(57)【要約】  本発明の細胞外小胞体分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能と、細胞外小胞体に特異的に結合するプローブの特性とを利用したもので、これを利用して、試料中に含まれている細胞外小胞体の定量分析、細胞外小胞体の物理化学的特性の分析、細胞外小胞体に含まれている構成成分の種類及び定量分析、細胞外小胞体の構成成分に対するプローブの結合特異性又は親和度分析を、迅速かつ容易にすることができる。また、本発明の分析方法を利用すれば、試料の精製又は前処理過程なしに試料中の細胞外小胞体を正確に分析することができるだけでなく、プローブの種類によって、細胞外小胞体の構成成分を簡単かつ正確に分析することができるので、細胞外小胞体を利用した診断効率を向上させることができる。また、プローブの特異性及び親和度の分析を利用して、細胞外小胞体特異的な抗体スクリーニング、タンパク質スクリーニング、化学物質スクリーニングなどに活用することができる。
2020535416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階；
（b）前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階；及び
（c）前記展開された試料から細胞外小胞体−プローブ複合体及び遊離プローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法。
【請求項２】
前記プローブは、
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含む単一物質；又は
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部を含む物質に、分析可能な一つ以上の信号部を含む物質が結合された複合物質である、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項３】
前記プローブの結合部は、細胞外小胞体の膜表面成分、細胞外小胞体の膜成分及び細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される一つ以上の成分と特異的に結合する、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項４】
前記プローブは、タンパク質、抗体、抗体由来の物質、ペプチド、核酸、核酸アミノ酸複合体、酵素、酵素基質、化学的リガンド及びこれらの化合物からなる群から選択される一つ以上である、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項５】
前記プローブは、蛍光物質、酵素基質、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、ビオチン、金属及び放射性同位元素からなる群から選択される一つ以上の信号部を含む、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項６】
前記検出段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含む、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項７】
前記特定の波長は、200 nm〜800 nmの範囲で選択される一つ以上の値である、請求項６記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項８】
前記検出段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含む、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項９】
前記プローブの信号部を検出する段階は、分光学的分析、物理化学的分析、量子化学的分析、酵素学的分析、ビオチン分析及び核酸分析からなる群から選択される一つ以上の方法を含む、請求項８記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１０】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、眼房水、汗、尿、糞、脳脊髄液（CSF、cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１１】
（a）細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階；
（b）前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階；及び
（c）前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムから細胞外小胞体−プローブ複合体を分離する段階；及び
（d）前記分離された細胞外小胞体−プローブ複合体からプローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１２】
前記プローブは、
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含む単一物質；又は
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部を含む物質に、分析可能な信号部を含む物質が結合された複合物質である、請求項１１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１３】
前記プローブの結合部は、細胞外小胞体の膜表面成分、細胞外小胞体の膜成分及び細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される一つ以上の成分と特異的に結合する、請求項１１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１４】
前記プローブは、タンパク質、抗体、抗体由来の物質、ペプチド、核酸、核酸アミノ酸複合体、酵素、酵素基質、化学的リガンド及びこれらの化合物からなる群から選択される一つ以上である、請求項１１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１５】
前記プローブは、蛍光物質、酵素基質、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、ビオチン、金属及び放射性同位元素からなる群から選択される一つ以上の信号部を含む、請求項１１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１６】
前記検出段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含む、請求項１１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１７】
前記特定の波長は、200 nm〜800 nmの範囲で選択される一つ以上の値である、請求項１６記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１８】
前記検出段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含む、請求項１１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項１９】
前記プローブの信号部を検出する段階は、分光学的分析、物理化学的分析、量子化学的分析、酵素学的分析、ビオチン分析、放射線分析及び核酸分析からなる群から選択される一つ以上の方法を含む、請求項１８記載の細胞外小胞体の分析方法。
【請求項２０】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、眼房水、汗、尿、糞、脳脊髄液（CSF、cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを利用した細胞外小胞体の分析方法及びその使用に関するものであって、より具体的には、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能と、細胞外小胞体に特異的に結合するプローブとを利用して、試料中に含まれている細胞外小胞体を分析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞体（extracellular vesicles、EV）は、細胞の普遍的なメカニズムで、生体内又は試験管内の多数の種類の細胞から分泌されるナノサイズの生体粒子として、血液、尿、唾液、涙などのような体液に存在して、細胞から由来した脂質二重層を含み、20〜1000 nmの範囲の様々なサイズを有する膜構造の小胞体である。
【０００３】
これらの細胞外小胞体は、様々な生命現象から多数の重要な機能に関与する。真核細胞から由来した細胞外小胞体の場合、赤血球分化、免疫反応の調節などに関与し、特に癌細胞の微小環境では、癌の進行、転移、血管形成などに関する多くの機能が明らかになったことにより、癌を含む様々な疾患の診断マーカーへの活用において高い関心を浴びている。
【０００４】
原核細胞から分泌される細胞外小胞体は、真核細胞の細胞外小胞体と類似して原核細胞の構成物を含有しており、人体では、全身炎症をはじめ、流入経路によって急性肺炎症疾患を誘導し、皮膚の場合、局所皮膚組織の炎症反応を慢性的に誘導して、現代人の代表疾病の一つであるアトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）の原因ともなることが報告された。また、人体において、バクテリア由来の細胞外小胞体が、癌をはじめ、様々な疾患などとの関連性があることが報告されることにより、原核細胞由来の細胞外小胞体もまた高い関心を浴びている。
【０００５】
細胞外小胞体は、タンパク質、脂質、核酸、アミノ酸など母細胞から由来した物質で構成されており、生体では、これらの物質を伝達する輸送体の役割をするため、細胞外小胞体を構成するタンパク質、脂質、アミノ酸、核酸などを分析することにより、母細胞の生理的、病理的特性を知ることができる重要な根拠となる。したがって、様々な試料に存在する細胞外小胞体の構成成分の分析は、基礎及び医学分野で高い関心を受けている。
【０００６】
また、細胞外小胞体に含まれている核酸、成長ホルモン、タンパク質などは、細胞膜形態のリン脂質により保護されており、可溶性形態の成長因子及びサイトカインより安定的な機能を遂行できることが知られ、細胞外小胞体の重要性が漸次増大しており、細胞外小胞体に含まれている物質を分析して、疾病の診断、治療を含む様々な用途への活用可能性が期待されている。
【０００７】
最近、非侵襲的液体生検（liquid biopsy）を疾病診断に活用する案が多角的に展開されており、さらには体液内の細胞外小胞体を活用して、新しい疾病の診断マーカーを発掘して、これを利用して診断方法を開発しようとする努力が試みられている。診断方法の開発において重要な要素は、プローブを利用して、少量の試料において迅速かつ正確に対象物質を定量する技術開発にある。したがって、生物学的試料に存在する細胞外小胞体の構成成分を、プローブを利用して分析する方法が極めて重要であるものの、このような細胞外小胞体の構成成分の分析は、段階が複雑で効率が落ちる超遠心分離技術を通じた精製に基づいて行われており、これらの超遠心分離法では、細胞外小胞体分離収率が低く、細胞外小胞体と結合していないプローブの除去が効率的に行われていないため、相対的に制限された量と高い複雑性を示す体液の場合、前記の方法で定量的な分析をすることは殆ど不可能である。したがって、通常の細胞外小胞体分析法とは差別化される、迅速でかつ過程が単純な新規技術の開発が急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
［発明の具体的な説明］
［技術的課題］
本発明の目的は、（a）細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階、（b）前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階、及び（c）前記展開された試料から細胞外小胞体−プローブ複合体及び遊離プローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、（a）細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階、（b）前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階、及び（c）前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムから細胞外小胞体−プローブ複合体を分離する段階、及び（d）前記分離された細胞外小胞体−プローブ複合体からプローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［技術的解決方法］
本発明は、上述した問題点を解決するためのもので、細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する様々な物質をプローブとして使用して、試料と反応させることにより、細胞外小胞体−プローブ複合体を形成し、これをサイズ排除クロマトグラフィーで展開させた後、プローブを検出することにより、細胞外小胞体を分析する方法を提供する。
【００１１】
本発明において、“サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、SEC）”とは、様々な大きさの溶質が多孔性マトリックスを通過する速度（透過度）を基盤に、混合物を分離する技術を意味する。つまり、分析対象試料を、ゲル、マトリックス、ビーズ（bead）などの多孔性固定相（stationary phase）が満たされたカラムを通過させると、カラムの穴を通過できない大きな分子は穴に入れず周辺の空間を通って速やかにカラムを抜け出す反面、小さい分子はカラムの穴を通り抜けながら相対的に徐々に移動してカラムを抜け出る原理を利用したものである。この方法は、一般的に緩衝液交換（buffer exchange）のための脱塩（desalting）、精製のための分離又は溶質サイズによる分子量の測定に使用される。
【００１２】
本発明では、細胞外小胞体を含む様々な試料に特異的に結合するプローブを反応させて、細胞外小胞体−プローブ複合体を形成し、これをサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通過させることにより、前記複合体と遊離プローブとを迅速かつ容易に分画することができ、次の段階でこのように分離された溶出物を分析することにより、細胞外小胞体の定量分析及び構成成分の分析を容易かつ効率的に行うことができる。
【００１３】
本発明の用語“細胞外小胞体”とは、古細菌（Archaea）、原核生物（Prokarya）又は真核生物（Eukarya）の細胞から由来した生体ナノ粒子を通称し、細胞外小胞体（exosome）、アルゴソーム（argosomes）、デキソソーム（dexosomes）、エクトソーム（ectosomes）、エキソベジクル（exovesicle）、オンコソーム（oncosome）、プロミノソーム（prominosome）、プロスタソーム（prostasome）、トレロソーム（tolerosome）、微小粒子（microparticle）、微小小胞（microvesicle）、ナノ小胞（nanovesicle）、水疱性小胞（blebbing vesicle）、出芽性小胞（budding vesicle）、細胞外小胞体類似小胞（exosome-like vesicle）、マトリックス小胞（matrix vesicle）、膜小胞（membrane vesicle）、脱皮性小胞（shedding vesicle）、膜粒子（membrane particle）、脱皮性微小小胞（shedding microvesicle）、膜水泡（membrane bleb）、エピディディモソーム（epididimosome）、プロミニノソーム（promininosome）、テキソソーム（texosome）又はアキオソーム（archeosome）を含めることができるが、これに限定されるものではない。
本発明による細胞外小胞体分析方法を図１に模式的に示した。
【００１４】
本発明の細胞外小胞体分析方法は、細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体とを含む試料を混合して反応させる段階[（a）段階]を含む。
【００１５】
本発明の用語“プローブ（probe）”とは、細胞外小胞体を構成する成分と特異的に結合すると同時に、分光学的、物理化学的、量子化学的、酵素学的分析方法などを利用して検出及び分析が可能な物質を意味する。
【００１６】
本発明において、前記プローブは、i）細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含む単一物質又は、ii）細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部を含む物質に分析可能な一つ以上の信号部を含む物質が結合された複合物質でもある。
【００１７】
細胞外小胞体は、二重脂質膜に囲まれていて、タンパク質、脂質、核酸、アミノ酸など母細胞から由来した物質で構成されており、これらは成分によって細胞外小胞体の膜表面、細胞外小胞体の膜又は細胞外小胞体の内部に分布する。本発明において前記プローブの結合部は、前記のような細胞外小胞体の膜表面成分、細胞外小胞体の膜成分及び細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される一つ以上の成分と特異的に結合する特徴を有する。
【００１８】
本発明の前記プローブは、細胞外小胞体を構成する成分のうち、一つ以上の物質と特異的に結合するタンパク質、抗体、抗体由来の物質、ペプチド、核酸、核酸アミノ酸複合体、酵素、酵素基質、化学的リガンド及びそれらの化合物からなる群から選択できるが、これに限定されない。前記プローブは細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合すると同時に、検出段階で検出可能な物質でもある。本発明の一実施例によれば、細胞外小胞体の内部成分であるエステル分解酵素（esterase）の基質の一つであるVPD450又はCFDA-SEをプローブとして使用した。前記基質は、細胞外小胞体のうちエステル分解酵素と特異的に結合すると同時に、酵素活性によって蛍光物質に変換することができて、別の標識無しで蛍光信号の検出が可能である。
【００１９】
本発明の前記プローブは、細胞外小胞体を構成する成分のうち、一つ以上の物質と特異的に結合する物質に検出可能な信号部をさらに含むことができる。前記プローブの信号部は、蛍光物質、酵素基質、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、ビオチン、金属及び放射性同位元素からなる群から一つ以上が選択されることがあるが、これに限定されない。本発明の一実施例によれば、細胞外小胞体の膜表面タンパク質を認識する抗体に蛍光標識を付着したプローブを使用した。
【００２０】
本発明の用語“試料”とは、細胞外小胞体を含む生体試料又は細胞培養液、組織試料などを含むものであって、具体的に哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、眼房水、汗、尿、糞、脳脊髄液（CSF、cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から一つ以上が選ばれるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明の細胞外小胞体分析方法は、前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階[（b）段階]を含む。
【００２２】
本発明の用語“カラム”とは、サイズ排除クロマトグラフィーに使用される多孔性固定相が満たされた単位であり、前記固定相は、分子量によって物質を分画するための様々なサイズの穴がある粒子を意味する。前記固定相に存在する穴の大きさによって、試料内に存在する分子の分子サイズによる分離能が変わるようになる。例として、固定相に存在する穴が大きい場合は、相対的に大きい分子の分離に効率的で、比較的小さい分子は分離されずに溶出される。一方、固定相に存在する穴の大きさが小さい場合、大きな分子の分離の程度は低く溶出されるが、一定の大きさ以上と以下の分子を分離するには効率的である。従って、通常的には分離しようとする分子の大きさと、試料内の汚染物質の大きさを考慮して、最適の分離効率を提供する大きさの穴を有する固定相を選択することになる。サイズ排除クロマトグラフィーで最も広く使用されるゲルはセファロース（Sepharose； GE Healthcare）、スーパーロース（Superose； GE Healthcare）、セファデックス（Sephadex； Pharmacia）、Bio-Gel P（Bio-Rad）及びTSKgel（silica-based； Sigma）などの系列であり、本発明の一実施例では、ナノ粒子の細胞外小胞体を、様々なサイズのタンパク質と分離することができるサイズの穴を有するセファクリル（Sephacryl）S500固定相を使用したが、これに限定されるものではない。本発明のサイズ排除クロマトグラフィーの展開方式はポンプ式、スピン式、重力式などがあるがこれに限定されない。
【００２３】
本発明の細胞外小胞体の分析方法は、前記展開された試料から細胞外小胞体−プローブ複合体及び遊離プローブを検出する段階[（c）段階]を含む。
【００２４】
本発明の前記検出段階は、前記サイズ排除クロマトグラフィーを通じて分離された細胞外小胞体−プローブ複合体だけでなく、細胞外小胞体と結合していない遊離プローブを同時に検出することにより、目的とする分析結果を得ることができる。
【００２５】
本発明の前記検出段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含むことがでる。本発明において、前記特定の波長は、200 nm〜800 nmの範囲で選択される一つ以上の値が選択される。本発明で前記の特定波長は、330乃至450 nmの範囲の内、一つ以上の波長、230 nm、260 nm又は 280nmの波長の中から選択することができるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明の前記検出段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含むことができる。具体的には、前記プローブの信号部を検出する段階は、プローブの信号部の種類によって適切な検出及び分析方法を選択することができ、分光学的分析（吸光、蛍光、散乱、放射性）、物理化学的分析、量子化学的分析、酵素学的分析、ビオチン分析及び核酸分析からなる群から選択することができるがこれに限定されない。
【００２７】
本発明のプローブ検出段階は、プローブの信号部の性質によって直接的分析又は間接的分析を含む。プローブが有する光の波長による直接的な分光学的分析が可能な場合、プローブの蛍光信号、吸光信号、散乱信号、又は発光及び放射性信号を検出して分析することができる。プローブの信号部に付加的な処理が必要な場合、ビオチン分析、抗体分析、酵素分析、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction； PCR）分析などを利用して間接的に分析することができる。
【００２８】
本発明はさらに、試料から細胞外小胞体−プローブ複合体を分離した後、これを分析することにより、細胞外小胞体を分析する方法を提供する。
【００２９】
本発明の細胞外小胞体分析方法は、細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体とを含む試料を混合して反応させる段階[（a）段階]及び前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階[（b）段階]を含む。
【００３０】
本発明のプローブ、試料又はサイズ排除クロマトグラフィーに関する詳細な説明は、前記の通りである。
【００３１】
本発明の細胞外小胞体分析方法は、前記のサイズ排除クロマトグラフィーカラムから細胞外小胞体−プローブ複合体を分離する段階[（c）段階]を含む。
【００３２】
本発明の細胞外小胞体−プローブ複合体分離段階は、サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能を利用したもので、試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通過させると、試料中に含まれている細胞外小胞体と、その他の不純物とが、サイズが大きい順に、また時間順に溶出される。ナノ粒子である細胞外小胞体と様々なサイズのタンパク質とを分離することができるサイズの穴を有する固定相を使用すると、細胞外小胞体は分子の大きさが1000kDa以上であり、遊離プローブ又は他の不純物に比べてサイズが大きい粒子に属するため、相対的に速やかに溶出される。本発明で、試料に混合させたプローブのうち一部は、細胞外小胞体と特異的に反応して複合体を形成して、残りは細胞外小胞体と結合していない遊離プローブとして残り、相対的にサイズが大きい細胞外小胞体−プローブ複合体が遊離プローブに比べて速やかに溶出されて分離される。各物質の溶出時間は、多孔性固定相のサイズ及び穴のサイズ、カラムの長さ、移動相の流速などによって異なり、同じ条件では特定の時間に溶出される。
【００３３】
本発明の細胞外小胞体分析方法は、前記の分離された細胞外小胞体−プローブ複合体からプローブを検出する段階[（d）段階]を含む。
【００３４】
本発明の前記検出段階に関する詳細な説明は前記の通りである。
【００３５】
本発明の前記検出段階では、細胞外小胞体の定量分析、細胞外小胞体と結合したプローブの量を分析することができ、プローブの種類によって細胞外小胞体に対する特異性又は親和度を分析してプローブの性能評価に活用することができる。
［発明の効果］
【００３６】
本発明の細胞外小胞体分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能と細胞外小胞体に特異的に結合するプローブの特性を利用したもので、これを利用して、試料中に含まれている細胞外小胞体の定量分析、細胞外小胞体の物理化学的特性の分析、細胞外小胞体に含まれている構成成分の種類及び定量分析、細胞外小胞体の構成成分に対するプローブの結合特異性又は親和度分析を迅速かつ容易にすることができる。また、本発明の分析方法を利用すれば、試料の精製又は前処理過程なしに試料中の細胞外小胞体を正確に分析することができるだけでなく、プローブの種類によって細胞外小胞体の構成成分を簡単で正確に分析することができるので、細胞外小胞体を利用した診断効率を向上させることができる。また、プローブの特異性及び親和度の分析を利用して、細胞外小胞体の特異的抗体スクリーニング、タンパク質スクリーニング、化学物質スクリーニングなどに活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明による細胞外小胞体分析方法の模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例による大腸癌細胞株SW480における標本細胞外小胞体の分離模式図及び分離した結果である。
【図３】図３は、本発明の一実施例による蛍光物質で標識されたマウス抗体（Normal mouse IgG）と標本細胞外小胞体の結合様相を確認したUV（a）及び蛍光（b）クロマトグラムである。
【図４】図４は、本発明の一実施例による蛍光物質で標識されたCD63抗体（anti-CD63 antibody）と標本細胞外小胞体の結合様相を確認したUV（a）及び蛍光（b）クロマトグラムである。
【図５】図５は、本発明の一実施例による蛍光物質で標識されたCD81抗体（anti-CD63 antibody）と標本細胞外小胞体の結合様相を確認したUV（a）及び蛍光（b）クロマトグラムである。
【図６】図６は、本発明の一実施例による標本細胞外小胞体から蛍光標識されたCD63抗体の特異性を確認した蛍光クロマトグラムである。
【図７】図７は、本発明の一実施例による起源が異なる細胞外小胞体からCD81細胞外小胞体マーカーの発現様相を確認したUV（a）及び蛍光（b）クロマトグラムである。
【図８】図８は、本発明の一実施例によるTNFa（Tumor necrosis factor alpha）が、大腸癌細胞から分泌される細胞外小胞体のICAM1タンパク質発現に及ぼす影響を分析したUV（a）及び蛍光（b、c）クロマトグラムある。
【図９】図９は、本発明の一実施例による蛍光標識されたCD63抗体を利用して、大腸癌細胞培養液から細胞外小胞体の分離過程なしに細胞外小胞体を確認した蛍光クロマトグラムである。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例による蛍光標識されたCD81抗体を利用して、大腸癌細胞培養液から細胞外小胞体の分離過程なしに細胞外小胞体を確認したUV（a）及び蛍光（b）クロマトグラムである。
【図１１】図１１は、本発明の一実施例による蛍光標識されたCD81抗体を利用して、培養時間を異にした大腸癌細胞培養液から細胞外小胞体の分離過程なしに試料内の細胞外小胞体をナノ粒子の濃度（a）及びUV（b）、蛍光（c）クロマトグラムで分析した結果である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施例によるエステル分解酵素活性により、蛍光を示す膜透過性VPD450（violet proliferation dye450）と、標本細胞外小胞体内エステル分解酵素活性を利用した細胞外小胞体の分析を示したUV（a）及び蛍光（b、c）クロマトグラムである。
【図１３】図１３は、本発明の一実施例によるエステル分解酵素活性により、蛍光を示す膜透過性VPD450（violet proliferation dye450）と、細胞外小胞体内エステル分解酵素活性を利用して、大腸癌細胞培養液から細胞外小胞体の分離過程なしに試料内の細胞外小胞体をUV（b）及び蛍光（c）クロマトグラムで分析した結果である。
【図１４ａ】図１４aは、本発明の一実施例によるエステル分解酵素活性により、蛍光を示す膜透過性VPD450（violet proliferation dye450）とスピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、蛍光物質が結合された標本細胞外小胞体をUV及び蛍光（b）クロマトグラムで分析した方法を示す。
【図１４ｂ】図１４bは、本発明の一実施例によるエステル分解酵素活性により、蛍光を示す膜透過性VPD450（violet proliferation dye450）とスピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、蛍光物質が結合された標本細胞外小胞体をUV及び蛍光（b）クロマトグラムで分析した結果である。
【図１５ａ】図１５aは、本発明の一実施例によるエステル分解酵素活性により、蛍光を示す膜透過性CFDA-SE（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）とスピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、蛍光物質が結合された標本細胞外小胞体をUV及び蛍光（b）クロマトグラムで分析した方法を示す。
【図１５ｂ】図１５bは、本発明の一実施例によるエステル分解酵素活性により、蛍光を示す膜透過性CFDA-SE（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）とスピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、蛍光物質が結合された標本細胞外小胞体をUV及び蛍光（b）クロマトグラムで分析した結果である。
【図１６ａ】図１６aは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた標本細胞外小胞体を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した方法を示す。
【図１６ｂ】図１６bは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた標本細胞外小胞体を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した結果である。
【図１７ａ】図１７aは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた大腸癌細胞培養液を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した方法を示す。
【図１７ｂ】図１７bは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた大腸癌細胞培養液を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した結果である。
【図１８ａ】図１８aは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた、ヒトの尿（b）、ヒトの血清（c）を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した方法を示す。
【図１８ｂ】図１８bは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた、ヒトの尿（b）を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した結果である。
【図１８ｃ】図１８cは、本発明の一実施例によるビオチンコレステロール（Biotin-cholesterol）と反応させた、ヒトの血清（c）を、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して分離したビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体の量を分析した結果である。
【図１９ａ】図１９aは、本発明の一実施例によるDiI（Lipophilic dye）と反応させた標本細胞外小胞体を、HPLCを利用して分析した方法を示す。
【図１９ｂ】図１９bは、本発明の一実施例によるDiI（Lipophilic dye）と反応させた標本細胞外小胞体を、HPLCを利用して分析した蛍光クロマトグラムである。
【図２０ａ】図２０aは、本発明の一実施例によるDiI（Lipophilic dye）と反応させた大腸菌由来の細胞外小胞体を、HPLCを利用して分析した方法を示す。
【図２０ｂ】図２０bは、本発明の一実施例によるDiI（Lipophilic dye）と反応させた大腸菌由来の細胞外小胞体を、HPLCを利用して分析した蛍光クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためだけのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないのは、当業界で通常の知識を有する者においては明らかなことである。
【００３９】
実施例１．標本細胞外小胞体の精製及び分析
大腸癌細胞株SW480培養液を、500×gで10分、2000×gで20分間遠心分離して、沈殿物を除去した。上澄み液に存在する細胞外小胞体を１次精製及び沈殿するために、ポリエチレングリコール溶液（8.4％Polyethylene Glycol 6000、250mM NaCl、20mM HEPES、pH7.4）を添加して、16時間冷蔵保管した後、12000×gで30分間遠心分離して沈殿された細胞外小胞体を回収し、その後、HEPES緩衝溶液（HEPES−buffered saline、20mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4）に沈殿物を溶かした。
【００４０】
密度及び浮力を利用して、細胞外小胞体を２次精製するために、前記試料に対して、30％−20％−5％オプティプレップ（Optiprep）浮遊密度勾配超遠心分離を200000×gで２時間行った。超遠心分離後、細胞外小胞体と高密度（1.08〜1.12 g/ml）領域を回収した。前記精製された細胞外小胞体を３次精製するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を利用して、セファクリル（Sephacryl）S500で充填されたカラム（10×100 mm）に注入して分子サイズ排除クロマトグラフィーを通じて、最終的な細胞外小胞体を精製した。標本細胞外小胞体の分離過程を図２（a）に示した。
【００４１】
前記２次精製方法の浮遊密度勾配超遠心分離後、得られた試料の表面から10個の領域の分画物を回収し、各分画物における細胞外小胞体マーカー（Alix、CD9、CD81、CD63）の分布を、ウェスタンブロットを通じて確認した後、これを図２（b）に示した。前記３次精製方法によって、最終分離した標本細胞外小胞体を、透過電子顕微鏡（TEM）を利用して観察した結果、精製した標本細胞外小胞体の形及び大きさ（約50〜200 nm）を確認することができた（図２（c））。
【００４２】
実施例２．ポンプ式サイズ排除クロマトグラフィーと蛍光標識された抗体を利用した標本細胞外小胞体の分析
サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能と細胞外小胞体の構成成分を認識する様々なプローブの量を定量することにより、細胞外小胞体の構成成分の量を分析することができることを究明するために、下記のような実験を行った。
【００４３】
２−１．蛍光標識されたマウス抗体（normal mouse IgG）
精製された標本細胞外小胞体と蛍光標識されたマウス抗体（normal mouse IgG）とを混合して、37℃で30分間反応させた後、セファクリルS500で満たされたカラムに注入して、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム（図３（a））と蛍光クロマトグラム（図３（b））を分析した。
【００４４】
その結果、吸光クロマトグラムの結果から、標本細胞外小胞体が6.5分で検出され、14.5分に抗体が検出されることを確認することができた。しかし、蛍光クロマトグラムからは、14.5分で蛍光標識された抗体の蛍光バンドは検出されたが、6.5分の分画に該当する標本細胞外小胞体の蛍光バンドが表示されなかった。これは、標本細胞外小胞体とマウス抗体とが、該当条件で非特異的結合をしていないことを意味し、また、一緒に注入された標本細胞外小胞体とマウス抗体の混合物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、効果的に分離されて溶出されることを知ることができた。
【００４５】
２−２．蛍光標識された抗CD63及び抗CD81抗体（aCD63 and aCD81 antibody）
前記精製された様々な量の標本細胞外小胞体と、細胞外小胞体の膜タンパク質（membrane surface protein）であるCD63を認識する蛍光標識された抗CD63抗体とを混合して、37℃で30分間反応させた後、セファクリルS500で満たされたカラムに注入して、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム（図４（a））と蛍光クロマトグラム（図４（b））を分析した。
【００４６】
また、前記精製された様々な量の標本細胞外小胞体と、細胞外小胞体のさらに他の膜タンパク質であるCD81を認識する蛍光標識された抗CD81抗体（aCD81 antibody）とを混合して、前記と同じ条件で、サイズ排除クロマトグラフィーで展開しながら、280nm吸光クロマトグラム（図５（a））と蛍光クロマトグラム（図５（b））を分析した。
【００４７】
その結果、該当カラムから6.5分で検出される標本細胞外小胞体の280nm吸光バンドと同じ検出時間に蛍光バンドが表れ、検出されたバンドの面積は、標本細胞外小胞体の注入量と高い相関関係を示すことを確認することができた。一方、14.5分で検出される蛍光標識された遊離抗体の蛍光バンドの面積が、注入された標本細胞外小胞体の量に反比例して減少することがわかった。これは、標本細胞外小胞体に混合した抗体が、細胞外小胞体の構成成分（CD63、CD81）を特異的に認識して、それぞれCD63又はCD81と結合することにより、“細胞外小胞体−抗体複合体”を形成し、相対的に分子量が小さな蛍光標識された抗体（14.5分で検出）が、巨大分子である細胞外小胞体と一緒に展開されて、細胞外小胞体の検出時間（6.5分）に蛍光バンドが検出されたことを意味する。また、蛍光標識された遊離抗体の検出時間に検出される蛍光バンドの面積は、試料に混合した抗体の総量から細胞外小胞体と結合した抗体の量を除いた遊離抗体の量を反映することがわかった。
【００４８】
２−３．抗CD63抗体の競争的結合
前記において蛍光標識された抗CD63抗体が、標本細胞外小胞体に存在するCD63を特異的に認識して複合体を形成するとき、蛍光標識が特異的結合に影響を及ぼすか否かを確認するために、蛍光標識された抗CD63抗体と、標識のない抗CD63抗体とを混合して反応させた。具体的には、前記標本細胞外小胞体に蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群と、標本細胞外小胞体に蛍光標識された抗CD63抗体と蛍光標識されていない抗CD63抗体とを1:10の割合で一緒に混合して反応させた群とにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーを通じた蛍光クロマトグラムを比較した。
【００４９】
その結果、前記蛍光標識されていない過剰量の抗CD63抗体を追加添加した群において、細胞外小胞体の抗体複合体の蛍光バンドが大きく減少したことを確認することができた（図６）。これは、過剰量の蛍光標識がされていない抗CD63抗体が、細胞外小胞体のCD63と結合して、蛍光標識された抗CD63抗体の結合を妨害することにより、細胞外小胞体に結合された蛍光標識された抗CD63抗体の量が大幅に減少したことを意味し、これは、細胞小胞体と抗CD63抗体との結合が極めて特異的であり、蛍光標識が抗CD63抗体の機能に影響しないことがわかった。
【００５０】
２−４．相違する母細胞から分泌された細胞外小胞体と蛍光標識された抗CD81抗体
同量の相違する母細胞（SW480、HMEC1）から分泌された細胞外小胞体に、同量の蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、各細胞外小胞体からCD81タンパク質の発現様相を前記サイズ排除クロマトグラフィーの方法を利用して、280nm吸光クロマトグラム（図7（a））と蛍光クロマトグラム（図7（b））で分析した。
【００５１】
その結果、該当カラムから6.5分で検出される各細胞外小胞体の280nm吸光バンドの面積が同じ反面、同一検出時間（6.5分）で、各細胞外小胞体と抗CD81抗体複合体の蛍光バンドの面積が相違して表示された。SW480大腸癌細胞由来の細胞外小胞体に比べ、HMEC1細胞由来の細胞外小胞体において大幅に低く、反面、8.5分の遊離抗体の蛍光バンドの面積は、HMEC1細胞由来の試料において、より高く表示されることを観察することができた。これは、母細胞の種類によって、単位試料当たりの細胞外小胞体の量が相違するためであり、これにより本発明の分析法によって、複数の細胞外小胞体の分析において、単位細胞外小胞体当たりの、各構成成分の相対量を速やかに分析できることがわかった。
【００５２】
２−５．TNFa処理の有無による細胞外小胞体の成分変化
本発明の方法を利用して、TNFaが、大腸癌細胞から分泌される細胞外小胞体の構成成分の変化に及ぼす影響を分析した。具体的には、大腸癌細胞培養時にTNFaを24時間処理した群（TNFa+）と、処理していない群（TNFa−）とに分けて、各培養液からの細胞外小胞体を従来の方法で精製した。各群で精製した細胞外小胞体に、蛍光（FITC）標識された抗CD81抗体と蛍光（PE）標識された抗ICAM1抗体を混合して反応させ、前記のサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム（図8（a））及び蛍光クロマトグラム（図8（b、c））を分析した。
【００５３】
その結果、該当カラムにおいて3.6分に検出される各細胞外小胞体の280nm吸光バンドの面積（a）と、CD81蛍光バンドの面積（b）が類似した反面、同じ検出時間（3.6分）におけるICAM1の蛍光バンド（c）が、TNFa+群においてTNFa−群に比べて大幅に増加することを確認することができた。このことから、TNFaの処理後、細胞外小胞体中のCD81タンパク質の量は変化が殆ど無く、ICAM1の量は大幅に増加することがわかった。このことから、同種の細胞であっても、細胞の状態、環境又は外部因子によって引き起こされた細胞の生理的変化が、それにより分泌された細胞外小胞体の構成成分の変化を導き出すことがわかり、本発明の方法で容易に分析できるという点を確認することができた。
【００５４】
総合すると、本分析方法は、簡単かつ迅速に、試料内の細胞外小胞体の総量及び細胞外小胞体の成分を分析するだけでなく、細胞外小胞体の構成成分に対する抗体及びリガンドの特異性及び親和度の分析にも活用できることがわかった。
【００５５】
実施例３．ポンプ式サイズ排除クロマトグラフィーと蛍光標識された抗体を利用した細胞培養液内細胞外小胞体の分析
３−１．蛍光標識された抗CD63 抗体
本発明の分析方法を利用して、細胞培養液から細胞外小胞体の量又は構成成分を分析するために、SW480大腸癌細胞をRPMI培養培地で24時間培養して細胞培養液を回収した。細胞を培養していないRPMI培養培地と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群、及び大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群のそれぞれを、37℃で30分間反応させ、TSK6000 HPLCカラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら蛍光クロマトグラムを分析した。
【００５６】
その結果、図９に示した通り、RPMI培養培地と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群では、22分で検出される遊離抗体の蛍光バンドだけが検出された反面、大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群では、22分で検出される遊離抗体の蛍光バンドと共に、17分で検出される蛍光バンドが追加検出された。また、大腸癌細胞培養液が含まれた試料から22分で検出された蛍光バンドの面積が、RPMI培養培地と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群の蛍光バンドの面積の約50％であることを確認することができた。これは、蛍光標識された抗CD63抗体の約50％が、大腸癌細胞培養液内細胞外小胞体のCD63タンパク質と特異的に結合して、“細胞外小胞−体抗体複合体”を形成して細胞外小胞体と共に展開された為、17分の蛍光バンドが形成されたのである。従って、前記の分析方法を利用すれば、細胞培養液から細胞外小胞体を別に精製しなくても、細胞培養液内細胞外小胞体の成分を分析できることがわかった。
【００５７】
３−２．蛍光標識された抗CD81抗体
前記３−１と同様に、前記大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、37℃で30分間反応させてセファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム（図10（a））及び蛍光クロマトグラム（図10（b））を分析した。
【００５８】
その結果、該当カラムから、3.5分で280nm吸光バンドと蛍光バンドが同時に検出された。これは、CD81タンパク質を発現する細胞外小胞体であることがわかり、別の細胞外小胞体精製過程なしに、試料内細胞外小胞体の構成成分を分析できることを確認した。
【００５９】
３−３．培養時間による細胞外小胞体分析
細胞が育つ間に分泌される細胞外小胞体の様相を分析するために、培養時間を異にした大腸癌細胞培養液に、それぞれ同量の蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、37℃で30分間反応させ、セファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開した。各細胞培養液に対して、ナノ粒子濃度分析（図11（a））、前記サイズ排除クロマトグラフィーを通じた280nm吸光クロマトグラム（図11（b））及び蛍光クロマトグラム（図11（c））を分析した。
【００６０】
その結果、ナノ粒子濃度分析を通じて、大腸癌細胞の培養時間が増加することにより、培養液内のナノ粒子濃度が増加されることがわかった。また、サイズ排除クロマトグラフィーの結果、大腸癌細胞培養時間が増加することにより、細胞外小胞体が溶出される3.6分で、280nm吸光バンド及びCD81抗体蛍光バンドが同時に増加することを確認し、これは、培養液内のナノ粒子濃度の増加と高い相関関係を有することを確認することができた。このことから、本発明の方法を利用すれば、細胞外小胞体の追加分離過程なしに、試料内の細胞外小胞体の相対量及び構成成分の分析を同時に行えることがわかった。
【００６１】
実施例４．ポンプ式サイズ排除クロマトグラフィーと膜透過性酵素基質を利用した標本細胞外小胞体の分析
本発明の方法において、細胞外小胞体の内部成分を認識するプローブ又は酵素を使用することにより、細胞外小胞体の構成成分の定量分析が可能であることを確認するために、細胞外小胞体の内部に存在する酵素の内の一つであるエステル分解酵素（esterase）の基質として、膜透過性があり、酵素活性によって蛍光物質に変換される物質であるVPD450を使用した。具体的には、前記精製された標本細胞外小胞体と蛍光標識された抗CD81抗体及び様々な濃度のVPD450を混合して、37℃で30分間反応させて、セファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム（図12（a））及び蛍光クロマトグラム（図12（b、c））を分析した。
【００６２】
その結果、280nm吸光バンドを通じて、該当カラムから、標本細胞外小胞体は、3.5分で検出されることがわかり、蛍光クロマトグラムの結果から、同じ溶出時間帯に抗CD81抗体の蛍光バンド及びVPD450の蛍光バンドが同時に表れた。これにより、前記標本細胞外小胞体は、CD81タンパク質とエステル分解酵素をすべて発現することがわかった。さらに、VPD450の蛍光バンドの面積はVPD450の濃度に比例し、VPD450濃度が増加することにより、蛍光を帯びた酵素活性産物が細胞外小胞体内に累積されることがわかった。一方、自然的な加水分解により生成されたVPD450の蛍光産物（図12（c）のうち、遅れて表れるピーク）は、分子の大きさが小さい為、サイズ排除クロマトグラフィー方法を通じて明確に区分されることがわかった。
【００６３】
実施例５．ポンプ式サイズ排除クロマトグラフィーと膜透過性酵素基質を利用した細胞培養液内の細胞外小胞体の分析
前記実施例４で証明された細胞外小胞体の内部に存在する酵素に対する基質を利用して、細胞外小胞体を分析する方法が、生物学的試料において、細胞外小胞体の追加精製なしでも可能であることを証明するために、細胞培養液を利用して実験した。具体的には、SW480大腸癌細胞培養液を前記膜透過性VPD450と混合して、37℃で様々な時間の間反応させた後、セファクリルS500カラムに注入し、その後、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム（図13（a））及び蛍光クロマトグラム（図13（b））を分析した。
【００６４】
その結果、該当カラムから3.5分で検出される標本細胞外小胞体の280nm吸光バンドの面積は、反応時間に関係なく一定した反面、蛍光バンドは反応時間によって増加した。これは、細胞外小胞体内部のエステル分解酵素が、反応時間に比例して、細胞外小胞体の内部に流入されたVPD450を蛍光物質に転換して、転換された蛍光物質が細胞外小胞体内部に蓄積されるからである。前記方法を活用して、基質の量又は反応時間を固定して試料を分析すると、細胞外小胞体の精製なしでも、生物学的試料において、細胞外小胞体の総量分析に活用することができることがわかった。
【００６５】
実施例６．スピン式サイズ排除クロマトグラフィーと膜透過性酵素基質を利用した標本細胞外小胞体の分析
６−１．標本細胞外小胞体蛍光VPD450複合体
前記膜透過性酵素基質を利用した細胞外小胞体の分析方法において、図14（a）に示した模式図の通り、細胞外小胞体と反応していない物質から、細胞外小胞体蛍光VPD450複合体を分離した後、分離された複合体を分析した。具体的には、標本細胞外小胞体と膜透過性基質であるVPD450を混合して反応させた後、スピン式セファクリルS500カラムにローディングし、遠心分離を通じて溶出液を回収した。前記溶出された細胞外小胞体蛍光VPD450複合体をセファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム（図14（b））を分析した。
【００６６】
その結果、VPD450と反応させていない標本細胞外小胞体は、3.5分で280nm吸光バンドのみが検出され、同じ時間に蛍光バンドは検出されなかったが、前記のスピン式サイズ排除クロマトグラフィーを利用して前処理した試料は、3.5分で280nm吸光バンドと強力なVPD450蛍光バンドが検出されることを確認した。このことから、細胞外小胞体と反応していない、分子量が小さい物質が、前処理を通じて効果的に除去されることがわかった。
【００６７】
６−２．標本細胞外小胞体-CFDA-SE複合体
図15（a）の模式図で示した通り、他のエステル分解酵素基質であるCFDA-SEを標本細胞外小胞体と混合した反応溶液を、前記６の方法に基づいて前処理した後、セファクリルS500カラムに注入してHPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム（図15（b））を分析した。
【００６８】
その結果、該当カラムから3.5分で280nm吸光バンドが検出され、同じ検出時間に蛍光バンドが検出されることにより、CFDA-SEも、VPD450と同じメカニズムに基づいて膜を透過して、細胞外小胞体内部のエステル分解酵素の活性により、蛍光物質で細胞外小胞体内部に蓄積されたことを知ることができた。
【００６９】
したがって、前記の細胞外小胞体を分離する段階を含む方法を利用して、試料内細胞外小胞体の総量を分析することができるだけでなく、精製されたプローブ細胞外小胞体複合体を提供して、細胞外小胞体を利用した様々な追跡研究に活用することができる。
【００７０】
実施例７．スピン式サイズ排除クロマトグラフィーとコレステロールプローブ（biotinylated cholesterol）を利用した標本細胞外小胞体の分析
サイズ排除クロマトグラフィー分析方法を利用して、細胞外小胞体の構成成分のうち、脂質二重層と結合するか、又は挿入（transmembrane）されるプローブの量を定量することにより、細胞外小胞体の総量を分析できることを究明するために、プローブとしてビオチンが標識されたコレステロール（Biotin−cholesterol）を使用した。
【００７１】
具体的には、図16（a）に示した模式図の通り、相違する量の精製された標本細胞外小胞体とビオチンが標識されたコレステロールとを混合して、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングし、700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は標本細胞外小胞体単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内ビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート（microplate）に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（streptavidin−peroxidase）と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光（chemiluminescence）を測定した（図16（b））。
【００７２】
その結果、ビオチンコレステロール単一群又は標本細胞外小胞体単一群では、化学発光が殆どなかった。これは分子量が小さいビオチンコレステロールは、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出されなかったことを意味して、分子量が大きい細胞外小胞体の場合、前記図15の結果のようにスピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出されるが、溶出された標本細胞外小胞体自体にはストレプトアビジンペルオキシダーゼと結合することができるビオチンが存在しないことがわかった。反面、前記の標本細胞外小胞体とビオチンコレステロールを混合して反応させた群では、高い化学発光が測定され、前記発光の強度は、標本細胞外小胞体の量に比例して増加した。これは、分子量が相対的に小さいビオチンコレステロールが細胞外小胞体を構成する脂質二重層に挿入され、分子量が大きい細胞外小胞体と共にスピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出されることがあり、ビオチンコレステロールの脂質二重層に挿入される程度は、細胞外小胞体の量に比例することを確認することができた。
【００７３】
実施例８．スピン式サイズ排除クロマトグラフィーとコレステロールプローブを利用した大腸癌細胞培養液内の細胞外小胞体の分析
前記実施例７で、標本細胞外小胞体とビオチンコレステロールの混合反応物からスピン式サイズ排除クロマトグラフィー前処理を通じてビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体のみを効果的に分離することができることを証明した。前記の方法を通じて、細胞外小胞体の精製なしに、細胞培養液内の細胞外小胞体の総量を分析することができるか否かを確認するために、SW480大腸癌細胞培養液とビオチンが標識されたコレステロール（Biotin−cholesterol）を使用した。具体的には、図17（a）に示した模式図の通り、互いに異なる濃度のSW480大腸癌細胞の培養液とビオチンコレステロールを混合して、37℃で30分間反応させた。次に、試料内の細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は大腸癌細胞培養液の単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内ビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート（microplate）に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（streptavidin−peroxidase）と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光（chemiluminescence）を測定した（図17（b））。
【００７４】
その結果、ビオチンコレステロール単一群及び癌細胞培養液の単一群では、化学発光が極めて低いか又は無かったが、大腸癌細胞培養液とビオチンコレステロールを混合して反応させた群では、高い化学発光を観察することができた。これは、ビオチンコレステロール分子が、細胞培養液内細胞外小胞体の脂質二重層に挿入されて、細胞外小胞体と共にスピン式前処理サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出された点を証明する。
【００７５】
実施例９．スピン式サイズ排除クロマトグラフィーと、コレステロールプローブを利用した体液内細胞外小胞体の分析
前記実施例８で確認した通り、細胞外小胞体の精製なしに、細胞培養液内の細胞外小胞体を分析することができ、前記の方法をヒトの体液に適用した。具体的には、図18（a）の模式図に示した通り、ヒトの尿又はヒトの血清とビオチン標識されたコレステロール（Biotin−cholesterol）を混合して、各群を37℃で30分間反応させた後、試料内の細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして、700×g、5分間遠心分離して、溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は各生物学的試料の単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内のビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート（microplate）に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（streptavidin−peroxidase）と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光（chemiluminescence）を測定した（図18（b、c））。
【００７６】
その結果、ビオチンコレステロール単一群及び大腸癌細胞培養液の単一群では、化学発光が極めて低いか又はなかったが、生物学的試料（尿、血清）とビオチン−コレステロールを混合して反応させた群では、高い化学発光を観察することができた。これは、ビオチンコレステロール分子が生物学的試料内の細胞外小胞体の脂質二重層に挿入されて、細胞外小胞体と一緒にスピン式前処理サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出され、これを通じて複数の様々な体液内に存在する細胞外小胞体の総量の測定に活用することができることがわかった。
【００７７】
実施例１０．スピン式サイズ排除クロマトグラフィーと親油性プローブ（DiI）を利用した標本細胞外小胞体の分析
細胞外小胞体の構成成分のうち、脂質二重層と結合するか、又は挿入されたプローブとして、コレステロールの代わりに蛍光標識された親油性DiIを使用して追加実験を実施した。具体的には、図19（a）に示した模式図の通り、蛍光標識された親油性DiI単一群又は標本細胞外小胞体と蛍光標識された親油性DiIを混合した群を、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していない蛍光標識された親油性DiIを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。この後、前記溶出液をセファクリルS500カラムに注入し、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム（図19（b））を分析した。
【００７８】
その結果、分子量が小さい蛍光標識された親油性DiIは、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出できず、蛍光バンドが検出されない反面、蛍光標識された親油性DiIと標本細胞外小胞体を混合した群では、細胞外小胞体の溶出時間である3.5分で高い蛍光バンドを確認することができた。したがって、分子量が小さい蛍光標識された親油性DiIが、細胞外小胞体の脂質二重層に挿入されてスピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムから細胞外小胞体と共に溶出されることがわかった。
【００７９】
実施例１１．スピン式サイズ排除クロマトグラフィーと親油性プローブ（DiI）を利用した大腸菌由来細胞外小胞体の分析
前記実施例１０と同じプローブを、大腸菌由来細胞外小胞体に適用して分析した。具体的には、図20（a）に示した模式図の通り、蛍光標識された親油性DiI単一群又は大腸菌由来の細胞外小胞体と蛍光標識された親油性DiIを混合した群を、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していない蛍光標識された親油性DiIを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングし、700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。この後、前記溶出液をセファクリルS500カラムに注入し、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム（図20（b））を分析した。
【００８０】
その結果、分子量が小さい蛍光標識された親油性DiIは、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出されず、蛍光バンドが検出できなかった反面、蛍光標識された親油性DiIと大腸菌由来細胞外小胞体を混合した群では、細胞外小胞体の溶出時間である3.5分で高い蛍光バンドを確認することができた。従って、分子量が小さい蛍光標識された親油性DiIが、大腸菌由来細胞外小胞体の脂質二重層に挿入されて、スピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムで大腸菌由来細胞外小胞体と一緒に溶出されることがわかった。
【００８１】
このことから、バクテリア由来の細胞外小胞体もやはり脂質二重層で構成されていることを確認し、この分析方法は、細胞外小胞体の総量だけでなく、細胞外小胞体の特性分析にも活用できることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【国際調査報告】
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