(57)【要約】  本発明は、免疫原性弱毒化生チクングニアウイルスを製造する方法と並んで、それを含む医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子と、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つの突然変異を有するＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子と、（ｉｉｉ）任意に、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項２】
（ｉ）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子と、
（ｉｉ）任意に、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であって、
該組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の少なくとも３０％が、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現する、医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の少なくとも５０％、少なくとも７５％又は少なくとも９０％が、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の５０％未満、２５％未満又は１０％未満が、配列番号２のアミノ酸配列に関して１つ又は複数の突然変異を有するＥ２構造タンパク質を発現する、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の５０％未満、２５％未満又は１０％未満が、配列番号２のアミノ酸配列中に突然変異Ｅ１６８Ｋを有するＥ２構造タンパク質を発現する、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の１％〜５０％、５％〜３０％又は１０％〜２０％が、配列番号２のアミノ酸配列中に１つ又は複数の突然変異、好ましくは突然変異Ｅ１６８Ｋを有するＥ２構造タンパク質を発現する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
ベロ細胞におけるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の製造により得られる又は取得可能である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物が、前記医薬組成物で免疫されたマウスにおいてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３に対する中和抗体を誘導し、該中和抗体を含む血清を生じ、該血清が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて細胞、例えばベロ細胞のＣＨＩＫＶ感染を１：８０の血清希釈液で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％中和する、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
（ｉ）の前記ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３が配列番号１のポリヌクレオチド配列によって定義される、請求項１〜８のいずれに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｅ２構造タンパク質における前記少なくとも１つの突然変異が、Ｅ１６８Ｋ及びＧ５５Ｒから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記Ｅ２構造タンパク質における前記少なくとも１つの突然変異がＥ１６８Ｋである、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、有効量の配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含み、前記有効量が、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、好ましくは少なくとも１０３個の配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子として定義される、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、有効量の配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含み、前記有効量が、ワクチン接種された被験体においてチクングニアウイルスのウイルス血症を予防するのに十分な量として定義される、請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物がワンショット医薬組成物である、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含む医薬組成物を製造する方法であって、
−ウイルスの免疫原性を低下させる突然変異の存在を最小限に抑えるように、宿主細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を増殖させる工程を含む、方法。
【請求項１６】
２継代目（Ｐ２）のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスを使用する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスレスキュー後、培養中の宿主細胞上で配列番号１によって定義されるポリヌクレオチド配列を用いてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を５回未満継代する工程を含む、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含む医薬組成物を製造する方法。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含む３継代目（Ｐ３）のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を製造する方法であって、
−前記ウイルスの免疫原性を低下させる突然変異の存在を最小限に抑えるように、宿主細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を増殖させる工程を含む、方法。
【請求項１９】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質における前記免疫原性を低下させる突然変異の頻度が、配列番号１によって定義されるポリヌクレオチド配列を用いて、培養中の宿主細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を５回以上継代することにより得られるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質における免疫原性を低下させる突然変異の頻度と比較して低下している、請求項１５、１６又は１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原性を低下させる突然変異の頻度が、５回以上の継代と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％又は少なくとも５０％低下する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原性を低下させる突然変異が、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＥ２構造タンパク質に位置する、請求項１５、１６又は１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｅ２構造タンパク質に位置する前記免疫原性を低下させる突然変異が、Ｇ５５Ｒ及びＥ１６８Ｋから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｅ２構造タンパク質に位置する免疫原性を低下させる突然変異（複数の場合もある）がＥ１６８Ｋである、請求項１５、１６又は１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｅ２構造タンパク質の前記Ｅ１６８Ｋ突然変異の頻度が、採取されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全プールにおいて９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、好ましくは５０％未満である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１によって定義されるポリヌクレオチド配列を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を培養中の宿主細胞で５回未満、好ましくは４回未満、好ましくは３回未満、好ましくは２回未満、より好ましくは１回のみ、最も好ましくは最大３回継代する、請求項１５〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞を約２８℃〜３７℃、好ましくは約３５℃の温度で増殖させる、請求項１５〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
播種後２日目〜５日目、好ましくは播種後４日目に宿主細胞に感染させる、請求項１５〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞がベロ細胞である、請求項１５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞感染後１日目及び／又は２日目にＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を採取する、請求項１５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子又はＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含む前記医薬組成物を製造するために使用される感染多重度（ＭＯＩ）が０．１未満、好ましくは約０．１〜０．００１、より好ましくは、約０．０９〜０．００１１、更により好ましくは約０．０５〜０．００５、最も好ましくは約０．０１である、請求項１５〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
請求項１５〜３０のいずれかに記載の方法により取得可能である、医薬組成物。
【請求項３２】
前記医薬組成物がワクチンである、請求項１〜１４又は３１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記医薬組成物が凍結乾燥形態で提供される、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
チクングニアウイルス感染を治療又は予防する方法で使用するための、請求項１〜１４又は３１〜３３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３５】
有効量の請求項１〜１４又は請求項３１〜３３のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする被験体においてチクングニアウイルス感染を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性弱毒化生チクングニアウイルスの製造方法、またそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）は、トガウイルス科アルファウイルス属のプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスである。チクングニアウイルス疾患は、主に突発疾患であり、高い発病率を伴う。該ウイルスは蚊ベクターを介してヒトに伝播され、発熱、発疹、疲労、重度の多発性関節痛を引き起こす。死亡率は１０％〜３０％であるＣＮＳ感染を伴うまれな症例を除いて、ＣＨＩＫＶによる感染は一般に自然に消散し、通常は致命的ではない。特にＣＨＩＫＶ  ＣＮＳ疾患のリスクがあるのは、１歳未満の乳児及び６５歳超の成人であり、感染率はそれぞれ一般集団よりも２５倍及び６倍高い。ＣＨＩＫＶ脳炎後の小児における永続的な障害の割合は、３０パーセント〜４５パーセントと推定されている（Ｇｅｒａｒｄｉｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ａ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ｌａ  Ｒｅｕｎｉｏｎ  Ｉｓｌａｎｄ，２００５−２００９（２０１６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ８６：１−９）。さらに、チクングニアの全患者の約３０パーセントが、回復後数ヶ月から数年にわたって関節痛を経験している。場合によっては、神経、腎臓、心臓、呼吸器又は肝臓の合併症が発生することがある。
【０００３】
現在、チクングニアウイルス疾患の予防又は治療に使用可能なワクチン又は医薬品はない。過去のアウトブレイクは主にアフリカで発生していたが、最近では東中央南アフリカ（ＥＣＳＡ）遺伝子型の地理的範囲が拡大し、インド、アジア、更には温暖なヨーロッパにおけるアウトブレイクをもたらした（Ｗｅａｖｅｒ，Ｓ．，Ａｒｒｉｖａｌ  ｏｆ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ（２０１４）ＰＬＯＳ  Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ８（６）：ｅ２９２１）。ＣＨＩＫＶは１９９５年以来アメリカに繰り返し持ち込まれてきたが、カリブ海では２０１３年まで自然伝播は報告されていなかった。２０１５年までに、この流行は本土に広がり、アメリカ大陸の２７か国で１００万件を超える疑いのある症例をもたらした（Ｐａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（２０１５）Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｃａｓｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）。ＣＨＩＫＶ蚊ベクターの非流行地域への拡散、またそれと並んで地域の蚊の種に適応するＣＨＩＫＶの能力によって、さらなる流行が部分的に促進される場合がある（Ｖｅｇａ−Ｒｕａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  Ｌｏｃａｌ  Ａｅｄｅｓ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅ（２０１５）ＰＬＯＳ  Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００３７８０）。チクングニアウイルスの高い感染力、その地理的広がり、及び長期に亘る合併症の可能性は、ワクチン等の予防手段を開発する必要性を強調している。
【０００４】
チクングニアウイルスに対するワクチンは、弱毒化生ＣＨＩＫＶ粒子、すなわち、病原性を低減させるように変更されているが、なおも免疫原性を維持する生ＣＨＩＫＶ粒子を含み得る。弱毒化ＣＨＩＫＶの一例には、非構造タンパク質３に欠失突然変異が含まれる（ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３；図２を参照されたい）。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、マウス（Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｃ５７Ｂｌ／６  ｍｉｃｅ（２０１４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８：２８５８−２８６６）及び非ヒト霊長類（Ｒｏｑｕｅｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ（２０１７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｉｎｓｉｇｈｔ  ２（６）：ｅ８３５２７）に防御免疫を付与することが示されている。マウス及び非ヒト霊長類におけるこれらの予備的なｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、一般的にはヒトワクチンの生産には好ましくない細胞型であるＢＨＫ−２１細胞で生産されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスにより行われた。したがって、本明細書に開示されるように、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス生産をより適した細胞培養プラットフォームに適合させることが必要であろう。かかる適応は平凡なプロセスではなく、例えば、特定の宿主細胞へのウイルスの適応は、ウイルス粒子の表面電荷を変化させる突然変異を引き起こす可能性があることが当技術分野で知られている。かかる後天的な突然変異は、ウイルスを弱毒化するのに役立ち、実際、ウイルスに対する多くのワクチンで使用されるかかる弱毒化ウイルス粒子の開発には、連続継代が使用されてきた。ＣＨＩＫＶに関しては、病原性野生型チクングニアウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの継代を繰り返すと特定の点突然変異に結び付くことがあり、ウイルスの部分的又は完全な弱毒化をもたらすことが示されている（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ：Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｂｏｖｉｒａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（２０１４）ＰＬＯＳ  Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ８（２）：ｅ２７１９）。
【０００５】
驚いたことに、現在、免疫原性の喪失をもたらす特定の点突然変異が弱毒化ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の細胞基質適応プロセスの間の初期に起こることがわかっており、ワクチン候補の生産の成功のため上記点突然変異の制御又は減少は必須の検討事項となっている。したがって、本発明は、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ワクチン候補の増殖のための明確に定義されたパラメーターを用いるプロセスを提供し、産業用途に適した細胞培養で高い生産力価を同時に達成しながら、高度に免疫原性のウイルス粒子の生産を可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、被験体において中和免疫応答、すなわち、チクングニアウイルスによる感染及び／又はチクングニアウイルスによって引き起こされる疾患に対して保護的である免疫応答を誘発するのに十分な量の免疫原性チクングニアウイルスを含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、弱毒化生ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子を含む医薬組成物を提供し、免疫原性を低下させる突然変異、特にＥ２タンパク質中に免疫原性を低下させる突然変異を有する上記ウイルス粒子の割合が最小限に抑えられる。本開示はさらに、弱毒化生ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含む医薬組成物を製造する方法を提供し、該方法は、ウイルスゲノム中、特にウイルスＥ２タンパク質のＥ１６８及び／又は他のＥ２残基及び／又は他の構造若しくは非構造ＣＨＩＫＶタンパク質の残基における免疫原性を低下させる突然変異の存在を最小限に抑える。本開示はさらに、本発明の方法により取得可能な免疫原性弱毒化生チクングニアウイルスを含む医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
現在、チクングニアウイルスに対するワクチンを開発する努力が行われている。最も先進的なワクチン候補の１つは、麻疹ウイルスプラットフォームのキメラコンストラクトを提供する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｍｉｓｂｉｏ．ｃｏｍ／＃／ｎｅｗｓを参照されたい）。現在第２相試験中のワクチンは、２回の投薬で送達される（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２８６１５８６？ｔｅｒｍ＝ｔｈｅｍｉｓ＆ｒｅｃｒｓ＝ａ＆ｒａｎｋ＝２）。ワンショットワクチンは、当該分野で明確な利点となろう。
【０００８】
したがって、一実施形態では、本発明の目的は、安定した、明確に定義された、安全且つ有効な医薬組成物、例えば、チクングニアウイルス等に対するワクチン、好ましくは、１回のみのワクチン接種で防御を付与する改善されたワクチン、すなわち、一般的な細胞基質を使用する工業規模でのいわゆる「ワンショット」ワクチンを提供すること、かかる安定した、明確に定義された、安全且つ効果的なワクチンを生成する方法、並びに上記安定した、明確に定義された、安全且つ効果的なワクチンの方法及び使用を提供することである。
【０００９】
添付の図面は、縮尺通りに描くことを意図したものではない。図面は例示にすぎず、本開示の実施に必要ではない。明確にするために、全ての構成要素が全ての図面で標識されているわけではない。図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】合成されたフラグメントからのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのフルアセンブリに使用されるｐＭＸプラスミドのマップ。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列のフルアセンブリには、アンピシリン耐性カセット（ｐＭＡ）を持つｐＭＸプラスミドを使用した。ｐＭＸベクターシリーズは、ｐＵＣ様クローニングベクターに基づいているが、不要なプロモーターは除外している（バイオセーフティレベル１）。
【図２】ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のゲノム構造の模式図。チクングニアウイルスのゲノムは、非構造タンパク質１〜非構造タンパク質４（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）及び構造タンパク質（Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）の２つのポリタンパク質をコードする。野生型ゲノム配列と比較して、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列は、ｎｓＰ３（ｎｓＰ１−４ポリタンパク質のアミノ酸１６５６〜１７１７）をコードする配列の３’部分に１８３ｂｐの欠失を含み、ｎｓＰ３レプリカーゼタンパク質中の６０個のアミノ酸の欠失をもたらす（Δ６０ａａで示される）。ＳＰ、サブゲノムプロモーター；ＵＴＲ、非翻訳領域。（上記Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４から適合させた図）
【図３−１】ｐＭＡでのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのアセンブリのためのクローニング戦略。（Ａ）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全ゲノムをカバーする合成ポリヌクレオチドフラグメントの設計図。（Ｂ）ｐＭＡプラスミドでのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのアセンブリのためのクローニング戦略。１．ＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩを介するフラグメント１を含むｐＭＡ（ｐＭＡフラグメント１）へのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３フラグメント２のクローニング。２．ＣｌａＩ及びＰａｃＩを介するフラグメント４及びフラグメント３のアセンブリ。３．最終的なフルアセンブリのため、ｐＭＡにおけるＸｈｏＩ及びＰａｃＩで消化したフラグメント５の調製。４．ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ消化フラグメント３及びグラフメント４、並びにＸｈｏＩ／ＰａｃＩ消化フラグメント５と、ＡｇｅＩ／ＰａｃＩ線形化ｐＭＡフラグメント１及びフラグメント２との融合によるｐＭＡにおけるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのフルアセンブリ。正しいＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムアセンブリを、サンガーシーケンシングにより検証した。
【図３−２】ｐＭＡでのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのアセンブリのためのクローニング戦略。（Ａ）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全ゲノムをカバーする合成ポリヌクレオチドフラグメントの設計図。（Ｂ）ｐＭＡプラスミドでのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのアセンブリのためのクローニング戦略。１．ＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩを介するフラグメント１を含むｐＭＡ（ｐＭＡフラグメント１）へのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３フラグメント２のクローニング。２．ＣｌａＩ及びＰａｃＩを介するフラグメント４及びフラグメント３のアセンブリ。３．最終的なフルアセンブリのため、ｐＭＡにおけるＸｈｏＩ及びＰａｃＩで消化したフラグメント５の調製。４．ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ消化フラグメント３及びグラフメント４、並びにＸｈｏＩ／ＰａｃＩ消化フラグメント５と、ＡｇｅＩ／ＰａｃＩ線形化ｐＭＡフラグメント１及びフラグメント２との融合によるｐＭＡにおけるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのフルアセンブリ。正しいＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムアセンブリを、サンガーシーケンシングにより検証した。
【図４−１】ベロ細胞での継代後のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の収率、プラークサイズ及び免疫原性。表２に詳述されているように、共通のＰ０（レスキュー）から開始して３つの並列する複製物（Ａ、Ｂ、及びＣ）でウイルスを継代した。（Ａ）０継代目〜１６継代目のベロ細胞の感染から２４時間後のウイルス力価。３つの複製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）の平均力価を示す。（Ｂ）プラークアッセイで評価したＰ０、Ｐ５、及びＰ１５のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の相対力価。ベロ細胞は、５％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％抗生物質−抗真菌剤（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ）で補足したＭＥＭ中、６ウェルプレートで１ウェル当たり４×１０５細胞の密度で播種し、３５℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、培養上清をベロ細胞から除去し、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の連続希釈液を細胞に添加した。３５℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、最終濃度２％のメチルセルロースオーバーレイを加え、細胞を３５℃／５％ＣＯ２で３日間更にインキュベートした。最後に、ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）及びプラーク形態を評価するため、クリスタルバイオレット染色（５％ホルムアルデヒド中０．５％クリスタルバイオレット）後にプラークを数えた。（Ｃ）ベロ細胞でのＰＲＮＴにおいてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）の中和により評価されるＰ０、Ｐ５Ｂ、Ｐ８Ｂ及びＰ１５ＣのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性。ベロ細胞を３×１０５の密度で１２ウェルプレートに播種し、３５℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群を、１０５  ＴＣＩＤ５０の用量の各ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３継代物を用いて皮下に１回免疫した。同じく１０５  ＴＣＩＤ５０のＰ０のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（ウイルスレスキュー）を陽性対照として使用した。１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続希釈の２１日目の血清プールを５６０ｐｆｕ／ｍｌのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）と混合し、１時間インキュベートした。次いで、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３／中和混合物をベロ細胞に加え、プレートを３５℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。この工程の後に、２％メチルセルロースオーバーレイが続き、プレートを３５℃／５％ＣＯ２で約６０時間インキュベートした。オーバーレイを除去した後、細胞をクリスタルバイオレット／５％ホルムアルデヒドで染色し、プラークを数えた。
【図４−２】ベロ細胞での継代後のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の収率、プラークサイズ及び免疫原性。表２に詳述されているように、共通のＰ０（レスキュー）から開始して３つの並列する複製物（Ａ、Ｂ、及びＣ）でウイルスを継代した。（Ａ）０継代目〜１６継代目のベロ細胞の感染から２４時間後のウイルス力価。３つの複製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）の平均力価を示す。（Ｂ）プラークアッセイで評価したＰ０、Ｐ５、及びＰ１５のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の相対力価。ベロ細胞は、５％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％抗生物質−抗真菌剤（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ）で補足したＭＥＭ中、６ウェルプレートで１ウェル当たり４×１０５細胞の密度で播種し、３５℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、培養上清をベロ細胞から除去し、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の連続希釈液を細胞に添加した。３５℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、最終濃度２％のメチルセルロースオーバーレイを加え、細胞を３５℃／５％ＣＯ２で３日間更にインキュベートした。最後に、ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）及びプラーク形態を評価するため、クリスタルバイオレット染色（５％ホルムアルデヒド中０．５％クリスタルバイオレット）後にプラークを数えた。（Ｃ）ベロ細胞でのＰＲＮＴにおいてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）の中和により評価されるＰ０、Ｐ５Ｂ、Ｐ８Ｂ及びＰ１５ＣのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性。ベロ細胞を３×１０５の密度で１２ウェルプレートに播種し、３５℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群を、１０５  ＴＣＩＤ５０の用量の各ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３継代物を用いて皮下に１回免疫した。同じく１０５  ＴＣＩＤ５０のＰ０のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（ウイルスレスキュー）を陽性対照として使用した。１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続希釈の２１日目の血清プールを５６０ｐｆｕ／ｍｌのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）と混合し、１時間インキュベートした。次いで、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３／中和混合物をベロ細胞に加え、プレートを３５℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。この工程の後に、２％メチルセルロースオーバーレイが続き、プレートを３５℃／５％ＣＯ２で約６０時間インキュベートした。オーバーレイを除去した後、細胞をクリスタルバイオレット／５％ホルムアルデヒドで染色し、プラークを数えた。
【図５】ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の継代中の制御されたＭＯＩ（０．０１）の免疫原性への影響。（Ａ）非制御の及び制御された条件下のベロ細胞でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３継代の概略図。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３  Ｐ０を、様々なＭＯＩの非制御条件下においてベロ細胞でＰ３Ｂまで継代した（表２に概説される；複製物Ｂ）。Ｐ３Ｂを出発物質として使用し、０．０１の定義されたＭＯＩで全ての後続感染で制御された感染プロセスを行い、マウスにおける免疫原性の分析のため１つのＰ４継代物、２つのＰ５継代物、及び１つのＰ６継代物を生成した。（Ｂ）ベロ細胞でのＰＲＮＴにおいてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ２）の中和によって評価されるＰ０（○）、Ｐ２Ｂ（□）、Ｐ５＃１（●）、
【数１】
2020534256.tif 000002
Ｐ６（■）、及びＰ１５（Δ）のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性。１０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウス群を、１０５  ＴＣＩＤ５０の予定用量のそれぞれのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３調製物の単回用量で皮下免疫し、免疫後２１日目に、図４について記載される１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続希釈にてプールした血清をＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（５６０ｐｆｕ／ｍｌ）中和能について評価した。
【図６−１】Ｐ５Ｂ及びＰ８ＢからのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の単一プラーク分離株の免疫原性及び観察されたゲノムの不均一性。２つのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスレスキューの採取物（４３９９ｇｒ１  Ｐ０（＃１）及び４４１５ｇｒ１  Ｐ０（＃２））及びＰ１５のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３採取物（Ｐ１５Ｃ−ＤＳ）は、それぞれ免疫原性及び非免疫原性の対照としての役割を果たした。（Ａ）ベロ細胞でのＰＲＮＴにおいてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ２）を中和することにより評価した、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−１１、Ｐ５Ｂ−０３、及びＰ８Ｂ−０５の免疫原性。１０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群を、示されるＴＣＩＤ５０用量でそれぞれのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３分離株の単回用量で皮下免疫し、免疫後１９日目に、図４に記載される１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続希釈にてプールした血清をＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（５６０ｐｆｕ／ｍｌ）の中和能について評価した。（Ｂ）示される同定された点突然変異を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全ゲノムをカバーするサンガーシーケンシングに由来する、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−１１、Ｐ５Ｂ−０３、及びＰ８Ｂ−０５の概略ゲノム。（Ｃ）更なるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−０２、Ｐ５Ｂ−０４、Ｐ５Ｂ−０７及びＰ８Ｂ−０１の免疫原性を（Ａ）と同様に評価した。（Ｄ）示される同定された点突然変異を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全ゲノムをカバーするサンガーシーケンシングに由来する、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−０２、Ｐ８Ｂ−０１、Ｐ５Ｂ−０４、及びＰ５Ｂ−０７の概略ゲノム。
【図６−２】Ｐ５Ｂ及びＰ８ＢからのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の単一プラーク分離株の免疫原性及び観察されたゲノムの不均一性。２つのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスレスキューの採取物（４３９９ｇｒ１  Ｐ０（＃１）及び４４１５ｇｒ１  Ｐ０（＃２））及びＰ１５のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３採取物（Ｐ１５Ｃ−ＤＳ）は、それぞれ免疫原性及び非免疫原性の対照としての役割を果たした。（Ａ）ベロ細胞でのＰＲＮＴにおいてＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ２）を中和することにより評価した、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−１１、Ｐ５Ｂ−０３、及びＰ８Ｂ−０５の免疫原性。１０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群を、示されるＴＣＩＤ５０用量でそれぞれのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３分離株の単回用量で皮下免疫し、免疫後１９日目に、図４に記載される１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続希釈にてプールした血清をＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（５６０ｐｆｕ／ｍｌ）の中和能について評価した。（Ｂ）示される同定された点突然変異を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全ゲノムをカバーするサンガーシーケンシングに由来する、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−１１、Ｐ５Ｂ−０３、及びＰ８Ｂ−０５の概略ゲノム。（Ｃ）更なるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−０２、Ｐ５Ｂ−０４、Ｐ５Ｂ−０７及びＰ８Ｂ−０１の免疫原性を（Ａ）と同様に評価した。（Ｄ）示される同定された点突然変異を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全ゲノムをカバーするサンガーシーケンシングに由来する、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３単一プラーク分離株Ｐ５Ｂ−０２、Ｐ８Ｂ−０１、Ｐ５Ｂ−０４、及びＰ５Ｂ−０７の概略ゲノム。
【図７】３継代目によって生じるＥ２タンパク質のＥ１６８Ｋ及びＥ２４７Ｋの不均一性を明らかにする、０継代目（Ｐ０）でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３及び３継代目に独立して生成された４つのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプル（Ｐ３の実施例１〜実施例４）のサンガーシーケンシングのクロマトグラム。Ｐ３で個別に生成された４つのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプル（Ｐ３の実施例１〜実施例４）は、いずれも同じＭＶＳＢ（Ｐ１）に由来した。示される領域は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１６８及び２４７をコードするゲノム領域をカバーし、示されるように、プライマー対１６及び１７で配列決定された。（プライマー配列については、表１を参照されたい）。比較のため、０継代目（Ｐ０）でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のシーケンシングクロマトグラムを示す。配列不均一性の部位を四角で示す。
【図８−１】マスターウイルスシードバンク（Ｐ１）及び独立して生成された２つの３継代目（Ｐ３）のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３調製物の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）：（Ａ）Ｐ１−ＭＶＳＢ；（Ｂ）Ｐ３−実施例３；（Ｃ）Ｐ３−実施例４。ゲノム不均一性のバックグラウンドレベルは、点線で示すように１５％に設定されている。３継代目によって生じるより頻繁な不均一性には、ゲノム核酸の８８８２位及び９１１９位での点突然変異が含まれ、これは、それぞれ（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるＥ２タンパク質のＥ１６８Ｋ及びＥ２４７Ｋの突然変異に対応する。
【図８−２】マスターウイルスシードバンク（Ｐ１）及び独立して生成された２つの３継代目（Ｐ３）のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３調製物の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）：（Ａ）Ｐ１−ＭＶＳＢ；（Ｂ）Ｐ３−実施例３；（Ｃ）Ｐ３−実施例４。ゲノム不均一性のバックグラウンドレベルは、点線で示すように１５％に設定されている。３継代目によって生じるより頻繁な不均一性には、ゲノム核酸の８８８２位及び９１１９位での点突然変異が含まれ、これは、それぞれ（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるＥ２タンパク質のＥ１６８Ｋ及びＥ２４７Ｋの突然変異に対応する。
【図９】セネガル３７９９７株のＣＨＩＫＶ  ＶＬＰのクライオＥＭ構造上の同等の位置にマークされたＥ２糖タンパク質内で頻繁に観察される不均一性（Ｇ５５Ｒ、Ｇ８２Ｒ、Ｅ１６８Ｋ、及びＥ２４７Ｋ）を有するアミノ酸位置の場所（ＰＤＢ  ３Ｊ２Ｗ；Ｓｕｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ａｔ  ｐｓｅｕｄｏ  ａｔｏｍｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｈｏｗ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ（２０１３）ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４３５．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４３５）。Ｇ５５Ｒを四角で示し、Ｇ８２Ｒを円で示し、Ｅ１６８Ｋを三角形で示し、Ｅ２４７Ｋを星で示す。図は、括弧で示される膜貫通部分（ＴＭ）、膜の内側（底面）のカプシドタンパク質（Ｃ）を含むＥ１／Ｅ２二量体の４つのコピーで構成される、ウイルス膜にアッセンブルされ得る単位細胞のＣＨＩＫＶタンパク質を示す。３つのＥ１／Ｅ２／カプシドアセンブリが、全て表面提示において３つの異なる角度から見て、５回軸の近くで三量体ｑ３スパイクを構成し、４番目のアセンブリは３回軸のｉ３スパイクの３つの要素の１つである：（Ａ）ＣＨＩＫＶ単位細胞の側面図；膜平面上の視点。（Ｂ）ＣＨＩＫＶ単位細胞の側面図；膜平面下の視点、（Ｃ）ＣＨＩＫＶ単位細胞、上面図。
【図１０】Ｅ１６８Ｋ点突然変異の存在により、およそ３×１０４  ＴＣＩＤ５０の用量でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性が失われる閾値を決定するため、種々のＰ３：Ｐ５Ｂ−０７（Ｅ１６８Ｋ）比のウイルス調製物を用いるＣ５７Ｂｌ／６マウスの皮下免疫化のための群。群１、群３、及び群５のＰ３及びＰ５Ｂ−０７（Ｅ１６８Ｋ突然変異体）の配合比は、３×１０４のＴＣＩＤ５０の予定用量で、それぞれ１：０．１、１：１、１：１０であった。さらに、群６及び群７は、それぞれＰ３のみ及びＰ５Ｂ−０７（Ｅ１６８Ｋ）のみを表す。異型遺伝子位置（ヌクレオチド８８８２に対応）の参照配列（野生型）はＧであり、１：０．１、１：１又は１：１０のいずれかの比に応じて、ヌクレオチドＡへのシフト、すなわちＧ＞ＡからＧ＝Ａ又はＧ＜Ａは、シーケンシングクロマトグラムに従った。Ｐ３ウイルス集団は、約２０％のＥ１６８Ｋ突然変異体を示した。Ｐ５Ｂ−０７（Ｅ１６８Ｋ）ウイルス集団は不均一性を示さなかった（すなわち、約１００％がＥ２タンパク質Ｅ１６８Ｋ突然変異を含んだ）。
【図１１】ＶＲＰに基づく中和アッセイにより評価された、種々のＥ１６８Ｋの突然変異体ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３に対するＰ３の比の免疫原性への影響。図１０に概説されるように、１：０．１、１：１、１：１０の比のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｐ３：Ｅ１６８Ｋの３×１０４個のＴＣＩＤ５０の予定用量を用いるＣ５７Ｂｌ／６マウスの皮下免疫によって、単一のマウス血清を生成した。２１日目、単一の血清を、ＢＨＫ−２１細胞に基づくルシフェラーゼアッセイを使用してＬＲ−ＣＨＩＫＶウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の中和について分析した。ＶＲＰは、ＬＲ２００６−ＯＰＹ１野生型ウイルスのカプシド及びエンベロープのタンパク質を提示する複製欠損野生型ＣＨＩＫＶに類似する。簡潔には、２×１０４個のＢＨＫ−２１細胞を９６ウェルプレートに播種し、３５℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ＶＲＰを、マウス血清の連続希釈液（１：２０で開始して１：３１２５００まで）と共に３５℃で１時間インキュベートした。ＣＨＩＫＶ  ＶＲＰ／血清混合物をＢＨＫ−２１細胞にＭＯＩ  ５で添加し、３５℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加した。ルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、感染後２４時間の上清で測定した。Ｐ−ＭＶＳＢ陽性対照（○）、Ｐ５Ｂ−０７（Ｅ１６８Ｋ）陰性対照（□）、及びそれぞれのＰ３：Ｅ１６８Ｋ比で免疫された個々のマウス血清（黒丸）。（Ａ）１：０．１の比のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｐ３：Ｅ１６８Ｋの免疫原性（群１）。（Ｂ）１：１の比のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｐ３：Ｅ１６８Ｋの免疫原性（群３）。（Ｃ）１：１０の比のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｐ３：Ｅ１６８Ｋの免疫原性（群５）。（Ｄ）Ａ、Ｂ、及びＣに示される免疫原性の結果の要約：Ｐ３と比較して、強い免疫原性（＋＋陽性）、低免疫原性（＋低陽性）及び陰性（−）。
【図１２】８５０ｃｍ２のローラーボトルに入れたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の解凍から感染までのベロ細胞培養列。Ｐ：継代、Ｍ：百万、Ｔ７５：Ｔ−フラスコ７５ｃｍ２、Ｔ１７５：Ｔ−フラスコ１７５ｃｍ２、ＲＢ８５０：ローラーボトルＣｅｌｌＢＩＮＤ  ８５０ｃｍ２。
【図１３−１】ベロ細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を生産する際の細胞増殖温度、感染多重度、播種後感染時間のウイルス力価への影響。ベロ細胞を、ＭＥＭ、２ｍＭグルタミン及び１０％ＦＢＳにおいて３５℃で増殖させ、細胞感染のため８５０ｃｍ２ローラーボトルに播種した。ウイルス生産について、種々の温度（３７℃、３５℃、２８℃）、ＭＯＩ（０．１、０．０１、０．００１のＴＣＩＤ５０／細胞）及びベロ細胞播種後の細胞感染の日数（Ｄ２、Ｄ４、Ｄ５）を、ＦＢＳを欠く培養培地で試験した。Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ法に従ってベロ細胞で測定され、ＴＣＩＤ５０／ｍＬで表されるウイルスの生産性を示す。（Ａ）３７℃、（Ｂ）３５℃、（Ｃ）２８℃。
【図１３−２】ベロ細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を生産する際の細胞増殖温度、感染多重度、播種後感染時間のウイルス力価への影響。ベロ細胞を、ＭＥＭ、２ｍＭグルタミン及び１０％ＦＢＳにおいて３５℃で増殖させ、細胞感染のため８５０ｃｍ２ローラーボトルに播種した。ウイルス生産について、種々の温度（３７℃、３５℃、２８℃）、ＭＯＩ（０．１、０．０１、０．００１のＴＣＩＤ５０／細胞）及びベロ細胞播種後の細胞感染の日数（Ｄ２、Ｄ４、Ｄ５）を、ＦＢＳを欠く培養培地で試験した。Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ法に従ってベロ細胞で測定され、ＴＣＩＤ５０／ｍＬで表されるウイルスの生産性を示す。（Ａ）３７℃、（Ｂ）３５℃、（Ｃ）２８℃。
【図１４】図１３に記載される各条件からのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスの総生産性。
【図１５】ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の最大ウイルス力価：応答曲面二次モデル。（Ａ）モデルのＡＮＯＶＡ分析。灰色線：有意なモデル条件（Ｐｒｏｂ（Ｆ）＜０．０５；０．１超の値は、モデル条件が有意でないことを示す）。（Ｂ）モデルの等高線プロット。
【図１６】ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のウイルス安定性：応答曲面二次モデル。（Ａ）モデルのＡＮＯＶＡ分析。灰色線：有意なモデル条件（Ｐｒｏｂ（Ｆ）＜０．０５；０．１超の値は、モデル条件が有意でないことを示す）。（Ｂ）モデルの等高線プロット。
【図１７】Ｅ２アミノ酸１６８、２４７及び４２３にそれぞれ対応するゲノム核酸８８８２位、９１１２位及び９６４９位でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｅ２ウイルスタンパク質の不均一性：２日目のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプル採取からのモデル分析。（Ａ）モデルのＡＮＯＶＡ分析。灰色線：有意なモデル条件（Ｐｒｏｂ（Ｆ）＜０．０５）。（Ｂ）モデルの等高線プロット。
【図１８】Ｅ２アミノ酸１６８、２４７、４２３にそれぞれ対応する、ゲノム核酸８８８２位、９１１２位及び９６４９位でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｅ２ウイルスタンパク質の不均一性。２日目及び５日目のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプル採取（２８℃）からのモデル分析。（Ａ）モデルのＡＮＯＶＡ分析。灰色線：有意なモデル条件（Ｐｒｏｂ（Ｆ）＜０．０５）。（Ｂ）モデルの等高線プロット。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３弱毒化ウイルスワクチン候補の工業化の過程で、ベロ細胞でのウイルスの継代により、継代数が増加するにつれてウイルス力価が高くなることが観察されたが、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスゲノムの配列不均一性の付随的な増加も観察された。ベロ細胞での継代中に生じる特定の点突然変異は、バッチごとに再現可能であることがわかり、新たな細胞基質での初期継代で既に現れていた。驚いたことに、これらの突然変異の幾つかは、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスによって付与される免疫原性の中和の有意な損失又は減少と相関することが観察された。その他の再現可能な突然変異は、免疫原性を低下させず、及び／又は免疫原性を低下させる突然変異の「レスキュー」突然変異として作用した。低感染多重度（「ＭＯＩ」）とＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の配列不均一性増加の生成との相関が特定されたが、長年の製造期間にわたって単一のウイルス源を持つ必要があるため、一般に、高ＭＯＩは工業的使用には適していない。したがって、再現性があり信頼性の高い製造に十分な生産収率で免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の生成を可能にする培養条件を見つけることができるかどうか（本発明の課題）は、当初は明らかではなかった。
【００１２】
本明細書において提供されるのは、本明細書で観察される免疫原性を低下させる突然変異を制御及び最小限に抑える一方で、依然として高い生産収率を可能にする方法である。本明細書では、有効量の免疫原性チクングニアウイルスを、残存量のチクングニアウイルスの非免疫原性変異体と共に含む医薬組成物も提供される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、０．１未満、例えば０．１又は０．００１のＭＯＩ等の低ＭＯＩを使用して生産されるが、本明細書に記載されるチクングニアウイルスの非免疫原性変異体（複数の場合もある）の量を最小限に抑えるため、かかる制御された条件（例えば、レスキュー後の継代数の減少、最適化された温度及び宿主細胞のコンフルエンシー）のもとで生産される。幾つかの実施形態では、ウイルス粒子は、生ウイルス、キメラウイルス、弱毒化生ウイルス、改変生ウイルス、又は組換え生ウイルスである。一実施形態では、本発明のウイルス粒子は、任意に不活化されてもよい。幾つかの実施形態では、ウイルス粒子は弱毒化形態のウイルス粒子である。例えば、ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、宿主における感染性、毒性、及び／又は複製が減少している可能性がある。幾つかの実施形態では、ウイルスは突然変異ウイルス又は改変ウイルスであり、例えば、ウイルスの核酸は、野生型ウイルスと比較して少なくとも１つの置換又は欠失等の突然変異を含み得る。幾つかの実施形態では、ウイルスは組換え生ウイルスであり、組換えにより生成されて、異なる供給源に由来する核酸配列を含む可能性があるウイルスを意味する。幾つかの態様では、野生型チクングニアウイルスは不活化されている。好ましい実施形態では、ウイルスはホルムアルデヒドで不活化されている。
【００１３】
一実施形態では、免疫原性チクングニアウイルスは弱毒化生ウイルスである。好ましい実施形態では、弱毒化生チクングニアウイルスは、Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（上記）によって記載され、本明細書ではＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３と称され、配列番号１の核酸配列によって定義される、防御性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３である。簡潔には、野生型ＣＨＩＫＶゲノムは、非構造タンパク質（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）及び構造タンパク質（Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、及びＥ１）をそれぞれコードする２つのオープンリーディングフレームを含む１１ｋｂのプラス鎖１本鎖ＲＮＡゲノムを保有する。Ｌａ  Ｒｅｕｎｉｏｎ  ＣＨＩＫＶのＬＲ２００６−ＯＰＹ１株に基づく弱毒化ＣＨＩＫウイルスＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を、ｎｓＰ３タンパク質の超可変領域においてＰ１２３４ポリタンパク質のアミノ酸残基１６５６〜１７１７を小さなリンカー（ＡＡ配列ＡＹＲＡＡＡＧ）で置換することにより構築した（図２を参照されたい）。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、感染性で高免疫原性であって、野生型ＣＨＩＫＶによる攻撃に対して防御性であることが示されている（上記Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，及びＨａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｍｅ−Ｂｏｏｓｔ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｖｉｒｕｓ（２０１４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８８（２２）：１３３３３−１３３４３、及び上記Ｒｏｑｕｅｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．２０１７）。一実施形態では、弱毒化生チクングニアウイルスは、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３弱毒化突然変異体ウイルスの変異体であってもよい。好ましい実施形態では、本明細書で提供される生弱毒化チクングニアウイルスは、配列番号１によって定義される核酸配列によってコードされるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含む。本明細書で使用される場合、「ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３」という用語は、「ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス」、「ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子」、「ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス粒子」又はそれらの複数のバージョンと区別なく使用される。
【００１４】
本明細書では、有効量のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含む医薬組成物が提供される。一態様では、免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスの有効量は、チクングニアウイルスに対する中和抗体を誘発するのに十分な量として定義される。更なる態様では、免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスの有効量は、チクングニアウイルス感染に対する防御免疫を付与するワクチンを接種した被験体において免疫応答を誘発する量として定義される。好ましい態様では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の有効量は、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、好ましくは少なくとも１０３個の免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子として定義される。一態様では、免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子は、配列番号２のポリペプチド配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子として定義される。一態様では、Ｅ２構造タンパク質は、ウイルスの免疫原性に影響しない、すなわち免疫原性を低下させない１つ又は複数の点突然変異を含む。一実施形態では、ウイルスの免疫原性に影響しない点突然変異は、Ｈ２３２Ｙ及び／又はＥ２４７Ｋ等のＥ２タンパク質のアミノ酸２３２及び／又は２４７のものであってもよい。一実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質は、約１０個以下の点突然変異を含む。一実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質は、９個、８個、７個、６個、５個、又は４個以下の天突然変異を含む。好ましい実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質は、３個以下の点突然変異、最も好ましくは１個又は２個の点突然変異のみを含む。
【００１５】
本明細書で定義されるように、免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、例えば、約３×１０４  ＴＣＩＤ５０の用量で送達されると、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効な免疫応答、すなわち、チクングニアウイルス疾患の徴候又は症状を軽減又は予防するのに十分な中和抗体が生産される免疫応答を賦活することができるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３である。好ましい実施形態では、本明細書で定義される免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、配列番号２によって提供されるアミノ酸配列に従ってＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３である。更に好ましい実施形態では、本明細書で定義される免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、配列番号１のポリヌクレオチド配列によって定義される。代替又は追加の定義として、本発明の免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、免疫された被験体において中和能力を有する、すなわち、１：８０以上の血清希釈液で、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるチクングニアウイルスの中和を伴う抗体の生産を賦活する。
【００１６】
本明細書で定義されるように、非免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、チクングニアウイルス疾患の徴候又は症状を予防するのに不十分なワクチン接種被験体において中和抗体のレベルを誘発するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３である。好ましい実施形態では、非免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、少なくとも１つのアミノ酸置換、特にＥ２構造タンパク質のアミノ酸置換、特にＥ１６８Ｋ及び／又はＧ５５Ｒ置換、特にＥ１６８Ｋ置換を有するＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３である。非免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでチクングニアウイルス（野生型又は弱毒化）による細胞の感染を中和する能力が低いことを示す、免疫された被験体において抗体を誘発するものとして更に定義される。特に、非免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は、１：８０以上の血清希釈液で６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、特に１０％未満のｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおけるチクングニアウイルスの中和をもたらす、免疫された被験者における中和抗体のレベルを誘発するものとして定義される。
【００１７】
更なる態様では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の有効量は、野生型チクングニアウイルスに対して中和抗体を誘発するのに十分な量として定義される。一態様では、医薬組成物はツーショット（ｔｗｏ−ｓｈｏｔ）医薬組成物である。好ましい態様では、医薬組成物はワンショット（ｏｎｅ−ｓｈｏｔ）医薬組成物である。好ましい態様では、医薬組成物は、点突然変異、特に免疫原性を低下させる点突然変異の有無にかかわらず、粒子の合計プールに含まれる、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、好ましくは約１０３個〜１０５個の総ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス粒子、特に約１０３個又は１０４個のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含む。好ましい態様では、医薬組成物は、本明細書で定義される検出可能な量の非免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３、好ましくは、配列番号２によって定義される野生型Ｅ２タンパク質と比較して少なくとも１つの点突然変異を有する非免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含む。
【００１８】
好ましい実施形態では、医薬組成物はＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含み、例えば、上記Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．２０１４に記載されるマウス研究において、ＢＨＫ−２１細胞で生産されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含むワクチン組成物と比較してＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の非免疫原性変異体（複数の場合もある）を増加した量で含むが、ワクチン接種被験体において防御免疫をもたらすのに十分なＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性粒子を依然として含む。例えば、医薬組成物は、（ｉ）ワクチン接種した被験体において防御免疫をもたらすのに十分な量で配列番号２のポリペプチド配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３；（ｉｉ）例えば、上記Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．２０１４に記載されるマウス研究で使用されるＢＨＫ−２１で生産されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含むワクチン組成物と比較して、増加した量の上記Ｅ２構造タンパク質に少なくとも１つの突然変異を有するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３；及び（ｉｉｉ）任意に、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。
【００１９】
本明細書では、ベロ細胞での５回以上の連続継代によるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の生産は、特にＥ２構造タンパク質において高レベルの配列不均一性をもたらすことが実証されている（例えば、以下の実施例２を参照されたい）。例えば、Ｅ２タンパク質のＥ１６８Ｋ及び／又はＧ５５Ｒの突然変異は５継代目までに出現することが多く（例えば、以下の表３を参照されたい）、いずれも免疫原性の低下と相関した。したがって、上記Ｈａｌｌｅｎｇａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．２０１４に記載されるように、ベロ細胞での５回以上の継代を使用するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の生産は、不利に、ワクチン組成物にＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の非免疫原性突然変異体（Ｅ１６８Ｋ［Ｅ２］等）を高レベルでもたらす可能性がある。対照的に、５回未満の継代後のＥ２構造タンパク質の配列不均一性ははるかに低かったことが以下に実証される（例えば、実施例３を参照されたい−Ｅ１６８Ｋ突然変異は３回の継代後に存在したが、その頻度はわずか１８％であった）。
【００２０】
したがって、一態様では、医薬組成物は（ｉ）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３、及び（ｉｉ）任意に、薬学的に許容される賦形剤を含み、組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の少なくとも３０％が、配列番号２のポリペプチド配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現する。この実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の少なくとも３０％は、Ｅ２構造タンパク質に関して非突然変異体であり、すなわち、配列番号２のＥ２構造タンパク質を発現する。言い換えれば、配列不均一性（すなわち、配列番号２のＥ２構造タンパク質において少なくとも１つの突然変異を発現する突然変異ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子）の頻度は、は７０％以下である。特に明記しない限り、一般に「ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３」又は「ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子」について言及する場合、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の非変異体及び突然変異体の形態の両方、すなわち配列番号２のＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３、及び配列番号２に１つ又は複数の突然変異を有するＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を包含することを意図する。一実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質は、約１０個以下の点突然変異を含む。一実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質は、９個、８個、７個、６個、５個、又は４個以下の点突然変異を含む。好ましい実施形態では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２構造タンパク質は、３個以下の点突然変異、最も好ましくは１個又は２個の点突然変異のみを含む。
【００２１】
好ましい実施形態では、組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が非突然変異体であり、すなわち、配列番号２のポリペプチド配列によって定義されるＥ２構造タンパク質を発現する。
【００２２】
一態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３、及び（ｉｉ）任意に、薬学的に許容される賦形剤を含み、該組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の７０％未満が、配列番号２のポリペプチド配列に関して１つ又は複数の突然変異を有するＥ２構造タンパク質を発現する。
【００２３】
一態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３、及び（ｉｉ）任意に、薬学的に許容される賦形剤を含み、該組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の７０％未満が、配列番号２のポリペプチド配列中に突然変異Ｅ１６８Ｋを有するＥ２構造タンパク質を発現する。
【００２４】
好ましい実施形態では、Ｅ２構造タンパク質中の突然変異（例えば、突然変異Ｅ１６８Ｋ）は、７０％以下の頻度で存在し、例えば、全ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の７０％未満が１つ又は複数の突然変異（又は突然変異Ｅ１６８Ｋ）を含み、全ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の３０％以上が非変異Ｅ２構造タンパク質又は突然変異Ｅ１６８Ｋを含まないＥ２構造タンパク質を発現する。
【００２５】
好ましい実施形態では、組成物中に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子の６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％未満が、配列番号２のポリペプチド配列に関して１つ又は複数の突然変異（例えばＥ１６８Ｋ等）を有するＥ２構造タンパク質を発現する。例えば、上記組成物は、該組成物に存在するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子（突然変異体及び非突然変異体）の総数と比較して、１％〜７０％、１％〜５０％、１％〜３０％、１％〜２０％、５％〜７０％、５％〜５０％、５％〜３０％、５％〜２０％、１０％〜７０％、１０％〜５０％、１０〜３０％又は１０％〜２０％の突然変異体粒子（すなわち、配列番号２のポリペプチド配列に関して１つ又は複数の突然変異（例えばＥ１６８Ｋ等）を有するＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子）を含んでもよい。一実施形態では、Ｅ１６８Ｋ突然変異を有するＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子は、Ｅ１６８Ｋ突然変異によって付与される免疫原性の喪失を軽減する突然変異を更に含む。一実施形態では、突然変異は、ｎｓＰ１タンパク質、特に残基Ａ３８にある。好ましい実施形態では、Ｅ１６８Ｋ突然変異を有するＥ２構造タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３粒子は、Ａ３８Ｓ突然変異を有するｎｓＰ１も発現する。
【００２６】
本明細書では、１）細胞株でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスを増殖させる工程、及び２）ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスの免疫原性を低下させる突然変異の存在を最小限に抑える工程を含む、本発明の医薬組成物を製造する方法も提供される。一実施形態では、免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスは、ＥＢ６６細胞株、ベロ細胞株、Ｖｅｒｏ−αＨｉｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞株、２９３細胞株、ＰＣ１２細胞株、ＣＨＯ細胞株、３Ｔ３細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、ＭＤＳＫ細胞株、ニワトリ胚線維芽細胞株、アヒル細胞株及び二倍体鳥類細胞株からなる群から選択される細胞株で増殖される。幾つかの実施形態では、上記細胞株はアヒル細胞株である。幾つかの実施形態では、上記細胞株は二倍体鳥類細胞株である。幾つかの実施形態では、上記細胞株はＥＢ６６細胞株である。好ましい実施形態では、上記細胞株はベロ細胞株である。
【００２７】
一実施形態では、免疫原性を低下させる突然変異の存在は、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を５回未満、好ましくは４回未満、好ましくは３回未満、好ましくは２回未満、より好ましくは１回のみ、最も好ましくは多くても３回の継代によって最小限に抑えられる。本明細書で使用される場合、継代数は、ウイルスレスキュー（Ｐ０）後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代の数を指す。好ましい実施形態では、ウイルスはベロ細胞で継代される。一態様では、ウイルスを最適温度で増殖させる。好ましい実施形態では、該最適温度は約２８℃〜３７℃、好ましくは約３５℃である。
【００２８】
一実施形態では、宿主細胞培養物を、最適なＭＯＩでＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３に感染させる。一態様では、最適なＭＯＩは、過剰量のワーキングウイルスシードバンク培養物を必要としないほど低いが、本明細書に記載される免疫原性を低下させる突然変異を最小限に抑えるのに十分高いＭＯＩとして定義される。好ましい態様では、最適化されたＭＯＩは、０．１未満のＭＯＩ、好ましくは約０．１〜０．００１のＭＯＩ、より好ましくは約０．０９〜０．００１１のＭＯＩ、更により好ましくは約０．０５〜０．００５のＭＯＩ、最も好ましくは約０．０１のＭＯＩである。一態様では、宿主細胞のコンフルエンシーは感染前に評価される。一態様では、宿主細胞のコンフルエンシーは、約２０％〜９０％、好ましくは約３０％〜７５％、より好ましくは約４０％〜６０％、特に約５０％〜６０％である。一態様では、細胞培養物を、宿主細胞播種後の最適な時点、すなわち、宿主細胞播種後２日目〜５日目、好ましくは宿主細胞播種後約４日目に感染させる。一態様では、ウイルス粒子は、宿主細胞感染後１日目〜６日目、好ましくは１日目〜４日目、好ましくは宿主細胞感染後１日目又は２日目、好ましくは宿主細胞感染後１日目及び２日目の両方で採取される。
【００２９】
一態様では、免疫原性を低下させる突然変異は、配列番号１のポリヌクレオチド配列によって定義されるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のゲノム内の任意の位置の点突然変異である。一実施形態では、免疫原性を低下させる突然変異は、Ｅ２タンパク質以外の位置のゲノムに存在する。好ましい実施形態では、免疫原性を低下させる突然変異は、Ｅ２タンパク質中、好ましくはアミノ酸残基５５及び／又は１６８に位置し、例えばＧ５５Ｒ及び／又はＥ１６８Ｋの突然変異、特にＥ１６８Ｋである。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される免疫原性を低下させる突然変異は、ゲノム内の他の突然変異によって緩和又は「レスキュー」される。一実施形態では、Ｅ１６８Ｋの緩和突然変異（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）のＡ３８Ｓ突然変異である。
【００３０】
一態様では、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２タンパク質のＥ１６８Ｋ突然変異の頻度は、採取されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の全プールにおいて９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、好ましくは５０％未満である。
【００３１】
一態様では、本発明は、本明細書で提供されるプロセスによって取得可能な免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるプロセスによって取得可能な免疫原性ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明の態様は、チクングニアウイルス感染に対する免疫化のための組成物を製造する本明細書に記載される方法の使用を提供する。好ましい実施形態では、組成物はワクチンである。一実施形態では、ワクチンは被験体に１回、２回又は３回以上投与される。一態様では、免疫した被験体から単離されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス粒子は、特にＥ２構造タンパク質の点突然変異に関して、投与されるワクチン組成物と同様の点突然変異プロファイルを有する。一実施形態では、ワクチンは１回又は２回投与される。好ましい実施形態では、ワクチンは一度だけ投与される（例えばワンショットワクチン）。一態様では、追加免疫ワクチン接種が任意に適用される。特定の好ましい態様では、医薬組成物は凍結乾燥形態で提供される。
【００３３】
他の態様は、チクングニアウイルス感染を治療及び／又は予防する本明細書に記載の方法により得られるウイルス粒子を含む組成物を提供する。一態様では、該組成物は、被験体において免疫応答を賦活する方法及び／又はチクングニアウイルス感染を治療若しくは予防する方法において使用するものである。「予防する」という用語は本明細書で使用される場合、「から保護する」ことも意味する。一態様では、チクングニアウイルス感染は、西アフリカ、東／中央／南アフリカ（ＥＣＳＡ）及び／又はアジアのチクングニアウイルスの遺伝子型によって引き起こされる可能性がある。
【００３４】
本明細書に記載の方法のいずれかを使用して製造されたウイルス調製物は、追加の濾過工程及び／又は凍結乾燥を含む追加の処理工程に更に供されてもよい。ウイルス調製物は、調製物の純度の分析に供されてもよい。例えば、ウイルス調製物は、例えば宿主細胞ゲノムＤＮＡ、及び／又は宿主細胞タンパク質等の不純物及び汚染物質の存在について評価され得る。ウイルス調製物の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、様々な波長での光学密度、タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ及び／又はｑＰＣＲ等の当該技術分野で知られている任意の方法を使用して評価され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、ウイルス調製物は、残留する不純物又は汚染物質について評価される。幾つかの実施形態では、残留する不純物又は汚染物質の量は、例えばウイルス採取直後等、精製プロセスの初期段階での不純物又は汚染物質の量と比較される。幾つかの実施形態では、最終ウイルス調製物中の不純物の相対的減少は、精製プロセスの初期段階での不純物の存在と比較して６０％〜９５％である。幾つかの実施形態では、最終的なウイルス調製物中の不純物の相対的な減少は、およそ６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％である。幾つかの実施形態では、最終ウイルス調製物は、５％未満の不純物又は汚染物質を含む。幾つかの実施形態では、最終ウイルス調製物は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％未満、又は０．１％未満の不純物を含む。好ましい実施形態では、最終ウイルス調製物は、１％未満の不純物を含む。
【００３６】
本明細書に記載されるいずれかの方法は、被験体への投与のため精製されたウイルスを含む組成物の製造において使用され得る。幾つかの実施形態では、被験体は、家畜、ペット又は愛玩動物を含むヒト又は非ヒト動物等の哺乳動物の被験体である。幾つかの実施形態では、上記組成物は、ウイルス又はウイルス調製物に類似するウイルスに対する免疫化を必要とする被験体に投与される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して精製されたウイルス調製物又はウイルスを含む組成物は、ウイルス又はウイルス調製物に類似するウイルスによる感染を治療又は予防するものである。好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して精製されたウイルスを含むウイルス調製物又は組成物は、チクングニアウイルス感染、特に西アフリカ、東／中央／南アフリカ（ＥＣＳＡ）及び／又はアジアのチクングニアウイルスの遺伝子型によって引き起こされるチクングニアウイルス感染を治療又は予防するものである。
【００３７】
本明細書に記載の方法を使用して精製されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３医薬組成物又はＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスは、当技術分野で知られている任意の経路によって被験体に投与され得る。幾つかの実施形態では、上記調製物又は組成物は、非経口又は経口等の従来の経路を介して投与され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」投与には、皮下、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、静脈内、筋肉内、関節内、腹腔内、くも膜下腔内又は注入によるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法及び技術は、一般に、当該分野で周知の従来の方法に従って実施される。概して本明細書に記載される生化学、酵素学、分子生物学及び細胞生物学、微生物学、ウイルス学、細胞又は組織培養、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学に関連して使用される命名法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。本開示の方法及び技術は、概して当技術分野で周知の従来の方法に従って実施され、特に明記しない限り、本明細書を通じて引用及び検討される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載される。
【表１】
2020534256.tif 000003
【００３９】
実施例
実施例１.ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３原薬（ＤＳ）生産の初期試験
合成ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのアセンブリ
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスゲノムを、ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（ドイツ）において５つのフラグメントで合成し、標準的なクローニングベクターであるｐＭＡプラスミド（アンピシリン耐性をもつｐＭＸベクター）でフルアセンブリした。ｐＭＸベクター骨格を図１に示す。全てのクローニング及びプラスミド調製の手順は、エレクトロコンピテントＮＥＢ１０βＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用してＴＳＥ不含条件下で行われた。ｐＭＡにおけるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムのフルアセンブリに使用されるクローニング戦略の概要を図３Ｂに示す。簡潔には、ｎｓＰ１とｎｓＰ２の一部を包含するフラグメント１を含むｐＭＡプラスミド（図３Ａに示す）をＥｃｏＲＩ／ＰａｃＩ制限消化により線形化し、ｎｓＰ２及びｎｓＰ３の一部を包含するフラグメント２をフラグメント１に融合した。並行して、フラグメント３（ｎｓＰ４及びＣを包含する）をＣｌａＩ／ＰａｃＩクローニングを介してフラグメント４（Ｃ及びＥ２を包含する）に融合した。３回目のクローニング工程では、フラグメント３及びフラグメント４をＡｇｅＩ／ＸｈｏＩを介して、フラグメント５をＸｈｏＩ／ＰａｃＩを介して、既にフラグメント１及びフラグメント２を含むＡｇｅＩ／ＰａｃＩ−線形化ｐＭＡにクローニングした。クローニングは、配列決定によって検証されたように、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３をコードするｐＭＡ＿ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ベクターをもたらした。
【００４０】
ベロ細胞からのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３レスキュー（「ウイルスレスキュー」）
ベロ細胞上で改変されたｐＭＡ＿ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ベクターからＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス粒子を生産するため（ウイルスレスキュー）、ｐＭＡ＿ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３プラスミドをＮｏｔＩ制限消化により線形化し、ＡｍｂｉｏｎのｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ  ＳＰ６  Ｋｉｔ（ＡＭ１３０）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に供した。ＲＮＡの完全性をゲル電気泳動で確認した（表示せず）。並行して、ウイルスＲＮＡを用いるエレクトロポレーション用にベロ細胞を調製した。簡潔には、ベロ細胞を、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞培養フラスコから剥離させ、ＰＢＳで２回洗浄した。全ての遠心分離工程を、室温にて３００ｇで行った。ウイルスＲＮＡを８００μｌＰＢＳ中８×１０６個のベロ細胞と混合し、ベロ細胞／ＲＮＡ混合物を０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。８５０Ｖ、２５μＦ、２００オームで２回のパルスを行った。エレクトロポレーション後、ベロ細胞を室温で１０分間保持し、最終的にＭＥＭ／５％ＦＣＳ／１％抗生物質−抗真菌薬（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ）／２ｍＭ  Ｌ−グルタミンに再懸濁し、Ｔ７５フラスコで３５℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。レスキューされたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（０継代目；Ｐ０）を含む細胞培養上清を採取し、４℃で１０分間、３０００ｇで遠心分離した。ウイルス力価を、ベロ細胞に対するプラークアッセイ及びＴＣＩＤ５０アッセイにより決定した。レスキューされたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）を−８０℃で保存した。このようにして得られたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスワクチン候補のゲノム構造は、ＶＬＡ１５５３とも称され、図２に示される。
【００４１】
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列の検証
ウイルスゲノム配列を検証するため、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎキット（ＱＩＡＧＥＮ＃５７７０４）を使用して採取した細胞培養上清からウイルス核酸を抽出し、ランダムヘキサマーを使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８０８０−０５１）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＰＣＲは、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ゲノムの重複領域を増幅するプライマーを用いて行われ、ＰＣＲ産物をドイツのＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓでサンガーシーケンシングに供した。ＰＣＲ及び配列決定に使用されるプライマー対の配列を表１に示す。
【表２】
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【００４２】
ベロ細胞でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の継代
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のレスキューに続いて、ベロ細胞に感染させ、ウイルスを３つの複製物で繰り返し継代した（表２を参照されたい）。継代のため、Ｔ１５０フラスコに播種し、コンフルエントになるまで（１日間〜３日間）増殖させたベロ細胞を１×ＤＰＢＳで２回洗浄してから、２０ｍＬの感染培地（血清不含ＥＭＥＭ）を添加した。接種物を指示された量でフラスコに直接加え、細胞を３５℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ウイルスレスキュー（Ｐ０）から１回目の継代のため、３つの複製物（Ａ、Ｂ、及びＣ）において、０．０１のＭＯＩのベロ細胞で感染させ、継代を行った。２０ｍＬの採取物を感染後（ｐ．ｉ．）２４時間で５０ｍＬ  ＰＰチューブに移し、細胞片を遠心分離（３０００ｇ、１０分）で除去し、上清を新たな５０ｍＬ  ＰＰチューブに移した。４９％（ｗ／ｗ）スクロース溶液を１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで添加し、安定化した収集物の１ｍＬアリコートを−７０℃以下で保存した。
【００４３】
その後の感染を、スクロースを含まない採取物により行った。以前の継代及び並列する複製物で観察された細胞変性効果に基づいて大まかに計算された様々な容量の採取物を使用して感染を行った。感染に使用した採取物の容量は５μＬ〜１ｍＬで変動した。感染から２４時間後に１回の採取を行った。２継代目〜１６継代目の生産に使用されるＭＯＩは、ＴＣＩＤ５０の結果が利用可能になった後に遡及的に決定され、実験を通して幅広い（「制御されていない」）範囲のＭＯＩが得られることに留意されたい（表２を参照されたい）。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のベロ細胞継代への適応中に様々なパラメーターを体系的に観察できるように、３つの並列する複製物（複製物Ａ、Ｂ、及びＣ）において最大１６継代目までこの手順を行った。この実験中に、収量（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、感染量、フラスコ当たりのベロ細胞数、ベロ細胞継代数及び細胞変性効果（ＣＰＥ）を記録した。感染多重度（ＭＯＩ）を測定されたＴＣＩＤ５０に基づいて遡及的に決定し、また記録した。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３継代物を、３つ全ての複製物においてプラークサイズについて同時に評価した。
【表３】
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【００４４】
「制御されていない」ＭＯＩ条件下での連続継代中に観察された傾向
ベロ細胞の継代へのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の適応中、表２に示すように、ベロ細胞での継代数の増加に伴い、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスの総収量が大幅に増加することが観察された。図４Ａに示すように、６継代目以上の継代では、ウイルスレスキュー（Ｐ０）及び初期継代と比較して力価がおよそ１００倍増加した。また、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３プラークサイズの同時減少も観察された（図４Ｂ）。野生型チクングニアウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代が他の細胞株のプラークサイズに及ぼす影響は、以前、Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．（上記Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に記載されている。不活化ウイルスの工業生産には、高いウイルス収量が非常に望ましいであろうが、図４Ｃに示すように、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は継代が増えると共に免疫原性が低下することも本明細書で観察された。簡潔には、上記の表２で生成されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の異なる継代物の免疫原性を決定するため、５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群を１０５  ＴＣＩＤ５０の用量のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の５代継代物（Ｐ５Ｂ）、８代継代物（Ｐ８Ｂ）又はＰ１５（Ｐ１５Ｃ）を用いて皮下に１回免疫を行った。１０５  ＴＣＩＤ５０のＰ０（ウイルスレスキュー）のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を陽性対照として使用した。２１日目の血清プールは、ベロ細胞でのＰＲＮＴアッセイでＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）を中和する能力について、１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続血清希釈液を試験することにより評価した。図４Ｃに示すように、Ｐ５ＢＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のマウスにおける免疫原性は、継代していないＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）と比較してわずかにシフトした免疫原性を示したが、Ｐ８ＢウイルスはＰ１５Ｃウイルスに匹敵する免疫原性の大幅な低下を示した。（Ｐ１５Ｃウイルスは非免疫原性であったため、その後のＰＲＮＴアッセイでは陰性対照としての役割を果たした。）
【００４５】
最後に、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の選択された継代物の遺伝的安定性をサンガーシーケンシングで試験した。ベロ細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を最大１６回継代すると、ウイルスの弱毒化に関与するｎｓＰ３遺伝子の６０個のアミノ酸の欠失が遺伝的に安定していることが確認され、弱毒化生ワクチンの安全性に関する重要な検討事項である、ウイルスが野生型に戻らないことが示された。
【００４６】
制御されたＭＯＩ条件下での連続継代中に観察される傾向
高ＭＯＩ（例えば、０．１超）の使用は、開始材料が多すぎるため、工業規模のプロセスには役に立たない。このため、３つの継代物に対してより低いＭＯＩ（０．０１）の使用を試験し、得られた継代物の免疫原性を判断した。図５Ａに示すように、表２の複製物Ｂからの３つの継代物を、ＭＯＩが０．０１〜２．２３の範囲の非制御条件下で継代した。このようにして得られた３代継代物（Ｐ３Ｂ）から、各継代物に０．０１のＭＯＩを使用してＰ６まで更に継代し、図５Ａに「ＭＯＩ  ０．０１の制御条件」として示す。０．０１のＭＯＩを使用した条件下では、図５Ｂに示すように、得られたウイルスの免疫原性は非常に急速に失われた。５継代目までに、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３は非免疫原性となった。この結果は、はるかに高いＭＯＩでもたらされ（表２、複製物Ｂを参照されたい）、依然として免疫原性であった図４ＣのＰ５Ｂで見られた結果とは対照的であった。この観察結果は、ＭＯＩが低いほど、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性に影響する突然変異に関するベロ細胞継代中のより迅速な選択に結び付くことを示しているようである。
【００４７】
実施例２．免疫原性に影響を与えるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の配列不均一性の定義
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のより高い代での免疫原性の減少／喪失（中和抗体力価）及びプラークサイズの減少が観察されたことから、異なる継代数でのウイルス集団内の可能性のある配列不均一性を分析することは興味深いものであった。さらに、ウイルス集団の個々のプラークの配列を分析することは興味深いものであった。継代されていないＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）は、サンガーシーケンシングに基づく配列不均一性を示さなかった。一般に、継代数の増加に伴い、３つの全ての複製物について配列不均一性の増加が観察された（複製物Ａ、Ｂ、及びＣ、表３）。８継代目（Ｐ８Ｃ）で複製物Ｃを継代した場合、ウイルス集団は依然として不均一であったが（表３に示す配列不均一性）、Ｐ１５Ｃ継代物では、定義された点突然変異（＊で示される）を持つより均質なウイルス集団が示された。図４Ｃ（上記の実施例１）に示す免疫原性データは、Ｐ５Ｂ及びＰ８Ｂに注目しており、以下の表３に示すように、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３非構造タンパク質（ｎｓＰ）及びエンベロープタンパク質Ｅ２の配列の不均一性を示した。
【表４】
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【００４８】
単一のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３プラークの増殖及び配列決定
免疫原性に対する個々の突然変異の効果を理解し、その結果として高度に免疫原性であるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ワクチンの制御された再現可能な生産プロセスを開発するため、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３分離株Ｐ５Ｂ及びＰ８Ｂの個々のプラークを選択した。簡潔には、Ｐ５Ｂ及びＰ８ＢのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の連続希釈液をプラークアッセイでベロ細胞の感染に使用し（図４に記載される）、７２時間インキュベートした後、種々の形態の単一プラークを選択し（ベロ細胞を数回継代した後に出現し始めたため、小さなプラークを優先的に選択し）、６ウェルプレートでベロ細胞（５×１０５）の再感染により増殖させた。単一のプラークに由来する異なるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプルを、ベロ細胞でもう一度増殖する前に、Ｅ２遺伝子配列の突然変異に基づいて選択した。Ｐ５Ｂ−０２、Ｐ５Ｂ−０３、Ｐ５Ｂ−０４、Ｐ５Ｂ−０７、Ｐ５Ｂ−１１、Ｐ８Ｂ−０１及びＰ８Ｂ−０５のクローンを、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性実験のため増殖して精製した。各分離株にＣｅｌｌＢＩＮＤ表面を備えた単一の８５０ｃｍ２ローラーボトルを使用し、ローラーボトルで増殖させたベロ細胞において、個々のプラークを増殖した。コンフルエントに達すると、細胞を１００ｍＬ  Ｄ−ＰＢＳ＋Ｃａ＋Ｍｇで２回洗浄してから、ＭＯＩ  ０．０１の接種物を含む１００ｍＬ感染培地（血清不含ＥＭＥＭ）を加え、細胞を３５℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。１００ｍＬの採取物を感染後（ｐ．ｉ．）２４時間で５０ｍＬ  ＰＰチューブに移し、細胞片を遠心分離によって除去し、続いてＳｔｅｒｉｆｌｉｐ（登録商標）真空濾過装置（Ｍｅｒｃｋ）を使用して０．２μｍの濾過を行った。個々の清澄化されたウイルス採取物は、最初にＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ装置を使用して濃縮され、ＴＢＳバッファーでダイアフィルトレーションされ、硫酸プロタミン及びＣａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００処理によって精製された。そして、精製されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３クローンを、その後の研究に使用した。
【００４９】
増殖させたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプル、Ｐ５Ｂ＋１及びＰ８Ｂ＋１の全ゲノム配列；すなわち、単一プラーク、それぞれＰ５Ｂ及びＰ８Ｂから得られた上記のＰ５Ｂ−０２、Ｐ５Ｂ−０３、Ｐ５Ｂ−０４、Ｐ５Ｂ−０７、Ｐ５Ｂ−１１、Ｐ８Ｂ−０１、及びＰ８Ｂ−０５の全ゲノム配列をサンガーシーケンシングによって評価した。観察された個々のプラークの点突然変異を表４に要約し、概略ゲノム配列を図６Ｂ及び図６Ｄに示す。
【００５０】
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性に対する特定の点突然変異の影響を評価するために、個々のプラーク由来のウイルスで免疫されたマウスから１９日目のマウス血清を生成し、ＰＲＮＴで分析した。簡潔には、意図した１０５のＴＣＩＤ５０用量のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の単回用量をＣ５７Ｂｌ／６マウス（治療群当たり１０匹）に皮下投与し、１９日目の血清のプールを、１：２０〜１：３２７６８０の範囲の４倍連続希釈液で、ウイルス中和能力についてＰＲＮＴアッセイで分析した。ＰＲＮＴで中和されたウイルスは、２継代目のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ２、５６０  ｐｆｕ／ｍｌ）に対応し、配列不均一性を示さなかったことから、継代されていないＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）と同一であった。中和ミックス（５６０ｐｆｕ／ｍｌＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３Ｐ２及び連続血清希釈液）を室温で１時間インキュベートし、ベロ細胞に加えてから２時間インキュベートした。最後に、メチルセルロースオーバーレイ（０．８％）を追加し、続いて７２時間インキュベートした。プラークの読み取りを、クリスタルバイオレット染色（５％ホルムアルデヒド中の０．５％クリスタルバイオレット）後に行った。
【表５】
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【００５１】
図６Ａからわかるように、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＰ５Ｂ−１１及びＰ５Ｂ−０３の免疫原性は、いずれもＥ２タンパク質にそれぞれＥ２４７Ｋ及びＨ２３２Ｙの単一の点突然変異があり（図６Ｂ）、Ｐ０のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性と比較すると影響を受けない。Ｐ０血清の中和能力は、２つの独立したマウス実験（４４１５；Ｐ０＃２及び４３９９；Ｐ０＃１）により示され、免疫原性の許容範囲を表す。一方、ｎｓＰ２及びＥ２においてそれぞれＧ５７７Ｗ、Ｇ５５Ｒ、及びＨ２３２Ｙの３つの点突然変異を特徴とするＰ８Ｂ−０５は、マウスでは非免疫原性である。Ｇ５５Ｒ突然変異は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＨＩＫＶを継代した結果として、Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．によって既に文献に記載されている。ウイルス粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの弱毒化につながる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヘパラン硫酸結合への依存性の増加により影響を受ける（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４、上記）。
【００５２】
図６Ｃからわかるように、単一のプラーク（Ｐ５Ｂ−０２）に由来する４つのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプルの１つだけがまだ免疫原性であり、それぞれｎｓＰ１及びＥ２の２つの点突然変異であるＡ３８Ｓ及びＥ１６８Ｋを特徴とした（図６Ｄ）。また、ｎｓＰ３中のＲ４７０Ｓ、並びにＥ２タンパク質中のＨ９９Ｙ及びＥ１６８Ｋの３つの点突然変異を有するＰ８Ｂ−０１は、マウスで非免疫原性であり、陰性対照のＰ１５Ｃと同等であった。Ｐ５Ｂ−０４及びＰ５Ｂ−０７はそれぞれＥ２に単一の点突然変異を有し、すなわちグルタミン酸１６８はリジン（Ｅ１６８Ｋ）に変異しており、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３中和能力が失われたため、免疫原性に直接影響することも示された。
【００５３】
要約すると、ベロ細胞の継代中に生じる突然変異の多くがＥ２タンパク質にあることが観察された。Ｅ２タンパク質及び／又はゲノムの他の部分で同定された点突然変異の幾つか、特にＨ２３２Ｙ［Ｅ２］及びＥ２４７Ｋ［Ｅ２］の突然変異は、ウイルスの免疫原性に実質的に影響しなかった。しかしながら、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３で同定されたその他の突然変異の幾つか、特に、頻繁に発生するＥ１６８Ｋ［Ｅ２］突然変異は、単独であるか他の突然変異と組み合わされているかにかかわらず、免疫原性の喪失をもたらした。興味深い例外は、Ｅ１６８Ｋ［Ｅ２］とＡ３８Ｓ［ｎｓＰ１］の両方の突然変異を持つ突然変異体であり、これは免疫原性を維持していた。この所見は、Ａ３８Ｓ［ｎｓＰ１］突然変異がＥ１６８Ｋ［Ｅ２］突然変異によってもたらされる免疫原性の低下に緩和効果があることを示唆している。さらに、Ｇ５５Ｒ／Ｈ２３２Ｙ［Ｅ２］及びＧ５７７Ｗ［ｎｓＰ２］の突然変異を持つ分離株も、おそらくＨ２３２Ｙ変異だけではほとんど効果がなかったため、主にＥ２のＧ５５Ｒ変異が原因で免疫原性に乏しいことを実証した（Ｐ５Ｂ−０３を参照されたい）。
【００５４】
チクングニアウイルスＥ２タンパク質のＥ１６８Ｋ及びＧ５５Ｒの突然変異は、正の表面電荷の増加をもたらし、ヘパラン硫酸及び／又は他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との相互作用を増加させ、最終的には特異的な感染性を高めると以前に説明された。野生型ＣＨＩＫＶのバックグラウンドでは、ヘパラン硫酸への結合によって媒介されるプレート上の広がりが小さいため、突然変異によりプラークサイズが小さくなることが示された。さらに、その突然変異が筋骨格系疾患（ＭＳＤ）のマウスモデルにおけるＣＨＩＫＶの弱毒化をもたらし、マウスにおいて臓器への拡散が減少してウイルス血症のレベルが低下した（上記Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｉｌｖａ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  Ｅ２  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（２０１４）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．；８８（５）：２３８５−９７）。その他の点で、野生型ＣＨＩＫＶにおけるＥ１６８Ｋ及びＧ５５Ｒの突然変異の存在が中間の弱毒化をもたらしたという事実は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのプラークサイズの減少又は免疫原性の減少に関する本開示と一致する。しかしながら、弱毒化されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のバックグラウンドにある上記２つの突然変異が、本明細書で報告されるマウスにおける免疫原性の喪失をもたらすことは予想外であった。
【００５５】
また、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ；Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ＷＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７３（１２）：１０３８７−９８；Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ＷＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｆｕｒｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ＰＥ２  ｃａｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７３（８）：６２９９−３０６；Ｂｙｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７２（９）：７３４９−５６）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ；Ｈｅｉｌ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ２  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄａｐｔｓ  Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｕｔｉｌｉｚｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｓ  ａｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７５（１４）：６３０３−９）、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ；Ｓｍｉｔ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ａｎｄ  Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  （２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７６（２０）：１０１２８−３７）等の他の細胞培養継代アルファウイルスの一般的な現象として、Ｅ２の正に帯電した残基の置換が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヘパラン硫酸依存性の感染力を高めること、及びこれらの突然変異を数回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代で選択できることが報告されている。さらに、かかる突然変異はｉｎ  ｖｉｖｏでウイルスの弱毒化につながることが示された（Ｂｙｒｎｅｓ  ＡＰ  ａｎｄ  ＤＥ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｌａｒｇｅ−ｐｌａｑｕｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｓｈｏｗ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ，ｈｅｉｇｈｔｅｎｅｄ  ｖｉｒｅｍｉａ，ａｎｄ  ｓｌｏｗｅｒ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７４（２）：６４４−５１；上記Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ＷＢ，ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【００５６】
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＰ５及びＰ８の継代物において、免疫原性の低下を伴う配列不均一性が既に明らかであったため、初期の継代での配列不均一性と並んで、免疫原性への影響を以下で概説するようにより詳細に調べた。
【００５７】
実施例３．Ｐ３継代物でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の配列不均一性及び免疫原性の定義
抗体力価を中和することによって測定されるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性に悪影響を与える配列不均一性の後期継代での発生は、高い免疫原性と有効なワクチンの生産に十分なウイルス力価の両方を特徴とする最適な継代の発見を保証した。
【００５８】
ＭＶＳＢ（Ｐ１）、ＷＶＳＢ（Ｐ２）及びＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３原薬（「ＶＬＡ１５５３」）（Ｐ３）生産中のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の遺伝的安定性を判断するために、独立して生成された継代物１、２、及び３を配列決定した。サンガーシーケンシングによって決定されたＰ０（ウイルスレスキュー）、Ｐ１（ＭＶＳＢ）及びＰ２（ＷＶＳＢ）は、明らかな配列不均一性を示さなかった。次の工程は、Ｐ２（ＷＶＳＢ）を感染に使用して、Ｐ３由来の精製原薬（ＤＳ）の遺伝的安定性の再現性を実証することであった。感染用（ＭＯＩ  ０．０１）に、Ｐ２（ＷＶＳＢ）を使用して２つのＴ１５０  Ｔフラスコにおいて、１日目及び２日目の採取物を合わせて構成される合計で４つの独立したＰ３採取物を作製した。各複製物について、１日目及び２日目の個々の採取物をプールし（総量約５０ｍＬ）、およそ１０倍に濃縮した（Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａ限外ろ過装置）。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４に対してダイアフィルトレーションを行い、続いて硫酸プロタミン処理（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）で宿主細胞ＤＮＡを沈殿させた。次いで、透明な上清をＣａｐｔｏＣｏｒｅ  ７００樹脂（Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌバッファーに５０％スラリーを約１ｍＬ添加）を使用したバッチ吸着クロマトグラフィーで更に精製した。樹脂を遠心分離によって除去し、スクロースを１０％の最終濃度まで加えて、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の凍結及び解凍を可能にした。その後、最終製剤を０．２μｍ滅菌濾過し、更に処理するまで凍結保存（−６５℃未満）した。
【００５９】
３継代目（Ｐ３）では、自動塩基呼び出しによる不均一性は検出されなかった（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−いずれも２０％未満）。しかしながら、目視検査により、ウイルス集団のごく一部が、ＣＨＩＫＶ糖タンパク質Ｅ２の遺伝子におけるＥ１６８Ｋ及びＥ２４７Ｋの配列不均一性の一貫した増加を示し、これは、レスキューされたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（Ｐ０）並びに、ＭＶＳＢ及びＷＶＳＢサンプルにはなかった。図７は、０継代目（Ｐ０）のウイルスと比較した、独立して生成された４つのＰ３  ＤＳサンプル（実施例１〜実施例４）のシーケンシングクロマトグラムを示す。四角で示すように、アミノ酸１６８（ゲノム核酸８８８２位）のコドンでのＧ／Ａ不均一性は、４つ全ての複製物で検出可能であり、リバースシーケンシング反応で検証されて、同じ不均一性を明らかにした。Ｐ０サンプルの同じ位置は、フォワードシーケンス反応でＧ（及びリバースシーケンシング反応でＣ）の鋭いピークを示した。一方、Ｅ２４７Ｋの不均一性（ゲノム核酸位置９１１９）は存在していたものの、シーケンシングクロマトグラムではほとんど検出できなかった。
【００６０】
さらに、ウイルス集団内のＥ１６８Ｋ及びＥ２４７Ｋの量を定量するため、Ｐ３の次世代シーケンシングを行い、１継代目（Ｐ１−ＭＶＳＢ）のシーケンシングと比較した。図８からわかるように、Ｐ１−ＭＶＳＢの段階では、非常に低いレベルの配列不均一性しか検出できなかった（いずれもバックグラウンド未満；点線で示される１５％カットオフ）。しかしながら、２つの代表的なＰ３サンプルは、配列不均一性の全体的な増加を示し、Ｅ２遺伝子の２つの突然変異がバックグラウンドに到達したか、又はそれよりも上昇した（ウイルス集団の１８％及び１５％においてＥ１６８Ｋ−ゲノム核酸８８８２位、及びより低い程度のＥ２４７Ｋ−ゲノム核酸９１１９位）。
【００６１】
要約すると、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のＥ２タンパク質におけるＥ１６８Ｋ突然変異の存在は、独立して生成された８つのＰ３サンプルのサンガーシーケンシング及びＮＧＳによって同定され、この結果の再現性を実証した。代表的なシーケンスの例を図７及び図８に示す。これらのデータは、ＣＨ５Ｖ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスのＥ２タンパク質におけるＥ１６８Ｋ突然変異の出現が、ベロ細胞での継代時に非常に再現性があり、Ｐ５Ｂプラーク由来のウイルス（図６のＰ５Ｂ−０４及びＰ５Ｂ−０７）が非免疫原性であった実施例２に示されるように、弱毒化ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルスの免疫原性を減弱させたことを実証する。Ｅ１６８Ｋのようにベロ細胞でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の継代中に観察された２つの追加の突然変異、Ｇ５５Ｒ及びＧ８２Ｒは、ＣＨＩＫＶの毒性に影響を与えることが報告されており（上記Ｇａｒｄｎｅｒ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４、及びＳｉｌｖａ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎ  １８１／ｃｌｏｎｅ  ２５  ｉｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅ２  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；８６（１１）：６０８４−９６；Ｅｐｕｂ  ２０１２／０３／３０）、ウイルスの弱毒化に結び付く。これらの２つの突然変異はＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性にもマイナスの影響を与えるため、高度に免疫原性であるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ワクチン候補の生産では、それらの出現を回避する必要がある。
【００６２】
Ｅ１／Ｅ２二量体内で突然変異を起こしやすいアミノ酸の位置を図９に示す。３つのＥ２アミノ酸Ｇ５５、Ｇ８２、及びＥ１６８はいずれも表面でアクセス可能であるため、それらのアミノ酸の突然変異はＣＨＩＫＶとその細胞受容体との相互作用に影響を与える可能性がある。対照的に、Ｅ２４７［Ｅ２］はタンパク質構造内により埋もれているため、表面が同程度に露出していない可能性がある。Ｅ２４７の位置は、上に示されるように、Ｅ２４７Ｋ突然変異がＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性に顕著な影響を与えなかった理由の１つである可能性がある。
【００６３】
実施例４．異種ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ウイルス集団の免疫原性の喪失に対するＥ１６８Ｋ突然変異の閾値の決定
上記の観察は、ベロ細胞でのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の継代中にＥ１６８Ｋ［Ｅ２］突然変異が早期に頻繁に出現し、免疫原性の喪失にと関連することを示した。効果的な免疫原性弱毒化生チクングニアウイルスワクチンの信頼性の高い製造プロセスを開発するため、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ワクチンのサンプルにおけるこの突然変異の認容性を、種々の比のＰ３原薬とウイルスＰ５Ｂ−０７を調製することによって試験した（Ｅ１６８Ｋ単一突然変異体、表３を参照されたい）。
【００６４】
約２０％のＥ１６８Ｋ不均一性を示す３継代目（Ｐ３）の原薬（データは示していない）を、Ｐ５Ｂ−０７分離株（Ｅ１６８Ｋ突然変異体）からのＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の調製物と１：０．１、１：１、及び１：１０の比で混合した。混合物を、各ウイルス調製物におけるＥ１６８Ｋ突然変異のおおよその頻度を確認するために配列決定した。図１０に示すように（不均一性と表示される行を参照されたい）、野生型ヌクレオチドＧと比較したヌクレオチドＡの相対量は、Ｐ５Ｂ−０７分離株の添加レベルの増加と共に増えることが示された（Ｅ１６８Ｋ対照群７で最大１００％のＡ）。
【００６５】
免疫原性に対するＥ１６８Ｋ突然変異の効果を判断するため、図１０に明示される種々のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３サンプルを用いて、３×１０４  ＴＣＩＤ５０の予定された用量で（実際の用量を図１１Ｄに示す）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを皮下免疫した。２１日目にマウス血清を収集し、１：０．１、１：１及び１：１０の群から個々の血清を試験し、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）に基づく中和アッセイを使用して、２つの対照群、Ｐ３（群６）及びＰ５Ｂ−０７（Ｅ１６８Ｋ、群７）からプールされた血清と比較した（図１１）。ＶＲＰは、ＬＲ２００６−ＯＰＹ１ウイルスのカプシドタンパク質及びエンベロープタンパク質を提示する複製欠損野生型ＣＨＩＫＶに類似している。該方法は、Ｇｌａｓｋｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（Ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂａｓｅｄ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓ  ｒｅａｄｏｕｔ（２０１３）Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．；１０：２３５）によって記載される通り、必須に行われた。ＶＲＰを、ＢＨＫ−２１細胞を、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を発現するＣＨＩＫＶレプリコン、並びに野生型ＣＨＩＫＶカプシドタンパク質及び残りの構造タンパク質（Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ及びＥ１）をそれぞれ発現する２つのヘルパーＲＮＡで同時トランスフェクトすることにより作製した。得られた単一の円形感染性粒子を、分泌されたＧＬｕｃを読み出しとして使用するＣＨＩＫＶ中和アッセイで使用した。ルシフェラーゼアッセイでＶＲＰを中和すると、ＢＨＫ−２１細胞によるＧＬｕｃ発現の減少を測定することができる。中和免疫を誘発する能力は、Ｅ１６８Ｋ突然変異体の量が多いほど低下することが観察された（それぞれ図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ）。チクングニアウイルスに対して陽性、低陽性又は陰性の免疫応答を示す個々のマウスの数をそれぞれ図１１Ｄに示す。
【００６６】
この知見は、ウイルス集団中の野生型ウイルス粒子に対するＥ１６８Ｋ変異体の比が増加すると、マウスにおけるＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の免疫原性が減弱されことを確認する。したがって、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ワクチンの高い免疫原性を確保するために、Ｅ２においてＥ１６８位を注意深くモニターすることが重要である。以前の継代プロセス及び８継代目でのウイルス集団内のＥ１６８Ｋの定量に基づいて、ＰＲＮＴでマウス血清プールを分析した場合、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３集団内においてＥ１６８Ｋ突然変異の約７０％の割合で免疫原性が失われることが観察された。
【００６７】
実施例５．ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３においてＥ１６８Ｋ突然変異を減少させる上流プロセス
この実施例の目的は、ローラーボトルでＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を生産するための最適化されたベロ細胞培養に基づくプロセスを特性評価することであった。Ｅ２タンパク質のウイルス生産性及び配列不均一性に対する幾つかの上流プロセスパラメーター（ＭＯＩ、播種後のベロ細胞感染の日、及びインキュベーション温度）の影響を、原薬（ＤＳ；３継代目、すなわち、「Ｐ３  ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３」とも称される）を製造するため、ＧＭＰワーキングウイルスシードバンク（ＧＭＰ  ＷＶＳＢ  Ｂ３００５０４４；２継代目、本明細書では「Ｐ２  ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３」とも称される）及びＲ＆Ｄ  ＶＥＲＯワーキング細胞バンクを使用して試験した。
【００６８】
ＧＭＰ  ＷＶＳＢ  Ｂ３００５０４４の調製
特性評価されたプレマスターウイルスシードバンク（ＰＭＶＳＢ、ベロ細胞からのウイルスレスキューに由来するプレマスターウイルスシードバンクＡＦＲ８８６／１９７５７９）をＲ＆Ｄ条件下で確立し、プレマスターウイルスシードバンクを使用してＧＭＰ条件下でＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のマスタースシードバンクを生成した。ＧＭＰワーキングウイルスシードバンク、ＶＬＡ７８−１５５３−ＷＶＳＢ−２０１６、バッチＢ３００５０４４を、ＶＬＡ７８−１５５３−ＭＶＳＢ−２０１６、バッチ番号Ｂ３００５５６７について記載されるのと同じ作製方法及びＧＭＰ条件でＨａｌｉｘ  Ｂ．Ｖ．において作製した。簡潔には、ＶＥＲＯワーキングシードバンク（内部の名称：ＩＣＢ  ２０１４／００２）を、図１２に示すように、Ｔ７５ｃｍ２フラスコ（１×）、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコ（３×）、最終段階の６×８５０ｃｍ２のローラーボトルを使用して、シード列で４段階に増殖させた。６個のローラーボトルのうち４個をＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３シードバンクの作製に使用した。４個のローラーボトル内の細胞の合計量を決定した。プレマスターウイルスシードバンク使用してＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３マスターウイルスシードバンクを生成した。その後、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３マスターウイルスシードバンクを使用して、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３ワーキングウイルスシードバンクを生成した。感染は全ての段階において０．０１のＭＯＩで行われた。２４時間の感染（３５℃；５％ＣＯ２；０．５ＲＰＭ）後、ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を採取した。Ｔｒｉｓ及びスクロースの原液を、採取プール中５％スクロース及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓの最終濃度まで加えた。調合後、プールを、蠕動ポンプを使用して、蒸気滅菌した０．２２μｍフィルターで濾過し、滅菌した５００ｍＬバイオプロセス容器に入れた。バイアルの充填を、蠕動充填ポンプを使用して、調合され濾過された０．７ｍＬの採取物を用いて１つずつ行った。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒキャッパー／デキャッパー装置を使用して、２  Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ  クライオバイアルを開閉した。ＧＭＰシードバンクの充填バイアルを−６５℃未満で保存した。
【００６９】
ベロ細胞の培養
ベロ細胞の培養を、３５℃、５％ＣＯ２、Ｔ７５ｃｍ２（Ｔ７５）、Ｔ１７５ｃｍ２（Ｔ１７５）Ｔ−フラスコ、及び８５０ｃｍ２ローラーボトル（８５０ＲＢ）で行った。種々の実験で使用されたベロ細胞は、ＧＭＰマスター細胞バンクＭＣＢ  ＩＣＢ／２０１４／００１に由来した。この研究ワーキング細胞バンクの内部の名称はＢｋ５６８５である。ＧＭＰマスター細胞バンクは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ）Ｐ１２９バンクに起源を持ち、最終的には元のＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１  Ｐ１１３バンクに由来するＷＨＯベロ細胞バンク１０−８７  Ｐ１３４に由来した。細胞培養列に関する更なる詳細を図１２に示す。細胞を、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補足したＭＥＭ培地で維持した。
【００７０】
８５０ｃｍ２ローラーボトルでのウイルス生産
３５℃、８５０ＲＢでの２日間、４日間、又は５日間の細胞増殖の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１、０．０１、又は０．００１  ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩでＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（ＷＶＳＢ  Ｂ３００５０４４）に感染させた。ウイルス生産のため、感染細胞を２ｍＭグルタミンで補足したＭＥＭ培地１００ｍＬにおいて３７℃、３５℃、又は２８℃でインキュベートした。
【００７１】
ウイルス滴定
ＴＣＩＤ５０アッセイを使用して、ベロ細胞でウイルス力価を特定した。細胞をマイクロプレートに播種し、０．５％ＦＢＳ及び２ｍＭグルタミンを補足したＥＭＥＭ中の１０倍連続希釈ウイルスサンプルで感染させた。３５℃／５％ＣＯ２での１週間のインキュベーション後、ウイルス誘導性細胞変性効果をモニターし、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．；Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ（１９３８）Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ２７：４９３−４９７）に従ってウイルス力価を計算した。
【００７２】
ウイルスゲノムの抽出及び配列決定
ウイルス核酸を、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して指定の時点でベロ細胞培養上清から抽出及び精製し、ランダムヘキサマーを使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。Ｅ２遺伝子領域の配列決定では、まず、プライマー１６Ｆ、１６Ｒ、１７Ｆ、１７Ｒ、１８Ｆ及び１８Ｒ（プライマー配列については表１を参照されたい）用いてＣＨＩＫＶ  Ｅ２遺伝子の重複領域を増幅するＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用するＰＣＲを行った。ＰＣＲアンプリコンの精製後、ドイツのＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓでサンガーシーケンシングを実施した。自動塩基呼び出し（２０％超）により検出された配列不均一性の分析に加えて、全てのシーケンシングクロマトグラムを手作業で読み取り、検出限界を下回る（２０％未満）不均一性も検出した。
【００７３】
免疫原性Ｐ３ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３原薬の生産プロセスの最適化
ベロ細胞で３継代目ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３を生産するプロセスを最適化するため、表５に示すように、種々のＭＯＩ、播種後のベロ細胞感染時間、及びインキュベーション温度を全ての組み合わせで試験した。さらに、感染後の異なる日に収量を分析した。採取されたウイルスの３つの特徴、ウイルスの生産性、力価の安定性と並んで、Ｅ２構造タンパク質の配列不均一性のレベルをモニターした。
【表６】
2020534256.tif 000009
【００７４】
ウイルスの生産
試験した全ての条件で達成されたＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の生産動態を図１３に示す。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３（３５℃、ＭＯＩ  ０．０１、ベロ細胞播種後４日目に感染）を生産するために現在使用されている最適なプロセスも実験に含まれており、感染後２４時間で１０８．０〜８．５／ｍＬの予想されたレベルでウイルス生産性を示した（図１３Ｂ）。
【００７５】
ＭＯＩ及び感染時間と比較して、温度はウイルス生産動態に最も影響を及ぼした。３７℃及び３５℃では（それぞれ図１３Ａ及び図１３Ｂ）、感染後１日目に最大の生産性が達成された。ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の感染力はその後の２４時間の間に大幅に低下し、３５℃でのウイルス力価の喪失はわずかに減少した。温度が２８℃に下がると、ウイルスの反応速度が著しく変化した。使用するＭＯＩに応じて、最大ウイルス生産性が１日〜４日遅れ、ウイルス力価の安定性の大幅な改善が観察された（図１３Ｃ）。全ての採取物から生産された総ウイルス収量を図１４に示す。図１３Ａに示すような２８℃の条件では、２回の採取の収量を合わせ（感染後１日目及び２日目）、３５℃の条件（図１３Ｂ）では、３回全ての採取の収量を合わせ（１日目〜３日目）、３７℃条件（図１３Ｃ）では、５回の採取の収量（１日目〜５日目）を合わせた。
【００７６】
初期の観察を完了するため、ウイルスの生産性及び力価安定性のデータを、応答曲面二次モデルを使用して分析した（図１５及び図１６）。ウイルス生産性には、最大ウイルス力価の値を使用した。ウイルス力価の安定性には、生産プロセスで１日後に測定された力価から最大力価を差し引いた結果のデルタ値を計算して使用した。総ウイルス生産性には、各時点での個々の力価を追加した。
【００７７】
両方のモデルのＡＮＯＶＡ分析により、統計学的に有意な影響因子を示すことができた（図１５Ａ及び図１６Ａ）。以前の観察結果を確認すると、温度はウイルスの生産性及び安定性に影響を与える最も強い要因であった。特に、低温（２８℃）では、ウイルス力価を経時的に適度に安定に保ちながら、より高いウイルス力価が得られた。しかしながら、この温度では、３５℃と比較して、全体の総ウイルス生産性はそれほど高くなかった（例えば図１４を参照されたい）。
【００７８】
ベロ細胞播種後の感染時間も応答に影響を及ぼしたが、その程度は低かった。ＭＯＩは大きな影響を与えなかった。両方のモデルについて、細胞播種後７２時間での感染は細胞感染に十分な時間であった。逆に、最高ウイルス収量は３５℃で見られ、最も安定した力価は２８℃で観察されたため、単一の温度では最適なウイルス生産と力価安定性を組み合わせることができなかった（図１５Ｂ及び図１６Ｂ）。感染後最短時間内での最大合計ウイルス生産性は３５℃で達成された（図１４を参照されたい）。
【００７９】
Ｅ２タンパク質遺伝子配列の分析
ベロ細胞の感染後２日目又は５日目（播種後４日目に感染）のいずれかに収集されたウイルスサンプルを選択して、ウイルスＥ２構造タンパク質のゲノムＲＮＡ配列の分析を行った。これらのサンプルは、ローラーボトルでのベロ細胞コンフルエンスの最も代表的なものである。以下の表６及び表７に、サンガーシーケンシングによって決定された核酸配列に基づいて、４つのアミノ酸（ＡＡ）位置について推定された不均一性のパーセンテージを要約する。表６は、３つの異なる温度で増殖させ、感染後２日目に採取したＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のデータを示し、表７は２８℃で増殖させ、感染後５日目に採取したＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３のデータを示す。
【表７】
2020534256.tif 000010
【表８】
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【００８０】
ＭＯＩ、温度、ベロ細胞播種後の感染日、及びサンプル採取日はいずれも、ベロ細胞で生産された場合のＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３の生産性及び品質に影響を与えた。しかしながら、各パラメーターの強度は、重要度が異なっていた。例えば、結果は、ＭＯＩ及び不均一性のレベルとの相関関係、すなわち、感染時のウイルス入力が低いほど、採取時の不均一性のレベルが高くなることを示唆した。３７℃でより高いレベルの不均一性が観察された９１１９位（Ｅ２４７Ｋ）を除き、インキュベーション温度はヌクレオチド配列の安定性に影響を与えないようであった（表６）。また、ウイルス動態の後半で収集されたサンプル採取は、同じＡＡ位置に対してわずかに高いレベルの不均一性を引き起こした。
【００８１】
この最初の分析を完了するために、生データの数学的モデリングも実行した（図１７及び図１８）。８５４３位について有意なモデルが計算されなかったため、分析できたのは３つの核酸位置（８８８２位、９１１９位、９６４９位）のみであった。図１７に示すように、温度及びＭＯＩは、検討した核酸の位置に応じて異なる影響を与えた。ＭＯＩは、核酸の８８８２位及び９６４９位で観察された不均一性に有意に影響したが、９１１２では影響しなかった。温度は９１１２位及び９６４９位に影響したが、８８２２位には影響しなかった（図１７）。２８℃で生産されたウイルスからのＤ２及びＤ５感染後採取サンプルを比較すると、ＭＯＩが不均一性のレベルに一貫して影響することが示され、細胞に大量のウイルス（ＭＯＩ  ０．１  ＴＣＩＤ５０／細胞）を接種した場合には、最小レベルのＡＡ不均一性を観察した。この観察により、Ｅ２タンパク質内の低レベルの不均一性を確保しながら、最大のウイルス生産／力価安定性を達成する手段として、より高いＭＯＩを持つ新たなプロセスパラメーター設定の確立が促される可能性がある。ただし、ＭＯＩが０．１では、ＧＭＰワーキングシウイルスシードバンクの消費が大幅に増加するため、実際の産業上の利用可能性が制限される。
【００８２】
感染後の収穫日は、核酸９１１９位の変動にのみ影響した（図１８）。
【００８３】
配列
配列番号１
ＣＨＩＫＶ−△５ｎｓＰ３のヌクレオチド配列
gatggctgcgtgagacacacgtagcctaccagtttcttactgctctactctgcaaagcaagagattaataacccatcatggatcctgtgtacgtggacatagacgctgacagcgcctttttgaaggccctgcaacgtgcgtaccccatgtttgaggtggaaccaaggcaggtcacaccgaatgaccatgctaatgctagagcgttctcgcatctagctataaaactaatagagcaggaaattgaccccgactcaaccatcctggatatcggcagtgcgccagcaaggaggatgatgtcggacaggaagtaccactgcgtctgcccgatgcgcagtgcggaagatcccgagagactcgccaattatgcgagaaagctagcatctgccgcaggaaaagtcctggacagaaacatctctggaaagatcggggacttacaagcagtaatggccgtgccagacacggagacgccaacattctgcttacacacagacgtctcatgtagacagagagcagacgtcgctatataccaagacgtctatgctgtacacgcacccacgtcgctataccaccaggcgattaaaggggtccgagtggcgtactgggttgggttcgacacaaccccgttcatgtacaatgccatggcgggtgcctacccctcatactcgacaaactgggcagatgagcaggtactgaaggctaagaacataggattatgttcaacagacctgacggaaggtagacgaggcaagttgtctattatgagagggaaaaagctaaaaccgtgcgaccgtgtgctgttctcagtagggtcaacgctctacccggaaagccgcaagctacttaagagctggcacctgccatcggtgttccatttaaagggcaaactcagcttcacatgccgctgtgatacagtggtttcgtgtgagggctacgtcgttaagagaataacgatgagcccaggcctttatggaaaaaccacagggtatgcggtaacccaccacgcagacggattcctgatgtgcaagactaccgacacggttgacggcgaaagaatgtcattctcggtgtgcacatacgtgccggcgaccatttgtgatcaaatgaccggcatccttgctacagaagtcacgccggaggatgcacagaagctgttggtggggctgaaccagagaatagtggttaacggcagaacgcaacggaatacgaacaccatgaaaaattatctgcttcccgtggtcgcccaagccttcagtaagtgggcaaaggagtgccggaaagacatggaagatgaaaaactcctgggggtcagagaaagaacactgacctgctgctgtctatgggcattcaagaagcagaaaacacacacggtctacaagaggcctgatacccagtcaattcagaaggttcaggccgagtttgacagctttgtggtaccgagtctgtggtcgtccgggttgtcaatccctttgaggactagaatcaaatggttgttaagcaaggtgccaaaaaccgacctgatcccatacagcggagacgcccgagaagcccgggacgcagaaaaagaagcagaggaagaacgagaagcagaactgactcgcgaagccctaccacctctacaggcagcacaggaagatgttcaggtcgaaatcgacgtggaacagcttgaggacagagcgggcgcaggaataatagagactccgagaggagctatcaaagttactgcccaaccaacagaccacgtcgtgggagagtacctggtactctccccgcagaccgtactacgtagccagaagctcagtctgattcacgctttggcggagcaagtgaagacgtgcacgcacaacggacgagcagggaggtatgcggtcgaagcgtacgacggccgagtcctagtgccctcaggctatgcaatctcgcctgaagacttccagagtctaagcgaaagcgcaacgatggtgtataacgaaagagagttcgtaaacagaaagctacaccatattgcgatgcacggaccagccctgaacaccgacgaagagtcgtatgagctggtgagggcagagaggacagaacacgagtacgtctacgacgtggatcagagaagatgctgtaagaaggaagaagccgcaggactggtactggtgggcgacttgactaatccgccctaccacgaattcgcatatgaagggctaaaaatccgccctgcctgcccatacaaaattgcagtcataggagtcttcggagtaccgggatctggcaagtcagctattatcaagaacctagttaccaggcaggacctggtgactagcggaaagaaagaaaactgccaagaaatcaccaccgacgtgatgagacagagaggtctagagatatctgcacgtacggttgactcgctgctcttgaatggatgcaacagaccagtcgacgtgttgtacgtagacgaggcgtttgcgtgccactctggaacgctacttgctttgatcgccttggtgagaccaaggcagaaagttgtactttgtggtgacccgaagcagtgcggcttcttcaatatgatgcagatgaaagtcaactataatcacaacatctgcacccaagtgtaccacaaaagtatctccaggcggtgtacactgcctgtgaccgccattgtgtcatcgttgcattacgaaggcaaaatgcgcactacgaatgagtacaacaagccgattgtagtggacactacaggctcaacaaaacctgaccctggagacctcgtgttaacgtgcttcagagggtgggttaaacaactgcaaattgactatcgtggatacgaggtcatgacagcagccgcatcccaagggttaaccagaaaaggagtttacgcagttagacaaaaagttaatgaaaacccgctctatgcatcaacgtcagagcacgtcaacgtactcctaacgcgtacggaaggtaaactggtatggaagacactttccggcgacccgtggataaagacgctgcagaacccaccgaaaggaaacttcaaagcaactattaaggagtgggaggtggagcatgcatcaataatggcgggcatctgcagtcaccaaatgaccttcgatacattccaaaataaagccaacgtttgttgggctaagagcttggtccctatcctcgaaacagcggggataaaactaaatgataggcagtggtctcagataattcaagccttcaaagaagacaaagcatactcacctgaagtagccctgaatgaaatatgtacgcgcatgtatggggtggatctagacagcgggctattttctaaaccgttggtgtctgtgtattacgcggataaccactgggataataggcctggagggaaaatgttcggatttaaccccgaggcagcatccattctagaaagaaagtatccattcacaaaagggaagtggaacatcaacaagcagatctgcgtgactaccaggaggatagaagactttaaccctaccaccaacatcataccggccaacaggagactaccacactcattagtggccgaacaccgcccagtaaaaggggaaagaatggaatggctggttaacaagataaacggccaccacgtgctcctggtcagtggctataaccttgcactgcctactaagagagtcacttgggtagcgccgttaggtgtccgcggagcggactacacatacaacctagagttgggtctgccagcaacgcttggtaggtatgacctagtggtcataaacatccacacaccttttcgcatacaccattaccaacagtgcgtcgaccacgcaatgaaactgcaaatgctcgggggtgactcattgagactgctcaaaccgggcggctctctattgatcagagcatatggttacgcagatagaaccagtgaacgagtcatctgcgtattgggacgcaagtttagatcgtctagagcgttgaaaccaccatgtgtcaccagcaacactgagatgtttttcctattcagcaactttgacaatggcagaaggaatttcacaactcatgtcatgaacaatcaactgaatgcagccttcgtaggacaggtcacccgagcaggatgtgcaccgtcgtaccgggtaaaacgcatggacatcgcgaagaacgatgaagagtgcgtagtcaacgccgctaaccctcgcgggttaccgggtggcggtgtttgcaaggcagtatacaaaaaatggccggagtcctttaagaacagtgcaacaccagtgggaaccgcaaaaacagttatgtgcggtacgtatccagtaatccacgctgttggaccaaacttctctaattattcggagtctgaaggggaccgggaattggcagctgcctatcgagaagtcgcaaaggaagtaactaggctgggagtaaatagtgtagctatacctctcctctccacaggtgtatactcaggagggaaagacaggctgacccagtcactgaaccacctctttacagccatggactcgacggatgcagacgtggtcatctactgccgcgacaaagaatgggagaagaaaatatctgaggccatacagatgcggacccaagtagagctgctggatgagcacatctccatagactgcgatattgttcgcgtgcaccctgacagcagcttggcaggcagaaaaggatacagcaccacggaaggcgcactgtactcatatctagaagggacccgttttcatcagacggctgtggatatggcggagatacatactatgtggccaaagcaaacagaggccaatgagcaagtctgcctatatgccctgggggaaagtattgaatcgatcaggcagaaatgcccggtggatgatgcagacgcatcatctccccccaaaactgtcccgtgcctttgccgttacgctatgactccagaacgcgtcacccggcttcgcatgaaccacgtcacaagcataattgtgtgttcttcgtttcccctcccaaagtacaaaatagaaggagtgcaaaaagtcaaatgctctaaggtaatgctatttgaccacaacgtgccatcgcgcgtaagtccaagggcttatagaggtgccgctgccggtaaccttgcggccgtgtctgattgggtaatgagcaccgtacctgtcgcgccgcccagaagaaggcgagggagaaacctgactgtgacatgtgacgagagagaagggaatataacacccatggctagcgtccgattctttagggcagagctgtgtccggtcgtacaagaaacagcggagacgcgtgacacagcaatgtctcttcaggcaccaccgagtaccgccacggaaccgaatcatccgccgatctccttcggagcatcaagcgagacgttccccattacatttggggacttcaacgaaggagaaatcgaaagcttgtcttctgagctactaactttcggagacttcttaccaggagaagtggatgacttgacagacagcgactggtccacgtgctcagacacggacgacgagttaagactagacagggcaggtgggtatatattctcgtcggacaccggtccaggtcatttacaacagaagtcagtacgccagtcagtgctgccggtgaacaccctggaggaagtccacgaggagaagtgttacccacctaagctggatgaagcaaaggagcaactattacttaagaaactccaggagagtgcatccatggccaacagaagcaggtatcagtcgcgcaaagtagaaaacatgaaagcagcaatcatccagagactaaagagaggctgtagactatacttaatgtcagagaccccaaaagtccctacttaccggactacatatccggcgcctgtgtactcgcctccgatcaacgtccgattgtccaatcccgagtccgcagtggcagcatgcaatgagttcttagctagaaactatccaactgtctcatcataccaaattaccgacgagtatgatgcatatctagacatggtggacgggtcggagagttgcctggaccgagcgacattcaatccgtcaaaactcaggagctacccgaaacagcacgcttaccacgcgccctccatcagaagcgctgtaccgtccccattccagaacacactacagaatgtactggcagcagccacgaaaagaaactgcaacgtcacacagatgagggaattacccactttggactcagcagtattcaacgtggagtgtttcaaaaaattcgcatgcaaccaagaatactgggaagaatttgctgccagccctattaggataacaactgagaatttagcaacctatgttactaaactaaaagggccaaaagcagcagcgctattcgcaaaaacccataatctactgccactacaggaagtaccaatggataggttcacagtagatatgaaaagggacgtaaaggtgactcctggtacaaagcatacagaggaaagacctaaggtgcaggttatacaggcggctgaacccttggcgacagcatacctatgtgggattcacagagagctggttaggaggctgaacgccgtcctcctacccaatgtacatacactatttgacatgtctgccgaggatttcgatgccatcatagccgcacactttaagccaggagacactgttttggaaacggacatagcctcctttgataagagccaagatgattcacttgcgcttactgctttgatgctgttagaggatttaggggtggatcactccctgctggacttgatagaggctgctttcggagagatttccagctgtcacctaccgacaggtacgcgcttcaagttcggcgccatgatgaaatcaggtatgttcctaactctgttcgtcaacacattgttaaacatcaccatcgccagccgagtgctggaagatcgtctgacaaaatccgcgtgcgcggccttcatcggcgacgacaacataatacatggagtcgtctccgatgaattgatggcagccagatgtgccacttggatgaacatggaagtgaagatcatagatgcagttgtatccttgaaagccccttacttttgtggagggtttatactgcacgatactgtgacaggaacagcttgcagagtggcagacccgctaaaaaggctttttaaactgggcaaaccgctagcggcaggtgacgaacaagatgaagatagaagacgagcgctggctgacgaagtgatcagatggcaacgaacagggctaattgatgagctggagaaagcggtatactctaggtacgaagtgcagggtatatcagttgtggtaatgtccatggccacctttgcaagctccagatccaacttcgagaagctcagaggacccgtcataactttgtacggcggtcctaaataggtacgcactacagctacctattttgcagaagccgacagcaagtatctaaacactaatcagctacaatggagttcatcccaacccaaactttttacaataggaggtaccagcctcgaccctggactccgcgccctactatccaagtcatcaggcccagaccgcgccctcagaggcaagctgggcaacttgcccagctgatctcagcagttaataaactgacaatgcgcgcggtaccacaacagaagccacgcaggaatcggaagaataagaagcaaaagcaaaaacaacaggcgccacaaaacaacacaaatcaaaagaagcagccacctaaaaagaaaccggctcaaaagaaaaagaagccgggccgcagagagaggatgtgcatgaaaatcgaaaatgattgtattttcgaagtcaagcacgaaggtaaggtaacaggttacgcgtgcctggtgggggacaaagtaatgaaaccagcacacgtaaaggggaccatcgataacgcggacctggccaaactggcctttaagcggtcatctaagtatgaccttgaatgcgcgcagatacccgtgcacatgaagtccgacgcttcgaagttcacccatgagaaaccggaggggtactacaactggcaccacggagcagtacagtactcaggaggccggttcaccatccctacaggtgctggcaaaccaggggacagcggcagaccgatcttcgacaacaagggacgcgtggtggccatagtcttaggaggagctaatgaaggagcccgtacagccctctcggtggtgacctggaataaagacattgtcactaaaatcacccccgagggggccgaagagtggagtcttgccatcccagttatgtgcctgttggcaaacaccacgttcccctgctcccagcccccttgcacgccctgctgctacgaaaaggaaccggaggaaaccctacgcatgcttgaggacaacgtcatgagacctgggtactatcagctgctacaagcatccttaacatgttctccccaccgccagcgacgcagcaccaaggacaacttcaatgtctataaagccacaagaccatacttagctcactgtcccgactgtggagaagggcactcgtgccatagtcccgtagcactagaacgcatcagaaatgaagcgacagacgggacgctgaaaatccaggtctccttgcaaatcggaataaagacggatgacagccacgattggaccaagctgcgttatatggacaaccacatgccagcagacgcagagagggcggggctatttgtaagaacatcagcaccgtgtacgattactggaacaatgggacacttcatcctggcccgatgtccaaaaggggaaactctgacggtgggattcactgacagtaggaagattagtcactcatgtacgcacccatttcaccacgaccctcctgtgataggtcgggaaaaattccattcccgaccgcagcacggtaaagagctaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgccgcaactaccgaggagatagaggtacacatgcccccagacacccctgatcgcacattaatgtcacaacagtccggcaacgtaaagatcacagtcaatggccagacggtgcggtacaagtgtaattgcggtggctcaaatgaaggactaacaactacagacaaagtgattaataactgcaaggttgatcaatgtcatgccgcggtcaccaatcacaaaaagtggcagtataactcccctctggtcccgcgtaatgctgaacttggggaccgaaaaggaaaaattcacatcccgtttccgctggcaaatgtaacatgcagggtgcctaaagcaaggaaccccaccgtgacgtacgggaaaaaccaagtcatcatgctactgtatcctgaccacccaacactcctgtcctaccggaatatgggagaagaaccaaactatcaagaagagtgggtgatgcataagaaggaagtcgtgctaaccgtgccgactgaagggctcgaggtcacgtggggcaacaacgagccgtataagtattggccgcagttatctacaaacggtacagcccatggccacccgcatgagataattctgtattattatgagctgtaccccactatgactgtagtagttgtgtcagtggccacgttcatactcctgtcgatggtgggtatggcagcggggatgtgcatgtgtgcacgacgcagatgcatcacaccgtatgaactgacaccaggagctaccgtccctttcctgcttagcctaatatgctgcatcagaacagctaaagcggccacataccaagaggctgcgatatacctgtggaacgagcagcaacctttgttttggctacaagcccttattccgctggcagccctgattgttctatgcaactgtctgagactcttaccatgctgctgtaaaacgttggcttttttagccgtaatgagcgtcggtgcccacactgtgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagactctagtcaatagacctggctacagccccatggtattggagatggaactactgtcagtcactttggagccaacactatcgcttgattacatcacgtgcgagtacaaaaccgtcatcccgtctccgtacgtgaagtgctgcggtacagcagagtgcaaggacaaaaacctacctgactacagctgtaaggtcttcaccggcgtctacccatttatgtggggcggcgcctactgcttctgcgacgctgaaaacacgcagttgagcgaagcacacgtggagaagtccgaatcatgcaaaacagaatttgcatcagcatacagggctcataccgcatctgcatcagctaagctccgcgtccttt
accaaggaaataacatcactgtaactgcctatgcaaacggcgaccatgccgtcacagttaaggacgccaaattcattgtggggccaatgtcttcagcctggacacctttcgacaacaaaattgtggtgtacaaaggtgacgtctataacatggactacccgccctttggcgcaggaagaccaggacaatttggcgatatccaaagtcgcacacctgagagtaaagacgtctatgctaatacacaactggtactgcagagaccggctgtgggtacggtacacgtgccatactctcaggcaccatctggctttaagtattggctaaaagaacgcggggcgtcgctgcagcacacagcaccatttggctgccaaatagcaacaaacccggtaagagcggtgaactgcgccgtagggaacatgcccatctccatcgacataccggaagcggccttcactagggtcgtcgacgcgccctctttaacggacatgtcgtgcgaggtaccagcctgcacccattcctcagactttgggggcgtcgccattattaaatatgcagccagcaagaaaggcaagtgtgcggtgcattcgatgactaacgccgtcactattcgggaagctgagatagaagttgaagggaattctcagctgcaaatctctttctcgacggccttagccagcgccgaattccgcgtacaagtctgttctacacaagtacactgtgcagccgagtgccaccccccgaaggaccacatagtcaactacccggcgtcacataccaccctcggggtccaggacatctccgctacggcgatgtcatgggtgcagaagatcacgggaggtgtgggactggttgttgctgttgccgcactgattctaatcgtggtgctatgcgtgtcgttcagcaggcactaacttgacaattaagtatgaaggtatatgtgtcccctaagagacacactgtacatagcaaataatctatagatcaaagggctacgcaacccctgaatagtaacaaaatacaaaatcactaaaaattataaaaacagaaaaatacataaataggtatacgtgtcccctaagagacacattgtatgtaggtgataagtatagatcaaagggccgaataacccctgaatagtaacaaaatatgaaaatcaataaaaatcataaaatagaaaaaccataaacagaagtagttcaaagggctataaaacccctgaatagtaacaaaacataaaattaataaaaatcaaatgaataccataattggcaaacggaagagatgtaggtacttaagcttcctaaaagcagccgaactcactttgagaagtaggcatagcataccgaactcttccacgattctccgaacccacagggacgtaggagatgttattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
配列番号２
ＬＲ２００６＿ＯＰＹ１チクングニアウイルス株に由来するＥ２タンパク質のアミノ酸配列−構造タンパク質に由来するアミノ酸３３９〜７４２  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＡＢＤ９５９３８．１（１〜１２４８アミノ酸）
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTsAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDHTLMSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEVVLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTVVVVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
本明細書で同定された幾つかのＥ２変異体
配列番号３
チクングニアウイルスに由来するＥ２タンパク質のＥ１６８Ｋ変異体
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTsAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIKVHMPPDTPDHTLMSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEVVLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTVVVVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
配列番号４
チクングニアウイルスに由来するＥ２タンパク質のＧ５５Ｒ変異体
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIRIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTsAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDHTLMSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEVVLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTVVVVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
配列番号５
チクングニアウイルスに由来するＥ２タンパク質のＥ２４７Ｋ変異体
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTsAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDHTLMSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAKLGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEVVLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTVVVVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
配列番号６
チクングニアウイルスに由来するＥ２タンパク質のＧ８２Ｒ変異体
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERARLFVRTsAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDHTLMSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEVVLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTVVVVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
配列番号７
チクングニアウイルスに由来するＥ２タンパク質のＨ２３２Ｙ変異体
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTsAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDHTLMSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNYKKWQYNSPLVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEVVLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTVVVVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
配列番号８
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１Ｆ
ttaggatccGATGGCTGCGTGAGACAC
配列番号９
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１Ｒ
taactcgagCCGTCAGGTCTGTTGAACAT
配列番号１０
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー２Ｆ
ttaggatccTACCACCAGGCGATTAAAG
配列番号１１
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３シーケンシングに対するプライマー２Ｒ
taactcgagCTTTGCCCACTTACTGAAGG
配列番号１２
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー３Ｆ
ttaggatccTGCTACAGAAGTCACGCC
配列番号１３
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー３Ｒ
taactcgagGCCAAAGCGTGAATCAG
配列番号１４
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー４Ｆ
ttaggatccAACAGCTTGAGGACAGAGCG
配列番号１５
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー４Ｒ
taactcgagCTCTGTCTCATCACGTCGG
配列番号１６
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー５Ｆ
ttaggatccAAATTGCAGTCATAGGAGTCTTC
配列番号１７
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー５Ｒ
taactcgagAGTACGTTGACGTGCTCTGA
配列番号１８
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー６Ｆ
ttaggatccGTGGGTTAAACAACTGCAAA
配列番号１９
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー６Ｒ
taactcgagGGTTAAAGTCTTCTATCCTCCTGG
配列番号２０
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー７Ｆ
ttaggatccGGATAACCACTGGGATAATAGG
配列番号２１
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー７Ｒ
taactcgagAGTTGTGAAATTCCTTCTGCC
配列番号２２
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー８Ｆ
ttaggatccCGCAGATAGAACCAGTGAAC
配列番号２３
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー８Ｒ
taactcgagCAGCAGCTCTACTTGGGTC
配列番号２４
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー９Ｆ
ttaggatccAGGAGGGAAAGACAGGCT
配列番号２５
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３シーケンシングに対するプライマー９Ｒ
taactcgagCCCTCGCCTTCTTCTG
配列番号２６
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１０Ｆ
ttaggatccCAAAATAGAAGGAGTGCAAAAAG
配列番号２７
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１０Ｒ
taactcgagCCTGGAGTTTCTTAAGTAATAGTTGC
配列番号２８
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１１Ｆ
ttaggatccACCGGTCCAGGTCATTTA
配列番号２９
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１１Ｒ
taactcgagGCAGCAAATTCTTCCCAG
配列番号３０
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１２Ｆ
ttaggatccCCATTCCAGAACACACTACAG
配列番号３１
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１２Ｒ
taactcgagATACCTGATTTCATCATGGC
配列番号３２
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１３Ｆ
ttaggatccCCTTTGATAAGAGCCAAGATG
配列番号３３
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１３Ｒ
taactcgagTACAAAGTTATGACGGGTCCT
配列番号３４
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１４Ｆ
ttaggatccCAACGAACAGGGCTAATTG
配列番号３５
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１４Ｒ
taactcgagGACCGCTTAAAGGCCAG
配列番号３６
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１５Ｆ
ttaggatccGTGCATGAAAATCGAAAATG
配列番号３７
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１５Ｒ
taactcgagTGGTCTTGTGGCTTTATAGACA
配列番号３８
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１６Ｆ
ttaggatccAACCGGAGGAAACCCTAC
配列番号３９
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１６Ｒ
taactcgagGTACCGCACCGTCTGG
配列番号４０
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１７Ｆ
ttaggatccAGCTACCTTGCAGCACGT
配列番号４１
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１７Ｒ
taactcgagCCCACCATCGACAGG
配列番号４２
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１８Ｆ
ttaggatccCGAGCCGTATAAGTATTGGC
配列番号４３
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１８Ｒ
taactcgagCGCCGGTGAAGACCTTAC
配列番号４４
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１９Ｆ
ttaggatccACTACTGTCAGTCACTTTGGAGC
配列番号４５
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー１９Ｒ
taactcgagTACCGGGTTTGTTGCTATTT
配列番号４６
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー２０Ｆ
ttaggatccCACAACTGGTACTGCAGAGAC
配列番号４７
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー２０Ｒ
taactcgagGCGTAGCCCTTTGATCTATAG
配列番号４８
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー２１Ｆ
ttaggatccGGTGCTATGCGTGTCGT
配列番号４９
ＣＨＩＫＶ−Δ５ｎｓＰ３配列決定に対するプライマー２１Ｒ
taactcgagATCTCCTACGTCCCTGTGGG
【図１】
2020534256.tif 000012
【図２】
2020534256.tif 000013
【図３−１】
2020534256.tif 000014
【図３−２】
2020534256.tif 000015
【図４−１】
2020534256.tif 000016
【図４−２】
2020534256.tif 000017
【図５】
2020534256.tif 000018
【図６−１】
2020534256.tif 000019
【図６−２】
2020534256.tif 000020
【図７】
2020534256.tif 000021
【図８−１】
2020534256.tif 000022
【図８−２】
2020534256.tif 000023
【図９Ａ】
2020534256.tif 000024
【図９Ｂ】
2020534256.tif 000025
【図９Ｃ】
2020534256.tif 000026
【図１０】
2020534256.tif 000027
【図１１】
2020534256.tif 000028
【図１２】
2020534256.tif 000029
【図１３−１】
2020534256.tif 000030
【図１３−２】
2020534256.tif 000031
【図１４】
2020534256.tif 000032
【図１５】
2020534256.tif 000033
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
2020534256000001.xml
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月26日(2020.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020534256000001.app
【国際調査報告】
2020534256.tif 000045
2020534256.tif 000046
2020534256.tif 000047
2020534256.tif 000048
2020534256.tif 000049
2020534256.tif 000050