(57)【要約】  化合物及び方法は、過度的な部分を消失させず、電位開口型ナトリウムチャネル電流の永続的な部分を少なくとも減少させる効果により、VGSC発現がんの転移挙動を減少させる又は防止するために開示される。
2020509082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんに罹患した患者において転移挙動及び/又は痛覚を減少させる又は防止する方法における使用のための、式I
【化１】
2020509082.tif 000010
[式中、R1が、トリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシである]
の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
R1が、トリフルオロメトキシである、請求項1に記載の使用のための化合物、すなわち、次式
【化２】
2020509082.tif 000011
の、式4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメトキシ)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オンの化合物。
【請求項３】
R1は、トリフルオロメチルである、請求項1に記載の使用のための化合物、すなわち、次式
【化３】
2020509082.tif 000012
の、式4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オンの化合物。
【請求項４】
がんが、血液がんである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
がんが、白血病又はリンパ腫である、請求項4に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
がんが、固形腫瘍がんである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
がんが、癌、中皮腫、肉腫、黒色腫、又は神経芽細胞腫である、請求項6に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
がんが、乳がんである、請求項6又は7に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
がんが、結腸がんである、請求項6又は7に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
がんが、前立腺がんである、請求項6又は7に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
がんが、非小細胞肺癌(NSCLC)である、請求項6又は7に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
がんが、胸膜がん(例えば、中皮腫)、子宮頚がん、卵巣がん、胃がん、又は神経芽細胞腫である、請求項6又は7に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
がんが、電位開口型ナトリウムチャネル(VGSC)発現がんである、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
がんが、3、4又は5期である、請求項1から13のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
がんが、VGSC発現がんでない、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
がんが、1又は2期である、請求項15に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
使用が、患者においてがんの転移挙動を減少させる方法におけるものである、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
使用が、患者においてがんの転移挙動を防止する方法におけるものである、請求項1から16のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
がん細胞を死滅させずに、VGSC発現がんにおける転移挙動を減少させる又は防止する方法における使用のための、請求項1から18のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
がん細胞の増殖に実質的に影響を与えずに、VGSC発現がんにおける転移挙動を減少させる又は防止する方法における使用のための、請求項1から19のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２１】
過度的な部分を消失させず、VGSC電流の永続的な部分を少なくとも減少させる効果により、VGSC発現がんにおいて、転移挙動を減少させる又は防止する方法における使用のための、請求項1から20のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２２】
転移挙動が、
(a)がん細胞の侵襲性を低下させること;
(b)場合によっては、低酸素下で、がん細胞の運動性を低減するが、正常酸素条件で、がん細胞の運動性を低減しないこと;
(c)場合によっては、正常酸素条件及び低酸素条件下で、少なくとも1種のVGSCのがん細胞発現を減少させること;
(d)がん細胞の接着性を増加させること;
(e)がん細胞が遊走する能力を低下させること;又は
(f)(a)及び(b)、(b)及び(c)、(a)及び(c)、(a)から(c)、又は(a)から(e)の組み合わせ
により減少する又は防止される、請求項1から21のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２３】
治療有効用量、場合によっては、1μmol〜10μmolの範囲に対応する投与量レベルで投与される、請求項1から22のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２４】
約1mg〜約30mgまでの投与量、場合によっては、約1mg〜約20mgまでの投与量で投与され、患者が、成人のヒトの患者、例えば、体重が、約50〜約150kgの範囲である成人のヒトの患者である、請求項1から23のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２５】
約3mg、約5mg、約6mg、約9mg、約10mg、約12mg、約15mg、又は約19mgの投与量で投与される、請求項24に記載の使用のための化合物。
【請求項２６】
1日1回、2日に1回、3日に1回、5日に1回、週1回、2週間に1回、又は月1回、例えば、1日1回投与される、請求項1から25のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２７】
少なくとも4週間、例えば、少なくとも8週間、例えば、少なくとも12週間、例えば、少なくとも24週間、例えば、少なくとも48週間、又はそれ以上の期間にわたって投与される、請求項26に記載の使用のための化合物。
【請求項２８】
化合物の1回限りの初回ブースト用量約10mg〜約100mgを投与する工程を含む、請求項26又は27に記載の使用のための化合物。
【請求項２９】
1回限りの初回ブースト用量約10mg〜約100mgで投与し、その後、少なくとも4週間の期間中に投与量約1mg〜約20mgを1日1回、例えば、1日投与量3mg又は6mgを投与する工程を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３０】
経口投与される、請求項1から29のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３１】
R1が、トリフルオロメチル若しくはトリフルオロメトキシである式Iの化合物、又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、患者に投与する工程を含む、がんに罹患している患者において、転移挙動及び/又は痛覚を減少させる又は防止する方法。
【請求項３２】
請求項1から30のいずれか一項に記載の特徴を更に備える、請求項31に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療に関し、特に、電位開口型ナトリウムチャネル(VGSC)を発現することが判明したすべてのがん、例えば、排他的でなく、乳がん、卵巣がん、結腸又は前立腺がん等の転移性がんの治療等に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移性疾患は、すべてのがん関連死の90%以上の原因となっている。転移性がんの進行、例えば、乳がん、結腸がん及び前立腺がん等は、一般に、次の5期を含むものとして考えられる。
1.発生、すなわち、正常な細胞のがん細胞への初期の形質転換;
2.増殖、すなわち、がん細胞の数を増加して、サイズを増加する原発腫瘍を形成;
3.がん細胞が、転移挙動の可能性がない状態から、がん細胞が転移挙動の可能性がある状態への、発生期又は増殖期中の、スイッチング;
4.原発腫瘍からのがん細胞の解離、その後、循環系に向かう同じ臓器内の組織の周囲の領域へのこれらの解離した細胞の移動;
5.転移、すなわち、これらの他の臓器中で2次腫瘍を創出するための、循環(血液又はリンパ)を通した、解離した細胞の他の臓器への移動。
【０００３】
細胞中で起こり、3期を超えた状態においてスイッチを引き起こす重要な変化は、機能性電位開口型ナトリウムチャネル(VGSC)の発現である。ヒトにおいて、9つの異なるVGSCαサブユニット又は「NaV」タンパク質(Nav1.1からNav1.9)があり、すべて、異なるタイプのがん細胞において発現されることが見出されている(Brackenbury、2012年;Rogerら、2015年)。乳がん及び結腸がんにおいて、これは、通常、Nav1.5チャネルであり、これが発現され、前立腺がんの場合では、これは、通常、Nav1.7チャネルである。VGSCは、新生児及び/又は成人型で発現しうる。乳がん及び結腸がんの場合では、これは、Nav1.5チャネル(nNav1.5)の新生児型であり、これが発現される。また、前立腺がんの場合では、これは、Nav1.7の新生児スプライス変異体であり、これが発現される(Dissら、2001年)。かかるチャネルの非存在下で、腫瘍細胞は、浸潤の可能性がなく、したがって、転移挙動の可能性がない。
【０００４】
場合によっては、発生期は、発端から、転移の可能性があるがん細胞の増殖を伴う。更に、血液がん、例えば、白血病等は、固有の転移性の特徴を有し、肝臓又は脾臓のような他の臓器に浸潤し、蓄積するおそれがある(Trendowski、2015年)。
【０００５】
これによって、機能性VGSCの発現を防止すること、発現されている機能性VGSCの活性を完全に遮断すること、又は細胞を死滅させることのうちの1つ又は複数により、転移を防止するための治療を見出すことを試みることが示唆されている。本発明は、異なる手法に関する。
【０００６】
電流は、VGSCを通して断続的に流れる、すなわち、この電流は、パルスで流れる。各パルスは、過度的な(又はピーク)部分を備え、続いて、遅延型電流又は永久電流として公知の、低レベルDC部分を備えることが公知である。後者は、増殖する腫瘍で生じることが周知の、低酸素により促進される。VGSC活性は、プロトン流出を促進する及び細胞周囲の空間を酸性化することにより、侵襲性を増加させる。VGSCはまた、痛覚を制御する。
【０００７】
エレクラジン(Eleclazine)、式Ia
【０００８】
【化１】
2020509082.tif 000003
【０００９】
の4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメトキシ)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オン及び式Ib
【００１０】
【化２】
2020509082.tif 000004
【００１１】
の4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オンはどちらも、心臓状態の治療のために公知である。そのそれぞれが、VGSC電流の過度的な及び永続的な部分の大きさに異なった影響を与えることが更に公知であり、この効果は、用量-依存方式である。これらの薬物の高用量は、VGSC電流を完全に遮断する。心臓組織においてVGSC電流を完全に遮断する効果を有する、これらの薬物又は任意の他の薬物の用量は、心臓が、その機能を実行するためにこれらの電流を要するため、患者に対して致命的であるはずである。式Ia及びIbの化合物は、永久ナトリウム電流(INaP)とも称される心臓の遅延ナトリウム電流(lNaL)の強力な及び選択的な阻害薬であり、ヒトにおけるQT延長症候群;詳細には、QT延長症候群3型(LQT3)を治療する上で有効であることが更に公知である(US2015/0038489A1を参照のこと)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】US2015/0038489A1
【特許文献２】US2017/0007617A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、
(i)乳がん及び結腸がんにおいて並びに前立腺がんにおいて、それぞれ、Nav1.5及びNav1.7電流の永続的な部分を抑制することによって、転移挙動を抑制する;
(ii)転移挙動を抑制するために、これらの電流の過度的な部分を抑制する必要はない;
(iii)下記に定義する式Iの化合物の適切な用量が、増殖を防止することなく又は腫瘍の細胞を破壊することなく、転移挙動を抑制する;及び
(iv)電流の永続的な部分に対する式Iの化合物の抑制効果は、先だって、増殖する腫瘍で生じ転移プロセスに決定的にプラスに寄与する状態である低酸素に曝露された細胞において高まるという知見に少なくとも一部で基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、第1の態様では、本発明は、がんに罹患した患者において転移挙動及び/又は痛覚を減少させる又は防止する方法における使用のための、式Iの化合物:
【００１５】
【化３】
2020509082.tif 000005
【００１６】
[式中、R1は、トリフルオロメトキシ又はトリフルオロメチルである]、又は薬学的に許容されるその塩に関する。一実施形態では、がんは、電位開口型ナトリウムチャネル(VGSC)-発現がんである。他の実施形態では、がんは、VGSC-発現がんでない。例えば、患者は、VGSC-発現及び/又は転移挙動のリスクを伴うがんに罹患するおそれがあるが、VGSC-発現及び/又は転移挙動は、まだ決定されていない。
【００１７】
本発明の一実施形態では、式Iの化合物中のR1は、トリフルオロメトキシであり、すなわち、式Iの化合物は、式Ia
【００１８】
【化４】
2020509082.tif 000006
【００１９】
のエレクラジン、4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメトキシ)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オンである。
【００２０】
本発明の他の実施形態では、式Iの化合物中のR1は、トリフルオロメチルであり、すなわち、式Iの化合物は、式Ib
【００２１】
【化５】
2020509082.tif 000007
【００２２】
の4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オンである。
【００２３】
本発明の一実施形態では、がんは、非固形腫瘍がんである。特定の一実施形態では、がんは、白血病である。特定の他の実施形態では、がんは、リンパ腫である。
【００２４】
本発明の一実施形態では、がんは、固形腫瘍がん、例えば、癌、中皮腫、肉腫、黒色腫又は神経芽細胞腫である。特定の実施形態では、がんは、乳がんである。特定の他の実施形態では、がんは、結腸がんである。特定の他の実施形態では、がんは、前立腺がんである。特定の他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん(NSCLC)である。特定の他の実施形態では、がんは、子宮頚がんである。特定の他の実施形態では、がんは、胃がんである。特定の他の実施形態では、がんは、神経芽細胞腫である。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、がんは、3、4、又は5期である。本発明の他の実施形態によれば、がんは、1又は2期である。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、転移挙動は、電位開口型ナトリウムチャネル(VGSC)発現がんに罹患した患者において、適切な投与量で、式I、すなわち、式Ia又はIbの化合物を投与することにより、がんを抑制する又は減少させる。
【００２７】
本発明の更なる実施形態によれば、転移挙動は、適切な投与量で、式Iの化合物を投与して、過度的な部分を遮断せずに、又は少なくとも完全に遮断せずに、VGSC電流の永続的な部分を抑制する又は減少させることにより、がんを抑制する又は減少させる。したがって、がんの転移は、致死的となるはずである薬物の用量を投与しなくてもよい方法で、抑制することができる又は減少させることができる。
【００２８】
下記に更に十分に説明される本発明の更なる実施形態によれば、式Iの化合物は、過度的な部分を遮断せずに又は完全に遮断せずに及び細胞死を直接的に引き起こさずに、VGSC電流の永続的な部分を抑制する投与量レベルで投与される。したがって、腫瘍又は転移は、がん細胞の死を引き起こさずに、抑制することができる。
【００２９】
最近の研究によって、細胞を死滅させることによりがんを治療することは、短期の利益となる一方、それにもかかわらず、がんは、再び現れ増殖すると言う意味で、少なくともいくつかの場合では、非生産的となりうるということが示唆されているため、転移挙動を、細胞死を引き起こさずに抑制する又は減少させることができるという事実は、有意な利点となりうる。したがって、本発明は、がん細胞を実際に死滅させることから生じうる潜在的な問題を伴わずに、転移挙動を抑制する又は防止する可能性を提供する。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、転移挙動は、
(a)がん細胞の侵襲性を低下させること;
(b)場合によっては、低酸素下で、がん細胞の運動性を低減するが、正常酸素条件で、がん細胞の運動性を低減しないこと;
(c)場合によっては、正常酸素条件及び低酸素条件下で、少なくとも1種のVGSCのがん細胞発現を減少させること;
(d)がん細胞の接着性を増加させること;
(e)がん細胞が遊走する能力を低下させること;又は
(f)(a)及び(b)、(b)及び(c)、(a)及び(c)、(a)から(c)、又は(a)から(e)の組み合わせ
により減少する又は防止される。
【００３１】
本化合物は、治療有効用量で、通常投与される。特定の投与量レジメンに関する実施形態は、下記により詳細に記載されている。特定の実施形態では、本化合物は、上記(a)から(f)のいずれか1つに従って、転移挙動の減少若しくは防止のために提供する、投与量又は投与量レジメンで投与される。
【００３２】
本発明の更なる実施形態によれば、式Iの化合物は、1μmol〜10μmolの範囲に対応する投与量レベルで用いられる。
【００３３】
本発明のこれらの及び他の態様及び実施形態は、添付図面及び実施例に記載される実験データに関連して、更に後述される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】腫瘍発生から2次腫瘍の形成(転移)までのがんの進行についての時間線を示す配置図である。
【図２】がんの開始及び進行から転移までの間に生じる細胞の過程を示す略図である。
【図３】VGSCによる電流を例示し、電流の過度的な及び永続的な部分を示し、また、正常酸素条件及び低酸素条件下での電流を示すスケッチである。
【図４】細胞の接着を単独に測定するための細胞接着測定装置を示す略図である。
【図５】細胞の側方への運動性を測定するために用いられる装置の略図である。図(a)は、細胞の半コンフルエント層を含有する細胞培養皿の上部から得られた平面図である;図(b)は、蒔かれた細胞の略側方断面図である;図(c)は、瘢痕が、細胞の層によって創出されている場合、時間t=0での蒔かれた細胞の平面図である及び図(d)は、細胞が移動し、創傷が部分的に閉じた後の遅い時間(t=24時間)での蒔かれた細胞の平面図である。
【図６】細胞の横方向の遊走を測定するために用いた装置の略側方断面図である。
【図７】細胞の侵襲性を測定するために用いた装置の略側方断面図である。
【図８】ヒト転移性乳がんMDA-MB-231細胞の単一の細胞接着に対する化学的に誘導された低酸素の濃度依存的な効果を示すグラフである。接着は、低酸素下で増加する(「解離陰圧」(DNP)が低下する)。
【図９】トリパンブルー-細胞の排除(すなわち、細胞生存率)アッセイの結果を示すグラフである。MDA-MB-231細胞は、20μMエレクラジン又は0.2%DMSO(負の溶媒対照)で48時間処理した。細胞生存率は、治療群及び対照群の場合ほぼ100%であり、エレクラジンが非毒性であったことを示した。
【図１０Ａ】MTT(増殖)アッセイの結果を示す図である。標準曲線。全細胞数(ウェル当たり)は、吸収度の読み込み(570nm)と共に直線的に増加する。背景の読み込み0.04(空のウェル)を、全データセットから減じた。
【図１０Ｂ】MTT(増殖)アッセイの結果を示す図である。正規化したデータは、低酸素及び正常酸素条件において48時間にわたってMDA-MB-231細胞の増殖を示す。エレクラジン及びラノラジンを、10μMの濃度で投与した。DMSO(0.2%)、TTX(10μM)及び培地は、陰性対照であった。2mM TEA(K+チャネル遮断薬)は、陽性対照として働いた。
【図１１】創傷治癒アッセイの結果を示す図である。低酸素性細胞の運動指数を、0.2%DMSO又は10μMエレクラジンで48時間処理した。エレクラジンは、すべての時点で側方への運動性を低下させた。
【図１２】in vitroで低酸素(O21%)下でのMDA MB-231細胞の浸潤に対する0.5μMエレクラジン及び20μMテトロドトキシン(TTX)の効果を示す図である。箱ヒゲ図は、対照と比較して、エレクラジン又はTTXによる処理後16hにわたって浸潤するMDA MB-231細胞の正規化された数を示す。細胞は、アッセイ開始の24h前にそれぞれの治療条件で、予めインキュベートされていた。4つの個別のインサートから得られた12カ所の視野を、各条件について評価し;***は、P<0.001)を示す。0.5μMエレクラジンは、侵襲性に影響を与えず;20μM TTXは低下する(陽性対照)。
【図１３】in vitroで低酸素(O21%)下でのMDA MB-231細胞の浸潤に対する1μMエレクラジン及び1μMラノラジンの効果を示す図である。箱ヒゲ図は、対照と比較してエレクラジン又はラノラジンによる処理後16hにわたって侵襲するMDA MB-231細胞の数を示す。細胞は、アッセイ開始の24h前にそれぞれの治療条件で、予めインキュベートされていた。中央値及び四分位範囲は、次の通りである。対照:175.0(113及び255);1μMエレクラジン131.5(100及び175)並びに1μMラノラジン106.3(181及び161)。各条件についての8つの個別のインサートから得られた12カ所の視野;***は、P<0.001を示し;Xは、P>0.05を示す。エレクラジン及びラノラジン(どちらも1μM)は、有意であるが、同様に侵襲性を抑制する。
【図１４】in vitroで低酸素(O21%)下でのMDA MB-231細胞の浸潤に対する5μMエレクラジン及び5μMラノラジンの効果を示す図である。箱ヒゲ図は、対照と比較してエレクラジン又はラノラジンによる処理後16hにわたって浸潤するMDA MB-231細胞の数を示す。細胞は、アッセイ開始の24h前にそれぞれの治療条件で、予めインキュベートされていた。各条件についての8つの個別のインサートから得られた12カ所の視野;***は、P<0.001を示し;Xは、P>0.05を示す。エレクラジン及びラノラジン(どちらも5μM)は、有意に侵襲性を抑制するが、エレクラジンの効果は、有意により大きかった。
【図１５】nNav1.5タンパク質発現のために染色されたMDA-MB-231細胞の補正された全細胞の蛍光(corrected total cell fluorescence)に対するエレクラジンの効果(10μM)を示す図である。エレクラジン処理によって、発現が低下する。
【図１６】正常酸素及び低酸素(O21%)下でのヒト白血病のFLG 29.1細胞系の侵襲性に対するエレクラジン、ラノラジン(どちらも5μM)及びTTX(0.1及び10μM)の効果を示す図である。全薬剤(陽性対照としてTTXを用いた)は、侵襲性を有意に抑制した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
転移挙動は、いくつかのステージを伴う、すなわち、
(a)腫瘍からの細胞の解離;
(b)周囲の組織への解離した細胞の移動;
(c)循環系に向かう周囲の組織を通した移動;及び
(d)循環系への移動(そこから、細胞は、最終的に出て、2次腫瘍を形成するおそれがある)
である。
【００３６】
したがって、これらのステージのうちのいずれか1つ又は複数において細胞の活性を抑制する又は減少させることは、少なくとも転移の減少に寄与する。これらの副ステージのそれぞれに対する薬物の効果は、以下で更に十分に説明される通り、実験の数によって決定される。すなわち、
(a)細胞の接着性に対する薬物の効果を試験する;
(b)細胞の側方への運動性に対する薬物の効果を試験する;
(c)細胞の横方向の遊走に対する薬物の効果を試験する;及び
(d)細胞の侵襲性、すなわち、細胞が細胞によって消費される培地を通して移動する能力に対する薬物の効果を試験する。
【００３７】
様々な投与量レベルにおいて式Iの化合物を投与することは、細胞の接着性を高める及び/又は細胞の側方への運動性、横方向の遊走及び侵襲性のうちの1つ又は複数を減少させることができる。
【００３８】
したがって、本発明の他の態様によれば、好ましくは、細胞死を直接的に引き起こさずに転移を抑制する又は減少させるために、転移性がん細胞においてVGSC電流の永続的な部分を抑制する又は減少させ、過度的な部分は影響されない又は部分的に減少するにすぎないようにするために適切な用量で用いられる又は用いることを目的とする化合物、組成物又は他の物質が提供される。
【００３９】
少なくともいくつかの態様又は形態で、本発明から流れる利点は、次のようなものが含まれる。
本発明によれば、乳がん、結腸がん及び前立腺がん(及びVGSCが、本明細書に記載した通り発現される又は発現するようになりうる他のがん)は、患者が、重篤な損害がなく、かかるがんと生きることができることもあるように、含むことができる。その結果、患者が、がん性細胞を破壊するために、化学療法又は放射線治療等による積極的な治療を行う必要は、避けることができる。患者が、乳がん、結腸がん若しくは前立腺がん又は他の転移性がんを有する疑いがある場合、式Iの化合物の適切な用量による即時の治療は、最終的な試験の結果を待ちながら、転移を抑制する又は防止するために行うことができる。これのみを達成するのに必要な投与量は、VGSC電流の永続的な部分を抑制するのに十分に高くなければならない。式Iの化合物の治療的に許容される用量は、これらの電流の永続的な部分の要求される抑制を達成し、過度的な部分は、実質的に影響を受けない。
【００４０】
図1に関して、時間線101は、腫瘍の発生、すなわち、がん性細胞の発生前の期102、期102の後、その間にがん細胞の発生が起こる期103及び期103の後、その間に増殖する腫瘍を形成するためにがん性細胞が増殖する期104における、3つの連続的な期の説明である。増殖期104は、発生期103が始まった後すぐに始まりうる。
【００４１】
多くのヒトがん細胞、例えば、乳がん、結腸がん及び前立腺がんのがん細胞等は、最初に、いかなる機能性VGSCをも含まないことがあること及びかかるチャネルが、腫瘍において発現される限り、腫瘍細胞は、浸潤性でないことが確立されている。しかしながら、かかる多くの腫瘍において、最初にはVGSCがない場合でも、いずれかの時点で機能性VGSCが発現される。これは、腫瘍が広がりうる状態への変化を誘発する。図1は、最初に、細胞が、いかなる機能性VGSCをも含有しないが、時間105におけるいずれかの時点で、機能性VGSCの発現が開始する状態を示す。これは、発生期103の開始後任意の期間に生じうる。
【００４２】
図1中の時間線106は、がんが、転移性になった場合、時間105後に起こる期を説明している。時間105後の最初の期107では、転移性細胞は、それ自体が腫瘍から解離する。その後、期108では、転移性細胞は、浸潤し、循環系、特に、脈管系及び/又はリンパ系に向かって同じ臓器中で周囲の組織によって移動する。期109において、転移性細胞は、循環系に入り、次いで、転移性細胞は、体内に他の臓器に運ばれるおそれもあり、そこで、転移性細胞は、2次腫瘍の形成を引き起こしうる。
【００４３】
上記の期は、図2において、絵画により表され、この中の参照番号200は、臓器の一部、例えば、乳房又は前立腺等を示す。乳房又は前立腺の健常な細胞201は、基底膜202において支持され、がん性腫瘍203を囲むように示され、これは、発生期103を経験し、増殖期104に入ることが想定される。
【００４４】
がん性腫瘍202のいくつかの細胞204は、腫瘍203から解離し、腫瘍203を含む臓器の隣接領域205に基底膜202の分解された領域202aを通し、この領域が、主に、コラーゲン繊維を含むことができるということを示す。腫瘍から解離するようになり、基底膜202を通過しているがん細胞206は、血管207に向かって領域205を通過することが示される。がん性細胞208は、血流209中に血管207の壁を通って遊走することが示される。
【００４５】
血流に既に入っている細胞210は、血流内で領域211に運ばれることを示し、細胞212は、他の臓器213、例えば、リンパ腺又は肝臓等に向かって血管207の壁を通って外向きに遊走し、この中で、これらは、二次腫瘍(図示せず)を形成しうるということが示される。
【００４６】
参照番号214は、休眠のがん性細胞を示し、これは、血管207の壁の中で又はその近傍で、単に定着している。
【００４７】
以下で更に十分に説明される通り、本発明は、記載される様々な期で起こるがん細胞の転移挙動のうちの1つ又は複数を防止する又は減少させるための治療又は手段を提供する。特に、本発明は、
(a)細胞が解離する可能性が低いように、腫瘍において細胞の接着性を高める;及び/又は
(b)細胞が、周囲の組織中で基底膜に及び基底膜を通って移動する可能性が低いため、解離するようになる細胞の運動性を低下させる;及び/又は
(c)循環系に向かってその組織を通って移動するその能力を低下させることにより、周囲の組織に入っている細胞の侵襲性を低下させる;及び/又は
(d)細胞が、それらの壁を介してその組織から循環器系に遊走する能力を低下させる
ための、治療又は手段を提供する。
【００４８】
その中で発現される機能性VGSCを有さないがん性細胞が、侵襲的に挙動しないことが、上記で説明されている。更に、電流が、パルスでVGSCを通り、そのそれぞれは、過度的な又はピーク部分を含み、その後、より低いレベルの永続的な又は遅延の部分を含むことは公知である。本発明の一態様によれば、上記転移挙動のうちの1つ又は複数は、電流の永続的な部分を抑制する又は減少させ、電流の永続的な部分を優先的に減少させる薬物を用いることが可能であるため、ピーク部分を除去しないことにより、抑制される又は減少する。
【００４９】
かかるいくつかの薬物は、例えば、不整脈又は狭心症等の心臓状態を治療するために知られている。心臓を治療する場合では、これは、心臓及びそのリズムの機能性を維持するために必須であるため、電流のピーク部分が除去されないことを保証することが不可欠である。したがって、本発明の一態様によれば、公知の薬物、例えば、ピーク部分を除去せずにVGSC電流の永続的な部分を抑制する又は減少させるために用いるために前述した、式Iの化合物等は、がん、特に、乳がん、結腸がん又は前立腺がんにおいて転移挙動を抑制する又は減少させるために用いられる。
【００５０】
VGSC電流の性質は、図3(a)に関して更に記載される。
【００５１】
図3(a)を参照して、実線として示される曲線301は、正常酸素条件下で機能性VGSCを通して流れる電流パルスを示し、水平軸は、時間であり、垂直軸は、電流の振幅又は大きさである。見てわかるように、この電流パルスは、ピーク又は過度的な部分302及び永続的な又は遅延の部分303を含む。図3(a)が、実験データから実際に得られた曲線よりも、図式によるスケッチであるため、これは、図中に図示されないが、実際には、永続的な部分303が持続する期間は、過度的な部分302の期間より非常に大きい。
【００５２】
チェーンドット線で描かれた曲線304は、低酸素条件下でのVGSC電流のパルスを示す。見てわかるように、低酸素条件下での電流のピーク部分305は、正常酸素条件下でピーク部分301より小さいが、低酸素条件下での永続的な部分306は、正常酸素条件下で永続的な部分303よりも大きい。がん性腫瘍中の細胞の多くが、血液循環系からの他のがん性細胞による、これらの部分単離により低酸素性であるため、低酸素及び正常酸素条件下でのこれらの曲線間の差は、関連する。
【００５３】
定義
「電位開口型ナトリウムチャネル」又は「VGSC」は、イオンチャネルを形成する完全な膜タンパク質の公知のクラスであり、細胞の原形質膜を通して、ナトリウムイオン(Na+)を導く。ヒトにおいて、異なる9つのVGSCαサブユニット又は「NaV」タンパク質(それぞれ、Nav1.1からNav1.9まで)をコードする、9つの遺伝子(SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、及びSCN11A)がある。本明細書で使用される場合、文脈によって矛盾しない限り、用語は、それだけには限らないが、(新生児又は成人の形態の)、Nav1.5(SCN5A)、Nav1.6(SCN8A)、及びNav1.7(SCN9A)(Fraserら、2005年;Djamgozら、2011年)を含めた、すべての公知のVGSCを意味しうる。或いは、Nav1.5は、本明細書中のNAV-1.5を意味しうる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、がんの「治療」には、それだけには限らないが、がんの転移挙動を減少させる、がんの転移挙動を防止する、痛覚を低下させる、又はその任意の組み合わせが含まれる。
【００５５】
「治療有効量」又は「治療有効用量」とは、がんに罹患した患者に投与した場合、患者の治療、例えば、がんの転移挙動の減少、がんの転移挙動の防止、疼痛の減少等に対してポジティブな治療効果をもたらす式Iの化合物の量又は投与量を意味する。
【００５６】
がんの「転移挙動を減少させる」とは、他の臓器において2次腫瘍を蓄積する及び/又は創出する又は周囲の組織を局所的に浸潤するために、循環(血液又はリンパ)による、解離されたがん細胞の移動を伴う任意の行動の減少を意味する。通常、患者は、3、4又は5期、例えば、4又は5期である。転移挙動を減少させるは、例えば、(i)がん細胞の運動性を低減させること(例えば、側方への運動性の低減)、(ii)がん細胞の遊走(例えば、横方向の遊走)を減少させること、(iii)がん細胞の接着性を低下させること、(iv)がん細胞の侵襲性を低下させること、(v)過度的な部分を消失させず、VGSC電流の永続的な部分を減少させること及び(vi)対照と比較して、がん細胞において少なくとも1種のVGSCの発現を減少させることのうちの1つ又は複数を含むことができる。VGSCは、例えば、(成人型及び/又は新生児型における)Nav1.5、Nav1.6及びNav1.7のうちの1つ又は複数となりうる。本明細書中の他で説明される通り、「運動性」は、腫瘍細胞が、最初に、周囲の組織中で基底膜に移動する又は基底膜を通して移動する能力を示し;細胞の「侵襲性」は、周囲の組織に入って、循環系に向かってその組織を通して移動する腫瘍細胞の能力を示し;「遊走」は、腫瘍細胞が、それらの壁を介して循環器系中でその組織から遊走する能力を示す。
【００５７】
がんの「転移挙動を防止する」とは、前述したがんの転移挙動についてのリスクを防止する又は低下させるために、転移性疾患についてのリスクがあるが、転移性疾患であるとまだ診断されていないがん患者の予防的治療を意味することを目的とする。通常、患者は、1、2又は3期である。転移挙動の防止には、少なくとも1種のVGSC、例えば、Nav1.5(成人型及び/又は新生児型における)、Nav1.6及びNav1.7等のうちの1つ又は複数の発現を防止する又は減少させることを含むことができる。
【００５８】
血液がんは、固形腫瘍がんが行うやり方で転移を形成するものでなく、血液がん細胞が、他の臓器に浸潤し、蓄積しうる転移挙動を特徴とする。したがって、本開示において、「転移挙動を防止する」又は「転移挙動を減少させる」に関する任意の実施形態は、特に血液がんを考慮して、或いは、「浸潤性挙動を防止する」及び「浸潤性挙動を防止する」と表すことができる。
【００５９】
本実施例2に示す通り、乳がん細胞に関して試験した式Iによる化合物(エレクラジン)は、細胞生存率(20microM)に対して効果がなく;細胞の増殖活性(10microM)に対して効果がなく;低酸素下で側方への運動性が低下したが、正常酸素条件で側方への運動性が低下せず;臨床的に関連する濃度(<10microM;濃度-依存的)でMatrigelの浸潤性を有意に抑止し;少なくとも同じ濃度で、参照化合物(5microM)より有効と思われ;正常酸素条件及び低酸素条件(10microM)下で、新生児Nav1.5タンパク質の発現を減少させた。更に、実施例3に示される通り、式Iによる化合物(エレクラジン)は、ヒト白血病細胞系に対するエレクラジン及びラノラジンの抗-浸潤効果を有した。
【００６０】
化合物
本発明は、特に、がんの転移挙動を減少させる、がんの転移挙動を防止する及びがんにおける痛覚を低下させることにより、がんに罹患した患者においてがんを治療する方法における使用のための、R1が、トリフルオロメチル若しくはトリフルオロメトキシである式Iの化合物、又は薬学的に許容されるその塩に関する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、R1は、トリフルオロメチルであり、その化合物は、4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメトキシ)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オン(すなわち、エレクラジン)、又は薬学的に許容されるその塩である。いくつかの実施形態では、R1は、トリフルオロメチルであり、その化合物は、4-(ピリミジン-2-イルメチル)-7-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-3,4-ジヒドロベンゾ[f][1,4]オキサゼピン-5(2H)-オン、又は薬学的に許容されるその塩である。
【００６２】
別々の及び詳細な実施形態では、化合物は、がん細胞に対して細胞毒性はなく、がん細胞の増殖に実質的に影響を与えず、かつ/又は好ましくは、治療有効濃度で、すなわち、化合物が、がん細胞の1種又は複数の転移挙動を減少させる濃度で、過度的な部分を消失させず、電位開口型ナトリウムチャネル電流の永続的な部分を少なくとも減少させる効果を有する。すなわち、がん細胞自体は、VGSC機序によって引き起こされた組織の分解により、周囲の組織中へ増殖し広がらないように抑制される以外に、影響を受けない。増殖自体は、実質的に影響を受けない。
【００６３】
式I、例えば、式Ia及びIbによる化合物の適当な塩は、US2017/007617A1に記載されている。特に、かかる塩には、患者への投与に安全である並びに化合物の生物学的有効性及び特性を保存する薬学的に許容される塩が含まれる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩には、単なる例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、それだけには限らないが、第1級、第2級及び第3級アミンの塩が含まれる。適当なアミンの詳細な例には、単なる例として、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ(イソ-プロピル)アミン、トリ(n-プロピル)アミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N-アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、N-エチルピペリジン等が含まれる。
【００６４】
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製することができる。無機酸に由来する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が含まれる。有機酸に由来する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエン-スルホン酸、サリチル酸等が含まれる。
【００６５】
本発明の一実施形態によれば、式Iの化合物は、1種又は複数のVGSCにおいて選択的であり、例えば、NAV-1.1から1.9のうちの1、2、3、4、5、6、7、8又はすべてにおいて選択的である。いくつかの実施形態では、式Iの化合物は、少なくともNAV-1.5、NAV-1.6及びNAV-1.7において選択的である。本発明の一実施形態では、式Iの化合物は、成人型NAV-1.5と比較して、nNAV-1.5において選択的である。
【００６６】
治療への適用
適当な患者には、哺乳動物の患者、例えば、がんに罹患したヒト、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ブタ、マウス及びラットが含まれる。好ましくは、患者は、ヒトの患者、例えば、成人のヒトの患者である。通常、そのような成人のヒトの患者は、体重が約50〜約150kgの範囲、例えば、約60〜約100kg等、例えば、約70kg等となりうる。
【００６７】
通常、本発明による治療のために選択されるがんは、VGSC-発現がん又はVGSC発現、それによる転移挙動についての公知のリスクを伴うがんである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、がんは、血液がん、例えば、白血病又はリンパ腫等である。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍がん、例えば、癌、中皮腫、肉腫、又は黒色腫等である。特定の実施形態では、固形腫瘍がんは、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん;NSCLC)、胸膜がん(例えば、中皮腫)、子宮頚がん、卵巣がん、胃がん又は神経芽細胞腫である。詳細な一実施形態では、がんは、白血病である。詳細な他の実施形態では、がんは、乳がんである。
【００６９】
以下のTable 1(表1)は、いくつかの特定のがんの形態とそれらのVGSC発現との間で判明しているリンクを示す。
【００７０】
【表１】
2020509082.tif 000008
【００７１】
いくつかの実施形態では、患者は、VGSC-発現がんに罹患している。VGSC-発現がんは、がん細胞におけるVGSCの発現を検出するために、1種又は複数のVGSCに特異的な検出可能なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いた、例えば、免疫組織化学的又は患者から得られたがん細胞-含有サンプル(例えば、腫瘍生検又は血液サンプル)の分析により同定することができる。
【００７２】
VGSC-発現がんは、成人型又は新生児型において、Nav1.1からNav1.9のうちのいずれか1つ又は複数を発現しうる。一実施形態では、このがんは、成人型及び/又は新生児型において、Nav1.5、Nav1.6及びNav1.7のうち少なくとも1つを発現する。詳細な実施形態では、このがんは、成人型及び/又は新生児型においてNav1.5、例えば、新生児Nav1.5を発現する。詳細な他の実施形態では、このがんは、成人型又は新生児型、例えば、新生児型等においてNav1.6を発現する。他の実施形態では、このがんは、成人型又は新生児型、例えば、新生児型等においてNav1.7を発現する。
【００７３】
VGSC-発現がんは、前述した通り、3、4又は5期である。
【００７４】
一実施形態では、患者は、例えば、4期又は5期等においてステージ3、4又は5となる。一実施形態では、がんは、例えば、1又は2期において、ステージ1、2、又は3となる。
【００７５】
一実施形態では、がんは、3期である。3期のがんに罹患している患者は、通常、転移性疾患と診断されないが、がんの転移挙動のリスクがある、すなわち、4期期又は5期に進行している。したがって、3期のがんに罹患している患者は、本発明に従って治療して、がんの転移挙動を防止することができる。
【００７６】
一実施形態では、がんは、4期である。4期のがんに罹患している患者は、転移性疾患と診断されないが、がんは、転移挙動に向かって進行しているおそれがある。したがって、4期のがんに罹患している患者は、本発明に従って治療して、がんの転移挙動を減少させることができる。
【００７７】
一実施形態では、がんは、5期である。5期のがんに罹患している患者は、転移性疾患と診断することができ、このがんは、転移挙動を特徴とする。したがって、5期のがんに罹患している患者は、本発明に従って治療して、がんの転移挙動を減少させることができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、患者は、VGSC-発現及び/又は転移挙動のリスクを伴うがんに罹患しているおそれがあるが、VGSC-発現及び/又は転移挙動は、まだ決定されていない。転移挙動しやすいがんには、例えば、白血病、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん;NSCLC)、胸膜がん(例えば、中皮腫)、子宮頚がん及び卵巣がん(Rogerら、2015年)が含まれる。例えば、がん細胞-含有サンプル、例えば、患者から得られた、腫瘍生検又は血液サンプルの免疫組織化学分析は、サンプル中の腫瘍細胞が、試験される1つ又は複数のVGSCを発現しなかったことを示すことができる。したがって、がんは、1期又は(より可能性が高い)2期でありうる。
【００７９】
一実施形態では、がんは、2期である。2期のがんに罹患している患者は、通常、転移性疾患と診断されていないが、がんのVGSC発現及び転移挙動、すなわち、3期、4期又はそれ以上への進行のリスクがある。したがって、2期のがんに罹患している患者は、本発明に従って治療して、がんのVGSC-発現又は転移挙動を防止することができる。
【００８０】
1〜5期のいずれか1期、好ましくは、2〜5期のいずれか1期のがんに罹患している患者は、がん、例えば、原発腫瘍によって引き起こされる疼痛にも罹患するおそれがあり、したがって、本発明に従って治療して、痛覚を低下させることができる。
【００８１】
一実施形態では、本発明による方法において用いられる場合、本化合物は、がん細胞を死滅させずに、VGSC発現がんにおいて、転移挙動を減少させる又は防止する。
【００８２】
一実施形態では、本発明による方法において用いられる場合、本化合物は、がん細胞の増殖に実質的に影響を与えずに、VGSC発現がんにおいて転移挙動を減少させる又は防止する。
【００８３】
一実施形態では、本発明による方法において用いられる場合、本化合物は、過度的な部分を消失させず、VGSC電流の永続的な部分を少なくとも減少させる効果により、VGSC発現がんにおいて転移挙動を減少させる又は防止する。VGSC電流に対する化合物の効果を評価するための適当なアッセイは、当技術分野で公知である(例えば、Rajamaniら、2016年を参照のこと)。
【００８４】
別々の及び詳細な他の実施形態では、本化合物は、
(a)がん細胞の侵襲性を低下させること;
(b)場合によっては、低酸素下でがん細胞の運動性を低減するが、正常酸素条件下でがん細胞の運動性を低減しないこと;
(c)場合によっては、正常酸素条件及び低酸素条件下で、少なくとも1種のVGSCのがん細胞発現を減少させること;
(d)がん細胞の接着性を増加させること;
(e)がん細胞が遊走する能力を低下させること;又は
(f)(a)及び(b)、(b)及び(c)、(a)及び(c)、(a)から(c)、又は(a)から(e)の組み合わせ
により転移挙動を減少させる又は防止する。
【００８５】
一実施形態では、少なくとも1種のVGSCは、Nav1.5、Nav1.6及びNav1.7のうちの1つ、2つ又はすべてを含む。一実施形態では、少なくとも1種のVGSCは、新生児Nav1.5を含む又は新生児Nav1.5からなる。
【００８６】
一実施形態では、本化合物によるがん細胞の治療によって、少なくとも1種のVGSCのがん細胞発現が、対照のがん細胞発現、例えば、予め決定された対照値、本化合物に曝露されないがん細胞又は参照化合物に曝露されたがん細胞等よりも有意に低くなる。一実施形態では、本化合物によるがん細胞の治療によって、本化合物で治療されたがん細胞の侵襲性、運動性及び/又はがん細胞を遊走させる能力が、対照のもの、例えば、予め決定された対照値、本化合物に曝露されないがん細胞又は選択された参照化合物に曝露されたがん細胞等より有意に低くなる。
【００８７】
(a)から(d)を評価するためのアッセイは、当技術分野で公知であり、下記及び実施例において記載される。
【００８８】
投与モード
本化合物は、それだけには限らないが、経口、口腔、唇下、舌下、直腸、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、経皮及び鼻腔内投与及び/又は腫瘍、例えば、原発腫瘍等への直接投与を含めて、患者への任意の適当な経路により投与することができる。好ましくは、本化合物は、例えば、錠剤又はカプセル剤として経口投与される。いくつかの場合では、錠剤又はカプセル剤は、所望の目標、例えば、胃に到達するまで、本化合物が放出されないように、配合されてもコーティングされてもよい。特に、長期間にわたって化合物を放出するように、持続放出系も用いることができる。
【００８９】
本化合物は、通常、当技術分野で周知の方法に従って、1種又は複数の薬学的に許容される添加剤、賦形剤又は担体と共に配合される。例えば、US2017/0007617A1では、静脈内投与のための式Iによる化合物の適当な配合物が記載されている。
【００９０】
投与量レジメン
本化合物は、所期の目的のために、並びに訓練された医師により決定された回数で及び期間に、治療有効量で患者に投与される。
【００９１】
一実施形態では、治療有効用量は、本化合物の約0.01μM〜約10μMの血漿濃度で、好ましくは、定常状態でもたらされるものである。したがって、いくつかの実施形態では、本化合物は、定常状態の血漿濃度約0.01μM〜約10μM、例えば、約1μM又は5μM等を達成するように投与される。
【００９２】
一実施形態では、本化合物は、投与量約1mg〜約30mg、例えば、1〜約15mg、例えば、約1〜10mg、例えば、約1mg〜約5mg、例えば、約2mg〜約4mgで、患者、例えば、成人のヒトの患者に投与される。他の実施形態では、本化合物は、投与量約5〜約15mg、例えば、約10mg〜約15mg、例えば、約12〜約14mgで、患者、例えば、成人のヒトの患者に投与される。他の実施形態では、本化合物は、投与量約8mg〜約13mgで、患者、例えば、成人のヒトの患者に投与される。
【００９３】
一実施形態では、本化合物は、約1mg、約3mg、約6mg、約9mg、約12mg、約15mg、約18mg、約21mg、約24mg、約27mg,又は約30mgの投与量で、患者、例えば、成人のヒトの患者等に投与される。
【００９４】
一実施形態では、本化合物は、1日1回、2日に1回、3日に1回、5日に1回、週1回、2週間に1回、又は月1回、例えば、1日1回投与される。好ましくは、本化合物は、維持療法のために、好ましくは、経口で(経口的に(p.o))1日1回投与される。
【００９５】
一実施形態では、本化合物は、少なくとも4週間、例えば、少なくとも8週間、例えば、少なくとも12週間、例えば、少なくとも24週間、例えば、少なくとも48週間、又はそれ以上にわたって、維持療法として投与される。
【００９６】
一実施形態では、維持療法の開始前、例えば、1又は2日前、化合物の1回限りの初回ブースト用量は、約10mg〜約100mg、例えば、約20mg〜約80mg、例えば、約30mg〜約70mg、例えば、約40mg〜約60mg、例えば、約30mg、約50mg、約80mg、約90mg、又は約95mgを、患者、例えば、成人のヒトの患者に投与される。
【００９７】
理論に限られるものではないが、エレクラジンの薬物動態の最近の知識から、例えば、初回ブースト用量約95mgを投与した後、式Iaによる化合物(エレクラジン、451,83g/mol;PubChem CID:71183216)を用いた、及び成人のヒトの患者(体重が約70kgであり、分布容積が約42リットルであると仮定した)において、約5μMの順で、所望の濃度について提供された、本発明による維持療法のための1日投与量は、次の通り推定することができる。
【００９８】
【表２】
2020509082.tif 000009
【００９９】
したがって、一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約10mg〜約100mgとして、最初に経口投与(p.o.)され、その後、1日1回少なくとも4週間の間、投与量約1mg〜約20mg、例えば、約1〜約15mgを経口投与される。
【０１００】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約20〜約100mgとして、最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約3mg〜約20mg、例えば、約3mg、約4mg、約5mg、約6mg、約7mg、約8mg、約9mg、約10mg、約12mg、約15mg、約19mg又は約20mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０１】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量(does)約20〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約3mg〜約10mg、例えば、約3mg、約5mg、約6mg、約9mg、又は約10mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０２】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約3mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０３】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約5mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０４】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約6mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０５】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約9mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０６】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約10mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０７】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約19mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０８】
特定の一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mg〜約100mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約20mgを経口投与される。別々の及び詳細な実施形態では、初回負荷用量は、約30mg、約50mg、約80mg、及び約95mgである。
【０１０９】
特定の他の実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約30mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約3mg又は約6mgを経口投与される。
【０１１０】
特定の他の実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、1回限りの初回ブースト(又は負荷)用量約48mgとして最初に経口投与(p.o.)され、その後、少なくとも4週間の間1日1回、投与量約3mg又は約6mgを経口投与される。
【０１１１】
一実施形態では、本発明に従って用いるための化合物は、式Iaによる化合物約0.45mg〜約4.5mgに対応した、1μmol〜10μmolの範囲に対応する投与量レベルで投与される。
【０１１２】
アッセイ
以下は、がん細胞の転移挙動又は他の特性に対する、本発明による化合物の効果を評価するのに有用なアッセイの限定しない例である。
【０１１３】
単一の細胞接着アッセイ
図4は、Palmerら(2008年)による論文に最初に記載された単一の細胞接着測定装置(SCAMA)の略図である。
【０１１４】
MDA-MB-231細胞系から得られたヒト乳がん細胞を、密度2.5×104細胞/mlで蒔き、測定の48時間前に細胞培養皿401に定着させた。培地を除去し、試験下で薬物2mlを、10分間適用した。接着力を、プラスチック製チューブを介して真空ポンプ403に接続したガラスマイクロピペット402を用いて測定した。マイクロピペットの先端は、先端の直径が約20μm(範囲、17〜24μm)を対象とした。陰圧が、密封可能な(sealable)Tピース406の開放端を親指で押すことにより、マイクロピペットの先端に適用することができるため、真空ポンプを用いて、溜め405の内側に陰圧を創出した。これらの細胞を、ランプ408の照明下で、20×顕微鏡対物407を用いて観察した。圧力を、RS232ケーブル411を経由してコンピュータ410に接続したデジタルマノメーターを用いて測定した。
【０１１５】
マイクロマニピュレーター412を用いて、マイクロピペット402を、単一の細胞の周辺に配置した。Tピース406を閉じた後、陰圧を、研究下で細胞に適用し、細胞が、培養皿401から解離されるのを観察した正確なモーメントで、圧力を、Tピース406を開放することにより放出した。細胞を解離するために要した陰圧を、スパイク圧としてコンピュータ上に記録した。このスパイク(「解離陰圧」(DNP:detachment negative pressure))のピークを、細胞の接着性の測度として用いた。この技法を用いて、いくつかの記録は、数分以内に単一の培養皿から行われうる。
【０１１６】
細胞についての低酸素条件を促進するために、低酸素を、試験の最終の24時間前に過酸化水素(1〜500μΜ)の適用により化学的に誘導した。
【０１１７】
所与の効果の可逆性について試験するために、薬剤を洗い落とし、新鮮な培地を加え、プレートを、再測定前に更に10分間インキュベートした。各治療を細胞の少なくとも2皿の培養皿で行い、培養皿当たり少なくとも100個の細胞を測定し、(対応する対照と共に)本実験を3回繰り返した。
【０１１８】
側方への運動性アッセイ
本アッセイを、局所的に伝播している間のがん細胞の「自由な」運動性を示すために用いた。図5(a)は、その表面に細胞の半コンフルエント層502を有する細胞培養皿501の上部からの平面図であり、細胞は、水性媒体503中にある。
【０１１９】
側方への運動性を決定するために、「創傷-治癒(「掻破」)」試験を行い、細胞培養皿の側断面図である図5(b)に示す通り、掻破504 0.5mmを、細胞の層に行った。掻破の形成後24時間の間、細胞は、間隙に移動した。
【０１２０】
図5(c)及び図5(d)は、それぞれ、掻破504の幅がw0である場合時間t=0、掻破504の幅がw24である場合時間t=24時間での細胞培養皿501の略平面図である。
【０１２１】
横方向の遊走アッセイ
本アッセイを、細胞が血管内/血管外遊出する場合、細胞が遊走する能力を示すために用いた。図6は、チャンバーが、便宜上、チャンバーの上部603及び下部604セクションと称される、2つのセクションに分かれている、Transwell(登録商標)インサート602を有する、遊走チャンバー601の略側方断面図を示す。インサート602は、そこから拡張する8μmの孔606を有するその底面において、遊走フィルター膜605を有する。
【０１２２】
細胞607を、フィルター膜605上に密度2×104/mlで蒔き、1%ウシ胎児血清(FBS)を含有する増殖培地608下に入れた。走化性グラジエントを、チャンバーの下部セクション604中に10%FBSを含有する増殖培地609を置くことにより、フィルター膜605全域に創出した。
【０１２３】
細胞を、24時間にわたって、フィルター膜605全域に遊走させ、細胞は、遊走し、フィルター膜605の下面に接着した。各アッセイの終了時に、遊走しなかった細胞を、2つの異なる脱脂綿でインサート602の上面から除去した。
【０１２４】
インサート602の下面に遊走する細胞の数を、クリスタルバイオレット染色を用いて決定した。遊走した細胞を、氷冷メタノールで15秒間固定した。次いで、(25%メタノール中)0.5%クリスタルバイオレットを、15分間加えた。インサートを、再度拭き取り、次いで、水中で洗浄し、乾燥させた。次いで、細胞を、インサート当たり12の別々の視野を用いてカウントした(×200倍率)。
【０１２５】
浸潤アッセイ
本アッセイは、前述の横方向の遊走アッセイの拡張である。「浸潤する」ために、細胞は、(i)横方向の遊走アッセイにあるように移動し、(ii)タンパク質分解酵素を分泌して、これらの周囲を消化することが必要である。したがって、細胞が、酵素分泌物により隣接する組織を浸潤する能力を、Transwell(登録商標)インサートの多孔質膜に拡散させたMatrigel(商標)(BD Biosciences社)の層を用いることにより評価した。Matrigel(商標)は、ラミニン、IV型コラーゲン、ニドジェン/エナクチン及びプロテオグリカンから構成され、組成物は、基底膜タンパク質と同様である。
【０１２６】
図7は、チャンバーを、上部703及び下部704セクションに分けるTranswell(登録商標)インサート702を有する浸潤チャンバー701の略側方断面図である。インサート702は、そこから拡張する8μmの孔706を有するその底面において、遊走フィルター膜705を有する。Matrigel(商標)の層707は、フィルター膜705をコーティングすることを示す。
【０１２７】
細胞708を、製造業者の指示に従って、24穴プレート(Becton-Dickinson社)中のMatrigel(商標)層707に、密度2×104/mlで蒔いた。Matrigel(商標)50μlを、1:7の希釈(10mg/ml原液)で、インサート上に播種し、終夜放置した。細胞を播種する前に、Matrigel(商標)を、何も加えない培地を用いて再水和した。この培地を、細胞を播種する前に除去した。
【０１２８】
細胞を、1〜5%FBS走化性グラジエント中に終夜(12時間)蒔いた。チャンバーの上部セクション703における培地709中の栄養素濃度は、Matrigel(商標)層707及び孔706を通したフィルター膜705の下面への細胞の移動を誘導するために、下部セクション704における培地710中の栄養素の濃度より低かった。各アッセイの終了時に、浸潤しなかった/遊走しなかった細胞を、2つの異なる脱脂綿でインサート702の上面から除去した。
【０１２９】
インサート702の下面に浸潤する細胞の数を、クリスタルバイオレット染色を用いて決定した。浸潤した細胞を、氷冷メタノールで15分間固定した。次いで、(25%メタノール中の)0.5%クリスタルバイオレットを、15分間加えた。インサートを、再度拭き取り、次いで、水中で洗浄し、乾燥させた。次いで、細胞を、インサート当たり12の別々の視野を用いてカウントした(×200倍率)。2つの対照インサートを浸潤する細胞の平均数の差が、40%を超える場合、その実験を、棄却した。
【０１３０】
細胞生存率アッセイ
細胞を、35mm Falcon組織培養皿中で5×104細胞/mlの密度で播種した。所与の薬物で処理した後、培地を除去し、増殖培地800μl及び0.4%トリパンブルー(Sigma社、Dorset、UK)200μlと交換し、インキュベーターにおいて10分間インキュベートした。トリパンブルーを除去し、細胞を、増殖培地3mlで1回洗浄した。各処理の場合、30のランダムな視野から得られた細胞を、100×倍率下でカウントした。青色で染色された、死滅した細胞の数を、各視野でカウントした。本データを、所与の視野における細胞の総数のうちの生きている細胞の百分率として表した。これらの百分率を、平均し、対照と治療との間の差を、少なくとも3つの独立した実験と比較した。
【０１３１】
細胞成長(増殖)アッセイ
細胞を、24穴プレート(Becton-Dickinson社)中で2×104細胞/mlで蒔き、終夜放置して定着させた。次いで、細胞を、培地を24時間毎に変えながら、インキュベーションの所要時間(24時間+)に処理した。処理の終了時に、培地を除去し、その後、これを、比色3-[4,5-ジメチルチアゾル-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ(Grimesら、1995年)を行った。簡単にいうと、MTT0.1ml(増殖培地中で作製した5mg/ml)及び増殖培地0.4mlを各ウェルに加え、プレートを、37℃で3〜4時間インキュベートした。次いで、培地をチャンバーから除去し、ジメチルスルホキシド(DMSO)0.5ml及びグリシン緩衝液(0.1Mグリシン及び0.1M NaCl;pH10.5)0.063mlと交換した。570nmでの吸収度を、グリシン緩衝液を加えて15分後に決定した。結果を、個別の浸潤ウェルからの処理対対照の分光光度計の読み取りをそれぞれ9回繰り返すことによって算出した。
【０１３２】
組織培養
実験を、4つの転移性の強い細胞系において行った。
(i)ヒト転移性乳がんMDA-MB-231、
(ii)ヒト転移性結腸がんSW620細胞、
(iii)ヒト白血病FLG29.1細胞、及び
(iv)ラットの転移性の強い前立腺がんMat-LyLu。
【０１３３】
細胞を、公知の方法(例えば、Grimesら、1995年;Fraserら、2005年)を用いて培養した。
【０１３４】
正常酸素条件及び低酸素条件
次の段落で論じられる単一の細胞接着試験を除いて、実験を、
(i)正常な正常酸素条件下(酸素95%、二酸化炭素5%)、又は
(ii)アッセイ中に継続される低酸素による前処理(O22%、CO25%、N293%)の24時間後に行った。
【０１３５】
単一の細胞接着実験において、低酸素を、24時間過酸化水素(1〜500μΜ)を適用することにより化学的に誘導した。
【実施例】
【０１３６】
(実施例1)
単一の細胞接着に対するMDA-MB-231細胞の化学的な低酸素の効果
化学的な低酸素を、異なる濃度の過酸化水素で、24時間細胞を処理することにより、誘導した。単一の細胞接着を、前述の及び図4に例示された技法を用いて測定した。解離陰圧(ADNP)の変化を、百分率対未処理の細胞の対照母集団として表した。低酸素が、細胞接着を低下させ、過酸化水素の濃度を増加させる、すなわち、低酸素の程度を増加させることによって、図8に示される通り、細胞接着を大いに減少させた。この図において、垂直軸は、解離陰圧(ADNP)の変化を表し、より高い負の値が、細胞のより低い接着力を表し、したがって、その解離の傾向を表すように、下方に増加する。水平軸は、過酸化水素濃度の対数目盛であり、左から右に増加する。
【０１３７】
MDA-MB-23 1細胞系から得られたヒト乳がん細胞を、2.5×104細胞/mlの密度で細胞培養皿中に蒔き、測定の48時間前に、放置して定着させた。細胞を、1μM、10μM及び100μMの過酸化水素濃度に曝し、細胞培養皿の底から細胞を解離させるのに要する陰圧を測定した。過酸化水素の各濃度で、培養皿当たり少なくとも100個の細胞について、細胞の少なくとも2つの培養皿で測定を行った。本実験を3回繰り返し、解離陰圧の測定を、平均±SEMとして図8において示す。
【０１３８】
図8では、濃度1μMの過酸化水素に曝露された細胞は、平均解離陰圧がおよそ-9%であり、濃度10μMの過酸化水素に曝露された細胞は、平均解離陰圧が、およそ-14%であり、濃度100μMの過酸化水素に曝露された細胞は、平均解離陰圧がおよそ-20%であったことを示す。したがって、過酸化水素の濃度が上昇すると、細胞の接着力が低下し、細胞が解離され易くなった。言い換えれば、低酸素条件の厳しさが増すと、細胞の解離能力が高まる。
【０１３９】
(実施例2)
転移性の高い乳がん細胞系に対するエレクラジンの効果
本実施例では、浸潤性の高いヒト乳がん細胞系MDA-MB-231を用いた、細胞生存率、増殖、運動性、侵襲性、nNAV-1.5発現、並びに過度的な及び永久ナトリウム電流に対するエレクラジンの効果を記載している。
【０１４０】
材料及び方法
組織培養及び処理:
MDA-MB-231ヒト乳がん細胞を、L-グルタミン4mmol/L及び5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ最小必須培地(DMEM)(今後、培地と称する)を用いた、100×20mm皿(Thermo Fisher Scientific社)中に、播種した。
【０１４１】
MDA-MB-231細胞は、ヒト乳腺癌からのこれらの起源により組織培養皿に自然に付着する。0.25%トリプシン-EDTA(Sigma Aldrich社)3mlを、15分間投与して、接着細胞を可溶化し、その後、1700rpmで2分間遠心した。ペレットを、培地中で再懸濁し、細胞数を、血球計算器を用いて決定した。培地を、2〜3日毎に新しくし、保存細胞を、37℃の正常酸素条件で維持した。
【０１４２】
エレクラジンを、DMSOに溶解し、-20℃で10mMの濃度として保存した。MDA-MB-231細胞の処理のために、薬物を、乳房培地中で希釈して、10又は20μMの濃度を達成した。標準の陰性対照を、同じ体積の99.9%DMSOを、培地に加えることにより調製した。
【０１４３】
細胞生存率アッセイ:
細胞生存率、したがって、薬物毒性を、トリパンブルーアッセイを用いて決定した。手順としては、未処理の二重膜に取り囲まれている生存可能な細胞は、トリパンブルー色素を吸収することができず、一方、死滅した及び断片化された細胞は、吸収することができるという原理に従う。最初に、3×104細胞を含有する35×10mm皿を、20μMエレクラジン又は0.4%DMSOで48時間予め処理した。
【０１４４】
続いて、溶液を、0.4%トリパンブルー(Sigma-Aldrich社)0.2ml及び培地0.8mlと交換した。10分後、トリパンブルー混合物を、吸引し、培地と交換した。細胞生存率を、各皿(Zeiss Axiovert 25位相差顕微鏡、×40倍率)上で30の視野で、生存可能な及び死滅した細胞の割合をカウントすることにより決定した。
【０１４５】
増殖アッセイ:
増殖を、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム)を用いて、間接的に測定した。原則的に、MTTを、溶解し、代謝活性のある細胞によって処理し、これは、副生成物として、ホルマザンを生成する。ホルマザンは、紫色の色素であり、これは、分光光度計において定量化することができ、吸収度の読み込み(570nm)と細胞数との間の関連を示す。
【０１４６】
細胞を、ウェル当たり2×104細胞の密度で24穴プレートに蒔き、低酸素及び正常酸素中で48時間それぞれの薬物溶液1mlで予め処理した(図5を参照のこと)。培地0.4ml中で希釈したMTT(1mg/ml)0.1mlを各ウェルに投与し、その後、暗所の、正常酸素条件(MTTは、感光性である)で4時間インキュベートした。続いて、溶液を吸引し、99.9%DMSO0.5mlを、グリシン緩衝液75μLと組み合わせて加えた。色素は、振動プラットフォームで150周期/分で15分間のインキュベーションの間DMSOに溶解することができた。吸収度を、ELX800 Universal Microplate Reader(BioTek Instruments社)を用いて読み取り、バックグラウンドは0.04を測定した。(各4回の生物学的な繰り返しを含む)3回の技術的な繰り返しのデータを、正規化し、統計解析を、SPSSを用いて行った。
【０１４７】
側方への運動性アッセイ:
106細胞を、各35×10mm皿に蒔き、正常酸素条件で維持して、終夜定着させた。各皿を、15本の平行な縦線及び3本の重複しない横線によって印付けした。培地を新しくし、1ml Gilsonピペットチップを用いて、印付けされた縦線に沿って、3カ所傷を付けた。浮遊する細胞を、培地を連続3回洗浄することにより除去し、接着細胞を、それぞれの薬物溶液(10μMエレクラジン/DMSO)1mlで処理した。初回の傷の幅(W0)を、位相差顕微鏡(×10倍率)上で目盛りを用いて、(縦線が、それらの傷を横断する)45カ所の定点で測定した。次いで、細胞を、正常酸素条件及び低酸素条件においてインキュベートし、薬物溶液は、24時間毎に交換した。傷の幅を、12時間毎に測定し、この乳がん細胞系の運動性を、「運動指数」(MI=1-(Wt/W0))を用いて分析した。運動指数1は、完全に傷が塞いだことを説明しており、MI=0は、細胞移動が0であることを表す。4つの条件のそれぞれの場合(正常酸素及び低酸素におけるエレクラジン及びDMSO)、(それぞれ3つの生物学的な繰り返しを含めた)5回の技術的な繰り返しを行った。データ分析を、SPSS統計を用いて終了した。
【０１４８】
Matrigel浸潤アッセイ:
細胞を、低酸素条件下で10μMエレクラジン又は0.2%DMSOで24時間予め処理した。8μmの孔を有するTranswellフィルターを、24穴プレートに挿入し、無FBS培地50μL中に希釈したMatrigel62.6μgでコーティングした。Matrigelを、37℃の正常酸素で終夜凝固させ、無FBS培地0.5mlを用いて37℃の正常酸素で3時間水和させた。5%FBSを含有する培地300μLを、下部チャンバーに投与し、1%FBSを含有する培地の同じ量を、上部チャンバー(transwellフィルター)に加えた。2×104細胞を、1%溶液に加え、走化性グラジエントに沿ってMatrigelを通して、これらの浸潤を可能にした。細胞を放置して定着させ、低酸素条件下で終夜浸潤させた。
【０１４９】
次の日、両チャンバー中の培地を吸引し、浸潤しなかった細胞を、綿棒で除去した。100%氷冷メタノールを下部チャンバーに投与して、浸潤した細胞を固定し、続いて、クリスタルバイオレット(25%メタノール中で希釈した0.5g/ml)300μLで15分間染色した。Transwellフィルターを、蒸留水中で洗浄し、室温で数時間乾燥した。
【０１５０】
免疫細胞化学:
細胞を、10μMエレクラジン又はDMSOで、正常酸素条件及び低酸素条件で、24時間予め処理した。次の日、円形の13mmカバーガラスを、24穴プレートに入れ、ポリ-L-リジン0.5mlで20分間インキュベートした。溶液を、吸引し、予め処理した2×104細胞を、各カバーガラスの最上部に加えた。これらのウェルを、それぞれの薬物溶液で0.5mlまで満たし、細胞を放置して、正常酸素条件及び低酸素条件において、終夜カバーガラスに定着させた。
【０１５１】
細胞を、PBSで洗浄し、(PBS中の)4%PFA0.5mlで15分間カバーガラスをインキュベートすることにより固定した。次いで、カバーガラスを、PBS中で5分間3回洗浄した。サンプルの半分を、0.1%サポニン/PBS中で(4分間)透過処理し、その後、PBS中で5分間3回洗浄した。細胞を、5%BSA/PBS(pH7.4)0.5mlで1時間遮断した。カバーガラスを、湿度チャンバー(室温)中で1時間NESOpAb70μL(新生児Nav1.5に特異的な一次抗体;1:100希釈)でインキュベートした。5分間の3回のPBS洗浄によって、残留NESOpAbをすすぎ落とし、二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 568、1:100希釈)を暗所で1時間投与した。5分間の3回のPBS洗浄を、0.1%BSAを含むPBSを用いて行い、カバーガラスを、Dako蛍光性封入剤を用いて取り付けた。
【０１５２】
画像化を、Zeiss axiovert 200倒立顕微鏡において行った。位相差の像を、jpeg形式で撮像し、蛍光性の画像を、raw形式で保存した。補正された全細胞の蛍光を、ImageJを用いて定量化した。
【０１５３】
結果
・  20μMエレクラジンは、MDA-MB-231細胞生存率に対して効果がなかった。
・  10μMエレクラジン及び10μMラノラジンは、MTTアッセイ中に細胞増殖に影響を与えなかった。
・  10μMエレクラジンは、低酸素において、転移性の高い乳がん細胞の側方への運動性を低下させたが、正常酸素条件において低下させなかった。この効果は、12時間後の5%の減少から48時間後の30%の減少まで進行した。
・  5μMエレクラジンは、侵襲性をおよそ50%まで低下させ、ラノラジンよりも効率的であった。
・  免疫細胞化学では、10μMエレクラジンによって、正常酸素条件及び低酸素条件においてnNaV1.5の発現が減少することが示された。nNaV1.5は、低酸素と比較して正常酸素においてより高発現すると思われる。
【０１５４】
エレクラジンは、MDA-MB-231細胞に対して非毒性であった。すなわち、
治療条件当たりの270の視野の分析では、20μMエレクラジンが、0.2%DMSOと比較して、細胞生存率に対して有意な効果を有さなかったことが示された(図9)。視野当たりの生存可能な細胞の平均の割合は、DMSO及びエレクラジンの場合99.96%であった。生存可能な細胞の最小の割合は、93%であった。これらの結果及びパッチクランプデータ(図示せず)を考慮して、10μMを、これで実験を進める濃度として選んだ(これらの結果は、細胞死を通して交絡がなく、永久電流は、効率的に遮断されることが知られている)。
【０１５５】
エレクラジンも、ラノラジンも増殖に影響を与えなかった。すなわち、
増殖が、がん細胞の重要な特徴であるため、潜在的な抗がん薬としてのエレクラジンが、この過程に影響を与えるか否かを決定することは興味深い。図10Aに示す検量線によって、各ウェル中に蒔かれた細胞の数が、570nmで測定された吸収度と直線的に相関することが示される。
【０１５６】
MTTアッセイから得られたデータは、ノンパラメトリックであり、したがって、Mann-Whitney U検定(95%信頼区間)を用いて分析した。図10Bに示される通り、10μMエレクラジンと陰性対照(0.2%DMSO、10μM TTX、培地)のいずれかの間で統計的有意差はなかった。同様に、陰性対照及びエレクラジンと比較して、10μMラノラジンの有意な効果がなかった。2mM TEA(陽性対照)は、細胞増殖をおよそ50%まで低下させた。すべての処理について、低酸素は、細胞増殖に対して小さく弱める効果を有した。結論として、エレクラジンは、三種陰性乳がん細胞の増殖に影響を与えなかった。
【０１５７】
側方への運動性に対するエレクラジンの効果:
運動指数(MI)を用いて、MDA-MB-231細胞が、in vitroで移動する速度を記載した。この速度は、正常酸素と比較して低酸素において高かった。これら2つの実験条件間の差は、全時点の場合統計的に有意であったが(95%信頼区間)、運動性に対する低酸素の効果は、経時的に増加しなかった。
【０１５８】
エレクラジンのみが、低酸素条件中に側方への運動性の速度を低下させたが、正常酸素条件中に側方への運動性の速度を低下させなかった(図11)。細胞の運動性に対するこの効果は、経時的に増加した。12時間後にMIが5%上昇し始めることによって、細胞は、10μMエレクラジンによる48時間のインキュベーション後運動性が30%下回った。
【０１５９】
結論として、10μMエレクラジンは、低酸素条件下でMDA-MB-231細胞の運動性を効率的に低下させた。
【０１６０】
侵襲性に対するエレクラジンの効果:
侵襲性を、Matrigelを通して遊走した、視野当たりの細胞の数として定量化した。予備的なアッセイでは、10μMエレクラジンによって、酸素条件において、MDA-MB-231細胞の侵襲性が大幅に低下したことを示した。したがって、次の実験では、より低い濃度の効果を調べた。低酸素下におけるMDA MB-231細胞の浸潤に対する0.5μMエレクラジン及び20μMテトロドトキシン(TTX)による結果について図12を参照のこと。エレクラジン及びラノラジンはいずれも、侵襲性を、濃度1μMまで低下させたが、2つのVGSC遮断薬の間に統計的有意差はなかった(図13)。図14において示される通り、5μMエレクラジンによって、MDA-MB-231細胞の侵襲性が、およそ50%まで低下し、5μMラノラジンよりも有意に有効であった。
【０１６１】
エレクラジンによって、nNav1.5タンパク質発現が減少した。すなわち、
MDA-MB-231細胞における新生児Nav1.5タンパク質発現の発現に対する、エレクラジンの影響を、免疫細胞化学-パラメーター、すなわち、補正された全細胞の蛍光(CTCF)を用いて定量化した。図15に可視化されたとおり、10μMエレクラジンによる24時間の処理によって、統計的に有意な減少をもたらした。これによって、エレクラジンが、nNav1.5の活性及び発現を遮断することが示される。
【０１６２】
(実施例3)
ヒト白血病細胞系の侵襲性に対するエレクラジンの効果
本実施例では、ヒト白血病細胞系(FLG29.1)に対するエレクラジン及びラノラジンの抗-浸潤効果を記載している。FLG 29.1細胞を、10%ウシ胎児血清を補充したRPMI培地中で培養し、37℃でCO25%でインキュベートした。低酸素の場合、細胞を、1%酸素に24h予め曝露した。浸潤アッセイにおいて、細胞を、Matrigel(1:7に希釈)上に蒔き、エレクラジン、ラノラジン(各5μM)又はTTX(0.1若しくは10μM)で処理した(前処理なし)。細胞を18h、浸潤により、8μm孔を有するtranswellフィルターを通り抜けさせた。次の日、両チャンバー中の培地を、吸引し、浸潤しなかった細胞を、綿棒で除去した。100%氷冷メタノールを、下部チャンバーに投与して、浸潤した細胞を固定し、続いて、それを、クリスタルバイオレット300μL(25%メタノールに希釈した0.5g/ml)で15分間染色した。Transwellフィルターを、蒸留水中で洗浄し、室温で数時間乾燥した。浸潤した細胞を、無作為に選んだ視野において顕微鏡下でカウントした。データを、浸潤する細胞の百分率として表した。
【０１６３】
すべての薬剤(TTXを、陽性対照として用いた)は、図16中に示す通り、侵襲性を有意に抑制した。
【０１６４】
(参照文献)
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US 2017/0007617 A1 (Strickley R)
ClinicalTrials.gov identifier NCT02291237
ClinicalTrials.gov identifier NCT02104583
【符号の説明】
【０１６５】
101  時間線
102  がん性細胞の発生前の期
103  がん細胞の発生が起こる期
103  発生期
104  がん性細胞が増殖する期
104  増殖期
105  時間
106  時間線
107  最初の期
108  期
109  期
200  参照番号
201  乳房又は前立腺の健常な細胞
202  基底膜
202  がん性腫瘍
202a  分解された領域
203  がん性腫瘍
204  いくつかの細胞
205  臓器の隣接領域
205  領域
206  がん細胞
207  血管
208  がん性細胞
209  血流
210  血流に既に入っている細胞
211  領域
212  細胞
213  他の臓器
214  参照番号
301  実線として示される曲線
301  正常酸素条件下でピーク部分
302  ピーク又は過度的な部分
302  過度的な部分
303  永続的な又は遅延の部分
303  永続的な部分
303  正常酸素条件下で永続的な部分
304  チェーンドット線で描かれた曲線
305  低酸素条件下での電流のピーク部分
306  低酸素条件下での永続的な部分
401  細胞培養皿
402  ガラスマイクロピペット
403  真空ポンプ
405  溜め
406  密封可能なTピース
407  20×顕微鏡対物
408  ランプ
410  コンピュータ
411  RS232ケーブル
412  マイクロマニピュレーター
501  細胞培養皿
502  細胞の半コンフルエント層
503  水性媒体
504  掻破
601  遊走チャンバー
602  Transwell(登録商標)インサート
603  チャンバーの上部セクション
604  チャンバーの下部セクション
605  遊走フィルター膜
606  8μmの孔
607  細胞
608  増殖培地
609  増殖培地
701  浸潤チャンバー
702  Transwell(登録商標)インサート
703  上部セクション
703  チャンバーの上部セクション
704  下部セクション
705  遊走フィルター膜
706  8μmの孔
707  Matrigel(商標)の層
708  細胞
709  培地
710  培地
【図１】
2020509082.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
2020509082.tif 000017
【図５（ｂ）】
2020509082.tif 000018
【図５（ｃ）】
2020509082.tif 000019
【図５（ｄ）】
2020509082.tif 000020
【図６】
2020509082.tif 000021
【図７】
2020509082.tif 000022
【図８】
2020509082.tif 000023
【図９】
2020509082.tif 000024
【図１０Ａ】
2020509082.tif 000025
【図１０Ｂ】
2020509082.tif 000026
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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2020509082.tif 000034
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