｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、馴化フェーズとそれに続く翌日に実施されるトレーニングおよび検査から構成された。トレーニングの２４時間前、マウスはオープン検査アリーナ（４０ｃｍＬｘ４０ｃｍＷｘ３５ｃｍＨ）に５分間、馴化され、その間の総距離（ｃｍ）、中心滞在時間（秒）、および速度（ｃｍ／秒）が算出される（ＴＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）。トレーニング中、マウスは同じ箱内に置かれ、その箱には向かい合わせの角に置かれた二つの同じ物体がある。マウスはトータルで２０秒の物体相互作用時間（１０分間の最大時間フレーム内）が与えられ、その後直ちにアリーナから取り出された。物体記憶は、一つの物体がその位置で新しい物体で置き換えられた点は除き、トレーニング中と同じ手順を使用して１時間後に検査された。物体探索は、いずれか物体と鼻先が接触したときに記録され、認識インデックス、ＲＩ＝Ｔ新規／（Ｔ新規＋Ｔ慣れた）、により算出された。式中、Ｔ新規およびＴ慣れたはそれぞれ新規物体および慣れた物体に費やされた時間を示す。
【０３３７】
新規物体位置
【０３３８】
新規位置認識（ＮＯＬ）タスクは、二つの同一物体がトレーニングと検査の両方に使用され、検査の間は一つの物体が新規の位置に移された点を除き、物体認識タスクと同じ手順を使用して実施された。
【０３３９】
モリス水迷路検査
【０３４０】
空間参照記憶検査は、およそ２２℃の白い不透明な水で満たされた環状タンク（直径１．２ｍ）中で実施された。参照合図は異なる色と形状から構成され、タンクを取り囲む壁に沿って配置された。タンク内には固定プラットフォーム（直径１０ｃｍ）が標的四分円に置かれた。検査中、プラットフォームは沈められ、マウスは、タンクの壁に無作為に面する７ポイントのうちの一つで、タンク内に置かれた。マウスはプラットフォーム探索に６０秒が与えられ、発見できなかった場合、穏やかにプラットフォームに誘導された。マウスは１５秒間、プラットフォーム上に置かれた。１日あたり２回のトライアルを実施し、トライアルの間は１時間の間隔を置いた。トライアルの間、マウスは穏やかに足を乾かされ、ヒートパッド上で暖められた。マウスの行動は、ＴＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用してビデオ記録された。逃避潜時、またはマウスがプラットフォームに到達するまでにかかった時間は、各トライアルでスコア化され、検査日ごとに平均化された。６日目にプラットフォームを取り外し、記憶検査（プローブ検査）が実施された。四つの四分円のそれぞれで過ごした時間と、プラットフォームがあったエリアを交差した回数が記録された。遊泳速度は自動的に記録された。
【０３４１】
結論
【０３４２】
本開示の発明に関する態様は、本明細書に記載する個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、二つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０３４３】
また、様々な発明の概念が、一つ以上の方法として具現化されてもよく、その例を提供してきた。方法の一部として行われる行為は、任意の適切な手段で順序付けられうる。したがって、行為が例示するものとは異なる順序で行われる実施形態を構築してもよく、それは、例示的実施形態に連続する行為として示す場合であっても、一部の行為を同時に行うことを含みうる。
【０３４４】
本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０３４５】
本明細書で定義および使用するすべての定義は、辞書定義、参照により組み込まれる文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味を統制するものと理解されるべきである。
【０３４６】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確にそうでないと示されない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解されるべきである。
【０３４７】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「および／または」という語句は、結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味し、すなわち、一部の場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で挙げられる複数の要素は、同じ形式、すなわち、等位接続される要素のうちの「一つ以上」と解釈されるべきである。他の要素は、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に、随意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「備える」などの制限のない語法と連動して使われるときに、一実施形態においては、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢと両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
【０３４８】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的なもの、すなわち、多数の要素または要素のリスト、および随意にリストに無い追加の項目のうちの少なくとも一つを含むが、二つ以上も含むと解釈されるものとする。それとは反対であると明確に指示した用語のみ、例えば、「のうちの一つのみ」もしくは「のうちの正確に一つ」、または特許請求の範囲において使用するときの「から成る」は、例えば多数の要素またはリストの要素のうちの正確に一つの要素の包含とみなす。概して、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの一つ」、「のうちの一つのみ」、または「のうちの正確に一つ」など、排他性の用語が先行するときには、排他的な選択肢（すなわち、「両方ともでなくどちらか一方」）を示すとのみ解釈されるものとする。「から基本的に成る」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。
【０３４９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、一つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも一つ」という語句は、要素のリストの中の要素のいずれか一つ以上から選択される、少なくとも一つの要素を意味するが、要素のリスト内で具体的に列挙したありとあらゆる要素のうちの、少なくとも一つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストのいかなる要素の組み合せも除外するものではない、と理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも一つ」という語句が指す、要素のリスト内で具体的に識別される以外の要素が、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に存在しうることを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも一つ」（または、等価的に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一つ」、もしくは、等価的に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一つ」）は、一実施形態においては、Ｂは存在せず、任意選択的に二つ以上のＡを含む、少なくとも一つのＡ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態においては、Ａは存在せず、任意選択的に二つ以上のＢを含む、少なくとも一つのＢ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、また別の実施形態においては、任意選択的に二つ以上のＡを含む、少なくとも一つのＡ、および任意選択的に二つ以上のＢを含む、少なくとも一つのＢ（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
【０３５０】
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書で、すべての移行句、例えば、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「持つ（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保つ（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」、および類似のものは制限がないと理解され、すなわち、含むがそれに限定はされないということを意味する。「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から基本的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句のみが、米国特許局の特許審査手続便覧、セクション２１１１．０３に記載されている、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句であるものとする。
【図１−１】
2020536653.tif 000005
【図１−２】
2020536653.tif 000006
【図１−３】
2020536653.tif 000007
【図１−４】
2020536653.tif 000008
【図１−５】
2020536653.tif 000009
【図１−６】
2020536653.tif 000010
【図１−７】
2020536653.tif 000011
【図１−８】
2020536653.tif 000012
【図１−９】
2020536653.tif 000013
【図１−１０】
2020536653.tif 000014
【図１−１１】
2020536653.tif 000015
【図１−１２】
2020536653.tif 000016
【図１−１３】
2020536653.tif 000017
【図１−１４】
2020536653.tif 000018
【図１−１５】
2020536653.tif 000019
【図２−１】
2020536653.tif 000020
【図２−２】
2020536653.tif 000021
【図２−３】
2020536653.tif 000022
【図２−４】
2020536653.tif 000023
【図２−５】
2020536653.tif 000024
【図３−１】
2020536653.tif 000025
【図３−２】
2020536653.tif 000026
【図３−３】
2020536653.tif 000027
【図３−４】
2020536653.tif 000028
【図３−５】
2020536653.tif 000029
【図４−１】
2020536653.tif 000030
【図４−２】
2020536653.tif 000031
【図４−３】
2020536653.tif 000032
【図４−４】
2020536653.tif 000033
【図４−５】
2020536653.tif 000034
【図４−６】
2020536653.tif 000035
【図５−１】
2020536653.tif 000036
【図５−２】
2020536653.tif 000037
【図５−３】
2020536653.tif 000038
【図５−４】
2020536653.tif 000039
【図６−１】
2020536653.tif 000040
【図６−２】
2020536653.tif 000041
【図６−３】
2020536653.tif 000042
【図６−４】
2020536653.tif 000043
【図６−５】
2020536653.tif 000044
【図６−６】
2020536653.tif 000045
【図６−７】
2020536653.tif 000046
【図６−８】
2020536653.tif 000047
【図６−９】
2020536653.tif 000048
【図７−１】
2020536653.tif 000049
【図７−２】
2020536653.tif 000050
【図７−３】
2020536653.tif 000051
【図７−４】
2020536653.tif 000052
【図７−５】
2020536653.tif 000053
【図７−６】
2020536653.tif 000054
【図７−７】
2020536653.tif 000055
【図７−８】
2020536653.tif 000056
【図８−１】
2020536653.tif 000057
【図８−２】
2020536653.tif 000058
【図８−３】
2020536653.tif 000059
【図８−４】
2020536653.tif 000060
【図８−５】
2020536653.tif 000061
【図８−６】
2020536653.tif 000062
【図８−７】
2020536653.tif 000063
【図８−８】
2020536653.tif 000064
【図８−９】
2020536653.tif 000065
【図８−１０】
2020536653.tif 000066
【図８−１１】
2020536653.tif 000067
【図８−１２】
2020536653.tif 000068
【図８−１３】
2020536653.tif 000069
【図８−１４】
2020536653.tif 000070
【図８−１５】
2020536653.tif 000071
【図８−１６】
2020536653.tif 000072
【図８−１７】
2020536653.tif 000073
【図８−１８】
2020536653.tif 000074
【図９−１】
2020536653.tif 000075
【図９−２】
2020536653.tif 000076
【図９−３】
2020536653.tif 000077
【図９−４】
2020536653.tif 000078
【図９−５】
2020536653.tif 000079
【図９−６】
2020536653.tif 000080
【図１０−１】
2020536653.tif 000081
【図１０−２】
2020536653.tif 000082
【図１０−３】
2020536653.tif 000083
【図１０−４】
2020536653.tif 000084
【図１０−５】
2020536653.tif 000085
【図１１−１】
2020536653.tif 000086
【図１１−２】
2020536653.tif 000087
【図１１−３】
2020536653.tif 000088
【図１１−４】
2020536653.tif 000089
【図１２−１】
2020536653.tif 000090
【図１２−２】
2020536653.tif 000091
【図１２−３】
2020536653.tif 000092
【図１２−４】
2020536653.tif 000093
【図１２−５】
2020536653.tif 000094
【図１２−６】
2020536653.tif 000095
【図１２−７】
2020536653.tif 000096
【図１３−１】
2020536653.tif 000097
【図１３−２】
2020536653.tif 000098
【図１３−３】
2020536653.tif 000099
【図１３−４】
2020536653.tif 000100
【図１３−５】
2020536653.tif 000101
【図１３−６】
2020536653.tif 000102
【図１３−７】
2020536653.tif 000103
【図１３−８】
2020536653.tif 000104
【図１３−９】
2020536653.tif 000105
【図１３−１０】
2020536653.tif 000106
【図１３−１１】
2020536653.tif 000107
【図１３−１２】
2020536653.tif 000108
【図１３−１３】
2020536653.tif 000109
【図１３−１４】
2020536653.tif 000110
【図１３−１５】
2020536653.tif 000111
【図１３−１６】
2020536653.tif 000112
【図１３−１７】
2020536653.tif 000113
【図１３−１８】
2020536653.tif 000114
【図１３−１９】
2020536653.tif 000115
【図１３−２０】
2020536653.tif 000116
【図１３−２１】
2020536653.tif 000117
【図１４−１】
2020536653.tif 000118
【図１４−２】
2020536653.tif 000119
【図１４−３】
2020536653.tif 000120
【図１４−４】
2020536653.tif 000121
【図１４−５】
2020536653.tif 000122
【図１４−６】
2020536653.tif 000123
【図１４−７】
2020536653.tif 000124
【図１４−８】
2020536653.tif 000125
【図１４−９】
2020536653.tif 000126
【図１４−１０】
2020536653.tif 000127
【図１４−１１】
2020536653.tif 000128
【図１４−１２】
2020536653.tif 000129
【図１４−１３】
2020536653.tif 000130
【図１４−１４】
2020536653.tif 000131
【図１４−１５】
2020536653.tif 000132
【図１４−１６】
2020536653.tif 000133
【国際調査報告】
2020536653.tif 000134
2020536653.tif 000135