(57)【要約】以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)のための組成物及び方法を、本明細書に記載する：1種以上の抗原提示ドメイン；及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、1種以上の抗原提示ドメインは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。前記SABRの様々な免疫学的機能についても記載する。【選択図】図１
2020534809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)：
抗原提示ドメイン；及び、
シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインが主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。
【請求項２】
前記抗原提示ドメインがMHCを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項３】
請求項１に記載のSABRをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含む細胞。
【請求項５】
前記MHCがクラスI MHCを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項６】
前記MHCがクラスII MHCを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項７】
ペプチドを更に含み、ここで、前記ペプチドがエピトープを含む、ここで、前記ペプチドのエピトープが前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインが前記ペプチドに結合する、請求項５又は６に記載のSABR。
【請求項８】
前記シグナル伝達ドメインがT細胞シグナリング・ドメインを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項９】
前記シグナル伝達ドメインが、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レセプター、Gタンパク質共役レセプター、又は、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項１０】
前記シグナル伝達ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の2量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レせプター、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項１１】
膜貫通ドメインを更に含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、TIM3、CD3ゼータ、Notch、SynNotch、化学的に誘導される二量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レセプター、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、NOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む、請求項１１記載のSABR。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む、請求項１１に記載のSABR。
【請求項１４】
前記抗原提示ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項１５】
前記シグナル伝達ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項１６】
前記抗原提示ドメインが前記シグナル伝達ドメインに融合している、請求項１に記載のSABR。
【請求項１７】
1つ以上のリンカーを更に含む、請求項１に記載のSABR。
【請求項１８】
以下を含む細胞：
以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：
シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子を含む。
【請求項１９】
請求項１〜２及び５〜１７の何れか一項からの、何れか1種以上のSABRを含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１〜２及び５〜１７のSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子。
【請求項２１】
シグナリング細胞を調製する為の方法、前記方法は以下を含む：
ターゲット細胞を提供すること；及び、
前記ターゲット細胞に、T細胞の表面で発現する少なくとも1種のT細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入すること、ここで、前記SABRはシグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
【請求項２２】
抗原探索の為の方法、前記方法は以下を含む：
少なくとも1種のレポーター細胞において、請求項１〜２、及び５〜１７の何れか一項に記載のSABRを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する；
前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること；
前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、
前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
【請求項２３】
前記抗原レセプターが可溶性分子を含む、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項２４】
前記可溶性分子が抗体を含む、請求項２３に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項２５】
前記抗原レセプターが細胞表面上で発現している、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項２６】
前記抗原レセプターが、T細胞表面上で発現しているTCRを含む、請求項２５に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項２７】
少なくとも1種のレポーター細胞が細胞のライブラリを含む、ここで、前記細胞のライブラリが多数の種々のSABRを有し、及びここで、多数の種々のSABRが種々の抗原レセプターに結合することができる、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項２８】
前記抗原レセプターが多数の抗原レセプターを含む、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項２９】
多数の種々のSABRが発現し、前記測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを示した細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定する、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３０】
2種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３１】
2種以上の抗原レセプター及び2種以上のSABRが存在する、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３２】
少なくとも1種のレポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３３】
前記測定可能なシグナルが、検出可能なマーカーの発現に由来する、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３４】
前記測定可能なシグナルを発現するレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを用いて同定する、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３５】
前記抗原レセプターが、発現したオーファンT細胞レセプターを含む、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３６】
前記1種以上のレポーター細胞が、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する、請求項２２に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む、請求項３６に記載の抗原探索の為の方法。
【請求項３８】
以下を含むライブラリ：
請求項１〜２、及び５〜１７の何れか一項に記載のSABR；並びに、
少なくとも1種の候補抗原レセプター。
【請求項３９】
前記少なくとも1種の抗原レセプターが細胞表面上で発現し、ここで、前記細胞が抗原レセプター細胞である、請求項３８に記載のライブラリ。
【請求項４０】
前記SABRがレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記SABRが前記抗原レセプターに結合すると、前記細胞が検出可能なマーカーを呈する、請求項３８又は３９に記載のライブラリ。
【請求項４１】
前記レポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む、請求項４０に記載のライブラリ。
【請求項４２】
前記抗原レセプター細胞が、TCRを含むT細胞を含む、請求項３９に記載のライブラリ。
【請求項４３】
前記抗原レセプター細胞が、オーファンTCRを発現する細胞を含む、請求項３９に記載のライブラリ。
【請求項４４】
治療反応を開始させる為の方法、前記方法は以下を含む：
請求項１〜２、及び５〜１７の何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること；並びに、
治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。
【請求項４５】
前記細胞反応が、以下のうちの1種以上を生じさせる、請求項４４に記載の治療反応を開始させる為の方法：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
【請求項４６】
前記治療用細胞が病原性T細胞を殺す、請求項４４に記載の治療反応を開始させる為の方法。
【請求項４７】
前記治療用細胞がターゲットT細胞を活性化する、請求項４４に記載の治療反応を開始させる為の方法。
【請求項４８】
前記治療用細胞が病原性T細胞を抑制する、請求項４４に記載の治療反応を開始させる為の方法。
【請求項４９】
以下を含む組成物：
請求項１、２及び５〜１７の何れか一項に記載のSABRを含む治療用T-細胞。
【請求項５０】
細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T細胞を患者に投与することを含む、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む、患者を治療する為の方法。
【請求項５１】
以下を含むSABR：
MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；並びに
細胞内シグナリング・ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願と共に出願された出願データシートにおいて外国又は国内の優先権主張が識別される全ての出願は、37 CFR 1.57の下で参照により本明細書に組み込まれる。本出願は2017年9月06日に出願された米国仮出願第62/554,652号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、広く、免疫学的に使用し、治療をする為の分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
T細胞は、病原体やがんに対する免疫反応に不可欠な役割をしている。T細胞は、そのターゲット細胞表面上の主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子上に提示された特異的な抗原性エピトープに反応する。T細胞による抗原認識はそのT細胞レセプター(TCR)によって媒介され、それは細胞内シグナルを引き起こしてT細胞活性化を誘導し、続いて機能的な反応を引き起こす。しかし、抗原を提示するMHC分子にはシグナリング・ドメインがないため、ターゲット細胞に反応を誘導することはできない。従って、TCR-抗原-MHC相互作用は、T細胞に向かう一方向性のシグナルをもたらす。前記ターゲット細胞に向かうシグナル伝達が無いことは、種々の機能のためにTCR-抗原-MHC相互作用を利用する可能性を大きく制約する。従って、TCR-抗原-MHC相互作用の利用を拡大する新規で拡張可能な技術及び分子が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決する為の手段】
【０００４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)：抗原提示ドメイン、及び、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインがMHC分子の結合フラグメントを含む、に関する。
【０００５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原提示ドメインがMHCを含むSABRに関する。
【０００６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、SABRをコードする核酸に関する。
【０００７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、SABRをコードする核酸を含む細胞に関する。
【０００８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記MHCがクラスI MHCを含むSABRに関する。
【０００９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記MHCがクラスII MHCを含むSABRに関する。
【００１０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ペプチドを更に含み、ここで、前記ペプチドがエピトープを含む、ここで、前記ペプチドのエピトープがSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインが前記ペプチドに結合するSABRに関する。
【００１１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインがT細胞シグナリング・ドメインを含むSABRに関する。
【００１２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、又はTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む、SABRに関する。
【００１３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む、SABRに関する。
【００１４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを更に含むSABRに関する。
【００１５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記膜貫通ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、NOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む、SABRに関する。
【００１６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記膜貫通ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含むSABRに関する。
【００１７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記抗原提示ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含むSABRに関する。
【００１８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含むSABRに関する。
【００１９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記抗原提示ドメインが前記シグナル伝達ドメインに融合しているSABRに関する。
【００２０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、1つ以上のリンカーを更に含むSABRに関する。
【００２１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む細胞：以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子を含む、に関する。
【００２２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRのうちの何れか1種以上を含む、細胞に関する。
【００２３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子に関する。
【００２４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、シグナリング細胞を調製する為の方法に関し、前記方法は以下を含む：ターゲット細胞を提供すること；及び、前記ターゲット細胞に、T細胞の表面で発現する少なくとも1種のT細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入すること、ここで、前記SABRはシグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
【００２５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRのうちの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する；前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること；前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
【００２６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが可溶性分子を含む。
【００２７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記可溶性分子が抗体を含む。
【００２８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが細胞表面上で発現している。
【００２９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが、T細胞表面上で発現しているTCRを含む。
【００３０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が細胞のライブラリを含む、ここで、前記細胞のライブラリが多数の種々のSABRを有し、及びここで多数の種々のSABRが種々の抗原レセプターに結合することができる。
【００３１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが多数の抗原レセプターを含む。
【００３２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、多数の種々のSABRが発現し、前記測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを示した細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定する。
【００３３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、2種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する。
【００３４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、2種以上の抗原レセプター及び2種以上のSABRが存在する。
【００３５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【００３６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記測定可能なシグナルが、検出可能なマーカーの発現に由来する。
【００３７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記測定可能なシグナルを発現するレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを用いて同定する。
【００３８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが、発現したオーファンTCRを含む。
【００３９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記1種以上のレポーター細胞が、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する。
【００４０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む。
【００４１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか1種、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター。
【００４２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記少なくとも1種の抗原レセプターが細胞表面上で発現し、ここで、前記細胞が抗原レセプター細胞である。
【００４３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記SABRがレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記SABRが前記抗原レセプターに結合すると、前記細胞が検出可能なマーカーを呈する。
【００４４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記レポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【００４５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記抗原レセプター細胞が、TCRを含むT細胞を含む。
【００４６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記抗原レセプター細胞が、オーファンTCRを発現する細胞を含む。
【００４７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載されるSABRのうちの何れか1種以上を治療用細胞に形質導入すること；並びに、治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。
【００４８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記細胞反応が、以下のうちの1種以上を生じさせる：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
【００４９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞が病原性T細胞を殺す。
【００５０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞がターゲットT細胞を活性化する。
【００５１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞が病原性T細胞を抑制する。
【００５２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む組成物に関する：本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む治療用T-細胞。
【００５３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T細胞物を患者に投与することを含む、患者を治療する為の方法に関し、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
【００５４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；並びに、細胞内シグナリング・ドメイン。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1Aは、本明細書の様々な実施形態による、CD8+ T細胞の例示的なSABRコンストラクトを示す。  図1Bは、本明細書の様々な実施形態による、CD4+ T細胞の例示的なSABRコンストラクトを示す。  図1Cは、本明細書の様々な実施形態による、SABRコンストラクトを示す。  図1Dは、抗原提示ドメインを有するが、伝達シグナリング・ドメインを有しない、典型的な抗原提示細胞を示す。  図1Eは、抗原提示ドメイン、及び抗原提示細胞内でシグナルの誘導が可能な伝達シグナリング・ドメインの両方を含むSABRを有する抗原提示細胞を示す。
【図２】図2Aは、本明細書の様々な実施形態による、TCR結合又は認識時にシグナルを発現するレポーター細胞株において、SABRを使用することを説明する概略図を示す。  図2Bは、本明細書中に記載されるSABRによる、抗原特異的なシグナリングのプロセスを記載するフローチャートを示す。  図2Cは、本明細書の様々な実施形態による、抗原探索のためにSABRライブラリを使用すること概略的に示す図である。
【図３】図3Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABRの機能を実証するために使用するT細胞及びターゲット細胞の概略図を示す。  図3Bは、TCRを発現しているT細胞と共インキュベーションしたときの、SABR形質導入レポーター細胞におけるGFP発現の計測値を示すグラフである。  図3Cは、種々の患者由来の4種の異なるTCRへの応答性における、B27-KK10-SCTRの機能を実証するグラフを示す。
【図４】図4Aは、本明細書の様々な実施形態による、T細胞の抗原を探索するために、様々なSABRコンストラクトを使用することを説明する概略図を示す。  図4Bは、本明細書の様々な実施形態による、TCRの交差反応性を検討する為に、又はヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定する為に、SCTRを使用することを説明する概略図を示す。
【図５】図5Aは、本明細書の様々な実施形態による、特定のT細胞が特異的な抗原を認識するのに応じて、SABRが毒性を誘導することができることを説明する概略図を示す。  図5Bは、本明細書の様々な実施形態による、SABRを介した細胞毒性を試験するために使用する細胞毒性アッセイを説明する概略図を示す。  図5Cは、A2-NYESO-SCTRによって誘導されるTCR特異的な細胞傷害性を実証する結果を示すグラフを示す。
【図６】図6Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABR-F及びSABR-Eコンストラクトを示す概略図を示す。  図6Bは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkatsにおいて、8時間での%GFP+ 細胞をY軸上に示す棒グラフを示す。
【図７】図7Aは、SABR及びTCR-pMHC特異的なシグナル伝達を実証する概略図を示す。  図7Bは、培養から8時間後の実験から得た、代表的なフロー・サイトメトリーによるプロットを示す。  図7Cは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した時の、SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現の棒グラフを示す。  図7Dは、SABRにより僅かな細胞数を検出することを示すグラフである。  図7Eは、F5を形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞が、GFPを発現する時間経過を示す。  図7Fは、図7Eの実験から得られた代表的なフロー・サイトメトリーのプロットを示す。
【図８】図8Aは、様々な実施形態による、SCT、SABR、空のSABR、及びタンデム・ミニ遺伝子(TMG)を示す概略図を示す。  図8Bは、様々な実施形態による、BsmBI部位を含むスタッファー・フラグメント（stuffer fragment）を有するSABRベクターのコンストラクト、及びオーバーラップを隣接させたエピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを使用するクローニング方法を示す。  図8Cは、様々な実施形態による、空のSABRコンストラクトを示す。  図8Dは、本明細書の様々な実施形態による、空のSABR(即ち、コードされたペプチドがない)及び内生的に発現したペプチドを示す。  図8Eは、外因性ペプチドでパルスした、空のSABRの概略図を示す。  図8Fは、空のSABRを形質導入した、可溶性MART1又はKK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現を示すグラフを示す。  図8Gは、TMGの新たに翻訳されたエピトープを提示する空のSABRの概略図を示す。  図8Hは、空のB27-SABR KK10-TMGを一緒に形質導入した、又は空のB27-SABRを形質導入して、KK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現のグラフを示す。  図8Iは、本明細書の様々な実施形態による、CD3zシグナル伝達ドメインを有するSCDRのコンストラクトを示す。  図8Jは、種々のTCR-ペプチドに変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。  図8Kは、種々のTCR-ペプチド組成物及び濃度に変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。  図8Lは、本明細書の様々な実施形態による、タンデム・ミニ遺伝子(TMG)抗原を有するSCDRコンストラクトを示す概略図を示す。  図8Mは、種々のTCR-ペプチドに変えた時の%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。
【図９】図9Aは、SABRによるCD69の誘導に関する、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。  図9Bは、SABRを発現する初代T細胞によってJurkat細胞に誘導された細胞毒性に関するグラフを示す。  図9Cは、SABRを発現する初代T細胞によって自己ターゲット細胞に誘導された細胞毒性に関する棒グラフを示す。  図9Dは、A2-SABR及びF5-TCRの抗原感受性を測定する為のアッセイの概略図を示す。  図9Eは、SABRの抗原感受性及びTCRシグナリングに関するプロットを示す。
【図１０】図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。  図10Bは、様々な実施形態による、オーファンTCRによって認識される細胞をSABRライブラリから選択する為の共培養実験を示す概略図である。  図10Cは、様々な実施形態による、計算解析のパイプラインを示すフローチャートを示す。
【図１１】図11Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。  図11Bは、F5及びSL9選別の平均ランクのプロットを示す。  図11Cは、F5選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。  図11Dは、SL9選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。  図11Eは、実施例４のA2-SABRライブラリにおけるEAAGIGILTVの類似体についての平均ランクのプロットを示す。  図11Fは、A2-SABRライブラリにおけるSLYNTVATLの類似体についての平均ランクのプロットを示す。
【図１２】図12Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。  図12Bは、neoTCR及びモック選別（mock sorts）の平均ランクのプロットを示す。  図12Cは、neoTCR選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。  図12Dは、NeoAg-SABRライブラリにおけるUSP7に由来するエピトープの平均ランクのプロットを示す。  図12Eは、NeoAg-SABRスクリーニングで同定された上位ヒットの妥当性評価を示すプロットを示す。
【図１３】図13Aは、GFP発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。  図13Bは、GFP及びCD69の発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。  図13Cは、細胞毒性アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。
【図１４】図14Aは、TCR-pHLA認識時のSABRの構造及びSABRによるシグナル誘導を示す概略図である。  図14Bは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種のT細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示す、SABRの概略図を示す。  図14Cは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種のT細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示す棒グラフを示す。  図14Dは、DQ2-DQ8ヘテロ接合性である患者由来のAPC表面上におけるHLA-DQ対立遺伝子の4種の組み合わせを示す。  図14Eは、4種のDQ2/8の組み合わせをコードするSABRが別々のAPC表面上にあり、それらの区別が可能であることを、示している。
【図１５】図15Aは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。  図15Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。
【図１６】図16Aは、IAb-OVA DCH及びIAb-OVA DCH-SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。  図16Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRがOT-II TCRを発現するマウス脾細胞を認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。
【図１７】図17Aは、%GFP+ 細胞を経時的に示す折れ線グラフを示す。  図17Bは、本実験の代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。
【図１８】図18Aは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したJurkat細胞についての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。  図18Bは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。  図18Cは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の経時的な頻度を示す折れ線グラフを示す。
【図１９】図19は、本明細書中の様々な実施形態による(例えば、糖尿病の治療のための)抗原性エピトープの例を示す。
【図２０】図20Aは、多種多様な種間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。  図20Bは、ヒト間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。  図20Cは、多種多様な種間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。  図20Dは、ヒト間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。  図20Eは、多種多様な種間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。  図20Fは、ヒト間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。
【発明を実施する為の形態】
【００５６】
詳細な説明
抗原を提示するMHC分子にはシグナル伝達ドメインが無いため、このターゲット細胞中で応答を誘導することはできない。従って、TCR-抗原-MHC相互作用は、T細胞に向かう一方向性のシグナルをもたらす。前記ターゲット細胞に向かうシグナリングが無いことは、種々の機能のためにTCR-抗原-MHC相互作用を利用する可能性を大きく制約する。従って、TCR-抗原-MHC相互作用の利用を拡大する新規で拡張可能な技術及び分子が必要とされていて、本明細書にて(いくつかの実施形態として)提供される。
【００５７】
本明細書において、以下を含むシグナリング及び抗原提示の２機能性レセプターのための組成物及び方法が記載される：1種以上の抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、1種以上の抗原提示ドメインは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。前記SABRの様々な免疫学的機能についても記載する。前記SABRの様々な使用及び機能が本明細書中で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRを、抗原探索、病原性T細胞を抑制すること及び／又は殺すこと、治療反応を開始させること、治療の方法、SABRライブラリを構築すること、ネオ抗原の探索、並びに他の用途に使用することがある。
【００５８】
定義及び様々な実施形態
本明細書で使用する場合、セクションの見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、説明された主題をいかなる形でも、限定するものとして解釈されるべきではない。限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネット・ウェブページ等を含む、本出願において引用される全ての文献及び同様の物件は、任意の目的のために、それらの全体が参照により明確に取り込まれる。取り込まれた参考文献における用語の定義が、本明細書において提供される定義と異なるように見える場合、本明細書において提供される定義が支配するものとする。
【００５９】
本出願において、単数形を使用することは、特に断らない限り、その複数形を含む。また、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含む(including)」を使用することは、限定することを意図していない。前記の一般論としての記載及び以下の詳細な説明の両方とも、例示的且つ説明的だけなものであり、限定的なものではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)を参照。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。前記の一般論としての記載及び以下の詳細な説明の両方ともが、単に例示的且つ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものではない、と理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は特に断らない限り、その複数形を含む。本出願において、「又は(or)」の使用は、特に断らない限り、「及び／又は(and/or)」を意味する。更に、「含む(including)」という用語、並びに、「含む(includes)」及び「含む(included)」等の他の形態の使用は限定的ではない。本明細書及び特許請求の範囲において使用するように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容が別段の明確な指示をしない限り、複数を参照することを含む。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「約」は、参照となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1%ほど変化する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを意味する。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「抗原提示ドメイン」は、細胞を介した免疫反応を担うT細胞に抗原ペプチド・フラグメントを提示するように機能する細胞外ドメインをいう。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「シグナル伝達ドメイン」は、細胞外シグナルを細胞内に伝達し得る任意のドメインをいう。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「主要組織適合性遺伝子複合体」(MHC)は、獲得免疫系が外来分子を認識するのに必須である一組の細胞表層タンパク質をいう。特に断らない限り、MHCは、クラスI MHC及びクラスII MHCの両方を指す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の鎖をいう。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、免疫系によって認識される抗原の一部をいう。これは、例えば、抗体、B細胞、又はT細胞によることがある。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「T細胞シグナリング・ドメイン」は、細胞内シグナルを伝達するために機能する細胞質T細胞ドメインを指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「サイトカイン・レセプター」は、サイトカインに結合する任意のレセプターをいう。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」は細胞膜を貫通し、そしてその中に存在するアミノ酸配列をいう。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、タンパク質ドメイン間に存在するペプチド配列をいう。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「シグナリング細胞」は、シグナリング・ドメインを介して、細胞外シグナルを細胞内に伝達することができる任意の細胞をいう。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ターゲット細胞」は、シグナリング分子によって認識されるレセプターを有する細胞をいう。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「レポーター細胞」は、レポーター遺伝子を発現している細胞をいい、刺激に曝露された場合に、定性的に及び定量的に容易に評価され得る測定可能なシグナル活性を誘導する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「測定可能なシグナル」は、定性的に又は定量的に評価され得る任意のレポーター活性をいう。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「抗原探索」は、T細胞反応がターゲットとする抗原を発見する過程をいう。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「可溶性分子」は、液体に溶解可能な化合物をいう。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ライブラリ」とは1種以上のシグナリング分子を有する細胞のコレクションをいう。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「検出可能なマーカー」は、シグナル伝達に反応する任意の識別可能な特性をいう。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「フロー・サイトメトリー」は、流体中に細胞を懸濁させ、そしてそれらを電子検出装置に通すことによる、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出及びタンパク質工学において使用される、レーザー又はインピーダンスに基づく生物物理学的な技術をいう。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「治療用細胞」はSABRを形質導入した細胞をいい、ここで、前記SABRは、対象中で抗原レセプターに結合すると、対象中で細胞反応を誘導する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「細胞反応」は、受信したシグナルに応答する細胞内の任意の生化学的反応をいう。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「病原性T細胞」は、疾患(例えば、自己免疫疾患)を引き起こすか、又は疾患に寄与する任意のT細胞をいう。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「細胞質ドメイン」は、細胞の細胞質内のアミノ酸配列をいう。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ベクター」はトランスジェニック・コンストラクト、ターゲティング・コンストラクト、又は単にコンストラクトと互換的に呼ばれる核酸である。本明細書で使用する場合、「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、リボ核酸(RNA)を指すことがある。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるコンストラクトは、1つ以上の調節エレメントを含む。原核生物における例示的な調節エレメントには、プロモーター、オペレーター及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞において使用される調節エレメントには、限定されるものではないが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、スプライシング・シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、インターナル・リボソーム−エントリー・エレメント(IRES)、2A配列等、転写及び翻訳をコントロールする配列が含まれ、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の発現及び／若しくはコードされたポリペプチドの産生を、提供する並びに／又は調節する。例えば、プロモーターはRNAポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、5'ノン−コーディング領域にあり、遺伝子の転写開始部位の近位にある。転写開始の際に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサス・ヌクレオチド配列をしばしば特徴とする。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、バクテリア、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物(ヒトを含む)由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑制性、及び／又は構成性であることがある。誘導性プロモーターは、培養条件の変化(例えば、温度の変化)に応答して、それらの制御下で、DNAからの転写レベルの増加を開始させる。症状を「治療する」又は「治療」とは、前記症状を予防すること、前記状態の発症及び／又は進展の速度を遅らせること、前記症状の進展リスクを低下させること、前記症状に関連する徴候の進展を予防及び／又は遅らせること、前記症状に関連する徴候を軽減又は無くすこと、前記症状から完全に又は部分的に回復させること、又はそれらの組合せをいうことがある。「予防」という用語は、障害又は疾患を、絶対的に止めることを必要としない。
【００８４】
「治療有効量」又は「治療有効用量」は、対象において所望の治療効果(例えば、ターゲット症状の予防、治療、障害及び／又は徴候の発症の遅延、及び／又は症状に関連する徴候の軽減等)を生じさせる量である。この量は、限定されるものではないが、治療用化合物の特徴(活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティ等を含む)、対象の生理学的状態(年齢、性別、病型及び病期、一般的な身体状態、所与の投薬量に対する応答性、及び投薬のタイプ等を含む)、その製剤中の薬学的に許容可能な担体の性質、及び／又は投与経路等を含む様々な因子に依存して変わる。臨床及び薬理学分野の当業者は、本開示を考慮して、日常的な検討を通して（例えば、化合物の投与に対する対象の応答をモニターし、そしてそれに応じて投薬量を調節することによって）、治療有効量を決定し得る。更なるガイダンスについては、Remington:  The  Science and Practice of Pharmacy 21.sup.st Edition, Univ. of  Sciences  in  Philadelphia  (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2005を参照のこと。
【００８５】
「抗体」という用語は、限定されるものではないが、遺伝子操作された、又は他の方法で修飾された形態の免疫グロブリン、例えば、イントラボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント、及びヘテロコンジュゲート抗体(例えば、バイスペシフィック抗体(bispecific antibody)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等)を含む。「抗体」という用語は、シス-ダイアボディ及びミニボディを含む。「抗体」という用語は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、又は対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、及び特異的に結合することができる免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを含む。例示的な抗体構造ユニットは四量体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、2つの同一の一対のポリペプチド鎖で構成されることがあり、各対が1つの「軽」鎖及び1つの「重」鎖を有し、ジスルフィド結合を介して連結している。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミューの定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長鎖について、軽鎖はカッパ又はラムダの何れかに分類される。全長鎖について、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、これらは次に、それぞれ、免疫グロブリン・クラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを規定する。それぞれの鎖のN末端は、主に抗原認識に関与する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、軽鎖及び重鎖に関するこれらの領域を指す。本出願で使用する場合、「抗体」は、抗体及びそのフラグメントの全てのバリエーションを包含する。従って、このコンセプトの範囲内には、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(scFv)、Fab、Fab'、及び同じ結合特異性を有するこれらのフラグメントの多量体バージョン(例えば、F(ab')2)がある。いくつかの実施形態では、前記抗体は、所望のターゲットに特異的に結合する。
【００８６】
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に適用する場合、核酸又はタンパク質が、天然の状態では相互作用している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、それは、乾燥又は水溶液の何れかであることがある。純度及び均質性を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して決定することができる。調製物中に存在する主な種のタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームから分けられている。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルにおいて、核酸又はタンパク質が、本質的に1つのバンドとなることを意味する。いくつかの実施形態では、これは、核酸又はタンパク質がin vivo 状態で存在する分子の少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを示すことがある。
【００８７】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖の何れかの形態にあるデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)及びそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は参照核酸と同様の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特段に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変したバリアント(例えば、縮重コドンによる置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNPs、及び相補的配列、並びに明示的に示される配列、を黙示的に包含する。具体的には、縮重コドンによる置換は、1つ以上の選択した(又は全ての)コドンの3番目の位置を、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって、行うことがある(Batzer et al., Nucleic Acid Res.  19:5081  (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【００８８】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、及びO-ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（即ち、水素に結合するα-炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド、メチオニン・メチルスルホニウム）を指す。このような類似体は、改変したR基(例えば、ノルロイシン)又は改変したペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とはアミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式において機能する化学的化合物をいう。
【００８９】
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関する：抗原提示ドメイン；及び、シグナル伝達ドメイン。前記抗原提示ドメインが主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中のSABRは、ターゲット細胞内のシグナル伝達を可能にし、本明細書中に記載されるような様々な用途を有する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：1種以上の抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記1種以上の抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：1種以上の抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、前記1種以上の抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
【００９０】
図1Aは、本明細書の様々な実施形態による、CD8+ T細胞での例示的なSABRコンストラクトを示す。図1Bは、本明細書の様々な実施形態による、CD4+ T細胞での例示的なSABRコンストラクトを示す。いくつかの実施形態では、SABRを、2つの部分：抗原提示ドメイン102及びシグナル伝達ドメイン104、を連結することによって構築する。T細胞への抗原提示は、ペプチド・エピトープ106をT細胞に提示するクラスI及びクラスIIのMHC分子に依存する。クラスI MHC分子108Aは通常、CD8+ T細胞110Aに8〜11aaの長さのペプチド・エピトープを提示するが、一方でクラスII MHC 108B分子は通常、CD4+ T細胞110Bに12〜15aaの長さのペプチド・エピトープを提示する。いくつかの実施形態では、SABRは、抗原提示ドメイン102をシグナル伝達ドメイン104に繋げることによって作製される。
【００９１】
図1Cは、本明細書の様々な実施形態による、SABRコンストラクトを示す。いくつかの実施形態では、抗原提示ドメイン102は、共有結合ペプチド106を有するクラスI MHC分子108A(SCTR)、又はペプチド・エピトープを全く有さないクラスI MHC分子108A(SCDR)、又は共有結合ペプチド106を有するクラスII MHC分子108B(DCHR)、であり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメイン104は、キメラ抗原レセプター(CAR)で使用されるものと類似したTCR-CD3シグナリング・ドメイン、サイトカインレセプター、又は多量体化時にシグナルを発する他のレセプターに由来することがある。いくつかの実施形態では、SABR-ライブラリは、抗原性エピトープを共有結合的に連結させる、又はSABR発現細胞中で、前記抗原性タンパク質／エピトープを発現させることによって構築することがある。
【００９２】
図1Dは、抗原提示ドメイン102Dを有するが、伝達シグナリング・ドメインを有しない、典型的な抗原提示細胞100Dを示す。図1Eは、抗原提示ドメイン102Eと、抗原提示細胞100E内でシグナル誘導が可能な伝達シグナリング・ドメイン104E、の両方を含むSABR、を有する抗原提示細胞100Eを示す。
【００９３】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
【００９４】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかをコードする核酸に関する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRをコードする核酸に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
【００９５】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかをコードする核酸を含む細胞に関する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRをコードする核酸に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
【００９６】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。
【００９７】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。
【００９８】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかに関し、更にペプチドを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関する、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、表6.3又は6.4のエピトープの何れかを使用することがある。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで前記ペプチドはエピトープを含む、及び前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合していない。
【００９９】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、又はCD3ゼータを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む、及びここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, 又はPMID: 22437870を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、1種以上の表0.1のドメインを含む。いくつかの実施形態では、1種以上の以下の表0.1の項目のフラグメントを使うこともある。
【０１００】
【表１】
2020534809.tif 000003
【０１０１】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、又はTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 24679437, PMID: 19239902 を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、1種以上の表0.2のドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカイン・レセプターのフラグメントを使用することがある。
【０１０２】
【表２】
2020534809.tif 000004
【０１０３】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 26830878, 米国特許 No. 9,670,281,   PMID: 26431673, PMID: 21816833, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 19239902, PMID: 20567250, PMID: 25045879, PMID: 15932016, PMID: 21616437, 又はPMID: 26632377 を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、1種以上の表0.3のドメインを含む。いくつかの実施形態では、表0.3のシグナル伝達ドメインのフラグメントを使用することがある。
【０１０４】
【表３−１】
2020534809.tif 000005
【表３−２】
2020534809.tif 000006
【０１０５】
いくつかの実施形態では、表0.1の任意の選択肢を、表0.2の任意の選択肢、及び表0.3の任意の選択肢、と組み合わせることがある。いくつかの実施形態では、表0.1〜0.3の任意の選択肢を、任意の抗原提示ドメイン(MHC I若しくはMHC II又はそれらの結合ドメイン)と組み合わせることがある。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される任意のSABRは、表0.1〜0.3で提供される任意の構成要素をその中に有することがある。
【０１０６】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関する。
【０１０７】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569,  PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870,  PMID: 26830878, 米国特許 No. 9,670,281, PMID: 26431673, PMID: 21816833,   PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 19239902, PMID: 20567250, PMID: 25045879, PMID: 15932016, PMID: 21616437, 又は PMID: 26632377 のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、表0.3のドメインの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。
【０１０８】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及び膜貫通ドメイン、ここで、前記膜貫通ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む。
【０１０９】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記抗原提示ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。
【０１１０】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。
【０１１１】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、前記シグナル伝達ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、前記SABRのMHC部分は、MHCの一部又は全部を含む。いくつかの実施形態では、前記MHCはヒトMHCである。いくつかの実施形態では、前記MHCは、MHCの保存された配列の1種以上又は全て(例えば、図20A−20Fの何れか1つ内の保存された残基)を含む。
【０１１２】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、1つ以上のリンカーを含むSABRに関する。
【０１１３】
細胞組成物
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して、本明細書中で提供される各実施形態を、細胞組成物に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１１４】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含む細胞に関する：以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子を含む。
【０１１５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関する。本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRを含む細胞に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは更にペプチドを含む、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープは前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは更に膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞物に関し、前記SABRは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを更に含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは、1つ以上のリンカーを更に含む。
【０１１６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞はJurkat細胞、NFAT-GFP-Jurkat細胞のような任意のT細胞株を起源とする。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞は、患者若しくは健康なドナー由来の初代T細胞、又はナチュラル・キラー細胞を起源とする。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞は、調節性T細胞、樹状細胞、B細胞、マクロファージ、又はナチュラル・キラー細胞を起源とする。
【０１１７】
核酸へのコード化
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して、本明細書中で提供される各実施形態を、核酸へのコード化に関して本明細書中に記載される本実施形態内で使用することがある。
【０１１８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは以下を含む：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは更にペプチドを含む、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープは前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは更に膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは膜貫通ドメインを更に含む、ここで、前記膜貫通ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインは、前記シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは、1つ以上のリンカーを更に含む。
【０１１９】
シグナリング細胞調製のための方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して上記で提供された各実施形態を、シグナリング細胞調製のための方法に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１２０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、シグナリング細胞を調製する為の方法に関する。前記方法は、以下を含む：ターゲット細胞を提供すること、T-細胞の表面で発現する少なくとも1種のT-細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ターゲット細胞に導入すること、ここで、前記SABRは、シグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
【０１２１】
抗原探索の方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して上記で提供された各実施形態を、抗原探索の為の方法に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１２２】
抗原探索は、タンパク質の1種以上のペプチド配列を同定することをいう。いくつかの実施形態では、その同定した抗原を、患者を処置するためのワクチンを作製する際に、使用することがある。いくつかの実施形態では、抗原レセプター探索とは、特異的な抗原を認識する1種以上の抗原レセプターを同定することをいう。例えば、抗原レセプター探索は、特異的な抗原を認識する複数のTCRのうちの1種以上の特異的TCRを同定することを含むことがある。いくつかの実施形態では、同定した抗原レセプター(例えば、TCR)を免疫療法に使用することがある。いくつかの実施形態では、本明細書で説明するSABRを、抗原探索及び抗原レセプター探索の両方のために使用することがある。
【０１２３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
【０１２４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞中の少なくとも1種のペプチドを同定し、それによってSABRを有するペプチドを前記抗原レセプターと関連付ける。
【０１２５】
図2Aは、本明細書の様々な実施形態に従って、TCRシグナル伝達時にシグナルを発現するレポーター細胞株において、SABRを使用することを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、抗原探索、TCRの交差反応性、及び関連するアプローチにSABR 200を使用するために、SABR 200を、シグナル伝達時に測定可能なシグナルを生成するレポーター細胞202において発現させることがある。SABR 200の使用の例は、T細胞シグナル伝達時に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレポーター細胞株(例えば、NFAT-GFP-Jurkat細胞)に依存する。いくつかの実施形態では、所与のTCRを発現するT細胞を、SABRを発現する、例えば、NFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートすることがある。いくつかの実施形態では、SABR発現細胞は、SABR 200によって提示される同種抗原204が前記T細胞によって認識される場合、GFPを発現することがある。いくつかの実施形態では、SABRによる無関係な抗原206の提示又は無関係なTCR 208は、GFP発現をもたらさず、同種抗原204を提示するSABR 200の同定が、フロー・サイトメトリーによる可能になる。
【０１２６】
図2Bは、本明細書中に記載されるSABRによる、抗原特異的シグナリングのプロセスを記載するフローチャートを示す。所与のTCRを発現するJurkat細胞を、例えば、SABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートすることがある。発現したTCRにマッチする抗原を含むSABRは、TCRによって認識されると活性化することがあり、NFAT-GFP-Jurkat細胞でシグナルを誘導することがある。ミスマッチ又は無関係な抗原を含むSABRは、発現したTCRによって認識され得ず、及び活性化しないことがある。
【０１２７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは可溶性分子を含む。
【０１２８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは可溶性分子を含む、ここで、前記可溶性分子は抗体を含む。
【０１２９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは細胞表面上で発現している。
【０１３０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは細胞表面上で発現している、及びここで、前記抗原レセプターはT細胞表面上で発現しているTCRを含む。
【０１３１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞は細胞のライブラリを含む、ここで前記細胞のライブラリは多数の種々のSABRを有する、及びここで、前記多数の種々のSABRは種々の抗原レセプターに結合することがある。
【０１３２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは多数の種々の抗原レセプターを含む。
【０１３３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、多数の種々のSABRを発現させ、並びに測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを呈する細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定すること(「抗原探索」)。
【０１３４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索（及び／又は抗原レセプター探索）の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、1種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する。
【０１３５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索（及び／又は抗原レセプター探索）の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、1種以上の抗原レセプター及び1種以上のSABRが存在する。
【０１３６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【０１３７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞、任意のT細胞株の細胞、任意のB細胞株の細胞、任意のNK細胞株の細胞、単球細胞株、又は骨髄細胞株を含む。
【０１３８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記測定可能なシグナルは検出可能なマーカーの発現に由来する。
【０１３９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記測定可能なシグナルを発現しているレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを使用して同定する。
【０１４０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプター細胞はオーファンT-細胞レセプター(TCR)を発現している細胞を含む。
【０１４１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは発現したオーファンT-細胞レセプター(TCR)を含む。
【０１４２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記少なくとも1種のレポーター細胞は遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する。
【０１４３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記少なくとも1種のレポーター細胞は遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する、及び遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む。
【０１４４】
細胞ライブラリ
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、細胞ライブラリに関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１４５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター。
【０１４６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である。本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞はレポーター細胞である。
【０１４７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記SABRはレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記細胞は、前記SABRが前記抗原レセプターに結合したときに検出可能なマーカーを呈する。
【０１４８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【０１４９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である、及びここで、前記抗原レセプター細胞はTCRを含むT細胞を含む。
【０１５０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である、及びここで、前記抗原レセプター細胞はオーファンTCRを発現している細胞を含む。
【０１５１】
図2Cは、本明細書の様々な実施形態による、抗原探索のためにSABRライブラリを使用することを概略的に示す図である。いくつかの実施形態では、SABRのライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞のようなレポーター細胞を、抗原特異性を見出すために使用することがある。いくつかの実施形態では、SABRライブラリ中の各細胞210、212、214、216、218、220、222、224、及び226は、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを一意的に発現し、これを、DNAシークエンシングによって同定することができる。いくつかの実施形態では、前記SABRライブラリを、未知の特異性を有するT細胞、又は未知の特異性を有するTCRを発現するT細胞株、と共インキュベートすることがある。いくつかの実施形態では、GFP+ 細胞210、216、及び222のようなシグナルを産生する細胞を選別し、その抗原性エピトープをシークエンシングして、所与のT細胞又はTCRの同種抗原を決定することがある。
【０１５２】
治療方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して上記で提供された各実施形態を、治療方法に関して本明細書に記載される本実施形態内で使用することがある。
【０１５３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、調節性T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、又は例えば造血幹細胞、前駆細胞、リンパ球及び骨髄細胞等を含む任意の造血細胞、を含む。
【０１５４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記細胞反応は、以下のうちの1種以上を生じさせる：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
【０１５５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は病原性T細胞を殺す。
【０１５６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞はターゲットT細胞を活性化する。
【０１５７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は病原性T細胞を抑制する。
【０１５８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、患者を治療する為の方法に関し、細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T-細胞を前記患者に投与することを含む、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
【０１５９】
治療用T細胞組成物
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態は、治療用T細胞組成物に関して本明細書に記載される本実施形態内で使用されることがある。
【０１６０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む組成物に関する：本明細書中に記載される何れかのSABRを含む治療用T-細胞。
【０１６１】
更なるSABR組成物
このセクションでは、SABRの配置及び組み合わせ、並びにそれらの使用のための選択肢を追加して提供する。
【０１６２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに細胞内シグナリング・ドメイン。
【０１６３】
T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットホーム：
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットホームに関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１６４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、TCR抗原探索のための新規な細胞ベースのプラットホームにおけるキメラSABRに関する。いくつかの実施形態では、SABRは細胞外のペプチド-MHC複合体を提示し、同種TCRと結合するとTCR様シグナルを介して細胞内シグナリングを誘導する。本明細書中のいくつかの実施形態は、例えば、数千の抗原性エピトープをスクリーニングするためにSABRライブラリを使用する抗原探索に関する。このプラットフォームは、特異性が既知であるパブリック（public）のTCRが認識するターゲットを同定することによって検証されたものである。更に、このアプローチを、個別化したネオ抗原探索に拡張することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原探索プラットホームは、免疫療法のための新規ターゲットを開発する為の拡張可能である及び汎用性のある方法を提供することができる。
【０１６５】
CD8+ T細胞は、ヒトでヒト白血球抗原(HLA)としても知られるクラスI MHC分子上に提示された8〜12残基の長さのペプチド・エピトープを認識する固有の表面T細胞レセプター(TCR)をコードする。TCR複合体が同種ペプチド-MHC(pMHC)に結合すると、前記TCR複合体と相互作用したCD3ζ鎖は二量体化し、下流シグナルを開始する。複数のシグナリング・カスケードが活性化され、転写因子NF-κB、AP-1、及びNFAT7によって駆動される遺伝子発現が直ちに誘導される。CD8+ T細胞では、TCRシグナリングは初期活性化マーカー(CD69及びCD107a)の発現、細胞傷害性顆粒の放出、及びサイトカイン(IFNγ、IL2、及びTNFα)の分泌を誘導し、最終的にそのターゲット細胞を死滅させる。同種TCRとpMHC複合体の相互作用は、ターゲット抗原に対して高度な特異性を生みだす。T細胞は腫瘍細胞によって提示されたエピトープを認識し、腫瘍環境に浸潤することができる。抗腫瘍T細胞は、2種類の腫瘍由来エピトープに反応する：1)非変異、組織特異的な抗原又はがん‐精巣抗原に由来するパブリック（public）又はプライベート（private）エピトープ、及び2)非同義変異に由来するプライベート（private）ネオ抗原。内生的な抗原及びネオ抗原の両方が、免疫療法のターゲットとして用いられることがある。
【０１６６】
腫瘍免疫学の分野におけるボトルネックの一つは、特定の抗腫瘍CD8+ T細胞によって認識される抗原を同定することである。T細胞の同種抗原を同定するために、いくつかの技術が開発されてきている。最も一般的な手法は、pMHC多量体を使用して、フロー・サイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を同定する。しかし、pMHC多量体を使用する抗原探索は、抗原性の状況を最初に知る必要があり、103種の抗原を超えて拡張可能ではないが、同時に多数の抗原特異性を同定することができる。このアプローチは、パブリック（public）の腫瘍抗原並びにプライベート（private）なネオ抗原を発見するために使用されてきた。あるアプローチは、共有結合の縮重ライブラリを使用する。選別、伸長、シークエンシング、及び腫瘍エクソームのデータを参照すること、を複数回繰り返して、TCRの同種抗原が同定される。しかしながら、このアプローチは、可溶性TCRが必要であるため、技術的に困難であり、生理的なTCR-pMHC相互作用を反映したものではない。しかし、抗原について知らなくても良く、106-108種のエピトープに拡張可能である。これらの限界があることから、T細胞の抗原を探索するために新しい技術が非常に必要とされている。
【０１６７】
従って、本明細書中のいくつかの実施形態は、満たされていない必要性に対処する為の新規な抗原探索技術に関する。いくつかの実施形態では、T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットフォームを提示する。いくつかの実施形態では、pMHC複合体による抗原提示を細胞内シグナリングと組み合わせることによって、SABRは、TCR-pMHC相互作用の同定を可能にする。いくつかの実施形態は、SABRライブラリを使用するTCR抗原探索、及び既知のパブリック（public）TCRのためのその使用に関する。いくつかの実施形態は、個別化したネオ抗原に指向性がある手法のために、SABRライブラリを適合させることに関する。いくつかの実施形態は、T細胞の抗原を探索するための柔軟で且つ拡張可能な方法を記載する。
【０１６８】
更に企図される実施形態
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、更に企図される実施形態に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１６９】
本明細書で記載される様々な実施形態は、SABRを導入することにより、TCR-抗原-MHC相互作用の限界に対処するものである。本明細書で議論されるように、SABRの使用により、様々な機能を目的に、TCR-抗原-MHC相互作用を利用することが可能になる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる機能は、がん、感染症、及び自己免疫疾患におけるT細胞の抗原特異性を明らかにすることを含む。がんに対するT細胞を介した反応は、がん細胞表面上に発現する多数の抗原をターゲットとする。ターゲットとなる抗原を知ることは、がんを治療する為の免疫療法アプローチにとって非常に有用である。T細胞がターゲットとするエピトープを発見する為のいくつかの技術がある。最も広く使用されている技術は、MHC-ペプチド-多量体の使用に基づく。MHC多量体を使用することには、いくつかの欠点がある−それは労働集約的であり、容易に拡張可能ではなく、クラスII MHC-ペプチド複合体に適用することは容易でなく、及びそれは、低親和性相互作用に対しては感度が十分でない。酵母によるディスプレイもまた、TCRの抗原探索について試験されているが、いくつかの欠点を同様に有する。酵母ディスプレイは、ペプチド-MHC-b2ミクログロブリンの一本鎖三量体(single chain trimers (SCT))を用いることによるもので、これは、抗原提示を模倣し、前記抗原を遺伝子工学的にMHCに連結させている。しかし、SCT酵母ディスプレイ技術を使用するには、可溶性TCR分子を産生する必要があり、これは安定ではなく、容易に多数のTCRへと拡張することができない。更に、酵母は内生的なMHCを欠くため、前記SCTは正しく折りたたまれず、生理的なTCR結合を反映していない可能性がある。抗原指向性のある他の技術は、患者サンプルに由来する抗原性エピトープに関して事前に知っておく必要があるか、又は抗原特異性にバイアスがある可能性のある患者T細胞を増殖させる必要があるか、又は入手できないほどの大量の患者サンプルを必要とする。本明細書で記載するSABR技術は、所与のT細胞又はTCRによって認識されるターゲット細胞のライブラリを使用する、バイアスのないアプローチを使用している。SABRによって、例えば、106種以上のエピトープ並びにクラスI及びクラスII対立遺伝子を含む事実上全てのMHC対立遺伝子に対して、このアプローチを拡張することが可能となり、可溶性TCRを産生させる必要がなく、低親和性TCR-pMHC相互作用に適用が可能になり、患者の腫瘍サンプルが無くても使用することができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる別の機能には、T細胞レセプターの交差反応性及びヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を研究することが含まれる。TCRは、それらの同種エピトープのバリアントを認識することにおいて、かなりの組み合わせを示す。TCRの交差反応性を検討することは、TCR又は特定のTCRを有するT細胞の安全性と有効性を理解するために大切である。がん免疫療法において、TCRの交差反応性に関する知見は、オフターゲット又はオンターゲット（但し、望ましくない副作用無しにそのTCRを治療的に使用することに関する意図しない効果）を理解するのに役立つ。HIVのようなウイルスに対する免疫療法において、TCRの交差反応性に関する知見は、そのTCRから病原体が免疫逃避をする傾向を理解するのに役立つ。TCRの交差反応性を研究する現行の技術は、個々のバリアント・ペプチドを使用する低スループットな方法、又は骨が折れ、可溶性TCRの産生を必要とする酵母ディスプレイ技術、の何れかに基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABR技術により、可溶性TCR産生の必要無しに、例えば、任意の所与のMHC-ペプチドの組合せについて、103〜106種の抗原性エピトープ・バリアントのライブラリを構築すること、及びその後に認識されるバリアントを同定すること、が可能になる。更に、このアプローチを使用して、より高い親和性を有するヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）及びアンタゴニスト等、様々な結合特性を有し得る所与のエピトープのバリアントを同定することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる更に別の機能には、特異的なT細胞反応を誘導することが含まれる。T細胞反応を誘発するワクチン接種アプローチには、T細胞に対する抗原性エピトープの提示と、それに続くそれらのT細胞の刺激が必要である。プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)は、内生的な又は外生的な抗原を処理し、それらをT細胞に提示する。抗原特異的な免疫を、弱毒性又は不活性ウイルス、可溶性抗原タンパク質を用いることによって、又はベクターを用いることによって、誘発させることができる。しかし、これらのアプローチでは、前記抗原性エピトープは、天然の細胞機構によって処理され、従って、所与のエピトープが強力な免疫反応を誘発するかどうかについての制御はない。所与のエピトープに対する応答を誘発するために、それを、エピトープをコードするタンデム・ミニ遺伝子のタンパク質全体のための発現カセットを使って、APC中で発現させる。一本鎖三量体を使用して、APC表面上に所与のMHC-ペプチド複合体を発現させ、免疫反応を誘発させることもできる。一本鎖三量体は、APC中でシグナルを送ることができないので、APCがT細胞を刺激する仕方を操作することはできない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるSABRは、APCがサイトカインを分泌し、及びそれらを認識するT細胞を活性化することを可能にする特異的なシグナリング分子に共役することがある。いくつかの実施形態では、SABRを、APCにおいて免疫抑制性サイトカインを誘発するように構成することがあり、これは、特定の応答の抑制を引き起こすことがある。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる更に別の機能には、T細胞特異性を排除することが含まれる。病原性T細胞のクローン特異性は、T細胞白血病及び自己免疫疾患において中心的な働きをしている可能性がある。T細胞白血病では、過増殖し、形質転換したクローンを、それらが認識する抗原性エピトープに基づいて、特異的にターゲット化することができる。自己免疫障害では、自己反応性であるT細胞クローンもまた、それらの同種エピトープに基づいて、ターゲット化することもできる。それらの抗原特異性に基づいてT細胞クローンを排除することによって、オフターゲット効果が最小である正確なターゲティングが可能になる。これまでに試験されたアプローチは、特定のTCR可変領域を認識するモノクローナル抗体によるものであった。特定のTCR可変領域をターゲット化することによって、正確さは提供されるが、同じ抗原を特異的に認識しながら種々の可変領域を含むことがあるTCRをターゲット化することは可能にならない。更に、この手法は、所与の可変領域を含む全てのTCRを、それらの特異性に関係なく、排除してしまうことがある。いくつかの実施形態では、SABRにより、TCRを、それらの抗原特異性に基づいて、ターゲット化することが可能になる。所与のエピトープを提示するSABRを形質導入したT細胞を治療的に使用し、特定の病原性T細胞を排除することができる。更に、T細胞クローンによって認識され得る抗原を同定することを、それらの天然の同種抗原を知らない時でも、SABRを開発するために使用することがある。いくつかの実施形態では、既存の技術の欠点を、シグナル伝達及び抗原提示をSABRを介して連結することによって、克服することができる。抗原提示とシグナル伝達を組み合わせることにより、SABRは、所与のTCRによって認識される細胞中でシグナル伝達が始まり、機能的なアウトプットを生成する、安定な、拡張可能な、高スループットな、及び高感度なアプローチを可能にする。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、MHC分子は、T細胞によって認識されるために、細胞表面上にペプチド・エピトープを提示する。天然型では、MHC分子はシグナル伝達ドメインを欠き、抗原提示細胞に何らシグナルを伝達できない。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、MHC分子の細胞内末端にシグナル伝達ドメインを付加するキメラ・コンストラクト(例えば、SABR)に関する。いくつかの実施形態では、これらのSABRは、抗原を提示することができ、T細胞によって認識されると細胞内シグナルを誘導することができる。いくつかの実施形態では、SABRは、例えば、ペプチド・エピトープをT細胞に提示するMHC分子に基づいた1種以上の抗原認識ドメイン等を含む、2種以上の別個の機能的部分を有する。いくつかの実施形態では、これらを、遺伝子的にコードさせ、MHC分子に共有結合させるか、又は細胞において発現させ、MHC分子によって自然に提示させることがある。更に、いくつかの実施形態では、前記SABRは、SABRがそれらの同種T細胞に結合すると転写反応を誘導する細胞内シグナルを誘導する1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。SABRコンストラクトを、例えば、がん、自己免疫疾患、及び感染症における抗原探索のために、特定のT細胞を排除する免疫療法アプローチのために、抗原特異的サイトカイン・シグナリングを誘導するために等、多種多様な目的のために使用することがある。
【０１７５】
図3Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABRの機能を実証するために使用するT細胞及びターゲット細胞の概略図を示す。いくつかの実施形態では、クラスI SABR 302を、図1Cに示す2つのコンストラクトに基づいて構築することがある。これらには、MHCに共有結合したペプチド・エピトープからなるSCTRコンストラクト、及びいくつかの実施形態では、MHCに遺伝子的に結合していないペプチド・エピトープを提示させることができるSCDRコンストラクトが含まれる。いくつかの実施形態では、前記SCTRコンストラクトを、例えば、A2-NYESO(がん特異的なMHC-抗原の組合せ)又はB27-KK10(HIV特異的なMHC-抗原の組合せ)の何れかを発現するように構築することがある。いくつかの実施形態では、A2及びB27のSCDRコンストラクトを構築することがあり、そしてペプチドを使用して、例えば、NYESO又はKK10抗原の何れかを提示させることがある。いくつかの実施形態では、例えば、NFAT-GFP-Jurkatsに、SCTRコンストラクト又はSCDRコンストラクトを形質導入することがあり、そしてレポーター細胞304としてペプチド抗原でパルスすることがある。いくつかの実施形態では、前記レポーター細胞304は、例えば、A2-NYESO特異的TCR又はB27-KK10特異的TCRの何れかを発現するJurkat細胞306によって、シグナルを導入させることがあり、そしてGFP+ 細胞の頻度をフロー・サイトメトリーで測定することがある。
【０１７６】
図3Bに示すように、NFAT-GFP-Jurkatsは、SABRがMHC-抗原を特異的に認識した時にのみGFPを発現することができる。図3Cは、様々な実施形態による、B27-KK10-SCTRコンストラクトを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を使用する同様なアッセイを示す。いくつかの実施形態では、Jurkat細胞に、4人の異なるHIV患者に由来する4種の異なるB27-KK10特異的TCRを形質導入し、それらをNFAT-GFP-Jurkat細胞とインキュベートすることがある。図3Cに示すように、前記レポーター細胞は、4種のTCRすべてによって認識されると、GFPを発現することができる。従って、いくつかの実施形態では、クラスI SABRは、上述の提案された方法で機能し、レポーター細胞株で使用することがある。
【０１７７】
図4Aは、本明細書の様々な実施形態による、T細胞の抗原探索をするために、様々なSABRコンストラクトを使用することを説明する概略図を示す。図4Bは、本明細書の様々な実施形態による、TCRの交差反応性を検討する為に、又はヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定する為に、SCTRを使用することを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、これらのアプローチを使用して、がん特異的な、病原体特異的な、又は自己反応性のT細胞の抗原反応性を同定することができる。いくつかの実施形態では、がん、病原体、正常細胞のプロテオームに由来する抗原又は抗原性エピトープを発現するSABRライブラリを構築することがある。いくつかの実施形態では、これらのライブラリを、例えば、がん免疫、糖尿病及び神経変性障害等を含む自己免疫障害、病原体に対する免疫、及びワクチン応答におけるT細胞の特異性を同定するために使用することがある(図4A)。いくつかの実施形態では、所与のT細胞の特異性について、同種エピトープのバリアントを発現するSABRライブラリを構築し、これを用いて、TCRの交差反応性を理解し、ヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定することがある(図4B)。
【０１７８】
図5Aは、様々な実施形態による、特定のT細胞が特異的な抗原を認識するのに応じて、SABRが毒性を誘導することができることを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、SABRはまた、他の病原性T細胞をターゲットとするようにT細胞の特異性を変えることもできる。SABRはCARに類似したシグナリングを T細胞中で誘導することができるので、SABRを、それらが認識するT細胞に対する細胞毒性反応を開始するために用いることができる。いくつかの実施形態では、所与の抗原を認識するSABRを形質導入した治療用T細胞502を、図5Aに記載されるような特異的な様式で、病原性T細胞504を特異的に排除するために使用することがある。いくつかの実施形態では、この性能を、図5Bに記載されるような細胞毒性アッセイを用いて試験することがある。いくつかの実施形態では、初代T細胞を、2つの異なったA2-NYESO-SCTRコンストラクトで形質導入し、エフェクター／治療用T細胞として、それらの使用を可能にすることがある。いくつかの実施形態では、A2-NYESO-、A2-MART1-、又はB27-KK10特異的なTCRを発現するJurkat細胞をターゲット細胞として使用することがある。いくつかの実施形態では、治療用T細胞及びターゲット細胞を共インキュベートし、そしてターゲット細胞の生存を24時間後に測定することがある。図5Bに記載されるように、A2-NYESO-SCTRはA2-NYESO特異的なTCRを発現するターゲット細胞に対して特異的に細胞毒性を誘導することができ、SABRの細胞毒性機能を実証する。いくつかの実施形態では、これらの結果に基づいて、SABRを使用して、T細胞レパートリーから抗原特異性を排除することができる。例えば、自己免疫疾患では、病原性T細胞は自己反応性のT細胞であることがあり、これは、それらの同種自己抗原を発現するSABRによって認識されることがある。例えば、T細胞白血病の場合、病原性T細胞はクローン的に増殖したT細胞であってもよく、これはそれらの同種抗原又はそれらによって認識されることがあるヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を発現するSABRによって認識されることがある。いくつかの実施形態では、SABRの特異性によって、SABRが、正常なT細胞レパートリーをターゲットとしない一方で、特定のT細胞を特異的にターゲットとすることが可能になる。
【０１７９】
要約すると、本明細書中に記載される種々の実施形態において、SABRを、抗原提示とシグナル伝達とを共役させるための、安定な、拡張可能な、特異的な、及び多様な方法として使用することがある。様々な実施形態において、この機能をいくつかの異なる方法で利用し、T細胞の特異性を理解し、操作することがある。
【０１８０】
特定の実施形態において、SABRを、抗原探索のために使用することがある。抗原探索のための現行の技術には、MHC多量体、機能的アッセイ、酵母ディスプレイ、質量分析、及びDNAバーコーディング／NACSが含まれる。これらの技術には、拡張可能性に欠けること、多くのMHC対立遺伝子に拡大することができないこと、特殊な機器を必要とすること、及び安定性に欠ける、等を含むいくつかの欠点がある。更に、現行の技術は全て、がん特異的なT細胞、及びMHC-I抗原に焦点が当てられている。MHC-II抗原を同定する為のアプローチ／戦略はひどく不足している。
【０１８１】
MHC多量体は、ペプチド・エピトープを合成し、ビオチン化MHC分子でそれらをリフォールディングすることによって産生される。しかし、MHC多量体は、一度に10〜100種の抗原に限定され、従って、拡張可能ではない。更に、MHC-II抗原のための多量体を作製することは、それらの固有の不安定性のために技術的に困難である。ELISPOTのような機能的アッセイはまた、ペプチド・エピトープを合成し、及びそれらをターゲット細胞表面上に提示させることに依存する。これは一般的な技術であるが、多数のMHC-I及びMHC-II対立遺伝子、並びに広範囲のエピトープ、を含むようにスケール・アップすることは複雑である。酵母ディスプレイ技術は、酵母細胞表面上でMHC-ペプチドを提示することを利用し、続いて可溶性TCRを使用して酵母を染色する。可溶性TCRを産生することは非常に不安定であり、時間がかかり、従って容易に拡張可能ではない。質量分析技術は、抗原提示細胞の質量分析に基づいて、予想される抗原性エピトープを同定する。しかしながら、質量分析は大量の組織を必要とし、これは、I型糖尿病のような多くの疾患について、入手することが困難である。更に、それはまた、MHC多量体に基づく検証も必要とする。最後に、DNAバーコーディング／NACSは、チップ又はビーズ上に固定化された、バーコード化して特殊化されたMHC多量体を使用する。効果的ではあるが、この技術は細胞を捕捉し、それらのバーコードを読み取るための特殊な装置を必要とすること、及び一度に多数のサンプルを取り扱うことができないこと、によって限界がある。
【０１８２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、T細胞の抗原反応性を探索する及び検証する為の新規な技術を対象とする。T細胞は、感染症やがんと闘う適応免疫系に不可欠な役割を果たす。T細胞はその表面のTCRを用いて、MHCタンパク質によって提示される抗原性ペプチド・エピトープを認識する。MHC表面上に提示される抗原は、病原体(例えば、インフルエンザ・ウイルス由来のペプチド)、がん性細胞(例えば、メラノーマ細胞表面上に発現するMART1/MelanAペプチド)、又は正常な細胞(例えば、正常な膵臓細胞由来のプロインスリン・ペプチド)の何れかに由来することがある。T細胞反応は、それらの正常な型では防御的であるが、調節不全になると病原性になることがある。
【０１８３】
T-細胞はウイルス感染やがんに対する免疫に必須であるが、機能不全になるとI型糖尿病のような自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。T細胞の研究における最大の課題の1つは、それらが認識する特異的タンパク質抗原を発見することである。いくつかの実施形態では、SABRを使用して、タンパク質抗原を提示し、それらを認識するT細胞に関して測定可能なアウトプットを誘導することがある。いくつかの実施形態では、SABRのこの性能によって、抗原同定の課題を解決することができ、そしてT細胞を介した療法を開発するのに恩恵がもたらされる。本明細書中のいくつかの実施形態は、例えば、がん、I型糖尿病, 多発性硬化症、HIV/AIDS、及びその他等を含む多数の疾患における抗原探索において使用するためのSABR技術を使用することに関する。例えば、図19は、本明細書中のSABR技術と組み合わせた場合に、1型糖尿病の治療において有益であり得る抗原性エピトープを示す。
【０１８４】
病原体又はがんに対する等の防御的な細胞反応を、ワクチン又は免疫療法を介した予防／治療のために、操作する。自己抗原に特異的な、機能不全となったT細胞反応は、I型糖尿病において正常な膵臓細胞にターゲティングする等、病原性であることがある。2種類のT細胞が免疫反応を仲介する：クラスI MHC(MHC-I)分子上に提示された8〜12残基の長さのペプチドを認識し、感染した又はがん性細胞を直接的に殺傷することを開始するCD8+ T細胞、及びクラスII MHC(MHCII)分子上に提示された12〜17残基の長さのペプチドを認識し、CD8+ T細胞を免疫学的に助けるCD4+ T細胞。CD8+ T細胞とCD4+ T細胞の両方が、防御性の免疫と病原性の免疫に重要な役割を果たしている。これらの細胞がターゲットとする抗原を理解することは、これらの反応を操作する為の重要なファクターである。ターゲットとなる抗原を同定し、検証する為の技術がますます必要とされている。
【０１８５】
本明細書中の様々な実施形態は、所与のT細胞がターゲットとする抗原性エピトープを同定する及び／又は検証する為の新規な技術を対象とする。いくつかの実施形態では、その技術は、SABRと呼ばれる合成タンパク質に依存している。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、SABRは、細胞外MHCドメインを介して抗原性エピトープを提示すること、及びそのエピトープを認識すると、細胞内シグナル伝達ドメインを介して測定可能な細胞シグナルを開始すること等を含む、種々の機能を実行する。いくつかの実施形態では、これらの2つの機能を組み合わせることによって、SABRは、抗原を提示し、次いで、T細胞がその抗原を認識する場合、シグナルを伝達することができる。いくつかの実施形態では、認識された細胞を標識するために、伝達されたシグナルを、レポーター遺伝子、例えばGFP、の発現等、測定可能なアウトプットに変換することがある。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載するSABRの種々の性能を、ELISPOTアッセイと同様に、所与の抗原に対する反応性をスクリーニングする、又は確認するために使用することがある。様々な実施形態による、この戦略の例示的な使用には、インフルエンザ感染において、ワクチン／疾患により誘発されるT細胞反応をモニタリングすること、及びI型糖尿病において、病原性の自己反応性T細胞をスクリーニングすること、が含まれる。或いは、いくつかの実施形態では、多数の抗原を提示するSABRのライブラリを、特異性が未知であるT細胞が認識する抗原を同定するために、構築することがある。様々な実施形態によるこの方法の例示的な使用には、腫瘍浸潤リンパ球が認識する腫瘍抗原を同定すること、及びがん患者におけるネオ抗原に特異的なT細胞反応を同定すること、が含まれる。
【０１８８】
本明細書中の様々な実施形態によれば、本SABR技術は、拡張可能性、使用の容易さ、MHC-II抗原を同定する性能、及びより容易な商業化等を含む、既存の技術を超える主要な利点を提示する。従って、いくつかの実施形態では、SABR技術を、感染性疾患、がん、及び自己免疫疾患のT細胞抗原の探索、診断、及び検証を可能にすることができる、商業的な方法又はキットに使用することができる。いくつかの実施形態では、前記SABR技術を、SABRを発現させる為のプレパッケージされたレンチウイルス・ベクター及びSABRを発現する細胞ベースのライブラリを含めて、商業化することができる。
【０１８９】
SABR技術の利点
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRライブラリ技術は、多数の利点を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRライブラリを、懸案である疾患に応じて、柔軟なスケールで、例えば、ライブラリ中に1〜106種以上の抗原で、100、200、300、400、1000、又はそれ以上の種類の抗原で、構築することがある。いくつかの実施形態では、前記ライブラリには、完全なタンパク質のエピトープを同定する為の数百の抗原、疾患に関する数千の抗原(ネオ抗原、リステリア)、又は広い識別のための数十万の抗原が含まれることがある。
【０１９０】
更に、いくつかの実施形態では、このスケール・アップ／スケール・ダウンは、特殊な装置を必要とせずに、通常の免疫学実験室で行うことができる。SABRライブラリは、任意の数のMHC対立遺伝子に対して構築することもでき、汎用的な又は患者特異的な抗原ライブラリの間を切り換えるのを容易にする。更に、いくつかの実施形態では、意図される製品及びその使用は、日常的な実験室手順のフォーマットである。従って、製品を使用する為のターンアラウンド時間は、3〜5日程度に短くすることができる。更に、酵母ディスプレイ又はDNAバーコーディングとは異なり、前記SABR技術は、一度に多数サンプルを扱うことができ、スループットを増加させる。最後に、いくつかの実施形態では、SABRライブラリは、MHC-I抗原に主に限定される現行の技術とは異なり、MHC-I及びMHC-II抗原の両方について構築することができる。いくつかの実施形態では、この汎用性により、多数の自己免疫疾患に対して、前記SABR技術を使用することが可能になる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、前記SABR技術は、他のアプローチよりも著しいコスト面の利点を有し得る。いくつかの実施形態では、前記技術を実施することは、通常の免疫学実験室が有していない特殊な装置の使用を何ら必要としない。例えば、いくつかの実施形態では、前記技術をアカデミック／産業界の研究室で実施するのに、フロー・サイトメトリーをベースとしたセル・ソーター及びイルミナ・シークエンシング装置にアクセスすることで充分である。これまでの技術は、特殊な装置、例えば質量分析計(MS)へのアクセス、又はDNAバーコーディング／NACSのための特殊なチップが必要であることから、制限を受ける。また、いくつかの実施形態では、他の技術とは異なり、前記SABR技術は、それを実施するのに重要である特殊な試薬を合成することを何ら必要としない。例えば、酵母ディスプレイ技術は、非常に不安定で、時間のかかる／お金のかかるタンパク質精製を必要とする可溶性TCRを合成することを、必要とする。いくつかの実施形態では、SABRを、一般的なBSL2実験室環境で行うことができる簡単な細胞ベースのアッセイで使用する。いくつかの実施形態では、前記SABR技術は、多数サンプルを一度に処理することができるので、より高いスループットを提供する。これまでの技術のほとんどは、一度に1人の患者サンプルのみを取り扱うことができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、前記SABR技術を、大きなスケールで工業化することがある。いくつかの実施形態では、ライブラリにおいてコードされ得る抗原の数を、疾患／ユーザ特異的である要件に従いながら、スケール・アップ／スケール・ダウンすることがある。例えば、患者特異的なスクリーニングのためのがんネオ抗原のライブラリは、6000種のペプチドをコードすることがあり、一方、多数のクラスI HLA対立遺伝子の汎用ライブラリには、〜106種のペプチドがあることがある。いくつかの実施形態では、このレベルでの拡張可能性は、大規模なオリゴヌクレオチド合成が可能かによる。いくつかの実施形態では、所与のSABRのライブラリは、例えば、約105〜106細胞であることがある。いくつかの実施形態では、この数字を、市販の細胞株と同様に、比較的容易にスケール・アップすることができる。
【０１９３】
本明細書で記載される実施形態のうちの何れかの1つ以上を、以下で記載される実施形態のうちの別の1つ以上と組み合わせることがある。以下で記載される組成物のうちの何れかの1つ以上を、以下で記載される方法及び／又はメカニズムのうちの何れかの1つに、組み合わせることがある、又は置換することがある。
【実施例】
【０１９４】
実施例１：SABR、ペプチド融合、シグナリング・ドメイン-MHC、MHC-ペプチド抗原
ターゲット抗原を認識したときのT細胞の活性化によって、検出可能な遺伝子発現が誘導される。しかしながら、MHC分子はシグナリング・ドメインを欠くため、認識されたAPCを検出することは困難である。細胞内シグナリング・ドメインをpMHC複合体に融合させることにより、シグナル伝達が可能になる。SABRと呼ぶキメラ・レセプターを構築した。SABRの細胞外ドメインは、共有結合したペプチド-β2ミクログロブリン-MHC三量体であり、CD28共刺激ドメインを有する細胞内CD3ζシグナリング・ドメインに融合している。図6Aに見られるように、MHC分子全体又はMHC分子の細胞外部分のみを、それぞれ含むSABRの2つのバリエーション（SABR-F及びSABR-E）を構築した。図6Aは、様々な実施形態によるSABR-F及びSABR-Eのコンストラクトを示す概略図を示す。SABR-F 600Aは、HLA由来の膜貫通ドメイン602Aを含み、一方、SABR-E 600BはCD3ζ由来の膜貫通ドメイン602Bを含む。2本の水平線は、細胞膜の2つの層を示す。図6Bは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkatsにおいて、8時間での%GFP+ 細胞をY軸上に示す棒グラフを示す。共培養アッセイは、50,000個のターゲット細胞及び50,000個のエフェクター細胞を用いて行った。図6Bにおいて、バーは、平均±sd、n=12を示す。
【０１９５】
TCRと相互作用すると、その同種抗原を提示するSABRは細胞内シグナルを誘導することがある。図7Aは、一本鎖三量体(SCT)及び抗原(Ag)を用いて、SABR及びTCR-pMHC特異的なシグナル伝達を実証する概略図を示す。図7Aにおいて、点線はGly-Serリンカーを示す。シグナリング・ドメインをもたないSCTは、TCRによって認識された場合でも、抗原提示細胞において細胞内シグナルを誘導しないであろう。同様に、関連性がない抗原を提示するSABRは、TCRによって認識された場合、細胞内シグナルを誘導しないであろう。しかしながら、同種抗原を提示するSABRは、TCRによって認識された場合、細胞内シグナルを誘導するのであろう。
【０１９６】
SABRによって誘導されるシグナルを検出するために、NFAT-GFP-Jurkat細胞を使用し、これは、CD3ζを介してシグナルを受け取るとGFPを発現する。NFAT-GFP-Jurkat細胞は、HLA-A*0201上にEAAGIGILTVエピトープ(MART1タンパク質由来)を提示するSABR(以下、A2-MART1-SABRとする)、又はHLA-B*2705上にHIV-1由来のKRWIILGLNKエピトープ(KK10、HIV-1 Gagタンパク質由来)を提示するSABR (以下、B27-K10-SABRとする)を形質導入した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、TCRを発現するJurkat細胞と共インキュベートしてシグナル伝達をさせ、8時間後にフロー・サイトメトリーでGFP発現を測定した。具体的には、F5(A2-MART1を認識する)、EC27(B27-KK10を認識する)、SL9(A2-SLYNTVATLを認識する)TCR又は形質導入をしていないJurkat細胞を用いた。同種のTCR-SABR-Fペアとの共培養アッセイにおいてのみ、強固なGFP発現が検出された。図7Cは、TCRを形質導入したJurkat細胞との共培養における、SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFPの発現を示す。図7B内では、Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後での%GFP+ 細胞を示す。図7C内では、バーは、平均±sd、n=3を示す。図7Bは、図7Cのアッセイから得られた代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。図7B内では、GFP+ 細胞の頻度をパーセンテージで示す。
【０１９７】
SABR-Fコンストラクトは、SABR-Eコンストラクトよりも高いシグナルを示した。そこで、SABR-Fコンストラクトを更なる実験に使用した。SABRがポリクローナル集団において、T細胞特異性を検出できるかどうかを試験するために、F5 TCRを発現するJurkat細胞の数を、形質導入していないJurkat細胞でタイトレーションし、それらをA2-MART1-SABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートした。SABRシグナルは、タイトレーション可能であり、モックで形質導入した10,000個のJurkat細胞と混合して少なくとも10個程度のF5+ Jurkat細胞を検出するのに十分な感度であった。
【０１９８】
図7Dは、SABRにより僅かな細胞数を検出することを示すグラフである。図7D内で、前記Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後でのGFP+ 細胞の数を示す。X軸は形質転換していないJurkat細胞と混ぜたF5+ Jurkat細胞の個数を示す。図7Dにおいて、バーはn=1の値を示す。図7Eは、F5を形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞が、GFPを発現する時間経過を示す。Y軸は、50,000個のエフェクター細胞及び50,000個のターゲット細胞で実施した共培養アッセイにおける%GFP+ 細胞を示す。図7Eにおいて、点は平均±sd、n=3を示す。
【０１９９】
図7E及び図7Fに示すように、GFPシグナルは共インキュベーションの3時間以内に検出可能になり、6〜8時間以内に飽和に達したので、SABRシグナルは急速でもあった。図7Fは、図7Eに示した試験からの典型的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。図7Fにおいて、右下隅の長方形は、GFP+ 細胞を計数する為のゲートを示す。それぞれのサンプルを収集した時刻を時間として示す。GFP+ゲート内における細胞の頻度をパーセンテージとして示す。
【０２００】
総合すると、これらの結果は、特異的なTCR-pMHC相互作用があったとき、SABRがシグナリングを誘導し、認識されたAPCを同定することを可能にすることを示している。
【０２０１】
実施例２：SABRは、異なるモードの抗原提示を可能にする
上記の内生的なMHC複合体は、交差提示を介して、新たに翻訳されたタンパク質又はエンドサイトーシスされたタンパク質に由来するエピトープを提示する。SABRも、これらの経路を抗原提示に利用できるかどうかを検証するために、β2-ミクログロブリンをA2又はB27と連結したが、エピトープを遺伝子的にコードしていない「空」型のSABRを構築した。図8Aは、エピトープ(EP)、シグナル配列(S)、及びMHCクラスI輸送シグナル(MIHC)を有する、様々な実施形態による、SCT、SABR、空のSABR、及びタンデム・ミニ遺伝子(TMG)を示す概略図を示す。図8Aにおいて、数字1〜6はGly-Serリンカーを示す。図8Bは、様々な実施形態による、BsmBI部位を含むスタッファー・フラグメント（stuffer fragment）を有するSABRベクターのコンストラクト、及びオーバーラップを隣接させたエピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを使用するクローニング方法を示す。図8Cは、様々な実施形態による、空のSABRコンストラクトを示す。図8Dは、本明細書の様々な実施形態による、空のSABR(即ち、コードされたペプチドがない)及び内生的に発現したペプチドを示す。
【０２０２】
SABR-APCを可溶性ペプチドと一緒にインキュベートして、これらのペプチドの提示及び認識について試験をした。図8Eは、外因性ペプチドでパルスした、空のSABRの概略図を示す。空のSABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を可溶性のMART1又はKK10ペプチドとインキュベートし、F5又はEC27 TCRを発現するJurkat細胞と共培養した。
【０２０３】
図8Fは、空のSABRを形質導入した、可溶性MART1又はKK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現を示すグラフを示す。Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞で行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後における、%GFP+ 細胞を示す。バーは、平均±sd、n=3を示す。A2及びB27両方の空のSABRは、前記TCRに対応する可溶性ペプチドが存在するときにのみシグナルを誘導し、ミスマッチ・ペプチドが存在するとき又は可溶性ペプチドが存在しないときには誘導しなかった。更に、正しいペプチド-TCRの組み合わせによって誘導されたシグナルは、対応する共有結合したエピトープを提示するSABRによって誘導されたシグナルと同等であった。
【０２０４】
内生的にプロセシングされたペプチド・エピトープを試験して、それらが「空の」SABR上に提示され得るかどうかを測定した。そのために、五量体TMGを、4種の関連性の無いCMV由来エピトープと共にKK10エピトープを発現するように構築した。図8Gは、TMGの新たに翻訳されたエピトープを提示する空のSABRの概略図を示す。
【０２０５】
NFAT-GFP-Jurkat細胞に、空のB27-SABR及びKK10 TMGを一緒に形質導入した。EC27又はF5発現Jurkat細胞との共インキュベーション後、前記「空の」SABRは、図8Hに例示されるように、内生的に発現するエピトープを提示し、特異的なシグナリングを誘導することが可能であった。図8Hは、空のB27-SABR KK10-TMGを一緒に形質導入した、又は空のB27-SABRを形質導入して、KK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現のグラフを示す。Y軸は、50,000個のエフェクター細胞及び50,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後における、%GFP+ 細胞を示す。図8Hにおいて、バーは、平均±sd、n=3を示す。しかしながら、全体のシグナルは、対応する空のSABRを可溶性ペプチドでパルスしたものよりも低かった。これらの結果は、SABRが、内生的な抗原のプロセシング及び提示経路を介して生成されたエピトープを非共有結合的に提示することができることを示す。
【０２０６】
SABRは、内生的な抗原のプロセシング及び提示経路を介して生成されたエピトープを非共有結合的に提示することができる。図8Iは、本明細書の様々な実施形態による、CD3zシグナル伝達ドメインを有するSCDRのコンストラクトを示す。TCRを形質導入したJurkat細胞を、SCTRコンストラクトとインキュベートし、ペプチド抗原でパルスした。図8Jは、種々のTCR-ペプチドに変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。図8Kは、種々のTCR-ペプチド組成物及び濃度に変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。本結果は、T細胞シグナリングと同様に、SABRシグナリングが、提示されたペプチド量でタイトレーション可能であることを示す。
【０２０７】
図8Lは、本明細書の様々な実施形態による、タンデム・ミニ遺伝子(TMG)抗原を有するSCDRコンストラクトを示す概略図を示す。TCRを形質導入したJurkat細胞を、TMGを形質導入したSCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞とインキュベートした。図8Mは、種々のTCR-ペプチドに変えた時の%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。本結果は、SABRが抗原と直接的に連結していない場合、内生的なペプチド(細胞中のタンパク質に由来するフラグメント化したタンパク質配列)を提示することを示す。
【０２０８】
実施例３：SABRは、真正のTCRシグナルを開始する
SABRを治療ターゲットとして用いるために、患者の病原性T細胞に結合するSABRを同定することがある。前記SABRを、レンチウイルス・ベクター又はレトロウイルス・ベクターのような免疫療法のための適切なベクター中にクローン化することができる。患者自身の血液を白血球アフェレーシスに供し、続いてT細胞を分離することができる。前記T細胞は、OKT3抗体を使用するなど、市販の方法を使用して、活性化及び増殖させることができる。増やしたT細胞に、SABRを含むベクターで形質導入することができる。形質導入した細胞を、治療薬として患者体内に再注入することができる。適当なSABRを発現する増殖させたT細胞は、患者の病原性T細胞をターゲットとし、前記病原性T細胞を排除し、疾病の改善につなげるだろう。
【０２０９】
これを、1型糖尿病（病原性T細胞が、HLA-A2.1上のインスリン由来エピトープ(A2.1-インスリン)をターゲットとすることがある）に対して行うことができる。この場合では、インスリン・エピトープを提示するHLA-A2.1を含むSABR、及びシグナリング・ドメインをレンチウイルス・ベクターにクローニングすることができる。患者自身のT細胞を増殖させ、A2.1-インスリン-SABR発現ベクターで形質導入することがある。前記細胞を前記患者に再注入することがあり、前記細胞は、A2.1-インスリンをターゲットとする病原性T細胞を排除することができる。
【０２１０】
SABRは、キメラ抗原レセプター(CAR)及びTCRと同様に、細胞内シグナリングにCD3ζ-CD28ドメインを用いる。そこで、SABRの細胞内シグナリング能はTCRと同等であることを試験した。NFAT-GFP-Jurkat細胞において、SABRが初期活性化マーカーを誘導する性能を試験した。A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞は、F5 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養をしたときに、初期のT細胞活性化マーカーであるCD69を発現した。図9Aに示されるように、A2-MART1一本鎖三量体ではなく、A2-MART1-SABRを発現する細胞において、レポーター駆動性GFP及び内生的なCD69が共発現することは、SABRシグナリングが内生的な遺伝子発現を活性化することを意味する。図9Aは、SABRによるCD69の誘導に関する実験の、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。SABRを形質導入した10,000個のNFAT-GFP-Jurkat細胞及びF5 TCRを形質導入した10,000個のJurkat細胞を用いた共培養アッセイにおいて、GFP及びCD69が発現することが示される。各ゲートにおける細胞の頻度を、パーセンテージで示す。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、SABRが真正のTCRシグナルを誘導する場合、それらは初代T細胞にとって細胞毒性となることがある。活性化した初代T細胞をA2-MART1-SABRで形質導入し、F5 TCRを発現するCFSEで標識したターゲット細胞とインキュベートした。図9B及び図9Cに示すように、形質導入した初代T細胞は、F5 TCRを特異的に発現するJurkat細胞又は初代T細胞を溶解した。図9Bは、SABRを発現する初代T細胞によってJurkat細胞に誘導された細胞毒性に関するグラフを示す。Y軸は、共培養後24時間でのCFSE標識ターゲット細胞の生存%を示す。細胞毒性アッセイは、200,000個のSABR形質導入細胞及び50,000個のTCRを形質導入した細胞を用いて実施した。図9Bでは、バーが平均±sd、n=8を示す。図9Cは、SABRを発現する初代T細胞によって自己ターゲット細胞に誘導された細胞毒性に関する棒グラフを示す。Y軸は、共培養後24時間でのターゲット細胞の生存%を示す。細胞毒性アッセイは、SABRを形質導入した200,000個の細胞及びTCRを形質導入した50,000個の細胞を用いて実施した。図9Cにおいて、バーは、平均±sd、n=8を示す。
【０２１２】
SABRとTCRの抗原感度を比較した。その目的のために、NFAT-GFP-Jurkat細胞を空のA2-SABR又はF5 TCRの何れかで形質導入し、エフェクターとして使用した。ターゲットとして、図9Dに示すように、A2-SABR又はF5 TCRで形質導入したJurkat細胞を使用した。図9Dは、A2-SABR 902及びF5-TCR 904の抗原感受性を測定する為のアッセイの概略図を示す。
【０２１３】
ある範囲の濃度のMART1ペプチドの存在下で、エフェクターをそれらの同種ターゲットと共培養し、GFP発現を測定した。抗原感度は、最大シグナリングの半分のシグナリングに必要なペプチドの濃度として決定した。図9Eに示すように、SABRの抗原感度はTCRと比較して30倍低かった。図9Eは、SABRの抗原感受性及びTCRシグナリングに関するプロットを示す。図9Eは、SABR及びTCRシグナリングの抗原感度のプロットを示す。Y軸は、MART1ペプチドでパルスしたSABRを又はTCRを形質導入した50,000個の細胞を用いた共培養アッセイにおける、8時間での%GFP+ 細胞の%最大を示す。X軸は、前記細胞をパルスするために使用したMART1ペプチドの濃度を示す。図9E内で、点は、平均±sd、n=3を示す。水平の点線は、最大シグナルの半分のシグナルを示している。
【０２１４】
まとめると、これらの結果は、SABRは、TCRに類似したシグナルを、いくつかの例では、抗原感度がより低いが、伝達することを示している。
【０２１５】
上記の実施例３はまた、治療薬としてのSABRの例である。例えば、前記F5 TCRを、1型糖尿病抗原を認識するTCRのような病原性TCRで置換することができる場合である。その治療用シナリオでは、有効性を示すために、同様の実験を行うことがあり、前記SABRは、病原性TCRによって認識される抗原を提示している。前記SABRを発現する初代T細胞を使用して、病原性TCRに細胞毒性を誘導することができ、その後、治療上有益なことに、それらは排除される。
【０２１６】
実施例４：SABRライブラリを使用した抗原探索
いくつかの実施形態では、ペプチド・エピトープをMHCと遺伝子的に連結することにより、SABRを用いて、規定の抗原を提示し、それをTCRがうまく認識できるようにすることができる。そこで、TCR-pMHC相互作用をスクリーニングするために使用する多数のエピトープを提示するSABRライブラリ能を試験した。抗原未知の「オーファン」抗腫瘍TCRのT細胞抗原を探索するためのSABRライブラリを構築し、使用する戦略を作製した。まず最初に、ターゲット・エピトープのリストを、既存のデータベースから、又は腫瘍エキソーム・データから作製し、続いてMHC結合の予想を行った。ターゲット・エピトープをコードするプールしたオリゴヌクレオチド・ライブラリを合成し、図10Aに従ってSABRプラスミドにクローニングした。図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。左パネル1002は、エピトープのリストを取得して合成する手順を示している。右パネル1004は、SABRライブラリの概略図を示している。
【０２１７】
SABRライブラリをレンチウイルス・ベクターにパッケージングし、NFAT-GFP-Jurkat細胞に形質導入をするために使用した。SABRライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を、「オーファン」TCRを発現するJurkat細胞と共培養した。GFP+CD69+ NFAT-GFP-Jurkat細胞を、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting:FACS)を用いて選別し、続いてゲノムDNAを抽出した。図10Bに示すように、SABRのエピトープ部分を増幅し、ハイ・スループットなシークエンシングに供した。図10Bは、様々な実施形態による、オーファンTCRによって認識される細胞をSABRライブラリから選択する為の共培養実験を示す概略図である。左パネル1006は、多数の固有のエピトープを提示するSABRライブラリを示す。中央のパネル1008は、オーファンTCRの同種エピトープを提示するSABRによって誘導されるレポーターの発現を示す細胞APCを示す。右パネル1010は、選択された細胞を処理するステップを示す。
【０２１８】
このシークエンシング・リードを、Burrows-Wheelerアラインメントを使用して、SABRベクターの骨格と一緒にアライメントを行った。アライメントを行ったリードを翻訳して、そのエピトープを明らかにした。各エピトープに対応するリードの数をカウントし、リストに記録した。共インキュベーション・アッセイを最低3回反復した。各反復について、リードの数の降順に基づいて、各エピトープに数値による順位を付与した。各アッセイについての3つの反復からのランクを平均し、図10Cのフローチャートに従って「平均ランク」として記録した。図10Cは、様々な実施形態による、計算解析のパイプラインを示すフローチャートを示す。
【０２１９】
上位にランクしたエピトープは、そのTCRについての推定される抗原であり、その後、各エピトープを提示する個々のSABRを構築し、及び共培養アッセイにおいてGFP発現を測定することによって、検証する。
【０２２０】
図10A−10Cに詳述した方法のプルーフ・オブ・コンセプト（proof-of-concept）を実証するために、バイアスのない方法で公知のTCRの同種抗原を同定することで、SABRライブラリの性能を試験した。免疫エピトープ・データベース(Immune Epitope Database  (IEDB))の全ての既知のHLA-A*0201制限エピトープからなり、HLA-A*0201(A2-SABR-ライブラリ)上に提示される12,055種のエピトープをコードするSABRライブラリを構築した。既知の特異性を有する2つのTCR(EAAGIGILTVを認識するF5及びSLYNTVATLを認識するSL9)の同種抗原を同定することで、A2-SABR-ライブラリの性能を試験した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、A2-SABR-ライブラリで形質導入し、F5又はSL9 TCRを発現するJurkat細胞と一緒にインキュベートした。10時間の共培養後、GFP+CD69+ 細胞をFACSによって選別し、ゲノムDNAを抽出し、そのエピトープをシークエンシングし、記載したように各エピトープについての平均ランクを図10A〜10Cにおいて計算した。図11Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。A2-SABRライブラリ細胞を、レポーター遺伝子発現に基づいて選別した。900万個のライブラリ細胞を、TCRを形質導入した900万個のJurkat細胞と一緒に用いる共培養アッセイを設定した。共培養の10時間後に、前記細胞をCD69について染色し、FACSを用いて選別した。各フロー・プロットの右上隅の長方形1102は、選別に使用したゲートを示す。選別ゲート中の細胞の頻度をパーセンテージとして示す。
【０２２１】
SL9選別から得られた各エピトープの平均ランクをF5選別から得られた平均ランクに対してプロットした。図11Bは、F5及びSL9選別の平均ランクのプロットを示す。図11Bにおいて、各点は、図10A〜10Cに記載した方法を用いて計算した、固有のエピトープについての平均ランクを表す。Y軸はSL9選別の平均ランクを示し、X軸はF5選別の平均ランクを示す。点1104はEAAGIGILTVの類似体を示し、点1106はSLYNTVATLの類似体を示す。
【０２２２】
6種のエピトープは、F5選別におけるそれらの順位によって、別個のクラスターを形成した。SL9選別では、トップランクは異常値であったが、別個のクラスターを形成しなかった。図11Cは、F5選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクが付いたエピトープは、EAAGIGILTVの類似体を示す。図11Cに示すように、F5選別の上位6個のエピトープはEAAGIGILTVの類似体であり、これは、その抗原の同定に成功したことを示していた。
【０２２３】
図11Dは、SL9選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクが付いたエピトープは、SLYNTVATLの類似体を示す。図11Dに示すように、SL9選別の上位10個のエピトープのうち6個は、SLYNTAVATLの類似体であった。図11Eは、A2-SABRライブラリにおける全てのEAAGIGILTVの類似体についての平均ランクのプロットを示す。図11Fは、A2-SABRライブラリにおける全てのSLYNTVATLの類似体についての平均ランクのプロットを示す。図11E及び11Fに示されるように、エピトープは、それらの対応するTCRについて濃縮されたが、ミスマッチのTCRにおいては濃縮されなかった。
【０２２４】
SL9選別で観察されたノイズは、おそらく、SLYNTVATLペプチドの類似体の数が多いことによるものであった。前記A2-SABRライブラリは、EAAGIGILTVの22種の類似体及びSLYNTVATLの60種の類似体を含む。認識される類似体の数が多ければ多いほど、エピトープ間の競合のために、各エピトープについての平均ランクは低くなる。
【０２２５】
前記選別におけるEAAGIGILTV及びSLYNTVATLの全ての類似体のランクを比較した。図11Eに示すように、22種のEAAGIGILTVの類似体のうちの6種はF5選別で同定され、一方、図11Fに示すように、60種のSLYNTVATLの類似体のうちの9種はSL9選別で同定された。全ての類似体が同定されていないのは、おそらく、それらに対するF5又はSL9 TCRの交差反応性が減少していることに起因する。実際、類似体SLYNTIATL (V6I) 及び SLFNTVATL (Y3F)は、SLYNTVATLエピトープにおいて確認されているエスケープ突然変異である。ともあれ、これらの実験により、SABRライブラリ・アプローチが、何千ものエピトープをスクリーニングすることによって、TCRの同種抗原を同定し得ることが示された。
【０２２６】
実施例５：SABRを使用した個別化されたネオ抗原探索
SABRを、腫瘍の免疫療法のための候補T細胞レセプター(TCR)を同定するために実施することがある。腫瘍の生検に由来するゲノムDNA又はRNAをまずシークエンシングし、その患者由来の非腫瘍組織と比較する。「ネオ抗原」と称される、前記腫瘍に特異的な突然変異は免疫療法の理想的なターゲットであり、患者の体内の他の部位に免疫反応を誘導しないことが期待される。これらの突然変異のリストを作製し、患者のタンパク質のアミノ酸配列を変化させない突然変異を除外する。このリストを、これらの突然変異を含む短いペプチド(クラスI MHCについては8〜12アミノ酸、クラスII MHCについては12〜17アミノ酸)のリストを作製するために使用する。次いで、前記ペプチド・リストを、短いオリゴヌクレオチド配列（これは、それらのペプチドを遺伝子的にコードしていて、SABRベクターへのクローニングに必要なヌクレオチド配列を隣接して含む）に変換する。これらのオリゴヌクレオチドを、適切な分子技術を用いて、合成し、次いでベクターにクローニングする。次いで、そのベクターを、適切な技術を使用して、細胞に入れる。本発明者らの場合、前記ベクターをクローニングするために、Gibsonアセンブリを単純化するIn-Fusionキットを使用した。得られたプラスミドからレンチウイルスを作製し、NFAT-GFP-Jurkat細胞に感染させた。この一群の細胞は、それぞれが固有のSABRを発現し、本発明者らがSABRライブラリと呼ぶものである。総じて、それぞれの細胞は、腫瘍の変異をもつ固有の短いペプチドに連結したMHC分子を含み、それらのMHC分子はシグナリング・ドメインに直接的に繋がっており、SABRを作り出す。十分な量の細胞をレンチウイルスに感染させ、前記一群の細胞が短いペプチドのリストにある全ての突然変異を網羅するようにした。
【０２２７】
患者特異的な治療法を見つけるためのライブラリを用いるためには、TCRα及びβのフラグメントのRNAについて、同じ腫瘍生検のシークエンシングを行うのが良いであろう。これらのフラグメントは、腫瘍の抑制を試みて腫瘍に浸潤していたT細胞（腫瘍浸潤リンパ球(TIL)として知られる）に由来する。これらの細胞に由来する個々のTCRは、そのシークエンシングから再構築されるであろう（適当な任意の技術を使って、TCR配列を含むDNAフラグメントを合成し、ベクター中にクローニングする）。そのプラスミドのレンチウイルスを作製し、そのウイルスにJurkat細胞(NFAT-GFPレポーターを持たない)を感染させる。次いで、候補TCR細胞を、約8時間、SABRライブラリと一緒にインキュベートし、次いで、陽性シグナルを示す細胞についてFACS選別で選別する。本発明者らの場合では、前記レポーターはGFP及びCD69細胞マーカーの発現であった。選別された細胞からゲノムDNAを抽出し、シークエンシングをし、解析して、どの特異抗原が前記候補TCRによって認識されるかを決定する。本発明者らの場合では、前記ゲノムDNAをNucleoSpinカラムの抽出キットで抽出し、遺伝子的にコードされた抗原配列に隣接するプライマーでPCR増幅し、イルミナ・シークエンシングに特異的なプライマーで再増幅し、シークエンシングをした。得られたシークエンシング・データを短いペプチド配列のデーターベースと比較し、前記TCRがこれらのペプチドを認識する場合、抽出したゲノムDNAのプール中に濃縮された遺伝子配列が見られると予想される。
【０２２８】
もし、前記TCRが突然変異の配列を認識するが、非突然変異の配列を認識しない場合、それは免疫療法のよい候補となるであろう。これは、前記患者から免疫細胞を摘出すること、これらの細胞に所望のTCRを発現させるために所望される任意の技術を使用すること、及びこれらの養子細胞を前記患者に注入して、それらが腫瘍を攻撃し始めることができるようにすること、を含む。
【０２２９】
SABRライブラリの汎用性を更に実証するために、ネオ抗原探索のための個別化された手法を試験した。最近の研究により、DNAバーコーディング四量体を用いて、メラノーマ患者からネオ抗原特異的な腫瘍反応性TCRが同定された。同定されたTCR(neoTCR)は、USP7タンパク質中の非同義変異によって生成されたネオ抗原性エピトープを認識することが示された。前記SABRライブラリ法を用いて、前記腫瘍サンプルで同定された全ての考えられるネオエピトープをスクリーニングすることにより、neoTCRにより認識されるneo抗原性エピトープを同定した。その目的のためには、前記腫瘍で見出された108種の非同義変異に対応する、3291種の予想されるHLAA*0201制限エピトープを提示するSABRライブラリ(NeoAg-SABRライブラリ)を作製した。前記neoTCRを腫瘍反応性オーファンTCRの代用として用い、NeoAg-SABRライブラリを用いてその抗原を同定した。neoTCRを形質導入したJurkat細胞を、NeoAg-SABRライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共培養し、GFP+CD69+細胞を選別し、選別した細胞に由来するエピトープをシークエンシングし、ランク付けした。図12Aは、1回の反復から得られた代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。レポーター遺伝子発現に基づいて、NeoAg-SABRライブラリ細胞を選別した。TCRを形質導入した600万個のJurkat細胞と一緒に600万個のライブラリ細胞を用いた共培養アッセイを設定した。共培養の10時間後に、細胞をCD69について染色し、FACSを用いて選別した。各フロー・プロットの右上隅の長方形1202は、前記選別をするのに使用したゲートを示す。前記選別ゲート中の細胞の頻度を、パーセンテージとして示す。
【０２３０】
それぞれのエピトープについて、モック選別に対するneoTCR選別の平均ランクをプロットした。図12Bは、neoTCR及びモック選別の平均ランクのプロットを示す。図12B内では、各点は、図10A〜10Cに記載された手順を用いて計算した固有のエピトープの平均ランクを表す。Y軸はneoTCR選別における平均ランクを示し、X軸はモック選別における平均ランクを示す。点1204は、USP7に由来するエピトープを示す。7種のエピトープは、neoTCR分類におけるそれらの順位によって分離された別個のクラスターを形成した。
【０２３１】
図12Cは、neoTCR選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクを付けたエピトープは、USP7に由来するエピトープを示す。前記neoTCR選別における上位7ヒットはUSP7に由来するエピトープであり、本発明者らのアプローチを用いてネオ抗原をきちんと同定できることが実証された。
【０２３２】
図12Dは、NeoAg-SABRライブラリにおける全てのUSP7に由来するエピトープの平均ランクのプロットを示す。USP7における非同義的なD798Y変異は、30種のオーバーラップしたエピトープを生成すると予測され、そのうち7種がneoTCRの同種エピトープとして同定された。残りの23種のエピトープがそのスクリーニングにおいて認識されなかった理由は、おそらく、neoTCRによって認識されるエピトープの幅（register）が限られているためである。7種の検出されたエピトープを検証するために、それらを提示する為の個々のSABRを構築した。図12Eに示されるように、これらのSABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞は、neoTCRを発現するJurkat細胞と共培養したときに、GFP発現を誘導した。図12Eは、NeoAg-SABRスクリーニングで同定された上位ヒットの妥当性評価を示すプロットを示す。Y軸は、neoTCRを形質導入したJurkat細胞と共培養したNFAT-GFP-Jurkat細胞において、8時間でのGFP発現を示す。neoTCRを形質導入した10,000個のJurkat細胞を、エピトープを提示するSABRを発現している10,000個のNFAT-GFP-Jurkat細胞と一緒に用いて共培養アッセイを設定し、X軸に示した。モックには、形質導入していないNFAT-GFP-Jurkat細胞が含まれていた。図12E内で、バーは平均±sd、n=4を表す。
【０２３３】
これらの結果は、本明細書に提示される抗原探索のアプローチに関して、妥当であること並びに個別化がうまくいくことを実証する。まとめると、本結果は、前記SABRがT細胞の抗原探索のための強力なツールであることを示している。
【０２３４】
実施例６：材料及び方法
実施例１〜５で使用した具体的な試薬を表6.1に詳述する。クローニング及びシークエンシングに使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを表6.2に列挙する。A2-SABRライブラリのエピトープのリストを表6.3に示した
【０２３５】
【表４−１】
2020534809.tif 000007
【表４−２】
2020534809.tif 000008
【表４−３】
2020534809.tif 000009
【０２３６】
【表５−１】
2020534809.tif 000010
【０２３７】
表6.2の中で、NNN…NNNは逆翻訳したエピトープを示し、［index］は、シークエンシングに使用される6ヌクレオチドの固有のインデックスを示す。
【０２３８】
実施例１〜５について、Jurkat細胞(ATCC)を、10%ウシ胎仔血清(Corning)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Corning)を添加したR10(RPMI1640(Corning))中で培養した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、2 mg/mlのG-418(Corning)を添加したR10中で培養した。初代T細胞を、Immunocult CD3/28(StemCell Technologies)及び40 U/ml IL-2(Miltenyi Biotec)を添加したR10中で活性化させた。D10(10%ウシ胎仔血清(Corning)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Corning)を添加したDMEM(Corning))中で、HEK-293T細胞(ATCC)を培養した。ペプチドEAAGIGILTV及びKRWIILGLNKを、Pierce Thermo Fisherで合成した。
【０２３９】
実施例１〜５のSABRを構築するために、β2-ミクログロブリン及びHLAをコードする単一分子をgBlocksとして合成し(IDT)、プライマーSS-Fwd及びCD28-Overlap-HLA-Revを用いて増幅した。CD3ζ/CD28シグナリング・ドメインを、プライマーCD28Intracell-Fwd及びXhoI-CD3z-Revを用いてJ3 CARからクローニングした。SABRの2つの部分を、PCR又はInFusion HDクローニング・キット(Takara)によって組み立てた。BsmBI部位に隣接する非特異的スタッファーDNAである合成2kbフラグメント(IDT)をエピトープの代わりにクローニングした。所与のエピトープをSABRベクターにクローニングするために、前記ベクターを最初にBsmBI(NEB)で切断することによって線状化し、Nucleospin Gel and PCRキット(Takara)を用いてゲルから精製した。ベクターとのオーバーラップ及び前記エピトープを含む一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した(IDT)。前記オリゴヌクレオチドを、KODポリメラーゼ(Millipore)及びOligo-Insert-Fwd及びOligo-Insert-Revを用いて増幅した。増幅したオリゴヌクレオチドを、InFusion HDクローニング・キット(Takara)を使用して、線状化SABRベクターにクローニングした。全てのクローニング反応物で、Stellarコンピテント細胞を形質転換し、100μg/mlカルベニシリン(Life Technologies)を含むLB+寒天プレート上で増殖させ、及び個々のコロニーを液体培養物中に接種した。プラスミド・ミニプレップを、Zyppy ミニプレップ・キット(Zymo)を用いて行った。プラスミドは、サンガー・シークエンシング(Laragen)によって確認した。
【０２４０】
実施例１〜５のTCRクローニングのために、F5、SL9、及びneoTCRの配列を、gBlocksとして合成し(IDT)、前述のように、切断を受けた短い型のLNGFR遺伝子とともにpCCLc-MND-X骨格中にクローニングした。EC27 TCRを既報のようにクローニングした。
【０２４１】
実施例１〜５においてSABRベクター中にクローニングするエピトープのリストを作製するために、2つのアプローチをとった。汎用A2-SABRライブラリでは、免疫エピトープ・データベース(Immune Epitope Database  (IEDB))の全てのHLA-A*0201制限エピトープをダウンロードした。ネオ抗原SABRライブラリでは、腫瘍ミュータノーム（mutanome）のデータから作製したHLA-A*0201制限ネオエピトープを用いた。GenScript Codon Usage Frequency Table Tool (GenScript)に基づいて、それぞれのアミノ酸について最も高い頻度のコドンを用いて、タンパク質配列をヌクレオチド配列に逆翻訳した。エピトープをコードし、SABRベクターとのオーバーラップを含むオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリ(Twist Biosciences)にプールした。オリゴヌクレオチド・ライブラリを増幅し、前述のようにSABRベクター中にクローニングした。充分な網羅性を確保するために、クローニング反応物で形質転換したバクテリア細胞を、500mlの液体培養液に直接播種し、一晩培養した。前記ライブラリを含むプラスミドDNAは、Nucleobond Xtra Maxi Plus EFを用いて調製した。
【０２４２】
SABR又はTCRを発現するレンチウイルス・ベクターを、以前に記載された手順を用いてパッケージングした。簡単に説明すると、500万個のHEK-293T細胞をポリ-L-リジン被覆プレート上に播いて24時間培養し、続いて、TransIT-293(Mirus Bio)及びOPTI-MEM(Life Technologies)を用いて、レンチウイルス・シャトル・プラスミド、pMDG-VSVG及びpCMV-RD8.9の混合物をトランスフェクションした。ウイルスを0.45μmのシリンジ・フィルター(Millipore)を通して濾過し、次に使用するまで-80℃で保存した。Jurkat、NFAT-GFP-Jurkat、又は初代T細胞に形質導入するために、2-5×105細胞を培養培地中にプレーティングし、12ウェルプレート中で等量の解凍したウイルスと3日間混合した。NFAT-GFP-Jurkat細胞については、48時間後にG-418を形質導入混合液に添加した。
【０２４３】
実施例１〜５におけるSABRシグナリングを試験する為の共培養アッセイのために、1〜5×104個の形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞を、同数の形質導入したJurkat細胞と一緒に、96ウェル平坦又は丸底プレート上で8〜10時間インキュベートした。次いで、前記細胞をMACSQuant(Miltenyi)で取得するか、又は抗CD69-APC-Cy7(Biolegend Clone #)で染色し、次いでMACSQuant(Miltenyi)で取得した。前記SABRライブラリ・アッセイのために、1.5×106個のSABRライブラリ細胞を、6ウェルプレートの各ウェル中で1.5×106個のJurkat細胞と共にインキュベートした。共培養の8〜10時間後に、細胞を回収し、抗CD69-APC-Cy7(Biolegend)で染色し、BD FACS SORP(Becton-Dickinson)で選別した。細胞毒性アッセイは、先に記載したようにCFSE(Biolegend)で標識したターゲット細胞を用いて行った。空のSABRアッセイのために、形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞を、100 mg/mlの可溶性ペプチドと共に37℃で2時間インキュベートした。次いで、同数の形質導入したJurkat細胞を前記細胞に添加し、続いて8〜10時間共培養した。これらのアッセイのためのゲーティング戦略を図13A〜13Cに示す。図13Aは、GFP発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。図13Bは、GFP及びCD69の発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。図13Cは、細胞毒性アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。
【０２４４】
実施例１〜５のハイ・スループット・シークエンシング及び解析のために、PureLinkゲノムDNA抽出キット(Life Technologies)を使用して、選別の直後に選別した細胞からゲノムDNAを抽出した。前記SABRベクターは、KODポリメラーゼ(Millipore)並びにTruSeq-Univ-SCTfixed-F、TruSeq-Read2-SCTfixed-R、及びTruseq-Adapter-Indexのプライマーの10:1:10の混合物を用いて増幅した。それぞれのサンプルについて、1〜30ngのゲノムDNAを用いた5〜10の反応を30〜35サイクル行った。前記反応物をプールし、Nucleospin Gel and PCR purification kit (Takara)を用いて精製した。精製したPCR産物をバイオアナライザー(Agilent)で分析し、HiSeq 2500(Illumina)でシークエンシングした。シークエンサーによって生成された、アラインメントされていないリードは、FASTQファイルに保存した。前記リードを、まず最初に、Burrows-Wheeler Alignmentを使用して、122のミスマッチ・ペナルティで、SABRベクターとのアライメントを行った。アライメントを行った各リードについて、前記エピトープを翻訳し、数を数えた。全てのエピトープをリードの数に従ってランク付けし、それぞれのリードについて平均ランクを計算した。次いで、前記平均ランクを使用して更に解析をした。
【０２４５】
フロー・サイトメトリー・プロットをFlowJo  (Treestar)で分析した。統計解析及びグラフィックな表現を、Microsoft Excel(Microsoft)及びGraphPad Prism(Graphpad)によって行った。
【０２４６】
SABRライブラリ中のエピトープのリストを表6.3に示す。
【０２４７】
［表６］
表６.３
【０２４８】
いくつかの実施形態では、表6.3のエピトープのうちの任意を、本明細書中で提供されるSABR構成のエピトープとして、使用することがある。いくつかの実施形態では、表6.4のエピトープのうちの任意を、本明細書中で提供されるSABR構成のエピトープとして使用することがある。
【０２４９】
【表７−１】
2020534809.tif 000011
【表７−２】
2020534809.tif 000012
【０２５０】
実施例７：I型糖尿病における膵島自己免疫を検出するための抗原提示細胞
I型糖尿病(T1D)は、インスリン産生膵β細胞島が進行性に破壊されることによって引き起こされる自己免疫疾患である。T1Dの病態におけるT細胞の役割は、免疫学的な研究及び遺伝学的なリスク・ファクターの発見によって十分に確立されている。しかしながら、これらの遺伝学的なリスク・ファクターの免疫症状を結びつけるツールに対しては、アンメット・ニーズ（unmet need）が存在する。
【０２５１】
T1Dにおける膵臓β細胞のような免疫反応性細胞は、その細胞表面で、ヒト白血球抗原分子(pHLA複合体)上の抗原性エピトープを提示する。T細胞はpHLAを特異的に認識するために固有のTCRを用いている。T1Dでは、CD4+とCD8+ T細胞の両方が、膵β細胞表面上の自己抗原を認識し、応答する。CD8+ T細胞はクラスI pHLAを認識し、細胞傷害応答を誘導する。一方で、CD4+ T細胞はクラスII pHLAを認識し、免疫機能を調節するヘルパー応答を誘導する。T細胞を研究する際のボトルネックは、T細胞がターゲットとする抗原を同定することにある。抗原特異的なT細胞を検出する為の2つの主要なツールは、pHLA多量体及び機能的アッセイである。pHLA多量体は、ペプチドと複合体化し、フルオロフォアと結合した精製されたHLA分子であり、フロー・サイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を同定するために使用される。pHLA多量体は、よく使用されるにもかかわらず、それらにはいくつかの限界がある：即ち、クラスIIpHLA多量体は本質的に不安定であり、特に、T1Dのリスクの増加と関連する対立遺伝子(HLA-DQ2及び-DQ8)のpHLA多量体は不安定である。それ故、扱うのが難しく且つ不安定であり、それらは生理学的な免疫シナプスを反映しておらず、自己免疫と本質的に関連する低親和性のT細胞を検出することができない。ELISA及びELISPOTのような機能的アッセイでは、所望のエピトープを提示する抗原提示細胞(APC)を使って刺激をしたときのサイトカイン産生を測定することによって、T細胞機能を効率的に検出する。しかし、APCは3〜10個の異なるHLA対立遺伝子を有するため、これらのアッセイによって、種々のpHLA間の区別をすることはできない。また、それらの機能的アッセイは、IFNγの分泌のような強力な機能的反応が誘導されることに依存しているため、機能的な障害がある自己免疫T細胞を検出することはできない。抗原特異的な調節性T細胞(Treg)を検出することは、それらの活性が一般的に測定される応答を阻害し、それ故に、機能的アッセイにおいてはネガティブ応答としてマスクされるので、特に困難である。まさに、抗原特異的Tregを検出することに対しては、アンメット・ニーズ（unmet need）が存在する。
【０２５２】
その目的のために、pHLA-TCR相互作用を検出する為のSABRを構築した。図14Aは、TCR-pHLA認識時のSABRの構造及びSABRによるシグナル誘導を示す概略図である。本実施例で使用したSABRの細胞外ドメインはpHLA複合体であり、これは、T細胞によって認識されると、細胞内ドメインにシグナルを誘導させる。SABRを発現するように操作したAPCは、所与のエピトープを提示し、及び同種T細胞によって認識された場合に、測定可能なアウトプットを誘導する。多量体又は機能的アッセイに対するSABR-APCの利点には、以下が含まれる：APCの表面上に単一対立遺伝子のpHLAが生理学的にディスプレイされること、pHLAの組み合わせを遺伝的に規定することができること、エピトープ特異性を多重検出すること、及びT細胞機能とは独立してpHLA-TCR相互作用を検出すること。図14B及び図14Cは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種T細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示すことによって、この技術を実証するものである。これらのSABR-APCを使用して、T1D患者における膵島特異的な免疫応答を検出すること、遺伝的リスク・ファクターの免疫学的な影響を研究すること、及び普通の及び免疫療法‐誘導性のT細胞を検討すること、ができる。
【０２５３】
SABR-APCを使って、防御性の及び感受性のある遺伝的リスク・ファクターの免疫学的機序を理解することができる。いくつかのクラスII HLA対立遺伝子は、T1Dに対する防御性又は感受性の何れかと関連している。HLA-DQ2及びDQ8はいずれもT1Dのリスク・ファクターであり、特に、両方の対立遺伝子を保有する患者は、何れかの対立遺伝子のみを保有する患者よりも有意にリスクが高い。この現象は、ペプチド・エピトープを提示し、自己免疫を誘導し得るDQ2及びDQ8鎖のクロスペアリング（cross-pairing）(DQ2trans又はDQ8transとして知られる)に起因すると考えられる。これらの患者由来のAPCは、図14Dに示すように、正確にペアリングした分子及びクロスペアリングした分子を同時に発現し、これらを、これまでの方法によって区別することはできない。図14Dは、DQ2-DQ8ヘテロ接合性である患者由来のAPC表面上におけるHLA-DQ対立遺伝子の4種の組み合わせを示す。図14Eに示すように、SABRを使用して、内生のDR及びDQ遺伝子座を欠損する稀なB-細胞株を用い、このようないわゆるHLA-DQトランスダイマーのうちの特定のペアに連結した、遺伝子的にコードしたペプチド・エピトープを、別々のAPC表面上で、提示させ、異なる遺伝的リスク・ファクターを有する患者間の差異を検討することができる。図14Eは、4種のDQ2/8の組み合わせをコードするSABRが別々のAPC表面上にあり、それらの区別が可能であることを、示している。更に、SABR-APCを使用して、インスリン欠陥リボソーム産物(Insulin  Defective  Ribosomal Products (INS-DRiPs))の防御性の及び感受性のあるバリアントの免疫原性を区別することができる。このようにして、異なる遺伝的リスク対立遺伝子を保有する個人からの免疫反応間の差異を検討することができる。
【０２５４】
SABR-APCを用いて、膵島自己反応性のエフェクターT細胞及び調節性T細胞の機能を研究することもできる。自己免疫性T細胞は、異常な抗原認識モードとその後の機能的アウトプットを示す。例えば、HLA-DR4-プロインスリン(C19-A3)に特異的な調節性T細胞は、同じエピトープに対して特異的なエフェクターT細胞と比較して、逆の極性で結合する。pHLA多量体には固有の限界があるために、これらの差異を研究することは、極めて困難であった。そこで、これらのエピトープを基質として提示するSABR-APCを、T1D患者に由来する膵島特異的なT細胞クローン間の機能的な差異を測定するために使用することができる。これらの研究により、前記APCの観点から、異なるT細胞サブタイプの機能的基盤を理解することができる。
【０２５５】
天然の及び免疫療法‐誘導性の膵島特異的なT細胞反応を、SABRを用いて検出することができる。免疫機能が抑制されている状況では、これまでの方法では抗原特異的なT細胞を検出できない。これは、膵島移植、又は健常者において、若しくはプロインスリンC19-A3のワクチン接種のような寛容原性免疫療法により治療し、奏功した患者において観察される免疫トレランスの状況に特に関連する。本明細書中に記載される技術プラットフォームは、TCR/エピトープ/HLA相互作用のみに依存するので、膵島特異的なエフェクターT-細胞又は調節性T-細胞を、それらの反応が抑制されているとしても、検出及び定量することができる。SABR-APCを使用して、この免疫学的に優性なプロインスリン・ペプチドでパルスした寛容原性の樹状細胞を使った免疫療法を受けている患者に由来するT細胞のC19-A3特異的な反応を診断することができる。SABRの使用を、同じ患者サンプルのいくつかのエピトープを多重検出することによる免疫モニタリングへと拡張することができ、SABRの使用によって、この新しいタイプの組織特異的な免疫介入療法への応答性と相関している可能性のある、膵島特異的な自己免疫応答における「免疫的な特徴（immune signatures）」を同定することが可能になる。
【０２５６】
実施例８：クラスII MHC SABR
クラスII MHCを含む抗原提示ドメインを含むSABRを試験して、シグナリング誘導能を測定した。実施例１及び６に記載の実験方法を用いて、クラスII MHC SABRによる誘導能を試験した。図15Aは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。図15Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。図15Bに示すように、クラスII MHC SABRはシグナルを誘導することができたが、他のコンストラクトはシグナルを誘導しなかった。本結果は、クラスII MHCを含むSABRが、特異的なTCR-pMHC相互作用があったときに、シグナリングを誘導できることを示す。
【０２５７】
更に、図16Aは、IAb-OVA DCH及びIAb-OVA DCH-SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。図16Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。これらの結果はまた、クラスII MHCを含むSABRが、特異的なTCR-pMHC相互作用があったときに、シグナリングを誘導できることを示す。このように、クラスI MHC SABRを用いた実験（これは、比較的容易に機能することが知られている）は、クラスII MHC SABR（これは、本明細書に記載されている抗原探索のために、従来の方法を使って機能させることが困難であることが知られている）についても機能した。
【０２５８】
実施例９：SABRは、初代細胞を認識する
SCDRコンストラクトを、例えば、A2 NYESO(がん特異的なMHCT抗原の組み合わせ)又はB27-KK10(HIV特異的なMHC-抗原の組み合わせ)の何れかを発現するように構築した。いくつかの実施形態では、A2及びB27のSCDRコンストラクトを構築することができ、ペプチドを使用して、例えば、NYESO又はKK10抗原の何れかを提示することができる。NFAT-GFP-Jurkatsは、SCTRコンストラクト又はSCDRコンストラクトを形質導入することがあり、そしてレポーター細胞としてペプチド抗原でパルスすることがある。前記レポーター細胞は、例えば、A2-NYESO特異的なTCR又はB27-KK10特異的なTCRの何れかを発現するJurkat細胞に形質導入して得ることがあり、そしてGFP+ 細胞の頻度を、フロー・サイトメトリーで測定することがある。図17Aは、%GFP+ 細胞を経時的に示す折れ線グラフを示す。図17Bは、本実験の代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。
【０２５９】
本結果は、シグナルが、インキュベーションの4時間以内に約30%のレポーター細胞で誘導され、インキュベーションの8時間以内に約50%のレポーター細胞で誘導されたことを示す。また、最大シグナルの約50%は4時間で達成され、最大シグナルの約100%は8時間で達成された。
【０２６０】
実施例３及び６の実験結果を用いて、TCRを形質導入したJurkat細胞をSCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートした。図18Aは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したJurkat細胞についての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。図18Bは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。図18Cは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の経時的な頻度を示す折れ線グラフを示す。
【０２６１】
図18A〜18Cに例示されるように、SABRは、初代細胞表面上の抗原レセプターを(例えば、患者のサンプルから直接的に)認識することができ、同じように、SABR は細胞株における遺伝子導入抗原レセプターを認識することができる。
【０２６２】
実施形態の種、バリアント、欠損、又は改変バージョン
いくつかの実施形態では、記載したタンパク質成分(とりわけ、MHCフラグメント)の各々の任意の種、バリアント、欠損、又は改変バージョンを、それらが本明細書に記載されるように機能する限り、使用することができる。いくつかの実施形態では、これは、使用する配列が本明細書中で提供される成分についてのヒト配列である場合に、達成される。いくつかの実施形態では、前記構成要素の配列は哺乳動物であることがある。いくつかの実施形態では、前記構成要素の配列は、本明細書中で提供される配列又は本明細書中で提供される構成要素のヒト配列に対して80%以上が同一であることがあり、例えば、前記構成要素(例えば、MHC、エピトープ等)のヒト配列に対して、例えば、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.9%以上が同一であることがある。いくつかの実施形態では、前記構成要素は、生物間で保存されている配列を保持している限り、バリアントであり得る。このような許容可能なバリアントの例を、図20A〜20Fで提供されるロゴベースの配列アラインメントに記載する。図20Aは、多種多様な種間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。図20Bは、ヒト間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。図20Cは、多種多様な種間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。図20Dは、ヒト間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。図20Eは、多種多様な種間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。図20Fは、ヒト間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。これにより、当業者のうちのある者は、保存され、従って機能にとって重要なタンパク質のセクション、及び保存されず、従って変化することがあるセクション、を理解するのであろう。
【０２６３】
図20A〜20Fの図は、配列のロゴであり、アミノ酸又は核酸の配列をマルチプル・アラインメントしたものをグラフィカルに表示したものである。前記ロゴは、文字を積層した配列であり、アミノ酸配列のアラインメントにおける各位置の1つの積層である。前記スタックの全体の高さは、その位置での配列保存度を示し、一方、スタック内の記号の高さは、その位置での各アミノ酸又は核酸の相対的な頻度を示す。積み重ね棒グラフと同様に、アミノ酸の1文字コードを、着色した棒の代わりに使用する。前記スタックの幅は、その位置における欠損配列の割合に比例する。なお、MHC分子の多くは完全な配列を含まない。より細い文字は、いくつかの配列がその領域についての情報を欠いていることを意味する。これらの図では、文字の幅はあまり重要ではない。いくつかの実施形態では、この指針は、より深いシークエンシング被覆率を有する部分のセクションに焦点を当てている。
【０２６４】
参考文献
全ての参考文献が、その全体が、参照により取り込まれる。
【０２６５】
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【図１Ａ】
2020534809.tif 000013
【図１Ｂ】
2020534809.tif 000014
【図１Ｃ】
2020534809.tif 000015
【図１Ｄ−Ｅ】
2020534809.tif 000016
【図２Ａ】
2020534809.tif 000017
【図２Ｂ】
2020534809.tif 000018
【図２Ｃ】
2020534809.tif 000019
【図３Ａ】
2020534809.tif 000020
【図３Ｂ】
2020534809.tif 000021
【図３Ｃ】
2020534809.tif 000022
【図４Ａ】
2020534809.tif 000023
【図４Ｂ】
2020534809.tif 000024
【図５Ａ】
2020534809.tif 000025
【図５Ｂ】
2020534809.tif 000026
【図５Ｃ】
2020534809.tif 000027
【図６Ａ】
2020534809.tif 000028
【図６Ｂ】
2020534809.tif 000029
【図７−１】
2020534809.tif 000030
【図７−２】
2020534809.tif 000031
【図７−３】
2020534809.tif 000032
【図７−４】
2020534809.tif 000033
【図８−１】
2020534809.tif 000034
【図８−２】
2020534809.tif 000035
【図８−３】
2020534809.tif 000036
【図８−４】
2020534809.tif 000037
【図８−５】
2020534809.tif 000038
【図８−６】
2020534809.tif 000039
【図８−７】
2020534809.tif 000040
【図８−８】
2020534809.tif 000041
【図９−１】
2020534809.tif 000042
【図９−２】
2020534809.tif 000043
【図９−３】
2020534809.tif 000044
【図１０Ａ】
2020534809.tif 000045
【図１０Ｂ】
2020534809.tif 000046
【図１０Ｃ】
2020534809.tif 000047
【図１１−１】
2020534809.tif 000048
【図１１−２】
2020534809.tif 000049
【図１１−３】
2020534809.tif 000050
【図１２−１】
2020534809.tif 000051
【図１２−２】
2020534809.tif 000052
【図１２−３】
2020534809.tif 000053
【図１３Ａ】
2020534809.tif 000054
【図１３Ｂ】
2020534809.tif 000055
【図１３Ｃ】
2020534809.tif 000056
【図１４−１】
2020534809.tif 000057
【図１４−２】
2020534809.tif 000058
【図１４−３】
2020534809.tif 000059
【図１５】
2020534809.tif 000060
【図１６】
2020534809.tif 000061
【図１７】
2020534809.tif 000062
【図１８】
2020534809.tif 000063
【図１９】
2020534809.tif 000064
【図２０Ａ】
2020534809.tif 000065
【図２０Ｂ】
2020534809.tif 000066
【図２０Ｃ】
2020534809.tif 000067
【図２０Ｄ】
2020534809.tif 000068
【図２０Ｅ】
2020534809.tif 000069
【図２０Ｆ】
2020534809.tif 000070
【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年7月3日(2020.7.3)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願と共に出願された出願データシートにおいて外国又は国内の優先権主張が識別される全ての出願は、37 CFR 1.57の下で参照により本明細書に組み込まれる。本出願は2017年9月06日に出願された米国仮出願第62/554,652号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、広く、免疫学的に使用し、治療をする為の分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
T細胞は、病原体やがんに対する免疫反応に不可欠な役割をしている。T細胞は、そのターゲット細胞表面上の主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子上に提示された特異的な抗原性エピトープに反応する。T細胞による抗原認識はそのT細胞レセプター(TCR)によって媒介され、それは細胞内シグナルを引き起こしてT細胞活性化を誘導し、続いて機能的な反応を引き起こす。しかし、抗原を提示するMHC分子にはシグナリング・ドメインがないため、ターゲット細胞に反応を誘導することはできない。従って、TCR-抗原-MHC相互作用は、T細胞に向かう一方向性のシグナルをもたらす。前記ターゲット細胞に向かうシグナル伝達が無いことは、種々の機能のためにTCR-抗原-MHC相互作用を利用する可能性を大きく制約する。従って、TCR-抗原-MHC相互作用の利用を拡大する新規で拡張可能な技術及び分子が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決する為の手段】
【０００４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)：抗原提示ドメイン、及び、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインがMHC分子の結合フラグメントを含む、に関する。
【０００５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原提示ドメインがMHCを含むSABRに関する。
【０００６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、SABRをコードする核酸に関する。
【０００７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、SABRをコードする核酸を含む細胞に関する。
【０００８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記MHCがクラスI MHCを含むSABRに関する。
【０００９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記MHCがクラスII MHCを含むSABRに関する。
【００１０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ペプチドを更に含み、ここで、前記ペプチドがエピトープを含む、ここで、前記ペプチドのエピトープがSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインが前記ペプチドに結合するSABRに関する。
【００１１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインがT細胞シグナリング・ドメインを含むSABRに関する。
【００１２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、又はTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む、SABRに関する。
【００１３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む、SABRに関する。
【００１４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを更に含むSABRに関する。
【００１５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記膜貫通ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、NOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む、SABRに関する。
【００１６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記膜貫通ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含むSABRに関する。
【００１７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記抗原提示ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含むSABRに関する。
【００１８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含むSABRに関する。
【００１９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記抗原提示ドメインが前記シグナル伝達ドメインに融合しているSABRに関する。
【００２０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、1つ以上のリンカーを更に含むSABRに関する。
【００２１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む細胞：以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子を含む、に関する。
【００２２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRのうちの何れか1種以上を含む、細胞に関する。
【００２３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子に関する。
【００２４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、シグナリング細胞を調製する為の方法に関し、前記方法は以下を含む：ターゲット細胞を提供すること；及び、前記ターゲット細胞に、T細胞の表面で発現する少なくとも1種のT細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入すること、ここで、前記SABRはシグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
【００２５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRのうちの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する；前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること；前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
【００２６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが可溶性分子を含む。
【００２７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記可溶性分子が抗体を含む。
【００２８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが細胞表面上で発現している。
【００２９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが、T細胞表面上で発現しているTCRを含む。
【００３０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が細胞のライブラリを含む、ここで、前記細胞のライブラリが多数の種々のSABRを有し、及びここで多数の種々のSABRが種々の抗原レセプターに結合することができる。
【００３１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが多数の抗原レセプターを含む。
【００３２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、多数の種々のSABRが発現し、前記測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを示した細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定する。
【００３３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、2種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する。
【００３４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、2種以上の抗原レセプター及び2種以上のSABRが存在する。
【００３５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【００３６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記測定可能なシグナルが、検出可能なマーカーの発現に由来する。
【００３７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記測定可能なシグナルを発現するレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを用いて同定する。
【００３８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが、発現したオーファンTCRを含む。
【００３９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記1種以上のレポーター細胞が、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する。
【００４０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む。
【００４１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか1種、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター。
【００４２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記少なくとも1種の抗原レセプターが細胞表面上で発現し、ここで、前記細胞が抗原レセプター細胞である。
【００４３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記SABRがレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記SABRが前記抗原レセプターに結合すると、前記細胞が検出可能なマーカーを呈する。
【００４４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記レポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【００４５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記抗原レセプター細胞が、TCRを含むT細胞を含む。
【００４６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記抗原レセプター細胞が、オーファンTCRを発現する細胞を含む。
【００４７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載されるSABRのうちの何れか1種以上を治療用細胞に形質導入すること；並びに、治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。
【００４８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記細胞反応が、以下のうちの1種以上を生じさせる：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
【００４９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞が病原性T細胞を殺す。
【００５０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞がターゲットT細胞を活性化する。
【００５１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞が病原性T細胞を抑制する。
【００５２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む組成物に関する：本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む治療用T-細胞。
【００５３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T細胞物を患者に投与することを含む、患者を治療する為の方法に関し、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
【００５４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；並びに、細胞内シグナリング・ドメイン。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1Aは、本明細書の様々な実施形態による、CD8+ T細胞の例示的なSABRコンストラクトを示す。  図1Bは、本明細書の様々な実施形態による、CD4+ T細胞の例示的なSABRコンストラクトを示す。  図1Cは、本明細書の様々な実施形態による、SABRコンストラクトを示す。  図1Dは、抗原提示ドメインを有するが、伝達シグナリング・ドメインを有しない、典型的な抗原提示細胞を示す。  図1Eは、抗原提示ドメイン、及び抗原提示細胞内でシグナルの誘導が可能な伝達シグナリング・ドメインの両方を含むSABRを有する抗原提示細胞を示す。
【図２】図2Aは、本明細書の様々な実施形態による、TCR結合又は認識時にシグナルを発現するレポーター細胞株において、SABRを使用することを説明する概略図を示す。  図2Bは、本明細書中に記載されるSABRによる、抗原特異的なシグナリングのプロセスを記載するフローチャートを示す。  図2Cは、本明細書の様々な実施形態による、抗原探索のためにSABRライブラリを使用すること概略的に示す図である。
【図３】図3Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABRの機能を実証するために使用するT細胞及びターゲット細胞の概略図を示す。  図3Bは、TCRを発現しているT細胞と共インキュベーションしたときの、SABR形質導入レポーター細胞におけるGFP発現の計測値を示すグラフである。  図3Cは、種々の患者由来の4種の異なるTCRへの応答性における、B27-KK10-SCTRの機能を実証するグラフを示す。
【図４】図4Aは、本明細書の様々な実施形態による、T細胞の抗原を探索するために、様々なSABRコンストラクトを使用することを説明する概略図を示す。  図4Bは、本明細書の様々な実施形態による、TCRの交差反応性を検討する為に、又はヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定する為に、SCTRを使用することを説明する概略図を示す。
【図５】図5Aは、本明細書の様々な実施形態による、特定のT細胞が特異的な抗原を認識するのに応じて、SABRが毒性を誘導することができることを説明する概略図を示す。  図5Bは、本明細書の様々な実施形態による、SABRを介した細胞毒性を試験するために使用する細胞毒性アッセイを説明する概略図を示す。  図5Cは、A2-NYESO-SCTRによって誘導されるTCR特異的な細胞傷害性を実証する結果を示すグラフを示す。
【図６】図6Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABR-F及びSABR-Eコンストラクトを示す概略図を示す。  図6Bは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkatsにおいて、8時間での%GFP+ 細胞をY軸上に示す棒グラフを示す。
【図７】図7Aは、SABR及びTCR-pMHC特異的なシグナル伝達を実証する概略図を示す。  図7Bは、培養から8時間後の実験から得た、代表的なフロー・サイトメトリーによるプロットを示す。  図7Cは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した時の、SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現の棒グラフを示す。  図7Dは、SABRにより僅かな細胞数を検出することを示すグラフである。  図7Eは、F5を形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞が、GFPを発現する時間経過を示す。  図7Fは、図7Eの実験から得られた代表的なフロー・サイトメトリーのプロットを示す。
【図８】図8Aは、様々な実施形態による、SCT、SABR、空のSABR、及びタンデム・ミニ遺伝子(TMG)を示す概略図を示す。  図8Bは、様々な実施形態による、BsmBI部位を含むスタッファー・フラグメント（stuffer fragment）を有するSABRベクターのコンストラクト、及びオーバーラップを隣接させたエピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを使用するクローニング方法を示す。  図8Cは、様々な実施形態による、空のSABRコンストラクトを示す。  図8Dは、本明細書の様々な実施形態による、空のSABR(即ち、コードされたペプチドがない)及び内生的に発現したペプチドを示す。  図8Eは、外因性ペプチドでパルスした、空のSABRの概略図を示す。  図8Fは、空のSABRを形質導入した、可溶性MART1又はKK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現を示すグラフを示す。  図8Gは、TMGの新たに翻訳されたエピトープを提示する空のSABRの概略図を示す。  図8Hは、空のB27-SABR KK10-TMGを一緒に形質導入した、又は空のB27-SABRを形質導入して、KK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現のグラフを示す。  図8Iは、本明細書の様々な実施形態による、CD3zシグナル伝達ドメインを有するSCDRのコンストラクトを示す。  図8Jは、種々のTCR-ペプチドに変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。  図8Kは、種々のTCR-ペプチド組成物及び濃度に変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。  図8Lは、本明細書の様々な実施形態による、タンデム・ミニ遺伝子(TMG)抗原を有するSCDRコンストラクトを示す概略図を示す。  図8Mは、種々のTCR-ペプチドに変えた時の%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。
【図９】図9Aは、SABRによるCD69の誘導に関する、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。  図9Bは、SABRを発現する初代T細胞によってJurkat細胞に誘導された細胞毒性に関するグラフを示す。  図9Cは、SABRを発現する初代T細胞によって自己ターゲット細胞に誘導された細胞毒性に関する棒グラフを示す。  図9Dは、A2-SABR及びF5-TCRの抗原感受性を測定する為のアッセイの概略図を示す。  図9Eは、SABRの抗原感受性及びTCRシグナリングに関するプロットを示す。
【図１０】図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。  図10Bは、様々な実施形態による、オーファンTCRによって認識される細胞をSABRライブラリから選択する為の共培養実験を示す概略図である。  図10Cは、様々な実施形態による、計算解析のパイプラインを示すフローチャートを示す。
【図１１】図11Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。  図11Bは、F5及びSL9選別の平均ランクのプロットを示す。  図11Cは、F5選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。  図11Dは、SL9選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。  図11Eは、実施例４のA2-SABRライブラリにおけるEAAGIGILTVの類似体についての平均ランクのプロットを示す。  図11Fは、A2-SABRライブラリにおけるSLYNTVATLの類似体についての平均ランクのプロットを示す。
【図１２】図12Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。  図12Bは、neoTCR及びモック選別（mock sorts）の平均ランクのプロットを示す。  図12Cは、neoTCR選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。  図12Dは、NeoAg-SABRライブラリにおけるUSP7に由来するエピトープの平均ランクのプロットを示す。  図12Eは、NeoAg-SABRスクリーニングで同定された上位ヒットの妥当性評価を示すプロットを示す。
【図１３】図13Aは、GFP発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。  図13Bは、GFP及びCD69の発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。  図13Cは、細胞毒性アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。
【図１４】図14Aは、TCR-pHLA認識時のSABRの構造及びSABRによるシグナル誘導を示す概略図である。  図14Bは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種のT細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示す、SABRの概略図を示す。  図14Cは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種のT細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示す棒グラフを示す。  図14Dは、DQ2-DQ8ヘテロ接合性である患者由来のAPC表面上におけるHLA-DQ対立遺伝子の4種の組み合わせを示す。  図14Eは、4種のDQ2/8の組み合わせをコードするSABRが別々のAPC表面上にあり、それらの区別が可能であることを、示している。
【図１５】図15Aは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。  図15Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。
【図１６】図16Aは、IAb-OVA DCH及びIAb-OVA DCH-SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。  図16Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRがOT-II TCRを発現するマウス脾細胞を認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。
【図１７】図17Aは、%GFP+ 細胞を経時的に示す折れ線グラフを示す。  図17Bは、本実験の代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。
【図１８】図18Aは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したJurkat細胞についての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。  図18Bは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。  図18Cは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の経時的な頻度を示す折れ線グラフを示す。
【図１９】図19は、本明細書中の様々な実施形態による(例えば、糖尿病の治療のための)抗原性エピトープの例を示す。
【図２０】図20Aは、多種多様な種間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。  図20Bは、ヒト間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。  図20Cは、多種多様な種間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。  図20Dは、ヒト間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。  図20Eは、多種多様な種間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。  図20Fは、ヒト間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。
【発明を実施する為の形態】
【００５６】
詳細な説明
抗原を提示するMHC分子にはシグナル伝達ドメインが無いため、このターゲット細胞中で応答を誘導することはできない。従って、TCR-抗原-MHC相互作用は、T細胞に向かう一方向性のシグナルをもたらす。前記ターゲット細胞に向かうシグナリングが無いことは、種々の機能のためにTCR-抗原-MHC相互作用を利用する可能性を大きく制約する。従って、TCR-抗原-MHC相互作用の利用を拡大する新規で拡張可能な技術及び分子が必要とされていて、本明細書にて(いくつかの実施形態として)提供される。
【００５７】
本明細書において、以下を含むシグナリング及び抗原提示の２機能性レセプターのための組成物及び方法が記載される：1種以上の抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、1種以上の抗原提示ドメインは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。前記SABRの様々な免疫学的機能についても記載する。前記SABRの様々な使用及び機能が本明細書中で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRを、抗原探索、病原性T細胞を抑制すること及び／又は殺すこと、治療反応を開始させること、治療の方法、SABRライブラリを構築すること、ネオ抗原の探索、並びに他の用途に使用することがある。
【００５８】
定義及び様々な実施形態
本明細書で使用する場合、セクションの見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、説明された主題をいかなる形でも、限定するものとして解釈されるべきではない。限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネット・ウェブページ等を含む、本出願において引用される全ての文献及び同様の物件は、任意の目的のために、それらの全体が参照により明確に取り込まれる。取り込まれた参考文献における用語の定義が、本明細書において提供される定義と異なるように見える場合、本明細書において提供される定義が支配するものとする。
【００５９】
本出願において、単数形を使用することは、特に断らない限り、その複数形を含む。また、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含む(including)」を使用することは、限定することを意図していない。前記の一般論としての記載及び以下の詳細な説明の両方とも、例示的且つ説明的だけなものであり、限定的なものではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)を参照。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。前記の一般論としての記載及び以下の詳細な説明の両方ともが、単に例示的且つ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものではない、と理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は特に断らない限り、その複数形を含む。本出願において、「又は(or)」の使用は、特に断らない限り、「及び／又は(and/or)」を意味する。更に、「含む(including)」という用語、並びに、「含む(includes)」及び「含む(included)」等の他の形態の使用は限定的ではない。本明細書及び特許請求の範囲において使用するように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容が別段の明確な指示をしない限り、複数を参照することを含む。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「約」は、参照となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1%ほど変化する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを意味する。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「抗原提示ドメイン」は、細胞を介した免疫反応を担うT細胞に抗原ペプチド・フラグメントを提示するように機能する細胞外ドメインをいう。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「シグナル伝達ドメイン」は、細胞外シグナルを細胞内に伝達し得る任意のドメインをいう。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「主要組織適合性遺伝子複合体」(MHC)は、獲得免疫系が外来分子を認識するのに必須である一組の細胞表層タンパク質をいう。特に断らない限り、MHCは、クラスI MHC及びクラスII MHCの両方を指す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の鎖をいう。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、免疫系によって認識される抗原の一部をいう。これは、例えば、抗体、B細胞、又はT細胞によることがある。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「T細胞シグナリング・ドメイン」は、細胞内シグナルを伝達するために機能する細胞質T細胞ドメインを指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「サイトカイン・レセプター」は、サイトカインに結合する任意のレセプターをいう。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」は細胞膜を貫通し、そしてその中に存在するアミノ酸配列をいう。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、タンパク質ドメイン間に存在するペプチド配列をいう。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「シグナリング細胞」は、シグナリング・ドメインを介して、細胞外シグナルを細胞内に伝達することができる任意の細胞をいう。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ターゲット細胞」は、シグナリング分子によって認識されるレセプターを有する細胞をいう。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「レポーター細胞」は、レポーター遺伝子を発現している細胞をいい、刺激に曝露された場合に、定性的に及び定量的に容易に評価され得る測定可能なシグナル活性を誘導する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「測定可能なシグナル」は、定性的に又は定量的に評価され得る任意のレポーター活性をいう。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「抗原探索」は、T細胞反応がターゲットとする抗原を発見する過程をいう。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「可溶性分子」は、液体に溶解可能な化合物をいう。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ライブラリ」とは1種以上のシグナリング分子を有する細胞のコレクションをいう。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「検出可能なマーカー」は、シグナル伝達に反応する任意の識別可能な特性をいう。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「フロー・サイトメトリー」は、流体中に細胞を懸濁させ、そしてそれらを電子検出装置に通すことによる、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出及びタンパク質工学において使用される、レーザー又はインピーダンスに基づく生物物理学的な技術をいう。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「治療用細胞」はSABRを形質導入した細胞をいい、ここで、前記SABRは、対象中で抗原レセプターに結合すると、対象中で細胞反応を誘導する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「細胞反応」は、受信したシグナルに応答する細胞内の任意の生化学的反応をいう。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「病原性T細胞」は、疾患(例えば、自己免疫疾患)を引き起こすか、又は疾患に寄与する任意のT細胞をいう。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「細胞質ドメイン」は、細胞の細胞質内のアミノ酸配列をいう。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ベクター」はトランスジェニック・コンストラクト、ターゲティング・コンストラクト、又は単にコンストラクトと互換的に呼ばれる核酸である。本明細書で使用する場合、「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、リボ核酸(RNA)を指すことがある。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるコンストラクトは、1つ以上の調節エレメントを含む。原核生物における例示的な調節エレメントには、プロモーター、オペレーター及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞において使用される調節エレメントには、限定されるものではないが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、スプライシング・シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、インターナル・リボソーム−エントリー・エレメント(IRES)、2A配列等、転写及び翻訳をコントロールする配列が含まれ、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の発現及び／若しくはコードされたポリペプチドの産生を、提供する並びに／又は調節する。例えば、プロモーターはRNAポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、5'ノン−コーディング領域にあり、遺伝子の転写開始部位の近位にある。転写開始の際に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサス・ヌクレオチド配列をしばしば特徴とする。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、バクテリア、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物(ヒトを含む)由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑制性、及び／又は構成性であることがある。誘導性プロモーターは、培養条件の変化(例えば、温度の変化)に応答して、それらの制御下で、DNAからの転写レベルの増加を開始させる。症状を「治療する」又は「治療」とは、前記症状を予防すること、前記状態の発症及び／又は進展の速度を遅らせること、前記症状の進展リスクを低下させること、前記症状に関連する徴候の進展を予防及び／又は遅らせること、前記症状に関連する徴候を軽減又は無くすこと、前記症状から完全に又は部分的に回復させること、又はそれらの組合せをいうことがある。「予防」という用語は、障害又は疾患を、絶対的に止めることを必要としない。
【００８４】
「治療有効量」又は「治療有効用量」は、対象において所望の治療効果(例えば、ターゲット症状の予防、治療、障害及び／又は徴候の発症の遅延、及び／又は症状に関連する徴候の軽減等)を生じさせる量である。この量は、限定されるものではないが、治療用化合物の特徴(活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティ等を含む)、対象の生理学的状態(年齢、性別、病型及び病期、一般的な身体状態、所与の投薬量に対する応答性、及び投薬のタイプ等を含む)、その製剤中の薬学的に許容可能な担体の性質、及び／又は投与経路等を含む様々な因子に依存して変わる。臨床及び薬理学分野の当業者は、本開示を考慮して、日常的な検討を通して（例えば、化合物の投与に対する対象の応答をモニターし、そしてそれに応じて投薬量を調節することによって）、治療有効量を決定し得る。更なるガイダンスについては、Remington:  The  Science and Practice of Pharmacy 21.sup.st Edition, Univ. of  Sciences  in  Philadelphia  (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2005を参照のこと。
【００８５】
「抗体」という用語は、限定されるものではないが、遺伝子操作された、又は他の方法で修飾された形態の免疫グロブリン、例えば、イントラボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント、及びヘテロコンジュゲート抗体(例えば、バイスペシフィック抗体(bispecific antibody)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等)を含む。「抗体」という用語は、シス-ダイアボディ及びミニボディを含む。「抗体」という用語は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、又は対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、及び特異的に結合することができる免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを含む。例示的な抗体構造ユニットは四量体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、2つの同一の一対のポリペプチド鎖で構成されることがあり、各対が1つの「軽」鎖及び1つの「重」鎖を有し、ジスルフィド結合を介して連結している。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミューの定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長鎖について、軽鎖はカッパ又はラムダの何れかに分類される。全長鎖について、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、これらは次に、それぞれ、免疫グロブリン・クラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを規定する。それぞれの鎖のN末端は、主に抗原認識に関与する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、軽鎖及び重鎖に関するこれらの領域を指す。本出願で使用する場合、「抗体」は、抗体及びそのフラグメントの全てのバリエーションを包含する。従って、このコンセプトの範囲内には、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(scFv)、Fab、Fab'、及び同じ結合特異性を有するこれらのフラグメントの多量体バージョン(例えば、F(ab')2)がある。いくつかの実施形態では、前記抗体は、所望のターゲットに特異的に結合する。
【００８６】
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に適用する場合、核酸又はタンパク質が、天然の状態では相互作用している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、それは、乾燥又は水溶液の何れかであることがある。純度及び均質性を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して決定することができる。調製物中に存在する主な種のタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームから分けられている。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルにおいて、核酸又はタンパク質が、本質的に1つのバンドとなることを意味する。いくつかの実施形態では、これは、核酸又はタンパク質が in vivo 状態で存在する分子の少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを示すことがある。
【００８７】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖の何れかの形態にあるデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)及びそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は参照核酸と同様の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特段に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変したバリアント(例えば、縮重コドンによる置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNPs、及び相補的配列、並びに明示的に示される配列、を黙示的に包含する。具体的には、縮重コドンによる置換は、1つ以上の選択した(又は全ての)コドンの3番目の位置を、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって、行うことがある(Batzer et al., Nucleic Acid Res.  19:5081  (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【００８８】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、及びO-ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（即ち、水素に結合するα-炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド、メチオニン・メチルスルホニウム）を指す。このような類似体は、改変したR基(例えば、ノルロイシン)又は改変したペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とはアミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式において機能する化学的化合物をいう。
【００８９】
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関する：抗原提示ドメイン；及び、シグナル伝達ドメイン。前記抗原提示ドメインが主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中のSABRは、ターゲット細胞内のシグナル伝達を可能にし、本明細書中に記載されるような様々な用途を有する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：1種以上の抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記1種以上の抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：1種以上の抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、前記1種以上の抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
【００９０】
図1Aは、本明細書の様々な実施形態による、CD8+ T細胞での例示的なSABRコンストラクトを示す。図1Bは、本明細書の様々な実施形態による、CD4+ T細胞での例示的なSABRコンストラクトを示す。いくつかの実施形態では、SABRを、2つの部分：抗原提示ドメイン102及びシグナル伝達ドメイン104、を連結することによって構築する。T細胞への抗原提示は、ペプチド・エピトープ106をT細胞に提示するクラスI及びクラスIIのMHC分子に依存する。クラスI MHC分子108Aは通常、CD8+ T細胞110Aに8〜11aaの長さのペプチド・エピトープを提示するが、一方でクラスII MHC 108B分子は通常、CD4+ T細胞110Bに12〜15aaの長さのペプチド・エピトープを提示する。いくつかの実施形態では、SABRは、抗原提示ドメイン102をシグナル伝達ドメイン104に繋げることによって作製される。
【００９１】
図1Cは、本明細書の様々な実施形態による、SABRコンストラクトを示す。いくつかの実施形態では、抗原提示ドメイン102は、共有結合ペプチド106を有するクラスI MHC分子108A(SCTR)、又はペプチド・エピトープを全く有さないクラスI MHC分子108A(SCDR)、又は共有結合ペプチド106を有するクラスII MHC分子108B(DCHR)、であり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメイン104は、キメラ抗原レセプター(CAR)で使用されるものと類似したTCR-CD3シグナリング・ドメイン、サイトカインレセプター、又は多量体化時にシグナルを発する他のレセプターに由来することがある。いくつかの実施形態では、SABR-ライブラリは、抗原性エピトープを共有結合的に連結させる、又はSABR発現細胞中で、前記抗原性タンパク質／エピトープを発現させることによって構築することがある。
【００９２】
図1Dは、抗原提示ドメイン102Dを有するが、伝達シグナリング・ドメインを有しない、典型的な抗原提示細胞100Dを示す。図1Eは、抗原提示ドメイン102Eと、抗原提示細胞100E内でシグナル誘導が可能な伝達シグナリング・ドメイン104E、の両方を含むSABR、を有する抗原提示細胞100Eを示す。
【００９３】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
【００９４】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかをコードする核酸に関する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRをコードする核酸に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
【００９５】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかをコードする核酸を含む細胞に関する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRをコードする核酸に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
【００９６】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。
【００９７】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。
【００９８】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかに関し、更にペプチドを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関する、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、表6.3又は6.4のエピトープの何れかを使用することがある。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで前記ペプチドはエピトープを含む、及び前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合していない。
【００９９】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、又はCD3ゼータを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む、及びここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, 又はPMID: 22437870を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、1種以上の表0.1のドメインを含む。いくつかの実施形態では、1種以上の以下の表0.1の項目のフラグメントを使うこともある。
表0.1
【表１】
2020534809.tif 000071
【０１００】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、又はTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 24679437, PMID: 19239902 を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、1種以上の表0.2のドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカイン・レセプターのフラグメントを使用することがある。
表0.2
【表２】
2020534809.tif 000072
【０１０１】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 26830878, 米国特許 No. 9,670,281,   PMID: 26431673, PMID: 21816833, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 19239902, PMID: 20567250, PMID: 25045879, PMID: 15932016, PMID: 21616437, 又はPMID: 26632377 を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、1種以上の表0.3のドメインを含む。いくつかの実施形態では、表0.3のシグナル伝達ドメインのフラグメントを使用することがある。
表0.3
【表３】
2020534809.tif 000073
2020534809.tif 000074
【０１０２】
いくつかの実施形態では、表0.1の任意の選択肢を、表0.2の任意の選択肢、及び表0.3の任意の選択肢、と組み合わせることがある。いくつかの実施形態では、表0.1〜0.3の任意の選択肢を、任意の抗原提示ドメイン(MHC I若しくはMHC II又はそれらの結合ドメイン)と組み合わせることがある。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される任意のSABRは、表0.1〜0.3で提供される任意の構成要素をその中に有することがある。
【０１０３】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関する。
【０１０４】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569,  PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870,  PMID: 26830878, 米国特許 No. 9,670,281, PMID: 26431673, PMID: 21816833,   PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 19239902, PMID: 20567250, PMID: 25045879, PMID: 15932016, PMID: 21616437, 又は PMID: 26632377 のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、表0.3のドメインの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。
【０１０５】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及び膜貫通ドメイン、ここで、前記膜貫通ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む。
【０１０６】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記抗原提示ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。
【０１０７】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。
【０１０８】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、前記シグナル伝達ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、前記SABRのMHC部分は、MHCの一部又は全部を含む。いくつかの実施形態では、前記MHCはヒトMHCである。いくつかの実施形態では、前記MHCは、MHCの保存された配列の1種以上又は全て(例えば、図20A−20Fの何れか1つ内の保存された残基)を含む。
【０１０９】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、1つ以上のリンカーを含むSABRに関する。
【０１１０】
細胞組成物
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して、本明細書中で提供される各実施形態を、細胞組成物に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１１１】
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含む細胞に関する：以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子を含む。
【０１１２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関する。本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRを含む細胞に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは更にペプチドを含む、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープは前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは更に膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞物に関し、前記SABRは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを更に含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは、1つ以上のリンカーを更に含む。
【０１１３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞はJurkat細胞、NFAT-GFP-Jurkat細胞のような任意のT細胞株を起源とする。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞は、患者若しくは健康なドナー由来の初代T細胞、又はナチュラル・キラー細胞を起源とする。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞は、調節性T細胞、樹状細胞、B細胞、マクロファージ、又はナチュラル・キラー細胞を起源とする。
【０１１４】
核酸へのコード化
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して、本明細書中で提供される各実施形態を、核酸へのコード化に関して本明細書中に記載される本実施形態内で使用することがある。
【０１１５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは以下を含む：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは更にペプチドを含む、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープは前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは更に膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは膜貫通ドメインを更に含む、ここで、前記膜貫通ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインは、前記シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは、1つ以上のリンカーを更に含む。
【０１１６】
シグナリング細胞調製のための方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して上記で提供された各実施形態を、シグナリング細胞調製のための方法に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１１７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、シグナリング細胞を調製する為の方法に関する。前記方法は、以下を含む：ターゲット細胞を提供すること、T-細胞の表面で発現する少なくとも1種のT-細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ターゲット細胞に導入すること、ここで、前記SABRは、シグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
【０１１８】
抗原探索の方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して上記で提供された各実施形態を、抗原探索の為の方法に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１１９】
抗原探索は、タンパク質の1種以上のペプチド配列を同定することをいう。いくつかの実施形態では、その同定した抗原を、患者を処置するためのワクチンを作製する際に、使用することがある。いくつかの実施形態では、抗原レセプター探索とは、特異的な抗原を認識する1種以上の抗原レセプターを同定することをいう。例えば、抗原レセプター探索は、特異的な抗原を認識する複数のTCRのうちの1種以上の特異的TCRを同定することを含むことがある。いくつかの実施形態では、同定した抗原レセプター(例えば、TCR)を免疫療法に使用することがある。いくつかの実施形態では、本明細書で説明するSABRを、抗原探索及び抗原レセプター探索の両方のために使用することがある。
【０１２０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
【０１２１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞中の少なくとも1種のペプチドを同定し、それによってSABRを有するペプチドを前記抗原レセプターと関連付ける。
【０１２２】
図2Aは、本明細書の様々な実施形態に従って、TCRシグナル伝達時にシグナルを発現するレポーター細胞株において、SABRを使用することを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、抗原探索、TCRの交差反応性、及び関連するアプローチにSABR 200を使用するために、SABR 200を、シグナル伝達時に測定可能なシグナルを生成するレポーター細胞202において発現させることがある。SABR 200の使用の例は、T細胞シグナル伝達時に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレポーター細胞株(例えば、NFAT-GFP-Jurkat細胞)に依存する。いくつかの実施形態では、所与のTCRを発現するT細胞を、SABRを発現する、例えば、NFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートすることがある。いくつかの実施形態では、SABR発現細胞は、SABR 200によって提示される同種抗原204が前記T細胞によって認識される場合、GFPを発現することがある。いくつかの実施形態では、SABRによる無関係な抗原206の提示又は無関係なTCR 208は、GFP発現をもたらさず、同種抗原204を提示するSABR 200の同定が、フロー・サイトメトリーによる可能になる。
【０１２３】
図2Bは、本明細書中に記載されるSABRによる、抗原特異的シグナリングのプロセスを記載するフローチャートを示す。所与のTCRを発現するJurkat細胞を、例えば、SABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートすることがある。発現したTCRにマッチする抗原を含むSABRは、TCRによって認識されると活性化することがあり、NFAT-GFP-Jurkat細胞でシグナルを誘導することがある。ミスマッチ又は無関係な抗原を含むSABRは、発現したTCRによって認識され得ず、及び活性化しないことがある。
【０１２４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは可溶性分子を含む。
【０１２５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは可溶性分子を含む、ここで、前記可溶性分子は抗体を含む。
【０１２６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは細胞表面上で発現している。
【０１２７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは細胞表面上で発現している、及びここで、前記抗原レセプターはT細胞表面上で発現しているTCRを含む。
【０１２８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞は細胞のライブラリを含む、ここで前記細胞のライブラリは多数の種々のSABRを有する、及びここで、前記多数の種々のSABRは種々の抗原レセプターに結合することがある。
【０１２９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは多数の種々の抗原レセプターを含む。
【０１３０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、多数の種々のSABRを発現させ、並びに測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを呈する細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定すること(「抗原探索」)。
【０１３１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索（及び／又は抗原レセプター探索）の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、1種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する。
【０１３２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索（及び／又は抗原レセプター探索）の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、1種以上の抗原レセプター及び1種以上のSABRが存在する。
【０１３３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【０１３４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞、任意のT細胞株の細胞、任意のB細胞株の細胞、任意のNK細胞株の細胞、単球細胞株、又は骨髄細胞株を含む。
【０１３５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記測定可能なシグナルは検出可能なマーカーの発現に由来する。
【０１３６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記測定可能なシグナルを発現しているレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを使用して同定する。
【０１３７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプター細胞はオーファンT-細胞レセプター(TCR)を発現している細胞を含む。
【０１３８】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは発現したオーファンT-細胞レセプター(TCR)を含む。
【０１３９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記少なくとも1種のレポーター細胞は遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する。
【０１４０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記少なくとも1種のレポーター細胞は遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する、及び遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む。
【０１４１】
細胞ライブラリ
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、細胞ライブラリに関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１４２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター。
【０１４３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である。本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞はレポーター細胞である。
【０１４４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記SABRはレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記細胞は、前記SABRが前記抗原レセプターに結合したときに検出可能なマーカーを呈する。
【０１４５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
【０１４６】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である、及びここで、前記抗原レセプター細胞はTCRを含むT細胞を含む。
【０１４７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である、及びここで、前記抗原レセプター細胞はオーファンTCRを発現している細胞を含む。
【０１４８】
図2Cは、本明細書の様々な実施形態による、抗原探索のためにSABRライブラリを使用することを概略的に示す図である。いくつかの実施形態では、SABRのライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞のようなレポーター細胞を、抗原特異性を見出すために使用することがある。いくつかの実施形態では、SABRライブラリ中の各細胞210、212、214、216、218、220、222、224、及び226は、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを一意的に発現し、これを、DNAシークエンシングによって同定することができる。いくつかの実施形態では、前記SABRライブラリを、未知の特異性を有するT細胞、又は未知の特異性を有するTCRを発現するT細胞株、と共インキュベートすることがある。いくつかの実施形態では、GFP+ 細胞210、216、及び222のようなシグナルを産生する細胞を選別し、その抗原性エピトープをシークエンシングして、所与のT細胞又はTCRの同種抗原を決定することがある。
【０１４９】
治療方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して上記で提供された各実施形態を、治療方法に関して本明細書に記載される本実施形態内で使用することがある。
【０１５０】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、調節性T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、又は例えば造血幹細胞、前駆細胞、リンパ球及び骨髄細胞等を含む任意の造血細胞、を含む。
【０１５１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記細胞反応は、以下のうちの1種以上を生じさせる：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
【０１５２】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は病原性T細胞を殺す。
【０１５３】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞はターゲットT細胞を活性化する。
【０１５４】
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は病原性T細胞を抑制する。
【０１５５】
本明細書中のいくつかの実施形態は、患者を治療する為の方法に関し、細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T-細胞を前記患者に投与することを含む、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
【０１５６】
治療用T細胞組成物
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態は、治療用T細胞組成物に関して本明細書に記載される本実施形態内で使用されることがある。
【０１５７】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む組成物に関する：本明細書中に記載される何れかのSABRを含む治療用T-細胞。
【０１５８】
更なるSABR組成物
このセクションでは、SABRの配置及び組み合わせ、並びにそれらの使用のための選択肢を追加して提供する。
【０１５９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに細胞内シグナリング・ドメイン。
【０１６０】
T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットホーム：
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットホームに関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１６１】
本明細書中のいくつかの実施形態は、TCR抗原探索のための新規な細胞ベースのプラットホームにおけるキメラSABRに関する。いくつかの実施形態では、SABRは細胞外のペプチド-MHC複合体を提示し、同種TCRと結合するとTCR様シグナルを介して細胞内シグナリングを誘導する。本明細書中のいくつかの実施形態は、例えば、数千の抗原性エピトープをスクリーニングするためにSABRライブラリを使用する抗原探索に関する。このプラットフォームは、特異性が既知であるパブリック（public）のTCRが認識するターゲットを同定することによって検証されたものである。更に、このアプローチを、個別化したネオ抗原探索に拡張することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原探索プラットホームは、免疫療法のための新規ターゲットを開発する為の拡張可能である及び汎用性のある方法を提供することができる。
【０１６２】
CD8+ T細胞は、ヒトでヒト白血球抗原(HLA)としても知られるクラスI MHC分子上に提示された8〜12残基の長さのペプチド・エピトープを認識する固有の表面T細胞レセプター(TCR)をコードする。TCR複合体が同種ペプチド-MHC(pMHC)に結合すると、前記TCR複合体と相互作用したCD3ζ鎖は二量体化し、下流シグナルを開始する。複数のシグナリング・カスケードが活性化され、転写因子NF-κB、AP-1、及びNFAT7によって駆動される遺伝子発現が直ちに誘導される。CD8+ T細胞では、TCRシグナリングは初期活性化マーカー(CD69及びCD107a)の発現、細胞傷害性顆粒の放出、及びサイトカイン(IFNγ、IL2、及びTNFα)の分泌を誘導し、最終的にそのターゲット細胞を死滅させる。同種TCRとpMHC複合体の相互作用は、ターゲット抗原に対して高度な特異性を生みだす。T細胞は腫瘍細胞によって提示されたエピトープを認識し、腫瘍環境に浸潤することができる。抗腫瘍T細胞は、2種類の腫瘍由来エピトープに反応する：1)非変異、組織特異的な抗原又はがん‐精巣抗原に由来するパブリック（public）又はプライベート（private）エピトープ、及び2)非同義変異に由来するプライベート（private）ネオ抗原。内生的な抗原及びネオ抗原の両方が、免疫療法のターゲットとして用いられることがある。
【０１６３】
腫瘍免疫学の分野におけるボトルネックの一つは、特定の抗腫瘍CD8+ T細胞によって認識される抗原を同定することである。T細胞の同種抗原を同定するために、いくつかの技術が開発されてきている。最も一般的な手法は、pMHC多量体を使用して、フロー・サイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を同定する。しかし、pMHC多量体を使用する抗原探索は、抗原性の状況を最初に知る必要があり、103種の抗原を超えて拡張可能ではないが、同時に多数の抗原特異性を同定することができる。このアプローチは、パブリック（public）の腫瘍抗原並びにプライベート（private）なネオ抗原を発見するために使用されてきた。あるアプローチは、共有結合の縮重ライブラリを使用する。選別、伸長、シークエンシング、及び腫瘍エクソームのデータを参照すること、を複数回繰り返して、TCRの同種抗原が同定される。しかしながら、このアプローチは、可溶性TCRが必要であるため、技術的に困難であり、生理的なTCR-pMHC相互作用を反映したものではない。しかし、抗原について知らなくても良く、106-108種のエピトープに拡張可能である。これらの限界があることから、T細胞の抗原を探索するために新しい技術が非常に必要とされている。
【０１６４】
従って、本明細書中のいくつかの実施形態は、満たされていない必要性に対処する為の新規な抗原探索技術に関する。いくつかの実施形態では、T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットフォームを提示する。いくつかの実施形態では、pMHC複合体による抗原提示を細胞内シグナリングと組み合わせることによって、SABRは、TCR-pMHC相互作用の同定を可能にする。いくつかの実施形態は、SABRライブラリを使用するTCR抗原探索、及び既知のパブリック（public）TCRのためのその使用に関する。いくつかの実施形態は、個別化したネオ抗原に指向性がある手法のために、SABRライブラリを適合させることに関する。いくつかの実施形態は、T細胞の抗原を探索するための柔軟で且つ拡張可能な方法を記載する。
【０１６５】
更に企図される実施形態
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、更に企図される実施形態に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
【０１６６】
本明細書で記載される様々な実施形態は、SABRを導入することにより、TCR-抗原-MHC相互作用の限界に対処するものである。本明細書で議論されるように、SABRの使用により、様々な機能を目的に、TCR-抗原-MHC相互作用を利用することが可能になる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる機能は、がん、感染症、及び自己免疫疾患におけるT細胞の抗原特異性を明らかにすることを含む。がんに対するT細胞を介した反応は、がん細胞表面上に発現する多数の抗原をターゲットとする。ターゲットとなる抗原を知ることは、がんを治療する為の免疫療法アプローチにとって非常に有用である。T細胞がターゲットとするエピトープを発見する為のいくつかの技術がある。最も広く使用されている技術は、MHC-ペプチド-多量体の使用に基づく。MHC多量体を使用することには、いくつかの欠点がある−それは労働集約的であり、容易に拡張可能ではなく、クラスII MHC-ペプチド複合体に適用することは容易でなく、及びそれは、低親和性相互作用に対しては感度が十分でない。酵母によるディスプレイもまた、TCRの抗原探索について試験されているが、いくつかの欠点を同様に有する。酵母ディスプレイは、ペプチド-MHC-b2ミクログロブリンの一本鎖三量体(single chain trimers (SCT))を用いることによるもので、これは、抗原提示を模倣し、前記抗原を遺伝子工学的にMHCに連結させている。しかし、SCT酵母ディスプレイ技術を使用するには、可溶性TCR分子を産生する必要があり、これは安定ではなく、容易に多数のTCRへと拡張することができない。更に、酵母は内生的なMHCを欠くため、前記SCTは正しく折りたたまれず、生理的なTCR結合を反映していない可能性がある。抗原指向性のある他の技術は、患者サンプルに由来する抗原性エピトープに関して事前に知っておく必要があるか、又は抗原特異性にバイアスがある可能性のある患者T細胞を増殖させる必要があるか、又は入手できないほどの大量の患者サンプルを必要とする。本明細書で記載するSABR技術は、所与のT細胞又はTCRによって認識されるターゲット細胞のライブラリを使用する、バイアスのないアプローチを使用している。SABRによって、例えば、106種以上のエピトープ並びにクラスI及びクラスII対立遺伝子を含む事実上全てのMHC対立遺伝子に対して、このアプローチを拡張することが可能となり、可溶性TCRを産生させる必要がなく、低親和性TCR-pMHC相互作用に適用が可能になり、患者の腫瘍サンプルが無くても使用することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる別の機能には、T細胞レセプターの交差反応性及びヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を研究することが含まれる。TCRは、それらの同種エピトープのバリアントを認識することにおいて、かなりの組み合わせを示す。TCRの交差反応性を検討することは、TCR又は特定のTCRを有するT細胞の安全性と有効性を理解するために大切である。がん免疫療法において、TCRの交差反応性に関する知見は、オフターゲット又はオンターゲット（但し、望ましくない副作用無しにそのTCRを治療的に使用することに関する意図しない効果）を理解するのに役立つ。HIVのようなウイルスに対する免疫療法において、TCRの交差反応性に関する知見は、そのTCRから病原体が免疫逃避をする傾向を理解するのに役立つ。TCRの交差反応性を研究する現行の技術は、個々のバリアント・ペプチドを使用する低スループットな方法、又は骨が折れ、可溶性TCRの産生を必要とする酵母ディスプレイ技術、の何れかに基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABR技術により、可溶性TCR産生の必要無しに、例えば、任意の所与のMHC-ペプチドの組合せについて、103〜106種の抗原性エピトープ・バリアントのライブラリを構築すること、及びその後に認識されるバリアントを同定すること、が可能になる。更に、このアプローチを使用して、より高い親和性を有するヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）及びアンタゴニスト等、様々な結合特性を有し得る所与のエピトープのバリアントを同定することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる更に別の機能には、特異的なT細胞反応を誘導することが含まれる。T細胞反応を誘発するワクチン接種アプローチには、T細胞に対する抗原性エピトープの提示と、それに続くそれらのT細胞の刺激が必要である。プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)は、内生的な又は外生的な抗原を処理し、それらをT細胞に提示する。抗原特異的な免疫を、弱毒性又は不活性ウイルス、可溶性抗原タンパク質を用いることによって、又はベクターを用いることによって、誘発させることができる。しかし、これらのアプローチでは、前記抗原性エピトープは、天然の細胞機構によって処理され、従って、所与のエピトープが強力な免疫反応を誘発するかどうかについての制御はない。所与のエピトープに対する応答を誘発するために、それを、エピトープをコードするタンデム・ミニ遺伝子のタンパク質全体のための発現カセットを使って、APC中で発現させる。一本鎖三量体を使用して、APC表面上に所与のMHC-ペプチド複合体を発現させ、免疫反応を誘発させることもできる。一本鎖三量体は、APC中でシグナルを送ることができないので、APCがT細胞を刺激する仕方を操作することはできない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるSABRは、APCがサイトカインを分泌し、及びそれらを認識するT細胞を活性化することを可能にする特異的なシグナリング分子に共役することがある。いくつかの実施形態では、SABRを、APCにおいて免疫抑制性サイトカインを誘発するように構成することがあり、これは、特定の応答の抑制を引き起こすことがある。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる更に別の機能には、T細胞特異性を排除することが含まれる。病原性T細胞のクローン特異性は、T細胞白血病及び自己免疫疾患において中心的な働きをしている可能性がある。T細胞白血病では、過増殖し、形質転換したクローンを、それらが認識する抗原性エピトープに基づいて、特異的にターゲット化することができる。自己免疫障害では、自己反応性であるT細胞クローンもまた、それらの同種エピトープに基づいて、ターゲット化することもできる。それらの抗原特異性に基づいてT細胞クローンを排除することによって、オフターゲット効果が最小である正確なターゲティングが可能になる。これまでに試験されたアプローチは、特定のTCR可変領域を認識するモノクローナル抗体によるものであった。特定のTCR可変領域をターゲット化することによって、正確さは提供されるが、同じ抗原を特異的に認識しながら種々の可変領域を含むことがあるTCRをターゲット化することは可能にならない。更に、この手法は、所与の可変領域を含む全てのTCRを、それらの特異性に関係なく、排除してしまうことがある。いくつかの実施形態では、SABRにより、TCRを、それらの抗原特異性に基づいて、ターゲット化することが可能になる。所与のエピトープを提示するSABRを形質導入したT細胞を治療的に使用し、特定の病原性T細胞を排除することができる。更に、T細胞クローンによって認識され得る抗原を同定することを、それらの天然の同種抗原を知らない時でも、SABRを開発するために使用することがある。いくつかの実施形態では、既存の技術の欠点を、シグナル伝達及び抗原提示をSABRを介して連結することによって、克服することができる。抗原提示とシグナル伝達を組み合わせることにより、SABRは、所与のTCRによって認識される細胞中でシグナル伝達が始まり、機能的なアウトプットを生成する、安定な、拡張可能な、高スループットな、及び高感度なアプローチを可能にする。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、MHC分子は、T細胞によって認識されるために、細胞表面上にペプチド・エピトープを提示する。天然型では、MHC分子はシグナル伝達ドメインを欠き、抗原提示細胞に何らシグナルを伝達できない。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、MHC分子の細胞内末端にシグナル伝達ドメインを付加するキメラ・コンストラクト(例えば、SABR)に関する。いくつかの実施形態では、これらのSABRは、抗原を提示することができ、T細胞によって認識されると細胞内シグナルを誘導することができる。いくつかの実施形態では、SABRは、例えば、ペプチド・エピトープをT細胞に提示するMHC分子に基づいた1種以上の抗原認識ドメイン等を含む、2種以上の別個の機能的部分を有する。いくつかの実施形態では、これらを、遺伝子的にコードさせ、MHC分子に共有結合させるか、又は細胞において発現させ、MHC分子によって自然に提示させることがある。更に、いくつかの実施形態では、前記SABRは、SABRがそれらの同種T細胞に結合すると転写反応を誘導する細胞内シグナルを誘導する1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。SABRコンストラクトを、例えば、がん、自己免疫疾患、及び感染症における抗原探索のために、特定のT細胞を排除する免疫療法アプローチのために、抗原特異的サイトカイン・シグナリングを誘導するために等、多種多様な目的のために使用することがある。
【０１７２】
図3Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABRの機能を実証するために使用するT細胞及びターゲット細胞の概略図を示す。いくつかの実施形態では、クラスI SABR 302を、図1Cに示す2つのコンストラクトに基づいて構築することがある。これらには、MHCに共有結合したペプチド・エピトープからなるSCTRコンストラクト、及びいくつかの実施形態では、MHCに遺伝子的に結合していないペプチド・エピトープを提示させることができるSCDRコンストラクトが含まれる。いくつかの実施形態では、前記SCTRコンストラクトを、例えば、A2-NYESO(がん特異的なMHC-抗原の組合せ)又はB27-KK10(HIV特異的なMHC-抗原の組合せ)の何れかを発現するように構築することがある。いくつかの実施形態では、A2及びB27のSCDRコンストラクトを構築することがあり、そしてペプチドを使用して、例えば、NYESO又はKK10抗原の何れかを提示させることがある。いくつかの実施形態では、例えば、NFAT-GFP-Jurkatsに、SCTRコンストラクト又はSCDRコンストラクトを形質導入することがあり、そしてレポーター細胞 304としてペプチド抗原でパルスすることがある。いくつかの実施形態では、前記レポーター細胞304は、例えば、A2-NYESO特異的TCR又はB27-KK10特異的TCRの何れかを発現するJurkat細胞306によって、シグナルを導入させることがあり、そしてGFP+ 細胞の頻度をフロー・サイトメトリーで測定することがある。
【０１７３】
図3Bに示すように、NFAT-GFP-Jurkatsは、SABRがMHC-抗原を特異的に認識した時にのみGFPを発現することができる。図3Cは、様々な実施形態による、B27-KK10-SCTRコンストラクトを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を使用する同様なアッセイを示す。いくつかの実施形態では、Jurkat細胞に、4人の異なるHIV患者に由来する4種の異なるB27-KK10特異的TCRを形質導入し、それらをNFAT-GFP-Jurkat細胞とインキュベートすることがある。図3Cに示すように、前記レポーター細胞は、4種のTCRすべてによって認識されると、GFPを発現することができる。従って、いくつかの実施形態では、クラスI SABRは、上述の提案された方法で機能し、レポーター細胞株で使用することがある。
【０１７４】
図4Aは、本明細書の様々な実施形態による、T細胞の抗原探索をするために、様々なSABRコンストラクトを使用することを説明する概略図を示す。図4Bは、本明細書の様々な実施形態による、TCRの交差反応性を検討する為に、又はヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定する為に、SCTRを使用することを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、これらのアプローチを使用して、がん特異的な、病原体特異的な、又は自己反応性のT細胞の抗原反応性を同定することができる。いくつかの実施形態では、がん、病原体、正常細胞のプロテオームに由来する抗原又は抗原性エピトープを発現するSABRライブラリを構築することがある。いくつかの実施形態では、これらのライブラリを、例えば、がん免疫、糖尿病及び神経変性障害等を含む自己免疫障害、病原体に対する免疫、及びワクチン応答におけるT細胞の特異性を同定するために使用することがある(図4A)。いくつかの実施形態では、所与のT細胞の特異性について、同種エピトープのバリアントを発現するSABRライブラリを構築し、これを用いて、TCRの交差反応性を理解し、ヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定することがある(図4B)。
【０１７５】
図5Aは、様々な実施形態による、特定のT細胞が特異的な抗原を認識するのに応じて、SABRが毒性を誘導することができることを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、SABRはまた、他の病原性T細胞をターゲットとするようにT細胞の特異性を変えることもできる。SABRはCARに類似したシグナリングを T細胞中で誘導することができるので、SABRを、それらが認識するT細胞に対する細胞毒性反応を開始するために用いることができる。いくつかの実施形態では、所与の抗原を認識するSABRを形質導入した治療用T細胞502を、図5Aに記載されるような特異的な様式で、病原性T細胞504を特異的に排除するために使用することがある。いくつかの実施形態では、この性能を、図5Bに記載されるような細胞毒性アッセイを用いて試験することがある。いくつかの実施形態では、初代T細胞を、2つの異なったA2-NYESO-SCTRコンストラクトで形質導入し、エフェクター／治療用T細胞として、それらの使用を可能にすることがある。いくつかの実施形態では、A2-NYESO-、A2-MART1-、又はB27-KK10特異的なTCRを発現するJurkat細胞をターゲット細胞として使用することがある。いくつかの実施形態では、治療用T細胞及びターゲット細胞を共インキュベートし、そしてターゲット細胞の生存を24時間後に測定することがある。図5Bに記載されるように、A2-NYESO-SCTRはA2-NYESO特異的なTCRを発現するターゲット細胞に対して特異的に細胞毒性を誘導することができ、SABRの細胞毒性機能を実証する。いくつかの実施形態では、これらの結果に基づいて、SABRを使用して、T細胞レパートリーから抗原特異性を排除することができる。例えば、自己免疫疾患では、病原性T細胞は自己反応性のT細胞であることがあり、これは、それらの同種自己抗原を発現するSABRによって認識されることがある。例えば、T細胞白血病の場合、病原性T細胞はクローン的に増殖したT細胞であってもよく、これはそれらの同種抗原又はそれらによって認識されることがあるヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を発現するSABRによって認識されることがある。いくつかの実施形態では、SABRの特異性によって、SABRが、正常なT細胞レパートリーをターゲットとしない一方で、特定のT細胞を特異的にターゲットとすることが可能になる。
【０１７６】
要約すると、本明細書中に記載される種々の実施形態において、SABRを、抗原提示とシグナル伝達とを共役させるための、安定な、拡張可能な、特異的な、及び多様な方法として使用することがある。様々な実施形態において、この機能をいくつかの異なる方法で利用し、T細胞の特異性を理解し、操作することがある。
【０１７７】
特定の実施形態において、SABRを、抗原探索のために使用することがある。抗原探索のための現行の技術には、MHC多量体、機能的アッセイ、酵母ディスプレイ、質量分析、及びDNAバーコーディング／NACSが含まれる。これらの技術には、拡張可能性に欠けること、多くのMHC対立遺伝子に拡大することができないこと、特殊な機器を必要とすること、及び安定性に欠ける、等を含むいくつかの欠点がある。更に、現行の技術は全て、がん特異的なT細胞、及びMHC-I抗原に焦点が当てられている。MHC-II抗原を同定する為のアプローチ／戦略はひどく不足している。
【０１７８】
MHC多量体は、ペプチド・エピトープを合成し、ビオチン化MHC分子でそれらをリフォールディングすることによって産生される。しかし、MHC多量体は、一度に10〜100種の抗原に限定され、従って、拡張可能ではない。更に、MHC-II抗原のための多量体を作製することは、それらの固有の不安定性のために技術的に困難である。ELISPOTのような機能的アッセイはまた、ペプチド・エピトープを合成し、及びそれらをターゲット細胞表面上に提示させることに依存する。これは一般的な技術であるが、多数のMHC-I及びMHC-II対立遺伝子、並びに広範囲のエピトープ、を含むようにスケール・アップすることは複雑である。酵母ディスプレイ技術は、酵母細胞表面上でMHC-ペプチドを提示することを利用し、続いて可溶性TCRを使用して酵母を染色する。可溶性TCRを産生することは非常に不安定であり、時間がかかり、従って容易に拡張可能ではない。質量分析技術は、抗原提示細胞の質量分析に基づいて、予想される抗原性エピトープを同定する。しかしながら、質量分析は大量の組織を必要とし、これは、I型糖尿病のような多くの疾患について、入手することが困難である。更に、それはまた、MHC多量体に基づく検証も必要とする。最後に、DNAバーコーディング／NACSは、チップ又はビーズ上に固定化された、バーコード化して特殊化されたMHC多量体を使用する。効果的ではあるが、この技術は細胞を捕捉し、それらのバーコードを読み取るための特殊な装置を必要とすること、及び一度に多数のサンプルを取り扱うことができないこと、によって限界がある。
【０１７９】
本明細書中のいくつかの実施形態は、T細胞の抗原反応性を探索する及び検証する為の新規な技術を対象とする。T細胞は、感染症やがんと闘う適応免疫系に不可欠な役割を果たす。T細胞はその表面のTCRを用いて、MHCタンパク質によって提示される抗原性ペプチド・エピトープを認識する。MHC表面上に提示される抗原は、病原体(例えば、インフルエンザ・ウイルス由来のペプチド)、がん性細胞(例えば、メラノーマ細胞表面上に発現するMART1/MelanAペプチド)、又は正常な細胞(例えば、正常な膵臓細胞由来のプロインスリン・ペプチド)の何れかに由来することがある。T細胞反応は、それらの正常な型では防御的であるが、調節不全になると病原性になることがある。
【０１８０】
T-細胞はウイルス感染やがんに対する免疫に必須であるが、機能不全になるとI型糖尿病のような自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。T細胞の研究における最大の課題の1つは、それらが認識する特異的タンパク質抗原を発見することである。いくつかの実施形態では、SABRを使用して、タンパク質抗原を提示し、それらを認識するT細胞に関して測定可能なアウトプットを誘導することがある。いくつかの実施形態では、SABRのこの性能によって、抗原同定の課題を解決することができ、そしてT細胞を介した療法を開発するのに恩恵がもたらされる。本明細書中のいくつかの実施形態は、例えば、がん、I型糖尿病, 多発性硬化症、HIV/AIDS、及びその他等を含む多数の疾患における抗原探索において使用するためのSABR技術を使用することに関する。例えば、図19は、本明細書中のSABR技術と組み合わせた場合に、1型糖尿病の治療において有益であり得る抗原性エピトープを示す。
【０１８１】
病原体又はがんに対する等の防御的な細胞反応を、ワクチン又は免疫療法を介した予防／治療のために、操作する。自己抗原に特異的な、機能不全となったT細胞反応は、I型糖尿病において正常な膵臓細胞にターゲティングする等、病原性であることがある。2種類のT細胞が免疫反応を仲介する：クラスI MHC(MHC-I)分子上に提示された8〜12残基の長さのペプチドを認識し、感染した又はがん性細胞を直接的に殺傷することを開始するCD8+ T細胞、及びクラスII MHC(MHCII)分子上に提示された12〜17残基の長さのペプチドを認識し、CD8+ T細胞を免疫学的に助けるCD4+ T細胞。CD8+ T細胞とCD4+ T細胞の両方が、防御性の免疫と病原性の免疫に重要な役割を果たしている。これらの細胞がターゲットとする抗原を理解することは、これらの反応を操作する為の重要なファクターである。ターゲットとなる抗原を同定し、検証する為の技術がますます必要とされている。
【０１８２】
本明細書中の様々な実施形態は、所与のT細胞がターゲットとする抗原性エピトープを同定する及び／又は検証する為の新規な技術を対象とする。いくつかの実施形態では、その技術は、SABRと呼ばれる合成タンパク質に依存している。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、SABRは、細胞外MHCドメインを介して抗原性エピトープを提示すること、及びそのエピトープを認識すると、細胞内シグナル伝達ドメインを介して測定可能な細胞シグナルを開始すること等を含む、種々の機能を実行する。いくつかの実施形態では、これらの2つの機能を組み合わせることによって、SABRは、抗原を提示し、次いで、T細胞がその抗原を認識する場合、シグナルを伝達することができる。いくつかの実施形態では、認識された細胞を標識するために、伝達されたシグナルを、レポーター遺伝子、例えばGFP、の発現等、測定可能なアウトプットに変換することがある。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載するSABRの種々の性能を、ELISPOTアッセイと同様に、所与の抗原に対する反応性をスクリーニングする、又は確認するために使用することがある。様々な実施形態による、この戦略の例示的な使用には、インフルエンザ感染において、ワクチン／疾患により誘発されるT細胞反応をモニタリングすること、及びI型糖尿病において、病原性の自己反応性T細胞をスクリーニングすること、が含まれる。或いは、いくつかの実施形態では、多数の抗原を提示するSABRのライブラリを、特異性が未知であるT細胞が認識する抗原を同定するために、構築することがある。様々な実施形態によるこの方法の例示的な使用には、腫瘍浸潤リンパ球が認識する腫瘍抗原を同定すること、及びがん患者におけるネオ抗原に特異的なT細胞反応を同定すること、が含まれる。
【０１８５】
本明細書中の様々な実施形態によれば、本SABR技術は、拡張可能性、使用の容易さ、MHC-II抗原を同定する性能、及びより容易な商業化等を含む、既存の技術を超える主要な利点を提示する。従って、いくつかの実施形態では、SABR技術を、感染性疾患、がん、及び自己免疫疾患のT細胞抗原の探索、診断、及び検証を可能にすることができる、商業的な方法又はキットに使用することができる。いくつかの実施形態では、前記SABR技術を、SABRを発現させる為のプレパッケージされたレンチウイルス・ベクター及びSABRを発現する細胞ベースのライブラリを含めて、商業化することができる。
【０１８６】
SABR技術の利点
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRライブラリ技術は、多数の利点を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRライブラリを、懸案である疾患に応じて、柔軟なスケールで、例えば、ライブラリ中に1〜106種以上の抗原で、100、200、300、400、1000、又はそれ以上の種類の抗原で、構築することがある。いくつかの実施形態では、前記ライブラリには、完全なタンパク質のエピトープを同定する為の数百の抗原、疾患に関する数千の抗原(ネオ抗原、リステリア)、又は広い識別のための数十万の抗原が含まれることがある。
【０１８７】
更に、いくつかの実施形態では、このスケール・アップ／スケール・ダウンは、特殊な装置を必要とせずに、通常の免疫学実験室で行うことができる。SABRライブラリは、任意の数のMHC対立遺伝子に対して構築することもでき、汎用的な又は患者特異的な抗原ライブラリの間を切り換えるのを容易にする。更に、いくつかの実施形態では、意図される製品及びその使用は、日常的な実験室手順のフォーマットである。従って、製品を使用する為のターンアラウンド時間は、3〜5日程度に短くすることができる。更に、酵母ディスプレイ又はDNAバーコーディングとは異なり、前記SABR技術は、一度に多数サンプルを扱うことができ、スループットを増加させる。最後に、いくつかの実施形態では、SABRライブラリは、MHC-I抗原に主に限定される現行の技術とは異なり、MHC-I及びMHC-II抗原の両方について構築することができる。いくつかの実施形態では、この汎用性により、多数の自己免疫疾患に対して、前記SABR技術を使用することが可能になる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、前記SABR技術は、他のアプローチよりも著しいコスト面の利点を有し得る。いくつかの実施形態では、前記技術を実施することは、通常の免疫学実験室が有していない特殊な装置の使用を何ら必要としない。例えば、いくつかの実施形態では、前記技術をアカデミック／産業界の研究室で実施するのに、フロー・サイトメトリーをベースとしたセル・ソーター及びイルミナ・シークエンシング装置にアクセスすることで充分である。これまでの技術は、特殊な装置、例えば質量分析計(MS)へのアクセス、又はDNAバーコーディング／NACSのための特殊なチップが必要であることから、制限を受ける。また、いくつかの実施形態では、他の技術とは異なり、前記SABR技術は、それを実施するのに重要である特殊な試薬を合成することを何ら必要としない。例えば、酵母ディスプレイ技術は、非常に不安定で、時間のかかる／お金のかかるタンパク質精製を必要とする可溶性TCRを合成することを、必要とする。いくつかの実施形態では、SABRを、一般的なBSL2実験室環境で行うことができる簡単な細胞ベースのアッセイで使用する。いくつかの実施形態では、前記SABR技術は、多数サンプルを一度に処理することができるので、より高いスループットを提供する。これまでの技術のほとんどは、一度に1人の患者サンプルのみを取り扱うことができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、前記SABR技術を、大きなスケールで工業化することがある。いくつかの実施形態では、ライブラリにおいてコードされ得る抗原の数を、疾患／ユーザ特異的である要件に従いながら、スケール・アップ／スケール・ダウンすることがある。例えば、患者特異的なスクリーニングのためのがんネオ抗原のライブラリは、6000種のペプチドをコードすることがあり、一方、多数のクラスI HLA対立遺伝子の汎用ライブラリには、〜106種のペプチドがあることがある。いくつかの実施形態では、このレベルでの拡張可能性は、大規模なオリゴヌクレオチド合成が可能かによる。いくつかの実施形態では、所与のSABRのライブラリは、例えば、約105〜106細胞であることがある。いくつかの実施形態では、この数字を、市販の細胞株と同様に、比較的容易にスケール・アップすることができる。
【０１９０】
本明細書で記載される実施形態のうちの何れかの1つ以上を、以下で記載される実施形態のうちの別の1つ以上と組み合わせることがある。以下で記載される組成物のうちの何れかの1つ以上を、以下で記載される方法及び／又はメカニズムのうちの何れかの1つに、組み合わせることがある、又は置換することがある。
【実施例】
【０１９１】
実施例１：SABR、ペプチド融合、シグナリング・ドメイン-MHC、MHC-ペプチド抗原
ターゲット抗原を認識したときのT細胞の活性化によって、検出可能な遺伝子発現が誘導される。しかしながら、MHC分子はシグナリング・ドメインを欠くため、認識されたAPCを検出することは困難である。細胞内シグナリング・ドメインをpMHC複合体に融合させることにより、シグナル伝達が可能になる。SABRと呼ぶキメラ・レセプターを構築した。SABRの細胞外ドメインは、共有結合したペプチド-β2ミクログロブリン-MHC三量体であり、CD28共刺激ドメインを有する細胞内CD3ζシグナリング・ドメインに融合している。図6Aに見られるように、MHC分子全体又はMHC分子の細胞外部分のみを、それぞれ含むSABRの2つのバリエーション（SABR-F及びSABR-E）を構築した。図6Aは、様々な実施形態によるSABR-F及びSABR-Eのコンストラクトを示す概略図を示す。SABR-F 600Aは、HLA由来の膜貫通ドメイン602Aを含み、一方、SABR-E 600BはCD3ζ由来の膜貫通ドメイン602Bを含む。2本の水平線は、細胞膜の2つの層を示す。図6Bは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkatsにおいて、8時間での%GFP+ 細胞をY軸上に示す棒グラフを示す。共培養アッセイは、50,000個のターゲット細胞及び50,000個のエフェクター細胞を用いて行った。図6Bにおいて、バーは、平均±sd、n=12を示す。
【０１９２】
TCRと相互作用すると、その同種抗原を提示するSABRは細胞内シグナルを誘導することがある。図7Aは、一本鎖三量体(SCT)及び抗原(Ag)を用いて、SABR及びTCR-pMHC特異的なシグナル伝達を実証する概略図を示す。図7Aにおいて、点線はGly-Serリンカーを示す。シグナリング・ドメインをもたないSCTは、TCRによって認識された場合でも、抗原提示細胞において細胞内シグナルを誘導しないであろう。同様に、関連性がない抗原を提示するSABRは、TCRによって認識された場合、細胞内シグナルを誘導しないであろう。しかしながら、同種抗原を提示するSABRは、TCRによって認識された場合、細胞内シグナルを誘導するのであろう。
【０１９３】
SABRによって誘導されるシグナルを検出するために、NFAT-GFP-Jurkat細胞を使用し、これは、CD3ζを介してシグナルを受け取るとGFPを発現する。NFAT-GFP-Jurkat細胞は、HLA-A*0201上にEAAGIGILTVエピトープ(MART1タンパク質由来)を提示するSABR(以下、A2-MART1-SABRとする)、又はHLA-B*2705上にHIV-1由来のKRWIILGLNKエピトープ(KK10、HIV-1 Gagタンパク質由来)を提示するSABR (以下、B27-K10-SABRとする)を形質導入した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、TCRを発現するJurkat細胞と共インキュベートしてシグナル伝達をさせ、8時間後にフロー・サイトメトリーでGFP発現を測定した。具体的には、F5(A2-MART1を認識する)、EC27(B27-KK10を認識する)、SL9(A2-SLYNTVATLを認識する)TCR又は形質導入をしていないJurkat細胞を用いた。同種のTCR-SABR-Fペアとの共培養アッセイにおいてのみ、強固なGFP発現が検出された。図7Cは、TCRを形質導入したJurkat細胞との共培養における、SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFPの発現を示す。図7B内では、Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後での%GFP+ 細胞を示す。図7C内では、バーは、平均±sd、n=3を示す。図7Bは、図7Cのアッセイから得られた代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。図7B内では、GFP+ 細胞の頻度をパーセンテージで示す。
【０１９４】
SABR-Fコンストラクトは、SABR-Eコンストラクトよりも高いシグナルを示した。そこで、SABR-Fコンストラクトを更なる実験に使用した。SABRがポリクローナル集団において、T細胞特異性を検出できるかどうかを試験するために、F5 TCRを発現するJurkat細胞の数を、形質導入していないJurkat細胞でタイトレーションし、それらをA2-MART1-SABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートした。SABRシグナルは、タイトレーション可能であり、モックで形質導入した10,000個のJurkat細胞と混合して少なくとも10個程度のF5+ Jurkat細胞を検出するのに十分な感度であった。
【０１９５】
図7Dは、SABRにより僅かな細胞数を検出することを示すグラフである。図7D内で、前記Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後でのGFP+ 細胞の数を示す。X軸は形質転換していないJurkat細胞と混ぜたF5+ Jurkat細胞の個数を示す。図7Dにおいて、バーはn=1の値を示す。図7Eは、F5を形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞が、GFPを発現する時間経過を示す。Y軸は、50,000個のエフェクター細胞及び50,000個のターゲット細胞で実施した共培養アッセイにおける%GFP+ 細胞を示す。図7Eにおいて、点は平均±sd、n=3を示す。
【０１９６】
図7E及び図7Fに示すように、GFPシグナルは共インキュベーションの3時間以内に検出可能になり、6〜8時間以内に飽和に達したので、SABRシグナルは急速でもあった。図7Fは、図7Eに示した試験からの典型的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。図7Fにおいて、右下隅の長方形は、GFP+ 細胞を計数する為のゲートを示す。それぞれのサンプルを収集した時刻を時間として示す。GFP+ゲート内における細胞の頻度をパーセンテージとして示す。
【０１９７】
総合すると、これらの結果は、特異的なTCR-pMHC相互作用があったとき、SABRがシグナリングを誘導し、認識されたAPCを同定することを可能にすることを示している。
【０１９８】
実施例２：SABRは、異なるモードの抗原提示を可能にする
上記の内生的なMHC複合体は、交差提示を介して、新たに翻訳されたタンパク質又はエンドサイトーシスされたタンパク質に由来するエピトープを提示する。SABRも、これらの経路を抗原提示に利用できるかどうかを検証するために、β2-ミクログロブリンをA2又はB27と連結したが、エピトープを遺伝子的にコードしていない「空」型のSABRを構築した。図8Aは、エピトープ(EP)、シグナル配列(S)、及びMHCクラスI輸送シグナル(MIHC)を有する、様々な実施形態による、SCT、SABR、空のSABR、及びタンデム・ミニ遺伝子(TMG)を示す概略図を示す。図8Aにおいて、数字1〜6はGly-Serリンカーを示す。図8Bは、様々な実施形態による、BsmBI部位を含むスタッファー・フラグメント（stuffer fragment）を有するSABRベクターのコンストラクト、及びオーバーラップを隣接させたエピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを使用するクローニング方法を示す。図8Cは、様々な実施形態による、空のSABRコンストラクトを示す。図8Dは、本明細書の様々な実施形態による、空のSABR(即ち、コードされたペプチドがない)及び内生的に発現したペプチドを示す。
【０１９９】
SABR-APCを可溶性ペプチドと一緒にインキュベートして、これらのペプチドの提示及び認識について試験をした。図8Eは、外因性ペプチドでパルスした、空のSABRの概略図を示す。空のSABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を可溶性のMART1又はKK10ペプチドとインキュベートし、F5又はEC27 TCRを発現するJurkat細胞と共培養した。
【０２００】
図8Fは、空のSABRを形質導入した、可溶性MART1又はKK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現を示すグラフを示す。Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞で行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後における、%GFP+ 細胞を示す。バーは、平均±sd、n=3を示す。A2及びB27両方の空のSABRは、前記TCRに対応する可溶性ペプチドが存在するときにのみシグナルを誘導し、ミスマッチ・ペプチドが存在するとき又は可溶性ペプチドが存在しないときには誘導しなかった。更に、正しいペプチド-TCRの組み合わせによって誘導されたシグナルは、対応する共有結合したエピトープを提示するSABRによって誘導されたシグナルと同等であった。
【０２０１】
内生的にプロセシングされたペプチド・エピトープを試験して、それらが「空の」SABR上に提示され得るかどうかを測定した。そのために、五量体TMGを、4種の関連性の無いCMV由来エピトープと共にKK10エピトープを発現するように構築した。図8Gは、TMGの新たに翻訳されたエピトープを提示する空のSABRの概略図を示す。
【０２０２】
NFAT-GFP-Jurkat細胞に、空のB27-SABR及びKK10 TMGを一緒に形質導入した。EC27又はF5発現Jurkat細胞との共インキュベーション後、前記「空の」SABRは、図8Hに例示されるように、内生的に発現するエピトープを提示し、特異的なシグナリングを誘導することが可能であった。図8Hは、空のB27-SABR KK10-TMGを一緒に形質導入した、又は空のB27-SABRを形質導入して、KK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現のグラフを示す。Y軸は、50,000個のエフェクター細胞及び50,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後における、%GFP+ 細胞を示す。図8Hにおいて、バーは、平均±sd、n=3を示す。しかしながら、全体のシグナルは、対応する空のSABRを可溶性ペプチドでパルスしたものよりも低かった。これらの結果は、SABRが、内生的な抗原のプロセシング及び提示経路を介して生成されたエピトープを非共有結合的に提示することができることを示す。
【０２０３】
SABRは、内生的な抗原のプロセシング及び提示経路を介して生成されたエピトープを非共有結合的に提示することができる。図8Iは、本明細書の様々な実施形態による、CD3zシグナル伝達ドメインを有するSCDRのコンストラクトを示す。TCRを形質導入したJurkat細胞を、SCTRコンストラクトとインキュベートし、ペプチド抗原でパルスした。図8Jは、種々のTCR-ペプチドに変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。図8Kは、種々のTCR-ペプチド組成物及び濃度に変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。本結果は、T細胞シグナリングと同様に、SABRシグナリングが、提示されたペプチド量でタイトレーション可能であることを示す。
【０２０４】
図8Lは、本明細書の様々な実施形態による、タンデム・ミニ遺伝子(TMG)抗原を有するSCDRコンストラクトを示す概略図を示す。TCRを形質導入したJurkat細胞を、TMGを形質導入したSCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞とインキュベートした。図8Mは、種々のTCR-ペプチドに変えた時の%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。本結果は、SABRが抗原と直接的に連結していない場合、内生的なペプチド(細胞中のタンパク質に由来するフラグメント化したタンパク質配列)を提示することを示す。
【０２０５】
実施例３：SABRは、真正のTCRシグナルを開始する
SABRを治療ターゲットとして用いるために、患者の病原性T細胞に結合するSABRを同定することがある。前記SABRを、レンチウイルス・ベクター又はレトロウイルス・ベクターのような免疫療法のための適切なベクター中にクローン化することができる。患者自身の血液を白血球アフェレーシスに供し、続いてT細胞を分離することができる。前記T細胞は、OKT3抗体を使用するなど、市販の方法を使用して、活性化及び増殖させることができる。増やしたT細胞に、SABRを含むベクターで形質導入することができる。形質導入した細胞を、治療薬として患者体内に再注入することができる。適当なSABRを発現する増殖させたT細胞は、患者の病原性T細胞をターゲットとし、前記病原性T細胞を排除し、疾病の改善につなげるだろう。
【０２０６】
これを、1型糖尿病（病原性T細胞が、HLA-A2.1上のインスリン由来エピトープ(A2.1-インスリン)をターゲットとすることがある）に対して行うことができる。この場合では、インスリン・エピトープを提示するHLA-A2.1を含むSABR、及びシグナリング・ドメインをレンチウイルス・ベクターにクローニングすることができる。患者自身のT細胞を増殖させ、A2.1-インスリン-SABR発現ベクターで形質導入することがある。前記細胞を前記患者に再注入することがあり、前記細胞は、A2.1-インスリンをターゲットとする病原性T細胞を排除することができる。
【０２０７】
SABRは、キメラ抗原レセプター(CAR)及びTCRと同様に、細胞内シグナリングにCD3ζ-CD28ドメインを用いる。そこで、SABRの細胞内シグナリング能はTCRと同等であることを試験した。NFAT-GFP-Jurkat細胞において、SABRが初期活性化マーカーを誘導する性能を試験した。A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞は、F5 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養をしたときに、初期のT細胞活性化マーカーであるCD69を発現した。図9Aに示されるように、A2-MART1一本鎖三量体ではなく、A2-MART1-SABRを発現する細胞において、レポーター駆動性GFP及び内生的なCD69が共発現することは、SABRシグナリングが内生的な遺伝子発現を活性化することを意味する。図9Aは、SABRによるCD69の誘導に関する実験の、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。SABRを形質導入した10,000個のNFAT-GFP-Jurkat細胞及びF5 TCRを形質導入した10,000個のJurkat細胞を用いた共培養アッセイにおいて、GFP及びCD69が発現することが示される。各ゲートにおける細胞の頻度を、パーセンテージで示す。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、SABRが真正のTCRシグナルを誘導する場合、それらは初代T細胞にとって細胞毒性となることがある。活性化した初代T細胞をA2-MART1-SABRで形質導入し、F5 TCRを発現するCFSEで標識したターゲット細胞とインキュベートした。図9B及び図9Cに示すように、形質導入した初代T細胞は、F5 TCRを特異的に発現するJurkat細胞又は初代T細胞を溶解した。図9Bは、SABRを発現する初代T細胞によってJurkat細胞に誘導された細胞毒性に関するグラフを示す。Y軸は、共培養後24時間でのCFSE標識ターゲット細胞の生存%を示す。細胞毒性アッセイは、200,000個のSABR形質導入細胞及び50,000個のTCRを形質導入した細胞を用いて実施した。図9Bでは、バーが平均±sd、n=8を示す。図9Cは、SABRを発現する初代T細胞によって自己ターゲット細胞に誘導された細胞毒性に関する棒グラフを示す。Y軸は、共培養後24時間でのターゲット細胞の生存%を示す。細胞毒性アッセイは、SABRを形質導入した200,000個の細胞及びTCRを形質導入した50,000個の細胞を用いて実施した。図9Cにおいて、バーは、平均±sd、n=8を示す。
【０２０９】
SABRとTCRの抗原感度を比較した。その目的のために、NFAT-GFP-Jurkat細胞を空のA2-SABR又はF5 TCRの何れかで形質導入し、エフェクターとして使用した。ターゲットとして、図9Dに示すように、A2-SABR又はF5 TCRで形質導入したJurkat細胞を使用した。図9Dは、A2-SABR 902及びF5-TCR 904の抗原感受性を測定する為のアッセイの概略図を示す。
【０２１０】
ある範囲の濃度のMART1ペプチドの存在下で、エフェクターをそれらの同種ターゲットと共培養し、GFP発現を測定した。抗原感度は、最大シグナリングの半分のシグナリングに必要なペプチドの濃度として決定した。図9Eに示すように、SABRの抗原感度はTCRと比較して30倍低かった。図9Eは、SABRの抗原感受性及びTCRシグナリングに関するプロットを示す。図9Eは、SABR及びTCRシグナリングの抗原感度のプロットを示す。Y軸は、MART1ペプチドでパルスしたSABRを又はTCRを形質導入した50,000個の細胞を用いた共培養アッセイにおける、8時間での%GFP+ 細胞の%最大を示す。X軸は、前記細胞をパルスするために使用したMART1ペプチドの濃度を示す。図9E内で、点は、平均±sd、n=3を示す。水平の点線は、最大シグナルの半分のシグナルを示している。
【０２１１】
まとめると、これらの結果は、SABRは、TCRに類似したシグナルを、いくつかの例では、抗原感度がより低いが、伝達することを示している。
【０２１２】
上記の実施例３はまた、治療薬としてのSABRの例である。例えば、前記F5 TCRを、1型糖尿病抗原を認識するTCRのような病原性TCRで置換することができる場合である。その治療用シナリオでは、有効性を示すために、同様の実験を行うことがあり、前記SABRは、病原性TCRによって認識される抗原を提示している。前記SABRを発現する初代T細胞を使用して、病原性TCRに細胞毒性を誘導することができ、その後、治療上有益なことに、それらは排除される。
【０２１３】
実施例４：SABRライブラリを使用した抗原探索
いくつかの実施形態では、ペプチド・エピトープをMHCと遺伝子的に連結することにより、SABRを用いて、規定の抗原を提示し、それをTCRがうまく認識できるようにすることができる。そこで、TCR-pMHC相互作用をスクリーニングするために使用する多数のエピトープを提示するSABRライブラリ能を試験した。抗原未知の「オーファン」抗腫瘍TCRのT細胞抗原を探索するためのSABRライブラリを構築し、使用する戦略を作製した。まず最初に、ターゲット・エピトープのリストを、既存のデータベースから、又は腫瘍エキソーム・データから作製し、続いてMHC結合の予想を行った。ターゲット・エピトープをコードするプールしたオリゴヌクレオチド・ライブラリを合成し、図10Aに従ってSABRプラスミドにクローニングした。図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。左パネル1002は、エピトープのリストを取得して合成する手順を示している。右パネル1004は、SABRライブラリの概略図を示している。
【０２１４】
SABRライブラリをレンチウイルス・ベクターにパッケージングし、NFAT-GFP-Jurkat細胞に形質導入をするために使用した。SABRライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を、「オーファン」TCRを発現するJurkat細胞と共培養した。GFP+CD69+ NFAT-GFP-Jurkat細胞を、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting:FACS)を用いて選別し、続いてゲノムDNAを抽出した。図10Bに示すように、SABRのエピトープ部分を増幅し、ハイ・スループットなシークエンシングに供した。図10Bは、様々な実施形態による、オーファンTCRによって認識される細胞をSABRライブラリから選択する為の共培養実験を示す概略図である。左パネル1006は、多数の固有のエピトープを提示するSABRライブラリを示す。中央のパネル1008は、オーファンTCRの同種エピトープを提示するSABRによって誘導されるレポーターの発現を示す細胞APCを示す。右パネル1010は、選択された細胞を処理するステップを示す。
【０２１５】
このシークエンシング・リードを、Burrows-Wheelerアラインメントを使用して、SABRベクターの骨格と一緒にアライメントを行った。アライメントを行ったリードを翻訳して、そのエピトープを明らかにした。各エピトープに対応するリードの数をカウントし、リストに記録した。共インキュベーション・アッセイを最低3回反復した。各反復について、リードの数の降順に基づいて、各エピトープに数値による順位を付与した。各アッセイについての3つの反復からのランクを平均し、図10Cのフローチャートに従って「平均ランク」として記録した。図10Cは、様々な実施形態による、計算解析のパイプラインを示すフローチャートを示す。
【０２１６】
上位にランクしたエピトープは、そのTCRについての推定される抗原であり、その後、各エピトープを提示する個々のSABRを構築し、及び共培養アッセイにおいてGFP発現を測定することによって、検証する。
【０２１７】
図10A−10Cに詳述した方法のプルーフ・オブ・コンセプト（proof-of-concept）を実証するために、バイアスのない方法で公知のTCRの同種抗原を同定することで、SABRライブラリの性能を試験した。免疫エピトープ・データベース(Immune Epitope Database  (IEDB))の全ての既知のHLA-A*0201制限エピトープからなり、HLA-A*0201(A2-SABR-ライブラリ)上に提示される12,055種のエピトープをコードするSABRライブラリを構築した。既知の特異性を有する2つのTCR(EAAGIGILTVを認識するF5及びSLYNTVATLを認識するSL9)の同種抗原を同定することで、A2-SABR-ライブラリの性能を試験した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、A2-SABR-ライブラリで形質導入し、F5又はSL9 TCRを発現するJurkat細胞と一緒にインキュベートした。10時間の共培養後、GFP+CD69+ 細胞をFACSによって選別し、ゲノムDNAを抽出し、そのエピトープをシークエンシングし、記載したように各エピトープについての平均ランクを図10A〜10Cにおいて計算した。図11Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。A2-SABRライブラリ細胞を、レポーター遺伝子発現に基づいて選別した。900万個のライブラリ細胞を、TCRを形質導入した900万個のJurkat細胞と一緒に用いる共培養アッセイを設定した。共培養の10時間後に、前記細胞をCD69について染色し、FACSを用いて選別した。各フロー・プロットの右上隅の長方形1102は、選別に使用したゲートを示す。選別ゲート中の細胞の頻度をパーセンテージとして示す。
【０２１８】
SL9選別から得られた各エピトープの平均ランクをF5選別から得られた平均ランクに対してプロットした。図11Bは、F5及びSL9選別の平均ランクのプロットを示す。図11Bにおいて、各点は、図10A〜10Cに記載した方法を用いて計算した、固有のエピトープについての平均ランクを表す。Y軸はSL9選別の平均ランクを示し、X軸はF5選別の平均ランクを示す。点1104はEAAGIGILTVの類似体を示し、点1106はSLYNTVATLの類似体を示す。
【０２１９】
6種のエピトープは、F5選別におけるそれらの順位によって、別個のクラスターを形成した。SL9選別では、トップランクは異常値であったが、別個のクラスターを形成しなかった。図11Cは、F5選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクが付いたエピトープは、EAAGIGILTVの類似体を示す。図11Cに示すように、F5選別の上位6個のエピトープはEAAGIGILTVの類似体であり、これは、その抗原の同定に成功したことを示していた。
【０２２０】
図11Dは、SL9選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクが付いたエピトープは、SLYNTVATLの類似体を示す。図11Dに示すように、SL9選別の上位10個のエピトープのうち6個は、SLYNTAVATLの類似体であった。図11Eは、A2-SABRライブラリにおける全てのEAAGIGILTVの類似体についての平均ランクのプロットを示す。図11Fは、A2-SABRライブラリにおける全てのSLYNTVATLの類似体についての平均ランクのプロットを示す。図11E及び11Fに示されるように、エピトープは、それらの対応するTCRについて濃縮されたが、ミスマッチのTCRにおいては濃縮されなかった。
【０２２１】
SL9選別で観察されたノイズは、おそらく、SLYNTVATLペプチドの類似体の数が多いことによるものであった。前記A2-SABRライブラリは、EAAGIGILTVの22種の類似体及びSLYNTVATLの60種の類似体を含む。認識される類似体の数が多ければ多いほど、エピトープ間の競合のために、各エピトープについての平均ランクは低くなる。
【０２２２】
前記選別におけるEAAGIGILTV及びSLYNTVATLの全ての類似体のランクを比較した。図11Eに示すように、22種のEAAGIGILTVの類似体のうちの6種はF5選別で同定され、一方、図11Fに示すように、60種のSLYNTVATLの類似体のうちの9種はSL9選別で同定された。全ての類似体が同定されていないのは、おそらく、それらに対するF5又はSL9 TCRの交差反応性が減少していることに起因する。実際、類似体SLYNTIATL (V6I) 及び SLFNTVATL (Y3F)は、SLYNTVATLエピトープにおいて確認されているエスケープ突然変異である。ともあれ、これらの実験により、SABRライブラリ・アプローチが、何千ものエピトープをスクリーニングすることによって、TCRの同種抗原を同定し得ることが示された。
【０２２３】
実施例５：SABRを使用した個別化されたネオ抗原探索
SABRを、腫瘍の免疫療法のための候補T細胞レセプター(TCR)を同定するために実施することがある。腫瘍の生検に由来するゲノムDNA又はRNAをまずシークエンシングし、その患者由来の非腫瘍組織と比較する。「ネオ抗原」と称される、前記腫瘍に特異的な突然変異は免疫療法の理想的なターゲットであり、患者の体内の他の部位に免疫反応を誘導しないことが期待される。これらの突然変異のリストを作製し、患者のタンパク質のアミノ酸配列を変化させない突然変異を除外する。このリストを、これらの突然変異を含む短いペプチド(クラスI MHCについては8〜12アミノ酸、クラスII MHCについては12〜17アミノ酸)のリストを作製するために使用する。次いで、前記ペプチド・リストを、短いオリゴヌクレオチド配列（これは、それらのペプチドを遺伝子的にコードしていて、SABRベクターへのクローニングに必要なヌクレオチド配列を隣接して含む）に変換する。これらのオリゴヌクレオチドを、適切な分子技術を用いて、合成し、次いでベクターにクローニングする。次いで、そのベクターを、適切な技術を使用して、細胞に入れる。本発明者らの場合、前記ベクターをクローニングするために、Gibsonアセンブリを単純化するIn-Fusionキットを使用した。得られたプラスミドからレンチウイルスを作製し、NFAT-GFP-Jurkat細胞に感染させた。この一群の細胞は、それぞれが固有のSABRを発現し、本発明者らがSABRライブラリと呼ぶものである。総じて、それぞれの細胞は、腫瘍の変異をもつ固有の短いペプチドに連結したMHC分子を含み、それらのMHC分子はシグナリング・ドメインに直接的に繋がっており、SABRを作り出す。十分な量の細胞をレンチウイルスに感染させ、前記一群の細胞が短いペプチドのリストにある全ての突然変異を網羅するようにした。
【０２２４】
患者特異的な治療法を見つけるためのライブラリを用いるためには、TCRα及びβのフラグメントのRNAについて、同じ腫瘍生検のシークエンシングを行うのが良いであろう。これらのフラグメントは、腫瘍の抑制を試みて腫瘍に浸潤していたT細胞（腫瘍浸潤リンパ球(TIL)として知られる）に由来する。これらの細胞に由来する個々のTCRは、そのシークエンシングから再構築されるであろう（適当な任意の技術を使って、TCR配列を含むDNAフラグメントを合成し、ベクター中にクローニングする）。そのプラスミドのレンチウイルスを作製し、そのウイルスにJurkat細胞(NFAT-GFPレポーターを持たない)を感染させる。次いで、候補TCR細胞を、約8時間、SABRライブラリと一緒にインキュベートし、次いで、陽性シグナルを示す細胞についてFACS選別で選別する。本発明者らの場合では、前記レポーターはGFP及びCD69細胞マーカーの発現であった。選別された細胞からゲノムDNAを抽出し、シークエンシングをし、解析して、どの特異抗原が前記候補TCRによって認識されるかを決定する。本発明者らの場合では、前記ゲノムDNAをNucleoSpinカラムの抽出キットで抽出し、遺伝子的にコードされた抗原配列に隣接するプライマーでPCR増幅し、イルミナ・シークエンシングに特異的なプライマーで再増幅し、シークエンシングをした。得られたシークエンシング・データを短いペプチド配列のデーターベースと比較し、前記TCRがこれらのペプチドを認識する場合、抽出したゲノムDNAのプール中に濃縮された遺伝子配列が見られると予想される。
【０２２５】
もし、前記TCRが突然変異の配列を認識するが、非突然変異の配列を認識しない場合、それは免疫療法のよい候補となるであろう。これは、前記患者から免疫細胞を摘出すること、これらの細胞に所望のTCRを発現させるために所望される任意の技術を使用すること、及びこれらの養子細胞を前記患者に注入して、それらが腫瘍を攻撃し始めることができるようにすること、を含む。
【０２２６】
SABRライブラリの汎用性を更に実証するために、ネオ抗原探索のための個別化された手法を試験した。最近の研究により、DNAバーコーディング四量体を用いて、メラノーマ患者からネオ抗原特異的な腫瘍反応性TCRが同定された。同定されたTCR(neoTCR)は、USP7タンパク質中の非同義変異によって生成されたネオ抗原性エピトープを認識することが示された。前記SABRライブラリ法を用いて、前記腫瘍サンプルで同定された全ての考えられるネオエピトープをスクリーニングすることにより、neoTCRにより認識されるneo抗原性エピトープを同定した。その目的のためには、前記腫瘍で見出された108種の非同義変異に対応する、3291種の予想されるHLAA*0201制限エピトープを提示するSABRライブラリ(NeoAg-SABRライブラリ)を作製した。前記neoTCRを腫瘍反応性オーファンTCRの代用として用い、NeoAg-SABRライブラリを用いてその抗原を同定した。neoTCRを形質導入したJurkat細胞を、NeoAg-SABRライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共培養し、GFP+CD69+細胞を選別し、選別した細胞に由来するエピトープをシークエンシングし、ランク付けした。図12Aは、1回の反復から得られた代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。レポーター遺伝子発現に基づいて、NeoAg-SABRライブラリ細胞を選別した。TCRを形質導入した600万個のJurkat細胞と一緒に600万個のライブラリ細胞を用いた共培養アッセイを設定した。共培養の10時間後に、細胞をCD69について染色し、FACSを用いて選別した。各フロー・プロットの右上隅の長方形1202は、前記選別をするのに使用したゲートを示す。前記選別ゲート中の細胞の頻度を、パーセンテージとして示す。
【０２２７】
それぞれのエピトープについて、モック選別に対するneoTCR選別の平均ランクをプロットした。図12Bは、neoTCR及びモック選別の平均ランクのプロットを示す。図12B内では、各点は、図10A〜10Cに記載された手順を用いて計算した固有のエピトープの平均ランクを表す。Y軸はneoTCR選別における平均ランクを示し、X軸はモック選別における平均ランクを示す。点1204は、USP7に由来するエピトープを示す。7種のエピトープは、neoTCR分類におけるそれらの順位によって分離された別個のクラスターを形成した。
【０２２８】
図12Cは、neoTCR選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクを付けたエピトープは、USP7に由来するエピトープを示す。前記neoTCR選別における上位7ヒットはUSP7に由来するエピトープであり、本発明者らのアプローチを用いてネオ抗原をきちんと同定できることが実証された。
【０２２９】
図12Dは、NeoAg-SABRライブラリにおける全てのUSP7に由来するエピトープの平均ランクのプロットを示す。USP7における非同義的なD798Y変異は、30種のオーバーラップしたエピトープを生成すると予測され、そのうち7種がneoTCRの同種エピトープとして同定された。残りの23種のエピトープがそのスクリーニングにおいて認識されなかった理由は、おそらく、neoTCRによって認識されるエピトープの幅（register）が限られているためである。7種の検出されたエピトープを検証するために、それらを提示する為の個々のSABRを構築した。図12Eに示されるように、これらのSABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞は、neoTCRを発現するJurkat細胞と共培養したときに、GFP発現を誘導した。図12Eは、NeoAg-SABRスクリーニングで同定された上位ヒットの妥当性評価を示すプロットを示す。Y軸は、neoTCRを形質導入したJurkat細胞と共培養したNFAT-GFP-Jurkat細胞において、8時間でのGFP発現を示す。neoTCRを形質導入した10,000個のJurkat細胞を、エピトープを提示するSABRを発現している10,000個のNFAT-GFP-Jurkat細胞と一緒に用いて共培養アッセイを設定し、X軸に示した。モックには、形質導入していないNFAT-GFP-Jurkat細胞が含まれていた。図12E内で、バーは平均±sd、n=4を表す。
【０２３０】
これらの結果は、本明細書に提示される抗原探索のアプローチに関して、妥当であること並びに個別化がうまくいくことを実証する。まとめると、本結果は、前記SABRがT細胞の抗原探索のための強力なツールであることを示している。
【０２３１】
実施例６：材料及び方法
実施例１〜５で使用した具体的な試薬を表6.1に詳述する。クローニング及びシークエンシングに使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを表6.2に列挙する。A2-SABRライブラリのエピトープのリストを表6.3に示した
【０２３２】
表6.1
【表４】
2020534809.tif 000075
2020534809.tif 000076
2020534809.tif 000077
【０２３３】
表6.2
【表５】
2020534809.tif 000078
【０２３４】
表6.2の中で、NNN…NNNは逆翻訳したエピトープを示し、［index］は、シークエンシングに使用される6ヌクレオチドの固有のインデックスを示す。
【０２３５】
実施例１〜５について、Jurkat細胞(ATCC)を、10%ウシ胎仔血清(Corning)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Corning)を添加したR10(RPMI1640(Corning))中で培養した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、2 mg/mlのG-418(Corning)を添加したR10中で培養した。初代T細胞を、Immunocult CD3/28(StemCell Technologies)及び40 U/ml IL-2(Miltenyi Biotec)を添加したR10中で活性化させた。D10(10%ウシ胎仔血清(Corning)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Corning)を添加したDMEM(Corning))中で、HEK-293T細胞(ATCC)を培養した。ペプチドEAAGIGILTV及びKRWIILGLNKを、Pierce Thermo Fisherで合成した。
【０２３６】
実施例１〜５のSABRを構築するために、β2-ミクログロブリン及びHLAをコードする単一分子をgBlocksとして合成し(IDT)、プライマーSS-Fwd及びCD28-Overlap-HLA-Revを用いて増幅した。CD3ζ/CD28シグナリング・ドメインを、プライマーCD28Intracell-Fwd及びXhoI-CD3z-Revを用いてJ3 CARからクローニングした。SABRの2つの部分を、PCR又はInFusion HDクローニング・キット(Takara)によって組み立てた。BsmBI部位に隣接する非特異的スタッファーDNAである合成2kbフラグメント(IDT)をエピトープの代わりにクローニングした。所与のエピトープをSABRベクターにクローニングするために、前記ベクターを最初にBsmBI(NEB)で切断することによって線状化し、Nucleospin Gel and PCRキット(Takara)を用いてゲルから精製した。ベクターとのオーバーラップ及び前記エピトープを含む一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した(IDT)。前記オリゴヌクレオチドを、KODポリメラーゼ(Millipore)及びOligo-Insert-Fwd及びOligo-Insert-Revを用いて増幅した。増幅したオリゴヌクレオチドを、InFusion HDクローニング・キット(Takara)を使用して、線状化SABRベクターにクローニングした。全てのクローニング反応物で、Stellarコンピテント細胞を形質転換し、100μg/mlカルベニシリン(Life Technologies)を含むLB+寒天プレート上で増殖させ、及び個々のコロニーを液体培養物中に接種した。プラスミド・ミニプレップを、Zyppy ミニプレップ・キット(Zymo)を用いて行った。プラスミドは、サンガー・シークエンシング(Laragen)によって確認した。
【０２３７】
実施例１〜５のTCRクローニングのために、F5、SL9、及びneoTCRの配列を、gBlocksとして合成し(IDT)、前述のように、切断を受けた短い型のLNGFR遺伝子とともにpCCLc-MND-X骨格中にクローニングした。EC27 TCRを既報のようにクローニングした。
【０２３８】
実施例１〜５においてSABRベクター中にクローニングするエピトープのリストを作製するために、2つのアプローチをとった。汎用A2-SABRライブラリでは、免疫エピトープ・データベース(Immune Epitope Database  (IEDB))の全てのHLA-A*0201制限エピトープをダウンロードした。ネオ抗原SABRライブラリでは、腫瘍ミュータノーム（mutanome）のデータから作製したHLA-A*0201制限ネオエピトープを用いた。GenScript Codon Usage Frequency Table Tool (GenScript)に基づいて、それぞれのアミノ酸について最も高い頻度のコドンを用いて、タンパク質配列をヌクレオチド配列に逆翻訳した。エピトープをコードし、SABRベクターとのオーバーラップを含むオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリ(Twist Biosciences)にプールした。オリゴヌクレオチド・ライブラリを増幅し、前述のようにSABRベクター中にクローニングした。充分な網羅性を確保するために、クローニング反応物で形質転換したバクテリア細胞を、500mlの液体培養液に直接播種し、一晩培養した。前記ライブラリを含むプラスミドDNAは、Nucleobond Xtra Maxi Plus EFを用いて調製した。
【０２３９】
SABR又はTCRを発現するレンチウイルス・ベクターを、以前に記載された手順を用いてパッケージングした。簡単に説明すると、500万個のHEK-293T細胞をポリ-L-リジン被覆プレート上に播いて24時間培養し、続いて、TransIT-293(Mirus Bio)及びOPTI-MEM(Life Technologies)を用いて、レンチウイルス・シャトル・プラスミド、pMDG-VSVG及びpCMV-RD8.9の混合物をトランスフェクションした。ウイルスを0.45μmのシリンジ・フィルター(Millipore)を通して濾過し、次に使用するまで-80℃で保存した。Jurkat、NFAT-GFP-Jurkat、又は初代T細胞に形質導入するために、2-5×105細胞を培養培地中にプレーティングし、12ウェルプレート中で等量の解凍したウイルスと3日間混合した。NFAT-GFP-Jurkat細胞については、48時間後にG-418を形質導入混合液に添加した。
【０２４０】
実施例１〜５におけるSABRシグナリングを試験する為の共培養アッセイのために、1〜5×104個の形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞を、同数の形質導入したJurkat細胞と一緒に、96ウェル平坦又は丸底プレート上で8〜10時間インキュベートした。次いで、前記細胞をMACSQuant(Miltenyi)で取得するか、又は抗CD69-APC-Cy7(Biolegend Clone #)で染色し、次いでMACSQuant(Miltenyi)で取得した。前記SABRライブラリ・アッセイのために、1.5×106個のSABRライブラリ細胞を、6ウェルプレートの各ウェル中で1.5×106個のJurkat細胞と共にインキュベートした。共培養の8〜10時間後に、細胞を回収し、抗CD69-APC-Cy7(Biolegend)で染色し、BD FACS SORP(Becton-Dickinson)で選別した。細胞毒性アッセイは、先に記載したようにCFSE(Biolegend)で標識したターゲット細胞を用いて行った。空のSABRアッセイのために、形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞を、100 mg/mlの可溶性ペプチドと共に37℃で2時間インキュベートした。次いで、同数の形質導入したJurkat細胞を前記細胞に添加し、続いて8〜10時間共培養した。これらのアッセイのためのゲーティング戦略を図13A〜13Cに示す。図13Aは、GFP発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。図13Bは、GFP及びCD69の発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。図13Cは、細胞毒性アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。
【０２４１】
実施例１〜５のハイ・スループット・シークエンシング及び解析のために、PureLinkゲノムDNA抽出キット(Life Technologies)を使用して、選別の直後に選別した細胞からゲノムDNAを抽出した。前記SABRベクターは、KODポリメラーゼ(Millipore)並びにTruSeq-Univ-SCTfixed-F、TruSeq-Read2-SCTfixed-R、及びTruseq-Adapter-Indexのプライマーの10:1:10の混合物を用いて増幅した。それぞれのサンプルについて、1〜30ngのゲノムDNAを用いた5〜10の反応を30〜35サイクル行った。前記反応物をプールし、Nucleospin Gel and PCR purification kit (Takara)を用いて精製した。精製したPCR産物をバイオアナライザー(Agilent)で分析し、HiSeq 2500(Illumina)でシークエンシングした。シークエンサーによって生成された、アラインメントされていないリードは、FASTQファイルに保存した。前記リードを、まず最初に、Burrows-Wheeler Alignmentを使用して、122のミスマッチ・ペナルティで、SABRベクターとのアライメントを行った。アライメントを行った各リードについて、前記エピトープを翻訳し、数を数えた。全てのエピトープをリードの数に従ってランク付けし、それぞれのリードについて平均ランクを計算した。次いで、前記平均ランクを使用して更に解析をした。
【０２４２】
フロー・サイトメトリー・プロットをFlowJo  (Treestar)で分析した。統計解析及びグラフィックな表現を、Microsoft Excel(Microsoft)及びGraphPad Prism(Graphpad)によって行った。
【０２４３】
SABRライブラリ中のエピトープのリストを表6.3に示す。
【０２４４】
表6.3
【表５−１】
2020534809.tif 000079
【表５−２】
2020534809.tif 000080
【表５−３】
2020534809.tif 000081
【表５−４】
2020534809.tif 000082
【表５−５】
2020534809.tif 000083
【表５−６】
2020534809.tif 000084
【表５−７】
2020534809.tif 000085
【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
2020534809.tif 000089
【表５−１２】
2020534809.tif 000090
【表５−１３】
2020534809.tif 000091
【表５−１４】
2020534809.tif 000092
【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
2020534809.tif 000099
【表５−２２】
2020534809.tif 000100
【表５−２３】
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【表５−２４】
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【表５−２５】
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【表５−２６】
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【表５−２７】
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【表５−２８】
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【表５−２９】
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【表５−３０】
2020534809.tif 000108
【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【表５−４０】
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【表５−４１】
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【表５−４２】
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【表５−４３】
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【表５−４４】
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【表５−４５】
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【表５−４６】
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【表５−４７】
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【表５−４８】
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【表５−４９】
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【表５−５０】
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【表５−５１】
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【表５−５２】
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【表５−５３】
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【表５−５４】
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【表５−５５】
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【表５−５６】
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【表５−５７】
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【表５−５８】
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【表５−５９】
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【表５−６０】
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【表５−６１】
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【表５−６２】
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【表５−６３】
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【表５−６４】
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【表５−６５】
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【表５−６６】
2020534809.tif 000144
【表５−６７】
2020534809.tif 000145
【表５−６８】
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【表５−６９】
2020534809.tif 000147
【表５−７０】
2020534809.tif 000148
【表５−７１】
2020534809.tif 000149
【表５−７２】
2020534809.tif 000150
【表５−７３】
2020534809.tif 000151
【表５−７４】
2020534809.tif 000152
【表５−７５】
2020534809.tif 000153
【表５−７６】
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【表５−７７】
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【表５−７８】
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【表５−７９】
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【表５−８０】
2020534809.tif 000158
【表５−８１】
2020534809.tif 000159
【表５−８２】
2020534809.tif 000160
【表５−８３】
2020534809.tif 000161
【表５−８４】
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【表５−８５】
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【表５−８６】
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【表５−８７】
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【表５−８８】
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【表５−８９】
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【表５−９０】
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【表５−９１】
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【表５−９２】
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【表５−９３】
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【表５−９４】
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【表５−９５】
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【表５−９６】
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【表５−９７】
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【表５−９８】
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【表５−９９】
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【表５−１００】
2020534809.tif 000178
【表５−１０１】
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【表５−１０２】
2020534809.tif 000180
【表５−１０３】
2020534809.tif 000181
【表５−１０４】
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【表５−１０５】
2020534809.tif 000183
【表５−１０６】
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【表５−１０７】
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【表５−１０８】
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【表５−１０９】
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【表５−１１０】
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【表５−１１１】
2020534809.tif 000189
【表５−１１２】
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【表５−１１３】
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【表５−１１４】
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【表５−１１５】
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【表５−１１６】
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【表５−１１７】
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【表５−１１８】
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【表５−１１９】
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【表５−１２０】
2020534809.tif 000198
【表５−１２１】
2020534809.tif 000199
【表５−１２２】
2020534809.tif 000200
【表５−１２３】
2020534809.tif 000201
【表５−１２４】
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【表５−１２５】
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【表５−１２６】
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【表５−１２７】
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【表５−１２８】
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【表５−１２９】
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【表５−１３０】
2020534809.tif 000208
【表５−１３１】
2020534809.tif 000209
【表５−１３２】
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【表５−１３３】
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【表５−１３４】
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【表５−１３５】
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【表５−１３６】
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【表５−１３７】
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【表５−１３８】
2020534809.tif 000216
【表５−１３９】
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【表５−１４０】
2020534809.tif 000218
【表５−１４１】
2020534809.tif 000219
【表５−１４２】
2020534809.tif 000220
【表５−１４３】
2020534809.tif 000221
【表５−１４４】
2020534809.tif 000222
【表５−１４５】
2020534809.tif 000223
【表５−１４６】
2020534809.tif 000224
【表５−１４７】
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【表５−１４８】
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【表５−１４９】
2020534809.tif 000227
【表５−１５０】
2020534809.tif 000228
【表５−１５１】
2020534809.tif 000229
【表５−１５２】
2020534809.tif 000230
【表５−１５３】
2020534809.tif 000231
【表５−１５４】
2020534809.tif 000232
【表５−１５５】
2020534809.tif 000233
【表５−１５６】
2020534809.tif 000234
【表５−１５７】
2020534809.tif 000235
【表５−１５８】
2020534809.tif 000236
【表５−１５９】
2020534809.tif 000237
【表５−１６０】
2020534809.tif 000238
【表５−１６１】
2020534809.tif 000239
【表５−１６２】
2020534809.tif 000240
【表５−１６３】
2020534809.tif 000241
【表５−１６４】
2020534809.tif 000242
【表５−１６５】
2020534809.tif 000243
【表５−１６６】
2020534809.tif 000244
【表５−１６７】
2020534809.tif 000245
【表５−１６８】
2020534809.tif 000246
【表５−１６９】
2020534809.tif 000247
【表５−１７０】
2020534809.tif 000248
【表５−１７１】
2020534809.tif 000249
【表５−１７２】
2020534809.tif 000250
【表５−１７３】
2020534809.tif 000251
【表５−１７４】
2020534809.tif 000252
【表５−１７５】
2020534809.tif 000253
【表５−１７６】
2020534809.tif 000254
【表５−１７７】
2020534809.tif 000255
【表５−１７８】
2020534809.tif 000256
【表５−１７９】
2020534809.tif 000257
【表５−１８０】
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【表５−１８１】
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【表５−２４５】
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【表５−２４９】
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【表５−２８２】
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【表５−２８９】
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【表５−２９０】
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【表５−２９１】
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【表５−２９２】
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【表５−２９５】
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【表５−２９７】
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【表５−２９９】
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【表５−３００】
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【表５−３０１】
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【表５−３１１】
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【表５−３１２】
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【表５−３１３】
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【表５−３１９】
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【表５−３２０】
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【表５−３２１】
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【表５−３２２】
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【表５−３２３】
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【表５−３２４】
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【表５−３２５】
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【表５−３２６】
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【表５−３２７】
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【表５−３２８】
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【表５−３２９】
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【表５−３３０】
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【表５−３３１】
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【表５−３３２】
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【表５−３３３】
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【表５−３３４】
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【表５−３３５】
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【表５−３３６】
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【表５−３３７】
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【表５−３３８】
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【表５−３３９】
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【表５−３４０】
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【表５−３４１】
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【表５−３４２】
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【表５−３４３】
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【表５−３４４】
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【表５−３４５】
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【表５−３４６】
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【表５−３４７】
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【表５−３４８】
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【表５−３４９】
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【表５−３５０】
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【表５−３５１】
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【表５−３５２】
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【表５−３５３】
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【表５−３５４】
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【表５−３５５】
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【表５−３５６】
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【表５−３５７】
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【表５−３５８】
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【表５−３５９】
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【表５−３６０】
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【０２４５】
いくつかの実施形態では、表6.3のエピトープのうちの任意を、本明細書中で提供されるSABR構成のエピトープとして、使用することがある。いくつかの実施形態では、表6.4のエピトープのうちの任意を、本明細書中で提供されるSABR構成のエピトープとして使用することがある。
【０２４６】
表6.4
【表６】
2020534809.tif 000439
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【０２４７】
実施例７：I型糖尿病における膵島自己免疫を検出するための抗原提示細胞
I型糖尿病(T1D)は、インスリン産生膵β細胞島が進行性に破壊されることによって引き起こされる自己免疫疾患である。T1Dの病態におけるT細胞の役割は、免疫学的な研究及び遺伝学的なリスク・ファクターの発見によって十分に確立されている。しかしながら、これらの遺伝学的なリスク・ファクターの免疫症状を結びつけるツールに対しては、アンメット・ニーズ（unmet need）が存在する。
【０２４８】
T1Dにおける膵臓β細胞のような免疫反応性細胞は、その細胞表面で、ヒト白血球抗原分子(pHLA複合体)上の抗原性エピトープを提示する。T細胞はpHLAを特異的に認識するために固有のTCRを用いている。T1Dでは、CD4+とCD8+ T細胞の両方が、膵β細胞表面上の自己抗原を認識し、応答する。CD8+ T細胞はクラスI pHLAを認識し、細胞傷害応答を誘導する。一方で、CD4+ T細胞はクラスII pHLAを認識し、免疫機能を調節するヘルパー応答を誘導する。T細胞を研究する際のボトルネックは、T細胞がターゲットとする抗原を同定することにある。抗原特異的なT細胞を検出する為の2つの主要なツールは、pHLA多量体及び機能的アッセイである。pHLA多量体は、ペプチドと複合体化し、フルオロフォアと結合した精製されたHLA分子であり、フロー・サイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を同定するために使用される。pHLA多量体は、よく使用されるにもかかわらず、それらにはいくつかの限界がある：即ち、クラスIIpHLA多量体は本質的に不安定であり、特に、T1Dのリスクの増加と関連する対立遺伝子(HLA-DQ2及び-DQ8)のpHLA多量体は不安定である。それ故、扱うのが難しく且つ不安定であり、それらは生理学的な免疫シナプスを反映しておらず、自己免疫と本質的に関連する低親和性のT細胞を検出することができない。ELISA及びELISPOTのような機能的アッセイでは、所望のエピトープを提示する抗原提示細胞(APC)を使って刺激をしたときのサイトカイン産生を測定することによって、T細胞機能を効率的に検出する。しかし、APCは3〜10個の異なるHLA対立遺伝子を有するため、これらのアッセイによって、種々のpHLA間の区別をすることはできない。また、それらの機能的アッセイは、IFNγの分泌のような強力な機能的反応が誘導されることに依存しているため、機能的な障害がある自己免疫T細胞を検出することはできない。抗原特異的な調節性T細胞(Treg)を検出することは、それらの活性が一般的に測定される応答を阻害し、それ故に、機能的アッセイにおいてはネガティブ応答としてマスクされるので、特に困難である。まさに、抗原特異的Tregを検出することに対しては、アンメット・ニーズ（unmet need）が存在する。
【０２４９】
その目的のために、pHLA-TCR相互作用を検出する為のSABRを構築した。図14Aは、TCR-pHLA認識時のSABRの構造及びSABRによるシグナル誘導を示す概略図である。本実施例で使用したSABRの細胞外ドメインはpHLA複合体であり、これは、T細胞によって認識されると、細胞内ドメインにシグナルを誘導させる。SABRを発現するように操作したAPCは、所与のエピトープを提示し、及び同種T細胞によって認識された場合に、測定可能なアウトプットを誘導する。多量体又は機能的アッセイに対するSABR-APCの利点には、以下が含まれる：APCの表面上に単一対立遺伝子のpHLAが生理学的にディスプレイされること、pHLAの組み合わせを遺伝的に規定することができること、エピトープ特異性を多重検出すること、及びT細胞機能とは独立してpHLA-TCR相互作用を検出すること。図14B及び図14Cは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種T細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示すことによって、この技術を実証するものである。これらのSABR-APCを使用して、T1D患者における膵島特異的な免疫応答を検出すること、遺伝的リスク・ファクターの免疫学的な影響を研究すること、及び普通の及び免疫療法‐誘導性のT細胞を検討すること、ができる。
【０２５０】
SABR-APCを使って、防御性の及び感受性のある遺伝的リスク・ファクターの免疫学的機序を理解することができる。いくつかのクラスII HLA対立遺伝子は、T1Dに対する防御性又は感受性の何れかと関連している。HLA-DQ2及びDQ8はいずれもT1Dのリスク・ファクターであり、特に、両方の対立遺伝子を保有する患者は、何れかの対立遺伝子のみを保有する患者よりも有意にリスクが高い。この現象は、ペプチド・エピトープを提示し、自己免疫を誘導し得るDQ2及びDQ8鎖のクロスペアリング（cross-pairing）(DQ2trans又はDQ8transとして知られる)に起因すると考えられる。これらの患者由来のAPCは、図14Dに示すように、正確にペアリングした分子及びクロスペアリングした分子を同時に発現し、これらを、これまでの方法によって区別することはできない。図14Dは、DQ2-DQ8ヘテロ接合性である患者由来のAPC表面上におけるHLA-DQ対立遺伝子の4種の組み合わせを示す。図14Eに示すように、SABRを使用して、内生のDR及びDQ遺伝子座を欠損する稀なB-細胞株を用い、このようないわゆるHLA-DQトランスダイマーのうちの特定のペアに連結した、遺伝子的にコードしたペプチド・エピトープを、別々のAPC表面上で、提示させ、異なる遺伝的リスク・ファクターを有する患者間の差異を検討することができる。図14Eは、4種のDQ2/8の組み合わせをコードするSABRが別々のAPC表面上にあり、それらの区別が可能であることを、示している。更に、SABR-APCを使用して、インスリン欠陥リボソーム産物(Insulin  Defective  Ribosomal Products (INS-DRiPs))の防御性の及び感受性のあるバリアントの免疫原性を区別することができる。このようにして、異なる遺伝的リスク対立遺伝子を保有する個人からの免疫反応間の差異を検討することができる。
【０２５１】
SABR-APCを用いて、膵島自己反応性のエフェクターT細胞及び調節性T細胞の機能を研究することもできる。自己免疫性T細胞は、異常な抗原認識モードとその後の機能的アウトプットを示す。例えば、HLA-DR4-プロインスリン(C19-A3)に特異的な調節性T細胞は、同じエピトープに対して特異的なエフェクターT細胞と比較して、逆の極性で結合する。pHLA多量体には固有の限界があるために、これらの差異を研究することは、極めて困難であった。そこで、これらのエピトープを基質として提示するSABR-APCを、T1D患者に由来する膵島特異的なT細胞クローン間の機能的な差異を測定するために使用することができる。これらの研究により、前記APCの観点から、異なるT細胞サブタイプの機能的基盤を理解することができる。
【０２５２】
天然の及び免疫療法‐誘導性の膵島特異的なT細胞反応を、SABRを用いて検出することができる。免疫機能が抑制されている状況では、これまでの方法では抗原特異的なT細胞を検出できない。これは、膵島移植、又は健常者において、若しくはプロインスリンC19-A3のワクチン接種のような寛容原性免疫療法により治療し、奏功した患者において観察される免疫トレランスの状況に特に関連する。本明細書中に記載される技術プラットフォームは、TCR/エピトープ/HLA相互作用のみに依存するので、膵島特異的なエフェクターT-細胞又は調節性T-細胞を、それらの反応が抑制されているとしても、検出及び定量することができる。SABR-APCを使用して、この免疫学的に優性なプロインスリン・ペプチドでパルスした寛容原性の樹状細胞を使った免疫療法を受けている患者に由来するT細胞のC19-A3特異的な反応を診断することができる。SABRの使用を、同じ患者サンプルのいくつかのエピトープを多重検出することによる免疫モニタリングへと拡張することができ、SABRの使用によって、この新しいタイプの組織特異的な免疫介入療法への応答性と相関している可能性のある、膵島特異的な自己免疫応答における「免疫的な特徴（immune signatures）」を同定することが可能になる。
【０２５３】
実施例８：クラスII MHC SABR
クラスII MHCを含む抗原提示ドメインを含むSABRを試験して、シグナリング誘導能を測定した。実施例１及び６に記載の実験方法を用いて、クラスII MHC SABRによる誘導能を試験した。図15Aは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。図15Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。図15Bに示すように、クラスII MHC SABRはシグナルを誘導することができたが、他のコンストラクトはシグナルを誘導しなかった。本結果は、クラスII MHCを含むSABRが、特異的なTCR-pMHC相互作用があったときに、シグナリングを誘導できることを示す。
【０２５４】
更に、図16Aは、IAb-OVA DCH及びIAb-OVA DCH-SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。図16Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。これらの結果はまた、クラスII MHCを含むSABRが、特異的なTCR-pMHC相互作用があったときに、シグナリングを誘導できることを示す。このように、クラスI MHC SABRを用いた実験（これは、比較的容易に機能することが知られている）は、クラスII MHC SABR（これは、本明細書に記載されている抗原探索のために、従来の方法を使って機能させることが困難であることが知られている）についても機能した。
【０２５５】
実施例９：SABRは、初代細胞を認識する
SCDRコンストラクトを、例えば、A2 NYESO(がん特異的なMHCT抗原の組み合わせ)又はB27-KK10(HIV特異的なMHC-抗原の組み合わせ)の何れかを発現するように構築した。いくつかの実施形態では、A2及びB27のSCDRコンストラクトを構築することができ、ペプチドを使用して、例えば、NYESO又はKK10抗原の何れかを提示することができる。NFAT-GFP-Jurkatsは、SCTRコンストラクト又はSCDRコンストラクトを形質導入することがあり、そしてレポーター細胞としてペプチド抗原でパルスすることがある。前記レポーター細胞は、例えば、A2-NYESO特異的なTCR又はB27-KK10特異的なTCRの何れかを発現するJurkat細胞に形質導入して得ることがあり、そしてGFP+ 細胞の頻度を、フロー・サイトメトリーで測定することがある。図17Aは、%GFP+ 細胞を経時的に示す折れ線グラフを示す。図17Bは、本実験の代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。
【０２５６】
本結果は、シグナルが、インキュベーションの4時間以内に約30%のレポーター細胞で誘導され、インキュベーションの8時間以内に約50%のレポーター細胞で誘導されたことを示す。また、最大シグナルの約50%は4時間で達成され、最大シグナルの約100%は8時間で達成された。
【０２５７】
実施例３及び６の実験結果を用いて、TCRを形質導入したJurkat細胞をSCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートした。図18Aは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したJurkat細胞についての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。図18Bは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。図18Cは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の経時的な頻度を示す折れ線グラフを示す。
【０２５８】
図18A〜18Cに例示されるように、SABRは、初代細胞表面上の抗原レセプターを(例えば、患者のサンプルから直接的に)認識することができ、同じように、SABR は細胞株における遺伝子導入抗原レセプターを認識することができる。
【０２５９】
実施形態の種、バリアント、欠損、又は改変バージョン
いくつかの実施形態では、記載したタンパク質成分(とりわけ、MHCフラグメント)の各々の任意の種、バリアント、欠損、又は改変バージョンを、それらが本明細書に記載されるように機能する限り、使用することができる。いくつかの実施形態では、これは、使用する配列が本明細書中で提供される成分についてのヒト配列である場合に、達成される。いくつかの実施形態では、前記構成要素の配列は哺乳動物であることがある。いくつかの実施形態では、前記構成要素の配列は、本明細書中で提供される配列又は本明細書中で提供される構成要素のヒト配列に対して80%以上が同一であることがあり、例えば、前記構成要素(例えば、MHC、エピトープ等)のヒト配列に対して、例えば、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.9%以上が同一であることがある。いくつかの実施形態では、前記構成要素は、生物間で保存されている配列を保持している限り、バリアントであり得る。このような許容可能なバリアントの例を、図20A〜20Fで提供されるロゴベースの配列アラインメントに記載する。図20Aは、多種多様な種間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。図20Bは、ヒト間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。図20Cは、多種多様な種間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。図20Dは、ヒト間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。図20Eは、多種多様な種間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。図20Fは、ヒト間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。これにより、当業者のうちのある者は、保存され、従って機能にとって重要なタンパク質のセクション、及び保存されず、従って変化することがあるセクション、を理解するのであろう。
【０２６０】
図20A〜20Fの図は、配列のロゴであり、アミノ酸又は核酸の配列をマルチプル・アラインメントしたものをグラフィカルに表示したものである。前記ロゴは、文字を積層した配列であり、アミノ酸配列のアラインメントにおける各位置の1つの積層である。前記スタックの全体の高さは、その位置での配列保存度を示し、一方、スタック内の記号の高さは、その位置での各アミノ酸又は核酸の相対的な頻度を示す。積み重ね棒グラフと同様に、アミノ酸の1文字コードを、着色した棒の代わりに使用する。前記スタックの幅は、その位置における欠損配列の割合に比例する。なお、MHC分子の多くは完全な配列を含まない。より細い文字は、いくつかの配列がその領域についての情報を欠いていることを意味する。これらの図では、文字の幅はあまり重要ではない。いくつかの実施形態では、この指針は、より深いシークエンシング被覆率を有する部分のセクションに焦点を当てている。
【０２６１】
参考文献
全ての参考文献が、その全体が、参照により取り込まれる。
【０２６２】
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