(57)【要約】  本発明は、不整脈を予防または治療するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはそれをコードするヌクレオチドを含む、医薬組成物に関する。不整脈を予防または治療するための本発明の医薬組成物は、電気的機能を回復させ、構造的異常を引き起こす筋線維芽細胞の活性を阻害するために、心房性不整脈および心室性不整脈の主因である心臓の電気的異常を誘導するＣａＭＫＩＩの病理学的活性を阻害する。したがって、本発明の医薬組成物は、不整脈の予防または治療において効果的に使用することができる。
2020535203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
ＣＣＮ５タンパク質が配列番号１によって表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号２によって表される配列である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
遺伝子コンストラクトがそれに作動可能に連結したプロモーター配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
遺伝子コンストラクトがＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
遺伝子コンストラクトにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列が、５’から３’の方向で、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列−ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の順に含まれる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
遺伝子コンストラクトが、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列とＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の間に位置する自己切断配列を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
自己切断配列が、ブタテッショウウイルス−１、ゾセア・アシグナウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルスまたは口蹄疫ウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
自己切断配列がブタテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
自己切断配列が配列番号６によって表されるヌクレオチド配列である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
不整脈が心房性不整脈または心室性不整脈である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
発現ベクターがＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに搭載する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
発現ベクターにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列が、５’から３’の方向で、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列−ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の順に含まれる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
発現ベクターが、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列とＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の間に位置する自己切断配列をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
発現ベクターが、プラスミドベクターおよびコスミドベクターからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
組換えウイルスが、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１、１３および１８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、不整脈を予防または治療するための方法。
【請求項２２】
ＣＣＮ５タンパク質を含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２３】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＣＣＮ５タンパク質を対象に投与することを含む、不整脈を予防または治療するための方法。
【請求項２５】
ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を対象に投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
不整脈を予防または治療するための、請求項１、１３および１８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２７】
不整脈を予防または治療するための医薬の製造のための、請求項１、１３および１８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不整脈を予防または治療するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
不整脈は、心臓における電気信号に関する問題が原因で生じる、規則的な心臓リズムおよび効果的な心臓収縮の異常によって引き起こされる心疾患である。定義によれば、不整脈は、その発症場所に応じて、心房性不整脈および心室性不整脈に分類される。特に、心房性不整脈は、心房細動、心房頻脈および洞結節機能不全に分類され、心室性不整脈は、心室頻拍および心室細動に分類される（Swarminathan PD, et al. Circ Res 2012; 110:1661-1677）。
【０００３】
不整脈は、特に先進国において、かなりの罹患率および死亡率をもたらし、心停止は、先進国における死亡の主因のうちの１つである（Mozaffarian D, et al. Circulation 2015; 131: e29-e322）。特に、心室性不整脈は心臓性突然死の主因であり、心疾患の他の危険因子が心室性不整脈を加速および増幅する（Roberts-Thomson KC, et al. Nat Rev Cardiol 2011; 8: 311-321）。さらに、不整脈の中で、心房細動は、最も一般的な不整脈であり、発生率が高まっており、不整脈および発作などの疾患の発生率を大きく高める（Andrada D, et al. Circ Res 2014; 114; 1453-1458）。
【０００４】
不整脈の治療のための療法としては、抗不整脈薬、カテーテルアブレーション、心室性不整脈を治療するための埋め込み型除細動器が挙げられる。しかし、これらの療法は、限られた治療効果しか示さない。抗不整脈薬治療の主な機構であるイオンチャンネル遮断は、不整脈の長期にわたる治療および予防において制限を生じさせる。不整脈の阻害に関する臨床試験では、心室性期外収縮の治療の間、抗不整脈薬は、心筋梗塞の患者において、心血管死亡率を高めることが示された。現在使用されている抗不整脈薬のよくある副作用は、不整脈を促進させる危険性をともなう（Camm J, Int Cardiol 2012; 155: 363-371）。
【０００５】
一方、研究によって、ＣａＭＫＩＩ（Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）が不整脈の電気的態様において中心的役割を果たすことが報告された。ＣａＭＫＩＩ活性の増大は、イオンチャネルの過剰活性化、細胞内のＣａ２＋恒常性の欠陥および組織損傷につながり、それによって、不整脈を促進する。したがって、ＣａＭＫＩＩ活性の阻害は、不整脈を治療する効果的な方法として使用することができる。
【０００６】
不整脈に対する効果的な治療を開発するために、その病理学的機構および新しいその上流治療標的の発見の理解を通して、そのような治療を開発することが必要である。
【０００７】
したがって、本発明は、不整脈の発症および持続のための、ならびに不整脈の症状の持続的な悪化のための治療として、電気的機能不全の重要な標的であるＣａＭＫＩＩと構造的機能不全の主な原因である線維化とに同時に対処する治療を開発するための解決法を提供することを意図する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これに関して、本発明者らは、不整脈に対する効果的な治療を開発するために研究し、その結果、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードする遺伝子を含む医薬組成物が、ＣａＭＫＩＩの病理学的活性を阻害し、筋線維芽細胞の活性を阻害することを確認し、それによって、本発明を完成させた。さらに、本発明者らは、ＣＣＮ５タンパク質およびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードする遺伝子を含む医薬組成物が、不整脈の動物モデルを使用する実験において電気的機能不全に対して相乗的治療効果を示すことを確認し、それによって、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様では、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様では、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００１２】
本発明のさらになお別の態様では、本発明の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらになお別の態様では、活性成分としてＣＣＮ５タンパク質を含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００１４】
本発明のさらになお別の態様では、ＣＣＮ５タンパク質を対象に投与する工程を含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらになお別の態様では、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを対象に投与する工程を含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらになお別の態様では、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与する工程を含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらになお別の態様では、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを対象に投与する工程を含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
不整脈を予防または治療するための本発明の医薬組成物は、心房性不整脈および心室性不整脈の主因である心臓の電気的機能不全を誘導する、ＣａＭＫＩＩの病理学的活性を阻害し、その結果、心臓の電気的機能が回復し、構造的機能不全を引き起こす筋線維芽細胞の活性を阻害する。したがって、本発明の医薬組成物は、不整脈の予防または治療で効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５ベクターの構造の模式図を図示する。
【図２】図２はｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５ベクターの構造の模式図を図示する。
【図３ａ】図３ａは、ＣＣＮ５タンパク質の心臓線維化の阻害効果を確認するための、野生型マウスおよびＣＣＮ５  ＴＧマウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図３ｂ】図３ｂは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織をマッソンのトリクローム染色で染色することによって得られた写真を図示する。
【図３ｃ】図３ｃは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織をマッソンのトリクローム染色で染色し、染色された心房組織の線維化の程度を定量化することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図３ｄ】図３ｄは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるα−ＳＭＡのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図３ｅ】図３ｅは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるコラーゲンＩのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図３ｆ】図３ｆは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図３ｇ】図３ｇは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図３ｈ】図３ｈは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図３ｉ】図３ｉは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＦ４／８０のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図３ｊ】図３ｊは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図４ａ】図４ａは、心房細動に対するＣＣＮ５タンパク質の阻害効果を確認するための、野生型マウスおよびＣＣＮ５  ＴＧマウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図４ｂ】図４ｂは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心臓を摘出し、それに電気刺激を加えて心房細動を誘導し、心電図を測定することによって得られた結果を図示する。
【図４ｃ】図４ｃは、野生型マウスまたはＣＣＮ５  ＴＧマウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、そこから心臓を摘出し、電気刺激を心臓に加えて心房細動を誘導する場合に、誘導される心房細動の振動数を測定することによって得られた結果を図示する。
【図５ａ】図５ａは、心房細動に対するＣＣＮ５タンパク質の阻害効果を確認するための、ＨＬ−１細胞を使用する実験の概念図を図示する。
【図５ｂ】図５ｂは、ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、ＨＬ−１細胞におけるタンパク質、すなわち、ｐ−ＣａＭＫＩＩ（Ｔｈｒ２８６）、ＣａＭＫＩＩ、ｐＲｙＲ２（Ｓｅｒ２８０８）、ｐＲｙＲ２（Ｓｅｒ２８１４）、ＲｙＲ２、カルセケストリン２、Ｎａ＋／Ｃａ＋交換輸送体２（ＮＣＸ２）およびＧＡＰＤＨの発現をウエスタンブロッティングによって確認することによって得られた結果を図示する。
【図５ｃ】図５ｃは、ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、ＨＬ−１細胞におけるｐ−ＣａＭＫＩＩ（Ｔｈｒ２８６）／ＣａＭＫＩＩ値を計算することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５ｄ】図５ｄは、ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、ＨＬ−１細胞におけるｐＲｙＲ２（Ｓｅｒ２８０８）／ＲｙＲ２値を計算することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５ｅ】図５ｅは、ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、ＨＬ−１細胞におけるｐＲｙＲ２（Ｓｅｒ２８１４）／ＲｙＲ２値を計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５ｆ】図５ｆは、ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、ＨＬ−１細胞におけるカルセケストリン２／ＧＡＰＤＨ値を計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５ｇ】図５ｇは、ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、ＨＬ−１細胞におけるＮＣＸ２／ＧＡＰＤＨ値を計算することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図６ａ】図６ａは、心房細動に対するＣＣＮ５タンパク質の阻害効果を確認するための、ラット心房線維芽細胞を使用する実験の概念図を図示する。
【図６ｂ】図６ｂは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、培養したラット心房線維芽細胞を蛍光免疫化学で染色することによって得られた写真を図示する。
【図６ｃ】図６ｃは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房線維芽細胞におけるタンパク質、すなわち、α−ＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＴＧＦ−β１およびα−チューブリンの発現をウエスタンブロッティングによって確認することによって得られた結果を図示する。
【図６ｄ】図６ｄは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房線維芽細胞におけるα−ＳＭＡ／α−チューブリン値を計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図６ｅ】図６ｅは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房線維芽細胞におけるコラーゲンＩ／α−チューブリン値を計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図６ｆ】図６ｆは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房線維芽細胞におけるＴＧＦ−β１／α−チューブリン値を計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図６ｇ】図６ｇは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房組織におけるα−ＳＭＡのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図６ｈ】図６ｈは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房組織におけるコラーゲンＩのｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図６ｉ】図６ｉは、ラット心房線維芽細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、４８時間培養を行い、次いで、心房組織におけるＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図７ａ】図７ａは、心房線維化に対するＡＡＶ−ＣＣＮ５タンパク質の治療効果を確認するための、心房線維化誘導マウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図７ｂ】図７ｂは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、ウエスタンブロッティングによってＣＣＮ５のタンパク質発現を確認することによって得られた結果を図示する。
【図７ｃ】図７ｃは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、ＣＣＮ５のタンパク質およびｍＲＮＡ発現レベルを確認することによって得られた結果を図示する。
【図７ｄ】図７ｄは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織をマッソンのトリクローム染色で染色することによって得られた写真を図示する。
【図７ｅ】図７ｅは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織をマッソンのトリクローム染色で染色し、染色された心房組織における線維化の程度を定量化することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図７ｆ】図７ｆは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるα−ＳＭＡ／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図７ｇ】図７ｇは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるコラーゲンＩ／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図７ｈ】図７ｈは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＴＧＦ−β１／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図７ｉ】図７ｉは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＩＬ−１β／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図７ｊ】図７ｊは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＲＡＮＴＥＳ／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図７ｋ】図７ｋは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＦ４／８０／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図７ｌ】図７ｌは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にそこから心房組織を摘出し、心房組織におけるＭＣＰ−１／１８ｓ  ｒＲＮＡ値をｑＲＴ−ＰＣＲによって計算することによって得られた結果を図示する（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図８ａ】図８ａは、ＡＡＶ−ＣＣＮ５タンパク質の心房細動阻害効果を確認するための、心房細動誘導マウスを使用する動物実験の概念図を図示する。
【図８ｂ】図８ｂは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後に心電図を測定することによって得られた心電図結果を図示する。
【図８ｃ】図８ｃは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後に電気刺激による不整脈の発生率を観察することによって得られた結果を図示する。
【図８ｄ】図８ｄは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後に不整脈を誘導するのに必要とされる電気刺激の強度を観察することによって得られた結果を図示する。
【図８ｅ】図８ｅは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後にＣａ２＋の活動電位を測定することによって得られた結果を図示する。
【図８ｆ】図８ｆは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後に活動電位持続時間５０（ＡＰＤ５０）および活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）を測定することによって得られた結果を図示する。
【図８ｇ】図８ｇは、野生型マウスにアンギオテンシンＩＩを１４日間投与し、それにＡＡＶ−対照またはＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射し、注射してから４週後に脱分極速度を測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図９ａ】図９ａは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおける６週間にわたる短縮率および体重変化を図示する。
【図９ｂ】図９ｂは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスの右心室（ＲＶ）に１０Ｈｚの電気刺激を加え、写真を撮ることによって得られた光学マップを図示する。
【図９ｃ】図９ｃは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスの右心室（ＲＶ）に２０Ｈｚの電気刺激を加え、写真を撮ることによって得られた光学マップを図示する。
【図９ｄ】図９ｄは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおいてＣａ２＋の活動電位を測定することによって得られた結果を図示する。
【図９ｅ】図９ｅは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおいて活動電位持続時間５０（ＡＰＤ５０）および活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）を測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図９ｆ】図９ｆは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおいて活動電位持続時間の分散を測定することによって得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図９ｇ】図９ｇは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおける伝導速度および脱分極速度を図示する（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０ａ】図１０ａは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じたＣａ２＋の活動電位の変化を図示する。
【図１０ｂ】図１０ｂは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスの右心室における、ＩＳＯ処理に応じたＣａ２＋の再分極パターンの変化を図示する。
【図１０ｃ】図１０ｃは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じた活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）の変化を図示する。
【図１０ｄ】図１０ｄは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスをＩＳＯによる処理にかけた後に得られたＣａ２＋光学マップを図示する。
【図１０ｅ】図１０ｅは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスを  ＩＳＯによる処理にかけ、次いで、活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）を測定した後に得られた結果を図示する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図１０ｆ】図１０ｆは、野生型マウスおよび心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じた脱分極速度の変化を図示する（＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図１１ａ】図１１ａは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、６週にわたる短縮率を図示する。
【図１１ｂ】図１１ｂは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、６週にわたる左室壁厚の変化を図示する。
【図１１ｃ】図１１ｃは、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスならびにＩＳＯおよびＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスについてのＣａ２＋光学マップを図示する。
【図１１ｄ】図１１ｄは、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスならびにＩＳＯおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスについてのＣａ２＋光学マップを図示する。
【図１１ｅ】図１１ｅは、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じたＣａ２＋の活動電位の変化を図示する。
【図１１ｆ】図１１ｆは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスの左心室におけるＣａ２＋の再分極パターンを図示する。
【図１１ｇ】図１１ｇは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じた活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）の変化を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図１１ｈ】図１１ｈは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じた伝導速度を図示する（＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図１１ｉ】図１１ｉは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、ＩＳＯ処理に応じた脱分極速度を図示する。（＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図１２ａ】図１２ａは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスに電気刺激を加える場合に観察される心電図の変化を図示する。
【図１２ｂ】図１２ｂは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、不整脈を誘導するのに必要とされる電気刺激の強度を図示する。
【図１２ｃ】図１２ｃは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスにおける、電気刺激による不整脈の発生率を図示する。
【図１３ａ】図１３ａは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスから心臓を摘出し、マッソンのトリクローム染色で心臓を染色することによって得られた写真を図示する。
【図１３ｂ】図１３ｂは、野生型マウス、ＡＡＶ９−対照を注射した心室性不整脈誘導マウス、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスおよびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射した心室性不整脈誘導マウスの心臓組織において、タンパク質、すなわち、Ｎａｖ  １．５、ＦＡＰ、コネキシン４３、ＭｓｒＡ、Ｋｉｒ２．１、チューブリン、ＳＥＲＣＡ２ａ、Ｓｍａｄ７およびＣＣＮ５の発現をウエスタンブロッティングによって確認することによって得られた結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明を詳細に記載する。
【００２１】
本発明の一態様では、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＣＮ５タンパク質」は、血管疾患誘導、血管新生、腫瘍発生、線維化疾患誘導、細胞分化および生存などの細胞機能の調節において様々な役割を果たすＣＣＮファミリーに属するマトリックス細胞タンパク質を指す。ＣＣＮ５タンパク質は、他のＣＣＮファミリータンパク質と異なって、Ｃ末端ドメインがなく、ＷＩＳＰ−２、ＨＩＣＰ、Ｃｏｐ１、ＣＴＧＦ−Ｌなどとも呼ばれる。さらに、ＣＣＮ５タンパク質は、２５０アミノ酸配列の単一ポリペプチド鎖からなる。Ｎ末端にある２２アミノ酸の分泌性リーダー配列によって、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され、シグナルタンパク質として機能する。したがって、ヌクレオチド配列が細胞中で発現する場合、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され得る。ここで、ヌクレオチド配列はｍＲＮＡの形態でもよい。
【００２３】
特に、ＣＣＮ５タンパク質は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列を有し得る。さらに、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号４１によって表される配列でもよい。
【００２４】
さらに、ＣＣＮ５タンパク質の断片は、断片がＣＣＮ５タンパク質の活性を維持する限り、野生型ＣＣＮ５のＮ末端および／またはＣ末端の一部のトランケーションによって得られるものでもよい。特に、ＣＣＮ５タンパク質の断片は、Ｎ末端またはＣ末端から１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個のアミノ酸のトランケーションによって得られるものでもよい。
【００２５】
さらに、遺伝子コンストラクトは、それに作動可能に連結したプロモーター配列を含むことができる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結した」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列または一連の転写因子結合部位）と他のヌクレオチド配列の間の機能的連結を指す。調節配列は、他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節する。
【００２７】
特に、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列に連結したプロモーターは、好ましくは動物細胞で、より好ましくは哺乳類細胞で、ＣＣＮ５遺伝子の転写を調節するように作動し得る。プロモーターとしては、哺乳類ウイルスに由来するプロモーターおよび哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーターが挙げられる。プロモーターは、心臓細胞において特異的に作動することができる。
【００２８】
プロモーターは、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモーター、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）後期プロモーター、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つでもよい。しかし、プロモーターはこれらに限定されない。特に、プロモーターはＣＭＶプロモーターでもよい。
【００２９】
遺伝子コンストラクトは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。ここで、ヌクレオチド配列はｍＲＮＡの形態でもよい。
【００３０】
ここで、遺伝子コンストラクトにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列−ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の順に含まれ得る。ここで、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、終止コドンを含むことができる。
【００３１】
さらに、遺伝子コンストラクトにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列−ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の順に含まれ得る。ここで、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、終止コドンを含むことができる。
【００３２】
さらに、遺伝子コンストラクトは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列とＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の間に自己切断配列をさらに含むことができる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質」は、ＡＴＰエネルギーを使用して筋小胞体中へのカルシウムの再取り込みを引き起こすように機能するタンパク質を指す。駆出率（ＨＦｒＥＦ）が低減した心不全の患者において、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の著しく低下した発現レベルが観察されることが報告されている。ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現低下に起因する、筋小胞体中へのカルシウムの再取り込みの低減は、ミトコンドリア中へのカルシウムの流入が理由で、有害な酸素の発生、エネルギー代謝機能の破壊などを引き起こすことにより、細胞質中のカルシウム濃度を異常に高め、心筋細胞の収縮−弛緩機能を弱め、心筋細胞死の直接の原因となる。
【００３４】
特に、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は配列番号３によって表されるアミノ酸配列を有することができる。さらに、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４または配列番号４２によって表される配列でもよい。
【００３５】
さらに、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の断片は、断片がＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の活性を維持する限り、野生型ＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端および／またはＣ末端の一部のトランケーションによって得られるものでもよい。特に、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の断片は、Ｎ末端またはＣ末端から１〜１００個、１〜５０個、１〜２０個または１〜１０個のアミノ酸のトランケーションによって得られるものでもよい。
【００３６】
自己切断配列は、ブタテッショウウイルス−１（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ−１）、ゾセア・アシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）または口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列でもよい。特に、自己切断配列は、ブタテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、自己切断配列は、配列番号６によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３７】
ブタテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号５によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３８】
ゾセア・アシグナウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号７によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００３９】
ウマ鼻炎Ａウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号９によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００４０】
口蹄疫ウイルスに由来する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。さらに、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２によって表されるヌクレオチド配列でもよい。
【００４１】
遺伝子コンストラクトの一実施形態であるＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５が細胞中で発現する場合、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は筋小胞体膜中に挿入され得、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され得る。さらに、本発明の遺伝子コンストラクトの一実施形態であるＣＣＮ５−Ｐ２ａ−ＳＥＲＣＡ２ａが細胞中で発現する場合、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は筋小胞体膜中に挿入され得、ＣＣＮ５タンパク質は細胞外へ分泌され得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「不整脈」は、心臓における電気刺激の発生が不十分である、または刺激の伝達が不十分であるため、心臓が規則的な収縮を続けず、心拍が異常に速く、遅く、または不規則になる疾患を指す。
【００４３】
不整脈は、その発症場所に応じて、心房性不整脈および心室性不整脈に分類される。心房性不整脈としては、心房細動、心房頻脈または洞結節機能不全を挙げることができる。心室性不整脈としては、心室頻拍または心室細動を挙げることができる。
【００４４】
さらに、本発明の遺伝子コンストラクトは、リポソームを使用して細胞中にデリバリーされ得る。リポソームは、水性相中に分散したリン脂質によって自動的に形成され、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着または血漿細胞膜との融合などの機構を介して、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、細胞中にデリバリーされることを可能にする。
【００４５】
本発明の別の態様では、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００４６】
ＣＣＮ５タンパク質は、活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物について上述した通りである。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「発現ベクター」は、標的宿主細胞中で標的タンパク質を発現することができる組換えベクターを指し、組換えベクターは、遺伝子挿入断片が発現するように遺伝子挿入断片に作動可能に連結した必須調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトである。
【００４８】
さらに、発現ベクターは、細胞培養からのタンパク質の単離が促進されるように、融合ポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含むことができる。特定の開始シグナルも、挿入された核酸配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。こうしたシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび連続する配列を含む。ある場合には、ＡＴＧ開始コドンを含むことができる外来性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。こうした外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、様々な天然源および合成源のものでもよい。適切な転写または翻訳増強エレメントの導入によって、発現効率を高めることができる。
【００４９】
さらに、発現ベクターは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに搭載することができる。ここで、発現ベクターにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列−ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の順に含まれ得る。
【００５０】
発現ベクターは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドとＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドの間に自己切断配列をさらに含むことができる。自己切断配列は、活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物について上述した通りである。
【００５１】
発現ベクターは、本発明のＣＣＮ５タンパク質もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載することができる。ここで、使用されるベクターは、本発明のＣＣＮ５タンパク質および／またはＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を生成する限り、特に、制限されない。発現ベクターは、プラスミドベクターおよびコスミドベクターからなる群から選択されるいずれか１つでもよい。
【００５２】
プラスミドベクターとしては、限定はされないが、市販のプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤおよびｐＩＤＴＳＡＭＲＴ−ＡＭＰを挙げることができる。
【００５３】
不整脈は、活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物について上述した通りである。
【００５４】
本発明のさらに別の態様では、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００５５】
ＣＣＮ５タンパク質は、活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物について上述した通りである。
【００５６】
ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus）（ＡＡＶ）、レトロウイルス（retrovirus）、レンチウイルス（lentivirus）、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）、ワクシニアウイルスなどからなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、ウイルスは、限定はされないが、アデノ随伴ウイルスでもよい。
【００５７】
アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞範囲および優れた感染力が理由で、遺伝子導入ベクターとして広く使用されている。そのゲノムは、ＤＮＡ複製およびパッケージングに必須のシスエレメントである１００〜２００ｂｐの逆位末端配列（ＩＴＲ）に挟まれている。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスのＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする。
【００５８】
アデノウイルスベクターの中で、Ｅ１領域を欠く複製能力がないアデノウイルスが広く使用されている。その一方で、Ｅ３領域は、外来遺伝子の挿入のための部位を提供するために、従来のアデノウイルスベクターから除去される。
【００５９】
したがって、本発明のＣＣＮ５遺伝子は、除去されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／もしくはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域中に挿入することができる。特に、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子は、Ｅ３領域中に挿入することができる。
【００６０】
一方、細胞中にデリバリーされる標的ヌクレオチド配列は、除去されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／もしくはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域、好ましくはＥ３領域中に挿入することができる。さらに、標的ヌクレオチド配列は、プロモーター−標的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列−ＩＲＥＳ−ＣＣＮ５タンパク質遺伝子のような、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されたバイシストロニック発現系によっても発現させることができる。
【００６１】
およそ１０５％までの野生型ゲノムをアデノウイルス中にパッケージングすることができるので、約２ｋｂをアデノウイルス中にさらにパッケージングすることができる。したがって、アデノウイルス中に挿入される外来配列をアデノウイルスゲノムにさらに連結させることができる。
【００６２】
アデノウイルスは、４２の異なる血清型および亜群Ａ〜Ｆを有する。これらの中で、亜群Ｃに属するアデノウイルス５型は、本発明のアデノウイルスベクターを得るのに適している。アデノウイルス５型に関する生化学情報および遺伝情報は周知である。
【００６３】
アデノウイルスによってデリバリーされる外来遺伝子は、エピソームと同じ方法で複製するので、宿主細胞に対して非常に低い遺伝毒性しか有さない。
【００６４】
レトロウイルスは、遺伝子導入ベクターとして広く使用されており、なぜならば、レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノム中に挿入することができ、大量の外来遺伝物質をデリバリーすることができ、感染することができる広範囲の細胞を有するからである。
【００６５】
レトロウイルスベクターを構築するために、レトロウイルスの配列の代わりに、ＣＣＮ５遺伝子およびデリバリーされる標的ヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノム中に挿入して、複製能力がないウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含み、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）およびΨ配列を欠くパッケージング細胞株を構築する。この細胞株中に、ＣＣＮ５遺伝子、デリバリーされる標的ヌクレオチド配列、ＬＴＲおよびΨ配列を含む組換えプラスミドが導入されると、Ψ配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物の生成が可能になる。この転写産物はウイルス中にパッケージングされ、ウイルスが培地中に分泌される。組換えレトロウイルスを含む培地は収集され、濃縮され、遺伝子デリバリーシステムとして使用される。
【００６６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明の遺伝子デリバリーシステムとして適切であり、なぜなら、このウイルスは非分裂細胞に感染することができ、様々なタイプの細胞に感染する能力を有するからである。ＡＡＶベクターの構築および使用の詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号で開示されている。
【００６７】
典型的には、ＡＡＶウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復に挟まれている標的遺伝子配列（ＣＣＮ５遺伝子およびデリバリーされる標的ヌクレオチド配列）を含むプラスミドと末端反復を欠く野生型ＡＶＶコード配列を含む発現プラスミドとの同時形質転換によって生成される。
【００６８】
ＣＣＮ５遺伝子およびデリバリーされる標的ヌクレオチド配列を細胞中にデリバリーするために、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたは単純ヘルペスウイルスに由来するベクターも使用することができる。
【００６９】
さらに、ウイルスは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター配列をさらに含むことができる。作動可能に連結したプロモーター配列は、活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物について上述した通りである。
【００７０】
さらに、組換えウイルスは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに搭載することができる。ここで、組換えウイルスにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列−ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の順に含まれ得る。
【００７１】
さらに、組換えウイルスは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列とＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の間に自己切断配列を含むことができる。自己切断配列は、活性成分として遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物について上述した通りである。
【００７２】
不整脈は上記の通りである。
【００７３】
本発明では、遺伝子コンストラクトを含むウイルスを活性成分として含む医薬組成物を投与する方法を、当技術分野で既知のウイルス感染方法に従って実施することができる。さらに、本発明では、活性成分としての遺伝子コンストラクトが、裸の組換えＤＮＡ分子またはプラスミド中に含まれる場合、遺伝子を細胞中に導入するために、マイクロインジェクション方法、リポソーム媒介トランスフェクション方法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理方法および遺伝子銃方法を使用することができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物に含まれる医薬的に許容可能な担体は、製剤のために従来から使用されているものであり、それらの例としては、限定されないが、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルが挙げられる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、上記の成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、着香剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤などをさらに含むことができる。適切な医薬的に許容可能な担体および製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【００７６】
医薬組成物の剤形は、使用方法によって変わる可能性があり、注射剤にしてもよい。
【００７７】
本発明の医薬組成物の用量は、望ましくは、患者の年齢、性別、状態、体内への活性成分の吸収度、不活性化速度および組み合わせて使用される薬物を考慮して決定され、医薬組成物は、ＣＣＮ５タンパク質に基づいて０．０００１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で、投与することができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物の用量は、望ましくは、患者の年齢、性別、状態、体内への活性成分の吸収度、不活性化速度および組み合わせて使用される薬物を考慮して決定され、医薬組成物がウイルスである場合、医薬組成物は、成人基準で１日あたり１．０×１０３〜１．０×１０２０ウイルスゲノムの量で投与することができる。特に、本発明の医薬組成物は、成人基準で１日あたり１．０×１０３〜１．０×１０２０、１．０×１０８〜１．０×１０１６、１．０×１０１２〜１．０×１０１５または１．０×１０１３〜１．０×１０１４ウイルスゲノムの量で投与することができる。
【００７９】
さらに、医薬組成物がプラスミドベクターである場合、医薬組成物は、成人基準で１日あたり０．１μｇ／１μｌ〜１ｍｇ／１μｌの濃度で投与することができる。さらに、医薬組成物がプラスミドベクターである場合、用量は、０．１ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたはそれ以上を含み、それらの間のすべての値および範囲を含む。
【００８０】
本発明のさらになお別の態様では、活性成分としてＣＣＮ５タンパク質を含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質をさらに含むことができる。ＣＣＮ５タンパク質およびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質は上記の通りである。
【００８１】
本発明の医薬組成物は非経口的に投与され、非経口投与としては、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与、組織中への直接注射のための方法などが挙げられる。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「許容可能な担体」は、以下の物質のいくつかまたはすべてを指し、特定の投与に適したものを含む：溶媒、希釈剤、液体媒体、分散剤、懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増ちょう剤、乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤など。Alfanso R. Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th edition, 1995, Macna Publishing Co. Easton, PAは、既知の技法および組成物を用いて医薬組成物で使用するための様々な担体を提示する。医薬組成物の医薬的に許容可能な担体の例には、限定されないが、以下のもの：グルコース、ショ糖、デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン、セルロースならびにその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末状のトラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター、座薬用ワックス、ピーナッツバター、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝水、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、着色剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤および芳香剤、抗酸化剤などが含まれ、化合物製造者の裁量で含めることができる。
【００８３】
本発明のさらになお別の態様では、本発明の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００８４】
医薬組成物は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物でもよい。さらに、医薬組成物は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物でもよい。さらに、医薬組成物は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物でもよい。
【００８５】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、不整脈を罹患しているか、または不整脈の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００８６】
本発明のさらになお別の態様では、ＣＣＮ５タンパク質を対象に投与することを含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。さらに、方法は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を対象に投与することをさらに含むことができる。
【００８７】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、不整脈を罹患しているか、または不整脈の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００８８】
本発明のさらになお別の態様では、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトおよびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを対象に投与することを含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００８９】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、不整脈を罹患しているか、または不整脈の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００９０】
本発明のさらになお別の態様では、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターおよびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを対象に投与することを含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００９１】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、不整脈を罹患しているか、または不整脈の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００９２】
本発明のさらになお別の態様では、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスおよびＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを対象に投与することを含む、不整脈を予防または治療するための方法が提供される。
【００９３】
ここで、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。特に、対象は、不整脈を罹患しているか、または不整脈の危険性があり得る、ヒトまたは別の哺乳動物であり得る。
【００９４】
本発明のさらになお別の態様では、不整脈を予防または治療するための、本発明の医薬組成物の使用が提供される。
【００９５】
本発明のさらになお別の態様では、不整脈を予防または治療するための医薬の製造のための、本発明の医薬組成物の使用が提供される。
【００９６】
医薬組成物は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物でもよい。さらに、医薬組成物は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を搭載している発現ベクターを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物でもよい。さらに、医薬組成物は、活性成分として、ＣＣＮ５タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスを含む、不整脈を予防または治療するための医薬組成物でもよい。
【００９７】
本発明の形態
以下に、例として本発明を詳細に記載する。しかし、以下の実験例および実施例は本発明を例示するためだけであり、本発明は、以下の製造例および実施例に限定されない。
【００９８】
製造例１．ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の構築
ＣＣＮ５タンパク質を発現させるために、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＣＣＮ５遺伝子コンストラクトを構築した。さらに、ＣＣＮ５タンパク質とＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を同時に発現させるために、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５遺伝子コンストラクトを構築した（図１および２）。
【００９９】
遺伝子コンストラクトにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａ部分は、ヒトＳＥＲＣＡ２ａタンパク質のｃＤＮＡ配列からなる。次に連結されたＰ２Ａ部分はブタテッショウウイルス−１に由来する自己切断部位であり、２２アミノ酸をコードするヌクレオチド配列からなる。最後に、ＣＣＮ５部分はヒトＣＣＮ５タンパク質のｃＤＮＡ配列からなる。
【０１００】
ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５組換えプラスミドは、ｐＴＲ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼベクターからルシフェラーゼ部分を除去し、その代わりにＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５遺伝子コンストラクトを挿入することによって構築した。この組換えプラスミドによって生成されるタンパク質は、Ｐ２Ａ部位にある２１番目のアミノ酸グリシンと２２番目のアミノ酸プロリンの間の自己切断によって、ＳＥＲＣＡ２ａ部分とＣＣＮ５部分に分けられる。ＳＥＲＣＡ２ａ部分は小胞体膜中に残存したままであり得、その固有の機能を果たし得る。さらに、ＣＣＮ５部分は小胞体中に移動することができ、次いで、シグナルペプチドが切断されている形態で細胞外へ分泌され得、それによって、固有の機能を果たす。
【０１０１】
ヒトＣＣＮ５遺伝子をｐｄｓ−ＡＡＶ２−ＥＧＦＰベクターにクローニングして、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、血清型９）を構築した。ウイルスパッケージングおよびウイルスデリバリーの効率を向上させるために、ＡＡＶベクターの構築中にｅＧＦＰ配列を除去した。２９３Ｔ細胞を使用して組換えＡＡＶを構築した。細胞培養中のＡＡＶ粒子を収集し、硫酸アンモニウムで沈殿させた。イオジキサノール勾配を使用する超遠心分離法によって、生成物を精製した。遠心分離を使用してイオジキサノールを乳酸リンゲル溶液と交換するような方式で、いくつかの希釈および濃縮プロセスを通してＡＡＶ粒子を濃縮した。定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ＡＡＶの濃度を定量化した。
【０１０２】
実験方法１．実験モデルの生成および遺伝子導入
実験方法１．１．ＣＣＮ５過剰発現マウスモデルへのアンギオテンシンＩＩの注入による心房細動マウスモデルの生成
実験のために、雄のＣ５７ＢＬ６  ＷＴ（野生型、黒色の毛色）マウスおよびＣＣＮ５が心臓特異的に過剰発現しているトランスジェニック（ＴＧ）マウスを使用した。
【０１０３】
ＣＣＮ５−ＴＧマウスは、遺伝子の心臓特異的発現を誘導するα−ＭＨＣプロモーターを含むｐＮＣベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）にマウスＣＣＮ５遺伝子をサブクローニングし、マイクロインジェクション技法を使用してＣ５７ＢＬ／６の受精卵に生成物を導入することによって、生成した。さらに、意味あるマウス系統を獲得し、維持するために、Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）という名前の会社にシークエンシングを依頼した。サザンブロッティングを使用して、マウスゲノムにおけるＣＣＮ５導入遺伝子の存在を確認した。
【０１０４】
使用したすべてのマウスは、２０ｇ〜２５ｇの体重の８〜１０週齢マウスであった。ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ、アンギオテンシンＩＩの皮下注入によって心房細動を誘導した。ここで、アンギオテンシンＩＩは、小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  １００２、Ａｌｚｅｔ）を使用して、１日あたり３．０ｍｇ／ｋｇの濃度で１４日間皮下注入した。
【０１０５】
実験方法１．２．アンギオテンシンＩＩの注入およびウイルス注射による心房細動マウスモデルの生成
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、８〜１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１（灰色の毛色）マウスに麻酔をかけ、アンギオテンシンＩＩの皮下注入によって心房細動を誘導した。ここで、アンギオテンシンＩＩは、小型浸透圧ポンプを使用して、１日あたり３ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間皮下注入した。アンギオテンシンＩＩ注入で心房細動を誘導してから２週間後に、１×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇｓ）のＡＡＶ９−対照またはＡＡＶ９−ＣＣＮ５を、尾静脈を介して各マウスに注射した。
【０１０６】
実験方法１．３．アンギオテンシンＩＩの注入およびウイルス遺伝子導入による心室性不整脈マウスモデルの生成
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、８〜１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに麻酔をかけ、アンギオテンシンＩＩの皮下注入によって心室性不整脈を誘導した。アンギオテンシンＩＩは、小型浸透圧ポンプを使用して、１日あたり３ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間皮下注入した。アンギオテンシンＩＩ注入で心室性不整脈を誘導してから２週間後に、１×１０１１  ｖｇｓのＡＡＶ９−対照、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を、尾静脈を介して各マウスに注射した。
【０１０７】
実験方法２．組織染色
心臓組織を動物モデルから得て、次いで、室温で５日間１０％（ｗ／ｖ）ホルマリンで固定した。次いで、ＰＢＳで洗浄した。各試料をパラフィンに包埋し、組織ブロックを７μｍ厚の切片に切断した。
【０１０８】
マッソンのトリクローム染色を行って、線維化の程度を測定した。線維化が進行している部位の組織は青色に染色され、正常組織は赤色に染色される。線維化の程度は、全組織のうちから線維化が生じた部分を計算することによって表した。これは、光学顕微鏡下で観察し、Ａｐｅｒｉｏ  Ｉｍａｇｅｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プログラムを使用して解析した。
【０１０９】
実験方法３．リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現レベルの確認
心臓組織を動物モデルから得て、次いで、そこからｍＲＮＡを抽出して、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ）を使用して行った。これによって、それらの転写レベルを解析した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して心臓組織からＲＮＡを単離し、それからｃＤＮＡを合成した。定量的リアルタイムＰＣＲの条件は以下の通りであった：９４℃１０秒間を３７サイクル、５７℃１５秒間、７２℃５秒間。実験で使用したプライマーの情報を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
2020535203.tif 000003
【０１１１】
実験方法４．電気生理学的実験方法
実験方法４．１．ＣＣＮ５  ＴＧマウスを使用した心房細動モデルにおける心電図測定
心房の電気生理学研究のために、取り出したマウス心臓をランゲンドルフシステムに接続することによって、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で実験を行った。取り出した心臓をクレブス−ヘンゼライト緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース）で灌流し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガス、３７℃の温度および６０ｍｍＨｇの圧力を維持した。電気刺激を加える前に、ランゲンドルフシステムに接続することによって、取り出した心臓を１０分間安定化した。次いで、テフロンコーティングした銀双極電極を右心房、左心房および左心室に設置した。心房細動を誘導するために、自動刺激装置を使用して、２秒間のバーストペーシングを３回行った。最初の２秒間のバーストペーシングでは、５ｍｓのパルス持続時間で、４０ｍｓのサイクル長で刺激を加えた。刺激を加えた後に、３分間安定化させた。第２の２秒間のバーストを、５ｍｓのパルス持続時間で、２０ｍｓのサイクル長で加え、再び３分間安定化させた。最後の２秒間のバーストを、１０ｍｓのパルス持続時間で、２０ｍｓのサイクル長で加えた。少なくとも１秒間不規則なＲ−Ｒ間隔を示し、不規則な急速なリズムを示した心房は、心房細動を有すると決定された。
【０１１２】
実験方法４．２．ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した心房細動マウスにおける心電図の測定
実験方法４．１で行ったように、取り出したマウス心臓をランゲンドルフシステムに接続することによって、エクスビボで実験を行った。特に、血液凝固を予防するために、ヘパリンをマウスに最初に投与し、１００％イソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、ＵＳＰ、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、マウスに麻酔をかけた。その後、マウスの心臓を摘出し、ランゲンドルフシステムに接続した。大動脈を介して心臓をカニューレに取り付け、この心臓を、１．５〜２．０分−１の流速で、タイロード溶液（ＮａＣｌ  １３０ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  ２４ｍＭ、ＫＣｌ  ４ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＣａＣｌ２  １．８ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  １．２ｍＭ、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６  ５．６ｍＭ、１％アルブミン）で灌流し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガス、３８±１℃の温度、ｐＨ７．３〜ｐＨ７．５および６０ｍｍＨｇ〜７０ｍｍＨｇの圧力（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＢＰ−１、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を維持した。電気機械式デカップラー（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｃｏｕｐｌｅｒ）（５ｍＭブレビスタチン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＳＡ）を使用して、心臓の機械的収縮を最小限にした。
【０１１３】
特別注文のＡｇ−ＡｇＣｌペーシング電極を右心房に設置し、他の電極を両方の心外膜表面および心中隔に固定した。心臓の前面を使用して、左心房の電気活動を半垂直的に連続的マッピングした（Ｍｉｇｈｔｅｘ  ＢｉｏＬＥＤ  Ｌｉｇｈｔ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｏｄｕｌｅ、ＢＬＳ  Ｓｅｒｉｅｓ）。
【０１１４】
容積測定心電図検査（Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ）を行って、不整脈を判定した。電子増幅器を使用して、１５０Ｈｚで増幅およびローパスフィルター処理を行って、心臓の容積測定心電図（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ）を連続的記録した。さらに、１ｋＨｚの速度でデジタルサンプリングを行った（ＢｉｏＰａｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＰ１５０）。電気信号および光信号で持続性不整脈の発生を確認するために、ペーシングを右心房における７Ｈｚ（ＰＣＬ＝１４０ｍｓ）の基本振動数で開始し、２Ｈｚ〜３Ｈｚの振動数で２ｍｓの刺激持続時間を用いながら、振動数を漸増させた。
【０１１５】
実験方法４．３．心房細動および心室性不整脈マウスモデルにおける光学マッピングのための実験方法
心臓の逆灌流を開始してから２０〜３０分後に、心拍が４Ｈｚ〜５Ｈｚの定常状態に達したら、０．３ｍｌの１５μＭ電位感受性色素（Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を大動脈の近くに注射することによって、心臓を染色した。単色光（Ｍｉｇｈｔｅｘ、ＢｉｏＬＥＤ）を使用して、５３０ｎｍの波長でフルオロフォアを励起させた。ロングパスバンドフィルター（＞５９０ｎｍ）を通して放射波長をフィルター処理し、これを、３×の総倍率で、８７．５μＭの空間分解能、１ｋＨｚのフレームレートおよび８０×８０画素のＣＣＤ素子（ＳｃｉＭｅａｓｕｒｅ、ＳｃｉＭｅａｓｕｒｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて投影した。
【０１１６】
フレームを選択することによってマウスの心臓に最適化された、ＭＡＴＬＡＢで書かれた特別注文のソフトウェア（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）によって、収集した生データを処理した。シグナル対ノイズ比を向上させ、心拍の変動性を低下させるために、整ったリズム中の８〜１０の連続した拍動について平均を計算した。各画素で５×５の均一なカーネルを使用して、画像を空間的に平均化し、そこからベースラインを引いた。次いで、生成物を最大振幅に対して正規化し、反転させた。少なくとも連続した１０フレームについて膜電位閾値が０．５を超えたポイントを活性化時間として決定した。
【０１１７】
実験方法５．ウエスタンブロッティング
本実験で使用した細胞および得た心臓は、広域性プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充した、ホモジナイズしたＲＩＰＡ緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム）を使用して調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、サイズによってタンパク質を分離し、このタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした。５％（ｗ／ｖ）スキムミルクで１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで洗浄した後、ｐ−ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＩ、Ｎａ＋／Ｃａ＋交換輸送体２（ＮＣＸ２）、ＲｙＲ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐＲｙＲ２（Ｓｅｒ２８０８）、ｐＲｙＲ２（Ｓｅｒ２８１４）（Ｂａｄｒｉｌｌａ）、ＧＡＰＤＨ（研究室で作製）、α−チューブリン、ＴＧＦ−β１、α−ＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ）、コラーゲンＩ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、ＮａＶ  １．５、コネキシン４３、Ｋｉｒ２．１（Ａｌｏｍｏｎｅ  ｌａｂｓ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ミトコンドリアペプチドのメチオニンスルホキシド還元酵素（ＭｓｒＡ）、チューブリン（Ａｂｃａｍ）、ＳＥＲＣＡ２ａ（２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｓｍａｄ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＣＮ５（Ｇｅｎｅｓｃｉｐｔ）の抗体と調製した膜を反応させた。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と膜を反応させ、化学発光基質（Ｄｏｇｅｎ）を使用して発光させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。ＬＡＳソフトウェアを使用して、ブロットをスキャンし、定量化した。
【０１１８】
実験方法６．心房線維芽細胞の単離および培養
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）白色ラットの心臓を使用して、白色ラットの心房から線維芽細胞を単離した。コラゲナーゼ溶液を使用して組織を消化することによって、左心房を単一細胞に分解した。心房から収集した細胞を最初に５０×ｇで３分間遠心分離した。このようにして得られた上清を収集し、再び５００×ｇで１０分間遠心分離した。このようにして得られた細胞層を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質を含むＤＭＥＭ培養を使用して培養した。２〜３日後、培養物を１００ｎＭアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時に対照馴化培地（ＣＭ−Ｃｏｎ）またはＣＣＮ５含有馴化培地（ＣＭ−ＣＣＮ５）による処理にかけた。４８時間後、実験を終了した。明確な実験結果のために、最初の継代から得られた左心房線維芽細胞のみを左心房線維芽細胞として使用した。
【０１１９】
実験方法７．ＣＭ−ＣＣＮ５の調製
ＣＭ−ＣＣＮ５を調製するために、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＣＮ５ＨＡプラスミドを使用した。ＨＥＫ２９３細胞を６０ｍｍの培養皿に５×１０５細胞で分注し、１日間安定化させた。次いで、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＣＮ５ＨＡのトランスフェクションを行った。４時間後、培地交換を行って、リポフェクタミンを除去した。次いで、２４時間培養を行い、得られた培養培地をＣＭ−ＣＣＮ５と名付けた。
【０１２０】
実験方法８．蛍光免疫化学
１５，０００細胞を１６ｍｍのカバーガラス上に分注し、安定化のために一晩インキュベートした。次いで、細胞を１００ｎＭアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、かつＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけ、インキュベートした。得られた細胞は、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液で固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を使用して細胞膜に透過性を持たせ、次いで、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液でブロッキングした。次いで、抗α−ＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ）抗体を用いて反応を進めさせ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート化抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を二次抗体として使用した。ヘキスト色素を使用して核を染色した。免疫化学にかけた細胞については、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用した。
【０１２１】
実験方法９．心エコー検査による心筋機能の測定
ケタミン（９５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ、心エコー検査を行った。記録は、２次元イメージングおよびＭモードトラッキング機能を介して行い、短縮率および心室サイズ比を決定した（ＧＥ  Ｖｉｖｉｄ  Ｖｉｓｉｏｎ）。
【０１２２】
実験例１．心房細動マウスモデルにおけるＣＣＮ５タンパク質の治療効果の確認
実験例１．１．ＣＣＮ５タンパク質の心房線維化阻害効果の確認
ＷＴマウスおよび実験方法１．１に記載されている方法によって生成されたＣＣＮ５  ＴＧマウスに、小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  １００２、Ａｌｚｅｔ）を使用して、１日あたり３．０ｍｇ／ｋｇの濃度で１４日間アンギオテンシンＩＩを皮下注入した。２週間後、マウスの心臓を摘出した。実験方法２に記載されている方法によって組織染色を行って、線維化の程度を確認した（図３ａ）。
【０１２３】
結果として、アンギオテンシンＩＩを注射した対照マウス群では、心房組織の約８％においてコラーゲンが蓄積していることが観察され、その一方で、アンギオテンシンＩＩを注射したＣＣＮ５  ＴＧマウス群では、コラーゲン蓄積は心房組織の約４％において観察され、これは、有意な低下を示すものである（図３ｂおよび３ｃ）。
【０１２４】
さらに、ｍＲＮＡ発現で生じる変化を確認するために、実験方法３に記載されている方法によって、マウス左心房からｍＲＮＡを摘出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１２５】
結果として、心臓線維化マーカー遺伝子、α−ＳＭＡ、コラーゲンＩおよびＴＧＦ−β１、ならびに炎症反応マーカー遺伝子、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、Ｆ４／８０、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）については、アンギオテンシンＩＩを注射した対照マウス群では、これらのｍＲＮＡ発現は増大し、その一方で、アンギオテンシンＩＩを注射したＣＣＮ５  ＴＧマウス群では、これらのマーカー遺伝子の発現は有意に低下した（図３ｄ〜３ｊ）。これらの結果から、ＣＣＮ５は、アンギオテンシンＩＩによって引き起こされる心房線維化を阻害するのに効果的であることが確認された。
【０１２６】
実験例１．２．ＣＣＮ５の心房細動阻害効果の確認
心房の電気生理学研究のために、実験４．１と同様の方式で、取り出したマウス心臓をランゲンドルフシステムに接続することによって、エクスビボで実験を行った。結果として、アンギオテンシンＩＩを注射したＷＴマウスにおいて、６匹の動物のうち４匹で心房細動が誘導された。しかし、アンギオテンシンＩＩを注射したＣＣＮ５  ＴＧマウスにおいて、４匹の動物のすべてが、電気刺激の後でさえ正常な心電図結果を示した（図４ｂおよび４ｃ）。これらの結果から、ＣＣＮ５は、アンギオテンシンＩＩによって引き起こされる心房細動を阻害することが確認された。
【０１２７】
実験例１．３．ＣＣＮ５による細胞内Ｃａ２＋濃度の調節の確認
マウス心房心筋細胞株であるＨＬ−１細胞（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＣＣＮ５が心筋細胞中のＣａ２＋を調整するという推定を検討した。さらに、ウエスタンブロッティングを使用して、培養されたＨＬ−１細胞中のＣａ２＋濃度に対するその調節効果を確認した。
【０１２８】
細胞レベルの実験では、ＣＣＮ５の効果を確認するために、実験例８に記載されている方法によって調製したＣＭ−ＣＣＮ５を使用した。ＨＬ−１細胞をアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−Ｃｏｎ（対照）またはＣＭ−ＣＣＮ５（実験群）による処理にかけた。４８時間後、タンパク質レベルの変化をウエスタンブロッティングでモニターした（図５ａ）。
【０１２９】
結果として、ＨＬ−１細胞を４００ｎＭのアンギオテンシンＩＩによる処理にかけた場合、ＣａＭＫＩＩのリン酸化（Ｔｈｒ２８７）が増加するが、ＣＭ−ＣＣＮ５による同時処理にかけた細胞においてＣａＭＫＩＩのリン酸化が減少することが見出された。アンギオテンシンＩＩによる処理にかけたＨＬ−１細胞では、Ｓｅｒ２８０８およびＳｅｒ２８１４における筋小胞体リアノジン受容体２（ＲｙＲ２）の過剰リン酸化が誘導されたが、そのような過剰リン酸化はＣＣＮ５によって阻害された。ＣＣＮ５によって、アンギオテンシンＩＩによって引き起こされるＮａ＋／Ｃａ＋交換輸送体２（ＮＣＸ２）の発現の増大も低下した。筋小胞体におけるカルシウム結合タンパク質であるカルセケストリン２の発現レベルはアンギオテンシンＩＩによって低下したが、その発現はＣＭ−ＣＣＮ５による同時処理にかけた細胞において増大した（図５ｂ〜５ｇ）。これらの結果から、ＣＣＮは心筋細胞を直接調節し、それにより、心房細動に関与することが確認された。
【０１３０】
実験例１．４．インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのＣＣＮ５の心房線維化阻害効果の確認
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）白色ラットの心臓を使用して、心房から線維芽細胞を単離した。実験方法６に記載されている方法によって、心房線維芽細胞を単離した。２〜３日後、単離した心房線維芽細胞を１００ｎＭアンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時に対照馴化培地（ＣＭ−Ｃｏｎ）または実験例８で調製したＣＣＮ５含有馴化培地（ＣＭ−ＣＣＮ５）による処理にかけた。４８時間後、実験を終了した（図６ａ）。アンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、かつＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけた線維芽細胞を実験方法８と同様の方式で蛍光免疫細胞化学検査にかけた。
【０１３１】
結果として、１００ｎＭアンギオテンシンＩＩによる処理にかけた線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、筋線維芽細胞特異的マーカータンパク質α−ＳＭＡを発現したが、ＣＭ−ＣＣＮ５による同時処理にかけた線維芽細胞はα−ＳＭＡを全く発現しなかった（図６ｂ）。
【０１３２】
さらに、実験方法５に記載されている方法に従って、培養した心房線維芽細胞をウエスタンブロッティングにかけて、心房線維化阻害効果を確認した。結果として、アンギオテンシンＩＩによる処理にかけた線維芽細胞はタンパク質、すなわち、α−ＳＭＡ、コラーゲンＩおよびＴＧＦ−β１の発現の増大を示したが、ＣＭ−ＣＣＮ５による同時処理にかけた線維芽細胞はこれらのタンパク質の発現の著しい低下を示した（図６ｃ〜６ｆ）。
【０１３３】
さらに、培養した心房線維芽細胞のｍＲＮＡ発現レベルを確認するために、心房線維化阻害効果をｑＲＴ−ＰＣＲによってモニターした。結果として、アンギオテンシンＩＩによる処理にかけ、同時にＣＭ−ＣＣＮ５による処理にかけた線維芽細胞において、対照レベルに対して、α−ＳＭＡ、コラーゲンＩおよびＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現レベルが低下していることが確認された（図６ｇ〜６ｉ）。これらの結果から、ＣＣＮ５は、線維化を調節し、それにより心房細動を阻害するだけでなく、心筋細胞を直接調節し、それにより心房細動に関与することが確認された。
【０１３４】
実験例１．５．心房細動マウスモデルにおけるＡＡＶ−ＣＣＮ５の心房線維化阻害効果の確認
実験方法１．２と同様の方式で、アンギオテンシンＩＩを３ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で８〜１０週齢マウスに注入した。２週の時点で、ＡＡＶ９−対照（対照）またはＡＡＶ９−ＣＣＮ５（比較群）を５×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇｓ）の量で尾静脈に注射した。４週間後に、心房組織をマッソンのトリクローム染色にかけ、分子解析した（図７ａ）。
【０１３５】
最初に、ＡＡＶ９ウイルスが心臓特異的に十分に発現しているかどうかを確認するために、ウエスタンブロッティングを使用して、心房組織におけるＣＣＮ５の発現を確認した。結果として、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したマウス群において、ＣＣＮ５タンパク質が過剰発現していることが確認された。さらに、心房組織におけるＣＣＮ５のｍＲＮＡ発現レベルの確認から得られた結果から、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の注射によって、ＣＣＮ５のｍＲＮＡも同様に増大したことが見出された（図７ｂおよび７ｃ）。
【０１３６】
トリクローム染色による心房のコラーゲン蓄積の程度の確認によって得られた結果から、アンギオテンシンＩＩ、続いてＡＡＶ９−対照を注射したマウスにおいて、心房組織の約６％でコラーゲンが蓄積しているが、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したマウス群では、コラーゲン蓄積の程度は約３％に低下していることが確認された（図７ｄおよび７ｅ）。
【０１３７】
さらに、実験方法３と同様の方式で、心房組織を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行って、線維化関連マーカー遺伝子、α−ＳＭＡ、コラーゲンＩおよびＴＧＦ−β１、ならびに炎症関連マーカー遺伝子、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｆ４／８０およびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現レベルを確認した。結果として、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５は、発現レベルがアンギオテンシンＩＩによって増大したこれらのマーカー遺伝子を有意に低下させることが見出された（図７ｆ〜７ｌ）。これらの結果から、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を使用してＣＣＮ５を心臓特異的に過剰発現させたマウスモデルにおいてでさえ、アンギオテンシンＩＩ誘導性心房線維化が効果的に阻害されることが確認された。
【０１３８】
実験例１．６．ＡＡＶ９−ＣＣＮ５によって示される心房細動阻害効果の確認
実験方法４．２と同様の方式でマウスモデルを生成し、６週目の終わりに心臓生理学実験を行った（図８ａ）。最初に、心電図を調べ、その結果として、ＡＡＶ９−対照を注射したマウス群では、アンギオテンシンＩＩによって心房機能が弱められ、それにより、電気刺激（ｓｔｉｍｕｌｉｕｓ）後に心房細動が連続的誘導されることが確認された。その一方で、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したマウス群では、心拍は、電気刺激後に正常なリズムに戻ることが観察された。Ｃａ２＋の活動電位（光信号）を測定した実験においてでさえ、ＡＡＶ９−対照を注射した群は、刺激後に伝導の不規則性を連続的示したが、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した群は、刺激後に正常な心房活性化を示した（図８ｂおよび８ｃ）。
【０１３９】
心電図解析の結果として、ＡＡＶ９−対照を注射したマウス群では、電気刺激後に５匹のマウスのうち４匹で心房細動が誘導されたが、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したマウス群では、５匹のマウスのうち２匹が心房の異常を示し、残りは正常な心房活性化を示した（図８ｄ）。
【０１４０】
心電図実験を行っている間に、電気刺激を加えて心房細動を誘導した場合、対照［模擬（Ｓｈａｍ）］マウス群は、心房細動を誘導するのに約２８Ｈｚの刺激を必要としたが、アンギオテンシンＩＩおよびＡＡＶ９−対照を注射した対照マウス群では、心房細動は、約２０Ｈｚ程度の低い刺激であっても十分に誘導された。その一方で、アンギオテンシンＩＩおよびＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したマウス群では、刺激を模擬群と同様のレベルである約２５Ｈｚまで上げた場合のみ心房細動が誘導されることが見出された（図８ｅ）。
【０１４１】
実験方法４．２で述べられているように、左心房の電気活動をマッピングして、Ｃａ２＋の活動電位を図表で表した。グラフ上の活動電位持続時間５０（ＡＰＤ５０）および活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）の各時点でグラフを解析した。結果として、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した群では、活動電位持続時間は、ＡＡＶ９−対照を注射した群と比較した場合、模擬群と同様の速度で出現することが確認された（図８ｆ）。
【０１４２】
各群について、図８ｅのグラフの傾斜を解析した。これは、活動電位の脱分極に必要とされる速度を示し、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したマウス群では、アンギオテンシンＩＩによって遅くなった脱分極に必要とされる速度が、模擬と同様のレベルに回復することが見出された（図８ｇ）。これらの結果から、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の注射によってＣＣＮ５が過剰発現しているマウス群においてでさえ、アンギオテンシンＩＩによって誘導される心房細動が確実に阻害されることが確認された。
【０１４３】
実験例２．心室性不整脈マウスモデルにおけるＡＡＶ−ＣＣＮ５およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の治療効果の確認
実験例２．１．心室性不整脈マウスモデルの生成
心室性不整脈マウスモデルは、実験方法１．３に記載されている方法によって生成した。使用した雄のＢ６Ｃ３Ｆ１  ＷＴ（野生型、灰色の毛色）マウスは、２０〜２５ｇの体重の８〜１０週齢マウスであった。アンギオテンシンＩＩは、３ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間皮下注入した。２週間後、心臓機能の変化を心エコー検査によって確認した。確認したマウスを無作為に選択し、ＣＣＮ５ベクター単独（ＡＡＶ９−ＣＣＮ５）またはＣＣＮ５とＳＥＲＣＡ２ａベクターの組み合わせ（ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５）を５×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇｓ）の量で注射した。次いで、最終的な機能評価のために、これらのマウスをさらに４週間維持した。
【０１４４】
最初に、アンギオテンシンＩＩによって心室性不整脈マウスモデルが適切に生成されたかを確認するために、対照マウス群（模擬）および比較マウス群（ＡｎｇＩＩ）の心臓機能を心エコー検査によって調べた。結果として、アンギオテンシンＩＩが皮下注射されたマウス群は、対照（模擬）と比較した場合、短縮率の低下を示した。しかし、これら２つの群は、マウスの体重に関して大きな違いを示さなかった（図９ａ）。
【０１４５】
心室頻拍を判定するために、実験方法４．３と同様の方式で、１０Ｈｚの電気刺激（図９ｂ）または２０Ｈｚの電気刺激（図９ｃ）を右心室（ＲＶ）に加えることによって、光学マッピングを行った。電気刺激が大きいほど、実験群と対照の間で明白な違いが観察された。アンギオテンシンＩＩを注射したマウス群では、２０Ｈｚの電気刺激を加えた場合、カルシウムイオンチャネルなどは、その本来の状態に局部的に回復せず、それにより、刺激伝達の不連続性が観察された。カルシウムの活動電位を図表で表し、図９ｄに図示する。グラフ上の活動電位持続時間５０（ＡＰＤ５０）および活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）の各時点でグラフを解析した。結果として、アンギオテンシンＩＩの注射によってより速い活動電位持続時間が達成されることが見出された（図９ｅ）。さらに、アンギオテンシンＩＩ群において、活動電位持続時間の分散度の有意な低下が観察された（図９ｆ）。伝導速度および活動電位の脱分極に必要とされる速度を解析した結果として、そのような速度はアンギオテンシンＩＩによって大きく低下することが見出された（図９ｇ）。これらの結果から、アンギオテンシンＩＩによって心室性不整脈マウスモデルが確実に生成されることが確認された。
【０１４６】
実験例２．２．心室性不整脈マウスモデルにおけるβ−アドレナリン受容体アンタゴニストの効果
イソプロテレノール（ＩＳＯ）は、β−アドレナリン受容体に臨床的に作用するので、心筋の収縮性を増大させ、それによって心拍出量を増大させる薬物である。アンギオテンシンＩＩ誘導性心室性不整脈マウスモデルでは、イソプロテレノールを使用してβ受容体を刺激した場合に、心室におけるＣａ２＋の活動電位が確認された（図１０ａ）。２０Ｈｚの電気刺激を右心室に加え、Ｃａ２＋の得られた再分極パターンを図で示した。
【０１４７】
結果として、アンギオテンシンＩＩを注射したマウスモデルでは、カルシウムの再分極パターンは、ＩＳＯ処理でさえも遅くなることが確認された（図１０ｂ）。活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）を解析した結果として、アンギオテンシンＩＩを注射したマウスモデルでは、ＩＳＯ処理は活動電位持続時間速度の違いをもたらさないことが見出された（図１０ｃ）。
【０１４８】
心室頻拍を判定するために、実験方法４．３と同様の方式で、２０Ｈｚの電気刺激を右心室（ＲＶ）に加えることによって、光学マッピングを行った。結果として、ＩＳＯで処理したアンギオテンシンＩＩマウス群は、ＩＳＯで処理した対照マウス群と比較した場合、刺激による伝導ブロックの不連続性を示した（図１０ｄ）。活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）を解析した結果として、模擬群と比較した場合、アンギオテンシンＩＩ処理したマウス群は、有意に増大した活動電位持続時間を示しが、ＩＳＯ処理ではわずかな変化しか示さなかった（図１０ｅ）。伝導速度を解析した結果として、アンギオテンシンＩＩを注射したマウス群は、模擬と比較した場合にはるかに遅い速度を示し、ＩＳＯ処理が伝導速度の回復をもたらさないことが確認された（図１０ｆ）これらの結果から、アンギオテンシンＩＩの注射は、β−アドレナリン受容体を刺激に対して非感受性にすることが見出された。
【０１４９】
実験例２．３．心室性不整脈マウスモデルにおけるＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の治療効果の確認
実験例２．３に記載されている実験方法によって、心室性不整脈モデルを確実に生成した。アンギオテンシンＩＩをマウスに２週間注射し、２週目の終わりに、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５ベクターをマウス尾静脈に注射した。合計で６週後、実験を終了し、心室性不整脈関連実験を行った。
【０１５０】
心エコー検査を行って、アンギオテンシンＩＩ誘導性心室性不整脈マウスモデルにおいて、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の影響を受ける心臓機能を確認した。ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の注射は、アンギオテンシンＩＩによって低下した短縮率を模擬レベルの短縮率を示すようにした。さらに、左室壁厚（ＬＶＳｄ）を解析した結果として、アンギオテンシンＩＩによって低下した左室壁厚が、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５によってほぼ正常レベルまで回復することが確認された（図１１ａおよび１１ｂ）。
【０１５１】
光学マッピングを使用して、Ｃａ２＋の活動電位を示した。２０Ｈｚの刺激で心室に電気刺激を加えた場合、ＩＳＯ処理にかかわらず、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５注射したマウス群において、伝導が規則的に広がることが見出された（図１１ｃおよび１１ｄ）。カルシウムの活動電位を図表で表し、図１１ｅに図示する。
【０１５２】
模擬、ＡｎｇＩＩ、ＡｎｇＩＩ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５、ＡｎｇＩＩ＋ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５のそれぞれの群について、ＩＳＯによる処理を行い、再分極マップを描くことによって解析を行った。結果として、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の注射は、アンギオテンシンＩＩの注射によって遅くなった再分極を、模擬と同様のパターンを有する再分極を示すようにすることが確認された（図１１ｆ）。
【０１５３】
Ｃａ２＋の活動電位持続時間７５（ＡＰＤ７５）を解析した結果として、アンギオテンシンＩＩによって増大した活動電位持続時間が、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の注射によって低下し（図１１ｇ）、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５によって模擬レベルまで確実に低下することが見出された。さらに、アンギオテンシンＩＩによって遅くなった伝導速度および脱分極速度が、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５の注射によって正常化することが確認された（図１１ｈおよび１１ｉ）。これらの結果から、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５は、アンギオテンシンＩＩによって誘導される心室性不整脈を治すのに効果的であることが確認された。
【０１５４】
さらに、アンギオテンシンＩＩ注射モデルにおいて、プログラムされた電気刺激（ＰＥＳ）によって誘導される心室性不整脈を確認した（図１２ａ）。心室性不整脈を誘導するための刺激頻度を解析した結果として、ＡｎｇＩＩマウス群において、心室性不整脈は、低い刺激頻度によってでさえ誘導されたが、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５を注射したマウス群において、心室性不整脈は、模擬群のレベル以上の刺激頻度によって誘導された。心室性不整脈の発生率を解析した結果として、心室性不整脈は、ＡｎｇＩＩマウス群において５／５のエピソード率で、ＡｎｇＩＩ＋ＡＡＶ９−ＣＣＮ５マウス群において１／５のエピソード率で、ＡｎｇＩＩ＋ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５マウス群において０／５のエピソード率で生じた（図１２ｂおよび１２ｃ）。
【０１５５】
不整脈は心臓線維化と密接に関係しているので、マッソンのトリクローム染色によって心臓線維化を測定した。結果として、アンギオテンシンＩＩによって誘導される心臓線維化は、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５またはＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５が注射された心臓において著しく低下していることが見出された（図１３ａ）。
【０１５６】
さらに、この現象はまた、心臓の電気信号を調節するチャネル関連タンパク質と密接に関連している。したがって、心臓組織におけるＮａＶ１．５およびコネキシン４３タンパク質の発現をウエスタンブロッティングによって調べた。結果として、アンギオテンシンＩＩによって引き起こされたチャネル関連タンパク質ＮａＶ１．５およびコネキシン４３の発現低下は、ＡＡＶ９−ＳＥＲＣＡ２ａ−Ｐ２Ａ−ＣＣＮ５によって回復することが確認された（図１３ｂ）。これらの結果から、ＣＣＮ５ベクター単独またはＳＥＲＣＡ２ＡとＣＣＮ５の共発現を使用する遺伝子療法は、アンギオテンシンＩＩによって誘導される心室頻拍の発生を阻害することもできることが確認された。
【図１】
2020535203.tif 000004
【図２】
2020535203.tif 000005
【図３ａ】
2020535203.tif 000006
【図３ｂ】
2020535203.tif 000007
【図３ｃ】
2020535203.tif 000008
【図３ｄ】
2020535203.tif 000009
【図３ｅ】
2020535203.tif 000010
【図３ｆ】
2020535203.tif 000011
【図３ｇ】
2020535203.tif 000012
【図３ｈ】
2020535203.tif 000013
【図３ｉ】
2020535203.tif 000014
【図３ｊ】
2020535203.tif 000015
【図４ａ】
2020535203.tif 000016
【図４ｂ】
2020535203.tif 000017
【図４ｃ】
2020535203.tif 000018
【図５ａ】
2020535203.tif 000019
【図５ｂ】
2020535203.tif 000020
【図５ｃ】
2020535203.tif 000021
【図５ｄ】
2020535203.tif 000022
【図５ｅ】
2020535203.tif 000023
【図５ｆ】
2020535203.tif 000024
【図５ｇ】
2020535203.tif 000025
【図６ａ】
2020535203.tif 000026
【図６ｂ】
2020535203.tif 000027
【図６ｃ】
2020535203.tif 000028
【図６ｄ】
2020535203.tif 000029
【図６ｅ】
2020535203.tif 000030
【図６ｆ】
2020535203.tif 000031
【図６ｇ】
2020535203.tif 000032
【図６ｈ】
2020535203.tif 000033
【図６ｉ】
2020535203.tif 000034
【図７ａ】
2020535203.tif 000035
【図７ｂ】
2020535203.tif 000036
【図７ｃ】
2020535203.tif 000037
【図７ｄ】
2020535203.tif 000038
【図７ｅ】
2020535203.tif 000039
【図７ｆ】
2020535203.tif 000040
【図７ｇ】
2020535203.tif 000041
【図７ｈ】
2020535203.tif 000042
【図７ｉ】
2020535203.tif 000043
【図７ｊ】
2020535203.tif 000044
【図７ｋ】
2020535203.tif 000045
【図７ｌ】
2020535203.tif 000046
【図８ａ】
2020535203.tif 000047
【図８ｂ】
2020535203.tif 000048
【図８ｃ】
2020535203.tif 000049
【図８ｄ】
2020535203.tif 000050
【図８ｅ】
2020535203.tif 000051
【図８ｆ】
2020535203.tif 000052
【図８ｇ】
2020535203.tif 000053
【図９ａ】
2020535203.tif 000054
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図９ｇ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
2020535203.tif 000073
【図１１ｈ】
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【図１１ｉ】
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【図１２ａ】
2020535203.tif 000076
【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020535203.tif 000081
2020535203.tif 000082
2020535203.tif 000083
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