(57)【要約】  【解決手段】  対象において免疫応答を調節するための組成物および方法が開示されている。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者において癌を治療、阻害、および／または予防するための方法であって、前記方法は、
Ａ）前記対象に対するポリアミン輸送系阻害剤であって、前記ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有するものであり、
2020500939.tif 000008
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルであり、Ａｒはアリール基であり、およびＲ２はＨまたは
2020500939.tif 000009
であるポリアミン輸送系阻害剤と、
Ｂ）前記対象に対する抗癌療法と
を投与する工程を有するものである、方法。
【請求項２】
抗癌療法の治療効果を高めるための方法であって、前記方法は、前記抗癌療法とともにポリアミン輸送系阻害剤を投与する工程を有し、前記ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有するものであり、
2020500939.tif 000010
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルであり、Ａｒはアリール基であり、およびＲ２はＨまたは
2020500939.tif 000011
である、方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、およびアントラセンからなる群から選択される、方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の方法であって、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤を投与する工程をさらに有する、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤は、α−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）である、方法。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記癌は転移性である、方法。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記癌は悪性黒色腫である、方法。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記癌はＣＸＣＲ４陽性細胞を有する、方法。
【請求項９】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記癌は前記抗癌療法に対して耐性がある、方法。
【請求項１０】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記抗癌療法は、化学療法、放射線療法、外科手術、および／または免疫療法である、方法。
【請求項１１】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有するものであり、
2020500939.tif 000012
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルである、方法。
【請求項１２】
対象の免疫系を調節するための方法であって、前記方法は、前記対象にポリアミン輸送系阻害剤を投与する工程を有し、前記ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有するものであり、
2020500939.tif 000013
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルであり、Ａｒはアリール基であり、およびＲ２はＨまたは
2020500939.tif 000014
である、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、およびアントラセンからなる群から選択されるものである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法であって、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤を投与する工程をさらに有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤は、α−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）である、方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法において、前記ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有するものであり、
2020500939.tif 000015
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルである、方法。
【請求項１７】
請求項１２記載の方法において、前記方法は、前記対象の炎症誘発性サイトカインを増加させるものである、方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、およびＭＣＰ−１の少なくとも一つを含むものである、方法。
【請求項１９】
請求項１２記載の方法において、前記方法は前記対象における免疫応答を増大させるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／４３１，６６３号に対する優先権を主張する。上記出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＲＯ１  ＣＡ７０７３９のもとで政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に免疫調節の分野に関するものである。具体的には、本発明は、対象における免疫応答を調節するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
癌細胞は、化学療法剤、特に特定のシグナル伝達経路を標的とする薬剤の効果を回避するための多くの多様かつ複雑なメカニズムを発達させる（Ｒｅｂｕｃｃｉ、ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，８５：１２１９−２６）。この化学療法抵抗性は癌治療を成功させる上で重大な障害となっている。ほとんどの腫瘍の異質性および可塑性を考慮すると、より良いアプローチは、腫瘍微小環境において、腫瘍上皮細胞ならびに間質性および浸潤性免疫細胞の両方を含む腫瘍の複数の構成要素を支持する腫瘍修飾因子を標的とすることであり得る（Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，１３：１７９−９６；Ｚｈａｏ，Ｊ．（２０１６）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６０：１４５−５８；Ｃｏｌｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３０：１０７３−８１）。正常細胞と比較して、腫瘍細胞は高レベルのポリアミン（プトレシン、スペルミジン、およびスペルミン）を含有することが示されている（Ｐｅｇｇ，Ａ．Ｅ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８：７５９−７４；Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：７４９−９０；Ｐｅｇｇ，Ａ．Ｅ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３４：２４９−６２；Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：７８１−９２）。ポリアミンは、広範囲の生物学的過程に関与していると考えられるアミノ酸由来のポリカチオンであり、それらは細胞増殖、分化、および細胞死に不可欠である（Ｇｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：７８１−９２；Ｃｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １０：３８７１−８５；Ｍｉｒｚｏｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８９：８７７−８９；Ｍｏｒｓｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９２：６１５−２９；Ｍｏｒｓｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．１４：２２５１−６９；Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７６：１−１４；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７：１１３−２６；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，４６：６１１−７；Ｐｅｇｇ，Ａ．Ｅ．（２００９）ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ６１：８８０−９４）。細胞内ポリアミンレベルは、厳密に調節された生合成経路、異化経路、ならびに取り込み経路および輸送経路によって維持されている（Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７６：１−１４）。ＭＹＣおよびＲＡＳなどの癌遺伝子はどちらもポリアミン生合成を上方制御し（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：７８０４−８；Ｆｏｒｓｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，３：１４０−７；Ｏｒｉｇａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７：４８３４−４２）、および、ポリア���ン輸送系（ＰＴＳ）を誘導することによってポリアミンの細胞内取り込みを増加させる（Ｂａｃｈｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１：１２０５−８；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７：２６４−７０）。それらの莫大な代謝要求を満たすために、ほとんどの腫瘍は正常細胞と比較してポリアミンの必要性が非常に増加しており、そしてその結果、ポリアミンは腫瘍発生の強力な修飾因子である（Ｓｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８：８４３−６１）。
【０００５】
ポリアミン代謝を標的とすることは、長い間、癌の化学療法に対する魅力的なアプローチであった。ポリアミン生合成における律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、腫瘍において上昇し、そして腫瘍形成の初期のマーカーおよびプロモーターである（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：７８１−９２；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：２６３０−７；Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２４：６０２−１４；Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：５６９６−７０３；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９：１４０９−１５）。不可逆的なＯＤＣ活性の阻害剤であるα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）はインビトロにおいて化学療法剤として有望であることを示したが、それは癌患者を治療することにおいて中程度の成功を収めただけであった（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：７８１−９２）。その後の研究は、ポリアミン生合成を阻害することに対するその効果が、腫瘍細胞におけるＰＴＳの代償的な増加した活性によって生体内で打ち消され、その結果食餌および腸内細菌叢由来のポリアミンの腫瘍細胞への取り込みの増加をもたらした（Ｓｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８：８４３−６１；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５８：２４４−５８）。したがって、ポリアミン代謝を標的とする新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様により、対象における癌を抑制、治療、および／または予防するための組成物および方法が提供される。抗癌療法の治療効果（例えば、抗癌特性）を改善または増強するための方法もまた提供される。特定の実施形態では、本発明の方法は、アリール系ポリアミン輸送系阻害剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ポリアミン輸送系阻害剤は、抗癌療法と共に（連続的におよび／または同時に）投与される。特定の実施形態では、この方法はオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、α−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ））を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、癌は転移性である。特定の実施形態では、癌は黒色腫である。特定の実施形態では、癌はＣＸＣＲ４陽性細胞を含む。特定の実施形態では、癌は（ポリアミン輸送系阻害剤および／またはオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤の非存在下で）抗癌治療に耐性がある。抗癌療法の例には、これらに限定されないが、化学療法、放射線療法、外科手術、および／または免疫療法が含まれる。
【０００７】
本発明の別の態様に従って、対象において免疫系を調節する（例えば、攻撃に対する免疫応答を増強または増加させる）ための組成物および方法が提供される。特定の実施形態では、本発明の方法は、アリール系ポリアミン輸送系阻害剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、この方法はオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、α−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ））を投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩによるＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍増殖阻害を示す。図１Ａ：マウスに５×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍の大きさが５０〜１００ｍｍ３になったとき、食塩水、飲料水中の０．２５％ＤＦＭＯ（ｗ／ｖ）、三量体ＰＴＩ（腹腔内、３ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、またはＤＦＭＯと三量体ＰＴＩの両方で処理を開始した。グラフは、異なる処理下でのＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍増殖を示す（平均腫瘍体積±ＳＥＭ）。図１Ｂ：屠殺時に、腫瘍を切除して秤量した（平均±ＳＥＭ）。図１Ｃ：屠殺時に脾臓重量を決定した（平均±ＳＥＭ）。図１Ｄ：ポリアミンレベルをＨＰＬＣによって腫瘍中で決定し、そして組織抽出物中のＤＮＡレベル（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＤＮＡ）に対して正規化した。図１Ｅ：腫瘍および非腫瘍担持皮膚組織をＰＢＴ処置マウスから切除し、急速冷凍し、乳鉢および乳棒を用いて液体窒素中で微粉砕し、３３％水、６６％メタノールおよび１％酢酸の溶液中で均質化した。その後、５０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離した。三量体ＰＴＩレベルを、質量分析法によって腫瘍および皮膚上清中で決定し、そして組織タンパク質濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）に対して正規化した。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；ビヒクル処置マウスと比較して、＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの同時処理が細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させ、そして腫瘍のマクロファージ浸潤を促進することを示す。図２Ａ：ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の頻度を、１００万個の脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）としてＥＬＩＳポットアッセイによって測定した。図２Ｂ：ビヒクル処置マウスまたはＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩで同時処理したマウスのいずれか由来の百万個のＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ黒色腫細胞あたりのＦ４／８０＋細胞の数。ビヒクル（図２Ｃ）またはＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩ（図２Ｄ）で処理し、そしてＦ４／８０＋マクロファージについて染色したマウスからのＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍切片の代表的な画像。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；ビヒクル処置マウスと比較して、＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図３】図３は、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの同時処理が、Ｂ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍において炎症誘発性サイトカインのレベルを増加させることを示す。屠殺時に、腫瘍を切除し、液体窒素中で急速冷凍し、次いで均質化して腫瘍溶解物を生成し、これをサイトカインビーズアレイまたはＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＶＥＧＦのレベルについてアッセイした。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；示された群と比較して、＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇が腫瘍増殖のＰＢＴ阻害を逆転させることを示す。図４Ａ：マウスに５×１０５個のＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌細胞を皮下注射した。腫瘍の大きさが５０〜１００ｍｍ３になったとき、食塩水または飲料水中の０．２５％ＤＦＭＯ（ｗ／ｖ）および三量体ＰＴＩ（腹腔内、３ｍｇ／ｋｇ、１日１回）のいずれかで処理を開始した。抗ＣＤ４／ＣＤ８群のマウスに、処理開始の３日前から３日毎に７５μｇの抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体を合計４回投与して腹腔内注射した。グラフは、異なる処理下でのＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍増殖を示す（平均腫瘍体積±ＳＥＭ）。屠殺時に、腫瘍（図４Ｂ）および脾臓（図４Ｃ）を切除し、秤量した（平均±ＳＥＭ）。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；示された群と比較して、＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図５】図５Ａは、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの同時処理が免疫抑制性および腫瘍形成促進性細胞集団を減少させることを示す。屠殺時に、腫瘍をＣＴ２６．ＣＬ２５担癌マウスから切除し、フローサイトメトリーによる分析のために処理した。示された細胞部分母集団のパーセンテージについてＣＤ４５＋腫瘍細胞を分析した。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；示された群と比較して、＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。図５Ｂは、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの同時処理が、脾臓中の免疫抑制性および腫瘍形成促進性細胞集団を減少させることを示す。屠殺時に、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するマウスから脾臓を摘出し、フローサイトメトリーによる分析のために処理した。示された細胞型のパーセンテージについてＣＤ４５＋腫瘍細胞を分析した。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；示された群と比較して、＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの同時処理が腫瘍における細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させることを示す。屠殺時に、腫瘍をＣＴ２６．ＣＬ２５担癌マウスから切除し、浸潤性白血球を不連続パーコール勾配により単離した。フローサイトメトリーによって、ＩＦＮ−γ＋（図６Ａおよび６Ｂ）およびグランザイムＢ＋（図６Ａおよび６Ｃ）細胞のパーセンテージについてＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。図６Ｄ：５×１０５腫瘍浸潤白血球あたりのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）として、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の頻度をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；示された群と比較して＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの同時処理がＭＤＳＣの免疫抑制活性を低下させることを示す。図７Ａ：屠殺の１週間前に、ビヒクルまたはＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの減少による同時処理のいずれかで処理したＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍担持マウスの脾臓からＭＤＳＣを単離した。次いで、単離したＭＤＳＣ（マウスあたり５．２×１０６）を、ＰＢＴ処置群のレシピエント腫瘍担持マウスの別々の群に養子移入した。図７Ｂ：屠殺時に、レシピエントマウスからの脾細胞を使用して、腫瘍発現β−ガラクトシダーゼペプチドで攻撃した後のＥＬＩＳポットアッセイによってＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の頻度を測定した。１群あたりｎ＝５〜１０匹のマウス；示された群と比較して＊＝ｐ≦０．０５および＃＝ｐ≦０．０１。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＢＲＡＦＷＴ細胞と比較して、ＢＲＡＦＶ６００Ｅヒト黒色腫細胞においてより高いＰＴＳ活性およびＡＰに対する感受性の増加を示す。図８Ａ：ＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＷＭ９８３Ｂ黒色腫細胞およびＢＲＡＦＷＴ  ＷＭ３７４３黒色腫細胞を、１ｍＭ  ＤＦＭＯありまたはなしで４０時間培養し、次いで１μＭ  ３Ｈ−スペルミジンを用いて３７℃で６０分間パルスした。５０μＭスペルミジンを含有する冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、そして、細胞溶解物は、シンチレーションカウンティングによりタンパク質１ｍｇあたりのＣＰＭ  ３Ｈ−スペルミジンについてアッセイされた。図８Ｂ：ＷＭ９８３ＢおよびＷＭ３７４３黒色腫細胞を用量漸増のＡＰで処理した。７２時間の培養後、細胞の生存率をＥＺＱｕａｎｔ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇアッセイで測定した。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によって計算された。図８Ｃ：ＷＭ９８３Ｂ黒色腫細胞を、１ｍＭ  ＤＦＭＯの存在下または非存在下で、用量漸増のＡＰで処理した。７２時間の培養後、細胞の生存率をＥＺＱｕａｎｔ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇアッセイで測定した。７２時間のＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によって計算された。値は、５〜６サンプルの平均値±ＳＤである。ｐ≦０．０５を統計的に有意と見なした。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅマウス黒色腫細胞が、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞よりもＡＰに対してより感受性があることを示す。図９Ａ：マウスＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＹＵＭＭ１．７黒色腫細胞およびＢＲＡＦＷＴ  Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を用量漸増のＡＰで処理した。７２時間の培養後、細胞の生存率をＥＺＱｕａｎｔ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇアッセイで測定した。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によって計算された。図９Ｂ：マウスＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＹＵＭＭ１．７黒色腫細胞およびＢＲＡＦＷＴ  Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、用量漸増のＡＰ±１ｍＭ  ＤＦＭＯまたはＰＬＸ４７２０で処理した。７２時間の培養後、細胞の生存率をＥＺＱｕａｎｔ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇアッセイで測定した。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によって計算された。図９Ｃ：変異ＢＲＡＦＶ６００Ｅタンパク質を発現するようにレトロウイルス感染させたＹＵＭＭ  １．７およびＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞およびＢ１６Ｆ１０細胞を、１ｍＭ  ＤＦＭＯ存在下または非存在下で４０時間培養し、次いで１μＭ３Ｈ−スペルミジンを用いて３７℃で６０分間パルスした。５０μＭスペルミジンを含有する冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、そして、細胞溶解物は、シンチレーションカウンティングによりタンパク質１ｍｇあたりのＣＰＭ  ３Ｈ−スペルミジンについてアッセイされた。
【図１０】図１０は、ＰＬＸ４７２０に対するスフェロイド黒色腫細胞の増加した耐性がＡＰ同時処理によって克服されることを示す。ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異型１２０５  Ｌｕ黒色腫細胞を、２４ウェルＮＣＰの各ウェルに１×１０４細胞で播種した。３日目にスフェロイドが形成されたとき、スフェロイドの３Ｄ培養物をＰＬＸ４７２０（２５μＭ）および／またはＡＰ（２５μＭ）で処理した。１２０５  Ｌｕ黒色腫細胞の２Ｄ単層培養物もまたＰＬＸ４７２０（２５μＭ）および／またはＡＰ（２５μＭ）で処理した。４８時間の薬剤処理後、スフェロイドおよび単層培養物の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いてアッセイした。各処理群におけるパーセント細胞生存率は、同じ条件下でのみ培地で処理した細胞に対して計算した。対照として、各条件下で薬剤処理なしの細胞の増殖を別々に１００％として正規化した。平均は±ＳＤで示されている。
【図１１】図１１は、ＰＬＸ４７２０単独またはＡＰおよびＤＦＭＯの遅延投与を伴うＰＬＸ４７２０での処理後の経時的なマウスにおける腫瘍体積のグラフを提供する。
【図１２】図１２Ａは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を注射し、そして対照またはＡＰ（式（ＩＩ））のいずれかで処理したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、ビヒクル、ＤＦＭＯ、ＡＰ、またはＡＰ＋ＤＦＭＯで処理したマウスからのＦ４／８０＋ＣＤ２０６＋脾細胞のパーセンテージを示す。図１２Ｃは、対照またはＡＰ処置マウスからの脾細胞のイオノマイシンおよびＰＭＡ刺激後のＩＦＮγ産生Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図１３】図１３は、ＡＭＤ３１００またはＡＰの存在下での間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）が刺激したマクロファージの遊走を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ポリアミンは低分子量脂肪族アミンであり、細胞増殖に必須の代謝産物である（Ｃｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：７１７−７２９；Ｓｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８：８４３−８６１；Ｓｅｉｌｅｒら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２１１−２１８；Ｐｏｕｌｉｎら（２０１２）ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ  ４２：７１１−７２３）。腫瘍細胞は上昇したポリアミンレベルを有し、そして外因性ポリアミンを移入するための活性ポリアミン輸送系を有する（Ｃｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：７１７−７２９）。ポリアミン輸送系（ＰＴＳ）は、多くの癌細胞がその成長速度を維持するため、そして細胞生存のためにポリアミンを移入する必要があるため、重要な標的である。腫瘍をポリアミン枯渇させるために、ポリアミン生合成およびポリアミン輸送の両方を阻害することができる。ＤＦＭＯ処理が腫瘍におけるＰＴＳを上方制御するという発見に続いて、研究はＰＴＳを標的とすることができる薬剤を見出すことに焦点を合わせてきた。
【００１０】
腫瘍細胞の増殖および生存に必須であるポリアミンの腫瘍細胞を枯渇させるために、１）ポリアミン輸送阻害剤（ＰＴＩ）および、任意で、２）ＤＦＭＯの組み合わせを含む新しいポリアミン遮断療法（ＰＢＴ）が本明細書に提供される。このアプローチは、ＰＴＳを新規の三量体ＰＴＩで阻害することによって、腫瘍細胞における発癌遺伝子およびＤＦＭＯ誘導ＰＴＳ活性を利用する。（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６：５８１９〜２８； Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７：３４８−６３）。天然ポリアミンとポリアミン系薬剤の両方が、この特定のポリアミン取り込みシステムを介して腫瘍に移入される。対照的に、正常細胞は、それらの低いＰＴＳ活性のために、三量体ＰＴＩに対して有意に感受性が低いと予測される（Ｐｈａｎｓｔｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３３：３０５−１３）。本明細書では、２つの動物腫瘍モデルにおけるＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの併用処理の抗腫瘍効果が提供される。このポリアミン標的療法は、それらの増殖および生存に必要なポリアミン成長因子の腫瘍を枯渇することによって、そしてこれらの腫瘍に対する免疫攻撃を活性化することによって、腫瘍に対する二重の攻撃を提供することが示される。
【００１１】
本発明は、局所的および／または全身的免疫調節のために細胞中のポリアミン輸送系を標的とするアリールポリアミン薬剤様化合物の新規用途を提供する。ポリアミンはすべての細胞に見られる小さなアミノ酸由来の分子であり、あらゆる生命過程に不可欠なものである。生合成の増加およびポリアミン輸送系（ＰＴＳ）を介した取り込みの増加の両方のために、ポリアミンのレベルは、正常細胞と比較して腫瘍細胞において劇的に増加している。アリール化合物の３アーム型ポリアミン誘導体は、有効なポリアミン輸送系阻害剤（ＰＴＩ）である（Ｍｕｔｈ、ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７（２）：３４８−３６３）。さらに、アリール化合物の２アーム型ポリアミン誘導体は、ＰＴＳを介して細胞内に接近することができ（Ｍｕｔｈら（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）、毒性物質を細胞内に送達するための「トロイの木馬」薬剤として使用することができる。
【００１２】
理論に縛られることなく、これらのポリアミン由来薬剤は両方とも、ポリアミン輸送システム（ＰＴＳ）を介した細胞への進入について正常なポリアミンと競合するそれらのポリアミンテールによってポリアミンの取り込みを阻害する（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。ポリアミンの腫瘍を枯渇させるために、本明細書では、（１）ポリアミン生合成経路における律速酵素の阻害剤−オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）（例えば、α−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）、ＦＤＡ承認薬剤）および（２）ポリアミン輸送系阻害剤（ＰＴＩ）を含む新規ポリアミン系の治療が用いられる。この戦略は、それらの増殖および生存に不可欠であるポリアミンの腫瘍細胞を枯渇状態にする。
【００１３】
上記のように、アリール化合物の２アーム型ポリアミン誘導体は、ＰＴＳを介して細胞内に侵入する能力もあるため、トロイの木馬として機能することができる。アリール化合物の２アーム型ポリアミン誘導体はまた、それらとＤＮＡとの多重静電相互作用（Ｄａｌｌａｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ。Ｃｈｅｍ．，４９（１７）：５１７７−５１８６）およびトポイソメラーゼＩＩ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４（２２）：３６８２−３６９１）を介して細胞毒性を高め得る。しかしながら、正常細胞は、正常細胞における非常に低いＰＴＳ活性およびポリアミン取り込みのために、腫瘍細胞と比較してアリール化合物の２−アーム型ポリアミン誘導体に対する感受性が有意に低い（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。
【００１４】
ポリアミンレベルは腫瘍内で上昇し、化学療法または放射線療法後に腫瘍の低酸素および壊死領域に見られる、死にかけている癌細胞によって放出される。生体内でのエビデンスは、腫瘍の微小環境に放出されたポリアミンの抗炎症作用が、ほとんどの腫瘍で一般的に見られる免疫抑制環境に寄与することを示している。複数のマウス腫瘍モデルを用いて、以下のことが明らかにされている：ｉ）抗原特異性免疫応答のポリアミン媒介抑制の上昇は、腫瘍増殖のためのより許容性の高い微小環境を作り出す；ｉｉ）ＤＦＭＯおよびポリアミン輸送阻害剤の同時処理による腫瘍中のポリアミン枯渇による腫瘍増殖の阻害はＴ細胞依存性である；およびｉｉｉ）原発腫瘍の外科的除去の前のＤＦＭＯおよびポリアミン輸送阻害剤による処理は、腫瘍の再攻撃に対する防御免疫をもたらす。さらに、ポリアミンは、単球における炎症誘発性サイトカインの誘導を阻害し、致命的な敗血症から保護し、そして免疫細胞活性を抑制することが示されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２８（４  Ｓｕｐｐｌ）：Ｎ６０−６６；  Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１５（７−８）：２７５−２８２；  Ｃｈａｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（４）：１０２７−１０３３；Ｃｈａｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（３）：３６５−３７０）。さらに、ポリアミンは適応免疫応答を抑制することが示されている。オルニチンデカルボキシラーゼ活性が表皮を特異的に標的とするトランスジェニックマウスを用いて、上昇したポリアミンレベルは、Ｔ細胞媒介性であるハプテン誘導性接触アレルギー反応を強力に抑制することが示された（Ｋｅｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ，１３１（１）：１５８−１６６）。したがって、感染部位または創傷部位における局所抗炎症エフェクター分子としてのポリアミンの役割は、免疫応答を回避するための生存メカニズムを提供するために腫瘍によって奪われている。
【００１５】
ＣＸＣＲ４は、治療抵抗性および腫瘍進行を促進し得る腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の動員および極性化において重要な役割を果たす（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，５（１０）：２５９２−２５９９）。本明細書に提供されるデータは、本発明のポリアミン輸送系阻害剤がポリアミンの取り込みを阻害するだけでなく、転移を促進する腫瘍−間質相互作用の重要な調節因子であるＣＸＣＲ４／間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）シグナル伝達も阻害することを示す。本発明のポリアミン輸送系阻害剤はまた、ＣＸＣＲ４を高度に発現し、そして免疫／化学療法耐性に寄与し、そして腫瘍の進行および転移を間接的に促進することが見出されたＭ２マクロファージを標的とし得る（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７５（１７）：３４７９−９１；Ｂｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５（２２）：１１２８３−１１２９６）。抗癌療法は腫瘍壊死、血管損傷、および低酸素症を引き起こすので、これらのすべては、腫瘍微小環境においてＳＤＦ−１を含む骨髄性細胞化学誘引物質を上方制御し、前腫瘍形成性Ｍ２表現型へのＴＡＭの偏極を促進することができる（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７５（１７）：３４７９−９１；Ｄｅ  Ｐａｌｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２３（３）：２７７−２８６；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４：１５７）。したがって、本発明のポリアミン輸送系阻害剤は、ポリアミン輸送阻害剤としてだけでなく、転移（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７０（２４）：１０４１１−１０４２１）、免疫療法に対する耐性（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，５（１０）：２５９２−２５９９）、ならびに治療耐性および腫瘍進行を促進できるＴＡＭの動員およびＭ２分極進行（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７５（１７）：３４７９−９１；  Ｂｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５（２２）：１１２８３−１１２９６）の原因であると推定されるＣＸＣＲ４シグナル伝達の阻害剤としても二重の活性を有する。
【００１６】
本発明に従って、対象の免疫系を刺激する（例えば、対象における免疫応答および／または反応を刺激する、増加させる、および／または増強する）方法が提供される。特定の実施形態では、この方法は対象における免疫系の抑制（例えば免疫抑制）を軽減する。対象の免疫系の抑制は、限定されるものではないが、癌または微生物感染症（例えば、細菌感染症、ウイルス感染症、または真菌感染症）などの疾患状態によるものであり得る。
【００１７】
特定の実施形態では、この方法はポリアミン輸送系阻害剤を対象に投与することを含み、ここでポリアミン輸送系阻害剤はポリアミンアリール化合物である。特定の実施形態では、ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有する。
【化１】
2020500939.tif 000002
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルであり、ここでＡｒはアリール基であり、
式中、Ｒ２はＨまたは
【化２】
2020500939.tif 000003
である。特定の実施形態では、各Ｒ１はメチルである。特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。化合物のポリアミンアームは、アリール基の化学的に可能な位置、特に芳香環の原子（例えば、炭素）に結合していてもよい。特定の実施形態では、Ｒ２がＨであるとき、化合物のポリアミンアームは芳香環の両側に結合している。特定の実施形態では、化合物のポリアミンアームは、それらが互いに等間隔になるように芳香環に結合している（例えば、３つのポリアミンアームがあるとき、６員環の１、３および５位または２、４および６位）。
【００１８】
本明細書で使用されるアリール基は、環部分に約５〜約１８個の炭素を含有する単環式、二環式、および三環式芳香族基を指す。アリール基は、利用可能な炭素原子を通して任意に置換されていてもよい（例えば、１〜約４個の置換基を含んでいてもよい）。例示的な置換基としては、これに限定されないが、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシル、アルキルチオ、ヒドロキシル、メトキシ、カルボキシル、オキソ、エポキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アミノ、カルバモイル、尿素、アルキル尿素、およびチオールが挙げられ得る。アリール基は、少なくとも１つの硫黄、酸素または窒素ヘテロ原子環員を含む環系を含み得る（すなわち、アリール基はヘテロアリール基であり得る）。アリール基の例には、これに限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、インドール、ピリジン、ピロール、フラン、チオペン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、オキサジアゾール、フラザン、チアジアゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、ジオキシン、チアジン、トリアジン、ペンタレン、ピロリジン、インドリジン、ベンゾフラン、ベンゾチオペン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンズチアゾール、プリン、キノリン、キノリジン、キナゾリン、ベンゾピラジン、ナフチリジン、フタラジン、プテリジン、アセナフチレン、カルバゾール、アントラセン、フェナントレン、アクリジン、フェナジンおよびフェナントロリンが含まれる。特定の実施形態では、アリール基はベンゼン、ナフタレン、およびアントラセンからなる群から選択される。
【００１９】
特定の実施形態では、ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有する。
【化３】
2020500939.tif 000004
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルである。
【００２０】
特定の実施形態では、ポリアミン輸送系阻害剤は以下の構造を有する。
【化４】
2020500939.tif 000005
式中、各Ｒ１は独立してＨまたはメチルである。
【００２１】
本発明の方法はまた、オルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤を投与することをさらに含み得る。オルニチンデカルボキシラーゼは、ポリアミン生合成経路のオルニチンからプトレシンへの律速変換を触媒する。特に、オルニチンデカルボキシラーゼ活性の増加は腫瘍増殖の増加と関連している。ポリアミン生合成を阻害すること（例えば、オルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤を用いる）およびポリアミン輸送を阻害すること（例えば、ポリアミン輸送系阻害剤を用いる）によって、細胞に利用可能なポリアミンの量は大幅に減少する。オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤としては、これに限定されないが、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ；エフロルニチンとしても知られる）、Ｎ−（４’−ピリドキシル）−オルニチン（ＢＯＣ）−ＯＭｅ（ＰＯＢ；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，６：１８３１）、α−メチルオルニチン、１，４−ジアミノ−２−ブタノン（ＤＡＢ）、および１，３−ジアミノプロパンが含まれる。特定の実施形態では、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤はＤＦＭＯである。
【００２２】
本発明の他の態様に従って、対象における癌を治療、抑制、および／または予防するための方法が提供される。本発明はまた、抗癌療法の治療効果を改善する方法も包含する。これらの方法は、上記のように、ポリアミン輸送系阻害剤を投与することを含む。特定の実施形態では、これらの方法は、上記のように、抗癌療法と組み合わせて、ポリアミン輸送系阻害剤を（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与することを含む。換言すると、（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）ポリアミン輸送系阻害剤は、補助療法として使用される。例えば、ポリアミン輸送系阻害剤は（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）、化学療法（例えば、少なくとも１つの化学療法剤の投与）、放射線療法、癌性細胞または腫瘍を除去するための手術（例えば、切除）および/または免疫療法と組み合わせて投与され得る。治療剤は、ポリアミン輸送系阻害剤と連続的に（前または後に）および／または同時に（合せて）（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与することができる。同時投与剤は、同じ組成物または別々の組成物で投与することができる。
【００２３】
特定の実施形態では、治療されている癌は、投与されている抗癌療法に対して耐性がある。しかしながら、ポリアミン輸送系阻害剤の（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤との）同時投与は、耐性癌を本発明の治療に対して感受性にする。特定の実施形態では、治療されている癌は転移性である。特定の実施形態では、治療されている癌は、ＣＸＣＲ４陽性細胞（例えば、ＣＸＣＲ４陽性癌幹細胞）を含む。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法を使用して治療することができる癌には、これに限定されないが、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌（胃癌）、子宮内膜癌、脳癌、膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌、頭頸部癌、咽頭癌、皮膚癌、黒色腫、基底癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、食道癌、乳癌、横紋筋肉腫、肉腫、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、副腎癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨癌、および絨毛癌が含まれる。特定の実施形態では、癌は腫瘍を形成する。特定の実施形態では、癌は転移性である。 特定の実施形態では、癌は黒色腫（例えば、変異型ＢＲＡＦ（例えば、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）を有する黒色腫）である。
【００２５】
化学療法剤は、抗癌活性を示す化合物、および／または細胞に有害な化合物（例えば、毒素）である。適切な化学療法剤は、これに限定されないが：毒素（例えば、サポリン、リシン、アブリン、臭化エチジウム、ジフテリア毒素、およびシュードモナス外毒素）、タキサン、アルキル化剤（例えば、テモゾロミド、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、およびウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホネートエステル；カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシンなどのニトロソ尿素；白金錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、チオプラチン、サトラプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ヘプタプラチン、イプロプラチン、トランスプラチン、およびロバプラチン）；マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびアルトレタミンなどの生体還元性アルキル化剤；ＤＮＡ鎖切断剤（例えば、ブレオマイシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、アムサクリン、メノガリル、アモナフィド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、エリプチシン、ダウノマイシン、ピラゾロアクリジン、イダルビシン、ミトキサントロン、ｍ−ＡＭＳＡ、ビサントレン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デオキシドキソルビシン、エトポシド（ＶＰ−１６）、エトポシドホスフェート、オキサントラゾール、ルビダゾン、エピルビシン、ブレオマイシン、およびテニポシド）；ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、プリカミジン）；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよびトリメトレキサートなどの葉酸拮抗薬）；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスリジンなどのピリミジン拮抗薬；メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンなどのプリン拮抗薬；アスパルギナーゼ；およびヒドロキシ尿素などのリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；アントラサイクリン；チューブリン相互作用剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）））；および抗体（例えば、ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ））を含む。
【００２６】
放射線療法とは、癌細胞を標的とするためのＸ線、ガンマ線、中性子、陽子およびその他の線源からの高エネルギー放射線の使用を指す。放射線は外部から投与されてもよく、または内部から与えられた放射性物質を用いて投与されてもよい。化学放射線療法は化学療法と放射線療法を組み合わせたものである。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明の方法（例えば、癌を治療、抑制、および／または予防するため、または抗癌療法の治療効果を高める／改善するための方法）は、ポリアミン輸送系阻害剤を（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与すること、および免疫チェックポイント阻害剤（例えば、免疫チェックポイント遮断療法）を投与することを含む。免疫チェックポイント阻害剤の例は、これに限定されないが、：ＰＤ−１阻害剤（例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））などのＰＤ−１に免疫学的に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体）；ＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））のようなＰＤ−Ｌ１に免疫学的に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体）；およびＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））のようなＣＴＬＡ−４に免疫学的に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体）を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明の方法（例えば、癌を治療、抑制、および／または予防するため、または抗癌療法の治療効果を高める／改善するための方法）は、ポリアミン輸送系阻害剤を（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与すること、および癌ワクチン（治療用ワクチン）を投与することを含む。「癌ワクチン」は、特定の癌または様々な癌に対する免疫応答を引き出す化合物または組成物を指す。癌ワクチンは、これに限定されないが、前立腺酸性ホスファターゼ（例えば、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）；例えば、前立腺癌用）；熱ショックタンパク質ｇｐ９６（例えば、オンコファージ；例えば、腎臓癌、黒色腫、または神経膠腫用）；上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、ＣｉｍａＶａｘ−ＥＧＦ；例えば、肺癌用）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（例えば、Ｎｅｕｖｅｎｇｅ（商標）、ラプルーセル−Ｔ；例えば、乳癌、結腸癌、膀胱癌、または卵巣癌用）、およびムチン  １（例えば、テセモチド、エメペピムット−Ｓ；例えば、乳癌用）を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明の方法（例えば、癌を治療、抑制、および／または予防するため、または抗癌療法の治療効果を高める／改善するための方法）は、ポリアミン輸送系阻害剤を（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与すること、および養子Ｔ細胞療法を含む。養子Ｔ細胞療法は、その後に癌患者に戻される自己由来の天然の腫瘍特異的Ｔ細胞の生体外拡大を含む。この養子移入の前に、宿主は放射線照射および／または化学療法によって免疫枯渇され得る。本明細書中で使用される場合、養子Ｔ細胞療法はまた、腫瘍関連抗原に対する特異性を付与するための正常末梢血Ｔ細胞の生体外での遺伝子改変を包含し得る（例えば、所望の抗腫瘍応答を有するＴ細胞のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲを発現することによる）。ＣＡＲは抗体様特異性を有し、Ｔ細胞を活性化することができるＴＣＲ細胞内ドメイン上に移植された標的細胞の表面上のＭＨＣ非制限構造を認識する。
【００３０】
本発明の別の態様に従って、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を治療、阻害、および／または予防するための方法が提供される。この方法は、上記のように、ポリアミン輸送系阻害剤を（場合によりオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与することを含む。この方法は、抗ウイルス剤、特に抗ＨＩＶ化合物／薬剤の投与をさらに含み得る。治療剤は、ポリアミン輸送系阻害剤と連続的に（前または後に）および／または同時に（合せて）（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与することができる。同時投与剤は、同じ組成物または別々の組成物で投与することができる。
【００３１】
抗ＨＩＶ化合物または抗ＨＩＶ剤は、ＨＩＶ（例えば、複製または感染）を阻害する化合物である。 抗ＨＩＶ剤の例は、これに限定されないが、以下を含む。
（Ｉ）ヌクレオシド−アナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）。ＮＲＴＩは、ＨＩＶ−１逆転写酵素の活性を阻害するヌクレオシドおよびヌクレオチドならびにそれらの類似体を指す。ヌクレオシド−アナログ逆転写酵素阻害剤の例は、これに限定されないが、アデホビルジピボキシルである。
（ＩＩ）非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）。ＮＮＲＴＩは、ＨＩＶ逆転写酵素上の非基質結合部位に可逆的に結合し、それによって活性部位の形状を変えるか、またはポリメラーゼ活性を遮断するアロステリック阻害剤である。ＮＮＲＴＩの例は、これに限定されないが、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン、カプラビリン、エミビリン（＋）−カラノリドＡおよびＢ、エトラビリン、リルピビリン、ならびにダピビリンを含む。
（ＩＩＩ）プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）。プロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤の例は、これに限定されないが、ダルナビル、アンプレナビル、チプラニビル、インジナビル、サキナビル、フォサンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、ラシナビル、およびブレカナビルを含む。
（ＩＶ）融合阻害剤または侵入阻害剤。融合阻害剤または侵入阻害剤は、ＨＩＶエンベロープタンパク質に結合し、ウイルスが宿主細胞と融合するのに必要な構造変化を阻止することによって作用するペプチドなどの化合物である。融合阻害剤の例は、これに限定されないが、ＣＣＲ５受容体拮抗薬（例えば、マラビロック）、エンフビルチド、Ｔ−２０（ＤＰ−１７８）およびＴ−１２４９を含む。
（Ｖ）インテグラーゼ阻害剤。インテグラーゼ阻害剤は、ウイルスゲノムを宿主細胞のＤＮＡに挿入するウイルス酵素であるインテグラーゼの作用を遮断するように設計された一種の抗レトロウイルス剤である。インテグラーゼ阻害剤の例は、これに限定されないが、ラルテグラビル、エルビテグラビル、カボテグラビル、ドルテグラビル、およびＭＫ−２０４８を含む。
【００３２】
抗ＨＩＶ化合物はまた、成熟阻害剤（例えば、ベビリマット）を含む。成熟阻害剤は、典型的には、ＨＩＶ  ｇａｇに結合し、そしてウイルスの成熟の間にそのプロセシングを混乱させる化合物である。抗ＨＩＶ化合物はまた、これに限定されないが、ＡＬＶＡＣ（登録商標）ＨＩＶ（ｖＣＰ１５２１）、ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ（ｇｐ１２０）、およびそれらの組み合わせなどのＨＩＶワクチンを含む。抗ＨＩＶ化合物はまた、ＨＩＶ抗体（例えば、ｇｐ１２０またはｇｐ４１に対する抗体）、特に広く中和する抗体を含む。
【００３３】
特に上記薬剤が異なる作用機序を有する場合には、複数の抗ＨＩＶ薬剤を使用することができる。 特定の実施形態では、抗ＨＩＶ療法は高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）である。
【００３４】
本発明の別の態様に従って、対象にワクチンを投与するための方法が提供される。この方法は、上記のように、ワクチンと組み合わせて、ポリアミン輸送系阻害剤を（場合によってはオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤と一ともに）投与することを含む。換言すると、ポリアミン輸送系阻害剤は（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）補助療法として使用される。例えば、ポリアミン輸送系阻害剤（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）は、これに限定されないが、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）ワクチン、ロタウイルスワクチン、ジフテリア、百日咳、および破傷風ワクチン、ヘモフィルスインフルエンザｂ型（Ｈｉｂ）ワクチン、肺炎球菌ワクチン、ポリオワクチン、インフルエンザワクチン、はしか、おたふく風邪、および風疹（ＭＭＲ）ワクチン、水痘ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、およびヒトパピローマウイルスワクチンなどのワクチンと組み合わせて投与できる。治療剤は、ポリアミン輸送系阻害剤と連続的に（前または後に）および／または同時に（合せて）（任意にオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤とともに）投与することができる。同時投与剤は、同じ組成物または別々の組成物で投与することができる。
【００３５】
本発明の別の態様に従って、上記で特定された薬剤のうちの１つ以上および薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、上記のように薬剤が別々の組成物に含まれる場合、別々の組成物はキット内に含まれる。
【００３６】
本発明の組成物は、任意の適切な経路により、例えば注射（例えば、局所的（直接、腫瘍または腫瘍内を含む）または全身投与用）、経口、肺、局所、経鼻または他の様式により投与され得る。組成物は、非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、局所投与、吸入投与、経皮投与、肺内投与、動脈内投与、直腸内投与、筋肉内投与、および鼻腔内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。特定の実施形態では、組成物は血液に（例えば静脈内に）投与される。一般に、組成物の薬学的に許容される担体は、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体の群から選択される。組成物は、様々な緩衝剤含有量（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；および洗剤および可溶化剤（例えば、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソル、ベンジルアルコール）および膨化物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含み得る。組成物はまた、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、エチレンビニルアセテートコポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の粒状調製物中に、またはリポソーム中に組み込むことができる。そのような組成物は、本発明の医薬組成物の成分の物理的状態、安定性、生体内放出速度、および生体内クリアランス速度に影響を及ぼし得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）。本発明の医薬組成物は、例えば、液体形態で調製することができ、または乾燥粉末形態（例えば後の再構成のために凍結乾燥）にすることができる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、前段落で例示されるように、医薬製剤の所望の投与経路に適切であり得るありとあらゆる溶媒、分散媒体などを含む。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体の使用は当技術分野において公知である。 任意の従来の媒体または薬剤が投与される分子と適合しない場合を除いて、医薬製剤におけるその使用が企図される。
【００３８】
特定の患者への投与に適した本発明の分子の用量および投与計画は、患者の年齢、性別、体重、一般的な病状、ならびに、阻害剤が投与されている特定の状態および重症度を考慮して医師によって決定される。医師はまた、投与経路、医薬担体、および分子の生物学的活性を考慮することがある。
【００３９】
適切な医薬製剤の選択は、選択された投与方法に依存する 例えば、本発明の分子は、任意の癌性組織または癌周辺領域への直接注射によって投与することができる。この場合、医薬製剤は、癌性組織と適合性のある媒体中に分散した分子を含む。
【００４０】
本発明の分子はまた、血流中への静脈内注射によって、または皮下注射、筋肉内注射、髄腔内注射もしくは腹腔内注射によって非経口的に投与され得る。非経口注射用の医薬製剤は当技術分野において公知である。非経口注射が分子を投与するための方法として選択される場合、十分な量の分子がそれらの標的細胞に確実に到達して生物学的効果を発揮することを確実にするための工程がとられるべきである。分子の親油性、またはそれらが送達される医薬製剤は、分子がそれらの標的位置に到達することができるように増加させる必要があり得る。分子の親油性を増加させるための方法は当技術分野において公知である。
【００４１】
活性成分として本発明の化合物を医薬担体と緊密に混合して含有する医薬組成物は、慣用の医薬配合技術に従って製造することができる。担体は、投与に望ましい製剤の形態、例えば静脈内、経口、局所または非経口に応じて多種多様な形態をとることができる。経口剤形で分子を調製する際には、経口用液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤および溶液など）の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香料、保存料、着色料などのような任意の通常の薬学的媒体を使用することができ、または、経口固形製剤（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤など）の場合、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を使用することができる。それらの投与の容易さのために、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口投与単位形態であり、その場合には明らかに固体の製薬学的担体が使用される。必要に応じて、錠剤は標準的な技術によって糖衣錠または腸溶コーティングすることができる。非経口剤の場合、担体は通常滅菌水を含むが、例えば溶解性を補助するため、または保存目的のために他の成分を含んでもよい。注射用懸濁液も調製することができ、その場合には適切な液体担体、懸濁剤などを使用することができる。
【００４２】
本発明の医薬製剤は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形に処方することができる。投与量単位形態は、本明細書で使用されるとき、治療を受けている患者に適切な医薬製剤の物理的に不連続な単位を指す。各投与量は、選択された医薬担体とともに所望の効果を生じるように計算された量の活性成分を含むべきである。適切な投与単位を決定するための手順は当業者において周知である。投与量単位は、患者の体重に基づいて比例的に増減することができる。特定の病理学的状態の緩和のための適切な濃度は、当該分野で公知のように、投与量濃度曲線計算によって決定され得る。本発明の分子を投与するための適切な投与量単位は、動物モデルにおける分子の毒性を評価することによって決定することができる。種々の濃度の医薬製剤は、移植されたヒト腫瘍を有するマウスに投与することができ、そして最小および最大投与量は、治療の結果としての腫瘍サイズの有意な減少および副作用の結果に基づいて決定することができる。適切な投与量単位はまた、治療の有効性を評価することによって決定され得る。分子の投与量単位は、腫瘍のより大きな収縮および／または減少した増殖速度に従って、個々にまたは各抗癌療法と組み合わせて決定することができる。
【００４３】
本発明の分子を含む医薬製剤は、病理学的症状が軽減または緩和されるまで適切な間隔で、例えば１日に少なくとも２回以上投与し、その後投与量を維持レベルにまで低下させることができる。特定の場合における適切な間隔は通常、患者の状態に依存する。
【００４４】
定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００４５】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主」、「対象」、および「患者」は、ヒトなどの哺乳動物を含む任意の動物を指す。
【００４７】
化合物または医薬組成物の「治療有効量」とは、特定の障害または疾患の症状を予防、抑制、治療、または軽減するのに有効な量を指す。
【００４８】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局による承認、あるいは米国薬局方または他の一般に認められている薬局方における動物、より詳細にはヒトにおける使用の承認を示す。
【００４９】
「担体」とは、例えば、本発明の活性剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、補助剤またはビヒクルを指す。薬学的に許容される担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物または合成由来のものを含む、水および油などの滅菌液体であり得る。水または食塩水、ならびにブドウ糖およびグリセロール水溶液が、特に注射用溶液のための担体として好ましく使用される。適切な医薬担体は、例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００５０】
「抗体」または「抗体分子」は、特定の抗原に結合する、抗体およびその断片を含む任意の免疫グロブリンである。本明細書中で使用される場合、抗体または抗体分子は、非修飾免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の融合を企図する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的に特異的」とは、目的のタンパク質または化合物の１つ以上のエピトープに結合するが、抗原性生物学的分子の混合集団を含む試料中の他の分子を実質的に認識および結合しないタンパク質／ポリペプチド、特に抗体をいう。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「予防する」とは、状態を発症する危険性がある対象の予防的処置をいい、その結果、対象がその状態を発症する確率が低下することを指す。
【００５３】
本明細書で使用される「治療する」という用語は、（例えば、１つまたは複数の症状における）患者の状態の改善、状態の進行の遅延などを含む、疾患に罹患している患者に利益を与える任意の種類の治療を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、一般に、一緒に定義された使用に適している要素の集まりを指す。特定の実施形態では、「キット」とは、典型的には使用者にとって都合がよく、かつ組成物の化学的安定性を確実にする配置で、本発明の方法を実施するのに必要な組成物を含む容器の集まりを指す。キットは、１つまたは複数の容器（チューブまたはバイアルなど）を有する送達システムを含み得る。例えば、そのような送達システムは、本発明の組成物および／または支持材料（例えば、教育資料）の一箇所から他所への保管、輸送、または送達を可能にするシステム（例えば、封入物（例えばボックス））を含む。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するために提供される。 実施例は、決して本発明を限定することを意図しない。
【００５６】
実施例１
材料および方法
動物
雌Ｃ５７Ｂｌ６またはＢａｌｂ／ＣマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ／ＮＣＩから入手した。
【００５７】
細胞培養
ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドを発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ細胞を、１０％ウシ胎児血清および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。ＣＴ２６．ＣＬ２５細胞を、１０％ウシ胎児血清、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８二硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。ＣＴ２６．ＣＬ２５（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル）は、大腸菌β−ｇａｌ遺伝子で形質導入されたＣＴ２６結腸癌細胞のサブクローンであり、これは、正常なマウスにおいて、親クローンＣＴ２６．ＷＴと同じくらい致死的であることが示されている。
【００５８】
生体内腫瘍モデル
腫瘍モデルは、Ｃ５７Ｂｌ６マウスに５×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ細胞またはＢａｌｂ／ｃマウスに５×１０５個のＣＴ２６．ＣＬ２５細胞を皮下注射することによって確立した。腫瘍増殖についてマウスを週に２回モニターした。腫瘍が触知可能になったとき（５０〜１００ｍｍ３）、飲料水中の０．２５％（ｗ／ｖ）ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩ（腹腔内注射により１日３ｍｇ／ｋｇ）による治療を開始した。養子移入のために、脾臓を摘出し、そしてナイロンフィルターを通して加圧して単一細胞懸濁液を得た。得られた懸濁液を赤血球溶解緩衝液と共に５分間インキュベートして赤血球を溶解した。Ｇｒ１＋細胞をＰＥコンジュゲート抗体で染色した後、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造元の指示に従って用いて単離した。Ｇｒ１＋陽性細胞を後眼窩腔に注入した。キャリパーを使用して腫瘍増殖を形態計測的に評価し、式Ｖ（ｍｍ３）＝π／６×Ａ×Ｂ２（Ａはより大きい直径であり、Ｂはより小さい直径である）を使用して腫瘍体積を計算した。
【００５９】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳポットによる抗原特異的Ｔ細胞応答の検出
屠殺時に、Ｂ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍担持マウス由来の脾細胞およびＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍担持マウス由来の腫瘍細胞懸濁液を、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳポット）アッセイによってＩＦＮ−γ産生細胞について分析した。マルチスクリーン濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、４℃で一晩、０．５μｇ／ｍＬの精製抗マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でコーティングした。脾細胞または腫瘍の単細胞懸濁液を、ウェルあたりそれぞれ１×１０６および５×１０５でめっきした。Ｂ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍担持マウス由来の脾細胞を用いたＥＬＩＳポットアッセイのために、細胞を２０μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ）で刺激した。ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍由来の細胞を既知のＨ−２Ｄ拘束性β−ガラクトシダーゼペプチド（ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（配列番号２）；ＣｈｅｍＰｅｐ）で処理した。３７℃で１６時間刺激した後、細胞を洗浄により除去し、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ検出抗体およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート、続いてＮＩＴＲＯ−ブルーテトラゾリウムクロリドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドイルホスフェートｐ−トルイジン塩基質（Ｓｉｇｍａ）でスポットを発達させた。スポット数を数え、データを１０６細胞あたりのＩＦＮ−γスポット形成細胞として報告した。
【００６０】
免疫組織化学
マウス腫瘍組織をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、そしてパラフィン中に包埋した。切片を脱パラフィン処理し、水和し、次いでスチーマー中で０．０１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で８分間加熱した。切片を一次抗体（ラットモノクローナル抗マウスＦ４／８０  ［ＢｉｏＲａｄ  ＭＣＡ４９７ＧＡ］）と共に室温で２時間インキュベートし、続いてビオチン化二次抗体、次いでアビジンＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＮＣ）とインキュベートした。切片をジアミノベンジジンおよび過酸化物と共にインキュベートし、次いでヘマトキシリンで対比染色することによって免疫反応性細胞を局在化させた。デジタルカラーカメラを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）および対応するソフトウェアを使用して写真を得た。
【００６１】
サイトカイン分析
Ｂ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍を液体窒素中で急速冷凍し、粉砕し、０．５μＭジチオトレイトール、０．５μＭのＰｅｆａｂｌｏｃおよび８μｇ／ｍＬロイペプチンを含有するＰＢＳ中で均質化した。製造業者のプロトコルに従い、マウス炎症サイトメトリービーズアレイ試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）およびフローサイトメトリーを用いて、試料を、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）について分析した。製造業者の説明書に従って、マウスＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＶＥＧＦサイトカインレベルを分析した。
【００６２】
免疫細胞浸潤物のフローサイトメトリー分析
腫瘍組織を０．３％コラゲナーゼ／０．１％ヒアルロニダーゼ溶液中で消化し、ナイロンメッシュフィルターを通して加圧して単一細胞懸濁液を得て、赤血球溶解緩衝液（０．１７Ｍトリス−ＨＣＬ、０．１６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ）中で５分間インキュベートした。細胞を遠心沈殿させ、４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に再懸濁した。次いで、腫瘍細胞懸濁液を８０％パーコール溶液で覆い、３２５×ｇで２３分間回転させた。４０％と８０％のパーコール溶液の間の界面にある細胞を取り出し、洗浄し、そしてフローサイトメトリー分析のために調製した。同数の生存細胞を以下の組み合わせで染色した：ＣＤ８ａ−ＰＥＣｙ７、ＣＤ４−ＰＥ、Ｆ４／８０−ＰＥＣｙ７、ＣＤ２０６−ＦＩＴＣ、Ｇｒ１−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ、ＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｃｙ７、グランザイムＢ−ＦＩＴＣおよびＩＦＮ−γ−ＡＰＣ。フローサイトメトリーデータをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーターで取得し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【００６３】
統計分析
全てのインビトロ実験は少なくとも三重に行われ、そしてデータは２〜３回の別々の実験からまとめられた。統計的有意性についてのテューキー検定またはスチューデントｔ検定によって一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて分析を行った。複数の動物を用いて生体内試験を実施した（処置群あたりｎ＝５〜１０）。腫瘍増殖曲線を、治療および時間の固定効果を用いて一般化線形モデルで分析した。処置群と観察日との間の相互作用についてデータを調べ、増殖曲線の傾き（腫瘍体積対観察日）が対照群と処置群とで有意に異なるかどうかを試験した。全ての場合において、ｐ<０．０５の値は統計的に有意であると見なされた。
【００６４】
結果
ＰＢＴ療法は腫瘍の増殖と進行を減少させる
ポリアミン遮断療法（ＰＢＴ）の効果を評価するために、Ｂ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ黒色腫モデルを使用した。Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおいて、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドを発現するＢ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ細胞を皮下注射した後、腫瘍の大きさが５０〜１００ｍｍ３になったときに治療を開始した。マウスに三量体ＰＴＩ（Ｎ１、Ｎ１’、Ｎ１"−（ベンゼン−１，３，５−トリイルトリス（メチレン））トリス（Ｎ４−（４−（メチルアミノ）ブチル）ブタン−１，４−ジアミン）（腹腔内注射、１日３ｍｇ／ｋｇ）を、飲料水中の０．２５％α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ、ＯＤＣ阻害剤）（ｗ／ｖ）の有無にかかわらず、投与した。ＤＦＭＯまたは三量体ＰＴＩのいずれかによる治療は、ビヒクル処置と比較して、Ｂ１６Ｆ１０−ｓＴＡＣ腫瘍増殖を個々にわずかに減少させた（図１Ａおよび１Ｂ）。しかしながら、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの両方で治療したマウスでは、ビヒクル処置マウスと比較して最終腫瘍重量が４分の１に減少し、腫瘍増殖に対して有意な抑制効果があった。ＤＦＭＯを含むまたは含まない三量体ＰＴＩによる治療は、脾臓重量に有意な影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。腫瘍中のポリアミン含有量の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンを含む全てのポリアミンが、腫瘍を持たない皮膚と比較して腫瘍中で上昇していることを示した。三量体ＰＴＩ単独での治療はポリアミンレベルに識別可能な効果を及ぼさなかったにもかかわらず、ＤＦＭＯ単独での治療はビヒクル処置マウスと比較してプトレシンのレベルを減少させた（図１Ｄ）。しかしながら、ＤＦＭＯと三量体ＰＴＩの両方との同時処置は、ビヒクル処置マウスと比較して腫瘍中のプトレシンおよびスペルミジンの両方のレベルを有意に減少させた（図１Ｄ）。質量分析により、三量体ＰＴＩが周囲の非腫瘍担持皮膚で検出されたレベルと比較して、ＰＢＴ処置マウスの腫瘍（３０フォールド）に優先的に蓄積することが実証された（図１Ｅ）。
【００６５】
ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩで治療したマウスにおける腫瘍増殖の減少は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドによる生体外刺激後のＥＬＩＳポットアッセイによって測定されるように、腫瘍におけるＦ４／８０陽性マクロファージの数の増加（図２Ｂ）と同様に、ＩＦＮ−γ産生脾細胞数の有意な増加と関連していた（図２Ａ）。ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩで同時処置したマウスの腫瘍におけるＦ４／８０陽性マクロファージの増加はまた、ビヒクル処置腫瘍で内部に見られるように、腫瘍の末梢からのマクロファージの移動と関連していた（図２Ｃおよび２Ｄ）。マクロファージの腫瘍浸潤の増加は、単球／マクロファージの遊走および浸潤を調節する重要なケモカインの１つである単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含む炎症誘発性サイトカインのレベルの増加と相関していた。ＤＦＭＯまたは三量体ＰＴＩによる処置は、ビヒクル処置マウスと比較して、サイトカインレベルを個々に有意に変化させなかった（図３）。しかしながら、ＤＦＭＯと三量体ＰＴＩの同時処置は、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、およびＭＣＰ−１のレベル、すなわち腫瘍および腫瘍微小環境における免疫活性の増加に関連するサイトカインを有意に増加させた。
【００６６】
ＰＢＴの抗腫瘍効果は宿主の免疫プロセスに依存する
ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩで同時処置したマウスにおける腫瘍増殖の減少は、ＥＬＩＳポットアッセイによって測定されるＴ細胞ＩＦＮ−γ産生の増加、ならびにＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−γのレベルの増加と関連していたため、ＰＢＴ抗腫瘍形成特性は宿主免疫系の能力に依存し得ると仮定した。これを試験するために、皮下ＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌腫腫瘍を有するマウスを抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体で処理して、ＰＢＴによる治療の前およびその間にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。予想通り、抗ＣＤ４／ＣＤ８抗体で処置したマウスの腫瘍は、ビヒクル処置マウスと比較して速い速度で成長した（図４Ａ）。ＰＢＴ処置は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の全相補体を有するマウスにおいてＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍増殖を有意に減少させたが（図４Ａおよび４Ｂ）、抗ＣＤ４／ＣＤ８抗体を受けたマウスにおける腫瘍増殖に対して、ＰＢＴ処置は有意な阻害効果を示さなかった（図４Ａ）。ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍担持マウスの脾臓重量は、ＰＢＴ処置マウスおよび腫瘍なしのマウスと比較して有意に高かった（図４Ｃ）。
【００６７】
ＰＢＴ治療は、Ｔエフェクター細胞インターフェロン−γおよびグランザイムＢ産生を増加させながら、サプレッサー細胞および前腫瘍形成性細胞の特定の部分母集団を減少させる。
【００６８】
ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍における免疫細胞浸潤の部分母集団は、不連続パーコール勾配を用いて腫瘍白血球を単離した後にフローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＴによる処置は、多くの異なる腫瘍型に見られる主要な免疫抑制細胞型である、Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇｓ）の集団を有意に減少させた（図５Ａ）。ＰＢＴ処置はまた、広範囲の腫瘍における腫瘍増殖を支持しそして促進することが示されているＦ４／８０＋ＣＤ２０６＋Ｍ２マクロファージのレベルを有意に減少させた。ビヒクルマウスおよびＰＢＴ処置マウスからの脾細胞のＦＡＣＳ分析においても同様の変化が見られた。ＰＢＴによる処置は、Ｍ２マクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）、ＭＤＳＣ（アルギナーゼ＋／Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）集団ならびに全体的なアルギナーゼ＋ＣＤ４５＋白血球を有意に減少させた（図５Ｂ）。ＰＢＴ処理は腫瘍に浸潤した免疫抑制性および前腫瘍形成性白血球のレベルを減少させたが、それはまた腫瘍細胞を直接殺す原因となる免疫細胞であるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージを有意に増加させた（図５Ａ）。腫瘍に浸潤しているＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞をさらに特徴付けるために、細胞傷害性Ｔ細胞から放出されて免疫系を刺激し、標的細胞においてアポトーシスを活発に誘導するタンパク質であるＩＦＮ−γおよびグランザイムＢの細胞内レベルをそれぞれ分析した。ビヒクル処置マウスと比較して、ＰＢＴでの処置は、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを１．３±０．３％から１８．８±６．６％に有意に増加させ（図６Ａおよび６Ｂ）、一方、ビヒクル処置マウスにおいては、グランザイムＢを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞産生のパーセンテージを１．０±０．３％から１５．２±５．４％まで増加させた（図６Ａおよび６Ｃ）。腫瘍から単離した浸潤白血球もまた、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳポットアッセイでアッセイした。ＰＢＴによる処理は、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍特異性ＬａｃＺペプチドによる生体外刺激後のＩＦＮ−γ産生単離浸潤白血球数の有意な増加と関連していた（図６Ｄ）。
【００６９】
ＰＢＴによる治療は細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させながらＭＤＳＣおよびＴｒｅｇを有意に減少させたので、ＰＢＴ治療は抑制細胞集団に直接影響を及ぼし、その後ＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制およびＴ細胞活性の増加を減少させると仮定された（ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳポットアッセイによって見られるように）。この仮説を検証するために、ＭＤＳＣを、ビヒクルコントロールで処理した、またはＰＢＴで処理したＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍担持マウスから単離し、その後、屠殺する１週間前に、ＭＤＳＣをレシピエントＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍担持マウスに養子移入した（図７Ａ）。ビヒクル処置マウスからＰＢＴで処置されたレシピエント腫瘍担持マウスへのＭＤＳＣの単回養子移入は、抗原特異的Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答のＰＢＴ誘発性増加を鈍くした（図７Ｂ）。しかしながら、ＰＢＴで処置したレシピエント腫瘍保有マウスへの、腫瘍を有するＰＢＴ処置マウスから単離したＭＤＳＣの養子移入は、ＭＤＳＣ養子移入を受けなかったＰＢＴ処置マウスで見られたものと比較して、腫瘍特異的Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生の有意な減少をもたらさなかった。これらのデータは、ＰＢＴ処置がＭＤＳＣを修飾または変更してそれらの免疫抑制性を低下させたことを示している。総合的にこれらの結果は、ＤＦＭＯと三量体ＰＴＩとの同時処理が、免疫抑制性腫瘍微小環境を逆転させることによって、複数の腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を有意に阻害することを示している。
【００７０】
ポリアミンの必要性の増大は、タンパク質翻訳の劇的な増加によるバイオマスの提供および腫瘍細胞の生存経路への寄与の両方において、腫瘍における発癌活性にとって不可欠である。腫瘍における細胞内ポリアミンレベルの上昇は、ポリアミン生合成酵素および輸入経路の誘導によって達成される。ＤＦＭＯなどのポリアミン生合成阻害剤の存在下では、多くの腫瘍型がＰＴＳ活性を上方制御するので、ポリアミン輸送阻害剤の開発は重要である。本明細書では、ＤＦＭＯと新規の三量体ＰＴＩとの併用ＰＢＴ治療が細胞内腫瘍ポリアミンレベルを有意に低下させ、その結果、動物の腫瘍増殖が低下することが示されている。重要なことに、これらの結果は、ＰＢＴが腫瘍微小環境を再調整することによって腫瘍誘発性免疫抑制を元に戻す代謝拮抗治療であることを実証している。実際、腫瘍骨髄抑制細胞集団のＰＢＴ減少および抗腫瘍免疫応答の活性化は、それがＴ細胞を欠くマウスにおいて腫瘍増殖を減少させることができないので、その抗腫瘍効力にとって重要である。
【００７１】
ポリアミンは、特にそれらが高濃度で見出される腫瘍微小環境において、免疫応答の重要なモジュレーターである。スペルミンは、インビトロで刺激されたマクロファージによって、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、およびＭＩＰ−１ｂの産生を阻害し（Ｈａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｈｏｃｋ  １４：１４４−９；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，２８：Ｎ６０−６）、そして局所および全身性炎症反応を減弱させることにより致死的敗血症から保護する（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１５：２７５−８２）。インビトロ研究はまた、ポリアミンがリンパ球増殖を抑制し、マクロファージ殺腫瘍活性および好中球運動性を低下させ、そしてＩＬ−１２依存性ＮＫ細胞活性を低下させることを示した（Ｌａｂｉｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：２６６−９；Ｆｅｒｒａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，８：４１１−７；Ｃｈａｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６：３６５−７０；Ｃｈａｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：１０２７−３３；Ｓｏｄａ，Ｋ．（２０１１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３０：１−９）。ＰＢＴ処置マウスの腫瘍において有意に上昇したＩＬ−１０レベルが観察された。ＩＬ−１０は、状況に応じて腫瘍プロモーターおよび腫瘍進行の阻害剤の両方として特徴付けられている非常に多面的なサイトカインである。複数の研究が、おそらくＩＬ−１０の免疫抑制特性に起因する、ＩＬ−１０レベルと黒色腫における予後不良との間の正の相関を見出した（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，３６７：１０３−７）。しかしながら、ＩＬ−１０は強力な抗腫瘍効果を有することが見出された。ＩＬ−１０の静脈内投与は、常在ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖により移植腫瘍の拒絶をもたらす（Ｅｍｍｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７２：３５７０−８１）。ＩＬ−１０を投与されたマウスにおける腫瘍浸潤性細胞傷害性白血球の３倍の増加とともにＩＦＮ−γおよびグランザイムＢの発現の増加も観察されている（Ｅｍｍｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７２：３５７０−８１）。本明細書では、ＤＦＭＯ単独または三量体単独による処置は、腫瘍増殖を有意に阻害するのに十分ではなかった。しかしながら、ポリアミン生合成およびポリアミン細胞取り込みの両方をＰＢＴで遮断することは、腫瘍ポリアミンレベルを低下させ、腫瘍増殖を有意に低下させるだけでなく、抗腫瘍免疫応答も増強した。Ｂ１６Ｆ１０またはＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するマウスでは、ＰＢＴ処置マウスからの脾細胞は、ＤＦＭＯまたは三量体単独で処置した腫瘍担持マウスには存在しなかった腫瘍特異的ＩＦＮ−γ発現の有意な増加を示した。データは、ＰＢＴの抗腫瘍効果がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が抗体枯渇したマウスにおいて失われたので、ＰＢＴがＴ細胞依存性である抗腫瘍免疫効果を刺激することを示す。��ＢＴ抗腫瘍活性は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加およびＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、およびＣＤ２０６＋Ｆ４／８０＋Ｍ２マクロファージを含む免疫抑制性腫瘍浸潤細胞の減少を伴った。ＰＢＴ併用治療の抗腫瘍活性は、それらが生存のために必要とするポリアミンのポリアミン中毒性腫瘍を奪い、そしてまた腫瘍微小環境におけるポリアミン媒介免疫抑制を軽減する。
【００７２】
三量体ＰＴＩは、ＰＴＳの細胞表面受容体（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン）への結合について天然ポリアミンを凌駕するＰＴＳの競合的阻害剤である（Ｐｈａｎｓｔｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３３：３０５−１３；Ｐｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４２：７１１−２３）。正常細胞は、十分なレベルのポリアミンを合成することができ、ポリアミンをはるかに必要とする腫瘍細胞と比較して非常に低いＰＴＳ活性を有する。質量分析は、腫瘍細胞における高いＰＴＳ活性が、正常組織と比較して腫瘍における三量体ＰＴＩのより高い蓄積をもたらし、それ故、腫瘍におけるポリアミンレベルをより明確に減少させながら、非腫瘍組織における毒性を減少させることを示す。他のポリアミン系のＰＴＩ、ＡＭＸＴ１５０１もまた、ＤＦＭＯと組み合わせたときに抗腫瘍効果を有することが示されている（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２：２７４−８５）。しかしながら、ＡＭＸＴ１５０１の親油性直鎖パルミチン酸−リジン−スペルミン構造の設計は、三量体ＰＴＩの１，３，５−トリ−置換ベンゼンとは異なる（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７：３４８−６３）。例えば、三量体ＰＴＩは、より水溶性であり、経口投与可能であり、そしてＡＭＸＴ１５０１によって提示されるＮ１−アシル化スペルミンモチーフと比較して３つのホモスペルミジン「メッセージ」を受容体に提示する（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７：３４８−６３）。ＡＭＸＴ１５０１のＮ１−位がＮ−アシル化されているので、この設計はスペルミン頭部基を修飾Ｎ−アルキル化スペルミジンモチーフに変換する。三量体ＰＴＩ中のホモスペルミジンモチーフは、活性ポリアミン輸送で細胞を選択的に標的化するという点で、ＡＭＸＴ１５０１で利用可能なスペルミジンテールより優れていることがインビトロで示されている（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７：３４８−６３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４６：２６６３−７１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４６：２６７２−８２）。両方のＰＴＩアプローチには利点があるが、三量体ＰＴＩの末端第一級アミンのＮ−メチル化は、アミンオキシダーゼに対するさらなる代謝安定性を提供し（Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１：２５５１−６０）、血液および組織分析は、脱メチル化によるその代謝がさらに強力なＰＴＩを作り出すことを明らかにした（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７：３４８−６３）。要約すると、三量体ＰＴＩは、低毒性、高効力、改善されたターゲティング、および代謝安定性のバランスのとれた特性を持っている。
【００７３】
腫瘍免疫応答のＰＢＴ活性化は、Ｔ細胞腫瘍浸潤物に対する直接活性化効果、ならびにＴ細胞活性化を抑制する骨髄細胞部分母集団に対する間接的阻害効果によるものであり得る。ＭＤＳＣ、Ｍ２マクロファージ、およびＴｒｅｇ集団を含む様々な腫瘍浸潤性免疫抑制性骨髄性集団が、細胞傷害性Ｔ細胞活性を抑制することが示されている。データは、ＰＢＴが腫瘍に浸潤する多数の免疫抑制性骨髄細胞集団のレベルを減少させることを示している。対照的に、別の研究では、短期間の培養におけるＭＤＳＣのＤＦＭＯ処理はアルギナーゼ依存的にＴ細胞増殖の抑制を阻害したが、高用量のＤＦＭＯ単独での処理は担癌マウスにおけるＭＤＳＣ蓄積を減少させなかった（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９６：９１５−２３）。したがって、ＤＦＭＯおよび三量体ＰＴＩの両方を用いたポリアミン枯渇は、担癌動物におけるＭＤＳＣ蓄積を減少させると思われる。これは、ＭＤＳＣの養子移入がＰＢＴ処置腫瘍担持マウスにおいて刺激された腫瘍特異的Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生を減少させることを示す実験データによりさらに補強されている。しかしながら、ＰＢＴ処置マウスからのＭＤＳＣの養子移入は、この腫瘍特異的Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生を有意に減少させず、ポリアミン生合成および生体内輸送の両方を阻止することはＭＤＳＣの蓄積および免疫抑制機能を損なうことを示す。骨髄性免疫抑制活性に対するＰＢＴ媒介阻害効果の分子基盤はまだ決定されていないが、ＤＦＭＯはマクロファージにおけるアルギナーゼ活性のＩＬ−４誘導を遮断し（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ。Ｒｅｓ．，２：２７４−８５）、アルギナーゼ活性を低下させることによってＭＤＳＣの免疫抑制活性を損なう（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９６：９１５−２３）。ＰＢＴは、免疫抑制性骨髄性細胞においてだけでなく、ポリアミンレベルが上昇した腫瘍上皮細胞においても誘導されるアルギナーゼ活性を低下させる（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２：２７４−８５）。さらに、ＭＤＳＣによって放出されたポリアミンは、樹状細胞にインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）依存性の免疫抑制表現型を付与することができる（Ｍｏｎｄａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４６：２３３−４４）。したがって、ＰＢＴは、腫瘍上皮細胞ならびに免疫抑制性腫瘍関連細胞集団の両方の代謝に影響を及ぼす複数のメカニズムを介して抗腫瘍免疫応答を活性化する可能性が高い。
【００７４】
これらのデータは、ＤＦＭＯと三量体ＰＴＩの両方との併用治療が、ポリアミン中毒の腫瘍細胞からポリアミンを奪うだけでなく、腫瘍の微小環境におけるポリアミン媒介免疫抑制を軽減し、したがって殺腫瘍性Ｔ細胞の活性化を可能にすることを示す。ポリアミンの腫瘍合成および放出は、腫瘍の免疫編集および腫瘍微小環境における免疫抑制細胞の選択に寄与する。このポリアミン遮断療法は、従来の化学療法剤による、および腫瘍免疫療法による抗腫瘍免疫応答の刺激における補助的な癌治療として使用することができる。
【００７５】
実施例２
黒色腫は、転移期の予後不良を伴う非常に攻撃的な腫瘍である。複数の発癌性変異（ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴを含む）がこの非常に不均一な疾患を引き起こし、ＢＲＡＦ変異は全黒色腫腫瘍の半分で検出されている（Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１７（６８９２）：９４９−９５４）。転移性黒色腫の治療は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の構成的活性化を促進し、無制御増殖を促進する、非常に一般的なＢＲＡＦ突然変異の発見により、過去１０年間にわたって革命を起こした（Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１７（６８９２）：９４９−９５４）。報告されたＢＲＡＦ変異の９０％は、アミノ酸６００でバリンをグルタミン酸に置換する（Ｖ６００Ｅ変異）（Ｓｏｌｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６４（８）：７７２−７７４；Ｈａｑ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．，２６（４）：４６４−４６９）。その後のＶ６００Ｅ変異型ＢＲＡＦタンパク質の選択的阻害剤（ベムラフェニブおよびダブラフェニブ）の急速な開発は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する黒色腫患者の治療における大きな進歩を実証した。しかしながら、ほぼ１００％の患者が、ＢＲＡＦ阻害剤での治療後７ヶ月以内に疾患の進行を示す（Ｆｌａｈｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６３（９）：８０９−８１９；Ｓｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６６（８）：７０７−７１４；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ  ３８０（９８３９）：３５８−３６５）。したがって、これらの阻害剤に対する獲得耐性を克服するための新しい方法は、黒色腫患者の生存率を高めるために緊急に必要とされている。
【００７６】
代替的なアプローチは、癌遺伝子中毒性腫瘍細胞の生存に不可欠である下流経路を標的とすることである。癌遺伝子は確かに増殖を促進するが、それらは下流のエフェクター分子を介して促進する。例えば、ＥＲＫシグナル伝達の下流には、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）転写およびポリアミン生合成の公知の調節因子であるｃ−ＭＹＣがある（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０（１６）：７８０４−７８０８）。天然ポリアミン（プトレシン、スペルミジンおよびスペルミン）は、細胞増殖、分化、クロマチンリモデリング、真核生物開始因子−５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）およびアポトーシスを含む広範な生物学的プロセスに関与しているアミノ酸由来ポリカチオンである（Ｃａｓｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，６（５）：３７３−３９０）。ポリアミン輸送系（ＰＴＳ）を活性化することによるポリアミンの細胞取り込み（Ｐｏｕｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ａｍｉｎｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ４２（２−３）：７１１−７２３；Ｂａｃｈｒａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１（３）：１２０５−１２０８；Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７（１）：２６４−２７０；Ｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，４７（７）：５３８−５５３）と同様に、複数の癌遺伝子（ｃ−ＭＹＣおよびＲＡＳ）が重要なポリアミン生合成酵素を上方制御することが知られている（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０（１６）：７８０４−７８０８；Ｆｏｒｓｈｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，３（２）：１４０−１４７；Ｏｒｉｇａｎｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７（１０）：４８３４−４８４２）。正常細胞と比較して、腫瘍細胞は高レベルのポリアミンを含むことが示されている（Ｐｅｇｇ，ＡＥ（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８：７５９−７７４；Ｔａｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：７４９−７９０；Ｐｅｇｇ，Ａ．Ｅ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３４：２４９−２６２；Ｇｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４（１０）：７８１−７９２）。これらの細胞内ポリアミンレベルは、厳密に調節された生合成経路、異化経路、および取り込み経路および搬出経路を介して維持される（Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｊ．，３７６（Ｐｔ  １）：１−１４）。ポリアミン取り込みは、正常細胞と比較した場合、多くの腫瘍型、特に黒色腫腫瘍細胞において上方制御されている（Ｐｏｕｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４２（２−３）：７１１−７２３；Ｓｅｉｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２８（８）：８４３−８６１）。このように、悪性黒色腫腫瘍細胞は複数の発癌性突然変異を多く含むこ��で知られているが、それらの増加した代謝要求を満たすためには正常細胞と比較してポリアミンの必要性が非常に高い（Ｓｅｉｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２８（８）：８４３−８６１）。
【００７７】
したがって、黒色腫細胞における癌遺伝子誘導ポリアミン輸送活性は、新規なアリールメチル−ポリアミン（ＡＰ）化合物を用いてＰＴＳを選択的に標的化することによって利用することができた（Ｍｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。ナフチルコアを前提としたＡＰの２−アーム型設計は、ＰＴＳ超選択性および高い効力を提供する（Ｍｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。外因性ポリアミンおよびポリアミン系薬剤の両方が、特異的取り込み系を介して腫瘍に取り込まれる（Ｃａｓｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，６（５）：３７３−３９０；Ｍｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８；Ｃａｓｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，６（５）：３７３−３９０）。ここで、ポリアミンの取り込みがＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞において増加すること、そしてＡＰ処理がＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞と比較してＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞において細胞死を有意に増加させることが示される。さらに、黒色腫腫瘍スフェロイド培養物におけるＢＲＡＦ阻害剤耐性は、ＡＰによる治療によって克服することができることが示されている。これらの研究は、ＢＲＡＦ阻害剤に対する黒色腫腫瘍細胞の感受性を回復するためのより効果的な治療戦略を開発するための貴重な洞察を提供する。要するに、ＢＲＡＦ駆動型ポリアミン依存症は、高いポリアミン輸入活性を有する黒色腫細胞を選択的に標的とする細胞傷害性ポリアミン化合物によって標的とされ得る。
【００７８】
材料および方法
細胞株と試薬
ＷＭ９８３Ｂ、ＷＭ９８３Ｂ−ＢＲ、ＷＭ３７４３、およびＷＭ３２１１を含むすべてのヒト黒色腫細胞株は、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。これらの細胞を、２％ウシ胎児血清および２ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２を添加したＭＣＤＢ１５３（Ｓｉｇｍａ）／Ｌｅｉｖｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５（Ｃｅｌｌｇｒｏ）培地（４：１の比率）中で維持した。Ｂ１６Ｆ１０細胞をＡＴＣＣから入手し、そして１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。ＹＵＭＭ１．７細胞系（Ｙａｌｅ大学、ニューヘブン、コネチカット州）を、１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で維持した。ＰＬＸ４７２０（Ｓ１１５２；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、ＰＬＸ４０３２／Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂに関連するツール化合物）をＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製し、−２０℃で保存した。
【００７９】
ＡＰ化合物の合成は記載の通りである（Ｍｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。化合物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して初期ストック（１０ｍＭ）を提供し、これを０．２μｍフィルターに通して濾過して無菌性を確実にした。続いてＰＢＳで希釈して所望のストック溶液を生成した。ＡＰの構造：
【化５】
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【００８０】
３Ｄスフェロイド培養
無機ナノスケール足場ナノカルチャープレート（ＮＣＰ）はＳＣＩＶＡＸから購入した。各ＮＣＰの基部は、ナノスケールの凹んだパターンを有する透明なシクロオレフィン樹脂シートで構成されている。スフェロイドを形成するために、１２０５Ｌｕヒト黒色腫細胞を、２％の熱不活性化ウシ胎児血清および２ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加したＭＣＤＢ１５３（Ｓｉｇｍａ）／Ｌｅｉｖｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５（Ｃｅｌｌｇｒｏ）培地中に１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルＮＣＰに播種し、５％ＣＯ２および正常なＯ２レベルの雰囲気下、３７℃で従来の細胞培養器でインキュベートした。細胞がＮＣＰ上に播種された後３日目に目に見えるスフェロイドが形成し始めたとき、ＰＬＸ４７２０および／またはＡＰによる処理を開始した。４８時間の薬剤処理後、スフェロイド培養物を細胞生存率についてアッセイした。
【００８１】
細胞生存率アッセイ
細胞増殖アッセイは、２５〜３０％の開始コンフルエントで９６ウェルプレート中で行われ、１ｍＭのＤＦＭＯの存在下または非存在下で、漸増濃度のＰＬＸ４７２０またはＡＰへの７２時間の曝露の影響を決定した。細胞生存率は、ＷＳＴ−８がホルマザン色素に対する生細胞の代謝活性によって低下するＥＺＱｕａｎｔ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｌｓｔｅｍ）を用いて評価した。Ｘ４７２０および／またはＡＰで処理されたスフェロイドについて、スフェロイド細胞の生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して存在するＡＴＰの定量化によって推定された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ５；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）における阻害率対阻害剤濃度の対数のプロットの非線形回帰（シグモイド用量反応）を用いてＡＰの７２時間ＩＣ５０値を計算した。
【００８２】
放射性標識スペルミジン輸送アッセイ
腫瘍細胞におけるポリアミン輸送を、本質的に記載のように評価した（Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５５（２）：３９９−４０７；Ｎｉｌｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７（５）：４３３−４４４）。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒからの放射性スペルミジン（Ｎｅｔ−５２２スペルミジン三塩酸塩，［末端メチレン−３Ｈ（ｎ）］）を使用した（比放射能：１６．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。細胞を９６ウェルプレートに播種し、そして約８０％コンフルエントまで増殖させた。細胞の半分を１ｍＭのＤＦＭＯで４０時間処理した。ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、３Ｈ−スペルミジンを１μＭで加え、３７℃で６０分間インキュベートした。次に細胞を５０μＭのスペルミジンを含む冷ＰＢＳで洗浄し、混合しながら３７℃で３０分間０．１％ＳＤＳに溶解した。次いで、シンチレーション計数およびｍｉｎｉ−ＢｉｏＲａｄアッセイを用いたタンパク質アッセイのために細胞溶解物を等分した。結果はＣＰＭ／μｇタンパク質として表した。
【００８３】
統計分析
全てのインビトロ実験は少なくとも三重に行われ、そしてデータは２〜３回の別々の実験からまとめられた。統計的有意性についてのテューキー検定またはスチューデントt検定によって、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて分析を行った。全ての場合において、ｐ<０．０５の値は統計的に有意であると見なされた。
【００８４】
結果
異なるＢＲＡＦ突然変異状態を有するヒト黒色腫細胞株のパネルを、ＢＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０に対するそれらの感受性についてスクリーニングした。ＷＭ９８３Ｂ、ＷＭ３７３４、１２０５Ｌｕ、ＷＭ９８９、およびＷＭ８８を含む変異型ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞は、ＰＬＸ４７２０に対して著明な感受性を示した（ＩＣ５０値≦３．０μＭ）。一方、ＷＭ３４５１、ＷＭ３７４３、およびＷＭ３２１１を含むＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞は、ＰＬＸ４７２０による治療に対する相対的耐性を示した（ＩＣ５０>３．０μＭ）（Ｓｃｈａｙｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，７（１２）：ｅ５２７６０）。ＩＣ５０値は、未処理対照と比較して５０％の細胞生存率を阻害するのに必要な化合物（ＰＬＸ４７２０）の濃度として定義される。このアプローチは、ＰＬＸ４７２０  ＢＲＡＦ阻害剤に対する各細胞株の相対感度の順位付けを可能にした。したがって、ＰＬＸ４７２０によるＢＲＡＦ阻害に対するこれらのＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞の感受性は、それらの増殖および生存能力を維持するための変異型ＢＲＡＦシグナル伝達に対するそれらの機能的依存性を反映していた。同様に、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞が、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞と比較して、細胞毒性ポリアミン輸送リガンドＡＰの濃度を増加させることに対してより敏感であるかどうかを試験した。
【００８５】
【表１】
2020500939.tif 000007
【００８６】
表１は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞が、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞（ＩＣ５０>４．０μＭ）よりもＡＰに対して高い感受性（ＩＣ５０<２．５μＭ）を示したことを示す。この観察結果は、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞と比較してＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞におけるより大きなポリアミン輸送活性によって反映された（図８Ａおよび表１）。ＡＰは、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞（ＷＭ３７４３など）と比較してより高いポリアミン輸送速度を有するＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞（ＷＭ９８３Ｂなど）においてより速い速度で蓄積したので、ＷＭ９８３Ｂ細胞は、ＷＭ３７４３細胞よりもＡＰ曝露に対してより感受性が高かった（図８Ｂ）。まとめると、高いポリアミン輸入活性を有する細胞株は、細胞傷害性ポリアミン化合物に対してより感受性が高かった。
【００８７】
ポリアミン生合成の阻害剤を用いてポリアミンの細胞内レベルを低下させると、細胞外ポリアミンならびに外因性ポリアミン類似体の取り込みを増加させることができることはよく知られている（Ｓｅｉｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８（８）：８４３−８６１；Ａｌｈｏｎｅｎ−Ｈｏｎｇｉｓｔｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９２（３）：９４１−９４５）。ＷＭ９８３ＢおよびＷＭ３７４３黒色腫細胞を、それらのポリアミン輸送活性を測定する前に、１ｍＭのα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、ＯＤＣの阻害剤、ポリアミン生合成における最初の律速酵素で４０時間前処理した。図８Ａは、ＤＦＭＯ処理がＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＷＭ９８３Ｂ黒色腫細胞においてポリアミン輸送活性を劇的に増加させたが、ＢＲＡＦＷＴ  ＷＭ３７４３黒色腫細胞においては増加させなかったことを示す。一般に、ＤＦＭＯ処理によるポリアミン枯渇は、表１に示されるＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞と比較して、スクリーニングされたヒトＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞においてより多くのポリアミン取り込みを増強した。ＤＦＭＯ処理はポリアミン輸送活性を増加させるので、ＡＰおよびＤＦＭＯとの同時処理がＡＰに対する黒色腫細胞の感受性を増加させるかどうかを試験した。図８Ｃは、ＷＭ９８３Ｂ黒色腫細胞が、ＡＰ単独（ＩＣ５０＝２．３μＭ）と比較して、ＤＦＭＯ（ＩＣ５０＝０．７μＭ）と同時処理した場合に、ＡＰ処理に対してより感受性が高いことを示している。対照的に、ＡＰに対する感受性は、ＤＦＭＯで同時処理されたＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞では増加したが、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞では増加しなかった（表１）。これらのデータは、ヒトＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞が、ＢＲＡＦＷＴ黒色腫細胞と比較してより大きなポリアミン輸送活性およびＡＰに対する増大した感受性を示し、そしてそれらの感受性がＤＦＭＯによるポリアミン生合成の阻害によって増大され得ることを示す。
【００８８】
ヒト黒色腫細胞はＢＲＡＦＶ６００Ｅに加えて複数の発癌性突然変異を有するので、ＡＰ細胞毒性およびＰＴＳ活性について、ＢＲＡＦＷＴであるマウスＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株とＢＲＡＦＶ６００Ｅ／ＰＴＥＮｎｕｌｌトランスジェニックマウスで自然発生した黒色腫腫瘍に由来するＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＹＵＭＭ１．７細胞株とを比較した（Ｏｂｅｎａｕｆ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２０（７５４７）：３６８−３７２）。予想通り、ＹＵＭＭ１．７細胞は、Ｂ１６Ｆ１０細胞と比較してより低いＩＣ５０でＰＬＸ４７２０に対して非常に感受性が高かった（図９Ｂ）。さらに、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＹＵＭＭ１．７細胞はＡＰに対して有意により感受性が高く、そしてＢＲＡＦＷＴ  Ｂ１６Ｆ１０細胞と比較してＡＰについてはるかに低いＩＣ５０値を有した（図９Ａ、９Ｂ）。特に、ＤＦＭＯ同時処理はＡＰに対するＹＵＭＭ１．７細胞の感受性を劇的に増加させ、これはＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＹＵＭＭ１．７細胞におけるＰＴＳ活性の顕著なＤＦＭＯ誘導と相関していた（図９Ｃ）。対照的に、ＢＲＡＦＷＴ  Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ＤＦＭＯ処理後のポリアミン取り込みにおいて有意な誘導を示さなかった（図９Ｃ）。しかしながら、変異型ＢＲＡＦＶ６００Ｅタンパク質を発現するようにレトロウイルス感染させたＢ１６Ｆ１０細胞は、ＹＵＭＭ１．７細胞で見られるものと同様のＰＴＳ活性プロファイルを示した。ＹＭＭ１．７細胞で見られたように、ＤＦＭＯ処理は、Ｂ１６Ｆ１０−ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞におけるポリアミン取り込みを増強することが示された（図９Ｄ）。ＡＰはまた、空のプラスミドを発現するレトロウイルスに感染した対照感染Ｂ１６Ｆ１０−ｐＢＡＢＥ細胞（ＩＣ５０＝３６．４μＭ）と比較して、Ｂ１６Ｆ１０−ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞（ＩＣ５０＝２４．４μＭ）においてより細胞傷害性であった。これらのデータは、変異型ＢＲＡＦＶ６００Ｅタンパク質を有する黒色腫細胞は、ＢＲＡＦＷＴタンパク質を有する細胞と比較して、ポリアミン取り込みシステムにより強く依存しており、その結果、ポリアミン輸送系を介して黒色腫細胞に侵入して死滅させるＰＴＳ標的細胞傷害性ＡＰ化合物に対する感受性が高いことを示す。
【００８９】
３Ｄ培養系での細胞増殖は生体内微小環境の代表的なものであることがわかっているため、腫瘍細胞が３Ｄスフェロイドを容易に形成する無機ナノスケール足場ベースのＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅプレート（ＮＣＰ）を用いて１２０５Ｌｕヒト黒色腫細胞を培養した（Ｙｏｓｈｉｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２（２６）：６０５２−６０５８）。これらの腫瘍スフェロイド培養物は周囲空気中で増殖するが、スフェロイド微小環境は低酸素コアを有する腫瘍中のものと非常によく似ており、単層培養物で見られるものと比較して薬剤感受性に対してより関連性がある（Ｙｏｓｈｉｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２（２６）：６０５２−６０５８；Ｙａｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３０（４）：６０１−６１０；Ｈａｙｃｏｃｋ，Ｊ．Ｗ．，３Ｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３Ｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１−１５）。ＮＣＰ上でスフェロイドとして増殖させたＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異型１２０５  Ｌｕ黒色腫細胞は、周囲空気中で２Ｄ単層培養で増殖させた同じ細胞と比較して、ＰＬＸ４７２０（２５μＭ）での４８時間処理に対してより耐性があった（Ｑｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐ．，１５（１０）：２４４２−２４５４）。スフェロイドおよび単層培養物は両方とも、高濃度のＡＰ（２５μＭ）単独での４８時間処理に対して同様に感受性が高かった。１２０５  Ｌｕスフェロイドおよび単層培養物のＰＬＸ４７２０耐性表現型に対するＡＰ処理の効果を試験した。ＰＬＸ４７２０（２５μＭ）およびＡＰ（２５μＭ）の両方の同時処理は、ＰＬＸ４７２０処理単独と比較して細胞生存率のさらなる減少を示さなかった単層培養とは異なり、スフェロイド培養において細胞生存率の劇的な減少をもたらした（図１０）。このように、黒色腫スフェロイド培養物のＰＬＸ４７２０に対する耐性の増加は、ＡＰ同時処理によって排除された。
【００９０】
上記に加えて、生体内でのＡＰの有効性もまた試験された。 図１１に見られるように、ＢＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０の投与は、マウスにおけるＢＲＡＦ変異型黒色腫腫瘍を最初急速に退行させるが、その後再び成長させる。しかしながら、腫瘍が退行したときから始まるＡＰとの同時処理は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性腫瘍の再成長を著しく遅らせる（図１１）。これらのデータは、ＡＰを用いた薬剤送達のためにＰＴＳを利用することが、それらの重要な生存様式の１つを介して変異型ＢＲＡＦ黒色腫腫瘍細胞を攻撃することを示している。
【００９１】
本明細書に提供されるデータは、変異型ＢＲＡＦＶ６００Ｅを発現する黒色腫腫瘍細胞がポリアミン成長因子および非常に上方制御されたポリアミン輸送系（ＰＴＳ）に対する高い需要を示すことを示す。ＰＴＳを薬剤送達に利用して、ＡＰ化合物はその主要な生存様式の１つを介して黒色腫細胞を攻撃する。確かに、ポリアミンは黒色腫の生存に不可欠である。ポリアミンレベルは正常細胞と比較して腫瘍細胞において劇的に上昇し、これはしばしば発癌誘発の結果である（Ｐｏｕｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４２（２−３）：７１１−７２３；Ｓｅｉｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８（８）：８４３−８６１）。ＭＹＣおよびＲＡＳ癌遺伝子はポリアミン生合成を上方制御することができ（Ｆｏｒｓｈｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，３（２）：１４０−１４７；Ｏｒｉｇａｎｔｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７（１０）：４８３４−４８４２）、およびＰＴＳ活性を誘導することによってポリアミンの細胞取り込みを増加させる（Ｂａｃｈｒａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１（３）：１２０５−１２０８；Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７（１）：２６４−２７０；Ｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，４７（７）：５３８−５５３）。黒色腫細胞は複数の発癌性突然変異で有名であるが、全黒色腫腫瘍の半分以上が突然変異ＢＲＡＦタンパク質を発現する（Ｓｅｉｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８（８）：８４３−８６１）。本明細書のデータは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫腫瘍が、正常細胞と比較して、ポリアミンについての代謝需要が非常に高いことを示している。転移性黒色腫細胞におけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ誘導ＰＴＳ活性は、ＡＰを用いてＰＴＳを標的化することによって利用された。
【００９２】
プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンは、細胞増殖、シグナル伝達、遺伝子発現、および腫瘍の生存に寄与する自食作用状態において重要な役割を果たす（Ｃｕｆｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １０（２２）：３８７１−３８８５；Ｍｉｒｚｏｅｖａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８９（９）：８７７−８８９；Ｍｏｒｓｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １４（１１）：２２５１−２２６９；Ｍｏｒｓｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９２（４）：６１５−６２９）。これらの内因性ポリアミンおよびポリアミン系ＡＰは、ＰＴＳを介して腫瘍に取り込まれるために競合する（Ｍｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。しかしながら、ＡＰのようなアリールメチル−ポリアミン薬剤は、それらとＤＮＡとの多重静電相互作用（Ｄａｌｌａｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９（１７）：５１７７−５１８６）およびトポイソメラーゼＩＩ（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２７（１−２）：１６７−７４）を介して細胞毒性効力を高め得る。ＡＰは高いポリアミン輸送速度を有する腫瘍細胞を選択的に標的とするので、正常細胞は低いＰＴＳ活性を有するので、ＡＰに対して有意に感受性が低い（Ｍｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ。Ｃｈｅｍ．，５６（１４）：５８１９−５８２８）。ポリアミン生合成および細胞取り込みは、腫瘍の低酸素領域および腫瘍スフェロイドにおいて誘導される（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（２２）：９２９１−９３０１）。さらに、低酸素中のポリアミンの枯渇はアポトーシスの増加をもたらし（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（２２）：９２９１−９３０１）、ポリアミンが低酸素ストレスおよび活性酸素種に適応する腫瘍細胞の能力において本質的な役割を果たすことを示す。実際、ポリアミンは抗酸化機能を発揮することが知られている（Ｍｏｚｄｚａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３８（１）：６９−８１）。この研究における黒色腫スフェロイド培養物は周囲空気で培養されたが、スフェロイドの中心にある細胞は低酸素性であることはよく文書化されており、したがって低酸素領域をしばしば含む生体内黒色腫腫瘍の不均一３Ｄ構造をモデル化する（Ｙｏｓｈｉｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２（２６）：６０５２−６０５８；Ｑｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，１５（１０）：２４４２−２４５４）。固形腫瘍は、細胞生存、腫瘍血管形成、および転移を促進する低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を介して低酸素ストレス応答を活性化することによって腫瘍進行に寄与する血管新生が不十分な低酸素領域を含む（Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０９２）：４３７−４４３；Ｋｅｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １２���（３）：４６５−４７２）。低酸素腫瘍細胞およびスフェロイド培養物は、ＢＲＡＦ阻害剤を含む化学療法に対してより耐性がある（Ｑｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，１５（１０）：２４４２−２４５４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．，３（１２）：１３７８−１３９３；Ｐｕｃｃｉａｌｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｐｔｓ．，１３（４）：３２８１−３２８８）。同様に、ＮＣＰ上でスフェロイドとして増殖した１２０５Ｌｕ黒色腫細胞の３Ｄ培養物は、周囲空気中で２Ｄ単層培養物中において増殖した１２０５Ｌｕ細胞と比較して、ＰＬＸ４７２０処理に対してより耐性がある。ポリアミン取り込みが腫瘍スフェロイドの低酸素領域で誘導されることを知っているので、ＰＴＳリガンドＡＰでの処理はＰＬＸ４７２０に対する１２０５Ｌｕスフェロイド細胞の感受性を増加させる。実際、黒色腫スフェロイドのＰＬＸ４７２０に対する耐性の増加はＡＰ同時処理で克服された。
【００９３】
ＰＬＸ４７２０などのＢＲＡＦ阻害剤での治療は、ＪＡＲＩＤ１Ｂおよびスフェロイド形成を含む幹細胞マーカーを特徴とする黒色腫細胞の緩徐周期性癌幹細胞様（ＣＳＣ）部分母集団を富化する（Ｒｏｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４１（４）：５８３−５９４；Ｒｏｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２３（６）：８１１−８２５）。癌幹細胞集団は低酸素微小環境に存在すると考えられている（Ｓｃｈｗａｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４（１）：Ｒ６；Ｍａｔｈｉｅｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７１（１３）：４６４０−４６５２；Ｍｏｈｙｅｌｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７（２）：１５０−１６１）。内因性ＲＯＳレベルは、ミトコンドリア呼吸の増加および酸化的リン酸化の結果として、低速周期のＪＡＲＩＤ１Ｂｈｉｇｈ黒色腫細胞において増加する（Ｒｏｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２３（６）：８１１−８２５）。この高い酸素消費量は、ＪＡＲＩＤ１Ｂｈｉｇｈ低速循環ＣＳＣ様表現型を支持することが示されている低酸素状態に寄与する（Ｒｏｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４１（４）：５８３−５９４）。ＪＡＲＩＤ１Ｂ−プロモーター−ＥＧＦＰ−レポーター構築物で安定的に形質導入された１２０５Ｌｕ黒色腫細胞を使用すると（Ｒｏｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４１（４）：５８３−５９４）、ＰＬＸ４７２０への２日間の短い曝露がスフェロイドとして増殖した１２０５Ｌｕ黒色腫細胞を発現するＪＡＲＩＤ１Ｂ駆動ＧＦＰの４倍濃縮をもたらすことが見出された。本明細書中に提供されるデータは、ＰＬＸ４７２０耐性黒色腫スフェロイドがＡＰとの同時処理によりＰＬＸ４７２０に対してより感受性になり、そしてＡＰはおそらくＰＬＸ４７２０耐性黒色腫スフェロイドに富むＣＳＣ部分母集団を標的とすることを示す。
【００９４】
ポリアミンはまた、自食作用状態を誘導することによって腫瘍の生存に寄与し得る（Ｃｕｆｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １０（２２）：３８７１−３８８５；Ｍｉｒｚｏｅｖａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８９（９）：８７７−８８９；Ｍｏｒｓｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １４（１１）：２２５１−２２６９；Ｍｏｒｓｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９２（４）：６１５−６２９）。例えば、スペルミジンは、酵母細胞、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、およびヒト腫瘍細胞を含む複数の系において自食作用を誘導すること（Ｍｏｒｓｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９２（４）：６１５−６２９；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１（１１）：１３０５−１３１４）、および培養中の多能性幹細胞の生存を増加させること（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１））Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  １０（５）：９０８−９１１）が示されている。自食作用は、化学療法および放射線によって攻撃されたときに腫瘍が経験する一般的な生存過程として最近浮上した（Ｓｔｒｏｈｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４（７）：７６６−７７２）。それは、栄養素欠乏、成長因子の除去、および低酸素などの細胞ストレスによって誘発される（Ｋｒｏｅｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，４０（２）：２８０−２９３）。確立された腫瘍において、自食作用はまた、ＢＲＡＦ阻害剤を含む多くの治療法に対する耐性メカニズムでもある（Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２４（３）：１４０６−１４１７）。ポリアミン取り込みの増加は、ＢＲＡＦ阻害剤による治療を生き残るために自食作用を受けるのに十分なポリアミンを獲得するためのＢＲＡＦｉ耐性黒色腫細胞のためのメカニズムを提供する。
【００９５】
臨床試験では、ＯＤＣ阻害剤ＤＦＭＯの抗腫瘍効果が試験されている。しかしながら、ＤＦＭＯ単独による治療は癌患者の治療において中程度の成功しか示さなかった（Ｓｅｉｌｅｒ，Ｎ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４（７）：５３７−５６４）。その後の研究は、ポリアミン生合成のＤＦＭＯ阻害がＰＴＳ活性の上方制御をもたらし、その結果、食事および腸内細菌叢から腫瘍細胞へのポリアミンの取り込みが増加することを発見した（Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７６（Ｐｔ  １）：１−１４）。本明細書中に提供される知見は、ＤＦＭＯが、変異したＢＲＡＦタンパク質を保有する黒色腫細胞においてＰＴＳ活性を誘導しそしてＡＰ感受性を増加させることを示す。要約すると、ＡＰを用いた治療は、ＤＦＭＯの有無にかかわらず、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫の薬剤耐性を克服するための補助的な癌療法として大きな可能性を秘めている。
【００９６】
実施例３
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１．５×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下注射した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞は、免疫原性が低く、転移性が高く、攻撃的な癌細胞株である。腫瘍が４０〜８０ｍｍ３の大きさになったとき、ＡＰ（式（ＩＩ））処置（腹腔内、隔日で２ｍｇ／ｋｇ）を開始した。一部のマウスには飲料水中の０．２５％ＤＦＭＯ（ｗ／ｖ）も投与した。キャリパーを用いて腫瘍を測定し、１４日間の治療にわたる腫瘍体積を決定した（図１２Ａ）。ビヒクル、ＤＦＭＯ、ＡＰ、またはＡＰ＋ＤＦＭＯで処置したマウスからの脾細胞を、Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋Ｍ２マクロファージについてフローサイトメトリーによって分析した（図１２Ｂ）。サイトカイン分泌を遮断するために、ブレフェルジンＡの存在下で脾細胞をイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）およびＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で４時間処理してＴ細胞を刺激してＩＦＮγを産生させた。細胞をブレフェルジンＡの存在下において抗ＣＤ４抗体で染色し、固定し、透過処理し、そして抗ＩＦＮγ抗体で細胞内染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した（図１２Ｃ）。図１２に見られるように、ＡＰ単独での処置はマウスにおける腫瘍増殖を阻害し、そして腫瘍保有マウスにおいてＩＦＮ−ガンマ−分泌Ｔ細胞を増加させながら、ＣＤ２０６＋Ｆ４／８０＋マクロファージを劇的に減少させる（免疫抑制）。
【００９７】
マクロファージの間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）刺激遊走を阻害する能力もまた、インビトロ走化性アッセイにおいて試験された。具体的には、ＣＸＣＲ４＋ＲＡＷ２４７．６マクロファージ細胞をＳＤＦ−１α単独またはＡＭＤ３１００、ＳＤＦ−１によるＥＲＫ１／２の細胞遊走およびリン酸化を阻害する特異的ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、またはＡＰ（式（ＩＩ））で処理した。図１３に見られるように、ＡＰは、マクロファージの生存率に影響を与えることなく、インビトロ走化性アッセイにおいてＣＸＣＲ４＋マクロファージのＳＤＦ−１刺激遊走を阻害する。
【００９８】
本発明が属する技術水準をより完全に説明するために、いくつかの刊行物および特許文献が前述の明細書に引用されている。これらの引用のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
本発明の特定の好ましい実施形態を上に記載し、具体的に例示はしたが、本発明をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。 添付の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な変更を行うことができる。
【０１００】
【図１Ａ−Ｂ】
2020500939.tif 000016
【図１Ｃ−Ｅ】
2020500939.tif 000017
【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2020500939.tif 000021
【図４Ｂ−Ｃ】
2020500939.tif 000022
【図５Ａ】
2020500939.tif 000023
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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