(57)【要約】  免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤を組み合わせてウイルス導入ベクターを投与するための方法および関連する組成物またはキットが、本明細書に提供される。
2020536939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリア、および抗ＩｇＭ剤を含む、組成物。
【請求項２】
抗ＩｇＭ剤が、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１に特異的に結合する、抗体またはそれらのフラグメント；チロシンキナーゼ阻害剤、例として、ｓｙｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、またはＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ＰＫＣ阻害剤；ＡＰＲＩＬアンタゴニスト；ミゾリビン；トファシチニブ；および、テトラサイクリン、から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗ＩｇＭ剤が、抗ＢＡＦＦ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗ＩｇＭ剤が、ＢＴＫ阻害剤、例としてイブルチニブである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ウイルス導入ベクターが、レトロウイルス導入ベクター、アデノウイルス導入ベクター、レンチウイルス導入ベクターまたはアデノ随伴ウイルス導入ベクターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ウイルス導入ベクターが、アデノウイルス導入ベクターであり、ならびに、アデノウイルス導入ベクターが、サブグループＡ、サブグループＢ、サブグループＣ、サブグループＤ、サブグループＥまたはサブグループＦのアデノウイルス導入ベクターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ウイルス導入ベクターが、レンチウイルス導入ベクターであり、ならびに、レンチウイルス導入ベクターが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶまたはヒツジレンチウイルスベクターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ウイルス導入ベクターが、アデノ随伴ウイルス導入ベクターであり、ならびに、アデノ随伴ウイルス導入ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６.２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１アデノ随伴ウイルス導入ベクターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ウイルス導入ベクターが、キメラウイルス導入ベクターである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
キメラウイルス導入ベクターが、ＡＡＶアデノウイルス導入ベクターである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ウイルス導入ベクターの導入遺伝子が、遺伝子治療導入遺伝子、遺伝子編集導入遺伝子、エクソンスキッピング導入遺伝子または遺伝子発現調節導入遺伝子を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
合成ナノキャリアが、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、金属ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルション、デンドリマー、バッキーボール、ナノワイヤー、ウイルス様粒子またはペプチドもしくはタンパク質粒子を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
合成ナノキャリアが、ポリマーナノ粒子を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリマーナノ粒子が、非メトキシ末端のプルロニックポリマーではないポリマーを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ポリマーナノ粒子が、ポリエステル、ポリエーテルに接着したポリエステル、ポリアミノ酸、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリケタール、多糖、ポリエチルオキサゾリンまたはポリエチレンイミンを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリエステルが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）またはポリカプロラクトンを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ポリマーナノ粒子が、ポリエステルおよびポリエーテルに接着したポリエステルを含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ポリエーテルが、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
合成ナノキャリアの集団の動的光散乱を使用して得られた粒子サイズ分布の平均が、１１０ｎｍより大きい直径である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
直径が、１５０ ｎｍより大きい、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
直径が、２００ｎｍより大きい、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
直径が、２５０ ｎｍより大きい、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
直径が、５μｍより小さい、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
直径が、４μｍより小さい、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
直径が、３μｍより小さい、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
直径が、２μｍより小さい、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
直径が、１μｍより小さい、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
直径が、５００ ｎｍより小さい、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
直径が、４５０ ｎｍより小さい、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
直径が、４００ ｎｍより小さい、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
直径が、３５０ ｎｍより小さい、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
直径が、３００ ｎｍより小さい、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
合成ナノキャリア中に含まれる免疫抑制剤の負荷量が、合成ナノキャリア全体の平均で、０．１％と５０％（重量／重量）との間である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
負荷量が、０．１％と２５％との間である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
負荷量が、１％と２５％との間である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
負荷量が、２％と２５％との間である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
負荷量が、２％と２０％との間にある、２％と１５％との間にある、または、２％と１０％との間にある、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
免疫抑制剤が、ＮＦ−ｋＢ経路の阻害剤である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
免疫抑制剤が、ｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
免疫抑制剤が、ラパログである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
免疫抑制剤が、ラパマイシンである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
合成ナノキャリアの集団のアスペクト比が、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７または１：１０より大きい、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物、および使用のための説明書を含む、キット。
【請求項４４】
先行する請求項のいずれか一項に記載のウイルス導入ベクター、先行する請求項のいずれか一項に記載の合成ナノキャリア、先行する請求項のいずれか一項に記載の抗ＩｇＭ剤、および使用のための説明書を含む、キット。
【請求項４５】
使用のための説明書が、本明細書に記載の方法のいずれか１つを実行するための説明書を含む、請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】
対象へのウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリア、および抗ＩｇＭ剤の併用投与によって、対象における抗ウイルス導入ベクター減弱化応答を確立することを含む、方法。
【請求項４７】
抗ウイルス導入ベクター減弱化応答が、ウイルス導入ベクターに対するＩｇＭ応答である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗ウイルス導入ベクター減弱化応答が、更に、ウイルス導入ベクターに対するＩｇＧ応答を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリア、および抗ＩｇＭ剤を、繰り返し、併用して、対象に投与することによって、対象におけるウイルス導入ベクターの導入遺伝子発現を拡大することを含む、方法。
【請求項５０】
ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリア、および／または抗ＩｇＭ剤の併用投与が、繰り返される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ウイルス導入ベクターが、先行する請求項のいずれか一項に記載のとおりである、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
合成ナノキャリアが、先行する請求項のいずれか一項に記載のとおりである、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
抗ＩｇＭ剤が、先行する請求項のいずれか一項に記載のとおりである、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
併用投与が、同時投与である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ウイルス導入ベクターおよび／または合成ナノキャリアが、静脈内に投与される、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
抗ＩｇＭ剤が、腹腔内に投与される、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１０月１３日に出願された米国仮出願６２／５７２，２９７の３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９下における利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、対象に、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ（ＩｇＭ）剤を伴うウイルス導入ベクターを、投与するための方法および関連する組成物に、関する。好ましくは、該方法および組成物は、ウイルス導入ベクターに対するＩｇＭ応答を低下させるかまたは阻止するために、ある。
【発明の概要】
【０００２】
一側面において、対象へのウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤の併用投与によって、対象における抗ウイルス導入ベクター減弱化応答を確立することを含む方法が、提供される。
本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、抗ウイルス導入ベクター減弱化応答は、ウイルス導入ベクターに対するＩｇＭ応答である。
【０００３】
別の側面において、対象へ、ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤を、繰り返し、併用して、対象に投与することによって、対象におけるウイルス導入ベクターの導入遺伝子発現を拡大することを含む方法が、提供される。
本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび／または抗ＩｇＭ剤の併用投与は、繰り返される。
【０００４】
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、該ウイルス導入ベクターは、本請求項のいずれか１つにおいて定義されたかかるベクターのいずれか１つなどの、本明細書に提供されるウイルス導入ベクターのいずれか１つである。
【０００５】
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、該合成ナノキャリアは、本請求項のいずれか１つにおいて定義されたかかる合成ナノキャリアのいずれか１つなどの、本明細書に提供される合成ナノキャリアのいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＩｇＭアンタゴニスト抗体である。
【０００６】
ＩｇＭアンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１に特異的に結合する。
【０００７】
一態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１抗体またはそれらの抗原結合フラグメントのいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１抗体またはそれらの抗原結合フラグメントのいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体は、抗ＢＡＦＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。
【０００８】
一態様において、抗ＢＡＦＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかる抗ＢＡＦＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメントのいずれか１つなどの、本明細書に提供される、抗ＢＡＦＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメントのいずれか１つである。
【０００９】
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、抗ＢＡＦＦ剤である。一態様において、抗ＢＡＦＦ剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかる抗ＢＡＦＦ剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、抗ＢＡＦＦ剤のいずれか１つである。
【００１０】
提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＩＬ−２１調節剤、例として、ＩＬ−２１アンタゴニストまたはＩＬ−２１受容体アンタゴニストである。一態様において、剤を調節しているＩＬ−２１は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＩＬ−２１の調節剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＩＬ−２１の調節剤のいずれか１つである。
【００１１】
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例として、Ｓｙｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、またはＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。
【００１２】
一態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるチロシンキナーゼ阻害剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、チロシンキナーゼ阻害剤のいずれか１つである。提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、Ｓｙｋ阻害剤である。一態様において、Ｓｙｋキナーゼ阻害剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＳｙｋ阻害剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、Ｓｙｋ阻害剤のいずれか１つである。
【００１３】
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤である。一態様において、ＢＴＫキナーゼ阻害剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＢＴＫ阻害剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＢＴＫ阻害剤のいずれか１つである。提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。
【００１４】
一態様において、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤のいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。一態様において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＰＫＣ阻害剤である。一態様において、ＰＫＣ阻害剤は、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＰＫＣ阻害剤のいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＰＫＣ阻害剤のいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＡＰＲＩＬアンタゴニストである。
【００１５】
一態様において、ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるＡＰＲＩＬアンタゴニストのいずれか１つなどの、本明細書に提供される、ＡＰＲＩＬアンタゴニストのいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、テトラサイクリンである。一態様において、テトラサイクリンは、請求項のいずれか１つにおいて定義される、かかるテトラサイクリンのいずれか１つなどの、本明細書に提供される、テトラサイクリンのいずれか１つである。
提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、抗ＩｇＭ剤は、ミゾリビンまたはトファシチニブである。
【００１６】
別の側面において、本明細書に提供されるウイルス導入ベクターのいずれか１つ、本明細書に提供される合成ナノキャリアのいずれか１つ、および本明細書に提供される抗ＩｇＭ剤のいずれか１つを含むキットなどの組成物が、提供される。
別の側面において、本明細書に提供される組成物または組成物の組み合わせのいずれか１つを含むキットが、提供される。
【００１７】
提供されるキットのいずれか１つの一態様において、キットは、使用のための説明書をさらに含む。提供されるキットのいずれか１つの一態様において、使用のための説明書は、本明細書に提供される方法のいずれか１つを実行するための説明書を、含む。
別の側面において、例のいずれか１つにおいて記載のような方法または組成物が提供される。
別の側面において、組成物のいずれか１つは、提供される方法のいずれか１つにおける使用のためのものである。
別の側面において、方法または組成物のいずれか１つは、本明細書において記載の疾患または状態のいずれか１つを処置することにおける使用のためのものである。
【００１８】
別の側面において、方法または組成物のいずれか１つは、抗ウイルス導入ベクター応答（例として、ＩｇＭ応答）を減弱化させること、減弱化された抗ウイルス導入ベクター応答（例えば、ＩｇＭ応答）を確立すること、導入遺伝子発現を拡大させることにおける、および／またはウイルス導入ベクターの反復投与に関する使用のために、ある。
別の側面において、例の剤のいずれかの組み合わせを投与する方法が、提供される。別の側面において、剤のこれらの組み合わせのいずれか１つを含む組成物またはキットも、提供される。
方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、該方法、組成物またはキットは、ＩｇＧ応答、体液、または細胞免疫応答などの、別の免疫応答に加えてＩｇＭ応答を減弱化するために、ある。
方法、組成物、またはキットのいずれか１つの一態様において、該方法、組成物またはキットは、導入遺伝子発現を増加させることに加えて、ＩｇＭ応答を減弱化させるために、ある。
【００１９】
方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、該方法、組成物またはキットは、ＩｇＧ応答、体液性または細胞性の免疫応答などの、別の免疫応答、ならびに導入遺伝子発現の増加に加えて、ＩｇＭ応答を減弱化するために、ある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、指し示された処置（分泌されるアルカリホスファターゼ（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ）をコードするアデノ関連ウイルスべクター単独、ラパマイシン（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］）を含む合成ナノキャリアとの組み合わせ、または、抗ＢＡＦＦ（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦ）との組み合わせ）の投与に続く、５、９、１２、１６、および２１日のマウスにおける、血清抗ＡＡＶＩｇＭレベルを、示す。それぞれの処置群は、６匹のマウスを含んだ。
【図２】図２は、図１に記載されているように、同じマウスからの処置の投与の５、９、１２、および１６日後に、ケミルミネッセンスを使用して測定された、ＳＥＡＰ発現レベルを、示す。
【図３】図３は、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬの両方が、Ｂ細胞の生存および分化を支持することを、示す。ＢＡＦＦまたはデュアルＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ阻害剤ＴＡＣＩ−Ｆｃ（膜貫通活性化因子及びカルシウム・モジュレーター配位子インタラクターＦｃ−融合）に対する抗体が、使用された。この検討のレイアウトは、図１、２、４−１０、および１５−１７中に提示されるデータに、関する。
【図４Ａ】図４Ａは、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］による、典型的なＩｇＭレベル、およびそれらの完全な抑制を示す（図４Ｂ）；ＢＡＦＦ阻害は、ＩｇＭ応答を低下させる追加の効果を有するようである（図４Ａ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］による、典型的なＩｇＧレベル、およびそれらの完全な抑制を示す。
【図５】図５は、ＩｇＧレベルおよびそれらのＳＶＰ［Ｒａｐａ］による初期の完全な抑制に続く、１／６のポストブーストブレークスルーを、示す。ＢＡＦＦまたはＴＡＣＩ−Ｆｃによって処置群でのブレークスルーは、ポストブースト１８日時点でなかった（矢印によって示される）。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、［Ｒａｐａ］―及び［Ｒａｐａ］＋ＴＡＣＩ−Ｆｃ処置群；より明確には［Ｒａｐａ］＋ＢＡＦＦ処置マウスにおけるＩｇＭ阻害を示す。
【図６Ｃ−６Ｄ】図６Ｃ−６Ｄは、１６日と２１日での［Ｒａｐａ］―及び［Ｒａｐａ］＋ＴＡＣＩ−Ｆｃ処置群；より明確には［Ｒａｐａ］＋ＢＡＦＦ処置マウスにおけるＩｇＭ阻害を示す。
【図７】図７は、未処置群（ポストブースト上昇がみられる）における、および、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］−処置群（１／６のブレークスルーマウスにおける高いポストブーストレベル）における、ポストブーストＩｇＭの変遷を、示す；ＢＡＦＦ阻害は、ＩｇＭ応答を低下させる追加の効果を有するようである；Ｆｃ−ＴＡＣＩは、プライムで多くをＳＶＰ［Ｒａｐａ］に加えず、追加のポストブースト利益を与えるかもしれない。
【図８】図８は、［Ｒａｐａ］によるＳＥＡＰの上昇を、示す；さらに、抗ＢＡＦＦの存在において増強される。
【図９Ａ】図９Ａは、５日での導入遺伝子（ＳＥＡＰ）発現の上昇に関する［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦの組合せの、一貫して有意な効果を示す。
【図９Ｂ−９Ｃ】図９Ｂ−９Ｃは、９および１２日での導入遺伝子（ＳＥＡＰ）発現の上昇に関する［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦの組合せの、一貫して有意な効果を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、１６日での導入遺伝子（ＳＥＡＰ）発現の上昇に関する［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦの組合せの、一貫して有意な効果を示す。
【図１０】図１０は、ｄ２１／２８のプレブーストから、および次いで、ｄ３７ブーストの後、最高１４日間のデータを、提供する。［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦの組合せは、導入遺伝子発現の上昇に関して、一貫して有意な効果を、提供する。
【図１１】図１１は、別の試験のためのレイアウトを、示す。この検討のレイアウトは、図１２−１４および１８−２０において提示されるデータに、関する。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｂは、ＩｇＭ抑制に関する、初期のＩｇＭおよびＩｇＧの変遷を、示す。
【図１３】図１３は、ＩｇＭ抑制に関する、抗ＢＡＦＦと［Ｒａｐａ］の相乗効果を、立証する。
【図１４】図１４は、［Ｒａｐａ］によるＳＥＡＰレベルおよびその増強を、示す。
【図１５】図１５は、０、３７および、１５５日での、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦで処置されたマウスにおける、ＡＡＶＩｇＭレベルを、示す。
【図１６】図１６は、０、３７および、１５５日での、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦで処置されたマウスにおける、ＡＡＶＩｇＧレベルを、示す。
【図１７】図１７は、０、３７および、１５５日での、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦで処置されたマウスにおける、ＳＥＡＰレベルを、示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｂは、０、３２、および９８日での、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋抗ＢＡＦＦ、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦで処置されたマウスにおける、ＳＥＡＰ、およびＩｇＭレベルを、示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＩｇＧレベルを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、注入日のみ、または第１の、第３の、および第４のＡＡＶ投与後１４日でも投与された、抗ＢＡＦＦの有無による、０、３２、９８、および１６０日での、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］（５０μｇ）、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］で処置されたマウスにおける、ＳＥＡＰレベルを、示す。
【図１９Ｂ−１９Ｃ】図１９Ｂ−１９Ｃは、１５０μｇ（図１９Ｂ）のラパマイシンでの、ＳＥＡＰレベル、およびＩｇＭレベルを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、ＩｇＧレベルを示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、ＩｇＭレベルを示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｆは、ＩｇＧレベルを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａおよび２０Ｂは、０、３２、９８、および１６０日での、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦで処置されたマウスにおける、ＳＥＡＰと初期の１１日でのＩｇＭレベルの間の関係を、示す。
【図２０Ｂ】上記と同様である。
【図２１Ａ】図２１Ａ−２１Ｆは、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋抗ＢＡＦＦ、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦ（Ｂ、Ｄ、Ｆ）、または、ｗ/ｏＡＡＶ、すなわち、ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、抗ＢＡＦＦまたはＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦ（Ａ、Ｃ、Ｅ）処置により処置されたマウスにおける、種々のＢ細胞集団の割合を、示す。
【図２１Ｂ】上記と同様である。
【図２１Ｃ】上記と同様である。
【図２１Ｄ】上記と同様である。
【図２１Ｅ】上記と同様である。
【図２１Ｆ】上記と同様である。
【図２２Ａ】図２２Ａ−２２Ｆは、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋イブリチナブで処置されたマウスにおける、ＩｇＭレベルを示す。
【図２２Ｂ】上記と同様である。
【図２２Ｃ】上記と同様である。
【図２２Ｄ】上記と同様である。
【図２２Ｅ】上記と同様である。
【図２２Ｆ】上記と同様である。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ−２３Ｂは、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋イブリチナブで処置されたマウスにおける、ＳＥＡＰおよびＩｇＭレベルとの関係を、示す。ＳＥＡＰレベルは、図２３Ａにおいて示される。初期の６日でのＩｇＭレベルと遅い（ｄ１０４／１１１）でのＳＥＡＰレベルとの関係は、図２３Ｂにおいて示される。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋イブリチナブ、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋イブリチナブで処置されたマウスにおける、ＩｇＭを、示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋イブリチナブ、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋イブリチナブで処置されたマウスにおける、ＩｇＧレベルを、示す。
【図２５】図２５は、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ単独、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］、ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋イブリチナブ、またはＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋イブリチナブで処置されたマウスにおける、ＳＥＡレベルを、示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
【００２２】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特に例示された材料またはプロセスに限定されず、パラメーターのようなものは無論変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書において用いられる用語は、本発明の特定の態様のみを記載することを目的とし、本発明を記載する代替的用語の使用を限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００２３】
上記または下記のいずれであっても、本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体において全ての目的のために本明細書により参考として援用される。かかる参考としての援用は、本明細書において引用される援用された刊行物、特許および特許出願のいずれかが先行技術を構成するという承認であることを意図しない。
本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を支持しない限り、複数の参照対象を含む。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、用語「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｅ)」または「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ)」もしくは「含むこと(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」などのそのバリエーションは、いずれかの列記される完全体(ｉｎｔｅｇｅｒ)（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）または完全体の群（例えば特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）の包含を示すが、いずれかの他の完全体または完全体の群の除外を示すものではないと読まれるべきである。したがって、本明細書において用いられる場合、用語「含むこと(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」は、包括的であり、さらなる列記されていない完全体または方法／プロセスステップを除外しない。
【００２５】
本明細書において提供される組成物および方法のいずれかの態様において、「含むこと(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」は、「から本質的になる(ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ)」または「からなる(ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ)」で置き換えることができる。句「から本質的になる」は、本明細書において、特定された完全体（単数または複数）またはステップ、ならびに請求される発明の特徴または機能に実質的には影響を及ぼさないものを要求するために用いられる。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、用語「からなる」は、列記される完全体（例えば特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）または完全体の群（例えば特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）単独での存在を示すために用いられる。
Ａ. 序論
【００２７】
ウイルス導入ベクターは、遺伝子治療、遺伝子編集、遺伝子発現調節およびエクソンスキッピングなどの多様な適用のための有望な治療剤である。ウイルス導入ベクターは、したがって、治療用のタンパク質または核酸をコードする導入遺伝子を含んでもよい。残念ながら、これらの治療法の見込みは、ウイルス導入ベクターに対する免疫応答のため、大部分においてまだ完全には実現されていなかった。これらの免疫応答は、抗体、Ｂ細胞、およびＴ細胞応答を含み、そして、ウイルスカプシドまたはコートタンパク質またはそれらのペプチドなどの、ウイルス導入ベクターのウイルス抗原に特異的であることができる。
【００２８】
驚くべきことに、ＡＡＶが、ＩｇＭおよびＩｇＧの両方の、極めて強いおよび速い抗体産生を誘発し、それらの後者が有意にブロックされ、前者が、ラパマイシンを含む合成ナノキャリアによって遅延させられることが、見出された。また、驚くべきことに、免役抑制剤を含む合成ナノキャリア、およびＩｇＭ応答免疫を抑制する剤、例として、抗ＢＡＦＦモノクローナル抗体などの抗ＩｇＭ剤と組み合わせたウイルス導入ベクターによる処置は、ＩｇＭ応答などの免疫応答の上で相乗効果を有することができ、ウイルス導入ベクターの第１の投与の後、導入遺伝子発現の実質的増加にも、結果としてなる。
【００２９】
処置のためのウイルス導入ベクターの効果的な使用に対する障害に対する解決方法を提供する方法および組成物が、提供される。とりわけ、ＩｇＭ抗ウイルス導入ベクター免疫応答単独、または他の免疫応答と組み合わせが、本明細書に提供される方法および関連した組成物によって減弱化されることができることが、予想外に発見された。方法および組成物は、ウイルス導入ベクターによる処置の有効性を増大し、ウイルス導入ベクターの投与を反復する必要がある場合であっても、免疫減弱化を提供することができる。
本発明をここで、以下により詳細に記載する。
Ｂ．定義
【００３０】
「投与すること」または「投与」または「投与する」とは、材料を、薬理学的に有用である様式において、対象に与えるかまたは分配することを意味する。当該用語は、「投与させること(ｃａｕｓｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ)」を含むことを意図される。「投与させること」とは、別の当事者が材料を投与することを、直接的または間接的に、引き起こすこと、駆り立てること、奨励すること、補助すること、誘導することまたは指示することを含む。本明細書に提供される方法のいずれか１つは、ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤を併用投与するステップを、含んでもよいかまたはさらに含んでもよい。いくつかの態様において、併用投与は、反復して行われる。本発明のまたさらなる態様において、併用投与は、同時投与である。
【００３１】
本明細書において提供される組成物または対象への投与のための投与形態に関する「有効量」とは、例えば、ＩｇＭ応答などのウイルス導入ベクターに対する免疫応答の軽減もしくは除去、または抗ウイルス導入ベクター減弱化応答の発生を生成する、対象において１以上の所望される結果となる、組成物または投与形態の量を指す。有効量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの目的のためのものであってよい。ｉｎ ｖｉｖｏでの目的のために、量は、医師が、ウイルス導入ベクターの投与の結果として望ましくない免疫応答を経験し得る対象のための臨床的利益を有し得ると考えるものであってよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、投与される組成物は、本明細書において提供されるような有効量のうちのいずれか１つにおけるものであってよい。
有効量は、望ましくない免疫応答のレベルを低下させることを含み得るが、いくつかの態様において、それは、望ましくない免疫応答を完全に予防することを含む。有効量はまた、望ましくない免疫応答の発生を遅延させることを含んでもよい。有効量は、所望される治療的エンドポイントまたは所望される治療効果を結果としてなる量であってもよい。有効量は、好ましくは、対象において、ウイルス導入ベクター抗原などの抗原に対して、免疫寛容原性免疫応答に結果としてなる。有効量はまた、好ましくは、導入遺伝子発現の増大をもたらし得る（ウイルス導入ベクターにより送達されている導入遺伝子）。このことは、対象における多様な目的の組織または系において、導入遺伝子発現を測定することにより、決定することができる。この発現の増大は、局所的にまたは全身で測定することができる。前述のもののいずれかの達成は、慣用的な方法によりモニタリングすることができる。
【００３２】
提供される組成物および方法のいずれか１つのいくつかの態様において、有効量は、ウイルス導入ベクターに対する免疫応答の軽減もしくは除去、または抗ウイルス導入ベクター減弱応答の発生などの所望される免疫応答は、対象において、少なくとも１週間、少なくとも２週間または少なくとも１か月間にわたり持続する。提供される組成物および方法のいずれか１つの他の態様において、有効量は、ウイルス導入ベクターに対する免疫応答の軽減もしくは除去、または抗ウイルス導入ベクター減弱応答の発生などの、測定可能な所望される免疫応答に結果としてなるものである。いくつかの態様において、有効量は、測定可能な所望される免疫応答を（例えば特定のウイルス導入ベクター抗原に対して）、少なくとも１週間、少なくとも２週間または少なくとも１か月間にわたりもたらすものである。
【００３３】
有効量は、無論、処置された特定の対象；状態、疾患または障害の重篤度；年齢、体調、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーター；処置の期間；併用療法の性質（あれば）；投与の特定の経路、ならびに保健実施者の知識および経験の範囲内の類似の要因に依存するであろう。これらの要因は、当業者に周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。
【００３４】
「抗ＢＡＦＦ剤」は、いずれかの剤、小分子、抗体、ペプチド、または核酸を指し、それが、ＢＡＦＦの産生、またはレベル、または活性を低下させることが、公知である。いくつかの態様において、抗ＢＡＦＦ剤は、抗ＢＡＦＦ抗体である。例示的な抗ＢＡＦＦ剤は、ＴＡＣＩ−Ｉｇおよび可溶性ＢＡＦＦ受容体を含むが、これらに限定されない。
「抗ＢＡＦＦ抗体」は、ＢＡＦＦポリペプチドに特異的に結合するいかなる抗体も、指す。
【００３５】
たとえば、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）などの、抗ＢＡＦＦ抗体は、モノクローナル抗体でもよい。いくつかの例において、抗ＢＡＦＦ抗体は、ＢＡＦＦの生物活性を抑制することができる。あるいは、または、加えて、抗ＢＡＦＦ抗体は、ＢＡＦＦと、ＢＡＦＦ−ＲおよびＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）などの、その受容体との間の相互作用を、ブロックしてもよい。いくつかの態様において、全部完全な抗体が、使用される。いくつかの態様において、抗ＢＡＦＦ抗体の抗原結合フラグメントは、代わりとして使用される。
【００３６】
「抗ＩｇＭ剤」は、小分子、抗体、ペプチド、または核酸を含むがこれらに限定されない、ＩｇＭの産生またはレベルを低下させることが公知であるいずれかの剤、例として、ＩｇＭ抗体を、指す。Ｂ細胞が抗体を発生させることが、当業者によって、認識されるだろう。
【００３７】
したがって、いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、Ｂ細胞レベルを調節するかまたは抑制することが公知である、いずれかの剤である。いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、Ｂ細胞成熟を調節するかまたは抑制することが公知である、いずれかの剤である。いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、Ｂ細胞活性化を調節するかまたは抑制することが公知である、いずれかの剤である。いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、Ｔ細胞から独立したＢ細胞活性化を調節するかまたは抑制することが公知である、いずれかの剤である。
【００３８】
抗ＩｇＭ剤は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１に特異的に結合する、ＩｇＭアンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合フラグメント；ＩＬ２１調節剤、例として、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体アンタゴニスト；チロシンキナーゼ阻害剤、例として、Ｓｙｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ＰＫＣ阻害剤；ＡＰＲＩＬ アンタゴニスト、例として、ＴＡＣＩ-Ｉｇ；ミゾリビン；トファシチニブ；および、テトラサイクリンを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
「ＩｇＭアンタゴニスト抗体」は、ＩｇＭの産生またはレベルを低下させることが公知である抗体、例として、ＩｇＭ抗体を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体は、ＩｇＭの産生に関わる、例として、ＩｇＭ抗体、または、ＩｇＭの産生につながる調節または刺激免疫経路に関わる、例として、ＩｇＭ抗体に関わるタンパク質またはペプチドに結合し活性を阻害する。
【００４０】
いくつかの態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体は、Ｂ細胞レベルを調節することが公知であるいずれかの抗体である。いくつかの態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体は、Ｂ細胞成熟を調節することが公知であるいずれかの抗体である。いくつかの態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体は、Ｂ細胞活性化を調節することが公知であるいずれかの抗体である。いくつかの態様において、ＩｇＭアンタゴニスト抗体は、Ｔ細胞から独立したＢ細胞活性化を調節するかまたは抑制することが公知であるいずれかの抗体である。
本明細書に提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、抗体の代用で使用されることができる。
【００４１】
ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦまたはＢ７ＲＰ−１に特異的に結合する、ＩｇＭアンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、本明細書において提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つにおいて、使用されることができる抗ＩｇＭ剤の例である。したがって、かかる剤は、かかるマーカーに特異的に結合するＢ細胞マーカーまたは他の分子に対する、抗体または抗原結合性剤であることも、できる。
【００４２】
「ＡＰＲＩＬアンタゴニスト」は、ＡＰＲＩＬの機能または産生を阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、別名腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３））は、細胞表面受容体ＴＡＣＩによって認識されるＴＮＦスーパーファミリーのタンパク質である。ＡＰＲＩＬは、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーに関する、リガンドである。このタンパク質およびその受容体が、両方ともＢ細胞の発生にとって重要であるとわかる。
【００４３】
ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬの小型分子阻害剤、ＡＰＲＩＬに対する抗体、およびＡＰＲＩＬの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＡＰＲＩＬ阻害剤は、ＢＩＯＮ−１３０１（Ａｄｕｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、  Ｉｎｃ．）を含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、ＡＰＲＩＬ アンタゴニストは、ＴＡＣＩ-Ｉｇである。ＴＡＣＩ−Ｉｇは、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの結合部位を免疫グロブリンの一定の領域と結合する組み換え融合タンパク質である。
【００４４】
「Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤」は、チロシンキナーゼのＢＴＫファミリーのメンバーの機能または産生を低下させるかまたは阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。チロシン−タンパク質キナーゼＢＴＫ酵素を阻害することによって、ＢＴＫ阻害剤は機能し、それはＢ細胞発生において重要な役割を果たす。ＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫの小型分子阻害剤、ＢＴＫに対する抗体、およびＢＴＫの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＢＴＫ阻害剤は、ＡＶＬ−２９２、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、ＰＣＩ−３２７６５、アカラブルチニブ、ＧＳ−４０５９、スペブルチニブ、ＢＧＢ−３１１１、およびＨＭ７１２２４を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
「ＩＬ−２１調節剤」は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１受容体の機能または産生を低下させるかまたは阻害する、いずれかの分子を含むが、これらに限定されない。インターロイキン−２１は、ウイルスに感染しているかがん性の細胞を破壊することができるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞障害性Ｔ細胞を含む、免疫系の細胞上の強力な調節効果を有する、サイトカインである。ＩＬ−２１が、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞がウイルス感染への免疫系応答を統制する機構に寄与することが、報告されてきた。いくつかの態様において、ＩＬ２１調節剤は、ＩＬ−２１アンタゴニストである。ＩＬ−２１アンタゴニストは、ＩＬ−２１の小型分子阻害剤、ＩＬ−２１に対する抗体、およびＩＬ−２１の発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＩＬ−２１阻害剤は、ＮＮＣ０１１４（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）を含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、そして、ＩＬ−２１調節剤は、ＩＬ−２１受容体アンタゴニストである。ＩＬ−２１受容体アンタゴニストは、ＩＬ−２１受容体の小型分子阻害剤、ＩＬ−２１受容体に対する抗体、およびＩＬ−２１受容体の発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＩＬ−２１受容体阻害剤は、ＡＴＲ−１０７（Ｐｆｉｚｅｒ）を含むが、これに限定されない。
【００４６】
「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、ＰＩ３Ｋキナーゼファミリーのメンバーの機能または産生を低下させるかまたは阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。ＰＩ３キナーゼは、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＩＫ３Ｒ６、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｇ、およびＰＩＫ３Ｃ３を含むが、これらに限定されない。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの小型分子阻害剤、ＰＩ３Ｋに対する抗体、およびＰＩ３Ｋの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を含む。例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＧＳ−１１０１、イデラリシブ、デュベリシブ、ＴＧＲ−１２０２、ＡＭＧ−３１９、コパンリシブ、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＩＣ４８６０６８、およびＩＣ８７１１４（ＩＣＯＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびＧＤＣ−０９４１を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
「ＰＫＣ阻害剤」は、ＰＫＣキナーゼファミリーのメンバーの機能または産生を低下させるかまたは阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。タンパク質キナーゼＣは、これらのタンパク質またはこのファミリーのメンバー上のセリンおよびトレオニンのアミノ酸残基のヒドロキシル基のリン酸化による、他のタンパク質の機能の制御に関わる、タンパク質キナーゼ酵素のファミリーである。ＰＫＣ酵素は、ＰＫＣ−α（ＰＲＫＣＡ）、ＰＫＣ−β１（ＰＲＫＣＢ）、ＰＫＣ−β２（ＰＲＫＣＢ）、ＰＫＣ−γ（ＰＲＫＣＧ）、ＰＫＣ−δ（ＰＲＫＣＤ）、ＰＫＣ−ε（ＰＲＫＣＥ）、ＰＫＣ−η（ＰＲＫＣＨ）、ＰＫＣ−θ（ＰＲＫＣＱ）、およびＰＫＣ−ι（ＰＲＫＣＩ）、（ＰＫＣ−ζ（ＰＲＫＣＺ））を含むが、これらに限定されない。ＰＫＣ阻害剤は、ＰＫＣの小型分子阻害剤、ＰＫＣに対する抗体、およびＰＫＣの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。
【００４８】
例示的なＰＫＣ阻害剤は、エンザスタウリン、ルボキシスタウリン、ケレリトリン、ミヤベノールＣ、ミリシトリン、ゴシポール、ベルバスコシド、ＢＩＭ−１、およびブリオスタチン１を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
「ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤」は、ＳＲＣキナーゼファミリーのメンバーの機能または産生を低下させるかまたは阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。ＳＲＣ阻害剤は、ＳＲＣの小型分子阻害剤、ＳＲＣに対する抗体、およびＳＲＣの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。
例示的なＳｙｋ阻害剤は、ダサチニブを含むが、これに限定されない。
【００５０】
「Ｓｙｋ阻害剤」は、チロシンキナーゼのＳｙｋファミリーのメンバーの機能または産生を低下させるかまたは阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。Ｓｙｋは、Ｂ細胞受容体およびＴ細胞受容体からのシグナル伝達に関わる。Ｓｙｋ阻害剤は、Ｓｙｋの小型分子阻害剤、Ｓｙｋに対する抗体、およびＳｙｋの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＳｙｋ阻害剤は、フォスタマチニブ（Ｒ７８８）、エントスプレチニブ（ＧＳ−９９７３）、セルズラテニブ（ＰＲＴ０６２０７０）、およびＴＡＫ−６５９（エントスプレチニブおよびニルバジピン）を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
「テトラサイクリン」は、共通の基本構造を有する一群の広域抗生物質化合物であり、ストレプトマイセスバクテリアのいくつかの種から直接単離されることができるか、または少なくとも半合成的に、産生されることができる。例示的なテトラサイクリンは、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、リメサイクリン、クロモサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、および３級−ブチルグリシルアミドミノサイクリンを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、１以上のチロシンキナーゼの機能または産生を低下させるかまたは阻害するいずれかの分子を含むが、これらに限定されない。チロシンキナーゼ阻害剤は、チロシンキナーゼの小型分子阻害剤、チロシンキナーゼに対する抗体、およびチロシンキナーゼの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。
【００５３】
例示的なチロシンキナーゼ阻害剤は、Ｓｙｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、およびＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を、含む。「抗ウイルス導入ベクター免疫応答」または「ウイルス導入ベクターに対する免疫応答」または類似のものは、ＩｇＭ応答などの、ウイルス導入ベクターに対するいずれかの望ましくない免疫応答を、指す。いくつかの態様において、望ましくない免疫応答は、ウイルス導入ベクターまたはその抗原に対する抗原特異的免疫応答である。いくつかの態様において、免疫応答は、ウイルス導入ベクターのウイルス抗原に対して特異的である。
【００５４】
抗ウイルス導入ベクター免疫応答は、それが、対象において何らかの様式において、または対象もしくは別の対象において予測もしくは測定される応答と比較して、低下するかまたは取り除かれる場合に、「抗ウイルス導入ベクター減弱応答」であるといえる。いくつかの態様において、本明細書において提供される併用投与の後に対象から得られた生物学的試料を用いて測定される、当該対象における抗ウイルス導入ベクター減弱化応答は、別の対象（試験対象など）から、この他方の対象への、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤の併用投与なしでのウイルス導入ベクター投与の後に得られた生物学的試料を用いて測定される抗ウイルス導入ベクター免疫応答と比較して、低下した抗ウイルス導入ベクター免疫応答（ＩｇＭ抗体応答など）を含む。いくつかの態様において、抗ウイルス導入ベクター減弱応答は、本明細書において提供される併用投与の後に対象から得られた生物学的試料中の、対象の生物学的試料に対して行われるその後のウイルス導入ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏでの負荷(ｃｈａｌｌｅｎｇｅ)により、別の対象（試験対象など）から、この他方の対象への、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤の併用投与なしでのウイルス導入ベクターの投与の後に得られた生物学的試料に対して行われるウイルス導入ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ負荷の後で検出される、抗ウイルス導入ベクター免疫応答と比較して、低下した抗ウイルス導入ベクター免疫応答（抗ＩｇＭ抗体など）である。
【００５５】
「抗原」とは、Ｂ細胞抗原またはＴ細胞抗原を意味する。「抗原の型」とは、同じまたは実質的に同じ抗原性の特徴を共有する分子である。いくつかの態様において、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質、糖脂質、ポリヌクレオチド、多糖などであってよい。
【００５６】
「接着する(ａｔｔａｃｈ)」または「接着している(ａｔｔａｃｈｅｄ)」または「カップリングする」または「カップリングされた」（など）は、１つの実体（例えば部分）を別のものに化学的に会合させることを意味する。いくつかの態様において、接着は共有的であり、これは、接着が２つの実体の間の共有結合の存在に関して起こることを意味する。非共有的態様において、非共有的接着は、限定されないが以下を含む非共有的相互作用により媒介される：電荷相互作用、アフィニティー相互作用、金属配位、物理的吸着、主客相互作用、疎水性相互作用、ＴＴスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁性相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用、および／またはこれらの組み合わせを含む。態様において、封入は、接着の形態である。
【００５７】
「平均」とは、本明細書において用いられる場合、他に記述されないかぎり、算数的平均値を指す。「共に(ｃｏｎｃｏｍｉｎｔａｎｔｌｙ)」とは、対象に、時間的に相関する、好ましくは、免疫応答の調節を提供するために時間的に十分に相関する様式において、２以上の材料／剤を投与すること、およびさらにより好ましくは２以上の材料／剤が組み合わせて投与されることを意味する。態様において、併用投与は、２以上の材料／剤の、特定された期間内、好ましくは１か月間以内、より好ましくは１週間以内、なおより好ましくは１日以内、さらにより好ましくは１時間以内の投与を包含してもよい。態様において、材料／剤は、繰り返し併用投与してもよい；すなわち２以上の場合の併用投与である。
【００５８】
「投与形態」とは、培地、対象への投与のために好適なキャリア、ビヒクルまたはデバイス中の薬理学的におよび／または免疫学的に活性な材料を意味する。本明細書において提供される組成物または用量のいずれか１つは、投与形態におけるものであってもよい。
「封入する」とは、合成ナノキャリア内の物質の少なくとも一部を囲い込むことを意味する。いくつかの態様において、物質は、合成ナノキャリア内に完全に囲い込まれる。
【００５９】
他の態様において、封入される物質の殆どまたは全てが、合成ナノキャリアの外の局所環境に暴露されない。他の態様において、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％（重量／重量）以下が、局所環境に暴露される。封入は、吸収とは別のものであり、吸収は、物質の殆どまたは全てを合成ナノキャリアの表面上に配置し、物質を合成ナノキャリアの外部の局所環境に暴露させる。
【００６０】
「導入遺伝子発現を拡大させること」とは、対象におけるウイルス導入ベクターの導入遺伝子発現産物のレベルを増大させることを指し、導入遺伝子は、ウイルス導入ベクターにより送達されるものである。いくつかの態様において、導入遺伝子発現産物のレベルは、対象における目的の多様な組織または系における導入遺伝子発現を測定することにより決定することができる。いくつかの態様において、導入遺伝子発現産物は、タンパク質である。他の態様において、導入遺伝子発現産物は、核酸である。導入遺伝子発現を拡大させることは、例えば、対象から得られた試料中の導入遺伝子発現産物の量を測定すること、およびそれを前の試料と比較することにより決定することができる。試料は、組織試料であってよい。いくつかの態様において、導入遺伝子発現産物は、フローサイトメトリーを用いて決定することができる。
【００６１】
「エクソンスキッピング導入遺伝子」とは、エクソンスキッピングを発生させ得るアンチセンスオリゴヌクレオチトまたは他の剤をコードするいずれかの核酸を意味する。「エクソンスキッピング」とは、タンパク質産生の間に、ｍＲＮＡ前駆体のレベルにおいてスキップされて取り除かれるエクソンを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライス部位またはエクソン内の調節要素と干渉し得る。これは、遺伝子変異の存在に関わらず、短縮された部分的に機能的なタンパク質に結果としてなる。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異特異的であり、メッセンジャーＲＮＡ前駆体中の変異部位に結合して、エクソンスキッピングを引き起こす。
【００６２】
対象は、エクソンスキッピングが有益となるであろう疾患または障害を有する対象であってよい。対象は、本明細書において提供される、ジストロフィーなどの、エクソンスキッピングの発生が有益となるであろう疾患または障害のいずれか１つを有していてよい。
【００６３】
加えて、エクソンスキッピング導入遺伝子は、エクソンスキッピングの結果が利益を与えるであろういずれかの内因性タンパク質の発現の間にエクソンスキッピングを発生させることができる剤をコードしていてもよい。かかるタンパク質の例は、本明細書において提供される疾患または障害、例えば本明細書において提供されるジストロフィーのいずれかに関連するタンパク質である。タンパク質は、いくつかの態様においては、本明細書において提供される治療用タンパク質のいずれかの内因性のバージョンであってもよい。
【００６４】
「遺伝子編集導入遺伝子」とは、遺伝子編集プロセスに関与する剤または成分をコードするいずれかの核酸を意味する。「遺伝子編集」とは、一般に、ターゲティングされたＤＮＡの挿入、置き換え、変異誘発または除去などの、ゲノムＤＮＡに対する持続的または恒久的な改変を指す。遺伝子を編集は、発現されたタンパク質の部分もしくは全てをコードするＤＮＡ配列を標的としても、または標的遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡの非コード配列を標的としてもよい。遺伝子編集は、目的のＤＮＡ配列をコードする核酸の送達、およびエンドヌクレアーゼを用いて目的の配列をゲノムＤＮＡ中の標的部位に挿入することを含む。
【００６５】
エンドヌクレアーゼは、ゲノム中の所望される位置において二本鎖ＤＮＡの切断部を作り出し、宿主細胞の機構を使用して、相同組み換え、非相同末端結合などを用いて切断部を修復することができる。遺伝子を編集するために用いることができるエンドヌクレアーゼのクラスとして、これらに限定されないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【００６６】
本明細書において提供される対象は、本明細書において提供される疾患または障害のいずれか１つであってよく、導入遺伝子は、本明細書において提供されるタンパク質のいずれか１つ、またはその内因性バージョンにおける欠損を補正するために用いることができる遺伝子編集剤をコードするものである。あるいは、いくつかの態様において、遺伝子を編集するウイルス導入ベクターはまた、本明細書において提供される治療用タンパク質またはその部分または核酸をコードする導入遺伝子を含んでもよい。いくつかの態様において、遺伝子を編集するウイルス導入ベクターは、本明細書において提供される治療用タンパク質またはその部分または核酸をコードする導入遺伝子を有するウイルス導入ベクターと共に、対象に投与することができる。
【００６７】
「遺伝子発現調節導入遺伝子」は、遺伝子発現モジュレーターをコードするいずれかの核酸を指す。「遺伝子発現モジュレーター」とは、１以上の内在遺伝子の発現を、増強、阻害または調節することができる分子を指す。遺伝子発現モジュレーターは、したがって、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、人工転写因子）ならびにＲＮＡ干渉を媒介する分子を含む。遺伝子発現モジュレーターは、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む。遺伝子発現モジュレーターはまた、前述のＲＮＡ分子のいずれかの改変されたバージョンを含む、改変されたＲＮＡを含んでもよい。
【００６８】
本明細書において提供される対象は、本明細書において提供される疾患または障害のいずれか１つであってよく、導入遺伝子は、本明細書において提供されるタンパク質のいずれか１つの発現を制御するために用いることができる遺伝子発現モジュレーターをコードするものである。いくつかの態様において、対象は、タンパク質の対象の内因性バージョンが欠損しているか、または限定された量においてのみ産生されるか、全く産生されない疾患または障害を有し、遺伝子発現モジュレーターは、かかるタンパク質の発現を制御することができる。したがって、遺伝子発現モジュレーターは、いくつかの態様において、本明細書において提供されるタンパク質のいずれか１つまたはその内因性バージョン（例えば本明細書において提供される治療用タンパク質の内因性バージョン）の発現を制御することができる。
「遺伝子治療導入遺伝子」は、タンパク質または核酸などの発現産物をコードし、細胞に導入される場合に、タンパク質または核酸の発現を導く核酸を、指す。タンパク質の場合、タンパク質は、治療タンパク質であることができる。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ウイルス導入ベクターにより遺伝子治療導入遺伝子が投与される対象は、タンパク質の対象の内因性バージョンが欠損しているか、または限定された量においてのみ産生されるか、全く産生されない疾患または障害を有する。いくつかの態様において、コードされたタンパク質は、ヒトのカウンターパートを有しないが、疾患または障害の処置において治療的に有益な効果を提供することが予測される。
【００６９】
「免疫抑制剤」は、好ましくはＡＰＣに対する効果を通して、免疫寛容原性効果を引き起こす化合物を意味する。免疫寛容原性効果は、一般に、ＡＰＣまたは他の免疫細胞による、全身性および／または局所的な調節であって、耐久的な様式において抗原に対する望ましくない免疫応答を阻害または予防するものを指す。一態様において、免疫抑制剤は、ＡＰＣに、１以上の免疫エフェクター細胞における調節性の表現型を促進させるものである。例えば、調節性の表現型は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ細胞の産生、誘導、刺激または動員の阻害、抗原特異的抗体の産生の阻害、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞）の産生、誘導、刺激または動員などにより特徴づけられ得る。このことは、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ細胞の調節性の表現型への変換の結果であってもよい。このことはまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよびｉＮＫＴ細胞などの他の免疫細胞におけるＦｏｘＰ３の誘導の結果であってもよい。一態様において、免疫抑制剤は、ＡＰＣが抗原をプロセッシングした後の応答に影響を及ぼすものである。別の態様において、免疫抑制剤は、抗原のプロセッシングに干渉するものではない。さらなる態様において、免疫抑制剤は、アポトーシスシグナル分子ではない。別の態様において、免疫抑制剤は、リン脂質ではない。
【００７０】
いくつかの態様において、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアの構造を構成する材料に加える要素である。例えば、一態様において、合成ナノキャリアが１以上のポリマーからなる場合、免疫抑制剤は、追加の、およびいくつかの態様においては１以上のポリマーに接着した、化合物である。別の例として、一態様において、合成ナノキャリアが、１以上の脂質からなる場合、免疫抑制剤は、やはり、１以上の脂質に加えるものであり、およびはいくつかの態様においては、接着している。他の実施態様において、合成ナノキャリアの材料も免疫寛容原性効果に結果としてなる場合に、免疫抑制剤は、免疫寛容原性効果に結果としてなる合成ナノキャリアの材料に加えて存在する要素である。
【００７１】
免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：スタチン；ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（すなわち、ラパログ(ｒａｐａｌｏｇ)）などのｍＴＯＲ阻害剤；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；ＴＧＦ−β受容体アゴニスト；トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤；副腎皮質ステロイド；ロテノンなどのミトコンドリアの機能の阻害剤；Ｐ３８阻害剤；６Ｂｉｏ、デキサメタゾン、ＴＣＰＡ-１、ＩＫＫ ＶＩＩなどのＮＦ-κβ阻害剤；アデノシン受容体アゴニスト；ミソプロストールなどのプロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）；ホスホジエステラーゼ阻害剤、ロリプラムなどのホスホジエステラーゼ４阻害剤（ＰＤＥ４）；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役受容体アゴニスト；Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト；糖質コルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体阻害剤；サイトカイン受容体アクチベーター；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アンタゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；ＴＧＸ-２２１などのＰＩ３ＫＢ阻害剤；３−メチルアデニンなどのオートファジー阻害剤；アリール炭化水素受容体阻害剤；プロテアソーム阻害剤Ｉ（ＰＳＩ）；ならびにＰ２Ｘ受容体遮断薬などの酸化ＡＴＰ。ＩＤＯ、ビタミン Ｄ３、レチノイン酸、シクロスポリンＡなどのシクロスポリン、アリール炭化水素受容体阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン (アザ)、６-メルカプトプリン (６-ＭＰ)、６-チオグアニン (６-ＴＧ)、ＦＫ５０６、サングリフィーリンＡ、サルメテロール、ミコフェノール酸モフェチル (ＭＭＦ)、アスピリンおよび他のＣＯＸ阻害剤、ニフルミン酸、エストリオールおよびトリプトライド。他の例示的な免疫抑制剤として、限定されないが、低分子薬、天然生成物、抗体（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ４に対する抗体）、生物製剤ベースの薬物、炭水化物ベースの薬物、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸、アプタマー、メトトレキサート、ＮＳＡＩＤ；フィンゴリモド；ナタリズマブ；アレムツズマブ；抗ＣＤ３；タクロリムス（ＦＫ５０６）、アバタセプト、ベラタセプトなどが挙げられる。「ラパログ」とは、ラパマイシン（シロリムス）に構造的に関連する（そのアナログである）分子を指す。ラパログの例として、限定することなく、テムシロリムス（ＣＣＩ-７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダフォロリムス（ＡＰ-２３５７３）、およびゾタロリムス（ＡＢＴ-５７８）が挙げられる。ラパログのさらなる例は、例えばＷＯ公開ＷＯ１９９８/００２４４１および米国特許第８,４５５,５１０号において見出すことができ、それらのラパログは、本明細書においてその全体において参考として援用される。
さらなる免疫抑制剤は、当業者に公知であり、本発明は、この点において限定されない。
態様において、免疫抑制剤は、本明細書に提供される剤のいずれか１つを含んでもよい。
【００７２】
「負荷量(ｌｏａｄ)」とは、合成ナノキャリアと共役する場合、合成ナノキャリア全体における材料の乾燥処方重量（重量／重量）に基づいた、合成ナノキャリアと共役する免疫抑制剤の量である。一般に、かかる負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均として計算される。一態様において、負荷量は、合成ナノキャリア全体の平均で０．１％と５０％との間である。別の態様において、負荷量は、０．１％と２０％との間である。さらなる態様において、負荷量は、０．１％と１０％との間である。なおさらなる態様において、負荷量は、１％と１０％との間である。なおさらなる態様において、負荷量は、７％と２０％との間である。さらに別の態様において、負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均で、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％である。そのうえさらなる態様において、負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均で、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％である。いくつかの上の態様のうちの態様において、負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均で、２５％以下である。態様において、負荷量は、当該技術分野において公知のいかなる方法も使用して算出される。免疫抑制剤の負荷量は、合成ナノキャリアにおいて、本明細書に提供される負荷量のいずれか１つを含んでもよい。
【００７３】
「合成ナノキャリアの最大寸法」とは、合成ナノキャリアのいずれかの軸に沿って測定されるナノキャリアの最大寸法を意味する。「合成ナノキャリアの最小寸法」とは、合成ナノキャリアのいずれかの軸に沿って測定される合成ナノキャリアの最小寸法を意味する。例えば、球体の合成ナノキャリアについて、合成ナノキャリアの最大および最小寸法は、実質的に同一であり、その直径のサイズである。同様に、立方状合成ナノキャリアについて、合成ナノキャリアの最小寸法は、その高さ、幅または長さのうちの最小のものであり、一方、合成ナノキャリアの最大寸法は、その高さ、幅または長さのうちの最大のものである。一態様において、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１００ｎｍと等しいか、またはこれより大きい。一態様において、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最大寸法は、５μｍと等しいか、またはこれより小さい。好ましくは、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１１０ｎｍより大きく、より好ましくは１２０ｎｍより大きく、より好ましくは１３０ｎｍより大きく、より好ましくはなお、１５０ｎｍより大きい。合成ナノキャリアの最大および最小寸法のアスペクト比は、態様に依存して変化し得る。例えば、合成ナノキャリアの最小寸法に対する最大寸法のアスペクト比は、１：１〜１，０００，０００：１、好ましくは１：１〜１００，０００：１、より好ましくは１：１〜１０，０００：１、より好ましくは１：１〜１０００：１、なおより好ましくは１：１〜１００：１、およびさらにより好ましくは１：１〜１０：１の間で変化し得る。好ましくは、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最大寸法は、３μｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは２μｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは１μｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは８００ｎｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは６００ｎｍと等しいか、またはこれより小さく、およびより好ましくはなお、５００ｎｍと等しいか、またはこれより小さい。好ましい態様において、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１００ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、より好ましくは１２０ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、より好ましくは１３０ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、より好ましくは１４０ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、およびより好ましくはなお、１５０ｎｍと等しいか、またはこれより大きい。合成ナノキャリアの寸法（例えば有効直径）の測定は、いく���かの態様において、合成ナノキャリアを液体（通常は水性）媒体中に懸濁して、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いること（例えばＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰＡＬＳ装置を用いること）により、得ることができる。例えば、合成ナノキャリアの懸濁液を、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの最終合成ナノキャリア懸濁液濃度を達成するために、水性バッファーから精製水中で希釈することができる。希釈された懸濁液は、ＤＬＳ分析のために好適なキュベット中で直接調製しても、またはこれに移してもよい。キュベットを、次いで、ＤＬＳ内に置き、制御された温度まで平衡化させて、次いで、媒体の粘度および試料の屈折率のための適切なインプットに基づいて、安定で再現性のある分布を得るために十分な時間にわたりスキャンすることができる。有効直径、または分布の平均を、次いで報告させる。高アスペクト比または非球形の合成ナノキャリアの有効サイズを決定することは、より正確な測定値を得るために、電子顕微鏡法などの増強技術を必要とする場合がある。合成ナノキャリアの「次元」または「寸法」または「直径」は、例えば動的光散乱を用いて得られる粒子サイズ分布の平均を意味する。「非メトキシ末端のポリマー」とは、メトキシ以外の部分で終了する少なくとも１つの末端を有するポリマーを意味する。いくつかの態様において、ポリマーは、メトキシ以外の部分で終了する少なくとも２つの末端を有する。他の態様において、ポリマーは、メトキシで終了する末端を有しない。
【００７４】
「非メトキシ末端のプルロニックポリマー」とは、両端にメトキシを有する直鎖状プルロニックポリマー以外のポリマーを意味する。本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、いくつかの態様において、非メトキシ末端のポリマーまたは非メトキシ末端のプルロニックポリマーを含むことができる。他の態様において、ポリマーナノ粒子は、かかるポリマーを含まない。「薬学的に許容し得る賦形剤」または「薬学的に許容し得るキャリア」とは、組成物を処方するために薬理学的に活性な材料と一緒に用いられる薬理学的に不活性な材料を意味する。薬学的に許容し得る賦形剤は、当該分野において公知の多様な材料を含み、これは、限定されないが、糖（例えばグルコース、ラクトースなど）、抗菌剤などの保存剤、再構成補助剤、色素、食塩水（例えばリン酸緩衝化食塩水）およびバッファーを含む。
【００７５】
「プロトコル」とは、対象に投与するパターンを意味し、１以上の物質の対象へのいずれかの投薬レジメンを含む。プロトコルは、要素（または変数）からなり；したがって、プロトコルは、１以上の要素を含む。プロトコルのかかる要素は、投薬量（用量）、投薬頻度、投与の経路、投薬期間、投薬速度、投薬の間隔、前述のもののいずれかの組み合わせなどを含んでもよい。いくつかの態様において、プロトコルは、１以上の本発明の組成物を、１以上の試験対象に投与するために用いることができる。これらの試験対象における免疫応答を、次いで、所望される、または所望されるレベルの、免疫応答または治療効果を生じることにおいてプロトコルが有効であったか否かを決定するために評価することができる。いずれかの治療効果および／または免疫性効果を評価することができる。プロトコルの要素の１以上は、非ヒト対象などの試験対象において前に実証されていてもよく、次いでヒトプロトコルに翻訳してもよい。例えば、相対成長率または他の尺度法などの確立された技術を用いて、非ヒト対象において実証された投薬量を、トプロトコルの要素としてスケーリングしてもよい。プロトコルが所望される効果を有したか否かは、本明細書において提供されるかまたは他の当該分野において公知の方法のうちのいずれかを用いて決定することができる。例えば、試料は、特定の免疫細胞、サイトカイン、抗体などが、低下、産生または活性化されたか否かなどを決定するために、本明細書において提供される組成物が特定のプロトコルにしたがって投与された対象から得ることができる。例示的なプロトコルは、ウイルス導入ベクター抗原に対する免疫寛容原性免疫応答に結果としてなること、または本明細書において記載の有益な結果のいずれか１つを達成することが、以前に示されているものである。
【００７６】
免疫細胞の存在および／または数検出するために有用な方法として、これらに限定されないが、フローサイトメトリー法（例えば、ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖応答、サイトカイン産生、および免疫組織化学法が挙げられる。免疫細胞マーカーの特異的染色のための抗体および他の結合剤は、市販されている。かかるキットは、典型的には、ＦＡＣＳベースの検出、不均一な細胞の集団からの所望される細胞集団の精製および／または定量化を可能にする、抗原についての染色試薬を含む。態様において、本明細書において提供される組成物は、選択された要素が対象において所望される結果を達成すると予測されることを前提として、プロトコルを構成する要素の１もしくは２以上、または全てもしくは実質的に全てを用いて、対象に投与される。かかる予測は、試験対象において決定されたプロトコルおよび必要とされる場合にはスケーリングに基づくものであってよい。本明細書に提供される方法のいずれか１つは、免疫抑制剤と、ＩｇＭ応答などの、抗ウイルス導入ベクター免疫応答を減弱化し、および／またはウイルス導入ベクターの反復投与をゆるす、および／またはウイルス導入ベクターに対する１以上の免疫応答の減弱化に結果としてなる、および／または増加した導入遺伝子発現に結果としてなるために示されたプロトコルにしたがって本明細書に記載の抗ＩｇＭ剤とを含む合成ナノキャリアと組み合わせて、ウイルス導入ベクターの用量を投与するステップを、含んでもよいかさらに含んでもよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、本明細書において記載の有益な結果のいずれか１つを達成するかかるプロトコルを決定することを含んでもよいか、またはこれをさらに含んでもよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、本明細書において記載の有益な結果のいずれか１つを達成するプロトコルに従い投与することを含んでもよいか、またはこれをさらに含んでもよい。
【００７７】
「反復用量」または「反復投薬」または類似のものは、同じ材料の以前の用量または投薬の後に対象に投与される、少なくとも１回のさらなる用量または投薬を意味する。例えば、ウイルス導入ベクターの反復用量は、同じ材料の以前の用量の後の、ウイルス導入ベクターの少なくとも１回のさらなる用量である。材料は同じであってよいが、一方で、反復用量中の材料の量は、以前の用量と異なっていてもよい。本明細書に提供されるように、反復用量は、例の間隔などで、投与されてもよい。反復投薬は、それが対象のために有益な効果に結果としてなる場合、有効であると考えられる。好ましくは、有効な反復投与は、減弱化された抗ウイルス導入ベクター応答と連動して、治療効果などの、有益な効果に結果としてなる。
【００７８】
「同時(ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ)」とは、医師が、投与の間のいずれかの時間を、所望される治療成績に対して影響を及ぼすためには実質的に無または無視し得ると考えるであろう場合に、同じ時間または実質的に同じ時間における投与を意味する。いくつかの態様において、同時とは、投与が、５、４、３、２、１分間またはそれより短い時間内に起きることを意味する。
【００７９】
「対象」とは、ヒトおよび霊長類などの温血哺乳動物；鳥類；ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマおよびブタなどの家庭内または家畜動物；マウス、ラットおよびモルモットなどの実験動物；魚類；爬虫類；動物園および野生の動物などを含む動物を意味する。本明細書において用いられる場合、対象は、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つを必要とするものであってよい。
【００８０】
「合成ナノキャリア（単数または複数）」とは、天然では見出されない個別の物体であって、サイズが５マイクロメートルより小さいか、またはこれと等しい、少なくとも１つの寸法を有するものを意味する。アルブミンナノ粒子は、一般に合成ナノキャリアとして含まれるが、しかし、ある態様においては、合成ナノキャリアは、アルブミンナノ粒子を含まない。態様において、合成ナノキャリアは、キトサンを含まない。他の態様において、合成ナノキャリアは、脂質ベースのナノ粒子ではない。さらなる態様において、合成ナノキャリアは、リン脂質を含まない。
【００８１】
合成ナノキャリアは、これらに限定されないが、１つまたは複数の脂質ベースのナノ粒子（また本明細書において液体ナノ粒子、すなわち、それらの構造を構成する材料の大部分が脂質であるナノ粒子としても言及される）、ポリマーナノ粒子、金属ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルション、デンドリマー、バッキーボール、ナノワイヤー、ウイルス様粒子（すなわち、主にウイルスの構造タンパク質からなるが、感染性ではないか、低い感染性を有する粒子）、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子（また本明細書において、タンパク質粒子、すなわち、それらの構造を構成する材料の大部分がペプチドもしくはタンパク質である粒子としても言及される）（アルブミンナノ粒子など）および／または脂質−ポリマーナノ粒子などのナノ材料の組み合わせを用いて開発されるナノ粒子であってもよい。合成ナノキャリアは、多様な異なる形状であってよく、これは、限定されないが、球体、立方状、錐体、長方形、円柱状、ドーナツ型などを含む。本発明による合成ナノキャリアは、１以上の表面を含む。本発明の実施における使用のために適応させることができる例示的な合成ナノキャリアは、以下を含む：（１）Ｇｒｅｆらに対する米国特許５,５４３,１５８において開示される生分解性ナノ粒子、（２）Ｓａｌｔｚｍａｎらに対する米国特許出願公開２００６０００２８５２のポリマーナノ粒子、（３）ＤｅＳｉｍｏｎｅらに対する米国特許出願公開２００９００２８９１０のリソグラフィーにより構築されるナノ粒子、（４）ｖｏｎ Ａｎｄｒｉａｎらに対するＷＯ ２００９/０５１８３７の開示、（５）Ｐｅｎａｄｅｓらに対する米国特許出願公開２００８/０１４５４４１において開示されるナノ粒子、（６）ｄｅ ｌｏｓ Ｒｉｏｓらに対する米国特許出願公開２００９０２２６５２５において開示されるタンパク質ナノ粒子、（７）Ｓｅｂｂｅｌらに対する米国特許出願公開２００６０２２２６５２において開示されるウイルス様粒子、（８）Ｂａｃｈｍａｎｎらに対する米国特許出願公開２００６０２５１６７７において開示される核酸結合ウイルス様粒子、（９）ＷＯ２０１００４７８３９Ａ１またはＷＯ２００９１０６９９９Ａ２において開示されるウイルス様粒子、（１０）Ｐ. Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ., 「Ｓｕｒｆａｃｅ-ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＬＧＡ-ｂａｓｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｃａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ-ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ. ５(６): ８４３-８５３ (２０１０)において開示されるナノ沈殿させたナノ粒子、（１１）米国公開２００２/００８６０４９において開示されるアポトーシス細胞、アポトーシス小体または合成もしくは半合成模倣物、あるいは（１２）Ｌｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｎａｎｏｇｅｌ-ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ」Ｊ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２３(４): １７４１-１７４９ (２０１３)のもの。
【００８２】
約１００ｎｍと等しいかこれより小さい、好ましくは１００ｎｍと等しいかこれより小さい最小寸法を有する、本発明による合成ナノキャリアは、補体を活性化するヒドロキシル基を有する表面を含まないか、あるいは、補体を活性化するヒドロキシル基ではない部分から本質的になる表面を含む。好ましい態様において、約１００ｎｍと等しいかこれより小さい、好ましくは１００ｎｍと等しいかこれより小さい最小寸法を有する、本発明による合成ナノキャリアは、補体を実質的に活性化する表面を含まないか、あるいは、補体を実質的に活性化しない部分から本質的になる表面を含む。より好ましい態様において、約１００ｎｍと等しいかこれより小さい、好ましくは１００ｎｍと等しいかこれより小さい最小寸法を有する、本発明による合成ナノキャリアは、補体を活性化する表面を含まないか、あるいは、補体を活性化しない部分から本質的になる表面を含む。態様において、合成ナノキャリアは、ウイルス様粒子を除外する。態様において、合成ナノキャリアは、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７より大きい、または１：１０より大きいアスペクト比を有してもよい。
【００８３】
「治療用タンパク質」とは、本明細書において提供される遺伝子治療導入遺伝子から発現され得るいずれかのタンパク質を意味する。治療用タンパク質は、タンパク質の置き換えまたはタンパク質の補充のために用いられるものであってよい。治療用タンパク質として、これらに限定されないが、酵素、酵素補因子、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、増殖因子などが挙げられる。他の治療用タンパク質の例は、本明細書において他の場所で提供される。対象は、本明細書において提供される治療用タンパク質のいずれかによる処置を必要とするものであってよい。
【００８４】
「ウイルス導入ベクターの導入遺伝子」とは、細胞中に輸送するためにウイルス導入ベクターが用いられる核酸材料であって、一旦細胞中に入ると、発現して、本明細書において記載のような治療的適用のためのタンパク質または核酸分子を産生するものを指す。導入遺伝子は、遺伝子治療導入遺伝子、遺伝子編集導入遺伝子、遺伝子発現調節導入遺伝子またはエクソンスキッピング導入遺伝子であってよい。「発現される」または「発現」または類似のものは、導入遺伝子が細胞中に形質導入されて、形質導入された細胞によりプロセッシングされた後の、機能的（すなわち、所望される目的のために生理学的に活性な）遺伝子産物の合成を指す。かかる遺伝子産物はまた、本明細書において「導入遺伝子発現産物」としても言及される。発現された産物は、したがって、導入遺伝子によりコードされた結果としてのタンパク質または核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは治療用ＲＮＡを含む。
【００８５】
「ウイルス導入ベクター」は、本明細書に提供されるように、導入遺伝子などの、核酸を送達するのに適していたウイルスのベクターを意味し、かかる核酸を含む。「ウイルスベクター」とは、ウイルス導入ベクターのウイルス成分の全てを、指す。したがって、「ウイルス抗原」は、それが送達する導入遺伝子などの核酸ではなく、カプシドまたはコートタンパク質などの、ウイルス導入ベクターのウイルス成分の抗原を、またはそれがコードするいずれかの生成物を、指す。「ウイルス導入ベクター抗原」は、導入遺伝子などの送達された核酸と同様に、そのウイルス成分を含むウイルス導入ベクターのいずれかの抗原、またはそれらのいずれかの発現生成物を、指す。導入遺伝子は、遺伝子治療導入遺伝子、遺伝子編集導入遺伝子、遺伝子発現調節導入遺伝子またはエクソンスキッピング導入遺伝子であってよい。いくつかの態様において、導入遺伝子は、治療用タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質またはエンドヌクレアーゼなどの本明細書において提供されるタンパク質をコードするものである。
【００８６】
他の態様において、導入遺伝子は、ガイドＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｄｓＲＮＡもしくはｓｓＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、または三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）などをコードするものである。ウイルスベクターは、限定することなく、レトロウイルス（例えば、マウスレトロウイルス、トリレトロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーヴェイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルスなどに基づくものであってよい。他の例は、本明細書において他の場所において提供されるか、当該分野において公知である。ウイルスベクターは、ウイルスの天然のバリアント、株、または血清型、例えば本明細書において提供されるもののいずれか１つに基づくものであってよい。ウイルスベクターはまた、分子進化を通して選択されるウイルスに基づくものであってよい。ウイルスベクターはまた、操作されたベクター、組み換えベクター、変異体ベクター、またはハイブリッドベクターであってよい。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、「キメラウイルスベクター」である。かかる態様において、このことは、ウイルスベクターが、１種より多くのウイルスまたはウイルスベクターに由来するウイルス成分からなることを意味する。
Ｃ．本発明の方法における使用のための組成物
【００８７】
重要なことに、明細書に提供される方法および組成物が、ウイルス導入ベクターに対して、ＩｇＭ応答などの、本免疫応答を減弱化することが、わかった。その上、本明細書に提供される方法および組成物が、導入遺伝子発現の実質的増加を、可能にすることが、わかった。
【００８８】
本明細書において提供される方法および組成物は、ウイルス導入ベクターによる対象の処置のために有用である。ウイルス導入ベクターは、遺伝子治療、遺伝子編集、遺伝子発現調節およびエクソンスキッピングのためのものを含む多様な目的のために導入遺伝子を送達するために用いることができ、本明細書において提供される方法および組成物もまた、そのように適用可能である。
導入遺伝子
【００８９】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターの導入遺伝子は、遺伝子治療導入遺伝子であってよく、疾患または障害によるものなどの、対象にとって有益ないずれかのタンパク質またはその部分をコードしてもよい。タンパク質は、細胞外、細胞内、または膜結合タンパク質であってよい。該タンパク質は、治療用タンパク質であり、ウイルス導入ベクターにより遺伝子治療導入遺伝子が投与される対象は、当該タンパク質の対象の内因性バージョンが欠損しているか、限定された量で産生されるか、または全く産生されない疾患または障害を有する。したがって、対象は、本明細書において提供される疾患または障害のいずれか１つを有するものであってよく、導入遺伝子は、本明細書において提供される治療用タンパク質またはその部分のいずれか１つをコードするものであってもよい。
【００９０】
治療用タンパク質の例として、これらに限定されないが、注入可能なまたは注射可能な治療用タンパク質、酵素、酵素補因子、ホルモン、血液または血液凝固因子、サイトカインおよびインターフェロン、増殖因子、アディポカインなどが挙げられる。
【００９１】
注入可能なまたは注射可能な治療用タンパク質の例として、例えば、トシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ/Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））、アルファ−１アンチトリプシン（Ｋａｍａｄａ／ＡＡＴ）、Ｈｅｍａｔｉｄｅ（登録商標）（ＡｆｆｙｍａｘおよびＴａｋｅｄａ、合成ペプチド）、アルブインターフェロンアルファ−２ｂ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ/Ｚａｌｂｉｎ（商標））、Ｒｈｕｃｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｃ１阻害剤補充療法）、テサモレリン（Ｔｈｅｒａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ/Ｅｇｒｉｆｔａ、合成成長ホルモン放出因子）、オクレリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＲｏｃｈｅおよびＢｉｏｇｅｎ）、ベリムマブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ／Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））、ペグロチカーゼ（Ｓａｖｉｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ（商標））、タリグルセラーゼアルファ（Ｐｒｏｔａｌｉｘ／Ｕｐｌｙｓｏ）、アガルシダーゼアルファ（Ｓｈｉｒｅ／Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））、ならびにベラグルセラーゼアルファ（Ｓｈｉｒｅ）が挙げられる。
【００９２】
酵素の例として、リゾチーム、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパラナーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、溶解素およびリガーゼが挙げられる。酵素の他の例は、酵素補充療法のために用いられるものを含み、これは、限定されないが、イミグルセラーゼ（例えば、ＣＥＲＥＺＹＭＥ（商標））、ａ−ガラクトシダーゼＡ（ａ-ｇａｌ Ａ）（例えば、アガルシダーゼベータ、ＦＡＢＲＹＺＹＭＥ（商標））、酸ａ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）（例えば、アルグルコシダーゼアルファ、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（商標）、ＭＹＯＺＹＭＥ（商標））、およびアリールスルファターゼＢ（例えば、ラロニダーゼ、ＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）、イデュルスルファーゼ、ＥＬＡＰＲＡＳＥ（商標）、アリールスルファターゼＢ、ＮＡＧＬＡＺＹＭＥ（商標））を含む。
【００９３】
ホルモンの例は、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、メラノコルチン、脳下垂体ホルモン、バゾプレシン、オキシトシン、成長ホルモン、プロラクチン、オレキシン、ナトリウム排泄増加ホルモン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エリスロポイエチン、および膵臓ホルモンを含むが、これらに限定されない。
【００９４】
血液または血液凝固因子の例として、第Ｉ因子（フィブリノーゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、第ＶＩＩ因子（安定因子、プロコンバーチン）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病性グロブリン）、第ＩＸ因子（クリスマス因子または血漿トロンボプラスチン成分）、第Ｘ因子（スチュアート・プロワー因子）、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォン・ヴィルブランド因子、フォン・ヘルデブラント因子、プレカリクレイン（フレッチャー因子）、高分子キニノーゲン（ＨＭＷＫ）（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、フィブリン、トロンビン、アンチトロンビンＩＩＩなどのアンチトロンビン、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２−アンチプラスミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ１）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２（ＰＡＩ２）、癌凝血原(ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ)、およびエポエチンアルファ（Ｅｐｏｇｅｎ、Ｐｒｏｃｒｉｔ）が挙げられる。
【００９５】
サイトカインの例として、リンホカイン、インターロイキン、ならびにケモカイン、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−βなどの１型サイトカイン、ならびにＩＬ-４、ＩＬ-１０およびＩＬ-１３などの２型サイトカインが挙げられる。
【００９６】
増殖因子の例として、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子受容体（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞腫由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ-８）、神経増殖因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ-α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達経路、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、［（ウシ胎仔ソマトトロフィン）］（ＦＢＳ）、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６およびＩＬ-７が挙げられる。
アディポカインの例として、レプチンおよびアディポネクチンが挙げられる。
【００９７】
治療用タンパク質のさらなる例として、これらに限定されないが、受容体、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、足場タンパク質、転写因子、構造タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、結合タンパク質、核タンパク質、分泌型タンパク質、ゴルジ体タンパク質、小胞体タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、および小胞タンパク質などが挙げられる。
【００９８】
本明細書において提供される遺伝子治療用ウイルス導入ベクターの導入遺伝子は、対象におけるその内因性バージョンの何らかの欠損（内因性バージョン発現の欠損を含む）を通して、対象において疾患または障害に結果としてなる、いずれかのタンパク質の機能的なバージョンをコードしていてもよい。かかる疾患または障害の例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：リソソーム蓄積性疾患／障害、例えばＳａｎｔａｖｕｏｒｉ-Ｈａｌｔｉａ病（小児性神経セロイドリポフスチン沈着症１型）、Ｊａｎｓｋｙ-Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病（遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、２型）、バッテン病（若年性神経セロイドリポフスチン症、３型）、クーフス病（神経セロイドリポフスチン症、４型）、フォン・ギールケ病（糖原病、Ｉａ型）、糖原病、Ｉｂ型、ポンペ病（糖原病、ＩＩ型）、フォーブス病またはコリ病（糖原病、ＩＩＩ型）、ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ−細胞病）、ムコリピドーシスＩＩＩ（偽性ハーラー・ポリジストロフィー）、ムコリピドーシスＩＶ（シアロリピドーシス(ｓｉａｌｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ)）、シスチン症（成人非腎症性型）、シスチン症（小児性腎症性型）、シスチン症（若年性または青年性腎症型）、サラ病／小児型シアル酸蓄積障害、およびサポシン欠損；脂質およびスフィンゴ脂質分解の障害、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス（小児性、遅発型小児性／若年性、および成人型／慢性）、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、Ａｂバリアント、ファブリー病、ゴーシェ病、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病（早発型および遅発型）、ニーマン・ピック病、Ａ、Ｂ、Ｃ１およびＣ２型、ファーバー病およびウォルマン病（コレステリルエステル蓄積症）；ムコ多糖分解の障害、例えばハーラー症候群（ＭＰＳＩ）、シャイエ症候群（ＭＰＳ ＩＳ）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ ＩＨ/Ｓ）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、サンフィリポＡ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）、サンフィリポＣ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＣ）、サンフィリポＤ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＤ）、モルキオＡ症候群（ＭＰＳ ＩＶＡ）、モルキオＢ症候群（ＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトー・ラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ）、およびスライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）；糖タンパク質分解の障害、例えばアルファマンノース症、ベータマンノース症、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、ムコリピドーシスＩ（シアリドーシス）、ガラクトシアリドーシス、シンドラー病、およびＩＩ型シンドラー病／神崎病；ならびに白質ジストロフィー疾患／障害、例えば、無ベータリポ蛋白血症、新生児副腎白質ジストロフィー、カナバン病、脳腱黄色腫症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、タンジール病、小児性レフサム病、および古典的レフサム病。
【００９９】
本明細書において提供される対象のかかる疾患／障害のさらなる例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：酸性マルターゼ欠損症（例えば、ポンペ病、糖原病２型、リソソーム蓄積症）；カルニチン欠損症；カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症；
【０１００】
脱分枝酵素欠損症（例えば、コリ病またはフォーブス病、糖原病３型）；ラクタート デヒドロゲナーゼ 欠乏症 (例として、グリコーゲンｏｓｉｓ タイプ １１)；ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症；ホスホフルクトキナーゼ欠損症（例えば、垂井病、糖原病７型）；ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症（例えば、糖原病９型）；ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症（例えば、糖原病１０型）；ホスホリラーゼ欠損症（例えば、マッカードル病、筋ホスホリラーゼ欠損症、糖原病５型）；ゴーシェ病（例えば、染色体１、酵素グルコセレブロシダーゼが影響を受ける）；軟骨無形成症（例えば、染色体４、線維芽細胞増殖因子受容体３が影響を受ける）；ハンチントン病（例えば、染色体４、ハンチンチン）；ヘモクロマトーシス（例えば、染色体６、ＨＦＥタンパク質）；嚢胞性線維症（例えば、染色体７、ＣＦＴＲ）；フリートライヒ運動失調症（染色体９、フラタキシン）；ベスト病（染色体１１、ＶＭＤ２）；鎌状赤血球症（染色体１１、ヘモグロビン）；フェニルケトン尿症（染色体１２、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）；マルファン症候群（染色体１５、フィブリリン）；筋緊張性ジストロフィー（染色体１９、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ）；副腎白質ジストロフィー（Ｘ染色体、ペルオキシソーム中のリグノセロイル−ＣｏＡリガーゼ）；デュシェンヌ筋ジストロフィー（Ｘ染色体、ジストロフィン）；レット症候群（Ｘ染色体、メチルＣｐＧ結合タンパク質２）；レーベル遺伝性視神経症（ミトコンドリア、呼吸器タンパク質）；ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中（ＭＥＬＡＳ）（ミトコンドリア、トランスファーＲＮＡ）；
ならびに尿素回路の酵素欠損。
【０１０１】
かかる疾患または障害のなおさらなる例として、これらに限定されないが、鎌状赤血球貧血、筋細管ミオパチー、血友病Ｂ、リポタンパク質リパーゼ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、クリグラー・ナジャー症候群、ムコリピドーシスＩＶ、ニーマン・ピック病Ａ、サンフィリポＡ、サンフィリポＢ、サンフィリポＣ、サンフィリポＤ、ｂ−地中海貧血症およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーが挙げられる。疾患または障害のなおさらなる例として、脂質およびスフィンゴ脂質分解、ムコ多糖分解、糖タンパク質分解における欠損の結果であるもの、白質ジストロフィーなどが挙げられる。
【０１０２】
本明細書において提供される疾患または障害のいずれか１つの欠損タンパク質の機能的バージョンは、遺伝子治療用ウイルス導入ベクターの導入遺伝子によりコードされていてもよく、また治療用タンパク質と考えられる。治療用タンパク質もまた、筋ホスホリラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、線維芽細胞増殖因子受容体３、ハンチンチン、ＨＦＥタンパク質、ＣＦＴＲ、フラタキシン、ＶＭＤ２、ヘモグロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フィブリリン、筋強直性ジストロフィータンパク質キナーゼ、リグノセロイル−ＣｏＡリガーゼ、ジストロフィン、メチルＣｐＧ結合タンパク質２、ベータヘモグロビン、ミオチューブラリン、カテプシンＡ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ、ベータガラクトシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１−１、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン(Ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ)−１、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質、スフィンゴミエリナーゼ、酸性セラミダーゼ、ライソゾーム酸性リパーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡアルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ、アルファ−マンノシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子および呼吸器タンパク質を含むということになる。
【０１０３】
さらなる例として、治療用タンパク質はまた、以下に関連するタンパク質の機能的バージョンを含む：脂質およびスフィンゴ脂質分解の障害（例えば、β−ガラクトシダーゼ−１、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ、ＧＭ２アクチベータータンパク質、８−ガラクトシダーゼＡ、グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１、ＨＥ１タンパク質（コレステロール輸送の欠陥）、酸性セラミダーゼ、ライソゾーム酸性リパーゼ）；ムコ多糖分解の障害（例えば、Ｌ−イズロニダーゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、ガラクトサミン−６−スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、グルクロニダーゼ）；糖タンパク質分解の障害（例えば、マンノシダーゼ、マンノシダーゼ、ｌ−フコシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、ノイラミニダーゼ、リソソーム保護タンパク質、リソソーム８−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、リソソーム８−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ）；リソソーム蓄積障害（例えば、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ、少なくとも４種のサブタイプ、リソソーム膜タンパク質、未知、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコース−６−ホスファートトランスロカーゼ、酸性マルターゼ、脱分枝酵素アミロ−１，６グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、ガングリオシドシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）、リソソームシステイン輸送タンパク質、リソソームシステイン輸送タンパク質、リソソームシステイン輸送タンパク質、シアル酸輸送タンパク質サポニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）および白質ジストロフィー（例えば、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質／アポリポタンパク質Ｂ、ペルオキシソーム膜輸送タンパク質、ペルオキシン、アスパルトアシラーゼ、ステロール−２７−ヒドロキシラーゼ、プロテオリピドタンパク質、ＡＢＣ１トランスポーター、ペルオキシソーム膜タンパク質３またはペルオキシソーム新生因子１、フィタン酸オキシダーゼ）。
【０１０４】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターは、遺伝子編集のために用いることができる。かかる態様において、ウイルス導入ベクターの導入遺伝子は、遺伝子編集導入遺伝子である。かかる導入遺伝子は、遺伝子編集プロセスに関与する剤または成分をコードする。一般に、かかるプロセスは、ゲノムＤＮＡに対する、ターゲティングされたＤＮＡの挿入、置き換え、変異誘発または除去などの、持続性のまたは恒久的な改変に結果としてなる。
【０１０５】
遺伝子編集は、目的のＤＮＡ配列をコードする核酸の送達、およびエンドヌクレアーゼを用いて目的の配列をゲノムＤＮＡ中の標的部位に挿入することを含む。したがって、遺伝子編集導入遺伝子は、挿入のための目的のＤＮＡ配列をコードするこれらの核酸を含んでもよい。
【０１０６】
いくつかの態様において、挿入のためのＤＮＡ配列は、本明細書において提供される治療用タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ配列である。あるいは、またはこれに加えて、遺伝子編集導入遺伝子は、単独で、または他の成分と組み合わせて遺伝子編集プロセスを行う１以上の成分をコードする核酸を、含んでもよい。本明細書において提供される遺伝子編集導入遺伝子は、エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡなどをコードしていてもよい。
【０１０７】
エンドヌクレアーゼは、ゲノム中の所望される位置において二本鎖ＤＮＡ中に切断部を作り出し、宿主細胞の機構を用いて、相同組み換え、非相同末端結合などを用いて切断部を修復する。遺伝子を編集するために用いることができるエンドヌクレアーゼのクラスとして、これらに限定されないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。本明細書において提供されるウイルス導入ベクターの遺伝子編集導入遺伝子は、本明細書において提供されるエンドヌクレアーゼのいずれか１つをコードしていてもよい。
【０１０８】
メガヌクレアーゼは、一般に、それらがＤＮＡ配列を認識して切断する能力により特徴づけられる(約１４〜４０塩基対）。加えて、変異誘発およびハイスループットスクリーニングおおよびコンビナトリアルアセンブリなどの公知の技術を用いて、カスタマイズされたメガヌクレアーゼを作り出すことができ、ここで、タンパク質のサブユニットを会合または融合させることができる。メガヌクレアーゼの例は、米国特許第８,８０２,４３７号、同第８,４４５,２５１号および同第８,３３８,１５７号；ならびに米国公開番号２０１３０２２４８６３、２０１１０１１３５０９および２０１１００３３９３５において見出すことができ、これらのメガヌクレアーゼは、本明細書において参考として援用される。
【０１０９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、典型的には、核酸分子内の特異的な標的部位に結合するジンクフィンガードメイン、および結合ドメインに結合した標的部位内またはその近傍において核酸分子を切断する核酸切断ドメインを含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、３〜６の個別のジンクフィンガーモチーフを有し、９塩基対〜１８塩基対の範囲の長さの標的部位に結合する、結合ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、所与の核酸分子中の実質的にあらゆる所望される配列を、切断のための標的とするように設計することができる。例えば、既知の特異性の個々のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることにより、所望される特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。ＤＮＡに結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８の構造は、この分野における研究の多くの情報をもたらし、６４の可能な塩基対トリプレットの各々についてジンクフィンガーを得て、次いでこれらのモジュラージンクフィンガーを混合およびマッチングして、いずれかの所望される配列特異性を有するタンパク質を設計するというコンセプトが記載されている（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ ＮＰ, Ｐａｂｏ ＣＯ（１９９１年５月）、「Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ-ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｚｉｆ２６８-ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２.１ Ａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２ (５００７)：８０９-１７；この全内容は、本明細書において参考として援用される）。いくつかの態様において、細菌またはファージディスプレイを用いて、所望される核酸配列、例えば所望されるエンドヌクレアーゼ標的部位を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、いくつかの態様において、リンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して互いに融合または他の方法で共役した、ジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインとを含む。リンカーの長さにより、ジンクフィンガードメインに結合した核酸配列からの切断部の距離を決定することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼの例は、米国特許第８,９５６,８２８号；同第８,９２１,１１２号；同第８,８４６,５７８号；同第８,５６９,２５３号において見出すことができ、そのジンクフィンガーヌクレアーゼは、は、本明細書において参考として援用される。
【０１１０】
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、特異的ＤＮＡ結合ドメインを一般的なＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより作製された、人工制限酵素である。いずれかの所望されるＤＮＡ配列に結合するように設計することができるＤＮＡ結合ドメインは、植物に感染する特定の細菌により排出されるＤＮＡ結合タンパク質であるトランスクリプション・アクチベーター−ライク（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ-ｌｉｋｅ）(ＴＡＬ）エフェクターに由来する。ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際にいずれかのＤＮＡ配列に結合するように設計するか、または一緒に結合させてＤＮＡ切断ドメインと組み合わせてアレイにすることができる。ＴＡＬＥＮは、ジンクフィンガーヌクレアーゼを設計するために同様に用いることができる。ＴＡＬＥＮの例は、米国特許第８,６９７,８５３号；ならびに米国公開番号２０１５０１１８２１６、２０１５００７９０６４および２０１４００８７４２６において見出すことができ、そのＴＡＬＥＮＳは、本明細書において参考として援用される。
【０１１１】
ＣＲＩＳＰＲ(ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ)／Ｃａｓシステムもまた、遺伝子編集のためのツールとして用いることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノムにより、またはエピソームにより（例えば、プラスミド上で）コードされる。ｇＲＮＡは、転写に続いて、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼと複合体を形成する。複合体は、次いで、ｇＲＮＡの特異性決定配列（ＳＤＳ）により、典型的には細胞のゲノム中に位置するＤＮＡ標的配列にガイドされる。Ｃａｓ９またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼとは、ＲＮＡによりガイドされる、Ｃａｓ９タンパク質、またはそのフラグメント（例えば、Ｃａｓ９の活性もしくは不活性なＤＮＡ切断ドメインまたは部分的に不活性なＤＮＡ切断ドメイン（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ(ｎｉｃｋａｓｅ)）、および／あるいはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含む、エンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー(ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ)隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己を区別することを助ける。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知である（例えば「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ｍ１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ.」Ｆｅｒｒｅｔｔｉ Ｊ.Ｊ., ＭｃＳｈａｎ Ｗ.Ｍ., Ａｊｄｉｃ Ｄ.Ｊ., Ｓａｖｉｃ Ｄ.Ｊ., Ｓａｖｉｃ Ｇ., Ｌｙｏｎ Ｋ., Ｐｒｉｍｅａｕｘ Ｃ., Ｓｅｚａｔｅ Ｓ., Ｓｕｖｏｒｏｖ Ａ.Ｎ., Ｋｅｎｔｏｎ Ｓ., Ｌａｉ Ｈ.Ｓ., Ｌｉｎ Ｓ.Ｐ., Ｑｉａｎ Ｙ., Ｊｉａ Ｈ.Ｇ., Ｎａｊａｒ Ｆ.Ｚ., Ｒｅｎ Ｑ., Ｚｈｕ Ｈ., Ｓｏｎｇ Ｌ. ｅｘｐａｎｄ/ｃｏｌｌａｐｓｅ ａｕｔｈｏｒ ｌｉｓｔ ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ Ｒ.Ｅ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ.Ｓ.Ａ. ９８:４６５８-４６６３(２００１)；「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ-ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ.」Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ., Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ., Ｓｈａｒｍａ Ｃ.Ｍ., Ｇｏｎｚａｌｅｓ Ｋ., Ｃｈａｏ Ｙ., Ｐｉｒｚａｄａ Ｚ.Ａ., Ｅｃｋｅｒｔ Ｍ.Ｒ., Ｖｏｇｅｌ Ｊ., Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ., Ｎａｔｕｒｅ ４７１:６０２-６０７(２０１１)；および「Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ-ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ.」Ｊｉｎｅｋ Ｍ., Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ., Ｆｏｎｆａｒａ Ｉ., Ｈａｕｅｒ Ｍ., Ｄｏｕｄｎａ Ｊ.Ａ., Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ. Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７:８１６-８２１(２０１２) を参照）。ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ：「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＮＲＡ」）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方の側面を単一のＲＮＡ種中に組み込むように操作することができる。
例えば、Ｊｉｎｅｋ Ｍ., Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ., Ｆｏｎｆａｒａ Ｉ., Ｈａｕｅｒ Ｍ., Ｄｏｕｄｎａ Ｊ.Ａ., Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ.参照。
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７:８１６-８２１(２０１２）を参照。
【０１１２】
Ｃａｓ９のオルトログは、多様な種において記載されており、これは、これらに限定されないが、Ｓ. ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ. ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む。さらなる好適なＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび配列は、当業者には明らかであり、かかるＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび配列は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ、ＲｈｕｎおよびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ、「Ｔｈｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０:５, ７２６-７３７において開示される生物および遺伝子座からのＣａｓ９配列を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集導入遺伝子は、野生型Ｃａｓ９、フラグメントまたはＣａｓ９バリアントをコードする。「Ｃａｓ９バリアント」は、Ｃａｓ９の機能を有するいずれかのタンパク質であって、天然に存在するＣａｓ９野生型エンドヌクレアーゼと同一ではないものである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９またはそのフラグメントに対して相同性を共有する。Ｃａｓ９バリアントは、いくつかの態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ. ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９タンパク質に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、Ｃａｓ９の機能性を保持する。好ましくは、配列同一性は、少なくとも９０％、９５％であるかまたはそれより高い。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも９８％または９９％の配列同一性である。本明細書において提供される方法のいずれか１つにおける使用のためのＣａｓ９バリアントのいずれか１つのいくつかの態様において、配列同一性は、アミノ酸配列同一性である。Ｃａｓ９バリアントはまた、Ｃａｓ９二量体、Ｃａｓ９融合タンパク質、Ｃａｓ９フラグメント、最小化されたＣａｓ９タンパク質、切断ドメインを有しないＣａｓ９バリアント、ｇＲＮＡドメインを有しないＣａｓ９バリアント、Ｃａｓ９リコンビナーゼ融合物、ｆＣａｓ９、ＦｏｋＩ-ｄＣａｓ９などを含む。かかるＣａｓ９バリアントの例は、例えば、米国公開番号２０１５００７１８９８および２０１５００７１８９９において見出すことができ、そのＣａｓ９タンパク質およびＣａｓ９バリアントの記載は、本明細書において参考として援用される。
【０１１３】
Ｃａｓ９バリアントはまた、Ｃａｓ９ニッカーゼを含み、これは、Ｃａｓ９中の単一のエンドヌクレアーゼドメインを不活化する変異を含む。かかるニッカーゼは、標的核酸において、二本鎖切断とは対照的に、一本鎖の切断を誘導することができる。Ｃａｓ９バリアントはまた、１つのヌクレアーゼドメインが変異により不活化されているＣａｓ９バリアントであるＣａｓ９ヌルヌクレアーゼを含む。さらなるＣａｓ９バリアントおよびさらなるＣａｓ９バリアントを同定する方法の例は、米国公開番号２０１４０３５７５２３、２０１５０１６５０５４および２０１５０１６６９８０において見出すことができ、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９バリアントおよびそれらの同定の方法に関するこれらの内容は、本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
Ｃａｓ９バリアントのなお他の例は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａとして知られるニッカーゼ活性のみを有する変異形態を含む。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａは、遺伝子座が、隣接するＤＮＡニックを生じるように設計された一対のＣａｓ９複合体により標的とされる場合に、標的特異性に関して魅力的である。
【０１１５】
Ｃａｓ９バリアントの別の例は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。ＨＮＨドメインにおける変異Ｈ８４０ＡおよびＲｕｖＣドメインにおける変異Ｄ１０Ａは、切断活性を不活化するが、ＤＮＡ結合を妨げない。したがって、このバリアントは、切断をともなくことなくゲノムのいずれかの領域を配列特異的にターゲティングするために、用いることができる。実際に、多様なエフェクタードメインと融合させることにより、ｄＣａｓ９は、遺伝子サイレンシングまたは活性化のいずれかのツールとして用いることができる。遺伝子編集導入遺伝子は、いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９バリアントのいずれか１つをコードしていてもよい。
【０１１６】
Ｃａｓ９などのＲＮＡによりプログラム可能なエンドヌクレアーゼを部位特異的な切断のために（例えばゲノムを改変するために）用いる方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｃｏｎｇ, Ｌ. ｅｔ ａｌ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ. Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９, ８１９-８２３ (２０１３)；Ｍａｌｉ, Ｐ. ｅｔ ａｌ. ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９. Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９, ８２３-８２６ (２０１３)；Ｈｗａｎｇ, Ｗ.Ｙ. ｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ. Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１, ２２７-２２９ (２０１３)；Ｊｉｎｅｋ, Ｍ. ｅｔ ａｌ. ＲＮＡ-ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ. ｅＬｉｆｅ ２, ｅ００４７１ (２０１３)；Ｄｉｃａｒｌｏ, Ｊ.Ｅ. ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ (２０１３)；Ｊｉａｎｇ, Ｗ. ｅｔ ａｌ. ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ. Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１, ２３３-２３９ (２０１３)を参照）。
【０１１７】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、数個または単一の位置において、それらを合成するために用いられたゲノムＤＮＡの加水分解を触媒することができ、それにより、それらの遺伝子を宿主中で水平方向に伝達して、それらの対立遺伝子頻度を増大することができる。
【０１１８】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、一般に、長い認識配列を有し、それにより、それらは、低い確率の無作為切断を有する。１つの対立遺伝子は、伝達の前に遺伝子を担持し（ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子＋、ＨＥＧ＋）、一方、他方はこれを担持せず（ＨＥＧ−）、酵素切断されやすい。酵素は、合成された後、ＨＥＧ−の対立遺伝子において染色体を破壊し、細胞のＤＮＡ修復システムからの応答を開始させ、これが、組み換えを用いて、エンドヌクレアーゼのための遺伝子を含む、損傷を受けていないＤＮＡ対立遺伝子ＨＥＧ＋の逆のパターンを取る。したがって、遺伝子は、初めはそれを有しなかった別の対立遺伝子にコピーされ、首尾よく伝播される。ホーミングエンドヌクレアーゼの例は、例えば、米国公開番号２０１５０１６６９６９；および米国特許第９,００５,９７３号において見出すことができ、そのホーミングエンドヌクレアーゼは、本明細書において参考として援用される。
【０１１９】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターは、遺伝子発現調節のために用いることができる。かかる態様において、ウイルス導入ベクターの導入遺伝子は、遺伝子発現調節導入遺伝子である。かかる導入遺伝子は、１以上の内在遺伝子の発現を増強するか、阻害するか、または調節することができる、遺伝子発現モジュレーターをコードする。内在遺伝子は、本明細書において提供されるタンパク質のいずれか１つをコードしていてもよい（当該タンパク質が対象の内因性タンパク質であることを前提とする）。したがって、対象は、遺伝子発現調節により提供される利益が存在するであろう、本明細書において提供される疾患または障害のいずれか１つを有するものであってよい。
【０１２０】
遺伝子発現モジュレーターは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、人工転写因子、例えば米国公開番号２０１４０２９６１２９のもの（その人工転写因子は、本明細書において参考として援用される）；および米国公開番号２００３０１２５２８６の転写サイレンサータンパク質（そのＮＲＦ転写サイレンサータンパク質ＮＲＦは、本明細書において参考として援用される））、ならびに治療用ＲＮＡを含む。治療用ＲＮＡとして、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤（アンチセンス）、ＲＮＡ干渉の剤（ＲＮＡｉ）、触媒活性ＲＮＡ分子（リボザイム）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ならびにタンパク質および他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）が挙げられる。遺伝子発現モジュレーターは、前述のうちのいずれかの剤を含み、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む。遺伝子発現モジュレーターはまた、前述のＲＮＡ分子のいずれかの改変されたバージョンを含んでもよく、したがって、改変されたｍＲＮＡ、例えば合成化学的に改変されたＲＮＡを含む。
【０１２１】
遺伝子発現モジュレーターは、アンチセンス核酸であってもよい。アンチセンス核酸は、遺伝子発現（例えば、変異体タンパク質、優性的に活性な遺伝子産物、毒性に関連するタンパク質、またはウイルスなどの感染性の剤により細胞中に導入される遺伝子産物の発現）の、ターゲティングされた阻害を提供することができる。したがって、遺伝子発現調節ウイルス導入ベクターは、ドミナント・ネガティブまたは機能獲得型の病原機構に関連する疾患もしくは障害、がんまたは感染症を処置するために用いることができる。本明細書において提供される方法のいずれか１つの対象は、ウイルス感染、炎症性障害、心血管疾患、がん、遺伝子障害または自己免疫性疾患を有する対象であってよい。
【０１２２】
アンチセンス核酸はまた、ｍＲＮＡスプライシング機構に干渉して、正常な細胞によるｍＲＮＡプロセッシングを妨害することができる。したがって、遺伝子発現調節導入遺伝子は、スプライソソームと相互作用する要素をコードしていてもよい。アンチセンス核酸（および関連するコンストラクト）の例は、例えば、米国公開番号２００５００２０５２９および２００５０２７１７３３において見出すことができ、そのアンチセンス核酸およびコンストラクトは、本明細書において参考として援用される。
【０１２３】
遺伝子発現モジュレーターはまた、リボザイム（すなわち、一本鎖ＲＮＡなどの他のＲＮＡを切断することができるＲＮＡ分子）であってもよい。かかる分子は、ＲＮＡ分子中の特異的なヌクレオチド配列を認識して、それを切断するように操作することができる（Ｃｅｃｈ, Ｊ. Ａｍｅｒ. Ｍｅｄ. Ａｓｓｎ., ２６０:３０３０, １９８８）。例えば、リボザイムは、そのリボザイムを含むコンストラクトに相補的な配列を有するｍＲＮＡのみが不活化されるように、操作することができる。リボザイムの型および関連するコンストラクトを調製する方法は、当該分野において公知である（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ, ３３４:５８５, １９８８; ａｎｄ 米国公開番号２００５００２０５２９；かかるリボザイムおよび方法に関するその教示は、本明細書において参考として援用される）。
【０１２４】
遺伝子発現モジュレーターは、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であってよい。ＲＮＡ干渉は、干渉ＲＮＡにより媒介される配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。一般に、ｄｓＲＮＡの存在は、ＲＮＡｉ応答を引き起こし得る。ＲＮＡｉは、多様な系において研究されてきた。Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ., １９９８, Ｎａｔｕｒｅ, ３９１, ８０６、Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓにおけるＲＮＡｉ；Ｂａｈｒａｍｉａｎ ａｎｄ Ｚａｒｂｌ, １９９９, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, １９, ２７４-２８３およびＷｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ, １９９９, Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ２, ７０、哺乳動物系においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉ；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ., ２０００, Ｎａｔｕｒｅ, ４０４, ２９３、ショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｅｌｌｓ；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ., ２００１, Ｎａｔｕｒｅ, ４１１, ４９４、培養哺乳動物細胞において合成の２１ヌクレオチドのＲＮＡの二本鎖の導入により誘導されるＲＮＡｉ。かかる研究は、他のものと共に、ＲＮＡｉ活性を媒介するためにＲＮＡｉ分子の構築において役立つ、長さ、構造、化学組成および配列に関するガイダンスを提供してきた。多様な刊行物が、遺伝子発現モジュレーターとして用いることができるＲＮＡｉ分子の例を提供する。かかる刊行物として、米国特許第８,９９３,５３０号、同第８,８７７,９１７号、同第８,２９３,７１９号、同第７,９４７,６５９号、同第７,９１９,４７３号、同第７,７９０,８７８号、同第７,７３７,２６５号、同第７,５９２,３２２号；ならびに米国公開番号２０１５０１９７７４６、２０１４０３５００７１、２０１４０３１５８３５、２０１３０１５６８４５および２０１００２６７８０５が開挙げられ、ＲＮＡｉ分子の型ならびにそれらの作製に関する教示は、本明細書において参考として援用される。
【０１２５】
アプタマーは、多様なタンパク質標的に結合して、それらのタンパク質の他のタンパク質との相互作用を妨害することができる。したがって、遺伝子発現モジュレーターは、アプタマーであってもよく、遺伝子発現調節導入遺伝子は、かかるアプタマーをコードしていてもよい。アプタマーは、それらが、調節性タンパク質のＤＮＡ結合部位に特異的に結合することにより遺伝子の転写を妨げる能力のために選択され得る。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８/２９４３０およびＷＯ ００/２００４０は、遺伝子発現を調節するために用いられたアプタマーの例を提供し；米国公開番号２００６０１２８６４９もまた、かかるアプタマーの例を提供する；これらの各々のアプタマーは、本明細書において参考として援用される。
さらなる例として、遺伝子発現の調節は、三重鎖オリゴマーであってもよい。
【０１２６】
かかる分子は、転写を停止させることができる。一般に、これは、オリゴマーが二重らせんＤＮＡの周りを取り巻き、三重鎖らせんを形成するので、三重鎖戦略として知られる。かかる分子は、選択された遺伝子上のユニークな部位を認識するように設計することができる（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ., Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ. ａｎｄ Ｄｅｖ., １(３):２２７, １９９１；Ｈｅｌｅｎｅ, Ｃ., Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ, ６(６):５６９, １９９１）。
【０１２７】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターはまた、エクソンスキッピングのために用いることができる。かかる態様において、ウイルス導入ベクターの導入遺伝子は、エクソンスキッピング導入遺伝子である。かかる導入遺伝子は、エクソンスキッピングを生じることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の剤をコードする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン内のスプライス部位または調節要素に干渉して、遺伝子変異の存在に関わらず部分的に機能的な、短縮されたタンパク質に結果としてなることができる。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異特異的であってもよく、メッセンジャーＲＮＡ前駆体中の変異部位に結合してエクソンスキッピングを誘導することができる。エクソンスキッピングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野において公知であり、一般に、ＡＯＮと称される。かかるＡＯＮは、ｓｎＲＮＡを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチド、それらを設計する方法および関連する作製方法の例は、例えば、米国公開番号２０１５０２２５７１８、２０１５０１５２４１５、２０１５０１４０６３９、２０１５００５７３３０、２０１５００４５４１５、２０１４０３５００７６、２０１４０３５００６７および２０１４０３２９７６２において見出すことができ、それらのＡＯＮ、ならびに記載の関連する方法、例えばＡＯＮを設計および作製する方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つは、それを必要とする対象の細胞においてエクソンスキッピングに結果としてなるために用いることができる。
【０１２８】
対象は、エクソンスキッピングが利益に結果としてなるであろういずれかの疾患または障害を有していてよく、かかる疾患または障害に関連する適切な（その発現の間のエクソンスキッピングが有益であろう）タンパク質に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる。疾患および障害ならびに関連するタンパク質の例は、本明細書において提供される。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィー（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー）などの本明細書において記載のジストロフィーのいずれか１つを有する。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、エクソンスキッピング導入遺伝子は、本明細書において提供されるジストロフィーのいずれか１つと関連する本明細書において提供されるタンパク質のいずれか１つにおいてエクソンスキッピングに結果としてなることができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の剤をコードする。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の剤は、ジストロフィンにおいてエクソンスキッピングに結果としてなることができる。
【０１２９】
導入遺伝子の配列はまた、発現制御配列を含んでもよい。発現制御ＤＮＡ配列は、プロモーター、エンハンサーおよびオペレーターを含み、一般に、発現コンストラクトが利用されるべき発現系に基づいて選択される。いくつかの態様において、プロモーターおよびエンハンサー配列は、遺伝子発現を増大する能力のために選択され、一方、オペレーター配列は、遺伝子発現を調節する能力のために選択され得る。導入遺伝子はまた、宿主細胞中での相同組み換えを容易にする、および好ましくは促進する、配列を含んでもよい。導入遺伝子はまた、宿主細胞中での複製のために必要である配列を含んでもよい。
【０１３０】
例示的な発現制御配列は、プロモーター配列、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター；ラウス肉腫ウイルスプロモーター；およびサルウイルス４０プロモーター；ならびに本明細書において他の場所で開示されるか当該分野において他に公知のいずれかの他の型のプロモーターを含む。一般に、プロモーターは、所望される発現産物をコードする配列の上流（すなわち５'）で作動的に連結される。導入遺伝子はまた、コード配列の下流で作動的に連結された（すなわち３'）好適なポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化配列）を含んでもよい。
ウイルスベクター
【０１３１】
ウイルスは、それらが感染する細胞の内部でそれらのゲノムを輸送するために特化した機構を進化させてきた；かかるウイルスに基づくウイルスベクターは、特別な用途のために細胞に形質移入するように仕立てることができる。本明細書において提供されるとおり用いることができるウイルスベクターの例は、当該分野において公知であるか、本明細書において記載の。好適なウイルスベクターとして、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくベクター、アデノウイルスに基づくベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクター、およびＡＡＶ-アデノウイルスキメラベクターが挙げられる。
【０１３２】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターは、レトロウイルスに基づくものであってもよい。レトロウイルスは、広範な宿主細胞に感染することができる一本鎖ポジティブ・センスＲＮＡウイルスである。感染すると、レトロウイルスゲノムは、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡを生成するためにそれ自身の転写酵素を用いて、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。ウイルスＤＮＡが、次いで、ウイルスおよび宿主の遺伝子を翻訳および転写する宿主細胞ＤＮＡと共に複製される。レトロウイルスベクターは、ウイルス複製能力を失うように操作することができる。したがって、レトロウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定な遺伝子導入のために特に有用であると考えられる。レトロウイルスベクターの例は、例えば、米国公開番号２０１２０００９１６１、２００９０１１８２１２および２００９００１７５４３において見出すことができ、そのウイルスベクターおよびそれらの作製の方法は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
【０１３３】
レンチウイルスベクターは、本明細書において提供されるウイルス導入ベクターの作製のために用いることができるレトロウイルスベクターの例である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染する能力を有し、これは、遺伝子送達ベクターのより効率的な方法を構成する特性である（例えば、Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ., Ｖｉｒｕｓｅｓ. ２０１１ Ｆｅｂ; ３(２)：１３２-１５９を参照）。レンチウイルスの例として、ＨＩＶ（ヒト）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）が挙げられる。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶに基づくベクターは、それらのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞中に組み込むことが知られている。レンチウイルスベクターの例は、例えば、米国公開番号２０１５０２２４２０９、２０１５０２０３８７０、２０１４０３３５６０７、２０１４０２４８３０６、２００９０１４８９３６および２００８０２５４００８において見出すことができ、そのウイルスベクターおよびそれらの作製の方法は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
【０１３４】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくウイルスベクターもまた、本明細書において提供される使用のために好適である。多くの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために、１以上のｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ-ｅａｒｌｙ遺伝子を取り除く欠失を含む。
【０１３５】
ヘルペスベクターの利点は、潜伏期に入る能力により長期のＤＮＡ発現に結果としてなることができること、および大きなウイルスＤＮＡゲノムにより２５ｋｂまでの外来ＤＮＡを収容することができることである。ＨＳＶに基づくベクターの記載については、例えば、米国特許第５,８３７,５３２号、同第５,８４６,７８２号、同第５,８４９,５７２号および同第５,８０４,４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ ９１/０２７８８、ＷＯ ９６/０４３９４、ＷＯ ９８/１５６３７およびＷＯ ９９/０６５８３を参照；そのウイルスベクターおよびそれらの作製の方法の記載は、その全体において参考として援用される。
【０１３６】
アデノウイルス（Ａｄ）は、多様な異なる標的細胞型にｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡを導入することができる無エンベロープウイルスである。ウイルスは、ウイルス複製のために必要とされる選択遺伝子を欠失させることにより、複製欠損にすることができる。より大きなＤＮＡインサートのためのさらなる余地を可能にするために、犠牲にしてもよい複製に必須でないＥ３領域もまた頻繁に欠失させられる。ウイルス導入ベクターは、アデノウイルスに基づいていてもよい。アデノウイルス導入ベクターは、高い力価において作製することができ、ＤＮＡを複製中および非複製中の細胞に効率的に導入することができる。レンチウイルスとは異なり、アデノウイルスＤＮＡは、ゲノム中には組み込まれず、したがって、細胞分裂の間には複製せず、その代わりに、それらは宿主細胞の核内で、宿主の複製機構を用いて複製する。
ウイルス導入ベクターの基礎となるアデノウイルスは、いずれかの起源、いずれかのサブグループ、いずれかのサブタイプ、サブタイプの混合物、またはいずれかの血清型からのものであってよい。
【０１３７】
例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５および５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９および４２〜４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０および４１）、未分類の血清群（例えば、血清型４９および５１）、またはいずれかの他のアデノウイルス血清型のものであってよい。アデノウイルス血清型１〜５１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ, Ｖａ.）から入手可能である。非Ｃ群アデノウイルス、および非ヒトアデノウイルスですら、複製欠損アデノウイルスベクターを調製するために用いることができる。
【０１３８】
非Ｃ群アデノウイルスベクター、非Ｃ群アデノウイルスベクターを作製する方法、および非Ｃ群アデノウイルスベクターを用いる方法は、例えば、米国特許第５,８０１,０３０号、同第５,８３７,５１１号および同第５,８４９,５６１号、ならびに国際特許出願ＷＯ ９７/１２９８６およびＷＯ ９８/５３０８７において開示される。いずれかのアデノウイルス、キメラアデノウイルスですら、アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムのソースとして用いることができる。
【０１３９】
例えば、ヒトアデノウイルスを、複製欠損アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムのソースとして用いることができる。アデノウイルスベクターのさらなる例は、米国公開番号２０１５００９３８３１、２０１４０２４８３０５、２０１２０２８３３１８、２０１００００８８８９、２００９０１７５８９７および２００９００８８３９８において見出すことができ、そのウイルスベクターおよびそれらの作製の方法の記載は、その全体において参考として援用される。
【０１４０】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターはまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づいていてもよい。ＡＡＶベクターは、本明細書において記載のもののような治療的適用における使用のために、特に関心を集めて来た。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こすことは知られていないＤＮＡウイルスである。一般に、ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムに特定の部位において安定に感染する能力を有し、それにより、レトロウイルスより予測可能である；しかし、一般に、ベクターのクローニング能力は４．９ｋｂである。遺伝子治療の適用において用いられてきたＡＡＶベクターは、一般に、ＤＮＡ複製およびパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復（ＩＴＲ）のみが残るように、親ゲノムの約９６％を欠失している。ＡＡＶに基づくベクターの記載については、例えば、米国特許第８,６７９,８３７号、同第８,６３７,２５５号、同第８,４０９,８４２号、同第７,８０３,６２２号および同第７,７９０,４４９、ならびに米国公開番号２０１５００６５５６２、２０１４０１５５４６９、２０１４００３７５８５、２０１３００９６１８２、２０１２０１００６０６および２００７００３６７５７を参照；そのウイルスベクターおよびそれらの作製の方法は、は、本明細書においてその全体において参考として援用される。ＡＡＶベクターは、組み換えＡＡＶベクターであってよい。ＡＡＶベクターはまた、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターであってよく、これは、例えば、米国特許公開２００７/０１１１０７２４および２００４/００２９１０６、ならびに米国特許第７,４６５,５８３号および同第７,１８６,６９９号において記載され、ベクターおよびその作製の方法は、本明細書において参考として援用される。
【０１４１】
ウイルス導入ベクターの基礎となるアデノ随伴ウイルスは、いずれかの血清型または血清型の混合物のものであってよい。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１を含む。例えば、ウイルス導入ベクターが血清型の混合物に基づく場合、ウイルス導入ベクターは、ＡＡＶ血清型の１つ（例えばＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１のいずれか１つから選択される）から取得されるカプシドシグナル配列、ならびに異なる血清型（例えばＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１のいずれか１つから選択される）からのパッケージング配列を含んでもよい。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ２/８ベクターである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの他の態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ２/５ベクターである。
【０１４２】
本明細書において提供されるウイルス導入ベクターはまた、アルファウイルスに基づいていてもよい。アルファウイルスとして、シンドビス（およびＶＥＥＶ）ウイルス、アウラ(Ａｕｒａ)ウイルス、ババンキ(Ｂａｂａｎｋｉ)ウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバル(Ｂｅｂａｒｕ)ウイルス、カバソウ(Ｃａｂａｓｓｏｕ)ウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレード(Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ)ウイルス、フォートモーガン(Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ)ウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪ(Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ)ウイルス、キジラガチ(Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ)ウイルス、マヤロウイルス、メトリ(Ｍｅ Ｔｒｉ)ウイルス、ミデルバーグ(Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ)ウイルス、モッソダスペドラス(Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ)ウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、南部ゾウアザラシ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ)ウイルス、トナテ(Ｔｏｎａｔｅ)ウイルス、トロカラ(Ｔｒｏｃａｒａ)ウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびワタロアウイルスが挙げられる。一般に、かかるウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質中で翻訳されることができる、非構造タンパク質（例えばレプリコン）および構造タンパク質（例えば、カプシドおよびエンベロープ）をコードする。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は全て、導入遺伝子送達のためのウイルス導入ベクターを開発するために用いられてきた。シュードタイプウイルスは、アルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスのカプシドとを組み合わせることにより形成させることができる。アルファウイルスベクターの例は、米国公開番号２０１５００５０２４３、２００９０３０５３４４および２００６０１７７８１９において見出すことができ；ベクターおよびそれらの作製の方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
抗ＩｇＭ剤
抗ＩｇＭ剤は、ＩｇＭ、例として、ＩｇＭ抗体の産生を低下させる、いずれかの剤である。
【０１４３】
ＩｇＭ抗体は、Ｂ細胞によって産生される。ＩｇＧ抗体が、Ｂ細胞のＴ細胞依存的な活性化に応答してまず産生される一方で、ＩｇＭ抗体は、ウイルスのベクターに伴う感染に応答して生じるなどの、Ｔ細胞から独立したＢ細胞活性化に応答してまず産生される。
【０１４４】
抗ＩｇＭ剤は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１に特異的に結合する、ＩｇＭアンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合フラグメント；ＩＬ２１調節剤、例として、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体アンタゴニスト；チロシンキナーゼ阻害剤、例として、Ｓｙｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ＰＫＣ阻害剤；ＡＰＲＩＬ アンタゴニスト、例として、ＴＡＣＩ-Ｉｇ；ミゾリビン；トファシチニブ；および、テトラサイクリンを含むが、これらに限定されない。
ＩｇＭアンタゴニスト抗体
【０１４５】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＩｇＭアンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、Ｂ細胞上の細胞表面分子を標的とし、そして、抗体の結合は、対象の免疫系を補充し、Ｂ細胞を攻撃して、殺す。
【０１４６】
いくつかの態様において、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ１０抗体、例として、ＣＤ１０を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＣＤ１０抗体は、Ｊ５を含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ２７抗体、例として、ＣＤ２７を特異的に結合する抗体である。ＣＤ２７は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ３４抗体、例として、ＣＤ３４を特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ７９ａ抗体、例として、ＣＤ７９ａを特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ７９ｂ抗体、例として、ＣＤ７９ｂを特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＣＤ７９ｂ抗体は、ポラツズマブベドチンを含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ１２３抗体、例として、ＣＤ１２３を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＣＤ１２３抗体は、ＫＨＫ２８２３およびＣＳＬ３６２を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ１７９ｂ抗体、例として、ＣＤ１７９ｂを特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、抗体は、抗ＦＬＴ−３抗体、例として、ＦＬＴ−３を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＦＬＴ−３抗体は、ソラフェニブおよびキザルチニブを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、抗体は、抗ＲＯＲ１抗体、例として、ＲＯＲ１を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＲＯＲ１抗体は、シルムツズマブを含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、抗体は、抗ＢＲ３抗体、例として、ＢＲ３を特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、抗体は、抗Ｂ７ＲＰ−１抗体、例として、Ｂ７ＲＰ−１を特異的に結合する抗体である。例示的な抗Ｂ７ＲＰ−１抗体は、プレザルマブを含むが、これに限定されない。
いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ１９抗体、例として、ＣＤ１９を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＣＤ１９抗体は、ＭＯＲ００２０８（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓＡＧ）を含むが、これに限定されない。
【０１４７】
いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ２０抗体、例として、ＣＤ２０を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、イブリツモマブ、ヒアルロニダーゼ／リツキシマブ、およびイブリツモマブを含むが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ２２抗体、例として、ＣＤ２２を特異的に結合する抗体である。
例示的な抗ＣＤ２２抗体は、エプラツズマブおよびモキセツモマブを含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ４０抗体、例として、ＣＤ４０を特異的に結合する抗体である。例示的な抗ＣＤ４０抗体は、ＡＢＢＶ−９２７（Ａｂｂｖｉｅ）およびＡＰＸ００５Ｍ（Ａｐｅｘｉｇｅｎ）を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
いくつかの態様において、抗体は、抗ＢＡＦＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。ＢＡＦＦ、Ｂ細胞活性化因子（Ｂリンパ球スティミュレーター）は、Ｂ細胞の発生および維持のための重要なサイトカインである。ＢＡＦＦは複数の受容体を有し、ＢＡＦＦ−Ｒなどの、Ｂ細胞の種々のクラスにシグナルを伝達することにおいて重要な役割を果たし、それは、初期のＢ細胞ホメオスタシスおよびＴ-ｒｅｇ機能およびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）において選択的および重要であり、それは抗体産生細胞に限定され、そして、血漿細胞の長寿にとって重要である。ベリムマブなどの抗ＢＡＦＦ抗体は、ＢＡＦＦを特異的に結合する剤を含むことができる。抗ＢＡＦＦ抗体は、ＢＡＦＦと、ＢＡＦＦ−ＲおよびＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）などの、その受容体との間の相互作用を、干渉してもよい。抗ＢＡＦＦ抗体は商業的に入手可能であり、そして、当業者は、一定の剤が、抗ＢＡＦＦ抗体であるかどうか、確かめることが可能である。本明細書に記載の、さもなくば公知の抗ＢＡＦＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントのいずれか１つは、提供される方法のいずれか１つにおいて使用されてもよいか、または提供される組成物またはキットのいずれか１つに含まれてもよい。
【０１５０】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、結合することができ、その標的の活性を少なくとも５０％（例として、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）阻害することができる。本明細書に記載の抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントのいずれかの阻害性活性は、たとえば、ＥＬＩＳＡによって当該技術分野において公知のルーチンの方法によって決定されることができる。さらにその上、結合アフィニティー（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または（例として、蛍光アッセイを使用する）分光法を含む様々な方法によって、決定されることができる。  本明細書に使用されているように、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を、指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書にＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書にＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられ、より保護され、フレームワーク領域（ＦＲｓ）と名付けられた領域により点在された超可変性の領域に、さらに再分割されることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４ＦＲｓで構成され、以下の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端まで調整される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０１５１】
重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、にすることまたは免疫系（例として、エフェクター細胞）の様々な細胞および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を、仲介してもよい。
【０１５２】
本明細書に使用されているように、抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の部分を、指す。抗体の抗原結合性機能は、全長の抗体のフラグメントによって遂行されることができる。抗体の、用語「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの例は、以下を含む：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、一価のフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖフラグメント、
【０１５３】
（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ., (１９８９) Ｎａｔｕｒｅ ３４１:５４４-５４６)；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらにその上、Ｆｖフラグメント、ＶおよびＶＨ、の２つのドメインが、別々の遺伝子によってコードされるにもかかわらず、それらを、ＶＬおよびＶＨ領域が一対になる単一タンパク質鎖として作成され、一価の分子を形成することを可能にする合成リンカーによって、組み換え方法を用いて、それらは、接続されることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例としてＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ. (１９８８) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２:４２３-４２６; ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ. (１９８８) Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５:５８７９-５８８３参照）。かかる単鎖抗体は、抗体の、用語「抗原結合性部分」内に包含されることも、意図する。Ｊ. Ｇｏｄｉｎｇ, Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ: Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ, ｐｐ ９８-１１８ (Ｎ.Ｙ. Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３)に記載されているように、これらの抗体フラグメントは、タンパク分解性断片化手順などの、従来の手順を使用して得られ、それは、当業者に公知の他の技法と同様に、本願明細書により参考として援用される。フラグメントは、完全な抗体と同様の手法で、有用性に関してスクリーニングされることができる。
【０１５４】
本明細書において提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つの態様において、該抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントに基づいて操作された配列によって、産生されてもよい。
【０１５５】
本明細書に記載の抗体の例は、商業的に入手可能であり、そして、当業者は、一定の剤が、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９ｂ、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、またはＢ７ＲＰ−１抗体であるかどうかを、確かめることが可能である。
【０１５６】
本明細書に記載の、さもなくば公知の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントのいずれか１つは、提供される方法のいずれか１つにおいて使用されてもよいか、または提供される組成物またはキットのいずれか１つに含まれてもよい。
チロシンキナーゼ阻害剤
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例として、ｓｙｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、またはＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。
【０１５７】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ｓｙｋ阻害剤である。例示的なＳｙｋ阻害剤は、フォスタマチニブ（Ｒ７８８）、エントスプレチニブ（ＧＳ−９９７３）、セルズラテニブ（ＰＲＴ０６２０７０）、およびＴＡＫ−６５９（エントスプレチニブおよびニルバジピン）を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＢＴＫ阻害剤である。ＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫの小型分子阻害剤、ＢＴＫに対する抗体、およびＢＴＫの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＢＴＫ阻害剤は、ＡＶＬ−２９２、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、ＰＣＩ−３２７６５、アカラブルチニブ、ＧＳ−４０５９、スペブルチニブ、ＢＧＢ−３１１１、およびＨＭ７１２２４を含むが、これらに限定されない。
【０１５９】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。ＳＲＣ阻害剤は、ＳＲＣの小型分子阻害剤、ＳＲＣに対する抗体、およびＳＲＣの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。
例示的なＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブを含むが、これに限定されない。
【０１６０】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、抗ＢＡＦＦ剤である。抗ＢＡＦＦ剤は、いずれかの剤、小分子、抗体、ペプチド、または核酸を指し、それが、ＢＡＦＦの産生、またはレベル、または活性を低下させることが、公知である。いくつかの態様において、抗ＢＡＦＦ剤は、本明細書に記載の抗ＢＡＦＦ抗体である。例示的な抗ＢＡＦＦ剤は、ＴＡＣＩ−Ｉｇおよび可溶性ＢＡＦＦ受容体を含むが、これらに限定されない。
【０１６１】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。ＰＩ３キナーゼは、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＩＫ３Ｒ６、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｇ、およびＰＩＫ３Ｃ３を含むが、これらに限定されない。  ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの小型分子阻害剤、ＰＩ３Ｋに対する抗体、およびＰＩ３Ｋの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を含む。例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＧＳ−１１０１、イデラリシブ、デュベリシブ、ＴＧＲ−１２０２、ＡＭＧ−３１９、コパンリシブ、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＩＣ４８６０６８、およびＩＣ８７１１４（ＩＣＯＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびＧＤＣ−０９４１を含むが、これに限定されない。
【０１６２】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＰＫＣ阻害剤である。ＰＫＣ阻害剤は、ＰＫＣの小型分子阻害剤、ＰＫＣに対する抗体、およびＰＫＣの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＰＫＣ阻害剤は、ダサチニブを含むが、これに限定されない。
【０１６３】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＡＰＲＩＬアンタゴニストである。ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬの小型分子阻害剤、ＡＰＲＩＬに対する抗体、およびＡＰＲＩＬの発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。いくつかの態様において、ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、抗体である。例示的な抗ＡＰＲＩＬ抗体は、ＢＩＯＮ−１３０１（Ａｄｕｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、  Ｉｎｃ．）を含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＴＡＣＩ−Ｉｇ、アタシセプトである。
【０１６４】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＩＬ−２１調節剤である。例示的なＩＬ−２１阻害剤は、ＮＮＣ０１１４（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）を含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、そして、ＩＬ−２１調節剤は、ＩＬ−２１受容体アンタゴニストである。ＩＬ−２１受容体アンタゴニストは、ＩＬ−２１受容体の小型分子阻害剤、ＩＬ−２１受容体に対する抗体、およびＩＬ−２１受容体の発現を低下させるアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡｉ阻害剤を、含む。例示的なＩＬ−２１受容体阻害剤は、ＡＴＲ−１０７（Ｐｆｉｚｅｒ）を含むが、これに限定されない。例示的なＩＬ−２１アンタゴニストは、ＮＮＣ０１１４（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）を含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ＩＬ−２１受容体アンタゴニストである。例示的なＩＬ−２１受容体アンタゴニストは、ＡＴＲ−１０７（Ｐｆｉｚｅｒ）を含むが、これに限定されない。
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、ミゾリビンである。
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、トファシチニブである。
【０１６５】
いくつかの態様において、抗ＩｇＭ剤は、テトラサイクリンである。例示的なテトラサイクリンは、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、リメサイクリン、クロモサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、および３級−ブチルグリシルアミドミノサイクリンを含むが、これらに限定されない。
免疫抑制剤を含む合成ナノキャリア
【０１６６】
多種多様な他の合成ナノキャリアは、本発明にしたがって使用されることができる。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、球体または球状体である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、扁平または平板状である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、立方体または立方である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、卵円または楕円である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、円柱、円錐または錐体である。
【０１６７】
いくつかの態様において、各々の合成ナノキャリアが類似の特性を有するように、サイズまたは形状に関して比較的均一である合成ナノキャリアの集団の使用が望ましい。例えば、提供される組成物または方法のいずれか１つの合成ナノキャリアの、合成ナノキャリアの合計数に基づいて、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、合成ナノキャリアの平均直径または平均寸法の５％、１０％、または２０％以内に該当する最小寸法または最大寸法を有していてもよい。
合成ナノキャリアは、中実であっても中空であってもよく、１以上の層を含んでもよい。
【０１６８】
いくつかの態様において、各層は、他の層と比較してユニークな組成およびユニークな特性を有する。一例のみを挙げると、合成ナノキャリアは、コア／シェル構造を有していてもよく、ここで、コアは１つの層であり（例えばポリマーのコア）、シェルは第２の層である（例えば脂質二重層または単層）。
【０１６９】
合成ナノキャリアは、複数の異なる層を含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、１以上の脂質を任意に含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、リポソームを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質二重層を含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質単層を含んでもよい。
【０１７０】
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、ミセルを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質層（例えば、脂質二重層、脂質単層など）に囲まれたポリマーマトリックスを含むコアを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質層（例えば、脂質二重層、脂質単層など）に囲まれた非ポリマー性のコア（例えば、金属粒子、量子ドット、セラミック粒子、骨粒子、ウイルス粒子、タンパク質、核酸、炭水化物など）を含んでもよい。
【０１７１】
他の態様において、合成ナノキャリアは、金属粒子、量子ドット、セラミック粒子などを含んでもよい。いくつかの態様において、非ポリマー性合成ナノキャリアは、金属原子（例えば金原子）の凝集物などの、非ポリマー性成分の凝集物である。
【０１７２】
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、１以上の両親媒体を任意に含んでもよい。いくつかの態様において、両親媒体は、増大した安定性、改善した均一性または増大した粘性により、合成ナノキャリアの製造を促進することができる。いくつかの態様において、両親媒体は、脂質膜（例えば、脂質二重層、脂質単層など）の内部表面に関連していてもよい。当該分野において公知の多くの両親媒体が、本発明による合成ナノキャリアを作製するために好適である。かかる両親媒性の実体は、ホスホグリセリドを含むが、これに限定されない；ホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；ジオレイルオキシプロピルトリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；ジオレオイルホスファチジルコリン；コレステロール；コレステロールエステル；ジアシルグリセロール；コハク酸ジアシルグリセロール；ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサンデカノール；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの脂肪アルコール；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；パルミチン酸またはオレイン酸などの界面活性脂肪酸；脂肪酸；脂肪酸モノグリセリド；脂肪酸ジグリセリド；脂肪酸アミド；ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）グリココーレート；ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）；ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）；ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）；ポリソルベート６５（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）；ポリソルベート８５（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）；ポリオキシエチレンモノステアレート；サーファクチン；ポロキサマー；ソルビタントリオレアートなどのソルビタン脂肪酸エステル；レシチン；リゾレシチン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）；カルジオリピン；ホスファチジン酸；セレブロシド；リン酸ジセチル；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；ステアリルアミン；ドデシルアミン；ヘキサデシルアミン；パルミチン酸アセチル；グリセロールリシノレート；ヘキサデシルステアレート；ミリスチン酸イソプロピル；チロキサポール；ポリ（エチレングリコール）５０００−ホスファチジルエタノールアミン；ポリ（エチレングリコール）４００−モノステアレート；リン脂質；高い界面活性剤特性を有する合成および／または天然の洗剤；デオキシコラート；シクロデキストリン；カオトロピックな塩；イオン対化剤(ｉｏｎ ｐａｉｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ)；およびこれらの組み合わせ。両親媒体成分は、異なる両親媒体の混合物であってもよい。当業者は、これは例示的な界面活性剤効果を有する物質のリストであって、包括的なものではないことを理解するであろう。本発明により用いられるべき合成ナノキャリアの製造において、いずれかの両親媒体を用いることができる。
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、１以上の炭水化物を任意に含んでもよい。
【０１７３】
炭水化物は、天然であっても合成であってもよい。炭水化物は、誘導体化された天然の炭水化物であってもよい。態様において、炭水化物は、単糖または二糖を含み、これは、限定されないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、リボース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、マンノース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸を含む。態様において、炭水化物は多糖であり、これは、限定されないが、プルラン、セルロース、微晶質セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシセルロース（ＨＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン、グリコン(ｇｌｙｃｏｎ)、アミロース、キトサン、Ｎ，Ｏ−カルボキシルメチルキトサン、アルギン酸およびアルギニン酸、デンプン、キチン、イヌリン、コンニャク、グルコマンナン、プスツラン(ｐｕｓｔｕｌａｎ)、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードランおよびキサンタンを含む。態様において、合成ナノキャリアは、多糖などの炭水化物を含まない（または特に除外する）。態様において、炭水化物は、糖アルコールなどの炭水化物誘導体を含んでもよく、これは、限定されないが、マンニトール、ソルビトールキシリトール、エリスリトール、マルチトールおよびラクチトールを含む。
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、１以上のポリマーを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、非メトキシ末端のプルロニックポリマーである１以上のポリマーを含む。
【０１７４】
いくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％（重量／重量）は、非メトキシ末端のプルロニックポリマーである。
【０１７５】
いくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの全てが、非メトキシ末端のプルロニックポリマーである。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、非メトキシ末端のポリマーである１以上のポリマーを含む。いくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％（重量／重量）は、非メトキシ末端のポリマーである。いくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの全ては、非メトキシ末端のポリマーである。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、プルロニックポリマーを含まない１以上のポリマーを含む。いくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％（重量／重量）は、プルロニックポリマーを含まない。いくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの全ては、プルロニックポリマーを含まない。いくつかの態様において、かかるポリマーは、コーティング層（例えば、リポソーム、脂質単層、ミセルなど）により囲まれていてもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアの要素は、ポリマーに接着していてもよい。
【０１７６】
免疫抑制剤は、多数の方法のうちのいずれかにより合成ナノキャリアにカップリングすることができる。一般に、接着は、免疫抑制剤と合成ナノキャリアとの間の接着の結果である。この結合により、免疫抑制剤の合成ナノキャリアの表面への接着、および／または合成ナノキャリア中での包含（封入）に結果としてなることができる。いくつかの態様において、しかし、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアへの結合よりもむしろ合成ナノキャリアの構造の結果として、合成ナノキャリアにより封入される。好ましい態様において、合成ナノキャリアは、本明細書において提供されるポリマーを含み、免疫抑制剤はポリマーに接着している。
【０１７７】
接着が、免疫抑制剤と合成ナノキャリアとの間の結合の結果として生じる場合、接着は、カップリング部分を介して生じてもよい。カップリング部分は、それを通して免疫抑制剤が合成ナノキャリアに結合するいずれかの部分であってよい。かかる部分は、アミド結合またはエステル結合などの共有結合、ならびに免疫抑制剤を合成ナノキャリアに（共有的または非共有的に）結合する別の分子を含む。かかる分子は、リンカーまたはポリマーまたはその単位を含む。例えば、カップリング部分は、免疫抑制剤が静電気的に結合する荷電したポリマーを含んでもよい。別の例として、カップリング部分は、それが共有結合しているポリマーまたはその単位を含んでもよい。
好ましい態様において、合成ナノキャリアは、本明細書において提供されるポリマーを含む。これらの合成ナノキャリアは、完全にポリマー性のものであっても、ポリマーと他の材料との混合物であってもよい。
【０１７８】
いくつかの態様において、合成ナノキャリアのポリマーは、会合してポリマーマトリックスを形成する。これらの態様のいくつかにおいて、免疫抑制剤などの成分は、ポリマーマトリックスの１以上のポリマーと共有的に会合することができる。いくつかの態様において、共有的会合は、リンカーにより媒介される。いくつかの態様において、成分は、ポリマーマトリックスの１以上のポリマーに、非共有的に会合していてもよい。例えば、いくつかの態様において、成分は、ポリマーマトリックス中に封入されていても、ポリマーマトリックスにより囲まれていても、および／またはポリマーマトリックス全体に分散していてもよい。あるいはまたは加えて、成分は、疎水性相互作用、電荷相互作用、ファンデルワールス力などにより、ポリマーマトリックスの１以上のポリマーに会合することができる。それらからポリマーマトリックスを形成するための広範なポリマーおよび方法が、慣習的に知られている。
【０１７９】
ポリマーは、天然または非天然の（合成の）ポリマーであってよい。ポリマーは、ホモポリマーであっても、２以上のモノマーを含むコポリマーであってよい。配列に関して、コポリマーは、ランダムであっても、ブロックであっても、またはランダムおよびブロック配列の組み合わせを含んでもよい。典型的には、本発明によるポリマーは、有機ポリマーである。
【０１８０】
いくつかの態様において、ポリマーは、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミドまたはポリエーテル、またはこれらの単位を含む。他の態様において、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー、またはポリカプロラクトン、またはこれらの単位を含む。いくつかの態様において、ポリマーは、生分解性であることが好ましい。したがって、これらの態様において、ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）またはポリプロピレングリコールまたはこれらの単位などのポリエーテルを含む場合、ポリマーが生分解性となるように、ポリマーが、ポリエーテルのブロックコポリマーおよび生分解性ポリマーを含むことが好ましい。他の態様において、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール)またはポリプロピレングリコールまたはその単位などのポリエーテルまたはその単位を単独では含まない。
【０１８１】
本発明に好適なポリマーの他の例は、ポリエチレン、ポリカーボネート（例として、ポリ（１,３−ジオキサ−２オン））、ポリ無水物（例として、ポリ（セバシン酸無水物））、ポリプロピルフメラート、ポリアミド（例として、ポリカプロラクタム）、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル（例として、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸−コ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酸（例として、ポリ（β−ヒドロキシアルカノアート）））ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、およびポリアミン、ポリリジン、ポリリジン−ＰＥＧコポリマー、およびポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンイミン−ＰＥＧコポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
いくつかの態様において、本発明によるポリマーは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により２１ Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１７７.２６００下においてヒトにおける使用について承認されているポリマーを含み、これは、限定されないが、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３−ジオキサン−２オン））；ポリ酸無水物（例えばポリ（セバシン酸無水物））；ポリ酸無水物（例えばポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）；ポリウレタン；
【０１８３】
ポリメタクリラート；およびポリシアノアクリラートを含む。いくつかの態様において、ポリマーは、親水性であってよい。例えば、ポリマーは、アニオン基（例えば、リン酸基、硫酸基、カルボン酸基）；カチオン基（例えば、四級アミン基）；または極性基（例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミン基）を含んでもよい。いくつかの態様において、親水性ポリマーマトリックスを含む合成ナノキャリアは、合成ナノキャリア中に親水性環境を生じる。
【０１８４】
いくつかの態様において、ポリマーは、疎水性であってもよい。いくつかの態様において、疎水性ポリマーマトリックスを含む合成ナノキャリアは、合成ナノキャリア中に疎水性環境を生じる。ポリマーの親水性または疎水性の選択は、合成ナノキャリア中に組み込まれる材料の性質に対して影響を有し得る。
【０１８５】
いくつかの態様において、ポリマーは、１以上の部分および／または官能基により修飾されていてもよい。本発明により多様な部分または官能基を用いることができる。いくつかの態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により、炭水化物により、および／または多糖から誘導される非環式ポリアセタールにより修飾することができる（Ｐａｐｉｓｏｖ, ２００１, ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ, ７８６:３０１）。ある態様は、Ｇｒｅｆらに対する米国特許第５５４３１５８号またはＶｏｎ ＡｎｄｒｉａｎらによるＷＯ公開ＷＯ２００９/０５１８３７の一般的教示を用いて行ってもよい。
いくつかの態様において、ポリマーを、脂質または脂肪酸基により修飾してもよい。
【０１８６】
いくつかの態様において、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸またはリグノセリン酸の１以上であってよい。いくつかの態様において、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノール酸、ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはエルカ酸の１以上であってよい。
【０１８７】
いくつかの態様において、ポリマーは、ポリエステルであってよく、これは、乳酸およびグリコール酸の単位を含むコポリマー、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（本明細書において集合的に「ＰＬＧＡ」として言及される）；ならびにグリコール酸単位を含むホモポリマー（本明細書において「ＰＧＡ」として言及される）、ならびにポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド乳酸単位を含むホモポリマー（本明細書において集合的に「ＰＬＡ」として言及される）を含む。いくつかの態様において、例示的なポリエステルとして、例えば、ポリヒドロキシ酸；ＰＥＧコポリマーおよびラクチドとグリコリドとのコポリマー（例えば、ＰＬＡ-ＰＥＧコポリマー、ＰＧＡ-ＰＥＧコポリマー、ＰＬＧＡ-ＰＥＧコポリマー）およびそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの態様において、ポリエステルとして、例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）−ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−Ｌ−リジン）コポリマー、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］およびそれらの誘導体が挙げられる。
【０１８８】
いくつかの態様において、ポリマーは、ＰＬＧＡであってよい。ＰＬＧＡは、乳酸とグリコール酸との生体適合性かつ生分解性のコポリマーであり、ＰＬＧＡの多様な形態は、乳酸：グリコール酸の比により特徴づけられる。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸またはＤ，Ｌ−乳酸であってよい。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸：グリコール酸比を変更することにより調節することができる。いくつかの態様において、本発明により用いられるべきＰＬＧＡは、約８５：１５、約７５：２５、約６０：４０、約５０：５０、約４０：６０、約２５：７５または約１５：８５の乳酸:グリコール酸の比により特徴づけられる。
いくつかの態様において、ポリマーは、１以上のアクリル酸ポリマーであってよい。
【０１８９】
態様において、アクリル酸ポリマーとして、例えば、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリラートコポリマー、エトキシエチルメタクリラート、シアノエチルメタクリラート、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（メタクリル酸無水物）、メチルメタクリラート、ポリメタクリラート、ポリ（メチルメタクリラート）コポリマー、ポリアクリルアミド、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、グリシジルメタクリラートコポリマー、ポリシアノアクリラート、および前述のポリマーの１以上を含む組み合わせが挙げられる。アクリル酸ポリマーは、低い含有量の四級アンモニウム基と共に、アクリル酸とメタクリル酸エステルとの完全に重合したコポリマーを含んでもよい。
いくつかの態様において、ポリマーは、カチオン性ポリマーであってよい。
【０１９０】
一般的に、カチオン性ポリマーは、核酸の負に荷電した鎖を縮合および／または保護することができる。ポリ（リジン）などのアミン含有ポリマー（Ｚａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ., １９９８, Ａｄｖ. Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ. Ｒｅｖ., ３０:９７；およびＫａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ., １９９５, Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ., ６:７）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ; Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ., １９９５, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., ＵＳＡ, １９９５, ９２:７２９７）、およびポリ（アミドアミン）デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ-Ｌａｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ., １９９６, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., ＵＳＡ, ９３:４８９７；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ., １９９６, Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ., ７:７０３；およびＨａｅｎｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ., １９９３, Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ., ４:３７２）は、生理学的ｐＨにおいて正に荷電しており、核酸とイオン対を形成する。態様において、合成ナノキャリアは、カチオン性ポリマーを含まなくともよい（またはこれを除外してもよい）。
【０１９１】
いくつかの態様において、ポリマーは、カチオン性側鎖を有する分解性ポリエステルであってもよい（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ３２:３６５８；Ｂａｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ., １９９３, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １１５:１１０１０；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ., １９８９, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ２２:３２５０；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １２１:５６３３；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ., １９９０, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ２３:３３９９）。そして、Ｚｈｏｕその他、１９９０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２３：３３９９）。これらのポリエステルの例として、ポリ（Ｌ−ラクチド−Ｌ−リジン）コポリマー（Ｂａｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ., １９９３, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １１５:１１０１０）、ポリ（セリンエステル）（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ., １９９０, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ２３:３３９９）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ３２:３６５８；およびＬｉｍ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １２１:５６３３）、ならびにポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ３２:３６５８; ａｎｄ Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １２１:５６３３）が挙げられる。
【０１９２】
これらのおよび他のポリマーの特性およびそれらを調製するための方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第６,１２３,７２７号；同第５,８０４,１７８号；同第５,７７０,４１７号；同第５,７３６,３７２号；同第５,７１６,４０４号；同第６,０９５,１４８号；同第５,８３７,７５２号；同第５,９０２,５９９号；同第５,６９６,１７５号；同第５,５１４,３７８号；同第５,５１２,６００号；同第５,３９９,６６５号；同第５,０１９,３７９号；同第５,０１０,１６７号；同第４,８０６,６２１号；同第４,６３８,０４５号；同第および同第４,９４６,９２９号；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００１, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １２３:９４８０；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ., ２００１, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., １２３:２４６０；Ｌａｎｇｅｒ, ２０００, Ａｃｃ. Ｃｈｅｍ. Ｒｅｓ., ３３:９４；Ｌａｎｇｅｒ、１９９９、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ。解放、６２：７；およびＵｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ., １９９９, Ｃｈｅｍ. Ｒｅｖ., ９９:３１８１を参照）。より一般的には、特定の好適なポリマーを合成するための多様な方法は、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔｓ、Ｇｏｅｔｈａｌｓ編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ, １９８０；ＯｄｉａｎによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、第４版、２００４；ＡｌｌｃｏｃｋらによるＣｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ-Ｈａｌｌ、１９８１；
【０１９３】
Ｄｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ., １９９７, Ｎａｔｕｒｅ, ３９０:３８６において；および米国特許第６,５０６,５７７号、同第６,６３２,９２２号、同第６,６８６,４４６号および同第６,８１８,７３２号において記載されている。
【０１９４】
いくつかの態様において、ポリマーは、直鎖状または分枝状ポリマーであってよい。いくつかの態様において、ポリマーは、デンドリマーであってよい。いくつかの態様において、ポリマーは、互いに実質的に架橋されていてもよい。いくつかの態様において、ポリマーは、実質的に架橋を含まなくてもよい。いくつかの態様において、ポリマーは、架橋するステップを経ることなく用いることができる。さらに、合成ナノキャリアは、前述のおよび他のポリマーのいずれかのブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ブレンド、混合物および／または付加物を含んでもよいことが、理解されるべきである。当業者は、本明細書において列記されるポリマーは、本発明による使用のものである例示的なポリマーのリストを代表するが、包括的なものではないことを認識するであろう。
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、ポリマー成分を含まない。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、金属粒子、量子ドット、セラミック粒子などを含んでもよい。いくつかの態様において、非ポリマー性合成ナノキャリアは、金属原子（例えばとして金原子）の凝集物などの、非ポリマー性成分の凝集物である。
【０１９５】
本明細書に提供されるいかなる免疫抑制剤も、いくつかの実施形態において、合成ナノキャリアに連結することができる。免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：スタチン；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；ＴＧＦ−β受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；副腎皮質ステロイド；ロテノンなどのミトコンドリアの機能の阻害剤；Ｐ３８阻害剤；ＮＦ-κβ阻害剤；アデノシン受容体アゴニスト；プロスタグランジンＥ２アゴニスト；ホスホジエステラーゼ４阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役受容体アゴニスト；Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト；糖質コルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体阻害剤；サイトカイン受容体アクチベーター；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アンタゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤ならびに酸化ＡＴＰ。免疫抑制剤はまた、ＩＤＯ、ビタミンＤ３、シクロスポリンＡ、アリール炭化水素受容体阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アスピリン、ニフルミン酸、エストリオール、トリポリド（ｔｒｉｐｏｌｉｄｅ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-１０）、シクロスポリンＡ、サイトカインまたはサイトカイン受容体などを標的とするｓｉＲＮＡを含む。
【０１９６】
ｍＴＯＲ阻害剤の例として、ラパマイシンおよびそのアナログ（例えば、ＣＣＬ-７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、Ｃ２０−メタリルラパマイシン（Ｃ２０-Ｍａｒａｐ）、Ｃ１６−（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６-ＢＳｒａｐ）、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン（Ｃ１６-ｉＲａｐ）（Ｂａｙｌｅ ｅｔ ａｌ. Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ & Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６、１３:９９-１０７）、ＡＺＤ８０５５、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ-ＢＥＺ２３５）、クリソファン酸（クリソファノール）、デフォロリムス（ＭＫ-８６６９）、エベロリムス（ＲＡＤ０００１）、ＫＵ-００６３７９４、ＰＩ-１０３、ＰＰ２４２、テムシロリムス、およびＷＹＥ-３５４（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
【０１９７】
ＮＦ（例えば、ＮＫ-κβ）阻害剤の例として、ＩＦＲＤ１、２−（１，８−ナフチリジン−２−イル）−フェノール、５−アミノサリチル酸、ＢＡＹ １１-７０８２、ＢＡＹ １１-７０８５、ＣＡＰＥ（Ｃａｆｆｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌエステル）、マレイン酸ジエチル、ＩＫＫ-２阻害剤ＩＶ、ＩＭＤ ０３５４、ラクタシスチン、ＭＧ-１３２［Ｚ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-ＣＨＯ］、ＮＦκＢ活性化阻害剤ＩＩＩ、ＮＦ-κＢ活性化阻害剤ＩＩ、ＪＳＨ-２３、パルテノライド、フェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）、ＰＰＭ-１８、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム塩、ＱＮＺ、ＲＯ １０６-９９２０、ロカグラミド、ロカグラミドＡＬ、ロカグラミドＣ、ロカグラミドＩ、ロカグラミドＪ、ロカグラオール、(Ｒ) -ＭＧ-１３２、サリチル酸ナトリウム、トリプトライド（ＰＧ４９０）、およびウェデロラクトンが挙げられる。
【０１９８】
「ラパログ」は、本明細書に使用されているように、構造的にラパマイシン（シロリムス）の（類似体）に関する分子を、指す。ラパログの例として、限定することなく、テムシロリムス（ＣＣＩ-７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダフォロリムス（ＡＰ-２３５７３）、およびゾタロリムス（ＡＢＴ-５７８）が挙げられる。ラパログのさらなる例は、例えばＷＯ公開ＷＯ１９９８/００２４４１および米国特許第８,４５５,５１０号において見出すことができ、それらのラパログは、本明細書においてその全体において参考として援用される。さらなる免疫抑制剤は、当業者に公知であり、本発明は、この点において限定されない。提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つの態様において、免疫抑制剤は、本明細書に提供される剤のいずれか１つを含んでもよい。
本発明による組成物は、保存剤、バッファー、食塩水またはリン酸緩衝化食塩水などの薬学的に許容し得る賦形剤を含んでもよい。
組成物は、有用な投与形態を達成するために、慣用的な医薬の製造および配合技術を用いて製造することができる。一態様において、組成物は、注射のために、無菌の食塩水溶液中で保存剤と一緒に懸濁される。
Ｄ．組成物を使用および作製する方法
【０１９９】
ウイルス導入ベクターは、当業者に公知の、または本明細書において他の場所で記載の方法により作製することができる。例えば、ウイルス導入ベクターは、例えば、米国特許第４,７９７,３６８号およびＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ, ２３, ６５-７３（１９８３）において記載の方法を用いて構築および／または精製することができる。
【０２００】
例として、複製欠損アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターにおいては存在しないが、ウイルスの伝播のために必要とされる遺伝子の機能を提供する補完細胞株において、高力価のウイルス導入ベクターストックに結果としてなるために適切なレベルにおいて、作製することができる。補完細胞株は、全てのアデノウイルス機能を含む、ｅａｒｌｙ領域、ｌａｔｅ領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域、またはそれらの組み合わせによりコードされる、少なくとも１つの複製必須遺伝子の機能の欠損を補完することができる（例えば、アデノウイルスアンプリコンの伝播を可能にするために）。補完細胞株の構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.（１９８９年）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ.Ｙ.（１９９４年）により記載のような標準的な分子生物学および細胞培養技術を伴う。
【０２０１】
アデノウイルスベクターを作製するための補完細胞株として、これらに限定されないが、２９３細胞（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｇｅｎ. Ｖｉｒｏｌ., ３６, ５９-７２ (１９７７)において記載の）、ＰＥＲ.Ｃ６細胞（例えば国際特許出願ＷＯ ９７/００３２６、ならびに米国特許第５,９９４,１２８号および同第６,０３３,９０８号において記載の）、ならびに２９３-ＯＲＦ６細胞（例えば国際特許出願ＷＯ ９５/３４６７１およびＢｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｖｉｒｏｌ., ７１, ９２０６-９２１３ (１９９７)において記載の）が挙げられる。いくつかの例において、補完細胞は、全ての必要とされるアデノウイルス遺伝子機能を補完しない。ヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターの複製を可能にするために、細胞またはアデノウイルスのゲノムによりコードされていない遺伝子機能を、トランスに提供するために使用することができる。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５,９６５,３５８号、同第５,９９４,１２８号、同第６,０３３,９０８号、同第６,１６８,９４１号、同第６,３２９,２００号、同第６,３８３,７９５号、同第６,４４０,７２８号、同第６,４４７,９９５号および同第６,４７５,７５７号、米国特許出願公開番号２００２/００３４７３５ Ａ１、ならびに国際特許出願ＷＯ ９８/５３０８７、ＷＯ ９８/５６９３７、ＷＯ ９９/１５６８６、ＷＯ ９９/５４４４１、ＷＯ ００/１２７６５、ＷＯ ０１/７７３０４およびＷＯ ０２/２９３８８、ならびに本明細書において同定される他の参考文献において記載の材料および方法を用いて、構築するか、伝播させるか、および／または精製することができる。アデノウイルス血清型３５ベクターを含む非Ｃ群アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５,８３７,５１１号および同第５,８４９,５６１号、ならびに国際特許出願ＷＯ ９７/１２９８６およびＷＯ ９８/５３０８７において記載の方法を用いて作製することができる。
【０２０２】
ＡＡＶベクターは、組み換え方法を用いて作製することができる。典型的には、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる組み換えＡＡＶベクター；ならびに組み換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするために十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、ウイルス導入ベクターは、以下からなる群から選択されるＡＡＶ血清型の反転末端反復（ＩＴＲ）を含んでもよい：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびそれらのバリアント。
【０２０３】
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシド中にパッケージングするために宿主細胞において培養されるべき成分を、宿主細胞にトランスに提供してもよい。あるいは、必要とされる成分のいずれか１つまたは２つ以上（例えば、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）を、当業者に公知の方法を用いて、必要とされる成分のいずれか１つまたは２つ以上を含むように操作された安定な宿主細胞により、提供してもよい。
【０２０４】
最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下において、必要とされる成分を含むことができる。しかし、必要とされる成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。本発明のｒＡＡＶを作製するために必要とされる組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、いずれかの適切な遺伝子要素を用いてパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択される遺伝子要素は、本明細書において記載のものを含むいずれかの好適な方法により送達することができる。本発明のいずれかの態様を構築するために用いられる方法は、核酸操作において技術を有する当業者に公知であり、遺伝子工学、組み換え工学および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.を参照。同様に、ｒＡＡＶウイルス粒子を作製する方法は、周知であり、好適な方法の選択は、本発明に対する限定ではない。例えば、Ｋ. Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ, Ｊ. Ｖｉｒｏｌ., ７０:５２０-５３２（１９９３）および米国特許第５,４７８,７４５号を参照。
【０２０５】
いくつかの態様において、組み換えＡＡＶベクターは、三重トランスフェクション法(ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ)を用いて作製することができる（例えば、米国特許第６,００１,６５０号において詳細に記載のように；三重トランスフェクション法に関するその内容は、本明細書において参考として援用される）。典型的には、組み換えＡＡＶは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされるべき組み換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターでトランスフェクションすることにより作製する。一般に、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、増殖性ＡＡＶの複製およびカプシド形成のためにトランスで機能する、ＡＡＶヘルパー機能配列（ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いずれかの検出可能な野生型ＡＡＶウイルス粒子（すなわち、機能的なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶウイルス粒子）を作製することなく、効率的なＡＡＶベクター作製を支持する。補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する、非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞の機能のためのヌクレオチド配列をコードしていてもよい。補助機能は、ＡＡＶ複製のために必要とされる機能を含み、これは、限定することなく、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的なＡＡＶのｍＲＮＡのスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡの複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリーの活性化に関与する部分を含む。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外のもの）、およびワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来してよい。
【０２０６】
レンチウイルスベクターは、当該分野において公知の多数の方法のいずれかを用いて作製することができる。レンチウイルスベクターおよび／またはそれらの作製の方法の例は、例えば、米国公開番号２０１５０２２４２０９、２０１５０２０３８７０、２０１４０３３５６０７、２０１４０２４８３０６、２００９０１４８９３６および２００８０２５４００８において見出すことができ、かかるレンチウイルスベクターおよび作製の方法は、本明細書において参考として援用される。例として、レンチウイルスベクターが組み込み不能である場合、レンチウイルスゲノムはさらに複製起点（ｏｒｉ）を含み、その配列は、レンチウイルスゲノムを発現させなければならない細胞の性質に依存する。前記複製起点は、真核生物由来、好ましくは哺乳動物起源のもの、最も好ましくヒト起源のものであってよい。レンチウイルスゲノムは細胞宿主のゲノム中に組み込まれない（不完全なインテグラーゼのため）ので、レンチウイルスゲノムは、頻繁な細胞分裂を経験している細胞においては失われ得る；このことは、ＢまたはＴ細胞などの免疫細胞における場合はことさらである。複製起点の存在は、いくつかの場合において有益であり得る。
【０２０７】
ベクター粒子は、２９３Ｔ細胞などの適切な細胞のトランスフェクションの後で、前記プラスミドにより、または他のプロセスにより、産生させることができる。レンチウイルス粒子の発現のために用いられる細胞において、プラスミドの全てまたは一部を、それらがコードしているポリヌクレオチドを安定に発現させるために、またはそれらがコードしているポリヌクレオチドを一過性にもしくは半安定して(ｓｅｍｉ-ｓｔａｂｌｙ)発現させるために用いることができる。
本明細書において提供される他のウイルスベクターを作製するための方法は、当該分野において公知であり、上の例示的な方法と同様である。さらに、ウイルスベクターは市販されている。
態様において、免疫抑制剤を含む一定の合成ナノキャリアを調製する場合、免疫抑制剤を合成ナノキャリアに付着させるための方法は、有用かもしれない。
【０２０８】
ある態様において、接着は、共有的リンカーであってよい。態様において、本発明による免疫抑制剤は、外側表面に、アルキン基を含む免疫抑制剤とのアジド基の１，３−双極性環化付加反応により、またはアジド基を含む免疫抑制剤とのアルキンの１，３−双極性環化付加反応により形成された、１，２，３−トリアゾールリンカーを介して、共有的に接着していてもよい。かかる環化付加反応は、好ましくは、好適なＣｕ（Ｉ）−リガンドおよびＣｕ（ＩＩ）化合物を触媒活性Ｃｕ（Ｉ）化合物に還元するための還元剤と共に、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下において行う。このＣｕ（Ｉ）により触媒されたアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）はまた、クリック反応としても言及される。
【０２０９】
加えて、共有的カップリングは、共有的リンカーを含んでもよく、これは、アミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、ヒドラゾンリンカー、ヒドラジドリンカー、イミンまたはオキシムリンカー、ウレアまたはチオウレアリンカー、アミジンリンカー、アミンリンカー、およびスルホンアミドリンカーを含む。
【０２１０】
アミドリンカーは、免疫抑制剤などの１つの成分上のアミンと、ナノキャリアなどの第２の成分のカルボン酸基との間のアミド結合を介して形成される。リンカー中のアミド結合は、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドにより活性化されたエステルなどの好適に保護されたアミノ酸との慣用的なアミド結合形成反応のいずれかを用いて生成することができる。
【０２１１】
ジスルフィドリンカーは、例えばＲ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２の形態の２つの硫黄原子の間のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の形成を介して、生成することができる。ジスルフィド結合は、チオール／メルカプタン基（−ＳＨ）を含む成分の、別の活性化されたチオール基との、またはチオール／メルカプタン基を含む成分の、活性化されたチオール基を含む成分とのチオール交換により、形成させることができる。
Ｒ１およびＲ２は、いずれかの化学成分である形態の、トリアゾールリンカー、特に１，２，３−トリアゾール
【０２１２】
【化１】
2020536939.tif 000003
【０２１３】
は、第１の成分に接着したアジドの、免疫抑制剤などの第２の成分に接着した末端アルキンによる１，３−双極性環化付加反応により生成することができる。１，３−双極性環化付加反応は、触媒を用いてまたはこれを用いずに、好ましくは１，２，３−トリアゾール官能基を通して２つの成分を連結するＣｕ（Ｉ）触媒を用いて行う。この化学は、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ., Ａｎｇｅｗ. Ｃｈｅｍ. Ｉｎｔ. Ｅｄ. ４１(１４), ２５９６, (２００２)およびＭｅｌｄａｌ, ｅｔ ａｌ, Ｃｈｅｍ. Ｒｅｖ., ２００８, １０８(８), ２９５２-３０１５において詳細に記載され、しばしば、「クリック」反応またはＣｕＡＡＣとして言及される。
【０２１４】
チオエーテルリンカーは、例えばＲ１−Ｓ−Ｒ２の形態における硫黄−炭素（チオエーテル）結合の形成により生成される。チオエーテルは、１つの成分上でのチオール／メルカプタン（−ＳＨ）基の、第２の成分上のハライドまたはエポキシドなどのアルキル化基によるアルキル化により、生成することができる。チオエーテルリンカーはまた、１つの成分上のチオール／メルカプタン基の、マイケルアクセプターとしてマレイミド基またはビニルスルホン基を含む第２の成分上の電子欠乏アルケン基に対するマイケル付加により、形成させることができる。別の方法において、１つの成分上のチオール／メルカプタン基の、第２の成分上のアルケン基によるラジカルチオール−エン反応により、チオエーテルリンカーを調製することができる。
ヒドラゾンリンカーは、１つの成分上のヒドラジド基の、第２の成分上のアルデヒド／ケトン基との反応により生成することができる。
【０２１５】
ヒドラジドリンカーは、１つの成分上のヒドラジン基の、第２の成分上のカルボン酸基との反応により生成することができる。かかる反応は、一般に、カルボン酸が活性化試薬により活性化される、アミド結合の形成に類似する化学を用いて行う。
イミンまたはオキシムリンカーは、１つの成分上のアミンまたはＮ−アルコキシアミン（またはアミノオキシ）基の、第２の成分上のアルデヒドまたはケトン基との反応により形成される。
ウレアまたはチオウレアリンカーは、１つの成分上のアミン基の、第２の成分上のイソシアナートまたはチオイソシアナート基との反応により調製される。
アミジンリンカーは、１つの成分上のアミン基の、第２の成分上のイミドエステル基との反応により調製される。
【０２１６】
アミンリンカーは、１つの成分上のアミン基の、第２の成分上のハライド、エポキシドまたはスルホナートエステル基などのアルキル化基によるアルキル化反応により生成される。あるいは、アミンリンカーはまた、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムなどの好適な還元試薬による、１つの成分上のアミン基の、第２の成分上のアルデヒドまたはケトン基による還元性アミノ化により生成することができる。
スルホンアミドリンカーは、１つの成分上のアミン基の、第２の成分上のスルホニルハライド（スルホニルクロリドなどの）基との反応により生成される。
スルホンリンカーは、ビニルスルホンへの求核試薬のマイケル付加により生成される。
ビニルスルホンまたは求核試薬のいずれかは、ナノキャリアの表面上にあるか、成分に接着していてもよい。
【０２１７】
成分はまた、非共有的共役方法を介して共役させることができる。例えば、静電吸着を通して、負に荷電した免疫抑制剤を、正に荷電した成分に共役させることができる。金属配位子を含む成分はまた、金属−配位子錯体を介して金属錯体に共役させることができる。
【０２１８】
態様において、成分は、合成ナノキャリアのアセンブリーの前に、ポリマー、例えばポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールに接着していてもよく、合成ナノキャリアは、反応性または活性化可能な基により形成させることができる。後者の場合において、成分は、合成ナノキャリアの表面により提示される接着化学に適合性である基を用いて調製することができる。他の態様において、ペプチド成分は、好適なリンカーを用いてＶＬＰまたはリポソームに接着させることができる。リンカーは、２つの分子を一緒にカップリングすることができる化合物または試薬である。一態様において、リンカーは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ２００８において記載のようなホモ二官能性またはヘテロ二官能性の試薬であってよい。例えば、表面上にカルボン酸基を含むＶＬＰまたはリポソーム合成ナノキャリアを、ＥＤＣの存在下において、ホモ二官能性リンカーであるアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）で処置して、ＡＤＨリンカーを有する対応する合成ナノキャリアを形成させることができる。結果として生じるＡＤＨと連結された合成ナノキャリアを、次いで、ナノキャリア上のＡＤＨリンカーの他方の末端を介して、酸基を含むペプチド成分と共役させて、対応するＶＬＰまたはリポソームペプチドコンジュゲートを生成する。
【０２１９】
態様において、ポリマー鎖の末端側にアジドまたはアルキン基を含むポリマーを調製する。このポリマーを、次いで、複数のアルキンまたはアジド基がナノキャリアの表面上に位置するような様式において合成ナノキャリアを調製するために用いる。あるいは、合成ナノキャリアを、別の経路により調製して、その後、アルキンまたはアジド基で官能化してもよい。成分は、アルキン（ポリマーがアジドを含む場合）またはアジド（ポリマーがアルキンを含む場合）基のいずれかの存在と共に調製される。成分を、次いで、１，３−双極性環化付加反応を介して、１，４−二置換１，２，３−トリアゾールリンカーを通して成分を粒子に共有的に接着させる触媒を用いてまたはこれを用いずに、ナノキャリアと反応させる。
【０２２０】
成分が低分子である場合、合成ナノキャリアのアセンブリーの前に成分をポリマーに接着させることは、有利であり得る。態様において、成分を合成ナノキャリアに接着させるために用いられる表面基を用いて、成分をポリマーに接着させるというよりはむしろこれらの表面基の使用を通して、合成ナノキャリアを調製し、次いで、このポリマーコンジュゲートを合成ナノキャリアの構築において用いることもまた、有利であり得る。
【０２２１】
利用可能な共役方法の詳細な記載については、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｇ Ｔ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｉｎｃ.刊行、２００８年を参照。共有的接着に加えて、成分は、予め形成された合成ナノキャリアに吸着させることにより接着させても、または合成ナノキャリアの形成の間の封入により接着させてもよい。
【０２２２】
合成ナノキャリアは、当該分野において公知の広範な方法を用いて調製することができる。例えば、合成ナノキャリアは、ナノ沈殿、流体チャネルを用いるフローフォーカシング(ｆｌｏｗ ｆｏｃｕｓｉｎｇ)、スプレー乾燥、シングルおよびダブルエマルション溶媒蒸発、溶媒抽出、相分離、製粉、マイクロエマルション法、微細加工(ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ)、ナノ加工(ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ)、犠牲層、単純および複合コアセルベーションなどの方法、ならびに当業者に周知の他の方法により形成することができる。あるいはまたは加えて、単分散半導体のための水性および有機性の溶媒合成、伝導性、磁性、有機および他のナノ材料が記載されている（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ., ２００５, Ｓｍａｌｌ, １:４８; Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ., ２０００, Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｍａｔ. Ｓｃｉ., ３０:５４５; ａｎｄ Ｔｒｉｎｄａｄｅ ｅｔ ａｌ., ２００１, Ｃｈｅｍ. Ｍａｔ., １３:３８４３）。さらなる方法は、文献において記載されている（例えば、Ｄｏｕｂｒｏｗ編、「Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ, １９９２；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ., １９８７, Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ, ５:１３; Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ., １９８７, Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ, ６:２７５；ならびにＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ., １９８８, Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ., ３５:７５５；米国特許第５５７８３２５号および同第６００７８４５号；Ｐ. Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ., 「Ｓｕｒｆａｃｅ-ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＬＧＡ-ｂａｓｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｃａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ-ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ. ５(６):８４３-８５３ (２０１０)を参照）。
【０２２３】
材料を、望ましい場合には、限定されないが以下を含む多様な方法を用いて、合成ナノキャリア中に封入してもよい：Ｃ. Ａｓｔｅｔｅ ｅｔ ａｌ., 「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｊ. Ｂｉｏｍａｔｅｒ. Ｓｃｉ. Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ、第１７巻、第３号、ｐｐ. ２４７-２８９（２００６）；Ｋ. Ａｖｇｏｕｓｔａｋｉｓ「Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙ(Ｌａｃｔｉｄｅ) ａｎｄ Ｐｏｌｙ(Ｌａｃｔｉｄｅ-Ｃｏ-Ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ) Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ, Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １:３２１-３３３（２００４）；Ｃ. Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ., 「Ｎａｎｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｉ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ-ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２:８- ２１（２００６）；Ｐ. Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ., 「Ｓｕｒｆａｃｅ-ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＬＧＡ-ｂａｓｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｃａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ-ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ. ５(６): ８４３-８５３（２０１０）。材料を合成ナノキャリア中に封入するために好適な他の方法を用いてもよく、これらは、限定することなく、２００３年１０月１４日に発行されたＵｎｇｅｒに対する米国特許第６,６３２,６７１号において開示される方法を含む。
【０２２４】
ある態様において、合成ナノキャリアは、ナノ沈殿法またはスプレー乾燥により調製される。合成ナノキャリアを調製することにおいて用いられる条件は、所望されるサイズおよび特性（例えば、疎水性、親水性、外側の形態、「粘着性」、形状など）の粒子を得るために改変することができる。合成ナノキャリアを調製する方法および用いられる条件（例えば、溶媒、温度、濃度、気体の流速など）は、合成ナノキャリアに結合させるべき材料および／またはポリマーマトリックスの組成に依存し得る。
上記の方法のいずれかにより調製される合成ナノキャリアが所望される範囲の外のサイズ範囲を有する場合、合成ナノキャリアを、例えば篩を用いて、サイズ分類することができる。
【０２２５】
合成ナノキャリアの要素は、例えば１以上の共有結合により合成ナノキャリア全体に接着させても、１以上のリンカーにより接着させてもよい。合成ナノキャリアを官能化するさらなる方法は、Ｓａｌｔｚｍａｎらに対する米国特許出願公開２００６/０００２８５２、ＤｅＳｉｍｏｎｅらに対する米国特許出願公開２００９/００２８９１０、またはＭｕｒｔｈｙらに対する国際特許出願公開ＷＯ/２００８/１２７５３２ Ａ１から適応させることができる。
【０２２６】
あるいはまたは追加で、合成ナノキャリアは、非共有相互作用を経由して直接的または万節的に接着されることができる。非共有的態様において、非共有的接着は、限定されないが以下を含む非共有的相互作用により媒介される：電荷相互作用、アフィニティー相互作用、金属配位、物理的吸着、主客相互作用、疎水性相互作用、ＴＴスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、磁性相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用、および／またはこれらの組み合わせを含む。かかる接着は、合成ナノキャリアの外部表面または内部表面上にあるように配置することができる。態様において、封入および／または吸収は、接着の形態である。
【０２２７】
本明細書において提供される組成物は、無機または有機の緩衝化剤（例えば、リン酸、炭酸、酢酸またはクエン酸のナトリウムまたはカリウム塩）およびｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウムまたはカリウム、クエン酸または酢酸の塩、アミノ酸およびそれらの塩）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン９-１０ノニルフェノール、デオキシコール酸ナトリウム）、溶液および／または低温(ｃｒｙｏ)／凍結安定化剤（例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、トレハロース）、浸透圧調節剤（例えば、塩または糖）、抗菌剤（例えば、安息香酸、フェノール、ゲンタマイシン）、消泡剤（例えば、ポリジメチルシロキサン、保存剤（例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール、ＥＤＴＡ）、ポリマー性安定化剤および粘度調節剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ポロキサマー４８８、カルボキシメチルセルロース）および共溶媒（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール）を含んでもよい。
【０２２８】
本発明による組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤を含んでもよい。組成物は、有用な投与形態を達成するために、慣用的な医薬の製造および配合技術を用いて製造することができる。本発明を実践するために、好適な技法は、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ＭｉｘｉｎｇのＨａｎｄｂｏｏｋで見つかってもよい：ＳｃｉｅｎｃｅおよびＰｒａｃｔｉｃｅ、Ｅｄｗａｒｄ Ｌ.ＰａｕｌによるＥｄｉｔｅｄ、Ｖｉｃｔｏｒ Ａ.Ａｔｉｅｍｏ-ＯｂｅｎｇおよびＳｕｚａｎｎｅ Ｍ.Ｋｒｅｓｔａ(２００４のＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、 Ｉｎｃ.）；そして、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ:Ｄｏｓａｇｅの中でＳｃｉｅｎｃｅフォームＤｅｓｉｇｎ、第２の版。Ｍ.Ｅ.Ａｕｔｅｎ、２００１、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅによって編集される。一態様において、組成物を、注射のために、保存剤と共に、無菌の食塩水溶液中に懸濁する。
【０２２９】
本発明の組成物は、いずれかの好適な様式において製造することができることが、理解されるべきであり、本発明は、本明細書において記載の方法を用いて製造することができる組成物に決して限定されない。適切な製造の方法の選択は、関連する特定の部分の特性に対する注意を必要とする場合がある。
【０２３０】
いくつかの態様において、組成物は、無菌条件下において製造されるか、最終的に無菌化される。このことにより、結果として生じる組成物が無菌であり、非感染性であることを確実にすることができ、それにより、非無菌の組成物と比較して安全性を改善する。このことは、特に組成物を投与されている対象が免疫欠損を有するか、感染症を罹患しているか、および／または感染に対して感受性である場合に、有益な安全性の指標を提供する。
【０２３１】
本発明による投与は、多様な経路によるものであってよく、これは、限定されないが、静脈内および腹腔内経路を含む。本明細書において言及される組成物は、投与、いくつかの態様においては併用投与のために、従来の方法を用いて製造および調製することができる。
【０２３２】
本発明の組成物は、有効量、例えば本明細書において他の場所で記載の有効量で投与することができる。いくつかの態様において、ウイルス導入ベクターおよび／または免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび／または抗ＩｇＭ剤は、有効な量の投与形態に存在して、ＩｇＭ応答などの、抗ウイルス導入ベクター免疫応答を減弱化しておよび／または対象および／または増加導入遺伝子にウイルス導入ベクターの再投与のために、ウイルス導入ベクターの発現を許す。投与形態は、多様な頻度において投与することができる。
免疫抑制剤を備えている合成ナノキャリアを有するウイルス導入ベクターのいくつかの態様において繰り返された投与および行われる抗ＩｇＭ剤。
【０２３３】
本発明の側面は、本明細書において提供される投与の方法のためのプロトコルを決定することに関する。プロトコルは、ウイルス導入ベクターの、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの、および／または抗ＩｇＭ剤の、少なくとも頻度、投与量を変化させることにより、続いて所望されるまたは所望されない免疫応答を評価することによって、決定されることができる。発明の実施のための好ましいプロトコルは、ＩｇＭ応答などのウイルス導入ベクターに対する免疫応答を減弱化し、および／またはウイルス導入ベクターに対する所望されない別の免疫応答を減弱化し、および／または導入遺伝子発現を拡大する。プロトコルは、いくつかの態様において、ウイルス導入ベクター、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＩｇＭ剤の、少なくとも投与頻度および用量を、含むことができる。
【０２３４】
開示の別の側面は、キットに関する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に提供される組成物のいずれか１以上の、または本明細書に提供される組成物の組み合わせのいずれか１つを、含む。いくつかの態様において、キットは、ウイルス導入ベクターを含む１以上の組成物、および／または免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを含む１以上の組成物、および／または抗ＩｇＭ剤を含む１以上の組成物を、含む。好ましくは、組成物は、量において、本明細書に提供されるいずれか１以上の用量を、提供する。組成物は、１つの容器において、または、キットにおいて複数の容器中に、あることができる。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、容器は、バイアルまたはアンプルである。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物は、引き続き再構成されてもよいように、各々別々の容器中で、または同じ容器中で、凍結乾燥型で、ある。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、キットは、再構成、混合、投与等々のための説明書をさらに備える。提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、説明書は、本明細書に記載の方法のいずれか１つの記載を、含む。説明書は、例として、印刷された挿入または標識として、いずれかの好適な形であることが、できる。本明細書に提供されるキットのいずれか１つのいくつかの態様において、キットは、対象にｉｎ ｖｉｖｏで、組成物を送達することができる１以上のシリンジ、または他の装置を、さらに含む。
【０２３５】
例
例１：免疫抑制剤を含む合成ナノキャリア
ラパマイシンなどの免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、当業者に公知のいずれかの方法を使用して、産生されることができる。好ましくは、本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ. ＵＳ ２０１６/０１２８９８６ Ａ１およびＵＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ. ＵＳ ２０１６/０１２８９８７ Ａ１の方法のいずれか１つによって産生され、かかる産生および結果として生じる合成ナノキャリアの記載の方法は、本明細書においてその全体において参考として援用される。本明細書に提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つにおいて、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、かかる援用された合成ナノキャリアである。ラパマイシンを含む合成ナノキャリアは、少なくともこれらの援用された方法と類似の方法によって産生し、以下の例において使用した。
【０２３６】
例２：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよび抗ＢＡＦＦ抗体との組み合わせ送達
免疫抑制剤（ラパマイシン）を含む合成ナノキャリアおよび抗ＢＡＦＦ抗体を伴うアデノ随伴ウイルスベクターを投与する効果を、調査した。以下の３つの処置を、試験した：分泌されたアルカリホスファターゼ（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ）単独、ラパマイシン（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］）を含む合成ナノキャリアと組み合わせて、および、抗ＢＡＦＦ抗体（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ＋ＳＶＰ［ＲＡＰＡ］＋抗ＢＡＦＦ］）と組わせてコードするアデノ随伴ウイルスベクター。６匹のマウスの３つの群は、上記の３つの処置のうちの１つと同一量によって、１回で注入した。注入は、ＡＡＶ−ＳＥＡＰおよびＳＶＰ［ＲＡＰＡ］に関して静脈内（ｉ．ｖ．）に、抗ＢＡＦＦに関して腹腔内に（ｉ．ｐ．）、投与した。
【０２３７】
全血は、注入後後５、９、１２、１６、および２１日目のそれぞれの対象から血清を単離するために、収集し、処理した。プレートに結合したＡＡＶへと導いた血清ＩｇＭは、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。未処置の血清は、負のベースラインレベルとして使用した。図１に示すように、ラパマイシンを含む合成ナノキャリアおよび抗ＢＡＦＦ抗体と組み合わせたＡＡＶ−ＳＥＡＰの投与は、その他の２つの群と比較して、血清抗ＡＡＶＩｇＭレベルの低下に、結果としてなった。１６および２１日までに、ＡＡＶベクターおよびラパマイシンを含む合成ナノキャリアおよび抗ＢＡＦＦ抗体の組み合わせを受けた多数のマウスにおいて、抗ＡＡＶ免疫は、ほとんど消滅した。
上記載のマウスからの血清も、ＳＥＡＰ発現レベルを決定するために、分析した。
【０２３８】
図２に示すように、５、９、１２および１６日目に、ラパマイシンを含む合成ナノキャリアおよび抗ＢＡＦＦ抗体と組み合わせたＡＡＶ−ＳＥＡＰの投与は、２つの他の群と比較して、ＳＥＡＰのより大きな発現レベルを生んだ。その上、該組み合わせが、初期におよび経時的に改善された標的導入遺伝子発現につながることを示し、ＳＥＡＰ発現の規模は、それぞれの時点で増強された。
【０２３９】
例３:合成ナノキャリア封入ラパマイシンと全身への抗ＢＡＦＦとの組み合わせによるＡＡＶに対するｉｎ ｖｉｖｏ ＩｇＭ免疫応答の相乗的低下
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの３つの群（各々６匹のマウス）は、いかなるナノキャリアも伴わない（１つの群）、または１５０μｇでのＳＶＰ［Ｒａｐａ］を伴う（２つの群）ＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧを、０、３７、および１５５日目に、３回注入した（ｉ．ｖ．尾静脈）。後者の２つのうち、１つの群は、０、１５、３７、１５５、および１６９日目、すなわちＡＡＶ８注入ごとに、および、プライムおよび第２のブーストの後の１４日にも、全身への抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）（ｃｌｏｎｅ Ｓａｎｄｙ-２ ｆｒｏｍ Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ., Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ, ＵＳＡ）で、追加で、処置した。
【０２４０】
指し示された時間（５、９、１２、１６、２１、４２、４７、５１、５５、１６２,１６７,１７４、１９５、および２１０日）に、マウスから採血し、血清を全血から分離し、分析まで−２０±５°Ｃで保存した。次いで、ＡＡＶに対するＩｇＭ抗体をＥＬＩＳＡで測定した：９６ウェルプレートをｏ／ｎでＡＡＶでコートし、つぎの日に洗浄し、ブロックし、次いで希釈した血清試料（１：４０）をプレートに加え、インキュベートした；プレートを洗浄し、ロバ抗マウスＩｇＭ特異的ＨＲＰを加え、別のインキュベーションおよび洗浄の後、ＡＶに対するＩｇＭ抗体の存在を、ＴＭＢ基質を加え５７０ ｎｍのレファレンス波長により４５０ ｎｍの吸光度で測定することにより、検出した（最上部光学密度（ＯＤ）として提示されるシグナルの強度は、試料のＩｇＭ抗体の量と、直接比例する）。
【０２４１】
図１５において示されているように、ＡＡＶによって併用投与したＳＶＰ［Ｒａｐａ］は、特にプライムの後、ＡＡＶＩｇＭの初期の誘発を抑制し、その出現を遅延させた。しかしながら、これは、ブースト（矢印によって指し示す）の後、特に３７日目のそれらの最初の後、より目立たず、４２〜５５日の間にＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群において、ＩｇＭ上昇が結果として目立った。同時に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］および全身への抗ＢＡＦＦで処置した群におけるＩｇＭ産生は、ＩｇＭ応答のさらにより強いおよび統計学的により著しい抑制を示し、それは最初の２つの注入（０日および３７日）の後にＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群において、より低く、３番目のもの（１５５日）の後、それを統計学的に上回らなかった。
【０２４２】
例４：ＡＡＶ ＩｇＧブレークスルーのより低いレベルが、ラパマイシンを封入したナノキャリアと全身への抗ＢＡＦＦとの組み合わせによって誘導される
例３からと同じ血清試料は、使用しているヤギ抗マウスＩｇＧ特異的ＨＲＰを除いてＩｇＭと同じラインに沿って、ＥＬＩＳＡによって測定したＡＡＶ ＩｇＧに関しても、試験した。以前に示されたように、図１６は実験動物の大多数のＡＡＶ ＩｇＧの誘発抑制ＡＡＶによって共投与されたＳＶＰ［Ｒａｐａ］を示す。但し、それらのいくつかは、試験後半に、ＩｇＧの進展を始めた（この群の遅延ＩｇＭ速度論と相関する）。顕著に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］および抗ＢＡＦＦの組み合わせにより処置した群におけるＩｇＧブレークスルーは、存在せず、それは、ＩｇＭのより低いレベルおよびその産生におけるより著しい遅延にさえ、相関する。
【０２４３】
例５：ナノキャリアを封入したラパマイシンと全身への抗ＢＡＦＦとの組み合わせによるｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ誘導導入遺伝子発現の相乗的な長期増強
例３および４と同じ検討において、血清中のＳＥＡＰレベルは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ, ＭＡ, ＵＳＡ）からのアッセイキットを使用して、測定した。希釈緩衝液中で血清試料および陽性コントロールを希釈し、６５°Ｃで３０分間インキュベートし、次いで室温まで冷却し、９６ウェルフォーマットに塗布し、緩衝液を検定し（５分）、そして、次いで基質を加え（２０分）、そして、プレートを照度計（４７７ ｎｍ）で読み込んだ。
【０２４４】
図１７において示されているように、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置された群の導入遺伝子発現において、即時の増加があった。これらのうちで、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置された群の血清ＳＥＡＰ上昇は、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみの処置によって発生したレベルから、より高くおよび統計学的に異なっていた（各時点の相対的な発現レベルは、未処置の群のレベルに対して算出してグラフ内に示し、それは百（１００）のスコアに割り当てた）。さらに、あらゆるその後のＡＡＶ投与（３７および１５５日、図１７の矢印によって示す）で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとを組み合わせた群は、ＳＥＡＰ発現において更なるブーストを示し、それは、特に第２のブーストの後に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群にみられるものより、決して劣っておらず、大部分が、より高かった（以前記載のように、未処置のマウスにおいては、ブーストはなく；ポストからプレブースト発現レベルは、相対的な発現レベルより上の最上部ラインのすべてのポストブースト時点に関して示した）。これは、検討においてみられるＳＥＡＰ発現の安定したおよび最も高いレベルに、結果としてなった。検討の半年越えにわたる期間の多数の場合に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置した群のＳＥＡＰ発現が、１６日目の初期にみられたレベルを超え、その一方で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群、または無処置のままの群のどちらも超えなかったことに注意すべきである。まとめると、多数の時点で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置した群のＳＥＡＰ発現レベルは、ＡＡＶだけで処置した群より３倍以上高い。
【０２４５】
例６：ナノキャリア封入ラパマイシンと全身への抗ＢＡＦＦとの組み合わせによる、相乗的なＡＡＶ誘導導入遺伝子発現の増加と、ＡＡＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧ免疫応答の低下が、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］なしで、抗ＢＡＦＦ単独で使用した場合、見られない
【０２４６】
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの４つの群（各々６匹のマウス）は、いかなるナノキャリアも伴わない（２つの群）、または１５０μｇでのＳＶＰ［Ｒａｐａ］を伴う（２つの群）ＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧを、０、３２、および９８日目に、３回注入した（ｉ．ｖ．尾静脈）。両アームにおいて、１つの群は、いかなる追加の介入なし（すなわち、１つは完全に未処置であり、そして、１つはＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置された）のままとし、そして、他のものは、追加で、ＡＡＶ投与の日（０、３２、および９８日）に、全身への抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）で、処置した。
【０２４７】
指し示した時（５、１１、２１、２８、３８、４２、４９、６３、９１、１０８、１１２、１１８、１２５、１３９、および１５３日）に、マウスを採血し、血清を全血から分離し、上記のＡＡＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体（図１８Ｂ−１８Ｃ）と同様に、ＳＥＡＰレベル（図１８Ａ）の決定のために使用した。
【０２４８】
図１８Ａにおいて示されているように、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］単独が、一定の利益を導入遺伝子発現に提供する一方で、特に９８日目の第２のブーストの後、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置しる群のＳＥＡＰ活性の、きわめてより高く、統計学的に異なる増加が、あった（各時点の相対的な発現レベルは、未処置の群のレベルに対して算出して示し、１００のスコアに割り当て；ポストからプレブースト発現レベルは、相対的な発現レベルより下のすべてのポストブースト時点に関して示した）。これは、まとめると、未処置のマウスと比較して、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置した群のＳＥＡＰ発現の３．５〜４倍の上昇に、結果としてなった。重要なことに、特に第２のブースト（第３のＡＡＶ−ＳＥＡＰ投与）の後、導入遺伝子発現の統計的に有意な上昇は、抗ＢＡＦＦで単独で処置した群においてみられなかった。
【０２４９】
反対に、ＡＡＶＩｇＭ（およびＩｇＧブレークスルーがない）の最も低いレベルは、他の群と比較して、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置した群において、みられた。この群のＩｇＭ応答は、第１および第３のＡＡＶ投与の後で特に低く、多数の時点で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］（図１８Ｂ）のみで処置したものを含む他の全ての群から、統計学的に異なっていた。
【０２５０】
ＩｇＭレベルがまず最初にわずかに遅延し、抗ＢＡＦＦのみで処置した群において低下する一方で、それらはＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置した両群、特にＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置したものより、常により高かった（図１８Ｂ）。同様に、ＩｇＧ速度論は、マウスの大多数が２１日までに血清陽性となり、それらのすべてが、３８日までに変換したこの群において、ほんのわずかに遅延したのみであり（未処置のマウスは２１日までに完全に転換した）、その一方で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置した群のマウスは、９１日まで転換せず、そして、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置した群のマウスは、検討の期間に、ＩｇＧ陽性にならなかった（図１８Ｃ）。
【０２５１】
まとめると、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］単独が、ＡＡＶ誘導導入遺伝子発現およびＩｇＭ／ＩｇＧ抑制に関する利益を示し、そして、抗ＢＡＦＦ単独が、ＡＡＶ特異的ＩｇＭおよびＩｇＧの発生を遅延させる一定の能力を立証し、両方の処置の組み合わせが、特に反復ＡＡＶ投与の後で、ＡＡＶ特異的ＩｇＭ／ＩｇＧ抑制と同様にＳＥＡＰ発現を上昇させることにおいて、はるかに優れていた。
【０２５２】
例７：ナノキャリア封入ラパマイシンと全身への抗ＢＡＦＦとの組み合わせによるＡＡＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧ免疫応答の連続した抑制と結合したＡＡＶ誘導導入遺伝子発現の相乗的な増加は、複数回のＡＡＶ投与の後にみられる
【０２５３】
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの６つの群（各々６匹のマウス）は、単独で、または注入日のみに投与する追加の全身への抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）での処置を伴いまたは伴わずに、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］の種々の容量（５０または１５０μｇ）と組み合わせてＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧを、０、３２、９８、および１６０日目に、４回注入し（ｉ．ｖ．尾静脈）、次いで４つの処理の総量を等しくし、「低い」と定義し、または第１、第３、および第４のＡＡＶ投与、すなわち該検討の１４、１１２、および１７４日後の１４日にも与え、次いで７つの総量の処置を等しくし、「中間」と定義した。指し示された時（２８、３８、９１、１０８、１５３、１６７、１７２、１７９、１８６、および２１４日）にマウスを採血し、そして、血清を全血から分離し、上記のとおり、ＡＡＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体と同様に、ＳＥＡＰレベル（図１９Ａ−１９Ｂ）の決定のために使用された（図１９Ｃ−１９Ｆ）。
【０２５４】
顕著に、両方のＳＶＰ［Ｒａｐａ］用量で、抗ＢＡＦＦを投与することは、ＳＥＡＰ発現の有意に遅いブーストを提供し、それは、ほぼ３週間のポスト注入に関して相当な上昇を示す抗ＢＡＦＦと５０μｇのＳＶＰ［Ｒａｐａ］との組み合わせ（図１９Ａ）、および注入後８週間までの持続導入遺伝子上昇を提示する、１５０μｇのＳＶＰ［Ｒａｐａ］との同じ組み合わせ（図１９Ｂ）を伴う、１６０日での最後のＡＡＶ注入の後、よく明示され、それは、両方の場合に、単独使用のＳＶＰ［Ｒａｐａ］によって達成された利益から、より明確に、そして、統計学的に異なっていた（各時点の相対的な発現レベルは、未処置の群のレベルに対して算出して示し、１００のスコアに割り当て；ポストからプレブースト発現レベルは、相対的な発現レベルより下のすべてのポストブースト時点に関して示した）。あらゆるその後の注入で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］によって、そして、そうであるからより、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせによって処置した群は導入遺伝子活性の増加をしめし、その一方で、未処置のマウスはそうではなく（図１９Ａ中の点線によって記録した２８日の、それぞれの群に関するＳＥＡＰ活性レベルを参照）、そして、このように、まとめると、いくつかの時点で、いかなる追加の処置もないＡＡＶ−ＳＥＡＰにより４回注入した群と比較して、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦの蓄積効果は、７倍の近いかそれを超えた（図１９Ｂ）。
【０２５５】
ＡＡＶに対するＩｇＭとともに、検討の期間に著しく抑制され続けたＡＡＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧの両方は、１５０μｇのＳＶＰ［Ｒａｐａ］と中間の抗ＢＡＦＦとの組み合わせにより処置した群において、特によく抑制された（図１９Ｃおよび図１９Ｅ）。
【０２５６】
この群におけるＩｇＭ応答は、検討の２１４日までマウスの大多数においてベースラインにとどまり（図１９Ｅ）、他の全ての群から統計学的に異なっていた（最上部の＞０．１のＯＤが、図１９Ｃおよび図１９Ｄ中において示されるとおりに定義された、それぞれの群におけるＩｇＭとＩｇＧのブレークスルーの数）。抗ＢＡＦＦと組み合わせて１５０μｇのＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置した両群は、検討の最後まで、ＩｇＧブレークスルーを示さなかった（図１９Ｄおよび図１９Ｆ）。
【０２５７】
例８：抗ＢＡＦＦを伴うかまたは伴わないＳＶＰ［Ｒａｐａ］を投与したマウスにおける初期のおよび後期のＩｇＭレベルは、ＡＡＶ誘導導入遺伝子の長期の発現に逆相関する
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの５つの群（各々６匹のマウス）は、全身への抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）の追加の処置を伴うか伴わずに、ＶＰ［Ｒａｐａ］の種々の用量（５０または１５０μｇ）と組み合わせて、ＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧで、Ｓ０、３２、９８および１６０日目に４回、注入した（ｉ．ｖ．尾静脈）。図２０において示されているように、わずかなマウスが、それまでに血清変換したにもかかわらず、これらのマウスの全ては、ＡＡＶＩｇＭを形成することにおいて遅延を立証し、それは、１１日で著しく抑制された（ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で非処置のマウスは、５日までに、一様にＩｇＭ陽性である、より以前の例を参照）。１１日に、ＩｇＭ値を、３２、９８、および１６０日に投与した各３つのその後のＡＡＶブーストのそれぞれの前に、そして、その後に決定した血清ＳＥＡＰレベルに対してプロットした場合に、これらのデータセットの全ては、統計的に有意な逆相関を示し、それは時間とともに強くなり（３８日目のｐ＝０．０４３から１７９日目のｐ＝０．０００１まで、図２０Ａを参照）それゆえ、初期のＩｇＭ応答が、ＡＡＶ伝達およびその後の長期の導入遺伝子発現を決定することができることを示した。
【０２５８】
同様に、（第４のＡＡＶ接種＝第３のブーストの前一週）中で、抗ＢＡＦＦが伴うかまたは伴わない１５０μｇでのＳＶＰ［Ｒａｐａ］により処置したマウスに見られた１５３日目のＩｇＭレベルを、ポストブーストＳＥＡＰ上昇に対してプロットし（ポストからプレブーストの発現レベルの比として）、同様に強い逆相関が、見られた（図２０Ｂ）。
【０２５９】
まとめると、これは、ＡＡＶに対する初期および長期のＩｇＭ応答が、特に反復ＡＡＶ後に、ＡＡＶ誘導導入遺伝子発現レベルを決定することができ、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせによって達成される抗原特異的ＩｇＭ抑制が、有益であることができ、ｉｎ ｖｉｖｏで長期のおよび安定な導入遺伝子発現に結果としてなることができることを、示す。
【０２６０】
例９：ＳＶＰ［Ｒａｐａ］の抗ＢＡＦＦによる組み合わせは、未処置のおよびＡＡＶを注射したマウスにおいて、一般的なおよび具体的な脾臓Ｂ細胞集団を低下させ抑制する
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの７つの群（各々９匹のマウス、それぞれの時点当たり３匹のマウス）に、ＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧによって注入したか（ｉ．ｖ．尾静脈）（４つの群）、またはウイルス未処置のままにした（３つの群）。前者のうち、１つの群は、さらに処置せず、１つは、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］の１５０μｇによって同時注入し、１つは、追加で抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）によって処置し、そして、最後の１つは、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と全身への抗ＢＡＦＦとの組み合わせで処置した。同様に、ＡＡＶによって注入しなかった３つの群は、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］の１５０μｇ、抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）、およびそれらの組み合わせによって処置した。注入をしなかったマウスは、ベースラインコントロール（０日目）として役立った。
【０２６１】
指し示した時（注入後１,４、および７日）マウスを処理し、そして、脾臓をとりだし、単一細胞浮遊液にメッシュし、次いでＢ細胞表面マーカーＣＤ１９、ＣＤ１３８、およびＣＤ１２７に対する抗体で染色した。図２１Ａおよび図２１Ｂにグラフに示されるように、未処置であるかまたはＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置したＡＡＶ注入マウス）では、Ｂ細胞起源（ＣＤ１９＋として定義される）の脾細胞の総数において、いかなる低下も経験できなかった。
【０２６２】
同様に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置したウイルス未処置のマウスは、ＣＤ１９＋細胞の数の軽微な低下のみを示した。反対に、抗ＢＡＦＦで処置した（ＡＡＶ注入したかウイルス未処置の）マウスは、ＣＤ１９＋脾細胞の著しいおよび時間依存的な低下を示し（少なくとも２倍の）、それは、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］も使用した場合、さらに著しかった（３〜４倍の）。
この効果は、（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）と（ＣＤ１９＋ＣＤ１３８＋として定義された）形質芽細胞、抗体分泌長寿命血漿の直接前駆体の分画を評価した場合、さらに目立った。この場合、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］処置は、抗ＢＡＦＦ処置のように、時間依存的脾臓形質芽細胞低下につながった（２〜３倍の；未処置のＡＡＶ注射マウスの変化は、実質的になかった）。
【０２６３】
しかしながら、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせ処置の蓄積効果は、形質芽細胞分画の７倍以上の低下より強い結果となり、この組み合わせが、Ｂ細胞株の抗体産生細胞に対して、特異的に作用することができることを示した。
【０２６４】
これは、グラフ図２１Ｅおよび図２１Ｆに示されるように、プレ／プロＢ細胞分画（すなわち、ＣＤ１９＋ＣＤ１２７＋として定義された未成熟Ｂ細胞の即時前駆体）の相対的な増加に相互に反映された。この場合には、未処置のおよびＳＶＰ［Ｒａｐａ］処置ＡＡＶ注入マウスは、プレ／プロＢ細胞変遷の変化を示さず、そして、ウイルス未処置のマウスへのＳＶＰ［Ｒａｐａ］の効果は、２倍未満であり、７日目のみに、見られた。抗ＢＡＦＦは、より強い効果を呈し、それは、ウイルス未処置のおよびＡＡＶ注入マウスの両方にみられ、前者において、顕著に、より著しくなかった。顕著に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせ処置は、相乗効果を、再び呈し（ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦによる単一処置の、算術和より高い）、ＡＡＶ注入マウスにおいて、未成熟Ｂ細胞前駆体の分画を、ほぼ４倍に上昇させ、ウイルス未処置のものにおけるより高くさえあった。まとめると、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と抗ＢＡＦＦとの組み合わせ処置が、ウイルス未処置マウスの、そして、さらに重要なことに、ＡＡＶ感染の場合さえ、その両方において、Ｂ細胞成熟の特異的および初期のブロックにつながり、それは、この組み合わせ処置によって達成されたウイルス特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ産生の著しい抑制と、相関したように、見えた。
【０２６５】
例１０：ナノキャリア封入ラパマイシンとＢｒｕｔｏｎチロシンキナーゼ阻害剤ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブ）の全身投与との組み合わせによるＡＡＶに対するｉｎ ｖｉｖｏ ＩｇＭ免疫応答の相乗的低下
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの５つの群（各々６匹のマウス）は、いかなるナノキャリアも伴わない（１つの群）、または１００μｇでのＳＶＰ［Ｒａｐａ］を伴う（４つの群）ＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧを、０および９３日目に、２回注入した（ｉ．ｖ．尾静脈）。後者のうち、３つの群は、ＡＡＶ−ＳＥＡＰおよびＳＶＰ［Ｒａｐａ］注入（−２〜１４日および９１〜１０７日）の２日前に開始し、以下の用量：２０、１００、または５００μｇ／マウスで、毎日１７日間連続の全身へのイブルチニブ（ｉ．ｐ．２００μＬ）により処置した。
【０２６６】
指し示された時（６、９、１４、２１、２８、４９、６３、９１、９７、１００、１０４、および１１１日）に、マウスを採血し、血清を全血から分離し、分析まで−２０±５°Ｃで保存した。次いで、ＡＡＶに対するＩｇＭ抗体をＥＬＩＳＡで測定した：９６ウェルプレートをｏ／ｎでＡＡＶでコートし、つぎの日に洗浄し、ブロックし、次いで希釈した血清試料（１：４０）をプレートに加え、インキュベートした；プレートを洗浄し、ロバ抗マウスＩｇＭ特異的ＨＲＰを加え、別のインキュベーションおよび洗浄の後、ＡＶに対するＩｇＭ抗体の存在を、ＴＭＢ基質を加え５７０ ｎｍのレファレンス波長により４５０ ｎｍの吸光度で測定することにより、検出した（最上部光学密度（ＯＤ）として提示されるシグナルの強度は、試料のＩｇＭ抗体の量と、直接比例する）。
【０２６７】
図２２において示されているように、ＡＡＶによって共投与したＳＶＰ［Ｒａｐａ］は、ＡＡＶＩｇＭの初期の誘発を抑制し、その出現を遅延させた（図２２Ａ）。しかしながら、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群において、ＩｇＭは、一般に検出可能で、また９３日での反復ＡＡＶ注入の後、一定のブーストが立証された（図２２Ａの矢印によって示される）。
【０２６８】
同時に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と全身へのイブルチニブで共処置したすべての群は、初期のＩｇＭ応答のさらにより強いおよび統計学的により著しい抑制を、示し、それは、５００μｇの高いイブルチニブ用量で、１４日まで、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群から統計学的に異なっていた（図２２Ｂ−２２Ｄ）。さらにその上、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と全身へのイブルチニブとの組み合わせで処置した群の全ては、９３日の反復ＡＡＶ注入のすぐ後、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群と比較して、統計学的により低いＩｇＭレベルを示した（図２２Ｅ−２２Ｆ）。
【０２６９】
例１１：初期のＡＡＶＩｇＭと逆相関するナノキャリア封入ラパマイシンと全身へのイブルチニブとの組み合わせによってｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ誘導導入遺伝子発現の相乗的ポストブースト増強
例１０と同じ検討において、血清中のＳＥＡＰレベルは、上記のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ, ＭＡ, ＵＳＡ）からのアッセイキットを使用して、測定した：希釈緩衝液中で試料を希釈し、６５°Ｃで３０分間インキュベートし、次いで室温まで冷却し、９６ウェルフォーマットに塗布し、緩衝液を検定し（５分）、そして、次いで基質を加え（２０分）、そして、プレートを照度計（４７７ ｎｍ）で読み込んだ。
【０２７０】
ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置されない群と比較して、これらの全ては、血清ＳＥＡＰの高次を示したが、イブルチニブ投与にかかわりなくＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置したすべての群間の最初のＳＥＡＰ発現レベルにおいて、目立つ違いはなかった（図２３Ａ中の１４日のデータを参照；他のいかなる処置もないＡＡＶ-ＳＥＡＰを受けたマススにおけるＳＥＡＰレベルは、すべての時点で、およびしたがって、算出した他の全ての群における相対的な発現で、「１００」の数を割り当てた）。後の時点（９１日目、すなわち反復ＡＡＶ投与の２日前；図２３Ａ）で測定した場合、すべての試験群は、おおよそＳＥＡＰ発現と同じレベルを示した。
９３日目での反復ＡＡＶ−ＳＥＡＰ投与の直後に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置したすべての群は、導入遺伝子発現の上昇を示した（図２３Ａ）。
【０２７１】
ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置したマウスの群は、６３〜７５％の未処置のマウスを超えるＳＥＡＰレベルを有する一方で（図２３Ａ、９７〜１００日、すなわちブーストの４〜７日後）、その時、効果は、イブルチニブ用量に依存していなかったが、より高い上昇が、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］とフリーのイブルチニブとの組み合わせで処置したすべてのマウスにおいて、見られた（１００日での未処置のマウスと比較して２倍超）。これは、未処置のマウス対５倍の違い超える上昇したＳＥＡＰレベルを呈し続けるＳＶＰ［Ｒａｐａ］とイブルチニブとの組み合わせにより処理した群により１０４日（ＡＡＶブーストの１１日後）までに変化をはじめ（１００および５００μｇの最も高いイブルチニブ用量に関して）、そして、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置したマウスにおけるそれより、２倍より高かったまでの変化およびに、スタートさせた（図２３Ａ）。２０μｇのイブルチニブを使用した群と比較して、イブルチニブの１００〜５００μｇを組み合わせたＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置したマウスにおいてみられた高い発現レベルが１０４日から始まったとみられる例において、用量依存が、あるように思えた。顕著に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］処置マウスのＡＡＶＩｇＭの初期（プライム後６日）のレベルは、ポストブースト血清ＳＥＡＰレベルと逆相関し（図２３Ｂ）、初期のＩｇＭ抑制（イブルチニブと組み合わせたＳＶＰ［Ｒａｐａ］により処置したマウスにおいてより著しい）が、ＡＡＶに対する免疫記憶のより低いレベルに、その結果、反復ＡＡＶ投与後のより低い既往応答に、およびブースト後のより多く維持されたおよび上昇した導入遺伝子発現に、結果としてなることができることを示唆した。
【０２７２】
例１２：ナノキャリア封入ラパマイシンと全身へのイブルチニブとの組み合わせによるＡＡＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧ免疫応答の相乗的な低下が、単独で使用したラパマイシンまたはイブルチニブによって達成したそれより、強い
【０２７３】
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの４つの群（各々８〜１０匹のマウス）は、いかなるナノキャリアも伴わない（２つの群）、または１００μｇでのＳＶＰ［Ｒａｐａ］を伴う（２つの群）ＡＡＶ８−ＳＥＡＰの１×１０１０ＶＧを、０、５１、および１０５日目に、３回注入した（ｉ．ｖ．尾静脈）。群の両方の対において、１つの群は、ＡＡＶ８の注入ごとに１４日後に終わる前に、２日に開始して、毎日１７日間の全身へのイブルチニブ（ｉ．ｐ．５００μｇ）により、追加で処置した（実験のタイムラインの０日としてみなされるＡＡＶ−ＳＥＡＰ注入日による−２〜１４日、４９〜６５日、および日１０３〜１１９）。
【０２７４】
指し示された時（６、９、１５、２２、２９、３６、４３、４９、５８、６５、７２、および７９日）に、マウスを採血し、血清を全血から分離し、分析まで−２０±５°Ｃで保存した。次いで、ＡＡＶに対するＩｇＭ抗体をＥＬＩＳＡで測定した：９６ウェルプレートをｏ／ｎでＡＡＶでコートし、つぎの日に洗浄し、ブロックし、次いで希釈した血清試料（１：４０）をプレートに加え、インキュベートした；プレートを洗浄し、ロバ抗マウスＩｇＭ特異的ＨＲＰを加え、別のインキュベーションおよび洗浄の後、ＡＶに対するＩｇＭ抗体の存在を、ＴＭＢ基質を加え５７０ ｎｍのレファレンス波長により４５０ ｎｍの吸光度で測定することにより、検出した（最上部光学密度（ＯＤ）として提示されるシグナルの強度は、試料のＩｇＭ抗体の量と、直接比例する）。
【０２７５】
図２４において示されているように、ＡＡＶによって共投与したＳＶＰ［Ｒａｐａ］は、特にプライムの後、ＡＡＶＩｇＭの初期の誘発を抑制し、その出現を遅延させた（図２４Ａ、グラフ２）。しかしながら、これは、５１日のブースト（矢印によって指し示した）の後により目立たなく、５８〜７９日間隔の間に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群における、目立つＩｇＭ上昇に結果としてなった。同時に、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と全身へのイブルチニブで処置した群（図２４Ａ、群３）のＩｇＭ産生は、ＩｇＭ応答のさらにより強いおよび統計学的により著しい抑制を示し、それは、最初の２つの注入（０日および５１日）の後、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群において、より低かった。重要なことに、全身へのイブルチニブ単独（図２４Ａ、群４）は、未処置の群１（図２４Ａ）と同じその誘発の変遷を示すＩｇＭ抑制において、完全に非効率的だった。
【０２７６】
これは、２２日までに転換したすべての動物（８／８および１０／１０）に伴う本質的に類似のおよび強固な応答を産生する未処置およびイブルチニブのみで処置したマウス（群１および４に対応して）によるＩｇＧ変遷（図２４Ｂ）にも、同様に翻訳されることができ、その一方で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］処置したマウス（群２）は、２２日までに変換した動物の２／１０およびブースト（ｄ４９）の前に検出可能なＩｇＧレベルを示すわずか４／１０の動物による遅延したおよび抑制されたＩｇＧ速度を提示した。この抑制は、７９日（ポストブースト２８日）までのＡＡＶ ＩｇＧ陽性になった５／１０の動物のみによる５１日のブーストの後、持続した。依然として、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と全身へのイブルチニブとの組み合わせは、７９日での１／９のポストブースト変換のみの直前の変換なしに（０／９）、単独使用のＳＶＰ［Ｒａｐａ］より、優れていた（そして、統計学的に７９日までのそれと異なっていた）。
【０２７７】
例１３：ナノキャリア封入ラパマイシンと全身へのイブルチニブとの組み合わせによる反復ＡＡＶ免疫処置の後の導入遺伝子発現の上昇は、それが単独で使用したラパマイシンとイブルチニブによって達成したそれより高い
【０２７８】
例１２と同じ検討において、血清中のＳＥＡＰレベルは、上記のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのアッセイキットを使用して、測定した：図２５において示されているように、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］で処置された群の導入遺伝子発現において、小さいとはいえ即時の増加があった。これらのうちで、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］とイブルチニブとの組み合わせで処置した群の血清ＳＥＡＰ上昇は、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみの処置によって発生したレベルから、統計学的に異なっていなかったが、より高く（各時点の相対的な発現レベルは、未処置の群のレベルに対して算出してグラフ内に示し、それは百（１００）のスコアに割り当てた）、一方で、単独で使用したイブルチニブは、対無処置マウスで効果を示さなかった。さらに、あらゆるその後のＡＡＶ投与（５１および１０５日、矢印によって示した）で、群はＳＶＰ［Ｒａｐａ］とイブルチニブとを組み合わせて投与した群は、ＳＥＡＰ発現において、最も高いブーストを示し、それは、特に最初のブーストの後、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］のみで処置した群に対して、決して劣っておらず、ほとんどが高かった（ポストからプレブースト発現レベルは、相対的な発現レベルの下の最下端のすべての時点に関して示された）。
【０２７９】
示されているように、イブルチニブで処置した群と同様に、未処置のマウスのブーストは、なかった。これは、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］と全身へのイブルチニブとの組み合わせにより処置した群３において呈される検討においてみられる、ＳＥＡＰ発現の安定な最も高いレベルに結果としてなった。まとめると、多数の時点で、ＳＶＰ［Ｒａｐａ］とイブルチニブとの組み合わせで処置したＡＡＶ注入群におけるＳＥＡＰ発現レベルが、は、ＡＡＶのみによって、または、ＡＡＶ＋イブルチニブによって処置した群においてより、２倍高かった。
【０２８０】
例１４：ナノキャリア封入ラパマイシンおよびリツキシマブによるＡＡＶ免疫化（プロフェティック）
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの３つの群は、いかなるナノキャリアも伴わない（１つの群）、または１５０μｇでのＳＶＰ［Ｒａｐａ］を伴う（２つの群）ＡＡＶ８−ＳＥＡＰを、０、３７、および１５５日目に、３回注入する（ｉ．ｖ．尾静脈）。後者２つのうち、１つの群は、０、１５、３７、１５５、および１６９日目に、すなわちプライムおよび第２のブーストの１４日後の、それぞれのＡＡＶ注入で、リツキシマブにより、追加の処置をする。
【０２８１】
指し示された時（５、９、１２、１６、２１、４２、４７、５１、５５、１６２,１６７,１７４、１９５、および２１０日）に、マウスから採血し、血清を全血から分離し、分析まで−２０±５°Ｃで保存する。次いで、Ａｄに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡで測定する。血清のＳＥＡＰレベルは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのアッセイキットを使用して、測定する。
【０２８２】
例１５：ＧＳＫ１０５９６１５と抗ＢＡＦＦ抗体とを含む合成ナノキャリアによるＡＡＶ免疫化（プロフェティック）
Ｃ５７ＢＬ／６の雌のマウスの３つの群は、いかなるナノキャリアも伴わない（１つの群）、またはＧＳＫ１０５９６１５を含む合成ナノキャリアを伴う（２つの群）ＡＡＶ８−ＳＥＡＰを、０、３７、および１５５日目に、３回注入する（ｉ．ｖ．尾静脈）。後者２つのうち、１つの群は、０、１５、３７、１５５、および１６９日目に、すなわちそれぞれのＡＡＶ注入で、およびプライムおよび第２のブーストの１４日後にも、全身抗ＢＡＦＦ（ｉ．ｐ．１００μｇ）により、追加の処置をする。
【０２８３】
指し示された時（５、９、１２、１６、２１、４２、４７、５１、５５、１６２,１６７,１７４、１９５、および２１０日）に、マウスから採血し、血清を全血から分離し、分析まで−２０±５°Ｃで保存する。次いで、Ａｄに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡで測定する。血清のＳＥＡＰレベルは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのアッセイキットを使用して、測定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ−６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ−１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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