(57)【要約】【課題】プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、ハイスループットシーケンシングに適用するプローブ及び前記プローブでターゲット領域を濃縮する方法を開示する。プローブは、５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、ｄＵ領域、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり；マスク配列１、マスク配列２、ｄＵ領域、ＵＩＤ配列１及びＵＩＤ配列２は、０ｂｐであってもよい。本発明のプローブで作ったライブラリーのシーケンシング時にシーケンシングプライマーを別途添加する必要がなく、本発明の方法を使用することで、ＲＮＡをテンプレートとしてターゲット領域を直接キャプシャーすることができ、実験プロセスが簡素化される。【選択図】図１
2020536525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、マスク配列２、伸長アームの順であり、前記ＵＩＤ配列１が３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
【請求項２】
５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり、前記ＵＩＤ配列２が３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
【請求項３】
５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり；前記ＵＩＤ配列１及びＵＩＤ配列２は、いずれも３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
【請求項４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列とＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列との間に、１〜３個のデオキシウラシル塩基であるｄＵ領域が存在することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記リンカーアームは、核酸テンプレートと相補的に結合する１５−４５ｂｐの塩基配列であり；
前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補又は逆相補配列の任意の組み合わせであり；
伸長アームは、核酸テンプレートと相補的に結合する１５−４５ｂｐの塩基配列である、
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
前記伸長アームが修飾され；好ましくは、ホスホロチオエート修飾が行われ；より好ましくは、リンカーアームのＴｍ値は、伸長アームのＴｍ値より２℃以上高く；
代替的に、前記リンカーアームの５’末端は、リン酸化修飾が行われ；
代替的に、前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用ライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補配列或いは逆相補配列の任意の組み合わせから選択される、
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブを使用し、
テンプレートＤＮＡは、前記プローブとハイブリダイズ、伸長、ライゲーションして第１の産物を得るハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップと、
過剰プローブ及びテンプレートＤＮＡを酵素で切断して消化し、タグ付きプライマーを使ってＰＣＲ増幅して第２の産物を得る第２の産物取得ステップと、
第２の産物を精製してライブラリーを得る精製ステップと、
ライブラリーをシーケンサーにロードしてシーケンシングするステップと、
を含む、ハイスループットシーケンシングに適用されるターゲット領域の濃縮方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップ：テンプレートＤＮＡと請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブは、先にハイブリダイズしてからポリメラーゼ、リガーゼを加えて伸長、ライゲーションさせて第１の産物を得；
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水                                                        ６μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ                            ２μＬ；
３I１０−３μＭの請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ    １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                        １μＬ；
プロセスは、９５℃で５分間変性させ、６０℃で２時間インキュベーションすることであり；その後、上記反応系に以下の試薬を加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは６０℃で１時間インキュベーションすることであり；
精製水                                                      １．４μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                              １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ            １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                      ０．５μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋                                          ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                                        １μＬ；
又はテンプレートがＲＮＡの場合、
ヌクレアーゼフリー水                                        ５．５μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＲＮＡ                              ２μＬ；
３I１０−３μＭの前記プローブ                                    １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                              ０．５μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ；
７０℃で２分間変性させ、６５℃で２時間インキュベーションした後、以下の試薬を加え、４２℃で１時間反応させて伸長、ライゲーション反応を行い；
１ｍＭのｄＮＴＰｓ                                              １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ            １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ；
５０ｍＭのＮＡＤ＋                                          ０．１μＬ；
５I  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ                    ４μＬ；
１００ｍＭのＤＴＴ                                              ２μＬ；
ＳＭＡＲＴ  ＭＭＬＶ  ＲＴ                                      １μＬ；
又は、テンプレートＤＮＡ、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ、ポリメラーゼ及びリガーゼを同時に添加し、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーションを同時に行って第１の産物を得；
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水                                                      ３．４μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ                              ２μＬ；
３I１０−３μＭの前記プローブ                                    １μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                              １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ            １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋                                          ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．５μＬ；
反応プロセスは、９５℃５分間、６０℃３時間である、
ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の産物取得ステップは、先に過剰プローブ及びテンプレートＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化し、次に第１の産物をＵＳＥＲ酵素で線形化してからタグ付きプライマーによってＰＣＲ増幅して、第２の産物を得；
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                              ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                          ０．５μＬ；
３７℃で４０分間インキュベーションし、９５℃で５分間インキュベーションし；
さらに以下の試薬を加え：
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ            ５０μＬ；
精製水                                                    ２９μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                            ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                            ２μＬ；
ＵＳＥＲ酵素                                                １μＬ；
インキュベーション３７℃１５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温し；
又はエキソヌクレアーゼ、タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーを同時に添加し、酵素切断・消化、線形化及びＰＣＲ増幅を同時に行って第２の産物を得；
前記タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーの３’末端にホスホロチオエートを修飾し、５’末端にホスホロチオエート、アミノ或いはスペンサーアームを修飾することで、エキソヌクレアーゼによって切断されることを防止し；
好ましくは、テンプレートがＤＮＡの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物                                                    １８μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌａｍｂｄａ                        ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                                  １μＬ；
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ                ５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                                    ２９．５μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                              ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                              ２μＬ；
反応プロセスは、インキュベーション３７℃４０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温することであり；
又はテンプレートがＲＮＡの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物                                                １０．１μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                                      １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ａ                                              ０．１μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｈ                                              ０．１μＬ；
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ                ５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                                    ２４．８μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                                ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                                ２μＬ；
インキュベーション３７℃６０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング６０℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２７サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温する、
ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記タグ付きプライマー内の上流プライマー構造は、５’末端から開始し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、ｉｎｄｅｘ配列領域及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列に逆相補的なペア全長配列領域であり；
タグ付きプライマー内の下流プライマー構造は、５’末端から開始し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、ｉｎｄｅｘ配列領域及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２全長配列領域である、
ことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーシーケンシング分野に関し、特に、プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイスループットシーケンシング技術の急速な発展につれ、シーケンシング効率が大幅に向上し、時間が大幅に短縮され、コストも大幅に削減され、遺伝子検出法は革命的な変化を遂げ、その技術が大規模、産業化された方向に向けて発展している。ハイスループットシーケンシング全体的なコストは大幅に削減されたが、高深度全ゲノムシーケンスコスト及び大規模なシーケンスデータを解読する複雑さは、研究者がやはり難しいと感じる。ターゲットシーケンシング技術の出現は、上記の困難をある程度緩和した。ターゲットシーケンシングは、興味のある遺伝子領域を濃縮やシーケンシングする研究戦略である。ターゲット領域シーケンシングの主な利点は、特定領域に対しシーケンシングを行うことができ、シーケンシングコストを効果的に削減し、シーケンシング深度を深め、特定領域の遺伝的変異情報をより経済的かつ効率的に研究できる。
【０００３】
現在、ターゲット領域の濃縮を実現するのは、主に：ハイブリッドキャプチャー技術、マルチプレックスＰＣＲ技術及び分子反転プローブ技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ，ＭＩＰ）の３つの方法がある。ハイブリッドキャプチャー技術：まず物理方法又は酵素切断法によってゲノムＤＮＡが断片化され、ＰＣＲ増幅のため、両端にアダプターが接続される。次に、ビオチン標識プローブとハイブリダイズし、ハイブリダイズされていないＤＮＡは磁気ビーズでキャプチャーされずに洗い流される。最後に、濃縮されたＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅、シーケンシングにかける。ハイブリッドキャプチャーの特徴は、優れたスケーラビリティとエクソームまたはさらに大きなサイズのターゲット領域をキャプチャーできるが、欠点は操作手順が複雑で、周期が長く、コストが高く、比較的多い特別機器が必要になる。
【０００４】
マルチプレックスＰＣＲ増幅技術は、標的配列に基づいて特異的なプライマーを設計し、多重増幅を通じて對標的配列を濃縮する。マルチプレックスＰＣＲ技術の操作が簡単で、運用が柔軟で、安価で、分析が簡単で、機器への要求も最小限で、標的配列の濃縮及びライブラリー構築を数時間で完了できる。超深度シーケンシングを利用すると、アンプリコンシーケンシングは、複雑なサンプルの超低周波数の変異を検出することができ、癌などの疾患の臨床研究に特に適している。その欠点は、比較的小さな標的配列のキャプチャーに適しているだけであり、増幅阻害、プライマーの交差増幅、深刻なプライマー二量体などの問題を解決する必要がある。
【０００５】
分子反転プローブ技術は、新型マルチ標的配列決定方法であり、この方法には簡単な操作手順、少量のサンプル、低コスト、高精度などの利点がある。ただし、ハイスループットシーケンシング分野における分子反転プローブの運用は未熟であり、ハイブリダイゼーション時間が長く、エラー率が高く、操作ステップが複雑であるという欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、改善された分子反転プローブ技術を利用して、簡単、迅速、高効率かつ正確なターゲット領域の濃縮方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は、プローブを提供しており、前記プローブは５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、マスク配列２、伸長アームの順であり、前記ＵＩＤ配列１が３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする。
【０００８】
本発明の別の態様では、プローブを提供しており、前記プローブは５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり、前記ＵＩＤ配列２が３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の別の態様では、プローブも提供しており、前記プローブは５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり；前記ＵＩＤ配列１及びＵＩＤ配列２は、いずれも３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の別の態様では、上記プローブをベースにして、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列とＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列との間に、１〜３個のデオキシウラシル塩基であるｄＵ領域が存在するプローブをさらに提供する。
【００１１】
さらに、前記リンカーアームは、核酸テンプレートと相補的に結合する１５−４５ｂｐの塩基配列であり；
前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補又は逆相補配列の任意の組み合わせであり；
伸長アームは、核酸テンプレートと相補的に結合する１５−４５ｂｐの塩基配列である。
【００１２】
さらに、前記伸長アームが修飾され；好ましくは、ホスホロチオエート修飾が行われ；より好ましくは、リンカーアームのＴｍ値は、伸長アームのＴｍ値より２℃以上高く；
代替的に、前記リンカーアームの５’末端は、リン酸化修飾が行われ；
代替的に、前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用ライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補配列の任意の組み合わせから選択される。
【００１３】
本発明の別の態様では、前記プローブを使用し、ハイスループットシーケンシングに適用されるターゲット領域の濃縮方法も提供し、
テンプレートＤＮＡは、前記プローブとハイブリダイズ、伸長、ライゲーションして第１の産物を得るハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップと、
過剰プローブ及びテンプレートＤＮＡを酵素で切断して消化し、タグ付きプライマーを使ってＰＣＲ増幅して第２の産物を得る第２の産物取得ステップと、
第２の産物を精製してライブラリーを得る精製ステップと
ライブラリーをシーケンサーにロードしてシーケンシングするステップと、
を含む。
【００１４】
さらに、前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップ：テンプレートＤＮＡと前記プローブは、先にハイブリダイズしてからポリメラーゼ、リガーゼを加えて伸長、ライゲーションさせて第１の産物を得；
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水                                                ６μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ                    ２μＬ；
３I１０−３μＭの前記プローブ                          １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                １μＬ；
プロセスは、９５℃で５分間変性させ、６０℃で２時間インキュベーションすることであり；その後、上記反応系に以下の試薬を加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは６０℃で１時間インキュベーションすることであり；
精製水                                            １．４μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                      １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ    １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ              ０．５μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋                                  ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  
ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                      １μＬ；
又はテンプレートがＲＮＡの場合、
ヌクレアーゼフリー水                                ５．５μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＲＮＡ                      ２μＬ；
３I１０−３μＭの前記プローブ                            １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                      ０．５μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                  １μＬ；
７０℃で２分間変性させ、６５℃で２時間インキュベーションした後、以下の試薬を加え、４２℃で１時間反応させて伸長、ライゲーション反応を行い；
１ｍＭのｄＮＴＰｓ                                      １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ    １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                  １μＬ；
５０ｍＭのＮＡＤ＋                                  ０．１μＬ；
５I  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ            ４μＬ；
１００ｍＭのＤＴＴ                                      ２μＬ；
ＳＭＡＲＴ  ＭＭＬＶ  ＲＴ                              １μＬ；
又は、テンプレートＤＮＡ、前記プローブ、ポリメラーゼ及びリガーゼを同時に添加し、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーションを同時に行って第１の産物を得；
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水                                                ３．４μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ                        ２μＬ；
３I１０−３μＭの前記プローブ                              １μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                        １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ      １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                    １μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋                                      ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．５μＬ；
反応プロセスは、９５℃５分間、６０℃３時間である。
【００１５】
さらに、前記第２の産物取得ステップは、先に過剰プローブ及びテンプレートＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化し、次に第１の産物をＵＳＥＲ酵素で線形化してからタグ付きプライマーによってＰＣＲ増幅して、第２の産物を得；
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                            ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                        ０．５μＬ；
３７℃で４０分間インキュベーションし、９５℃で５分間インキュベーションし；
さらに以下の試薬を加え：
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ          ５０μＬ；
精製水                                                  ２９μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                          ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                          ２μＬ；
ＵＳＥＲ酵素                                              １μＬ；
インキュベーション３７℃１５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温し；
又はエキソヌクレアーゼ、タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーを同時に添加し、酵素切断・消化、線形化及びＰＣＲ増幅を同時に行って第２の産物を得；
前記タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーの３’末端にホスホロチオエートを修飾し、５’末端にホスホロチオエート、アミノ或いはスペンサーアームを修飾することで、エキソヌクレアーゼによって切断されることを防止し；
好ましくは、テンプレートがＤＮＡの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物                                              １８μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌａｍｂｄａ                  ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                            １μＬ；
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ          ５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                              ２９．５μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                          ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                          ２μＬ；
反応プロセスは、インキュベーション３７℃４０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温することであり；
又はテンプレートがＲＮＡの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物                                          １０．１μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                                １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ａ                                        ０．１μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｈ                                        ０．１μＬ；
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ          ５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                              ２４．８μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                          ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                          ２μＬ；
インキュベーション３７℃６０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング６０℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２７サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温する。
【００１６】
さらに、前記タグ付きプライマー内の上流プライマー構造は、５’末端から開始し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、ｉｎｄｅｘ配列領域及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列に逆相補的なペア全長配列領域であり；
タグ付きプライマー内の下流プライマー構造は、５’末端から開始し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、ｉｎｄｅｘ配列領域及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２全長配列領域である。
【００１７】
その実施過程は、具体的に次の部分が含まれる。
【００１８】
１．プローブと核酸サンプルのハイブリダイゼーション
プローブと核酸サンプルのハイブリダイゼーションは、プローブの伸長アーム及びリンカーアームが一本鎖核酸サンプルの標的領域と相補的なペア配列を持っていることを意味し、適切なハイブリダイゼーション体系及び温度の下でハイブリダイゼーションが行われる。核酸サンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡであり、ＤＮＡとｃＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの混合物であり得る。図１では、改善されたＭＩＰプローブ構造の１つを示す。プローブの由来は、様々な合成方法であるか、合成後に分子生物学的手法によって改造することができる。プローブは、次の８つの部分の構造で構成され、すなわち、１）核酸テンプレートに相補的に結合する可変長リンカーアーム（１５〜４５  ｎｔ）；２）リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基で、マスクとして機能し；３）１〜２個のＵＩＤ（Ｕｎｉｑｕｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列で、前記ＵＩＤ配列は、３〜１２個のランダムな塩基で構成され、オリジナルテンプレートの標識配列を区別するために用いられ；４）Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームシーケンシングの標識配列１（Ｔａｇ１，Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔｓ内のＮｅｘｔｅｒａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  Ａｄａｐｔｅｒｓ  Ｒｅａｄ  ２の１つの配列セグメントの逆相補配列５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＣ−３’）に用いられ、前記配列３’末端は０〜１６個の塩基を減らすことができ；５）０〜３個のデオキシウラシル（ｄＵ）塩基；６）Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームシーケンシングの標識配列２（Ｔａｇ２，Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ試薬キット５末端のアダプター上の１つの配列セグメント５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’）に用いられ、前記配列５’末端は０〜１９個の塩基を減らすことができ；ここで、シーケンシングに用いられる２つの標識配列１と２は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補配列の任意の組み合わせであってもよい。７）伸長アームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない１〜３個のランダムな塩基で、マスクとして機能し；８）核酸テンプレートと相補的に結合する可変長伸長アーム（１５〜４５  ｎｔ）。伸長アームには、ホスホロチオエート修飾又はその他の修飾が可能であり；プローブの合成時、リンカーアームの５’末端にリン酸化を修飾し、合成時リン酸化修飾を行わず、リン酸化反応を通じてプローブの５’末端にリン酸化を修飾するよう選択できる）。
【００１９】
２．伸長、リガーゼ連結反応
プローブの伸長アーム及びリンカーアームが標的領域に固定された後、ＤＮＡポリメラーゼの重合機能を利用して、伸長アームの３’末端からリンカーアームの５’末端まで伸長する。忠実度の高いＤＮＡポリメラーゼが好ましい。テンプレートがＲＮＡの場合、逆転写酵素で伸長される。次に、リガーゼによりニックを連結して環状産物を得る。当然、ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応は１つのステップで同時に実施することもできる。
【００２０】
３．エキソヌクレアーゼによる線形プローブ及び核酸の消化
後続のＰＣＲ増幅に対する核酸サンプル及び過剰プローブの影響を排除するため、一本鎖エキソヌクレアーゼ及び二本鎖エキソヌクレアーゼでプローブ及び一本鎖・二本鎖核酸サンプルを消化し、環状産物のみを残す。エキソヌクレアーゼは、単一の酵素でも複数の酵素の混合物でもよい。
【００２１】
４．環状産物の線形化、ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅効率を高めるため、ＵＳＥＲ酵素で環状産物を線状に切断してからプローブ構造内のシーケンシング標識配列と同じ又は相補的な構造を含有する上流・下流プライマー（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（ホスホロチオエート修飾を経ていないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（ホスホロチオエート修飾を経ていないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）によりライブラリー増幅を行う。下線部分は、ｉｎｄｅｘ配列で、混合ライブラリーのシーケンシング時に異なるライブラリーの標識を区別するために用いられ、その配列が変更できる。
【００２２】
当然、エキソヌクレアーゼとＰＣＲ試薬（ＵＳＥＲ酵素を含まない）を混合し、先に酵素切断反応を実施してからホスホロチオエート修飾を行った上流・下流プライマーによりライブラリー増幅を行うこともできる。
【００２３】
５．ライブラリーの精製
ライブラリーから酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、イオン、プライマー及びプライマー二量体などの不純物を除去するため、Ｂｅｃｋｍａｎ社製のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズでライブラリーを精製し、電気泳動後の切り出したゲル回収又はカラム精製などの他の方法で精製してもよい。
【００２４】
６．ハイスループットシーケンシング
調製されたライブラリーは、濃度、フラグメントの品質管理に合格した後、ハイスループットシーケンサーでシーケンシングする。本発明に係るライブラリーシーケンシング方法は、可逆終止法を含むが、これに限定されず、他のシーケンシングプラットフォームであってもよい。シーケンシングタイプは、シングルエンドシーケンシング又はダブルエンドシーケンシングにできる。本発明の実施形態では、前記シーケンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａであり、シーケンシングタイプがダブルエンドシーケンシングである。
【発明の効果】
【００２５】
従来のＭＩＰ方法に比べると、本発は、次の有利な効果を奏する。
【００２６】
１．本発明は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑアダプター上の配列をプローブのバックボーン配列として使用し、シーケンシング時にシーケンシングプライマーを別途添加する必要がないため、実験プロセスが簡素化される。
【００２７】
２．本発明は、ＰＣＲタグ付きプライマーを修飾し、酵素切断試薬及びＰＣＲ試薬を反応管に同時に加えることができため、操作ステップを減らす。
【００２８】
３．本発明は、ＲＮＡをテンプレートとして使用してターゲット領域を直接キャプシャーすることができ、先に逆転写を行う必要がないため、実験プロセスが簡素化される。
【００２９】
４．本発明は、ＵＩＤ構造を導入することにより、ＰＣＲ増幅で得られた反復配列を除去し、エラー率を著しく低下させ、サンプルの真の突然変異頻度を復元する。プローブ構造内にｄＵ塩基を導入し、ＵＳＥＲ酵素により環状テンプレートを線形化してＰＣＲ増幅効率を高めて、ＰＣＲ増幅エラーを低減する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１はプローブ構造を示すための図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に、本発明の実施例を詳細に説明し、前記実施例は添付図面に例示され、ここで、同一又は類似の符号は、同一又は類似の要素或いは同一又は類似の機能を有する要素を表す。以下、図面に描写される実施例は例示的なものであり、本発明を説明することを意図しているが、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。具体的技術又は条件が実施例内に明記されていない場合、この分野内の文献に記載される技術又は条件、或いは製品の説明書に基づいて実施する。使用する試薬又は機器がメーカーを明記していない場合は、均しく市場から購入できる従来の製品である。
【００３２】
以下のプライマー及びプローブは、いずれも生工生物工程（上海）股▲ふん▼有限公司によって合成された。
【００３３】
本実施例で使用されるＨＣＴ１５細胞は、普諾賽生物、上海研域生物工程有限公司などのバイオ企業から購入し、その後従来のＤＮＡ抽出方法によってそのＤＮＡを抽出することができる。
【００３４】
ＮＣＩ−Ｈ３１２２細胞系は、上海澤葉生物科技有限公司、上海継和生物科技有限公司などの企業から購入し、その後従来のＲＮＡ抽出方法によってそのＲＮＡを抽出することができる。
【００３５】
以下に、図１のプローブ構造を参照しつつ実施例内のプローブ構造を説明する。
【００３６】
［実施例１］
改善されたＭＩＰプローブライブラリーによるターゲット領域の濃縮
本実施例では、ヒト乳癌感受性遺伝子（ＢＲＣＡ）を標的とする４つのプローブが使用された。実験は、２群に分けられ、実験群１がｄＵ構造を含まないプローブであり、実験群２がｄＵ構造を含むプローブであり、その他の構造及び配列が同じである。
【００３７】
注：Ｂは、Ｇ、Ｔ又はＣを表し；Ｄは、Ｇ、Ａ又はＴを表し；Ｈは、Ａ、Ｔ又はＣを表し；Ｖは、Ｇ、Ａ又はＣを表し；Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧを表し；５Ｐｈｏｓは、リン酸化修飾を表し；−ｓ−は、２個の塩基間にホスホロチオエートを修飾することを表す。
【００３８】
実験群１のプローブ配列は、次の通りである。
【００３９】
【化１】
2020536525.tif 000003
【００４０】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、波線の下線が伸長アームである。
【００４１】
【化２】
2020536525.tif 000004
【００４２】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＶＶがマスク配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００４３】
【化３】
2020536525.tif 000005
【００４４】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＶＢＤがマスク配列１、ＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮがＵＩＤ配列２、ＢＤＢがマスク配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００４５】
【化４】
2020536525.tif 000006
【００４６】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、Ｂがマスク配列１、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列２、Ｈがマスク配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００４７】
実験群２プローブ配列は、次の通りである。
【００４８】
【化５】
2020536525.tif 000007
【００４９】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、ｄＵがデオキシウラシル、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、波線の下線が伸長アームである。
【００５０】
【化６】
2020536525.tif 000008
【００５１】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＶＶがマスク配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、ｄＵがデオキシウラシル、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００５２】
【化７】
2020536525.tif 000009
【００５３】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＶＢＤがマスク配列１、ＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、ｄＵがデオキシウラシル、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮがＵＩＤ配列２、ＢＤＢがマスク配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００５４】
【化８】
2020536525.tif 000010
【００５５】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、Ｂがマスク配列１、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、ｄＵがデオキシウラシル、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列２、ＤＢＨがマスク配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応系は、次の通りであり、
精製水                                                      ６μＬ；
５０ｎｇ／μＬのＨＣＴ１５細胞系ＤＮＡ                      ２μＬ；
３I１０−３μＭ  Ｐ０１−０４又はＰ０５−０８プローブの等量混合合物
１μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ。
【００５７】
プロセスは、９５℃で５分間変性させ、６０℃で２時間インキュベーションすることであり；その後、上記ハイブリダイズ産物に以下の試薬を加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは６０℃で１時間インキュベーションすることであり；
精製水                                                  １．４μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  （ＮＥＢ）                              １μＬ；
５  Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
０．５μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋（ＮＥＢ）                            ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）                １μＬ。
【００５８】
過剰プローブ及びＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化する。さらに上記産物に以下の試薬を加え、
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  （ＮＥＢ）                ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（ＮＥＢ）              ０．５μＬ。
【００５９】
３７℃で４０分間インキュベーションし、９５℃で５分間インキュベーションした。
【００６０】
ｄＵ構造含有群の環状産物を線状の一本鎖に切断するため、ＰＣＲ反応内にＵＳＥＲ酵素を加えた。すなわち、さらに上記産物に以下の試薬を加えた。
【００６１】
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
５０μＬ；
精製水                                                  ２９μＬ；
２０μＭのタグ１付きプライマー                            ２μＬ；
２０μＭのタグ２付きプライマー                            ２μＬ；
ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）                                    １μＬ。
【００６２】
【化９】
2020536525.tif 000011
【００６３】
ここで、波線で下線が引かれた配列がＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ試薬キットの５末端アダプター上の１つの配列セグメントであり、本発明のプローブ構造内のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２はこの配列セグメントの５’末端から０〜１９個の塩基を減少することである。二重下線は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列であるため、変更できない。下線部分は、均しくｉｎｄｅｘ配列であり、配列が変更できる。点線で下線が引かれたＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  Ａｄａｐｔｅｒｓ  Ｒｅａｄ  ２の１つの配列セグメントは、本発明のプローブ構造内のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１と逆相補ペアである。
【００６４】
タグ付きプライマー配列は、環状産物のＰＣＲ増幅に用いられ、Ｔａｇ１、２配列をＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製キットの他のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその他の組み合わせで置き換えた場合、下線及び波線・点線が引かれた位置の配列を適宜変更する必要がある。
【００６５】
インキュベーション３７℃１５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温した。
【００６６】
増幅終了後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズでライブラリーを精製した。次にライブラリーの品質管理を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにロードしてシーケンシングした。
【００６７】
【表１】
2020536525.tif 000012
【００６８】
表１から、ｄＵ構造含有プローブのテンプレート回収率は、ｄＵ構造非含有プローブに比べると、ほとんど変わらないが、ライブラリーの収率を大幅に向上できることが分かる。
【００６９】
［実施例２］
リンカーアーム、伸長アームの融解温度（Ｔｍ）値を最適化するＭＩＰプローブライブラリーによるターゲット領域の濃縮
プローブ配列は、次の通りである。
【００７０】
Ｐ０９：
Ｐ５に基づいて、その３’末端の最後の３つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
【００７１】
Ｐ１０：
Ｐ６に基づいて、その３’末端の最後の３つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
【００７２】
Ｐ１１：
Ｐ７に基づいて、その３’末端の最後の３つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
【００７３】
Ｐ１２：
Ｐ８に基づいて、その３’末端の最後の３つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
【００７４】
ＰＣＲプライマー配列は、実施例１と同じであり、すなわち、タグ１付きプライマー配列は実施例１内のタグ１付きプライマー配列と同じであり；ここでのタグ２付きプライマー配列は、実施例１内のタグ２付きプライマー配列と同じである。
【００７５】
本実施例では、プローブの設計時リンカーアームのＴｍ値は、伸長アームより２℃以上高く、伸長アームにホスホロチオエート修飾が行われた。実験は２群に分けられ、対照群がＰ０５〜Ｐ０８プローブを用い、最適化群が最適化後のＰ０９〜Ｐ１２プローブを用い、具体的なステップは次の通りである。
【００７６】
１．ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応を表３に示す。
【００７７】
【表２】
2020536525.tif 000013
【００７８】
反応プロセスは、９５℃５分間、６０℃３時間であった。
【００７９】
２．上記反応系に以下の試薬をさらに加えて酵素切断反応を行い、反応プロセスは、３７℃で４０分間インキュベーションし、９５℃で５分間インキュベーションすることであった。
【００８０】
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  I（ＮＥＢ）                                ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  III（ＮＥＢ）                                ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌａｍｂｄａ（ＮＥＢ）                        ０．５μＬ；
３．上記反応系に以下の試薬を加えて産物の線形化及びＰＣＲ増幅を行った。
【００８１】
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）        ５０μＬ；
精製水                                                        ３４μＬ；
２０μＭのタグ１付きプライマー                          ２μＬ；
２０μＭのタグ２付きプライマー                        ２μＬ；
ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）                                          １μＬ。
【００８２】
ここでのタグ１付きプライマー配列は、実施例１内のタグ１付きプライマー配列と同じであり；ここでのタグ２付きプライマー配列は、実施例１内のタグ２付きプライマー配列と同じである。
【００８３】
反応プロセス：インキュベーション３７℃１５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温した。
【００８４】
４．増幅終了後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズでライブラリーを精製した。次に、ライブラリーの品質管理を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにロードしてシーケンシングした。分析結果を表４に示す。
【００８５】
【表３】
2020536525.tif 000014
【００８６】
表４から、本実施例の方法を用いると、最適化群のライブラリー収率及びテンプレート回収率は、対照群より著しく高いことが分かる。
【００８７】
［実施例３］
改善されたプロセスのＭＩＰスキームによるターゲット領域の濃縮
本実施例では、最適化プロセスは、酵素切断試薬、ＰＣＲ試薬を反応管に同時に加えた。ハイブリダイゼーション反応系は、次の通りである。
【００８８】
精製水                                                  ６μＬ；
５０ｎｇ／μＬのＨＣＴ１５細胞系ＤＮＡ                  ２μＬ；
３I１０−３μＭ  Ｐ０５−０８プローブの等量混合物        １μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ。
【００８９】
プロセスは、９５℃で５分間変性させ、６０℃で２時間インキュベーションした。その後、上記ハイブリダイズ産物に以下の試薬をさらに加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは６０℃で１時間インキュベーションした。
【００９０】
精製水                                                １．４μＬ
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  （ＮＥＢ）                          １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）        
０．５μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋（ＮＥＢ）                          ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）                        １μＬ。
【００９１】
過剰プローブ及びＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化してからＰＣＲ増幅を行った。上記産物に以下の試薬を加えた。反応プロセスは、インキュベーション３７℃４０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温した。
【００９２】
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌａｍｂｄａ                  ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                            １μＬ；
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                              ２９．５μＬ；
２０μＭのタグ３付きプライマー                            ２μＬ；
２０μＭタグ４付きプライマー                              ２μＬ。
【００９３】
【化１０】
2020536525.tif 000015
【００９４】
タグ３付きプライマー配列は、タグ１付きプライマーに基づいて５’末端にホスホロチオエート修飾が行われ、タグ４付きプライマー配列はタグ２付きプライマーに基づいて５’末端にホスホロチオエート修飾が行われた。
【００９５】
増幅終了後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズでライブラリーを精製した。次に、ライブラリーの品質管理を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにロードしてシーケンシングした。ライブラリー収率は、５８．５ｎｇ、テンプレート回収率は２２．４％であり、酵素切断試薬とＰＣＲ試薬の混合スキームが実現可能であり、操作プロセスが簡素化されていることが分かる。
【００９６】
［実施例４］
改善されたプロセスのＭＩＰスキームでＲＮＡテンプレートに対しターゲット領域を濃縮
本実施例のプローブ配列は、次の通りである。
【００９７】
【化１１】
2020536525.tif 000016
【００９８】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＨＶＤがマスク配列１、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、ｄＵがデオキシウラシル、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列２、ＨＨＨがマスク配列２、波線の下線が伸長アームである。
【００９９】
【化１２】
2020536525.tif 000017
【０１００】
ここで、５’末端から開始し、下線は、リンカーアーム、ＨＶＤがマスク配列１、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列１、二重下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１、ｄＵがデオキシウラシル、点線の下線がＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２、ＮＮＮＮＮがＵＩＤ配列２、ＢＢＢがマスク配列２、波線の下線が伸長アームである。
【０１０１】
本実施例では、ヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ（−棘皮動物微小管結合タンパク質様４−未分化リンパ腫キナーゼ）融合遺伝子を標的とする２つのプローブを使用した。ハイブリダイゼーション反応条件は次の通りである。
【０１０２】
ヌクレアーゼフリー水（ＮＥＢ）                          ５．５μＬ；
５０ｎｇ／μＬのＨ３１２２細胞系ＲＮＡ                      ２μＬ；
３I１０−３μＭ  Ｐ１３−１４プローブの等量混合物            １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴａＫａＲａ）          ０．５μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ。
【０１０３】
プロセスは、７０℃で２分間変性させ、６５℃で２時間インキュベーションした。その後、上記ハイブリダイズ産物に以下の試薬を加え、反応プロセス：４２℃で１時間伸長、ライゲーション反応を行った。
【０１０４】
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  （ＮＥＢ）                            １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ；
１０IＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）
１μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋（ＮＥＢ）                          ０．１μＬ；
５I  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）
４μＬ；
１００ｍＭ  ＤＴＴ（ＴａＫａＲａ）                        ２μＬ；
ＳＭＡＲＴ  ＭＭＬＶ  ＲＴ（ＴａＫａＲａ）                １μＬ。
【０１０５】
過剰プローブ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖上のＲＮＡをエキソヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼで消化してからＰＣＲ増幅を行った。
【０１０６】
上記産物に以下の試薬を加えた。反応プロセスは、インキュベーション３７℃６０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング６０℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２７サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温した。
【０１０７】
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                                １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ａ                                        ０．１μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｈ                                        ０．１μＬ；
２I  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                                ２４．８μＬ；
２０μＭのタグ１付きプライマー                            ２μＬ；
２０μＭのタグ２付きプライマー                            ２μＬ。
【０１０８】
ここでのタグ１付きプライマー配列は、実施例１内のタグ１付きプライマー配列と同じであり；ここでのタグ２付きプライマー配列は、実施例１内のタグ２付きプライマー配列と同じである。
【０１０９】
増幅終了後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズでライブラリーを精製した。次に、ライブラリーの品質管理を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにロードしてシーケンシングした。結果を表５に示す。
【０１１０】
【表４】
2020536525.tif 000018
【０１１１】
実験群１〜３は、３つの反復であった。表５から、ライブラリーシーケンシング結果のマッピング率は９５％以上で、カバレッジが１００％であり、改善されたプロセスＭＩＰスキームがテンプレートとしてＲＮＡを使用してターゲット領域を濃縮することができることを示している。
【０１１２】
以上の実施例は、本発明の技術的手段を説明するためにのみ使用され、限定するものではない。本発明は好ましい実施例を参照しつつ詳細に説明されるが、当業者は本発明の技術的手段の精神及び範囲から逸脱することなく、技術的手段に対し修正又は均等範囲内の置換を行うことができ、それらはすべて本発明の特許請求の範囲に網羅されるべきであることを理解されたい。
【図１】
2020536525.tif 000019
【配列表】
2020536525000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月27日(2020.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、マスク配列２、伸長アームの順であり、前記ＵＩＤ配列１が３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
【請求項２】
５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり、前記ＵＩＤ配列２が３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
【請求項３】
５’末端からリンカーアーム、マスク配列１、ＵＩＤ配列１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列、ＵＩＤ配列２、マスク配列２、伸長アームの順であり；前記ＵＩＤ配列１及びＵＩＤ配列２は、いずれも３〜１２個のランダムな塩基で構成され；前記マスク配列１は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であり；前記マスク配列２は、０〜３個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない０〜３個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
【請求項４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列とＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列との間に、１〜３個のデオキシウラシル塩基であるｄＵ領域が存在することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記リンカーアームは、核酸テンプレートと相補的に結合する１５−４５ｂｐの塩基配列であり；
前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補又は逆相補配列の任意の組み合わせであり；
伸長アームは、核酸テンプレートと相補的に結合する１５−４５ｂｐの塩基配列である、
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
前記伸長アームが修飾され；
代替的に、前記リンカーアームの５’末端は、リン酸化修飾が行われ；
代替的に、前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用ライブラリー調製キット内のトランスポゾンＡｄａｐｔｅｒｓ、アダプター上の配列又はその相補配列或いは逆相補配列の任意の組み合わせから選択される、
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
前記伸長アームは、ホスホロチオエート修飾が行われることを特徴とする、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
前記リンカーアームのＴｍ値は、伸長アームのＴｍ値より２℃以上高いことを特徴とする、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブを使用することを特徴とする、ハイスループットシーケンシングに適用されるターゲット領域の濃縮方法。
【請求項１０】
テンプレートＤＮＡは、前記プローブとハイブリダイズ、伸長、ライゲーションして第１の産物を得るハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップと、
過剰プローブ及びテンプレートＤＮＡを酵素で切断して消化し、タグ付きプライマーを使ってＰＣＲ増幅して第２の産物を得る第２の産物取得ステップと、
第２の産物を精製してライブラリーを得る精製ステップと、
ライブラリーをシーケンサーにロードしてシーケンシングするステップと、
を含むことを特徴とする、請求項９に記載のハイスループットシーケンシングに適用されるターゲット領域の濃縮方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップ：テンプレートＤＮＡと請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブは、先にハイブリダイズしてからポリメラーゼ、リガーゼを加えて伸長、ライゲーションさせて第１の産物を得ることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーション反応の反応系及び反応プロセスは、テンプレートがＤＮＡの場合、
精製水                                                        ６μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ                            ２μＬ；
３×１０−３μＭの請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ    １μＬ；
１０×Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                        １μＬ；
プロセスは、９５℃で５分間変性させ、６０℃で２時間インキュベーションすることであり；その後、上記反応系に以下の試薬を加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは６０℃で１時間インキュベーションすることであり；
精製水                                                      １．４μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                              １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ            １μＬ；
１０×Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                      ０．５μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋                                          ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                                        １μＬ；
又はテンプレートがＲＮＡの場合、
ヌクレアーゼフリー水                                        ５．５μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＲＮＡ                              ２μＬ；
３×１０−３μＭの前記プローブ                                    １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                              ０．５μＬ；
１０×Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ；
７０℃で２分間変性させ、６５℃で２時間インキュベーションした後、
１ｍＭのｄＮＴＰｓ                                              １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ            １μＬ；
１０×Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ；
５０ｍＭのＮＡＤ＋                                          ０．１μＬ；
５×  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ                    ４μＬ；
１００ｍＭのＤＴＴ                                              ２μＬ；
ＳＭＡＲＴ  ＭＭＬＶ  ＲＴ                                      １μＬ；
上記の試薬を加え、４２℃で１時間反応させて伸長、ライゲーション反応を行うことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーション反応ステップは、テンプレートＤＮＡ、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ、ポリメラーゼ及びリガーゼを同時に添加し、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーションを同時に行って第１の産物を得ることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーション反応の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水                                                      ３．４μＬ；
５０ｎｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ                              ２μＬ；
３×１０−３μＭの前記プローブ                                    １μＬ；
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                              １μＬ；
５Ｕ／μＬ  Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ            １μＬ；
１０×Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １μＬ；
５０ｍＭ  ＮＡＤ＋                                          ０．１μＬ；
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．５μＬ；
反応プロセスは、９５℃５分間、６０℃３時間である、
ことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の産物取得ステップは、先に過剰プローブ及びテンプレートＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化し、次に第１の産物をＵＳＥＲ酵素で線形化してからタグ付きプライマーによってＰＣＲ増幅して、第２の産物を得ることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の産物を得る反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                              ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                          ０．５μＬ；
３７℃で４０分間インキュベーションし、９５℃で５分間インキュベーションし；
さらに以下の試薬を加え：
２×  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ            ５０μＬ；
精製水                                                    ２９μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                            ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                            ２μＬ；
ＵＳＥＲ酵素                                                １μＬ；
インキュベーション３７℃１５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の産物を得るステップは、エキソヌクレアーゼ、タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーを同時に添加し、酵素切断・消化、線形化及びＰＣＲ増幅を同時に行って第２の産物を得；
前記タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーの３’末端にホスホロチオエートを修飾し、５’末端にホスホロチオエート、アミノ或いはスペンサーアームを修飾することで、エキソヌクレアーゼによって切断されることを防止することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の産物を得る反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物                                                    １８μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌａｍｂｄａ                        ０．５μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ                                  １μＬ；
２×  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ                ５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                                    ２９．５μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                              ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                              ２μＬ；
反応プロセスは、インキュベーション３７℃４０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２６サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温することであり；
又はテンプレートがＲＮＡの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第１の産物                                                １０．１μＬ；
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ                                      １μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ａ                                              ０．１μＬ；
ＲＮａｓｅ  Ｈ                                              ０．１μＬ；
２×  ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ                ５０μＬ；
Ｈ２Ｏ                                                    ２４．８μＬ；
２０μＭのタグ付き上流プライマー                                ２μＬ；
２０μＭのタグ付き下流プライマー                                ２μＬ；
インキュベーション３７℃６０分間、インキュベーション９５℃５分間、予備変性９８℃３０秒間、変性９８℃１０秒間、アニーリング６０℃３０秒間、伸長７２℃３０秒間を１サイクルとして２７サイクルを行い；７２℃で２分間伸長し、４℃で保温する、
ことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タグ付きプライマー内の上流プライマー構造は、５’末端から開始し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、ｉｎｄｅｘ配列領域及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ１配列に逆相補的なペア全長配列領域であり；
タグ付きプライマー内の下流プライマー構造は、５’末端から開始し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、ｉｎｄｅｘ配列領域及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔａｇ２全長配列領域である、
ことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
2020536525.tif 000020
2020536525.tif 000021
2020536525.tif 000022
2020536525.tif 000023
2020536525.tif 000024
2020536525.tif 000025