(57)【要約】  本発明は、架橋したヒアルロン酸（ＨＡ）又はその誘導体若しくは塩を含むヒドロゲルプロドラッグ組成物に関し、この架橋剤系は生分解性スペ−サ−を有し、架橋したＨＡはコンジュゲ−トした薬物−リンカ−を含み、リンカ−は生理的条件下で薬物を放出することができる。本発明はさらに、ヒドロゲルプロドラッグ組成物を調製するための方法に関する。本発明はさらに、ヒドロゲル組成物を用いて目の状態を治療するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヒアルロン酸ポリマ−２Ａ及び複数のヒアルロン酸ポリマ−２Ｂを含む架橋ＨＡ薬物コンジュゲ−トであって：
各２Ａは、本質的に：
2020515545.tif 000097
からなる複数の線形に接続する単位を含み；
各２Ｂは、本質的に：
2020515545.tif 000098
からなる複数の線形に接続する単位を含み；
上式中、
印のない破線は、隣接する単位の＃で印した破線の位置への、又は水素への結合点を示し、
＃で印した破線は、隣接する単位の印のない破線の位置への、又はヒドロキシルへの結合点を示し；
＊で印した破線は、少なくとも一つの２Ａが少なくとも一つの２Ｂに架橋するような２Ａの単位Ｚ３と２Ｂの単位Ｚ４の間の架橋結合点を示し；
薬物は治療剤であり；
Ｒａ１及びＲａ２は、各々が独立して、水素；Ｃ１−４アルキル；アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、又はアルカリ土類金属イオンであり；
Ｌ２は可逆的プロドラッグリンカ−であり；
Ｌ４は、生分解性であってよいスペ−サ−であり、Ｚ２とＺ４で同じでも異なってもよく；
２Ａは、合計ｓの単位を含み、ｓは２５から２５００であり、ここで；
２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８ｓから約０．９９ｓであり、且つ
Ｚ３単位の数は約０．１ｓから約０．０１ｓであり；
２Ｂは合計ｔの単位を含み、ｔは２５から２５００であり、ここで；
２Ｂ中のＺ１単位の数は約０．７５ｔから約０．９４ｔであり；
Ｚ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１４ｔから約０．０６ｔであり；
Ｚ２単位の数は少なくとも０．０１ｔであり；
Ｚ４単位の数は少なくとも０．０１ｔである、
架橋ＨＡ薬物コンジュゲ−ト。
【請求項２】
薬物をスペ−サ−Ｌ４に結合させる可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２が、式ＸＩＩａ
2020515545.tif 000099
のものであり、式中：
破線は、アミド結合を形成することによる薬物化合物（示さない）の窒素への結合を示し、；
−Ｘ−は、−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｎ（Ｒ４）−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−；−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｎ（Ｒ６）−；−Ｎ（Ｒ６）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｏ−；−Ｏ−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ７Ｒ７ａ）−であり；
Ｘ１はＣ；又はＳ（Ｏ）であり；
−Ｘ２−は、−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−Ｃ（Ｒ９Ｒ９ａ）−であり；
＝Ｘ３は＝Ｏ；＝Ｓ；又は＝Ｎ−ＣＮであり；
−Ｒ１、−Ｒ１ａ、−Ｒ２、−Ｒ２ａ、−Ｒ４、−Ｒ４ａ、−Ｒ５、−Ｒ５ａ、−Ｒ６、−Ｒ８、−Ｒ８ａ、−Ｒ９、−Ｒ９ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；
−Ｒ３、−Ｒ３ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され、但し−Ｒ３、−Ｒ３ａのうちの一つ又はそれら両方が−Ｈ以外である場合、それらはＳＰ３混成炭素原子を通してそれらが結合するＮに接続し；
−Ｒ７は−Ｎ（Ｒ１０Ｒ１０ａ）；又は−ＮＲ１０−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ１１であり；
−Ｒ７ａ、−Ｒ１０、−Ｒ１０ａ、−Ｒ１１は、互いに独立して、−Ｈ；又はＣ１−１０アルキルであり；
対−Ｒ１ａ／−Ｒ４ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ７ａ、−Ｒ４ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ８ａ／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は化学結合を形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ１ａ、−Ｒ２／−Ｒ２ａ、−Ｒ４／−Ｒ４ａ、−Ｒ５／−Ｒ５ａ、−Ｒ８／−Ｒ８ａ、−Ｒ９／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合してＣ３−１０シクロアルキル；又は３から１０員のヘテロシクリルを形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ４、−Ｒ１／−Ｒ５、−Ｒ１／−Ｒ６、−Ｒ１／−Ｒ７ａ、−Ｒ４／−Ｒ５、−Ｒ４／−Ｒ６、−Ｒ８／−Ｒ９、−Ｒ２／−Ｒ３のうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合して環Ａを形成してもよく；
Ｒ３／Ｒ３ａは、それらが結合する窒素原子と結合して３から１０員の複素環を形成してもよく；
環Ａは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ３−１０シクロアルキル；３から１０員のヘテロシクリル；及び８から１１員のヘテロビシクリルからなる群より選択され；
式（ＸＩＩａ）中アスタリスクで印された水素が−Ｌ４又はその他置換基で置き換えられていない場合は式ＸＩＩａの基は−Ｌ４で置換され；
−Ｌ４−は単一の化学結合であるか、又はここで定義されるスペ−サ−部分である、
請求項１に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３】
Ｘ３が＝Ｏであり；
−Ｒ１及び−Ｒ１ａが水素であり；
−Ｒ３がメチルであり、Ｒ３ａが水素であり；     
Ｘが−Ｃ（Ｒ７Ｒ７ａ）であり−；ここでＲ７はＮＲ１０−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ１１である、
請求項２に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項４】
可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２が式ＶＩＩａ（ｉ）：
2020515545.tif 000100
のものであり、式中：
各アスタリスクはスペ−サ−Ｌ４への独立した結合部位を表している、
請求項１又は２に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項５】
可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２がスペ−サ−Ｌ４と共に式ＶＩＩｃ：
2020515545.tif 000101
のものであり、式中：
一番右の波線は、薬物の窒素原子への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸２Ｂの単位Ｚ２への結合点を表している、
請求項１から４のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項６】
ヒアルロン酸ポリマ−２Ａをヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接続するスペ−サ−Ｌ４が、式：
2020515545.tif 000102
のものであり、式中：
一番右の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ３への結合点を表し；
一番左の波線はヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ４への結合点を表し；
可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２をヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接合するスペ−サ−Ｌ４が、式
2020515545.tif 000103
のものであり、式中：
一番右の波線はＬ２への結合点を表し；
一番左の波線はヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ２への結合点を表し；
式中：
Ｌ１はスペ−サ−であり；
Ｌ３は生分解性スペ−サ−である、
請求項１から５のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項７】
単位Ｚ４が
2020515545.tif 000104
であり；
単位Ｚ２が
2020515545.tif 000105
であり；
式中：
Ｌ１はスペ−サ−であり；
Ｌ３は生分解性スペ−サ−であり；
２Ａ、２Ｂ、薬物、Ｒａ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｌ２、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、請求項１に記載されている通りである、
請求項１から６のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項８】
ヒアルロン酸ポリマ−２Ａをヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接続するスペ−サ−Ｌ４が式：
2020515545.tif 000106
のものであり、式中：
一番右の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ３への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ４への結合点を表し；
可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２をヒアルロン酸ポリマ−２Ａに接合するスペ−サ−Ｌ４が式
2020515545.tif 000107
のものであり、式中：
一番右の波線はＬ２への結合点を表し；
一番左の波線はヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ２への結合点を表し；
式中：
ＬＡはスペ−サ−であり；
ＬＢはスペ−サ−であり；
ＬＣは生分解性スペ−サ−である、
請求項１から５のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項９】
ＬＡが、置換されていてもよい及び／又は中断されていてもよいＣ１−１０アルキレンである、請求項８に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１０】
ＬＡが直鎖Ｃ２−４アルキレンである、請求項８又は９に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１１】
ＬＢが直鎖−（Ｏ）−Ｃ１−５アルキレンである、請求項８から１０のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１２】
ＬＣが：
2020515545.tif 000108
であり、式中、ｍは０から１０であり、ｎは１から４であり、ｏは１から４である、請求項８から１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１３】
ＬＣが：
2020515545.tif 000109
である、請求項８から１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１４】
薬物が抗体である、請求項８から１３のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１５】
抗体がＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項１４に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１６】
抗体が抗ＶＥＧＦ抗体断片である、請求項１５に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１７】
抗体断片がＦａｂ抗体断片である、請求項１６に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１８】
Ｆａｂ抗体断片がラニビズマブである、請求項１７に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項１９】
抗体が以下の６個の超可変領域（ＨＶＲ）：
（ｇ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｈ）ＧＸ１ＴＰＸ２ＧＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＤＳＶＸ７Ｘ８（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２であって、Ｘ１がＩｌｅ又はＨｉｓであり、Ｘ２がＡｌａ又はＡｒｇであり、Ｘ３がＴｙｒ又はＬｙｓであり、Ｘ４がＴｈｒ又はＧｌｕであり、Ｘ５がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕであり、Ｘ６がＡｌａ又はＧｌｕであり、Ｘ７がＬｙｓ又はＧｌｕであり、Ｘ８がＧｌｙ又はＧｌｕである、ＨＶＲ−Ｈ２；
（ｉ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＲＡＳＱＸ１ＶＳＴＡＶＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１であって、Ｘ１がＡｓｐ又はＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ１；
（ｋ）Ｘ１ＡＳＦＬＹＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２であって、Ｘ１がＳｅｒ又はＭｅｔであるＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｌ）Ｘ１ＱＧＹＧＸ２ＰＦＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３であって、Ｘ１がＧｌｎ、Ａｓｎ、又はＴｈｒであり、Ｘ２がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇであるＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１５に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２０】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｇ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｈ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）、ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、又はＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｉ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｋ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｌ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）又はＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１９に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２１】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｇ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｈ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｉ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｋ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｌ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１９又は２０に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２２】
抗体が、以下の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：
（ｅ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｆ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｇ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｈ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２３】
抗体が、以下の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＦＲ：
（ｅ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｆ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｇ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｈ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２４】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｇ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｈ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｉ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｋ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｌ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１９又は２０に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２５】
抗体が、以下のＶＬドメインのＦＲ：
（ｅ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｆ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｇ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｈ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項２４に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２６】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｇ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｈ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｉ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｋ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｌ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１９又は２０に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２７】
抗体が、以下のＶＬドメインのＦＲ：
（ｅ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、又はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｆ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）又はＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｇ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｈ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項２６に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２８】
抗体が、以下のＶＨドメインのＦＲ：
（ｉ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｊ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｋ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｌ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項２９】
抗体が、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む、請求項１５に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３０】
抗体が、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む、請求項１６に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３１】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１７に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３２】
抗体が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１８に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３３】
抗体が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１８に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３４】
抗体−ヒドロゲルコンジュゲ−トが、ヒドロゲルに共有結合していない参照抗体と比較して延長された眼の有効半減期を有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３５】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約２倍延長される、請求項３４に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３６】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約２．５倍延長される、請求項３５に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３７】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約３倍延長される、請求項３６に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３８】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約３．５倍延長される、請求項３７に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項３９】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約４倍延長される、請求項３８に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項４０】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約５倍延長される、請求項３９に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項４１】
眼の有効半減期が、参照抗体と比較して少なくとも約６倍延長される、請求項４０に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項４２】
眼の有効半減期が、硝子体の有効半減期である、請求項３４から４１のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項４３】
参照抗体がヒドロゲルコンジュゲ−トの抗体と同一である、請求項３４から４２のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれか一項に記載のヒドロゲルコンジュゲ−トと、薬学的に許容される担体、添加物、又は希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項４５】
抗体、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群より選択される第２の薬剤をさらに含む、請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
抗血管新生剤がＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項４５に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶型ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマ−、抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、又はＶＥＧＦＲチロシンキナ−ゼ阻害剤である、請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体が抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体である、請求項４８に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体がＲＧ−７７１６である、請求項４９に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
可溶型ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質が、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
アプタマ−がペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）がアビシパルペゴル（ａｂｉｃｉｐａｒ  ｐｅｇｏｌ）である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
ＶＥＧＦＲチロシンキナ−ゼ阻害剤が、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインド−ル−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群より選択される、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
第２の生体分子が、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；並びにＡＭＤリスクに遺伝的にリンクするタンパク質からなる群より選択される、請求項４５に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、又はｓＶＥＧＦＲである、請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
ＡＭＤリスクに遺伝的にリンクするタンパク質が、補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；並びにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群より選択される、請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
第２の生体分子に結合する化合物が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項４５及び５５から５７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
抗原結合抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群より選択される、請求項５８に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
医薬としての使用のための、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
対象における病的血管新生を伴う障害を治療するための医薬の製造における使用のための、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
病的血管新生を伴う障害を有する対象における血管新生の低減又は阻害における使用のための、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
対象における病的血管新生を伴う障害の治療における使用のための、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
病的血管新生を伴う障害が眼の障害である、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の、使用のための薬学的組成物。
【請求項６５】
眼の障害が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑変性、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ、及びびまん性の、中心窩を含むＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高高度ＤＲを含む）、その他虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生関連疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生関連疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コ−ト病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜の血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎を含む）、レ−バ−先天黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、及びシェ−グレン症候群からなる群より選択される、請求項６４に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項６６】
眼の障害が、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯである、請求項６５に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項６７】
眼の障害がＡＭＤである、請求項６５又は６６に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項６８】
ＡＭＤが湿潤性ＡＭＤである、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項６９】
眼適応症を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする対象に対し、請求項４４から６８のいずれか一項に記載の組成物の溶液の治療量を投与することを含む方法。
【請求項７０】
投与が眼内投与である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
組成物が対象の硝子体中に注射される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
組成物が、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のゲ−ジを有する針を用いて注射される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
眼適応症が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑変性、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ、及びびまん性の、中心窩を含むＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高高度ＤＲを含む）、その他虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生関連疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生関連疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コ−ト病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜の血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎を含む）、レ−バ−先天黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、及びシェ−グレン症候群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
眼適応症がＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
眼適応症がＡＭＤである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ＡＭＤが湿潤性ＡＭＤである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ヒドロゲル薬物コンジュゲ−トを生成するための方法であって：
（ａ）上に少なくとも三つの第１の反応性基を有する、第１のヒアルロン酸又はその誘導体を提供すること；
（ｂ）上に少なくとも二つの第２の反応性基を有する第２のヒアルロン酸又はその誘導体を提供することであって、第１の反応性基と第２の反応性基が互いと反応して共有結合を形成することができる、第２のヒアルロン酸又はその誘導体を提供すること；
（ｃ）少なくとも一つの薬物を第１の反応性基のうちの一つに結合させること；及び
（ｄ）第１の反応性基と第２の反応性基を反応させて架橋剤を形成し、ヒドロゲルコンジュゲ−トを形成することにより、第１のヒアルロン酸と第２のヒアルロン酸を架橋させること
を含み、工程（ｂ）と（ｃ）は任意選択的に交換可能である、方法。
【請求項７８】
薬物が、可逆的プロドラッグリンカ−を介して第１のヒアルロン酸に結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
薬物が、第１のヒアルロン酸と結合する前に、可逆的プロドラッグリンカ−と結合し、精製されて、精製済み薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トを形成し、この薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トは：
（ａ）薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トに精製タグをタグ付けしてタグ化薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−ト混合物を形成すること；
（ｂ）クロマトグラフ分離法により混合物からタグ付き薬物−可逆的プロドラッグリンカ−モノコンジュゲ−トを精製すること；及び
（ｃ）タグ付き薬物−可逆的プロドラッグリンカ−モノコンジュゲ−トから精製タグを除去して精製済み薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トを形成すること
により精製される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
薬物を第１のヒアルロン酸に結合する可逆的プロドラッグリンカ−が、式ＸＩＩａ
2020515545.tif 000110
のものであり、式中：
破線は、アミド結合を形成することによる薬物化合物（示さない）の窒素への結合を示し、；
−Ｘ−は、−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｎ（Ｒ４）−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−；−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｎ（Ｒ６）−；−Ｎ（Ｒ６）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｏ−；−Ｏ−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ７Ｒ７ａ）−であり；
Ｘ１は、Ｃ；又はＳ（Ｏ）であり；
−Ｘ２−は、−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−Ｃ（Ｒ９Ｒ９ａ）−であり；
＝Ｘ３は、＝Ｏ；＝Ｓ；又は＝Ｎ−ＣＮであり；
−Ｒ１、−Ｒ１ａ、−Ｒ２、−Ｒ２ａ、−Ｒ４、−Ｒ４ａ、−Ｒ５、−Ｒ５ａ、−Ｒ６、−Ｒ８、−Ｒ８ａ、−Ｒ９、−Ｒ９ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；
−Ｒ３、−Ｒ３ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され、但し−Ｒ３、−Ｒ３ａのうちの一つ又はそれら両方が−Ｈ以外である場合、それらはＳＰ３混成炭素原子を通してそれらが結合するＮに接続し；
−Ｒ７は−Ｎ（Ｒ１０Ｒ１０ａ）；又は−ＮＲ１０−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ１１であり；
−Ｒ７ａ、−Ｒ１０、−Ｒ１０ａ、−Ｒ１１は、互いに独立して、−Ｈ；又はＣ１−１０アルキルであり；
対−Ｒ１ａ／−Ｒ４ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ７ａ、−Ｒ４ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ８ａ／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は化学結合を形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ１ａ、−Ｒ２／−Ｒ２ａ、−Ｒ４／−Ｒ４ａ、−Ｒ５／−Ｒ５ａ、−Ｒ８／−Ｒ８ａ；−Ｒ９／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合してＣ３−１０シクロアルキル；又は３から１０員のヘテロシクリルを形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ４、−Ｒ１／−Ｒ５、−Ｒ１／−Ｒ６、−Ｒ１／−Ｒ７ａ、−Ｒ４／−Ｒ５、−Ｒ４／−Ｒ６、−Ｒ８／−Ｒ９、−Ｒ２／−Ｒ３のうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合して環Ａを形成してもよく；
Ｒ３／Ｒ３ａは、それらが結合する窒素原子と結合して３から１０員の複素環を形成してもよく；
環Ａは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ３−１０シクロアルキル；３から１０員のヘテロシクリル；及び８から１１員のヘテロビシクリルからなる群より選択され；
式（ＸＩＩａ）中アスタリスクで印された水素が−Ｌ４又はその他置換基で置き換えられていない場合は式（ＸＩＩａ）の基は−Ｌ４で置換され；
−Ｌ４−は単一の化学結合であるか、又はここで定義されるスペ−サ−部分である、
請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
Ｘ３が＝Ｏであり；
−Ｒ１及び−Ｒ１ａが水素であり；
−Ｒ３がメチルであり、Ｒ３ａが水素であり；
Ｘが−Ｃ（Ｒ７Ｒ７ａ）であり−；ここでＲ７はＮＲ１０−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ１１である、
請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
可逆的プロドラッグリンカ−が、式ＶＩＩａ（ｉ）：
2020515545.tif 000111
のものであり、式中：
各アスタリスクはスペ−サ−Ｌ４による第１のヒアルロン酸への独立した結合部位を表している、
請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
可逆的プロドラッグリンカ−が、任意選択的なスペ−サ−Ｌ４と共に、式ＶＩＩｃ：
2020515545.tif 000112
のものであり、式中：
一番右の波線は、薬物の窒素原子への結合点を表し；
一番左の波線は、第１のヒアルロン酸への結合点を表し；
Ｌ４は任意選択的な生分解性スペ−サ−である、
請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
架橋剤が生分解性スペ−サ−部分を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
架橋剤がアゼライン酸エステル部分を含む、請求項８４に記載の方法。    
【請求項８６】
薬物が抗体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
抗体がＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
抗体が抗ＶＥＧＦ抗体断片である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
抗体断片がＦａｂ抗体断片である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
Ｆａｂ抗体断片がラニビズマブである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
抗体が、以下の６個の超可変領域（ＨＶＲ）：
（ｍ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｎ）ＧＸ１ＴＰＸ２ＧＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＤＳＶＸ７Ｘ８（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２であって、Ｘ１がＩｌｅ又はＨｉｓであり、Ｘ２がＡｌａ又はＡｒｇであり、Ｘ３がＴｙｒ又はＬｙｓであり、Ｘ４がＴｈｒ又はＧｌｕであり、Ｘ５がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕであり、Ｘ６がＡｌａ又はＧｌｕであり、Ｘ７がＬｙｓ又はＧｌｕであり、Ｘ８がＧｌｙ又はＧｌｕである、ＨＶＲ−Ｈ２；
（ｏ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｐ）ＲＡＳＱＸ１ＶＳＴＡＶＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１であって、Ｘ１がＡｓｐ又はＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ１；
（ｑ）Ｘ１ＡＳＦＬＹＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２であって、Ｘ１がＳｅｒ又はＭｅｔであるＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｒ）Ｘ１ＱＧＹＧＸ２ＰＦＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３であって、Ｘ１がＧｌｎ、Ａｓｎ、又はＴｈｒであり、Ｘ２がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇであるＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｍ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｎ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）、ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、又はＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｏ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｐ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｑ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｒ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）又はＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｍ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｎ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｏ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｐ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｑ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｒ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９４】
抗体が、以下の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：
（ｉ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｊ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｋ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｌ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む、請求項９１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
抗体が、以下の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＦＲ：
（ｉ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｊ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｋ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｌ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項９１から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｍ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｎ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｏ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｐ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｑ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｒ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９７】
抗体が、以下のＶＬドメインのＦＲ：
（ｉ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｊ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｋ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｌ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
抗体が以下の６個のＨＶＲ：
（ｍ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｎ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｏ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｐ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｑ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｒ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９９】
抗体が、以下のＶＬドメインのＦＲ：
（ｉ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、又はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｊ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）又はＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｋ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｌ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
抗体が、以下のＶＨドメインのＦＲ：
（ｍ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｎ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｏ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｐ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む、請求項９６から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
抗体が、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
抗体が、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
抗体が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
抗体が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項８６に記載の抗体−ヒドロゲルコンジュゲ−ト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／４７５０９４号の優先権を主張するものであり、この米国特許仮出願の開示内容は参照により本明細書に包含される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全内容は参照により本明細書に援用される。前記ＡＳＣＩＩコピ−は、２０１８年３月２１日に作成され、Ｐ３４１２８＿ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、大きさは３８，０４８バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一つ又は複数の眼の状態の治療のための、薬学的組成物、関連する調製方法、及び薬学的組成物の使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
失明の一番の原因は、特定の目の疾患を十分に治療できないことである。最大の限界は、薬物又は治療剤を目の中に導入し、これら薬物又は薬剤を必要な期間にわたってその中で治療的に有効な濃度に維持する適切な選択肢がないことである。有効な眼内濃度を達成するために、時に許容不能なほど高いレベルの全身性投薬が必要となり、許容できない薬物の副作用の発生率が上昇するため、全身投与は理想的な解決法ではありえない。単純な点眼又は適用は、薬物は涙の作用により急速に洗われてしまったり眼の内部から体循環へと枯渇したりするために、多くの場合許容可能な代替法ではない。局所的な点眼療法は、吸収の悪さ、数日から数年の期間にわたる頻繁な及び／又は慢性的な投与、眼房水の急速な代謝回転、涙膜の生成と運動、及び他の原因による限界を有しており、これにより、療法の完了又は適切な用量の送達のずっと前に、治療剤が除去されてしまう場合がある。
【０００５】
眼内注射は、局所送達といった他の送達機序に対して、目の標的となる位置（例えば、網膜）に生物学的利用能の強化を提供することができるという利点を有している。しかしながら、眼内注射は、欠点も有し、多種多様な合併症を呈しうる。例えば、硝子体内注射は、特に治療剤が比較的可溶型であるとき、標的位置又はその他の位置への望ましくないほど高い濃度の治療剤の送達をもたらすことがある。加えて、眼内注射は、患者にとって不快度が高い。さらに、眼内注射自体が眼内炎及び網膜剥離といった合併症を引き起こす可能性があるため、目の中に薬物の治療レベルを保持しながらも注射間の間隔を最大限長くすることが望ましい。
【０００６】
上述に加えて、硝子体内注射により送達される治療剤は、注射後時に薬剤が眼の内部で急速に分散しうるため、作用期間が失われる場合がある。このように作用期間が失われることは、注射の頻度を増加させる必要を生じさせうるため、特に望ましくない。ラニビズマブ及びペガプタニブは、例えば、それぞれ４及び６週毎に眼内注射により患者に投与される。これは患者にとって極めて不快な経験である。
【０００７】
したがって、製剤の持続期間を延長することが眼科学の分野の利益になることが広く認識されている。長期持続性製剤は、目に治療剤を長期間にわたって送達することにより、患者のケアと眼の健康に利すると同時に、処方された治療的医療レジメンに対する患者コンプライアンスに関連付けられる問題を最小化する。
【０００８】
脈管形成と血管新生を刺激する細胞により生成されるシグナルタンパク質である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現は、特定の形態の黄斑変性及び網膜症といった種々の眼の状態に重要な役割を果たす。
【０００９】
ラニビズマブ、アフリベルセプト及びペガプタニブといった、このような眼の状態を治療するための種々の医薬が市販されている。患者への適用は、４及び８週毎の眼内注射により行われる。
【００１０】
上記を鑑みると、上記のような欠点を少なくとも部分的に克服する投与の形態を提供することが必要である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、架橋したヒアルロン酸（ＨＡ）薬物コンジュゲ−ト、薬学的組成物、及び眼適応症の治療にそのようなコンジュゲ−トを使用する方法、並びにそのようなコンジュゲ−トを作製する方法を提供する。
【００１２】
特定の実施態様では、本発明は、複数のヒアルロン酸ポリマ−２Ａ及び複数のヒアルロン酸ポリマ−２Ｂを含む架橋したＨＡ薬物コンジュゲ−トを提供し、ここで
各２Ａは、本質的に：
2020515545.tif 000002
からなる複数の線形に接続する単位を含み；
各２Ｂは、本質的に：
2020515545.tif 000003
からなる複数の線形に接続する単位を含み；
式中、
印のない破線は、隣接する単位の＃で印した破線の位置への、又は水素への結合点を示し、
＃で印した破線は、隣接する単位の印のない破線の位置への、又はヒドロキシルへの結合点を示し；
＊で印した破線は、少なくとも一つの２Ａが少なくとも一つの２Ｂに架橋するような２Ａの単位Ｚ３と２Ｂの単位Ｚ４の間の架橋結合点を示し；
薬物は治療剤であり；
Ｒａ１及びＲａ２は、各々が独立して、水素；Ｃ１−４アルキル；アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルカリ土類金属イオン、又はその他の適切な対イオンであり；
Ｌ２は可逆的プロドラッグリンカ−であり；
Ｌ４は、生分解性スペ−サ−であってよく、Ｚ２とＺ４で同じでも異なってもよく；
２Ａは、合計ｓの単位を含み、ｓは２５から２５００であり、ここで；
２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８ｓから約０．９９ｓであり、
Ｚ３単位の数は約０．２ｓから約０．０１ｓであり；
２Ｂは合計ｔの単位を含み、ｔは２５から２５００であり、ここで；
２Ｂ中のＺ１単位の数は約０．７５ｔから約０．９４ｔであり；
Ｚ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．２５ｔから約０．０６ｔであり；
Ｚ２単位の数は少なくとも０．０１ｔであり；
Ｚ４単位の数は少なくとも０．０１ｔである。
【００１３】
特定の実施態様では、ｓは５０から２０００である。
【００１４】
特定の実施態様では、ｓは７５から１５００である。
【００１５】
特定の実施態様では、ｓは７５から１０００である。
【００１６】
特定の実施態様では、ｓは８０から５００である。
【００１７】
特定の実施態様では、ｓは１００から２５０である。
【００１８】
特定の実施態様では、ｓは１００から２００である。
【００１９】
特定の実施態様では、ｓは２００から８００であるか、又は３００から６００である。
【００２０】
特定の実施態様では、ｔは５０から２０００である。
【００２１】
特定の実施態様では、ｔは７５から１５００である。
【００２２】
特定の実施態様では、ｔは７５から１０００である。
【００２３】
特定の実施態様では、ｔは８０から５００である。
【００２４】
特定の実施態様では、ｔは１００から２５０である。
【００２５】
特定の実施態様では、ｔは１００から２００である。
【００２６】
特定の実施態様では、ｔは２００から８００であるか、又は３００から６００である。
【００２７】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．９１ｓから約０．９８ｓである。
【００２８】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８ｓから約０．９９ｓである。
【００２９】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８２ｓから約０．９９ｓである。
【００３０】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８４ｓから約０．９９ｓである。
【００３１】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８６ｓから約０．９９ｓである。
【００３２】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．８８ｓから約０．９９ｓである。
【００３３】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．９ｓから約０．９９ｓである。特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．９２ｓから約０．９７ｓである。
【００３４】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．９３ｓから約０．９６ｓである。
【００３５】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ１単位の数は約０．９４ｓから約０．９５ｓである。
【００３６】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ３単位の数は約０．２ｓから約０．０１ｓである。
【００３７】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ３単位の数は約０．１８ｓから約０．０１ｓである。
【００３８】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ３単位の数は約０．１６ｓから約０．０１ｓである。
【００３９】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ３単位の数は約０．１４ｓから約０．０１ｓである。特定の実施態様では、２Ａ中のＺ３単位の数は約０．１２ｓから約０．０１ｓである。
【００４０】
特定の実施態様では、２Ａ中のＺ３単位の数は約０．１０ｓから約０．０１ｓである。
【００４１】
特定の実施態様では、Ｚ３単位の数は約０．０９ｓから約０．０２ｓである。
【００４２】
特定の実施態様では、Ｚ３単位の数は約０．０８ｓから約０．０３ｓである。
【００４３】
特定の実施態様では、Ｚ３単位の数は約０．０７ｓから約０．０４ｓである。
【００４４】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ１単位の数は約０．８８ｓから約０．９２ｓである。
【００４５】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ１単位の数は約０．８６ｓから約０．９４ｓである。
【００４６】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ１単位の数は約０．８９ｓから約０．９１ｓである。
【００４７】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ１単位の数は約０．８６ｓから約０．９４ｓである。
【００４８】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．２５ｔから約０．０５ｔである。
【００４９】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．２３ｔから約０．０５ｔである。
【００５０】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．２１ｔから約０．０５ｔである。
【００５１】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１９ｔから約０．０５ｔである。
【００５２】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１７ｔから約０．０５ｔである。
【００５３】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１５ｔから約０．０５ｔである。
【００５４】
特定の実施態様では、２Ｂ中のＺ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１３ｔから約０．０５ｔである。
【００５５】
特定の実施態様では、Ｚ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１２ｔから約０．０６ｔである。
【００５６】
特定の実施態様では、Ｚ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．１１ｔから約０．０７ｔである。
【００５７】
特定の実施態様では、Ｚ２単位とＺ４単位を組み合わせた数は約０．２５ｔから約０．０６ｔである。
【００５８】
特定の実施態様では、Ｚ２単位の数は０．０２ｔから０．１２ｔである。
【００５９】
特定の実施態様では、Ｚ２単位の数は０．０４ｔから０．１０ｔである。
【００６０】
特定の実施態様では、Ｚ２単位の数は０．０６ｔから０．０８ｔである。
【００６１】
特定の実施態様では、Ｚ２単位の数は０．０７ｔから０．０８ｔである。
【００６２】
特定の実施態様では、Ｚ２単位の数は０．０７５ｔから０．０８ｔである。
【００６３】
特定の実施態様では、Ｚ２単位の数は０．０７７ｔである。
【００６４】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０１ｔから０．１２ｔである。
【００６５】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０２ｔから０．１２ｔである。
【００６６】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０４ｔから０．１０ｔである。
【００６７】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０６ｔから０．０８ｔである。
【００６８】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０１ｔから０．０４ｔである。
【００６９】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０２ｔから０．０３ｔである。
【００７０】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０２ｔから０．０２５ｔである。
【００７１】
特定の実施態様では、Ｚ４単位の数は０．０２３ｔである。
【００７２】
特定の実施態様では、薬物をスペ−サ−Ｌ４に結合する可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２は、式ＸＩＩａ
2020515545.tif 000004
ものであり、式中、
破線は、アミド結合を形成することによる薬物化合物（示さない）の窒素への結合を示し、；
−Ｘ−は、−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｎ（Ｒ４）−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−；−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｎ（Ｒ６）−；−Ｎ（Ｒ６）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｏ−；−Ｏ−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ７Ｒ７ａ）−であり；
Ｘ１はＣ；又はＳ（Ｏ）であり；
−Ｘ２−は、−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−Ｃ（Ｒ９Ｒ９ａ）−であり；
＝Ｘ３は＝Ｏ；＝Ｓ；又は＝Ｎ−ＣＮであり；
−Ｒ１、−Ｒ１ａ、−Ｒ２、−Ｒ２ａ、−Ｒ４、−Ｒ４ａ、−Ｒ５、−Ｒ５ａ、−Ｒ６、−Ｒ８、−Ｒ８ａ、−Ｒ９、−Ｒ９ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；
−Ｒ３、−Ｒ３ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６  アルキルからなる群より選択され、但し−Ｒ３、−Ｒ３ａのうちの一つ又はそれら両方が−Ｈ以外である場合、それらはＳＰ３に混成した炭素原子を通してそれらが結合するＮに接続し；
−Ｒ７は−Ｎ（Ｒ１０Ｒ１０ａ）；又は−ＮＲ１０−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ１１であり；
−Ｒ７ａ、−Ｒ１０、−Ｒ１０ａ、−Ｒ１１は、互いに独立して、−Ｈ；又はＣ１−１０アルキルであり；
対−Ｒ１ａ／−Ｒ４ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ７ａ、−Ｒ４ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ８ａ／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は化学結合を形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ１ａ、−Ｒ２／−Ｒ２ａ、−Ｒ４／−Ｒ４ａ、−Ｒ５／−Ｒ５ａ、−Ｒ８／−Ｒ８ａ，−Ｒ９／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合してＣ３−１０シクロアルキル；又は３−から１０員のヘテロシクリルを形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ４、−Ｒ１／−Ｒ５、−Ｒ１／−Ｒ６、−Ｒ１／−Ｒ７ａ、−Ｒ４／−Ｒ５、−Ｒ４／−Ｒ６、−Ｒ８／−Ｒ９、−Ｒ２／−Ｒ３のうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合して環Ａを形成してもよく；
Ｒ３／Ｒ３ａは、それらが結合する窒素原子と結合して３から１０員の複素環を形成してもよく；
環Ａは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ３−１０シクロアルキル；３から１０員のヘテロシクリル；及び８から１１員のヘテロビシクリルからなる群より選択され；
式（ＸＩＩａ）中アスタリスクで印された水素が−Ｌ４又はその他置換基で置き換えられていないことを条件に、式ＸＩＩａの基は−Ｌ４で置換され；
−Ｌ４−は単一の化学結合であるか、又は本明細書において定義されるスペ−サ−部分である。
【００７３】
特定の実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２は、式ＶＩＩａ：
2020515545.tif 000005
のものであり、式中：
各アスタリスクはスペ−サ−Ｌ４への独立した結合部位を表している。
【００７４】
特定の実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２とスペ−サ−Ｌ４は式ＶＩＩｃ：
2020515545.tif 000006
のものであり、式中：
一番右の波線は、薬物の窒素原子への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸２Ｂの単位Ｚ２への結合点を表している。
【００７５】
特定の実施態様では、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａをヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接続するスペ−サ−Ｌ４（ポリマ−２Ａの単位Ｚ３をポリマ−２Ｂの単位Ｚ４に結合することにより）が式：
2020515545.tif 000007
のものであり、式中：
一番右の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ３への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ４への結合点を表している。
【００７６】
ヒアルロン酸ポリマ−２Ａをヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接続するスペ−サ−Ｌ４は、特定の実施態様では、上式の一番右の波線がヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ４への結合点を表し；一番左の波線がヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ３への結合点を表すように、逆向きである。
【００７７】
特定の実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２をヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接合するスペ−サ−Ｌ４は、式
2020515545.tif 000008
のものであり、式中：
一番右の波線はＬ２への結合点を表し；
一番左の波線はヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ２への結合点を表し；
式中：
Ｌ１はスペ−サ−であり；
Ｌ３は生分解性スペ−サ−である。
【００７８】
特定の実施態様では、単位Ｚ４は
2020515545.tif 000009
であり；式中、Ｌ１、Ｌ３及びＲａ２は本明細書に規定される通りである。
【００７９】
特定の実施態様では、単位Ｚ２は
2020515545.tif 000010
であり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＲａ２は本明細書に規定される通りである。
【００８０】
特定の実施態様では、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａをヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接続するスペ−サ−Ｌ４は、式：
2020515545.tif 000011
のものであり、式中：
一番右の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ３への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ４への結合点を表し；
ＬＡはスペ−サ−であり；
ＬＢはスペ−サ−であり；
ＬＣは生分解性スペ−サ−である。
【００８１】
特定の実施態様では、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａをヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接続するスペ−サ−Ｌ４は、式：
2020515545.tif 000012
のものであり、式中：
一番右の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ３への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ４への結合点を表している。
【００８２】
特定の実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２をヒアルロン酸ポリマ−２Ａに接合するスペ−サ−Ｌ４は、式
2020515545.tif 000013
のものであり、式中：
一番右の波線はＬ２への結合点を表し；
一番左の波線はヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ２への結合点を表し；
式中：
ＬＡはスペ−サ−であり；
ＬＢはスペ−サ−であり；
ＬＣは生分解性スペ−サ−である。
【００８３】
特定の実施態様では、ＬＡは、置換されていてもよい及び／又は中断されていてもよいＣ１−１０アルキレンである。
【００８４】
特定の実施態様では、ＬＡは線形Ｃ２−４アルキレンである。
【００８５】
特定の実施態様では、ＬＢは線形−（Ｏ）−Ｃ１−５アルキレンである。
【００８６】
特定の実施態様では、ＬＣは：
2020515545.tif 000014
であり、式中、ｍは０から１０であり、ｎは１から４であり、ｏは１から４である。
【００８７】
特定の実施態様では、ＬＣは：
2020515545.tif 000015
である。
【００８８】
特定の実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２をヒアルロン酸ポリマ−２Ｂに接合するスペ−サ−Ｌ４は、式
2020515545.tif 000016
のものであり、式中：
一番右の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ａ上の単位Ｚ３への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸ポリマ−２Ｂ上の単位Ｚ４への結合点を表している。
【００８９】
特定の実施態様では、単位Ｚ４は：
2020515545.tif 000017
であり、式中、Ｒａ２は本明細書に規定される通りである。
【００９０】
特定の実施態様では、単位Ｚ２は
【００９１】
2020515545.tif 000018
であり、式中、Ｌ２、Ｒａ２及び薬物は本明細書に規定される通りである。
【００９２】
特定の実施態様では、単位Ｚ２は
2020515545.tif 000019
であり、Ｒａ２及び薬物は本明細書に規定される通りである。
【００９３】
特定の実施態様では、スペ−サ−Ｌ４と組み合わされた可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２は式ＶＩＩｄ
2020515545.tif 000020
のものであり、式中：
一番右の波線は、薬物の窒素原子への結合点を表し；
一番左の波線は、ヒアルロン酸２Ｂの単位Ｚ２への結合点を表している。
【００９４】
特定の実施態様では、薬物は抗体である。
【００９５】
特定の実施態様では、抗体はＶＥＧＦアンタゴニストである。
【００９６】
特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ抗体断片である。
【００９７】
特定の実施態様では、抗体断片はＦａｂ抗体断片である。
【００９８】
特定の実施態様では、Ｆａｂ抗体断片はラニビズマブ又はＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）である。
【００９９】
特定の実施態様では、抗体は、以下の６個の超可変領域（ＨＶＲ）：
（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＧＸ１ＴＰＸ２ＧＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＤＳＶＸ７Ｘ８（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２であって、Ｘ１がＩｌｅ又はＨｉｓであり、Ｘ２がＡｌａ又はＡｒｇであり、Ｘ３がＴｙｒ又はＬｙｓであり、Ｘ４がＴｈｒ又はＧｌｕであり、Ｘ５がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕであり、Ｘ６がＡｌａ又はＧｌｕであり、Ｘ７がＬｙｓ又はＧｌｕであり、Ｘ８がＧｌｙ又はＧｌｕである、ＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＸ１ＶＳＴＡＶＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１であって、Ｘ１がＡｓｐ又はＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）Ｘ１ＡＳＦＬＹＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２であって、Ｘ１がＳｅｒ又はＭｅｔである、ＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）Ｘ１ＱＧＹＧＸ２ＰＦＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３であって、Ｘ１がＧｌｎ、Ａｓｎ、又はＴｈｒであり、Ｘ２がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１００】
特定の実施態様では、抗体は、以下の６個のＨＶＲ：
（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）、ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、又はＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）又はＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１０１】
特定の実施態様では、抗体は、以下の６個のＨＶＲ：
（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１０２】
特定の実施態様では、抗体は、以下の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：
（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む。
【０１０３】
特定の実施態様では、抗体は、以下の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＦＲ：
（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む。
【０１０４】
特定の実施態様では、抗体は、以下の６個のＨＶＲ：
（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１０５】
特定の実施態様では、抗体は、以下のＶＬドメインのＦＲ：
（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む。
【０１０６】
特定の実施態様では、抗体は、以下の６個のＨＶＲ：
（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１０７】
特定の実施態様では、抗体は、以下のＶＬドメインのＦＲ：
（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、又はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）又はＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む。
【０１０８】
特定の実施態様では、抗体は、以下のＶＨドメインのＦＲ：
（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む。
【０１０９】
特定の実施態様では、抗体は、以下のＶＨドメインのＦＲ：
（ｅ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｆ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｇ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｈ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む。
【０１１０】
特定の実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む。
【０１１１】
特定の実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む。
【０１１２】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１３】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１１４】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１１５】
特定の実施態様では、抗体−ヒドロゲルコンジュゲ−トは、ヒドロゲルに共有結合していない参照抗体と比較して延長された眼の有効半減期を有する。
【０１１６】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約２倍延長される。
【０１１７】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約５倍延長される。
【０１１８】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約８倍延長される。
【０１１９】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約１０倍延長される。
【０１２０】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約１２倍延長される。
【０１２１】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約１５倍延長される。
【０１２２】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、参照抗体と比較して少なくとも約１６倍延長される。
【０１２３】
特定の実施態様では、眼の有効半減期は、硝子体の半減期である。
【０１２４】
特定の実施態様では、参照抗体は、抗体コンジュゲ−トの抗体と同一である。
【０１２５】
特定の実施態様では、本発明は、医薬としての使用のための、対象の病的血管新生を伴う障害の治療のための医薬の製造における使用のための、病的血管新生を伴う障害を有する対象の血管新生の低減又は阻害における使用のための、及び／又は対象の病的血管新生を伴う障害の治療における使用のための、薬学的組成物を提供する。
【０１２６】
特定の実施態様では、本薬学的組成物は、ヒドロゲルコンジュゲ−トと薬学的に許容される担体、添加物、又は希釈剤とを含む。
【０１２７】
特定の実施態様では、本薬学的組成物は第２の薬剤をさらに含み、第２の薬剤は、抗体、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群より選択される。
【０１２８】
特定の実施態様では、本薬学的組成物は第２の薬剤をさらに含み、第２の薬剤は、抗体、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群より選択される。
【０１２９】
特定の実施態様では、本薬学的組成物の抗血管新生剤はＶＥＧＦアンタゴニストである。
【０１３０】
特定の実施態様では、本薬学的組成物のＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶型ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマ−、抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、又はＶＥＧＦＲチロシンキナ−ゼ阻害剤である。
【０１３１】
特定の実施態様では、本薬学的組成物の抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０１３２】
特定の実施態様では、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体である。
【０１３３】
特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体はＲＧ−７７１６である。
【０１３４】
特定の実施態様では、可溶型ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質はアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である。
【０１３５】
特定の実施態様では、アプタマ−はペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である。
【０１３６】
特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）はアビシパルペゴル（ａｂｉｃｉｐａｒ  ｐｅｇｏｌ）である。
【０１３７】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦＲチロシンキナ−ゼ阻害剤は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインド−ル−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群より選択される。
【０１３８】
特定の実施態様では、第２の生体分子は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；並びにＡＭＤの危険に遺伝的にリンクするタンパク質からなる群より選択される。
【０１３９】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、又はｓＶＥＧＦＲである。
【０１４０】
特定の実施態様では、ＡＭＤの危険に遺伝的にリンクするタンパク質は、補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；並びにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群より選択される。
【０１４１】
特定の実施態様では、第２の生体分子に結合する化合物は、抗体又はその抗原結合断片である。
【０１４２】
特定の実施態様では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群より選択される。
【０１４３】
特定の実施態様では、病的血管新生を伴う障害は眼の障害である。
【０１４４】
特定の実施態様では、眼の障害は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑変性、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ、及びびまん性の、中心窩を含むＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高高度ＤＲを含む）、その他虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生関連疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生関連疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コ−ト病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜の血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎を含む）、レ−バ−先天黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、及びシェ−グレン症候群からなる群より選択される。
【０１４５】
特定の実施態様では、眼の障害は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯである。
【０１４６】
特定の実施態様では、眼の障害はＡＭＤである。
【０１４７】
特定の実施態様では、ＡＭＤは湿潤性のＡＭＤである。
【０１４８】
特定の実施態様では、本発明は、眼適応症を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載される薬学的組成物の治療上有効量の溶液を投与することを含む。
【０１４９】
特定の実施態様では、薬学的組成物の投与は眼内投与である。
【０１５０】
特定の実施態様では、薬学的組成物は、対象の硝子体に注射される。
【０１５１】
特定の実施態様では、薬学的組成物は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のゲ−ジを有する針を用いて注射される。
【０１５２】
特定の実施態様では、眼適応症は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑変性、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ、及びびまん性の、中心窩を含むＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高高度ＤＲを含む）、その他虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生関連疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生関連疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コ−ト病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜の血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎を含む）、レ−バ−先天黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、及びシェ−グレン症候群より選択される。
【０１５３】
特定の実施態様では、本発明は、ヒドロゲル薬物コンジュゲ−トを生成するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）上に少なくとも三つの第１の反応性基を有する、第１のヒアルロン酸又はアルカリ金属塩若しくはその誘導体を提供すること；
（ｂ）上に少なくとも二つの第２の反応性基を有する第２のヒアルロン酸又はアルカリ金属塩若しくはその誘導体を提供することであって、第１の反応性基と第２の反応性基が互いと反応して共有結合を形成することができる、第２のヒアルロン酸又はアルカリ金属塩若しくはその誘導体を提供すること；
（ｃ）少なくとも一つの薬物を第１の反応性基のうちの一つに結合させること；並びに
（ｄ）第１の反応性基と第２の反応性基を反応させて架橋剤を形成し且つヒドロゲルコンジュゲ−トを形成することにより、第１のヒアルロン酸と第２のヒアルロン酸を架橋させること
を含む。
【０１５４】
特定の実施態様では、薬物は、可逆的プロドラッグリンカ−を介して第１のヒアルロン酸に結合する。
【０１５５】
特定の実施態様では、薬物は、第１のヒアルロン酸と結合する前に、可逆的プロドラッグリンカ−と結合し、精製されて、精製済み薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トを形成し、この薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トは：
（ａ）薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トに精製タグをタグ付けしてタグ付き薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−ト混合物を形成すること；
（ｂ）クロマトグラフ分離法により混合物からタグ付き薬物−可逆的プロドラッグリンカ−モノコンジュゲ−トを精製すること；及び
（ｃ）タグ付き薬物−可逆的プロドラッグリンカ−モノコンジュゲ−トから精製タグを除去して精製済み薬物−可逆的プロドラッグリンカ−コンジュゲ−トを形成すること
により精製される。
【０１５６】
特定の実施態様では、架橋剤は、生分解性スペ−サ−部分を含む。
【０１５７】
特定の実施態様では、架橋剤は、アゼライン酸エステル部分を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】本発明による架橋したヒアルロン酸薬物コンジュゲ−トである。
【図２】マレイミド官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）及びコンジュゲ−トした薬物を有するマレイミド官能化ヒアルロン酸を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図３】保護されたチオ−ル官能化ヒアルロン酸、チオ−ル官能化ヒアルロン酸、及び架橋ヒアルロン酸プロドラッグ組成物を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図４】マレイミド官能化ヒアルロン酸及び保護されたジスルフィド官能化ヒアルロン酸を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図５】チオ−ル官能化ヒアルロン酸、コンジュゲ−トした薬物を有するチオ−ル官能化ヒアルロン酸、及び架橋ヒアルロン酸プロドラッグ組成物を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図６】アミン官能化ヒアルロン酸を調製するため、及びそこからマレイミド官能化ヒアルロン酸を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図７】マレイミド官能化ヒアルロン酸及びコンジュゲ−トした薬物を有するマレイミド官能化ヒアルロン酸を示す、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図８】アミン官能化ヒアルロン酸、保護されたジスルフィド官能化ヒアルロン酸、及びチオ−ル官能化ヒアルロン酸を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図９】架橋ヒアルロン酸プロドラッグ組成物を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図１０】架橋ヒアルロン酸プロドラッグ組成物を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図１１】架橋ヒアルロン酸プロドラッグ組成物を調製するための、本開示の一態様による反応スキ−ムである。
【図１２】遊離ＲａｂＦａｂ（青の点と線）と比較した、ＮＺＷ  Ｒａｂｂｉｔｓ（赤の点と線）の架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂから放出された後のＲａｂＦａｂ硝子体のＰＫを示す。
【図１３】Ａ及びＢは、ＮＨＰの目の中での架橋ＨＡヒドロゲルプラセボの最小断片化と粒子移動をを示している。
【図１４】架橋ＨＡヒドロゲルＲａｂｆａｂコンジュゲ−トのウサギの目内の忍容性を示している。
【図１５】架橋ＨＡＧ６．３．１  ＡＡＲコンジュゲ−トのカニクイザルの目内の忍容性を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１５９】
いくつかの態様では、本開示は、概して、架橋したヒアルロン酸（ＨＡ）又はその誘導体若しくは塩を含むヒドロゲルプロドラッグ組成物を調製するための方法に関し、この架橋剤系は生分解性スペ−サ−を有し、架橋したＨＡはコンジュゲ−トした薬物−リンカ−を含み、リンカ−は生理的条件下で薬物を放出することができる。いくつかのこのような態様では、本開示のヒドロゲルＨＡプロドラッグ組成物は、図１、３、５及び９にそれぞれ示されている式１、１０、１６及び２６のものである。本明細書の式、構造及び反応スキ−ムにおいて、炭素、窒素、酸素又は硫黄原子上のあらゆるオ−プンな原子価は、水素原子を表していると理解されたい。
【０１６０】
図１は、本発明による架橋したＨＡ薬物コンジュゲ−ト化合１を示している。化合物１は、後述のようにして調製することができる。化合物１中、薬物部分はリンカ−Ｌ２を介してＨＡ部分に結合しており、このリンカ−は、本明細書で後述するように、可逆的プロドラッグリンカ−部分、及びスペ−サ−Ｌ４である。薬物部分は、やはり本明細書で後述するように、いずれかの治療的又は生物学的活性部分を含みうる。ＨＡ部分は、スペ−サ−Ｌ４によってまとめて結合又は架橋され、Ｌ２−薬物部分はスペ−サ−Ｌ４によりＨＡ部分に結合する。スペ−サ−Ｌ４は、各出現において同じでも異なってもよく、本明細書で後述するように、多くの実施態様において生分解性である。
【０１６１】
スペ−サ−Ｌ４は、ＨＡ部分を架橋するため、及びＬ２−薬物部分をＨＡ部分に結合するために使用される化学の種類により変化しうる。本明細書の多くの実施態様では、本発明の架橋ＨＡ薬物コンジュゲ−トはチオ−ル−マレイミド化学に基づいており、したがってスペ−サ−Ｌ４は、チオ−ルとマレイミドの反応の結果得られるチオスクシンイミド基を含む。しかしながら、ＨＡ部分を架橋するため、及びＬ２−薬物部分を本発明によるＨＡ部分に結合させるために、様々な種類の化学を使用することができることも、本開示の範囲に含まれることを理解されたい。例えば、国際公開第２００３１０１９７２号、国際公開第２０１１１３６６４５号、国際公開第２０１３０３６７４８号及び国際公開第２０１３１７１４８５号に開示されている、アルキンとアジドの反応に基づく「クリック」ケミストリ−（その開示内容は参照により本明細書に包含される）を、ＨＡ部分を架橋させるため、及びＬ２−薬物部分をＨＡ部分に結合するために使用することができる。アクリル系架橋化学、アミン−エポキシド架橋化学、及びその他結合形成化学も本発明に使用することができる。
【０１６２】
また、図２及び３は、本発明による架橋したＨＡ薬物コンジュゲ−トヒドロゲル化合物１０（図３）を示している。化合物１０において、ＨＡ部分をまとめて結合する化合物１のスペ−サ−Ｌ４が、
2020515545.tif 000021
のようにさらに詳細に示されており、Ｌ２−薬物部分をＨＡ部分に結合するスペ−サ−Ｌ４が
2020515545.tif 000022
のようにさらに詳細に示されており、式中のＬ１とＬ３は本明細書に規定される通りである。一般に、化合物１０は、図２及び３に示される方法により調製することができる。第１の工程では、第１のＨＡ化合物２（又はその誘導体若しくは塩）をマレイミド化合物３にコンジュゲ−トさせて、スペ−サ−Ｌ１によりＨＡにコンジュゲ−トしたマレイミド反応性基を含む化合物４を形成する。
【０１６３】
第２の工程では、チオ−ル−Ｌ２−薬物コンジュゲ−ト化合物５を化合物４のマレイミド反応性基と反応させて、コンジュゲ−トした−Ｓ−Ｌ２−薬物コンジュゲ−ト部分を含む化合物６を形成する。いくつかの態様では、Ｌ２は、本明細書の他の部分にさらに記載される、生理的条件下で薬物を制御放出することのできる可逆的プロドラッグリンカ−部分である。化合物５中のチオ−ル基は、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２の一部でありうる。いくつかの態様では、薬物は、目の疾患の治療に有効な抗ＶＥＧＦ分子といった、治療的なものである。化合物４のマレイミド基の等価物は、化合物６が遊離マレイミド基を含むように、薬物コンジュゲ−ト化合物５の等価物を上回る。
【０１６４】
第３の工程では、第２のＨＡ化合物２（又はその誘導体若しくは塩）は、保護された（保護基ＰＧで示す）チオ−ル化合物７とコンジュゲ−トして、スペ−サ−Ｌ３によりＨＡにコンジュゲ−トした保護チオ−ル基を含む化合物８を形成する。いくつかの態様では、Ｌ３は生分解性スペ−サ−部分である。
【０１６５】
第４の工程では、化合物８の保護基が除去されてチオ−ル基を有する化合物９が生成される。特定の実施態様では、保護基は、保護基の除去が還元剤により達成されるように、チオ−ル基を有するジスルフィドである。
【０１６６】
第５の工程では，化合物６と化合物９を混合し、反応させて、架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ化合物１０を形成する。
【０１６７】
図に示すようなマレイミドとチオ−ルの官能化の度合いは、例示のみを目的としており、ＨＡ化合物２中のカルボキシレ−ト基のすべてが反応するわけではなく、大多数の実施態様ではカルボキシレ−ト基の大部分が未反応であることを理解されたい。図２のマレイミド官能化ＨＡ化合物４は、化合物４中のマレイミド官能基の一部が薬物（化合物６中に示される）の結合のために利用可能であるように、十分な度合いの官能化を有し、残りのマレイミド基は、化合物９のチオ−ル基と架橋反応し、最終的に本発明による架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ組成物１０を提供するために利用可能である。例えば、化合物４のマレイミド官能化の度合いは約５％から約１５％であり、チオ−ル化合物９の官能化の度合いは約１％から約７％である。
【０１６８】
特定の実施態様では、マレイミドによるＨＡ化合物４の官能化の度合いは、約６％から約１４％、約７％から約１３％、約８％から約１２％、約１０％から約１２％、及び約９％から約１１％の範囲である。図３に示されるチオ−ルによるＨＡ化合物９の官能化の度合いは、例えば、約１％から約７％、約２％から約６％、及び約３％から約５％の間で変化しうる。
【０１６９】
特定の実施態様では、図２に示されるＨＡ化合物４のマレイミド官能化の度合いは、第１のＨＡ化合物２上の約１０分の１のカルボキシレ−ト基がマレイミドで誘導体化されるように、約１０％である。換言すれば、ＨＡ化合物２がその上にｘ個のカルボキシレ−ト基を有する場合、化合物４は０．１ｘ個のマレイミド基を含む。図３に示されるＨＡ化合物９のチオ−ル官能化の度合いは約４％であり、即ちＨＡ化合物２のｘ個のカルボキシレ−ト基に対し、化合物９には０．０４ｘ個のチオ−ル基が存在する（これに対応して０．０４ｘ個の保護チオ−ル基が化合物８に存在する）。
【０１７０】
化合物６中、平均で約７７％のマレイミドが薬物で置換されることになり、残りの約２３％は化合物９との架橋反応に使用されて、架橋したゲル１０を提供する。したがって、例えば、マレイミドで１０％官能化されている１１６ｋＤａのＨＡの場合、その上に約２８個のマレイミド基が存在し、そのうち約２２個のマレイミド基が薬物により対処される。
４．
【０１７１】
次に、化合物１６の調製を示す図４及び５を参照する。
【０１７２】
第１の工程では、第１のＨＡ化合物２（又はその誘導体若しくは塩）をマレイミド化合物３にコンジュゲ−トさせて、スペ−サ−Ｌ３によりＨＡにコンジュゲ−トしたマレイミド反応性基を含む化合物１１を形成する。
【０１７３】
第２の工程では、第２のＨＡ化合物２（又はその誘導体若しくは塩）は、保護された（ＰＧ）ジスルフィド化合物７とコンジュゲ−トして、スペ−サ−Ｌ１によりＨＡにコンジュゲ−トした保護ジスルフィド基を含む化合物１２を形成する。いくつかの態様では、Ｌ１は生分解性スペ−サ−部分である。
【０１７４】
第３の工程では、化合物１２の保護基が除去されてチオ−ル基を有する化合物１３が生成される。
【０１７５】
第４の工程では、マレイミド−Ｌ２−薬物コンジュゲ−ト化合物１４を化合物１３のチオ−ル反応性基と反応させて、コンジュゲ−トした薬物部分を含む化合物１５を形成する。チオ−ル基の等価物は、化合物１５が遊離チオ−ル基を含むように、化合物１４の等価物を上回る。いくつかの態様では、Ｌ２は、生理的条件下で薬物を制御放出することのできる可逆的プロドラッグリンカ−部分である。いくつかの態様では、薬物は抗ＶＥＧＦ分子である。
【０１７６】
工程５では、それぞれの遊離マレイミド基とチオ−ル基が反応して架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ化合物１６を形成するように、化合物１１と化合物１５が混合される。化合物１６において、ＨＡ部分をまとめて結合する図１に示されるスペ−サ−Ｌ４が、
2020515545.tif 000023
によりさらに詳細に表されており、Ｌ２−薬物部分をＨＡ部分に結合するスペ−サ−Ｌ４が
2020515545.tif 000024
のようにさらに詳細に示されており、式中のＬ１とＬ３は本明細書に規定される通りである。
【０１７７】
上述のように、図示のＨＡ化合物２のカルボキシレ−ト基の官能化の度合いは、恣意的なものであり、例示を目的としている。チオ−ル官能化ＨＡ化合物１３（及び保護チオ−ル官能化化合物１２）は、マレイミド官能化ＨＡ化合物１１より高い官能化の度合いを有するであろう。化合物１３のチオ−ル官能基の一部分は、薬物の結合のために使用され、残りのチオ−ル基は、化合物１１のマレイミド基と架橋反応させて架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ組成物１６を提供するために利用可能である。例えば、化合物１３のチオ−ル官能化の度合いは約５％から約１５％であり、マレイミド化合物１１の官能化の度合いは約１％から約７％である。チオ−ルとマレイミドの官能化の度合いが変動することにより、上述のように本発明のバイオコンジュゲ−ト中において異なる架橋密度及び異なる薬物ロ−ディングの度合いが可能になる。
【０１７８】
いくつかの態様では、図６から９に示されるように、架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグは、（１）第１のアミン官能化ＨＡの調製とそこからのマレイミド官能化ＨＡの調製，（２）第２のアミン官能化ＨＡの調製とそこからのチオ−ル官能化ＨＡの調製，（３）マレイミド基の一部分が薬物−リンカ−コンジュゲ−トとコンジュゲ−トしない、薬物−リンカ−コンジュゲ−トのマレイミド官能化ＨＡへのコンジュゲ−ション、及び（４）第１の官能化ＨＡ上のマレイミド基と第２の官能化ＨＡ上のチオ−ル基の反応による、架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグの形成により調製される。
【０１７９】
図６の工程１では、第１のヒアルロン酸ナトリウム化合物２（又はその酸形態若しくは誘導体）はＨ２Ｎ−ＬＡ−ＮＨ２化合物１７と反応してアミン官能化ＨＡ化合物１８が形成され、この場合のＨＡのアミン官能化の度合いは、約５％から約１５％、約６％から約１４％、約７％から約１３％、約８％から約１２％、約９％から約１１％であるか、又はいくつかの実施態様では約１０％；約１１％；又は約１２％である。いくつかの態様では、ＬＡは、本明細書に規定されるスペ−サ−部分である。
【０１８０】
図６の工程２に示すように、化合物１８はＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ＬＢ−マレイミド化合物１９と反応し、図７に示すマレイミド官能化ＨＡ化合物２０が形成される。いくつかの態様では、ＬＢは、試薬１９のスクシンイミド部分と活性化エステルを形成するスペ−サ−部分である。
【０１８１】
図７の工程３に示すように、化合物２０はチオ−ル薬物コンジュゲ−ト化合物５と反応してプロドラッグ前駆体化合物２１を形成する。Ｌ２は、本明細書に規定される可逆的プロドラッグリンカ−である。
【０１８２】
図８の工程４に示すように、第２のヒアルロン酸ナトリウム化合物２（又はその酸形態若しくは誘導体）はＨ２Ｈ−ＬＡ−ＮＨ２化合物１７と反応してアミン官能化ＨＡ（化合物２２）を形成する。ＨＡのアミン官能化の度合いは、約１％から約７％、約２％から約６％、約３％から約５％の間で変動してよく、特定の実施態様では４％である。
【０１８３】
図８の工程５にさらに示すように、化合物２２はＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ＬＣ−Ｓ保護基（「ＰＧ」と示す保護基）化合物２３と反応して化合物２４を形成する。次いで化合物２４が工程６で脱保護されて保護基が除去され、チオ−ル官能化ＨＡ化合物２５が形成される。いくつかの態様では、ＬＣは、試薬２３のスクシンイミド部分と活性化エステルを形成する生分解性スペ−サ−部分である。図９に示すように、プロドラッグ前駆体化合物２１がチオ−ル官能化ＨＡ化合物２５と架橋し、架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ組成物２６が形成される。化合物２６において、ＨＡ部分をまとめて結合する図１に示されるスペ−サ−Ｌ４が、
2020515545.tif 000025
によりさらに詳細に表されており、Ｌ２−薬物部分をＨＡ部分に結合するスペ−サ−Ｌ４が
2020515545.tif 000026
のようにさらに詳細に表されており、式中のＬＡ、ＬＢ及びＬＣは本明細書に規定される通りである。
【０１８４】
上述の図２〜３の実施態様のように、図６〜９の実施態様では、図７のマレイミド官能化ＨＡ化合物２０は、図８のチオ−ル官能化ＨＡ化合物２５より高い官能化の度合いを有する。化合物２０のマレイミド官能基の一部分は、薬物（化合物２１に示す）の結合のために使用され、残りのマレイミド基は化合物２５のチオ−ル基と架橋反応して本発明による架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ組成物２６を提供するために利用可能である。本明細書の他の部分に関連するマレイミド基及びチオ−ル基の官能化度合いの範囲及び値、架橋密度の範囲及び値、並びに薬物ロ−ディングの範囲及び値は、図６〜９の実施態様にも適用される。
【０１８５】
定義
本明細書において使用されるヒアルロン酸（ＨＡ）は、ＨＡ及びそのいずれかの誘導体及び塩を指す。特定の実施態様では、ＨＡは式：
2020515545.tif 000027
のものであり、式中、Ｒａ１及びＲａ２は、各々独立して、水素、低級アルキル又はその他エステル形成基、金属又はアンモニウム（モノ−、ジ−、トリ−及びテトラ−アルキルアンモニウムを含む）対イオン又は他の種類の対イオンを表す。特定の実施態様では、Ｒａ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル及びアルカリ金属対イオンから選択され、各Ｒａ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル及びアルカリ金属対イオンから選択される。いくつかの態様では、各Ｒａ１はＮａ＋であり、各Ｒａ２はＨである。上に示されるいくつかの可能なＨＡの誘導体においては、ヒドロキシル基は、各々独立して、Ｃ１−４アルキルエ−テル（示さない）又はＣ１−４アルキルエステル（示さない）で置き換えられ、アミド官能性の各々の窒素原子は、Ｃ１−４アルキル（示さない）で置換（アルキル化）されてもよい。ＨＡの数平均分子量は、約１０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１２５ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１７５ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２２５ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約２７５ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３２５ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約３７５ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４２５ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約４７５ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約６５０ｋＤａ、約７００ｋＤａ、及びその範囲、例えば約１０ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａ、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａ、約７５ｋＤａから約１７５ｋＤａ、約１００ｋＤａから約１５０ｋＤａ、又は約１００ｋＤａから約１２５ｋＤａである。
【０１８６】
用語「可逆的プロドラッグリンカ−」又は単純に「リンカ−」は、その一端が可逆的結合を通して薬物、例えばＶＥＧＦ中和薬に結合しており、他端が本発明によるヒドロゲルといった担体への恒久的結合を通して結合することにより薬物を担体に結合する部分を指す。本発明に使用できる例示的可逆的プロドラッグリンカ−は、国際公開第２００９０９５４７９号に開示されており、この開示内容は参照により本明細書に包含される。このような実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−は、式ＸＩＩａ
2020515545.tif 000028
の基であり、式中、
破線は、アミド結合を形成することによる薬物化合物（示さない）の窒素への結合を示し、；
−Ｘ−は、−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｎ（Ｒ４）−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−；−Ｃ（Ｒ５Ｒ５ａ）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｎ（Ｒ６）−；−Ｎ（Ｒ６）−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−Ｏ−；−Ｏ−Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ７Ｒ７ａ）−であり；
Ｘ１はＣ；又はＳ（Ｏ）であり；
−Ｘ２−は、−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−；又は−Ｃ（Ｒ８Ｒ８ａ）−Ｃ（Ｒ９Ｒ９ａ）−であり；
＝Ｘ３は＝Ｏ；＝Ｓ；又は＝Ｎ−ＣＮであり；
−Ｒ１、−Ｒ１ａ、−Ｒ２、−Ｒ２ａ、−Ｒ４、−Ｒ４ａ、−Ｒ５、−Ｒ５ａ、−Ｒ６、−Ｒ８、−Ｒ８ａ、−Ｒ９、−Ｒ９ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；
−Ｒ３、−Ｒ３ａは、独立して、−Ｈ；及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され、但し−Ｒ３、−Ｒ３ａのうちの一つ又はそれら両方が−Ｈ以外である場合、それらはＳＰ３に混成した炭素原子を通してそれらが結合するＮに接続し；
−Ｒ７は−Ｎ（Ｒ１０Ｒ１０ａ）；又は−ＮＲ１０−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ１１であり；
−Ｒ７ａ、−Ｒ１０、−Ｒ１０ａ、−Ｒ１１は、互いに独立して、−Ｈ；又はＣ１−１０アルキルであり；
対−Ｒ１ａ／−Ｒ４ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ１ａ／−Ｒ７ａ、−Ｒ４ａ／−Ｒ５ａ、−Ｒ８ａ／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は化学結合を形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ１ａ、−Ｒ２／−Ｒ２ａ、−Ｒ４／−Ｒ４ａ、−Ｒ５／−Ｒ５ａ、−Ｒ８／−Ｒ８ａ，−Ｒ９／−Ｒ９ａのうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合してＣ３−１０シクロアルキル；又は３から１０員のヘテロシクリルを形成してもよく；
対−Ｒ１／−Ｒ４、−Ｒ１／−Ｒ５、−Ｒ１／−Ｒ６、−Ｒ１／−Ｒ７ａ、−Ｒ４／−Ｒ５、−Ｒ４／−Ｒ６、−Ｒ８／−Ｒ９、−Ｒ２／−Ｒ３のうちの一つ又は複数は、それらが結合する原子と結合して環Ａを形成してもよく；
Ｒ３／Ｒ３ａは、それらが結合する窒素原子と結合して３から１０員の複素環を形成してもよく；
Ａは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ３−１０シクロアルキル；３から１０員のヘテロシクリル；及び８から１１員のヘテロビシクリルからなる群より選択され；
式（ＸＩＩａ）中アスタリスクで印された水素が−Ｌ４又はその他置換基で置き換えられていないことを条件に、式ＸＩＩａの基は−Ｌ４で置換され；
ここでの−Ｌ４−は単一の化学結合であるか、又は本明細書に定義されるスペ−サ−部分であり；
ここでのＣ１−１０アルキルは、本明細書に規定されるように中断されていてもよい及び／又は置換されていてもよい。
【０１８７】
本発明の他の実施態様において使用可能な追加の可逆的プロドラッグリンカ−は、国際公開第０５０９９７６８Ａ２号、同第Ｏ０６１３６５８６Ａ２号、同第２０１１／０１２７２２Ａ１号、同第２０１１／０８９２１４Ａ１号、同第２０１１／０８９２１６Ａ１号、同第２０１１／０８９２１５Ａ１号、同第２０１３／０２４０５３Ａ１号、同第２０１３／１６０３４０Ａ１号、同第２０１６／０２０３７３Ａ１号、同第２０１６／１９６１２４Ａ２号、ＥＰ１５３６３３４Ｂ１、国際公開第２００９／００９７１２号、同第２００８／０３４１２２Ａ１号、同第２００９／１４３４１２Ａ２号、同第２０１１／０８２３６８Ａ２号、米国特許第８６１８１２４Ｂ２号、同第８９４６４０５Ｂ２号、同第８７５４１９０Ｂ２号、国際公開第２０１３／０３６８５７Ａ１号、米国特許第７５８５８３７Ｂ２号及び国際公開第２００２／０８９７８９Ａ１号に記載されており、これらの開示内容は参照により本明細書に包含される。
【０１８８】
多くの実施態様のスペ−サ−又はスペ−サ−部分は、−Ｔ−、−Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ１）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ１ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ１）−、−ＯＣ（ＯＲｙ１）（Ｒｙ１ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１ａ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルから選択することができ；−Ｔ−、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されてもよく、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ３）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ３ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ３）−、−ＯＣ（ＯＲｙ３）（Ｒｙ３ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３ａ）−、及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−からなる群より選択される一つ又は複数の基により中断されていてもよく；
ここで：
−Ｒｙ１と−Ｒｙ１ａは、互いに独立して、−Ｈ、−Ｔ、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルからなる群より選択され；−Ｔ、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されていてもよく、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ４）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ４）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ４ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ４）−、−ＯＣ（ＯＲｙ４）（Ｒｙ４ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ４）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４ａ）−、及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４）−からなる群より選択される一つ又は複数の基により中断されていてもよく；
各Ｔは、独立して、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、３から１０員のヘテロシクリル、８から１１員のヘテロビシクリル、８から３０員のカルボポリシクリル、及び８から３０員のヘテロポリシクリルからなる群より選択され；各Ｔは、独立して、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されていてもよく；
各−Ｒｙ２は、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、オキソ（＝Ｏ）、−ＣＯＯＲｙ５、−ＯＲｙ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒｙ５、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｙ５、−Ｓ（Ｏ）Ｒｙ５、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ５ａＲｙ５ｂ）、−ＳＲｙ５、−Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−ＮＯ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｙ５、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｃ（Ｏ）Ｒｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｓ（Ｏ）２Ｒｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｓ（Ｏ）Ｒｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｃ（Ｏ）ＯＲｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５ａＲｙ５ｂ）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されていてもよく；
各−Ｒｙ３、−Ｒｙ３ａ、−Ｒｙ４、−Ｒｙ４ａ、−Ｒｙ５、−Ｒｙ５ａ及び−Ｒｙ５ｂは、独立して、−Ｈ、及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されていてもよい。
【０１８９】
このようなスペ−サ−は、スペ−サ−部分が少なくとも一つの生分解性結合を含む場合、「生分解性スペ−サ−」である。
【０１９０】
特定の実施態様では、スペ−サ−部分は、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ１）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ１ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ１）−、−ＯＣ（ＯＲｙ１）（Ｒｙ１ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１ａ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルから選択され；−Ｔ−、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ２−２０アルケニル、及びＣ２−２０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されてもよく、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ２−２０アルケニル、及びＣ２−２０アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ３）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ３ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ３）−、−ＯＣ（ＯＲｙ３）（Ｒｙ３ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３ａ）−、及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−からなる群より選択される一つ又は複数の基で中断されていてもよく；
ここで：
−Ｒｙ１と−Ｒｙ１ａは、互いに独立して、−Ｈ、−Ｔ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、及びＣ２−１０アルキニルからなる群より選択され；−Ｔ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、及びＣ２−１０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されていてもよく、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、及びＣ２−１０アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ４）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ４）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ４ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ４）−、−ＯＣ（ＯＲｙ４）（Ｒｙ４ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ４）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４ａ）−、及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ４）−からなる群より選択される一つ又は複数の基により中断されていてもよく；
各Ｔは、独立して、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、３から１０員のヘテロシクリル、８から１１員のヘテロビシクリル、８から３０員のカルボポリシクリル、及び８から３０員のヘテロポリシクリルからなる群より選択され；各Ｔは、独立して、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されていてもよく；
−Ｒｙ２は、ハロゲン、−ＣＮ、オキソ（＝Ｏ）、−ＣＯＯＲｙ５、−ＯＲｙ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒｙ５、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｙ５、−Ｓ（Ｏ）Ｒｙ５、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ５ａＲｙ５ｂ）、−ＳＲｙ５、−Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、−ＮＯ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｙ５、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｃ（Ｏ）Ｒｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｓ（Ｏ）２Ｒｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｓ（Ｏ）Ｒｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｃ（Ｏ）ＯＲｙ５ａ、−Ｎ（Ｒｙ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５ａＲｙ５ｂ）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ５Ｒｙ５ａ）、及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されていてもよく；
各−Ｒｙ３、−Ｒｙ３ａ、−Ｒｙ４、−Ｒｙ４ａ、−Ｒｙ５、−Ｒｙ５ａ及び−Ｒｙ５ｂは、互いに独立して、−Ｈ、及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されていてもよい。
【０１９１】
このようなスペ−サ−は、スペ−サ−部分が少なくとも一つの生分解性結合を含む場合、「生分解性スペ−サ−」である。
【０１９２】
また他の実施態様では、スペ−サ−部分は、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ１）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ１ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ１）−、−ＯＣ（ＯＲｙ１）（Ｒｙ１ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１ａ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）−、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルから選択され；ここで−Ｔ−、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数の−Ｒｙ２で置換されてもよく、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−５０アルケニル、及びＣ２−５０アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｙ３）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｙ３ａ）−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｙ３）−、−ＯＣ（ＯＲｙ３）（Ｒｙ３ａ）−、−Ｎ（Ｒｙ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３ａ）−、及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ３）−からなる群より選択される一つ又は複数の基により中断されていてもよく；
ここで：
−Ｒｙ１及び−Ｒｙ１ａは、独立して、−Ｈ、−Ｔ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、及びＣ２−１０アルキニルから選択され；
各Ｔは、独立して、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、３から１０員のヘテロシクリル、８から１１員のヘテロビシクリル、８から３０員のカルボポリシクリル、及び８から３０員のヘテロポリシクリルからなる群より選択され；
各−Ｒｙ２は、独立して、ハロゲン、及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され；
各−Ｒｙ３、−Ｒｙ３ａ、−Ｒｙ４、−Ｒｙ４ａ、−Ｒｙ５、−Ｒｙ５ａ及び−Ｒｙ５ｂは、互いに独立して、−Ｈ、及びＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されていてもよい。
【０１９３】
このようなスペ−サ−は、スペ−サ−部分が少なくとも一つの生分解性結合を含む場合、「生分解性スペ−サ−」である。さらなる実施態様では、スペ−サ−部分は、Ｃ１−２０アルキル鎖であり、独立して−Ｏ−、−Ｔ−及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ１）から選択される一つ又は複数の基により中断されていてもよく；このＣ１−２０アルキル鎖は、−ＯＨ、−Ｔ及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｙ６Ｒｙ６ａ）から独立して選択される一つ又は複数の基で置換されてもよく；ここで−Ｒｙ１、−Ｒｙ６、−Ｒｙ６ａは、Ｈ及びＣ１−４アルキルからなる群より独立して選択され、Ｔは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、３から１０員のヘテロシクリル、８から１１員のヘテロビシクリル、８から３０員のカルボポリシクリル、及び８から３０員のヘテロポリシクリルからなる群より選択される。
【０１９４】
このようなスペ−サ−は、スペ−サ−部分が少なくとも一つの生分解性結合を含む場合、「生分解性スペ−サ−」である。
【０１９５】
生分解性結合は、例えばエステル又はカ−ボネ−ト結合でよい。
【０１９６】
本明細書において使用される「ＴＡＧ」及び「精製タグ」は、第２の部分にコンジュゲ−トしたとき、（ａ）タグ部分を持たない前記第２の部分には存在しない一つ又は複数の物理的及び／又は化学的特性を付与する部分であって、その一つ又は複数の異なる物理的及び／又は化学的特性が、そのようなコンジュゲ−トの精製を可能にする部分を指す。
【０１９７】
本明細書において使用される「保護基」又は「ＰＧ」は、化学反応プロセスの間に官能基の可逆的保護して前記化学反応プロセスにおいてそれら官能基を本質的に非反応性にする部分を指す。
【０１９８】
本明細書において使用される用語「プロドラッグ」は、薬物が可逆的リンカ−部分に共有結合的且つ可逆的にコンジュゲ−トしているコンジュゲ−トを意味し、この可逆的プロドラッグリンカ−部分は、本発明によるヒドロゲルといった担体に結合したスペ−サ−部分を通して直接的又は間接的である。プロドラッグは生理的条件下で薬物を放出する（水性バッファ−、３７．４℃、（ｐＨ７．４））。放出されたこのような薬物は、非修飾のものでよく、これは放出された薬物に結合したまま残る可逆的プロドラッグリンカ−部分からの残留物がないことを意味する。
【０１９９】
本明細書において使用される用語「薬物」は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物、及びヒトを含むがそれらに限定されない生物有機体のいずれかの物理的又は生化学的特性に影響を与えうる物質を指す。特に、本明細書において使用される用語は、生物体、特にヒト又は動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療、又は予防を目的とした、或いはそれ以外の方法で生物体、特にヒト又は動物の身体的又は精神的健康状態を増進するためのあらゆる物質を含む。いくつかの態様では、薬物は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォ−ミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォ−ミング増殖因子ベ−タ（ＴＧＦβ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンギオゲニン、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インタ−ロイキン−１（ＩＬ−１）、インタ−ロイキン−８（ＩＬ−８）、インタ−ロイキン−１２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン−Ｉ、Ｄｅｌ−Ｉ、ホリスタチン、顆粒球コロニ−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、レプチン、ミドカイン、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、アンギオアレスチン、アンギオスタチンプラスミノゲン断片、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤＳ９補体断片、エンドスタチンコラ−ゲンＸＶＩＩＩ断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベ−タ、ヘパリナ−ゼ、ヘパリン六糖断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インタ−フェロンアルファ／ベ−タ／ガンマ、インタ−フェロン誘導タンパク質（ＩＰ−ＩＯ）、クリングルＳプラスミノゲン断片、メタロプロテイナ−ゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオ−ル、胎盤リボヌクレア−ゼ阻害剤、プラスミノゲンアクチベ−タ−阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾル−Ｓ、トロンボスポンジン−Ｉ（ＴＳＰ−Ｉ）、バスキュロスタチン、バソスタチンカルレティキュリン断片、プロスタグランジン受容体、成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、スフィンゴシン−１−ホスフェ−ト、Ｄ因子、ＲＴＰ８０１、補体の阻害剤、α２アドレナリン作動アゴニスト、ｍＴＯＲ、毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、水晶体上皮細胞由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）、杆体由来錐体生存率（ＲｄＣＶＦ）、色素上皮細胞由来因子（ＰＥＤＦ）、好中球−活性化タンパク質、単球化学誘因物質タンパク質、マクロファ−ジ−炎症タンパク質、小さな誘導性分泌（ＳＩＳ）タンパク質、血小板因子、血小板塩基性タンパク質、メラノ−マ増殖刺激活性、上皮増殖因子、神経成長因子、骨形成タンパク質、骨成長軟骨−誘導因子、インタ−ロイキン、インタ−ロイキン阻害剤、インタ−ロイキン受容体、造血因子、顆粒球コロニ−刺激因子、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インヒビン、及びアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎｇ）からなる群より選択��れる一つ又は複数のタンパク質の活性を調節する生物学的に活性な部分である。いくつかの態様では、薬物はＶＥＧＦアンタゴニストである。用語「薬物」は、遊離した薬物と比較して水素を欠く、コンジュゲ−トした薬物にも試用される。
【０２００】
本明細書において使用される用語「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ発現量を低減し、又はＶＥＧＦ生物活性（一つ又は複数のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合、ＶＥＧＦシグナル伝達、並びにＶＥＧＦ媒介性血管新生及び内皮細胞の生存又は増殖を含むが、これらに限定されない）を中和、遮断、阻害、抑制、低減、又は妨害することのできる分子を指す。例えば、ＶＥＧＦ生物活性を中和、遮断、阻害、抑制、低減、又は妨害することのできる分子は、一つ又は複数のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、又は可溶型ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））に結合することによりその効果を発揮することができる。本発明の方法に有用なＶＥＧＦアンタゴニストとして含まれるものは、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合しそれによって一つ又は複数のレセプタ−への結合を隔離するレセプタ−分子及びその誘導体、融合タンパク質（例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、並びにＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）である。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦポリペプチドをコ−ドする核酸分子の少なくとも断片に相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマ−である、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体；ＶＥＧＦポリペプチドをコ−ドする核酸分子の少なくとも断片に相補的なｓｍａｌｌ  ＲＮＡ；ＶＥＧＦを標的とするリボザイム；ＶＥＧＦに対するペプチボディ；及びＶＥＧＦ  アプタマ−も含む。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ抗体、及びその抗原結合断片に結合するポリペプチド、並びに、ＶＥＧＦＲに結合し、それによりＶＥＧＦ生物活性（例えばＶＥＧＦシグナル伝達）を遮断、阻害、抑制、低減又は妨害する誘導体、或いは融合タンパク質も含む。ＶＥＧＦアンタゴニストはまた、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲに結合する非ペプチド小分子も含み、ＶＥＧＦ生物活性を、遮断、阻害、抑制、低減、又は妨害することができる。したがって、「ＶＥＧＦ活性」は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介性生物活性を特に含む。特定の実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上ＶＥＧＦの発現量又は生物活性を低減又は阻害する。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストにより阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ（８−１０９）、ＶＥＧＦ（１−１０９）、又はＶＥＧＦ１６５である。
【０２０１】
本明細書において使用されるＶＥＧＦアンタゴニストには、限定されないが、抗ＶＥＧＦＲ２抗体及び関連分子（例えば、ラムシルマブ、タニビルマブ、アフリベルセプト）、抗ＶＥＧＦＲ１抗体及び関連分子（例えば、イクルクマブ、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ；ＥＹＬＥＡ（登録商標））、及びｚｉｖ−アフリベルセプト（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ；ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）））、二重特異性ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＭＰ−０２５０、バヌシズマブ（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）、並びに米国特許出願公開第２００１／０２３６３８８号に開示される二重特異性抗体）、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ１、及び抗ＶＥＧＦＲ２ア−ムのうちの二つの組み合わせを含む二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、セバシズマブ、及びラニビズマブ）、並びに非ペプチド小分子ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、パゾパニブ、アキシチニブ、バンデタニブ、スチバ−ガ、カボザンチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、テラチニブ、ドビチニブ、セディラニブ、モテサニブ二リン酸塩、スルファチニブ、アパチニブ、フォレチニブ、ファミチニブ、及びチボザニブ）が含まれうる。さらなるＶＥＧＦアンタゴニストを後述する。
【０２０２】
「障害」は、本明細書に記載される抗体コンジュゲ−トを用いた治療から恩恵を受けるであろういずれかの状態である。例えば、異常な血管新生（過度の、不適切な又は制御されていない血管新生）又は血管透過性に罹患している哺乳動物又はその予防を必要としている哺乳動物。これは、哺乳動物を問題の障害に罹患し易くするような病態を含む、慢性及び急性の障害又は疾病を含む。ここで治療される障害の非限定的な例には、病的血管新生（例えば、眼の障害及び細胞増殖性疾患）を伴う障害、及び望ましくない血管透過性を伴う障害が含まれる。
【０２０３】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【０２０４】
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患のいずれかの直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、疾患の進行速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体コンジュゲ−ト又は本発明の抗体コンジュゲ−トを含む他の組成物（例えば、薬学的製剤）は、疾患の発生を遅らせるため又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０２０５】
用語「中断」は、二つの炭素原子間にある部分が挿入されること、又はこのような挿入がその部分の端部の一方において行われる場合、炭素又はヘテロ原子と水素原子の間、好ましくは炭素と水素原子の間に挿入されることを意味する。このような原子と部分の非限定的な例には、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（置換された）−、−ＮＣ（Ｏ）−及び−ＯＣ（Ｏ）−が含まれる。
【０２０６】
本明細書において使用される用語「Ｃ１−４アルキル」は、単独で又は組み合わせで、１から４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル部分を意味する。分子の端部に存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１−４アルキルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチルである。分子の二つの部分がＣ１−４アルキルにより結合されるとき、そのようなＣ１−４アルキル基の例は、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。Ｃ１−４アルキル炭素の各水素は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもよい。Ｃ１−４アルキルは、上記に定義された一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。
【０２０７】
本明細書において使用される用語「Ｃ１−６アルキル」は、単独で又は組み合わせで、１から６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル部分を意味する。分子の端部に存在する場合、直鎖及び分岐Ｃ１−６アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル及び３，３−ジメチルプロピルである。分子の二つの部分がＣ１−６アルキル基により結合されるとき、このようなＣ１−６アルキル基の例は、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−及び−Ｃ（ＣＨ３）２−である。Ｃ１−６炭素の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもい。Ｃ１−６アルキルは、上記に定義された一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。したがって、「Ｃ１−１０アルキル」，「Ｃ１−２０アルキル」又は「Ｃ１−５０アルキル」は、それぞれ１から１０、１から２０又は１から５０個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味し、Ｃ１−１０、Ｃ１−２０又はＣ１−５０炭素の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもよい。Ｃ１−１０又はＣ１−５０アルキルは、上記に定義された一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。
【０２０８】
本明細書において使用される用語「アルキレン」は、二価の飽和した脂肪族ラジカル、例えばメチレン、エチレン、プロピレンなどを指す。
【０２０９】
本明細書において使用される用語「Ｃ２−６アルケニル」は、単独で又は組み合わせで、２から６個の炭素原子を有する少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素部分を意味する。分子の端部に存在する場合、例は、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−ＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ２である。分子の二つの部分がＣ２−６アルケニル基により結合されるとき、このようなＣ２−６アルケニルの例は−ＣＨ＝ＣＨ−である。Ｃ２−６アルケニル部分の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもい。Ｃ２−６アルケニルは、上記に定義された一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。したがって、用語「Ｃ２−１０アルケニル」、「Ｃ２−２０アルケニル」又は「Ｃ２−５０アルケニル」は、単独で又は組み合わせで、２から１０、２から２０又は２から５０個の炭素原子を有する少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素部分を意味する。Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−２０アルケニル又はＣ２−５０アルケニル基の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもよい。Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−２０アルケニル又はＣ２−５０アルケニルは、以下に定義される一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。
【０２１０】
本明細書において使用される用語「Ｃ２−６アルキニル」は、単独で又は組み合わせで、２から６個の炭素原子を有する少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素部分を意味する。分子の端部に存在する場合、例は、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及びＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３である。分子の二つの部分がアルキニル基により結合されるとき、例は−Ｃ≡Ｃ−である。Ｃ２−６アルキニル基の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもよい。一つ又は複数の二重結合が発生していてもよい。Ｃ２−６アルキニルは、以下に定義される一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。したがって、本明細書において使用される用語「Ｃ２−１０アルキニル」、「Ｃ２−２０アルキニル」又は「Ｃ２−５０アルキニル」は、単独で又は組み合わせで、それぞれ２から１０、２から２０又は２から５０個の炭素原子を有する少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖又は分岐の炭化水素部分を意味する。Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ２−２０アルキニル又はＣ２−５０アルキニル基の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えられていてもよい。一つ又は複数の二重結合が発生していてもよい。Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ２−２０アルキニル又はＣ２−５０アルキニルは、以下に定義される一つ又は複数の部分によって中断されていてもよい。
【０２１１】
上述のように、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ１−５０アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−２０アルケニル、Ｃ２−５０アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ２−２０アルケニル又はＣ２−５０アルキニルは、好ましくは
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からなる群より選択される一つ又は複数の部分によって中断されていてもよく、上式中、
破線はこの部分又は試薬の残りに対する結合を示し；
−Ｒ及び−Ｒａは、互いに独立して、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルからなる群より選択される。
【０２１２】
本明細書において使用される用語「Ｃ３−１０シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の、３から１０個の炭素原子を有する環状アルキル鎖、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル又はシクロデシルを意味する。Ｃ３−１０シクロアルキル炭素の各水素原子は、上記に定義された置換基によって置き換えることができる。用語「Ｃ３−１０シクロアルキル」は、ノルボルナン又はノルボルネンのような架橋した二つの環も含む。
【０２１３】
用語「８から３０員のカルボポリシクリル」又は「８から３０員の炭素多環」は、８から３０個の環原子を有する二つ以上の環の環状部分を意味し、この場合二つの隣接する環は少なくとも一つの環原子を共有し、それは最大数までの二重結合（完全に若しくは部分的に飽和した、又は不飽和の、芳香族又は非芳香族環）を含みうる。好ましくは８から３０員のカルボポリシクリルは、２、３、４又は５、好ましくは２、３又は４の環の環状部分を意味する。
【０２１４】
本明細書において使用される用語「３から１０員のヘテロシクリル」又は「３から１０員の複素環」は、最大数までの二重結合（完全に若しくは部分的に飽和した、又は不飽和の、芳香族又は非芳香族環）を含みうる３、４、５、６、７、８、９又は１０の環原子を有する環を意味し、この場合少なくとも一つの環原子から最大４の環原子は、硫黄（−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）からなる群より選択されるヘテロ原子によって置き換えられ、環は分子の残りに炭素又は窒素原子を介して結合している。３から１０員の複素環の例には、限定されないが、アジリジン、オキシラン、チイラン、アジリン、オキシレン、チイレン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、フラン、チオフェン、ピロ−ル、ピロリン、イミダゾ−ル、イミダゾリン、ピラゾ−ル、ピラゾリン、オキサゾ−ル、オキサゾリン、イソオキサゾ−ル、イソキサゾリン、チアゾ−ル、チアゾリン、イソチアゾ−ル、イソチアゾリン、チアジアゾ−ル、チアジアゾリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、チアジアゾリジン、スルホラン、ピラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、イミダゾリジン、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、テトラゾ−ル、トリアゾ−ル、トリアゾリジン、テトラゾリジン、ジアゼパン、アゼピン及びホモピペラジンが含まれる。３から１０員のヘテロシクリル又は３から１０員の複素環式基の各水素原子は、以下に定義される置換基によって置き換えることができる。
【０２１５】
本明細書において使用される用語「８から１１員のヘテロビシクリル」又は「８から１１員のヘテロ二環」は、８から１１の環原子を有する二つの環の複素環式部分を意味し、ここで少なくとも一つの環原子は両方の環によって共有されており、これは最大数までの二重結合（完全に若しくは部分的に飽和した、又は不飽和の、芳香族又は非芳香族環）を含み、少なくとも一つの環原子から最大６の環原子は、硫黄（−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）からなる群より選択されるヘテロ原子によって置き換えられており、環は分子の残りに炭素又は窒素原子を介して結合している。８から１１員のヘテロ二環の例は、インド−ル、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾキサゾ−ル、ベンゾイソキサゾ−ル、ベンゾチアゾ−ル、ベンゾイソチアゾ−ル、ベンズイミダゾ−ル、ベンズイミダゾリン、キノリン、キナゾリン、ジヒドロキナゾリン、キノリン、ジヒドロキノリン、テトラヒドロキノリン、デカヒドロキノリン、イソキノリン、デカヒドロイソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロイソキノリン、ベンズアゼピン、プリン及びプテリジンである。８から１１員のヘテロ二環という用語は、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカンのような二つの環のスピロ構造又は８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクタンのような架橋した複素環も含む。８から１１員のヘテロビシクリル又は８から１１員のヘテロ二環炭素の各水素原子は、以下に定義される置換基によって置き換えることができる。
【０２１６】
同様に、用語「８から３０員のヘテロポリシクリル」又は「８から３０員のヘテロ多環」は、８から３０の環原子、好ましくは３、４又は５の環を有する二を超える環の複素環式部分を意味し、この場合二つの隣接する環は少なくとも一つの環原子を共有し、これは最大数までの二重結合（完全に若しくは部分的に飽和した、又は不飽和の、芳香族又は非芳香族環）を含み、少なくとも一つの環原子から最大１０の環原子は、硫黄（-Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）の群より選択されるヘテロ原子によって置換され、環は分子の残りに炭素又は窒素原子を介して結合している。
【０２１７】
本明細書において使用される「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨ−ドを意味する。ハロゲンがフルオロ又はクロロであることが通常好ましい。
【０２１８】
本明細書において使用される用語「部分的に不飽和」は、環原子間に少なくとも一つの二重又は三重結合を含むが芳香族でない環部分を指す。用語「部分的に不飽和」は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図しているが、本明細書に定義されるように、アリ−ル又はヘテロアリ−ル部分を含むことは意図していない。
【０２１９】
スペ−サ−部分又はその他の化学種に関して本明細書において使用される用語「生分解性」は、スペ−サ−部分又は化学種が、生物学的又は生理的条件下において分解又は結合解裂を受けることができることを意味する。生分解は、加水分解、酵素的切断又は他の機序を介して起こりうる。本明細書に記載されるスペ−サ−部分は、硝子体への注射又は曝露の１２カ月以内の半減期、いくつかの実施態様では６カ月以下の半減期で起こる、結合解裂反応による硝子体の流体の分解を受ける。スペ−サ−部分の生分解は、スペ−サ−部分を他の基に結合する化学結合、並びにスペ−サ−部分内部の化学結合において起こりうる。
【０２２０】
本明細書において使用される用語「置換されて（いて）もよい」は、別途断りのない限り、一つの基が、その基について列挙された置換基のうちの一つ又は複数（例えば、１、２、３又は４）により置換されてよく、前記置換基が同じでも異なってもよいことを意味する。いくつかの態様では、置換されていてもよい基は１の置換基を有する。別の態様では、置換されていてもよい基は２の置換基を有する。別の態様では、置換されていてもよい基は３の置換基を有する。
【０２２１】
本明細書においてアルキル、アルケニル、アルキニル又はアルキレンと共に使用される用語「中断」は、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアルキレンが中断されるように、一つ又は複数の炭素原子が官能基又はヘテロ原子で置き換えられることを意味する。アルキル、アルケニル、アルキニル又はアルキレンを中断することのできる例示的な基には、本明細書において別途断りのない限り、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）２−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１７ａ）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ１７）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１７；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）２−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７ａ）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７Ｒ１７ａ）が含まれ、ここでＲ１７は各出現において独立にＨ又はＣ１−５０アルキルである。
【０２２２】
用語「置換」とは、分子の一つ又は複数の−Ｈ原子が、「（一つ又は複数の）置換基」と呼ばれる異なる原子又は原子の群により置き換えられることを意味する。適切な置換基は、ハロゲン；ＣＮ；ＣＯＯＲ１５；ＯＲ１５；Ｃ（Ｏ）Ｒ１５；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５Ｒ１５ａ）；Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１５Ｒ１５ａ）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５Ｒ１５ａ）；Ｓ（Ｏ）２Ｒ１５；Ｓ（Ｏ）Ｒ１５；Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１５ａＲ１５ｂ）；ＳＲ１５；Ｎ（Ｒ１５Ｒ１５ａ）；ＮＯ２；ＯＣ（Ｏ）Ｒ１５；Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｒ１５ａ；Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｒ１５ａ；Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）Ｒ１５ａ；Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５ａ；Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５ａＲ１５ｂ）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５Ｒ１５ａ）；Ｔ；Ｃ１−５０アルキル；Ｃ２−５０アルケニル；又はＣ２−５０アルキニルからなる群より選択され、ここでＴ；Ｃ１−５０アルキル；Ｃ２−５０アルケニル；及びＣ２−５０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数のＲ１６で置換されていてもよく、Ｃ１−５０アルキル；Ｃ２−５０アルケニル；及びＣ２−５０アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）２−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１７ａ）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ１７）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１７；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）２−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７ａ）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７Ｒ１７ａ）からなる群より選択される一つ又は複数の基により中断されていてもよい。いくつかのこのような態様では、Ｒ１５、Ｒ１５ａ、Ｒ１５ｂ  は、Ｈ；Ｔ；及びＣ１−５０アルキル；Ｃ２−５０アルケニル；又はＣ２−５０アルキニルからなる群より独立して選択され、ここでＴ；Ｃ１−５０アルキル；Ｃ２−５０アルケニル；及びＣ２−５０アルキニルは、同じ又は異なる一つ又は複数のＲ１６で置換されてもよく、Ｃ１−５０アルキル；Ｃ２−５０アルケニル；及びＣ２−５０アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−；−Ｓ（Ｏ）２−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１７ａ）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ１７）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１７；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）２−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７ａ）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１７Ｒ１７ａ）からなる群より選択される一つ又は複数の基で中断されていてもよい。いくつかのこのような態様では、Ｔは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ３−１０シクロアルキル；４から７員のヘテロシクリル；又は８から１１員のヘテロビシクリルからなる群より選択され、ここでＴは、同じ又は異なる一つ又は複数のＲ１６で置換されてもよい。いくつかのこのような態様では、Ｒ１６は、ハロゲン；ＣＮ；オキソ（＝Ｏ）；ＣＯＯＲ１８；ＯＲ１８；Ｃ（Ｏ）Ｒ１８；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１８Ｒ１８ａ）；Ｓ（Ｏ）２���（Ｒ１８Ｒ１８ａ）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１８Ｒ１８ａ）；Ｓ（Ｏ）２Ｒ１８；Ｓ（Ｏ）Ｒ１８；Ｎ（Ｒ１８）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１８ａＲ１８ｂ）；ＳＲ１８；Ｎ（Ｒ１８Ｒ１８ａ）；ＮＯ２；ＯＣ（Ｏ）Ｒ１８；Ｎ（Ｒ１８）Ｃ（Ｏ）Ｒ１８ａ；Ｎ（Ｒ１８）Ｓ（Ｏ）２Ｒ１８ａ；Ｎ（Ｒ１８）Ｓ（Ｏ）Ｒ１８ａ；Ｎ（Ｒ１８）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１８ａ；Ｎ（Ｒ１８）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１８ａＲ１８ｂ）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１８Ｒ１８ａ）；又はＣ１−６アルキルであり、ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されてもよい。いくつかのこのような態様では、Ｒ１７、Ｒ１７ａ、Ｒ１８、Ｒ１８ａ、Ｒ１８ｂは、Ｈ；又はＣ１−６アルキルからなる群より独立して選択され、ここでＣ１−６アルキルは、同じ又は異なる一つ又は複数のハロゲンで置換されてもよい。
【０２２３】
本明細書において使用される「アルカリ金属対イオン」は、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＬｉ＋を指す。
【０２２４】
本明細書において使用される用語「ヒドロゲル」は、共有結合性の化学架橋の存在により不溶性である、ホモポリマ−又はコポリマ−を含む親水性又は両親媒性ポリマ−網目構造を意味する。
【０２２５】
本明細書において使用される用語「数平均分子量」は、個々のポリマ−の分子量の通常の算術平均を意味する。当業者であれば、重合反応から得られる重合生成物がすべて同じ分子量を有するわけではなく、むしろ分子量分布を呈することを理解する。結果として、本明細書において使用される分子量範囲、分子量、ポリマ−中のモノマ−数の範囲、及びポリマ−中のモノマ−数は、モノマ−の数平均分子量及び数平均を指す。
【０２２６】
本明細書において使用される用語「薬学的組成物」は、一つ又は複数の活性成分、及び一つ又は複数の不活性成分、並びにそれら成分のうちのいずれか二つ以上の組み合わせ、複合体形成又は凝集から、又はそれら成分のうちの一つ又は複数の解離から、或いはそれら成分のうちの一つ又は複数の他の種類の反応又は相互作用から直接的又は間接的に生じるいずれかの生成物を含む組成物を指す。
【０２２７】
本明細書において使用される用語「添加物」は、治療剤、即ちＶＥＧＦ中和プロドラッグ、例えば抗ＶＥＧＦ抗体を投与する希釈剤、アジュバント、又はビヒクルを指す。このような製薬添加物は、水；ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含むがこれらに限定されない動物、植物又は合成起源の油及び石油；デンプン；グルコ−ス；ラクト−ス；スクロ−ス；マンニト−ル；トレハロ−ス；ゼラチン；麦芽；米；小麦粉；チョ−ク；シリカゲル；ステアリン酸ナトリウム；グリセロ−ルモノステアリン酸塩；タルク；塩化ナトリウム；脱脂粉乳；グリセロ−ル；プロピレン；グリコ−ル；エタノ−ル；アセテ−ト；スクシネ−ト；トリス；炭酸塩；ホスフェ−ト；ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）；ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）；ポロキサマ−；ポロキサミン；ＣＨＡＰＳ；Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）；例えば、グリシン、リジン、又はヒスチジンのようなアミノ酸；トリグリセリド；マンニト−ル；ラクト−ス；デンプン；ステアリン酸マグネシウム；サッカリンナトリウム；セルロ−ス；及び炭酸マグネシウムとすることができる。適切な製薬添加物の例は、”Remington's Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martinに記載されている。製剤は投与様式に適していなければならない。
【０２２８】
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、分子又は試薬が、動物、好ましくはヒトに使用するために、ＥＭＡ（欧州）及び／又はＦＤＡ（米国）及び／又は他のいずれかの国の監督機関といった監督機関によって承認されていることを意味する。
【０２２９】
本明細書における目的のための「アクセプタ−ヒトフレ−ムワ−ク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレ−ムワ−ク又はヒトコンセンサスフレ−ムワ−クから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレ−ムワ−ク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレ−ムワ−クのアミノ酸配列を含有するフレ−ムワ−クである。ヒト免疫グロブリンのフレ−ムワ−ク又はヒトコンセンサスフレ−ムワ−ク「に由来する」アクセプタ−ヒトフレ−ムワ−クは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプタ−ヒトフレ−ムワ−クは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレ−ムワ−ク配列又はヒトコンセンサスフレ−ムワ−ク配列と配列が同一である。
【０２３０】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パ−トナ−（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバ−間の１：１の相互作用を反映する本質的な結合親和性を指す。一般的に、分子Ｘのそのパ−トナ−Ｙに対する親和性は、解離定数（ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的且つ例示的な実施態様は、以下で説明される。
【０２３１】
「親和性成熟」抗体は、改変を有さない親抗体と比較して、一つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）及び／又はフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）に抗原に対する抗体の親和性に改善をもたらす一つ又は複数の改変を有する抗体を指す。
【０２３２】
用語「血管内皮増殖因子」又は「ＶＥＧＦ」は、配列番号４７により例示される血管内皮増殖因子プロテインＡを指す（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１５６９２、Ｇｅｎｅ  ＩＤ（ＮＣＢＩ）：７４２２も参照のこと）。用語「ＶＥＧＦ」は、配列番号４７のアミノ酸配列と、そのホモログ及びアイソフォ−ムを有するタンパク質を包含する。用語「ＶＥＧＦ」は、既知のアイソフォ−ム、例えば、ＶＥＧＦのスプライスアイソフォ−ム、例えば、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、及びＶＥＧＦ２０６を、天然に存在する対立遺伝子及びＶＥＧＦ１６５のプラスミン切断により生成される１１０−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子を含むその処理形態と共に包含する（Ferrara Mol. Biol. Cell. 21:687 （2010）, Leung et al., Science, 246:1306 （1989）, and Houck et al., Mol. Endocrin., 5:1806 （1991）に記載）。また、用語「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物種由来のＶＥＧＦも指す。時に特異的な種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦに対するｈＶＥＧＦ、マウスのＶＥＧＦに対するｍＶＥＧＦなどの用語により示される。用語「ＶＥＧＦ」は、１６５−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８から１０９又は１から１０９を含むポリペプチドの欠失型を指すためにも用いられる。そのようなＶＥＧＦの形態のいずれかへの言及は、本出願では、例えば、「ＶＥＧＦ１０９」、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」により同定してもよい。「欠失型の」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示される。例えば、欠失型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７（メチオニン）でもある。欠失型の天然ＶＥＧＦは、天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプタ−結合親和性を有する。本明細書において使用される用語「ＶＥＧＦ変異体」は、天然ＶＥＧＦ配列に一つ又は複数のアミノ酸変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを指す。一つ又は複数のアミノ酸変異は、アミノ酸置換（複数可）を含んでもよい。本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体の略称のために、数字は推定される天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を表すことに注意されたい（Leung et al.、上掲及びHouck et al.、上掲）。特に断らない限り、本明細書に記載される用語「ＶＥＧＦ」はＶＥＧＦ−Ａを示す。
【０２３３】
用語「抗ＶＥＧＦ抗体」、「ＶＥＧＦに結合する抗体」、及び「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」は、ＶＥＧＦを標的とするうえで抗体が診断剤及び／又は治療剤として有用であるために十分な親和性でＶＥＧＦに結合できる抗体を指す。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体の、無関係な、非ＶＥＧＦタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＶＥＧＦへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＶＥＧＦに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、異なる種由来のＶＥＧＦに保存されているＶＥＧＦのエピト−プに結合する。
【０２３４】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクロ−ナル抗体、ポリクロ−ナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【０２３５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。いくつかの事例では、抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ  ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【０２３６】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片が生じ、消化は容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、軽（Ｌ）鎖全体並びに重（Ｈ）鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び一つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のペプシン処理により単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは凡そ、二価の抗原結合活性を有するジスルフィド結合した二つのＦａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基をさらに有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ−Ｃ分子は、配列が第１のヒンジシステインで切断されるように発現され、その結果発現時に直接遊離システインを有するＦａｂがもたらされるＦａｂ分子である（例えば、Shatz et al. Mol. Pharmaceutics 2016; PubMed identifier （PMID） 27244474参照）。例えば、Ｆａｂ−Ｃ分子は、重鎖のＣｙｓ２２７位に遊離システインを有する。他の場合には、Ｆａｂ−Ｃ分子は、重鎖のＣｙｓ２２９位に遊離システインを有する。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオ−ル基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【０２３７】
本明細書では、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付け方式に従う。
【０２３８】
「Ｆｖ」は、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これら二つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する六つの超可変ル−プ（それぞれＨ鎖及びＬ鎖に由来する３つのル−プ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な三つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、しばしば結合部位全体よりも親和性が低くなるものの、抗原を認識して結合する能力を有している。
【０２３９】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に接続するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカ−をさらに含み、それはｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説については、例えば、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 （1994）を参照のこと。
【０２４０】
用語「ダイアボディ」は、ｓＦｖ断片（前段落参照）を、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に短いリンカ−（約５〜１０の残基）を用いて構築し、Ｖドメインの鎖内ペアリングではなく鎖間ペアリングを達成させることにより二価の断片、即ち二つの抗原結合部位を有する断片をつくることにより調製される小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、二つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する二つの「クロスオ−バ−」Ｆｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第９３／０１１６１号；及びＥＰ４０４，０９７；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444−6448(1993)にさらに詳細に記載されている。
【０２４１】
「阻止」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物活性を阻害又は低減する抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、実質的に又は完全に抗原の生物活性を阻害する。
【０２４２】
参照抗体と「同じエピト−プに結合する抗体」とは、 競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【０２４３】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【０２４４】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０２４５】
「親抗体」は、そこから一つ又は複数のアミノ酸残基が一つ又は複数の残基によって置き換えられるアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然型又は野生型の配列を含みうる。親抗体は、抗体の他の天然型、野生型又は修飾型に対する既存のアミノ酸配列修飾（例えば追加、欠失及び／又は置換）を有していてもよい。親抗体は、対象の標的抗原、例えば、ＶＥＧＦといった生物学的に重要なポリペプチドに対する抗体である。本明細書に記載される抗体のいずれもが（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）、親抗体でありうる。
【０２４６】
「エフェクタ−機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクタ−機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【０２４７】
「フレ−ムワ−ク」又は「フレ−ムワ−ク領域」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に四つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。
【０２４８】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【０２４９】
「ヒトコンセンサスフレ−ムワ−ク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレ−ムワ−ク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレ−ムワ−クである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグル−プからなされる。一般的に、配列のサブグル−プは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91−3242, Bethesda MD （1991）, vols. 1−3のサブグル−プである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグル−プは上掲のＫａｂａｔらのサブグル−プカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグル−プは上掲のＫａｂａｔらのサブグル−プＩＩＩである。
【０２５０】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種、例えば、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物の超可変領域（ドナ−抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲの残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナ−抗体に見られない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練させるためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、超可変ル−プのすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの、定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522−525 （1986）; Riechmann et al., Nature 332:323−329 （1988）;及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593−596 （1992）を参照のこと。
【０２５１】
用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントは抗体間で配列が広範囲に異なるという事実を指す。可変即ち「Ｖ」ドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に関する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの範囲にわたって一様に分布してはいない。そうではなく、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域で分割されている、１５〜３０個のアミノ酸のフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから成る。「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、例えば、ＶＬ中約２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）の残基と、ＶＨ中約２６−３５（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）の残基由来のアミノ酸残基（一実施態様では、Ｈ１は約３１−３５の残基）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. （1991））及び／又は「超可変ル−プ」由来の残基（例えば、ＶＬ中２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）の残基と、ＶＨ中２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）の残基；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901−917 （1987）を含む。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲを含み、大部分がベ−タシ−ト構成をとり、三つの超可変領域により繋がっており、この三つの超可変領域はβシ−ト構造と繋がり、場合によってはベ−タシ−ト構造の一部を形成する、ル−プを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲにより互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）を参照）。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与といった、種々のエフェクタ−機能を呈する。
【０２５２】
用語「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置の番号付け」及びそれらの変形は、上掲のＫａｂａｔらの抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに対して用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮物又はそれらへの挿入物に相当する、より少ないアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含みうる。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けをされた配列と、抗体の配列相同性がある領域において配列比較することにり、所与の抗体について決定されうる。
【０２５３】
Ｋａｂａｔ番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を指す場合に用いられる（例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. （1991））。免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、一般に「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる（例えば、上掲のＫａｂａｔらに記載のＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号を指す。本明細書では、特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基の番号付けを意味する。本明細書では、特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基の番号付けを意味する（例えば、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵナンバリングの図参照）。
【０２５４】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号が付けられる。
【０２５５】
本明細書に開示される種々の抗体を記載するために使用される用語「単離された抗体」は、それを発現する細胞又は細胞培養物から同定され分離された抗体、及び／又は回収された抗体を意味する。その自然環境の夾雑物成分は、典型的にはポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含みうる。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリ−電気泳動）又はクロマトグラフィ−（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、実施例Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79−87 （2007）を参照のこと。好ましい実施態様では、抗体は、（１）スピニングカップシ−クエネ−タ−を使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度まで、又は（２）ク−マシ−ブル−又は好ましくは銀染色を使用した非還元又は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離された抗体には、ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも一つの精製工程により調製される。
【０２５６】
本明細書で使用される用語「モノクロ−ナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 即ち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクロ−ナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピト−プに結合する。異なる決定基（エピト−プ）に対する異なる抗体を通常含むポリクロ−ナル抗体調製物とは対照的に、モノクロ−ナル抗体調製物の各モノクロ−ナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクロ−ナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクロ−ナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリド−マ法、組換えＤＮＡ法、ファ−ジディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクロ−ナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【０２５７】
用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味で使用され、特に、ＶＨ−ＶＬ単位がポリエピト−プ特異性を有する（即ち、一つの生体分子上の二つの異なるエピト−プ又は異なる生体分子上の各エピト−プに結合することができる）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を含む。このような多重特異性抗体には、限定されないが、完全長抗体、二つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ．  Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディといった抗体断片、共有結合的に又は非共有結合的に結合した抗体断片が含まれる。「ポリエピト−プ特異性」とは、同じ又は異なる標的上で二つ以上の異なるエピト−プと特異的に結合する能力を指す。「二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」又は「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、同じ又は異なる標的（複数可）上の二つの異なるエピト−プに対する特異的結合能を指す。しかしながら、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）抗体とは対照的に、二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、アミノ酸配列が同じ二つの抗原結合ア−ムを有し、各Ｆａｂア−ムは二つの抗原を認識することができる。二重特異性により、抗体は、単一のＦａｂ又はＩｇＧ分子として二つの異なる抗原と高い親和性で相互作用することができる。一実施態様によれば、ＩｇＧ１形態の多特異性抗体は、５μＭ  から０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で各エピト−プと結合する。「単一特異性」は唯一つのエピト−プに結合する能力を指す。
【０２５８】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、これには三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これには一つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【０２５９】
抗体と標的分子との結合に関して、特定のポリペプチド、又は特定のポリペプチド標的上のエピト−プについて、その「特異的結合」、又はそれと「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という表現は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、コントロ−ル分子の結合と比較した分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似のコントロ−ル分子、例えば過剰な非標識標的との競合により決定することができる。この場合、特異的結合は、プロ−ブとの標識標的の結合が、過剰な非標識標的により競合的に阻害される場合に示される。本明細書において使用される用語「特異的結合」、或いは特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピト−プに「特異的に結合する」又は「特異的」であるとは、例えば、標的に対して１０−４Ｍ以下、代替的に１０−５Ｍ以下、代替的に１０−６Ｍ以下、代替的に１０−７Ｍ以下、代替的に１０−８Ｍ以下、代替的に１０−９Ｍ以下、代替的に１０−１０Ｍ以下、代替的に１０−１１Ｍ以下、代替的に１０−１２Ｍ以下のＫｄ、又は１０−４Ｍから１０−６Ｍ、若しくは１０  ６Ｍから１０  １０Ｍ、若しくは１０  ７Ｍから１０  ９Ｍの範囲のＫｄを有する分子により示される。当業者であれば理解するように、親和性及びＫｄの値は反比例している。抗原に対する高い親和性は、低いＫｄ値によって測定される。一実施態様では、用語「特異的結合」は、分子が特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド上のエピト−プに、実質的に他のいずれのポリペプチド若しくはポリペプチドエピト−プにも結合することなく結合することを指す。
【０２６０】
参照ポリペプチド配列に関する「パ−セント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパ−セント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパ−セントとして定義される。パ−セントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュ−タソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメ−タ−を決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュ−タプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュ−タプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソ−スコ−ドは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソ−スコ−ドからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレ−ティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメ−タ−は、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。
【０２６１】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：１００×Ｘ／Ｙ。ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュ−タプログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
【０２６２】
本明細書において使用される「投与」とは、対象に対し、化合物（例えば、本発明の抗体−ヒドロゲルコンジュゲ−ト）又は組成物（例えば、薬学的組成物、例えば、本発明の抗体−ヒドロゲルコンジュゲ−トを含む薬学的組成物）の一投薬量を与える方法を意味する。本明細書に記載される方法において利用される組成物は、例えば、硝子体内（例えば、硝子体内注射により）に、目薬により、筋肉内に、局所的に、結膜下に、小胞内に、眼内に、眼窩内に、注射により、移植により、点滴により、連続的注入により、脂質組成物中において、投与することができる。
【０２６３】
「血管新生」は、既存の血管から新規の血管が形成される過程を指す。血管新生は、中胚葉細胞前駆体からの内皮細胞の新たな形成である脈管形成とは異なる。病的血管新生を伴う障害は、本発明の組成物及び方法により治療することができる。これら障害には、非腫瘍性障害と細胞増殖性疾患の両方が含まれる。細胞増殖性疾患には、限定されないが、以下に記載されるものが含まれる。非腫瘍性障害には、限定されないが、眼の状態（非限定的な眼の状態には、例えば、増殖性糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病及びその他虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、網膜静脈閉塞症（中心（ＣＲＶＯ）型及び分岐型（ＢＲＶＯ）を含む）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コ−ト病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、及び高血圧網膜症を含む網膜症が含まれる）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、強直性脊椎炎、及び炎症性腸疾患（例えば、クロ−ン病及び潰瘍性大腸炎））、望ましくない又は異常な肥大症、関節炎、乾癬性関節炎、乾癬プラ−ク、サルコイド−シス、アテロ−ム性動脈硬化症、動脈硬化プラ−ク、動脈性動脈硬化、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管繊維腫、甲状腺過形成（グレ−ブス病を含む）、角膜及びその他組織の移植、肺の炎症、急性肺傷害／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧、悪性肺浸出液、脳水腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部外傷／トラウマを伴うもの）、滑膜の炎症、ＲＡ中のパンヌスの形成、骨化性筋炎、肥厚性骨形成、変形性関節症（ＯＡ）、難治性の腹水症、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、流体疾患の第３のスペ−ス（膵炎、コンパ−トメント症候群、火傷、腸疾患）、慢性喘息、子宮類線維腫、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クロ−ン病及び潰瘍性大腸炎）、炎症腎性疾患（糸球体腎炎、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症及び高血圧性腎硬化症を含む）、移植後に生じる疾患、腎同種移植片拒絶、炎症性疾患、ネフロ−ゼ症候群、望ましくない又は異常な組織腫瘤成長（非がん）、血友病性関節、肥厚性瘢痕、発毛の阻害、オスラ−ウェ−バ−症候群、化膿性肉芽腫後水晶体繊維増殖症、強皮症、トラコ−マ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癪前症、腹水症、心膜液貯留（例えば心膜炎を伴うもの）、及び胸膜滲出液が含まれる。さらなる眼の障害を以下に記載する。
【０２６４】
病的血管新生を伴いうる他の障害には、偽関節骨折（治癒しない骨折）、化膿性肉芽腫、トラコ−マ、血友病性関節、血管癒着及び肥厚性瘢痕、移植片拒絶、血管結合組織、酒土性挫創、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピ−性角膜炎、細菌性潰瘍、ベ−チェット病、頸動脈閉塞性疾患、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズの長時間着用、角膜移植後拒絶反応、角膜移植血管新生、イ−ルズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、過粘着性症候群、カポジ肉腫、白血病、脂肪変性、ライム病、辺縁部表皮剥離、モ−レン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼陥凹、変形性関節症、パジェット病、扁平部炎、類天疱瘡、糸球体炎、多発性動脈炎、ポストレ−ザ−合併症、原虫症、弾力線維性仮性黄色腫、乾燥翼状片角膜炎、放射状角膜切開術、後水晶体繊維増殖症、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェ−グレン症候群、スタ−ガルト病、スティ−ブンス・ジョンソン病、上輪部角膜炎、梅毒、全身性狼瘡、テリエン周辺角膜変性症、トキソプラズマ症、トラウマ、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏及びウェゲナ−のサルコイド−シス、糖尿病を伴う望ましくない血管新生、寄生虫病、異常創傷治癒、手術後肥大、損傷又はトラウマ、発毛の阻害、排卵及び黄体形成の阻害、，着床（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の阻害、並びに子宮内胚発生の阻害が含まれる。
【０２６５】
本明細書において使用される用語「眼の障害」には、病的な血管新生を伴うあらゆる眼の障害（本明細書では交換可能に「眼の状態」とも呼ぶ）を含む。眼の障害は、異常な又は制御されていない増殖及び／又は網膜又は角膜といった眼組織の構造内への新規血管の侵入を特徴とすることができる。非限定的な眼の障害には、例えば、ＡＭＤ（例えば、湿潤性のＡＭＤ、乾燥性のＡＭＤ、中間のＡＭＤ、進行性のＡＭＤ、及び地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ及びびまん性で中心窩を含むＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高高度ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、中心型（ＣＲＶＯ）及び分岐型（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生を伴う疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生を伴う疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コ−ト病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（例えば、伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎）、レ−バ−先天黒内障（レ−バ−の先天性黒内障、即ちＬＣＡとしても知られる）、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、シェ−グレン症候群、及び疾患又は障害が眼の血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫を伴うその他眼疾患が含まれる。さらなる例示的な眼の障害には、皮膚潮紅（角度の血管新生）を伴う疾患と、増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む、血管結合組織又は繊維組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患が含まれる。
【０２６６】
角膜血管新生を伴う例示的疾患には、限定されないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏、コンタクトレンズの着け過ぎ、アトピ−性角膜炎、上輪部角膜炎、乾癬性角膜炎、シェ−グレン症候群、酒土性挫創、糸球体炎、梅毒、マイコバクテリア感染、脂肪変性、化学火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染，帯状疱疹感染、原虫症、カポジ肉腫、モ−レン潰瘍、テリエン周辺角膜変性症、辺縁角膜炎、関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、トラウマ、ウェゲナ−のサルコイド−シス、強膜炎、スティ−ブンス−ジョンソン症候群、類天疱瘡放射状角膜切開術、及び角膜グラフ（ｇｒａｐｈ）拒絶が含まれる。
【０２６７】
網膜／脈絡膜血管新生を伴う例示的疾患には、限定されないが、糖尿病網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血サルコイド、梅毒、弾力線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性紅斑性狼瘡、未熟児網膜症、網膜色素変性症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イ−ルズ病、ベ−チェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を引き起こす感染症（例えば、多巣性脈絡膜炎）、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病（卵黄様黄斑変性）、近視、眼陥凹、スタ−ガルト病、扁平部炎、網膜剥離（例えば、慢性網膜剥離）、過粘着性症候群、トキソプラズマ症、トラウマ、及びポストレ−ザ−合併症が含まれる。
【０２６８】
本明細書において使用される「望ましくない血管透過性を伴う障害」には、例えば、脳腫瘍を伴う浮腫、悪性腫瘍を伴う腹水症、メイグス症候群、肺の炎症、ネフロ−ゼ症候群、心膜液貯留、胸膜滲出液、心筋梗塞及び卒中などの後の状態のような心血管疾患に関連付けられる透過性が含まれる。
【０２６９】
開始又は参照ポリペプチド（例えば、参照抗体又はその可変ドメイン（複数可）／ＨＶＲ（複数可））の「変異体」又は「突然変異」は、（１）開始又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、（２）天然又は人工の（人造の）突然変異誘発を通した開始又は参照ポリペプチド由来のポリペプチドである。このような変異体は、例えば、対象のポリペプチドのアミノ酸配列内部での、「アミノ酸残基の改変」と呼ばれる残基の欠失及び／又は残基への挿入及び／又は残基の置換を含む。したがって、変異体のＨＶＲは、開始又は参照ポリペプチド配列（例えばソ−ス抗体又は抗原結合断片）に対する変異体配列を含むＨＶＲを指す。アミノ酸残基の改変は、本明細書の文脈では、開始又は参照ポリペプチド配列（例えば参照抗体又はその断片の配列）中の対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。最終コンストラクトが所望の機能的特性を保有する限りにおいて、欠失、挿入、及び置換のいずれの組み合わせも最終変異体又は変異体コンストラクトに到達するために行なわれてよい。アミノ酸変化もポリペプチドの翻訳後プロセスを変化させることができ、例えばグリコシル化部位の数又は位置を変化させる。
【０２７０】
「野生型（ＷＴ）」又は「参照」配列、又は「野生型」又は「参照」タンパク質／ポリペプチドの配列、例えば参照抗体のＨＶＲ又は可変ドメインは、突然変異の導入により変異体ポリペプチドを誘導する参照配列でありうる。一般に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然において最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然界で最も一般的に見られるその遺伝子の配列である。突然変異は、自然のプロセスにより又は人工的に誘導された手段により「野生型」遺伝子中に（したがってそれがコ−ドするタンパク質にも）挿入することができる。このようなプロセスの生成物が、元の「野生型」タンパク質又は遺伝子の「変異体」又は「突然変異」形態である。
【０２７１】
本明細書において使用される用語「クリアランス」は、単位時間当たりに区画（例えば目（例えば硝子体））から除去された物質（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体コンジュゲ−ト、融合タンパク質（例えば、Ｆａｂ融合タンパク質）、又はポリマ−製剤）の容積を指す。
【０２７２】
用語「半減期」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば目（例えば硝子体））又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで物質（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体コンジュゲ−ト、融合タンパク質（例えば、Ｆａｂ融合タンパク質）、又はポリマ−製剤）の濃度が半分に低下するまでに必要な時間を指す。
【０２７３】
用語「有効半減期」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば目、例えば硝子体）又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、コンジュゲ−ト、例えばヒドロゲル−リンカ−−抗体コンジュゲ−トの濃度が半分に低下するまでに必要な時間を指す。コンジュゲ−トの成分の各々、例えば、ヒドロゲル、リンカ−、及び抗体が、コンジュゲ−トの有効半減期に寄与しうることを理解されたい。
【０２７４】
ＨＡ精製
ＨＡは、本開示の方法による誘導体化の前に、任意選択的に精製することができる。いくつかのこのような態様では、ＨＡを含む、約０．５から約１ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウムの水溶液が形成される。ＨＡは、約８０％エタノ−ルｖ／ｖまでエタノ−ルを付加することにより、溶液から沈殿させる。沈殿したＨＡは、収集され、約８０％ｖ／ｖのエタノ−ルで、続いて無水エタノ−ルで洗浄される。溶解／沈殿／洗浄の手順は、所望の純度に達するまで必要に応じて繰り返すことができる。
【０２７５】
アミン官能化ヒアルロン酸の調製
いくつかの態様では、以下の反応スキ−ム１に従って、式ＩのＨＡと一級アミン（Ｈ２Ｎ−ＬＡ−ＮＨ２）とカルボキシル活性化カップリング試薬とを含む反応混合物を反応させることにより、ヒアルロン酸がアミンで官能化され、式ＩＩのアミン−ＨＡと、部分的に架橋した式ＩＩＩのアミン−ＨＡが形成される。
【０２７６】
反応スキ−ム１
2020515545.tif 000030
【０２７７】
反応スキ−ム１に示されるアミン試薬Ｈ２Ｎ−ＬＡ−ＮＨ２を用いたＨＡ  ＩＩ及びＩＩＩの官能化の度合いについては、本明細書の他の部分に記載する。
【０２７８】
反応スキ−ム１では、各Ｒａ１は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、アルカリ金属対イオン、アンモニウム対イオン、又はアルカリ土類金属対イオンから独立して選択される。各Ｒａ２は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル及びアルカリ金属対イオンから独立して選択される。式ＩＩＩの架橋エステル結合は、以下にさらに記載するようにその後加水分解されて、式ＩＩの追加的材料を提供し、スキ−ム１の反応生成物を滅菌濾過することを可能にする。
【０２７９】
いくつかのこのような態様では、ＬＡはスペ−サ−である。他のいくつかの態様では、ＬＡは、置換されていてもよい及び／又は中断されていてもよいＣ１−１０アルキレンである。いくつかのこのような態様では、ＬＡは線形Ｃ２−４アルキレンであるか、又はｎ−プロピレンである。他の態様では、ＬＡはオキシアルキレンオリゴマ−又はポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）といったポリマ−を含む。
反応スキ−ム１のアミド形成はカップリング試薬を利用し、このような試薬は、特定の実施態様では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）及び２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）（ＣＤＭＴ）から選択されうる。いくつかの特定の態様では、カップリング試薬はＥＤＣである。
いくつかの態様では、反応混合物は、カップリング添加剤をさらに含む。いくつかのこのような態様では、カップリング添加剤は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、及びエチル  ２−シアノ−２−（ニトロソ）アセテ−ト（Ｏｘｙｍａ  ｐｕｒｅ（登録商標））から選択される。いくつかの特定の態様では、カップリング添加剤はＨＯＢｔである。他の実施態様では、カップリング試薬は１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウム  ヘキサフルオロホスファ−ト（ＣＯＭＵ）である。約５０ｍＭから１５０ｍＭの濃度で約５から約６のｐＨを有するバッファ−が、アミン官能化ヒアルロン酸を形成するための反応混合物に一般に適している。いくつかのこのような態様では、バッファ−は２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）である。
【０２８０】
反応混合物は、いくつかの実施態様では、反応物の溶解度を向上させるための極性非プロトン溶媒をさらに含む。このような態様では、バッファ−と極性非プロトン溶媒の適切な比は、約１：３ｖ／ｖ、約１：２ｖ／ｖ、約１：１．５ｖ／ｖ、約１：１ｖ／ｖ、約１．５：１ｖ／ｖ、約２：１ｖ／ｖ、約３：１ｖ／ｖ、約５：１ｖ／ｖ又は約１０：１ｖ／ｖである。いくつかのこのような態様では、極性非プロトン溶媒は、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びこれらの組み合わせから選択される。一態様では、溶媒はアセトニトリルである。
【０２８１】
アミン官能化は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃の温度で、本質的に完全なカップリングを達成するために適した時間、例えば約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間又はそれより長時間行われうる。
【０２８２】
本開示の種々の態様のいずれにおいても、上述のように、カルボキシル基の当量は、形成された官能化ＨＡの一級アミンの当量を上回り、反応スキ−ムＩに示されるように、ＨＡカルボキシル基のすべてが官能化されるわけではない。さらに詳細には、アミン官能性が導入されて、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％又は約１５％、及びその範囲、或いは本明細書の他の部分に記載されるＨＡ（又はその誘導体若しくはそのアルカリ金属塩）の一定の官能化を提供する。ヒアルロン酸、一級アミン及びカップリング添加剤の濃度は一定に保持することができ、前記濃度は形成されたアミン官能化ヒアルロン酸の所望のアミン負荷から独立している。
【０２８３】
適切なヒアルロン酸濃度の例は、例えば、２ｇ／Ｌから１６ｇ／Ｌの範囲である。ＨＡ  Ｉのカルボキシレ−ト基の当量に対するアミン試薬及びアミドカップリング添加剤の当量は、所望の度合いの官能化を提供するために必要に応じて変化しうる。いくつかの実施態様の官能化の度合いは、過剰なアミン試薬の存在下においてアミドカップリング試薬の当量に基づいて制御されうる。
【０２８４】
反応スキ−ム１に示すように、ＨＡの一部分は、エステル結合により架橋して部分的に架橋したアミン−ＨＡを形成しうる。このような部分的に架橋したＨＡは、水性系において可溶型であるが、多くの場合滅菌濾過することができない。架橋したＨＡは、塩基の存在下でインキュベ−トされてエステル結合を加水分解させ、線形アミン−ＨＡを提供することができる。適切な塩基には、アルカリ金属塩基、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＬｉＯＨが含まれる。加水分解は、約０．１Ｍ、約０．５Ｍ、約１Ｍ、約１．５Ｍ又は約２Ｍといった塩基濃度、約１２から約１４、約１３から約１４、又は約１４のｐＨ、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃の温度で、本質的に完全な加水分解を達成するために適した時間、例えば約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間又はそれより長時間行われうる。このような加水分解されたアミン−ＨＡは、天然ＨＡ出発物質と本質的に同じ数平均分子量を有し、水性系に可溶型であり、滅菌濾過可能である。加水分解に続いて、ｐＨを、鉱酸又は有機酸を用いて約６から約８．５、約６．５から約８、又は約７．５に調節することができる。いくつかの態様では、酸は酢酸である。
【０２８５】
マレイミド官能化ＨＡの調製
本開示のいくつかの態様では、本明細書の他の部分に記載されるアミン官能化ＨＡを−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−Ｌａ−マレイミド又はＮＨＳ−ＬＣ−マレイミドと反応させてマレイミド官能化ＨＡを形成する。いくつかのこのような態様では、以下の反応スキ−ム２にしたがって、式ＩＩのＨＡ誘導体をＮＨＳ−ＬＢ−マレイミド又はＮＨＳ−ＬＣ−マレイミド（ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、ＬＢ又はＬＣで活性化されたエステルの形態である）と反応させて式ＩＶのマレイミド官能化ＨＡを形成する。
【０２８６】
反応スキ−ム２
2020515545.tif 000031
式中、Ｒａ１、Ｒａ２及びＬＡは本明細書の他の部分に記載される通りである。いくつかの特定の態様では、マレイミドスペ−サ−はＬＢである。他の態様では、マレイミドスペ−サ−はＬＣである。それぞれアミン試薬Ｈ２Ｎ−ＬＡ−ＮＨ２及びＬＢ−マレイミド又はＬＣ−マレイミドによるＨＡ  ＩＩ及びＩＶの官能化の度合いは、反応スキ−ム２に示されるように恣意的なものであり、官能化の度合いは本発明の異なる実施態様に対する必要に応じて変化してよく、且つマレイミド官能化の度合いは本明細書の他の部分に記載される通りでよい。多くの実施態様において、ＨＡ  ＩＩのアミン官能基のほとんど又はすべてがＬＢ−マレイミド又はＬＣ−マレイミドと反応するが、特定の実施態様では、残余アミン官能基が存在してよい。
【０２８７】
いくつかの態様では、ＬＢは本明細書に記載されるスペ−サ−部分である。いくつかの態様では、ＬＢは、置換されていてもよい及び／又は中断されていてもよいＣ１−１０アルキレンである。いくつかの態様では、ＬＢは−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−５アルキレンである。いくつかのこのような態様では、ＬＢは、線形−（Ｏ）−Ｃ２−３アルキレンであるか、又は−Ｃ（Ｏ）−エチレンである。
【０２８８】
いくつかの態様では、ＬＣは本明細書に記載される生分解性スペ−サ−部分である。いくつかの態様では、ＬＣは、少なくとも一つのエステル部分、少なくとも一つのカ−ボネ−ト結合又はそれらの組み合わせを含みうる。
【０２８９】
いくつかの態様では、ＬＣは構造：
2020515545.tif 000032
のものであり、式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０、並びにそれらからなる範囲、例えば１から１０、２から８、又は５から８から選択される。ｎは、１、２、３及び４、並びにそれらからなる範囲、例えば１から４、又は１から３から選択される。ｏは、１、２、３及び４、並びにそれらからなる範囲、例えば１から４、又は１から３から選択される。このような実施態様では、Ｌｃ−マレイミド試薬は以下の構造を有する。
2020515545.tif 000033
【０２９０】
いくつかの態様では、ｍは７であり、ＬＣは、アゼライン酸に由来する部分、例えばアゼライン酸エステル部分を含む。一つのそのような態様では、ＬＣは構造：
2020515545.tif 000034
のものである。
このような実施態様では、ＬＣ−マレイミド試薬は以下の構造を有する。
2020515545.tif 000035
【０２９１】
反応スキ−ム２の事象の反応ｐＨは、適切には約６．５から約９、約７から約８、又は約７，４である。約５０ｍＭから約１５０ｍＭのバッファ−濃度が、一般に、マレイミド官能化ヒアルロン酸を形成するための反応混合物に適している。いくつかのこのような態様では、バッファ−は、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、マレア−ト、シトレ−ト、ビス−トリス、ホスフェ−ト、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、炭酸塩、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、イミダゾ−ル、ビス−トリス−プロパン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ），（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）（ＭＯＰＳ）、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）デハイドレ−ト（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）（ＰＯＰＳＯ）、トリセン（ｔｒｉｃｅｎｅ）、グリシルグリシン、及びトリスから選択される。いくつかの特定の態様では、バッファ−はＨＥＰＥＳである。反応混合物は、反応物の溶解度を向上させるために極性非プロトン溶媒をさらに含むことができる。このような態様では、バッファ−と極性非プロトン溶媒の適切な比は、約１：３ｖ／ｖ、約１：２ｖ／ｖ、約１：１．５ｖ／ｖ、約１：１ｖ／ｖ、約１．５：１ｖ／ｖ、約２：１ｖ／ｖ、約３：１ｖ／ｖ、約５：１ｖ／ｖ又は約１０：１ｖ／ｖである。いくつかのこのような態様では、極性非プロトン溶媒は、アセトン、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＭＳＯ、及びこれらの組み合わせから選択される。一態様では、溶媒はＡＣＮである。反応温度は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃であり、反応時間は約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、又はそれより長い時間である。
【０２９２】
いくつかの反応スキ−ム２の態様では、以下の反応スキ−ム３に従って、マレイミド官能化ＨＡが、アミン官能化ＨＡの一級アミンをＮＨＳ−ＬＢ−マレイミド試薬と反応させることにより得られる。
【０２９３】
反応スキ−ム３
2020515545.tif 000036
【０２９４】
いくつかの特定の態様では、ＬＡはｎ−プロピレンであり、ＬＢは−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−である。いくつかの態様では、バッファ−はＨＥＰＥＳであり、反応ｐＨは約７から約８、又は約７．４であり、バッファ−は約２：１のバッファ−対ＡＣＮの容積比でＡＣＮを含み、反応温度は約２０℃から約３０℃であり、反応時間は約０．５時間から約２時間である。
【０２９５】
他のいくつかの反応スキ−ム２の態様では、以下の反応スキ−ム４に従って、マレイミド官能化ＨＡが、アミン官能化ＨＡの一級アミンをＮＨＳ−ＬＣ−マレイミド試薬と反応させることにより得られる。
【０２９６】
反応スキ−ム４
2020515545.tif 000037
【０２９７】
いくつかの特定の態様では、ＬＡはｎ−プロピレンであり、ＬＣは構造
2020515545.tif 000038
のものであり、式中、ｍは７であり、ｐは２であり、ｏは２である。いくつかの態様では、バッファ−はＨＥＰＥＳであり、反応ｐＨは約８から約９又は約７．４であり、バッファ−は約２：１のバッファ−対ＡＣＮの容積比でＡＣＮを含み、反応温度は約２０℃から約３０℃であり、反応時間は約１時間から約３時間である。
【０２９８】
マレイミド官能化ＨＡの直接調製
いくつかの態様では、図２に示すように、ＨＡ（又はその誘導体若しくは塩）と構造
2020515545.tif 000039
のマレイミド化合物２とカルボキシル活性化カップリング試薬とを含む反応混合物を反応させることにより、マレイミド基がＨＡに直接コンジュゲ−トし、マレイミド基にコンジュゲ−トした化合物４が形成される。
【０２９９】
Ｌ１は本明細書に記載されるスペ−サ−部分である。いくつかの態様では、Ｌ１はＣ１−１２アルキル、Ｃ２−１０アルキル又はＣ３−８アルキルである。Ｌ１は、本明細書の他の部分に記載されるように、置換されていてもよい及び／又は中断されていてもよい。例えば、Ｌ１は、アミド又はアミンのうちの一つ又は複数により中断されていてもよい。
【０３００】
チオ−ル官能化ＨＡの調製
本開示のいくつかの態様では、本明細書の他の部分に記載されるアミン官能化ＨＡをＮＨＳ−ＬＢ−Ｓ−保護基又はＮＨＳ−ＬＣ−Ｓ−保護基と反応させ、続いて脱保護してチオ−ル官能化ＨＡを形成する。いくつかのこのような態様では、以下の反応スキ−ム５に従って、式ＩＩ又は式ＩＩａをＮＨＳ−ＬＢ−Ｓ−保護基又はＮＨＳ−ＬＣ−Ｓ−保護基と反応させて式Ｖを形成し、続いて脱保護して式ＶＩのチオ−ル官能化ＨＡを形成する。
【０３０１】
反応スキ−ム５
2020515545.tif 000040
式中、Ｒａ１、Ｒａ２、ＬＡ、ＬＢ及びＬＣは、本明細書の他の部分に記載される通りである。いくつかの特定の態様では、スキ−ム５の化合物ＶのＳ−ＰＧ及び化合物ＶＩの−ＳＨに接続するスペ−サ−はＬＣである。
【０３０２】
上記反応スキ−ム５のように、反応スキ−ム５に示されるＮＨＳ−ＬＢ−Ｓ−保護基又はＮＨＳ−ＬＣ−Ｓ−保護基によるＨＡ  Ｖ及びＶＩの官能化の度合いは恣意的なものであり、官能化の度合いは本発明の異なる実施態様に対する必要に応じて変化しうる。保護されたチオ−ル（及び最終的にチオ−ル）の官能化の度合いは、本明細書の他の部分に記載される通りである。多くの実施態様において、ＨＡ  ＩＩのアミン官能基のほとんど又はすべてがＮＨＳ−ＬＢ−Ｓ−保護基又はＮＨＳ−ＬＣ−Ｓ−保護基と反応するが、特定の実施態様では、残余アミン官能基が存在してよい。
【０３０３】
反応スキ−ム５のコンジュゲ−ション反応のｐＨは、適切には約７．５から約９．５、又は約８から約９、例えば約８．５である。約５０ｍＭから約１５０ｍＭの濃度の適切なバッファ−は、本明細書の他の部分に記載される。いくつかの態様では、バッファ−はＨＥＰＥＳである。反応混合物は、反応物の溶解度を向上させるために、本明細書の他の部分に記載される極性非プロトン溶媒をさらに含むことができる。いくつかの態様では、溶媒はＡＣＮである。バッファ−と極性非プロトン溶媒の比は、適切には、約１：２ｖ／ｖから約４：１、又は約３：１から約１：１、例えば約２：１である。反応温度は約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃であり、反応時間は約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、又はそれよりも長い時間である。
【０３０４】
式ＶのＨＡ誘導体を還元剤と接触させて、保護基をジスルフィド結合の位置で切断することにより、チオ−ルで終端するＬＢ又はＬＣが精製される（式ＶＩ）。切断可能な保護基は当技術分野で既知であり、非限定的な例には、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＣＯ２Ｈ、及びＢｒから独立して選択される少なくとも一つの置換基で置換されていてもよいピリジル−チオ−ル及びフェニル−チオ−ルが含まれる。一つのそのような態様では、脱離基は２−メルカプトピリジルである。還元剤は当技術分野で既知であり、（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）ＨＣｌ塩（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノ−ル、及びジチオスレイト−ルを含む。
【０３０５】
チオ−ル官能化ＨＡの直接調製
いくつかの態様では、図３に示すように、ＨＡ（又はその誘導体若しくは塩）と構造Ｈ２Ｎ−Ｌ３−Ｓ−ＰＧの保護されたジスルフィド化合物６とカルボキシル活性化カップリング試薬とを含む反応混合物を反応させることにより、保護されたジスルフィド基がＨＡに直接コンジュゲ−トし、保護されたジスルフィド基にコンジュゲ−トした化合物８が形成される。保護基を本明細書の他の部分に記載されるように切断し、チオ−ル官能化ＨＡを生成することができる。
【０３０６】
薬物−リンカ−コンジュゲ−ト
図２の試薬５、図５の試薬１４及び図７の試薬５といった薬物−リンカ−コンジュゲ−トは、本発明による架橋したＨＡ薬物コンジュゲ−トの調製に使用される。多くの実施態様において、薬物リンカ−コンジュゲ−トは、上述のように式ＩＩの可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２を利用する。他のいくつかの態様では、このような薬物モノコンジュゲ−トに使用される可逆的プロドラッグリンカ−部分Ｌ２は、式ＸＩＩａ：
2020515545.tif 000041
によって表され、式中：
破線は、アミド結合を形成することによる薬物化合物（示さない）の窒素への結合を示し；
Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ３及びＲ３ａは上記のように規定される。
【０３０７】
多くの実施態様において、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２は、合成の便宜のために、スペ−サ−Ｌ４又はスペ−サ−Ｌ４の一部と一緒に調製される。
【０３０８】
いくつかの実施態様では、可逆的プロドラッグリンカ−部分Ｌ２は、スペ−サ−Ｌ４の一部と一緒に、式ＸＩＩｃ
2020515545.tif 000042
を含むスペ−サ−−リンカ−化合物によって表され、式中、一番右の波線は薬物の窒素原子へのアミド結合を介した結合点を表し、一番左の波線は、本明細書に開示される架橋ＨＡヒドロゲル又はその前駆体へのスルフィド結合（示さない）を介した結合点を表す。リンカ−スペ−サ−部分ＸＩＩｃは、本発明の特定の実施態様における使用のための後述するように簡便に合成することのできる、可逆的プロドラッグリンカ−部分Ｌ２とスペ−サ−Ｌ４の一部分の特定の組み合わせを表している。
【０３０９】
いくつかの態様では、可逆的プロドラッグリンカ−部分Ｌ２  部分は、以下から選択することができ、これらの式中、波線は薬物の窒素への結合部位を示し、各Ｌ２は、アスタリスクで印された水素が置き換えられていないことを条件に、一つの部分Ｌ４で置換される：
2020515545.tif 000043
2020515545.tif 000044
2020515545.tif 000045
2020515545.tif 000046
2020515545.tif 000047
【０３１０】
薬物−スペ−サ−−リンカ−コンジュゲ−トの調製と精製
本開示の種々の態様のいずれにおいても、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２を用いる薬物−リンカ−コンジュゲ−トは、以下のように調製される。上記のように、多くの実施態様において、可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２は、合成の便宜のために、スペ−サ−Ｌ４又はスペ−サ−Ｌ４の一部分と一緒に調製される。式ＸＩＩｂの部分は例示を目的として使用されており、当業者であれば、本発明によるリンカ−Ｌ２及びスペ−サ−Ｌ４の他の実施様態用に以下の手順の変形が使用可能であることが分かるであろう。
【０３１１】
式ＶＩＩＩａ
2020515545.tif 000048
の化合物は、アミン保護基Ｐｇ１を有する可逆的プロドラッグリンカ−Ｌ２を含む部分と、上にチオ−ル保護基Ｐｇ２を有するスペ−サ−Ｌ４の一部分と、活性化基ＡＧとを表す。チオ−ル保護基は、図２から９に示す、架橋したＨＡコンジュゲ−ト１０、１６及び２６、又は対応する前駆体のＨＡ部分５、１４及び１９への結合点を表している。活性化基ＡＧは、ラニビズマブなどの薬物群又は上に遊離アミノ基を有するその他のペプチド性治療薬との反応の間に置換されてアミド結合を形成する基である。基Ｐｇ１によって保護されるアミン基は、薬物をリンカ−Ｌ２に接続するアミド結合の切断に参画する触媒基である。
【０３１２】
組み合わされた式ＶＩＩＩａのスペ−サ−Ｌ４化合物の部分とリンカ−Ｌ２を使用して、活性化基ＡＧの置換により式ＶＩＩＩｂ
2020515545.tif 000049
の化合物を調製し、薬物とのアミド結合を形成することができる。薬物は、例えば、リンカ−と反応させてアミド結合を介したリンカ−薬物コンジュゲ−トを形成するために利用可能な、一つ又は複数の利用可能な遊離アミノ基を有する本明細書に記載の治療的タンパク質、抗体又は抗体断片とすることができる。
【０３１３】
保護基（ＰＧ）は当技術分野で既知である。例えば、本開示の範囲内のいくつかの保護基は、国際公開第２０１５／０５２１５５号に記載されており、その内容その全内容が参照により本明細書に包含される。当業者であれば、例えばやはり本明細書に包含される”Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis,” Fifth Edition, 2014 by John Wiley & Sons, Inc.”に記載される多岐にわたる保護及び脱保護スキ−ムが、本明細書に示される特定の実施例の代替例として本発明に使用できることが分かるであろう。
【０３１４】
いくつかの態様では、アミン保護基Ｐｇ１は、部分
2020515545.tif 000050
のうちの一つを含みうる自壊性保護基であり、式中、Ｒ１８は、置換されていてもよい及び／又は中断されていてもよい  Ｃ１−１０アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ１８はＣ１−６アミンである。他の態様では、Ｒ１８はＣ１−６ジアミンである。
【０３１５】
アミン保護基Ｐｇ１の基の一例は以下：
2020515545.tif 000051
であり、式中、波線はリンカ−Ｌ２上のアミン基への結合点を示す。
【０３１６】
チオ−ル保護基の一例は、メタンチオスルホン酸ＭＴＳが形成されるような、式−ＳＯ２ＣＨ３のメタンスルホニルである。
【０３１７】
活性化基も、当技術分野でよく知られている。特定の実施態様では、活性化基ＡＧは、エステルの形態のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。他のそのような活性化エステル基には、４−ニトロフェノ−ル及びペンタフルオロフェノ−ルエステルが含まれる。
【０３１８】
特定の一態様では、上記式ＶＩＩＩａの部分は、構造ＶＩＩＩｃ：
2020515545.tif 000052
の、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルメタンチオスルホン酸化合物である。化合物ＶＩＩＩｃは、さらに詳細には、Ｐｇ２としてのメタンスルホニル基、ＡＧとしてのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、及びＰｇ１としての上記アミン保護基を含む化合物ＶＩＩＩｂを表す。次いで化合物ＶＩＩＩｃと薬物との反応により、式ＶＩＩＩｄ
2020515545.tif 000053
のスペ−サ−−リンカ−−薬物コンジュゲ−ト化合物が提供される。いくつかの実施態様では、薬物スペ−サ−リンカ−ビスコンジュゲ−ト及びトリスコンジュゲ−ト（示さない）も、モノコンジュゲ−トＶＩＩＩｄと一緒に形成され、このモノコンジュゲ−トは、より高次のコンジュゲ−トから、以下の実験的実施例に記載されるカラム分離により単離することができる。モノコンジュゲ−トＶＩＩＩｄの保護されていないチオ−ル基は、上述のように、ＨＡ部分のマレイミド基と反応させられ、保護されていないアミノ基は、薬物の時間制御放出を提供する薬物−アミド結合の接触開裂に参画する。
【０３１９】
ＮＨＳ基を置換する薬物（例えば、ラニビズマブ又は他の治療薬）は、適切には、約６から約９、又は約７から約８、例えば約７．４のｐＨ、約２０ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のバッファ−中において溶解させる。いくつかの態様では、このバッファ−は約３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。リンカ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、適切には、極性非プロトン溶媒、例えばＤＭＳＯ中において溶解させることができる。
【０３２０】
リンカ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液と薬物の溶液を、約５℃で、約７から約８、例えば約７．４のｐＨで混合し、約１０分、例えば約５分間反応させて、リンカ−−薬物コンジュゲ−トの溶液を形成する。リンカ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの当量と薬物の当量の比は約１：１、約５：１、約１０：１、約１５：１又は約２０：１、例えば約５：１、約１０：１又は約１５：１である。リンカ−−薬物コンジュゲ−トは、典型的には、非コンジュゲ−ト薬物、薬物モノコンジュゲ−ト、薬物ビスコンジュゲ−ト、薬物トリスコンジュゲ−ト、及びより高次のコンジュゲ−トの混合物を含む。もっと長い反応時間及びもっと多い量の当量、並びにもっと高い反応温度が必要に応じて使用される。
【０３２１】
薬物コンジュゲ−トの溶液のｐＨは、特定の保護基の使用に対する必要に応じて調節することができる。上記に示すＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルメタンチオスルホン酸化合物に使用するために、ｐＨは約４に調節することができる。いくつかの態様では、ｐＨは、約２から約３．５のｐＨを有するバッファ−を用いて調節される。いくつかのこのような態様では、バッファ−はｐＨ３のコハク酸（例えば、約３Ｍのコハク酸）である。いくつかの態様では、ｐＨの調節に続いて、約４のｐＨを有するバッファ−でのリンカ−−薬物コンジュゲ−トの溶液のバッファ−交換を行うことができる。いくつかのこのような態様では、バッファ−交換は、約５ｍＭ、ｐＨ４．０のコハク酸を用いて行われる。
【０３２２】
精製タグ部分は、本発明による薬物リンカ−モノコンジュゲ−トの調製及び精製において使用されうる。タグ付け工程において、精製タグは、精製タグがジスルフィド結合を介してコンジュゲ−トに結合するように、メタンスルホニル基を置換することにより導入される。本開示の範囲に含まれる精製タグは、国際公開第２０１５／０５２１５５号に開示されている。いくつかの態様では、精製タグは、以下の式ＩＸ：
2020515545.tif 000054
の一部分を含み、式中：
ＳＰはスペ−サ−部分であり；
破線は、ＴＡＧの残りへの結合、又は代替的にＴＡＧの薬物リンカ−コンジュゲ−トへの結合点（例えば、４−メルカプト−３−ニコチン酸がスペ−サ−であるジスルフィド結合の形成による）を示し；
Ｒ２１、Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２２、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂ、Ｒ２３、Ｒ２３ａ、Ｒ２３ｂ、Ｒ２４、Ｒ２４ａ及びＲ２４ｂは、各々独立して、Ｈ又はメチルであり；
各ｓは互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、又は８であり；
各ｔは互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、又は８であり；
各ｕは互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、又は８であり；
各ｖは互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、又は８である。
【０３２３】
いくつかの態様では、Ｒ２１、Ｒ２１ａ及びＲ２１ｂは各々がメチルである。他のいくつかの態様では、Ｒ２１はＨであり、Ｒ２１ａ及びＲ２１ｂはメチルである。いくつかの態様では、Ｒ２２、Ｒ２２ａ及びＲ２２ｂは各々がメチルである。他のいくつかの態様では、Ｒ２２はＨであり、Ｒ２２ａ及びＲ２２ｂはメチルである。いくつかの態様では、Ｒ２３、Ｒ２３ａ及びＲ２３ｂは各々がメチルである。他のいくつかの態様では、Ｒ２３はＨであり、Ｒ２３ａ及びＲ２３ｂはメチルである。いくつかの態様では、Ｒ２４、Ｒ２４ａ及びＲ２４ｂは各々がメチルである。他のいくつかの態様では、Ｒ２４はＨであり、Ｒ２４ａ及びＲ２４ｂはメチルである。
【０３２４】
いくつかの態様では、ｓは１、２、３、４、５、又は６；２、３、４又は５；３、４又は５；或いは４である。いくつかの態様では、ｔは１、２、３、４、５、又は６；２、３、４又は５；２、３又は４；或いは３である。いくつかの態様では、ｕは１、２、３、４、５、又は６；１、２、３又は４；１、２又は３；或いは１である。いくつかの態様では、ｖは１、２、３、４、５、又は６；１、２、３又は４；１、２又は３；或いは１である。
【０３２５】
いくつかの態様では、Ｒ２１、Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２２、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂ、Ｒ２３、Ｒ２３ａ、Ｒ２３ｂ、Ｒ２４、Ｒ２４ａ及びＲ２４ｂ  は各々がメチルであり；ｓは４であり、ｔは３であり、ｕは１であり、ｖは１である。他のいくつかの態様では、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は各々がＨであり；Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂ、Ｒ２３ａ、Ｒ２３ｂ、Ｒ２４ａ及びＲ２４ｂは各々がメチルであり；ｓは４であり、ｔは３であり、ｕは１であり、ｖは１である。
【０３２６】
本開示の範囲に含まれる式ＩＸの対イオンには、Ｃｌ−、ＴＦＡ−、ＨＳＯ４−及びＳＯ４２−が含まれる。
【０３２７】
式ＩＸ中の破線は、式ＩＸの化合物が試薬である場合タグの残りへの結合を示し、好ましくは水素であり、代替的に薬物リンカ−コンジュゲ−トへのコンジュゲ−ション後は前記薬物リンカ−コンジュゲ−トへの結合を示すことを理解されたい。
【０３２８】
いくつかの特定の態様では、精製タグは式Ｘ：
2020515545.tif 000055
のものであり、式中、破線は式Ｘのチオ−ルの部分への結合を示す。
【０３２９】
いくつかの特定の態様では、精製タグ試薬は式Ｘａ：
2020515545.tif 000056
のものである。
【０３３０】
いくつかの特定の態様では、ＴＡＧ−スペ−サ−−リンカ−−薬物脱保護モノコンジュゲ−トは、式ＶＩＩＩｅ：
2020515545.tif 000057
のものである。ＴＡＧ−スペ−サ−−リンカ−−薬物脱保護モノコンジュゲ−トＶＩＩＩｅは、メタンスルホニル保護基の代わりに精製タグＸａを伴うコンジュゲ−トＶＩＩＩｄを表す。ＴＡＧ−スペ−サ−−リンカ−−薬物脱保護モノコンジュゲ−トＶＩＩＩｅは、上述のように、より高次のコンジュゲ−ト（示さない）と共に存在しうる。
部分ＶＩＩＩｅ及び以下のセクションで言及する他の化合物は、Ｌ４の部分も含むことを理解されたい。便宜上及び命名を容易にするために、スペ−サ−部分は、後述する化合物の名称から省略される。
【０３３１】
タグ付け及びアミンの脱保護は、以下のように行うことができる。精製タグの導入は、化学量論的に過剰な精製タグ、例えばリンカ−−薬物コンジュゲ−トに対して約１．５、２、２．５若しくは３、又は場合によってはそれ以上の当量の精製タグを含む溶液を、リンカ−−薬物コンジュゲ−トの溶液と混合することにより行われる。リンカ−−薬物コンジュゲ−ト溶液中のその濃度は、適切には、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ又は約４０ｍｇ／ｍＬ、例えば約１０ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬから約４０ｍｇ／ｍＬである。薬物リンカ−コンジュゲ−トとの反応に使用される溶液中のＴＡＧの濃度は、適切には、約０．１ｍＭから約１ｍＭ、約０．２ｍＭから約０．８ｍＭ、約０．３ｍＭから約０．７ｍＭ、約０．４ｍＭから約０．６ｍＭである。特定の実施態様では、ＴＡＧ濃度は約０．５ｍＭである。いくつかの態様では、タグ溶液は水溶液である。反応のｐＨは、適切には、約３から約５、約３．５から約４．５、又は約４である。反応温度は、適切には、約１０℃から約４０℃、例えば約２５℃である。反応時間は、適切には、少なくとも５分、又は少なくとも１０分、又は少なくとも３０分、例えば約１５分又は約３５分である。
【０３３２】
脱保護は、約７から約８、例えば約７．４のｐＨでのインキュベ−ションによって行うことができる。いくつかの態様では、ｐＨは、Ｎ，Ｎ，Ｎ′−トリメチルエチレン−１，３−ｄｉアミン（ＴｒｉＭＥＤ）を含むリン酸バッファ−で約７から約８に調節される。インキュベ−ションは、適切には、約１０℃から約４０℃、例えば約２５℃の温度で、少なくとも８時間、例えば約１６時間にわたって行うことができる。
【０３３３】
脱保護後、ＴＡＧ−リンカ−−薬物脱保護コンジュゲ−トの溶液のｐＨは、その後の精製のために、約３．５から約４．５、又は約４．０に調節される。いくつかの態様では、ｐＨの調節は、約２．５から約３．５のｐＨを有するバッファ−、例えばｐＨ３．０のコハク酸バッファ−を用いて行われる。ｐＨを調節した溶液は、任意選択的に、その後の精製の前にバッファ−で希釈してもよい。いくつかの態様では、希釈は、ｐＨ４．０のコハク酸バッファ−、例えば、２０ｍＭのコハク酸バッファ−を用いて行われる。
【０３３４】
脱保護に続いて、ＴＡＧ−リンカ−−薬物脱保護コンジュゲ−トのモノコンジュゲ−ト種が単離される。いくつかの態様では、モノコンジュゲ−トは、陽イオン交換クロマトグラフィ−（ＣＩＥＣ）により単離される。他のいくつかの態様では、モノコンジュゲ−トは、サイズ排除クロマトグラフィ−により単離される。他のいくつかの態様では、モノコンジュゲ−トは、アフィニティ−クロマトグラフィ−により単離される。ＣＩＥＣ種では、適切な樹脂が当技術分野で既知であり、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されており、これには、例えば限定しないが、ＡＧ（登録商標）５０Ｗ、ＡＧ（登録商標）ＭＰ−５０、Ｂｉｏ−Ｒｅ×７０、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）１００、ＡＧ（登録商標）５０Ｗ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）シリ−ズ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＴＭシリ−ズ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ及びＮｕｖｉａＴＭ  Ｓが含まれる。第２の工程で希釈に使用される同じバッファ−は、ＣＩＥＣバッファ−に使用されうる。例えば、バッファ−Ａは、２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）とし、バッファ−Ｂ（溶出用）は２０ｍＭのコハク酸、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０）とすることができる。ＣＩＥＣ分離では、まず非コンジュゲ−ト薬物が、続いて薬物モノコンジュゲ−トが溶出され、その後より高次のコンジュゲ−ト（ビス−及びトリス−）が溶出されるなどである。
【０３３５】
ＴＡＧ−リンカ−−薬物脱保護モノコンジュゲ−トの単離後、モノコンジュゲ−トは、当技術分野で既知の方法、例えばタンジェント流濾過（ＴＦＦ）又は膜を通した遠心分離により濃縮することができる。濃縮されたモノコンジュゲ−トは、任意選択的に濾過することができる。濃縮後、最終濃度は、適切には、約０．２ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約５ｍｇ／ｍＬでありうる。
【０３３６】
次に、単離され、且つ濃縮されていてもよいＴＡＧ−リンカ−−薬物脱保護モノコンジュゲ−トから、精製タグが、還元剤の存在下でのジスルフィド結合の切断により切断され、切断されたＴＡＧとリンカ−−薬物モノコンジュゲ−トとを含む混和剤を形成する。
【０３３７】
還元剤は、典型的には小分子であり、例えば、s−メルカプトエタノ−ル、グルタチオン、ジチオスレイト−ル（ＤＴＴ）及びＴＣＥＰから選択されうる。いくつかの態様では、還元剤はＤＴＴである。ＴＡＧ切断は、適切には、約３．５から約５．５、例えば約４又は約４．５のｐＨで行うことができる。いくつかの態様では、ＤＴＴは、ＴＡＧ−リンカ−−薬物脱保護モノコンジュゲ−トの溶液に対し、約０．１ｍＭから約２０ｍＭ、例えば約１ｍＭの濃度まで、約１５℃未満、例えば約２℃から約８℃の温度で加えられる。インキュベ−ションは、適切には、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間行うことができる。
【０３３８】
いくつかの態様では、精製タグの脱保護及び除去後のリンカ−−薬物モノコンジュゲ−トは、式ＶＩＩＩｆ：
2020515545.tif 000058
のものである。
【０３３９】
リンカ−−薬物モノコンジュゲ−トは、本明細書の他の部分に記載されるように、クロマトグラフィ−を介して、切断されたＴＡＧを含む混合物から単離することができる。ＣＩＥＣの態様において、適切な樹脂は本明細書の他の部分に記載される。通常、リンカ−−薬物モノコンジュゲ−トの単離のためのＣＩＥＣは、約４から約７、例えば約５．５のｐＨを有するバッファ−系を用いて行われる。例えば、バッファ−Ａは、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５）とし、バッファ−Ｂ（溶出用）は１０ｍＭのヒスチジン、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）とすることができる。ＣＩＥＣ分離では、まずリンカ−−薬物モノコンジュゲ−トが、続いて存在しうるジスルフィド結合ダイマ−及び切断ＴＡＧが溶出される。
【０３４０】
タンパク質溶液の浸透圧を調節するためにさらなるバッファ−Ｂを任意選択的に加えてもよい。単離されたリンカ−−薬物モノコンジュゲ−トは、本開示の架橋したＨＡを含むプロドラッグ組成物の調製にその後使用するために、５０ｍｇ／ｍＬを超える又は６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度に任意選択的に濃縮することができる。濃縮は、ＴＦＦにより又は膜を通した遠心分離により、行うことができる。
【０３４１】
薬物−リンカ−モノコンジュゲ−トとマレイミド官能化ＨＡのコンジュゲ−ション
再び図２及び３と、図６から図９を参照すると、リンカ−−薬物モノコンジュゲ−トＶＩＩＩｆは、リンカ−薬物コンジュゲ−ト試薬５として使用することができる。マレイミド基は、マレイミド基のいくらかの部分が薬物−リンカ−モノコンジュゲ−トとコンジュゲ−トしないように、したがって本明細書の他の部分に記載されるように、チオ−ル官能化ＨＡとの架橋に利用可能であるように試薬５を上回る当量で存在する。いくつかの態様では、マレイミド官能化ＨＡと薬物−リンカ−モノコンジュゲ−トの当量比は、１．１：１から約２：１、例えば約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、又は約１．８：１である。いくつかの態様では、反応混合物は、約２５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ（タンパク質に基づいて）、約３５ｍｇ／ｍＬから約５５ｍｇ／ｍＬ、又は約５５ｍｇ／ｍＬの薬物−リンカ−モノコンジュゲ−ト濃度を有する。コンジュゲ−ションは、約４．５から約６．５又は約５から約６、例えば約５．５のｐＨを有するバッファ−系において行われる。いくつかの態様では、バッファ−は、１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０である。反応温度は、約０℃、約５℃、１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃であり、反応混合物は、実質的に完全なコンジュゲ−ションを達成するために適切な時間、例えば約１時間から約１２時間、又はそれよりも長い時間、例えば約２時間、約４時間、若しくは約６時間にわたってインキュベ−トされる。
【０３４２】
いくつかの態様では、薬物−リンカ−−マレイミド官能化ＨＡは、構造ＸＩＩ：
2020515545.tif 000059
のものである。ＨＡ化合物ＸＩＩの官能化の度合いは上述のように変化してよく、構造ＸＩＩにおける官能化の相対的度合いは例示のみを目的としている。いくつかの実施態様では、ＸＩＩのＨＡ鎖上のカルボキシレ−ト部位の約０．５％から約６％、約１％から約５％、約１．５％から約４％、約２％から３％、又は約２％から約２．５％が未反応のマレイミド（したがってその後の架橋反応に利用可能である）によって占められ、同カルボキシレ−ト部位の約３％から約１０％、約５％から約９％、約６％から約８％、又は約７％から約８％はリンカ−薬物コンジュゲ−トによって占められる。特定の実施態様では、ＸＩＩのＨＡ鎖上のカルボキシレ−ト部位の約４％が未反応のマレイミドによって占められ、同カルボキシレ−ト部位の約６％がリンカ−薬物コンジュゲ−トによって占められる。特定の実施態様では、ＸＩＩのＨＡ鎖上のカルボキシレ−ト部位の約２．３％が未反応のマレイミドによって占められ、同カルボキシレ−ト部位の約７．７％がリンカ−薬物コンジュゲ−トによって占められる。薬物リンカ−コンジュゲ−トは、本明細書に記載されるＨＡ鎖上のマレイミド基と反応する薬物リンカ−コンジュゲ−トのチオ−ル基の反応を介してＨＡ鎖に結合する。未反応のマレイミドによって占められる部位とリンカ−薬物コンジュゲ−トによって占められる部位のパ−センテ−ジは、最終的なヒドロゲルコンジュゲ−トの架橋の度合いと薬物負荷を制御するために変更することができる。
【０３４３】
架橋したＨＡを含むプロドラッグ組成物の調製
いくつかの態様では、本開示のプロドラッグ組成物は、本明細書の他の部分に記載される薬物−リンカ−−マレイミド官能化ＨＡの溶液及び本明細書の他の部分に記載されるチオ−ル官能化ＨＡの溶液を含む反応混合物を形成すること、及びＨＡ架橋を達成するために十分なｐＨ、時間及び温度で反応混合物をインキュベ−トすることにより、調製することができる。反応は通常、図９に示される反応スキ−ムの工程７にしたがって進行し、ここで、ＬＡ、ＬＢ、ＬＣ、Ｌ２及び薬物は本明細書の他の部分に記載される通りである。いくつかの態様では、ｐＨは、約４．５から約６．５又は約５から約６、例えば約５．５である。反応温度は、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃である。
【０３４４】
いくつかの態様では、反応混合物は、完全に混合されてその後すぐにシリンジに充填される。次いで事前充填されたシリングは、本開示の架橋ＨＡプロドラッグ組成物の架橋及び形成を完了させるために、常温で約８時間から約４週間インキュベ−トされる。事前充填シリンジはまた、２−８℃で直接貯蔵され、その後常温で貯蔵されることはない。一実施態様では、薬物−リンカ−−マレイミド官能化ＨＡとチオ−ル官能化ＨＡの別々の溶液を、事前充填シリンジデバイスに各々直接導入してその中で混合し、事前充填シリンジデバイス内で架橋させ、その中で架橋反応を起こさせて、事前充填シリンジデバイス内部においてｉｎ  ｓｉｔｕで架橋ＨＡプロドラッグ組成物を形成する。架橋反応のための適切な時間（温度及びその他条件に応じて変化しうる）が経過した後、架橋ＨＡプロドラッグ組成物は、それ以上混合又は移動されることなく、患者への注射の準備が整う。
【０３４５】
他の実施態様では、架橋反応を実行するためにバッチ重合を実施することができる。次いでその結果得られるゲルを、メッシュに通すことにより細断して注射可能にし、その後シリンジデバイスに移す。
【０３４６】
いくつかの態様では、本開示のプロドラッグ組成物は式１０：
2020515545.tif 000060
のものであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、官能化の度合い及び薬物は本明細書の他の部分に規定される通りである。他のいくつかの態様では、ＨＡは、本明細書の他の部分に記載されるＲａ１及び／又はＲａ２で置換されうる。
【０３４７】
他のいくつかの態様では、本開示のプロドラッグ組成物は式１６：
2020515545.tif 000061
のものであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、官能化の度合い及び薬物は本明細書の他の部分に規定される通りである。他のいくつかの態様では、ＨＡは、本明細書の他の部分に記載されるＲａ１及び／又はＲａ２で置換されうる。
【０３４８】
他のいくつかの態様では、本開示のプロドラッグ組成物は式２６：
2020515545.tif 000062
のものであり、ＬＡ、ＬＢ、ＬＣ、Ｌ２、官能化の度合い及び薬物は本明細書の他の部分に規定される通りである。他のいくつかの態様では、ＨＡは、本明細書の他の部分に記載されるＲａ１及び／又はａで置換されうる。
【０３４９】
架橋したＨＡを含むプロドラッグ組成物の調製のための全体のプロセス
架橋したＨＡを含むプロドラッグ組成物の調製のための全体のプロセスは、図１０及び１１に示されている。
【０３５０】
架橋したＨＡを含むプロドラッグ組成物を調製するための一のプロセスが、図１０に示される。工程１では、アミン−ＨＡ  １が、本明細書の他の部分に記載されるアミン官能化ＨＡを調製するための方法に従って調製される。工程２では、恒久的なスペ−サ−を有するマレイミド−ＨＡが、本明細書の他の部分に記載されるマレイミド官能化ＨＡを調製するための方法に従って、アミン−ＨＡ  １から調製される。工程３では、アミン−ＨＡ  ２が、本明細書の他の部分に記載されるアミン官能化ＨＡを調製するための方法に従って調製される。工程４では、分解可能に結合したチオ−ル基を含むチオ−ル−ＨＡ  ２が、本明細書の他の部分に記載されるチオ−ル官能化ＨＡを調製するための方法に従って調製される。工程５では、薬物−リンカ−−チオ−ルモノコンジュゲ−トが、本明細書の他の部分に記載される方法に従って調製される。工程６では、薬物−リンカ−−チオ−ルモノコンジュゲ−トが、本明細書の他の部分に記載されるスペ−サ−を有するマレイミド−ＨＡにコンジュゲ−トされる。工程７では、架橋ＨＡを含むプロドラッグ組成物が、本明細書の他の部分に記載されるように、分解可能なチオ−ル−ＨＡ及び薬物−リンカ−−マレイミド−ＨＡから調製される。工程７は、架橋が行われる事前充填シリンジデバイスの中へ、工程６の薬物−マレイミド−ＨＡ及び工程４の分解可能なチオ−ルＨＡを直接滅菌濾過することを含みうる。
【０３５１】
架橋ＨＡを含むプロドラッグ組成物を調製するための別のプロセスが、図１１に示される。工程１では、アミン−ＨＡ  １が、本明細書の他の部分に記載されるアミン官能化ＨＡを調製するための方法に従って調製される。工程２では，スペ−サ−を有するマレイミド−ＨＡが、本明細書の他の部分に記載されるマレイミド官能化ＨＡを調製するための方法に従って、アミン−ＨＡ  １から調製される。工程３では、アミン−ＨＡ  ２が、本明細書の他の部分に記載されるアミン官能化ＨＡを調製するための方法に従って調製される。工程４では、分解可能に結合したチオ−ル基を含むチオ−ル−ＨＡ  ２が、本明細書の他の部分に記載されるチオ−ル官能化ＨＡを調製するための方法に従って調製される。工程５では、薬物−リンカ−−チオ−ルモノコンジュゲ−トが、本明細書の他の部分に記載される方法に従って調製される。工程６では、薬物−リンカ−−チオ−ルモノコンジュゲ−ト、恒久的なリンカ−を有するマレイミド−ＨＡ、及び分解可能リンカ−を有するチオ−ル−ＨＡが混合されてコンジュゲ−トされ、架橋ＨＡを含むプロドラッグ組成物が形成される。マレイミドＨＡ、薬物リンカ−チオ−ルモノコンジュゲ−ト及びチオ−ルＨＡは、各々が滅菌濾過されて事前充填シリンジデバイスに移され、そこで反応して最終的な架橋ＨＡプロドラッグが形成される。図１１の工程６の反応条件は、通常、本明細書の他の部分に記載される薬物−リンカ−−マレイミド−ＨＡ及び分解可能チオ−ル−ＨＡから架橋ＨＡを含むプロドラッグ組成物を調製するための条件のための反応条件と一致している。
【０３５２】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、緩衝剤、等張性修飾剤、防腐剤／抗菌剤、安定剤、抗吸着剤、抗酸化剤、増粘剤／粘性増強剤、及び／又はその他補助剤を含む、一つ又は複数の薬学的に許容される添加物を含む。
【０３５３】
緩衝剤は、組成物のｐＨを所望の範囲内に維持するために使用されうる。緩衝剤の非限定的な例には、リン酸ナトリウム、重炭酸塩、スクシネ−ト、ヒスチジン、シトレ−ト及びアセテ−ト、硫酸塩、ナイトレ−ト、クロリド、及びピルベ−トが含まれる。
【０３５４】
等張性修飾剤は、注射部位における浸透圧の差異に起因する細胞損傷により生じうる痛みを最小化するために使用することができる。等張剤の非限定的な例には、グリセリン及び塩化ナトリウムが含まれる。
【０３５５】
防腐剤／抗菌剤は、感染のリスクを最小限にするために使用することができる。防腐剤の非限定的な例には、ｍ−クレゾ−ル、フェノ−ル、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノ−ル、ベンジルアルコ−ル、硝酸フェニル水銀、チメロサ−ル（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾ−ル、及びベンザルコニウムクロリドが含まれる。
【０３５６】
安定剤は、ヒドロゲル及び薬物の分解を抑制するために使用することができる。安定剤の非限定的な例には：アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリンといったアミノ酸；グルコ−ス、スクロ−ス、トレハロ−スといった糖類；グリセロ−ル、マンニト−ル、ソルビト−ルといったポリオ−ル；リン酸カリウム、硫酸ナトリウムといった塩；ＥＤＴＡ、六リン酸塩といったキレ−ト剤；二価の金属イオン（亜鉛、カルシウムなど）といったリガンド；シクロデキストリン、デキストラン、デンドリマ、ＰＥＧ若しくはＰＶＰ、又はプロタミン若しくはＨＡＳといったオリゴマ−又はポリマ−；及び／又はフェノ−ル誘導体といったその他の塩又は有機分子が含まれる。
【０３５７】
抗吸着剤は、例えば、薬学的組成物を含むシリンジなどの容器の表面をコ−ティングする又はそのような表面に競合的に吸着するために使用されうる。抗吸収剤は、イオン性又は非イオン性界面活性剤、タンパク質、又は可溶型ポリマ−でありうる。界面活性剤の非限定的な例には：ラウリル硫酸アンモニウム及びラウリル硫酸ナトリウムといったアルキル硫酸；ラウレス硫酸ナトリウム及びナトリウムミレス硫酸塩といったアルキルエ−テル硫酸塩；スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホネ−ト、ペルフルオロブタンスルホネ−ト、アルキルベンゼンスルホネ−トといったスルホネ−ト；アルキルアリ−ルエ−テルホスフェ−ト及びアルキルエ−テルホスフェ−トといったホスフェ−ト；脂肪酸塩（石鹸）又はステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ペルフルオロノナノエ−ト、ペルフルオロオクタノエ−トといったカルボキシレ−ト；オクテニジン二塩酸塩；臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、セチルピリジニウムクロリド、ポリエトキシル化獣脂アミン、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムといった第四アンモニウムカチオン；３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネ−ト、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、アミノ酸、イミノ酸、コカミドプロピルベタイン、レシチンといった双性イオン；セチルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、セトステアリルアルコ−ル、オレイルアルコ−ルといった脂肪アルコ−ル；オクタエチレングリコ−ルモノドデシルエ−テル、ペンタエチレングリコ−ルモノドデシルエ−テルといったポリオキシエチレングリコ−ルアルキルエ−テル；ポリオキシプロピレングリコ−ルアルキルエ−テル；デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシドといったグルコシドアルキルエ−テル；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００といったポリオキシエチレングリコ−ルオクチルフェノ−ルエ−テル；ノノキシノ−ル−９といったポリオキシエチレングリコ−ルアルキルフェノ−ルエ−テル；ラウリン酸グリセリルといったグリセロ−ルアルキルエステル；ポリソルベ−トといったポリオキシエチレングリコ−ルソルビタンアルキルエステル；ソルビタンアルキルエステル；コカミドＭＥＡ及びコカミドＤＥＡ；ドデシルジメチルアミンオキサイド；ポリエチレングリコ−ルとポリプロピレングリコ−ルのブロックコポリマ−、例えばポロキサマ−（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）、ＰＥＧドデシルエ−テル（Ｂｒｉｊ  ３５）、ポリソルベ−ト  ２０及び８０が含まれ、その他の抗吸収剤は、デキストラン、ポリエチレングリコ−ル、ＰＥＧ−ポリヒスチジン、ＢＳＡ及びＨＳＡ及びゼラチンである。
【０３５８】
抗酸化剤の非限定的な例には、アスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロ−ル、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、キレ−ト剤、例えばクエン酸、ＥＤＴＡ、六リン酸塩、及びチオグリコ−ル酸が含まれる。
【０３５９】
架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ薬学的組成物は、複数回用量の薬学的組成物を含む容器内に提供される。このような複数回用量の薬学的組成物は、それを必要とする異なる患者に使用することができるか、又は一名の患者に使用することができ、初回用量の適用後、必要とされるまで残りの用量は貯蔵される。いくつかのこのような態様では、容器は事前充填シリンジである。
【０３６０】
架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ薬学的組成物は、事前充填シリンジ内の単一回又は複数回用量の薬学的組成物として提供されうる。
【０３６１】
本開示の架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ薬学的組成物は、適切には、約１０℃未満の温度でシリンジ内に貯蔵されうる。
【０３６２】
治療的量の架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ薬学的組成物は、眼内注射により投与することができる。例えば、組成物は、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のゲ−ジを有する針を使用して、それを必要とする対象の硝子体の中に注射される。
【０３６３】
いくつかの態様では、架橋ＨＡヒドロゲルプロドラッグ薬学的組成物は、キット内に提供される。このような態様では、キットは、架橋したＨＡヒドロゲルプロドラッグ薬学的組成物を事前充填したシリンジ、皮下針、及び使用説明書を含む。
【０３６４】
本発明は、本明細書に記載される架橋ＨＡヒドロゲル組成物に共有結合する抗体（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）を含む抗体コンジュゲ−トを提供する。
【０３６５】
本発明の架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト組成物における使用のための例示的抗体
あらゆる適切な抗体（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）を使用することができる。例えば、抗体は、ＶＥＧＦ；インタ−ロイキン−１ベ−タ（ＩＬ−１β）；インタ−ロイキン−６（ＩＬ−６）；インタ−ロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）；インタ−ロイキン−１３（ＩＬ−１３）；ＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）；ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）；アンジオポエチン；アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合ＶＥＧＦ−受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、又は可溶型ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））；ＳＴ−２受容体；並びに加齢黄斑変性（ＡＭＤ）リスクに遺伝的に関連するタンパク質（例えば、補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インタ−ロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。このような抗体は、例えば、血管新生を低減するため及び／又は病的血管新生（例えば、眼の障害又は細胞増殖性疾患）を伴う障害を治療するため若しくはそのような障害の進行を遅らせるために有用でありうる。本発明の抗体コンジュゲ−トに使用することのできる、例示的で非限定的な抗ＶＥＧＦ抗体について後述する。
【０３６６】
いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＸ１ＴＰＸ２ＧＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＤＳＶＸ７Ｘ８（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（Ｘ１はＩｌｅ又はＨｉｓであり、Ｘ２はＡｌａ又はＡｒｇであり、Ｘ３はＴｙｒ又はＬｙｓであり、Ｘ４はＴｈｒ又はＧｌｕであり、Ｘ５はＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕであり、Ｘ６はＡｌａ又はＧｌｕであり、Ｘ７はＬｙｓ又はＧｌｕであり、Ｘ８はＧｌｙ又はＧｌｕである）；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＸ１ＶＳＴＡＶＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（Ｘ１はＡｓｐ又はＡｒｇである）；（ｅ）Ｘ１ＡＳＦＬＹＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（Ｘ１はＳｅｒ又はＭｅｔである）；及び（ｆ）Ｘ１ＱＧＹＧＸ２ＰＦＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（Ｘ１はＧｌｎ、Ａｓｎ、又はＴｈｒであり、Ｘ２はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇである）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６個のＨＶＲ、或いは上記ＨＶＲのうちの一つ又は複数と、配列番号１〜６のうちのいずれか一つに対して少なくと約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有するその変異体のうちの一つ又は複数との組み合わせを含む。
【０３６７】
例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）、ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、又はＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）又はＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６個のＨＶＲ、或いは上記ＨＶＲのうちの一つ又は複数と、配列番号１、３、７〜１０、又は２１〜２３のうちのいずれか一つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有するその変異体のうちの一つ又は複数との組み合わせを含む。
【０３６８】
例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６個のＨＶＲ、或いは上記ＨＶＲのうちの一つ又は複数と、配列番号１、３、又は７〜１０のいずれか一つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有するその変異体のうちの一つ又は複数との組み合わせを含む。特定の実施例において、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３６９】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の重鎖可変ドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０３７０】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０３７１】
例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３７２】
例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６個のＨＶＲ、或いは上記ＨＶＲのうちの一つ又は複数と、配列番号１、３、８、９、２２又は２３のいずれか一つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有するその変異体のうちの一つ又は複数との組み合わせを含む。特定の実施例において、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３７３】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の重鎖可変のドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１、２、３、又は４個を含む。
【０３７４】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０３７５】
例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３７６】
いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３７７】
例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６個のＨＶＲ、或いは上記ＨＶＲのうちの一つ又は複数と、配列番号１、３、８〜１０、又は２２のいずれか一つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有するその変異体のうちの一つ又は複数との組み合わせを含む。特定の実施例において、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３７８】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の重鎖可変ドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１、２、３、又は４個を含む。
【０３７９】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、又はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）又はＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０３８０】
例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８１】
例えば、他の事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８２】
例えば、他の事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨのアミノ酸配列（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８３】
例えば、さらに他の事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８４】
例えば、さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８５】
他の事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８６】
例えば、他の事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８７】
他の事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６個のＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨのアミノ酸配列（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の重鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４個の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８８】
いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号１１、４０、又は４２のうちのいずれか一つに対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、或いは配列番号１１、４０、又は４２のうちのいずれか一つの配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号１２、４１、又は４６のいずれか一つに対して少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２、４１、又は４６のいずれか一つの配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；或いは（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの事例では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３８９】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の重鎖可変ドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）又はＷＶＲＱＥＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０３９０】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）又はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＤＣ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（配列番号４４）、又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）又はＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０３９１】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９２】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９３】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９４】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９５】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９６】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）の  アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９７】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）の  アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９８】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）の  アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０３９９】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）の  アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０４００】
いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）の  アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３又は１１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、或いは配列番号１１の配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１の配列を含むＶＬドメイン；或いは（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含みうる。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の重鎖フレ−ムワ−ク領域：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の軽鎖フレ−ムワ−ク領域：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。いくつかの事例では、例示的抗ＶＥＧＦは、Ｎ９４Ａ．Ｆ８３Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｙ５８Ｒ（Ｇ６．３１．ＡＡＲＲとも呼ばれる）である。
【０４０１】
いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３又は５１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、或いは配列番号３３又は５１の配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、３４、３５、３６、３７、又は３８のいずれか一つに対して少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２、３４、３５、３６、３７、又は３８のいずれか一つの配列を含むＶＬドメイン；或いは（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０４０２】
いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３又は５１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、或いは配列番号３３又は５１の配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号１２、３４、３５、３６、３７、又は３８のいずれか一つに対して少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２、３４、３５、３６、３７、又は３８のいずれか一つの配列を含むＶＬドメイン；或いは（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの事例では、抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０４０３】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の重鎖可変のドメインのフレ−ムワ−ク領域（ＦＲ）：ＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）又はＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）又はＷＶＲＱＥＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１、２、３、又は４個を含む。
【０４０４】
いくつかの事例では、前述の抗ＶＥＧＦ抗体はいずれも、以下の軽鎖可変ドメインのＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、又はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）又はＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１、２、３、又は４個を含みうる。
【０４０５】
いくつかの事例では、本発明は、（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。特定の実施態様では、抗体は、Ｆａｂフォ−マットに発現されるＧ６．３１  ＡＡＲＲである。
【０４０６】
いくつかの事例では、本発明は、（ａ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。特定の実施態様では、抗体は、抗ヒトＩｇＧに対する反応性を欠くＧ６．３１  ＡＡＲＲの変異型である。
【０４０７】
さらなる態様では、上記実施態様のいずれかによる抗体（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）には、以下のセクション１〜７に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
【０４０８】
セクション１：抗体親和性
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。例えば、いくつかの事例では、本明細書に提供される抗体は、約１０ｎＭ以下のＫｄで抗原（例えばヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ））と結合する。いくつかの事例では、本明細書に提供される抗体は、約５ｎＭ以下のＫｄで抗原（例えば、ｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、本明細書に提供される抗体は、約２ｎＭ以下のＫｄでｈＶＥＧＦと結合する。例えば、いくつかの事例では、抗体は、約２５ｐＭと約２ｎＭの間（例えば、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ、約６２５ｐＭ、約６５０ｐＭ、約６７５ｐＭ、約７００ｐＭ、約７２５ｐＭ、約７５０ｐＭ、約７７５ｐＭ、約８００ｐＭ、約８２５ｐＭ、約８５０ｐＭ、約８７５ｐＭ、約９００ｐＭ、約９２５ｐＭ、約９５０ｐＭ、約９７５ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、又は約２ｎＭ）のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約６００ｐＭの間（例えば、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ）のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約５００ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約４００ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約３００ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約２００ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約１５０ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約１２５ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭと約１００ｐＭの間のＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約８０ｐＭのＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約６０ｐＭのＫｄで抗原（例えばｈＶＥＧＦ）と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約４０ｐＭのＫｄで抗原（例���ばｈＶＥＧＦ）と結合する。
【０４０９】
一実施態様において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。一実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバ−ジョン及びその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原を用いてＦａｂを均衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体をコ−ティングしたプレ−トを用いて結合した抗原を捕獲することによって測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865−881（1999）を参照）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレ−ト（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コ−ティングし、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２％（ｗ／ｖ））のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、２から５時間室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着プレ−ト（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593−4599 （1997））の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで目的のＦａｂを一晩インキュベ−トするが、インキュベ−ションは、平衡状態に達したことを確実にするためにさらに長い時間にわたって（例えば約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕獲プレ−トに移し、室温で（例えば１時間）インキュベ−トする。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベ−ト２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））でプレ−トを８回洗浄する。プレ−トが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレ−トをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭガンマ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測する。最大結合の２０％以下が得られるＦａｂの濃度が、競合結合アッセイに用いるために選択される。
【０４１０】
別の実施態様によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアッセイは、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定化した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサ−チップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）が、供給業者の指示書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈した後で、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群を遮断するために、１Ｍのエタノ−ルアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃、及び約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のポリソルベ−ト２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサ−グラム及び解離センサ−グラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバ−ジョン３．２）を使用して、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865−881 （1999）を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリ−ズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下、２５℃、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【０４１１】
セクション２：抗体安定性
いくつかの事例では、本発明の抗体コンジュゲ−ト又はその組成物に使用される抗体は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばＧ６．３１（例えば、参照によりその全体が本明細書に包含される米国特許第７７５８８５９号及び国際公開第２００５／０１２３５９号参照）と比較して、安定性が増している。抗体の安定性は、当技術分野で既知の方法、例えば、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色法（ＣＤ）、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定法、分光法、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ））、自己相互作用クロマトグラフィ−（ＳＩＣ）を用いて決定することができる。抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばＧ６．３１と比較して、例えば、向上した融解温度（Ｔｍ）、凝集の温度（Ｔａｇｇ）、又は安定性のその他の測定基準を有している可能性がある。
【０４１２】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、約８０℃（例えば、約８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、又は約９３℃）以上のＴｍを有している。例えば、いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、約８３．５℃以上（例えば、約８３．５℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、又は約９３℃）のＴｍを有している。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は、約８２℃から約９２℃（例えば、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、又は約９２℃）のＴｍを有している。場合によっては、抗ＶＥＧＦ抗体は約８２℃のＴｍを有する。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体の前述のＴｍの値はいずれも、ＤＳＦを用いて決定される。いくつかの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体のＴｍの値は、例えば、参照によりその全体が本明細書に包含される国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３４５４の実施例１に記載されているように決定される。
【０４１３】
セクション３：抗体断片
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに下記の他の断片を含む。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129−134 （2003）を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer−Verlag, New York）, pp. 269−315 （1994）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベ−ジ受容体結合エピト−プ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０４１４】
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129−134 （2003）; 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444−6448 （1993）を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129−134 （2003）に記載されている。
【０４１５】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照）。
【０４１６】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファ−ジ）による生産を含む。
【０４１７】
セクション４：キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、実施例、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851−6855 （1984）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変ドメイン（例えば、マウス、ラット、ハムスタ−、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）とヒト定常ドメインとを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０４１８】
特定の実施態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したままヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合によってヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０４１９】
ヒト化抗体及びその作製方法については、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619−1633 （2008）に概説があり、さらには、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323−329 （1988）; Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029−10033 （1989）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25−34 （2005）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングについて記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489−498 （1991）（「リサ−フェイシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36:43−60 （2005）（「ＦＲシャフリング」について記載）；及びOsbourn et al., Methods 36:61−68 （2005） and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252−260 （2000）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」手法について記載）に記載がある。
【０４２０】
ヒト化に用いることのできるヒトフレ−ムワ−ク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレ−ムワ−ク領域（例えば、Sims et al., J. Immunol. 151:2296 （1993）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグル−プのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレ−ムワ−ク領域（例えば、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 （1992）;及びPresta et al., J. Immunol., 151:2623 （1993）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレ−ムワ−ク領域又はヒトの生殖細胞系フレ−ムワ−ク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619−1633 （2008）を参照）；及びＦＲライブラリ−スクリ−ニング由来のフレ−ムワ−ク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678−10684 （1997）及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611−22618 （1996）を参照）が含まれる。
【０４２１】
セクション５：ライブラリ−由来の抗体
本発明の抗体は、一つ又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリ−をスクリ−ニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファ−ジディスプレイライブラリ−を生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなラリ−をスクリ−ニングするために、当技術分野で知既知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1−37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）に総説が、さらに、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552−554; Clackson et al., Nature 352: 624−628 （1991）; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581−597 （1992）; Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161−175 （Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003）; Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338（2）: 299−310 （2004）; Lee et al., J. Mol. Biol. 340（5）: 1073−1093 （2004）; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（34）: 12467−12472 （2004）; 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284（1−2）: 119−132（2004）に記載がある。
【０４２２】
特定のファ−ジディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパ−トリ−を、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクロ−ニングし、ファ−ジライブラリ−にランダムに再結合させ、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433−455 （1994）に記載されるように、抗原結合ファ−ジについてスクリ−ニングすることができる。ファ−ジは通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。免疫された起源からのライブラリ−は、ハイブリド−マを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725−734 （1993）に記載されるように、ナイ−ブなレパ−トリ−を、いかなる免疫感作も無く、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対し、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クロ−ニングすることができる。最後に、ナイ−ブなライブラリ−は、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクロ−ニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマ−を用いて高度に可変のＣＤＲ３領域をコ−ドし、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381−388 （1992）により記載されるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配置を達成することにより、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファ−ジライブラリ−を記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第２００９／０００２３６０を含む。
【０４２３】
抗体又は抗体断片は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３４５４号に記載されるように、ファ−ジライブラリ−から得ることができる。
【０４２４】
ヒト抗体ライブラリ−から単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０４２５】
セクション６：多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクロ−ナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一つはＶＥＧＦに対するものであり、他方は他のいずれかの抗原（例えば第２の生体分子、例えば、インタ−ロイキン−１  ベ−タ（ＩＬ−１β）；インタ−ロイキン−６（ＩＬ−６）；インタ−ロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）；インタ−ロイキン−１３（ＩＬ−１３）；ＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）；ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）；アンジオポエチン；アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合ＶＥＧＦ−受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、又は可溶型ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））；ＳＴ−２受容体；並びに加齢黄斑変性（ＡＭＤ）リスクに遺伝的に関連するタンパク質（例えば、補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インタ−ロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）に対するものである。したがって、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ及びＩＬ−１β；ＶＥＧＦ及びＩＬ−６；ＶＥＧＦ及びＩＬ−６Ｒ；ＶＥＧＦ及びＩＬ−１３；ＶＥＧＦ及びＩＬ−１３Ｒ；ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ（例えばＰＤＧＦ−ＢＢ）；ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン；ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２；ＶＥＧＦ及びＴｉｅ２；ＶＥＧＦ及びＳ１Ｐ；ＶＥＧＦ及びインテグリンαｖβ３；ＶＥＧＦ及びインテグリンαｖβ５；ＶＥＧＦ及びインテグリンα５β１；ＶＥＧＦ及びベ−タセルリン；ＶＥＧＦ及びアペリン／ＡＰＪ；ＶＥＧＦ及びエリスロポエチン；ＶＥＧＦ及び補体因子Ｄ；ＶＥＧＦ及びＴＮＦα；ＶＥＧＦ及びＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、又はｓＶＥＧＦＲ）；ＶＥＧＦ及びＳＴ−２受容体；ＶＥＧＦ及びＣ２；ＶＥＧＦ及びＢ因子；ＶＥＧＦ及びＨ因子；ＶＥＧＦ及びＣＦＨＲ３；ＶＥＧＦ及びＣ３ｂ；ＶＥＧＦ及びＣ５；ＶＥＧＦ及びＣ５ａ；ＶＥＧＦ及びＣ３ａ；ＶＥＧＦ及びＡＲＭＳ２；ＶＥＧＦ及びＴＩＭＰ３；ＶＥＧＦ及びＨＬＡ；ＶＥＧＦ及びＩＬ−８；ＶＥＧＦ及びＣＸ３ＣＲ１；ＶＥＧＦ及びＴＬＲ３；ＶＥＧＦ及びＴＬＲ４；ＶＥＧＦ及びＣＥＴＰ；ＶＥＧＦ及びＬＩＰＣ；ＶＥＧＦ及びＣＯＬ１０Ａ１；又はＶＥＧＦ及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａに対する結合特異性を有しうる。特定の実施態様において、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦの二の異なるエピト−プに結合することができる。二重特異性抗体はまた、ＶＥＧＦを発現する細胞に対して細胞傷害性剤を局在化させるために用いてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦａｂ−Ｃ断片）として調製することができる。
【０４２６】
いくつかの事例では、二重特異性抗体は、参照によりその全体が本明細書に包含される米国特許出願公開第２０１４／００１７２４４号に開示された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）抗体である。例えば、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ（例えば本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか）に結合する第１の結合ドメインと、（ａ）ＧＹＹＭＨ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＳＰＮＰＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹＰＧＡＦＤＩ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＷＶ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は上記ＨＶＲのうちの一つ又は複数と、配列番号６２〜６７のいずれか一つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する一つ又は複数のその変異体の組み合わせを含む、Ａｎｇ２に結合する第２の結合ドメインとを含む。
【０４２７】
いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか）に結合する第１の結合ドメインと、Ａｎｇ２に結合し、且つ（ａ）配列番号６８に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号６８の配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）配列番号６９に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号６９の配列を含むＶＬドメイン；或いは（ｃ）（ａ）のＶＨドメインと（ｂ）のＶＬドメインを含む第２の結合ドメインとを含む。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか）に結合する第１の結合ドメインと、Ａｎｇ２に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含み、第２の結合ドメインは、参照によりその全体が本明細書に包含される国際公開第２０１０／０６９５３２号に記載されるいずれかの抗体結合ドメイン、又はその変異体である。
【０４２８】
他の事例では、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、国際公開第２０１６／０７３１５７号に記載されるいずれかの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体である。
【０４２９】
いくつかの事例では、二重特異性抗体は二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６抗体である。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか）に結合する第１の結合ドメインと、ＩＬ−６に結合する第２の結合ドメインを含む。第２の結合ドメインは、当技術分野で既知のいずれかの抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；例えば、参照によりその全体が本明細書に包含される国際公開第２０１６／０７３８９０号参照）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ（ｇｅｒｉｌｉｍｚｕｍａｂ）、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、又はこれらの変異体の結合ドメインとすることができる。
【０４３０】
いくつかの事例では、二重特異性抗体は二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６Ｒ抗体である。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６Ｒ二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか）に結合する第１の結合ドメインと、ＩＬ−６Ｒに結合する第２の結合ドメインを含む。第２の結合ドメインは、当技術分野で既知のいずれかの抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、参照によりその全体が本明細書に包含される国際公開第１９９２／０１９５７９号参照）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、又はこれらの変異体の結合ドメインとすることができる。
【０４３１】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 （1983）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 （1991）を参照）及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 （1985）を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパ−を使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148（5）:1547−1553 （1992）を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444−6448 （1993）を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマ−を使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 （1994）を参照）；及び、例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 （1991）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０４３２】
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む三又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０４３３】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＶＥＧＦ並びに別の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０４３４】
セクション７：抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体のアミノ酸配列の変異体（例えば、一つ又は複数のアミノ酸残基の変化を含む抗体変異体）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコ−ドするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させるために作製することができる。
【０４３５】
（ａ）置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施態様では、一つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異体の目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。より実質的な変更は、「例示的置換」と題して表１に示し、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記にさらに説明する。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その生成物は所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はその他の機能的特徴、例えば、安定性又はエフェクタ−機能についてスクリ−ニングされる。
【０４３６】
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【０４３７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグル−プ化することができる。（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；非保存的置換は、これらのクラスのうちの一クラスのメンバ−を別のクラスのものと交換することを必要とする。
【０４３８】
置換変異体の一種は、親抗体（例えばヒト化抗体）の一つ又は複数の超可変領域残基及び／又はＦＲ残基の置換を伴う。一般的に、その結果得られてさらなる研究のために選択された変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の向上、安定性の向上、発現の増大、ｐＩの改変、免疫原性の低下）を有する、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファ−ジディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成される。簡潔に言えば、一つ又は複数のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファ−ジ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリ−ニングされる。
【０４３９】
改変（例えば置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによってコ−ドされた残基（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179−196 （2008）を参照）、及び／又は抗原に接する残基内で行うことができ、得られる変異体ＶＨ又はＶＬの結合親和性が試験される。二次ライブラリ−から構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1−37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, （2001）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、エラ−プロ−ンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリ−が作成される。次いで、ライブラリ−は、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリ−ニングされる。多様性を導入する別の方法は、複数のＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向の手法を含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０４４０】
特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、 これらの改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一つ又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、例えば、ＨＶＲ内の残基に接する抗原の外側で生じる。上記変異体ＶＨ又はＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは不変であるか、又は一つ、二つ、若しくは三つを超えないアミノ酸置換を含む。
【０４４１】
特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、これらの改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一つ又は複数のＦＲ内で生じうる。このような改変は、例えば、抗体親和性及び／又は安定性を向上させる（例えば、上昇した融解温度により評価される）。
【０４４２】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells （1989） Science, 244:1081−1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグル−プ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリ−ニングされうる。
【０４４３】
アミノ酸配列挿入物は、１残基から、１００以上の残基を有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ−及び／又はカルボキシル末端融合体、並びに単一つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドへの融合を含む。
【０４４４】
（ｂ）等電点変異体
本発明は、改変された等電点を有する抗体変異体を提供する。例えば、本発明は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばＧ６．３１と比較して、減少した等電点（ｐＩ）を有する抗体変異体を提供する。いくつかの事例では、表面電荷が生理学的ｐＨにおいて低下する。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は約８（例えば、約８、約７、約６、約５、又は約４）以下のｐＩを有する。いくつかの事例では、抗体は約４から約８（例えば、約４、約５、約６、約７、又は約８）のｐＩを有する。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は約５から約７（例えば、約５、約６、又は約７）のｐＩを有する。いくつかの事例では、抗ＶＥＧＦ抗体は約５から約６（例えば、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６）のｐＩを有する。
【０４４５】
本発明の抗体は、低下したｐＩを有するように、例えば、所与の位置において野生型アミノ酸残基を、それよりも低いｐＩを有するアミノ酸で置換することにより、操作することができる。アミノ酸のｐＩは、アミン（−ＮＨ２）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、及び当技術分野において既知であるアミノ酸の側鎖のｐＫａ値に基づいて決定することができる。いくつかの実施態様では、抗体のｐＩを低下させるために、表面露出アミノ酸残基を置換することができる。一実施態様では、表面露出アミノ酸残基は、グルタメ−ト（Ｅ）で置換されうる。一実施態様では、表面露出アミノ酸残基は、アスパルテ−ト（Ｄ）で置換されうる。
【０４４６】
組み換え方法及び組成物
本明細書に記載される抗体はいずれも（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されるように、組み換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体をコ−ドする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコ−ドしうる。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む一つ又は複数のベクタ−（例えば、発現ベクタ−）が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコ−ドする核酸を含むベクタ−、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコ−ドする核酸を含む第一ベクタ−及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコ−ドする核酸を含む第ニベクタ−を含む（例えば、同ベクタ−で形質転換されている）。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコ−ドする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＶＥＧＦ抗体を作製する方法が提供される。
【０４４７】
抗体（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）の組み換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコ−ドする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクロ−ニング及び／又は発現のために、一つ又は複数のベクタ−に挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコ−ドする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプロ−ブを使用することによって）配列決定することができる。
【０４４８】
抗体をコ−ドするベクタ−のクロ−ニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載される原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクタ−機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で生成されうる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照のこと（大腸菌中の抗体断片の発現を記載しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003）, pp. 245−254も参照）。発現の後、抗体を、可溶性画分において細菌の細胞ペ−ストから単離し、さらに精製することができる。
【０４４９】
原核生物に加えて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パタ−ンを有する抗体の産生をもたらす、「ヒト化」されたグリコシル化経路を有する真菌及び酵母の株を含む、糸状菌又は酵母のような真核微生物も、抗体をコ−ドするベクタ−のための適切なクロ−ニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409−1414 （2004）及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210−215 （2006）を参照。
【０４５０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。
【０４５１】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。
【０４５２】
脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３細胞又は２９３細胞）；ベビ−ハムスタ−腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243−251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファロ−ラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44−68 （1982）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含むチャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、実施例、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255−268 （2003）を参照。
【０４５３】
アッセイ
抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体）、並びに抗体コンジュゲ−ト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗体コンジュゲ−ト（例えば、本明細書に提供される任意の抗ＶＥＧＦ抗体））は、当技術分野において既知の種々のアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリ−ニング、又は特徴付けすることができる。
【０４５４】
（ａ）結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）、又はその抗体コンジュゲ−トが、例えば、既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどにより、その抗原結合活性について試験される。
【０４５５】
別の態様では、競合アッセイを使用して、抗原（例えばＶＥＧＦ）への結合について、本明細書に記載される抗体又はその抗体コンジュゲ−トと競合する抗体を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、本明細書に記載される抗体が結合する同じエピト−プ（例えば直鎖状又は立体構造エピト−プ）に結合する。抗体が結合するエピト−プをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris （1996）“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。
【０４５６】
代表的な競合アッセイでは、ＶＥＧＦに結合する第一の標識抗体と、ＶＥＧＦへの結合について第一の抗体と競合する能力について試験する第二の非標識抗体とを含む溶液中で固定化したＶＥＧＦをインキュベ−トする。第二の抗体はハイブリド−マ上清中に存在してもよい。コントロ−ルとして、固定化したＶＥＧＦが、第一の標識抗体を含むが第二の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベ−トされる。ＶＥＧＦへの第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベ−トした後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化したＶＥＧＦに結合した標識の量を測定する。固定化したＶＥＧＦに結合した標識の量が対照資料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体がＶＥＧＦへの結合に関して第一の抗体と競合していることを示している。他の抗原について同様のアッセイを実施してもよい。Harlow and Lane （1988） Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring 担持する, NY）を参照。
【０４５７】
（ｂ）活性のアッセイ
一態様において、生物活性を有する抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）、又はその抗体コンジュゲ−トを同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｅ×  ｖｉｖｏでの、抗原（例えば、ＶＥＧＦ（例えば、血流中のＶＥＧＦ））又はそのペプチド断片への結合が含まれる。特定の実施態様では、生物活性には抗原を遮断又は中和することが含まれる。例えば、特定の実施態様では、生物活性には、ＶＥＧＦを遮断若しくは中和すること、又はＶＥＧＦがリガンド、例えば、ＫＤＲ又はＦｌｔ−１といった受容体に結合することを防止することが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有する抗体、又はその抗体コンジュゲ−トも提供される。特定の実施態様では、本発明の抗体、又はその抗体コンジュゲ−トが、そのような生物活性について試験される。
【０４５８】
（ｃ）安定性のアッセイ
一態様において、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又はその抗体コンジュゲ−トの安定性（例えば、耐温性）を決定するためのアッセイが提供される。例えば、抗体、又はその抗体コンジュゲ−トの安定性は、当技術分野で既知の方法、例えば、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色法（ＣＤ）、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定法、分光法、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ））、自己相互作用クロマトグラフィ−（ＳＩＣ）を用いて決定することができる。抗体又はその抗体コンジュゲ−トの安定性は、例えば、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３４５４の実施例１及び２に記載されるＤＳＦを用いて、本明細書に記載されるようにして決定することができる。いくつかの事例では、抗体コンジュゲ−トの安定性は、屈折率及び多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ）とインラインのサイズ排除クロマトグラフィ−により決定することができる。
【０４５９】
治療的方法及び組成物
本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又はその抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、治療方法に使用することができる。
【０４６０】
一態様において、医薬としての使用のための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。別の態様では、医薬としての使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）が提供される。さらなる態様では、本発明は、病的血管新生を伴う障害の治療における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。別の態様では、本発明は、病的血管新生を伴う障害の治療における使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）を提供する。いくつかの実施態様では、病的血管新生を伴う障害は、眼の障害又は細胞増殖性障害である。いくつかの事例では、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、湿潤性のＡＭＤ、乾燥性のＡＭＤ、中間のＡＭＤ、進行性のＡＭＤ、又は地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ又はびまん性で中心窩を含むＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、又は高高度ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、中心型（ＣＲＶＯ）及び分岐型（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生を伴う疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生を伴う疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コ−ト病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（例えば、伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎）、レ−バ−の先天性黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、又はシェ−グレン症候群である。いくつかの事例では、細胞増殖性疾患はがんである。いくつかの事例では、がんは、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎がん、前立腺がん、肝がん、頭頚部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、又は多発性骨髄腫である。別の態様では、望ましくない血管透過性を伴う障害の治療における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。いくつかの事例では、望ましくない血管透過性を伴う障害は、脳腫瘍を伴う浮腫、悪性腫瘍を伴う腹水症、メイグス症候群、肺の炎症、ネフロ−ゼ症候群、心膜液貯留、胸水、又は心血管疾患を伴う透過性である。
【０４６１】
別の態様では、治療方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。別の態様では、治療方法における使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）が提供される。特定の事例では、本発明は、病的血管新生を伴う障害を有する患者の治療方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）を提供し、前記方法は、有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を個体に投与することを含む。本発明は、病的血管新生を伴う障害を有する患者の治療方法における使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）も提供し、前記方法は、有効量の抗体コンジュゲ−トを個体に投与することを含む。いくつかの事例では、病的血管新生を伴う障害は眼の障害である。いくつかの事例では、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、湿潤性のＡＭＤ、乾燥性のＡＭＤ、中間のＡＭＤ、進行性のＡＭＤ、又は地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ又はびまん性で中心窩を含むＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、又は高高度ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、中心型（ＣＲＶＯ）及び分岐型（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コ−ト病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（例えば、伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎）、レ−バ−の先天性黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、又はシェ−グレン症候群である。いくつかの事例では、細胞増殖性疾患はがんである。いくつかの事例では、がんは、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎がん、前立腺がん、肝がん、頭頚部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、又は多発性骨髄腫である。
【０４６２】
他の事例では、本発明は、望ましくない血管透過性を伴う障害を有する個体の治療方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。他の事例では、本発明は、望ましくない血管透過性を伴う障害を有する個体の治療方法における使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）を提供する。いくつかの事例では、望ましくない血管透過性を伴う障害は、脳腫瘍を伴う浮腫、悪性腫瘍を伴う腹水症、メイグス症候群、肺の炎症、ネフロ−ゼ症候群、心膜液貯留、胸水、又は心血管疾患を伴う透過性である。上述の使用はいずれも、例えば後述するように、個体に対し、少なくとも一つの追加の治療剤の有効量を投与することをさらに含みうる。
【０４６３】
いくつかの事例では、本発明は、対象における血管新生の低減又は阻害における使用のための抗ＶＥＧＦを提供する。別の態様では、対象における血管新生の低減又は阻害における使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）が提供される。特定の実施態様では、本発明は、対象の血管新生を低減又は阻害する方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、前記方法は、個体に対し、血管新生を低減又は阻害するために有効な抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む。本発明は、対象の血管新生を低減又は阻害する方法における使用のための抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）も提供し、前記方法は、個体に対し、有効量の抗体コンジュゲ−トを投与することを含む。他の事例では、本発明は、対象における血管透過性の低減又は阻害における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）を提供する。特定の実施態様では、本発明は、対象における血管透過性の低減又は阻害における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）を提供し、前記方法は、個体に対し、血管透過性を低減又は阻害するために、有効な抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体コンジュゲ−トを投与することを含む。上記使用のいずれによる「対象」も、ヒトであってよい。
【０４６４】
本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＶＥＧＦ抗体の使用を提供する。本発明は、医薬の製造又は調製における抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）の使用も提供する。例えば、一つの事例では、医薬は病的血管新生を伴う障害の治療を目的としている。さらなる事例では、医薬は、病的血管新生を伴う障害の治療方法における使用を目的としており、前記方法は、病的血管新生を伴う障害を有する対象に対して有効量の医薬を投与することを含む。いくつかの事例では、病的血管新生を伴う障害は眼の障害である。いくつかの事例では、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、湿潤性のＡＭＤ、乾燥性のＡＭＤ、中間のＡＭＤ、進行性のＡＭＤ、又は地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ又はびまん性で中心窩を含むＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、又は高高度ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、中心型（ＣＲＶＯ）及び分岐型（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コ−ト病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（例えば、伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎）、レ−バ−の先天性黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、又はシェ−グレン症候群である。いくつかの事例では、細胞増殖性疾患はがんである。いくつかの事例では、がんは、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎がん、前立腺がん、肝がん、頭頚部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、又は多発性骨髄腫である。さらなる事例では、医薬は、対象における血管新生を低減又は阻害することを目的としている。さらなる事例では、医薬は、対象の血管新生を低減又は阻害する方法における使用を目的としており、前記方法は、血管新生を低減又は阻害するために、対象に対して有効量の医薬を投与することを含む。上記いずれの医薬の使用においても、方法は、例えば後述するように、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤の有効量を投与することを含む。
【０４６５】
別の事例では、医薬は、望ましくない血管透過性を伴う障害の治療を目的としている。いくつかの事例では、望ましくない血管透過性を伴う障害は、脳腫瘍を伴う浮腫、悪性腫瘍を伴う腹水症、メイグス症候群、肺の炎症、ネフロ−ゼ症候群、心膜液貯留、胸水、又は心血管疾患を伴う透過性である。さらなる事例では、医薬は望ましくない血管透過性を伴う障害の治療方法における使用を目的としており、前記方法は、望ましくない血管透過性を伴う障害を有する対象に対して有効量の医薬を投与することを含む。別の事例では、医薬は、対象における血管透過性を低下又は阻害することを目的としている。さらなる事例では、医薬は、対象の血管新生を低減又は阻害する方法における使用を目的としており、前記方法は、血管透過性を低下又は阻害するために、対象に対して有効量の医薬を投与することを含む。前記医薬の使用のいずれにおいても、方法は、例えば後述するように、対象に対して、少なくとも一つの追加の治療剤の有効量を投与することを含みうる。上記使用のいずれによる「対象」も、ヒトであってよい。
【０４６６】
本発明は、病的血管新生を伴う障害を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、病的血管新生を伴う障害を有する個体に対し、有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む。別の実施例では、方法は、病的血管新生を伴う障害を有する個体に対し、有効量の抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）を投与することを含む。いくつかの事例では、病的血管新生を伴う障害は眼の障害である。いくつかの事例では、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、湿潤性のＡＭＤ、乾燥性のＡＭＤ、中間のＡＭＤ、進行性のＡＭＤ、又は地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、極限性の、中心窩を含まないＤＭＥ又はびまん性で中心窩を含むＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、又は高高度ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、中心型（ＣＲＶＯ）及び分岐型（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コ−ト病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生の疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、乳頭水腫、網膜炎、結膜炎（例えば、伝染性結膜炎及び非伝染性（例えば、アレルギ−性）結膜炎）、レ−バ−の先天性黒内障、ブドウ膜炎（伝染性及び非伝染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、又はシェ−グレン症候群である。いくつかの事例では、細胞増殖性疾患はがんである。いくつかの事例では、がんは、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎がん、前立腺がん、肝がん、頭頚部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、又は多発性骨髄腫である。さらなる態様では、方法は、個体に対し、後述するような少なくとも一の追加的な治療剤の有効量を投与することをさらに含む。上記方法のいずれによる「対象」も、ヒトであってよい。
【０４６７】
本発明は、望ましくない血管透過性を伴う障害を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、望ましくない血管透過性を伴う障害を有する個体に対し、有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む。別の実施態様では、方法は、望ましくない血管透過性を伴う障害を有する個体に対し、有効量の抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）を投与することを含む。いくつかの事例では、望ましくない血管透過性を伴う障害は、脳腫瘍を伴う浮腫、悪性腫瘍を伴う腹水症、メイグス症候群、肺の炎症、ネフロ−ゼ症候群、心膜液貯留、胸水、又は心血管疾患を伴う透過性である。さらなる態様では、方法は、個体に対し、後述するような少なくとも一の追加的な治療剤の有効量を投与することをさらに含む。上記方法のいずれによる「対象」も、ヒトであってよい。
【０４６８】
本発明の抗体又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、哺乳動物を治療するために使用されうることが企図される。一実施態様では、抗体又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、例えば前臨床デ−タを取得する目的で非ヒト哺乳動物に投与される。治療される非ヒト哺乳動物には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）と、前臨床研究が実施されるその他の哺乳動物が含まれる。このような哺乳動物は、抗体で治療される疾病について確立された動物モデルであるか、又は対象の抗体の毒性又は薬物動態を研究するために使用することができる。これら実施態様の各々において、用量漸増試験を哺乳動物において実施することができる。抗体又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、例えば、固形腫瘍モデルにおいて宿主のげっ歯類に投与されうる。抗体又は抗体コンジュゲ−トは、眼の薬物動態学試験のために、例えば硝子体内投与（例えば、硝子体内注射）により宿主（例えばげっ歯類、例えばウサギ）に投与されうる。
【０４６９】
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）のいずれかと、薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、例えば後述するように、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）のいずれかと、少なくとも一つの追加の治療剤を含む。特定の実施態様では、薬学的製剤は、一つ又は複数の追加の化合物を含む。特定の実施態様では、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インタ−ロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；並びにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群より選択される、第２の生体分子に結合する。特定の実施態様では、追加の化合物は、抗体又はその抗原結合断片である。例えば、いくつかの事例では、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、国際公開第２０１０／０６９５３２号又は同第２０１６／０７３１５７号に開示されたＲＧ−７７１６又はいずれかの二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体といった抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、又はその変異体である。別の実施例では、いくつかの事例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；例えば、国際公開第２０１６／０７３８９０号参照）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、又はこれらの変異体である。またさらなる実施例では、いくつかの事例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、国際公開第１９９２／０１９５７９号参照）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、又はこれらの変異体である。
【０４７０】
抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、治療法において、単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、少なくとも一つの追加の治療剤と共投与することができる。特定の実施態様では、追加の治療剤は、別の抗体、化学療法剤、細胞傷害性剤、抗血管新生剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐薬、がんワクチン、鎮痛剤、増殖阻害剤、又はこれらの組み合わせである。
【０４７１】
例えば、特定の実施態様では、上記方法のいずれもが、一つ又は複数の追加の化合物をさらに含む。特定の実施態様では、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）が、追加の化合物（複数可）と同時に投与される。特定の実施態様では、抗体又は抗体コンジュゲ−トは、追加の化合物（複数可）の前又は後に投与される。特定の実施態様では、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；及びＡＭＤのリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インタ−ロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；並びにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群より選択される、第２の生体分子に結合する。特定の実施態様では、追加の化合物は、抗体又はその抗原結合断片である。上記実施態様のいずれかによる（又はそれらのいずれかに適用される特定の実施態様では、眼の障害は、増殖性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性及びその他虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯを含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、並びに未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群より選択される眼内血管新生性疾患である。例えば、いくつかの事例では、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、国際公開第２０１０／０６９５３２号若しくは同第２０１６／０７３１５７号に開示されたＲＧ−７７１６又はいずれかの二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体といった抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、又はその変異体である。別の実施例では、いくつかの事例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；例えば、国際公開第２０１６／０７３８９０号参照）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、又はこれらの変異体である。またさらなる実施例では、いくつかの事例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、国際公開第１９９２／０１９５７９号参照）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、又はこれらの変異体である。
【０４７２】
いくつかの事例では、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、眼の障害、例えば本明細書に記載される眼の障害（例えば、ＡＭＤ（例えば湿潤性ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療ための少なくとも一つの追加の治療剤と組み合わせて投与されうる。眼の障害の治療のための併用療法に例示的な追加の治療剤には、限定されないが、例えば抗ＶＥＧＦ抗体（抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ  ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）など）を含む抗血管新生剤、可溶性受容体融合タンパク質（例えば、組み換え可溶性受容体融合タンパク質ＥＹＬＥＡ（登録商標）（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  Ｅｙｅとしても知られるアフリベルセプト；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ））、アプタマ−（例えば、抗ＶＥＧＦペグ化アプタマ−ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウムを含む；ＮｅＸｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、及びＶＥＧＦＲ  チロシンキナ−ゼ阻害剤（例えば、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインド−ル−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））；トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテタ−ゼ（ＴｒｐＲＳ）；スクアラミン；ＲＥＴＡＡＮＥ（登録商標）（デポ懸濁液用の酢酸アネコルタブ；Ａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ．）；コンブレタスチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）；ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン−ｒｕ４８６）；サブテノントリアムシノロンアセトニド；硝子体内結晶質トリアムシノロンアセトニド；マトリックスメタロプロテイナ−ゼ阻害剤（例えば、Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ（ＡＧ３３４０；Ｐｆｉｚｅｒ））；フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内レンズを含む；Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ／Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；リノミド；インテグリンβ３機能の阻害剤；アンギオスタチン、及びこれらの組み合わせが含まれる。本発明の抗体コンジュゲ−トと組み合わせて投与することのできる上記の及びその他の治療剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に包含される米国特許出願公開第２０１４／００１７２４４号に記載されている。
【０４７３】
眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療のために、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）と組み合わせて使用することのできる追加の治療剤のさらなる例には、限定されないが、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン；一般的には非熱レ−ザ−を用いる光力学療法と組み合わせて使用される光活性化薬）、ＰＫＣ４１２、Ｅｎｄｏｖｉｏｎ（ＮＳ  ３７２８；ＮｅｕｒｏＳｅａｒｃｈ  Ａ／Ｓ）、神経栄養因子（例えば、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ））、ジルチアゼム、ドルゾラミド、ＰＨＯＴＯＴＲＯＰ（登録商標）、９−シス−網膜、目の薬（例えば、ヨウ化ホスホリン、エコチオフェ−ト、又は炭酸脱水酵素阻害剤）、ヴェオバスタット（ｖｅｏｖａｓｔａｔ）（ＡＥ−９４１；ＡＥｔｅｒｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｉｒｎａ−０２７（ＡＧＦ−７４５；Ｓｉｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ニュ−ロトロフィン（例示のみを目的として、ＮＴ−４／５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含む）、Ｃａｎｄ５（Ａｃｕｉｔｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ−３７２１７（Ｉｎｓｐｉｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インテグリンアンタゴニスト（Ｊｅｒｉｎｉ  ＡＧ  ａｎｄ  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのものを含む）、ＥＧ−３３０６（Ａｒｋ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．）、ＢＤＭ−Ｅ（ＢｉｏＤｉｅｍ  Ｌｔｄ．）、サリドマイド（例えばＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．によって使用される）、カルジオトロフィン−１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、２−メトキシエストラジオ−ル（Ａｌｌｅｒｇａｎ／Ｏｃｕｌｅｘ）、ＤＬ−８２３４（Ｔｏｒａｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＮＴＣ−２００（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）、テトラチオモリブデ−ト（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ＬＹＮ−００２（Ｌｙｎｋｅｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、小型藻類化合物（Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ／Ａｌｂａｎｙ、Ｍｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｄ−９１２０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ  ｐｌｃ）、ＡＴＸ−Ｓ１０（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）、ＴＧＦ−ベ−タ  ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｌｔｒｉｘ）、チロシンキナ−ゼ阻害剤（例えば、Ａｌｌｅｒｇａｎ、ＳＵＧＥＮ、又はＰｆｉｚｅｒのもの）、ＮＸ−２７８−Ｌ（ＮｅＸｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏｐｔ−２４（ＯＰＴＩＳ  Ｆｒａｎｃｅ  ＳＡ）、網膜細胞ガングリオン神経保護物質（Ｃｏｇｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎ−ニトロピラゾ−ル誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＫＰ−１０２（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロスポリンＡ、光力学療法に使用される治療剤（例えばＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）；受容体標的化ＰＤＴ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｃｏ．；ＰＤＴによる注射のためのポルフィマ−ナトリウム；ベルテポルフィン、ＱＬＴ  Ｉｎｃ．；ＰＤＴによるロスタポルフィン、Ｍｉｒａｖｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅ��ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＰＤＴによるタラポルフィンナトリウム、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ；及びモテキサフィンルテチウム、Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Ｎｏｖａｇａｌｉ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡにより試験済みの製品及びＩＳＩＳ−１３６５０、Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓを含む）、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０４７４】
本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療のための治療法又は外科手技と組み合わせて投与することができ、そのような治療法又は外科手技には、例えば、レ−ザ−光凝固（例えば、汎網膜光凝固（ＰＲＰ））、ドル−ゼンレ−ザ−治療、黄斑円孔の手術、黄斑移動術、移植式超小型テレスコ−プ、ＰＨＩ−モ−ション血管造影法（マイクロレ−ザ−療法及びフィ−ダ−血管治療としても知られる）、陽子線治療、微小刺激療法、網膜剥離及び硝子体手術、胸膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱療法、光化学系Ｉ療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレ−シス（ｒｈｅｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）（膜差圧濾過及びレオセラピ−としても知られる）、マイクロチップ移植、幹細胞療法、遺伝子置換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答エレメントの遺伝子療法（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ）；Ｌｅｎｔｉｐａｋ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）；及びＰＤＥＦ遺伝子療法（ＧｅｎＶｅｃ）を含む）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞（Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．）；網膜細胞移植、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．）、針療法、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【０４７５】
いくつかの事例では、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療のための抗血管新生剤と組み合わせて投与することができる。いずれの適切な抗血管新生剤も、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−トと組み合わせて使用することができ、これには、限定されないが、Carmeliet et al. Nature 407:249−257, 2000によって列挙されているものが含まれる。いくつかの実施態様では、抗血管新生剤はＶＥＧＦアンタゴニストであり、これには、限定されないが、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ  ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ−２５８（前のＥＳＢＡ−１００８、抗ＶＥＧＦ単鎖抗体断片；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＲＧ−７７１６といった抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体；Ｒｏｃｈｅ））、可溶型組み換え受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、ＶＥＧＦ変異体、可溶型ＶＥＧＦＲ断片、ＶＥＧＦ（例えば、ペガプタニブ）又はＶＥＧＦＲを遮断することのできるアプタマ−、中和性抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナ−ゼの小分子阻害剤、抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、ａｂｉｃｉｐａｒ  ｐｅｇｏｌ）、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ、ＶＥＧＦＲチロシンキナ−ゼ阻害剤（例えば、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインド−ル−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））、並びにこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの事例では、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は第２の生体分子に結合し、このような分子には、限定されないが、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベ−タセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、又はｓＶＥＧＦＲ）；ＳＴ−２受容体；及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；並びにＴＮＦＲＳＦ１０Ａが含まれる。例えば、いくつかの事例では、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、国際公開第２０１０／０６９５３２号若しくは同第２０１６／０７３１５７号に開示されたＲＧ−７７１６又はいずれかの二重特異性抗��ＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体といった抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、又はその変異体である。
【０４７６】
眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療のために、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）と組み合わせて投与することのできる他の適切な抗血管新生剤には、コルチコステロイド、抗欠陥新生ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンギオスタチン、エンドスタチン、チロシンキナ−ゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナ−ゼ（ＭＭＰ）阻害剤、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、間質由来因子（ＳＤＦ−１）アンタゴニスト（例えば、抗ＳＤＦ−１抗体）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ガンマ−セクレタ−ゼ、Ｄｅｌｔａ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αアンタゴニスト、プロテインキナ−ゼＣＫ２アンタゴニスト、血管新生の部位への幹細胞（例えば、内皮前駆細胞）ホ−ミングを阻害する薬剤（例えば、抗血管内皮カドヘリン（ＣＤ−１４４）抗体及び／又は抗ＳＤＦ−１抗体）、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【０４７７】
さらなる実施例では、いくつかの事例において、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療のために、血管新生に対して活性を有する薬剤と組み合わせて投与することがで、そのような薬剤は、例えば、抗炎症薬、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、ラパマイシン、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）（エベロリムス）の哺乳動物標的、及びＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）（テムシロリムス））、シクロスポリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びゴリムマブ）又は可溶性受容体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト））、抗補体剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、或いはこれらの組み合わせである。
【０４７８】
またさらなる実施例では、いくつかの事例では、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）は、神経保護性で、乾燥性ＡＭＤから湿潤性ＡＭＤへの進行を低減させうる薬剤、例えば「神経ステロイド」と呼ばれる薬剤のクラスと組み合わせて投与することができ、そのような薬剤には、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（商標名：ＰＲＡＳＴＥＲＡＴＭ及びＦＩＤＥＬＩＮ（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩、及びプレグネノロン硫酸塩といった薬物が含まれる。
【０４７９】
眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、又はＲＶＯ）の治療のために、いずれかの適切なＡＭＤ治療剤を、追加の治療剤として、本発明の抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）又は抗体コンジュゲ−ト（例えば、架橋ＨＡヒドロゲルコンジュゲ−ト）と組み合わせて投与することができ、そのような治療剤には、限定されないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ−２５８（前のＥＳＢＡ−１００８、抗ＶＥＧＦ単鎖抗体断片；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体、例えばＲＧ−７７１６；Ｒｏｃｈｅ））、可溶型ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパルペゴル（ａｂｉｃｉｐａｒ  ｐｅｇｏｌ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）、又は抗ＶＥＧＦ  アプタマ−（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム））；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体（例えば、ＲＥＧＮ２１７６−３）、抗ＰＤＧＦ−ＢＢペグ化アプタマ−（例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、可溶型ＰＤＧＦＲ受容体融合タンパク質、又は二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＤＥ−１２０（Ｓａｎｔｅｎ）又はＸ−８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））又は二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体））；ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン）と光力学療法の組み合わせ；抗酸化剤；補体系アンタゴニスト、例えば、補体因子Ｃ５アンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＡＲＣ−１９０５；Ｏｐｔｈｏｔｅｃｈ）又は抗Ｃ５抗体（例えば、ＬＦＧ−３１６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、プロパ−ジンアンタゴニスト（例えば、抗プロパ−ジン抗体、例えば、ＣＬＧ−５６１；Ａｌｃｏｎ）、又は補体因子Ｄアンタゴニスト（例えば、抗補体因子Ｄ抗体、例えば、ランパリズマブ；Ｒｏｃｈｅ））；視覚サイクル修飾剤（例えば、エミクススタット塩酸塩）；スクアラミン（例えば、ＯＨＲ−１０２；Ｏｈｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ビタミン及びミネラルのサプリメント（例えば、加齢性眼疾患の研究１（ＡＲＥＤＳ１；亜鉛及び／又は抗酸化剤）及び研究２（ＡＲＥＤＳ２；亜鉛、抗酸化剤、ルテイン、ゼアキサンチン、及び／又はオメガ−３脂肪酸）に記載のもの）；細胞療法、例えば、ＮＴ−５０１（Ｒｅｎｅｘｕｓ）；ＰＨ−０５２０６３８８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ｈｕＣＮＳ−ＳＣ細胞移植（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）、ＣＮＴＯ−２４７６（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＯｐＲｅｇｅｎ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又はＭＡ０９−ｈＲＰＥ細胞移植（Ｏｃａｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；組織因子アンタゴニスト（例えば、ｈＩ−ｃｏｎ１；Ｉｃｏｎｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；アルファ−アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、酒石酸ブリモニジン）；ペプチドワクチン（例えば、Ｓ−６４６２４０；Ｓｈｉｏｎ���ｇｉ）；アミロイドベ−タアンタゴニスト（例えば、抗ベ−タアミロイドモノクロ−ナル抗体、例えば、ＧＳＫ−９３３７７６）；Ｓ１Ｐアンタゴニスト（例えば、抗Ｓ１Ｐ抗体、例えば、ｉＳＯＮＥＰＴＭ；Ｌｐａｔｈ  Ｉｎｃ）；ＲＯＢＯ４アンタゴニスト（例えば、抗ＲＯＢＯ４抗体、例えば、ＤＳ−７０８０ａ；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）；レンチウイルスベクタ−発現エンドスタチン及びアンギオスタチン（例えば、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ）；並びにこれらのいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの事例では、ＡＭＤ治療剤（前記ＡＭＤ治療剤のいずれかを含む）を共製剤化することができる。例えば、抗ＰＤＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ２１７６−３は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））と共製剤化することができる。いくつかの事例では、このような共製剤は、本発明の抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの事例では、眼の障害はＡＭＤ（例えば、湿潤性ＡＭＤ）である。
【０４８０】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）と、本発明の抗体又は抗体コンジュゲ−トの投与が、一つ又は複数の追加の治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起きうる分離投与とを包含する。一実施態様では、抗体又は抗体コンジュゲ−トの投与と追加の治療剤の投与は、互いの約１、２、３、４、若しくは５カ月以内に、又は約１、２、若しくは３週間以内に、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。
【実施例】
【０４８１】
以下の実施例及び本明細書の他の部分では、次の略記を使用している場合がある。
2020515545.tif 000064
2020515545.tif 000065
【０４８２】
実施例１Ａ    自壊性保護基  ４−（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ３の合成
2020515545.tif 000066
スキ−ム１Ａ
【０４８３】
４−（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ３の合成が、スキ−ム１Ａに示されている。
工程１    ４−（ヒドロキシメチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−ト  ａ２の調製
４−ヒドロキシベンジルアルコ−ルａ１（１．７０ｇ；１３．６９ｍｍｏｌ；１．００当量）を、ＴＨＦ（２０．５ｍｌ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（４．８ｍｌ；２７．３９ｍｍｏｌ；２．００当量）を撹拌しながら加えた。ＴＨＦ（５ｍｌ）中、４−ニトロフェニル  クロロホルメ−ト（２．９０ｇ；１４．３８ｍｍｏｌ；１．０５当量）を、２５分かけて滴下した。反応物を、さらに２０分間室温で撹拌した。ＬＣＭＳによるＩＰＣにより、所望の中間体の形成を確認した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルエチレンジアミン（２．２１ｍｌ；１７．１２ｍｍｏｌ；１．２５当量）を、溶液にゆっくりと加え、反応混合物をさらに２０分間撹拌した。ＬＣＭＳによるＩＰＣにより、カ−ボネ−トの完全な変換を確認した。反応物を、氷浴で冷却し、ＴＦＡ（３．１７ｍｌ；４１．０８ｍｍｏｌ；３．００当量）でクエンチし、水で希釈した。ｐＨ紙により示されるｐＨは、２未満でなければならない。水性相を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で洗浄したところ、その後水性相のｐＨが約ｐＨ４．５に上昇した。水性相を凍結乾燥させて油性残留物を生じさせた。残留物を、酢酸エチル（３ｘ）でコエバポレ−トし、ＤＣＭに溶解し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。濾過後、溶媒をエバポレ−トし、油性残留物を高真空下で乾燥させた（２ｈ）。ＬＣＭＳによるＱＣにより、９３％の純度が明らかになった。その結果得られたクル−ドな４−（ヒドロキシメチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ２を、精製することなく次の工程で使用した。
【０４８４】
工程２    ４−（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ３の調製
工程１からのクル−ドな４−（ヒドロキシメチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ２（１１．７６ｇ；最大１３．６９ｍｍｏｌ；１．００当量；４０ｗｔ％の最大純度）を、アセトニトリル（２４ｍｌ）に溶解し、溶液を氷浴で冷却した。ビス（ペンタフルオロフェニル）  カルボネ−ト（１０．１５ｇ；２５．７５ｍｍｏｌ；１．８８当量）、ＤＭＡＰ（３１５ｍｇ；２．５８ｍｍｏｌ；０．１９当量）及びＤＩＰＥＡ（９．０ｍｌ；５１．５３ｍｍｏｌ；３．７６当量）を、撹拌しながら加えた。溶液は、オレンジ色から緑色へ、次いで灰色へと変化した。反応混合物を１５分間撹拌した。ＬＣＭＳにより生成物の形成を確認した。反応混合物を−１５℃に冷却し、０．１％  ＴＦＡ（１２．３８ｍｌ）を含む水とニ−トのＴＦＡ（３．９ｍｌ；５１．４８ｍｍｏｌ；３．７６当量）の混合物でクエンチした。黄色の溶液を４回のＲＰ−ＬＰＬＣにより精製した。純粋な画分を、混合し、凍結し、凍結乾燥させて、４−（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ３を、黄色のオイルとして得た（４．７３ｇのＴＦＡ塩（８．２１ｍｍｏｌ、２工程で６０％）。
【０４８５】
実施例１Ｂ    保護されたリンカ−ｂ５の合成
2020515545.tif 000067
スキ−ム１Ｂ
【０４８６】
リンカ−ｂ５の合成をスキ−ム１Ｂに示す。
工程１    アミド化合物ｂ３の調製
Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ  ｂ１（６．９６ｇ；１６．３６ｍｍｏｌ；１．００当量）をＤＭＦ（１３９ｍｌ）に溶解した。ＰｙＢＯＰ（１２．７７ｇ；２４．５４ｍｍｏｌ；１．５０当量）及びＤＩＰＥＡ（１４．２５ｍｌ；８１．７９ ｍｍｏｌ；５．００当量）を加え、完全に溶解するまで撹拌した。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−１，３−ジアミノプロパン塩酸塩  ｂ２（４．０４ｇ；１７．９９ｍｍｏｌ；１．１０当量）を加え、反応混合物を室温で１５分間撹拌した。生成物への完全な変換をＬＣＭＳにより観察した。反応混合物を、４００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、４００ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌで３回洗浄した。有機層を、４００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液で三回、及び２００ｍｌのブラインで一回、洗浄した。有機層をＮａ４ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、１４ｍｌのジクロロメタンに溶解し、順相フラッシュクロマトグラフィ−により精製した。画分を含む生成物をプ−ルし、溶媒をエバポレ−トした。最終物質を、高真空下で乾燥させてアミド化合物ｂ３を白色の泡状物として得た。収率：８．８１ｇ（１４．７９ｍｍｏｌ、９０％）。
【０４８７】
工程２    アミド化合物ｂ４の精製
アミド化合物ｂ３（８．８１ｇ；１４．７９ｍｍｏｌ；１．００当量）をＴＨＦ（１３０ｍｌ）に溶解した。ＤＢＵ（２．５６ｍｌ；１７．１５ ｍｍｏｌ；１．１６当量）を加え、混合物を室温で５分間撹拌した。ＬＣＭＳクロマトグラムは、出発物質の完全な変換を示した。加えて、ＴＬＣを調製した（酢酸エチル／メタノ−ル  ９：１、ＫＭｎＯ４染色）、Ｒｆ（Ｐｄｔ）＝０．４８）。粗反応混合物の溶媒をエバポレ−トした。残留物を酢酸エチルに溶解して２０ｍｌの最終容積を達成し、溶液をフラッシュクロマトグラフィ−により精製した。画分を含む生成物をプ−ルし、溶媒をエバポレ−トした。最終物質を、一晩高真空下で乾燥させて、アミド化合物ｂ４を黄色がかったオイルとして得た。収率：５．１３ｇ（２１５ｎｍで９４％の純度、１３．７４ｍｍｏｌ、８７％の収率）
【０４８８】
工程３    リンカ−化合物ｂ５の調製
ＤＩＰＥＡ（７．１９ｍｌ；４１．２１ｍｍｏｌ；３．００当量）を、ジクロロメタン（３５ｍｌ）中、実施例１Ｅのカルボン酸ｃ３（３．４２ｇ；１５．１１ｍｍｏｌ；１．１０当量）及びＰｙＢＯＰ（７．８６ｇ；１５．１１ｍｍｏｌ；１．１０当量）の溶液に加えると、その混合物は有意に温まり、黄色がかった色から暗黄色へと変化した。混合物を、室温で５分間撹拌し、酸を事前活性化させた。活性化された酸溶液に対し、新しく調製したジクロロメタン（３５ｍｌ）中アミド化合物ｂ４（５．１３ｇ；１３．７４ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液を一度に加えると、混合物は明褐色へと変化した。カップリング溶液を室温で１００分間撹拌した。ＬＣＭＳによるＩＰＣは、出発物質のほぼ完全な変換を示した。反応混合物を５００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、０．２Ｎ  ＨＣｌ（４×３００ｍｌ）、ブライン（１×１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（５０、２５、１６０ｍｌ）、５％クエン酸（１×１００ｍｌ）及びブライン（１×１００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物を、週末に高真空下で乾燥させた（１３．５９ｇの粗物質）。残留物を酢酸エチルに溶解して最終容積を約２２ｍｌにした。粗物質をフラッシュクロマトグラフィ−により精製した。画分（ＴＬＣ：酢酸エチル、ＫＭｎＯ４染色、Ｒｆ（Ｐｄｔ）＝０．５４）を含む生成物をプ−ルし、溶媒をエバポレ−トして、粘着性で褐色のゴム様残留物を得た。最終物質を、一晩高真空下で乾燥させて、泡状物としてリンカ−化合物ｂ５を得た。収率：６．６１ｇ（１１．３６ｍｍｏｌ、８３％の収率、９６％の純度）。
【０４８９】
実施例１Ｃ    リンカ−（Ｓ）−４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸  ｂ７の合成
2020515545.tif 000068
スキ−ム１Ｃ
【０４９０】
（Ｓ）−４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ７の合成をスキ−ム１Ｃに示す。
工程１（Ｓ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−（３−（メチルアミノ）プロピルアミノ）−４−オキソブタン酸ｂ６の調製
アミド化合物ｂ５（３．４０ｇ；５．８４ｍｍｏｌ；１．００当量）をジクロロメタン（１９ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（１９ｍｌ）を加えた。反応混合物を、開放したフラスコ内において、７５分間室温で撹拌した。ＬＣＭＳによるＩＰＣは、生成物への良好な変換を示した。揮発性物質の除去を、制御された方式（２５℃及び１２ ｍｂａｒ、次いで高真空で６０分間の回転エバポレ−タ−）で実施した。その結果得られたクル−ドな（Ｓ）−４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ６を、それ以上精製することなく直ちに次の工程で使用した。
【０４９１】
工程２（Ｓ）−４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ７の調製
アセトニトリル（３５．００ｍｌ）中、実施例１からの４−（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）フェニル  ２−（ジメチルアミノ）エチル（メチル）カルバメ−トａ３（４．３８ｇ；７．６０ｍｍｏｌ；１．３０当量）の溶液を、氷浴で０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（１０．１９ｍｌ；５８．４４ｍｍｏｌ；１０．００当量）を加え、混合物をこの温度で１分間撹拌した後、アセトニトリル（３５．００ｍｌ）中粗化合物ｂ６の溶液を１０分以内に滴下した。完全に追加した後、混合物を０℃でさらに５分間撹拌し、次いで反応混合物を分析した。両性イオンｂ６の完全な変換が観察された。反応物を、０℃でのＴＦＡ（４．００ｍｌ；５１．９２ｍｍｏｌ；８．８８当量）の追加によりクエンチした。すべての揮発性物質を除去し、残留物を＜１０ｍｂａｒ及び４０℃で１０分間回転エバポレ−タ−で乾燥させた。粗残留物を、６ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ（１：１：０．００２）と１２ｍｌの０．１％  ＴＦＡの混合物に溶解した。明褐色の溶液を、ＲＰ−フラッシュクロマトグラフィ−により精製した。注射まで、溶液を氷上に保持した。画分を含む生成物を、混合し、凍結させ、凍結乾燥させて、（Ｓ）−４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ７を得た。収率：ＴＦＡ塩として３．２５ ｇ（６８％の収率）。
【０４９２】
実施例１Ｄ    ＮＨＳ活性化リンカ−（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ８の合成
2020515545.tif 000069
スキ−ム１Ｄ
【０４９３】
（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ８の調製をスキ−ム１Ｄに示す。
実施例１Ｃのリンカ−ｂ７（２．０２ｇ；２．４７ｍｍｏｌ；１．００当量）を、ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解した。ＨＯＳｕ（８５２．７２ｍｇ；７．４１ｍｍｏｌ；３．００当量）及びＥＤＣ（１．４２ｇ；７．４１ｍｍｏｌ；３．００当量）を加え、混合物を室温で窒素雰囲気下で撹拌した。加えた試薬が溶解すると、混合物はやや黄色に変化した。１時間後、ＬＣＭＳによるＩＰＣは、生成物への良好な変換を示した。７５分後、反応混合物を、ＤＣＭ（７５ｍｌ）で希釈し、７５ｍｌの酸性ブラインで一回洗浄した（２５０ｍｌのブラインを２．５ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌと混合し、その結果得られた溶液をさらなるＮａＣｌで飽和させた）。水層（ｐＨ約６．５）を、５０ｍｌのＤＣＭを用いて抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。ＴＦＡ（１９０ μＬ；２．４７ｍｍｏｌ；１．００当量）を加えた後、揮発性物質をエバポレ−トした。油性残留物を高真空下で３０分間乾燥させて、クル−ドな（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ８（約２．４ｇ）を白色の泡状物として得た。粗生成物を、５ｍｌの無水アセトニトリル（総容積〜６ｍｌ）に溶解し、ＲＰ−ＬＰＬＣにより精製した。クロマトグラフィ−用の溶出剤を冷却し、次いで凍結及び凍結乾燥させた。凍結乾燥させた、乾燥した物質を、無水アセトニトリル（合計で凡そ２０ｍｌ）と混合した。溶媒を除去し（回転エバポレ−タ−、４０℃）、高真空下で乾燥させて、２．０５ｇ（９１％の収率）の（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（３−（（（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）カルバモイルオキシ）ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピルアミノ）−３−（Ｎ−メチル−６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサンアミド）−４−オキソブタン酸ｂ８を無色の泡状物として得た。この物質を２２．３７ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解した。透明で無色の溶液を滅菌濾過し（滅菌ＰＴＦＥシリンジフィルタ−、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、２５ ｍｍ、０．２μｍ）、約２３．５ｍｌの透明で無色の溶液を得た。この物質を、−８０℃のアルゴン下でアリコ−ト中に貯蔵した。ＬＣＭＳ分析により、７９％のＮＨＳ活性が決定された。
【０４９４】
実施例１Ｅ    ６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサン酸ｃ３の合成
2020515545.tif 000070
スキ−ム１Ｅ
【０４９５】
６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサン酸ｃ３の調製をスキ−ム１Ｅに示す。
６−ブロモヘキサン酸（５．８９ｇ；３０．１９ｍｍｏｌ；１．００当量）とメタンチオスルホン酸ナトリウム（４．０５ｇ；３０．１９ｍｍｏｌ；１．００当量）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、無水（４７．１０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を、８０℃で３時間撹拌し、次いで室温に冷ました。ＬＣＭＳ分析により、生成物ｃ３の形成を確認した。反応混合物を、１１６ｍｌの水で希釈し、２３３ｍｌのジエチルエ−テルで三回洗浄した。有機相を、ブライン（３５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で４０ｍｌの容積まで濃縮した。その結果得られた溶液を、２×１０００ｍｌの冷たいｎ−ヘプタン中において、−１８℃で一晩沈殿させた。上清をデカントし、沈殿物を８０ｍｌのジエチルエ−テル（４０℃）に溶解した。その結果得られた溶液を、２×１０００ｍｌの冷たいｎ−ヘプタン中に、−１８℃で３時間沈殿させた。沈殿物を濾別し、白色の固体を高真空下で一晩乾燥させて、６−（メチルスルホニルチオ）ヘキサン酸ｃ３を得た。収率：５．７２ｇ；８４％。
【０４９６】
実施例１Ｆ  １−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）  ９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エチル）  ノナンジオエ−トｄ９の合成
2020515545.tif 000071
スキ−ム１Ｆ
【０４９７】
１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）  ９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エチル）  ノナンジオエ−トｄ９の調製をスキ−ム１Ｆに示す。
工程１    ９−（ベンジルオキシ）−９−オキソノナン酸  ｄ２の合成
トルエン（５６１．８２ｍｌ）中、アゼライン酸ｄ１（１０３．００ｇ；５４７．２３ｍｍｏｌ；１．１０当量）、ベンジルアルコ−ル（５１．７３ｍｌ；４９７．４８ｍｍｏｌ；１．００当量）及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１．９９ｇ；１０．４５ｍｍｏｌ；０．０２当量）の混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置において５時間還流させた。次いで反応混合物を室温まで冷まし、この温度で１時間貯蔵した。次いで、固体を濾別し、５０ｍｌのトルエンで洗浄した。残留物を約８００ｍｌの０．４Ｍ  ＮａＯＨ溶液で処理し、ｐＨを、約３０ｍｌの４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ＝９に調節した。水性相を分離し、有機相に対して１００ｍｌの水と８０ｍｌの０．４Ｍ  ＮａＯＨを加え、ｐＨを９に調節した。合わせた水性相を、５０ｍｌの１Ｍ硫酸でｐＨ＝５に酸性化し、２００ｍｌのＭＴＢＥで二回抽出した。合わせた有機相を、２００ｍｌのブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で溶媒をエバポレ−トした。粗生成物（６２ｇ）を、４０ｍｌのヘプタンと、２０ｍｌのＴＨＦに溶解し（総容積１２０ｍｌ）、自動フラッシュクロマトグラフィ−により二回精製した。溶出剤をエバポレ−トし、残留物をオイルとして得た（５５．００ｇ；３９．７２％）。残留物を、８０ｍｌのＭＴＢＥに溶解し、３０℃に加熱した２０００ｍｌのヘプタンを加えた。結晶化のために、溶液を−２０℃で一晩貯蔵した。生成物を、ガラスフィルタ−（Ｐｏｒ．３）を通した濾過により収集し、５００ｍｌのヘプタンで洗浄した。白色の結晶を、４時間＜１ｍｂａｒで乾燥させ、９−（ベンジルオキシ）−９−オキソノナン酸ｄ２を得た。収率：４８．０２ｇ；３５％。
【０４９８】
工程２    Ｂｏｃ−保護１−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）  ９−ベンジル  ノナンジオエ−トｄ４の合成
ＤＣＣ（３．３２ｇ；１６．０８ｍｍｏｌ；１．１０当量）を、ＣＭ（５０．００ｍｌ）中、Ｂｏｃ−２−（２−アミノエトキシ）エタノ−ルｄ３（３．００ｇ；１４．６２ｍｍｏｌ；１．００当量）、化合物ｄ２（４．０７ｇ；１４．６２ｍｍｏｌ；１．００当量）及びＤＭＡＰ（４４６．４１ｍｇ；３．６５ｍｍｏｌ；０．２５当量）の溶液に加えた。形成中の懸濁液を室温で一晩撹拌した。白色の懸濁液を、２０ｍｌのシリンジフリットを通して濾過し、濾過ケ−キを約５０ｍｌのＤＣＭで洗浄した。生成物をＬＣＭＳにより検出した。すべての揮発性物質を除去した。そして残留物をＤＣＭ（総容積２０ｍｌ）に溶解した。その結果得られたやや混濁した懸濁液を、フラッシュクロマトグラフィ−により精製した。画分を含む生成物を混合し、すべての揮発性物質をエバポレ−トしてＢｏｃ保護された１−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）  ９−ベンジル  ノナンジオエ−トｄ４を無色のオイルとして得た。収率：６．１１ｇ；９０％。
【０４９９】
工程３    Ｂｏｃ保護９−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−９−オキソノナン酸ｄ５の合成
１０％  Ｐｄ／Ｃ（３４８．５８ｍｇ；０．３３ｍｍｏｌ；０．０３当量）を、ＴＨＦ（７５．００ｍｌ）中、Ｂｏｃ保護１−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）  ９−ベンジル  ノナンジオエ−トｄ４（６．１０ｇ；１３．１０ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液に加え、フラスコ内の空気層を窒素と交換した。次いで、フラスコを５０℃の水浴中に置き、水素流を、バル−ン及び２０Ｇのカニュ−レを用いて黒い懸濁液に通した。５分後、水素流を止め、混合物を、５０℃の水素雰囲気下で、脱保護反応の完了まで勢いよく撹拌した。その結果得られた懸濁液を、セライトのパッドを通して濾過した。濾過ケ−キを、追加のＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）で洗浄した。合わせた濾液の揮発性物質をエバポレ−トし、粗物質をＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）に溶解した。溶液を、０．２２μｍ−ＲＣシリンジフィルタ−を通して濾過し、揮発性物質を除去してＢｏｃ保護された９−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−９−オキソノナン酸ｄ５をやや黄色のオイルとして得た。収率：５．０９ｇ、定量。
【０５００】
工程４    ９−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−９−オキソノナン酸ｄ６の合成
ＴＦＡ（５．００ｍｌ；６４．９０ｍｍｏｌ；４．７９当量）を、ジクロロメタン（１０．００ｍｌ）中、Ｂｏｃ保護９−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−９−オキソノナン酸  ｄ５（５．０９ｇ；１３．５５ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液に加えた。４０分後、ＴＦＡの追加のアリコ−ト（５．００ｍｌ；６４．９０ｍｍｏｌ；４．７９当量）を混合物に加え、窒素流を反応混合物に通した。７０分後のＬＣＭＳにより、出発物質の完全な変換が明らかになった。揮発性物質を除去し、褐色の油性残留物をジエチルエ−テル（５０ｍｌ）で希釈すると、二相系が形成された。この乳濁物を、再びすべての揮発性物質からロ−タリ−エバポレ−タ−で遊離させ、褐色の油性残留物を一晩高真空中で乾燥させた。トルエン（３０ｍｌ）を残留物に加え、混合物を再び、ロ−タリ−エバポレ−タ−ですべての揮発性物質から遊離させた（６０℃の水浴）。この物質を、＜９ｍｂａｒ及び６０℃の水浴温度のロ−タリ−エバポレ−タ−で乾燥させて、９−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−９−オキソノナン酸ｄ６を褐色のオイルとして得た。収率：６．０４ｇ；９７％。
【０５０１】
工程５    ９−オキソ−９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エトキシ）ノナン酸ｄ８の合成
ＤＩＰＥＡ（９５１．９０μＬ；５．４６ｍｍｏｌ；５．００当量）を、アセトニトリル（５．００ｍｌ）中、９−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−９−オキソノナン酸ｄ６（５００．００ｍｇ；１．０９ｍｍｏｌ；１．００当量）及びスクシンイミジル  ３−［［（２−ピリジル）チオ］チオ］プロピオナ−トｄ７（３７５．０５ｍｇ；１．２０ｍｍｏｌ；１．１０当量）の溶液に加えた。反応混合物を、室温で４５分間撹拌した。反応物を、酢酸（１．００ｍｌ；１７．４８ｍｍｏｌ；１６．０２当量）を加えることによりクエンチした。混合物を、６．５ｍｌのアセトニトリル及び１４．５ｍｌの水で希釈し、その結果得られた溶液を分取ＨＰＬＣにより精製した。画分を含む生成物を混合し、液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥させた。生成物のバッチをＤＣＭと混合した。揮発性物質を除去し、油性残留物を高真空下で乾燥させ、９−オキソ−９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エトキシ）ノナン酸ｄ８をやや黄色のオイルとして得た；３９２．００ｍｇ；６１％。
【０５０２】
工程６    １−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）  ９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エチル）  ノナンジオエ−トｄ９の合成
ジクロロメタン（５．００ｍｌ）中、９−オキソ−９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エトキシ）ノナン酸ｄ８（３９２．００ｍｇ；０．６７ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液に対し、ＨＯＳｕ（１５３．８１ｍｇ；１．３４ｍｍｏｌ；２．００当量）及びＥＤＣ＊ＨＣｌ（２５６．１９ｍｇ；１．３４ｍｍｏｌ；２．００当量）を連続して加えた。懸濁液を室温で撹拌すると、固体含有量が時間をかけてゆっくりと溶解し、明黄色の透明な溶液が形成された。８０分後、追加のＨＯＳｕ（５０．００ｍｇ；０．４３ｍｍｏｌ；０．６５当量）及びＥＤＣ＊ＨＣｌ（５０．００ｍｇ；０．２６ｍｍｏｌ；０．３９当量）を加えた。１２０分後、ＬＣＭＳによる分析により、反応の完了が明らかになった。揮発性物質を除去し、残留物をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解した。水（５ｍｌ）及び１：１：０．００２のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ（４ｍｌ）を加えた。透明な溶液が得られるまで、アセトニトリルを混濁した乳濁物に加えた。その結果得られた溶液を、分取ＨＰＬＣにより精製した。画分を含むすべての生成物を、混合、凍結、及び凍結乾燥するまで氷上に保持した。この生成物のバッチをジクロロメタンと混合し、すべての揮発性物質を除去した。この生成物を高真空下で乾燥させて、１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）９−（２−（２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）エトキシ）エチル）  ノナンジオエ−トｄ９を無色のオイルとして得た；４５５．００ｍｇ；定量的収率。
【０５０３】
実施例１Ｇ    精製ＴＡＧ  Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−１６−（４−メルカプトニコチノイル）−２−メチル−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ８の合成
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スキ−ム１Ｇ
【０５０４】
精製ＴＡＧ  Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−１６−（４−メルカプトニコチノイル）−２−メチル−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ８  の調製をスキ−ム１Ｇに示す。
工程１（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ビス（３−アミノプロピル）カルバメ−トｅ２の合成
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（９．７７ｇ；２８．９６ｍｍｏｌ；１．２０当量）を、ＴＨＦ（８０．００ｍｌ）中、１，９−ビス−Ｂｏｃ−１，５，９−トリアザノナンｅ１（８．００ｇ；２４．１４ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液に加えた。この混合物に対し、水（８０．００ｍｌ）中、Ｋ２ＣＯ３（５．００ｇ；３６．２０ｍｍｏｌ；１．５０当量）の溶液を１０分かけて室温で滴下した。付加の間に、白色の乳濁物が形成された。室温で５０分間撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル（６００ｍｌ）で希釈した。有機層を、塩酸（０．１Ｍ、３×２００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２００ｍｌ）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した後、すべての揮発性物質を除去した。粗残留物を高真空中で２０分間乾燥させて白色の泡状物を得た。この泡状物を、ジクロロメタンに溶解し、フラッシュクロマトグラフィ−により精製した。画分を含む生成物を混合及び濃縮して、９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル  Ｎ，Ｎ−ビス［３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル］カルバメ−ト中間体（スキ−ム１Ｇに示さない）を、無色のガラス状固体として得た；１２．８１ｇ；９６％。
【０５０５】
この中間生成物（１２．７８ｇ；２３．０８ｍｍｏｌ；１．００当量）を、室温でＴＦＡ（３０．００ｍｌ；３８９．３９ｍｍｏｌ；１６．８７当量）に溶解した。溶解完了後、黄色の溶液を室温で３５分間撹拌した。生成物を、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチュ−ブ中のジエチルエ−テル（４０ｍｌのジエチルエ−テル中２ｍｌの反応溶液）中に反応混合物を滴下により付加することにより沈殿させた。Ｆａｌｃｏｎチュ−ブを、７０００ｘＧ且つ０℃で３分間遠心分離した。エ−テルの上清を棄て、残留物をメタノ−ル（１ｍｌ／チュ−ブ）に溶解した。混合したメタノ−ル溶解性溶液を、５００ｍｌの丸底フラスコ内のジエチルエ−テル（２００ｍｌ）に滴下した。すべてのチュ−ブをメタノ−ル（合計〜１５０ｍｌ）で洗浄し、洗浄溶液をエ−テル／沈殿物混合物に加えると、無色透明の溶液が形成された。この溶液を濃縮し、油性残留物を高真空中において一晩乾燥させて、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ビス（３−アミノプロピル）カルバメ−トｅ２を白色の泡状物として得た：１３．６８ｇ；定量的収率。
【０５０６】
工程２（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ビス（３−（（Ｓ）−２，６−ジアミノヘキサンアミド）プロピル）カルバメ−トｅ３の合成
ＤＩＰＥＡ（２０．４４ｍｌ；１１７．２０ｍｍｏｌ；５．００当量）を、ＤＭＦ（２５０．００ｍｌ）中、化合物ｅ２（１３．６３ ｇ；２３．４４ｍｍｏｌ；１．００当量）及びＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＳｕ（２４．９５ｇ；５６．２５ｍｍｏｌ；２．４０当量）の溶液に加え、明黄色の混合物を室温で４５分間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１２００ｍｌ）で希釈し、有機層を、塩酸（０．１Ｍ、４×５００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×２５０ｍｌ）及びブライン（２００ ｍｌ）で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させて濾過した後、すべての揮発性物質を除去してＢｏｃ保護された中間体（スキ−ム１Ｇに示さない）を白色の泡状物として得た。粗残留物を、ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィ−により精製した。画分を含む生成物を混合し、すべての揮発性物質を真空中で除去した。冷酢酸エチル溶液から純粋な生成物が沈殿した。メタノ−ルを加えて生成物を完全に溶解させた。混合した画分のエバポレ−ションにより無色のオイルが得られ、これを高真空中において一晩乾燥させ、Ｂｏｃ保護された中間体を得た：１８．２７ｇ；７７％。
【０５０７】
この中間体（１８．１２ｇ；１７．９４ｍｍｏｌ；１．００当量）を、ＴＦＡ（４０．００ｍｌ；５１９．１９ ｍｍｏｌ；２８．９５当量）に溶解した。溶解の間に、多量のガスが発生し、混合物が約４５℃に温まって黄色に変化した。この透明な粘性の溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を、ジエチルエ−テル（５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチュ−ブ内の４０ｍｌのエ−テル中２ｍｌの反応溶液）に加えた。勢いよく振とうした後、この二相系は、酸性ジエチルエ−テル中、白色の粉状沈殿物の懸濁液に変化した。混合物をＦａｌｃｏｎチュ−ブに移し、すべてのＦａｌｃｏｎを０℃且つ７０００ｘＧで３分間遠心分離し、上清を棄てた。すべての沈殿物を各４０ｍｌのジエチルエ−テルで洗浄し、遠心分離を繰り返した。再び上清を棄てた後、すべての沈殿物をロ−タリ−エバポレ−タ−で事前乾燥させて乾燥粉末を形成した。すべてのアリコ−トを混合し、高真空中で一晩乾燥させ、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ビス（３−（（Ｓ）−２，６−ジアミノヘキサンアミド）プロピル）カルバメ−トｅ３を得た：１９．５２ｇ；定量的収率。
【０５０８】
工程３    化合物ｅ５の合成
ＤＩＰＥＡ（１８．０２ｍｌ；１０３．２９ｍｍｏｌ；６．００当量）を、ＤＭＦ（１８０．００ｍｌ）中、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンｅ４（８．８８ｇ；８６．０８ｍｍｏｌ；５．００当量）及びＰｙＢＯＰ（４４．７９ｇ；８６．０８ｍｍｏｌ；５．００当量）の懸濁液に加えた。混合物を１５分間室温で撹拌すると、透明な溶液が形成された。この溶液を一回でＤＭＦ（１８０．００ｍｌ）中（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ビス（３−（（Ｓ）−２，６−ジアミノヘキサンアミド）プロピル）カルバメ−トｅ３（１８．３５ｇ；１７．２２ｍｍｏｌ；１．００当量）及びＤＩＰＥＡ（１５．０１ｍｌ；８６．０８ｍｍｏｌ；５．００当量）の溶液に加えた。黄色の反応混合物を、室温で撹拌した。３５分後、反応混合物を、ＴＦＡ（２２．０２ｍｌ；２８５．８２ｍｍｏｌ；１６．６０当量）の付加によりクエンチした。溶液を濃縮し、黄色のオイルを得た。その後このオイルをメタノ−ル（４５０ｍｌ）に溶解し、６００ｍｌの暗黄色の溶液を得た。この中間生成物（スキ−ム１Ｇに示さない）を、ジエチルエ−テルから二回沈殿させた。沈殿物をジエチルエ−テルで洗浄した後、生成スラリ−を濃縮し、生成物を真空中で７２時間乾燥させた：２３．１７ｇ；９６％。ピペリジン（１７．５０ｍｌ；０．１８ｍｏｌ；１０．８３当量）を一回で、ＤＭＦ（６９．００ｍｌ）中、中間生成物（２３．００ｇ；０．０２ｍｏｌ；１．００当量）の溶液に加え、オレンジ色の溶液を室温で３５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＦＡ（２００ｍｌ）を残留物に加えた。スラリ−を、ＰＥフリットを通して濾過した。生成物がジエチルエ−テルから沈殿し、生成物をジエチルエ−テルで洗浄した後、真空中で乾燥させ、化合物ｅ５をオフホワイトの粉末として得た：１９．８２ｇ；９３％。
【０５０９】
工程４    Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−２−メチル−１６−（４−（メチルジスルファニル）ニコチノイル）−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ７の合成
ＰｙＢＯＰ（５２８．１７ｍｇ；１．０１ｍｍｏｌ；１．００当量）及び４−（メチルジスルファニル）ニコチン酸  ｅ６（３２０．００ｍｇ；１．０１ｍｍｏｌ；１．００当量、４−メルカプトニコチン酸をＳ−メチル  メタンチオ−ルスルホネ−トと反応させることにより調製）を、アセトニトリル（１０．００ｍｌ）に懸濁した。ＤＩＰＥＡ（１．５９ｍｌ；９．１３ｍｍｏｌ；９．００当量）を加えると、透明な暗黄色の溶液が形成された。室温で２分後、混合物を、アセトニトリル（１０．００ｍｌ）中、化合物ｅ５（１  ３１７．４９ｍｇ；１．０１ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＴＦＡ（１．５９ｍｌ；２０．６４ｍｍｏｌ；２０．３３当量）を加え、生成物をジエチルエ−テル（１４０ｍｌ）から沈殿させた。沈殿物をジエチルエ−テル（１００ｍｌ）で洗浄した。沈殿物を、メタノ−ル（８ｍｌ）に溶解し、ジエチルエ−テル（１４０ｍｌ）から二回目の沈殿をさせた。生成物を高真空中で一晩乾燥させて、Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−２−メチル−１６−（４−（メチルジスルファニル）ニコチノイル）−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ７を粉末として得た：１．２３１ｇ；８２％。
【０５１０】
工程５    Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−１６−（４−メルカプトニコチノイル）−２−メチル−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ８の合成
ＮａＢＨ４（２２０．０７ｍｇ；５．８２ｍｍｏｌ；７．００当量）を四回に分けて、水（１５．００ｍｌ）中、Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−２−メチル−１６−（４−（メチルジスルファニル）ニコチノイル）−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ７（１．２３１ｇ；０．８３ｍｍｏｌ；１．００当量）の溶液に加えた。最後の付加の後、混合物を６０分間室温で撹拌した。ＴＦＡ（１．００ｍｌ；１２．９８ｍｍｏｌ；１５．６２当量）を反応混合物に加えた。反応混合物を、最終容積が２５ｍｌになるまで水で希釈した。この溶液を分取ＨＰＬＣにより精製した。画分を含む生成物を、混合、凍結、凍結乾燥させて、Ｎ，Ｎ’−（（１０Ｓ，２２Ｓ）−１０−（２−（ジメチルアミノ）アセタミド）−１６−（４−メルカプトニコチノイル）−２−メチル−４，１１，２１−トリオキソ−２，５，１２，１６，２０−ペンタアザヘキサコサン−２２，２６−ジイル）ビス（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）ｅ８のＴＦＡ塩を得た；９４２．００ｍｇ；７９％。
【０５１１】
実施例２Ａ：アミン官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）の調製
アミン官能性を、ＨＡに導入した。いくつかの態様では、最大約１１％の度合いの官能性を、その後のマレイミド官能化ＨＡ及び薬物のマレイミドへの付着のために導入し、最大約５％の度合いの官能化を、その後のチオ−ル官能化ＨＡのために導入した。
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スキ−ム２Ａ
【０５１２】
ＨＡのアミン官能化は、反応スキ−ム２Ａに従って進行する：
２００ｍｇの１１６ｋＤａヒアルロン酸ナトリウム塩ｆ１を、勢いよく撹拌しながら２５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ、０．４Ｍ  １，３−ジアミノプロパン、ｐＨ５．５）に溶解した。ＨＡのカルボン酸官能性に対して３．００当量（２２９．１４ｍｇ；１．５０ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔを加えた。０．９３当量（８８．９２ｍｇ；０．４６ｍｍｏｌ）のＥＤＣ・ＨＣｌを加えた後、懸濁液がゆっくりと溶液へと変化した。この溶液を常温で一晩撹拌したところ、その後懸濁液が形成された。この懸濁液に対し、５０．００当量（３．３９ｇ；２４．９４ｍｍｏｌ）の酢酸ナトリウムを加えて溶液を形成した。修飾されたＨＡ  ｆ２を、無水エタノ−ルの付加により沈殿させ、エタノ−ルで洗浄し、一晩高真空下で乾燥させた。ペレットを１６ｍＬの水に溶解し、透明な溶液を形成した。５．４０ｍＬの４Ｍ  ＮａＯＨを加え、溶液を常温で二時間撹拌した。１．２４ｍＬの酢酸を加えた。アミノ官能化ＨＡ  ｆ３を、無水エタノ−ルの付加により沈殿させ、８０ｖ／ｖ％のエタノ−ル及び無水エタノ−ルで洗浄し、高真空下で乾燥させて、白色のペレットを得た。０．９３当量のＥＤＣにより、ＨＡ上のカルボキシレ−ト基の約１１％のアミン官能性がもたらされた。約５％のアミン官能化でのアミン官能化ＨＡの調製のために、０．４０当量（３８．６３ｍｇ；０．２０ｍｍｏｌ）のＥＤＣ・ＨＣｌを使用した。
【０５１３】
実施例２Ｂ    マレイミド官能化ＨＡの調製
マレイミド官能化ＨＡを、以下の反応スキ−ムに従ってアミン官能化ＨＡ  ｆ３をマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルｆ４と反応させることにより得た：
2020515545.tif 000074
スキ−ム２Ｂ
１７６．１ｍｇのアミン官能化ＨＡ  ｆ３（０．２５２ｍｍｏｌ／ｇアミン）を、１７．６ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．４）に溶解した。９．５０ｍＬのアセトニトリル中、１５０．４８ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ；１０．００当量）の３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルｆ４を加えた。反応混合物を常温で正確に６０分間撹拌した。２７．１ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）を、撹拌下で溶液に加えた。無水エタノ−ルを加えてＨＡを沈殿させた。得られたペレットを、８０ｖ／ｖ％のエタノ−ル及び無水エタノ−ルで連続して洗浄した。ペレットを混合し、この物質を高真空中において三時間乾燥させ、その後−２０℃で貯蔵した。得られたペレットを１７．６ｍＬの１％酢酸に溶解した。１７．６ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）を溶液に加えた。得られた混合物を、３３ｍｍ径の０．２２μｍ  ＰＥＳシリンジフィルタ−を通して濾過し、マレイミド官能化ＨＡ  ｆ５を、無水ＥｔＯＨの付加により沈殿させた。ペレットを、８０％  ｖ／ｖのエタノ−ル及び無水エタノ−ルで連続して洗浄した。ペレットを、混合し、高真空下で三時間乾燥させて、１５９．５０ｍｇを白色のペレットとして得た。マレイミド含有量の決定は、２−メルカプトエタノ−ルの付加及び未反応のまま残った２−メルカプトエタノ−ルの検出により、逆エルマン（ｉｎｖｅｒｓｅ  Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを介して行った。天然ＨＡ中において最初に利用可能であったカルボキシレ−ト基に対し、約１０％の度合いのマレイミド官能化が検出された。
【０５１４】
実施例２Ｃ：チオ−ル官能化ＨＡの調製
生理的条件下での架橋ＨＡゲルのインキュベ−ション後のＨＡゲルの分解を可能にするチオ−ル官能化ＨＡを設計した。この実施例では、アゼライン酸を用いるエステル結合が導入された。
2020515545.tif 000075
スキ−ム２Ｃ
１６６．９０ｍｇのアミン官能化ＨＡ  ｆ３（０．１０４ｍｍｏｌ／ｇ  アミン官能性）を、１３．９ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ８．４０）に溶解した。新しく調製された、７．５ｍＬのアセトニトリル中、７５．３ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ；５．００当量）のＮＨＳ  エステルｄ９（スキ−ム１Ｆ参照）の溶液を、混合物に加えた。混合物を、常温で１２０分分間撹拌し、ジスルフィド官能化ＨＡ（図示しない）を調製した。新しく調製された、２．１ｍＬの水中、６３．２ｍｇのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ塩（ＴＣＥＰ）（０．２２ｍｍｏｌ；１０．００当量）の溶液を、反応混合物に加えた。溶液を一時間常温で撹拌した。２２．９ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）を、反応混合物に加えた。その結果得られた溶液を、Ｆａｌｃｏｎチュ−ブに分けた。ＨＡ含有物を沈殿させるために、無水エタノ−ルを加えた。チュ−ブを閉じ、振とうし、遠心分離した。得られたペレットを、８０ｖ／ｖ％のエタノ−ル及び無水エタノ−ルで連続して洗浄した。ペレットは、混合され、高真空中で三時間乾燥させられ、その後さらなる使用までアルゴン雰囲気下において−２０℃で貯蔵された。このペレットを、アルゴン雰囲気下で勢いよく撹拌することにより、１６．７ｍＬの１％酢酸に溶解した。１６．７ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）を溶液に加えた。得られた混合物を３３ｍｍ径の０．２２μｍＰＥＳシリンジフィルタ−を通してＦａｌｃｏｎチュ−ブ中へと濾過し、無水エタノ−ルの付加により沈殿させた。チュ−ブを閉じ、振とうし、遠心分離した。ペレットを、８０％  ｖ／ｖのエタノ−ル及び無水エタノ−ルで連続して洗浄した。ペレットを、混合し、高真空下で三時間乾燥させて、１５０．１０ｍｇのチオ−ル官能化ＨＡ  ｆ６を白色のペレットとして得た。チオ−ル含有量の決定は、エルマンアッセイにより実施した。天然ＨＡ中において最初に利用可能であったカルボキシレ−ト基に対し、約４％の度合いのチオ−ル官能化が検出された。
【０５１５】
実施例３Ａ：リンカ−−ラニビズマブコンジュゲ−ト
2020515545.tif 000076
スキ−ム３Ａ
実施例１Ｄのリンカ−ｂ８に対するＲｂｚのコンジュゲ−ションを、スキ−ム３Ａに従って行った。
バッファ−の交換及び濃縮を、ＨｉＰｒｅｐカラムに続いて遠心濾過器（小規模）を介した濃縮を行うことにより、又はタンジェント流濾過（ＴＦＦ）系（大規模）を使用することにより、実施することができる。
この実施例では、１０ｍＭ  ヒスチジン、１０ｗｔ％  α，α−Ｄ−トレハロ−ス、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）中に配合された４０ｍｇ／ｍＬの６２ｍＬ  Ｒｂｚを使用した。３０ｍＭのホスフェ−ト（ｐＨ７．４）へのバッファ−交換及び濃縮後、Ｒｂｚ溶液を、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅ×ＧＶ  ３３ｍｍフィルタ−を使用して濾過した。約５０ｇのタンパク質溶液を回収した。濃度決定後、リン酸バッファ−の付加により試料を４０ｍｇ／ｍＬに希釈し、５３．１４９３ｇの最終容積を得た。２１１８．５ｍｇ（８５％）のＲｂｚが、３９．８ｍｇ／ｍＬの濃度及び約５３ｍＬの容積の総容積で回収された。
３０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、１９９０ｍｇのＲｂｚ（３９．８ｍｇ／ｍＬで５０ｍＬ）を、氷上で冷却した。１５当量（８．０ｍＬ）の化合物ｂ８（実施例１Ｄ）（ＮＨＳ含有量に対して修正、ＤＭＳＯ中１００ｍＭの保存溶液）を加え、溶液を慎重に振とうした（スタ−ラ−は使用しなかった）。
この溶液を氷上で５分間インキュベ−トした直後にｐＨシフトを行い、バッファ−交換を行って余分なリンカ−種をＲｂｚリンカ−コンジュゲ−ト溶液から除去した。０．１２容積当量（６ｍＬ）の０．５Ｍ  コハク酸（ｐＨ３．０）を加えることによりバッファ−シフトを行い、溶液を慎重に振とうした。溶液のｐＨを、約ｐＨ４．０に向けてシフトさせた。バッファ−交換は、ＧＥ  ＨｉＰｒｅｐカラムを備えたＡｋｔａ  Ｐ−９００を用いて実施した。バッファ−は、一回当たり５ｍＬの注入容積で１３回にわたり、８．０ｍＬ／分の流速で導入された５ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）であった。１４．５ｍｇ／ｍＬ（自然薬の消衰係数に基づいて計算）の濃度を有する１３４ｍＬの生成物溶液を収集した。
コンジュゲ−ションの前と後の試料を、質量分析により分析した。コンジュゲ−ションの前のデコンボリュ−ションしたＭＳスペクトルは、４８３８１にＲｂｚの単一ピ−クを示した。コンジュゲ−ションの後のスペクトルは、Ｒｂｚのピ−クを４８３８２に、モノコンジュゲ−トｇ１のピ−クを４９０６６に、ビスコンジュゲ−トを４９７５４３に、トリスコンジュゲ−トを５０４３７に、それぞれ示した。明瞭性のため、主な生成物であるモノコンジュゲ−トｇ１のみがスキ−ム３Ａに示されている。このモノコンジュゲ−トは、後述するように、より高次のコンジュゲ−トから単離された。
【０５１６】
実施例３Ｂ：Ｒｂｚリンカ−コンジュゲ−トへの精製タグの導入
2020515545.tif 000077
スキ−ム３Ｂ
Ｒｂｚリンカ−コンジュゲ−トｇ１への精製タグｅ８の導入を、スキ−ム３Ｂに従って行った。
モノコンジュゲ−トｇ１（及び図示されないより高次のコンジュゲ−ト）（１４．５３ｍｇ／ｍＬ、１８２４ｍｇのタンパク質、３７．７μｍｏｌ）を含む１２５ｍＬのリンカ−コンジュゲ−ト混合物の溶液に対し、タンパク質含有量に対して２．５モル当量の精製タグｅ８（スキ−ム１Ｇ）を常温で加え（１８８６μＬの５０ｍＭ  ｅ８、９４．３μｍｏｌ、水中）、この溶液を慎重に振とうし、タグ化Ｒｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トｇ２及びより高次のコンジュゲ−ト（示さない）を得た。３５分後、ｐＨ７．４へのｐＨシフトとアミンの脱保護を、０．１７０容積当量（２１．４ｍＬ）の０．５Ｍホスフェ−ト、２００ｍＭのＴｒｉＭＥＤ（ｐＨ７．８）（タグ化溶液の容積は考慮しなかった）の付加により行い、その間に保護基が切断され、タグ化Ｒｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トｇ３及びより高次のコンジュゲ−ト（示さない）が得られた。この溶液を、制御された２５℃の温度で一晩インキュベ−タ−内に貯蔵した。
約１４８ｍＬのタンパク質溶液を２５℃のインキュベ−タ−から取り出し、０．４１９容積当量（５２．４ｍＬ、最初の１２５ｍＬのタンパク質容量に基づく、５２．７ｍＬを実際に付加）の０．５Ｍコハク酸（ｐＨ３．０）をｇ３の溶液及びより高次のコンジュゲ−トに加え、約ｐＨ４．０のｐＨを得た。
【０５１７】
実施例３Ｃ：Ｒｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トの単離
ＣＩＥＣの精製のために、非コンジュゲ−トＲｂｚの混合物、及びタグ化Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ３とより高次のコンジュゲ−トの混合物を含むタンパク質溶液を、２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）で３．３倍に希釈し、約６６０ｍＬの最終容積を得た。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｏｕｒｃｅカラム１５Ｓ（カラムＸＫ２６、高さ５．２ｃｍ）を以下のバッファ−に使用した：２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）（バッファ−Ａ）；及び２０ｍＭのコハク酸、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０）（バッファ−Ｂ）。勾配は線形であった（１０％−５０％  Ｂ、３２ＣＶ（２０ｍＬ／分の流量））。負荷は約３００ｍｇであった。コンジュゲ−ト混合物を、ＣＩＥＣの前にＭＳにより分析し、デコンボリュ−ションしたＭＳスペクトルで、４８３８０ｍ／ｚのピ−ク（自然のＲｂｚ）、４９５７３のピ−ク（モノコンジュゲ−トｇ３）、５０７６６のピ−ク（ビスコンジュゲ−ト）、及び５１９５８のピ−ク（トリコンジュゲ−ト）が示された。ＣＩＥＣ画分１は、自然のＲｂｚ（４８３８０のｍ／ｚピ−ク）を優勢に含んでおり、ＣＩＥＣ画分２は、モノコンジュゲ−トｇ３（４９５７３のｍ／ｚピ−ク）を優勢に含んでおり、ＣＩＥＣ画分３はビスコンジュゲ−ト（５０７６６のｍ／ｚピ−ク）を優勢に含んでいた。
Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ３の単離後、タンジェント流濾過を用いてタンパク質溶液を約５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。出発物質は、スクシネ−トバッファ−（ｐＨ４．０）中に配合された約４５０ｍＬのＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ３を約０．８５ｍｇ／ｍＬ含んでいた。０．２２μｍの孔径を有する一つのＭｉｌｌｅ×ＧＶ  ３３ｍｍのフィルタ−を使用して試料を濾過した。４．８２ｍｇ／ｍＬの濃度の６８ｍＬのＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−ト溶液が得られた。
【０５１８】
実施例３Ｄ：精製タグの切断
2020515545.tif 000078
スキ−ム３Ｄ
精製タグｅ８を、スキ−ム３Ｃに示す手順に従って除去した。
精製タグｅ８の切断（脱タグ化）を、Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ３（６８ｍｌ、４．８２ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍＭのＤＴＴ濃度のＤＴＴと共に一晩２〜８℃でインキュベ−トすることにより行った。２０ｍＭのコハク酸中、２５ｍＭのＤＴＴ保存溶液（ｐＨ４．０）を、０．０１６１ｇのＤＴＴを４．１７５ｍＬのスクシネ−トバッファ−に溶解することにより調製した。この溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  １３ｍｍフィルタ−（孔径０．２２μｍ）を通して濾過した。Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−ト溶液及び２５ｍＭのＤＴＴ保存溶液を、氷上で４℃に冷却した。２．８３８ｍＬの２５ｍＭ  ＤＴＴ溶液を、タンパク質溶液に加えて最終的なＤＴＴ濃度を１ｍＭとした。インキュベ−ションを、一晩２〜８℃で実施した。精製タグの除去をＭＳにより監視した。切断前のＲｂｚ−スペ−サ−−リンカ−−精製タグは、精製タグモノコンジュゲ−トｇ３を示す、４９５７３にピ−クを有していた。切断後のＲｂｚ−リンカ−コンジュゲ−トｇ４は、精製タグの切断後のＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トを示す、４８７０９にピ−クを有していた。
Ｒｂｚ−リンカ−コンジュゲ−トｇ４をＣＩＥＣにより精製した。ＤＴＴ媒介脱保護後の７０．９ｍＬのＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トを、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５）を用いて、最終容積が約８５０ｍＬとなるまで１２倍に希釈した。カラムはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  ＸＫ２６  カラム（高さ５．２ｃｍ）であった。バッファ−系は：１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ５．５（バッファ−Ａ）；及び１０ｍＭ  ヒスチジン、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）（バッファ−Ｂ）であった。勾配は線形であった（０％−５０％  Ｂ、２５ＣＶ（１７．５ｍＬ／分の流量））。負荷は約３００ｍｇであった。
ＣＩＥＣ工程の後、タンパク質溶液の浸透圧を、バッファ−Ｂ（１０ｍＭ  ヒスチジン、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いたさらなる希釈により調節し、ＮａＣｌ濃度を約１５０ｍＭとした。６３ｍＬのＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トが、ＣＩＥＣ実行の間に収集された。１５．６ｍＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を試料に加え、Ｒｂｚ−スペ−サ−−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ４の全体の容積を７８．６ｍＬとした。
【０５１９】
実施例３Ｅ：Ｒｂｚ−リンカ−の濃度
４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質負荷でＨＡ−リンカ−−Ｒｂｚ  ｈ１を調製するために、Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ４を６０ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。二つのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５  ＰＬＣＧ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ＭＷＣＯ  １０ｋＤａを、３０００ｇでの遠心分離によるタンパク質溶液の濃縮に使用した。６４．６ｍｇ／ｍＬ（２９３．８ｍｇ）のタンパク質含有量を有する約４．５ｇのＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ４の溶液を得た。Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ４をＭＳにより分析し、Ｒｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トを示す４８７１０のピ−クが見られた。
【０５２０】
実施例４Ａ：マレイミド官能化ＨＡへの−リンカ−−Ｒｂｚコンジュゲ−トのコンジュゲ−ション
2020515545.tif 000079
スキ−ム４Ａ
マレイミド官能化ＨＡ  ｆ５へのＲｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トｇ４のコンジュゲ−ションを、スキ−ム４Ａに示すように実行した。
マレイミド官能化ＨＡ  ｆ５へのＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−トｇ４のコンジュゲ−ションは、チオ−ル含有量に対して１．３当量のマレイミド官能化ＨＡ  ｆ５へのＲｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トｇ４の濃縮溶液の付加により実施され、その結果４４ｍｇ／ｍＬのタンパク質（Ｒｂｚ）濃度（チオ−ル含有量に基づく）と約０．４９％のＨＡ含有量が得られた。実施例３Ｃに従って調製されたＲｂｚ−リンカ−モノコンジュゲ−ト試料（１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）中に配合された６４．６ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液）を、常温まで温めた。試料を、孔径０．２２μｍのＧＶ  Ｍｉｌｌｅｘフィルタ−３３ｍｍを介して濾過した。Ｒｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トｇ４溶液のチオ−ル含有量は、６９．０ｍｇ／ｍＬであると決定された。１３００μＬのＲｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トｇ４溶液を、５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチュ−ブに移した。３３６μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−を加えた。６８μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）を加えた。３３５μＬのＨＡ−マレイミドｆ５溶液（０．２４ｍｍｏｌ／ｇのマレイミド含有量を有する１１６ｋＤａ  ＨＡの含有量３０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。その結果得られた溶液をよく混合し、４時間常温でインキュベ−トした。４時間の反応時間の後、２５μＬの試料を回収し、ＳＥＣで分析した。９２％のＲｂｚリンカ−モノコンジュゲ−トは、既にマレイミド官能化ＨＡに結合していた。
【０５２１】
実施例４Ｂ：リンカ−−薬物架橋ＨＡゲルを形成するチオ−ル−マレイミド架橋
架橋はスキ−ム４Ｂに従って行った。
2020515545.tif 000080
2020515545.tif 000081
スキ−ム４Ｂ
２０１４μＬのリンカ−−Ｒｂｚ  ＨＡ−コンジュゲ−トｈ１を４時間インキュベ−トした後。２０１μＬのＨＡ−チオ−ルｆ６溶液（０．０９８ｍｍｏｌ／ｇのチオ−ル含有量を有する１１６ｋＤａ  ＨＡの２７．８ｍｇ／ｍＬ含有量）を加え、その結果得られる溶液に４０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質含有量（チオ−ル含有量に基づく）と７．０１ｍｇ／ｍＬの最終ＨＡ含有量が得られた。この溶液をよく混合し、１８Ｇの鈍端カニュ−レを備えた２ｍＬのシリンジに吸引した。充填用シリンジチップを使用して、溶液を素早く８個の１ｍＬ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジに充填した。ネジキャップをシリンジに装着し、それらを約２４時間直立位置で常温でインキュベ−トした。その後シリンジを、５℃で三週間インキュベ−トした。架橋反応がシリンジ内で完了し、架橋ＨＡゲル  Ｒｂｚコンジュゲ−トｈ２が得られた。
【０５２２】
実施例４Ｃ    架橋ＨＡ  ＲｂｚゲルからのＲｂｚの放出
架橋ＨＡ  ＲｂｚゲルからのＲｂｚの放出を、小さな調整を加えて実施例４Ｂに従って調製した物質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。１３〜１７ｍｇのＲｂｚ  ＨＡゲルｈ２を、滅菌の、パイロジェンフリ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチュ−ブに移した。リリ−スバッファ−（６０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．４））を、２５ｍｇのＨＡに対して９７５μＬのバッファ−の比に従って加えた。チュ−ブは反転も振とうもさせなかった。すべてのチュ−ブを、制御された３７℃の温度でインキュベ−タ−内に貯蔵した。異なる時点において、チュ−ブをインキュベ−タ−から取り外し、遠心分離した（９３００ｒｃｆ、３分）。上清を新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチュ−ブに移し、上清のタンパク質濃度を、消衰係数１．９ｍＬ／ｃｍ．ｍｇのＲｂｚを用いて、参照波長３３８ｎｍで２８０ｎｍでの吸光度測定により決定した。各試料について、％での放出を、ゲルの移動質量及びタンパク質含有量（表４ｃ）を用いて計算した。
【０５２３】
2020515545.tif 000082
【０５２４】
実施例５Ａ：リンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲコンジュゲ−トの調製
2020515545.tif 000083
スキ−ム５Ａ
実施例１Ｄのリンカ−ｂ８に対するＧ６．３１  ＡＡＲＲのコンジュゲ−ションを、スキ−ム５Ａに従って行った。
バッファ−の交換及び濃縮を、ＨｉＰｒｅｐカラムに続いて遠心濾過器（小規模）を介した濃縮を行うことにより、又はタンジェント流濾過（ＴＦＦ）系（大規模）を使用することにより、実施することができる。
この実施例では、２０ｍＭ  ヒスチジン、２４０ｍＭ  スクロ−ス、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）中に配合された４０ｍｇ／ｍＬの３１ｍＬ  Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ（スキ−ム５Ａ及び以下の反応物スキ−ムに「Ｇ６．３１」として示す）を使用した。３０ｍＭのホスフェ−ト（ｐＨ７．４）へのバッファ−交換及び濃縮後、約２３ｇのタンパク質溶液を回収し、濃度を決定した。リン酸バッファ−の付加により、試料を４０ｍｇ／ｍＬに希釈した。濃度３９．９ｍｇ／ｍＬで１２７７ｍｇのＧ６．３１を含む総容積３２．０ｇのタンパク質溶液が得られた。
３０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、１２７７ｍｇのＧ６．３１  ＡＡＲＲ（３９．９ｍｇ／ｍＬで３２．０ｍＬ）を、氷上で冷却した。１５当量（４．６ｍＬ）の化合物ｂ８（実施例１Ｄ）（ＮＨＳ含有量に対して修正、ＤＭＳＯ中１００ｍＭの保存溶液）を加え、溶液を数回反転させた。
溶液を直ちに氷上でインキュベ−トした。５分後、ｐＨを約ｐＨ４．０にシフトさせることにより、コンジュゲ−ション反応を止めた。したがって、０．１２容積当量（３．８ｍＬ）の０．５Ｍ  コハク酸（ｐＨ３．０）を加え、この溶液を数時間反転させた。５ｍＭ  コハク酸（ｐＨ４．０）へのバッファ−交換を、ＧＥ  ＨｉＰｒｅｐカラムを備えたＡｋｔａ  Ｂａｓｉｃ  １０を用いて流速８ｍＬ／分で１０回実施した。１回当たり４ｍＬの溶液を注入した。合計で、濃度１２．９ｍｇ／ｍＬの生成物溶液９３．１ｇが収集された。
コンジュゲ−ションの前と後の試料を、質量分析により分析した。コンジュゲ−ションの前のデコンボリュ−ションしたＭＳスペクトルは、４７３９０にＧ６．３１の単一ピ−クを示した。コンジュゲ−ションの後のスペクトルは、Ｇ６．３１  ＡＡＲＲのピ−クを４７３９２に、モノコンジュゲ−トｊ１のピ−クを４８０７７に、ビスコンジュゲ−トを４８７６６に、トリスコンジュゲ−トを４９４５２に、テトラコンジュゲ−トを５０１４７に、それぞれ示した。明瞭性のため、主生成物であるモノコンジュゲ−トｊ１のみがスキ−ム３Ａに示されている。このモノコンジュゲ−トは、後述するように、より高次のコンジュゲ−トから単離された。
【０５２５】
実施例５Ｂ：Ｇ６．３１  ＡＡＲＲリンカ−コンジュゲ−トへの精製タグの導入
2020515545.tif 000084
スキ−ム５Ｂ
Ｇ６．３１  ＡＡＲＲリンカ−コンジュゲ−トｊ１への精製タグｅ８の導入を、スキ−ム５Ｂに従って行った。
モノコンジュゲ−トｊ１（自然のＧ６．３１  ＡＡＲＲ及びより高次のコンジュゲ−ト（示さない））（１２．９ｍｇ／ｍＬ、１２０３ｍｇタンパク質、２５．４μｍｏｌ（簡単にするためにＧ６．３１  ＡＡＲＲの消衰係数及び分子量を使用した））を含む９３．１ｍＬのリンカ−コンジュゲ−ト混合物の溶液に対し、タンパク質含有量に対して２．５ｍｏｌ当量の精製タグｅ８（スキ−ム１Ｇ）を常温で加え（２０ｍＭ  コハク酸（ｐＨ４．０）、６３．５μｍｏｌ中、１２７０μＬの５０ｍＭ  ｅ８）、この溶液を慎重に振とうし、タグ化Ｇ６．３１リンカ−モノコンジュゲ−トｊ２及びより高次のコンジュゲ−ト（示さない）を得た。５０分後、ｐＨ７．４へのｐＨシフトとアミンの脱保護を、０．１７０容積当量（１５．８ｍＬ）の０．５Ｍ  ホスフェ−ト、２００ｍＭ  ＴｒｉＭＥＤ（ｐＨ７．８）の付加により行った（加えた精製タグ溶液の容積は考慮しなかった）。モノ−タグ化ビス−コンジュゲ−トがｐＨシフト後も依然として混合物中に検出されたため、タンパク質含有量に対してさらに０．２当量の精製タグｅ８（スキ−ム１Ｇ）（２０ｍＭ  コハク酸中、５０ｍＭ  ｅ８  １００μＬ（ｐＨ４．０）、５μｍｏｌ）を混合物に加えた。溶液を、２５℃の制御された温度でインキュベ−タ−内に一晩貯蔵し、その間に、タグ化リンカ−モノコンジュゲ−トｊ２（及びより高次のコンジュゲ−ト）のリンカ−の保護基が切断されてｊ３が生成された。
約１１０ｍＬのタンパク質溶液を２５℃のインキュベ−タ−から取り出し、０．４１９容積当量（３９．０ｍＬ、最初の９３．１ｍＬのタンパク質容量に基づく）の０．５Ｍコハク酸（ｐＨ３．０）をｊ３の溶液及びより高次のコンジュゲ−トに加え、約ｐＨ４．０のｐＨを得た。
【０５２６】
実施例５Ｃ：Ｇ６．３１  ＡＡＲＲリンカ−モノコンジュゲ−トの単離
ＣＩＥＣ（陽イオン交換クロマトグラフィ−）の精製のために、非コンジュゲ−トＧ６．３１の混合物と、タグ化Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ３及びより高次のコンジュゲ−トの混合物とを含むタンパク質溶液を、２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）で３．３倍に希釈し、約５００ｍＬの最終容積を得た。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓカラム（カラムＨｉＳｃａｌｅ２６、高さ９．８ｃｍ）を次のバッファ−に使用した：２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）（バッファ−Ａ）；及び２０ｍＭのコハク酸、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０）（バッファ−Ｂ）。勾配は線形であった（２０ｍＬ／分の流量で４０ＣＶ中０％〜５０％のＢ、又は３２ＣＶ中１０％〜５０％のＢ）。負荷は１回当たり約６００ｍｇであった。コンジュゲ−ト混合物はＣＩＥＣの前にＭＳにより分析され、デコンボリュ−ションしたＭＳスペクトルにおいて、４７３９５のピ−ク（自然のＧ６．３１  ＡＡＲＲ）、４８５８４のピ−ク（モノコンジュゲ−トｊ３）、４９７８２のピ−ク（ビスコンジュゲ−ト）、５０９８６のピ−ク（トリスコンジュゲ−ト）、及び５２１７４のピ−ク（テトラコンジュゲ−ト）が観察された。ＣＩＥＣのすべてのピ−クを収集した。モノコンジュゲ−トｊ３を優勢に含む画分をプ−ルし（５３４．２ｍＬ；０．６７ｍｇ／ｍＬ）、次の工程で使用した。
【０５２７】
実施例５Ｄ：精製タグの切断
2020515545.tif 000085
スキ−ム５Ｄ
精製タグｅ８を、スキ−ム５Ｄに示す手順に従って除去した。
精製タグｅ８の切断（脱タグ化）を、ＤＴＴの存在下での単離されたタグ化Ｇ６．３１ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ３（５３４．２ｍｌ、０．６７ｍｇ／ｍＬ）のインキュベ−ションにより行った。０．１３６４ｇのＤＴＴを３５．４ｍＬの２０ｍＭ  コハク酸（ｐＨ４．０）に溶解することにより、２５ｍＭのＤＴＴ保存溶液を調製した。Ｇ６．３１−リンカ−モノコンジュゲ−ト溶液及び２５ｍＭのＤＴＴ保存溶液を４℃に冷却した。２２．３ｍＬの２５ｍＭ  ＤＴＴ保存溶液をタンパク質溶液に加え、最終ＤＴＴ濃度を１ｍＭとした。その結果得られた溶液を、制御された５℃の温度でインキュベ−タ−内に一晩貯蔵した。精製タグの除去をＭＳにより監視した。切断前には、タグ化モノコンジュゲ−トｊ３を示す、４８５８５におけるピ−クが検出された。切断後、脱タグ化及びＧ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４の生成を確認する、４７７２０におけるピ−クが検出された。
Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４を、ＣＩＥＣにより精製した。ＤＴＴ媒介脱保護後の５５６．５ｍＬのＧ６．３１−リンカ−モノコンジュゲ−トを、２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．０）を用いて、最終容積が約１６６０ｍＬとなるまで３倍に希釈した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  ＨｉＳｃａｌｅ２６カラム（高さ９．８ｃｍ）が使用された。バッファ−系は：１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ５．５（バッファ−Ａ）；２０ｍＭ  コハク酸、ｐＨ４．０（Ａ２）；及び１０ｍＭ  ヒスチジン、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５（バッファ−Ｂ）であった。カラムロ−ディング後、カラムを２ＣＶのバッファ−Ａ２で洗浄し、続いてカラムを２ＣＶのＡ１で洗浄した。その後、直線勾配を適用した：０％〜５０％  Ｂ、２５ＣＶ（２０ｍＬ／分の流量）。負荷は約３００ｍｇであった。
ＣＩＥＣ工程の後、タンパク質溶液の浸透圧を、バッファ−Ｂ（１０ｍＭ  ヒスチジン、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いたさらなる希釈により調節し、ＮａＣｌ濃度を約１５０ｍＭとした。１３０ｍＬのＧ６．３１−リンカ−モノコンジュゲ−トが、ＣＩＥＣ実行の間に収集された。２８ｍＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を試料に加え、Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４の全体の容積を１５８ｍＬとした。
【０５２８】
実施例５Ｅ：Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−の濃度
４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質負荷でＨＡ−リンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ  ｋ１（後述の実施例６Ａ）を調製するために、Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４を６０ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。四つのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５  ＰＬＣＧ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ＭＷＣＯ  １０ｋＤａを、３０００ｇでの遠心分離によるタンパク質溶液の濃縮に使用した。７６．５ｍｇ／ｍＬ（２９８ｍｇ）のタンパク質含有量を有する約３．９ｇのＧ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４の溶液を得た。濃縮した溶液をＭＳにより分析し、Ｇ６．３１−リンカ−モノコンジュゲ−ト  ｊ４に対応する４７７２３にピ−クが検出された。６８９μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を加えることにより、試料を６５ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【０５２９】
実施例６Ａ：マレイミド官能化ＨＡへのＧ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−ト  ｊ４のコンジュゲ−ション
2020515545.tif 000086
スキ−ム６Ａ
リンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−ＨＡコンジュゲ−トｋ１を作製するために、マレイミド官能化ＨＡ  ｆ５へのＧ６．３１リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４のコンジュゲ−ションを、スキ−ム６Ａに示すように実行した。
マレイミド官能化ＨＡ  ｆ５（実施例２Ｂ）へのＧ６．３１−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４のコンジュゲ−ションは、チオ−ル含有量に対して１．３当量のマレイミド官能化ＨＡ  ｆ５へのＧ６．３１リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４の濃縮溶液の付加により実施され、その結果４４ｍｇ／ｍＬのタンパク質（Ｇ６．３１）濃度（チオ−ル含有量に基づく）と約０．４９％のＨＡ含有量が得られた。実施例５Ｄに従って調製されたＧ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４試料（１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）中において製剤化された６４．７ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液）を、常温まで温めた。試料を、孔径０．２２μｍのＧＶ  Ｍｉｌｌｅｘフィルタ−３３ｍｍを介して濾過した。Ｇ６．３１リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４溶液のチオ−ル含有量は、７３．４ｍｇ／ｍＬであると決定された。２１９０μＬのＧ６．３１リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４溶液を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチュ−ブに移した。７３５．５μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−を加えた。１１５．３μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）を加えた。６１２．５μＬの滅菌濾過された（Ｍｉｌｌｅ×ＧＰ、２５ｍｍ径、０．２２μｍ）ＨＡ−マレイミドｆ５溶液（０．２４ｍｍｏｌ／ｇのマレイミド含有量を有する１１６ｋＤａ  ＨＡの含有量３０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。その結果得られた溶液をよく混合し、４時間常温でインキュベ−トした。４時間の反応時間の後、２５μＬの試料を回収し、ＳＥＣで分析した。９５％のＧ６．３１  ＡＡＲＲ−リンカ−モノコンジュゲ−トｊ４が、マレイミド官能化ＨＡ  ｆ５にコンジュゲ−トし、リンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−ＨＡコンジュゲ−トｋ１を提供した。
【０５３０】
実施例６Ｂ：リンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ架橋ＨＡゲルを形成するチオ−ル−マレイミド架橋
リンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ架橋ＨＡヒドロゲルｋ２を提供するチオ−ル  ＨＡ  ｆ６とリンカ−−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ−ＨＡコンジュゲ−トｋ１の架橋を、スキ−ム６Ｂに従って実施した。
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スキ−ム６Ｂ
３６２８μＬのリンカ−−Ｇ６．３１  ＨＡ−コンジュゲ−トｋ１を４時間インキュベ−トした後。３６３μＬの滅菌濾過された（Ｍｉｌｌｅ×ＧＰ、２５ｍｍ径、０．２２μｍ）ＨＡ−チオ−ルｆ６溶液（０．０９８ｍｍｏｌ／ｇのチオ−ル含有量を有する１１６ｋＤａ  ＨＡの２８．４ｍｇ／ｍＬ含有量）を加え、その結果得られる溶液に４０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質含有量（チオ−ル含有量に基づく）と７．１６ｍｇ／ｍＬの最終ＨＡ含有量が得られた。この溶液をよく混合し、１８Ｇの鈍端カニュ−レを備えた５ｍＬのシリンジに吸引した。充填用シリンジチップを使用して、溶液を素早く１８個の１ｍＬ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジに充填した。ネジキャップをシリンジに装着し、それらを約２４時間直立位置で常温でインキュベ−トした。その後シリンジを、５℃で三週間インキュベ−トした。架橋反応がシリンジ内で完了し、架橋ＨＡゲルＧ６．３１コンジュゲ−トｋ２が得られた。
【０５３１】
実施例６Ｃ    架橋ＨＡ  Ｇ６．３１ゲルからのＧ６．３１  ＡＡＲＲの放出
架橋ＨＡ  Ｇ６．３１  ＡＡＲＲゲルｋ２からのＧ６．３１  ＡＡＲＲの放出を、実施例６Ｂの物質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。１１〜１６ｍｇのＧ６．３１  ＨＡゲルを、滅菌の、パイロジェンフリ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチュ−ブに移した。リリ−スバッファ−（６０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．４））を、２５ｍｇのＨＡに対して９７５μＬのバッファ−の比に従って加えた。チュ−ブは反転も振とうもさせなかった。すべてのチュ−ブを、制御された３７°Ｃの温度でインキュベ−タ−内に貯蔵した。異なる時点において、チュ−ブをインキュベ−タ−から取り外し、遠心分離した（９３００ｒｃｆ、３分）。上清を新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチュ−ブに移し、上清のタンパク質濃度を、１．３８ｍＬ／ｃｍ．ｍｇのＧ６．３１の消衰係数を用いて、参照波長３３８ｎｍで２８０ｎｍでの吸光度測定により決定した。各試料について、％での放出を、ゲルの移動質量及びタンパク質含有量を用いて計算した（表６Ｃ）。
【０５３２】
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【０５３３】
実施例７Ａ  架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂゲルの調製
ＲａｂＦａｂ−リンカ−コンジュゲ−トの調製を、実施例３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄに記載される手順に従って実施した。ＲａｂＦａｂ−リンカ−モノコンジュゲ−トの濃縮を、実施例３Ｅに記載される手順に従って実施した。但し、コンジュゲ−トは４６ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮し、それにより最終的なゲル内部のタンパク質含有量は約３０ｍｇ／ｍＬである。
マレイミド官能化ＨＡへのＲａｂＦａｂ−リンカ−コンジュゲ−トのコンジュゲ−ションを、実施例４Ａに記載される手順に従って実施した。５５０２μＬのＲａｂＦａｂ−リンカ−コンジュゲ−トを、１８０４μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−と混合した。２８９μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）を加えた。１１２４μＬのＨＡ−マレイミドｆ５溶液（０．２４ｍｍｏｌ／ｇのマレイミド含有量を有する１１６ｋＤａ  ＨＡの含有量３０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。その結果得られた溶液をよく混合し、４時間常温でインキュベ−トした。
架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂゲルの調製を、実施例４Ｂに記載される手順に従って実施した。８６９１μＬのＲａｂＦａｂ−リンカ−−ＨＡコンジュゲ−トに対し、８６９μＬのＨＡ−チオ−ルｆ６溶液（０．０９６ｍｍｏｌ／ｇのチオ−ル含有量を有する１１６ｋＤａ  ＨＡの２２．６ｍｇ／ｍＬ含有量）を加えた。この溶液をよく混合し、１８Ｇの鈍端カニュ−レを備えた１０ｍＬのシリンジに吸引した。充填用シリンジチップを使用して、溶液を素早く４８  １ｍＬ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジに充填した。ネジキャップをシリンジに装着し、それらを約２４時間直立位置で常温でインキュベ−トした。その後シリンジを、５℃で三週間インキュベ−トした。架橋反応がシリンジ内で完了し、架橋ＨＡゲルＲａｂＦａｂコンジュゲ−トｍ１が得られた。
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【０５３４】
実施例７Ｂ    カルボキシフルオロセイン標識されたＨＡプラセボゲルの調製
アミン官能化ＨＡの調製を、実施例２Ａに記載される手順に従って行った。より高いアミン官能化の度合いを有するＨＡ変異体を得るために、１．００ｇの１１６ｋＤａ  ＨＡを１２５ｍＬの１００  ＭＥＳ、０．４Ｍの１，３−ジアミノプロパンバッファ−（ｐＨ５．５）及び１．１５ｇ（７．４８ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔに溶解し、４４４．６ｍｇ（２．３２ｍｍｏｌ）のＥＤＣを使用した。その後のカルボキシフルオロセイン及びマレイミド標識は、４６ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ−（ｐＨ７．４）に４６３ｍｇの上記アミン官能化ＨＡを溶解した後、１．５ｍＬの５（６）−カルボキシフルオロセインＮ−スクシンイミジルエステル溶液（アセトニトリル中５．２８ｍｇ／ｍＬ）に加えることにより行った。この溶液に、常温での撹拌下で一時間のインキュベ−ション後、新しく調製した、２４ｍＬのアセトニトリル中、３９６ｍｇの３−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルの溶液を加えた。常温での撹拌下で一時間のインキュベ−ション後、反応混合物のワ−クアップを、実施例２Ｂに記載される手順に従って実施した。
カルボキシフルオロセイン標識されたＨＡゲルの調製を、以下の手順に従って行った。１４０．６ｍｇのカルボキシフルオロセイン標識マレイミド官能化ＨＡを６５８０μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−に溶解した。８２．８ｍｇのチオ−ル官能化ＨＡを、２９４６μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−に溶解した。５７．６ｍｇの２−メルカプトエタノ−ルを、６２１６μＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−に溶解した。５００μＬのこの２−メルカプトエタノ−ル溶液を、新しいバイアルに移し、４９．５ｍＬの１０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）バッファ−で希釈した。１２１．５ｍｇの自然の１１６ｋＤａ  ＨＡを、８４３３μＬの希釈した２−メルカプトエタノ−ル溶液に溶解した。８４３３μＬのこの溶液を、新しいバイアルに移し、２５６８μＬのマレイミドＨＡ溶液を加えた。その結果得られた溶液を短時間振とうし、遠心分離し、２時間常温でインキュベ−トした。１０ｍＬのこの溶液を、新しいバイアルに移し、１ｍＬのチオ−ルＨＡ溶液を加えた。この溶液をよく混合し、１８Ｇの鈍端カニュ−レを備えた１０ｍＬのシリンジに吸引した。充填用シリンジチップを使用し、シリンジ１つ当たり約３００μＬの充填容積を適用して、溶液を素早く３４  １ｍＬ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジに充填した。ネジキャップをシリンジに装着し、それらを約２４時間直立位置で常温でインキュベ−トした。その後シリンジを、５℃で三週間インキュベ−トした。架橋反応がシリンジ内で完了し、架橋したカルボキシフルオロセイン標識ＨＡプラセボゲルｍ２が得られた。
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【０５３５】
実施例７Ｃ：架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂゲルからのｉｎ  ｖｉｖｏでの放出動態力学
架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂゲルを、ウサギへの単回の両側硝子体内注射を介してナイ−ブなニュ−ジ−ランドホワイト（ＮＺＷ）種のウサギに投与し、その後６０日間の観察を行った。局所的抗生物質（トブラマイシン眼軟膏）を、注射の直後、治療の前日に二回、注射の直後、及び注射の翌日に二回（１日目及び２日目に剖検に送られた動物は除く）、両目に適用した。投薬前、散瞳性の点眼薬（１％のトロピカミド）を、完全な瞳孔拡張のために各目に適用した。動物は、手順の前又は手順の間に、イソフルラン／酸素ガスで鎮静させた。また、アルカイン（０．５％）を、注射の前に各目に適用した。コンジュゲ−トを、滅菌水であるＵ．Ｓ．Ｐ．中で１：１０，０００（ｖ／ｖ）に希釈したベンザルコニウムクロライド（ＺｅｐｈｉｒａｎＴＭ）で洗い流した。
架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂゲルを、すべての動物の両目への単回の３０μＬ硝子体内注射（０．３ｍｇの用量）により投与した。用量は、２５−ゲ−ジｘ１／２インチの針を有する１ｍＬのＬｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジを用いて委員会認定獣医眼科医により投与された。臨床的投薬を模擬するために、目への投薬は、下耳側象限、即ち、左右の目のそれぞれ５時と７時の位置（動物に正対して）において行われた。目は、治療後直ちに、スリットランプ検査及び／又は倒像検査法により試験した。
すべての動物には、ペントバルビタ−ルナトリウムの静脈内注射による麻酔後、腋窩動脈又は大腿動脈の切開による放血を行った。水性体液、硝子体液及び網膜組織を収集し、液体窒素でスナップ凍結し、−８０℃で貯蔵した。試験品の硝子体濃度の決定は、抗原結合ＥＬＩＳＡにより行った。ＬＬＯＱを下回る値は、薬物動態分析に、又は図表に若しくは要約的目的で使用されなかった。
ＥＬＩＳＡ分析は、標的コ−ティング法を用いて実施した。このアッセイでは、標的コ−ティングは、ＫＬＨにコンジュゲ−トしたリン酸化ｃＭｅｔペプチド（Ｙｅｎｚｙｍ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡのＰ−ｃＭｅｔペプチド）であった。アッセイプレ−トの調製のために、凍結乾燥させたＰ−ｃＭｅｔペプチドを、３００μｌのバッファ−で再構成し、０．０５Ｍの重炭酸ナトリウムバッファ−中において１：２００にさらに希釈した。希釈したＰ−ｃＭｅｔペプチド（１００μＬ／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタ−プレ−ト（Ｎｕｎｃ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に加え、２〜８°Ｃで一晩インキュベ−トした。インキュベ−ション後、プレ−トを３回４００μｌの洗浄バッファ−（ＢＡ０２９）で洗浄し、続いてアッセイ希釈剤（０．５％のウシ血清アルブミン及び０．０５％のＰｒｏｃｌｉｎを含む洗浄バッファ−）で遮断した。標準曲線を、Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を２００ｎｇ／ｍｌに希釈し、次いでアッセイ希釈剤中において１：２に段階希釈することにより準備した。コントロ−ルをアッセイ希釈剤中において１：１００に希釈した。各試料を、アッセイ希釈剤を用いてアッセイの量的範囲に希釈した。すべての試料、コントロ−ル、及び参照物を、１００μｌでプレ−トに加え、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベ−トした。インキュベ−ション及び洗浄の後、１００μｌの検出抗体（マウス抗ウサギ軽鎖−ＨＲＰ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を、アッセイ希釈剤中で１／４０００に希釈した後で各ウェルに加えた。次いでプレ−トを、穏やかに撹拌しながら１時間室温でインキュベ−トした。さらなる洗浄後、１００μｌのＨＲＰ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ、Ｋｉｒｋｅｇａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに加え、続いて１５分間穏やかに撹拌しながら室温でインキュベ−トした。反応を１００μｌの１Ｍリン酸で止めた。プレ−トを、検出のために４５０ｎｍで、参照波長のために６３０ｎｍで読み取った（ＳｐｅｃｔｒａＭａ×３８４−ｐｌｕｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）。標準の光学濃度の値を、４パラメ−タ−ロジスティック曲線当てはめソフトウェア（Ｓｏｆｔｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてグラフ化し、そこから外挿によりコントロ−ル及び試験試料の濃度値を導出した。
硝子体中の濃度は、上述し、時間の関数としてグラフ化したように、抗原結合ＥＬＩＳＡにより決定した。図１２は、注射後の硝子体の濃度を時間の関数としてまとめたグラフである。ＩＶＴ投与後の遊離ＲａｂＦａｂは青で提示されており、架橋ＨＡからの放出は赤で提示されている。点は個々の観察デ−タであり、線は、硝子体内の遊離Ｆａｂ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの可逆プロドラッグリンカ−の放出、並びにウサギ硝子体のｐＨ及び温度について既知のＰＫパラメ−タ−に基づいて予想される硝子体濃度のモデル予測である。これらデ−タに非コンパ−トメント分析を実施して、薬物動態（ＰＫ）パラメ−タ−を得た。
薬物動態パラメ−タ−は、公称時間及び用量を用いた非コンパ−トメント分析により決定された（Ｐｈｏｅｎｉ×ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。非コンパ−トメント分析を用いて計算されたＰＫパラメ−タ−を表２にまとめる。
【０５３６】
2020515545.tif 000092
【０５３７】
ＮＺＷウサギにおける架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂからの放出後のＲａｂＦａｂ硝子体ＰＫは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出に基づく予測と一致している。初期のより高い濃度は、〜３．６％の遊離Ｆａｂ及び〜４．９％の遊離Ｆａｂ−ＨＡ種を含む用量溶液に起因している。ウサギ硝子体液の放出半減期は、５３日と推定される。
硝子体の遊離Ｆａｂの終末相半減期は、可逆プロドラッグリンカ−の半減期に等しい。これは、ＨＡからの薬物放出の動態及びその後の硝子体からの消失が均衡に達すると、硝子体中の活性薬物の効果的除去の半減期が、遊離ＦａｂのＩＶＴ注射後に典型的に観察されるものと比較して、５３／３．２＝１６．５倍の長さになることを意味する。
【０５３８】
実施例５Ｅ    ＮＨＰの目における有意な断片化又は粒子移動の非存在
二匹のカニクイザルに対し、下耳側象限におけるプラセボ架橋ＨＡゲル−フルオレセインの単回ＩＴＶ投与（５０μＬ／目）を、両側性に投与した。動物を、３０日間にわたり、臨床所見、体重の変化、食事量及び眼の所見（ＩＯＰ，生体顕微鏡（スリットランプ）並びに眼底検査試験について観察した。加えて、物質の位置及び粘着性を、ゴニオスコピ−、ゴニオイメ−ジング、共焦点走査型レ−ザ−検眼鏡を用いた眼底画像、及びＦｌｕｏｒｏｔｏｎを用いた蛍光分析を使用して、同期間にわたって監視した。
図１４Ａは、１５日目に撮られた代表的なｃＳＬＯ画像である。ＴＡ（矢印）は下部硝子体に残り、中心窩（Ｆ）又は視神経乳頭板（ＯＮ）を不明瞭にしない。図１４Ｂは、前上葉区及び水晶体の除去後に、コバルトブル−の光で剖検時に撮られた画像である。ＴＡ（矢印）が粘着性のままであることに注意されたい。図示のように、プラセボ架橋ＨＡゲルｍ２は、３０日後に、最小の断片化と移動を示した。
【０５３９】
実施例７Ｆ    ウサギにおける架橋ＨＡ  ＲａｂＦａｂゲルの忍容性試験
三匹のニュ−ジ−ランドホワイト種のウサギに対し、下耳側象限における架橋ＨＡ−ＲａｂＦａｂゲルの単回ＩＴＶ投与（５０μＬ／眼）を、両側性に投与した。動物を、６０日間にわたり、臨床所見、体重の変化、食事量及び眼の所見（ＩＯＰ， 生体顕微鏡（スリットランプ）並びに眼底検査試験）について観察した。血清試料をＡＤＡ及びＴＫのために取得した。剖検では、目を取り除き、組織組織診断のために処理した。図１５は組織学切片を示している。図示のように、架橋ＨＡ−ＲａｂＦａｂゲルは、２カ月の試験において良好な耐容性を示した。浸潤細胞、炎症反応、及び異物反応はまったく観察されなかった（６個の目）。
【０５４０】
実施例７Ｇ    カニクイザルにおける架橋ＨＡ  Ｇ６．３１  ＡＡＲＲゲルの忍容性試験
二匹のカニクイザルに対し、下耳側象限における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂにコンジュゲ−トした架橋ＨＡゲル、Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ（５０μＬ／目；１．９２ｍｇ  Ｆａｂ／目）の単回ＩＴＶ注射を、両側性に投与した。動物を、３カ月（９２日間）にわたり、臨床所見、体重の変化、食事量及び眼の所見（ＩＯＰ， 生体顕微鏡（スリットランプ）並びに眼底検査試験）について観察した。物質の位置及び粘着性を、ゴニオスコピ−及びゴニオイメ−ジングを用いて同期間にわたって監視した。ＡＤＡ及びＴＫの評価のために血清試料を取得し、３か月目に病理組織検査により眼を評価した。
ヒドロゲルは、評価の期間を通して粘着性のまま下部硝子体に留まった。両方の動物に２８日目までにＡＤＡが誘導されたが、有意な生存中の炎症は見られなかった。臨床所見、質的食事量、及び体重に、試験物に関連する変化はなかった。図１６は、試験物を含む目の下部頭蓋冠の超下位組織切片を示している。図示のように、架橋ＨＡ−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲゲルは、３カ月の試験において良好な耐容性を示した。浸潤細胞、炎症反応、及び異物反応はまったく観察されなかった（４個の目）。
ＰＥＧに基づくラニビズマブにコンジュゲ−トした微粒子ヒドロゲルと比較して、架橋ＨＡ−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲゲルは、超安全性プロファイルを示した。下部硝子体窩に注射されたとき、架橋ＨＡ−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲゲルは動かずに視軸の下に留まり、したがって患者の視覚に干渉しないと思われる。逆に、ＰＥＧに基づく微粒子ヒドロゲルは硝子体窩内部で自由に移動する。
架橋ＨＡ−Ｇ６．３１  ＡＡＲＲゲルは粘着性のままであり、有意な数の遊離微粒子様断片を形成しないので、流出が妨害される危険が制限される。ＰＥＧに基づく微粒子ヒドロゲルの画分が、カニクイザルの目の前房で観察された。
【０５４１】
実施例８：本発明の抗体コンジュゲ−トにおける使用のための例示的最適化抗ＶＥＧＦ抗体
この実施例に記載される最適化抗ＶＥＧＦ抗体のいずれもが、上記実施例３Ａから４Ｄに記載される抗体コンジュゲ−トを調製するために使用することができる。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３４５４号に記載されているいずれの最適化抗ＶＥＧＦ抗体も、使用することができる。表３には、使用できる例示的最適化抗ＶＥＧＦ抗体と、各抗体のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列が記載されている。表４には、表３に記載された抗ＶＥＧＦ抗体のＶＬ  ＨＶＲアミノ酸配列が記載されている。表５には、表３に記載された抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨ  ＨＶＲアミノ酸配列が記載されている。特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ（本明細書では「Ｇ６．３１．ＡＡＲＲ」とも呼ぶ）が使用される。
【０５４２】
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【０５４３】
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【０５４４】
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【０５４５】
上記に列挙された抗体のいずれのＦａｂ重鎖の上部ヒンジ領域も（例えばＧ６．３１  ＡＡＲＲ）、文献に報告されている抗ＩｇＧ１ヒンジ自己抗体への反応性を除去するために変異させることができる。例えば、Brezski et al., J. Immunol. 181:3183−3192, 2008 and Brezski et al., mAbs 2:3, 212−220, 2010参照。したがって、Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ重鎖のＣ末端アミノ酸は、Ｔ（野生型（ＷＴ）バ−ジョン）又はＬ（抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂに対する反応性を欠く変異体バ−ジョン）でありうる。野生型Ｇ６．３１  ＡＡＲＲの完全長重鎖アミノ酸配列は配列番号４８である。抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂへの反応性を欠く変異体バ−ジョンの完全長重鎖アミノ酸配列は配列番号４９である。Ｇ６．３１  ＡＡＲＲ及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂへの反応性を欠く変異体バ−ジョン両方の完全長軽鎖アミノ酸配列は配列番号５０である。
【０５４６】
本明細書の記載では、ベストモ−ドを含む発明を開示するため、さらには当業者が、任意の装置又はシステムを作製及び使用すること、並びに組み込まれている任意の方法を実施することを含む、本発明を実施することを可能にするために、実施例が用いられている。本発明の特許性のある範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者が想起する他の実施例を含みうる。このような他の実施例は、特許請求の範囲の文字通りの記述から相違していない構造的要素を有している場合、又は特許請求の範囲の文字通りの記述から実質的に相違しない等価な構造的要素を含む場合、特許請求の範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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