(57)【要約】  本発明は、レチノールの変換によって、特にレチニル長鎖エステルなどのレチニルエステルを生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の使用を含む。前記プロセスは、ビタミンＡの生物工学的生産のために使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノールアシル化活性、好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］活性、より好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．２０］活性を有する酵素を含むカロテノイド産生宿主細胞であって、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約２０％の割合で長鎖レチニルエステルを産生する、カロテノイド産生宿主細胞。
【請求項２】
異種アシルトランスフェラーゼを含む、請求項１に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、パラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項１又は２に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項４】
前記アシルトランスフェラーゼが植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌から選択され、好ましくは、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ヒト、ラット及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項５】
前記アシルトランスフェラーゼが、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から選択され、好ましくは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はＤ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から選択されるアシルトランスフェラーゼである、請求項４に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項６】
前記アシルトランスフェラーゼが、配列ＸＭ＿５０２５５７又は配列ＮＭ＿１３５９６９に従うアシルトランスフェラーゼに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項５に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項７】
前記長鎖レチニルエステルがさらにビタミンＡに変換される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞。
【請求項８】
アシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］の酵素活性によって長鎖レチニルエステルを含むレチノイドを生産するためのプロセスであって、レチノールを前記アシルトランスフェラーゼと接触させることを含み、前記長鎖レチニルエステル混合物中のトランス−アイソフォームのシス−アイソフォームに対する比率が少なくとも約４である、プロセス。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のカロテノイド産生宿主細胞を用いる、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
（ａ）アシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］をコードする核酸分子を適切なカロテン産生宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）レチノールを、少なくとも約４の比率のトランス−及びシス−レチニルエステルを含む長鎖レチニルエステル混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下で長鎖レチニルエステルをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【請求項１１】
少なくとも約４の比率のトランス−及びシス−レチニルエステルを含む長鎖レチニルエステル混合物を生産するためのアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］の使用であって、前記アシルトランスフェラーゼが適切なカロテノイド産生宿主細胞において異種発現される、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、レチノールの変換によって、特にレチニル長鎖エステルなどのレチニルエステルを生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の使用を含む。前記プロセスは、ビタミンＡの生物工学的生産のために使用され得る。
【０００２】
例えば、長鎖レチニルエステルを含むレチニルエステルは、特にビタミンＡの生産プロセスなどのレチノイドの生産プロセスにおける重要な中間体／前駆体である。ビタミンＡを含むレチノイドは、栄養による供給を受けなければならないヒトにとって非常に重要で不可欠な栄養素の１つである。レチノイドは、特に視覚、免疫系及び成長に関して、ヒトの健康な状態を促進する。
【０００３】
ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドの現在の化学的生産方法は、例えば、高エネルギー消費、複雑な精製工程及び／又は望ましくない副産物などのいくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、過去数十年間にわたって、ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドを製造するために、より経済的且つ生態学的であり得る、微生物変換工程を含む他のアプローチが研究されている。
【０００４】
一般に、レチノイドを産生する生物系は産業的に扱いが困難であり、且つ／或いは非常に低レベルの化合物を生じるので、商業規模の単離が実用的でない。これには、このような生物系におけるレチノイドの不安定性、又は比較的高い副産物の生成を含むいくつかの理由がある。
【０００５】
したがって、ベータ−カロテンからビタミンＡへの酵素変換の産物特異性及び／又は生産性を改善することが継続中の課題である。特に、例えば長鎖レチニルエステルなどのレチニルエステルに対するレチノールの変換に関与する酵素の生産性を最適化することが望ましい。
【０００６】
驚くことに、我々は今回、レチニルエステル、特に長鎖レチニルエステルの産生が、レチノールを長鎖レチニルエステルに変換することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有する特定の酵素の使用によって誘発されることを見出した。
【０００７】
特に、本発明は、アシルトランスフェラーゼ活性を含む宿主細胞、特にカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、レチニル長鎖エステルを産生することができる、すなわち、レチノールをレチニル長鎖エステルに酵素的に変換することができる。
【０００８】
「アシルトランスフェラーゼ」、「レチノールアシル化酵素」、「レチノールアシル化活性を有する酵素」という用語は本明細書では互換的に使用され、レチノールから長鎖レチニルエステルへの変換を触媒することができる酵素を指す。
【０００９】
本明細書に記載される酵素は、それぞれの宿主細胞において発現されるトランス特異的ベータ−カロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）酵素の作用に起因し得る高い割合のトランス−アイソフォームを産生することができる、例えば、少なくとも約６５％の割合が、例えばトランス−レチナール又はトランス−レチノールを含むトランス−レチノイドであるレチノイド、例えば、少なくとも約６５〜９０％のトランス−アイソフォームのレチノイドを産生することができるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞の使用を含むプロセスにおいて特に有用であり得る。しかしながら、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼは、同じ活性を有するトランス−レチノール又はシス−レチノールのいずれかを触媒することができる。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「真菌宿主細胞」という用語は、特に、宿主細胞としての酵母、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などを含む。
【００１１】
レチノールの酵素触媒作用に関連する「変換」又は「アシル化」という用語は本明細書において互換的に使用され、本明細書で定義されるＤＧＡＴ、ＤＧＡ、ＹＡＬを含むが、これらに限定されないアシルトランスフェラーゼの作用を指す。
【００１２】
レチニルエステル、特に長鎖レチニルエステルの総量を基準として少なくとも約２０％の長鎖レチニルエステルの産生をもたらす本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼは、好ましくは、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞に導入される、すなわち異種酵素として発現されるか、又は内在性酵素として発現されてもよい。好ましくは、本明細書に記載される酵素は異種酵素として（過剰）発現される。
【００１３】
本発明に従う適切なアシルトランスフェラーゼは、例えば、植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌などの種々の供給源から得ることができる。適切なアシルトランスフェラーゼには、ＤＧＡＴ［ＥＣ２．３．１．２０］、例えば、ＤＧＡＴ１又はＤＧＡＴ２、ＡＲＡＴ、ｍｄｙを含むがこれらに限定されないアシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼファミリー［ＥＣ２．３．１］のメンバー、特に、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、好ましくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されるアシルトランスフェラーゼ、例えば、配列番号５、７に従う酵素、又はデータベースからの配列（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡ２をコードするＸＭ＿５０４７００；ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＲＥ２をコードするＸＭ＿５０５０８６）によってコードされる酵素など；ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、好ましくはムコール・キルキネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）から単離されるアシルトランスフェラーゼ、例えば、データベースから知られている配列（例えば、ＥＰＢ９３０５１．１）によってコードされる酵素など；フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、好ましくはフザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）から単離されるアシルトランスフェラーゼ、例えば、データベースから知られている配列（例えば、ＣＣＴ６６２８２．１）によってコードされる酵素など；例えばヒト又はラットなどの哺乳類、好ましくはホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）又はラトゥス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）から単離されるアシルトランスフェラーゼ、例えば、データベースから知られている配列（例えば、ＮＭ＿０５３４３７又はＮＭ＿０１２０７９）によってコードされる酵素など；ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、好ましくはドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されるアシルトランスフェラーゼ、例えば、データベースから知られている酵素（ＮＭ＿１３５９６９、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ配列Ｑ９６０Ｕ８）などが含まれる。
【００１４】
一実施形態では、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有する、すなわちレチノールのアシル化による長鎖レチニルエステルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などのドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から得ることができ、特に、例えば配列番号４に従うポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３に対して少なくとも約６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択され、前記配列は、適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において、本明細書に記載される適切な条件下で発現される。配列は、それぞれの宿主細胞における発現に対してコドン最適化され得る。
【００１５】
一実施形態では、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有する、すなわちレチノールのアシル化による長鎖レチニルエステルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）などのフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から得ることができ、特に、ＦｆＤｇａｔ１（配列ＣＣＴ６６２８２．１）に対して少なくとも約６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択され、前記配列は、適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において、本明細書に記載される適切な条件下で発現される。配列は、それぞれの宿主細胞における発現に対してコドン最適化され得る。
【００１６】
一実施形態では、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有する、すなわちレチノールのアシル化による長鎖レチニルエステルの形成に対する活性が増大されたポリペプチドは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から得ることができ、特に、ＹｌＤＧＡ２（配列ＸＭ＿５０４７００）、ＹｌＡＲＥ２（配列ＸＭ＿５０５０８６）、配列番号５又は７に対して少なくとも約６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択され、前記配列は、適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において、本明細書に記載される適切な条件下で発現される。配列は、それぞれの宿主細胞における発現に対してコドン最適化され得る。
【００１７】
好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞への形質転換の後に、その中にクローン化された前記ポリヌクレオチドの発現を増強することができる適切な（発現）ベクターにおいて発現される。クローン化ポリヌクレオチドは、通常、例えばプロモーター配列などの特定の制御配列に動作可能に連結される。当業者には、どの（発現）ベクター及び／又はプロモーターが本明細書に記載されるカロテノイド産生宿主細胞における発現に適しているかが分かる。
【００１８】
本明細書で定義される宿主細胞に、遺伝子及び／又はタンパク質のコピーをより多く生じさせるための改変は、強力なプロモーター、適切な転写及び／若しくは翻訳エンハンサーの使用、又はカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞への１つ若しくは複数の遺伝子コピーの導入を含み得、所与の時間におけるそれぞれの酵素の蓄積の増大をもたらし得る。当業者には、宿主細胞に基づいてどの技術を使用するかが分かる。遺伝子発現の増大又は低減は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００１９】
核酸又はアミノ酸への突然変異の発生、すなわち突然変異誘発は、例えば、ランダム若しくは部位特異的（ｓｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、例えば放射線などの作用物質によって生じる物理的損傷、化学的処理、又は遺伝因子の挿入などによる種々の方法で実施され得る。当業者には、突然変異を導入する方法が分かる。
【００２０】
したがって、本発明は、発現ベクター、又はその染色体ＤＮＡに組み込まれた本明細書に記載されるアシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。本明細書に記載されるアシルトランスフェラーゼをコードする、発現ベクター上の又は染色体ＤＮＡに組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むこのようなカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、組換え宿主細胞と呼ばれる。カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、配列番号３、５、７、９に従う既知の配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するか、又はデータベース配列、例えば、ＸＭ＿５０４７００、ＥＰＢ９３０５１．１、ＸＭ＿５０５０８６、ＣＣＴ６６２８２．１、ＮＭ＿０１２０７９、又はＮＭ＿０５３４３７によってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの１つ又は複数のコピーを含有し、本明細書で定義されるようなアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現をもたらし得る。遺伝子発現の増大は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。
【００２１】
本明細書で開示される配列と、長鎖レチニルエステルの形成において少なくとも約２０％の変換率を有するレチノールの長鎖レチニルエステルへのアシル化に対する優先性とに基づいて、レチノールから長鎖レチニルエステルへの変換に使用され得る、本明細書で定義されるレチノールアシル化活性を有するポリペプチドをコードするさらなる適切な遺伝子を容易に推定することができる。したがって、本発明は、新規のレチノールアシル化酵素を同定するための方法に関し、ここで、トランス−又はシス−アイソフォームのいずれかの長鎖レチニルエステルの産生に対する優先性を有する新規のアシルトランスフェラーゼのスクリーニングプロセスにおけるプローブとして、配列番号３、５、７、９に対して少なくとも約６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するか、又はデータベース配列、例えば、ＸＭ＿５０４７００、ＥＰＢ９３０５１．１、ＸＭ＿５０５０８６、ＣＣＴ６６２８２．１、ＮＭ＿０１２０７９、若しくはＮＭ＿０５３４３７によってコードされるポリペプチドが使用される。アシル化作用が、産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約２０％の長鎖レチニルエステルをもたらす限り、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、本明細書で開示されるあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されるレチノールからの長鎖レチニルエステルの産生のために使用され得る。
【００２２】
本発明は特に、長鎖レチニルエステルの生産プロセスにおけるこのような新規のアシルトランスフェラーゼの使用に関し、ここで、シス−アイソフォームの生産は、レチノイドの総量を基準として約２０％以下まで低減され得る。このプロセスは、前記アシルトランスフェラーゼを発現し（好ましくは、前記酵素をコードする遺伝子は異種発現される、すなわち前記宿主細胞に導入される）、さらに、ベータ−カロテンから、好ましくはトランス−アイソフォームのレチナールへの変換を触媒する例えばトランス特異的ＢＣＯなどのトランス特異的酵素を発現する、適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いて実施することができる。レチニルエステル、特に長鎖レチニルエステルはさらに、（既知の）適切な機構の作用によってビタミンＡに変換され得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、長鎖レチニルエステルの産生に関して「少なくとも約２０％」という用語は、レチノイドの少なくとも約２０％、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８７、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までが長鎖レチニルエステルであることを意味する。シス−アイソフォームの長鎖レチニルエステルの産生に関して「約２０％以下」という用語は、産生した長鎖レチニルエステルの約２０％以下、例えば、１８、１６、１４、１２、１０、８、７、５、２又は０％までがシス−アイソフォームの形態であることを意味する。これらの数値は全て、本明細書で定義される適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞中に存在するレチノイドの総量を基準とする。
【００２４】
「配列同一性」、「同一性％」又は「配列相同性」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的で、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性の割合を決定するために、配列は最適な比較を目的として整列されることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアライメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アライメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって行われてもよい。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列はいずれも、このアルゴリズムによって整列され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列につては、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択的パラメータは、１０のギャップ−オープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらの異なるパラメータ全てがわずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを用いたときに２つの配列の全体の同一性の割合は有意に変化されないことを認識するであろう。
【００２５】
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメントの後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：両方の配列内の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメント内の対応する位置の数を、アライメント内のギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「最長同一性」として標識される。比較される両方のアミノ酸配列が、そのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、これらは同一である、すなわち１００％の同一性を有する。本明細書で定義される植物に由来する酵素に関して、当業者には、植物由来の酵素が例えば葉緑体プロセシング酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素により切断され得る葉緑体標的シグナルを含有し得ることが分かる。
【００２６】
宿主細胞に応じて、レチノールのアシル化のための本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、それぞれの宿主細胞における発現のために最適化され得る。当業者には、このような改変ポリヌクレオチドを作成する方法が分かる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、このような宿主最適化核酸分子が本明細書で定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、これらも包含することが理解される。
【００２７】
本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼは、酵素活性を変更しないアミノ酸置換を保有する酵素も包含し、すなわちこれらは野生型酵素に関して同じ特性を示し、本明細書で定義されるレチノールから長鎖レチニルエステルへの変換を触媒する。このような突然変異は「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載される酵素の（酵素）活性を変更しない。
【００２８】
本発明に従う核酸分子は、本発明により提供される核酸配列の一部のみ又は断片、例えば、本明細書で開示される配列、例えば、配列ＸＭ＿５０４７００、ＸＭ＿５０４０３８、ＥＰＢ９３０５１．１、ＸＭ＿５０５０８６、ＣＣＴ６６２８２．１、ＸＭ＿５０２５５７、ＮＭ＿１３５９６９、ＮＭ＿０１２０７９、ＮＭ＿０５３４３７に従う、又は配列番号１若しくは２に従う配列に示されるような配列、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得る断片、又は本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼの一部をコードする断片を含み得る。アシルトランスフェラーゼのクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種からの他の相同体の同定及び／又はクローニングにおいて使用するために設計されるプローブ及びプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、これは、通常、本明細書で開示されるヌクレオチド配列の少なくとも約１２若しくは１５、好ましくは約１８若しくは２０、より好ましくは約２２若しくは２５、さらにより好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、若しくは７５以上の連続ヌクレオチド、例えば、配列ＸＭ＿５０４７００、ＸＭ＿５０４０３８、ＥＰＢ９３０５１．１、ＸＭ＿５０５０８６、ＣＣＴ６６２８２．１、ＸＭ＿５０２５５７、ＮＭ＿１３５９６９、ＮＭ＿０１２０７９、ＮＭ＿０５３４３７若しくは配列番号１、２、４、６、８、１０に従うヌクレオチド配列、又はこれらの断片若しくは誘導体に対して好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００２９】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃における６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃における１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回又は複数回の洗浄である。
【００３０】
高ストリンジェント条件には、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むか又は含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、又は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、及び２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含む溶液などの溶液中でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識化系；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙを用いて調製）を用いた４２℃における２時間〜４日間のインキュベーションと、その後、室温において２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で５〜１５分間フィルターを２回洗浄し、次に、６５〜６８℃において０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ又は０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５〜３０分間２回洗浄することが含まれる。
【００３１】
本明細書で定義される特異的アシルトランスフェラーゼの１つをコードする酵素／ポリヌクレオチドの発現は、カロテノイド／レチノイドの産生に適しており、且つ本明細書に記載される機能的等価物又は誘導体を含む本明細書で開示される酵素の１つをコードする核酸の発現を可能にする（微）生物を含む任意の宿主系において達成することができる。適切なカロテノイド／レチノイド産生宿主（微）生物の例は、細菌、藻類、酵母を含む真菌、植物、又は動物細胞である。好ましい細菌は、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、例えばパラコックス・ゼアキサンチニファキエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などのパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）のものである。好ましい真核微生物、特に酵母を含む真菌は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）などのフィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、例えばブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）などのブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。特に好ましいのは、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）若しくはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞における発現、又はエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）における発現、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現である。
【００３２】
本発明に関して、例えば、微生物、真菌、藻類、又は植物などの生物は、原核生物の国際命名規約又は藻類、真菌、及び植物の国際命名規約（メルボルン規約）によって定義されるような、同じ生理学的特性を有するこのような種の同義語又はバソニムも含むことが理解される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、カロテノイド、例えばベータ−カロテンの産生をもたらす宿主細胞である。カロテノイド産生宿主細胞を作成するための遺伝子及び方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットが参照される。産生されるカロテノイドに応じて、異なる遺伝子が関与し得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、レチノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、ベータ−カロテンからレチナール、レチノール及びレチニルエステルへの酵素変換によって、レチノイド、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体の産生をもたらす宿主細胞である。これらのポリペプチドは、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼを含む。ビタミンＡ経路の遺伝子、及びレチノイド産生宿主細胞の作成方法は、当該技術分野において知られている。
【００３５】
本明細書で使用される場合、レチニルエステル混合物は、長鎖レチニルエステルを含むレチニルエステルの混合物である。さらに、酢酸レチニルなどの他のエステル形態も含み得る。好ましくは、このような混合物はトランス−アイソフォームを多く含み、例えば、少なくとも約２０％のトランス−アイソフォームのレチニルエステル、特に長鎖トランスレチニルエステルを含む。「長鎖レチニルエステル」という用語は、少なくとも約８個、例えば、９、１０、１２、１３、１５又は２０個の炭素原子及び最大約２６個まで、例えば、２５、２２、２１個又はそれより少ない炭素原子からなり、好ましくは最大約６個までの不飽和結合、例えば、０、１、２、４、５、６個の不飽和結合を有する炭化水素エステルを定義する。長鎖レチニルエステルは、リノール酸、オレイン酸、又はパルミチン酸を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明は、本明細書に記載されるアシルトランスフェラーゼの作用によるレチノールのアシル化によって、少なくとも２０％の割合のトランス−又はシス−アイソフォームのいずれか、好ましくはトランス−アイソフォームの長鎖レチニルエステルを有する長鎖レチニルエステル、すなわちレチノイドを生産するためのプロセスに関し、ここで、アシル化酵素は、好ましくは、本明細書に記載される適切な条件下、適切な宿主細胞において異種発現される。産生される長鎖レチニルエステルは、培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。さらなる実施形態では、長鎖レチニルエステルは、ビタミンＡをもたらす多段階プロセスにおける前駆体として使用することができる。ビタミンＡは、当該技術分野で知られているように培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。
【００３７】
ベータ−カロテン産生遺伝子、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ、任意選択的に、ベータ−カロテン酸素化酵素をコードする遺伝子、任意選択的に、レチナール還元酵素をコードする遺伝子、及び／又は任意選択的に、ビタミンＡの生合成に必要とされるさらなる遺伝子を発現することができる宿主細胞、すなわち微生物、藻類、真菌、動物又は植物細胞は、好気性又は嫌気性条件下で適切な栄養分が補充され、種々の宿主細胞に対して当業者により知られているような水性培地中で培養され得る。任意選択的に、このような培養は、本明細書で定義される電子の移動に関与するタンパク質及び／又は補助因子の存在下で行われる。宿主細胞の培養／成長は、バッチ、流加バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、半連続又は連続モードで行うことができる。宿主細胞に応じて、好ましくは、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体（レチナール、レチノール、レチニルエステルなど）などのレチノイドの産生は、当業者に知られているように異なり得る。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択されるベータ−カロテン及びレチノイド産生宿主細胞の培養及び単離は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される宿主細胞におけるレチノイドの産生に関して、方法は、例えば、Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１０：９５（２０１１）に記載されている。例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母宿主細胞においてベータ−カロテン及びレチノイドを生産するための特定の方法は、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットに開示されている。
【００３８】
本明細書で使用される場合、酵素に関して「比活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。比活性は、規定温度において所与の期間に規定量のタンパク質によって消費される基質及び／又は産生される産物の量を定義する。通常、比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）で略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）という比活性の単位の定義は、本文書を通して互換的に使用される。酵素は、インビボで、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内、又は適切な基質が存在する系内でその触媒活性を実施すれば活性である。当業者には、酵素活性、特に、本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼの活性の測定方法が分かる。レチノールの変換からのレチニルエステルの産生、特に長鎖レチニルエステルの産生について本明細書で定義される適切なアシルトランスフェラーゼの能力を評価するための分析方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの実施例４などに記載されている。簡単には、レチニルエステル、特に長鎖レチニルエステル、レチノール、トランス−レチナール、シス−レチナール、ベータ−カロテンなどの産物の力価は、ＨＰＬＣによって測定することができる。
【００３９】
本明細書で使用されるレチノイドは、レチナール、レチノール酸、レチノール、レチノイン酸メトキシド（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）、酢酸レチニル、レチニルエステル、４−ケト−レチノイド、３ヒドロキシ−レチノイド又はこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、アポカロテノイドとしても知られているベータカロテン切断産物を含む。レチナール、レチノール及びレチニルエステルを含む混合物は、本明細書では、「レチノイド混合物」と呼ばれる。レチノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。
【００４０】
本明細書で使用されるレチナールは、ＩＵＰＡＣ名（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエナールで知られている。これは、本明細書では互換的にレチンアルデヒド又はビタミンＡアルデヒドと称され、シス−及びトランス−アイソフォームの両方、例えば、１１−シスレチナール、１３−シスレチナール、トランス−レチナール及び全トランスレチナールなどが含まれる。
【００４１】
本明細書で使用される「カロテノイド」という用語は、当該技術分野においてよく知られている。これは、２つの２０炭素ゲラニルゲラニルピロリン酸分子の連結により天然で形成される長い４０炭素の結合イソプレノイドポリエンを含む。これらには、４−ケト位置又は３−ヒドロキシ位置で酸化されてカンタキサンチン、ゼアキサンチン、又はアスタキサンチンをもたらし得る、フィトエン、リコペン、及び例えばベータ−カロテンなどのカロテンが含まれるが、これらに限定されない。カロテノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットに記載される。
【００４２】
本明細書で使用されるビタミンＡは、水溶液中に見られるビタミンＡの任意の化学形態（例えば、その遊離酸形態で非解離、又はアニオンとして解離）であり得る。本明細書で使用される用語は、生物工学的ビタミンＡ経路における全ての前駆体又は中間体を含む。また、酢酸ビタミンＡも含む。
【００４３】
特に、本発明は、本実施形態を特徴とする：
【００４４】
−  レチノールアシル化活性、好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］活性、より好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．２０］活性を有する酵素を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約２０％の割合で長鎖レチニルエステルを産生する、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００４５】
−  レチノールアシル化活性、好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］活性、より好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．２０］活性を有する酵素を含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞が長鎖レチニルエステルを含むレチニルエステル混合物を産生し、混合物が、少なくとも約２０％、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８７、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までのトランス−アイソフォームの長鎖レチニルエステルを含む、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００４６】
−  レチニルエステルが長鎖レチニルエステルから選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００４７】
−  異種アシルトランスフェラーゼを含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００４８】
−  宿主細胞が植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、パラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００４９】
−  アシルトランスフェラーゼが植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌から選択され、好ましくは、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ヒト、ラット及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５０】
−  アシルトランスフェラーゼが、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から選択され、好ましくは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はＤ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から選択されるアシルトランスフェラーゼである、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５１】
−  アシルトランスフェラーゼが、配列ＸＭ＿５０２５５７、配列ＮＭ＿１３５９６９に従うか、又は配列番号１及び２に従うポリヌクレオチドによってコードされるアシルトランスフェラーゼに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５２】
−  長鎖レチニルエステルを含むレチニルエステルがさらにビタミンＡに変換される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。
【００５３】
−  アシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］の酵素活性によって長鎖レチニルエステルを含むレチニルエステル混合物を生産するためのプロセスであって、レチノールを前記アシルトランスフェラーゼと接触させることを含み、混合物中のトランス−アイソフォームのシス−アイソフォームに対する比率が少なくとも約４である、プロセス。
【００５４】
−  アシルトランスフェラーゼの酵素作用から産生されるレチノイド混合物中のシス−アイソフォームの量を低減するためのプロセスであって、前記プロセスがレチノールをアシルトランスフェラーゼと接触させることを含み、前記酵素作用から得られるレチノイド混合物中のシス−レチニルエステルの量が、酵素との接触前のレチノイド混合物中の量と比較して少なくとも２０％低減される、プロセス。
【００５５】
−  アシルトランスフェラーゼの酵素作用から産生されるレチノイド混合物中のトランス−アイソフォームの量を増大させるためのプロセスであって、前記プロセスがレチノールをアシルトランスフェラーゼと接触させることを含み、前記酵素作用から得られるレチノイド混合物中のトランス−レチニルエステルの量が、酵素との接触前のレチノイド混合物中の量と比較して少なくとも約２０％増大される、プロセス。
【００５６】
−  レチノールアシル化活性、好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］活性、より好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．２０］活性を有する酵素を含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いる、上記に従う及び本明細書で定義されるプロセスであって、前記宿主細胞が、長鎖レチニルエステルを含むレチニルエステル混合物を産生し、混合物が、少なくとも約２０％、例えば３０、４０、５０、６０、７０、８０、８７、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までのトランス−アイソフォームのレチニルエステルを含む、プロセス。
【００５７】
−  （ａ）本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］をコードする核酸分子を適切なカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）レチノールを、少なくとも約４の比率のトランス−及びシス−レチニルエステルを含む長鎖レチニルエステル混合物に酵素変換するステップと、
（ｃ）適切な培養条件下でレチニルエステルをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。
【００５８】
−  少なくとも約４の比率のトランス−及びシス−レチニルエステルを含む長鎖レチニルエステル混合物を産生するための、定義されるアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１］の使用であって、アシルトランスフェラーゼが適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において異種発現される、使用。
【００５９】
以下の実施例は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは全く意図されない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に国際公開第２００６１０２３４２号パンフレット、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレット又は国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの内容は、参照によって本明細書に援用される。
【００６０】
［実施例］
［実施例１：一般的な方法、菌株、及びプラスミド］
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。
【００６１】
［振とうプレートアッセイ］
通常、８００μｌの０．０７５％酵母抽出物、０．２５％ペプトン（０．２５Ｘ  ＹＰ）に、１０μｌの新たに成長させたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を播種し、２００μｌのＤｒａｋｅｏｌ５鉱油でオーバーレイし、炭素源として鉱油中５％のコーン油及び／又は水相中５％のグルコースを用いた。２４ウェルプレート（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、３０℃、８００ＲＰＭ）において、形質転換体をＹＰＤ培地中で２０％のドデカンと共に４日間成長させた。鉱油画分を振とうプレートウェルから取り出し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて、順相カラムでＨＰＬＣにより分析した。
【００６２】
［ＤＮＡ形質転換］
菌株をＹＰＤプレート培地上で一晩成長させることにより形質転換させる。５０μｌの細胞をプレートからこすり取り、１μｇの形質転換ＤＮＡ、通常は組込み形質転換のための直鎖ＤＮＡ、４０％のＰＥＧ  ３５５０ＭＷ、１００ｍＭの酢酸リチウム、５０ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌ中、４０℃で６０分間のインキュベーションにより形質転換させ、選択培地に直接プレーティングするか、或いは優性抗生物質マーカー選択の場合は、細胞をＹＰＤ液体培地において３０℃で４時間増殖させた後、選択培地にプレーティングする。
【００６３】
［ＤＮＡ分子生物学］
ｐＵＣ５７ベクターにおいてＮｈｅｌ及びＭｌｕｌ末端を用いて遺伝子を合成した。国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットの場合のように、通常、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換におけるマーカー選択のために、遺伝子をＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」、ＭＢ６１５７ＨｙｇＲ、及びＭＢ８３２７ＮａｔＲベクターにサブクローニングした。遺伝子及びマーカーＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌ（ＭＢ５０８２）又はＰｖｕｌｌ（ＭＢ６１５７及びＭＢ８３２７）のランダム非相同末端結合によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれゲル電気泳動及びＱｉａｇｅｎゲル精製カラムにより精製した。
【００６４】
［プラスミドのリスト］
使用するプラスミド、菌株、及びコドン最適化配列は、表１、２及び配列表に記載される。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現に対してコドン最適化された配列番号１、２を除いて、全ての配列は、データベースにおけるヌクレオチド（ｎｔ）としての受託配列と同じであった。
【００６５】
【表１】
2020534806.tif 000002
【００６６】
【表２】
2020534806.tif 000003
【００６７】
［順相レチノール法］
Ｗａｔｅｒｓ  ７１７オートサンプラーに取り付けたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリーポンプを用いて、サンプルを注入した。安全シリカガードカラムキットを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｓｉｌｉｃａ（２），１５０ｘ４．６ｍｍを使用して、レチノイドを分離した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、３０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸、又はゼアキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、６０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸のいずれかからなる。それぞれの流速は、０．６ｍＬ／分である。カラム温度は周囲温度である。注入容積は２０μＬである。検出器は、２１０ｎｍから６００ｎｍまでを収集するフォトダイオードアレイ検出器である。表３に従って分析物を検出した。
【００６８】
【表３】
2020534806.tif 000004
【００６９】
［サンプル調製］
条件に応じて種々の方法によりサンプルを調製した。全培養液又は洗浄培養液サンプルのために、培養液を秤量したＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）管に入れ、移動相を添加した。製造指示書に従って最高設定３ＸにおいてＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｃｏｒｐ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）内でサンプルを処理した。洗浄培養液中、サンプルを微量遠心管において１００００ｒｐｍで１分間、１．７ｍｌ管内で回転させ、培養液をデカントし、１ｍｌの水を添加し、混合し、ペレットにし、デカントして、元の容積にした。混合物を再度ペレットにし、適切な量の移動相中に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ビーズビーティングにより処理した。鉱油画分の分析のために、サンプルを４０００ＲＰＭで１０分間回転させ、ポジティブディスプレイスメントピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）により油を上部からデカントして除去し、移動相中に希釈し、ボルテックスにより混合し、ＨＰＬＣ分析によりレチノイド濃度を測定した。
【００７０】
［発酵条件］
発酵は既に記載された条件と同一であり、鉱油のオーバーレイと、０．５Ｌ〜５Ｌの全容積のベンチトップ反応器内に供給されたコーン油である攪拌槽とを用いた（国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットを参照）。一般的に、生産性が増大された流加バッチ攪拌漕反応器を用いて同じ結果が観察され、レチノイドの生産のためのシステムの有用性が実証された。
【００７１】
［実施例２：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチノイドの産生］
レチノール産生菌株ＭＬ１７７６７を、ＵＲＡ３栄養マーカーに連結されたコドン最適化アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する精製ＨｉｎＤＩＩＩ／Ｘｂａｌ遺伝子断片で形質転換し、ウラシルを含まない最小培地において選択した。複数の単離株を振とうプレートアッセイにおいてレチノールのアシル化の増大及び残留レチノールの低減についてスクリーニングした。成功した単離株を流加バッチ攪拌漕反応器において実行させ、レチノールエステルの産生の増大のための方法の有用性が示された。実験の結果は以下に示され、真菌産生系においてレチノールアシル化活性が増大された遺伝子が単離されたことを示した。
【００７２】
【表４】
2020534806.tif 000005
【００７３】
［実施例３：サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチノイドの産生］
通常、ベータカロテン菌株は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０１３０６２８号明細書又は国際公開第２００９１２６８９０号パンフレットに記載される）ような標準的方法に従って、ベータカロテンを産生している構築されたゲラニルゲラニルシンターゼ、フィトエンシンターゼ、リコペンシンターゼ、リコペンシクラーゼなどの酵素をコードする異種遺伝子で形質転換される。本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ酵素を導入すること、及び／又は過剰発現させることにより、長鎖レチニルエステルの産生に関して同様の結果が得られる。さらに、ベータカロテンオキシダーゼ遺伝子で形質転換される場合、レチナールを産生することができる。さらに、レチノールデヒドロゲナーゼで形質転換されると、レチノールを産生することができる。このアプローチを用いて、長鎖レチニルエステルに対する生産性に関して同様の結果が得られる。
【配列表】
2020534806000001.app
【国際調査報告】
2020534806.tif 000006
2020534806.tif 000007
2020534806.tif 000008