(57)【要約】  本発明は、限定されるものではないが、ＣＤ７３を発現する細胞を特徴とするがんの処置を含む、がんを処置するための、可溶性ヒトＣＤ３９の酵素活性を阻害する化合物を使用する方法に関する。
2020536109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体の処置における使用のための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体であって、処置が、患者に、（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体、および（ｂ）ヒトＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤のそれぞれの有効量を投与することを含む、抗体。
【請求項２】
ヒト個体の処置における使用のための、ヒトＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤であって、処置が、患者に、（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体、および（ｂ）ヒトＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤のそれぞれの有効量を投与することを含む、薬剤。
【請求項３】
ＣＤ７３陽性がんを有する個体の処置における使用のための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体。
【請求項４】
方法が、個体に、ヒトＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤、適宜、抗体を投与することをさらに含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ヒトＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する薬剤が、ヒトＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤の投与の前に投与される、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
ヒトＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体が、溶液中でのヒト細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性の５０％を超える、適宜、６０％を超える、適宜、７０％を超える、または適宜、８０％を超える低下を引き起こすことができる、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
ヒトＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤が抗体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
ヒトＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体およびＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤が、別々の投与のために製剤化され、同時的に、または連続的に投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
個体がＣＤ７３陽性がんを有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体が、配列番号６に記載の配列を有する重鎖可変ドメインの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号７に記載の配列を有する軽鎖可変ドメインの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインとを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤が、ＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３の細胞内内在化を誘導する、または増加させる抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤が、ＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３の細胞内内在化を実質的に増加させることなく、ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体が、ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよび／またはＣＤ６４ポリペプチドへの結合を実質的に欠く、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
前記抗ＣＤ３９抗体および／または抗ＣＤ７３抗体が、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
抗ＣＤ３９抗体および／または抗ＣＤ７３抗体がＦｃドメインを欠くか、またはＦｃドメインとＦｃγ受容体との結合を減少させるように改変されたＦｃドメインを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
前記抗体が抗体断片である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体断片、または複数の異なる抗体断片を含む多特異的抗体から選択される、請求項１６に記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良である個体、および／またはヒトＣＤ７３ポリペプチドを阻害する薬剤を用いた処置に対して耐性である固形腫瘍を有する個体におけるがんの処置における使用のための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体。
【請求項１９】
個体が、免疫抑制および／または消耗の１つまたは複数のマーカーを特徴とする免疫エフェクター細胞を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
個体が、高レベルのＣＤ７３を発現する細胞を特徴とする腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２１】
個体におけるがんの処置または防止における使用のための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体であって、処置が、
ａ）個体がＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良であるかどうかを決定すること、および、
ｂ）個体がＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良であると決定された際に、個体に、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体を投与すること、
を含む、抗体。
【請求項２２】
個体がＣＤ７３の阻害活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良であることの決定が、個体由来生物試料中の免疫エフェクター細胞が免疫抑制および／または消耗の１つまたは複数のマーカーを特徴とするかどうかを評価することを含み、免疫抑制および／または消耗の１つまたは複数のマーカーを特徴とする免疫エフェクター細胞の存在および／またはそのレベルの上昇が、ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良であることを示す、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
個体がＣＤ７３の阻害活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良であることの決定が、個体に由来する腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織がＣＤ７３発現、適宜、高レベルのＣＤ７３発現を特徴とするかどうかを評価することを含み、ＣＤ７３発現、適宜、高レベルのＣＤ７３発現が、ＣＤ７３の阻害活性を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良であることを示す、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
個体が、ヒトＣＤ７３ポリペプチドを阻害する薬剤を用いた以前の処置の後に進行または再発したがんを有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
処置が、個体にヒトＣＤ７３ポリペプチドを阻害する薬剤を投与することをさらに含む、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
個体が固形腫瘍を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
個体が卵巣がんを有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
個体が胃がんを有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
個体が肺がんを有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
個体が結腸がんを有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
個体が食道がんを有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体、ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤、適宜、抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体の用量、および（ｂ）ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤、適宜、抗体の用量を含むキット。
【請求項３４】
（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体の有効量を含有する単回用量医薬組成物の複数のパッケージ、および（ｂ）ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する抗体の有効量を含有する単回用量医薬組成物の複数のパッケージを含むキット。
【請求項３５】
抗体が、アミノ酸配列ＤＹＮＭＨ（配列番号８）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＶＰＬＮＧＧＳＴＦＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列ＧＧＴＲＦＡＹ（配列番号１０）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＶＳＦＭＹ（配列番号１１）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号１２）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列ＱＱＴＫＥＶＰＹＴ（配列番号１３）を含むＬＣＤＲ３領域を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【請求項３６】
抗体が、配列番号６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【請求項３７】
可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体が、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【請求項３８】
可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体が、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９の重鎖可変領域の機能保存変異体である重鎖可変領域と、それぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域の機能保存変異体である軽鎖可変領域とを含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【請求項３９】
可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができる抗体が、配列番号５９〜６２のいずれかのヒト重鎖定常領域に融合した抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９の重鎖可変領域の機能保存変異体である重鎖と、ヒトＣκ軽鎖定常領域に融合したそれぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域の機能保存変異体である軽鎖とを含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【請求項４０】
抗体が、
（ａ）前記抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７（配列番号１を参照する）からなる群から選択される１、２、３または４個の残基に突然変異を含むＣＤ３９ポリペプチド突然変異体；
（ｂ）前記抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、突然変異Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９ＡおよびＥ１４２Ｋ（配列番号１を参照する）を含むＣＤ３９ポリペプチド突然変異体；
（ｃ）前記抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、突然変異Ｋ８７Ａ、Ｅ１００ＡおよびＤ１０７Ａ（配列番号１を参照する）を含むＣＤ３９ポリペプチド突然変異体；ならびに／または
（ｄ）前記抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、突然変異Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６ＧおよびＶ３７７Ｓ、および残基３７６と３７７の間にバリンの挿入（配列番号１を参照する）を含むＣＤ３９ポリペプチド突然変異体
への結合が減少している、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【請求項４１】
抗体が、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７にＮ結合グリコシル化を含み、Ｋａｂａｔ残基２３４および２３５、適宜、さらにＫａｂａｔ残基３３１、適宜、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７ならびにＫａｂａｔ残基３３０および／または３３１にアミノ酸置換を含む改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、適宜、Ｆｃドメインが、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の組成物または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５６８，８１２号および２０１８年６月１８日に出願された同第６２／６８６，１４３号（両方とも、図面を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子形式での配列表と共に出願される。配列表は、２０１８年１０月５日に作成された「ＣＤ３９−７＿ＳＴ２５」の表題のファイルとして提供され、７３ＫＢのサイズである。配列表の電子形式での情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、がんの処置のためのＣＤ３９中和剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＮＴＰＤａｓｅ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１）は、ＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１または血管ＣＤ３９としても知られ、別の酵素、ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）と共に機能して、細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を加水分解してアデノシンを生成し、これがアデノシン受容体に結合し、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答を阻害することによって、免疫系を抑制する。ＣＤ７３／ＣＤ３９経路によるアデノシンの生成は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）免疫抑制機能の主な機構として認識されている。ＣＤ３９は、ＮおよびＣ末端の近くの２個の膜貫通ドメイン、短い細胞質ＮおよびＣ末端セグメント、ならびに活性部位を含有する大きい細胞外ドメインを有する。しかしながら、ＣＤ３９は、典型的には、分子の２つの末端にある２個の膜貫通ドメインによって膜に固定されるが、可溶性の触媒的に活性な形態のＣＤ３９を、ヒトおよびマウスにおける循環中に見出すことができることも最近報告された（Yegutkin et al., (2012) FASEB J. 26(9): 3875-3883）。
【０００５】
ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）は、通常、内皮細胞および造血幹細胞のサブセット上に発現される７０ｋＤａのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質である。ＣＤ７３の発現は、特に、白血病、膀胱がん、グリオーマ、グリア芽腫、卵巣がん、メラノーマ、前立腺がん、甲状腺がん、食道がんおよび乳がんを含む様々な腫瘍細胞中で報告されている。ＣＤ７３の発現は、メラノーマおよび乳がんにおける前転移表現型とも関連している。
【０００６】
ＣＤ７３に特異的に結合する抗体は、ＣＤ７３に対する選択性がより高い低分子の代替手段を提供し得る。しかしながら、試験された抗体は、一般に、ＣＤ７３の酵素活性の部分的阻害を示したに過ぎない。マウスＣＤ７３に結合する抗体を用いた治療は、マウスにおける乳腺腫瘍の増殖および転移を阻害することができることが示された（Stagg, et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:1547-1552）。しかしながら、抗体はヒトおよびマウスのＣＤ７３と交差反応せず、抗体およびＣＤ７３の生物学的機能の研究を複雑にしている。Ａ２Ａ受容体の遺伝的欠失が、Ｔ細胞依存的腫瘍拒絶を誘導することができることが示された（Ohta, et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103: 13132-13137）。ｓｉＲＮＡを使用するノックダウンまたは腫瘍細胞上でのＣＤ７３の過剰発現は、腫瘍の増殖および転移をモジュレートすることができる（Beavis et al (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14711-716；Stagg et al. (2010), supra；Jin et al. (2010) Cancer Res. 70: 2245-55）。ＣＤ７３−／−マウスは、移植された腫瘍および自然発生した腫瘍から保護される（Stagg et al. (2010) Cancer Res. 71: 2892-2900）。ヒトにおいては、高いＣＤ７３発現は、がんの負の予後であり得る（Loi et al (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 11091-11096）。ＣＤ７３に結合する抗体、例えば、クローンＡＤ２（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）は、受容体のクラスター化および内在化を引き起こすことによってＣＤ７３を機能的に遮断するが、酵素活性に対する影響は最小限であると報告されている。Sachsenmeier et al. ((2012) J. Biomed. Screening 17:993-998)および（Rust et al. (2013) Mol. Cancer 12:11）も、細胞内内在化を誘導する抗体を報告した。より最近では、可溶性ＣＤ７３と細胞表面ＣＤ７３との両方を遮断する抗体が、ＷＯ２０１６／０５５６０９およびＷＯ２０１６／１３１９５０に開示され、ならびに細胞（例えば、腫瘍細胞）中でＣＤ７３の細胞内内在化を誘導することによって細胞表面ＣＤ７３を阻害する抗体がＷＯ２０１７／０６４０４３、ＷＯ２０１６／０７５０９９およびＷＯ２０１６／０８１７４８に開示された。
【０００７】
ＣＤ７３は、ＣＤ３９と共に、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）代謝を調節する。ＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ−１）は、ＡＴＰをＡＭＰに変換し、ほんの微量のＡＤＰが放出されるが、ＣＤ７３は、ＡＭＰのアデノシンへの変換を触媒する。ＣＤ３９＋Ｔｒｅｇの数は、一部のヒトがんにおいて増加し、腫瘍の増殖および転移の促進におけるＣＤ３９＋Ｔｒｅｇの重要性は、いくつかのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）モデルを使用して証明されている。しかしながら、ＣＤ３９も腫瘍細胞によって発現され、ＣＤ３９＋腫瘍細胞は、アデノシン経路によって免疫抑制を媒介することができる。がん細胞中のＣＤ３９は、ＡＴＰａｓｅ活性を示し、ＣＤ７３と一緒になって、アデノシンを生成する。ＣＤ７３＋ＣＤ３９＋がん細胞は、ＣＤ３９およびアデノシン依存的様式で、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の増殖ならびに細胞傷害性エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生成を阻害した。ＣＤ３９に結合し、これを阻害する抗体は、ＷＯ２００９／０９５４７８に開示されている。Hayes et al. (2015) Am. J. Transl. Res. 7(6):1181-1188は、遮断的であるとも言われる抗ＣＤ３９抗体を利用するが、この抗体もＦｃγＲに結合し、エフェクター機能を有する。
【０００８】
Hausler et al. (2014) Am J Transl Res. 6(2):129-139は、Ｆｃγ受容体に結合する能力を介してＡＤＣＣを媒介するＣＤ３９およびＣＤ７３に対する抗体がそれぞれ標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘導すること、ならびにそれぞれの抗体が、アデノシンの産生の部分的減少も引き起こすことを報告している。しかしながら、抗ＣＤ３９およびＣＤ７３抗体を、アデノシン産生の減少について一緒に試験した場合、抗体の組合せの付加効果はなかった。
【０００９】
ＣＤ３９を実際に遮断しないか、または純粋な遮断剤ではない抗体の使用と組み合わせた、免疫細胞および腫瘍細胞を含む様々な細胞型上でのＣＤ３９の発現は、抗体の基本的な活性の評価のための複雑な設定を創出する。抗体などのタンパク質薬剤を使用した酵素活性部位の遮断は困難であることが一般に公知であった。したがって、抗体がＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができるかどうか、およびどのように阻害するか、また、改良された分子をどのように設計するかを理解することが必要である。
【００１０】
かくして、ＣＤ３９およびＣＤ７３を標的化する際の興味にも拘わらず、アデノシン生成を減少させる最も有効な方法を依然として決定すべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、特に、ＣＤ７３遮断と組み合わせて使用した場合、免疫抑制を実質的に減少させない公知の抗ＣＤ３９中和抗体と違って、可溶性ＣＤ３９タンパク質を中和する抗体が、ＣＤ７３遮断と組み合わせて使用した場合、免疫抑制の劇的な減少を提供するという発見から生じる。
【００１２】
可溶性ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することによって、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ７３にとって利用可能な基質のプールを減少させ、次いで、おそらく、ＣＤ７３を阻害する薬剤がＣＤ７３活性を完全に阻害するその能力において限られているため、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する薬剤の効能を強く増強する。対照的に、可溶性ＣＤ３９ではなく、膜結合型ＣＤ３９を阻害する抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する薬剤の効能を増強しない。
【００１３】
さらに、高濃度では、可溶性ＣＤ３９を中和する抗体は、ＣＤ３９／ＣＤ７３軸の異化活性の実質的に完全な阻害を提供する。可溶性ＣＤ３９を中和する抗体の効果は、例えば、アッセイ系における外因的に添加されたＡＴＰの存在下（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で観察することができるように、またはＣＤ３９／ＣＤ７３軸の異化活性を有する固形腫瘍もしくは一般的な腫瘍（例えば、ＣＤ７３ポリペプチドおよび／またはＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞を特徴とする腫瘍）などの腫瘍中で起こり得るように、有意なレベルのＡＴＰの存在下で観察される。したがって、可溶性ＣＤ３９を中和する抗体を、ＣＤ７３ポリペプチドおよび／もしくはＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞を特徴とする腫瘍において、またはＣＤ７３発現を増加させる薬剤（例えば、化学療法剤、アントラサイクリン）もしくはＡＴＰの生成をもたらす薬剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせて、有利に使用することができる。
【００１４】
さらに、可溶性および膜結合型ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和することによって、抗体は、抗腫瘍免疫を増強するＡＴＰの利用可能なプールの保存を可能にする（ＡＴＰは免疫刺激性である）。したがって、抗ＣＤ３９抗体を、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する治療剤、特に、免疫原性がん細胞死を誘導する薬剤または処置（例えば、化学療法剤、放射線療法）と組み合わせて有利に使用することができる。抗ＣＤ３９抗体は、放出されたＡＴＰがＣＤ７３基質（最終的には、アデノシン）のプールを増加させないようにするだけでなく、放出されたＡＴＰを保持して、その免疫刺激機能を促進するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、一態様では、本発明は、ＣＤ７３を阻害する薬剤と組み合わせた、可溶性ＣＤ３９に結合し、これを中和する抗体の使用によって、抗腫瘍免疫応答を増強する改良された方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ＣＤ７３タンパク質の存在を特徴とするがん（例えば、可溶性ＣＤ７３および／またはＣＤ７３を発現する細胞を有する腫瘍；ＣＤ７３陽性腫瘍）の処置のための、可溶性ＣＤ３９に結合し、これを中和する抗体の使用（ＣＤ７３を阻害する薬剤との組合せ処置を用いる、または用いない）によって、抗腫瘍免疫応答を増強する改良された方法を提供する。
【００１７】
理論によって束縛されることを望むものではないが、細胞表面の膜結合型ＣＤ３９を中和する抗体は、膜結合型ＣＤ３９（ｍｅｍＣＤ３９）のドメインの運動を阻害することによって機能するが、可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）の活性に同様に影響することはないと考えられる。ｍｅｍＣＤ３９はホモ多量体（例えば、単量体形態に加えて、四量体および／または他の多量体）として存在するが、ｓＣＤ３９は単量体であり、さらに、ｍｅｍＣＤ３９中の膜貫通ドメインは、活性部位との機能的関係の基礎にある動的運動を受けることが報告された（Schulte am Esch et al. 1999 Biochem. 38(8):2248-58）。ｍｅｍＣＤ３９のみを遮断する抗体は、酵素活性部位の外部でＣＤ３９を認識し、単量体形態のＣＤ３９を遮断することなく、多量体化を防止することができる。多量体化の遮断は、酵素活性を低下させ得るが、ＣＤ３９多量体化はＡＴＰａｓｅ活性を実質的に増大させることが報告された。対照的に、ｓＣＤ３９も遮断する抗体は、ＣＤ３９基質と干渉し、単量体形態の酵素を阻害し得る。そのような抗体はまた、ｍｅｍＣＤ３９の多量体化をも防止し、かくして、ＣＤ３９の酵素活性の阻害の第２の機構を提供し得る。残留ＡＭＰは免疫抑制を媒介するのに十分なＣＤ７３媒介性アデノシン産生をもたらすことができるため、ＡＴＰ（例えば、腫瘍環境中のような）の存在下で、ｓＣＤ３９の遮断を伴わない多量体化の防止によるＣＤ３９の部分的阻害は、ＣＤ７３を阻害する薬剤に対する検出可能な付加効果を防止するのに十分な残留ＡＭＰをもたらすことができる。
【００１８】
結果として、可溶性ＣＤ３９（例えば、単量体ｓＣＤ３９）のＡＴＰａｓｅ活性に結合し、これを阻害する抗体を有利に使用して、膜結合型と可溶性ＣＤ３９タンパク質（溶液中の細胞外ドメインタンパク質）の両方を中和することによって個体におけるＣＤ３９活性のより高い中和を達成し、それによって、例えば、がんおよび／または感染症の処置のために、免疫抑制を減少させることができる。
【００１９】
したがって、一態様では、ＣＤ７３陽性がんを有する個体に、ｓＣＤ３９の阻害活性を中和する抗体を投与することを含む処置が提供される。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんを有する個体におけるがんまたは感染症を処置または防止するための方法であって、個体に、単量体ヒトＣＤ３９タンパク質（例えば、可溶性ＣＤ３９および／または単量体ｍｅｍＣＤ３９）に特異的に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する薬剤を投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、腫瘍または腫瘍環境中の可溶性ＣＤ７３タンパク質および／またはＣＤ７３を発現する細胞の存在を一般的特徴とすることが知られるがんである。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、ＣＤ７３を発現する細胞を含むと決定された腫瘍を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、ＣＤ７３を発現する悪性細胞を含む腫瘍組織を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、ＣＤ７３を発現する免疫細胞（例えば、非悪性免疫細胞）の浸潤を特徴とする腫瘍組織または腫瘍隣接組織を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、白血病、グリオーマもしくはグリア芽腫、または膀胱がん、乳がん、結腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮癌）、および皮膚がん（例えば、メラノーマ）である。一実施形態では、処置は、個体に、ＣＤ７３タンパク質の阻害活性を中和する薬剤を投与することをさらに含む。適宜、ＣＤ７３陽性がんを有する個体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する治療剤、特に、免疫原性がん細胞死を誘導する薬剤または処置（例えば、化学療法剤、放射線療法）を用いてさらに処置される。適宜、ＣＤ７３陽性がんを有する個体は、ＣＤ７３発現を誘導する、または増加させる薬剤を用いてさらに処置される。
【００２０】
別の態様では、がんを有する個体の処置における使用のための、抗ＣＤ３９抗体（例えば、本明細書に記載のさらなる特徴を有する）の使用であって、処置が、ＣＤ７３の活性を阻害するための手段と共に抗ＣＤ３９抗体を個体に投与することを含む、使用が本明細書で提供される。一実施形態では、がんを有する個体の処置における使用のための、抗ＣＤ３９抗体（例えば、本明細書に記載のさらなる特徴を有する）であって、処置が、（ａ）ＣＤ７３の活性を阻害するための手段（例えば、薬剤もしくは処置、タンパク質薬剤、抗体薬剤、核酸薬剤、または低分子薬剤）および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物と共に抗ＣＤ３９抗体を個体に投与することを含む、抗ＣＤ３９抗体が提供される。
【００２１】
別の態様では、ＣＤ７３の活性を阻害する薬剤と共に、ＣＤ３９に結合し、可溶性（細胞外ドメイン）ヒトＣＤ３９タンパク質の酵素活性（ＡＴＰａｓｅ活性）を阻害する抗体の使用が本明細書で提供される。可溶性ＣＤ３９に結合する抗体は、細胞膜結合型ＣＤ３９酵素（細胞表面に発現されるＣＤ３９）の酵素活性（ＡＴＰａｓｅ活性）をさらに強力に阻害する。ＣＤ７３の活性を阻害する薬剤と組み合わせた、単量体（例えば、可溶性および膜結合型ＣＤ３９）と多量体ＣＤ３９（例えば、膜結合型ＣＤ３９）の両方の中和は、ＣＤ７３陽性がんを処置するのに特に有利であり得る。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、腫瘍または腫瘍環境中の可溶性ＣＤ７３タンパク質および／またはＣＤ７３を発現する細胞の存在を一般的特徴とすることが知られるがんである。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、ＣＤ７３を発現する細胞を含むと決定された腫瘍を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、ＣＤ７３を発現する悪性細胞を含む腫瘍組織を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、ＣＤ７３を発現する免疫細胞（例えば、非悪性免疫細胞）の浸潤を特徴とする腫瘍組織または腫瘍隣接組織を特徴とする。一実施形態では、ＣＤ７３陽性がんは、白血病、グリオーマもしくはグリア芽腫、または膀胱がん、乳がん、結腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮癌）、および皮膚がん（例えば、メラノーマ）である。
【００２２】
単量体（例えば、可溶性および膜結合型ＣＤ３９）と多量体ＣＤ３９（例えば、膜結合型ＣＤ３９）の両方の中和は、ＣＤ７３阻害剤が準最適に活性である処置設定、例えば、ＣＤ７３阻害が腫瘍組織内（例えば、ＣＤ７３陽性腫瘍中）で求められる処置設定、ＣＤ７３阻害剤を、それが腫瘍組織中にＣＤ７３を飽和させる、および／もしくはそれが腫瘍組織中（例えば、ＣＤ７３陽性腫瘍中）でのＣＤ７３阻害のためのＥＣ５０、ＥＣ７０もしくはＥＣ１００を提供する用量またはレジメンで；十分な期間（例えば、１、２、３、４、６もしくは８週間、またはそれより長い期間）にわたって１、５もしくは１０μｇ／ｍｌ未満（または以下）の腫瘍濃度を提供する用量で投与することができない処置設定；ＣＤ７３阻害剤が、ＣＤ７３活性を完全に阻害しない処置設定（例えば、可溶性ＣＤ７３を阻害しない抗ＣＤ７３抗体；酵素活性の阻害を媒介するためにＣＤ７３下方モジュレーション／細胞内内在化の誘導に依拠する抗ＣＤ７３抗体）；またはより一般的には、腫瘍もしくは腫瘍隣接組織中の細胞によるＣＤ７３の有意なレベルの発現を特徴とするがん（例えば、グリオーマもしくはグリア芽腫、または膀胱がん、乳がん、結腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮癌）、および皮膚がん（例えば、メラノーマ）の処置においてそのようなＣＤ７３阻害剤の活性を増強するのに特に有利であり得る。
【００２３】
一実施形態では、個体におけるがんまたは感染症を処置または防止するための方法であって、個体に、（ａ）可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する薬剤、および（ｂ）ヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害する薬剤を投与することを含む、方法が提供される。
【００２４】
一実施形態では、個体におけるがんまたは感染症を処置または防止するための方法であって、個体に、（ａ）単量体ヒトＣＤ３９タンパク質（例えば、可溶性ＣＤ３９および／または単量体ｍｅｍＣＤ３９）に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する薬剤、ならびに（ｂ）ヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害する薬剤を投与することを含む、方法が提供される。
【００２５】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害するか、または中和する化合物は、ＣＤ３９タンパク質に結合する抗体または抗体断片（例えば、一特異的抗体、二特異的抗体または多特異的抗体）であるか、またはそれを含む。
【００２６】
一態様では、個体に、ｓＣＤ３９の阻害活性を中和する抗体と、ＣＤ７３の阻害活性を中和する薬剤との組合せを投与することを含む処置が提供される。
【００２７】
一態様では、ｓＣＤ３９の阻害活性を中和する抗体を、ＣＤ７３の阻害活性を中和する薬剤を用いた処置に対して耐性であるか、またはそれに対する応答について予後不良である個体に投与することを含む処置が提供される。一実施形態では、個体は、ＣＤ７３陽性がんを有する。
【００２８】
一態様では、ＣＤ７３の阻害活性を中和する抗体を用いた処置に対して個体を感作するための方法であって、個体に、ｓＣＤ３９の阻害活性を中和する抗体を投与することを含む、方法が提供される。
【００２９】
一態様では、ヒトｓＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗体と、ヒトＣＤ７３ポリペプチドを阻害する抗体であってもよい薬剤とを含む組成物が提供される。一態様では、組成物は、がん、適宜、固形腫瘍、適宜、血液悪性腫瘍、適宜、ＣＤ７３を発現する悪性細胞を特徴とする血液悪性腫瘍、適宜、白血病、適宜、悪性細胞を特徴とするがん、適宜、ＣＤ７３ポリペプチドを発現する腫瘍または腫瘍隣接組織中の悪性および／または非悪性細胞を特徴とするがんの処置または防止における使用のためのものである。
【００３０】
それらの抗体は、ＡＭＰ（ならびに上流のＡＴＰおよびＡＤＰ）のアデノシンへの異化を阻害する、例えば、それぞれの工程で利用可能なアデノシン前駆体のプールを減少させる、最終的には、腫瘍微小環境中のアデノシンの濃度を減少させるのに有用であろう。したがって、これらの抗体は、例えば、がんの処置において、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびアデノシン受容体を発現する他の細胞に対するＣＤ３９および／またはＣＤ７３および／またはアデノシンの免疫抑制効果を逆転させるのに有用であろう。一実施形態では、抗体は、Ｔ細胞中での増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性および／またはＮＦκＢ活性のアデノシン媒介性阻害を中和する。一実施形態では、本開示の方法は、個体における、抗腫瘍免疫を増大させる、もしくは増強する、免疫抑制を減少させる、免疫エフェクター細胞、適宜、ＣＤ８＋腫瘍浸潤性Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の活性を活性化および／もしくは強化する、ならびに／または腫瘍環境中のアデノシンの量および／もしくは濃度を減少させるのに有用である。
【００３１】
一実施形態では、個体における、免疫エフェクター細胞、適宜、ＣＤ８＋腫瘍浸潤性Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞を活性化する、もしくはその活性を強化する方法、ならびに／または腫瘍環境中のアデノシンの量および／もしくは濃度を減少させる方法であって、個体に、（ａ）ヒトｓＣＤ３９ポリペプチドに結合し、その酵素活性（ＡＴＰａｓｅ活性）を阻害する治療活性量の化合物、および（ｂ）ヒトＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を阻害する治療活性量の化合物を投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、個体における、腫瘍浸潤性Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化する、その活性を強化する、および／またはその増殖を増加させる方法であって、個体に、（ａ）ヒトｓＣＤ３９ポリペプチドに結合し、その酵素活性（ＡＴＰａｓｅ活性）を阻害する治療活性量の化合物、および（ｂ）ヒトＣＤ７３ポリペプチドを阻害する治療活性量の化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００３２】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、ヒトＣＤ７３ポリペプチドを阻害する化合物は、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する抗ＣＤ７３抗体である。別の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、細胞表面に発現されたＣＤ７３の増加および／もしくはその細胞内内在化の誘導、またはより一般的には、その下方モジュレーションを引き起こすことによって、ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を阻害する、ならびに／またはＣＤ７３を中和するその能力について少なくとも部分的にそれに依存する。一実施形態では、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する抗ＣＤ７３抗体は、適宜、抗体がより高い（例えば、１０倍）過剰の抗体：酵素で提供される場合に、可溶性ＣＤ７３の酵素活性を実質的に中和または阻害することができない抗体である。一実施形態では、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する抗ＣＤ７３抗体は、適宜、抗体がより高い（例えば、１０倍）過剰の抗体：酵素で可溶性ＣＤ７３の酵素活性を中和することができる場合に、可溶性ＣＤ７３の酵素活性を中和することができる抗体である。一実施形態では、ヒトＣＤ７３を阻害する化合物は、有機分子、適宜、低分子有機化合物、適宜、３０００ｇ／ｍｏｌ以下、適宜、２０００ｇ／ｍｏｌ以下、適宜、１０００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有する有機化合物、適宜、１００ｇ／ｍｏｌ〜３００ｇ／ｍｏｌ、１００ｇ／ｍｏｌ〜１０００ｇ／ｍｏｌ、適宜、少なくとも３００ｇ／ｍｏｌ、４００ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７００ｇ／ｍｏｌ、８００ｇ／ｍｏｌ、９００ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌまたは２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する有機化合物である。
【００３３】
一実施形態では、個体におけるがんまたは感染症を処置または防止するための方法であって、個体に、（ｉ）可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する、および（ｉｉ）ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、その５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を阻害する（例えば、そのようなＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞中で）ことができる、治療活性量の薬剤を投与することを含む、方法が提供される。
【００３４】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、ｓＣＤ３９タンパク質は、膜結合型ＣＤ３９中に見出される２個の膜貫通ドメイン（すなわち、ＮおよびＣ末端の近くの膜貫通ドメイン）を欠くものとして特徴付けることができる。一実施形態では、ｓＣＤ３９は、循環中、例えば、ヒト個体中に見出される非膜結合型ｓＣＤ３９タンパク質である。一実施形態では、ｓＣＤ３９は、配列番号５のアミノ酸配列（Ｃ末端タグまたは別の非ＣＤ３９由来アミノ酸配列をさらに含んでもよい）、例えば、本明細書の実施例で生産されるようなｓＣＤ３９タンパク質を含む、またはそれからなる。一実施形態では、タンパク質、抗体または抗体断片は、例えば、本明細書に開示される方法に従って、溶液中でｓＣＤ３９と共にインキュベートした場合、ｓＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害または中和する。一実施形態では、タンパク質、抗体または抗体断片は、可溶性形態（細胞外ドメインタンパク質）と膜結合形態の両方において、ヒトＣＤ３９タンパク質に特異的に結合する。
【００３５】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、がんは、固形腫瘍である。一実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍である。本明細書の任意の実施形態の一態様では、がんは、検出可能なＣＤ７３タンパク質を発現する腫瘍または腫瘍隣接組織中の細胞（例えば、腫瘍環境中の悪性細胞および／または非悪性細胞）を特徴とする。
【００３６】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、個体は、ヒトであると特定することができる。
【００３７】
一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、末梢および／または腫瘍微小環境中のＣＤ３９（ｓＣＤ３９および／またはｍｅｍＣＤ３９）の活性を中和するのに十分な量および頻度で、がんを有する個体に投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍微小環境中でのＡＭＰおよび／またはアデノシンの生成および／または濃度を減少させるのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍細胞によって発現されるＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、白血球またはリンパ球、例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞および／またはＢ細胞によって発現されるＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。
【００３８】
一実施形態では、ＣＤ７３の活性を阻害する薬剤は、末梢および／または腫瘍微小環境中のＣＤ７３（可溶性ＣＤ７３タンパク質および／または膜結合型ＣＤ７３）の活性を中和するのに十分な量および頻度で、がんを有する個体に投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍環境中に存在する腫瘍細胞または非腫瘍細胞によって発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、および／またはＢ細胞によって発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。
【００３９】
一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体およびＣＤ７３の活性を阻害する薬剤は、腫瘍微小環境中でのアデノシンの生成および／または濃度を減少させるのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍微小環境中でのＡＴＰの生成および／または濃度を増加させるのに十分な量および頻度で投与される。
【００４０】
一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体およびＣＤ７３の活性を阻害する薬剤は、それぞれ、抗ＣＤ３９抗体およびＣＤ７３の活性を阻害する薬剤の少なくとも１回目および２回目（適宜、３回目、４回目、５回目、６回目、７回目および／または８回目またはさらなる回数）の投与を含む、少なくとも１つの投与サイクルにわたって投与される。
【００４１】
一実施形態では、がんは、進行性および／または難治性固形腫瘍である。１つの非限定的な実施形態では、がん（例えば、進行性難治性固形腫瘍）は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎臓がん、膵臓または食道腺癌、乳がん、腎細胞癌（ＲＣＣ）、メラノーマ、結腸直腸がん、および卵巣がん（適宜、本明細書に記載のさらなるがん型）からなる群から選択される。
【００４２】
ある特定の任意の態様では、抗ＣＤ３９薬剤を使用して、免疫抑制、適宜、腫瘍への免疫浸潤の欠如または不十分性、適宜、抗腫瘍免疫の欠如または不十分性を特徴とするがんまたは腫瘍を有する個体におけるがんを処置することができる。
【００４３】
ある特定の任意の態様では、抗ＣＤ３９薬剤を使用して、疾患予後不良、特に、ＣＤ７３を中和する薬剤を用いた処置に対する応答について予後不良である個体におけるがんを処置することができる。疾患予後不良である個体は、例えば、１つまたは複数の予測因子に基づいて、進行のリスクがより高い。一実施形態では、予測因子は、１つまたは複数の遺伝子中の突然変異の存在または非存在を含む。一実施形態では、予測因子は、免疫エフェクター細胞上での１つまたは複数の遺伝子もしくはタンパク質、または例示的な阻害もしくは活性化受容体の発現レベルを含む。一実施形態では、予測因子は、ＣＤ７３および／もしくはＣＤ３９を発現する循環もしくは腫瘍環境中の細胞の存在（例えば、数）、ならびに／または循環もしくは腫瘍環境中の細胞上でのＣＤ７３および／もしくはＣＤ３９の発現レベルを含む；一実施形態では、細胞は腫瘍細胞である；一実施形態では、細胞は白血球、例えば、Ｂ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。ＣＤ７３および／もしくはＣＤ３９の発現上昇、ならびに／またはＣＤ７３および／もしくはＣＤ３９発現細胞数の上昇の存在は、個体がＣＤ７３を中和する抗体を用いた処置に対する応答について予後不良であることを示してもよい。
【００４４】
ある特定の任意の態様では、抗ＣＤ３９薬剤を使用して、ＣＤ７３を中和する薬剤を用いた処置に対する非応答者である個体、またはそれに対する部分的もしくは不完全な応答を経験した個体、またはＣＤ７３を中和する抗体を用いた処置後に疾患が再発もしくは進行した個体におけるがんを処置することができる。
【００４５】
一実施形態では、抗ＣＤ３９薬剤は、ＣＤ３９上のエピトープまたは決定基への結合において、それぞれ、配列番号５２および５３の重鎖および軽鎖を有する抗体と競合する。薬剤は、例えば、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ３９抗体であってもよい。一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、それぞれ、配列番号５２の重鎖アミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５３の軽鎖アミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００４６】
ある特定の任意の態様では、患者がＣＤ７３中和剤に対する弱い応答者である（応答について予後不良である）かどうかを評価することによって、ＣＤ３９中和剤およびＣＤ７３中和剤（例えば、本明細書に開示される任意の薬剤）を用いた処置のために、患者を同定することができる。弱い応答者を、ＣＤ３９中和剤とＣＤ７３中和剤との組合せを用いて処置することができる。
【００４７】
ある特定の任意の態様では、循環および／または腫瘍試料（例えば、腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織）中の、ＣＤ７３ポリペプチド発現レベルの上昇および／またはＣＤ７３発現細胞数の上昇の存在を評価することによって、ＣＤ３９中和剤（適宜、さらにＣＤ７３中和剤）を用いた処置のために、患者を同定することができる。
【００４８】
ある特定の任意の態様では、循環および／または腫瘍試料（例えば、腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織）中の、ＣＤ３９ポリペプチド発現レベルの上昇および／またはＣＤ３９発現細胞数の上昇の存在を評価することによって、ＣＤ３９中和剤およびＣＤ７３中和剤を用いた処置のために、患者を同定することができる。
【００４９】
他の実施形態では、医薬組成物およびキット、ならびにそれらを使用するための方法が提供される。一実施形態では、ヒトＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰａｓｅ活性を中和する化合物と、ＣＤ７３ポリペプチドの５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤とを含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、ヒトＣＤ３９ポリペプチドの阻害活性を中和する化合物と、ＣＤ７３ポリペプチドの５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤とを含むキットが提供される。
【００５０】
これらの態様は、本明細書に提供される発明の説明により完全に記載され、さらなる態様、特徴、および利点は、それから明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、陽性対照のＩ−３９４抗体と比較した、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８およびＩ−３９９抗体を示す代表的なスクリーニング結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢＹ４０、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５およびＩ−３９６抗体が、細胞膜結合型ＣＤ３９を阻害することを示し、Ｉ−３９４とＩ−３９５は両方とも、ＢＹ４０と比較して、全ての濃度でより高い効力ならびに細胞性ＣＤ３９のより高い最大阻害を示す。図２Ｂは、Ｉ−３９５とＩ−３９６抗体が両方とも、陰性対照（ＢＹ４０）および陽性対照（Ｉ−３９４）抗体と比較して、可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。
【図２Ｂ】図２Ａは、ＢＹ４０、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５およびＩ−３９６抗体が、細胞膜結合型ＣＤ３９を阻害することを示し、Ｉ−３９４とＩ−３９５は両方とも、ＢＹ４０と比較して、全ての濃度でより高い効力ならびに細胞性ＣＤ３９のより高い最大阻害を示す。図２Ｂは、Ｉ−３９５とＩ−３９６抗体が両方とも、陰性対照（ＢＹ４０）および陽性対照（Ｉ−３９４）抗体と比較して、可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＤ３９タンパク質の表面上での突然変異体５（Ｍ５）、１５（Ｍ１５）および１９（Ｍ１９）中の突然変異した残基の位置を示す。図３Ｂは、異なる抗体についての突然変異体５、１５および１９への結合の結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ａは、ＣＤ３９タンパク質の表面上での突然変異体５（Ｍ５）、１５（Ｍ１５）および１９（Ｍ１９）中の突然変異した残基の位置を示す。図３Ｂは、異なる抗体についての突然変異体５、１５および１９への結合の結果を示す。
【図４】図４は、フローサイトメトリーによって評価した場合の、ヒトＣＤ３９を発現する細胞へのＩ−３９４抗体の結合を示す。Ｉ−３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）、カニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）およびＲａｍｏｓリンパ腫細胞に結合するが、マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｍｏＣＤ３９）には結合しない。
【図５】図５は、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することによって評価した場合、Ｉ−３９４抗体が、腫瘍（Ｒａｍｏｓ）細胞、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）、およびカニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）中のＣＤ３９酵素活性を遮断するのに非常に強力であることを示す。
【図６】図６は、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することによって評価した場合、Ｉ−３９４抗体が、可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質の酵素活性を遮断するのに非常に強力であることを示す。
【図７】図７は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した場合、Ｉ−３９４抗体が、ヒトＣＤ３９に結合するが、ヒトアイソフォームＣＤ３９−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３または−Ｌ４のいずれにも結合しないことを示す。
【図８】図８は、ＡＴＰ活性化ＤＣを洗浄した後、５日間、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種異系ＣＤ４  Ｔ細胞（１ＭｏＤＣ／４  Ｔ細胞の比）と共にインキュベートした、ＣＤ４  Ｔ細胞活性化に対するＡＴＰ媒介性ＤＣ活性化の効果を評価するための実験手順を示す。Ｔ細胞の活性化および増殖を、フローサイトメトリーによるＣＤ２５発現およびＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈を介して分析した。
【図９】図９は、ｍｏＤＣ上でのＨＬＡ−ＤＲ発現を示す。
【図１０】図１０は、ｍｏＤＣ上でのＣＤ８３発現を示す。これらの図面は、抗ＣＤ３９遮断抗体Ｉ−３９４およびＣＤ３９の化学的阻害剤が、それぞれ０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭまたは０．５ｍＭでｍｏＤＣ活性化をもたらすことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体ＢＹ４０または抗ＣＤ７３抗体は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰ誘導性活性化を促進することができなかったが、これは、抗体がＡＴＰ異化を十分に回避する酵素活性を遮断することができないことを示唆している。上から下の凡例は、左から右のグラフ中のバーに対応する。
【図１１】図１１は、ＣＤ２５発現が、ＡＴＰの存在下で活性化されたＭｏＤＣがＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞の活性化および増殖を誘導することができたことを示す；抗ＣＤ３９遮断抗体Ｉ−３９４によるＡＴＰ媒介性ＭｏＤＣ活性化の増強は、より高いＴ細胞の増殖および活性化をもたらした。上から下の凡例は、左から右のグラフ中のバーに対応する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、抗ｓＣＤ３９抗体の３つの異なる用量、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのいずれかにおける、添加されたＡＴＰの存在下での、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の用量範囲を示す。可溶性ヒトＣＤ３９を中和することができる抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖の回復における抗ＣＤ７３抗体の強力な強化を示す。図１２Ｂは、添加されたＡＴＰの存在下での、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の用量範囲を示し、抗ｓＣＤ３９抗体は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖の回復における抗ＣＤ７３抗体の強力な強化を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａは、抗ｓＣＤ３９抗体の３つの異なる用量、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのいずれかにおける、添加されたＡＴＰの存在下での、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の用量範囲を示す。可溶性ヒトＣＤ３９を中和することができる抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖の回復における抗ＣＤ７３抗体の強力な強化を示す。図１２Ｂは、添加されたＡＴＰの存在下での、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の用量範囲を示し、抗ｓＣＤ３９抗体は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖の回復における抗ＣＤ７３抗体の強力な強化を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、疾患のステージおよび時間を考慮に入れた、ヒトがん試料中でのＣＤ３９およびＣＤ７３遺伝子発現と、生存とを相関付ける試験を示す。図１３Ａは、卵巣がんにおける結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、卵巣がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、卵巣がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。図１３Ｂは、食道がんにおける結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、食道がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、食道がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。図１３Ｃは、胃腺癌における結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、胃がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、胃がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。
【図１３Ｂ】図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、疾患のステージおよび時間を考慮に入れた、ヒトがん試料中でのＣＤ３９およびＣＤ７３遺伝子発現と、生存とを相関付ける試験を示す。図１３Ａは、卵巣がんにおける結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、卵巣がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、卵巣がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。図１３Ｂは、食道がんにおける結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、食道がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、食道がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。図１３Ｃは、胃腺癌における結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、胃がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、胃がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。
【図１３Ｃ】図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、疾患のステージおよび時間を考慮に入れた、ヒトがん試料中でのＣＤ３９およびＣＤ７３遺伝子発現と、生存とを相関付ける試験を示す。図１３Ａは、卵巣がんにおける結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、卵巣がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、卵巣がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。図１３Ｂは、食道がんにおける結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、食道がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、食道がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。図１３Ｃは、胃腺癌における結果を示し、特に、がん試料中の低いＣＤ３９発現は、胃がんにおけるより高い生存確率と相関する；また、胃がんにおける高いＣＤ７３発現と、より低い生存確率との相関も示される。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１または複数を意味してもよい。特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１または１より多いものを意味してもよい。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれより多いものを意味してもよい。
【００５３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これを、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」によって置き換えてもよい。
【００５４】
エクト−５’−ヌクレオチダーゼおよび５’−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼとしても知られ、ＮＴ５Ｅ遺伝子によってコードされるＥＣ３．１．３．５であるヒトＣＤ７３は、５’−ヌクレオチダーゼ、特に、ＡＭＰ−、ＮＡＤ−およびＮＭＮ−ヌクレオシダーゼ活性を示す。ＣＤ７３は、中性ｐＨで、プリン５’−モノヌクレオチドの、ヌクレオシドへの変換を触媒し、好ましい基質は、ＡＭＰである。この酵素は、形質膜の外面にグリコシルホスファチジルイノシトール結合によって結合した２個の同一の７０ｋＤサブユニットの二量体からなる。アミノ酸１〜２６にシグナル配列を含む、ヒトＣＤ７３プレタンパク質（単量体）のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００２５１７の下でＧｅｎｂａｎｋに示され、その全開示が参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである。
【化１】
2020536109.tif 000003
【００５５】
本明細書の文脈では、ＣＤ７３ポリペプチドに言及する場合の「阻害する」、「阻害すること」、「中和する」または「中和すること」（例えば、「ＣＤ７３を中和する」、「ＣＤ７３の活性を中和する」または「ＣＤ７３の酵素活性を中和する」など）は、ＣＤ７３の５’−ヌクレオチダーゼ（５’−エクトヌクレオチダーゼ）活性が阻害されるプロセスを指す。これは、特に、アデノシンのＣＤ７３媒介性生成の阻害、すなわち、ＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化の阻害を含む。これを、例えば、直接的または間接的に、ＡＭＰのアデノシンへの変換を阻害する試験化合物の能力を測定する無細胞アッセイにおいて測定することができる。一実施形態では、抗体調製物は、例えば、本明細書に記載のアッセイに言及して、ＡＭＰのアデノシンへの変換の少なくとも５０％の減少、ＡＭＰのアデノシンへの変換の少なくとも７０％の減少、またはＡＭＰのアデノシンへの変換の少なくとも８０％の減少を引き起こす。
【００５６】
ＮＴＰｄａｓｅ１、ＥＮＴＰＤ１、ＡＴＰＤａｓｅおよび血管ＡＴＰジホスホヒドロラーゼとしても知られるヒトＣＤ３９は、ＡＴＰａｓｅ活性を示す。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰおよびＡＤＰをＡＭＰに加水分解し、さらに、別の酵素である５’−ヌクレオチダーゼによってアデノシンに変換される膜結合型タンパク質である。ヒトＣＤ３９成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、受託番号Ｐ４９９６１の下でＧｅｎｂａｎｋに示され、その全開示は参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである。
【化２】
2020536109.tif 000004
【００５７】
本明細書の文脈では、ＣＤ３９ポリペプチドに言及する場合の「阻害する」、「阻害すること」、「中和する」または「中和すること」（例えば、「ＣＤ３９を中和する」、「ＣＤ３９の活性を中和する」または「ＣＤ３９の酵素活性を中和する」など）は、ＣＤ３９のＡＴＰ加水分解（ＡＴＰａｓｅ）活性が阻害されるプロセスを指す。これは、特に、ＡＭＰおよび／またはＡＤＰのＣＤ３９媒介性生成の阻害、すなわち、ＡＴＰからＡＭＰおよび／またはＡＤＰへのＣＤ３９媒介性異化の阻害を含む。これを、例えば、直接的または間接的に、ＡＴＰのＡＭＰおよび／またはＡＤＰへの変換を阻害する試験化合物の能力を測定する細胞アッセイにおいて測定することができる。例えば、ＡＴＰの消失および／またはＡＭＰの生成を、本明細書に記載のように評価することができる。一実施形態では、抗体調製物は、例えば、本明細書に記載のアッセイに言及して、ＡＴＰのＡＭＰへの変換の少なくとも６０％の減少、ＡＴＰのＡＭＰへの変換の少なくとも７０％の減少、またはＡＴＰのＡＭＰへの変換の少なくとも８０％または９０％の減少（例えば、ＡＴＰの消失および／またはＡＭＰの生成）を引き起こす。
【００５８】
薬剤および特定の活性（例えば、細胞への結合、酵素活性の阻害、免疫細胞の活性化または阻害）に関する「ＥＣ５０」とは、そのような活性に関してその最大の応答または効果の５０％をもたらす薬剤の有効濃度を指す。薬剤および特定の活性に関する「ＥＣ１００」とは、そのような活性に関してその実質的に最大の応答をもたらす薬剤の有効濃度を指す。
【００５９】
本明細書で使用される用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインの種類に応じて、抗体は、５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つを割り当てられる。これらのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラスまたはアイソタイプにさらに分割される。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。それぞれの四量体は、それぞれの対が１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する、２個の同一の対のポリペプチド鎖から構成される。それぞれの鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）の用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構成は、周知である。ＩｇＧは、生理的状況において最も一般的な抗体であるため、および研究室設定で最も容易に作製されるため、本明細書で使用される抗体の例示的なクラスである。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。抗体の特定例は、ヒト化、キメラ、ヒト、またはそうでなければヒトにとって好適な抗体である。「抗体」はまた、本明細書に記載の抗体のいずれかの任意の断片または誘導体も含む。
【００６０】
用語「特異的に結合する」とは、抗体が、組換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、または単離された標的細胞の表面上に存在する天然タンパク質のいずれかを使用して評価した場合、好ましくは競合結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、ＣＤ３９、ＣＤ７３に結合することができることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するための他の方法は、当業界で周知である。例えば、放射標識、質量分析などの物理的方法、または例えば、細胞蛍光分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される直接もしくは間接蛍光標識により、結合を検出することができる。対照の非特異的薬剤に関して見られる量を超える結合は、その薬剤が標的に結合することを示す。
【００６１】
抗体が特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言われる場合、それは、抗体が、組換え分子（例えば、ＣＤ３９、ＣＤ７３）または表面に発現された分子（例えば、ＣＤ３９、ＣＤ７３）のいずれかを使用する結合アッセイにおいてモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいて、抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７のいずれかの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体の、ＣＤ７３ポリペプチドまたはＣＤ７３を発現する細胞への結合を減少させる場合、その抗体はそのような抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいて、配列番号６の重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体の、ＣＤ３９ポリペプチドまたはＣＤ３９を発現する細胞への結合を減少させる場合、その抗体はそのような抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【００６２】
本明細書で使用される用語「親和性」は、抗体のエピトープへの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合の抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合の抗原のモル濃度である）として定義される、解離定数Ｋｄによって与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)に見出すことができ、これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当業界で周知の１つの標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析デバイスを用いる分析などによる）の使用である。
【００６３】
本明細書の文脈内で、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用または結合の部位を指す。
【００６４】
用語「エピトープ」とは、抗原決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリアまたは領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基ならびに特定の抗原結合抗体またはペプチドによって効率的に遮断されるアミノ酸残基、すなわち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含んでもよい。それは、例えば、抗体または受容体と化合することができる複合抗原分子上の最も単純な形態または最も小さい構造エリアである。エピトープは、線状または立体的／構造的であってよい。用語「線状エピトープ」は、アミノ酸の線状配列上で連続するアミノ酸残基から構成されるエピトープと定義される（一次構造）。用語「立体的または構造的エピトープ」は、全て連続的ではなく、かくして、分子の折畳みによって互いに近くにもたらされるアミノ酸の線状配列の分離された部分であるアミノ酸残基から構成されるエピトープと定義される（二次、三次および／または四次構造）。立体的エピトープは、３次元構造に依存する。したがって、用語「立体的」は、「構造的」と互換的に使用されることが多い。
【００６５】
ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する細胞に関する用語「枯渇する」または「枯渇している」とは、試料または対象中に存在するそのようなＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する細胞の数に負に影響するような、殺傷、除去、溶解またはそのような殺傷、除去もしくは溶解の誘導をもたらすプロセス、方法、または化合物を意味する。
【００６６】
「細胞内内在化」と互換的に使用される用語「内在化」とは、ある分子を、細胞の細胞外表面から、細胞の細胞内表面に移行させるプロセスと関連する分子的、生化学的および細胞的事象を指す。分子の細胞内内在化を担うプロセスは周知であり、特に、細胞外分子（ホルモン、抗体、および有機低分子など）；膜結合型分子（細胞表面受容体など）；および細胞外分子に結合した膜結合型分子（細胞表面受容体など）の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンドまたは膜結合型分子に結合した抗体）の内在化を含んでもよい。かくして、「内在化を誘導すること、および／または増加させること」は、細胞内内在化が開始される、ならびに／または細胞内内在化の速度および／もしくは程度が増加する事象を含む。
【００６７】
本明細書で使用される用語「薬剤」は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子、または生物学的材料から作られる抽出物を指す。用語「治療剤」とは、生物活性を有する薬剤を指す。
【００６８】
本明細書における目的のために、「ヒト化」または「ヒト」抗体とは、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が、動物免疫グロブリンの結合領域、例えば、ＣＤＲに融合された抗体を指す。そのような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。そのような抗体を、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスまたは他の動物から取得することができる（例えば、教示全体が参照により本明細書に組み込まれるGreen et al. (1994) Nature Genet 7:13；Lonberg et al. (1994) Nature 368:856；Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579を参照されたい）。また、完全ヒト抗体を、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技術によって構築することもでき、それらは全て当業界で公知である（例えば、McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553を参照されたい）。ヒト抗体を、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で活性化されたＢ細胞によって生成させることもできる（例えば、全体が参照により組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【００６９】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なる、もしくは変化したクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に対して新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに連結されるように、定常領域、もしくはその一部が変化した、置き換えられた、もしくは交換された抗体分子；または（ｂ）可変領域、もしくはその一部が、変化した、置き換えられた、もしくは異なる、もしくは変化した抗原特異性を有する可変領域と交換された抗体分子である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al. 1991）ならびに／または「超可変ループ」に由来する残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917）、または抗原結合を担う必須アミノ酸を決定するための同様のシステムを含む。典型的には、この領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., supraに記載の方法によって行われる。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔに記載のような可変ドメイン残基ナンバリング」および「Ｋａｂａｔによる」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに関するこのナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムを使用すると、あるペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、またはそれへの挿入に対応する、より少ない、または追加のアミノ酸を含有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲの残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔのナンバリングを、抗体の配列の相同な領域での、「標準的な」Ｋａｂａｔのナンバリングされた配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定することができる。
【００７１】
本明細書で使用される「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、ＣＤＲとして定義される領域を除く抗体可変ドメインの領域を意味する。それぞれの抗体可変ドメインフレームワークを、ＣＤＲによって隔てられた連続する領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）。
【００７２】
用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」とは、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖もしくは他の種類の抗体重鎖におけるその対応配列（例えば、ヒト抗体については、α、δ、εおよびμ）の約２３０アミノ酸（ａａ）〜約４５０ａａの抗体重鎖のＣ末端断片、またはその天然に存在するアロタイプを指す。別途特定しない限り、免疫グロブリンに関する一般的に受け入れられているＫａｂａｔのアミノ酸ナンバリングが、本開示を通して使用される（Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MDを参照されたい）。
【００７３】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、通常はその天然状態で見出されるようなそれに伴う成分を実質的に、または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。
【００７４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書で互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００７５】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して使用される場合の用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質もしくはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。かくして、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内に見出されない遺伝子を発現する、またはそうでなければ、異常に発現される、過少発現される、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００７６】
本明細書の文脈内では、ポリペプチドまたはエピトープに「結合する」抗体という用語は、特異性および／または親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
【００７７】
２つまたはそれより多いポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、用語「同一性」または「同一の」とは、２つまたはそれより多いアミノ酸残基の一続きの間の一致数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（もしあれば）を有する２つまたはそれより多い配列の小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に算出することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991；およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載のものが挙げられる。
【００７８】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性を決定するための方法は、公共的に利用可能なコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラムとしては、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschul et al., supra）から公共的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。
【００７９】
ｓＣＤ３９タンパク質を阻害する薬剤
本明細書による使用のためのＣＤ３９に結合し、これを阻害する薬剤は、可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害または中和する、抗原結合ドメインまたは適宜、そのような抗体もしくは抗体断片を含むタンパク質であってもよい。一実施形態では、ｓＣＤ３９タンパク質は、膜結合型ＣＤ３９中に見出される２個の膜貫通ドメイン（すなわち、ＮおよびＣ末端の近くの膜貫通ドメイン）を欠く。一実施形態では、ｓＣＤ３９は、循環中、例えば、ヒト個体中に見出される非膜結合型ｓＣＤ３９タンパク質である。一実施形態では、ｓＣＤ３９は、配列番号５のアミノ酸配列（Ｃ末端タグまたは別の非ＣＤ３９由来アミノ酸配列をさらに含んでもよい）を含む、またはそれからなる。一実施形態では、タンパク質、抗体または抗体断片は、例えば、本明細書に開示される方法に従って、溶液中でｓＣＤ３９と共にインキュベートした場合、ｓＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する。一実施形態では、タンパク質、抗体または抗体断片は、可溶性形態（細胞外ドメインタンパク質）と膜結合形態の両方において、ヒトＣＤ３９タンパク質に特異的に結合する。
【００８０】
ｓＣＤ３９（およびｍｅｍＣＤ３９）の活性を中和する抗体は、二価結合剤としての使用に加えて、それらがｓＣＤ３９に加えてｍｅｍＣＤ３９を標的化していようとなかろうと、一価結合剤として有効であってもよい。結果として、一実施形態では、ＣＤ３９を阻害する薬剤は、ヒトＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９および適宜、さらにｍｅｍＣＤ３９）に一価的に結合し、その酵素（ＡＴＰａｓｅ）活性を中和する抗原結合タンパク質であってもよい。抗原結合タンパク質を、単一のＣＤ３９タンパク質に結合する、および／またはＣＤ３９タンパク質に結合することができる単一の抗原結合ドメインを担持するものとして特定してもよい。一実施形態では、ヒトＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９および／またはｍｅｍＣＤ３９）に一価的に結合し、その酵素（ＡＴＰａｓｅ）活性を中和する、抗体断片、適宜、Ｆ（ａｂ）断片、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、多特異的抗体が提供される。一実施形態では、ヒトＣＤ３９タンパク質に一価的に結合するＣＤ３９中和抗原結合タンパク質は、多特異的抗原結合タンパク質、例えば、多特異的抗体、二特異的抗体、三特異的抗体などである。一実施形態では、ヒトＣＤ３９タンパク質に一価的に結合するＣＤ３９中和抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ７３タンパク質にさらに結合し、その酵素活性を阻害する。一実施形態では、ＣＤ３９（ｓＣＤ３９および／またはｍｅｍＣＤ３９）に結合する第１の（または単一の）抗原結合ドメインと、ＣＤ７３タンパク質に結合し、これを阻害する第２の（および適宜、さらなる）抗原結合ドメインとを含むヒトＣＤ３９タンパク質に一価的に結合するＣＤ３９中和抗原結合タンパク質の使用が提供される。
【００８１】
一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、細胞表面に発現されたＣＤ３９の細胞内内在化、もしくはより一般的には、その下方モジュレーションを増加させない、もしくは誘導しない、および／またはそのＣＤ３９阻害活性についてそれに依存しない。
【００８２】
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、（ａ）細胞の表面に発現された膜結合型ＣＤ３９タンパク質（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む）の酵素活性を阻害する、および（ｂ）可溶性ＣＤ３９タンパク質（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有する）の酵素活性を阻害することができる。
【００８３】
一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４）および／もしくはＣ１ｑに実質的に結合しない（例えば、そのＦｃドメインを介して）、ならびに／またはＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを、ＣＤ３９を発現する細胞に向かって実質的に指向させない。抗体は、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧアイソタイプの）を保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持してもよい。
【００８４】
一実施形態では、ＣＤ３９中和抗体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の、ｓＣＤ３９ポリペプチドおよび／または単量体ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の低下を引き起こす、適宜、可溶性単量体ヒトＣＤ３９タンパク質、例えば、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤ３９タンパク質によるＡＭＰ生成の減少を引き起こすことができることを特徴としてもよい。
【００８５】
一実施形態では、ＣＤ３９中和抗体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の、ＣＤ３９の細胞のＡＴＰａｓｅ活性の低下を引き起こす、適宜、ＣＤ３９を発現する細胞によるＡＭＰ生成の減少を引き起こすことができることを特徴としてもよい。一実施形態では、ＣＤ３９中和抗体は、１μｇ／ｍｌ以下、適宜、０．５μｇ／ｍｌ以下、適宜、０．２μｇ／ｍｌ以下の細胞によって発現されたＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の阻害に関するＥＣ５０（例えば、ＣＤ３９を発現する細胞によるＡＭＰ生成の阻害に関するＥＣ５０）を特徴としてもよい。
【００８６】
抗原結合化合物を、本明細書にさらに記載されるように生産し、任意の所望の段階で、ＣＤ３９の酵素活性を阻害する、特に、ｓＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を遮断し、可溶性ＣＤ３９タンパク質および適宜、さらにＣＤ３９を発現する細胞によるＡＤＰおよびＡＭＰ（およびＣＤ７３と一緒になって、アデノシン）の産生を減少させ、次いで、リンパ球の活性を回復させる、ならびに／またはリンパ球の活性化および／もしくは増殖のアデノシン媒介性阻害を軽減するその能力について評価することができる。
【００８７】
抗体の阻害活性（例えば、免疫増強能力）を、例えば、ＡＴＰの消失（加水分解）および／またはＡＭＰの生成を検出するためのアッセイにおいて評価することができる。
【００８８】
可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質を阻害する抗体の能力を、試験抗体を可溶性ＣＤ３９タンパク質（例えば、実施例１で生産される配列番号５のアミノ酸配列を有し、適宜、精製タグまたは他の機能的または非機能的な非ＣＤ３９由来アミノ酸配列をさらに含むＣＤ３９タンパク質）と共にインキュベートした後、ＡＴＰを検出することによって試験することができる。例えば、実施例１を参照されたい。簡単に述べると、試験抗体の用量範囲を、３７℃で１時間、実施例１に記載される可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にインキュベートするアッセイにおいて、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＡＴＰを定量することができる。２０μＭのＡＴＰを、ＣＴＧ試薬の添加前に３７℃でさらに３０分間、プレートに添加する。暗室中で５ｍｉｎ、短くインキュベートした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）照度計を使用して、放射光を定量する。
【００８９】
ＣＤ３９タンパク質を発現する細胞を阻害する抗体の能力を、試験抗体を細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞、ＣＤ３９をトランスフェクトした細胞など）と共にインキュベートした後、ＡＴＰを検出することによって試験することができる。例えば、実施例１を参照されたい。細胞を、３７℃で１時間、試験抗体と共にインキュベートすることができる。次いで、細胞を、３７℃でさらに１時間、２０μＭのＡＴＰと共にインキュベートする。プレートを４００ｇで２ｍｉｎ遠心分離し、細胞上清を発光マイクロプレート（白色ウェル）に移す。ＣＴＧを上清に添加し、暗室中で５ｍｉｎインキュベートした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）照度計を使用して放射光を定量する。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）および細胞と一緒になったＡＴＰ（最小光放射）とを比較することによって、抗ＣＤ３９抗体の効能を決定する。
【００９０】
抗体の存在下での、ＡＴＰのＡＭＰへの加水分解の減少、および／またはＡＴＰの増加および／またはＡＭＰの生成の減少は、抗体がＣＤ３９を阻害することを示す。一実施形態では、例えば、本明細書の実施例に記載のように、ＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）を、試験抗体と共にインキュベートした後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを検出することによって評価した場合、抗体調製物は、細胞によって発現されるＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下を引き起こすことができ、好ましくは、抗体は、細胞中のＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％または９０％の低下を引き起こす。一実施形態では、抗体は、本明細書に記載の抗ＣＤ３９抗体、例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９に関して観察されるＥＣ５０以下、適宜、本明細書に記載の抗ＣＤ３９抗体、例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９のものよりも２−ｌｏｇまたは１−ｌｏｇ以下高いＥＣ５０の、細胞によって発現されるＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の低下を引き起こすためのＥＣ５０を特徴とする。
【００９１】
一実施形態では、例えば、実施例１に記載のように、可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドを、試験抗体と共にインキュベートした後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを検出することによって評価した場合、抗体調製物は、可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下、好ましくは、可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％または９０％の低下を引き起こすことができる。
【００９２】
また、抗体の活性を、免疫細胞（例えば、アデノシン受容体を発現する免疫細胞；Ａ２Ａ受容体を発現する細胞）の活性をモジュレートする、例えば、リンパ球活性のアデノシン媒介性阻害を軽減する、またはリンパ球活性の活性化を引き起こすその能力について、間接的アッセイにおいて測定することもできる。これに、例えば、サイトカイン放出アッセイを使用して対処することができる。別の例では、抗体を、リンパ球の増殖をモジュレートするその能力について間接的アッセイにおいて評価することができる。
【００９３】
一例では、本開示の方法において使用することができる（例えば、ＣＤ７３陽性がんの処置における使用のための；ＣＤ７３の酵素活性を阻害する薬剤と組み合わせて使用するための）抗ＣＤ３９抗体または抗原結合ドメインを生産または同定するための方法であって、
（ａ）ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供する工程、
（ｂ）それぞれの抗体を、可溶性細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質と接触させ、そのＡＴＰａｓｅ活性の中和を評価する工程、および
（ｃ）少なくとも７０％、適宜８０％または適宜９０％のＡＴＰａｓｅ活性の中和をもたらす工程（ｂ）の抗体を選択する工程
を含む方法が提供される。
【００９４】
方法は、
（ｄ）ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害する薬剤の活性を強化する、工程（ｃ）で選択された抗体の能力を評価する工程；および
（ｅ）ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害する薬剤の活性を強化する、工程（ｄ）の抗体を選択する工程
をさらに含んでもよい。
【００９５】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で選択された抗体およびＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害する薬剤を、細胞、適宜、ヒトＴ細胞、適宜、ＣＤ４  Ｔ細胞、適宜、ＣＤ８  Ｔ細胞と接触させ、それらの細胞の活性化および／または増殖を評価することを含んでもよい。アッセイを、ＡＴＰ（例えば、外因的に添加されたＡＴＰ）の存在下で行ってもよい。
【００９６】
本明細書における任意の実施形態において、中和抗ＣＤ３９抗体は、ｓＣＤ３９と、細胞表面に発現されるＣＤ３９（ｍｅｍＣＤ３９）との両方に存在する抗原決定基に結合してもよい。
【００９７】
本明細書における任意の実施形態において、中和抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体が結合するＣＤ３９上のエピトープへの結合について競合してもよい（例えば、ＣＤ３９ポリペプチド上のエピトープへの結合について、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９のいずれかの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体と競合する）。
【００９８】
本明細書における任意の実施形態において、中和抗ＣＤ３９抗体は、モノクローナル抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９と同じエピトープに結合する、および／またはＣＤ３９ポリペプチドへの結合について、それと競合してもよい、例えば、ＣＤ３９ポリペプチドへの結合について、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体と競合してもよい。一実施形態では、中和抗ＣＤ３９抗体は、配列番号６および配列番号７の、それぞれＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体と同じエピトープに結合する、および／またはＣＤ３９ポリペプチドへの結合について、それと競合する。
【００９９】
本明細書における任意の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９が結合するＣＤ３９上のアミノ酸残基からなる群から選択される１、２または３個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合してもよい。
【０１００】
本明細書における任意の実施形態において、結合分子（例えば、抗ＣＤ３９抗体）は、本明細書に記載の軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含む可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、本明細書に記載の重鎖ＣＤＲ１、２および３を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、またはＣＤＲ（または重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲのセット）が、前記ＣＤＲ（または重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲの前記セット）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本明細書における任意の実施形態の一態様では、抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の３個のＣＤＲを含む重鎖と、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の３個のＣＤＲを含む軽鎖とを含んでもよい。
【０１０１】
本明細書における任意の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、本明細書に記載の重鎖（例えば、配列番号５２の重鎖）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、本明細書に記載の軽鎖（例えば、配列番号５３の軽鎖）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むことを特徴としてもよい。
【０１０２】
本明細書における任意の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、本明細書に開示される抗体のいずれかの機能保存的変異体であることを特徴としてもよい。「機能保存的変異体」は、限定されるものではないが、アミノ酸の、類似する特性（例えば、極性、水素結合能力、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するものとの置き換えを含む、ポリペプチドの全体のコンフォメーションおよび機能を変化させることなく、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が変化したものである。保存されると示されるもの以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なってもよく、類似する機能のいずれか２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性パーセントは、変化してもよく、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくものであるＣｌｕｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄなどによるアラインメントスキームに従って決定された場合、７０％〜９９％であってもよい。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定された場合、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、それが比較される天然のタンパク質または親タンパク質と同じか、または実質的に類似する特性または機能を有するポリペプチドを含む。
【０１０３】
本明細書における任意の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、Ｆｃドメインと、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４ポリペプチドとの結合を減少させるように改変される（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）ヒトＦｃドメインを含み、前記抗体は、（ｉ）配列番号６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖ならびに（ｉｉ）配列番号７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖を含んでもよい。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインと、ヒトＣ１ｑポリペプチドとの結合を減少させるように改変される（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）。一実施形態では、抗体は、重鎖定常領域中の、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０および３３１（ＫａｂａｔのＥＵナンバリング）からなる群から選択されるいずれか１、２、３、４、５個またはそれより多い残基にアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体は、重鎖定常領域中の、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０および３３１からなる群から選択されるいずれか３、４、５個またはそれより多い残基にアミノ酸置換を有する。一実施形態では、抗体は、配列番号５９〜６２のいずれかのアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。
【０１０４】
一実施形態では、抗体は、下記のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔの２３４、２３５および３３１位（下線）のアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む。
【化３】
2020536109.tif 000005
【０１０５】
一実施形態では、抗体は、下記のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔの２３４、２３５および３３１位（下線）のアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む。
【化４】
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【０１０６】
一実施形態では、抗体は、下記のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔの２３４、２３５、２３７、３３０および３３１位（下線）のアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む。
【化５】
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【０１０７】
一実施形態では、抗体は、下記のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔの２３４、２３５、２３７および３３１位（下線）のアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む。
【化６】
2020536109.tif 000008
【０１０８】
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体と同じエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体が結合するエピトープと少なくとも一部重複する、またはその中の少なくとも１個の残基を含むＣＤ３９のエピトープに結合する。抗体が結合する残基を、ＣＤ３９ポリペプチドの表面上に存在する、例えば、細胞の表面上に発現されるＣＤ３９ポリペプチド中に存在すると特定することができる。
【０１０９】
抗ＣＤ３９抗体の、ＣＤ３９突然変異体をトランスフェクトされた細胞への結合を測定し、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号２）に結合する抗ＣＤ３９抗体の能力と比較することができる。抗ＣＤ３９抗体と、ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体（例えば、表１の突然変異体）との結合の減少は、抗ＣＤ３９抗体の結合親和性の減少（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験などの公知の方法、またはポリペプチド突然変異体への結合のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定した場合）および／または抗ＣＤ３９抗体の総結合能力の低下（例えば、抗ＣＤ３９抗体濃度とポリペプチド濃度のプロットにおけるＢｍａｘの低下によって証明される）があることを意味する。結合の有意な減少は、突然変異した残基が、抗ＣＤ３９抗体への結合に直接関与するか、または抗ＣＤ３９抗体がＣＤ３９に結合する場合、結合タンパク質のごく近いところにあることを示す。
【０１１０】
一部の実施形態では、結合の有意な減少は、抗ＣＤ３９抗体と、ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体との間の結合親和性および／または能力が、抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、４０％を超えて、５０％を超えて、５５％を超えて、６０％を超えて、６５％を超えて、７０％を超えて、７５％を超えて、８０％を超えて、８５％を超えて、９０％を超えて、または９５％を超えて低下することを意味する。ある特定の実施形態では、結合は、検出限界より下に減少する。一部の実施形態では、結合の有意な減少は、抗ＣＤ３９抗体の、ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体への結合が、抗ＣＤ３９抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間で観察される結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）である場合に証明される。
【０１１１】
一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体が結合するアミノ酸残基を含む断片中の残基が異なるアミノ酸で置換されたＣＤ３９ポリペプチド突然変異体に対する有意により低い結合を示す。
【０１１２】
一部の実施形態では、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８またはＩ−３９９抗体が結合するＣＤ３９上のエピトープに結合する抗ＣＤ３９抗体（例えば、Ｉ−３９４以外）が提供される。
【０１１３】
一態様では、抗体は、Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２（配列番号２を参照する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２または３個の残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１４】
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号２のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２または３個の残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示す；ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９ＡおよびＥ１４２Ｋを有してもよい。１つの任意の態様では、抗体は、突然変異体１９以外の表１に記載のＣＤ３９ポリペプチド突然変異体のいずれかへの結合の喪失を有しない。別の任意の態様では、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号２のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２、３または４個の残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（適宜、実質的に完全な結合の喪失ではないが、減少；または適宜、実質的に完全な結合の喪失）を示す；ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３ＡおよびＲ１４７Ｅを有してもよい。
【０１１５】
一態様では、抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７（配列番号２を参照する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３または４個の残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。一態様では、抗体は、それぞれ、前記抗体と、配列番号２のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２、３または４個の残基に突然変異を含むＣＤ３９ポリペプチド突然変異体への結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を有する。
【０１１６】
一態様では、抗体は、（ａ）Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２（配列番号２を参照する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２または３個の残基）、ならびに（ｂ）Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３または４個の残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１７】
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、それぞれ、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号２のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、（ａ）Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２、３または４個の残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドと、（ｂ）Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２、または３個の残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドとの両方への結合の減少（例えば、実質的に完全な喪失）を示す。（ａ）のＣＤ３９ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３ＡおよびＲ１４７Ｅを有してもよい。（ｂ）のＣＤ３９ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９ＡおよびＥ１４２Ｋを有してもよい。抗体は、突然変異体５および１９以外の表１に記載のＣＤ３９ポリペプチド突然変異体のいずれかへの結合の喪失を有しない。
【０１１８】
一態様では、抗体は、Ｋ８７、Ｅ１００およびＤ１０７（配列番号２を参照する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３または４個の残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１９】
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号２のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｋ８７、Ｅ１００およびＤ１０７（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２、３または４個の残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示す；ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｋ８７Ａ、Ｅ１００ＡおよびＤ１０７Ａを有してもよい。抗体は、突然変異体１５以外の表１に記載のＣＤ３９ポリペプチド突然変異体のいずれかへの結合の喪失を有しない。
【０１２０】
一態様では、抗体は、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６およびＶ３７７（配列番号２を参照する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３または４個の残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１２１】
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号２のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６およびＶ３７７（配列番号２を参照する）からなる群から選択される１、２、３、４または５個の残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示す；ＣＤ３９ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６ＧおよびＶ３７７Ｓ、ならびに残基３７６と３７７の間にバリンの挿入を有してもよい。抗体は、突然変異体１１以外の表１に記載のＣＤ３９ポリペプチド突然変異体のいずれかへの結合の喪失を有しない。
【０１２２】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＤＹＮＭＨ（配列番号８）、またはその少なくとも４個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＶＰＬＮＧＧＳＴＦＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＧＴＲＦＡＹ（配列番号１０）、またはその少なくとも４、５もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＶＳＦＭＹ（配列番号１１）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号１２）、またはその少なくとも４、５、もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＱＱＴＫＥＶＰＹＴ（配列番号１３）、またはその少なくとも４、５、６、７、もしくは８個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が欠失するか、もしくは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９４のＬＣＤＲ３領域を含んでもよい。ＣＤＲ位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングによるものであってもよい。
【０１２３】
ヒトｓＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害する抗体の例示的な抗ＣＤ３９  ＶＨおよびＶＬ対は、抗体Ｉ−３９４のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に列挙され（配列番号６）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下に列挙される（配列番号７）。ＫａｂａｔのナンバリングによるＣＤＲは、配列番号６および配列番号７中で下線付きで示される。ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、含むように改変される）。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。
【化７】
2020536109.tif 000009
【化８】
2020536109.tif 000010
【０１２４】
本開示による別の例示的な抗ＣＤ３９  ＶＨおよびＶＬ対は、抗体Ｉ−３９５のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に列挙され（配列番号１４）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下に列挙される（配列番号１５）。ＫａｂａｔのナンバリングによるＣＤＲは、配列番号１４および配列番号１５中で下線付きで示される。ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、含むように改変される）。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。
【化９】
2020536109.tif 000011
【化１０】
2020536109.tif 000012
【０１２５】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＤＹＮＭＨ（配列番号１６）、またはその少なくとも４個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９５のＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＮＰＮＮＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９５のＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＧＴＲＦＡＳ（配列番号１８）、またはその少なくとも４、５もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９５のＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＹ（配列番号１９）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９５のＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＡＡＳＴＱＧＳ（配列番号２０）、またはその少なくとも４、５、もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９５のＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＱＱＳＫＥＶＰＦＴ（配列番号２１）、またはその少なくとも４、５、６、７、もしくは８個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が欠失するか、もしくは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９５のＬＣＤＲ３領域を含んでもよい。ＣＤＲ位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングによるものであってもよい。
【０１２６】
本開示による別の例示的な抗ＣＤ３９  ＶＨおよびＶＬ対は、抗体Ｉ−３９６のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に列挙され（配列番号２２）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下に列挙される（配列番号２３）。ＫａｂａｔのナンバリングによるＣＤＲは、配列番号２２および配列番号２３中で下線付きで示される。ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、含むように改変される）。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。
【化１１】
2020536109.tif 000013
【化１２】
2020536109.tif 000014
【０１２７】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＤＴＹＩＮ（配列番号２４）、またはその少なくとも４個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号２５）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＷＧＹＤＤＥＥＡＤＹＦＤＳ（配列番号２６）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号２７）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２８）、またはその少なくとも４、５、もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＨＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号２９）、またはその少なくとも４、５、６、７、もしくは８個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が欠失するか、もしくは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９６のＬＣＤＲ３領域を含んでもよい。ＣＤＲ位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングによるものであってもよい。
【０１２８】
本開示による別の例示的な抗ＣＤ３９  ＶＨおよびＶＬ対は、抗体Ｉ−３９９のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に列挙され（配列番号３０）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下に列挙される（配列番号３１）。ＫａｂａｔのナンバリングによるＣＤＲは、配列番号３０および配列番号３１中で下線付きで示される。ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、含むように改変される）。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる）を含む。
【化１３】
2020536109.tif 000015
【化１４】
2020536109.tif 000016
【０１２９】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＳＦＷＭＮ（配列番号３２）、またはその少なくとも４個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＦＹＴＮＳＮＱＲＦＫＧ（配列番号３３）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＤＦＧＷＹＦＤＶ（配列番号３４）、またはその少なくとも４、５、もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＳＡＳＳＳＩＮＳＮＹＬＨ（配列番号３５）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号３６）、またはその少なくとも４、５、もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＱＱＧＳＳＬＰＲＴ（配列番号３７）、またはその少なくとも４、５、６、７、もしくは８個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が欠失するか、もしくは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、Ｉ−３９９のＬＣＤＲ３領域を含んでもよい。ＣＤＲ位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングによるものであってもよい。
【０１３０】
Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６およびＩ−３９９抗体のいずれかにおいて、ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列（独立に、それぞれのＣＤＲ、または全部のＣＤＲ）を、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムのもの（ＶＨおよびＶＬ配列中で下線付きで示される）、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングシステムのもの、またはＩＭＧＴのナンバリングシステムのもの、または任意の他の好適なナンバリングシステムのものであると特定することができる。
【０１３１】
任意の態様では、特定される可変領域、ＦＲおよび／またはＣＤＲ配列は、１個または複数の配列改変、例えば、置換（１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれより多い配列改変）を含んでもよい。一実施形態では、置換は、保存的改変である。
【０１３２】
別の態様では、抗ＣＤ３９化合物は、本明細書に開示される抗体のＶＨドメインに対して、少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様では、抗ＣＤ３９抗体は、本明細書に開示される抗体のＶＬドメインに対して、少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
【０１３３】
ＣＤ７３を阻害する薬剤
ＣＤ７３酵素のエクト−５’ヌクレオチダーゼ活性の阻害または中和は、有利には、ＣＤ７３に結合し、ＣＤ７３酵素のエクト−５’ヌクレオチダーゼ活性を阻害する薬剤（例えば、低分子有機化合物、抗体、Ｆｃドメインに誘導したポリペプチド、イムノアドヘシンなど）の使用を含んでもよい。
【０１３４】
ＣＤ７３二量体のそれぞれのサブユニットは、２個の構造ドメイン：Ｎ末端ドメイン（Knapp et al. (2012)を参照してナンバリングされた、残基２７〜３１７）およびＣ末端ドメイン（残基３３７〜５４９）からなり、ＣＤ７３の大きい方のＮ末端ドメインは、金属イオン結合部位を含有し、２個のサンドイッチ型混合ｂシートを含む、４層のａ／ｂ−ｂ−ｂ−ａ構造を有する。Ｃ末端ドメインは、基質結合部位および二量体化接触面を含有し、ａ／ｂ−ｂ−ａ−ｂの組成の４層構造を有する。２個のドメインは、酵素が大きいドメイン移動を受け、それによって、開いたコンフォメーションと閉じたコンフォメーションとの間を切り替えるようにすることができる、小さいヒンジ領域を含む単一のヘリックス（残基３１８〜３３６）によって連結される。閉じたコンフォメーションにおいて観察される活性部位は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の接触面に位置し、両方のドメインの残基から形成される。例えば、参照により本明細書に組み込まれるKnapp et al. (2012) Structure 20, 2161-2173を参照されたい。
【０１３５】
異なる作用機序によってＣＤ７３のエクト−５’ヌクレオチダーゼ活性を阻害するように機能する様々な異なるＣＤ７３結合剤が当業界で公知である。プリンなどの低分子薬剤および非加水分解性ＡＤＰアナログＡＰＣＰ（アデノシン５’−［α，β−メチレン］二リン酸）などのＡＤＰアナログは、ＡＤＰの競合的阻害剤として作用する（例えば、ＣＤ７３のＡＤＰ結合部位に結合することによる）。抗体と低分子薬剤の両方を含む、他の薬剤は、非競合的阻害剤として作用し得る。例えば、ＣＤ７３の細胞内内在化を誘導することによってＣＤ７３の酵素活性を阻害するＢＭＳ−９８６１７９などの抗体が報告されている（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０８１７４８号を参照されたい）。他の例では、両方の低分子および／または抗体薬剤は、例えば、酵素活性にとって必要とされるドメイン運動の障害をもたらす部位でＣＤ７３に結合することによって、アロステリック阻害剤として作用することができる。例えば、計算生物学により、ＣＤ７３の二量体化接触面を標的化することによって、ＣＤ７３を非競合的に阻害することができる三分枝に基づく分子として、５または６員芳香環などの剛性の足場を組み合わせる低分子の設計が可能になり（Rahimova et al. (2018) PLOS Computational Biology; https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005943）、２−アルコキシ−３−（スルホニルアリールアミノメチレン）−クロマン−４−オン誘導体が、非競合的阻害剤として報告されている（Al-Rashida and Iqbal (2014) Med Res Rev 34: 703-743を参照されたい）。抗体ＭＥＤＩ９４４７（オレクルマブ；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０７５０９９号も参照されたい）は、ＣＤ７３を立体的に遮断し、ＣＤ７３が触媒的に活性なコンフォメーションを採るのを防ぐ（Geoghegan et al. (2016) mAbs 8: 454-467を参照されたい）。細胞膜結合型ＣＤ７３の非競合的阻害剤（内在化に依拠しない）として作用し、さらに、可溶性ＣＤ７３の酵素活性を阻害し、さらに、適宜、内在化に依拠することなく可溶性ＣＤ７３ポリペプチドを阻害することができる抗体も報告されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０５５６０９号を参照されたい。他の薬剤は、ＣＤ７３発現の核酸（例えば、ＲＮＡ）に基づく阻害剤を含んでもよい。
【０１３６】
ＣＤ７３の酵素活性を阻害することが報告された抗体薬剤の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０５５６０９号；第ＷＯ２０１６／１３１９５０号；第ＷＯ２０１７／０６４０４３号；第ＷＯ２０１７／１００６７０号；第ＷＯ２０１６／０７５０９９号；および第ＷＯ２０１６／０８１７４８号に開示されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ７３の酵素活性を阻害することが報告された低分子有機化合物の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０４９４４７号および第ＷＯ２０１５／１６４５７３号（プリン誘導体）、第ＷＯ２０１８／０９４１４８号、第ＷＯ２０１７／１２０５０８号、第ＷＯ２０１７／１５３９５２号および第ＷＯ２０１７／０９８４２１号に開示されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
抗体は、好ましくは、腫瘍細胞を含む細胞の表面に発現されるＣＤ７３上に存在するエピトープに結合し、ＣＤ７３酵素（例えば、細胞の表面に発現される膜結合型ＣＤ７３タンパク質）の酵素（エクト−５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する。一実施形態では、これらの抗体を、純粋なＣＤ７３遮断抗体として使用することができ、例えば、それらは、Ｆｃγ受容体に実質的に結合することなく、および／またはＣＤ７３を発現する細胞に向かってＡＤＣＣを実質的に指向させることなく、細胞の表面に発現される膜結合型ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害する。抗体は、Ｆｃドメインを保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持してもよい。抗体は、例えば、プロテアーゼ感受性（例えば、腫瘍環境中のＭＭＰなどのプロテアーゼに向かう）を低下させる、および／またはヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）への結合を減少させる、改変されたＦｃドメインを含んでもよい。
【０１３８】
抗体を、抗ＣＤ７３抗体の次の連続投与まで、所望の期間、例えば、１週間、２週間、１ヶ月間にわたって、ＣＤ７３の酵素活性を阻害するのに有効な量で投与してもよい。
【０１３９】
抗ＣＤ７３抗体の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０６４０４３号；第ＷＯ２０１７／１００６７０号；第ＷＯ２０１６／０７５０９９号；及び第ＷＯ２０１６／０８１７４８号に提供されている。
【０１４０】
一例では、本開示に従って使用される抗ＣＤ７３抗体は、細胞表面に発現されるＣＤ７３の、細胞内内在化、または一般的には、下方モジュレーションを引き起こす、または誘導することによって、ＣＤ７３の酵素活性を中和する。抗体ＢＭＳ−９８６１７９（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０８１７４８号）は、そのような抗体の一例である；この抗体は、ＣＤ７３上の立体的エピトープに結合することによって機能し、ここで、抗体は、ヒトＣＤ７３（配列番号１を参照する）のセグメント６５〜８３および１５７〜１７２中のアミノ酸残基を含む部位に結合する。
【０１４１】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、基質に結合していない場合の「開いた」コンフォメーションだけでなく、基質（例えば、ＡＭＰなどの天然の基質またはＡＭＰアナログであるアデノシン５’−（α，β−メチレン）二リン酸（ＡＰＣＰ）などの活性部位に結合する阻害剤もしくは他の化合物）に結合している場合の「閉じた」コンフォメーションでＣＤ７３上に存在するＣＤ７３上のエピトープに結合することができる。一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドへの結合についてＣＤ７３の基質と競合しない。ＣＤ７３の基質の例としては、例えば、ＡＭＰなどの天然の基質またはＡＭＰアナログであるアデノシン５’−（α，β−メチレン）二リン酸（ＡＰＣＰ）などの活性部位に結合する阻害剤もしくは他の化合物が挙げられる。
【０１４２】
一実施形態では、これらの抗体は、可溶性組換えＣＤ７３タンパク質としてＣＤ７３の酵素活性を阻害しない、例えば、これらの抗体は、抗体がオリゴマーを形成することができない設定／構成にある場合、例えば、それらがＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰（例えば、少なくとも１０倍、２０倍、１００倍など）で提供される場合に、可溶性ヒト二量体ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を阻害することができない。例えば、ＣＤ７３の細胞内内在化を引き起こすことによってＣＤ７３を阻害する抗体（例えば、ＢＭＳ−９８６１７９）または必ずしも可溶性ＣＤ７３ではなく、膜結合型ＣＤ７３を阻害するように設計された抗体（例えば、オレクルマブおよび／もしくはヒト化１Ｅ９抗体）は、抗体がオリゴマーを形成することができない設定／構成にある場合、可溶性ヒト二量体ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を阻害することができない可能性がある。残留ＣＤ７３酵素活性は十分なアデノシン生成をもたらして、免疫抑制効果を媒介することができるため、高レベルの抗体媒介性酵素遮断が、治療効果を媒介するために有利である。ｓＣＤ３９を阻害する抗体との組合せを利用する本明細書の処置方法および組成物は、そのような抗体の活性を増強するのに特に有用であり得る。
【０１４３】
一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＭＥＤＩ９４４７（オレクルマブ；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０７５０９９号を参照されたい）、またはそれとＣＤ７３上の共通の決定基もしくはエピトープ部位を共有する抗体である。一実施形態では、治療的抗ＣＤ７３抗体は、ＢＭＳ−９８６１７９（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０８１７４８号を参照されたい）、またはそれとＣＤ７３上の共通の決定基もしくはエピトープ部位を共有する抗体である。一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ヒト化１Ｅ９（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００６７０号を参照されたい）、またはそれとＣＤ７３上の共通の決定基もしくはエピトープ部位を共有する抗体である。
【０１４４】
一実施形態では、本開示に従って使用される抗ＣＤ７３抗体は、細胞表面に発現されたＣＤ７３の細胞内内在化、もしくはより一般的には、その下方モジュレーションを引き起こさない、および／またはそのＣＤ７３中和活性についてそれに依存しない。そのような抗体の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０７５０９９号（例えば、抗体ＭＥＤＩ９４４７、オレクルマブ）、第ＷＯ２０１６／０５５６０９号（例えば、抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７）および第ＷＯ２０１６／１３１９５０号に記載されている。オレクルマブは、アミノ酸セグメント１５８〜１７１および２０６〜２１１中の残基、例えば、残基Ｖ１７０、Ｋ２０６およびＮ２１１（配列番号１を参照する）でＣＤ７３に結合する。抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７は、残基Ｋ１３６（配列番号１のＣＤ７３ポリペプチドを参照する）に置換を有するＣＤ７３突然変異体への結合を失う。抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７はまた、残基Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５（配列番号１のＣＤ７３ポリペプチドを参照する）に置換を有する突然変異体、ならびに残基Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３およびＫ３３０（配列番号１のＣＤ７３ポリペプチドを参照する）に置換を有する突然変異体への結合も失う。
【０１４５】
本開示に従って使用される抗ＣＤ７３抗体は、可溶性組換えＣＤ７３タンパク質としてＣＤ７３の酵素活性を阻害することができてもよい（例えば、これらの抗体は、抗体がオリゴマーを形成することができない設定／構成にある場合、例えば、それらがＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰（例えば、少なくとも１０倍、２０倍、１００倍など）で提供される場合に、可溶性ヒト二量体ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を阻害することができる）。抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７は、そのような抗体の例である。そのようなＣＤ７３機能を遮断する抗体を同定するために使用することができる可溶性ＣＤ７３を使用するアッセイは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０５５６０９号および第ＷＯ２０１６／１３１９５０号に提供されている。そのような抗体は、ｓＣＤ３９を阻害する抗体と組み合わせて使用した場合、最も高い程度のアデノシン生成および／または免疫抑制の阻害を提供することができる。
【０１４６】
したがって、抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドのアロステリック阻害剤であってもよく、例えば、抗体は、限定されるものではないが、腫瘍細胞を含む細胞の表面に発現されたヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３ポリペプチドに結合するＣＤ７３ポリペプチドの基質の能力と干渉することなく、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素（エクト−５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する。
【０１４７】
ＣＤ７３がＣＤ７３二量体として存在する場合に同じ面に存在するＣＤ７３上のエピトープに結合する、例えば、特に、結合部位が空間的にさらに離れている「閉じた」位置において、抗体を１個のＣＤ７３二量体に二価的に潜在的に結合させる例示的な抗体は、本明細書に記載される。リガンドに結合したＣＤ７３への結合を考慮すると、本明細書に記載の抗体は、例えば、上流のＡＤＰおよび／またはＡＭＰが処置前に十分なレベルで存在する腫瘍環境中で、ＡＭＰに結合した場合、ＣＤ７３への結合にとって有用であり得る。腫瘍微小環境は、任意の適切なパラメータによって、例えば、間質および細胞浸潤物（例えば、ＴＲｅｇ細胞）上でＣＤ３９によって取り込まれて、高レベルのＡＭＰをもたらす高レベルのＡＤＰ（例えば、死滅しつつある細胞によって生成される）によって、ならびにより一般的には、ＡＭＰ、アデノシンによって、ＣＤ３９発現またはＣＤ３９を発現する細胞の存在またはレベルによって、ＣＤ７３発現またはＣＤ７３を発現する細胞の存在またはレベルによって、アデノシン受容体発現またはアデノシン受容体を発現する細胞の存在またはレベルによって特徴付けることができる。かくして、腫瘍環境中のＣＤ７３分子は、基質に結合したコンフォメーションにあってよく、非基質に結合したＣＤ７３に加えて、基質に結合した細胞性ＣＤ７３（例えば、ＡＭＰなどの基質と共に予備インキュベートしたＣＤ７３を発現する細胞）に結合し、これを阻害する能力は、インビボでＣＤ７３を阻害するより高い能力を提供することができる。適宜、ＡＤＰまたはＡＭＰ（および／またはＡＴＰもしくはアデノシン）のレベルを、処置前の腫瘍環境中で評価することができる。抗体は、腫瘍試料中に有意なレベル（例えば、参照と比較して高レベル）のＡＤＰ、ＡＭＰ、ＡＴＰまたはアデノシンを有する個体における処置にとって特に有利であってもよい。
【０１４８】
例示的な抗体は、細胞の表面に発現されたヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素（エクト−５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害してもよく、ここで、抗体は単一のＣＤ７３ポリペプチド二量体（可溶性ＣＤ７３ポリペプチド二量体または細胞によって発現されたＣＤ７３ポリペプチド二量体）に二価的に結合することができる。抗体は、第１の抗原結合ドメインを用いて二量体内の第１のＣＤ７３ポリペプチドに、第２の抗原結合ドメインを用いて第２のＣＤ７３ポリペプチドに結合する。
【０１４９】
例示的な抗体は、細胞の表面に発現されたヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素（エクト−５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害してもよく、ここで、抗体は基質に結合したコンフォメーションでＣＤ７３ポリペプチドに結合することができる。
【０１５０】
薬剤（例えば、ＣＤ７３に結合する化合物、抗ＣＤ７３抗体）を、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する、特に、ＣＤ７３の５’−ヌクレオチダーゼ活性を遮断する、およびＣＤ７３を発現する細胞によるアデノシンの産生を減少させ、次いで、リンパ球の活性を回復する、および／またはリンパ球のアデノシン媒介性阻害を軽減するその能力について評価および選択することができる。
【０１５１】
ＣＤ７３の酵素活性を阻害する抗体の能力を、ＡＭＰのアデノシンへの変換（および／またはその阻害）を直接的に（例えば、基質および生成物、すなわち、ＡＭＰ、アデノシンおよび／もしくはリン酸の測定により）、または間接的に検出する、組換え可溶性ヒトＣＤ７３（二量体として）およびＡＭＰを使用する無細胞アッセイにおいて試験することができる。一例では、ＡＭＰおよび／またはアデノシンを、試験化合物と組換えＣＤ７３とのインキュベーションの前後にＨＰＬＣによって検出する。組換えＣＤ７３は、例えば、ＷＯ２０１６／０５５６０９およびＷＯ２０１６／１３１９５０に記載されている。
【０１５２】
抗体の阻害活性を、いくつかの他の方法のいずれかにおいて評価することもできる。例えば、間接アッセイにおいては、ルシフェラーゼに基づく試薬（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）システム）を使用して、ＡＭＰの消失を検出する。アッセイにおけるルシフェラーゼ反応は、ＡＭＰによって阻害される。反応物へのＣＤ７３酵素の添加は、ＡＭＰを分解し、阻害を軽減して、検出可能なシグナルを産生する。
【０１５３】
可溶性ＣＤ７３を使用するアッセイは、有利には、抗体がＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰（例えば、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など）で提供される条件での試験を含んでもよい。酵素に対してモル過剰で提供される場合、抗ＣＤ７３抗体は、抗体とＣＤ７３二量体との多量体複合体を最早形成することができないであろう；次いで、ＣＤ７３の酵素活性の阻害を保持する抗体を選択することができる。
【０１５４】
あるいは、またはさらに、ＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ酵素活性を阻害する抗体の能力を、細胞アッセイ（ＣＤ７３を発現する細胞を使用する）において試験することもできる。有利には、抗体を無細胞アッセイにおいて最初に試験またはスクリーニングして、ＣＤ７３の内在化を引き起こすことによってＣＤ７３を阻害する抗体を選択する可能性を低下させる酵素の活性を遮断する抗体を同定した後、細胞アッセイにおいて精製された抗体として試験することができる。細胞アッセイを、ＷＯ２０１６／０５５６０９に示されたように実行することができる。例えば、ＣＤ７３を発現する細胞株（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株）を、抗ＣＤ７３抗体の存在下で平底９６ウェルプレート中に播種し、インキュベートする。ＡＭＰを細胞に添加し、４℃（ＣＤ７３下方モジュレーションを避けるため）でインキュベートする。次いで、プレートを遠心分離し、上清を平底９６ウェル培養プレートに移す。次いで、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解によって産生される遊離リン酸を定量する。抗体の存在下でのＡＭＰに変換のアデノシンへの加水分解の減少は、抗体が細胞性ＣＤ７３を阻害することを示す。
【０１５５】
一実施形態では、抗体調製物は、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性の少なくとも５０％の低下、好ましくは、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％、７０％または８０％の低下を引き起こす（例えば、可溶性ホモ二量体ＣＤ７３ポリペプチド；細胞によって発現されるＣＤ７３）。
【０１５６】
また、抗体の活性を、リンパ球の活性をモジュレートする、例えば、リンパ球活性のアデノシン媒介性阻害を軽減する、またはリンパ球活性の活性化を引き起こすその能力について、間接的アッセイにおいて測定することもできる。これに、例えば、サイトカイン放出アッセイを使用して対処することができる。別の例では、抗体を、リンパ球の増殖をモジュレートするその能力について間接的アッセイにおいて評価することができる。
【０１５７】
抗体を、ＣＤ７３の下方モジュレーションを内在化するか、または誘導するその能力、例えば、細胞表面から脱落するＣＤ７３の内在化または誘導によるかどうかについて試験することができる。抗ＣＤ７３抗体が哺乳動物細胞上にＣＤ７３を結合させる際に内在化するかどうか、またはＣＤ７３ポリペプチドが細胞内内在化を受けるかどうか（例えば、抗体が結合する際に）を、ＷＯ２０１６／０５５６０９（例えば、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む様々なアッセイによって決定することができる。
【０１５８】
一例では、抗体がオリゴマーを形成することができない設定／構成にある場合、例えば、それらがＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰（例えば、少なくとも１０倍、２０倍、１００倍など）で提供される場合に、可溶性ヒト二量体ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を阻害する能力について、抗体を選択することができる。オリゴマー化を引き起こすことによって機能する抗体は、抗体がＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰で提供される場合、ＣＤ７３を阻害することができない。抗体はさらに、ＣＤ７３が細胞表面に発現される場合に維持されるＣＤ７３上のエピトープに結合する。このアッセイの使用によって、単一のＣＤ７３二量体に二価的に結合する抗体を同定することもできる；そのような抗体は、ＣＤ７３を発現する細胞中、インビトロおよびインビボで改善されたＣＤ７３結合活性およびＣＤ７３遮断活性を有してもよい。次いで、これらの方法によって同定された抗体を、精製された抗体を使用する細胞酵素活性アッセイにおいて試験したところ、細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和することが見出された。内在化を誘導することによってＣＤ７３を阻害する、または細胞性ＣＤ７３への有意な結合を失う抗体は、効力が弱く、酵素活性を中和することができず、細胞中でＣＤ７３の酵素活性のよくても部分的な阻害しかもたらさなかった。
【０１５９】
これらの抗体が結合するＣＤ７３上のエピトープは、様々な細胞、例えば、がん細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細胞、トランスフェクトされた細胞によって発現されるＣＤ７３ポリペプチド上に存在し、フローサイトメトリーによって決定された場合、高い親和性で結合する。例えば、抗体は、ＣＤ７３ポリプチドを表面に発現する細胞への結合に関する、本明細書に記載の抗ＣＤ７３抗体（例えば、抗体６Ｅ１）のものと同等である、またはそれより２−ｌｏｇ以下、適宜、１−ｌｏｇ以下高い、または５μｇ／ｍｌ以下、適宜、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下もしくは０．０５μｇ／ｍｌ以下である、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０を特徴としてもよい。一実施形態では、細胞は、その表面にＣＤ７３を発現するように作製された細胞である。一実施形態では、細胞は、その表面にＣＤ７３を内因的に発現する細胞、例えば、がん細胞、白血病細胞、膀胱がん細胞、グリオーマ細胞、グリア芽腫細胞、卵巣がん細胞、メラノーマ細胞、前立腺がん細胞、甲状腺がん細胞、食道がん細胞または乳がん細胞である。
【０１６０】
一実施形態では、ＣＤ７３中和抗体は、少なくとも６０％、７５％または８０％の、ＣＤ７３の細胞の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性の低下を引き起こすことができることを特徴としてもよい。一実施形態では、ＣＤ７３中和抗体は、本明細書に記載の抗ＣＤ７３抗体（例えば、抗体６Ｅ１）のものと同等である、またはそれ以下のものである、それより２−ｌｏｇ以下、適宜、１−ｌｏｇ以下高い、または１μｇ／ｍｌ以下、適宜、０．５μｇ／ｍｌ以下、適宜、０．２μｇ／ｍｌ以下である、細胞によって発現されるＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害に関するＥＣ５０を特徴としてもよい。
【０１６１】
細胞によって発現されるＣＤ７３の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害を、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を定量することによってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中の５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによって決定してもよい（例えば、ＷＯ２０１６／０５５６０９の実施例５を参照されたい）。
【０１６２】
本明細書に開示される中和抗体が結合するＣＤ７３上のエピトープは、二価様式でＣＤ７３に結合する完全長抗体を使用する場合を含めて、細胞上でのＣＤ７３発現の下方モジュレーションをもたらさない（例えば、抗体−ＣＤ７３複合体のクラスタリングおよび内在化を引き起こさない）。かくして、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３と一緒になって、細胞表面に結合したままである。ＣＤ７３の広い組織発現を考慮すると、ＣＤ７３の下方モジュレーションおよび／または内在化を誘発しない抗体は、改善された薬理学的特性および腫瘍微小環境中の大量の抗体を提供することができる。
【０１６３】
一実施形態では、ヒトＣＤ７３（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）に特異的に結合し、溶液中でホモ二量体ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する単離された抗体が提供される。一実施形態では、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、その酵素活性を阻害する抗体、特に、ＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化を中和する抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、二価様式でＣＤ７３に結合する。一実施形態では、抗体は、非枯渇抗体、例えば、Ｆｃサイレント抗体である。一実施形態では、抗体は、ＣＤ７３ポリペプチド：抗ＣＤ７３抗体オリゴマーの誘導に依拠せずに溶液中のＣＤ７３を中和する。
【０１６４】
一実施形態では、抗体は、細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。一実施形態では、抗体は、可溶性ＣＤ７３のオリゴマー化を誘導しない。
【０１６５】
一実施形態では、抗体は、細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、細胞性ＣＤ７３（細胞によって発現されるＣＤ７３）の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。一実施形態では、抗体は、細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、その５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和し、ＣＤ７３への結合の際にＣＤ７３を発現する細胞中に内在化されない。この抗体は、ＣＤ７３の多量体化およびその後の内在化を引き起こさない。一実施形態では、抗体は、溶液中の組換えヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、その酵素活性を阻害することができ、前記抗体は、ＣＤ７３を発現する細胞中に内在化されない。一実施形態では、非内在化抗体は、二価様式でＣＤ７３に結合する。一実施形態では、抗体は、非枯渇抗体、例えば、Ｆｃサイレント抗体である。この抗体は、さらに、ＣＤ７３ポリペプチド抗ＣＤ７３抗体のオリゴマーの誘導に依拠することなく、溶液中の二量体ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。
【０１６６】
一実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに二価的に特異的に結合し、細胞性ヒトＣＤ７３（および適宜、さらに組換え可溶性ヒトＣＤ７３）の酵素活性を阻害し、前記抗体は、ＣＤ７３を発現する細胞中に内在化されない。好ましくは、抗体は、Ｆｃγ受容体結合（例えば、そのＦｃドメインを介する）を実質的に欠く。
【０１６７】
一実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに特異的に結合し、細胞性ヒトＣＤ７３（および適宜、さらに組換え可溶性ヒトＣＤ７３）の酵素活性を阻害し、前記抗体は、ＣＤ７３を発現する細胞中でのＣＤ７３の細胞内内在化を増加させる、または誘導する。好ましくは、この抗体は、Ｆｃγ受容体結合（例えば、そのＦｃドメインを介する）を実質的に欠く。
【０１６８】
一態様では、抗体は、ＡＭＰと共に予備インキュベートされた細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、その５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。５’−エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を定量することによってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中の５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによって決定してもよい（例えば、ＷＯ２０１６／０５５６０９の実施例５を参照されたい）。
【０１６９】
適宜、抗ＣＤ７３抗体は、可溶性ＣＤ７３と、細胞表面に発現されるＣＤ７３との両方に存在する共通の抗原決定基に結合することができる。
【０１７０】
抗ＣＤ７３抗体は、それが「開いた」コンフォメーションにある場合（ＣＤ７３活性部位が基質、例えば、ＡＭＰ、ＡＰＣＰによって占有されない／それに結合しない場合）のＣＤ７３と、それが「閉じた」コンフォメーションにある場合（ＣＤ７３活性部位が基質、例えば、ＡＭＰ、ＡＰＣＰによって占有される／それに結合する場合）の「閉じた」ＣＤ７３の上に存在する共通の抗原決定基に結合してもよい。
【０１７１】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、抗原決定基がＣＤ７３二量体の共通の面に存在する場合、ＣＤ７３二量体内のそれぞれのＣＤ７３ポリペプチド鎖内の抗原決定基に結合する。
【０１７２】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、セグメント１５８〜１７１中の残基および／またはセグメント２０６〜２１１中の残基にアミノ酸置換を有するＣＤ７３ポリペプチド、例えば、Ｖ１７０  Ｋ２０６およびＮ２１１（配列番号１を参照する）のいずれか１個またはそれより多い残基にアミノ酸置換を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少している。
【０１７３】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、セグメント６５〜８３中の残基および／またはセグメント１５７〜１７２中の残基（配列番号１を参照する）にアミノ酸置換を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少している。
【０１７４】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、残基Ｋ１３６（配列番号１を参照する）を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【０１７５】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３およびＫ３３０（配列番号１を参照する）からなる群から選択される１、２、３または４個の残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【０１７６】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、およびＡ１３５（配列番号１を参照する）からなる群から選択される１、２、３、４または５個の残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【０１７７】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、少なくとも部分的には、アミノ酸残基Ｋ９７、Ａ９９、Ｅ１２５、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、Ａ１３５、Ｋ１３６、Ｑ１５３およびＫ３３０（配列番号１を参照する）を含むヒトＣＤ７３タンパク質（例えば、ＣＤ７３ホモ二量体タンパク質）上のアミノ酸残基のドメインまたはセグメント内に結合する。一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ａ９９、Ｅ１２５、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、Ａ１３５、Ｋ１３６、Ｑ１５３およびＫ３３０（配列番号１を参照する）からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４または５個、またはそれより多い残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【０１７８】
一態様では、残基Ｋ１３６（配列番号１を参照する）に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少している；ＣＤ７３ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｋ１３６Ａを有してもよい。
【０１７９】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３およびＫ３３０（配列番号１を参照する）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少している；ＣＤ７３ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ、Ｑ１５３Ａおよび／またはＫ３３０Ａ（例えば、Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５ＡおよびＫ３３０Ａ；Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａおよび／またはＱ１５３Ａ）を有してもよい。
【０１８０】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５（配列番号１を参照する）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少している；ＣＤ７３ポリペプチド突然変異体は、突然変異：Ａ９９Ｓ、Ｅ１２９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｅ１３４ＮおよびＡ１３５Ｓを有してもよい。
【０１８１】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、オレクルマブ、ヒト化１Ｅ９、ＢＭＳ−９８６１７９、１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２および／または６Ｅ１が結合するＣＤ７３上のエピトープへの結合について競合する（例えば、ＣＤ７３ポリペプチド上のエピトープへの結合について、前記抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体と競合する）。
【０１８２】
本明細書における任意の実施形態の一態様では、抗原結合化合物は、モノクローナル抗体１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２および／または６Ｅ１と同じエピトープに結合する、および／またはＣＤ７３ポリペプチド上のエピトープへの結合について、それと競合する（例えば、ＣＤ７３ポリペプチドへの結合について、１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１のいずれかの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体と競合する）。一実施形態では、抗原結合化合物は、
（ａ）それぞれ、配列番号３および配列番号４のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（６Ｅ１）；
（ｂ）それぞれ、配列番号４０および配列番号４１のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１１Ｅ１）；
（ｃ）それぞれ、配列番号４２および配列番号４３のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（８Ｃ７）；ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号４４および配列番号４５のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（３Ｃ１２）からなる群から選択される抗体
と同じエピトープに結合する、および／またはＣＤ７３ポリペプチド上のエピトープへの結合について、それと競合する。
【０１８３】
一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、１１Ｅ、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７が結合するＣＤ７３上のアミノ酸残基からなる群から選択される１、２または３個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合してもよい。
【０１８４】
本明細書における任意の実施形態の一態様では、抗体は、オレクルマブ、ヒト化１Ｅ９、ＢＭＳ−９８６１７９、１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７からなる抗体群から選択される抗体の対応する重鎖および／または軽鎖の１、２または３個のＣＤＲを有する重鎖および／または軽鎖を有してもよい。
【０１８５】
本明細書における任意の実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、細胞（例えば、腫瘍細胞、ＣＤ７３を発現するように作製された細胞、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞株、またはＷＯ２０１６／０５５６０９に示されたような、ＣＤ７３を発現するように作製された組換え宿主細胞）の表面上に発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合することを特徴としてもよく、さらに、この抗体は、フローサイトメトリーによって決定した場合、高い親和性で結合してもよい。例えば、抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドを表面に発現する細胞、例えば、ＣＤ７３を発現する腫瘍細胞、ＣＤ７３ポリペプチドを表面に発現する細胞、ＣＤ７３を発現するリンパ球などへの結合に関する、５μｇ／ｍｌ以下、適宜、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下または０．０５μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるインビトロでのＥＣ５０を特徴としてもよい。抗原結合化合物は、（ｉ）ヒトＣＤ７３（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を表面に発現する細胞および／または（ｉｉ）非ヒト霊長類ＣＤ７３（例えば、カニクイザルＣＤ７３）を表面に発現する細胞への結合に関する、１μｇ／ｍｌ以下、適宜、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下または０．０５μｇ／ｍｌ以下のインビトロでのＥＣ５０を有してもよい。
【０１８６】
本明細書における任意の実施形態の一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、重鎖がヒトアイソタイプのＦｃ領域を含み、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４）への結合を実質的に欠く、２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む四量体抗体である。一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、Ｆｃドメインと、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４ポリペプチドとの結合を減少させるように改変された（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、抗体は、重鎖定常領域中の、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０および３３１（ＫａｂａｔのＥＵナンバリング）からなる群から選択されるいずれか１、２、３、４、５個またはそれより多い残基にアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体は、重鎖定常領域中の、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０および３３１からなる群から選択されるいずれか３、４、５個またはそれより多い残基にアミノ酸置換を有する。一実施形態では、抗体は、配列番号５９〜６２のいずれかのアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。
【０１８７】
抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、表Ａに列挙する。特定の実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７と同じか、または実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供する；この抗体は、抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７の超可変領域を含んでもよい。本明細書における任意の実施形態において、抗体１１Ｅ１は、アミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴としてもよい。一実施形態では、モノクローナル抗体は、１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７の重鎖可変領域の３個のＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＩＧＭＴのナンバリングによる）を含む。また、１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２もしくは８Ｃ７の軽鎖可変領域または１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２もしくは８Ｃ７の軽鎖可変領域の１、２もしくは３個のＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＩＧＭＴのナンバリングによる）をさらに含むモノクローナル抗体も提供される。前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４もしくは５個またはそれより多いアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有してもよい。適宜、抗体１１Ｅ１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域、適宜、ヒト定常領域、適宜、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプに融合された抗体も提供される。一実施形態では、ヒト定常領域は、エフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を減少させるアミノ酸置換をさらに含んでもよい。一実施形態では、ヒト定常領域（適宜、ヒンジ領域）は、ＣＤ７３の細胞内内在化を増加させる、または誘導するアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１８８】
抗ＣＤ７３抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＳＹＮＭＹ（配列番号４６）、またはその少なくとも４個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、６Ｅ１のＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＮＰＮＮＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号４７）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、６Ｅ１のＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＹＮＮＹＫＡＷＦＡＹ（配列番号４８）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、６Ｅ１のＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＫＡＳＱＳＶＴＮＤＶＡ（配列番号４９）、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、６Ｅ１のＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号５０）、またはその少なくとも４、５、もしくは６個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、６Ｅ１のＬＣＤＲ２；および／またはアミノ酸配列：ＱＱＤＹＳＳＬＴ（配列番号５１）、またはその少なくとも４、５、６、７、もしくは８個の連続するアミノ酸の配列を含み、これらのアミノ酸のうちの１個または複数が欠失するか、もしくは異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、６Ｅ１のＬＣＤＲ３を含んでもよい。ＣＤＲ位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングによるものであってもよい。
【０１８９】
本明細書における任意の実施形態の別の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および／または３のいずれかは、少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列、および／または対応する配列番号中に列挙される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴としてもよい。
【０１９０】
抗体、例えば、１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１のいずれかにおいて、特定の可変領域およびＣＤＲ配列は、配列改変、例えば、置換（１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれより多い配列改変）を含んでもよい。一実施形態では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および／または３は、１、２、３個またはそれより多いアミノ酸置換を含み、置換された残基は、ヒト起源の配列中に存在する残基である。一実施形態では、置換は、保存的改変である。保存的配列改変とは、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響しない、またはそれを変化させないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。改変を、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発などの、当業界で公知の標準的な技術によって、抗体中に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、あるアミノ酸残基が類似する物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。特定の可変領域およびＣＤＲ配列は、１、２、３、４個またはそれより多いアミノ酸挿入、欠失または置換を含んでもよい。置換を作製する場合、好ましい置換は保存的改変であろう。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。かくして、抗体のＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基と置き換え、変化した抗体を、本明細書に記載のアッセイを使用して、保持された機能（すなわち、本明細書に記載の特性）について試験することができる。
【０１９１】
抗体の可変領域の配列は、以下の表Ａに列挙される（リーダー配列が存在する場合、任意の抗体鎖を、リーダー配列の終わりの直後のアミノ酸位置で開始すると特定することができる）。本明細書の任意の実施形態において、ＶＬまたはＶＨ配列を、シグナルペプチドまたはその任意の一部を含有する、または欠くように特定するか、またはナンバリングすることができる。表Ａに示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する抗体のＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３を、適宜、全て（またはそれぞれ独立に）、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムのもの、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングシステムのもの、ＩＭＧＴのナンバリングシステムのもの、または他の任意の好適なナンバリングシステムのものであると特定することができる。
【０１９２】
【表１】
2020536109.tif 000017
【０１９３】
一実施形態では、抗体は、腫瘍微小環境中のＣＤ７３の活性を阻害するのに十分な量および頻度で、がんを有する個体に投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍微小環境中でのアデノシンの生成および／または濃度を減少させるのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍微小環境中でのＡＴＰの生成および／または濃度を増加させるのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、腫瘍細胞によって発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。一実施形態では、抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、および／またはＢ細胞によって発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。
【０１９４】
一実施形態では、ＣＤ７３の低分子阻害剤は、ＣＤ７３の二量体化接触面に結合し、非競合的阻害剤として作用する。別の実施形態では、ＣＤ７３の低分子阻害剤は、ＣＤ７３の基質（ＡＤＰ）結合部位に結合する。一実施形態では、阻害剤は、プリン誘導体部分を含む。一実施形態では、阻害剤は、ＷＯ２０１７／０９８４２１に記載の部分、式（Ｉ）：
【化１５】
2020536109.tif 000018
（式中、Ｒは、
アリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
シクロアルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏアリール、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２アリール、および、
−ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたアリール、
ヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏアリール、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２アリール、および
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたヘテロアリール、
ビシクロヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏアリール、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２アリール、および、
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたビシクロヘテロアリール、
シクロアルキル、ならびに
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏアリール、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２アリール、および、
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたシクロアルキルから選択され；
Ｒ１は、
水素、
Ｃ１〜４アルキル、および、
フルオロ、クロロ、−ＯＨおよび−ＮＨから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ２は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキルから選択され；
Ｒ３は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ４は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ５は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキルから選択される）
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１９５】
適宜、上記の式（Ｉ）の化合物は、以下の式（ＩＩＸａ）：
【化１６】
2020536109.tif 000019
（式中、
Ｒ１０は、
アリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏアリール、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２アリール、および、
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたアリール、
ヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、ならびに
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたヘテロアリール、
ビシクロヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、ならびに
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたビシクロヘテロアリール、
シクロアルキル、ならびに
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
シクロアルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、ならびに
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたシクロアルキルから選択され；
Ｒ１１は、
水素、および、
Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ１２は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ１３は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ１４は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキルから選択され；
Ｒ１５は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、
フルオロ、クロロ、およびブロモから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキルオキシ、ならびに
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択される）
およびその薬学的に許容される塩によって表される。
【０１９６】
適宜、化合物は、以下の式（ＩＩＩ）：
【化１７】
2020536109.tif 000020
（式中、
Ｒ２０は、
フェニル、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮ、シクロアルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏアリール、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２アリール、ならびに
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたフェニル、
ヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ならびに
−Ｎ（ＣＨ３）２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたヘテロアリール、
ビシクロヘテロアリール、ならびに
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ならびに
−Ｎ（ＣＨ３）２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたビシクロヘテロアリール
から選択され；
Ｒ２１は、
水素、および、
Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ２２は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、および−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ２３は、
水素、フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、および
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ２４は、
水素、フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、および−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択され；
Ｒ２５は、
水素、フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
−ＯＨ、
−ＣＮ、
Ｃ１〜４アルキル、
Ｃ１〜４アルキルオキシ、および、
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル
から選択される）
およびその薬学的に許容される塩によって表される。
【０１９７】
一実施形態では、ＣＤ７３阻害剤は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５３９５２号の開示による低分子有機化合物、例えば、以下の式（Ｉ）に記載の化合物：
【化１８】
2020536109.tif 000021
（式中、
Ｒは、
アリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ３１０Ｒ３２０、−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２および−ＣＮから独立に選択される１〜９個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
シクロアルキル、
ヘテロアリール、
Ｃ１〜６アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨ、フェニルおよび−ＣＮから独立に選択される１〜９個の置換基で置換されたＣ１〜６アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏシクロアルキル、
−Ｏフェニル、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３、
−ＣＯＯＨ、
−Ｃ１〜４アルキルＯＣ１〜４アルキル、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜９個の置換基で置換された−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｃ１〜４アルキルＮＨＢｏｃ、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２フェニル、
−ＳＣ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜９個の置換基で置換されたＳＣ１〜６アルキル、
−ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたアリール、ならびに
ヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、−ＯＨ、−ＮＲ３１０Ｒ３２０、および−ＣＮ、アリールから独立に選択される１〜９個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＩＭＨ２、ならびに
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたヘテロアリール、
ビシクロヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ３１０Ｒ３２０、および−ＣＮから独立に選択される１〜９個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキル、
シクロアルキル、
アリール、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏフェニル、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｎ（Ｈ）アリール、ならびに
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたビシクロヘテロアリールから選択され；
Ｒ１およびＲ２は、
水素、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、オキソ、−ＯＨおよび−ＮＨ２から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ２、フェニル、置換フェニル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールから独立に選択される１〜９個の置換基で置換された−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜６アルキル
から独立に選択され；
Ｒ３１０およびＲ３２０は、水素およびＣ１〜４アルキルから独立に選択されるか、またはＲ３１０およびＲ３２０は、それらが結合する窒素と一緒になって、酸素および窒素から選択される最大１個の他のヘテロ原子を含有する５〜６員複素環を形成する）
またはその薬学的に許容される塩である。
【０１９８】
適宜、上記の式（Ｉ）は、以下の式（ＩＩ）：
【化１９】
2020536109.tif 000022
（式中、
Ｒ１０は、
アリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、Ｃ１〜４アルキルオキシ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＲ３１１Ｒ３２１から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
シクロアルキル、
ヘテロアリール、
Ｃ１〜６アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨ、フェニルおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−Ｏシクロアルキル、
−Ｏフェニル、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＮＨ２、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換された−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｎ（Ｈ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）アリール、
−Ｎ（Ｈ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ１〜４アルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、
−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２フェニル、
−ＳＣ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換された−ＳＣ１〜６アルキル、ならびに
−ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたアリール、
ヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、−ＯＨ、−ＮＲ３１１Ｒ３２１、および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
アリール、
Ｃ１〜４アルコキシ、
−ＣＮ、
オキソ、
−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＯ２、
−ＩＭＨ２、ならびに
ＳＯ２ＮＨ２
から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたヘテロアリール、
ビシクロヘテロアリール、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ３１１Ｒ３２１、および−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキル、
シクロアルキル、
アリール、
Ｃ１〜４アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、オキソ、−ＯＨおよび−ＣＮから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜４アルキル、−ＣＮ、オキソ、−ＯＨ、−Ｏフェニル、−ＣＯＯＨ、−ＮＯ２、−ＩＭＨ２、ならびに−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜４アルキルから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたビシクロヘテロアリール
から選択され；
Ｒ１１およびＲ１２は、
水素、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、オキソ、−ＯＨおよび−ＮＨ２から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ２、フェニル、置換フェニル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールから独立に選択される１〜５個の置換基で置換された−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜６アルキル
から独立に選択され；
Ｒ３１１およびＲ３２１は、水素およびＣ１〜４アルキルから独立に選択され、Ｒ３１１およびＲ３２１は、それらが結合する窒素と一緒になって、酸素および窒素から選択される最大１個の他のヘテロ原子を含有する５〜６員複素環を形成する）
またはその薬学的に許容される塩によって表される。
【０１９９】
適宜、化合物は、以下の式（ＶＩＩＩ）：
【化２０】
2020536109.tif 000023
（式中、
Ａ環は、点線で示される任意の二重結合を含有し、
Ｒ５０は、
水素、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、クロロ、オキソ、−ＯＨおよび−ＮＨ２から独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
フルオロ、
クロロ、
ブロモ、
ヨード、ならびに
−Ｎ（Ｈ）Ｃ１〜６アルキル
から選択され；
Ｒ５１は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、および−ＯＨから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜６アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨ、−ＣＮ、およびフェニルから独立に選択される１〜３個の置換基で置換されたＣ１〜６アルコキシ、−ＯＨ、ならびに
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキル
から選択され；
Ｒ５２は、存在しないか、または
水素、
フルオロ、
クロロ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、および−ＯＨから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜６アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨ、−ＣＮおよびフェニルから独立に選択される１〜３個の置換基で置換されたＣ１〜６アルコキシ、
−ＯＨ、ならびに
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキル
から選択され；
Ｒ５３は、
水素、
フルオロ、
クロロ、
Ｃ１〜６アルキル、
フルオロ、および−ＯＨから独立に選択される１〜５個の置換基で置換されたＣ１〜６アルキル、
Ｃ１〜６アルコキシ、
フルオロ、クロロ、ブロモ、オキソ、−ＯＨ、−ＣＮおよびフェニルから独立に選択される１〜３個の置換基で置換されたＣ１〜６アルコキシ、
−ＯＨ、ならびに
−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキル
から選択される）
およびその薬学的に許容される塩によって表されるが、
但し、Ｒ５２が存在する場合、Ａ環は、点線で示される二重結合を含有しない。
【０２００】
ＣＤ７３の酵素活性を阻害する低分子有機薬剤のさらなる例は、プリンに基づく薬剤である。例えば、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する薬剤は、ＷＯ２０１５／１６４５７３の式Ｉの化合物、または例えば、
（ｌ−（（５−（６−アミノ−２−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−２−エトキシ−２−オキソエチル）ホスホン酸；
（ｌ−（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−２−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−２−エトキシ−２−オキソエチル）ホスホン酸；または
（（Ｒ）−ｌ−（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−２−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−２−エトキシ−２−オキソエチル）ホスホン酸；
のいずれか１つ、またはその薬学的に許容される塩であってもよい。
【０２０１】
さらなる例では、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する低分子有機薬剤は、ＷＯ２０１８／０９４１４８の式Ｉの部分：
【化２１】
2020536109.tif 000024
［式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、水素、適宜置換されたＣ１〜６アルキル、適宜置換されたアリール、適宜置換された−Ｃ（Ｒ２ａＲ２ｂ）−アリール、−Ｃ（Ｒ２ａＲ２ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ３、−Ｃ（Ｒ２ａＲ２ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、および−Ｃ（Ｒ２ａＲ２ｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３からなる群から独立に選択され；
Ｒ１ａおよびＲ１ｂ基は、組み合わさって５〜６員複素環を形成してもよく；
Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ、Ｈおよび適宜置換されたＣ１〜６アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ３はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ（Ｃ１〜４）アルキルおよび適宜置換されたアリールからなる群から独立に選択され；
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、Ｈ、適宜置換されたＣ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｃ３〜６シクロアルキル（Ｃ１〜６）アルキル、アリール（Ｃ１〜６）アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルおよびアリールからなる群から独立に選択され；
Ｘはそれぞれ、Ｏ、ＨおよびＳからなる群から選択され；
Ａは、
【化２２】
2020536109.tif 000025
（これらはそれぞれ、１〜５個のＲ６置換基で適宜置換され、下付き文字ｎは、０〜３の整数であり；
Ｚは、ＮＨ、ＮＲ６、およびＯからなる群から選択され；
Ｒ６はそれぞれ、ＣＨ３、ＯＲｇ、ＣＮ、Ｆ、および適宜置換されたＣ１〜６アルキルからなる群から独立に選択され；
または隣接する環の頂点上の２個のＲ６基は、一緒になって連結されて、環の頂点として少なくとも１個のヘテロ原子を有する５〜６員環を形成してもよい）からなる群から選択され；ならびに
Ｈｅｔは、
【化２３】
2020536109.tif 000026
（式中、波線は、残りの化合物への結合点を示し、Ｇはそれぞれ、存在する場合、ＮおよびＣＲｅからなる群から独立に選択され、
Ｒａは、Ｈ、ＮＨ２、ＮＨＲ７ａ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ７ａ、ＮＲ７ａＲ７ｂ、Ｒ７ａ、ＯＨ、ＳＲ７ａおよびＯＲ７ａからなる群から選択され；
Ｒｂは、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨＲ７ａ、ＮＲ７ａＲ７ｂ、Ｒ７ａ、ＯＨからなる群から選択され、
ＲｃおよびＲｄは、Ｈ、ハロゲン、ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＨＲ７ａ、ＮＲ７ａＲ７ｂ、Ｒ７ａ、ＯＨ、ＯＲ７ａ、ＳＲ７ａ、ＳＯ２Ｒ７ａ、−Ｘ１ＮＨ２、−Ｘ１ＮＨＲ７ａ、−Ｘ１ＮＲ７ａＲ７ｂ、−Ｘ１ＯＨ、−Ｘ１ＯＲ７ａ、−Ｘ１ＳＲ７ａおよび−Ｘ１ＳＯ２Ｒ７ａからなる群から独立に選択され；
Ｒｅはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、および適宜置換されたＣ１〜６アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒｇはそれぞれ、Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｘ１はそれぞれ、Ｃ１〜４アルキレンであり；
Ｒ７ａおよびＲ７ｂはそれぞれ、適宜置換されたＣ１〜１０アルキル、適宜置換されたＣ２〜１０アルケニル、適宜置換されたＣ２〜１０アルキニル、適宜置換されたＣ３〜７シクロアルキル、適宜置換されたＣ３〜７シクロアルキルＣ１〜４アルキル、適宜置換された４〜７員シクロヘテロアルキル、適宜置換された４〜７員シクロヘテロアルキルＣ１〜４アルキル、適宜置換されたアリール、適宜置換されたアリールＣ１〜４アルキル、適宜置換されたアリールＣ２〜４アルケニル、適宜置換されたアリールＣ２〜４アルキニル、適宜置換されたヘテロアリール、適宜置換されたヘテロアリールＣ１〜４アルキル、適宜置換されたヘテロアリールＣ１〜４アルケニル、および適宜置換されたヘテロアリールＣ２〜４アルキニルからなる群から独立に選択され；またはＲ７ａおよびＲ７ｂは、同じ窒素原子に結合する場合、一緒に連結されて、アリール環に適宜融合された４〜７員複素環を形成してもよい）］を含む。
【０２０２】
抗体の生産
抗ＣＤ７３抗体および抗ＣＤ３９抗体を、当業界で公知の様々な技術のいずれかによって生産することができる。典型的には、それらは、それぞれ、ＣＤ７３もしくはＣＤ３９ポリペプチドを含む免疫原を用いた、非ヒト動物、例えば、マウスの免疫化によって、またはＣＤ７３もしくはＣＤ３９ポリペプチドを用いて候補結合ドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって生産される。ＣＤ３９またはＣＤ７３ポリペプチドは、それぞれ、ヒトＣＤ３９もしくはＣＤ７３ポリペプチドの完全長配列、またはその断片もしくは誘導体、典型的には、免疫原性断片、すなわち、ＣＤ３９もしくはＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞の表面上に露出したエピトープを含むポリペプチドの一部を含んでもよい。そのような断片は、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７個の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含有する。断片は、典型的には、受容体の細胞外ドメインから本質的に誘導される。一実施形態では、免疫原は、脂質膜中に、典型的には、細胞の表面に、野生型ヒトＣＤ３９またはＣＤ７３ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、免疫原は、インタクトな細胞、特に、インタクトなヒト細胞を含み、適宜処理または溶解される。別の実施形態では、ポリペプチドは、組換えＣＤ３９またはＣＤ７３ポリペプチドである。
【０２０３】
抗原を用いて非ヒト動物を免疫する工程を、マウスにおいて抗体の産生を刺激するための当業界で周知の任意の様式で実行することができる（例えば、開示全体が参照により本明細書に組み込まれるE. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照されたい）。免疫原は、適宜、完全または不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントなどのアジュバントと共に、緩衝液中に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液の種類およびアジュバントの量を決定するための方法は、当業者には周知であり、決して限定されるものではない。これらのパラメータは、異なる免疫原については異なっていてもよいが、容易に解明される。
【０２０４】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫化の位置および頻度も、当業界で周知である。典型的な免疫化プロトコールでは、非ヒト動物に、１日目に、および約１週間後に再度、抗原を腹腔内注射する。この後、２０日目あたりで、適宜、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントなどのアジュバントと共に、抗原のリコール注射を行う。リコール注射は静脈内で実施し、数日間連続で繰り返してもよい。この後、４０日目に、静脈内または腹腔内で、典型的にはアジュバントを用いずに、追加注射を行う。このプロトコールは、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の産生をもたらす。他のプロトコールが免疫化において使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、それらを使用してもよい。
【０２０５】
モノクローナル抗体については、脾細胞を、免疫した非ヒト哺乳動物から単離した後、これらの脾細胞を、不死化細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを形成させる。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当業界で周知であり、典型的には、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出すこと、それを小片に切断すること、および細胞ストレーナーのナイロンメッシュを通して脾膜から脾細胞を適切な緩衝液中に搾り出して、単一細胞懸濁液を生産することを含む。細胞を洗浄し、遠心分離し、赤血球を溶解する緩衝液中に再懸濁する。溶液を再度遠心分離し、ペレット中に残存するリンパ球を最後に新鮮な緩衝液中に再懸濁する。
【０２０６】
単離され、単一細胞懸濁液中に存在させたら、リンパ球を不死細胞株に融合することができる。これは、典型的には、マウスミエローマ細胞株であるが、ハイブリドーマを創出するのに有用な他の多くの不死細胞株が当業界で公知である。マウスミエローマ株としては、限定されるものではないが、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＸ６３  Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞が挙げられる。ポリエチレングリコールなどを使用して、融合を行う。次いで、得られたハイブリドーマを、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する選択培地中で増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）酵素を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【０２０７】
ハイブリドーマを、典型的には、マクロファージの支持細胞層上で増殖させる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するために使用された非ヒト哺乳動物の同腹子に由来し、典型的には、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントなどを用いて、ハイブリドーマを播種する数日前にプライミングする。融合方法は、Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
コロニー形成および抗体産生にとって十分な時間にわたって、選択培地中で細胞を増殖させる。これは通常、約７〜約１４日である。
【０２０９】
次いで、ハイブリドーマコロニーを、ＣＤ３９またはＣＤ７３ポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する抗体の産生についてアッセイする。アッセイは、典型的には、比色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマを増殖させるウェルに適合することができる任意のアッセイを用いてもよい。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイまたは蛍光活性化細胞選別が挙げられる。所望の抗体産生について陽性のウェルを検査して、１個または複数の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１個より多いコロニーが存在する場合、細胞を再クローニングし、増殖させて、単一細胞のみが所望の抗体を産生するコロニーを生じたことを確実にしてもよい。典型的には、抗体を、ＣＤ３９またはＣＤ７３ポリペプチド、例えば、ＣＤ３９またはＣＤ７３を発現する細胞に結合する能力についても試験する。
【０２１０】
モノクローナル抗体を産生することが確認されたハイブリドーマを、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中で、大量に増殖させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、動物中で腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０２１１】
所望のモノクローナル抗体を産生させるために十分に増殖させた後、モノクローナル抗体を含有する増殖培地（または腹水）を細胞から分離除去し、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡもしくはプロテインＧ−セファロースを使用するクロマトグラフィー、またはアガロースもしくはセファロースビーズなどの固相支持体に連結された抗マウスＩｇによって達成される（全て、例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるAntibody Purification Handbook, Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition ACに記載されている）。結合した抗体を、典型的には、低いｐＨの緩衝液（ｐＨ３．０またはそれより低いグリシンまたは酢酸緩衝液）を使用することによってプロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出させ、抗体含有画分を即時に中和する。これらの画分をプールし、透析し、必要に応じて濃縮する。
【０２１２】
単一の明確なコロニーを有する陽性ウェルを、典型的には、再クローニングし、再度アッセイして、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、産生されることを確実にする。
【０２１３】
また、例えば、（全開示が参照により本明細書に組み込まれるWard et al. Nature, 341 (1989) p. 544）に開示された、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって、抗体を生産することもできる。
【０２１４】
目的の抗原、すなわち、ＣＤ３９またはＣＤ７３、特に、ＣＤ７３に関してはモノクローナル抗体１１Ｅ１、８Ｃ７もしくは６Ｅ１と実質的に、もしくは本質的に同じエピトープ、または特に、ＣＤ３９に関してはモノクローナル抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６もしくはＩ−３９９と実質的に、もしくは本質的に同じエピトープに結合する１つまたは複数の抗体の同定を、抗体競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に決定することができる。多くのそのようなアッセイは、日常的に実行され、当業界で周知である（例えば、参照により具体的に本明細書に組み込まれる１９９７年８月２６日に発行された米国特許第５，６６０，８２７号を参照されたい）。本明細書に記載の抗体が結合するエピトープの実際の決定は、本明細書に記載のモノクローナル抗体と同じか、または実質的に同じエピトープに結合することを同定するのに決して必要とされない。
【０２１５】
例えば、検査しようとする試験抗体が異なる供給源動物から得られるか、またはさらには異なるＩｇアイソタイプのものである場合、対照（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、またはＩ−３９９）と試験抗体とを混合し（または予め吸着させ）、ＣＤ３９またはＣＤ７３ポリペプチドを含有する試料に適用する単純競合アッセイを用いることができる。ウェスタンブロッティングおよびＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用に基づくプロトコールは、そのような競合試験における使用にとって好適である。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３９抗原試料に適用する前に、一定期間にわたって、対照抗体（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）と、変化する量の試験抗体と（例えば、約１：１０または約１：１００）を、予め混合する。他の実施形態では、対照と、変化する量の試験抗体とを、ＣＤ３９抗原試料への曝露の間に簡単に混合することができる。当業者が、結合した抗体と遊離抗体とを識別することができる限り（例えば、未結合の抗体を除去するための分離もしくは洗浄技術を使用することによる）、およびＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６もしくはＩ−３９９と、試験抗体とを識別することができる限り（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的二次抗体を使用することによる、またはＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６もしくはＩ−３９９を検出可能な標識で特異的に標識することによる）、当業者であれば、試験抗体が、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９の抗原への結合を減少させるかどうかを決定し、試験抗体がＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９と同じＣＤ３９上の部位への結合について競合することを示すことができる。完全に無関係の抗体の非存在下での（標識された）対照抗体の結合は、対照高値として役立ち得る。対照低値を、標識された（Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）抗体を、正確に同じ型の未標識の抗体（Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）と共にインキュベートして、競合が起こり、標識された抗体の結合を減少させることによって得ることができる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識された抗体の反応性の有意な低下は、実質的に同じエピトープを認識する試験抗体、すなわち、標識された（Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）抗体と「交差反応」するか、または競合するものを示す。約１：１０〜約１：１００のＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９：試験抗体の任意の比で、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９のＣＤ３９抗原への結合を、少なくとも約６０％、またはより好ましくは、少なくとも約８０％もしくは９０％（例えば、約６５〜１００％）などの少なくとも約５０％減少させる試験抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９と実質的に同じエピトープまたは決定基への結合について競合する抗体であると考えられる。好ましくは、そのような試験抗体は、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９のＣＤ３９抗原への結合を、少なくとも約９０％（例えば、約９５％）減少させるであろう。
【０２１７】
競合を、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価することもできる。そのような試験では、所与のＣＤ３９ポリペプチドを担持する細胞を、最初に、例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９と共にインキュベートし（またはＣＤ７３ポリペプチドを、１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と共にインキュベートする）、次いで、蛍光色素またはビオチンで標識された試験抗体と共にインキュベートすることができる。飽和量のＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９との予備インキュベーションの際に得られた結合が、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９と予備インキュベートせずに抗体によって得られた結合（蛍光によって測定する）の約８０％、好ましくは、約５０％、約４０％またはそれ未満（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体はＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９と競合すると言われる。あるいは、飽和量の試験抗体と共に予備インキュベートした細胞上で標識されたＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９抗体を用いて得られた結合（蛍光色素またはビオチンによる）が、試験抗体との予備インキュベーションを用いずに得られた結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％、またはそれ未満（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体はＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９と競合すると言われる。
【０２１８】
試験抗体を予め吸着させ、ＣＤ３９抗原（または抗ＣＤ７３抗体については、ＣＤ７３）が固定される表面に飽和濃度で適用する単純競合アッセイを用いることもできる。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析にとって好適な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）を、ＣＤ３９飽和濃度で表面と接触させ、ＣＤ３９と、対照抗体の表面結合とを測定する。対照抗体のこの結合を、試験抗体の非存在下での対照抗体の、ＣＤ３９を含有する表面への結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるＣＤ３９を含有する表面の結合の有意な減少は、試験抗体が対照抗体と同じ決定基またはエピトープへの結合について競合し、試験抗体が対照抗体と「交差反応」することを示し得る。対照抗体（Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９など）のＣＤ３９抗原への結合を、少なくとも約３０％またはそれより多く、好ましくは、約４０％減少させる試験抗体は、対照（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であると考えることができる。好ましくは、そのような試験抗体は、対照抗体（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９）のＣＤ３９抗原への結合を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％またはそれより多く）減少させるであろう。対照および試験抗体の順序を逆転させてもよいことが理解されるであろう：すなわち、対照抗体を最初に表面に結合させ、その後、競合アッセイにおいて、試験抗体を表面と接触させることができる。第２抗体について見られる結合の減少（抗体が交差反応すると推測する）はより大きい規模のものであると予想されるため、好ましくは、ＣＤ７３抗原に対するより高い親和性を有する抗体を、最初に表面に結合させる。そのようなアッセイのさらなる例は、例えば、Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41に提供されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１９】
一実施形態では、抗体は、それぞれ、ＣＤ３９またはＣＤ７３を発現する細胞に結合するその能力を試験するためのイムノアッセイにおいて検証される。例えば、採血または腫瘍生検を実施し、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞を収集する。次いで、細胞に結合する所与の抗体の能力を、当業者には周知の標準的な方法を使用して評価する。抗体は、例えば、有意なパーセンテージの個体または患者（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより高い）に由来する、実質的な割合（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより高い）の、それぞれ、ＣＤ３９またはＣＤ７３を発現することが知られる細胞、例えば、腫瘍細胞に結合してもよい。抗体を、患者における悪性細胞の存在またはレベルを決定するための診断目的で、例えば、患者が抗ＣＤ７３薬剤を用いた処置にとって、または本明細書に記載の治療方法における使用にとって好適であるかどうかを評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体を直接的または間接的に標識することができる。間接的に標識される場合、典型的には、二次標識抗体を添加する。
【０２２０】
抗体がエピトープ領域内に結合するかどうかの決定を、当業者には公知の方法で実行することができる。そのようなマッピング／特性評価方法の一例として、抗ＣＤ７３抗体または抗ＣＤ３９抗体のエピトープ領域を、それぞれのＣＤ７３またはＣＤ３９タンパク質中での露出したアミン／カルボキシルの化学的改変を使用するエピトープ「フットプリンティング」によって決定することができる。そのようなフットプリンティング技術の１つの特定例は、受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が起こり、タンパク質結合に関与する骨格アミド基が逆交換から保護され、したがって、重水素化されたままである、ＨＸＭＳ（質量分析によって検出される水素−重水素交換）の使用である。消化性タンパク質溶解、高速マイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離、および／または電子スプレーイオン化質量分析によって、この点で関連領域を同定することができる。例えば、Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999)、Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265Aを参照されたい。好適なエピトープ同定技術の別の例は、典型的には、遊離抗原および抗体などの抗原結合ペプチドと複合体化した抗原の二次元ＮＭＲスペクトル中のシグナルの位置を比較する核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）である。ＮＭＲスペクトル中で、抗原に対応するシグナルのみが見られ、抗原結合ペプチドに由来するシグナルは見られないように、抗原を、典型的には、１５Ｎで選択的に同位体標識する。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸を起源とする抗原シグナルは、典型的には、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸をそのように同定することができる。例えば、Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67；Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998)；およびSaito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24を参照されたい。
【０２２１】
また、エピトープマッピング／特性評価を、質量分析法を使用して実施することもできる。例えば、Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503およびKiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801を参照されたい。また、プロテアーゼ消化技術も、エピトープマッピングおよび同定の文脈において有用であり得る。抗原決定基関連領域／配列を、プロテアーゼ消化によって、例えば、ＣＤ７３に対する約１：５０の比でトリプシンを使用すること、またはｐＨ７〜８でのｏ／ｎ消化、次いで、ペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）によって決定することができる。続いて、抗ＣＤ７３または抗ＣＤ３９結合剤によってトリプシン切断から保護されるペプチドを、トリプシン消化にかけた試料および抗体と共にインキュベートした後、例えば、トリプシンによる消化にかけた試料の比較によって同定することができる（それによって、結合剤のフットプリントを示す）。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も、またはあるいは、同様のエピトープ特性評価法において使用することができる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列が、表面に露出していないＣＤ７３またはＣＤ３９ポリペプチドの領域内にあるかどうか、したがって、十中八九、免疫原性／抗原性に関して関連しないかどうかを分析するための迅速な方法を提供することができる。
【０２２２】
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープの解明にとって有用な別の技術である。例えば、「アラニン走査」では、タンパク質セグメント内のそれぞれの残基を、アラニン残基で置き換え、結合親和性に関する結果を測定する。突然変異が結合親和性の有意な低下をもたらす場合、それは十中八九、結合に関与する。構造的エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、アンフォールディングされたタンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置き換えがタンパク質の全体的な折畳みに影響しないことを検証することができる。例えば、Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; and Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6を参照されたい。
【０２２３】
また、電子顕微鏡を、エピトープ「フットプリンティング」のために使用することもできる。例えば、Wang et al., Nature 1992; 355:275-278は、低温電子顕微鏡法、３次元画像再構築、およびＸ線結晶解析の協調的適用を使用して、天然ササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂ断片の物理的フットプリントを決定する。
【０２２４】
エピトープ評価のための他の形態の「無標識」アッセイとしては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Faegerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14；Nice et al., J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168；Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311；Kroeger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944を参照されたい。
【０２２５】
また、抗体と同じか、または実質的に同じエピトープに結合する抗体を、本明細書に記載の１つまたは複数の例示的競合アッセイにおいて同定することができることにも留意すべきである。
【０２２６】
典型的には、本明細書に提供される抗ＣＤ７３または抗ＣＤ３９抗体は、約１０４〜約１０１１Ｍ−１（例えば、約１０８〜約１０１０Ｍ−１）の範囲の対応するＣＤ７３（例えば、ＣＤ７３ホモ二量体として）またはＣＤ３９ポリペプチドに対する親和性を有する。例えば、特定の態様では、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析デバイスを用いた分析など）により決定された場合、それぞれ、ＣＤ７３またはＣＤ３９に関して１ｘ１０−９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する。より特定の例示的な態様では、抗ＣＤ７３または抗ＣＤ３９抗体は、それぞれ、ＣＤ７３またはＣＤ３９に関する、約１ｘ１０−８Ｍ〜約１ｘ１０−１０Ｍ、または約１ｘ１０−９Ｍ〜約１ｘ１０−１１ＭのＫＤを有する。一実施形態では、結合は、一価結合である。一実施形態では、結合は、二価結合である。
【０２２７】
抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５または１ナノモル濃度以下、好ましくは、ナノモル濃度以下、または適宜、約５００、２００、１００または１０ピコモル濃度以下の平均ＫＤ（すなわち、より良好な親和性）を特徴としてもよい。例えば、組換え産生されたヒトＣＤ７３またはＣＤ３９タンパク質をチップ表面上に固定した後、試験しようとする抗体を溶液中に加えることによって、ＫＤを決定することができる。一実施形態では、前記方法は、（ｂ）ＣＤ７３への結合について抗体１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２もしくは６Ｅ１と競合することができる、またはＣＤ３９への結合について抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６もしくはＩ−３９９と競合することができる抗体を選択する工程をさらに含む。
【０２２８】
任意の実施形態の一態様では、本発明の方法に従って調製される抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様では、本明細書に記載の方法に従って抗体を生産するために使用される非ヒト動物は、齧歯類、ウシ、ブタ、鳥、ラクダ、ウマ、ウサギ、ヤギ、またはヒツジなどの哺乳動物である。
【０２２９】
ＣＤ７３またはＣＤ３９ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡを、ハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのために適切な発現ベクター中に入れる。次いで、宿主を、抗体、またはそのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、もしくは検出可能部分を含むバージョンなどの、その変異体の組換え生産のために使用する。
【０２３０】
本開示のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、例えば、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、またはＩ−３９９、１１Ｅ１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１を、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定することができる。単離した後、発現ベクター中にＤＮＡを配置した後、これらを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を他の方法で産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。本明細書の他の箇所に記載されるように、多数の目的のいずれかのために、例えば、抗体をヒト化するため、断片もしくは誘導体を生産するため、または例えば、抗原結合部位において、抗体の配列を改変して、抗体の結合特異性を最適化するために、そのようなＤＮＡ配列を改変することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当業界で周知である（例えば、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993)；およびPluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992)を参照されたい）。
【０２３１】
抗体の断片および誘導体（文脈によって別途記述されない、または明確に否定されない限り、本出願で使用される用語「抗体」または「複数の抗体」によって包含される）を、当業界で公知の技術によって生産することができる。「断片」は、インタクトな抗体の一部、一般には、抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；限定されるものではないが、（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）重鎖部分と結合していない、ただ１個の軽鎖可変ドメインを含有する一本鎖ポリペプチド、または軽鎖可変ドメインの３個のＣＤＲを含有するその断片、および（３）軽鎖部分と結合していない、ただ１個の重鎖可変領域を含有する一本鎖ポリペプチド、または重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含有するその断片を含む、連続するアミノ酸残基の１つの途切れない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」と呼ばれる）；ならびに抗体断片から形成される多特異的（例えば、二特異的）抗体が挙げられる。特に、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が含まれる。
【０２３２】
一態様では、薬剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体から選択される抗体である。
【０２３３】
一態様では、薬剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される定常ドメインを含む抗体の断片である。一態様では、薬剤は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマまたはラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、単一ドメインＦＶ、および一本鎖抗体断片から選択される抗体断片である。一態様では、薬剤は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲから選択される合成もしくは半合成抗体由来分子；および多特異的抗体である。一態様では、抗体は、少なくとも部分的に精製された形態にある。一態様では、抗体は、本質的に単離された形態にある。
【０２３４】
抗体などの抗ＣＤ３９または抗ＣＤ７３薬剤を、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、２．０〜１０．０のｐＨを有する医薬製剤中に組み込むことができる。製剤は、緩衝剤系、保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤をさらに含んでもよい。一実施形態では、医薬製剤は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。そのような製剤は、典型的には、溶液または懸濁液である。さらなる実施形態では、医薬製剤は、水性溶液である。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤と定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液と定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液と定義される。
【０２３５】
別の実施形態では、医薬製剤は、医師または患者が使用前に溶媒および／または希釈剤を添加する凍結乾燥製剤である。
【０２３６】
別の実施形態では、医薬製剤は、予め溶解することなく使用できる乾燥製剤（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）である。
【０２３７】
さらなる態様では、医薬製剤は、そのような抗体の水性溶液、および緩衝剤を含み、ここで、抗体は、１ｍｇ／ｍｌまたはそれより高い濃度で存在し、前記製剤は、約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【０２３８】
別の実施形態では、製剤のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０、および約５．５〜約７．５からなる一覧から選択される範囲にある。
【０２３９】
さらなる実施形態では、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝剤のそれぞれ１つは、本発明の代替的な実施形態を構成する。
【０２４０】
さらなる実施形態では、製剤は、薬学的に許容される保存剤をさらに含む。さらなる実施形態では、製剤は、等張剤をさらに含む。さらなる実施形態では、製剤は、キレート剤も含む。本発明のさらなる実施形態では、製剤は、安定剤をさらに含む。さらなる実施形態では、製剤は、界面活性剤をさらに含む。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照する。
【０２４１】
他の成分が本発明のペプチド医薬製剤中に存在してもよい。そのような追加の成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、等張性改変剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および両性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）を含んでもよい。そのような追加の成分は、勿論、本発明の医薬製剤の全体の安定性に有害に影響すべきではない。
【０２４２】
本発明による医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路、例えば、静脈内によるものであってもよい。好適な抗体製剤を、他の既に開発された治療用モノクローナル抗体に関する経験を検査することによって決定することもできる。Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｏｎｃｏｌｙｍなどのいくつかのモノクローナル抗体が、臨床状況において有効であることが示されており、同様の製剤を本発明の抗体と共に使用することができる。
【０２４３】
また、前記方法における使用のために適合化された治療有効量の、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ７３抗体、および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を含むキットも提供される。キットはまた、例えば、施術者（例えば、医師、看護師、または患者）が、その中に含まれる組成物を、がん（例えば、固形腫瘍）を有する患者に投与することを可能にするための、投与スケジュールを含む指示書を含んでもよい。キットはまた、シリンジを含んでもよい。
【０２４４】
キットは、上記で提供された方法による単回投与のための、有効量の抗ＣＤ３９または抗ＣＤ７３抗体をそれぞれ含有する単回用量医薬組成物の複数のパッケージを含んでもよい。医薬組成物を投与するのに必要な機器またはデバイスを、キットに含有させることもできる。例えば、キットは、ある量の抗ＣＤ３９抗体を含有する１つまたは複数の予め充填されたシリンジおよびある量の抗ＣＤ７３抗体を含有するシリンジ、または抗ＣＤ３９抗体と抗ＣＤ７３抗体の両方の量を含有するシリンジを提供してもよい。
【０２４５】
一実施形態では、本発明は、ヒト患者におけるがんを処置するためのキットであって、
（ａ）抗体が、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９の重鎖可変領域の超可変領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン）と、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６またはＩ−３９９の軽鎖可変領域の超可変領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン）とを含んでもよい、ｓＣＤ３９の活性を中和する抗ＣＤ３９抗体の用量；
（ｂ）薬剤が、抗ＣＤ７３抗体であってもよい、ＣＤ７３に結合し、ＣＤ７３の活性を中和する薬剤の用量；ならびに
（ｃ）適宜、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて抗ＣＤ３９抗体およびＣＤ７３結合剤を使用するための指示書
を含む、キットを提供する。
【０２４６】
悪性腫瘍の診断、予後診断、および処置
個体におけるがんの診断、予後診断、モニタリング、処置および防止において有用な方法が記載される。本明細書に記載の処置レジメンおよび方法は、固形腫瘍の処置にとって特に有用であるが、本明細書に記載の処置レジメンおよび方法を、様々な血液がんのために使用することもできる。本発明の方法および組成物は、例えば、限定されるものではないが、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、子宮、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、頭頸部（頭頸部扁平上皮癌）、および皮膚（例えば、メラノーマ）のものを含む癌腫；白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫、および多発性骨髄腫を含むリンパ系の造血腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、および骨髄異形成症候群を含む、骨髄細胞系列の造血腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、奇形癌、神経芽腫およびグリオーマを含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、グリオーマ、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；ならびにメラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、および濾胞性甲状腺がんを含む他の腫瘍を含む、様々ながんおよび他の増殖性疾患の処置のために使用される。
【０２４７】
一実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ３９抗体を、ＣＤ７３陽性であるがんを処置するために有利に使用することができる。したがって、ＣＤ７３陽性がんを有する個体におけるがんまたは感染症を処置または防止するための方法であって、個体に、単量体ヒトＣＤ３９タンパク質（例えば、可溶性ＣＤ３９および／または単量体ｍｅｍＣＤ３９）に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する薬剤または抗体を投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、本開示は、個体におけるＣＤ７３陽性がんの処置または防止のための方法であって、個体に、可溶性ヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、その活性を阻害する抗体を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、抗体は、単量体ヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を阻害する。
【０２４８】
ＣＤ７３陽性がんは、腫瘍または腫瘍環境中のＣＤ７３を発現する細胞の存在を一般的特徴とすることが知られるがんである。したがって、がんを有する個体を、腫瘍微小環境中の細胞（例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細胞）上でのＣＤ７３の発現を評価するための検出工程を予め行って、または行わずに、抗ＣＤ３９抗体を用いて処置することができる。
【０２４９】
適宜、処置方法は、個体に由来する腫瘍の生物試料（例えば、がん組織、がんに近い組織またはがんの周辺にある組織、がんに隣接する組織、隣接する非腫瘍組織または正常な隣接組織）中のＣＤ７３核酸またはポリペプチドを検出する工程を含んでもよい。生物試料がＣＤ７３ポリペプチドを特徴とする、例えば、ＣＤ７３を発現する細胞を含むことの決定は、患者が、ｓＣＤ３９を阻害する薬剤（適宜、ＣＤ７３を阻害する薬剤とさらに組み合わせる）を用いた処置から強力な利益を有し得るがんを有することを示す。本開示による処置にとって好適ながんを有する患者を、ＣＤ７３を顕著に発現する；高レベルで（例えば、参照値と比較して、健康な個体と比較して、抗ＣＤ７３薬剤を用いた処置の弱い応答者である個体に対応するレベルで、腫瘍が１つまたは複数の免疫療法に対して耐性である個体に対応するレベルで）ＣＤ７３を発現する、抗ＣＤ７３抗体による高強度の染色を示す腫瘍を有すると決定することができる。
【０２５０】
一実施形態では、方法は、生物試料中のＣＤ７３核酸またはポリペプチドの発現レベルを決定すること、およびそのレベルと、健康な個体に対応する参照レベルとを比較することを含む。生物試料が参照レベルと比較して増加したレベルでＣＤ７３核酸またはポリペプチドを発現する細胞を含むとの決定は、患者が抗ＣＤ３９抗体を用いて処置することができるがんを有することを示す。生物試料中でのＣＤ７３ポリペプチドの検出は、悪性細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細胞の表面上に発現されるＣＤ７３ポリペプチドを検出することを含んでもよい。一実施形態では、生物試料がＣＤ７３核酸またはポリペプチドを顕著に発現する細胞を含むとの決定は、患者が抗ＣＤ３９抗体を用いて処置することができるがんを有することを示す。ＣＤ７３ポリペプチドに言及する場合、「顕著に発現される」とは、ＣＤ７３ポリペプチドが所与の患者から採取された実質的な数の細胞中で発現されることを意味する。用語「顕著に発現される」の定義は、正確なパーセンテージ値によって束縛されるものではないが、一部の例では、「顕著に発現される」と言われる受容体は、患者から採取された腫瘍組織または腫瘍隣接組織試料（例えば、生検）中の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多い腫瘍細胞または細胞上に存在する。
【０２５１】
個体がＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞を特徴とするがんを有するかどうかの決定は、例えば、がん環境に由来する細胞（例えば、腫瘍または腫瘍隣接組織）を含む個体から生物試料を取得すること（例えば、生検を実施することによる）、前記細胞を、ＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗体と接触させること、および細胞がその表面上にＣＤ７３を発現するかどうかを検出することを含んでもよい。個体がＣＤ７３を発現する細胞を有するかどうかの決定は、免疫組織化学アッセイを行うことを含んでもよい。
【０２５２】
一実施形態では、本開示は、それを必要とする個体におけるがんの処置または防止のための方法であって、
ａ）腫瘍環境内、適宜、腫瘍内および／または隣接組織内のＣＤ７３ポリペプチド（例えば、ＣＤ７３を発現する細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍環境が、適宜、参照レベルと比較して増加したレベルでＣＤ７３を含むことの決定の際に、個体に、（ａ）ＣＤ３９の活性を阻害するための手段（例えば、薬剤もしくは処置、タンパク質薬剤、抗体薬剤、核酸薬剤、または低分子薬剤）および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与すること
を含む、方法を提供する。一実施形態では、薬剤は、可溶性ヒトＣＤ３９タンパク質に結合し、その活性を阻害する抗体である。方法は、個体に、ヒトＣＤ７３タンパク質に結合し、その活性を阻害する薬剤を投与することをさらに含んでもよい（すなわち、ＣＤ３９阻害剤に加えて）。方法は、個体に、ＣＤ３９阻害剤に加えて、放射線療法または化学療法剤を含む組成物である、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する、および／または腫瘍細胞の細胞死を誘導する処置（例えば、薬剤）を投与することをさらに含んでもよい。腫瘍環境内のＣＤ７３ポリペプチドまたはＣＤ７３を発現する細胞の検出は、個体から、がん組織および／またはがんに近い組織もしくはがんの周辺にある組織（例えば、がん隣接組織、隣接する非腫瘍組織もしくは正常な隣接組織）を含む生物試料を取得すること、ならびにＣＤ７３ポリペプチドまたはＣＤ７３を発現する細胞のレベルを検出することを含んでもよい。ＣＤ７３を発現する細胞は、例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細胞を含んでもよい。
【０２５３】
本明細書で提供されるがんの処置のための組合せ療法は、がんに罹患した対象を処置するための、中和抗ＣＤ３９薬剤（例えば、抗体）およびＣＤ７３中和剤（例えば、抗体）の投与を含む。一実施形態では、本発明は、固形腫瘍（例えば、固形腫瘍、進行性難治性固形腫瘍）を有する対象または血液腫瘍を有する対象を処置するための、組み合わせて使用するための、抗ＣＤ３９抗体および抗ＣＤ７３抗体を提供する。
【０２５４】
本明細書で使用する場合、補助または組合せ投与（同時投与）は、同じか、もしくは異なる剤形での化合物の同時的投与、または化合物の別々の投与（例えば、連続投与）を含む。かくして、抗ＣＤ３９および抗ＣＤ７３抗体を、単一製剤中で同時に投与することができる。あるいは、抗ＣＤ３９および抗ＣＤ７３抗体を、別々の投与のために製剤化し、同時的に、または連続的に投与する。
【０２５５】
がんを有する患者を、細胞（例えば、循環および／または腫瘍浸潤リンパ球、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞および／または腫瘍細胞）上での腫瘍のＡＴＰａｓｅ活性、５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、腫瘍アデノシン蓄積（例えば、腫瘍内アデノシン濃度）、ならびに／またはＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３発現を評価するための検出工程を予め行って、または行わずに、抗ＣＤ３９薬剤および抗ＣＤ７３薬剤を用いて処置することができる。適宜、処置方法は、腫瘍を有する個体に由来する生物試料（例えば、腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織を含む試料）中での腫瘍ＡＴＰａｓｅ活性および／または腫瘍アデノシン蓄積（例えば、腫瘍内アデノシン濃度の上昇）を検出する工程を含んでもよい。生物試料が、例えば、参照と比較して、腫瘍ＡＴＰａｓｅ活性または腫瘍アデノシン蓄積（例えば、腫瘍内アデノシン濃度）が上昇していることの決定は、個体が、ＣＤ７３を阻害する薬剤と組み合わせたＣＤ３９を阻害する薬剤を用いる処置から強力な利益を得ることができるがんを有することを示す。適宜、処置方法は、個体に由来する腫瘍（例えば、腫瘍細胞上の）の生物試料中のＣＤ３９核酸またはポリペプチドを検出する工程を含んでもよい。生物試料がＣＤ３９を発現する（例えば、腫瘍細胞、腫瘍浸潤細胞または一般的には、ＴＲｅｇ細胞がＣＤ３９を発現する、細胞が、参照と比較して、高レベルでＣＤ３９を発現する、多数の細胞がＣＤ３９陽性である、抗ＣＤ３９抗体による高強度の染色を示す）ことの決定は、個体が、適宜、ＣＤ７３を阻害する薬剤と組み合わせた、可溶性ＣＤ３９タンパク質を阻害する薬剤を用いた処置から強力な利益を得ることができるがんを有することを示す。
【０２５６】
適宜、処置方法は、個体に由来する生物試料中のＣＤ３９核酸またはポリペプチドを検出する工程を含んでもよい。生物試料の例としては、任意の好適な生体液（例えば、血清、リンパ液、血液）、細胞試料、または組織試料が挙げられる。参照と比較して、生物試料中の細胞（例えば、がん細胞、リンパ球、例えば、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞）が高レベルでＣＤ３９を発現すること、または試料中の多数の細胞がＣＤ３９陽性である、もしくは抗ＣＤ３９抗体による高強度の染色を示すことの決定は、個体が、ＣＤ７３を阻害する薬剤と組み合わせた、ＣＤ３９を阻害する薬剤を用いた処置から強力な利益を得ることができるがんを有することを示してもよい。一実施形態では、処置方法は、腫瘍の生物試料中（例えば、腫瘍浸潤細胞上）のＣＤ３９核酸またはポリペプチドを検出する工程を含んでもよい。
【０２５７】
処置方法において、抗ＣＤ３９抗体およびＣＤ７３中和剤（例えば、抗ＣＤ７３抗体）を、別々に、一緒に、もしくは連続的に、またはカクテル中で投与することができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ７３中和剤の投与の前に投与される。例えば、抗ＣＤ３９抗体を、ＣＤ７３中和剤の投与の約０〜３０日前に投与することができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ７３中和剤の投与の約３０分〜約２週間前、約３０分〜約１週間前、約１時間〜約２時間前、約２時間〜約４時間前、約４時間〜約６時間前、約６時間〜約８時間前、約８時間〜１日前、または約１〜５日前に投与される。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ７３中和剤の投与と同時に投与される。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ７３中和剤の投与の後に投与される。例えば、抗ＣＤ３９抗体を、ＣＤ７３中和剤の投与の約０〜３０日後に投与することができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ７３中和剤の投与の約３０分〜約２週間後、約３０分〜約１週間後、約１時間〜約２時間後、約２時間〜約４時間後、約４時間〜約６時間後、約６時間〜約８時間後、約８時間〜１日後、または約１〜５日後に投与される。
【０２５８】
がんを有するヒトを処置するための好適な処置プロトコールは、例えば、患者に、有効量の、ＣＤ３９の活性を阻害する抗体と、ヒトＣＤ７３の活性を中和する抗体のそれぞれを投与することを含み、その方法は、少なくとも１用量の抗ＣＤ３９抗体を１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与し、少なくとも１用量の抗ＣＤ７３抗体を１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する少なくとも１回の投与サイクルを含む。一実施形態では、投与サイクルは、２週〜８週である。
【０２５９】
一実施形態では、方法は、サイクルが、８週またはそれ未満の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、２、３または４用量の抗ＣＤ３９抗体を、１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与し、２、３または４用量の抗ＣＤ７３抗体を、１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する、少なくとも１回の投与サイクルを含む。
【０２６０】
一実施形態では、抗ＣＤ３９抗体を、抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで、所望の期間、例えば、１週間、２週間、１ヶ月間にわたって、ｓＣＤ３９および／またはｍｅｍＣＤ３９の酵素活性を中和するのに有効な量で投与する。一実施形態では、抗体を、ｓＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性の阻害に関する少なくともＥＣ５０、ＥＣ７０またはＥＣ１００に等しい抗体の血中濃度を提供する用量および／または頻度で投与し、適宜、濃度は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、または抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで維持される。
【０２６１】
一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および抗ＣＤ３９抗体を、ｉ．ｖ．によって投与する。一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および抗ＣＤ３９抗体を、同じ日に、適宜、さらに２週間毎に１回、適宜、さらにｉ．ｖ．によって投与する。
【０２６２】
本明細書の任意の実施形態では、処置は、抗ＣＤ３９抗体を、抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与の間に、ＣＤ３９の酵素活性の中和のための、少なくともインビトロでのＥＣ５０（例えば、０．０１〜０．５μｇ／ｍｌのＥＣ５０）、適宜、ＥＣ７０または適宜、ＥＣ１００（例えば、０．０５〜１μｇ／ｍｌ、０．１〜１μｇ／ｍｌのＥＣ１００）に対応する血液（血清）または血管外組織（例えば、腫瘍環境）中の濃度を達成する、および／または維持するのに有効な量で、少なくとも１回、適宜、少なくとも２回投与する、少なくとも１回の投与サイクルにわたって、ＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を個体に投与することを含んでもよい。インビトロでのＥＣ５０、ＥＣ７０またはＥＣ１００を、例えば、抗ＣＤ３９抗体の中和活性を試験するための本明細書に開示される方法に従って決定することができる。例えば、抗体を、少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌの循環または血管外組織（例えば、腫瘍環境）中での濃度を達成する、および／または維持する量で投与することができる。例えば、０．０５〜１μｇ／ｍｌ、または０．１〜１μｇ／ｍｌの血管外組織中での濃度を達成するために、抗ＣＤ３９抗体を、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、または１〜１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の循環中での濃度を達成するのに有効な量で投与する。抗ＣＤ３９抗体を、少なくとも２回、ならびに抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与の間に、および／または投与サイクルを通して、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間にわたって、抗ＣＤ３９抗体の濃度、少なくとも上記濃度を維持するのに有効な量で投与してもよい。
【０２６３】
本明細書の任意の実施形態では、処置は、抗ＣＤ７３抗体を、抗ＣＤ７３抗体の２回の連続投与の間に、ＣＤ７３の酵素活性の中和のための、少なくともインビトロでのＥＣ５０（例えば、０．０１〜０．５μｇ／ｍｌのＥＣ５０）、適宜、ＥＣ７０または適宜、ＥＣ１００（例えば、０．０５〜１μｇ／ｍｌ、０．１〜１μｇ／ｍｌのＥＣ１００）に対応する血液（血清）または血管外組織（例えば、腫瘍環境）中の濃度を達成する、および／または維持するのに有効な量で、少なくとも１回、適宜、少なくとも２回投与する、少なくとも１回の投与サイクルにわたって、ＣＤ７３の酵素活性を中和する抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含んでもよい。例えば、抗体を、少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌの循環または血管外組織（例えば、腫瘍環境）中での濃度を達成する、および／または維持する量で投与することができる。例えば、０．０５〜１μｇ／ｍｌ、または０．１〜１μｇ／ｍｌの血管外組織中での濃度を達成するために、抗ＣＤ７３抗体を、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、または１〜１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ７３抗体の循環中での濃度を達成するのに有効な量で投与する。抗ＣＤ７３抗体を、少なくとも２回、ならびに抗ＣＤ７３抗体の２回の連続投与の間に、および／または投与サイクルを通して、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間にわたって、抗ＣＤ７３抗体の濃度、少なくとも上記濃度を維持するのに有効な量で投与してもよい。
【０２６４】
ある特定の態様では、抗ＣＤ３９薬剤および抗ＣＤ７３抗体を使用して、消耗および／または免疫抑制の１つまたは複数のマーカーを特徴とする免疫エフェクター細胞を有する個体におけるがんを処置することができる。
【０２６５】
ある特定の態様では、抗ＣＤ３９薬剤（抗ＣＤ７３薬剤と組み合わせてもよい、または抗ＣＤ７３薬剤との組合せ処置を用いなくてもよい）を使用して、抗ＣＤ７３薬剤に対する応答について疾患予後不良である、例えば、十分な抗腫瘍免疫応答の欠如を示す、免疫消耗を示す、および／またはＣＤ７３を中和する薬剤（例えば、抗ＣＤ７３抗体）を用いた処置に対する応答について免疫抑制、特に、予後不良を示す個体におけるがんを処置することができる。疾患予後不良である個体は、例えば、１つまたは複数の予測因子に基づいて、進行のリスクがより高い。一実施形態では、予測因子は、１つまたは複数の遺伝子中に突然変異を有すること、または欠くことを含む。一実施形態では、予測因子は、１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質（例えば、遺伝子シグネチャー）の発現レベルを含む。
【０２６６】
一実施形態では、予測因子は、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３を発現する循環もしくは腫瘍環境中の細胞の存在（例えば、数）、ならびに／または循環もしくは腫瘍環境中の細胞上でのＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３の発現レベルを含む；一実施形態では、細胞は腫瘍細胞である；一実施形態では、細胞は白血球、例えば、Ｂ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３の発現上昇、ならびに／またはＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３を発現する細胞のレベルの上昇の存在は、個体がＣＤ７３を中和する抗体を用いた処置に対する応答について予後不良であることを示してもよい。
【０２６７】
一態様では、抗ＣＤ３９薬剤を使用して、ＣＤ７３を中和する薬剤（例えば、抗ＣＤ７３抗体）を用いた処置に対する非応答者である個体、またはそれに対する部分的もしくは不完全な応答を経験した個体、またはＣＤ７３を中和する薬剤を用いた処置後に疾患が進行した個体におけるがんを処置することができる。一実施形態では、個体は、ＣＤ７３を中和する薬剤との組合せ処置を用いずに（例えば、抗ＣＤ３９単剤療法、または抗ＣＤ３９抗体と、ＣＤ７３を中和する薬剤以外の第２の治療剤との組合せとして）抗ＣＤ３９薬剤を用いて処置される。別の実施形態では、個体は、ＣＤ７３を中和する薬剤と組み合わせた抗ＣＤ３９薬剤を用いて処置される。
【０２６８】
一態様では、抗ＣＤ３９薬剤を使用して、ＣＴＬＡ−４もしくはＰＤ−１軸を阻害する薬剤（例えば、抗体）に対する応答について予後不良である、または非応答者である、またはＣＴＬＡ−４もしくはＰＤ−１軸を阻害する薬剤（例えば、抗体）を用いた処置に対して部分的もしくは不完全な応答を経験した、またはＣＴＬＡ−４もしくはＰＤ−１軸を阻害する薬剤（例えば、抗体）を用いた処置後に疾患が進行した個体におけるがんを処置することができる。一実施形態では、個体は、ＣＤ７３を中和する薬剤との組合せ処置を用いずに（例えば、抗ＣＤ３９単剤療法、または抗ＣＤ３９抗体と、ＣＤ７３を中和する抗体以外の第２の治療剤との組合せとして）抗ＣＤ３９薬剤を用いて処置される。別の実施形態では、個体は、ＣＤ７３を中和する抗体と組み合わせた抗ＣＤ３９薬剤を用いて処置される。
【０２６９】
抗ＣＤ３９抗体組成物を、適宜、さらにＣＤ７３に結合し、これを阻害する薬剤と共に、１つまたは複数の他の処置または治療剤を用いた処置と適宜組み合わせる（さらに組み合わせる）ことができる。そのような治療剤としては、限定されるものではないが、抗がん剤および化学療法剤が挙げられる。
【０２７０】
一実施形態では、さらなる治療剤は、腫瘍細胞の細胞死を誘導する薬剤または処置、例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤または処置、免疫原性がん細胞死を誘導する薬剤または処置である。細胞外ＡＴＰは、ストレス（機械的、低張性もしくは低酸素性）の場合、または細胞死の場合に腫瘍細胞から放出される。壊死は、全細胞内容物の放出によってＡＴＰの受動的放出を促進するが、アポトーシスは、パネキシン１（ＡＴＰ輸送因子）を切断、活性化するカスパーゼ３および９の活性化によってＡＴＰの放出を促進する。腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の例としては、化学療法、放射線療法、より一般的には、アポトーシスを誘導し、それによってＡＴＰ放出を促進する薬剤が挙げられる。ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤は、免疫原性細胞死を誘導することが示されている。例えば、実質的なＡＴＰ放出は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチンおよびＸ線によって誘導される。ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤のさらなる例としては、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、窒素マスタード、メイタンシノイド、カリケアミシン、デュオカルマイシン、チューブリシン、ドラスタチンおよびオーリスタチン、エンジイン、アマトキシン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、放射性同位体、治療タンパク質およびペプチド、ならびにその毒素または断片が挙げられる。薬剤は、例えば、遊離化合物またはコンジュゲートの一部としてなど、任意の好適な構成または製剤中にあってもよい。薬剤を、イムノコンジュゲート中などの標的化部分に都合良くコンジュゲートすることができる。用語「イムノコンジュゲート」および「抗体コンジュゲート」は、互換的に使用され、別の部分（例えば、細胞傷害剤）にコンジュゲートされた抗原結合剤、例えば、抗体結合タンパク質または抗体を指す。細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗原結合剤を含むイムノコンジュゲートは、「抗体薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と呼ぶこともできる。
【０２７１】
一実施形態では、さらなる治療剤は、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１軸を阻害する（すなわち、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を阻害する）薬剤（例えば、抗体）である。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を、例えば、そのような薬剤が単剤療法として、例えば、以下に記載されるように使用される例示的な用量および／または頻度で使用することができる。
【０２７２】
一実施形態では、第２の、またはさらなる第２の治療剤は、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１軸を阻害する（すなわち、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を阻害する）薬剤（例えば、抗体）である。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を、例えば、そのような薬剤が単剤療法として、例えば、以下に記載されるように使用される例示的な用量および／または頻度で使用することができる。
【０２７３】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含むＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害的メンバーである。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄性細胞上で発現される（Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82；Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8）。ＰＤ−１のための２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が同定されており、ＰＤ−１への結合時にＴ細胞活性化を下方調節することが示されている（Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8；Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ−Ｌ１は、様々なヒトがんにおいて豊富に存在する（Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の減少、およびがん性細胞による免疫回避をもたらす。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との部分的相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転させることができ、その効果は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用が同様に遮断された場合には付加的である。ＰＤ−１の遮断は、有利には、例えば、その天然のリガンドであるＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断することによって、ＰＤ−Ｌ１誘導性ＰＤ−１シグナル伝達を防止する抗体の使用を含んでもよい。一態様では、抗体は、ＰＤ−１に結合する（抗ＰＤ−１抗体）；そのような抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用および／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用を遮断することができる。別の態様では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１に結合し（抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する。
【０２７４】
現在、上市されているか、または臨床評価中であるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断する少なくとも６つの薬剤が存在し、これらはいずれも、本開示の抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用することができる。１つの薬剤は、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ／ＯＮＯ−４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；以前はＭＤＸ−１１０６）である。ニボルマブ（商標名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、ＰＤ−１とＣＤ８０の両方へのＰＤ−Ｌ１リガンドの結合を阻害するＦＤＡに認可された完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂであり、開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／１２１１６８に抗体５Ｃ４として記載されている。メラノーマ患者について、最も有意なＯＲは、３ｍｇ／ｋｇの用量で観察されたが、他のがん型については、それは１０ｍｇ／ｋｇであった。ニボルマブは、一般的には、がん進行まで３週毎に１０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２７５】
別の薬剤は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発され、ＷＯ２０１１／０６６３８９およびＵＳ２０１３／０３４５５９に記載された抗ＰＤ−Ｌ１である、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標）、ＭＥＤＩ−４７３６）である。
【０２７６】
別の薬剤は、メラノーマの処置のためにＦＤＡによって認可され、他のがんにおいて試験中である、ランブロリズマブまたはペンブロリズマブ（商標名Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））とも呼ばれるＭＫ−３４７５（ＭｅｒｃｋからのヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−１  ｍＡｂ）である。ペンブロリズマブは、疾患進行まで２または３週毎に２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで試験された。
【０２７７】
別の薬剤は、ＦｃγＲ結合および結果として生じる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最小化することによって効能および安全性を最適化するように設計された操作されたＦｃドメインを含有するヒト抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂであるアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）である。１、１０、１５および２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量のＭＰＤＬ３２８０Ａを、最大１年間、３週毎に投与した。第３相試験では、ＭＰＤＬ３２８０Ａは、ＮＳＣＬＣにおいて３週毎に静脈内輸注によって１２００ｍｇで投与される。
【０２７８】
さらなる公知のＰＤ−１抗体および他のＰＤ−１阻害剤としては、セミプリマブ（ＳａｎｏｆｉおよびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ  ｉｎｃ．およびＩｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐ．）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａからのヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤ１  ｍＡｂ、例えば、ＷＯ２００９／１０１６１１を参照されたい）、ＡＭＰ−２２４（ＧＳＫにライセンス付与されたＢ７−ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されたＡＭＰ−５１４、ＷＯ２０１０／０７７６３４に記載された抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＷＯ２００７／００５８７４に記載されたＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発された抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるＢＭＳ−９３６５５９としても知られるＭＤＸ−１１０５、ならびにＷＯ２００６／１２１１６８、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ２００９／１１４３３５およびＷＯ２０１３／０１９９０６に記載された抗体および阻害剤が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。抗ＰＤ−１抗体のさらなる例は、ＷＯ２０１５／０８５８４７（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｅｎｇｒｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に開示されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１への結合についてこれらの抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。
【０２７９】
ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の別の阻害的メンバーであり、Ｔ細胞上に発現される。ＣＴＬＡ−４に結合し、これを阻害する抗体は、当業界で公知である。一例では、その抗体は、ヒトＩｇＧ抗体であるイピリムマブ（商標名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）である。一例では、その抗体は、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。Ｙｅｒｖｏｙに関する例示的な投与レジメンは、３週毎に９０分かけて静脈内で３ｍｇ／ｋｇである。一例では、本開示の抗ＣＤ７３と組み合わせて使用される抗体は、ＣＴＬＡ−４への結合についてイピリムマブまたはトレメリムマブと競合する抗体である。
【実施例】
【０２８０】
方法
ＣＤ３９突然変異体の生成
ＣＤ３９突然変異体を、ＰＣＲによって生成した。増幅された配列をアガロースゲル上で泳動し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（参照番号７４０６０９）を使用して精製した。次いで、それぞれの突然変異体について生成された精製されたＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎＴｅｃｈ  ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムを用いて、発現ベクター中にライゲーションした。突然変異配列を含有するベクターを、Ｍｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、配列決定した。配列決定後、突然変異配列を含有するベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してＭｉｄｉｐｒｅｐとして調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用してベクターをトランスフェクトし、ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４８時間インキュベートした後、トランスジーン発現について試験した。以下の表に示されるように、突然変異体をＨｅｋ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。以下の表１中の標的化されたアミノ酸突然変異は、配列番号２のナンバリングを使用して示される。
【０２８１】
【表２】
2020536109.tif 000027
【０２８２】
可溶性ｈｕＣＤ３９のクローニング、産生および精製
分子生物学
ｈｕＣＤ３９タンパク質を、以下のプライマー
【化２４】
2020536109.tif 000028
および
【化２５】
2020536109.tif 000029
を使用してヒトＰＢＭＣ  ｃＤＮＡからクローニングした。次いで、精製されたＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して発現ベクター中にクローニングした。Ｍ２タグ（ＦＬＡＧタグ、配列番号３９中で下線付き）を、精製工程のためにタンパク質のＣ末端部分中に添加した；ＣＤ３９細胞外ドメインタンパク質（例えば、配列番号５４の）を、任意の実施形態において、適宜Ｍ２タグを欠くように特定することができることが理解されるであろう。
【０２８３】
ｈｕＣＤ３９タンパク質の発現および精製
クローニングされた配列の検証後、ＣＨＯ細胞をヌクレオフェクトした後、産生プールをサブクローニングして、ｈｕＣＤ３９タンパク質を産生する細胞クローンを取得した。ローラー中で増殖したｈｕＣＤ３９クローンに由来する上清を収獲し、Ｍ２クロマトグラフィーカラムを使用して精製し、Ｍ２ペプチドを使用して溶出させた。次いで、精製されたタンパク質を、Ｓ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラム上にロードした。単量体に対応する精製タンパク質を、ＴＢＳ  ｐＨ７．５緩衝剤中で製剤化した。Ｍ２タグを含まないＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
【化２６】
2020536109.tif 000030
【０２８４】
Ｍ２タグを含むＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
【化２７】
2020536109.tif 000031
【０２８５】
可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害
産生された可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルを生成する試薬の使用によるＡＴＰ加水分解の評価を可能にするＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｇ７５７１）を使用して評価した。このように、可溶性ＣＤ３９媒介性ＡＴＰ加水分解の阻害を評価することができる。簡単に述べると、１００μｇ／ｍｌ〜６ｘ１０−３μｇ／ｍｌの用量範囲の抗ＣＤ３９抗体を、方法のセクションに記載されたアミノ酸配列（配列番号５４）を有する４００ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共に、３７℃で１ｈインキュベートした。２０μＭのＡＴＰを、ＣＴＧ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）試薬の添加前に３７℃でさらに３０分間、プレートに添加した。暗室中で５ｍｉｎ、短くインキュベートした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）照度計を使用して、放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）および可溶性ＣＤ３９タンパク質と一緒になったＡＴＰ（最小光放射）とを比較することによって、抗ＣＤ３９抗体の効能を決定した。
【０２８６】
細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害
抗体によるＣＤ３９を発現する細胞中のＣＤ３９酵素活性の阻害を、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルを生成する試薬の使用によるＡＴＰ加水分解の評価を可能にするＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｇ７５７１）を使用して評価した。かくして、アッセイを、細胞培養上清中でのＣＤ３９により加水分解されたＡＴＰの阻害の評価を可能にするように設計した。簡単に述べると、５ｘ１０４個のＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞、５ｘ１０３個のヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９およびマウスＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞を、３０μｇ／ｍｌ〜５ｘ１０−４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体と共に、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、３７℃でさらに１時間、２０μＭのＡＴＰと共にインキュベートした。プレートを４００ｇで２ｍｉｎ遠心分離し、５０μｌの細胞上清を発光マイクロプレート（白色ウェル）に移した。５０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（ＣＴＧ）を上清に添加し、暗室中で５ｍｉｎインキュベートした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）照度計を使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）および細胞と一緒になったＡＴＰ（最小光放射）とを比較することによって、抗ＣＤ３９抗体の効能を決定した。
【０２８７】
抗体の生成：マウスにおける免疫化およびスクリーニング
抗ヒトＣＤ３９抗体を得るために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、上記の組換えヒトＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質で免疫した。マウスは、５０μｇのＣＤ３９タンパク質および完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントのエマルジョンを用いる腹腔内での１回の初回免疫、５０μｇのＣＤ３９タンパク質および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントのエマルジョンを用いる腹腔内での２回目の免疫、ならびに最後に、１０μｇのＣＤ３９タンパク質を用いる静脈内での追加免疫を受けた。免疫脾臓細胞を、Ｘ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞を用いる追加免疫の３日後に融合し、照射された脾臓細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマを、半固体メチルレルロース含有培地中に播種し、増殖するクローンを、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ２装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して拾った。
【実施例１】
【０２８８】
公知の中和ＣＤ３９  ｍＡｂのエピトープマッピング
細胞性ＣＤ３９の酵素（ＡＴＰａｓｅ）活性を阻害する抗体の機能についての洞察を得るために、本発明者らは、細胞アッセイにおいてＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することが報告された抗体：ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０９５４７８号に開示されたＢＹ４０が結合するエピトープを調査した。
【０２８９】
抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＣＤ３９の表面と比較して分子表面に露出したアミノ酸の置換によって定義されたＣＤ３９突然変異体を設計した。突然変異体を、配列番号２のナンバリングを使用して、表１に示されたようにＨｅｋ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。
【０２９０】
Ｉ−３９４の用量範囲（１０−２．５−０．６２５−０．１５６３−０．０３９１−０．００９８−０．００２４−０．０００６μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーによって２０個の生成された突然変異体上で試験した。ＢＹ４０抗体は両方とも、ＣＤ３９の突然変異体５を発現する細胞への結合を完全に喪失したが、他の突然変異体への結合は喪失しなかった。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７にアミノ酸置換を含有する。ＣＤ３９の表面上の突然変異体５の位置を、図３Ａに示す。
【実施例２】
【０２９１】
公知の中和ＣＤ３９  ｍＡｂは組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができない
細胞アッセイにおいてＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することが報告された２つの抗体（ＢＹ４０およびＢＹ１２）を評価して、組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することができるかどうかを決定した。上記のように産生された可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｇ７５７１）を使用して評価した。細胞性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、上に示されたように評価した。
【０２９２】
予想通り、ＢＹ４０は、細胞中のＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害した。しかしながら、ＢＹ４０は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害することができなかった。図２Ｂは、ＢＹ４０と、本明細書で同定される新しい抗体との比較を示す。
【実施例３】
【０２９３】
ｓＣＤ３９活性を遮断する新しいｍＡｂのスクリーニング
一連の免疫化を実行して、ｓＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体を探索した。抗ヒトＣＤ３９抗体を得るために、動物を、上記の組換えヒトＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質で免疫した。異なるプロトコールを使用し、異なる動物において、合計で１５回の一連の免疫化を実行した。異なるマウス株、ラットおよびウサギを含有させた。
【０２９４】
初回免疫化プロトコールでは、一次スクリーニングは、野生型ＣＨＯおよびｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞株を使用するフローサイトメトリーによって増殖中のクローンの上清（ＳＮ）を試験することを含んでいた。細胞を、それぞれ、０．１μＭおよび０．００５μＭのＣＦＳＥで染色した。フローサイトメトリースクリーニングのために、全ての細胞を同等に混合し、上清中の反応抗体の存在を、ＡＰＣで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって示した。次いで、ｈｕＣＤ３９に結合した抗体のために、上清を、上記の開発されたスクリーニングアッセイ（方法）を使用して可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害についてスクリーニングした。
【０２９５】
その結果、いくつかの特異的なＣＤ３９結合抗体を取得することができるが、これらの免疫化のいずれかに由来する抗体はいずれも、可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害を示さないことが示された。１つの可能性は、ＣＤ３９上のドミナントエピトープは、ＣＤ３９の触媒部位に、またはその近くに好適に配置されたエピトープを含まないということである。細胞性ＣＤ３９を阻害する抗体の利用可能性が少ないこと、および抗体を使用した酵素の触媒部位の阻害の公知の困難性を考慮すると、ｓＣＤ３９を中和する抗体の非存在は、可溶性（細胞外ドメイン）ＣＤ３９を阻害する抗体を取得することができないことを示し得る。他の可能性は、特に、可溶性ＣＤ３９を阻害することができる抗体の欠如は、ｓＣＤ３９遮断アッセイの検証を妨げるため、非機能的スクリーニングアッセイおよび／または不適切に折り畳まれた、もしくは機能する可溶性ＣＤ３９タンパク質に関する。
【０２９６】
可溶性ＣＤ３９を阻害することができる抗体の非存在を考慮して、さらなる免疫化を、抗体ＢＹ４０のエピトープによって同定されるＣＤ３９の活性部位に結合する抗体の生成を促進するように設計されたスクリーニングプロトコールを用いて実行した。簡単に述べると、一次スクリーニングは、先述の免疫化のように、野生型ＣＨＯおよびｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞株を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清（ＳＮ）を試験すること、次いで、表１に示されたように、野生型ＣＤ３９と比較した、ＣＤ３９を発現するＨｅｋ−２９３Ｔ細胞の突然変異体５への結合の喪失についてスクリーニングを含んでいた。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７に置換を有する。しかしながら、再びその結果、突然変異体５への結合の喪失を示すいくつかの特異的なＣＤ３９結合抗体を取得することができるが、初回免疫化のいずれかに由来する抗体はいずれも、可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害を示さないことが示された。
【実施例４】
【０２９７】
エピトープ指向性スクリーニングの一部としてのｓＣＤ３９活性を阻害する第１抗体の同定
本発明者らは、ＢＹ４０様抗体と競合しない抗体を得るために、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７領域（突然変異体５によって定義される）に結合しない抗ＣＤ３９抗体を同定しようとした。ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を遮断する能力を有する必要がないそのような抗体は、例えば、細胞性ＣＤ３９を阻害するＢＹ４０またはＢＹ４０様抗体の存在下で細胞上の遊離ＣＤ３９タンパク質を検出および定量するための、ＢＹ４０結合部位に結合する細胞性ＣＤ３９を阻害する抗体の薬理試験にとって有用であり得る。
【０２９８】
ハイブリドーマをＣＤ３９突然変異体５への結合の喪失についてスクリーニングした実施例３の免疫化の結果から出発して、ＣＤ３９突然変異体５への結合の喪失を示したものではないハイブリドーマを選択した。このハイブリドーマ（Ｉ−３９４）は、突然変異体５への結合のあり得る部分的減少を示す決定的ではないデータにおそらく起因するより広いプールの中のものであったが、Ｉ−３９４は、突然変異体５への結合を喪失せず、したがって、最初は保持されなかった。
【０２９９】
可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害のためのさらなる免疫化に由来する上清の進行中のスクリーニングの状況では、クローニングおよび産生された抗体Ｉ−３９４は、対照として含まれていた。驚くべきことに、抗体Ｉ−３９４はエピトープ指向性スクリーニングにおいて保持されたクローンではないにも拘わらず、この抗体は、上記のアッセイ（方法）において可溶性ＣＤ３９の酵素活性の強力な阻害を示した。
【０３００】
ヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ６４への結合の欠如をもたらす突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（ＫａｂａｔのＥＵナンバリング）を有する改変されたＦｃドメインと共に、ＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域を有するＩ−３９４を産生した。簡単に述べると、Ｉ−３９４抗体のＶＨおよびＶｋ配列（それぞれ、配列番号６および配列番号７に示されるＶＨおよびＶｋ可変領域）を、それぞれ、上記の突然変異を担持するｈｕＩｇＧ１定常ドメインおよびｈｕＣｋ定常ドメインを含有する発現ベクター中にクローニングした。２個の得られたベクターを、ＣＨＯ細胞株中に同時トランスフェクトした。確立された細胞プールを使用して、ＣＨＯ培地中で抗体を生産した。次いで、プロテインＡを使用して抗体を精製した。Ｉ−３９４のそれぞれの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、以下に示す（ＫａｂａｔのＣＤＲに下線を付す）。
Ｉ−３９４重鎖可変ドメイン配列：
【化２８】
2020536109.tif 000032
Ｉ−３９４軽鎖可変ドメイン配列：
【化２９】
2020536109.tif 000033
【０３０１】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換（Ｎ２９７結合グリコシル化を保持する）と共に、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するＩ−３９４の重鎖および軽鎖配列を、以下に示す：
Ｉ−３９４重鎖配列：
【化３０】
2020536109.tif 000034
Ｉ−３９４軽鎖配列：
【化３１】
2020536109.tif 000035
【０３０２】
次いで、ＣＤ３９の表面と比較して分子表面に露出したアミノ酸の置換によって定義されたＣＤ３９突然変異体への結合の喪失について、抗体Ｉ−３９４を試験した。突然変異体を、配列番号２のナンバリングを使用して、表１に示されたようにＨｅｋ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。抗体Ｉ−３９４の用量範囲を、フローサイトメトリーによって２０種の突然変異体上で試験した。図３Ｂに示されるように、Ｉ−３９４は、ＣＤ３９の突然変異体１９を発現する細胞への結合の完全な喪失を示した。突然変異体１９は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２に置換を含む。かくして、Ｉ−３９４のコアエピトープは、Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２の１つまたは複数（または全部）の残基を含む。
【０３０３】
突然変異体５への結合を喪失し、細胞性ＣＤ３９を阻害するが、可溶性ＣＤ３９は阻害しない能力を有する以前の抗体ＢＹ４０と違って、抗体Ｉ−３９４は、隣接する突然変異体１９への結合を喪失し、突然変異体５への結合が大きく減少する（しかし、突然変異体５への結合が一部残存する）。興味深いことに、突然変異体１９の残基は、残基５のものにごく近いか、または隣接し、Ｉ−３９４はＢＹ４０と比較してエピトープのシフトを示し得る。かくして、抗体Ｉ−３９４は、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性の阻害を可能にする抗ＣＤ３９抗体のための有益な新しいエピトープを提示する。それは、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を中和するさらなる抗体を検出するためのスクリーニングアッセイの検証および試験を可能にする特異的な陽性対照も提供する。
【実施例５】
【０３０４】
ｓＣＤ３９中和ｍＡｂのための非エピトープ指向性スクリーニング
可溶性ＣＤ３９の抗体媒介性阻害が可能であることを示す実施例４の結果に基づいて、実施例３とは異なるプロトコールを使用する異なる免疫化に由来する融合物を、ｓＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体を探索するために再検討した。
【０３０５】
次いで、ＡＴＰａｓｅ阻害に関するスクリーニングのための異なる手法を評価した。１つの実験では、Ｉ−３９４抗体を使用して、可溶性ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する能力について陰性であることがわかった実施例３の免疫化のハイブリドーマに由来する上清を混合した。上清へのＩ−３９４のこの添加は、ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する陰性の上清の能力を回復させなかった。次いで、抗体Ｉ−３９４を、プロテインＡ被覆ビーズを使用して陰性の上清から精製し、本発明者らは、精製されたＩ−３９４が再びＡＴＰａｓｅ活性を阻害する能力が回復したことを観察した。
【０３０６】
前記結果を考慮して、新しい、および過去の免疫化に由来する増殖中のクローンを、可溶性ＣＤ３９または細胞性ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の阻害を評価することなく、およびエピトープに関するスクリーニングの偏りなく、野生型ＣＨＯおよびｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞株を使用するフローサイトメトリーによってスクリーニングする新しい免疫化およびスクリーニングのプロトコールを開発した。突然変異体５または１９への結合の喪失に関するデータが一部のハイブリドーマについて利用可能であったが、そのようなデータは、クローン選択のために使用されなかったが、ＡＴＰａｓｅ遮断アッセイにおける陰性結果の事象におけるクローニングのためのハイブリドーマをレスキューする目的で保持されたに過ぎなかった。ＣＤ３９に結合するハイブリドーマを選択およびクローニングした後、以下のプロトコールに従ってプロテインＡを使用して精製した：
−  ３００μｌのハイブリドーマ上清に、１０μｌのプロテインＡビーズを添加する。
−  １．５Ｍの最終濃度となるようにＮａＣｌを添加する。
−  チューブを４℃で３〜４ｈ回転させる。
−  １５００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離する。
−  上清を除去し、１ｍｌのＴＢＳで３回洗浄する。
−  ３回目の洗浄後、全てのＴＢＳを除去する。
−  ０．１Ｍ  ｐＨ３のクエン酸塩５０μｌを添加し、ホモジェネートし、ＲＴで５ｍｉｎインキュベートする。
−  ビーズを１５００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離する。
−  ５０μｌの溶出液を収獲し、４５０μｌのＴＢＳを迅速に添加し、４℃で保存する。
【０３０７】
次いで、得られた抗体を、Ｉ−３９４と同程度にＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する能力について競合アッセイにおいてスクリーニングした。可溶性および細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害のために使用されたアッセイは、上記の通りであった（方法）。驚くべきことに、この方法で生産された例示的抗体のうち、いくつかのものが可溶性ＣＤ３９の阻害（ならびに細胞性ＣＤ３９の阻害）を示した。図１は、陽性対照のＩ−３９４抗体と比較した、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８およびＩ−３９９抗体を示す代表的なスクリーニング結果を示す。同様に、異なる免疫化に由来する抗体Ｉ−３９５およびＩ−３９６は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害した。図２Ａおよび図２Ｂは、より多量の抗体が可溶性と細胞性の両方のＣＤ３９中和のための追加実験に利用可能であった抗体Ｉ−３９５およびＩ−３９６の結果を示す。図２Ａは、抗体Ｉ−３９５とＩ−３９６が両方とも、ＢＹ４０およびＩ−３９４抗体と比較して細胞膜に結合したＣＤ３９を阻害し、Ｉ−３９４とＩ−３９５が両方とも、ＢＹ４０と比較して細胞性ＣＤ３９のより大きい効力および最大阻害を示したことを示す。図２Ｂは、Ｉ−３９５とＩ−３９６抗体が両方とも、ＢＹ４０およびＩ−３９４抗体と比較して、可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。ＢＹ４０は任意の濃度で可溶性ＣＤ３９を阻害しないが、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５およびＩ−３９６は全て、可溶性ＣＤ３９を阻害し、Ｉ−３９４が最大の効力を示し、次いで、Ｉ−３９５、さらに次いで、Ｉ−３９６はより低い効力を示す。
【０３０８】
得られた結果は、ＡＴＰのシグナルが、従来の方法を使用する抗体のスクリーニングでは検出されないように、ハイブリドーマ上清中の因子が、細胞培養物および可溶性ＣＤ３９アッセイの両方においてＡＴＰを迅速に加水分解している可能性を高める。可溶性因子は、ＣＤ３９または例えば、融合パートナーによって産生される、一部の他の酵素であってもよい。
【０３０９】
次いで、Ｉ−３９４について本明細書で示されたものと同じように、ヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ６４への結合の欠如をもたらす突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（ＫａｂａｔのＥＵナンバリング）を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメインと共にヒト定常領域を有するように改変された抗体をクローニングした。次いで、得られた抗体を、滴定にかけた後、実施例７〜９に示されるようなより詳細な活性評価（滴定、ＡＴＰａｓｅ活性の阻害）にかけて、効力に従って抗体を順位付けるためにＥＣ５０およびＩＣ５０の決定を評価することができる。
【実施例６】
【０３１０】
ｓＣＤ３９中和ｍＡｂのエピトープマッピング
実施例４に示されるように、Ｉ−３９４は、ＣＤ３９の突然変異体１９を発現する細胞への結合の完全な喪失を示したが、突然変異体５への結合を喪失しなかった。実施例５のさらなる抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、それらを、実施例１および表１に記載されたようにＣＤ３９突然変異体のパネルへの結合の喪失について試験した。突然変異体を、配列番号２のナンバリングを使用して、表１に示されたようにＨｅｋ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。試験抗体の用量範囲（１０−２．５−０．６２５−０．１５６３−０．０３９１−０．００９８−０．００２４−０．０００６μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーによって２０個の生成された突然変異体上で試験した。
【０３１１】
その結果、可溶性ＣＤ３９を阻害する能力について実施例５で選択された抗体は、いくつかの異なるエピトープを表すことが示された。実施例５で可溶性細胞外ＣＤ３９の阻害を示した抗体のうち、抗体Ｉ−３９５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７に置換を有する突然変異体５への結合の喪失、およびまた、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２に置換を有する突然変異体１９への結合の喪失を示した抗体の例である。突然変異体１９は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２に置換を含む。かくして、Ｉ−３９５のＣＤ３９上のコアエピトープは、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７のうちの１、２、３または４個の残基、ならびにＲ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２のうちの１、２または３個の残基を含む。
【０３１２】
他方で、抗体Ｉ−３９８は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９およびＥ１４２に置換を有する突然変異体１９への結合の喪失を示したが、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３およびＲ１４７に置換を有する突然変異体５への結合が減少しない、またはその喪失を示さない抗体の例である。
【０３１３】
実施例５で可溶性細胞外ＣＤ３９の阻害を示した他の抗体は、非常に異なるエピトープを有し、突然変異体５または１９のいずれかへの結合の喪失を示さなかったが、可溶性ＣＤ３９をｓＣＤ３９上の他の部位に結合させることによって阻害することもできることを示唆している。一部の抗体については、表１の２０種の突然変異体の１つへの結合の喪失は、ＣＤ３９上の結合部位の局在化を可能にしたが、他の抗体については、結合部位は、それらが２０種の突然変異体のいずれかへの結合を喪失しなかったため、残存していると決定された。実施例５で可溶性ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の阻害を示す抗体のうち、抗体Ｉ−３９６は、他の２０種の突然変異体のいずれかへの結合を喪失することなく、置換Ｋ８７Ａ、Ｅ１００ＡおよびＤ１０７Ａを有する突然変異体１５への結合の喪失を示した。かくして、この抗体のＣＤ３９上のコアエピトープは、Ｋ８７、Ｅ１００およびＤ１０７の１つまたは複数（または全部）の残基を含む。抗体Ｉ−３９９は、他の２０種の突然変異体のいずれかへの結合を喪失することなく、置換Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６Ｇ、Ｖ３７７ＡおよびＫ３７６とＶ３７７の間にバリンの挿入（表１では「挿入３７７Ｖ」と呼ばれている）を有する突然変異体１１への結合の喪失を示した。かくして、この抗体のＣＤ３９上のコアエピトープは、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６およびＶ３７７の１つまたは複数（または全部）の残基を含む。図３Ａは、ＣＤ３９タンパク質の表面上での突然変異体５（Ｍ５）、１５（Ｍ１５）および１９（Ｍ１９）中の突然変異した残基の位置を示す。図３Ｂは、異なる抗体についての突然変異体５、１５および１９への結合の結果を示す。
【０３１４】
かくして、この結果は、可溶性ＣＤ３９を阻害する抗体を異なるエピトープに対して得ることができることを示す。エピトープは、可溶性ＣＤ３９ではなく、細胞性ＣＤ３９のみを阻害する（突然変異体５への結合を喪失する）ＢＹ４０またはＢＹ４０様抗体の結合部位に隣接して位置する突然変異体１９の１つまたは複数の残基によって定義されるエピトープ、おそらく、ＢＹ４０またはＢＹ４０様抗体と比較してより小さいシフトを示す、突然変異体１９の１つまたは複数の残基だけでなく、一部は突然変異体５によっても定義されるエピトープ、突然変異体５の残基ではなく、突然変異体１９の１つまたは複数の残基によって定義されるエピトープ、ならびに突然変異体１１の１つもしくは複数の残基または突然変異体１５の１つもしくは複数の残基によって、またはさらには、エピトープの局在化が残存すると決定された突然変異体５、１５もしくは１９のいずれかへの結合が減少していない他の抗体によって定義されるものなどの他のエピトープを含む。
【実施例７】
【０３１５】
フローサイトメトリーによるＣＤ３９を発現する細胞上での抗体滴定
抗体Ｉ−３９４を、ヒトＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、カニクイザル（マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、マウスＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、およびヒトＲａｍｏｓリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ（商標）、参照番号ＣＲＬ−１５９６）への結合について２回の反復実験において試験した。細胞を、３０μｇ／ｍｌ〜５ｘ１０−４μｇ／ｍｌの様々な濃度の未標識抗ＣＤ３９抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ標識二次抗体と共に、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
【０３１６】
結果を、図４に示す。抗体Ｉ−３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）、カニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）およびＲａｍｏｓリンパ腫細胞に結合したが、マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｍｏＣＤ３９）には結合しなかった。Ｉ−３９４は、それぞれ、第１および第２のセットの実験において、０．１６μｇ／ｍｌおよび０．１９μｇ／ｍｌのＥＣ５０値でＲａｍｏｓ細胞に結合した。他のいくつかの抗ＣＤ３９抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞への結合について同等のＥＣ５０値を示した。
【実施例８】
【０３１７】
細胞ＡＴＰａｓｅ活性の阻害に関するＩＣ５０の決定
ＣＤ３９を発現する細胞中のＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の抗体Ｉ−３９４による阻害を、上記の細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイ（方法）を使用して評価した。
【０３１８】
結果を、図５に示す。Ｉ−３９４は、腫瘍（Ｒａｍｏｓ）細胞中でＣＤ３９酵素活性を遮断するのに非常に強力であり、試験した他の全ての抗体と比較して高い効力を示す。Ｉ−３９４はまた、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）およびカニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）中でＣＤ３９酵素活性を遮断する。マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｍｏＣＤ３９）を、陰性対照として示す。ＩＣ５０計算値（５０，０００個のＲａｍｏｓ細胞によって発現されるＣＤ３９の酵素活性の５０％の阻害）は、０．０５μｇ／ｍｌである。達成される最大阻害は、８１．６％である。アイソタイプ対照は、効果がなかった。
【実施例９】
【０３１９】
組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性の阻害に関するＩＣ５０の決定
ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性の抗体Ｉ−３９４による阻害を、上記の可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイ（方法）を使用して評価した。結果を、図６に示す。Ｉ−３９４は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害する。それと比較して、抗体ＢＹ４０は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害しなかった。ＩＣ５０計算値は、０．００３μｇ／ｍｌである。達成される最大阻害は、７４．９％である。
【実施例１０】
【０３２０】
ＣＤ３９−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４アイソフォーム上でのＥＬＩＳＡ滴定
抗体Ｉ−３９４を、以下に示されるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣＤ３９アイソフォーム（Ｒｅｃ−ｈｕＣＤ３９アイソフォーム）への結合について試験し、５００ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌで、４℃で一晩、ＰＢＳ  １Ｘ中、９６ウェルプレート中でコーティングした。ウェルをＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄し、ＴＢＳブロッキング緩衝液中、ＲＴで２ｈ、さらに飽和させた。用量範囲濃度の一次抗体を、ＲＴで２ｈ、ＴＢＳブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ウェルを、ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した。二次抗体（ＴＢＳブロッキング緩衝液中のＧＡＭ−ＨＲＰまたはＧＡＨ−ＨＲＰ）を、ＲＴで１ｈインキュベートし、ＴＭＢを用いて示した。光密度を、ＯＤ＝４５０でＥｎｓｐｉｒｅ（商標）上で測定した。
【０３２１】
クローニングされたｈｕＣＤ３９（血管アイソフォーム）のアミノ酸配列：
ＮＴＰＤａｓｅ２またはＥＮＴＰＤ２としても知られるヒトＣＤ３９−Ｌ１：
【化３２】
2020536109.tif 000036
ＮＴＰＤａｓｅ６またはＥＮＴＰＤ６としても知られるヒトＣＤ３９−Ｌ２：
【化３３】
2020536109.tif 000037
ＮＴＰＤａｓｅ３またはＥＮＴＰＤ３としても知られるヒトＣＤ３９−Ｌ３：
【化３４】
2020536109.tif 000038
ＮＴＰＤａｓｅ５またはＥＮＴＰＤ５としても知られるヒトＣＤ３９−Ｌ４：
【化３５】
2020536109.tif 000039
【０３２２】
Ｉ−３９４は、ＣＤ３９に結合したが、アイソフォームＣＤ３９−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３または−Ｌ４のいずれにも結合しなかった。アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）は、ＣＤ３９またはＣＤ３９−Ｌ分子のいずれにも結合しなかった。結果を、図７に示す。
【実施例１１】
【０３２３】
樹状細胞の活性化
ＡＴＰは炎症性活性を有するが、ＡＴＰのＣＤ３９媒介性異化は、樹状細胞（ＤＣ）活性化を弱めることができ、次いで、腫瘍抗原に対するより広い適応免疫応答を変化させると考えられる。抗ＣＤ３９抗体を使用するＣＤ３９遮断がＡＴＰの存在下での樹状細胞（ＤＣ）活性化のＣＤ３９媒介性変化を克服することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＡＴＰの存在下で、単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）を抗ＣＤ３９抗体と共にインキュベートした。
【０３２４】
簡単に述べると、ヒト単球を、ヒトの健康な血液から精製し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６日間、ＭｏＤＣに分化させた。次いで、ＭｏＤＣをＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、０．２５〜１ｍＭ）の存在下で２４時間活性化し、フローサイトメトリーによってＣＤ８０、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲ発現を分析することによって、ＤＣの活性化を評価した。一部の場合、ＭｏＤＣを、ＣＤ３９阻害剤：ＡＲＬ６７１６（Ｔｏｃｒｉｓ、２５０μＭ）、ＣＤ７３阻害剤：ＡＰＣＰ（Ｔｏｃｒｉｓ、５０μＭ）、抗ＣＤ３９遮断抗体Ｉ−３９４もしくはＢＹ４０（ＢＹ４０については、ＷＯ２００９／０９５４７８を参照されたい）、または抗ＣＤ７３遮断抗体の存在下で１時間予備インキュベートした。ＬＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性対照として使用した。ＣＤ４  Ｔ細胞活性化に対するＡＴＰ媒介性ＤＣ活性化の得られる効果を評価するために、ＡＴＰ活性化ＤＣを洗浄した後、５日間、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種異系ＣＤ４  Ｔ細胞（１ＭｏＤＣ／４  Ｔ細胞の比）と共にインキュベートした。Ｔ細胞の活性化および増殖を、フローサイトメトリーによるＣＤ２５発現およびＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈を介して分析した（図８）。
【０３２５】
結果を、図９、図１０および図１１に示す。陰性対照（培地）の存在下では、ｍｏＤＣ活性化は１ｍＭのＡＴＰの存在下で観察されたが、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭまたは０．５ｍＭのＡＴＰはｍｏＤＣ活性化を可能にしなかった。活性部位に結合することによってＣＤ３９酵素活性を完全に遮断すると考えられるＣＤ３９の化学的阻害剤の添加は、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭまたは０．５ｍＭのそれぞれにおいてｍｏＤＣ活性化をもたらす。しかしながら、ＢＹ４０などの抗ＣＤ３９抗体または抗ＣＤ７３抗体は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰ誘導性活性化を促進することができなかったが、これは、抗体がＡＴＰ異化を十分に回避する酵素活性を遮断することができないことを示唆している。驚くべきことに、ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を実質的に完全に遮断し、したがって、ＡＴＰの蓄積を可能にし得る抗ＣＤ３９遮断抗体（１０μｇ／ｍｌの濃度で図面に示される）は、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭまたは０．５ｍＭのそれぞれにおいてＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ８３発現によって評価した場合、ｍｏＤＣ活性化を可能にした（図９および図１０）。興味深いことに、ＡＴＰの存在下で活性化されたＭｏＤＣは、ＭＬＲアッセイにおいてより良好なＴ細胞の活性化および増殖を誘導することができた。さらに、抗ＣＤ３９遮断抗体Ｉ−３９４によるＡＴＰ媒介性ＭｏＤＣ活性化の増強は、より高いＴ細胞の増殖および活性化をもたらした（図１１）。
【０３２６】
ＡＴＰの存在下でＤＣを活性化するＣＤ３９阻害剤の能力の評価は、高い程度のＣＤ３９の阻害を達成することができる抗ＣＤ３９抗体を同定および評価するための方法を提供する。さらに、ＤＣ上のＣＤ３９によって示される免疫抑制効果を軽減するために抗ＣＤ３９抗体を使用する可能性は、特に、腫瘍細胞上の抗原に対する適応免疫応答の増強を提供することができる。さらに、そのような抗ＣＤ３９抗体は、化学療法剤の免疫原性効果を増強するために使用される場合、特に興味深いものであり得る。腫瘍細胞の壊死を引き起こすいくつかの化学療法剤は、ＡＴＰを誘導することができる；抗ＣＤ３９抗体との組み合わせた使用は、これらの設定において抗腫瘍応答を増強するのに特に有用であり得る。
【実施例１２】
【０３２７】
組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する抗体はＡＴＰの存在下でＣＤ７３遮断を強く強化する
Ｔ細胞増殖アッセイ
健康なドナーに由来する末梢血をＥＦＳから取得し、単核細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配上で単離した。細胞ペレットの収集によって５２％Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上でリンパ球をさらに富化し、製造業者によって提供されたＴＤＳに従ってＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ染料（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて染色した。５ｘ１０４〜１ｘ１０５個の染色された細胞を、９６丸底プレートに分配し、抗ｈｕＣＤ７３抗体（抗体６Ｅ１）および／または抗ｈｕＣＤ３９抗体（本明細書に記載のＩ−３９４）と共に、３７℃で１時間インキュベートし、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体被覆ビーズ（ビーズ：細胞＝１：４；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加により、３〜５日間活性化した。Ｔ細胞増殖の阻害を、ＡＴＰ（２００μＭ）の添加によって達成した。Ｔ細胞増殖およびＡＭＰの免疫抑制効果を遮断する抗体の能力を、増殖中のＴ細胞サブセット中で染料希釈液を定量することによるフローサイトメトリーによって評価した。
【０３２８】
抗ＣＤ７３  Ａｂ濃度に対する増殖中のＴ細胞のパーセンテージを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ中にプロットする。
【０３２９】
結果
腫瘍環境中に見出すことができる状態を代表するように意図された、添加されたＡＴＰの存在下でＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞増殖を回復させる能力について、抗体を試験した。抗ＣＤ７３抗体およびＣＤ３９のそれぞれを、他の抗ＣＤ７３抗体または抗ＣＤ３９抗体の３つの異なる用量の用量範囲で試験した。抗ＣＤ３９抗体Ｉ−３９４は、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞増殖の回復における抗ＣＤ７３抗体の効果を強く強化し、低濃度の抗ＣＤ７３抗体（例えば、０．０１μｇ／ｍｌ未満、０．００１μｇ／ｍｌ未満およびさらには０．００１μｇ／ｍｌ未満）であっても、抗ＣＤ３９抗体と組み合わせて使用した場合、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞増殖を強く増強した。さらに、抗ＣＤ７３抗体を含まない用量範囲のみで試験した場合、抗ＣＤ３９抗体Ｉ−３９４は、０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度でＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞増殖の顕著な増強をもたらした。図１２Ａは、抗ＣＤ３９抗体Ｉ−３９４の３つの異なる用量、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのいずれかにおける、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体６Ｅ１の用量範囲を示す。可溶性ヒトＣＤ３９を中和することができる抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖の回復における抗ＣＤ７３抗体に関する効果の強力な強化を示す。この効果は、抗ＣＤ７３抗体を用いた処置の経過中に腫瘍組織において観察することができる濃度範囲に対応する、抗ＣＤ７３抗体が準最適に活性である濃度で特に強力であった。０．０１μｇ／ｍｌの濃度で、抗ＣＤ３９抗体は、抗ＣＤ７３抗体の効力の約１ｌｏｇの増加を提供し、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、抗ＣＤ３９抗体は、抗ＣＤ７３抗体の効力の約４ｌｏｇの増加を提供した。したがって、抗ＣＤ３９抗体は、特に、腫瘍細胞、例えば、ＣＤ７３を発現する細胞を担持する腫瘍における、抗ＣＤ７３抗体の活性を増強するのに有用であり得る。さらに、試験した抗ＣＤ７３抗体（可溶性ＣＤ７３タンパク質を中和することができる）はＣＤ４  Ｔ細胞増殖を回復させる高い能力を有していたが、効力がより低い他の抗体（例えば、酵素阻害アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、または他の好適なアッセイにおいて評価した場合）は、抗ｓＣＤ３９抗体との組合せからさらにより多くの利益を得ることができる。図１２Ｂは、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７３抗体の用量範囲を示す。再度、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖の回復において抗ＣＤ７３抗体との強力な相乗効果および／または付加効果を示す。この効果は、抗ＣＤ７３抗体を用いた処置の経過中に腫瘍組織において観察することができる濃度範囲に対応する、抗ＣＤ７３抗体が準最適に活性である濃度で特に強力であった。
【０３３０】
ＣＤ３９およびＣＤ７３の遺伝子発現の試験を、３３種のがんにおける重要なゲノム変化の多次元マップに基づいて、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅと、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅとの共同研究）を使用して実行した。疾患ステージおよび時間を考慮して、発現レベル（高い、または低いとして示される）を考えた。それぞれのがん、およびそれぞれの遺伝子（ＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１およびＣＤ７３／ＮＴ５Ｅ）について、Ｃｏｘ回帰のｐ値に従って、患者を２群（高いおよび低い遺伝子発現）に分割した（それぞれの群は少なくとも１０％の患者を含有する必要がある）。生存確率曲線を、それぞれの２群について描いた。ＣＤ３９低発現と高発現との統計的生存差を卵巣がんおよび胃腺癌試料について観察したところ、ＣＤ３９高発現がより低い生存を示した。食道扁平上皮癌および肺扁平上皮癌試料についても傾向を観察した。ヒトがん（それぞれ、図１３Ａ、ＢおよびＣにおける卵巣、食道および胃がん）におけるＣＤ３９低発現はより高い生存確率と相関するが、ＣＤ７３高発現はより低い生存確率と相関する（卵巣、食道および胃がん）ことを示す結果を、図１３Ａ〜Ｃに示す。
【０３３１】
本明細書で引用された刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、本明細書の他の箇所で為された特定の文献の別々に提供された組込みに関係なく、その全体が、およびそれぞれの参考文献が参照により組み込まれると個別に、かつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されたのと同程度に（法律によって許容される最大程度に）、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３２】
別途記述しない限り、本明細書で提供される全ての厳密値は、対応する近似値を代表する（例えば、特定の因子または測定値に関して提供される全ての厳密値は、必要に応じて、「約」で改変された、対応する近似測定も提供すると考えることができる）。「約」が数に関連して使用される場合、これを、特定の数の±１０％に対応する値を含むものとして特定することができる。
【０３３３】
ある要素または複数の要素に関して「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施形態の本明細書における記載は、別途記述されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、その特定の要素または複数の要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「を実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本発明の類似する態様または実施形態について支持を提供することが意図される（例えば、特定の要素を含むと本明細書で記載された組成物は、別途記述しない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、その要素からなる組成物も記載すると理解されるべきである）。
【０３３４】
本明細書で提供される任意かつ全ての例、または例を表す言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明の理解をより容易にすることを意図するものであり、別途特許請求されない限り、本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書における言語は、本発明の実施にとって必須であるものとして特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【図１】
2020536109.tif 000040
【図２Ａ】
2020536109.tif 000041
【図２Ｂ】
2020536109.tif 000042
【図３Ａ】
2020536109.tif 000043
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020536109.tif 000049
【図９】
2020536109.tif 000050
【図１０】
2020536109.tif 000051
【図１１】
2020536109.tif 000052
【図１２Ａ】
2020536109.tif 000053
【図１２Ｂ】
2020536109.tif 000054
【図１３Ａ】
2020536109.tif 000055
【図１３Ｂ】
2020536109.tif 000056
【図１３Ｃ】
2020536109.tif 000057
【配列表】
2020536109000001.app
【国際調査報告】
2020536109.tif 000058
2020536109.tif 000059
2020536109.tif 000060
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