(57)【要約】本開示は、免疫系調節特性を有するペプチドについて言及する。より具体的には、本開示は、ＮａＰｉ２Ｂ輸送体に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖相補性決定領域３に由来する免疫学的に活性のあるペプチドについて言及する。このようなペプチドは、癌の処置の下にある対象の免疫系の調節に有用であることが発見された。【代表図】図１
2020525551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の免疫系を調節する方法であって、前記対象の樹状細胞をＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来する有効量のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来する前記有効量のペプチドが、前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
樹状細胞を含む試料が、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来するペプチドとエクスビボで接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
樹状細胞をエクスビボで処理する方法であって、樹状細胞を、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来するペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項５】
対象の免疫系を調節するための組成物を調製するための、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来するペプチドの使用。
【請求項６】
対象の免疫系の調節因子としての使用のための、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来するペプチド。
【請求項７】
前記対象が、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある、請求項１もしくは４に記載の方法、請求項５に記載の使用、または請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ９＿ＭＩＤ（配列番号２）、Ｒｂ１０（配列番号３）から選択され、これらの機能がスクランブル（Ｓｃｒ）環状構造（配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８）によって制御される、請求項１もしくは４に記載の方法、請求項５に記載の使用、または請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
スクランブル（Ｓｃｒ）環状構造（配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８）によって機能が正にまたは負に制御されたＲｂ９（配列番号１）が、ＭＩＦおよびＣＤ７４に結合し、樹状細胞内での個々のシグナル伝達を単独でまたは複合体として改変する、請求項８に記載の方法、使用またはペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、前記樹状細胞の表現型を改変する、請求項８に記載の方法、使用またはペプチド。
【請求項１１】
過剰に刺激された樹状細胞が阻害され、あまり活性化されていないかもしくは抑制された樹状細胞が刺激され、平衡の取れた樹状細胞が機能の変化をまったく受けない、請求項８に記載の方法、使用またはペプチド。
【請求項１２】
Ｓｃｒペプチド（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８）および類似の線状構造または環状構造によって機能が正にまたは負に制御されたＲｂ９（配列番号１）が、ＭＩＦおよびＭＩＦ受容体を介して免疫調節として作用する、請求項８に記載の方法、使用またはペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫系調節特性を有するペプチドについて言及する。より具体的には、本開示は、ＮａＰｉ２Ｂ輸送体に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖相補性決定領域３に由来する免疫学的に活性のあるペプチドについて言及する。このようなペプチドは、癌の処置の下にある対象の免疫系の調節に有用であることが発見された。
【背景技術】
【０００２】
癌は、毎年数百万の人がそれに起因して死亡する、ヒトの主たる死因である。癌は再発性疾患であり、現に利用可能な癌処置のいくつかの副作用は、新生物細胞の成長を抑制することができる新たな薬剤についての研究を刺激している。
【０００３】
正常組織に由来する新生物細胞は、異常な成長を示し、新たに形成された血管によって栄養を供給される腫瘍集団を形成し、隣接組織を侵襲し、リンパ系および血液循環系を経て遠隔部位へと広がることができ（転移）、免疫抑制および死亡を誘導する。
【０００４】
ある特定の種類の新生物の成長を遅滞させまたは抑止する上での有益な効果のほかに、抗癌薬は、患者における免疫機能の損失を生じ得る。
【０００５】
腫瘍抗原を特異的に標的とするモノクローナル抗体は、その特異性および結果としての有効性がより良好であり、副作用がより少ないので、可能な癌処置ツールのうちの１つである。モノクローナル抗体の最も顕著な特性のうちの１つは、免疫応答を調節する該抗体の能力である。
【０００６】
免疫調節
免疫調節とは、免疫強化、免疫抑制または免疫寛容の誘導におけるような所望のレベルに対する免疫応答の調整である（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｉｃａｌ−ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．ｔｈｅｆｒｅｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）。以前、免疫調節抗菌ペプチド（ＡＭＰ）に対して非常に多くの注目が集められてきたように、免疫調節モノクローナル抗体に対して非常に多くの注目が集められてきた（Ｈａｎｅｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｃｏｃｋ，２０１３）。
【０００７】
しかしながら、ペプチド誘導性免疫調節は、シグナル伝達経路を活性化し、樹状細胞に関する成熟マーカーの発現を刺激しまたは調節し、抗原提示、サイトカイン産生およびリンパ球相互作用、究極的な免疫応答を規定することになる表現型を刺激しすることもできる。エフェクターＴ細胞または調節Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞および記憶Ｂ細胞は誘導されることができ、そのことは、免疫応答の抗感染有効性または抗腫瘍有効性を決定することになる。
【０００８】
ペプチドおよび他の薬剤による免疫調節の他の標的とは、マクロファージである。マクロファージは、Ｍ２マクロファージにあるような「治癒成長促進」からＭ１マクロファージにあるような「殺滅／抑制機能」までのマクロファージの代謝機能を修正するよう調節されることができ、または選択されることができる。Ｍ２マクロファージにおいて、アルギニン代謝はオルニチンおよびポリアミンへと移行される。Ｍ１マクロファージにおいて、アルギニン代謝はＮＯおよびシトルリンへと移行される。ＩＬ−２３ｌｏＩＬ−１０ｈｉＴＧＦ−ベータｈｉ表現型を特徴とするＭ２細胞は、Ｔｈ２応答の極性化、アレルギー、寄生虫クリアランス、炎症の減衰、組織再構築、血管新生、免疫調節、および腫瘍促進に関与する（Ｓｉｃａｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，２０１２）。逆に、Ｍ１マクロファージは、インビトロでＩＬ−１２ｈｉＩＬ−２３ｈｉＩＬ−１０ｌｏ表現型を特徴とし、毒性エフェクター分子（ＲＯＳおよびＮＯ）および炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ベータ、ＴＮＦ、ＩＬ−６）の効率的な産生因子であり、Ｔｈ１応答の極性化における誘導因子およびエフェクター細胞として関与し、細胞内寄生虫および腫瘍に対する抵抗性を仲介する（Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，２００５）。ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）は、黒色腫細胞によって異常に産生され、Ｍ２マクロファージの分化を優先的に刺激する。マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）内でのＭＩＦ−ＣＤ７４シグナル伝達における干渉は、免疫抑制因子を下方調節することができ、細胞毒性Ｔ細胞を活性化することができ、したがって、転移性黒色腫におけるように抗腫瘍免疫応答を復原することができる（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。
【０００９】
（現に焦点を絞っているような）Ｃ３６Ｌ１およびＲｂ９のようなペプチドは、ＭＩＦおよびＣＤ７４に結合し、このことは該ペプチドの活性を変更することができ、抗腫瘍効果を示すことができる。次に、免疫調節は、ＤＣおよびマクロファージを標的細胞として保証するペプチドの属性であり得る。
【００１０】
それゆえ、腫瘍抗原、受容体および免疫系の同時シグナル伝達分子を特異的に標的とするモノクローナル抗体とは別に、いくつかの源に由来する生物活性ペプチドが、微生物および真核細胞に対する種々の特異性および親和性を用いて研究されてきた。例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）内部配列に由来するペプチドは、インビトロおよびインビボでの異なる抗菌性、抗ウイルス性および抗腫瘍性の活性を提示することが示されてきた（Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３（６）：ｅ２３７１，２００８、Ｍａｇｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  ＭｅｄＣｈｅｍ．６（１８）：２３０５−２３，２００９）。
【００１１】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、免疫調節系生物活性を含む生物活性を提示するペプチド配列を有する最多数のドメインを保有しているとみられる。ＩｇＳＦタンパク質は、ヒトゲノム内での最大のファミリーであるヒト遺伝子の２％超を構成している（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｅｓｋｅ，２００５）。
【００１２】
Ｉｇ−ＣＤＲペプチド
抗原組み合わせ部位を提示する抗体のＣＤＲと同様に、ＩｇＳＦ（免疫グロブリンスーパーファミリー）受容体−リガンド相互作用の高い特異性は、ＣＤＲ様領域の内部配列および立体配座によって決定される。
【００１３】
ＩｇＳＦタンパク質間相互作用のペプチドアンタゴニストは、合成ペプチドとして検査されるとき、異なる受容体および系を標的とする抗菌性、抗ウイルス性および抗腫瘍性の活性を示す抗体ＣＤＲについても説明されてきたように、複数の動物モデルにおいて治療可能性を有する（Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｄｏｂｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｍａｇｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００１４】
マウスｍＡｂ抗血液群ＡのＶＨＣＤＲ３に由来する１つのペプチドであるＡＣ１００１−Ｈ３は、マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞におけるインビトロでのアポトーシス効果および自食効果（Ｒａｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）ならびに同系黒色腫モデルにおける抗転移性活性を示した。これは、免疫調節効果を発揮することが報告されている第１のＣＤＲペプチドでもあった（Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。このＶＨＣＤＲ３ペプチドは、マクロファージによって取り込まれ、炎症促進性サイトカイン、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路、およびＴＮＦアルファによって誘導されるＴＬＲ−４の発現上昇を刺激した。
【００１５】
インビボでの黒色腫細胞内と同様に、該ペプチドは、直接的な殺カンジダ性特性を有しない全身性カンジダ症に対する治療効果も発揮した。ＣＤＲペプチドの抗感染性活性または抗腫瘍活性は、３つの種類の応答、すなわち、ａ）インビトロおよびインビボの両方の抗感染性効果および／または抗腫瘍効果と、ｂ）インビボでの効果なしでのインビトロでの生物活性応答と、ｃ）同じ標的生体に対するインビボでの抗感染性効果および／または抗腫瘍効果、ならびにインビトロでの該効果の非存在とを含んでいた。インビボは、本明細書では最終的には生死にかかわる結果となる疾患を発症する動物宿主またはヒト宿主において成長する感染因または腫瘍細胞を意味する。
【００１６】
Ｉｇに由来する抗腫瘍活性を有するペプチドは、軽鎖および重鎖の両方に由来する超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する。免疫グロブリンＣＤＲ（Ｉｇ−ＣＤＲ）とは、重鎖ＣＤＲ３を除く、異なる抗体ファミリー間で共有される抗原認識配列である。このような配列は非常に多様であり、該配列の長さは１０ａａ〜２０ａａの範囲であり得る。
【００１７】
ヒト化ＲｅｂＭａｂ２００モノクローナル抗体の重鎖の相補性決定領域３に由来するペプチドは、例えば、米国特許第９，１９３，７９７号明細書に開示されている。ヒト化ＲｅｂＭａｂ２００モノクローナル抗体のＶＨＣＤＲ３に由来する配列に基づいた合成ペプチド（ｈｕＭＸ３５）（米国特許出願公開第２０１６／０００９８１６号明細書に開示）は、いくつかのヒト腫瘍細胞株のインビトロでの成長に影響し、同系モデルにおける黒色腫細胞のインビボでの転移性成長も抑制することが、米国特許第９，１９３，７９７号明細書に示された。ペプチドＲｂ９ならびにその類似体ＲＢ９−ＭＩＤおよびＲｂ１０は、抗腫瘍活性を有すると米国特許第９，１９３，７９７号明細書に説明されていた。ペプチドＲｂ９、Ｒｂ９−ＭＩＤおよびＲｂ１０は、リン酸ナトリウム輸送体ＮａＰｉ２ｂ中に存在するエピトープに対する親和性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＶＨＣＤＲ３に由来する（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、米国特許出願公開第２０１６／０００９８１６号明細書）。
【００１８】
このようなペプチドの生物活性は、ｍＡｂ特異性とは無関係であることが示されている（Ｇｉｒｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。実際、Ｒｂ９ペプチド（配列番号１）およびＲｂ１０（配列番号３）は、黒色腫細胞のような、ｍＡｂ  ＭＸ３５に対する親和性を有しないであろう腫瘍細胞に対してでさえ抗腫瘍活性を示し、このようなペプチドの活性は抗体特異性とは無関係であることを示した。Ｒｂ９による抗腫瘍保護は、イミキモドＴｏｌｌ−Ｒ結合剤に匹敵しており、ポリ−Ｉ：Ｃで同時刺激される。
【発明の概要】
【００１９】
しかしながら、抗腫瘍活性とは別に、Ｒｂ９および類似のペプチドは、担癌マウス脾細胞サイトカイン、ＤＣ同時刺激分子、リンパ節Ｔ−ＣＤ８＋細胞増殖およびＴＧＦ−ベータ阻害を免疫調節することが近年発見された。例えば、Ｒｂ９は、ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）の表面表現型およびリンパ刺激活性に影響する。Ｒｂ９およびＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来する他のペプチド、例えば、Ｒｂ９＿ＭＩＤ（配列番号２）およびＲｂ１０（配列番号３）は、例えば、癌患者のｍｏ−ＤＣの表現型を改変し、機能的偏りを修正し、Ｔ細胞免疫応答を誘導する能力を高めることも発見された。それゆえ、Ｒｂ９は、樹状細胞に関する明確な免疫調節活性を有し、該樹状細胞の機能的状態に応じて、阻害することができ（過剰刺激された細胞）、刺激することができ（あまり活性化されたり抑制されたりしていない細胞）、または（「平衡の取れた」細胞において）表現型および機能の変化をほとんど生じ得ない。Ｒｂ９は、免疫コンピテント動物において抗腫瘍特性を有するが、免疫不全動物においてはそうではないとすでに説明されており、インビボでの保護活性に対するコンピテント免疫反応の必要性を含意している。
【００２０】
ペプチドＲｂ９（配列番号１）は、ヘパリン構造および高占有率の数多くのＨ結合に基づく分子の硬性および安定性を高めるアルファヘリックスを形成する。ジスルフィド結合は、ＨＳＰ９０および接着Ｇ共役受容体のようなリガンドとの反応性に対して曝露される。その一方で、Ｒｂ１０ペプチド（配列番号３）は、アルファヘリックスを有しない開いた可撓性構造を有する（Ｇｉｒｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｒｂ１０（配列番号３）およびコアペプチドＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）は、該ペプチドの効率、親和性および標的結合特異性を考慮して、該ペプチドの免疫調節特性におけるＲｂ９のジスルフィド結合およびコア配列の重要性を示す。Ｒｂ９の免疫調節活性は、抗原提示細胞におけるＭＩＦおよびＣＤ７４との相互作用によっても発揮され、このことが受容体の発現を刺激し、かつＭＩＦのシグナル伝達を改変する。
【００２１】
先の点において、本開示は、治療法および／または予防法を必要とする対象に、有効量の免疫調節ペプチドを単独でまたは他の適切な化学療法薬もしくは免疫療法薬と組み合わされて投与することを含む、治療法および／または予防法について言及する。
【００２２】
別の実施形態において、本開示は、単独で、または癌療法および予防法における使用のための他の適切な化学療法薬もしくは免疫療法薬と組み合わされた免疫調節薬、あるいはこのような免疫調節ペプチドの単独での、または癌療法および予防法における使用のための組成物を調製するための他の適切な化学療法薬もしくは免疫療法薬と組み合わされた使用について言及する。
【００２３】
樹状細胞は、Ｒｂ９ペプチドによって誘導される免疫応答に関与することが発見されており、その理由は、Ｒｂ９の保護活性が樹状細胞の養子移動によって再現されることができ、ペプチドを用いてエクスビボで、腫瘍細胞負荷動物へと処理されることができたからである。それゆえ、担癌実験動物におけるペプチド接種部位が何であれ、ペプチドは、局所的なかつ動員された樹状細胞に到達し、腫瘍退行および宿主の長期生存をもたらす方法で該樹状細胞の活性を調節することが推測され得る。Ｒｂ９が、腫瘍（例えば、黒色腫）の転移性成長に対して保護する樹状細胞を刺激することも発見された。Ｒｂ９は、細胞シグナル伝達のために樹状細胞へ浸潤してその核へと移動する。
【００２４】
それゆえ、本開示は、Ｒｂ９の免疫応答依存性活性、およびヒト樹状細胞に及ぼすその免疫調節効果についても言及する。Ｒｂ９のこのような免疫調節効果は、免疫系を調節することを必要とする対象、例えば、癌処置の下にある対象の免疫系を調節するのに有用であることが発見された。
【００２５】
癌処置を改善するための新たな選択肢を展開する必要性を考慮すると、本開示は、免疫応答を調節するための方法における使用のためのペプチド、このようなペプチドを用いて免疫応答を調節するための方法、および対象の免疫応答、特に癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象の免疫応答を調節するための薬剤を調製するためのこのようなペプチドの使用についても言及する。
【００２６】
それゆえ、本開示は、対象における免疫系応答を調節する方法について言及し、免疫系応答を調節するこのような方法は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象において使用されることができる。
【００２７】
本開示は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象における免疫系応答を調節するのに有用であるペプチドについても言及する。
【００２８】
別の実施形態において、本開示は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象における免疫系応答を調節するための組成物を調製するためのペプチドの使用について言及する。
【００２９】
より具体的には、本開示は、ペプチドＲｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）および切断型Ｒｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）の免疫調節特性、ならびにスクランブル（Ｓｃｒ）環状構造（配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７）について言及し、これらは、強力な免疫調節薬として本明細書に開示される。先に明らかにされたように、ペプチドＲｂ９（配列番号１）およびその類似体は、腫瘍成長を抑制し、癌を処置するのに有用であることが現に既知である。それにもかかわらず、このようなペプチドの免疫調節特性はわかっていない。
【００３０】
特許請求される一般的な実施形態のうちの１つは、Ｒｂ９の免疫調節特性に、より具体的には、対象の樹状細胞をペプチドＲｂ９または本明細書にも説明するその類似体と接触させることによって、対象における免疫系応答を調節する方法に関する。いくつかの詳細な実施形態において、樹状細胞は、インビボで（体内で）または、それに代わるものとして、エクスビボで（体外で）免疫調節ペプチドと接触させられる。いくつかの詳細な実施形態において、対象は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある。
【００３１】
代替的な一般的な実施形態において、免疫調節ペプチドＲｂ９、または本明細書でも説明されるその類似体は、対象における免疫系応答を調節する方法において使用される。このような方法は、対象の樹状細胞を免疫調節ペプチドと接触させることを含む。いくつかの詳細な実施形態において、樹状細胞は、免疫調節ペプチドとインビボで、またはそれに代わるものとして、エクスビボで接触させられる。いくつかの詳細な実施形態において、対象は、癌に罹患しているかまたは癌の処置の下にある。
【００３２】
別の代替的な一般的な実施形態は、免疫調節ペプチドＲｂ９の使用であるか、または本明細書でも説明されるその類似体は、対象における免疫系応答を調節する方法における使用のための組成物を調製するためのものである。このような方法は、対象の樹状細胞を免疫調節ペプチドと接触させることを含む。すでに説明した一般的な実施形態のうちのいずれかに適用可能ないくつかの詳細な実施形態において、樹状細胞は、免疫調節ペプチドとインビボで（体内で）、またはそれに代わるものとしてエクスビボで（体外で）、免疫調節ペプチドと接触させられる。すでに説明した実施形態のうちのいずれか１つに適用可能な他の詳細な実施形態において、動物であり得る、またはより具体的にはヒトであり得る対象は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、ＮａＰｉ２Ｂ輸送体に対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖相補性決定領域３に由来する免疫学的に活性のあるペプチドに関する。
【００３４】
詳細には、本開示は、このような免疫学的に活性のあるペプチドの免疫応答依存性活性、およびヒト樹状細胞に及ぼす免疫調節効果に関する。
【００３５】
このような免疫学的に活性のあるペプチドは、合成ペプチドであってもよく、該合成ペプチドは、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化モノクローナルの重鎖相補性決定領域３の改変され伸長した配列に由来する。モノクローナル抗体の部分配列に対応する例示的な合成ペプチドは、例えば、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）であり得る。
【００３６】
一実施形態において、本開示は、対象の免疫系を調節するペプチドについて言及する。
【００３７】
別の実施形態において、本発明は、対象に、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）のような、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＣＤＲに由来する有効量の改変されたペプチドを投与することを含む、対象の免疫系を調節する方法について言及する。好ましくは、該方法は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象における免疫系応答を調節するのに適している。
【００３８】
詳細な実施形態において、このような方法は、対象に、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）のような、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＣＤＲに由来する有効量の改変されたペプチドを投与することを含む。あるいは、対象の細胞は、このようなペプチドとエクスビボで接触させられ、次いで、対象に投与される。このような方法は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象における免疫系応答を調節する。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）のような、ナトリウム依存性リン酸輸送体（ＮａＰｉ２Ｂ）に対するヒト化抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する改変されたペプチドの、対象の免疫系を調節するための使用について言及する。このような使用は、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＣＤＲに由来する有効量の改変されたペプチドを含む組成物を調製することを含む。例えば、ヒト化抗体の部分配列に対応する合成ペプチドは、例えば、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）であってもよい。
【００４０】
特に、このような使用は、対象に、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＣＤＲに由来する有効量の改変されたペプチド、例えば、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）を単純に投与することを含んでもよい。
【００４１】
あるいは、このような使用は、樹状細胞をエクスビボで、ナトリウム依存性リン酸輸送体（ＮａＰｉ２Ｂ）に対するヒト化抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する改変されたペプチドと接触させることを含んでもよい。
【００４２】
別の実施形態において、本開示は、樹状細胞を処理する方法について言及し、該方法は、樹状細胞を、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＶＨＣＤＲ３に由来し、次いで対象に投与されるペプチドと接触させることを含む。好ましくは、ペプチドは、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ９＿ＭＩＤ（配列番号２）およびＲｂ１０（配列番号３）から選択される。好ましくは、このような方法は、樹状細胞の表現型を改変し、それにより過剰刺激された樹状細胞が阻害され、あまり活性化されていないかまたは抑制された樹状細胞が刺激され、平衡の取れた樹状細胞が機能の変化をまったく受けない。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、対象の免疫系を調節するための、ナトリウム依存性リン酸輸送体（ＮａＰｉ２Ｂ）に対するヒト化抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する改変されたペプチドと接触させられた樹状細胞の使用について言及する。
【００４４】
好ましくは、上述の使用は、癌に罹患しているかまたは癌処置の下にある対象における免疫系応答を調節するのに適している。
【００４５】
上述の実施形態のうちのいずれかに適用可能な本発明の一態様において、樹状細胞を含んでいる試料は、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＣＤＲに由来するペプチドと接触させられ、次いで対象に投与される。例えば、ヒト化抗体の部分配列に対応する合成ペプチドは、例えば、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｒｂ１０（配列番号３）またはＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）であり得る。
【００４６】
別の実施形態において、本開示は、ＮａＰｉ２Ｂに対するヒト化抗体のＣＤＲに由来し、細胞シグナル伝達のＭＩＦおよびＭＩＦ／Ｃ７４軸を結合してその活性を改変する試薬として特異的に使用されるペプチドＲｂ９（配列番号１）について言及し、ＭＩＦおよびＭＩＦ／Ｃ７４軸は、腫瘍の成長を刺激し、血管新生、腫瘍細胞の病原力および転移能を高める。それゆえ、本開示は、スクランブル（Ｓｃｒ）環状構造（配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８）によって機能的に制御されるＲｂ９（配列番号１）が、ＭＩＦおよびＣＤ７４に結合し、個々のシグナル伝達を、単独でまたは複合体として、樹状細胞内で改変する方法についても言及する。あるいは、本開示は、スクランブル（Ｓｃｒ）環状構造（配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８）によって機能が正または負に制御されるＲｂ９（配列番号１）の、免疫系を調節するための組成物を調製するための使用について言及する。このような調節は、ＭＩＦおよびＣＤ７４に結合すること、ならびに個々のシグナル伝達を単独でまたは複合体として樹状細胞内で改変することによって生じる。
【００４７】
それゆえ、本開示は、概して、ＭＩＦおよびＭＩＦ受容体を介して免疫調節因子として作用し、Ｒｂ９（配列番号１）、Ｓｃｒペプチド対照（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８）および実験動物において抗癌特性を発揮する類似の線状構造または環状構造についても言及する。このようなものとして、対象の免疫系を調節するためのこのようなペプチドの方法および使用は、本明細書に特許請求される。
【００４８】
上述の方法、ペプチドおよび使用のうちのいずれかに適用可能な本発明の別の実施形態において、ペプチドは、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体のようなチェックポイント阻害薬のような他の適切な化学療法薬または免疫療法薬と組み合わせてもよい。
【００４９】
その上、ナトリウム依存性リン酸輸送体（ＮａＰｉ２Ｂ）に対するヒト化抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するペプチドは、任意に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共役させられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】転移性黒色腫モデルにおけるＲｂ９の抗腫瘍効果と、免疫不全マウスにおける抗腫瘍効果がないこととを示す。
【図２】５０〜２００μｇ範囲のＲｂ９の転移性黒色腫モデル腹腔内用量は、保護に有効であることを示す。図２は、ジスルフィド結合を保持する環状スクランブルペプチド（配列番号５、６、７、８）が対照として機能するように、およびＲｂ９抗腫瘍活性の特異性を査定するように設計されたことも示す。
【図３】Ｒｂ９とＰＥＧとの共役が転移性黒色腫モデルにおけるペプチド抗腫瘍活性を高めたことを示す。
【図４】皮下経路を用いたＲｂ９の抗腫瘍活性が同系の結腸直腸腫瘍モデルにおいてみられたことを示す。
【図５】皮下経路を用いたＲｂ９の抗腫瘍活性が同系の膵癌モデルにおいてみられたことを示す。
【図６】予防プロトコルにおけるＲｂ９によって刺激された樹状細胞が転移性黒色腫に対する保護を提供することを示す。インビトロでの線状Ａ１Ｃ陰性対照は、ＤＣ刺激因子として保護されていたが、Ｒｂ９ほどではなかった。治療プロトコルにおいて、Ｒｂ９により刺激されたＤＣを黒色腫細胞を用いた負荷後に８日間投与した。有意な保護は、刺激されていないＤＣまたはＲｂ１０Ａ１処理したＤＣと比較してみられ、肺結節数を転移性黒色腫の３つの実験由来のクラスターと比較することによって、７日間後および１２日間後の肺結節数が示されている。
【図７】転移性黒色腫に対して保護する先の予防プロトコルにおいて、Ｒｂ９が、ＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ数を低減し、有効なＴ−ＣＤ４＋およびＴ−ＣＤ８＋免疫応答を刺激したことを示す。
【図８】転移性黒色腫モデルにおいて、ｉ．ｄ．（皮内）経路が抗腫瘍保護のためのＲｂ９の投与において最も効率的であったことを示す。
【図９】ＦＩＴＣで標識したビオチン化Ｒｂ９が樹状細胞に浸透し、ＤＡＰＩと共局在する核へと移動することを示す。ファロイジンとの何らかの共局在もみられる。
【図１０】Ｒｂ９が転移性黒色腫モデルにおいてイミキモドと同じように保護していることを示す。Ｒｂ９は、免疫系をポリＩ：Ｃとともに同時刺激するようにみえる。
【図１１】担癌同系動物において、脾細胞における黒色腫抗原で刺激したＩＦＮ−ガンマと一緒のＲｂ９の投与はＩＬ−６を有意に低減し、ＴＮＦアルファおよびＩＬ−１０の発現において何ら効果を示さなかったことを示す。ＩＬ−１２のわずかな刺激がみられた。
【図１２】図１２と同じ系において、Ｒｂ９の投与はリンパ節におけるＴＧＦベータの発現を最も有意に阻害したことを示す。
【図１３】皮内を経て投与されたＲｂ９は、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞と反応する抗体の産生のための効率的なアジュバントとして作用したことを示す。
【図１４】Ｒｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）が、骨髄樹状細胞に及ぼす免疫効果を与えるＲｂ９のコア配列であることを示す。
【図１５】Ｒｂ９（だがＲｂ１０Ａ１またはＲｂ−ＭＩＤではない）のドットブロット法による組換えＭＩＦとの反応性を示す。
【図１６】Ｒｂ９（だがＲｂ１０Ａ１および４つの他のペプチドではない）のドットブロット法によるＣＤ７４との反応性を示す。別のＩｇ  ＣＤＲに由来するＣ３６Ｌ１は、等しく反応性であった。
【図１７】Ｒｂ９で６時間事前刺激し、次いで組換えＭＩＦで処理したマウス樹状細胞は、短時間のインキュベーションで、ｒＭＩＦ単独のレベルを上回ってＡｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）を高めたことを示す。
【図１８】Ｒｂ９で６時間事前刺激し、組換えＭＩＦで処理したマウス樹状細胞は、異なる時間のインキュベーションで、ＥＲＫ１／２リン酸化を低減したことを示す。
【図１９】Ｒｂ９で６時間事前刺激し、組換えＭＩＦで処理したマウス樹状細胞は、短時間のインキュベーションで、ＩＫＫαβおよびＩｋＢαを低下させたことを示す。
【図２０】Ｒｂ９で６時間事前刺激し、組換えＭＩＦで処理したマウス樹状細胞は、５、１０および２０分間のインキュベーションで、細胞内ＮＦｋＢ  ｐ６５リン酸化（Ｓｅｒ５３６）を低下させたことを示す。
【図２１】Ｒｂ９によって刺激したマウス樹状細胞は、可溶化した細胞ならびに単離された集団ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋のいずれにおいてもＣＤ７４の発現を高めたことを示す。
【図２２】インビトロで分化させたヒト単球に由来する樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）に添加したＲｂ９は、該樹状細胞の表面の表現型に影響を及ぼし、単独で添加したときまたはＴＮＦアルファのような生理学的刺激との組み合わせのときのいずれにおいても、成熟マーカーの分化および発現を亢進したことを示す。
【図２３】Ｒｂ９が、腫瘍可溶化液と一緒にヒトｍｏ−ＤＣへ添加したとき、同種異系リンパ球増殖を誘導するヒトｍｏ−ＤＣの能力を亢進したことを示す。
【図２４】Ｒｂ９が癌患者の単球に由来するｍｏ−ＤＣの表面の表現型にも影響するが、効果は異質であったことを示す。
【図２５】２つの群、すなわち、「正常な」ｍｏ−ＤＣの表現型および機能を有するものと、「欠損がある」表現型を有する第２のものに分けた癌患者の研究を示す（該群のリンパ刺激活性による）。Ｒｂ９は、「欠損がある」細胞の表現型に及ぼす、より明らかな効果を示した。
【図２６】同種異系Ｔ細胞増殖を誘導する癌患者ｍｏ−ＤＣの能力に及ぼすＲｂ９の効果が細胞の状態に応じて反対になり、欠損ｍｏ−ＤＣは刺激されており、非欠損細胞はＲｂ９によって阻害されたことを示す。
【図２７】Ｒｂ９の免疫調節活性を示す。Ｒｂ９を「免疫寛容原性」条件（ＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０）下で生じたｍｏ−ＤＣへ添加すると、Ｒｂ９はｍｏ−ＤＣの分化を高め、ｍｏ−ＤＣを軽度の刺激（ＴＮＦアルファ）によって刺激すると、Ｒｂ９は細胞の分化に有意には影響しなかったが、細胞をＬＰＳによって強く刺激すると、Ｒｂ９は阻害した。
【図２８】これもＲｂ９の免疫調節活性を示す。Ｒｂ９を「免疫寛容原性」条件（ＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０）下で生じたｍｏ−ＤＣへ添加すると、Ｒｂ９はｍｏ−ＤＣの成熟を高め、ｍｏ−ＤＣが軽度の刺激（ＴＮＦアルファ）を受けると、Ｒｂ９はｍｏ−ＤＣの成熟を亢進したが、細胞をＬＰＳによって強く刺激すると、Ｒｂ９は阻害した。
【図２９】これもＲｂ９の免疫調節活性を実証する。Ｒｂ９を「免疫寛容原性」条件（ＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０）下で生じたｍｏ−ＤＣへ添加すると、Ｒｂ９はｍｏ−ＤＣの同時刺激能を高め、ｍｏ−ＤＣが軽度の刺激（ＴＮＦアルファ）を受けると、Ｒｂ９は部分的に阻害したが、細胞をＬＰＳによって強く刺激すると、Ｒｂ９は明らかに阻害した。
【図３０】Ｒｂ９処理が、ＬＰＳで刺激されたヒトｍｏ−ＤＣによるＭＩＦ受容体ＣＤ７４およびＭＩＦ共受容体ＣＸＣＲ４の発現を高めることを示す。
【図３１】Ｒｂ９処理が、細胞をＲｂ９へ曝露したとき、抗ＣＤ４４  ｍＡｂによって標識した陽性細胞の頻度によって、およびＭＦＩによっての両方で査定される、ＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０処理したヒトｍｏ−ＤＣによるＭＩＦ共受容体ＣＤ４４の発現を低下させることを示す。
【図３２】ＬＰＳで刺激したヒトｍｏ−ＤＣのＲｂ９処理後のＣＤ７４低ＣＸＣＲ４低細胞分集団の消失を示す。
【実施例】
【００５１】
次の実施例は、本開示の範囲および特許請求の範囲を制限するよう企図するものではない。以下に報告される実験は、当業者が本発明の実施の最良の様式を理解できるために、本発明を十分に説明する目的で行った。
【００５２】
注記
短鎖天然ペプチドは、実験動物に注射されると、腎濾過および血漿ペプチダーゼによる分解によって血液循環から急速に除去される。ペプチド喪失を補償するために、インビボでの実験は通常、１００〜３００μｇ／個体の投与量を必要とし、該投与量は、健常動物においては細胞毒性がない。ペプチドクリアランスは、ポリエチレングリコールとの結合の際にペプチドの分子質量を高めることによって回避することもできる。本発明者らは、ＰＥＧ−Ｒｂ９が、転移性黒色腫モデルにおける抗腫瘍薬として遊離Ｒｂ９よりも効率的であることを観察した。
【００５３】
最も有効な応答を提供するペプチドの投与経路は、おそらく、Ｉｇ−ＣＤＲと相互作用してＩｇ−ＣＤＲによって刺激される免疫系の一次細胞である樹状細胞の量と一致する。Ｒｂ９投与の皮内経路はまた、化学発光ＥＬＩＳＡおよびＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞によって測定されるように抗黒色腫抗体の最大応答を促進した。エクスビボの系において、Ｒｂ９はエンドサイトーシスを受け、一次エンドソームはＦアクチンと部分的に相互作用し、ペプチドは核へ輸送され、核内でペプチドはＤＣ機能の免疫調節のためのシグナル伝達に関与することができる。
【００５４】
腫瘍が成長している動物において免疫調節を単球表現型と相関させるために、同系の転移性黒色腫のセットアップを、Ｒｂ９で、またはエクスビボでＲｂ９によって刺激され、黒色腫抗原（腫瘍細胞可溶化液由来）で予備刺激した樹状細胞で処置されたマウスを用いて使用した。腫瘍可溶化液の非存在下で、予備刺激は、腫瘍細胞可溶化、アプトネクローシス（ａｐｔｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、または何らかの他の交差予備刺激過程によってばらばらになった腫瘍抗原を用いてインビボで生じることができた。Ｒｂ９で刺激された樹状細胞を用いた予防プロトコルおよび治療プロトコルは、同系のモデルにおける転移性黒色腫に対して保護することに成功した。
【００５５】
黒色腫静脈内細胞負荷および腹腔内ペプチド投与（Ｒｂ９およびＲｂ１０Ａ１）は、腫瘍細胞可溶化液の存在下で脾細胞サイトカインの読み取りが高まることをもたらした。Ｒｂ９で高まったＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１２は、ＴＮＦおよびＩＬ−１０を変化させず、未処置の黒色腫負荷した対照動物と比較してＩＬ−６を低下させた。
【００５６】
また、マウス骨髄樹状細胞（ＤＣ）のＲｂ９免疫調節を、同時刺激マーカーに的を絞って検討した。ＣＤ１１ｃ＋  ＭＨＣ−ＩＩ＋を特徴とするＬＰＳで刺激したＤＣにおいて、主として５０μｇ／ｍｌのＲｂ９、およびＲｂ１０Ａ１は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を有意に刺激した。対照的に、Ｒｂ９およびＲｂ１０−Ａ１は、ＣＤ４０発現を調節した。
【００５７】
Ｒｂ９によってエクスビボで刺激された樹状細胞は、皮下養子移入後に転移性黒色腫に対して保護効果を発揮した。１４日後に、マウスにＢ１６Ｆ１０．Ｎｅｘ２黒色腫腫瘍細胞を静脈内接種し、２９日後に肺、脾臓ならびに頸部および腋窩リンパ節をＣＤ３＋細胞、ならびにＴ−ＣＤ４＋細胞およびＴ−ＣＤ８＋細胞の比率ついて検討した。肺を除き、Ｒｂ９およびＲｂ１０Ａ１によって刺激されたＤＣによる処置は、Ｔ−ＣＤ８＋細胞がＴ−ＣＤ４＋エフェクター細胞よりも大いに優勢である免疫応答を構築した。それゆえ、好ましいプロトコルを使用する際、Ｔ−ＣＤ８＋細胞免疫応答を誘起する、Ｒｂ９で刺激されたＤＣは、転移性黒色腫に対して保護する。
【００５８】
ＴＧＦベータは、未処置のＣＤ４＋細胞から制御性Ｔ細胞が分化するのに必須であるが、制御性Ｔ細胞は、癌の撲滅において重要な対抗するエフェクター細胞に関与する。本発明者らは、転移性黒色腫のセットアップにおいて、Ｒｂ９処置が、黒色腫可溶化液によって刺激された対照細胞と比較して、リンパ節ＣＤ１１ｃ＋細胞によって分泌されたＴＧＦベータを大いに低減した。
【００５９】
リンパ節におけるＴＧＦベータ分泌のＲｂ９阻害は、高い割合のＴ−ＣＤ８＋細胞を示すこの系において制御性Ｔ細胞が含まれていないことを示す。
【００６０】
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合するＤＣアゴニストであるポリＩ：Ｃは、マウス転移性黒色腫に対して極めて活発である。Ｒｂ９はこの効果に加わる。ＴＬＲ３は、マウス従来型ＤＣ（ＣＤ１１ｃ高Ｂ２２０−−）、ＣＤ４−−ＣＤ８ａ−−（＋／−−）およびＣＤ８＋（＋）において発現する（Ｓｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ｒｂ９およびそのコアペプチドＲｂ９−ＭＩＤ（配列番号２）の免疫調節効果を評価するために、これらのペプチドをプロトコル２によって取得した骨髄ＤＣとともにポリＩ：Ｃを含有してまたは含有することなく６０時間インキュベートした（材料および方法を参照されたい）。Ｒｂ９−ＭＩＤは、Ｒｂ９に非常に類似して、ポリＩ：ＣよりもＣＤ４０発現を刺激した。ＣＤ８０発現に及ぼす両ペプチドの効果は類似していた。Ｒｂ９はポリＩ：ＣよりもＣＤ８６を刺激したが、Ｒｂ９−ＭＩＤは刺激せず、Ｒｂ９−ＭＩＤは、ポリＩ：ＣおよびＲｂ９よりもＭＨＣＩＩの発現を有意に高めた。それゆえ、Ｒｂ９と骨髄ＤＣとのインビボまたはエクスビボでの反応性は、Ｒｂ９のインビトロ抗腫瘍直接活性との反応性と同様に、Ｎ末端システイン残基を必要としないようにみえる（Ｇｉｒｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｒｂ９−ＭＩＤを用いた結果は、アラニンに置き換えられて末端システインを有していないＲｂ１０Ａ１を用いた結果とも同様に、免疫調節特性に必要とされるペプチド構造を確立するのを助けることができる。４つのスクランブルペプチド（配列番号５、６、７、８）をＲｂ９対照として検査し、転移性黒色腫に対して陽性および陰性の活性を有するＳ−Ｓ含有環状ペプチドはそれゆえ、特にＭＩＦおよびＭＩＦ／ＣＤ７４軸に対して免疫調節対照として機能するのに適切であった。ＭＩＦは、サイトカイン、ケモカイン、血管形成因子および癌細胞の成長を刺激する腫瘍細胞のオートクリン産物である（Ｎｏｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＭＩＦによるシグナル伝達は、ＣＤ７４を必要とする（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＭＩＦは、ＩＬ−２産生を調節することによってＴｒｅｇを増加させ（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＣＴＬ応答を概して調節する（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。抗ＭＩＦ処置したマウスの腫瘍に由来するＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、ＩＦＮ−γの発現と一緒に増加した。すでに、ＭＩＦ−ＣＤ７４免疫抑制シグナル伝達に及ぼすＣ３６Ｌ１ペプチドの干渉は、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８によって報告されたように、黒色腫細胞に対して特異的ＣＴＬの活性化を高め、Ｔｒｅｇを減少させた。同じ系において、遊離ペプチドとしてまたはペプチドで刺激されたＤＣとして投与される、ＭＩＦおよびＣＤ７４の両方に結合するＲｂ９は、Ｔｒｅｇを減少させ、Ｔエフェクター細胞を増加させた。
【００６１】
マウスモデルにおいて取得されたこれらのデータは、データが示したように、インビボまたはエクスビボのいずれかで樹状細胞の抗腫瘍活性を亢進することによってＲｂ９ペプチドの作用を発揮したＲｂ９ペプチドについての有意な免疫調節活性を支持した。したがって、Ｒｂ９活性を、ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）について査定した。これらの細胞は、その不十分な量により、臨床プロトコルに適していないが、容易に取得可能な前駆体からインビトロで発生させることができるｍｏ−ＤＣによって置き換えられることができる天然のＤＣのための有効な代替物を表す（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ａｎｄ  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，１９９４）。このことは、免疫応答のトリガとしての樹状細胞の独特な特性（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｔｍｅｒ，１９７８）に基づいた新たな免疫治療戦略の設計を可能にした（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかしながら、時に臨床結果においても指摘されるこれらの細胞の能力にもかかわらず（Ｂａｒｂｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、樹状細胞を基にしたワクチンは、該ワクチンに起因する理論的な可能性になおも到達し損ねている（Ｂａｒｂｕｔｏ  ２０１３）。この見かけの失敗はおそらく、腫瘍内の樹状細胞（Ｂａｌｅｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）および癌患者における循環前駆体に由来する樹状細胞（Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）は機能的に偏っており、それゆえ、有効な抗腫瘍Ｔリンパ球を誘導することがしばしばできない。この文脈で、樹状細胞に関して腫瘍の存在によって与えられる偏りの修正は、癌における免疫治療アプローチの開発にとって非常に魅力的な経路であり、マウスモデルにおいて取得されたデータは、このことがＲｂ９活性の機序であり得ることを支持している。
【００６２】
実際、Ｒｂ９は、単独で、またはＴＮＦアルファのような樹状細胞の既知の活性化因子との組み合わせで使用されるときのいずれにおいても、成熟マーカーの発現上昇を誘導するｍｏ−ＤＣの表現型に影響を及ぼすことができた。さらに、Ｒｂ９は、腫瘍可溶化液で刺激した同種異系ＤＣによって誘導されるＴリンパ球の増殖応答を亢進することもできた。
【００６３】
しかしながら、面白いことに、Ｒｂ９を癌患者から取得したｍｏ−ＤＣに関して検査すると、成熟マーカーの発現を同様に亢進する能力を示すが、この効果は非常に異質であった。それにもかかわらず、患者から取得したｍｏ−ＤＣの表面および機能的表現型を考慮すると、明確なパターンを識別することができるようになった。すなわち、「正常な」表現型（健常対照から取得した細胞の表現型とは明確に区別できない）がＲｂ９によってほとんど影響されないが、「欠損型」表現型（そのリンパ刺激活性は健常ドナー細胞のリンパ刺激活性を下回った）を有する細胞をＲｂ９によって刺激したｍｏ−ＤＣである。実際、この二分は、さらにより顕著であり、その理由は、「正常な」ｍｏ−ＤＣのリンパ刺激活性が阻害されたのに対し、「欠損型の」ｍｏ−ＤＣのリンパ刺激活性は高まったからである。
【００６４】
これらの観察は、Ｒｂ９がＤＣの単純な活性化因子ではなく、実際、両方向におけるこれらの細胞に及ぼす機能の回復を誘導した分子であった。この仮説を検査するために、免疫応答誘導性ＤＣの発生または寛容誘導性ＤＣの発生をもたらす条件下でｍｏ−ＤＣを発生させた。応答誘導性ＤＣについて、２つの異なる刺激、すなわちＴＮＦアルファおよびＬＰＳを使用した。ＴＮＦは、細胞の「軽度の」活性化を誘導する刺激であり、したがって、恒常性により近い状況に似ているのに対し、ＬＰＳは、より強い刺激であり、明確により乱れた環境をシグナル伝達する。寛容誘導ＤＣについて、ＴＧＦベータおよびＩＬ−１０を使用した（Ｒｕｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｒｂ９をこれら３つの異なるｍｏ−ＤＣへ添加するとき、その免疫調節効果を確認した。Ｒｂ９はＴＮＦで刺激したｍｏ−ＤＣの表現型にほとんど影響しなかったのに対し、ＬＰＳで刺激したｍｏ−ＤＣによる成熟マーカーの発現の低下、およびＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０で刺激したｍｏ−ＤＣに及ぼす同じマーカーの増加を誘導した。
【００６５】
インビトロでのヒトｍｏ−ＤＣを用いた実験において取得したデータは、インビボおよびインビトロでの種々のマウスモデルにおいて取得されたデータと整合性がとれている。バルクにおいて、本データは、癌免疫療法について、および疾患の病原発生に不均衡な免疫応答が寄与する他の条件下でも探索されることができるＲｂ９の免疫調節作用を指摘している。
【００６６】
材料および方法
ペプチド
ペプチドは、マウスＭＸ３５ｍＡｂの特異性と一致し、ＮａＰｉ２Ｂ膜輸送体上に規定されたペプチドエピトープを認識するヒト化ＲｅｂＭａｂ２００由来の塩基性ＶＨＣＤＲ３（Ｈ３）配列の誘導体とした（Ｒｉｔｔｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  米国特許出願公開第２０１６／０００９８１６号明細書）。ＣＤＲ由来ペプチドをＣ末端アミノ酸でアミド化し、水または培地中で完全に可溶化し、システインを付加して酸化的条件下でジスルフィド結合を形成することによって線状または環状とした。Ｎ−ビオチン化ＡＧＧ−Ｒｂ９も使用した。
【００６７】
Ｐｅｐｔｉｄｅ  ２．０  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡは、ペプチドをすべて８５〜９５％純度で合成した。Ｃｙｓ−Ｃｙｓ環状立体配座（Ｒｂ９）におけるＶＨＣＤＲ３（Ｈ３）由来ペプチドは、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）によって、伸長した配列へシステインを付加した（Ｃｙｓ９２からＧｌｙ１０４へと定義）。この配列の２つの追加的なアミノ酸Ｇｌｎ１０５およびＧｌｙ１０６をスペーサーとして使用して、Ｈ３配列へ直接、新たな末端システインを連結するのを回避した。最終的なＲｂ９配列は、Ｃ−ＡＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−Ｃ−ＮＨ２とした。Ｒｂ１０は、末端システインを欠失している線状ペプチドである。Ｒｂ９の内部フラグメントも合成した（Ｒｂ９−ＭＩＤ）。Ｃ末端アミド形態における次のペプチド配列を試験した。
【表１】
2020525551.tif 000003
【００６８】
細胞株および培養条件
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２をＬｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＬＩＣＲ）サンパウロ支部から初めに取得した。亜系Ｎｅｘ２をＦｅｄｅｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ（ＵＮＩＦＥＳＰ）のＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔで単離し、Ｂａｎｃｏ  ｄｅ  Ｃｅｌｕｌａｓ  ｄｏ  Ｒｉｏ  ｄｅ  Ｊａｎｅｉｒｏ（ＢＣＲＪ）に登録番号０３４２で寄託した。細胞株をすべて、３７℃で湿潤雰囲気および５％ＣＯ２の下で、１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２４ｍＭ重炭酸ナトリウム、４０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、ｐＨ７．２および１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２は、Ｈ−２ｂ  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて同系であった。Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ  Ｄ．Ｍａｚｚｏｌｉｎｉ，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｂｕｅｎｏｓ  Ａｉｒｅｓ，Ａｒｇｅｎｔｉｎａは、追加的な同系腫瘍細胞、すなわちＨ−２ｂ  Ｃ５７ＢＬ６において同系のマウス膵癌Ｐａｎｃ０２細胞、およびＨ−２ｄ  Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて同系の大腸癌ＣＴ２６細胞を提供した。中等度の毒力のＣＴ２６腫瘍細胞の別の試料をＡＴＣＣから取得した（ＣＴ２６．ＷＴ細胞株）（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２６３８）。
【００６９】
動物および実験用黒色腫転移モデル
６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＦｅｄｅｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ（ＵＮＩＦＥＳＰ）のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ（ＣＥＤＥＭＥ）から取得した。インビボでの転移モデルのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、１００μＬ中の２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫生細胞の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。Ｒｂ９およびＲｂ１０の治療有効性を対照のアポトーシスペプチドＡ４Ｈ３（Ｄｏｂｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）と一緒に検査するために、ペプチドの腹腔内投与は、腫瘍細胞の翌日に開始し、１００μＬのＰＢＳ中の２５０〜３００μｇのペプチドの５〜６回投与を隔日で行った。対照群は、１００μＬのＰＢＳを受けた。２２日後、マウス（１群あたり最低ｎ＝３）の肺を収集し、肉眼で黒色腫結節数を計数した。Ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ、プロジェクト番号１２３４、２０１１は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓにより、動物を用いた実験をすべて承認した。皮下モデルのために、マウスに、１００μＬのＰＢＳ中に懸濁した５×１０５個の腫瘍細胞を皮下経路を介して右側腹に注射した。ペプチド（３００μｇ）を１０μＬの蒸留Ｈ２Ｏおよび９０μＬのＰＢＳ中に可溶化し、１個体あたりで腹腔内経路を介して注射した。ペプチドの投与を腫瘍の負荷の翌日に開始し、隔日で５回実施した。腫瘍の長径（Ｄ）および短径（ｄ）を、腫瘍の体積が３，０００ｍｍ３に到達するまで、２日間ごとに測定した。許容体積に到達したとき、動物を屠殺した。体積を式ｖ＝Ｄｄ２×０．５２を用いて計算した。
【００７０】
インビトロおよびインビボでの腫瘍細胞の成長
インビトロでの腫瘍細胞の成長、細胞毒性検査、生細胞の測定およびマウス転移モデルにおいてＢ１６Ｆ１０細胞を用いたインビボでの保護実験の詳細は、Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３（６）：ｅ２３７１，２００８）およびＤｏｂｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃ．，３：２０４−２１７，２０１０）において説明されている。
【００７１】
骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）発生プロトコル
ＢＭＤＣプロトコル１
ＤＣを６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ６マウスの骨髄から取得した。簡潔には、マウスの大腿および脛骨を取り出し、筋肉および腱を剥ぎ、両骨端を切断し、骨片を１ｍｌチップに置くことによって骨髄を抽出し、これを次に１５ｍｌチューブに挿入し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をＤＭＥＭ中に再懸濁し、細胞クラスターを反復ピペッティングによって解離させた。１０ｍｌのＲ１０培地（２ｍＭグルタミン、１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ＭＥＭビタミン溶液、１０％熱失活ウシ胎児血清およびＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、）およびＩＬ−４（４０ｎｇ／ｍｌ）、を補充したＤＭＥＭ培地）中で１００ｍｍ処理した組織培養ディッシュ内で全骨髄細胞を培養した。ＧＭ−ＣＳＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（４００ｎｇ／ｍｌ）を含有する新鮮培地（３ｍｌ）を３日間ごとに添加した。７日後に、ＰＢＳ２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて収集した接着細胞を非接着細胞と一緒にプールし、実験用の出発細胞源として使用した。
【００７２】
ＢＭＤＣプロトコル２
ＤＣを６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ６マウスの骨髄から取得した。簡潔には、マウス由来の大腿および脛骨を取り出し、筋肉および腱を剥がし、両骨端を切断し、２１ゲージ針および注射器を用いてＲＰＭＩ１６４０培地で骨髄を流出させた。細胞ストレイナを通過させることによって細胞クラスターを解離させ、０．４５Ｍの塩化アンモニウムを赤血球溶解のために添加した。細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、１ウェルあたり１０×１０６個の骨髄細胞を、４ｍｌの完全培地（２ｍＭグルタミン、１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン、１０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）含有５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％熱失活ウシ胎児血清）を含有する未処理の組織培養６ウェルプレート内で培養した。培地の半分を２日後に除去し、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに補充して３７℃で加温した新たな培地を添加した。培地を３日後に完全に廃棄し、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）含有の加温した新鮮培地に置き換えた。６日後、培養上清中の非接着細胞およびＰＢＳを用いた緩徐な洗浄によって収集された緩く接着していた細胞をプールし、実験用の出発細胞源として使用した。
【００７３】
ヒト単球由来の樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）のインビトロでの分化
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での遠心分離によって単離した。プラスチック６ウェルプレート内で２時間インキュベーション後、非接着細胞を培養物から除去し、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ−Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｍｅｘｉｃｏ）およびＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ−Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で接着細胞（単球）を７日間培養した。培養の５日後、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｍｅｘｉｃｏ）をｍｏ−ＤＣの成熟のために添加した。
【００７４】
フローサイトメトリー分析
マウス細胞分析のために、これらをＢＳＡ（０．５％）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含有する氷冷ＰＢＳ中で、適切な抗体−フルオロホア結合体を用いて染色した。多重パラメータ分析をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ分析装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。次の抗体、すなわち、抗ＭＨＣクラスＩＩ、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８ａ、抗ＣＤ３ｅ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０を使用し、獲得前に、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．５％／ＥＤＴＡ（２ｍＭ）中に再懸濁した。
【００７５】
ヒト細胞を類似の様式で分析したが、染色をＥＤＴＡ非含有のＢＳＡ−ＰＢＳ中で実施した。異なる蛍光色素および生／死標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）と結合した、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＣＲ７、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体を使用した。獲得は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ分析装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において実施し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｘ．１０．０７ｒ２（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
【００７６】
ＦｏｘＰ３＋ヒト細胞の頻度を、製造元のプロトコルにおいて説明されるとおり、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を用いて解析した。細胞内染色の前に、蛍光標識した抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および抗ＣＤ２５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を標識した。
【００７７】
培養上清中のサイトカインをＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。
【００７８】
腫瘍細胞可溶化液の調製
剥がしたＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞をＰＢＳで洗浄し、滅菌ＰＢＳ中に約１×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁し、５周期の凍結解凍（液体窒素／９０℃）によって可溶化した。処理後の細胞生死判別を、トリパンブルー除外染色を用いて評価した。実験プロトコルによって、可溶化液を異なる濃度で使用した。
【００７９】
ヒトリンパ球増殖アッセイ
Ｍｏ−ＤＣを同種異系リンパ球と共培養して（ＤＣ：Ｌｙ＝１：３０）、リンパ球増殖を誘導する該Ｍｏ−ＤＣの能力を査定した。これをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）希釈によって測定し、活性化をＣＤ４／ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３発現間の相関によって測定した（Ｃｌａｖｉｊｏ−Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【００８０】
実施例では基本的に、腫瘍細胞に対するＣ末端アミノ酸においてアミド化したモノクローナル抗体の配列を含有する合成ペプチドを用いた実験を報告する。わかることになるように、同系宿主における本発明のペプチドのインビボでの抗黒色腫効果は免疫系によるものであり、その理由は、ペプチドの保護が免疫欠損動物において検出されなかったからである。
【００８１】
マウス制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のフローサイトメトリー分析
樹状細胞をＲｂ９またはＲｂ９＋可溶化液、およびＡ１ＣまたはＡ１Ｃ＋可溶化液、および未処理によって刺激した予防プロトコルからの脾臓、リンパ節および肺を取り出し、液体で柔らかくした後、細胞ストレイナにおいて濾過した。肺を２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼとともに３７℃で４０分間インキュベートした後、液体で柔らかくした。細胞懸濁液を冷溶血緩衝液とともに１分間インキュベートした後、遠心分離した。ペレットをＲＰＭＩ培地で懸濁し、計数した。各群１×１０６個の細胞を加工し、Ｔｒｅｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）を用いて染色した。リンパ球を、抗ＣＤ４（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ２５（ＰＥ）および抗Ｆｏｘｐ３（ＡＰＣ）を用いて特徴づけた。試料を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。獲得したデータを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて解析した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋の割合を示す。
【００８２】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球のフローサイトメトリー分析
Ｒｂ９もしくはＲｂ９＋可溶化液またはＡ１ＣもしくはＡ１Ｃ＋可溶化液または未処理によって刺激した予防プロトコルによる肺を取り出し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼとともに３７℃で４０分間インキュベートした後、液体で柔らかくした。細胞懸濁液を冷溶血緩衝液とともに１分間インキュベートした後、遠心分離した。ペレットをＲＰＭＩ培地で懸濁し、計数した。各群１×１０６個の細胞を抗ＣＤ３（ＰＥ）および抗ＣＤ４（ＦＩＴＣ）または抗ＣＤ３（ＰＥ）および抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）で染色した。使用した抗体はすべて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡから購入した。試料を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。獲得したデータを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて解析した。ＣＤ３＋リンパ球中のＣＤ４＋またはＣＤ８＋の割合を示す。
【００８３】
骨髄樹状細胞中のＣＤ７４受容体のフローサイトメトリー分析
骨髄由来の樹状細胞（５×１０５）を５０μｇのＲｂ９とともに４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）または３０個のＤＣ：１個の腫瘍細胞の比率の腫瘍可溶化液（Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞）を用いてまたは用いずに２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を収集し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製の抗ＣＤ７４（ＢＶ７８６）で染色した。染色した細胞を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて獲得し、データ解析を、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて実施した。結果をＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋またはＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋集団におけるＣＤ７４＋細胞の割合として表す。
【００８４】
同系転移性黒色腫モデルおよびＲｂ９スクランブルペプチドアッセイ
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝５）にＦＢＳ非含有の０．１ｍＬのＲＰＭＩ培地中の１×１０５個の同系Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２生細胞を静脈内負荷し、各３００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）のＳｃｒ１、Ｓｃｒ２、Ｓｃｒ３もしくはＳｃｒ４のペプチドの腹腔内投与を翌日用いて、または対照ビヒクル（ＰＢＳ）を隔日用いて合計５回処置した。１４日後、マウスを安楽死させ、肺を収集し、転移性コロニー形成について評価した。転移性病変数を、立体顕微鏡（ニコン、東京）を用いて定量した。また、腫瘍面積／総面積の割合をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量した。
【００８５】
タンパク質抽出およびウェスタンブロット法
骨髄ＤＣを２４時間血清飢餓にし、２００μＭ濃度のＲｂ９で６時間前処理し（またはせず）、ＡＫＴ、ＥＲＫ１／２、ＩＫＫα／βおよびＩｋＢαのリン酸化の測定のために組換えマウスＭＩＦ（１μｇ／ｍＬ）で２、５、１０または２０分間刺激した。タンパク質可溶化液を電気泳動法によって分離し、イムノブロット法による分析を総ＡＫＴ、総ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）、総ＩＫＫα、総ＩｋＢα、総ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５、ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ホスホＩＫＫα／β（Ｓｅｒ１７６／１８０）、ホスホＩｋＢα（Ｓｅｒ３２）およびホスホＮＦｋＢ  ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）について実施した。ＧＡＰＤＨを負荷対照についてアッセイした。ＨＲＰ結合二次抗体を使用した後、ＥＣＬ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）とともにインキュベートした。一次抗体および二次抗体はすべて、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗ＣＤ７４受容体もアッセイした（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。リン酸化比を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。結果を、未処理対照レーンに対して正規化した任意単位で表す。リン酸化のシグナル強度比も、総レーンに対して正規化した任意単位で示す。
【００８６】
化学発光ドットブロット法
Ｒｂ９ペプチドと組換えマウスＣＤ７４または組換えマウスＭＩＦとの相互作用を、化学発光ドットブロット法によって測定した。各ペプチド、すなわち、Ｒｂ９、Ｒｂ１０Ａ１、Ｃ３６Ｌ１、ＷＴｚｎ、ＩＮＫＫＩ、Ｐ５または無関連ＣＤＲペプチド対照（ｉＣＤＲ）の２５ｎｍｏｌ量およびビヒクル（ｄＨ２Ｏ中の０．０２５％ＤＭＳＯ）をニトロセルロース膜上に固定し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％中の５％ＢＳＡでブロッキングし、２５ｎＭの組換えＣＤ７４（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ，ＵＫ）または組換えＭＩＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、一次マウス抗ＣＤ７４または抗ＭＩＦ（いずれもＡｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ製）とともにインキュベートし、洗浄し、二次抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰとともにインキュベートした。免疫反応性を、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて測定し、シグナルをトランスイルミネーターＵｖｉｔｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）において検出した。
【００８７】
同じアッセイを用いて、本発明者らは、ペプチドＲｂ９、Ｒｂ１０Ａ１、Ｒｂ９−ＭＩＤおよびビヒクル（ｄＨ２Ｏ中の１％ＤＭＳＯ）と何らかの改変をした組換えマウスＭＩＦとの相互作用を比較した。１００μｇのペプチドをニトロセルロース膜上に点在させ、ブロッキングし、５０ｎＭのｒＭＩＦ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）とともに４℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、一次マウス抗ＭＩＦ（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、二次抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。反応を上述のとおり検出した。グラフは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量したドット面積におけるＲＬＵを表す。
【００８８】
実施例１
２５０μｇの腹腔内用量のＲｂ９を免疫適格Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて、および免疫不全ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒ−ガンマゼロマウスを、腫瘍細胞負荷の１、３、５、７、９、１１日後に投与した。ＲＰＭＩ（１００μｌ）におけるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２腫瘍細胞（２×１０５個）を両動物群において尾静脈中に０日後に注射した。動物をペプチドの最後の投与の２２日後または１０日後に屠殺し、肺を暗色の黒色腫結節について検討した。免疫適格マウスにおいて、Ｒｂ９は、腫瘍細胞結節数を有意に低減して明らかに保護した。免疫不全動物において保護はみられず（図１）、インビボでのＲｂ９の保護活性は免疫応答によることを示した。先に測定したように（米国特許第９，１９３，７９７号明細書）、ＲｅｂＭａｂ２００のＶＨＣＤＲ３（Ｈ３）であるＲｂ９は、転移性黒色腫に対してインビボでの保護を示したが、このモノクローナル抗体の他の５つのＣＤＲはそうではなかった。
【００８９】
また、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫モデルを用いて、他のｍＡｂのＣＤＲを検査した。ｍＡｂ  Ｃ７Ｈ２（Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｍａｓｓａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）およびＣ３６Ｌ１（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）ＣＤＲペプチドは、転移性黒色腫に対して保護していたが、ＣＤＲペプチドの抗腫瘍細胞毒性は、インビトロで異なる標的および作用機序を包含していた。
【００９０】
転移性モデルにおけるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫に対する保護についてのＲｂ９の最良濃度は、１個体あたり２００〜３００μｇの用量範囲であり、その理由はおそらく、腎濾過およびタンパク質分解性分解によるようなインビボでのクリアランスのためである。しかしながら、転移性モデルにおいて、有意な保護は、５０〜１００μｇ腹腔内用量でも取得された（図２）。皮下成長黒色腫は、Ｒｂ９腹腔内投与に対して非常により抵抗性であった。
【００９１】
また、スクランブル（Ｓｃｒ）ペプチドを合成して対照として使用し、それらのうちのすべてにおけるジスルフィド構造を維持する配列の特異性を検討した。５つのＳｃｒ環状ペプチドのうち、Ｓｃｒ１のみがＲｂ９と類似の活性を示した。Ｓｃｒペプチド３は、転移性黒色腫を用いたインビボでの実験のための良好な陰性対照とみなされた。
【００９２】
転移性黒色腫処置におけるＲｂ９の有効性は、ＰＥＧ２０００を用いてさえ、ペプチドのペグ化によって改善された（図３）。Ｃ５７Ｂｌ６マウスにＦＢＳ非含有の０．１ｍｌのＲＰＭＩ中の４×１０５個の同系のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞を静脈内負荷した。腫瘍細胞を負荷した動物を、１５０および３００μｇのＲｂ９または分子量３９１０．５のＰＥＧ２０００に結合した同じペプチドモル濃度用量の５回腹腔内投与で翌日処置した。
【００９３】
以前示したように（米国特許第９，１９３，７９７Ｂ２号）、観察された効果について使用したＲｂ９用量に関して、ＲＢ９を７日間連続で注射したマウス（腹腔内を介した３００μｇ）は、肝臓、肺、心臓、腎臓および脾臓において毒性または組織学的変化の徴候は何ら示さなかった。また、ペプチドは、溶血性ではなかった。
【００９４】
実施例２
腹腔内での３００μｇのＲｂ９は、同系のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて中等度の毒性のＣＴ２６大腸癌細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２６３８）の皮下成長を遅延させた。ペプチドの投与を腫瘍負荷の翌日に開始して連続５日間行った。また、Ｒｂ１０は皮下でも遅延させた。高い毒性のＣＴ２６細胞（アルゼンチン細胞株）は、Ｈ−２ｄ同系動物の生存時間を長期化した（図４）。ペプチドの投与を腫瘍負荷の翌日に開始して隔日で５日間実施した。
【００９５】
検査する別の同系の腫瘍細胞株は、膵癌Ｐａｎｃ０２とした。また、３００μｇ腹腔内のＲｂ９は、皮下腫瘍成長を有意に遅延させた。ペプチドの投与は、１日後（腫瘍負荷の１日後）に開始し、隔日で合計５回用量を付与した。未処置の対象とは異なり、Ｒｂ９処置した同系の動物においては４０日後まで死亡は記録されなかった（図５）。ＣＴ２６およびＰａｎｃ０２皮下腫瘍は、腹腔内投与されたＲｂ９によって阻害されたのに対し、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫は抵抗性であったことは注目に値する。Ｒｂ９によって活性化された免疫細胞の異なる易罹患性は、異なる皮下腫瘍に及ぼすこれらの効果を説明することが示唆される。
【００９６】
同系動物において腹腔内投与および皮下投与されたＲｂ９による有意な抗腫瘍保護を示すこれらの結果は、免疫系によるインビボでのＲｂ９の作用機序の問題を浮かび上がらせる。実際、インビトロで黒色腫細胞に及ぼす直接的なＲｂ９およびＲｂ１０の活性（Ｇｉｒｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）は、腫瘍細胞受容体を必要とし、３つの同系の腫瘍に対して観察されるインビボでの保護効果とは異なる。
【００９７】
実施例３
同系の腫瘍に対するインビボでのＲｂ９およびＲｂ１０の保護効果は、免疫系の刺激に起因した。それゆえ、ペプチドによってエクスビボで刺激された同系の樹状細胞（ＤＣ）を用いた予防処置を検査して、この点を立証した。プロトコル１（材料および方法）にあるように取得した、６ウェル培養プレートの１つのウェルあたり５×１０５個の密度の骨髄ＤＣを５０μｇ／ｍｌのＲｂ９（配列番号１Ｄ）またはＲｂ１０Ａ１（配列番号４Ｄ）単独でまたはそれに続くＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２（５×１０４）細胞可溶化液による処理とともに２４時間インキュベートした。ＤＣを同系のマウスにおいて皮下接種した。１４日後、マウスに黒色腫腫瘍細胞（５×１０５個）を静脈内接種し、２９日後に、肺黒色腫結節を計数した。
【００９８】
顕著な保護効果は、腫瘍細胞可溶化液ありまたはなしでＲｂ９によって刺激されたＤＣを用いて観察された（図６Ａ）。インビトロでの実験において陰性対照として使用される、Ｎ末端Ｃｙｓをアラニンによって置き換えたＲｂ１０Ａ１（Ａ１Ｃ）も、転移性モデルにおける黒色腫に対して保護したが、Ｒｂ９よりも有効性は低かった。Ｒｂ９によって刺激され、腫瘍抗原（可溶化液）を用いて予備刺激されたＤＣの保護効果は、このことが免疫系のペプチドＲｂ９刺激のインビボでの機序において優勢であることを強く示唆する。腹腔内、皮下、皮内投与されたペプチドは、活性化されまたは免疫調節されて特異的な種類の免疫応答をもたらすことができる樹状細胞とすぐに相互作用することになる。活性化されたＤＣ、予備刺激された腫瘍抗原は、リンパ節へ移動して特異的な免疫応答を誘導することになる。
【００９９】
また、５０μｇ／ｍｌのＲｂ９またはＲｂ１０Ａ１（Ａ１Ｃ）単独を用いてエクスビボで刺激された同系の樹状細胞（ＤＣ）を用いた治療処置を図６Ｂに示す。黒色腫腫瘍細胞負荷の８日後、ＤＣを同系のマウスにおいて皮下接種した。本アッセイでは、インビボでの腫瘍細胞溶解に由来する過剰な腫瘍抗原、および免疫寛容原性応答を回避するために、ＤＣを呼び刺激するためにＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞可溶化液を使用しなかった。図６Ｃの治療実験との比較のために、３つの独立した実験から７日間後および１２日間後に皮下注射され形成された黒色腫細胞の肺結節を合わせて、コロニー形成クラスターを表した。
【０１００】
予防プロトコルにおいて、Ｒｂ９で刺激されたＤＣの保護効果は、部分的にＴｒｅｇを低減させ、Ｔ−ＣＤ４＋およびＴ−ＣＤ８＋エフェクター細胞を増加させることが原因となることができた（図７）。
【０１０１】
腹腔内、皮内および静脈内ペプチド投与を比較した実験において、皮内（またはマウスにおける皮下）は、黒色腫転移性モデルにおいて最良の結果を与えた（図８）。
【０１０２】
実施例４
Ｒｂ９を、機能的保護応答をエクスビボでもたらすＤＣに組み込む。また、このような組み込みを共焦点顕微鏡を用いて観察した。Ｒｂ９のビオチン誘導体であるビオチン−ＡＧＧ−Ｒｂ９をＤＣとともに次のとおりインキュベートした（プロトコル1、材料および方法）。Ｒ１０培地（１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ、ＭＥＭ非必須アミノ酸１００Ｘ、グルタミン２００ｍＭ，、ＭＥＭビタミン溶液１００Ｘ、β−メルカプトエタノール０．０５Ｍ、１０．０００Ｕペニシリン、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ、ＧＭＣＳＦ２０ｎｇ／ｍＬおよび２０ｎｇ／ｍｌを補充したＤＭＥＭ）中で７日間分化した骨髄ＤＣを遠心分離し、新鮮なＲ１０培地中に懸濁した。細胞を２４ウェル培養プレート内のスライドガラス上に２５，０００個／６０μＬの密度で分配した。新鮮なＲ１０培地（３００μｌ）を接着細胞１ウェルあたりに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次に、細胞を、０．５ｍＭのビオチン化Ｒｂ９とともに、１、３、８および２４時間インキュベートした。陰性対照は、細胞を有しており、ペプチドを有していなかった。培地を除去し、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ホルムアルデヒド中で固定し、洗浄し、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ１００で透過処理した。細胞をファロイジン−ローダミン１０００Ｘ、抗ビオチン−ＦＩＴＣ２５０Ｘ、ＤＡＰＩ１００Ｘで１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、スライドガラスを調製し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いて被覆した。この細胞を共焦点顕微鏡において検討した。
【０１０３】
ビオチン化Ｒｂ９は、おそらくエンドソームによってＤＣに浸透し、Ｆアクチンと相互作用した。次に、このペプチドは、ＤＡＰＩ／ＦＩＴＣとの共焦点がみられる核に移動した（図９）。ファロイジンとの共焦点もみられたが、広範囲ではなかった。Ｒｂ９がＤＣの核へ移動する傾向があるという事実は、Ｒｂ９がシグナル伝達仲介因子として作用することができることを示唆する。
【０１０４】
実施例５
Ｒｂ９および十分に確立されたＴｏｌｌ−Ｒアゴニストの保護効果の機能的比較を、転移性黒色腫モデルを用いて行った。マウスに、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁した５×１０５個のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞を静脈内注射した。腫瘍細胞負荷の翌日、３００μｇ／１００μｌのＲｂ９を５日間連続で腹腔内注射した。５０μｇ／１００μｌのイミキモドを隔日３日間腹腔内注射し、ＣｐＧ  ＯＤＮ１５８５を隔日２日間腹腔内注射し、ポリ（Ｉ：Ｃ）を隔日２日間腹腔内注射した。１５日間の腫瘍負荷の後、動物を屠殺し、肺を取り出し、肺結節を計数した。Ｒｂ９およびイミキモドの抗腫瘍活性は同じであったが、相加的ではなかった。ＣＰＧは保護しなかったが、ポリＩ；Ｃは単独でまたはＲｂ９との組み合わせで強く活性があった（図１０）。
【０１０５】
実施例６
転移性腫瘍成長の条件下でのサイトカイン産生およびＲｂ９投与を同系の動物の脾細胞において検討した。
【０１０６】
マウスに静脈内経路を介して５×１０５個のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞を負荷した。動物を３群、すなわち、対照（ペプチド投与なし）、Ｒｂ９およびＲｂ１０Ａ１（インビトロでの実験からの陰性対照ペプチド）に分けた。１０μｌの蒸留Ｈ２Ｏおよび９０μｌのＰＢＳ中に可溶化した３００μｇのペプチドを１個体あたり腹腔内経路を介して、腫瘍細胞負荷の翌日に開始する５日間連続で注射した。腫瘍負荷の１７日間後にマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。溶血緩衝液中でのインキュベーション後の脾細胞をＲ１０培地中に懸濁し、６ウェルプレートに１０６個／ウェルで播種した。細胞を腫瘍細胞可溶化液（１０５個のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞由来）とともにまたはそれなしで３つ組で７２時間インキュベートした。上清を回収し、サイトカインをＥＬＩＳＡによって測定した（図１１）。
【０１０７】
ＩＬ−１２を除き、ほとんどの場合、脾細胞サイトカインの読み取りは、腫瘍細胞可溶化液の存在下でのみ有意であった。刺激は、ＩＬ−１２産生の場合に必要ではなく、このことは、３つの群において同等であった。Ｒｂ９は、未処置の対象と関連してＩＦＮ−ガンマを増加し、ＩＬ−６を減少させ、ＴＮＦアルファおよびＩＬ−１０の産生には何ら効果を示さなかった。概して、Ｒｂ１０Ａ１は、脾細胞においてサイトカインの産生を下方調節した。
【０１０８】
腫瘍可溶化液によって刺激されるこれらの細胞において、黒色腫成長およびＲｂ９投与は、抗腫瘍表現型に寄与し得るＴｈ−１応答に助力した。
【０１０９】
実施例７
Ｒｂ９は、ある特定のサイトカインを発現するよう脾細胞を免疫調節し、Ｒｂ９はまた、同時刺激分子を発現するよう樹状細胞を刺激し、肺転移性黒色腫に局所性のリンパ節内でＴ−ＣＤ８＋細胞の増殖を強く誘導した。転移性黒色腫セットアップにおけるリンパ様器官由来の、Ｒｂ９で刺激したＤＣによるＴＧＦベータ産生にアプローチするために、５×１０５個のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞をＣ５７Ｂｌ６同系マウスに静脈内注射し、Ｒｂ９およびＲｂ１０Ａ１の腹腔内処理（３００μｇ／回）を腫瘍細胞負荷の翌日に開始する５日間連続中に投与した。動物を１７日後に屠殺し、肺、頸部リンパ節および腋窩リンパ節、ならびに脾臓を検討のために加工した。リンパ節および脾臓を個別に液体で柔らかくし、ＤＭＥＭを添加し、細胞ストレイナを通過させた。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、マウスＣＤ１１ｃ＋ビーズおよび磁気選別を用いて単離した。細胞をＲ１０培地中に懸濁し、１０６個／ウェルで９５ウェルプレート内に播種した。細胞を腫瘍可溶化液とともにまたはそれなしで２４時間インキュベートした（Ｂ１６Ｆ１０刺激）。上清をＴＧＦベータ１ＥＬＩＳＡ検査において使用した。
【０１１０】
Ｒｂ９処理は、腫瘍可溶化液で刺激した、脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋細胞内のＴＧＦベータを増加させたのに対し、Ｒｂ１０Ａ１処置は、この応答を顕著に抑制した。対照的に、Ｒｂ９は、黒色腫可溶化液によって刺激されたビヒクル（ＰＢＳ）対照細胞との比較で、リンパ節ＣＤ１１ｃ＋細胞によって分泌されたＴＧＦベータを大いに低減した（図１２）。Ｒｂ１０Ａ１は、ＴＧＦベータ産生を完全に抑制した。
【０１１１】
Ｔエフェクター細胞およびＴｒｅｇはいずれも、リンパ節内で活性化されると増殖し、ＴＧＦベータ産生のＲｂ９抑制は、Ｔｒｅｇが、高い割合のＴ−ＣＤ８＋細胞を示すこの系において誘導されないことを示す。
【０１１２】
実施例８
Ｒｂ９は、同系の黒色腫モデルを用いて抗腫瘍特性を示してきた。Ｒｂ９のインビボでの保護活性は、Ｔ−ＣＤ８＋の多い免疫応答の能動的な誘導因子となるＤＣのペプチド刺激を受けやすかった。また、抗腫瘍抗体を産生するＢ細胞のＲｂ９の活性化は、転移性黒色腫セットアップにおいて研究されてきた。
【０１１３】
転移性黒色腫を発症し、腹腔内または皮内投与されるＲｂ９を用いて処置された動物由来の血清を回収し、１ウェルあたり２．５×１０４個の密度で９６ウェルプレート上に播種したＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞に対して検査した。先に滴定したように、良好な応答は、１／５希釈した血清で達成された。これらの条件下で、ＢＳＡありまたはなしでの黒色腫細胞は、Ｒｂ９で処置された転移性黒色腫担持同系マウスにおいて産生された抗体と反応した。ＢＳＡ処理したまたは未処理の腫瘍細胞をいずれも用いて、Ｒｂ９を皮内注射した動物由来の血清は、Ｒｂ９を腹腔内投与されるよりも４〜５倍最良にＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞と反応した。明らかに、皮内経路を介したＲｂ９は、転移性黒色腫に対する保護を高めることができる抗黒色腫抗体を誘導するＢ細胞の応答を刺激した（図１３）。
【０１１４】
実施例９
Ｒｂ９（配列番号１）のコア配列は、Ｒｂ９−ＭＩＤ配列［ＲＡＴＦＡＹＷＧ］（配列番号２）であるように見える。実際、ＣＤ１１ｃ＋において、プロトコル２によって取得されたＭＨＣＩＩ＋骨髄ＤＣであるＲｂ９−ＭＩＤを、ポリＩ：Ｃ（図１４中のポリ）ありまたはなしでの数個のマーカーの免疫調節におけるＲｂ９と比較した。
【０１１５】
ＤＣを１００μｇ／ｍｌのＲｂ９、１００μｇ／ｍｌのＲｂ９−Ｍ、１２，５μｇ／ｍｌのポリＩ：ＣおよびポリＩＣ＋Ｒｂ９またはＲｂ９−ＭＩＤで６０時間処理した。ＤＣを遠心分離し、ＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞（１０６個）を４５μｌの緩衝液および５μｌの抗体／フルオロホア、ＣＤ１１ｃＡＰＣ、ＭＨＣＩＩＰＥ、ＣＤ８０ＦＩＴＣ、ＣＤ８６ＶｉｏＢｌｕｅおよびＣＤ４０ＰＥ中で再懸濁した。ＦａｃｓＤｉｖａソフトウェアを用いてＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにおいて試料を獲得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いることによってデータを解析した。
【０１１６】
Ｒｂ９−ＭＩＤは、ＲＢ９に非常に類似したポリＩ：ＣよりもＣＤ４０を刺激した。ＣＤ８０の発現に及ぼす両ペプチドの効果は同様であった。Ｒｂ９は、ポリＩ：ＣよりもＣＤ８６を刺激したが、Ｒｂ９−ＭＩＤはそうではなく、Ｒｂ９−ＭＩＤは、ポリＩ：ＣおよびＲｂ９よりもＭＨＣＩＩの発現を有意に上昇させた。Ｒｂ９−ＭＩＤが有効な免疫調節効果のための異なる誘導体を与えることができることは起こり得る（図１４）。
【０１１７】
実施例１０
ペプチドは、マクロファージおよび樹状細胞に主として及ぼすＭＩＦおよびＭＩＦ／ＣＤ７４軸との相互作用による抗腫瘍応答を免疫調節することができる。ドットブロット法ならびに組換えＭＩＦおよびＣＤ７４を用いることによって、Ｒｂ９（Ｒｂ９−ＭＩＤおよびＲｂ１０Ａ１ではない）はｒＭＩＦに結合し（図１５）、認識されたＭＩＦの受容体であるＣＤ７４へさらにより強力に結合する（図１６）ことが示された。ＣＤ７４およびＭＩＦに結合するＲｂ９は、別のＣＤＲペプチド（Ｃ３６Ｌ１）のものと非常に類似しており、ＭＩＦ／ＣＤ７４軸を経たＭＩＦシグナル伝達に干渉する（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。
【０１１８】
実施例１１
実施例１１において示される結合データに基づいたＭＩＦ／ＣＤ７４軸に及ぼすＲｂ９の役割を規定することを目的とした実験を説明する。樹状細胞をＲｂ９とともに６時間、次にｒＭＩＦと２、５、１０および２０分間プレインキュベートした。ＭＩＦとの初期のインキュベーションは、ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）を増加させた。リン酸化は、ＭＩＦを、Ｒｂ９でプレインキュベートしたＤＣへ添加したときさらにより高まった。この相加効果は、Ｒｂ９がＭＩＦ誘導性Ａｋｔリン酸化を遮断せず、逆に該効果を高めることを示す（図１７）。Ａｋｔリン酸化の初期のピーク（２分）は、経時的に維持されておらず、活性のあるＡｋｔシグナル伝達経路を示唆している。また、ＭＩＦは、ＤＣ内でのｐ−ＥＲＫ１／２形成を惹起した。この場合、Ｒｂ９とのプレインキュベーションは、ｐ−ＥＲＫ１／２を低減し、このことは、ＭＩＦシグナル伝達の陰性調節として、翻訳することができた（図１８）。ＩＫＫαβおよびＩｋＢαおよびＮＦ−κＢのリン酸化に及ぼすＲｂ９の効果（図２０）は、特に後者において、ＭＩＦ応答を減衰させる傾向があった。
【０１１９】
実施例１２
ＭＩＦは、マクロファージおよび樹状細胞内でＣＤ７４を腫瘍受容体として使用する。それにもかかわらず、ＭＩＦ単独は、ＣＤ７４の発現を高めなかったが、Ｒｂ９へ添加すると高めた。Ｒｂ９は、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋細胞のいずれにおいても、ＣＤ７４の発現上昇を促進した（図２１）。
【０１２０】
実施例１３
Ｒｂ９は、マウスＤＣに及ぼす免疫調節活性を示した。本実験において、ヒトＭｏ−ＤＣ膜表現型に及ぼすＲｂ９活性を研究した。健常ドナーから取得したＭｏ−ＤＣを５日後にＲｂ９（５０μｇ／ｍＬ）で処理し、培養物中でさらに２日後、細胞を収穫し、膜表現型の分析のために使用し、該分析は、Ｒｂ９が、未成熟ｍｏ−ＤＣに及ぼす活性化マーカーの発現を亢進することを示した（図２２Ａ）。また、５日後、Ｒｂ９（５０μｇ／ｍＬ）およびＴＮＦアルファ（５０ｎｇ／ｍＬ）のいずれも未成熟ｍｏ−ＤＣに添加し、２日後、細胞を等しく収穫し分析した。この分析は、成熟刺激の存在下においても、Ｒｂ９がｍｏ−ＤＣの表面表現型に影響し、細胞の表面上での成熟マーカーの発現をさらに亢進することを示した（図２２Ｂ）。
【０１２１】
実施例１４
Ｒｂ９はヒトｍｏ−ＤＣ表現型に影響したので、本発明者らは、細胞のリンパ刺激能に及ぼすＲｂ９の効果を分析した。５日後に実施例１４において説明するとおり取得されたｍｏ−ＤＣをＴＮＦアルファ単独（ｍＤＣ）、ＴＮＦアルファおよび腫瘍可溶化液（ｍＤＣ＋Ｔｕ可溶化液）またはＴＮＦ、腫瘍可溶化液およびＲｂ９（すべて先に説明した濃度）のいずれかで刺激し、収穫し、１：３０のｍｏ−ＤＣ：リンパ球比率でＣＦＳＥ標識した同系異種リンパ球と共培養した。共培養における２日後、リンパ球におけるＣＦＳＥの希釈をリンパ球増殖の測定結果として査定した。Ｒｂ９は、腫瘍可溶化液によって既に刺激されたｍｏ−ＤＣのリンパ刺激能をさらに亢進することができた（図２３）。
【０１２２】
実施例１５
Ｒｂ９は、ヒトｍｏ−ＤＣを改変する能力を有しており、分化および成熟の表面マーカーの発現の上昇を誘導し、それらのリンパ刺激能を亢進する。したがって、Ｒｂ９効果を癌患者の単球から取得したｍｏ−ＤＣにおいて分析した。これらの細胞を先に説明したとおり取得し、再びＲｂ９は、その表面表現型に影響した（図２４Ａ）。しかしながら、ｍｏ−ＤＣの表面表現型に及ぼすＲｂ９の効果は、刺激活性を示唆するものの、ペプチドＲｂ１０の表面表現型とは対照的に、異種性であった（図２４Ｂおよび図２４Ｃ）。
【０１２３】
癌患者由来のｍｏ−ＤＣが機能的に偏る可能性があるが、必ずしもそうではないことは周知であるので、患者を同種異系Ｔ細胞増殖を誘導するｍｏ−ＤＣの能力により、２群に分けた。ｍｏ−ＤＣがフィトヘマグルチニンＡ（ＰＨＡ）誘導性応答の３５％未満を誘導した患者は、１つの群（「欠損型」）およびもう１つ（「正常型」）であるＰＨＡ応答の３５％よりも高い応答をｍｏ−ＤＣが誘導した患者を構成した。このように分けたとき、分化（図２５Ａ）または成熟（図２５Ｂ）をいずれも考慮すると、Ｒｂ９は「欠損型」のｍｏ−ＤＣから細胞の表現型に明らかに影響したが、「正常型」のｍｏ−ＤＣに及ぼす効果はほとんどなかったことを留意することは可能であった。
【０１２４】
さらに、Ｒｂ９におけるこの変動は、Ｒｂ９処理したｍｏ−ＤＣの機能を同種異系Ｔ細胞増殖を誘導する能力によって分析したとき、さらにより顕著であった。この設定において、Ｒｂ９は、対称的な効果を示し、「欠損型」のｍｏ−ＤＣを亢進したが、Ｒｂ９は、「正常型」ｍｏ−ＤＣのリンパ刺激活性を抑制した（図２６）。
【０１２５】
実施例１６
Ｒｂ９は、免疫刺激活性よりもむしろ免疫調節活性を有するようにみえる。この特性をさらに査定し確認するために、ｍｏ−ＤＣをＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下ですべて、３つの異なる条件下で健常ドナー細胞から作製した。５日後の１群の細胞に、ＴＧＦベータ（１０ｕｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１０（１ｕｇ／ｍＬ）を添加し、５日後の第２の群に、ＴＮＦアルファを添加し、第３の群にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）を６日後に添加した。第１の条件は、細胞の免疫寛容原性活性と一致するｍｏ−ＤＣの表現型の変化を誘導することが既知であるのに対し、他の条件はいずれも成熟ｍｏ−ＤＣを生じ、ＬＰＳは、ＴＮＦアルファよりも強い成熟刺激を表す。各群に、Ｒｂ９を５日後に添加しまたは添加しなかった。７日後に細胞をすべて収穫し、フローサイトメトリーによって分析した。分化マーカー（ＣＤ１１ｃおよびＨＬＡ−ＤＲ）を分析すると、各群における細胞の表現型は、期待されているものに対応していたが、各群の細胞をＲｂ９で刺激すると、ペプチドの効果はそれとは乖離した。Ｒｂ９は、ＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０群において期待されているｍｏ−ＤＣの表現型（ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）を有する細胞の割合を上昇させたのに対し、ＴＮＦ群に対してはほとんど効果がなく、ＬＰＳ処理した細胞においてこの表現型を有する細胞数を減少させた（図２７）。
【０１２６】
Ｒｂ９の類似の対比効果は、成熟型のＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ８３＋細胞（図２８）を測定したとき、および同時刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して二重陽性の細胞（図２９）を分析したときに認められた。
【０１２７】
実施例１７
Ｒｂ９処理は、ＬＰＳで刺激したヒトｍｏ−ＤＣによって、ＭＩＦ受容体ＣＤ７４（ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体によって査定される５６．８％から８７．５％へ）およびＭＩＦ共受容体ＣＸＣＲ４（ＰＥ−Ｃｙ５標識モノクローナル抗体によって査定される１６．７％から２８．２％へ）の発現を高める（図３０）。ＣＤ４４発現をＢＶ−４２１標識モノクローナル抗体によって査定し、図における陰性対照は、未標識の細胞を指す。
【０１２８】
Ｒｂ９処理は、ＢＶ−４２１標識抗ＣＤ４４  ｍＡｂによって、より明らかには、細胞をＲｂ９へ曝露したときの強度の２０％低減が認められたＭＦＩによって標識した５７％から５２％への陽性細胞の頻度によっていずれも査定される、ＴＧＦベータ＋ＩＬ−１０処理したヒトｍｏ−ＤＣによるＭＩＦ共受容体ＣＤ４４の発現を低下させる（図３１）。図における陰性対照は、未標識細胞を指す。
【０１２９】
実施例１８
ＣＤ７４低ＣＸＣＲ４低細胞部分集団の消失が、図３０に示される同じ細胞のｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）によって検出されるような、ＬＰＳで刺激したヒトｍｏ−ＤＣのＲｂ９処理および細胞内のこれらのマーカーの分布における全体的な変化の後で示されている（図３２）。分析に含まれるパラメータは、ＨＬＡ−ＤＲ（ＢＶ−５１０標識ｍＡｂ）、ＰＤ−Ｌ１（ＰＥ標識ｍＡｂ）、ＣＤ４４（ＢＶ−４２１標識ｍＡｂ）、ＣＤ７４（ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ）およびＣＸＣＲ４（ＰＥ−Ｃｙ５標識ｍＡｂ）の発現とした。
参考文献：
Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｐｏｎｔｏｎ，Ｊ．，Ｅｌｇｕｅｚａｂａｌ，Ｎ．，Ｍｏｒａｇｕｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｃａｓｏｌｉ，Ｃ．，Ｐｉｌｏｔｔｉ，Ｅ．，Ｒｏｎｚｉ，Ｐ．，Ｄｏｂｒｏｆｆ，ＡＳ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，ＥＧ．，Ｊｕｌｉａｎｏ，ＭＡ．，Ｍａｆｆｅｉ，ＤＬ．，Ｍａｇｌｉａｎｉ，Ｗ．，Ｃｏｎｔｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｒａｖａｓｓｏｓ，ＬＲ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）  ｃａｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２００８）；３，ｅ２３７１．
Ｍａｇｌｉａｎｉ  Ｗ，Ｃｏｎｔｉ  Ｓ，Ｃｕｎｈａ  ＲＬ，Ｔｒａｖａｓｓｏｓ  ＬＲ，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｃｒｙｐｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）；１６（１８）：２３０５−２３．
Ｍｏｒｅａ，Ｖ．，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．，Ｒｕｓｔｉｃｉ，Ｍ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）；２７５，２６９−９４．
Ｇｉｒｏｌａ  Ｎ，Ｍａｔｓｕｏ  ＡＬ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＣＲ，Ｍａｓｓａｏｋａ  ＭＨ，Ｆａｒｉａｓ  ＣＦ，Ａｒｒｕｄａ  ＤＣ，Ａｚｅｖｅｄｏ  ＲＡ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  ＨＰ，Ｒｅｓｅｎｄｅ−Ｌａｒａ  ＰＴ，Ｃｕｎｈａ  ＲＬ，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌ，Ｔｒａｖａｓｓｏｓ  ＬＲ．Ｔｈｅ  Ｉｇ  ＶＨ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ３−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｒｂ９  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｓｐ９０  ａｎｄ  ａｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２０１６）；８５：１−１５．
Ｙｉｎ  ＢＷ，Ｋｉｙａｍｏｖａ  Ｒ，Ｃｈｕａ  Ｒ，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ  ＯＬ，Ｇｏｕｔ  Ｉ，Ｇｒｙｓｈｋｏｖａ  Ｖ，Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｎ，Ｓｏｕｃｈｅｌｎｙｔｓｋｙｉ  Ｓ，Ｈｅｌｌｍａｎ  Ｕ，Ｆｉｌｏｎｅｎｋｏ  Ｖ，Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ  ＡＡ，Ｏｄｕｎｓｉ  Ｋ，Ｌｌｏｙｄ  ＫＯ，Ｏｌｄ  ＬＪ，Ｒｉｔｔｅｒ  Ｇ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＭＸ３５  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＮａＰｉ２ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｕｌｏｇｙ（２００８）；８，３．
Ａｒｒｕｄａ  ＤＣ，Ｓａｎｔｏｓ  ＬＣ，Ｍｅｌｏ  ＦＭ，Ｐｅｒｅｉｒａ  ＦＶ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＣＲ，Ｍａｔｓｕｏ  ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．ｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ２  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃ７  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２）；２８７：１４９１２−１４９２２．
Ｍａｓｓａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ；ｉｎ  Ｍ．Ｇｉｅｓｅ（ｅｄ）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ  １．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｗｉｅｎ，２０１３；ｐ３９７−４１２
Ｈａｎｅｙ  ＥＦ  ，Ｈａｎｃｏｃｋ  ＲＥＷ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．（２０１３）；１００（６）：５７２−５８３．
Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ｍ，Ｒｏｅｓｋｅ  ＲＷ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ＩｇＳＦ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）；６（２），１８５−１９６．
Ｍａｇｌｉａｎｉ  Ｗ，Ｃｏｎｔｉ  Ｓ，Ｇｉｏｖａｔｉ  Ｌ，Ｚａｎｅｌｌｏ  ＰＰ，Ｓｐｅｒｉｎｄｅ  Ｍ，Ｃｉｏｃｉｏｌａ  Ｔ，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２）；３，１９０
Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＣＲ，Ｍａｔｓｕｏ  ＡＬ，Ａｚｅｖｅｄｏ  ＲＡ，Ｍａｓｓａｏｋａ  ＭＨ，Ｇｉｒｏｌａ  Ｎ，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌ，Ｔｒａｖａｓｓｏｓ  ＬＲ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｃ３６Ｌ１  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１５）；５，１４３１０．
Ｄｏｂｒｏｆｆ  ＡＳ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ＥＧ，Ｊｕｌｉａｎｏ  ＭＡ，Ｆｒｉａｃａ  ＤＭ，Ｎａｋａｙａｓｕ  ＥＳ，Ａｌｍｅｉｄａ  ＩＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｎｅｗ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１０）；３，２０４−２１７．
Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ  Ｅ，Ｐｅｒｉｃｏｌｉｎｉ  Ｅ，Ｃｅｎｃｉ  Ｅ，Ｏｒｔｅｌｌｉ  Ｆ，Ｍａｇｌｉａｎｉ  Ｗ，Ｃｉｏｃｉｏｌａ  Ｔ，Ｂｉｓｔｏｎｉ  Ｆ，Ｃｏｎｔｉ  Ｓ，Ｖｅｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ  Ａ，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）：ａ  ｂｒｉｄｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２００９）；４，ｅ８１８７
Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ  Ｅ，Ｐｅｒｉｃｏｌｉｎｉ，Ｅ．，Ｃｅｎｃｉ，Ｅ．，Ｏｒｔｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｍａｇｌｉａｎｉ，Ｗ．，Ｃｉｏｃｉｏｌａ，Ｔ．，Ｂｉｓｔｏｎｉ，Ｆ．，Ｃｏｎｔｉ，Ｓ．，Ｖｅｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ，Ａ．，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ，Ｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃａｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｃｔｉｎ−１  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）；７，ｅ４３９７２．
Ｓｅｙａ  Ｔ，Ｓｈｉｍｅ  Ｈ，Ｔａｋｅｄａ  Ｙ，Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｍ．Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ−−ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ａｎｄ  ３  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  ｓａｆｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）；１０６（１２），１６５９−１６６８．
Ｓｉｃａ  Ａ，Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  Ａ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｖｅｒｉｔａｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１２）；１２２：７８７−７９５．
Ｇｏｒｄｏｎ  Ｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＰＲ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）；５，９５３−９６４
Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｗｉｔｍｅｒ，Ｍ．Ｄ．（１９７８）．Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉｘｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７５（１０），５１３２−５１３６．
Ｉｎａｂａ，Ｋ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐａｃｋ，Ｍ．Ｗ．，Ａｙａ，Ｈ．，Ｉｎａｂａ，Ｍ．，Ｓｕｄｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌｏｏｄ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７５（５），１１５７−１１６７．
Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ａｎｄ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９４）；１７９（４），１１０９−１１１８．
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ｔｅｒａｂｅ，Ｍ．，Ｏｈ，Ｓ．，Ｂｅｌｙａｋｏｖ，Ｉ．Ｍ．，Ａｈｌｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｊａｎｉｋ，Ｊ．Ｅ．，＆  Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｎ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２００４）；１１３（１１），１５１５−１５２５．
Ｂａｒｂｕｔｏ，Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ｅｎｓｉｎａ，Ｌ．Ｆ．Ｃ．，Ｎｅｖｅｓ，Ａ．Ｒ．，Ｂｅｒｇａｍｉ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｌｅｉｔｅ，Ｋ．Ｒ．Ｍ．，Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，（２００４）；５３（１２），１１１１−１１１８．
Ｂａｒｂｕｔｏ，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａｒｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆａｉｌｕｒｅｓ？  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３）；５（２），１０５−１０７．
Ｂａｌｅｅｉｒｏ，Ｒ．Ｂ．，Ａｎｓｅｌｍｏ，Ｌ．Ｂ．，Ｓｏａｒｅｓ，Ｆ．Ａ．，Ｐｉｎｔｏ，Ｃ．Ａ．Ｌ．，Ｒａｍｏｓ，Ｏ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２００８）；５７（９），１３３５−１３４５．
Ｒａｍｏｓ，Ｒ．Ｎ．，Ｃｈｉｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｓａｎｔｏｓ，Ｄｏｓ，Ａ．Ｐ．Ｓ．Ａ．，Ｂｅｒｇａｍｉ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｌａｇｉｎｈａ，Ｆ．，Ｂａｒｂｕｔｏ，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｂｉａｓｅｄ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２）；９２（３），６７３−６８２．
Ｒｕｔｅｌｌａ，Ｓ．，Ｄａｎｅｓｅ，Ｓ．，＆  Ｌｅｏｎｅ，Ｇ．Ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｂｌｏｏｄ（２００６）；１０８（５），１４３５−１４４０．
Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＣＲ，Ａｚｅｖｅｄｏ  ＲＡ，Ｍｏｕｓｄｅｌｌ  Ｓ，Ｒｅｓｅｎｄｅ−Ｌａｒａ  ＰＴ，Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌ，Ｓａｎｔｏｓ  Ａ，Ｇｉｒｏｌａ  Ｎ，Ｃｕｎｈａ  ＲＬＯＲ，Ｓｃｈｍｉｄ  ＭＣ，Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌ，Ｔｒａｖａｓｓｏｓ  ＬＲ  ａｎｄ  Ｍｉｅｌｇｏ  Ａ．Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＭＩＦ−ＣＤ７４  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｏｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１８）；９：１１３２．
Ｃｈｏｉ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＨＲ，Ｌｅｎｇ  Ｌ，Ｋａｎｇ  Ｉ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＷＬ，Ｃｈｏ  ＣＳ，Ｂｕｃａｌａ  Ｒ，Ｋｉｍ  ＷＵ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｌｏｇｙ（２０１２）；１８９：３９０５−３９１３．
Ａｂｅ  Ｒ，Ｐｅｎｇ  Ｔ，Ｓａｉｌｏｒｓ  Ｊ，Ｂｕｃａｌａ  Ｒ，Ｍｅｔｚ  ＣＮ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１；１６６：７４７−７５３
Ｎｏｂｒｅ  ＣＣ，ｄｅ  Ａｒａｕｊｏ  ＪＭ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＴＡ，Ｃｏｂｕｃｃｉ  ＲＮ，Ｌａｎｚａ  ＤＣ，Ａｎｄｒａｄｅ  ＶＳ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＪＶ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ）：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｔｈｏｌｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７）；２３：２３５−２４４．
Ｌｅｎｇ  Ｌ，Ｍｅｔｚ  ＣＮ，Ｆａｎｇ  Ｙ，Ｘｕ  Ｊ，Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  Ｓ，Ｂａｕｇｈ  Ｊ，Ｄｅｌｏｈｅｒｙ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＲＡ，Ｂｕｃａｌａ  Ｒ．ＭＩＦ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＣＤ７４．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）；１９７：１４６７−１４７６．
【図１】
2020525551.tif 000004
【図２】
2020525551.tif 000005
【図３】
2020525551.tif 000006
【図４】
2020525551.tif 000007
【図５】
2020525551.tif 000008
【図６】
2020525551.tif 000009
【図７】
2020525551.tif 000010
【図８】
2020525551.tif 000011
【図９】
2020525551.tif 000012
【図１０】
2020525551.tif 000013
【図１１】
2020525551.tif 000014
【図１２】
2020525551.tif 000015
【図１３】
2020525551.tif 000016
【図１４】
2020525551.tif 000017
【図１５】
2020525551.tif 000018
【図１６】
2020525551.tif 000019
【図１７】
2020525551.tif 000020
【図１８】
2020525551.tif 000021
【図１９】
2020525551.tif 000022
【図２０】
2020525551.tif 000023
【図２１】
2020525551.tif 000024
【図２２】
2020525551.tif 000025
【図２３】
2020525551.tif 000026
【図２４】
2020525551.tif 000027
【図２５】
2020525551.tif 000028
【図２６】
2020525551.tif 000029
【図２７】
2020525551.tif 000030
【図２８】
2020525551.tif 000031
【図２９】
2020525551.tif 000032
【図３０】
2020525551.tif 000033
【図３１】
2020525551.tif 000034
【図３２】
2020525551.tif 000035
【配列表】
2020525551000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２８】
2020525551.tif 000036
【国際調査報告】
2020525551.tif 000037
2020525551.tif 000038
2020525551.tif 000039