(57)【要約】本明細書においていくつかの場合において提供されるのは、ヌクレオシド三リン酸およびリボ核酸の生成のための方法および組成物である。
2020536570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成に適切な条件下でインキュベートすること
を含み、任意にここで、反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む、前記方法。
【請求項２】
反応混合物中、５’ヌクレオシド一リン酸（５’ＮＭＰ）、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＤＰの生成に適切な条件下でインキュベートすること
をさらに含み、任意にここで、反応混合物は、ＮＭＰキナーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物中、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）と、
（ａ）ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）および無機リン酸とを、５’ＮＤＰの生成に適切な条件下で（任意にここで、反応混合物は、ヘリカーゼをさらに含む）；または
（ｂ）リボヌクレアーゼとを、５’ＮＭＰの生成に適切な条件下で、
インキュベートすること
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
反応混合物中、ＮＴＰ、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成に適切な条件下でインキュベートすること
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＮＤＰが、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰおよび／またはＵＤＰを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＮＤＰが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
５’ＮＭＰが、５’ＡＭＰ、５’ＧＭＰ、５’ＣＭＰおよび／または５’ＵＭＰを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
５’ＮＭＰが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１またはＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択され、任意にここで、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）が、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのＰＰＫ２（配列番号１）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
（ａ）ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、PNPase、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはＲＮＡポリメラーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、PNPase、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはＲＮＡポリメラーゼを発現または生成する細胞から調製されるか；または、
（ｂ）反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、PNPase、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはＲＮＡポリメラーゼを発現または生成する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含み、任意にここで、細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されており、および任意にここで、細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、プロテアーゼターゲティング、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、化学阻害剤、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、
前記方法。
【請求項１２】
ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含み、および任意にここで、細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、請求項３〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中、細胞ＲＮＡおよびリボヌクレアーゼ（RNase）を、５’ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）の生成に適切な条件下でインキュベートすること；
（ｂ）RNaseを除去すること；ならびに
（ｃ）反応混合物中、または、第２の反応混合物中、ＮＭＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成に適切な条件下で、インキュベートすること、任意にここで、ステップ（ｃ）の反応混合物は、ＮＭＰキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中、細胞ＲＮＡ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）および無機リン酸を、５’ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）の生成に適切な条件下でインキュベートすること、任意にここで、反応混合物は、ヘリカーゼをさらに含み、
（ｂ）PNPaseを除去すること；ならびに
（ｃ）反応混合物中、または第２の反応混合物中、ＮＤＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成に適切な条件下でインキュベートすること、任意にここで、ステップ（ｃ）の反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
RNaseが、ヌクレアーゼＰ１またはRNase Rである、請求項１５に記載の方法
【請求項１８】
細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含み、任意にここで、細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１またはＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択され、および任意にここで、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）が、Deinococcus geothermalis（配列番号１）からのクラスＩＩＩのＰＰＫ２を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
RNaseまたはPNPaseが、RNaseまたはPNPaseを発現する細胞から調製されるか、またはここで、（ａ）の反応混合物が、RNaseまたはPNPaseを発現する細胞から調製された細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、化学阻害剤、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介してRNaseまたはPNPaseを除去することを含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはＲＮＡポリメラーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞から調製されるか、またはここで、ステップ（ａ）またはステップ（ｃ）の反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはＲＮＡポリメラーゼを発現または生成する細胞から調製された細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されており、および任意にここで、細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、プロテアーゼターゲティング、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、化学阻害剤、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはＲＮＡポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年１０月１１日に出願された米国仮出願番号６２／５７１，０７１の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
リボ核酸（ＲＮＡ）は、リボヌクレオチドの反復単位を含み、遺伝子発現およびタンパク質合成を含む重要な細胞のプロセスにおいて役割を果たす。したがって、ＲＮＡは、細胞の基礎的なプロセスを調節するための魅力的な標的である（例えば、細胞性免疫応答を誘導するＲＮＡワクチン）。商業スケール（例えばグラム〜キログラム）でのＲＮＡの低コスト生成は、しかし、出発材料（例えばヌクレオシド三リン酸(triphosphate)（ＮＴＰ））および反応構成要素（例えばＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼ）のコストに部分的に起因して、難しい。高品質なＲＮＡを商業的に妥当なスケールにおいて提供することは、ＮＴＰとＲＮＡとの両方のコスト効率的な生成を必要とする。
【発明の概要】
【０００３】
要旨
本明細書において提供されるのは、低コスト基質（例えば細胞ＲＮＡ、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、および／またはヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ））、組み換えおよび／または内在の酵素（例えばキナーゼおよび／またはポリメラーゼ）、ならびにエネルギーソース（例えばＮＴＰ、ポリリン酸(polyphosphate)、および／またはピロリン酸(pyrophosphate)）を利用するように開発された生合成経路を用いる、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの低コスト生成（生合成）のための系、方法、組成物（例えば細胞、細胞ライセート、試薬、および反応混合物）ならびにキットである。ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成は、いくつかの場合において、望ましくない酵素活性を最小化し（例えば減少させるか、阻害するか、および／またはこれを取り除き）、それにより所望される最終生成物のプロセスの効率および収率を増大させるように設計された、in vitroおよび／またはセルフリーライセートの系を用いて達成される。
【０００４】
本明細書において記載される生合成経路は、典型的には、ポリリン酸キナーゼおよびポリリン酸を、内在経路酵素およびリン酸ソースに対する代替物として利用する。
したがって、本開示のいくつかの側面は、反応混合物中で、ＮＤＰ（例えばＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、および／またはＵＤＰ）、ポリリン酸キナーゼ（例えばＰＰＫ２）、およびポリリン酸（例えばヘキサメタリン酸）を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む、ＮＴＰを生成するための方法および組成物を提供する。図２Ａにおいて示されるとおり、ＰＰＫは、ポリリン酸からＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰおよびＵＤＰへリン酸を転移させ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＤＰおよびＵＴＰの生成をもたらす。いくつかの場合において、この反応混合物は、ＮＤＰキナーゼ（例えばｎｄｋ）をさらに含む。
【０００５】
本開示の他の側面は、ＮＴＰを生成するための系、方法、組成物、およびキットを提供し、これらは、反応混合物中で、ＮＭＰ（例えば５’−ＡＭＰ、５’−ＣＭＰ、５’−ＧＭＰ、および／または５’−ＵＭＰなどの５’−ＮＭＰ）ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ＮＭＰキナーゼまたはＮＤＰキナーゼ（例えばｎｄｋ）をさらに含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ＮＭＰキナーゼ（例えばａｄｋ、ｃｍｋ、ｇｍｋおよび／またはｐｙｒＨ）ならびにＮＤＰキナーゼ（例えばｎｄｋ）をさらに含む。
【０００６】
本開示のなお他の側面は、ＮＴＰを生成するための系、方法、組成物、およびキットを提供し、これらは、反応混合物中で、ヌクレオシド（例えばアデノシン、シチジン、グアノシン、および／またはウリジン）、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼおよびＮＤＰキナーゼをさらに含む。
【０００７】
本開示のさらなる側面は、ＮＴＰを生成するための系、方法、組成物、およびキットを提供し、これらは、反応混合物中で、核酸塩基（例えばアデニン、シトシン、グアニン、および／またはウラシル）、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼおよびＮＤＰキナーゼをさらに含む。
【０００８】
いくつかの場合において、ＮＴＰの生合成のための出発材料（例えばＮＭＰ、ＮＤＰ、および／またはヌクレオシド）は、細胞ＲＮＡから生成される。したがって、本開示のいくつかの側面は、ＮＴＰを生成するための系、方法、組成物、およびキットを提供し、これらは、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡ（例えば単細胞または多細胞生物から得られたもの）、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）および無機リン酸を、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）の生成のために好適な条件下においてインキュベートすること；（ｂ）PNPaseを除去すること（および任意に他の望ましくない酵素活性を除去すること）；ならびに（ｃ）生じる反応混合物中で、ＮＤＰ、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすること、を含む。いくつかの場合において、ステップ（ｃ）の反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む。あるいは、方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）、PNPase、無機リン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ヌクレオシド二リン酸の生成のために好適な条件下においてインキュベートすること（任意にここで、反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む）；（ｂ）PNPaseを除去すること；ならびに（ｃ）ＮＴＰの生成のために好適な条件下において、反応混合物をインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、必要とされる経路酵素（例えばポリリン酸キナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼ）は、PNPaseを除去（例えば、減少させるか、阻害するか、および／またはこれを取り除く）ために用いられた条件への暴露の後で、それらの活性（例えば、それらの活性のうちの少なくとも５０％）を保持するように、除去条件（例えば、高温または化学阻害剤への暴露）に耐えることができる。
【０００９】
本開示の他の側面は、ＮＴＰを生成するための系、方法、組成物、およびキットを提供し、これらは、（ａ）第１の反応混合物中で、細胞ＲＮＡおよびリボヌクレアーゼ（RNase、例えばRNase RまたはヌクレアーゼＰ１）を、ＮＭＰ（例えば５’−ＮＭＰ）の生成のために好適な条件下においてインキュベートすること；（ｂ）RNaseを除去すること（および任意に他の望ましくない酵素活性）；ならびに（ｃ）生じる反応混合物中で、ＮＭＰ、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすること、を含む。いくつかの場合において、ステップ（ｃ）の反応混合物は、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼまたはＮＭＰキナーゼとＮＤＰキナーゼとの両方をさらに含む。あるいは、方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡ、RNase、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＭＰ（例えば５’−ＮＭＰ）の生成のために好適な条件下においてインキュベートすること；（ｂ）RNaseを除去すること；ならびに（ｃ）反応混合物を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすること、を含んでもよい。
【００１０】
本明細書において生成されるＮＴＰは、いくつかの場合において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ）の生成のために用いられる。このことは、例えば、ＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を、本明細書において記載されるようなＮＴＰの生成のために用いられる反応混合物のいずれかに添加することにより、達成することができる。あるいは、ＮＴＰは、単離して、ＲＮＡを生成するために別の反応混合物中でＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼと組み合わせてもよい。したがって、本開示は、ＲＮＡの生成のために方法および組成物を提供する。
【００１１】
本明細書において記載される生合成経路のいずれかにおいて、核酸塩基、ヌクレオシド、ＮＭＰ、ＮＤＰ、またはＮＴＰは、出発基質として用いられる場合、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または他の手段により生成されたものであってよい。
本明細書において記載される系、反応混合物、および方法において用いられるポリリン酸キナーゼは、表２または１２において列記されるポリリン酸キナーゼのいずれかから選択することができる。いくつかの場合において、ポリリン酸キナーゼは、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む。
ポリリン酸は、経路酵素のための基質として役立つ任意のポリリン酸であってよい。いくつかの場合において、ポリリン酸は、ヘキサメタリン酸である。
【００１２】
細胞ＲＮＡが用いられる態様において、細胞ＲＮＡは、例えば、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む。細胞ＲＮＡは、単細胞生物（例えば細菌もしくは酵母）または多細胞生物（例えば植物）からのものであってよい。
本開示において有用な生合成経路の酵素は、例えば、経路の酵素（例えばヌクレアーゼ（RNasesおよび／またはPNPasesなど）、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼ）を発現する細胞（例えば操作された細胞）から調製された（単離および／または精製された）（少なくとも１つの）細胞ライセートから得てもよい。これらの細胞ライセートを調製するための例示的な方法は、本明細書において記載される。あるいは、反応混合物は、経路の酵素を発現する細胞（例えば操作された細胞）から調製された細胞ライセート（単一の細胞ライセートまたは細胞ライセートの混合物）を含んでもよい。すなわち、完全な反応は、当該経路の組み換え酵素および／または内在酵素、ならびにＮＴＰの生成のために必要とされる他の反応構成要素（例えばポリリン酸）を含む、細胞ライセートまたは細胞ライセートの混合物中で行ってもよい。いくつかの場合において、（少なくとも１つの）精製された経路酵素を、反応混合物に添加する。
【００１３】
細胞ライセートから得られた細胞ライセートまたは酵素を含む反応混合物について、本明細書において記載される除去方法のいずれかを用いて望ましくないネイティブな酵素活性を除去することが、有利であり得る。望ましくないネイティブな酵素活性として、例えば、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼが挙げられる。いくつかの場合において、ネイティブな酵素活性は、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、局在化（例えば周辺質ターゲティング）、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去される。他の態様において、ネイティブな酵素活性は、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコールまたは他の溶媒、および／または化学阻害剤を介して除去される。さらに他の態様において、ネイティブな酵素活性は、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去される。
【００１４】
本発明のいくつかの態様の詳細は、添付の例、図面および詳細な説明において記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、ヌクレオチドを出発材料として用いる、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）および下流のリボ核酸（ＲＮＡ）の生成のための生合成経路を示す。図１Ｂは、高エネルギーリン酸戦略の例を示し、ここではポリリン酸が反応混合物に供給される。図１Ｃは、さらなる高エネルギーリン酸戦略の例を示す。
【００１６】
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａは、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）を出発材料として用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。図２Ｂは、５’ヌクレオシド一リン酸（５’−ＮＭＰ）を出発材料として用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。図２Ｃは、ヌクレオシドを出発材料として用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。図２Ｄは、核酸塩基を出発材料として用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、核酸塩基およびリボースを出発材料として用いるＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。
【００１７】
【図３Ａ】図３Ａは、細胞ＲＮＡを出発材料として用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。この経路において、ポリヌクレオチドホスホリラーゼが、細胞ＲＮＡをＮＤＰに分解するために用いられる。図３Ｂは、細胞ＲＮＡを出発材料として用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。この経路において、リボヌクレアーゼが、細胞ＲＮＡをＮＭＰに分解するために用いられる。
【００１８】
【図４Ａ】図４Ａは、ポリリン酸キナーゼの身を用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。図４Ｂは、ポリリン酸キナーゼ（例えばＰＰＫ２）と、ＡＴＰ／ＡＤＰ依存性キナーゼ（例えばａｄｋ、ｃｍｋ、ｇｍｋおよび／もしくはｐｙｒＨなどのＮＭＰキナーゼ、ならびに／またはｎｄｋなどのＮＤＰキナーゼ）との両方を用いる、ＮＴＰおよび下流のＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。
【００１９】
【図５】図５は、５’−ＮＭＰから開始するＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。
【図６】図６は、細胞ＲＮＡから開始するＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。模式図は、鋳型、キナーゼ、およびポリメラーゼがＲＮＡ生成反応の間に添加される例を示す。
【００２０】
【図７】図７は、細胞ＲＮＡから出発する、ＲＮＡの生成のための生合成経路を示す。模式図は、一例を示し、ここでは、鋳型は、脱重合期またはＲＮＡ生成期の間に添加してよく、キナーゼは、脱重合期またはＲＮＡ生成期の間に添加してよく、ポリメラーゼは、脱重合期またはＲＮＡ生成期の間に添加してよい。
【００２１】
【図８Ａ】図８Ａは、過剰発現されたRNase Rを用いてE. coliライセートからＲＮＡの脱重合の間に経時的に生成された、酸溶解性ヌクレオチド（ｍＭ）のグラフを示す。酸溶解性ヌクレオチドは、ＵＶ吸光度により測定した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＲＮＡポリメラーゼおよび脱重合の間に生成されたＮＭＰ（−ＮＭＰ）または精製されたＮＭＰ（＋ＮＭＰ、各４ｍＭ）を含む反応において生成されたＲＮＡ生成物のアガロースゲルを示す。略語：? 2log：2-log DNA ladder（New England Biolabs）、ＮＭＰ：５’−ＮＭＰ、RNA Pol：熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの当モルの混合物、鋳型１：直鎖状ＤＮＡ鋳型、鋳型２：プラスミドＤＮＡ鋳型。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａは、１ｍｇ／ｍＬの精製されたRNase Rを用いて、精製されたＲＮＡの脱重合の間に経時的に生成された、酸溶解性ヌクレオチド（ｍＭ）のグラフを示す。酸溶解性ヌクレオチドは、ＵＶ吸光度により測定される。
【図９Ｂ】図9Bは、ＲＮＡポリメラーゼおよび精製されたＲＮＡの脱重合により生成されたＮＭＰを含む反応の間に生成された、ＲＮＡ生成物のアガロースゲルを示す。陰性対照として、ＲＮＡポリメラーゼの不在下において反応を行った。略語：? 2log：2-log DNA ladder（New England Biolabs）、ＮＭＰ：５’−ヌクレオシド一リン酸の当モル混合物、RNA Pol：熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型１：直鎖状ＤＮＡ鋳型、鋳型２：プラスミドＤＮＡ鋳型。
【００２３】
【図１０】図１０は、３７℃で野生型ポリメラーゼ（Ｗ）または熱安定性ポリメラーゼ変異体（Ｔ）を用いるセルフリーＲＮＡ合成により生成された、ＲＮＡ生成物のアガロースゲルを示す。略語：? 2log：2-log DNA ladder（New England Biolabs）、Ｗ：野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs）、Ｔ：熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型１：直鎖状ＤＮＡ鋳型、鋳型２：プラスミドＤＮＡ鋳型。
【００２４】
【図１１Ａ】図１１Ａは、単独キナーゼとしてのＤｇＰＰＫ２または５−酵素ライセート系のいずれかを含む反応の応答因子（市販のｄｓＲＮＡ内部標準の面積に対する目的のｄｓＲＮＡの面積の比として計算される）の、プロットを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＤｇＰＰＫ２ライセート、５−酵素ライセート系を含む反応において生成されたｄｓＲＮＡ生成物、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いない陰性対照のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００２５】
【図１２Ａ】図１２Ａは、精製されたRNase RまたはヌクレアーゼＰ１を用いて多様なＲＮＡのソースの脱重合の間に経時的に生成された、酸溶解性ヌクレオチド（ｍＭ）のグラフを示す。酸溶解性ヌクレオチドは、ＵＶ吸光度により測定した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、E. coliまたは酵母からヌクレアーゼＰ１を用いてＲＮＡの脱重合の間に経時的に生成された、利用可能な５’−ＮＭＰのパーセンテージのグラフを示す。利用可能な５’−ＮＭＰのパーセンテージは、ＬＣ−ＭＳにより決定した。
【００２６】
【図１３】図１３は、様々な温度にわたる、GL17-109からのライセートのＲＮＡ脱重合についてのヌクレオミクス的（nucleomic）プロフィールのプロットを示す。２０の分析物の累積濃度を示す。ヌクレオシドは、白い細点パターンにおいて示し、最小限に生成された。５０℃についてのデータを収集したが、これは示さない。
【図１４】図１４は、酢酸の周期性リン酸化を通してのピロリン酸からのＡＴＰの生成のための酵素経路の模式図である。略語の意味は、以下のとおりである：ＡｃＫ１＝第１の酢酸キナーゼ、ＡｃＫ２＝第２の酢酸キナーゼ、ＰＰｉ＝無機ピロリン酸、Ｐｉ＝無機リン酸、ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸、ＡＤＰ＝アデノシン二リン酸、およびアセチル−Ｐ＝アセチル−リン酸。
【００２７】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、クエン酸からのＡＴＰの生成のための酵素経路の模式図である。図15Aは、クエン酸およびピロリン酸からのＡＴＰ生成のための３つの酵素反応を表す。図15Bは、全体的な化学反応を表す。略語の意味は、以下のとおりである：ＰＰｉ＝無機ピロリン酸、ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸、ＣＯ２＝二酸化炭素、Ｐｉ＝無機リン酸、ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸、およびＡＭＰ＝アデノシン一リン酸。
【００２８】
【図１６】図１６は、亜硫酸からのＡＴＰの生成のための酵素経路の模式図である。略語の意味は、以下のとおりである：ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸、ＡＭＰ＝アデノシン一リン酸、ＡＰＳ＝アデノシン５’−ホスホ硫酸、およびＰＰｉ＝無機ピロリン酸。
【００２９】
【図１７】図１７は、ｄｓＲＮＡのセルフリー合成が、ヌクレオチドソースにかかわらず、類似の生成物力価をもたらすことを示すグラフである。
【図１８】図１８は、ｄｓＲＮＡのセルフリー合成が、中温性の反応温度において、野生型および熱安定性変異体のＲＮＡポリメラーゼに匹敵する生成物力価をもたらすことを示すグラフである。
【００３０】
【図１９】図19は、ＮＴＰのセルフリー合成が、ヌクレオチドソースにかかわらず、４８℃における１時間のインキュベーションの後で類似のＮＴＰ力価をもたらすことを示すグラフである。ヌクレオチドの各々のソース（細胞ＲＮＡ、精製ＮＭＰまたは精製ＮＤＰ）について、約４ｍＭの各ヌクレオチドを提供するために十分な基質の量を、反応に添加した。例えば、ＮＤＰとの反応は、各４ｍＭのＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰおよびＵＤＰを含んだ。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本開示は、いくつかの側面において、費用対効果の高い反応構成要素、例えば細胞ＲＮＡ基質または単量体基質、例えば核酸塩基、ヌクレオシド、ＮＭＰまたはＮＤＰ、組み換えされたおよび／または精製された経路酵素（例えばホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ）、高エネルギーリン酸のソース（例えばポリリン酸）、および／またはＤＮＡ鋳型を利用する、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のための生合成経路を提供する。
【００３２】
反応構成成分
細胞ＲＮＡ．細胞ＲＮＡは、例えば、細胞の材料（バイオマス）から得られるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む。細胞ＲＮＡは、限定されないが、酵から、またはプロセスの廃水流からの、単細胞生物（例えば細菌および酵母）ならびに多細胞生物（例えば植物および動物）を含む細胞の材料の任意のソースから得てよく、例えば、酵素（例えばキナーゼ）を発現するライセートから得られた細胞ＲＮＡであってよい。
核酸塩基．核酸塩基は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの窒素塩基構成要素である。核酸塩基は、遺伝子コードの基本単位として機能する。核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を含む。核酸塩基は、シュードウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）および７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）を含むが、これらに限定されない、修飾された核酸塩基を含む。
ヌクレオシド．ヌクレオシドは、五炭糖（例えばリボース）に連結した核酸塩基である。ヌクレオシドの例として、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンが挙げられる。
【００３３】
ヌクレオチド．ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびリン酸基を含む。１つのリン酸基を有するヌクレオシドは、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）であり、これは、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、およびウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を含む。２つのリン酸基を有するヌクレオシドは、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）であり、これは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、およびウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を含む。３つのリン酸基を有するヌクレオシドは、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）であり、これは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。
【００３４】
ホスホリボシルトランスフェラーゼ．アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRTase）などのホスホリボシルトランスフェラーゼは、細胞において、ヌクレオチド生合成に対する代替を提供するヌクレオチドサルベージ経路に関与する。APRTaseは、プリンヌクレオチドサルベージ経路において、以下の反応を触媒する：アデニン＋ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）−＞アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）＋ピロリン酸（ＰＰｉ）。
リボキナーゼ．リボキナーゼは、高エネルギーリン酸ソース（例えばＡＴＰまたはポリリン酸）からＤ−リボースへリン酸を転移させて、Ｄ−リボース−５−リン酸を形成する酵素である。例として、E. coliのrbsK遺伝子生成物、およびThermus sp. 2.9のQT17_05185遺伝子生成物が挙げられる。
【００３５】
ホスホペントムターゼ．ホスホペントムターゼは、リボース−リン酸分子中のリン酸を転移させる酵素である。特に、ホスホリボムターゼは、Ｄ−リボース−１−リン酸とＤ−リボース−５−リン酸との可逆的相互変換を触媒する。例として、E. coliのdeoB遺伝子生成物およびThermotoga maritimaのTM0167遺伝子生成物が挙げられる。
ヌクレオシドホスホリラーゼ．ヌクレオシドホスホリラーゼは、以下の可逆的反応を触媒する酵素である−核酸塩基＋Ｄ−リボース−１−リン酸＜＝＞ヌクレオシド＋無機リン酸。プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、プリン核酸塩基（例えばアデニン、グアニン）およびプリンヌクレオシド（例えばアデノシン、グアノシン）との反応などを触媒する。ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、ピリミジン核酸塩基（例えばシトシン、ウラシル）およびピリミジンヌクレオシド（例、シチジン、ウリジン）との反応などを触媒する。ヌクレオシドホスホリラーゼの例として、E. coliのdeoD、xapAおよびudp遺伝子生成物、ならびにThermus thermophilus HB27のTtPNPI、TtPNPIIおよびTtPyNP、酵素が挙げられる。
【００３６】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ．ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）は、加リン酸分解的な３’から５’へのエキソリボヌクレアーゼ活性および３’末端オリゴヌクレオチドポリメラーゼ活性を有する、二官能性酵素である。PNPaseは、無機リン酸を補助基質として用いて、ヌクレオシド５’二リン酸（ＮＤＰ）へのＲＮＡの分解を触媒することができる。ＲＮＡを分解するためにPNPaseを使用しながらの高濃度の無機リン酸の使用により、PNPase活性を駆動しつつ、同時に、反応混合物中に存在し得るホスファターゼ活性に起因する潜在的なＮＤＰ収量の損失を減少させることができる。なぜならば、無機リン酸は、かかる望ましくない活性を阻害することが知られているからである。いくつかの場合において、PNPaseは、任意に１つ以上のヘリカーゼと組み合わせて、ＲＮＡのＮＤＰへの分解を触媒するために用いられる。ヘリカーゼを添加することにより、構造化されたＲＮＡのアクセシビリティを改善することにより、PNPaseにより媒介される細胞ＲＮＡの脱重合を改善することができる。
【００３７】
ヌクレアーゼ．ヌクレアーゼは、ＤＮＡ（DNases）またはＲＮＡ（RNases）の骨格中のホスホジエステル結合を切断する酵素である。したがって、リボヌクレアーゼ（RNases）は、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）へのＲＮＡの分解を触媒することができる。本明細書において提供されるようにＲＮＡを脱重合するために用いることができる酵素の非限定的な例を、表１において提供する。いくつかの場合において、１つより多くのヌクレアーゼが、ＲＮＡを脱重合するために、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるヌクレアーゼが、反応混合物中で用いられる。
【００３８】
表１．ＲＮＡ脱重合のための酵素の例
【表１】
2020536570.tif 000003
【００３９】
キナーゼ．キナーゼとは、一般に、高エネルギーリン酸供与分子（例えばＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、またはポリマー中にｎ個のリン酸基を含むポリリン酸）から特異的な基質／分子へのリン酸基の転移を触媒する酵素である。このプロセスは、リン酸化された基質、および高エネルギーリン酸供与分子の脱リン酸化された形態（例えばＡＤＰ、ＧＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、またはポリマー中にｎ−１個のリン酸基を含むポリリン酸）を生成する。本明細書において提供されるような用途のためのキナーゼの非限定的な例として、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、およびポリリン酸キナーゼが挙げられる。
【００４０】
ポリリン酸キナーゼ．ポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸（ＰｏｌｙＰｎ）などの高エネルギーのリン酸供与分子から、特異的な基質／分子への、リン酸基の転移を触媒する酵素である。このプロセスは、リン酸化として言及され、ここで、基質は、リン酸基を獲得し、高エネルギーのリン酸供与分子は、リン酸基を供与する。このエステル転移反応は、リン酸化された基質および供与されたリン酸基を失ったリン酸供与分子（ＰｏｌｙＰｎ−１など）を生成する。本開示のポリリン酸キナーゼは、いくつかの場合において、ヌクレオシドをＮＭＰに、ＮＭＰをＮＤＰに、および／またはＮＤＰをＮＴＰに転換する。ポリリン酸キナーゼの非限定的な例を、表２において提供する。いくつかの場合において、１つより多くのポリリン酸キナーゼが、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるポリリン酸キナーゼが、反応混合物中で用いられる。
【００４１】
表２．ポリリン酸キナーゼの例
【表２】
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【００４２】
ヌクレオシドキナーゼ．ヌクレオシドキナーゼは、高エネルギーリン酸供与分子（例えばヌクレオチド三リン酸）から、典型的にはヌクレオシドの糖部分（例えばアデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）の５’−ヒドロキシル基であるＲ−ＯＨアクセプターへの、ホスホリル転移を触媒する。このプロセスは、ヌクレオシドをＮＭＰ（例えばＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ）に転換する。いくつかの場合において、ヌクレオシドキナーゼは、リン酸供与分子からアデノシンへののリン酸の転移を触媒して、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を生成する。いくつかの場合において、ヌクレオシドキナーゼは、リン酸供与分子からシチジンへのリン酸の転移を触媒して、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）を生成する。いくつかの場合において、ヌクレオシドキナーゼは、リン酸供与分子からグアノシンへのリン酸の転移を触媒して、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を生成する。いくつかの場合において、ヌクレオシドキナーゼは、リン酸供与分子からウリジンへのリン酸の転移を触媒して、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を生成する。ヌクレオシドキナーゼの非限定的な例を、表３において提供する。いくつかの場合において、１つより多くのヌクレオシドキナーゼが、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるヌクレオシドキナーゼが、反応混合物中で用いられる。
【００４３】
表３．ヌクレオシドキナーゼの例
【表３】
2020536570.tif 000005
【００４４】
ＮＭＰキナーゼ．ヌクレオシド一リン酸キナーゼ（ＮＭＰキナーゼ）は、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）（通常はＡＴＰ）からの末端ホスホリル基の、ヌクレオシド一リン酸（例えばＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ）上のホスホリル基への転移を触媒する酵素である。このプロセスは、ＮＭＰをＮＤＰ（例えばＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＵＤＰ）に転換する。いくつかの場合において、ＮＭＰキナーゼは、リン酸供与分子からＡＭＰへのリン酸の転移を触媒して、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を生成する。いくつかの場合において、ＮＭＰキナーゼは、リン酸供与分子からＣＭＰへのリン酸の転移を触媒して、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）を生成する。いくつかの場合において、ＮＭＰキナーゼは、リン酸供与分子からＧＭＰへのリン酸の転移を触媒して、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）を生成する。いくつかの場合において、ＮＭＰキナーゼは、リン酸供与分子からＵＭＰへのリン酸の転移を触媒して、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を生成する。ＮＭＰキナーゼの非限定的な例を、表４において提供する。いくつかの場合において、１つより多くのＮＭＰキナーゼが、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるＮＭＰキナーゼが、反応混合物中で用いられる。
【００４５】
表４Ａ．ＡＭＰキナーゼ酵素の例
【表４Ａ】
2020536570.tif 000006
【００４６】
表４Ｂ．ＣＭＰキナーゼ酵素の例
【表４Ｂ】
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【００４７】
表４Ｃ．ＵＭＰキナーゼ酵素の例
【表４Ｃ】
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【００４８】
表４Ｄ．ＧＭＰキナーゼ酵素の例
【表４Ｄ】
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【００４９】
ＮＤＰキナーゼ．ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰキナーゼ）は、様々なＮＤＰ（例えばＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＵＤＰ）とヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）との間の末端リン酸の可逆的な様式における交換を触媒して、ＮＴＰ（例えばＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を生成する酵素である。いくつかの場合において、ＮＤＰキナーゼは、リン酸供与分子からＡＤＰへのリン酸の転移を触媒して、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成する。いくつかの場合において、ＮＤＰキナーゼは、リン酸供与分子からＣＤＰへのリン酸の転移を触媒して、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）を生成する。いくつかの場合において、ＮＤＰキナーゼは、リン酸供与分子からＧＤＰへのリン酸の転移を触媒して、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を生成する。いくつかの場合において、ＮＤＰキナーゼは、リン酸供与分子からＵＤＰへのリン酸の転移を触媒して、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を生成する。ＮＤＰキナーゼの非限定的な例を、表５において提供する。いくつかの場合において、１つより多くのＮＤＰキナーゼが、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるＮＤＰキナーゼが、反応混合物中で用いられる。
【００５０】
表５．ＮＤＰキナーゼの例
【表５】
2020536570.tif 000010
【００５１】
ＮＤＰをＮＴＰに転換するキナーゼの非限定的な例として、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼが挙げられる。本明細書において議論されるとおり、前述の酵素の熱安定性バリアントは、本開示により包含される。いくつかの場合において、ＮＤＰキナーゼは、Aquifex aeolicusから得られる。
【００５２】
ＮＭＰのＮＴＰへのリン酸化は、いくつかの場合において、ポリリン酸依存性キナーゼ経路を通して起こり、ここで、高エネルギーリン酸は、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を介して、ポリリン酸からＡＤＰに転移される。いくつかの場合において、ポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸からＡＤＰへ高エネルギーリン酸を転移させてＡＴＰを形成する、ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）ファミリーに属する。このＡＴＰは、その後、ＮＭＰキナーゼ（例えばＡＭＰキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ＧＭＰキナーゼ、およびＣＭＰキナーゼ）により、ＮＭＰをそれらのコグネートなリボヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）に転換するために用いられる。さらに、ＡＴＰは、その後、ヌクレオチド二リン酸キナーゼにより、ＮＤＰをＮＴＰに転換するために用いられる。
【００５３】
いくつかの場合において、ポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）ファミリーに属する。いくつかの場合において、ポリリン酸キナーゼは、クラスＩのＰＰＫ２ファミリーに属し、これは、ポリリン酸からＮＤＰへ高エネルギーリン酸を転移させてＮＴＰを形成する。当該系により生成されるＡＴＰは、ＮＭＰをＮＤＰに転換するために、高エネルギーリン酸供与体として用いられる。いくつかの場合において、ポリリン酸キナーゼは、クラスＩＩＩのＰＰＫ２ファミリーに属し、これは、ポリリン酸からＮＭＰおよびＮＤＰへ高エネルギーリン酸を転移させて、ＮＴＰを形成する。いくつかの場合において、クラスＩＩＩのＰＰＫ２は、単独で、ＮＭＰからＮＴＰを生成するために用いられる。他の態様において、クラスＩＩＩのＰＰＫ２は、他のキナーゼと組み合わせて用いられる。クラスＩＩＩのＰＰＫ２は、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸からＡＴＰを生成し、これはその後、ＮＭＰおよびＮＤＰキナーゼにより、ＮＭＰをＮＴＰに転換するために用いられる。
【００５４】
本明細書において提供されるような用途のためのＰＰＫ２酵素の非限定的な例を、表２において列記する。したがって、いくつかの場合において、ＰＰＫ２酵素は、熱安定性である。例えば、ＰＰＫ２酵素は、熱安定性クラスＩＩＩのＰＰＫ２酵素であってよく、これは、ポリリン酸重合と比較してＡＴＰ合成に有利でありＡＤＰおよびＡＭＰの両方をＡＴＰに転換する。いくつかの場合において、ＰＰＫ２酵素は、例えば１時間当たり１０〜８００ｍＭの範囲（例えば１時間当たり１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０または８００ｍＭ）の速度で、ヘキサメタリン酸などのポリリン酸をＡＴＰに転換するために用いられる。
【００５５】
ポリリン酸および他の高エネルギーリン酸．高エネルギーリン酸分子（リン酸供与分子）は、高エネルギー結合の加水分解によりエネルギーを放出し、それにより生化学反応のためのエネルギーソースを提供する。ポリリン酸（ＰｏｌｙＰｎ）および他の高エネルギーリン酸分子は、本明細書において記載されるようなＮＴＰの生成および下流のＲＮＡの生成のためのリン酸ソースとして用いることができる。ＰｏｌｙＰｎは、例えば、共有される酸素原子により一緒に連結したリン酸（ＰＯ４）の反復単位を含む。本開示のキナーゼによる特異的な基質／分子のリン酸化は、ＰｏｌｙＰｎからのリン酸基の供与を含み、それによりＰｏｌｙＰｎ−１を生成する。
【００５６】
本開示は、ポリリン酸中のリン酸基の数により限定されない。いくつかの場合において、ＰｏｌｙＰｎは、少なくとも３個のリン酸基を含む（ＰｏｌｙＰ３）。いくつかの場合において、ＰｏｌｙＰｎは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のリン酸基を含む。いくつかの場合において、ＰｏｌｙＰｎは、ヘキサメタリン酸である。
高エネルギーリン酸分子の他の例として、これらに限定されないが、ＮＴＰ（例えばＡＴＰ）、ＮＤＰ（例えばＡＤＰ）、ＮＭＰ（例えばＡＭＰ）、ホスホエノールピルビン酸、１，３−ビスホスホグリセリン酸、クレアチンリン酸、ホスホエノールピルビン酸、グルコース１−リン酸、フルクトース６−リン酸、およびグルコース６−リン酸が挙げられる。いくつかの場合において、１つより多くの高エネルギーリン酸が、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なる高エネルギーリン酸が、反応混合物中で用いられる。
【００５７】
鋳型．ＤＮＡ鋳型は、所望されるＲＮＡ生成物をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーター、任意に誘導性プロモーター、任意に転写ターミネーターを含む。ＤＮＡ鋳型は、典型的には、プラスミドなどのベクター上で提供されるが、他の鋳型のフォーマットを用いてもよい（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、化学合成、または当該分野において公知の他の手段により作製される直鎖状ＤＮＡ鋳型）。いくつかの場合において、１つより多くのＤＮＡ鋳型が、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるＤＮＡ鋳型が、反応混合物中で用いられる。
プロモーターまたはターミネーターは、天然に存在する配列または操作された配列であってよい。いくつかの場合において、操作された配列は、転写活性を増強するために修飾される。いくつかの場合において、プロモーターは、天然に存在する配列である。他の態様において、プロモーターは、操作された配列である。いくつかの場合において、ターミネーターは、天然に存在する配列である。他の態様において、ターミネーターは、操作された配列である。
【００５８】
ポリメラーゼ．ポリメラーゼは、核酸のポリマーを合成する酵素である。本開示のポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。ポリメラーゼの非限定的な例を、表６において提供する。いくつかの場合において、ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの場合において、１つより多くのポリメラーゼが、反応混合物中で用いられる。いくつかの場合において、２、３、４または５つの異なるポリメラーゼが、反応混合物中で用いられる。
【００５９】
表６．ＲＮＡポリメラーゼの例
【表６】
2020536570.tif 000011
【００６０】
ＲＮＡ生成物．本明細書において提供される方法により生成されるＲＮＡは、任意の型のＲＮＡであってよく、これは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。一本鎖ＲＮＡの非限定的な例として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびアンチセンスＲＮＡが挙げられる。本明細書における二本鎖ＲＮＡは、一本鎖領域（例えばループまたはオーバーハング）を含まない完全に二本鎖の分子、ならびに二本鎖領域および一本鎖領域（例えばループまたはオーバーハング）を含む部分的に二本鎖の分子を含む。したがって、単鎖ヘアピン型ＲＮＡ（short hairpin RNA：ｓｈＲＮＡ）は、本開示の方法により生成することができる。
本明細書において提供される方法により生成されるＲＮＡは、本明細書において記載されるように修飾してもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡは、本明細書において記載される方法に従って生成され、その後修飾される。いくつかの場合において、ＲＮＡは、修飾された出発材料を用いて、本明細書において記載される方法に従って生成される。いくつかの場合において、修飾された出発材料は、修飾された核酸塩基である。いくつかの場合において、修飾された出発材料は、修飾されたヌクレオシドである。いくつかの場合において、修飾された出発材料は、修飾されたヌクレオチドである。
【００６１】
いくつかの場合において、修飾されたＲＮＡは、骨格修飾を含む。いくつかの場合において、骨格修飾は、ヌクレアーゼにより媒介される分解の減少に起因して、ＲＮＡにより長い半減期をもたらす。これが、次いで、より長い半減期をもたらす。好適な骨格修飾の例として、これらに限定されないが、ホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオエート修飾、ｐ−エトキシ修飾、メチルホスホネート修飾、メチルホスホロチオエート修飾、アルキル−およびアリール−リン酸（ここで荷電されたホスホネート酸素が、アルキルまたはアリール基により置き換えられている）、アルキルホスホトリエステル（ここで、荷電された酸素部分がアルキル化されている）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）骨格修飾などが挙げられる。これらの修飾は、互いに組み合わせて用いても、および／またはホスホジエステル骨格連結と組み合わせて用いてもよい。
【００６２】
あるいは、または加えて、ＲＮＡは、塩基または糖部分における修飾を含む他の修飾を含んでもよい。例として、３’位置におけるヒドロキシル基以外および５’位置におけるリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するＲＮＡ（例えば２’−Ｏ−アルキル化リボース）、リボースの代わりにアラビノースなどの糖を有するＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡはまた、Ｃ−５プロピン修飾塩基などの置換されたプリンおよびピリミジンを包含する（Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996）。他のプリンおよびピリミジンとして、これらに限定されないが、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチンが挙げられる。他のかかる修飾は、当業者に周知である。
【００６３】
ＮＴＰ生成経路
本明細書において提供されるのは、多様な異なる酵素経路を通してのＮＴＰの生成のための系、方法、組成物、およびキットであり、これらの各々は、本明細書において提供されるようなエネルギーソースおよび低コスト出発材料を反応混合物において利用する。これらの酵素経路は、いくつかの場合において、ＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼを反応混合物に添加することにより、ＲＮＡの生成（例えばｍＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ）に拡張することができる（例えば図１を参照）。
本明細書において記載される経路酵素のいずれか（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、および／またはポリメラーゼ）は、修飾されていない（ネイティブな）または操作された細胞から得てもよいことが理解されるべきである。いくつかの場合において、経路酵素は、細胞から分泌される（例えば、細胞は、酵素を分泌するように操作される）。他の態様において、経路酵素は、細胞の細胞ライセートから得られる。いくつかの場合において、経路酵素は、細胞の細胞ライセートの構成要素であり、この場合において、細胞ライセートは、生合成反応において、反応混合物に添加されるか、反応混合物として働く。細胞ライセートが反応混合物中で用いられるかまたは反応混合物として働く場合において、細胞ライセートを、目的の生成物（ＮＴＰおよび／またはＲＮＡ）を生成する前に、以下に記載するような望ましくない酵素活性を除去するための条件に暴露することができる。
【００６４】
ＮＤＰのＮＴＰへの変換．いくつかの側面において、ＮＴＰは、図２Ａにおいて表されるとおり、ＮＤＰを基質として用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応混合物中で、ＮＤＰ、（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸キナーゼ、および（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成のための反応混合物は、ＮＤＰキナーゼを含む（例えば表５を参照）。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい.
【００６５】
ＮＭＰのＮＴＰへの変換．いくつかの側面において、ＮＴＰは、図２Ｂにおいて表されるとおり、５’ＮＭＰを基質として用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応混合物中で、５’−ＮＭＰ、（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸キナーゼ、および（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成のための反応混合物は、ＮＭＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはＮＤＰキナーゼ（例えば表５を参照）を含む。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい.
【００６６】
ヌクレオシドのＮＴＰへの変換．いくつかの側面において、ＮＴＰは、図２Ｃにおいて表されるとおり、ヌクレオシドを基質として用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応中で、ヌクレオシド、（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸キナーゼ、および（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼ（例えば表３を参照）および／またはＮＭＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはＮＤＰキナーゼ（例えば表５を参照）を含んでもよい。
【００６７】
核酸塩基のＮＴＰへの変換．いくつかの側面において、ＮＴＰは、図２Ｄにおいて表されるとおり、核酸塩基を基質として用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応混合物中で、核酸塩基、（例えば１、２、３または４つ）のホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸キナーゼ、および（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ＮＭＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはＮＤＰキナーゼ（例えば表５を参照）を含んでもよい。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
いくつかの場合において、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のための生合成経路は、最初に細胞ＲＮＡをＮＤＰに脱重合すること、または最初に細胞ＲＮＡをＮＭＰに脱重合することにより、細胞ＲＮＡを基質として用いてもよい。
【００６８】
核酸塩基およびリボースのＮＴＰへの変換．いくつかの側面において、ＮＴＰは、図２Ｅにおいて表されるとおり、核酸塩基を基質として用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応中で、核酸塩基、Ｄ−リボース、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、少なくとも１つ（例えば１、２、３または４つ）のヌクレオシドホスホリラーゼ、少なくとも１つ（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸キナーゼ、および少なくとも１つ（例えば１、２、３または４つ）のポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、少なくとも１つのＮＭＰキナーゼ（例えば表３を参照）および／または少なくとも１つのＮＤＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００６９】
細胞ＲＮＡのＮＴＰへのＮＤＰを介する変換．いくつかの側面において、図３Ａにおいて表されるとおり、ＮＴＰは、最初に細胞ＲＮＡをＮＤＰに破壊（分解／脱重合）すること、および次いでＮＤＰをＮＴＰに転換することにより、細胞ＲＮＡを基質として用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応混合物中で、細胞ＲＮＡ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、およびリン酸を、ＮＤＰの生成のために好適な条件下において、インキュベートすることを含んでもよい。ＮＴＰの生成を進行させるために、反応混合物は、いくつかの場合においてはまた、ポリリン酸キナーゼおよびポリリン酸を含む。したがって、方法はさらに、反応混合物を、ＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい.
【００７０】
細胞ＲＮＡのＮＴＰへのＮＭＰを介する変換．いくつかの側面において、ＮＴＰは、図３Ｂにおいて表されるとおり、最初に細胞ＲＮＡを５’−ＮＭＰに破壊すること、および次いでＮＭＰをＮＤＰに、およびＮＤＰをＮＴＰに転換することにより、細胞ＲＮＡを基質を用いて生成される。例えば、ＮＴＰ生成方法は、反応混合物中で、細胞ＲＮＡおよびリボヌクレアーゼを、５’−ＮＭＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。ＮＴＰの生成を進行させるために、反応混合物、いくつかの場合においてはまた、ポリリン酸キナーゼおよびポリリン酸を含む。したがって、方法はまた、反応混合物をＮＴＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む。いくつかの場合において、ＮＴＰ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。あるいは、ＮＴＰ生成方法は、反応混合物中で、細胞ＲＮＡ、ＲＮＡを３’−ＮＭＰに切断するリボヌクレアーゼ、および適切なホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ他）を、ヌクレオシドの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。ホスファターゼは、次いで、ＮＴＰの生成に進行する前に、除去されるであろう。
【００７１】
ＲＮＡ生成経路
図１において示すとおり、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ）は、多様な異なる酵素経路を通して生成してもよく、これらの各々は、本明細書において記載されるような、エネルギーソースおよび低コスト出発材料を、反応混合物においてを利用する。したがって、ＲＮＡの生成のための系、方法、組成物、およびキットが、本明細書において提供される。
【００７２】
ＮＤＰのＲＮＡへの変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図２Ａにおいて表されるとおり、ＮＤＰを基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、ＮＤＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ＮＤＰキナーゼを含んでもよい（例えば表５を参照）。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００７３】
ＮＭＰのＲＮＡへの変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図２Ｂにおいて表されるとおり、５’ＮＭＰを基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、５’ＮＭＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ＮＭＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはＮＤＰキナーゼ（を参照例えば表５）を含んでもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００７４】
ヌクレオシドのＲＮＡへの変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図２Ｃにおいて表されるとおり、ヌクレオシドを基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、ヌクレオシド、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含む。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼ（例えば表３を参照）および／またはＮＭＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはＮＤＰキナーゼ（例えば表５を参照）を含んでもよい。
【００７５】
細胞ＲＮＡのＲＮＡへのＮＤＰを介する変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図３Ａにおいて表されるとおり、最初に細胞ＲＮＡをＮＤＰに破壊することにより、細胞ＲＮＡを基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、細胞ＲＮＡ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、およびリン酸を、ＮＤＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。ＲＮＡの生成に進行する前に、最終生成物を分解することを回避するために、PNPaseを除去することは、有利であり得る。したがって、方法はさらに、PNPaseを除去すること、および反応混合物中で、または第２の反応混合物中で、ＮＤＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００７６】
いくつかの場合において、これらの経路酵素は、以下において議論するとおり、除去条件を耐えることができ、したがって、全ての反応構成要素は、単一の（ワンステップ）反応混合物中に含まれる。例えば、ＲＮＡ生成方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡ、PNPase、リン酸、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、ＮＤＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすること（任意にここで、反応混合物は、ＮＤＰキナーゼをさらに含む）、（ｂ）PNPaseを除去すること、ならびに（ｃ）反応混合物を、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。
【００７７】
細胞ＲＮＡのＲＮＡへのＮＭＰを介する変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図３Ｂにおいて表されるとおり、最初に細胞ＲＮＡを５’ＮＭＰに破壊することにより、細胞ＲＮＡを基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、細胞ＲＮＡおよびリボヌクレアーゼを、５’ＮＭＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。ＲＮＡの生成に進行する前に、最終生成物を分解することを回避するために、リボヌクレアーゼを除去することは、有利であり得る。したがって、方法はさらに、リボヌクレアーゼを除去すること、および、反応混合物中で、または第２の反応混合物中で、５’ＮＭＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、反応混合物は、ＮＭＰキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼさらに含む。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００７８】
いくつかの場合において、これらの経路酵素は、以下において議論するとおり、除去条件を耐えることができでき、したがって、全ての反応構成要素は、単一の（ワンステップ）反応混合物中に含まれる例えば、ＲＮＡ生成方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡ、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、ＮＭＰの生成のために好適な条件下においてインキュベートすること（任意にここで、反応混合物は、ＮＭＰキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼさらに含む）、（ｂ）リボヌクレアーゼを除去すること、ならびに（ｃ）反応混合物を、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。
【００７９】
核酸塩基のＲＮＡへの変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図２Ｄにおいて表されるとおり、核酸塩基を基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、核酸塩基、（例えば１、２、３または４つ）のホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ＮＭＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはＮＤＰキナーゼ（例えば表５を参照）を含んでもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、ヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００８０】
核酸塩基およびリボースのＲＮＡへの変換．いくつかの側面において、ＲＮＡは、図２Ｅにおいて表されるとおり、核酸塩基を基質として用いて生成される。例えば、ＲＮＡ生成方法は、反応混合物中で、核酸塩基、Ｄ−リボース、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、少なくとも１つ（例えば１、２、３または４つ）のヌクレオシドホスホリラーゼ、少なくとも１つのポリリン酸キナーゼ、少なくとも１つのポリリン酸、少なくとも１つのＤＮＡ鋳型、および少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡの生成のために好適な条件下においてインキュベートすることを含んでもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡ生成反応混合物はまた、少なくとも１つのＮＭＰキナーゼ（例えば表３を参照）および／または少なくとも１つのＮＤＰキナーゼ（例えば表４を参照）および／またはヌクレオシドキナーゼを含んでもよい。
【００８１】
酵素ソース
本明細書において提供される経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）のうちのいずれか（例えば１つ、２つ、３つもしくはそれより多く）または全ては、内在の（修飾されていない）酵素であっても、細胞により発現される組み換え酵素であってもよい。いくつかの場合において、経路酵素は、反応混合物中に含まれる細胞ライセートの構成要素として提供される。いくつかの場合において、経路酵素は、細胞ライセートから精製され、反応混合物中に含められる。いくつかの場合において、経路酵素は、細胞ライセートの構成要素として提供され、経路酵素は、細胞ライセートから精製される。いくつかの場合において、経路酵素は、細胞ブロスから、分泌されて、任意に精製される。
【００８２】
いくつかの場合において、経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）は、細胞から精製される内在酵素であり、精製された酵素として反応混合物中に含まれる。いくつかの場合において、経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）は、内在酵素は、反応混合物中に含まれる細胞ライセートの構成要素として提供される。いくつかの場合において、経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）は、細胞から精製される組み換え酵素であり、精製された酵素として反応混合物中に含まれる。いくつかの場合において、経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）は、反応混合物中に含まれる細胞ライセートの構成要素として提供される組み換え酵素である。いくつかの場合において、経路酵素は、細胞ブロスから、分泌されて、任意に精製される。
【００８３】
本開示はまた、細胞から分泌された内在酵素および組み換え酵素を包含する。したがって、いくつかの場合において、経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）は、細胞から分泌される内在酵素である。いくつかの場合において、経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）は、細胞から分泌される組み換え酵素である。
【００８４】
望ましくない酵素活性の除去
本明細書において提供される多様な態様において、経路酵素を発現する細胞または細胞のライセートから調製される酵素を、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のための反応混合物中で用いる。これらの細胞または細胞ライセートにおいて、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡ生成に対して有害効果を有し得る酵素が存在する。かかる酵素の非限定的な例として、Escherichia coli細胞により発現されるもののような、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、および／またはヒドロラーゼが挙げられる。ホスファターゼは、リン酸基を取り除き（例えばＮＭＰをヌクレオシドに変換するか、ＮＤＰをＮＭＰに変換するか、またはＮＴＰをＮＤＰに変換する）、これは、ヌクレオチドリン酸化／脱リン酸化の無益な周期に起因して、ＮＴＰ生成を低下させる。ヌクレアーゼは、核酸をモノマーまたはオリゴマーに切断し、これが、ＲＮＡ生成物分解（例えばRNaseによる）および／またはＤＮＡ鋳型分解（例えばDNaseによる）をもたらす。プロテアーゼは、タンパク質をアミノ酸またはペプチドに切断し、これが、経路酵素を分解する。デアミナーゼは、アミノ基を取り除き、これは、経路中間体の不要な基質（例えばキサンチンおよびヒポキサンチン）への転換によりＮＴＰの濃度を低下させ、ＲＮＡ生成物における変異（例えばＣからＵへ）をもたらし得る。ヒドロラーゼ（例えばヌクレオシドヒドロラーゼまたはヌクレオチドヒドロラーゼ）は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを塩基および糖部分に切断し、これは、ヌクレオチドの不可逆的分解に起因して、ＮＴＰの濃度を低下させる。オキシドレダクターゼは、１つの分子（酸化体）から別の分子（還元体）への電子の転移を触媒する。酸化および／または還元反応は、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ中の核酸塩基に損傷を与えて転写および／または翻訳におけるエラーをもたらすか、またはタンパク質もしくは酵素に損傷を与えて機能の喪失をもたらし得る。
【００８５】
したがって、多くの態様において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物中の、これらのネイティブな酵素活性または他の望ましくない酵素活性を除去することは有利である。本明細書において、酵素活性の「除去」は、望ましくない酵素活性のうちの一部（例えば、活性のうちの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が除去される）であっても、完全（活性の１００％が除去される）であってもよい。本明細書において議論されるとおり、酵素活性は、遺伝子修飾、条件付け失活、および／または物理的分離により除去することができる。また、他の除去方法を用いてもよい。望ましくない酵素活性は、限定されないが、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼおよび／またはヒドロラーゼを含む、少なくとも１つ（例えば１、２、３、４または５つの）ネイティブな（内在）酵素に由来してもよい。
【００８６】
いくつかの場合において、望ましくないホスファターゼ活性は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物において除去される。いくつかの場合において、望ましくないヌクレアーゼ活性は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物において除去される。いくつかの場合において、望ましくないプロテアーゼ活性は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物において除去される。いくつかの場合において、望ましくないデアミナーゼ活性は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物において除去される。いくつかの場合において、望ましくないヒドロラーゼ活性は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物において除去される。
【００８７】
望ましくない（例えばネイティブな）酵素活性は、遺伝子的、条件付け、または分離のアプローチを用いて、除去することができる。いくつかの場合において、遺伝子的アプローチを、望ましくない酵素活性を除去するために用いることができる。したがって、いくつかの場合において、細胞は、望ましくない酵素活性を低下させるかまたはこれを除去するために修飾される。望ましくない酵素活性を低下させるかまたはこれを除去するために用いることができる遺伝子的アプローチの例として、これらに限定されないが、分泌、遺伝子ノックアウト、およびプロテアーゼターゲティングが挙げられる。いくつかの場合において、望ましくない酵素活性を取り除くために、条件付けアプローチが用いられる。したがって、いくつかの場合において、望ましくない活性を示す望ましくない酵素は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物中に残存し、選択的に失活させられる。望ましくない酵素活性を低下させるかまたはこれを除去するために用いることができる条件付けアプローチの例として、これらに限定されないが、温度の変化、ｐＨ、塩、洗剤、有機溶媒（例えばアルコール）、および化学阻害剤の使用が挙げられる。いくつかの場合において、望ましくない酵素活性を取り除くために、分離／精製のアプローチが用いられる。したがって、いくつかの場合において、望ましくない活性を示す望ましくない酵素は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から物理的に取り除かれる。望ましくない酵素活性を低下させるかまたはこれを除去するために用いることができる分離アプローチの例として、これらに限定されないが、沈殿、固定、ろ過、およびクロマトグラフィーが挙げられる。
【００８８】
遺伝子的アプローチ．いくつかの場合において、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡ生成経路の酵素および／またはＤＮＡ鋳型を発現する細胞は、望ましくない酵素活性を低下させるかまたはこれを除去するために修飾される。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素をコードする遺伝子を、細胞から削除する。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素をコードする遺伝子を、生じる遺伝子生成物が非機能的となるように変異させる。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、当該酵素が「ターゲティングされ」て、失活のために切断され得るように、それらのタンパク質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を含むように修飾する（例えば２０１２年３月１日に公開された米国公開番号2012/0052547 A1；２０１５年２月１２日に公開された国際公開番号WO 2015/021058 A2；および２０１２年３月８日に公開された国際公開番号WO 2012/030980を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
【００８９】
部位特異的プロテアーゼ認識配列を含む酵素の切断は、細胞増殖期（例えば、操作された細胞が培養される場合）の間に、細胞の周辺質中で隔離されており（標的酵素から分離しており）、ＡＴＰ生成期（例えば細胞ライセートを生成するための細胞溶解に続く）の間に酵素と接触させられる、コグネートな部位特異的プロテアーゼとの接触から生じる。したがって、本開示の操作された細胞は、いくつかの場合において、（ｉ）望ましくない活性を示す酵素をコードし、酵素のタンパク質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を含む、操作された核酸、および（ｉｉ）当該酵素の部位特異的プロテアーゼ認識配列を切断する部位特異的プロテアーゼをコードし、周辺質を標的とする配列を含む、操作された核酸を含む。この周辺質を標的とする配列は、細胞が溶解されるまで、部位特異的プロテアーゼを細胞の周辺質空間に隔離する原因となる。周辺質を標的とする配列の例は、公知である。
【００９０】
本開示に従って用いることができるプロテアーゼの例として、限定することなく、アラニンカルボキシペプチダーゼ、アスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、癌凝血原、カテプシンＢ、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＢｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリクシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、Ｉｇａ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、リジルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクタ―（myxobacter）、ナルディライジン、膵臓エンドペプチダーゼＥ、ピコルナシン（picornain）２Ｂ、ピコルナシン３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質コンバターゼＩ、プロタンパク質コンバターゼＩＩ、ルスセリリシン、サッカロペプシン（saccharopepsin）、セメノゲラーゼ、Ｔ−プラスミノーゲンアクチベーター、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲンアクチベーター、Ｖ８、ベノンビン（venombin）Ｂ、ベノンビンＢＢおよびＸａａ−プロアミノペプチダーゼが挙げられる。
【００９１】
条件付けアプローチ．いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物は、望ましくない活性を示す酵素であって、選択的に失活するものを含む。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素は、酵素を、除去条件（例えば高温または低温、酸性または塩基性のｐＨ値、高塩または低塩、洗剤、および／または有機溶媒）に暴露することにより、選択的に失活させられる。
【００９２】
いくつかの場合において、酵素調製、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物を、望ましくない活性を示す酵素を、一時的に、または不可逆的に失活させる温度に暴露する。「温度失活」とは、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物を、ネイティブな標的酵素を失活させる（または少なくとも部分的に失活させる）ために十分な温度まで、加熱または冷却するプロセスを指す。一般に、温度失活のプロセスは、有害酵素の変性（アンフォールディング）を含む。酵素が変性する温度は、生物の間で異なる。例えばE. coliにおいては、酵素は、一般に、４１℃より上の温度で編成する。変性温度は、他の生物については、４１℃より高い場合も低い場合もある。ここで提供されるような細胞ライセートの酵素は、０℃〜９５℃、またはより高い温度で温度失活させることができる。いくつかの場合において、細胞ライセートの酵素は、０〜９０℃、０〜８０℃、０〜７０℃、０〜６０℃、０〜５０℃、０〜４０℃、０〜３０℃、０〜２０℃、０〜１０℃、または０〜５℃の温度で、温度失活させる。いくつかの場合において、細胞ライセートの酵素は、５〜９５℃、１０〜９５℃、２０〜９５℃、３０〜９５℃、４０〜９５℃、５０〜９５℃、６０〜９５℃、７０〜９５℃、８０〜９５℃、または９０〜９５℃の温度で、温度失活させる。例えば、細胞ライセートの酵素は、約４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃の温度で温度失活させてもよい。いくつかの場合において、細胞ライセートの酵素は、５０〜８０℃の温度で温度失活させる。いくつかの場合において、細胞ライセートの酵素は、約７０℃の温度で温度失活させる。いくつかの場合において、細胞ライセートの酵素は、約６０℃の温度で温度失活させる。
【００９３】
いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物は、望ましくない活性を示す酵素を一時的に、または不可逆的に失活させる、酸または塩基（ｐＨの変化）に暴露される。「酸または塩基による失活」とは、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物を、酵素を失活させる（または少なくとも部分的に失活させる）ために十分なｐＨに調整するプロセスを指す。一般に、酸または塩基による失活のプロセスは、酵素の変性（アンフォールディング）を含む。酵素が変性するｐＨは、生物の間で異なる。例えばE. coliにおいては、ネイティブな酵素は、一般に、７．５より高い、または６．５より低いｐＨで変性する。変性ｐＨは、他の生物についての変性ｐＨよりも高い場合も低い場合もある。本明細書において提供されるような酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、７．５〜１４、またはそれより高いｐＨで塩基失活させてもよい。いくつかの場合において、細胞ライセートの酵素は、８〜１４、８．５〜１４、９〜１４、９．５〜１４、１０〜１４、１０．５〜１４、１１〜１４、１１．５〜１４、１２〜１４、１２．５〜１４、１３〜１４、または１３．５〜１４のｐＨで塩基失活させる。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、７．５〜１３．５、７．５〜１３、７．５〜１２．５、７．５〜１２、７．５〜１１．５、７．５〜１１、７．５〜１０．５、７．５〜１０、７．５〜９．５、７．５〜９、７．５〜８．５、または７．５〜８のｐＨで塩基失活させる。例えば、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、約７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、または１４のｐＨで塩基失活させてもよい。本明細書において提供されるような酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、６．５〜０、またはより低いｐＨで酸失活させてもよい。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、６．５〜０．５、６．５〜１、６．５〜１．５、６．５〜２、６．５〜２．５、６．５〜３、６．５〜３．５、６．５〜４、６．５〜４．５、６．５〜５、または６．５〜６のｐＨで酸失活させる。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、６〜０、５．５〜０、５〜０、４．５〜０、４〜０、３．５〜０、３〜０、２．５〜０、２〜０、１．５〜０、１〜０、または０．５〜０のｐＨで酸失活させる。例えば、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、約６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５、または０のｐＨで酸失活させてもよい。
【００９４】
いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物を、望ましくない活性を示す酵素を一時的に、または不可逆的に失活させる高塩または低塩（塩濃度の変化）に暴露する。「塩失活」とは、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物を、酵素を失活させる（または少なくとも部分的に失活させる）ために十分な塩濃度に調整するプロセスを指す。一般に、塩失活のプロセスは、酵素の変性（アンフォールディング）を含む。酵素が失活する塩濃度は、生物の間で異なる。例えばE. coliにおいては、ネイティブな酵素は、一般に、６００ｍＭより高い塩濃度で変性する。変性塩濃度は、他の生物についての変性塩濃度より高い場合も低い場合もある。塩は、アニオンとカチオンとの組み合わせである。カチオンの非限定的な例として、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムが挙げられる。アニオンの非限定的な例として、酢酸、塩酸、硫酸およびリン酸が挙げられる。本明細書において提供されるような酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、６００〜１０００ｍＭ、またはそれより高い塩濃度で塩失活させてもよい。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、７００〜１０００ｍＭ、７５０〜１０００ｍＭ、８００〜１０００ｍＭ、８５０〜１０００ｍＭ、９００〜１０００ｍＭ、９５０〜１０００ｍＭの塩濃度で塩失活させる。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、６００〜９５０ｍＭ、６００〜９００ｍＭ、６００〜８５０ｍＭ、６００〜８００ｍＭ、６００〜７５０ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、または６００〜６５０ｍＭの塩濃度で塩失活させる。例えば、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、約６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、または１０００ｍＭの塩濃度で塩失活させてもよい。本明細書において提供されるような酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、４００〜０ｍＭ、またはそれより低い塩濃度で塩失活させてもよい。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、３５０〜０ｍＭ、３００〜０ｍＭ、２５０〜０ｍＭ、２００〜０ｍＭ、１５０〜０ｍＭ、１００〜０ｍＭ、または５０〜０ｍＭの塩濃度で塩失活させる。いくつかの場合において、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、４００〜５０ｍＭ、４００〜１００ｍＭ、４００〜１５０ｍＭ、４００〜２００ｍＭ、４００〜２５０ｍＭ、４００〜３００ｍＭ、または４００〜３５０ｍＭの塩濃度で塩失活させる。例えば、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素は、約４００ｍＭ、３５０ｍＭ、３００ｍＭ、２５０ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、または０ｍＭの塩濃度で塩失活させてもよい。
【００９５】
いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を失活させるために、有機溶媒を、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物に添加する。有機溶媒の非限定的な例として、エタノール、メタノール、エーテル、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、およびトルエンが挙げられる。
いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を失活させるために、洗剤を、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物に添加する。洗剤の非限定的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＭＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、およびラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）が挙げられる。
【００９６】
いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を失活させるために、化学阻害剤を、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物に添加する。化学阻害剤の非限定的な例として、オルトバナジン酸ナトリウム（タンパク質ホスホチロシルホスファターゼの阻害剤）、フッ化ナトリウム（ホスホセリルおよびホスホスレオニルホスファターゼの阻害剤）、ピロリン酸ナトリウム(ホスファターゼ阻害剤）、リン酸ナトリウム、および／またはリン酸カリウムが挙げられる。いくつかの場合において、化学阻害剤は、化学阻害剤ライブラリーから選択される。
【００９７】
本明細書において用いられる条件付けアプローチのうちのいずれかについて、細胞ライセートまたは反応混合物中に存在する経路酵素のいずれかをまた、除去条件（例えば高温もしくは低温、酸性もしくは塩基性のｐＨ値、高塩もしくは低塩、洗剤および／または有機溶媒）に暴露してもよいことが、理解されるべきである。したがって、いくつかの場合において、経路酵素（例えばポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼ）が、除去条件に耐えることができる。酵素は、当該酵素が、除去条件への暴露の後で、（失活条件への暴露の前の酵素活性と比較して）その酵素活性の少なくとも１０％（例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）を保持する場合に、除去条件を耐えるとみなされる。
【００９８】
例えば、ネイティブな酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物の酵素が、熱失活する（例えば少なくとも４０℃または４０〜９５℃の温度に、少なくとも２分間または２〜６０分間暴露される）場合、経路酵素は、熱安定性酵素であり得る。したがって、いくつかの場合において、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼおよびポリメラーゼのうちの少なくとも１つは、熱安定性である。酵素（例えばキナーゼまたはポリメラーゼ）は、当該酵素が、（ａ）ネイティブな酵素を変性させる高温への一時的暴露の後で活性を保持するか、または（ｂ）ネイティブな酵素が低率で機能する中温〜高温への一時的暴露の後で高率で機能する場合、熱安定性であるとみなされる。熱安定性酵素は公知であり、および使用のための熱安定性酵素の非限定的な例は、本明細書において提供される。除去条件に耐えることができる経路酵素の他の非限定的な例もまた、本明細書において提供する。
【００９９】
分離アプローチ．いくつかの場合において、望ましくない活性を示すネイティブな酵素は、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から物理的に取り除かれる。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から沈殿させる。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物からろ過する（例えばサイズに基づいて）。いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、キャプチャーおよび／またはクロマトグラフィーを介して（例えば、固定相に対する差次的アフィニティーにより）、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から取り除く。
【０１００】
いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、アフィニティークロマトグラフィーを介して、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から取り除く。アフィニティークロマトグラフィーの例として、これらに限定されないが、タンパク質Ａクロマトグラフィー、タンパク質Ｇクロマトグラフィー、金属結合クロマトグラフィー（例えばニッケルクロマトグラフィー）、レクチンクロマトグラフィー、およびＧＳＴクロマトグラフィーが挙げられる。
いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、イオン交換クロマトグラフィーを介して、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から取り除く。アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の例として、これらに限定されないが、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー、四級アミノエチル（ＱＡＥ）クロマトグラフィー、および四級アミン（Ｑ）クロマトグラフィーが挙げられる。カチオン交換クロマトグラフィーの例として、これらに限定されないが、カルボキシメチル（ＣＭ）クロマトグラフィー、スルホエチル（ＳＥ）クロマトグラフィー、スルホプロピル（ＳＰ）クロマトグラフィー、リン酸（Ｐ）クロマトグラフィー、およびスルホネート（Ｓ）クロマトグラフィーが挙げられる。
【０１０１】
いくつかの場合において、望ましくない活性を示す酵素を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して、酵素調製物、細胞ライセート、および／または反応混合物から取り除く。疎水性相互作用クロマトグラフィーの例として、これらに限定されないが、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ブチルセファロースクロマトグラフィー、オクチルセファロースクロマトグラフィー、カプトフェニルクロマトグラフィー、Toyopearlブチルクロマトグラフィー、Toyopearlフェニルクロマトグラフィー、Toyopearlヘキシルクロマトグラフィー、Toyopearlエーテルクロマトグラフィー、およびToyopearl ＰＰＧクロマトグラフィーが挙げられる。上で詳述される化学のうちのいずれかを、経路酵素を固定またはキャプチャーするために代替的に用いることができる。
【０１０２】
熱安定性酵素
本明細書において提供される経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）のうちのいずれかは、熱安定性酵素であり得る。熱安定性とは、相対的に高温または低温において変性に耐える、酵素の性質を指す。例えば、４２℃の温度において酵素が変性する（失活する）場合、類似の活性（例えばキナーゼ活性）を有する酵素は、それが４２℃で編成しない場合、「熱安定性」であるとみなされる。
酵素（例えばキナーゼまたはポリメラーゼ）は、当該酵素が、（ａ）他のネイティブな酵素を変性させる高温への一時的暴露の後で活性を保持するか、または（ｂ）ネイティブな酵素が低率で機能する中温〜高温への一時的暴露の後で高率で機能する場合に、熱安定性であるとみなされる。
【０１０３】
酵素（例えばキナーゼまたはポリメラーゼ）はまた、当該酵素が、（ａ）他のネイティブな酵素を変性させる低温への一時的暴露の後で活性を保持するか、または（ｂ）ネイティブな酵素が低率で機能する中温〜低温への一時的暴露の後で高率で機能する場合に、熱安定性であるとみなされる。
いくつかの場合において、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的高温（例えばE. coliから得られたキナーゼについては４１℃より高い、多くのＲＮＡポリメラーゼについては３７℃より高い）への一時的暴露の後で、１０％より高い活性を保持する。いくつかの場合において、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的高温への一時的暴露の後で、１０〜１００％、２５〜１００％、または５０〜１００％の活性を保持する。例えば、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的高温への一時的暴露の後で１０〜９０％、１０〜８５％、１０〜８０％、１０〜７５％、１０〜７０％、１０〜６５％、１０〜６０％、１０〜５５％、２５〜９０％、２５〜８５％、２５〜８０％、２５〜７５％、２５〜７０％、２５〜６５％、２５〜６０％、２５〜５５％、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、または５０〜５５％を保持し得る。いくつかの場合において、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的高温への一時的暴露の後で１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の活性を保持する。
【０１０４】
いくつかの場合において、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的低温（例えばE. coliから得られたキナーゼについては３２℃より低い、多くのＲＮＡポリメラーゼについては３２℃より低い）への一時的暴露の後で、５０％より高い活性を保持する。いくつかの場合において、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的低温への一時的暴露の後で、５０〜１００％の活性を保持する。例えば、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的低温への一時的暴露の後で、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、または５０〜５５％の活性を保持し得る。いくつかの場合において、熱安定性酵素は、他では類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素を変性させる比較的低温への一時的暴露の後で、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の活性を保持する。
【０１０５】
いくつかの場合において、中温〜高温（例えば４２〜８０℃）への一時的暴露の後の熱安定性酵素の活性は、類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素の活性よりも高い（例えば２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％高い）。
いくつかの場合において、中温〜低温（例えば３２〜０℃）への一時的暴露の後の熱安定性酵素の活性は、類似の（非熱安定性の）ネイティブな酵素の活性よりも高い（例えば２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％高い）。
【０１０６】
熱安定性キナーゼの活性は、例えば、当該キナーゼがリン酸化することができるＮＭＰまたはＮＤＰの量により測定してもよい。したがって、いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的高温（例えば４２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの５０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの５０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的高温（例えば４２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの６０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの６０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的高温（例えば４２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの７０％より多くをＮＤＰ、またはＮＤＰの７０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的高温（例えば４２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの８０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの８０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的高温（例えば４２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの９０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの９０％より多くをＮＴＰに変換する。
【０１０７】
いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的低温（例えば３２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの５０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの５０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的低温（例えば３２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの６０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの６０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的低温（例えば３２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの７０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの７０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的低温（例えば３２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの８０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの８０％より多くをＮＴＰに変換する。いくつかの場合において、熱安定性キナーゼは、比較的低温（例えば３２℃）において、３７℃での類似の変換を完了させるために必要とされるものと同じ量の時間内に、ＮＭＰの９０％より多くをＮＤＰに、またはＮＤＰの９０％より多くをＮＴＰに変換する。
【０１０８】
熱安定性ポリメラーゼの活性、例えば、フィデリティーおよび重合動態学（例えば重合の速度）に基づいて評価する。したがって、１単位の熱安定性Ｔ７ポリメラーゼは、例えば、３０分間以内に３７℃より高い温度で（例えば５０℃で）、１０ｎｍｏｌｅｓのＮＴＰを酸不溶性材料中に組み込むことができる。別の例において、１単位の熱安定性Ｔ７ポリメラーゼは、３０分間以内に、３２℃より低い温度で（例えば２５℃で）１０ｎｍｏｌｅｓのＮＴＰを酸不溶性材料中に組み込むことができる。
いくつかの場合において、熱安定性酵素（例えばキナーゼまたはポリメラーゼ）は、４２℃〜８０℃またはそれより高い温度で、活性であり続けてもよい（反応を触媒することができる）。いくつかの場合において、熱安定性酵素は、４２〜８０℃、４２〜７０℃、４２〜６０℃、４２〜５０℃、５０〜８０℃、５０〜７０℃、５０〜６０℃、６０〜８０℃、６０〜７０℃、または７０〜８０℃の温度で、活性であり続ける。例えば、熱安定性酵素は、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃の温度で、活性であり続けてもよい。熱安定性酵素は、比較的高温で、１５分間〜４８時間またはそれより長くにわたり、活性であり続けてもよい。例えば、熱安定性酵素は、比較的高温で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間にわたり、活性であり続けてもよい。
【０１０９】
いくつかの場合において、熱安定性酵素（例えばキナーゼまたはポリメラーゼ）は、３２℃〜０℃またはそれより低い温度で、活性であり続けてもよい（反応を触媒することができる）。いくつかの場合において、熱安定性酵素は、３２〜５℃、３２〜１０℃、３２〜２０℃、３２〜２５℃、３２〜３０℃、３０〜０℃、２５〜０℃、２０〜０℃、１０〜０℃、または５〜０℃の温度で活性であり続ける。例えば、熱安定性酵素は、３２℃、３１℃、３０℃、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、または０℃の温度で、活性であり続けてもよい。熱安定性酵素は、比較的低温で、１５分間〜４８時間またはそれより長くにわたり、活性であり続けてもよい。例えば、熱安定性酵素は、比較的低温で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間にわたり、活性であり続けてもよい。
【０１１０】
熱安定性ＮＭＰキナーゼの非限定的な例を、表４Ａ〜４Ｄにおいて列記する。他の熱安定性キナーゼとして、熱安定性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（例えば表５を参照）、熱安定性ピルビン酸キナーゼ、および熱安定性ポリリン酸キナーゼ（例えば表２を参照）が挙げられる。他の熱安定性キナーゼは、本開示により包含される。
ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例を、表６において列記する。熱安定性ＲＮＡポリメラーゼを含む他のＲＮＡポリメラーゼは、本開示により包含される。
【０１１１】
熱安定性ＲＮＡポリメラーゼは、野生型酵素を修飾することにより調製してもよい。かかる修飾（例えば変異）は、公知である。例えば、バリアント熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、以下の点変異のうちの１つ以上を含んでもよい：Ｖ４２６Ｌ、Ａ７０２Ｖ、Ｖ７９５Ｉ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｐ、Ｆ８８０Ｙ、Ｃ５１０ＲおよびＳ７６７Ｇ（ＥＰ２３７７９２８およびＥＰ１２６１６９６Ａ１；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。いくつかの場合において、バリアント熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｖ４２６Ｌ、Ａ７０２ＶおよびＶ７９５Ｉ変異を含む。いくつかの場合において、バリアント熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３ＰおよびＦ８８０Ｙ変異を含む。いくつかの場合において、バリアント熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｆ８８０Ｙ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｐ、Ｃ５１０ＲおよびＳ７６７Ｇ変異を含む。いくつかの場合において、バリアント熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｙ６３９Ｖ、Ｈ７８４Ｇ、Ｅ５９３ＧおよびＶ６８５Ａ変異を含む。いくつかの場合において、バリアント熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｓ４３０Ｐ、Ｎ４３３Ｔ、Ｓ６３３Ｐ、Ｆ８４９ＩおよびＦ８８０Ｙ変異を含む。他のバリアントおよび組み換え熱安定性ポリメラーゼは、本開示により包含される。
【０１１２】
いくつかの場合において、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼが、目的のＲＮＡを生成するために用いられる。例えば、総タンパク質の０．１〜５％の濃度を有する熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば３７〜６０℃の温度でインキュベートされる）を、１ｇ／Ｌ／ｈｒ（または、例えば１ｇ／Ｌ／ｈｒ〜２０ｇ／Ｌ／ｈｒ）より早い速度で目的のＲＮＡを合成するために用いてもよい。
本開示の多くの態様が熱安定性ポリメラーゼ／酵素の使用を記載する一方で、他の酵素／ポリメラーゼを用いてもよいことが、理解されるべきである。いくつかの場合において、例えば熱安定性酵素の活性の任意の低下または喪失を代償するために、ポリメラーゼを、熱失活させた細胞ライセートに外因的に添加してもよい。
【０１１３】
融合酵素
本明細書において提供される経路酵素（例えばヌクレアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなど）のいずれかは、個々の酵素、複数の活性を有する酵素、または融合酵素であってもよい。融合酵素は、別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子または遺伝子セグメントを連結することにより、作製することができる。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一または複数のポリペプチドをもたらし、例えば、融合タンパク質は、ヌクレアーゼとして作用する、キナーゼとして作用する、および／またはポリメラーゼとして作用する。他の酵素もまた、融合タンパク質として発現させてもよい。
天然に存在するいくつかの酵素は、多機能性である（例えばＣＭＰ−ＵＭＰキナーゼ）。したがって、用語「酵素」は、それらがどのようにして提供されるかにかかわらず、「酵素活性」を包含する。
【０１１４】
融合酵素は、当該酵素がヌクレアーゼ活性を示す（核酸を切断するかまたは脱重合させる；例えばRNase R）場合に、「ヌクレアーゼとして作用する」ものとみなされる。融合酵素は、当該酵素がキナーゼ活性を示す（１つの分子から別の分子へのリン酸基の転移を触媒する；例えばポリリン酸キナーゼ）場合に、「キナーゼとして作用する」ものとみなされる。融合酵素は、当該酵素がポリメラーゼ活性を示す（ヌクレオチドを集めて核酸を生成する；例えばＲＮＡポリメラーゼ）場合に、「ポリメラーゼとして作用する」ものとみなされる。
【０１１５】
エネルギーソース
ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のために本明細書において提供されるように用いることができる、いくつかのエネルギーおよびリン酸ソースが存在する。リン酸のソースの非限定的な例として、ＮＴＰ（例えばＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）、ポリリン酸（例えばヘキサメタリン酸）およびピロリン酸（ＰＰｉ）が挙げられる。いくつかの場合において、ＮＴＰは、化学合成されたか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出されたかにかかわらず、ＲＮＡの生成のために反応混合物中に含まれる。いくつかの場合において、ポリリン酸およびポリリン酸キナーゼが、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のために反応混合物中に含まれる。いくつかの場合において、酢酸、ＡＤＰ、ピロリン酸、および少なくとも２つの酢酸キナーゼ（例えば酢酸キナーゼ（二リン酸）EC 2.7.2.12および酢酸キナーゼ（リン酸化性）EC.7.2.1）が、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のために反応混合物中に含まれる。いくつかの場合において、クエン酸、ＡＭＰ、ピロリン酸、クエン酸リアーゼ（クエン酸リアーゼ複合体）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）またはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）およびピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）が、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のために反応混合物中に含まれる。いくつかの場合において、亜硫酸、ＡＭＰ、ピロリン酸、アデニリル硫酸レダクターゼおよび硫酸アデニリルトランスフェラーゼが、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のために反応混合物中に含まれる。他のエネルギーソースもまた、本開示により包含される。
【０１１６】
いくつかの場合において、エネルギーソースは、酢酸の周期性リン酸化を通してピロリン酸から、ピロリン酸およびクエン酸から、またはピロリン酸および亜硫酸から生成されたＡＴＰである。上の経路からのＡＴＰ生成のための方法は、本明細書において記載される。ＡＴＰ生成経路および経路酵素のまとめを、以下の表７において提供する。
表７：例示的なＡＴＰ生成経路および酵素のまとめ
【表７】
2020536570.tif 000012
【０１１７】
酢酸リン酸化／脱リン酸化周期を通してのピロリン酸およびＡＤＰからのＡＴＰ生成
本開示のいくつかの側面は、酢酸リン酸化／脱リン酸化周期（例えば図１４を参照）を通してピロリン酸（高エネルギーリン酸供与体）およびＡＤＰ（最終的なエネルギー／リン酸アクセプター）からＡＴＰを生成するための方法を使用する。第１の酢酸キナーゼ（ＡｃＫ１；EC 2.7.2.12）は、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を用いて酢酸をリン酸化し、これは、アセチル−リン酸および無機リン酸（Ｐｉ）を生成する。アセチル−リン酸は、次いで、第２の酢酸キナーゼ（ＡｃＫ２；EC 2.7.2.1）により脱リン酸化され、これは、高エネルギーリン酸基をアセチル−リン酸からＡＤＰに転移し、ＡＴＰおよび酢酸を生成する。生じる酢酸は、次いで、ＡｃＫ１により自由に再度リン酸化され、それにより、反応周期を完成する。
【０１１８】
いくつかの場合において、ピロリン酸およびＡＤＰからＡＴＰを生成する方法は、第１の酢酸キナーゼ、第２の酢酸キナーゼ、または２つの異なる酢酸キナーゼを発現するように操作された細胞を培養することを含む。いくつかの場合において、方法は、第１の酢酸キナーゼおよび第２の酢酸キナーゼ発現するように操作された細胞を培養することを含む。いくつかの場合において、第１の酢酸キナーゼぷｐぼ第２の酢酸キナーゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質として発現される。
いくつかの場合において、酵素の少なくとも１つは、熱安定性酵素である。いくつかの場合において、酵素のうちの少なくとも２つは、熱安定性酵素である。いくつかの場合において、酵素の全てが、熱安定性酵素である。したがって、いくつかの場合において、方法は、熱安定性酢酸キナーゼを発現するように操作された細胞を培養することを含む。他の態様において、方法は、第１の熱安定性酢酸キナーゼおよび第２の熱安定性酢酸キナーゼを発現するように操作された細胞を培養することを含む。
【０１１９】
いくつかの場合において、酢酸の周期性リン酸化を通してピロリン酸からＡＴＰを生成する方法は、培養された細胞を溶解して（例えば熱、浸透圧、機械（例えば超音波処理）、化学、または酵素溶解）、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の細胞ライセートを生成することを含む。複数の細胞ライセート（およびしたがって、例えば同じ生物（例えば細菌）から、または異なる生物（例えば細菌、酵母および／または植物）からの、複数の細胞集団）を、本明細書において提供されるような酵素反応におうて用いてもよいことが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、ＡＴＰ生成経路の第１の酢酸キナーゼを発現するように操作されていてもよく、一方、別の細胞集団は、ＡＴＰ生成経路の第２の酢酸キナーゼを発現するように操作されていてもよい。したがって、いくつかの場合において、方法は、酢酸キナーゼを発現するように操作された細胞の集団を培養すること、および／または少なくとも１つのさらなる酢酸キナーゼを発現するように操作された細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解の後で、細胞ライセートを、酵素が単一の細胞ライセート／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【０１２０】
いくつかの場合において、酢酸の周期性リン酸化を通してピロリン酸からＡＴＰを生成する方法は、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）を、ネイティブな酵素活性を失活させるが、ＡＴＰ生成経路の熱安定性酵素のいずれも失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成することをさらに含む。細胞ライセートは、いくつかの場合において、少なくとも５０℃の温度まで加熱する。例えば、細胞ライセートは、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃の温度まえで加熱してもよい。ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）は、いくつかの場合において、その活性のレベルが少なくとも５０％低下している場合に、失活しているとみなされる。いくつかの場合において、ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）は、その活性のレベルが、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低下している場合に、失活しているとみなされる。
【０１２１】
細胞ライセートは、当該細胞のネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）を失活させるために十分な期間にわたり、加熱してもよい。例えば、細胞ライセートは、少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間にわたり加熱してもよい。いくつかの場合において、細胞ライセートは、５分間より長くにわたり加熱する。いくつかの場合において、細胞ライセートは、１５分間より長くにわたり加熱する。いくつかの場合において、細胞ライセートは、２時間未満にわたり加熱する。いくつかの場合において、細胞ライセートは、ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるために十分な期間にわたり加熱する。
【０１２２】
熱失活に続いて、いくつかの場合において、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つまたは少なくとも３つ）の精製された酵素を、細胞ライセート／反応混合物に添加してもよい。したがって、反応混合物は、いくつかの場合において、細胞ライセート中に存在する酵素（操作された宿主細胞により発現されたもの）と、少なくとも１つの精製された酵素との組み合わせを含んでもよい。少なくとも１つの精製された酵素は、第１の酢酸キナーゼおよび／または第２の酢酸キナーゼであってよい。いくつかの場合において、細胞ライセートは、熱失活ステップの後で、精製された酵素を添加する前に、冷却してもよい（例えば５０℃まで）。
いくつかの場合において、酢酸の周期性リン酸化を通してピロリン酸からＡＴＰを生成する方法はまた、熱失活したライセートを、酢酸、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、ＡＴＰを生成することを含む。無機リン酸は、例えばピロリン酸であってよい。限定されないが、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ペンタポリリン酸、ヘキサメタリン酸およびこれらの混合物を含む、他の無機リン酸および／またはオルトリン酸ポリマーを用いてもよい。
【０１２３】
本明細書においてまた包含されるのは、酢酸の周期性リン酸化を通したピロリン酸からのＡＴＰの生成のために用いられる細胞および細胞ライセートである。したがって、本開示の操作された細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の酢酸キナーゼを含んでもよい。いくつかの場合において、本開示の操作された細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の熱安定性酢酸キナーゼを含む。
表８．例示的な酢酸キナーゼ酵素
【表８】
2020536570.tif 000013
【０１２４】
ピロリン酸、ＡＭＰ、およびクエン酸からのＡＴＰ生成
本開示のいくつかの側面は、ピロリン酸、ＡＭＰ、およびクエン酸からＡＴＰを生成するための方法を用いる（例えば図１５Ａ〜１５Ｂを参照）。３ステップ酵素経路を、図１５Ａにおいて示す。第１のステップにおいて、クエン酸リアーゼは、クエン酸を酢酸およびオキサロ酢酸に変換する。第２のステップにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）は、第１のステップにおいて生成されたピロリン酸およびオキサロ酢酸を、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および無機リン酸（Ｐｉ）に変換する。第３のステップにおいて、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）は、第２のステップにおいて生成された無機ピロリン酸（ＰＰｉ）、ＡＭＰおよびＰＥＰを、ピルビン酸、ＰｉおよびＡＴＰに変換する。組み合わせた化学反応は、１モルのクエン酸、１モルのＡＭＰおよび２モルのＰＰｉを用いて、１モルの酢酸、１モルのピルビン酸、１モルのＣＯ２、２モルのＰｉおよび１モルのＡＴＰを生じる（図１５Ｂ）。あるいは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）を用いて、ＰＥＰのオキサロ酢酸へのカルボキシル化を触媒させてもよく、これは、特定の条件下においては可逆的であり得る。
【０１２５】
これらの方法は、いくつかの場合において、クエン酸リアーゼ、ＰＥＰＣＫ（もしくは少なくとも１つのＰＥＰＣ）、ＰＰＤＫ、または前述の酵素の少なくとも２つもしくは少なくとも３つの組み合わせを発現するように操作された細胞を培養することを含む。いくつかの場合において、クエン酸リアーゼおよびＰＥＰＣＫ（もしくはＰＥＰＣ）、ＰＥＰＣＫ（もしくはＰＥＰＣ）およびＰＰＤＫ、またはクエン酸リアーゼおよびＰＰＤＫは、単一の融合（キメラ）タンパク質として発現される。
いくつかの場合において、酵素のうちの少なくとも１つは、熱安定性酵素である。いくつかの場合において、酵素の少なくとも２つまたは少なくとも３つは、熱安定性酵素である。いくつかの場合において、酵素の全てが熱安定性酵素である。したがって、いくつかの場合において、方法は、熱安定性クエン酸リアーゼ、熱安定性ＰＥＰＣＫ、ＰＰＤＫまたは前述の熱安定性酵素のうちの少なくとも２つもしくは少なくとも３つの組み合わせを発現するように操作された細胞を培養することを含む。
【０１２６】
いくつかの場合において、クエン酸からＡＴＰを生成する方法は、培養された細胞を溶解して（例えば熱、浸透圧、機械（例えば超音波処理）、化学、または酵素溶解）、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ、または３つ）の細胞ライセートを生成することを含む。
複数の細胞ライセート（およびしたがって、例えば同じ生物（例えば細菌）から、または異なる生物（例えば細菌、酵母および／または植物細胞）からの複数の細胞集団）を、本明細書において提供されるような酵素反応において用いてもよいことが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、ＡＴＰ生成経路の１つ以上の酵素を発現するように操作されていてもよく、別の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、ＡＴＰ生成経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように操作されていてもよい。したがって、いくつかの場合において、方法は、クエン酸リアーゼを発現するように操作された細胞の集団を培養すること、ＰＥＰＣＫ（熱安定性ＰＥＰＣＫ）を発現するように操作された細胞集団を培養すること、および／またはＰＰＤＫを発現するように操作された細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解の後で、細胞ライセートを、酵素が単一の細胞ライセート／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【０１２７】
いくつかの場合において、クエン酸からＡＴＰを生成する方法はさらに、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）を、ネイティブな酵素活性を失活させるが、ＡＴＰ生成経路の熱安定性酵素のいずれも失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成することを含む。細胞ライセートは、いくつかの場合において、少なくとも５０℃の温度まで加熱する。例えば、細胞ライセートは、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃の温度まえで加熱してもよい。ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）は、いくつかの場合において、その活性のレベルが少なくとも５０％低下している場合に、失活しているとみなされる。いくつかの場合において、ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）は、その活性のレベルが、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低下している場合に、失活しているとみなされる。
【０１２８】
細胞ライセートは、当該細胞のネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）を失活させるために十分な期間にわたり、加熱してもよい。例えば、細胞ライセートは、少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間にわたり加熱してもよい。いくつかの場合において、細胞ライセートは、５分間より長くにわたり加熱する。いくつかの場合において、細胞ライセートは、ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるために十分な期間にわたり加熱する。
【０１２９】
熱失活に続いて、いくつかの場合において、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つまたは少なくとも３つ）の精製された酵素を、細胞ライセート／反応混合物に添加してもよい。したがって、反応混合物、いくつかの場合において、細胞ライセート中に存在する酵素（操作された宿主細胞により発現されたもの）と、少なくとも１つの精製された酵素との組み合わせを含んでもよい。少なくとも１つの精製された酵素は、クエン酸リアーゼ、ＰＥＰＣＫ（またはＰＥＰＣ）およびＰＰＤＫからなる群より選択してもよい。いくつかの場合において、細胞ライセートは、熱失活ステップの後で、精製された酵素を添加する前に、冷却してもよい（例えば５０℃まで）。
いくつかの場合において、クエン酸からＡＴＰを生成する方法はまた、熱失活したライセートを、クエン酸、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、ＡＴＰを生成することを含む。無機リン酸は、例えばピロリン酸であってよい。限定されないが、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ペンタポリリン酸、ヘキサメタリン酸およびこれらの混合物を含む、他の無機リン酸および／またはオルトリン酸ポリマーを用いてもよい。
【０１３０】
本明細書においてまた包含されるのは、クエン酸からのＡＴＰの生成のために用いられる細胞および細胞ライセートである。したがって、本開示の操作された細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、および／もしくは植物細胞）または細胞ライセートは、クエン酸リアーゼ、ＰＥＰＣＫ（またはＰＥＰＣ）およびＰＰＤＫからなる群より選択される少なくとも１つ（例えば少なくとも２つまたは少なくとも３つ）の酵素を含んでもよい。いくつかの場合において、本開示の操作された細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、熱安定性クエン酸リアーゼ、熱安定性ＰＥＰＣＫ（または熱安定性ＰＥＰＣ）および熱安定性ＰＰＤＫからなる群より選択される少なくとも１つ（例えば少なくとも２つまたは少なくとも３つ）の酵素を含む。
表９．例示的なピロリン酸およびクエン酸経路酵素からのＡＴＰ生成
【表９】
2020536570.tif 000014
【０１３１】
ピロリン酸、ＡＭＰおよび亜硫酸からのＡＴＰ生成
本開示のいくつかの側面は、ピロリン酸、ＡＭＰおよび亜硫酸からＡＴＰを生成するための方法を用いる（例えば図１６を参照）。第１のステップにおいて、アデニリル硫酸レダクターゼは、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）をアデノシン５’-ホスホ硫酸（ＡＰＳ）に変換し、これは亜硫酸の消費を伴う。第２のステップにおいて、硫酸アデニリルトランスフェラーゼは、ＡＰＳの硫酸への変換を触媒し、これはＡＴＰの生成およびピロリン酸の消費を伴う。
いくつかの場合において、ピロリン酸からＡＴＰを生成する方法、ＡＭＰおよび亜硫酸は、アデニリル硫酸レダクターゼ、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ、またはアデニリル硫酸レダクターゼと硫酸アデニリルトランスフェラーゼとの組み合わせ発現するように操作された細胞を培養することを含む。いくつかの場合において、アデニリル硫酸レダクターゼおよび硫酸アデニリルトランスフェラーゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質、または二官能性タンパク質として発現される。
【０１３２】
いくつかの場合において、電子シンク（electron sink）として働く還元剤を、添加してもよい。かかる還元剤の例として、限定されないが、以下が挙げられる：ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはグルタチオンまたはフェリシアン化物またはジチオエリスリトールまたはトリス−２−カルボキシエチルホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）。個々の酵素は、それらの補助因子の優先度において異なるが、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどの生物学的補助因子が、これらの電子を吸収するために１つの酵素によって用いられ得る場合が存在し得る。これらの場合において、これらのような補助因子もまた、含まれ得る。
いくつかの場合において、酵素のうちの少なくとも１つは、熱安定性酵素である。いくつかの場合において、酵素のうちの少なくとも２つは、熱安定性酵素である。いくつかの場合において、酵素の全てが、熱安定性酵素である。したがって、いくつかの場合において、方法は、熱安定性アデニリル硫酸レダクターゼおよび熱安定性硫酸アデニリルトランスフェラーゼを発現するように操作された細胞を培養することを含む。
【０１３３】
いくつかの場合において、亜硫酸からＡＴＰを生成する方法は、培養された細胞を溶解して（例えば熱、浸透圧、機械（例えば超音波処理）、化学、または酵素溶解）、少なくとも１つ（例えば２、３、４または５つ）の細胞ライセートを生成することを含む。複数の細胞ライセート（およびしたがって、例えば同じ生物（例えば細菌）から、または異なる生物（例えば細菌、酵母および／または植物）からの複数の細胞集団を、本明細書において提供されるような酵素反応において用いてもよいことが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、アデニリル硫酸レダクターゼを発現するように操作されていてもよく、一方、別の細胞集団（または複数の他の細胞集団）は、硫酸アデニリルトランスフェラーゼを発現するように操作されていてもよい。したがって、いくつかの場合において、方法は、アデニリル硫酸レダクターゼを発現するように操作された細胞の集団を培養すること、および／または硫酸アデニリルトランスフェラーゼを発現するように操作された細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解の後で、細胞ライセートを、酵素が単一の細胞ライセート／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【０１３４】
いくつかの場合において、亜硫酸からＡＴＰを生成する方法はさらに、、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）を、ネイティブな酵素活性を失活させるが、ＡＴＰ生成経路の熱安定性酵素のいずれも失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成することを含む。細胞ライセートは、いくつかの場合において、少なくとも５０℃の温度まで加熱する。例えば、細胞ライセートは、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃の温度まえで加熱してもよい。ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）は、いくつかの場合において、その活性のレベルが少なくとも５０％低下している場合に、失活しているとみなされる。いくつかの場合において、ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）は、その活性のレベルが、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低下している場合に、失活しているとみなされる。
【０１３５】
細胞ライセートは、当該細胞のネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）を失活させるために十分な期間にわたり、加熱してもよい。例えば、細胞ライセートは、少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間にわたり加熱してもよい。いくつかの場合において、細胞ライセートは、５分間より長くにわたり加熱する。いくつかの場合において、細胞ライセートは、ネイティブな酵素（または他の非熱安定性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるために十分な期間にわたり加熱する。
【０１３６】
熱失活に続いて、いくつかの場合において、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つまたは少なくとも３つ）の精製された酵素を、細胞ライセート／反応混合物に添加してもよい。したがって、反応混合物、いくつかの場合において、細胞ライセート、細胞ライセート中に存在する酵素（操作された宿主細胞により発現されたもの）、および少なくとも１つの精製された酵素の組み合わせを含んでもよい。少なくとも１つの精製された酵素は、第１の酢酸キナーゼおよび／または第２の酢酸キナーゼであってよい。いくつかの場合において、細胞ライセートは、熱失活ステップの後で、精製された酵素を添加する前に、冷却してもよい（例えば５０℃まで）。
いくつかの場合において、亜硫酸からＡＴＰを生成する方法はまた、熱失活したライセートを、亜硫酸、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、ＡＴＰを生成することを含む。無機リン酸は、例えばピロリン酸であってよい。限定されないが、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ペンタポリリン酸、ヘキサメタリン酸およびこれらの混合物を含む、他の無機リン酸および／またはオルトリン酸ポリマーを用いてもよい。
【０１３７】
本明細書においてまた包含されるのは、ＡＴＰの生成のために用いられる細胞および細胞ライセートである。したがって、本開示の操作された細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）のアデニリル硫酸レダクターゼおよび／または少なくとも１つの硫酸アデニリルトランスフェラーゼを含んでもよい。いくつかの場合において、本開示の操作された細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の熱安定性アデニリル硫酸レダクターゼおよび／または少なくとも１つの熱安定性硫酸アデニリルトランスフェラーゼを含む。
表１０．例示的なピロリン酸、ＡＭＰおよび亜硫酸経路酵素からのＡＴＰ生成
【表１０】
2020536570.tif 000015
【０１３８】
細胞ＲＮＡの脱重合
いくつかの場合において、細胞ＲＮＡは、ＮＴＰおよび／またはＲＮＡの生成のための基質として働く。細胞ＲＮＡの脱重合（分解）は、脱重合のために用いられた酵素に依存して、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）または５’−ヌクレオシド一リン酸（５’−ＮＭＰ）を含むプールをもたらす。
細胞ＲＮＡは、いくつかの場合において、例えばポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）を用いて、ＮＤＰに脱重合する（例えば表１を参照）。いくつかの場合において、反応混合物中で用いられるPNPaseの濃度は、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬ（例えば０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、５または１０ｍｇ／ｍＬ）である。いくつかの場合において、反応混合物中のPNPaseの濃度は、０．５〜５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの場合において、反応混合物中のPNPaseの濃度は、５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの場合において、反応混合物中のPNPaseの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬより高い。
【０１３９】
細胞ＲＮＡは、他の態様において、例えばヌクレアーゼ（例えばRNase RまたはＰ１ヌクレアーゼ）を用いて、ＮＭＰに脱重合される（例えば表１を参照）。酵素に依存して、酵素によるＲＮＡの脱重合は、３’−ＮＭＰ、５’−ＮＭＰ、または３’−ＮＭＰと５’−ＮＭＰとの組み合わせを生じ得る。３’−ＮＴＰ（３’−ＮＭＰから変換された３’−ＮＤＰから変換されたもの）を重合することはできないので、５’-ＮＭＰ(これは次いで５’-ＮＤＰに変換され、次いで５’-ＮＴＰに変換される)を生じる酵素（例えばRNase Rおよび／またはＰ１ヌクレアーゼ）が好ましい。いくつかの場合において、反応混合物中で用いられるヌクレアーゼ（例えばRNase Rおよび／またはＰ１ヌクレアーゼ）の濃度は、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬ（例えば０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、５または１０ｍｇ／ｍＬ）である。いくつかの場合において、反応混合物中のヌクレアーゼの濃度は、０．０．５〜５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの場合において、反応混合物中のヌクレアーゼの濃度は、５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの場合において、反応混合物中のヌクレアーゼの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬより高い。
【０１４０】
PNPaseおよび／またはRNaseは、いくつかの場合において、PNPaseおよび／またはRNaseを発現する細胞の細胞ライセートの構成要素から得られるか、または構成要素である。
目的のＲＮＡ生成物を合成するために必要とされる細胞ＲＮＡの量は、例えば、所望されるＲＮＡ生成物の長さおよび収率、ならびに細胞ＲＮＡ出発材料のヌクレオチド組成と比較したＲＮＡ生成物のヌクレオチド組成に依存して、変化し得る。典型的には、例えば細菌細胞または酵母細胞について、細胞ＲＮＡ含有量は、総細胞質量の５〜５０％の範囲である。総細胞質量のパーセンテージは、例えば、以下の式を用いて計算することができる：（乾燥細胞重量のＲＮＡ／キログラムのキログラム（ｋｇ））×１００％。
【０１４１】
ＮＭＰの生成のために好適な条件およびＮＤＰの生成のために好適な条件は、当該分野において公知であるか、例えば、反応混合物のｐＨ（例えばｐＨ３〜８）、温度（例えば１５℃〜７０℃）、時間の長さ（例えば５分〜７２時間）、および塩濃度（例えば、５ｍＭ〜１Ｍの濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム）を含むヌクレアーゼ（例えばRNase）活性のための最適条件、ならびに任意の外因性補助因子を考慮して、当業者により決定され得る。いくつかの場合において、例えば特定のｐＨ値および／または塩濃度を達成するために、細胞ライセートにバッファーを添加する。バッファーの例として、限定することなく、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、リンゴ酸バッファー、ＭＥＳバッファー、ヒスチジンバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ビス−トリスバッファー、およびエタノールアミンバッファーが挙げられる。
【０１４２】
いくつかの場合において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物を、２４時間にわたり３７℃の温度でインキュベートする。いくつかの場合において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物を、５〜３０分間にわたり３７℃の温度でインキュベートする。いくつかの場合において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物は、７．０のｐＨを有し、１５分間にわたり３７℃の温度でインキュベートされる。いくつかの場合において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物は、６５％より高いＲＮＡのＮＤＰへの、またはＲＮＡの５’−ＮＭＰへの変換をもたらす条件下においてインキュベートしてもよい。いくつかの場合において、ＲＮＡは、５０ｍＭ／ｈｒ、１００ｍＭ／ｈｒまたは２００ｍＭ／ｈｒの速度（または少なくともこの速度）で、ＮＤＰまたは５’−ＮＭＰに変換される。他の態様において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物を、例５におけるもののように、より高い温度（例えば、５０℃〜７０℃）でインキュベートする。
【０１４３】
ＲＮＡ生成物の重合
いくつかの場合において、ＮＴＰは、本明細書において提供される方法により生成されるものであっても、商業的ソースから供給されるものであっても、目的のＲＮＡ生成物の生成のための生合成経路において用いられる。ＲＮＡ生成物をコードするように設計されたＤＮＡは、ＲＮＡの合成のための鋳型として働く。ＤＮＡ鋳型は、いくつかの場合において、いくつかの場合において、目的のＲＮＡの転写を選択的に駆動する転写プロモーターを有するように操作してもよい。ＲＮＡの重合は、ＮＴＰ、転写プロモーターを含むＤＮＡ鋳型、および当該転写プロモーターに対して特異的なポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼ）を必要とする。典型的には、本明細書において提供されるような用途のためのポリメラーゼは、単一サブユニットポリメラーゼであり、そのコグネートな転写プロモーターについて高度に選択的であり、高いフィデリティーを有し、高度に効率的である。
いくつかの場合において、反応混合物中のＤＮＡ鋳型の濃度は、０．００１〜１０μｇ／μｌである。いくつかの場合において、反応混合物中のＤＮＡ鋳型の濃度は、０．００１μｇ／μｌ、０．０５μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、０．５μｇ／μｌ、１．０μｇ／μｌ、５μｇ／μｌまたは１０μｇ／μｌである。
【０１４４】
ＲＮＡの生成のために好適な条件は、当該分野において公知であるか、例えば、反応混合物のｐＨ（例えばｐＨ３〜８）、温度（例えば１５℃〜７０℃）、時間の長さ（例えば５分〜７２時間）、および塩濃度（例えば、５ｍＭ〜１Ｍの濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム）を含むポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）活性のための最適条件、ならびに任意の外因性補助因子を考慮して、当業者により決定され得る。いくつかの場合において、例えば特定のｐＨ値および／または塩濃度を達成するために、細胞ライセートにバッファーを添加する。バッファーの例として、限定することなく、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、リンゴ酸バッファー、ＭＥＳバッファー、ヒスチジンバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ビス−トリスバッファー、およびエタノールアミンバッファーが挙げられる。
いくつかの場合において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物を、０．５〜２４時間にわたり３７℃の温度でインキュベートする。いくつかの場合において、ＲＮＡ脱重合反応の間の反応混合物を、０．５〜２４時間にわたり５０℃の温度でインキュベートする。
【０１４５】
細胞および細胞ライセート
本開示の細胞は、いくつかの場合において、細胞ＲＮＡ、ＲＮＡを脱重合する酵素（例えばRNases）、経路酵素（例えばポリリン酸キナーゼなどの組み換え酵素）、および／またはポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼ）を発現する。いくつかの場合において、操作された細胞は、目的のＲＮＡ生成物をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、プロモーター、および任意に転写ターミネーターを含むＤＮＡ鋳型を含む。
いくつかの場合において、細胞は、操作された細胞である。操作された細胞は、操作された（例えば組み換えまたは合成の）核酸を含むか、天然に存在するカウンターパートと構造的に、および／または機能的に区別し得るように別段に修飾された、細胞である。したがって、操作された核酸を含む細胞は、「操作された細胞」とみなされる。 
【０１４６】
核酸（例えば操作された核酸）によりコードされる生成物が、細胞において生成される場合、当該細胞は、当該生成物を「発現する」。遺伝子発現とは、核酸の形態における遺伝子のインストラクションが、タンパク質（例えば酵素）などの生成物を合成するために用いられるプロセスを指すことは、当該分野において公知である。
細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。いくつかの場合において、細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または他の型の細胞である。
【０１４７】
本開示の細菌細胞として、限定することなく、Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.、Pantoea sppおよびVibrio natriegensが挙げられる。
本開示の酵母細胞として、限定することなく、操作されたSaccharomyces spp.、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ、カンジダ、クリベロミセス属、ヤロウイア属およびピキア属が挙げられる。
【０１４８】
いくつかの場合において、本開示の細胞は、Escherichia coli細胞、Bacillus subtilis細胞、Pseudomonas putida細胞、Saccharomyces cerevisiae細胞、またはLactobacillus brevis細胞。いくつかの場合において、本開示の細胞は、Escherichia coli細胞である。
典型的には、細胞は、培養される。培養は、典型的にはそれらの天然の環境の外で、制御された条件下において細胞を増殖させるプロセスである。例えば、細菌細胞などの細胞は、液体栄養ブロス（また、液体培養培地としても言及される）中で細胞懸濁液として増殖させてもよい。
【０１４９】
一般に用いられる細菌Escherichia coliの培養培地の例として、限定することなく、以下が挙げられる：ＬＢ（溶原性ブロス）Millerブロス（１％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母抽出物および１％ＮａＣｌ；ＬＢ（溶原性ブロス）Lennoxブロス（０．５％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母抽出物および０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（Super Optimal Broth）：２％ペプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（Super Optimal broth with Catabolic repressor（異化抑制因子））：ＳＯＢ＋２０ｍＭのグルコース；２×ＹＴブロス（２×酵母抽出物およびトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母抽出物および０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ（Terrific Broth）培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母抽出物、７２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および０．４％グリセロール；ならびにＳＢ（Super Broth）培地：３．２％ペプトン、２％酵母抽出物および０．５％ＮａＣｌおよび／またはKorz培地（Korz, DJ et al. 1995）。
高密度細菌Escherichia coli増殖培地の例として、これらに限定されないが、DNAGro（商標）培地、ProGro（商標）培地、AutoX（商標）培地、DetoX（商標）培地、InduX（商標）培地およびSecPro（商標）培地が挙げられる。
【０１５０】
いくつかの場合において、細胞は、酵素または核酸の発現をもたらす条件下において培養される。かかる培養条件は、発現されている特定の生成物および所望される生成物の量に依存し得る。
いくつかの場合において、細胞は、３０℃〜４０℃の温度で培養される。例えば、操作された細胞は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃の温度で培養してもよい。典型的には、操作されたE. coli細胞などの細胞は、３７℃の温度で培養される。
いくつかの場合において、細胞は、１２時間〜７２時間またはそれより長い期間にわたり培養される。例えば、操作された細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間の期間にわたり培養してもよい。典型的には、操作された細菌細胞などの細胞は、１２〜２４時間の期間にわたり培養される。いくつかの場合において、細胞は、１２〜２４時間にわたり３７℃の温度で培養される。
【０１５１】
いくつかの場合において、細胞は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定される光学密度が５〜２００となるまで培養される（例えば液体細胞培養培地中で）。いくつかの場合において、細胞は、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０または２００のＯＤ６００まで培養される。
いくつかの場合において、細胞は、細胞培養培地１ｍｌあたり１×１０８（ＯＤ６００＜１）〜２×１０１１（ＯＤ〜２００）の生細胞の密度まで培養される。いくつかの場合において、細胞は、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１または２×１０１１の生細胞／ｍｌの密度まで培養される。（変換因数：ＯＤ１＝８×１０８細胞／ｍｌ）。
いくつかの場合において、細胞は、バイオリアクター中で培養される。バイオリアクターとは、単純に、その中で細胞を培養する容器、例えばフラスコ、ディッシュまたはバックを指し、これらは、単回使用（使い捨て）、オートクレーブ可能、または滅菌可能であってよい。バイオリアクターは、ガラス製であっても、ポリマーベースであってもよく、または他の材料でできていてもよい。
【０１５２】
バイオリアクターの例として、限定することなく、撹拌槽（例えばよく混合された）バイオリアクターおよび管状（例えばプラグフロー（plug flow））バイオリアクター、エアリフト（airlift）バイオリアクター、メンブレン撹拌槽、スピンフィルター撹拌槽、バイブロミキサー（vibromixer）、流動床リアクター、およびメンブレンバイオリアクターが挙げられる。バイオリアクターを操作するモードは、回分（batch）プロセスであっても連続プロセスであってもよく、培養されている操作された細胞に依存するであろう。バイオリアクターは、供給流および生成物流が連続的に供給され、系から取り出される場合に、連続的である。回分バイオリアクターは、連続的な再循環流を有していてよいが、連続的な栄養物の供給または生成物の収集は有しない。間欠的収集（intermittent-harvest）および流加回分（fed-batch）（または回分流加（batch fed））培養については、細胞を、回分培地に対する組成物中のものと類似の、より低い生存可能な細胞密度において、培地中に播種する。細胞を、本質的に外部からの操作なしで栄養が若干枯渇し、細胞が定常増殖期に近づくまで、指数関数的に増殖させる。この時点において、間欠的回分流加プロセスについて、細胞および生成物の一部を収集し、取り除いた培養培地を、フレッシュな培地で補充する。このプロセスを、数回繰り返してもよい。組み換えタンパク質および抗体の生成については、流加回分プロセスを用いる。細胞は指数関数的に増殖するが、一方、栄養は枯渇し始め、さらなる栄養を供給するために、濃縮された供給培地（例えば１０〜１５倍濃縮した基礎培地）を、連続的にまたは間欠的に添加し、細胞の濃度のさらなる増大および生成期の長さのさらなる延長を可能にする。培養培地（ブロス）を取り除くことなく、フレッシュな培地を、細胞の濃度に比例して添加してもよい。培地の添加を適応させるために、バイオリアクターの全容量よりもはるかに低い容積において（例えば、最大容積の約４０％〜５０％）、流加培養を開始する。
【０１５３】
本開示のいくつかの方法は、大規模（商業規模）のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の生成に向けられる。大規模生成方法のために、細胞を、５リットル（Ｌ）〜２５０，０００Ｌ、またはそれより多い容積において、液体培養培地中で増殖させてもよい。いくつかの場合において、細胞を、液体培養培地中で、１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１００００Ｌまたは１０００００Ｌより大きい（またはそれに等しい）容積において、増殖させる。いくつかの場合において、細胞を、液体培養培地中で、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌ、１０００００Ｌ、１５００００Ｌ、２０００００Ｌ、２５００００Ｌまたはそれより多い容積において増殖させる。いくつかの場合において、細胞を、液体培養培地中で、５Ｌ〜１０Ｌ、５Ｌ〜１５Ｌ、５Ｌ〜２０Ｌ、５Ｌ〜２５Ｌ、５Ｌ〜３０Ｌ、５Ｌ〜３５Ｌ、５Ｌ〜４０Ｌ、５Ｌ〜４５Ｌ、１０Ｌ〜１５Ｌ、１０Ｌ〜２０Ｌ、１０Ｌ〜２５Ｌ、２０Ｌ〜３０Ｌ、１０Ｌ〜３５Ｌ、１０Ｌ〜４０Ｌ、１０Ｌ〜４５Ｌ、１０Ｌ〜５０Ｌ、１５Ｌ〜２０Ｌ、１５Ｌ〜２５Ｌ、１５Ｌ〜３０Ｌ、１５Ｌ〜３５Ｌ、１５Ｌ〜４０Ｌ、１５Ｌ〜４５Ｌまたは１５〜５０Ｌの容積において増殖させてもよい。いくつかの場合において、細胞を、液体培養培地中で、１００Ｌ〜３０００００Ｌ、１００Ｌ〜２０００００Ｌまたは１００Ｌ〜１０００００Ｌの容積において増殖させてもよい。
【０１５４】
典型的には、細胞の培養の後に、細胞を溶解する。溶解は、例えばウイルス、熱、化学、酵素、機械、または浸透圧の機構により、細胞を破壊するプロセスである。細胞ライセートとは、例えば小器官、膜脂質、タンパク質、核酸および反転した膜小胞を含む、溶解された細胞（例えば溶解された操作された細胞）の内容物を含む液体である。本開示の細胞ライセートは、本明細書において提供されるような操作された細胞の任意の集合を溶解することにより、精製してもよい。
細胞溶解は、注意深く制御された細胞の環境を妨害し得、制御されない内在プロテアーゼおよびホスファターゼによるタンパク質の分解および修飾をもたらし得る。したがって、いくつかの場合において、プロテアーゼ阻害剤および／またはホスファターゼ阻害剤および／またはヌクレアーゼ阻害剤および／またはヒドロラーゼ阻害剤および／またはデアミナーゼ阻害剤を、細胞ライセートまたは溶解前の細胞に添加してもよく、または、熱失活、遺伝子失活またはプロテアーゼターゲティングによりこれらの活性を取り除いてもよい。
【０１５５】
細胞ライセートは、いくつかの場合において、栄養と組み合わせてもよい。例えば、細胞ライセートは、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２と組み合わせてもよい。他の栄養の例として、限定することなく、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロト酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸三カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸一水素アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび水酸化アンモニウムが挙げられる。
細胞ライセートは、いくつかの場合において、補助因子と組み合わせてもよい。例えば、細胞ライセートは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素の活性のために必要とされる他の非タンパク質化学化合物（例えば無機イオンおよび補酵素）と組み合わせてもよい。
単一の反応のために用いられる細胞ライセートの容積は、変化し得る。いくつかの場合において、細胞ライセートの容積は、０．００１〜２５０ｍ３である。
【０１５６】
核酸
「核酸」とは、共有結合により一緒に連結している少なくとも２つのヌクレオチドであって、いくつかの場合において、ホスホジエステル結合（例えばホスホジエステル「骨格」）を含んでもよい。核酸（例えば、核酸の構成要素または部分）は、天然に存在するものであっても、操作されていてもよい。「天然に存在する」核酸は、ヒトの介入の不在下において、天然において存在する細胞において存在する。「操作された核酸」は、組み換え核酸および合成の核酸を含む。「組み換え核酸」とは、核酸分子（例えば同じ種から、または異なる種からのもの）を連結することにより構築される分子であって、典型的には、生細胞において複製することができるものを指す。「合成の核酸」とは、生物学的に合成されたか、化学合成されたか、または他の手段により合成されたかもしくは増幅された分子を指す。合成の核酸は、化学修飾されたか、または別段に修飾された核酸であるが、天然に存在する核酸分子と塩基対形成することができるものを含む。組み換えおよび合成の核酸はまた、前述のもののいずれかの複製から生じる分子を含む。操作された核酸は、天然に存在する核酸の部分を含んでもよいが、全体としては、操作された核酸は、天然には存在せず、ヒトの介入を必要とする。いくつかの場合において、本開示の生成物をコードする核酸は、組み換え核酸または合成の核酸である。他の態様において、生成物をコードする核酸は、天然に存在する。
【０１５７】
本明細書において提供されるようなＲＮＡをコードする操作されたＤＮＡ鋳型は、核酸の制御領域であるプロモーターに作動的に連結されていてもよく、ここで、核酸の残りの部分の転写の開始および速度が制御される。プロモーターは、それが制御する核酸の発現を駆動するか、またはその転写を駆動する。
プロモーターは、遺伝子または配列と天然で会合するものであってよく、これは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得ることができる。かかるプロモーターは、内在型であってよい。
【０１５８】
いくつかの場合において、コード核酸配列を、組み換えまたは異種性のプロモーターの制御下においてもよく、これは、その天然の環境においては、コードされた配列と通常では会合しないプロモーターを指す。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されたプロモーター；および「天然に存在」しない合成のプロモーターまたはエンハンサー、例えば、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または当該分野において公知の遺伝子操作の方法を通して発現を改変する変異を含むものなどを含んでもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、配列は、組み換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を用いて生成することができる。
プロモーターは、それが、それが調節するヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の転写開始および／または発現を制御（「駆動」）するために正確な機能的位置および配向にある場合に、ヌクレオチド配列に作動的に連結しているとみなされる。
【０１５９】
本開示の操作された核酸は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含んでもよい。いくつかの場合において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターは、コード配列、および任意に１つ以上の転写ターミネーターに、作動的に連結している。いくつかの場合において、コード配列は、タンパク質またはＲＮＡ生成物をコードする。「構成的プロモーター」とは、細胞において常に活性であるプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」とは、インデューサーまたは誘導剤（inducing agent）の存在下において、その影響により、もしくはそれと接触した場合に、または、抑制を引き起こす因子の不在下において活性化された場合に、転写活性を開始させるかまたは増強するプロモーターを指す。本開示による使用のための誘導性プロモーターは、本明細書において記載されるか、当業者に公知の、任意の誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例として、限定することなく、化学的に/生化学的に調節される、および物理的に調節されるプロモーター、例えば有機溶媒により調節されるプロモーター、テトラサイクリンにより調節されるプロモーター、ステロイドにより調節されるプロモーター、金属により調節されるプロモーター、発病により調節されるプロモーター、温度／熱により誘導可能な、リン酸により調節される（例えばPhoA）、および光により調節されるプロモーターが挙げられる。
【０１６０】
本明細書において提供されるようなＲＮＡをコードする操作されたＤＮＡ鋳型はまた、１つ以上の転写ターミネーターに作動的に連結していてもよく、これは、ポリメラーゼに転写を停止させ、ＤＮＡ鋳型から解離させる、核酸の制御領域である。
ターミネーターは、遺伝子または配列に天然で会合する１つ以上の配列であって、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの下流に位置する３’非コード配列を単離することにより得ることができる。かかるターミネーターは、内在型であっても、改善された終結の効率のために操作されたものであってもよい。改善された終結の効率のために、１つ以上のソースからの内在および／または操作されたターミネーター配列を、連続して添加してもよい。
【０１６１】
ＲＮＡによりコードされる環状ＤＮＡ鋳型は、非鋳型ＤＮＡ配列、例えばプラスミド骨格の一部である配列の転写を最小化または予防するために、１つ以上の転写ターミネーターを含んでもよい。
操作された核酸は、限定することなく、形質転換、遺伝子導入（例えば化学的（例えばリン酸カルシウム、カチオン性ポリマーもしくはリポソーム）または非化学的（例えばエレクトロポレーション、ソノポレーション（sonoporation）、インペールフェクション（impalefection）、光学的遺伝子導入、水力学的遺伝子導入））および形質導入（例えばウイルスによる形質導入）を含む、当該分野において公知の任意の手段を用いて、宿主細胞中に導入してもよい。
天然に存在する細胞内核酸によりコードされる酵素または他のタンパク質は、「内在酵素」または「内在タンパク質」として言及され得る。
【０１６２】
組成物
いくつかの場合において、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の生成のための反応混合物は、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を含む。いくつかの場合において、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
いくつかの場合において、ＮＴＰの生成のための反応混合物は、５’ヌクレオシド一リン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
いくつかの場合において、ＮＴＰの生成のための反応混合物は、ヌクレオシド、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
【０１６３】
いくつかの場合において、ＮＴＰの生成のための反応混合物は、核酸塩基、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
いくつかの場合において、ＮＴＰの生成のための反応混合物は、核酸塩基、Ｄ−リボース、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
いくつかの場合において、リボ核酸（ＲＮＡ）の生成のための反応混合物は、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびポリメラーゼを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＯキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
【０１６４】
いくつかの場合において、ＲＮＡの生成のための反応混合物は、５’ヌクレオシド一リン酸、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびポリメラーゼを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
いくつかの場合において、ＲＮＡの生成のための反応混合物は、ヌクレオシド、ヌクレオシドキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびポリメラーゼを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
【０１６５】
いくつかの場合において、ＲＮＡの生成のための反応混合物は、核酸塩基、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびポリメラーゼを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
いくつかの場合において、ＲＮＡの生成のための反応混合物は、核酸塩基、Ｄ−リボース、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型、およびポリメラーゼを含む。いくつかの場合において、反応混合物は、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む。
【０１６６】
さらなる態様
本開示のさらなる態様は、以下のナンバリングされたパラグラフにより包含される。
１．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
２．ＮＤＰが、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰおよび／またはＵＤＰを含む、パラグラフ１の方法。
３．ＮＤＰが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ１または２の方法。
４．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１〜３のいずれか１つの方法。
５．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ４の方法。
【０１６７】
６．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１〜５のいずれか１つの方法。
７．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１〜６のいずれか１つの方法。
８．反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ１〜７のいずれか１つの方法。
９．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ８の方法。
１０．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ９の方法。
【０１６８】
１１．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ９または１０の方法。
１２．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ９〜１１のいずれか１つの方法。
１３．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ９〜１２のいずれか１つの方法。
１４．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、５’ヌクレオシド一リン酸（５’ＮＭＰ）、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
【０１６９】
１６．５’ＮＭＰが、５’ＡＭＰ、５’ＧＭＰ、５’ＣＭＰおよび／または５’ＵＭＰを含む、パラグラフ１５の方法。
１７．５’ＮＭＰが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ１５または１６の方法。
１８．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１５〜１７のいずれか１つの方法。
１９．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１８の方法。
２０．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１５〜１９のいずれか１つの方法。
【０１７０】
２１．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１５〜２０のいずれか１つの方法。
２２．反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ１５〜２１のいずれか１つの方法。
２３．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ２２の方法。
２４．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ２３の方法。
２５．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ２３または２４の方法。
【０１７１】
２６．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ２３〜２５のいずれか１つの方法。
２７．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ２３〜２６のいずれか１つの方法。
２８．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ１５〜２７のいずれか１つの方法。
２９．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、ヌクレオシド、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
３０．ヌクレオシドが、アデノシン、グアノシン、シチジン、および／またはウリジンを含む、パラグラフ２９の方法。
【０１７２】
３１．ヌクレオシドが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ２９または３０の方法。
３２．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ２９〜３１のいずれか１つの方法。
３３．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ３２の方法。
３４．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ２９〜３３のいずれか１つの方法。
３５．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する、細胞から調製される、パラグラフ２９〜３４のいずれか１つの方法。
【０１７３】
３６．反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ２９〜３５のいずれか１つの方法。
３７．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ３６の方法。
３８．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ３７の方法。
３９．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ３７または３８の方法。
４０．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ３７〜３９のいずれか１つの方法。
【０１７４】
４１．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ３７〜４０のいずれか１つの方法。
４２．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ２９〜４１のいずれか１つの方法。
４３．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、核酸塩基、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
４４．核酸塩基が、アデニン、グアニジン、シトシン、および／またはウラシルを含む、パラグラフ４３の方法。
４５．核酸塩基が、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ４３または４４の方法。
【０１７５】
４６．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ４３〜４５のいずれか１つの方法。
４７．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ４６の方法。
４８．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ４３〜４７のいずれか１つの方法。
４９．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ４３〜４８のいずれか１つの方法。
５０．反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ４３〜４９のいずれか１つの方法。
【０１７６】
５１．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ５０の方法。
５２．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ５１の方法。
５３．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ５１または５２の方法。
５４．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ５１〜５３のいずれか１つの方法。
【０１７７】
５５．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ５１〜５４のいずれか１つの方法。
５６．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ４３〜５５のいずれか１つの方法。
５７．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、核酸塩基、リボース、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
５８．核酸塩基が、アデニン、グアニジン、シトシン、および／またはウラシルを含む、パラグラフ５７の方法。
５９．核酸塩基が、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ５７または５８の方法。
６０．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ５７〜５９のいずれか１つの方法。
【０１７８】
６１．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ６０の方法。
６２．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ５７〜６１のいずれか１つの方法。
６３．リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ５７〜６２のいずれか１つの方法。
６４．反応混合物が、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製されたライセートを含む、パラグラフ５７〜６３のいずれか１つの方法。
６５．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ６４の方法。
【０１７９】
６６．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ６５の方法。
６７．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、有機溶媒、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ６５または６６の方法。
６８．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ６５〜６７のいずれか１つの方法。
６９．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ６５〜６８のいずれか１つの方法。
７０．リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはヌクレオシドキナーゼが、除去条件を耐えるように修飾される、パラグラフ５７〜６９のいずれか１つの方法。
【０１８０】
７１．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、無機リン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、ＮＤＰおよびＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
７２．細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む、パラグラフ７１の方法。
７３．細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、パラグラフ６１または７２の方法。
７４．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ７１〜７３のいずれか１つの方法。
７５．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ７４の方法。
【０１８１】
７６．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ７１〜７５のいずれか１つの方法。
７７．PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ７１〜７６のいずれか１つの方法。
７８．反応混合物が、PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ７１〜７７のいずれか１つの方法。
７９．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ７８の方法。
８０．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ７９の方法。
【０１８２】
８１．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ７９または８０の方法。
８２．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ７９〜８１のいずれか１つの方法。
８３．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ７９〜８２のいずれか１つの方法。
８４．PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ７９〜８３のいずれか１つの方法。
８５．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中で、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸を、５’ＮＭＰおよびＮＴＰの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
【０１８３】
８６．細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む、パラグラフ８５の方法。
８７．細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、パラグラフ８５または８６の方法。
８８．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ８５〜８７のいずれか１つの方法。
８９．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ８８の方法。
９０．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ８５〜８９のいずれか１つの方法。
【０１８４】
９１．リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ８５〜９０のいずれか１つの方法。
９２．反応混合物が、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ８５〜９１のいずれか１つの方法。
９３．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ９２の方法。
９４．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ９３の方法。
９５．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ９３または９４の方法。
【０１８５】
９６．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ９３〜９５のいずれか１つの方法。
９７．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ９３〜９６のいずれか１つの方法。
９８．リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ９３〜９７のいずれか１つの方法。
９９．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
１００．ＮＤＰが、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰおよび／またはＵＤＰを含む、パラグラフ９９の方法。
【０１８６】
１０１．ＮＤＰが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ９９または１００の方法。
１０２．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ９９〜１０１のいずれか１つの方法。
１０３．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１０２の方法。
１０４．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ９９〜１０３のいずれか１つの方法。
１０５．ポリリン酸キナーゼ、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ９９〜１０４のいずれか１つの方法。
【０１８７】
１０６．反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ９９〜１０５のいずれか１つの方法。
１０７．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ１０６の方法。
１０８．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ１０７の方法。
１０９．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ１０７または１０８の方法。
１１０．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１０７〜１０９。
【０１８８】
１１１．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ１０７〜１１０のいずれか１つの方法。
１１２．ポリリン酸キナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ９９〜１１１のいずれか１つの方法。
１１３．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ９９〜１１２のいずれか１つの方法。
１１４．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、５’ヌクレオシド一リン酸（５’ＮＭＰ）、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
１１５．５’ＮＭＰが、５’ＡＭＰ、５’ＧＭＰ、５’ＣＭＰおよび／または５’ＵＭＰを含む、パラグラフ１１４の方法。
【０１８９】
１１６．５’ＮＭＰが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ１１４または１１５の方法。
１１７．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１１４〜１１６のいずれか１つの方法。
１１８．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１１７の方法。
１１９．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１１４〜１１８のいずれか１つの方法。
１２０．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１１４〜１１９のいずれか１つの方法。
【０１９０】
１２１．反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ１１４〜１２０のいずれか１つの方法。
１２２．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ１２１の方法。
１２３．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ１２２の方法。
１２４．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ１２２または１２３の方法。
１２５．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１２２〜１２４のいずれか１つの方法。
【０１９１】
１２６．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ１２２〜１２５のいずれか１つの方法。
１２７．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ１１４〜１２６のいずれか１つの方法。
１２８．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ１１４〜１２７のいずれか１つの方法。
１２９．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、ヌクレオシド、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
１３０．ヌクレオシドが、アデノシン、グアノシン、シチジン、および／またはウリジンを含む、パラグラフ１２９の方法。
【０１９２】
１３１．ヌクレオシドが、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ１２９または１３０の方法。
１３２．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１２９〜１３１のいずれか１つの方法。
１３３．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１３２の方法。
１３４．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１２９〜１３３のいずれか１つの方法。
１３５．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、すくなくとも１つのポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ポリリン酸、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１２９〜１３４のいずれか１つの方法。
【０１９３】
１３６．反応混合物が、すくなくとも１つのポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ１２９〜１３５のいずれか１つの方法。
１３７．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ１３６の方法。
１３８．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ１３７の方法。
１３９．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ１３７または１３８の方法。
１４０．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１３７〜１３９のいずれか１つの方法。
【０１９４】
１４１．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ１３７〜１４０のいずれか１つの方法。
１４２．すくなくとも１つのポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ１２９〜１４１のいずれか１つの方法。
１４３．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ１２９〜１４２のいずれか１つの方法。
１４４．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、核酸塩基、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸、ポリリン酸キナーゼ、およびポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
１４５．核酸塩基が、アデニン、グアニジン、シトシン、および／またはウラシルを含む、パラグラフ１４４の方法。
【０１９５】
１４６．核酸塩基が、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ１４４または１４５の方法。
１４７．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１４４〜１４６のいずれか１つの方法。
１４８．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１４８の方法。
１４９．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１４４〜１４８のいずれか１つの方法。
１５０．ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１４４〜１４９のいずれか１つの方法。
【０１９６】
１５１．反応混合物が、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞からの細胞ライセートまたは酵素調製物を含む、パラグラフ１４４〜１５０のいずれか１つの方法。
１５２．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ１５１の方法。
１５３．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ１５２の方法。
１５４．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ１５２または１５３の方法。
１５５．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１５２〜１５４のいずれか１つの方法。
【０１９７】
１５６．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ１５２〜１５５のいずれか１つの方法。
１５７．ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ１４４〜１５６のいずれか１つの方法。
１５８．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ１４４〜１５７のいずれか１つの方法。
１５９．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
反応混合物中で、核酸塩基、リボース、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼが、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／または少なくとも１つのＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
１６０．核酸塩基が、アデニン、グアニジン、シトシン、および／またはウラシルを含む、パラグラフ１５９の方法。
【０１９８】
１６１．核酸塩基が、化学合成されるか、発酵の生成物であるか、または天然のソースから抽出される、パラグラフ１５９または１６０の方法。
１６２．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１５９〜１６１のいずれか１つの方法。
１６３．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１６２の方法。
１６４．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１５９〜１６３のいずれか１つの方法。
１６５．リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現するように修飾された操作された細胞から調製された、少なくとも１つのライセートからのものである、パラグラフ１５９〜１６４のいずれか１つの方法。
【０１９９】
１６６．反応混合物が、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製されたライセートを含む、パラグラフ１５９〜１６５のいずれか１つの方法。
１６７．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ１６６の方法。
１６８．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ１６７の方法。
１６９．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、有機溶媒、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ１６７または１６８の方法。
１７０．細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１６７〜１６９のいずれか１つの方法。
【０２００】
１７１．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ１６７〜１７０のいずれか１つの方法。
１７２．リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件を耐えるように修飾される、パラグラフ１５９〜１７１のいずれか１つの方法。
１７３．少なくとも１つのポリメラーゼが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ１５９〜１７２のいずれか１つの方法。
１７４．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中で、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、および無機リン酸を、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）の生成のために適切な条件下においてインキュベートすること；
（ｂ）PNPaseを除去すること；ならびに
（ｃ）反応混合物中で、、または第２の反応混合物中で、ＮＤＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、ステップ（ｃ）の反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
１７５．細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む、パラグラフ１７４の方法。
【０２０１】
１７６．細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、パラグラフ１７４または１７５の方法。
１７７．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１７４〜１７６のいずれか１つの方法。
１７８．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１７７の方法。
１７９．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１７４〜１７８のいずれか１つの方法。
１８０．PNPaseが、PNPaseを発現する細胞から調製される、パラグラフ１７４〜１７９のいずれか１つの方法。
【０２０２】
１８１．（ａ）の反応混合物が、PNPaseを発現する細胞から調製された細胞ライセートを含む、パラグラフ１７４〜１８０のいずれか１つの方法。
１８２．ステップ（ｂ）が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介してPNPaseを除去することを含む、パラグラフ１８１の方法。
１８３．ステップ（ｂ）が、PNPaseを除去することを含み、ここで、細胞ライセートまたは酵素調製物中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１８１または１８２の方法。
１８４．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１７４〜１８３のいずれか１つの方法。
１８５．ステップ（ｃ）の反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製された細胞ライセートを含む、パラグラフ１７４〜１８３のいずれか１つの方法。
【０２０３】
１８６．ステップ（ｃ）の細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ１８５の方法。
１８７．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ１８６の方法。
１８８．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ１８６または１８７の方法。
１８９．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ１８６〜１８８のいずれか１つの方法。
１９０．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ１８６〜１８９のいずれか１つの方法。
【０２０４】
１９１．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ１８６〜１９０のいずれか１つの方法。
１９２．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ１７４〜１９１のいずれか１つの方法。
１９３．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中で、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、無機リン酸、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、ヌクレオシド二リン酸の生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼおよび／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む；
（ｂ）PNPaseを除去すること；ならびに
（ｃ）反応混合物を、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、
を含む、前記方法。
１９４．細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む、パラグラフ１９３の方法。
１９５．細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、パラグラフ１９３または１９４の方法。
【０２０５】
１９６．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ１９３〜１９５のいずれか１つの方法。
１９７．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ１９６の方法。
１９８．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ１９３〜１９７のいずれか１つの方法。
１９９．PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ１９３〜１９８のいずれか１つの方法。
２００．（ａ）の反応混合物が、PNPase、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製された細胞ライセートを含む、パラグラフ１９３〜１９９のいずれか１つの方法。
【０２０６】
２０１．ステップ（ｂ）が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して、細胞ライセート中のPNPaseおよびネイティブな酵素の活性を除去することを含む、パラグラフ２００の方法。
２０２．ステップ（ｂ）が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して、細胞ライセート中のPNPaseおよびネイティブな酵素の活性を除去することを含む、パラグラフ２００または２０１の方法。
２０３．ステップ（ｂ）が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して、細胞ライセート中のネイティブな酵素活性を除去することを含む、パラグラフ２００〜２０２のいずれか１つの方法。
２０４．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ２０１〜２０３のいずれか１つの方法。
２０５．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ２０１〜２０４のいずれか１つの方法。
【０２０７】
２０６．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ１９３〜２０５のいずれか１つの方法。
２０７．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中で細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）およびリボヌクレアーゼを、５’ヌクレオシド一リン酸（５’ＮＭＰ）の生成のために適切な条件下においてインキュベートすること；
（ｂ）リボヌクレアーゼを除去すること；ならびに
（ｃ）反応混合物中で、または第２の反応混合物中で、５’ＮＭＰ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、任意にここで、ステップ（ｃ）の反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、および／またはＮＤＰキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
２０８．細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む、パラグラフ２０７の方法。
２０９．細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、パラグラフ２０７または２０８の方法。
２１０．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ２０７〜２０９のいずれか１つの方法。
【０２０８】
２１１．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ２１０の方法。
２１２．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ２０７〜２１１のいずれか１つの方法。
２１３．リボヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ２０７〜２１２のいずれか１つの方法。
２１４．（ａ）の反応混合物が、リボヌクレアーゼを発現する細胞から調製された細胞ライセートを含む、パラグラフ２０７〜２１３のいずれか１つの方法。
２１５．ステップ（ｂ）が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介してリボヌクレアーゼを除去することを含む、パラグラフ２１４の方法。
【０２０９】
２１６．ステップ（ｂ）が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介してリボヌクレアーゼを除去することを含む、パラグラフ２１４または２１５の方法。
２１７．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ２０７〜２１６のいずれか１つの方法。
２１８．ステップ（ｃ）の反応混合物が、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製された細胞ライセートを含む、パラグラフ２０７〜２１６のいずれか１つの方法。
２１９．ステップ（ｃ）の細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、除去されている、パラグラフ２１８の方法。
２２０．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去されている、パラグラフ２１９の方法。
【０２１０】
２２１．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して除去されている、パラグラフ２１９または２２０の方法。
２２２．細胞ライセート中の酵素のネイティブな酵素活性が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して除去されている、パラグラフ２１９〜２２１のいずれか１つの方法。
２２３．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ２１９〜２２２のいずれか１つの方法。
２２４．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ２１９〜２２３のいずれか１つの方法。
２２５．ポリメラーゼが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ２０７〜２２４のいずれか１つの方法。
【０２１１】
２２６．リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法であって、
（ａ）反応混合物中で、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼを、５’ヌクレオシド一リン酸（５’ＮＭＰ）の生成のために適切な条件下においてインキュベートすること；
（ｂ）リボヌクレアーゼを除去すること；ならびに
（ｃ）反応混合物を目的のＲＮＡの生成のために適切な条件下においてインキュベートすること、
を含む、前記方法。
２２７．細胞ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはトランスファーＲＮＡを含む、パラグラフ２２６の方法。
２２８．細胞ＲＮＡが、単細胞生物または多細胞生物からのものである、パラグラフ２２６または２１４の方法。
２２９．ポリリン酸キナーゼが、ＰＰＫ１ファミリーの酵素およびＰＰＫ２ファミリーの酵素から選択される、パラグラフ２２６〜２２８のいずれか１つの方法。
２３０．ポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２を含む、パラグラフ２２９の方法。
【０２１２】
２３１．ポリリン酸が、ヘキサメタリン酸を含む、パラグラフ２２６〜２３０のいずれか１つの方法。
２３２．リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼが、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、パラグラフ２２６〜２３１のいずれか１つの方法。
２３３．（ａ）の反応混合物が、リボヌクレアーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ鋳型、および／またはポリメラーゼを発現する細胞から調製された細胞ライセートを含む、パラグラフ２２７〜２３２のいずれか１つの方法。
２３４．ステップ（ｂ）が、温度、ｐＨ、塩、洗剤、アルコール、および／または化学阻害剤を介して、細胞ライセート中のリボヌクレアーゼおよびネイティブな酵素の活性を除去することを含む、グラフ２３３の方法。
２３５．ステップ（ｂ）が、分離、沈殿、ろ過、キャプチャー、および／またはクロマトグラフィーを介して、細胞ライセート中のリボヌクレアーゼおよびネイティブな酵素の活性を除去することを含む、パラグラフ２３３または２３４の方法。
【０２１３】
２３６．ステップ（ｂ）が、遺伝子修飾、細胞からの酵素分泌、および／またはプロテアーゼターゲティングを介して、細胞ライセート中のネイティブな酵素活性を除去することを含む、パラグラフ２３３〜２３５のいずれか１つの方法。
２３７．ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、およびヒドロラーゼから選択される、パラグラフ２３４〜２３６のいずれか１つの方法。
２３８．ポリリン酸キナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、および／またはポリメラーゼが、除去条件に耐えることができる、パラグラフ２３４〜２３７のいずれか１つの方法。
２３９．ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼを含む、パラグラフ２２６〜２３８のいずれか１つの方法。
【０２１４】
例
例１−ライセートＲＮＡまたは精製E. coli ＲＮＡのいずれかから出発するＲＮＡのセルフリー合成材料および方法
株およびライセート
E. coli株BL21（DE3）を、以下の酵素のコドン最適化されたバージョンをコードするpETDuet-1ベクターで形質転換した：E. coli（EcRNR）からのRNase R（K544R）、Pyrococcus furiosus（PfPyrH）からのＵＭＰキナーゼ、Thermus thermophilus（TthCmk）からのＣＭＰキナーゼ、Thermotoga maritima（TmGmk）からのＧＭＰキナーゼ、Aquifex aeolicus（AaNdk）からのＮＤＰキナーゼおよびDeinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩのポリリン酸キナーゼ２（DgPPK2）。DgPPK2を除く全ての酵素は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを含んだ。生じた株を、３７℃での回分発酵プロセスにおいて、４０ｇ／Ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを添加したKorz培地中で、ＯＤ６００＝２０まで増殖させ、０．８ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、さらに１時間にわたり増殖させ、その後、遠心分離を介して収集した。収集の後で、バイオマスペレットを−８０℃保存した。
【０２１５】
バイオマスペレットを、次いで、細胞ライセートを調製するために用いた。ライセートを、バイオマスペレットを氷上で融解し、次いで、１．５容積の再懸濁バッファー中で再懸濁することにより調製した。EcRNRを発現する株について、バイオマスを、５８．８ｍＭのリン酸一水素カリウム中で再懸濁した。PfPyrH、TthCmk、TmGmkおよびAaNdkを発現する株については、バイオマスを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中で５０ｍＭのＮａＣｌと共に再懸濁した。DgPPK2を発現する株については、バイオマスを、１００ｍＭのＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）中で再懸濁した。全ての株について、バイオマスを、１５，０００ｐｓｉにおける４℃での機械的均質化に２〜３回通過させることにより溶解した。ライセートを、次いで、１６，０００×ｇでの１時間にわたる４℃での遠心分離により清澄化した。
【０２１６】
E. coli ＲＮＡの抽出および精製
確立されたプロトコルに従って、高密度E. coliライセート（タンパク質濃度：４０〜５０ｍｇ／ｍＬ）から、ＲＮＡを抽出し、精製した（Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in Enzymology, 447, 3-29）。
【０２１７】
タンパク質の発現および精製
E. coli株BL21（DE3）を、熱安定性変異体 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをＮ末端ヘキサヒスチジンタグと共にコードするpBAD24ベクターで形質転換した。生じた株を、整流振盪フラスコ中で、５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを添加した溶原性ブロス（ＬＢ）培地を用いて、培養した。培養を、増殖させた３７℃で、振盪しながらＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、次いで０．２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノースで誘導し、さらなる４時間にわたり増殖させた。バイオマスを、次いで遠心分離により収集し、溶解まで−８０℃で保存した。ライセートを、バイオマスペレットを氷上で融解して、１．５容積の平衡化／洗浄バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、５００ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのイミダゾール）中で再懸濁し、１５，０００ｐｓｉにおける４℃での機械的均質化に２〜３回通過させることにより調製した。ライセートを、次いで遠心分離により清澄化した。HisTrap HPカラム（GE Healthcare Life Sciences）を備えたAKTAPrime Plusを標準的なプロトコルに従って用いて、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により組み換えタンパク質を精製した。組み換えタンパク質を含む画分を、次いで組み合わせて、バッファーを、透析により、５ｍＭのＤＴＴおよび０．０１％のTriton X-100を添加した２×リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に交換した。透析の後で、タンパク質ストックを、等容積のグリセロールで希釈し、−２０℃で保存した。
E. coli RNase Rについて、本明細書において記載されるプロトコルに従って、培養物を増殖させ、発現を誘導し、ライセートを調製した。酵素を、次いで、精製された酵素を、グリセロールと混合する前に、透析によりバッファーを５００ｍＭのＮａＣｌを添加した２×ＰＢＳに交換したことを除いて、本明細書において記載されるプロトコルに従って精製した。
【０２１８】
ＤＮＡ鋳型調製
合成のＤＮＡから、ＰＣＲにより直鎖状ＤＮＡ鋳型を増幅し、常磁性ビーズ上への固相可逆的固定（ＳＰＲＩ）を用いて精製した。プラスミドＤＮＡ鋳型を、目的の配列を好適なプラスミドベクター中にクローニングし、生じるプラスミドでE. coli株DH10bを形質転換させ、形質転換体をＬＢ培地中で培養し、Plasmid MaxiまたはGigaキット（Qiagen）を用いてプラスミドを精製することにより調製した。
【０２１９】
ライセートＲＮＡからのセルフリーＲＮＡ合成
EcRNR、TthCmk、PfPyrH、TmGmk、AaNdkおよびDgPPK2を発現するライセートを、各々、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中で４２ｍｇ／ｍＬまで希釈し、次いで、等比率で組み合わせた。５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中の３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を等容積添加し、３７℃で１５分間にわたりインキュベートすることにより、ライセート中でのＲＮＡの脱重合を開始させた。２６０ｎｍでの吸光度により酸溶解性ヌクレオチドを定量することにより、脱重合をモニタリングした。硫酸マグネシウムおよびヘキサメタリン酸ナトリウムを、ライセートに、それぞれ３０ｍＭおよび１ｍＭの最終濃度まで添加し、次いで、ライセートを、７０℃で１５分間にわたりインキュベートし、EcRNRおよび内在E. coli酵素を失活させた。１５分後、温度を５０℃まで低下させ、以下の組成により反応を組み立てた：
表11．反応条件
【表１１】
2020536570.tif 000016
反応を５０℃で２時間にわたりインキュベートし、TURBO DNase（Thermo Fisher）で処置し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０２２０】
精製E. coli ＲＮＡからのセルフリーＲＮＡ合成
精製E. coli ＲＮＡ（約８ｇ／Ｌ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭの塩化ナトリウム、および２ｍＭの硫酸マグネシウムを含むバッファー中で、１ｇ／Ｌの精製E. coli RNase Rと共にインキュベートすることにより、脱重合させた。脱重合反応を３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、２６０ｎｍにおける吸光度により酸溶解性ヌクレオチドを定量することによりモニタリングした。３０分後、脱重合反応を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ中で各々希釈したTthCmk、TmGmk、PfPyrH、AaNdk、およびDgPPK2ライセートと組み合わせ、等比率において混合した。硫酸マグネシウムおよびヘキサメタリン酸ナトリウムを、次いで、それぞれ３０ｍＭおよび１ｍＭの最終濃度まで添加し、反応を70℃まで１５分間にわたり加熱した。熱失活の後で、本明細書において記載するように以下の組成で反応を組み立てた：
表１２．反応条件
【表１２】
2020536570.tif 000017
【０２２１】
結果
ライセートＲＮＡを基質として用いて、ＲＮＡのセルフリー合成を行った。経路酵素を過剰発現するプールされたライセートからのＲＮＡを、最初に、過剰発現された、５’ＮＭＰを生成するエキソヌクレアーゼであるE. coli RNase R（EcRNR）により脱重合した。脱重合は、迅速であり、約１４ｍＭの酸溶解性ヌクレオチドを１５分後に生成した（図８Ａ）。経路酵素および５’ＮＭＰを含むライセート混合物を、次いで、熱処理してEcRNRおよび内在E. coli酵素を失活させたが、一方、熱安定性経路酵素は活性なままであった。熱失活の後で、ＲＮＡ合成反応を組み立て、５０℃でインキュベートし、アガロースゲル上で可視化した（図８Ｂ）。直鎖状ＰＣＲ生成物（鋳型１）およびプラスミド上でコードされるヘアピン型鋳型（鋳型２）を含む、２つの異なる鋳型による反応は、アガロースゲル上で区別し得るバンドを生じた（図８Ｂ）。ＲＮＡポリメラーゼなしでの条件においては、バンドは観察されなかった。陽性対照として、精製５’ＮＭＰ（各４ｍＭのＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＵＭＰ）を添加する反応を行った。これらの反応は、ＲＮＡを脱重合することにより生成されたＮＭＰを用いる反応と同じサイズで移動する生成物を生成した。
【０２２２】
ＲＮＡのセルフリー合成をまた、精製E. coli RNAを基質として用いて行った。ＲＮＡを、最初に精製E. coli RNase R（K544R）と共にインキュベートして、５’ＮＭＰを放出させた（図9Ａ）。３０分後、脱重合反応を、経路酵素を含むライセート混合物と組み合わせ、熱処理して、EcRNRおよび内在E. coli酵素を失活させたが、一方、熱安定性経路酵素は活性なままであった。熱失活の後で、ＲＮＡ合成反応を組み立て、５０℃でインキュベートし、アガロースゲル上で可視化した（図９Ｂ）。直鎖状ＰＣＲ生成物（鋳型１）およびプラスミド上でコードされるヘアピン型鋳型（鋳型２）を含む、２つの異なる鋳型による反応は、アガロースゲル上で規定のバンドを生じたが、収率は、鋳型２については、より低いように見えた（図９Ｂ）。やはり、ＲＮＡポリメラーゼなしでの条件においては、バンドは観察されなかった。
【０２２３】
まとめると、これらの結果は、高純度の購入したＮＭＰ、ライセートＲＮＡの酵素による脱重合により生成されたＮＭＰ、および精製ＲＮＡの酵素による脱重合により生成されたＮＭＰを含む、多様なＮＭＰソース材料から目的のＲＮＡを生成するために、セルフリーＲＮＡ合成を用いることができることを示す。
【０２２４】
例２−非熱安定性野生型ポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼ変異体、および基質として精製ＮＭＰを用いるＲＮＡのセルフリー合成
材料および方法
バイオマス、ライセート、精製タンパク質およびＤＮＡ鋳型を、本明細書において記載されるように調製した。EcRNRを除外して、各４ｍＭのＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＵＭＰを反応に添加したことを除いて、本質的に例１において記載されるように、ＲＮＡのセルフリー合成を行った。
【０２２５】
結果
精製ＮＭＰを基質として用いて、３７℃の反応温度で、ＲＮＡのセルフリー合成を行った。経路酵素を含むライセートを組み立て、熱処理して、内在E. coli酵素を失活させたが、熱安定性経路酵素は活性なままであった。熱失活の後で、野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたは熱安定性変異体のいずれかを用いて反応を組み立て、３７℃で２時間にわたりインキュベートし、アガロースゲル上で可視化した（図１０）。直鎖状ＰＣＲ生成物（鋳型１）およびプラスミド上でコードされるヘアピン型鋳型（鋳型２）を含む、２つの異なる鋳型による反応は、両方のポリメラーゼにより、区別し得るバンドを生じた。３７℃において、鋳型２によっては特に、ＲＮＡの収率は、熱安定性変異体よりも野生型ポリメラーゼを用いた場合により高いように見えた。ＲＮＡポリメラーゼなしの条件においては、バンドは観察されなかった。
これらの結果は、セルフリーＲＮＡ合成のために用いられたＲＮＡポリメラーゼは熱安定性であることを必要としないこと、および野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを37℃の反応において用いて、ＲＮＡを生成することができることを示す。
【０２２６】
例３−Deinococcus geothermalisからのクラスＩＩＩポリリン酸キナーゼ２（DgPPK2）および基質としてＮＭＰを用いるＲＮＡのセルフリー合成
材料および方法
以下の組成により、本質的には例２において記載されるように、セルフリーＲＮＡ合成反応を組み立てた。
表１３．反応条件
【表１３】
2020536570.tif 000018
陽性対照として、ウリジル酸（uridylate）キナーゼ、シチジル酸（cytidylate）キナーゼ、グアニル酸キナーゼ、ヌクレオチド二リン酸キナーゼおよびポリリン酸キナーゼを含む５酵素ライセート系を、例１〜２に従う反応において用いた。反応において合成されたｄｓＲＮＡを、本明細書において記載されるように、適応させたRNASwift抽出プロトコルを介して精製し、逆相イオン対クロマトグラフィーを用いて定量した（Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift：A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry, 512, 36 -46）。
【０２２７】
結果
DgPPK2を反応中に単独のキナーゼとして、ＮＭＰを基質として含む反応において、ＲＮＡのセルフリー合成を行った。陽性対照として、ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、グアニル酸キナーゼ、ヌクレオチド二リン酸キナーゼ、およびポリリン酸キナーゼを含む５酵素ライセート系の存在下において、ＲＮＡを合成した。ポリメラーゼの不在下において、対照反応を行った。
各反応についての応答因子を決定した。応答因子は、市販のｄｓＲＮＡ内部標準の面積に対する目的のｄｓＲＮＡの面積の比として計算した。応答因子の比較は、DgPPK2を単独のキナーゼとして含む反応が、５酵素ライセート系を含む反応において合成された合成ｄｓＲＮＡのうちの約４８％を合成したことを示した（図１１Ａ）。DgPPK2反応および５酵素ライセート系反応において合成された合成ｄｓＲＮＡ生成物を、ＨＰＬＣにより分析した。反応からのｄｓＲＮＡ生成物のＨＰＬＣクロマトグラムは類似しており、このことは、DgPPK2のみの系により生成されたｄｓＲＮＡ生成物が、５酵素系により生成された生成物と類似することを示している（図１１Ｂ）。
まとめると、これらの結果は、DgPPK2を、ＮＭＰまたはＮＤＰからセルフリーｄｓＲＮＡを合成するための単独のキナーゼとして用いることができたことを示す。
【０２２８】
例４−精製RNase Rまたは精製ヌクレアーゼP1を用いる多様なソースからのＲＮＡの脱重合
材料および方法
ＲＮＡおよびヌクレアーゼの抽出および精製
確立されたプロトコルに従って、高密度E. coliライセート（タンパク質濃度：４０〜５０ｍｇ／ｍＬ）から、ＲＮＡを抽出し、精製した（Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in Enzymology, 447, 3-29）。
V. natriegens細胞ブロスから、RNASwiftプロトコルを用いて、ビブリオ属からのＲＮＡを精製した（Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry, 512, 36-46）。
【０２２９】
酵母由来ＲＮＡ抽出物は、市販のソースから購入した。ＲＮＡ粉末は、約８５％〜約９０％純粋であり、さらなる精製は必要としなかった。RNase Rは、RNase Rを過剰発現するE. coli株から精製し、高細胞密度まで増殖させた。AKTAPrime Plus FPLC系（GE Healthcare）に連結したHisTrap HPカラムを用いる固定金属アフィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。精製されたヌクレアーゼＰ１、５’ホスホジエステラーゼは、市販のソースから入手した。
【０２３０】
外来ヌクレアーゼによるＲＮＡの脱重合
ヌクレアーゼフリー水中に再懸濁したE. coli ＲＮＡ、V. natriegens ＲＮＡ、酵母由来ＲＮＡの粉末（１１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ含有量）、RNase R溶液（３００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２中、１ｍｇ／ｍＬ）および精製ヌクレアーゼＰ１（また５’ホスホジエステラーゼとも称される）（１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中、１〜２ｍｇ／ｍＬ）を、反応を開始する前に、予め２℃で平衡化した。時間ｔ＝０において、５０μＬのＲＮＡおよび５０μＬのヌクレアーゼ溶液を混合し、余熱した３７℃ブロックに移すことにより、反応を開始させた。開始の後で、反応を３７℃でインキュベートし、１０μＬを氷上の酸クエンチ溶液（９０μＬの０．２Ｍの硫酸）に移すことにより、周期的に試料採取した。タイムコースの完了の後で、クエンチした試料を、３，２００×ｇで２０分間にわたり２℃での遠心分離により清澄化した。脱重合を、２６０ｎｍでの酸溶解性ヌクレオチドの吸光度により最初に定量した。ＲＮＡのアルカリ加水分解により総ヌクレオチドプール（例えば１００％の脱重合）を決定した：５０μＬのＲＮＡを、１５０μＬの０．２Ｍの水酸化カリウムと組み合わせ、次いで、９９℃まで２０分間にわたり加熱した。アルカリ加水分解した試料を、次いでクエンチして、上記のように分析した。脱重合はまた、５’、２’および３’ＮＭＰのＬＣ−ＭＳ分析により定量した：１０μＬの試料を３０μＬの１００％アセトニトリル中でクエンチして、内部標準として用いられる１０μＭのアジピン酸を含む５００μＬの脱イオン化水中で希釈する。試料を、次いで遠心分離して、ＬＣ−ＭＳ分析の前に０．２μｍのフィルターを通過させる。
【０２３１】
ヌクレオチド分析
ABSCIEX API 5000質量分析計およびSequant Zinc-hilicカラム（２．１×５０ｍｍ、内径３μｍ）を備えた標準的なAgilent 1200 HPLCを用いて、質量分析および液体クロマトグラフィーにより、２’、３’および５’ＮＭＰの分析を行った。移動相は、９０％アセトニトリル中の２０ｍＭの酢酸アンモニウム（Ａ）および１０％アセトニトリル中の２０ｍＭの酢酸アンモニウム（Ｂ）からなる。分離方法は、以下からなる：６％のＢから勾配を開始し、その後の６００秒間にわたる８．５％のＢへの勾配、４００秒間にわたる１３％のＢへの勾配と、その後の６０秒間にわたる２０％のＢへの勾配、６０秒間にわたる５０％のＢにおける洗浄、および最終的に２２０秒間にわたる６％のＢでの再平衡化。ネガティブモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）において、以下の質量分析トランジションを用いて、定量を行った：２’３’５’ＡＭＰ：３４６．１−１３４．１、２’３’５’ＵＭＰ：３２３．０−９７、２’３’５’ＣＭＰ：３２２−９７、２’３’５’ＧＭＰ：３６２．１−２１１。ピーク面積を、精製化合物（２’および３’ＣＭＰ、ＵＭＰおよびＧＭＰをBiolog Life Science Instituteから購入したことを除いて、Sigma-Aldrichから購入した）からなる標準曲線と比較し、分析の前に試料に添加した内部標準（アジピン酸）に対して正規化した。試料の分析のために、標準曲線を、本明細書において記載される試料調製ステップにあるように、脱イオン化水中で調製し、内部標準で希釈し、ろ過した。
【０２３２】
結果
V. natriegensのＲＮＡを、精製E. coli RNase Rを用いて消化し、およびE. coli RNAおよび酵母由来ＲＮＡ抽出物を、E. coli RNase RおよびヌクレアーゼＰ１の両方を用いて消化した。酸溶解性ヌクレオチドの放出により、脱重合をモニタリングした。RNase RによるE. coliおよびV. natriegens ＲＮＡの処理は、３０分間のインキュベーションの後で約９８〜約１００％の脱重合に達するＲＮＡの酸溶解性ヌクレオチドへの時間依存性変換を示した（図１２Ａ）。酵母由来ＲＮＡ抽出物の処置は、ヌクレアーゼＰ１により約９４％の脱重合に達した（図１２Ａ）。また、ヌクレアーゼＰ１によるE. coli ＲＮＡの処置は、約９０％の脱重合をもたらした（図１２Ａ）。ＬＣ−ＭＳによるその後の分析は、ヌクレアーゼＰ１で処置されたE. coli ＲＮＡおよび酵母由来ＲＮＡ抽出物中の５’ＮＭＰの放出を明らかにした（図１２Ｂ）。
これらの結果は、異なるヌクレアーゼ（例えばRNase RおよびヌクレアーゼＰ１）を用いて、多様なＲＮＡソース（例えばビブリオ属のＲＮＡ、E. coli ＲＮＡ、および酵母ＲＮＡ）を５’ＮＭＰに消化することができることを示す。
【０２３３】
例５−ＲＮＡ脱重合に対する温度およびライセート失活の効果
材料および方法
株およびライセート
株GL17-086（BL21(DE3).ΔtolC.Δph[DE3]1+2*.Δph[285p]*.ΔfhuA*.ΔlamB*. rna::tolC）および株GL17-109（BL21(DE3). ΔtolC.Δph[DE3]1+2*.Δph[285p]*.ΔfhuA* .ΔlamB*. Δrna*. ΔphoA*.ΔappA*.Δamn*.ΔnagD*.ΔushA::tolC）を、本明細書において記載される研究において用いた。両方の株について、１Ｌの培養物を、回分増殖条件下において、KORZ培地（５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１５．７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．７ｇ／Ｌのクエン酸、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、０．１％のチアミン−ＨＣｌ、０．０１％のPluronic、微量金属、および４０ｇ／Ｌのグルコース）中で、約７時間にわたり増殖させた。増殖の後で、細胞を６０００ｇで２０分間にわたり遠心分離し、次いで−８０℃で保存した。凍結バイオマスを、1.5×容積の58.8mMのリン酸一水素カリウム溶液中で融解し、EmulsiFlex C3ホモジェナイザー（Avestin）を３回にわたり、１５０００〜２００００ｐｓｉのパルスで再循環させながら通過させることにより溶解した。１５０００ｇでの一時間にわたる４℃でのスピンによりライセートを清澄化した。ライセートを、次いで、単回使用アリコートにおいて、−８０℃で保存した。
【０２３４】
多様な温度におけるＲＮＡ重合生成物の分析
両方の株（086および109）についての凍結ライセートを、様々な温度でインキュベートし、ＲＮＡ脱重合生成物およびそれらの潜在的な分解をプロファイリングした。ライセートのアリコートを、氷上で融解し、次いでＰＣＲストリップチューブ中に分注した。チューブを、次いで、４０℃、５０℃、６０℃および７０℃で、１時間まで、間欠的に試料採取しながらインキュベートした。初めのｔ０時点を、ライセートがなお氷上にある状態でクエンチすることにより採取した。全ての他の時点について試料は、５×容積のアセトニトリル中でクエンチし、６０μｌを５０ｍＭの酢酸アンモニウム中の５０μＭのアジピン酸溶液５００μｌ中に希釈し、次いでＬＣ−ＱＱＱにかける。ＭＲＭを用いて、４つ全ての主なヌクレオチドおよびそれらの関連する誘導体（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、アデニン、アデノシン、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、グアニン、グアノシン、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＭＰ、シチジン、シトシン、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ、ウリジンおよびウラシル）を、各々の時点において定量した。ライセートを３×容積の０．２ＭのＮａＯＨ中９９℃で２０分間にわたりインキュベートすることにより、ＲＮＡがＮＭＰまで完全に加水分解されるライセートの塩基加水分解を行った。次いでそれを等容積の１５０ｍＭのＨＣｌで中和して、２０μｌのこの溶液を、５０μＭのアジピン酸と共に２００μｌの５０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液中に希釈した。塩基加水分解されたライセートの値は、100%脱重合を表す。いくつかの条件下において、これらのライセートをそのままインキュベートし、他の条件下においては、ライセートを、０．５ｍｇ／ｍｌのヌクレアーゼＰ１（Sigma N8630）またはRNase Rのいずれかと混合した。RNase Rは、以下のとおり調製した：細胞を、１．５×容積の溶解バッファー（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ＝７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）中で再懸濁し、EmulsiFlex C3ホモジェナイザー（Avestin）で、１５０００−２５０００ｐｓｉで３回通過させて溶解し、１時間にわたり１６０００ｇで４℃にて清澄化した。上清を、次いでＦＰＬＣを介して精製し、次いで、２×ＰＢＳ中で一晩透析した。透析後に沈殿したタンパク質を、５００ｍＭのＮａＣｌを添加することにより回収して、グリセロールと混合して、分取および−２０℃での保存のための５０％のグリセロール溶液を得た。
【０２３５】
ＲＮＡ脱重合に対する希釈効果および予熱失活（pre-heat kill）効果の分析
本明細書において記載されるように調製したGL17-109のライセートを用いて実験を行った。ライセートを、広範な条件下において調製した。全ての条件にわたって共通して、反応は、１５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ＝７．４）、１００ｍＭのＫＣｌおよび０．１ｍＭのＺｎＣｌ２の添加を受け、以下の条件の全ては、RNase R、ヌクレアーゼＰ１により、または外来ヌクレアーゼを添加せずに、試験した。両方のヌクレアーゼストック溶液は、先に記載されるように作製した。８０％および５０％のライセートの水への希釈下において、脱重合反応を行った。これらを、それぞれ０．５または０．３１ｍｇ／ｍｌの外来ヌクレアーゼを添加してスクリーニングした。また、１ｍｇ／ｍｌのヌクレアーゼライセートを作製して、それを添加していないライセート中に混合することにより、ライセート混合物を調製し、８０％希釈条件において０．０６４および０．０４ｍｇ／ｍｌのヌクレアーゼを、または５０％希釈条件において０．０４および０．０２５ｍｇ／ｍｌヌクレアーゼを得た。最後に、添加されたヌクレアーゼをライセートが含まなかった条件を試験し、７０℃で１５分間にわたり加熱失活（heat kill）させ、次いで、精製ヌクレアーゼ、またはなお活性な１ｍｇ／ｍｌのヌクレアーゼライセートのいずれかと混合した。試料を３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、５×容積のアセトニトリル中でクエンチし、５０ｍＭの酢酸アンモニウム中の５０μＭのアジピン酸溶液１ｍｌ中に希釈することにより、試料採取した。クエンチ溶液を、次いでスピンダウンし、０．２μｍのフィルタープレートを通してろ過し、ろ過物をＬＣ−ＱＱＱにかけて、ＮＭＰ、ヌクレオシドおよび核酸塩基を測定した。
【０２３６】
結果
ＲＮＡヌクレアーゼ（RNases）は、温度プロフィールを、中温性のソースからの多くの他の酵素より広く広げ、時に、３７℃で生育するように進化した生物に由来するにもかかわらず、６０℃までの活性を示す、活性プロフィールを有することが知られている。E. coliライセートにおけるＲＮＡ脱重合に対する上昇した温度の影響を評価するために、２つの別個の研究を行った。第１に、２つの別個の株からのライセートを、３７℃よりも高い温度で１時間の経過にわたり、２つのRNases−RNase RまたはRNase P1のうちの一方を添加して、またはこれを添加しないで、インキュベートした。第２の研究は、有害酵素活性を取り除くためにライセートを除去して、ＲＮＡ脱重合に対する潜在的な影響を研究するために、この不活性なライセートを活性なライセートと混合すること、または外来ヌクレアーゼを失活したライセート中に混合することを含む。
【０２３７】
ライセートを６０℃および７０℃でインキュベートした場合に、改善された脱重合が観察された（図１３）。脱重合は、いくつかの点において改善した。ＲＮＡが脱重合する場合に、それは、主にＮＭＰを生成する。しかし、活性なライセートにおいては、これらのＮＭＰは、他の酵素により分解され続け、２つの主要な生成物−グアノシンおよびウラシルが、非常に大量に蓄積する。ライセートを６０℃および７０℃でインキュベートすることにより、外来RNase RまたはヌクレアーゼＰ１を添加されなかったライセートにおいてすら、これらの核酸塩基の蓄積が著しく減少した（図１３）。核酸塩基の各モルが、ＲＮＡからのＮＭＰの不可逆的減少に相関するので、このことは、ライセートにおける改善されたＮＭＰ安定性を示した。加えて、図１３において示すように、これらの温度条件下において外来ヌクレアーゼが添加される場合に、７０℃でRNase Rを添加した場合に、総ＮＭＰ蓄積の劇的な改善が観察された。GL17-109ライセートの塩基加水分解は、３２．６ｍＭのＮＭＰの最大濃度を示した。添加されたヌクレアーゼの希釈について補正することにより、７０℃でRNase Rにより観察された約２２ｍＭのＮＭＰの蓄積は、７５％の収率である。ｔＲＮＡが総ＲＮＡプールのうちの約１５％を表すこと、これらのヌクレアーゼが隔絶されていることを仮定して、これは、全てのアクセス可能なＲＮＡのうちの９４％の収率を表すであろう。GL17-086における脱重合は、ボード全体にわたりGL17-109よりより少なく、これは、より高いリン酸分解（phosphorylytic）活性に起因する可能性がある（データは示さず）。
【０２３８】
予熱失活およびライセート希釈の影響は、小さな利益を示したが、これは、より高い希釈率で希釈されたライセートについてのみであった。本研究においては、２つの型のライセート−脱重合されるべきＲＮＡを含む「試薬」ライセート、および外来ヌクレアーゼ（RNase RまたはヌクレアーゼＰ１）を含む「触媒」ライセートを作製した。下の表１４において示すような、多くの異なる条件を評価して、ＲＮＡ脱重合に対するそれらの影響を決定した。ほんの８０％に希釈したライセートは、ライセートの一部が加熱失活されているか否かにかかわらず、類似の脱重合性能を示した。しかし、ＲＮＡの大部分が失活したライセート中に存在した場合に、５０％まで希釈したライセートは、わずかにより良好に働いた。この希釈率で試験した条件全てにわたって、２．７％の平均の脱重合収率の改善が観察された。これらの条件下におけるこの脱重合反応の性能は、劇的な改善は示さないが、同等に、またはわずかにより良好に働くことにより、これは、万一当該プロセスの他の部分（例えば、培養中に残っている可能性がある任意の溶解していない細胞の増殖を停止すること、または、加熱処理の後にペレット化のステップが含まれる場合にライセート中のタンパク質含有量を減少させること）が必要とする場合に、脱重合前の加熱失活を実行することについての可能性を残しておく。
【０２３９】
表１４．ライセート、ヌクレアーゼ、および失活したライセートの多様な混合物全体のＲＮＡ脱重合の収率のまとめ。収率のパーセンテージは、ＲＮＡのライセート塩基加水分解を通して定量された３２．６ｍＭのＮＭＰの基礎に基づく。
【表１４】
2020536570.tif 000019
【０２４０】
例６：多様なヌクレオチドソースを用いるＲＮＡのセルフリー生成
材料および方法
市販のソースから得た酵母ＲＮＡ粉末を、水中で４５〜６０ｇ／Ｌに溶解して、１．２ｇ／ＬのＰ１ヌクレアーゼを、７０℃、ｐＨ５．５〜５．８で１時間にわたり０．０５ｍＭの塩化亜鉛の存在下において用いて、脱重合した。生じた脱重合された材料を、遠心分離により清澄化し、１０ｋＤａのMWCOフィルターを用いてろ過した。生じたろ過流は、５’ヌクレオチド一リン酸（ＮＭＰ）を、約９０〜１００ｍＭの総濃度（約２０〜２５ｍＭのＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＵＭＰ）で含んだ。個々のキナーゼ酵素（TthCmk、PfPyrH、TmGmk、AaNdk、およびDgPPK2）をコードするpBAD24由来のベクターを担持するE. coli BL21（DE3）誘導体を、５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを添加したKorz培地を用いた発酵物中で、標準的な技術を用いて培養した［Korz, D. J., Rinas, U., Hellmuth, K., Sanders, E. A., & Deckwer, W. D. (1995). Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli. Journal of biotechnology, 39(1), 59-65.］。Ｌ−アラビノースを添加することにより、タンパク質発現を誘導した。収集の後で、高圧均質化を用いて６０ｍＭのリン酸バッファー中で、ライセートを調製し、約４０ｇ／Ｌの総タンパク質の混合物を生じた。
【０２４１】
５２４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ配列をコードする１つ以上の転写鋳型（各々が、Ｔ７プロモーター、標的配列および１つ以上の転写ターミネーターからなる）を含むpUC19由来のベクターを担持するE. coli BL21（DE3）誘導体。細胞を、Korz培地中の発酵物中で、標準的な技術を用いて培養した［Phue, J. N., Lee, S. J., Trinh, L., & Shiloach, J. (2008). Modified Escherichia coli B (BL21), a superior producer of plasmid DNA compared with Escherichia coli K (DH5alpha). Biotechnology and bioengineering, 101(4), 831.］。類似の手順に従って、収集の後で、高圧均質化によりライセートを作製し、希釈し、加熱処理した。
類似の手順を用いて、熱安定性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素をコードするpBAD24由来のベクターを担持するE. coli BL21（DE3）誘導体を培養し、酵素発現を誘導し、ライセートを調製した。ポリメラーゼ酵素を、２ステップの硫酸アンモニウム分画を用いて、部分的に精製した。
３０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、表１５に従って、反応を組み立てた。
【０２４２】
表１５．反応条件
【表１５】
2020536570.tif 000020
セルフリー反応を組み立てるうえで、キナーゼ酵素および鋳型ＤＮＡを含むライセートを希釈し、等比率で組み合わせ、硫酸マグネシウムおよびヘキサメタリン酸ナトリウムなどの反応添加物と混合した。ライセートを、７０℃で１５分間にわたりインキュベートし、過剰発現されたキナーゼの活性を保存しつつ、他の酵素活性を失活させた。ＲＮＡポリメラーゼの添加によりセルフリー反応を開始させ、４８℃で１時間にわたりインキュベートし、確立されたプロトコルに従って分析した［Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA 抽出method free from phenol and chloroform. Analytical biochemistry, 512, 36］。
【０２４３】
結果
細胞ＲＮＡ、ヌクレオシド５’−一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ）の当モル混合物、または５’ヌクレオシド二リン酸（ＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＵＤＰ）の当モル混合物を用いて、セルフリーＲＮＡ合成反応を行った。各々のヌクレオチドソースについて、類似の力価のｄｓＲＮＡ生成物が生成された（図１７）。
これらの結果は、細胞ＲＮＡ、ヌクレオシド５’−一リン酸、およびヌクレオシド二リン酸を含むヌクレオチドの複数のソースからＲＮＡを合成するために、本明細書において記載されるセルフリー反応を用いることができることを示す。
【０２４４】
例７：野生型ＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡのセルフリー生成
材料および方法
ヘキサヒスチジンタグ付けされた熱安定性または野生型のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素をコードするpBAD24由来のベクターを担持するE. coli BL21（DE3）誘導体を、本明細書において記載される手順を用いて、培養し、酵素発現を誘導し、ライセートを調製した。本明細書において記載されるとおり、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により、ポリメラーゼ酵素を精製した。ある範囲の温度（３７〜４８℃）で２時間にわたり反応を行ったことを除いて、本明細書において記載されるとおりに、セルフリー反応を行った。本明細書において記載されるとおりに、ｄｓＲＮＡ生成物の力価を定量した。
【０２４５】
結果
野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたは熱安定性変異体を用いて、セルフリーＲＮＡ合成反応を行った（図１８）。熱安定性変異体により行われた反応は、３７℃および４８℃でｄｓＲＮＡ生成物を生成した。対照的に、野生型ポリメラーゼにより行われた反応は、３７℃で生成物を生成したが、４８℃では生成しなかった。
これらの結果は、本明細書において記載されるセルフリー反応は、それらが適切な温度でインキュベートされることを前提として、熱安定性ＲＮＡポリメラーゼを必要としないことを示す。
【０２４６】
例８：多様なヌクレオチドソースを用いるＮＴＰのセルフリー生成
材料および方法
鋳型ＤＮＡライセートおよびＲＮＡポリメラーゼを除外したことを除いて、例６において記載されるとおり、セルフリー反応を行った。ヌクレオチドは、公開された方法の適応を用いてＨＰＬＣにより分析した［de Korte, D., Haverkort, W. A., Roos, D., & van Gennip, A. H. (1985). Anion-exchange high performance liquid chromatography method for the quantitation of nucleotides in human blood cells. Clinica chimica acta；international journal of clinical chemistry, 148(3), 185.］
【０２４７】
結果
細胞ＲＮＡ、ヌクレオシド５’−一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ）の当モル混合物、または５’ヌクレオシド二リン酸（ＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＵＤＰ）の当モル混合物を用いて、ヌクレオチド５’−三リン酸（ＮＴＰ：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）を生成するためのセルフリー反応を行った。各々のヌクレオチドソースについて、類似の力価の各々のＮＴＰが生成された（図１９）。
これらの結果は、本明細書において記載されるセルフリー反応はまた、単純にＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ鋳型を除外することにより、ＮＴＰを生成するために用いることができることを示す。例６において記載されるＲＮＡを生成するセルフリー反応と同様に、ＮＴＰを生成するセルフリー反応は、細胞ＲＮＡ、ヌクレオシド５’−一リン酸、およびヌクレオシド二リン酸を含む、ヌクレオチドの複数のソースを利用することができる。
【０２４８】
参考文献
【表１６−１】
2020536570.tif 000021
【表１６−２】
2020536570.tif 000022
【表１６−３】
2020536570.tif 000023
【表１６−４】
2020536570.tif 000024
【表１６−５】
2020536570.tif 000025
【０２４９】
配列
【表１７−１】
2020536570.tif 000026
【表１７−２】
2020536570.tif 000027
【表１７−３】
2020536570.tif 000028
【０２５０】
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それについて各々が引用される手段に関して、参考として援用され、それは、いくつかの場合においては、当該文書の全体を包含し得る。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書において明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、明らかに逆であることが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
明らかに逆であることが示されない限り、本明細書において請求される任意の方法であって、１つより多くのステップまたは動作を含むものにおいて、当該方法のステップまたは動作の順序は、必ずしも、当該方法のステップまたは動作が記述される順序に限定されないことが、理解されるべきである。
【０２５１】
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「からなる（composed of）」などは、オープンエンドである、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁、特許審査便覧（Manual of Patent Examining Procedures）、セクション2111.03.において記載されるとおり、移行句「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、クローズドまたはセミクローズドな移行句であるべきである。
数値に先行する用語「約（about）」および「実質的に（substantially）」は、記述される数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供される場合、当該範囲の上限および下限の間の各々の値は、本明細書において、特に企図され、記載される。
【図１】
2020536570.tif 000029
【図２Ａ−Ｂ】
2020536570.tif 000030
【図２Ｃ−Ｅ】
2020536570.tif 000031
【図３】
2020536570.tif 000032
【図４】
2020536570.tif 000033
【図５】
2020536570.tif 000034
【図６】
2020536570.tif 000035
【図７】
2020536570.tif 000036
【図８】
2020536570.tif 000037
【図９】
2020536570.tif 000038
【図１０】
2020536570.tif 000039
【図１１Ａ】
2020536570.tif 000040
【図１１Ｂ】
2020536570.tif 000041
【図１２】
2020536570.tif 000042
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2020536570000001.app
【国際調査報告】
2020536570.tif 000050
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