(57)【要約】  廃水処理における膜生物汚損を低減および／または防止するためのアルギン酸カルシウムのごとき架橋された高分子マトリックス材料内に保持されたクオラムクエンチング（ＱＱ）バクテリアを含む複合材料が本明細書に開示される。前記複合材料は、さらに、活性炭のごとき生物学的適合性吸収材料、およびポリスルホンのごときさらなる高分子材料の表面コーティングを含み得る。本明細書に開示された複合材料は、特にメンブレン・バイオリアクタでの使用に適することもでき、特定のＱＱバクテリアコンソーシアムは、好気性メンブレン・バイオリアクタに適し、他のものは、嫌気性メンブレン・バイオリアクタに適する。
2020500698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜生物汚損を低減および／または防止する嫌気性メンブレン・バイオリアクタに用いる複合材料であって、
バクテリア増殖と適合性の架橋された高分子マトリックス材料；および
バクテリア集団
を含み、
前記バクテリア集団は高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合され、前記バクテリア集団はミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になり；および
均一に混合された前記バクテリア集団および前記高分子マトリックス材料は、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料でコートされる前記複合材料。
【請求項２】
前記複合材料が、高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合される生物学的適合性吸着材料をさらに含む請求項１記載の複合材料。
【請求項３】
膜生物汚損を低減および／または防止する好気性メンブレン・バイオリアクタに用いる複合材料であって、
バクテリア増殖と適合性の架橋された高分子マトリックス材料；
バクテリア集団；および
生物学的適合性吸着材料
を含み、
前記バクテリア集団および前記吸着材料は、高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合され、前記バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４から選択される１以上のバクテリア種から実質的になる前記複合材料。
【請求項４】
前記バクテリア集団がさらに大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳを含む請求項３記載の複合材料。
【請求項５】
均一に混合された前記バクテリア集団および前記高分子マトリックス材料が、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料でコートされた請求項３または４記載の複合材料。
【請求項６】
前記生物学的適合性吸着材料が、活性炭、イオン交換樹脂、キトサン、ゼオライトおよびリグニンよりなる群の１以上から選択される請求項２〜５のいずれか１記載の複合材料。
【請求項７】
前記生物学的適合性吸着材料が活性炭である請求項６記載の複合材料。
【請求項８】
前記架橋された高分子マトリックス材料が、二価（２＋）または三価（３＋）の金属イオンによって架橋されたポリアニオン性ポリマーである請求項１〜７のいずれか１記載の複合材料。
【請求項９】
前記ポリアニオン性ポリマーが、アルギン酸塩またはポリアニオン性セルロースであり、および／または架橋される金属イオンが、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋よりなる群から選択される二価の金属イオンである請求項８記載の複合材料。
【請求項１０】
前記架橋された高分子マトリックス材料が、アルギン酸カルシウムである請求項９記載の複合材料。
【請求項１１】
前記バクテリア集団（乾燥重量）−対−前記架橋された高分子マトリックス材料の比が、１：５００〜１：２，０００ｗ／ｗ、例えば、１：７５０〜１：１，５００ｗ／ｗ、例えば、約１：１，０００ｗ／ｗである請求項１〜１０のいずれか１記載の複合材料。
【請求項１２】
前記バクテリア集団（乾燥重量）−対−生物学的適合性吸着材料の比が、１：３００〜１：８００ｗ／ｗ、例えば、１：４００〜１：６００ｗ／ｗ、例えば、約１：５００ｗ／ｗである請求項１〜１１のいずれか１記載の複合材料。
【請求項１３】
２〜３ｍｍの直径を持つ球状ビーズとして提供される請求項１〜１２のいずれか１記載の複合材料。
【請求項１４】
４０，０００〜１００，０００Ｐａ、例えば、４５，０００〜７０，０００Ｐａ、例えば、４８，０００〜１００，０００Ｐａ、例えば、４８，０００〜７０，０００Ｐａのヤング率値を有する請求項３〜４および請求項３または４に従属する請求項６〜１３のいずれか１記載の複合材料。
【請求項１５】
コーティング材料でコートされる場合、コートされた複合材料が、２００，０００〜４００，０００Ｐａ、例えば、２５０，０００〜３５０，０００Ｐａ、例えば、３００，０００〜３１０，０００のヤング率値を有する請求項１〜１４のいずれか１記載の複合材料。
【請求項１６】
廃水を処理するための好気性メンブレン・バイオリアクタの使用方法であって、
（ａ）請求項３〜５のいずれかに従属する請求項３〜１５のいずれか１記載の複合材料から作製されたビーズの０．５〜１０％ｖ／ｖをメンブレン・バイオリアクタに添加する工程；および
（ｂ）引き続いて、好気性条件下の前記メンブレン・バイオリアクタで廃水を処理する工程
を含むことを特徴とする前記使用方法。
【請求項１７】
廃水を処理するための嫌気性メンブレン・バイオリアクタの使用方法であって、
（ａ）請求項１もしくは２または請求項１もしくは２に従属する請求項６〜１５のいずれか１記載の複合材料から作製されたビーズの０．５〜１０％ｖ／ｖをメンブレン・バイオリアクタに添加する工程；および
（ｂ）引き続いて、嫌気性条件下の前記メンブレン・バイオリアクタで廃水を処理する工程
を含むことを特徴とする前記使用方法。
【請求項１８】
前記ビーズが１％〜５％ｖ／ｖの量にて提供されることを特徴とする請求項１６または１７記載の使用方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）の一部として逆洗工程をさらに含むことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれかの１記載の使用方法。
【請求項２０】
請求項３〜５のいずれかに従属する請求項３〜１５のいずれか１記載の複合材料の製造方法であって、
（ｉ）溶媒中のバクテリア集団、未架橋の高分子材料および生物学的適合性吸着材料を含む第１の混合物を提供する工程；
（ｉｉ）溶媒中の未架橋の高分子材料のための架橋剤を含む第２の混合物に第１の混合物を添加して、複合材料を形成する工程
を含み、
前記バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４から選択される１以上のバクテリア種から実質的になることを特徴とする前記製造方法。
【請求項２１】
前記バクテリア集団はさらに大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳを含むことを特徴とする請求項２０記載の製造方法。
【請求項２２】
ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料で請求項２０における工程（ｉｉ）の複合材料をコートする工程をさらに含むことを特徴とする請求項２０または２１記載の製造方法。
【請求項２３】
請求項１もしくは２または請求項１もしくは２に従属する請求項６〜１５のいずれか１記載の複合材料の製造方法であって、
（ｉ）溶媒中のバクテリア集団、未架橋の高分子材料および所望による生物学的適合性吸着材料を含む第１の混合物を提供する工程；
（ｉｉ）溶媒中の未架橋の高分子材料のための架橋剤を含む第２の混合物に第１の混合物を添加して、複合材料を形成する工程；および
（ｉｉｉ）ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料で工程（ｉｉ）の生成物をコートする工程
を含み、
前記バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になることを特徴とする前記製造方法。
【請求項２４】
前記生物学的適合性吸着材料が、存在する場合、活性炭、キトサン、ゼオライトおよびリグニンよりなる群の１以上から選択されることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか１記載の製造方法。
【請求項２５】
前記生物学的適合性吸着材料が活性炭であることを特徴とする請求項２４記載の製造方法。
【請求項２６】
前記未架橋の高分子材料がポリアニオン性ポリマー塩であり、塩の対イオンが一価（１＋）金属イオンであることを特徴とする請求項２０〜２５のいずれか１記載の製造方法。
【請求項２７】
前記ポリアニオン性ポリマーがアルギン酸塩またはポリアニオン性セルロースであり、および／または一価金属イオンがＮａ＋およびＫ＋からなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の製造方法。
【請求項２８】
未架橋の高分子マトリックス材料が、アルギン酸カリウムまたはアルギン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項２７記載の製造方法。
【請求項２９】
前記架橋剤が、二価（２＋）または三価（３＋）の金属イオン塩であることを特徴とする請求項２０〜２８のいずれか１記載の製造方法。
【請求項３０】
前記金属イオンが、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋よりなる群から選択される二価（２＋）金属イオンであることを特徴とする請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】
前記第１の混合物の前記第２の混合物への添加が、滴下添加であることを特徴とする請求項２０〜３０のいずれか１記載の製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜生物汚損（biofouling）を低減および／または防止するためにメンブレン・バイオリアクタ（膜型バイオリアクタ；membrane bioreactor）において用いる複合材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中の先行されるような文書のリストまたは言及は、その文書が当該技術分野の技術水準の一部であるか、または共通の一般知識であるという認容として必ずしも取られるべきではない。
【０００３】
生物学的分解および膜濾過の組合せであるメンブレン・バイオリアクタ（ＭＢＲ）は、高度廃水処理技術として広く認められ、廃水再生利用および再利用における高まる人気を世界的に獲得している［J. Membr. Sci. 284 (2006) 17-53］。従来の活性汚泥法に比較して、ＭＢＲは、高い処理効率、低い汚泥生成、小さなフットプリント(footprint)およびより良好な流出液水質（effluent quality）を含む特有の有利さを有する［Desalination. 306 (2012) 35-40］。しかしながら、膜汚損（または生物汚損）は、著しく流れを減退し、その結果、運転および維持の費用を増加させるという主要な挑戦を残している。かくして、膜汚損は、依然として、汚損制御に関連した高いエネルギー需要および運転費のため、ＭＢＲ市場の成長を妨げる障害である。
【０００４】
嫌気性メンブレン・バイオリアクタ（ＡｎＭＢＲ）における低強度の都市廃水の嫌気性処理は、中立またはポジティブさえのエネルギーバランス、低固体生成、および通常の好気的処理よるより小さなフットプリントにより、近年増加する注目を浴びている。しかしながら、好気性ＭＢＲと同様に、膜生物汚損はＡｎＭＢＲの広範囲の適用への最も大きな障害を残している。膜生物汚損は、濾過流を低下させ、運転費用を増加させ；バイオガスを撒き、最も広く用いる生物汚損制御方法は、廃水処理プラントの総運転費用の６０％も掛かりかねなかった。したがって、新規な抗汚損膜および汚損制御技術の開発は、膜技術に対する研究の焦点である。
【０００５】
膜生物汚損は、膜間差圧（ＴＭＰ）プロフィールにおける３つの主要ステージ：
１.細孔閉塞による初期上昇（ステージ１）；
２.膜表面上の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の蓄積による緩慢な上昇；および
３．バイオフィルム形成に起因した急激なジャンプ（ステージ３）
により特徴付けることができる。
【０００６】
流体力学的パラメーターにおける変動値（通気速度および空気拡散器位置（air diffuser position）、緩和／濾過モードおよび逆洗）、凝固／凝集による材料前処理、化学的（酸、塩基および酸化剤）洗浄、およびポリマーまたは粉末活性炭（ＰＡＣ）の添加のごとき種々の手段を好気性系における膜生物汚損を引き起こす要因を同定および根絶する試みに用いてきた。しかしながら、これらのすべてのアプローチは、膜表面上でバイオフィルム形成の課題−膜の非常に重要な流れにおける急激な減少に導く自然プロセスに取り組まないため、膜生物汚損の軽減に制限を有している。
【０００７】
過去数年間、生物学的アプローチ−バクテリアクオラムクエンチング（ＱＱ、quorum quenching）を採用して、バクテリア中の細胞−細胞コミュニケーションを低下させ、それにより、膜上のバイオフィルム発生を遅延させてきた。ＱＱは、液体培養[J. Microbiol. Biotechnol. 24 (2014) 97-105]、またはアルギン酸塩ビーズ中で固定化した[J. Membr. Sci. 411-412 (2012) 130-136]のいずれにおいてもＭＢＲにＱＱ酵素生成バクテリアを導入する。異なるアプローチのうち、アルギン酸塩またはポリマーコートしたアルギン酸塩ビーズに固定化したＱＱバクテリアの添加は汚損制御に最も有効であることが示されている。
【０００８】
Ｎ−アシル−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）は、グラム陰性菌中の同一種内の相互作用を媒介し、一方、自己誘導物質−２（ＡＩ−２）はグラム陰性およびグラム陽性菌の双方を横切って種間の相互作用を媒介し、双方はＥＰＳの生成に寄与し、バイオフィルム増殖を刺激する。前記に注目のごとく、最も広範囲に研究された好気性系のＱＱベースの生物汚損制御技術は、アルギン酸塩ビーズ中にこれらのバクテリアを固定化することによりＡＨＬをクエンチするバクテリア株の富化を含む。ＱＱ包埋したアルギン酸塩ビーズがＭＢＲに加えられる場合、ＱＱ株はＡＨＬのレベルを涸渇させ、かくして、膜上のバイオフィルム（ケーキ層）増殖を妨害する。また、刺激の連続的補足を介する内因性ＱＱ株のバイオ刺激は、好気性ＭＢＲにおける生物汚損制御に効力を有する[Biotechnol. Bioeng. 113 (2016) 2624-2632]。また、最近、アルギン酸塩ビーズに包埋した真菌株を利用する好気性系のための第１の自己誘導物質−２（ＡＩ−２標的化）ＱＱ技術は、好気性ＭＢＲにおける汚損制御についてのその潜在性を示した[Environ. Sci. Technol. 50 (2016) 10914-10922]。
【０００９】
好気性系についての初期のアプローチにおいて、ＱＱバクテリアはアルギン酸カルシウムビーズ中に固定化した。さらに、最近、これらのアルギン酸カルシウムビーズは、それらの安定性を改善するためにポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンのごときポリマーでコートされた。
【００１０】
さらに、嫌気性メンブレン・バイオリアクタ中のＱＱベースの生物汚損制御は検討されていない。メタン生成菌中で特徴付けられたＡＨＬ媒介クオラムセンシング（ＱＳ）だけが、メタノサエタ ハルンディナセア（Methanosaeta harundinacea）中のＡＨＬが従前に記載された好気性ＡＨＬと構造的および機能的に異なることを示している[ISME J. 6 (2012) 1336-1344]。
【００１１】
したがって、厳しい環境条件に対して安定し、好気性および嫌気性系についての大規模生成に実現可能である新しいバクテリア固定方法の緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、前記に遭遇し記載された多数の課題を解決する複合材料を驚くべきことに提供する。驚くべきことには、嫌気性メンブレン・バイオリアクタにおいて用いるのに適する複合材料を得ることができることが判明した。かくして、本発明の第１の態様において、膜生物汚損を低減および／または防止する、嫌気性メンブレン・バイオリアクタに用いる複合材料が提供され：前記複合材料は、
バクテリア増殖（細菌増殖）と適合性の架橋された高分子マトリックス材料；および
バクテリア集団（微生物集団）
を含み、
バクテリア集団は高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合され、バクテリア集団はミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になり；および
均一に混合された前記バクテリア集団および前記高分子マトリックス材料は、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料でコートされる。
【００１３】
本発明の第１の態様の具体例において、複合材料は、高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合される生物学的適合性吸着材料を含み得る（例えば、生物学的適合性吸着材料は、活性炭、イオン交換樹脂、キトサン、ゼオライトおよびリグニンよりなる群の１以上から、例えば、活性炭が選択され得る）。
【００１４】
また、生物学的適合性吸着材料を含有する好気性系のための複合材料が、驚くベきことに、優れた特性を有することが判明した（適切な生物学的適合性吸着材料は、活性炭、イオン交換樹脂、キトサン、ゼオライトおよびリグニンよりなる群の１以上から、例えば、活性炭が選択され得る）。かくして、本発明の第２の態様において、膜生物汚損を低減および／または防止するメンブレン・バイオリアクタに用いる複合材料が提供され、複合材料は：
バクテリア増殖と適合性の架橋された高分子マトリックス材料；
バクテリア集団；および
生物学的適合性吸着材料を含み、
バクテリア集団および吸着材料は、高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合され、バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカ（Enterobacter cloaca）ＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４から選択される１以上のバクテリア種から実質的になる。
【００１５】
本発明の第２の態様のある種の具体例において：
（Ｉ）    バクテリア集団が大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳをさらに含むこともでき；
（ＩＩ）  均一に混合された前記バクテリア集団および前記高分子マトリックス材料が、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料でコートすることもでき；
（ＩＩＩ）  複合材料は、４０，０００〜１００，０００Ｐａ、例えば、４５，０００〜７０，０００Ｐａ、例えば、４８，０００〜１００，０００、例えば、４８，０００〜７０，０００のヤング率値を有し得る。
【００１６】
本発明の第１および第２の態様の具体例において：
（Ａ）架橋された高分子マトリックス材料は、二価（２＋）または三価（３＋）の金属イオンによって架橋されたポリアニオン性ポリマーであり得（例えば、ポリアニオン性ポリマーは、アルギン酸塩またはポリアニオン性セルロースであり得る、および／または架橋している金属イオンは、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋からなる群から選択される二価金属イオンであり得、例えば、架橋された高分子マトリックス材料は、アルギン酸カルシウムであり得る）；
（Ｂ）バクテリア集団（乾燥重量）−対−架橋された高分子マトリックス材料の比は、１：５００〜１：２，０００ｗ／ｗ、例えば、１：７５０〜１：１，５００ｗ／ｗ、例えば、約１：１，０００ｗ／ｗであり得；
（Ｃ）バクテリア集団（乾燥重量）−対−生物学的適合性吸着材料の比は、１：３００〜１：８００ｗ／ｗ、例えば、１：４００〜１：６００ｗ／ｗ、例えば、約１：５００ｗ／ｗであり得；
（Ｄ）複合材料は２〜３ｍｍの直径を持つ球状ビーズとして提供でき；
（Ｅ）複合材料がコーティング材料でコートされる場合、コートされた複合材料は、２００，０００〜４００，０００Ｐａ、例えば、２５０，０００〜３５０，０００Ｐａ、例えば、３００，０００〜３１０，０００のヤング率値を有し得る。
【００１７】
前記のごとく、本発明の第１の態様の材料は、嫌気性膜型リアクターの一部として特に有用である。したがって、本発明の第３の態様において、廃水を処理するための嫌気性メンブレン・バイオリアクタの使用方法が提供され、その方法は、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の複合材料およびその具体例のいずれかの技術的に知覚可能な組合せからの作製された０．５〜１０％ｖ／ｖのビーズをメンブレン・バイオリアクタに添加する工程；および
（ｂ）引き続いて、嫌気性条件下の前記メンブレン・バイオリアクタで廃水を処理する工程
を含む。
【００１８】
本発明の第２の態様の複合材料は、好気性メンブレン・バイオリアクタで用いるのに特に適し得る。したがって、本発明の第４の態様において、廃水を処理するための好気性メンブレン・バイオリアクタの使用方法が提供され、その方法は、
（ａ）本発明の第２の態様に記載の複合材料およびその具体例のいずれかの技術的に知覚可能な組合せから作製された０．５〜１０％ｖ／ｖのビーズをメンブレン・バイオリアクタに添加する工程；および
（ｂ）引き続いて、好気性条件下の前記メンブレン・バイオリアクタで廃水を処理する工程
を含む。
【００１９】
本発明の第３および第４の態様の具体例において、ビーズは、１％〜５％ｖ／ｖ量で提供できる、および／またはその方法は、工程（ｂ）の一部として逆洗工程を含み得る。
【００２０】
本発明の第５の態様において、本発明の第２の態様、およびその具体例のいずれの技術的に知覚可能な組合せによる複合材料の製造方法が提供され、その方法は、
（ｉ）溶媒中のバクテリア集団、未架橋の高分子材料および生物学的適合性吸着材料を含む第１の混合物を提供する工程；
（ｉｉ）溶媒中の未架橋の高分子材料のための架橋剤を含む第２の混合物に第１の混合物を添加して、複合材料を形成する工程
を含み、
バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４から選択される１以上のバクテリア種から実質的になる。
【００２１】
本発明の第５の態様の具体例において、バクテリア集団は、大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳをさらに含むこともでき、および／または方法は、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料で工程（ｉｉ）の複合材料をコートする工程をさらに含むこともできる。
【００２２】
本発明の第６の態様において、本発明の第１の態様、およびその具体例のいずれかの技術的に知覚可能な組合せによる複合材料の製造方法が提供され、その方法は、
（ｉ）溶媒中のバクテリア集団、未架橋の高分子材料、および所望による生物学的適合性吸着材料を含む第１の混合物を提供する工程；
（ｉｉ）溶媒中の未架橋の高分子材料ための架橋剤を含む第２の混合物に第１の混合物を添加して、複合材料を形成する工程；および
（ｉｉｉ）ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料で工程（ｉｉ）の生成物をコートする工程
を含み、
バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になる。
【００２３】
第５および第６の態様の具体例において：
（ａａ）生物学的適合性吸着材料は、存在する場合、活性炭、キトサン、ゼオライトおよびリグニンよりなる群の１以上から選択でき（例えば、生物学的適合性吸着材料は活性炭であり得る）；
（ｂｂ）未架橋の高分子材料は、塩が一価（１＋）金属イオンである場合、ポリアニオン性ポリマー塩であり得（例えば、ポリアニオン性ポリマーは、アルギン酸塩もしくはポリアニオン性セルロースであり得る、および／または一価金属イオンは、Ｎａ＋およびＫ＋からなる群から選択され得る、例えば、未架橋の高分子マトリックス材料は、アルギン酸カリウムまたはアルギン酸ナトリウムであり得る；
（ｃｃ）架橋剤は、二価（２＋）または三価（３＋）の金属イオン塩であり得（例えば、金属イオンは、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋よりなる群から選択される二価（２＋）金属イオンであり得）；
（ｄｄ）第１の混合物の第２の混合物への添加は、滴下添加であり得る。
【００２４】
本開示のある種の具体例は、添付図面を参照して十分に以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＭＢＲの膜間差圧（ＴＭＰ）傾向を示す。ＭＢＲのＴＭＰプロフィールは種々のビーズを補足した。「ＭＢＲ−Ｃ」−いずれのビーズも含まない対照ＭＢＲ。「ＭＢＲ−ＰＡＣＶ」−ＰＡＣアルギン酸塩ビーズを添加したＭＢＲ。「ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ」−ＡＰＱビーズを補足したＭＢＲ。
【図２】図２は、ＬＣ−ＭＳによって検出されたすべてのＭＢＲにおけるシグナル分子の残存レベルを示し、（Ａ）は汚泥中のアシル−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）濃度を示し、（Ｂ）はバイオケーキ中のＡＨＬ濃度を示し、また、（Ｃ）は汚泥中の自己誘導物質（ＡＩ−２）濃度を示す。
【図３】図３は、ＭＢＲが始められ（０ｄ）、完全に汚濁された（４日、８日または１９日）場合の測定された混合液中の可溶性微生物生成物（ＳＭＰ）を示し、（Ａ）は、疎水性および親水性の溶存有機炭素（ＤＯＣ）の濃度を示し、また、（Ｂ）は、ＭＢＲ中のタンパク質および多糖の分布を示す。
【図４】図４の上部グラフは、ゼータ電位（左軸）および導電率（右軸）のプロットを示し、下部のグラフは、（Ａ）ＭＢＲ−Ｃ、（Ｂ）ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよび（Ｃ）ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて、各々、過剰な細胞外高分子物質（ＥＰＳ；左軸）、結合ＥＰＳ（第１の右軸）およびタンパク質−対−炭水化物比（ＰＮ／Ｃ）（第２の右軸）を示す。
【図５】図５は、（Ａ）ＭＢＲ−Ｃ、（Ｂ）ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよび（Ｃ）ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて観察した汚泥フロックサイズを示す顕微鏡画像を示す。
【図６】図６は、ＭＢＲの浸透水（permeate）（バー、左軸）および汚泥に吸着されたそれらの含量（ドット、右軸）における５種の医薬活性化合物（ＰｈＡＣ）の平均除去効率を示す。誤差バーは、複数の測定の標準偏差を表す（ＭＢＲ−ＰＡＣＶについてｎ＝５、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱについてｎ＝６）。
【図７】図７は、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中の医薬活性化合物（ＰｈＡＣｓ）が、どのように除去されるかの分布を示す。
【図８】図８は、ＭＢＲコミュニティーにおける変動を比較する、重み付けＵｎｉＦｒａｃ距離の主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットを示す。Ｔ１〜Ｔ１２は試料名である。
【図９】図９は、ＭＢＲ中のバイオケーキ（ＢＣ）、汚泥およびビーズのコミュニティーにおける主要なバクテリアおよび古バクテリア門（＞１％）の相対存在量（abundance）を示す。各バーは、「汚泥−ＭＢＲ−ＰＡＣＶ」を除く二重の試料の平均を示し、それは唯一の１つの試料の結果である。
【図１０】図１０は、Ａ）トリメトプリム、Ｂ）スルファメトキサゾール（Ｃ）カルバマゼピン、Ｄ）ジクロフェナク、Ｅ）トリクロサンについての種々のビーズ−対−体積比での吸着等温線を示す：Ｑｅ＝ＰＡＣに対する平衡負荷（ｍｇ汚濁物質／ｇＰＡＣ）；Ｃｅ＝水中の平衡濃度（ｍｇ汚濁物質／Ｌ）。
【図１１】図１１は概略的なＭＢＲ構成を示す。
【図１２】図１２は、ＱＱ株による嫌気性分解（４時間）後の残余のＡＨＬ（Ｃ／Ｃ０）を示す。
【図１３】図１３は、Ａ）ＭＢＲ１およびＢ）ＭＢＲ２中のＴＭＰプロフィールの比較を示す。
【図１４】図１４は、Ａ）Ｃ−ＭＢＲおよびＢ）ＱＱ１−ＭＢＲ中の多糖（ＰＳ）およびタンパク質（ＰＮ）のＥＰＳ成分における変動を示す。誤差バーは、三連ＡｎＭＢＲにおける測定の１つの標準偏差を表す。
【図１５】図１５は、Ａ）開始され、Ｂ）汚濁された場合のＣ−ＭＢＲおよびＱＱ１−ＭＢＲ中のＡＨＬ濃度を示す。誤差バーは、三連のＭＢＲ中で測定の１つの標準偏差を表す。Ｃ４−ＨＬは最初にＱＱ１−ＭＢＲにおいて検出されなかった。Ｃ８−ＨＬは、最終試料中の三連のＭＢＲの１つにおいてだけ検出された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（説明）
本発明は、高分子材料に繋がれるバクテリア細胞の集団を含有する複合ポリマー粒子に関する。粒子は、粒子にさらなる強度および安定性を提供するために、ある場合には、ポリマーコーティング材料でコートし得る。これらの複合材料は、廃水を処理する嫌気性および／または好気性のメンブレン・バイオリアクタで用いるのに適し得る。
【００２７】
かくして、膜生物汚損を低減および／または防止する、嫌気性メンブレン・バイオリアクタに用いるのに適する複合材料が開示され：
バクテリア増殖と適合性の架橋された高分子マトリックス材料；および
バクテリア集団を含み、
バクテリア集団は高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合され、バクテリア集団がミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になり；
均一に混合された前記バクテリア集団および前記高分子マトリックス材料は、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料でコートされる。所望により、複合材料は、高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合される生物学的適合性吸着材料をさらに含み得る。
【００２８】
前記に開示された複合材料が嫌気性メンブレン・バイオリアクタで用いるのに特に適し得るが、それは必ずしもこの使用単独に限定されないことが認識されるであろう。本明細書に用いた「嫌気性メンブレン・バイオリアクタ」なる用語は、廃水を処理する場合に嫌気性条件下で作動するために構成されたメンブレン・バイオリアクタの使用をいう。
【００２９】
本明細書に用いた「廃水」は、産業用プラントからの汚水（sewage）または汚染水をいい得る。より詳しくは、「廃水」は、余剰汚泥（waste sludge）、二次スラッジ、油汚泥、産業汚泥または沈澱汚泥のごとき汚泥をいい得る。
【００３０】
また、膜生物汚損を低減および／または防止する、好気性メンブレン・バイオリアクタに用いる複合材料も開示し、複合材料は：
バクテリア増殖と適合性の架橋された高分子マトリックス材料；
バクテリア集団；および
生物学的適合性吸着材料を含み、
前記バクテリア集団および前記吸着材料は、高分子マトリックス材料の全体にわたって均一に混合され、前記バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４がから選択される１以上のバクテリア種から実質的になる。
必ずしも好気性メンブレン・バイオリアクタ中で機能するためのものではないが：
・バクテリア集団は大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳをさらに含むこともでき；および／または
均一に混合された前記バクテリア集団および前記高分子マトリックス材料は、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料でコートされ得る。
【００３１】
直前に開示された複合材料は、好気性メンブレン・バイオリアクタで用いるのに特に適し得ることが認識されるであろうが、必ずしもこの使用単独に限定されない。本明細書に用いた「好気性メンブレン・バイオリアクタ」なる用語は、廃水を処理する場合に好気性条件下で作動するために構成されたメンブレン・バイオリアクタの使用をいう。
【００３２】
本明細書の具体例において、「含む（comprising）」および「含む（comprises）」なる語彙は、言及された特徴を必要とすると解釈し得るが、他の特徴の存在を制限しない。また、別法として、「含む（comprising）」なる語彙は、リストされた成分／特徴だけが存在することが意図される状況に関係し得る（例えば、「含む（comprising）」なる語彙は、「よりなる」または「より実質的になる」なる語句と置換し得る）。より広いおよびより狭いの双方の解釈が、本発明のすべての態様および具体例に適用することができると明示的に考えられる。換言すれば、「含む（comprising）」なる語彙およびその同意語は、「よりなる」なる語句もしくは「より実質的になる」なる語句またはそれらの同意語により置換でき、また逆に置換できる。
【００３３】
本明細書に用いた「バクテリア集団」とは、本明細書に開示された複合材料の一部を形成するバクテリア細胞の集団をいう。バクテリア集団の細胞は、前記のバクテリア種から選択し得る。
【００３４】
「１以上のバクテリア種」なる用語は、好気性リアクターに用いる複合材料が、単に、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４から選択されるバクテリア腫の一つを有することもでき、それはいずれかの適切な組合せでこれらの種の２、３または４すべてを有し得ることを意味することが認識されるであろう。また、これらの組合せは、大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳにより補足され得る。例えば、好気性メンブレン・バイオリアクタに用いる複合材料のバクテリア集団は、以下のものから選択し得る：
（ａ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）；
（ｂ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）；
（ｃ）シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）；
（ｄ）ロドコッカス種ＢＨ４；
（ｅ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）およびエンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）；
（ｆ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）およびシュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）；
（ｇ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｈ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｉ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）およびシュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）；
（ｊ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｋ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｌ）シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｍ）シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｎ）ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｏ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）およびシュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）；
（ｐ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｑ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｒ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｓ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｔ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｕ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｖ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｗ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｘ）シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｙ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４；
（ｚ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ａａ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｂｂ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；
（ｃｃ）エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ；および
（ｄｄ）ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）、ロドコッカス種ＢＨ４および大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ。
【００３５】
本明細書に言及し得る本発明の特定の実施例において、バクテリア種の組合せは、前記群の（ｅ）〜（ｄｄ）から選択し得る。例えば、バクテリア種の組合せは、前記群の（ｏ）〜（ｄｄ）、例えば、（ｙ）〜（ｄｄ）から選択し得る。本明細書に言及し得る本発明の特定の実施例において、バクテリア種の組合せは前記群の（ｙ）または（ｄｄ）から選択し得る。
【００３６】
理論による拘束を望むことなく、複合材料の一部を形成するバクテリアは、高分子マトリックス一般的によく繋がれるかまたは付着すると考えられる。すなわち、バクテリア細胞が高分子マトリックスによって保持されるために、たとえそれらが複合材料の表面上にあったとしても、バクテリア細胞は自由に移動することができないと考えられる。
【００３７】
本明細書に用いた「より実質的になる」なる用語は、そのように識別された物質が、リストされた成分材料だけから実質的に作製されるが、それは微量の不純物を含み得ることを意味することが意図される。例えば、不純物のレベルは、０．００００１ｗｔ％〜５ｗｔ％、例えば、０．００１ｗｔ％〜１ｗｔ％等、例えば、０．０００１ｗｔ％〜０．５ｗｔ％であり得る。より詳細には、「ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になる」または「ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４から選択される１以上のバクテリアから実質的になる」なる用語は、特記されない限りは、そのバクテリア集団がバクテリアの指定された種から形成され、（例えば、汚染により）微量の他のバクテリアが存在し得ることを意味する。
【００３８】
認識されるように、コーティング材料は、（ある種の態様および具体例において）本明細書に開示された複合材料の表面に適用され、複合材料は一般的に粒子形態で提供し得る。複合材料の粒子形態は、いずれの適切な形状およびサイズも有し得る。例えば、複合材料は２〜３ｍｍの直径を有する球状ビーズとして提供し得る。
【００３９】
本明細書に用いた「生物学的適合性材料」なる用語とは、本明細書に言及されたバクテリア集団を形成するバクテリア細胞を死滅させない材料をいう。本明細書に用いた「吸着材料」なる用語とは、その接触可能表面上でもう一つの材料を吸収する材料をいい、それは、吸着材料中の細孔または亀裂等を介してアクセス可能である材料の内部の一部を含み得る。本明細書に言及し得る適切な生物学的適合性吸着材料は、限定されるものではないが、活性炭、イオン交換樹脂、キトサン、ゼオライトおよびリグニンを含む。本明細書に言及し得る特定の生物学的適合性吸着材料は、活性炭である。
【００４０】
本明細書に用いた「バクテリア増殖と適合性の架橋された高分子マトリックス材料」なる用語とは、バクテリア細胞に無毒であり、高分子マトリックス内のバクテリアの細胞物質の増殖を少なくとも完全には阻害しない高分子材料をいう。適切な高分子マトリックス材料は、限定されるものではないが、二価（２＋）または三価（３＋）の金属イオンによって架橋されるポリアニオン性ポリマーを含む。適切なポリアニオン性高分子材料として、限定されるものではないが、アルギン酸塩またはポリアニオン性セルロースが挙げられる。適切な二価（２＋）または三価（３＋）の金属イオンとして、限定されるものではないが、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、またはより特定には、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋が挙げられる。本明細書に言及し得る本発明の特定の実施例において、架橋された高分子マトリックス材料は、アルギン酸カルシウムであり得る。
【００４１】
本明細書に開示された複合材料は、バクテリア集団（すなわち、バクテリア細胞の乾燥重量）−対−架橋された高分子マトリックス材料のいずれの適切な比も用い得る。適切な比は、限定されるものではないが、１：５００〜１：２，０００ｗ／ｗ、例えば、１：７５０〜１：１，５００ｗ／ｗ、例えば、約１：１，０００ｗ／ｗのバクテリア細胞：高分子材料である。さらなるまたは別法の具体例において、本明細書に開示された複合材料は、バクテリア集団（すなわち、バクテリア集団のバクテリア細胞の乾燥重量）−対−生物学的適合性吸着材料のいずれの適切な比も用い得る。適切な比には、限定されるものではないが、１：３００〜１：８００ｗ／ｗ、例えば、１：４００〜１：６００ｗ／ｗ、例えば、約１：５００ｗ／ｗの菌株細胞：吸着材料が含まれる。
【００４２】
認識されるごとく、特にメンブレン・バイオリアクタに入れられる場合、複合材料は、結合を保持するために少なくともいくらかの機械強度を必要とする。複合材料がコートされない具体例において、複合材料は、４０，０００〜１００，０００Ｐａ、例えば、４５，０００〜７０，０００Ｐａ、例えば、４８，０００〜１００，０００Ｐａ、例えば、４８，０００〜７０，０００Ｐａのヤング率値を有し得る。複合材料がコーティング材料でコートされる具体例において、コートされた複合材料は、２００，０００〜４００，０００Ｐａ、例えば、２５０，０００〜３５０，０００Ｐａ、例えば、３００，０００〜３１０，０００のヤング率値を有し得る。示されるごとく、コートされた複合材料は、コートされていない材料と比較して、ヤング率によって測定された機械強度の増加を有し得る。
【００４３】
理論による拘束を望むことなく、本明細書に記載されたコーティング材料が複合材料の機械強度を増大し得るが、メンブレン・バイオリアクタ環境に入れられた場合、コーティング材料が複合材料の化学分解を妨げるので、コーティング材料の主要な利益は、それらが複合材料に増加した化学的安定性を提供することであると考えられている。
【００４４】
前記材料は廃水を処理するためにメンブレン・バイオリアクタ中で用いられる場合、ユニークでかつ驚くべき特性を提供し得る。これらの特性は、嫌気性条件下で操作するためのファーストインクラス（first-in-class）であること、ならびに驚くべきことには、従前に用いられた従来のシステムより永続性で、より有効で、より効率的であることを含み得る。部分的には、これらの特性は、６か月以内の間のごとき延長された期間バイオリアクタ中の膜生物汚損を防止するためのこれらの複合材料の能力から生起し得る。
【００４５】
かくして、廃水を処理するために嫌気性メンブレン・バイオリアクタを用いる方法も提供され、その方法は、
（ａ）バクテリア集団がミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）より実質的になる前記の複合材料から作製されたビーズの０．５〜１０％ｖ／ｖをメンブレン・バイオリアクタに添加する工程；および
（ｂ）引き続いて、嫌気性条件下の前記メンブレン・バイオリアクタで廃水を処理する工程を含む。
【００４６】
バクテリア集団がミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になる本明細書に開示されたいずれの適切な複合材料もこの方法に用い得ることが認識されるであろう。
【００４７】
別法の具体例において、方法は廃水を処理するために好気性メンブレン・バイオリアクタを用いる方法に関係でき、その方法は、
（ａ）バクテリア集団が、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４（所望による大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ）から選択される１以上のバクテリア種から実質的になる、複合材料から作製されたビーズの０．５〜１０％ｖ／ｖをメンブレン・バイオリアクタに添加する工程；および
（ｂ）引き続いて、好気性条件下の前記メンブレン・バイオリアクタで廃水を処理する工程を含む。
【００４８】
ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４（および、所望により大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ）から選択される１以上のバクテリア種から実質的になる本明細書に開示されたいずれの適切な複合材料も、この方法に用い得ると認識されるであろう。
【００４９】
前記の廃水処理の方法は、いずれかの適切な量の複合材料をビーズ形態で使用し得る（ビーズは前記に言及されるようないずれかの適切な形態、例えば、球形を取り得る）。適切な量のビーズは、メンブレン・バイオリアクタの体積に対して、０．５％から１０％ｖ／ｖ、例えば、１％から５％ｖ／ｖであり得る。
【００５０】
また、前記に開示された廃水処理の方法は、これらのプロセスの工程（ｂ）の逆洗工程から利益を得ることもできる。本明細書に用いた場合の「逆洗」なる用語は「膜逆洗」をいい、透過水（permeate water）（すなわち、浄化水）は、膜に戻しポンプ輸送され、したがって、膜の細孔を通って供給材料チャネルに流れ、それにより、内部および外部の汚濁物質を除去する。
【００５１】
前記の使用方法のさらなる詳細は、以下の実験セクションで提供される。
【００５２】
嫌気性メンブレン・バイオリアクタ中で用いるのに適する前記に言及された複合材料を製造するために、以下の方法を適用でき、それは、
（ｉ）溶媒中のバクテリア集団、未架橋の高分子材料および所望による生物学的適合性吸着材料を含む第１の混合物を提供する工程；
（ｉｉ）第１の混合物を、溶媒中の未架橋の高分子材料のための架橋剤を含む第２の混合物に添加して、複合材料を形成する工程；および
（ｉｉｉ）ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料で工程（ｉｉ）の生成物をコートする工程
を含み、バクテリア集団は、ミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）から実質的になる。
【００５３】
好気性メンブレン・バイオリアクタに用いるのに適切である前記に言及された複合材料を製造するために、以下の方法が適用でき、それは、 
（ｉ）溶媒中のミクロバクテリウム種ＱＱ１（ＫＲ０５８８４８）、エンテロバクタークロアカＱＱ１３（ＫＲ０５８８５４）、シュードモナス種ＱＱ３（ＫＲ０５８８４６）およびロドコッカス種ＢＨ４（および、所望により大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ）、未架橋の高分子材料および生物学的適合性吸着材料から選択される１以上のバクテリア種から実質的になるバクテリア集団を含む第１の混合物を提供する工程；および
（ｉｉ）溶媒中の未架橋の高分子材料のための架橋剤を含む第２の混合物への第１の混合物を添加して、複合材料を形成する工程、および、所望により、
（ｉｉｉ）ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンよりなる群の１以上から選択されるコーティング材料で複合材料をコートする工程を含む。
【００５４】
認識されるように、いくつかの成分（例えば、嫌気性メンブレン・バイオリアクタに用いるのに適する複合材料中の生物学的適合性吸着材料）および／または工程（例えば、好気性メンブレン・バイオリアクタに用いるのに適する複合材料のコーティング工程）が、前記方法の一方または他方においてオプションであり得るが、前記製造方法は相互に関連し、同じ一般的なプロセスを共有する。
【００５５】
前記プロセスの第１の工程において、未架橋の高分子材料および、存在する場合に溶媒中の生物学的適合性吸着材料と組み合わせた関連するバクテリア集団を含有する、第１の混合物が提供される。
【００５６】
本明細書に用いたバクテリア集団は、生物学的適合性吸着材料が存在する場合、未架橋の高分子材料および生物学的適合性吸着材料を含む溶液へいずれかの適切な量で提供でき、その結果、それは、本明細書において前記のごときバクテリア細胞の所望の乾燥重量−対−高分子材料を提供する。例えば、バクテリアの０．５ＯＤ溶液の５ｍＬ（または１ＯＤ（光学密度）の２．５ｍＬ）を未架橋の高分子材料を含む溶液の４５ｍＬ（または４７．５ｍＬ）に添加して、得られた複合材料中の適切な量のバクテリア細胞を提供し得る。認識されるように、バクテリアは、生物学的適合性の水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）のごとき適切な溶液に未架橋の高分子材料（および存在する場合、生物学的適合性吸着材料）を含む溶液に添加し得る。
【００５７】
未架橋の高分子材料を含む溶液は、水等のごときいずれの適切な溶媒も使用し得る。未架橋の高分子材料が溶解形態でなければならないので、未架橋の高分子材料は選択された溶媒に溶解できるであろう。便利なことには、塩対イオンが一価（１＋）金属イオンである場合、未架橋の高分子材料は（例えば、水溶性）ポリアニオン性ポリマー塩であり得る。例えば、限定されるものではないが、アルキン酸塩またはポリアニオン性セルロースを含めた群からのいずれの適切なポリアニオン性ポリマーも用い得る。加えて、いずれの適切な一価（１＋）対イオンも使用でき、それはＮａ＋およびＫ＋を含み得る。これらの製造方法に用いる本明細書に言及し得る特定の未架橋の高分子マトリックス材料は、アルギン酸カリウムおよびアルギン酸ナトリウムを含む。未架橋の高分子マトリックス材料は、バクテリア集団の添加前に、溶液中で０．５〜１０％ｗ／ｖ、例えば、１〜２％ｗ／ｖの濃度で存在し得る。
【００５８】
前記のごとく、方法は、本明細書に前記に定義される生物学的適合性吸収材料の組込みを含み得る。いずれの適切な生物学的適合性吸着材料も、前記の製造方法に組み入み得る。例えば、存在する場合、生物学的適合性吸着材料は、限定されるものではないが、キトサン、ゼオライト、リグニン、より特に、活性炭を含み得る。存在する場合、生物学的適合性吸着材料は、バクテリア集団の添加前に溶液中に０．１〜３％ｗ／ｖ、例えば、０．５から２％ｗ／ｖの量で未架橋の高分子材料を含む溶液中に存在し得る。
【００５９】
次いで、前記された第１の混合物を前記のプロセスの工程（ｉｉ）における第２の混合物に添加する。第２の混合物は、第１の混合物中で未架橋の高分子材料と架橋して、架橋された高分子マトリックスおよびその中に捕捉されたバクテリア細胞の複合材料を形成する架橋剤を含有する。架橋剤は、二価（２＋）および／または三価（３＋）の金属イオン塩であり得る。二価（２＋）および／または三価（３＋）の金属イオンは、第１の混合物中の１を超える高分子鎖からの一価（１＋）金属イオンを置換し、高分子鎖の架橋に導く。いずれの適切な二価（２＋）および／または三価（３＋）の金属イオンも、これらの製造方法に用い得る。本明細書に言及し得る適切な二価（２＋）および／または三価（３＋）の金属イオンは、限定されるものではないが、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む。架橋剤は、１〜１０％ｗ／ｖ、例えば、２〜５％ｗ／ｖ、例えば、４％ｗ／ｖの第２の混合物の溶媒中濃度を有し得る。
【００６０】
第１の混合物の第２の混合物への添加のいずれの適切な方法も用い得る。しかしながら、滴下添加プロセスの使用は便利であり得る。このプロセスの結果、高分子マトリックス内にバクテリア細胞を組込む、架橋された高分子材料の略球状粒子が形成し得る。
【００６１】
認識されるように、複合材料の実際の形状およびビーズのサイズは、第２の混合物中への第１の混合物の流速の速度、ならびにノズルの形状およびサイズによって影響され得る。例えば、大きな液滴を生じる（例えば、滴下添加を用いた場合）遅い流速は、複合材料の比較的大きな球状ビーズを生じるが、速い流速（依然として液滴を生成する）は、複合材料の比較的より小さなビーズを生成するであろう。同様に、第１の混合物の連続的な流れが第２の混合物に加えられるならば、その時、チューブ／ストリング様の複合材料が生成され、但し、第２の材料中への第１の材料の流速が、第１の材料が分散し始める前に、架橋が起こることを可能にするように十分に制御される。実施例において本明細書に後記されるごとく、前記製造方法における工程（ｉｉ）の複合材料の球状ビーズを得るための適切な流速は、直径が１ｍｍのノズルを用いて、１．０ｍＬ／分であり得る。当業者ならば、これらの変数が、得ようとする複合材料のサイズおよび／または形状に依存して、適切と考えるようにそれらの変数を適用し得る。
【００６２】
認識されるように、第１の混合物の第２の混合物への添加の反応生成物は、用いる溶媒に可溶ではない架橋された高分子複合材料である。したがって、製造方法における工程（ｉｉ）の複合材料は、液体から容易に分離され、次いで、−前記に開示された廃水を処理する方法における貯蔵および／もしくは使用、または所望のコーティング工程のいずれかのために洗浄および乾燥し得る。
【００６３】
嫌気性メンブレン・バイオリアクタに用いるのに適する複合材料に必要な場合、または好気性メンブレン・バイオリアクタに用いるのに適する複合材料に所望により必要な場合、前記プロセスにおける工程（ｉｉ）で得られた架橋された高分子複合材料は、さらに、コーティング材料でのコーティング工程に付され得る。このプロセスは、前記製造工程における工程（ｉｉ）の形成された複合材料を適切な濃度で適切な時間量（例えば、約１秒から約６０秒、例えば、約５秒から約３０秒、例えば、約１０秒）の間、所望のコーティング材料を含有する溶液に浸すことを含み得る。前記のごとく、コーティング材料は、−特に、メンブレン・バイオリアクタにおいて判明した条件に関しては、得られた複合材料の化学的または機械的な安定性を高めるのを助け得るいずれかの適切な高分子材料であり得る。言及し得る適切なコーティング材料は、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレンを含む。溶媒中のコーティング材料の濃度は、適切な溶媒中の１％ｗ／ｖ〜５０％ｗ／ｖ、例えば、２％ｗ／ｖ〜２５％ｗ／ｖ、例えば、４％ｗ／ｖ〜８％ｗ／ｖであり得る。コーティング材料を溶解することができるが、前記製造工程の工程（ｉｉ）の複合材料を溶解しないいずれの溶媒も用い得る。本明細書に言及し得るこの目的に適切な溶媒は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンであるが、他の溶媒は、コーティング材料として使用されるポリマー、および工程（ｉｉ）の高分子マトリックス材料を形成するポリマーに依存して等しく適し得る。
【００６４】
認識されるように、コートされた複合材料は、コーティング工程を適用するのに用いる溶媒に溶解せず、したがって、水に入れ、貯蔵される複合材料を回収して、それにより、複合材料の表面上に記載されたコーティング材料のコーティングを提供することは容易である。理論による拘束を望むことなく、前記のコーティングプロセスは、水によってその選択された溶媒からのコーティング材料の沈澱によって得られると考えられる。すなわち、工程（ｉｉ）の複合材料がコーティング材料の溶液に添加される場合、複合材料の高分子マトリックス中の残留水は、複合材料の表面上でのコーティング材料のいくらかの沈澱を導く。引き続いて、コートされた材料がコーティング材料を含有する溶液から取り出された場合、それを使用および／または貯蔵前に水性環境に置く。コーティング材料を含有する溶液から取り出された複合材料は、工程（ｉｉ）の複合材料の表面に堆積したコーティング材料の層を有し、また、それは、この層の頂部上にコーティング材料溶液の層を含む。コーティング材料溶液のこの層が水と接触する場合、そこに含有されるポリマーも堆積して、コーティング膜を完成する。
【００６５】
本発明によってコートされた複合粒子を提供するための別法のプロセスは、Kimら, Journal of Membrane Science 473 (2015) 109-117  （ここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなす）のセクション２．３（第１１０頁）に記載されたコーティングプロセスに基づいてもよい。
【００６６】
コーティング層は、存在する場合、１〜１００μｍ、例えば、１０〜１００μｍ、例えば、６０〜１００μｍの厚みを有し得る。コーティング層は、バクテリアを収容する架橋された高分子マトリックスへの外部からの材料の輸送を可能にする細孔を含有し得る。細孔は、５０ｎｍ〜１μｍの細孔サイズを有し得る。
【００６７】
本発明のさらに非限定の実施例は、以下の実施例を参照して記載されるであろう。
【実施例】
【００６８】
材料および方法
好気性ＭＢＲに用いる化学物質およびＱＱ株
未標識のＳＭＸ、ＣＢＺ、ＤＣＦおよびＴＣＳをＷＡＫＯ（シンガポール）から購入し、一方、ＴｒＭＰをMP Biomedical（シンガポール）から購入した。重水素標識したＴＭＰ−ｄ３、ＳＭＸ−ｄ４、ＣＢＺ−ｄ１０、ＤＣＦ−ｄ４およびＴＣＳ−ｄ３の標準は、C/D/N Isotopes社（ケベック、カナダ）から購入した。
【００６９】
ＡＩ−２分解株大腸菌ΔｌｓｒＲΔｌｕｘＳ［Cell Rep. 10 (2015) 1861-1871]ならびに、活性汚泥から単離された４つのＡＨＬ分解株：エンテロバクタークロアカ（ＱＱ１３）、ミクロバクテリウム種（ＱＱ１）およびシュードモナス種（ＱＱ３）（各々、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子受入番号：ＫＲ０５８８５４、ＫＲ０５８８４８およびＫＲ０５８８４６）、およびロドコッカス種ＢＨ４[J. Membr. Sci. 473 (2015) 109-117; J. Membr. Sci. 483 (2015) 75-83]よりなるＱＱコンソーシアム（consortium）を選択した。ＡＨＬ分解株をビーズ中の固定化に先立って３０℃にて約１６時間ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で増殖させ、一方、ＡＩ−２分解株を３７℃にて約１６時間１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含有するＬＢ培地中で増殖させた。
【００７０】
膜抵抗分析−膜抵抗は、ダルシー則：
【数１】
2020500698.tif 000003
（式中、Ｒは透過抵抗（hydraulic resistance）（１／ｍ）、ΔＰはＴＭＰ上昇（Ｐａ）、Ｊは操作流れ（operational flux）（ｍ３／ｍ２／ｓ）、μは透過動粘度（dynamic viscosity）（Ｐａ・ｓ）である）に基づいて[Water Res. 30 (1996) 1771-1780]に記載された単純なレジスタンスインシリーズモデル（resistance in series model）を用いて評価した。ＭＢＲにおいて、総透過抵抗Ｒｔは、ケーキ層抵抗（Ｒｃ）、細孔閉塞抵抗（Ｒｐ）および固有膜抵抗（Ｒｍ）の合計である。
【００７１】
Ｒｍは、新しいまたは化学的に浄化された膜を介してきれいな水を濾過させることにより測定し、一方、Ｒｔは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏが濾過された場合の膜を横切る流れおよびＴＭＰを測定することにより実験の終わりにて測定した。次いで、ケーキ層をスポンジブラシで優し取り除き、膜は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏに沈めて、Ｒｍ＋Ｒｐを測定した。ＲｃはＲｔからＲｍ＋Ｒｐを除することにより計算した。
【００７２】
ＰｈＡＣおよびＡＨＬ分析−吸着テストからの水性試料中のＰｈＡＣは、前処理なくして直接的に分析した。ＭＢＲ実験からの水性試料中のＰｈＡＣは、従前[Chem. Eng. J. 321 (2017) 335-345]に記載された６−ｍＬ ３０μｍ Oasis（登録商標）ＨＬＢ固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（ウォータース、シンガポール）を用いて濃縮した。汚泥またはビーズ上に吸着したＰｈＡＣ量は、液液抽出を用いて１ｍＬの混合液試料または１０個のランダムに選択されたビーズから抽出した。ビーズを抽出前に乳棒で粉砕した。前処理後に、ＰｈＡＣは液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析した。ＡＨＬは、Waheed ら [Int. Biodeterior. Biodegrad. 113 (2016) 66-73]によって記載された方法によりＭＢＲからのバイオケーキおよび活性汚泥（５０ｍＬ）から抽出した。単離したＡＨＬおよびＡＩ−２をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００７３】
ＰｈＡＣおよびＡＨＬ分析−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳについての詳細な方法
ＡＪＳ電気スプレーインターフェースを装備したAgilent 6460 (USA) QQQ三連四重極質量分析器（ＭＳ）をＰｈＡＣ、ＡＨＬおよびＡＩ−２の分析に用いた。装置設定をすべての測定のために以下のごとく最適化した：インターフェース電圧、３．５ｋＶ；乾燥ガス温度、３２５℃；乾燥ガス（Ｎ２）流速、８Ｌ／分；シースガス温度、３００℃；シースガス（Ｎ２）流速、１１Ｌ／分。Agilent 1290 Infinity II HPLCは、クロマトグラフ分離に用いた。ＰｈＡＣおよびＡＨＬの双方について、１００×２．１ｍｍ Kinetex ２．６μｍビフェニルカラム（Phenomenex、米国）を移動相としての０．１％ギ酸（Ａ）および０．１％ギ酸を含むメタノール（Ｂ）と共に用い、１０分以内の１０％（ＡＨＬにつき５％）から８５％Ｂへの勾配とした。ＡＩ−２について、２．１×１００ｍｍ  Poroshell １２０ ２．７μｍ ＳＢ−Ａｑカラム（Agilent、米国）を移動相としての０．１％のギ酸（Ａ）および０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）と共に用い、５．５分以内に３５％から８５％Ｂへの勾配とした。
【００７４】
嫌気性ＭＢＲに用いる化学物質およびＱＱ株
Ｎ−ブチリル−、Ｎ−ヘキサノイル−、Ｎ−ヘプタノイル−、Ｎ−オクタノイル−、Ｎ−デカノイル−、Ｎ−ドデカノイル−およびＮ−テトラデカノイル−ＤＬ−ホモセリンラクトン（Ｃ４−、Ｃ６−、Ｃ７−、Ｃ８−、Ｃ１０−、Ｃ１２−またＣ１４−ＨＬ）；Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−およびＮ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（３ＯＣ６−、３ＯＣ８−、３ＯＣ１２−、３ＯＣ１４−ＨＬ）を含むＡＨＬをSigma-Aldrich（シンガポール）から購入した。
【００７５】
活性汚泥から分離した４種のＱＱ株のミクロバクテリウム種ＱＱ１、シュードモナス・プレコグロッシキダＱＱ２、シュードモナス種ＱＱ３およびエンテロバクタークロアカＱＱ１３をこの試験に用いた[Chemosphere 182 (2017) 40-47]。それらは４℃にてＬＢ寒天平板上に維持し、３０日毎に新たに移植した。使用に先立って、これらの株の単一コロニーを５ｍＬ ＬＢ培地中に接種し、３０℃にて培養してそれらをリフレッシュさせた。
【００７６】
実施例１：ＱＱバクテリア不存在下でのＰＡＣビーズ組成、および体積比に対するビーズの最適化
表１の異なるビーズ組成およびビーズ用量（リアクターに対するビーズの体積比）の５つの独立したセットのバッチスケール実験を行い、医薬活性化合物（ＰｈＡＣ）の吸着を最適化した。
【００７７】
方法
ＰＡＣアルギン酸塩ビーズは、異なる比率（１％ｗ／ｖまたは２％ｗ／ｖ、表１を参照）にてＰＡＣ（ＳＡＥ２、Norit、オランダ）とアルギン酸Ｎａ溶液（２％ｗ／ｖ）とを混合し、蠕動ポンプを用いて１ｍＬ／分の速度でノズルを介して、ＣａＣｌ２溶液（４％ｗ／ｖ）に滴下することにより調製し；ＣａＣｌ２溶液に３時間浸漬後に、半分のビーズをポリスルホン溶液（Ｎ−メチル−２−ピロリドン中の８％ｗ／ｖ）に１０秒間浸した後、使用まで４℃にて貯蔵し、一方、その残りのビーズを直接的にＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏに移した。また、ＰＡＣを含まないビーズを対照として調製した。
【００７８】
５種の医薬活性化合物を標的吸着物として集合的に用いた。各タイプのビーズについて、５つの特定量のビーズを５０ｍＬのＰｈＡＣ溶液を含む１５０ｍＬ血清ボトルに添加して、５つの異なる容積負荷（１、２、５、１０および２０％）を提供した（表１）。ボトルを１５０ｒｐｍ、２５℃にて７日間振盪機上に維持した。試料は所定の間隔にて各ボトルから得て、平衡に達するために必要な時間を評価した。
【００７９】
【表１】
2020500698.tif 000004
【００８０】
結果
図１０に示した結果は、ＰｈＡＣの同じ吸着が、１％ｗ／ｖ（セット１）〜２％ｗ／ｖ（セット２）のＰＡＣ用量の増加に関係なく達成され；１〜５％ｗ／ｖのビーズ体積比の増加の結果、ＰｈＡＣの吸着を有意に増加させるが、５％ｗ／ｖを超えて、さらなる増加は観察されなかったことを示した。したがって、１％ｗ／ｖのＰＡＣ用量および５％ｗ／ｖのビーズ用量は、引き続いての実施例につき選択した。
【００８１】
図１０は非コートのビーズがコートされたビーズより高い吸着を示すことを示すが、非コートのビーズは、それらが速く分離するために、メンブレン・バイオリアクタ、特に、嫌気性系に適用された場合、貧弱な安定性を示す。これにより、コートされたビーズを引き続いての実施例に選択した。
【００８２】
ＰｈＡＣの水性濃度を７日間一定間隔でモニターして、吸着平衡に達する時間を決定した。５種のＰｈＡＣの吸着量は、経時的に増加したが、１日以内に主要な吸着（＞９５％）が完了し（データは示さず）、吸着の高駆動力、すなわち、ＰｈＡＣとバイオ収着結合部位との間の強力な静電的引力を示した。ＳＭＸの水性濃度の急速な減少を２日後に観察し、これは非生物的分解に起因した。かくして、１日の平衡時間を吸着等温モデル化に選択した。
【００８３】
吸着等温モデルのうち、フロイントリヒモデルは、特に、活性炭および分子ふるい上の有機化合物または高度相互作用種についての異種系で広く適用されている（Foo and Hameed, 2010)。表２は、ｋが吸着剤の相対的な吸着容量を示す定数であり、ｎが吸着の強度を示す定数である場合(HamdaouiおよびNaffrechoux, 2007)、平衡データをフロイントリヒモデルおよび回帰推定された定数値に適合させる結果を示す。セット１および２の双方におけるすべてのＰｈＡＣに対するＲ２（＞０．９）値は、フロイントリヒモデルの良好な適合を示唆する。ＰｈＡＣが種々の程度の吸着強度（ＰＡＣへの表２におけるｎ値）を固有に示し、それがそれらの疎水性によく対応することが注目される。さらなる試験について、セット１は、より低い量のＰＡＣで汚濁物質の同一の除去効率のため、セット２よりもより好ましいと考えられた。
【００８４】
【表２】
2020500698.tif 000005
【００８５】
アルギン酸塩ビーズへのＰＡＣの添加がそれらの機械強度をわずかに高めだが（表３を参照）、サイズおよび形状の明確な変化はＱＱ株の添加で観察されなかったことが注目される。
【００８６】
【表３】
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【００８７】
ビーズのヤング率は、Ouwerxら 1998 (Polym. Gels Netw. 6, 393-408)により記載されたＭＴＳ Criterionモデル４３機械テスターで決定した。各タイプのビーズについて、１０個の無作為に選択したビーズを２５０Ｎの圧縮セルで試験し；ピストンは、２ｍｍ／分で連続的に移動し、５０％の変形に達した場合に停止した。
【００８８】
実施例２：ＱＱ−ＰＡＣビーズの調製手順
生物汚損制御およびＭＢＲ中の有機汚染物質（ＴｒＯＣ）の除去のためのＱＱ−ＰＡＣビーズを以下の手順により調製した。
１．ＱＱバクテリアを活性汚泥から分離し、−８０℃にて貯蔵した。ビーズを調製する前に、ＱＱバクテリアをルリアーベルターニ（ＬＢ）培地中で生き返らせた。次いで、５０μＬの生き返らせた培養物（ＯＤ＞０．５）を用いて、５ｍＬのＬＢ培地に接種し、培養物を使用前に３０℃にて一晩培養した。
２. ５ｍＬの一晩の培養物（ＯＤ  ０．５）を遠心分離によって収集し、５ｍＬの１×リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁した。１×ＰＢＳは、１０ｍＭ  ＰＯ４３−、１３７ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ  ＫＣｌの最終濃度を有した。次いで、バクテリア懸濁液を１％（ｗ／ｖ）ＰＡＣ（ＳＡＥ２、Norit、オランダ）を含有する２％（ｗ／ｖ；４５ｍＬ溶液に対し）アルギン酸ナトリウム溶液の４５ｍＬに添加し、撹拌しつつ混合させた。１％ＰＡＣ（ｗ／ｖ）を実施例１に詳述したバッチ吸着試験に基づき最適化した比として確立した。
３．撹拌を維持しつつ、混合物を約１．０ｍＬ／分の速度の蠕動ポンプでポンプ輸送し、１ｍｍのノズルを介して４％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウム溶液に滴下（１滴／秒）して、球状ビーズを形成した。
４．ＡＰＱビーズを２〜３時間塩化カルシウム溶液中に維持して、ビーズを成熟させた。次いで、ビーズを１０秒間ポリスルホン溶液（Ｎ−メチル−２−ピロリドン中の８％ｗ／ｖ）に浸した後、それらをＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏに移した。ビーズはＭＢＲ中の適用に先立って１週以内Ｈ２Ｏ中で貯蔵できる。長期貯蔵のために、ビーズを４℃のＨ２Ｏに貯蔵することができる。これらのビーズは、ＬＢ培地への一晩の浸漬を介して生き返さなければならないであろう。
【００８９】
ＱＱ株をビーズ中で別々に捕捉し、ＭＢＲに等しく添加し、非均質の混合物を回避した。
ＱＱバクテリア（乾燥重量）：ＰＡＣ：アルギン酸塩の質量比は、１：５００：１０００であると推測される。
【００９０】
培養物の体積（Ｖ）は、培養物のＯＤおよび最終体積（ＶＦ）に依存する。ＶＦとは、蠕動ポンプでポンプ輸送し、方程式Ｖ＝０．１＊ＶＦ＊０．５／ＯＤによって計算される最終混合物の体積をいう。
【００９１】
実施例３：空ＰＡＣビーズの調製手順
空ＰＡＣビーズは、１％ｗ／ｖの用量にてＰＡＣ（ＳＡＥ２、Norit、オランダ）とアルギン酸Ｎａ溶液（２％ｗ／ｖ）とを混合し、蠕動ポンプを用いて１ｍＬ／分の速度でノズルを介して、ＣａＣｌ２溶液（４％ｗ／ｖ）に滴下することにより調製した。ＣａＣｌ２溶液に３時間浸漬後に、ビーズをポリスルホン溶液（Ｎ−メチル−２−ピロリドン中の８％ｗ／ｖ）に１０秒間浸した後、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏに移し、使用まで４℃にて貯蔵した。
【００９２】
実施例４：ＭＢＲパフォーマンスに対するＰＡＣおよびＱＱの効果
実験室スケールのＭＢＲ構成および操作
０．０４μｍの細孔サイズおよび０．０４７ｍ２（浸漬）の表面積を持つ中空繊維限外濾過ＰＶＤＦ膜モジュール(ZeeWeed, GE, 米国)を装備した円筒状アクリル酸リアクター（３．２Ｌの作動体積）を従来のＭＢＲ（ＭＢＲ−Ｃ）、実施例３により調製した空ＰＡＣビーズを含むＭＢＲ（ＭＢＲ−ＰＡＣＶ）、実施例２により調製したＱＱ−ＰＡＣビーズを含むＭＢＲ（ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ）として順次操作した（図１１）。内部にビーズを含む後者の２つのモードについて、膜は、２時間ごとに５分間濾過の時点で同じ流れでの流出液で逆洗した。各操作サイクルは、ＴＭＰ値が３０ｋＰａに達した場合に終了した。次いで、膜はリアクターから取り出し、１時間次亜塩素酸ナトリウム溶液（２％）に浸漬し、未使用の膜が用いた場合のＭＢＲ−Ｃを除いて、次の試行に先立って水道水で徹底的に濯いだ。合成廃水（後記の表４を参照）をＭＢＲ−Ｃ用の供給材料として用いたが、５種のＰｈＡＣは、他のものについて２μｇ／Ｌの濃度にて供給材料に補足した。
【００９３】
汚泥（Ulu Pandan Water Reclamation Plant、シンガポールから採取された）は１か月間、合成廃水に順応させた後、種子汚泥として用いた。混合された液懸濁固体（ＭＬＳＳ）濃度は、試験全体にわたってＭＢＲの典型的な範囲（５．７±０．５ｇ／ｌ）に維持した。固体滞留時間（ＳＲＴ）および水理学的滞留時間（ＨＲＴ）は、１５Ｌ／ｍ２／時間（ＬＭＨ）の初期流れにて、各々、３０日および６時間維持した。ビーズは、５％の体積比（実施例１に詳述された吸着テストに基づいて確立された）でＭＢＲに添加した。
【００９４】
ＱＱ−ＰＡＣビーズは、ＭＢＲ汚損制御につき１〜１０％の用量（リアクターの有効容積に対するビーズのバルク体積の比）にてＭＢＲに添加できる。また、必要な場合、より高用量を用いて、流体化されたＭＢＲを創生することができ、これは、非常に長期間のＴｒＯＣｓの効率的な除去を可能にするであろう。
【００９５】
【表４】
2020500698.tif 000007
【００９６】
結果
図１は、ＭＢＲ−Ｃ、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおける膜差圧（ＴＭＰ）の時間的経過を示す。未使用の膜をＭＢＲ−Ｃに用い、これを４日間の操作後に汚損し；全体的なＴＭＰ上昇は、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱより、各々、３および６．５倍速かった。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて、ＴＭＰは１６日目に８ｋＰａに達するまで、徐々に増加し、次いで、急激に上昇した。ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶと比較して、この急激な上昇は、各々、４５０％および１５０％遅延した。全体として、ＭＢＲ−Ｃ、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱについての平均汚損率（ΔＴＭＰ／Δｔ）は、各々、０．３、０．１６および０．０７ｋＰａ／時間であった。初期の試験において、ＰＡＣだけの添加の結果、２５％濾過時間を増加させたが[Water Res. 105 (2016) 65-75]、１００％の濾過時間の増加がＰＡＣおよび逆洗の組合せによってこの試験において達成した。ＱＱを添加すると、濾過時間は、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中で４５０％さらに増加した。これは、ＰＡＣと一緒のＱＱバクテリアの組合せが膜生物汚損を妨害するのに有用なことを明確に示す。
【００９７】
膜汚損制御に対するＰＡＣおよびＱＱメカニズムの効果を解明するために、膜抵抗分析を各ＭＢＲ試行後に行った（計算について「膜抵抗分析」下の項を参照）。固有膜抵抗（Ｒｍ）におけるわずかな上昇をすべての化学洗浄後に観察した（表５）。ＭＢＲ−Ｃについて、ケーキ抵抗（Ｒｃ）は、総抵抗（Ｒｔ）の８６％に優位に寄与し、操作の４日以内に膜表面上の強力なケーキ層形成を示した。Ｒｔに対するＲｃの寄与はＭＢＲ−ＰＡＣＶにおいて５０％に減少し、これは、空ＰＡＣビーズおよび逆洗による表面研磨の組合せ効果が、膜表面に対するバクテリア付着を低下させることを示すようである。理論による拘束を望むことなく、ＰＡＣ粒子はケーキ層の構造を変更でき、より厚いがより浸透性にし、コンパクトでなくしていると考えられる。たとえＰＡＣ粒子を低用量で用いたとしても、それらは、汚泥フロックの強度を高め、汚濁放出を減少させることにより、生物汚損を緩和した。この実施例に開示されるごとく、ＰＡＣ粒子はアルギン酸塩ビーズ中に捕捉され、汚染物質（foulant）の吸着を妨害しつつ、機械的酸性化効果を非常に高めた。ＰＡＣビーズへのＱＱバクテリアの添加は、ＭＢＲ−ＰＡＣＶと比較して、Ｒｃの相対的寄与をさらに５０％低下させた。
【００９８】
細孔ブロッキングの制御がＭＢＲに伴う生物汚損の最小化に必須であるので、逆洗を導入して、ＭＢＲ−ＰＡＣＶにおける細孔閉塞抵抗（Ｒｐ）を低下させた。逆洗は、物理的に可逆的な細孔閉塞を部分的に低下するが、不可逆性の細孔閉塞を低下させない。ＭＢＲ−Ｃのものと比較して１７％のＭＢＲ−ＰＡＣＶ中のＲｐの有意な増加を達成した。しかしながら、より長い濾過時間では、不可逆性の細孔閉塞はより有意になり；Ｒｔへのその寄与はＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて最大（３２％）であった。これらの結果は、ＰＡＣおよび逆洗でのＱＱメカニズムの統合がバイオケーキ形成および物理的に可逆的な細孔閉塞を有効に低下させ、かくして、膜サイクル時間を非常に延長させたことを示す。。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
実施例５：ＱＳシグナリング分子のクエンチング
ＱＱバクテリアの役割は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いる２つのタイプのシグナル分子、ＡＨＬおよびＡＩ−２の濃度をモニターにより、この実施例において確認した。
【０１０１】
方法
ＡＨＬは、Waheedら [Int. Biodeterior. Biodegrad. 113 (2016) 66-73]によって記載された方法によりＭＢＲからのバイオケーキおよび活性汚泥（５０ｍＬ）から抽出した。ＡＨＬおよびＡＩ−２をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した（詳細な方法につき、「材料および方法」を参照）。
【０１０２】
結果
図２Ａは、３つのすべてのＭＢＲの汚泥およびバイオケーキ中のＡＨＬの濃度を示す。ＡＨＬの組成が３つのリアクター中で全く異なったことが注目される。ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱの双方における優位なＡＨＬであるＣ６−ＨＳＬは、ＭＢＲ−ＰＡＣＶにおいて検出されなかった。ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおけるＡＨＬの主要構成分である３ＯＣ１２−ＨＳＬは、ＭＢＲ−Ｃにおいて検出されなかった。Ｃ４−ＨＳＬ、Ｃ１０−ＨＳＬおよびＣ１４−ＨＳＬを含めたＭＢＲ−ＰＡＣＶにおける大部分のＡＨＬは、他の２つのＭＢＲにおいて検出されなかった。さらに、各リアクターのバイオケーキは、そのリアクターの上清とは異なるＡＨＬプロフィールを示した。ＭＢＲにおいて最も広く検出されるＡＨＬであるＣ８−ＨＳＬは、一般的に汚泥中に非常に低濃度で存在したが、ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶの双方のバイオケーキにおいて重要なＡＨＬであった。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱのバイオケーキにＡＨＬは検出されなかった。汚泥中のＡＨＬ濃度は、ＭＢＲ−ＣにおけるＣ６−ＨＳＬおよび３ＯＣ８−ＨＳＬについて、０．５〜１ｎｇ／ｍｇＶＳＳ、ＭＢＲ−ＰＡＣＶにおけるＣ４−ＨＳＬ、Ｃ１０−ＨＳＬ、３ＯＣ１２−ＨＳＬおよびＣ１４−ＨＳＬについて、０．２５〜０．５ｎｇ／ｍｇ、ならびにＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおけるＣ６−ＨＳＬおよび３ＯＣ１２−ＨＳＬについて、０．２〜０．４ｎｇ／ｍｇの範囲にある。これらのすべては、他の検出されたＡＨＬよりも２桁高い。ＭＢＲ間の微生物コミュニティーの差（実施例９に詳述される）は、異なるＡＨＬ媒介クオラムセンシング分子を生じることもできた。リアクター間の別個のＡＨＬプロフィールにも拘わらず、ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶの汚泥における総ＡＨＬ濃度は、同じ（約１．５ｎｇ／ｍｇ ＶＳＳ）であったが、それは、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおけるものの半分未満（約０．６ｎｇ／ｍｇ ＶＳＳ）であった。ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶのバイオケーキにおける総ＡＨＬ濃度は、各々、３９００ｎｇ／ｍ２および６０００ｎｇ／ｍ２であり、これらは、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱで判明したものよりかなり高かった（図２Ｂ）。これらの結果は、バイオケーキ中で、ＱＱがバルク汚泥中でＡＨＬを部分的に低下させるが、ＡＨＬ、特にＣ８−ＨＳＬを非常に涸渇させたことを示唆する。
【０１０３】
ＡＩ−２シグナル分子の低下におけるＱＱバクテリアの有効性は図２Ｃに示され、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱは第４日にＡＩ−２の最低濃度を有した。しかしながら、その後のＡＩ−２レベルの徐々の増加は、ＱＱコンソーシアム中のＡＩ−２−低下株が長期的操作においてそのクエンチング活性を失ったことを示唆している。
【０１０４】
実施例６：ＳＭＰ生成およびその組成に対するＰＡＣおよびＱＱの効果
ＭＢＲプロセスにおける可溶性微生物生成物（ＳＭＰ）の生成は、ＭＢＲの浸透が種々の適用に再利用されるならば、それらが生物汚損および排水液の化学的酸素要求量（ＣＯＤ）に直接的に寄与するので、重大な懸念である。本実施例において、ＬＣ−ＯＣＤ−ＯＮＤを用いて、ＳＭＰを特徴付けした。
【０１０５】
ＳＭＰ分析−有機炭素および窒素の検出（ＬＣ−ＯＣＤ−ＯＮＤ）（ＤＯＣ−ＬＡＢＯＲ、ドイツ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、すべてのＭＢＲの混合液（mixed liquor）中で可溶性微生物生成物（ＳＭＰ）を特徴付けおよび定量した。略言すると、有機化合物、すなわち、生体高分子、親水性の溶存有機炭素（ＤＯＣ）、疎水性のＤＯＣ、高分子量（ＨＭＷ）タンパク質、ビルディングブロック、低分子量（ＬＭＷ）中性物、ＬＭＷ酸、ＨＭＷ多糖を識別し、詳細は、Xiaoら [Chemosphere. 170 (2017) 233-241]に記載されている。製造者からのソフトウェアは、データ収集および処理に用いた[S.A. Huber, A. Balz, M. Abert, W. Pronk, Water Res. 45 (2011) 879-885]。
【０１０６】
ＥＰＳ抽出および分析−熱抽出法[X.Y. Li, S.F. Yang, Water Res. 41 (2007) 1022-1030]を細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の抽出に用いた。略言すると、１５ｍＬの汚泥をＭＢＲから採取し、４０００ｒｐｍおよび４℃にて３０分間遠心分離し（また、特記しない限りは、この条件を以下の遠心分離工程に用いた）、上清を可溶性ＥＰＳとして貯蔵した。汚泥ペレットを０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ中に再懸濁し；次いで、試料は（４℃の４０００ｒｐｍにて１５分間）遠心分離し、上清を緩く結合した（ＬＢ）ＥＰＳとして貯蔵した。汚泥ペレットは同じＮａＣｌ溶液に再懸濁し、６０℃にて１時間インキュベートし；遠心分離後に、上清はしっかりと結合した（ＴＢ）ＥＰＳとして貯蔵した。
【０１０７】
タンパク質（ＰＮ）分析について、フォリン-チオカルトフェノール酸試薬を用いるローリー法[J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275]を用い、７５０ｎｍの吸収度を分光光度計（ＵＶ−２６００、島津製作所、シンガポール）を介して測定した。多糖（ＰＳ）の定量化について、４９０ｎｍでの吸収度をフェノール硫酸法を用いて測定した[Anal. Chem. 28 (1956) 350-356]
。
【０１０８】
総タンパク質および多糖の濃度を改変したローリー法[B. Frolund, R. Palmgren, K. Keiding, P.H. Nielsen, Water Res. 30 (1996) 1749-1758] およびフェノール硫酸法（同上）によって決定した。ＬＭＷタンパク質およびＬＭＷ多糖の濃度は、各々、分光計法によって試験された総タンパク質および多糖の濃度からＨＭＷタンパク質およびＨＭＷ多糖を除することにより決定した。
【０１０９】
結果
生体高分子、ビルディングブロック、低分子量（ＬＭＷ）酸および中性物を、親水性（ＨＩ）ＤＯＣ内容物の一部として定量する場合の初期レベルに関する溶存有機炭素（ＤＯＣ）含量における変化は、各ＭＢＲにつき比較した（図３Ａ）。
【０１１０】
膜が完全に汚損した時点まで、ＭＢＲ−Ｃ、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおける総ＤＯＣ濃度がすべて、それらの初期値と比較して増加した。ＰＡＣはＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中のＰＡＣの飽和点まで最初にある量のＤＯＣを吸着し得たが、より長い操作時間の結果、最終段階でより高いＤＯＣ濃度を生じた。興味深いことには、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中のＤＯＣ組成は、その他の２つとは有意に異なっていた。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて、ＤＯＣは、主としてＬＭＷ中性物および疎水性（ＨＢ）ＤＯＣよりなり、それらは総ＤＯＣ含量の７６％および２０％に寄与した。対照的に、ＬＭＷ中性物およびＨＢ ＤＯＣの合計は、ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶにおいて５０％未満であった。さらに、ビルディングブロック、生体高分子およびＬＭＷ酸のすべてがＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中で有意に減少したが、それらすべてが他の２つのＭＢＲ中で増加した。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中の高ＭＷの有機化合物（例えば、生体高分子およびビルディングブロック）の減少は、ＰＡＣＱＱビーズの懸濁の延長の結果として低ＭＷの有機物へのこれらの分子の分解によることができた。これらの結果は、ＱＳ分子に加えて、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおける微生物の変動がこれらのビルディングブロック、生体高分子およびＬＭＷ酸を生物学的に分解し得ることを示唆する。しかしながら、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中の最終汚損は、（ｉ）微生物または高分子による細孔の部分的な妨害のため、経時的なＰＡＣの吸着容量の低下、および／または（ｉｉ）長期間操作中のＡＩ−２クエンチング活性における低下（図２Ｃ）のためであり得る。
【０１１１】
加えて、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱについてのＳＭＰ中の芳香族化合物の存在は、各々、７４および３６％有意に低下させ、それはＰＡＣへの芳香族化合物の強い親和性に帰する。
【０１１２】
操作の終わりにて、ＭＢＲ−Ｃ、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおける総タンパク質および多糖の濃度は、各々、２７、５１および５ｍｇ／Ｌであると判明した（図３Ｂ）。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中のこれらの物質の有意により低い濃度は、膜生物汚損におけるＱＱメカニズムの役割を示した。多糖の濃度は、ＭＢＲ−ＰＡＣＶを除いてすべてのＭＢＲの混合液中のＬＭＷおよびＨＭＷのタンパク質よりも高かった。ＤＯＣ組成と一緒のこれらの結果は、多糖（生体高分子＝多糖＋タンパク質（ＨＭＷ＋ＬＭＷ））がケーキ層形成により有意に寄与するが、ＬＭＷ有機物が部分的または完全に膜の細孔に入り、その結果、流体学的に不可逆性の膜生物汚損を生じることを示唆する。これは、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて特に重要であり、２．４倍のより長い操作時間は、ＭＢＲ−ＰＡＣＶと比較して、Ｒｐにおいて１．６倍増加させた。
【０１１３】
図４（グラフＡ〜Ｃの下部）は、すべてのＭＢＲにおける異なる時間的間隔にて、結合ＥＰＳの炭水化物に対するタンパク質の比（ＰＮ／Ｃ）および結合ＥＰＳの濃度を示す。結合ＥＰＳは、ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶの双方で増加し、膜が汚損した場合に、約７０ｍｇ／ｇ ＶＳＳのままであった。この比率も最初の４日以内にＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中で増加したが、それはその後に徐々に減少し、膜が汚損した場合に、約５０ｍｇ／ｇ ＶＳＳを維持した。ＥＰＳが膜表面上のバイオフィルム・マトリックスの空間的配置を維持するのを助けることは広く受け入れられいる。理論による拘束を望むことなく、ＱＱビーズはＥＰＳの放出を低下させ、かくして、バイオフィルム層形成を崩壊させると考えられる。
【０１１４】
実施例７：汚泥特性の変更
パフォーマンスおよび汚泥特徴付け。化学的酸素要求量（ＣＯＤ）、汚泥容積指標（ＳＶＩ）、混合液浮遊物質（ＭＬＳＳ）および揮発性浮遊物質（ＶＳＳ）は、標準分析法により分析した[American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA), Water Environment Federation (WEF), Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st ed., Washington, DC, 2012]。溶存酸素（ＤＯ）および固有酸素摂取速度（ＳＯＵＲ）はマルチメーター（XL600, Fisher Scientific,米国）を用いて分析した。フロックサイズ分布は、粒径分析器(SALD-3101, Shimadzu,シンガポール）を用いてモニターした。また、汚泥フロックは、蛍光顕微鏡（Nikon-ECLIPSE、日本）を用いて時々画像化した。毛管吸引時間（ＣＳＴ）に関する汚泥脱水性は、ＣＳＴ装置(Ofite 294-50, OFI Testing Equipment Inc.,米国）を用いて評価した。混合液のゼータ電位および導電率（ＥＣ）はzetasizer (MRK570-01, Malvern,英国）によって測定した。
【０１１５】
固有酸素摂取速度（ＳＯＵＲ）を頻繁に用いて、呼吸活性を特徴付け、かつ細胞の生理的な状態を推論した[Biochem. Eng. J. 49 (2010) 289-307]。ＳＯＵＲは、表６に示されるごとく、ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶにおいて同じであるが、それはＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおける実験の終わりに２倍になった。これは、ＱＱ現象またはバクテリアのシグナリング中の混乱が微生物細胞の代謝活性に直接的な影響を及ぼすこともでき、それはバクテリアのコミュニケーションにおける中断の間に現れる欠乏条件と関係し得ることを示す。
【０１１６】
フロックサイズ分布は、試験の全体にわたってモニターした。表６に示されるごとく、ＭＢＲ−Ｃにおけるフロックサイズは有意に変わらなかったが、それは操作の終わりまで、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中で、各々、５９％および１２８％増加した。顕微鏡画像（図５）は、ＭＢＲ−Ｃからの、ＭＢＲ−ＰＡＣＶへ、さらにＭＢＲ−ＰＡＣＱＱへの汚泥フロックサイズを増加させる傾向を明確に示している。汚泥フロックサイズの減少は、ＱＱを補足したＭＢＲ中で報告されている[H. Waheed, Y. Xiao, I. Hashmi, D. Stuckey, Y. Zhou, Insights into quorum quenching mechanisms to control membrane biofouling under changing organic loading rates, Chemosphere. 182 (2017) 40-47]、かくして、かかる増加はＱＱビーズ中のＰＡＣに起因するようである。ＰＡＣの添加は、生物学的安定性、汚泥沈降性を高め、そのより大きな表面積により活性汚泥法の有効性を改善し、これは支持媒体として働き、バクテリアに適切な環境を供給する。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱと比較したＭＢＲ−ＰＡＣＶ中のより小さな汚泥フロックは、汚泥とのＰＡＣのより短い接触時間のためであることができた。すべてのＭＢＲのうち最低のＣＳＴ値によって証明されるごとく、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ中のより大きなフロックはよりよい脱水性に寄与し得る（表６）。
【０１１７】
【表６】
2020500698.tif 000009
【０１１８】
ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶからの汚泥のゼータ電位は、各々、比較的安定な約−８および−１４ｍＶを維持した（図４。Ａ〜Ｃのグラフ上部）。ＥＰＳにおけるタンパク質、フミン酸、ウロン酸および核酸のごとき個々のＥＰＳ成分が、一般的に多糖より、表面電荷源である豊富なイオン化官能基を運ぶので、ゼータ電位の絶対値の増加はＰＮ／Ｃ比における増加のためであり得る。それにより、ＱＱによりＥＰＳの組成を変更することも、得られた汚泥のゼータ電位に影響し得る。典型的には、より負のゼータ電位はより多くの負電荷を運び、それは反発的な静電的相互作用を増加させ、凝集プロセスに影響する。前記に示されるごとく、ＰＡＣの添加は汚泥フロックサイズを増加させ；それにより、約−１２ｍＶの初期の安定化後のＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおける−１８ｍＶ未満までの突然の落下が、より大きなフロックサイズにより脱水性の増加を相殺しなかった。
【０１１９】
実施例８：ＭＢＲパフォーマンスおよびミクロ汚濁物質除去
ＭＢＲ中の選択された医薬化合物のＣＯＤ除去効率に対するＰＡＣまたはＱＱの添加の効果を検討した。
【０１２０】
方法
化学的酸素要求量（ＣＯＤ）、汚泥容積指標（ＳＶＩ）、混合液浮遊物質（ＭＬＳＳ）および揮発性浮遊物質（ＶＳＳ）は、標準分析法により分析した[American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA), Water Environment Federation (WEF), Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st ed., Washington, DC, 2012]。
【０１２１】
ＭＢＲ実験からの水性試料中のＰｈＡＣは、Xiaoら. [Chem. Eng. J. 321 (2017) 335-345]により従前に記載のごとく、６−ｍＬ  ３０−μｍ Oasis（登録商標）ＨＬＢ固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（Waters, シンガポール）を用いて濃縮した。汚泥またはビーズに吸着されたＰｈＡＣ量は、液液抽出を用いて、１ｍＬの混合液試料または１０個の無作為に選択されたビーズから抽出した。ビーズを抽出前に乳棒で粉砕した。前処理後、ＰｈＡＣを液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した。
【０１２２】
ＡＪＳ電気スプレーインターフェースを装備したAgilent ６４６０（米国）ＱＱＱ三連四重極質量分析器（ＭＳ）をＰｈＡＣの分析に用いた。装置設定は、全測定につき以下の通り最適化した：インターフェース電圧、３．５ｋＶ；乾燥ガス温度、３２５℃；乾燥ガス（Ｎ２）流速、８Ｌ／分；シースガス温度、３００℃；シースガス（Ｎ２）流速、１１Ｌ／分。Agilent  １２９０ Infinity II ＨＰＬＣをクロマトグラフ分離に用いた。１００×２．１ｍｍ Kinetex ２．６μｍビフェニルカラム（Phenomenex、米国）は、０．１％ ギ酸（Ａ）および０．１％ギ酸を含むメタノール（Ｂ）と共に用い、１０分以内に１０％（ＡＨＬにつき５％）から８５％Ｂへの勾配とした。
【０１２３】
結果
同様のＣＯＤ除去効率（９３．０±２．５、９５±４および９２．１±１．５％）は、各々、ＭＢＲ−Ｃ、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて達成した。ＰＡＣまたはＱＱの添加の結果、ＣＯＤ除去におけるいずれの有意な変化も生じなかった。
【０１２４】
図６は、ＭＢＲにおいて選択された医薬化合物の除去効率を示し、医薬化合物は、トリメトプリム（ＴｒＭＰ）、スルファメトキサゾール（ＳＭＸ）、カルバマゼピン（ＣＢＺ）、ジクロフェナク（ＤＣＦ）およびトリクロサン（ＴＣＳ）であった。ＴｒＭＰ、ＳＭＸ、ＣＢＺ、ＤＣＦおよびＴＣＳの除去効率は、ＭＢＲ−ＰＡＣＶにおいて、各々、７１±１５、８０±７、６３±２１、８２±８および６７±２２％であったが；効率はＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおけるすべてのＰｈＡＣにつきわずかに増加した。ＣＢＺは、すべてのＰｈＡＣ中で最小の除去効率を示した。しかしながら、ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱの間のＰｈＡＣ除去効率における統計的有意差は観察しなかった（すべてにつきｐ＞０．０５）。また、汚泥に吸着されたＰｈＡＣは、双方のＭＢＲにつき分析した（図７）。比較的低濃度のＳＭＸ、ＤＣＦおよびＴＣＳのより低い濃度が汚泥で判明し、かくして、これらの成分は、高度に分解性であると考えることができる。平均ＴｒＭＰ濃度は０．１８〜０．９１μｇ／ｇＶＳＳの範囲にあったが、ＣＢＺについての値は、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱにおいて０．８８〜１．２８μｇ／ｇＶＳＳであった。したがって、ＴｒＭＰおよびＣＢＺの除去は、生物分解よりむしろ吸着によるものであり得る。他方、ビーズ中の吸着されたＴｒＭＰ、ＳＭＸ、ＣＢＺ、ＤＣＦ、ＴＣＳについてのｔ検定のｐ値は、各々、０．４２５、０．１１９、０．４２８、０．１５９および０．６１７であった。ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱの間の吸着されたＰｈＡＣにおける統計的有意差は観察されなかった（すべてにつきｐ＞０．０５）。
【０１２５】
すべてのＰｈＡＣの運命（fate）を計算し、図７に示す。この図は、ＳＭＸ、ＤＣＦおよびＴＣＳの運命に対する生物分解の寄与がＱＱ株の添加で増加したことを明確に示す。これは、ＤＣＦで特に顕著であり、汚泥に対する生物分解（３３％）および吸着（４２％）を介してＰＡＣＶにおいて除去されたが、ＰＡＣＱＱにおいては生物分解（８６％）を介して主として除去された。ＱＱビーズ上に吸着されたすべてのＰｈＡＣの生物分解性の一貫性は、ＰＡＣ−ＱＱビーズの有効性を示す。さらに、ＰＡＣビーズに吸着された汚濁物質量を定量化し、表７に示す。ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱの透過において達成したよりよい除去効率、および双方のＭＢＲの汚泥中の吸着質の同じ濃度に関係なく、ＱＱバクテリア捕捉ビーズ上に吸着したＰｈＡＣの濃度は、空ＰＡＣビーズよりはるかに高かった。ミクロの汚濁物質の取り込みまたは吸着が吸着剤に対する吸着部位の有効性に一般的に依存することは周知である。したがって、ＰＡＣに吸着された汚濁物質が、炭素源としてバクテリア株によってさらに利用され、かくして、吸着部位のうちのいくつかを再生成し、全体的な除去効率を高めると推測し得る。
これらの見解は、同時の吸着および生物分解がＰＡＣ−ＱＱビーズを介して可能であり得ることを示唆する。
【０１２６】
【表７】
2020500698.tif 000010
【０１２７】
実施例９：微生物コミュニティーにおける変動
ＭＢＲ中のＱＱまたはＰＡＣの効果についてのよりよい理解のために、Illumina MiSeq高性能配列決定法を用いて微生物コミュニティーを分析した。
【０１２８】
ＲＮＡ抽出および微生物コミュニティー分析
ＭＢＲからのバルク汚泥、バイオケーキおよびビーズの二連試料を操作が終了した場合に、−８０℃にて直ちに冷凍させた。ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは、Toweら [J. Microbiol. Methods. 84 (2011) 406-412]の方法を用いて、冷凍試料から抽出した。混合物は製造者の指示に従い、ＲＱ１ RNaseフリーＤＮアーゼ（Promega、米国）で処理して、ＲＮＡを得た。ｃＤＮＡは、製造者のプロトコールにより４０μｌの全容積中でGoScript Reverse Transcription System（Promega、米国）を用いて、ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡは、Research Technology Support Facility, Michigan State University,米国にてIllumina Miseqプラットフォーム上で配列決定するために用いた。二重の指標を付けたIllumina適合性ライブラリーは、Takahashiら [PLOS ONE. 9 (2014)]によって記載されたプライマーを用いて調製し、これを広範囲のバクテリアおよび古バクテリア種の１６Ｓ rRNAのＶ３〜Ｖ４領域を増幅した。ＰＣＲに続いて、反応生成物をInvitrogen Sequal Prep DNA標準化プレートを用いて標準化し、回収したＤＮＡをプールした。最終プールはAmpureXPを用いてクリーンアップした。ライブラリープールは、Qubit dsDNAアッセイ、Caliper LabChipGXおよびKapa Illumina Library Quantification qPCR キットの組合せを用いて確証および定量化した。各プールは、Illumina MiSeq standard v2 フローセルに負荷し、配列決定をv2 500 サイクル  試薬カートリッジを用いて2x250bp 対のエンドフォーマットにおいて行った。
【０１２９】
配列決定データは、QIIME 1 パイプライン[Nat. Methods. 7 (2010) 335-336] を用いて解析した。対合したエンドデータを50 bpのmin_オーバーラップおよび 15 %のperc_max_diffの設定にてjoin_paired_ends scriptを用いて連結し、次いで、QIIME [N.A. Bokulich, et al.,Nat. Methods. 10 (2013) 57-59]におけるデフォルト戦略を用いて品質をフィルタリングした。配列は、オープンリファレンスＯＵＴピッキングプロトコール（open-reference OUT picking protocol）[PeerJ. 2 (2014)]を用いて操作上の分類単位（ＯＴＵ）にクラスター化した。多様性はコア多様性解析スクリプトを用いて解析し、結果は、Emperorツールを備えた主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットにおいて視覚化した[Y. Vazquez-baezaら, GigaScience. 2 (2013) 16].
【０１３０】
ＰＣｏＡプロット（図８）は、３つのＭＢＲのバイオケーキ、ならびにＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱの汚泥間の微生物コミュニティーにおいて有意差が存在したことを示す。プロテオバクテリア門のメンバーは、すべてのコミュニティー（図９）における最も優位な群であり、ＯＵＴカウントは３４〜５５％の範囲にあった。このバクテリアに続いたものは、すべての汚泥またはバイオケーキコミュニティー中でアクチノバクテリア（１９〜３６％）であった。候補ＴＭ７門のメンバーは、ＭＢＲ−Ｃのバイオケーキにおいて優位な群（２６〜３０％）であったが、それは他のコミュニティーにおいてかろうじて存在し、ＭＢＲ−ＰＡＣＶにおいてシアノバクテリア（１１〜２２％）のメンバーおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱのバイオケーキにおいてバクテロイデス（２４〜２５％）により大きく置き換わった。剪断力（shear forces）に起因する微生物コミュニティーに対する同様の影響も逆浸透膜において観察したので、ビーズによって生成された流体力は、ＭＢＲ−ＣおよびＭＢＲ−ＰＡＣＶの間の微生物コミュニティーの差異に導く主要因子であり得た。しかしながら、ＰＡＣも、微生物コミュニティーのシフトに寄与することができた。ＭＢＲ−ＰＡＣＶおよびＭＢＲ−ＰＡＣＱＱ間の微生物コミュニティーの差異は、ＱＱ活性に帰することができた。ＭＢＲ間の微生物コミュニティーのこれらの差異の結果、ＭＢＲにおける別個のＡＨＬプロフィール（図２）を生じた。
【０１３１】
ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱのバイオケーキの微生物コミュニティーが同一リアクター中の汚泥のものとは異なったことに注目する価値がある。バクテロイデスの存在量（abundance）は汚泥中で３〜５％に大きく低下したが、プロテオバクテリアおよびアクチノバクテリアの組成が、各々、汚泥中で８〜５０％および３２〜３６％、バイオケーキ中で３９〜４１％および１９〜２１％に増加した。ＭＢＲ中のバイオケーキおよびバルク汚泥間の微生物コミュニティーのこの差異は、フルスケールのＭＢＲにおい広範囲に観察され、ＨＲＴ、Ｆ／Ｍ（食物−対−微生物の比）またはＭＬＳＳの変動は、バイオケーキ形成に対して選択圧を創生した。しかしながら、本願発明者および関係者によって行った実験室での試験において、バイオケーキ中の微生物コミュニティーはバルク汚泥においてのものに非常に類似した。スピロソーマおよびコマモナス（Comamondaceae）科の未確認の属は、バイオケーキ中の２つの優位な種類であり、各々、総ＯＵＴカウントの約２２％および約１４％を占めたが、メチロシスティス科およびストレプトミセス科の２つの未確認の種類は、バルク汚泥中の優位な種類であり、各々、約１７％および約１０％の存在量であった。スピロソーマのメンバーは、規定された連続的ステージ下の新鮮な川のバイオフィルムとしてのみ増殖することが観察された[Microb. Ecol. 50 (2005) 589-601]。また、バクテロイデスは、超音波処理下の嫌気性ＭＢＲのバイオケーキ中の重要な部分であり、これはタンパク質ＥＰＳの生成を増加させたEPS [Z. Yu, X. Wen, M. Xu, X. Huang, Characteristics of extracellular polymeric substances and bacterial communities in an anaerobic membrane bioreactor coupled with online ultrasound equipment, Bioresour. Technol. 117 (2012) 333-340]。かくして、ＥＰＳでの多糖生成の主要な抑制で、ＱＱ活性は、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱバイオケーキで微生物コミュニティーのバランスを乱し、スピロソーマの増殖に有利である。
【０１３２】
また、図８および９は、非常に別個の微生物コミュニティーがＰＡＣＶとＰＡＣＱＱのビーズ中で形成されたことを示す。プロテオバクテリアは、依然として、これらのビーズにおいて最も優位な門（４６〜５５％）であったが、ユリアーキオータのメタン生成菌は、大部分のアクチノバクテリアを置換し、ＰＡＣＶおよびＰＡＣＱＱのビーズにおいて、各々、第２（１５〜２１％）および第３（１３〜１５％）の最も優位な門を形成した。メタノサエタ属は、ほとんど双方のビーズ中のユリアーキオータの単独の（＞９９．５％）メンバーであった。加えて、ファーミキューテスのメンバーは、ＰＡＣＶおよびＰＡＣＱＱのビーズ中で、各々、８〜１３％および５〜７％に増加した。メタノサエタおよびファーミキューテスの双方は、一般的にメタン生成リアクター中に存在することが知られている。これらの結果は、酸素がアルギン酸塩ビーズに拡散できず、この結果、ビーズ内部の低下条件が形成し、メタン形成が、ＰＡＣＶおよびＰＡＣＱＱのビーズの内部の物質代謝の活性ルートであり得ることを示唆する。ＭＢＲ中のメタン生成菌によって生成されたメタンは、ＭＢＲにおいて、多数のメタン−酸化バクテリアを含む科であるメチロシスティスのメンバーによって利用し得る。酸化および還元条件の双方の存在は、双方のリアクター内部のＰｈＡＣの高生物分解に寄与し得る。
【０１３３】
ＡＩ−２分解大腸菌株を除いたＱＱ株の同じ種類のメンバーは、ＰＡＣＱＱビーズ中にすべて存在した。しかしながら、それらの存在量は非常に低かった（総ＯＵＴカウントの＜０．５％）。これらの微生物の存在は、ミクロバクテリウム属を除いたこれらの種類もＰＡＣＶビーズ中に存在した（総ＯＵＴカウントの＜０．５％）ので、ＱＱ株の生存および活性を保証しない。かくして、ビーズ中の微生物コミュニティーは、リアクター中の汚泥によって主として影響された。ＰＡＣＱＱビーズの微生物コミュニティー中の大腸菌の不存在は、ＭＢＲ−ＰＡＣＱＱリアクター中のＡＩ−２レベルの増加を説明する（図２Ｃ）。
【０１３４】
実施例１０：ＱＱ株によるＡＨＬの嫌気性分解
４種のＱＱ株による嫌気性条件におけるＡＨＬの分解についての能力は、バッチテストで検討した。この実施例においてテストされた４種のＱＱ株のすべては、高いＡＨＬ分解効率を好気的に示した。４種のＱＱ株は、活性汚泥から分離されたミクロバクテリウム種ＱＱ１、シュードモナス・プレコグロッシキダＱＱ２、シュードモナス種ＱＱ３、およびエンテロバクタークロアカＱＱ１３である。
【０１３５】
Ｃ４−、Ｃ６−、Ｃ７−、Ｃ８−、Ｃ１０−、３ＯＣ６−、および３ＯＣ８−ＨＬを含むＡＨＬの混合物（各々、約１００μｇ／Ｌ）をＰＢＳ緩衝液中で嫌気的に調製した。５ミリリットル（５ｍＬ）の各々の一晩のＱＱ培養物を洗浄し、Ｎ２でフラッシングしたＰＢＳの１ｍＬ中に再懸濁し、４ｍＬのＡＨＬ溶液を含むＨｕｎｇａｔｅチューブに添加した。５ｍＬの最終体積を有する混合物をＮ２でフラッシングし密閉した。次いで、チューブを回転振盪機中で１００ｒｐｍで３５℃にて４時間培養した。試料は、液液抽出およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってＡＨＬの分析のために指定された間隔（以下を参照）にて採取した（本明細書に用いる詳細な方法について前記「材料および方法」を参照）。
【０１３６】
結果
４種のＱＱ株を好気的に増殖させ、嫌気性条件に移した場合、ＱＱ２およびＱＱ３株の洗浄した細胞はＡＨＬを分解できず、残余のＡＨＬは対照より大きかった（図１２を参照）。対照的に、すべてのＡＨＬの有意な分解は、ＱＱ１およびＱＱ１３株、特にＱＱ１株の洗浄されたセルによって達成し、対照よりも２０〜３０％より多くＡＨＬ（３ＯＣ８−ＨＬを除く）を分解した。ＱＱ１とＱＱ１３の双方は、４時間以内に３ＯＣ８−ＨＬをほとんど完全に分解した。
【０１３７】
３０分間の遅滞期を株ＱＱ１によってＣ４−ＨＬおよび３ＯＣ６−ＨＬの分解について観察した。しかしながら、他のＡＨＬについて遅滞期は観察しなかった（データを示さず）。ＱＱ１株によるすべてのＡＨＬの分解傾向は、擬一次反応によく適合でき（Ｒ２＞０．８６）、それは対照（データを示さず）でのＡＨＬの自然崩壊のゼロ次反応速度論とは全く異なる。これらの結果は、ＱＱ１株のＱＱ酵素が嫌気性条件において依然として活性であったことを示唆する。
【０１３８】
実施例１１：嫌気性ＭＢＲ操作および膜間差圧（ＴＭＰ）傾向
４種のＱＱ株（ミクロバクテリウム種ＱＱ１、シュードモナス・プレコグロッシキダＱＱ２、シュードモナス種ＱＱ３およびエンテロバクタークロアカＱＱ１３）は、ポリマーコートしたアルギン酸塩ビーズ上で固定化し、三連のＭＢＲに添加した。ＴＭＰが３０ｋＰａに達した場合、操作を終了した。
【０１３９】
バクテリアの固定化
ＱＱ株をアルギン酸塩ビーズ中で固定化し、ポリマー膜でコートした。略言すると、ＱＱ株を５ｍＬの培養物の抽出により新鮮な増殖した培養物から収穫し、次いで、遠心分離して、バクテリアペレットを提供し、次いで、５ｍＬのＮａＣｌ溶液（０．０５％ｗ／ｖのＮａＣｌ濃度を有する）で再懸濁した。次いで、これらの混合物をアルギン酸Ｎａ溶液（２％ｗ／ｖ）に添加（１０％ｖ／ｖ）し、蠕動ポンプを用いて、１ｍＬ／分の速度でノズルを通してＣａＣｌ２溶液（４％ｗ／ｖ）に滴下し；ＣａＣｌ２溶液に３時間浸漬した後に、ビーズをポリスルホン溶液（Ｎ−メチル−２−ピロリドン中の８％ｗ／ｖ）に１０秒間浸した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏに移し、使用まで４℃にて貯蔵した。ここで作製したビーズを以下、ＱＱビーズという。
【０１４０】
空ビーズは、前記と同じ手順（ＣａＣｌ２溶液中へのアルギン酸Ｎａ溶液の滴下）であるが、ＮａＣｌ溶液におけるＱＱの添加なくして作製した。
【０１４１】
ＭＢＲ操作
ハンドメイドのＰＶＤＦ中空繊維膜モジュール（０．１μｍの細孔サイズおよび０．００７ｍ２の表面積）を装備した同一の４種の実験室スケールの浸漬ＡｎＭＢＲ（有効容積０．５Ｌ）を用いて、ブドウ糖、ペプトン、肉エキスおよび他のミネラルから構成される合成廃水（ＣＯＤ 約５００ｍｇ／Ｌ）を処理した[Chem. Eng. J. 321 (2017) 335-345]。ＡｎＭＢＲを実験室において同じ供給材料で維持された嫌気性消化汚泥に撒き、３５℃、９時間のＨＲＴおよび８ ＬＭＨの一定の流れで作動させた。各ＱＱ株について、３つのＭＢＲを空ビーズ（Ｃ−ＭＢＲ）およびＱＱビーズ（ＱＱ−ＭＢＲ）の添加で引き続いて作動させた。膜差圧（ＴＭＰ）を連続的にモニターし、圧力センサーおよびデータロガー（data logger）で記録した。
【０１４２】
結果
三連のＭＢＲは、その中の空ビーズとは非常に異なって行ない、それらをＭＢＲ１、ＭＢＲ２およびＭＢＲ３につき、各々、２６、１１４および４１時間で汚損させた。それらのＭＢＲ中のハンドメイドの膜モジュールが同様の透過抵抗（７．３±０．５×１０１１ｍ−１）およびガススパージング（sparging）速度（０．４１±０．０４Ｌ／分）を有したので、汚損率の差は、多孔分散管（sparger）のガス泡の不均等分布に起因し、これの結果、有効な研磨に差異を生じさせた。
【０１４３】
ＱＱ２、ＱＱ３およびＱＱ１３の添加は生物汚損制御に対していずれの有益な効果も示さず、それらのＱＱ−ＭＢＲ中の汚損率は、Ｃ−ＭＢＲとほとんど同じ（ＱＱ２）かまたはそれより速かった（ＱＱ３とＱＱ１３）（データを示さず）。対照的に、ＱＱ１はかなり生物汚損を遅延させ、濾過時間がＭＢＲ１およびＭＢＲ２において、各々、３．６および３．０倍延長した（図１３）。ＭＢＲ３におけるガス多孔分散管中の機能障害はそのパフォーマンスを害し、濾過時間において１．６倍延長させた（データを示さず）。
【０１４４】
バイオガス中の６０％のメタン含量を含むＣＯＤの７０％を超える除去は、すべてのＱＱ１−ＭＢＲにおいて達成し、これはＣ−ＭＢＲと同じであった。かくして、ＣＯＤ除去およびメタン生成についてのＭＢＲのパフォーマンスは、ＱＱ１の添加によって影響されなかった。
【０１４５】
実施例１２：ＥＰＳ生成およびＡＨＬ分解に対するＱＱの影響
分析
８５ｍＬのＭＢＲ上清中のＡＨＬを１００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、１００μＬのアセトニトリル中で濃縮した。次いで、それらをＡＪＳ電気スプレー・インターフェースを装備したAgilent 6460 (米国)ＱＱＱ三連四重極質量分析器（ＭＳ）を用いて分析した(Waheed, H. et al., Chemosphere 182, 40-47)。
【０１４６】
汚泥中のＥＰＳを抽出し、可溶性（Ｓ）、緩く結合した（ＬＢ）および堅く結合した（ＴＢ）カテゴリーに分類した。各部分における多糖およびタンパク質含量はフェノール硫酸法およびローリー法で決定した。詳細は、従前に記載した(Waheed, H. ら, Chemosphere 182, 40-47)。
【０１４７】
固有膜（Ｒｍ）、細孔閉塞（Ｒｐ）およびケーキ層（Ｒｃ）についての膜透過抵抗は、比流速にて膜を通る超純水の濾過のＴＭＰを測定することによってダルシー則に基づいて評価した(Waheed, H. et al., Chemosphere 182, 40-47)。ＣＯＤは、標準分析法(American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation, 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st ed)により測定した。バイオガス組成は、Shimadzu GC 2010 Plusガスクロマトグラフを用いて分析した(Chem. Eng. J. 321, 335-345)。
【０１４８】
結果
ＡｎＭＢＲ中のＱＱ１による汚損制御の機序を評価するため、Ｃ−ＭＢＲおよびＱＱ１−ＭＢＲ中の初期（作動の始め）および最終（作動の終わり）のＥＰＳレベルをモニターし、図１４にプロットした。多糖に対するタンパク質の比がＬＢ−ＥＰＳおよびＴＢ−ＥＰＳにつき５〜２０、ならびにＳ−ＥＰＳにつき６〜４０であったので、タンパク質は双方のＭＢＲ中の優位な成分であった。双方のリアクター中のＬＢおよびＴＢ−ＥＰＳ中の多糖レベルがそれらの初期レベルと比較して低下したが、それらは、Ｓ−ＥＰＳにおいて増加した。これはビーズ研磨から生じ、水相へ結合した多糖を水相に解離させたかもしれない。対照的に、ＥＰＳの３つのすべての画分における最終タンパク質レベルは、４４％だけ有意に低下したＱＱ１−ＭＢＲ中のＬＢ−ＥＰＳでのそれを除いて、初期のものと同じことを維持した。これらの結果は、ＱＱ１がＡｎＭＢＲｓ中のタンパク質のＬＢ−ＥＰＳ生成を大きく抑制したことを示唆する。
【０１４９】
１１種の定量可能なＡＨＬのうち、Ｃ４−、Ｃ６−、Ｃ８−ＨＬおよびＣ１０−ＨＬだけをＡｎＭＢＲにおいて検出した。１９〜４３ｎｇ／Ｌの濃度で、Ｃ４−ＨＬは、それら中で最も高濃度を有した。Ｃ６−ＨＬおよびＣ８−ＨＬの濃度は１〜２０ｎｇ／Ｌの範囲にあり、それは好気性ＭＢＲにおけるものと同様であった。Ｃ１０−ＨＬは０．７〜０．９ｎｇ／Ｌの最小レベルで検出した。ＡｎＭＢＲをまさに始めた場合、Ｃ４−ＨＬはＣ−ＭＢＲにおいて約２４ｎｇ／Ｌであったが、ＱＱ１−ＭＢＲにおいて検出せず（図１５）；ＱＱ１−ＭＢＲにおけるＣ６−およびＣ８−ＨＬは、Ｃ−ＭＢＲにおけるものよりさらに有意に低かった。しかしながら、ＡｎＭＢＲを汚損した場合、３種のＡＨＬの濃度は２種のＡｎＭＢＲ間で有意に異なっていなかった。これらの結果は、ＱＱビーズが操作の初めにてそれらの最も高活性を有することもできるが、活性が経時的に減少したことを示唆する。２種のＡｎＭＢＲにおけるＣ１０−ＨＬ濃度間の有意差は、いずれの段階でも観察せず、バッチ試験の結果と対照をなした（図１２）。ビーズ上のポリマーコーティングは、Ｃ１０−ＨＬの拡散を遮断したかもしれなかった。
【０１５０】
ＱＱ活性（バイオフィルム形成）がＡＨＬの閾値濃度により引き起こされることが注目されるべきである；かくして、それはＡＨＬの濃度に比例しない。ＱＱ１−ＭＢＲにおけるＣ４−ＨＬ、Ｃ６−ＨＬおよびＣ８−ＨＬの濃度は、それらが始められた場合、閾値濃度より低くなり得、これはＴＭＰジャンプの遅延に導き得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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