(57)【要約】  抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質のアミノ酸配列ＲＫＧＤＶＳＬ（配列番号９）および／またはＥＫＦＮＬＫＬ（配列番号１０）を含むペプチドに結合することができる。抗体は免疫細胞活性を調節することができる。抗体またはその結合フラグメントは、肺癌、肝臓癌、食道癌および固形腫瘍などの細胞表面ＴＩＭ−３を発現することが報告されている癌の診断、予後、および治療に有用である。
2020509995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＭ−３においてＲＫＧＤＶＳＬ（配列番号９）の配列を有する領域およびＥＫＦＮＬＫＬ（配列番号１０）の配列を有する領域に位置するエピトープに結合することができる、
抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはその結合フラグメントの解離定数（Ｋｄ）が１０ｎＭ以下である、
請求項１に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体またはその結合フラグメントがＴＩＭ−３を介してヒト免疫細胞活性を調節することができる、
請求項１に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはその結合フラグメントが以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列：ＨＣＤＲＩ（配列番号３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４）、ＨＣＤＲ３（配列番号５）を有する重鎖可変ドメイン、および／または以下のＣＤＲ配列：ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ＬＣＤＲ２（配列番号７）、およびＬＣＤＲ３（配列番号８）を有する軽鎖可変ドメインを含む、
請求項１に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項５】
前記重鎖が配列番号１の配列を含む、
請求項４に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項６】
前記軽鎖が配列番号２の配列を含む、
請求項４に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項７】
前記重鎖が配列番号１の配列を含み、前記軽鎖が配列番号２の配列を含む、
請求項４に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体またはその結合フラグメントがＴ細胞を誘導し、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを含むサイトカインを分泌することができる、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、
請求項８に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメントを含む、
癌の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項１１】
前記癌が肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌または前立腺癌である、
請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌を診断するための方法であって、
試験対象からのサンプルと、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメントとを反応させて、抗体またはその結合フラグメントとサンプル中のＴ細胞との間の結合の程度を決定することを含み、参照値よりも高い結合の程度が癌性状態を示す、
癌を診断するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体の産生方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答は、癌の予防に重要な役割を果たす。したがって、Ｔ細胞の疲弊は、宿主の腫瘍増殖と関連している可能性がある。Ｔ細胞の疲弊は、多くのメカニズムから生じる可能性がある。プログラム細胞死分子（ＰＤ−１）は、疲弊したＴ細胞のマーカーである。ＰＤ−１とそのリガンド（ＰＤ−１リガンド、またはＰＤ１Ｌ）との相互作用の遮断は、Ｔ細胞機能を部分的に回復させることができる。
【０００３】
ＰＤ−１に加えて、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ−３）の発現は、固形腫瘍を有するマウスのＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球で見られた。ＴＩＭ−３はもともと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１特異的Ｉ型膜タンパク質であることが見出された。免疫チェックポイントであるＴＩＭ−３は、マクロファージ活性化を調節し、Ｔｈ１免疫および耐性誘導において重要な役割を果たしている。
【０００４】
ＴＩＭ−３を発現する腫瘍浸潤リンパ球はすべて、ＰＤ−１を発現することも見出されている。これらのＴＩＭ−３およびＰＤ−１発現リンパ球は、腫瘍に浸潤するＴ細胞の主要な画分を占める。さらに、これらのＴＩＭ−３およびＰＤ−１発現リンパ球はまた、最も重度の疲弊表現型を示し：それらは増殖することができず、そしてまたＩＬ−２、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γを産生することもできない。（Ｓａｋｕｉｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０１０年、２０７（１０）：２１８７−２１９４）。
【非特許文献１】Ｓａｋｕｉｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０１０年、２０７（１０）：２１８７−２１９４
【０００５】
さらに最近では、ＴＩＭ−３はまた、Ｔｈ１７細胞、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞および特定の自然免疫細胞など他の細胞の制御にも役割を果たすことが見出された。
【０００６】
ＴＩＭ−３経路は、自己免疫疾患、慢性ウイルス感染症、および癌の病因に関与しているので、ＴＩＭ−３シグナル伝達経路を阻害またはブロックすることができる薬剤を見出す必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の実施形態は、ＴＩＭ−３と特異的に結合し、それによってＴＩＭ−３の機能を阻害することができる抗体に関する。ＴＩＭ−３シグナル伝達経路は、Ｔ細胞の疲弊と関連していることが見出されている。したがって、本発明の抗体は、自己免疫疾患および癌などのＴ細胞の疲弊に関連する疾患または状態を予防または治療するために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ）２）に関する。本発明の一実施形態に従って、抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメントは、ＴＩＭ−３中の配列ＲＫＧＤＶＳＬ（配列番号９）および／またはＥＫＦＮＬＫＬ（配列番号１０）からなるエピトープに結合することができる。抗体またはその結合フラグメントの解離定数（Ｋｄ）は、１０ｎＭ以下であってもよい。抗体またはその結合フラグメントは、ＴＩＭ−３を介してヒト免疫細胞活性を調節することができる。
【０００９】
本発明の実施形態に従って、抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメントは、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列：ＨＣＤＲＩ（配列番号３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４）、ＨＣＤＲ３（配列番号５）を有する重鎖可変ドメイン、および／または以下のＣＤＲ配列：ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ＬＣＤＲ２（配列番号７）、およびＬＣＤＲ３（配列番号８）を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。
【００１０】
本発明の実施形態に従って、抗ヒトＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）抗体、またはその結合フラグメントは、配列番号１の配列を有する重鎖および／または配列番号２の配列を有する軽鎖を含み得る。
【００１１】
本発明の実施形態に従って、抗体、またはその結合フラグメントは、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを含むサイトカインを分泌するようにＴ細胞を誘導することができる。本発明のいくつかの実施形態に従って、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。
【００１２】
本発明の実施形態に従って、本発明の抗体またはその結合フラグメントは、細胞表面ＴＩＭ−３を発現する癌の診断、予後、および治療に有用である。これらの癌は、例えば、肺癌、肝臓癌、食道癌、および固形腫瘍を含み得る。
【００１３】
本発明の他の態様および利点は、以下の説明および添付の請求項から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、モノクローナル抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）配列は、太字および下線の配列として示されている。フレームワーク配列は、ＣＤＲ配列の間に隣接して分散している。
【００１５】
【図２】図２は、種々の抗ヒトＴＩＭ−３抗体の結合活性を示す。これらの結果は、マウス抗体８Ｃ１１および他のＴＩＭ−３結合抗体についての結合データを要約する。
【００１６】
【図３Ａ】図３Ａは、ＦＡＣＳアッセイにおいて、モノクローナル抗体８Ｃ１１がそれぞれヒトＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞に結合することを示す。これらの結果は、８Ｃ１１がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に結合できることを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＦＡＣＳアッセイにおいて、モノクローナル抗体８Ｃ１１がそれぞれヒトＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞に結合することを示す。これらの結果は、８Ｃ１１がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に結合できることを示す。
【００１７】
【図４Ａ】図４Ａは、ガレクチン−９トランスフェクションの前に、ヒトＴＩＭ−３−ｈＦｃ組換えタンパク質（Ｔｉｍ３デコイ受容体）がＦ２９３細胞に結合できないことを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦＡＣＳアッセイにおいて、ヒトＴＩＭ−３−ｈＦｃ組換えタンパク質が、ガレクチン−９でトランスフェクトされたＦ２９３細胞に結合できることを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１が、ＴＩＭ−３  ｈＦｃとガレクチン−９との結合をブロック（競合）できることを示す。
【００１８】
【図５】図５は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１が、ガレクチン−９のヒトＣＤ４  Ｔ細胞への結合をブロックし、それによってアポトーシスを減少させることができることを示す。
【００１９】
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１がヒトＣＤ４＋Ｔ細胞死を誘導しないことを示す
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１がヒトＣＤ４＋Ｔ細胞死を誘導しないことを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１がヒトＣＤ８＋Ｔ細胞死を誘導しないことを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１がヒトＣＤ８＋Ｔ細胞死を誘導しないことを示す。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａは、抗ヒトＴＩＭ−３抗体の非存在下または存在下で、ペプチドフラグメントの水素および重水素交換速度を測定するＨＤＸ−ＭＳ研究からの結果を示す。ヒトＴＩＭ−３の細胞外ドメインのペプチドフラグメントを、抗体の存在下または非存在下でＨＤＸに供した。次いで、重水素交換の程度について、ＨＤＸペプチドをＭＳで分析した。これらの結果は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体が、ＴＩＭ−３中の２つのペプチド領域に優先的に結合することを示し、エピトープがこれら２つの領域に位置することを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗ヒトＴＩＭ−３抗体の非存在下または存在下で、ペプチドフラグメントの水素および重水素交換速度を測定するＨＤＸ−ＭＳ研究からの結果を示す。ヒトＴＩＭ−３の細胞外ドメインのペプチドフラグメントを、抗体の存在下または非存在下でＨＤＸに供した。次いで、重水素交換の程度について、ＨＤＸペプチドをＭＳで分析した。これらの結果は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体が、ＴＩＭ−３中の２つのペプチド領域に優先的に結合することを示し、エピトープがこれら２つの領域に位置することを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｍＡｂ  ８Ｃ１１との結合に対するＴＩＭ−３  ｍＡｂ結合エピトープ領域における部位特異的変異誘発の効果の分析結果を示す。
【００２１】
【図８Ａ】図８Ａは、抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１がヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を増強することを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１がヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α分泌を増強することを示す。
【００２２】
【図９】図９は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１の治療的応用を示す。動物モデルを用いることにより、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、メラノーマ増殖を阻害することが示されている。この治療効果は、治療が抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされると、相乗効果のためにさらに顕著になる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書中で使用される場合、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、抗原認識に関与する可変領域中の３つの超可変配列を指す。３つのＣＤＲは、軽鎖または重鎖可変領域中の４つの「フレームワーク」領域によって分散されている。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与している。各鎖のＣＤＲは、一般的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から連続して番号が付けられ、一般的には特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。これらは、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と略記することができ、Ｈは重鎖を表し、Ｌは軽鎖を表す。
【００２４】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを配置および整列させるのに役立つ。３つのＣＤＲに隣接する４つのＦＲは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれることがある。
【００２５】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列は、当技術分野における様々な周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（国産免疫遺伝学）データベース（ＩＭＧＴ）、およびＡｂＭ（例えばＪｏｈｎｓｏｎら、ｓｕｐｒａ；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２、８７７−８８３；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７、７９９−８１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７、２７３（４）参照）を使用して決定することができる。抗原結合部位の定義はまた、以下に記載されている：Ｒｕｉｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８、２１９−２２１（２０００）；およびＬｅｆｒａｎｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ  １；２９（１）：２０７−９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２−７４５（１９９６）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０３：１２１−１５３、（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、１、１２６、（１９９２）；およびＲｅｅｓら、Ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１−１７２  １９９６）。
【００２６】
抗体は、抗原上の「エピトープ」に結合する。エピトープは、抗原上の特異的抗体結合相互作用部位であり、エピトープは、数個のアミノ酸またはペプチドフラグメントの一部を含むことができる。例えば、エピトープは、５または６個以上のアミノ酸残基の一続きのペプチドを含み得る。
【００２７】
本発明の実施形態は、ヒトＴＩＭ−３と特異的に結合する抗体分子に関する。これらの抗ヒトＴＩＭ−３抗体分子は、免疫疾患または癌性疾患を治療および／または診断するために使用することができる。
【００２８】
免疫応答は、癌の予防に重要な役割を果たす。しかし、慢性ウイルス感染症および癌では、Ｔ細胞の疲弊がこれらの疾患と関連していることが見出されている。Ｔ細胞の疲弊は、多くのメカニズムから生じる可能性がある。プログラム細胞死分子（ＰＤ−１）は、疲弊したＴ細胞のマーカーである。ＰＤ−１とそのリガンド（ＰＤ−１リガンド、またはＰＤ１Ｌ）との相互作用の遮断は、Ｔ細胞機能を部分的に回復させることができる。
【００２９】
ＰＤ−１に加えて、免疫チェックポイントマーカーであるＴ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ−３）はまた、Ｔ細胞の疲弊に関与することが見出されている。ＴＩＭ−３はもともと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１特異的Ｉ型膜タンパク質であることが見出された。免疫チェックポイントであるＴＩＭ−３は、マクロファージ活性化を調節し、Ｔｈ１免疫および耐性誘導において重要な役割を果たしている。
【００３０】
ＴＩＭ−３の発現はまた、固形腫瘍を有するマウスのＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球で見られた。ＴＩＭ−３を発現する腫瘍浸潤リンパ球はすべて、ＰＤ−１を発現することも見出されている。これらのＴＩＭ−３およびＰＤ−１発現リンパ球は、腫瘍に浸潤するＴ細胞の主要な画分を占める。さらに、これらのＴＩＭ−３およびＰＤ−１発現リンパ球はまた、最も重度の疲弊表現型を示し：それらは増殖することができず、そしてまたＩＬ−２、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γを産生することもできない。（Ｓａｋｕｉｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０１０年、２０７（１０）：２１８７−２１９４）。
【００３１】
さらに最近では、ＴＩＭ−３は、Ｔｈ１７細胞、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞および特定の自然免疫細胞など他の細胞の制御にも役割を果たすことが見出された。ＴＩＭ−３経路は、自己免疫疾患、慢性ウイルス感染症および癌の病因に関与しているので、本発明の抗体はこれらの疾患の治療に使用することができる。
【００３２】
本発明の実施形態に従って、ヒトＴＩＭ−３に対する抗体のいくつかのクローンを作成した。可変ドメイン配列を決定した。
【００３３】
１つの例示的な抗体８Ｃ１１をさらに研究した。８Ｃ１１に対するＴＩＭ−３の細胞外ドメイン上のエピトープは、ＲＫＧＤＶＳＬおよび／またはＥＫＦＮＬＫＬの領域にあることが見出された。８Ｃ１１はＴＩＭ−３と結合することができ、ＴＩＭ−３とそのリガンドであるガレクチン−９との間の相互作用を妨害することができることが見出された。さらに、ＴＩＭ−３への８Ｃ１１の結合は、Ｔ細胞死を誘導しない、すなわち、ＴＩＭ−３への抗体の結合は、ＴＩＭ−３シグナル伝達経路を誘発しない。したがって、本発明の抗体によってＴ細胞の疲弊を誘導する危険性はない。
【００３４】
さらに、本発明の抗体は、Ｔ細胞によってＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌を増強し、それにより、免疫応答を増強することができる。これらの抗体は、動物モデルにおいて、腫瘍増殖を抑制することができる。したがって、本発明の抗体は、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌、または前立腺癌などの癌を治療するために使用することができる。
【００３５】
本発明の実施形態は、以下の実施例により説明される。当業者は、これらの実施例が例示のみを目的とするものであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の修正および変形が可能であることを理解するであろう。
【００３６】
実施例１：抗ヒトＴＩＭ−３モノクローナル抗体の生成
ヒトＴＩＭ−３に対するモノクローナル抗体を生成するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、精製組換えヒトＴＩＭ−３抗原（６×Ｈｉｓタグとの融合タンパク質として）で抗原刺激した。脾細胞を採取し、次いで、Ｆｏ細胞と融合した後に培養した。ＴＩＭ−３抗原を認識することができるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、ＴＩＭ−３抗原に基づくＥＬＩＳＡによって選択された。選択したクローンをＦＡＣＳアッセイにより確認した。多くのクローンを単離し、下記のようにして分析した。
【００３７】
実施例２：抗ＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への結合
これらの抗体が細胞表面上の天然のＴＩＭ−３分子を認識できるかどうかを、ＦＡＣＳ分析によって評価した。これらの試験では、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ダイナミックビーズで刺激し、ＴＩＭ−３発現を誘導した。次いで、これらの細胞を、対照として、それぞれ細胞マーカーＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＡＰＣ、およびＴＩＭ−３  ＰＥ（２Ｅ２）で染色した。
【００３８】
図３Ａは、ヒトＣＤ４  Ｔ細胞に結合したモノクローナル抗体８Ｃ１１の結果を示し、図３Ｂは、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞に結合したモノクローナル抗体８Ｃ１１の結果を示す。これらの結果は、ヒトＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞上のＴＩＭ−３発現が、抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体８Ｃ１１によって検出され得ることを示す。つまり、抗ＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、細胞表面上の天然ＴＩＭ−３を認識することができる。
【００３９】
実施例３：２７個の抗体クローンのヒトＴＩＭ−３結合ＥＬＩＳＡ
上記で単離した２７個の抗体クローンのＴＩＭ−３結合能力を分析するために、個々のハイブリドーマクローンを３ｍｌの培養上清中で増幅した。これらの培養上清を、さらなる分析のために１倍希釈した。Ｈｉｓタグを有するＴＩＭ−３の残基２２〜２０２を有するタンパク質として発現されるヒトＴＩＭ−３タンパク質を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．２μｇ／ウェル）上にコーティングし、ＣＤ４０の残基２１〜１９３を有するペプチドとして発現されるＣＤ４０を、０．２μｇ／ウェルでウェルにコーティングし、陰性対照として使用した。マウス抗ヒスチジンタグ抗体を、陽性対照として使用した。
【００４０】
抗体クローンの結合後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用し、抗体−ＴＩＭ−３結合を評価した。活性を計算するためにＯＤ４０５を読み取り、結果を図２に示す。
【００４１】
図２に示すように、８Ｃ１１、３Ｆ１０、９Ａ１１、６Ｆ９、およびＣＨ１１を含むいくつかのクローンが、ＴＩＭ−３との結合において良好な親和性を有し、これらはすべて結合活性を有する（このアッセイではＯＤ４５０＞０．９）。以下の実験のほとんどは、例として８Ｃ１１クローンを使用する。しかし、当業者は、妥当な結合親和性を有する他の抗体もまた、使用され得ることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、８Ｃ１１クローンまたは本明細書に記載されている任意の特定の例に限定されない。
【００４２】
実施例４：抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、Ｆ２９３細胞上のガレクチン−９／ＴＩＭ−３結合を妨害する
ガレクチン−９／ＴＩＭ−３結合を妨害する抗ヒトＴＩＭ−３抗体の能力を評価するために、Ｆ２９３細胞ベースのアッセイを設定した。ガレクチン−９遺伝子を哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ヒトＴＩＭ−３細胞外ドメインの遺伝子をクローニングし、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインと融合させた。次いで、融合遺伝子を哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ガレクチン−９発現Ｆ２９３細胞株を作成し、ヒトＴＩＭ−３細胞外ドメインの組換えタンパク質を産生するために、トランスフェクションキットを使用して、プラスミドをＦ２９３細胞に導入し、次いで安定な形質転換体をＧ４１８処理で選択した。
【００４３】
アッセイ系は、競合アッセイとして設定した。結果を図４Ａ〜図４Ｃに示す。図４Ａは、ガレクチン−９でのトランスフェクション前に、Ｆ２９３細胞が、ＴＩＭ−３デコイ（すなわち、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインと融合した組換えＴＩＭ−３細胞外ドメイン）と結合しなかったことを示す。図４Ｂは、ガレクチン−９でのトランスフェクション後に、Ｆ２９３細胞が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインと融合した組換えＴＩＭ−３細胞外ドメインを発現する細胞と結合することができることを示す。図４Ｃでは、結果は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１が、ガレクチン−９／ＴＩＭ−３結合と競合し得ることを示す。したがって、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、ＴＩＭ−３によって媒介されるシグナル伝達経路を妨害するために使用することができ、それによってガレクチン−９またはＴＩＭ−３機能を阻害する。
【００４４】
実施例５：抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、ガレクチン−９／ＴＩＭ−３結合を妨害することによって、ヒトＴ細胞死を減少させることができる。
ヒトＴ細胞におけるガレクチン−９／ＴＩＭ−３のシグナル伝達経路は、細胞死を誘導し、Ｔ細胞活性を低下させることができる。抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１がガレクチン−９／ＴＩＭ−３シグナル経路をブロックできるかどうかを調べるために、ガレクチン−９誘導Ｔ細胞死モデルを作成した。正常マウス由来のＩｇＧ抗体を陰性対照として使用し、モノクローナル抗体２Ｅ２を陽性対照として使用した。ＣＤ２５は、ヒトＴ細胞初期活性化マーカーとして使用される。
【００４５】
このＴ細胞死アッセイの結果を図５に示す。図５に示すように、ガレクチン−９処理は、約４０．２％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を誘導し、これらは免疫抑制効果を有する制御性Ｔ細胞である。対照ＩｇＧの添加は、このＴ細胞集団の誘導に実質的に影響を及ぼさなかったが、抗ＴＩＭ−３抗体２Ｅ２の添加は、このＴ細胞集団を３５．８％までいくらか減少させた。対照的に、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体（８Ｃ１１）の添加は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の著しい減少をもたらした（１９．２％）。
【００４６】
これらの結果は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１が、ヒトＴ細胞におけるガレクチン−９／ＴＩＭ−３シグナル伝達をブロックして、ヒトＴ細胞死を減少させることができることを示している。したがって、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、ガレクチン−９／ＴＩＭ−３シグナル伝達によって媒介される疾患および／または状態を治療するために使用することができる。
【００４７】
実施例６：抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１はＴ細胞死を誘導しない
８Ｃ１１はＴＩＭ−３に結合することができるので、それはＴＩＭ−３受容体のシグナル伝達経路を誘発してもよく、または誘発しなくてもよい。抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１がヒトＴ細胞と相互作用して、細胞死に至るシグナル伝達を引き起こすことができるかどうかを調べるために、我々は、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ３、ＣＤ２８、および／または抗ＩＬ４、ＩＬ−１２で細胞分化を誘導した。ＣＤ２５は、ヒトＴ細胞初期活性化マーカーとして使用される。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いて細胞死を評価する。ＦＡＣＳ分析により、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１はＴ細胞死を誘導しないことが見出された。
【００４８】
図６Ａおよび図６Ｂに示すように、抗ＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１は、対照抗体ｍＩｇＧおよび抗ＴＩＭ−３  ２Ｅ２と同様の効果をもたらした。この観察は、抗体８Ｃ１１がヒトＣＤ４＋Ｔ細胞死を誘導しないことを示唆している。さらに、抗ＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１はまた、図６Ｃおよび図６Ｄに示し、対照抗体ｍＩｇＧおよびｍＡｂ  ２Ｅ２と同様のパターンによって証明されるように、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞死を誘導しない。
【００４９】
したがって、８Ｃ１１は、ＴＩＭ−３によって媒介されるシグナル伝達経路を誘発することなく、ＴＩＭ−３に結合することができる。上記のように、８Ｃ１１は、ガレクチン−９とＴＩＭ−３の間の相互作用をブロックすることができる。したがって、８Ｃ１１は、Ｔ細胞の疲弊を誘導することを懸念することなく、ＴＩＭ−３媒介疾患または状態を治療するための治療薬として使用することができる。
【００５０】
実施例７：ＴＩＭ−３上のエピトープ
抗体に結合するエピトープを決定するために、組換えタンパク質中の水素−重水素交換を、マウスモノクローナル抗体の存在下および非存在下で、ペプシン消化フラグメントおよびＨＤＸ  ＭＳ法を使用することによって測定した。
【００５１】
組換えタンパク質（１５ｐｍｏｌ）およびタンパク質−抗体複合体（１５ｐｍｏｌ：１０ｐｍｏｌ）を、交換緩衝液（ＰＢＳ中９９．９％Ｄ２Ｏ、ｐＨ７．４）で１：１０の比で希釈して、室温でＨＤ交換を開始した。７時点（１０秒、３０秒、６０秒、３００秒、６００秒、１２００秒、４８００秒）で、アリコート（それぞれ２ｐｍｏｌの標的タンパク質）を取り出し、予冷したクエンチング緩衝液（最終濃度１Ｍ塩酸グアニジン、１５０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、および０．５％ギ酸）と混合した。
【００５２】
クエンチした混合物を、オンライン消化のために、直ちに自製ペプシンカラムに充填した。次いで、消化したペプチド混合物を逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８、０．３×５ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ウィルミントン、デラウェア州、米国）に充填した。次いで、脱塩したペプチドを、直線勾配の８〜９５％ＨＰＬＣ緩衝液（９９．９％アセトニトリル／０．１％ギ酸／０．０２５％トリフルオロ酢酸）を用いた自製カラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ５μｍ、内径７５μｍ、長さ１０ｃｍ）により、０．５μｌ／分の流速で１０分間分離した。
【００５３】
ＬＣ装置を、Ｘｃａｌｉｂｕｒ  ２．２ソフトウェア（サーモフィッシャー社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）で操作される２Ｄリニアイオントラップ質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｃｌａｓｓｉｃ；サーモフィッシャー社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）と結合した。フルスキャンＭＳは、Ｏｒｂｉｔｒａｐで、３５０〜１，６００Ｄａの範囲およびｍ／ｚ  ４００で６０，０００の分解能で実施した。ロックマスとしてｍ／ｚ  ５３６．１６５３６５で［Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｏ］６Ｈ＋のイオン信号を用いて内部較正を行った。エレクトロスプレー電圧を０．２ｋＶに設定し、キャピラリーの温度を２００℃に設定した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ自動利得制御を、最大蓄積時間またはイオンについて、それぞれ１，０００ｍｓ（フルスキャン）および１２０ｍｓ（ＭＳ／ＭＳ）、または２ｘ１０６イオン（フルスキャン）および３ｘ１０３イオン（ＭＳ／ＭＳ）に設定した。
【００５４】
ペプチドの同定は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン１．４、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴサーチエンジンを用いて、単一タンパク質データベースに対して検索した。ペプチド同定のために、無傷のペプチド質量に対して２０ｐｐｍの質量許容差が許容され、ＣＩＤフラグメントイオンに対して０．５Ｄａが許容された。次いで、ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を、ペプチド同定の高い信頼性および検索エンジンランク１に基づいてフィルタリングして、０．０１未満の全体的な誤発見率を確実にした。
【００５５】
ＨＤＸプロファイル分析のために、ペプチド同定テンプレートを、標的タンパク質同定のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ結果に基づいて作成した。次いで、テンプレートを、ＭＡＴＬＡＢにインストールされたＥｘＭＳモジュールにプリロードした。ＨＤＸのＭＳスペクトルをロードし、分析して、各ペプチドについて取り込まれた重水素の数を計算し、次いで、２回の独立した実験の重水素取り込みの平均数として提示した。
【００５６】
ＨＤＸプロファイルを表すために、二重ＨＤＸ−ＭＳ実験の再現可能な結果を選択した。２つのエピトープ領域は、ペプチド配列ＲＫＧＤＶＳＬ（配列番号９、ＴＩＭ−３の残基８７〜９３）およびＥＫＦＮＬＫＬ（配列番号１０、ＴＩＭ−３の残基１１９〜１２５）に見出され、これらは、抗体の非存在下と比較して、マウスモノクローナル抗体の存在下でより低い重水素取り込み数を示した（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００５７】
図７Ａは、抗体の存在下および非存在下で、ペプチドセグメントＲＫＧＤＶＳＬ（配列番号９）への重水素の取り込みを時間の関数として示す。抗体の非存在下と比較して、抗体の存在下で有意に遅い取り込み速度は、このペプチドセグメントが抗体結合の際に溶媒から保護されることを示す。すなわち、このペプチドセグメントは抗体結合に関与している。
【００５８】
図７Ｂは、抗体の存在下および非存在下で、ペプチドセグメントＥＫＦＮＬＫＬ（配列番号１０）への重水素の取り込みを時間の関数として示す。抗体の非存在下と比較して、抗体の存在下で有意に遅い取り込み速度は、このペプチドセグメントが抗体結合の際に溶媒から保護されることを示す。すなわち、このペプチドセグメントは抗体結合に関与している。
【００５９】
上記実験から、ｍＡｂ  ８Ｃ１１に対する結合エピトープは、ＲＫＧＤＶＳＬ（配列番号９）およびＥＫＦＮＬＫＬ（配列番号１０）にまたがる領域に位置することが見出された。これらの領域がｍＡｂ  ８Ｃ１１結合エピトープを含むことを確認し、ｍＡｂ  ８Ｃ１１結合に重要であるこれらの領域内の残基を調べるために、我々はこれらの領域においてアラニンスキャニングを実施した。
【００６０】
図７Ｃに示す結果は、ｍＡｂ  ８Ｃ１１結合エピトープが実際にこれらの領域に位置していることを確認している。さらに、アラニンスキャニングの結果は、残基９０（Ｄ９０Ａ）および１２１（Ｆ１２１Ａ）でのアラニン置換が、ｍＡｂ  ８Ｃ１１のＴＩＭ−３への結合を無効にしたことを示している。対照的に、残基８８（Ｋ８８Ａ）、１１７（Ｎ１１７Ａ）、１１９（Ｅ１１９Ａ）、および１２０（Ｋ１２０Ａ）でのアラニン置換は、ｍＡｂ  ２Ｅ２８Ｃ１１のＴＩＭ−３への結合を無効にしなかった。これらの結果は、残基Ｄ−９０およびＦ−１２１が、ｍＡｂ  ８Ｃ１１のＴＩＭ−３への結合に重要であることを示している。
【００６１】
実施例８：抗ＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１はヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌を調節する
疲弊したＴ細胞は、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどの適切な免疫応答にとって重要な因子を産生しない。本発明の抗ＴＩＭ−３抗体がＴ細胞によるこれらの因子の産生を増強できるかどうかを試験するために、以下の実験を行った。ヒトＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を抗体で、または抗体なしで処理し、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナミックビーズで３日間刺激した。次いで、上清をマルチプレックスによるさらなる分析のために回収した。結果は、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの分泌が治療群において増加したことを示す。抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１での処置群は、抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ２Ｅ２処置群と比較して、実質的により大きな増加を示す。
【００６２】
図８Ａは、抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１処置がヒトＴ細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を増強することを示す。図８Ｂは、抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ  ８Ｃ１１処置がヒトＴ細胞におけるＴＮＦ−α分泌を増強することを示す。これらの結果は、本発明の抗体がＴ細胞の疲弊を予防または逆転させるために使用され、それによって正常な免疫応答を増強し得ることを示す。
【００６３】
実施例９：８Ｃ１１モノクローナル抗体をコードする遺伝子のクローニング
８Ｃ１１  ｍＡｂをコードする遺伝子のクローニングは以下の方法に従って行われる。以下の手順は、特定の条件およびパラメータを説明し得るが、これは本発明の実施形態を説明するための一例にすぎず、本発明の範囲から逸脱することなく他の修正および変形が可能であることを当業者は認識するであろう。
【００６４】
抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングおよび調製
ハイブリドーマは規定の培養液中で培養した。細胞数が約１０×１０６細胞／ｍｌに達した際、細胞を遠心分離によって回収し、次いでＴＲＩｚｏｌキットを添加して取扱説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、供給業者からの取扱説明書に従ってマウスＩｇ−プライマーセットを用いて行った。第１鎖ｃＤＮＡは、テンプレートとしての５μｇの全ＲＮＡ、５０ｎｇ／ｍｌのランダムプライマー、および１０μＭのｄＮＴＰを用いて調製し、それらはＰＣＲチューブ中のＤＥＰＣ−水中で混合された。
【００６５】
反応混合物を６５℃で５分間インキュベートした後、氷上に置いた。２μｌの１０×ＲＴ緩衝液、４μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌのＤＴＴ、１μｌの４ユニットのＲＮａｓｅＯＵＴ、および１μｌの２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴを含む１０μｌのｃＤＮＡ合成混合物を穏やかに混合し、短時間の遠心分離により回収した。反応チューブを２５℃で１０分間、続いて５０℃で５０分間インキュベートした。８５℃で５分間加熱することにより反応を停止させ、次いでチューブを氷上で冷却した。チューブを短時間遠心分離して反応生成物を回収し、１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈを添加して３７℃で２０分間インキュベートした。
【００６６】
５μｌのｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μｌの２．５ユニットＴａｑポリメラーゼ、および１μｌのフォワードおよびリバースプライマーの組成を有する反応混合物を再蒸留水で５０μｌの最終容量で調製し、ＰＣＲに供した。抗体の軽鎖および重鎖を増幅するために、最初のステップとして９４℃、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した。反応サイクル後、最終ステップは７２℃で１０分間であった。反応混合物を２％アガロースゲルで分析した。予測分子量を有する生成物をクローニングベクターに連結し、次いでヌクレオチド配列を決定するために使用した。
【００６７】
配列情報に基づいて、抗体配列をＥｘＰＡＳＹ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎツールを用いてタンパク質配列に翻訳した。抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１の得られた配列は、重鎖アミノ酸配列および軽鎖配列を含む。これらの配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ公開９１〜３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１年）、第１〜３巻の方法により決定された。
【００６８】
図１は、８Ｃ１１抗体可変重鎖領域（配列番号１）および軽鎖領域（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）およびＣＤＲ（ＨＣＤＲ１  配列番号３、ＨＣＤＲ２  配列番号４、ＨＣＤＲ３  配列番号５、ＬＣＤＲ１  配列番号６、ＬＣＤＲ２  配列番号７、およびＬＣＤＲ３  配列番号８）が示される。
【００６９】
実施例１０：異種移植動物モデルは抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１による腫瘍増殖阻害の能力を例示する
腫瘍増殖は、Ｔ細胞の疲弊と関連していることが多い。Ｔ細胞の疲弊は、免疫応答の低下をもたらし、それは癌細胞が検査されずに増殖することを可能にする。抗ＴＩＭ−３抗体は、Ｔ細胞の疲弊状態を逆転または最小限に抑えること、例えばＴ細胞によるガレクチン−９／ＴＩＭ−３の結合のブロックならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌の増強などが見られるため、これらの抗体が癌細胞の増殖を予防または遅らせる可能性があることが考えられる。これを試験するために、以下の実験を行った。
【００７０】
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍｌｗｊｌ／ＹｃｋＮａｒｌマウス（５〜６週齢）に０．５ｘ１０６個のヒト新鮮ＰＢＭＣを腹腔内注射し、実験の０日目に、合計１０６個のＡ３７５ヒトメラノーマ細胞を５０μＬのＰＢＳ中で皮下（ｓ．ｃ．）注射した。マウスを抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ（各注射につき８Ｃ１１、５ｍｇ／ｋｇ）、抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（各注射につき８ｍｇ／ｋｇ）、コンボ（各注射につき抗ＴＩＭ−３、８Ｃ１１、５ｍｇ／ｋｇプラス抗ｈＰＤ−１、８ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水対照で処置した。
【００７１】
ＴＩＭ−３に対する抗体については０、２、４日目に、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体については０、３、６、９、１２日目に、マウスに腹腔内投与により注射した。生存および異種移植片対宿主反応を、２８日まで毎日モニターした。異種移植片対宿主病（ｘＧＶＨＤ）の臨床症状（１５％超の体重減少、猫背の姿勢、運動性の低下、毛皮の減少、頻呼吸）を発症した動物を屠殺し、生存の終点を記録した。マウスを２５日目に屠殺し、皮下腫瘍を取り出し、秤量し、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＦＡＣＳ分析のために処理した。
【００７２】
結果は、２１日目までに、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１処置単独では、腫瘍増殖を約３０％減少させ、抗ｈＰＤ−Ｌ１処置単独では、腫瘍増殖抑制を約２０％減少させることを示した。しかし、抗ｈＰＤ−Ｌ１との併用処置は、腫瘍増殖を約７０％減少させた。これらの結果は、腫瘍細胞増殖の抑制において、ＴＩＭ−３に対する抗体がＰＤ−Ｌ１に対する抗体よりも有効であることを示している。より重要なことに、これらの結果は、抗ヒトＴＩＭ−３抗体８Ｃ１１および抗ｈＰＤ−Ｌ１との併用処置において相乗効果があることを示している。ＰＤ−１およびＴＩＭ−３は、Ｔ細胞の疲弊に関与することが見出された２つの主要な受容体であるので、抗ＴＩＭ−３抗体は、単独でまたは抗ＰＤ−１抗体と一緒に、Ｔ細胞の疲弊に対して有用であり、したがって、免疫抑制（Ｔ細胞の疲弊）を伴う疾患または状態を治療するために使用することができる。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態は、ＴＩＭ−３によって媒介されるＴ細胞の疲弊に関連する疾患または障害の治療における本発明の抗体の使用に関する。そのような疾患には、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌、または前立腺癌などの癌が含まれる。本発明の実施形態に従って、そのような癌を治療するための方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の抗体を投与することを含み得る。有効量は、治療を実施するのに必要な量である。当業者は、有効量が疾患、患者（年齢、体重）、剤形、投与経路などに依存することを理解するであろう。当業者は、過度の実験をすることなく有効量を決定することができる。投与は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射などの注射を含む任意の適切な手段によるものであってもよい。
【００７４】
本発明を限られた数の実施形態に関して説明してきたが、本開示の恩恵を受ける当業者であれば、本明細書に開示した本発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態を考案できることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
2020509995.tif 000003
【図２】
2020509995.tif 000004
【図３Ａ】
2020509995.tif 000005
【図３Ｂ】
2020509995.tif 000006
【図４Ａ】
2020509995.tif 000007
【図４Ｂ】
2020509995.tif 000008
【図４Ｃ】
2020509995.tif 000009
【図５】
2020509995.tif 000010
【図６Ａ】
2020509995.tif 000011
【図６Ｂ】
2020509995.tif 000012
【図６Ｃ】
2020509995.tif 000013
【図６Ｄ】
2020509995.tif 000014
【図７Ａ】
2020509995.tif 000015
【図７Ｂ】
2020509995.tif 000016
【図７Ｃ】
2020509995.tif 000017
【図８Ａ】
2020509995.tif 000018
【図８Ｂ】
2020509995.tif 000019
【図９】
2020509995.tif 000020
【配列表】
2020509995000001.app
【国際調査報告】
2020509995.tif 000021
2020509995.tif 000022