(57)【要約】本発明は、医療及び分子診断法の分野に関する。特に、本発明は、代謝に関与する遺伝子を含む疾患に関与する遺伝子からの、転写産物及びその選択的スプライスバリアント並びにその中の変異の同時検出を可能にし、食品化合物、栄養補助食品又は代謝の阻害剤と組み合わせた、疾患関連分子異常を標的にする薬物による個別化治療のアドバイスをもたらす、新規のＲＮＡ次世代シーケンシングベースのプロファイリングアッセイに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の試料を用意するステップと、
前記試料のＲＮＡプロファイリングを行うステップと
を含み、
異常なレベルの転写産物、選択的スプライスバリアント及び／又は変異の存在が、感受性及び／又は抵抗性の徴候となる、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性をインビトロで決定するための方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡプロファイリングが、目的とする多重領域を標的にする多重ｍＲＮＡシーケンシングにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多重ｍＲＮＡシーケンシングが、検出可能な部分、好ましくはＭＩＰのライゲーション部分又はＭＩＰ配列（ｓｍＭＩＰ）の伸長部分に隣接したランダムヌクレオチド（Ｎ）の固有の識別子配列を好ましくは含む、分子反転プローブ（ＭＩＰ）を用いて行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記異常なレベルの転写産物、選択的スプライスバリアント及び／又は変異が、代謝経路の異常と関連があり、代謝経路の異常が、今度は、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、薬物に関する感受性及び／又は抵抗性と関連がある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患又は状態が、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、自己免疫疾患及び遺伝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、組織、腫瘍組織、尿、精液、唾液、血液、血漿、脳脊髄液、血小板、及び／又はエクソソームからなる群から選択される、好ましくは腫瘍組織及び血小板から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記代謝経路が、グルコース処理経路、グルタミン処理経路及び／又は脂肪酸経路である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記目的とする多重領域が、
グルコース処理遺伝子：ＡＢＡＴ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＬＹ、ＡＣＯ２、ＡＣＳＳ２、ＡＤＰＧＫ、ＡＬＤＯＡ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＴＧ４Ａ、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＢＲ１、ＣＢＳ、ＣＨＫＡ、ＣＫＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＣＹＣＳ、ＥＧＬＮ１、ＥＮＯ１、Ｇ６ＰＣ、ＧＡＤ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＧＦＰＴ１、ＧＬＤＣ、ＧＳＳ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＨＫ３、ＧＬＹ１、Ｇ６ＰＤ、グルコノラクトナーゼ、ＰＧＤ、ＲＰＩＡ、ＲＰＥ、ＴＫＴ、ＰＧＩ、ＡＬＤＯＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＡＭ１／２、ＥＮＯ、ＰＫＭ１／２、ＰＤＨＡ１、ＰＤＫ１、ＰＦＫＢ１、ＰＦＫＭｂ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＤ、ＰＧＫ１、ＰＫＭ、ＰＲＤＸ１、ＰＲＫＡＡ１、ＲＰＩＡ、ＰＣ、ＣＳ、ＡＣＯ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＤＨ３Ａ、ＩＤＨ３Ｂ、ＩＤＨ３Ｇ、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＡ２、ＳＤＨＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＦＨ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＰＤＫ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＡ９、ＣＡ１２、ＳＬＣ４Ａ１０、ＶＨＬ、ＳＤＨ、ＳＤＨＡＦ２、ＨＰＧＬ／ＰＣＣ、ＦＨ、ＣＳ、Ｄ−２ＨＧＤＨ、Ｌ−２ＨＧＤＨ、ＦＨ、ＩＤＨ１−３Ａ−Ｇ、ＭＤＨ１−２、ＭＹＣ、ＯＧＤＨ、ＳＤＨＡ−Ｄ、ＶＨＬ、ＰＨＤ、ＨＩＦ１ａ、ＥＰＡＳ２及び／又はＰＤＣＤ１；
グルタミン処理遺伝子：ＳＬＣ１Ａ５、ＡＳＣＴ２、ＧＬＳ、ＧＬＵＤ１／２、ＧＯＴ、ＧＰＩ、ＧＳ、ＢＣＡＴ１、ＢＣＡＴ２、ＳＬＣ１Ａ２及び／又はＳＬＣ７Ａ１１；
脂肪酸同化遺伝子：ＳＬＣ２５Ａ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＦＡＳＮ、ＣＰＴ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＣＨＫＡ、ＣＰＴ２、ＶＬＣＡＤ、ＨＡＤＨＡ／Ｂ、ＳＣＡＤ、ＭＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＳＣＨＡ−Ｄ、２−エノイル−ＶｏＡヒドラターゼ及び／又はＭＣＫＡＴ；
トランスポーター遺伝子；ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ７、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ７Ａ１、ＳＬＣ９Ａ１及び／又はＳＬＣＡ１２；
レドックス恒常性遺伝子：ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰＲＴ１、ＮＯＸ１、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４Ａ、ＮＱＯ１、ＳＯＤ、ＳＯＤ２、ＣＡＴ、ＴＡＬ、ＴＩＧＡＲ及び／又はＴＲＸ；
ＤＮＡ修復遺伝子：ＰＡＲＰ１；ＭＧＭＴ、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、ＲＡＤ５４、Ｈ２ＡＸ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６
がんに関与している可能性がある遺伝子：ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＭＡＰＫ８、ＭＹＣ、ＴＰ５３Ｉ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＫＤＲ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＭＥＲＴＫ、ＰＬＸＮＤ１、ＲＥＴ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＡＲバリアント７、ＡＲバリアント１２、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ３、ＭＥＴ、ＭＥＴデルタ１４、ＭＥＴデルタ７〜８、ＫＩＴ、ＲＯＮ及び／又はＰＴＥＮ；
血管新生に関与する遺伝子：ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４４、ＶＥＧＦ−Ａ１６５及び／又はＶＥＧＦ−Ａ１８９
免疫抑制に関与する遺伝子：ＣＤ２７４及び／又はＣＴＬＡ４；並びに／或いは、
ウイルス遺伝子：ＨＰＶ−Ｅ２、ＨＰＶ／Ｅ６及び／又はＨＰＶ−Ｅ７
のｍＲＮＡ内にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
異常なレベルの転写産物、選択的スプライスバリアント及び／又は変異の存在が、任意選択で薬物と組み合わせた食品化合物又はファイトケミカルによる治療の徴候も提供する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法の実施を要請し、又は請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実施し、故に、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性を決定するステップと、
対象の疾患又は状態を、対象の疾患又は状態が感受性である薬物で治療するステップと
を含む、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の治療の方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法が行われ、又は行われるよう要請され、故に、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性を決定するステップと、
疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象に、対象の疾患又は状態が感受性である薬物を投与するステップと
を含む、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の治療における使用のための医薬品。
【請求項１２】
前記疾患又は状態が、がん、好ましくは神経膠腫、髄膜腫、上衣腫、毛様細胞性星状細胞腫、腺がん、肉腫、血管腫、頭頸部がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、食道がん、基底細胞がん、陰茎がん、外陰がん、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、胆管細胞がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫又は骨肉腫；
ウイルス感染症；細菌感染症；自己免疫疾患及び遺伝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の方法又は請求項１１に記載の使用のための医薬品。
【請求項１３】
前記薬物治療が、食品化合物又はファイトケミカルによる治療で補完される、請求項１０若しくは１２に記載の方法又は請求項１１若しくは１２に記載の使用のための医薬品。
【請求項１４】
表ＩＩに示されている群から選択される分子反転プローブ。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる環状化分子反転プローブのライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療及び分子診断法の分野に関する。特に、本発明は、代謝に関与する遺伝子を含む疾患に関与する遺伝子からの、特に転写産物及びその選択的スプライスバリアント並びにその中の変異の同時検出を可能にし、任意選択で食品化合物、栄養補助食品又は代謝の阻害剤と組み合わせた、疾患関連分子異常を標的にする薬物による個別化治療の手引きをもたらす、新規のＲＮＡプロファイリングアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
機能不全細胞は、代謝を変えているという点で健康な細胞と典型的には異なる。例として、糖尿病患者の細胞は、グリコーゲン合成の欠如及び高い細胞外グルコース濃度に対処するように構成されている。別の例では、過形成及びがんなどで異常に増殖する細胞は、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成、タンパク質合成及び膜合成のためのヌクレオチド、アミノ酸及び脂肪酸を産生するのに過量の栄養素を処理する必要がある。この需要に応えるために、増殖細胞は変化した代謝により適応している。機能不全細胞の燃料として働き得るいくつかの化合物がある。これらには、グルコース、脂肪酸、並びにグルタミン及びグルタミン酸などのアミノ酸が挙げられる。細胞代謝に関与する遺伝子の選択は、以下の本明細書の表Ｉに示されている。一代謝経路に関与する遺伝子はまた、別の代謝経路にも関与し得ることが注意されるべきであり、当業者はこれを承知している。
【０００３】
表Ｉ：細胞代謝に関与する遺伝子の選択
グルコース処理（ＧＬＹ１：グルコースからピルビン酸；ＰＰＰ：ペントースリン酸経路；ＧＬＹ２：ピルビン酸から乳酸；ＴＣＡ：トリカルボン酸回路）
１．  細胞質ゾルへのグルコース取り込みを確実にする膜貫通グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ３（ＳＬＣ２Ａ１及びＳＬＣ２Ａ）
２．  グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するヘキソキナーゼ（ＨＫ１、２、３）（ＧＬＹ１）
３．  グルコース−６−リン酸を６−ホスホグルコノラクトンに変換するグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）（ＰＰＰ）
４．  ６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグルコン酸に変換するグルコノラクトナーゼ（ＰＰＰ）
５．  ６−ホスホグルコン酸をリブロース−５−リン酸に変換する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（ＰＧＤ）（ＰＰＰ）
６．  リブロース−５−リン酸をリボース−５−リン酸に変換するリブロース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩＡ）（ＰＰＰ）
７．  リブロース−５−リン酸をキシルロース−５−リン酸に変換するリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ＲＰＥ）（ＰＰＰ）
８．  ステップ５及びステップ６の産物をグリセルアルデヒド−３−リン酸及びセドヘプツロース７−リン酸に変換するトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）（ＰＰＰ）
９．  ステップ８の産物をフルクトース−６−リン酸及びエリトロース４−リン酸に変換するトランスアルドラーゼ（ＰＰＰ）
１０．  グルコース−６−リン酸をフルクトース６−リン酸に変換するホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）（ＧＬＹ１）
１１．  フルクトース−６−リン酸をフルクトース１，６−ビスリン酸に変換するホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）（ＧＬＹ１）
１２．  フルクトース１，６−ビスリン酸をジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド−３−リン酸に変換するフルクトース二リン酸アルドラーゼ（ＡＬＤＯＡ）（ＧＬＹ１）
１３．  グリセルアルデヒド−３−リン酸を１，３−ビスホスホグリセリン酸に変換するグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（ＧＬＹ１）
１４．  １，３−ビスホスホグリセリン酸を３−ホスホグリセリン酸に変換するホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（ＧＬＹ１）
１５．  ３−ホスホグリセリン酸を２−ホスホグリセリン酸に変換するホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１／２）（ＧＬＹ１）
１６．  ２−ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸に変換するエノラーゼ（ＥＮＯ）（ＧＬＹ１）
１７．  ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に変換するピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ１／２）（ＧＬＹ１）
１８．  ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換するピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）（ＴＣＡ）
１９．  アセチルＣｏＡをオキサロ酢酸に変換するピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）（ＴＣＡ）
２０．  アセチルＣｏＡ及びオキサロ酢酸からクエン酸を作るクエン酸合成酵素（ＣＳ）（ＴＣＡ）
２１．  クエン酸をｃｉｓ−アコニット酸及びイソクエン酸に変換するアコニターゼ（ＡＣＯ１）（ＴＣＡ）
２２．  イソクエン酸をαＫＧに変換するイソクエン酸脱水素酵素１／２／３（ＩＤＨ１／２／３）（ＴＣＡ）
２３．  αＫＧをスクシニルＣｏＡに変換するαＫＧ脱水素酵素（ＯＧＤＨ）（ＴＣＡ）
２４．  スクシニルＣｏＡをコハク酸に変換するスクシニルＣｏＡ合成酵素（ＳＵＣＬＡ２）（ＴＣＡ）
２５．  ＮＡＤＨ−コエンザイムＱ酸化還元酵素（ＯＸＰＨＯＳ）
２６．  コハク酸−Ｑ−酸化還元酵素（ＯＸＰＨＯＳ）
２７．  フラボタンパク質＿Ｑ酸化還元酵素（ＯＸＰＯＳ
２８．  シトクロムＣオキシダーゼ（ＯＸＰＨＯＳ）
２９．  ＡＴＰ合成酵素（ＯＸＰＨＯＳ）
３０．  コハク酸をフマル酸に変換するコハク酸脱水素酵素（ＳＤＨＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）（ＴＣＡ）
３１．  フマル酸をリンゴ酸に変換するフマル酸ヒドラターゼ（ＦＨ）（ＴＣＡ）
３２．  リンゴ酸をオキサロ酢酸に変換するリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ１／２）（ＴＣＡ）
３３．  ＰＤＨをリン酸化及びブロックする（ステップ１１）ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＫ）（ＧＬＹ２）
３４．  ピルビン酸から乳酸を作る乳酸脱水素酵素（ＬＤＨＡ）（ＧＬＹ２）
３５．  乳酸をピルビン酸に変換する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨＢ）
３６．  細胞から乳酸及び関連陽子を輸送してｐＨ恒常性を調節する、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ１（ＳＬＣ１６Ａ１）及びＭＣＴ４（ＳＬＣ１６Ａ３）
３７．  細胞表面でＨ２Ｏ及びＣＯ２からＨＣＯ３−を作る炭酸脱水酵素（ＣＡ９及びＣＡ１２）
３８．  ｐＨ恒常性のためにＨＣＯ３−を取り込むＨＣＯ３−取り込み輸送体（ＳＬＣ４Ａ１０）
グルタミン処理
増殖のためにアミノ酸グルタミンにも依存するいくつかの細胞がある。グルタミン代謝に関与する遺伝子には、
３９．  グルタミンのための膜取り込み輸送体タンパク質、ＳＬＣ１Ａ５又はＡＳＣＴ２
４０．  グルタミンをグルタミン酸に変換するグルタミナーゼ（ＧＬＳ）
４１．  グルタミン酸をアルファ−ケトグルタル酸（αＫＧ）に変換するグルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＵＤ１／２）
４２．  αＫＧからグルタミン酸を作る分岐鎖アミノ酸トランスフェラーゼ１及び２（ＢＣＡＴ１／２）
４３．  グルタミン酸を細胞に取り込む興奮性アミノ酸トランスポーターＥＡＡＴ２（ＳＬＣ１Ａ２）
４４．  シスチンと引き換えに細胞からグルタミン酸を排出するＳｙｓｔｅｍ  Ｘｃ−（ＳＬＣ７Ａ１１）
が挙げられる。
脂肪酸
脂肪酸は、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体及びリソソーム及びペルオキシソームの膜を構成するリン脂質二重層の合成の基盤となるため、細胞の重要なビルディングブロックである。脂肪酸同化に関与する酵素には、
４５．  ミトコンドリアから細胞質ゾルへクエン酸を輸送するＣＩＣ（ＳＬＣ２５Ａ１）
４６．  クエン酸をオキサロ酢酸及びアセチルＣｏＡに変換するＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）
４７．  アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡに変換するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ）
４８．  アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ及びＮＡＤＰＨをパルミチン酸に変換する脂肪酸合成酵素（ＦＡＳＮ）
４９．  脂肪酸の取り込みのための脂肪酸トランスポーター（ＣＰＴ１）
５０．  コリンを取り込むコリントランスポーター（ＳＬＣ５Ａ７）
５１．  コリンをホスファチジルコリンに変換するコリンキナーゼ（ＣＨＫＡ）
５２．  アシルカルニチンを長鎖アシルＣｏＡに変換するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ２）
５３．  長鎖アシルＣｏＡを２−エノイルＣｏＡに変換するアシルＣｏＡ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）
５４．  ２−エノイルＣｏＡを中鎖及び短鎖アシルＣｏＡに変換する三機能性タンパク質（ＨＡＤＨＡ／Ｂ）
５５．  アシルＣｏＡを２−エノイルＣｏＡに変換するアシルＣｏＡ脱水素酵素（ＳＣＡＤ、ＭＣＡＤ、ＬＣＡＤ）
５６．  ２−エノイルＣｏＡを３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換する２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
５７．  ３−ヒドロキシアシルＣｏＡを３−ケトアシルＣｏＡに変換する３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素（ＳＣＨＡＤ）
５８．  ３−ケトアシルＣｏＡをアセチルＣｏＡに変換する３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＭＣＫＡＴ）
が挙げられる。
【０００４】
代謝変化は、細胞のがん化の結果である可能性があるが、いくつかのがんタイプについてはがんの原因にもなる。がん増殖から生じる代謝性変化（１つ又は複数の代謝経路内の変化）のよく知られた例は、増殖している組織で生じる、血管の血液供給より大きくなった酸素の欠乏、低酸素の結果の変化である。酸素化条件下、転写因子低酸素誘導因子ＨＩＦ１α及びＨＩＦ２αは、酸素依存性酵素プロリンヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）によりヒドロキシル化される。プロリン−ヒドロキシル化ＨＩＦは、ＶＨＬ−Ｅ３ユビキチン複合体の結合部位を有し、ＨＩＦユビキチン化及びプロテアソーム分解をもたらす。この経路は、細胞中のＨＩＦレベルの重要な調節因子である。正常酸素条件下、グルコースはピルビン酸に変換され、ピルビン酸はアセチルＣｏＡへと処理され、アセチルＣｏＡはトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路での処理のためにミトコンドリアに入る。ＴＣＡ回路は、酸化的リン酸化と直接共役され、グルコース１モルにつきエネルギー等量３６モルのＡＴＰ、ＣＯ２及びＨ２Ｏを産生する。この経路を経由するグルコースの全処理は、炭素ビルディングブロックを産生しない。
【０００５】
低酸素条件下でＰＨＤは不活性であり、その結果として非ヒドロキシル化ＨＩＦ１／２αが細胞に蓄積し、ＨＩＦ−β（ＡＲＮＴ）とヘテロ二量体化し、低酸素を生き延びるのに必要とされる遺伝子を活性化する。これらの遺伝子（表Ｉ、ステップ１〜３８）は、アセチルＣｏＡ産生ではなく乳酸産生にピルビン酸を用いてグルコースの種々の処理を調節する。ピルビン酸から乳酸への変換は、グルコース１モルにつき２モルのＡＴＰしか産生しない。エネルギー生産の点でこのプロセスの効率の悪さは、グルコースの余分な摂取を必要とし、これは、グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３）の発現増加により達成される。グルコース処理の次のステップに関与する遺伝子もまた活性化される（特にヘキソキナーゼ２）。ＨＩＦ蓄積はまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）をコードする遺伝子の活性化ももたらし、血管新生応答をもたらす。
【０００６】
がんにおける解糖は低酸素領域に限定されず、常酸素条件下でも生じ得る。正常酸素状態のがんにおける解糖にはいくつかの原因があり、例えば、Ｍｙｃがん原遺伝子の発現上昇［ＰＤＫ（表Ｉ、ステップ３３）の活性化をもたらし、ＴＣＡ回路へのアセチルＣｏＡの流入を防ぐ］、腫瘍抑制因子（ＶＨＬ、ＰＴＥＮ）の機能低下、及び発がん経路（例えばＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ）の活性上昇は全て、ＨＩＦ活性の増加につながる。がんにおける好気性解糖は、ワールブルク効果として知られている。
【０００７】
がん及び低酸素などの状態におけるがん原遺伝子及び腫瘍抑制因子遺伝子の異常が、代謝性変化を誘導する一方、これらの変化は分子異常の特異性に依存する。その結果、各腫瘍は、自身の特異的代謝要求を有する。
【０００８】
極めて複雑にしているのは、発がんの結果ではなく、代謝変化もまた発がんを駆動し得ることである。脳のびまん性神経膠腫、急性骨髄性白血病、軟骨肉腫及び肝胆管がんのかなりの割合におけるイソクエン酸脱水素酵素１及び２（表Ｉ、ステップ２２）のホットスポット変異は、アルファケトグルタル酸（α−ＫＧ）及びＮＡＤＰＨの消費をもたらして、ミリモル濃度まで蓄積し得るがん代謝物Ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｄ−２ＨＧ）を産生する。α−ＫＧとＤ−２ＨＧの化学構造のわずかな違いが高濃度の後者と組み合わさって、α−ＫＧ依存性酵素からα−ＫＧの競合的置換をもたらし、α−ＫＧ依存性酵素はその後、正しく機能することができない。重要な例は、ＤＮＡのＣｐＧアイランドの脱メチル化に関与する酵素のＴｅｎ  Ｅｌｅｖｅｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ファミリー、及びヒストン脱メチル化に関与するＪｍＪタンパク質である。その結果として、ＩＤＨ変異がんは、高メチル化ＣｐＧアイランド及びヒストンを呈し、異常な遺伝子転写プロファイルをもたらす。重要なのは、ＩＤＨ変異がん細胞におけるＮＡＤＰＨの消費は、低レベルの還元グルタチオン、及び活性酸素種（ＲＯＳ）に対する耐性減少をもたらす。ＩＤＨ変異がん細胞におけるＲＯＳの活性増加は、がん原遺伝子及び腫瘍抑制因子遺伝子の二度目のヒットのチャンスを高め、がんをもたらす可能性がある。２−ＨＧ産生につながる公知のホットスポット変異以外に、ＮＡＤＰＨ産生には欠陥があるが、Ｄ−２ＨＧを産生しないＩＤＨ変異体が記載されている（１）。
【０００９】
代謝酵素の変異ががんドライバーであるがんの他の例は、ＳＤＨサブユニットＡ〜Ｄ（表Ｉ、ステップ３０）のうちの１つ又はＳＤＨ会合因子ＳＤＨＡＦ２に不活性変異を有する褐色細胞腫及び傍神経節腫である（２）。これらの変異は、ＨＰＧＬ／ＰＣＣ症候群につながる遺伝性であり得、又は体細胞性であり得る。がんを引き起こす代謝遺伝子の他の変異は、ＦＨ（表Ｉ、ステップ３１）で生じる。ＦＨの変異は、平滑筋腫症及び乳頭状腎細胞がんと関連している（３）。ＶＨＬタンパク質の変異は明細胞腎細胞がんで生じ、上記に記載したように、ＨＩＦ分解の欠損を介して解糖を直接もたらす。ＩＤＨ、ＳＤＨ及びＦＨ遺伝子は、それ故に腫瘍抑制因子遺伝子と考えることができる。
【００１０】
代謝経路を阻害することができる食品化合物、栄養補助食品又は安全に使用できる薬物が存在し、そのような薬物の使用は、がんの治療に潜在的に有益と考えられてきた。例は、細胞によるグルコース取り込みを阻害し、解糖（表Ｉ、ステップ１及びそれに続くステップ）を防ぐデオキシグルコース（４）、ヘキソキナーゼ（表Ｉ、ステップ２及びそれに続くステップ）の活性をブロックする３−ブロモピルビン酸（５、６）、６−アミノ−ニコチンアミド（ペントースリン酸経路でＧ６ＰＤをブロックする６−ＡＮ、表Ｉ、ステップ３（７））、ＯＸＰＨＯＳをブロックするメトホルミン（８）、ビス−２−（５−フェニルアセトアミド−１，２，４−チアジアゾール−２−イル）エチルスルフィド（グルタミナーゼをブロックするＢＰＴＥＳ、表Ｉ、ステップ２８）、エピガロ−３−カテキンガレート（グルタミン酸脱水素酵素及び他のＮＡＤＰＨ生成酵素（表Ｉ、ステップ４１）並びに脂肪酸合成酵素  表Ｉ、ステップ３６をブロックするＥＧＣＧ（９））（１０）、脂肪酸合成酵素（表Ｉ、ステップ４８）を阻害するセルレニン（９）である。これらの阻害剤は、がんの種々のモデルにおいて抗腫瘍効果を有することが示されている。
【００１１】
これらの化合物は、ヒトでもテストされてきたが、抗がん効果は、健康な組織には耐えられない全身濃度を必要とする場合がある。しかし、非毒性濃度では、最大耐量以下の阻害剤による治療は、放射線療法、化学療法又は標的化療法などの他の治療の活性を増大させることができる。
【００１２】
外科手術によって治癒することができないがんを有する患者のための現在の治療プロトコルは、がんが一般には治療に対する抵抗性を生じるという点で効果がない（１１〜１４）。
【００１３】
それ故に、最先端の療法の有効性を高める安全な補助剤治療への大きなニーズがある。これらの最先端の療法は、第ＩＩＩ相臨床試験の成績に基づくガイドラインに従って適用される。一部のがんタイプに関して、治療の効果は予測することができる（例えば、ＫＲＡＳ変異を伴う結腸がんはＥＧＦＲ阻害剤に応答しない、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ変異を伴うがんは、ＥＧＦＲからのシグナル伝達を上方制御することによりＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブに対する抵抗性を生じる、ＤＮＡ修復遺伝子ＭＧＭＴの高メチル化を伴う神経膠腫は、ＤＮＡアルキル化化学療法テモゾロミドにより良好に応答する）。一部のがんタイプは、現在、いわゆるコンパニオンバイオマーカー−それに基づいて個別化治療が開始され得るバイオマーカー−について日常的に分析されているが、そのようなマーカーに関する分析は、例えば手術不可能ながんを有する患者の場合のように、組織が入手可能になり得なければ行うことができない。
【００１４】
したがって、最適な利用可能な標的化薬物又は放射線療法又は化学療法と組み合わされた最適な代謝阻害剤からなる治療プロトコルを用いて、患者（対象）において治療判断に関連するパラメーターを測定する検査への差し迫ったニーズがある。がんにおける代謝を調べるための現在利用可能な検査には、磁気共鳴分光イメージング（ＭＲＳＩ）が挙げられるが、これは、専門センターでのみ行うことができる技術的に難しい手法であり、ＭＲ原理及び細胞生物学の同時の深い知識を必要とする。さらに、ＭＲＳＩは、限られた数の代謝物を測定することしかできない。がんにおける代謝を調べる代替の方法は、がんの代謝物の抽出物を作り、質量分析を行うことである。この場合、結果は、これらのアッセイが、外科手術後に低酸素を認めている組織で行われるという事実によって影響を受けることになる。
【００１５】
がんの分子診断は、現在、腫瘍ＤＮＡの解析により行われ、アクショナブル変異の検出を目的としている。ＤＮＡ解析は、並びにＦＨ、ＳＤＨ及びＩＤＨなどの代謝酵素の変異及び変動、並びにがん原遺伝子及び腫瘍抑制因子遺伝子のアクショナブル変異及び増幅の同定を可能にする。ＤＮＡ解析は、全ゲノム解析又は全エクソーム解析を用いて行うことができるが、文献に記載されているように分子反転プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）で行うこともできる（１５）。該手法は、図１に示されている。ＭＩＰは、伸長プローブ及びライゲーションプローブを介して目的とするＤＮＡに逆にハイブリダイズし、骨格配列によって接続され、標的配列に小さなギャップを残す。このギャップは、酵素的に埋められ、ライゲートされ、環状分子を残す。環状分子は、非環状化ヌクレオチド鎖のエクソヌクレアーゼベースの分解により精製することができる。骨格中のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる埋められたギャップのＰＣＲベースの増幅は、アンプリコンのライブラリーを生成し、該ライブラリーは、例えば次世代シーケンシング方法論を用いて解析され得る。アッセイを定量的にするために、例えば８個のランダムヌクレオチドの固有分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＵＭＩ）をＭＩＰに組み込んで、１つのＭＩＰに対して同じＵＭＩを用いて全ＰＣＲ産物の逆算を可能にすることができる。同じＵＭＩを有する２つの異なるｓｍＭＩＰの確率は（１／４）８＝１：６５，５３６であり、これは各ＭＩＰに対するこれらのＵＭＩを固有にする。ＵＭＩを有するＭＩＰは、単一分子ＭＩＰ又はｓｍＭＩＰと呼ばれる（１６）。ＤＮＡ配列の解析のためのｓｍＭＩＰの手法は、文献に記載されている。
【００１６】
ＤＮＡ解析は、エピジェネティックプロセス並びに転写因子及び転写抑制因子の存在によって調節される遺伝子活性、例えば代謝遺伝子の活性を測定することができない（１７）。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングの原理。手順は、骨格配列を介して接続される、ライゲーション及び伸長プローブからなる分子反転プローブのハイブリダイゼーションに依存する。捕捉ハイブリダイゼーションは、ｓｍＭＩＰごとに１１２ｎｔのギャップを残し、これが酵素的に伸長され、ライゲーションにより閉じられる。非ライゲートプローブのエクソヌクレアーゼ消化後、環状化ｓｍＭＩＰの残りのライブラリーが、ｓｍＭＩＰ骨格中のプライマーでＰＣＲ増幅される。ライゲーションプローブは、ＰＣＲ重複の修正を可能にするランダムな８Ｎの固有分子識別子（ＵＭＩ）配列によって隣接される。ＰＣＲ中、試料特異的リードの同定を可能にする固有のバーコードプライマーが試料ごとに使用される。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ  ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞のＶＨＬ遺伝子座のＩｎｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）表示。これらの細胞株からの全ＲＮＡｓｅｑデータを含有するＢＡＭファイルがＩＧＶにロードされた。タンパク質レベルでＶＨＬＱ１３２−ｓｔｏｐ変異をもたらすＣＡＡ−ＵＡＡ変異に注意。
【図２Ｂ】図２Ａ、２Ｂ  ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞のＶＨＬ遺伝子座のＩｎｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）表示。これらの細胞株からの全ＲＮＡｓｅｑデータを含有するＢＡＭファイルがＩＧＶにロードされた。
【図２Ｃ】図２Ｃ及び２Ｄは、ＳＫＲＣ７（Ｃ）及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞の同じＶＨＬ遺伝子座のＳｅｑＮｅｘｔ表示を示す。Ｅ）ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡのＶＨＬ関連ＴＰＭ及びＦＰＭ値を示す棒グラフ。Ｆ）抗ＨＡ抗体で染色されたＳＫＲＣ７細胞及びＶＨＬ発現誘導体のウェスタンブロット。
【図２Ｄ】図２Ｃ及び２Ｄは、ＳＫＲＣ７（Ｃ）及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞の同じＶＨＬ遺伝子座のＳｅｑＮｅｘｔ表示を示す。
【図２Ｅ】ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡのＶＨＬ関連ＴＰＭ及びＦＰＭ値を示す棒グラフ。
【図２Ｆ】抗ＨＡ抗体で染色されたＳＫＲＣ７細胞及びＶＨＬ発現誘導体のウェスタンブロット。
【図３Ａ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑとよく相関する。平均のｓｍＭＩＰベースの代謝ＦＰＭレベル（Ａ、Ｃ）及びチロシンキナーゼ転写産物ＦＰＭレベル（Ｂ、Ｄ）が、全ＲＮＡｓｅｑデータから抽出された同じ転写産物のＴＰＭレベルにプロットされた。ＦＰＭ値が極めて低い（１０−２ＦＰＭ）転写産物は、ＲＮＡｓｅｑデータセットでは検出されなかったことに注意。本発明者らは、これらの転写産物をこれらの解析に含めたが、ピアソン係数を下げた可能性がある。
【図３Ｂ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑとよく相関する。平均のｓｍＭＩＰベースの代謝ＦＰＭレベル（Ａ、Ｃ）及びチロシンキナーゼ転写産物ＦＰＭレベル（Ｂ、Ｄ）が、全ＲＮＡｓｅｑデータから抽出された同じ転写産物のＴＰＭレベルにプロットされた。ＦＰＭ値が極めて低い（１０−２ＦＰＭ）転写産物は、ＲＮＡｓｅｑデータセットでは検出されなかったことに注意。本発明者らは、これらの転写産物をこれらの解析に含めたが、ピアソン係数を下げた可能性がある。
【図３Ｃ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑとよく相関する。平均のｓｍＭＩＰベースの代謝ＦＰＭレベル（Ａ、Ｃ）及びチロシンキナーゼ転写産物ＦＰＭレベル（Ｂ、Ｄ）が、全ＲＮＡｓｅｑデータから抽出された同じ転写産物のＴＰＭレベルにプロットされた。ＦＰＭ値が極めて低い（１０−２ＦＰＭ）転写産物は、ＲＮＡｓｅｑデータセットでは検出されなかったことに注意。本発明者らは、これらの転写産物をこれらの解析に含めたが、ピアソン係数を下げた可能性がある。
【図３Ｄ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑとよく相関する。平均のｓｍＭＩＰベースの代謝ＦＰＭレベル（Ａ、Ｃ）及びチロシンキナーゼ転写産物ＦＰＭレベル（Ｂ、Ｄ）が、全ＲＮＡｓｅｑデータから抽出された同じ転写産物のＴＰＭレベルにプロットされた。ＦＰＭ値が極めて低い（１０−２ＦＰＭ）転写産物は、ＲＮＡｓｅｑデータセットでは検出されなかったことに注意。本発明者らは、これらの転写産物をこれらの解析に含めたが、ピアソン係数を下げた可能性がある。
【図４Ａ】ＳｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡｓｅｑは、２つの独立した重複実験（Ａ、Ｂ）において解糖関連遺伝子、とりわけＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＨＫ２及びＬＤＨＡの発現レベルの減少を明らかにする。相対値は、全トランスクリプトームＲＮＡ  ｓｅｑ解析から得られたものに匹敵し（Ｃ）、図３に示された相関と一致する。発現レベルの差は、チューブリンをハウスキーピング対照として用いて、ＨＫ２及びＣＡ９のタンパク質レベルで検証された（Ｄ）。
【図４Ｂ】ＳｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡｓｅｑは、２つの独立した重複実験（Ａ、Ｂ）において解糖関連遺伝子、とりわけＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＨＫ２及びＬＤＨＡの発現レベルの減少を明らかにする。相対値は、全トランスクリプトームＲＮＡ  ｓｅｑ解析から得られたものに匹敵し（Ｃ）、図３に示された相関と一致する。発現レベルの差は、チューブリンをハウスキーピング対照として用いて、ＨＫ２及びＣＡ９のタンパク質レベルで検証された（Ｄ）。
【図４Ｃ】ＳｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡｓｅｑは、２つの独立した重複実験（Ａ、Ｂ）において解糖関連遺伝子、とりわけＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＨＫ２及びＬＤＨＡの発現レベルの減少を明らかにする。相対値は、全トランスクリプトームＲＮＡ  ｓｅｑ解析から得られたものに匹敵し（Ｃ）、図３に示された相関と一致する。発現レベルの差は、チューブリンをハウスキーピング対照として用いて、ＨＫ２及びＣＡ９のタンパク質レベルで検証された（Ｄ）。
【図４Ｄ】ＳｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡｓｅｑは、２つの独立した重複実験（Ａ、Ｂ）において解糖関連遺伝子、とりわけＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＨＫ２及びＬＤＨＡの発現レベルの減少を明らかにする。相対値は、全トランスクリプトームＲＮＡ  ｓｅｑ解析から得られたものに匹敵し（Ｃ）、図３に示された相関と一致する。発現レベルの差は、チューブリンをハウスキーピング対照として用いて、ＨＫ２及びＣＡ９のタンパク質レベルで検証された（Ｄ）。
【図５Ａ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡ次世代シーケンシングは、適切なバリアントコーリングに使用することができる。示されているのは、Ｅ４７８異種移植片（Ａ）及び臨床グレードＩＩＩ星状細胞腫（Ｃ、この変異は遺伝子解析によって確認された）におけるＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異を含有する遺伝子座であるが、Ｅ９８細胞におけるＩＤＨ１−Ｒ３１４Ｃ変異も同定することができた（Ｂ）。
【図５Ｂ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡ次世代シーケンシングは、適切なバリアントコーリングに使用することができる。示されているのは、Ｅ４７８異種移植片（Ａ）及び臨床グレードＩＩＩ星状細胞腫（Ｃ、この変異は遺伝子解析によって確認された）におけるＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異を含有する遺伝子座であるが、Ｅ９８細胞におけるＩＤＨ１−Ｒ３１４Ｃ変異も同定することができた（Ｂ）。
【図６】２つの異なるｃｃＲＣＣ細胞株における代謝酵素をコードするＲＮＡのｓｍＭＩＰ解析の例。
【図７】ｓｍＭＩＰは、スプライスバリアントの特異的検出を可能にする。内因性ＶＥＧＦ−Ａを発現しないＭｅｌ５７細胞株に、発現プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ−ＶＥＧＦ−Ａ１２１及びｐＩＲＥＳｎｅｏ−ＶＥＧＦ−Ａ１６５がトランスフェクトされ、ネオマイシンを含有する培地で培養されて安定なトランスフェクタントを生成した。これらのトランスフェクタント由来のＲＮＡが、ｓｍＭＩＰパネルによるｓｍＭＩＰプロファイリングに供され、そのうちＶＥＧＦ−Ａ転写産物のエクソン５及び８にそれぞれライゲーション及び伸長プローブを有するｓｍＭＩＰ１２１は、故にＶＥＧＦ−Ａ１２１のみを検出し、ＶＥＧＦ−Ａ転写産物のエクソン５及び７にそれぞれライゲーション及び伸長プローブを有するｓｍＭＩＰは、故にＶＥＧＦ−Ａ１６５のみを検出した。ｓｍＭＩＰ１２１はＶＥＧＦ−Ａ１２１を検出するが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は検出せず、ｓｍＭＩＰ１６５はＶＥＧＦ−Ａ１６５のみを検出するが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は検出しないことに注意。
【図８】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡ次世代シーケンシングは、適切な診断に使用することができる。示されているのは、臨床グレードＩＩＩ星状細胞腫におけるＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異を含有するＩＤＨ遺伝子座である。チロシンキナーゼトランスクリプトームの解析は、対応するチロシンキナーゼ阻害剤への応答性を示唆する、この腫瘍におけるチロシンキナーゼＮＴＲＫ２及びＰＤＧＦＲＡをコードする遺伝子の高い発現レベルを明らかにする。
【図９】神経膠腫におけるＥＧＦＲスプライスバリアントのｓｍＭＩＰベースの検出。示されているのは、神経膠腫群では、３９／７５脳腫瘍でＥＧＦＲの発現上昇（５２％；陽性で平均ＦＰＭ  ７３８  ｖｓ陰性で平均ＦＰＭ  ３５、任意のカットオフＦＰＭ値１００を使用）、及び１２／７５脳腫瘍でＥＧＦＲｖＩＩＩの発現（１６％；陽性で平均ＦＰＭ  ６４２  ｖｓ陰性で平均ＦＰＭ  ０．２７、任意のカットオフ値６を使用）があることである。
【図１０Ａ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、正確な診断及び予後に使用することができる。Ａ）個々の遺伝子プロファイルのヒートマップ。目的とする標的化遺伝子のログ変換発現レベルの目的変数なしの凝集型クラスタリングを行った。凝集型クラスタリングは、生物情報学のＲ−ソフトウェアスクリプトを用いて個々のプロファイル間のマンハッタン距離を計算することにより、ＷａｒｄＤ２方法に従って行った。
【図１０Ｂ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、正確な診断及び予後に使用することができる。Ｂ）パネルａ）のヒートマップのコンピュータ生成された群Ａ及びＢの全生存率データを示すカプラン−マイヤー曲線。結果は、群Ａ及びＢが、有意性が高い（フィッシャーの正確確率検定；ｐ＜０．０００１）異なる生存率を有することを示し、この検定が、神経膠腫における高い予後値を有することを実証している。群Ａ及びＢは、本明細書ではＩＤＨ−ＭＴ及びＩＤＨ−ＷＴとして注釈が付されている。
【図１０Ｃ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、正確な診断及び予後に使用することができる。Ｃ）試料の１つにおけるヘテロ接合ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ検出。この場合、転写産物の３８％が変異体対立遺伝子由来であり、転写産物の６２％がｗｔ対立遺伝子由来である。
【図１０Ｄ】ｓｍＭＩＰベースの標的化ＲＮＡシーケンシングは、正確な診断及び予後に使用することができる。Ｄ）生存率が極めて不良（ＯＳ＜１２カ月）なＩＤＨ野生型患者対予後がより良好（ＯＳ＞１４カ月）なＩＤＨ野生型患者のサブグループ解析は、炭酸脱水酵素１２の高い発現レベルが、予後不良と関連していることを示した（ｐ＜０．００１；フィッシャーの正確確率検定、Ｄのカプラン−マイヤー曲線参照）。
【図１１】ＰＳＭＡ転写産物レベルが高い及び低い腫瘍の免疫組織化学的検査。ＰＳＭＡタンパク質の血管発現は、転写産物レベルが高い腫瘍由来の血管で観察され、転写産物レベルが低い腫瘍では観察されない（種々の写真の下のＦＰＭ値参照。
【図１２Ａ】チロシンキナーゼプロファイルは、インビトロでの標的化療法に対する感受性及び非感受性を予測する。Ａ）星状細胞腫細胞株Ｅ９８は、（Ｂ）に示されている腎臓がん細胞株ＳＫＲＣ１７と類似したレベルのＭＥＴを発現する。Ｃ）しかし、Ｅ９８細胞と対照的に、ＳＫＲＣ１７細胞は化合物Ａに応答せず、増殖率は低下する。Ｄ）膜チロシンキナーゼのプロファイリングは、アッセイで測定される膜チロシンキナーゼの選択された群内において、ＭＥＴはＥ９８によって発現される唯一のものであるのに対し、ＳＫＲＣ１７細胞は、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを含む、さらにいくつかの他のチロシンキナーゼ阻害剤を発現することを明らかにする。
【図１２Ｂ】チロシンキナーゼプロファイルは、インビトロでの標的化療法に対する感受性及び非感受性を予測する。Ａ）星状細胞腫細胞株Ｅ９８は、（Ｂ）に示されている腎臓がん細胞株ＳＫＲＣ１７と類似したレベルのＭＥＴを発現する。Ｃ）しかし、Ｅ９８細胞と対照的に、ＳＫＲＣ１７細胞は化合物Ａに応答せず、増殖率は低下する。Ｄ）膜チロシンキナーゼのプロファイリングは、アッセイで測定される膜チロシンキナーゼの選択された群内において、ＭＥＴはＥ９８によって発現される唯一のものであるのに対し、ＳＫＲＣ１７細胞は、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを含む、さらにいくつかの他のチロシンキナーゼ阻害剤を発現することを明らかにする。
【図１２Ｃ】チロシンキナーゼプロファイルは、インビトロでの標的化療法に対する感受性及び非感受性を予測する。Ａ）星状細胞腫細胞株Ｅ９８は、（Ｂ）に示されている腎臓がん細胞株ＳＫＲＣ１７と類似したレベルのＭＥＴを発現する。Ｃ）しかし、Ｅ９８細胞と対照的に、ＳＫＲＣ１７細胞は化合物Ａに応答せず、増殖率は低下する。Ｄ）膜チロシンキナーゼのプロファイリングは、アッセイで測定される膜チロシンキナーゼの選択された群内において、ＭＥＴはＥ９８によって発現される唯一のものであるのに対し、ＳＫＲＣ１７細胞は、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを含む、さらにいくつかの他のチロシンキナーゼ阻害剤を発現することを明らかにする。
【図１２Ｄ】チロシンキナーゼプロファイルは、インビトロでの標的化療法に対する感受性及び非感受性を予測する。Ａ）星状細胞腫細胞株Ｅ９８は、（Ｂ）に示されている腎臓がん細胞株ＳＫＲＣ１７と類似したレベルのＭＥＴを発現する。Ｃ）しかし、Ｅ９８細胞と対照的に、ＳＫＲＣ１７細胞は化合物Ａに応答せず、増殖率は低下する。Ｄ）膜チロシンキナーゼのプロファイリングは、アッセイで測定される膜チロシンキナーゼの選択された群内において、ＭＥＴはＥ９８によって発現される唯一のものであるのに対し、ＳＫＲＣ１７細胞は、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを含む、さらにいくつかの他のチロシンキナーゼ阻害剤を発現することを明らかにする。
【図１３】ＨＰＶ  ＲＮＡプロファイリング。正常な子宮の摘出から卵巣がん、子宮内膜がん及び子宮頸がんにわたる２９個の婦人科組織のプロファイル。ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ＲＮＡ発現が、１２個の試料で観察された。全てのＨＰＶ１６陽性試料がＤＮＡレベルについて確認されたが、ＨＰＶ−ＲＮＡ検定で陰性であった５個の組織は、ＨＰＶ−ＤＮＡ検定では陽性であった（矢印）。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明者らは、代謝に関与するどの遺伝子が活性であり、病理に関与するどの遺伝子が活性かを決定するために、ＲＮＡ転写産物の多重プロファイリングを使用した。本発明者らは、ＲＮＡプロファイルで組み合わされた情報から、病理組織において最も顕著な代謝経路が推定され得、病理に活発に関与する遺伝子が同定され得ることを見出した。この情報は、個々の疾患に罹患している個人を、例えば、異常に発現され、疾患進行に関与している遺伝子の産物を標的にする薬物で治療するための個別化されたアドバイスをもたらすことができる。これらの薬物（医薬化合物）には、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び／又は欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって承認され、及び標的化薬物として当業者に公知である薬物が挙げられるが、これに限定されない。そのような治療アドバイスは、病理組織における最も不可欠な代謝経路を阻害する化合物で疾患をさらに治療するためのアドバイスと組み合わせることができる。この概念は、合成致死性として当業者に公知である。検定の付加価値は、代謝遺伝子の変異状態に関する同時の情報によって生成される。
【００１９】
検定は、固形組織、単離された細胞、又は唾液、尿、精液、血液、血小板及び脳脊髄液を含むがこれらに限定されない体液に由来し得る少量の目的とするＲＮＡを必要とする。試料ＲＮＡは、オリゴｄＴプライマー又はランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いるなど、当技術分野で公知の方法を用いて、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換することができる。これらの手法は標準的な手法であり、当業者に公知である（（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ参照）。
【００２０】
目的とするＲＮＡは、ヒト遺伝子由来であってもよいが、同様に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むがこれに限定されないＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルス；サブタイプＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８を含むがこれらに限定されないヒトパピローマウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；エボラウイルス；エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）；インフルエンザウイルス；西ナイルウイルス、チクングニアウイルス、ポリオーマウイルス；サイトメガロウイルス；ライノウイルスなどの病原体の遺伝子由来であってもよいが、同様に、がんを治療する当業者に公知の腫瘍溶解性ウイルスのカテゴリーからの遺伝子であってもよい。目的とするＲＮＡはまた、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、マラリアを引き起こす寄生虫、及びトリパノソーマを含むがこれらに限定されない寄生虫の遺伝子由来であってもよい。さらに、目的とするＲＮＡは、アスペルギルス属を含むがこれに限定されない（病原性）真菌由来であってもよい。目的とするＲＮＡはまた、リステリア属、レジオネラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、マイコバクテリウム属及び／又はエルシニア属などの（病原性）細菌由来であってもよい。
【００２１】
対象（互換的に患者とも呼ばれる）は、ヒト又は動物であってもよい。したがって、目的とするＲＮＡはまた、飼育動物、野生動物及び家畜由来の遺伝子由来、並びに／又は本明細書で上記に列挙された病原体、若しくは動物において疾患を引き起こすその対応物などの病原体に存在する遺伝子由来であってもよい。
【００２２】
本発明は、治療アドバイスを組み立てるのに必要とされる情報を有する目的とするＲＮＡを検出するための、単一分子分子反転プローブ（ｓｍＭＩＰ）のセットをさらに提供する。好ましいセットは、表ＩＩに列挙されている群から選択される。
【００２３】
ＲＮＡプロファイルを生成する好ましい方法は、公開ＭＩＰＧＥＮプロトコル（１８）で設計することができるｓｍＭＩＰを使用することによる。該プロトコルは、目的とするｃＤＮＡに対してハイブリダイズすると予測される最適なライゲーションプローブ配列及び伸長プローブ配列を選択するが、プローブのライゲーション部分と伸長部分の間にギャップを残す。プローブのライゲーション及び伸長部分は、タンパク質コード領域及び非翻訳領域である配列を含む、ｃＤＮＡの任意の部分にハイブリダイズし得る。プローブの伸長及びライゲーション部分は、同じエクソンに位置することができる。
【００２４】
好ましい方法は、プローブのライゲーション及び伸長部分をｃＤＮＡの異なるエクソンに置くことであり、これは、特異的スプライスバリアントの検出を可能にする。
【００２５】
本発明による好ましい方法は、任意の数のｓｍＭＩＰからなり得る本発明による設計されたｓｍＭＩＰのライブラリーを、ｃＤＮＡ分子の集団と接触させることである。最初の加熱及び変性ステップとその後の冷却後、各ｓｍＭＩＰは、その標的ｃＤＮＡ配列にハイブリダイズする。混合物をＤＮＡポリメラーゼ酵素、全ての４つのデオキシヌクレオチド及びＤＮＡリガーゼと適切な緩衝液でインキュベートすることにより、ライゲーションプローブの５’末端に達するまでＭＩＰの伸長プローブ部分が伸長される。ＤＮＡリガーゼは、次いで、伸長された伸長プローブ部分の３’末端をライゲーションプローブ部分に共有結合させ、環状ｓｍＭＩＰ分子を産生する。
【００２６】
次のステップでは、当業者に公知の方法が、未反応の直鎖状ｓｍＭＩＰ及びｃＤＮＡをエクソヌクレアーゼ処理により反応混合物から除去するのに使用され、環状ｓｍＭＩＰの精製ライブラリーを残す。
【００２７】
ＭＩＰのライゲーション及び伸長プローブ部分を接続する骨格配列に特異的にアニールするフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ギャップ配列のＰＣＲ増幅が行われる。が好ましい。このＰＣＲで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの１つは、特定の試料から得られる全てのＰＣＲ産物の容易な選択を可能にするバーコードを備えていることが好ましい。次のステップでは、ＰＣＲアンプリコンのライブラリーが、試料中の全てのＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列に関する情報を含有するＦＡＳＴＱファイルをもたらす次世代シーケンシングプラットフォームで解析される。アルゴリズムを用いて、同じバーコードを有する全てのＰＣＲアンプリコンがグループ化され、個々のｃＤＮＡ試料ごとに配列のリストをもたらす。
【００２８】
次に、ＵＭＩを使用する別のアルゴリズムを用いて、全ての同一のＰＣＲ産物は、１つの起源ｓｍＭＩＰに由来すると見なされることになる。このような方法で元のＲＮＡ試料ごとに、元のライブラリー中の環状化ｓｍＭＩＰの元の数を表す値を含有するリストが作成され得る。この数は、元の試料中のｃＤＮＡの数に比例する。
【００２９】
好ましい解釈方法において、個々のｓｍＭＩＰごとに得られた値は、各試料の全ｓｍＭＩＰの合計値で除され、因数の１００万を乗じ、故にｓｍＭＩＰごとに１００万あたりの断片値をもたらす。
【００３０】
好ましい解釈方法において、１つの転写産物に対応する、全ての異なるｓｍＭＩＰの平均ＦＰＭ値は、解析の最初のＲＮＡ試料に存在した転写産物の数に比例すると見なされる。
【００３１】
別の好ましい解釈方法において、個々の転写産物の平均ＦＰＭ値は、いわゆるハウスキーピング遺伝子の平均ＦＰＭ値で除されて、目的とする転写産物の相対存在量値をもたらす。
【００３２】
別の好ましい方法において、代謝経路に関与する遺伝子由来の転写産物の平均ＦＰＭ値は、組織において優勢な代謝経路を推定するのに使用される。
【００３３】
ＦＡＳＴＱファイルをさらに解析するための好ましい方法は、次世代シーケンシングデータで変異を検出することである。変異が２つを超えるリードで検出される場合、変異は関連性があると見なされることが好ましい。ＦＡＳＴＱファイルで提供されるような配列情報は、誤同定された塩基の包含を必要とするほど狭義に解釈されるべきではない。当業者は、そのような誤同定された塩基を同定することができ、そのような誤差の補正の仕方を知っている。試料中の関連性のある変異のリストは、データベース、好ましくは、例えば多変量解析による統計解析を可能にする標準クエリ言語（ＳＱＬ）ベースのデータベースに含めることができる。
【００３４】
データベースの好ましい解析方法は、組織又は疾患を有する人において活性な代謝経路のリストをもたらし、疾患の症状を軽減し、他の療法の有効性を改善するための食事指導を行うのに使用することができる。
【００３５】
データベースの別の好ましい解析方法は、利用可能な薬理学的薬物で治療することができる異常のリストをもたらす。
【００３６】
本発明のさらに別の好ましい方法は、パーソナルコンピュータ又はモバイル機器にインストールすることができるアプリケーションにより与えられ得る、病変組織のＲＮＡプロファイルを治療アドバイスに直接翻訳するソフトウェアアルゴリズムを使用する。
本発明による方法は、病変組織又は血小板由来のＲＮＡが利用可能である場合は、日常的な患者ケアにおいて容易に実施することができる。
【００３７】
したがって、第１の態様において、本発明は、
対象由来の試料を用意するステップと、
試料のＲＮＡプロファイリングを行うステップと
を含み、
異常なレベルの転写産物、選択的スプライスバリアント及び／又は変異の存在が、感受性及び／又は抵抗性の徴候となる、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性をインビトロで決定するための方法を提供する。
【００３８】
前記方法は、本明細書において本発明による方法と呼ばれる。「ＲＮＡプロファイリング」は、本明細書において転写産物の標的化ＲＮＡシーケンシングとも呼ばれる。転写産物の異常なレベルは、参照試料と比較した、及び／又は健康な対象における転写産物のレベルと比較した転写産物レベルより高く又は低くなり得る転写のレベルである。
【００３９】
本発明による方法において、ＲＮＡプロファイリングは、目的とする多重領域を標的にする多重ｍＲＮＡシーケンシングにより行われることが好ましい。目的とするＲＮＡ試料は、オリゴｄＴプライマー又はランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いるなど、当技術分野で公知の方法を用いて、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に先ず変換され得る。目的とするＲＮＡは、ヒト遺伝子由来であってもよいが、同様に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むがこれに限定されないＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルス；サブタイプＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８を含むがこれらに限定されないヒトパピローマウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；エボラウイルス；エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）；インフルエンザウイルス；西ナイルウイルス、チクングニアウイルス、ポリオーマウイルス；サイトメガロウイルス；ライノウイルスなどの病原体の遺伝子由来であってもよいが、同様に、がんを治療する当業者に公知の腫瘍溶解性ウイルスのカテゴリーからの遺伝子であってもよい。目的とするＲＮＡはまた、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫、マラリアを引き起こす寄生虫、及びトリパノソーマを含むがこれらに限定されない寄生虫の遺伝子由来であってもよい。さらに、目的とするＲＮＡは、アスペルギルス属を含むがこれらに限定されない（病原性）真菌由来であってもよい。目的とするＲＮＡはまた、リステリア、レジオネラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、マイコバクテリウム属及び／又はエルシニア属などの（病原性）細菌由来であってもよい。
【００４０】
本発明による方法において、多重ｍＲＮＡシーケンシングは、分子反転プローブ（ＭＩＰ）、好ましくは検出可能な部分（ＭＩＰのライゲーション部分又はＭＩＰ配列（ｓｍＭＩＰ）の伸長部分に隣接したひと続きの３〜１０個のランダムヌクレオチド（配列リストに「Ｎ」として示されている）、より好ましくはひと続きの３個、より好ましくは４個、より好ましくは５個、より好ましくは６個、より好ましくは７個、最も好ましくは８個、又は好ましくは８個を超えるランダムヌクレオチド（Ｎ）の固有の識別子配列が好ましい）を含むＭＩＰを用いて行われることが好ましい。
【００４１】
本発明による方法において、異常なレベルの転写産物、選択的スプライスバリアント及び／又は変異は、代謝経路の異常と関連があり、代謝経路の異常は、今度は、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、薬物に関する感受性及び／又は抵抗性と関連があることが好ましい。本発明の全ての実施形態において、薬物は、当技術分野で意味されるように、医薬化合物である。そのような医薬化合物は、医薬組成物に含まれ得る。本発明の全ての実施形態において、対象は、ヒト又は動物、好ましくはヒトである。動物は、任意の動物、好ましくは飼育動物、野生動物又は家畜であってもよい。
【００４２】
本発明による方法において、疾患又は状態は、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、自己免疫疾患及び遺伝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００４３】
本発明による方法において、試料は、好ましくは組織、腫瘍組織、尿、精液、唾液、血液、血漿、脳脊髄液、血小板、及び／又はエクソソームからなる群から選択される、より好ましくは腫瘍組織及び血小板から選択される、当業者に公知の任意の適切な試料であってもよい。
【００４４】
本発明による方法において、代謝経路は、好ましくはグルコース処理経路、グルタミン処理経路及び／又は脂肪酸経路からなる群から選択される。
【００４５】
本発明による方法において、目的とする多重領域は、グルコース処理遺伝子、グルタミン処理遺伝子、脂肪酸同化遺伝子、トランスポーター遺伝子、レドックス恒常性遺伝子、がん原遺伝子などのがんに関与している可能性がある遺伝子、血管新生に関与する遺伝子、免疫抑制に関与する遺伝子、及びウイルス遺伝子のｍＲＮＡ内にあることが好ましい。
【００４６】
本発明による方法において、目的とする多重領域は、ＡＢＡＴ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＬＹ、ＡＣＯ２、ＡＣＳＳ２、ＡＤＰＧＫ、ＡＬＤＯＡ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＴＧ４Ａ、ＡＴＰ５Ａ１、ＣＢＲ１、ＣＢＳ、ＣＨＫＡ、ＣＫＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＣＹＣＳ、ＥＧＬＮ１、ＥＮＯ１、Ｇ６ＰＣ、ＧＡＤ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＧＦＰＴ１、ＧＬＤＣ、ＧＳＳ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＨＫ３、ＧＬＹ１、Ｇ６ＰＤ、ＲＧＮ、ＰＧＤ、ＲＰＩＡ、ＲＰＥ、ＴＫＴ、ＰＧＩ、ＡＬＤＯＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＡＭ１／２、ＥＮＯ、ＰＫＭ１／２、ＰＤＨＡ１、ＰＤＫ１、ＰＦＫＢ１、ＰＦＫＭｂ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＤ、ＰＧＫ１、ＰＫＭ、ＰＲＤＸ１、ＰＲＫＡＡ１、ＲＰＩＡ、ＰＣ、ＣＳ、ＡＣＯ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＤＨ３Ａ、ＩＤＨ３Ｂ、ＩＤＨ３Ｇ、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＡ２、ＳＤＨＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＦＨ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＰＤＫ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＡ９、ＣＡ１２、ＳＬＣ４Ａ１０、ＶＨＬ、ＳＤＨ、ＳＤＨＡＦ２、ＨＰＧＬ／ＰＣＣ、ＦＨ、ＣＳ、Ｄ−２ＨＧＤＨ、Ｌ−２ＨＧＤＨ、ＦＨ、ＩＤＨ１−３Ａ−Ｇ、ＭＤＨ１−２、ＭＹＣ、ＯＧＤＨ、ＳＤＨＡ−Ｄ、ＶＨＬ、ＰＨＤ、ＨＩＦ１ａ、ＥＰＡＳ２  ＰＤＣＤ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＡＳＣＴ２、ＧＬＳ、ＧＬＵＤ１／２、ＧＯＴ、ＧＰＩ、ＧＳ、ＢＣＡＴ１、ＢＣＡＴ２、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ７Ａ１１、ＳＬＣ２５Ａ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＦＡＳＮ、ＣＰＴ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＣＨＫＡ、ＣＰＴ２、ＶＬＣＡＤ、ＨＡＤＨＡ／Ｂ、ＳＣＡＤ、ＭＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＳＣＨＡ−Ｄ、２−エノイル−ＶｏＡヒドラターゼ、ＭＣＫＡＴ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ７、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ７Ａ１、ＳＬＣ９Ａ１、ＳＬＣＡ１２、レドックス恒常性遺伝子：ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰＲＴ１、ＮＯＸ１、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４Ａ、ＮＱＯ１、ＳＯＤ、ＳＯＤ２、ＣＡＴ、ＴＡＬ、ＴＩＧＡＲ、ＴＲＸ、ＰＡＲＰ１、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＭＡＰＫ８、ＭＹＣ、ＴＰ５３Ｉ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＫＤＲ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＭＥＲＴＫ、ＰＬＸＮＤ１、ＲＥＴ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＡＲバリアント７、ＡＲバリアント１２、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ３、ＭＥＴ、ＭＥＴデルタ１４、ＭＥＴデルタ７〜８、ＫＩＴ、ＲＯＮ  ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４４、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９、ＣＤ２７４、ＣＴＬＡ４、ＨＰＶ−Ｅ２、ＨＰＶ−Ｅ６、及びＨＰＶ−Ｅ７からなる群から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個又は少なくとも６個の遺伝子のｍＲＮＡ内にあることが好ましい。
【００４７】
本発明による方法において、目的とする多重領域は、
グルコース処理遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＡＢＡＴ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＬＹ、ＡＣＯ２、ＡＣＳＳ２、ＡＤＰＧＫ、ＡＬＤＯＡ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＴＧ４Ａ．  ＡＴＰ５Ａ１、ＣＢＲ１、ＣＢＳ、ＣＨＫＡ、ＣＫＢ、ＣＰＴ１Ａ、ＣＹＣＳ、ＥＧＬＮ１、ＥＮＯ１、Ｇ６ＰＣ、ＧＡＤ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＧＦＰＴ１、ＧＬＤＣ、ＧＳＳ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＨＫ３、ＧＬＹ１、Ｇ６ＰＤ、グルコノラクトナーゼ、ＰＧＤ、ＲＰＩＡ、ＲＰＥ、ＴＫＴ、ＰＧＩ、ＡＬＤＯＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＡＭ１／２、ＥＮＯ、ＰＫＭ１／２、ＰＤＨＡ１、ＰＤＫ１、ＰＦＫＢ１、ＰＦＫＭｂ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＤ、ＰＧＫ１、ＰＫＭ、ＰＲＤＸ１、ＰＲＫＡＡ１、ＲＰＩＡ、ＰＣ、ＣＳ、ＡＣＯ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＤＨ３Ａ、ＩＤＨ３Ｂ、ＩＤＨ３Ｇ、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＡ２、ＳＤＨＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＦＨ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＰＤＫ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＡ９、ＣＡ１２、ＳＬＣ４Ａ１０、ＶＨＬ、ＳＤＨ、ＳＤＨＡＦ２、ＨＰＧＬ／ＰＣＣ、ＦＨ、ＣＳ、Ｄ−２ＨＧＤＨ、Ｌ−２ＨＧＤＨ、ＦＨ、ＩＤＨ１−３Ａ−Ｇ、ＭＤＨ１−２、ＭＹＣ、ＯＧＤＨ、ＳＤＨＡ−Ｄ、ＶＨＬ、ＰＨＤ、ＨＩＦ１ａ、ＥＰＡＳ２及び／又はＰＤＣＤ１；
グルタミン処理遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＳＬＣ１Ａ５、ＡＳＣＴ２、ＧＬＳ、ＧＬＵＤ１／２、ＧＯＴ、ＧＰＩ、ＧＳ、ＢＣＡＴ１、ＢＣＡＴ２、ＳＬＣ１Ａ２及び／又はＳＬＣ７Ａ１１；
脂肪酸同化遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＳＬＣ２５Ａ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＦＡＳＮ、ＣＰＴ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＣＨＫＡ、ＣＰＴ２、ＶＬＣＡＤ、ＨＡＤＨＡ／Ｂ、ＳＣＡＤ、ＭＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＳＣＨＡ−Ｄ、２−エノイル−ＶｏＡヒドラターゼ及び／又はＭＣＫＡＴ；
トランスポーター遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ７、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ７Ａ１、ＳＬＣ９Ａ１及び／又はＳＬＣＡ１２；
レドックス恒常性遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰＲＴ１、ＮＯＸ１、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４Ａ、ＮＱＯ１、ＳＯＤ、ＳＯＤ２、ＣＡＴ、ＴＡＬ、ＴＩＧＡＲ及び／又はＴＲＸ；
ＤＮＡ修復遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＰＡＲＰ１；
がんに関与している可能性がある遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＴＰ５３、ＭＡＰＫ８、ＭＹＣ、ＴＰ５３Ｉ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＫＤＲ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＭＥＲＴＫ、ＰＬＸＮＤ１、ＲＥＴ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＡＲバリアント７、ＡＲバリアント１２、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ３、ＭＥＴ、ＭＥＴデルタ１４、ＭＥＴデルタ７〜８、ＫＩＴ、ＲＯＮ及び／又はＰＴＥＮ；
血管新生に関与する遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４４、ＶＥＧＦ−Ａ１６５及び／又はＶＥＧＦ−Ａ１８９
免疫抑制に関与する遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＣＤ２７４及び／又はＣＴＬＡ４；並びに／或いは、
ウイルス遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＨＰＶ−Ｅ２、ＨＰＶ−Ｅ６及び／又はＨＰＶ−Ｅ７
のｍＲＮＡ内にあることが好ましい。
【００４８】
本発明による方法において、異常なレベルの転写産物、選択的スプライスバリアント及び／又は変異の存在はまた、任意選択で薬物と組み合わせた食品化合物又はファイトケミカルによる治療の徴候も提供することが好ましい。当業者は、薬物治療が、有益には食品化合物又はファイトケミカルによる治療と組み合わされ得ることを知っている。
【００４９】
本発明による方法は、好都合には対象における治療を導くために使用することができる（個別化医療）。したがって、さらなる態様において、本発明は、
本発明による方法の実施を要請し、又は本発明による方法を実施し、故に、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性を決定するステップと、
対象の疾患又は状態を、対象の疾患又は状態が感受性である薬物で治療するステップと
を含む、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の治療の方法を提供する。この態様において、全ての特徴は、好ましくは第１の態様のものである。
【００５０】
本発明による治療の方法において、疾患又は状態は、神経膠腫、髄膜腫、上衣腫、毛様細胞性星状細胞腫、腺がん、肉腫、血管腫、頭頸部がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、食道がん、基底細胞がん、陰茎がん、外陰がん、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、胆管細胞がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、及び骨肉腫を含むがこれらに限定されないがん；ウイルス感染症；細菌感染症；自己免疫疾患及び遺伝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００５１】
本発明による治療の方法において、薬物治療は、食品化合物又はファイトケミカルによる治療で補完されることが好ましい。
【００５２】
本発明は、
本発明による方法が行われ、又は行われるよう要請され、故に、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性を決定するステップと、
疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象に、対象の疾患又は状態が感受性である薬物を投与するステップと
を含む、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の治療における使用のための医薬品（薬物）をさらに提供する。
【００５３】
本発明による使用のための医薬品（薬物）において、疾患又は状態は、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、自己免疫疾患及び遺伝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００５４】
本発明による使用のための医薬品（薬物）において、薬物治療は、食品化合物又はファイトケミカルによる治療で補完されることが好ましい。
【００５５】
本発明は、
本発明による方法の実施を要請し、又は本発明による方法を実施し、故に、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の、疾患又は状態を治療する薬物に関する感受性及び／又は抵抗性を決定するステップと、
対象の疾患又は状態を、対象の疾患又は状態が感受性である薬物で治療するステップと
を含む、疾患若しくは状態に罹患している又はこのリスクがある対象の治療用医薬品（薬物）の製造のための方法をさらに提供する。
【００５６】
本発明による治療用医薬品（薬物）の製造のための方法において、疾患又は状態は、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、自己免疫疾患及び遺伝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００５７】
本発明による治療用医薬品（薬物）の製造のための方法において、薬物治療は、食品化合物又はファイトケミカルによる治療で補完されることが好ましい。
【００５８】
本発明は、表ＩＩに示されている群から選択される分子反転プローブをさらに提供する。本発明は、表ＩＩに示されている群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の分子反転プローブのセットをさらに提供する。
【００５９】
本発明は、本発明の第１又は第２の態様による方法によって得ることができる環状化分子反転プローブのライブラリーをさらに提供する。
【００６０】
定義
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、非限定的な意味で使用されて、該単語の後に続く項目が含まれるが、具体的に述べられていない項目が排除されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、唯一の要素があることを文脈が明白に要求しない限り、１つを超える要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、故に「少なくとも１つ」を通常は意味する。
【００６１】
単語「約（ａｂｏｕｔ）」又は「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、数値と関連して使用されるとき（例えば約１０）、該値は、該値の５％多い又は少ない（１０の）所与の値となり得ることを好ましくは意味する。
【００６２】
本明細書で提供される配列情報は、誤同定された塩基の包含を必要とするほど狭義に解釈されるべきではない。当業者は、そのような誤同定された塩基を同定することができ、そのような誤差の補正の仕方を知っている。配列誤差の場合、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、配列番号１に存在する遺伝子の発現により得ることができるポリペプチドの配列が、優先するべきである。
【００６３】
本明細書に引用された全ての特許及び文献参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【表１】
2020509741.tif 000002
2020509741.tif 000003
2020509741.tif 000004
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【実施例】
【００６４】
実施例１−標的化ｓｍＭＩＰベースのＲＮＡシーケンシングは代謝に関する関連性のある情報をもたらす
過去４０年間に圧倒的な量のデータが、発がんの根底にある分子事象に関して利用可能になった。研究は、分子変化と、とりわけＰＩ３Ｋ／ｐＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路（１９〜２２）及び細胞周期制御、アポトーシス（２３、２４）及びＤＮＡ修復経路（２５、２６）へのその影響に主に注目してきた。現在、従来の化学療法では達成できない特異度のレベルで、これらの遺伝子異常に基づいてがん細胞を標的にし、個別化医療を可能にする多数のＦＤＡ承認薬が利用可能である（２７、２８）。標的化がん療法は生存を延長し得るが、固有の遺伝的不安定性が、最終的にほとんどのがんの治療抵抗性につながることは現在広く認識されている（１１〜１４）。
【００６５】
増殖のために、がん細胞は、ＡＴＰを生成してエネルギーバランス及びイオン恒常性を維持し、アミノ酸、ヌクレオチド及び脂質の合成のための炭素及び窒素源を取り込み（２９、３０）、レドックス電位を維持して酸化ストレスに対して細胞を保護する（３１）必要がある。これらのプロセスの１つ又は複数をブロックすることは、増殖を妨げ、及び／又は合成致死性アプローチでの毒性療法に細胞を増感させ得る。一例として、代謝阻害剤でがんにおける酸化ストレスを高めることは、放射線療法（３２）又は化学療法（３３）の有効性を強化し得る。がんにおける異常な代謝経路の知識が高まるにつれて（３４〜３７）、がん特異的代謝経路の（補助剤）標的化は、現在の治療プロトコルに対する非常に興味深い追加となり得る。がん特異的代謝適応の最もよく知られた例は、ワールブルク効果としても知られる好気性解糖系である（３８）。解糖系は、ＡＴＰ産生に関して非効率的であることから、がん細胞は、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１及び／又はＧＬＵＴ３を特徴的に上方制御する。グルコース以外に、グルタミン及び脂肪酸は、がん細胞の重要な燃料として認識されている（３９、４０）、（４１、４２）。
【００６６】
代謝適応は、大部分が発がんの結果として見られるが、代謝性変化もまたがんを引き起こし得ることが明解に確立されている。例は、ミトコンドリア（例えばＩＤＨ２、ＦＨ、ＳＤＨ）及び細胞質ゾル（例えばＩＤＨ１）代謝酵素をコードする遺伝子の変異であり（４３、４４）（４５、４６）（１、４７、４８）、後者は、とりわけ低グレード神経膠腫及び続発性膠芽腫で顕著である（１、４８）。明細胞腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）は、明細胞腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）の約８０％で見出される、ＶＨＬの不活性化変異又はエピジェネティックサイレンシングから間接的に生じる代謝性変化を伴う代謝性疾患と現在考えられている（４９）。ｐＶＨＬは、転写因子低酸素誘導因子ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αのユビキチン化及び分解の主要な調節因子である（４９）。上述の代謝酵素及びＶＨＬの変異は、他の代謝酵素の発現に予測不可能な方法で影響を与えるエピジェネティック変化を誘導することが示されている（１７、５０〜５２）。
【００６７】
現在の抗腫瘍医療道具への潜在的追加物として代謝阻害剤を適用するために、どの代謝経路が特定のがんにおいて活性であるかを個別化された方法で同定することが非常に重要である。本明細書において本発明者らは、単一分子分子反転プローブ（ｓｍＭＩＰ（１５））を用いる新規の次世代シークエンシングベースの方法を適用して、代謝に関与する１０４個の遺伝子の発現レベルを検出し、同時にその中のバリアントを同定した。概念実証として、本発明者らは、ＶＨＬ欠損ｃｃＲＣＣ細胞株及び対応するＶＨＬレスキュー同質遺伝子誘導体の代謝トランスクリプトームのマッピング部分、並びに患者由来神経膠腫異種移植片モデルにｓｍＭＩＰを適用した。本発明者らは、結果を全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑデータ（トランスクリプトーム解析のゴールドスタンダードとしての）及びタンパク質発現と相関させることにより、該手法を検証した。本発明者らは、細胞株及び患者腫瘍組織における発がん変異を検出するアッセイの能力をさらに検証した。
【００６８】
本発明者らのデータは、ｓｍＭＩＰを用いた代謝酵素をコードする転写産物の標的化ＲＮＡシーケンシングが、がんで作動可能であり（５３）、同時に標的化転写産物中のバリアント検出を可能にする優勢な代謝経路を予測することを示している。
【００６９】
材料及び方法
細胞株−
細胞株ＳＫＲＣ７は、一次ヒトｃｃＲＣＣに由来し、以前に記載されている（５４）。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）及び４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃｅｎｔｒａｆａｒｍ、エッテン−ルール、オランダ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ、スイス）で培養した。機能性ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付けＶＨＬ（ＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ）を発現する同質遺伝子ＳＫＲＣ７細胞株を、ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＨＬＨＡによるトランスフェクションと、その後の４００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）を含む同じ培地での安定なトランスフェクタントの選択により作成した。患者由来神経膠腫異種移植片モデルＥ４７８及びＥ９８は、以前に記載されている（５５、５６）。
【００７０】
患者材料−
患者材料の使用は、患者材料の使用のための地元の倫理委員会のガイドラインに従い、インフォームドコンセントを得て行った。グレードＩＩＩ星状細胞腫を有する男性患者から外科的に得られた組織を、液体窒素で急速凍結した。
【００７１】
ＲＮＡ及びｃＤＮＡ調製−
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、急速凍結Ｅ４７８異種移植片組織、ヒト腫瘍組織の切片及び８０％コンフルエントなＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞から単離した。ＲＮＡ品質を、アガロースゲルの２８Ｓ、１８Ｓ及び５Ｓ  ｒＲＮＡバンドの相対的レベルに基づき、及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒアッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アムステルフェーン、オランダ）により推定した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）及びランダムヘキサマープライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて、標準的なプロトコルに従ってｃＤＮＡに逆転写した。次に、ｃＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、デューレン、ドイツ）を用いて精製した。品質管理のために、ｃＤＮＡを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ３６０マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ  ＵＳＡ）を用いてフォワードプライマーＨＭＢＳＦｗ（５’−ＣＴＧＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＴ−３’）及びリバースプライマーＨＭＢＳＲｖ（５’−ＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣ−３’）による参照遺伝子ヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＢＭＳ）のＰＣＲに供した。
【００７２】
全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑ解析
ＲＩＮスコアが＞８の高品質ＲＮＡを、標準的なプロトコルに従って全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑに供した。シーケンシングはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑで行い、１試料あたり３０〜５千万リードを得た（ペアードエンドシーケンシングプロトコル）。データセットを「Ｔｕｘｅｄｏ」プロトコルを用いて解析し、ＴｏｐＨａｔでリードをＲｅｆＳｅｑヒトゲノム（ｈｇ１９）に対してマッピングし、最終転写産物アセンブリをＣｕｆｆｌｉｎｋｓパッケージで行った（５７）。正規化を、Ｃｕｆｆｑｕａｎｔ及び１００万個のマッピングされたリードあたりの転写産物（ＴＰＭ）としての断片の計算の両方で行って、相対的発現値を得た。単一ヌクレオチドバリアントの出現を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ  ｂｒｏｗｓｅｒ（ＩＧＶ、ｔｈｅ  Ｂｒｏａｄ研究所）で可視化した。
【００７３】
ｓｍＭＩＰ設計
ｓｍＭＩＰを用いる標的化ＲＮＡｓｅｑの手法を図１に示す。該手法は、「定常」骨格配列によって反転して結合された伸長及びライゲーションプローブの、目的とするｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、その後のギャップフィリング／ライゲーション及びＰＣＲに基づく。１０４個の予測された転写産物（ＵＣＳＣヒトゲノムアセンブリｈｇ１９）のアンチセンス鎖に対するＳｍＭＩＰを、Ｂｏｙｌｅらによって記載されたＭＩＰｇｅｎアルゴリズムに基づき設計した（１８）。ゲノムＤＮＡの潜在的混入物にハイブリダイズするｓｍＭＩＰプローブの寄与を防ぐために、可能な限りｓｍＭＩＰは、隣接するエクソンに位置するライゲーション及び伸長プローブを用いて設計した。目的とする転写産物は、脂質代謝、解糖、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、グルタミノリシス及び還元電位の制御を含む、様々な代謝経路で機能する酵素及びトランスポーターをコードしていた（表Ｉ参照）。ｓｍＭＩＰセットは、ハウスキーピング遺伝子としてのβ−アクチン及びβ−チューブリン、並びにがんに関連するいくつかのチロシンキナーゼの検出のためのプローブも含有した。ＳｍＭＩＰは、ひと続きの８つのランダムヌクレオチドがライゲーションプローブに隣接して組み込まれた定常骨格配列（４０ｎｔ）によって結合された、長さ１６〜２０ｎｔの伸長プローブ及び長さ２０〜２４ｎｔのライゲーションプローブを用いて設計した。ランダム８Ｎ配列は、１個のｓｍＭＩＰから生じる全てのアンプリコンを１個の固有のＭＩＰに減らすために組み込まれる（以下参照）。ギャップフィルの長さは１１２ｎｔに設定した。設計はフルカバーに基づいたが、転写産物の大部分に対して１転写産物あたり５〜１０個のｓｍＭＩＰＳを、標的領域がリーディングに均等に分布したパネルに含めた。１８個の転写産物（ＣＳ、Ｄ−２ＨＧＤＨ、Ｌ−２ＨＧＤＨ、ＦＨ、ＩＤＨ１−３Ａ−Ｇ、ＭＤＨ１−２、ＭＹＣ、ＯＧＤＨ、ＳＤＨＡ−Ｄ、ＶＨＬ）について、完全コード配列をカバーするｓｍＭＩＰセットを選択した。
【００７４】
捕捉及びライブラリー調製
６４２個のｓｍＭＩＰ（ＩＤＴ、ルーバン、ベルギー）を１００μＭ／ｓｍＭＩＰでプールした。ｓｍＭＩＰプールを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）で３７℃、４５分間リン酸化し、その後、６５℃で２０分間不活性化した。捕捉反応は、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）、ｄＮＴＰｓ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）及び熱安定性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含有する２５μＬ反応混合物で、５０ｎｇのｃＤＮＡ及び推定８０００倍モル過剰のリン酸化ｓｍＭＩＰプール（１６）を用いて行った。捕捉混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし（変性）、その後、６０℃で１８時間インキュベートした。この間にハイブリダイゼーション及び同時のプライマー伸長及びライゲーションが生じる。このステップの直後に、非環状化ｓｍＭＩＰ、ＲＮＡ及びｃＤＮＡを、１０ＵエクソヌクレアーゼＩ及び５０ＵのエクソヌクレアーゼＩＩＩ（両方ともＮＥＢ）により３７℃で４５分間処理し、その後、加熱不活性化（９５℃、２分）して除去した。環状化ｓｍＭＩＰライブラリーを、試料ごとに固有のバーコード化リバースプライマーを含有するプライマーセットを含む２×ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ）を用いる標準的ＰＣＲに供した。適切なサイズ（２６６ｂｐ）のＰＣＲ産物の生成を、アガロースゲル電気泳動で検証し、異なる試料からのＰＣＲライブラリーを、相対的なバンド強度に基づきプールした。プールを、次いで、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ハイウィカム、ＵＫ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製ライブラリーをＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  ２２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実行し、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ  ＵＳＡ）により定量化してライブラリーの品質を評価した。
【００７５】
手法の再現性を、同じ細胞株由来の種々のＲＮＡ調製物を用いて、生物学的複製ライブラリーを調製してテストした。
【００７６】
シークエンシング及びアノテーション
ライブラリーを、Ｒａｄｂｏｕｄｕｍｃシーケンシング施設においてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）に配列決定して、２×１５０ｂｐペアエンドリードを得た。リードを、ＪＳＩ  ＳｅｑｕｅｎｃｅＰｉｌｏｔバージョン４．２．２ビルド５０２のＳｅｑＮｅｘｔモジュール（ＪＳＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、エッテンハイム、ドイツ）を用いて、参照トランスクリプトーム（ｈｇ１９）にマッピングした。ライゲーションプローブに隣接するランダム８ｎｔ配列を使用して、ＰＣＲ増幅物を１個のｓｍＭＩＰ（ユニークリード）に減らした。
【００７７】
単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）コーリング及び発現解析−
少なくとも５個のユニークリード（フォワード及びリバース）において検出された５％の最小バリアント割合でコールした全ての単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を、さらなる解析のために選択した。バリアントをアノテーションし、同義又は非同義に分類した。次に、これらを、同じ細胞株由来の種々のＲＮＡ単離物から生成した全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑデータで検証した。
【００７８】
ｓｍＭＩＰごとの個々のリード数を、試料内の全リード数で除し、１０６を乗じ、試料中のｓｍＭＩＰごとに１００万個あたりの断片（ＦＰＭ）値をもたらした。完全なハウスキーピング遺伝子は存在しないため、本発明者らは、ハウスキーピング遺伝子に対する正規化の代わりにこの正規化手順を選択する。例えば、代謝遺伝子の発現は細胞周期に依存して変動を受け、同じことがアクチン及びチューブリンなどの遺伝子の発現についても言える。
【００７９】
ウェスタンブロッティング−
細胞抽出物を、ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に可溶化してＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞から調製し、ＢＣＡアッセイを用いて及びタンパク質濃度を決定した。２０μｇのタンパク質を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースにエレクトロブロットした。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１：１）でブロック後、ＨＫ−２（２８６７Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＡ９（Ｍ７５、Ｄｒ．  Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ）又はγ−チューブリン（Ｃ２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダラス、ＴＸ）に対する抗体をローディングコントロールとして含有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液で膜を一晩インキュベートした。抗体を、Ａｌｅｘａ６８０又はＤｙＬｉｇｈｔ８００とコンジュゲートゲートされた二次抗体で検出し、シグナルをＯｄｙｓｓｅｙスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ）で可視化した。
【００８０】
統計
各転写産物のＦＰＭ値（１個の転写産物を標的にする全ｓｍＭＩＰからの平均ＦＰＭ値）を、ＴＰＭ値（同じ細胞株由来の全ＲＮＡｓｅｑデータから得られた同じ転写物の１００万個あたりの転写産物値と相関させた。３試料について反復アッセイを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて相関解析を行った。
【００８１】
結果
ゲノムＤＮＡのＳｍＭＩＰベースの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ＤＮＡの腫瘍関連変異を検出するために本発明者らの研究所における日常的な診断に近年導入された（１６）。ｓｍＭＩＰを、バリアント検出と同時に遺伝子発現レベルの多重決定にも使用することができるかを調べるために、本発明者らは、代謝酵素をコードする転写産物の標的化検出及びシークエンシングのためのｓｍＭＩＰセットを設計した。手法の強みを確立するために、本発明者らは、異なる代謝経路が優先する原型細胞株としてＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ同質遺伝子細胞株対を使用した。ｃｃＲＣＣの８０％のように、ＳＫＲＣ７細胞株もまた、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αの構成的安定化及び偽低酸素応答をもたらす欠損ＶＨＬ遺伝子を有する（５３、５４、５８）。ＶＨＬの再導入は、迅速なＨＩＦ１／２分解及びこの代謝異常の修復をもたらすと期待された。
【００８２】
ＳＫＲＣ７細胞の全ＲＮＡｓｅｑ由来遺伝子発現データは、ＶＨＬ転写産物の１００％でナンセンス及び機能的不活性化Ｑ１３２ストップ変異の存在を確認した（図２Ａ）のに対し、ＳＫＲＣ７ＶＨＬＨＡではｗｔＶＨＬ配列のみが検出され（図２Ｂ）、これはｓｍＭＩＰアッセイで容易に再現された（図２Ｃ、Ｄ）。機能性ＶＨＬＨＡのＳＫＲＣ７細胞への導入は、ＶＨＬ発現の１００倍の増加をもたらした（図２Ｅ、図２Ｆのウェスタンブロットも参照）。
【００８３】
ライブラリー調製の最適化
この試験の１０４個の目的とする転写産物をカバーする、６４２個のｓｍＭＩＰの最初のセットを用いて（表Ｉ参照）、本発明者らは、全ＲＮＡｓｅｑデータセットも利用可能な１３の異なるＲＮＡ試料（細胞株由来及び異種移植片由来）から生成した、５０ｎｇのヘキサマープライムｃＤＮＡを用いるライブラリー調製の本発明者らのプロトコルをテストした。環状化ｓｍＭＩＰライブラリーでのバーコード化プライマーによる２５サイクルのＰＣＲは、２６６ｂｐの期待サイズのＰＣＲ断片をもたらした（不図示）。
【００８４】
最初の実験に基づき、本発明者らは、１０及び２５ｎｇ  ｃＤＮＡでの手順もテストした。両方の条件は、５０ｎｇと比べて少ないＰＣＲ断片及び少ないユニークリードをもたらした。本発明者らは、それ故にその後の実験では５０ｎｇ  ｃＤＮＡインプットを続けた。ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬ細胞の生成したライブラリーのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑシーケンシングは、それぞれ２８６，０００及び６９，０００個のアノテーションユニークリード（ｓｍＭＩＰのランダム８Ｎ配列に基づくＰＣＲ増幅物に対して補正）をもたらした。これは、同じｓｍＭＩＰパネルで行った他の試料の範囲内である（不図示）。ほとんどの転写産物について、個々のｓｍＭＩＰのパフォーマンスはばらつきがあった（両方の細胞株におけるＶＨＬ転写産物に対して設計された１０個の異なるｓｍＭＩＰのＦＰＭ値を示す、表ＩＩの例参照）、ＤＮＡ  ｓｍＭＩＰ  ＮＧＳでも基地の現象（１６））。これは、１遺伝子転写産物あたり少なくとも５個のｓｍＭＩＰを本発明者らのパネルに含め、転写産物ごとに平均正規化ｓｍＭＩＰ値を用いるトランスクリプトーム解析を可能にする先験的理由となった。この数は、無駄で無関係なデータを一部に生じるであろう高額な大パネルを生成することと、転写産物レベルの過小又は過大評価をもたらす小さすぎるパネルとのトレードオフであった。
【００８５】
最初に、本発明者らは、８６４個のｓｍＭＩＰパネルで生成した標的化ｓｍＭＩＰ  ＲＮＡｓｅｑデータセットを、同じ細胞株由来の種々のＲＮＡ単離物で行った全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑデータセット（ゴールドスタンダードと見なす）と比較した。全ＲＮＡｓｅｑデータセットは、ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡの４４，５０３個の異なる転写産物にそれぞれ割り当てられた、３．２×１０７及び３．４×１０７リードからなる。目的とする転写産物ごとに、全ＲＮＡｓｅｑデータセットからのＴＰＭ（１００万個あたりの転写産物）値を、ｓｍＭＩＰ解析からの平均ＦＰＭ値に対してプロットした。代謝転写産物及びチロシンキナーゼ転写産物の別々のそのような解析は、ＳＫＲＣ７に関しては、それぞれ０．９０３及び０．９７４（図３Ａ、３Ｂ）、並びにＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡに関してはそれぞれ０．７８４及び０．９０３（図３Ｃ、３Ｄ）の相関係数を与えた。これは、予想通り、代謝遺伝子の発現がチロシンキナーゼより変動しやすいことを示唆している。１転写産物あたりの最もパフォーマンスの良いｓｍＭＩＰで得られたユニークリードに対する、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑデータのプロット、又は転写産物ごとのユニークリードの中央値（パフォーマンスなし又はパフォーマンスが低いｓｍＭＩＰによるバイアスを防ぐための）は、この相関を改善しなかった（不図示）。
【００８６】
ｓｍＭＩＰを用いる標的化ＲＮＡｓｅｑの魅力的な特徴の１つは、パネルを拡大して新規の目的とする転写産物を検出することができることである。これがアッセイの成績にどのように影響するかをテストするために、本発明者らは、目的とする他の転写産物の検出及び標的化シーケンシングのための２２２個のｓｍＭＩＰを本発明者らの最初のパネルに追加し、同じ細胞株から新たに単離したＲＮＡを用いてアッセイを再び行った。試料内の転写産物の相対的レベルは、最初の及び拡大したｓｍＭＩＰセットによるアッセイ間でよく相関した（ＳＫＲＣ７：ｒ＝０．９０３、ＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ：ｒ＝０．８７６）。
【００８７】
標的化ｓｍＭＩＰデータの機能検証
ｓｍＭＩＰデータセットの妥当性を確認したため、本発明者らは、ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞において代謝に関与する遺伝子の発現レベルを解析した。図４Ａ及び４Ｂは、解糖に関与するいくつかの転写産物についてｓｍＭＩＰベースの平均ＦＰＭ値の２つの生物学的重複を示している。ＨＩＦ標的遺伝子グルコーストランスポーター１及び３（ＳＬＣ２Ａ１及びＳＣＬ２Ａ３）、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ４（ＳＬＣ１６Ａ３）、炭酸脱水酵素９及び１２（ＣＡ９、ＣＡ１２）、ヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨ−Ａ）及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現は、ＳＫＲＣ７細胞と比べてＳＫＲＣ７−ＶＨＬＨＡ細胞で有意に及び再現可能に低下し（図４Ａ、４Ｂ）、全トランスクリプトームＲＮＡ  ｓｅｑデータから得られたデータと一致した（図４Ｃ）。ＣＡ９及びＨＫ２転写産物レベルの相対的発現レベルを、タンパク質レベルでさらに確認した（図４Ｄ）。ＣＡ９、ＨＫ２及びＬＤＨＡ、ＨＩＦの全ての標的遺伝子の強い低下は、ＶＨＬ欠損細胞株の期待値と一致した。
【００８８】
バリアント検出
ｓｍＭＩＰベースのＲＮＡｓｅｑが、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）の効率的な検出を可能にするかを調べるために、本発明者らは、ＳｅｑＮｅｘｔでｓｍＭＩＰライブラリーのバリアントコーリングを行った。全ＲＮＡｓｅｑデータセットで検証することができるいくつかのヘテロ接合及びホモ接合バリアントを検出した（図２Ｃ及び２ＤのＶＨＬ例参照）。本発明者らは、次いで、ＳＮＶ（参照ゲノムｈｇ１９との関連でバリアントと呼ばれる）を検出するアッセイの感度をさらに検証し、本発明者らが、以前にＩＤＨ１における新規の変異を同定した（ＩＤＨ１Ｒ３１４Ｃ）（１）、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異体乏突起膠腫株Ｅ４７８（５６）及び星状細胞腫細胞株Ｅ９８から単離したＲＮＡでｓｍＭＩＰ解析を行った。両方の変異が同定された（図５Ａ、５Ｂ）。
【００８９】
考察
本明細書において本発明者らは、ｓｍＭＩＰを用いる標的化ＲＮＡ次世代シーケンシングのためのライブラリー生成の新規のアプローチを提示し、該手法が、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑに質的に匹敵する、再現可能な及び生物学的に関連性のある情報をもたらすことを示している。特に、エピジェネティック制御及び転写因子ベースの制御に適した、がんにおける代謝経路の相対的寄与の評価に関して、ＤＮＡシーケンシングは、必ずしも関連性のある情報をもたらし得るとは限らない。ＶＨＬ発現のみが異なる細胞株の同質遺伝子対をテストケースとして用いて、本発明者らは、本発明者らのｓｍＭＩＰパネルによる代謝に関与する転写産物の標的化ＲＮＡ  ｓｅｑは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑのものと類似した相対存在量を有する、代謝経路に関する関連性のある情報をもたらすことを本明細書で示している。
【００９０】
標的化ＲＮＡｓｅｑのためのｓｍＭＩＰライブラリーの生成は、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑと比べてわずかなデータしか明らかにもたらさないが、これは明白な利点を有する：１）該手法の費用は、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑの費用の約５〜１０％である、２）隣接するエクソンに局在化したライゲーション及び伸長プローブを用いてｓｍＭＩＰを設計することにより、ライブラリーは、前処理に依存して全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑで多数のリードを占める得る異核ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡで汚染されないことが期待される、３）伸長及びライゲーション標的配列の選択は、スプライスバリアントを特異的に検出するｓｍＭＩＰの設計を可能にする、４）該手法は、ｓｍＭＩＰが変異領域をカバーするように選択されると、高効率性でＳＮＶ及びインデルの検出を可能にする、５）目的とする転写産物の１標的配列あたりのカバレッジは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑより高い、６）ｓｍＭＩＰセットは、パフォーマンスに影響を与えることなく目的とする新規のｓｍＭＩＰで伸長することができる、７）データセットは、はるかにより小さく、より扱いやすい。
【００９１】
手法を、ＶＨＬの発現のみ異なる同質遺伝子ｃｃＲＣＣ細胞株対で検証した。本発明者らの標的化ｓｍＭＩＰ解析は、ＨＩＦ標的遺伝子ＨＫ−２、ＣＡ９、ＣＡ１２及びＬＤＨ−Ａの発現レベルは、ＨＩＦタンパク質分解の既知の調節因子、ＶＨＬをレスキューすると、予想通り下方制御されることを明らかにした。これは、ＶＨＬ機能のレスキューが、解糖経路へのグルコースの流入を低下させることを示唆している。
【００９２】
がんにおける代謝活性の変化は、一般的発がんストレスの結果であり得るが、代謝酵素をコードする遺伝子、及び微小環境（酸素圧力、間質細胞由来代謝物の利用（５９））に関連する状態の変異の結果でもあるため、がん代謝は極めて複雑な景観である（６０）。それにもかかわらず、がん特異的代謝経路の標的化は、がん研究において重要性を増している。数十年来、解糖はがんにおける優勢な代謝経路と考えられてきたが、腫瘍もまた、グルタミンを炭素及び窒素ドナーとして用いて成長し得ることはますます明らかである。がんにおける代謝の弱点となる燃料−処理経路の同定が、個別化された方法で代謝阻害を適用するために重要である。臨床的がんの代謝経路を同定するためのアプローチには、現在、エクスビボ質量分析を用いる炭素追跡（５９、６１、６２）及びインビボでの１Ｈ、１３Ｃ炭素又は３１Ｐベースの磁気共鳴分光イメージング（４０、６３）が挙げられるが、これらのアプローチは、日常的な患者ケアでの実施には適していない。相対的な遺伝子発現レベル及びバリアントのスマートな組み合わせを同時に測定して代謝の弱点を同定することができることから、ＳｍＭＩＰベースの転写プロファイリングは、がん診断の分野で付加価値を有する極めて関連性のある代替物となり得る。がん原遺伝子又は腫瘍抑制因子遺伝子のアクショナブル変異を検出するｓｍＭＩＰセットと組み合わせる場合、個別化治療プロトコルは、解糖（例えば３−ブロモピルビン酸、ジクロロ酢酸（６４〜６６））、ペントースリン酸経路（例えば６−アミノニコチンアミド（３３）、グルタミノリシス（例えばエピガロカテキン−３−ガレート（６７、６８））、ミトコンドリア酸化的リン酸化（例えばメトホルミン（６９〜７１））、脂肪酸酸化及び脂質合成（例えばセルレニン（７２））などの最も優勢な代謝経路の阻害剤を含むことにより、さらに最適化することができる。
【００９３】
実施例２−がんにおけるグルタミノリシスは、放射線療法単独と比較してエピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）及び放射線療法の組み合わせに対する感受性強化を予測する
明細胞腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）は、放射線療法及び化学療法に比較的抵抗性である。機能障害性フォンヒッペルリンドウ病（ＶＨＬ）タンパク質に起因して、これらの腫瘍は、低酸素誘導因子ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αを蓄積し、異常な代謝を伴う偽低酸素応答をもたらす（４９、７３）。これが、酸化的リン酸化の代わりに、好気性解糖及び乳酸産生で使用するためのグルコース取り込みを増加させる一連のトランスポーター及び酵素の発現に変換する（７３）。酵素のヘキソキナーゼファミリーによるグルコースの取り込み及びグルコース−６−リン酸へのその変換の増加は、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）を通じた流入増加につながり、細胞における還元力の最も重要な形態、ＮＡＤＰ、及びヌクレオチド合成の前駆体、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）を細胞に提供する（３３）。正常な細胞では、酸化的グルコース代謝は、脂質生合成の主な炭素源としてミトコンドリアのクエン酸を産生するのに対し、この経路は、ＴＣＡ回路フィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）のためのアセチルＣｏＡの代わりに、ピルビン酸を乳酸へと処理するＶＨＬ欠損細胞ではブロックされる（７４）。ＶＨＬ欠損を有する細胞は、それ故に、代謝レスキュー経路としてグルタミンを使用する。グルタミノリシスの間に、グルタミンは、グルタミナーゼ及びグルタミン酸脱水素酵素の逐次活性化を介して、グルタミン酸及びα−ＫＧに変換される。その後、細胞は、細胞質でのα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）の還元的カルボキシル化を使用してイソクエン酸（ＩＤＨ１の逆反応）を産生し、イソクエン酸はクエン酸（アコニターゼ）及びアセチルＣｏＡ（ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ）に変換され、アセチルＣｏＡは、ＮＡＤＰＨと共に脂肪酸へと処理される（７５）。ＶＨＬ変異がんでは、低レベルのＴＣＡ酵素と組み合わされたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の高い発現レベル酵素が、生存不良と相関している（７６）。
【００９４】
ｃｃＲＣＣでは、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αの差次的発現が観察され、腫瘍は、両方のサブタイプ又はもっぱらＨＩＦ−２αのどちらかを発現する。ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αの影響の一部は重複しているが、これらは細胞代謝に対して異なる影響も及ぼす。ＨＩＦ−１αは、解糖酵素発現を引き起こし（７７）、ミトコンドリアのピルビン酸消費を制限し（７８、７９）、これによりこの経路を介した同化生合成をブロックする。さらに、ＨＩＦ−１αは、ｃ−ｍｙｃの阻害により細胞周期の進行を阻害する（８０）。しかし、ＨＩＦ−２αは解糖系を制御せず、細胞周期の進行を刺激する（８１）。正確な代謝経路は、それ故に、異なるＶＨＬ変異がん間で異なる可能性がある。悪性挙動を促進するがん細胞の代謝経路の解明は、これらが、細胞増殖及び腫瘍進行の阻害、又は酸化ストレス増感細胞を放射線療法若しくは化学療法に誘導することを目的とした標的化に適している可能性があるため、極めて重要である。
【００９５】
本明細書において本発明者らは、２つのＶＨＬ障害ｃｃＲＣＣ細胞株、ＳＫＲＣ−１７（ＨＩＦ−２のみを発現する）及びＳＫＲＣ−７（ＨＩＦ−１及びＨＩＦ２の両方を発現する）における代謝経路を調べた（５４、５８）。代謝酵素の発現をｓｍＭＩＰシーケンシングで調査し、これらの細胞の増殖に不可欠な炭素源を同定した。結果は、ＳＫＲＣ−７細胞が、乳酸産生にグルコース（グルコースからピルビン酸、ピルビン酸から乳酸のための高レベルの酵素）を使用することを示している。ＳＫＲＣ−１７の遺伝子発現プロファイルは、細胞がペントースリン酸経路にはグルコースを主に使用することを示唆している。両方の細胞型は、グルタミン酸脱水素酵素阻害剤ＥＧＣＧに対する感受性を示唆する、高レベルのグルタミナーゼ及びグルタミン酸脱水素酵素を有する。ＳＫＲＣ１７における高レベルのＰＰＰは、６−アミノニコチンアミド（６−ＡＮ）のさらなる活性を示唆するものである。
【００９６】
材料及び方法
細胞培養
原発性ヒトＲＣＣに由来するＳＫＲＣ−７、及びヒトＲＣＣの軟組織転移性病変に由来するＳＫＲＣ−１７（８２）は、両方ともＶＨＬにナンセンス変異を有し（ＳＫＲＣ−７ではＱ１３２Ｘ及びＳＫＲＣ−１７ではＳ６５Ｘ）、それ故に機能性ｐＶＨＬを欠く。ＳＫＲＣ−７では、これは高レベルのＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αにつながるが、一方ＳＫＲＣ−１７は、高レベルのＨＩＦ−２αのみを示す（５４、５８）。特に言及がない限り、細胞は、補完され１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）及び４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃｅｎｔｒａｆａｒｍ、エッテン−ルール、オランダ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ、スイス）で培養した。
【００９７】
ＳｍＭＩＰシーケンシング
６４２個のｓｍＭＩＰ（ＩＤＴ、ルーバン、ベルギー）を１００μＭ／ｓｍＭＩＰでプールした。ｓｍＭＩＰプールを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）で３７℃、４５分間リン酸化し、その後、６５℃で２０分間不活性化した。捕捉反応は、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）、ｄＮＴＰｓ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）及び熱安定性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含有する２５μＬ反応混合物で、５０ｎｇのｃＤＮＡ及び推定８０００倍モル過剰のリン酸化ｓｍＭＩＰプール（１６）を用いて行った。捕捉混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし（変性）、その後、６０℃で１８時間インキュベートした。この間にハイブリダイゼーション及び同時のプライマー伸長及びライゲーションが生じる。このステップの直後に、非環状化ｓｍＭＩＰｓ、ＲＮＡ及びｃＤＮＡを、１０ＵエクソヌクレアーゼＩ及び５０ＵのエクソヌクレアーゼＩＩＩ（両方ともＮＥＢ）により３７℃で４５分間処理し、その後、加熱不活性化（９５℃、２分）して除去した。環状化ｓｍＭＩＰライブラリーを、試料ごとに固有のバーコード化リバースプライマーを含有するプライマーセットを含む２×ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ）を用いる標準的ＰＣＲに供した。適切なサイズ（２６６ｂｐ）のＰＣＲ産物の生成を、アガロースゲル電気泳動で検証し、異なる試料からのＰＣＲライブラリーを、相対的なバンド強度に基づきプールした。プールを、次いで、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ハイウィカム、ＵＫ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製されたライブラリーをＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  ２２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実行し、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ  ＵＳＡ）により定量化してライブラリーの品質を評価した。
【００９８】
手法の再現性を、同じ細胞株由来の種々のＲＮＡ調製物を用いて、生物学的複製ライブラリーを調製してテストした。
【００９９】
ウェスタンブロッティング
ｓｍＭＩＰシーケンシングデータで観察された転写産物レベルをタンパク質レベルで検証するために、解糖（ＨＫ２、ＰＫＭ２、ＧＡＰＤＨ）、グルタミノリシス（ＧＬＵＤ）及びリバースカルボキシル化（ＩＤＨ１）において活性な興味深い酵素の一部についてウェスタンブロットを行った。細胞を８０％コンフルエンシーまで６ウェルプレートで培養し、次いで細胞を回収し、１００μｌ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５及び０．３２Ｍスクロースにかき集め、氷上で超音波処理（３０秒最大出力及び３０秒オフを３サイクル、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）して細胞溶解物に処理した。溶解物を遠心分離し（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、タンパク質濃度測定のために上清をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）に供した。２０μｇの全細胞質ゾルタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｏｐｔｉｔｒａｎ  ＢＡ−Ｓ８５、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、リトルチャルフォント、ＵＫ）にエレクトロブロットした。ＰＢＳ中Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）（１：１）でブロック後、マウス抗ＨＡ（１：５００、Ｓｃ−７９３２、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、ダラス、ＴＸ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ＧＬＵＤ（１：４００、ＧＴＸ１０５７６５、ＧｅｎｅＴｅｘ  Ｉｎｃ、サンアントニオ、ＴＸ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ＩＤＨ１（１：１０００、ＨＰＡ０３５２４８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）、マウス抗ＧＡＰＤＨ（１：１０，０００、ａｂ８２４５、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＵＳ）、ウサギ抗ＨＫ２（１：１０００、２８６７Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバーズ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ＰＫＭ２（１：１０００、Ｄ７８Ａ４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバーズ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びヤギ抗γチューブリン（１：５０００、ｓｃ−７３９６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ダラス、ＴＸ、ＵＳＡ）とブロッキング緩衝液で膜をインキュベートし、その後、ヤギ抗マウスＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：１０．０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ６８０（１：１０．０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）、又はロバ抗ヤギＡｌｅｘａ６８０（１：１０，０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）とブロッキング緩衝液でインキュベートした。洗浄後、ブロットをＯｄｙｓｓｅｙスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）で解析した。シグナルをγ−チューブリンに対して補正し、３つの独立した実験の平均をプロットする。対応のないスチューデントＴ検定で統計的有意性を決定した。
【０１００】
細胞増殖アッセイ
細胞のタンパク質含量を、（８３）に記載されているスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを用いて細胞増殖の尺度として決定した。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ロスキレ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に１ウェルあたり１，０００細胞を播種した翌日、ＥＧＣＧの濃度範囲（０〜５０μＭ）又はＤＭＳＯ溶媒を添加してＥＧＣＧに対する感受性を決定した。ＳＲＢアッセイを３日後に行い、可変勾配非線形回帰解析によるシグモイド用量反応を用いて、ＩＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで決定した。
【０１０１】
さらに、ＥＧＣＧの存在下又は非存在下の８日間にわたる細胞増殖を決定した。細胞を１ウェルあたり１，０００細胞で播種し、播種後１日目及び５日目に培地を、１０μＭ  ＥＧＣＧを含む又は含まない培地に交換した。対照は、ＤＭＳＯとインキュベートした。タンパク質含量を２日おきに決定した。実験は３通りに行い、ボンフェローニ補正による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性を決定した。
【０１０２】
グルタミン又はグルコース欠乏に対する細胞の感受性を決定するために、細胞を播種した翌日、通常の培地を、１０μＭ  ＥＧＣＧを含む又は含まない、１０％ＦＣＳ及び抗生物質を補充したＤ−グルコース枯渇（０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース及び４ｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン）、Ｌ−グルタミン枯渇（１ｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン及び５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース）ＲＰＭＩ培地又は通常のＲＰＭＩ培地のどちらかに交換した。再びタンパク質含量を２日おきに決定した。実験は３通りに行い、ボンフェローニ補正による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性を決定した。
【０１０３】
細胞呼吸及びミトコンドリア呼吸
細胞を８０％コンフルエンシーまで培養フラスコで増殖させ、トリプシン処理後、１．５＊１０６細胞を培養培地に再懸濁し、Ｄａｔｌａｂ記録及び解析ソフトウェアを備えたＯｘｙｇｒａｐｈ−２ｋのサーモスタット（３７℃）チャンバーに移した（Ｏｒｏｂｏｒｏｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、インスブルック、オーストリア）。基礎呼吸を測定し、次いで残りのミトコンドリア呼吸を、２．５μＭ複合体Ｖ阻害剤オリゴマイシンで阻害した。次いで最大呼吸を、０．５μＭミトコンドリア脱共役剤ＦＣＣＰｍｐの逐次添加により測定した。その後、０．５μＭ複合体Ｉ阻害剤ロテノン及び２．５μＭ複合体ＩＩＩ阻害剤アンチマイシンＡを添加して、電子伝達鎖を完全にシャットダウンした。残りの酸素消費は、非ミトコンドリア呼吸に起因する。２つの別個の実験を行い、対応のないスチューデントＴ検定で有意性を決定した。
【０１０４】
放射線療法実験
ＳＫＲＣ−７及びＳＫＲＣ−１７細胞は、コロニーとして増殖することができないため、放射線療法に対する感受性は、細胞増殖をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅでモニタリングして解析した。この方法は、従来のコロニー形成アッセイ（８４）と相関する放射線療法の効果を測定することが示されている。細胞を１ウェルあたり１，０００細胞で播種し、一晩付着させた。次いで、細胞を１０μＭ  ＥＧＣＧで２４時間処理し、この後、細胞に４Ｇｙを照射した（ＩＲ、３．１Ｇｙ／分；ＸＲＡＤ  ３２０  ｉｘ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＸＲＴ；Ｎ．ブランフォード、ＣＴ、ＵＳＡ）。播種の瞬間から２００時間、１５分間隔で細胞指数をリアルタイムに測定し、１０μＭ  ＥＧＣＧを補充した新鮮培地を添加した。細胞指数を放射線療法を適用した瞬間に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで線形回帰を行って細胞増殖を計算した。実験は２つの内部重複で行い、対応のないスチューデントＴ検定で統計的有意性を決定した。
【０１０５】
結果
ＶＨＬレスキューは、ＳＫＲＣ−７及びＳＫＲＣ−１７の代謝の差分変化をもたらす
ＳＫＲＣ７及びＳＫＲＣ１７は、種々の発現プロファイルを示す（図６Ａ）。ＰＧＫ１及びＰＤＫ１転写産物のレベルは、ＳＫＲＣ７ではＳＫＲＣ１７より３倍低かった。これは、ＳＫＲＣ１７におけるグルコースからピルビン酸への比較的非効率な処理を示唆している。一方、この細胞株では、ＰＰＰの酵素（Ｇ６ＰＤ及びＲＰＩＡ）は、ＳＫＲＣ７と比べて上方制御された。この違いが、ＰＰＰ阻害剤６−ＡＮに対する感受性変化に反映されるかどうかをテストするために、本発明者らは、この化合物を増殖アッセイでテストした。注目すべきは、ＳＫＲＣ−７細胞が、驚くべきことに細胞増殖の増加に応答したのに対し、ＳＫＲＣ−１７細胞は、細胞増殖の有意な減少により応答した。高レベルのグルタミン及びグルタミン酸処理酵素は、ＧＬＵＤ１阻害剤ＥＧＣＧに対する感受性を示唆する。ＥＧＣＧ及び６−ＡＮの組み合わせは、細胞増殖を完全にブロックすることができた（図６Ｂ）。
【０１０６】
実施例３−ｓｍＭＩＰベースの標的化シーケンシングは、スプライスバリアントの区別を可能にする
黒色腫細胞株Ｍｅｌ５７は、低レベルの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）を発現する。ＶＥＧＦ−Ａは、エクソン１〜５、８（ＶＥＧＦ−Ａ１２１）、エクソン１〜５、７、８（ＶＥＧＦ−１６５）及びエクソン１〜８（ＶＥＧＦ−１８９）からなる種々のスプライスバリアントからなる。これらのバリアントは、血管拡張から完全な血管新生までにわたる特異的活性を有する（８５）。本発明者らは、そのライゲーション及び伸長プローブをエクソン５及び７に有するｓｍＭＩＰ１６５、そのライゲーション及び伸長プローブをエクソン５及び８に有するｓｍＭＩＰ１２１、並びにそのライゲーション及び伸長プローブをエクソン５及び６に有するｓｍＭＩＰ１８９を設計した。本発明者らは、（８５）に記載されているように、Ｍｅｌ５７細胞株及び種々のＶＥＧＦアイソフォームを発現する細胞株から単離されたＲＮＡのＶＥＧＦの全てのアイソフォームを認識する、ｓｍＭＩＰ１２１、ｓｍＭＩＰ１６５、ｓｍＭＩＰ１８９、及びエクソン１〜５に位置する５個のｓｍＭＩＰを含むパネルでｓｍＭＩＰアッセイを行った。図７及び添付の表は、種々のアイソフォーム特異的ｓｍＭＩＰが、スプライスバリアントを特異的に認識することを示している。
【０１０７】
ＲＮＡスプライシング事象の変化が細胞に増殖優位性を与えるならば、がん細胞はこれを誘導し得る。これらの変化は、がん固有の特徴であり得るが、治療の圧力下で選択される可能性もある。一例は、成熟転写産物のエクソン２〜７の欠損をもたらす、ＥＧＦＲ遺伝子の遺伝子内欠失から生じるＥＧＦＲバリアントＩＩＩである。膠芽腫の５０％がＥＧＦＲがん原遺伝子の増幅を特徴とするが、この集団の５０％でＥＧＦＲｖＩＩＩの発現が見出される。４０ヌクレオチドの骨格配列は、野生型転写産物ではエクソン２〜７をつなげることが物理的にできないため、個々のｓｍＭＩＰの伸長及びライゲーションプローブをそれぞれエクソン１及び８に入れることにより、エクソン１〜８融合産物のみを検出する（図９は、神経膠腫群において３９／７５脳腫瘍でＥＧＦＲの発現が上昇し（５２％；陽性の平均ＦＰＭ  ７３８  ｖｓ陰性の平均ＦＰＭ  ３５、ＦＰＭ値１００を使用）、１２／７５脳腫瘍でＥＧＦＲｖＩＩＩの発現がある（１６％；陽性の平均ＦＰＭ  ６４２  ｖｓ陰性の平均ＦＰＭ  ０．２７、任意のカットオフ値６を使用）ことを示している。故に、ＥＧＦＲｖＩＩＩのｓｍＭＩＰベースの検出は、特異度が高く、及び感度が高い。
【０１０８】
別の例は、前立腺がんのアンドロゲン受容体である。去勢抵抗性前立腺がん患者は、エンザルタミドで治療される。しかし、エクソン７の欠損をもたらすスプライシングの変化（ＡＲｖ７）は、エンザルタミドに対する抵抗性をもたらす。エクソン６及び８にそれぞれ伸長及びライゲーションプローブアームを有するｓｍＭＩＰを設計することにより、Ａｒｖ７は、エンザルタミド抵抗性がんに由来する細胞株で容易に検出されるが、任意の他のがんタイプでは検出されない（ＶＣＡＰ及びＤｕＣＡＰ前立腺がん株では、それぞれＦＰＭ＝２７７及び６４０  ｖｓ  １３０種類の他のがんでは平均ＦＰＭ＝０．０１）。
【０１０９】
実施例４−ｓｍＭＩＰベースの標的化シーケンシングは正確な診断に使用することができる
試験のインフォームドコンセントに署名した患者Ｎ１６−１０から得られた脳腫瘍組織の試料を、外科手術直後に急速凍結した。ＲＮＡをトリゾールプロトコルにより組織から単離し、その後、ｃＤＮＡ合成及びｓｍＭＩＰライブラリーの調製を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング後、ホットスポットＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ変異に対応するＩＤＨ１遺伝子の変異を同定した。同じ解析は、低酸素応答の欠如を示す、低レベルの炭酸脱水酵素９及びヘキソキナーゼ２を明らかにした。さらに、試料は、グルタミナーゼ／グルタミン酸脱水素酵素の低い比を示す。これは、腫瘍が代謝にグルタミン酸を使用していたことを示唆し、それ故にＥＧＣＧ及びクロロキンなどのグルタミン酸脱水素酵素阻害剤に対する感受性を示唆する。さらに、データは、高い発現レベルのＴｒｋＢ、及び程度はより低いがＰＤＧＦＲαを示す。低酸素の欠如は、腫瘍が、世界保健機関のガイドラインに定義されたグレードＩＶ型ではなかったことを示唆している。高レベルのチロシンキナーゼの存在は星状細胞腫を示唆し、データに基づきＩＤＨ１変異グレードＩＩＩ星状細胞腫の診断がなされ、組織病理診断で確定された元の診断と一致した。
【０１１０】
実施例５−ｓｍＭＩＰベースの標的化シーケンシングは、正確な診断及び予後に使用することができる
全員が試験のインフォームドコンセントに署名した患者から得られた、脳腫瘍組織の７４の追加の試料により、実施例４のデータを拡大した。試料を外科手術直後に急速凍結し、実施例４に記載されたものと同様に処理した。すなわち、ＲＮＡをトリゾールプロトコルにより組織から単離し、その後、ｃＤＮＡ合成、ｓｍＭＩＰライブラリーの調製、及びバーコード化ＰＣＲを行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング後、ＦＡＳＴＱファイルをＳｅｑＮｅｘｔソフトウェア（ＪＳＩ  ＳｅｑｕｅｎｃｅＰｉｌｏｔバージョン４．２．２ビルド５０２［ＪＳＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、エッテンハイム、ドイツ］）により処理した。全てのリードを、ヒトゲノム（バージョンｈｇ１９）及び手動で追加したバリアント転写産物（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ａｒｖ７、ＭＥＴｄ７／８、ＭＥＴｄ１４）に対してマッピングした。故に、腫瘍試料ごとに、標的化転写産物レベルのリスト及び全ての検出された変異／変動のリストを生成した。７５名の患者全員から、完全に文書化された臨床的経過観察が得られた。
【０１１１】
最初のステップでは、本発明者らは目的とする標的化遺伝子のログ変換発現レベルの目的変数なしの凝集型クラスタリングを行った。凝集型クラスタリングは、生物情報学のＲ−ソフトウェアスクリプトを用いて個々のプロファイル間のマンハッタン距離を計算することにより、Ｗａｒｄ方法に従って行った。プロファイルを、図１０Ａに表されヒートマップに変換した。示されているように、コンピュータは２つの主要な群、Ａ及びＢを生成し、これらがいくつかのサブグループに細分化される。
【０１１２】
次のステップでは、クラスターと全生存率との潜在的な関連を、患者の生存率データ（最初の診断からカウントした全生存率）を今度は含め、カプラン−マイヤー曲線を生成して調べた。図１０Ｂの結果は、コンピュータが生成した群が、有意性が高い（フィッシャーの正確確率検定；ｐ＜０．０００１）異なる生存率を有することを示す。これは、神経膠腫に関してこの検定が高い予後値を有することを示している。
【０１１３】
第３のステップでは、群と変異の間の関係を、試料中の全ての検出変異のリストを含めて解析した。群Ａ及びＢは、高い有意性（ｐ＜１０Ｅ〜１１）でイソクエン酸脱水素酵素遺伝子（ＩＤＨ１Ｒ１３２及びＩＤＨ２Ｒ１７２）の変異により区別された。図１０Ｃは、試料の１つにおけるヘテロ接合ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ検出の例を示し、この場合、転写産物の３８％が変異体対立遺伝子由来であり、転写産物の６２％が対立遺伝子由来である。転写産物頻度の差は、野生型ＩＤＨ転写産物のみを有する遺伝的に正常な間質細胞に起因する。
【０１１４】
第４のステップでは、本発明者らは、予後をさらに精緻化するためにサブグループ解析を行った。生存率が極めて不良（ＯＳ＜１２カ月）なＩＤＨ野生型患者対予後がより良好なＩＤＨ野生型患者（カプラン−マイヤー曲線の群Ｂ）の、そのようなサブグループ解析での解析は、炭酸脱水酵素１２の高い発現レベルが、極めて不良な予後と関連していることを示した（ｐ＜０．００１；フィッシャーの正確確率検定、図１０Ｄ）。
【０１１５】
第５のステップでは、本発明者らは、日常的な患者ケアの中で得られた分子情報に関して全てのデータを後ろ向きに解析した。本発明者らがＲＮＡレベルで観察した、及び神経膠腫患者ケアにおいて日常的に検査される全ての変異を、ＤＮＡシーケンシング技術で確認した（表ＩＩＩ）。
【０１１６】
プロファイルはまた、他のがんと関連がある脳腫瘍の遺伝子の発現も明らかにする。例は、前立腺がん、及び前立腺特異的膜タンパク質（ＰＳＭＡ）において高レベルでしばしば発現されるアンドロゲン受容体である。他のグループが、神経膠腫を含む悪性腫瘍の血管におけるこの標的の発現を記載している（８７）。これをさらに調べるために、本発明者らは、ＰＳＭＡ転写産物レベルが高い及び低い腫瘍を、免疫組織化学的検査を用いて解析した。結果は、転写産物レベルが高い腫瘍由来の血管におけるＰＳＭＡタンパク質の血管発現を実際に明らかにし、転写産物レベルが低い腫瘍では明らかにしなかった（図１１の３例参照）。
【表２】
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【０１１７】
実施例６−ＩＤＨ変異神経膠腫における代謝
代謝遺伝子の発現の詳細な解析は、長期生存者の群では、低レベルのグルコース取り込み輸送体、炭酸脱水酵素及びヘキソキナーゼ２が発現されたことを明らかにし、低酸素の欠如を示した。さらに、この群では、高レベルのグルタミン酸脱水素酵素及びアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＢＡＴ）ＲＮＡが観察された。これは、これらの腫瘍が、その異化に神経伝達物質（グルタミン酸及びＧＡＢＡ）を使用し、グルタミン酸脱水素酵素阻害剤及びＡＢＡＴ阻害剤（エピガロカテキン−３−ガレート、ビガバトリン）に対する感受性を誘導することを示唆している。
【０１１８】
実施例７−神経膠腫におけるチロシンキナーゼ
ＩＤＨ変異神経膠腫の群では、ＴｒｋＢの高い発現レベル（ＩＤＨｍｕｔ  ｖｓ  ＩＤＨｗｔの平均ＦＰＭ  １５８３３  ｖｓ  ４７０８、ｐ＝２×１０Ｅ−１１）が検出され、ＴｒｋＢ阻害剤エヌトレクチニブに対する感受性を示唆した。ＥＧＦＲ発現はＩＤＨｗｔ腫瘍で高かった（ＩＤＨｗｔ  ｖｓ  ＩＤＨｍｕｔがんで６０９  ｖｓ  １１６、ｐ＝０．００４）が、ＥＧＦＲｖＩＩＩはもっぱらこの群で発現された（ＩＤＨｗｔ  ｖｓ  ＩＤＨｍｕｔで２０１  ｖｓ  ０．１６、ｐ＝０．０００５、図９も参照）。
【０１１９】
ＩＤＨ野生型がんの群では、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が試料の５２％で観察されたが、チロシンキナーゼＭＥＴは９／７５脳腫瘍（１２％）で観察される。興味深いことに、プロファイルは、比較的高レベルのＭＥＴを発現した腫瘍はＥＧＦＲが少なく、逆もまた同様であることを示した（相関係数ｒ＝−０．９５）。興味深いさらなる知見は、１つの神経膠腫におけるＢＲＡＦの変異（ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ）の出現であった。野生型ＢＲＡＦは、活性化された膜チロシンキナーゼ（例えばＥＧＦＲ、ＭＥＴ）から核へのシグナルを処理し、これにより細胞増殖を誘導する重要なシグナル伝達中間体である。ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅは、受容体チロシンキナーゼからのインプットなしで無制御的に核へシグナル伝達する自動活性分子である。このＢＲＡＦ変異は黒色腫がんの５０％で生じ、標的化薬物ベムラフェニブにより阻害することができる。この変異を含有する神経膠腫は、ＭＥＴもＥＧＦＲも発現しなかった。裏付けに乏しいものの、このケースは、ベムラフェニブに対する感受性、及びＥＧＦＲ又はＭＥＴ阻害剤に対する非感受性を示唆するものである。
【０１２０】
実施例７−チロシンキナーゼプロファイルは、インビトロでの標的化療法に対する感受性及び非感受性を予測する。
星状細胞腫細胞株Ｅ９８は、ｃ−ＭＥＴに自動活性化変異を有し（２２）、多特異的ＶＥＧＦＲ２／ＭＥＴキナーゼ阻害剤カボザンチニブ（８６）及びＭＥＴ選択的阻害剤化合物Ａ（８８）に対し極めて感受性である。この感受性は、ウェスタンブロットでのＭＥＴリン酸化の減少、及びインビトロでの増殖率低下、及びインビボでの腫瘍発達の遅延に反映される。
【０１２１】
腎臓がん細胞株ＳＫＲＣ１７は類似したレベルのＭＥＴを発現し、そのリン酸化は化合物Ａによって効率的に阻害される（図１２）。さらに、ＳＫＲＣ１７細胞は化合物Ａに応答せず、増殖率が低下する。膜チロシンキナーゼのプロファイリングは、アッセイで測定される膜チロシンキナーゼの選択された群内では、ＭＥＴはＥ９８によって発現される唯一のものであるが、ＳＫＲＣ１７細胞は、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを含む、さらなる数の他のチロシンキナーゼ阻害剤を発言することを明らかにする。これらの結果は、１つの受容体チロシンキナーゼの標的化阻害は、レスキューキナーゼの非存在下でのみ有効であること、及びがんの有効な治療は、細胞における全ての膜受容体チロシンキナーゼの同時の遮断を必要とすることを示唆している。
【０１２２】
実施例８−ＨＰＶ  ＲＮＡプロファイリングは、ＨＰＶ−ＤＮＡベースの集団ベースのスクリーニングの偽陽性成績を低下させる
オランダは、子宮頸がんの早期検出及び予防治療を可能にするために、集団全体のスクリーニングプログラムにおいて、子宮頸部スワブで高リスクヒトパピローマウイルス（ｈｒＨＰＶ）の検出を実施している最初の国の１つである。ＨＰＶ感染の障害リスクは８０％であり、参加女性群では８％が、このアッセイで検査陽性となるであろう。一方、ＨＰＶ感染は自然に回復し得るため、これらの女性の９０％は過剰治療されていることが公知である。さらに、ＨＰＶ陽性パートナーとの性交は、感受性ＰＣＲベースのＨＰＶ  ＤＮＡ検出検査で陽性をもたらすが、ウイルスが子宮頸部上皮細胞に実際に感染することを意味するものではない。
【０１２３】
汚染と実際の細胞感染を識別するために、本発明者らは、Ｅ２遺伝子発現の欠損は、感染細胞への染色体組み込み並びにＨＰＶ−Ｅ６及びＥ７腫瘍性タンパク質の過剰発現と関連があるという利用可能な知識に基づき、ｈｒＨＰＶ転写産物Ｅ２、Ｅ６及びＥ７の検出のためにｓｍＭＩＰを設計した。ｈｒＨＰＶ検出ｓｍＭＩＰプローブを追加したｓｍＭＩＰプローブの全パネルを用いて、本発明者らは、正常な子宮の摘出から卵巣がん、子宮内膜がん及び子宮頸がんにわたる一連の２９個の婦人科組織をプロファイリングした（図１３）。試料は、病理を盲検化してプロファイリングした。ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ＲＮＡ発現が１２試料で観察された。後から見ると、これらの全てが子宮頸部の扁平細胞がんであった。次のステップでは、本発明者らは、ＨＰＶ−ＤＮＡ  ＰＣＲ検査を用いて全ての試料を解析した。全てのＨＰＶ１６陽性試料をＤＮＡレベルで確認したが、ＨＰＶ−ＲＮＡ検査で陰性であった５つの組織が、ＨＰＶ−ＤＮＡ検査では陽性であった（矢印）。後から見ると、これらの試料は２つの正常な子宮及び２つの子宮内膜がん（ＨＰＶ誘導性でないことが実際に知られている）からなった。これらのデータは、ＨＰＶ−ＲＮＡスクリーニングが、ＨＰＶ−ＤＮＡスクリーニングの偽陽性検査の数を減らすことができることを明らかに示している。
【０１２４】
第２のステップでは、本発明者らは、ＨＰＶ−１８陽性子宮頸がんの女性から４９０年前に得られた１、１０、１００、１０００、及び１０，０００個のＨｅｌａ細胞をプロファイリングして、ＨＰＶ検査の感度を調べた。わずか１細胞のプロファイリングが、６９個のユニークＨＰＶ１８リードをすでに検出し、１０、１００及び１０００細胞では、それぞれ１６８、１４１９、３６７６７リードに増加した。
【０１２５】
［文献］
1. van Lith SA, Navis AC, Lenting K,Verrijp K, Schepens JT, Hendriks WJ, et al. Identification of a novelinactivating mutation in Isocitrate Dehydrogenase 1 (IDH1-R314C) in a highgrade astrocytoma. Sci Rep. 2016;6:30486.
2. Bardella C, Pollard PJ, Tomlinson I. SDHmutations in cancer. Biochim Biophys Acta. 2011;1807(11):1432-43.
3. Linehan WM, Rouault TA. Molecularpathways: Fumarate hydratase-deficient kidney cancer--targeting the Warburgeffect in cancer. Clin Cancer Res. 2013;19(13):3345-52.
4. Chuang JH, Chou MH, Tai MH, Lin TK, LiouCW, Chen T, et al. 2-Deoxyglucose treatment complements the cisplatin- orBH3-only mimetic-induced suppression of neuroblastoma cell growth. Int JBiochem Cell Biol. 2013;45(5):944-51.
5. Lis P, Dylag M, Niedzwiecka K, Ko YH,Pedersen PL, Goffeau A, et al. The HK2 Dependent "Warburg Effect" andMitochondrial Oxidative Phosphorylation in Cancer: Targets for EffectiveTherapy with 3-Bromopyruvate. Molecules. 2016;21(12).
6. Pedersen PL. 3-Bromopyruvate (3BP) afast acting, promising, powerful, specific, and effective "smallmolecule" anti-cancer agent taken from labside to bedside: introduction toa special issue. J Bioenerg Biomembr. 2012;44(1):1-6.
7. Haghighat N, McCandless DW. Effect of6-aminonicotinamide on metabolism of astrocytes and C6-glioma cells. MetabBrain Dis. 1997;12(1):29-45.
8. Song IS, Han J, Lee HK. Metformin as ananticancer drug: A Commentary on the metabolic determinants of cancer cellsensitivity to glucose limitation and biguanides. J Diabetes Investig.2015;6(5):516-8.
9. Flavin R, Peluso S, Nguyen PL, Loda M.Fatty acid synthase as a potential therapeutic target in cancer. Future Oncol.2010;6(4):551-62.
10. Burchardt P, Rzezniczak J, Dudziak J,Dzumak A, Marchlewski T, Ganowicz-Kaatz T, et al. Evaluation of plasma PCSK9concentrations, transcript of LDL receptor, as well as the total number ofmonocyte LDL receptors in acute coronary syndrome patients. Cardiol J.2016;23(6):604-9.
11. Lord CJ, Ashworth A. Mechanisms ofresistance to therapies targeting BRCA-mutant cancers. Nat Med.2013;19(11):1381-8.
12. Hata AN, Niederst MJ, Archibald HL,Gomez-Caraballo M, Siddiqui FM, Mulvey HE, et al. Tumor cells can followdistinct evolutionary paths to become resistant to epidermal growth factorreceptor inhibition. Nat Med. 2016;22(3):262-9.
13. Chong CR, Janne PA. The quest toovercome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nat Med.2013;19(11):1389-400.
14. Bouwman P, Jonkers J. Molecularpathways: how can BRCA-mutated tumors become resistant to PARP inhibitors? ClinCancer Res. 2014;20(3):540-7.
15. Hiatt JB, Pritchard CC, Salipante SJ,O'Roak BJ, Shendure J. Single molecule molecular inversion probes for targeted,high-accuracy detection of low-frequency variation. Genome Res.2013;23(5):843-54.
16. Eijkelenboom A, Kamping EJ, Kastner-vanRaaij AW, Hendriks-Cornelissen SJ, Neveling K, Kuiper RP, et al. ReliableNext-Generation Sequencing of Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue UsingSingle Molecule Tags. J Mol Diagn. 2016;18(6):851-63.
17. Tonjes M, Barbus S, Park YJ, Wang W,Schlotter M, Lindroth AM, et al. BCAT1 promotes cell proliferation throughamino acid catabolism in gliomas carrying wild-type IDH1. Nat Med.2013;19(7):901-8.
18. Boyle EA, O'Roak BJ, Martin BK, KumarA, Shendure J. MIPgen: optimized modeling and design of molecular inversionprobes for targeted resequencing. Bioinformatics. 2014;30(18):2670-2.
19. Luo J, Manning BD, Cantley LC.Targeting the PI3K-Akt pathway in human cancer: rationale and promise. CancerCell. 2003;4(4):257-62.
20. Carracedo A, Pandolfi PP. The PTEN-PI3Kpathway: of feedbacks and cross-talks. Oncogene. 2008;27(41):5527-41.
21. Yin Y, Shen WH. PTEN: a new guardian ofthe genome. Oncogene. 2008;27(41):5443-53.
22. Navis AC, van Lith SA, van DuijnhovenSM, de Pooter M, Yetkin-Arik B, Wesseling P, et al. Identification of a novelMET mutation in high-grade glioma resulting in an auto-active intracellularprotein. Acta Neuropathol. 2015;130(1):131-44.
23. Soussi T, Wiman KG. Shaping geneticalterations in human cancer: the p53 mutation paradigm. Cancer Cell.2007;12(4):303-12.
24. Sherr CJ, McCormick F. The RB and p53pathways in cancer. Cancer Cell. 2002;2(2):103-12.
25. Boulton SJ. Cellular functions of theBRCA tumour-suppressor proteins. Biochem Soc Trans. 2006;34(Pt 5):633-45.
26. Burgess DJ. Chromosome instability:Tumorigenesis via satellite link. Nat Rev Cancer. 2011;11(3):158.
27. Casaletto JB, McClatchey AI. Spatialregulation of receptor tyrosine kinases in development and cancer. Nat RevCancer. 2012;12(6):387-400.
28. Rocca A, Farolfi A, Bravaccini S,Schirone A, Amadori D. Palbociclib (PD 0332991) : targeting the cell cyclemachinery in breast cancer. Expert Opin Pharmacother. 2014;15(3):407-20.
29. Payen VL, Porporato PE, Baselet B,Sonveaux P. Metabolic changes associated with tumor metastasis, part 1: tumorpH, glycolysis and the pentose phosphate pathway. Cell Mol Life Sci.2016;73(7):1333-48.
30. Patra KC, Hay N. The pentose phosphatepathway and cancer. Trends Biochem Sci. 2014;39(8):347-54.
31. Acharya A, Das I, Chandhok D, Saha T.Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential.Oxid Med Cell Longev. 2010;3(1):23-34.
32. Hao J, Graham P, Chang L, Ni J,Wasinger V, Beretov J, et al. Proteomic identification of the lactatedehydrogenase A in a radioresistant prostate cancer xenograft mouse model forimproving radiotherapy. Oncotarget. 2016.
33. Lucarelli G, Galleggiante V, RutiglianoM, Sanguedolce F, Cagiano S, Bufo P, et al. Metabolomic profile of glycolysisand the pentose phosphate pathway identifies the central role ofglucose-6-phosphate dehydrogenase in clear cell-renal cell carcinoma.Oncotarget. 2015;6(15):13371-86.
34. Cairns RA, Harris IS, Mak TW.Regulation of cancer cell metabolism. Nat Rev Cancer. 2011;11(2):85-95.
35. Yang C, Ko B, Hensley CT, Jiang L,Wasti AT, Kim J, et al. Glutamine oxidation maintains the TCA cycle and cellsurvival during impaired mitochondrial pyruvate transport. Mol Cell.2014;56(3):414-24.
36. Shanware NP, Mullen AR, DeBerardinisRJ, Abraham RT. Glutamine: pleiotropic roles in tumor growth and stressresistance. J Mol Med (Berl). 2011;89(3):229-36.
37. Wise DR, DeBerardinis RJ, Mancuso A,Sayed N, Zhang XY, Pfeiffer HK, et al. Myc regulates a transcriptional programthat stimulates mitochondrial glutaminolysis and leads to glutamine addiction.Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(48):18782-7.
38. Lunt SY, Vander Heiden MG. Aerobicglycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annu RevCell Dev Biol. 2011;27:441-64.
39. Roodink I, van der Laak J, Kusters B,Wesseling P, Verrijp K, de Waal R, et al. Development of the tumor vascular bedin response to hypoxia-induced VEGF-A differs from that in tumors withconstitutive VEGF-A expression. Int J Cancer. 2006;119(9):2054-62.
40. Hamans B, Navis AC, Wright A, WesselingP, Heerschap A, Leenders W. Multivoxel (1)H MR spectroscopy is superior tocontrast-enhanced MRI for response assessment after anti-angiogenic treatmentof orthotopic human glioma xenografts and provides handles for metabolictargeting. Neuro Oncol. 2013;15(12):1615-24.
41. Altman BJ, Stine ZE, Dang CV. FromKrebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2016.
42. Bensaad K, Favaro E, Lewis CA, Peck B,Lord S, Collins JM, et al. Fatty acid uptake and lipid storage induced byHIF-1alpha contribute to cell growth and survival after hypoxia-reoxygenation.Cell Rep. 2014;9(1):349-65.
43. Saxena N, Maio N, Crooks DR, RickettsCJ, Yang Y, Wei MH, et al. SDHB-Deficient Cancers: The Role of Mutations ThatImpair Iron Sulfur Cluster Delivery. J Natl Cancer Inst. 2016;108(1).
44. Lussey-Lepoutre C, Hollinshead KE,Ludwig C, Menara M, Morin A, Castro-Vega LJ, et al. Loss of succinatedehydrogenase activity results in dependency on pyruvate carboxylation forcellular anabolism. Nat Commun. 2015;6:8784.
45. Cancer Genome Atlas Research N, LinehanWM, Spellman PT, Ricketts CJ, Creighton CJ, Fei SS, et al. ComprehensiveMolecular Characterization of Papillary Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med.2016;374(2):135-45.
46. Kampjarvi K, Makinen N, Mehine M,Valipakka S, Uimari O, Pitkanen E, et al. MED12 mutations and FH inactivationare mutually exclusive in uterine leiomyomas. Br J Cancer.2016;114(12):1405-11.
47. Molenaar RJ, Botman D, Smits MA, HiraVV, van Lith SA, Stap J, et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells bythe IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 2015;75(22):4790-802.
48. van Lith SA, Navis AC, Verrijp K,Niclou SP, Bjerkvig R, Wesseling P, et al. Glutamate as chemotactic fuel fordiffuse glioma cells: are they glutamate suckers? Biochim Biophys Acta. 2014;1846(1):66-74.
49. Kim WY, Kaelin WG. Role of VHL genemutation in human cancer. J Clin Oncol. 2004;22(24):4991-5004.
50. Laukka T, Mariani CJ, Ihantola T, CaoJZ, Hokkanen J, Kaelin WG, Jr., et al. Fumarate and Succinate RegulateExpression of Hypoxia-inducible Genes via TET Enzymes. J Biol Chem.2016;291(8):4256-65.
51. Losman JA, Kaelin WG, Jr. What adifference a hydroxyl makes: mutant IDH, (R)-2-hydroxyglutarate, and cancer.Genes Dev. 2013;27(8):836-52.
52. Robinson CM, Ohh M. The multifacetedvon Hippel-Lindau tumour suppressor protein. FEBS Lett. 2014;588(16):2704-11.
53. Hakimi AA, Reznik E, Lee CH, CreightonCJ, Brannon AR, Luna A, et al. An Integrated Metabolic Atlas of Clear CellRenal Cell Carcinoma. Cancer Cell. 2016;29(1):104-16.
54. Grabmaier K, MC AdW, Verhaegh GW,Schalken JA, Oosterwijk E. Strict regulation of CAIX(G250/MN) by HIF-1alpha inclear cell renal cell carcinoma. Oncogene. 2004;23(33):5624-31.
55. Claes A, Schuuring J, Boots-Sprenger S,Hendriks-Cornelissen S, Dekkers M, van der Kogel AJ, et al. Phenotypic andgenotypic characterization of orthotopic human glioma models and its relevancefor the study of anti-glioma therapy. Brain Pathol. 2008;18(3):423-33.
56. Navis AC, Niclou SP, Fack F, Stieber D,van Lith S, Verrijp K, et al. Increased mitochondrial activity in a novelIDH1-R132H mutant human oligodendroglioma xenograft model: in situ detection of2-HG and alpha-KG. Acta Neuropathol Commun. 2013;1:18.
57. Trapnell C, Roberts A, Goff L, PerteaG, Kim D, Kelley DR, et al. Differential gene and transcript expressionanalysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc.2012;7(3):562-78.
58. Sjolund J, Johansson M, Manna S, NorinC, Pietras A, Beckman S, et al. Suppression of renal cell carcinoma growth byinhibition of Notch signaling in vitro and in vivo. The Journal of clinicalinvestigation. 2008;118(1):217-28.
59. Tardito S, Oudin A, Ahmed SU, Fack F,Keunen O, Zheng L, et al. Glutamine synthetase activity fuels nucleotidebiosynthesis and supports growth of glutamine-restricted glioblastoma. Nat CellBiol. 2015;17(12):1556-68.
60. Martinez-Outschoorn UE, Peiris-Pages M,Pestell RG, Sotgia F, Lisanti MP. Cancer metabolism: a therapeutic perspective.Nat Rev Clin Oncol. 2016.
61. Chaumeil MM, Radoul M, Najac C, ErikssonP, Viswanath P, Blough MD, et al. Hyperpolarized (13)C MR imaging detects nolactate production in mutant IDH1 gliomas: Implications for diagnosis andresponse monitoring. Neuroimage Clin. 2016;12:180-9.
62. Yizhak K, Chaneton B, Gottlieb E,Ruppin E. Modeling cancer metabolism on a genome scale. Mol Syst Biol.2015;11(6):817.
63. Esmaeili M, Hamans BC, Navis AC, vanHorssen R, Bathen TF, Gribbestad IS, et al. IDH1 R132H mutation generates adistinct phospholipid metabolite profile in glioma. Cancer Res.2014;74(17):4898-907.
64. Ganapathy-Kanniappan S, Vali M,Kunjithapatham R, Buijs M, Syed LH, Rao PP, et al. 3-bromopyruvate: a newtargeted antiglycolytic agent and a promise for cancer therapy. Curr PharmBiotechnol. 2010;11(5):510-7.
65. Ganapathy-Kanniappan S, KunjithapathamR, Geschwind JF. Anticancer efficacy of the metabolic blocker 3-bromopyruvate:specific molecular targeting. Anticancer Res. 2013;33(1):13-20.
66. Kankotia S, Stacpoole PW.Dichloroacetate and cancer: new home for an orphan drug? Biochim Biophys Acta.2014;1846(2):617-29.
67. Singh BN, Shankar S, Srivastava RK.Green tea catechin, epigallocatechin-3-gallate (EGCG): mechanisms, perspectivesand clinical applications. Biochem Pharmacol. 2011;82(12):1807-21.
68. Altman BJ, Stine ZE, Dang CV. FromKrebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nat Rev Cancer.2016;16(10):619-34.
69. Sosnicki S, Kapral M, Weglarz L.Molecular targets of metformin antitumor action. Pharmacol Rep.2016;68(5):918-25.
70. Zhang HH, Guo XL. Combinationalstrategies of metformin and chemotherapy in cancers. Cancer ChemotherPharmacol. 2016;78(1):13-26.
71. Gong J, Kelekar G, Shen J, Shen J, KaurS, Mita M. The expanding role of metformin in cancer: an update on antitumormechanisms and clinical development. Target Oncol. 2016;11(4):447-67.
72. Thupari JN, Pinn ML, Kuhajda FP. Fattyacid synthase inhibition in human breast cancer cells leads tomalonyl-CoA-induced inhibition of fatty acid oxidation and cytotoxicity.Biochem Biophys Res Commun. 2001;285(2):217-23.
73. Baldewijns MM, van Vlodrop IJ,Vermeulen PB, Soetekouw PM, van Engeland M, de Bruine AP. VHL and HIFsignalling in renal cell carcinogenesis. J Pathol. 2010;221(2):125-38.
74. Metallo CM, Gameiro PA, Bell EL,Mattaini KR, Yang J, Hiller K, et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 2012;481(7381):380-4.
75. Gameiro PA, Yang J, Metelo AM,Perez-Carro R, Baker R, Wang Z, et al. In vivo HIF-mediated reductivecarboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cellsto glutamine deprivation. Cell metabolism. 2013;17(3):372-85.
76. Cancer Genome Atlas Research N.Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma.Nature. 2013;499(7456):43-9.
77. Hu CJ, Wang LY, Chodosh LA, Keith B,Simon MC. Differential roles of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha)and HIF-2alpha in hypoxic gene regulation. Molecular and cellular biology.2003;23(24):9361-74.
78. Kim JW, Tchernyshyov I, Semenza GL,Dang CV. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: ametabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell metabolism.2006;3(3):177-85.
79. Papandreou I, Cairns RA, Fontana L, LimAL, Denko NC. HIF-1 mediates adaptation to hypoxia by actively downregulatingmitochondrial oxygen consumption. Cell metabolism. 2006;3(3):187-97.
80. Koshiji M, Kageyama Y, Pete EA,Horikawa I, Barrett JC, Huang LE. HIF-1alpha induces cell cycle arrest byfunctionally counteracting Myc. EMBO J. 2004;23(9):1949-56.
81. Gordan JD, Bertout JA, Hu CJ, Diehl JA,Simon MC. HIF-2alpha promotes hypoxic cell proliferation by enhancing c-myctranscriptional activity. Cancer Cell. 2007;11(4):335-47.
82. Ebert T, Bander NH, Finstad CL,Ramsawak RD, Old LJ. Establishment and characterization of human renal cancerand normal kidney cell lines. Cancer Res. 1990;50(17):5531-6.
83. Skehan P, Storeng R, Scudiero D, MonksA, McMahon J, Vistica D, et al. New colorimetric cytotoxicity assay foranticancer-drug screening. Journal of the National Cancer Institute.1990;82(13):1107-12.
84. Ibahim MJ, Crosbie JC, Paiva P, Yang Y,Zaitseva M, Rogers PA. An evaluation of novel real-time technology as a toolfor measurement of radiobiological and radiation-induced bystander effects.Radiation and environmental biophysics. 2016;55(2):185-94.
85. Kusters B, de Waal R, Wesseling P,Verrijp K, Maass C, Heerschap A, et al. Differential effects of vascularendothelial growth factor a isoforms in a mouse brain metastasis model of humanmelanoma. Cancer Research. 2003;63(17):5408-13.
86.  Navis, A.C., Bourgonje, A.,Wesseling, P., Wright, A., Hendriks, W., Verrijp, K., van der Laak, J.A.,Heerschap, A., and Leenders, W.P. (2013). Effects of dual targeting of tumorcells and stroma in human glioblastoma xenografts with a tyrosine kinaseinhibitor against c-MET and VEGFR2. PLoS One 8, e58262.
87. Nomura, N., Pastorino, S., Jiang, P.,Lambert, G., Crawford, J.R., Gymnopoulos, M., Piccioni, D., Juarez, T., Pingle,S.C., Makale, M., et al. (2014). Prostate specific membrane antigen (PSMA)expression in primary gliomas and breast cancer brain metastases. Cancer CellInt 14, 26.
88. Van den Heuvel, C., Navis, A.C., deBitter, T., Amiri, H., Verrijp, K., Heerschap, A., Rex, K., Dussault, I.,Caenepeel, S., Coxon, A., et al. (2017). Selective MET Kinase Inhibition inMET-Dependent Glioma Models Alters Gene Expression and Induces TumorPlasticity. Mol Cancer Res 15, 1587-1597.
【図１】
2020509741.tif 000061
【図２Ａ】
2020509741.tif 000062
【図２Ｂ】
2020509741.tif 000063
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2020509741.tif 000072
【図４Ｂ】
2020509741.tif 000073
【図４Ｃ】
2020509741.tif 000074
【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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