(57)【要約】本主題は、罹患組織を同定する、モニターする、処置する、かつ除去するための化合物、組成物、および方法を提供する。血液などの循環している体液を同定する、モニターする、かつ検出するための化合物、組成物、および方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）pHトリガーポリペプチド（pH-triggered polypeptide）（pHLIPペプチド）と、
（b）フルオロフォアであって、近赤外（NIR）フルオロフォア、シアニンフルオロフォア、または光音響造影イメージング剤（optoacoustic contrast imaging agent）である、該フルオロフォアと
を含む、pHLIPフルオロフォア化合物。
【請求項２】
以下の構造:
2020500926.tif 000137
を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
前記pHLIPペプチドが配列LFPTXTLL（SEQ ID NO:1）におけるアミノ酸を含み、Xがプロトン化可能アミノ酸であり、かつ前記フルオロフォアがNIRフルオロフォアを含む、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
XがDである、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
前記フルオロフォアがインドシアニングリーン（ICG）を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
前記pHLIPペプチドが配列:
2020500926.tif 000138
を含み、ここで、
i）Yが、溶媒和エネルギー
2020500926.tif 000139
を有する非極性アミノ酸、またはGlyであり、
ii）Xがプロトン化可能アミノ酸であり、かつ
iii）n、m、I、j、l、h、g、fが1〜8の整数である、
請求項1記載の化合物。
【請求項７】
前記pHLIPペプチドが水中で約7.5または7.75のpHで、ある正味の負電荷を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項８】
前記pHLIPペプチドが対数尺度で約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、または7未満の酸解離定数（pKa）を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
前記pHLIPペプチドが少なくとも1つの人工プロトン化可能アミノ酸を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１０】
前記pHLIPペプチドが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の遺伝的にコードされたアミノ酸を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１１】
前記pHLIPペプチドが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の非遺伝的にコードされたアミノ酸を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１２】
前記pHLIPペプチドが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個のD-アミノ酸を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１３】
前記pHLIPペプチドが少なくとも8個のアミノ酸を含み、前記pHLIPペプチドの該8個のアミノ酸の少なくとも2、3、または4個が非極性であり、前記pHLIPペプチドの少なくとも8個のアミノ酸の少なくとも1、2、3、または4個がプロトン化可能である、請求項1記載の化合物。
【請求項１４】
前記フルオロフォアがシアニンフルオロフォアである、請求項1記載の化合物。
【請求項１５】
前記フルオロフォアがNIRフルオロフォアである、請求項1記載の化合物。
【請求項１６】
前記フルオロフォアが光音響造影イメージング剤を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１７】
（a）配列LFPTXTLL（SEQ ID NO:1）におけるアミノ酸を含むpHLIPペプチドであって、Xがプロトン化可能アミノ酸であり、該pHLIPペプチドが、pH8.0と比較してpH5.0で膜脂質二重層に対してより高い親和性を有する、該pHLIPペプチドと、
（b）pHLIPペプチドのN末端から数えて1番目または2番目のアミノ酸に共有結合している、インドシアニングリーン（ICG）と
を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１８】
XがDである、請求項17記載の化合物。
【請求項１９】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000140
におけるアミノ酸を含み、そのシステインに前記ICGが共有結合している、請求項17記載の化合物。
【請求項２０】
以下の構造:
2020500926.tif 000141
を含む、請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000142
におけるアミノ酸を含み、そのN末端アラニンに前記ICGが共有結合している、請求項17記載の化合物。
【請求項２２】
以下の構造:
2020500926.tif 000143
を含む、請求項21記載の化合物。
【請求項２３】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000144
におけるアミノ酸を含み、そのリジンに前記ICGが共有結合している、請求項17記載の化合物。
【請求項２４】
以下の構造:
2020500926.tif 000145
を含む、請求項23記載の化合物。
【請求項２５】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000146
におけるアミノ酸を含み、そのシステインに前記ICGが共有結合している、請求項17記載の化合物。
【請求項２６】
以下の構造:
2020500926.tif 000147
を含む、請求項25記載の化合物。
【請求項２７】
前記pHLIPペプチドが人工プロトン化可能アミノ酸を含む、請求項17記載の化合物。
【請求項２８】
人工プロトン化可能アミノ酸が少なくとも1、2、3、4または5つのカルボキシル基を含む、請求項27記載の化合物。
【請求項２９】
プロトン化可能アミノ酸がアスパラギン酸またはガンマカルボキシグルタミン酸を含む、請求項17記載の化合物。
【請求項３０】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000148
におけるアミノ酸を含む、請求項17記載の化合物。
【請求項３１】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000149
におけるアミノ酸を含む、請求項30記載の化合物。
【請求項３２】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000150
におけるアミノ酸を含む、請求項31記載の化合物。
【請求項３３】
前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000151
におけるアミノ酸を含む、請求項32記載の化合物。
【請求項３４】
前記pHLIPペプチドが配列:
2020500926.tif 000152
におけるアミノ酸を含む、請求項33記載の化合物。
【請求項３５】
前記pHLIPペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:15〜24に記載のアミノ酸配列のそれぞれと100％、99％、または95％未満同一である、請求項17記載の化合物。
【請求項３６】
前記pHLIPペプチドが20〜30個のアミノ酸を含む、請求項17記載の化合物。
【請求項３７】
請求項1記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項３８】
D-グルコースをさらに含む、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
口内洗浄剤を含む、請求項38記載の組成物。
【請求項４０】
対象における罹患組織または損傷組織を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法:
（a）請求項1記載の化合物を対象に投与する工程;
（b）該対象をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）該化合物から放射される電磁放射線を検出する工程であって、該放射線の検出が罹患組織の存在を示す、該検出する工程。
【請求項４１】
罹患組織または損傷組織が、がん組織、前がん性組織、炎症組織、虚血組織、関節炎組織、嚢胞性線維性組織、微生物に感染した組織、またはアテローム硬化性組織である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
罹患組織ががん組織であり、該がん組織が対象の膀胱、上部尿路、腎臓、前立腺、乳房、頭、首、口腔、膵臓、肺、肝臓、子宮頸部、卵巣、または脳にある、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前がん性組織またはがん組織から放射される放射線のレベルが、正常な非がん性組織から放射される放射線のレベルよりも少なくとも20％大きい、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
前記身体の臓器が腎臓または膀胱を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
対象における体液の動きを検出するための方法であって、以下の工程を含む方法:
（a）請求項1記載の化合物を対象に投与する工程;
（b）該対象をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）該化合物から放射される電磁放射線を検出する工程であって、該放射線の検出が体液の存在を示す、該検出する工程。
【請求項４６】
体液が血液を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
血液が身体内腔内、血管腔内、毛細管腔内、静脈内腔内、動脈内腔内、または固形組織内を循環している、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
体液がリンパ液を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が、膀胱内注入、静脈内投与、腹腔内投与、局所投与、粘膜投与、経口投与、動脈内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、心臓内投与、陰茎海綿体内投与、骨内投与、眼内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、皮内投与、経皮投与、経粘膜投与、病巣内投与、皮下投与、皮膚上投与、羊膜外投与、膣内投与、膀胱内投与、または経鼻投与を介して対象に投与される、請求項40記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が、前記化合物を含む液体、粉末、または噴霧剤を対象の表面に適用することによって投与される、請求項40記載の方法。
【請求項５１】
前記表面が、手術を介してアクセスされる対象の身体内の部位を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物から放射される電磁放射線がインビボで検出される、請求項40記載の方法。
【請求項５３】
前記化合物から放射される電磁放射線がエクスビボで検出される、請求項40記載の方法。
【請求項５４】
工程（c）によって同定されたがんまたは前がん性の細胞または組織を外科的に除去する工程をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項５５】
蛍光血管造影を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５６】
眼科的処置、心胸郭手術、バイパス冠動脈手術、脳神経外科手術、肝胆道手術、再建手術、胆嚢摘除術、結腸直腸切除術、脳手術、筋肉灌流、創傷もしくは外傷手術、または腹腔鏡手術中に行われる、請求項47記載の方法。
【請求項５７】
生物学的試料中のフルオロフォアをエクスビボで検出するための方法:
（a）対象からの生物学的試料を請求項1記載の化合物と接触させる工程;
（b）該生物学的試料をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）フルオロフォアから放射される電磁放射線を検出する工程。
【請求項５８】
前記生物学的試料が、組織生検標本、液体生検標本、外科的に除去された組織、外科的に除去された液体、または血液を含む、請求項58記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、2016年9月22日に提出された米国仮出願第62/398,448号に対する35 U.S.C.§119（e）に基づく優先権の恩典を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により拠出されたR01 GM073857の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、例えば、蛍光画像にガイドされる手法を含むがん療法および診断法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
米国において、膀胱がんは、5番目に多いがんであり、全新規がん症例の4.5％を構成する。76,960の新規症例が2016年に推定され、膀胱がんから現在予想される死亡率は、21％（16,390）である。男性および女性の約2.4％は、生涯のある時点で膀胱がんと診断されるだろう。2012年には、米国で膀胱がんを抱えて生きている推定577,403の個人がいた。これらの患者のほとんど全てが継続的な監視、および時折、処置を必要とする。組み合わせた全てのステージに関して、5年相対生存率は、77％である。生存率は、診断後10年で70％、15年で65％に低下する。膀胱がんは、非筋肉浸潤性または筋肉浸潤性であり得る。全ての膀胱がん患者の半数は、5年生存率が96％である、腫瘍が非筋肉浸潤性である間に診断される。悪性膀胱腫瘍の大部分（最大98％）は、上皮に発生し、これらの膀胱がんの90〜92％は、尿路上皮癌である（Siegel et al.（2012）CA Cancer J Clin 62（1）:10-29（非特許文献1）, Pasin et al.（2008）Rev Urol 10（1）:31-43（非特許文献2））。あまり一般的でない膀胱がんは、扁平上皮または腺癌である。約20〜25％の患者が筋肉浸潤性疾患を有し、非筋肉浸潤性疾患の患者の約20〜25％は、進行の中または高リスクに応じて5年の経過観察で筋肉浸潤性疾患に進行するだろう（Anastasiadis＆de Reijke（2012）Ther Adv Urol 4（1）:13-32（非特許文献3）, Kamat et al.（2014）J Urol 192（2）:305-315（非特許文献4））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Siegel et al.（2012）CA Cancer J Clin 62（1）:10-29
【非特許文献２】Pasin et al.（2008）Rev Urol 10（1）:31-43
【非特許文献３】Anastasiadis＆de Reijke（2012）Ther Adv Urol 4（1）:13-32
【非特許文献４】Kamat et al.（2014）J Urol 192（2）:305-315
【発明の概要】
【０００６】
本主題は、とりわけ、pHトリガーポリペプチド（「pHLIPペプチド」）と、フルオロフォアとを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる蛍光化合物を提供する。そのような化合物は、本明細書において「pHLIPフルオロフォア化合物」と称され得る。そのような蛍光化合物を含む方法および組成物も提供される。例えば、非限定的な実施態様は、蛍光および光音響イメージングなどの蛍光画像にガイドされる医学的手技に関する。
【０００７】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、配列:
2020500926.tif 000002
を有し、ここで、
i）Yは、溶媒和エネルギー
2020500926.tif 000003
を有する非極性アミノ酸またはGlyであり（例えば、表1を参照されたい）、
ii）Xは、プロトン化可能アミノ酸であり、かつ
iii）n、m、I、j、l、h、g、fは、1〜8の整数である。
【０００８】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000004
を有し、ここで、「NH2-」は、ペプチドのアミノ末端であり（かつN末端アラニンの一部であり）、「-COOH」は、ペプチドのカルボキシ末端である（かつC末端アラニンの一部である）。本明細書において（例えば、本文、表、構造、リスト、またはその他において）開示されるアミノ酸配列において、ペプチドの「NH2-」および/または「-COOH」は、任意で省略されるまたは示されないことがある。
【０００９】
ある態様では、フルオロフォアは、配列:
2020500926.tif 000005
を有するpHLIPペプチドのシステインに共有結合している。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、以下の構造:
2020500926.tif 000006
を有する。
【００１０】
上記の配列において、pHLIPペプチド配列は、
2020500926.tif 000007
であるが、しかしながら、ペプチドのN末端のアラニンおよびシステインの構造が示されている。
【００１１】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約7.5または7.75のpHで、ある正味の負電荷を有する。
【００１２】
ある態様では、pHLIPペプチドは、対数尺度で約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、または7未満の酸解離定数（pKa）を有する。
【００１３】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1つの人工プロトン化可能アミノ酸を含む。本明細書において使用される場合、「人工」アミノ酸は、遺伝的にコードされていないアミノ酸である。
【００１４】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の遺伝的にコードされたアミノ酸を含む。
【００１５】
ある態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の非遺伝的にコードされたアミノ酸を含む。
【００１６】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個のD-アミノ酸を含む。
【００１７】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも8個のアミノ酸を含み、ここで、該ペプチドの8個のアミノ酸の少なくとも2、3または4個は非極性であり、該pHLIPペプチドの少なくとも8個のアミノ酸の少なくとも1、2、3または4個はプロトン化可能である。
【００１８】
ある態様では、pHLIPペプチドは、フルオロフォアが結合され得る官能基を含む。例えば、pHLIPペプチドは、それがpHLIPフルオロフォア化合物の一部である前は官能基を含んでおり、フルオロフォアは、この官能基が関与する化学的相互作用を介してpHLIPペプチドに共有結合された。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、官能基を含み、フルオロフォアは、官能基に（例えば、静電相互作用などの非共有結合を介して）非共有結合している。フルオロフォアとのpHLIPペプチドの結合の文脈において、「官能基」は、別の化合物へ化合物（フルオロフォアに対するpHLIPペプチドなど）を結合させるのに使用される化合物（pHLIPペプチドなど）の一部である。「官能基」は、任意で「結合基」と称され得る。様々な態様では、官能基は、化学的に反応性である。いくつかの態様では、pHLIPペプチド上の官能基は、フルオロフォア上の官能基と反応して、pHLIPペプチドをフルオロフォアに接続する共有結合を残し、その結果、pHLIPフルオロフォア化合物が生じる。官能基の非限定的な例は、アミノ酸側鎖（システインの-SH側鎖またはリジンの-NH2側鎖など）、チオール（例えば、-SHを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる部分）、マレイミドエステルなどのエステル、-sheを含む部分、およびクリック反応に関与し得る部分（アジド、アルキン、歪みジフルオロオクチン、ジアリール歪みシクロオクチン、1,3-ニトロン、シクロオクテン、トランスシクロアルケン、オキサノルボルナジエン、テトラジン、テトラゾール、活性化アルケン、およびオキサノルボルナジエンなど）を含む。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「フルオロフォア」という用語は、エネルギーを放射する任意の化合物を含む。エネルギーは、例えば、音響エネルギー（音波など）、熱、または電磁放射線の形態とすることができる。様々な態様では、電磁放射線は、ヒトの眼に可視または非可視であり得る。いくつかの態様では、電磁放射線は、赤外または近赤外である。フルオロフォアの非限定的な例は、発光化合物、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、光音響化合物、およびクエンチャー化合物（例えば、蛍光クエンチャー化合物）を含む。フルオロフォアは、例えば、小分子化合物（例えば、約2000、1000、または500ダルトン未満の分子量を有する有機化合物）、タンパク質、またはキレート化金属（例えば、共有または非共有配位結合を介して金属に結合したキレーター、ここで、キレーターと金属の組合せが蛍光性である）を含み得る。いくつかの態様では、キレート化金属は、キレーターによって形成された「ケージ」内にあり、キレーターと金属の組合せは蛍光性である。ある態様では、エネルギー（例えば、発光などの電磁放射、音波などの音響エネルギー、または熱）の放射は、エネルギーの吸収およびその後の放射を伴わない。いくつかの態様では、エネルギーの放射は、エネルギーの吸収度、その後の放射を伴う。
【００２０】
本明細書において使用される場合、吸収された光のエネルギーの50％超を熱に変える化合物は、「クエンチャー」と称される。いくつかの態様では、クエンチャーは、吸収された光のエネルギーの全てを熱に変える。様々な態様では、クエンチャーは、ある量の光を放射することができるが、ほとんどの吸収されたエネルギー（例えば、吸収されたエネルギーの少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）は、熱に変えられる。クエンチャーの非限定的な例は、i）Dabsyl（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）、ii）Black Hole Quencher（広範囲の事実上全可視スペクトルをクエンチすることができる）、およびiii）IRDye QC-1［可視からNIR（500〜900nm）までの範囲内でクエンチすることができる］を含む。光音響イメージングの主な原理は次の通りである:フルオロフォアまたはクエンチャーによる光の吸収、および熱へのエネルギーの変化（これは、熱膨張および検出される音波の発生につながり得る）。一般に、フルオロフォアは、いくらか、例えば、最小量のエネルギーを熱に変えるが、フルオロフォアのエネルギーの大部分は光の形で放射される。発光フルオロフォア（例えば、光などの電磁放射線を放射するフルオロフォア）に関するある好ましい態様では、フルオロフォアは、電磁放射線（例えば、光）の形態でより多くのエネルギーを放射し、より少ないエネルギーが熱に変えられる。クエンチャーに関するある好ましい態様では、クエンチャーは、電磁放射線（例えば、光）の形態でより少ないエネルギーを放射し、より多くのエネルギーが熱に変えられる。したがって、ICGは、一部のエネルギーを熱に変えるというその特性のために、光音響イメージングにおいてだけでなく蛍光イメージングにおいてもフルオロフォアとして使用され得る。
【００２１】
様々な態様では、1、2、3、4、5つまたはそれ以上のフルオロフォアがpHLIPペプチドに結合している。
【００２２】
いくつかの態様では、フルオロフォアが結合し得る（または結合している）pHLIPペプチドの官能基は、アミノ酸、アジド修飾アミノ酸、またはアルキニル修飾アミノ酸を含む。ある態様では、pHLIPペプチドは、アミド結合を介してフルオロフォアに共有結合している。
【００２３】
ある態様では、pHLIPペプチドの官能基は、遊離スルフヒドリル（SH）、または第一級アミンを含む（または含んだ）。
【００２４】
態様では、pHLIPペプチドは、1つまたは複数のフルオロフォア（例えば、フルオロフォア、フルオロフォアクエンチャーなどのクエンチャー、またはフルオロフォア-クエンチャー対を含む組合せ）に結合しており、診断、イメージング、エクスビボイメージング剤として、または研究ツールとして使用されるpHLIPフルオロフォア化合物を形成する。様々な態様では、pHLIPペプチドは、診断、イメージング、エクスビボイメージング剤として、または研究ツールとして使用される、官能基に結合した1つまたは複数のフルオロフォアを含む。
【００２５】
いくつかの態様では、フルオロフォアは、蛍光色素、または蛍光クエンチャー、または両者の組合せを含む。
【００２６】
いくつかの態様では、フルオロフォア-クエンチャー系は、蛍光ガイドイメージングにおいて使用される。そのような系の非限定的な説明に関しては、例えば、www.bachem.com/service-support/newsletter/peptide-trends-july-2016/を参照されたい。フルオロフォア-クエンチャー系の使用の非限定的な例は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるKarabadzhak et al.（2014）ACS Chem Biol.9（11）: 2545-53に記載されている。ある態様では、［例えば、立体構造変化のため、またはフルオロフォアとクエンチャーを接続する結合（ペプチドまたは他の結合など）の切断により］フルオロフォアとクエンチャー間の距離が増加する場合、フルオロフォアの放射の強度が増加する。ある態様では、フルオロフォアとクエンチャー間の距離が増加する場合、蛍光の効率が増加し、その結果、蛍光強度が増加する。
【００２７】
いくつかの態様では、フルオロフォアまたはクエンチャー（例えば、pHLIPクエンチャー）を含むpHLIP化合物が光音響イメージングに使用される。様々な態様では、光音響イメージングは、（例えば、光音響イメージング剤を用いて）光を吸収し、それを、熱に変える化合物または部分を含み、この熱は、蛍光とは対照的に超音波によって測定される。態様では、蛍光は、光を吸収し、蛍光またはリン光の形態でそれを放射する部分の化合物を含む。いくつかの態様では、フルオロフォア（例えば、光の形態で熱の形態よりも多くのエネルギーを放射するフルオロフォア）が光音響イメージングに使用される。ある態様では、ICG-pHLIPペプチドが光音響イメージングに使用される。マルチスペクトル光音響トモグラフィー（MSOT）イメージング剤としてのpHLIPペプチドおよび蛍光色素を含む化合物の使用の非限定的な例は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるKimbrough et al.（2015）Clin Cancer Res.21（20）: 4576-85に記載されている。
【００２８】
ある態様では、フルオロフォアは、近赤外（NIR）蛍光色素、例えば、NIR波長において作用する（例えば、NIR波長内でピーク放射波長を有する）インドシアニングリーン（ICG）を含む。赤外線は、700ナノメートル（nm）での可視スペクトルの名目上のレッドエッジから1mmに及ぶ。NIR放射線は、750nmから1.4μmの波長を含む。いくつかの態様では、ICGは、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）810nmから880nmの間のピーク放射波長を有する。ある態様では、ICGは、810nmから860nmの間のピーク放射波長を有する。様々な態様では、ICGは、約800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、または880nmのピーク放射波長を有する。いくつかの態様では、805nmレーザーがICG励起に使用される。ある態様では、801、802、803、804、804、805、806、807、808、809、810、800〜805、804〜806、または802〜807nmレーザーがICG励起に使用される。
【００２９】
（例えば、臨床適用および診断適用において有用であり得る）NIRイメージングシステムの非限定的な例は、Carl Zeiss Meditec AGから入手可能なINFRARED 800（商標）、Quest Medical Imaging BVから入手可能なArtemis（登録商標）、Mizuho Medical Co. Ltd.から入手可能なHyperEye Medical System（登録商標）、Hamamatsu Photonics K.K.から入手可能なNear infrared fluorescence imager PDE（登録商標）C9830、Spectropath Inc.から入手可能なSPECTROPATH（登録商標）Image-Guided Surgery System、NOVADAQ Technologies Inc.製の以下のもの:SPY Elite（登録商標）（直視下手術用イメージング）、PINPOINT（登録商標）（内視鏡蛍光イメージング）、LUNA（登録商標）（創傷治療用蛍光血管造影）、Intuitive Surgical Inc.から入手可能なda Vinci Si System用のFirefly（登録商標）Fluorescence imaging、Leica Microsystemsから入手可能なNIR Leica（登録商標）FL800、Fluoptics Minatec-BHTから入手可能なFluobeam（登録商標）、Karl Storz GmbH＆Co.から入手可能なKG, Storz Karl Storz-Endoskope（登録商標）（Near-Infrared/Indocyanine Green）、およびStryker Corporationから入手可能なInfraVision（商標）Imaging Systemを含む。
【００３０】
様々な態様では、フルオロフォアは、約670nm〜約750nmの波長で作用する（例えば、その範囲内にピーク放射波長を有する）薬剤、例えばメチレンブルーを含む。
【００３１】
ある態様では、フルオロフォアは、シアニン色素を含む。態様では、シアニン色素は、550〜620nm、590〜700nm、650〜730nm、680〜770nm、750〜820nm、または770〜850nmの波長で作用する（例えば、その範囲内にピーク放射波長を有する）。シアニン色素の非限定的な例は、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、およびCy7.5を含む。いくつかの態様では、シアニン色素は、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、またはCy7.5である。ある態様では、Cy3は、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）550から620nmの間にピーク放射波長を有する。様々な態様では、Cy3.5は、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）590から700nmの間にピーク放射波長を有する。いくつかの態様では、Cy5は、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）650から730nmの間にピーク放射波長を有する。ある態様では、Cy5.5は、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）680から770nmの間にピーク放射波長を有する。様々な態様では、Cy7は、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）750から820nmの間にピーク放射波長を有する。ある態様では、Cy7.5は、（例えば、pHLIPフルオロフォア化合物の文脈において）770から850nmの間にピーク放射波長を有する。
【００３２】
いくつかの態様では、フルオロフォアのピーク放射波長は、フルオロフォア周囲の環境および/または溶媒に基づいて（例えば、約5、6、7、8、9、または10％）変動し得る。
【００３３】
いくつかの態様では、フルオロフォアは、蛍光または光音響造影イメージング剤（optoacoustic contrast imaging agent）を含む。ある態様では、光音響イメージング剤は、蛍光性である。様々な態様では、光音響イメージング剤は、蛍光性ではない。ある態様では、光音響イメージング剤は、光を吸収し、光エネルギーの大部分（例えば、光エネルギーの少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）を熱に変える。様々な態様では、熱は、超音波によって検出される。いくつかの態様では、クエンチャーは、非常に低い量子収量を有するフルオロフォアであり、クエンチャーによって吸収されるエネルギーの大部分が（光などの）電磁放射線ではなく熱に変えられる。
【００３４】
光音響造影イメージング剤の非限定的な例は、ICG（光音響イメージングだけでなく蛍光イメージングにも使用され得る）、Alexa Fluor 750、Evans blue、BHQ3（Black Hole Quencher（登録商標）-3;例えば、Biosearch Technologies, California, United Statesから市販されている）、QXL（登録商標）680（例えば、Cambridge Bioscience, Cambridge, United Kingdomから市販されている）、IRDye（登録商標）800CW（例えば、LI-COR, Nebraska, United Statesから市販されている）、MMPSense（商標）750 FAST（例えば、PerkinElmer Inc., Texas, United Statesから市販されている）、ジケトピロロピロールシアニン、シパテート-C18、Auナノ粒子（Auナノ球体、Auナノシェル、Auナノロッド、Auナノケージ、Auナノクラスター、Auナノスター、およびAuナノビーコンなど）、ラマン分子タグトランス-1,2-ビス（4-ピリジル）-エチレンで覆われた金コアを含むナノ粒子、Agナノプレート、Agナノシステム、量子ドット、ナノダイヤモンド、ポリピロールナノ粒子、硫化銅、グラフェンナノシート、酸化鉄-金コアシェル、Gd2O3、単層カーボンナノチューブ、色素担持パーフルオロカーボン系ナノ粒子、AuMBs、トリガーされたナノ液滴、コバルトナノワントン（nanowonton）、ナノロース、金シリカコアシェルナノロッド、超常磁性酸化鉄、およびメチレンブルーを含む。光音響造影イメージング剤の非限定的な例および説明は、Wu et al.（2014）Int.J.Mol.Sci., 15, 23616-23639（例えば、表1を参照されたい）に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３５】
様々な態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、術前、術中および術後の状況における薬剤としての使用のためのものである。
【００３６】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、エクスビボイメージングおよびエクスビボ診断法用の薬剤としての使用のためのものである。
【００３７】
様々な態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、罹患組織を検出または造影するために使用される。罹患組織の非限定的な例は、がん性組織、炎症組織、虚血組織、関節炎組織、嚢胞性線維性組織、微生物に感染した組織、およびアテローム硬化性組織を含む。
【００３８】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、蛍光血管造影法における薬剤としての使用のためのものである。蛍光血管造影法は、蛍光化合物（本明細書において開示されるpHLIPフルオロフォア化合物など）が血流中に注射される手法である。蛍光化合物は、血管を強調する。様々な態様では、血管は、眼の後ろにある。いくつかの態様では、血管は、造影または撮影される。非限定的な例では、蛍光血管造影法を使用して、画像を同定する、検出する、または眼障害を管理する。眼科学に関するある態様では、蛍光血管造影法を使用して、例えば、網膜および脈絡膜における血流を見ることができる。
【００３９】
様々な態様では、蛍光血管造影法は、外科的手技中の変化を追跡するための血管のリアルタイムイメージングを提供する。いくつかの非限定的な例は、脈絡網膜脈管構造を評価するための眼科学における；冠動脈バイパスの有効性を評価するための心胸郭手術における；脳血行再建術における浅側頭動脈-中大脳動脈バイパス移植片の効果を評価するための神経血管手術における；解剖学的肝切除のための触覚セグメントおよびサブセグメントを同定するための肝胆道手術における；再建手術における；ならびに胆嚢切除および結腸直腸切除における、蛍光の使用を含む。診断適用の非限定的な例では、蛍光血管造影法は、脳における血行動態、関節リウマチの循環特徴、筋肉灌流、やけどのイメージングに、および外傷の様々な他の影響を評価するために使用される。
【００４０】
ある態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、眼科学、心胸郭手術、バイパス冠動脈手術、脳神経外科手術、肝胆道手術、再建手術、胆嚢切除、結腸直腸切除、脳手術、筋肉灌流、創傷および外傷手術、ならびに腹腔鏡手術における血液循環の可視化のためのものである。
【００４１】
様々な態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、リンパ節の可視化のためのものである。
【００４２】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、前がん性組織またはがん性病変の可視化または検出のためのものである。
【００４３】
ある態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、膀胱、上部尿路、腎臓、前立腺、乳房、頭頸部、口、膵臓、肺、肝臓、頸部、卵巣、または脳腫瘍における前がん性組織またはがん性病変の可視化または検出のためのものである。
【００４４】
様々な態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、術中手順中の血流および組織灌流のリアルタイム評価のためのものである。
【００４５】
一局面では、pHLIPフルオロフォア化合物を含む、非経口、局所、または全身投与のための組成物が本明細書において提供される。
【００４６】
一局面では、pHLIPフルオロフォア化合物の静脈内、動脈内、腹腔内、脳内、脳室内、髄腔内、心臓内、陰茎海綿体内、骨内、眼内、硝子体内投与のための組成物が本明細書に含まれる。
【００４７】
一局面では、pHLIPフルオロフォア化合物の筋肉内、皮内、経皮、経粘膜、病巣内、皮下、局所、皮膚上、羊膜外、膣内、膀胱内、経鼻または経口投与のための組成物が本明細書において提供される。
【００４８】
一局面では、pHLIPフルオロフォア化合物を含む、生検標本、液体生検標本、外科的に除去された組織、外科的に除去された液体、または血液のエクスビボ処置のための組成物が本明細書に含まれる。
【００４９】
一局面では、対象の血液が（例えば、インビボまたはエクスビボで）pHLIPフルオロフォア化合物と接触させられる。
【００５０】
様々な態様では、フルオロフォアがpHLIPフルオロフォア組成物の一部、例えば、コンジュゲート体である場合、遊離フルオロフォア、例えば、非コンジュゲートフルオロフォアの（例えば、イメージングまたは検出のための）有効量と比較して、より低い用量のフルオロフォア（ICGなど）で効果を有する。いくつかの態様では、pHLIPフルオロフォア化合物の一部としてのより低い有効用量のフルオロフォアの投与は、より低い副作用をもたらす。ある態様では、フルオロフォアは、投与後に対象を日射に対してより感受性にし得、対象は、ICGなどのフルオロフォアが投与されていない対象と比較して、日射への曝露後により大きな程度の日焼けを発症する。様々な態様では、フルオロフォアは、フルオロフォアが遊離形態で投与された場合に必要とされるよりも低い用量でpHLIPフルオロフォア化合物の一部として対象に送達され、それによって、日射への曝露からの光毒性（例えば、皮膚/日焼けに対する毒性）が遊離型のフルオロフォアが投与された場合よりも低減または最小化される。
【００５１】
いくつかの態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、pHLIPおよびICGを含む（例えば、ICG-Var3などのICG-pHLIPペプチド）。ある態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、対象のkg当たり約0.01〜0.5mgの用量で投与される。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、対象のkg当たり約0.02〜0.2mgの用量で投与される。いくつかの態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、対象のkg当たり約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.25、または0.5mgの用量で投与される。ある態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、少なくとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175、または0.2mg/kg、しかし、約0.25、0.5、1、2、3、4、または5mg/kg未満の用量で投与される。様々な態様では、1〜10mgのpHLIPフルオロフォア化合物が対象に投与される。いくつかの態様では、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または15mgのpHLIPフルオロフォア化合物が対象に投与される。ある態様では、少なくとも0.5、1、2、または3mg、しかし、10または1mg未満のpHLIPフルオロフォア化合物が対象に投与される。様々な態様では、約0.3〜3μmolのpHLIPフルオロフォア化合物が対象に投与される。いくつかの態様では、約0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、または5μmolのpHLIPフルオロフォア化合物が対象に投与される。ある態様では、少なくとも約0.1、0.5、または1μmol、しかし、3、4、または5μmol未満のpHLIPフルオロフォア化合物が対象に投与される。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1〜10、1〜15、5〜10、5〜15、5〜20、10〜15、10〜20、または15〜20分間の静脈内注射によって投与される。
【００５２】
ある態様では、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または15mgのpHLIPフルオロフォア化合物が臓器または組織（例えば、膀胱）に滴下注入される。ある態様では、少なくとも0.5、1、2、または3mg、しかし、10または1mg未満のpHLIPフルオロフォア化合物が臓器または組織（例えば、膀胱）に滴下注入される。様々な態様では、約0.3〜3μmolのpHLIPフルオロフォア化合物が臓器または組織（例えば、膀胱）に滴下注入される。いくつかの態様では、約0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、または5μmolのpHLIPフルオロフォア化合物が臓器または組織（例えば、膀胱）に滴下注入される。ある態様では、少なくとも約0.1、0.5、または1μmol、しかし、3、4、または5μmol未満のpHLIPフルオロフォア化合物が臓器または組織（例えば、膀胱）に滴下注入される。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物が約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1〜10、1〜15、5〜10、5〜15、5〜20、10〜15、10〜20、または15〜20分間、臓器または組織（例えば、膀胱）に滴下注入される。
【００５３】
ある態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、ポリエチレングリコールをさらに含む。いくつかの態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、1つまたは複数のポリエチレングリコールサブユニット（例えば、3、4、5、6、7、8、9、0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、3〜10、10〜20、または3〜20サブユニット）をさらに含む。
【００５４】
対象における血流を検出（例えば、イメージング）するための方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に含まれる:（a）本明細書において開示されるフルオロフォア（ICGなど）を含むpHLIPフルオロフォア化合物を対象に投与する工程;（b）対象（例えば、投与されたpHLIPフルオロフォア化合物の一部を含み得る領域または組織などの対象の領域、細胞、組織または臓器）をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および（c）対象におけるpHLIPフルオロフォア化合物から放射される電磁放射線を検出する工程。態様では、放射線の検出は、対象における血液の存在（例えば、位置、またはある位置での量）を示す。態様では、対象における血液の画像が作製される。
【００５５】
対象におけるpHLIPフルオロフォア化合物を検出（例えば、イメージング）するための方法であって、以下の工程を含む方法も提供される:（a）本明細書において開示されるフルオロフォア（ICGなど）を含むpHLIPフルオロフォア化合物を対象に投与する工程;（b）対象（例えば、投与されたpHLIPフルオロフォア化合物の一部を含み得る領域、細胞、組織、または臓器などの対象の領域または組織）をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および（c）対象におけるpHLIPフルオロフォア化合物から放射される電磁放射線を検出する工程。態様では、放射線の検出は、対象における血液などの体液の存在（例えば、位置またはある位置での量）を示す。態様では、対象における血液の画像が作製される。
【００５６】
対象における血流の光音響検出またはイメージングのための方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に含まれる:（a）pHLIPフルオロフォア化合物を投与する工程であって、該フルオロフォアが発光フルオロフォアまたはクエンチャーなどの光音響イメージング剤である、pHLIPフルオロフォア化合物を投与する工程;（b）対象（例えば、投与されたpHLIPフルオロフォア化合物の一部を含み得る領域または組織などの対象の領域、細胞、組織または臓器）をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および（c）音響エネルギー（例えば、音波）などのエネルギーを検出する工程。態様では、エネルギーの検出は、対象における血液の存在（例えば、位置またはある位置での量）を示す。様々な態様では、対象における血液の画像が作製される。いくつかの態様では、音響エネルギーの存在が超音波によって検出される（例えば、熱が放出され、膨張を生じ、音波を発生させ、それが検出される）。
【００５７】
本主題は、対象におけるpHLIPフルオロフォア化合物を検出（例えば、イメージング）するための方法であって、該フルオロフォアが発光フルオロフォアまたはクエンチャーなどの光音響イメージング剤であり、該方法が以下を含む、方法も提供する：（a）pHLIPフルオロフォア化合物を対象に投与する工程;（b）対象（例えば、投与されたpHLIPフルオロフォア化合物の一部を含み得る領域、細胞、組織、または臓器などの対象の領域または組織）をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および（c）音響エネルギー（例えば、音波）などのエネルギーを検出する工程。態様では、エネルギーの検出は、対象における血液などの体液の存在（例えば、位置またはある位置での量）を示す。態様では、対象における血液の画像が作製される。態様では、音響エネルギーの存在は、超音波によって検出される。
【００５８】
文脈に応じて、「励起波長」は、「吸収波長」と同義に使用され得る。
【００５９】
様々な態様では、方法は、手術中または医師の診察中に行われる蛍光ガイドイメージング手法を含む。いくつかの態様では、方法は、蛍光血管造影法を含む。ある態様では、方法は、組織および臓器の灌流の評価を含む。様々な態様では、方法は、肝機能の評価を含む。いくつかの態様では、蛍光ガイドイメージング手法は、前がん性組織、がん性組織、炎症組織、虚血組織、関節炎組織、微生物に感染した組織、および/またはアテローム硬化性組織のターゲティング、マーキング、検出または可視化を含む。ある態様では、方法は、心胸郭手術中の冠動脈バイパスの開存性を評価する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、例えば、脳血行再建術における、神経血管手術中または後の浅側頭動脈-中大脳動脈バイパス移植片の効果を評価する工程を含む。ある態様では、方法は、肝胆道手術中の解剖学的肝切除のための触覚セグメントおよびサブセグメントを同定する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、再建手術中に組織または血液をイメージングする工程を含む。ある態様では、方法は、胆嚢切除または結腸直腸切除中に組織または血液をイメージングする工程を含む。いくつかの態様では、方法は、悪性神経膠腫などの脳腫瘍を手術中に同定する工程を含む。
【００６０】
様々な態様では、方法は、画像診断手法を含む。いくつかの態様では、方法は、網膜血管造影法を含む。ある態様では、方法は、脈絡網膜脈管構造を検出またはイメージングすることを含む。
【００６１】
いくつかの態様では、方法は、リンパ節のマッピングおよび可視化を含む。ある態様では、方法は、前がん性組織、がん性病変をターゲティングかつマーキング（例えば、可視化または検出）すること、および/または腫瘍周縁部の評価を含む。
【００６２】
様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、非経口、局所、または全身投与によって投与される。ある態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、静脈内、動脈内、腹腔内、脳内、脳室内、髄腔内、心臓内、陰茎海綿体内、骨内、眼内、または硝子体内投与によって投与される。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、筋肉内、皮内、経皮、経粘膜、病巣内、皮下、局所、皮膚上、羊膜外、膣内、膀胱内、経鼻または経口投与によって投与される。
【００６３】
一局面では、ヒト標本のエクスビボ染色およびエクスビボ診断のための方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書において提供される:（a）対象からの生物学的試料を、本明細書において開示されるフルオロフォア（ICGなど）を含むpHLIPフルオロフォア化合物と接触させる工程;（b）前記生物学的試料をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および（c）pHLIPフルオロフォア化合物から放射される電磁放射線を検出する工程。態様では、生物学的試料は、生検標本、液体生検標本、外科的に除去された組織、外科的に除去された液体、または血液を含む。
【００６４】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000008
のいずれか1つに存在する少なくとも8〜25個の連続したアミノ酸（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸）の配列を含む。  
【００６５】
態様では、pHLIPペプチドは、任意でどちら側に追加されていてもよい追加のアミノ酸（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のアミノ酸）を有するアミノ酸配列
2020500926.tif 000009
を含む。
【００６６】
ある態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列を有する。
2020500926.tif 000010
【００６７】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000011
のいずれか1つに存在する少なくとも8〜25個の連続したアミノ酸（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸）の配列を含み、ここで、各Xは、個々に、D、E、Gla、またはAadである。
【００６８】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000012
を含み、ここで、各Xは、個々に、D、E、Gla、またはAadである。
【００６９】
ある態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000013
のいずれか1つに存在する少なくとも8〜25個の連続したアミノ酸（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸）の配列を含み、ここで、各X1は、個々に、D、E、Gla、またはAadであり、各X2は、個々に、A、I、L、M、F、P、W、Y、V、またはGであり、各X3は、個々に、S、T、またはGである。
【００７０】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000014
を含み、ここで、各X1は、個々に、D、E、Gla、またはAadであり、各X2は、個々に、A、I、L、M、F、P、W、Y、V、またはGであり、各X3は、個々に、S、T、またはGである。
【００７１】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000015
2020500926.tif 000016
のいずれか1つに存在する少なくとも8〜25個の連続したアミノ酸（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸）の配列を含む。
【００７２】
ある態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列を含む。
2020500926.tif 000017
2020500926.tif 000018
【００７３】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000019
2020500926.tif 000020
のいずれか1つに存在する少なくとも8〜25個の連続したアミノ酸（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸）の配列を含み、ここで各Xは、個々に、D、E、Gla、またはAadである。
【００７４】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000021
2020500926.tif 000022
を含み、ここで、各Xは、個々に、D、E、Gla、またはAadである。
【００７５】
ある態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000023
のいずれか1つに存在する少なくとも8〜25個の連続したアミノ酸（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸）の配列を含み、ここで、各X1は、個々に、D、E、Gla、またはAadであり、各X2は、個々に、A、I、L、M、F、P、W、Y、V、またはGであり、各X3は、個々に、S、T、またはGである。
【００７６】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000024
を含み、ここで、各X1は、個々に、D、E、Gla、またはAadであり、各X2は、個々に、A、I、L、M、F、P、W、Y、V、またはGであり、各X3は、個々に、S、T、またはGである。
【００７７】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも8つの連続したアミノ酸を含み、ここで、（i）8つの連続したアミノ酸の少なくとも4つは非極性アミノ酸であり、（ii）少なくとも8つの連続したアミノ酸の少なくとも1つはプロトン化可能であり、（iii）少なくとも8つの連続したアミノ酸は、天然のヒトタンパク質において生じる8つの連続したアミノ酸の配列と同一である配列における8つの連続したアミノ酸を含む。ある態様では、pHLIPペプチドは、pH7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0での親和性と比較して、pH5.0、5.5、6、6.0、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、または7.0で膜脂質二重層に対してより高い親和性を有する。
【００７８】
様々な態様では、少なくとも8つの連続したアミノ酸は、（i）天然のヒトタンパク質において生じる8つの連続したアミノ酸の配列、または（ii）天然のヒトタンパク質において生じる少なくとも8つの連続したアミノ酸の配列の逆と少なくとも85％、90％、または95％同一である（例えば、100％同一である）配列を含む。いくつかの態様では、天然のヒトタンパク質は、ヒトロドプシンタンパク質である。ある態様では、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8つの連続したアミノ酸は、以下の配列:
2020500926.tif 000025
に含まれる。この配列の逆は、
2020500926.tif 000026
である。
【００７９】
様々な態様では、pHLIPペプチドの配列は、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸の配列と少なくとも85％、90％、または95％同一である配列を有する8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸を含み、ここで、pHLIPペプチドの8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸の配列は、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸の配列と比較して1、2、または3個のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、配列は、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸と比較して、LからD、LからE、AからP、またはCからGへの置換を有する。ある態様では、pHLIPペプチドの配列は、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸の配列の逆と85％、90％、または95％同一である配列を有する20個の連続したアミノ酸を含み、ここで、20個の連続したアミノ酸の配列は、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸の配列の逆と比較して1、2、または3個のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、配列は、ヒトロドプシンタンパク質において生じる8〜20個（例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8〜15、8〜20、10〜15、10〜20、または15〜20個）の連続したアミノ酸の逆と比較して、LからD、LからE、AからP、またはCからGへの置換を有する。
【００８０】
ヒトロドプシンをコードするゲノムヌクレオチド配列の非限定的な例は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）Reference Sequence No: NC＿000003.12の下で入手可能であり、NCBI Reference Sequence No: NC＿000003.12の下で入手可能な全ての情報は、参照により本明細書に組み入れられる。NCBI Reference Sequence No: NC＿000003.12から入手可能であるヌクレオチド配列は、以下の通りである。
2020500926.tif 000027
2020500926.tif 000028
2020500926.tif 000029
2020500926.tif 000030
2020500926.tif 000031
【００８１】
ヒトロドプシンアミノ酸配列の非限定的な例は、UniProt Accession No: P08100の下で入手可能である。UniProt Accession No: P08100の下で入手可能な全ての情報は、参照により本明細書に組み入れられる。UniProt Accession No: P08100から入手可能であるアミノ酸配列は、以下の通りである（下線が引かれたアミノ酸は、特に、pHLIPペプチドを設計するための出発点として、pHLIPの非限定的な例において使用され得る）。
2020500926.tif 000032
【００８２】
例えば、配列
2020500926.tif 000033
を含むpHLIPペプチドは、
2020500926.tif 000034
と比較して、3つの置換変異（下線）および1つの付加されたアミノ酸（N末端D）を含む有用なpHLIPペプチドである。例えば、表11のHum pHLIP、ならびに表5および6の配列も参照されたい。
【００８３】
ヒトロドプシンをコードするcDNA配列の非限定的な例は、NCBI Reference Sequence No: NM＿000539.3の下で入手可能であり、NCBI Reference Sequence No: NM＿000539.3の下で入手可能な全ての情報は、参照により本明細書に組み入れられる。NCBI Reference Sequence No: NM＿000539.3から入手可能なヌクレオチド配列は、以下の通りである。
2020500926.tif 000035
2020500926.tif 000036
【００８４】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列:
2020500926.tif 000037
を含み、ここで、（i）各Yは、個々に、溶媒和エネルギー
2020500926.tif 000038
を有する非極性アミノ酸またはGlyであり、（ii）各Xは、個々に、プロトン化可能アミノ酸であり、（iii）n、m、i、j、l、h、g、fはそれぞれ、個々に、1〜8の整数である。
【００８５】
ある態様では、pHLIPペプチドは、水中で約6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、または7.5のpHで、ある正味の負電荷を有する。
【００８６】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、10を底とする対数尺度で約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、または7.0未満の酸解離定数（pKa）を有する。ある態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも約6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、または7.0のpKaを有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、約6.5から約7.0、例えば、約6.6から約7.0、約6.7から約7.0、約6.8から約7.0、または約6.9から約7.0の間のpKaを有する。ある態様では、pHLIPペプチドは、約6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、または7.0のpKaを有する。
【００８７】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、（a）アスパラギン酸、グルタミン酸、アルファ-アミノアジピン酸、またはガンマカルボキシグルタミン酸である1つのプロトン化可能アミノ酸、または（b）アスパラギン酸、グルタミン酸、アルファ-アミノアジピン酸、ガンマ-カルボキシグルタミン酸、またはその任意の組合せを含む少なくとも2、3または4つのプロトン化可能アミノ酸を含む。
【００８８】
ある態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1つの非天然プロトン化可能アミノ酸を含む。様々な態様では、非天然プロトン化可能アミノ酸は、少なくとも1、2、3、または4つのカルボキシル基を含む。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個のカルボキシル基を含む。ある態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の遺伝的にコードされたアミノ酸を含む。
【００８９】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の非遺伝的にコードされたアミノ酸を含む。いくつかの態様では、pHLIPペプチドのアミノ酸は、非天然アミノ酸である。ある態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個のD-アミノ酸を含む。
【００９０】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1つの非遺伝的にコードされたアミノ酸を含み、ここで、非遺伝的にコードされたアミノ酸は、アスパラギン酸誘導体、またはグルタミン酸誘導体である。
【００９１】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも8つの連続したアミノ酸を含み、ここで、この少なくとも8個のアミノ酸の少なくとも2、3または4個は非極性であり、少なくとも8個の連続したアミノ酸の少なくとも1、2、3または4個は、プロトン化可能である。
【００９２】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、フルオロフォアに結合を介して直接共有結合しているか、またはリンカーを介して共有結合している。
【００９３】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、共有結合によってフルオロフォアに結合しており、ここで、共有結合は、エステル結合、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、硫黄とセレン原子間の結合、または酸に不安定な結合である。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、共有結合によってフルオロフォアに結合しており、ここで、共有結合は、クリックケミストリー反応によって形成された結合である。ある態様では、共有結合は、（i）アジドとアルキン、（ii）アルキンと歪みジフルオロオクチン、（iii）ジアリール歪みシクロオクチンと1,3-ニトロン、（iv）シクロオクテン、トランス-シクロアルケン、またはオキサノルボルナジエンと、アジド、テトラジン、またはテトラゾール、（v）活性化アルケンまたはオキサノルボルナジエンとアジド、（vi）歪みシクロオクテンまたは他の活性化アルケンとテトラジン、または（vii）紫外線によって活性化されたテトラゾールとアルケン間の反応によって形成された結合である。ある態様では、共有結合は、ペプチド結合である。様々な態様では、共有結合は、ペプチド結合ではない。
【００９４】
様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、共有結合によってリンカーに結合しているpHLIPペプチドを含む。いくつかの態様では、共有結合は、ペプチド結合である。ある態様では、共有結合は、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、または硫黄とセレン原子間の結合である。様々な態様では、共有結合は、クリックケミストリー反応によって形成された結合である。いくつかの態様では、共有結合は、（i）アジドとアルキン、（ii）アルキンと歪みジフルオロオクチン、（iii）ジアリール歪みシクロオクチンと1,3-ニトロン、（vi）シクロオクテン、トランス-シクロアルケン、またはオキサノルボルナジエンと、アジド、テトラジン、またはテトラゾール、（v）活性化アルケンまたはオキサノルボルナジエンとアジド、（vi）歪みシクロオクテンまたは他の活性化アルケンとテトラジン、または（vii）紫外線によって活性化されたテトラゾールとアルケン間の反応によって形成された結合である。ある態様では、共有結合は、ペプチド結合である。様々な態様では、共有結合は、ペプチド結合ではない。
【００９５】
いくつかの態様では、リンカーは、天然に存在する高分子の構造を有する人工高分子または合成的に作製された高分子を含む。ある態様では、リンカーは、ポリペプチド、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリシステイン、またはポリ核酸を含む。様々な態様では、リンカーは、アミノ酸を含まない。いくつかの態様では、リンカーは、多糖、キトサン、またはアルギネートを含む。ある態様では、リンカーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸-グリコール酸共重合体）、ポリ（リンゴ酸）、ポリオルトエステル、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（アミドアミン）、ポリ酸無水物、またはポリシアノアクリレートを含む。様々な態様では、リンカーは、ポリ（エチレングリコール）を含む。ある態様では、ポリ（エチレングリコール）は、60〜100000ダルトン、例えば、少なくとも約60、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000、15000、20000、25000ダルトン、しかし、約100000、90000、70000、60000、50000、40000、または30000ダルトン未満の分子量を有する。様々な態様では、リンカーは、直鎖状高分子または分岐状高分子を含む。いくつかの態様では、リンカーは、有機化合物構造を含む。ある態様では、有機化合物構造は、約10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、または0.5kDa未満の分子量を有する。
【００９６】
いくつかの態様では、リンカーは、共有結合を介してフルオロフォア（例えば、発光フルオロフォアまたはクエンチャー）に結合している。ある態様では、共有結合は、エステル結合、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、硫黄とセレン原子間の結合、または酸に不安定な結合である。様々な態様では、共有結合は、クリックケミストリー反応によって形成された結合である。いくつかの態様では、共有結合は、（i）アジドとアルキン、（ii）アルキンと歪みジフルオロオクチン、（iii）ジアリール歪みシクロオクチンと1,3-ニトロン、（vi）シクロオクテン、トランス-シクロアルケン、またはオキサノルボルナジエンと、アジド、テトラジン、またはテトラゾール、（v）活性化アルケンまたはオキサノルボルナジエンとアジド、（vi）歪みシクロオクテンまたは他の活性化アルケンとテトラジン、または（vii）紫外線によって活性化されたテトラゾールとアルケン間の反応によって形成された結合である。ある態様では、共有結合は、ペプチド結合である。様々な態様では、共有結合は、ペプチド結合ではない。
【００９７】
いくつかの態様では、フルオロフォアは、蛍光色素または蛍光タンパク質である。フルオロフォアの非限定的な例は、蛍光色素、リン光色素、量子ドット、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアキソール誘導体、ピレン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、またはテトラピロール誘導体を含む。キサンテン誘導体は、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、およびCal Fluor色素を含むが、これらに限定されない。シアニン誘導体は、シアニン、インドカルボシアニン、インドシアニングリーン（ICG）、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、およびクエーサー色素を含むが、これらに限定されない。ナフタレン誘導体は、ダンシルおよびプロダン誘導体を含むが、これらに限定されない。オキサジアゾール誘導体は、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾールを含むが、これらに限定されない。ピレン誘導体の非限定的な例は、カスケードブルーである。オキサジン誘導体は、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、およびオキサジン170を含むが、これらに限定されない。アクリジン誘導体は、プロフラビン、アクリジンオレンジ、およびアクリジンイエローを含むが、これらに限定されない。アリールメチン誘導体は、オーラミン、クリスタルバイオレット、およびマラカイトグリーンを含むが、これらに限定されない。テトラピロール誘導体は、ポルフィン、フタロシアニン、およびビリルビンを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
様々な態様では、本明細書に含まれるpHLIPフルオロフォア化合物は、診断薬、イメージング剤として使用される。いくつかの態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、インビボイメージングのための薬剤として、またはインビボ診断法において使用される。ある態様では、本明細書において提供されるpHLIPフルオロフォア化合物は、エクスビボイメージングのための薬剤として、またはエクスビボ診断法において使用される。
【００９９】
ある実施態様は、本明細書において開示されるpHLIPフルオロフォア化合物を含む非経口、局所、または全身投与のための製剤を含む。
【０１００】
静脈内、動脈内、腹腔内、脳内、脳室内、髄腔内、心臓内、陰茎海綿体内、骨内、眼内、または硝子体内投与のためのpHLIPフルオロフォア化合物を含む製剤も提供される。
【０１０１】
本主題は、本明細書において開示されるpHLIPフルオロフォア化合物を含む膀胱内注入のための製剤も含む。
【０１０２】
様々な態様では、フルオロフォアは、チオール結合またはエステル結合または酸に不安定な結合などの結合を介して膜挿入ペプチドに共有結合している。他のタイプの結合、化学結合、または結合会合も使用される。例示的な結合または会合は、ジスルフィド、および/またはタンパク質結合モチーフを有するペプチド、および/またはタンパク質キナーゼコンセンサス配列、および/またはタンパク質ホスファターゼコンセンサス配列、および/またはプロテアーゼ反応性配列、および/またはペプチダーゼ反応性配列、および/またはトランスフェラーゼ反応性配列、および/またはヒドロラーゼ反応性配列、および/またはイソメラーゼ反応性配列、および/またはリガーゼ反応性配列、および/または細胞外メタロプロテアーゼ反応性配列、および/またはリソソームプロテアーゼ反応性配列、および/またはベータラクタマーゼ反応性配列、および/またはオキシドレダクターゼ反応性配列、および/またはエステラーゼ反応性配列、および/またはグリコシダーゼ反応性配列、および/またはヌクレアーゼ反応性配列によって媒介される。
【０１０３】
ある態様では、フルオロフォアは、切断不可能な結合を介して膜挿入ペプチドに共有結合している。様々な態様では、切断不可能な結合は、哺乳類細胞によって発現される酵素によって切断されない、かつ/またはグルタチオンによって切断されない、かつ/または低pHの条件で切断されない共有結合である。切断不可能な結合の非限定的な例は、マレイミド結合、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと第一級アミン（例えば、リジン側鎖の第一級アミン）との反応から生じる結合、クリック反応から生じる結合、チオエーテル結合、または第一級アミン（-NH2）もしくはチオ（-SH）官能基とスクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）との反応から生じる結合を含む。例示的な切断不可能な結合は、マレイミドアルカンリンカー、
2020500926.tif 000039
を含む結合、およびマレイミドシクロヘキサンリンカー、
2020500926.tif 000040
を含む結合を含む。
【０１０４】
上記のように、組成物は、例えば、ヒトおよび動物（例えば、イヌおよびネコなどのコンパニオンアニマル、およびウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラマなどの家畜）における診断および治療適用のための臨床設定において使用され得る。そのような部分を含む膜挿入化合物（membrane-inserting compound）は、リアルタイム画像にガイドされる治療介入を含めた様々な臨床診断方法において使用され得る。
【０１０５】
例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、診断的使用のために身体に投与される組成物が本明細書に含まれる。例えば、その方法は、例えば、静脈を通して（頸静脈、末梢静脈または血管周囲腔を介してなど）血管内腔に注入することによって行われる。いくつかの態様では、組成物は、例えば、エアロゾルまたは洗浄液として哺乳類の肺に注入される。様々な態様では、組成物は、ヒトまたは動物の膀胱、口腔、腸腔、食道、または気管への膀胱内注入によって投与される。いくつかの態様では、注射は、哺乳類の腹膜腔に、真皮下で、または皮下で行われ得る。
【０１０６】
pHトリガー化合物と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が本明細書に含まれる。
【０１０７】
いくつかの態様では、対象は、哺乳類である。ある態様では、哺乳類は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、霊長類（例えば、チンパンジー、ゴリラ、サル、テナガザル、ヒヒ）、乳牛、ラクダ、イヌ、ネコ、ウマ、ラマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、シチメンチョウ、またはアヒルである。ある態様では、対象は、ヒトである。
【０１０８】
本主題は、罹患組織を検出するための化合物および組成物を提供する。例えば、本主題の局面は、（例えば、腫瘍または転移巣の）がん性組織および/または前がん性組織（例えば、異形成組織）の検出に関する。化合物は、インドシアニングリーン（ICG）に共有結合しているpHLIPペプチドを含む。pHLIPペプチドは、配列LFPTXTLL（SEQ ID NO:1）におけるアミノ酸を含み、ここで、Xは、プロトン化可能アミノ酸である。好ましい態様では、Xは、アスパラギン酸などのグルタミン酸以外のプロトン化可能アミノ酸である。さらに、pHトリガーペプチドは、pH8.0でと比較して、pH5.0で膜脂質二重層に対してより高い親和性を有する。様々な実施態様では、ICGは、pHLIPペプチドのN末端から数えて1番目または2番目のアミノ酸に共有結合している。
【０１０９】
本開示の局面は、ICG化合物に結合したpHLIPペプチドを提供する。様々な実施態様では、pHLIPペプチドは、共有結合によってICGに直接結合している。いくつかの非限定的な例では、共有結合は、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、硫黄とセレン原子間の結合、または酸に不安定な結合である。
【０１１０】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドとICG間の共有結合は、クリック反応によって形成された結合である。クリック反応の非限定的な例は、アジドとアルキン、アルキンと歪みジフルオロオクチン、ジアリール歪みシクロオクチンと1,3-ニトロン、シクロオクテン、トランス-シクロアルケン、またはオキサノルボルナジエンと、アジド、テトラジン、またはテトラゾール、活性化アルケンまたはオキサノルボルナジエンとアジド、歪みシクロオクテンまたは他の活性化アルケンとテトラジン、または紫外線によって活性化されたテトラゾールとアルケン間の反応を含む。
【０１１１】
いくつかの実施態様は、共有結合によってリンカー化合物に結合しているpHLIPペプチドを提供し、ここで、リンカー化合物は、共有結合によってIGCに結合している。非限定的な例では、pHLIPペプチドとリンカー化合物間の共有結合および/またはリンカー化合物とICG間の共有結合は、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、硫黄とセレン原子間の結合、またはクリック反応によって形成された結合である。
【０１１２】
様々な態様では、ICGは、チオール結合またはチオエステル結合またはエステル結合または酸不安定結合などの結合を介してpHLIPペプチドに共有結合している。他のタイプの結合、化学結合、または結合会合も使用され得る。例示的な結合または会合は、ジスルフィド、および/またはタンパク質結合モチーフを有するペプチド、および/またはタンパク質キナーゼコンセンサス配列、および/またはタンパク質ホスファターゼコンセンサス配列、および/またはプロテアーゼ反応性配列、および/またはペプチダーゼ反応性配列、および/またはトランスフェラーゼ反応性配列、および/またはヒドロラーゼ反応性配列、および/またはイソメラーゼ反応性配列、および/またはリガーゼ反応性配列、および/または細胞外メタロプロテアーゼ反応性配列、および/またはリソソームプロテアーゼ反応性配列、および/またはベータラクタマーゼ反応性配列、および/またはオキシドレダクターゼ反応性配列、および/またはエステラーゼ反応性配列、および/またはグリコシダーゼ反応性配列、および/またはヌクレアーゼ反応性配列によって媒介される。
【０１１３】
ある態様では、フルオロフォアは、切断不可能な結合を介してpHLIPペプチドに共有結合している。様々な態様では、切断不可能な結合は、哺乳類細胞によって発現される酵素によって切断されない、かつ/またはグルタチオンによって切断されない、かつ/または低pHの条件で切断されない共有結合である。切断不可能な結合の非限定的な例は、マレイミド結合［例えば、マレイミドエステルとチオール（例えば、システイン側鎖のチオールでの）との反応から生じる結合］、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）結合［例えば、NHSエステルと第一級アミン（例えば、ポリペプチド鎖のN末端またはリジン側鎖の第一級アミンでの）との反応から生じる結合］、クリック反応から生じる結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、または第一級アミン（-NH2）もしくはチオ（-SH）官能基とスクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）との反応から生じる結合を含む。例示的な切断不可能な結合は、マレイミドアルカンリンカー、例えば、
2020500926.tif 000041
およびマレイミドシクロヘキサンリンカー、例えば、
2020500926.tif 000042
を含む。
【０１１４】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000043
におけるアミノ酸を含み、ここで、そのシステインにICGが共有結合している。ある態様では、ICGは、システインに共有結合している。一部の態様では、N末端および/またはC末端は、どの化合物にも結合していない。非限定的な例では、化合物は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000044
【０１１５】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000045
におけるアミノ酸を含み、ICGは、pHLIPペプチドのN末端アラニンに共有結合している。非限定的な例では、化合物は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000046
【０１１６】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000047
におけるアミノ酸を含み、ICGは、pHLIPペプチドのリジンに共有結合している。そのような化合物の非限定的な例は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000048
【０１１７】
ある態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000049
におけるアミノ酸を含み、ICGは、pHLIPペプチドのシステインに共有結合している。非限定的な例では、化合物は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000050
【０１１８】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000051
におけるアミノ酸を含み、ここで、そのシステインにICGが共有結合している。ある態様では、ICGは、システインに共有結合している。一部の態様では、N末端および/またはC末端は、どの化合物にも結合していない。非限定的な例では、化合物は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000052
この構造は、任意で以下のように描かれてもよい。
2020500926.tif 000053
【０１１９】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000054
におけるアミノ酸を含み、ICGは、pHLIPペプチドのN末端アラニンに共有結合している。非限定的な例では、化合物は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000055
【０１２０】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000056
におけるアミノ酸を含み、ICGは、pHLIPペプチドのリジンに共有結合している。そのような化合物の非限定的な例は、以下の構造を含む。
2020500926.tif 000057
【０１２１】
プロトン化可能アミノ酸は、酸性側鎖（例えば、1つまたは複数のカルボキシル基を含む側鎖）を有するアミノ酸を含む。例えば、プロトン化可能アミノ酸は、25℃で約7.0、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5.0、4.75、4.5、4.25、4.0、3.75、3.5、3.25、または3.0未満のpKaを有する側鎖を有し得る。プロトン化可能アミノ酸の非限定的な例は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびガンマカルボキシグルタミン酸を含む。様々な態様では、pHLIPペプチドは、人工プロトン化可能アミノ酸を含む。いくつかの態様では、人工プロトン化可能アミノ酸は、少なくとも1、2、3、4または5つのカルボキシル基を含む。
【０１２２】
標準的なα-アミノ酸のうち、グリシンを除く全てのものは、L-またはD-アミノ酸と称される2つの光学異性体のどちらかで存在し得、これらは、互いの鏡像である。L-アミノ酸がリボソーム内での翻訳中にタンパク質中に見出されるアミノ酸の全てを表す一方、D-アミノ酸は、翻訳および小胞体への移行後の酵素翻訳後修飾によって作製される一部のタンパク質中に見出される。D-アミノ酸は、細菌のペプチドグリカン細胞壁の豊富な構成要素であり、D-セリンは、脳内の神経伝達物質として作用する。アミノ酸立体配置に関するLおよびDの慣例は、アミノ酸自体の光学活性ではなく、むしろそのアミノ酸がそこから合成され得るグリセルアルデヒドの異性体の光学活性を表す（D-グリセルアルデヒドは、右旋性であり、L-グリセルアルデヒドは、左旋性である）。いくつかの態様では、pHLIPペプチドにおけるアミノ酸の全てまたは一部は、D-アミノ酸である。例えば、pHLIPペプチドは、L-アミノ酸のみ、またはD-アミノ酸のみ、またはD-アミノ酸とL-アミノ酸の両方の組合せを含み得る。
【０１２３】
様々な態様は、配列
2020500926.tif 000058
におけるアミノ酸を含むpHLIPペプチドを含む。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000059
におけるアミノ酸を含む。ある態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000060
におけるアミノ酸を含む。様々な態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000061
におけるアミノ酸を含む。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、配列
2020500926.tif 000062
におけるアミノ酸を含む。任意で、pHLIPペプチドは、本明細書において開示されるアミノ酸配列のN末端および/またはC末端に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸を含んでもよい。
【０１２４】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、以下の配列:
2020500926.tif 000063
におけるアミノ酸を含む。
【０１２５】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24として記載されたアミノ酸配列と100％、99％、または95％未満同一である。いくつかの態様では、pHLIPペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、および24として記載されたアミノ酸配列のそれぞれと100％、99％、または95％未満同一である。ある態様では、pHLIPペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、および24として記載されたアミノ酸配列の1つまたは複数と95〜100％、95〜99％、または90〜95％同一である。いくつかの態様では、pHLIPペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24と同一である。
【０１２６】
ある態様では、pHLIPペプチドは、20〜30個のアミノ酸を含む。例えば、pHLIPペプチドは、約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、pHLIPペプチドの少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、または1〜3、1〜5、もしくは5〜10個のN末端アミノ酸は、pHLIPペプチドが細胞膜に挿入された場合、細胞の外側にある（すなわち、細胞膜の脂質二重層内にない）。様々な態様では、化合物が細胞膜に挿入された場合、そのICG部分は、細胞膜の脂質二重層から少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1〜5、5〜10、5〜15、または10〜15オングストローム（Å）である。
【０１２７】
本主題の局面は、本明細書において開示される化合物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物は、D-グルコース、例えば、約5〜25mMのD-グルコース、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、もしくは25mMのD-グルコースをさらに含む。いくつかの態様では、組成物は、緩衝剤を含み、例えば、組成物は、約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.8、7.9、または8.0のpHを含むように緩衝されている。ある態様では、組成物は、リン酸緩衝食塩水（PBS）を含む。
【０１２８】
本主題の局面は、例えば、口腔に本明細書において開示される化合物を含む組成物を噴霧するまたは投与することによる、口腔がんの検出に関する。例えば、組成物は、口内洗浄剤または口腔スプレーを含み得る。
【０１２９】
身体の臓器または組織におけるがん組織または前がん性組織を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法も提供される:（a）身体の臓器または組織を本明細書において開示される化合物と接触させる工程;（b）化合物をICGの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および（c）化合物から放射される電磁放射線を検出する工程であって、前記放射線の検出ががん性組織または前がん性組織の存在を示す、検出する工程。様々な態様では、前がん性組織および/またはがん組織から放射される放射線のレベルは、（例えば、相当する身体の臓器または組織における対応する正常な非がん性組織に相当する）正常な非がん性組織から放射される放射線のレベルより少なくとも5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、または20倍、25倍またはそれ以上大きい。
【０１３０】
本明細書において提供される化合物、組成物、および方法は、多くの身体の臓器および組織におけるがん性または前がん性組織を検出するのに有用である。いくつかの態様では、身体の臓器は、腎臓または膀胱である。がん性または前がん性組織が検出され得る組織の非限定的な例は、骨、関節、靭帯、筋肉、腱、唾液腺、歯、歯肉、耳下腺、顎下腺、舌下腺、咽頭、食道、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸、および/または回腸）、大腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、腎臓、尿管、膀胱、尿道、卵巣、子宮、卵管、子宮、子宮頸部、膣、精巣、精巣上体、精管、精嚢、前立腺、尿道腺、脳下垂体、松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、心臓、動脈、静脈、毛細血管、リンパ管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、脳、大脳半球、間脳、脳幹、中脳、橋、延髄、小脳、脊髄、心室、脈絡叢、神経、眼、耳、嗅覚、乳房、および皮膚組織を含む。いくつかの態様では、検出される患部がん組織は、肉腫または癌組織である。本明細書において開示される化合物、組成物、および方法を使用して検出され得るがんの非限定的なタイプは、膀胱がん、肺がん、脳がん、黒色腫、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、副腎がん、食道がん、上部消化管がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、キャッスルマン病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛性疾患、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、肝臓がん、悪性中皮腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、およびウィルムス腫瘍を含む。様々な態様では、がんは、固形腫瘍を含む。
【０１３１】
いくつかの態様では、がん性または前がん性組織は、膀胱、上部尿路、リンパ節、乳房、前立腺、頭、首、脳、膵臓、肺、肝臓、または腎臓にある。
【０１３２】
本明細書において提供される化合物、組成物、および方法は、リンパ節などの組織におけるがん細胞（転移性がん細胞など）を検出するのにも有用である。いくつかの態様では、リンパ節は、がんを有する対象に存在する。様々な態様では、リンパ節は、膀胱がん、上部尿路がん、乳がん、前立腺がん、頭頸部がん、脳がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、または腎臓がんを有する対象にある。
【０１３３】
罹患組織（例えば、前がん性またはがん組織）は、対象から得られた、除去された、または提供された組織試料または生検材料において検出され得る。様々な態様では、組織は、組織生検材料を含む。代わりに、またはさらに、罹患組織の存在は、インビボまたはインサイチューで生物学的表面、例えば、皮膚表面、粘膜、または内部部位の表面（例えば、対象内の膀胱の内部表面、結腸の表面、食道の表面、または手術部位の表面）上で検出される。例えば、調べられる組織は、内腔、例えば、管（例えば、腎臓管など）、尿管、腸組織（大腸または小腸）、食道、または気管支管もしくは肺胞管などの気管内腔を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される化合物は、黒色腫組織の存在を検出するために使用される。いくつかの態様では、身体の臓器または組織は、対象に存在する。
【０１３４】
任意で、本明細書において開示される方法は、過剰な非結合または未結合化合物、すなわち細胞膜へのpHLIPペプチド構築物の挿入を介した低pH組織への結合が成されていない化合物を除去するための洗浄工程などの工程を含んでもよい。例えば、ICG蛍光が検出される（例えば、造影される）前に、臓器試料または組織生検材料は、洗浄または灌流され得る。体腔または表面が化合物（例えば、液体または噴霧剤の形態にある）と接触させられた非限定的な例では、腔または表面は、検出または撮像の前に、過剰なICGを除去するために洗い流しまたは洗浄され得る。いくつかの態様では、洗い流し/洗浄は、例えば、食塩水または水などの水溶液を使用して行われる。いくつかの態様では、洗い流し/洗浄は、ICG-pHLIPペプチドを送達するために使用された担体を用いて行われる。
【０１３５】
いくつかの態様では、身体の臓器、組織、または体液（血液など）を本明細書において提供される化合物と接触させる工程は、化合物を対象に投与する工程を含む。例えば、化合物は、インビボで検出される。ある態様では、化合物は、膀胱内注入、静脈内注射、腹腔内注射、局所投与、粘膜投与、または経口投与を介して対象に投与される。例えば、化合物は、対象に挿入される管を介して対象内の部位に投与され得る（例えば、液体として噴霧され得る、適用され得る、送達され得る）。その部位は、例えば、既存の、以前の、もしくは疑わしい腫瘍部位、および/またはがん性もしくは前がん性組織の存在に関して評価されている正常組織とすることができる。いくつかの態様では、管または他のデバイス（例えば、カテーテル、針、吸引器、吸入器、内視鏡、膀胱鏡、アトマイザー、噴霧ノズル、プローブ、シリンジ、ピペット、またはネブライザー）が、例えば、食道、膀胱、または結腸に化合物を送達するために使用される。ある態様では、化合物の蛍光は、内視鏡または膀胱鏡を使用して検出（例えば、造影）される。例えば、内視鏡または膀胱鏡は、（i）ICGの励起波長を含む電磁放射線を放射する、かつ/または（ii）化合物から放射される電磁放射線（すなわち、化合物のICG構成要素）を検出するように構成され得る。いくつかの態様では、化合物は、化合物を含む液体、粉末、または噴霧剤を対象の表面に適用することによって投与される。いくつかの態様では、表面は、手術を介して接近かつ/または露出される対象の身体内の部位を含む。いくつかの態様では、手術は、内視鏡手術または膀胱鏡手術を含む。ある態様では、化合物は、対象の口腔に投与される。
【０１３６】
様々な態様では、化合物から放射される電磁放射線は、エクスビボで検出される。いくつかの態様では、対象からの組織試料（例えば、生検材料または臓器）は、本明細書の化合物を含む組成物を灌流され、浸され、噴霧され、インキュベートされ、かつ/または注射され、その後洗浄され、次いでICG蛍光に関してイメージングされる。
【０１３７】
本主題の局面は、がん性組織または前がん性組織、例えば、本明細書において開示される化合物、組成物、または方法で検出されたがん性組織または前がん性組織を外科的に除去する工程を含む方法に関する。例えば、本明細書において提供される化合物の蛍光は、全てのがん性および/または前がん性組織が除去される、すなわち、手術部位のきれいな（がんを含まない）周縁部が達成されるように手術をガイドするために使用され得る。
【０１３８】
本主題は、既存の病理学的方法よりも速く前がん性およびがん/腫瘍組織を同定するための方法を提供する。例えば、手術中に除去された組織は、例えば、除去された組織の全てが前がん性またはがん性であったどうかおよび/または前がん性もしくはがん性組織が対象に残っているかどうかを決定するために、ICG-pHLIPペプチドと接触させられ、洗浄され、次いで、迅速に造影され得る。代わりに、またはさらに、手術部位は、罹患組織がその部位に残っているかどうかを決定するために（例えば、局所投与または全身投与により）化合物と接触させられ得る。本明細書において提供される方法は、例えば、時間のかかる免疫組織学的染色または訓練を受けた病理学者による評価を必要としない。本明細書において提供される方法が行われ得るスピード（例えば、30分以下）により、臨床医は、例えば、（例えば、より多くの組織を除去するために）手術を続けるべきかどうか、およびどこで手術を続けるべきかを決定するために、進行中の手術中に（例えば、対象または対象からの試料内の）前がん性またはがん性組織の存在または非存在に関して試験することが可能になる。
【０１３９】
がんの発生、再発、および処置も検出かつモニターされ得る。例えば、がんを外科的に除去または処置された（例えば、化学療法または放射線で）対象は、本明細書において開示される化合物および方法を使用してがんに関して試験され得る。例えば、膀胱、結腸、食道、もしくは口腔の内部、および/または粘膜/皮膚表面は、本明細において提供される化合物と接触させられ、次いで、前がん性および/またはがん性組織が発生しているかまたは発生したかを決定するために検出され得る。例えば、化学療法または放射線療法の有効性が評価される場合には、がん組織の量がモニターされ得る。したがって、本明細書において提供されるICG-pHトリガー化合物は、がん処置が開始されるまたは継続されるべきか、および/または異なる処置計画が試みられるべきか（例えば、以前に投与された用量/計画が要望通りにがん組織の量を減少させていない場合）に関する決定を補助するために使用され得る。
【０１４０】
様々なステージのがんを有する多くの異なるタイプの対象が、本明細書において提供される化合物、組成物、および方法を使用して、評価かつ/または処置され得る。しかしながら、様々な態様は、大量の組織（例えば、膀胱または腎臓などの臓器、または例えば、結腸などの臓器の一部）の除去が正当化されるまたは推奨される前のがんの検出および処置に関する。様々な態様では、対象は、浸潤がんまたは転移がんを含まない。ある態様では、尿路上皮癌を有する対象に関して、対象は、高悪性度尿路上皮癌を含まない。いくつかの態様では、対象は、浸潤性高悪性度尿路上皮癌腫を含まない。
【０１４１】
本明細書において開示される各態様は、他の開示された態様のそれぞれに適用可能であると企図される。したがって、本明細書において記載されている様々なエレメントの全ての組合せは、本発明の範囲内である。
【０１４２】
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。
【０１４３】
図面の説明
図面および実施例1〜3において提供されるデータに関して、本明細書において使用される場合、「ICG-Var3」、「ICG-Var3ペプチド」、「ICG-Var3化合物」および「ICG-Var3構築物」という用語は、アミノ酸配列
2020500926.tif 000064
を含むpHLIPペプチドのシステインにICGが共有結合したもの
2020500926.tif 000065
を含むpHLIPフルオロフォア化合物を表し、これは、以下の構造を有する。
2020500926.tif 000066
【０１４４】
「ICG-pHLIPペプチド」という用語は、「ICG-Var3」よりも一般的な用語であり、ICGとpHLIPペプチドとを含む任意のpHLIPフルオロフォア化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図1A〜Bは、10mM D-グルコースを含有するpH7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）中で測定されたICG-Var3化合物の正規化吸光度（A）および蛍光（B）スペクトルを示すグラフである。ICG-Var3化合物の蛍光（790nmの励起波長を有する）は、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）リポソームの存在下で、緩衝液中の放射と比較して約25倍増加される。
【図２】図2A〜Lは、膀胱標本の代表的な白色光（A、D、G、J）、NIR蛍光（B、E、H、K）エクスビボイメージングを示す画像であり、溶血素およびエオシン（HE）染色腫瘍切片（C、F、I、L）が示されており、ICG-Var3イメージング剤による浸潤性高悪性度尿路上皮癌腫（A、B、C）、非浸潤性高悪性度尿路上皮癌腫（D、E、F）、上皮内癌（G、H、I）および異形成（J、K、L）のターゲティングを実証している。診断は、病理学的分析によって確認された。蛍光病変を、病理分析のための位置を同定するために、症例＃11においてマーキングした。
【図３】図3A〜Bは、（A）罹患組織における細胞の表面へのカーゴ分子のpHLIP繋ぎ止めおよび（B）罹患組織における細胞中へのカーゴのpHLIP送達の非限定的な例を示すカーツーンである。
【図４】図4A〜Fは、ICG-Var3化合物での膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像であり、白色光（A、D）、NIR蛍光（B、E）および白色光と蛍光画像の重ね合わせ（C、F）が示されている。
【図５】図5A〜Iは、ICG-Var3化合物での膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像であり、白色光（A、D、G）、NIR蛍光（B、E、H）および白色光と蛍光画像の重ね合わせ（C、F、G）が示されている。
【図６】図6A〜Fは、ICG-Var3化合物での膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像であり、白色光（A、D）、NIR蛍光（B、E）および白色光と蛍光画像の重ね合わせ（C、F）が示されている。
【図７】図7A〜Cは、ICG-Var3化合物での膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像であり、白色光（A）、NIR蛍光（B）および白色光と蛍光画像の重ね合わせ（C）が示されている。
【図８】図8A〜Gは、ICG-Var3化合物での膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像であり、白色光（A、D、F）、NIR蛍光（B、E、G）および白色光と蛍光画像の重ね合わせ（C）が示されている。図FおよびGでは、正常組織の場合が示されており、ICG-Var3化合物によってターゲティングされていない。
【図９】図9A〜Cは、ICG-Var3化合物での膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像であり、白色光（A）、NIR蛍光（B）および白色光と蛍光画像の重ね合わせ（C）が示されている。
【図１０】図10は、ICG-Var3化合物での腎臓組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一組の画像であり、左に腎臓のNIR蛍光画像が示され、右に白色光画像が示されている。根治的腎摘出術後に採取された腎臓に動脈を通して30分間ICG-Var3化合物を灌流して、化合物のIV投与を模倣し、続いて食塩水で洗浄し、エクスビボイメージングした。
【図１１】図11は、ICG-Var3化合物での4T1マウス乳癌のターゲティングを示す画像である。ICG-Var3化合物を静脈内（IV）注射（40μM、100μL）によって投与し、注射の16時間後（h）に造影した。高浸潤性4T1乳癌モデルは、ヒト乳がんのステージIVを模倣する。
【図１２】図12は、ICG-Var3化合物でのヌードマウスにおけるAY27ラット膀胱がんのターゲティングを示す画像である。ICG-Var3化合物をIV注射（40μM、100μL）によって投与し、注射の16時間後に造影した。
【図１３】図13は、ICG-Var3化合物での4T1腫瘍のターゲティングを示す画像である。ICG-Var3化合物をIV注射（20、10および5μM、示されるように）によって投与し、注射の16時間後に造影した。蛍光シグナルは、注射されたICG-Var3化合物用量の減少とともに減少した。
【図１４】図14は、ICG-Var3化合物での4T1腫瘍のターゲティングを示すグラフである（20、10および5μM濃度、静脈内注射、16時間の時点で造影）。ICG-Var3化合物の濃度の減少とともに、腫瘍、肝臓および腎臓における蛍光強度は減少する。蛍光値は、レーザー出力2およびゲイン3で標準的な内視鏡光源/イメージングシステムを使用して記録された画像から得た。
【図１５】図15は、IVおよび腹腔内（IP）注射での10μMのICG-Var3化合物での4T1腫瘍のターゲティングを示す画像である。イメージングは、注射の16時間後に行われた。
【図１６】図16は、20μMのIR800-pHLIP化合物と比較した、20μMのICG-Var3化合物での4T1腫瘍のターゲティングを示す画像である。化合物をIV注射によって投与し、イメージングを注射の16時間後に行った。内視鏡（例えば、標準的な内視鏡光源/イメージングシステム）で検出された腫瘍における蛍光シグナルは、IR800-pHLIP化合物と比較して、ICG-Var3化合物に関してより高い。
【図１７】図17は、20μMのICG-Var3化合物対20μMのIR800-pHLIP化合物での4T1腫瘍のターゲティングを比較するチャートである。化合物をIV注射によって投与し、イメージングを注射の16時間後に行った。内視鏡によって検出された腫瘍における蛍光シグナルは、IR800-pHLIP化合物と比較して、ICG-Var3化合物に関してより高かった。ICG-Var3化合物は、肝臓によって除去され、IR800-pHLIP化合物は腎臓によって除去された。
【図１８】図18は、ICG-Var3化合物での腫瘍周縁部の可視化を示す一組の画像である。腫瘍周縁部は、ICG-Var3化合物によって非常によく明確化されている。さらに、筋組織は、ICG-Var3化合物によってターゲティングされない。
【図１９】図19は、BLOSUM62マトリックスを示す。
【図２０】図20は、ICG-Cys（ICGマレイミドをCys残基とコンジュゲートさせた）のIV投与から5および30分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である。
【図２１】図21は、ICG-Var3 pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である（ICG-Var3 pHLIPは、Var3 pHLIPペプチドを有するICG-Var3化合物である。pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図２２】図22は、ICG-WT pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である（ICG-WT pHLIPは、WT pHLIPペプチドを有するICG-Var3化合物である。pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図２３】図23は、ICG-Hum pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である（ICG-Hum pHLIPは、Hum pHLIPペプチドを有するICG-Var3化合物である。pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図２４】図24は、ICG-NpHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である（ICG-NpHLIPは、NpHLIPペプチドを有するICG-Var3化合物である。pHLIPペプチド配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図２５】図25は、ICG-Cys（ICGマレイミドをCys残基とコンジュゲートさせた）のIV投与から5および30分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である。
【図２６】図26は、ICG-Var3 pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である。
【図２７】図27は、ICG-WT pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である。
【図２８】図28は、ICG-Hum pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である。
【図２９】図29は、ICG-NpHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である。
【図３０】図30は、ICG-Cys、ICG-WT pHLIP、ICG-Var3 pHLIP、ICG-NpHLIPおよびICG-Hum pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に採取されたマウス血液の一組のNIR蛍光写真である。
【図３１】図31は、IR800-Cys（IR800マレイミドをCys残基とコンジュゲートさせた）のIV投与から5および30分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である。
【図３２】図32は、IR800-Var3 pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図３３】図33は、IR800-WT pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの脚の一組のNIR蛍光写真である（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図３４】図34は、IR800-Cys（IR800マレイミドをCys残基とコンジュゲートさせた）のIV投与から5および30分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である。
【図３５】図35は、IR800-Var3 pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図３６】図36は、IR800-WT pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に得られたマウスの耳の一組のNIR蛍光写真である（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図３７】図37は、IR800-Cys、IR800-WT pHLIPおよびIR800-Var3 pHLIPのIV投与から5、30、60、90および120分後に採取されたマウス血液の一組のNIR蛍光写真である（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図３８】図38A〜Cは、ICG-Var3化合物でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）膀胱の蛍光画像、（C）腫瘍周縁部を同定する輪郭線を有する膀胱のカラー画像が示されている［アウトライン/輪郭線は、浸潤性高悪性度移行上皮癌（TCC）を示す］。診断は、病理学的調査によって確認された。4μMの80mL（1.34mg）のICG-Var3をグルコースを含むPBSに入れて膀胱切除手術後に得られたヒト膀胱に15分間滴下注入し、続いて食塩水で洗浄し、切断し、NIR内視鏡でイメージングした（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。標準的な病理学的分析（溶血素およびエオシン染色）を蛍光および非蛍光組織試料に行った。
【図３９】図39A〜Cは、ICG-Var3化合物でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）膀胱の蛍光画像、（C）腫瘍周縁部を同定する輪郭線を有する膀胱のカラー画像が示されている（アウトライン/輪郭線は、上皮内癌を示す）。診断は、病理学的調査によって確認された。4μMの80mL（1.34mg）のICG-Var3をグルコース含むPBSに入れて膀胱切除手術後に得られたヒト膀胱に15分間滴下注入し、続いて食塩水で洗浄し、切断し、NIR内視鏡でイメージングした（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。標準的な病理学的分析（溶血素およびエオシン染色）を蛍光および非蛍光組織試料に行った。
【図４０】図40A〜Cは、ICG-Var3化合物でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）膀胱の蛍光画像、（C）腫瘍周縁部を同定する輪郭線を有する膀胱のカラー画像が示されている。診断は、病理学的調査によって確認された（アウトライン/輪郭線は、浸潤性高悪性度TCCを示す）。4μMの80mL（1.34mg）のICG-Var3をグルコースを含むPBSに入れて膀胱切除手術後に得られたヒト膀胱に15分間滴下注入し、続いて食塩水で洗浄し、切断し、NIR内視鏡でイメージングした（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。標準的な病理学的分析（溶血素およびエオシン染色）を蛍光および非蛍光組織試料に行った。
【図４１】図41A〜Dは、ICG-Var3化合物（4μMの80mLまたは1.34mg）でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）膀胱のカラーおよび蛍光画像の重ね合わせ、（CおよびD）異なる励起レーザー出力で得られた膀胱の蛍光画像が示されている。
【図４２】図42AおよびBは、ICG-Var3化合物でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）食塩水で満たされた膀胱において得られた蛍光画像であり、膀胱鏡検査のような方法が行われる。4μMの80mL（1.34mg）のICG-Var3をグルコースを含むPBSに入れて膀胱切除手術後に得られたヒト膀胱に15分間滴下注入し、続いて食塩水で洗浄し、NIR内視鏡の5mm先端を使用して食塩水で満たされた膀胱をイメージングした（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図４３】図43A〜Cは、IR800-pHLIP化合物でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）膀胱の蛍光画像、（C）腫瘍周縁部を同定する輪郭線を有する膀胱のカラー画像が示されている（アウトライン/輪郭線は、壊死および処置効果を示す）。診断は、病理学的調査によって確認された。4μMの80mL（1.34mg）のIR800-Var3をグルコースを含むPBS似れて膀胱切除手術後に得られたヒト膀胱に15分間滴下注入し、続いて食塩水で洗浄し、切断し、NIR内視鏡でイメージングした（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。標準的な病理学的分析（溶血素およびエオシン染色）を蛍光および非蛍光組織試料に行った。
【図４４】図44A〜Cは、IR800-pHLIP化合物でのヒト膀胱組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）膀胱のカラー画像、（B）膀胱の蛍光画像、（C）腫瘍周縁部を同定する輪郭線を有する膀胱のカラー画像が示されている（アウトライン/輪郭線は、扁平上皮癌（SCC）を伴う高悪性度TCCを示す）。診断は、病理学的調査によって確認された。4μMの80mL（1.34mg）のIR800-Var3をグルコースを含むPBSに入れて膀胱切除手術後に得られたヒト膀胱に15分間滴下注入し、続いて食塩水で洗浄し、切断し、NIR内視鏡でイメージングした（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。標準的な病理学的分析（溶血素およびエオシン染色）を蛍光および非蛍光組織試料に行った。
【図４５】図45は、ICG-Var3化合物（4μMの80mLまたは1.34mg）での上部尿路におけるがん性病変のターゲティングを示すカラーおよび蛍光画像の重ね合わせである（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図４６】図46は、ICG-Var3化合物（4μMの80mLまたは1.34mg）での上部尿路におけるがん性病変のターゲティングを示すカラーおよび蛍光画像の重ね合わせである（pHLIPペプチドアミノ酸配列に関しては、表11を参照されたい）。
【図４７】図47A〜Cは、ICG-Var3化合物（4μMの80mLまたは1.34mg）でのヒト上部尿路組織におけるがん性病変のターゲティングを示す一連の画像である。（A）カラー画像、（B）蛍光画像、（C）腫瘍周縁部を同定する輪郭線を有するカラー画像が示されている（アウトライン/輪郭線は、浸潤性高悪性度TCCを示す）。診断は、病理学的調査によって確認された。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
詳細な説明
蛍光イメージングは、多くの画像ガイド手法に関する医学における適用を有する。長年の例は、術前、術中、術後の設定における血流および組織灌流の評価のための蛍光血管造影法である。蛍光血管造影法は、外科的手技中の変化を追跡するための血管のリアルタイムイメージングを提供し得る。いくつかの例は、脈絡網膜脈管構造を評価するための眼科学（Jia et al.2015 Proc Natl Acad Sci U S A 112（18）: E2395-2402; Campagnoli et al.2016 Retin Cases Brief Rep 10（2）: 175-182）、冠動脈バイパスの開存性を評価するための心胸郭手術（Desai et al.2005 J Am Coll Cardiol 46（8）: 1521-1525; Unno et al.2008 Eur J Vasc Endovasc Surg 35（2）: 205-207; Handa et al.2009 Interact Cardiovasc Thorac Surg 9（2）: 150-154）、脳血行再建術における浅側頭動脈-中大脳動脈バイパス移植片の効果を評価するための神経血管手術（Woitzik et al.2005 J Neurosurg 102（4）: 692-698）、解剖学的肝切除のための触覚セグメントおよびサブセグメントを同定するための肝胆道手術（Aoki et al.2008 World J Surg 32（8）: 1763-1767; Ishizawa et al. 2009 J Am Coll Surg 208（1）: e1-4）、再建手術（Azuma et al. 2008 Plast Reconstr Surg 122（4）: 1062-1067; Lee et al.2010 Plast Reconstr Surg 126（5）: 1472-1481; Lee et al.2010 J Reconstr Microsurg 26（1）: 59-65; Murray et al. 2010 Plast Reconstr Surg 126（1）: 33e-34e）、胆嚢切除および結腸直腸切除（Boni et al. 2015 Surg Endosc 29（7）: 2046-2055）における蛍光の使用を含む。診断適用では、蛍光血管造影法が、外傷の様々な他の効果を評価するために（Schomacker et al.1997 J Trauma 43（5）: 813-819）、脳における血行動態（Kohl-Bareis et al.2002 J Biomed Opt 7（3）: 464-470; Leung et al. 2007 Appl Opt 46（10）: 1604-1614）、関節リウマチの循環特徴（Fischer et al. 2010 Acad Radiol 17（3）: 375-381; Gompels et al. 2010 Rheumatology（Oxford）49（8）: 1436-1446）、筋肉灌流（Habazettl et al.2010 J Appl Physiol（1985）108（4）: 962-967）、やけど（Griffiths et al.2016 Gland Surg 5（2）: 133-149）のイメージングに使用される。さらに、蛍光画像にガイドされる手法は、リンパ節のマッピングおよび可視化、がん性病変のターゲティングおよびマーキング（例えば、可視化または検出）、ならびにインビボおよびエクスビボイメージングによる腫瘍周縁部の評価に用いられる（Jacobs 2008 Ann Surg Oncol 15（5）: 1271-1272; Ankersmit et al.2011 Colorectal Dis 13 Suppl 7: 70-73; Ferroli et al.2011 Acta Neurochir Suppl 109: 251-257; Cahill et al.2012 Surg Endosc 26（1）: 197-204; Mondal et al.2014 Adv Cancer Res 124: 171-211; Burggraaf et al.2015 Nat Med 21（8）: 955-961）。
【０１４７】
いくつかのU.S.Food and Drug Administration（FDA）が承認した蛍光色素が診療において使用されており、裸眼で可視の500〜600nmの波長で光を放射するフルオレセインは、従来より網膜血管造影法で使用され、ICGおよびIR800を含めたNIR蛍光色素（専売のLi-COR Biosciences蛍光色素）も使用されている。NIR色素は、光がその最大の組織透過性を有する、650〜1350nmのいわゆる組織光窓において機能する。透過NIR光が励起（750〜805nm）のために選択され、蛍光が窓内のより長い放射波長で観察され、最も深い組織イメージングを可能にする。
【０１４８】
ICGは、最も広く使用されているNIR蛍光色素である（Desai et al.2005 J Am Coll Cardiol 46（8）: 1521-1525; Woitzik et al.2005 J Neurosurg 102（4）: 692-698; Unno et al. 2008 Eur J Vasc Endovasc Surg 35（2）: 205-207; Marshall et al. 2010 Open Surg Oncol J 2(2）: 12-25; Polom et al.2011 Cancer 117（21）: 4812-4822; Alander et al.2012 Int J Biomed Imaging 2012: 940585; Zelken and Tufaro 2015 Ann Surg Oncol 22 Suppl 3: S1271-1283; Griffith et al.2016 Gland Surg 5（2）: 133-149）。ICGは、1955年にKodak Research Laboratoriesによって写真技術のために開発され、1956年に臨床使用が既に承認されている（Bjornsson et al.1982 Experientia 38（12）: 1441-1442; Bjornsson et al. 1983 J Clin Chem Clin Biochem 21（7）: 453-458）。ICG血管造影は、ICGの最初の臨床適用であった（Choromokos et al. 1969 J Biol Photogr Assoc 37（2）: 100-104; Kogure and Choromokos 1969 J Appl Physiol 26（1）: 154-157; Kogure et al.1970 Arch Ophthalmol 83（2）: 209-214）。1970年代初頭から、ICGは、網膜血管をイメージングする網膜血管造影法のために眼科学において使用された（Flower 1973 Invest Ophthalmol 12（12）: 881-895）。
【０１４９】
静脈内注射後、ICGは、間質への漏出は最小限で、血漿タンパク質に急速に結合する。半減期時間は、2.5分である（Benson and Kues 1978 Phys Med Biol 23（1）: 159-163; Desmettre et al.2000 Surv Ophthalmol 45（1）: 15-27）。既知の代謝産物はない。ICGは、肝血管新生および機能に依存して、修飾なしに肝臓によって急速に抽出され、注射から約8分後に肝臓によってほぼ排他的に排出され、胆汁中にコンジュゲートされていないように見える（Alander et al。2012 Int J  Biomed Imaging 2012: 940585）。血管外に注射された場合、ICGは、タンパク質に結合し、リンパ中に見出され、通常15分以内に最も近い排出リンパ節に到達し、1〜2時間後に、局所リンパ節に結合し、マクロファージに沈着される（Tajima et al. 2010 Ann Surg Oncol 17（7）: 1787-1793; Korn et al.2014 Plast Reconstr Surg 133（4）: 914-922）。ICGの静脈内注射用量は、0.5 mg/ml/kgから2.0 mg/ml/kg体重の範囲で典型的に変動する。5 mg/kg体重の高用量でのヒトにおける著しい毒性効果は観察されておらず（Alander et al.2012 Int J Biomed Imaging 2012: 940585）、長年の目立たない臨床経験を考慮すると慢性的毒性は、適度であるにちがいない。
【０１５０】
FDA承認フルオレセインおよびNIR色素に加えて、メチレンブルー（Winer et al.2010 Ann Surg Oncol 17（4）: 1094-1100; van der Vorst et al. 2012 World J Gastrointest Surg 4（7）: 180-184; Verbeek et al.2013 J Urol 190（2）: 574-579）ならびに5-アミノレブリン酸（5-ALA）およびその誘導体などの特定の適用において使用される他のFDA承認蛍光分子はわずかしかない。米国ではCysviewと称される5-ALAおよびヘキサアミノレブリン酸塩酸塩は、蛍光プロトポルフィリン、PpIXの作製および細胞内蓄積を誘導するヘム前駆体である。5-ALAは、主に悪性神経膠腫などの脳腫瘍を手術中に同定するために神経外科手術の分野で適用されている（Stummer et al. 2006 Lancet Oncol 7（5）: 392-401; Roberts et al.2011 J Neurosurg 114（3）: 595-603）。Cysviewは、50 ml（400 μmol）に溶解された100 mgのCysview剤が約1時間膀胱内注入によって局所的に適用される青色光膀胱鏡検査を使用して、膀胱におけるがん性病変の蛍光可視化に使用される。青色光膀胱鏡検査は、白色光膀胱鏡検査と比較して、患者におけるがん性病変の可視化および無再発生存を改善することが示された（Jocham et al.2008 Eur Urol 53（6）: 1138-1148; Santos Cortes et al.2011 Arch Esp Urol 64（1）: 18-31; Lerner et al. 2012 Urol Oncol 30（3）: 285-289; Burger et al.2013 Eur Urol 64（5）: 846-854; Rink et al. 2013 Eur Urol 64（4）: 624-638）。
【０１５１】
とりわけ、膜挿入ペプチドおよびフルオロフォア（例えば、ICG）を含むpHLIPフルオロフォア化合物が本明細書において提供され、すなわち、ここで、フルオロフォアが膜挿入ペプチドに共有結合している。ICGを含むpHLIPフルオロフォア化合物は、代わりに「ICG-pHLIPペプチド」と称され得る。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、循環細胞および/または体腔（血管、動脈、静脈、毛細血管、尿路、尿道、腎臓管、気道、または肺胞など）の内側を覆う細胞に挿入される。いくつかの態様では、pHLIPフルオロフォア化合物は、細胞膜への挿入時に増加した蛍光強度を有する。本主題の非限定的な局面は、中性のpH（例えば、pH7.0）または血液（例えば、pH7.35〜7.45のpHを有する正常血液）などの体液のpHで細胞膜に挿入される膜挿入ペプチドの使用に関する。
【０１５２】
ICG-pHLIPペプチド、すなわち、ICGとpHLIPペプチドとを含む化合物が本明細書に含まれ、ここで、ICGは、pHLIPペプチドに共有結合している。本主題の局面は、ICG-pHLIPペプチド化合物の予想外の特性に関する。驚くべきことに、（i）ICG-pHLIPペプチドは、患部（例えば、腫瘍）組織を選択的にターゲティングかつマーキングし、（ii）細胞膜への挿入時に増加した蛍光強度を有する。
【０１５３】
いくつかの態様では、フルオロフォアは、ICGである。遊離ICG（すなわち、別の分子にコンジュゲートしていないICG）は、細胞膜の疎水性脂質二重層に対する親和性を有し得るが、対象の血液に注射された場合、急速に排除される。したがって、高および/または反復用量の遊離ICGが画像診断技術に必要とされる。しかしながら、膜挿入ペプチドにコンジュゲートされた場合、ICGは、循環において非常により長く持続する。様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物の一部として投与されるICGの量は、ICGが遊離ICGとして投与された場合に投与されたであろう量よりも（遊離ICGのモル数に換算して）10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％低い。いくつかの態様では、pHLIPフルオロフォア化合物の一部であるICGは、相当する条件下で同じ量で投与された場合、遊離ICGよりも（遊離ICGのモル数に換算して）少なくとも25％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、または1000％長く、血液中で検出可能である。
【０１５４】
いかなる科学理論にも縛られることなく、ICGを含む膜挿入化合物は、赤血球および/または循環器系の内側を覆う細胞などの循環細胞の細胞膜にICGを繋ぎ止めることによって、（例えば、腎臓および/または肝臓によって）循環から除去されるICGの速度を減少させる。細胞膜へのICGの繋ぎ止めは、非共有結合性かつ可逆的である。さらに、後述するように、ICGの蛍光は、それが脂質二重層（細胞膜など）に近接近している場合に増加し、より少ないICGでより多くの蛍光が達成されることを可能にする。したがって、典型的に使用される遊離ICGの用量と比較して、より低い用量の膜挿入ペプチドコンジュゲートICGが（例えば、診断アプローチのために）使用され得る。本明細書において提供される膜挿入化合物は、遊離ICGよりも高いシグナル対ノイズも提供し得る。血液および心臓血管構造に関する態様に関して、中性または中性付近のpHで細胞膜間に挿入される膜挿入ペプチドが使用され得る。したがって、最小限に酸性、中性、またはわずかに塩基性のpHで挿入され得る、酸性組織を検出するのに適していない場合があるpHトリガー化合物は、本明細書において開示される様々な態様において有用である。いくつかの態様では、ICGを含む膜挿入化合物は、遊離ICGの少なくとも約5、10、20、25、50、または100倍の（例えば、血中）半減期を有する。
【０１５５】
診断方法のためにICGを単独で使用することの不利な点は、血液中のタンパク質（アルブミンなど）および循環リン脂質への迅速な結合、低い組織透過性、およびがん性組織をターゲティングすることができないことを含む。しかしながら、ICG-pHLIPペプチドは、がん性組織に容易に透過して、例えば、外科的除去のために腫瘍組織を特異的かつ効果的に標識する。驚くべきことに、ICG-pHLIPペプチド構築物中のICGの存在は、pHLIPペプチドが腫瘍組織に蓄積し、腫瘍細胞の膜に特異的に挿入される能力を崩壊させない。
【０１５６】
ICG-pHLIPペプチドが細胞（例えば、腫瘍または酸性組織における細胞、または赤血球などの循環細胞）に挿入される場合、そのICG成分は、細胞膜の表面から少し離れて（すなわち、細胞膜の脂質二重層の外に）保持され、ここで、ICGの蛍光が、膜と直接結合するICG単独とは対照的に、がん細胞を検出するために使用され得る。ICG構成要素は、ICG-pHLIPペプチドのpHLIPペプチド構成要素に結合しているので、ICG構成要素は、結合していない場合のように直接細胞膜とまたは周囲の分子と自由に相互作用することはない。したがって、例えば、細胞膜に対するICGの位置と向きの両方は、人工的かつ間接的である。驚くべきことに、ICG-pHLIPペプチドのICG構成要素は、（例えば、腫瘍または転移巣における）がん細胞の表面に繋ぎ止められた場合、劇的に増加した蛍光を示す。例えば、繋ぎ止められていないICGと比較して、少なくとも約10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、50％、75％、100％、2倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍またはそれ以上の蛍光強度増加が達成される。ある態様では、細胞膜への結合時のICG-pHLIPペプチドの蛍光の増加は、腫瘍/バックグラウンドシグナルを著しく増加させる。
【０１５７】
ICGは、細胞膜の疎水性脂質二重層に対する親和性を有し得るが、この親和性は、pH特異的ではない。驚くべきことに、（例えば、血管に沿った、および正常組織における）細胞膜に対するICGの非特異的親和性は、pHLIPペプチドが浸潤すること、ならびに前がん性およびがん性組織を特異的かつ選択的にタグ付けすることを妨げない。
【０１５８】
ICGと細胞膜との間の接続は、pHトリガーペプチドへのその結合を介しており、非天然かつ間接的である。様々な態様では、pHトリガーペプチドは、例えば、一続きのアミノ酸を介して、細胞膜からICGを引き離し得る。例えば、実施例1において使用される非限定的ICG-pHLIPペプチド（ICG-Var3化合物）は、細胞膜からICGを引き離すN末端アミノ酸を有するpHLIPペプチドを含む。
【０１５９】
引離しは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドテザーを含み得る。SEQ ID NO:3は、細胞膜から約11ÅだけICGを引き離す約7個のN末端アミノ酸を含む。以下の配列の下線を引いた部分は、潜在的な膜貫通部分に相当し、斜体のアミノ酸は、7個のN末端アミノ酸を示す。
2020500926.tif 000067
【０１６０】
脂質二重層の外側の7個のN末端アミノ酸のランダムコイル立体配置を仮定し、残基当たりの輪郭長を4.3Åとすると（Dietz, H.Rief, M.Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103, 1244-1247; Carrion-Vazquez et al., Nat Struct Biol 2003, 10, 738-743; Oesterhelt et al., Science 2000, 288, 143-146）、コイルの平均末端間長さは、11Åと推定され得る。したがって、ICGがSEQ ID NO:3の配列におけるアミノ酸に結合している場合、ICGは、約11Åの長さであるアミノ酸の柔軟なリンカーの末端にある。驚くべきことに、pHLIPペプチドのN末端にコンジュゲートしたICGの蛍光は、細胞膜への挿入時に約25倍増加することが見出された。
【０１６１】
しかしながら、細胞膜からのICGの引離しは、必要ではない。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、細胞膜からICGを引き離さない。ある態様では、pHLIPペプチドのN末端アミノ酸配列は、コンジュゲートしたICGが細胞膜から約10Å、9Å、8Å、7Å、6Å、5Å、4Å、3Å、2Å、1Å、1〜5Å、1〜10Å、または5〜10Å未満となる、またはあるいは細胞膜と接触しているような長さまたは構造を有する。代わりに、pHLIPペプチドのN末端アミノ酸配列は、コンジュゲートしたICGが細胞膜から少なくとも約1Å、2Å、3Å、4Å、5Å、6Å、7Å、8Å、9Å、10Å、11Å、12Å、13Å、14Å、15Å、または20Åであるような長さまたは構造を有する。（細胞膜からのIGCの距離にかかわらず）ICGと細胞膜の間接的な結合時の蛍光の増加は、驚くべきである。
【０１６２】
膀胱がんは、5番目に多いがんである。タイムリーな診断と適切な早期管理プロトコルは、患者の予後を改善するために最も重要なものである。本主題の局面は、本明細書において提示された非限定的なデータに関し、これは、正常組織をターゲティングすることなく、膀胱悪性腫瘍の効率的なpH依存性近赤外イメージングを示すための最初の研究において作成された。本明細書において提示されたデータは、ICGと、pHLIPペプチド（pHLIPペプチドである）とを含むコンジュゲート体ががん性および前がん性組織に結合し、それらを同定することを示す。近赤外蛍光色素（ICG）構築物とコンジュゲートしたpH低挿入ペプチド（pHLIPペプチド）（ICG-Var3などのICG-pHLIPペプチド）は、エクスビボ膀胱内投与後にヒト膀胱腫瘍を特異的に染色する予測臨床マーカーとしての使用に適している。ターゲティングは、早期診断を提供し、尿路上皮癌の内視鏡的および根治的外科切除の予後を改善し得る、様々なイメージングプローブの送達を可能にする。さらに、pHLIPなどのpHLIPペプチドによるがん組織への治療用分子の送達は、膀胱がんの新規なターゲティングされた処置の機会をもたらすかもしれない。
【０１６３】
重要な医学的目的は、前がん性組織または上皮内癌などの初期病変の同定であるが、これは、このステージでの診断が処置の頻度を減らすことになり、患者の健康を増し、支出を減らすことが期待されるからである。膀胱がんの各タイプおよびステージは、異なるタイプの処置を必要とする。高い再発頻度、処置上のコスト、および長期間の活発なモニタリングの必要性により、膀胱がんは、米国における最も高価ながんの1つになり、生涯の内視鏡的追跡調査および処置から健康管理システムへの大きな経済的負担がかかる。患者は、高い罹患率ならびに化学療法、放射線および根治手術に関連する合併症を患っている（Mariotto et al.（2011）J Natl Cancer Inst 103（2）: 117-128）。したがって、前述のように、腫瘍のタイムリーな診断および適切な管理プロトコルは、処置コストの削減および患者のライフスタイルの改善に非常に重要である。膀胱がん病変の早期検出の進歩は、タイムリーで成功的な処置、再発の防止、および膀胱機能保存の見込みを高める可能性がある。
【０１６４】
尿路上皮癌を含めたがんは、エピジェネティックな調節の変化、点変異、遺伝子欠失、重複および染色体再編を含めた、ゲノムにおける複数の変化と関連している。これらの変化は不均一であり、腫瘍内および腫瘍間のがん細胞の表面での特定のバイオマーカーの過剰発現の不均一性をもたらす。不均一性は、治療薬のターゲティングされた送達のための細胞表面バイオマーカーの使用における成功を著しく制限する。一方、複数の研究により、新生物細胞は、代謝活性の増加により酸性環境を作り出すことが明らかになった（Damaghi et al.（2013）Front Physiol 4: 370）。高度に酸性の微小環境への適応は、無血管性前浸潤性腫瘍から悪性浸潤性癌腫への移行における重大な段階である（Gillies et al.（2012）Nat Rev Cancer 12（7）: 487-493; Estrella et al.（2013）Cancer Res 73（5）: 1524-1535; Gatenby et al.（2006）Cancer Res 66（10）: 5216-5223）。したがって、酸性度は、耐性細胞株の選択に左右されない腫瘍ターゲティングのための普遍的なバイオマーカーを提供し得る（Bailey et al.（2012）Adv Pharmacol 65: 63-107）。pHLIPペプチド（pHLIPペプチドなど）は、細胞外pHが低い場合、細胞膜を横切って挿入されることによって（Weerakkody et al.（2013）Proc Natl Acad Sci U S A 110（15）: 5834-5839）、インビトロおよびインビボで酸性細胞を特異的にターゲティングする膜結合ペプチドのクラスである（Andreev et al.（2014）Front Physiol 5: 97）。蛍光色素とコンジュゲートしたpHLIPペプチド（pHLIPペプチドなど）は、様々な動物腫瘍モデルにおいて（（Weerakkody et al.（2013）Proc Natl Acad Sci U S A 110（15）: 5834-5839; Reshetnyak et al.（2011）Mol Imaging Biol 13（6）: 1146-1156; Adochite et al.（2014）Mol Pharm 11（8）: 2896-2905; Cruz-Monserrate et al.（2014）Sci Rep 4: 4410）、およびヒト生検頭頸部試料において（Luo et al.（2014）Cancer Prev Res（Phila）7（10）: 1035-1044; Luo et al.（2012）J Biomed Opt 17（10）: 106006）、新生物組織から正常組織を区別するために使用されてきた。
【０１６５】
様々な実施態様では、ICG-pHLIPペプチド（ICG-Var3またはICG-pHLIPなど）は、低い細胞外pHをターゲティングし、エクスビボでヒト膀胱癌における悪性病変の可視化を可能にする。以下の非限定的な例では、根治手術後に得られた膀胱切除標本を緩衝化されていない食塩水で直ちに灌注し、ICG-Var3構築物の溶液を滴下注入し、インキュベートし、すすいだ。続いて膀胱を開いてイメージングし、蛍光スポットをマーキングし、ICG-Var3イメージングと白色光病理学的評価間の相関を確立するために標準的な病理学的分析を行った。膀胱病変の正確なターゲティングは、97％の感度で達成された。特異性は100％であるが、以前の経尿道的切除または化学療法からの壊死組織のターゲティングが偽陽性とみなされる場合、80％に減少する。ICG-Var3イメージング剤は、筋肉浸潤性と非筋肉浸潤性の両方の高悪性度尿路上皮癌をマーキングした。上皮内癌（CIS）は、11の症例で正確に診断された一方、4例の症例のみが白色光を使用して見られ、ICG-Var3化合物を用いた画像診断は、膀胱がんの改善された早期診断を提供し、新しい処置代替法も可能にし得る。
【０１６６】
ICG-Var3化合物は、サブタイプにかかわらず、高い感度および特異性を有する尿路上皮癌の早期検出のための有望なツールである。検出は、疾患の状況のモニタリングおよび/または外科的除去のための病変のマーキングに使用され得る。
【０１６７】
対象におけるがんのモニタリングおよび/または診断は、例えば、ICG-pHLIPペプチドが新生物に関して試験される組織に特異的に結合するかどうかを評価することによって、様々ながんに関して行われ得る。いくつかの態様では、組織は、対象中にあり、化合物は、組織に直接適用されるか、または全身的に（または、例えば、皮下または腹腔内に）注射される。非限定的な例では、カテーテルなどの管を使用して、本明細書において開示される化合物を膀胱、食道、胃、および結腸組織に送達する。化合物は、例えば、噴霧剤、ミスト、液滴、液体、または粉末の形態で投与され得る。いくつかの態様では、化合物は経口投与され、次いで、例えば内視鏡または膀胱鏡で検出される。本主題の化合物を含む口内洗浄剤および噴霧剤は、口腔内のがんまたは前がん性病変を検出するために使用され得る。本明細書において開示される化合物はまた、例えば、子宮頸がん組織を検出するために子宮頸部に直接適用され得る。例えば、皮膚がんに関して、化合物は、皮膚表面に適用され得る。ある態様では、組織は、生検材料および/または外科的に除去された臓器もしくはその一部などの試料である。
【０１６８】
ICG-Var3イメージング剤などのICG-pHLIPペプチドは、膀胱におけるがん性病変の診断および切除を改善する。本明細書において提供される方法、化合物、組成物、システム、およびキットは、膀胱がんに関する再発率を減らし、患者の予後を改善し、医療費を下げるであろう。さらに、ターゲティングされたイメージングでの成功は、膀胱腫瘍細胞への治療用分子のpHLIPペプチド（pHLIPなど）送達をもたらし、膀胱がんのターゲティングされた処置の機会を生み出す。様々な態様では、ICG-pHLIPペプチド構築物（ICG-Var3構築物など）は、それが腫瘍微小環境の一般的特性である腫瘍酸性度をターゲティングするので、一般的に適用可能なイメージング剤である。蛍光pHLIPペプチドによる原発腫瘍および転移巣のターゲティングは、リンパ腫、黒色腫、膵臓、乳房および前立腺トランスジェニックマウスモデルならびにヒト組織（エクスビボで染色された膀胱、腎臓、乳房および頭/首）を含めたヒト、マウスおよびラット腫瘍の15を超える種類において示された。ICGは、組織透過性に乏しく、血中のタンパク質に結合することが知られているが、試みられたことはない。驚くべきことに、ICGと、pHLIPペプチド（例えば、pHLIPペプチド）とを含むコンジュゲート体は、がん組織を特異的にターゲティングすることができる。さらに、ICGと、pHLIPペプチドとを含むコンジュゲート体は、特に、他のフルオロフォアを含むコンジュゲート体と比較して、予想外の特性を有する。例えば、ICG蛍光は、それをpHLIPペプチドが膜に繋ぎ止めた場合、約25倍増強される。これは、腫瘍の検出だけでなく、がん性組織と非がん性組織間の境界の同定も促進する。細胞膜への繋ぎ止め時の蛍光強度の増加は、pHLIPペプチドに結合している他の色素/フルオロフォアでは観察されておらず、増強された腫瘍/正常組織蛍光比を可能にする。
【０１６９】
本明細書において非限定的な例に提示されたデータは、ICG-Var3および
2020500926.tif 000068
が多数の臨床的手法における蛍光血管造影法に有用であることを示している。遊離ICGと比較した利点は、著しい。様々な態様では、イメージング時間は、現在使用されている遊離ICGに関する2〜5分から、ICG-Var3（またはICG-WT）では、2〜3時間に延長される。現在、いくつかの手法の間、遊離ICGは、10回以上注射される。
【０１７０】
いくつかの態様では、ICG-pHLIP（ICG-Var3など）は、1回のみ注射され、（例えば、遊離ICGが再注射される場合に生じる）臨床的な流れのいかなる妨害も生み出すことなく、手法全体を通して造影され得る。したがって、臨床的手法における工程または動作の流れまたは順序は、遊離ICGよりもICG-pHLIPの方が乱されることが少ない。ICG-pHLIPは、蛍光血管造影法および臨床的手法の他のものにおける遊離ICGの使用と比較して、重要な利点を有し、改善を提供する。
【０１７１】
潜在的なICG-pHLIP（ICG-Var3など）使用の3つの非限定的な例は、以下の通りである:
1.  ICG-pHLIP（ICG-Var3など）の静脈内投与後の血管造影法:イメージングが血管および血液灌流の可視化のためのICG-pHLIPの静脈内注射後5分から最大2〜3時間以内に行われる。ICG-Var3は、多数の臨床的手法において使用され得る。
2.  ICG-pHLIP（ICG-Var3など）の静脈内投与後の酸性罹患組織のターゲティング（例えば、その後の外科的切除のための同定）:イメージングは、リンパ節における前がん性病変、腫瘍、がん細胞、虚血性心筋、アテローム硬化性プラーク、感染の部位などの酸性罹患組織のターゲティングの可視化のためのICG-pHLIPの静脈内注射後4時間を超えるまたは翌日などのより遅い時点で行われる。態様では、罹患組織と非罹患組織間の最良のコントラスト（例えば、最適な時点での）を観察するための、ICG-pHLIPからの血中クリアランスおよび隣接する非罹患組織のクリアランスまでの時間がより長い。
3.  ICG-pHLIP（ICG-Var3など）の局所投与後の酸性疾患組織のターゲティング（例:その後の外科的切除のための同定）:イメージングは、膀胱がんを検出するための膀胱への滴下注入、口腔がんを検出するための口のすすぎ、皮膚がんを検出するための皮膚への噴霧、子宮頸がんを検出するための子宮頸部への噴霧、結腸がんを検出するための結腸への噴霧、および肺がんを検出するための肺気道路への噴霧または吸入などの、ICG-pHLIPの局所投与後に行われる。薬剤は、創傷または感染の部位（それらの組織も酸性である）の可視化などの非がん性適用にも使用され得る。例えば、薬剤は、様々なデバイス、例えば、整形外科具、義装具、徐放用パッチ、移植片、および身体におけるステントなどの心血管デバイスの移植に関連する感染部位の可視化に使用される。ICG-pHLIPの局所適用を含むある態様では、イメージングは、ICG-pHLIPの局所適用から10〜60分後に行われる。
【０１７２】
pHトリガーポリペプチド
pHトリガーポリペプチド（pHLIPペプチド、「pHトリガーpH（低）挿入ペプチド」としても知られる）は、中性pHでは脂質二重層への挿入がなく、細胞膜と弱く相互作用する水溶性膜ペプチドであるが、酸性pH（例えば、約7.0、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5.0、4.75、4.5、4.25、4.0、3.75、3.5、3.25、または3.0未満のpH）では細胞膜に挿入され、安定な膜貫通アルファヘリックスを形成する。
【０１７３】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の遺伝的にコードされたアミノ酸を含む。代わりに、またはさらに、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の非遺伝的にコードされたアミノ酸を含む。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のD-アミノ酸を含む。
【０１７４】
ある態様では、pHLIPペプチドは、フルオロフォアが結合した官能基を含んだ。様々な態様では、pHLIPペプチドの官能基は、アミノ酸、アジド修飾アミノ酸、またはアルキニル修飾アミノ酸を含んだ。いくつかの態様では、pHLIPペプチドの官能基は、遊離スルフヒドリル（SH）、または第一級アミンを含んだ。ある態様では、1つまたは複数のフルオロフォアが官能基に結合していた。
【０１７５】
様々な態様では、pHLIPペプチド（例えば、pHLIPペプチドと、フルオロフォアとを含む化合物内にあるpHLIPペプチド）は、低pHで、ある正味の中性電荷、および中性または高pHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水、例えば蒸留水中で約7、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、または4.0未満のpHで、ある正味の中性電荷を有し、約7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、または7.75のpHで、ある正味の負電荷を有する。ある態様では、pHLIPペプチドは、水中で約7未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約6.9未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約6.8未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約6.7未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約6.6未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約6.5未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。様々な態様では、pHLIPペプチドは、約6.0未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約5.5未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。ある態様では、pHLIPペプチドは、水中で約5.0未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。様々な態様では、pHLIPペプチドは、水中で約4.5未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、水中で約4.0未満のpHで、ある正味の中性電荷、および約7のpHで、ある正味の負電荷を有する。
【０１７６】
いくつかの態様では、pHLIPペプチド（例えば、pHLIPペプチドと、フルオロフォアとを含む化合物内にあるpHLIPペプチド）は、水中で約7、7.25、7.5、または7.75のpHで、ある正味の負電荷を有する。代わりに、またはさらに、pHLIPペプチドは、対数尺度で約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、または7未満の酸解離定数（pKa）を有し得る。
【０１７７】
様々な態様では、プロトン化可能アミノ酸は、約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、または7未満のpKaを有するアミノ酸である。ある態様では、プロトン化可能アミノ酸は、約6.5未満のpKaを有するアミノ酸である。いくつかの態様では、プロトン化可能アミノ酸は、約5.5未満のpKaを有するアミノ酸である。ある態様では、プロトン化可能アミノ酸は、約4.5未満のpKaを有するアミノ酸である。様々な態様では、プロトン化可能アミノ酸は、約4.0未満のpKaを有するアミノ酸である。いくつかの態様では、プロトン化可能アミノ酸は、カルボキシル基を含む。
【０１７８】
pHLIPフルオロフォア化合物は、様々なサイズのpHLIPペプチドを含み得る。例えば、pHLIPペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50個またはそれ以上のアミノ酸、8〜15個のアミノ酸、8〜50個のアミノ酸、8〜40個のアミノ酸、8〜30個のアミノ酸、8〜20個のアミノ酸、8〜10個のアミノ酸、約20個未満のアミノ酸、9、10、11、12、13、14、もしくは15個未満のアミノ酸、10個のアミノ酸、9個のアミノ酸、または8個のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様では、pHLIPペプチドにおける1、2、3、4、または5個未満のアミノ酸は、水中で7、7.25、7.5、または7.75のpHで、ある正味の正電荷を有する。ある態様では、pHLIPペプチドは、水中で約7、7.25、7.5、または7.75のpHで、ある正味の正電荷を有する0個のアミノ酸を含む。
【０１７９】
ある態様では、pHLIPペプチドは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の芳香族アミノ酸を有する。例えば、芳香族アミノ酸は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、および人工芳香族アミノ酸の1つまたは複数とすることができる。
【０１８０】
様々な態様では、本主題のpHLIPペプチドは、少なくとも1つのプロトン化可能アミノ酸を有する。例えば、pHLIPペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはガンマ-カルボキシグルタミン酸である1つのプロトン化可能アミノ酸;またはアスパラギン酸、グルタミン酸、およびガンマカルボキシグルタミン酸の1つまたは複数を含む少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のプロトン化可能アミノ酸を含み得る。いくつかの態様では、プロトン化可能アミノ酸は、人工アミノ酸である。非限定的な例では、pHLIPペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のプロトン化可能アミノ酸を有し、ここで、プロトン化可能アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ガンマカルボキシグルタミン酸、またはその任意の組合せを含む。
【０１８１】
本主題は、少なくとも1つの人工プロトン化可能アミノ酸などの人工アミノ酸を有するpHLIPペプチドを提供する。様々な態様では、人工プロトン化可能アミノ酸は、少なくとも1、2、3、4または5つのカルボキシル基を含む、かつ/またはpHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のカルボキシル基を有し得る。いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の人工アミノ酸を有する。非限定的な例では、pHLIPペプチドの全てのアミノ酸は、人工アミノ酸である。ある態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のD-アミノ酸を含み得る。
【０１８２】
本主題の様々な実施態様は、システイン誘導体、アスパラギン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、フェニルアラニン誘導体、チロシン誘導体、またはトリプトファン誘導体である少なくとも1つの人工アミノ酸を有するpHLIPペプチドに関する。例えば、pHLIPペプチドは、D-エチオニン、セレノ-L-シスチン、S-（2-チアゾリル）-L-システイン、およびS-（4-トリル）-L-システインからなる群より選択されるシステイン誘導体;アスパラギン酸のN-フェニル（ベンジル）アミノ誘導体であるアスパラギン酸誘導体;γ-カルボキシ-DL-グルタミン酸、4-フルオロ-DL-グルタミン酸、および（4S）-4-（4-トリフルオロメチル-ベンジル）-L-グルタミン酸からなる群より選択されるグルタミン酸誘導体;（S）-N-アセチル-4-ブロモフェニルアラニン、N-アセチル-2-フルオロ-DL-フェニルアラニン、N-アセチル-4-フルオロ-DL-フェニルアラニン、4-クロロ-L-フェニルアラニン、DL-2,3-ジフルオロフェニルアラニン、DL-3,5-ジフルオロフェニルアラニン、3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン、3-（3,4-ジメトキシフェニル）-L-アラニン、4-（ヒドロキシメチル）-D-フェニルアラニン、N-（3-インドリルアセチル）-L-フェニルアラニン、p-ヨード-D-フェニルアラニン、α-メチル-DL-フェニルアラニン、4-ニトロ-DL-フェニルアラニン、および4-（トリフルオロメチル）-D-フェニルアラニンからなる群より選択されるフェニルアラニン誘導体;α-メチル-DL-チロシン、3-クロロ-L-チロシン、3-ニトロ-L-チロシン、およびDL-o-チロシンからなる群より選択されるチロシン誘導体;および/または5-フルオロ-L-トリプトファン、5-フルオロ-DL-トリプトファン、5-ヒドロキシ-L-トリプトファン、5-メトキシ-DL-トリプトファン、または5-メチル-DL-トリプトファンからなる群より選択されるトリプトファン誘導体を含有し得る。
【０１８３】
様々な態様では、pHLIPペプチドは、少なくとも8個の連続したアミノ酸を有し、ここで、pHLIPペプチドの8個の連続したアミノ酸の少なくとも2、3、4、5、または6個は非極性であり、pHLIPペプチドの少なくとも8個の連続したアミノ酸の少なくとも1個または2個はプロトン化可能である。例えば、pHLIPペプチドは、非極性である8〜10個の連続したアミノ酸の少なくとも2、3、4、5、または6個、およびプロトン化可能である少なくとも1個または2個のアミノ酸を含めた、8〜10個の連続したアミノ酸を有し得る。
【０１８４】
本開示の局面は、フルオロフォアに結合しているpHLIPペプチドを提供する。様々な実施態様では、pHLIPペプチドは、共有結合によってリンカー部分および/またはフルオロフォアに直接結合している。いくつかの非限定的な例では、共有結合は、エステル結合、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、硫黄とセレン原子間の結合、または酸に不安定な結合である。
【０１８５】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドとリンカー部分および/またはフルオロフォア間の共有結合は、クリック反応によって形成された結合である。クリック反応の非限定的な例は、アジドとアルキン、アルキンと歪みジフルオロオクチン、ジアリール歪みシクロオクチンと1,3-ニトロン、シクロオクテン、トランス-シクロアルケン、またはオキサノルボルナジエンと、アジド、テトラジン、またはテトラゾール、活性化アルケンまたはオキサノルボルナジエンとアジド、歪みシクロオクテンまたは他の活性化アルケンとテトラジン、または紫外線によって活性化されたテトラゾールとアルケン間の反応を含む。
【０１８６】
いくつかの実施態様は、共有結合によってリンカー化合物に結合しているpHLIPペプチドを提供し、ここで、リンカー化合物は、共有結合によってフルオロフォアに結合している。非限定的な例では、pHLIPペプチドとリンカー化合物間の共有結合および/またはリンカー化合物とフルオロフォア間の共有結合は、ジスルフィド結合、2つのセレン原子間の結合、硫黄とセレン原子間の結合、またはクリック反応によって形成された結合である。
【０１８７】
様々な態様では、フルオロフォアは、（a）少なくとも約0.5、1、1.5、2、2.5、5、6、7、8、9、もしくは10キロダルトン（kDa）、または（b）約0.5、1、1.5、2、2.5、5、6、7、8、9、もしくは10kDa未満の質量を有する。非限定的な例では、pHLIPペプチドは、少なくとも約15kDaの質量を有するフルオロフォアに結合している。フルオロフォアは、例えば、極性または非極性とすることができる。
【０１８８】
様々な非限定的な例では、フルオロフォアは、蛍光色素または蛍光タンパク質を含む。
【０１８９】
様々な態様では、pHLIPフルオロフォア化合物（またはpHLIPフルオロフォア化合物内のpHLIPペプチド）は、通常のpHでの親和性と比較して、低pHで膜脂質二重層に対してより高い親和性を有する。例えば、親和性は、pH5.0でpH8.0よりも少なくとも5倍高い。いくつかの態様では、親和性は、pH5.0でpH8.0よりも少なくとも10倍高い。いくつかの態様では、膜脂質二重層とのpHトリガー化合物の結合/会合/分配は、より高いpH（例えば、pH≧6.5または7.0）と比較して、低pH（例えば、pH＜6.5または7.0）でより強い。
【０１９０】
いくつかの態様では、1個または複数個の非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンを含む。いくつかの態様では、1個または複数個の極性アミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミンを含む。いくつかの態様では、非極性アミノ酸は、1-メチル-トリプトファンなどの人工アミノ酸である。
【０１９１】
様々な態様では、非極性アミノ酸は、≧0.5kcal/molの側鎖溶媒和エネルギーを有するものとして定義される。20の一般的な天然アミノ酸に関する溶媒和エネルギー（ΔGXcorr）の値は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wimley WC, Creamer TP＆White SH（1996）Biochemistry 35, 5109-5124（以下、Wimley et al.1996）またはMoon and Fleming,（2011）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101: 10174-10177によって決定されるように公知である。以下の表は、天然のアミノ酸に関する例示的な側鎖溶媒和エネルギーを提供する。
【０１９２】
（表１）AcWL-X-LLにおける20の天然アミノ酸の側鎖（X）の溶媒和自由エネルギー
非極性残基は太字で示され、
2020500926.tif 000069
を有する残基として定義される。
2020500926.tif 000070
【０１９３】
Wimley et al.1996, page 5116の表1におけるデータから計算された、グリシンに対する20の天然アミノ酸の残基溶媒和自由エネルギー。自由エネルギーは、隣接残基領域の閉じ込め（本文を参照されたい）およびグリシンの異常な特性（本文を参照されたい）に関して補正された。モル分率単位で計算された残基溶媒和自由エネルギー。参照として仮想グリシン（GLY＊）を使用して（Wimley et al.1996の本文を参照されたい）、表1またはWimley et al.1996, page 5116における自由エネルギーから計算されたAcWL-X-LLペプチドの文脈におけるX残基に関する残基溶媒和自由エネルギー。
2020500926.tif 000071
【０１９４】
これらの「補正された」値は、宿主ペプチドの非極性ASAにおけるX依存性変化を説明する。ArgおよびLysに関する値を側鎖とカルボキシル基間のイオン相互作用が生じないpH1で測定された実験的自由エネルギーから計算した。
2020500926.tif 000072
は、中程度のサイズの隣接残基によって閉じ込められた残基の溶媒和エネルギーの最良推定値である。
【０１９５】
遺伝的にコードされたアミノ酸および例示的な非遺伝的にコードされたアミノ酸を表2において以下に列挙する。
【０１９６】
いくつかの態様では、pHLIPペプチドは、1つまたは複数のシステイン残基を含む。システイン残基は、例えば、チオール結合を使用して、カーゴのコンジュゲーションの点として機能する。カーゴをpHLIPペプチドに結合させる他の手段は、エステルおよび/または酸に不安定な結合を含む。切断不可能な共有化学結合も、（pHLIPペプチドなどの）膜挿入ペプチドにフルオロフォアを永久に固定するために作られ得る。
【０１９７】
本明細書において提供される膜挿入化合物は、診断およびイメージングに、または（例えば、血管もしくは腎臓組織構造または機能を評価するための）研究試薬/ツールとして有用である。本主題の様々な実施態様は、pHトリガー化合物と、そこに結合した薬学的に許容される検出可能マーカーとを含む診断コンジュゲート体に関する。例示的な検出可能マーカーは、イメージング剤、色素、ナノ粒子、または他の検出可能な標識を含む。様々な態様では、膜挿入化合物自体は、特に、有効量の膜挿入化合物が使用される場合、無毒性である。
【０１９８】
単量体として働くpHLIPペプチドは、孔を形成することなく細胞膜を横切って挿入される。pHLIPペプチド-ナノテクノロジープラットフォームは、例えば、治療薬またはイメージング剤が腫瘍細胞の表面に繋ぎ止められる固形腫瘍への治療薬またはイメージング剤のpH選択的ターゲティング、および/または切断可能な結合を介してpHLIPペプチドのC末端に結合しているカーゴ分子の細胞質送達での腫瘍細胞のpH選択的ターゲティングに使用され得る。非限定的な例では、カーゴ分子は、細胞質において切断されるS-S結合を介してpHLIPペプチドのC末端に結合している。成功裏に注射される分子の中には、有機色素、ファロイジン（1kDaを超える極性環状ペプチド）、ならびに12塩基長および18塩基長のペプチド核酸（PNA）がある。カーゴ分子が切断不可能な結合を介してpHLIPペプチドのN末端に結合している場合、pHLIPペプチドは、カーゴ分子を酸性組織の細胞の表面に繋ぎ止め得る。膜へのpHLIPペプチドのpH選択的挿入および折り畳みは、腫瘍および炎症部位を含めた酸性組織をインビボでターゲティングするために使用されてきた。膜へのpHLIPペプチドの侵入および細胞内への分子の移行の経路は、エンドサイトーシスによってではなく、細胞受容体との相互作用によって、または細胞膜における孔の形成によって媒介される。いくつかの態様では、pHLIPペプチド挿入は、Asp残基などの残基のプロトン化と関連しており、これは、細胞膜へのペプチドの挿入を直ちに（数秒以内に）トリガーするpHLIPペプチド疎水性の増加につながる。挿入は、エネルギーの放出を伴い、これは、細胞不透過性カーゴ分子を膜の脂質二重層を通して細胞内に移動させるのに使用され得る。
【０１９９】
タンパク質、特に、血漿タンパク質、および膜とのペプチドの相互作用は、中性pHでのペプチドの薬物動態に影響を与える。pHLIPペプチドは、血液中での長期の循環を実証し、これは、それらが中性および高pHでは膜表面に弱く結合する能力と一致し、小さいペプチドに予想される腎臓による急速なクリアランスを妨げる。
【０２００】
本主題の局面は、「変異体3」または「Var3」pHLIPペプチドに関する。Var3 pHLIPペプチドは、配列LFPTXTLLにおける一続きのアミノ酸を含み、ここで、Xは、アスパラギン酸である。Var3 pHLIPペプチド配列の非限定的な例は、以下を含む。
2020500926.tif 000073
【０２０１】
本明細書において例示されている、またはそうでなければ開示されるpHLIPペプチドの変異体は、当技術分野においてよく理解されている置換技術を使用して設計され得る。本明細書において例示されるpHLIPペプチドも、以下に考察される変異体も、本明細書において開示される主題の全範囲を限定しない。
【０２０２】
非限定的例示ペプチドの非限定的変異体
本明細書において提供される膜挿入化合物は、膜挿入ペプチド（pHLIPペプチドまたはpHトリガーされないペプチド）、例えば、本明細書において提供される非限定的な例であるpHLIPペプチドまたはその変異体のいずれか1つを含み得る。本明細書において例示されている、またはそうでなければ開示される膜挿入ペプチドの変異体は、当技術分野においてよく理解されている置換技術を使用して設計され得る。本明細書において例示される膜挿入ペプチドも、以下に考察される変異体も、本明細書において開示される主題の全範囲を限定しない。本明細書において開示される特定の膜挿入の変異体の非限定的な例は、開示される特定の膜挿入ペプチドの逆アミノ酸配列を有するペプチドを含む。例えば、配列WARYADWL（SEQ ID NO:34）を含む膜挿入ペプチドの開示は、配列LWDAYRAW（SEQ ID NO:35）を含む膜挿入ペプチドの開示も提供する。
【０２０３】
本主題の局面は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の保存的アミノ酸置換から生じる膜挿入ペプチドに関する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、（例えば、本明細書において開示されるSEQ ID NOに対する位置に相当する）pHトリガーペプチド配列中の残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換され得る。ある態様では、保存的アミノ酸置換は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸を使用してなされ得る。
【０２０４】
（表２）L-異性体、D-異性体、アルファ-異性体、ベータ-異性体、グリコール-、およびメチル-修飾体を含めた、遺伝的にコードされたおよび例示的な非遺伝的にコードされたアミノ酸
2020500926.tif 000074
2020500926.tif 000075
2020500926.tif 000076
【０２０５】
（表３）L-異性体、D-異性体、アルファ-異性体、およびベータ-異性体を含めたプロトン化可能残基およびそれらの置換の非限定的な例
2020500926.tif 000077
【０２０６】
（表４）遺伝的にコードされたアミノ酸置換の例
2020500926.tif 000078
【０２０７】
（表５）pHLIPペプチドの異なる群に属する推定上の膜挿入配列の非限定的な例
各プロトン化可能残基（下線で示された）は、表3からのその置換によって置換される得る。各非極性残基は、表4からのその遺伝的にコードされたアミノ酸置換、および/または表2からの非遺伝的にコードされたアミノ酸置換によって置換され得る。
2020500926.tif 000079
【０２０８】
（表６）pHLIP配列の非限定的な例
システイン、リジン、アジド修飾アミノ酸、またはアルキニル修飾アミノ酸が、カーゴおよびリンカーとのコンジュゲーションのためにペプチドのN末端（最初の6残基）またはC末端（最後の6残基）部分で組み入れられ得る。
2020500926.tif 000080
2020500926.tif 000081
2020500926.tif 000082
上記の表では、「Am」は、C末端アミド化を意味し、これは、保護されたC末端である、すなわち、C末端に遊離COOH基がなく、C末端に電荷がない。「Ac」は、N末端アシル化を意味し、これは、保護されたN末端である、すなわち、N末端に遊離NH2基がなく、N末端に電荷がない。
【０２０９】
（表７）リンカーおよびその構成要素の非限定的な例
2020500926.tif 000083
【０２１０】
天然アミノ酸での置換は、BLOcks SUbstitution Matrix（BLOSUMマトリックス）を使用して代わりにまたは追加的に特徴付けられ得る。BLOSUMマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックスであり、これは、Styczynski et al.（2008）“BLOSUM62 miscalculations improve search performance”Nat Biotech 26（3）: 274-275に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。BLOSUM62マトリックスを図19に示す。
【０２１１】
BLOSUM62マトリックス上で少なくとも4とスコア付けされた置換は、本明細書において「クラスI置換」と称され、BLOSUM62マトリックス上で3とスコア付けされた置換は、本明細書において「クラスII置換」と称され、BLOSUM62マトリックス上で2または1とスコア付けされた置換は、本明細書において「クラスIII置換」と称され、BLOSUM62マトリックス上で0または-1とスコア付けされた置換は、本明細書において「クラスIV置換」と称され、BLOSUM62マトリックス上で-2、-3、または-4とスコア付けされた置換は、本明細書において「クラスV置換」と称される。
【０２１２】
本出願の様々な態様は、本明細書において例示される膜挿入ペプチドと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のクラスI、II、III、IV、もしくはV置換か、または本明細書において例示される膜挿入ペプチドと比較して、クラスI、II、III、IV、および/もしくはV置換の任意の組合せのうちの任意の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上を有する、膜挿入ペプチド（例えば、pHLIPペプチド）を含む。
【０２１３】
本主題の局面は、本明細書において例示される膜挿入ペプチドと比較して、1、2、3、4、5つまたはそれ以上のアミノ酸挿入または欠失を有する膜挿入ペプチドにも関する。
【０２１４】
D-アミノ酸
標準的なα-アミノ酸のうち、グリシンを除く全てのものは、L-またはD-アミノ酸と称される2つの光学異性体のどちらかで存在し得、これらは、互いの鏡像である。L-アミノ酸がリボソーム内での翻訳中にタンパク質中に見出されるアミノ酸の全てを表す一方、D-アミノ酸は、翻訳および小胞体への移行後の酵素翻訳後修飾によって作製される一部のタンパク質中に見出される。D-アミノ酸は、細菌のペプチドグリカン細胞壁の豊富な構成要素であり、D-セリンは、脳内の神経伝達物質として作用する。アミノ酸立体配置に関するLおよびDの慣例は、アミノ酸自体の光学活性ではなく、むしろそのアミノ酸がそこから合成され得るグリセルアルデヒドの異性体の光学活性を表す（D-グリセルアルデヒドは、右旋性であり、L-グリセルアルデヒドは、左旋性である）。
【０２１５】
完全にまたは部分的にD-アミノ酸から構築された膜挿入ペプチドは、L-膜挿入ペプチドに勝る利点を有する。例えば、D-膜挿入ペプチドは、それらの左旋性対応物よりも遅く生分解され、これは、活性の増強およびより長い生物学的半減期につながる（参照により本明細書に組み入れられるSela and Zisman, 1997 FASEB J, 11: 449-456）。したがって、D-膜挿入ペプチドは、本明細書において開示される方法において使用され得る。L-アミノ酸のみ、またはD-アミノ酸のみ、またはD-アミノ酸とL-アミノ酸の両方の組合せを含む膜挿入ペプチドが本明細書に含まれる。
【０２１６】
インドシアニングリーン
非浸潤近赤外（NIR）蛍光イメージング色素ICGは、心拍出量および肝血流および機能を決定するための眼科用血管造影法に関してUnited States Food and Drug administration（FDA）によって承認されている。この色素は、固形腫瘍の検出、リンパ節の局在化のため、ならびに再建手術中の血管造影法、網膜および脈絡膜脈管構造の可視化、および光線力学的療法のためにがん患者においても使用されている。がんの診断法および治療学において、ICGは、イメージング色素と温熱療法剤の両方として使用され得る。
【０２１７】
ICGは、NIR吸収特性（800nm付近のピーク吸収）を有し、可視域における吸収はほとんどないトリカルボシアニン型色素であり、したがって低い自己蛍光、組織吸光度を示し、NIR波長（700〜900nm）で散乱する。
【０２１８】
コンジュゲートしていないICGは、以下の構造を含み得る。
2020500926.tif 000084
【０２１９】
ICGのCAS Registry Numberは、3599-32-4である。
【０２２０】
ICGは、例えば、本明細書において開示されるpHLIPなどのペプチドへのその結合を促進するために修飾され得る。市販の（例えば、Intrace Medical SA, Lausanne, Switzerlandからの）修飾ICG化合物の非限定的な例は、ICG N-スクシンイミジルエステル（ICG-NHSエステル）、ICG-CBT、ICG-マレイミド、ICG-アジド、ICG-アルキン、およびICG-PEG-NHSエステルを含む。
【０２２１】
ICG色素のスクシンイミジルエステル（NHS）は、最適なコンジュゲート体を開発するための機会を提供する。スクシンイミジルエステル活性基は、様々な基質（抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬など）上の第一級アミン（R-NH2）にICG色素を選択的に結合するための効率的かつ便利な方法を提供する。スクシンイミジルエステルは、チロシンおよびヒスチジンを含めた、芳香族アミン、アルコール、およびフェノールとの反応性が非常に低い。ICG-NHSエステルの例は、以下の特徴を含む:
励起クラス:近赤外、NIR
励起/放射最大（nm）:790/830
分子量:828.04g.mol-1
式:C49H53N3O7S
構造:
2020500926.tif 000085
【０２２２】
上記構造の丸で囲まれた部分は、リンカー部分を示す。
【０２２３】
マレイミド活性基は、中性（生理学的）pHでいかなる活性化もなく様々な基質（抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、小分子薬など）上のスルフヒドリル基（遊離チオール、R-SH）にICG色素を選択的に結合するための効率的かつ便利な方法を提供する。マレイミドは、アミン、アルコール、およびフェノール（チロシンおよびヒスチジンなど）との反応性が非常に低く、ヒスチジンおよびメチオニンと反応せず、非常に高い標識化選択性を提供する。ICG-マレイミドの例は、以下の特徴を含む:
励起クラス:近赤外、NIR
励起/放射最大（nm）:790/830
分子量:853.09g.mol-1
式:C51H56N4O6S
構造:
2020500926.tif 000086
【０２２４】
上記構造の丸で囲まれた部分は、リンカー部分を示す。
【０２２５】
2-シアノベンゾチアゾール標識化手法は、2-シアノベンゾチアゾール部分と任意の1,2-または1,3-アミノチオール（例えば遊離またはN末端システイン）との間の生体適合性クリック反応に基づく。このクリック反応は、一般的に使用されているStaudingerライゲーションよりも3桁速く、有用なコンジュゲート体を提供し得る。シアノベンゾチアゾール（CBT）活性基は、追加の活性化なく様々な基質（抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬など）上の1,2-または1,3-アミノチオールにICG色素を部位選択的に結合するための効率的かつ便利な方法を提供する。アミノチオールでの標識化反応は、単純なチオールでの反応よりも選択的である。CBTクリックケミストリーは、それが非常に選択的であるので、全ての他の生体適合性クリック反応（アジド、アルキン、トリフェニルホスフィン、テトラジンなど）と一緒に使用され得る。さらに、ICG-CBT標識化手法では、（NHSエステルとは異なり）ここに脱離基がないので、副生成物は形成されない。ICG-CBTの例は、以下の特徴を含む:
励起クラス:近赤外、NIR
励起/放射最大（nm）:790/830
分子量:931.38g.mol-1
式:C55H57N5O5S2
構造:
2020500926.tif 000087
【０２２６】
上記構造の丸で囲まれた部分は、リンカー部分を示す。
【０２２７】
ICG-アジドは、クリックケミストリーを介してアルキンタグ付き生体分子（タンパク質、脂質、核酸、糖など）を化学選択的に標識するために使用され得る。ICG-アジドの例は、以下の特徴を含む:
励起クラス:近赤外、NIR
励起/放射最大（nm）:790/830
分子量:931.21g.mol-1
式:C53H66N6O7S
2020500926.tif 000088
【０２２８】
上記構造の丸で囲まれた部分は、リンカー部分を示す。
【０２２９】
ICG-アルキンは、Cu（II）触媒クリック反応を介してアジドタグ付き分子を標識するために使用され得る。反応は、化学選択的かつ生体適合性である。ICG-アルキンの例は、以下の特徴を含む:
励起クラス:近赤外、NIR
励起/放射最大（nm）:790/830
溶解性:DMSO、DMF、アセトニトリル、メタノール
分子量:767.38g.mol-1
式:C48H53N3O4S
【０２３０】
シアニンフルオロフォア
シアニンフルオロフォアは、本明細書において任意で「シアニン色素」と称され得る。シアニン色素は、非局在化電荷を有する2つの窒素原子間にポリメチン架橋を含有する分子である:
2020500926.tif 000089
【０２３１】
それらの構造により、シアニンは、しばしば100,000Lmol-1cm-1を超える著しく高い吸光係数を有する。異なる置換基は、光吸収波長、光安定性、および蛍光などの発色団の特性を制御することを可能にする。例えば、吸光度および蛍光波長は、ポリメチン架橋長の選択によって制御され得る。より長いシアニンは、近赤外領域までのより高い吸光度および放射波長を有する。シアニン色素の非限定的な例は、非スルホン化シアニン、およびスルホン化シアニンを含む。
【０２３２】
利用可能な非スルホン化色素は、例えば、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、およびCy7.5を含む。Cy（登録商標）は、「シアニン」を表し、最初の数字は、インドレニン基間の炭素原子数を特定する。インドレニンではなくオキサゾール誘導体であるCy2は、この規則からの例外である。接尾辞「.5」がベンゾ縮合シアニンに関して追加される。ある態様では、構造の多様性は、分子の蛍光特性を変化させること、およびいくつかのフルオロフォアで可視およびNIRスペクトルの最も重要な部分を包含することを可能にする。
【０２３３】
Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、およびCy7.5の構造は以下の通りである。
2020500926.tif 000090
2020500926.tif 000091
2020500926.tif 000092
【０２３４】
スルホン化シアニンは、いくつかの態様では、水相への色素分子の溶解を促進する追加のスルホ基を含む。様々な態様では、荷電スルホネート基は、色素分子および高標識コンジュゲート体の凝集を減少させる。
【０２３５】
スルホン化シアニンの非限定的な例は、スルホ-Cy3、スルホ-Cy5、およびスルホ-Cy7を含む。
2020500926.tif 000093
【０２３６】
IR800
IR800マレイミドの構造は、以下の通りである。
2020500926.tif 000094
【０２３７】
IR800は、IRDye（登録商標）800CW Infrared Dyeとしても公知であり、LI-COR Biosciences（Nebraska, United States）から入手可能である。
【０２３８】
クリック反応
本明細書に記載の化合物（例えば、pHLIPペプチドおよび複数のpHLIPペプチドを含む化合物）は、化合物とカーゴ化合物間、リンカーとカーゴ化合物間、pHLIPペプチドとリンカー間、および2つのpHLIPペプチド間の共有結合を含み得る。態様では、共有結合は、環化付加反応（例えば、「クリック」反応）などの生体直交反応によって形成されている。そのような化合物の調製に適した例示的な生体直交反応は、例えば、Zheng et al., “Development of Bioorthogonal Reactions and Their Applications in Bioconjugation,” Molecules, 2015, 20, 3190-3205に記載されている。ペプチド前駆体の多様性および商業的利用可能性は、本明細書に記載の多機能実体を構築するのに魅力的である。例えば、ペプチドとカーゴ化合物間の共有結合を含むpHトリガーペプチド化合物の調製に適した例示的で非限定的なクリック反応が本明細書に記載されている。
【０２３９】
ヒュスゲン環状付加
クリック反応のカテゴリーは、アジドへのアセチレンのヒュスゲン1,3-双極性付加を含む。例えば、スキーム1を参照されたい。
スキーム1
2020500926.tif 000095
【０２４０】
態様では、CARGOは、本明細書に記載の任意のカーゴ化合物（フルオロフォアなど）に相当する。
【０２４１】
態様では、L1は、独立して、結合、-NRA-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL1は、R1と結合して、置換もしくは非置換8員シクロアルキニレン環を形成するか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２４２】
態様では、R1は、水素、置換もしくは非置換アルキルであるか、またはR1は、L1と結合して、置換もしくは非置換8員シクロアルキニレン環を形成するか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２４３】
態様では、L1は、R1と結合して、置換または非置換8員シクロアルキニレン環を形成する。態様では、8員シクロアルキニレン環は、非置換である。態様では、8員シクロアルキニレン環は、2つのフルオロ置換基（例えば、アルキニルへのα）を含む。
【０２４４】
態様では、L2は、独立して、結合、-NRB-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである、またはL2は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２４５】
態様では、各RAおよびRBは、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【０２４６】
態様では、ヒュスゲン環状付加は、スキーム2およびスキーム3に記載のものである。
スキーム2
2020500926.tif 000096
【０２４７】
態様では、CARGOは、本明細書に記載の任意のカーゴ化合物（フルオロフォアなど）に相当する。
【０２４８】
態様では、L1は、独立して、結合、-NRA-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２４９】
態様では、L2は、独立して、結合、-NRB-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL2は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２５０】
スキーム3
2020500926.tif 000097
【０２５１】
態様では、CARGOは、本明細書に記載の任意のカーゴ化合物（フルオロフォアなど）に相当する。
【０２５２】
態様では、L1は、独立して、結合、-NRA-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２５３】
態様では、R3、R4、およびR5の1つは、カーゴ化合物であり、他の2つの変数は、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【０２５４】
態様では、R3'、R4'、およびR5'の1つは、pHトリガーペプチドであり、他の2つの変数は、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【０２５５】
アルケンとの環状付加
態様では、化合物Fまたは化合物F'として表され得るある活性化アルケン（例えば、シス-もしくはトランス-シクロオクテンまたはオキサノルボルナジエンなどの歪みアルケン）は、例えば、アジド（スキーム4）、テトラジン（スキーム5）、またはテトラゾール（スキーム6）との環化付加反応を受け得る。
スキーム4
2020500926.tif 000098
【０２５６】
態様では、CARGOは、本明細書に記載の任意のカーゴ化合物（フルオロフォアなど）に相当する。
【０２５７】
態様では、L1は、独立して、結合、-NRA-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２５８】
態様では、L2は、独立して、結合、-NRB-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL2は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２５９】
スキーム5
2020500926.tif 000099
【０２６０】
態様では、CARGOは、本明細書に記載の任意のカーゴ化合物（フルオロフォアなど）に相当する。
【０２６１】
態様では、L1は、独立して、結合、-NRA-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２６２】
態様では、L2は、独立して、結合、-NRB-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL2は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２６３】
スキーム6
2020500926.tif 000100
【０２６４】
態様では、CARGOは、本明細書に記載の任意のカーゴ化合物（フルオロフォアなど）に相当する。
【０２６５】
態様では、L1は、独立して、結合、-NRA-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL1は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２６６】
態様では、L2は、独立して、結合、-NRB-、O、S、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであるか、またはL2は、本明細書に記載の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２６７】
態様では、各R6は、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【０２６８】
態様では、本発明は、本明細書に記載の化合物のいずれか（例えば、化合物A、A'、B、B'、C、C'、D、D'、E、E'、F、F'、G、G'、H、またはH'のいずれか;式（I-A）、（I-B）、（I-C）、（I-D）、（II-A）、（II-B）、（II-C）、（II-D）、（III-A）、（III-B）、（IV-A）、（IV-B）、（IV-C）、（IV-C'）、（IV-D）、（IV-D'）、（IV-E）または（IV-F）のいずれか1つの化合物;式（A4）〜（A20）のいずれか1つなどの式（A）による化合物;またはSEQ ID NO:1〜4のいずれかの化合物）、またはその薬学的に許容される塩を特徴とする。
【０２６９】
態様では、本発明は、本明細書に記載の化合物のいずれか（例えば、化合物A、A'、B、B'、C、C'、D、D'、E、E'、F、F'、G、G'、H、またはH'のいずれか;式（I-A）、（I-B）、（I-C）、（I-D）、（II-A）、（II-B）、（II-C）、（II-D）、（III-A）、（III-B）、（IV-A）、（IV-B）、（IV-C）、（IV-C'）、（IV-D）、（IV-D'）、（IV-E）または（IV-F）のいずれか1つの化合物;式（A4）〜（A20）のいずれか1つなどの式（A）による化合物;またはSEQ ID NO:1〜4のいずれかの化合物）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）またはその薬学的に許容される塩を特徴とする。
【０２７０】
「アルキル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、非環状直鎖（すなわち、非分枝鎖）もしくは分枝鎖、またはその組合せを意味し、これは、完全に飽和、一または多価不飽和とすることができ、指定された数（すなわち、C1〜C10は、1〜10個の炭素を意味する）の炭素原子を有する二価および多価ラジカルを含み得る。飽和炭化水素ラジカルの例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、（シクロヘキシル）メチル、例えば、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの同族体および異性体などの基を含むが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、1つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例は、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-（ブタジエニル）、2,4-ペンタジエニル、3-（1,4-ペンタジエニル）、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、ならびに高級同族体および異性体を含むが、これらに限定されない。アルコキシは、酸素リンカー（-O-）を介して分子の残りの部分に結合しているアルキルである。
【０２７１】
「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、-CH2CH2CH2CH2-で例示されるがこれに限定されないアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、1〜24個の炭素原子を有する。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、8以下の炭素原子を一般に有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【０２７２】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、少なくとも1つの炭素原子および少なくとも1つのヘテロ原子（例えば、O、N、P、S、SeおよびSiからなる群より選択され、ここで、窒素、セレン、および硫黄原子は、任意で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意で四級化されていてもよい）からなる安定な直鎖もしくは分岐鎖、またはその組合せを意味する。ヘテロ原子O、N、P、S、Se、およびSiは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に配置され得る。例は、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N（CH3）-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、- -CH2-CH2、-S（O）-CH3、-CH2-CH2-S（O）2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si（CH3）3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N（CH3）-CH3、-O-CH3、-O-CH-2-CH3、および-CNを含むが、これらに限定されない。例えば、-CH2-NH-OCH3など、最大2つのヘテロ原子が連続していてもよい。
【０２７３】
同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-で例示されるがこれに限定されないヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子はまた、鎖終端の一方または両方を占め得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の向きは、連結基の式が書かれている方向によって暗示されない。例えば、式-C（O）2R'-は、-C（O）2R'-と-R'C（O）2-の両方を表す。上記のように、本明細書において使用される場合、ヘテロアルキル基は、-C（O）R'、-C（O）NR'、-NR'R''、-OR'、-SeR'、-SR'、および/または-SO2R'などのヘテロ原子を通して分子の残りの部分に結合している基を含む。「ヘテロアルキル」が列挙され、続いて-NR'R''などの特定のヘテロアルキル基が列挙される場合、ヘテロアルキルおよび-NR'R''という用語は、重複性でも相互に排他的でもないことが理解されよう。むしろ、特定のヘテロアルキル基は、明確さを付加するために列挙されている。したがって、「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書において、-NR'R''などの特定のヘテロアルキル基を除外するものとして解釈されるべきではない。
【０２７４】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式バージョンを意味する。さらに、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合している位置を占め得る。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルを含むが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例は、1-（1,2,5,6-テトラヒドロピリジル）、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルを含むが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」は、単独でまたは別の置換基の一部として、それぞれシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。
【０２７５】
「アリール」という用語は、特に明記しない限り、一緒に縮合している（すなわち、縮合環アリール）または共有結合している単環または多環（好ましくは1〜3環）とすることができる多価不飽和芳香族炭化水素置換基を意味する。縮合環アリールは、縮合環の少なくとも1つがアリール環である、一緒に縮合した複数の環を表す。「ヘテロアリール」という用語は、1〜4つのヘテロ原子（例えば、N、O、およびSから選択され、ここで、窒素原子および硫黄原子は、任意で酸化されていてもよく、窒素原子は、任意で四級化されていてもよい）を含有するアリール基（または環）を表す。したがって、「ヘテロアリール」という用語は、縮合環ヘテロアリール基（すなわち、一緒に縮合した複数の環、ここで、縮合環の少なくとも1つがヘテロ芳香環である）を含む。5,6-縮合環ヘテロアリーレンは、1つの環が5員を有し、他の環が6員を有し、少なくとも1つの環がヘテロアリール環である、一緒に縮合した2つの環を表す。同様に、6,6-縮合環ヘテロアリーレンは、1つの環が6員を有し、他の環が6員を有し、少なくとも1つの環がヘテロアリール環である、一緒に縮合した2つの環を表す。6,5-縮合環ヘテロアリーレンは、1つの環が6員を有し、他の環が5員を有し、少なくとも1つの環がヘテロアリール環である、一緒に縮合した2つの環を表す。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合され得る。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例は、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルを含む。上記のアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれに関する置換基は、下記の許容される置換基の群より選択される。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は、単独でまたは別の置換基の一部として、それぞれアリールおよびヘテロアリールに由来する二価のラジカルを意味する。
【０２７６】
縮合環ヘテロシクロアルキル-アリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル-ヘテロアリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル-シクロアルキルは、シクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル-ヘテロシクロアルキルは、別のヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル-アリール、縮合環ヘテロシクロアルキル-ヘテロアリール、縮合環ヘテロシクロアルキル-シクロアルキル、または縮合環ヘテロシクロアルキル-ヘテロシクロアルキルは、それぞれ独立して、非置換であるか、または本明細書に記載の置換基の1つまたは複数で置換され得る。スピロ環は、隣接する環が単一の原子を通して結合している2つ以上の環である。スピロ環内の個々の環は、同一でも異なっていてもよい。スピロ環中の個々の環は、置換されていても置換されていなくてもよく、一組のスピロ環内の他の個々の環とは異なる置換基を有し得る。スピロ環内の個々の環に関する可能な置換基は、スピロ環の一部ではない場合に同じ環に関する可能な置換基である（例えば、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環の置換基）。スピロ環は、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンとすることができ、スピロ環基内の個々の環は、1つのタイプの全ての環を有することを含めた、直前のリストのいずれかとすることができる（例えば、全ての環は置換ヘテロシクロアルキレンであり、ここで、各環は、同じまたは異なる置換ヘテロシクロアルキレンとすることができる）。スピロ環系に言及する場合、ヘテロスピロ環は、少なくとも1つの環がヘテロ環であり、各環が異なる環とすることができるスピロ環を意味する。スピロ環系に言及する場合、置換スピロ環は、少なくとも1つの環が置換されており、各置換基は、任意で異なっていてもよいことを意味する。
【０２７７】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）のそれぞれは、示された基の置換および非置換形態の両方を含む。ラジカルの各タイプに関する好ましい置換基が以下に提供される。
【０２７８】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカルの置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含めた）は、ゼロから（2m'＋1）にわたる数で-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC（O）R'、-C（O）R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC（O）NR'R''、-NR''C（O）R'、-NR'-C（O）NR''R'''、-NR''C（O）2R'、-NR-C（NR'R''R'''）＝NR''''、-NR-C（NR'R''）＝NR'''、-S（O）R'、-S（O）2R'、-S（O）2NR'R''、-NRSO2R'、-CN、および-NO2から選択されるが、これらに限定されない様々な基の1つまたは複数とすることができ、式中、m'は、そのようなラジカル中の炭素原子の総数である。R'、R''、R'''、およびR''''は、それぞれ好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール（例えば、1〜3つハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、またはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が1つを超えるR基を含む場合、例えば、R基のそれぞれは、1つを超えるこれらの基が存在する場合に各R'、R''、R'''、およびR''''基であるように、独立して選択される。R'およびR''が同じ窒素原子に結合している場合、それらは、窒素原子と結合されて、4、5、6、または7員環を形成し得る。例えば、-NR'R''としては、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。置換基の上記考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（例えば、-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば、-C（O）CH3、-C（O）CF3、-C（O）CH2OCH3など）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。
【０２７９】
アルキルラジカルに関して記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基に関する置換基は、多様であり、例えば、ゼロから芳香環系上の開放原子価（open valence）の総数までの範囲の数で-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC（O）R'、-C（O）R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC（O）NR'R''、-NR''C（O）R'、-NR'-C（O）NR''R'''、-NR''C（O）2R'、-NR-C（NR'R''R'''）＝NR''''、-NR-C（NR'R''）＝NR'''、-S（O）R'、-S（O）2R'、-S（O）2NR'R''、-NRSO2R'、-CN、-NO2、-R'、-N3、-CH（Ph）2、フルオロ（C1-C4）アルコキシ、およびフルオロ（C1-C4）アルキルから選択され、ここで、R'、R''、R'''、およびR''''は、好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、および置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が1つを超えるR基を含む場合、例えば、R基のそれぞれは、1つを超えるこれらの基が存在する場合、各R'、R''、R'''、およびR''''基であるように、独立して選択される。
【０２８０】
環に関する置換基（例えば、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレン）は、環の特定の原子上ではなく環上の置換基として表され得る（一般に浮遊置換基と称される）。そのような場合、置換基は、環原子のいずれかに結合していてもよく（化学原子価の法則に従って）、縮合環またはスピロ環の場合、縮合環またはスピロ環の1員に関連して表される置換基（単環上の浮遊置換基）は、縮合環またはスピロ環のいずれか上の置換基とすることができる（多環上の浮遊置換基）。置換基が環に結合しているが特定の原子には結合しておらず（浮遊置換基）、置換基に関する下付き文字が1より大きい整数である場合、複数の置換基が同じ原子、同じ環、異なる原子、異なる縮合環、異なるスピロ環上にあり得、各置換基は、任意で異なっていてもよい。分子の残りの部分への環の結合の点が単一原子に限定されない場合（浮遊置換基）、結合点は、化学原子価の法則に従いながら、環の任意の原子とすることができ、縮合環またはスピロ環の場合、縮合環またはスピロ環のいずれかの任意の原子とすることができる。環、縮合環、またはスピロ環が1つまたは複数の環ヘテロ原子を含有し、環、縮合環、またはスピロ環が1つまたは複数の浮遊置換基（分子の残りの部分への結合の点を含むが、これらに限定されない）と共に示される場合、浮遊置換基は、ヘテロ原子に結合していてもよい。浮遊置換基を有する構造または式において、環ヘテロ原子が1つまたは複数の水素に結合していることが示される（例えば、環原子への2つの結合および水素への3つ目の結合を有する環窒素）場合、ヘテロ原子が浮遊置換基に結合している場合、置換基は、化学原子価の法則に従いながら、水素を置換すると理解されるであろう。
【０２８１】
本明細書において使用される場合、「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）、リン（P）、およびケイ素（Si）を含むことを意味する。
【０２８２】
例が本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の例は、本発明を行うかつ実行する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例において開示された特定の態様に限定されず、代替の方法が類似した結果を得るために利用され得るので、これらは、例証の目的のためだけである。
【０２８３】
一般的な定義
他に具体的に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者（例えば、医学、細胞培養、分子遺伝学、および生化学における）によって一般的に理解されるのと同じ意味を有するとみなされる。
【０２８４】
本明細書において使用される場合、数値または範囲の文脈における「約」という用語は、その文脈がより限定された範囲を必要としない限り、列挙または請求された数値または範囲の±10％を意味する。
【０２８５】
上記の説明および特許請求の範囲では、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」などの句が出現し、その後にエレメントまたは特徴の接続的なリストが続くことがある。「および/または」という用語も、2つ以上のエレメントまたは特徴のリスト中に出現し得る。それが使用される文脈によって他に暗黙的または明示的に矛盾しない限り、そのような句は、列挙されたエレメントまたは特徴のいずれかを個々に、または列挙されたエレメントもしくは特徴のいずれかを他の列挙された要素または特徴のいずれかと組み合わせて意味することが意図されている。例えば、「AおよびBのうちの少なくとも1つ」、「AおよびBのうちの1つまたは複数」、および「Aおよび/またはB」という句は、「A単独、B単独、またはAおよびBが一緒に」をそれぞれ意味することが意図されている。同様の解釈は、3つ以上の項目を含むリストにも意図されている。例えば、句「A、B、およびCの少なくとも1つ」、「A、B、およびCの1つまたは複数」、ならびに「A、B、および/またはC」は、「A単独、B単独、C単独、AおよびBが一緒に、AおよびCが一緒に、BおよびCが一緒に、またはAおよびBおよびCが一緒に」をそれぞれ意味することが意図されている。さらに、上記および特許請求の範囲における「に基づく」という用語の使用は、列挙されていない特徴またはエレメントも許容されるように、「少なくとも部分的に基づく」を意味することが意図されている。
【０２８６】
パラメータ範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数、およびその10分の1も本発明によって提供されることが理解される。例えば、「0.2〜5mg」は、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mgなど、5.0mg以下の開示である。
【０２８７】
小分子は、質量が2000ダルトン未満の化合物である。小分子の分子質量は、好ましくは1000ダルトン未満、より好ましくは600ダルトン未満であり、例えば、化合物は、500ダルトン、400ダルトン、300ダルトン、200ダルトン、または100ダルトン未満である。
【０２８８】
本明細書中において使用される場合、「単離された」または「精製された」化合物、核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え技術によって作製される場合、他の細胞材料または培地を実質的に含まず、化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。精製化合物は、対象となる化合物の少なくとも60重量％（乾燥重量）である。好ましくは、調製物は、対象となる化合物の少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％である。例えば、精製化合物は、所望の化合物の少なくとも90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％、または100重量％であるものである。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA））は、その天然の状況でそれに隣接する遺伝子または配列を含まない。精製されたとは、例えば、感染性または毒性作用物質を欠いている、ヒト対象への投与に安全である無菌性の程度も定義する。
【０２８９】
同様に、「実質的に純粋な化合物」は、それに天然に付随する構成要素から分離されている化合物を意味する。典型的に、化合物は、化合物が天然に関連しているタンパク質および天然の有機分子を少なくとも60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％、またはさらに99重量％含まない場合、実質的に純粋である。
【０２９０】
「含む（including）」、「含有する（containing）」、または「によって特徴付けられる」と同義である「含む（comprising）」という移行語は、包含的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていないエレメントまたは方法工程を除外しない。対照的に、「からなる」という移行句は、特許請求の範囲において特定されていないあらゆるエレメント、工程、または成分を除外する。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲の範囲を、明記された材料または工程と、特許請求される発明の「基本的かつ新規の特徴に著しく影響を及ぼさないものと」に限定する。
【０２９１】
典型的にかつ文脈に依存して、本明細書において使用される「対象」、「患者」、「個体」などの用語は、概して相互交換され得る。つまり、「患者」と記載されている固体は、必ずしも所与の病気を有するわけではなく、単に医学的なアドバイスを求めているだけであり得る。
【０２９２】
本明細書において使用される「対象」という用語は、哺乳類、魚、鳥、爬虫類、または両生類などの脊椎動物を含めた任意の動物を含む。したがって、本明細書において開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ネコ、モルモット、またはげっ歯類とすることができる。いくつかの態様では、対象は、哺乳類である。ある態様では、対象は、ヒトである。
【０２９３】
本明細書において使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「疾患」、「疾患状態」、または「核酸」への言及は、1つまたは複数のそのような態様への言及であり、当業者に公知のその均等物などを含む。
【０２９４】
本明細書において使用される場合、「処置すること」は、例えば、障害の進行の阻害、後退、または停滞を包含する。処置することは、障害の任意の症状の予防または寛解も包含する。本明細書において使用される場合、対象における疾患進行または疾患合併症の「阻害」は、対象における疾患進行および/または疾患合併症を予防または軽減することを意味する。
【０２９５】
本明細書において使用される場合、障害に関連する「症状」は、障害に関連する任意の臨床的または実験的徴候を含み、対象が感じ得るまたは観察し得るものに限定されない。
【０２９６】
本明細書において使用される場合、治療またはイメージング化合物の量を表す場合の「有効な」は、本開示の様式で使用された場合、妥当なベネフィット/リスク比と釣り合っている、過度の有害な副作用（毒性、刺激、またはアレルギー反応など）なく望ましい結果（例えば、治療予後またはイメージングシグナル強度）をもたらすのに十分である化合物の量を表す。
【０２９７】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」担体または賦形剤は、妥当なベネフィット/リスク比と釣り合っている、過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー反応など）のないヒトおよび/または動物での使用に適した担体または賦形剤を表す。それは、例えば、本化合物を対象に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルとすることができる。
【０２９８】
本発明の様々な態様は、「フルオロフォア」などの「カーゴ」に結合しているpHLIPを含むpHLIPフルオロフォア化合物に関する。文脈に依存して、カーゴは、カーゴがpHLIPペプチドにコンジュゲートされているかどうかにかかわらず、カーゴの非コンジュゲート形態の名称または特徴によって称され得る。例えば、非コンジュゲート形態にある場合に「フルオロフォアX」として公知であるフルオロフォアは、pHLIPペプチドに結合している形態にある場合にも「フルオロフォアX」と本明細書において称され得る。
【０２９９】
例および態様が本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の例および態様は、本発明を行うかつ実行する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、開示された特定の例および態様に限定されず、代替の方法が類似した結果を得るために利用され得るので、これらは例証の目的のためだけである。
【０３００】
態様
態様は、以下の態様P1〜P35を含む。
【０３０１】
態様P1．
（a）配列LFPTXTLL（SEQ ID NO:1）におけるアミノ酸を含むpHトリガーポリペプチドであって、Xがプロトン化可能アミノ酸であり、pHトリガーポリペプチドがpH8.0と比較してpH5.0で膜脂質二重層に対してより高い親和性を有する、pHトリガーポリペプチドと、
（b）pHトリガーポリペプチドのN末端から数えて1番目または2番目のアミノ酸に共有結合している、インドシアニングリーン（ICG）と
を含む、化合物。
【０３０２】
態様P2．前記pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000101
におけるアミノ酸を含み、そのN末端アラニンに前記ICGが共有結合している、態様P1の化合物。
【０３０３】
態様P3．以下の構造:
2020500926.tif 000102
を含む、態様P2の化合物。
【０３０４】
態様P4．pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000103
におけるアミノ酸を含み、そのリジンにICGが共有結合している、態様P1の化合物。
【０３０５】
態様P5．以下の構造:
2020500926.tif 000104
を含む、態様P4の化合物。
【０３０６】
態様P6．pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000105
におけるアミノ酸を含み、そのシステインにICGが共有結合している、態様P1の化合物。
【０３０７】
態様P7．以下の構造:
2020500926.tif 000106
を含む、態様P6の化合物。
【０３０８】
態様P8．pHトリガーポリペプチドが人工プロトン化可能アミノ酸を含む、態様P1の化合物。
【０３０９】
態様P9．人工プロトン化可能アミノ酸が少なくとも1、2、3、4または5つのカルボキシル基を含む、態様P8の化合物。
【０３１０】
態様P10．プロトン化可能アミノ酸がアスパラギン酸またはガンマカルボキシグルタミン酸を含む、態様P1、P8、またはP9のいずれか1つの化合物。
【０３１１】
態様P11．pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000107
におけるアミノ酸を含む、態様P1〜P10のいずれか1つの化合物。
【０３１２】
態様P12．pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000108
におけるアミノ酸を含む、態様11の化合物。
【０３１３】
態様P13．pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000109
におけるアミノ酸を含む、態様12の化合物。
【０３１４】
態様P14．pHトリガーポリペプチドが配列
2020500926.tif 000110
におけるアミノ酸を含む、態様13の化合物。
【０３１５】
態様P15．pHトリガーポリペプチドが配列:
2020500926.tif 000111
におけるアミノ酸を含む、態様14の化合物。
【０３１６】
態様P16．pHトリガーポリペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:15〜24に記載のアミノ酸配列のそれぞれと100％、99％、または95％未満同一である、態様P1またはP8〜P11のいずれか1つの化合物。
【０３１７】
態様P17．pHトリガーポリペプチドが20〜30個のアミノ酸を含む、態様P1〜P16のいずれか1つの化合物。
【０３１８】
態様P18．態様P1〜P17のいずれか1つの化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【０３１９】
態様P19．D-グルコースをさらに含む、態様18の組成物。
【０３２０】
態様P20．口内洗浄剤を含む、態様P18またはP19の組成物。
【０３２１】
態様P21．身体の臓器または組織におけるがん組織または前がん性組織を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法:
（a）身体の臓器または組織を態様P1〜P17のいずれか1つの化合物と接触させる工程;
（b）化合物をICGの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）化合物から放射される電磁放射線を検出する工程であって、前記放射線の検出ががん性組織または前がん性組織の存在を示す、該検出する工程。
【０３２２】
態様P22．前がん性組織またはがん組織から放射される放射線のレベルが、正常な非がん性組織から放射される放射線のレベルより少なくとも20％大きい、態様P21の方法。
【０３２３】
態様P23．前記身体の臓器が腎臓または膀胱を含む、態様P21またはP22の方法。
【０３２４】
態様P24．がん性組織または前がん性組織を外科的に除去する工程をさらに含む、態様P21〜P23のいずれか1つの方法。
【０３２５】
態様P25．前記組織が対象から得られた、除去された、または提供されたものである、態様21の方法。
【０３２６】
態様P26．前記組織が組織生検材料を含む、態様P21またはP25の方法。
【０３２７】
態様P27．前記身体の臓器または組織が対象に存在する、態様P21〜P24のいずれか1つの方法。
【０３２８】
態様P28．前記身体の臓器または組織を態様P1〜P17のいずれか1つの化合物と接触させる工程が、該化合物を対象に投与する工程を含む、態様P21〜P24のいずれか1つの方法。
【０３２９】
態様P29．前記化合物が、膀胱内注入、静脈内注射、腹腔内注射、局所投与、粘膜投与、または経口投与を介して対象に投与される、態様P28の方法。
【０３３０】
態様P30．前記化合物が、該化合物を含む液体、粉末、または噴霧剤を対象の表面に適用することによって投与される、態様P28またはP29の方法。
【０３３１】
態様P31．前記表面が、手術を介してアクセスされる対象の身体内の部位を含む、態様P30の方法。
【０３３２】
態様P32．前記化合物が対象の口腔に投与される、態様P28またはP29の方法。
【０３３３】
態様P33．前記化合物から放射される電磁放射線がインビボで検出される、態様P21〜P32のいずれか1つの方法。
【０３３４】
態様P34．前記化合物から放射される電磁放射線がエクスビボで検出される、態様P21〜P32のいずれか1つの方法。
【０３３５】
態様P35．前記身体の臓器または組織からがん組織または前がん性組織を除去するための方法であって、以下の工程を含む方法:態様P21〜P24またはP27〜P34のいずれか1つの方法に従って検出されたがん細胞または前がん細胞を外科的に除去する工程。
【０３３６】
さらなる態様は、以下の態様1〜55を含む。
【０３３７】
態様1．
（a）pHトリガーポリペプチド（pH-triggered polypeptide）（pHLIPペプチド）と、
（b）フルオロフォアであって、近赤外（NIR）フルオロフォア、シアニンフルオロフォア、または光音響造影イメージング剤（optoacoustic contrast imaging agent）である、該フルオロフォアと
を含む、pHLIPフルオロフォア化合物。
【０３３８】
態様2．以下の構造:
2020500926.tif 000112
を有する、態様1の化合物。
【０３３９】
態様3．前記pHLIPペプチドが配列LFPTXTLL（SEQ ID NO:1）におけるアミノ酸を含み、Xがプロトン化可能アミノ酸であり、かつ前記フルオロフォアがNIRフルオロフォアを含む、態様1または2の化合物。
【０３４０】
態様4．XがDである、態様1〜3のいずれかの化合物。
【０３４１】
態様5．前記フルオロフォアがインドシアニングリーン（ICG）を含む、態様1〜4のいずれかの化合物。
【０３４２】
態様6．前記pHLIPペプチドが配列:
2020500926.tif 000113
を含み、ここで、
i）Yが、溶媒和エネルギー
2020500926.tif 000114
を有する非極性アミノ酸、またはGlyであり、
ii）Xがプロトン化可能アミノ酸であり、かつ
iii）n、m、I、j、l、h、g、fが1〜8の整数である、
態様1〜5のいずれかの化合物。
【０３４３】
態様7．前記pHLIPペプチドが水中で約7.5または7.75のpHで、ある正味の負電荷を有する、態様1〜6のいずれかの化合物。
【０３４４】
態様8．前記pHLIPペプチドが対数尺度で約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、または7未満の酸解離定数（pKa）を有する、態様1〜7のいずれかの化合物。
【０３４５】
態様9．前記pHLIPペプチドが少なくとも1つの人工プロトン化可能アミノ酸を含む、態様1〜8のいずれかの化合物。
【０３４６】
態様10．前記pHLIPペプチドが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の遺伝的にコードされたアミノ酸を含む、態様1〜9のいずれかの化合物。
【０３４７】
態様11．前記pHLIPペプチドが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個の非遺伝的にコードされたアミノ酸を含む、態様1または3〜10のいずれかの化合物。
【０３４８】
態様12．前記pHLIPペプチドが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、または40個のD-アミノ酸を含む、態様1または3〜11のいずれかの化合物。
【０３４９】
態様13．前記pHLIPペプチドが少なくとも8個のアミノ酸を含み、前記pHLIPペプチドの該8個のアミノ酸の少なくとも2、3、または4個が非極性であり、前記pHLIPペプチドの少なくとも8個のアミノ酸の少なくとも1、2、3、または4個がプロトン化可能である、態様1〜12のいずれかの化合物。
【０３５０】
態様14．前記フルオロフォアがシアニンフルオロフォアである、態様1、3、4、または6〜13のいずれかの化合物。
【０３５１】
態様15．前記フルオロフォアがNIRフルオロフォアである、態様1〜14のいずれかの化合物。
【０３５２】
態様16．前記フルオロフォアが光音響造影イメージング剤を含む、態様1〜15のいずれかの化合物。
【０３５３】
態様17．
（a）配列LFPTXTLL（SEQ ID NO:1）におけるアミノ酸を含むpHLIPペプチドであって、Xがプロトン化可能アミノ酸であり、該pHLIPペプチドが、pH8.0と比較してpH5.0で膜脂質二重層に対してより高い親和性を有する、該pHLIPペプチドと、
（b）pHLIPペプチドのN末端から数えて1番目または2番目のアミノ酸に共有結合している、インドシアニングリーン（ICG）と
を含む、態様1〜16のいずれかの化合物。
【０３５４】
態様18．XがDである、態様17の化合物。
【０３５５】
態様19．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000115
におけるアミノ酸を含み、そのシステインに前記ICGが共有結合している、態様17または18の化合物。
【０３５６】
態様20．以下の構造:
2020500926.tif 000116
を含む、態様19の化合物。
【０３５７】
態様21．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000117
におけるアミノ酸を含み、そのN末端アラニンに前記ICGが共有結合している、態様17または18の化合物。
【０３５８】
態様22．以下の構造:
2020500926.tif 000118
を含む、態様21の化合物。
【０３５９】
態様23．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000119
におけるアミノ酸を含み、そのリジンに前記ICGが共有結合している、態様17または18の化合物。
【０３６０】
態様24．以下の構造:
2020500926.tif 000120
を含む、態様23の化合物。
【０３６１】
態様25．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000121
におけるアミノ酸を含み、そのシステインに前記ICGが共有結合している、態様17または18の化合物。
【０３６２】
態様26．以下の構造:
2020500926.tif 000122
を含む、態様25の化合物。
【０３６３】
態様27．前記pHLIPペプチドが人工プロトン化可能アミノ酸を含む、態様17または18の化合物。
【０３６４】
態様28．人工プロトン化可能アミノ酸が少なくとも1、2、3、4または5つのカルボキシル基を含む、態様27の化合物。
【０３６５】
態様29．プロトン化可能アミノ酸がアスパラギン酸またはガンマカルボキシグルタミン酸を含む、態様17の化合物。
【０３６６】
態様30．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000123
におけるアミノ酸を含む、態様17〜29のいずれかの化合物。
【０３６７】
態様31．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000124
におけるアミノ酸を含む、態様30の化合物。
【０３６８】
態様32．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000125
におけるアミノ酸を含む、態様31の化合物。
【０３６９】
態様33．前記pHLIPペプチドが配列
2020500926.tif 000126
におけるアミノ酸を含む、態様32の化合物。
【０３７０】
態様34．前記pHLIPペプチドが配列:
2020500926.tif 000127
におけるアミノ酸を含む、態様33の化合物。
【０３７１】
態様35．前記pHLIPペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:15〜24に記載のアミノ酸配列のそれぞれと100％、99％、または95％未満同一である、態様17〜34のいずれかの化合物。
【０３７２】
態様36．前記pHLIPペプチドが20〜30個のアミノ酸を含む、態様17〜35のいずれかの化合物。
【０３７３】
態様37．態様1〜36のいずれかの化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【０３７４】
態様38．D-グルコースをさらに含む、態様37の組成物。
【０３７５】
態様39．口内洗浄剤を含む、態様37または38の組成物。
【０３７６】
態様40．対象における罹患組織または損傷組織を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法:
（a）態様1〜36のいずれかの化合物を対象に投与する工程;
（b）該対象をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）該化合物から放射される電磁放射線を検出する工程であって、該放射線の検出が罹患組織の存在を示す、該検出する工程。
【０３７７】
態様41．罹患組織または損傷組織が、がん組織、前がん性組織、炎症組織、虚血組織、関節炎組織、嚢胞性線維性組織、微生物に感染した組織、またはアテローム硬化性組織である、態様40の方法。
【０３７８】
態様42．罹患組織ががん組織であり、該がん組織が対象の膀胱、上部尿路、腎臓、前立腺、乳房、頭、首、口腔、膵臓、肺、肝臓、子宮頸部、卵巣、または脳にある、態様41または41の方法。
【０３７９】
態様43．前がん性組織またはがん組織から放射される放射線のレベルが、正常な非がん性組織から放射される放射線のレベルよりも少なくとも20％大きい、態様40〜42のいずれかの方法。
【０３８０】
態様44．前記身体の臓器が腎臓または膀胱を含む、態様40〜43のいずれかの方法。
【０３８１】
態様45．対象における体液の動きを検出するための方法であって、以下の工程を含む方法:
（a）態様1〜36のいずれかの化合物を対象に投与する工程;
（b）該対象をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）該化合物から放射される電磁放射線を検出する工程であって、該放射線の検出が体液の存在を示す、該検出する工程。
【０３８２】
態様46．体液が血液を含む、態様45の方法。
【０３８３】
態様47．血液が身体内腔内、血管腔内、毛細管腔内、静脈内腔内、動脈内腔内、または固形組織内を循環している、態様46の方法。
【０３８４】
態様48．体液がリンパ液を含む、態様45の方法。
【０３８５】
態様49．前記化合物が、膀胱内注入、静脈内投与、腹腔内投与、局所投与、粘膜投与、経口投与、動脈内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、心臓内投与、陰茎海綿体内投与、骨内投与、眼内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、皮内投与、経皮投与、経粘膜投与、病巣内投与、皮下投与、皮膚上投与、羊膜外投与、膣内投与、膀胱内投与、または経鼻投与を介して対象に投与される、態様40〜48のいずれかの方法。
【０３８６】
態様50．前記化合物が、前記化合物を含む液体、粉末、または噴霧剤を対象の表面に適用することによって投与される、態様40〜49のいずれかの方法。
【０３８７】
態様51．前記表面が、手術を介してアクセスされる対象の身体内の部位を含む、態様50の方法。
【０３８８】
態様52．前記化合物から放射される電磁放射線がインビボで検出される、態様40〜51のいずれかの方法。
【０３８９】
態様53．前記化合物から放射される電磁放射線がエクスビボで検出される、態様40〜51のいずれかの方法。
【０３９０】
態様54．工程（c）によって同定されたがんまたは前がん性の細胞または組織を外科的に除去する工程をさらに含む、態様40〜53のいずれかの方法。
【０３９１】
態様55．蛍光血管造影を含む、態様40〜54のいずれかの方法。
【０３９２】
態様56．眼科的処置、心胸郭手術、バイパス冠動脈手術、脳神経外科手術、肝胆道手術、再建手術、胆嚢摘除術、結腸直腸切除術、脳手術、筋肉灌流、創傷もしくは外傷手術、または腹腔鏡手術中に行われる、態様40〜55のいずれかの方法。
【０３９３】
態様57．生物学的試料中のフルオロフォアをエクスビボで検出するための方法:
（a）対象からの生物学的試料を態様1〜36のいずれかの化合物と接触させる工程;
（b）該生物学的試料をフルオロフォアの励起波長を含む電磁放射線と接触させる工程;および
（c）フルオロフォアから放射される電磁放射線を検出する工程。
【０３９４】
態様58．前記生物学的試料が、組織生検標本、液体生検標本、外科的に除去された組織、外科的に除去された液体、または血液を含む、態様57の方法。
【実施例】
【０３９５】
実施例1:エクスビボでのICG-pHLIPペプチド（ICG-Var3）によるヒト膀胱における尿路上皮癌のターゲティングされたイメージング
膀胱がんは、発生率が5番目に多く、処置するのが最も高価ながんの1つである。早期検出は、生存および膀胱保存の見込みを大きく改善する。
【０３９６】
この報告は、エクスビボでの新鮮なヒト根治的膀胱切除試料における尿路上皮癌および前がん性病変の診断のためにICG-Var3コンジュゲート体を使用した最初の研究であり、幅広い診断および治療の選択肢への道をさし示している。
【０３９７】
近赤外蛍光色素であるICGで標識されたpHLIPペプチドを使用して、ヒト膀胱における腫瘍のターゲティングをモニターした。ICG-Var3の吸収スペクトルを図1Aに示す。ICG-Var3の蛍光は、POPCリポソームの存在下で約25倍増加する（図1B）。したがって、がん性細胞膜の脂質二重層へのICG-Var3の結合は、ICGの放射を著しく増強する。
【０３９８】
22人の根治的膀胱切除患者がこの研究に含まれた。患者の年齢は、51歳から84歳（平均年齢67.7歳）で、性比M/Fは、19/3であった。表8は、患者の対象者属性、術前診断、疾患の臨床ステージ、およびイメージング研究の結果を含む。標本は、ICG-Var3とのインキュベーション後に有害な形態学的所見を示さず、非腫瘍組織における損傷または変性作用の証拠はなかった。ICG-Var3の使用は、根治的膀胱切除組織の病理学的評価を変えなかった。全体として、29の悪性病変が、ICG-Var3で染色された22の膀胱標本の病理学的評価によって同定された（3例の根治的膀胱切除症例を、陰性対照としてICG-Cysと共にエクスビボでインキュベートした）。29の病変における異なる病状の頻度は、以下の通りであった（図2A〜L）:12の高悪性度筋肉浸潤性尿路上皮癌（HGI）、5つの高悪性度非筋肉浸潤性尿路上皮癌（HGN）、11の上皮内癌（CIS）、および1つの高悪性度異形成。7例の症例では、近赤外蛍光イメージングは、白色光検査によって観察されなかったCISに病理学者を導いた。症例＃2では、憩室内の壊死組織が近赤外蛍光陽性であった。陰性対照症例（症例＃13、19および20）に関しては、ICG-Cys色素のみを滴下注入に使用し（80ml体積中に8〜40μMの濃度で）、特異的な腫瘍ターゲティングは、観察されなかった。
【０３９９】
感度/特異性試験の結果の表を表9〜10に示す。試験を、壊死組織および以前に処置された組織のターゲティングを除いて、がん性組織 対 正常組織に関して行った（表9Aおよび9B）。正常に対するがん性組織のターゲティングの感度および特異性は、それぞれ、97％および100％であることがわかった。以前の膀胱腫瘍の経尿道的除去からの壊死組織およびICG-Var3によって以前に処置された（化学療法）壊死腫瘍のターゲティングが偽陽性とみなされる場合、特異性は、100％から80％に減少する（表10aおよび10b）。
【０４００】
ICG-Var3構築物は、正常細胞からがん細胞を高い感度と特異性で識別する
ICG-Var3（登録商標）構築物を使用して、外科的除去の直後にヒト膀胱標本中の尿路上皮癌をターゲティングした。ICGは、主に灌流および拡散の差、または新生物組織および正常組織（ウォッシュアウト）による、腎細胞癌において見られるような、新生物組織のターゲティングに関していかなる非依存的な傾向も示さない、FDA承認の近赤外蛍光色素である。ICGは、脈管構造またはリンパ管を可視化するために臨床的に使用されている（Tobis et al.（2012）J Endourol 26（7）: 797-802; Alander et al.（2012）Int J Biomed Imaging 2012: 940585; Desmettre et al.（2000）Surv Ophthalmol 45（1）: 15-27）。ICGは、水溶液中で低レベルの蛍光を有する一方、その放射は、タンパク質（アルブミンなど）または細胞膜の疎水性ポケットに結合すると増加する。pHLIPペプチドによるターゲティングは、がん細胞膜の脂質二重層への低pHトリガー挿入に基づく。したがって、pHLIPペプチドは、ICGを膜に繋ぎ止め、ICG蛍光を約25倍増強する。
【０４０１】
ICG-Var3ペプチドによる正常細胞のターゲティングを回避/最小化するために、構築物を10mMのD-グルコースを添加したpH7.4のPBSに滴下注入して、がん細胞によるICG-Var3（登録商標）ペプチドの取込みを促進した。解糖がん細胞は、高いグルコース取込みを示し、これは、インビトロおよびインビボで細胞外空間の酸性化を増強する（Kozin et al.（2001）Cancer Res 61（12）: 4740-4743）。したがって、本発明者らの目標は、正常な代謝を有する正常細胞に影響を与えずに、がん細胞表面での酸性度の増加を選択的に促進して、pHLIPペプチド挿入およびターゲティングを増強することであった。
【０４０２】
疾患が膀胱を除去しなければならない程度まで進行していることを考慮して、尿路上皮癌の異なるサブタイプの混合物を使用した。これらの症例は、典型的な高悪性度尿路上皮癌を含んだが、顕著な扁平上皮細胞分化、微小乳頭状尿路上皮癌、腺癌および形質細胞様形態を有する種々の異型も有した。ICG-Var3（登録商標）ペプチドによる腫瘍ターゲティングの感度（97％）および特異性（100％）は、腫瘍のサブタイプとは無関係であることが見出された。調査した膀胱切除標本の半分は、前の処置からの壊死および効果の証拠を明らかにし、残存腫瘍（浸潤またはインサイチュー）の全ての明らかにされた証拠は、おそらく壊死領域によるICGの捕捉および取込みから、ICG-Var3（登録商標）ペプチドによってターゲティングされた壊死に隣接かつ関連していた。以前の研究は、動物腫瘍モデルにおけるpHLIPペプチドによる壊死組織のターゲティングを示さなかった（Adochite et al.（2014）Mol Pharm 11（8）: 2896-2905）。壊死および以前に処置された組織のターゲティングが偽陽性とみなされる場合、特異性は、80％に減少するが、平静な病変に関しては偽陽性は見られなかった。
【０４０３】
1つの病変は、その後の病理分析によって明らかにされた異形成の存在下で陽性近赤外蛍光イメージングシグナルを与えた。尿路上皮異形成は、尿路上皮細胞が上皮内癌の診断に足りない軽度の非定型的特徴を示す偶発的な顕微鏡的所見である。それは前がん性過程とみなされ、研究により、尿路上皮異形成症例の最大19％が尿路上皮癌を発症することが示された（Althausen et al.（1976）J Urol 116（5）: 575-580; Smith et al.（1983）Br J Urol 55（6）: 665-669; Zuk et al.（1988）J Clin Pathol 41（12）: 1277-1280）。たとえ前がん性でも、異形成を有する患者は、切迫した癌の早期検出のために適切な臨床経過観察を受けることが推奨される。異形成は、臨床的に検出可能ではないため、ICG-Var3（登録商標）ペプチドは、尿路上皮における高悪性度異形成の検出に有用なマーカーであり得、前がん性病変の早期検出を可能にする。
【０４０４】
膀胱組織は、炎症および感染症を起こしやすい。長期にわたる炎症および重度の感染症は、高頻度のために嚢胞性膀胱炎および腺膀胱炎のように、粘膜の変形を引き起こし得、これらは尿路上皮における標準の所見とみなされる。ある場合には、ICG-Var3（登録商標）ペプチドの著しい取込みを有する領域は、異形成または悪性腫瘍の証拠なしに慢性的炎症を有する嚢性および腺性膀胱炎（cystitis cystica et glandularis）を示した。ほぼ全ての22の膀胱切除標本が、ある程度の嚢性および腺性膀胱炎を標本中のどこかに明らかにしたことは、注目に値する。2つの病変のみが他の病態を有さない嚢胞性膀胱炎を明らかにした:1つの病変（症例＃9）は、ICG-Var3（登録商標）ペプチドで陽性シグナルを示した。ICG-Var3ペプチドの滴下注入された濃度が4μMに減少した場合、第2の症例（症例＃18）の嚢胞性膀胱炎は、染色されなかった。ICG-Var3（登録商標）ペプチドの濃度を下げても、高悪性度浸潤癌およびCISのターゲティングに影響しなかった（症例＃17）。濃度を最適化し、ICG-Var3滴下注入の時間を短縮することは、炎症組織、壊死組織およびがん性組織の間の明確なシグナルの区別を可能にする。
【０４０５】
ICG-Var3ペプチドは、サブタイプにかかわらず、高い感度および特異性を有する尿路上皮癌の早期検出のための有用なツールである。様々な態様では、検出は、疾患の状況のモニタリングおよび/または外科的除去のための病変のマーキングに使用される。いくつかの態様では、ICG-Var3イメージング剤は、膀胱におけるがん性病変の診断および切除を改善する。ある態様では、再発率が低減され、患者の予後が改善され、膀胱がんの医療費が低下される。様々な態様では、ターゲティングされたイメージングでの成功は、膀胱腫瘍細胞への治療用分子のpHLIP送達を促進し、膀胱がんのターゲティングされた処置（例えば、化学療法剤の特異的送達）を可能にする。
【０４０６】
いかなる理論にも縛られることなく、ICG-Var3構築物は、それが腫瘍微小環境の一般的特性である腫瘍酸性度をターゲティングするので、一般的に適用可能なイメージング剤である。蛍光pHLIPは、リンパ腫、黒色腫、膵臓、乳房および前立腺トランスジェニックマウスモデルならびにヒト組織（エクスビボで染色された膀胱、腎臓、上部尿路、乳房、肝臓、口および頭/首）を含めたヒト、マウスおよびラット腫瘍の15を超える種類において原発腫瘍および転移巣をターゲティングすることが示された。
【０４０７】
（表８）対象者属性情報、病理学的ステージおよび診断、白色光および蛍光画像診断により見られる病変
2020500926.tif 000128
＊40μMの80mLの構築物を滴下注入に使用した。
＊＊4μMの80mLの構築物を滴下注入に使用した。
【０４０８】
（表９Ａ）ヒト膀胱標本中のがん性病変のICG-Var3（登録商標）ペプチドターゲティングの感度/特異性試験の結果の表:壊死組織および処置効果を除く、癌腫 対 正常。
2020500926.tif 000129
TPは、真陽性であり、TNは、真陰性であり、FPは、偽陽性であり、FNは、偽陰性である。
【０４０９】
（表９Ｂ）記述的パラメータ
2020500926.tif 000130
【０４１０】
（表１０Ａ）ヒト膀胱標本中のがん性病変のICG-Var3（登録商標）ペプチドターゲティングの感度/特異性試験の結果の表:壊死組織および処置効果を含めた、癌腫 対 正常。
2020500926.tif 000131
TPは、真陽性であり、TNは、真陰性であり、FPは、偽陽性であり、FNは、偽陰性である。
【０４１１】
（表１０Ｂ）記述的パラメータ
2020500926.tif 000132
【０４１２】
材料および方法
pHLIP（登録商標）ペプチドとのICGのコンジュゲーション
N末端に単一のCys残基を有するpHLIP（登録商標）変異体3（Var3）ペプチド、
2020500926.tif 000133
を、CS Bio, Inc（Menlo Park, California, USA）による逆相クロマトグラフィーによって合成し、精製した。近赤外蛍光色素、インドシアニングリーン（ICG）マレイミド（Intrace Medical, Lausanne, Switzerland）を、DMF（ジメチルホルムアミド）中で1:1の比でpHLIP（登録商標）ペプチドにコンジュゲートした。反応の進行を、0.05％トリフルオロ酢酸を含有する水中で5〜70％アセトニトリルの勾配を使用して、逆相（Zorbax SB-C18カラム、9.4×250mm 5μm、Agilent Technology）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によってモニターした。また、負の対照のために、ICG-マレイミドを遊離アミノ酸L-システイン（Sigma）とコンジュゲートした。緩衝液中の標識ペプチドの濃度を800nm、ε800＝137,000M-1 cm-1でのICG吸収によって決定した。構築物の純度は、分析用HPLCおよびSELDI-TOF質量分析によって行い、溶液中の遊離色素の量は、1％未満であった。
【０４１３】
リポソーム調製
大きな単層ベシクルを押出しによって調製した。2.5mgのPOPC（Avanti Polar Lipids, Inc.; Alabaster, Alabama）脂質を0.5mlのクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーター上で脱溶媒和し、高真空下で3時間乾燥させた。次に、リン脂質フィルムを10mMのD-グルコースを含有するpH7.4のPBS中で再水和し、5分間ボルテックスし、100nm孔サイズを有する膜を通して少なくとも15回繰り返し押し出した。
【０４１４】
吸収および蛍光測定
吸光度および蛍光測定を、それぞれ、Genesys 10S UV-Vis分光光度計（Thermo Scientific）およびSpectraMax M2分光蛍光光度計（Molecular Devices）上で行った。吸収スペクトルを、600〜850nmで、10mMのD-グルコースを含有するpH7.4のPBS中で測定した。10μMのICG-Var3ペプチドの蛍光スペクトルを、2mMのPOPCリポソーム有りまたは無しで10mMのD-グルコースを含有するpH7.4のPBS中で790nmの励起波長で810〜850nmで測定した。
【０４１５】
膀胱標本のエクスビボイメージング
根治的膀胱切除を予定されていた22人の尿路上皮癌患者を12ヶ月間にわたって選択した。根治的膀胱切除の後、膀胱標本を直ちに取り出し、カテーテルを介して非緩衝食塩水で5分間3回灌注し、10mM D-グルコースを含有するPBS pH7.4中の80mlの8μMまたは32.8μg/ml（特記しない限り、表8の注を参照）のICG-Var3構築物またはICG-Cysを滴下注入およびそれと共に60分間インキュベートした。その後、非結合構築物を80mlの食塩水で3〜5回すすぐことによって除去し、膀胱を緩衝食塩水で徹底的に灌注し、前壁のY切開を使用して開いた。da Vinci Si近赤外蛍光イメージングシステム（Firefly（登録商標））を使用して、膀胱全体およびその一部のエクスビボ蛍光および白色光イメージングを行った。蛍光スポットをマーキングし、標準的病理学的分析を行って、蛍光シグナルの出現とがん病変の相関を調査した。
【０４１６】
病理学的分析
標本を、膀胱のマーキングされた領域に重点を置きながら、標準的な施設内視鏡検査マニュアルに従って10％リン酸緩衝ホルマリン中で24時間固定した後に切片にして提出した。切片を通例の組織学的検査のためにパラフィン包埋ブロックに加工した。5マイクロメートル厚の組織切片を取得し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）について染色した。組織学的検査の評価を尿生殖器（GU）病理学者が行い、標準報告書をAmerican Joint Committee on Cancer（AJCC）Cancer Staging Manual, 7th edition, 2010に基づいて作成した。
【０４１７】
統計的分析
統計的パラメータを以下の等式に従って計算した。
2020500926.tif 000134
式中、TPは、真陽性であり、TNは、真陰性であり、FPは、偽陽性であり、FNは、偽陰性であり、TRPは、真陽性率または感度であり、SPCは、真陰性率または特異性であり、PPVは、陽性適中率または精度であり、NPVは、陰性適中率であり、FPRは、偽陽性率であり、FNRは、偽陰性率であり、FDRは、偽発見率であり、FORは、偽除外率（false omission rate）である。
【０４１８】
実施例2:がん性病変の可視化および検出
蛍光または光音響イメージング剤の全身投与によるヒト身体におけるがん性病変の可視化および検出は、非常に重要であり、腫瘍の切除および転移した細胞を有するリンパ節の検出/切除をガイドするために使用され得る。以下の研究の主な目標は、蛍光ICG-Var3およびIR800-Var3構築物が、蛍光構築物の静脈内または腹腔内投与後のマウスモデルにおいて様々な腫瘍をターゲティングする能力の調査であった。
【０４１９】
Var3ペプチド
2020500926.tif 000135
をCS Bio Co.から購入した。ペプチドを、Zorbax SB-C18およびZorbax SB-C8、4.6×250mm 5μmカラム（Agilent Technology）を使用して、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって特徴付けた。ペプチド濃度を280nmでの吸光度によって計算した。ICG（インドシアニングリーン、Intrace Medical）およびIRDye（登録商標）800CW（IR800、Li-Cor Biosciences）のマレイミド誘導体を、Var3ペプチドのN末端で単一のCys残基とコンジュゲートした。コンジュゲーション反応を約1:1の色素:ペプチドの比でDMF（ジメチルホルムアミド）中で行い、コンジュゲーションが完了するまで室温で約8時間、次に4℃でインキュベートした。反応の進行および純度を逆相RT-HPLCによってモニターして、最終溶液中に遊離色素が存在しないことを確実にした。生成物を凍結乾燥し、SELDI-TOF質量分析法によって特徴付けた。コンジュゲート体の濃度を、以下のモル吸光係数を使用して吸光度によってメタノール中で決定した:ε778＝300,000M-1・cm-1（IR800-pHLIPに関して）およびε800＝137,000M-1・cm-1（ICG-pHLIPに関して）。
【０４２０】
体重20〜25gの成体雌ヌードマウスおよび雌BALB/cAnNHsdマウス（Envigo）を試験に使用した。マウス乳がん4T1細胞を成体雌BALB/cAnNHsdマウスの右側腹部（8×105細胞/0.1mL/側腹部）に皮下移植した。ラット膀胱がんAY27細胞を成体雌ヌードマウスの右側腹部（8×105細胞/0.1mL/側腹部）に皮下移植した。腫瘍が直径約5〜6mmに達したときに、PBS中のフルオロフォア-pHLIP溶液の単回尾静脈注射または単回腹腔内注射を行った。蛍光構築物を100μLの40μM、または100μLの20μM、または100μLの10μM、または100μLの5μMの量で使用した。マウスのイメージングを構築物投与から16時間後に行った。皮膚を、動物がガス麻酔下にある間にイメージング直前に腫瘍部位から除去し、マウスをイメージング直後に安楽死させた。腫瘍、腎臓および肝臓を収集し、造影し、病理組織学的分析に使用した。イメージングをStryker臨床イメージング機器を使用して行った。自己蛍光を蛍光構築物の注射なしでマウスをイメージングすることによって確立した（自己蛍光シグナルのレベルは、構築物投与後のシグナルと比較してわずかであった）。
【０４２１】
マウス4T1異種移植モデルは、ヒト乳がんのステージIVを近似的に模倣する（Yang et al.（2004）Cell 117（7）: 927-939; Eckhardt et al.（2005）Mol Cancer Res 3（1）: 1-13; Tao et al.（2008）BMC Cancer 8: 228）。4T1乳房腫瘍は、有意なレベルの乳酸を産生し、浸潤性酸性腫瘍の優れたモデルとして役立つことも公知である（Serganova et al.（2011）Cancer Res 17（19）: 6250-6261）。4T1は、トリプルネガティブ乳房腫瘍であり、これは、ターゲティングすることが困難である。ICG-Var3による4T1腫瘍の優れたターゲティング（図11）。図12では、ヌードマウスにおけるラット膀胱腫瘍のターゲティングが示されている。腫瘍（ならびに腎臓および肝臓）におけるICG-Var3の蛍光シグナルは、濃度依存性を示した（図13および14）。腫瘍におけるシグナルは、腎臓におけるシグナルよりも高く、肝臓におけるシグナルと同様であるか、またはわずかに少ないことに注目することが重要である（図14）。ICG-Var3の静脈内投与と腹腔内投与の両方が、構築物投与から16時間後に優れた腫瘍ターゲティングおよび腫瘍の可視化をもたらした（図15）。ICG-Var3およびIR800-Var3の静脈内投与後のNIRシグナルによる腫瘍の可視化を比較した（図16）。両方の蛍光構築物が、腫瘍の高精度の腫瘍可視化を伴って腫瘍をターゲティングするという事実にもかかわらず、ICG-Var3を使用することは、IR800-Var3を使用した腫瘍の可視化と比較して、はるかに優れていた。いかなる理論にも縛られることなく、ICG-Var3を使用した、より優れた腫瘍可視化は、がん細胞膜の表面近くのICG蛍光の増幅（増強）および/またはIR800色素よりもむしろICG色素の励起およびイメージングにきわめてより良好に最適化されている臨床イメージング機器の使用（例えば、Stryker内視鏡または多くの他の臨床機器の使用）によるものであろう。腫瘍取込みの定量化を図17に提供する。肝臓および腎臓における蛍光シグナルもICG-Var3およびIR800-Var3に関して異なっていた。
【０４２２】
態様では、蛍光化合物は、蛍光にガイドされる外科的適用中に腫瘍切除のための周縁部を明確に確立するための腫瘍塊の可視化を可能にする。
【０４２３】
図18には、マウスから除去された、周囲の筋組織を伴う2つの異なる腫瘍塊が示されている。得られた画像は、蛍光シグナルが腫瘍周縁部を特定するのに有用であることを実証しており、この腫瘍周縁部は、標準的溶血素およびエオシン（H＆E）組織病理学的分析によって確認された。
【０４２４】
実施例3:ICG-Var3およびIR800-pHLIPによるマウスの血流の蛍光イメージング
蛍光血管造影法（FA）は、血管を可視化し、血流をモニターするための様々な手法において広く使用されている。ICGは、FAにおいて使用されるが、しかしながら、急速な血中クリアランス（半減期は、わずか数分である）のために、有用なイメージング期間は、ICGの投与後数分に制限される。いくつかの臨床的手法の過程では、ICGは、単一の手法中に最大10回注射される。より長い循環イメージング剤を使用することによってイメージング期間を延ばすことが明らかに必要である。以前のデータは、pHLIPが、同様のサイズのペプチドと比較して長い血中循環を有することを明らかに示している（Reshetnyak et al.（2011）Mol Imaging Biol 13（6）: 1146-1156; Daumar et al.（2012）Bioconjug Chem 23（8）: 1557-1566; Macholl et al.（2012）Mol Imaging Biol 14（6）: 725-734; Adochite et al.（2014）Mol Pharm 11（8）: 2896-2905; Cruz-Monserrate et al.（2014）Sci Rep 4: 4410; Viola-Villegas et al.（2014）Proc Natl Acad Sci U S A 111（20）: 7254-7259; Adochite et al.（2016）Mol Imaging Biol 18（5）: 686-696; Demoin et al.（2016）Bioconjug Chem 27（9）: 2014-2023）。したがって、マウスにおいて血液をイメージングする実現性が、ICGおよびIR800色素単独との比較において、近赤外ICGおよびIR800コンジュゲートpHLIPペプチドを使用して調査された。
【０４２５】
全てのペプチドをCS Bio Co.から購入した。研究に使用したペプチドのリストを表11に示す。ペプチドを、Zorbax SB-C18およびZorbax SB-C8、4.6×250mm 5μmカラム（Agilent Technology）を使用して、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって特徴付けた。ペプチド濃度を280nmでの吸光度によって計算した。
【０４２６】
（表１１）研究に使用されたpHLIP配列のリスト
2020500926.tif 000136
【０４２７】
ICG（インドシアニングリーン、Intrace Medical）およびIRDye（登録商標）800CW（IR800、Li-COR Biosciences）のマレイミド誘導体を、遊離Cys残基と、またはpHLIPペプチドのN末端の単一のCys残基を用いてpHLIPペプチドとコンジュゲートした。コンジュゲーション反応を約1:1の色素:ペプチドの比でDMF（ジメチルホルムアミド）中で行い、コンジュゲーションが完了するまで室温で約8時間、次に4℃でインキュベートした。反応の進行および純度を逆相RT-HPLCによってモニターして、最終溶液中に遊離色素が存在しないことを確実にした。生成物を凍結乾燥し、SELDI-TOF質量分析法によって特徴付けた。コンジュゲート体の濃度を、以下のモル吸光係数を使用して吸光度によってメタノール中で決定した:ε778＝300,000M-1・cm-1（IR800-コンジュゲート体に関して）およびε800＝137,000M-1・cm-1（ICG-コンジュゲート体に関して）。
【０４２８】
体重20gの成体雌ヌードマウス（Envigo）を試験に使用した。蛍光構築物をPBS中40μMを100μLの量で単回尾静脈注射として与えた。マウスの耳および脚のイメージングを構築物投与から5、30、60、90および120分後に行った。構築物投与から5、30、60、90および120分後に、5μLの血液を、動物がガス麻酔下にある間に尾から抜き取った（血液を保存するために5μLの抗凝固溶液と混合した）。マウスを最後のイメージング点（120分）の直後に安楽死させた。全ての動物から採取された血液をスライドガラス上に置き、乾燥させ、造影した。イメージングをNovadaq臨床イメージング機器を使用して行った。自己蛍光を蛍光構築物の注射なしでマウスをイメージングすることによって確立した（自己蛍光シグナルのレベルは、構築物投与後のシグナルと比較してわずかであった）。
【０４２９】
構築物投与後の異なる時点で得られた動物の耳および脚のNIR蛍光画像を図20〜37に示す。全ての画像は、血管のイメージングを最もよく表すために調整されたコントラスト/明るさ比で提示されている。第1組の画像をpHLIPとコンジュゲートしたICGおよびICG-Cysで得た。色素単独のイメージング（ICG-Cys）は、色素の急速な血中クリアランスを明らかに実証している。ICG-Cys注射の5分後に、血管を観察することは、既に問題があった。同じ時、ICG-WT pHLIPおよびICG-Var3 pHLIPは、2時間以内に血管の優れた持続的イメージングを示した。ICG-Hum pHLIPは、最良の造影可能条件に達するのが遅く、減衰するのが速かった。ICG-NpHLIPは、良好な性能を示さなかった:全体的なシグナルは低く、血流のイメージングは、あまりはっきりしていなかった。血液試料の分析は、血液試料中のICG-WT pHLIPおよびICG-Var3 pHLIPに関する2時間以内の強い蛍光シグナルの持続、およびICG-NpHLIPのシグナルの著しい減少を確認した。最もよく機能したペプチド、WTおよびVar3 pHLIPを、別のNIR蛍光色素であるIR800でも試験して、蛍光色素の役割を確立した。第一に、IR800-Cys単独では、血管からの良好なシグナルを記録することはできなかった。IR800-WTおよびIR800-Var3 pHLIPは、血管のイメージングにおいてより良好であったが、しかしながら、ICG-WTおよびICG-Var3 pHLIPには程遠かった。耳および脚、ならびに血液試料の画像から、pHLIP構築物のIR800バージョンが血液から漏れていて、2時間以内に組織内に分布し始めていることが明らかだった。色素の特性が体内分布および血液クリアランスに影響を与えることは明らかである。
【０４３０】
結果は、ICG-Var3 pHLIPおよびICG-WT pHLIPの使用が、それが撮像時間を2〜5分から2〜3時間に延長することができるので、多数の臨床的手法における血管および血流のイメージング可能性の著しい改善につながることを示している。
【０４３１】
他の態様
本発明をその説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【０４３２】
本明細書において参照される特許および科学文献は、当業者に利用可能である知識を確立する。全ての米国特許および本明細書において引用された公開または非公開の米国特許出願は、参照により本組み入れられる。本明細書において引用された全ての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用される受入番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された全ての他の公開参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０４３３】
本発明をその好ましい態様を参照して特に示し説明したが、当業者であれば添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更をなし得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月3日(2019.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2020500926.tif 000200
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