(57)【要約】本発明は、腸管の炎症、例えば、炎症性腸疾患と関連する炎症などを、γδＴ細胞（例えば、Ｖγ４＋細胞）を調節することによって処置するのに有用な組成物及び方法を特徴とする。特定の実施形態は、異種タンパク質を発現するＶγ４＋細胞、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及びＨＮＦ４Ａの機能発現に寄与する遺伝子を含有するポリヌクレオチド、Ｖγ４＋細胞または遺伝子治療を使用して対象を処置する方法、ならびに腸管の炎症と関連する変異を有する対象を同定する方法を含む。本発明の組成物及び方法は、腸管の炎症及びがんの処置に使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質を発現する単離したＶγ４＋細胞。
【請求項２】
Ｖγ４が前記異種タンパク質であり、前記Ｖγ４＋細胞がＶγ４−細胞に由来する、請求項１に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項３】
前記Ｖγ４−細胞が免疫細胞である、請求項１または２に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項４】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項３に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項５】
前記リンパ球が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項４に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項６】
前記Ｔ細胞がγδＴ細胞である、請求項５に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項７】
前記γδＴ細胞がＶδ２−細胞である、請求項６に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項８】
前記Ｖγ４＋細胞がヒト細胞に由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項９】
Ｖγ４が内因的に発現されるタンパク質である、請求項１に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項１０】
Ｖγ４＋γδＴ細胞と関連する表面マーカーをさらに発現する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項１１】
前記表面マーカーが、ＣＤ１０３または２Ｂ４から選択される、請求項１０に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項１２】
前記表面マーカーが異種である、請求項１０または１１に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項１３】
前記細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離したＶγ４＋細胞。
【請求項１４】
１０６〜１０１０細胞の集団を含む組成物であって、前記集団の少なくとも１０％が、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記単離したＶγ４＋Ｔ細胞の集団である、組成物。
【請求項１５】
Ｖγ４タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、場合によりＶδ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、ベクター。
【請求項１６】
ＣＤ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／またはＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、ベクター。
【請求項１８】
前記ベクターが、ＢＴＮＬ３タンパク質及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードする、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の前記ベクターを含む、組成物。
【請求項２３】
対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度を増加させる方法に使用するための、請求項１４または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
対象の前記腸管内における炎症を処置する方法に使用するための、請求項１４または２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記対象の前記腸管内における前記炎症が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＩＢＤが、クローン病、及び／または潰瘍性大腸炎である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
参照発現レベルと比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する対象の腸管内における炎症の処置方法であって、前記対象に、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記単離したＶγ４＋細胞、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の前記ベクター、または請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の前記組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の前記減少した発現レベルが、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列の変異の結果である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記変異が、細胞表面に対するＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の輸送の減少または除去を特徴とする、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記変異が、欠失バリアント、融合バリアント及び／または一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記変異が、ＢＴＮＬ３イントロンにおける１つ以上のＳＮＰである、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記変異がＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の融合である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記変異が、ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質及び／またはＬ３Ｂ３０．２ｌｃ遺伝子型の発現を特徴とする、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記変異がヘテロ接合変異である、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
２つ以上の変異型が存在する、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
参照発現レベルと比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する対象の腸管内における炎症の処置方法であって、前記対象に、ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、方法。
【請求項３７】
ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターによってコードされる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象の腸管内におけるγδＴ細胞集団中の、Ｖγ４＋細胞の数の増加方法であって、Ｖγ４＋細胞の集団を前記対象に投与することを含み、前記投与されたＶγ４＋細胞の集団が、Ｖγ４の発現についてスクリーニングされている、方法。
【請求項４０】
前記対象がＩＢＤと診断されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＩＢＤが、クローン病、及び／または潰瘍性大腸炎である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中に変異を有する、請求項３９、４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象に投与される前記Ｖγ４＋細胞が、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記単離したＶγ４＋細胞である、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象に投与される前記Ｖγ４＋細胞が、異種タンパク質を発現するように改変されていない、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象に投与されるＶγ４＋細胞の前記集団が、前記対象の前記腸管内におけるＶγ４＋細胞の前記数を、前記腸管内の炎症に関する１つ以上の症状を軽減するのに効果的な数まで増加させる、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記腸管内の前記炎症がＩＢＤと関連している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＩＢＤが、クローン病、及び／または潰瘍性大腸炎である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
１つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における変異の同定方法であって、
（ａ）前記対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中の欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列のレベルを、前記欠失バリアントと関連する前記ポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較すると、前記参照レベルと比較して、前記対象の前記試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中の欠失バリアントと関連する前記ポリヌクレオチド配列のレベル増加が、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における前記変異の存在を示すこと、あるいは
（ｂ）前記対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列のレベルを、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードする前記ポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較すると、
前記参照レベルと比較して、前記対象の前記試料中におけるＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードする前記ポリヌクレオチド配列のレベル減少が、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における前記変異の存在を示すことを含む、方法。
【請求項５０】
前記参照レベルが、野生型ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８遺伝子を有する試料のものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記変異が、細胞表面に対するＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の輸送の減少または除去を特徴とする、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記変異が、欠失バリアント、融合バリアント、及び／またはＳＮＰである、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記変異が、前記ＢＴＮＬ３イントロン中におけるイントロンのＳＮＰである、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記変異がＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の融合である、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記変異が、ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質及び／またはＬ３Ｂ３０．２ｌｃ遺伝子型の発現を特徴とする、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記変異がヘテロ接合変異である、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
２つ以上の変異型が存在する、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
ＩＢＤを発症する可能性がある対象の同定方法であって、
（ａ）前記対象が、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中に変異を有するかを決定することと、
（ｂ）前記変異の存在に基づいて、ＩＢＤを発症する可能性がある前記対象を同定することとを含む、方法。
【請求項５９】
ステップ（ａ）が、請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の前記方法を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＩＢＤが、クローン病、及び／または潰瘍性大腸炎である、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
（ｃ）請求項２７〜４８のいずれか１項に記載の前記方法に従って前記対象を処置することをさらに含む、請求項５８、５９または６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年９月１５日出願のＵＳ６２／５５９２２５の優先権を主張し、その内容及び要素が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置を目的とした、腸管内のγδＴ細胞の活性化及び増強に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸（ＧＩ）管の慢性炎症を特徴とする。米国では３００万人を超える居住者が、また欧州では２５０万人がＩＢＤを有すると推計され、ＩＢＤの世界的有病率は、アジア、南アメリカ、及び中東の新興工業国においてＩＢＤが出現したために上昇している。腸管は、腸ホメオスタシスを維持する様々な免疫細胞を含有し、腸管内における異常な免疫細胞組成または活性に応答してＩＢＤが発生し得る。
【０００４】
腸管内の免疫応答を調節することを含むＩＢＤの新規処置が、当該技術分野において必要である。ヒト腸管上皮細胞は、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８を発現すると報告されている。これらの因子は、共同してヒト結腸Ｖγ４＋細胞の選択的なＴＣＲ依存性応答を誘導すると報告されている（Ｄｉ  Ｍａｒｃｏ  Ｂａｒｒｏｓ（２２  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１６）Ｃｅｌｌ  １６７  ２０３−２１８）。しかしながら、腸管内におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８と上皮内リンパ球（ＩＥＬ）との相互作用に関する、γδＴ細胞などのＩＥＬ上におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８が結合する受容体を含む詳細（Ｃｈａｐｏｖａｌ（２０１３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５６  ８１９−８２８）、ならびにＩＢＤ及び他の腸管炎症性障害におけるＶγ４＋細胞の役割は、依然として確立されていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、Ｖγ４＋細胞の非定型レベルまたは活性が、ヒト腸管炎症と関連することを見出した。Ｖγ４＋細胞の非定型レベルまたは活性は、ヒト腸管におけるブチロフィリン３（ＢＴＮＬ３）及び／またはブチロフィリン８（ＢＴＮＬ８）機能の低下に起因する可能性がある。これらの知見は、例えば、ＩＢＤ、例えば、潰瘍性大腸炎及び／またはクローン病などの腸管炎症と関連する状態の診断及び処置に有用な可能性がある。
【０００６】
様々な態様において、本発明は、腸管内のＶγ４＋細胞の非定型レベルまたはＶγ４＋細胞活性（例えば、ＨＮＦ４Ａの変異または機能喪失の結果としての、例えば、腸管内のＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の変異及び／またはＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の機能喪失と関連するＶγ４＋細胞の存在または活性の喪失）と関連する腸管内の炎症を処置するための組成物及び方法を提供する。本発明の態様の組成物及び方法は、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の発現を調整するためにＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチドを含み、これらは、患者（例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチドの変異についてヘテロ接合またはホモ接合の対象）の腸管内においてＶγ４＋細胞を動員する、保持する、またはさもなければその細胞の活性に影響を及ぼすことによって腸管の炎症（例えば、ＩＢＤ）に影響を与え得る。組成物及び方法はまた、腸管の炎症（例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチドの変異についてヘテロ接合の対象における、例えば、ＩＢＤ）あるいは腸管のがんを処置するためのＶγ４＋細胞の投与を含む。Ｖγ４＋細胞は、組換え細胞、例えば、異種タンパク質を発現する細胞であってよい。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、異種タンパク質を発現するＶγ４＋細胞を提供する。いくつかの実施形態では、Ｖγ４＋細胞はＶγ４−細胞に由来し、Ｖγ４は異種タンパク質である。Ｖγ４−細胞は、免疫細胞（例えば、自然リンパ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、またはリンパ球、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、もしくはＮＫ細胞など）を含む、任意の好適な細胞型の哺乳動物細胞であってよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞もしくはＣＤ４Ｔ細胞）またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はγδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ２細胞（例えば、Ｖγ９δ２細胞）である。いくつかの実施形態では、Ｖγ４＋細胞は、ヒト細胞に由来する。いくつかの実施形態では、Ｖγ４＋細胞は、人工多能性幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、Ｖγ４は、内因的に発現されるタンパク質であり（例えば、内因性Ｖγ４δ１＋細胞の場合におけるような）、Ｖγ４＋細胞によって発現される異種タンパク質は、Ｖγ４以外のタンパク質である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、異種タンパク質を発現するＶγ４＋細胞は、医薬の製造における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、異種タンパク質を発現するＶγ４＋細胞、またはその医薬は、対象の腸管内の炎症（例えば、ＩＢＤ、例えば、潰瘍性大腸炎及び／またはクローン病）あるいはがん（例えば、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、小腸癌（例えば、腺癌、肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、リンパ腫、または消化管間質腫瘍））の処置における使用を目的とする。例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋細胞、またはその医薬は、参照発現レベルと比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する（例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードする遺伝子の変異がヘテロ接合であることの結果として）対象の腸管内の炎症を処置する方法に使用され得る。参照発現レベルは、野生型発現レベルであり得る。別の例では、異種タンパク質を発現するＶγ４＋細胞、またはその医薬は、対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度（例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードする遺伝子の変異がヘテロ接合であることの結果として）を増加させる方法に使用され得る。
【０００９】
第２の態様では、本発明は、第１の態様によるＶγ４＋細胞の集団を含有する組成物を提供する。集団は、１０６〜１０１０細胞（例えば、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、１×１０９細胞〜５×１０９細胞、５×１０９細胞〜１×１０１０細胞、例えば、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、約５×１０９細胞、または約１×１０１０細胞）を含有してよい。いくつかの実施形態では、集団の１０〜５０％がＶγ４＋Ｔ細胞の集団である（例えば、集団の１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、または４０％〜５０％、例えば、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％が、Ｖγ４＋Ｔ細胞の集団である）。いくつかの実施形態では、組成物中におけるＶγ４＋Ｔ細胞の数は、１×１０５〜５×１０９（例えば、１×１０５細胞〜５×１０５細胞、５×１０５細胞〜１×１０６、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、または１×１０９細胞〜５×１０９細胞、例えば、約１×１０５細胞、約１．５×１０５細胞、約２×１０５細胞、約３×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、または約５×１０９細胞）である。いくつかの実施形態では、Ｖγ４＋細胞は、異種タンパク質（例えば、Ｖγ４またはＶγ４以外のタンパク質）を発現する。例えば、集団内の細胞は、第１の態様のＶγ４＋細胞であってよい。組成物は、１つ以上の追加成分、例えば、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに含んでよい。
【００１０】
第３の態様では、本発明は、Ｖγ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びＶδ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、Ｖγ４タンパク質及びＶδ１タンパク質をコードするポリシストロニックポリヌクレオチド）を含有するベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＤ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｖγ４タンパク質及びＶδ１タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターは、Ｔ細胞（例えば、非Ｖγ４＋細胞、例えば、αβＴ細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、もしくは制御性Ｔ細胞）、またはＶδ２細胞などの非Ｖγ４＋γδ細胞）中のＶγ４δ１受容体の形質導入における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、Ｖγ４タンパク質、Ｖδ１タンパク質、及びＣＤ３タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターは、Ｖδ１γ４受容体を発現させるために非Ｔ細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞）の形質導入における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどである。
【００１１】
第４の態様では、本発明は、Ｖγ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びＶδ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、Ｖγ４タンパク質及びＶδ３タンパク質をコードするポリシストロニックポリヌクレオチド）を含有するベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＤ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｖγ４タンパク質及びＶδ３タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターは、Ｔ細胞（例えば、非Ｖγ４＋細胞、例えば、αβＴ細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、もしくは制御性Ｔ細胞）、またはＶδ２細胞などの非Ｖγ４＋γδ細胞）中のＶγ４δ３受容体の形質導入における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、Ｖγ４タンパク質、Ｖδ３タンパク質、及びＣＤ３タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターは、Ｖγ４δ３受容体を発現させるために非Ｔ細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞）の形質導入における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｖγ４タンパク質、Ｖδ１タンパク質またはＶδ３タンパク質、及び／またはＣＤ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するベクターは、Ｖγ４＋Ｔ細胞の集団の製造における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、Ｖγ４＋Ｔ細胞の集団は、参照発現レベルと比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する（例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードする遺伝子の変異がヘテロ接合であることの結果として）対象の腸管内の炎症を処置することを目的とする。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｖγ４タンパク質、Ｖδ１タンパク質またはＶδ３タンパク質、及び／またはＣＤ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するベクターを使用して製造される集団中のＶγ４＋Ｔ細胞の数は、１×１０５〜５×１０９（例えば、１×１０５細胞〜５×１０５細胞、５×１０５細胞〜１×１０６、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、または１×１０９細胞〜５×１０９細胞、例えば、約１×１０５細胞、約１．５×１０５細胞、約２×１０５細胞、約３×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、または約５×１０９細胞）である。
【００１４】
第５の態様では、本発明は、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＢＴＮＬ３タンパク質及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリシストロニックポリヌクレオチド）を含有するベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターは、腸管上皮細胞（例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド中に変異を有する腸管上皮細胞、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド中にヘテロ接合変異あるいはＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド中にホモ接合変異を有する腸管上皮細胞）の形質導入における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４Ａプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、このタンパク質は、対象がＨＮＦ４Ａの変異についてヘテロ接合またはホモ接合である場合に有用であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、医薬の製造における使用を目的とする。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、対象の腸管内の炎症（例えば、ＩＢＤ）または腸管のがんの処置における使用を目的とする。例えば、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、参照発現レベルと比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する（例えば、ＢＴＮＬ３またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチドの変異がホモ接合あるいはＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードする遺伝子の変異がヘテロ接合であることの結果として）対象に投与され得る。参照発現レベルは、野生型発現レベルであり得る。別の例では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度（例えば、ＢＴＮＬ３またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチドの変異がホモ接合あるいはＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及び／またはＨＮＦ４Ａをコードする遺伝子の変異がヘテロ接合であることの結果として）を増加させる方法に使用され得る。
【００１６】
第６の態様では、本発明は、第３、第４もしくは第５の態様またはその実施形態のいずれかのベクターで形質導入される細胞を提供する。
【００１７】
第７の態様では、本発明は、第３、第４もしくは第５の態様またはその実施形態のいずれかのベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度を増加させる方法に使用される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の腸管内の炎症を処置する方法に、または対象の腸管内のがんを処置する方法に使用される。いくつかの実施形態では、対象の腸管内の炎症は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する。
【００１８】
第８の態様では、本発明は、参照発現レベル（例えば、野生型発現レベル）と比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する対象の腸管内の炎症を、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド、第１の態様による細胞、第２の態様による組成物、第３〜第５の態様によるベクター、第６の態様による細胞または第７の態様による組成物を対象に投与することによって処置する方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルは、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列の変異の結果である。いくつかの実施形態では、変異は、欠失バリアントである。いくつかの実施形態では、変異は、細胞表面に対するＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の輸送の減少または除去を特徴とする。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質の発現を特徴とする。他の実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ−３及び／またはＢＴＮＬ−８遺伝子における１つ以上のバリアントＳＮＰ、例えば、Ｌ３Ｂ３０．２ｃｌ遺伝子型を特徴とする。いくつかの実施形態では、変異は、ヘテロ接合変異である。いくつかの実施形態では、変異は、ホモ接合変異である。いくつかの実施形態では、変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ３イントロンのＳＮＰである。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、同じ発現カセット上にある。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）である。
【００２１】
第９の態様では、本発明は、参照発現レベル（例えば、野生型発現レベル）と比較して、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現レベルを有する対象の腸管内の炎症を、ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することによって処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、参照集団と比較して、ＨＮＦ４Ａの減少した発現レベルを有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現と関連するＨＮＦ４Ａの変異を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＨＮＦ４Ａプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、ウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４Ａプロモーターをさらに含む。
【００２２】
第１０の態様では、本発明は、対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度を、対象にＶγ４＋細胞の集団を投与することによって増加させる方法を提供し、投与されたＶγ４＋細胞の集団は、Ｖγ４の発現についてスクリーニングされている。いくつかの実施形態では、Ｖγ４の発現についてのスクリーニングは、Ｖγ４が発現されるか否かまたはＶγ４発現の程度を（例えば、Ｖγ４を発現する細胞のパーセンテージ、Ｖγ４の平均発現密度（例えば、平均蛍光強度による）、またはそれらの任意の組合せによって）決定することを含む。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、１×１０５〜５×１０９（例えば、１×１０５細胞〜５×１０５細胞、５×１０５細胞〜１×１０６、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、または１×１０９細胞〜５×１０９細胞、例えば、約１×１０５細胞、約１．５×１０５細胞、約２×１０５細胞、約３×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、または約５×１０９細胞）である。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、非Ｖγ４＋細胞を含む、混合細胞集団内のものである。例えば、集団中のＶγ４＋は、全細胞集団の１０〜５０％を占める場合がある。Ｖγ４＋Ｔ細胞の集団は、例えば、本発明の第１〜第６の態様による細胞であってよい。
【００２３】
第１１の態様では、本発明は、対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度を、対象にＶγ４＋細胞の集団を投与することによって増加させる方法を提供し、対象がＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中に変異（例えば、ヘテロ接合変異）を有する。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、１×１０５〜５×１０９（例えば、１×１０５細胞〜５×１０５細胞、５×１０５細胞〜１×１０６、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、または１×１０９細胞〜５×１０９細胞、例えば、約１×１０５細胞、約１．５×１０５細胞、約２×１０５細胞、約３×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、または約５×１０９細胞）である。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、非Ｖγ４＋細胞を含む、混合細胞集団内のものである。例えば、集団中のＶγ４＋は、全細胞集団の１０〜５０％を占める場合がある。Ｖγ４＋Ｔ細胞は、例えば、本発明の第１〜第６の態様による細胞であってよい。
【００２４】
第１２の態様では、本発明は、対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数または頻度を、対象にＶγ４＋細胞の集団を投与することによって増加させる方法を提供し、対象が、ＩＢＤなどの腸管の炎症、または腸管のがんを有する。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、１×１０５〜５×１０９（例えば、１×１０５細胞〜５×１０５細胞、５×１０５細胞〜１×１０６、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、または１×１０９細胞〜５×１０９細胞、例えば、約１×１０５細胞、約１．５×１０５細胞、約２×１０５細胞、約３×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、または約５×１０９細胞）である。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、非Ｖγ４＋細胞を含む、混合細胞集団内のものである。例えば、集団中のＶγ４＋は、全細胞集団の１０〜５０％を占める場合がある。Ｖγ４＋Ｔ細胞の集団は、例えば、本発明の第１〜第６の態様による細胞であってよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象の腸管内の炎症を処置するために、または対象の腸管内におけるＶγ４＋細胞の数もしくは頻度を増加させるために対象に投与されるＶγ４＋細胞は、異種タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋細胞は、Ｖγ４−細胞に由来し、Ｖγ４は異種タンパク質である。Ｖγ４−細胞は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、もしくはそれらの組合せ））、またはそれらの組合せを含む、任意の好適な細胞型であってよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ球を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、もしくは制御性Ｔ細胞）またはＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はγδＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ２細胞（例えば、Ｖγ９δ２細胞）を含む。
【００２６】
第１〜第１２の態様のいずれかに関するいくつかの実施形態では、Ｖγ４＋細胞は、ヒト細胞に由来する。いくつかの実施形態では、Ｖγ４は、内因的に発現されるタンパク質であり（例えば、内因性Ｖγ４δ１＋細胞の場合におけるような）、Ｖγ４＋細胞によって発現される異種タンパク質は、Ｖγ４以外のタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｖγ４は、内因的に発現されるタンパク質であり（例えば、内因性Ｖδ１γ４＋細胞またはＶγ４δ３＋の場合におけるような）、Ｖγ４＋細胞によって発現される異種タンパク質は、Ｖγ４以外のタンパク質である。
【００２７】
第１〜第１２の態様のいずれかに関するいくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋細胞は、Ｖγ４を内因的に発現する。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋細胞は、異種タンパク質を発現するように改変されていない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋細胞の集団は、対象の腸管内におけるγδＴ細胞集団中のＶγ４＋細胞の数を、腸管内の炎症または腸管のがんに関する１つ以上の症状を軽減するのに効果的な数まで増加させる。いくつかの実施形態では、腸管内の炎症は、ＩＢＤと関連する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。
【００３０】
第１３の態様では、本発明は、第１０、第１１または第１２の態様のうちいずれか１つによる方法に使用するためのＶγ４＋細胞の集団を提供する。Ｖγ４＋細胞の集団は、例えば、第１の態様のＶγ４＋細胞であってよい。
【００３１】
第１４の態様では、本発明は、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中の変異を同定する方法を提供し、その手段とは、（ａ）対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド中の欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列のレベルを、欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較すると、参照レベルと比較して、対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド中の欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列のレベル増加が、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における変異の存在を示すこと、または（ｂ）対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列のレベルを、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較すると、参照レベルと比較して、対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチドのレベル減少が、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における変異の存在を示すことによるものである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、参照レベルは、野生型ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８遺伝子を有する試料のものである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、変異は、欠失バリアントである。いくつかの実施形態では、変異は、例えば、参照試料、例えば、野生型試料と比較して、細胞表面に対するＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の輸送の減少または除去を特徴とする。
【００３４】
いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質の発現を特徴とする。
【００３５】
いくつかの実施形態では、変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ３イントロンのＳＮＰである。
【００３６】
第１５の態様では、本発明は、腸管内の炎症に罹患しやすい対象を同定する方法を提供し、本方法は、
対象からの細胞試料を提供すること、ならびに
細胞中のＨＮＦ４Ａ、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における変異の存在を決定し、変異の存在が、対象が腸管内の炎症に罹患しやすいことを示していることを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、腸管内の炎症（例えば、ＩＢＤ）を発症する可能性がある、または発症するリスクがある対象を同定する方法は、（ａ）対象が、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中に変異を有するかを決定する、ならびに（ｂ）変異の存在に基づいて、ＩＢＤを発症する可能性がある対象を同定するという手段を含んでよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、（ｉ）対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド中の欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列のレベルを、欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較すると、参照レベルと比較して、対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド中の欠失バリアントと関連するポリヌクレオチド配列のレベル増加が、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における変異の存在を示すこと、または（ｉｉ）対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列のレベルを、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較すると、参照レベルと比較して、対象の試料中におけるＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチドのレベル減少が、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中における変異の存在を示すことによって、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中の変異を同定することを含む。いくつかの実施形態では、参照レベルは、野生型ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８遺伝子を有する試料のものである。いくつかの実施形態では、変異は、欠失バリアントである。いくつかの実施形態では、変異は、細胞表面に対するＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の輸送の減少または除去を特徴とする。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質の発現を特徴とする。いくつかの実施形態では、変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＮＬ３イントロンのＳＮＰである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｃ）遺伝子治療を遂行するように対象に勧告を提供し、または遺伝子治療のために個体を選択し、遺伝子治療がＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８発現の誘導を目的とすることをさらに含む。例えば、対象は、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及びＨＮＦ４Ａをコードする１つ以上の遺伝子中におけるヘテロ接合変異の結果として、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した発現を有する可能性がある。あるいは、対象は、例えば、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及びＨＮＦ４Ａをコードする１つ以上の遺伝子中におけるホモ接合変異の結果として、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の機能発現を全く有しない可能性がある。
【００４０】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、同じ発現カセット上にある。いくつかの実施形態では、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＢＴＮＬ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００４１】
他の実施形態では、遺伝子治療は、ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｃ）養子細胞療法を遂行するように対象に勧告を提供すること、または養子細胞療法のために対象を選択することをさらに含む。例えば、対象は、第１０、第１１または第１２の態様のうちいずれか１つの方法を使用する処置を勧告されてよい、またはそのために選択されてよい。養子細胞療法は、例えば、Ｖγ４＋細胞の集団を対象に投与することを含んでよく、対象がＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列中に変異（例えば、ヘテロ接合変異）を有する。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、１×１０５〜５×１０９（例えば、１×１０５細胞〜５×１０５細胞、５×１０５細胞〜１×１０６、１×１０６細胞〜５×１０６細胞、５×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜５×１０７細胞、５×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０８細胞〜５×１０８細胞、５×１０８細胞〜１×１０９細胞、または１×１０９細胞〜５×１０９細胞、例えば、約１×１０５細胞、約１．５×１０５細胞、約２×１０５細胞、約３×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約１．５×１０６細胞、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１．５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約３×１０７細胞、約５×１０７細胞、約１×１０８細胞、約２×１０８細胞、約３×１０８細胞、約５×１０８細胞、約１×１０９細胞、約２×１０９細胞、約３×１０９細胞、または約５×１０９細胞）である。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、非Ｖγ４＋細胞を含む、混合細胞集団内のものである。例えば、集団中のＶγ４＋は、全細胞集団の１０〜５０％を占める場合がある。
【００４３】
本出願で開示されるいずれの実施形態も、本発明の第１〜第１４の態様の各々内で、任意の他の開示される実施形態と組み合わされてよい。
【００４４】
本発明の原理を例示する実施形態及び実験は、添付の図面に関連して以下で検討されることになる：
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｇは、マウス上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の発達及び成熟について記載している一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。小腸Ｖγ７＋ＩＥＬは２〜３週齢で成長し、少なくとも９か月間は安定したままであった（図１Ａ）。
【図１Ｂ】２１日目までに、大半のＩＥＬが、全載小腸（ＳＩ）共焦点顕微鏡においてＶγ７＋であった（図１Ｂ）。
【図１Ｃ】Ｖγ７＋ＩＥＬが２１〜４０日齢のマウスは、ＣＤ１２２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３（ＴＣＲ）、及びＣＤ４５ＲＢの高表面発現、ならびにＲｏｒγｃ及びＳｏｘ１３の低発現を有した（図１Ｃ）。対照的に、Ｖγ７−及びαβＩＥＬは、低表面レベルのＣＤ１２２及びＴＩＧＩＴを有し、Ｖγ７−ＩＥＬは、より高レベルのＲｏｒγｃ及びＳｏｘ１３を発現した（図１Ｃ）。
【図１Ｄ】Ｖγ７＋ＩＥＬにおける様々なマーカーの表面レベルは、１４〜１７日目と比較して２１〜４０日目に増加し（ＣＤ１２２、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ３、ＣＤ８α）、未成熟Ｖγ７＋ＩＥＬは、成熟Ｖγ７−ＩＥＬとより類似した表現型を有していた（図１Ｄ〜図１Ｅ）。
【図１Ｅ】Ｖγ７＋ＩＥＬにおける様々なマーカーの表面レベルは、１４〜１７日目と比較して２１〜４０日目に増加し（ＣＤ１２２、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ３、ＣＤ８α）、未成熟Ｖγ７＋ＩＥＬは、成熟Ｖγ７−ＩＥＬとより類似した表現型を有していた（図１Ｄ〜図１Ｅ）。
【図１Ｆ】１４〜１７日目のマウスに由来するＶγ７＋ＣＤ１２２ＨＩとＶγ７＋ＣＤ１２２ＬＯＩＥＬとの間で差次的に発現される遺伝子は、Ｓｋｉｎｔ１選択的及び非選択的Ｖγ５＋樹状表皮Ｔ細胞（ＤＥＴＣ）の前駆細胞間で差次的に発現される遺伝子に類似していた（図１Ｆ）。
【図１Ｇ】Ｖγ７＋ＩＥＬはまた、Ｖγ７−ＩＥＬよりも高いＫｉ６７発現を有し、このことは細胞周期の進行を示していた（図１Ｇ）。Ｄ、日、Ｗ、週。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、ＣＤ１２２ＨＩＶγ７＋ＩＥＬと他のＩＥＬサブセットとの間における表現型の差を示す一連のグラフである。Ｖγ７＋、Ｖγ７−、及びＴＣＲβ＋ＩＥＬは、異なる細胞表面マーカーを発現する。Ｖγ７＋は、より高い表面レベルのＬａｇ３、ＣＤ６９、及びＣＤ８αα＋、ならびにより低いレベルのＴｈｙ１及びＣＤ５を発現した（図２Ａ）。ＷＴ  Ｖγ７＋ＣＤ１２２ＨＩＩＥＬは、Ｖγ７＋ＣＤ１２２ＬＯＩＥＬとは異なる細胞表面表現型を有した（図２Ｂ）。Ｄ１４〜Ｄ１７のＷＴマウスに由来するＶγ７＋ＣＤ１２２ＨＩ及びＶγ７＋ＣＤ１２２ＬＯＩＥＬは、多くの細胞表面タンパク質の差次的遺伝子発現（ｌｏｇ−２倍率変化）を示した。同じ遺伝子の多くはまた、ＤＥＴＣ前駆細胞のＳｋｉｎｔ１選択によって制御された（図２Ｃ）。Ｖγ７＋ＩＥＬは、Ｖγ７−ＩＥＬよりも有意に多くのＥｄＵを取り込み、このことは細胞分裂の増加を示していた（図２Ｄ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｅは、内因性腸エレメントがＩＥＬを形成することを実証する一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。ＩＥＬは、無胸腺ＮＵ／ＮＵマウス中に存在し、抗体ＧＬ２は、ＩＥＬ中でＶδ４（ＴＲＤＶ２−２によってコードされる）鎖を検出した（図３Ａ）。
【図３Ｂ】Ｖγ７＋ＩＥＬは、従来の飼育容器中のマウスと、無菌状態で、タンパク質無抗原飼料を給餌した、またはその両方で飼育したマウスとの間で、ＣＤ１２２及びＴＣＲ表面レベルが類似し、このことは、Ｖγ７＋ＩＥＬが環境因子ではなく内因性因子によって制御される可能性があることを示していた（図３Ｂ）。
【図３Ｃ】Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、及びＢｔｎｌ６は、近位ＳＩ中で発現され、出生後およそ１４日でレベルが安定した（図３Ｃ）。
【図３Ｄ】組織学的分析は、Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、及びＢｔｎｌ６が、ＩＥＬが散在している有糸分裂後絨毛腸細胞中で発現されたことを示した（図３Ｄ〜図３Ｅ）。
【図３Ｅ】組織学的分析は、Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、及びＢｔｎｌ６が、ＩＥＬが散在している有糸分裂後絨毛腸細胞中で発現されたことを示した（図３Ｄ〜図３Ｅ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｋは、ＣＤ１２２ＨＩＶγ７＋ＩＥＬの局所的腸発達を特徴付ける一連のグラフ及び概略図である。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。Ｗ７〜１０のＣ５７Ｂｌ／６（ＷＴ）マウスから選別したＷＴ  Ｖγ７＋ＩＥＬ中におけるＴＣＲＶδ鎖使用状況のディープシーケンシングは、およそ２５％のＴＲＤＶ２−２を示した（図４Ａ）。
【図４Ｂ】Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋胸腺細胞は、生後８週間では多数観察されなかった（図４Ｂ）。
【図４Ｃ】Ｖγ７＋胸腺細胞は、Ｖγ７＋ＩＥＬと比較して成熟の欠如を示す細胞表面マーカーを発現する（ＣＤ５＋、Ｔｈｙ１＋、及びＣＤ１２２、ＣＤ４５ＲＢ、ならびにＴＣＲ低）（図４Ｃ〜図４Ｅ）。
【図４Ｄ】Ｖγ７＋胸腺細胞は、Ｖγ７＋ＩＥＬと比較して成熟の欠如を示す細胞表面マーカーを発現する（ＣＤ５＋、Ｔｈｙ１＋、及びＣＤ１２２、ＣＤ４５ＲＢ、ならびにＴＣＲ低）（図４Ｃ〜図４Ｅ）。
【図４Ｅ】Ｖγ７＋胸腺細胞は、Ｖγ７＋ＩＥＬと比較して成熟の欠如を示す細胞表面マーカーを発現する（ＣＤ５＋、Ｔｈｙ１＋、及びＣＤ１２２、ＣＤ４５ＲＢ、ならびにＴＣＲ低）（図４Ｃ〜図４Ｅ）。
【図４Ｆ】リンパ節及びパイエル板が欠如しているマウス（ａｌｙ／ａｌｙ）は、Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬを発現した（図４Ｆ）。
【図４Ｇ】Ｂｔｎｌ１は、ＩＥＬが散在している有糸分裂後絨毛腸細胞中で発現され（図４Ｇ）、Ｂｔｎｌ１発現は、近位及び中央ＳＩ中で最も高く（図４Ｈ）、胸腺よりも近位ＳＩ中ではるかに高く発現された（図４Ｉ）。
【図４Ｈ】Ｂｔｎｌ１は、ＩＥＬが散在している有糸分裂後絨毛腸細胞中で発現され（図４Ｇ）、Ｂｔｎｌ１発現は、近位及び中央ＳＩ中で最も高く（図４Ｈ）、胸腺よりも近位ＳＩ中ではるかに高く発現された（図４Ｉ）。
【図４Ｉ】Ｂｔｎｌ１は、ＩＥＬが散在している有糸分裂後絨毛腸細胞中で発現され（図４Ｇ）、Ｂｔｎｌ１発現は、近位及び中央ＳＩ中で最も高く（図４Ｈ）、胸腺よりも近位ＳＩ中ではるかに高く発現された（図４Ｉ）。
【図４Ｊ】Ｂｔｎｌ１−／−及びＢｔｎｌ４−／−マウス中の標的遺伝子座を示す概略図（図４Ｊ）。
【図４Ｋ】サザンブロットを使用して、Ｂｔｎｌ１及びＢｔｎｌ４ゲノムＤＮＡ配列がノックアウトマウス中に存在しなかったことを確認した（図４Ｋ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄは、腸管ＩＥＬ組成がＢｔｎｌ１に依存することを実証する一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬは、Ｂｔｎｌ１−／−マウス中で減少したが、他のＩＥＬ細胞型は影響を受けなかった（図５Ａ〜図５Ｂ）。
【図５Ｂ】Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬは、Ｂｔｎｌ１−／−マウス中で減少したが、他のＩＥＬ細胞型は影響を受けなかった（図５Ａ〜図５Ｂ）。
【図５Ｃ】Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬの減少は、Ｂｔｎｌ−／−ＮＵ／ＮＵマウスでも観察され、このことはＢｔｎｌが胸腺外で機能することを示していた（図５Ｃ）。
【図５Ｄ】Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬは、Ｂｔｎｌ４−／−マウス中では減少せず、このことは、Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬがＢｔｎｌ１に特に依存していることを示していた（図５Ｄ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｅは、Ｂｔｎｌ１が全身性Ｔ、Ｂ、及び骨髄性細胞コンパートメントに対して検出可能な影響を全く有しないことを実証する一連のグラフ及び表である。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。Ｖγ７＋ＩＥＬは、ＷＴマウスと比較してＢｔｎｌ１ｉｎｄｅｌ／ｉｎｄｅｌマウス中で減少した（図６Ａ）。
【図６Ｂ】ＷＴ、Ｂｔｎｌ１＋／−、及びＢｔｎｌ１−／−の腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び脾臓の免疫コンパートメントをフローサイトメトリーによって分析し、３つの遺伝子型全ての間で同等であったことを見出した（図６Ｂ〜図６Ｃ）。
【図６Ｃ】ＷＴ、Ｂｔｎｌ１＋／−、及びＢｔｎｌ１−／−の腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び脾臓の免疫コンパートメントをフローサイトメトリーによって分析し、３つの遺伝子型全ての間で同等であったことを見出した（図６Ｂ〜図６Ｃ）。
【図６Ｄ】ＷＴ、Ｂｔｎｌ１＋／−及びＢｔｎｌ１−／−マウスから採取したＭＬＮ及び脾臓のリンパ球中におけるＴＣＲＶγ鎖使用状況をフローサイトメトリーによって評価し、３つの遺伝子型の間で同等であったことを見出した（図６Ｄ）。
【図６Ｅ】ＷＴまたはＢｔｎｌ１＋／−及びＢｔｎｌ１−／−マウスに由来するＶγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋胸腺細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、３つの時点で総細胞数（左）及び細胞表面表現型（右）を列挙し、これらは３つの遺伝子型の間で類似していた（図６Ｅ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｅは、Ｂｔｎｌ１が腸管ＩＥＬの選択的増殖及び成熟を誘導することを示す一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。ＷＴと比較して、５週齢のＢｔｎｌ１−／−マウス中でＥｄＵを取り込んだＶγ７＋ＩＥＬは有意に少なかった（図７Ａ）。
【図７Ｂ】Ｂｔｎｌ１−／−マウス中のＶγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬは未成熟な表現型も保持し、これは成熟ＷＴ  Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬよりも低レベルのＣＤ１２２及びＴＩＧＩＴ、ならびに高レベルのＴｈｙ１を有した（図７Ｂ〜図７Ｃ）。
【図７Ｃ】Ｂｔｎｌ１−／−マウス中のＶγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬは未成熟な表現型も保持し、これは成熟ＷＴ  Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬよりも低レベルのＣＤ１２２及びＴＩＧＩＴ、ならびに高レベルのＴｈｙ１を有した（図７Ｂ〜図７Ｃ）。
【図７Ｄ】放射線照射したＴＣＲδ−／−マウスへの骨髄（ＢＭ）移植は、ＷＴまたはＢｔｎｌ１−／−マウスのいずれかに由来するＢＭが、ＩＥＬ再構築に等しく効果的であったことを実証した（図７Ｄ）。
【図７Ｅ】しかしながら、放射線照射したＢｔｎｌ１−／−Ｖγ７＋ＩＥＬの再構成は、ＣＤ４５．２＋Ｃ５７Ｂｌ／６ＢＭが使用された、放射線照射したＣＤ４５．２＋Ｃ５７Ｂｌ／６Ｖγ７＋ＩＥＬの再構成よりもはるかに効果が弱かった（図７Ｅ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｄは、ＣＤ１２２ＨＩＶγ７＋ＩＥＬの腸生着、増殖、及び保持に対するＢｔｎｌ１の影響を示す一連のグラフである。ＷＴマウス中よりもＢｔｎｌ１−／−マウス中でＫｉ６７を発現したＶγ７＋ＩＥＬは有意に少なく、このことは細胞周期進行の減少を示していた（図８Ａ）。図７Ｂに示されるｂｔｎｌ１−／−Ｖγ７＋ＣＤ１２２ＨＩ及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＣＤ１２２ＨＩＩＥＬは、図７Ｂに示されるＶγ７＋ＣＤ１２２ＬＯ及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＣＤ１２２ＬＯＩＥＬとは異なる細胞表面表現型を有する（図８Ｂ）。ＷＴ  ＢＭで再構成した、放射線照射したＴＣＲδＫＯマウスを、時間の経過を確認するためにＢＭ移植後の表示時点でγδＩＥＬ組成について分析した（図８Ｃ）。Ｗ４〜５のＷＴマウスから単離したＩＥＬを、ＣＤ４５マイクロビーズを使用してカラム精製し、Ｗ６  ＴＣＲδ−／−またはＴＣＲδ−／−Ｂｔｎｌ１−／−宿主中へと静脈内に養子移入した。γδＴ細胞組成を、２〜３週間後にフローサイトメトリーによってアッセイし、再構成がＴＣＲδ−／−Ｂｔｎｌ１−／−宿主中で障害されたことを示した（図８Ｄ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｅは、ビリン特異的Ｂｔｎｌ１誘導がインビボでＶγ７＋ＩＥＬを回復させることを示す一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。ビリンプロモーターの制御下でＤｏｘ誘導性Ｂｔｎｌ１及びｒｔＴＡを発現するバイトランスジェニック（ＢｉＴｇ）成体マウス中のＶγ７＋ＩＥＬは、マウスがＤｏｘ（１ｍｇ／ｍｌ、２％スクロース）を投与された場合に、より成熟したＶγ７＋表現型へと表面マーカーの発現がシフトしたことを示した（図９Ａ）。
【図９Ｂ】Ｄｏｘ処置成体ＢｉＴｇマウスはＫｉ６７の増加も示し、これは、ｒｔＴＡを持たなかったシングルトランスジェニック（ＳｉＴｇ）Ｄｏｘ処置マウスまたはＤｏｘを投与されなかった（２％スクロースを投与された）マウスでは観察されなかった（図９Ｂ）。
【図９Ｃ】Ｄｏｘ処置成体ＢｉＴｇマウスは、Ｖγ７＋細胞数の変化を示さなかった（図９Ｃ）。
【図９Ｄ】ＢｉＴｇ仔のＤｏｘ処置は、Ｖγ７＋ＩＥＬのパーセンテージを増加させ（図９Ｄ）、Ｄｏｘに曝露したＢｉＴｇ仔に由来するＶγ７＋細胞が、ＷＴ  Ｖγ７＋細胞を表現型模写したように細胞表面マーカーの発現を変化させた（図９Ｅ）。
【図９Ｅ】ＢｉＴｇ仔のＤｏｘ処置は、Ｖγ７＋ＩＥＬのパーセンテージを増加させ（図９Ｄ）、Ｄｏｘに曝露したＢｉＴｇ仔に由来するＶγ７＋細胞が、ＷＴ  Ｖγ７＋細胞を表現型模写したように細胞表面マーカーの発現を変化させた（図９Ｅ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、成体マウス中の誘導性Ｂｔｎｌ１導入遺伝子発現及びその影響を特徴付ける一連の概略図及びグラフである。ＷＴ  Ｂｔｎｌ１遺伝子座（上）及びＴＲＥ−Ｂｔｎｌ１導入遺伝子構築物（下）の略図。薄いバー：非翻訳領域、濃いバー：翻訳領域、（ＴＲＥ）上流−テトラサイクリン応答エレメント／ＣＭＶプロモーター及び下流−β−グロブリン／ポリＡ（図１０Ａ）。導入遺伝子挿入を検出するサザンブロット。示される通り（矢印）にゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、表示領域（ＯＲＦのエクソン３／４境界）を標的とするプローブ（図１０Ａのバー下の概略図）を生成して、ＷＴ及び標的アレルを検出した（図１０Ｂ）。Ｂｔｎｌ１−／−バックグラウンド上の表示遺伝子型を持つＷ７〜１３（成体）のマウスに、ドキシサイクリン水（１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘ、２％スクロース）または対照水（２％スクロース）を１〜２週間投与した。表示処置後に成体マウスの近位小腸中でｑＲＴＰＣＲによって評価した遺伝子発現は、ｂｔｎｌ１発現が、Ｄｏｘで処置したＢｉＴｇマウス中で増加したことを実証した（図１０Ｃ）。γδＩＥＬ組成（左）及び絶対細胞数（右）を、表示処置後に成体マウス中でフローサイトメトリーによって評価し、処置が、Ｖγ７＋細胞の比または細胞数に影響を及ぼさなかったことを見出した（図１０Ｄ）。Ｋｉ６７及び細胞表面ＣＤ１２２発現を、表示処置後に成体マウスに由来するＶγ７＋ＩＥＬ中で分析し、両方ともＤｏｘ処置ＢｉＴｇマウス中で増加したことを見出した（図１０Ｅ）。Ｋｉ６７発現は、Ｄｏｘ処置ＢｉＴｇ成体マウスに由来するＶγ７−及びＴＣＲβ＋ＩＥＬ中よりも、Ｖγ７＋ＩＥＬ中で有意に高かった（図１０Ｆ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｈは、腸管Ｖγ７＋ＩＥＬがＢｔｎｌタンパク質に応答することを示す一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。Ｌ１＋６ＭＯＤＥ−Ｋ細胞（Ｂｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６でトランスフェクトした細胞）に１２時間曝露したＩＥＬは、主にＶγ７＋ＩＥＬ中においてＴＣＲ刺激の測定値である、ＣＤ２５の上方制御を示した（図１１Ａ）。
【図１１Ｂ】Ｌ１＋６細胞と、Ｎｕｒ７７．ｇｆｐマウスに由来するＩＥＬとの１２時間の共培養は、ＴＣＲ活性化の別の指標であるＧＦＰの、Ｖγ７＋ＩＥＬ中での増加をもたらした（図１１Ｂ）。
【図１１Ｃ】ＣＤ２５活性化はＣＤ１２２の下方制御ももたらし、ＣＤ２５＋ＧＦＰ＋ＣＤ１２２−の集団は、Ｌ１＋６ＭＯＤＥ−Ｋ細胞と共培養したＶγ７＋ＩＥＬ中で発生したが、空ベクター（ＥＶ）でトランスフェクトしたＭＯＤＥ−Ｋ細胞と共培養したＶγ７＋ＩＥＬ中では発生しなかった（図１１Ｃ）。
【図１１Ｄ】Ｌ１＋６ＭＯＤＥ−Ｋ細胞と共培養したＶγ７＋ＣＤ２５＋ＩＥＬは、ＴＣＲ（ＣＤ３）のわずかな下方制御も示した（図１１Ｄ）。
【図１１Ｅ】Ｌ１＋６細胞と接触したＩＥＬのみが、ＣＤ２５の増加を示した（図１１Ｅ）。
【図１１Ｆ】Ｂｔｎｌ１−／−マウスに由来するＶγ７＋細胞はまた、ＣＤ２５の表面発現を増加させることによってＬ１＋６に応答し得（図１１Ｆ）、インビボでＢｔｎｌ１選択を経なかったＩＥＬ（Ｂｔｎｌ１−／−マウスに由来するＩＥＬ、ならびにＴＣＲαβ＋及びＶγ７＋ＩＥＬ）は、表面ＣＤ２５発現を増加させることによって抗ＣＤ３に応答した（図１１Ｇ）。
【図１１Ｇ】Ｂｔｎｌ１−／−マウスに由来するＶγ７＋細胞はまた、ＣＤ２５の表面発現を増加させることによってＬ１＋６に応答し得（図１１Ｆ）、インビボでＢｔｎｌ１選択を経なかったＩＥＬ（Ｂｔｎｌ１−／−マウスに由来するＩＥＬ、ならびにＴＣＲαβ＋及びＶγ７＋ＩＥＬ）は、表面ＣＤ２５発現を増加させることによって抗ＣＤ３に応答した（図１１Ｇ）。
【図１１Ｈ】ＩＥＬエフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＣＣＬ４、及びＧＭ−ＣＳＦの増加は、ＷＴ及びＴＣＲβ−／−マウスに由来するＬ１＋６細胞とのＩＥＬ共培養物の上清では観察されたが、ＴＣＲδ−／−マウスに由来するものでは観察されなかった（図１１Ｈ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｅは、Ｖγ７＋ＩＥＬ上でのＢｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６の共発現の影響を示す一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。ＭＯＤＥ−Ｋ細胞中で共トランスフェクトしたＦＬＡＧ−Ｂｔｎｌ１、ＨＩＳ−Ｂｔｎｌ４またはＨＡ−Ｂｔｎｌ６の細胞表面発現。ヒストグラムオーバーレイは、ＧＦＰ＋細胞でのゲーティング後における各ＢＴＮＬの発現を示し（丸括弧内の数字は、幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を示す）、Ｂｔｎｌ４またはＢｔｎｌ６とＢｔｎｌ１との共発現が表面発現を増加させることを実証する（図１２Ａ）。
【図１２Ｂ】空ベクター（ＥＶ）対Ｂｔｎｌ１＋Ｂｔｎｌ６（Ｌ１＋６）を発現する構築物で形質導入したＭＯＤＥ−Ｋ細胞と共に表示時間だけ培養した初代小腸ＩＥＬは、Ｌ１＋６を発現するＭＯＤＥ−Ｋ細胞と共培養した場合に、Ｖγ７＋ＩＥＬがＣＤ２５表面発現を増加させたことを示した（図１２Ｂ）。
【図１２Ｃ】一晩の表示培養条件後におけるＶγ７＋細胞上での細胞表面ＣＤ１２２及びＣＤ２５発現の代表的なプロットは、ＭＯＤＥ−Ｋ細胞との共培養が、ＣＤ２５の増加及びＣＤ１２２の減少をもたらすことを実証した（図１２Ｃ）。
【図１２Ｄ】細胞表面ＣＤ２５発現は、ＥＶと比較して、Ｌ１＋６を発現するＭＯＤＥ−Ｋ細胞との一晩の共培養後に陽性のＦＡＣＳ選別Ｖγ７＋ＩＥＬ中で増加した（図１２Ｄ）。
【図１２Ｅ】ＰＰ２、ＰＰ３またはビヒクルの存在下における表示ＭＯＤＥ−Ｋ形質導入体との一晩の共培養後、初代Ｖγ７＋ＩＥＬ中における細胞表面ＣＤ２５発現は、ＣＤ２５の上方制御がＰＰ２によって阻害されたことを示す（図１２Ｅ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｈは、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８によるヒト腸管Ｖγ４＋細胞の制御を実証する一連のグラフである。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。上行結腸から単離したヒトγδ細胞は、Ｖδ１＋細胞に富んでいたが、Ｖδ２＋及びＶδ１−Ｖδ２−細胞も存在していた（図１３Ａ）。
【図１３Ｂ】特定のＶδプロファイルを有するヒト腸管γδＴ細胞は、異なるＶγ抗体と反応し、このことは細胞のサブセットの存在を示していた（図１３Ｂ）。
【図１３Ｃ】ヒト腸管リンパ球上での表面ＴＣＲγδ／Ｖδ１発現は、ＢＴＮＬ３（Ｌ３）形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、ＢＴＮＬ３とＢＴＮＬ８（Ｌ３＋８）による形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞との１２時間の共培養後に減少した。矢印は、ＴＣＲ染色のシフトを表す（図１３Ｃ）。
【図１３Ｄ】ＴＣＲの下方制御は、Ｖδ２−細胞中においてのみ、かつＬ３＋８細胞との共培養に応答した場合にのみ観察された（図１３Ｄ）。
【図１３Ｅ】Ｌ３＋８細胞はまた、ＣＤ２５の上方制御を誘導した（図１３Ｅ）。
【図１３Ｆ】Ｌ３＋８細胞との共培養後にＴＣＲの下方制御を示したＶδ２−細胞は、Ｖγ２／３／４に対する抗体で検出されたが、Ｖγ８、Ｖγ５／３、またはＶγ９に対する抗体では検出されなかった（図１３Ｆ〜図１３Ｇ）。
【図１３Ｇ】Ｌ３＋８細胞との共培養後にＴＣＲの下方制御を示したＶδ２−細胞は、Ｖγ２／３／４に対する抗体で検出されたが、Ｖγ８、Ｖγ５／３、またはＶγ９に対する抗体では検出されなかった（図１３Ｆ〜図１３Ｇ）。
【図１３Ｈ】Ｌ３＋８は、皮膚または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するγδＴ細胞中ではＴＣＲの下方制御を誘導しなかった（図１３Ｈ）。全てのエラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｉは、ヒト腸γδ細胞及びγδ細胞上でのＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８共発現の選択的影響を特徴付ける一連のグラフ、ゲル及び概略図である。ヒト腸組織から採取したＦＡＣＳ選別γδＴ細胞を、ＴＣＲＶγ鎖使用状況についてディープシーケンシングによって分析し、主にＶγ４及びＶγ８を発現することを見出した（図１４Ａ）。
【図１４Ｂ】ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅ  ｖｉｅｗｅｒから編集した、マウス及びヒトＢｔｎｌ２／ＢＴＮＬ２及びＢｔｎｌ９／ＢＴＮＬ９遺伝子座を例示する概略図（図１４Ｂ）。
【図１４Ｃ】（Ｃ）表示組織中におけるＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８発現に関する従来のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８が腸管内で特異的に発現されたことを示した（図１４Ｃ）。
【図１４Ｄ】表示試料中におけるＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＥＰＣＡＭ及びＴＣＲＶγ２／３／４発現に関する従来のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８がＥｐＣＡＭ＋上皮細胞で発現されたことを示した（図１４Ｄ）。
【図１４Ｅ】表示構築物を用いてＨＥＫ２９３細胞中で共トランスフェクトしたＦＬＡＧ−ＢＴＮＬ３、ＦＬＡＧ−ＢＴＮＬ８ＳまたはＦＬＡＧ−ＢＴＮＬ８の細胞表面発現。ヒストグラムオーバーレイは、ＧＦＰ＋細胞でのゲーティング後における各ＢＴＮＬの発現を示し（丸括弧内の数字は、幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を示す）、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の共発現が両方のタンパク質の発現を増加させることを実証する（図１４Ｅ）。
【図１４Ｆ】ヒト腸組織定住リンパ球の単離及びＨＥＫ２９３形質導入体との共培養の方法を例示する概略図。（１）健康なドナーの上行結腸から回収した内視鏡生検。（２）抗生物質を補充した完全培地中で洗浄。（３）各マトリックスに適用した１つの生検。（４）抗生物質、ＩＬ−２及びＩＬ−１５を補充した完全培地中で５〜７日間培養。（５）ＥＶ、Ｌ３、Ｌ８またはＬ３＋８で形質導入したＨＥＫ２９３細胞株との共培養（図１４Ｆ）。
【図１４Ｇ】細胞表面ＣＤ２５発現は、ＥＶ形質導入細胞と比較して、Ｌ３＋８形質導入ＨＥＫ２９３細胞との共培養後にヒト腸管由来のリンパ球のサブセット中で増加した（図１４Ｇ）。
【図１４Ｈ】Ｂｔｎｌ３＋８応答ヒト腸管由来リンパ球の選別に関するゲーティングパラメータ。Ｌ３＋８応答細胞が選別された場合に、より多くのＶγ４発現が観察された（図１４Ｈ）。
【図１４Ｉ】ＥＶ対Ｌ３＋８形質導入ＨＥＫ２９３細胞との共培養後、腸管由来のγδＴ細胞（ＢＴＮＬ３＋８に応答しないドナーから単離した）中のＴＣＲＶγ鎖使用状況（左）及び細胞表面ＴＣＲγδ発現（右）は、Ｖγ８＋細胞が優位を占めるγδＴ細胞集団を、応答しないドナーが有していたことを示した（図１４Ｉ）。
【図１５】腸及び皮膚細胞のＴＣＲγ鎖の配列を示す配列アラインメントである。上から４つの配列は、１人のドナーからフローサイトメトリーで選別した下方制御されたＴＣＲを有するＬ３＋８応答腸管リンパ球に由来する。これらの細胞はＶγ４を発現した。下から４つの配列は、皮膚由来のＴＣＲγδ＋細胞（Ｇ２３４ＳＫ０１）からのＴＣＲγ転写物であり、これらはＶγ３に偏っていた。
【図１６】図１６Ａは、空ベクター（ＥＶ）またはＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８を発現するベクター（赤ヒストグラム）で形質導入した２９３細胞との一晩の共培養後における、ヒト腸管γδ細胞の応答を示す一連のフローサイトメトリーヒストグラムである。図１６Ｂは、一連のグラフである。左から１番目のパネルは、７人のドナーについて、図１６Ａと同様に測定したＴＣＲγδ発現の定量を示す。左から２番目のパネルは、全てのＴＣＲＶ９細胞と比較した、ＴＣＲＶγ２／３／４細胞中におけるＴＣＲγδ発現を示す。左から３番目のパネルは、ＣＤ３細胞のパーセンテージとしてγδ細胞頻度を示す。４番目（右端）のパネルは、ＴＣＲＶγ２／３を発現する各細胞型のパーセンテージを示す。
【図１７】図１７Ａは、ヒトＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、及びＢＴＮＬ８＊３の概略のタンパク質コード構造を示し、ＢＴＮＬ８＊３はＢＴＮＬ８エクトドメイン及び膜貫通（ＴＭ）ドメインが、示されるように、ＢＴＮＬ３の細胞内ドメインに融合されているハプロタイプによってコードされる融合タンパク質である（図１７Ａ）。図１７Ｂは、ＢＴＮＬ８及びＢＴＮＬ３をコードする共通のハプロタイプを、ＢＴＮＬ８＊３をコードする希少なハプロタイプから検出するために使用されるＰＣＲ戦略を示す。共通のフォワードプライマー（黒）及び遺伝子型特異的リバースプライマー（青、赤）が存在する。各ＰＣＲ反応の産物は、およそ１．３ｋｂである。
【図１８】ＢＴＮＬ８＊３ジェノタイピング結果を示す一連の画像である。各レーン上に指定した個々のドナーのゲル電気泳動ＰＣＲ産物を、昇順におよそ１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、及び３ｋｂであるサイズマーカーを用いて並べた。ドナーの名称は、左上のボックスにまとめたＰＣＲ分析で同定する遺伝子型によって色分けされる。左上：赤＝ＢＴＮＬ８＊３のホモ接合体、紫＝ＢＴＮＬ８＊３ならびにＢＴＮＬ８及びＢＴＮＬ３をコードするアレル［ＷＴと称される］のヘテロ接合体、青＝各々がＢＴＮＬ８及びＢＴＮＬ３をコードする２つのアレル。
【図１９】ＢＴＮＬタンパク質の細胞生物学的分析を示す一連のグラフである。遺伝子導入によって２９３細胞中に導入されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質（各プロット上に指定）の２９３細胞による表面タンパク質発現のフローサイトメトリーを、パネルの下に列挙したタグ付けされていない構築物と共に、各々のヒストグラムに一致するように色分けした。
【図２０】ＢＴＮＬタンパク質の機能分析を示す一連のフローサイトメトリープロットである。空ベクター（ＥＶ）、または各パネルに示されたＢＴＮＬ遺伝子が導入された２９３細胞との共培養後における、ＴＣＲγδ発現（ｘ軸）及びＴＣＲＶγ２／３／４発現（ｙ軸）のフローサイトメトリーデータ。
【図２１】ＢＴＮＬ８＊３ホモ接合体への腸管γδＴ細胞コンパートメントを示すフローサイトメトリープロットのセットである。左パネルは、ＩＢＤと診断された患者ＧＮ００６のγδＴ細胞集団を示し、右パネルは、潰瘍性大腸炎の家族歴を有する患者ＧＮ０１４のγδＴ細胞集団を示す。
【図２２】ＢＴＮＬ８＊３ヘテロ接合体中の表示ＴＣＲ発現を示す一連のイムノブロットである。バンド１（左）は、患者ＧＮ０１７からのグリッド全体の培養細胞に由来し、バンド２（中央）は、患者ＧＮ０１９からのグリッド全体の培養細胞に由来し、バンド３（右）は、患者ＧＮ０１９からのＶγ２／３／４＋選別細胞に由来する。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｂは、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８細胞表面レベルに対するＳＮＰの効果を示す一連のグラフである。図２３Ａは、より一般的なアレル（ＧＧ、ｎ＝７５）と比較して、ホモ接合体（ＡＡ、ｎ＝９）として、またはヘテロ接合体（ＧＡ、ｎ＝３６）としてｒｓ４７００７７２ハプロタイプを有する対象におけるＢＴＮＬ３（左）及びＢＴＮＬ８（右）の発現を示すひげプロットのセットである。図２３Ｂは、より一般的なアレル（ＣＣ、ｎ＝６９）と比較して、ホモ接合体（ＴＴ、ｎ＝６）として、またはヘテロ接合体（ＣＴ、ｎ＝３０）としてｒｓ６８６８４１８ハプロタイプを有する対象におけるＢＴＮＬ３（左）及びＢＴＮＬ８（右）の発現を示すひげプロットのセットである。発現レベルを、個々の結腸生検試料からの正規化ＲＮＡＳｅｑデータから得た。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｂは、γδＴＣＲによって付与されたＢＴＮＬ応答性を示す一連のグラフである。左側のパネルは、ＣＤ３（ｘ軸）またはＴＣＲγδ（ｙ軸）の抗体媒介検出によって評価されるような、Ｖγ４Ｖδ１（上）またはＶγ９Ｖδ２（下）の形質導入組換えＴＣＲを発現するＪ７６ヒトＴ細胞のフローサイトメトリープロットを示す。右側のパネルは、示した条件：空ベクターで形質導入した２９３細胞、ＢＴＮＬ３で形質導入した２９３細胞、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８で形質導入した２９３細胞に一晩曝露した後の、左側パネルに示された細胞についてのＴＣＲ発現及びＣＤ６９発現の三重測定の定量を示す。ＰＭＡｉｏｎｏ＝ＰＭＡ／イオノマイシン。
【図２５】図２５Ａは、本試験に使用されるような、ヒト上皮細胞（Ｃａｃｏ２）の様々な増殖条件を示す概略図である。図２５Ｂは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定を示すグラフであり、ｘ軸は培養日数を示す。図２５Ｃは、図２５Ａに示された条件下で増殖させたＣａｃｏ２細胞による表示遺伝子発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す一連のグラフである。
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｂは、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８、ＨＮＦ４Ａ、ＣＤＸ２、ならびにＩＬ−８発現に対するストレスの効果を示すグラフのセットである。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｂは、機能に影響を及ぼす可能性がある追加のＢＴＮＬ多型を示す。図２７Ａは、ＢＴＮＬ３のＢ３０．２ドメイン（Ｌ３Ｂ３０．２ｃｌ）中における非同義ＳＮＰのパネルである。図２７Ｂは、ＢＴＮＬ３＊８及びＬ３Ｂ３０．２ｃｌ遺伝子型と応答性との関連を例示する。コピー数バリアント（ＣＮＶ）の状態：ＮＥＧ＝陰性Ｌ８＊３アレル。ＨＥＴ＝Ｌ８＊３のヘテロ接合体。ＵＣ＝潰瘍性大腸炎。「ｒｓ」数字は、一塩基多型を示す。応答は、全長Ｌ３＋Ｌ８との共培養後のＥＶと比較して＞２５％のＴＣＲ下方制御として定義した。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｂは、２つ以上のＢＴＮＬ多型の保因が、Ｖγ４−ＢＴＮＬ軸の破壊と関連し、非応答エンドフェノタイプと関連することを実証する。図２８Ａ：ドナー遺伝子型による、ドナーのＬ３＋Ｌ８を発現するＨＥＫ２９３Ｔとの共培養後の、ＥＶと比較した％ＴＣＲ下方制御。ＨＯＭ（Ｌ８＊３／Ｌ３Ｂ３０．２ｃｌのホモ接合ドナー）（ｎ＝１０）、Ｌ３Ｂ３０．２ｃｌ＋Ｌ８＊３（複合ヘテロ接合体）（ｎ＝４）、Ｌ８＊３ＨＥＴ（ｎ＝２１）、ＮＥＧ（ｎ＝３１）。図２８Ｂ：結腸全体のｍＲＮＡのＴＣＲシーケンシングによって分析したＴＣＲＶｇ鎖の使用状況。Ｖｇ４を１０，０００の総Ｖｇ鎖リードあたりのリード数として示し、遺伝子型により示した。ＨＯＭ＝Ｌ８＊３のホモ接合遺伝子型を有するドナー。ＨＥＴ（Ｒ）＝インビトロＢＴＮＬ応答アッセイでＬ３＋Ｌ８に応答して予想されるＴＣＲ下方制御応答（＞２５％）を行うＬ８＊３のホモ接合ドナー。ＮＥＧ（Ｒ）＝インビトロＢＴＮＬ応答アッセイでＬ３＋Ｌ８に応答して予想されるＴＣＲ下方制御応答（＞２５％）を行うＬ８＊３アレルの陰性ドナー。（一元配置ＡＮＯＶＡで分析した）。
【図２９】関連する多型の、Ｌ８＊３ＣＮＶの代理であるｒｓ７２４９４５８１及びＬ３Ｂ３０．２ドメイン中における４つのミスセンス多型の１つであるｒｓ５９２２０４２６について、ＴａｑＭａｎ  ＳＮＰアッセイによってジェノタイピングした症例対照研究におけるＢＴＮＬ多型の関連性を示す。これらをカイ二乗検定によって分析する。遺伝子型は最後の列に組み込まれ、≧２多型の保因が疾患群でより多いことを実証する。≧２の保因によって、ＢＴＮＬ多型は疾患のオッズ比１．３８  １．１〜１．６  ｐ＜０．００４をもたらすことが同定された。
【図３０−１】図３０Ａ〜図３０Ｄは、典型的な結腸γδ表面表現型がＩＢＤでは異常制御されていることを示している。図３０Ａ：対照ドナー及び活動性ＵＣ（ＵＣＩ）を有するドナーの結腸粘膜から、短期間の組織片培養による単離後に得られたＴＣＲγδ＋Ｖδ２−細胞のＣＤ１０３発現を実証する代表的なフローサイトメトリー等高線プロット（灰色はアイソタイプ対照）。図３０Ｂ：疾患サブタイプ（ｎ＝５〜１４）によるＴＣＲγδ＋Ｖδ２−細胞の発現レベルの要約データ（一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した）。
【図３０−２】図３０Ｃ：対照ドナー及び活動性ＵＣ（ＵＣＩ）を有するドナーの結腸粘膜から、短期間の組織片培養による単離後に得られたＴＣＲγδ＋Ｖδ２−細胞のＣＤ１０３発現を実証する代表的なフローサイトメトリー等高線プロット（灰色はアイソタイプ対照）。図３０Ｄ：疾患サブタイプ（ｎ＝５〜１４）によるＴＣＲγδ＋Ｖδ２−細胞の発現レベルの要約データ（一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した）。ＨＣ：健常対照、ＣＤＵ：炎症していないクローン病、ＣＤＩ：炎症しているクローン病、ＵＣＵ：炎症していない潰瘍性大腸炎、ＵＣＩ：炎症している潰瘍性大腸炎。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の態様及び実施形態は、添付の図面に関連して以下で検討されることになる。さらなる態様及び実施形態は、当業者には明らかとなる。本明細書中で言及される全ての文献及びデータベースのアクセッション番号は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本発明は、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードする遺伝子を含有するポリヌクレオチド領域中の変異が、細胞表面に輸送できない２つのタンパク質の融合をもたらし得るという発見に、部分的に基づく。そのような変異についてホモ接合のヒトでは、たとえＶγ４＋Ｔ細胞が存在していたとしても、腸管内にはほとんど存在しない。ヘテロ接合の患者では、Ｖγ４＋Ｔ細胞の存在は減少している。これらの患者におけるＶγ４＋Ｔ細胞の欠如は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のリスク変化と関連する（例えば、相関する）。したがって、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の発現、またはそれらの発現を促進する転写因子の発現を回復させることによって（例えば、遺伝子治療によって）、Ｖγ４＋Ｔ細胞が、腸管内のホメオスタシスを回復させて、炎症を制御するように動員され得る。同様に、Ｖγ４＋Ｔ細胞（例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞またはＶγ４を発現するＶγ４−細胞）の投与は、ＩＢＤ処置のための戦略を支援し得る。事実、本発明者らは、細胞上でのＶγ４の異種発現が、ＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８に結合し、応答するのに十分であると示されたことを示している。
【００４８】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の参照物を含む。
【００４９】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者には容易に分かる個々の値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。いくつかの場合では、「約」は、指定値から＋２０％、いくつかの場合では＋１０％、いくつかの場合では＋５％、いくつかの場合では＋１％、またはいくつかの場合では＋０．１％の変動を包含し、そのような変動が、開示される方法を実行するのに適切であるようにする。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、処置が検討されるか、または望まれる任意の単一の動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類としての非ヒト動物）を指す。特定の実施形態では、本明細書における対象はヒトである。対象は、「がん患者」、すなわち、がんに罹患しているか、またはがんに罹患するリスクがあるか、またはがんの１つ以上の症状に罹患している対象であってよい。
【００５０】
「ブチロフィリン３」または「ＢＴＮＬ３」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の霊長類由来（例えば、ヒト）の任意の機能性ＢＴＮＬ３タンパク質を指す。機能性ＢＴＮＬ３は、細胞表面上で発現され、ＢＴＮＬ８と結合して腸管などの組織中でＶγ４＋細胞を保持する。例示的なヒトＢＴＮＬ３のアミノ酸配列は、配列番号：１に記載され、アクセッション番号ＡＡＱ８８７５１．１に対応する。ヒトＢＴＮＬ３をコードする例示的な遺伝子の核酸配列は、配列番号：２に示され、アクセッション番号ＮＭ＿１９７９７５．２に対応する。マウスブチロフィリン１またはＢＴＮＬ１は、ヒトＢＴＮＬ３のオルソログである。例示的なマウスＢＴＮＬ１のアミノ酸配列は、配列番号：３に記載され、アクセッション番号ＮＰ＿００１１０４５６４．１に対応する。マウスＢＴＮＬ１をコードする例示的な遺伝子の核酸配列は、配列番号：４に示され、アクセッション番号ＮＭ＿００１１１１０９４．１に対応する。ＢＴＮＬ３またはＢＴＮＬ１タンパク質は、例えば、上に並べたような参照アミノ酸配列またはそのバリアントを含んでよい。
【００５１】
「ブチロフィリン８」または「ＢＴＮＬ８」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の霊長類由来（例えば、ヒト）の任意の機能性ＢＴＮＬ８タンパク質を指す。機能性ＢＴＮＬ８は、細胞表面上で発現され、ＢＴＮＬ３と結合して腸管などの組織中でＶγ４＋細胞を保持する。例示的なヒトＢＴＮＬ８のアミノ酸配列は、配列番号：５に記載され、アクセッション番号ＡＡＩ１９６９７．１に対応する。ヒトＢＴＮＬ８をコードする例示的な遺伝子の核酸配列は、配列番号：６に示され、アクセッション番号ＮＭ＿００１０４０４６２．２に対応する。ＢＴＮＬ８Ｓは、ＢＴＮＬ８の例示的なスプライスバリアントである。例示的なヒトＢＴＮＬ８Ｓのアミノ酸配列は、配列番号：７に記載され、アクセッション番号ＮＰ＿０７９１２６．１に対応する。ヒトＢＴＮＬ８Ｓをコードする例示的な遺伝子の核酸配列は、配列番号：８に示され、アクセッション番号ＮＭ＿０２４８５０．２に対応する。ＢＴＮＬ８またはＢＴＮＬ８Ｓタンパク質は、例えば、上に並べたような参照アミノ酸配列またはそのバリアントを含んでよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質」という用語は、ＢＴＮＬ８（またはその一部）及びＢＴＮＬ３（またはその一部）を含むタンパク質を指す。例示的なＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質は、Ａｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３），１４：１６で報告されているように、約５６ｋｂの欠失多型（ｈｇ１９におけるｃｈｒ５：１８０３７５０２７〜１８０４３０５９６）に起因する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、Ｌ３Ｂ３０．２ｃｌという用語は、図２７に示す通り、Ｌ３Ｂ３０．２ドメイン内に４つのＳＮＰを含有するＢＴＮＬ−３をコードする遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を指す。
【００５４】
「肝細胞核因子４−アルファ」または「ＨＮＦ４Ａ」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の霊長類由来（例えば、ヒト）の任意の機能性ＨＮＦ４Ａタンパク質を指す。機能性ＨＮＦ４Ａは、腸内で発現される転写因子である。例示的なヒトＨＮＦ４Ａのアミノ酸配列は、配列番号：９に記載され、アクセッション番号ＮＰ＿００１２７４１１３．１に対応する。ヒトＨＮＦ４Ａをコードする例示的な遺伝子の核酸配列は、配列番号：１０に示され、アクセッション番号Ｐ４１２３５（遺伝子ＩＤ：３１７２）に対応する。Ｈｎｆ４ａのマウスオルソログをコードする例示的な遺伝子の核酸配列は、配列番号：１１に示され、これは配列番号：１２に示される配列を有するタンパク質をコードする。ＨＮＦ４Ａタンパク質は、例えば、上に並べたような参照アミノ酸配列またはそのバリアントを含んでよい。
【００５５】
「ＣＤ１０３」または「分化抗原群１０３」（遺伝子ＩＤ３６８２）という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の霊長類由来（例えば、ヒト）の任意の機能性ＣＤ１０３タンパク質を指す。例示的または参照ヒトＣＤ１０３のアミノ酸配列は、データベースアクセッション番号ＮＰ＿００２１９９．３のアミノ酸配列を含んでよい。ヒトＣＤ１０３をコードする例示的または参照ヌクレオチド配列の核酸配列は、データベースアクセッション番号ＮＭ＿００２２０８．４の配列を含んでよい。ＣＤ１０３タンパク質は、例えば、上に並べたような参照アミノ酸配列またはそのバリアントを含んでよい。
【００５６】
「２Ｂ４」という用語（ＣＤ２４４とも呼ばれる、遺伝子ＩＤ５１７４４）は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の霊長類由来（例えば、ヒト）の任意の機能性２Ｂ４タンパク質を指す。例示的または参照ヒト２Ｂ４のアミノ酸配列は、データベースアクセッション番号ＮＰ＿００１１６０１３５．１のアミノ酸配列を含んでよい。ヒト２Ｂ４をコードする例示的または参照ヌクレオチド配列の核酸配列は、データベースアクセッション番号ＮＭ＿００１１６６６６３．１の配列を含んでよい。２Ｂ４タンパク質は、例えば、上に並べたような参照アミノ酸配列またはそのバリアントを含んでよい。
【００５７】
「ＣＤ３」または「表面抗原分類３」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の霊長類由来（例えば、ヒト）の任意の機能性ＣＤ３タンパク質を指す。ＣＤ３という用語は、ＣＤ３Ｇ（遺伝子ＩＤ９１７）、ＣＤ３Ｅ（遺伝子ＩＤ９１６）及び／またはＣＤ３Ｅ（遺伝子ＩＤ９１５）を含んでよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＤ３の発現は、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄのうちいずれか１つ、２つまたは３つ全ての発現を含んでよい。例示的または参照ヒトＣＤ３のアミノ酸配列は、データベースアクセッション番号ＮＰ＿００００６４．１（ＣＤ３Ｇ）、ＮＰ＿０００７２４．１（ＣＤ３Ｅ）またはＮＰ＿０００７２３．１（ＣＤ３Ｄ）のアミノ酸配列を含んでよい。ヒトＣＤ３をコードする例示的または参照ヌクレオチド配列の核酸配列は、データベースアクセッション番号ＮＭ＿００００７３．２（ＣＤ３Ｇ）、ＮＭ＿０００７３３．３（ＣＤ３Ｅ）、またはＮＭ＿０００７３２．４（ＣＤ３Ｄ）の配列を含んでよい。ＣＤ３タンパク質は、例えば、上に並べたような参照アミノ酸配列またはそのバリアントを含んでよい。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「野生型」またはＷＴタンパク質またはポリヌクレオチドは、変異型バリアントが由来する参照配列を指す。一般に、所与のタンパク質の野生型配列は、自然界で最も一般的な配列である。同様に、野生型遺伝子配列は、自然界で最も一般に見られるその遺伝子の配列である。
【００５９】
参照配列、例えば、上に記載されるＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３またはＨＮＦ４Ａ配列などのバリアントである本明細書に記載されるタンパク質は、参照配列と比較して変化した１つ以上のアミノ酸残基を有してよい。例えば、５０以下のアミノ酸残基が、参照配列と比較して変化していてよく、好ましくは４５以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下もしくは３以下、２つまたは１つである。例えば、本明細書に記載されるバリアントは、参照配列のアミノ酸残基が５０以下、４５以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、３以下、２つまたは１つ変異している配列を含んでよい。例えば、本明細書に記載されるキメラタンパク質は、配列番号：１、３、５、７、または９のいずれか１つと比較して変化した５０以下、４５以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、３以下、２つまたは１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【００６０】
参照配列中のアミノ酸残基は、挿入、欠失または置換、好ましくは異なるアミノ酸残基の置換によって変化または変異していてよい。そのような変化は、コード核酸中における１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換のうち１つ以上によって引き起こされてよい。
【００６１】
参照配列、例えば、上に記載されるＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３またはＨＮＦ４Ａ配列などのバリアントである本明細書に記載されるタンパク質は、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、すなわち、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を共有してよい。例えば、本明細書に記載されるタンパク質のバリアントは、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、すなわち、参照アミノ酸配列、例えば、配列番号：１、３、５、７、または９のうち１つ以上と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【００６２】
配列同一性は、アルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｐａｃｋａｇｅ，Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＵＳＡ）を参照して一般に定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、マッチ数を最大にし、かつギャップ数を最小にする２つの完全な配列をアラインメントする。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４である。ＧＡＰの使用が好ましい可能性があるが、他のアルゴリズムが使用されてもよく、例えば、ＢＬＡＳＴ（これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（これはＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８の方法を使用する）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）、あるいは上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）の、一般にデフォルトパラメータを用いるＴＢＬＡＳＴＮプログラムである。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズムが使用されてよい（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５  ３３８９−３４０２）。配列同一性及び類似性はまた、Ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  ＭＡ  ＵＳＡ）を使用して決定されてよい。
【００６３】
配列比較は、好ましくは、本明細書に記載される関連配列の全長にわたって行われる。
【００６４】
「参照レベル」、「参照発現レベル」、または「参照試料」は、本明細書で使用される場合、比較目的で使用されるレベル、発現レベル、試料、または基準を指す。例えば、参照試料は、健康な個体（例えば、機能レベルのＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８を発現する個体）から得られ得る。参照レベルは、１つ以上の参照試料の発現レベルであり得る。例えば、複数の個体（例えば、健康な個体、あるいは機能レベルのＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８を発現する個体）間の平均（ａｖｅｒａｇｅ）発現（例えば、平均（ｍｅａｎ）発現または中央値発現）。他の場合では、参照レベルは、他の方法で、例えば、経験的アッセイによって決定されるような、例えば、機能発現に基づいた所定の閾値レベルであり得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「Ｖγ４＋細胞」または「Ｖγ４＋Ｔ細胞」は、Ｖγ４Ｖδ１Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１及びＶγ４を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞）またはＶγ４Ｖδ３Ｔ細胞（例えば、Ｖδ３及びＶγ４を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞）を指す。Ｖγ４＋細胞は、Ｖδ１もしくはＶδ３、及び／またはＶγ４を内因性タンパク質として、または異種タンパク質として発現し得る。いくつかの場合では、Ｖγ４＋細胞は、ＷＯ２０１７／０７２３６７で定義されるような、非造血細胞である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、マーカー（例えば、Ｖγ４）の発現「についてスクリーニングされた」細胞または細胞集団とは、マーカーがエクスビボで明示的に同定され、及び／または定量された細胞または細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、例えば、対象に投与されるＶγ４＋細胞の集団は、Ｖγ４の発現について（例えば、ドナーからの単離及び／または増殖後ならびに対象への投与前に）スクリーニングされ、Ｖγ４＋細胞の存在、Ｖγ４＋細胞の総数、所与の細胞集団内におけるＶγ４＋細胞の頻度（例えば、Ｖδ１＋細胞の総数中のＶγ４＋細胞のパーセンテージ、Ｖδ３＋細胞の総数中のＶγ４＋細胞のパーセンテージ、γδＴ細胞の総数中のＶγ４＋細胞のパーセンテージ、もしくはＴ細胞の総数中のＶγ４＋細胞のパーセンテージ）、所与の集団中の平均もしくは中央値Ｖγ４発現レベル、または１つ以上のそのような特徴の任意の測定値を確認することになる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、異なる表現型の細胞「に由来する」細胞とは、内因性細胞型から改変された細胞を指す。例えば、Ｖγ４−細胞に由来するＶγ４＋細胞は、Ｖγ４について内因的に陰性であったが、Ｖγ４をコードする遺伝子を用いた形質導入によってＶγ４＋となった細胞について記載している。
【００６８】
目的のマーカーを「発現する」細胞または細胞集団とは、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはその断片を含むタンパク質自体が、細胞または集団中に存在していると決定されているものである。マーカーの発現は、様々な手段によって検出され得る。例えば、いくつかの実施形態では、マーカーの発現は、細胞上のマーカーの表面密度を指す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、フローサイトメトリーの測定値として使用される場合、細胞集団上のマーカーの密度を表す。当業者は、ＭＦＩ値が、染色パラメータ（例えば、濃度、持続時間、及び温度）ならびに蛍光色素組成に依存することを理解することになる。しかしながら、ＭＦＩは、適切な対照物との関連において考慮される場合、定量的であり得る。例えば、細胞集団は、抗体のマーカーに対するその抗体のＭＦＩが、同等の条件下で染色された、同じ細胞集団上の適切なアイソタイプ対照抗体のＭＦＩよりも有意に高い場合、マーカーを発現していると言われ得る。さらにまたはあるいは、細胞集団は、従来のフローサイトメトリー分析法により（例えば、アイソタイプまたは「蛍光マイナス１」（ＦＭＯ）対照によるゲートを設定することによって）、陽性及び陰性のゲートを使用して、細胞に応じてマーカーを発現していると言われ得る。この測定基準によって、集団は、マーカーが陽性であると検出された細胞数が、バックグラウンド（例えば、アイソタイプ対照でゲーティングすることによって）よりも有意に高い場合、マーカーを「発現している」と言われ得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、集団の発現が陽性細胞のパーセンテージとして記載され、そのパーセンテージが参照集団における陽性細胞の対応するパーセンテージと比較される場合、パーセンテージの差は、各個々の集団の母集団におけるパーセンテージである。例えば、あるマーカーが集団Ａの細胞の１０％上で発現され、同じマーカーが集団Ｂの細胞の１％上で発現される場合には、集団Ａは、集団Ｂよりもマーカー陽性細胞の頻度が９％高いと言われる（すなわち、１０％÷１％ではなく、１０％−１％）。頻度に母集団の細胞数を掛け合わせると、細胞の絶対数の差が算出される。上記の例では、集団Ａに１００個の細胞が存在し、集団Ｂに１０個の細胞が存在する場合には、集団Ａは、集団Ｂと比較して１００倍の細胞数を有し、すなわち、（１０％×１００）÷（１％×１０）である。
【００７０】
マーカーの発現レベルは、核酸発現レベル（例えば、ＤＮＡ発現レベルまたはＲＮＡ発現レベル、例えば、ｍＲＮＡ発現レベル）であってよい。核酸発現レベルを決定する任意の好適な方法が使用されてよい。いくつかの実施形態では、核酸発現レベルは、ｑＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マルチプレックスｑＰＣＲもしくはＲＴ−ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、またはそれらの組合せを使用して決定される。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「処置」（及びその文法上の変化形、例えば「処置する」または「処置すること」など）は、臨床的介入を指し、ヒトまたは動物（例えば、獣医学的用途において）のいずれであっても、その場合に何らかの所望の治療効果が達成され、例えば、状態の進行の阻害または遅延であり、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒もしくは寛解（部分的もしくは全体的のいずれも）、状態の１つ以上の症状及び／または徴候の予防、遅延、緩和、もしくは阻止すること、または処置がない場合に予想される期間を超えて対象もしくは患者の生存を延長させることを含む。
【００７２】
予防的手段（すなわち、予防）としての処置も含まれる。例えば、炎症の発生または再発の影響を受けやすい、またはそのリスクがある患者、対象、または個体は、本明細書に記載されるように処置されてよい。そのような処置は、患者、対象、または個体における炎症の発生または再発を予防または遅延させる可能性がある。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、治療用組成物（例えば、医薬組成物）の投与量を対象に投与する方法を意味する。本明細書に記載される方法に利用される組成物は、例えば、筋肉内に、静脈内に、皮内に、経皮的に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、髄腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、眼窩内に、硝子体内に（例えば、硝子体内注射によって）、点眼によって、経口的に、局所的に、経皮的に、吸入によって、注射によって、移植によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞の直接の局所灌流浴によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームで、または脂質組成物で投与され得る。本明細書に記載される方法に利用される組成物はまた、全身に、または局所的に投与され得る。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される治療剤または組成物及び処置される状態、疾患、または障害の重症度）に依存して変化し得る。
【００７４】
「医薬組成物」という用語は、その中に含有される１つ以上の活性成分の生物活性が効果的となり得るような形態であり、製剤が投与されることになる患者にとって許容できないほどの毒性がある追加成分を一切含有しない調製物を指す。
【００７５】
本明細書に記載される方法のいずれかによって得られる細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）は、医薬として、例えば、養子Ｔ細胞療法として使用されてよい。この療法は自己由来であってよい、またはこの療法は同種異型であってよい。Ｖγ４＋Ｔ細胞の移植を含む事例では、Ｖγ４＋Ｔ細胞は、非Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、Ｖγ９δ２Ｔ細胞またはαβＴ細胞などを実質的に含まなくともよい。例えば、非Ｖγ４＋Ｔ細胞（例えば、Ｖγ９δ２Ｔ細胞またはαβＴ細胞）は、当該技術分野において既知の任意の好適な手段を使用して（例えば、ネガティブセレクションによる、例えば、磁気ビーズを使用して）、インビボ増殖前、インビボ増殖後、またはインビボ増殖中の任意の時点でＶγ４＋Ｔ細胞集団から枯渇させてよい。他の実施形態では、細胞は選択されず、混合細胞集団が投与されてよい。
【００７６】
いくつかの場合では、患者に投与されるＶγ４＋Ｔ細胞の集団は、非Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、Ｖγ９δ２Ｔ細胞及びαβＴ細胞などを含む、より大きな集団の一部である。Ｖγ４＋Ｔ細胞はまた、αβＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及び自然リンパ細胞（ＩＬＣ）を含む集団の一部であり得る。Ｖγ４＋Ｔ細胞は、単回投与で、またはレジメンにわたって患者に投与される全細胞集団の１％〜９９％を占めてよい（単回投与で、またはレジメンにわたって患者に投与される全細胞集団の、例えば、５％〜９５％、１０％〜９０％、１５％〜８５％、２０％〜８０％、２５％〜７５％、３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、または４５％〜５５％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、例えば、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、または９５％以下、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％）。
【００７７】
いくつかの実施形態では、増殖細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、または５×１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、少なくとも約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、または５×１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、増殖細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、最大約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、または５×１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、増殖細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、約１．１×１０６〜約１．８×１０７細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、増殖細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の用量は、最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９細胞を含む。いくつかの実施形態では、対象は、対象の体重１ｋｇあたり１０４〜１０６細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）を投与される。いくつかの実施形態では、対象は、細胞集団の初期投与（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４〜１０６細胞、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４〜１０５細胞の初期投与）、及び１回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の細胞の後続投与（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４〜１０６個の増殖非造血組織定住γδＴ細胞、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０４〜１０５個の増殖細胞の、１回以上の後続投与）を施される。いくつかの実施形態では、１回以上の後続投与は、前回の投与後１５日未満、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、または２日未満、例えば、前回の投与後４日、３日、または２日未満で投与される。処置は、１回、または場合により、反復して１回以上、例えば、週に１回、隔週に１回、月に１回、隔月に１回、年に３回、年に２回、または年に１回投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、細胞集団の少なくとも３回の投与にわたって、対象の体重１ｋｇあたり合計で約１０６細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）を施され、例えば、対象は、１×１０５細胞の初期投与、３×１０５細胞の２回目の投与、及び６×１０５細胞の３回目の投与を施され、各投与は、前回の投与後４日、３日、または２日未満で投与される。
【００７８】
本発明の一部として有用なＶγ４＋Ｔ細胞は、任意の好適な細胞源に由来し得る。例えば、本発明の組成物及び方法の一部として使用するためのＶγ４＋細胞は、固形組織（例えば、胃腸上皮の組織などの上皮組織（例えば、結腸、例えば、上行結腸の生検から）、もしくは皮膚組織）または血液などの体液に由来し得る。組織由来の細胞は、ドナー組織からの単離後、例えば、分離（例えば、別の集団からのポジティブまたはネガティブセレクション）によって操作され得る。いくつかの場合では、リンパ球は、器官型細胞培養物、例えば、Ｃｌａｒｋ，ｅｔ  ａｌ（Ｃｌａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２００６．１２６（５）：１０５９−７０）及び国際特許出願第ＷＯ２０１７／０７２３６７号（その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によって記載されているものなどを使用して固形組織から分離される。細胞は、分離ステップの前及び／または後に、既知の方法によって増殖され得る。本発明で使用するための細胞は、自己由来または同種異系であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明の一部として有用なＶγ４＋Ｔ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞は、ｉＰＳＣから分化したものであってよいか、またはそのような細胞の子孫であってよい。ｉＰＳＣからＴ細胞を生成する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ２０１８／１４７８０１を参照のこと）。
【００８０】
本発明は、異種タンパク質を発現する細胞（例えば、Ｖγ４＋細胞）の生成及び使用を含む。例えば、Ｖγ４＋細胞は、異種タンパク質をコードする遺伝子で形質導入した内因性Ｖγ４δ１細胞であり得る。他の場合では、Ｖγ４＋細胞は、Ｖγ４−細胞に由来し得、Ｖγ４が異種タンパク質として形質導入される。異種タンパク質を発現するように哺乳動物細胞を形質導入する好適な方法、例えば、ウイルスベクターを使用する方法は、当該技術分野において周知である。この場合、Ｖγ４−細胞は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、またはリンパ球、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＩＬＣ、もしくはＮＫ細胞など）を含む、任意の好適な細胞型であってよい。例えば、免疫細胞は、リンパ球であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、もしくは制御性Ｔ細胞（例えば、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ））またはＮＫ細胞である。例えば、ＣＤ８及び／またはＣＤ４Ｔ細胞は、腸管のがんの処置に使用され得る。あるいは、Ｔｒｅｇまたは他の抑制性Ｔ細胞が、腸管内の炎症の処置に使用され得る。
【００８１】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、γδＴ細胞（例えば、Ｖδ２細胞、例えば、Ｖγ９δ２細胞）である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤が、対象に投与され得る。追加の治療剤は、免疫療法剤、細胞傷害剤、増殖阻害剤、放射線療法剤、抗血管新生剤、またはそれらの２つ以上の剤の組合せからなる群から選択されてよい。追加の治療剤は、細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞、例えば、異種タンパク質を発現するＶγ４＋Ｔ細胞）の投与と同時に、投与前に、または投与後に投与されてよい。追加の治療剤は免疫療法剤であってよく、これは、対象の体内の標的（例えば、対象自身の免疫系）に、及び／または移植細胞に作用する可能性がある。組成物の投与は、任意の簡便な方法で実施されてよい。本明細書に記載される組成物は、患者に、経動脈的に、皮下に、皮内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射によって、直腸内に、腹腔内に、皮内または皮下注射によって、糞便移植材料（例えば、糞便移植の一部として（例えば、結腸内視鏡検査、浣腸、もしくは経口胃管による））と混合して、または経口的に投与されてよい。
【００８３】
医薬組成物は、本明細書に記載されるような細胞（例えば、Ｖγ４＋Ｔ細胞）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含んでよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含んでよい。本発明の医薬組成物に使用されてよい凍結保存溶液としては、例えば、ＤＭＳＯが挙げられる。組成物は、例えば、静脈内投与のために製剤化され得る。
【００８４】
本明細書に記載される組成物（例えば、細胞またはベクター）で、本明細書に記載される方法によって処置される可能性のある対象は、ＩＢＤを有するか、またはＩＢＤを発症するリスクがある対象を含む。ＩＢＤは、消化管の慢性炎症を伴う障害を含み、ＩＢＤの種類としては、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病が挙げられる。本明細書に記載される組成物及び方法はまた、がんを有する対象、例えば、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）癌（例えば、腺癌、肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、リンパ腫、または消化管間質腫瘍）、及び小腸（ｓｍａｌｌ  ｂｏｗｅｌ）癌を有する対象などを処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんは、胃腸癌、例えば、非転移性または転移性結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、または肝細胞癌などである。本明細書に記載される組成物及び方法は、正常数の腸管内のγδＴ細胞、減少した数の腸管内のγδＴ細胞、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の減少した細胞表面発現、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の正常な表面発現、ＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の変異、ＨＮＦ４Ａの減少した発現、あるいはＨＮＦ４Ａの正常な発現を有する対象を処置するために使用され得る。本発明の組成物（例えば、細胞またはベクター）は、ＩＢＤまたはがんの症状のうち１つ以上を改善するのに十分な量で投与される。本明細書に記載される組成物は、以下の症状：下痢、発熱、疲労、腹痛及び痙攣、食欲低下、または意図しない体重減少のうち１つ以上の症状を軽減または阻害するのに十分な量で投与され得る。本明細書に記載される組成物は、がんもしくは腫瘍を処置する、寛解をもたらす、腫瘍の成長、体積、転移、浸潤、増殖、もしくは数を減少させる、がん細胞死を増加させる、再発までの時間を増加させる、または生存期間を改善するのに十分な量で投与され得る。本明細書に記載される組成物は、腸管内のγδＴ細胞数を増加させる、あるいはベクターを投与する場合には、ＢＴＮＬ３細胞表面発現を増加させる、ＢＴＮＬ８細胞表面発現を増加させる、及び／またはＨＮＦ４Ａ発現を増加させるのに十分な量で投与され得る。本明細書に記載される組成物は、１つ以上のＩＢＤ症状を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少させる可能性がある。これらの効果は、本明細書に記載される組成物の投与後、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間以内に、またはそれを超えて生じる可能性がある。患者は、処置に使用される投与経路に応じて、組成物の投与後、例えば、２週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれを超えて評価されてよい。
【００８５】
本発明によって提供される任意の発現産物（例えば、ＢＴＮＬ３／８、Ｖγ４δ１ＴＣＲ、Ｖγ４δ３ＴＣＲ、またはＨＮＦ４Ａ）は、当該技術分野において既知の、または本明細書に記載されるベクター上でコードされ得る。いくつかの場合では、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８は、細胞表面上での二量体化を促進するために一緒に（例えば、同じベクター上に）送達される。同様に、Ｖδ１及びＶγ４またはＶδ３及びＶγ４は、正確なＴＣＲ集合を促進するために一緒に（例えば、同じベクター上に）送達され得る。
【００８６】
高い転写率及び翻訳率を達成することに加えて、哺乳動物細胞中における外来遺伝子の安定発現が、遺伝子を含有するポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核ゲノム中に組み込むことによって達成され得る。外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核ＤＮＡ中に送達して、組み込むための様々なベクターが開発されている。発現ベクターの例は、例えば、ＷＯ１９９４／０１１０２６に開示されていて、それらは参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される組成物及び方法に使用するための発現ベクターは、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、Ｖδ１、Ｖδ３、Ｖγ４、またはＨＮＦ４Ａをコードするポリヌクレオチド配列に加えて、例えば、これらの剤の発現及び／またはこれらのポリヌクレオチド配列を哺乳動物細胞のゲノム中に組み込むために使用される追加の配列要素を含有する。ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、Ｖδ１、Ｖδ３、Ｖγ４、またはＨＮＦ４Ａの発現に使用され得るある特定のベクターは、遺伝子転写を指示するプロモーター及びエンハンサー領域などの調節配列を含有するプラスミドを含む。ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、Ｖδ１、Ｖδ３、Ｖγ４、またはＨＮＦ４Ａを発現するのに有用な他のベクターは、これらの遺伝子の翻訳率を増強するか、または遺伝子転写に起因するｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列要素は、発現ベクター上に乗せられた遺伝子の効率的な転写を指示するために、例えば、５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ならびにポリアデニル化シグナル部位を含む。本明細書に記載される組成物及び方法を用いた使用に好適な発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有してよい。好適なマーカーとしては、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシンなどに対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８７】
本明細書に記載される組成物及び方法に使用するための発現ベクターは、モノシストロニックまたはポリシストロニック発現カセットからＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、Ｖδ１、Ｖδ３、Ｖγ４、またはＨＮＦ４Ａを発現してよい。モノシストロニック発現カセットは、単一遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含有する。本明細書に記載される多能性細胞は、例えば、プラスミドの各々がモノシストロニック発現カセットを含有する複数のプラスミドで、または２つ以上のモノシストロニック発現カセットを含有する単一プラスミドでトランスフェクトされ得る。ポリシストロニック発現カセットは、単一の転写物から２つ以上のタンパク質を同時に発現させるために使用され得る。ポリシストロニック発現カセットとしては、バイシストロニック発現カセットが挙げられ、これは単一の転写物から２つのタンパク質を生成するために使用され得、５’キャップ以外のｍＲＮＡの領域から翻訳を開始するためにリボソームを動員するＩＲＥＳ配列を含んでよい。
【００８８】
ウイルスゲノムは、ＢＴＮＬ３／８及びＶγ４δ１またはＶγ４δ３ＴＣＲなどの外来遺伝子を哺乳動物細胞中に、効率的に送達するために使用され得るベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、遺伝子送達に特に有用なベクターであり、その理由としては、そのようなゲノム内に含有されるポリヌクレオチドが、一般化または特化した形質導入によって哺乳動物細胞の核ゲノム中に通常組み込まれるからである。これらのプロセスは、自然なウイルス複製サイクルの一部として生じ、遺伝子組込みを誘導するためにタンパク質または試薬の添加を必要としない。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルスなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトフォーミーウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプーマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６））が挙げられる。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、ＭｃＶｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（ＵＳ５，８０１，０３０）に記載されていて、その教示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８９】
本明細書に記載される組成物及び方法の核酸は、ｒＡＡＶベクター及び／またはビリオン中に、細胞中へのそれらの導入を促進するために組み込まれてよい。ＡＡＶベクターは中枢神経系で使用され得、適切なプロモーター及び血清型が、Ｐｉｇｎａｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ（２０１７）（印刷前に電子出版）に記載されていて、その開示は、それがＣＮＳ遺伝子治療において有用なプロモーター及びＡＡＶ血清型に関する場合に参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される組成物及び方法に有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現される異種配列ならびに（２）異種遺伝子の組込み及び発現を促進するウイルス配列を含む組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、ＤＮＡの複製及びビリオン中へのＤＮＡのパッケージングにシスで必要なＡＡＶのそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含んでよい。そのようなｒＡＡＶベクターはまた、マーカーまたはレポーター遺伝子を含有してよい。有用なｒＡＡＶベクターは、全体または一部が欠失したＡＡＶ  ＷＴ遺伝子のうち１つ以上を有するが、機能的フランキングＩＴＲ配列を保持している。ＡＡＶ  ＩＴＲは、特定の用途に好適な任意の血清型のものであってよい。ｒＡＡＶベクターを使用する方法は、例えば、Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）、及びＭｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ７：２４（２０００）に記載されていて、その各々の開示は、それらが遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関する場合に参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本明細書に記載される核酸及びベクターは、細胞中への核酸またはベクターの導入を促進するために、ｒＡＡＶビリオン中に組み込まれ得る。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外側の非核酸部分を構成し、ＡＡＶｃａｐ遺伝子によってコードされる。ｃａｐ遺伝子は、３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードし、これらはビリオン集合に必要である。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、ＵＳ５，１７３，４１４、ＵＳ５，１３９，９４１、ＵＳ５，８６３，５４１、ＵＳ５，８６９，３０５、ＵＳ６，０５７，１５２、及びＵＳ６，３７６，２３７に、加えてＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）に記載されていて、その各々の開示は、それらが遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関する場合に参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本明細書に記載される組成物及び方法と組み合わせて有用なｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及びｒｈ７４を含む様々なＡＡＶ血清型に由来するものを含む。中枢神経系に位置するか、または中枢神経系に送達される細胞を標的とするには、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０が特に有用な可能性がある。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９（２０００）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３４２８（２０００）、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５（２００１）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載され、その各々の開示は、それらが遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関する場合に参照によって本明細書に組み込まれる。また、本明細書に記載される組成物及び方法と組み合わせて有用なのは、偽型ｒＡＡＶベクターである。偽型ベクターは、所与の血清型（例えば、とりわけ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０など）以外の血清型に由来するカプシド遺伝子で偽型化された所与の血清型のＡＡＶベクターを含む。偽型ｒＡＡＶビリオンの構築及び使用を含む技術は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７６６２（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されている。ビリオンカプシド内に変異を有するＡＡＶビリオンは、非変異カプシドビリオンよりも、特定の細胞型をより効果的に感染させるために使用されてよい。例えば、好適なＡＡＶ変異体は、特定の細胞型に対するＡＡＶの標的化を容易にするために、リガンド挿入変異を有してよい。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶカプシド変異体の構築及び特徴付けは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５（２０００）に記載されている。本明細書に記載される方法に使用され得る他のｒＡＡＶビリオンは、ウイルスの分子育種によって、加えてエクソンシャッフリングによって生成されるそれらのカプシドハイブリッドを含む。例えば、Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６（２０００）及びＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３（２００１）を参照のこと。
【００９２】
本明細書に記載される方法及び組成物に使用される送達ベクターは、レトロウイルスベクターであってよい。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されてよいレトロウイルスベクターの一種は、レンチウイルスベクターである。レトロウイルスのサブセットであるレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、広範囲の分裂及び非分裂細胞型に高効率で形質導入し、導入遺伝子の安定した長期発現を付与する。レンチウイルスベクターの最適化戦略の概要は、Ｄｅｌｅｎｄａ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：Ｓ１２５（２００４）で提供され、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。レンチウイルスベースの遺伝子導入技術の使用は、目的の導入遺伝子が収容されている高度に欠失したウイルスゲノムを持つ組換えレンチウイルス粒子のインビトロ産生に依存する。特に、組換えレンチウイルスは、（１）パッケージング構築物、すなわち、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体をＲｅｖと共に発現する（あるいは、トランスで発現される）ベクター、（２）一般に異種性のものである、エンベロープ受容体を発現するベクター、ならびに（３）全てのオープンリーディングフレームが除去されているウイルスｃＤＮＡからなるが、複製、カプシド形成、及び発現に必要な配列を維持し、その場合、発現されるべき配列が挿入されている導入ベクターの、許容される細胞株中におけるトランスでの共発現によって回収される。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるレンチウイルスベクターは、５’長末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶＰｓｉシグナル５’スプライス部位（ＳＤ）、デルタ−ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、３’スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１−アルファプロモーター及び３’−自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ−ＬＴＲ）のうち１つ以上を含んでよい。レンチウイルスベクターは、場合により、中央ポリプリン管（ｃＰＰＴ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、これはＵＳ６，１３６，５９７に記載される通りであり、その開示は、それがＷＰＲＥに関する場合に参照によって本明細書に組み込まれる。レンチウイルスベクターは、ｐＨＲ’骨格をさらに含んでよく、これは例えば、以下に提供されるようなものを含んでよい。
【００９３】
Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：９６３（２００４）に記載されているＬｅｎｔｉｇｅｎレンチウイルスベクターは、ＤＮＡ分子の発現及び／または細胞の形質導入に使用されてよい。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるレンチウイルスベクターは、５’長末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶＰｓｉシグナル５’スプライス部位（ＳＤ）、デルタ−ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、３’スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１−アルファプロモーター及び３’−自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ−ＬＴＲ）を含んでよい。場合により、これらの領域のうち１つ以上が、類似した機能を実行する別の領域で置換されていることが、当業者には容易に明らかとなる。導入遺伝子発現は、プロモーター配列によって促進される。場合により、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。プロモーターはまた、伸長因子（ＥＦ）１−アルファプロモーターまたはＰＧＫプロモーターであってもよい。当業者であれば、本明細書に記載されるベクター構築物に好適となる多数のプロモーターに精通していることになる。
【００９４】
エンハンサーエレメントは、修飾ＤＮＡ分子の発現を増加させるか、またはレンチウイルスの組込み効率を増加させるために使用され得る。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるレンチウイルスベクターは、ｎｅｆ配列をさらに含んでよい。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるレンチウイルスベクターは、ベクターの組込みを増強するｃＰＰＴ配列をさらに含んでよい。ｃＰＰＴは、（＋）鎖ＤＮＡ合成の第２起点として機能し、その天然ＨＩＶゲノムの中間に部分的な鎖重複を導入する。導入ベクター骨格中へのｃＰＰＴ配列の導入は、核輸送及び標的細胞のＤＮＡ中に組み込まれるゲノムの総量を強く増加させた。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるレンチウイルスベクターは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含んでよい。ＷＰＲＥは、転写物の核外輸送を促進することによって、及び／または新生転写物のポリアデニル化の効率を増加させることによって、それゆえ、細胞中のｍＲＮＡの総量を増加させて転写レベルで機能する。レンチウイルスベクターへのＷＰＲＥの付加は、インビトロ及びインビボの両方で、いくつかの異なるプロモーターからの導入遺伝子発現レベルに実質的な改善をもたらす。本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるレンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ配列及びＷＰＲＥ配列の両方を含んでよい。ベクターはまた、単一プロモーターからの複数のポリペプチド発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含んでよい。ＩＲＥＳ配列に加えて、複数のポリペプチド発現を可能にする当該技術分野において既知の他のエレメントが有用である。
【００９５】
本明細書に記載される方法及び組成物に使用されるベクターは、臨床グレードのベクターであってよい。
【００９６】
ウイルス調節エレメントは、核酸分子を宿主細胞中に導入するために使用される送達ビヒクルの構成要素である。ウイルス調節エレメントは、場合によりレトロウイルス調節エレメントである。例えば、ウイルス調節エレメントは、ＨＳＣ１またはＭＳＣＶからのＬＴＲ及びｇａｇ配列であってよい。レトロウイルス調節エレメントはレンチウイルス由来であってよいか、またはそれらは、他のゲノム領域から同定された異種配列であってよい。当業者であれば、他のウイルス調節エレメントが同定される場合、これらが本明細書に記載される核酸分子と共に使用されてよいことも理解することになる。
【００９７】
本発明のベクターは、腸管特異的プロモーター（例えば、構成的活性化腸管特異的プロモーター）の使用によって、腸管内で特異的に発現を誘導してよい。そのようなプロモーターは、当該技術分野において既知であり、それらとしては、例えば、腸型脂肪酸結合タンパク質（ＩＦＡＢＰ）、ヒトムチン−２プロモーター（ＨＭＵＣ２）、ヒトリゾチームプロモーター（ＨＬＹ）、ヒトスクロース−イソマルターゼエンハンサー（ＨＩＳ）、ＣＤＸ２、ビリン、及びＰＤＸ１が挙げられる。
【００９８】
本明細書に記載されるように処置されてよい対象は、腸管の炎症、例えば、ＩＢＤと関連する腸管の炎症などを有するか、またはそれを発症するリスクがある対象を含んでよい。対象が腸管の炎症（例えば、ＩＢＤ）を有するか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかは、腸管内のＶγ４＋Ｔ細胞の存在及び機能に影響を与えるある特定の変異を同定することによって決定され得る。
【００９９】
腸管の炎症を発症するリスクがある対象は、対照対象と比較して、この状態のリスクまたはこの状態に対する感受性が増加している可能性がある。
【０１００】
対象は、対象の試料中における、図１７Ｂに例示した、記載されるジェノタイピング法を使用してＢＴＮＬ８＊３変異と関連するポリヌクレオチド配列のレベルを、ポリヌクレオチド配列の参照レベルと比較することによって、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードするポリヌクレオチド配列の変異（例えば、約５６ｋｂ欠失多型（ｈｇ１９におけるｃｈｒ５：１８０３７５０２７〜１８０４３０５９６））を有するとして同定され得る。変異は、例えば、参照試料、例えば、野生型試料と比較して、細胞表面に対するＢＴＮＬ３及び／またはＢＴＮＬ８の輸送の減少または除去を特徴とし得る。いくつかの場合では、変異は、ＢＴＮＬ８＊３融合タンパク質の発現を特徴とする。例えば、個体は、ＢＴＮＬ８＊３変異のヘテロ接合体またはホモ接合体であってよい。
【０１０１】
変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、例えば、ＢＴＮＬ３イントロンまたはＢＴＮＬ８イントロンのＳＮＰであり得る。好適なＳＮＰとしては、ｒｓ６８６８４１８及びｒｓ４７００７７２が挙げられる（例えば、ＮＣＢＩ  Ｓｈｏｒｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓデータベース、ｄｂＳＮＰを参照のこと）。例えば、対象は、ｒｓ６８６８４１８（一般的アレルＣＣ）においてＴのホモ接合体（ＴＴ）もしくはヘテロ接合体（ＣＴ）及び／またはｒｓ４７００７７２（一般的アレルＧＧ）においてＡのホモ接合体（ＡＡ）もしくはヘテロ接合体（ＧＡ）であってよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、変異は、Ｌ３Ｂ３０．２ｌｃ遺伝子型であってよい。例えば、対象は、ｒｓ７３８１５１５３においてＴのヘテロ接合体（ＧＴ）またはホモ接合体（ＴＴ）、ｒｓ７７２６６０４においてＧのヘテロ接合体（ＣＧ）またはホモ接合体（ＧＧ）、ｒｓ７７２６６０７においてＧのヘテロ接合体（ＣＧ）またはホモ接合体（ＧＧ）、及びｒｓ５９２２０４２６においてＧのヘテロ接合体（ＣＧ）またはホモ接合体（ＧＧ）であってよい。
【０１０３】
腸管内のＶγ４＋Ｔ細胞の存在及び機能に影響を与える変異を有すると同定される対象は、本明細書に記載されるような処置に適しているか、またはそれに好適な可能性がある。
【０１０４】
本明細書に記載される通りであってよい腸管の炎症を有するか、またはそのリスクがあると同定される対象は、本発明の態様に従って処置されてよいか、または処置のために選択されてよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、腸管の炎症を有するか、または腸管の炎症を発症する可能性がある、もしくはそれを発症するリスクがあるものとして対象を同定し、続けて、療法（例えば、本明細書に記載されるか、または当該技術分野において既知の方法のいずれかによる、遺伝子治療または細胞療法）を遂行するように勧告を提供し得る。
【０１０６】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載されるように同定される、処置されるか、または処置のために選択される個体は、ＢＴＮＬ８＊３変異を欠く場合があり、ｒｓ７３８１５１５３においてヘテロ接合体（ＧＴ）、ｒｓ７７２６６０４においてヘテロ接合体（ＣＧ）、ｒｓ７７２６６０７においてヘテロ接合体（ＣＧ）、及びｒｓ５９２２０４２６においてヘテロ接合体（ＣＧ）であってよい。
【０１０７】
前述の記載に、または以下の特許請求の範囲に、または添付の図面に開示される特徴は、それらの特定の形態で、または適宜、開示される機能を実行するための手段、もしくは開示される結果を得るための方法もしくはプロセスの観点から表され、別々に、またはそのような特徴の任意の組合せで、本発明をその多様な形態で実現するために利用されてよい。
【０１０８】
本発明は、上に記載される例示的実施形態に関連して記載されてきたが、多くの同等の修正及び変更形態が、本開示が与えられる場合に当業者には明らかとなる。したがって、上述した本発明の例示的実施形態は、例示的であって限定するものではないと見なされる。記載される実施形態に対する様々な変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われてよい。
【０１０９】
あらゆる誤解を避けるために、本明細書で提供されるいかなる理論的説明も、読者の理解を向上させる目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも束縛されることを望むものではない。
【０１１０】
本明細書で使用されるいずれの節の見出しも、系統立てる目的のためだけにすぎず、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１１】
本明細書に続く特許請求の範囲を含む、本明細書全体を通して、文脈上別段の解釈が必要でない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変化形は、記載される整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を示唆するが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の排除は示唆しないと理解されることになる。
【０１１２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。範囲は、「約」１つの特定値から、及び／または「約」別の特定値までとして本明細書で表されてよい。そのような範囲が表されている場合、別の実施形態は、一方の特定値から、及び／または他方の特定値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表されている場合、特定値が別の実施形態を形成すると理解されることになる。数値に関連した「約」という用語は任意であり、例えば、＋／−１０％を意味する。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用、実行、かつ評価されてよいかについての説明を当業者に提供するために記載され、単に本発明の例示を意図するにすぎず、本発明者らが本発明者らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【０１１４】
実施例１．腸上皮Ｔ細胞の選択
上皮から回収した細胞のフローサイトメトリーによって、及び上皮全載の共焦点可視化によって、発明者らは、特徴的なマウス小腸Ｖγ７＋上皮内（ＩＥＬ）コンパートメントが、主に２〜３週齢で形となって、その後少なくとも９か月間は安定したままであったことを見出した（図１Ａ及び図１Ｂ）。２１日目には、Ｖγ７＋細胞は、大半が成熟Ｓｋｉｎｔ１選択的樹状上皮Ｔ細胞（ＤＥＴＣ）を表現型模写し、均一に高レベルのＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒ／ＩＬ−１５Ｒβ鎖）、ＴＩＧＩＴ（阻害性共受容体）、及びＴＣＲ（抗ＣＤ３抗体で検出）、ならびにγδＴ細胞の分化に寄与する２つの転写因子であるＲｏｒγｃ及びＳｏｘ１３の、低レベルのＲＮＡを発現した（図１Ｃ）。Ｖγ７−ＩＥＬ（大半がＶγ１またはＶγ４）は、この表現型を示さず、Ｖγ７＋及びＶγ７−ＩＥＬサブセットの両方とも、大半がＣＤ４５ＲＢｈｉ、ＣＤ４４＋、及びＣＣＲ９＋であったのに対して、Ｖγ７＋ＩＥＬは、Ｌａｇ３＋、Ｔｈｙ１−、ＣＤ６９＋、ＣＤ５−、及びＣＤ８αα＋であるという点で異なっていた（図１Ｃ及び図２Ａ）。
【０１１５】
しかしながら、２１日目前には、Ｖγ７＋ＩＥＬは、成体マウスのＶγ７−ＩＥＬを表現型模写していた。したがって、表面タンパク質共発現のシーケンシャルゲーティング及びレーダープロットによって、発明者は、成熟Ｖγ７＋ＩＥＬ（ＣＤ１２２ｈｉ［ＭＦＩ＞５００］、Ｔｈｙ１−、ＴＩＧＩＴ＋、Ｌａｇ３＋、ＣＤ８αα＋、ＣＤ５−、ＣＤ２４−、ＴＣＲｈｉ）を、推定Ｖγ７＋ＩＥＬ前駆細胞（ＣＤ１２２ｌｏ［ＭＦＩ＜２００］、Ｔｈｙ１＋、ＴＩＧＩＴ−、Ｌａｇ３−、ＣＤ８αα−、ＣＤ５＋、ＣＤ２４＋、ＴＣＲｌｏ、図１Ｄ、図１Ｅ、及び図２Ｂ）から明確に区別することができ、後者はＳｋｉｎｔ１選択前のＤＥＴＣ前駆細胞も表現型模写した。
【０１１６】
ＩＥＬをそれらの推定前駆細胞とさらに比較するために、ＣＤ１２２ｈｉ  Ｖγ７＋及びＣＤ１２２ｌｏ  Ｖγ７＋ＩＥＬを、同じ１４〜１７日齢のマウスから独立して４回精製し、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ、図２Ｃ）によって評価した。それらの異なる表現型と一致して、細胞は、細胞表面タンパク質に関する多くの遺伝子の有意に異なる発現を示した（図２Ｃ）。さらに、ＣＤ１２２ｈｉ対ＣＤ１２２ｌｏ  Ｖγ７＋細胞中で上方制御された（例えば、Ｔｎｆｒｓｆ９［４−１ＢＢ／ＣＤ１３７］、Ｘｃｌ１［リンホタクチン］、Ｎａｓｐ）または下方制御された（例えば、ｓｏｘ１３、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｃｘ３ｃｒ１）多くの遺伝子は、同様にＤＥＴＣ前駆細胞のＳｋｉｎｔ１選択によって制御された（図１Ｆ及び図２Ｃ）。
【０１１７】
さらに、ＣＤ１２２ｈｉ  Ｖγ７＋細胞は、２１〜２４日目に約１００％のＶγ７＋ＩＥＬが、＜４０％のＶγ７−細胞と比較してＫｉ６７＋であった（すなわち、Ｇ０の外側）ことと一致して、細胞周期遺伝子に富んでいた（ｐ＜０．０００１）（図１Ｇ）。同様に、２８日目のＶγ７＋ＩＥＬは、Ｖγ７−ＩＥＬが４％のみであったのと比較して、約１０％が３時間のパルス中にエチニルデオキシウリジン（ＥｄＵ）（標識ヌクレオチド）を取り込んだという点で、急速に分裂している胸腺細胞を表現型模写していた（図２Ｄ）。要するに、これらのデータは、３〜４週目までにγδＩＥＬコンパートメントの優位を占めるＣＤ１２２ｈｉ、Ｔｈｙ１−、ＴＩＧＩＴ＋、Ｌａｇ３＋、ＣＤ８αα＋、ＣＤ５−、ＣＤ２４−、ＴＣＲｈｉ  Ｖγ７＋細胞の選択的成熟及び増殖を支援する腸管と一致している。５週目以降、定常状態で周期進行する（Ｋｉ６７＋）Ｖγ７＋ＩＥＬの割合は、Ｖγ７−ＩＥＬと同等のレベルまで低下した（図１Ｇ）。
【０１１８】
実施例２．腸管上皮選択エレメント
Ｓｋｉｎｔ１は、胸腺中の特徴的なＶγ５＋ＤＥＴＣ前駆細胞を選択するため、ＤＥＴＣは、無胸腺ＮＵ／ＮＵマウスには存在しない。対照的に、腸ＩＥＬはＮＵ／ＮＵ中に存在し、数は若干減少した（胸腺のあるマウス中で＞２．０×１０６細胞であったのと比較して、平均で約１．３×１０６細胞）が、コンパートメントは再度ＣＤ１２２ｈｉ  Ｖγ７＋ＩＥＬが優位を占めた。さらに、ＮＵ／ＮＵ中及び胸腺のあるマウス中における約２５％のＶγ７＋ＩＥＬが、Ｖδ４（ＴＲＤＶ２−２によってコードされる）鎖を検出する抗体ＧＬ２と反応した。このことと一致して、ＴＲＤＶ２−２配列は、精製したＶγ７＋ＩＥＬによって発現されるＴＣＲδ鎖ＲＮＡの約２５％を占めた（図３Ａ及び図４Ａ）。要するに、腸管Ｖγ７＋ＩＥＬコンパートメントの形成は、胸腺を必要としなかった。
【０１１９】
このことと一致して、Ｖγ７＋胸腺細胞は希少であり、マウスの胸腺機能のピーク期間である生後８週間にわたって胎児及び出生後の胸腺中に＜１０％のＴＣＲγδ＋細胞を含んでいた（図４Ｂ）。さらに、大半のＶγ７＋胸腺細胞は、ＣＤ４５ＲＢｌｏ、Ｔｈｙ１＋、ＣＤ５ｈｉ、ＣＤ１２２ｌｏ、ＴＣＲｌｏ、及びＣＤ８αα−であって、したがって、胸腺内成熟の証拠を一切提供しなかった（図４Ｃ及び図４Ｅ）。同様に、リンパ節もパイエル板（ＰＰ）もＩＥＬコンパートメントを形成するのに必要ではなく、その理由として、特徴的な表現型を有する正常な数のＶγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬが、手術後にＰＰならびに末梢及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を欠いていることを確認したａｌｙ／ａｌｙ（リンパ形成不全）マウス中に存在したからである（図４Ｆ）。
【０１２０】
離乳マウス中におけるＩＥＬ成熟の腸誘導物（複数可）としては、微生物及び／または食物抗原が論理的な候補であった。しかしながら、無菌環境中で、及び／または基本的なタンパク質無抗原飼料を与えて飼育かつ維持したＣ５７Ｂｌ／６マウスは、従来の飼育対応物と同等のＶγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬコンパートメントを示した（図３Ｂ）。Ｖγ７＋ＩＥＬは、均一にＴＣＲｈｉ、ＣＤ１２２ｈｉであって、絶対数が若干増加し、無菌及びタンパク質無抗原マウス中のＴＣＲαβＩＥＬの低下を部分的に補った（図３Ｂ）。したがって、局所的Ｔ細胞コンパートメントは、内因性腸エレメント（複数可）によって形成されている可能性が最も高い。このエレメント（複数可）を探索する時に、発明者らは、Ｓｋｉｎｔ１と密接に関連している３つの遺伝子、Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、及びＢｔｎｌ６に注目した。Ｂｔｎｌ４は胎児から始まり、近位小腸中において低レベルで発現された。Ｂｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６のＲＮＡを産後６日目に検出し、Ｂｔｎｌ１レベルは、３つ全てのＢｔｎｌ遺伝子発現が安定化する前のおよそ１４日目にさらに増加した（図３Ｃ）。発現は、ＩＥＬが散在している有糸分裂後絨毛腸細胞中であって、複製上皮細胞の前駆細胞を保持し、ＩＥＬを欠いている絨毛陰窩には本質的に存在しなかった（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図４Ｇ）。Ｂｔｎｌ１発現は、近位及び中央小腸でピークを迎え（図４Ｈ）、その発現は胸腺中よりも＞１０７倍高かった（図４Ｉ）。これらの発現パターンは、Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、及び／またはＢｔｎｌ６が、離乳マウス中のＶγ７＋ＩＥＬに対して局所的に機能することを可能にし得た。この可能性を調査するために、発明者らは、各々が胚性幹細胞（ＥＳＣ）の標的変異誘発によって生成されたＢｔｎｌ１−／−マウスの３つの独立した株及びＢｔｎｌ４−／−マウスの１つの株、ならびにマウス卵子中で規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ９によって生成された内部欠失Ｂｔｎｌ１遺伝子座を有する株を得た（図４Ｊ）。株を、ＤＮＡ分析及び各々のＢｔｎｌ  ＲＮＡの欠如によって遺伝子ノックアウトとして確認した（図３Ｅ及び図４Ｉ〜図４Ｋ）。
【０１２１】
実施例３．Ｂｔｎｌ１は腸ＩＥＬコンパートメントを形成する
４つのＢｔｎｌ１−／−株は各々、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡によって評価した、Ｖγ７＋ＩＥＬの大半の、高度に選択的な欠如を示した（図５Ａ、図５Ｂ、及び図６Ａ）。Ｖγ７＋ＩＥＬ数は約９０％枯渇し、Ｖγ７ＧＬ２＋細胞がほぼ除去された。Ｖγ７−ＩＥＬ数がほとんど増加しなかったため、γδＩＥＬ中のＶγ７＋細胞のパーセンテージ表示は、野生型（ＷＴ）マウスと比較して約３分の１しか減少しなかったが、これを劇的に減少したγδＩＥＬ数のバックグラウンドに対して設定した（図５Ａ及び図６Ａ）。対照的に、ＴＣＲβ＋ＣＤ８α＋ＩＥＬ数は、Ｂｔｎｌ１−／−マウス中で有意に増加した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【０１２２】
Ｖγ７＋ＩＥＬに対するＢｔｎｌ１の特異性を、Ｂｔｎｌ１−／−、ＷＴ、及びＢｔｎｌ１＋／−マウスの包括的な免疫表現型解析によって強調し、これらは、４日目から８週目までの間に、同等の脾臓またはＭＬＮ免疫細胞サブセット（γδ細胞レパートリーを含む）ならびにＶγ７＋胸腺細胞の同等の表示及び表現型を示した（図６Ｂ〜図６Ｅ）。その発現パターンと一致して、Ｂｔｎｌ１は胸腺外で機能し、したがって、ＮＵ／ＮＵマウスで交配させたＢｔｎｌ１欠損は、Ｖγ７＋ＩＥＬの平均数を約９０％減少させ、Ｖγ７ＧＬ２＋ＩＥＬはほぼ完全に消失した（図５Ｃ）。ＮＵ／ＮＵマウスは大半のαβＴ細胞を欠いているため、この結果は、可能性がないとはいえ、胸腺のあるＢｔｎｌ１−／−マウスのＶγ７＋ＩＥＬ欠如が、間接的に増殖ＴＣＲαβＩＥＬを反映したという形式的可能性を除外する。Ｂｔｎｌ１に対するＶγ７＋ＩＥＬの特異性を、Ｂｔｎｌ４−／−マウスがいずれの主なＩＥＬサブセット中でも明白な欠陥を一切示さなかったという事実によって強調した（図５Ｄ）。
【０１２３】
実施例４．Ｂｔｎｌ１はトランスでＶγ７＋ＩＥＬを選択する
Ｂｔｎｌ１がどのように、いつＩＥＬに影響を与えるかを決定するために、発明者らは、Ｂｔｎｌ１−／−マウスの残存Ｖγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬを検査した。ＷＴマウスのそれらと比較して、Ｄ２８でＥｄＵを取り込んだ（ｐ＜０．０００１）か、またはＫｉ６７を発現したＶγ７＋ＩＥＬは有意に少なく、これはＷＴマウス中の大半のＶγ７＋ＩＥＬが周期進行から外れた場合のＷ７まで変化しなかった（図７Ａ及び図８Ａ）。したがって、Ｂｔｎｌ１−／−マウス中におけるＶγ７＋ＩＥＬの選択的増殖は一切存在しなかった。同様に、それらのＴＣＲレベルは高かったが、３〜５週目の多くの残存Ｖγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬ。Ｂｔｎｌ１−／−マウスは、ＣＤ１２２ｌｏ、Ｔｈｙ１＋、ＴＩＧＩＴ−、Ｌａｇ３−、ＣＤ８αα−、ＣＤ５＋、ＣＤ２４＋であって、それによって、１４〜１７日齢のＷＴマウスの未成熟Ｖγ７＋ＩＥＬを表現型模写した（図７Ｂ、図７Ｃ、及び図８Ｂ）。Ｂｔｎｌ１が、トランスでＶγ７＋Ｔ細胞に対してその選択的影響を発揮することを実証するために、発明者らは、３〜５週齢のＷＴマウスのＶγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬコンパートメントを、放射線照射した８〜１０週齢のγδＴ細胞欠損ＴＣＲδ−／−マウスにドナー骨髄（ＢＭ）を移植してから約５週間以内に再構成する条件を設定した（図８Ｃ）。ＷＴまたはＢｔｎｌ１−／−マウスのいずれかに由来するＢＭが、ＩＥＬ再構成に等しく効果的であることを証明した（図７Ｄ）。放射線照射したコンジェニックＴ細胞充足ＣＤ４５．２＋ＷＴレシピエント中におけるＶγ７＋ＩＥＬのＷＴ  ＢＭ再構成は、ＴＣＲδ−／−宿主中におけるそれよりも効果が弱かった（比較プロット、図７Ｄ及び図７Ｅの左上）が、それにもかかわらず、Ｂｔｎｌ１−／−宿主の再構成ははるかに効果が弱く、Ｂｔｎｌ１−／−レシピエント中で発生した少数のＶγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬは、Ｂｔｎｌ１−／−マウスの残存Ｖγ７＋細胞及び１４〜１７日齢のＷＴマウスの未成熟ＩＥＬを表現型模写した（図７Ｅ）。これらの知見を補完すると、４週齢マウスに由来する精製ＩＥＬは、非常に非効率的ではあるが、レシピエントＴＣＲδ−／−マウス中でＶγ７＋ＩＥＬを再構成することができ、これもまた、Ｂｔｎｌ１−／−ＴＣＲδ−／−宿主中で著しく障害された（図８Ｄ）。したがって、Ｂｔｎｌ１は非造血細胞中で機能し、Ｖγ７＋ＩＥＬの選択的増殖及び成熟を支援する。
【０１２４】
ＩＥＬ選択の回復を試みるために、発明者らは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性プロモーターから発現させたＢｔｎｌ１のトランスジェニックＢｔｎｌ１−／−マウスを提供し（図１０Ａ及び図１０Ｂ）、それらをＢｔｎｌ１−／−マウスと交配させ、その中に普遍的に発現するＲｏｓａ２６プロモーターによって制御されるＤｏｘ応答トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を導入した。報告された通り、低用量Ｄｏｘを飲用水に添加しても、数週間にわたって腸管に対する明白な影響はほとんどなかった。したがって、このシステムは、ｒｔＴＡ及び誘導性Ｂｔｎｌ１導入遺伝子の両方を継承したＢｔｎｌ１−／−バイトランスジェニック（ＢｉＴｇ）マウス中に、Ｂｔｎｌ１を新たに全体的に誘導する手段を提供した。逆に、砂糖水を投与したＢｉＴｇマウス及びＤｏｘ処置シングルトランスジェニック（ＳｉＴｇ）Ｂｔｎｌ１−／−マウス（Ｂｔｎｌ１導入遺伝子のみを継承した）は、対照として機能した。適切な遺伝子型を持つマウスでのＢｔｎｌ１誘導を、ｑＰＣＲによって検証した（図１０Ｃ）。
【０１２５】
いくつかのＷ１１  Ｂｔｎｌ１−／−ＢｉＴｇマウスをこの方法で処置した場合、Ｖγ７＋及びＶγ７＋ＧＬ２＋ＩＥＬの表示は、同腹仔対照と比較して変化しなかったが、ＣＤ１２２ｈｉであったＶγ７＋ＩＥＬのパーセンテージは大幅に増加し、大半がＫｉ６７を発現した。このことは、Ｖγ７−またはＴＣＲβ＋ＩＥＬには当てはまらなかった（図１０Ｄ〜図１０Ｆ）。したがって、成体マウス中への新たなＢｔｎｌ１誘導は、出生初期にＶγ７＋ＩＥＬ特異的成熟を部分的に表現型模写したが、Ｖγ７＋ＩＥＬ数を再構成することはなかった。全体的なＢｔｎｌ１誘導はまた、他のいかなる組織中でも異所性Ｖγ７＋細胞成熟を誘導することはなかった。
【０１２６】
実施例５．上皮Ｂｔｎｌ活性の時間ウィンドウ
さらなる実験では、発明者らは、ビリンプロモーターから発現されるｒｔＴＡのトランスジェニックＢｔｎｌ１−／−マウスを生成することによって、Ｂｔｎｌ１誘導を成熟腸細胞に限定した。数匹のＷ１１  ＢｉＴｇ  Ｂｔｎｌ１−／−マウスをＤｏｘ処置してから１〜２週間以内に、大半のＶγ７＋ＩＥＬは、Ｌａｇ３ｈｉ、Ｔｈｙ１−、及びＣＤ１２２ｈｉとなって、その大多数がＫｉ６７＋でもあった（図９Ａ及び図９Ｂ）。ここでも、この表現型移行は、砂糖水処置マウス中におけるＫｉ６７＋ＴＣＲβ＋ＩＥＬのＢｔｎｌ１非依存的な増加が時々存在していたにもかかわらず、Ｖγ７＋ＩＥＬ特異的であった。（図９Ｂ）。さらにまた、Ｖγ７＋ＩＥＬの数及び表示は、３〜４週間Ｄｏｘ上で保持したマウス中であっても変化しなかった（図９Ｃ）。このことは、Ｂｔｎｌ１が、成熟Ｖγ７＋細胞の選択的増殖を単に促進するのではなく、未成熟Ｖγ７＋ＩＥＬの表現型変換をもたらし得ることを証明している。
【０１２７】
しかしながら、Ｂｔｎｌ１発現をＢｔｎｌ１−／−マウス中で出生初期に誘導した場合、Ｄ７で授乳中の雌の、またはＤ２１で離乳仔のＤｏｘ処置を開始し、次いで２〜５週間処置を維持することによって、Ｖγ７＋及びＶγ７ＧＬ２＋ＩＥＬの表示が有意に増加した（図９Ｄ）。さらに、増殖したＶγ７＋細胞は、Ｗ４〜５  ＷＴマウスのＩＥＬを表現型模写し、Ｄｏｘ処置ＳｉＴｇマウス及びＢｔｎｌ１−／−マウスのＩＥＬとは有意に異なっていた（図９Ｅ）。したがって、純粋に腸管上皮でのＢｔｎｌ１の急性発現は、Ｖγ７＋ＩＥＬの選択的表現型成熟及び増殖を誘導するが、これらの効果は分離可能であり、選択的増殖は、大半が生後５週間以内の発達ウィンドウに限定されている。
【０１２８】
実施例６．上皮Ｂｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６はＶγ７＋細胞を制御する
Ｂｔｎｌ１の急性発現が、インビボでＶγ７＋ＩＥＬの選択的成熟を促進することを考慮し、発明者らは、Ｂｔｎｌ１がエクスビボでＶγ７＋ＩＥＬに特異性を示す可能性があるかを試験した。初代腸上皮細胞は、Ｂｔｎｌ１をＢｔｎｌ６との複合体で保持していると報告されているため、発明者らは、Ｂｔｎｌタンパク質のヘテロタイプ相互作用の証拠を求めた。事実、Ｂｔｎｌ１トランスフェクトＭＯＤＥ−Ｋ細胞（内在性Ｂｔｎｌ遺伝子が、無視できるほどしか発現されない既存の腸上皮細胞株）上でのＢｔｎｌ１の細胞表面発現は、Ｂｔｎｌ４またはＢｔｎｌ６との共トランスフェクションによって大幅に増強された（図１２Ａ）。同様に、表面Ｂｔｎｌ６発現は、Ｂｔｎｌ１によって大幅に増強されたが、Ｂｔｎｌ６とＢｔｎｌ４との間に協力の証拠は一切なかった（図１２Ａ）。Ｂｔｎｌ１に対するＢｔｎｌ６の特異性を考慮し、かつＢｔｎｌ４−／−マウスが全くＩＥＬ表現型を示さなかったことを考慮して、発明者らはＢｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６に注目した。
【０１２９】
Ｂｔｎｌ１（Ｌ１）、Ｂｔｎｌ６（Ｌ６）、Ｂｔｎｌ１に加えてＢｔｎｌ６（Ｌ１＋６）、または空ベクター（ＥＶ）で安定に形質導入したＭＯＤＥ−Ｋ細胞を新たに外植したＩＥＬと共培養し、次いでこのＩＥＬをＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα鎖）上方制御についてアッセイしたが、これは全身性Ｔ細胞に対するＴＣＲ刺激の最も確かな測定値の１つである。混合ＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋ＩＥＬは、ＥＶ、Ｌ１、またはＬ６細胞との共培養に対して小幅なＣＤ２５上方制御を示したのに対して、Ｌ１＋６細胞に曝露したＩＥＬは、Ｖγ７＋細胞（Ｖγ７ＧＬ２＋及びＶγ７ＧＬ２−細胞の両方）の約２０％に完全に起因する、非常に有意なＣＤ２５上方制御を示した（図１１Ａ）。有意なＣＤ２５上方制御は、全身性ＴＣＲ刺激に当てはまるように、４〜６時間以内で最初に明らかとなった（図１２Ｂ）。
【０１３０】
Ｌ１＋６細胞を、Ｎｕｒ７７．ｇｆｐマウスに由来する初代ＩＥＬと共培養した場合、ＧＦＰがＴＣＲシグナル伝達の下流で活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化によって上方制御され、ＣＤ２５を上方制御した全てのＩＥＬは本質的にＧＦＰ＋であった（図１１Ｂ）。この表現型は、同じ共培養物中のＶγ７−またはＴＣＲαβ＋ＩＥＬでは示されなかった（図１１Ｂ）。ＣＤ２５を上方制御するＩＥＬはまた、ＣＤ１２２を下方制御し、これは全身性ＴＣＲ刺激の追加症状であった（図１２Ｃ）。したがって、ＣＤ２５＋ＧＦＰ＋ＣＤ１２２−細胞は、Ｌ１＋６細胞と共培養したＶγ７＋ＩＥＬ中でのみ発生した（図１１Ｃ）。さらに、ＣＤ２５上方制御は、わずかではあるが有意なＴＣＲ下方制御を伴い、これはＴＣＲ刺激に対する別の迅速な応答であった（図１１Ｄ）。ＣＤ２５が、Ｌ１＋６細胞の共培養前にフローサイトメトリーによって精製しておいた細胞上で上方制御されたため、Ｂｔｎｌ１＋Ｂｔｎｌ６はＶγ７＋ＩＥＬに対して直接作用した（図１２Ｄ）。バックグラウンドＣＤ２５発現は、ＴＣＲ依存性選別によって増加したが、これによって結果が不明瞭にはならなかったことに留意されたい。
【０１３１】
ＩＥＬをトランスウェルによってＬ１＋６細胞から分離した場合、ＣＤ２５上方制御を停止させ、Ｌ１＋６細胞と接触していたＩＥＬによって、例えば、分泌サイトカインを介して、二次的にトランス活性化させることができなかった（図１１Ｅ）。Ｌ１＋６細胞と接触したＩＥＬによるＣＤ２５上方制御は、ＰＰ２による用量依存的阻害を示し、これはＬｃｋ及びＦｙｎなどのｓｒｃファミリーキナーゼによるシグナル伝達を阻害するが、ＰＰ２特異性に対する既存の対照であるＰＰ３では阻害しなかった（図１２Ｅ）。
【０１３２】
Ｂｔｎｌ１−／−マウスの残存Ｖγ７＋ＩＥＬがインビボで急性トランスジェニックＢｔｎｌ１誘導に応答したように、それらはエクスビボでＢｔｎｌ１に加えてＢｔｎｌ６に対する応答についてＷＴ  Ｖγ７＋ＩＥＬと同等であった（図１１Ｆ）。同じ実験では、ＷＴ  Ｖγ７＋ＩＥＬは抗ＣＤ３に対して相対的に弱い応答を示し、Ｓｋｉｎｔ１によるＶγ５＋ＤＥＴＣ前駆細胞に現れる応答性の減衰を表現型模写したのに対して、Ｂｔｎｌ１−／−マウスに由来するＶγ７＋ＩＥＬ、ならびにＷＴマウスに由来するＴＣＲαβ＋及びＶγ７−ＩＥＬは、そのサブセットのいずれも、前のＢｔｎｌ１選択をインビボで経ていなかったため、全て抗ＣＤ３に対して強い応答を示した（図１１Ｆ及び１１Ｇ）。
【０１３３】
最後に、Ｌ１＋６細胞とのＩＥＬ共培養物の上清は、試験した３６のサイトカインの中でも、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＣＣＬ４、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の、わずかではあるが有意な増加を示した（図１１Ｈ）。これらは典型的なＩＥＬエフェクターであり、産生をＶγ７＋ＩＥＬによるものとするには技術的に困難であったが、そのような増加は、ＴＣＲδ−／−マウスに由来するＩＥＬと培養したＬ１＋６細胞の上清では見られなかった。ＴＣＲδ−／−マウスのより高度なバックグラウンドサイトカイン発現は、多くの場合にγδ欠損と関連する自然炎症を反映している可能性があることに留意されたい。要するに、様々な測定基準によって、Ｖγ７＋ＩＥＬｓと、腸管上皮細胞上に共発現したＢｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６との高度に特異的かつ直接的なエクスビボでの相互作用が証明された。
【０１３４】
実施例７．特徴的なヒト腸γδＴ細胞
組織の利用が限定的であるため、ヒト腸管Ｔ細胞は研究中である。それにもかかわらず、腸管関連γδ細胞が存在し、そのＴＣＲ使用状況は、末梢血の優位を占めるＶγ９＋Ｖδ２＋細胞とは著しく異なる。そのような細胞をより良く特徴付けるために、発明者らは、健康な上行結腸からの生検材料を、ヒト皮膚Ｔ細胞を単離するために使用したプロトコールの修正版に供した（Ｃｌａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２００６．１２６（５）：１０５９−７０、参照によって本明細書に組み込まれる）。１７人のドナーのうち１６人について、γδ細胞はＶδ１＋細胞に富んでいたが、Ｖδ１−Ｖδ２−細胞も存在していて、したがって、「Ｖδ２−」という用語を使用して、組織関連γδ細胞を、非常に多様な数であっても、多くの腸管試料から同様に回収可能であったＶδ２＋細胞と区別する（図１３Ａ）。
【０１３５】
６つの機能的ヒトＶγ鎖遺伝子（Ｖγ２、３、４、５、８、及び９）のうち、Ｖγ４は、腸Ｖδ２−細胞の特徴的な鎖であることが報告された。事実、検査した最大１０人のドナーについて、大半の腸Ｖδ２−細胞がＶγ２／３／４特異的抗体と反応したが、Ｖγ５／３特異的抗体とは反応せず（図１３Ｂ、表１）、ＴＣＲディープシーケンシングは、Ｖγ４配列がＶγ２配列よりもはるかに数が多かったことを示した（図１４Ａ）。したがって、個体差にもかかわらず、大半の腸管γδＴ細胞コンパートメントが、実質的なＶγ４＋Ｖδ２−サブセットを含んだ一方で、一部のドナーはまた、Ｖγ８＋Ｖδ１＋細胞の相対的に高い表示を示した（図１３Ｂ、表１）。
【表１】
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【０１３６】
実施例８．ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８はヒトＶγ４＋細胞を制御する
Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、及びＢｔｎｌ６をコードするマウス１７番染色体上のＢｔｎｌ２近位アンプリコンに相当するものが、ヒトには存在しない。しかしながら、ヒトＢＴＮＬ９に隣接するアンプリコンはＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードし、その発現は、腸管、特にＥｐＣＡＭ＋上皮細胞中で高度に富化される（図１４Ｂ〜図１４Ｄ）。興味深いことに、上に記載されるＢｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６の挙動に類似して、ＢＴＮＬ３タンパク質とＢＴＮＬ８タンパク質のいずれも、両方が共発現されない限り、それらの各々の遺伝子でトランスフェクトした細胞上では効率的に発現されなかった（図１４Ｅ）。逆に、ＢＴＮＬ８Ｓ（ＢＴＮＬ８のスプライスバリアント）は、表面ＢＴＮＬ３発現を回復できなかった（図１４Ｅ）。
【０１３７】
発明者らが、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８に対するヒト腸管γδ細胞の発達依存性について試験できなかったのに対して、発明者らは、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８が、ＴＣＲ依存的方法で特徴的な腸管γδ細胞を特異的に活性化させることによってＢｔｎｌ１及びＢｔｎｌ６を表現型模写したどうかを評価することができた。したがって、発明者らは、初代腸管由来リンパ球と、ＢＴＮＬ３（Ｌ３）、ＢＴＮＬ８（Ｌ８）、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８（Ｌ３＋８）、またはＥＶで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞との短期共培養を確立した（図１４Ｆ）。示した代表的なドナーについて、対照（ＥＶ、Ｌ３、及びＬ８）細胞とのＴ細胞共培養物中では明らかであったＶδ１−及びＶδ１＋γδ細胞の個々のサブセットのうちいくつかは、Ｌ３＋８細胞と共培養した場合、顕著なＴＣＲ下方制御を示した（矢印、１３Ｃ）。
【０１３８】
特異性を強調すると、ＴＣＲ下方制御は、２３人のドナーのうち２１人においてＬ３＋８細胞に応答して発生したが、Ｌ３またはＬ８細胞との共培養物では全く見られず、腸Ｖδ２＋またはＴＣＲαβ＋細胞では、応答するＶδ２−細胞と同じ培養物であっても、全く示されなかった（図１３Ｄ）。より高いベースラインＣＤ２５発現は、エクスビボでのヒト対マウス腸管Ｔ細胞活性化に関するこのアッセイの感度を減少させたが、Ｌ３＋８細胞は、対照細胞と共培養した腸管Ｔ細胞に対して有意なＣＤ２５上方制御を誘導し（図１３Ｅ）、ＣＤ２５上方制御は、下方制御されたＴＣＲを有する細胞上で最も明白であった（図１４Ｇ）。
【０１３９】
全てのＶδ２−細胞がＬ３＋８に応答したわけではなかった（図１３Ｃ）。したがって、発明者らは、ＴＣＲγ鎖が、マウスでは当てはまるように、ＢＴＮＬ応答性を決定する可能性があると考えた。事実、Ｌ３＋８細胞との共培養物中でＴＣＲを下方制御したヒトＶδ２−集団を、Ｖγ２／３／４特異的抗体によって検出したが、Ｖγ８、Ｖγ５／３、またはＶγ９に対する抗体では検出できなかった（図１３Ｆ及び図１３Ｇ）。さらに、下方制御されたＴＣＲを有するＬ３＋８応答細胞を１人のドナーからフローサイトメトリーで選別し（図１４Ｈ）、それらのＶγ鎖をバイアスなしで増幅してシーケンシングした場合、生産的に再配列されたＶγ４遺伝子が高頻度に見られた（上の４つの配列、図１５）。対照的に、皮膚由来ＴＣＲγδ＋細胞（Ｇ２３４ＳＫ０１）からのＴＣＲγ転写物は、Ｖγ３に偏っていた（下の４つの配列、図１５）。興味深いことに、ＢＴＮＬ３＋８に対して実質的な応答を一切示さない２人のドナーのうち、１人は、Ｖγ８＋細胞が優位を占める非定型腸γδＴ細胞レパートリーを有することが事後的に証明された（図１４Ｉ）。同様に、Ｌ３＋８細胞は、Ｖγ４＋細胞が希少である皮膚または血液の初代γδ＋Ｔ細胞による有意なＴＣＲ下方調節を一切誘導しなかった（図１３Ｈ）。したがって、上皮ＢＴＮＬ遺伝子は、器官特異的でＴＣＲγ鎖特異的な方法でヒト組織定住γδＴ細胞を制御している。
【０１４０】
実施例９．実験方法
以下の方法を、実施例１〜８に記載した試験を実施するために必要に応じて実施した。
【０１４１】
マウス
野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎから入手した。Ｂｔｎｌ１−／−（Ｂｔｎｌ１ｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｍｂｐ）マウスの独立して得た３つの胚性幹（ｅ．ｓ．）細胞及びＢｔｎｌ４−／−（Ｂｔｎｌ４ｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｍｂｐ）マウスのｅ．ｓ．細胞を、国際マウス表現型解析コンソーシアム（ＩＭＰＣ）（プロジェクトＩＤ：ＣＳＤ６７９９４及びＣＳＤ８１５２４）から入手した。Ｂｔｎｌ１ｉｎｄｅｌ／ｉｎｄｅｌマウスを、ＣｒｉｓｐｒＣａｓ技術を使用して生成した。簡潔に述べると、エクソン１と２の間の、及びエクソン５と６の間のイントロン領域を標的とする、２つの独立した短鎖ガイドＲＮＡを、オンラインツール：ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／（ＣＲＩＳＰＲ設計プラットフォーム、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＭＡ  ＵＳＡ）を使用して同定した。イントロン１／２：ＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＴＧＧ（配列番号：１３）、イントロン５／６：ＴＣＣＡＴＡＧＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＴＧＧ（配列番号：１４）。ｓｇＲＮＡ及びＰＡＭ配列をｇ−ＲＮＡ基本ベクターにクローニングし、インビトロで翻訳し、精製して１日目の受精卵中にＣａｓ９と共注射し、偽妊娠仮親マウスに移植した。ＷＴ及びＢｔｎｌノックアウト株を、Ｔｈｅ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｃｒｉｃｋ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓで生成して維持した。時限妊娠については、マウスを一晩交配させ、Ｅ０を膣栓が観察される日と見なした。１〜３５週齢（示す通り）の雄及び雌マウスの両方を、本試験で使用した。性差は一切観察されなかった。
【０１４２】
無菌マウス及び食物無抗原栄養
無菌（ＧＦ）マウスを、プラスチックアイソレーター中にオートクレーブ処理した食物、寝床、及び水を入れて飼育した。動物の無菌性を、好気性及び嫌気性条件下で少なくとも１０日間、チオグリコレート培地中で糞便を培養することによって隔週で確認した。ＧＦマウスに関する全ての取り扱い手順を、層流フード中において無菌条件下で実施した。食物無抗原（ＦＡＦ）マウスを、最大で５世代、アミノ酸含有飼料で飼育した。ＦＡＦ飼料（ｓｓｎｉｆｆ、Ｓ７２４２−Ｅ０１４／−Ｅ７１４）のペレットは、全ての必須ビタミン、ミネラル、微量元素、脂肪、デキストリン、スクロース及び遊離アミノ酸を、通常のげっ歯類固形飼料（ＬＡＳＱＣｄｉｅｔＲｏｄ１６、ＬＡＳｖｅｎｄｉ）のタンパク質含有量と等モルで含有した。
【０１４３】
ドキシサイクリン誘導性Ｂｔｎｌ−１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスの生成
ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性Ｂｔｎｌ１−Ｔｇマウスを、Ｂｔｎｌ１−ＯＲＦの上流にＴＲＥ／ＣＭＶプロモーターを含有する線状化カセットを有するＢｔｎｌ１−／−胚盤胞の注入によって生成した。ＴＲＥ／ＣＭＶカセットは、以前に記載されている（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。Ｒ２６−ｒｔＴＡ２−Ｍ２（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）またはビリン−ｒｔＴＡ２−Ｍ２（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）マウスを交配してＢｔｎｌ１欠損のホモ接合性とし、３世代にわたってＢｔｎｌ−Ｔｇマウスと戻し交配して、飲用水に投与したドキシサイクリン（１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘ、２％スクロース）によってＢｔｎｌ１導入遺伝子発現の全体的（Ｒ２６）または局所的（ビリン）誘導を促進した。動物実験は、英国内務省の規定を完全に遵守し、Ａ．Ｈ．に対するプロジェクトライセンス（８０／２４８０）下で行った。
【０１４４】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを、表示した蛍光色素に結合した、以下の抗体を使用して実施した。マウスに対する抗体：ＣＤ３  ＡＰＣ  Ｃｙ７（１７Ａ２）、ＣＤ３  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（１４５−２Ｃ１１）、ＴＣＲβ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（Ｈ５７−５９７）、ＴＣＲβ  ＡＰＣ（Ｈ５７−５９７）、ＣＤ１２２  ＰＥ（ＴＭβ１）、ＣＤ１２２  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（ＴＭβ１）、ＣＤ１２２  ＡＰＣ（ＴＭβ１）、ＴＩＧＩＴ  ＰＥ（ＧＩＧＤ７）、ＣＤ４５ＲＢ  ＡＰＣ  Ｃｙ７（Ｃ３６３−１６Ａ）、Ｔｈｙ１．２  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ５１０（５３−２．１）、Ｌａｇ３  ＰｅｒＣＰ−ｅｆｌｕｏｒ７１０（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、ＣＤ５  ＰＥ（５３−７．３）、ＣＤ２４  ＦＩＴＣ（Ｍ１／６９）、ＣＤ２４  ＰＥＣｙ７（Ｍ１／６９）、ＣＤ８α  ＰＥＣｙ７（５３−６．７）、ＣＤ８α  ＰＥＣｙ７（５３−６．７）、ＴＣＲ  Ｖδ４  ＦＩＴＣ（ＧＬ−２）、ＴＣＲ  Ｖδ４  ＰＥ（ＧＬ−２）、ＣＤ８β  ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（ＹＴＳ１５６．７．７）、ＣＤ２５  ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（ＰＣ６１）、ＣＤ６９  ＰＥＣｙ７（Ｈ１．２Ｆ３）、ＣＣＲ９  ＰＥＣｙ７（ＣＷ−１．２）、ＣＤ４４  ＰＥＣｙ７（ＩＭ７）、ＴＣＲＶγ７（Ｆ２．６７）はＰａｂｌｏ  Ｐｅｒｅｉｒａ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）により提供された、ＴＣＲＶγ１  ＡＰＣ（２．１１）、ＴＣＲＶγ４  ＡＰＣ（ＵＣ３−１０Ａ６）、ＴＣＲδ  ＢＶ４２１（ＧＬ３）、Ｋｉ６７  ＦＩＴＣ（Ｂ５６／ＭＯＰＣ−２１）、ＣＤ４５  Ｑｄｏｔ６０５（３０−３５  Ｆ１１）、ＣＤ５  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ５１０（５３−７．３）、ＴＣＲδ  ＰｅＣｙ７（ＧＬ３）、ＣＤ１６１／ＮＫ１．１  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ６５０（ＰＫ１３６）、ＣＤ４  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ７８６（ＧＫ１．５）、ＣＤ８α  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（５３−６．７）、ＣＤ２５  ＡＰＣ（ＰＣ６１）、ＧＩＴＲ  ＰＥ（ＤＴＡ−１）、ＣＤ４４  ＦＩＴＣ（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭＥＬ−１４）、ＫＬＲＧ１  ＢＶ４２１（２Ｆ１）、ＣＤ１１ｃ  ＢＶ７８６（ＨＬ３）、ＣＤ１１ｂ  ＢＶ５１０（Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＢＭ８）、Ｌｙ６Ｇ  ＡＰＣ（１Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（ＡＬ−２１）、ＣＤ１０３  ＰＥ（Ｍ２９０）、ＣＤ３１７  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ６５０（９２７）、ＭＨＣＩＩ／ＩＡ／ＩＥ  ＦＩＴＣ（２Ｇ９）、ＣＤ８６  Ｐｅ−Ｃｙ７（ＧＬ１）、ＣＤ３  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ１９  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（１Ｄ３）、ＣＤ１６１／ＮＫ１．１（ｌｉｎ）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（ＰＫ１３６）、ＩｇＧ１  ＰＥ（Ａ８５−１）、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）ＡｌｅｘａＦｕｌｏｒ７００（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＩｇＭ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ７８６（Ｒ６−６０．２）、ＩｇＤ  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（１１−２６ｃ．２ａ）、ＧＬ−７  ＡｌｅｘａＦｕｌｏｒ６４７（ＧＬ７）、ＣＤ９５  ＰＥＣｙ７（Ｊｏ２）、ＣＤ１３８  Ｂｒｉｌｌｉａｎ��  Ｖｉｏｌｅｔ６５０（２８１−２）、ＣＤ２１／３５  ＦＩＴＣ（７Ｇ６）、ＣＤ２３  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂ−ｌｙ６）。
【０１４５】
ヒトに対する抗体：ＣＤ２５  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４２１（ＢＣ９６）、ＣＤ２５  ＰＥ（ＢＣ９６）、ＣＤ３  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）５１０（ＯＫＴ３）、ＣＤ３  ＢＵＶ（ＵＣＨＴ１）、ＥｐＣＡＭ  ｅＦｌｏｕｒ（商標）６６０（１Ｂ７）、ストレプトアビジンＡＰＣ−Ｃｙ７、ストレプトアビジンＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４２１、ＴＣＲγδ  ＰｅＣｙ７（ＩＭＭＵ５１０）、Ｖγ９  ＰＣ５（ＩＭＭＵ３６０）、Ｖγ９  ＰＥ（Ｂ３）、Ｖδ１  ＡＰＣ（ＲＥＡ１７３）、Ｖδ２  ＰｅｒＣＰ（Ｂ６）、Ｖγ２／３／４ビオチン（２３Ｄ１２）、Ｖγ３／５ビオチン（５６．３）及びＶγ８ビオチン（Ｒ４．５．１）は、Ｄ．Ｋａｂｅｌｉｔｚ及びＤ．Ｗｅｓｃｈ（キール大学）により提供された。
【０１４６】
他の抗体：ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＰＥ（Ｆｌａｇ）、ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＡＰＣ（Ｆｌａｇ）、ＨＡ−ＤｙＬｉｇｈｔ６５０、６×−ヒスチジン−ＰＥ。市販の抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＭｉｌｔｅｎｙｉから購入した。生存能色素（近ＩＲまたは青）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものであった。抗ＴＣＲＶγ７（Ｆ２．６７）を、マウスＴＣＳ精製システム（Ａｂｃａｍ）を使用してハイブリドーマ上清から精製し、ビオチンまたはＡＦ６４７と複合化した。
【０１４７】
Ｋｉ−６７染色を、Ｆｏｘｐ３染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して固定かつ透過処理した細胞で実施した。ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＥｄＵの取込みを、腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ）の３時間後に、それぞれ免疫組織化学によって、またはフローサイトメトリー（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  ＡＦ６４７アッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価した。抗ＴＣＲＶγ７（Ｆ２．６７）を、マウスＴＣＳ精製システム（ａｂｃａｍ−ａｂ１２８７４９）を使用してハイブリドーマ上清から精製した。精製した抗ＴＣＲＶγ７を、ビオチン（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、またはＡＦ６４７（標識キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と複合化した。他の抗体は、抗ヒトＶγ２／３／４（２３Ｄ１２、ビオチン化）、Ｖγ５／３（５６．３、ビオチン化）及びＶγ８（Ｒ４．５．１、ビオチン化）であった。フローサイトメトリーデータ分析を、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン９．９）で実施した。
【０１４８】
プラスミド、クローニング、ＲＴ−ＰＣＲ、トランスフェクション及びレンチウイルス形質導入
自己不活性化レンチウイルスベクターｐＣＳＩＧＰＷ（ＳＦＦＶプロモーター−マルチプルクローニングサイト［ＭＣＳ］−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＣＭＶプロモーター−ピューロマイシンＲ）を、ｐＡＰＭベクターからのピューロマイシンＲ／ｍＩＲカセット（Ｐｅｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）をカスタムＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ−ＰｍｅＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ−ＭｌｕＩ  ＭＣＳで置き換えることによって構築した。ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位を使用して、ｐＩＲＥＳ２−ｅＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からＰＣＲによってクローニングした。ＣＭＶプロモーターを、ＭｌｕＩ／ＣｌａＩ部位を使用して、ｐＣＤＮＡ３．１＋ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からＰＣＲによってクローニングした。ピューロマイシン耐性遺伝子を、ＣｌａＩ／ＡｇｅＩ部位を使用して、ｐＧＩＰＺベクター（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）からＰＣＲによってクローニングした。ｐＣＳＩＧＨＷバリアントを、ピューロマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と交換することによって生成し、これをｐＬＨＣＸベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲによってクローニングした。
【０１４９】
ｃＤＮＡをｐＣＳＩＧＰＷまたはバリアントベクターに（サブ）クローニングした。Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４及びＢｔｎｌ６は、以前に記載された（Ｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８Ｓ及びＢＴＮＬ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９７９７５．２、ＮＭ＿０２４８５０．２及びＮＭ＿００１０４０４６２．２）を、以下のプライマーを使用して、従来のＲＴ−ＰＣＲによってＣａｃｏ−２細胞からクローニングした：
ＢＴＮＬ３  Ｆｏｒ  ５’−ＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣ−３’（配列番号：１５）
ＢＴＮＬ３  Ｒｅｖ  ５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＣＣＣ−３’（配列番号：１６）
ＢＴＮＬ８  Ｆｏｒ  ５’−ＣＣＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧ−３’（配列番号：１７）
ＢＴＮＬ８Ｓ  Ｒｅｖ  ５’−ＴＡＴＧＧＧＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号：１８）
ＢＴＮＬ８  Ｒｅｖ  ５’−ＧＴＧＧＧＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＴＡＣ−３’（配列番号：１９）
【０１５０】
ＦＬＡＧ、ＨＡ及びＨＩＳタグを、オーバーラップＰＣＲによって推定リーダーペプチドの下流に付加した。ヒト全長ＴＣＲγ及びδ鎖を、以下のプライマーを使用してクローニングした（ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ、ｐＣＳＩＧＰＷ）：
Ｖγ２／３／４  Ｆｏｒ  ５’−ＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧ−３’（配列番号：２０）
Ｖγ８  Ｆｏｒ  ５’−ＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号：２１）
Ｖγ９  Ｆｏｒ  ５’−ＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号：２２）
Ｃγ１／２  Ｒｅｖ  ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号：２３）
Ｖδ１  Ｆｏｒ  ５’−ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：２４）
Ｖδ２  Ｆｏｒ  ５’−ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号：２５）
Ｖδ３  Ｆｏｒ  ５’−ＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：２６）
Ｃδ  Ｒｅｖ  ５’−ＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：２７）
【０１５１】
ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の発現を、上に示したプライマーを使用して、従来のＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＥＰＣＡＭ及びＧＡＰＤＨを、対照遺伝子として使用した。
ＢＴＮ３Ａ１  Ｆｏｒ  ５’−ＡＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号：２８）
ＢＴＮ３Ａ１  Ｒｅｖ  ５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：２９）
ＢＴＮ３Ａ２  Ｆｏｒ  ５’−ＴＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧ−３’（配列番号：３０）
ＢＴＮ３Ａ２  Ｒｅｖ  ５’−ＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号：３１）
ＥＰＣＡＭ  Ｆｏｒ  ５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧ−３’（配列番号：３２）
ＥＰＣＡＭ  Ｒｅｖ  ５’−ＴＴＡＴＧＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡ−３’（配列番号：３３）
ＧＡＰＤＨ  Ｆｏｒ  ５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号：３４）
ＧＡＰＤＨ  Ｒｅｖ  ５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号：３５）
【０１５２】
トランスフェクションを、ＰＥＩ（３：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で実施した。Ｂｔｎｌ／ＢＴＮＬ発現を、トランスフェクションの４８時間後に確認した。レンチウイルス粒子を、空の、またはＢｔｎｌ／ＢＴＮＬ  ｃＤＮＡ、ｐＣＭＶΔＲ８．９１（ＨＩＶ−１  ｔａｔ／ｒｅｖ／ｇａｇ／ｐｏｌ）、及びｐＨＩＴ／Ｇ（ＭＬＶ  ｅｎｖ）を含有するいずれかのｐＣＳＩＧＰＷまたはｐＣＳＩＧＨＷの共トランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で作製した。形質導入細胞を、ピューロマイシン及びハイグロマイシンで形質導入の４８時間後から７日間処置し、ＧＦＰ発現に基づいて選別して、機能アッセイに使用した。
【０１５３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
試料を、ＲＮＡ精製（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット）前にＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存するか、またはＲＬＴ緩衝液中で直接凍結させた。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成し、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、Ｓｙｂｒ−ｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析した。
【０１５４】
マウスｑＰＣＲのプライマー：
Ｂｔｎｌ１  Ｆｏｒ：５’−ＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：３６）
Ｂｔｎｌ１  Ｒｅｖ：５’−ＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＧＴ−３’（配列番号：３７）
Ｂｔｎｌ４  Ｆｏｒ：５’−ＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＡ−３’（配列番号：３８）
Ｂｔｎｌ４  Ｒｅｖ：５’−ＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号：３９）
ＢＴＮＬ６  Ｆｏｒ：５’−ＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：４０）
Ｂｔｎｌ６  Ｒｅｖ：５’−ＡＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡ−３’（配列番号：４１）
β−アクチン  Ｆｏｒ：５’−ＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴ−３’（配列番号：４２）
β−アクチン  Ｒｅｖ：５’−ＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号：４３）
Ｓｏｘ−１３  Ｆｏｒ：５’−ＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号：４４）
Ｓｏｘ−１３  Ｒｅｖ：５’−ＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：４５）
Ｒｏｒγｃ  Ｆｏｒ：５’−ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＧＧＡ−３’（配列番号：４６）
Ｒｏｒγｃ  Ｒｅｖ：５’−ＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号：４７）
Ｔｂｐ  Ｆｏｒ：５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴ−３’（配列番号：４８）
Ｔｂｐ  Ｒｅｖ：５’−ＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号：４９）
シクロ  Ｆｏｒ：５’−ＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号：５０）
シクロ  Ｒｅｖ：５’−ＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＴＧ−３’（配列番号：５１）
【０１５５】
サザンブロッティング
サザンブロットを、Ｄｉｇ−Ｐｒｏｂｅ標識キットを使用して生成したプローブで実施し、ブロットをＤＩＧ−Ｅａｓｙ−ｈｙｂ緩衝液中で一晩ハイブリダイズして、ＤＩＧ−Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して現像した。サザンブロッティングのＤＩＧ標識プローブを、以下のプライマーを使用して生成した：
Ｂｔｎｌ１  Ｆｏｒ：５’−ＡＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴ−３’（配列番号：５２）
Ｂｔｎｌ１  Ｒｅｖ：５’−ＣＡＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡ−３’（配列番号：５３）
Ｂｔｎｌ４  Ｆｏｒ：５’−ＧＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号：５４）
Ｂｔｎｌ４  Ｒｅｖ：５’−ＧＣＣＴＴＧＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡ−３’（配列番号：５５）
Ｂｔｎｌ１−Ｔｇ−Ｅｘ３−Ｆｏｒ：５’−ＧＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡ−３’（配列番号：５６）
Ｂｔｎｌ１−Ｔｇ−Ｅｘ４−Ｒｅｖ：５’−ＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号：５７）
【０１５６】
ＲＮＡｓｃｏｐｅ
ＲＮＡｓｃｏｐｅを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．から入手したプローブ及びキットを使用し、ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ２．０  ＨＤ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ−ＢＲＯＷＮを使用してパラフィン埋込切片上で実施した。参照配列は以下の通りである：Ｂｔｎｌ１．ＮＭ＿００１１１１０９４．１（５７６−１７２３）、Ｂｔｎｌ４．ＮＭ＿０３０７４６．１（５６０−９６８）、Ｂｔｎｌ６．ＮＭ＿０３０７４７．１（２４５−１５５２）。
【０１５７】
マウス腸上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の単離
ＩＥＬを、Ｗｅｎｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４，１５：８０−８７（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているようにマウス小腸から単離した。小腸を開いてＰＢＳで洗浄し、１ｃｍ片に切断して、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１ｍＭジチオスレイトールを補充したＲＰＭＩ１６４０中において回転輪上で２０分間インキュベートした。組織を洗浄してＲＰＭＩ中でボルテックスし、次いで７０μｍのナイロンセルストレーナーを２回通過させ、２０／４０／８０％のＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配で、７００ｇで３０分間遠心分離した。ＩＥＬを、４０〜８０％のＰｅｒｃｏｌｌ界面から採取した。
【０１５８】
ＭＯＤＥ−Ｋ共培養アッセイ
細胞を、１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２．５％ＨＥＰＥＳ、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、０．２％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及びＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＩＬ−３（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ）を含むサイトカインを補充したＲＰＭＩ１６４０中で共培養した。１０５個のＭＯＤＥ−Ｋを、１０５個の非選別または（示す場合）陽性のＦＡＣＳ選別（ＣＤ４５＋Ｖγ７＋）ＩＥＬを添加する２４時間前に４８ウェルプレート中に播種し、別段の指示がない限り、１０％ＣＯ２中で１６〜１８時間インキュベートした。トランスウェルアッセイのために、２×１０５個のＭＯＤＥ−Ｋ細胞を、３×１０５個のＩＥＬを添加する２４時間前に２４ウェルトランスウェルプレート（３μｍの孔径−Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、ＭＯＤＥ−Ｋ細胞と直接接触させて（下）、細胞とは離して（上）、または細胞を５０：５０に分けて（トランスウェルの上下）のいずれかで播種した。
【０１５９】
ＩＥＬ刺激
９６ウェルＵ底プレートを、１０μｇ／ｍｌのＬＥＡＦ精製抗マウスＣＤ３εまたはハムスターＩｇＧアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて４℃で一晩コーティングし、ＩＥＬを播種する前にＰＢＳ１×で１回洗浄した。１００，０００ＩＥＬをウェルごとに播種した。細胞を、分析前に３７℃で１６〜１８時間、１０％ＣＯ２中でインキュベートした。
【０１６０】
共焦点イメージング
近位小腸（ＳＩ）試料をＺａｍｂｏｎｉ固定液で固定し、正常ヤギ血清でブロックして、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲＶδ４（ＴＲＤＶ２−２によってコードされる）（ＧＬ２）、ＣＤ３及びＶγ７に対する抗体で染色した。Ｚ断面を共焦点ＬＳＭ−７１０顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）上で取得し、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｌ  Ｓｏｕｌｔｉｏｎｓ）を使用して加工し、分析した。
【０１６１】
骨髄キメラ及び養子ＩＥＬ移入
１０〜１２週齢のレシピエントマウスに９５０ラドで２４時間放射線照射し、５〜１０×１０６個のドナー骨髄細胞を注射（ＩＶ）して４〜１２週後に分析した。４週齢のＷＴマウスから採取したＩＥＬを、ＣＤ４５マイクロビーズ（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃ）を使用してカラム精製し、６週齢のＴＣＲδ−／−及びＴＣＲδ−／−Ｂｔｎｌ１−／−レシピエントにＩＶ注射した。分析を２〜３週間後に実施した。
【０１６２】
ＲＮＡシーケンシング
Ｖγ７＋ＣＤ１２２ｈｉ及びＶγ７＋ＣＤ１２２ｌｏ  ＩＥＬを、プールしたＤ１４〜１７の仔から直接ＲＬＴ緩衝液中に選別した。ＲＮＡを、ＲＮＡ−Ｍｉｃｒｏ−ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ＲＮＡライブラリーを、ＫＡＰＡ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲｉｂｏＥｒａｓｅ（ＨＭＲ）（ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して生成した。ラピッドランケミストリー（リード長：１００ｂｐ）を使用するＨｉＳｅｑ２５００（ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でのペアエンドシーケンシング。
【０１６３】
ヒト試料及び初代リンパ球の単離
内視鏡生検を、日常的に診断結腸内視鏡検査を受けている成人ドナーの上行結腸から得た。皮膚または再建手術時に廃棄された過剰な切除皮膚を、成人ドナーから得た。初代腸管リンパ球を、Ｋｕｐｐｅｒ及びＣｌａｒｋｅ（Ｃｌａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２００６．１２６（５）：１０５９−７０）の方法の改変版を使用して得た（図１４Ｆ）。皮膚リンパ球を、元々記載されていたような方法を使用して単離した。９ｍｍ×９ｍｍ×１．５ｍｍのＣｅｌｌｆｏａｍマトリックス（Ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ  ＰＴＹ  Ｌｔｄ）をオートクレーブ処理し、ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍＬのラット尾部コラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中において３０分間３７℃でインキュベートしてＰＢＳ中で２回洗浄した。現地の倫理審査の承認に従って、１２の内視鏡生検をドナーの上行結腸から採取した。生検を、２０分間５ｍＬの洗浄培地（ＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＣＳ、β−メルカプトエタノール、ペニシリン［５００Ｕ／ｍｌ］、ストレプトマイシン［５００μｇ／ｍｌ］、メトロニダゾール［５μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｇｕｙ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ］、ゲンタマイシン［１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］及びアンホテリシン１２．５μｇ／ｍｌ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）中で洗浄した。１つの内視鏡生検を各マトリックスの上に置き、これを反転させて加圧し、生検をマトリックスに押しつぶした。マトリックスを２４ウェルプレート（１ウェルあたり１）中に置き、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ、β−メルカプトエタノール、ペニシリン［１００Ｕ／ｍｌ］、ストレプトマイシン［１００μｇ／ｍｌ］、メトロニダゾール［１μｇ／ｍｌ］、ゲンタマイシン［２０μｇ／ｍｌ］、アンホテリシン［２．５μｇ／ｍｌ］を補充した）、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＵＫ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でカバーした。１ｍｌの培地を隔日で吸引し、２×濃縮サイトカインを含有する完全培地で置き換えた。細胞を採取し、残存生検及び空のウェルをＰＢＳ  ０．０２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓで洗浄した。細胞懸濁液を、７０μｍのナイロンセルストレーナーを通過させ、４００ｇで５分間遠心分離し、追加のサイトカインを含まない完全培地中に再懸濁させて直ちに共培養物中に置いた。リンパ球を、５〜７日間の培養後に使用した。ＰＢＭＣを、献血サービスから入手した血液からＦｉｃｏｌｌ勾配によって単離した。
【０１６４】
ヒト上皮細胞の単離
結腸試料を５ｍＭの１，４−ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、続いて１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＶＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）及び０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）で酵素消化した。ＥｐＣＡＭ＋細胞をフローサイトメトリーによって直接ＲＬＴ溶解緩衝液中に選別した。ＲＮＡ及びｃＤＮＡを上に記載した通りに調製した。
【０１６５】
ＨＥＫ２９３Ｔ共培養アッセイ
空ベクター（ＥＶ）、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８またはＢＴＮＬ３＋８のいずれかで形質導入した５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び２×１０５個の新たに採取した初代ヒトリンパ球を、９６ウェルプレート中において補足サイトカインを含まない完全培地を用いて共培養し、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした（図１４Ｆ）。
【０１６６】
ディープシーケンシング
マウスＴＲＤＶ遺伝子：Ｖγ７＋ＩＥＬを選別して精製したＲＮＡからのＴＣＲδＣＤＲ３の増幅及びシーケンシングを、Ａｍｐ２Ｓｅｑプラットフォーム（ｉＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を使用して実施した。ヒトＴＣＲＧ  Ｖγ遺伝子：ＴＣＲγＣＤＲ３の増幅及びシーケンシングを、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォーム（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
【０１６７】
統計
別段の記載がない限り、棒グラフ／スパイダーチャートは平均±ＳＤを示し、ｐ値を、同等のＳＤと仮定して、対応のない両側ｔ検定から得た（ｎｓ＞０．０５）。
【０１６８】
Ｉｍａｒｉｓ画像解析
共焦点顕微鏡を、４０×油対物レンズ（開口数１．３）を備えたＬＳＭ７１０レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して実施した。ｚスタック上の３Ｄ画像解析を、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して実施した。表面ツールを使用して、ＣＤ３＋細胞を同定した。これらの構造外側のボクセルをチャンネルの各々でゼロに設定し、マスクを作成した。
【０１６９】
ＲＮＡシーケンシングのバイオインフォマティクス解析
１０１塩基対のペアエンドリードを、Ｂｏｗｔｉｅ２を備えたＲＳＥＭ（ｖ１．２．１１）（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｅｗｅｙ，２０１１）を使用してアラインメントし、定量した。リードを、ｍｍ１０マウスゲノム及びＵＣＳＣ既知遺伝子ｇｔｆファイルから構築したトランスクリプトームにアラインメントした。試料あたりの平均アラインメント率が５，７４０万断片であることを観察した。遺伝子レベルの定量を使用して、検出した遺伝子（全試料にわたる平均ＴＰＭ値＞１、１３，３１３遺伝子）のみを選択した。ＣＤ１２２ｈｉとＣＤ１２２ｌｏ  Ｖγ７＋ＩＥＬ群との間の差次的発現を、ＤＥＳｅｑ２を使用して、複製群内のペア構造を考慮することによって同定した。０．０１のＦＤＲを使用して、２６６４の表現型依存性遺伝子発現効果を同定した。
【０１７０】
データ源
ＲＮＡシーケンシングデータ：ＧＥＯアクセッション番号−ＧＳＥ８５４２２。
【０１７１】
実施例１０．疾患におけるγδ細胞上のＢＴＮＬ３／ＢＴＮＬ８に関する役割の特徴付け
ＴＣＲγδ（図１６Ａ、左の３つのパネル）またはＴＣＲ．ＣＤ３（図１６Ａ、右端のパネル）の表面発現を、ヒト腸管Ｔ細胞を、空ベクターで形質導入した２９３細胞（ＥＶ、青のヒストグラム）またはＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８を発現するベクターで形質導入した２９３細胞（赤のヒストグラム）と一晩共培養した後、各パネルに示したＴ細胞サブタイプについて分析した。各サブタイプについて、２つの共培養状況におけるＴＣＲ／ＣＤ３発現が本質的に重なるのに対して、Ｖγ２、Ｖγ３、またはＶγ４（これらは、使用した検出試薬では区別できない）を発現するγδ細胞について、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８に曝露した細胞（赤ヒストグラム）によるＴＣＲγδ発現は、ＥＶに曝露した細胞（青）によって発現されたものと比較して左にシフトした（下方制御された）。ＴＣＲ発現を、７人のドナーで定量した（図１６Ｂ、左側のパネル）。ＴＣＲＶγ２／３／４細胞における下方制御は、全てのＴＣＲＶγ９（−）細胞における下方制御と同等であり、したがって、観察した完全な下方制御を説明する（図１６Ｂ、２番目のパネル）。これらのドナーにおけるドナーγδ及びＴＣＲＶγ２／３／４頻度を特徴付けた（図１６Ｂ、右の２つのパネル）。
【０１７２】
ＢＴＮＬ８及びＢＴＮＬ３をコードする共通のハプロタイプを、ＢＴＮＬ８＊３をコードする希少なハプロタイプから検出するための戦略を、図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。遺伝子型特異的プライマー（Ｌ８Ｒ及びＬ３Ｒ）を、共通のフォワードプライマー（Ｌ８Ｆ）と組み合わせて使用し、約１．３ｋｂのＰＣＴ産物を生成した。結果を図１８に示す。変異の約４６％はヘテロ接合であり、約８％はホモ接合であった。形質導入したタンパク質の発現を、図１９に示すように、ＦＬＡＧタグ付きタンパク質を使用して検出した。ＢＴＮＬ３は、ＢＴＮＬ８またはＢＴＮＬ８のアレルバリアントであるＢＴＮＬ８Ｓ１７９Ｆのいずれかと共発現しない限り、細胞表面での発現が弱い。しかしながら、ＢＴＮＬ８＊３との共発現では、その表面発現を増強しなかった。逆に、ＢＴＮＬ８＊３は、ＢＴＮＬ８及びＢＴＮＬ８Ｓ１７９Ｆの細胞表面発現を増強した。
【０１７３】
図２０は、ＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８及びＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８Ｓ１７９Ｆの曝露後、ＴＣＲγδ発現及びＴＣＲＶγ２／３／４発現が協調的に減少したが、他の状況では減少しないことを示している。フローサイトメトリーによって、ＩＢＤと診断されたホモ接合患者が、非常に小さなγδＴ細胞コンパートメントを示し、その大多数がＶδ１＋であることが明らかとなる。同様に、潰瘍性大腸炎の家族歴を有するホモ接合患者では、γδＴ細胞数も非常に少なく、８５％超のγδＴ細胞がＴＣＲＶγ２／３／４を発現していない（図２１）。
【０１７４】
２つのヘテロ接合患者試料を分析し、それらを図２２に示す。患者ＧＮ０１７が主にＴＣＲＶγ２／３／４ならびにＶδ１、Ｖδ３、Ｖγ９、及びＶδ２を発現したのに対して、患者ＧＮ０１９は、ＧＮ０１７で検出したものに加えて、Ｖγ８及びＶδ５の容易に検出可能なシグナルを有する、より多様な遺伝子を発現した。
【０１７５】
このことと一致して、ＴＣＲγ鎖ｃＤＮＡを２人のドナーの腸管試料からクローニングした場合、ＧＮ０１７では３１／３１の配列がＶγ４−Ｊγ１であったのに対して、ＧＮ０１９ではγ鎖配列がはるかに多様であって、Ｖγ４−Ｊγ１をコードするのは６／３３のみであった。注目すべきは、ＧＮ０１７は「応答者」であって、そのγδ細胞はＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８への曝露でそれらのＴＣＲを下方制御したのに対して、ＧＮ０１９は非応答者であったことである。ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８発現に対する表示ＳＮＰの効果を、図２３Ａ及び図２３Ｂに示す。
【０１７６】
Ｖγ４を異種発現する細胞もまた、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８に対して特異的に反応することを見出した。いずれのＴＣＲも内因的に発現しないＪｕｒｋａｔ細胞であるＪ７６細胞を、Ｖγ４Ｖδ１またはＶγ９Ｖδ２のいずれかをコードするベクターで形質導入し、次いで空ベクター、ＢＴＮＬ３のみ、またはＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８のいずれかを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共培養した。図２４Ａ及び図２４Ｂは、ＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８またはＰＭＡ＋イオノマイシンに特異的に曝露したＪ７６Ｖγ４Ｖδ１細胞では、特異的にＴＣＲを下方制御し、ＣＤ６９を上方制御していることを示している。逆に、Ｊ７６Ｖγ９Ｖδ２細胞は、ＰＭＡイオノマイシンに曝露した時のみにＴＣＲの下方制御及びＣＤ６９の上方制御を示した。初めて、細胞上でのＶγ４の異種発現が、ＢＴＮＬ３＋ＢＴＮＬ８に結合し、応答するのに十分であることが示された。
【０１７７】
図２５Ａ〜図２５Ｃに示すＣａｃｏ２分極実験では、ＢＴＮＬ３発現は、分極したＣａｃｏ２細胞においてのみ、特に専ら著しく発現された（図２５Ｂ及び図２５Ｃ）。ＨＮＦ４ａ発現及びＩＬ−８発現もまた、分極したＣａｃｏ２細胞中で両方とも上方制御された（図２５Ｃ）。ＢＴＮＬ８発現は、分極に関係なく、コンフルエント／静止Ｃａｃｏ２細胞中で上方制御された。
【０１７８】
ストレス（例えば、炎症腸管の微小環境を模倣するストレス、例えば、ＴＮＦα及びフリーラジカル（例えば、Ｈ２Ｏ２）の存在など）の影響に対する試験によって、ＴＮＦαがＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＨＮＦ４、及びＣＤＸ２の発現を減少させた一方で、ＩＬ−８が上方制御されたことが明らかとなった（図２６Ａ）。速度論的アッセイによって、ＴＮＦαの存在下では、未処置対照と比較して、電気抵抗が時間の経過とともに消失したことが明らかとなった（図２６Ｂ）。
【０１７９】
実施例１１．ＩＢＤを処置するためのＶγ４＋Ｔ細胞集団の投与
本明細書に開示した方法によれば、当該技術分野の技能を有する医師は、ＩＢＤの症状を減少または軽減させるように、ヒト患者などの患者を処置し得る。この目的のために、当該技術分野の技能を有する医師は、ヒト患者にＶγ４＋Ｔ細胞の集団を投与し、その場合に細胞の５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える）がＶγ４δ１＋またはＶγ４δ３＋Ｔ細胞である。１０６個のＶγ４＋Ｔ細胞を、２か月に１回の頻度で静脈内投与によって患者に投与する。患者を、処置に使用した投与経路に応じて、ＩＥＬ集団の投与後、例えば、２週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれを超えて評価する。Ｖγ４＋Ｔ細胞集団の投与後における１つ以上のＩＢＤ症状の減少に関する知見は、その処置がＩＢＤの処置に成功していることの指標を提供する。
【０１８０】
実施例１２．Ｖγ４δ１を発現するγδＴ細胞の生成
Ｖγ９δ２細胞などの非Ｖγ４δ１γδＴ細胞を、患者試料から単離し、Ｖγ４δ１を発現するように形質導入し得る。Ｖγ４δ１＋γδＴ細胞を作製する例示的方法では、構成的活性化プロモーター（例えば、当該技術分野において既知の任意の構成的活性化プロモーター、例えば、ヒトレトロウイルスＬＴＲ、ＳＦＦＶ、ＥＩＦ１α、またはＰＧＫなど）ならびにＶδ１及びＶγ４をコードする核酸配列を含有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）を、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して操作する。Ｖδ１及びＶγ４の両方を発現させるために、バイシストロニック発現カセットを使用し、その場合、Ｖδ１をコードする核酸配列とＶγ４をコードする核酸配列との間にＩＲＥＳ配列を配置する。ウイルスベクターを操作した後、ウイルスを使用してγδＴ細胞に形質導入し、Ｖδ１及びＶγ４を発現するγδＴ細胞の集団を生成し得る。
【０１８１】
実施例１３．Ｖγ４δ１を発現するＴｒｅｇの生成
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、患者試料から単離し、Ｖγ４δ１を発現するように形質導入し得る。Ｖγ４δ１＋Ｔｒｅｇを作製する例示的方法では、構成的活性化プロモーター（例えば、当該技術分野において既知の任意の構成的活性化プロモーター、例えば、ヒトレトロウイルスＬＴＲ、ＳＦＦＶ、ＥＩＦ１α、またはＰＧＫなど）ならびにＶδ１及びＶγ４をコードする核酸配列を含有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）を、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して操作する。Ｖδ１及びＶγ４の両方を発現させるために、バイシストロニック発現カセットを使用し、その場合、Ｖδ１をコードする核酸配列とＶγ４をコードする核酸配列との間にＩＲＥＳ配列を配置する。ウイルスベクターを操作した後、ウイルスを使用してＴｒｅｇに形質導入し、Ｖδ１及びＶγ４を発現するＴｒｅｇの集団を生成し得る。
【０１８２】
実施例１４．Ｖγ４δ１を発現するＮＫ細胞の生成
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、患者試料から単離し、Ｖγ４δ１を発現するように形質導入し得る。Ｖγ４δ１＋ＮＫ細胞を作製する例示的方法では、構成的活性化プロモーター（例えば、当該技術分野において既知の任意の構成的活性化プロモーター、例えば、ヒトレトロウイルスＬＴＲ、ＳＦＦＶ、ＥＩＦ１α、またはＰＧＫなど）ならびにＶδ１及びＶγ４をコードする核酸配列を含有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）を、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して操作する。Ｖδ１及びＶγ４の両方を発現させるために、バイシストロニック発現カセットを使用し、その場合、Ｖδ１をコードする核酸配列とＶγ４をコードする核酸配列との間にＩＲＥＳ配列を配置する。ＮＫ細胞プロモーター及びＣＤ３をコードする核酸配列を含有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）もまた、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して操作する。ウイルスベクターを操作した後、Ｖδ１及びＶγ４ウイルスならびにＣＤ３ウイルスを使用してＮＫ細胞に共形質導入し、Ｖδ１、Ｖγ４、及びＣＤ３を発現するＮＫ細胞の集団を生成する。
【０１８３】
実施例１５．ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８を使用する遺伝子治療
本明細書に開示した方法によれば、当該技術分野の技能を有する医師は、ＩＢＤの症状を減少または軽減させるように、ヒト患者などの患者を処置し得る。この目的のために、当該技術分野の技能を有する医師は、ヒト患者にＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８を発現するウイルスを投与する。ＨＮＦ４ＡプロモーターならびにＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８をコードする核酸配列を含有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）を、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して操作する。ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の両方を発現させるために、バイシストロニック発現カセットを使用し、その場合、ＢＴＮＬ３をコードする核酸配列とＢＴＮＬ８をコードする核酸配列との間にＩＲＥＳ配列を配置する。治療有効量のウイルスを静脈内投与によって患者に投与し、ＩＢＤを処置する。処置は、１回、または場合により、反復して１回以上、例えば、月に１回、隔月に１回、年に３回、年に２回、または年に１回投与される。患者を、処置に使用した投与経路に応じて、ウイルスの投与後、例えば、２週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれを超えて評価する。ウイルスの投与後における１つ以上のＩＢＤ症状の減少に関する知見は、その処置がＩＢＤの処置に成功していることの指標を提供する。
【０１８４】
実施例１６．ＨＮＦ４Ａを使用する遺伝子治療
本明細書に開示した方法によれば、当該技術分野の技能を有する医師は、ＩＢＤの症状を減少または軽減させるように、ヒト患者（例えば、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８の少なくとも１つのＷＴコピーを発現するヒト）などの患者を処置し得る。この目的のために、当該技術分野の技能を有する医師は、ヒト患者にＨＮＦ４Ａを発現するウイルスを投与する。ＨＮＦ４Ａプロモーター及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸配列を含有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）を、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して操作する。ウイルスを治療有効量で静脈内投与によって投与し、ＩＢＤを処置する。処置は、１回、または場合により、反復して１回以上、例えば、月に１回、隔月に１回、年に３回、年に２回、または年に１回投与され得る。患者を、処置に使用した投与経路に応じて、ウイルスの投与後、例えば、２週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれを超えて評価する。ウイルスの投与後における１つ以上のＩＢＤ症状の減少に関する知見は、その処置がＩＢＤの処置に成功していることの指標を提供する。
【０１８５】
実施例１７．ＢＴＮＬ多型及び疾患との関連性
図２７Ａ〜図２７Ｂに示す通り、Ｌ８＊３及びＬ３Ｂ３０．２ｃｌを、ＴＣＲ下方制御を誘導するそれらの能力について調査した。既知の疾患状態を有するドナーを、表示多型についてジェノタイピングした。ホモ接合または複合ヘテロ接合のいずれかであるそれらのドナーは、非応答者である傾向があった一方で、陰性対照は応答者であった。応答性を、図２８Ａ〜図２８Ｂに示す。
【０１８６】
多型との関連性を、２０４８人のクローン病患者及び１８７９人の健常対照のコホートをジェノタイピングすることによって評価した。図２９に示す通り、多型各々についてのホモ接合性は、クローン病発生率と有意な関連性を示さなかったが、２つ以上のＢＴＮＬ多型の保因はクローン病と関連している。Ｌ３Ｂ３０．２頻度も、クローン病に加えて、潰瘍性大腸炎と関連している（ＵＣ  Ｎ＝１９３２）。Ｌ３Ｂ３０．２頻度：３．４％の対照、４．７％のＵＣ  ｐ＝０．００３、４．９％のクローン病  ｐ＝０．０００９、４．８％のＩＢＤ  ｐ＝０．０００４。
【０１８７】
実施例１８．結腸γδＴ細胞表面表現型の異常制御。
γδ＋Ｖδ２−Ｔ細胞中における腸管ホーミングインテグリンＣＤ１０３の発現を、正常及び活動性ＵＣの組織片培養物中で、ならびに異なるＩＢＤ疾患サブタイプ中で、図３０Ａ〜図３０Ｂに示すように測定した。同様に、共刺激分子である２Ｂ４の発現も測定した。下方制御は、正常対照と比較した場合に両方の表面マーカーについて疾患と関連していた。
【０１８８】
他の実施形態
記載される本発明の様々な修正及び変更形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかとなる。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されてきたが、請求されるような本発明が、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。事実、当業者には明らかである本発明を実施するための記載された方法の様々な修正は、本発明の範囲内であることを意図する。他の実施形態は、特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2020534822.tif 000003
【図１Ｂ】
2020534822.tif 000004
【図１Ｃ】
2020534822.tif 000005
【図１Ｄ】
2020534822.tif 000006
【図１Ｅ】
2020534822.tif 000007
【図１Ｆ】
2020534822.tif 000008
【図１Ｇ】
2020534822.tif 000009
【図２】
2020534822.tif 000010
【図３Ａ】
2020534822.tif 000011
【図３Ｂ】
2020534822.tif 000012
【図３Ｃ】
2020534822.tif 000013
【図３Ｄ】
2020534822.tif 000014
【図３Ｅ】
2020534822.tif 000015
【図４Ａ】
2020534822.tif 000016
【図４Ｂ】
2020534822.tif 000017
【図４Ｃ】
2020534822.tif 000018
【図４Ｄ】
2020534822.tif 000019
【図４Ｅ】
2020534822.tif 000020
【図４Ｆ】
2020534822.tif 000021
【図４Ｇ】
2020534822.tif 000022
【図４Ｈ】
2020534822.tif 000023
【図４Ｉ】
2020534822.tif 000024
【図４Ｊ】
2020534822.tif 000025
【図４Ｋ】
2020534822.tif 000026
【図５Ａ】
2020534822.tif 000027
【図５Ｂ】
2020534822.tif 000028
【図５Ｃ】
2020534822.tif 000029
【図５Ｄ】
2020534822.tif 000030
【図６Ａ】
2020534822.tif 000031
【図６Ｂ】
2020534822.tif 000032
【図６Ｃ】
2020534822.tif 000033
【図６Ｄ】
2020534822.tif 000034
【図６Ｅ】
2020534822.tif 000035
【図７Ａ】
2020534822.tif 000036
【図７Ｂ】
2020534822.tif 000037
【図７Ｃ】
2020534822.tif 000038
【図７Ｄ】
2020534822.tif 000039
【図７Ｅ】
2020534822.tif 000040
【図８】
2020534822.tif 000041
【図９Ａ】
2020534822.tif 000042
【図９Ｂ】
2020534822.tif 000043
【図９Ｃ】
2020534822.tif 000044
【図９Ｄ】
2020534822.tif 000045
【図９Ｅ】
2020534822.tif 000046
【図１０】
2020534822.tif 000047
【図１１Ａ】
2020534822.tif 000048
【図１１Ｂ】
2020534822.tif 000049
【図１１Ｃ】
2020534822.tif 000050
【図１１Ｄ】
2020534822.tif 000051
【図１１Ｅ】
2020534822.tif 000052
【図１１Ｆ】
2020534822.tif 000053
【図１１Ｇ】
2020534822.tif 000054
【図１１Ｈ】
2020534822.tif 000055
【図１２Ａ】
2020534822.tif 000056
【図１２Ｂ】
2020534822.tif 000057
【図１２Ｃ】
2020534822.tif 000058
【図１２Ｄ】
2020534822.tif 000059
【図１２Ｅ】
2020534822.tif 000060
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
2020534822.tif 000071
【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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