(57)【要約】本発明は、膵臓癌の治療においてシナジー効果を奏することができる、ゴシポールおよびフェンホルミンを含む薬学的組成物を提供するものである。本発明で提供する濃度範囲でゴシポールおよびフェンホルミンを混合して膵臓癌の治療に適用すれば、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独投与によって有意な膵臓癌治療効果が得られない濃度範囲でも、併用投与によって膵臓癌死滅効果が著しく増加して効果的な膵臓癌の治療が可能である。また、ゴシポールおよびフェンホルミンに加えて、抗癌剤を混合して膵臓癌の治療に適用すれば、癌細胞死滅効果が著しく増加できるので、効果的な膵臓癌の治療が可能である。【選択図】図１０Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴシポールおよびフェンホルミン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む膵臓癌予防および治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記ゴシポールは、下記化学式１の化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物：
【化１】
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【請求項３】
前記フェンホルミンは、下記化学式２の化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物：
【化２】
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。
【請求項４】
前記ゴシポールおよびフェンホルミンは、１：１０〜１：５００のモル比率で混合されることを特徴とする、請求項１に記載の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の薬学的組成物に、抗癌剤を追加的にさらに含む、膵臓癌予防および治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗癌剤は、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）およびパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）からなる群より選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記薬学的組成物は、ゴシポール、フェンホルミンおよび抗癌剤を０．１〜１０：１０〜５００：１のモル比率で混合して含むことを特徴とする、請求項５に記載の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物。
【請求項８】
ゴシポールおよびフェンホルミン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、経口投与製剤。
【請求項９】
前記ゴシポールおよびフェンホルミンは、６０日以上の相乗的治療効果を示すことを特徴とする、請求項８に記載の経口投与製剤。
【請求項１０】
前記経口投与製剤は、徐放性または制御放出性製剤であることを特徴とする、請求項８に記載の経口投与製剤。
【請求項１１】
請求項８に記載の経口投与製剤に、抗癌剤を追加的に含む、経口投与製剤。
【請求項１２】
前記抗癌剤は、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）およびパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）からなる群より選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする、請求項１１に記載の経口投与製剤。
【請求項１３】
有効な量のゴシポールおよびフェンホルミンを必要な個体に投与する段階を含む、膵臓癌予防または治療方法。
【請求項１４】
有効な量のゴシポールおよびフェンホルミンとともに、抗癌剤を追加的にさらに含むことで、必要な個体に投与する段階を含む、膵臓癌予防または治療方法。
【請求項１５】
膵臓癌予防および治療に使用するための、ゴシポールおよびフェンホルミンを有効成分として含む薬学的組成物の用途。
【請求項１６】
膵臓癌予防および治療に使用するための、ゴシポールおよびフェンホルミンとともに、抗癌剤を追加的にさらに含む薬学的組成物の用途。
【請求項１７】
経口投与製剤として使用するための、ゴシポールおよびフェンホルミンの用途。
【請求項１８】
経口投与製剤として使用するための、ゴシポール、フェンホルミンおよび抗癌剤の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年２月２２日付で出願された大韓民国特許出願第１０−２０１７−００２３４０６号を優先権として主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、膵臓癌の治療においてシナジー効果を奏することができる、ゴシポールおよびフェンホルミンを含む薬学的組成物を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
癌とは、個体の必要に応じて規則的で節制ある増殖と抑制が可能な正常細胞とは異なり、組織内で必要な状態を無視し無制限の増殖をする未分化細胞から構成された細胞塊であって腫瘍ともいう。このような無制限の増殖をする癌細胞は周りの組織に浸透し、さらに深刻な場合は、身体の他の器官に転移して深刻な苦痛を伴い、やがて死を招く難病である。
【０００４】
癌は、血液癌と固形癌とに大きく分類され、膵臓癌、乳癌、口腔癌、肝臓癌、子宮癌、食道癌、皮膚癌など身体のほぼすべての部位で発生し、これらの治療方法として、最近、グリベックまたはハーセプチンのような少数の標的治療剤が特定の癌の治療に用いられているが、現在までは手術や放射線療法および細胞増殖を抑制する化学療法剤を用いた抗癌剤治療が主な方法である。しかし、標的治療剤ではないことから、既存の化学療法剤の最も大きな問題は細胞毒性による副作用と薬剤耐性であって、抗癌剤による初期の成功した反応にもかかわらず、結局は治療に失敗する主因である。したがって、このような化学療法剤の限界を克服するためには、抗癌作用機序が明確な標的治療剤の開発が持続的に必要である。
【０００５】
なかでも、膵臓癌は世界的に癌死亡原因の７位を占めており、韓国国内では死亡原因５位と報告されている。膵臓癌は、子宮癌、乳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、肺癌、肝臓癌などの他の部位の癌疾患に比べて攻撃的な疾患であるが、これを診断することは非常に難しいという欠点がある。また、膵臓癌は急性に発症し、診断が遅れ、低い生存率を示す最も深刻な悪性腫瘍の一つである。よって、肺癌のような他の種類の癌は平均生存率が上昇するのに対し、膵臓癌は診断および治療が難しくて生存率がむしろ下落する傾向を示している。
【０００６】
最も代表的な癌である肺癌と比較した時、膵臓癌は、他の臓器で癌が発症したという根本的な相違のみならず、異なる臨床病理学的特徴および分子生物学的特徴を示していて、治療に相違がある。分子生物学的に約９０％の大部分の膵臓癌において癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるｒａｓ遺伝子の変異が現れると報告されていて、ｒａｓ癌遺伝子の変異が１０％水準と低くなる肺癌などとは治療的観点が異なる。その他にも、大部分の膵臓癌患者では、肺癌患者に比べて非常に攻撃的な経過および生物学的特徴を示し、これによって悪い予後につながるという危険性を有する。膵臓癌患者は局所進行性であり、切除術を実施しにくい点が多く、転移性の疾患を一般的に示し、たびたび集中治療による副作用に敏感に反応する。患者のたった１０〜１５％だけが手術的切除で治療できる形であり、手術で根本的な治療をした後にも再発の割合が非常に高い状態で残っている。
【０００７】
したがって、膵臓癌をより効果的に治療できる抗癌剤の開発およびこれを用いる治療戦略に関する研究が持続的に行われているが、最近注目されているターゲット治療剤や免疫治療剤が臨床で実際に適用される範囲は、肺癌、乳癌、胃癌などのような代表的な癌疾患で適用される限界があり、これに比べて、膵臓癌でも同一の効果を奏し得ない場合が多く報告されている。したがって、膵臓癌に対する新たな治療戦略に対するニーズが高まっている。
【０００８】
ゴシポールは、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐ．）から誘導される、天然に存在する二重ビフェノール性化合物である。生体内でＡｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ）の抑制剤として知られていて、これを用いた治療用途について研究されている。男性避妊剤としてのゴシポールの人体実験は、これら化合物の長期間投与の安全性を示すことが報告されている。
【０００９】
フェンホルミン（Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）は、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）のようなビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系の薬物で糖尿病治療剤として知られている。しかし、フェンホルミンのようなビグアニド系の薬物が炭水化物代謝と脂質代謝を生理的に調節する核心酵素であるＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）を活性化させて、ｐ５３遺伝子が欠如した癌の治療に効果的と知られ始めるにつれ、フェンホルミン薬物の抗癌効果に関する研究が進められ、フェンホルミンの抗癌効果に対する可能性が裏付けられた。
【００１０】
このように、ゴシポールおよびフェンホルミンに対するそれぞれの抗癌効果については知られているが、膵臓癌でこれらを併用処理した時の相乗効果についてはまだ研究されていない。
【００１１】
したがって、本発明者らは、少ない用量でも相乗的抗癌効果を奏することができる膵臓癌治療剤を発掘するために努力した結果、膵臓癌細胞の生長抑制効果が、ゴシポールおよびフェンホルミンを混合して併用処理した時、それぞれの単独処理より有意に増加するシナジー効果を奏することができることを確認し、膵臓癌マウスモデルでも腫瘍の重量および体積の増加においてゴシポールおよびフェンホルミンの併用投与でシナジー効果を奏することができることを確認した。また、本発明者らは、ゴシポールおよびフェンホルミンにイリノテカン、ゲムシタビンまたはパクリタキセルを混合して、三重組み合わせ薬物として膵臓癌に処理した時、膵臓癌増殖抑制効果がより著しく増加できることを確認して、本発明のゴシポールおよびフェンホルミンを含む薬学的組成物が膵臓癌の治療においてそれぞれの薬物を少量投与してもシナジーの抗−膵臓癌効果を奏することができることを確認することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明者らは、膵臓癌の治療効果において、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用投与した時、単独投与時より有意なシナジー効果を奏することができることを確認することにより、本発明を完成した。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の目的を達成するために、本発明は、ゴシポールおよびフェンホルミンを有効成分として含む膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ゴシポールおよびフェンホルミンに、抗癌剤を追加的にさらに含む、膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、有効な量のゴシポールおよびフェンホルミンを必要な個体に投与する段階を含む、膵臓癌予防または治療方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、有効な量のゴシポールおよびフェンホルミンとともに、抗癌剤を追加的にさらに含むことで、必要な個体に投与する段階を含む、膵臓癌予防または治療方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、膵臓癌予防および治療に使用するための、ゴシポールおよびフェンホルミンを有効成分として含む薬学的組成物の用途を提供する。
【００１９】
なお、本発明は、膵臓癌予防および治療に使用するための、ゴシポールおよびフェンホルミンとともに、抗癌剤を追加的にさらに含む薬学的組成物の用途を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態において、前記ゴシポールは、下記化学式１の化合物であってもよく、前記フェンホルミンは、下記化学式２の化合物であってもよい：
【化１】
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；および
【化２】
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【００２１】
本発明の好ましい一実施形態において、前記ゴシポールおよびフェンホルミンは、１：１０〜１：５００のモル比率で混合される。
【００２２】
本発明の好ましい一実施形態において、前記追加的にさらに含む抗癌剤は、イリノテカン、ゲムシタビンおよびパクリタキセルからなる群より選択されるいずれか１つ以上であってもよい。
【発明の効果】
【００２３】
したがって、本発明は、ゴシポールおよびフェンホルミンを有効成分として含む膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００２４】
本発明のゴシポールは、ＡＬＤＨの発現および活性阻害剤として細胞内ＡＴＰの欠乏が誘発されて癌細胞が死滅できる役割を果たし、フェンホルミンは、ミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤としてミトコンドリア膜電位を減少させてＡＴＰの欠乏現象の相乗効果を奏することができるので、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理した時、それぞれの単独処理に比べて有意に増加した膵臓癌成長抑制効果を提供することができる。
【００２５】
同時に、ゴシポールおよびフェンホルミンに加えて、イリノテカン、ゲムシタビンまたはパクリタキセルを混合した三重薬物を処理した時、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理することに比べてより有意に増加した膵臓癌成長抑制効果を提供することができる。
【００２６】
したがって、本発明の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を用いて膵臓癌を治療する場合、低い濃度の薬物だけでも有意な膵臓癌細胞増殖抑制および腫瘍成長抑制効果を奏することができるので、正常細胞の生存には影響を及ぼすことなく特異的に膵臓癌のみを死滅することができて、効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、多様な膵臓癌細胞株におけるアルデヒド脱水素酵素（Ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＬＤＨ）の同型タンパク質の発現レベルの確認を示す。
【００２８】
【図２】図２は、多様な膵臓癌細胞株におけるＡＬＤＨの活性の確認を示す。
【００２９】
【図３】図３は、多様な膵臓癌細胞株におけるゴシポールまたはフェンホルミンの単独投与による細胞増殖阻害効果を示す。
【００３０】
【図４】図４は、Ｍａｉａｐａｃａ２、Ｐａｎｃ−１およびＡｓｐｃ−１の膵臓癌細胞株におけるゴシポールおよびフェンホルミンの併用処理による細胞増殖阻害のシナジー効果を示す：
【００３１】
【図４Ａ】図４Ａは、５μＭのゴシポールまたは１００μＭのフェンホルミンを単独処理したり、５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミンを併用処理した時の膵臓癌細胞株増殖抑制効果を確認した図であり；および
【００３２】
【図４Ｂ】図４Ｂは、１０μＭのゴシポールまたは５００μＭのフェンホルミンを単独処理したり、１０μＭのゴシポールおよび５００μＭのフェンホルミンを併用処理した時の膵臓癌細胞株増殖抑制効果を確認した図である。
【００３３】
【図５】図５は、正常細胞株であるＩＭＲ９０におけるゴシポール、フェンホルミンまたはこれらの混合処理による細胞死滅の有無を確認した図である：
【００３４】
【図５Ａ】図５Ａは、１０μＭのゴシポールまたは１００μＭのフェンホルミンを単独処理したり、１０μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミンを併用処理した時間の経過による細胞死滅の有無をＦＩＴＣアネキシンＶ細胞自殺検出分析により確認した結果であり；および
【００３５】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＦＩＴＣ  Ｖ細胞自殺検出分析の結果を定量化した図である。
【００３６】
【図６】図６は、膵臓癌細胞株におけるゴシポールおよびフェンホルミンの併用処理によるＡＴＰの欠乏効果を確認した図である。
【００３７】
【図７】図７は、膵臓癌細胞株におけるゴシポールおよびフェンホルミンの併用処理によるミトコンドリア膜電位の減少効果を示す：
【００３８】
【図７Ａ】図７Ａは、５μＭのゴシポールまたは１００μＭのフェンホルミンを単独処理したり、５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミンを併用処理した時のミトコンドリア膜電位の減少効果を確認した図であり；および
【００３９】
【図７Ｂ】図７Ｂは、５μＭのゴシポールまたは１ｍＭのフェンホルミンを単独処理したり、５μＭのゴシポールおよび１ｍＭのフェンホルミンを併用処理した時のミトコンドリア膜電位の減少効果を確認した図である。
【００４０】
【図８】図８は、膵臓癌マウスモデルにおけるゴシポール単独投与、フェンホルミン単独投与、並びにゴシポールおよびフェンホルミンの併用投与（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）群における体重変化を示す。
【００４１】
【図９】図９は、膵臓癌マウスモデルにおけるゴシポール単独投与、フェンホルミン単独投与、並びにゴシポールおよびフェンホルミンの併用投与（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）群における腫瘍成長減少効果を示す：
【００４２】
【図９Ａ】図９Ａは、飼育日数による膵臓癌腫瘍の大きさ変化を確認した図であり；
【００４３】
【図９Ｂ】図９Ｂは、飼育終了後の各薬物処理群における腫瘍重量を確認した図であり；および
【００４４】
【図９Ｃ】図９Ｃは、飼育終了後の各薬物処理群における腫瘍の大きさを比較した図である。
【００４５】
【図１０】図１０は、多様な膵臓癌細胞株におけるゴシポール、フェンホルミンおよびイリノテカンの併用処理による膵臓癌細胞増殖阻害のシナジー効果を示す：
【００４６】
【図１０Ａ】図１０Ａは、２．５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１μＭのイリノテカンを単独処理したり、２．５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；または２．５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１μＭのイリノテカンを併用処理した時の膵臓癌細胞株増殖抑制効果を確認した図であり；および
【００４７】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１μＭのイリノテカンを単独処理したり、５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；または５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１μＭのイリノテカンを併用処理した時の膵臓癌細胞株増殖抑制効果を確認した図である。
【００４８】
【図１１】図１１は、多様な膵臓癌細胞株におけるゴシポール、フェンホルミンおよび他の抗癌剤の併用処理による膵臓癌細胞増殖阻害のシナジー効果を示す：
【００４９】
【図１１Ａ】図１１Ａは、５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１μＭのゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）を単独処理したり；５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；５μＭのゴシポールおよび１μＭのゲムシタビン；または５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１μＭのゲムシタビンを併用処理した時の膵臓癌細胞株増殖抑制効果を確認した図であり；および
【００５０】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは２０ｎＭのパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を単独処理したり；５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；５μＭのゴシポールおよび２０ｎＭのパクリタキセル；または５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは２０ｎＭのパクリタキセルを併用処理した時の膵臓癌細胞株増殖抑制効果を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００５２】
上述のように、膵臓癌は、他の部位の癌に比べて診断および治療に困難がある癌であることから、これに対する効果的な治療方法が必要で、少ない濃度の抗癌剤を併用投与してシナジー効果を得ようとする研究が進められている。
【００５３】
本発明の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を用いて膵臓癌を治療する場合、低い濃度の薬物だけでも有意な膵臓癌細胞増殖抑制および腫瘍成長抑制効果を奏することができるので、正常細胞の生存には影響を及ぼすことなく特異的に膵臓癌だけを死滅することができて、効果的である。
【００５４】
したがって、本発明は、ゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）およびフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）を有効成分として含む膵臓癌予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００５５】
本発明で提供する組成物の「ゴシポール」は、細胞内でＡＬＤＨの発現抑制剤および活性抑制剤として役割を有する。具体的には、ゴシポールは、細胞内ｓｅｒｉｎｅ−ｆｏｌａｔｅ機序においてＡＬＤＨがＮＤＡＨを生成し、これからＡＴＰが生成される細胞機序において、ゴシポールがＡＬＤＨの発現および活性抑制剤として作用して細胞内ＡＴＰの欠乏を誘発することにより癌細胞が死滅できる。前記ゴシポールは、下記化学式１の構造を有する：
【化３】
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【００５６】
本発明で提供する組成物の「フェンホルミン」は、細胞内でミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤の役割を果たす。具体的には、フェンホルミンは、ミトコンドリア複合体Ｉの活性抑制によりミトコンドリア膜電位を減少させることができ、結果的に、細胞内ＡＴＰの合成が低下するため、癌細胞が効果的に死滅できる。前記フェンホルミンは、下記化学式２の構造を有する：
【化４】
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【００５７】
本発明で提供する組成物の有効成分として含まれるゴシポールおよびフェンホルミンにおいて、薬学的に同一または類似の水準の効果を奏すると当業者に認められる、同等物および等価物の範囲をすべて含むことができる。具体的には、前記ゴシポールおよびフェンホルミンは、これらの薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒和物を選択して使用することができる。
【００５８】
本発明の薬学的組成物において、前記ゴシポールおよび前記フェンホルミンを併用投与することにより、膵臓癌増殖抑制および死滅誘導効果において有意なシナジー効果を得ることができる。この時、ゴシポールおよびフェンホルミンは、１：１０〜１：５００のモル比率で混合され、具体的には、１：１０〜１：２００のモル比率で混合されることがより好ましい。本発明の薬学的組成物により少ない濃度の抗癌剤を用いて有意に膵臓癌予防および治療効果を得ようとする観点から、前記ゴシポールおよびフェンホルミンは、１：１０〜１：１００のモル比率で混合されることがより好ましい。
【００５９】
より具体的には、本発明の薬学的組成物は、ゴシポールを１〜２０μＭの濃度で含むことができ、この時、フェンホルミンの濃度は、前述した混合比率で混合することができ、１０μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、１０μＭ〜４ｍＭ、より好ましくは、１０μＭ〜２ｍＭの濃度範囲で通常の技術者によって選択的に使用可能である。また、本発明の薬学的組成物は、フェンホルミンを５０μＭ〜１ｍＭの濃度で含むことができ、この時、ゴシポールの濃度は、前述した混合比率で混合することができ、２μＭ〜１００μＭ、好ましくは、５μＭ〜１００μＭ、より好ましくは、１０μＭ〜１００μＭの濃度範囲で通常の技術者によって選択的に使用可能である。
【００６０】
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、膵臓癌細胞におけるＡＬＤＨの発現および活性レベルが増加した（図１および図２）。よって、ＡＬＤＨ抑制剤であるゴシポールを処理した時、膵臓癌細胞の増殖が有意に抑制されることを確認し、フェンホルミンの処理によっても膵臓癌細胞の増殖抑制効果が現れることを確認した（図３）。よって、本発明者らは、ゴシポールおよびフェンホルミンを混合して膵臓癌細胞に併用処理した結果、単独処理した実験群に比べて著しく増加した膵臓癌細胞増殖抑制効果が現れることを確認した（図４）。
【００６１】
そこで、本発明者らは、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理した時、膵臓癌抑制効果の相乗効果が現れる原因を究明するために、細胞内ＡＴＰの生産レベルを確認した結果、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独処理した群に比べて、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理した時、細胞内ＡＴＰの欠乏が増加することを確認し（図６）、これと同じく、ミトコンドリア膜電位も有意に減少して、これによってもＡＴＰの欠乏効果が増加できることを確認した（図７）。
【００６２】
本発明のもう一つの具体的な実施例において、本発明者らは、生体内レベルでゴシポールおよびフェンホルミンの併用投与による膵臓癌治療効果を奏することができるかを確認すべく、膵臓癌細胞をマウスに異種移植し、ゴシポールおよびフェンホルミンを経口投与で注射して、ゴシポールおよびフェンホルミンの併用投与によって膵臓癌の重量および体積の増加レベルが著しく減少することを確認した（図８および図９）。
【００６３】
本発明のもう一つの具体的な実施例において、本発明者らは、ゴシポールおよびフェンホルミンに加えてイリノテカンを併用する、三重薬物投与による膵臓癌治療効果を確認すべく、膵臓癌細胞に対する細胞増殖抑制効果を確認した結果、ゴシポールおよび／またはフェンホルミンを単独または併用投与する場合に比べて、ゴシポール、フェンホルミンおよびイリノテカンの組み合わせで三重併用投与する場合、より膵臓癌細胞増殖抑制活性が増加してシナジー効果を奏することができることを確認した（図１０）。イリノテカンを混合する場合、シナジー効果がより増加できるにあたり、イリノテカンの代わりにゲムシタビンまたはパクリタキセルを併用投与した時、ゴシポールおよびフェンホルミンのみを処理する場合に比べて膵臓癌細胞増殖抑制効果が増加することを確認した（図１０および図１１）。
【００６４】
したがって、本発明のゴシポールは、ＡＬＤＨの発現および活性阻害剤として細胞内ＡＴＰの欠乏が誘発されて癌細胞が死滅できる役割を果たし、フェンホルミンは、ミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤としてミトコンドリア膜電位を減少させてＡＴＰの欠乏現象の相乗効果を奏することができるので、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理した時、それぞれの単独処理に比べて有意に増加した膵臓癌成長抑制効果を提供することができる。
【００６５】
また、本発明で提供する濃度範囲でゴシポールおよびフェンホルミンを混合して膵臓癌の治療に適用すれば、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独投与によって有意な膵臓癌治療効果が得られない濃度範囲でも、併用投与によって膵臓癌死滅効果が著しく増加して効果的な膵臓癌の治療が可能である。特に、膵臓癌ではＡＬＤＨの発現および活性レベルが高いが、ゴシポールによりＡＬＤＨの発現および活性を抑制して細胞内ＡＴＰの欠乏効果を増加させることができ、この時、フェンホルミンによるＡＴＰの欠乏効果が相乗作用を示すことができ、これによって膵臓癌治療効果を奏することができることから、本発明の薬学的組成物は、正常細胞の生存には影響を及ぼすことなく特異的に膵臓癌だけを死滅することができて、効果的である。
【００６６】
また、本発明の膵臓癌予防および治療用薬学的組成物には、抗癌剤を追加的にさらに含んでもよい。この時、使用可能な抗癌剤は、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスクムアルブム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、ナベルビン、パドラゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチンおよびカルムスチンからなる群より選択されたいずれか１つ以上であることが好ましいが、これに限定されず、ゴシポールのようなＡＬＤＨ抑制活性を有するか、フェンホルミンのようなビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系の薬物であってもよい。具体的には、前記抗癌剤は、イリノテカン、ゲムシタビンおよびパクリタキセルからなる群より選択されるいずれか１つ以上であることがより好ましい。より具体的には、前記抗癌剤は、薬学的に同一または類似の水準の効果を奏すると当業者に認められる、同等物および等価物の範囲をすべて含むことができ、選択される抗癌剤に対して薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒和物を選択して使用することができる。
【００６７】
本発明の薬学的組成物において、前記ゴシポール、前記フェンホルミンおよび前記抗癌剤を併用投与することにより、膵臓癌増殖抑制および死滅誘導効果において有意なシナジー効果を得ることができる。この時、ゴシポール、フェンホルミンおよび抗癌剤は、抗癌剤を０．１〜１０：１０〜５００：１のモル比率で混合することができ、具体的には、１〜７：５０〜２００：１のモル比率で混合することがより好ましい。本発明の薬学的組成物により少ない濃度の抗癌剤を用いて有意に膵臓癌予防および治療効果を得ようとする観点から、前記ゴシポールおよびフェンホルミンは、２．５〜５：１００：１のモル比率で混合されることがより好ましい。
【００６８】
より具体的には、本発明の薬学的組成物は、選択される抗癌剤を２０ｎＭ〜１０μＭの濃度で含むことができ、この時、ゴシポールおよびフェンホルミンの濃度は、前述した混合比率で混合することができる。すなわち、前記ゴシポールは、０．００２μＭ〜１００μＭ、好ましくは、０．０２μＭ〜７０μＭ、より好ましくは、０．０５〜５０μＭの濃度範囲で通常の技術者によって選択的に使用可能である。また、フェンホルミンも、前述した混合比率で混合することができ、０．２μＭ〜５ｍＭ、好ましくは、１μＭ〜２ｍＭ、より好ましくは、２μＭ〜１ｍＭの濃度範囲で通常の技術者によって選択的に使用可能である。
【００６９】
本発明の組成物を医薬品として用いる場合、本発明の薬学的組成物は、臨床投与時に多様な下記の経口または非経口投与形態に製剤化されて投与されるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分のほか、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール）を含有している。錠剤はまた、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリジンのような結合剤を含有することができ、場合によって、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩壊剤または沸騰混合物、および／または吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を含有することができる。
【００７１】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与してもよいし、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射を注入する方法による。この時、非経口投与用剤形に製剤化するために、ゴシポールおよびフェンホルミンを安定剤または緩衝剤とともに水に混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアル単位の投与型に製造することができる。前記組成物は、滅菌され／されるか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤、およびその他治療的に有用な物質を含有することができ、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティング方法によって製剤化することができる。
【００７２】
また、本発明の薬学的組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患の程度に応じて異なり、体重が６０ｋｇの成人患者を基準とする時、一般的に、０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは、０．０１〜５００ｍｇ／日であり、医師または薬剤師の判断によって、一定時間間隔で１日１回〜数回分割投与してもよい。
【００７３】
また、本発明は、ゴシポールおよびフェンホルミン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒和物を有効成分として含む、経口投与製剤を提供する。
【００７４】
さらに、本発明は、ゴシポールおよびフェンホルミン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒和物に、追加的に抗癌剤をさらに含む、経口投与製剤を提供する。
【００７５】
本発明の経口投与製剤は、６０日以上の相乗的治療効果を奏することができる。具体的には、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独投与した時は、その薬理効果の持続期間が短くて繰り返し投与による抗癌効果を期待しなければならないのに対し、ゴシポールおよびフェンホルミン；またはゴシポール、フェンホルミンおよび追加の抗癌剤を併用投与する場合には、前記単独投与時に比べて腫瘍成長抑制および癌治療効果を持続的に示すことができ、繰り返しの薬物投与に比べて効果的であり得る。
【００７６】
本発明の経口投与製剤は、徐放性または制御放出性製剤であってもよい。徐放性製剤の場合には、ゴシポールおよびフェンホルミンが同時放出されてもよいし、制御放出性製剤の場合には、ゴシポールおよびフェンホルミン、またはフェンホルミンおよびゴシポールが順次に放出できるように調節可能である。
【００７７】
本発明の経口投与製剤において、追加的に含まれる前記抗癌剤は、イリノテカン、ゲムシタビンおよびパクリタキセルからなる群より選択されるいずれか１つ以上であってもよい。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００７９】
［実施例１］
多様な膵臓癌細胞株におけるアルデヒド脱水素酵素（Ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＬＤＨ）の発現および活性レベルの確認
膵臓癌におけるＡＬＤＨの発現および活性レベルの変化を確認するために、多様な膵臓癌細胞株から確認した。
【００８０】
具体的には、Ｐａｎｃ１、ＡＳＰＣ−１、Ｍｉａｐａｃａ２、ＳＮＵ−２１３、ＳＮＵ−３２４、ＳＮＵ−４１０、Ｃａｐａｎ１、Ｃａｐａｎ２またはＢｘｐｃ−３を培養した後、細胞を破砕して細胞抽出物を得て、免疫ブロッティング分析を行った。抗−ＡＬＤＨ抗体をそれぞれ用いて多様な同型ＡＬＤＨの発現レベルをそれぞれ確認した。
【００８１】
その結果、図１に示されるように、多様な膵臓癌細胞株におけるＡＬＤＨの同型タンパク質の発現レベルが有意に増加することを確認した。多様な膵臓癌細胞株を比較した時、ＡＬＤＨ１Ａ３、３Ａ２および４Ａ１のＡＬＤＨの発現レベルが、他の同型ＡＬＤＨに比べて有意に高いことを確認した。
【００８２】
また、それぞれの細胞内ＡＬＤＨの活性を確認するために、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ分析を行った。正常細胞であるＩＭＲ９０または２９３細胞株；Ｋｒａｓ変異膵臓癌細胞株であるＭｉａｐａｃａ２、Ｐａｎｃ１、ＳＮＵ−２１３、ＳＮＵ−３２４またはＡＳＰＣ−１細胞株；またはＫｒａｓ野生型膵臓癌細胞株であるＢＸＰＣ−３細胞株を培養し、ＡＬＤＨの基質（ＢＯＤＩＰＹＴＭ−ａｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ−ｄｉｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、ＢＡＡＡ−ＤＡ）を含むＡｌｄｅｆｌｕｏｒ分析緩衝溶液に懸濁し、３７℃で４５分間培養した。その後、流細胞分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＦＬ−１チャネルを介して細胞の蛍光強度を検出した。
【００８３】
その結果、図２に示されるように、正常細胞対照群と比較した時、全体的に多様な膵臓癌細胞株におけるＡＬＤＨの活性が増加することを確認した。このような増加は、特にＫＲＡＳ変異を有する膵臓癌で増加した。
【００８４】
［実施例２］
ゴシポールまたはフェンホルミンによる膵臓癌細胞生長抑制効果の確認
ゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）またはフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）がそれぞれ膵臓癌に対して癌細胞生長抑制効果を奏することができるかを確認した。
【００８５】
具体的には、多様な膵臓癌細胞株であるＭｉａｐａｃａ−２、Ｐａｎｃ−１、Ａｓｐｃ−１、ＳＮＵ−４１０、ＳＮＵ−３２４またはＢｘｐｃ−３細胞をそれぞれ培養しながら、培養時間の増幅期に応じて、それぞれの細胞を５０００〜２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。接種後、ゴシポールまたはフェンホルミンをそれぞれのウェルに添加し、２４時間、ＣＯ２培養器で培養した。その後、それぞれのウェルに最終濃度が１０％となるように冷却した５０％（ｗ／ｖ）卜リクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＣＡ）を加えて細胞を固定した。固定した細胞外の上層液を除去し、水道水で５回程度プレートを洗浄した後、空気で乾燥（ａｉｒ  ｄｒｙ）した。乾燥後、それぞれのウェルに１％酢酸を含む０．４％（ｗ／ｖ）スルホローダミンＢ緩衝溶液（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加え、室温で１０分間放置して細胞を染色した。細胞の染色後に１％酢酸で５回洗浄して着色されていない染色薬を除去した後、空気で乾燥した。着色された染色薬は１０ｍＭトリズマ塩基（ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ）で固定化した後、プレートリーダーを用いて５１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８６】
その結果、図３に示されるように、それぞれの膵臓癌細胞にゴシポールまたはフェンホルミンを添加した時、癌細胞の増殖が有意に抑制されて薬物処理４８時間後に完全に細胞増殖が抑制される効果を示した。これによって、ゴシポールおよびフェンホルミンは、それぞれ膵臓癌細胞に対して細胞増殖抑制効果を奏することができることを確認した。
【００８７】
［実施例３］
ゴシポールおよびフェンホルミンの並行処理による癌細胞生長抑制効果の確認
＜３−１＞ゴシポールおよびフェンホルミンの並行処理による膵臓癌細胞生長抑制効果の確認
ゴシポールおよびフェンホルミンがそれぞれ膵臓癌細胞に対して増殖抑制効果を示すが、ゴシポールおよびフェンホルミンを混合した時、膵臓癌の増殖を抑制する効果が増加できるかを確認しようとした。
【００８８】
具体的には、Ｍｉａｐａｃａ２、Ｐａｎｃ−１またはＡｓｐｃ−１細胞を培養した。培養した細胞に５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；または１０μＭのゴシポールおよび５００μＭのフェンホルミンを混合した混合薬物をそれぞれの細胞に処理して同一に培養した後、前記実施例２と同様の方法でＳＲＢ分析により膵臓癌細胞で細胞生長が抑制されるにあたり、ゴシポールおよびフェンホルミンの混合投与によるシナジー効果が現れるかを確認した。
【００８９】
その結果、図４に示されるように、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独で処理した時には、薬物の処理濃度が低くて有意に細胞の生長を抑制することができなかった。これに対し、ゴシポールおよびフェンホルミンを混合して細胞に処理した時、細胞増殖抑制効果が著しく増加して、５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；または１０μＭのゴシポールおよび５００μＭのフェンホルミンを混合した混合薬物を膵臓癌細胞に処理した時、薬物処理４８時間後に完全に細胞増殖が抑制される効果を示した。
【００９０】
＜３−２＞ゴシポールおよびフェンホルミンの並行処理による正常細胞死滅の有無の確認
ゴシポールおよびフェンホルミンを並行処理した時、膵臓癌細胞に対して有意な細胞生長抑制効果を確認したので、膵臓癌細胞でない正常細胞株に対して細胞死滅の活性を示すか否かも併せて確認した。
【００９１】
まず、正常上皮細胞株ＩＭＲ９０を培養した後、培養した細胞に１０μＭのゴシポールまたは１００μＭのフェンホルミンの単独薬物またはこれらを混合した混合薬物を細胞に処理し、計２４、４８および７２時間培養した。培養した細胞は培地を除去して、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１，４００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、１×１０６細胞／ｍＬｄｍｌの濃度で結合緩衝溶液を加えた。そして、１００μＭの緩衝溶液を５−ｍＬ培養チューブに移して、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびプロピジウムヨード（ＰＩ）をそれぞれ５μｌずつ加えた。チューブをゆっくりボルテックスして混合した後、室温の暗室で１５分間培養した。培養後、結合緩衝溶液（４００μｌ）を加え、流細胞分析器により細胞死滅の増加程度を確認した。
【００９２】
その結果、図５に示されるように、ゴシポール、フェンホルミンまたはこれらの混合を処理したＩＭＲ９０細胞において時間が経過しても有意な細胞死滅が増加しないことを確認した。これによって、本発明のゴシポールおよびフェンホルミンは、正常細胞に対しては癌細胞に比べて有意な細胞死滅効果を示しておらず、癌細胞標的の薬物として使用できると判断した。
【００９３】
［実施例４］
ゴシポールおよびフェンホルミンの並行投与によるＡＴＰ生産阻害効果の確認
膵臓癌細胞生長抑制効果においてゴシポールおよびフェンホルミンを並行投与によるシナジー効果が現れることを確認したので、このようなシナジー効果がどのような原因によって現れるかを確認しようとした。ゴシポールはＡＬＤＨの抑制剤として知られているので、ゴシポールおよびフェンホルミンを処理した時、膵臓癌細胞内におけるＡＴＰの生産レベルを確認した。
【００９４】
具体的には、Ｍｉａｐａｃａ２、Ｐａｎｃ−１またはＡｓｐｃ−１細胞を培養した。培養した細胞に５μＭのゴシポールおよび５００μＭのフェンホルミンを混合した混合薬物をそれぞれの細胞に処理して同一に培養した後、ＡＴＰ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ分析キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社の提供するプロトコルに従い、細胞内ＡＴＰのレベルを確認した。前記培養した細胞を１×１０６細胞に分けて１００μｌのＡＴＰ分析緩衝溶液を加えて細胞を溶解した後、４℃で１５，０００×ｇで２分間遠心分離して上層液のみを分離した。分離した上層液２〜５０μｌを９６ウェルプレートに移した後、最終体積がウェルあたり５０μｌとなるようにＡＴＰ分析緩衝溶液を加えた。その後、４４μｌのＡＴＰ分析緩衝溶液、２μｌのＡＴＰプローブ、２μｌのＡＴＰコンバーターおよび２μｌの展開剤混合物を含むＡＴＰ反応混合物を、前記９６ウェルプレートの各ウェルあたり５０μｌずつ加えて混合した。混合後、暗室で３０分間プレートを室温放置した後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定した値において相対的なＡＴＰのレベルを比較するために、ゴシポールおよびフェンホルミンを添加しない膵臓癌細胞に対する吸光度値を基準とし、それぞれの薬物を処理した場合の相対的な吸光度値を比較して、細胞内ＡＴＰのレベルを比較した。
【００９５】
その結果、図６に示されるように、ゴシポールまたはフェンホルミンをそれぞれ単独で処理した場合でも、薬物未処理対照群に比べて細胞内ＡＴＰのレベルが減少したが、ゴシポールおよびフェンホルミンを混合して併用処理した膵臓癌細胞においてＡＴＰのレベルがより有意に減少して、細胞内ＡＴＰ阻害効果において薬物の併用処理によるシナジー効果が現れることを確認した。
【００９６】
［実施例５］
ゴシポールおよびフェンホルミンの並行投与によるミトコンドリア膜電位の減少効果の確認
前記実施例４において、ゴシポールおよびフェンホルミンの並行投与によってＡＴＰ生産抑制効果がシナジー効果を奏することができることを確認したので、フェンホルミンの活性において変化があるか否かをさらに確認しようとした。フェンホルミンは、ミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤として知られているので、ゴシポールおよびフェンホルミンの並行投与によってミトコンドリア膜電位レベルに変化があるかを確認した。
【００９７】
具体的には、Ｍｉａｐａｃａ２、Ｐａｎｃ−１またはＡｓｐｃ−１細胞を培養した。培養した細胞に５μＭのゴシポールおよび１００μＭのフェンホルミン；または５μＭのゴシポールおよび１ｍＭのフェンホルミンを混合した混合薬物をそれぞれの細胞に処理して同一に２４時間培養した後、それぞれの細胞培養液をチャンバスライド（蛍光顕微鏡分析用）または６−ウェルプレート（流細胞分析器分析用）に分注した。分注した培養液に、蛍光プローブである１００ｎＭのテトラメチルローダミンエステル（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒhｏｄａｍｉｎｅ  ｅｓｔｅｒ、ＴＭＲＥ）を処理し、２０分間反応した。反応後、冷却したＰＢＳで細胞を洗浄し、ａ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｂａｄｅｎ−Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞の蛍光発色度を測定した。これとともに、５８５ｎｍ（ＦＬ−２）チャネルを用いて流細胞分析器で蛍光強度を分析した。
【００９８】
その結果、図７に示されるように、２４時間薬物を処理して細胞を培養した結果、５μＭのゴシポール、１００μＭのフェンホルミンまたは１ｍＭのフェンホルミンで単独処理した場合では、ミトコンドリア膜電位が薬物未処理対照群により増加するか、類似の水準で現れた。これに対し、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理した膵臓癌細胞の場合、ミトコンドリア膜電位が著しく減少したことを確認した。
【００９９】
［実施例６］
膵臓癌モデルにおけるゴシポールおよびフェンホルミンの併用投与による抗癌効果の確認
ゴシポールおよびフェンホルミンを併用処理する方が、それぞれを単独処理することに比べて、シナジーで上昇した癌細胞生長抑制効果を奏することができることを細胞レベル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で確認したので、この後、生体内（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ）レベルでも膵臓癌抑制効果を奏することができるかを確認した。
【０１００】
まず、膵臓癌マウスモデルを作るために、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ−ｎｕマウス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＫＹ、ＵＳＡ）を用意した。また、５．０×１０６のＭｉａｐａｃａ２膵臓癌細胞株を培養し、前記用意したマウスに１ｍｌのシリンジで皮下注射した。２週間マウスを飼育して、それぞれ６匹ずつ、計４つの群に分けて、これらをそれぞれ溶媒対照群（１０％ＤＭＳＯ、４０％ＰＥＧ、５０％ＰＢＳ）、４０ｍｇ／ｋｇ／１００μｌのゴシポール単独投与群、１００ｍｇ／ｋｇ／１００μｌのフェンホルミン単独投与群およびゴシポール＋フェンホルミン併用投与群として使用した。それぞれのマウス群には溶媒または薬物を毎日１回ずつ経口投与し、計６１日間、同じ環境で飼育した。飼育しながら、毎３日ごとに、マウス群の体重および腫瘍の大きさを確認して平均を求めた。膵臓癌細胞の注入後、初期腫瘍の大きさはキャリパー（ｃａｌｌｉｐｅｒ）を用いて特定した。腫瘍の体積は下記数式１を用いて求めた。
【０１０１】
【数１】
2020508290.tif 000007
【０１０２】
その結果、図８および図９に示されるように、膵臓癌腫瘍が成長するマウスモデルの体重は、各実験群間の有意な差を示していないが、腫瘍の体積および重量において薬物処理によって有意な差を示すことを確認した。膵臓癌細胞株の注入により膵臓癌腫瘍を移植したマウスモデルのうち、薬物を投与しなかった溶媒対照群において持続的に腫瘍の体積が増加した。これに対し、ゴシポールまたはフェンホルミンをそれぞれ単独で投与した群では、腫瘍の体積増加の大きさがやや減少する傾向を示した。しかし、このような腫瘍の体積増加が抑制される効果は、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用投与した場合でよりシナジー効果を示して、計６０日間の膵臓癌マウスモデルの飼育後にも有意に腫瘍が増加しないことを確認した。飼育終了後、マウスを犠牲にして腫瘍の大きさおよび重量を比較した時にも、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独で投与したモデル群より、ゴシポールおよびフェンホルミンを併用投与したモデル群の腫瘍の重量および大きさの増加レベルが著しく減少することを確認した。
【０１０３】
［実施例７］
ゴシポール、フェンホルミンおよび抗癌剤の並行処理による癌細胞生長抑制効果の確認
ゴシポールおよびフェンホルミンを混合した時、有意に膵臓癌に対する抗癌効果を奏することができることを確認して、ゴシポールおよびフェンホルミンに加えてイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）を混合して、３つの薬物を同時に処理すること（ｔｒｉｐｌｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、抗癌活性のシナジー効果を奏することができるかを確認しようとした。
【０１０４】
具体的には、Ｍｉａｐａｃａ２、Ｐａｎｃ−１、ＣＡＰＡＮ１、ＣＡＰＡＮ２、ＡＳＰＣ−１、ＳＮＵ−２１３、ＳＮＵ−３２４またはＢＸＰＣ−３細胞を培養した。それぞれ培養した細胞にゴシポール、フェンホルミンおよびイリノテカンを単独または混合した薬物をそれぞれの細胞に処理した。薬物を処理した後、細胞を４８時間培養した後、前記実施例２と同様の方法でＳＲＢ分析により膵臓癌細胞における細胞生長が抑制されるにあたり、ゴシポール、フェンホルミンおよびイリノテカンの混合投与によるシナジー効果が現れるかを確認した。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）として薬物を処理しない未処理群を用い、前記対照群に比べてそれぞれの薬物処理群の相対的な細胞増殖の程度を示して百分率で計算した。
【０１０５】
その結果、図１０に示されるように、ゴシポールまたはフェンホルミンを単独投与した群に比べると、イリノテカンを１μＭの濃度で処理した実験群における膵臓癌細胞の増殖程度が有意に減少することを確認した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。ゴシポールおよびフェンホルミンを並行処理した二重薬物処理群においては、単独投与群に比べてより膵臓癌細胞の増殖レベルが減少することを確認し、ゴシポール、フェンホルミンおよびイリノテカンを並行処理した三重薬物処理群において膵臓癌細胞増殖抑制効果が著しく増加して、膵臓癌細胞の増殖が抑制されるだけでなく、死滅効果まで同時に現れることを確認した。
【０１０６】
これとともに、ゴシポールおよびフェンホルミンと並行処理する抗癌剤として、イリノテカンの代わりにゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）またはパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を処理した後、ＳＲＢ分析を同一の方法で行って膵臓癌細胞の増殖レベルを確認した。
【０１０７】
その結果、図１１に示されるように、ゴシポール、フェンホルミンおよびゲムシタビンを並行処理した実験群、およびゴシポール、フェンホルミンおよびパクリタキセルを並行処理した実験群ともにおいて、ゴシポールおよびフェンホルミンの二重薬物を並行処理した実験群に比べて膵臓癌細胞の増殖レベルが有意に減少して、膵臓癌細胞に対する抗癌活性においてシナジー効果を示すことを確認した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
【図１】
2020508290.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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