(57)【要約】  本開示は、ポリペプチド複合体の第一の抗原結合部分と、第二の抗原結合部分を含む二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体、二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体を作製する方法、二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体を用いた疾患または障害を治療する方法、二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体を含む組成物および医薬組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第二の抗原結合部分に会合した第一の抗原結合部分を含む二重特異性ポリペプチド複合体であって、
前記第一の抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端に、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に動作可能に結合された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、および
Ｎ末端からＣ末端に、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に動作可能に結合された第一の抗体の第一の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、
ここで、Ｃ１は、配列番号１を含む操作されたＣβを含み、Ｃ２は、配列番号２を含む操作されたＣαを含み、
配列番号１のアミノ酸Ｃ４８と配列番号２のアミノ酸Ｃ４１は、非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、
Ｃ１とＣ２は二量体を形成することができ、前記非天然の鎖間ジスルフィド結合は前記二量体を安定させることができ、そして
前記第二の抗原結合部分は、
抗体重鎖ＣＨ１ドメインに動作可能に結合された第二の抗体の第二のＶＨ、および
抗体軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに動作可能に結合された第二の抗体の第二のＶＬを含み、
ここで、前記第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分の一方は抗ＣＤ３結合部分であり、他方は抗ＣＤ１９結合部分であり、
前記抗ＣＤ３結合部分は抗ＣＤ３抗体に由来し、前記抗ＣＤ３抗体は、
ａ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、ｂ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ２、ｃ）配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ３、ｄ）配列番号６を含むκ軽鎖ＣＤＲ１、ｅ）配列番号７を含むκ軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８を含むκ軽鎖ＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＤ１９結合部分は抗ＣＤ１９抗体に由来し、前記抗ＣＤ１９抗体は、
ａ）配列番号９を含む重鎖ＣＤＲ１、ｂ）配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ２、ｃ）配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ３、ｄ）配列番号１２を含むκ軽鎖ＣＤＲ１、ｅ）配列番号１３を含むκ軽鎖ＣＤＲ２、およびｆ）配列番号１４を含むκ軽鎖ＣＤＲ３を含み、そして
前記第一の抗原結合部分と前記第二の抗原結合部分の誤対合は、前記第一の抗原結合部分と前記第二の抗原結合部分の両方が天然のＦａｂの対部分である場合に起こる可能性よりも少ない、
二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項２】
前記抗ＣＤ３結合部分は、配列番号１５を含む重鎖可変領域配列と、配列番号１７を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項３】
前記抗ＣＤ１９結合部分は、配列番号１９を含む重鎖可変領域配列と、配列番号２１を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項４】
前記第一のＶＨは、第一の結合ドメインでＣ１に動作可能に結合され、かつ
前記第一のＶＬは、第二の結合ドメインでＣ２に動作可能に結合される、請求項１〜３の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項５】
前記第一の結合ドメインは配列番号２３を含むか、もしくは配列番号２３であり、かつ／または、前記第二の結合ドメインは配列番号２４を含むか、もしくは配列番号２４である、請求項４に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項６】
前記第一の抗原結合部分は第一の二量体化ドメインに結合され、前記第二の抗原結合部分は第二の二量体化ドメインに結合され、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは会合している、請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項７】
前記会合は結合部、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩架橋、疎水性親水性相互作用、またはこれらの組み合わせによる、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項８】
前記第一の二量体化ドメインおよび／または前記第二の二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部を含み、前記抗体ヒンジ領域は、任意によりＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来する、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項９】
前記第一の二量体化ドメインおよび／または前記第二の二量体化ドメインは、抗体ＣＨ２ドメインおよび／または抗体ＣＨ３ドメインを含む、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１０】
前記第一の二量体化ドメインは、第三の結合ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に動作可能に結合される、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１１】
前記第三の結合ドメインは配列番号２５を含む、請求項１０に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１２】
前記第二の二量体化ドメインは、前記第二の抗原結合部分の重鎖可変領域に動作可能に結合される、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１３】
前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは、異なっており、ホモ二量体化を妨げる、かつ／またはヘテロ二量体化を促進するように会合している、 請求項６〜１２の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１４】
前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは、ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または高められた柔軟性により会合してヘテロ二量体を形成することができる、請求項１３に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１５】
前記二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９という４つのポリペプチド配列の組み合わせを含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１６】
前記二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３０という４つのポリペプチド配列の組み合わせを含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体。
【請求項１７】
ある部分に接合した請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体を含む接合体。
【請求項１８】
請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、単離ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項１９に記載の単離ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
前記二重特異性ポリペプチド複合体が発現する条件で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体を発現させる方法。
【請求項２２】
二重特異性ポリペプチド複合体を作製する方法であって、
ａ）請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること、および
ｂ）前記宿主細胞に前記二重特異性ポリペプチド複合体を発現させること、を含む方法。
【請求項２３】
前記二重特異性ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体を含む組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
ＣＤ１９に関連した疾患または状態の治療を必要とする対象において、前記疾患または状態を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記疾患または状態は癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌はリンパ腫、肺癌、肝臓癌、頸部癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、メラノーマ、膠芽細胞腫、前立腺癌、食道癌、または胃癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患または状態はＢ細胞リンパ腫であり、任意によりホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫であり、ここで、前記非ホジキンリンパ腫は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺＬ）、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球リンパ腫（慢性リンパ性白血病、ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、またはヴァルデンストレームマクログロブリン血症（Waldenstrom's Macroglobulinemia）（ＷＭ）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１６の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド複合体を含むキット。
【請求項３１】
前記キットはＣＤ１９に関連した疾患または状態の検出、診断、予後、または治療に用いられる、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年９月２２日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１０３０３２の優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は、一般に、ＴＣＲ定常領域に融合した抗体可変領域を含む二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
二重特異性抗体は、新たなカテゴリーの治療用抗体となりつつある。これらは、異なる２つの標的または１つの標的表面の異なる２つのエピトープに結合して、個々の抗体の効果よりも優れた相加効果または相乗効果を生み出すことができる。ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＢｉＴＥなどの新規な二重特異性の形式を設計するのに抗体操作という多大な労力が注がれている(Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp.95-106 (2015))。しかしながら、現在、これら形式は安定性、溶解性、短い半減期、および免疫原性に様々な制限がある場合がある。
【０００４】
これらの二重特異性抗体形式の中でも、ＩｇＧ様二重特異性抗体は、一方の腕で標的Ａに結合し、他方の腕で標的Ｂに結合するのが一般的な形式である。構造的には天然のＩｇＧと同様の大きさと形状を持っているが、半分が抗体Ａ、半分が抗体Ｂで作られている。下方調節の進行を容易にするため、そのような二重特異性分子を通常のＩｇＧと同様に単一宿主細胞から高い発現量と正しい会合形態を持って容易に作製することができることが望ましい。しかしながら、同源の軽鎖・重鎖対合と２つの異なる半抗体の会合体を自動制御することができない。あらゆる種類の無作為な誤対合の結果、生成物が有意に不均一になることがある。
【０００５】
Ｆｃ領域に「ノブ・イントゥ・ホール(knobs-into-holes)」(Ridgway et al., Protein Engineering, 9(7), pp.617-21(1996); Merchant et al., Nature Biotechnology, 16(7), pp.677-681(1998))、 静電法 (Gunasekaran et al., Journal of Biological Chemistry, 285(25), pp.19637-19646 (2010))、あるいは陰性状態設計(Kreudenstein et al., mAbs, 5(5), pp.646-654 (2013); Leaver-Fay et al., Structure, 24(4), pp.641-651 (2016))などの突然変異を導入することにより、２つの異なる重鎖の好ましいヘテロ二量体会合体が得られた。しかしながら、それぞれ個々の抗体の軽鎖・重鎖の選択的対合はいまだに難題である。軽鎖と重鎖の界面（interface）は、可変領域（ＶＨ−ＶＬ）と定常領域（ＣＨ１−ＣＬ）を含む。同源の対合を促進するために、いくつかの方法が直交界面の設計に適用された。Rocheは、ＣＨ１とＣＬのドメインを交換して、CrossMabプラットフォームを作製した(Schaefer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(27), pp.11187-11192 (2011)), MedImmuneは代替的にジスルフィド結合を導入した (Mazor et al., mAbs, 7(2), pp.377-389 (2015))。AmgenはさらにＣＨ１−ＣＬ領域に静電気を起こして(Liu et al., Journal of Biological Chemistry, 290(12), pp.7535?7562 (2015)), そしてLilly (Lewis et al., Nature Biotechnology, 32(2), pp.191-198 (2014))及びGenentech (Dillon et al., mAbs, 9(2), pp.213-230 (2017))は、可変領域と定常領域の両方に突然変異を導入した。
【０００６】
ヒトＣＤ１９は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質である(Carter et al., Curr Dir Autoimmun, 7:4-32 (2004))。ヒトＣＤ１９はほとんどのＢ細胞表面で発現するが、血漿細胞、幹細胞、または正常な骨髄系統の表面では検出されない(Tedder, Nat Rev Rheumatol, 5(10):572-577 (2009))。ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）依存シグナル伝達およびＢ細胞受容体独立シグナル伝達の両方を調節することにより本来のＢ細胞シグナル伝達閾値を確定することに大きく関与する(Wang et al., Experimental Hematology & Oncology, 1:36 (2012))。ＣＤ１９はＣＤ２０よりも幅広く発現する。ＣＤ１９の発現パターンは、遅発性から攻撃性の形態を持つ亜種のＢ細胞リンパ腫すべてを含むＢ細胞悪性腫瘍、並びにＢ細胞慢性リンパ性白血病、および非Ｔ細胞型急性リンパ芽球性白血病に維持され、リツキシマブでは標的できない急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）などの初期Ｂ細胞の腫瘍標識を標的することができる。リンパ腫治療について数種のＣＤ１９モノクローナル抗体が検討されている（米国特許出願公開第20140072587A1号、米国特許第8,242,252B2号、および米国特許第8,097,703B2号）。
【０００７】
ＣＤ３  Ｔ細胞共受容体は、１つのＣＤ３γ鎖、１つのＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖という４つの個別の分子鎖からなるタンパク質複合体である。これら４つの分子鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子とζ鎖に会合してＴリンパ球内の活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子はＴＣＲ複合体を構成し、サブユニットとしてのＴＣＲは抗原を認識して結合し、下位単位としてのＣＤ３は抗原刺激をシグナル伝達経路に伝達して最終的にＴ細胞活性を調節する。ＣＤ３タンパク質は、実質すべてのＴ細胞に存在する。ＣＤ３−ＴＣＲ複合体は、自然免疫応答および適応免疫応答の両方においてＴ細胞機能を調節し、また細胞性免疫機能および液性免疫機能をも調節する。これらは、病原体生物を排除すること、および広範囲の細胞毒性効果により腫瘍増殖を制御することを含む。ヒトＣＤ３に特異的なマウスモノクローナル抗体、例えばＯＫＴ３(Kung et al., Science, 206: 347-9 (1979))は治療用に開発された第一世代のＣＤ３抗体であった。ＯＫＴ３は強い免疫抑制能を持っていたが、臨床での使用はその免疫原性と有糸分裂の可能性に関連した深刻な副作用により妨げられた(Chatenoud, Nature Reviews, 3:123-132 (2003))。ＯＫＴ３は抗グロブリン応答を誘導して、それ自体の素早い排除と中和を促進した(Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 137:830-8 (1982))。また、ＯＫＴ３はインビトロでのＴ細胞増殖とサイトカイン生成を誘導し、インビボでは多量のサイトカイン放出につながった(Hirsch et al., J. Immunol, 142: 737-43 (1989))。このような深刻な副作用により、移植でＯＫＴ３の使用をより普及させること、また自己免疫など他の臨床分野にその使用を拡大することが制限された。
【０００８】
ＣＤ３およびＣＤ１９を標的する二重特異性抗体は、同時にＴ細胞とＢ細胞に結合することができる。この二重特異性抗体がＣＤ３陽性Ｔ細胞とＣＤ１９陽性Ｂ細胞にひとたび結合すると、細胞溶解シナプスが形成される。次いで、細胞毒性Ｔ細胞の顆粒からパーフォリンとグランザイムの放出により細胞毒性が誘導される。後者は、悪性Ｂ細胞のアポトーシスと溶解を誘導する。
【０００９】
望ましい発現量とインビボでの半減期を有するＣＤ３とＣＤ１９に対する二重特異性分子を設計する必要性が高まっている。そのような二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体は癌を含むＣＤ１９に関連した疾患に対して有用である。
【発明の概要】
【００１０】
一態様では、本開示は、第二の抗原結合部分に会合した第一の抗原結合部分を含む二重特異性ポリペプチド複合体を提供する。前記二重特異性ポリペプチド複合体において、
前記第一の抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端に、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に動作可能に結合する第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含む第一のポリペプチド、および
Ｎ末端からＣ末端に、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に動作可能に結合する第一の抗体の第一の軽鎖可変領域（ＶＬ１）を含む第二のポリペプチドを含み、
ここで、Ｃ１は配列番号１を含む操作されたＣβを含み、Ｃ２は配列番号２を含む操作されたＣαを含み、
配列番号１のアミノ酸Ｃ４８と配列番号２のアミノ酸Ｃ４１は、非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、
Ｃ１とＣ２は二量体を形成することができ、前記非天然の鎖間ジスルフィド結合は前記二量体を安定させることができ、そして
前記第二の抗原結合部分は、
抗体重鎖ＣＨ１ドメインに動作可能に結合する第二の抗体の第二の重鎖可変領域（ＶＨ２）、および
抗体軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに動作可能に結合する前記第二の抗体の第二の軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含み、
ここで、前記第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分の一方は抗ＣＤ３結合部分であり、他方は抗ＣＤ１９結合部分であり、
前記抗ＣＤ３結合部分は抗ＣＤ３抗体に由来し、前記抗ＣＤ３抗体は、
ａ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、ｂ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ２、ｃ）配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ３、ｄ）配列番号６を含むκ軽鎖ＣＤＲ１、ｅ）配列番号７を含むκ軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８を含むκ軽鎖ＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＤ１９結合部分は抗ＣＤ１９抗体に由来し、前記抗ＣＤ１９抗体は、
ａ）配列番号９を含む重鎖ＣＤＲ１、ｂ）配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ２、ｃ）配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ３、ｄ）配列番号１２を含むκ軽鎖ＣＤＲ１、ｅ）配列番号１３を含むκ軽鎖ＣＤＲ２、およびｆ）配列番号１４を含むκ軽鎖ＣＤＲ３を含み、そして
前記第一の抗原結合部分と前記第二の抗原結合部分の誤対合は、前記第一の抗原結合部分と前記第二の抗原結合部分の両方が天然のＦａｂの対部分である場合に起こる可能性よりも少ない。
【００１１】
特定の実施形態では、前記二重特異性ポリペプチド複合体の抗ＣＤ３結合部分は、配列番号１５を含む重鎖可変領域配列と配列番号１７を含む軽鎖可変領域配列を含む抗ＣＤ３抗体に由来する。
【００１２】
特定の実施形態では、前記二重特異性ポリペプチド複合体の抗ＣＤ１９結合部分は、配列番号１９を含む重鎖可変領域配列と配列番号２１を含む軽鎖可変領域配列を含む抗ＣＤ１９抗体に由来する。
【００１３】
特定の実施形態では、前記二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９という４つのポリペプチド配列の組み合わせを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、前記二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３０という４つのポリペプチド配列の組み合わせを含む。
【００１５】
一態様では、本開示は、ある部分に接合した本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含む接合体を提供する。
【００１６】
一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
一態様では、本開示は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む単離ベクターを提供する。
【００１８】
一態様では、本開示は、本明細書で提供される単離ポリヌクレオチドまたは本明細書で提供される単離ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１９】
一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を発現させる方法を提供する。前記方法は、前記二重特異性ポリペプチド複合体が発現する条件で本明細書で提供される宿主細胞を培養することを含む。
【００２０】
一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含む組成物を提供する。
【００２１】
一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
一態様では、本開示は、ＣＤ１９に関連した疾患または状態の治療を必要とする対象において、前記疾患または状態を治療する方法を提供する。前記方法は、治療有効量の本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を前記対象に投与することを含む。特定の実施形態では、第一の抗原と第二の抗原の両方が調節されると前記疾患または状態を軽減、除去、治療、または予防することができる。
【００２３】
特定の実施形態では、第一のＶＨは、抗体Ｖ／Ｃ結合のＣ末端断片を含み、かつ配列番号２３のアミノ酸配列(LEDLKNVFPP)を有する第一の結合ドメインでＣβに動作可能に結合し、第一のＶＬは、TCR V/C結合のＮ末端断片を含み、かつ配列番号２４のアミノ酸配列(KPDIQNPDP)を有する第二の結合ドメインでＣαに動作可能に結合する。
【００２４】
特定の実施形態では、前記第一の抗原結合部分は第一の二量体化ドメインに結合し、前記第二の抗原結合部分は第二の二量体化ドメインに結合し、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは会合している。特定の実施形態では、前記会合は、結合部、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩架橋、疎水性−親水性相互作用、またはこれらの組み合わせによる。
【００２５】
特定の実施形態では、前記第一の二量体化ドメインおよび／または前記第二の二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部を含み、前記抗体ヒンジ領域は、任意によりＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来する。
【００２６】
特定の実施形態では、Ｃ１は操作されたＣβを含み、前記第一の二量体化ドメインは、配列番号２５ (YGPPCPPCPAPEFLGGP)を含む第三の結合ドメインで前記操作されたＣβに動作可能に結合される。
【００２７】
特定の実施形態では、前記第二の二量体化ドメインは、前記第二の抗原結合部分の重鎖可変領域に動作可能に結合される。
【００２８】
特定の実施形態では、前記前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは異なり、ホモ二量体化を妨げる、かつ／またはヘテロ二量体化を促進するように会合している。
【００２９】
特定の実施形態では、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは、「ノブ・イントゥ・ホール」、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または高められた柔軟性により会合してヘテロ二量体を形成することができる。
【００３０】
他の態様では、本開示は、疾患または状態の検出、診断、予後、または治療のための本明細書で提供されるポリペプチド複合体を含むキットを提供する。
【００３１】
本発明の上記の特徴および他の特徴、並びに利点は、以下に示すいくつかの実施形態の詳細な記述からさらに明らかになる。以下の記述は、添付の図面を参照しつつ行う。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、試験した抗体形式の概略図を示す。抗ＣＤ３抗体Ｔ３と抗ＣＤ１９抗体Ｕ４の両方を開発した。Ｔ３の定常領域（ＣＬおよびＣＨ１）をＴＣＲの定常領域で置換して、通常の抗体に直交する固有の軽鎖−重鎖界面を設計した。Ｆｃドメインの「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異と結合したＴＣＲ改変Ｔ３と天然のＵ４を用いて二重特異性抗体形式Ｅ１７とＦ１６を設計した。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｄは、抗体ＦｖとＴＣＲ定常領域を融合する経路を提供する抗体ＦｖモデルとＴＣＲ構造を重ね合わせた図を示す。図２Ａは、研究室で開発した抗ＣＤ３抗体Ｔ３の配列に基づいて構築された抗体Ｆｖ構造モデルを示す。図２Ｂは、PDB 4L4Tに由来するＴＣＲ構造を示す。図２Ｃは、ＴＣＲ可変領域に重ね合わせた抗体Ｆｖ構造モデルを異なる方向から示す。図２Ｄに示すように、重ね合わせた図のＴＣＲ可変領域を除去することにより粗キメラタンパク質を作製する。結合領域の重なっている残基により結合領域の設計が補助された。抗体ＶＬ鎖とＴＣＲα鎖は白色で示した。ＶＨとβ鎖は黒色で示した。
【図３Ａ】図３Ａは、天然のＴＣＲα鎖の配列と、突然変異させたシステイン残基を持つ対応する配列を示す。TRAC_Humanは、α鎖定常領域の天然の配列である。4L4T_Alpha_Crystalは、鎖間ジスルフィド結合を形成することができるＳ５５Ｃ突然変異を持つ結晶構造の配列（ＰＤＢコード４Ｌ４Ｔ）である。灰色の領域は、本発明のキメラタンパク質の主鎖として用いられる定常領域である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、天然のＴＣＲβ鎖の配列と突然変異させたシステイン残基を持つ対応する配列を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ、図４Ｂは、Ｎ−グリコシル化を除去したＴＣＲのＣα定常領域とＣβ定常領域の配列および番号を示す。図４Ａは、ＴＣＲのα定常領域の配列および番号を示す。図４Ｂは、ＴＣＲのβ定常領域の配列および番号を示す。
【図５】図５は、カニクイザルＣＤ１９形質導入細胞株WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9とCHO-K1親細胞株のフローサイトメトリーによるヒストグラムを示す。
【図６】図６は、W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPのSDS-PAGEを示す。M：タンパク質マーカー；帯１：W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP、非還元；帯３：W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP、還元。
【図７】図７は、W3438-T3U4.F16-1.uIgG4のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのSDS-PAGEを示す。Ｍ：タンパク質マーカー；帯１：W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP、非還元；帯２：W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP、還元。
【図９】図９は、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SＰのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｂは、ＦＡＣＳによるW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＲａｍｏｓ細胞（図１０Ａ）とＪｕｒｋａｔ細胞（図１０Ｂ）の結合を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｂは、ＦＡＣＳによるW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPのＲａｍｏｓ細胞（図１１Ａ）とＪｕｒｋａｔ細胞（図１１Ｂ）の結合を示す。
【図１２】図１２は、ＦＡＣＳによるW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのカニクイザルＣＤ１９発現細胞との結合を示したものである。
【図１３】図１３は、ＥＬＩＳＡによるW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのカニクイザルＣＤ３への結合を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、Ｒａｍｏｓ細胞（図１４Ａ）とＪｕｒｋａｔ細胞（図１４Ｂ）の結合により測定されたW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのヒトＣＤ１９およびＣＤ３との親和性を示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂは、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＣＤ１９およびＣＤ３（図１５Ａ）、ならびにW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの陰性対照（図１５Ｂ）との二重結合を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜図１６Ｂは、Ｒａｊｉ細胞表面のW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの細胞毒性活性（図１６Ａ）とＲａｊｉ細胞表面のW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの細胞毒性活性（図１６Ｂ）を示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａ〜図１７Ｄは、ＣＤ１９+標的細胞の存在／非存在下でのＴ細胞表面のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す。ＣＤ４+Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ６９発現Ｔ細胞の百分率（図１７Ａ）；ＣＤ８+Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ６９+発現Ｔ細胞の百分率（図１７Ｂ）；
【図１７Ｃ−１７Ｄ】ＣＤ４+Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５発現Ｔ細胞の百分率（図１７Ｃ）；ＣＤ８+Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５発現Ｔ細胞の百分率（図１７Ｄ）。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ〜図１８Ｄは、ＣＤ１９+標的細胞の存在／非存在下でのＴ細胞のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αサイトカイン放出を示す。ＣＤ４+Ｔ細胞サブセットにおけるＩＦＮ−γの放出（図１８Ａ）；ＣＤ４+Ｔ細胞サブセットにおけるＴＮＦ−αの放出（図１８Ｂ）；
【図１８Ｃ−１８Ｄ】ＣＤ８+Ｔ細胞サブセットにおけるＩＦＮ−γの放出（図１８Ｃ）；ＣＤ８+Ｔ細胞サブセットにおけるＴＮＦ−αの放出（図１８Ｄ）。
【図１９Ａ−１９Ｂ】図１９Ａ〜図１９Ｂは、ヒト血清中でのW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの安定性を示す。示した日における血清インキュベートW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP試料のＲａｍｏｓ細胞との結合（図１９Ａ）；示した日における血清インキュベートW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP試料のＪｕｒｋａｔとの結合（図１９Ｂ）。
【図２０】図２０は、ＥＬＩＳＡによるW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＣ１Ｑに対する結合を示す。ＩｇＧ１抗体をアッセイ対照として用いた。
【図２１】図２１は、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPを異なる投与量でＲａｊｉ異種移植片腫瘍を持つ混合ＰＢＭＣヒト化マウスに投与した後の腫瘍容積のグラフを示す。データ点は群の平均を示し、誤差範囲は平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。無関係のＩｇＧ４抗体を陰性対照として用いた。
【図２２】図２２は、１ｍｇ／ｋｇの単回投与後におけるカニクイザル血清中のW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP濃度を示す。２匹のサルに由来する血清試料をＥＬＩＳＡにより検出した。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ〜図２３Ｂは、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの投与前後を含むサル＃１に由来する血清試料（図２３Ａ）およびサル＃２に由来する血清試料（図２３Ｂ）中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示の以下の記載は、本開示の様々な実施形態を例示することのみを意図している。
【００３４】
定義
【００３５】
本明細書で用いられる冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つ以上（すなわち少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語を指すのに用いられる。例えば、「a polypeptide complex」は１つのポリペプチド複合体または２つ以上のポリペプチド複合体を意味する。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「約」または「ほぼ」は、ある量、レベル、値、数、周波数、百分率、寸法、大きさ、量、重量、または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％変動するような量、レベル、値、数、周波数、百分率、寸法、大きさ、量、重量、または長さを指す。特定の実施形態では、用語「約」または「ほぼ」が数値の前にある場合は、その数値プラスまたはマイナス１５％、１０％、５％、または１％の範囲を指す。
【００３７】
本開示を通して、特に文脈で必要とされない限り、用語「含む」、「含み」、および「含んでいる」は、記述された工程または要素あるいは工程または要素の群を含むことを含意するが、任意の他の工程または要素あるいは工程または要素の群を排除しないものと理解される。「からなる」は、「からなる」という表現の後に何が続こうとそれを含みかつそれに限定されることを意味する。従って、用語「からなる」は、列挙した要素が必要または必須であり、他の要素は存在していないことを示す。「から本質的になる」は、その表現の後に列挙された任意の要素を含み、列挙した要素について本開示で指定された活性または作用を阻害しない、あるいはそれらに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、用語「から本質的になる」は、列挙した要素が必要または必須であるが、他の要素は任意であり、列挙した要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
【００３８】
本開示を通して、「一実施形態」、「一実施の形態」、「一特定の実施形態」、「関連する一実施形態」、「特定の一実施形態」、「追加の一実施形態」、「さらなる実施形態」、あるいはこれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書を通して様々な箇所で上記の表現が現れた場合、必ずしもすべて同じ実施形態を指すわけではない。さらに、これらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態で任意の好適なやり方で組み合わせてもよい。
【００３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書では互いに言い換え可能であり、アミノ酸残基の重合体、アミノ酸残基の複数の重合体の会合体を指す。この用語は、１種以上のアミノ酸残基が対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸重合体、天然起源のアミノ酸重合体、および非天然のアミノ酸重合体にあてはまる。用語「アミノ酸」は、天然起源のアミノ酸、合成アミノ酸、および天然起源のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類縁体とアミノ酸模倣物を指す。天然起源のアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、およびアミノ酸が後に修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類縁体は天然起源のアミノ酸と同じ化学的基本構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を持つ化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類縁体は修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を持つが、天然起源のアミノ酸と同じ化学的基本構造を保持している。α炭素は、カルボニルなどの官能基に結合する１つ目の炭素原子を指す。β炭素は、２つ目のα炭素に結合した炭素原子を指し、この命名体系では続けてギリシャ文字のアルファベット順に炭素を命名する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つが、天然起源のアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。用語「タンパク質」は、典型的には大きいポリペプチドを指す。用語「ペプチド」は、典型的には短いポリペプチドを指す。ポリペプチド配列は、通常ポリペプチド配列の左側をアミノ末端（Ｎ末端）、ポリペプチド配列の右側をカルボキシル末端（Ｃ末端）と記載している。本明細書で用いられるように「ポリペプチド複合体」は、会合して特定の機能を行う１種以上のポリペプチドを含む複合体を指す。特定の実施形態では、ポリペプチドは免疫に関連する。
【００４０】
本明細書で用いられるように用語「抗体」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、多重特異性抗体、または二重特異性（２価の）抗体を包含する。天然の完全な抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域（「ＨＣＶＲ」）と第一、第二、および第三の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなり、各軽鎖は、可変領域（「ＬＣＶＲ」）と定常領域（ＣＬ）からなる。哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ、およびμに分類され、哺乳類の軽鎖はλまたはκに分類される。抗体は「Ｙ」形状を有し、２つの重鎖の第二および第三の定常領域からなるＹの柄はジスルフィド結合により互いに結合している。Ｙの各腕は、単一の軽鎖の可変領域と定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域と第一の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。これら両方の鎖の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変性ループ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ）を含む。抗体のＣＤＲ境界は、Kabat、Chothia、またはAl-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28; 342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))の規約により規定または同定されてもよい。これら３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接部分に挟まれている。フレームワーク領域は、ＣＤＲよりもよく保存されており、超可変ループを支える足場材料を形成している。それぞれのＨＣＶＲとＬＣＶＲは、４つのＦＲを含み、ＣＤＲとＦＲはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている。重鎖と軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要クラス、すなわちアイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それぞれα、δ、ε、γ、およびμ重鎖の存在により特徴づけられる。主要な抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。
【００４１】
本明細書で用いられるように、抗体に関する用語「可変領域」は、１つ以上のＣＤＲを含む抗体可変領域またはその断片を指す。可変領域は完全な可変領域（ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ）を含んでいてもよいが、完全な可変領域よりも短いが抗原との結合能あるいは抗原結合部位形成能を保持しえている可能性もある。
【００４２】
本明細書で用いられるように用語「抗原結合部分」は、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部、または抗原に結合するが完全な天然の抗体構造を含まない任意の他の抗体断片から形成された抗体断片を指す。抗原結合部分の例としては、これらに限定されないが、可変ドメイン、可変領域、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）2、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化二重特異性抗体（ｄｓ二重特異性抗体）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および２価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合部分は、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態では、抗原結合部分は、１種以上の異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域にグラフトされる特定のヒト抗体に由来する１つ以上のＣＤＲを含んでいてもよい。抗原結合部分のより詳細な形式については、Spiess et al, 2015 (Supra), and Brinkman et al., mAbs, 9(2), pp.182-212 (2017)に記載されており、これらの全内容を引用により本明細書に組み込む。
【００４３】
抗体に関して「Ｆａｂ」は、可変領域および単一の重鎖の第一の定常領域にジスルフィド結合によりに会合する単一の軽鎖（可変領域と定常領域の両方）からなる抗体の部分を指す。特定の実施形態では、軽鎖および重鎖の両方の定常領域はＴＣＲ定常領域により置換されている。
【００４４】
「Ｆａｂ’」は、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を指す。
【００４５】
「Ｆ（ａｂ’）2」はＦａｂ’の二量体を指す。
【００４６】
抗体に関して「フラグメント・ディフィカルト（fragment difficult、Ｆｄ）」は、軽鎖と結合してＦａｂを形成することができる重鎖断片のアミノ末端の半分を指す。
【００４７】
抗体に関して「Ｆｃ」は、ジスルフィド結合を介して第二の重鎖の第二および第三の定常領域に結合した第一の重鎖の第二の定常領域（ＣＨ２）と第三の（ＣＨ３）定常領域からなる抗体の部分を指す。抗体のＦｃ部分は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの様々なエフェクター機能に関与するが抗原結合には機能しない。
【００４８】
抗体に関して「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合させる重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５個のアミノ酸残基を含み、柔軟性があるので、２つのＮ末端抗原結合領域は独立して動くことができる。
【００４９】
本明細書で用いられるように「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、従来の付番スキーム（アミノ酸２４４〜３６０、Kabat付番システム；およびアミノ酸２３１〜３４０、EU付番システム；Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)を参照のこと）による、ＩｇＧ抗体のおおよそアミノ酸２４４〜アミノ酸３６０にある重鎖分子の部分を含む。
【００５０】
「ＣＨ３ドメイン」は、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端に延び、約１０８個のアミノ酸を含む。ある免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＭはＣＨ４領域をさらに含む。
【００５１】
抗体に関して「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を担持する抗体の最も小さい断片を指す。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。ｄｓＦｖを含む複数のＦｖ設計が提供されている。これらの設計では、導入されたジスルフィド結合により２つのドメイン間の会合が高められており、ペプチドリンカーを用いてｓｃＦｖを形成して２つのドメインを単一のポリペプチドとして結合させてもよい。対応する免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域と定常領域に会合した免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変領域を含むＦｖ構築物が作製されている。また、Ｆｖを多量化して、二重特異性抗体や三重特異性抗体が形成されている(Maynard et al., Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000))。
【００５２】
「ＳｃＦａｂ」は、ポリペプチドリンカーを介して軽鎖に結合させたＦｄを有する融合ポリペプチドを指す。これにより、単一鎖Ｆａｂ断片（ｓｃＦａｂ）が形成される。
【００５３】
「ＴｒｉＦａｂ」は、Ｆａｂ機能を持つ３つのユニットからなる３価の二重特異性融合タンパク質を指す。ＴｒｉＦａｂは、非対称のＦａｂ様部分に融合する２つの通常のＦａｂを有する。
【００５４】
「Ｆａｂ−Ｆａｂ」は、第一のＦａｂの腕のＦｄ鎖を第二のＦａｂの腕のＦｄ鎖のＮ末端に融合させることにより形成された融合タンパク質を指す。
【００５５】
「Ｆａｂ−Ｆｖ」は、ＨＣＶＲをＦｄ鎖のＣ末端に融合し、ＬＣＶＲを軽鎖のＣ末端に融合することにより形成された融合タンパク質を指す。「Ｆａｂ−ｄｓＦｖ」分子は、ＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインにドメイン間ジスルフィド結合を導入することで形成されてもよい。
【００５６】
「ＭＡｂ−Ｆｖ」または「ＩｇＧ−Ｆｖ」は、１つのＦｃ鎖のＣ末端と個別に発現させたか、あるいはもう一方のＣ末端に融合させたＬＣＶＲドメインにＨＣＶＲドメインを融合させて、ドメイン間ジスルフィド結合によって安定させたＦｖを有する３価の二重特異性ＩｇＧ−Ｆｖ（ｍＡｂ−Ｆｖ）融合タンパク質を得ることで形成された融合タンパク質を指す。
【００５７】
「ＳｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ2」および「ＳｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ」は、単一の鎖ＦａｂとＦｃとジスルフィド安定化Ｆｖドメインを融合させて形成された融合タンパク質を指す。
【００５８】
「付加ＩｇＧ（Appended IgG）」は、二重特異性（Ｆａｂ）2−Ｆｃの形式を形成するのにＩｇＧに融合させたＦａｂの腕を有する融合タンパク質を指す。これは、コネクタありまたはなしで、ＩｇＧ分子のＣ末端またはＮ末端に融合させたＦａｂを有する「ＩｇＧ−Ｆａｂ」または「Ｆａｂ−ＩｇＧ」を形成してもよい。特定の実施形態では、付加ＩｇＧは、ＩｇＧ−Ｆａｂ4の形式にさらに改変してもよい(Brinkman et al., 2017（上記参照）を参照のこと）。
【００５９】
「ＤＶＤ−Ｉｇ」は、第二の特異性を持つさらなるＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインを融合させることで形成した二重可変ドメイン抗体を指す。「ＣＯＤＶ−Ｉｇ」は、２つのＨＣＶＲドメインと２つのＬＣＶＲドメインが可変ＨＣＶＲ−ＬＣＶＲドメイン（ＨＣＶＲＡ−ＨＣＶＲＢおよびＬＣＶＲＢ−ＬＣＶＲＡの順、またはＨＣＶＲＢ−ＨＣＶＲＡおよびＬＣＶＲＡ−ＬＣＶＲＢの順の何れかで（Ｎ末端からＣ末端に）配置されている）の交差対合を可能にするような方法で繋がっている関連する形式を指す。
【００６０】
「ＣｒｏｓｓＭａｂ」は、無修飾軽鎖と対応する無修飾重鎖との対合および修飾軽鎖と対応する修飾重鎖との対合により軽鎖の誤対合を低減した抗体を得る技術を指す。
【００６１】
「ＢｉＴＥ」は、二重特異性Ｔ細胞結合分子であり、第二の特異性を有するＨＣＶＲ−ＬＣＶＲ方向の第二のｓｃＦｖに結合させた第一の抗原特異性を有するＬＣＶＲ−ＨＣＶＲ方向の第一のｓｃＦｖを含む。
【００６２】
「ＷｕＸｉＢｏｄｙ」は、抗体の可変領域とＴＣＲの定常領域を有する可溶性キメラタンパク質を含む二重特異性抗体であり、ＴＣＲ定常領域のサブユニット（例えば、αドメインおよびβドメイン）は操作されたジスルフィド結合により繋がっている。
【００６３】
アミノ酸配列（または核酸配列）に関して「百分率（％）配列同一性」は、配列を整列させ、任意によりギャップを導入して最大数の同一アミノ酸（または核酸）を達成した後の基準配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一の候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基の百分率として規定される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基として見なしてもそうでなくてもよい。百分率アミノ酸（または核酸）配列同一性を決定するための配列は、例えば、以下のような公開されているツールを用いて達成されてもよい：BLASTN, BLASTp (U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI)のウエブサイトで入手可能、またAltschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)を参照のこと; Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (European Bioinformatics Instituteのウエブサイトで入手可能、またHiggins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996)を参照のこと; Larkin M.A. et al., Bioinformatics （英国オックスフォード）、23(21): 2947-8 (2007))、およびALIGNまたはMegalign (DNASTAR)ソフトウェア。当業者はツールによって提供されている基準のパラメータを用いてもよく、あるいは例えば、好適なアルゴリズムを選択することにより配列に適切なようにパラメータをカスタマイズしてもよい。
【００６４】
本明細書で用いられるように「抗原」すなわち「Ａｇ」は、細胞培養物または動物において抗体の生成またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または物質を指す。「抗原」は、細胞培養物（例えば、ハイブリドーマ）に加える組成物（例えば、癌特異的タンパク質を含む組成物）あるいは動物に注入または吸収させる組成物を含む。抗原は、異種抗原により誘導されるものを含む特異的な液性免疫または細胞性免疫（例えば、抗体）の生成物と反応する。
【００６５】
「エピトープ」すなわち「抗原決定基」は、結合剤（例えば、抗体）が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、近接するアミノ酸から形成されてもよく（線状または連続エピトープともいう）、あるいはタンパク質の三次折りたたみにより並列している近接しないアミノ酸から形成されてもよい（構成または立体構造エピトープともいう）。近接するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的にはタンパク質表面の一次アミノ酸残基に沿って線状に配置されており、近接するアミノ酸の小分節は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子を有する抗原結合から消化されてもよく、あるいは変性溶媒にさらされた状態で保持されてもよい。一方、三次折りたたみによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理により失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３個、より一般的には、固有の空間高次構造において少なくとも５個、約７個、または約８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子（例えば、抗体と抗原）間の非無作為の結合反応を指す。特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体と二重特異性ポリペプチド複合体は、結合親和性（ＫD）が１０-6Ｍ以下（例えば、５×１０-7Ｍ以下、２×１０-7Ｍ以下、１０-7Ｍ以下、５×１０-8Ｍ以下、２×１０-8Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、５×１０-9Ｍ以下、２×１０-9Ｍ以下、１０-9Ｍ以下、または１０-10Ｍ以下）の抗原と特異的に結合する。本明細書で用いられるように、ＫDは、会合速度に対する解離速度の比（ｋoff／ｋon）を指し、例えば、Biacoreなどの装置を用いた表面プラズモン共鳴法で決定されてもよい。
【００６７】
用語「動作可能に結合（operably link）」または「動作可能に結合された」は、意図したように機能することができる関係にあるような２つ以上の対象とする生物学的配列の、スペーサーまたはリンカー付きまたはなしの並置を指す。ポリペプチドに関して用いる場合、結合した生成物が意図していた生物学的機能を持つようにポリペプチド配列が結合されていることを意味する。例えば、抗原結合活性を持つ安定した生成物を提供するため、抗体可変領域を定常領域に動作可能に結合させてもよい。この用語はまた、ポリヌクレオチドに関しても用いてもよい。一例として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが調節配列（例えば、プロモーター、転写促進因子、サイレンサー配列など）に動作可能に結合されている場合、これらのポリヌクレオチドからのポリペプチドの調節された発現が可能であるようにこれらのポリヌクレオチド配列は結合されていることを意味する。
【００６８】
アミノ酸配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）に関して用いられる場合の用語「融合」または「融合している」は、例えば、化学結合または組み換え手段により天然には存在しない単一のアミノ酸配列に変換される２つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを指す。融合アミノ酸配列は、２つのコードポリヌクレオチド配列の遺伝子組み換えにより産生されてもよく、組み換えポリヌクレオチドを含む構築物を宿主細胞に導入する方法で発現させてもよい。
【００６９】
本明細書に用いられるように、用語「スペーサー」は、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基を有する人工アミノ酸配列を指す。または、ペプチド結合により結合された５〜１５、２０、３０、５０個あるいはそれ以上の長さのアミノ酸残基を用いて１つ以上のポリペプチドを結合する。スペーサーは二次構造を持っていてもいなくてもよい。スペーサー配列は当該分野で知られており、例えば以下を参照のこと：Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)。当該分野で知られている何れの好適なスペーサーを用いてもよい。
【００７０】
用語「抗原特異性」は、抗原結合分子によって選択的に認識される特定の抗原またはエピトープを指す。
【００７１】
本明細書で用いられるように、アミノ酸残基関して用語「置換」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質における１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸との天然起原の置換あるいは誘導された置換を指す。ポリペプチドにおける置換により、ポリペプチドの機能が弱まる、高まる、あるいはなくなることがある。
【００７２】
置換は、また、アミノ酸配列に関して「保存的置換」であってもよい。これは、同様の生理化学特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換すること、あるいはポリペプチドの活性に重要ではないアミノ酸の置換を指す。例えば、非極性側鎖を持つアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）間、帯電してない極性側鎖を持つ残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、およびＧｌｎ）間、酸性の側鎖を持つ残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）間、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）間、β分岐状側鎖を持つアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＩｌｅ）間、硫黄含有側鎖を持つアミノ酸（例えば，ＣｙｓおよびＭｅｔ）間、芳香族側鎖を持つ残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、およびＰｈｅ）間で保存的置換が行われてもよい。特定の実施形態では、置換、欠失、または付加を「保存的置換」と見なしてもよい。挿入または削除されるアミノ酸の数は、約１〜５の範囲であってもよい。保存的置換は、一般的に、タンパク質の高次構造に有意な変化を起こさず、従って、タンパク質の生物学的活性を保持することができる。
【００７３】
本明細書で用いられるように、アミノ酸残基に関して用語「突然変異」または「突然変異した」は、アミノ酸残基の置換、挿入、または付加を指す。
【００７４】
本明細書で用いられるように「Ｔ細胞」は、細胞媒介免疫で重要な役割を果たすリンパ球の種類を指す。これには、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー３型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞）、細胞毒性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８+Ｔ細胞）、メモリーＴ細胞（例えば、中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）、および滞在型メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）（ＣＤ８+またはＣＤ４+の何れか）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、および抑制性Ｔ細胞が含まれる。
【００７５】
天然の「Ｔ細胞受容体」または天然の「ＴＣＲ」は、不変のＣＤ３鎖と会合してシグナル伝達を媒介することができる複合体を形成するヘテロ二量体Ｔ細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、単一の重鎖と単一の軽鎖を持つ半抗体に類似している。天然のＴＣＲは細胞外部分、貫通膜部分、および細胞内部分を持つ。ＴＣＲの細胞外ドメインは、膜近位定常領域と膜遠位可変領域を有する。
【００７６】
本明細書で用いられるように、用語「対象」、「個体」、「動物」、または「患者」は、疾患または障害の診断、予測、緩和、予防および／または治療が必要なヒトまたは非ヒト動物（哺乳類または霊長類を含む）を指す。哺乳類の対象としては、ヒト、家畜動物、農場の動物、動物園の動物、スポーツに使用する動物、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなど）が挙げられる。
【００７７】
二重特異性ポリペプチド複合体
【００７８】
一態様では、本開示は二重特異性ポリペプチド複合体を提供する。本明細書で用いられるように、用語「二重特異性」は、異なる抗原または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる２つの抗原結合部分があることを意味する。本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、第二の抗原結合部分と会合する第一の抗原結合部分を含み、その一方がＣＤ３に特異的に結合し、他方がＣＤ１９に特異的に結合する。換言すると、第一の抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合してもよく、第二の抗原結合部分はＣＤ１９に特異的に結合してもよい。あるいは、第一の抗原結合部分はＣＤ１９に特異的に結合してもよく、第二の抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合してもよい。
【００７９】
特定の実施形態では、本開示は、第二の抗原結合部分と会合した第一の抗原結合部分を含む二重特異性ポリペプチド複合体を提供する。
前記第一の抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端に、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に動作可能に結合する第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含む第一のポリペプチド、および
Ｎ末端からＣ末端に、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に動作可能に結合する第一の抗体の第一の軽鎖可変領域（ＶＬ１）を含む第二のポリペプチドを含み、
ここで、Ｃ１は配列番号１を含む操作されたＣβを含み、Ｃ２は配列番号２を含む操作されたＣαを含み、
配列番号１のアミノ酸Ｃ４８と配列番号２のアミノ酸Ｃ４１は、非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、
Ｃ１とＣ２は二量体を形成することができ、前記非天然の鎖間ジスルフィド結合は前記二量体を安定にすることができ、そして
前記第二の抗原結合部分は、
抗体重鎖ＣＨ１ドメインに動作可能に結合する第二の抗体の第二の重鎖可変領域（ＶＨ２）、および
抗体軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに動作可能に結合する前記第二の抗体の第二の軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含み、
ここで、前記第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分の一方は抗ＣＤ３結合部分であり、他方は抗ＣＤ１９結合部分であり、
前記抗ＣＤ３結合部分は抗ＣＤ３抗体に由来し、前記抗ＣＤ３抗体は、
ａ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、ｂ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ２、ｃ）配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ３、ｄ）配列番号６を含むκ軽鎖ＣＤＲ１、ｅ）配列番号７を含むκ軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８を含むκ軽鎖ＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＤ１９結合部分は抗ＣＤ１９抗体に由来し、前記抗ＣＤ１９抗体は、
ａ）配列番号９を含む重鎖ＣＤＲ１、ｂ）配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ２、ｃ）配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ３、ｄ）配列番号１２を含むκ軽鎖ＣＤＲ１、ｅ）配列番号１３を含むκ軽鎖ＣＤＲ２、およびｆ）配列番号１４を含むκ軽鎖ＣＤＲ３を含み、そして
前記第一の抗原結合部分と前記第二の抗原結合部分の誤対合する可能性は、前記第一の抗原結合部分と前記第二の抗原結合部分の両方が天然のＦａｂの対部分である場合に起こる可能性よりも少ない。
【００８０】
特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ＴＣＲ定常領域に由来する配列を含む第一の抗原結合部分を含むが、第二の抗原結合部分はＴＣＲ定常領域に由来する配列を含まない。
【００８１】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、誤対合した重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可能性が有意に低い。何らかの理論に束縛されるわけではないが、第一の抗原結合部分で安定させたＴＣＲ定常領域は互いに特異的に会合することができ、従って、意図したＶＨ１とＶＬ１の非常に特異的な対合に寄与する一方、意図した抗原結合部位を提供しない他の可変領域とのＶＨ１またはＶＬ１の望ましくない誤対合を妨げると考えられる。
【００８２】
特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は、ＶＨ２に動作可能に結合させた抗体の定常領域ＣＨ１と、ＶＬ２に動作可能に結合させた抗体の軽鎖定常領域をさらに含む。従って、第二の抗原結合部分はＦａｂを含む。
【００８３】
第一、第二、第三、および第四の可変領域（例えば、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ１、およびＶＬ２）が１つの細胞に発現している場合は、得られる二重特異性タンパク質生成物が正しい抗原結合特異性を有するようにＶＨ１がＶＬ１と特異的に対合し、ＶＨ２がＶＬ２と特異的に対合するのが非常に望ましい。しかしながら、ハイブリッドハイブリドーマ（またはクアドローマ）などの既存の技術では、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ１、およびＶＬ２のランダム対合が起こり、その結果、最大１０の異なる種が生成されるが、そのうちの１種のみが機能的二重特異性抗原結合分子である。これにより、生成の収率が低下するだけでなく、目標とする生成物の精製が複雑になる。
【００８４】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分の両方が天然のＦａｂの対部分である場合に比べて、その可変領域が誤対合する可能性が低いという点で例外的である。具体例では、第一の抗原結合ドメインはＶＬ１−Ｃ２と対合したＶＨ１−Ｃ１を含み、第二の抗原結合ドメインはＶＬ２−ＣＬと対合したＶＨ２−ＣＨ１を含む。意外にも、Ｃ１とＣ２は互いに優先的に会合し、ＣＬまたはＣＨ１とは会合しにくいことが分かった。これにより、Ｃ１−ＣＨ、Ｃ１−ＣＬ、Ｃ２−ＣＨ、およびＣ２−ＣＬなどの望ましくない対合の形成が阻害され、有意に低減される。Ｃ１−Ｃ２の特異的会合の結果、ＶＨ１はＶＬ１に特異的に対合することで第一の抗原結合部分が得られ、ＣＨ１がＣＬに特異的に対合することでＶＨ２−ＶＬ２の特異的対合が可能になり、第二の抗原結合部分が得られる。従って、第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分は、不一致を生じにくく、例えば、ＶＨ１−ＶＬ２、ＶＨ２−ＶＬ１、ＶＨ１−ＶＨ２、ＶＬ１−ＶＬ２の誤対合は、第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分の両方が天然のＦａｂの対部分である場合、例えば、ＶＨ１−ＣＨ１、ＶＬ１−ＣＬ、ＶＨ２−ＣＨ１、およびＶＬ２−ＣＬの形態に比べて有意に低減される。
【００８５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞から発現させると、誤対合の生成物が有意に少ない（例えば、誤対合の生成物が少なくとも１、２、３、４、５個あるいはそれ以上少ない）、かつ／または同等の条件で発現させた基準分子よりも生成収率が有意に高い（例えば、収率が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、あるいはそれ以上高い）。この基準分子は、Ｃ１の代わりに天然のＣＨ１、Ｃ２の代わりに天然のＣＬを有することを除いて二重特異性ポリペプチド複合体と同一である。
【００８６】
操作されたＣαおよびＣβを含む抗原結合部分
【００８７】
本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域に動作可能に結合第一の抗体の重鎖可変領域と、第二のＴＣＲ定常領域に動作可能に結合された第一の抗体の軽鎖可変領域を含み、第一のＴＣＲ定常領域と第二のＴＣＲ定常領域は少なくとも１つの非天然の鎖間ジスルフィド結合により会合している。第一の抗原結合部分は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、抗体由来の可変領域とＴＣＲ由来の定常領域を含む。従って、第一の抗原結合部分は、これらのＴＣＲ定常領域の対合に動作可能に、それぞれ結合された重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分のＴＣＲ定常領域の対合はα／β  ＴＣＲ定常領域である。本明細書で提供されるポリペプチド複合体のＴＣＲ定常領域は、互いに会合することができ、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を介して二量体を形成する。
【００８８】
意外にも、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を有する本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、組み換えで発現して所望の高次構造にすることができることが分かっている。この高次構造は、ＴＣＲ定常領域二量体を安定させ、かつ抗体の可変領域の抗原結合活性を向上させる。また、第一の抗原結合部分は、定法の抗体遺伝子操作、例えば、グリコシル化部位の修飾、およびいくつかの天然の配列の除去に寛容であることが分かっている。さらに、第一の抗原結合部分にＴＣＲ定常領域があるため、抗原結合配列の誤対合が最小あるいは実質的になしで容易に発現・会合させることができる二重特異性形式に本明細書で提供されるポリペプチド複合体を組み込むことができる。本明細書で提供される第一の抗原結合部分と構築物のさらなる利点は以下の開示でより明らかになる。
【００８９】
要するに、本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、Ｎ末端からＣ末端に、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に動作可能に結合された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に動作可能に結合された第一の抗体の第一の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、Ｃ１は配列番号１を含む操作されたＣβを含み、Ｃ２は配列番号２を含む操作されたＣαを含み、配列番号１のアミノ酸Ｃ４８と配列番号２のアミノ酸Ｃ４１は、非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、Ｃ１とＣ２は二量体を形成することができ、Ｃ１とＣ２の間の非天然の鎖間ジスルフィド結合は前記二量体を安定させることができる。
【００９０】
ＴＣＲ定常領域
【００９１】
本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、ＴＣＲ由来のαまたはβ定常領域を含む。
【００９２】
図３Ａおよび図３Ｂは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の天然のＴＣＲ定常領域のアミノ酸配列を示す。明瞭さと一貫性のため、これら配列のアミノ酸残基のそれぞれに図４Ａおよび図４Ｂで番号を付与し、本開示においてはこのような番号を用いて特定のＴＣＲ定常領域の特定のアミノ酸残基について述べる。
【００９３】
ヒトＴＣＲα鎖定常領域はＴＲＡＣ（ＮＣＢＩ登録番号：Ｐ０１８４８、あるいは配列番号３１のアミノ酸配列を持つ）として知られている。
【００９４】
ヒトＴＣＲβ鎖定常領域は、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２として知られる２つの異なる変形体を有する(IMGT nomenclature)（また、Toyonaga B, et al., PNAs, Vol. 82, pp.8624-8628, Immunology (1985)を参照のこと）。ＴＲＢＣ１配列（配列番号３３）を主鎖に選んで本明細書で開示されるポリペプチド複合体を設計した。
【００９５】
具体的には、天然のＴＣＲβ鎖は、位置７４に天然のシステイン残基を含む（図４Ｂを参照のこと）。この天然のシステイン残基は対合しておらず、従って、天然のα／β−ＴＣＲでジスルフィド結合を形成しない。本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、このＴＣＲβ鎖の位置７４にある天然のシステイン残基は突然変異させてアラニン残基になっている。これは、不正な鎖内対合または鎖間対合を避けるために有用な場合がある。特定の実施形態では、特定の実施形態における置換は、インビトロでのＴＣＲの再折りたたみ効率を向上させる場合がある。
【００９６】
本開示では、本明細書で提供される第一の抗原結合部分の第一のＴＣＲ定常領域と第二のＴＣＲ定常領域は、二量体を形成することができる。この二量体は、これらＴＣＲ定常領域の間に、二量体を安定させることができる少なくとも１つの非天然の鎖間ジスルフィド結合を含む。
【００９７】
本明細書で用いられるように、用語「二量体」は、ポリペプチドあるいはタンパク質などの２つの分子によって共有結合または非共有結合の相互作用により形成される会合構造を指す。ホモ二量体またはホモ二量体化は２つの同一の分子により形成され、ヘテロ二量体またはヘテロ二量体化は２つの異なる分子によって形成される。第一のＴＣＲ定常領域と第二のＴＣＲ定常領域により形成される二量体はヘテロ二量体である。
【００９８】
「突然変異」アミノ酸残基は、置換、挿入、または付加により、対応する天然のＴＣＲ定常領域でその天然の対応する残基とは異なるアミノ酸残基を指す。例えば、野生型のＴＣＲ定常領域の特定の位置にあるアミノ酸残基を「天然の」残基と言う場合、その突然変異されたものは天然の残基とは異なるが、そのＴＣＲ定常領域の同じ位置にある任意の残基である。突然変異残基は、同じ位置の天然の残基を置換する、あるいは天然の残基の前に挿入されてその本来の位置を占める異なる残基であってもよい。
【００９９】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、第一のＴＣＲ定常領域および／または第二のＴＣＲ定常領域は、非天然の鎖間ジスルフィド結合の形成に関与する１つ以上の突然変異アミノ酸残基を含むように遺伝子操作されている。ＴＣＲ定常領域にそのような突然変異残基を導入するため、ＴＣＲ領域のコード配列を操作して、例えば、天然の残基をコードするコドンを突然変異残基をコードするコドンで置換する、あるいは天然の残基のコドンの前に突然変異残基をコードするコドンを挿入してもよい。
【０１００】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、システイン残基への置換後に２つのＴＣＲ定常領域の間に非天然の鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、第一のＴＣＲ定常領域および／または第二のＴＣＲ定常領域を１つ以上の突然変異システイン残基を含むように遺伝子操作した。
【０１０１】
非天然の鎖間ジスルフィド結合は第一の抗原結合部分を安定させることができる。安定化におけるそのような効果は様々な方法で具体化してもよい。例えば、突然変異アミノ酸残基または非天然の鎖間ジスルフィド結合の存在により、ポリペプチド複合体は安定して発現し、かつ／または多量に発現でき、かつ／または会合して所望の生物学的活性（例えば、抗原結合活性）を持つ安定した複合体になり、かつ／または会合して多量の所望の生物学的活性を有する所望の安定した複合体となることができる。当該分野で知られた適切な方法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに表示された分子量、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で測定した熱安定性、あるいは示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ））を用いて、第一のＴＣＲ定常領域と第二のＴＣＲ定常領域を安定させる鎖間ジスルフィド結合の能力を評価してもよい。例示の一例では、生成物の分子量が第一のポリペプチドと第二のポリペプチドを合わせた分子量と同等である場合、本明細書で提供される安定した第一の抗原結合部分の形成はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認してもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、その熱安定性が天然のＦａｂの５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上であれば安定である。特定の実施形態では、本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、その熱安定性が天然のＦａｂの熱安定性と同等であれば、安定である。
【０１０２】
何らかの理論に束縛されるわけではないが、第一の抗原結合部分の第一のＴＣＲ定常領域と第二のＴＣＲ定常領域の間に形成される非天然の鎖間ジスルフィド結合は、これらＴＣＲ定常領域のヘテロ二量体を安定にすることができ、これにより、正しい折りたたみの量、構造的安定性および／またはヘテロ二量体と第一の抗原結合部分の発現量を高める。Ｔ細胞表面の膜表面に固定された天然のＴＣＲとは異なり、天然のＴＣＲ細胞外ドメインのヘテロ二量体は、三次元構造では抗体Ｆａｂに類似しているにも関わらず安定性がかなり低いことが分かっている。事実、用いる可溶条件での天然のＴＣＲの不安定性は、結晶構造の解明を妨げる大きな障害である（Wang, Protein Cell, 5(9), pp.649-652 (2014)を参照のこと）。ＴＣＲ定常領域にシステイン（Ｃｙ）突然変異の対合を導入し、これによって鎖間非天然ジスルフィド結合を形成することができるようにすることで、第一の抗原結合部分は安定して発現し、その間、抗体の可変領域の抗原結合能が保持される。
【０１０３】
突然変異残基を含むＴＣＲ定常領域はまた、「操作された」ＴＣＲ定常領域とも言う。特定の実施形態では、ポリペプチド複合体の第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）は操作されたＴＣＲα鎖（Ｃα）を含み、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）は操作されたＴＣＲβ鎖（Ｃβ）を含む。本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、Ｃ１は操作されたＣβを含み、Ｃ２は操作されたＣαを含む。
【０１０４】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、操作されたＴＣＲ定常領域は、第一の操作されたＴＣＲ定常領域および／または第二の操作されたＴＣＲ定常領域の接触界面内に１つ以上の突然変異システイン残基を含む。
【０１０５】
本明細書で用いられるように、用語「接触界面（contact interface）」は、ポリペプチドが互いに相互作用／会合するポリペプチド表面の特定の領域を指す。接触界面は、相互作用が生じた際に接触または会合する対応するアミノ酸残基と相互作用することができる１つ以上のアミノ酸残基を含む。接触界面のアミノ酸残基は連続した配列にあってもなくてもよい。例えば、界面が三次元である場合、界面内のアミノ酸残基は線状配列の異なる位置に離れてあってもよい。
【０１０６】
特定の実施形態では、１つ以上のジスルフィド結合は、操作されたＣαと操作されたＣβの間に形成されてもよい。特定の実施形態では、Ｃβの突然変異システイン残基はＳ５６Ｃ（配列番号１のアミノ酸Ｃ４８に対応する）であり、Ｃαの突然変異システイン残基はＴ４９Ｃ（配列番号２のアミノ酸Ｃ４１に対応する）であり、これらシステイン残基の対合は非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。
【０１０７】
本明細書の出願を通して用いられるように、ＴＣＲ定常領域に関する「ＸｎＹ」は、ＴＣＲ定常領域のｎ番目のアミノ酸残基Ｘ（本明細書で提供される図４Ａおよび図４Ｂの番号に基づく）がアミノ酸残基Ｙにより置換されていることを意味するものである。ここで、ＸおよびＹはそれぞれ、特定のアミノ酸残基の１文字で表したものである。なお、数字ｎは単に図４Ａおよび図４Ｂに示された番号に基づいたものであり、実際の位置とは異なる場合がある。例示のため、配列番号１に示すＣβ（Ｓ５６Ｃ）（Ｎ６９Ｑ）の配列を一例として用いる。ＳのＣへの置換は配列番号１の４８番目の残基で生じているが、この残基は図４Ｂの付番システムに基づく５６番目の残基として示されている。従って、ＳのＣへの置換はＳ４８ＣではなくＳ５６Ｃとして示されている。同様に、ＮのＱへの置換は図４Ａおよび図４Ｂの付番システムに基づくＮ６９Ｑとして示されている。特に断りのない限り、アミノ酸残基の置換を示すこの規則は本開示のすべてのＴＣＲ定常領域に当てはまる。
【０１０８】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、操作されたＣβは配列番号１を含むか、もしくは配列番号１であり、操作されたＣαは配列番号２を含むか、もしくは配列番号２である。
配列番号１および２のアミノ酸配列を以下に示す。
配列番号１
【表１】
2020534035.tif 000003
配列番号２
【表２】
2020534035.tif 000004
【０１０９】
本明細書で提供されるペプチド複合体では、天然のＴＣＲ定常領域に存在する１つ以上の天然のグリコシル化部位は、本開示で提供される第一の抗原結合部分で修飾（例えば、除去）されている。本明細書で用いられるように、ポリペプチド配列に関して用語「グリコシル化部位」は、糖鎖（例えば、オリゴ糖構造）を結合させることができる側鎖を有するアミノ酸残基を指す。ポリペプチド様抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、例えば、トリペプチド配列（例えば、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン）のアスパラギン残基などのアスパラギン残基の側鎖への糖鎖の結合を指す。ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。Ｏ−結合のグリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１種の結合を指す。天然のグリコシル化部位の除去は、従来、上記のトリペプチド配列（Ｎ−結合のグリコシル化部位の場合）のうちの１つ以上、あるいはセリンまたはトレオニン残基（Ｏ−結合のグリコシル化部位の場合）のうちの１つ以上が置換されるようにアミノ酸配列を変化させることで達成することができる。
【０１１０】
本明細書で提示される第一の抗原結合部分では、例えば、第一のＴＣＲ定常領域および／または第二のＴＣＲ定常領域の操作されたＴＣＲ定常領域中に、少なくとも１つの天然のグリコシル化部位が欠けている。何らかの理論に束縛されるわけではないが、本明細書で提供される第一の抗原結合部分は、タンパク質の発現と安定性に影響を及ぼすことなくグリコシル化部位のすべてまたは一部の除去に耐えられると考えられる。これに対して、従来の教示では、Ｃα（すなわち、Ｎ３４、Ｎ６８，およびＮ７９）およびＣβ（すなわち、Ｎ６９）などＴＣＲ定常領域でのＮ−結合グリコシル化部位の存在はタンパク質の発現と安定に必要である（Wu et al., Mabs, 7:2, 364-376, 2015を参照のこと）と考えられる。
【０１１１】
本明細書で提供される第一の抗原結合部分では、Ｎ３４、Ｎ６８、およびＮ７９の操作されたＣαにＮ−グリコシル化部位がない。グリコシル化部位がない操作されたＣα配列は配列番号２を含むか、もしくは配列番号２である。本明細書で提供される第一の抗原結合部分では、Ｎ６９の操作されたＣβにＮ−グリコシル化部位がない。グリコシル化部位がない操作されたＣβ配列（ＴＲＢＣ１）は配列番号１を含むか、もしくは配列番号１である。
【０１１２】
本明細書で提供される第一の抗原結合部分では、ＴＣＲに由来する定常領域は、抗体に由来する可変領域に動作可能に結合される。
【０１１３】
特定の実施形態では、第一の抗体の可変領域（ＶＨ）は第一の結合ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）と融合し、第一の抗体の可変領域（ＶＬ）は第二の結合ドメインで第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）と融合している。
【０１１４】
本明細書で用いられるように、「結合ドメイン（Conjunction domain）」は２つのアミノ酸配列が融合または結合している境界あるいは境界領域を指す。特定の実施形態では、第一の結合ドメインは抗体のＶ／Ｃ結合部のＣ末端断片の少なくとも一部を含み、第二の結合ドメインはＴＣＲのＶ／Ｃ結合部のＮ末端断片の少なくとも一部を含む。
【０１１５】
本明細書で用いられるように、用語「抗体Ｖ／Ｃ結合部」は、抗体の可変領域と定常領域の境界、例えば、重鎖可変領域とＣＨ１ドメイン、あるいは軽鎖可変領域と軽鎖定常領域との境界を指す。同様に、用語「ＴＣＲのＶ／Ｃ結合部」は、ＴＣＲの可変領域と定常領域の境界、例えば、ＴＣＲのα可変領域と定常領域、あるいはＴＣＲのβ可変領域と定常領域の境界を指す。
【０１１６】
特定の実施形態では、第一のポリペプチドは、式（Ｉ）：ＶＨ−ＨＣＪ−Ｃ１のように動作可能に結合されたドメインを含む配列を含み、第二のポリペプチドは、式（ＩＩ）：ＶＬ−ＬＣＪ−Ｃ２のように動作可能に結合されたドメインを含む配列を含み、ここで：
ＶＨは抗体の重鎖可変領域であり；
ＨＣＪは上に規定された第一の結合ドメインであり；
Ｃ１は上に規定された第一のＴＣＲ定常領域であり；
ＶＬは抗体の軽鎖可変領域であり；
ＬＣＪは上に規定された第二の結合ドメインであり；
Ｃ２は上に規定された第二のＴＣＲ定常領域である。
このような実施形態では、Ｃ１は配列番号１を含むか、もしくは配列番号１である操作されたＣβであり、Ｃ２は配列番号２を含むか、もしくは配列番号２である操作されたＣαであり、ＨＣＪは配列番号２３を含む、あるい配列番号２３であり、ＬＣＪは配列番号２４を含むか、もしくは配列番号２４である。
【０１１７】
抗体の可変領域
【０１１８】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、第二の抗原結合部分に会合した第一の抗原結合部分を含み、その一方はＣＤ３に特異的に結合し、他方はＣＤ１９に特異的に結合する。本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、第一の抗原結合部分は第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ１）と第一の軽鎖可変領域（ＶＬ１）を含み、第二の抗原結合部分は第二の抗体の第二の重鎖可変領域（ＶＨ２）と第二の軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含み、第一の抗体と第二の抗体は異なっており、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１９抗体からなる群より選択される。特定の実施形態では、第一の抗体は抗ＣＤ３抗体であり、第二の抗体は抗ＣＤ１９抗体である。特定の他の実施形態では、第一の抗体は抗ＣＤ１９抗体であり、第二の抗体は抗ＣＤ３抗体である。
【０１１９】
従来の天然の抗体では、可変領域は、例えば、下記式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4で表されるように、Ｎ末端からＣ末端に隣接フレームワーク（ＦＲ）領域が介在した３つのＣＤＲ領域を含む。
【０１２０】
ａ）抗ＣＤ３結合部分
【０１２１】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、第一の抗原結合部分または第二の抗原結合部分は抗ＣＤ３結合部分である。特定の実施形態では、抗ＣＤ３結合部分は、以下の表Ａに示す抗ＣＤ３抗体WBP3311_2.306.4-z1に由来する。WBP3311_2.306.4-z1抗体のＣＤＲ配列を以下に示す。
【表３】
2020534035.tif 000005
【０１２２】
WBP3311_2.306.4-z1抗体の重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を以下に示す。
【０１２３】
WBP3311_2.306.4-z1-VH
アミノ酸配列（配列番号１５）：
【表４】
2020534035.tif 000006
核酸配列（配列番号１６）：
【表５】
2020534035.tif 000007
【０１２４】
WBP3311_2.306.4-z1-VK
アミノ酸配列（配列番号１７）：
【表６】
2020534035.tif 000008
核酸配列（配列番号１８）：
【表７】
2020534035.tif 000009
【０１２５】
ＣＤＲは抗原結合に関与することが知られている。
【０１２６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、WBP3311_2.306.4-z1の重鎖ＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は抗原結合部位の中心に位置し、従って、抗原と最もよく接触して、抗体の抗原に対する親和性に最も高い自由エネルギーを与えると考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、これまでのところ、複数の多様化機構による長さ、アミノ酸組成物、および高次構造の点で抗原結合部位の中で最も多様なＣＤＲであると考えられる(Tonegawa S., Nature. 302:575-81 (1983))。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、大部分の抗体特異性(Xu JL, Davis MM., Immunity. 13:37-45 (2000))と望ましい抗原結合親和性(Schier R, et al., J Mol Biol. 263:551-67 (1996))を提供するのに十分である。
【０１２７】
本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、その抗ＣＤ３結合部分がＣＤ３に特異的に結合することができる限り、好適なフレームワーク領域（ＦＲ）配列をさらに含む。
【０１２８】
ヒト化抗ＣＤ３抗体WBP3311_2.306.4-z1は、ＣＤ３発現細胞（例えば、CD4 T細胞）に対する特異的結合親和性を有し、ヒトＴ細胞を活性化して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのサイトカイン放出を誘導することができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、配列番号１５を含む重鎖可変領域配列と、配列番号１７を含む軽鎖可変領域配列を含む。
【０１３０】
本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分の結合親和性はＫD値によって表すことができる。ＫD値は、抗原と抗原結合分子との結合が平衡に達する時の会合速度に対する解離速度の比（ｋoff／ｋon）を表す。抗原結合親和性（例えば、ＫD）は、例えば、フローサイトメトリーアッセイを含む当該分野で周知の好適な方法を用いて適切に決定されてもよい。実施形態によっては、異なる濃度での抗体の抗原への結合は、フローサイトメトリーによって決定されてもよい。まず、決定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を抗体濃度に対してプロットし、次いで、Prismバージョン５(GraphPad Software, カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて特異的結合蛍光強度（Ｙ）と抗体濃度（Ｘ）の依存度を一部位飽和式Ｙ＝Ｂmax＊Ｘ／（ＫD＋Ｘ）に当てはめてＫD値を算出してもよい。ここで、Ｂmaxは試験した抗体の抗原に対する最大特異的結合を指す。
【０１３１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、細胞表面に発現したヒトＣＤ３あるいは組み換えヒトＣＤ３に特異的に結合することができる。ＣＤ３は、細胞表面に発現した受容体である。組み換えＣＤ３は、組み換えによって発現し、細胞膜と会合していない可溶性ＣＤ３である。様々な組み換え技術により組み換えＣＤ３を作製してもよい。一例として、ヒトＣＤ３(NP_000724.1) (Met1-Asp126)の細胞外ドメインをコードするＣＤ３のＤＮＡ配列は、発現ベクターのＣ末端でポリヒスチジンタグと融合させて、２９３Ｅ細胞に形質導入して発現させ、Ｎｉ親和性クロマトグラフィーで精製してもよい。
【０１３２】
実施形態によっては、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、フローサイトメトリーアッセイで測定した５×１０-9Ｍ未満、４×１０-9Ｍ未満、３×１０-9Ｍ未満、２×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、４×１０-10Ｍ未満、３×１０-10Ｍ未満、２×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、４×１０-11Ｍ未満、３×１０-11Ｍ未満、２×１０-11Ｍ未満、または１０-11Ｍ未満の結合親和性（ＫD）を有する細胞の表面に発現したヒトＣＤ３に特異的に結合することができる。
【０１３３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、例えば、細胞表面に発現したカニクイザルＣＤ３、または可溶性組み換えカニクイザルＣＤ３と交差反応する。
【０１３４】
組み換えＣＤ３または細胞表面に発現したＣＤ３への抗ＣＤ３結合部分の結合は、当該分野で知られている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスティンブロット、フローサイトメトリーアッセイ、および他の結合アッセイなどのサンドイッチアッセイにより測定されてもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、ＥＬＩＳＡによる０．０１ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、０．０３ｎＭ未満、０．０４ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、０．０７ｎＭ、または０．０８ｎＭ未満のＥＣ50（すなわち、５０％の結合濃度）で組み換えヒトＣＤ３と特異的に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、フローサイトメトリーアッセイによる０．５ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、１ｎＭ未満、２ｎＭ未満、３ｎＭ未満、４ｎＭ未満、５ｎＭ未満、６ｎＭ未満、７ｎＭ未満、８ｎＭ未満、９ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＥＣ50で細胞表面に発現したヒトＣＤ３と特異的に結合する。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ３結合部分は、ヒトＣＤ３に対する結合親和性と同程度の結合親和性でカニクイザルＣＤ３に結合する。例えば、例示的な抗体WBP3311_2.306.4のカニクイザルＣＤ３との結合は、ヒトＣＤ３に対する親和性すなわちＥＣ50値と同程度である。
【０１３６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、ＥＬＩＳＡによる０．００１ｎＭ未満、０．００５ｎＭ未満、０．０１ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、０．０３ｎＭ未満、０．０４ｎＭ未満、または０．０５ｎＭ未満のＥＣ50で組み換えカニクイザルＣＤ３に特異的に結合する。
【０１３７】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３結合部分は、診断および／または治療での使用に十分なヒトＣＤ３に対する特異的結合親和性を有する。複数の治療方針は、ＴＣＲシグナル伝達を標的することにより、特に、臨床で用いられる抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体によりＴ細胞免疫を調節する。
【０１３８】
ｂ） 抗ＣＤ１９抗体
【０１３９】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、第一の抗原結合部分または第二の抗原結合部分は抗ＣＤ１９結合部分である。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、以下の表Ｂに示す抗ＣＤ１９抗体W7011-4.155.8-z1-P15に由来する。抗ＣＤ１９抗体のＣＤＲ配列を以下に示す。
【表８】
2020534035.tif 000010
【０１４０】
WBP7011_4.155.8-z1-P15抗体の重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を以下に示す。
【０１４１】
W7011-4.155.8-z1-P15-VH
アミノ酸配列（配列番号１９）：
【表９】
2020534035.tif 000011
核酸配列（配列番号２０）：
【表１０】
2020534035.tif 000012
【０１４２】
W7011-4.155.8-z1-P15-VK
アミノ酸配列（配列番号２１）：
【表１１】
2020534035.tif 000013
核酸配列（配列番号２２）：
【表１２】
2020534035.tif 000014
【０１４３】
ＣＤＲは抗原結合に関与することが知られている。
【０１４４】
特定の実施形態では、本明細書で開示される抗ＣＤ１９結合部分は、抗ＣＤ１９抗体W7011-4.155.8-z1-P15の重鎖ＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は抗原結合部位の中心に位置し、従って、抗原と最もよく接触して、抗体の抗原に対する親和性に最も高い自由エネルギーを与えると考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、これまでのところ、複数の多様化機構による長さ、アミノ酸組成物、および高次構造の点で抗原結合部位の中で最も多様なＣＤＲであると考えられる(Tonegawa S., Nature. 302:575-81 (1983))。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、大部分の抗体特異性(Xu JL, Davis MM., Immunity. 13:37-45 (2000))と望ましい抗原結合親和性(Schier R, et al., J Mol Biol. 263:551-67 (1996))を提供するのに十分である。
【０１４５】
本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、その抗ＣＤ１９結合部分がＣＤ１９に特異的に結合することができる限り、好適なフレームワーク領域（ＦＲ）配列をさらに含む。
【０１４６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、配列番号１９を含む重鎖可変領域配列と配列番号２１を含む軽鎖可変領域配列を含む。
【０１４７】
実施形態によっては、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、フローサイトメトリーアッセイで測定した結合親和性（ＫD）が５×１０-9Ｍ未満、１×１０-9Ｍ未満、９×１０-10Ｍ未満、８×１０-10Ｍ未満、７×１０-10Ｍ未満、６×１０-10Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、４×１０-10Ｍ未満、３×１０-10Ｍ未満、２×１０-10Ｍ未満、１×１０-10Ｍで細胞表面に発現したヒトＣＤ１９に特異的に結合することができる。
【０１４８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、カニクイザルＣＤ１９、例えば、細胞表面で発現したカニクイザルＣＤ１９、あるいは可溶性組み換えカニクイザルＣＤ１９と交差反応する。
【０１４９】
抗ＣＤ１９結合部分の細胞表面に発現したＣＤ１９への結合は、当該分野で知られている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスティンブロット、フローサイトメトリーアッセイ、および他の結合アッセイなどのサンドイッチアッセイにより測定されてもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、フローサイトメトリーアッセイによるＥＣ50が０．０１ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、０．０３ｎＭ未満、０．０４ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、または１ｎＭ未満で細胞表面に発現したヒトＣＤ１９に特異的に結合する。
【０１５０】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、ヒトＣＤ１９の結合親和性と同程度の結合親和性でカニクイザルＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、フローサイトメトリーアッセイによるＥＣ50が０．２ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、１ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または３ｎＭ未満で細胞表面に発現したカニクイザルＣＤ１９に特異的に結合する。
【０１５１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ１９結合部分は、Ｆａｂ−ＺａｐアッセイによるＥＣ50が１ｐＭ未満、２ｐＭ未満、３ｐＭ未満、４ｐＭ未満、５ｐＭ未満、６ｐＭ未満、７ｐＭ未満、８ｐＭ未満、９ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、１１ｐＭ未満、１２ｐＭ未満、１３ｐＭ未満、１４ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１６ｐＭ未満、１７ｐＭ未満、１８ｐＭ未満、１９ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、２１ｐＭ未満、２２ｐＭ未満、２３ｐＭ未満、２４ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、３５ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、４５ｐＭ未満、または５０ｐＭ未満でＣＤ１９発現細胞により内部移行される。
【０１５２】
二重特異性ポリペプチド複合体
【０１５３】
特定の実施形態では、第一の抗原結合部分および／または第二の抗原結合部分は、２価、３価、４価などの多価である。本明細書で用いられるように、用語「価数」は所与の分子における抗原結合部位の指定された数を指す。従って、用語「２価」、「４価」、および「６価」は、抗原結合分子においてそれぞれ２つ、４つ、および６つの結合部位があることを示す。２つの結合部位がいずれも同じ抗原または同じエピトープと特異的に結合する場合、２価の分子は単一特異性であってもよい。同様に、例えば、２つの結合部位が第一の抗原（またはエピトープ）に対して単一特異性であり、第三の結合部位が第二の抗原（またはエピトープ）に対して特異的である場合、３価の分子は二重特異性であってもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体の第一の抗原結合部分および／または第二の抗原結合部分は、同じ抗原またはエピトープに対して特異的な少なくとも２つの結合部位を持つ２価、３価、または４価の部位であってもよい。特定の実施形態では、これにより、１価のものに比べてより強く抗原またはエピトープと結合することができる。特定の実施形態では、２価の抗原結合部分では、結合部位の第一の価数と結合部位の第二の価数は構造的に同じである（すなわち、同じ配列を持つ）、あるいは構造的に異なる（すなわち、同じ特異性を持つが異なる配列を持つ）。
【０１５４】
特定の実施形態では、第一の抗原結合部分および／または第二の抗原結合部分は、多価であり、動作可能に結合した、スペーサー付きあるいはなしの２つ以上の抗原結合部位を含む。
【０１５５】
特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は第二の抗体の２つ以上のＦａｂを含む。２つのＦａｂを動作可能に互いに結合させてもよく、例えば、第一のＦａｂを重鎖を介して第二のＦａｂに共有結合させてもよく、その間にはスペーサーがあってもなくてもよい。
【０１５６】
特定の実施形態では、第一の抗原結合部分は第一の二量体化ドメインに結合し、第二の抗原結合部分は第二の二量体化ドメインに結合している。本明細書で用いられるように、用語「二量体化ドメイン」は、互いに会合して二量体を形成することができる、あるいは、いくつかの例では、２つのペプチドの自発的二量体化を可能にするようなペプチドドメインを指す。
【０１５７】
特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは第二の二量体化ドメインと会合されてもよい。会合は、例えば、結合部、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩架橋、疎水性親水性相互作用、またはこれらの組み合わせなどの任意の好適な相互作用、連結、または結合によってなされていてもよい。二量体化ドメインの例としては、これらに限定されないが、抗体ヒンジ領域、抗体ＣＨ２ドメイン、抗体ＣＨ３ドメイン、および二量体化して互いに会合することができる他の好適なタンパク質単量体が挙げられる。ヒンジ領域、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４などの任意の抗体アイソタイプに由来していてもよい。
【０１５８】
「ジスルフィド結合」は、構造Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’を持つ共有結合を指す。アミノ酸の１つであるシステインは、（例えば、他のシステイン残基由来の）第二のチオール基とジスルフィド結合を形成することができるチオール基を含む。ジスルフィド結合は、それぞれ２つのポリペプチド鎖にある２つのシステイン残基のチオール基の間で形成されてもよい。これにより、鎖間架橋または鎖間結合が形成される。
【０１５９】
水素結合は、水素原子が電気陰性度の高い原子（例えば、窒素、酸素、またはフッ素）に共有結合すると２つの極性基の間の静電引力によって形成される。水素結合は、ポリペプチド中で、２つの残基の骨格酸素（例えば、カルコゲン基）とアミド水素（窒素基）、例えば、アスパラギンの窒素基とヒスチジンの酸素基またはアスパラギンの酸素基とリシンの窒素基、の間でそれぞれ形成されてもよい。水素結合はファン・デル・ワールス相互作用よりも強いが、共有結合またはイオン結合よりも弱く、二次構造および三次構造の維持に重要である。例えば、αヘリックスは、アミノ酸残基の空間が位置ｉとｉ＋４の間に規則的に生じると形成される。βシートは、２つのペプチドが少なくとも２つまたは３つの主鎖の水素結合により連結されると形成される長さが３〜１０個のアミノ酸のペプチド鎖の伸張部であり、ねじれたひだ状のシートを形成する。
【０１６０】
静電相互作用は、非共有結合の相互作用であり、イオン性相互作用、水素結合、およびハロゲン結合を含むタンパク質の折りたたみ、安定性、柔軟性、および機能に重要である。静電相互作用は、ポリペプチドにおいて、例えば、リシンとアスパラギン酸との間、リシンとグルタミン酸との間、グルタミン酸とアルギニンとの間、または第一の鎖のグルタミン酸、トリプトファンと第二の鎖のアルギニン、バリン、またはトレオニンとの間に形成されてもよい。
【０１６１】
塩架橋は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアニオン性のカルボン酸基と、リシンまたはアルギニンのグアニジンに由来するカチオン性のアンモニウム（これらは天然のタンパク質構造で反対の電荷を帯びた残基の空間的に近位の対合である）から主に生じる狭い範囲の静電相互作用である。高疎水性界面に帯電した極性残基は、結合が起こりやすい箇所として作用することがある。とりわけ、ヒスチジン、チロシン、およびセリンなどのイオン性側鎖を有する残基もまた、塩架橋の形成に関与することがある。
【０１６２】
疎水性相互作用は、第一の鎖の１つ以上のバリン、チロシン、およびアラニンと第二の鎖の１つ以上のバリン、ロイシン、およびトリプトファンとの間、あるいは第一の鎖のヒスチジンおよびアラニンと第二の鎖のトレオニンおよびフェニルアラニンとの間に形成されてもよい（Brinkmann, et al, 2017（上記参照）を参照のこと）。
【０１６３】
特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインおよび／または前記第二の二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインおよび／または前記第二の二量体化ドメインは、抗体ＣＨ２ドメインおよび／または抗体ＣＨ３ドメインをさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインおよび／または前記第二の二量体化ドメインは、ヒンジ−Ｆｃ領域の少なくとも一部、すなわちヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは、第一のＴＣＲ定常領域のＣ末端に動作可能に結合されてもよい。特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインは、第二の抗原結合部分の抗体ＣＨ１定常領域のＣ末端に動作可能に結合されてもよい。
【０１６４】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、Ｃ１は操作されたＣβを含み、第一の二量体化ドメインは、配列番号２５を含む第三の結合ドメインで操作されたＣβに動作可能に結合される。
【０１６５】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、第一の二量体化ドメインは操作されたＴＣＲ定常領域のＣ末端に動作可能に結合されて、キメラ定常領域を形成する。換言すると、キメラ定常領域は、操作されたＴＣＲ定常領域に動作可能に結合された第一の二量体化ドメインを含む。
【０１６６】
特定の実施形態では、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４に由来する第一のヒンジ−Ｆｃ領域に結合された操作されたＣβを含む。そのようなキメラ定常領域の例示的な配列は実施例２に示される。
【０１６７】
特定の実施形態では、キメラ定常領域は、第一の抗体ＣＨ２ドメインおよび／または第一の抗体ＣＨ３ドメインをさらに含む。例えば、キメラ定常領域は、第三の結合ドメインのＣ末端に結合された第一の抗体ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをさらに含む。そのようなキメラ定常領域の例示的な配列は実施例２に示される。
【０１６８】
キメラ定常領域と第二のＴＣＲ定常領域のこのような対合は、本明細書で開示されるポリペプチド複合体を提供するように操作して所望の抗体可変領域と融合させることができるという点で有用である。例えば、抗体重鎖可変領域をキメラ定常領域（Ｃ１を含む）に融合させて、本明細書で提供されるポリペプチド複合体の第一のポリペプチド鎖とし、同様に抗体軽鎖可変領域を第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２を含む）に融合させて、本明細書で提供されるポリペプチド複合体の第二のポリペプチド鎖としてもよい。
【０１６９】
特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインは、ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４などの抗体に由来してもよい。特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインは、任意により、例えば、ヒンジ−Ｆｃ領域など、抗体ＣＨ２ドメインおよび／または抗体ＣＨ３ドメインをさらに含んでいてもよい。ヒンジ領域は、第二の抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ）の抗体重鎖に結合されてもよい。
【０１７０】
二重特異性ポリペプチド複合体では、第一の二量体化ドメインと第二の二量体化ドメインは会合して二量体とすることができる。特定の実施形態では、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは異なっていて、ホモ二量体化を妨げる、かつ／またはヘテロ二量体化を促進するように会合している。例えば、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは、これらの中でホモ二量体を形成するのではなく、これら２つのドメインは同じではなく、互いの間でヘテロ二量体を優先的に形成するように選択してもよい。特定の実施形態では、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは、「ノブ・イントゥ・ホール」の形成、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または高められた柔軟性により会合してヘテロ二量体とすることができる。
【０１７１】
特定の実施形態では、前記第一の二量体化ドメインと前記第二の二量体化ドメインは、それぞれ突然変異させてノブ・イントゥ・ホールを形成することができるＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを含む。ノブは、第一のＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチドの大きい方で小さいアミノ酸残基を置換して得てもよく、穴は、小さいほうで大きい残基を置換して得てもよい。ノブ・イントゥ・ホールの突然変異部位の詳細は、Ridgway et al., 1996（上記参照）, Spiess et al., 2015, supra and Brinkmann et al., 2017（上記参照）を参照のこと。
【０１７２】
二重特異性形式
【０１７３】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体では、第一の抗原結合部分と第二の結合部分を会合させてＩｇ様構造とする。Ｉｇ様構造は、抗原結合のための２つの腕と会合および安定化のための１つの柄を持つＹ形状の構築物を持つ天然抗体類似物である。天然の抗体に似ているため、インビボ薬物動態、所望の免疫応答および安定性などの様々な利点を持っている可能性がある。本明細書で提供される第二の抗原結合部分に会合した本明細書で提供される第一の抗原結合部分を含むＩｇ様構造は、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）と同等の熱安定性を有することが分かった。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＩｇ様構造は、天然のＩｇＧの少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。
【０１７４】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ｉ）ＶＨ１−Ｃ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ｉｉ）ＶＬ１−Ｃ２、ｉｉｉ）ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、およびｉｖ）ＶＬ２−ＣＬという４つのポリペプチド鎖を含み、Ｃ１とＣ２は少なくとも１つの非天然の鎖間結合を含む二量体を形成することができ、２つのヒンジ領域および／または２つのＣＨ３ドメインは二量体化を容易にすることができる１つ以上の鎖間結合を形成することができる。
【０１７５】
本明細書で開示される二重特異性ポリペプチド複合体は、他の形式の二重特異性ポリペプチド複合体に比べてインビボの半減期がより長く、製造が比較的容易になっている。
【０１７６】
二重特異性複合体配列
【０１７７】
実施形態によっては、二重特異性複合体の第一の抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合することができ、第二の抗原結合部分はＣＤ１９に特異的に結合することができる。他の実施形態では、二重特異性複合体の第一の抗原結合部分はＣＤ１９に特異的に結合することができ、第二の抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合することができる。
【０１７８】
特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、実施例２で示すように、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９（Ｅ１７）の４つのポリペプチド配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、実施例２で示すように、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号３０（Ｆ１６）の４つのポリペプチド配列の組み合わせを含む。そのような実施形態では、第一の抗原結合部分はＣＤ３に結合し、第二の抗原結合部分はＣＤ１９に結合する。Ｅ１７の設計は二重特異性の２価の抗体であり、Ｆ１６の設計は抗ＣＤ１９抗体Ｆａｂの２つの繰り返しを持つ二重特異性の３価の抗原結合複合体である。
【０１７９】
特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、ｉ）第一のキメラ定常領域に動作可能に結合させたＶＨ１、ｉｉ）第二のキメラ定常領域に動作可能に結合させたＶＬ１、ｉｉｉ）従来の抗体重鎖定常領域に動作可能に結合させたＶＨ２、およびｉｖ）従来の抗体軽鎖定常領域に動作可能に結合させたＶＬ２の４つのポリペプチド鎖を含む。特定の実施形態では、第一のキメラ定常領域は、それぞれ上に規定されたＣ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含んでいてもよい。特定の実施形態では、第二のキメラ定常領域は、それぞれ上に規定されたＣ２を含んでいてもよい。特定の実施形態では、従来の抗体重鎖定常領域は、それぞれ上に規定されたＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含んでいてもよい。特定の実施形態では、従来の抗体軽鎖定常領域は、上に規定されたＣＬを含んでいてもよい。
【０１８０】
作製法
【０１８１】
本開示は、ポリペプチド複合体をコードする単離された核酸またはポリヌクレオチドと、本明細書で提供される二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ１９ポリペプチド複合体を提供する。
【０１８２】
本明細書で用いられるように、用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態でのその重合体を指す。特に断りがなければ、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を持ち、天然起源のヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの周知の類縁体を含むポリヌクレオチドを包含する。特に断りがなければ、特定のポリヌクレオチド配列はまた、これらの保存的修飾変形体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、相同分子種、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明示された配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することで達成されてもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)を参照のこと）。
【０１８３】
組み換え技術を用いて、本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体をコードする核酸またはポリヌクレオチドを構築してもよい。この目的のため、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブにより）親抗体の抗原結合部分（例えば、ＣＤＲまたは可変領域）をコードするＤＮＡを単離して、並べてもよい。同様に、ＴＣＲ定常領域をコードするＤＮＡを得てもよい。一例として、可変領域（ＶＨ）をコードするポリヌクレオチド配列と第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）をコードするポリヌクレオチド配列を得て、動作可能に結合して、宿主細胞中で転写および発現させて第一のポリペプチドを産生する。同様に、宿主細胞内で第二のポリペプチドが発現するようにＶＬをコードするポリヌクレオチド配列を、Ｃ１をコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に結合する。任意により、１つ以上のスペーサーに対してコードされたポリヌクレオチド配列もまた、他のコード配列に動作可能に結合して所望の生成物を発現させる。
【０１８４】
コードするポリヌクレオチド配列は、さらに、適切な制御下で第一のポリペプチドと第二のポリペプチドの発現または生成が実行可能なように、任意により発現ベクター内で動作可能に１つ以上の調節配列に結合させてもよい。
【０１８５】
さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のため、当該分野で知られている組み換え技術を用いてコードするポリヌクレオチド配列をベクターに挿入してもよい。他の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体と二重特異性ポリペプチド複合体を当該分野で知られている相同組み換えにより作製してもよい。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般に、シグナル配列、複製起点、１種以上のマーカー遺伝子、転写促進因子要素、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）、および転写終止配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本明細書で用いられるように、用語「ベクター」は、タンパク質が発現するようにタンパク質をコードするポリヌクレオチドが動作可能に挿入されてもよい媒体を指す。典型的には、この構築物は適切な調節配列も含む。例えば、ポリヌクレオチド分子は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および／または部位指向修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（宿主細胞内で所望の転写物／遺伝子を発現することができるようにコード配列に動作可能に結合されている）の５’隣接領域に位置する調節配列を含んでいてもよい。宿主細胞内に運び込まれた遺伝要素が発現するように、ベクターを用いて宿主細胞を形質転換、形質導入、または形質移入してもよい。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、バクテリオファージ（例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ）、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして用いられる動物ウイルスのカテゴリーとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、転写促進因子配列、選択可能要素、およびレポーター遺伝子を含む発現を制御するための様々な要素を含んでいてもよい。また、ベクターは複製起点を含んでいてもよい。また、ベクターは、細胞に入るのを補助する材料を含んでいてもよく、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質被覆が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
実施形態によっては、ベクター系は、哺乳類系、細菌系、酵母菌系などを含み、プラスミド（これらに限定されないが、例えば、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ，ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２が挙げられる）および他の実験室のベクターや市販のベクターを含む。適切なベクターは、プラスミド、またはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含んでいてもよい。
【０１８８】
本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子の発現のために宿主細胞に導入されてもよい。本明細書で用いられるように、表現「宿主細胞」は、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入された細胞を指す。
【０１８９】
本明細書のベクター内でＤＮＡをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母菌、または高等真核生物の細胞である。この目的で好適な原核生物はグラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌を含み、グラム陰性またはグラム陽性生物は、腸内細菌科、例えば、大腸菌などの大腸菌属、エンテロバクタ−属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、ネズミチフス菌などのサルモネラ属、セラチア・マルセッセンスなどのセラチア属、および赤痢菌属、枯草菌およびバチルス・リケニフォルミスなどのバシラス属、緑膿菌などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属を含む。
【０１９０】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、ポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体をコードするベクターにとって好適なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母、すなわち一般的なパン酵母菌は、下等真核宿主微生物の中で最もよく用いられる。しかしながら、複数の他の属、種、および株が一般に利用可能であり、本明細書で有用である。例えば、分裂酵母；クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・フラギリス(ATCC 12,424)、クルイベロミセス・ブルガリカス(ATCC 16,045)、クルイベロミセス・ウィッカラミイ(ATCC 24,178)、クルイベロミセス・ワルティ(ATCC 56,500)、クルイベロミセス・ドロソフィラルム(ATCC 36,906)、クルイベロミセス・サーモトレランス、およびクルイベロミセス・マルシアヌスなどのクルイベロミセス宿主；ヤロウィア(EP 402,226)；ピキア酵母(EP 183,070)；カンジダ；トリコデルマ・レエシア(EP 244,234)；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオミセス・オキシデンタリスなどのシュワニオミセス；ニューロスポラ、アオカビ、トリポクラジウム、およびアスペルギルス宿主（アスペルギルス・ニデュランスおよびアスペルギルス・ニガーなど）などの糸状菌が挙げられる。
【０１９１】
本明細書で提供されるグリコシル化ポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体にとって好適な宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物の細胞の例としては、植物および昆虫の細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株、変異体、および宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞、例えば、ツマジロクサヨトウ（芋虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコが同定されている。例えば、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルスのＬ−１変異体およびカイコ核多角体病ウイルスのＢｍ−５株など、形質移入のための様々なウイルス株が公開されている。このようなウイルスを本発明によるウイルスとして、特にツマジロクサヨトウ細胞の形質移入に用いてもよい。綿、トウモロコシ、じゃがいも、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物を宿主として用いてもよい。
【０１９２】
しかしながら、最も関心が高いのは脊椎動物細胞であり、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は通常の手順となっている。有用な哺乳類の宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により形質変換されたサル腎臓ＣＶ１系統株(COS-7, ATCC CRL 1651)；Ｅｘｐｉ２９３などのヒト胚腎臓系統株（懸濁液培養物中での増殖用にサブクローンされた２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベイビーハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 10); チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980)); マウスセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol.Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト頸部上皮性悪性腫瘍細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather et al., Annals N.Y. Acad.Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4 細胞；およびヒトヘパトーマ系統株(Hep G2)である。
【０１９３】
宿主細胞は、上記の発現またはクローニングベクターで形質変換されており、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、クローニングベクターの増幅に適するように修飾された従来の栄養培地で培養されてもよい。
【０１９４】
本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体の生成のため、発現ベクターで形質変換した宿主細胞を様々な培地で培養してもよい。Ham's F10 (Sigma), 最小必須培地(MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), およびダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Sigma) など、市販の培地は宿主細胞の培養に好適である。また、Ham et al., Meth.Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal.Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4,767,704号; 4,657,866号; 4,927,762号; 4,560,655号; または5,122,469号; WO90/03430; WO87/00195;または米国再発行特許30,985号に記載の培地の何れかを宿主細胞の培養培地として用いてもよい。任意により、これら培地の何れかをホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、GENTAMYCIN（登録商標）薬物）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で一般的に存在する無機化合物として規定）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源で栄養補充してもよい。また、他の必要なサプリメントを当業者に知られている適切な濃度で含有させてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現に選択した宿主細胞でこれまで用いられたものであり、当業者には自明である。
【０１９５】
一態様では、本開示は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体を発現する方法を提供する。前記方法は、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体が発現する条件で本明細書で提供される宿主細胞を培養することを含む。
【０１９６】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を作製する方法を提供する。前記方法は、ａ）（１）Ｎ末端からＣ末端に第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に動作可能に結合させた第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一の抗原結合部分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、（２）Ｎ末端からＣ末端にに第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に動作可能に結合させた第一の抗体の第一の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、および（３）第二の抗原結合部分をコードする１つ以上のさらなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること（ここで、Ｃ１は配列番号１を含む操作されたＣβを含み、Ｃ２は配列番号２を含む操作されたＣαを含み、配列番号１のアミノ酸Ｃ４８と配列番号２のアミノ酸Ｃ４１は非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、Ｃ１とＣ２は二量体を形成することができ、非天然の鎖間ジスルフィド結合はＣ１とＣ２の二量体を安定にすることができ、第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分は、第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分の両方が天然のＦａｂの対応する部分である場合に比べて誤対合が減少し、第一の抗体は第一の抗原特異性を有し、第二の抗体は第二の抗原特異性を有する）、およびｂ）宿主細胞に二重特異性ポリペプチド複合体を発現させることを含む。
【０１９７】
特定の実施形態では、前記方法は、二重特異性ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む。
【０１９８】
組み換え技術を用いた場合、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞内または細胞周辺腔内で作製されるか、または直接培地に分泌されてもよい。第一の工程のように生成物が細胞内で作製される場合、粒子状の残骸、宿主細胞または溶解した断片の何れかを、例えば遠心分離または限外ろ過で除去する。Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)には、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する手順が記載されている。手短に言うと、約３０分かけて細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で解凍する。細胞の残骸を遠心分離で除去してもよい。生成物が培地に分泌される場合、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon 限外ろ過装置）を用いてそのような発現系からの上清をまず濃縮する。タンパク質分解を阻害するため、上記の工程のどこかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、偶然性の汚染物質の増殖を防ぐため、抗生物質を含めてもよい。
【０１９９】
細胞から作製される本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、および親和性クロマトグラフィーなどを用いて精製してもよいが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
【０２００】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体が免疫グロブリンＦｃドメインを含む場合は、ポリペプチド複合体に存在するＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じてＡタンパク質を親和性リガンドとして用いてもよい。Ａタンパク質をヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいてポリペプチド複合体を精製するのに用いてもよい(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。Ｇタンパク質はすべてのマウスアイソタイプとヒトγ３に対して推奨される(Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。親和性リガンドが結合される母材は、アガロースが最多であるが、他の母材も利用可能である。細孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定な母材により、アガロースの場合よりも高流速で短時間での処理が可能になる。
【０２０１】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。回収される抗体に応じて、イオン交換カラム分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカカラムクロマトグラフィー、ヘパリンカラムクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂カラム（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）SEPHAROSE（登録商標）クロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術もまた利用可能である。
【０２０２】
任意の予備精製工程の後、ｐＨが２．５〜４．５の溶出緩衝液を用いて、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で目的とするポリペプチド複合体と汚染物質を含む混合物を低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。
【０２０３】
特定の実施形態では、従来の方法を用いて本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を高収率で精製してもよい。二重特異性ポリペプチド複合体の利点の１つは重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列の誤対合が有意に低下することである。これにより、望ましくない副生物の生成が減少し、比較的簡単な精製過程を用いて高い収率で高純度の生成物を得ることができる。
【０２０４】
派生物
【０２０５】
特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体を所望の接合体との接合ベースとして用いてもよい。
【０２０６】
様々な接合体を本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に結合させてもよいと考えられる（例えば、“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと）。他の方法のうち、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合，複合体化、会合、ブレンド、付加を用いてこれらの接合体をポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に連結させてもよい。
【０２０７】
特定の実施形態では、１つ以上の接合体との結合に用いてもよいエピトープ結合部の外に特異的な部位を含むように、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を遺伝子操作してもよい。例えば、そのような部位は、接合体との共有結合を容易にするため、１つ以上の反応性アミノ酸残基（例えば、システインまたはヒスチジン残基）を含んでいてもよい。
【０２０８】
特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は接合体に直接、または間接的に（例えば、他の接合体あるいはリンカーを介して）連結していてもよい。
【０２０９】
例えば、システインなどの反応性残基を持つ二重特異性ポリペプチド複合体を、反応性基が例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、または他のチオール反応性接合相手であるチオール反応剤と連結してもよい(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671)。
【０２１０】
他の例では、二重特異性ポリペプチド複合体を、ビオチンに接合し、次いでアビジンに接合している第二の接合体に間接的に接合してもよい。さらに他の例では、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、接合体にさらに連結するリンカーに連結していてもよい。リンカーの例としては、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル−４−（Ｎ−オスイミドメチル）（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアナート）、およびヒスチジンに活性なフッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの二官能カップリング剤が挙げられる。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供する３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）(Carlsson et al., Biochem.J. 173:723-737 (1978))と、４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０２１１】
接合体は、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、精製部分、または細胞毒性部分であってもよい。検出可能な標識の例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、またはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、放射性同位体（例えば、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ、111Ｉｎ、112Ｉｎ、14Ｃ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、86Ｙ、88Ｙ、90Ｙ、177Ｌｕ、211Ａｔ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、153Ｓｍ、212Ｂｉ、および32Ｐ、他のランタノイド、発光標識）、色素体部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子、または検出用の金が挙げられる。特定の実施形態では、接合体は、抗体の半減期を長くするＰＥＧなどの薬物動態修飾部分であってもよい。他の好適な重合体としては、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体などが挙げられる。特定の実施形態では、接合体は磁性ビーズなどの精製部分であってもよい。「細胞毒性部分」は、細胞にとって好ましくない、あるいは細胞を損傷または殺傷することができる任意の薬剤であってもよい。細胞毒性部分の例としては、これらに限定されないが、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類縁体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバンジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてのダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０２１２】
抗体、免疫グロブリン、またはそれらの断片などのタンパク質に接合体を接合する方法は、例えば、米国特許第5,208,020号、米国特許第6,441,163号、WO2005/037992号、WO2005/081711号、およびWO2006/034488号に見られる。その全内容を引用により本明細書に組み込む。
【０２１３】
医薬品組成物
【０２１４】
本開示はまた、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０２１５】
用語「薬学的に許容される」は、示された担体、媒体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が一般に、配合物を含む他の成分と化学的におよび／または物理的に相溶性であり、その受容者と相性がよいことを表す。
【０２１６】
「薬学的に許容される担体」は、対象者にとって生物活性容認可能であり、かつ非毒性である、薬効成分以外の医薬品配合物中の成分を指す。本明細書で開示される医薬組成物に用いられる医薬的に容認可能な担体は、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、酸化防止剤、麻酔薬、懸濁／分散剤、封鎖またはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助物質、当該分野で知られている他の成分、あるいはこれらの様々な組み合わせが挙げられる。
【０２１７】
好適な成分としては、例えば、酸化防止剤、充填剤、結着剤、崩壊剤、緩衝液、保存料、潤滑剤、風味量、増粘剤、着色剤、乳化剤、または安定化剤（例えば、糖およびシクロデキストリン）が挙げられる。好適な酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセリン、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化アニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルが挙げられる。本明細書で開示されるように、本明細書で提供される医薬組成物にメチオニンなどの１種以上の酸化防止剤を含有させると、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体の酸化が抑制される。このように酸化が抑制されると、結合親和性の喪失が防止または抑制され、これによりタンパク質の安定性が向上し、品質保持期限を最大限に延ばすことができる。従って、特定の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体と１種以上の酸化防止剤（例えば、メチオニン）を含む組成物が提供される。
【０２１８】
さらなる例示のために、医薬品容認可能な担体としては、例えば、水性媒体（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張ブドウ糖注射液、殺菌水注射液、またはブドウ糖、および乳酸化リンゲル注射液）、非水性媒体（例えば、野菜由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ごま油、またはピーナッツ油）、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）、緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）、酸化防止剤（例えば、重硫酸ナトリウム）、局所麻酔薬（例えば、塩酸プロカイン）、懸濁および分散剤（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン）、乳化剤（例えば、ポリソルバート８０（ＴＷＥＥＮ−８０））、封鎖またはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸）が挙げられる。担体として用いられる抗菌剤を、フェノールまたはクレゾール、汞剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む複数の投与量の容器の医薬組成物に加えてもよい。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、またはエタノールが挙げられる。好適な非毒性の補助物質としては、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解性転写促進因子、あるいは酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、またはシクロデキストリンなどの薬剤が挙げられる。
【０２１９】
これらの医薬組成物は溶液、懸濁液、乳液、丸薬、カプセル、錠剤、徐放性製剤、または粉末であってもよい。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含んでいてもよい。
【０２２０】
特定の実施形態では、これらの医薬組成物は、注射可能な組成物として処方される。注射可能な医薬組成物は、任意の従来の形態、例えば、溶液、懸濁液、乳液、あるいは溶液、懸濁液、乳液を生成するための好適な固体形態で調製されてもよい。注射製剤は、注射液として準備された殺菌済みおよび／または非発熱性の溶液、使用する直前に溶媒と混合するように準備された殺菌乾燥可溶性生成物（凍結乾燥された粉末などで皮下錠剤、注射液として準備された殺菌懸濁液を含む）、使用する直前に媒体と混合するように準備された殺菌乾燥不溶性生成物、および殺菌済みおよび／または非発熱性乳液を含んでいてもよい。これらの溶液は水性または非水性の何れであってもよい。
【０２２１】
特定の実施形態では、単位投与量の非経口投与製剤は、アンプル、バイアル、または針付き注射器に入れられている。非経口投与用のすべての製剤は、当該分野で知られており、実践されているように殺菌済みであり、発熱性ではない。
【０２２２】
特定の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体を好適な溶媒に溶解して殺菌済み凍結乾燥粉末を調製する。この溶媒は、粉末またはその粉末から作製した再構成溶液の安定性や他の薬理成分を向上させる賦形剤を含んでもよい。用いてもよい賦形剤は、これらに限定されないが、水、ブドウ糖、ソルビトール、フルクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の好適な薬剤が挙げられる。この溶媒は、クエン酸塩、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムなどの緩衝剤、あるいは当業者に知られている、一実施形態ではほぼ中性の、その他の緩衝剤を含んでいてもよい。当業者に知られている標準的な条件で冷凍乾燥した後、溶液を殺菌ろ過することで、望ましい製剤が得られる。一実施形態では、得られた溶液を冷凍乾燥用のバイアルに分配してもよい。各バイアルは、単一の投与量または複数の投与量の本明細書で提供されるポリペプチド複合体、二重特異性ポリペプチド複合体、またはその組成物を含んでいてもよい。試料を正確に取り正確に投与できるように、１回または１組の投与量よりもわずかに多く（例えば約１０％）充填したバイアルが好ましい。凍結乾燥粉末を適切な条件、例えば約４℃〜室温で保存してもよい。
【０２２３】
凍結乾燥粉末を注射用の水で再構成して、非経口投与に用いられる製剤が得られる。一実施例では、殺菌済みおよび／または非発熱性の水あるいは他の液状の好適な担体を凍結乾燥粉末に加える。正確な量は、選択された治療に依存し、実験的に決定することができる。
【０２２４】
治療方法
【０２２５】
また、治療有効量の本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体をそれを必要とする対象に投与して、これにより疾患または障害を治療あるいは予防する治療方法が提供される。特定の実施形態では、対象は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に反応すると思われる障害または疾患を持つことが確認されている。
【０２２６】
本明細書で用いられるように、状態「を治療する」または「の治療」は、状態を予防または軽減すること、状態の発症または進行速度を下げること、状態が進行するリスクを低減すること、状態と関連づけられた症状の進行を予防または遅らせること、状態に関連づけられた症状を軽くあるいは終わらせること、状態の完全または部分的な退縮を生じさせること、状態を治癒すること、あるいはこれらのいくつかの組み合わせを含む。
【０２２７】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体の治療有効量は、当該分野で知られている様々な因子に依存する。そのような因子としては、例えば、体重、年齢、過去の病歴、現在処方されている薬物、対象の健康状態および交差反応の可能性、アレルギー、感度および好ましくない副作用、投与経路、および疾患の進行程度などが挙げられる。投与量は、これらの状況または要件および他の状況または要件によって示されるように、当業者（例えば、医師または獣医）により相応に増減されてもよい。
【０２２８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、約１００ｍｇ／ｋｇに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療有効投与量で投与されてもよい。これら実施形態のあるものでは、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与される。これら実施形態のあるものでは、投与量は１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施形態では、投与量は治療過程中に変えてもよい。例えば、特定の実施形態では、初期投与量は後続の投与量よりも多くてもよい。特定の実施形態では、投与量は、対象の反応に応じて治療過程中に変えてもよい。
【０２２９】
投薬計画を、最適な所望の応答（例えば、治療応答）が得られるように調節してもよい。例えば、単回投与量を投与してもよく、何回かに分けた投与量を時間をかけて投与してもよい。
【０２３０】
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、例えば、非経口投与（例えば、静脈注入、筋肉内または皮内投与注射を含む皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与）または非経口投与以外の投与（例えば、経口投与、経鼻投与、眼球内、舌下投与、直腸投与、または局所投与）などの当該分野で知られている任意の経路で投与してもよい。
【０２３１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体で治療される疾患または障害は、癌または癌性状態、自己免疫疾患、感染症および寄生虫性疾患、心臓血管疾患、神経障害、精神神経疾患、傷害、炎症、または凝固障害である。
【０２３２】
本明細書で用いられるように、「癌」または「癌性状態」は、腫瘍性または悪性細胞の成長、増殖、または転移により媒介される任意の医学的疾患を指し、例えば、固形癌および白血病などの非固形癌を含む。本明細書で用いられるように、「腫瘍」は腫瘍性および／または悪性細胞の固形腫瘤を指す。
【０２３３】
癌に関して、「治療する」または「治療」は、腫瘍性または悪性細胞の成長、増殖、または転移を阻害または遅らせること、あるいは腫瘍性または悪性細胞の成長、増殖、または転移の進行を予防または遅延させること、あるいはこれらのいくつかの組み合わせを指すことがある。腫瘍に関して、「治療する」または「治療」は、腫瘍のすべてまたは一部を根絶すること、腫瘍の成長および転移を阻害または遅らせること、腫瘍の進行を予防または遅延させること、あるいはこれらのいくつかの組み合わせを含む。
【０２３４】
例えば、癌を治療するための本明細書で開示される二重特異性ポリペプチド複合体の使用に関して、治療有効量は、腫瘍のすべてまたは一部を根絶する、腫瘍の成長および転移を阻害または遅らせる、癌性状態を媒介する細胞の成長または増殖を阻害する、腫瘍細胞の転移を阻害する、腫瘍または癌性状態に関連づけられた任意の症状またはマーカーを改善する、腫瘍または癌性状態の進行を予防または遅延させることができるような、あるいはこれらのいくつかの組み合わせでのポリペプチド複合体の投与量または濃度である。
【０２３５】
特定の実施形態では、前記状態および障害としては、腫瘍および癌、例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎臓細胞癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃上皮性悪性腫瘍、膀胱癌、食道癌、中皮腫、メラノーマ、頭部および頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、膠芽細胞腫、頸部癌、胸腺上皮性悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉腫、メルケル細胞癌、および他の血液悪性腫瘍（例えば、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、縦隔原発大Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球富化Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、およびＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭上皮性悪性腫瘍、およびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊椎軸腫瘍、脳幹グリオーマ）が挙げられる。
【０２３６】
特定の実施形態では、状態および障害は、ＣＤ１９関連疾患、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、任意によりホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含む。ここで、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺＬ）、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球リンパ腫（慢性リンパ性白血病、ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、またはヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含む。
【０２３７】
二重特異性ポリペプチド複合体は、単独で、または１つ以上のさらなる治療手段または治療薬と組み合わせて投与されてもよい。
【０２３８】
特定の実施形態では、癌、腫瘍、または増殖性疾患の治療に用いられる場合、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、化学療法、放射線治療、癌治療のための手術（例えば、腫瘍摘出）、１種以上の制吐薬または化学療法から生じる合併症のための他の治療薬、癌または関連する任意の医学的障害の治療で用いられる任意の他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。本明細書で用いられるように、「組み合わせて投与する」は、同じ医薬組成物の一部として同時に投与すること、個別の組成物として同時に投与すること、あるいは個別の組成物として異なるタイミングで投与することを含む。他の薬剤の前または後に投与される組成物は、その組成物と第二の薬剤が異なる経路で投与されても、本明細書で用いられる用語のように、「組み合わせて」投与されたと見なされる。可能であれば、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体と組み合わせて投与されるさらなる治療薬は、そのさらなる治療薬の製品情報シートに示された予定に従って、あるいはPhysicians' Desk Reference (Physicians' Desk Reference, 70th Ed (2016)) 、または当該分野でよく知られている試験規約に従って投与される。
【０２３９】
特定の実施形態では、治療薬は癌に対する免疫応答を誘導または増強させることができる。例えば、腫瘍ワクチンを用いて特定の腫瘍または癌に対する免疫応答を誘導してもよい。また、サイトカイン治療を用いて免疫系への腫瘍抗原提示を高めてもよい。サイトカイン治療の例としては、これらに限定されないが、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、および−γ）、コロニー刺激因子（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、および顆粒球−ＣＳＦ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）が挙げられる。また、例えば、ＴＧＦ−β阻害剤、ＩＬ−１０阻害剤、およびＦａｓリガンド阻害剤など、免疫抑制性標的を不活性化する薬剤を用いてもよい。他の薬剤群は、腫瘍または癌細胞に対する免疫応答性を活性化させるもの、例えば、Ｔ細胞活性化を高めるもの（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＯＸ−４０などのＴ細胞共刺激分子の作動薬）、および樹状細胞機能と抗原提示を高めるものを含む。
【０２４０】
キット
【０２４１】
本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含むキットをさらに提供する。実施形態によっては、これらキットは、生体試料中の目的の１種以上の標的の存在または量を検出する、あるいは標的を捕捉または富化するのに有用である。生体試料は、細胞または組織を含んでいてもよい。
【０２４２】
実施形態によっては、このキットは検出可能な標識に接合される本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含む。特定の他の実施形態では、このキットは、標識のない本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含み、この標識のない本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体に結合することができる第二の標識化抗体をさらに含む。このキットは、使用の指示と、キットの成分をそれぞれ分離する包装をさらに含んでいてもよい。
【０２４３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、基質または装置と関連づけられている。有用な基質または装置は、例えば、磁性ビーズ、マイクロタイタープレート、または試験片であってもよい。これらは、結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫グラフィックアッセイ、生体試料中の標的分子の富化に有用である場合がある。
【０２４４】
以下の実施例は、権利を主張する発明をよりよく例示するために提供されており、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。以下で記載するすべての特定の組成物、材料、および方法の全体あるいは一部が本発明の範囲内である。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定することを意図しておらず、本発明の範囲内の特定の実施形態を例示することのみを意図している。当業者は、発明的な能力を発揮することなく、また本発明の範囲を逸脱することなく等価の組成物、材料、および方法を開発してもよい。自明であるように、本発明の境界内に留まったまま本明細書に記載された手順に多くの変形をなすことができる。本発明者らは、その変形は本発明の範囲内に含まれることを意図している。
【実施例】
【０２４５】
実施例１：抗体とＴＣＲキメラタンパク質の設計および操作
【０２４６】
ＴＣＲ配列
【０２４７】
ＴＣＲは、２つの分子鎖で構成されるヘテロ二量体タンパク質である。約９５％のヒトＴ細胞はα鎖とβ鎖からなるＴＣＲを持つ。β鎖ＴＲＢＣ１に対して多くの結晶構造が利用可能であることを考慮して、本明細書で開示されるポリペプチド複合体（「ＷｕＸｉＢｏｄｙ」）を設計する主鎖としてＴＲＢＣ１配列を選んだ。ＴＲＢＣ１の典型的なアミノ酸配列は、Protein Data Bgank (PDB)構造４Ｌ４Ｔに見られる。
【０２４８】
ＴＣＲの鎖間ジスルフィド結合
【０２４９】
ＴＣＲ結晶構造を用いて本発明のＷｕＸｉＢｏｄｙ設計を導いた。Ｔ細胞表面の膜のに固定されている天然のＴＣＲとは異なり、可溶性ＴＣＲ分子は、その三次元構造は抗体Ｆａｂに非常に似ているが安定性が低い。事実、用いる可溶性条件でのＴＣＲの不安定性は、その結晶構造の解明を妨げる大きな障害である(Wang 2014, 上記参照)。本発明者らは、ＴＣＲ定常領域にシステイン突然変異の対合を導入する方法を取り、これが有意に鎖会合体を向上させて、発現を高めることができることを見い出した。
【０２５０】
抗体の可変領域とＴＣＲ定常領域を結合する結合部、これらの相対的な融合方向、並びにＦｃ結合接合部は、すべて慎重に細かく調整して安定した機能的WuXiBodyを作製した。ＴＣＲ構造は抗体Ｆａｂに非常に似ているので、ＴＣＲ可変領域に抗体Ｆｖ相同性モデルを重ね合わせた（ＰＤＢ  ４Ｌ４Ｔ、図２）。重ね合わせた構造は、抗体ＦｖがＴＣＲ定常領域と構造的に互換性があることを示している。この構造的な配列と対応する配列に基づき、すべての関連する操作パラメーターを設計した。実施例２に適切な結合領域を開示する。
【０２５１】
実施例２：二重特異性抗CD13×CD19 WuXiBody
【０２５２】
カニクイザルＣＤ１９発現細胞株の生成
【０２５３】
完全な長さのヒトまたはカニクイザルＣＤ１９の遺伝子をクローンしてｐｃＤＮＡ３．３ベクターに導入した。次いで、Lipofectamine 2000を用いて、各発現ベクターをそれぞれＣＨＯ−Ｋ１細胞に形質移入した。細胞を１０％のＦＢＳと共にＦ１２−Ｋで培養した。形質移入の２４〜４８時間後にブラストサイジンを加えた。選択したものを２世代または３世代継代後、細胞をＰＥ接合抗ＣＤ１９抗体と抗ＰＥマイクロビーズ(Miltenyi-013-048-801)により富化した。安定した単一の細胞クローンを限界希釈により単離して、抗ＣＤ１９抗体を用いてＦＡＣＳでスクリーニングした。
【０２５４】
標的発現腫瘍株
【０２５５】
Ｒａｊｉ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞をATCCから得た。Ｒａｍｏｓ細胞をECACCから得た。すべての腫瘍細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳで培養した。
【０２５６】
WuXiBody W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPおよびW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの生成
【０２５７】
既存の実験室のＤＮＡ鋳型からＰＣＲによりＶＬ、ＶＨ、Ｃｋ、ＣＨ１遺伝子を増幅した。ＣαおよびＣβ遺伝子はGenewiz Inc.により作製された。天然の抗ＣＤ１９軽鎖遺伝子または抗ＣＤ３キメラ軽鎖遺伝子を、ＣＭＶプロモーターとκシグナルペプチドを含む線状化ベクターに挿入した。抗CD3 VH-CβのＤＮＡ断片を、ノブ（knob）突然変異を持つヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ定常領域ＣＨ２−ＣＨ３を含む線状化ベクターに挿入した。抗CD19 VH-CH1のＤＮＡ断片を、ホール（hole）突然変異を持つヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ定常領域ＣＨ２−ＣＨ３を含む線状化ベクターに挿入した。このベクターは、ＣＭＶプロモーターとヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む。
【０２５８】
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPとW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの発現および精製
【０２５９】
Ｅｘｐｉ２９３発現システムキット(ThermoFisher-A14635)を用いて、製造者の指示に従って重鎖発現プラスミドと軽鎖発現プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞に共形質移入した。形質移入の5日後、上清を採取して、Ａタンパク質カラム(GE Healthcare-17543802)とさらにサイズ排除カラム(GE Healthcare-17104301)を用いてタンパク質を精製した。抗体濃度をNano Dropにより測定した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとＨＰＬＣ−ＳＥＣで評価した。
【０２６０】
ＦＡＣＳによる標的の結合
【０２６１】
ＪｕｒｋａｔとＲａｍｏｓを用いて、二重特異性抗体のＣＤ３発現細胞とＣＤ１９発現細胞との結合をそれぞれ評価した。アイソタイプ対照として、無関係の抗体を用いた。細胞を１０5細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート(Corning-3799)に広げて、ＰＢＳ／１％のＢＳＡで洗浄した。抗体を連続希釈して、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。ＰＥ結合ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体(Jackson-109-115-098)を用いて検出した。洗浄および再懸濁後、細胞をフローサイトメトリー(Canto II, BD Bioscience)で分析した。データをFlowJoソフトウェアを用いて分析した。４パラメーター非直線回帰分析を用いてPrism GraphPadソフトウェアによりＥＣ50値を算出した。
【０２６２】
カニクイザルＣＤ３への結合
【０２６３】
タンパク質結合ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体のカニクイザルＣＤ３への結合を試験した。９６ウェル高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート(Nunc MaxiSorp, ThermoFisher, Thermo-442404)を４℃で一晩、１μｇ／ｍｌのカニクイザルＣＤ３εタンパク質(Acro,#CDE-C5226)の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（２０ｍＭのＮａ2ＣＯ3、１８０ｍＭのＮａＨＣＯ3、ＰＨ９．２）１００ｕｌで被覆した。すべてのウェルを１ウェルあたり３００μＬのＰＢＳ／０．５‰のTween-20(v/v)で一回洗浄した。次いで、ウェルを室温で１時間、１ウェルあたり２００μＬのＰＢＳ／２％のＢＳＡ(BOVOGEN,＃BSAS)で遮断し、１ウェルあたり３００μＬのＰＢＳ／０．５‰のTween-20(v/v)で３回洗浄した。一次抗体の結合のため、ＰＢＳ／２％のＢＳＡで連続希釈したＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体を適切なウェルに加えて、室温で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌの二次抗体のヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ(Bethyl, #A80-304P)を１００ｕｌ加えた。プレートを室温で１時間インキュベートして、その後、上記のように６回洗浄した。結合の検出のため、暗室にて室温で１０分間、１００ｕｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液(Sigma-860336)をすべてのウェルに加えて、２ＭのＨＣｌ（１００ｕｌ）で反応を停止した。SpectraMax（登録商標）Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０吸光度を測定して、二重特異性抗体のカニクイザルＣＤ３との結合の度合いを決定した。適切であれば、４パラメーター非直線回帰分析を用いてGraphPad Prism5ソフトウェアにを用いて結合ＥＣ50値を得た。
【０２６４】
カニクイザルＣＤ１９への結合
【０２６５】
ＣＨＯＫ１細胞表面に発現したカニクイザルＣＤ１９標的タンパク質へのＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体の結合をフローサイトメトリー分析により決定した。手短に言うと、カニクイザルＣＤ１９を過剰発現させた安定細胞株(WBP701.CHOK1.cPro1.C9、WuXi Biologic)をトリプシンで採取して、１×１０6細胞／ｍｌの１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ溶液に希釈した。１×１０5細胞／ウェル（１００ｕｌ）を９６ウェルＵ−プレート(Corning,#3799)の各ウェルに加えて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し(Eppendorf, #5810R)、上清を除去した。１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳで連続希釈した抗体を１００ｕｌ／ウェルでペレット化した細胞に加えて、４℃で１時間インキュベートした。関連しないｈＩｇＧ４抗体をアイソタイプ対照として用いた。細胞を４℃で５分間１５００ｒｐｍで遠心分離して、１８０ｕｌ／ウェルの１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳで２回洗浄した。暗室でペレット化した細胞を４℃で３０分間、１００ｕｌ／ウェルの蛍光標識抗ヒトIgG Fc抗体(Jackson,＃109-115-098)（１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳで１：１５０に希釈）に再懸濁した。次いで、上記のように細胞を２回洗浄した。最終洗浄後、細胞を８０ｕｌの１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳに再懸濁して、蛍光値をFACS Canto II cytometer (BD Bioscience)で測定した。細胞表面に結合した抗ＣＤ１９＆ＣＤ３二重特異性抗体の量を平均蛍光（ＭＦＩ）を測定して評価した。FlowJoソフトウェアでＦＡＣＳ生データを分析して、抗体を含まないウェルまたは二次抗体のみを含むウェルを用いて背景蛍光を確立した。４パラメーター非直線回帰分析を用いてGraphPad Prism5ソフトウェアを用いて結合ＥＣ50値を得た。
【０２６６】
ＦＡＣＳによる親和性
【０２６７】
ＣＤ３およびＣＤ１９への結合親和性は、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を用いてフローサイトメトリーにより決定された。細胞を５×１０4細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ−底部プレート(BD)に移した。試験する抗体を１％の１×ＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：２倍に連続希釈し、４℃で１時間、細胞と共にインキュベートした。次いで、プレートを１５００ｒｐｍで４分間、遠心分離して、上清を捨てた。二次抗体のＡｌｅｘａ６４７結合ヤギ抗ヒトIgG Fc(Jackson, Cat# 109-605-098)またはＦＩＴＣ結合ヤギ抗Ｈｉｓ(Bethyl, Cat# A190-113F)を再懸濁した細胞に加えて、暗室にて４℃で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄して、１００μＬの１×ＰＢＳ／１％のＢＳＡに再懸濁させた。蛍光強度をフローサイトメトリー(BD Canto II)で測定し、FlowJoで分析した。定量ビーズ(Quantum（登録商標） MESF Kits, Bangs Laboratorie)に基づいて蛍光強度を結合分子／細胞に変換した。Graphpad Prism5でＫDを算出した。
【０２６８】
標的細胞表面の二重結合
【０２６９】
CD3 T細胞とCD19 B細胞を架橋する二重特異性抗体の能力をＦＡＣＳで試験した。３７℃で３０分間、１×１０6細胞／ｍｌの密度でＪｕｒｋａｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を２０ｎＭのCellTrace Far Red (Invitrogen-C34564)と５０ｎＭのカルセイン-AM (Invitrogen-C3099)で別々に予め標識した。予め標識した細胞ペレットをＰＢＳ／１％のＢＳＡで２回洗浄して、１：１で混合し、最終密度１×１０6細胞／ｍｌとした。細胞混合物を遠心分離して、１０ｎＭの抗体で再懸濁し、その後、１時間インキュベートした。インキュベーションの直後に細胞混合物をフローサイトメトリーで分析した。架橋百分率を、Far-Redとカルセインで同時に標識された事象の百分率として算出した。
【０２７０】
細胞毒性アッセイ
【０２７１】
Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17-1440-03)密度遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヘパリン化静脈血液から単離した。次いで、エフェクター細胞として用いたＣＤ８+Ｔ細胞の富化のため、得られたＰＢＭＣをEasySep (Stemcell-19053)カラムに通した。ＣＤ８+Ｔ細胞による腫瘍細胞溶解を媒介する抗体の有効性をフローサイトメトリーにより決定した。細胞毒性アッセイでは、３７℃で３０分間、標的細胞としてのRaji CD19 B細胞を２０ｎＭのCellTrace Far Red (Invitrogen-C34564)で予め標識し、次いで、１％ＦＢＳで栄養補充したフェノールを含まないRPMI 1640 (Invitrogen-11835030)で細胞ペレットを２回洗浄した。Far Red染色したＲａｊｉ（１ウェルあたり２００００細胞）を単離ＣＤ８+Ｔ細胞（エフェクター／標的細胞の比が５：１）と連続希釈された抗体と共に３７℃で４時間、９６ウェル丸底プレート(Corning-3799)でインキュベートした。インキュベーション後、死細胞を同定するため、３μＭのヨウ化プロピジウム(PI, Invitrogen-P3566)を全体に混合した。１５分間後、FACSCanto II cytometerを用いて細胞をフローサイトメトリーで分析した。Ａｂ媒介細胞毒性は、Far Red陽性標的細胞におけるＰＩ陽性標的細胞の百分率として規定してもよい。Prismを用いて細胞毒性のＥＣ50を決定した。
【０２７２】
Ｔ細胞活性化アッセイ：分泌されたサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ
【０２７３】
Ｔ細胞が活性化されたか否かは、上清に分泌されたＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの量に反映された。ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の単離手順は、項「Ｔ細胞活性化（細胞内サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ染色）」に記載した。ＲａｊｉヒトＢ細胞（２×１０4細胞／ウェル）、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞（１×１０5細胞／ウェル）、および抗体の混合物を３７℃で２４時間共インキュベートした。上清を採取後、反応混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清中のＴＮＦ−αとＩＦＮ−γの量をそれぞれ、ヒトTNF ELISAセット(R&D-DY210)およびヒトIFN-γ ELISAセット(Capture Ab: Thermo Fisher-M700A, Detection Ab: Thermo Fisher-M701B, 標準物質: PEROTECH- 300-02)で決定した。
【０２７４】
サンドイッチＥＬＩＳＡの手順は以下の通りであった。キットの仕様書に従って、４℃または室温で一晩、９６ウェル高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート(ThermoFisher-442404) を炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（２０ｍＭのＮａ2ＣＯ3、１８０ｍＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．２）の５０μｌ／ウェルの捕捉抗体で被覆した。すべてのウェルを１ウェルあたり３００μｌのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄した。アッセイの以下の洗浄工程はすべて同時に行った。次いで、ＴＮＦ−αはＰＢＳ／２％のＢＳＡ(BovoGen Biologicals-BSAS)、ＩＦＮ−γは１００％のカゼイン(Pierce-37528)でウェルを１時間ブロックして、３回洗浄した。その後、室温で１時間上記の採取した上清または標準物質（５０μｌ／ウェル）と結合させた後、３回洗浄した。検出抗体の結合のため、ＴＮＦ−αはＰＢＳ／２％のＢＳＡで、ＩＦＮ−γは５０％のカゼインで希釈した対応する抗体を適切なウェルに加えて、室温で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄して、５０μｌの二次抗体ＳＡ−ＨＲＰを加えた。プレートを室温で１時間インキュベートして、上記のように６回洗浄した。結合の検出のため、５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液(Sigma-860336)を１０分間すべてのウェルに加えて、５０μｌの２ＭのＨＣｌで反応を停止した。SpectraMax（登録商標）Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０吸光度を測定して、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γの量を決定した。
【０２７５】
Ｔ細胞活性化アッセイ：表面マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現
【０２７６】
Ｔ細胞が活性化されたか否かは、表面受容体ＣＤ２５とＣＤ６９の染色信号に反映された。ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の単離手順は、項「Ｔ細胞活性化（細胞内サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ染色）」に記載した。ＲａｊｉヒトＢ細胞（２×１０4細胞／ウェル）、ＣＤ４またはCD8 T細胞（１×１０5細胞／ウェル）、および抗体の混合物を３７℃で２４時間共インキュベートした。１％のＢＳＡで１回洗浄後、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４(BD-550628）またはPerCpCy5.5マウス抗ヒトＣＤ８(BD-560662)、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ６９(BD-560968）およびＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ２５(BD-555434)染色緩衝液で細胞ペレットを再懸濁させた。その後、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄した後、フローサイトメトリーでＦＩＴＣ陽性またはPerCpCy5.5陽性細胞中のＰＥ陽性およびＡＰＣ陽性細胞の百分率を決定した。
【０２７７】
熱安定性（ＤＳＦ）
【０２７８】
QuantStudio（登録商標） 7 FlexリアルタイムＰＣＲシステム (Applied Biosystems)を用いて抗体の融解温度（Ｔｍ）を調べた。１９μＬの抗体溶液を１μＬの62.5 X SYPROオレンジ溶液(Invitrogen)と混合し、９６ウェルプレート(Biosystems)に移した。プレートを０．９℃／分の速度で２６℃から９５℃に加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に対する蛍光変化の負の導関数を算出し、最大値を融解温度Ｔｍとして規定した。タンパク質のアンフォールディングが複数回あった場合、最初の２つのＴｍをＴｍ１およびＴｍ２として報告した。データの収集とＴｍの計算は操作ソフトウェアにより自動で行った。
【０２７９】
血清の安定性
【０２８０】
選択した提供者からヒト血液を新たに集めて、抗凝血剤を含まないポリスチレン管に入れた。３０分間室温で静置した後、ヒト血液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清層を採取した。血清が透明になるまで遠心分離工程を繰り返した。採取した血清で１：９の比での検出下、抗体を混合して、示した時間、０日目、１日目、４日目、７日目、および１４日目に一部を３７℃で取り出した。試料を異なる時点で液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。試料をＦＡＣＳで分析して、血清治療をしていない対応する抗体と比べてJurkat CD3 T細胞およびRamos CD19 B細胞に対する結合能を評価した。
【０２８１】
ＳＰＲによるＦｃγ受容体結合親和性
【０２８２】
Biacore T200(またはBiacore 8K)を用いてＦｃγＲに対する抗体の結合親和性を検出した。各受容体を抗ｈｉｓ抗体固定化ＣＭ５センサーチップ(GE)で捕捉した。異なる濃度の抗体を３０ｕＬ／分の流量で、６０秒の会合相、その後、６０秒の解離でセンサーチップに注入した。次いで、各結合サイクル後にチップを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）で再生した。
【０２８３】
黒色表面と緩衝液流路のセンサーグラムを試験センサーグラムから減じた。Langmiur分析（ＦｃγＲＩの場合）あるいは定常状態モデル（他の受容体の場合）を用いて１：１モデルで実験データをフィッティングした。分子量１５０ＫＤａを用いて抗体のモル濃度を算出した。
【０２８４】
ＥＬＩＳＡによるＣ１ｑ結合
【０２８５】
４℃で一晩、３μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレート(Nunc)を抗体試料で被覆した。ブロッキングと洗浄後、Ｃ１ｑを６００μｇ／ｍＬから始めて勾配希釈し、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄して、次いで、ヒツジ抗ヒトC1q Ab-HRPと共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を加えて、相互作用を２ＭのＨＣｌで停止した。マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０２８６】
ＳＰＲによるＦｃＲｎ結合親和性
【０２８７】
Biacore T200(またはBiacore 8K)を用いてＦｃＲｎに対する抗体結合親和性を検出した。各抗体をＣＭ５センサーチップ(GE)に固定した。測定用緩衝液（５０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中の異なる濃度のＦｃＲｎを、６０秒の会合相、その後、６０秒の解離で３０ｕＬ／分の流量でセンサーチップに注入した。次いで、各結合サイクル後にチップを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再生した。
【０２８８】
黒色表面と緩衝液流路のセンサーグラムを試験センサーグラムから減じた。実験データを定常状態モデルによりフィッティングした。分子量４５ＫＤａを用いてＦｃＲｎのモル濃度を算出した。
【０２８９】
マウスＲａｊｉ／ＰＢＭＣモデルにおける有効性の研究
【０２９０】
空気中、３７℃、５％のＣＯ2の雰囲気でＲａｊｉ腫瘍細胞(ATCC（登録商標） CCL-86（登録商標）)を１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで栄養補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で単層培養物としてインビトロで維持した。腫瘍細胞を週２回、定法により継代した。指数関数的成長相で成長する細胞を採取して、腫瘍の接種のために計測した。
【０２９１】
Ficoll-Paque Plusを用いて製造者の指示に従ってヒトＰＢＭＣをヘパリン全血から単離した。
【０２９２】
０日目に、Ｒａｊｉ腫瘍細胞、マトリゲル、新しいＰＢＭＣを０．２ｍｌのＰＢＳに混合したものを各マウスの右脇腹の皮下に共接種した。３日目に抗体注射液を行った（週に２回の静脈注射を４回）。
【表１３】
2020534035.tif 000015
【０２９３】
腫瘍の測定とエンドポイント
【０２９４】
主なエンドポイントは、腫瘍の成長が遅れたか否か、あるいはマウスが治癒したか否かを調べることであった。カリパスを用いて二次元の腫瘍の大きさを週２回測定した。式V = 0.5a×b2を用いて体積をｍｍ3で表した。ここで、ａおよびｂはそれぞれ、腫瘍の長径と短径である。Ｔ／Ｃ値（パーセント）は抗癌有効性の指標である。
【０２９５】
式TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100を用いて各群のＴＧＩを算出した。Ｔｉは、所与の日の治療群の平均腫瘍体積、Ｔ０は治療開始日の治療群の平均腫瘍体積、ＶｉはＴｉと同じ日の媒体対照群の平均腫瘍体積、およびＶ０は治療開始日の媒体群の平均腫瘍体積である。
【０２９６】
カニクイザルＰＫ、毒性および免疫原性
【０２９７】
１匹のオスと１匹のメスのカニクイザルにＷＢＰ３４３８を１ｍｇ／ｋｇで１回、静脈内急速静注投与により投与した。製剤は、２０ｍＭのNaAc-HAc、7.0%(w/w)スクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ｐＨ５．０で処方した。ＰＫ血液試料を投与前（−１日目）、０．２５時間、０．５時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、３日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に採取した。抗薬物抗体（ＡＤＡ）試料を３日目、１４日目（３１２時間）、および２８日目（４８０時間）に採取した。
【０２９８】
血清試料中のＷＢＰ３４３８およびＡＤＡの血清濃度をＥＬＩＳＡで決定した。Phoenix WinNonlinソフトウェア（バージョン６．３, Pharsight, Mountain View, カリフォルニア州）を用いてサルのＷＢＰ３４３８の血清濃度を非区画薬物動態分析にかけた。ＰＫパラメーターを得るのに線形／対数台形公式を用いた。
【０２９９】
一般的な健康と外観、特に皮膚の炎症についてケージでの観察を行った。血液学（ＣＢＣ）のための全血液試料分析と化学検出のための血清分析を、それぞれ血液分析器(ADVIA2120)および化学(HITACHI 7180)により決定した。
【０３００】
結果
【０３０１】
カニクイザルＣＤ１９発現細胞株の生成
【０３０２】
カニクイザルＣＤ１９発現細胞株WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9の発現をフローサイトメトリーにより抗ＣＤ１９抗体を用いて検出した。WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9は、サルＣＤ１９の高い発現を示した（図５）
【０３０３】
WuXiBodyの生成および最適化
【０３０４】
図１は、試験した抗体と形式の概略図を示す。抗ＣＤ３抗体Ｔ３と抗ＣＤ１９抗体Ｕ４の両方が開発された。通常の抗体に直交する固有の軽鎖・重鎖界面を設計するため、Ｔ３の定常領域（ＣＬおよびＣＨ１）はＴＣＲの定常領域と置換された。Ｆｃドメインに「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異と結合したＴＣＲ改変Ｔ３と天然のＵ４を用いて二重特異性抗体形式Ｅ１７とＦ１６を設計した。
【０３０５】
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPとW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPに由来する抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９結合部分の可変重鎖配列および軽鎖配列を以下に示す。
【表１４】
2020534035.tif 000016
【０３０６】
完全な長さのW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPとW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP配列を以下に示す。
【表１５】
2020534035.tif 000017
【表１６】
2020534035.tif 000018
【０３０７】
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの作製
【０３０８】
抗体W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの発現力価は、一過性発現を通して９０ｍｇ／Ｌより高い。２工程精製の後、W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの純度は９７．５％に達する（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、図７）。W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPは、２つの重鎖と２つの軽鎖に対応する還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけの分子質量が７５ｋＤａ、５５ｋＤａ、および２５ｋＤａで移動する。２つの軽鎖は、同じくらいの分子量なので重なっていることがある。抗体は、完全な二重特異性分子を示す非還元条件で見かけ分子質量２００ｋＤａで移動する（図６）。
【０３０９】
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの作製
【０３１０】
抗体W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの発現力価は、一過性発現を通じて１００ｍｇ／Ｌより高い。２工程精製の後、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの純度は９５％に達する（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、図９）。W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPは、２つの重鎖と２つの軽鎖に対応する還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけ分子質量が５４ｋＤａ、５６ｋＤａ、および、２５ｋＤａで移動する。２つの軽鎖は、同じくらいの分子量であるので重なっていることがある。抗体は、完全な二重特異性分子を示す非還元条件で見かけ分子質量１５０ｋＤａで移動する（図８）。
【０３１１】
標的結合
【０３１２】
Ｒａｍｏｓ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞についてW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＣＤ１９およびＣＤ３への結合をフローサイトメトリーにより試験した（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。抗体W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPは、Ｒａｍｏｓ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞に対して強い結合活性を示し、ＥＣ50値がそれぞれ１５．６ｎＭと４７ｎＭであった。
【０３１３】
Ｒａｍｏｓ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞について、W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPのＣＤ１９およびＣＤ３への結合をフローサイトメトリーにより試験した（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。抗体W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPは、Ｒａｍｏｓ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞に対して強い結合活性を示し、ＥＣ50値がそれぞれ１．８ｎＭと１９．３ｎＭであった。
【０３１４】
交差種結合
【０３１５】
WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9細胞（ＣＤ１９発現細胞）について、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのカニクイザルＣＤ１９への結合をフローサイトメトリーにより試験した（図１２）。結合ＥＣ50は２６ｎＭであった。W331-cynoPro1.ECD.His（カニクイザルＣＤ３εタンパク質）を用いて、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのカニクイザルＣＤ３への結合をＥＬＩＳＡにより試験した（図１３）。結合ＥＣ50は０．０４ｎＭであった。
【０３１６】
標的細胞に対する親和性
【０３１７】
Ｒａｍｏｓ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞について、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのヒトＣＤ１９およびＣＤ３への結合親和性をフローサイトメトリーにより試験した。結合ＩｇＧに対する結合ＩｇＧ／遊離ＩｇＧを図１４Ａ〜図１４Ｂにプロットした。ＣＤ１９およびＣＤ３への結合のフィッティングしたＫD値は、それぞれ２３ｎＭと９．０ｎＭであった。
【０３１８】
標的細胞表面の二重結合
【０３１９】
フローサイトメトリーにより、予め標識したＪｕｒｋａｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を用いてＣＤ３  Ｔ細胞およびＣＤ１９  Ｂ細胞を架橋するW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの活性を試験した（図１５Ａ〜図１５Ｂ）。Ｑ２は、架橋されたＪｕｒｋａｔ細胞およびＲａｊｉ細胞の集団を示す。陰性対照に比べて、細胞の約１８％が二重特異性抗体W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPを介して架橋された。
【０３２０】
細胞毒性アッセイ
【０３２１】
ＣＤ８+Ｔ細胞とｒａｊｉ細胞を用いてW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの細胞毒性活性を評価した。W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPは、４時間のインキュベーション後、素早く有効な細胞溶解を誘導し（図１６Ａ）、ＥＣ50値は１５ｎＭであった。最大細胞殺傷百分率は９０％であった。
【０３２２】
ＣＤ８+Ｔ細胞とｒａｊｉ細胞を用いてW3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPの細胞毒性活性を評価した。W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SPは、４時間のインキュベーション後、素早く有効な細胞溶解を誘導し（図１６Ｂ）、ＥＣ50値は３．２ｎＭであった。最大細胞殺傷百分率は９０％であった。
【０３２３】
標的特異的なＴ細胞活性化
【０３２４】
ＣＤ１９+標的細胞の存在／非存在下での活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５を介したＴ細胞活性化を示すアッセイで、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPを調べた。その結果から、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPはＣＤ１９+標的細胞の存在下でのみ投与量に依存してＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を誘導することが示された（図１７Ａ〜図１７Ｄ）。Ｂ細胞が存在しないと、ＣＤ４+Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８+Ｔ細胞サブセットの両方でＣＤ２５とＣＤ６９の発現は観察されなかった。
【０３２５】
また、ＣＤ１９+標的細胞の存在／非存在下でサイトカイン放出のＴ細胞活性化アッセイにおいてW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPを調べた。その結果から、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPは、ＣＤ１９+標的細胞の存在下でのみ投与量に依存してＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの放出を誘導することが示された（図１８Ａ〜図１８Ｄ）。Ｂ細胞が存在しないと、ＣＤ４+Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８+Ｔ細胞サブセットの両方でＩＦＮ−γとＴＮＦ−αは検出されなかった。
【０３２６】
熱安定性
【０３２７】
リアルタイムＰＣＲを用いてW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの熱安定性を調べた。W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＴm１とＴm２ は６０．２℃、７２．７℃であった。
【０３２８】
血清安定性
【０３２９】
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPを血清中、３７℃で１４日間インキュベートした。０日、１日、４日、７日、および１４日間インキュベートした抗体の結合活性をフローサイトメトリーにより検出した。その結果から、１４日間ヒト血清中でインキュベートした後のW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＣＤ３細胞およびＣＤ１９細胞に対する結合活性は変わらなかった（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。
【０３３０】
Ｆｃγ受容体結合
【０３３１】
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのFcγRI、FcγRIIa(H167)、FcγRIIa(R167)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F176)、FcγRIIIa(V176)、およびFcγRIIIbに対する結合活性をＳＰＲで調べた。表１に親和性をまとめた。W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPは、すべてのＦｃγ受容体に対して典型的なヒトＩｇＧ４結合親和性を示した。
【表１７】
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【０３３２】
ＥＬＩＳＡにより抗体のＣ１Ｑに対する結合活性を試験した。W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPはＥＬＩＳＡで結合信号を示さなかった（図２０）が、対照ヒトＩｇＧ１抗体は通常の結合信号を示した。
【０３３３】
ＦｃＲｎ結合
【０３３４】
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPのＦｃＲｎへの結合をＳＰＲによりｐＨ６．０で試験した。親和性は２．５８μＭとしてフィッティングした。これはＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ４の典型的な親和性である。
【０３３５】
インビボの特徴付け
【０３３６】
ＰＢＭＣ／Ｒａｊｉ異種移植モデルにおける有効性の研究
【０３３７】
本研究では、ＮＯＧマウスにＲａｊｉ細胞を担持させた混合ＰＢＭＣヒト化モデルでのW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの抗腫瘍有効性を調べた。図２１に腫瘍成長曲線を示す。
【０３３８】
１４日目にアイソタイプ対照治療群の平均腫瘍サイズは３４２ｍｍ3に達した。１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇのＷ３４３８−Ｔ３Ｕ４．Ｅ１７−１．ｕＩＧ４．ＳＰで治療すると有意な抗癌活性が得られた。平均腫瘍サイズは、それぞれ、７８ｍｍ3（Ｔ／Ｃ＝２３．０％、ＴＧＩ＝９３．９％、ｐ＝０．０１６）および７５ｍｍ3（Ｔ／Ｃ＝２２．０％、ＴＧＩ＝９５．３％、ｐ＝０．０１４）であり、高投与量群の１匹の動物の腫瘍は根絶された。非常に低い投与量（０．０６ｍｇ／ｋｇ）のW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPは抗癌活性を全くしめさなかった。
【０３３９】
カニクイザルにおけるＷｕＸｉＢｏｄｙの薬物動力学
【０３４０】
ＥＬＩＳＡによりカニクイザル血清におけるW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの濃度を試験した（図２２）。算出したＰＫパラメーターを表２に示す。１ｍｇ／ｋｇの１回の単回静脈注射液でのW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの半減期は１５２時間であった。チンパンジーでの半減期が非常に短い（１．５〜２．６時間）ブリナツモマブ(European Medicines Agency評価報告EMA/CHMP/469312/2015)に比べて、W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPはサルで非常に長い半減期を示した。
【表１８】
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【０３４１】
毒性
【０３４２】
本研究の全過程ですべてのサルは薬物に十分に忍容性であった。本研究の生存相中は有害効果は観察されなかった。食べ物の摂取および重量には明らかな変化はなかった。ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＷＢＣ、ＨＧＢ、およびＨＣＴを含む血液学と臨床化学のパラメーターは一般に基準範囲内であった。
【０３４３】
免疫原性
【０３４４】
投与の３日後、１４日後、および２８日後のW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの抗薬物抗体（ＡＤＡ）の結果を図２３Ａ〜図２３Ｂに示す。投与後３、１４及び２８日のサル血清中のW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPに対するＡＤＡの力価は、投与前と有意な差を示さなかった。従って、１ｍｇ／ｋｇでのW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SPの単回の静脈注射液はサルでは免疫原性ではないと思われる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ−１７Ｄ】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１８Ｃ−１８Ｄ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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