(57)【要約】本発明は、DNAに損傷を引き起こし又はその修復を妨げる治療との組合せで、癌の予防及び/又は治療に用いる二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。本発明は、アンドロゲン依存性前立腺癌を除き、癌の予防及び/又は治療に用いる二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン受容体をコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの両方と全体的又は部分的にハイブリタイズする少なくとも１つの二重特異性siRNAを含み、該ハイブリタイゼーションが両mRNAの分解を誘導し又はその翻訳を阻害し、siRNAがsiARH2AX-1(配列番号1及び配列番号2)又はsiARH2AX-1b(配列番号3及び配列番号4)から選択され、siRNAがDNA損傷をもたらし又はその修復を妨げる治療と併用される、癌の予防及び/又は治療に用いる組成物。
【請求項２】
DNA損傷をもたらす治療が放射線療法及び/又は化学療法から選択される、請求項1に記載の用途のための組成物。
【請求項３】
DNA損傷をもたらし又はその修復を妨げる少なくとも１つの化学療法は、次：
アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞毒性抗生物質、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、遺伝毒性剤、PARP阻害剤
から選択され、特に
アラビノシルシトシン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フロキシウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、特に5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イニパリブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、特に6-メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンC、ミトキサントロンHCl、ムスチン、ニラパリブ、オラパリブ、オキサリプラチン、プロカルバジン、ルビテカン、ルカパリブ、ストレプトゾシン、タラゾパリブ、ムチオグアニン、特に6-チオグアニン、トポテカン、ベリパリブ、アクチノマイシンD、アムサクリン、アントラサイクリン、カンプトセシン、エピポドフィロトキシン、プリカマイシン、テモゾロマイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、タキサン、エポチロン
から選択される少なくとも１つの剤を用いて実施される、請求項1に記載の用途のための組成物。
【請求項４】
癌は副腎皮質、食道、胃、基底細胞、甲状腺若しくは子宮の癌、星状細胞腫、グリア芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、胸腺腫、リンパ腫、黒色腫若しくは非黒色腫皮膚癌、白血病、中皮腫、胆管癌、骨髄腫、消化管癌、膀胱、胸部、頸部、頭頸部、非小細胞肺、卵巣、膵臓、前立腺、精巣、胸腺、腎臓、唾液腺、子宮内膜、肛門、結腸、盲腸、口、気管支及び/若しくは上気道、胆管、鼻腔及び副鼻腔、脳、心臓、胃、肝臓、喉、舌、唇、鼻咽頭、食道、骨、副甲状腺、陰茎、胸膜、肺、直腸、副腎、尿道、膣、胆嚢、外陰部、結腸線若しくは直腸の癌、類腱腫、鼻咽腔線維腫、肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、褐色細胞腫、又は他の器官に生じる癌の転移である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項５】
単回投与で又は断続的若しくは連続的な反復投与での局所領域(特に腫瘍内)又は全身投与用に製剤化され、特に全身投与は皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、経皮、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下、髄腔内、脳内及び経口投与から選択され、特に連続的な皮下投与である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項６】
二重特異性siRNAは酸性pHの緩衝液中、特にクエン酸緩衝液又はヒスチジン緩衝液中にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項７】
二重特異性siRNAは、無機又は有機塩、特に、カチオンがポリアミン、特にスペルミン、スペルミジン若しくはプトレッシンから選択される塩、又は、特に、カチオンが金属カチオンから選択される塩、特に、亜鉛、コバルト、銅、マンガン、カルシウム、マグネシウム若しくは鉄の塩、特にマンガン、亜鉛、マグネシウムの単独若しくは２つ若しくは３つの組合せから選択される塩が添加された酸性pHの緩衝液中にある、請求項6に記載の用途のための組成物。
【請求項８】
治療有効用量、特に0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日、より詳しくは0.01 mg/kg/日〜10mg/kg/日の用量でのsiRNA投与用に製剤化された請求項１〜７のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項９】
ベクター化剤もアドレス指定分子も含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項１０】
ベクター化剤を含まず、アドレス指定分子、特にCD36リガンド、より詳しくは酸化LDL又はヘキサレリンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項１１】
ベクター化剤を含むがアドレス指定分子を含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項１２】
ベクター化剤を含み、アドレス指定分子、特にCD36リガンド、より詳しくは酸化LDL又はヘキサレリンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つの二重特異性siRNAは化学修飾されていない又は化学修飾さている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の用途のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は二重特異性の二本鎖オリゴヌクレオチドに関しており、同時にアンドロゲン受容体及びヒストンH2AXを標的としている。
【背景技術】
【０００２】
生物の細胞は例えば酸素の反応性種を産生する代謝により、又は環境により、特に電離放射線又はUVにより、また特定の薬物((https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_damage_(naturally_occurring)を含めた物理的又は化学的因子により引き起こされる数多くのDNA損傷を日常的に受けている。細胞は検証に関する複数の機序を発達させており、ゲノムの完全性の維持のために進化しながら修復を行う。DNA損傷が正常な細胞に発生した時には、p53などの腫瘍抑制タンパク質は細胞分裂の阻害及び修復機序の活性化を調節する。多くの損傷は正常に修復される。しかしながらDNA損傷の一定の閾値を超えてくると、細胞はもはや成長できなくなりアポトーシスを起こして死滅する。
同条件下で、癌細胞は数多くのDNA損傷を蓄積する。なぜなら、そのDNA修復機序は頻繁に欠損し、及び/又は正常な細胞と比べてアポトーシスに抵抗性が高いからである。細胞死に繋がるDNA損傷の閾値は正常な細胞と比べて、腫瘍のほうが高い。
【０００３】
DNA損傷は、DNAが線形ではなく、ヒストンからなるヌクレオソームによりコンパクト化されている状況で発生する。一部のヒストンは構造的役割を果たし、H2AXなどのその他のものはゲノムの機能及び修復に重要である。 H2AXは身体の全ての細胞で発現されるヒストンである。例えばDNA-PK(DNA依存性タンパク質キナーゼ)、ATM(毛細血管拡張性運動失調症で変異)又はATR(毛細血管拡張性運動失調症及びRad3関連)などのタンパク質による、H2AXのリン酸化(γH2AXと呼ばれる)は、主要な事象であり、DNA修復の初期に起こり、損傷の修復に必要な多くの他のタンパク質の動員及び組立てを可能にする。γH2AXの(特に特異抗体による)検出は、DNA損傷の存在の感度のより定量的指標として頻繁に使用される。加えてH2AXはCBP/P300によるリシン36と、トレオニン101とにおいてアセチル化が可能であり、これら2つの翻訳後修飾は、H2AXのリン酸化とは独立して、細胞の電離放射線下の生存を可能にする。
【０００４】
細胞における、特に癌細胞におけるH2AXの発現阻害はDNA損傷の修復を妨げる方法である。しかしDNA損傷機序の多重性のために、H2AXの発現阻害だけでは細胞死の誘導には十分ではない(Yuan and Chen, 2010)。
癌を治療する放射線療法又は特定の化学療法は、DNA損傷数を細胞生存能に相応する閾値(この閾値を超えると癌細胞のアポトーシスが引き起こされる)を超えるように増加させることによって癌を治療しようと開発されてきた。この治療はDNA損傷を誘導し及び/又は癌細胞に存在する損傷の修復を妨げることで機能する。
放射線療法は腫瘍学においては不可欠である。なぜならば、放射線療法は、治療レジメンの3分の2において、単独又は手術及び/若しくは化学療法と併用で計画されているからである。これらの治療法はDNA損傷、特に二本鎖破断(DSB)を誘導する。
細胞毒性化学療法の目的は癌細胞の分裂を妨げること、及び/又はアポトーシスを誘導することである。これら治療の多くは、新たな損傷を生み出す作用機序に直接起因するか、DNA修復の防止によるか、又は修復プロセスの活性が乏しい細胞周期ステージに細胞を維持することにより、細胞内のDNA損傷の蓄積に至る。しかしDNA損傷の修復を試みる多くのゲノム検査及び修復機序は、これら化学療法又は放射線療法の有効性を低下させる。
【０００５】
このことからDNA損傷を誘導するか、修復を妨げる治療の有効性を向上させる確実なニーズが存在する。
従って、H2AXの阻害は、DNA損傷の修復を妨げることにより、DNA損傷を誘導し又は修復を防止する放射線療法又は化学療法により誘導された細胞死を増強する手段を提供する。
アンドロゲン受容体(AR)は転写因子であり、その活性はリガンドにより調節される。ARは、ほとんどの組織と器官及び造血系の多くの細胞型により男性と女性の両性で発現する。ARは、例えば増殖、移動、生存、浸潤、増殖因子の産生に関与する多くの遺伝子発現を調節する。
この特性から、(例えば非限定的な例として過剰発現、変異、オルタナティブスプライシング、翻訳後修飾、又はタンパク質パートナーの変化による)AR発現又は機能化の脱調節は、多くの癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病の発症、維持、進行において記載されており、それは例えば非限定的な例としては前立腺、胸部、卵巣、膀胱、肝臓、結腸、胃、副腎及び唾液腺、胸腺、甲状腺、子宮、腹膜、膵臓、精巣、肝臓、皮膚、脳、鼻咽頭、頭と首、髄膜、肺、精巣、骨などの或る種の癌である(Munoz et al., 2015)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ARリガンドの産生を妨げ、したがってARの転写活性を妨げる性腺摘除は、その効力が前立腺癌で臨床的に確かめられた治療ストラテジである。しかし、治療の有効性は一時的であり患者に全身的に再発する。このことから、これら癌においてシグナル伝達経路を標的にした治療の有効性を向上させる確実なニーズが存在する。
ARは身体のほとんどの細胞で発現し、その発現又は機能化の脱調節は前立腺以外に多くの癌について報告されているが、ARシグナル伝達経路の阻害が、前立腺癌以外でヒトにおいて以前に発症した癌を治療するに十分であることは示されていない。従って、極めて低いレベルから高いレベルまでの範囲のレベルでARを発現する他の癌細胞、例えば乳癌、黒色腫又はグリア芽腫からの細胞の増殖は、下記の実施例で示したように、この伝達経路の阻害による影響を受けない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、本発明者らの予想外の結果に基づいており、その結果によれば、或る種の特定の二本鎖オリゴヌクレオチドは、同時及び特異的に、ヒストンH2AXの発現及びアンドロゲン受容体の発現を阻害する(このことが、細胞の増殖及び生存を効果的に阻害する)ので、二重特異性である。 
AR及びH2AXの同時阻害の効果はDNA損傷数を増加させるか又は修復を妨げる化学療法又は放射線療法との併用で高めることができる。
マイクロRNA(miRNA)は全ての真核生物のゲノムによりコードされる約20ヌクレオチドの小さな二本鎖RNAである。これらは、転写及び変異後にタンパク質複合体RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に負荷(load)される。二本の鎖の一方は、１又は２以上のメッセンジャーRNA(mRNA)(標的mRNAと呼ばれる)と、一般に哺乳類では不完全にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションは、mRNAの分解に至る切断又はタンパク質翻訳を阻害を誘導する。miRNA(ガイド鎖の5'→3'方向、アンチセンス鎖とも呼ばれる)のヌクレオチド２〜8(両端を含む)(核形成領域又は「シード領域」と呼ばれる領域)の1又は２以上のmRNAとのハイブリダイゼーションは、RNA干渉機序を引き起こすのに特に重要である。同じ細胞内でmiRNAは幾つかの標的mRNAとハイブリダイズすることができ、その安定性又は翻訳を調節する。所与のmiRNAにより調節されるmRNAを正確に予測することが可能であるコンピュータ又はその他のツールは存在しない(Gorski et al., 2017)。
【０００８】
干渉RNA又は小干渉RNA(siRNAs)は合成二本鎖オリゴリボヌクレオチドであり、細胞に導入されたとき、miRNAの作用を模倣し、標的mRNAとハイブリダイズして、RNA干渉機序を引き起こす。これらは、miRNAと同様に、他のmRNAと不完全にハイブリダイズすることができ、コンピュータツールを使っても、多くの可能な不完全ハイブリダイゼーションの中からmRNAと干渉して機能化を妨げるものを正確に予測できない。このいわゆるオフターゲット効果は、一般に、潜在的に毒性である生物学的効果を生じ得ることから望ましものではなく、予測不可能の場合には実験的に評価するしかない。複数のsiRNAを同時に使用することは、潜在的オフターゲット効果の数、したがって毒性リスクを乗算的に増加させる。目的の遺伝子の発現を阻害するsiRNAの配列を選択する多くのコンピュータツールがある。これらツールは、選択されたsiRNAがたった1つのmRNAとハイブリタイズしてオフターゲット効果を回避するように設計される。
siRNAの作用機序と薬物動態学的及び薬力学的特性はリボザイム、モルホリノ、三重螺旋オリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、又はアンチセンスDNAオリゴデオキシヌクレオチド(ODNs)など、その他の型のオリゴヌクレオチドと同等ではない。
【０００９】
本発明は、本発明者らの予想外の結果に基づくものであり、その結果によれば、表1に記載された或る特定のsiRNAは、アンドロゲン受容体をコードするmRNAと完全にハイブリダイズし、その発現を阻害するものであるが、二重特異性である。なぜならば、それらはまた、表1に記載のH2AXをコードするmRNAと部分的にハイブリダイズし、その発現を特異的に阻害するからである。
本発明の目的は、二重特異性siRNAを使用して、アンドロゲン受容体及びH2AXの発現を同時に阻害する手段の提供である。
多くの癌プロセス、特に増殖及びアポトーシスへの抵抗性において重要であるアンドロゲン受容体と、DNA損傷の修復において重要であるヒストンH2AXとを同時に阻害することにより、AR及びH2AXの両方を阻害する二重特異性AR-H2AX siRNAの使用は、ARのみを標的するsiRNA又はH2AXのみを標的するsiRNAに対して優位性がある。
単一の二重特異性siRNAの使用は、一方がARを標的し、他方がH2AXを標的する2つのsiRNAの組合せより好ましく、このような組合せの潜在的毒性オフターゲット効果を制限し、この使用の臨床的及び産業的適用の開発を促進する。
【００１０】
第１の観点において、本発明は、少なくとも１つの二重特異性siRNAを含む、癌の予防及び/又は治療に用いる組成物に関し、該siRNAは、アンドロゲン受容体をコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの両方と全体的又は部分的にハイブリタイズし、その結果、該ハイブリタイゼーションが両mRNAの分解を誘導し又はその翻訳を阻害するものとして規定され、前記siRNAは、表１に記載されるsiARH2AX-1(配列番号1及び配列番号2)又はsiARH2AX-1b(配列番号3及び配列番号4)から選択され、該siRNAは、DNA損傷をもたらし又はその修復を妨げる治療と併用される。
部分的なハイブリタイゼーションとは、ハイブリダイズされるmRNAの切断又は翻訳阻害を引き起こすに十分な数のヌクレオチドでの本発明の二重特異性siRNAの、アンドロゲン受容体mRNAの配列又はH2AXの配列とのハイブリタイゼーションを意味し、このハイブリダイゼーションは、mRNAでコードされるタンパク質の発現の減少に誘導し、その減少は、例えばウェスタンブロットイムノアッセイ又は間接蛍光抗体イムノアッセイにより測定可能である。例えば、このハイブリタイゼーションには、7、8、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19ヌクレオチドが関与するを含み、siRNAがより多くのヌクレオチドを有する場合、ハイブリタイゼーションには、19ヌクレオチドより多く、例えば20、21、22又は23ヌクレオチドが関与する。例えば、本発明の意味ではハイブリタイゼーションの比率は30％〜95％であり得る。
【００１１】
本発明によると、予防及び/又は治療はヒトの患者又は哺乳類で行われる。
本発明のsiRNA配列を表1に示す。表1の表現「配列との少なくとも75％の同一性」とは75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％及び100％、特に79％、81％、84％、86％、90％、95％及び99％という意味である。
その配列が表1に示すsiRNAの配列に100％同一である全てのsiRNAは、エクソン1から転写されたアンドロゲン受容体をコードするmRNAの或る領域と100％ハイブリダイズする。 よって、これらの全てのsiRNAは、癌細胞に発現されるアンドロゲン受容体の全てのスプライシング形態(リガンド結合ドメインが部分的又は完全に欠失したものを含む)(例えば一部の癌で発現される該受容体のAV-V7変異体など)の発現を阻害する。
有利にはsiRNAガイド鎖核形成領域siARH2AX-1及びsiARH2AX-1bはまた、H2AXをコードするmRNAに完全に相補性である。
【００１２】
化学修飾
本発明によれば、また全ての観点において、二重特異性AR-H2AX siRNAは、一方の鎖及び/又は他方の鎖において、3'又は5'末端部に位置する１以上のヌクレオチドに及び/又は内部骨格を構成する１以上のヌクレオチドに化学修飾を有し得る。例えば、化学修飾はリボース及び/又は塩基及び/又はリン酸に位置する。化学修飾は、例えば、2'-O-メチル(2'OMe)又は2'-O-メトキシエチル(2'MOE)又は2'-フルオロ(2'F)若しくは2'-フルオロ-β-アラビノヌクレオチド(FANA)基によるリボースの2'OH基の置換、アミノエチル-、グアニジノエチル、シアノエチル-又はアリルへの2'の酸素のアリル化、ホスホロチオエートによるホスホジエステル基の置換、オリゴヌクレオチドの１以上のヌクレオチドのアルキル化又はチオール化、デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換、或いはロック核酸(LNA)によるヌクレオチドの置換を少なくとも１つ含む。
特定の観点では、二重特異性AR-HAX siRNAは化学修飾を欠く。
特定の観点では、siRNAは化学修飾を欠いており、3'末端に追加の２デオキシヌクレオチド、特に２つのデオキシチミジンを含む。
別の特定の観点では、siRNAは化学修飾を欠いており、3'末端に追加の２のデオキシヌクレオチド、特に２つのデオキシチミジンを含まない。
本発明によれば、また全ての観点において、二重特異性AR-H2AX siRNAは、腫瘍細胞に対して浸透可能な組成物に製剤化される。
【００１３】
ベクター化剤及びアドレス指定分子
特定の観点では、組成物はベクター化剤を含む。本発明によると、ベクター化剤は生物の細胞へのsiRNAの浸透を容易にする薬剤である。この薬剤は、siRNAの鎖に化学的に接合されるか又はsiRNAに非共有結合的に結合されている。例えば、これらは脂質、ポリマー、ペプチド、デンドリマ、単純糖質又は複合糖質、ポリエチレンイミン誘導体、ナノ粒子、磁性スフェア又は無機若しくは有機のナノ構造を含む。
特定の観点では、組成物はアドレス指定分子を含む。本発明によると、アドレス指定分子は、例えば内皮細胞又は癌細胞などの特定の細胞型に向けてオリゴヌクレオチドをアドレス指定する分子である。アドレス指定分子は、siRNAを細胞内に浸透させることもsiRNAと共に透過することも意図されておらず、目的の細胞の外膜における濃度を増加させることを意図される。例であり網羅的ではないが、アドレス指定分子はアプタマー、抗体、トランスフェリン、RGDペプチド、受容体リガンドであり、アドレス指定分子は、標的細胞表面で発現する分子、例えば受容体、インテグリン、膜抗原(例えば、前立腺特異的膜抗原(PSMA)又はCD36受容体)(これらに限定されない)と相互作用又は結合する。
本発明の特定の観点では、このアドレス指定分子は、CD36受容体リガンドであり例えば酸化LDL、ヘキサレリンペプチド若しくは長鎖脂肪酸(炭素数が16以上)又はこれらの２若しくは３の組合せである。
本発明の好ましい観点では、上述の組成物は酸化LDLを次の重量比：１のsiRNAに対して0.01〜10、優先的には0.1〜1の酸化LDLで含み、又はヘキサレリンペプチドを次の重量比：１のsiRNAに対して0.01〜10、選択的には0.1〜１のヘキサレリンで含む。
アドレス指定分子は、siRNAと非共有結合的に結合され若しくはsiRNAの鎖のいずれかに共有結合的に接合され、又は標的細胞若しくは組織にベクター化剤をアドレス指定するようにベクター化剤、例えばsiRNAを含むナノ粒子若しくはリポソームに取り入れられる。
特定の観点では、組成物はベクター化剤もアドレス指定分子も含まない。
特定の観点では、組成物はベクター化剤を含むがアドレス指定分子は含まない。
特定の観点では、組成物はアドレス指定分子を含むがベクター化剤は含まない。アドレス指定分子は特にCD36リガンドで、より詳しくは酸化LDL又はヘキサレリンである。
特定の観点では、組成物はベクター化剤及びアドレス指定分子を含む。アドレス指定分子は特にCD36リガンドであり、より詳しくは酸化LDL又はヘキサレリンである。
【００１４】
局所投与、局所領域投与又は全身投与
本発明によれば、また全ての観点において、二重特異性AR-H2AX siRNAを含む組成物は、局所的又は局所領域的に、特に腫瘍内投与により、単回又は反復注射で、間欠的又は連続的に投与されるように製剤化され、そのような投与には、体外若しくは移植可能ポンプ又はその他の装置或いは治療すべき腫瘍内(腫瘍内投与)若しくは近傍への該組成物の徐放性若しくは連続的放出を可能とする生分解性化合物を使用する。
本発明によると、連続投与の目的は、局所投与又は局所領域投与である場合には組織への、全身投与である場合には血中及び周辺組織へのsiRNA投与の全期間においてsiRNA濃度を実質的に一定に維持することである。表現「実質的に一定に維持する」とは、血液及び周辺組織でのsiRNA濃度が、組成物を投与された個体の代謝により僅かに変化し得るという意味である。
連続的とは、組成物を、途切れさせずに１日から数か月間投与するという意味であり、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、３週間、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、９か月間、１年間、２年間である。
本発明の好ましい観点では、連続送達方法で送達されるsiRNAは、２日間以上の期間途切れずに送達される。
本発明の好ましい観点では、連続投与方法で送達されるsiRNAは、siRNAを送達する装置の再充電又は交換に必要な時間を超えて投与が中断されること無く送達され、例えば４時間であり、２日間から１年の期間であり、具体的には２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、３週間、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、９か月間、１年間である。
本発明の好ましい観点では、連続送達方法で投与されるsiRNAは、24時間以上から数週間の無治療期間の中断がある逐次サイクルで実施され、各サイクルは、siRNAを送達する装置の再充電又は交換に必要な時間(例えば４時間)を超えて中断することのない、２日間から１か月間の投与期間の連続投与として規定される。
【００１５】
本発明によると、間欠投与とは、製剤投与の期間(例えば10秒間、1分間、1時間、2時間、4時間など)の後に投与されない期間(例えば1時間、2時間、6時間、24時間、1週間など)がある投与という意味である。これは、例であって限定されないが、単回の若しくは或る時間にわたって反復されるボーラス投与又は数時間にわたる緩徐注入であり、組織又は生物において製剤の濃度に有意な変化を経時的にもたらす。
がん死亡率は、しばしば二次部位への癌細胞の拡散に起因する。このことから、複数の組織及び器官に分布させる二重特異性siARH2AX siRNAの全身投与は、転位したか、転位しそうな癌治療に有利である。以下において、全身とは、局所又は局所領域投与とは対照的に、特に腫瘍内投与とは対照的に、siRNAが、投与された場所から離れた場所でで作用するように身体中に運ばれるという意味である。全身への分布は、siRNAが血液、リンパ液又は脳脊髄液などの細胞外液中を移動するいかなる方法でも得られ、siRNAを含む化合物は、摂取(経口)により又は注射(非経口)により又は皮膚若しくは粘膜経由で投与される。全身投与は、体外若しくは移植可能ポンプ若しくはその他の装置又は組成物の徐放性又は連続放出が可能な生分解性化合物の使用により、間欠的又はその他の様式で、組成物を単回若しくは反復投与で投与することにより行うことができ、二重特異性siARH2AX siRNAは、当該生物の細胞外液を経由して全身に輸送される。特定の観点では、全身投与方法は皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下、髄腔内、大脳内、口内から選択され、特には皮下である。
好ましい観点では、投与は連続的に皮下に行う。
【００１６】
緩衝液及びカチオン
特定の観点では、本発明のsiARH2AXは、酸性pH緩衝液中で製剤化して全身又は局所投与される。
本発明の緩衝液は、siRNA希釈溶液のpH安定性を提供する。緩衝液の例は表３に示す。
本発明の好ましい観点では、緩衝液のｐHは酸性でｐH3〜ｐH7の範囲、好ましくはｐH5〜ｐH6.5の範囲、選択的にはｐH6である。
本発明の好ましい観点では、緩衝液はｐH6のクエン酸又はヒスチジン緩衝液である。
特定の観点では、本発明のsiARH2AX siRNAは無機又は有機塩由来のカチオンを補充された酸性pH緩衝液中で全身又は局所に投与される。本発明の意味の範囲で、これらのカチオンは緩衝液の成分ではなく、緩衝効果を確実にすることを意図されるものでないが、緩衝液に添加される。このカチオンは、例であって限定されることなく、ポリアミン、特にプトレッシン及び/若しくはスペルミジン及び/若しくはスペルミン、並びに/又はそのカチオンが例えばZn2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+などである金属カチオンから選択される塩であり、対イオンは例えば塩素、硝酸、硫酸又は炭酸イオンである。本発明の好ましい観点では、緩衝液は、MgCl2、ZnCl2、MnCl2又はこれらの塩の２若しくは３の組合せを含む。
特定の観点では、単独又は組合せにかかわらず、各カチオンの濃度は0.02mM〜200mM、好ましくは0.05mM〜100mM、好ましくは１〜50mMである。
本発明の好ましい観点では、カチオンはクエン酸又はヒスチジン緩衝液である緩衝液に添加される。本発明の好ましい観点では、この溶液のｐHは6である。
【００１７】
用量
特定の観点では、組成物は、治療有効用量、特に0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日、特に0.01mg/kg/日〜10mg/kg/日の用量での二重特異性siARH2AX siRNA投与用に製剤化される。表現「0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日」とは、0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日の範囲の全ての用量であり、例えば0.008、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、10.0、10.5、14.0、14.5、20、20.5、25、25.5、29.5mg/kg/日という意味である。
【００１８】
DNA損傷を誘導し又はその修復を妨げる治療との組合せ
本発明の特定の観点では、組成物はDNA損傷を誘導し又はその修復を妨げる治療との組合せで使用され、該治療は放射線療法及び/又は化学療法から選択される。
放射線療法は、癌細胞を壊す放射線を用いて癌の増殖を妨げる癌の局所領域治療の方法をいう。放射線療法の技術及び手順、特に放射する放射線量は患者の癌により調節される。３つの主要な放射線療法は外部放射線療法、キュリー療法ベクター代謝放射線療法である。これらは腫瘍の型及びその位置により適応症がある。
−  外部放射線療法は最も知れられており、最も多く使用されているる。患者の外部にある放射線源は高エネルギーX線及び電子ビームを発生させる。
−  小線源療法とも呼ばれるキュリー療法は放射性グレイン又はニードルの移植による局所的な放射線療法である。この治療は特に前立腺癌の治療に使用される。
−  ベクター代謝放射線療法は、放射性元素で標識した放射線薬剤の投与又は注射に基づく放射線治療法である。放射性同位体は、疾患のある標的細胞に優先的に結合する。例えば、ヨウ素131は甲状腺に結合する。このことから、転移性骨痛は、例えばサマリウム153、ストロンチウム894で標識した液体塩化ストロンチウム又は塩化ラジウムの注射により治療できる。
【００１９】
化学療法とは、ガンに対抗する薬物療法(細胞増殖制御性の及び抗腫瘍性の化学療法剤)をいう。
特定の観点では、DNA損傷をもたらし又はその修復を妨げる化学療法は次：
アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞毒性抗生物質、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、遺伝毒性剤、PARP阻害剤(ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ)、微小管形成性及び解離阻害性の薬剤、例えばビンカアルカロイド、タキサン又はエポチロン
から選択される少なくとも１つの剤を用いて実施される。
特定の観点では、化学療法剤は特に次から選択される：
アラビノシルシトシン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フロキシウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、特に5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イニパリブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、特に6-メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンC、ミトキサントロンHCl、ムスチン、ニラパリブ、オラパリブ、オキサリプラチン、プロカルバジン、ルビテカン、ルカパリブ、ストレプトゾシン、タラゾパリブ、ムチオグアニン、特に6-チオグアニン、トポテカン、ベリパリブ、アクチノマイシンD、アムサクリン、アントラサイクリン、カンプトセシン、エピポドフィロトキシン、プリカマイシン、テモゾロマイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、タキサン、エポチロン。
【００２０】
特定の観点では、DNA損傷をもたらし又はその修復を妨げる療法と、少なくとも１つのsiAR-H2AX二重特異性siRNAを含む組成物の投与とは同時又は逐次である。用語「逐次的」とは、本発明によれば、表現「経時的に分離され、広がっている」と理解される。
特定の観点では、本発明は、以下を含む、癌の予防及び/又は治療に同時又は逐次に用いる組合せ品に関する： 
−  siARH2AX-1及びsiARH2AX-1bから選択されるsiRNAと、
−  DNA損傷を引き起こし又はその修復を妨げる少なくとも１つの化学療法剤。
１つの観点では、本発明は、以下を含む、癌の予防及び/又は治療に同時又は逐次に用いる組合せ品に関する：
−  siARH2AX-1及びsiARH2AX-1bから選択されるsiRNAと、
−  DNA損傷を引き起こす少なくとも１つの放射性薬剤。
１つの観点では、本発明は、癌の予防及び/又は治療に同時又は逐次に用いるための、以下を含む、間欠的又は連続的局所投与用に製剤化された組合せ品に関する： 
−  siARH2AX-1及びsiARH2AX-1bから選択されるsiRNAと、
−  DNA損傷を引き起こすキュリー療法。
【００２１】
１つの特定の観点では、癌は原発腫瘍又は原発腫瘍の転移である。
１つの特定の観点では、癌は副腎皮質、食道、胃、基底細胞、甲状腺若しくは子宮の癌、星状細胞腫、グリア芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、胸腺腫、リンパ腫、黒色腫若しくは非黒色腫皮膚癌、白血病、中皮腫、胆管癌、骨髄腫、消化管癌、膀胱、胸部、頸部、頭頸部、非小細胞肺、卵巣、膵臓、前立腺、精巣、胸腺、腎臓、唾液腺、子宮内膜、肛門、結腸、盲腸、口、気管支及び/若しくは上気道、胆管、鼻腔及び副鼻腔、脳、心臓、胃、肝臓、喉、舌、唇、鼻咽頭、食道、骨、副甲状腺、陰茎、胸膜、肺、直腸、副腎、尿道、膣、胆嚢、外陰部、結腸線若しくは直腸の癌、類腱腫、鼻咽腔線維腫、肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、褐色細胞腫、又は他の器官に生じる癌の転移である。
【００２２】
本発明の別の観点では、アンドロゲン受容体をコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの両方と全体的又は部分的にハイブリタイズする少なくとも１つの二重特異性siRNAを含み、該ハイブリタイゼーションが両mRNAの分解を誘導し又はその翻訳を阻害し、siRNAが表１に記載のsiARH2AX-1(配列番号1及び配列番号2)又はsiARH2AX-1b(配列番号3及び配列番号4)から選択される組成物は、癌、特に、副腎皮質、食道、胃、基底細胞、甲状腺若しくは子宮の癌、星状細胞腫、グリア芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、胸腺腫、リンパ腫、黒色腫若しくは非黒色腫皮膚癌、白血病、中皮腫、胆管癌、骨髄腫、消化管癌、膀胱、胸部、頸部、頭頸部、非小細胞肺、卵巣、膵臓、前立腺、精巣、胸腺、腎臓、唾液腺、子宮内膜、肛門、結腸、盲腸、口、気管支及び/若しくは上気道、胆管、鼻腔及び副鼻腔、脳、心臓、胃、肝臓、喉、舌、唇、鼻咽頭、食道、骨、副甲状腺、陰茎、胸膜、肺、直腸、副腎、尿道、膣、胆嚢、外陰部、結腸線若しくは直腸の癌、類腱腫、鼻咽腔線維腫、肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、褐色細胞腫、又は他の器官に生じた癌の転移の予防及び/又は治療に用いるために単独で用いられる。
【００２３】
本発明によると、予防及び/又は治療はヒトの患者又は哺乳類で実施される。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは、一方の鎖及び/又は他方の鎖において、3'又は5'末端部に位置する１以上のヌクレオチドに及び/又は内部骨格を構成する１以上のヌクレオチドに化学修飾を有することができる。化学修飾の例は「化学修飾」と題するセクションに示す。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは化学修飾を欠く。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは化学修飾を欠いており、3'末端に追加の２デオキシヌクレオチド、特に２デオキシチミジンを含む。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは化学修飾を欠いており、3'末端に追加の２デオキシヌクレオチド、特に２デオキシチミジンを含まない。
特定の観点では、組成物はベクター化剤もアドレス指定分子も含まないか、又はベクター化剤を含むがアドレス指定分子を含まないか、又はアドレス指定分子を含むがベクター化剤を含まないか、又はベクター化剤とアドレス指定分子の両方を含む。アドレス指定分子の例は「ベクター化剤及びアドレス指定分子」と題するセクションに示す。
アドレス指定分子は、siRNAと非共有結合的に結合され若しくはsiRNAの鎖のいずれかに共有結合的に接合され、又は標的細胞若しくは組織にベクター化剤をアドレス指定するようにベクター化剤、例えばsiRNAを含むナノ粒子若しくはリポソームに取り入れられる。
【００２４】
特定の観点では、二重特異性siARH2AX siRNAを含む組成物は、単回投薬で又は間欠的若しくは連続的に反復される態様での全身、局所又は局所領域投与用に製剤化されている。
特定の観点では、本発明のsiARH2AXは、酸性pH緩衝液中に製剤化されて全身又は局所投与される。緩衝液の例は表３に示す。
特定の観点では、緩衝液はクエン酸又はヒスチジン緩衝液である。
好ましい観点では、酸性pH緩衝液は無機又は有機塩由来のカチオンを補充されているか又はされていない。カチオンの例は「緩衝液及びカチオン」と題するセクションに示す。
カチオンの濃度は、0.02mM〜200mM、好ましくは0.05mM〜100mM、好ましくは１mM〜50mMの範囲である。
本発明の好ましい観点では、カチオンは、クエン酸又はヒスチジン緩衝液である緩衝液に添加される。
特定の観点では、組成物は、治療有効用量、特に0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日、特に0.01mg/kg/日〜10mg/kg/日の用量での二重特異性siARH2AX siRNA投与用に製剤化される。「0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日」とは、0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日の範囲の全ての用量であり、例えば0.008、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、10.0、10.5、14.0、14.5、20、20.5、25、25.5、29.5mg/kg/日という意味である。
【００２５】
別の観点では、本発明はまた、表１に記載のsiRNA siARH2AX-1(配列番号1及び配列番号2)又はsiARH2AX-1b(配列番号3及び配列番号4)から選択される少なくとも１つのsiRNAを含み、siRNAは酸性pH緩衝液中にある組成物に関する。緩衝液の例は表３に示す。
特定の観点では、組成物は、単回投薬で又は間欠的若しくは連続的に反復される態様での全身、局所又は局所領域投与用に製剤化されている。
特定の観点では、緩衝液はクエン酸又はヒスチジン緩衝液である。
好ましい観点では、酸性pH緩衝液は無機又は有機塩由来のカチオンを補充されているか又はされていない。カチオンの例は「緩衝液及びカチオン」と題するセクションに示す。
カチオンの濃度は、0.02mM〜200mM、好ましくは0.05mM〜100mM、好ましくは１mM〜50mMの範囲である。
本発明の好ましい観点では、カチオンは、クエン酸又はヒスチジン緩衝液である緩衝液に添加される。
【００２６】
特定の観点では、本発明はまた、
siRNA siARH2AX-1(配列番号1及び配列番号2)又はsiARH2AX-1b(配列番号3及び配列番号4)から選択される少なくとも１つのsiRNAを含み、siRNAは酸性pH緩衝液中にあり、緩衝液は特にクエン酸又はヒスチジン緩衝液中であり、酸性pH緩衝液は無機又は有機塩、特にそのカチオンがポリアミン、特にスペルミン、スペルミジン若しくはプトレッシンから選択される塩、又は特にそのカチオンが金属カチオンから選択される塩、特に亜鉛、コバルト、銅、マンガン、カルシウム、マグネシウム若しくは鉄の塩、特にマンガン、亜鉛、マグネシウムの塩単独若しくは２つ若しくは２つの組合せから選択される塩に由来するカチオンを補充されている組成物に関する。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは、一方の鎖及び/又は他方の鎖において、3'又は5'末端部に位置する１以上のヌクレオチドに及び/又は内部骨格を構成する１以上のヌクレオチドに化学修飾を有することができる。化学修飾の例は「化学修飾」と題するセクションに示す。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは化学修飾を欠く。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは化学修飾を欠いており、3'末端で追加の２デオキシヌクレオチド、特に２デオキシチミジンを含む。
特定の観点では、二重特異性AR-H2AX siRNAは化学修飾を欠いており、3'末端で追加の２デオキシヌクレオチド、特に２デオキシチミジンを含まない。
【００２７】
特定の観点では、組成物はベクター化剤もアドレス指定分子も含まないか、又はベクター化剤を含むがアドレス指定分子を含まないか、又はアドレス指定分子を含むがベクター化剤を含まないか、又はベクター化剤とアドレス指定分子の両方を含む。アドレス指定分子の例は「ベクター化剤及びアドレス指定分子」と題するセクションに示す。
アドレス指定分子は、siRNAと非共有結合的に結合され若しくはsiRNAの鎖のいずれかに共有結合的に接合され、又は標的細胞若しくは組織にベクター化剤をアドレス指定するようにベクター化剤、例えばsiRNAを含むナノ粒子若しくはリポソームに取り入れられる。
特定の観点では、組成物はDNA損傷を誘導し又はその修復を妨げる治療との組合せで使用され、該治療は放射線療法及び/又は化学療法から選択される。放射線療法又は化学療法の例は「DNA損傷を誘導し又はその修復を妨げる治療との組合せ」と題するセクションに示す。
特定の観点では、
組成物は、治療有効用量、特に0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日、特に0.01mg/kg/日〜10mg/kg/日の用量での二重特異性siARH2AX siRNA投与用に製剤化される。「0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日」とは、0.005mg/kg/日〜30mg/kg/日の範囲の全ての用量であり、例えば0.008、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、10.0、10.5、14.0、14.5、20、20.5、25、25.5、29.5mg/kg/日という意味である。
【００２８】
【表１】
2020500217.tif 000002
【００２９】
表１の１〜４と番号づけられた配列(配列番号)の各々について： 
−  第１欄はsiRNAの名称を示す。
−  第２欄は、オリゴヌクレオチド鎖型１(それぞれ1b)又はその配列がオリゴヌクレオチド鎖型１(それぞれ1b)と少なくとも75％の同一性を有するオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチド鎖型２(それぞれ2b)又はその配列がオリゴヌクレオチド鎖型２(それぞれ2b)と少なくとも75％の同一性を有するオリゴヌクレオチドとの組合せからなるsiRNAの組成を示す。
−  第３欄は、出願されたオリゴヌクレオチドの番号付けを示す。
−  第４欄は、配列を5'→3'方向で示す。表示[dT][dT]は、２つの追加デオキシヌクレオチドの存在を示すために用いられている。
表１に示すsiRNAが、その配列が当該表に示されたものと100％同一である２つの一本鎖オリゴヌクレオチドからなるとき、これらsiRNAの標的配列(つまり、siRNAガイド鎖がハイブリダイズするmRNAの配列)は、ヒトにおいて、アンドロゲン受容体をコードする全てのmRNAに存在し、このことは、該受容体が、ホルモン結合ドメインの部分的な若しくは完全な欠失に至るスプライシングバリエーションを示す野生型(例えば、バリアントAR-V7)又は前立腺癌で記述された変異の１つを有する野生型であるかに関わらない。
【００３０】
【表２】
2020500217.tif 000003
【００３１】
実施例に用いた細胞株の各々について、第２欄は細胞の組織起源を示し、ARをコードするmRNAのレベルは、これら株でのRT-qPCR法で測定し、シクロフィリンＡをコードする mRNAのレベルにより規格化した(デルタCT法)。第３欄に示す結果は、任意単位で表されており、22RV1で測定されたレベルは100,000とみなした。
【００３２】
【表３−１】
2020500217.tif 000004
【表３−２】
2020500217.tif 000005
【００３３】
参考文献
Gorski, S.A., J. Vogel, and J.A. Doudna. 2017. RNA-based recognition and targeting: sowing the seeds of specificity. Nat Rev Mol Cell Biol 18:215-228.
Munoz, J., J.J. Wheler, and R. Kurzrock. 2015. Androgen receptors beyond prostate cancer: an old marker as a new target. Oncotarget 6:592-603.
Yuan, J., and J. Chen. 2010. MRE11-RAD50-NBS1 complex dictates DNA repair independent of H2AX. J Biol Chem 285:1097-1104.
【００３４】
本発明は、以下の実施例及び図により、より十分に説明される。下記の実施例は、本発明の目的を明確にし、有利な実施形態を説明することを意図されており、決して本発明の範囲を限定するものとして意図されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】RT-qPCR法によるsiRNAの定量法の概略図。参照範囲の例。
【図２】本発明のsiRNA配列及びsiRNA2 siRNAと、ヒトのアンドロゲン受容体をコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAとの相補性の比較。示された位置は、それぞれ、ヒトアンドロゲン受容体mRNA(AR、アクセッション番号：NM_00044.3、配列番号５)及びヒトのH2AX mRNA(アクセッション番号：NM_002105.2、配列番号６)の位置に対応する。下線を付した塩基は、示されたsiRNAのガイド鎖のものと完全な相補性である塩基である。示されたsiRNAは、表１に記載されたものと100％同一であるオリゴヌクレオチドで構成される。灰色ボックスは、核形成領域(シード領域)、すなわち、siRNAガイド鎖(5'→3'方向)のヌクレオチド２〜８(両端を含む)、及びH2AXをコードするmRNAとの相補性を示す。
【図３】対照siRNA(Cont、黒色バー)、siAR2(灰色バー)又はsiARH2AX-1(白色バー)のC4-2細胞へのトランスフェクションの48時間後での、RT-qPCRによるARをコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの定量。各mRNA(HRPT)の発現レベルは、対照siRNAをトランスフェクトした細胞で測定したレベルとの相対値で表す。
【図４】対照siRNA(Cont、黒色バー)、siAR7(濃い灰色バー)又はsiARH2AX-1(白色バー)のLNCaP又はC4-2細胞へのトランスフェクションの72時間後での、RT-qPCR法によるARをコードするmRNA、PSAをコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの定量。各mRNA(HRPT)の発現レベルは、対照siRNAをトランスフェクトした細胞で測定したレベルとの相対値で表す。
【図５】対照siRNA(Cont、黒色バー)、SiH2AX(濃い灰色バー)、siARh(薄い灰色バー)又はsiARH2AX-1(白色バー)のLNCaP又はMDA MB-453細胞へのトランスフェクションの72時間後での、RT-qPCR法によるARをコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの定量。各細胞型について、各mRNAの発現レベルは、対照siRNAをトランスフェクトした細胞で測定したレベルとの相対値で表す。
【図６】次のsiRNA：対照(Cont)、siARH2AX-1、siRNA、siHeAX又はsiRNA siH2AXとsiARhとの組合せの１つのC4-2細胞へのトランスフェクションの72時間後での、AR及びH2AXの発現のウェスタンブロットによる免疫検出。
【図７】次のsiRNA：対照(Cont)、siAR7又はsiARH2AX-1のPC3細胞へのトランスフェクションの72時間後のAR、H2AX及びγH2AXの発現のウェスタンブロットによる免疫検出。
【図８】対照siRNA(Cont)、siAR7 siRNA又はsiARH2AX-1による細胞のトランスフェクションの72時間後での、ブレオマイシン(10μl)又はビヒクルを添加して６時間処理したC4-2細胞におけるγH2AX(第１欄)及び53BP1(第２欄)の免疫検出。
【図９】対照siRNA(黒色バー)、siRNA2(灰色バー)又はsiARH2AX-1(白色バー)のトランスフェクションの90時間後での、MDA MB231又はC4-2細胞のWST1試験による細胞生存の測定。測定値は、対照条件(対照siRNA、ビヒクル)で測定した値の平均値に相対化されている。
【図１０】左のパネル：siRNA対照(Cont)、siARh、siH2AX又はsiARH2AXのトランスフェクションの72時間後での、WST1試験により測定される22RV1、MDA MB-453、U87、WM266-4及びMDA MB231細胞の生存。右のパネル：siRNA対照(Cont)、AR7又はsiARH2AXのトランスフェクションの72時間での、WST1試験により測定されるLNCaP又はC4-2細胞の生存。各株について、結果は対照条件での細胞生存に相対化されている。
【図１１】対照siRNA(黒色バー)、siRNA2(灰色バー)又はsiARH2AX-1(白色バー)により48時間トランスフェクトした後、10μMのブレオマイシン又は10μMのエトポシド又はビヒクルを含む培地で48時間インキュベートしたC4-2細胞のWST1試験による細胞生存の測定。測定値は、対照条件(対照siRNA、ビヒクル)で測定した値の平均値に相対化されている。
【図１２】対照siRNA(Cont)又はsiARH2AX-1による細胞のトランスフェクションの24時間後に10μMのブレオマイシン又はそのビヒクルを添加して処理した48時間後での、WST1代謝試験により測定したLNCaP又はC4-2細胞の生存。異なるサンプルの生存測定は、100％とみなした対照条件(ブレオマイシンの無いsiRNA対照)下で培養した細胞で測定した値の平均値に相対化されている。
【図１３】対照siRNA(Cont、黒色バー)、siH2AX siRNA(濃い灰色バー)、siARh siRNA(薄い灰色バー)又はsiARH2AX-1(白色バー)による細胞のトランスフェクションの24時間後に40μMのエトポシド又はそのビヒクルを添加して処理した48時間後での、WST1代謝試験により測定したMDA MB231及びWM266-4細胞の生存。異なるサンプルの生存測定は、100％とみなした対照条件(ブレオマイシンの無いsiRNA対照)下で培養した細胞で測定した値の平均値に相対化されている。
【図１４】siARH2AX-1の連続全身投与による前立腺癌からの骨転移の阻害。左パネル：ビヒクル(154mMのNaCl、黒色バー)又はこのビヒクルに希釈したsiARH2AX-1(灰色バー)を皮下に３週間連続投与した、22RV1ヒト前立腺腫瘍を有するヌードマウスの脛骨におけるヒトAR mRNAの発現レベル(平均±SEM、ｎ＝7、NaCl群の平均値に対する値)。右パネル：両動物群におけるヒトHPRT mRNAの発現により測定した骨での転移量。各バーはマウスにおける転移量を表す。「０」は、その動物でHPRT mRNAが検出されなかったことを示す。
【図１５】154mMのNaCl溶液中(灰色バー)又は10mM MgCl2含有クエン酸緩衝液(pH６)中(黒色バー)で希釈され、皮下に３日間連続投与したsiARH2AX-1の、血清、種々の器官及び腫瘍におけるRT-qPCRによる定量(平均±SEM、ｎ＝4、NaCl群の血清中の平均値に対する値)。
【図１６】インビボでのsiRNA分布に対する、単回投与したsiH2AX-1とCD36受容体リガンドとを含む組成物の効果。生理食塩水(154mMのNaCl)中又はヘキサレリン(siAR-1：ヘキサレリン １：１、w/w)若しくは酸化LDL(siAR-1：酸化LDL １：0.1、w/w)を含む10mMクエン酸緩衝液(pH６)中のいずれかに製剤化されたsiARH2AX-1の、0.12mg/kgの単回皮下投与の10分後での血清(パネルＡ)又は種々の器官(パネルＢ)におけるRT-qPCRによる定量。各群(群当たり３匹のマウス)の平均は、NaCl群の値の平均として記録した。
【図１７】インビボでのsiRNA分布に対する、siH2AX-1とCD36受容体リガンドとを含み、皮下に連続投与された組成物の効果。２mg/kg/日のsiARH2AX-1 siRNAを３日間連続送達する浸透圧ポンプを、ヒト前立腺腫瘍22RV1を有するマウスの皮下に移植した。siRNAは、生理食塩水中(154mMのNaCl、灰色バー)又は１μM MgCl2を含み、酸化LDLを補充された10mMクエン酸緩衝液中(siARHAX-1:酸化LDL  １：0.1、w/w)(黒色バー)のいずれかに製剤化した。siARHAX-1は、３日間の処置の終時にRT-qPCRにより定量した。各群(群当たり３匹のマウス)の平均は、NaCl群の血清中の平均値に相対化されている。縦軸は、NaCl溶液中に希釈されたsiRNAを与えられたマウスの血清中で測定された濃度に対するsiARH2AX-1の濃度を示す。
【図１８】ビヒクル(DMSO)(黒色菱形印)、５mg/kg用量(薄い灰色菱形印)若しくは10mg/kg用量(濃い灰色菱形印)のエトポシドで１週間に３回の処置したか、或いはsiARH2AX-1 siRNAを単独(白色の三角形)で又は５mg/kg用量(薄い灰色の三角形)若しくは10mg/kg用量(濃い灰色の三角形)のエトポシドと共に１週間に３回の連続皮下投与で処置したヌードマウスにおいて発生したC4-2腫瘍の容積と時間の関係。
【実施例】
【００３６】
実施例１：方法
１-用いたsiRNA
既知のいずれのmRNA(siRNA対照)ともハイブリダイズしないsiRNAを用いた。このsiRNA(Cont)は次の２つのオリゴヌクレオチドで構成される： 
配列番号７：5'UAGCAAUGACGAAUGCGUA[dT][dT]
配列番号８：5'UACGCAUUCGUCAUUGCUA[dT][dT]
ARを阻害する４つのsiRNAを用いる：
−  siARH2AX siRNAは、表１に示される配列番号１及び配列番号２の２つのオリゴヌクレオチドで構成される。
−  siAR siRNAは、国際出願PCT/FR2002/003843に記載されるものであり、次の２つのオリゴヌクレオチドで構成される：
配列番号９：GACUCAGCUGCCCCAUCCACG[dT][dT]
配列番号10： CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC[dT][dT]
AR mRNAとハイブリダイズするがH2AXのものとはハイブリダイズしない別の２つのsiRNAを用いた。siARhはARの第１エキソンの配列と、siAR7はARの第７エキソンの配列とハイブリダイズする。これらsiRNAは次の２つのオリゴヌクレオチドで構成される：
siARh：
配列番号11：UCCCCAAGCCCAUCGUAGA[dT][dT]
配列番号12：UCUACGAUGGGCUUGGGGA[dT][dT]
siAR7：
配列番号13：AAUGAUACGAUCGAGUUCC[dT][dT]
配列番号14：GGAACUCGAUCGUAUCAUU[dT][dT]
H2AX mRNAとハイブリダイズするがARのものとはハイブリダイズしないsiRNAであるsiH2AXもまた用いた。
このsiRNAは次の２つのオリゴヌクレオチドで構成される：
siH2AX:
配列番号15：CUGGAAUUCUGCAGCUAAC[dT][dT]
配列番号16：GUUAGCUGCAGAAUUCCAG[dT][dT]
【００３７】
２-細胞株、培養及びトランスフェクション条件、遺伝子発現の測定
下記の実施例で用いた細胞の全てはヒト細胞でありH2AXを発現する。
表２は、細胞株の起源及びシクロフィリンＡの発現に対して規格化され、任意単位(22RV1＝100,000)で表された、RT-qPCRにより測定されたAR mRNAの相対的発現レベルを示す。
細胞は、10％ウシ胎仔血清を補充したEMEM又はRPMIで培養し、又はATCCの推奨どおりに培養する。示したときには、細胞は、供給業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン(Life Technologies)を用いてsiRNAでトランスフェクトされている。示された処置後の生存細胞の数は、供給業者(Roche)の指示書に従って、WST1試験による代謝活性の測定により定量した。
遺伝子発現に対する、siRNAトランスフェクション及び/又は異なる化学療法剤による処置の効果を次のように測定した：
−  従来のフェノール-クロロホルム法(Trizol)により抽出したmRNAのRT-qPCR定量による。RNAの量は、ARにより調節されないシクロフィリンＡをコードするmRNAを測定することにより規格化した(デルタデルタCT法)。
−  タンパク質抽出物に対するウェスタンブロットによる。用いた抗体は次の通りである： AR：Santacruz, N-20 sc-816；HeAX：Merck Millipore ref 07-627；チューブリン：Sigma T6199；アクチン：Merck Millipore MAB 1501；γH2AX：Merck Millipore 05-636。チューブリン又はアクチンの免疫検出法を用いて、確実に、比較可能な量のタンパク質を異なる条件下で分析する。
−  ガラスカバースリップ上で培養し固定した細胞の間接免疫蛍光による。用いた抗体は次の通りである：γH2AX：Merck Millipore 05-636；53BP1： Novus, NB 100-304。
【００３８】
３-改変定量RT-PCR法によるsiRNAの定量
生物学的サンプル中のsiRNAを定量するために、発明者らは、逆転写法に続く定量PCR(RT-qPCR)を開発した。各siRNAについて、追加の８ヌクレオチドを有する特異的ステムループプライマーを合成する。この８ヌクレオチドは、siRNAガイド(アンチセンス)鎖の3'末端の８ヌクレオチドに相補性である。逆転写工程後、得られた産物を２つのプライマーを用いてPCRにより増幅する。一方のプライマーは、逆転写プライマーのループに対応する領域とハイブリダイズする。第２のプライマーの3'末端の12ヌクレオチドは、siRNAガイド鎖の逆転写後に新たに合成されたcDNAの5'末端の12ヌクレオチドに対応する。増幅の検出は、TaqMan蛍光プローブの分解又はSybrGreenの取込みにより連続的に行われる。
水に希釈した一連の二本鎖siRNA(RT反応において103〜109コピー)を作製し、サンプルと共にRT-qPCRにより処理する。図１は、RT-qPCR法の概略を示し、この反応中に存在するコピー数と得られるCT(サイクル閾値又は増幅閾値)との関係を表す例示的範囲を示す。
siRNAを定量する生物学的サンプルは、血清、又はsiRNAを含むと考えられる重量既知の組織片から抽出したトータルRNAのいずれかである。これらRNAは、フェノール-クロロホルム法(trizol抽出)などの従来法で抽出される。抽出後、RNAは水に希釈する。
各サンプルについて得られたCT値を、前記の一連の二本鎖siRNAについて得られた値と比較する。これにより、被検サンプル中に存在するsiRNAコピー数の算出が可能になる。その後、この値を、先ずトータル逆転写RNAの量と比べて、次にRNAを抽出した組織重量又は血清容積と比べて記録し、全ての組織の密度が１g/cm3であることを考慮して、最終結果をモル/L(M)で表す。
【００３９】
４-マウスに移植された腫瘍細胞
腫瘍は、ヌードマウスの脇腹に腫瘍細胞を皮下注射して得る。腫瘍取込みが見られた動物のみを本研究に参加させ、処置又は対照処置を受けるものに無作為に分ける。
示した場合、DMSOに希釈した後154mMのNaCl溶液中で必要とする濃度に調節したエトポシドを、示した用量にて週に３回腹腔内注射をする。
全てのsiRNAを154mMのNaClを含む水中又は示した緩衝液中に希釈する。
示した場合、マウスの背中(マウスが腫瘍を有する場合、その反対側)にAlzet浸透圧ポンプを皮下移植することにより、siRNAの連続投与を行う。ポンプ中のsiRNA濃度は、製造業者が指示したポンプ流速を考慮して、示した量(mg/kg/日)を送達するように調節する。
皮下腫瘍容積は、測径器を用いて腫瘍の最大直径(Ｄ)及び最小直径(ｄ)並びに高さ(ｈ)を測定して見積もる。容積は式Ｖ＝Ｄ×ｄ×ｈ×π/6で算出する。
実験の終時に、動物を犠牲にして血清、腫瘍及び種々の組織を摘出し、RNAを抽出してこれらRNA中に存在するsiRNAを定量する。
用いた実験プロトコルは全て、フランス倫理委員会及び規制庁により認証されている。実験プロトコルは、用いる動物の数を限定し、不必要な苦痛を回避する態様で行う。
【００４０】
実施例２：本発明のsiARH2AX-1及びsiARH2AX-1b siRNAは二重特異性である。
図２に示すアライメントは、siARH2AXの19塩基及びsiAR2の21塩基がAR mRNAに完全に相補性であることを示す。この図はまた、siARH2AX-1の19塩基のうち17塩基及びsiAR2の21塩基のうち17塩基がH2AXをコードするmRNAの塩基とハイブリダイズすることを示す。これらsiRNAの追加の２デオキシチミジンの存在は、当該siRNAのハイブリタイゼーションに影響しない。
siARH2AX-1及びsiARH2AX-1bのsiRNA核形成領域、すなわちガイド鎖の5'→3'配列に含まれるヌクレオチド２〜ヌクレオチド8(図２中の灰色ボックス)は、H2AX mRNAに完全に相補性である(７塩基中７塩基、すなわち100％)。しかし、この相補性は、siAR2に関しては、部分的にすぎず、７塩基中５塩基(すなわち、71％)でしかなく、siAR2の２位及び３位のヌクレオチドはH2AX mRNAに相補性でない。この差は、図３に示したように、siARH2AX-1とsiAR2との機能的差異を引き起こす。この実験では、C4-2腫瘍細胞を次のsiRNAでトランスフェクトした：Cont、siARH2AX-1又はsiAR2。トランスフェクションの48時間後、siARH2AX-1及びsiAR2 siRNAはAR発現を類似する様式で阻害することが観察される。対照的に、核形成領域がH2AX mRNAに部分的(71％)に相補性であるsiAR2 siRNAは、核形成領域がH2AX mRNAに完全に相補性であるsiARH2AX-1 siRNAと比べて、H2AX発現の阻害に関して効果がかなり低い。
【００４１】
図４、５、６及び７では、種々の細胞株を、siARH2AX-1、ARのエクソン１(siARh)若しくはエクソン７(siAR7)の配列をそれぞれ標的するがH2AXを標的しない２つの他のsiRNA、又はH2AXを標的するがARを標的しないsiRNAでトランスフェクトした。
図４に示した実験では、LNCaP又はC4-2腫瘍細胞を次のsiRANでトランスフェクトした：Cont、siAR7又はsiARH2AX-1。トランスフェクションの72時間後、ARをコードするmRNA、アンドロゲン受容体により調節される遺伝子である前立腺特異的抗原(又はPSA)をコードするmRNA及びH2AXをコードするmRNAの分析により、両方の株において、siAR7及びsiARH2AX-1はAR及びPSAの発現を阻害するが、siARH2AX-1のみはH2AXの発現を90％以上阻害することが示された。
同様に、図５に示した試験では、LNCaP又はMDA MB-453腫瘍細胞を次のsiRANでトランスフェクトした：Cont、siH2AX、siARh、siARH2AX-1。両方の株において、siARhはARを阻害するがH2AXを阻害せず、siH2AXはH2AXを阻害するがARを阻害しない。siARH2AX-1 siRNAのみがAR-及びH2AXをコードする２つのmRNAの発現を阻害する。
図６に示した実験では、AR及びH2AXのタンパク質発現は、次のsiRNAでのC4-2細胞のトランスフェクションの72時間後に測定した：Cont、siARH2AX-1、siARh、siH2AX及びsiARhとsiH2AX siRNAとの混合物(1：1)。siARhはARを阻害するがH2AXを阻害せず、siH2AXはH2AXを阻害するがARを阻害せず、両siRNAの混合物はAR及びH2Aを阻害する。siARH2AX-1 siRNAのみがAR及びH2AXのタンパク質発現を共に阻害する。
【００４２】
図７に示した試験では、ARを弱く発現するPC3腫瘍細胞を次のsiRNAでトランスフェクトした：Cont、siAR7又はsiARH2AX-1。トランスフェクションの72時間後、AR及びH2AXのタンパク質発現を測定した。H2AXの発現はsiARH2AX-1により阻害されるが、siAR7により阻害されないことが観察される。H2AXの阻害にはγH2AXリン酸化型の阻害を伴う。
総合すると、以上の結果は、siARH2AX-1 siRNAのみがAR及びH2AXの両方を同時に阻害する能力を有することを示す。siARH2AX-1 siRNAは、H2AX発現の阻害について、siAR2siRNAより遥かに効果的である。これら２つのsiRNAの核形成領域における２塩基の差は、H2AXを阻害する能力を大きく改変する。
siARH2AX-1によるH2AX阻害は、ARを強力に(LNCaP、C4-2)、中程度に(MDA MB253)又は弱く(PC3)発現する細胞で生じる。
【００４３】
実施例３：H2AXの阻害は、ブレオマイシン誘導性DNA損傷における53BP1動員を妨げ、細胞生存を低下させる。
図８に示した実験では、C4-2細胞を対照又はsiARH2AX-1 siRNAでをトランスフェクトした。次いで、トランスフェクションの72時間後、細胞を、10μlのブレオマイシン又は対応するビヒクルを用いて６時間処理した。
対照条件下(Cont siRNA、ブレオマイシン不存在)、γH2AXは検出可能であるが弱く発現される一方、53BP1の発現は優勢に散在性であることが観察される。ブレオマイシン処理はγH2AXの発現を強力に増大させる一方、53BP1標識は点状であり、このことは、ブレオマイシンにより誘導されるDNA損傷におけるγH2AXを介するその動員を説明する。
siAR7でトランスフェクトした細胞では、ブレオマイシンはγH2AX標識の増加及び53BP1の動員を誘導する。
siARH2AX-1でトランスフェクトした細胞では、H2AXの発現は対照条件と比較して非常に小さい一方、53BP1の発現は同等である。ブレオマイシンでの処理後、siARH2AX-1でトランスフェクトした細胞は、H2AXの増加も、DNA損傷修復の中心への動員も示さなかった。
この実験からsiARH2AX siRNAはDNA修復を阻害すると結論付けられる。
【００４４】
実施例４：siARH2AX-1 siRNAは、AR発現レベルに関係なく細胞生存を低下させる。
図９に示した実験では、ARを弱く発現するMDA MB231細胞、又はC4-2細胞のトランスフェクションの90時間後、siARH2AX siRNAでトランスフェクトした細胞の生存はこの２株で有意に低下したが、siAR2 siRNAでトランスフェクトした細胞では僅かしか低下しないことが観察される。
図10に示した実験では、細胞を、左パネルでは、対照(Cont)、siH2AX、siARh又はsiARH2AX-1 siRNAでトランスフェクトし、右側パネルでは、対照(Cont)、siAR7又はsiARH2AX-1 siRNAをトランスフェクトした。siARh及びsiAR7 siRNAはARを強く発現する細胞(22RV1、C4-2、LNCaP)の増殖を阻害するが、ARを中程度又は低レベルに発現する他の株(MDA MB453、MDA MB231、WM266-4、U87)の増殖を阻害しない。
対照的に、siARH2AX-1 siRNAは、AR発現レベルとは無関係に、H2AXを阻害しないsiARh siRNAによるAR阻害の増殖に対する影響にも無関係に、全ての細胞株の増殖を阻害する一方、ARに影響を及ぼすことなくH2AX発現のみを阻害するsiH2AX siRNAは、細胞系統に無関係に細胞増殖にほとんど影響しない。
これら実験から、siARH2AX-1 siRNAのみが、AR発現に依存するしないに関わらず、細胞増殖を阻害し、ARは、これら細胞において非常に強力に、中程度のレベルで、又は非常に弱く発現されると結論付けられた。
【００４５】
実施例５：siARH2AX-1 siRNA及びDNA損傷誘導剤の影響は、AR発現レベルに無関係に増強される。
図11に示した実験では、Cont、siAR2又はsiARH2AX-1 siRNAによるC4-2細胞のトランスフェクションの48時間後、細胞をビヒクル又はDNA損傷を誘導する化学療法剤であるエトポシド(10μM)若しくはブレオマイシン(10μM)で処理した。化学療法剤の添加の48時間後、siAR2 siRNAとこれら薬剤のいずれか一方との組合せは、化学療法剤単独で測定された効果と比べて有意に大きな生存阻害効果を生じないことが観察される。対照的に、siARH2AX-1と化学療法剤のいずれかとの効果は、細胞生存の阻害を増強する。
図12に示した実験では、Cont又はsiARH2AX-1 siRNAでのC4-2細胞のトランスフェクションの48時間後、細胞をビヒクル又はブレオマイシン(10μM)で処理した。siARH2AX-1とブレオマイシン処理との組合せは、LNCaP細胞において、分離した２つの処理の効果の和から予想されるものと比べて約２倍の細胞生存阻害効果を生じることが観察される。
【００４６】
図13に示した実験では、ARを弱く発現するMDA MB231又はWM266-4細胞を、対照(Cont)、siH2AX、siARh又はsiARH2AX siRNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を40μlのエトポシド又はビヒクルで処理し、48時間後に WST1試験により、対照条件下の細胞のものと比較した細胞生存を測定した。両方の株においてエトポシドは細胞増殖を阻害することが観察される。この処理をsiH2AXによるH2AXの阻害又はsiARh siRNAによるARの阻害と組み合わせたとき、増殖に対するエトポシドの効果に増幅はない。他方で、エトポシド及びsiARH2AX-1の処理は、組み合わせると増強する。
これら実験結果から、腫瘍細胞(ARを低レベルで発現する細胞を含む)の増殖を阻害するには、DNA損傷誘導処理をsiARH2AX-1と組み合わせることが有利であると結論付けられる。siARH2AX-1 siRNAは、ARを低レベルで発現する細胞を含め、H2AX発現及び細胞生存の阻害において、siAR2 siRNAと比べて遥かに効果的である。加えて、siARH2AX-1は、化学療法剤が生じる生存阻害効果を増強するが、siAR2は増強しない。
【００４７】
実施例６：腫瘍を有するマウスへのsiARH2AX-1の投与は転移性拡散を阻害する。
図14に示した実験では、ヌードマウスに22RV1細胞を移植した。腫瘍が検知されたら、生理食塩水(154mM NaCl)中に処方したsiARH2AX-1 siRNAを0.2mg/kg/日で、又はビヒクル単独を投与するAlzetポンプを３週間移植した。処置終了時に骨(脛骨)を回収し、siARH2AX-1と、ヒト由来のアンドロゲン受容体及びHPRTをコードするmRNAを定量した。
ヒト前立腺腫瘍22RV1を有するマウスへのsiARH2AX-1 siRNAの連続皮下投与は、マウス骨におけるアンドロゲン受容体の発現を阻害する(図14左側パネル)。この阻害には、この腫瘍の骨転移を自然発症するマウスの数の減少と、骨におけるヒトmRNA(HRPT)の発現レベルにより評価した、腫瘍サイズの縮小とを伴う(図14右側パネル)。
siARH2AX-1 siRNAの連続皮下全身投与により、骨に発症する癌の転移へ送達することができ、骨における標的siRNA遺伝子の発現を阻害することができ、転移の移植及び/又は進展を制限することができる。
【００４８】
実施例７：製剤化によるsiRNAの分布を改善
図15に示した実験では、生理食塩水(154mM NaCl)中又は10mM MgCl2を含む10mMクエン酸緩衝液(pH６)(Cit/mg)中に希釈され、２/mg/kg/日の用量でsiARH2AX-1を連続送達する浸透圧ポンプを、腫瘍を有するマウスの皮下に移植した。３日後にsiARH2AX-1を、RT-qPCRにより血清、種々の器官及び腫瘍において定量した。生理食塩水を用いる製剤化と比べて、10mM MgCl2を補充したクエン酸緩衝液(pH６)を用いる製剤化は、組織及び腫瘍においてsiARH2AX-1の濃度を有意に増加させると認められる。
CD36受容体は、内皮細胞、多くの腫瘍細胞及びマクロファージなどのその他の細胞型の外膜に発現する。このCD36受容体は、酸化LDL又はヘキサレリンペプチドなどの異なるクラスのリガンドと結合する。
図16に示した実験では、154mM NaCl溶液(対照群、NaCLと表示)中又は0.02mMヘキサレリンペプチド若しくは30nM酸化LDLを添加した10mMクエン酸緩衝液(それぞれ、Cit/ヘキサレリン、Cit/LDL)中に製剤化したsiARH2AX-1 siRNAを、用量0.12mg/kgにてボーラスで皮下注射により成体マウス群に投与した。注射の20分後、、異なるマウス群(群当たり４匹のマウス)の血清(パネルＡ)又は組織(パネルＢ)で測定したsiRNAの平均濃度を対照群の平均値と比較すると、ヘキサレリン又は酸化LDLの添加により血清及び組織中のsiRNA濃度が増加することが示される。
図17に示した試験では、浸透圧ポンプを用いて、ヒト前立腺腫瘍22RV1を有するマウスの皮下に、siARH2AX-1 siRNAを用量２mg/kg/日にて３日間連続して投与した。siRNAは、154mM NaCl溶液中又は酸化LDLを含む10mMクエン酸緩衝液(pH６)(siARH2AX-1:LDLox比は１:0.1、重量:重量)中に製剤化した。siARH2AX-1濃度を、処置の３日後、血清、異なる器官及び腫瘍中で測定した。酸化LDLの添加は、血清、異なる器官及び腫瘍中のsiARH2AX-1濃度を増加させると認められる。
【００４９】
実施例８：siARH2AX-1 siRNAとDNA損傷誘導剤との組合せは、腫瘍発生に対する別々に行われたこれら処置の効果を増強する。
図18に示した実験では、浸透圧ポンプを、ヒト前立腺腫瘍22RV1を有するマウスに移植し、10mM MgCl2を含む10mMクエン酸緩衝液(pH６)中又はビヒクル単独に製剤化したsiARH2AX-1 siRNAを２mg/kg/日の用量にて、第１日目から22日間連続して皮下投与した。ポンプ移植の２日後、マウスに、エトポシドを用量５又は15mg/kgにて又はビヒクルを腹腔内注射し、この処置をマウスを犠牲にするまで週２回繰り返した。５mg/kgのエトポシドは腫瘍発生をほんの僅か阻害することが観察される。15mg/kgの用量は阻害を起こすが、処置した数匹の動物で体重減少を伴い、この処置の毒性を示す。siARH2AX-1 siRNAは、体重減少を起こさずに高用量のエトポシドと同程度に効果的である。
エトポシド及びsiARH2AX-1処置の併用は、別々になされた２つの処置の効果を増強する。
この実験から、siARH2AX-1 siRNAは、動物において有意な毒性効果を有することなく腫瘍発生を効果的に阻害し、この処置と低い非毒性用量のDNA損傷誘導剤との併用は腫瘍増殖阻害を増幅すると結論付けられる。
【図１】
2020500217.tif 000006
【図２】
2020500217.tif 000007
【図３】
2020500217.tif 000008
【図４】
2020500217.tif 000009
【図５】
2020500217.tif 000010
【図６】
2020500217.tif 000011
【図７】
2020500217.tif 000012
【図８】
2020500217.tif 000013
【図９】
2020500217.tif 000014
【図１０】
2020500217.tif 000015
【図１１】
2020500217.tif 000016
【図１２】
2020500217.tif 000017
【図１３】
2020500217.tif 000018
【図１４】
2020500217.tif 000019
【図１５】
2020500217.tif 000020
【図１６】
2020500217.tif 000021
【図１７】
2020500217.tif 000022
【図１８】
2020500217.tif 000023
【配列表】
2020500217000001.app
【国際調査報告】
2020500217.tif 000024
2020500217.tif 000025
2020500217.tif 000026
2020500217.tif 000027
2020500217.tif 000028
2020500217.tif 000029
2020500217.tif 000030
2020500217.tif 000031