(57)【要約】  ＥＲストレスの治療管理のためのガルシノールの使用が開示される。より具体的には、本発明は、タンパク質凝集を低下させ、かつＥＲストレスマーカー、ＳＸＢＰ、ＧＲＰ７８、およびＡＴＦ４の発現を減少させることにより、ＥＲストレスを減少させ、かつ毒性を緩和することにおけるガルシノールの能力を開示し、その能力は、高血糖、パラセタモール、アルコール、タプシガルジン、および高脂肪食によって誘発される毒性モデルにおいて翻訳減衰および回復を示す。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフォールディング化またはミスフォールディング化細胞タンパク質転写産物の蓄積により特徴づけられる哺乳類細胞において小胞体ストレスを処理する方法であって、前記哺乳類細胞を有効濃度のガルシノールで処理して、前記アンフォールディング化またはミスフォールディング化タンパク質転写産物の蓄積を減衰させる効果を引き起こすステップを含む、方法。
【請求項２】
ガルシノールの有効濃度が２〜１０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類細胞が好ましくはヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳類において小胞体ストレスおよび関連した毒性を低下させるための方法であって、有効濃度のガルシノールを前記哺乳類に投与して、毒性および小胞体ストレスマーカーの低下を引き起こすステップを含む、方法。
【請求項５】
小胞体ストレスが、メタボリックシンドローム、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性障害、アルコール性および非アルコール性脂肪肝、癌、ウイルス感染症、高血糖症、薬剤誘発性毒性、ならびに肥満症からなる群から選択される臨床状態に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
小胞体ストレスのマーカーがＳＸＢＰ、ＡＴＦ−４、およびＧＲＰ７８からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ガルシノールの有効濃度が０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
哺乳類がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ガルシノールが、薬学的に／栄養補助的に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤、または担体と共に組成物として製剤化され、かつ錠剤、カプセル、シロップ、グミ、粉末、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディ、および食料品の形をとって経口投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
小胞体ストレス誘発性メタボリックシンドロームの治療管理の方法であって、有効濃度のガルシノールを前記哺乳類に投与して、メタボリックシンドロームの症状をもたらす前記アンフォールディング化またはミスフォールディング化タンパク質転写産物の蓄積を減衰させる効果を引き起こすステップを含む、方法。
【請求項１１】
メタボリックシンドロームが、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性障害、アルコール性および非アルコール性脂肪肝、癌、ウイルス感染症、高血糖症、薬剤誘発性毒性、ならびに肥満症からなる群から選択される臨床状態に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ガルシノールの有効濃度が０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ガルシノールが、薬学的に／栄養補助的に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤、または担体と共に組成物として製剤化され、かつ錠剤、カプセル、シロップ、グミ、粉末、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディ、および食料品の形をとって経口投与される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６２５２３５９２号からの優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、小胞体ストレス（ＥＲストレス）についての治療介入に関する。より具体的には、本発明は、転写アテニュエータおよび転写回復剤としての急性ＥＲストレスについての治療剤としてのガルシノールの可能性に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体（ＥＲ）は、分泌性および膜タンパク質の合成およびプロセシングによる細胞ストレス応答において重要な役割を果たす（Umut O¨zcan et al., (2004), Endoplasmic Reticulum Stress Links Obesity, Insulin Action, and Type 2 Diabetes, Science; 306(5695):457-61）。ＥＲに存在する分子シャペロンは、適切なタンパク質フォールディングを促進し、それらをフォールディングされた状態に維持し、かつタンパク質凝集物形成を阻止する（Lee AS., (2005), The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress, Methods; 35(4):373-381）。適切なタンパク質フォールディングを保証するために、小胞体内腔は、ＥＲタンパク質負荷と、この負荷に対処する能力との間にバランスを確立するように独特な環境を維持する。ＥＲ恒常性を妨げる生理学的または病理学的過程は、ＥＲストレスを引き起こし、小胞体ストレス応答（Unfolded Protein Response）（ＵＰＲ）として知られた１連のシグナル伝達経路を活性化して、ストレスにうまく対応する。
【０００３】
ＵＰＲの最初の目的は、以下の２つの機構を通して、恒常性を再確立し、かつＥＲストレスを軽減することである：（ａ）タンパク質フォールディング性シャペロンの発現によりフォールディング能力を増加させること、および（ｂ）一般的なタンパク質翻訳を阻害し、かつミスフォールディング化タンパク質の分解を促進することによるＥＲタンパク質の下方制御。長期のまたは過酷なストレス下で、ＵＰＲは、アポトーシスおよび細胞死を惹起する。ＵＰＲ媒介性細胞死は、癌、２型糖尿病、神経変性、およびアテローム性動脈硬化症を含む多くの疾患の発病に寄与し得る（Tabas and Ron (2011), Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress. Nat Cell Biol. 13(3):184-90；Marciniak and Ron, (2006) Endoplasmic reticulum stress signaling in disease., Physiol Rev.;86(4):1133-49）。この複雑な細胞応答は、最初に、３つの分子、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、活性化転写因子６（ＡＴＦ６）、およびイノシトール要求酵素１（ＩＲＥ１）によって媒介される。
【０００４】
正常状態下では、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１、およびＡＴＦ６は、ＥＲシャペロンＧＲＰ７８（グルコース制御性タンパク質）と結合している；しかしながら、アンフォールディング化タンパク質の蓄積により、ＧＲＰ７８は、これらの分子から解離し、それらの活性化をもたらす。ＩＲＥ１は、細胞質エンドリボヌクレアーゼドメインを有し、そのドメインは、活性化により、Ｘボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ１）をコードするｍＲＮＡをスプライスして、それの翻訳を可能にする。スプライスされたＸＢＰ１（ＸＢＰ１ｓ）は、ＥＲフォールディング能力を増加させ、かつＥＲ膜表面積を拡大する多くの必須ＵＰＲ遺伝子を誘導する転写因子である。活性化ＰＥＲＫは、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）をリン酸化し、その結果として、全体的な翻訳減衰およびＥＲタンパク質負荷の低下を生じる。リン酸化ｅＩＦ２αは、ＡＴＦ４（活性化転写因子４）の翻訳を促進し、そのＡＴＦ４は、いくつかの機構を通してアポトーシスを誘発するＵＰＲエフェクターＣＨＯＰを誘導する。ＡＴＦ６はゴルジ複合体へ転位置し、そこで、それは、ｓｉｔｅ  １  ｐｒｏｔｅａｓｅおよびｓｉｔｅ  ２  ｐｒｏｔｅａｓｅにより切断される。生じた転写因子は、その後、核へ移動して、Ｇｒｐ７８などのＥＲシャペロンの発現を増加させる。
【０００５】
ある特定の病理学的ストレス状態は、ＥＲ恒常性の破壊に関与し、ＥＲ内腔におけるアンフォールディング化またはミスフォールディング化タンパク質の蓄積をもたらす（R. Y. Hampton, Curr. Biol. 10, R518 (2000)、K. Mori, Cell 101, 451 (2000)、H. P. Harding, M. Calfon, F. Urano, I. Novoa, D. Ron, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 575 (2002)）。ＥＲストレスについて関与する生理学的状態の中で、グルコースまたは栄養分欠乏、ウイルス感染、脂質、分泌性タンパク質の合成の増加、および変異体またはミスフォールディング化タンパク質の発現が、多大な重要性を担う（Y. Ma, L. M. Hendershot, Cell 107, 827 (2001)、R. J. Kaufman et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 411 (2002)、およびI. Kharroubi et al., Endocrinology (2004); published online 5 August 2004 (10.1210/en.2004-0478)）。以下の先行文献は、異なる疾患におけるＥＲストレスの役割に関して詳細に記載している。
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【０００６】
したがって、ＥＲストレス応答を制御する能力を有する治療介入は、ＥＲストレスに関与する病理群、最も重要なものには、メタボリックシンドロームの管理のために新しい機会を提供することが期待される。ＥＲストレスは以下の２つの別個の視点を有する（Oyadomari et al., “Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress”, Cell Death and Differentiation (2004) 11, 381-389）：
１．新しいタンパク質合成の負荷を低下させ、かつアンフォールディング化タンパク質のさらなる蓄積を阻止する翻訳減衰が起こるリモデリング相を可能にする急性の視点。この機構は、細胞が生存するための回復現象（生存シグナル）を提供する；および
２．ＥＲストレスがアポトーシスシグナルの活性化をもたらし、細胞死へと導く、慢性の視点。
【０００７】
治療介入は、どちらの相においても、または相のうちの１つにおいて有用であり得る。したがって、そのような治療介入の証拠は、ＥＲストレスの管理のための礎石となる。ＥＲストレスにおけるアポトーシスシグナル伝達剤としてのガルシノールは、Cheng et al, “Garcinol inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma Hep3B cells through induction of ROS-dependent apoptosis”, Food Funct. 2010 Dec;1(3):301-7により報告されている。ＤＮＡ損傷誘導性遺伝子１５３（ＧＡＤＤ１５３）の活性化を通してのアポトーシスシグナル伝達におけるガルシノールの役割は、この技術文献に報告されている。
【０００８】
しかしながら、慢性ＥＲストレスがアポトーシスの誘導によってのみ対処されなければならず、その場合、細胞の回復および生存の見込みはないという状況の前の、急性ＥＲストレスにおいて翻訳減衰を調節することに関しての細胞生存シグナル伝達剤としてのガルシノールの効果は、報告されたことがない。したがって、急性ＥＲストレスを治療的に管理することは、ＥＲストレス管理のための中心である。したがって、この最前線における科学的証拠は、ガルシノールの治療適用に関する既存の知識ネットワークへの新規で、非自明性で、かつ産業的に適用可能な追加となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、翻訳減衰機構を通しての急性ＥＲストレスの調節剤および翻訳回復の促進剤としてのガルシノールの可能性を開示することが、本発明の原理的目的である。
本発明は、前述の目的を果たし、さらなる関連した利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＥＲストレスの治療管理のためのガルシノールの能力を開示する。より具体的には、本発明は、タンパク質凝集を低下させ、かつＥＲストレスマーカー、ＳＸＢＰ、ＧＲＰ７８、およびＡＴＦ４の発現を減少させることにより、ＥＲストレスを減少させ、かつ毒性を緩和することにおけるガルシノールの能力を開示し、その能力は、高血糖、パラセタモール、アルコール、タプシガルジン、および高脂肪食によって誘発された毒性モデルにおいて翻訳減衰および回復を示す。
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面と共に示された以下のより詳細な説明から明らかになるだろう。その説明は、本発明の原理を例として示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ガルシノールによる、膵臓β細胞株におけるグルコース誘発性毒性からの保護のグラフ表示である。
【図２】Ｍｉｎ６膵臓β細胞における、ガルシノールによる、タンパク質凝集の低下およびＥＲストレスの低下を示すフローサイトメトリー画像である（グルコース誘発性毒性）。
【図３】ガルシノールを補充されたマウスの血清中グルコースの用量依存性低下を示すグラフ表示である（マウスにおける高脂肪誘発性糖尿病性状態）。
【図４】ガルシノールを補充された動物の膵臓におけるＥＲストレスマーカーの発現の減少を示すグラフ表示である（マウスにおける高脂肪誘発性糖尿病性状態）。
【図５ａ】研究動物におけるパラセタモール誘発性肝臓毒性におけるガルシノール（予防）による肝保護パーセンテージを示すグラフ表示である。
【図５ｂ】研究動物におけるパラセタモール誘発性肝臓毒性におけるガルシノール（治療）による肝保護パーセンテージを示すグラフ表示である。
【図６】ＨｅｐＧ２細胞のアルコール誘発性肝臓毒性におけるガルシノールによる肝保護パーセンテージを示すグラフ表示である。
【図７ａ】タプシガルジン誘発性ヒト肝臓細胞におけるチオフラビン染色により推定された、ガルシノールによるタンパク質凝集の低下パーセンテージを示すグラフ表示である。ＵＳ  −  ストレスを受けていない細胞、ＴＧ  −  タプシガルジン、Ｇ５、Ｇ１０  −  それぞれ、ガルシノール５ｕｇ／ｍｌおよび１０ｕｇ／ｍｌ、ＰＢＡ：フェニル酪酸（陽性対照）。
【図７ｂ】タプシガルジン誘発性ヒト肝臓細胞におけるチオフラビン染色により推定された、ガルシノールによるタンパク質凝集の低下パーセンテージを示すフローサイトメトリー画像である。
【図７ｃ】タプシガルジン誘発性マウス初代肝細胞におけるチオフラビン染色により推定された、ガルシノールによるタンパク質凝集の低下パーセンテージを示すグラフ表示である。
【図８】タプシガルジンで処理された肝細胞における、ガルシノールによるＥＲストレスマーカーの発現の減少を示すグラフ表示である。ＴＧ  −  タプシガルジン、Ｇ５、Ｇ１０  −  それぞれ、ガルシノール５ｕｇ／ｍｌおよび１０ｕｇ／ｍｌ、ＰＢＡ：フェニル酪酸（陽性対照）。
【図９】高脂肪食を投与された動物における、ガルシノールによる動物の肝臓質量の用量依存性減少を示すグラフ表示である。
【図１０】ガルシノールを補充された、高脂肪食投与動物の膵臓におけるＥＲストレスマーカーの発現の減少を示すグラフ表示である。
【図１１ａ】タプシガルジンで処理された脂肪細胞におけるＥＲストレスマーカーの発現の減少を示すグラフ表示である。ＴＧ  −  タプシガルジン、Ｇ５、Ｇ１０  −  それぞれ、ガルシノール５ｕｇ／ｍｌおよび１０ｕｇ／ｍｌ、ＰＢＡ：フェニル酪酸（陽性対照）。
【図１１ｂ】ガルシノールを補充された、高脂肪食投与動物の脂肪パッドにおけるＥＲストレスマーカーの発現の減少を示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
最も好ましい実施形態において、本発明は、アンフォールディング化（unfolded）またはミスフォールディング化（misfolded）細胞タンパク質転写産物の蓄積により特徴づけられる哺乳類細胞において小胞体ストレスを処理する方法であって、前記哺乳類細胞を有効濃度のガルシノールで処理して、前記アンフォールディング化またはミスフォールディング化タンパク質転写産物の蓄積を減衰させる効果を引き起こすステップを含む、方法に関する。関連した実施形態において、ガルシノールの有効濃度は、２〜１０μｇ／ｍｌである。関連した実施形態において、哺乳類細胞は好ましくはヒト細胞である。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳類において小胞体ストレスおよび関連した毒性を低下させるための方法であって、有効濃度のガルシノールを前記哺乳類に投与して、毒性および小胞体ストレスマーカーの低下を引き起こすステップを含む、方法を開示する。関連した実施形態において、ＥＲストレスは、非限定的に、メタボリックシンドローム、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性障害、アルコール性および非アルコール性脂肪肝、癌、ウイルス感染症、高血糖症、薬剤誘発性毒性、ならびに肥満症からなる群から選択される臨床状態に認められる。別の関連した実施形態において、ＥＲストレスのマーカーは、スプライスされたｘボックスＤＮＡ結合タンパク質（ＳＸＢＰ）、活性化転写因子４（ＡＴＦ−４）、およびグルコース制御性タンパク質７８（ＧＲＰ７８）からなる群から選択される。関連した実施形態において、哺乳類はヒトである。別の関連した実施形態において、ガルシノールの有効濃度は０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。別の好ましい実施形態において、ガルシノールは、薬学的に／栄養補助的に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤、または担体と共に組成物として製剤化され、錠剤、カプセル、シロップ、グミ、粉末、懸濁液、乳濁液、チュアブル（chewables）、キャンディ、および食料品の形をとって経口投与される。
【００１４】
さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明は、小胞体ストレス誘発性メタボリックシンドロームの治療管理の方法であって、有効濃度のガルシノールを前記哺乳類に投与して、メタボリックシンドロームの症状をもたらす前記アンフォールディング化またはミスフォールディング化タンパク質転写産物の蓄積を減衰させる効果を引き起こすステップを含む、方法に関する。関連した実施形態において、メタボリックシンドロームは、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性障害、アルコール性および非アルコール性脂肪肝、癌、ウイルス感染症、高血糖症、薬剤誘発性毒性、ならびに肥満症からなる群から選択される臨床状態に認められる。関連した実施形態において、哺乳類はヒトである。別の関連した実施形態において、ガルシノールの有効濃度は０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。別の好ましい実施形態において、ガルシノールは、薬学的に／栄養補助的に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤、または担体と共に組成物として製剤化され、錠剤、カプセル、シロップ、グミ、粉末、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディ、および食料品の形をとって経口投与される。
本発明の技術的特徴および技術的効果を組み入れる前述の最も好ましい実施形態は、本明細書において以下の例証的な例を通して説明される。
【実施例】
【００１５】
（例１）
方法
細胞株
ＨｅｐＧ２  −  ヒト肝臓細胞株、マウス初代肝細胞、Ｍｉｎ６  −  マウス膵臓β細胞株、３Ｔ３  Ｌ１  −  マウス前脂肪細胞を実験に用いた。細胞を、１０％熱失活したウシ胎仔血清、抗生物質と共に２５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエントになった時、それらをトリプシン処理し、洗浄し、ウェルあたり５×１０3個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。タプシガルジン（１ｕＭ）により４時間、グルコース（５０ｍＭおよび１００ｍＭ）およびアルコール（１０００ｍＭ）またはパラセタモール（４ｍＭ）により７２時間、ストレスを誘導した。ガルノールを予防的処理としてストレッサーと共に加えた。治療的処理として、細胞をストレス剤に曝露し、それから２４時間後、ガルシノールを細胞に加えた。保護を、７２時間の処理後、ＳＲＢアッセイにより評価した。
【００１６】
動物
週齢６〜８週間のＣ５７／ＢＬ６マウスを８匹／群で本研究に用いた。動物を、十分な新鮮な空気供給（１時間あたり１２〜１５回の空気交換）、室温２０．２〜２３．５℃、および相対湿度５８〜６４％で空調管理され、１２時間の蛍光の光と１２時間の暗闇のサイクルでの標準実験条件下、飼育した。温度および相対湿度を１日１回、記録した。
【００１７】
餌
動物に、順化および実験期間を通じて、正常食（９ｋｃａｌ／日）および高脂肪食（５０ｋｃａｌ／日）を与えた。水を、順化および実験期間を通じて、動物に高脂肪食と共に供給した。清浄器付き水濾し器からの水が、ステンレススチールシッパーチューブを有する動物給餌ボトルにおいて提供された。ガルシノールを、高脂肪食と共に動物に投与した。Regan-Shaw et al., (2007) Dose translation from animal to human studies revisited FASEB J. 22, 659-661により記載されているような、動物からヒトへの用量計算を参考として用いた。
全ての研究を、ＣＰＣＳＥＡの倫理指針に従って、その委員会から必要な認可を得た（承認番号：７９０／０３／ａｃ／ＣＰＣＳＥＡ）後で行った。
ａ．インドの１９９８年１２月１５日の公報において発表された実験動物施設についての動物に関する実験の管理および監視のための委員会（the Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals）（ＣＰＣＳＥＡ）指針の推奨による。
ｂ．本研究（抗肥満活性）についてのＣＰＣＳＥＡ承認番号はＳＡＣ／ＩＡＥＣ／ＢＣ／２０１７／ＩＰ．−００１である。
実験期間の終了時において、動物を、頚椎脱臼により屠殺し、ＥＲストレス関連遺伝子発現を研究するために器官を収集し、生化学的分析のために血清を収集した。
【００１８】
ＲＮＡ抽出
細胞を、７日目に、２回目の進行後に採取し、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ方法を用いて抽出した。抽出されたＲＮＡを、デオキシリボヌクレアーゼＩで処理して、いかなる混入ＤＮＡも除去し、再び、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出（２４：２５：１）を用いて抽出した。ＲＮＡの品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて２６０／２８０ｎｍにおける吸光度をチェックすることにより決定した。
マウス脂肪パッド、肝臓、および膵臓における遺伝子発現研究
処理された動物および未処理の動物由来の凍結器官は、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に収集され、凍結された。およそ１００ｍｇの組織を、氷中でホモジナイズし、前に記載されているように１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌで抽出した。
【００１９】
定量リアルタイムＰＣＲ
２μｇの全ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて取得した。褐色脂肪特異的遺伝子の発現を決定するために、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６において定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。βアクチンを、ハウスキーピング遺伝子として用いた。ＥＲストレスに関連した遺伝子の相対的ＲＮＡ量を、ハウスキーピングβアクチン遺伝子に対して標準化し、ΔΔＣＴ（Ｌｏｇ２により変換された倍数変化と等価）として表した。
【００２０】
ＩＲＥ１α活性化を測定するための方法
ＩＲＥ１αリン酸化レベルは、スプライスされたＸＢＰ−１産物をＲＴ−ＰＣＲにより測定することにより評価することができる。ＰＥＲＫ活性化は、それのリン酸化レベルにより測定され、またはＡＴＦ４  ｍＲＮＡレベルを測定することによる。ＡＴＦ４の活性化は、ＢｉＰ／ＧＲＰ７８などのＥＲシャペロンをコードする遺伝子を含む、遺伝子のネットワークの転写の増加をもたらす。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、タンパク質凝集物と選択的に結合することが示されている蛍光性をもつ小分子であり、フローサイトメトリーにより分析することができる。
プライマー配列：ＥＲストレス特異的遺伝子の発現を決定することのために用いられるプライマーは、表１に示されている。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
（例２）
結果
ガルシノールの膵臓ＥＲストレスへの効果
高グルコース濃度下、インビトロで膵臓β細胞においてＥＲストレスが誘導される。これらの細胞は、５〜１０ｍＭのグルコース中で増殖され、グルコース濃度が増加するにつれて、その細胞はストレスを受け、最終的に、より高い濃度においてアポトーシスを起こす。
ガルシノール処理は、高血糖により誘発された毒性を、メトホルミン（１００μＭ）に匹敵する効果で、用量依存性様式で低下させ（図１）、それにより、膵臓β細胞株におけるグルコース誘発性毒性からの保護を与えた。ガルシノール処理はまた、膵臓細胞におけるグルコースの高濃度により誘導されたタンパク質凝集を低下させ（図２）、ＥＲストレスを低下させた。
【００２３】
ガルシノールはまた、マウスにおいて高脂肪誘発性膵臓毒性および血清グルコースレベルからの保護を与えた。ガルシノールは血清グルコースレベルを有意に低下させ（図３）、それが、肥満による糖尿病を防止することにおいて有用であり得ることを示唆した。ＥＲストレスマーカーの相対的発現は、固形飼料給餌での対照動物と比較して、高脂肪食で維持された動物の膵臓において上方制御された。ガルシノール処理は、ＨＦＤ（高脂肪食）給餌動物においてＥＲストレスマーカーを低下させた（図４）。これらの結果は、ガルシノール処理が、マウス膵臓において高脂肪食により誘導されたＥＲストレスを効果的に低下させることができ、そのことが、次に、これらの動物においてより低い血清グルコースレベルを生じる。したがって、ガルシノールは、ＥＲストレスを低下させることにより糖尿病を軽減するのに役立ち得る。
【００２４】
ガルシノールの肝臓におけるＥＲストレスへの効果
パラセタモール誘発性肝臓毒性へのガルシノールの効果を測定した。ガルシノールは、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度において、予防として（図５ａ）および治療として（図５ｂ）、パラセタモール誘発性毒性から肝臓細胞を保護した。
アルコール誘発性毒性を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞を、異なる濃度のガルシノールの存在下で、１０００ｍＭのエタノールに７２時間、曝露し、保護を、ＳＲＢアッセイにより評価した。ガルシノールは、アルコール誘発性毒性からの肝保護を１０μｇ／ｍｌの濃度において４７％、与えた（図６）。
ヒト肝臓細胞におけるタプシガルジン誘導性ＥＲストレスへのガルシノールの効果もまた評価した。ヒト肝臓細胞株（ＨｅｐＧ２）を、１０％熱失活したウシ胎仔血清、抗生物質と共に２５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ中、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエントになった時、それらをトリプシン処理し、洗浄し、ウェルあたり５×１０3個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。初代肝細胞をマウス肝臓から単離した。細胞を、ＥＲストレスを誘導するために１μＭタプシガルジンと共にＤＭＥＭ中、３時間、培養した。タプシガルジンと共に、１０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌでのガルシノールを用いた。未処理の細胞を対照として用い、フェニル酪酸（ＰＢＡ）を陽性対照として用いた。処理された細胞および未処理の細胞をフローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ガルシノールは、１０μｇ／ｍｌの濃度で、タンパク質凝集をヒト肝臓細胞において４４．４％、マウス初代肝細胞において７０．４％、有意に低下させた。ガルシノールはまた、ＥＲストレスマーカーｓＸＢＰ  １およびＧＲＰ７８の発現を低下させ（図８）、ガルシノールが、タンパク質凝集の増加のせいで生じたＥＲストレスを低下させるのに有効であることを示した。
ガルシノールは、マウスにおける高脂肪誘発性肝臓毒性において肝臓質量を有意に低下させ（図９）、それが肥満による脂肪肝を防止するのに有用であり得ることを示唆した。ＥＲストレスのマーカー  −  ＳＸＢＰ、ＧＲＰ７８、およびＡＴＦ４の発現もまた、マウスモデルにおける高脂肪誘発性肝臓毒性においてガルシノールにより有意に低下し（図１０）、肝臓保護剤としてのそれの使用を示唆した。
【００２５】
脂肪細胞におけるＥＲストレスへのガルシノールの効果
ガルシノールは、脂肪細胞（図１１ａ）と脂肪パッド（図１１ｂ）の両方においてストレスマーカー  −  ＳＸＢＰ、ＧＲＰ７８、およびＡＴＦ４の発現を有意に減少させ、ガルシノールが、マウスの脂肪組織において高脂肪食誘発性ストレスにおけるＥＲストレスを低下させるのに有効であり、マウスにおいて脂肪生成および肥満を低下させることを示した。
【００２６】
これらの結果は、ガルシノールが、膵臓、肝臓、および脂肪細胞におけるＥＲストレスを低下させることにより、２型糖尿病、肝臓損傷、および脂肪生成から保護することを示唆している。ガルシノールの、糖尿病、肝臓毒性、および肥満（高脂肪食）（それらは全て、メタボリックシンドロームの発生についての重要な因子の一つである（Alberti et al., (2005), The metabolic syndrome-a new worldwide definition, The Lancet, Volume 366, No. 9491, p1059-1062））においてＥＲストレスを緩和する能力により、ガルシノールは、ＥＲストレスを低下させる機構によりメタボリックシンドロームを低下させる。
【００２７】
本発明への他の改変およびバリエーションは、前述の開示および教示から当業者に明らかであろう。したがって、本発明のある特定の実施形態だけが本明細書に具体的に記載されているが、多数の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それらになされ得ることは明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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