(57)【要約】  モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジー、クルクマ・ロンガ由来の抽出物、画分、植物化学物質、またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗的なハーブ組成物で、脂肪の少ない体組織と褐色脂肪組織を増加させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進し、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成、および終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加に関連する疾患を阻害する。本発明はさらに、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させる方法であって、前記方法は白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を加速させ、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成、および哺乳類における終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加に関連する疾患を抑制する方法を提供する。
2020536949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進するため、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加に関連する疾患状態を治療するため、および除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物、または画分または植物化学物質またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗的ハーブ組成物。
【請求項２】
モリンガ・オレイフェラ由来成分の重量が１０％〜９０％の範囲で変化し、ムラヤコエンジー由来成分の重量が１０％〜９０％の範囲で変化し、クルクマ・ロンガ由来の成分の重量は５％〜３０％の範囲で変化することを特徴とする請求項１に記載の相乗的ハーブ組成物。
【請求項３】
モリンガ・オレイフェラ由来成分の重量が３０％〜８０％の範囲で変化し、ムラヤ・コエニージ由来成分の重量が１０％〜６０％の範囲で変化し、クルクマ・ロンガ由来の成分の重量が５％〜２０％の範囲で変化する請求項２に記載の相乗的組成物。
【請求項４】
前記相乗的組成物は、場合により、薬学的、栄養補給的および食餌的に許容される賦形剤、担体および希釈剤から選択される少なくとも１つを含む請求項１に記載の相乗的組成物。
【請求項５】
薬学的または栄養補助的または食事療法的に許容される賦形剤において、担体および希釈剤が、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、スクラロース、アセルファムＫ、黄色デキストリン、白色デキストリン、アエロシル、微結晶セルロース、ノイシリン、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ソルビトール、ステビオシド、グリシルリチン酸モノアモニウム、アルギン酸ナトリウム、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アカシア、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンBグループ、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸、タンパク質、カルシウム塩、色素、香料、保存料、蒸留水、生理食塩水、グルコース水溶液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、さまざまな動物植物油、白色ソフトパラフィン、パラフィン、香料、着色料、ワックスから選択される、請求項４に記載の相乗的ハーブ組成物。
【請求項６】
前記組成物が、乾燥粉末形態、液体形態、飲料、食品、栄養補助食品または錠剤、カプセルナノテクノロジー、マイクロカプセル化、コロイド状担体システムおよびその他のドラッグデリバリーシステムを含む技術による制御放出ポリマーベースのコーティングを使用した制御放出錠剤などの任意の適切な形態から選択される剤形に製剤化され得る、請求項４に記載の相乗的組成物。
【請求項７】
前記組成物が、健康食品、またはチョコレートまたは栄養バーなどの固形食品、クリーム、ジャム、ジェルなどの半固形食品や清涼飲料、乳酸菌飲料などの飲料、ドロップ、キャンディー、チュアブルガムまたはグミベア、チューインガム、グミキャンディー、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ソフト小豆ゼリー、ゼリー、クッキー、お茶、ソフトドリンク、ジュース、牛乳、コーヒー、シリアル、スナックバーなどの特定の健康用途のための剤形に実装（contemplated）／作成できる栄養／栄養補助食品に配合できる、請求項４に記載の相乗的組成物。
【請求項８】
前記抽出物、画分、または植物化学物質が、葉、茎、柔らかい茎、空中部分、果実、果実皮、種子、花頭、根、樹皮、根茎または植物全体またはそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの植物部分から得られる、請求項１に記載の相乗的ハーブ組成物。
【請求項９】
前記抽出物、画分、または植物化学物質が、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロピルアルコールといった炭素数１〜５のアルコール、アセトン、メチルイソブチルケトンといったケトン、水およびそれらの混合物；二塩化メチレンおよびクロロホルムといった塩素化溶媒およびそれらの混合物；ヘキサンといった炭素数１〜７の炭化水素；酢酸エチルなどのようなエステルおよびそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの溶媒を用いて生成される、請求項１に記載の相乗的組成物。
【請求項１０】
前記モリンガ・オレイフェラ抽出物、ムラヤコエンジー抽出物およびクルクマ・ロンガ抽出物が、水性抽出物、アルコール抽出物および含水アルコール抽出物から選択される、請求項９に記載の相乗的組成物。
【請求項１１】
前記モリンガ・オレイフェラ抽出物、ムラヤコエンジー抽出物およびクルクマ・ロンガ抽出物の組み合わせが、６：３：１、８：１：１、４：５：１、２：２：１、３：６：１および６：３．５：０．５からなる群から選択される比率である、請求項１に記載の相乗的組成物。
【請求項１２】
哺乳動物における除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させる方法であって、白色脂肪組織（ＷＡＴ）を褐色脂肪組織（ＢＡＴ）に変換し、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害、および／または終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加による疾患を治療する方法であって、前記方法は、哺乳動物に、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物、または画分または植物化学物質またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗的組成物の適切な用量を加給することを含み、必要に応じて、製薬上、栄養補助食品上および栄養上許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む方法。
【請求項１３】
前記終末糖化産物（ＡＧＥ）関連疾患が、糖尿病、網膜症、腎症、神経障害、心筋症、関節リウマチ、骨粗しょう症、老化、癌およびアルツハイマー病といった加齢関連の神経変性疾患の進行を含むがこれらに限定されない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガから抽出された抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物の組み合わせを含み、栄養素および食事療法上許容される有毒な賦形剤、希釈剤、除脂肪担体を増加させるための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を任意で含む相乗的組成物の使用する、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加、および白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成の阻害、および／または終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加に関連する疾患を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるため、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＷＡＴ）への変換を促進するため、および終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（終末糖化末端)（ＡＧＥ）に関連する病状を治療するための、モリンガ・オレイフェラ（ワサビノキ）、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物、画分、植物化学物質、またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗的組成物に関する。本発明はさらに、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させる方法、白色脂肪組織（ＷＡＴ）を褐色脂肪組織（ＢＡＴ）に変換する方法、および必要とする哺乳動物に前記相乗的組成物を加給（supplementing）することにより、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する疾患状態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
除脂肪体重は、脂肪、骨などの他の部分に依存しない、体内の筋肉の量を示す。タンパク質、アミノ酸、微量栄養素に基づく栄養補助食品、および筋肉量を増やすための他のアプローチは、アスリートやボディビルダーの間で非常に人気がある。アスリートは継続的にパフォーマンスの向上を目指して努力しているため、除脂肪体重、筋肉サイズ、および／または筋力の増大させるための、より新しくより効果的なサプリメントが引き続き必要とされている。
【０００３】
脂肪組織は、脂肪貯蔵における役割がよく知られているが、熱を発生する特殊な脂肪細胞の作用により、体重増加および代謝性疾患を抑制することもできる。これは褐色脂肪細胞と呼ばれ、特定のデポ（depot）にあり、構成的に高レベルの熱発生遺伝子を発現する。さらに、ベージュ脂肪細胞としても知られている、誘導可能な「褐色」脂肪細胞と呼ばれる別の形態があり、さまざまな活性化因子に応答して白色脂肪で発生する。褐色脂肪細胞およびベージュ脂肪細胞は、代謝性疾患を軽減し、人間の痩せと相関する。褐色脂肪細胞およびベージュ脂肪細胞の生態を調節する多くの遺伝子および経路が同定され、代謝性疾患に有望な様々な治療標的の種類を提供する。
【０００４】
グリコトキシンとしても知られている終末糖化産物（ＡＧＥ）は、還元糖とタンパク質、脂質、または核酸の遊離アミノ基の間の非酵素反応によって形成される、非常に活性なオキシダント化合物の多様なグループであり、この反応は メイラード反応または褐変反応として知られている。ＡＧＥは正常の代謝中に形成され、組織や循環に高レベルのＡＧＥが蓄積されると病原性になる。病原性ＡＧＥは、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、正常な老化プロセス、関節炎、癌、アルツハイマー病などの加齢関連の神経変性疾患の進行やその合併症の発症や悪化に関与している。
【０００５】
特許文献１は、アルファリポ酸またはその誘導体、およびアミノ酸を含む食品サプリメント組成物を開示しており、特許文献２はさらに、個人、特に運動選手の除脂肪体重および／または筋肉のサイズおよび／または強度を増加させる際の前述の組成物の使用方法を開示している。
【０００６】
特許文献３は、体重減少、熱発生、代謝の増加、エネルギーレベルの向上、食欲抑制の促進のため、哺乳動物の除脂肪筋肉量を促進するために、有効量のエピガロカテキンガレート、カフェイン、および１‐チロシンを含む組成物を開示している。
【０００７】
特許文献４は、成長している動物に、総リジンと代謝エネルギーの比が約２．５〜約６ｇ／Ｍｃａｌである組成物を給餌することにより、除脂肪筋肉量を増加させ、および/または脂肪増加を減らすための組成物および方法であって、前記組成物は（ａ）総リジンに対する総アルギニンの比率が約１．１〜約１．６のアルギニン、（ｂ）総イソロイシン対総リジン比が約０．８〜約１．３のイソロイシン、（ｃ）総ロイシン対総リジン比約１．８〜約３．０のロイシン、（ｄ）総バリン対総リジン比が約０．８〜約１．４のバリン、（ｅ）総メチオニン＋シスチン対総リジン比が約０．８〜約１．７のメチオニンおよびシスチンを含む組成物を開示している。
【０００８】
特許文献５は、ＲＡＧＥタンパク質に結合する単離されたタンパク質、特にモノクローナル抗体、特にＣＤＲ移植ヒト化抗体を開示している。具体的には、これらの抗体は、ＲＡＧＥとそのさまざまなリガンドとの結合を阻害する能力を持っている。
【０００９】
特許文献６は、慢性的な糖尿病条件下で発生する終末糖化産物の過剰な生成を阻害するためのシナモンの小枝とムータンの根の樹皮、シナモンの小枝と牡丹の根、またはシナモンの小枝とポリアの組成物を開示しており、終末糖化産物とマトリックスタンパク質間の架橋の断片化の効果を示している。
【００１０】
特許文献７は、クルクマ・ロンガ、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーから得られる濃縮脱メチル化クルクミノイドから選択される少なくとも２つの抽出物を含む、脂肪生成および脂肪分解媒介疾患の予防と改善のための相乗的な抗脂肪生成および脂肪分解促進組成物を開示しているが、終末糖化産物の過剰な生成を阻害し、除脂肪筋量と褐色脂肪組織を増加させるサプリメントについては言及していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／２３８８９号
【特許文献２】米国特許第８８９号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／７７５５６号
【特許文献４】米国特許第９，４２０，８０８号
【特許文献５】欧州特許第２，５００，３６１号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１７／１８２１０７号
【特許文献７】米国特許第８，５４１，３８３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明者の知る限り、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジー、クルクマ・ロンガ由来の抽出物を含む組成物が、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させることは、従来技術には開示されていない。
【００１３】
したがって、終末糖化産物の過剰な生成を阻害し、除脂肪体重および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を増加させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）を褐色脂肪組織（ＷＡＴ）に変換させることにより安全な天然サプリメントを提供することが、当技術分野において引き続き必要とされている。
【００１４】
したがって、本発明の主な目的は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるため、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進するため、および終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する病状を治療するための、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗効果のある組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させる方法、白色脂肪組織（ＷＡＴ）を褐色脂肪組織（ＢＡＴ）に変換する方法、およびモリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジー、クルクマ・ロンガに由来の抽出物または画分または植物化学物質または混合物を含む相乗的組成物を必要とする哺乳動物に適切な用量与えることにより、哺乳動物の終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰生成を阻害し、哺乳動物の終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する病状を治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるため、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進するための、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する病状を治療する、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗効果のある組成物を提供する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させる方法、哺乳動物における白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進する方法であって、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物の組み合わせを含む相乗的組成物の有効用量を哺乳動物に加給することを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、哺乳動物において終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する疾患状態を治療する方法を提供し、この方法は、モリンガ・オレイフェラ（Moringa oleifera）、ムラヤコエンジー（Murraya koenigii）、クルクマ・ロンガ（Curcuma longa）由来の抽出物、画分、植物化学物質、またはそれらの混合物の組み合わせを含み、必要に応じて、薬学的、栄養学的、および栄養学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体の少なくとも１つの追加の成分を含む、相乗効果のある組成物を有効量哺乳類に加給することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】イムノブロットにより、組成物７が３Ｔ３‐Ｌ１脂肪細胞でＰ３ＡＲタンパクを過剰発現することを示す。アクチンタンパクの発現をローディングコントロールと見なした。Ｐ３ＡＲタンパク質発現をデンシトメトリーで測定し、アクチン発現で正規化した。棒グラフは、コントロールおよび組成物７（１０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬ）処理細胞におけるＰ３ＡＲタンパク質の標準化レベルを表す。
【図２Ａ】図２Ａは、組成物７（Composition-7）およびプラセボで処理された被験者における除脂肪体重の平均変化（Ａ）を表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、組成物７（Composition-7）およびプラセボで処理された被験者における脂肪体重の平均変化（Ｂ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を好ましい実施形態および選択的な実施形態に関連して詳細に説明するので、本発明の様々な態様を十分に理解および評価することができる。
【００２１】
除脂肪体重は、脂肪とは独立した体組成の構成要素を表し、総体重から体脂肪を差し引いた値を示す。アスリートやボディビルダーの間では、脂肪を増やさずに筋肉量を増やすためのハーブ抽出物をベースにした栄養補助食品が人気を博している。
【００２２】
褐色脂肪組織
【００２３】
脂肪組織（体脂肪）は、前脂肪細胞に由来する脂肪細胞で構成された緩く結合した結合組織のことであり、人間では、脂肪組織は主に皮膚の下（皮下脂肪）と内臓の周り（内臓脂肪）にある。白色脂肪とも呼ばれる白色脂肪組織（ＷＡＴ）は、哺乳類に見られる２種類の脂肪組織の１つであり、他の種類の脂肪組織は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）である。白色脂肪組織は脂質の形でエネルギーを蓄え、肥満の間に病理学的に拡大する。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、人間や他の哺乳動物における脂肪組織の特殊な形態である。ＢＡＴは哺乳類で進化し、多量の化学エネルギーを熱発生と呼ばれるプロセスを通じて熱として放散させる。褐色脂肪細胞は、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）として知られる特殊なタンパク質を備えたミトコンドリアを多数有する。ＵＣＰ１は、通常は細胞ＡＴＰの合成を促進するために通常使用される電子伝達系を短絡させ、ミトコンドリア膜電位を熱に変換する。これにより、ＢＡＴは、身体活動を増加させることなく、哺乳類のエネルギー消費と燃料代謝を変化させることができる組織になる。交感神経からのカテコールアミンの放出は、褐色脂肪細胞による増殖および熱発生を刺激するＵＣＰ１活性化をもたらす。さらに、褐色脂肪組織にはβ３受容体があり、活性化時に脂肪分解と熱発生に重要な役割を果たす。したがって、β３‐ΑΡνアゴニストはヒトのＢＡＴ熱発生を刺激することができ、代謝性疾患の有望な治療法に繋がる可能性がある。
【００２４】
ベージュ脂肪細胞およびＷＡＴの褐色化（browning）
【００２５】
近年、褐色脂肪組織に関するテーマは、褐色脂肪組織の分化、機能、および治療上の約束に関連する多くの新しい研究によって活発になっている。
【００２６】
特定のデポからのＷＡＴは、適切な刺激に応じて、ＵＣＰ１などの特定のタンパク質発現、多房性脂肪滴と複数のミトコンドリアの存在を増加させることにより、ＢＡＴの特性を引き継ぐ「褐色化」と呼ばれるプロセスを経る。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１α（ＰＧＣ １ａ）も、ＷＡＴの褐色化における中心となる転写の重要な調節因子の１つである。線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＷＡＴの熱発生増加において生理的役割を果たし、褐色化の重要な調節因子である。
【００２７】
ＦＧＦ２１は主に肝臓から分泌されるホルモンであり、ＦＧＦ２１が褐色脂肪組織の発熱機能に関与していることを示す根拠が増えている。脂肪由来のＦＧＦ２１は、オートクリン／パラクリン方式で作用し、脂肪組織におけるＵＣＰ１およびその他の熱発生遺伝子の発現を増加させ、脂肪組織のＰＧＣ １ａレベルを高める。
【００２８】
糖鎖としても知られる終末糖化産物（ＡＧＥ）は、還元糖とタンパク質、脂質、または核酸の遊離アミノ基との間の非酵素反応によって形成され、通常の老化に伴い蓄積する。 ＡＧＥの蓄積は、加齢に伴って発生するマルチシステムの機能低下を加速させ、これは加齢の一因となる。 高血糖時のＡＧＥ（AGEs）の蓄積率の増加は、網膜症、腎症、神経障害、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患など、糖尿病の長期合併症の発症に関係している。さらに、ＡＧＥ形成は、関節炎、結合組織疾患、アミロイドーシス、およびアルツハイマー病などの神経変性アミロイド疾患など、他の多くの病態に関与している。
【００２９】
本発明で使用されるハーブの供給源は以下の通りである
１．モリンガ・オレイフェラは、ウンダバリ村、ウンダバリパンチャヤット、タデパリマンダルグントゥール地区、アーンドラ・プラデーシュ州から収集され、栽培されている。
２．ムラヤコエンジーは、マルカプラム村、マルカプラム、エルルマンダル、ウェストゴダヴァリ地区、アーンドラ・プラデーシュ州から収集され、栽培されている。
３．クルクマ・ロンガは、クンチェナパリ村、クンチェナパリパンチャヤット、タデパリマンダル、グントゥール地区、アーンドラ・プラデーシュ州から収集され、栽培されている。
【００３０】
本発明の発明者は、いくつかのハーブ抽出物およびそれらの組成物を、終末糖化産物の形成を阻害する効力についてスクリーニングした結果、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物が、終末糖化産物（ＡＧＥ）形成の阻害において優れた効力を有することを見出した。
【００３１】
さらに、表５にまとめたように、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジー、クルクマ・ロンガ由来の抽出物を組み合わせた組成物は、個々の成分によって示される効果と比較して、ＡＧＥ形成の阻害において優れた効果を示した。
【００３２】
たとえば、０．６μｇ／ｍＬのモリンガ・オレイフェラ７５％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）は、ＡＧＥ形成の４．２６％の阻害を示した。ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）は０．３μｇ／ｍＬでＡＧＥ形成の８．７０％阻害を示し、９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化された（standardized）クルクマ・ロンガ抽出物は５０．１μｇ／ｍＬで４７％のＡＧＥ形成の阻害を示した。これらの３つの抽出物を６：３：１の比率で含む組成物１（Ｃ‐１）は、１μｇ／ｍＬの濃度で５０．４９％のＡＧＥ形成阻害を示し、これは相加効果（４．２６％＋８．７０％＋５．４７％＝１８．４３％）よりも優れている。これらの３つの成分から、モリンガ・オレイフェラ７５％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物によるＡＧＥ形成の相乗的阻害を示唆した。これらの３つの成分は、表５にまとめた、８：１：１、４：５：１、２：２：１、３：６：１、６：３．５：０．５の比率で組み合わせた、組成物２、３、４、５および６でも相乗効果を示し、ＡＧＥ形成の優れた阻害が示した。
【００３３】
同様に、０．６μｇ／ｍＬのモリンガ・オレイフェラ９０％水性エタノール抽出物（Ｍ.Ｏ‐２）は、ＡＧＥ形成の１７．３２％の阻害を示した。０．３μｇ／ｍＬの終末糖化産物（ＡＧＥ）関連疾患は、糖尿病、網膜症、腎症、神経障害、心筋症、関節リウマチ、骨粗しょう症、老化、癌およびアルツハイマー病といった経変性疾患の進行を含むがこれらに限定されない。（Ｍ．Ｋ‐２）はＡＧＥ形成の８．７０％阻害を示し、０．１％ｇ／ｍＬの９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物は５．４７％のＡＧＥ形成阻害を示した。これらの３つの抽出物を６：３：１の比率で含む組成物７は、１μｇ／ｍＬ濃度で１２．１０％のＡＧＥ形成阻害を示し、これは相加効果（１７．３２％＋８．７０％＋５．４７＝３１．４９％）よりもはるかに優れている。これら３つの成分は、９０％水性モリンガ・オレイフェラエタノール抽出物（ＭＯ‐２）、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物によるＡＧＥ形成の阻害における相乗効果を示唆し、これらのハーブの他の溶媒抽出物を含む組成物も、表５に表すように、ＡＧＥの相乗的阻害を示した。
【００３４】
ＲＡＧＥはＡＧＥの受容体であり、ＥＮ‐ＲＡＧＥ（細胞外に新たに同定されたＲＡＧＥ結合タンパク質）は、その天然の炎症誘発性リガンドである。ＡＧＥがその受容体（ＲＡＧＥ）に結合するには、ＥＮ ＲＡＧＥが必要である。したがって、ＥＮ‐ＲＡＧＥタンパク質の変性は、最終的にＡＧＥとその受容体（ＲＡＧＥ）の結合に影響を与える。ＡＧＥがインターロイキン−６（ＩＬ‐６）およびインターロイキン−８（ＩＬ‐８）の産生を誘発することも先行技術で報告された。そして、これらの炎症誘発性サイトカインは、ＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質のレベルを増加させる。本発明の発明者は、ＥＮ‐ＲＡＧＥ、ＩＬ６およびＩＬ８の調節のための臨床研究の一部として、組成物７を加給された対象から得られたヒト血清サンプルのプールされたサンプルを評価したところ、興味深いことに、組成物７は、プラセボで処理された被験者のそれと比較して、血清ＥＮ‐ＲＡＧＥ、ＩＬ６およびＩＬ８レベルを有意にダウンレギュレートすることが分かり、結果は表６にまとめた。
【００３５】
本発明の発明者はまた、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ抽出物ならびに除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるためのそれらの組成物の可能性を評価した。 脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）や線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）の増加などの特定のタンパク質発現を増加させるための細胞アッセイを用いて、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を加速させた。組成物Ｃ１〜Ｃ１６で処理したマウス３Ｔ３-Ｌ１脂肪前駆細胞は、細胞溶解液のウエスタンブロットアッセイでのバンド強度の増加によって示されるように、ＵＣＰ１の発現に有意な改善を示した。試験サンプルのバンド強度とβ−アクチンのバンド強度の比であるＵＣＰ１発現指数として表される試験サンプルの有効性を表３にまとめた。たとえば、モリンガ・オレイフ７５％エタノール水溶液（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール水溶液（Ｍ．Ｋ‐２）、および９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物を含む組成物１（Ｃ‐１）は、合計６：３：１の比率では、ＵＣＰ１発現指数が０．９２８であるのに対し、対照処理した細胞では０．６０だった。これは、発現指数のほぼ50％の増加になる。同様に、モリンガ・オレイフェラ水性７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、および９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物を含む組成物７（Ｃ‐７）は、合計６：３：１の比率では、０．８８６のＵＣＰ１発現指数が示された。他の組成物の発現データを表３にまとめた。
【００３６】
以前の研究では、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のγコアクチベーター１ａ（ＰＧＣｌａ）がＵＣＰ１の発現を直接誘導することで熱発生を調節することが明らかにされた。さらに、ＦＧＦ２１はＵＣＰ１とＰＧＣｌａの両方の発現を増加させることが知られている。したがって、ＦＧＦ２１は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換、熱発生、および除脂肪体重の増加に役割を果たしている。したがって、本発明者は、マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を用いた細胞アッセイにおけるＦＧＦ２１の調節のために、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガの抽出物ならびにそれらの組成物をスクリーニングした。予期せぬことに、上記の抽出物を含む組成物は、対応する個々の成分と比較して、ＦＧＦ２１レベルがより良い改善を示した。たとえば、モリンガ・オレイフェラ７５％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）は３．０μｇ／ ｍＬで２２．７１％のＦＧＦ２１の増加を示した。ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）は１．５μｇ／ｍＬでＦＧＦ２１が０．７３％の増加を示し、９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物は０．５μｇ／ｍＬで３．０３％のＦＧＦ２１の増加を示した。これらのモリンガ・オレイフェラ７５％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）および９５％総クルクミノイドで標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ.Ｌ‐１）３つの抽出物を６：３：１の比率で含む組成物１は、５μｇ／ｍＬ濃度でＦＧＦ２１の３４．６２％の増加を示し、これはＦＧＦ２１の増加における相加効果（２２．７１％＋０．７３％＋３．０３％＝２６．４７％）よりもはるかに優れている。これらの３つの成分は、表４にまとめられているように、ＦＧＦ２１レベルの優れた改善が示した、８：１：１、４：５：１、２：２：１、３：６：１、６：３．５：０．５の比率で組み合わせた組成物２、３、４、５および６においても相乗効果を示した。
【００３７】
同様に、３．０μｇ／ｍＬのモリンガ・オレイフェラ９０％水性エタノール抽出物（Ｍ.Ｏ‐２）は、２３．４５％のＦＧＦ２１の増加を示した。ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）は１．５μｇ／ｍＬで０．７３％のＦＧＦ２１の増加を示し、９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）で標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物は０．５μｇ／ｍＬで３．０３％のＦＧＦ２１の増加を示した。６：３：１の比率でこれら３つの抽出物を含む組成物７は、５μｇ／ｍＬ濃度でＦＧＦ２１の増加を示し、相添加効果よりもはるかに優れている（２３．４５％＋０．７３％＋３．０３％＝２７．２１％）。これらの３つの成分から、ムラヤコエンジー９０％水性エタノール抽出物（ＭＯ−２）、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）および９５％総クルクミノイド（Ｃ.Ｌ‐１）で標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物からの相乗効果が示唆された。これらのハーブの他の溶媒抽出物を含む組成物は、表４にまとめられているように、ＦＧＦ２１レベルの相乗的改善も示した。
【００３８】
β３アドレナリン受容体（β３‐ΑII）は脂肪細胞にある。この受容体は、Ｇタンパク質の作用を介して、アデニル酸シクラーゼのエピネフリンおよびノルエピネフリン誘発活性化に関与している。脂肪細胞におけるβ３ＡＲの活性化は、ベージュ/ブライト細胞を介した白色脂肪細胞から褐色脂肪細胞への形質転換の調節因子として示されている（Cypess et al．，Cell Metab．2015，21（1）：33-38）。本発明において、組成物７は、図１に示されるように、用量依存的に、マウス脂肪細胞においてＰ３ＡＲの過剰発現を誘導する。したがって、組成物７は、白色脂肪細胞の褐色脂肪細胞への変換または白色脂肪の褐色化を介して除脂肪体重を増加させる可能性がある。
【００３９】
本発明の発明者はまた、臨床研究において除脂肪体重を改善するために、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガから選択される抽出物を含む組成物７を評価した。プラセボ群と治療群の被験者の体重を基準日（ベースライン）と最終日に測定した。同様に、体脂肪組成は、ベースラインと最終日にＤＥＸＡ装置を使用して測定された。除脂肪体重は、プラセボ群と治療群の両方の被験者の標準式を使用して計算し、データは表７にまとめた。興味深いことに、このデータは、上記の組成物７を被験者に加給すると、除脂肪体重が増加し（図２Ａ）、脂肪体重が減少した（図２Ｂ）ことを示している。
【００４０】
したがって、前述のことは、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジー、クルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分、ならびにモリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジー、クルクマ・ロンガに由来する抽出物を含む相乗的組成物が、ａ）ＡＧＥの過剰な生成を阻害することにより、終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する合併症の治療、ｂ）白色脂肪組織の褐色脂肪組織への変換または脂肪の褐色化、およびｃ）ＵＣＰ１の増加およびＦＧＦ２１の増加により除脂肪体重を増加する強力な天然サプリメントであることを示した。
【００４１】
したがって、本発明の１つの重要な実施形態は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進し、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含む相乗的組成物を提供することである。
【００４２】
さらに他の実施形態では、本発明は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含む相乗的組成物を開示ておりし、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進するためのモリンガ・オレイフェラ由来成分の重量は１０％〜９０％の範囲で変化し、ムラヤコエンジー由来成分の重量は１０％〜９０％の範囲内で変化し、クルクマ・ロンガ由来成分の重量は５％〜３０％の範囲で変化する。
【００４３】
さらに別の実施形態では、本発明は、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含む相乗的組成物を開示しており、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進するためのモリンガ・オレイフェラ由来成分の重量は３０％〜８０％の範囲で変化し、ムラヤコエンジー由来成分の重量は１０％〜６０％範囲内で変化し、クルクマ・ロンガ由来成分の重量は、５％〜２０％の範囲で変化する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、モリンガ・オレイフェラ７５％水性エタノール抽出物６割、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物３割、および９５％総クルクミノイドで標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物１割を含む相乗的組成物（組成物１；Ｃ１）を開示しており、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるためのクルクミノイド; 白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、モリンガ・オレイフェラ９０％水性エタノール抽出物６割、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物３割、および９５％総クルクミノイドで標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物１割を含む相乗的組成物（組成物７；Ｃ７）を開示しており、除脂肪体重および褐色脂肪組織の増加、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進する。
【００４６】
他の実施形態では、本発明は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される希釈剤、および薬学的に許容される賦形剤から選択される少なくとも１つの追加成分を任意に含む相乗的組成物を開示しており、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進する許容可能な担体を開示している。
【００４７】
さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物において除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させる方法、ならびに哺乳動物において白色脂肪組織（ＷＡＴ）を褐色脂肪組織（ＷＡＴ）に変換する方法を開示し、この方法は、哺乳動物に有効量のモリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で、薬学的、栄養補助的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む相乗的組成物を加給することにある。
【００４８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含む相乗的組成物を開示し、これは、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの上昇に関連する疾患の兆候を治療する。
【００４９】
さらに別の実施形態において、本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加に関連する疾患の兆候を治療する、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含む相乗的組成物を開示しており、モリンガ・オレイフェラ由来成分の重量が１０％〜９０％の範囲で変化し、ムラヤコエンジー由来成分の重量は１０％〜９０％の範囲で変化し、クルクマ・ロンガ由来の成分の重量は５％〜３０％の範囲で変化する。
【００５０】
さらに別の実施形態において、本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、終末糖化産物（ＡＧＥ）レベルの増加に関連する疾患の兆候を治療する、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含む相乗的組成物を開示しており、モリンガ・オレイフェラ由来成分の重量が３０％〜８０％の範囲で変化し、ムラヤコエンジー由来の成分の重量が１０％〜６０％の範囲で変化し、クルクマ・ロンガ由来の成分の重量は５％〜２０％の範囲で変化する。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害する、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物６割、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物３割、および９５％総クルクミノイドに標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物１割を含む相乗的組成物（組成物１；Ｃ１）を開示する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害する、モリンガ・オレイフェラ９０％水性エタノール抽出物を６割、ムラヤコエンジー６０％水性エタノール抽出物を３割、および９５％総クルクミノイドに標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物１割を含む相乗的組成物（組成物７；Ｃ−７）を開示する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で栄養補給上および栄養学的に許容される賦形剤、希釈剤および終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害するための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む相乗的組成物を開示する。
【００５４】
さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する疾患を治療する方法を開示し、この方法は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、場合によっては、薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む組成物を哺乳動物に有効量加給することを含む。
【００５５】
さらに別の実施形態において、本発明は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガ由来の抽出物または、任意で、薬学的、栄養学的、および栄養学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む画分、植物化学物質、またはそれらの混合物を含む有効量の相乗的組成物を哺乳動物に加給（supplementing）することにより、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する疾患を治療する方法を開示する。ここで、ＡＧＥに関連する疾患状態には、糖尿病、網膜症、腎症、神経障害、心筋症、関節リウマチ、骨粗しょう症、老化、癌、およびアルツハイマー病などの加齢関連の神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する病状を治療するためのモリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤および除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む相乗的組成物を開示する。ここで、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体には、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、黄色デキストリン、白色デキストリン、アエロジル、微結晶セルロース、ニューシリン、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ソルビトール、ステビオシド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アカシア、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ニコチンアミド、色素、香料、防腐剤、蒸留水、生理食塩水、グルコース水溶液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、さまざまな動植物油、白色軟パラフィン、パラフィン、香料、着色料、ワックスが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳類における終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する疾患を治療するための、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で、薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤、除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む相乗的組成物を開示する。ここで、抽出物、画分および植物化学物質を調製するために使用される溶媒には、エタノール、メタノールなどの炭素数１〜５のアルコール、ヘキサンなどの炭素数１〜７の炭化水素、 酢酸エチルなどのようなエステルおよびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害（inhibiting）し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）関連の疾患を治療するためのモリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で、薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤および除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む相乗的組成物を開示する。ここで、抽出物、画分および植物化学物質を調製するために使用される植物部分には、葉、茎、柔らかい茎、空中部分、果実、果実皮、種子、花頭、根、樹皮、根茎または植物全体またはそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への変換を促進し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳類の終末糖化産物（ＡＧＥ）関連の疾患を治療するためのモリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤および除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させるための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含む相乗的組成物を開示する。ここで、本発明の組成物は、固体、液体、食品、栄養補助食品または任意の適切な剤形、例えば、制御放出ポリマーベースを使用して、錠剤、カプセルまたはソフトチュー、制御放出錠剤、ナノテクノロジー、マイクロカプセル化、コロイド担体システムおよび他の薬物送達システムを含む技術によるコーティングで製剤化され得る。
【００６０】
さらに別の実施形態では、本発明は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈剤、および終末糖化産物（ＡＧＥ）の過剰な生成を阻害し、哺乳動物における終末糖化産物（ＡＧＥ）に関連する疾患を治療するための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含むこれらの相乗的組成物の使用を提供する。
【００６１】
さらに別の実施形態では、本発明は、モリンガ・オレイフェラ、ムラヤコエンジーおよびクルクマ・ロンガに由来する抽出物または画分または植物化学物質またはそれらの混合物を含み、任意で薬学的、栄養学的および食餌療法的に許容される賦形剤、希釈液、および哺乳動物の除脂肪体重および褐色脂肪組織を増加させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）を褐色脂肪組織（ＷＡＴ）に変換するための担体から選択される少なくとも１つの追加成分を含むこれらの相乗的組成物の使用を提供する。
【００６２】
当業者は、その広範な発明の概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更を加えることができることを理解するであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態または実施例に限定されず、本明細書に規定された本発明の目的および範囲内における変更を含むことを意図することが理解される。提示された実施形態は本発明を例示するが、それらは決して本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【００６３】
実施例１：モリンガ・オレイフェラのエタノール抽出物の調製
【００６４】
モリンガ・オレイフェラの葉（１００ｇ）を粉砕し、エタノール（７００ｍＬ）で室温で１時間抽出した。抽出物をろ過し、使用済みの原材料を同様の条件下でエタノール（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、エタノール抽出物の残留物を乾燥粉末として得た（Ｍ．Ｏ‐１；８．７ｇ）。
【００６５】
実施例２：モリンガ・オレイフェラの水性エタノール抽出物の調製
【００６６】
モリンガ・オレイフェラの葉（１００ｇ）を粉砕し、９０％エタノール水溶液（７００ｍＬ）で６５〜７０℃で１時間抽出した。抽出物をろ過し、使用した原料を同様の条件下で９０％エタノール水溶液（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、９０％水性アルコール抽出物を乾燥粉末（Ｍ．Ｏ‐２；２０ｇ）として得た。７５％水性エタノール抽出物（Ｍ.Ｏ‐３；２２ｇ）と５０％水性エタノール抽出物（Ｍ.Ｏ‐４；２２ｇ）は、それぞれ７５％水性エタノールと５０％水性エタノールを抽出溶媒に使用して同様の手順で得た。
【００６７】
実施例３：モリンガ・オレイフェラのメタノールおよび水抽出物の調製
【００６８】
モリンガ・オレイフェラの葉（１００ｇ）を粉砕し、メタノール（７００ｍＬ）で室温で１時間抽出した。抽出物をろ過し、使用済みの原材料を同様の条件下でメタノール（２×５００ ｍＬ）で２回再抽出した。合わせた抽出物を濾過し、真空下で濃縮し、メタノール抽出物の残留物を乾燥粉末として得た（Ｍ．Ｏ‐５；２０ｇ）。
【００６９】
水抽出物（Ｍ．Ｏ‐６；２６ｇ）は、抽出溶媒として水を使用して同様の手順で得られた。
【００７０】
標準化（正規化）：上記のモリンガ・オレイフェラ抽出物は、分析用ＨＰＬＣ法によりケルセチン‐３‐Ｏ‐グリコシドに標準化された。結果を表１にまとめた。
【００７１】
【表１】
2020536949.tif 000003
【００７２】
実施例４：ムラヤコエンジーエタノール抽出物の調製
【００７３】
ムラヤコエンジー葉（１００ｇ）を粉砕し、エタノール（７００ｍＬ）で室温で１時間抽出した。抽出物をろ過し、使用済みの原材料を同様の条件下でエタノール（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。合わせた抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、エタノール抽出物の残留物を乾燥粉末として得た（Ｍ．Ｋ‐１；４．６ｇ）。
【００７４】
実施例５：ムラヤコエンジー水性エタノール抽出物の調製
【００７５】
ムラヤコエンジー葉（１００ｇ）を粉砕し、６０％水性エタノール（７００ｍＬ）で６５〜７０℃で１時間抽出した。抽出物をろ過し、使用済みの原料を同様の条件下で６０％エタノール水溶液（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。合わせた抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、エタノール抽出物の残留物を乾燥粉末として得た（Ｍ．Ｋ‐２；２０ｇ）。
【００７６】
８０％エタノール水溶液（Ｍ．Ｋ‐３；１５ｇ）は、抽出溶媒として８０％エタノール水溶液を用いて同様の手順を行うことで得られた。
【００７７】
実施例６：ムラヤコエンジー６０％水性メタノール抽出物の調製
【００７８】
ムラヤコエンジー葉（１００ｇ）を粉砕し、粉末を実験用抽出器に入れ、６５〜７０℃で１時間、６０％メタノール水溶液（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、使用した原料を同様の条件下で６０％メタノール水溶液（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。合わせた抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、乾燥粉末として水性６０％メタノール抽出物の残留物（Ｍ．Ｋ‐４；１９ｇ）を得た。
【００７９】
実施例７：ムラヤコエンジー水抽出物の調製
【００８０】
ムラヤコエンジー葉（１００ｇ）を粉砕し、水（７００ｍＬ）で室温で１時間抽出した。 抽出物をろ過し、使用した原材料を同様の条件下で水（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。 合わせた抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、乾燥粉末として水抽出物を得た（ＭＫ‐５；１６ｇ）。
【００８１】
標準化：上記のムラヤコエンジー葉抽出物は、分析用ＨＰＬＣ法によってマハニン（mahanine）に標準化された。結果は表２にまとめた。
【００８２】
【表２】
2020536949.tif 000004
【００８３】
実施例８：９５％総クルクミノイドに標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）
【００８４】
９５％総クルクミノイドに標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）は、市場で広く入手可能であり、商用から調達した。市販の材料は、社内仕様への準拠をチェックするために、社内のクルクミンマーカーでテストした。
【００８５】
実施例９：クルクマ・ロンガ抽出物の調製
【００８６】
クルクマ・ロンガ根茎（５００ｇ）を粉砕し、９０％エタノール水溶液（７００ｍＬ）で７０〜７５℃で１時間抽出した。抽出物をろ過し、使用した原料を同様の条件下で９０％エタノール水溶液（２×５００ｍＬ）で２回再抽出した。合わせた抽出物を濾過し、真空下で濃縮して、９０％エタノール抽出物の残渣を黄色の濃厚なペースト（Ｃ．Ｌ‐２；５０ｇ）として得た。ＨＰＬＣ：総クルクミノイド：２４．８％。
【００８７】
上記のＣＬ‐２サンプル（５０ｇ）を、攪拌しながら６０〜６５℃で０．５時間、８０％エタノール水溶液（３０ｍＬ）に溶解した。溶液を１６時間静置し、沈殿した固体を濾過し、５０％エタノール水溶液で洗浄し、減圧下で乾燥して、生成物を黄色の粉末（Ｃ．Ｌ‐３； １５ｇ）として得た。ＨＰＬＣ：総クルクミノイド：４０．０％。
【００８８】
実施例１０：モリンガ・オレイフェラ抽出物、ムラヤ・コエニーギ抽出物およびクルクマ・ロンガ抽出物を含む組成物の調製
【００８９】
組成物１（Ｃ‐１）：組成物１は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物を（Ｃ．Ｌ‐１）６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９０】
組成物２（Ｃ‐２）：組成物２は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物を（Ｃ．Ｌ‐１）８：１：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９１】
組成物３（Ｃ‐３）：組成物３は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を４：５：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９２】
組成物４（Ｃ‐４）：組成物４は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を２：２：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９３】
組成物５（Ｃ‐５）：組成物５は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を３：６：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９４】
組成物６（Ｃ‐６）：組成物６は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３．５：０．５の比率で組み合わせて調製した。
【００９５】
組成物７（Ｃ‐７）：組成物７は、モリンガ・オレイフェラ９０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９６】
組成物８（Ｃ‐８）：組成物８は、モリンガ・オレイフェラ５０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐４）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９７】
組成物９（Ｃ‐９）：組成物９は、モリンガ・オレイフェラ（Ｍ．Ｏ‐５）の７５％エタノール抽出物、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９８】
組成物１０（Ｃ‐１０）：組成物１０は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【００９９】
組成物１１（Ｃ‐１１）：組成物１１は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【０１００】
組成物１２（Ｃ‐１２）：組成物１２は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【０１０１】
組成物１３（Ｃ‐１３）：組成物１３は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー６０％メタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐４）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【０１０２】
組成物１４（Ｃ‐１４）：組成物１４は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジー水抽出物（ＭＫ‐５）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【０１０３】
組成物１５（Ｃ‐１５）：組成物１５は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジーの６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【０１０４】
組成物１６（Ｃ‐１６）：組成物１６は、モリンガ・オレイフェラ７５％エタノール抽出物（Ｍ．Ｏ‐３）、ムラヤコエンジーの６０％エタノール抽出物（Ｍ．Ｋ‐２）、およびクルクミノイド総量が９５％に標準化されたクルクマ・ロンガ抽出物（Ｃ．Ｌ‐１）を６：３：１の比率で組み合わせて調製した。
【０１０５】
実施例１１：脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）アッセイ
【０１０６】
マウス３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞（３ｍＬ、１５００００細胞／ウェル）を６ウェルの細胞培養プレートに播種し、１０％ＦＢＳおよび４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の加湿環境で維持した。
【０１０７】
細胞がコンフルエント（confluent）になった後（〜２日）、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、および１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに５００ｎＭのインスリンを含む分化培地（ＤＭ）を用いて、分化を４８時間行った。
【０１０８】
細胞培養培地を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに１００μΜのインスリンを含むポストＤＭ（post-DM）に交換し、ポストＤＭを６日目まで４８時間ごとに新しい培地に交換した。７日目に、培地をウェルから吸引し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２回洗浄した。
【０１０９】
細胞は、１％ＦＢＳ（総容量１ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地でさまざまな濃度の試験サンプル（５０μＬ）で処理し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃でさらに４８時間インキュベートした。
【０１１０】
ウエスタンブロット：インキュベーション後、細胞培養プレートをアイストレイに置き、ＩＸＢＰＳで2回洗浄した。８０マイクロリットルの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｇ／ｍＬ  アプロチニン、１０ｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３Ｖ０４、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、および１０Ｍμ ペプスタチン）を各ウェルに添加し、細胞溶解物をそれぞれのマイクロチューブに収集した。前記マイクロチューブを1分間超音波処理し、細胞タンパク質は２１９５２ｘｇでの遠心分離後に収集した。タンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific Cat＃23225）を用いて定量した。タンパク質サンプルに対してＳＤＳ‐ＰＡＧＥを行い、分離したタンパク質をウェットブロッティング法を用いてニトロセルロースメンブレンに転写した。簡潔には、タンパク質の１０μｇをアクリルアミドゲルにロードし（１０％分解）、１００Ｖで約１時間４０分泳動させた。電気泳動の終わりに、転写システムを４℃チャンバー（１００Ｖ、２時間）に置くことにより、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写（transferred）した。転写後、ＵＣＰ‐１は、抗ＵＣＰ‐１抗体（Thermo Scientific Cat＃PA1-24894; 1：1000希釈）を使用して４℃で１８時間インキュベートしてプローブされた。β‐アクチンは、室温で２時間インキュベートした抗Ｐ‐アクチン抗体（Sigma Cat＃A4700-100uL; 1：10000希釈）を用いてプローブされた。ペルオキシダーゼアフィニピュアマウス抗ヤギ二次抗体（Jackson Immuno Research Cat＃205-035-108; 1：10000希釈）を加え、室温で３０分間インキュベートした。最後に、化学発光基質（chemilumini scent substrate）（Thermo Scientific Cat＃34080）を用いてブロットを作成し、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ分子イメージャー（モデル：ChemiDOC XRS+）を用いて画像をキャプチャした。タンパク質バンドの強度は、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ ＭＩソフトウェアを使用して計算され、β‐アクチンを用いて標準化された。ＵＣＰ１発現の相対インデックスは、試験区または対照区とβ‐アクチンで処理した細胞のバンド強度の比を計算することで得られた。データを表３にまとめた。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
実施例１２：線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）アッセイ
【０１１３】
マウス３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞（３ｍＬ、１５００００細胞／ウェル）を６ウェル細胞培養プレートに播種し、１０％ＦＢＳおよび４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の加湿条件（humidified atmosphere）で維持した。細胞がコンフルエントになった後（〜２日）、０．５ｍＭの ＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、および１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに５００ｎＭインスリンを含む分化培地（ＤＭ）を用いて、分化を４８時間実行した。細胞培養培地を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１００μＭインスリンを含むポストＤＭに交換し、ポストＤＭを６日目まで４８時間ごとに新しく交換した。７日目に、培地をウェルから吸引し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２回洗浄した。 細胞は、１％ＦＢＳ（総容量１ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地でさまざまな濃度の試験サンプル（５０μＬ）で処理し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃でさらに４８時間インキュベートした。インキュベート後、５０μＬの無細胞上清をウェルから収集し、ＥＬＩＳＡによるＦＧＦ２１分析のために処理した。ＦＧＦ２１ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃ＤＹ２５３９）は、製造元のプロトコルに従って実施した。
【０１１４】
ＦＧＦ２１の増加率は以下の数式１を使用した。
【０１１５】
【数１】
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【０１１６】
各成分および各組成物におけるＦＧＦ２１の活性増加は以下の表４にまとめた。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
実施例１３：終末糖化産物（ＡＧＥ）アッセイ
【０１１９】
ＡＧＥ形成アッセイは、少し変更を加えて前述の方法に従って実施した（Tupe et al．，2015）。 簡単に言えば、組成物またはそれらの個々の成分は、０．２５ｍｇの１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．２５ｍＬの２５０ｍＭフルクトースおよび０．５ ｍＬの０．０２％アジ化ナトリウムを含むＩＸ Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸カリウムバッファー生理食塩水[IX DPBS、200μΜ 、pH 7.4]を含む。同時に、試験サンプルまたはフルクトース非含有の反応混合物は、それぞれＡＧＥ誘導またはネガティブコントロールと見なされる。すべての反応において、総反応容量は１．０ｍＬとなった。完全な反応混合物を、無菌条件下、密封されたチューブ内で３７℃で７日間暗所でインキュベートした。すべての反応において、ＤＭＳＯ濃度は０．０５％に維持された。インキュベーション期間後、未結合のフルクトースを１ＸＤＰＢＳに対する透析により除去し、透析液の蛍光強度をＥｘで測定した。 マルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｓｐｉｒｅ ２３００、マサチューセッツ州ウォルサム）での３７０ｎｍ／Ｅｍ４４０ｎｍ。 陰性対照で得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）値を使用して、テストサンプルと誘導からのデータを標準化した。ＡＧＥ形成阻害は以下の数式２により算出した。結果を表５にまとめた。
【０１２０】
【数２】
2020536949.tif 000008
【０１２１】
参照: Tupe RS, Sankhe NM, Shaikh SA, Kemse NG, Khaire AA, Phatak DV, and Parikh JU. Nutraceutical properties of dietary plants extracts: prevention of diabetic nephropathy through inhibition of glycation and toxicity to erythrocytes and HEK293 cells. Phar.Biol. 2015; 53: 40-50.
【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
実施例１４：プロテオームプロファイリングアッセイ
【０１２４】
プロテオームプロファイリングアッセイは、終末糖化産物（ＡＧＥ）のいくつかの重要なマーカーの変調を明らかにした。健康な肥満の被験者に対して行われた無作為化二重盲検臨床試験から得られたプールされた血清サンプルに対してアッセイを行った。１４０人の被験者（ボディマスインデックス２７〜２９．９ｋｇ／ｍ２、２９．３％男性、２１〜５０歳）を無作為にプラセボ（ｎ=７０）と組成物７（ｎ＝７０）のグループに分けた。対象は、９００ｍｇ／日の組成物７を２回に分けて投与するか、２つの同一のプラセボカプセルを１６週間投与した。試験期間の終わりに、収集された血清サンプルをグループごとにプールした。 プールされた血清サンプルは、市販のプロテオームプロファイラーキット（アディポカインアレイキット、Ｒ＆Ｄシステム、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、さまざまなバイオマーカーの発現の変調を分析した。アッセイ手順は、基本的にキットの製造元から提供された説明書に従った。簡単に言えば、それぞれが二重にプリント（printed）された異なる捕捉抗体を含む個々のニトロセルロース膜を、プラセボまたは組成物7のいずれかのプールされた血清サンプルと反応させた。膜上の免疫反応スポットは、キットに付属のＣｈｅｍｉ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｘを使用して開発された。膜上の化学発光スポットの画像は、分子イメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ+、ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によってキャプチャされた。キャプチャされた画像の免疫反応の濃度測定分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、コネチカット州ニューヘブン）によって実行された。プラセボと比較した、組成物７によるＡＧＥ関連のマーカーの変調の結果は、表６にまとめた。
【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
実施例１５：組成物７は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてβ３アドレナリン受容体（p3AR）の過剰発現を誘発する：
【０１２７】
細胞培養と処理：マウス前脂肪細胞３Ｔ３‐Ｌ１細胞を、２ｍＭグルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、および１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。同数の細胞を２４ウェル培養プレートの各ウェルに播種した。 細胞を１０および２５μｇ／ｍｌの組成物７で２時間前処理した後、５００ｎＭインスリン、１．０μＭデキサメタゾン、および０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む分化培地を４８時間添加した。
【０１２８】
その後、細胞を、組成物７の存在下または非存在下で、分化後培地（１００ｎＭインスリンを含むＤＭＥＭ）とさらにインキュベートした。 媒体対照細胞を０．２％ＤＭＳＯで処理した。
【０１２９】
最後に、細胞を採取し、冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、溶解緩衝液で溶解した。 タンパク質抽出物を１４，０００ｇで２０分間清澄化した。タンパク質含有量は、クーマシーブルー色素を使用してブラッドフォード法で測定し、細胞溶解物は、使用までアリコートで−８０℃で保存した。
【０１３０】
組成物７処理細胞におけるβ３アドレナリン受容体（Ｐ３ＡＲ）タンパク質発現の調節は、以下に記載されるように免疫ブロットアッセイを使用して評価された。
【０１３１】
ウエスタンブロットアッセイ：簡潔に言うと、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで等量の細胞溶解物タンパク質が７．５％で分離した。その後、タンパク質はニトロセルロース膜に移された。非特異的部位をブロックした後、膜をＰ３ＡＲ抗体（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マサチューセッツ州セイラム）とインキュベートした。
【０１３２】
最後に、特定の免疫反応性バンドがＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ‐Ｐｉｃｏ化学発光基質（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）で発現（developed）され、免疫ブロット画像はコダックイメージステーション（コダック、米国）で記録された。
【０１３３】
ブロットしたメンブレンを剥がし、β‐アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、ミズーリ州セントルイス）で再プローブした。バンド強度はデンシトメトリーで計算され、アクチンの発現で正規化された。図１に示すように、組成物７は用量依存的にβ３ＡＲを過剰発現させた。
【０１３４】
実施例１６：体組成の平均変化
【０１３５】
無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験は、組成物７の有効性を評価するためにヒト被験者で行われた。１４０人の適格な被験者を無作為に治療群またはプラセボ群に分けた。
【０１３６】
治療群の被験者には、９００ｍｇ（４５０ｍｇカプセル、１日２回）の組成物７が投与され、プラセボ群の被験者には、１１２日間同様のプラセボが投与された。治療群の66人の被験者とプラセボ群の６６人の被験者で研究を行った。
【０１３７】
脂肪量（ＦＭ）は、ベースラインと最終日に、ＤＥＸＡ装置と体重（ＢＷ）を用いて測定された。すべての被験者の除脂肪体重（ＬＢＭ）は、式ＬＢＭ＝ＢＷ−ＦＭに基づいて計算され、データは以下の表７にまとめた。
【０１３８】
試験期間の終わりに、組成物７を加給した治療群の被験者の除脂肪体重は有意に（ｐ＝０．００６１）０．９０±０．４６４ｋｇ増加した。一方、プラセボ群では、ベースラインから０．９１±０．４５３ｋｇ減少した。 除脂肪体重の平均変化（Ａ）と脂肪体重の平均変化（Ｂ）を図２に示す。
【０１３９】
【表７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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