(57)【要約】  本開示の側面は、特定の病変細胞（例えば、癌細胞）と正常細胞（例えば、非癌細胞）との間を差異的に調節する合成プロモーターを提供する。これらの合成プロモーターは、例えば、病変細胞における治療分子の標的化発現に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された核酸であって、下記コンセンサス配列：TFBS-AGA-TFBS-TCG-TFBS-GAC-TFBS-CTA-TFBS-ACT-TFBS-TGC-TFBS-GTA-TFBS、ここでTFBSは、表５の転写因子結合部位配列である、を含むプロモーターを含む、前記核酸。
【請求項２】
プロモーターの活性が、健常細胞と比較して病変細胞において増加している、請求項１に記載の操作された核酸。
【請求項３】
プロモーターの活性が、健常細胞と比較して病変細胞において減少している、請求項１に記載の操作された核酸。
【請求項４】
病変細胞が、乳癌細胞、結腸癌細胞および卵巣癌細胞から選択される、請求項２または３に記載の操作された核酸。
【請求項５】
プロモーターが、治療タンパク質をコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作された核酸。
【請求項６】
転写因子結合部位配列が、下記配列：CCACGTGC（配列番号１２２６５）を含む、請求項１、２、４または５のいずれか一項に記載の操作された核酸。
【請求項７】
プロモーターが、下記配列：
CCACGTGCAGACCACGTGCTCGCCACGTGCGACCCACGTGCCTACCACGTGCACTCCACGTGCTGCCCACGTGCGTACCACGTGCG（配列番号１２２６６）
を含む請求項６に記載の操作された核酸。
【請求項８】
転写因子結合部位配列が、下記配列：TGCTGAGTCAGCA（配列番号１２２６７）を含む、請求項１、２、４または５のいずれか一項に記載の操作された核酸。
【請求項９】
プロモーターが、下記配列：
TGCTGAGTCAGCAAGATGCTGAGTCAGCATCGTGCTGAGTCAGCAGACTGCTGAGTCAGCACTATGCTGAGTCAGCAACTTGCTGAGTCAGCATGCTGCTGAGTCAGCAGTATGCTGAGTCAGCAG（配列番号１２２６８）
を含む、請求項８に記載の操作された核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作された核酸を含む、細胞。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作された核酸を含む、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスである、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作された核酸または請求項１１もしくは１２に記載の腫瘍溶解性ウイルスを細胞に送達する方法であって、任意に対象において行われる、前記方法。
【請求項１４】
配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列または配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むプロモーターを含む、操作された核酸。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が、配列番号１〜４９のいずれか１つにより同定されるか、または配列番号１〜４９のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列である、請求項１４に記載の操作された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１７年３月１３日に出願された米国仮出願番号６２／４７０，７５４の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
２０１７年２月８日に製作された「M065670406WUS 00-SEQ-HJD.txt,」と名付けられ４．６７ＭＢのサイズを有するＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
背景
標的化治療は、無数の様々な病気を処置するのに有用である。遺伝子発現の細胞種特異的（cell type-specific）および／または細胞状態特異的(cellular state-specific）制御は、例えば、健常な（healthy）非病変細胞に悪影響を及ぼすことなく、病変細胞（例えば、癌細胞）に治療タンパク質を標的化送達することを可能にする。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示のいくつかの側面は、異なる細胞種および／または異なる細胞状態において差異的な活性を有する合成プロモーターを提供する。合成プロモーターは、特定の細胞種においてまたは特定の細胞状態にある間に、目的遺伝子（単数または複数）の発現を駆動させるために用いられ得る。いくつかの態様において、合成プロモーターは、特定の細胞種においてまたは特定の細胞状態において、検出可能な分子（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）の発現を駆動させる診断目的のために用いられる。いくつかの態様において、合成プロモーターは、特定の細胞種（例えば、癌細胞）においてまたは特定の細胞状態にある間に、治療分子（例えば、抗体などのタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの核酸）の発現を駆動させる治療目的のために用いられる。
【０００５】
したがって、本明細書においては、操作された核酸であって、下記コンセンサス配列：TFBS-AGA-TFBS-TCG-TFBS-GAC-TFBS-CTA-TFBS-ACT-TFBS-TGC-TFBS-GTA-TFBS、ここでTFBSは、表５の転写因子結合部位配列である、を含むプロモーターを含む、前記核酸が提供される。いくつかの態様において、プロモーターの活性は、健常細胞と比較して病変細胞において増加している。いくつかの態様において、プロモーターの活性は、健常細胞と比較して病変細胞において減少している。
【０００６】
いくつかの態様において、病変細胞は、乳癌細胞、結腸癌細胞および卵巣癌細胞から選択される。
いくつかの態様において、プロモーターは、治療タンパク質をコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結している。
いくつかの態様においては、転写因子結合部位配列が、下記配列：CCACGTGC（配列番号１２２６５）を含む。いくつかの態様においては、プロモーターが、下記配列：
CCACGTGCAGACCACGTGCTCGCCACGTGCGACCCACGTGCCTACCACGTGCACTCCACGTGCTGCCCACGTGCGTACCACGTGCG（配列番号１２２６６）
を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、転写因子結合部位配列は、下記配列：TGCTGAGTCAGCA（配列番号１２２６７）を含む。いくつかの態様においては、プロモーターが、下記配列：
TGCTGAGTCAGCAAGATGCTGAGTCAGCATCGTGCTGAGTCAGCAGACTGCTGAGTCAGCACTATGCTGAGTCAGCAACTTGCTGAGTCAGCATGCTGCTGAGTCAGCAGTATGCTGAGTCAGCAG（配列番号１２２６８）
を含む。
【０００８】
本明細書においてはまた、本明細書に記載の操作された核酸を含む、細胞が提供される。
さらに、本明細書においては、本明細書に記載の操作された核酸を含む、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および／または腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルスが提供される。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスである。
【０００９】
本開示はまた、本明細書に記載の操作された核酸または腫瘍溶解性ウイルスを、任意に対象において、細胞に送達する方法が提供される。
いくつかの態様において、操作された核酸は、配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様においては、プロモーターの活性は、健常細胞と比較して病変細胞（例えば、卵巣癌細胞または乳癌細胞）において増加している。いくつかの態様において、プロモーターの活性は、健常細胞と比較して病変細胞において減少している。配列番号１〜１２２６３は、プロモーターライブラリーから直接的に目的のプロモーターを増幅させるために用いられる、配列ATCATCTCACCTTGCCTCCTG（配列番号１２２６４）を包含する。「配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列を含むプロモーター」は、いくつかの態様においては、５’配列番号１２２６４を包含しないことが理解される。したがって、配列番号１２２６４は、配列番号１〜１２２６３のいずれか１つから除外されてもよい。
【００１０】
本明細書においてはまた、配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列を有する合成プロモーターを包含する操作された核酸を含む、細胞が提供される。
本開示はまた、配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列を有する合成プロモーターを包含する操作された核酸の、細胞への送達または対象への（例えば、直接的、または細胞を介した）送達を提供する。
Nissim, L. et al. Cell 2017; 171: 1138-1150の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
図面の簡潔な説明
添付の図は、一定の縮尺で描かれることを意図していない。明確性の目的のため、すべての構成要素がすべての図において標識され得るというわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、４種の異なる細胞株：ＨＣＴ、ＭＤＡ−４５３、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ａにおける合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図２】図２は、８種の異なる細胞株：ＯＶＣＡＲ８、ＭＤＡ−４５３、ＭＤＡ−２３１、ＨＣＴ、ａＨＤＦ、ＣＣＤ、１２Ａおよび１０Ａにおける合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図３】図３は、４種の細胞株：ＯＶＣＡＲ８、ＩＯＳＥ３８５、ＩＯＳＥ３８６およびＩＯＳＥ１２０における合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【００１２】
【図４】図４は、８種の異なる細胞株：ＯＶＣＡＲ８、ＩＯＳＥ３８５、ＩＯＳＥ３８６、ＩＯＳＥ１２０、ａＨＤＦ、ＣＣＤ、１２Ａ、１０Ａ、ＨＥＫおよびＮＢ５０８における合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図５】図５は、４種の異なる細胞株：ＯＶＣＡＲ８、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＢ５０８および４Ｔ１における合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図６】図６は、８種の異なる細胞株：ＯＶＣＡＲ８、ＩＯＳＥ３８５、ＩＯＳＥ３８６、ＩＯＳＥ１２０、ａＨＤＦ、ＣＣＤ、ＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ１２Ａにおける合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【００１３】
【図７】図７は、４種の異なる細胞株：ＯＶＣＡＲ８、ＩＯＳＥ３８６、ＩＯＳＥ１２０、１２Ａおよび１０Ａにおける合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図８】図８は、３種の異なる細胞株：ＮＢ５０８、４Ｔ１およびＯＶＣＡＲ８における合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図９】図９は、２種の異なる細胞株：１０ＡおよびＭＤＡにおける合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、２種の異なる細胞株：１０ＡおよびＭＤＡにおける合成プロモーターの活性を示すグラフである。
【００１４】
詳細な説明
本明細書においては、健常な（正常な）非病変細胞種と比較して、様々な病変細胞種間において差異的に調節される合成プロモーターが提供される。これらの合成プロモーターは、選択した細胞種（例えば、癌細胞または他の病変細胞）において、目的分子／生成物（例えば、治療および／または診断分子）の標的化発現のために用いられ得る。
【００１５】
合成プロモーター
「プロモーター」は、核酸配列のその後の部分（remainder）の転写の開始と速度が制御される、核酸配列の制御領域をいう。プロモーターは、それが動作可能に連結している核酸配列の発現または転写を制御する（例えば、活性化するもしくは抑制する）。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御タンパク質および分子が結合するサブ領域を含有している。プロモーターは、構成的、誘導可能、活性化可能、抑制可能、組織特異的、細胞種特異的、細胞状態特異的であってもよく、またはこれらのあらゆる組み合わせであってもよい。
【００１６】
本開示のプロモーターは、合成プロモーターである。合成プロモーターは、「天然に存在する」ものではないプロモーターである。本開示の合成プロモーターは、（例えば、化学合成を介して）合成的に、あるいは組み換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を用いて、生成してもよい（米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第５，９２８，９０６号参照）。
【００１７】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、１０〜３００ヌクレオチド長であってもよい。例えば、合成プロモーターの長さは、１０〜３００、１０〜２９０、１０〜２８０、１０〜２７０、１０〜２６０、１０〜２５０、１０〜２４０、１０〜２３０、１０〜２２０、１０〜２１０、１０〜２１０、１０〜２００、１０〜１９０、１０〜１８０、１０〜１７０、１０〜１６０、１０〜１５０、１０〜１４０、１０〜１３０、１０〜１２０、１０〜１１０、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜３００、２０〜２９０、２０〜２８０、２０〜２７０、２０〜２６０、２０〜２５０、２０〜２４０、２０〜２３０、２０〜２２０、２０〜２１０、２０〜２１０、２０〜２００、２０〜１９０、２０〜１８０、２０〜１７０、２０〜１６０、２０〜１５０、２０〜１４０、２０〜１３０、２０〜１２０、２０〜１１０、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、３０〜３００、３０〜２９０、３０〜２８０、３０〜２７０、３０〜２６０、３０〜２５０、３０〜２４０、３０〜２３０、３０〜２２０、３０〜２１０、３０〜２１０、３０〜２００、３０〜１９０、３０〜１８０、３０〜１７０、３０〜１６０、３０〜１５０、３０〜１４０、３０〜１３０、３０〜１２０、３０〜１１０、３０〜１００、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０、４０〜３００、４０〜２９０、４０〜２８０、４０〜２７０、４０〜２６０、４０〜２５０、４０〜２４０、４０〜２３０、４０〜２２０、４０〜２１０、４０〜２１０、４０〜２００、４０〜１９０、４０〜１８０、４０〜１７０、４０〜１６０、４０〜１５０、４０〜１４０、４０〜１３０、４０〜１２０、４０〜１１０、４０〜１００、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０、４０〜５０、５０〜３００、５０〜２９０、５０〜２８０、５０〜２７０、５０〜２６０、５０〜２５０、５０〜２４０、５０〜２３０、５０〜２２０、５０〜２１０、５０〜２１０、５０〜２００、５０〜１９０、５０〜１８０、５０〜１７０、５０〜１６０、５０〜１５０、５０〜１４０、５０〜１３０、５０〜１２０、５０〜１１０、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜３００、６０〜２９０、６０〜２８０、６０〜２７０、６０〜２６０、６０〜２５０、６０〜２４０、６０〜２３０、６０〜２２０、６０〜２１０、６０〜２１０、６０〜２００、６０〜１９０、６０〜１８０、６０〜１７０、６０〜１６０、６０〜１５０、６０〜１４０、６０〜１３０、６０〜１２０、６０〜１１０、６０〜１００、６０〜９０、６０〜８０、６０〜７０、７０〜３００、７０〜２９０、７０〜２８０、７０〜２７０、７０〜２６０、７０〜２５０、７０〜２４０、７０〜２３０、７０〜２２０、７０〜２１０、７０〜２１０、７０〜２００、７０〜１９０、７０〜１８０、７０〜１７０、７０〜１６０、７０〜１５０、７０〜１４０、７０〜１３０、７０〜１２０、７０〜１１０、７０〜１００、７０〜９０、７０〜８０、８０〜３００、８０〜２９０、８０〜２８０、８０〜２７０、８０〜２６０、８０〜２５０、８０〜２４０、８０〜２３０、８０〜２２０、８０〜２１０、８０〜２１０、８０〜２００、８０〜１９０、８０〜１８０、８０〜１７０、８０〜１６０、８０〜１５０、８０〜１４０、８０〜１３０、８０〜１２０、８０〜１１０、８０〜１００、８０〜９０、９０〜３００、９０〜２９０、９０〜２８０、９０〜２７０、９０〜２６０、９０〜２５０、９０〜２４０、９０〜２３０、９０〜２２０、９０〜２１０、９０〜２１０、９０〜２００、９０〜１９０、９０〜１８０、９０〜１７０、９０〜１６０、９０〜１５０、９０〜１４０、９０〜１３０、９０〜１２０、９０〜１１０、９０〜１００、１００〜３００、１００〜２９０、１００〜２８０、１００〜２７０、１００〜２６０、
【００１８】
１００〜２５０、１００〜２４０、１００〜２３０、１００〜２２０、１００〜２１０、１００〜２１０、１００〜２００、１００〜１９０、１００〜１８０、１００〜１７０、１００〜１６０、１００〜１５０、１００〜１４０、１００〜１３０、１００〜１２０、１００〜１１０、１１０〜３００、１１０〜２９０、１１０〜２８０、１１０〜２７０、１１０〜２６０、１１０〜２５０、１１０〜２４０、１１０〜２３０、１１０〜２２０、１１０〜２１０、１１０〜２１０、１１０〜２００、１１０〜１９０、１１０〜１８０、１１０〜１７０、１１０〜１６０、１１０〜１５０、１１０〜１４０、１１０〜１３０、１１０〜１２０、１２０〜３００、１２０〜２９０、１２０〜２８０、１２０〜２７０、１２０〜２６０、１２０〜２５０、１２０〜２４０、１２０〜２３０、１２０〜２２０、１２０〜２１０、１２０〜２１０、１２０〜２００、１２０〜１９０、１２０〜１８０、１２０〜１７０、１２０〜１６０、１２０〜１５０、１２０〜１４０、１２０〜１３０、１３０〜３００、１３０〜２９０、１３０〜２８０、１３０〜２７０、１３０〜２６０、１３０〜２５０、１３０〜２４０、１３０〜２３０、１３０〜２２０、１３０〜２１０、１３０〜２１０、１３０〜２００、１３０〜１９０、１３０〜１８０、１３０〜１７０、１３０〜１６０、１３０〜１５０、１３０〜１４０、１４０〜３００、１４０〜２９０、１４０〜２８０、１４０〜２７０、１４０〜２６０、１４０〜２５０、１４０〜２４０、１４０〜２３０、１４０〜２２０、１４０〜２１０、１４０〜２１０、１４０〜２００、１４０〜１９０、１４０〜１８０、１４０〜１７０、１４０〜１６０、１４０〜１５０、１５０〜３００、１５０〜２９０、１５０〜２８０、１５０〜２７０、１５０〜２６０、１５０〜２５０、１５０〜２４０、１５０〜２３０、１５０〜２２０、１５０〜２１０、１５０〜２１０、１５０〜２００、１５０〜１９０、１５０〜１８０、１５０〜１７０、１５０〜１６０、１６０〜３００、１６０〜２９０、１６０〜２８０、１６０〜２７０、１６０〜２６０、１６０〜２５０、１６０〜２４０、１６０〜２３０、１６０〜２２０、１６０〜２１０、１６０〜２１０、１６０〜２００、１６０〜１９０、１６０〜１８０、１６０〜１７０、１７０〜３００、１７０〜２９０、１７０〜２８０、１７０〜２７０、１７０〜２６０、１７０〜２５０、１７０〜２４０、１７０〜２３０、１７０〜２２０、１７０〜２１０、１７０〜２１０、１７０〜２００、１７０〜１９０、１７０〜１８０、１８０〜３００、１８０〜２９０、１８０〜２８０、１８０〜２７０、１８０〜２６０、１８０〜２５０、１８０〜２４０、１８０〜２３０、１８０〜２２０、１８０〜２１０、１８０〜２１０、１８０〜２００、１８０〜１９０、１９０〜３００、１９０〜２９０、１９０〜２８０、１９０〜２７０、１９０〜２６０、１９０〜２５０、１９０〜２４０、１９０〜２３０、１９０〜２２０、１９０〜２１０、１９０〜２１０、１９０〜２００、２００〜３００、２００〜２９０、２００〜２８０、２００〜２７０、２００〜２６０、２００〜２５０、２００〜２４０、２００〜２３０、２００〜２２０、２００〜２１０、２００〜２１０、２１０〜３００、２１０〜２９０、２１０〜２８０、２１０〜２７０、２１０〜２６０、２１０〜２５０、２１０〜２４０、２１０〜２３０、２１０〜２２０、２２０〜３００、２２０〜２９０、２２０〜２８０、２２０〜２７０、２２０〜２６０、２２０〜２５０、２２０〜２４０、２２０〜２３０、２３０〜３００、２３０〜２９０、２３０〜２８０、２３０〜２７０、２３０〜２６０、２３０〜２５０、２３０〜２４０、２４０〜３００、２４０〜２９０、２４０〜２８０、２４０〜２７０、２４０〜２６０、２４０〜２５０、２５０〜３００、２５０〜２９０、２５０〜２８０、２５０〜２７０、２５０〜２６０、２６０〜３００、２６０〜２９０、２６０〜２８０、２６０〜２７０、２７０〜３００、２７０〜２９０、２７０〜２８０、２８０〜３００、２８０〜２９０、または２９０〜３００ヌクレオチドであり得る。いくつかの態様においては、プロモーターは、３００ヌクレオチドよりも長くてもよい。いくつかの態様において、合成プロモーターは、３００ヌクレオチドより長くてもよい（例えば、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド長またはそれよりも長い）。
【００１９】
いくつかの態様においては、合成プロモーターの長さは、２００ヌクレオチド以下である。いくつかの態様においては、合成プロモーターは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００ヌクレオチド長であってもよい。
【００２０】
いくつかの態様においては、合成プロモーターは、（配列番号１２２６４により同定される５’配列を含むもしくは含まない）配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様においては、合成プロモーターは、（配列番号１２２６４により同定される５’配列を含むもしくは含まない）配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、それが動作可能に連結している配列の発現を制御する（例えば、活性化するもしくは抑制する）ことができる。例えば、合成プロモーターは、（配列番号１２２６４により同定される５’配列を含むもしくは含まない）配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよく、それが動作可能に連結している配列の発現を制御する（例えば、活性化するもしくは抑制する）ことができる。
【００２１】
いくつかの態様においては、合成プロモーターは、（配列番号１２２６４により同定される５’配列を含むもしくは含まない）配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と、９５〜９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、それが動作可能に連結している配列の発現を制御する（例えば、活性化するもしくは抑制する）ことができる。いくつかの態様においては、合成プロモーターは、（配列番号１２２６４により同定される５’配列を含むもしくは含まない）配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と、９５％〜９９％、９５％〜９８％、９５％〜９７％、９５％〜９６％、９６％〜９９％、９６％〜９８％、９６％〜９７％、９７％〜９９％、９７％〜９８％、または９８％〜９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、それが動作可能に連結している配列の発現を制御する（例えば、活性化するもしくは抑制する）ことができる。いくつかの態様において、合成プロモーターは、（配列番号１２２６４により同定される５’配列を含むもしくは含まない）配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよく、それが動作可能に連結している配列の発現を制御する（例えば、活性化するもしくは抑制する）ことができる。
【００２２】
本開示の他の側面は、異なる細胞株または異なる細胞状態において差異的な活性を有する合成プロモーターを提供する。「差異的な活性を有する」は、合成プロモーターの活性が、異なる細胞種または異なる細胞状態と比べて、それぞれ、ある細胞種もしくは細胞状態においてより高いまたはより低いことを意味する。いくつかの態様においては、ある細胞種もしくは細胞状態における合成プロモーターの活性は、別の細胞種もしくは別の細胞状態における合成プロモーターの活性と、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％  １００％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍）異なる。
【００２３】
いくつかの態様においては、ある細胞種もしくは細胞状態における合成プロモーターの活性は、別の細胞種もしくは別の細胞状態における合成プロモーターの活性と、１０％〜１００％異なる。例えば、ある細胞種もしくは細胞状態における合成プロモーターの活性は、別の細胞種もしくは別の細胞状態における合成プロモーターの活性と、１０％〜１００％、１０％〜９０％、１０％〜８０％、１０％〜７０％、１０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜１００％、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、３０％〜１００％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、３０％〜４０％、４０％〜１００％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、４０％〜７０％、４０％〜６０％、４０％〜５０％、５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、５０％〜６０％、６０％〜１００％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６０％〜７０％、７０％〜１００％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、８０％〜１００％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％異なっても（より高くもしくはより低くても）よい。
【００２４】
いくつかの態様においては、ある細胞種もしくは細胞状態における合成プロモーターの活性は、別の細胞種もしくは別の細胞状態における合成プロモーターの活性と、１〜１０００倍異なる（より高いもしくはより低い）。例えば、ある細胞種もしくは細胞状態における合成プロモーターの活性は、別の細胞種もしくは別の細胞状態における合成プロモーターの活性と（よりも）、１〜１０００、１〜９００、１〜８００、１〜７００、１〜６００、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００、１〜１００、１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、５〜１０００、５〜９００、５〜８００、５〜７００、５〜６００、５〜５００、５〜４００、５〜３００、５〜２００、５〜１００、５〜９０、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、１０〜１０００、１０〜９００、１０〜８００、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜１０００、２０〜９００、２０〜８００、２０〜７００、２０〜６００、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、３０〜１０００、３０〜９００、３０〜８００、３０〜７００、３０〜６００、３０〜５００、３０〜４００、３０〜３００、３０〜２００、３０〜１００、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０、４０〜１０００、４０〜９００、４０〜８００、４０〜７００、４０〜６００、４０〜５００、４０〜４００、４０〜３００、４０〜２００、４０〜１００、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０、４０〜５０、５０〜１０００、５０〜９００、５０〜８００、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜１０００、６０〜９００、６０〜８００、６０〜７００、６０〜６００、６０〜５００、６０〜４００、６０〜３００、
【００２５】
６０〜２００、６０〜１００、６０〜９０、６０〜８０、６０〜７０、７０〜１０００、７０〜９００、７０〜８００、７０〜７００、７０〜６００、７０〜５００、７０〜４００、７０〜３００、７０〜２００、７０〜１００、７０〜９０、７０〜８０、８０〜１０００、８０〜９００、８０〜８００、８０〜７００、８０〜６００、８０〜５００、８０〜４００、８０〜３００、８０〜２００、８０〜１００、８０〜９０、９０〜１０００、９０〜９００、９０〜８００、９０〜７００、９０〜６００、９０〜５００、９０〜４００、９０〜３００、９０〜２００、９０〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００倍異なっても（高くもしくは低くても）よい。
【００２６】
いくつかの態様においては、ある細胞種もしくは細胞状態における合成プロモーターの活性は、別の細胞種もしくは別の細胞状態における合成プロモーターの活性と（よりも）、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍異なっても（高くもしくは低くても）よい。いくつかの態様においては、合成プロモーターは、ある細胞種においては不活性であり、別の細胞種においては活性であってもよい。いくつかの態様において、合成プロモーターは、ある細胞状態においては不活性であり、別の細胞状態においては活性であってもよい。プロモーター（例えば、合成プロモーター）の活性を測定する方法は、例えば、Jeyaseelan et al., Nucleic Acids Research. 29 (12), 2001; Allard et al., Cell Notes (21), 2008; および Zaslaver et al., Nature Methods. 3 (8): 623-628, 2006において記載されているように、当業者に知られており、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、健常細胞または別の病変細胞種と比較して、ある病変細胞種においては（より高いまたはより低い）差異的な活性を有する。「病変細胞」は、特定の疾患または症状に関連する異常細胞をいう。病変細胞の非限定的な例には：癌細胞、病変神経細胞、病変心筋細胞、病変皮膚細胞、病変肝細胞、病変免疫細胞、病変上皮細胞、病変眼細胞、病変アストロサイト、病変ミクログリア、および病変幹細胞が含まれる。他の病変細胞種も本願明細書においては包含される。当業者は、病変細胞を同定することができる。「健常」細胞は、「非病変細胞」とも呼ばれ、いかなる疾患もしくは症状とも関連しない正常細胞をいう。
【００２８】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、別の細胞状態と比較して、ある細胞状態においては（例えば、より高いまたはより低い）差異的な活性を有する。異なる細胞状態間を移行し得る異なる細胞種の非限定的な例には、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、神経細胞、心筋細胞、皮膚細胞、肝細胞、免疫細胞、上皮細胞、眼細胞、アストロサイトおよびミクログリアが含まれる。
【００２９】
いくつかの態様においては、本明細書において提供される通りの合成プロモーターは、癌細胞においてのみ活性であるか、または癌細胞においてより高い活性を有する。例えば、本明細書において提供される通りの合成プロモーターは、乳癌細胞においてのみ活性であってもよく、かつ非乳癌細胞においては不活性なままであるか、または、健常細胞もしくは非乳癌細胞と比べて乳癌細胞においてより高い活性を有する。別の例のように、本明細書において提供される通りの合成プロモーターは、腫瘍癌細胞（tumor cancer cell）においてのみ活性であってもよく、かつ循環癌細胞（circulating cancer cell）においては不活性なままであり、または循環癌細胞と比べて腫瘍癌細胞においてより高い活性を有する。
【００３０】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、健常細胞と比較してまたは他の癌細胞種と比較して、乳癌細胞においてより高い活性を有する。
いくつかの態様において、合成プロモーターは、健常細胞と比較してまたは他の癌細胞種と比較して、卵巣癌細胞においてより高い活性を有する。
いくつかの態様において、合成プロモーターは、健常細胞と比較してまたは他の癌細胞種と比較して、大腸癌細胞においてより高い活性を有する。
【００３１】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、表５において同定される少なくとも１つの（１つ以上の）配列（特定の転写因子結合部位配列）を含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、表５において同定される少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの）タンデムリピート配列（単数または複数）を含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、表５において同定される１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のタンデムリピート配列を含む。表５のリピート配列は、リンカー配列により互いに離れていてもよい。いくつかの態様において、リンカー配列は、３個の（ランダムな）ヌクレオチド（例えば、ＡＧＡ、ＴＣＧ、ＧＡＣ、ＣＴＡ、ＡＣＴ、ＴＧＣ、ＧＴＡ）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、合成プロモーターは、下記コンセンサスモチーフ：TFBS-AGA-TFBS-TCG-TFBS-GAC-TFBS-CTA-TFBS-ACT-TFBS-TGC-TFBS-GTA-TFBS、ここで、「TFBS」は表５の転写因子結合部位である、を含む。
【００３２】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、USF1転写因子結合配列CCACGTGC（配列番号１２２６５）を含んでもよい。いくつかの態様において、合成プロモーターは、下記配列：CCACGTGCAGACCACGTGCTCGCCACGTGCGACCCACGTGCCTACCACGTGCACTCCACGTGCTGCCCACGTGCGTACCACGTGCG（配列番号１２２６６）を含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、MAFK転写因子結合部位TGCTGAGTCAGCA（配列番号１２２６７）を含んでもよい。いくつかの態様において、合成プロモーターは、下記配列：TGCTGAGTCAGCAAGATGCTGAGTCAGCATCGTGCTGAGTCAGCAGACTGCTGAGTCAGCACTATGCTGAGTCAGCAACTTGCTGAGTCAGCATGCTGCTGAGTCAGCAGTATGCTGAGTCAGCAG（配列番号１２２６８）を含む。
【００３３】
操作された核酸およびアウトプット分子（output molecule）
本明細書においては、さらに、本明細書に記載の合成プロモーターを含む操作された核酸（例えば、コンストラクト）が提供される。いくつかの態様において、合成プロモーターは、分子（例えば、タンパク質または核酸）をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結している。プロモーターは、それが、その配列の転写開始および／または発現をコントロールするのを制御する（「駆動させる」）核酸配列に関して、正しい機能的位置および配向性にある場合に、「動作可能に連結している」とみなされる。
【００３４】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、合成プロモーターの活性化がアウトプット分子の発現をもたらすように、アウトプット分子をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結している。アウトプット分子のシグナルは、検出されてもよく、その強度は合成プロモーターの活性化レベルの指標である。そのように、アウトプット分子からのシグナルを比べることにより、異なる細胞種における合成プロモーターの活性を比べることができる。いくつかの態様においては、アウトプット分子をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結しているプロモーターを診断目的に用いてもよい。例えば、病変細胞（例えば、乳癌細胞などの癌細胞）においてより高い活性を有する合成プロモーターが、アウトプット分子をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結している場合、別の細胞と比較したある細胞におけるアウトプット分子から生成するより強いシグナルは、その細胞が病変細胞（例えば、乳癌細胞などの癌細胞）であることを示す。例は限定を意味しない。本明細書に記載の合成プロモーターは、健常細胞または他の細胞種と比較して病変細胞において差異的な活性を有する限り、あらゆる疾患の診断に用いることができる。
【００３５】
いくつかの態様において、アウトプット分子は、検出可能なタンパク質である。いくつかの態様において、検出可能なタンパク質は、蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質は、適切な波長（例えば、青色光または紫外線の範囲）で光源に暴露された場合に、蛍光を発するタンパク質である。本開示の感知回路における検出可能なタンパク質として好適な蛍光タンパク質には、限定することなしにeGFP、eYFP、eCFP、mKate2、mCherry、mPlum、mGrape2、mRaspberry、mGrape1、mStrawberry、mTangerine、mBanana、およびmHoneydewが含まれる。いくつかの態様において、検出可能なタンパク質は、検出可能なシグナル（例えば、化学発光シグナル）を生成する基質を加水分解する酵素である。かかる酵素には、限定することなしに（LacZによりコードされる）ベータガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはルシフェラーゼが含まれる。いくつかの態様において、アウトプットシグナルは、蛍光ＲＮＡである。蛍光ＲＮＡは、フルオロフォアに結合して適切な波長（例えば、青色光または紫外線の範囲）で光源に暴露された場合に、蛍光を発するＲＮＡアプタマーである。本開示の感知回路におけるアウトプットシグナルとして用いられ得る好適な蛍光ＲＮＡには、限定することなしに（例えば、参照により本明細書に組み込まれるPaige et al., Science Vol.333, Issue 6042、pp.642-646、2011に記載されている通りの）SpinachおよびBroccoliが含まれる。
【００３６】
いくつかの態様において、合成プロモーターは、治療分子をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結している。「治療分子」は、疾患または症状に治療効果を有し、疾患または症状を処置するために用いられ得る分子である。本開示の治療分子は、核酸ベースであっても、またはタンパク質であっても、またはポリペプチドベースであってもよい。いくつかの態様において、合成プロモーターは、合成プロモーターの細胞特異的活性のために、所望の細胞種（例えば、癌細胞）において治療分子の発現を駆動させるが、他の細胞種においては駆動させない。そのようにして、疾患（例えば、癌）の標的化治療が達成される。
【００３７】
いくつかの態様において、核酸ベースの治療分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ）または核酸酵素（例えば、リボザイム）であってもよい。遺伝子発現のサイレンシングにおけるＲＮＡｉ分子およびその使用は、当業者によく知られている。いくつかの態様において、ＲＮＡｉ分子は、癌遺伝子を標的にする。
【００３８】
癌遺伝子は、ある環境において細胞を腫瘍細胞に転換することができる遺伝子である。癌遺伝子は、成長因子あるいはマイトジェン（mitogen）（例えば、c-Sis）、受容体型チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、Ｓｙｋ−ＺＡＰ−７０ファミリーキナーゼ、またはＢＴＫファミリーキナーゼ）、細胞質セリン／スレオニンキナーゼまたはその制御サブユニット（例えば、Ｒａｆキナーゼまたはサインクリン依存性キナーゼ）、制御型（regulatory）ＧＴＰａｓｅ（例えば、Ｒａｓ）、または転写因子（例えば、Ｍｙｃ）をコードする遺伝子であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、リポカリン（Lcn2）を標的にする（例えば、Lcn2 siRNA）。癌の処置のために標的化し得る遺伝子は、当業者によく知られている。
【００３９】
タンパク質またはポリペプチドベースの治療分子の非限定的な例には、酵素、制御タンパク質（例えば、免疫制御タンパク質）、抗原、抗体もしくは抗体フラグメント、および構造タンパク質が含まれる。いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドベースの治療分子は、癌治療用である。
【００４０】
本開示のいくつかの態様に好適な（合成プロモーターに動作可能に連結させるための）酵素には、例えば、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、合成酵素、イソメラーゼ、およびリガーゼ、消化酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、およびヌクレアーゼ）が含まれる。いくつかの態様において、酵素は、ラクターゼ、ベータガラクトシダーゼ、膵臓酵素、油脂分解（oil-degrading）酵素、ムチナーゼ、セルラーゼ、イソマルターゼ、アルギナーゼ、消化リパーゼ（例えば、舌リパーゼ、膵臓リパーゼ、ホスホリパーゼ）、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ）、エステラーゼ（例えば、ステロールエステラーゼ）、二糖類分解酵素（例えば、スクラーゼ、ラクターゼ、ベータガラクトシダーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ）、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅからなる群から選択される。
【００４１】
抗体および抗体フラグメントの非限定的な例には：ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標）)、トラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標）)、アレムツズマブ（CAMPATH（登録商標）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に適応される)、ゲムツズマブ（MYLOTARG（登録商標）、hP67.6、抗ＣＤ３３、急性骨髄性白血病などの白血病に適応される)、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標）)、トシツモマブ（BEXXAR（登録商標）、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性腫瘍に適応される)、MDX-210（HER-2/neu癌遺伝子タンパク質生成物および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するＩ型Ｆｃ受容体（FcガンマRI）に同時に結合する二重特異性抗体）、オレゴボマブ（OVAREX（登録商標）、卵巣がんに適応される)、エドレコロマブ（edrecolomab）（PANOREX（登録商標）)、ダクリズマブ（ZENAPAX（登録商標）)、パリビズマブ（SYNAGIS（登録商標）、ＲＳＶ感染などの呼吸器症状に適応される)、イブリツモマブ  チウキセタン（ZEVALIN（登録商標）、非ホジキンリンパ腫に適応される）、セツキシマブ（ERBITUX（登録商標）)、MDX-447、MDX-22、MDX-220（抗ＴＡＧ−７２)、IOR-C5、IOR-T6（抗ＣＤ１）、IOR EGF/R3、セロゴバブ（celogovab）(ONCOSCINT（登録商標）OV103)、エプラツズマブ(LYMPHOCIDE（登録商標）)、ペムツモマブ（pemtumomab）(THERAGYN（登録商標）)、Gliomab-H（脳腫瘍、黒色腫に適応される)が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、免疫チェックポイントタンパク質を阻害する抗体であり、例えば、ペムブロリズマブ（Keytruda（登録商標）)またはニボルマブ(Opdivo（登録商標）)などの抗ＰＤ−１抗体、あるいは、イピリムマブ（Yervoy（登録商標）などの抗CTLA−4抗体である。他の抗体および抗体フラグメントは、本明細書において提供される通り、合成プロモーターに動作可能に連結していてもよい。
【００４２】
制御タンパク質は、いくつかの態様において、転写因子または免疫制御タンパク質であってもよい。非限定的で例示的な転写因子には：Ｒｅｌ−Ａ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ｂ、ｐ５０およびｐ５２などのＮＦｋＢファミリーの転写因子；Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２、Ｊｕｎ、ＪｕｎＢおよびＪｕｎＤなどのＡＰ−１ファミリーの転写因子；ＡＴＦ；ＣＲＥＢ；ＳＴＡＴ−１、−２、−３、−４、−５および−６；ＮＦＡＴ−１、−２および−４；ＭＡＦ；甲状腺因子；ＩＲＦ；Ｏｃｔ−１および−２；ＮＦ−Ｙ；Ｅｇｒ−１；およびＵＳＦ−４３、ＥＧＲ１、Ｓｐ１、およびＥ２Ｆ１が含まれる。他の転写因子は、本明細書において提供される通り、合成プロモーターに動作可能に連結していてもよい。
【００４３】
本明細書において用いられる通り、免疫制御タンパク質は、免疫反応を制御するタンパク質である。免疫制御の非限定的な例には：抗体、アジュバント（例えば、フラジェリン、ムラミルジペプチド）、インターロイキンを含むサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／変異型）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３−リガンド）、および免疫制御抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、またはこれらの分子の一本鎖／抗体フラグメント）が含まれる。他の免疫制御タンパク質は、本明細書において提供される通り、合成プロモーターに動作可能に連結していてもよい。
【００４４】
本明細書において用いられる通り、抗原は、抗体の抗原結合部位により結合する分子もしくは分子の一部である。いくつかの態様において、抗原は、対象に投与される際または対象の細胞における発現の際に、抗原に特異的に結合する抗体の産生を活性化するかまたは増加させる。病原体の抗原は、当業者によく知られており、細菌、ウイルス、および他の微生物の一部（被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛および毒素）を含むがこれらに限定されない。本開示に従って用いられ得る抗原の例には、限定することなく、癌抗原、自己抗原、微生物抗原、アレルゲンおよび環境抗原が含まれる。他の抗原は、本明細書において提供される通り、合成プロモーターに動作可能に連結していてもよい。
【００４５】
いくつかの態様において、本開示の抗原は、癌抗原である。癌抗原は、癌細胞によって選択的に発現されている抗原であり（すなわち、非癌細胞においてよりも、癌細胞においてより高いレベルで発現されている）、いくつかの場合においては、癌細胞においてのみ発現されている。癌抗原は、癌細胞内または癌細胞の表面で発現され得る。本開示に従って用いられ得る癌抗原には、限定することなしに、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、大腸関連抗原（ＣＲＣ）―Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖およびＣＤ２０が含まれる。癌抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ-Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ―Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４およびＭＡＧＥ−Ｃ５からなる群から選択されてもよい。癌抗原は、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８およびＧＡＧＥ−９からなる群から選択されてもよい。
【００４６】
癌抗原は、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、線腫性大腸ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原Ｓｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ−核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ＣＤ２０ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択されてもよい。他の癌抗原は、本明細書において提供される通り、合成プロモーターに動作可能に連結していてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドベースの治療分子は、融合タンパク質である。融合タンパク質は、ペプチド結合を介し、直接的もしくは間接的（例えば、リンカーを介して）のいずれかで、互いに共有結合している２種の異種のタンパク質、タンパク質ドメインまたはタンパク質フラグメントを含むタンパク質である。いくつかの態様において、融合タンパク質は、付加的タンパク質のコーディング領域を伴ったフレーム内にタンパク質のコーディング領域を含む核酸によりコードされており、したがって、タンパク質が一緒に融合した単一のタンパク質の翻訳をもたらす。
【００４８】
「核酸」は、一緒に共有結合している少なくとも２個のヌクレオチドであり、いくつかの場合には、ホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「骨格」）を含有してもよい。（「コンストラクト」ともいわれる）「操作された核酸」は、天然に存在しない核酸である。しかしながら、操作された核酸は全体としては天然に存在しないが、天然に存在するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様において、操作された核酸は、異なる生物由来の（例えば、異なる種由来の）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの態様において、操作された核酸には、マウスのヌクレオチド配列、細菌のヌクレオチド配列、ヒトのヌクレオチド配列、および／またはウイルスのヌクレオチド配列が含まれる。操作された核酸には、組み換え核酸および合成核酸が含まれる。「組み換え核酸」は、核酸をつなげることにより構築された分子（例えば、単離された核酸、合成核酸またそれらの組み合わせ）であり、いくつかの態様においては、生細胞において複製することができる。
【００４９】
「合成核酸」は、増幅された、または化学的にもしくは他の手段によって合成された、分子である。合成核酸には、化学的に修飾され、または他によって修飾されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対となり得るものが含まれる。組み換えおよび合成核酸にはまた、前記のいずれかの複製に由来する核酸分子が含まれる。
【００５０】
いくつかの態様において、本開示の核酸は、核酸類似体とみなされ、少なくとも一部に、例えば、ホスホルアミド（phosphoramide）、ホスホロジチオアート、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合および／またはペプチド核酸を含む他の骨格を含有してもよい。核酸は、特定される通り、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であってもよく、あるいは、一本鎖および二本鎖の両者の部分を含有していてもよい。いくつかの態様において、核酸は、三本鎖配列の部分を含有していてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよび／またはｃＤＮＡ、ＲＮＡあるいはハイブリッドであってもよく、ここで核酸は、（例えば、人工のまたは天然の）デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのあらゆる組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基のあらゆる組み合わせを含有する。
【００５１】
本開示の核酸には、１以上の遺伝子エレメントが含まれてもよい。「遺伝子エレメント」は、核酸の発現において役割を有する（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、または操作された核酸の個々の生成物をコードする、特定のヌクレオチド配列（例えば、ガイドＲＮＡ、タンパク質および／または、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉分子をコードするヌクレオチド配列）をいう。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学的方法を用いて生成し得る（例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press参照）。
【００５２】
いくつかの態様において、核酸は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）クローニング（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343-345、2009；およびGibson, D.G. et al. Nature Methods、901-903、2010参照。各々が、参照により本明細書に組み込まれる。）を用いて生成される。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、典型的には単一チューブの反応において３種の酵素活性を用いる：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性、およびＤＮＡリガーゼ活性。５’エキソヌクレアーゼ活性は５’末端配列を取り除き（chew back）、アニーリングのための相補的配列を暴露させる。次いで、ポリメラーゼ活性がアニールされる領域の隙間を埋める。次いで、ＤＮＡリガーゼが、切れ目を閉じて、ＤＮＡフラグメントを一緒に共有結合で連結させる。接合するフラグメントの重複配列は、Golden Gate Assemblyにおいて用いられるものよりもずっと長いので、より高い割合の正確な会合（assembly）がもたらされる。
【００５３】
いくつかの態様において、操作された核酸は、ベクターで細胞に送達される。「ベクター」は、遺伝子材料（例えば、操作された核酸）を、例えば、それが複製および／または発現され得る細胞へ、人工的に運搬するための媒体として用いられる核酸（例えば、ＤＮＡ）をいう。いくつかの態様において、ベクターは、エピソーム性ベクターである（例えば、Van Craenenbroeck K. et al. Eur. J. Biochem. 267, 5665, 2000参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。ベクターの非限定的な例は、プラスミドである（例えば、図３）。プラスミドは、一般的には、宿主細胞において自動的に複製することができる二本鎖の環状ＤＮＡ配列である。プラスミドベクターは、典型的には、宿主においてプラスミドの半独立的複製をさせる複製起点を含有し、また、導入遺伝子インサートをも含有する。
【００５４】
プラスミドは、例えば、核酸インサートの挿入のためのヌクレオチドオーバーハング（overhang）を含む「多重クローニング部位（multiple cloning site）」、およびインサートのいずれかの側の多重制限酵素コンセンサス部位（multiple restriction enzyme consensus site）を含むさらなる特徴を有していてもよい。ベクターの別の非限定的な例は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターである。したがって、本開示は、配列番号１〜１２２６３のいずれか1つにより同定されるヌクレオチド配列または配列番号１〜１２２６３のいずれか1つにより同定されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むプロモーターを含む操作された核酸を含む、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスが提供される。
【００５５】
細胞
本開示の操作された核酸を含む細胞もまた提供される。本明細書に記載の合成プロモーターを含む操作された核酸は、いくつかの態様において、全身に送達され、または癌細胞、良性腫瘍細胞などの特定の細胞種もしくは他の病変細胞に送達される。いくつかの態様において、操作された核酸は、腫瘍細胞または癌細胞を有する対象に送達され、合成プロモーターが、腫瘍細胞または癌細胞において特異的に、動作可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を駆動させる。
【００５６】
癌性細胞は、あらゆる種の癌性細胞であってもよく、前癌性新生物、悪性腫瘍、転移性癌、または、癌性もしくは前癌性とみなされるであろうような、コントロール不可能な細胞増殖により特徴付けられるあらゆる疾患または障害を含むがこれらに限定されない。癌は、原発性または転移性癌であり得る。癌には、眼癌、胆道癌、膀胱癌、胸膜癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、髄膜癌、腎臓癌、グリア芽腫および髄芽腫を含む脳腫瘍、乳癌、頸部癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌（gastric cancer）、急性リンパ性および骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病ならびに成人Ｔ細胞性白血病リンパ腫を含む血液腫瘍、ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物、肝臓癌、肺癌、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じる卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫、黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌、精上皮腫、非精上皮腫、奇形腫、絨毛腫、間質性腫瘍および生殖細胞腫瘍などの生殖細胞腫瘍を含む精巣癌、甲状腺腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌、ならびに、腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が含まれるが、これらに限定されない。一般的にみられる癌としては、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、大腸癌および脳腫瘍が含まれる。いくつかの態様において、腫瘍は、黒色腫、癌腫、肉腫、またはリンパ腫である。
【００５７】
本開示の操作された核酸は、広い範囲の宿主細胞種において用いられ得る。いくつかの態様において、操作された核酸は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、細菌細胞（大腸菌細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または、他の細胞種において用いられる。本開示の操作された核酸は、例えば、ヒト対象などの対象において、in vivoで用いられ得る。
【００５８】
いくつかの態様において、合成プロモーターを含む操作された核酸は、哺乳類細胞において、例えば、研究または治療用途のために用いられる。例えば、いくつかの態様において、操作された核酸は、ヒト細胞、霊長類細胞（例えば、vero細胞）、ラット細胞（例えば、ＧＨ３細胞、ＯＣ２３細胞）またはマウス細胞（例えば、ＭＣ３Ｔ３細胞）において用いられる。様々なヒト細胞株が存在し、これには、限定することなしに、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、アメリカ合衆国国立癌研究所（the National Cancer Institute）の６０種の細胞株由来の癌細胞（ＮＣＩ６０）、ＤＵ１４５（前立腺癌）細胞、Ｌｎｃａｐ（前立腺癌）細胞、ＭＣＦ−７（乳癌）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳癌）細胞、ＰＣ３（前立腺癌）細胞、Ｔ４７Ｄ（乳癌）細胞、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）細胞、Ｕ８７（グリア芽腫）細胞、（骨髄腫からクローニングされた）ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、およびＳａｏｓ−２（骨癌）細胞が含まれる。
【００５９】
いくつかの態様において、操作された核酸は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において発現される。いくつかの態様において、操作された核酸は、例えば、多能性幹細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を含む、ヒト多能性幹細胞）などの幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）において発現される。「幹細胞」は、無限期間に培養中で分裂し、分化した細胞を生み出す能力を有する細胞をいう。「多能性幹細胞」は、全体的な生物の成長を維持することができるのみでなく、生物の全組織に分化することができる、幹細胞種をいう。「ヒト人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞の定義的特性を維持するのに重要な遺伝子および因子を発現させられることにより、胚性幹細胞様の状態に再プログラミングされた、体性の（例えば、成熟したまたは成体の）細胞をいう（例えば、Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト人工多能性幹細胞は、幹細胞マーカーを発現しており、全３種の胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）に特徴的な細胞を生成することができる。
【００６０】
本開示に従って用いられ得る細胞株のさらなる非限定的な例には、２９３−Ｔ、２９３−Ｔ、３Ｔ３、４Ｔ１、７２１、９Ｌ、Ａ−５４９、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ４３１、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ２Ｃ１２、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＧＲ８、ＣＨＯ、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、Ｅ１４Ｔｇ２ａ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、High Five細胞、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、ＨＵＶＥＣ、Ｊ５５８Ｌ細胞、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、Ｋｕ８１２、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ  １、２、３・・・４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＧ６３、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＲＣ５、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＡＬＭ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ  Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＰＴＫ２、Ｒａｊｉ、ＲＢＬ細胞、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓ２、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、ＳｉＨａ、ＳＫＢＲ３、ＳＫＯＶ−３、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ２、Ｔ８４、ＴＨＰ１、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１およびＹＡＲ細胞が含まれる。
【００６１】
本開示の細胞は、いくつかの態様において改変されている。改変細胞は、外在性核酸または天然に存在しない核酸を含有する細胞である。いくつかの態様においては、改変細胞は、ゲノム核酸中に変異を含有する。いくつかの態様においては、改変細胞は、外在性の、独立的に複製する核酸を含有する（例えば、操作された核酸は、エピソーム性ベクターに存在する）。いくつかの態様においては、改変細胞は、外来性または外在性核酸を細胞に導入することにより生成される。核酸は、細胞に、例えば、エレクトロポレーション（例えば、Heiser W.C. Transcription Factor Protocols: Methods in Molecular Biology（商標） 2000; 130: 117-134参照）、化学的（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション（例えば、Lewis W.H., et al., Somatic Cell Genet. 1980 May; 6(3): 333-47; Chen C.、et al., Mol Cell Biol. 1987 August; 7(8): 2745-2752参照）、組み換えプラスミドを含有する細菌プロトプラストによる融合（例えば、Schaffner W. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Apr; 77(4): 2163-7参照）、形質導入（transduction）、接合（conjugation）、または細胞核内への直接的な精製ＤＮＡのマイクロインジェクション（例えば、Capecchi M.R. Cell. 1980 Nov; 22(2 Pt 2): 479-88）などの慣用的方法により導入され得る。
【００６２】
いくつかの態様において、細胞は、レポーター分子を発現するように改変される。いくつかの態様において、細胞は、レポーター分子に動作可能に連結された誘導性プロモーターを発現するように改変される（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または他のレポーター分子などの蛍光タンパク質）。
【００６３】
いくつかの態様において、細胞は、目的の内在性タンパク質を過剰発現するように改変される（例えば、目的タンパク質をコードする内在性遺伝子の近傍において、プロモーターまたは他の制御エレメントを導入または改変することを介して、その発現レベルを増加させる）。いくつかの態様において、細胞は、変異生成により改変される。いくつかの態様において、細胞は、目的の遺伝子変化を生成するために、（例えば、挿入または相同組み換えを介して）細胞内に操作された核酸を導入することにより改変される。
【００６４】
いくつかの態様において、操作された核酸は、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）または他の細胞種における発現のために、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、ＤＮＡ配列のある種のヌクレオチドを、ＤＮＡ配列の他種のヌクレオチドに変換することによって、目的遺伝子の翻訳効率を増加させることにより、生きている生物におけるタンパク質発現を最大化するための技術である。コドン最適化の方法は、よく知られている。
【００６５】
いくつかの側面において、本明細書においてはまた、細胞内に、（例えば、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種以上の）操作された核酸または（例えば、操作された核酸を含む）エピソーム性ベクターを導入することを含む方法も提供される。操作された核酸は、細胞に、例えば、エレクトロポレーション、化学的（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション、組み換えプラスミドを含有する細菌プロトプラストを用いた融合、形質導入、接合、または細胞核内への直接的な精製ＤＮＡのマイクロインジェクションなどの慣用的方法により導入され得る。
【００６６】
本開示の操作された核酸は、当該分野において既知のあらゆるin vivo送達方法により、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に送達され得る。例えば、操作された核酸は、経静脈的に送達され得る。いくつかの態様において、操作された核酸は、送達ビヒクル（例えば、非リポソームナノ粒子またはリポソーム）で送達される。いくつかの態様において、操作された核酸は、癌または他の疾患を有する対象に、全身的に送達され、対象の癌細胞または病変細胞において特異的に活性化される（転写が活性化される）。
【００６７】
上述の通り、操作された核酸は、ウイルス性送達システム（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ヘルパー依存性アデノウイルスシステム、ハイブリッドアデノウイルスシステム、ヘルペス単純、ポックスウイルス、レンチウイルス、Epstein-Barrウイルス）または非ウイルス性送達システム（例えば、物理的：裸のＤＮＡ（naked DNA）、ＤＮＡボンバードメント（bombardment）、エレクトロポレーション、流体力学的（hydrodynamic）、超音波またはマグネトフェクション（magnetofection）；あるいは、化学的：カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマーまたは脂質ポリマー（参照により本明細書に組み込まれる、Nayerossadat N et al. Adv Biomed Res. 2012; 1: 27）を用いて、対象の細胞（例えば、癌細胞）に送達され得る。いくつかの態様において、非ウイルス性ベースの送達システムは、ヒドロゲルベースの送達システムである（例えば、Brandl F, et al. Journal of Controlled Release, 2010、142(2): 221-228参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６８】
さらなる態様
本開示はさらに、下記の番号付けされた段落に記載のさらなる態様を提供する：
１．配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列、または配列番号１〜１２２６３のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むプロモーターを含む、操作された核酸。
２．プロモーターの活性が、健常細胞と比較して病変細胞において増加している、段落１の操作された核酸。
３．プロモーターの活性が、健常細胞と比較して病変細胞において減少している、段落１の操作された核酸。
４．病変細胞が、乳癌細胞、結腸癌細胞および卵巣癌細胞から選択される、段落２または３の操作された核酸。
５．プロモーターが、治療タンパク質をコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結している、段落１〜４のいずれか１つの操作された核酸。
【００６９】
６．段落１〜５のいずれか１つの操作された核酸を含む、細胞。
７．段落１〜５のいずれか１つの操作された核酸を細胞に送達する方法。
８．段落１〜５のいずれか１つの操作された核酸を対象に送達する方法。
９．段落６の細胞を、対象に送達する方法。
１０．ヌクレオチド配列が、配列番号１〜４０のいずれか１つにより同定される、または、配列番号１〜４０のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列である、段落１〜５のいずれか１つの操作された核酸。
【００７０】
１１．ヌクレオチド配列が、配列番号１により同定される、段落１０の操作された核酸。
１２．ヌクレオチド配列が、配列番号２により同定される、段落１０の操作された核酸。
１３．ヌクレオチド配列が、配列番号３により同定される、段落１０の操作された核酸。
１４．ヌクレオチド配列が、配列番号４により同定される、段落１０の操作された核酸。
１５．ヌクレオチド配列が、配列番号５により同定される、段落１０の操作された核酸。
１６．ヌクレオチド配列が、配列番号６により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７１】
１７．ヌクレオチド配列が、配列番号７により同定される、段落１０の操作された核酸。
１８．ヌクレオチド配列が、配列番号８により同定される、段落１０の操作された核酸。
１９．ヌクレオチド配列が、配列番号９により同定される、段落１０の操作された核酸。
２０．ヌクレオチド配列が、配列番号１０により同定される、段落１０の操作された核酸。
２１．ヌクレオチド配列が、配列番号１１により同定される、段落１０の操作された核酸。
２２．ヌクレオチド配列が、配列番号１２により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７２】
２３．ヌクレオチド配列が、配列番号１３により同定される、段落１０の操作された核酸。
２４．ヌクレオチド配列が、配列番号１４により同定される、段落１０の操作された核酸。
２５．ヌクレオチド配列が、配列番号１５により同定される、段落１０の操作された核酸。
２６．ヌクレオチド配列が、配列番号１６により同定される、段落１０の操作された核酸。
２７．ヌクレオチド配列が、配列番号１７により同定される、段落１０の操作された核酸。
２８．ヌクレオチド配列が、配列番号１８により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７３】
２９．ヌクレオチド配列が、配列番号１９により同定される、段落１０の操作された核酸。
３０．ヌクレオチド配列が、配列番号２０により同定される、段落１０の操作された核酸。
３１．ヌクレオチド配列が、配列番号２１により同定される、段落１０の操作された核酸。
３２．ヌクレオチド配列が、配列番号２２により同定される、段落１０の操作された核酸。
３３．ヌクレオチド配列が、配列番号２３により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７４】
３４．ヌクレオチド配列が、配列番号２４により同定される、段落１０の操作された核酸。
３５．ヌクレオチド配列が、配列番号２５により同定される、段落１０の操作された核酸。
３６．ヌクレオチド配列が、配列番号２６により同定される、段落１０の操作された核酸。
３７．ヌクレオチド配列が、配列番号２７により同定される、段落１０の操作された核酸。
３８．ヌクレオチド配列が、配列番号２８により同定される、段落１０の操作された核酸。
３９．ヌクレオチド配列が、配列番号２９により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７５】
４０．ヌクレオチド配列が、配列番号３０により同定される、段落１０の操作された核酸。
４１．ヌクレオチド配列が、配列番号３１により同定される、段落１０の操作された核酸。
４２．ヌクレオチド配列が、配列番号３２により同定される、段落１０の操作された核酸。
４３．ヌクレオチド配列が、配列番号３３により同定される、段落１０の操作された核酸。
４４．ヌクレオチド配列が、配列番号３４により同定される、段落１０の操作された核酸。
４５．ヌクレオチド配列が、配列番号３５により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７６】
４６．ヌクレオチド配列が、配列番号３６により同定される、段落１０の操作された核酸。
４７．ヌクレオチド配列が、配列番号３７により同定される、段落１０の操作された核酸。
４８．ヌクレオチド配列が、配列番号３８により同定される、段落１０の操作された核酸。
４９．ヌクレオチド配列が、配列番号３９により同定される、段落１０の操作された核酸。
５０．ヌクレオチド配列が、配列番号４０により同定される、段落１０の操作された核酸。
【００７７】
５１．ヌクレオチド配列が、配列番号４１〜４９のいずれか１つにより同定される、または、配列番号４１〜４９のいずれか１つにより同定されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列である、段落１〜５のいずれか１つの操作された核酸。
５２．ヌクレオチド配列が、配列番号４１により同定される、段落５１の操作された核酸。
５３．ヌクレオチド配列が、配列番号４２により同定される、段落５１の操作された核酸。
５４．ヌクレオチド配列が、配列番号４３により同定される、段落５１の操作された核酸。
５５．ヌクレオチド配列が、配列番号４４により同定される、段落５１の操作された核酸。
５６．ヌクレオチド配列が、配列番号４５により同定される、段落５１の操作された核酸。
【００７８】
５７．ヌクレオチド配列が、配列番号４６により同定される、段落５１の操作された核酸。
５８．ヌクレオチド配列が、配列番号４７により同定される、段落５１の操作された核酸。
５９．ヌクレオチド配列が、配列番号４８により同定される、段落５１の操作された核酸。
６０．ヌクレオチド配列が、配列番号４９により同定される、段落５１の操作された核酸。
６１．段落１〜５または１０〜６０のいずれか１つの操作された核酸を含む、腫瘍溶解性ウイルス。
６２．腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスである、段落６１の腫瘍溶解性ウイルス。
【００７９】
例
例１．合成プロモーター活性および特異性−合成プロモーター１〜４０
レポーターコンストラクトは、合成プロモーターの下流にＥＣＦＰまたはｍＫａｔｅ２のコーディング配列を配置することにより構築した。レポーターコンストラクトは、表１に列挙された通りの異なる細胞株にトランスフェクションした。ＥＣＦＰまたはｍＫａｔｅ２の発現が、各細胞株における合成プロモーターの活性を示す。一連の合成プロモーター（表２）の活性は、異なる細胞株において試験した。結果は、図１〜７において提供される。
【００８０】
表１．プロモーター活性試験のための異なる細胞株
【表１】
2020509772.tif 000002
【００８１】
ＥＣＦＰの発現を制御するために用いられた合成プロモーターの例：
表２．合成プロモーター１〜４０
【表２】
2020509772.tif 000003
【００８２】
【表３】
2020509772.tif 000004
【００８３】
【表４】
2020509772.tif 000005
【００８４】
【表５】
2020509772.tif 000006
【００８５】
【表６】
2020509772.tif 000007
【００８６】
【表７】
2020509772.tif 000008
【００８７】
例２．合成プロモーター活性および特異性−合成プロモーター４１〜４９
レポーターコンストラクトは、ライブラリーから選択されたプロモーター（合成プロモーター４１〜４９）の支配下にｍＫａｔｅ２のコーディング配列を配置することにより作製した。レポーターコンストラクトは、表３に列挙された通りの異なる細胞株にトランスフェクションした。Ｐ１１９は、陰性コントロール細胞であり、ｐ１５３は、強力なｈＵｂＣプロモーターの下流でｍＫａｔｅ２を発現するｍＫａｔｅ２陽性細胞である。
【００８８】
ｍＫａｔｅ２の発現が、各細胞株における合成プロモーターの活性を示す。結果は、図８および表２において提供される。合成プロモーター４１および４４は、腫瘍細胞株において、試験された他の合成プロモーターよりも、より活性であることが見出された。興味深いことに、合成プロモーター４１および４４の両者は、ＣＲＥＢ、ＥＧＲ１、ＳＰ１およびＥ２Ｆ１を含む腫瘍特異的ＴＦに対する結合モチーフを有する。別の一連の合成プロモーターの活性は、表３において示される通りの異なる細胞株において試験された。
【００８９】
表３．異なる細胞株における合成プロモーター活性
【表８】
2020509772.tif 000009
【００９０】
【表９】
2020509772.tif 000010
【００９１】
表４．合成プロモーター１〜４９
【表１０】
2020509772.tif 000011
【００９２】
例３．ＭＤＡ−ＭＢ−４５３特異的プロモーター発現
２種の合成プロモーターであるＳ（ＵＳＦ１）ｐおよびＳ（ＭＡＦＫ）ｐを、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞株を特異的に標的とするが、非腫瘍原性の乳房上皮細胞株であるＭＣＦ−１０Ａを標的としないように設計した。各プロモーターにより生成されるｍＫａｔｅ２アウトプットは、両方の細胞株においてコントロール（Ｇ８−Ｐｅ）と比べた。Ｓ（ＵＳＦ１）ｐおよびＳ（ＭＡＦＫ）ｐは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞においてのみ強いアウトプットを生成した（図９）（Nissim, L. et al. Cell 2017; 171: 1138-1150も参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９３】
Ｓ（ＵＳＦ１）ｐ
CCACGTGCAGACCACGTGCTCGCCACGTGCGACCCACGTGCCTACCACGTGCACTCCACGTGCTGCCCACGTGCGTACCACGTGCG（配列番号１２２６６）
【００９４】
Ｓ（ＭＡＦＫ）ｐ
TGCTGAGTCAGCAAGATGCTGAGTCAGCATCGTGCTGAGTCAGCAGACTGCTGAGTCAGCACTATGCTGAGTCAGCAACTTGCTGAGTCAGCATGCTGCTGAGTCAGCAGTATGCTGAGTCAGCAG（配列番号１２２６８）
【００９５】
例４．合成プロモーター活性および特異性
レポーターコンストラクトは、ライブラリーから選択されたプロモーター（図１０参照）の支配下にｍＫａｔｅ２のコーディング配列を配置することにより作製した。レポーターコンストラクトは、異なる細胞株：１０Ａ（正常乳房組織細胞）またはＭＤＡ（癌性乳房細胞）にトランスフェクションした。
ｍＫａｔｅ２の発現が、各細胞株における合成プロモーターの活性を示す。結果は、図１０において提供される。一部の合成プロモーターは、腫瘍細胞株において、試験された他の合成プロモーターよりも、より活性であることが見出された。
【００９６】
例５．
合成プロモーターライブラリーは、ドキシサイクリン誘導性ＧＡＴＡ６発現に基づいて、肝芽様オルガノイドを形成するヒト人工多能性幹細胞株（ＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣ）において試験した（Guye, P. et al.  Nature Communications, 2016、これは参照により本明細書に組み込まれる）。２Ｄオルガノイドは、ＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣ  ２５，０００個／ｃｍ２を平底のマトリゲルコートされた組織培養プレートに播種することにより調製した。分化は、先に記載されたプロトコール（Guye, P. et al. Nature Communications, 2016）にしたがい、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）  １０００ｎｇ／ｍＬを５日間添加することにより開始した。５日目に、合成プロモーターライブラリーと形質導入コントロールとを当モルで混合して、オルガノイドに形質導入した。ウイルス力価は、形質導入マーカーが集団の＜１５％に発現するように定性的に調整した。分化は、全部で１６日間継続され、その後、オルガノイドをＰＢＳで洗浄して、Accutaseを用いてばらばらにし、単一の細胞懸濁液にした。細胞は、遠心し（３００×ｇで３分）、ＡＰＥＬ２培地に再懸濁した（StemCell Technologies）。再懸濁された細胞をＦＡＣＳ（BD FACS Aria, BD Biosciences）により、手動で規定したゲートを用いてｍＫａｔｅ陽性および陰性集団に分類した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の抽出は、全ての他の試料について行われた。
【００９７】
ｍＫａｔｅ陽性集団由来のｇＤＮＡを用いて、５０サイクルを必要とすることを除いては他の試料について記載された通りに、合成プロモーターをＰＣＲにより増幅させた。増幅されたプロモーターライブラリーおよびｐＬＮ４９０は、ＡｓｃＩおよびＳｂｆＩで消化し、ゲルにより精製した。消化および精製されたプロモーターおよびｐＬＮ４９０骨格を、ライゲーションして、大腸菌で形質転換し、アンピシリンにより選択した。コロニーを採取し、オルガノイド中においてｍＫａｔｅ発現をもたらす合成プロモーターを同定するために、サンガー法による配列決定を行った。サンガー法による配列決定で同定された候補プロモーターは、トリプリケートで確認した。確認は、ｍＫａｔｅ２の上流の特定プロモーターを発現するレンチウイルスを用いて、未分化ＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣに形質導入することにより行われた。形質導入は、ポリブレン２μｇ／ｍｌにより行い、９０％を超えるＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣにおいてｍＫａｔｅ２発現をもたらすことを定性的に評価した。オルガノイドは、上記の通りに分化させ、Leica TCS SP5 II共焦点顕微鏡を用いて、毎日、２０日間にわたって画像を取得した。各プロモーターはまた、ドキシサイクリンを添加せずにmTeSR1において細胞を培養することにより、＞５日間は未分化状態を維持したＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣにおいても発現させた。
【００９８】
ｈｉＰＳＣでＧＡＴＡ６発現を介して誘導された肝芽様オルガノイドにおける合成プロモーターライブラリーの発現は、１３９６個のｍＫａｔｅ陽性細胞のプールからの、３７種の異なる候補プロモーターの同定をもたらした。各プロモーターは、それぞれ、特定のプロモーターを用いたＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣの形質導入および肝芽様オルガノイドへの分化の再現により、確認した。これらのプロモーターのうちの１８種をトリプリケートで確認し、それらのうちの７種は、全試料においてｍＫａｔｅ２陽性であることが見出された。２種のプロモーターは、デュプリケートでのみｍＫａｔｅ２陽性であった。ｍＫａｔｅ２活性を有するこれら９種のプロモーターのうち、８種はまた、未分化のＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣにおいても検出可能な活性を有していた（活性は、４種のプロモーターについてはトリプリケートで、１種のプロモーターについてはデュプリケートで、および３種のプロモーターについては単一試料のみで、確認することができた）。しかしながら、ＧＡＴＡ６−ｈｉＰＳＣにおけるそれらの活性は、一般的に、ごく少ない細胞集団に限られており、このことは、これら未分化幹細胞の転写因子プロファイルにおいてわずかな違いがあり得ることを示している。
【００９９】
ＲＥＬＡ、ＳＴＡＴ＿ｄｉｓｃ５、ＨＩＦ１ＡおよびＴＰ５３結合部位を有する合成プロモーターは、全てのトリプリケートにわたって一貫した挙動を示した。これらのプロモーターの活性およびパターンは、日毎に変化したが、このことは、細胞種特異的なプロモーターの活性を示唆している。さらに、プロモーターが活性である細胞のパターン、強度および数もまた変化した。例えば、ＨＩＦ１Ａプロモーターは、先に同定された外胚葉由来の細胞に類似している、大きな球状で活性化しているようにみえた（P. Guye, 2016）。さらに、シグナルは、これらの球状構造内でパターンを示し、このことは、さらなる細胞種特異性を示している。ｍＫａｔｅ２発現は、オルガノイドの成長において遅く（約１５日目）に突然出現し、徐々に消失していく。シグナルは推定外胚葉領域から消えていくので、平坦な構造を好むオルガノイドの近傍領域において出現し始めるのであろう。
【０１００】
ＴＰ５３およびＳＴＡＴ＿ｄｉｓｃ５は、両方とも、オルガノイド成長の間の早期に活性であり、形態学的に区別できる細胞に対しても外観的な選択性を示さない。ＴＰ５３は、ｈｉＰＳＣにおいて、および早期（２日目）のオルガノイドにおいて、広く活性であった。ｍＫａｔｅ２陽性細胞の頻度は時間を経て消えていくが、残った数少ない陽性細胞においては、シグナルは強いまま残っていた。ＳＴＡＴ＿ｄｉｓｃ５は、ｈｉＰＳＣにおいては活性でないが、およそ３日目にオンになり、４／５日目でピークになった。次いで、これは、オルガノイドが成熟するにつれ、徐々にオフになり、１２日目には事実上消失した。
【０１０１】
ＲＥＬＡは、まず、およそ４日目に数少ない細胞において、強力にオンになったが、実験の間にわたって、細胞集団のより大きな画分に継続的に広がっていった。このプロモーターは、平坦な形態が特定の領域で有利に働くようであった。さらに、いくつかの細胞は−そのｍＫａｔｅ２蛍光に基づいて−、他のプロモーターで観察されたパターンとは形態学的に区別できる、長く薄い形態を示した。
【０１０２】
全体として、候補プロモーターからのｍＫａｔｅ２発現の確認はまた、ｍＫａｔｅ陽性領域を同定するために各オルガノイドの多重領域をスクリーニングすることを一般的に必要とする、プロモーターの異種発現を明らかにした。このことは、形態学的に類似した領域が、合成プロモーターからの転写に影響を与えるＴＦプロファイルにおいて、わずかな違いをなおも示す可能性があることを示唆する。要するに、再現された経時的、空間的および形態学的観察は、肝芽様オルガノイドの成長の間に現れて成熟する特定の細胞種に対して非ランダムな選択性を示す。
【０１０３】
ｈｉＰＳＣを肝芽様オルガノイドに分化させるための先に記載された方法は、全３種の異なる胚葉から生じる細胞系統を有するオルガノイドにおいて、異種の多様な細胞構成をもたらす。この細胞種の異種性によって、合成プロモーターライブラリーの細胞種選択性を試験するためのプラットフォームとして、オルガノイドが理想的なものとなった。
【０１０４】
特定の細胞のＴＦプロファイルにおける変化は、細胞の分化と成熟に典型的なものであって、合成プロモーターがこの変化を活用するように期待されるため、細胞種特異的な遺伝子制御についてのプラットフォームを提供する。実際に、我々は、候補プロモーターのいくつかが、オルガノイドにおいて、特定の形態学に区別できる領域に対し経時的特異性を示すことを見出している。しかしながら、プロモーター活性は、形態学的に類似した領域間でしばしば異なり、このことは、プロモーターが、細胞種間でＴＦ活性における変化に対して非常に感受性が高い可能性があることを示唆している。徹底したスクリーニング、および特定の細胞集団に対するより標的化した調査によれば、合成プロモーターは、異種細胞集団の下位集団における遺伝子ネットワークを制御するための強力なツールである。
【０１０５】
表５．合成プロモーターの転写因子結合部位
【表１１】
2020509772.tif 000012
【０１０６】
【表１２】
2020509772.tif 000013
【０１０７】
【表１３】
2020509772.tif 000014
【０１０８】
【表１４】
2020509772.tif 000015
【０１０９】
【表１５】
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【０１１０】
【表１６】
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【０１１１】
【表１７】
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【０１１２】
【表１８】
2020509772.tif 000019
【０１１３】
【表１９】
2020509772.tif 000020
【０１１４】
【表２０】
2020509772.tif 000021
【０１１５】
【表２１】
2020509772.tif 000022
【０１１６】
【表２２】
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【０１１７】
【表２３】
2020509772.tif 000024
【０１１８】
【表２４】
2020509772.tif 000025
【０１１９】
【表２５】
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【０１２０】
【表２６】
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【０１２１】
【表２７】
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【０１２２】
【表２８】
2020509772.tif 000029
【０１２３】
【表２９】
2020509772.tif 000030
【０１２４】
【表３０】
2020509772.tif 000031
【０１２５】
【表３１】
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【０１２６】
【表３２】
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【０１２７】
【表３３】
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【０１２８】
【表３４】
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【０１２９】
【表３５】
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【０１３０】
【表３６】
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【０１３１】
【表３７】
2020509772.tif 000038
【０１３２】
【表３８】
2020509772.tif 000039
【０１３３】
【表３９】
2020509772.tif 000040
【０１３４】
【表４０】
2020509772.tif 000041
【０１３５】
【表４１】
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【０１３６】
【表４２】
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【０１３７】
【表４３】
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【０１３８】
【表４４】
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【０１３９】
【表４５】
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【０１４０】
【表４６】
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【０１４１】
【表４７】
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【０１４２】
【表４８】
2020509772.tif 000049
【０１４３】
【表４９】
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【０１４４】
【表５０】
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【０１４５】
【表５１】
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【０１４６】
【表５２】
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【０１４７】
【表５３】
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【０１４８】
【表５４】
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【０１４９】
【表５５】
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【０１５０】
【表５６】
2020509772.tif 000057
【０１５１】
【表５７】
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【０１５２】
【表５８】
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【０１５３】
【表５９】
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【０１５４】
【表６０】
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【０１５５】
【表６１】
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【０１５６】
【表６２】
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【０１５７】
【表６３】
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【０１５８】
【表６４】
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【０１５９】
【表６５】
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【０１６０】
【表６６】
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【０１６１】
【表６７】
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【０１６２】
【表６８】
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【０１６３】
【表６９】
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【０１６４】
【表７０】
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【０１６５】
【表７１】
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【０１６６】
【表７２】
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【０１６７】
【表７３】
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【０１６８】
【表７４】
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【０１６９】
【表７５】
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【０１７０】
【表７６】
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【０１７１】
【表７７】
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【０１７２】
【表７８】
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【０１７３】
【表７９】
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【０１７４】
【表８０】
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【０１７５】
【表８１】
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【０１７６】
【表８２】
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【０１７７】
【表８３】
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【０１７８】
【表８４】
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【０１７９】
【表８５】
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【０１８０】
【表８６】
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【０１８１】
【表８７】
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【０１８２】
【表８８】
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【０１８３】
【表８９】
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【０１８４】
【表９０】
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【０１８５】
本明細書において開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用されている主題に関し、参照によって組み込まれており、ある場合には、その文書全体が包含され得る。
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に逆の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
明確に逆の指示がない限り、１よりも多いステップまたは動作を含むここで請求される任意の方法において、方法のステップまたは動作の順序は、必ずしも方法のステップまたは動作が記載される順序に限定されないことが理解されるべきである。
【０１８６】
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「もつ（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）」などのすべての移行句は、開放型であること、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみ米国特許庁Manual of Patent Examining Procedures、Section 2111.03に記載されているように、それぞれ閉鎖型または半閉鎖型の移行句とする。
【図１】
2020509772.tif 000092
【図２】
2020509772.tif 000093
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020509772.tif 000097
【図７】
2020509772.tif 000098
【図８】
2020509772.tif 000099
【図９】
2020509772.tif 000100
【図１０】
2020509772.tif 000101
【配列表】
2020509772000001.app
【国際調査報告】
2020509772.tif 000102
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2020509772.tif 000104
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