(57)【要約】ＩＬ−４及びＣＤ４０リガンドでＢ細胞の集団を処理することを含む、制御性Ｂ細胞の集団を増殖させるための方法が、本明細書中に提供される。本明細書では、Ｔｒｅｇ増殖条件下でＴ細胞集団を増殖させ、ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇを選択することを含む制御性Ｔ細胞集団を増殖させる方法をさらに提供する。制御性Ｂ細胞及び／又は制御性Ｔ細胞を用いて免疫障害を処置する方法もまた、本明細書中に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増殖させるためのインビトロの方法：
（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得ること；
（ｂ）Ｔｒｅｇ増殖条件下で前記ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団を培養し、それによって増殖したＴｒｅｇを産生すること；及び
（ｃ）前記増殖したＴｒｅｇからＣＤ９＋細胞を選択し、それによってＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの集団を得ること。
【請求項２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞としてさらに定義される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記選択がポジティブ選択としてさらに定義される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択が、ネガティブ選択としてさらに定義される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記選択が、ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇのためのソーティングを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
ソーティングが、抗体ビーズ選択、蛍光関連細胞選別（ＦＡＣＳ）、又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）としてさらに定義される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔｒｅｇ増殖条件が、ＴＣＲライゲーション、ＩＬ−２、及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＣＲライゲーションが、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔｒｅｇ増殖条件が、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）アゴニスト、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、アデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）、及び／又はＡ２ＡＲアゴニストの存在下でＣＤ４＋  Ｔ細胞を培養することをさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養が１０〜１４日間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得ることが、幹細胞、骨髄、末梢血、又は臍帯血からＴ細胞を単離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得ることが、プールされた臍帯血からＴ細胞を単離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記単離が、抗体ビーズ選択又は蛍光関連細胞選別（ＦＡＣＳ）を行うことを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＴｒｅｇが、グルココルチコイド受容体の発現を減少させるか、又は本質的に全く発現しないように操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＴｒｅｇが、１以上のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９酵素を用いて操作される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＴｒｅｇが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＴｒｅｇが、自殺遺伝子を発現するように操作される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記自殺遺伝子が、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３、又は誘導性カスパーゼ９である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって産生される、ＣＤ９＋制御性Ｔ細胞の集団。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＣＤ９＋制御性Ｔ細胞の集団及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
抑制性制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）を増殖させるインビトロの方法であって、以下を含む：
（ａ）Ｂ細胞の集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ−４、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の存在下で前記Ｂ細胞を培養すること；並びに
（ｃ）ＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、並びに、ＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤、の存在下で、前記Ｂ細胞をさらに増殖させ、それによって抑制性Ｂｒｅｇを産生すること。
【請求項２３】
前記工程（ｂ）及び／又は工程（ｃ）が、１つ以上の追加のサイトカインをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加のサイトカインが、ＩＬ−３３である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程（ｂ）の培養が、ＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び／又はＳＴＡＴ６阻害剤の存在をさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記増殖工程の前に前記Ｂ細胞を洗浄することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ４０Ｌが可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＦＯＸＯ１阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＦＯＸＯ１阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
ｍＴＯＲ阻害剤が、トルキニブ、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、デフォロリムス、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＢＥＺ２３５、ゲダトリシブ、又はＳＦ１１０１である、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
ｍＴＯＲ阻害剤が、トルキニブである、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
ＳＴＡＴ６阻害剤が、ＡＳ１５１７４９９又はレフルノミドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
ＳＴＡＴ６阻害剤が、ＡＳ１５１７４９９である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
さらにＢｒｅｇをａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
Ｂ細胞の集団を得ることが、血液サンプルからＢ細胞を単離することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離が、抗体ビーズ選択又は蛍光関連細胞選別（ＦＡＣＳ）を行うことを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記血液サンプルが末梢血又は臍帯血である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記血液サンプルが臍帯血（ＣＢ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記臍帯血が、２つ以上の個々の臍帯血ユニットからプールされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記臍帯血が、３、４、又は５個の個々の臍帯血単位からプールされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｂ細胞の集団が、ＣＢ単核細胞（ＣＢＭＣ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｂ細胞の集団が、ＣＤ５＋ＣＤ１ｄｈｉ  Ｂ細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｂ細胞の集団が、全Ｂ細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｂｒｅｇが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｂｒｅｇが、ヒトＢｒｅｇである、請求項２２に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養が、１〜５日間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４７】
前記増殖が、５〜１０日間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４８】
請求項２２〜４７のいずれか一項に記載の方法に従って産生された制御性Ｂ細胞の集団。
【請求項４９】
請求項４８に記載の制御性Ｂ細胞の集団及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
治療有効量の請求項２０の抑制性Ｔｒｅｇ及び／又は請求項４８の抑制性Ｂｒｅｇを対象に投与することを含む、対象における免疫障害を治療する方法。
【請求項５１】
前記対象がグルココルチコイド治療を受けたか、又は現在受けている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫障害が、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、又は自己免疫疾患である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇが、同種異系である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇが、自己由来である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫障害が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＧＶＨＤが慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、臍帯血移植（ＣＢＴ）を以前に投与されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇが、前記ＣＢＴと同時に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇが、前記ＣＢＴの前又は後に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫障害が移植拒絶であり、移植片が臓器移植片、骨髄又は他の細胞移植片、複合組織移植片、又は皮膚移植片である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息又はシェーグレン症候群である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
対象がヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
さらに少なくとも第２の治療剤を投与することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも第２の治療剤が、治療有効量の免疫調節剤又は免疫抑制剤である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、又はケモカイン若しくはインターロイキンの阻害剤である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｔｒｅｇ、Ｂｒｅｇ、及び／又は少なくとも第２の治療剤が、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下、局所的に、又は直接注射もしくは潅流によって投与される、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１７年６月２２日に出願された米国仮出願第６２／５２３，６３７号の優先権の利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［シークエンスリストの編入］
「UTFCP1312WO.txt」という名前のファイル（Microsoft Windowsで測定）は２  ＫＢであり、２０１８年６月２２日に作成された配列リストは、電子提出により本明細書に提出され、参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、HHSH234200737001C及びHHSH250201000011Cは、Health Resources and Services Administrationによって授与された助成金番号HHSH234200737001C及びHHSH250201000011Cのもとで政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
［技術分野］
本発明は、一般に、医学及び免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明が制御性Ｂ細胞及び制御性Ｔ細胞の産生並びにその使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
［関連技術の記載］
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）は、免疫応答を抑制し、自己免疫疾患に対して重要な役割を果たすことができ、そして移植寛容を提供することができる。末梢血は、これらの抑制性免疫細胞のわずかな割合しか含まないので、エクスビボでの増殖方法を用いて、免疫関連障害のインビボの治療又は予防のために十分な数の抑制性細胞を生成する。現在のＴｒｅｇ増殖に関するプロトコールはＴＣＲライゲーションとＩＬ−２（Ｈｅら、２０１６）を含んでおり、Ｂｒｅｇの増殖方法としては、ＢＣＲライゲーションとＣＤ４０リガンド（Ｔａｉｔａｎｏら、２０１６）を含んでいる。
【０００６】
しかしながら、炎症状態などにおいては、免疫療法は一般に、多数の細胞を必要とするため、産生されるＴｒｅｇ又はＢｒｅｇの数を最大にし、十分な数の抑制細胞を産生するのに必要な時間を最小にするために、インビトロでＴ又はＢ細胞増殖を誘導する方法を最適化することが重要である。従って、自己免疫、感染、癌、及びｃＧＶＨＤを含む種々の免疫障害の処置において使用するためのＴｒｅｇ又はＢｒｅｇを生成するための効率的な単離及び増殖方法のニーズが未だ満たされていない。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本開示の特定の実施形態は、Ｔｒｅｇ又はＢｒｅｇの増殖に関する方法及び組成物、並びに免疫介在性疾患の治療及び／又は予防におけるこれらの抑制性免疫細胞の使用のための方法を提供する。
【０００８】
第１の実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団（例えば、単離された集団）を得ること；Ｔｒｅｇ増殖条件下でＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団を培養し、それによって増殖したＴｒｅｇを産生すること；及び増殖されたＴｒｅｇからＣＤ９＋細胞を選択し、それによってＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの集団を得ることを含む、Ｔｒｅｇを拡大するインビトロ方法が提供される。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ９＋Ｔ細胞のようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞としてさらに定義される。
【０００９】
特定の態様において、選択は、ポジティブ選択としてさらに定義される。他の局面において、選択は、ネガティブ選択としてさらに定義される。いくつかの態様において、選択は、ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇのためのソーティングを含む。特定の局面において、ソーティングは、さらに抗体ビーズ選択、蛍光関連細胞選別（ＦＡＣＳ）、又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）として定義される。
【００１０】
いくつかの態様において、Ｔｒｅｇ増殖条件は、ＴＣＲライゲーション、ＩＬ−２、及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下でＣＤ４＋  Ｔ細胞を培養することを含む。特定の態様において、ＴＣＲライゲーションは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む。特定の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシンである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ増殖条件が腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）アゴニスト、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、アデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）、及び／又はＡ２ＡＲアゴニストの存在下でＣＤ４＋  Ｔ細胞を培養することをさらに含む。特定の態様において、培養は、１６日間、１０〜１４日間、８〜１０日間、９〜１５日間、又は１２〜１６日間、あるいは例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間である。
【００１１】
特定の態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団を得ることは、幹細胞、骨髄、末梢血、又は臍帯血からＴ細胞を単離することを含む。特定の態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団を得ることは、プールされた臍帯血、例えばプールされた臍帯血からＴ細胞を単離することを含む。いくつかの態様では、単離は、抗体ビーズ選択又はＦＡＣＳを実施することを含む。
【００１２】
さらなる態様では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＴｒｅｇは、グルココルチコイド受容体の発現を減少させるか、又は本質的に全く発現しないように操作される。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＴｒｅｇは、１つ以上のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９酵素を用いて操作される。
【００１３】
さらなる態様では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＴｒｅｇは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作される。
【００１４】
いくつかの態様では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＴｒｅｇは、自殺遺伝子を発現するように操作される。特定の局面において、自殺遺伝子は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３、又は誘導性カスパーゼ９である。
【００１５】
さらなる実施形態では、上記の実施形態及び態様、又は本発明に記載される方法のいずれかに従って産生されたＣＤ９＋制御性Ｔ細胞の集団、が提供される。
【００１６】
別の実施形態では、実施形態のＣＤ９＋制御性Ｔ細胞の集団及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
さらに別の実施形態では、Ｂ細胞の集団（例えば、単離された集団）を得ること；ＩＬ−４、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の存在下でＢ細胞を培養すること；並びに、ＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、並びに、ＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤、の存在下でＢ細胞をさらに増殖させ、それによって抑制性Ｂｒｅｇを産生することを含む、抑制性制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）を増殖させるインビトロ方法が提供される。
【００１８】
いくつかの態様では、増殖培養物は、１つ以上の培養工程において１つ以上の追加のサイトカインを含み得る。いくつかの態様では、追加のサイトカインは、ＩＬ−３３である。
【００１９】
特定の態様では、ＩＬ−４、ＣｐＧ、及びＣＤ４０Ｌの存在下での培養は、ＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び／又はＳＴＡＴ６阻害剤の存在をさらに含む。
【００２０】
いくつかの態様では、この方法は、増殖工程の前にＢ細胞を洗浄することをさらに含む。特定の態様では、培地は、増殖の任意の段階で、半分の培地を置換するなど、新鮮な培地と置換されてもよい。いくつかの態様において、培地交換は、ＩＬ−４及びシグナル伝達阻害剤を含む培地のような、培養工程と増殖工程との間である。
【００２１】
特定の態様では、ＣＤ４０Ｌは可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）である。いくつかの態様では、ＦＯＸＯ１阻害剤は、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である。特定の態様では、ＦＯＸＯ１阻害剤はＡＳ１８４２８５６である。いくつかの態様では、ｍＴＯＲ阻害剤がトルキニブ、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、デフォロリムス、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＢＥＺ２３５、ゲダトリシブ、又はＳＦ１１０１である。特定の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤はトルキニブである。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ６阻害剤は、ＡＳ１５１７４９９又はレフルノミドである。特定の態様では、ＳＴＡＴ６阻害剤はＡＳ１５１７４９９である。
【００２２】
さらなる態様では、この方法はさらに、Ｂｒｅｇをａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５と接触させる工程をさらに含む。Ｂｒｅｇは、増殖方法の任意の段階でａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５と接触させることができる。いくつかの態様では、ＢｒｅｇはＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、及び少なくとも１つの阻害剤の存在下での増殖後に、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５と接触される。
【００２３】
いくつかの態様では、Ｂ細胞の集団を得ることは、血液サンプルからＢ細胞を単離することを包含する。特定の態様では、単離は、抗体ビーズ選択又はＦＡＣＳを実施することを含む。いくつかの態様において、血液サンプルは、末梢血又は臍帯血である。いくつかの態様において、臍帯血は２つ以上の個々の臍帯血単位（例えば、３、４、又は５つの個々の臍帯血ユニット）からプールされる。いくつかの態様において、Ｂ細胞の集団は、ＣＢ単核細胞（ＣＢＭＣ）である。特定の局面において、Ｂ細胞の集団は、ＣＤ５＋ＣＤ１ｄｈｉ  Ｂ細胞である。特定の局面において、Ｂ細胞の集団は全Ｂ細胞である。
【００２４】
特定の態様では、ＢｒｅｇはＣＤ４＋  Ｔ細胞（例えば、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞）の増殖を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％抑制する能力を有する。特定の態様では、ＢｒｅｇはヒトＢｒｅｇである。
【００２５】
いくつかの態様において、培養は１〜５日間（例えば、２、３、又は４日間）である。特定の態様では、増殖は５〜１０日間（例えば、６、７、８、９、又は１０日間）である。
【００２６】
さらなる実施形態において、本明細書に記載される実施形態の方法に従って産生される制御性Ｂ細胞の集団が提供される。
【００２７】
本明細書に記載される実施形態の制御性Ｂ細胞の集団及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物もまた、本明細書に提供される。
【００２８】
別の実施形態では、治療有効量の実施形態の抑制性Ｔｒｅｇ及び／又は実施形態の抑制性Ｂｒｅｇを対象に投与することを含む、対象における免疫障害を治療する方法が提供される。いくつかの態様において、対象は、抑制性Ｔｒｅｇを投与される。いくつかの態様において、対象は、抑制性Ｔｒｅｇを投与される。特定の態様において、対象は、抑制性Ｔｒｅｇ及びＢｒｅｇを投与される。特定の態様では、対象はヒトである。
【００２９】
特定の態様では、対象は、グルココルチコイド治療を受けているか、又は現在受けている。
【００３０】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇは同種異系である。他の局面では、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇｓは自己由来である。
【００３１】
特定の態様において、対象は、臍帯血移植（ＣＢＴ）を以前に投与されている。いくつかの態様において、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇは、ＣＢＴと同時に投与される。他の態様において、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇは、ＣＢＴの前又は後に投与される。
【００３２】
いくつかの態様において、免疫障害は、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、又は自己免疫疾患である。特定の局面において、免疫障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。特定の態様において、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）である。いくつかの態様において、免疫障害は移植拒絶であり、ここで、移植は、臓器移植、骨髄又は他の細胞移植、複合組織移植、又は皮膚移植である。特定の局面において、免疫障害は、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息又はシェーグレン症候群である。
【００３３】
追加の態様では、方法は、さらに少なくとも第２の治療薬を投与することを含む。いくつかの態様では、少なくとも第２の治療剤は、治療有効量の免疫調節剤又は免疫抑制剤である。特定の態様において、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、又はケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ、Ｂｒｅｇ、及び／又は少なくとも第２の治療剤は、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下、局所的、又は直接注射もしくは潅流によって投与される。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明によって明らかとなるであろう。しかしながら、本発明の詳細な説明、特異的な実施例及び好適な実施例は例示として行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に自明な各種の変更や修正は、本発明の精神及び範囲内にあることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ又は複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【００３６】
【図１Ａ−Ｄ】ＣＤ９は、末梢血Ｔ細胞と比較して臍帯血Ｔ細胞上でより高度に発現される。（１Ａ）臍帯血から分離した休止期ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ９発現。（１Ｂ）増殖したＴｒｅｇ上のＣＤ９発現。（１Ｃ−１Ｄ）臍帯血（１Ｃ）又は末梢血（１Ｄ）から増殖したＴｒｅｇの抑制活性。１：１又は１：５の比率はＴｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。
【００３７】
【図２Ａ−Ｄ】（２Ａ）ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇは抑制活性のマーカーのより高い発現を有し、これには、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５、ニューロフィリン、ＴＩＧＩＴ、及びＦＯＸＰ３が含まれる。（２Ｂ）末梢血から増殖したＣＤ９−  Ｔｒｅｇに対するＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの抑制活性。（２Ｃ）臍帯血から増殖したＣＤ９−  Ｔｒｅｇに対するＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの抑制活性。（２Ｄ）ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇは、臍帯血から拡張したＣＤ９−  Ｔｒｅｇよりも抑制的である。
【００３８】
【図３Ａ−Ｃ】（３Ａ）ＴＣＲライゲーション及びＩＬ−２によって生成された新鮮な臍帯血Ｔｒｅｇの抑制機能。（３Ｂ）ＴＣＲライゲーション、ＩＬ−２及びラパマイシンで増殖させた新鮮臍帯血Ｔｒｅｇの抑制機能。（３Ｃ）増殖前のＴ細胞のネガティブコントロール。
【００３９】
【図４Ａ−Ｄ】（４Ａ）示されるように、ＩＬ−４＋ＩＬ−３３＋ＩＬ−２又はＩＬ−２１＋ＦＯＸＯ１阻害剤で増殖した制御性Ｂ細胞の抑制機能。（４Ｂ）ＩＬ２１＋ＳＴＡＴ６阻害剤で増殖したＢｒｅｇの抑制機能。（４Ｃ）ＩＬ‐４＋ＩＬ‐２１＋ＦＯＸＯ１阻害剤又はＩＬ‐４＋ＩＬ‐２１＋ＳＴＡＴ６阻害剤で増殖したＢｒｅｇの抑制機能。（４Ｄ）指示された補充を伴う１４日間にわたるＢｒｅｇ増殖の細胞数。
【００４０】
【図５Ａ−Ｃ】（５Ａ）臍帯血から増殖した制御性Ｂ細胞のＣＦＳＥアッセイ。（５Ｂ）２５、５０、１００μｇのｍｉＲＮＡ−１５５阻害剤、異なるエフェクター比でのＣＤ４＋臍帯血由来Ｂ細胞のＣＦＳＥアッセイ。（５Ｃ）２５、５０、又は１００μｇのｍｉＲＮＡ−１５５阻害剤でのＣＤ４＋Ｂ細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本開示の特定の実施形態は、高度に抑制的な制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を生成する効率的な方法を提供する。具体的には、本発明の方法によって産生される免疫細胞が非常に抑制的であり、そして炎症状態の処置のために十分な量であり得る。
【００４２】
１つの方法において、Ｔ細胞の開始集団はサンプル（例えば、末梢血、骨髄、又は臍帯血）から単離される。Ｔ細胞を、ＴＣＲ連結及び共刺激、ＩＬ−２、及びｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の存在下で増殖させる。ＴＣＲライゲーション及び共刺激は、ビーズ上の抗体などの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体による刺激を含んでもよい。さらに、Ｔｒｅｇ増殖は、ＴＮＦＲ２アゴニスト、ＡＴＲＡ又はアデノシン受容体アゴニストを含み得る。興味深いことに、本発明者らは、高度に抑制性であるＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ９＋  Ｔ細胞として表現型的に定義されるＴｒｅｇのサブセットを発見した。これらのＴ細胞は臍帯血中により高い頻度で存在し、さらにより抑制的なＴｒｅｇ集団を提供するために、増殖のために選択され得る。特定の態様において、抑制性Ｔｒｅｇを産生する方法は、拡大後にＣＤ９＋  Ｔｒｅｇを選択することを含む。従って、本発明の方法は以前のプロトコールと比較して、多数のＴｒｅｇを産生する際に、有意により効率的であり得る。
【００４３】
ＢｒｅｇはＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、及びＩＬ−４の存在下でＢ細胞（例えば、全Ｂ細胞又はＢ細胞の精製されたＣＤ５＋ＣＤ１ｄｈｉｇｈの集団）を培養することによって増殖させることができる。増殖培養物は、ＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び／又はＳＴＡＴ６阻害剤のような１つ以上のシグナル伝達阻害剤をさらに含み得る。Ｂ細胞の開始集団は、末梢血又は臍帯血から単離され得る。最初の増殖培養は、約３〜１０日間、例えば４〜５日間であり得る。Ｂｒｅｇは、ＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、及びＩＬ−３３又はシグナル伝達阻害剤、例えばＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び／又はＳＴＡＴ６阻害剤のいずれかの存在下で、さらに１〜４週間、特に２〜３週間、例えば５日目などにさらに増殖させることができる。さらに、本発明者らはＢ細胞のａｎｔｉ−ｍｉＲ１５５への暴露（例えば、薬理学的阻害又は遺伝子操作）が、それらの抑制機能をさらに増加させることを見出した。従って、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞又は増殖したＢｒｅｇを、ａｎｔｉ−ｍｉＲ１５５と接触させて、それらの抑制活性をさらに増強する。
【００４４】
Ｔｒｅｇ又はＢｒｅｇは、例えば、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ９を使用することによって、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の発現を抑制するように（例えば、増殖前又は増殖後に）遺伝的に改変されて、それらをコルチコステロイドに対して耐性にし得る。Ｔｒｅｇ又はＢｒｅｇは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作され得る。さらなる改変は、細胞の欠失を可能にして、任意の過度の毒性を防止する自殺スイッチを含み得る。
【００４５】
従って、この制御性細胞サブセットを、免疫応答及び炎症応答の操作のために、並びに免疫関連疾患、障害及び状態（炎症性疾患及び自己免疫疾患を含む）、並びにヒト及び他の哺乳動物における免疫抑制及び癌の処置のために利用するための方法もまた提供される。例えば、これらの刺激されたＢｒｅｇは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のような自己免疫又は同種免疫疾患を処置するために使用され得る。従って、本開示は、種々の免疫関連障害における免疫調節のために使用され得る、増殖したＴｒｅｇ及びＢｒｅｇの組成物を提供する。
【００４６】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書では特定の成分のいずれも組成物に意図的に配合されておらず、かつ／又は汚染物質としてのみ又は微量で存在することを意味するために使用される。従って、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法で特定の成分の量を検出することができない組成物である。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は複数を意味し得る。請求項において本明細書で使用されるように、単語「含む」とともに使用される場合、単語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。
【００４８】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、明示的に示されなければ、代替物のみをいうように「及び／又は」を意味するように用いられ、あるいは該代替物は相互に排他的であるが、開示は代替物と「及び／又は」を指す定義を支持する。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味することができる。
【００４９】
本出願全体を通して、用語「約」は、値がデバイス、値を決定するために使用される方法、又は研究対象の間に存在する変動の固有の変動を含むことを示すために使用される。
【００５０】
「細胞」という用語は本明細書では当技術分野で最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外部から隔離する膜構造によって囲まれ、自己複製能力を有し、遺伝情報及びそれを発現するための機構を有する生体を指す。本明細書中で使用される細胞は天然に存在する細胞又は人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞又は遺伝的に改変された細胞）であり得る。
【００５１】
用語「Ｔ細胞」はＴリンパ球を意味し、限定されるものではないが、γδ＋Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）だけでなく、ＴＨ０、ＴＨ１、ＴＨ２細胞が含まれる。制御性Ｔ細胞には、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５  ＴＨ３  Ｔｒｅｇ、及びＣＤ２５  ＴＲ１  Ｔｒｅｇの少なくとも３つのタイプがある。「細胞傷害性Ｔ細胞」は、別の細胞を殺すことができるＴ細胞を指す。細胞傷害性Ｔ細胞の大部分はＣＤ８＋  ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞であるが、一部の細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ４＋である。
【００５２】
「Ｂ細胞」という用語はその表面に免疫グロブリンを発現し、最終的に形質細胞を分泌する抗体に発達することができる白血球（白血球）の一種であるリンパ球を指す。ある例では、Ｂ細胞はＣＤ１９（ＣＤ１９＋）を発現する。「未成熟Ｂ細胞」は、成熟Ｂ細胞に発達することができる細胞である。一般に、プロＢ細胞（例えば、ＣＤ４５又はＢ２２０を発現する）は免疫グロブリン重鎖再配列を受けてプロＢプレＢ細胞になり、さらに免疫グロブリン軽鎖再構成を受けて未成熟Ｂ細胞になる。未成熟Ｂ細胞には、Ｔ１及びＴ２Ｂ細胞が含まれる。
【００５３】
「制御性Ｂ細胞」（Ｂｒｅｇ）は、免疫応答を抑制するＢ細胞である。制御性Ｂ細胞はＴ細胞活性化を直接的又は間接的に抑制することができ、抗原提示細胞、他の自然免疫細胞、又は他のＢ細胞を抑制することもできる。制御性Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋であってもよく、又は他の多くのＢ細胞マーカーを発現してもよく、かつ／又は他のＢ細胞サブセットに属してもよい。これらの細胞はまた、本明細書中に提供される刺激方法によって増強されるＩＬ−１０を分泌し得る。
【００５４】
「Ｂ細胞抗原受容体」又は「ＢＣＲ」は膜免疫グロブリン抗原結合成分、又はその生物学的に活性な部分（すなわち、リガンドに結合することができ、及び／又はトランスデューサー成分と会合することができる部分）を含むＢ細胞抗原受容体をいう。Ｂ細胞受容体は一般に、シグナル伝達が可能なＩｇ−α及びＩｇ−βヘテロ二量体に結合した表面結合ＩｇＭ又はＩｇＤ抗体から構成される。用語「Ｂ細胞受容体の膜貫通ドメイン」は、好ましくはＢ細胞受容体の抗体部分の膜貫通ドメイン、すなわち、ＩｇＭ又はＩｇＤ重鎖の膜貫通ドメインをいう。いくつかの実施形態では、用語「Ｂ細胞受容体」又は「ＢＣＲ」が、好ましくは成熟ＢＣＲを指し、好ましくは代理軽鎖を含むプレＢＣＲを除外する。
【００５５】
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」又は「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）」は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ  ＤＮＡ」、又は、リン酸結合によって連結された５′シトシンに続く３′グアノシンを含むＤＮＡ）を含有し、免疫系を活性化する核酸分子である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一般に、二本鎖分子はインビボでより安定であるが、一本鎖分子は増大した免疫活性を有する。
【００５６】
用語「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（即ち、リン酸基と、ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））又はプリン（例えば、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））のいずれかで置換された交換可能な有機塩基とに連結された糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）を含む分子）と交換可能に用いられる。本明細書中で使用される場合、この用語は、オリゴリボヌクレオチド並びにオリゴデオキシリボヌクレオチドを指す。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を引いたもの）及び任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含する。核酸分子は既存の核酸供給源（例えば、ゲノム又はｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって産生される）で得られる。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、抗体又はＴ細胞受容体によって結合され得る分子である。抗原は一般に、Ｂ及び／又はＴリンパ球の産生をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００５８】
「免疫障害」、「免疫関連障害」、又は「免疫介在性障害」は、免疫応答が疾患の発生又は進行において重要な役割を果たす障害を指す。免疫介在性障害には、自己免疫疾患、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、並びに炎症及びアレルギー状態が含まれる。
【００５９】
「免疫応答」は、刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は先天性免疫細胞などの免疫系の細胞の応答である。一実施形態では、応答が特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。
【００６０】
「エピトープ」は、アミノ酸配列の特異性によって決定される、抗体によって認識される抗原上の部位である。２つの抗体は競合結合アッセイにおいて測定されるように、それぞれが他の抗体の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じエピトープに結合すると言われる。あるいは、一方の抗体の結合を減少又は排除する抗原中のほとんどのアミノ酸変異が他方の結合を減少又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。２つの抗体は、各々が抗原への他方の結合を部分的に阻害する場合、及び／又は一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を減少させるか又は排除する場合、重複するエピトープを有すると言われる。
【００６１】
「自己免疫疾患」は免疫系が正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞応答）を引き起こし、その結果、組織を損傷する疾患をいう。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、又は粘膜表面に通常コロニー形成する微生物（共生生物として知られる）のような共生生物に由来し得る。
【００６２】
用語「移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）」は、移植レシピエント自身の組織に対する供与された免疫学的に適格なリンパ球の反応が存在する、骨髄又は他の組織移植の一般的かつ重篤な合併症を指す。ＧＶＨＤは、血縁ドナー又は非血縁ドナーのいずれかからの幹細胞を使用又は含有する任意の移植で起こり得る合併症である。いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤは慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）である。
【００６３】
「免疫反応のパラメーター」とは、サイトカイン分泌（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γなど）、ケモカインの分泌、移動又は細胞蓄積の変化、免疫グロブリンの酸性、樹状細胞の成熟、制御活性、制御性Ｂ細胞の数、及び免疫系の任意の細胞の増殖などを含む、免疫反応の特定の測定可能な態様である。免疫応答の別のパラメーターは、免疫学的攻撃から生じる任意の器官の構造的損傷又は機能的劣化である。当業者は、公知の実験室系アッセイを使用して、これらのパラメーターのいずれか１つの増加を容易に決定し得る。１つの具体的な非限定的な例としては、細胞増殖を評価するために、３Ｈ−チミジンの取り込みを評価することができる。免疫応答のパラメーターの「実質的な」増加は、対照と比較してこのパラメーターの有意な増加である。実質的な増加の具体的な非限定的な例としては、少なくとも約５０％の増加、少なくとも約７５％の増加、少なくとも約９０％の増加、少なくとも約１００％の増加、少なくとも約２００％の増加、少なくとも約３００％の増加、及び少なくとも約５００％の増加である。同様に、免疫応答のパラメーターの阻害又は減少は、対照と比較して、このパラメーターの有意な減少である。実質的な減少の具体的な非限定的な例は、少なくとも約５０％の減少、少なくとも約７５％の減少、少なくとも約９０％の減少、少なくとも約１００％の減少、少なくとも約２００％の減少、少なくとも約３００％の減少、及び少なくとも約５００％の減少である。ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ又はｔ検定のような統計的検定を使用して、第２の薬剤を使用して応答するサンプルの割合と比較して、１つの薬剤によって誘導される応答の大きさの差を比較することができる。いくつかの例では、ｐ≦０．０５は有意であり、任意の観察されたパラメーターの増加又は減少がランダム変動による可能性が５％未満であることを示す。当業者は、他の使用の統計的アッセイを容易に同定し得る。
【００６４】
疾患又は状態の「治療する」又は「治療」は疾患の徴候又は症状を緩和するために、１つ以上の薬物を患者に投与することを含み得るプロトコールを実行することをいう。治療の望ましい効果には、疾患進行の速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。緩和は、疾患又は状態の徴候又は症状が現れる前、並びにそれらの出現後に起こり得る。従って、「治療する」又は「治療」は、疾患又は望ましくない状態の「予防する」又は「予防する」を含み得る。さらに、「治療する」又は「治療」は徴候又は症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、特に、患者に対してわずかな効果しか有さないプロトコールを含む。
【００６５】
本出願全体を通して使用される「治療上の利益」又は「治療上有効」という用語は、この状態の医学的処置に関して対象の健康を促進又は増強する任意のものを指す。これには疾患の徴候又は症状の頻度又は重症度の減少が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の治療は例えば、腫瘍のサイズの減少、腫瘍の侵襲性の減少、癌の増殖速度の減少、又は転移の予防を含み得る。癌の治療はまた、癌を有する対象の生存を延長することを指し得る。
【００６６】
「対象」及び「患者」は、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物などのヒト又は非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態において、埋め込み対象はヒトを指す。
【００６７】
本明細書で使用される用語「抗体」は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の生物学的活性を示す限り、抗体フラグメント、を具体的に包含する。
【００６８】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、集団を含む個々の抗体は、可能性のある突然変異、例えば、天然に存在する突然変異（これは少量で存在し得る）を除いて同一である。従って、修飾語「モノクローナル」は、区別される抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体が、典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン（例えば、ハイブリドーマクローンのプール、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローン）からの独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその産生を改善するため、インビボでのその免疫原性を減少させるため、多重特異性抗体を作製するため、などの目的で、さらに改変され得ること、及び、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であること、が理解されるべきである。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
【００６９】
「薬学的又は薬理学的に許容される」という語句は必要に応じて、ヒトなどの動物に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。抗体又は追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のために、調製物はＦＤＡ生物学的基準局によって要求されるように、無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度基準を満たすべきであることが理解される。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に公知であるように、任意の全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど））、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル等））、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤又は抗真菌剤、キレート剤、及び不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、染料、流体及び栄養補充剤、例えば、材料及びそれらの組み合わせを含む。医薬組成物中の種々の成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調節される。
【００７１】
用語「ハプロタイプ決定又は組織タイピング」は、例えば、どのΗＬＡ遺伝子座（又は遺伝子座）が特定の対象のリンパ球上で発現されるかを決定することによって、対象のハプロタイプ又は組織型を同定するために使用される方法をいう。ΗＬＡ遺伝子は第６染色体の短腕上の主要組織適合性複合体（ＭΗＣ）遺伝子に位置し、細胞間相互作用、免疫反応、臓器移植、がんの発生、及び疾病感受性に関与する。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱと呼ばれる、移植に重要な６つの遺伝子座がある。各遺伝子座には、いくつかの異なる対立遺伝子のいずれかが存在し得る。
【００７２】
ハプロタイプ決定のために広く使用される方法は、対象のＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＭＨＣ抗原をコードする遺伝子の公知のセグメントと比較する。遺伝子のこれらの地域の可変性が、対象の組織型又はハプロタイプを決定する。血清学的方法はまた、細胞の表面上の血清学的に規定された抗原を検出するために使用される。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃ決定基は、公知の血清学的方法によって測定することができる。簡潔には、対象からのリンパ球（新鮮な末梢血から単離された）を、全ての公知のＨＬＡ抗原を認識する抗血清とともにインキュベートする。細胞を、種々の抗血清を含む顕微鏡ウェルを有するトレイに広げる。細胞を３０分間インキュベートし、続いてさらに６０分間補体インキュベートする。リンパ球がその表面に抗血清中の抗体によって認識される抗原を有する場合、リンパ球は溶解される。染料を添加して、細胞膜の透過性及び細胞死の変化を示すことができる。溶解によって破壊された細胞のパターンは、組織学的不適合性の程度を示す。例えば、ＨＬＡ−Ａ３について試験されるヒト由来のリンパ球がＨＬＡ−Ａ３についての抗血清を含むウェルにおいて破壊される場合、この試験は、この抗原群について陽性である。
【００７３】
「インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）」は、特異的抗原又は分裂促進刺激に応答してＴリンパ球によって産生されるタンパク質をいう。この用語は、天然に存在するＩＦＮ−γペプチド及び核酸分子並びに完全又は部分的なＩＦＮ−γ生物学的活性を保持するＩＦＮ−γフラグメント及び改変体を含む。ＩＦＮ−γの配列は公的に入手可能である（例えば、例示的なＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号: BC070256; AF506749；及びJ00219から入手可能であり、そして例示的なＩＦＮ−γタンパク質配列は、GenBank Accession No: CAA00226; AAA72254；及び0809316Aから入手可能である）。
【００７４】
「インターロイキン（ＩＬ）−２」は、Ｔリンパ球のすべての亜集団についての増殖因子を指す。これは、休止細胞において細胞周期の進行を誘導し、活性化Ｔリンパ球のクローン性増殖を可能にするＴ細胞の抗原非特異的増殖因子である。この用語は、天然に存在するＩＬ−２ペプチド及び核酸分子、並びに完全又は部分的なＩＬ−２生物学的活性を保持するＩＬ−２フラグメント及び改変体を含む。ＩＬ−２の配列は公に入手可能である（例えば、例示的なＩＬ−２ ｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号: BC066254; BC066257；E00978；及びNM_053836から入手可能であり、そして例示的なＤＬ−２タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号: AAD14263; AAG53575；及びAAK52904から入手可能である）。
【００７５】
用語「培養」は、適切な培地中での細胞のインビトロでの維持、分化、及び／又は増殖を指す。「濃縮された」とは、生物中に存在する組織において見出されるよりも、全細胞の存在割合が大きい、細胞を含む組成物を意味する。
【００７６】
「単離された」生物学的成分（血液成分などの血液材料の一部など）とは、成分が天然に存在する生物の他の生物学的成分から実質的に分離又は精製された成分を指す。単離された細胞は、細胞が天然に存在する生物の他の生物学的成分から実質的に分離又は精製された細胞である。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に」は、所望の成分の少なくとも８０％、より好ましくは所望の成分の９０％、又は最も好ましくは所望の成分の９５％を含む組成物を表すために使用される。いくつかの実施形態では、組成物が所望の成分の少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％を含む。
【００７８】
ＩＩ．制御性Ｂ細胞
本開示のいくつかの実施形態は、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）の単離及び増殖に関する。従って、高度に抑制的なＢｒｅｇの集団が本明細書中に開示される。ＢｒｅｇはＣＤ４＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞の増殖を阻害し、エフェクターＴ細胞による炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦα）の産生を阻害し、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を産生する能力によって特徴づけられる。
【００７９】
Ａ．Ｂ細胞集団の単離
Ｂ細胞の単離された集団は、対象、特にヒト対象から得ることができる。Ｂ細胞は、特定の疾患又は状態を有することが疑われる対象、特定の疾患又は状態に対する素因を有することが疑われる対象、又は特定の疾患又は状態に対する治療を受けている対象などの、目的の対象から得ることができる。Ｂ細胞は、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄を含むがこれらに限定されず、対象に存在する任意の位置から収集することができる。単離されたＢ細胞は直接分析されてもよいし、又はアッセイが行われるまで（例えば、凍結によって）保存されてもよい。
【００８０】
特定の実施形態では、Ｂ細胞は血液（例えば、末梢血、骨髄又は臍帯血）から単離されるか、又は幹細胞若しくはｉＰＳＣに由来する。いくつかの態様では、臍帯血から単離されたＢ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８陽性Ｔ細胞抑制によって測定されるような、増強された免疫調節能力を有する。特定の態様では、Ｂ細胞は、免疫調節能力を増強するために、プールされた血液（特に、プールされた臍帯血）から単離される。プールされた血液は２つ以上の供給源（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の供給源（例えば、ドナー対象））由来であり得る。
【００８１】
Ｂ細胞の集団は、治療を必要とするか、又は制御性Ｂ細胞活性の低下に関連する疾患に罹患している対象から得ることができる。従って、細胞は、治療を必要とする対象に対して自己由来である。あるいは、Ｂ細胞の集団は、ドナー、好ましくは組織適合性が一致したドナーから得ることができる。
【００８２】
制御性Ｂ細胞の集団が対象とは異なるドナーから得られる場合、得られる細胞が対象に導入され得るという点で対象に適合性という条件で、ドナーは同種異系であることが好ましい。同種ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性であってもなくてもよい。対象適合性にするために、同種異系細胞を処理して免疫原性を低下させることができる（Ｆａｓｔら、２００４）。
【００８３】
細胞集団の単離及び定量化の方法は、当技術分野で周知であり、ＣＤ１９＋細胞のような制御性Ｂ細胞の単離及び定量化は、当業者に公知の任意の手段によって達成することができる。ＣＤ１９に対する磁気ビーズ又は蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、又は他の細胞単離法を用いて、ＣＤ１９＋であり、特にＩＬ−１０も産生する細胞を単離することができる。ＣＤ１９を発現し、ＣＤ３８ｈｉ  ＣＤ２４ｈｉ、ＩｇＭｈｉ  ＩｇＤ＋  ＣＤ１０＋  ＣＤ２７−、ＣＤ３８ｉｎｔ  ＣＤ２４ｉｎｔ若しくはＩｇＭ  ｉｎｔ  ＩｇＤ＋  ＣＤ１０−  ＣＤ２７−、又は任意の他のＢ細胞亜集団に属する、制御性Ｂ細胞も単離することができる。特定の態様では、Ｂ細胞は、ＣＤ５＋  ＣＤ１ｄｈｉ  Ｂ細胞である。一実施形態では、１つ以上の細胞表面マーカーに特異的に向けられた標識抗体を用いて、ＣＤ１９＋細胞などの制御性Ｂ細胞を同定し、定量する。抗体は酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射活性化合物又は薬物を含むが、これらに限定されない、他の化合物と接合できる。抗体に結合させることができる酵素には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ及びＢ−ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。抗体に結合させることができる蛍光色素には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニン及びテキサスレッドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
制御性Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋  表面マーカーを有する細胞を選択し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のような自動細胞ソーティングを用いて分離することによって濃縮することができる。濃縮を増強するために、ポジティブ選択はネガティブ選択と組み合わされ得る；すなわち、非Ｂ細胞に特異的な表面マーカー及び／又は非制御性Ｂ細胞に特異的な表面マーカーを有する細胞を除去することによって組み合わされ得る。非制御性Ｂ細胞に特異的な、例示的な表面マーカーには、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ９４、ＣＤ１１６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５７、ＣＤ１６３、ＣＤ２０８、Ｆ４／８０、Ｇｒ−１、及びＴＣＲが含まれる。
【００８５】
いくつかの例では、ＣＤ１９＋細胞のような制御性Ｂ細胞は、目的の細胞を同定するために細胞を適切に標識された抗体と接触させ、続いてＦＡＣ又は抗体結合ビーズのような分離技術を行うことによって単離される。しかし、異なる有効性の他の技術を使用して、所望の細胞集団を精製及び単離してもよい。使用される分離技術は、収集される細胞の画分の生存率を最大に保持する必要がある。使用される特定の技術は、もちろん、分離の効率、方法の細胞毒性、分離の容易さ及び速度、並びに必要な装置及び／又は技術スキルに依存する。
【００８６】
さらなる分離手順は、抗体被覆した磁気ビーズを利用した磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合されるか又は補体と組み合わせて使用される細胞傷害剤、及び固体マトリックスに結合されたモノクローナル抗体を利用する「パニング」、又は他の簡便な技術を含み得る。磁気ビーズ及び他の固体マトリックス（例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空糸膜及びプラスチック製ペトリ皿など）に付着した抗体は、直接分離を可能にする。抗体によって結合された細胞は、単に細胞懸濁液から固体支持体を物理的に分離することによって、細胞懸濁液から除去することができる。細胞の固相結合抗体とのインキュベーションの正確な条件及び持続時間は、使用するシステムに特有のいくつかの因子に依存する。しかしながら、適切な条件の選択は、当技術分野で周知である。
【００８７】
次に、目的のマーカー（例えば、ＣＤ１９＋）を発現する細胞が固相結合抗体に結合するのに十分な時間が許された後に、非結合細胞を生理学的緩衝液で溶出又は洗い流すことができる。次いで、結合した細胞を、主に固相の性質及び使用される抗体に応じて、任意の適切な方法によって固相から分離し、そして当該分野で周知の方法を使用して定量する。１つの特定の非限定的な例では、固相から分離された結合細胞は、フローサイトメトリーによって定量される。
【００８８】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞のような制御性Ｂ細胞は、制御性Ｂ細胞ではない細胞をネガティブに選択することによって単離することもできる。これは、細胞がＴ系統、マクロファージ／単球系統、樹状細胞系統、顆粒球系統、赤血球系統、巨核球系統などの特定の系統に対する抗体で標識される系統枯渇を実施することによって実現し得る。次いで、１つ以上の系統特異的抗体で標識された細胞は、アフィニティーカラム処理（系統マーカー陽性細胞がカラム上に保持される場合）、アフィニティー磁気ビーズ又は粒子（系統マーカー陽性細胞が分離磁石に引き付けられる場合）、「パニング」（系統マーカー陽性細胞が二次抗体被覆表面に付着したままである場合）、又は補体媒介溶解（系統マーカー陽性細胞がそれらの細胞表面に結合した抗体のために補体の存在下で溶解される場合）のいずれかによって除去され得る。別の系統枯渇戦略は、四量体複合体形成を含む。細胞は四量体抗ヒト抗体複合体（例えば、制御性Ｂ細胞のマーカーではない複数の細胞型上の複数のマーカーに特定複合体、及びＳＴＥＭＳＴＥＰ（商標）カラム(Stem Cell Technologies、バンクーバー、カナダ）と組み合わせた磁気コロイド）を用いて単離される。次いで、任意選択で、細胞を遠心分離にかけて、四量体複合体が結合した細胞を全ての他の細胞から分離することができる。
【００８９】
特定の実施形態において、単一のドナー又はプールされたドナーから単離されたＢ細胞は、将来の使用のために保存され得る。この点に関して、単離されたＢ細胞集団は凍結保存することができる。凍結保存は、凍結保護剤の存在下で、７７Ｋ又は−１９６℃などの低い氷点下の温度に冷却することによって、細胞又は組織全体を保存するプロセスである。凍結保存による保存には液体窒素中での保存、約０℃の一定温度に維持されたフリーザー中での保存、約−２０℃の一定温度に維持されたフリーザー中での保存、約−８０℃の一定温度に維持されたフリーザー中での保存、及び約−８０℃未満の一定温度に維持されたフリーザー中での保存が含まれるが、これらに限定されない。この実施形態の一態様では、保存前に、エタノール／ドライアイス中で、又は液体窒素中で使用することなどによって、細胞を「瞬間凍結」することができる。この実施形態の別の局面において、細胞は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、スクロース、及びトレハロースを含むがこれらに限定されない凍結保護剤を含む培地中で保存することができる。生物学的物質を保存する他の方法は当業者に周知であり、例えば、米国特許公開第２００７／００７８１１３号（本明細書中に参考として援用される）を参照されたい。
【００９０】
Ｂ．制御性Ｂ細胞の増殖
次いで、Ｂ細胞の単離された集団は、細胞の数を増加させるために、及び／又は制御性Ｂ細胞の抑制能力を増加させるために、増殖され得る。制御性Ｂ細胞集団の増殖は、制御性Ｂ細胞の集団を、制御性Ｂ細胞の数の増加を引き起こすのに十分な刺激組成物と接触させることによって達成することができる。これは、単離されたＣＤ１９＋  Ｂ細胞を、マイトジェン、サイトカイン、増殖因子、又は、Ｂ細胞受容体又はフィーダー細胞に特異的に結合する抗体のような、抗体、と接触させることによって達成され得る。制御性Ｂ細胞は、少なくとも２倍、５倍、１０倍、例えば少なくとも５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、８００倍、１０００倍、１０，０００倍、又は１００，０００倍に増殖させることができる。
【００９１】
本開示は、細胞を１つ以上の増殖剤で処理してそれらの抑制能力を増強することによる、単離されたＢ細胞の増殖のための方法を提供する。増殖した制御性Ｂ細胞集団は、ＩＬ−１０を産生するか、又は他のメカニズムを介してそれらの抑制機能を発揮する、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の制御性Ｂ細胞を含むことができる。
【００９２】
増殖剤は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）などのＣＤ４０アゴニスト、特に可溶性ＣＤ４０及びＣｐＧヌクレオチドを含むことができる。さらなる増殖剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、ＩＬ−３３、又はそれらの組み合わせなどのサイトカインを含むことができる。培養物はまた、ＩＬ−２を含み得る。
【００９３】
いくつかの態様において、Ｂ細胞の単離された集団は、最初に、ＩＬ−４、ＣｐＧ、及びＣＤ４０Ｌの存在下で（例えば、約３〜４日間）培養される。培地は、１つ以上のシグナル伝達阻害剤をさらに含み得る。例えば、Ｂ細胞はＩＬ−４、ＣｐＧ、ＣＤ４０Ｌ、及びシグナル伝達阻害剤（例えば、ＦＯＸＯ１阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤、及び／又はｍＴＯＲ阻害剤）の存在下で培養され得る。第１の増殖工程の間、Ｂ細胞培養物の培地は、新鮮な培地で置き換えられ得る。新鮮な培地は、ＩＬ−４、ＣｐＧ、ＣＤ４０Ｌ、及びシグナル伝達阻害剤のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの態様において、新鮮な培地は、ＩＬ−４及びシグナル伝達阻害剤を含み得る。次に、Ｂ細胞を洗浄し、ＦＯＸＯ１阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤、及び／又はｍＴＯＲ阻害剤などのシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＩＬ−２１の存在下でさらに培養する。この第２の増殖工程は、ＣｐＧの存在下又は非存在下でＣＤ４０Ｌを含んでもよい。
【００９４】
増殖培養物は、ＩＬ−３３のような１つ以上のさらなるサイトカインをさらに含み得る。例えば、第２の培養工程は、ＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、及びＩＬ３３を含んでもよい。別の例では、第２の培養工程がＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、及びＦＯＸＯ１阻害剤を含んでもよい。全増殖培養は約８〜１５日間、例えば、１０〜１４日間実施され得る。
【００９５】
Ｂｒｅｇの抑制機能は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５の添加によって増強され得る。ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５は、プロセスの任意の段階で増殖培養物に添加することができる。しかし、特定の局面において、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５はＢｒｅｇの抑制活性をさらに増強するために、増殖後にＢｒｅｇ培養物に添加される。例えば、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１５５は、増殖培養の１２〜２０日目、例えば１３、１４、１５、又は１６日目にＢｒｅｇの培養物に添加され得る。
【００９６】
１．ＣＤ４０リガンド
特定の実施形態において、単離されたＢ細胞は、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、可溶性ＣＤ４０Ｌ）単独で、又は他の増殖剤と組み合わせて培養される。「ＣＤ４０」という用語は、任意の、好ましくは天然に存在するＣＤ４０タンパク質を指す。ＣＤ４０は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）受容体ファミリーと配列相同性を有する膜貫通糖タンパク質細胞表面受容体であり、当初は、モノクローナル抗体との連結の際にＢ細胞増殖を誘導するＢ細胞表面分子として同定されたものである。
【００９７】
そのリガンドであるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４とも呼ばれる）は、ＴＮＦ遺伝子スーパーファミリーに属する３４〜３９ｋＤａのＩＩ型内在性膜タンパク質であり、主に活性化Ｔ細胞上で発現される。そのリガンドによるＣＤ４０の連結は、ＣＤ４０の三量体クラスター化及びＣＤ４０の細胞質尾部へのＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）として知られるアダプタータンパク質の動員を導く。ＣＤ４０ＬはＣＤ１５４、ＴＮＦ５、ＴＲＡＰ、ｇｐ３９とも呼ばれ、αＩｌｂ−ｂｅｔａ３インテグリンだけでなくＣＤ４０を結合して活性化するために三量体化する可能性のあるＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０Ｌは約３０ｋＤａであり、全長バージョンは２６１アミノ酸を有し、そのうちの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はアミノ酸４５〜２６１である。それはタイプＩＩ膜糖タンパク質である。いくつかの生理学的状況において、ＣＤ４０Ｌは、アミノ酸１１３〜２６１からなる可溶性形態を生じるようにプロセシングされる。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ４０−Ｌ」は、膜貫通領域及び細胞内領域を欠く可溶性ＣＤ４０−Ｌポリペプチド、ヒトＣＤ４０−Ｌの哺乳動物ホモログ、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌのアナログ、又はヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの誘導体を含む。ＣＤ４０−Ｌアナログは、本明細書中で言及される場合、ヒト又はマウスのＣＤ４０−Ｌの配列に実質的に相同であるが、１つ又は複数の欠失、挿入又は置換のために、天然配列ＣＤ４０−Ｌ（ヒト又はマウス種）ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＣＤ４０−Ｌのアナログは、オリゴヌクレオチド合成及びライゲーションによって、又は部位特異的突然変異誘発技術によって調製されたＤＮＡ構築物から合成することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４０リガンド及び／又はアゴニスト抗ＣＤ４０抗体などの１つ又は複数のＣＤ４０アゴニストを、１つ又は複数の他の増殖剤と組み合わせて使用して、Ｂｒｅｇの増殖を増強することができる。例えば、ＣＤ４０アゴニストは、限定されるものではないが、少なくとも１つの、アゴニスト抗ＣＤ４０又はその抗原結合断片（限定されないが、第一には、抗ＣＤ４０抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ′）２抗原結合領域を含む）である。特定の態様では、ＣＤ４０アゴニストは、ヒト、ヒト化又は部分ヒトキメラ抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片である。その他の態様では、ＣＤ４０アゴニストは、Ｇ２８−５、ｍＡｂ８９、ＥＡ−５又はＳ２Ｃ６モノクローナル抗体を含む、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であるか、又はその抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
特定の実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）である。可溶性ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌの細胞外領域又はその断片を含む。例えば、可溶性モノマーＣＤ４０Ｌは米国特許第６，２６４，９５１号に記載されており、改変体は、国際公開第２００５／０３５５７０号に記載されている。ＣＤ４０−Ｌはまた、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることもできる。Ｂ細胞は、約１０〜５００ｎｇ／ｍＬ、例えば約２０〜２００ｎｇ／ｍＬ、例えば約３０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約５０、７５、８０、９０、９５、１００、１１０、又は１２０ｎｇ／ｍＬ、特に約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、水溶性ＣＤ４０Ｌと接触させることができる。いくつかの態様では、Ｂ細胞は１００〜５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０ｎｇ／ｍＬ）の濃度のＣＤ４０Ｌの存在下で培養される。
【０１０１】
２．サイトカイン
単離されたＢ細胞の高度に抑制的なＢｒｅｇへの増殖はまた、限定されないが、Ｂ細胞を１つ以上のサイトカイン（例えば、限定されないが、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、ＩＬ−３３、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、及びＢＡＦＦ）と接触させる工程を包含し得る。いくつかの態様において、Ｂ細胞は、最初にＩＬ−４と接触され、次いで、ＩＬ−２１の存在下で培養される。サイトカインは、約１０〜５００ＩＵ／ｍＬ、例えば約５０〜２００ＩＵ／ｍＬ、例えば約７５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、特に約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で存在し得る。いくつかの態様において、ＩＬ−４は約１〜５ｎｇ／ｍＬ、例えば、２ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３．５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、又は４．５ｎｇ／ｍＬ、又はその中で誘導可能な任意の範囲など、増殖培養物中に約０．１〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。特定の態様において、ＩＬ−２１は約１０〜２５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５〜５０ｎｇ／ｍＬ、５０〜７５ｎｇ／ｍＬ、７５〜１２５ｎｇ／ｍＬ、１２５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、１５０〜１７５ｎｇ／ｍＬ、１７５〜２２５ｎｇ／ｍＬ、又は２２５〜２５０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で増殖培養物中に存在する。
【０１０２】
３．ｍＴＯＲ阻害剤
ｍＴＯＲ阻害剤は、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）のファミリーに属する、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼである、mechanistic target of rapamycin（ｍＴＯＲ）を阻害する薬剤のクラスである。現在の方法で使用できる可能性がある典型的なｍＴＯＲ阻害剤にはラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、デフォロリムス、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＢＥＺ２３５、ゲダトリシブ、及びＳＦ１１０１が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ｍＴＯＲ阻害剤はＰＰ４２（トルキニブとしても知られる）である。ｍＴＯＲ阻害剤は、約５０〜５００ｎＭ、例えば１００〜４００ｎｍ、特に１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、又は３５０ｎＭの濃度で存在し得る。
【０１０３】
４．ＦＯＸＯ１阻害剤
横紋筋肉腫におけるフォークヘッドとしても知られる、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦＯＸＯ１）は、ヒトではＦＯＸＯ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＦＯＸＯ１はインスリンシグナル伝達による糖新生及びグリコーゲン分解の調節において重要な役割を果たす転写因子であり、また、前脂肪細胞が脂肪生成に関与する決定中心である。本発明の方法において使用され得る例示的なＦＯＸＯ１阻害剤には、ＡＳ１８４２８５６及びＡＳ１７０８７２７が含まれるが、これらに限定されない。ＦＯＸＯ１阻害剤は、約５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、例えば１００〜２００ｎｇ／ｍＬ、２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、３００〜４００ｎｇ／ｍＬ、又は４００〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。
【０１０４】
５．ＳＴＡＴ６阻害剤
本発明の方法において使用され得るＳＴＡＴ６阻害剤は、ＡＳ１５１７４９９及びレフルノミド（ＡＬＸ−４３０−０９５）を含むが、これらに限定されない。ＳＴＡＴ６のＳＨ２ドメインを標的とする小分子ペプチド模倣物は、米国特許第６，４２６，３３１号及びＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００１／０８３５１７号に開示されており、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。ＳＴＡＴ６阻害剤は、約１０〜２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば２０〜５０ｎｇ／ｍＬ、５０〜７５ｎｇ／ｍＬ、７５〜１００ｎｇ／ｍＬ、１００〜１５０ｎｇ／ｍＬ、１５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、又は２００〜２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。
【０１０５】
６．ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド
特定の実施形態において、Ｂ細胞は、ＣｐＧヌクレオチドで増殖される。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチドと、それに続く、免疫刺激剤として作用し得るグアニン三リン酸デオキシヌクレオチドとを含有する、短い一本鎖合成ＤＮＡ分子である。ＣｐＧモチーフは、Ｂ細胞及び樹状細胞上で発現されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と考えられる。
【０１０６】
細胞への取り込みを促進するために、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、好ましくは長さが８〜１００塩基の範囲である。しかし、より大きな核酸は細胞内でオリゴヌクレオチドに分解されるので、８ヌクレオチドより大きい任意のサイズ（何ｋｂもの長さであっても）の核酸は、十分な免疫刺激モチーフが存在する場合、本発明による免疫応答を誘導することができる。好ましくはＣｐＧオリゴヌクレオチドが８〜１００ヌクレオチドの範囲であり、いくつかの実施形態では８〜３０ヌクレオチドのサイズである。ＣｐＧ核酸配列は、ＷＯ２０００／０６５８８及びＷＯ２０００／０６５８８並びに米国特許第７，４８８，４９０号（すべて参照により本明細書に組み込まれる）であり得る。ＣｐＧオリゴヌクレオチド全体がメチル化されていないか、部分がメチル化されていなくてもよいが、少なくとも５′  ＣＧ  ３′のＣはメチル化されていてはならない。一つの例示的なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、式：５′  Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２  ３′（ここで、少なくとも１つのヌクレオチドは連続するＣｐＧを分離し；Ｘ１が、アデニン、グアニン、又はチミンであり；Ｘ２がシトシン、アデニン、又はチミンであり；Ｎが任意のヌクレオチドであり、そしてＮ１及びＮ２が、それぞれ約０〜２５個のＮから構成される核酸配列である）によって表される。例示的なＣｐＧ  ＯＤＮは、配列５′  TCCAT-GACGTTCCTGATGCT  ３′（配列番号１）を有する。追加の例示的なＣｐＧ  ＯＤＮは、ヒトとマウスの両方で免疫反応を調節することができる、２４ｍｅｒのＯＤＮ  ２００６であり、配列：５′−tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt−３′（配列番号２）である。ここで、通常の文字はＰＳ連結を表し、太字はＣｐＧジヌクレオチドを表す。
【０１０７】
増殖培養物は、０．１〜１０μｇ／ｍＬ、例えば約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、４．５、６、７、８、９、又は１０μｇ／ｍＬのＣｐＧ  ＯＤＮ、例えば０．１〜２、１〜３、２〜４、３〜６、４〜７、５〜８、７〜９、又は８〜１０μｇ／ｍＬのＣｐｇ  ＯＤＮの濃度で、１つ以上の別個のＣｐＧ  ＯＤＮ配列を含み得る。特定の態様において、Ｂ細胞は、約３μｇ／ｍＬのＣｐＧ  ＯＤＮで処理される。
【０１０８】
ＩＩＩ．制御性Ｔ細胞
Ａ．Ｔ細胞の開始集団
Ｔ細胞の開始集団は、対象、特にヒト対象から単離され得る。Ｔ細胞の開始集団は同種異系サンプルのようなドナーサンプルから、又は細胞を受け入れる対象（すなわち、自己）から単離及び増殖され得る。Ｔ細胞の開始集団は、特定の疾患又は状態を有することが疑われる対象、特定の疾患又は状態に対する素因を有することが疑われる対象、又は特定の疾患又は状態に対する治療を受けている対象のような、目的の対象から得ることができる。Ｔ細胞の開始集団は、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄を含むがこれらに限定されない、対象内に存在する任意の部位から収集することができる。Ｔ細胞の単離された開始集団は直接使用してもよいし、又は凍結などにより一定期間貯蔵されてもよい。
【０１０９】
Ｔ細胞の開始集団は、それらが存在する任意の組織（血液（血液バンク又は臍帯血バンクによって収集された血液を含む）、脾臓、骨髄、外科的手順の間に除去及び／又は露出された組織、並びに生検処置を介して得られた組織を含むが、これらに限定されない）から濃縮／精製され得る。免疫細胞が濃縮され、単離され、及び／又は精製される組織／器官は、生体及び非生体の両方の対象から単離することができ、非生体の対象は臓器ドナーである。
【０１１０】
特定の実施形態において、Ｔ細胞の開始集団は、血液（例えば、末梢血又は臍帯血）から単離される。いくつかの態様において、臍帯血から単離されたＴ細胞の開始集団は、ＣＤ４又はＣＤ８陽性Ｔ細胞抑制によって測定されるような、増強された免疫調節能力を有する。特定の態様において、Ｔ細胞の開始集団は、免疫調節能力を増強するために、プールされた血液（特に、プールされた臍帯血）から単離される。プールされた血液は、２つ以上の供給源（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の供給源（例えば、ドナー対象））由来であり得る。
【０１１１】
免疫細胞の集団が対象とは異なるドナーから得られる場合、得られる細胞が対象に導入され得るという点で対象適合性であるならば、ドナーは同種異系であることが好ましい。同種ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性であってもなくてもよい。対象に適合させるために、同種細胞を処理して免疫原性を低下させることができる。
【０１１２】
いくつかの態様では、細胞はヒト細胞である。細胞は、典型的には、対象から直接単離された細胞及び／又は対象から単離され凍結された細胞などの初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞がＴ細胞又は他の細胞型の１つ以上のサブセット（例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びその亜集団（例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、増殖、再循環、局在化、及び／又は維持能、抗原特異性、抗原受容体の型、特定の臓器又は区画における存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は分化の程度によって定義されるもの）を含む。治療される対象に関して、細胞は、同種異系及び／又は自己であってもよい。既製技術などのいくつかの態様では、細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞などの多能性及び／又は多能性である。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養すること、及び／又は操作すること、並びにそれらを凍結保存の前又は後に同じ患者に再導入することを含む。
【０１１３】
Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋  Ｔ細胞）のサブタイプ及びサブ集団の中には、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、記憶Ｔ細胞及びそのサブタイプ、例えば幹細胞記憶Ｔ（ＴＳＣＭ）、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）、エフェクター記憶Ｔ（ＴＥＭ）、又は最終分化エフェクター記憶Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連不変Ｔ（ＭＡＩＴ）細胞、天然及び適応制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えばＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びΔ／γＴ細胞がある。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴ細胞集団が表面マーカーなどの特定のマーカーについて陽性であるか、又は特定のマーカーについて陰性である細胞について濃縮されるか、又は枯渇される。いくつかの場合において、このようなマーカーはＴ細胞の特定の集団（例えば、非記憶細胞）上では存在しないか、又は比較的低いレベルで発現されるが、Ｔ細胞の特定の他の集団（例えば、記憶細胞）上では比較的高いレベルで存在するか、又は発現されるマーカーである。
【０１１５】
特定の実施形態では、単離されたＴ細胞集団がＣＤ９＋Ｔ細胞集団である。本研究は、ＣＤ９が高度に抑制的であるＴ細胞を単離及び増殖させるためのマーカーとして使用され得ることを示した。いくつかの態様において、ＣＤ９＋Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋、特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ９＋Ｔ細胞集団である。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は非Ｔ細胞（例えば、Ｂ細胞、単球、又は他の白血球（例えば、ＣＤ１４））上で発現されるマーカーのネガティブ選択によって、ＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの態様において、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋選択段階を用いて、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離する。このようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団はさらに、１以上のナイーブ、記憶、及び／又はエフェクターＴ細胞亜集団上で比較的高い度合いで発現又は発現されるマーカーについての正又は負の選択によって、亜集団に分類することができる。
【０１１７】
一般に、開始細胞集団は、例えば、アフェレーシス（例えば、白血球アフェレーシス）又は静脈穿刺を使用して、対象から採取された血液から単離される。１つの例において、血液は、ＨＬＡ適合ドナー又は抗原特異的Ｔ細胞を受け入れる同一の対象（レシピエント対象）のようなドナー対象から得られる。一例では、ＨＬＡ適合ドナーがＨＬＡ遺伝子座（Ａ、Ｂ、及びＤＲ遺伝子座など）の少なくとも１／６、例えば２／６、３／６、４／６、又は特に５／６又は６／６で適合するドナーである。特定の例では、ＨＬＡ適合ドナーは第一度近親者である。単球は、当該分野で公知の方法を使用して、対象から得られた血液から単離され得る。一例では、単球は、単球のエルトリエーション（elutriation）によって得られる。別の例では、単球は非単球細胞を枯渇させるためのキット（例えば、Miltenyi Biotec、オーバーン、カリフォルニア、のもの）を使用して、又は製造業者（Miltenyi Biotec）によって推奨されるような抗ＣＤ１４磁気ビーズを使用するポジティブ選択によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。別の例において、ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）の密度勾配での遠心分離によって調製され、単球は対向流遠心分離（例えば、Ｊ６−ＭＣエルトリエーターシステム; Beckman Instruments、パロアルト、カリフォルニアを使用する）又は連続Percoll（Pharmacia、ピスカタウェイ、ニュージャージー）密度勾配遠心分離によってリンパ球から分離される。
【０１１８】
同様に、リンパ球は、当該分野で公知の方法を使用して、対象から得られた血液から単離され得る。一例では、リンパ球がリンパ球のエルトリエーションによって収集される。Ｂ細胞も枯渇させることができる。別の例において、ＰＢＭＣはFicoll-Paque密度勾配上での遠心分離によって調製され、リンパ球は上記のように単球から分離される。
【０１１９】
いくつかの例において、単球／リンパ球集団（白血球パック又は末梢血白血球（ＰＢＬ））が、対象から単離される。ＰＢＬは赤血球を溶解する培地中でクエン酸塩化血液をインキュベートし、溶解した細胞を除去し、それによってＰＢＬ集団を生成される。例えば、ＮＨ４Ｃｌ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３［ｐＨ  ７．４］）中で４℃で５分間インキュベートし（これを３回繰り返すことができる）、続いて、０．０３５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＥＤＴＡを補充した、Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ａ）中で洗浄し、遠心分離して溶解赤血球を除去する。しかしながら、この方法は例示的なものであり、当業者に知られている他の方法も利用することができる。得られた単球、リンパ球、又は単球／リンパ球産物は標準的な方法を使用して（例えば、Pentastarch及びＤＭＳＯの組み合わせを使用して）、使用前に凍結保存され得る。いくつかの例では、細胞が、５〜２００×１０６細胞／バイアル、例えば６〜１０×１０６単球／バイアル、例えば５０〜２００×１０６リンパ球／バイアル、例えば１０〜５０×１０６ＰＢＬ／バイアルなどに分注して凍結保存される。凍結保存に適するようにするために、細胞培養物は、理想的にはフローサイトメトリーによって、主に単球、リンパ球、又は単球／リンパ球細胞を含む。集団の無菌性は、標的抗原特異的Ｔ細胞生成手順のこの段階で決定される必要はなく；このような決定が細胞の最終共培養後に生じ得る。樹状細胞及びＢリンパ芽球様細胞のような他のＡＰＣ集団を得るための方法は、当該分野で公知である。例えば、Blood Dendritic Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec Inc、オーバーン、カリフォルニア）を使用して、製造元の指示に従って、又は参照により本明細書に組み込まれるＷｏｎｇら、２００２年の方法を使用して血液細胞から培養することによって、血液から樹状細胞を得ることができる。Ｂリンパ芽球様細胞は例えば、Ｔｏｓａｔｏの方法を使用して、末梢血から培養され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９４、本明細書中に参考として援用される）。
【０１２０】
Ｂ．制御性Ｔ細胞の増殖
Ｔｒｅｇｓの増殖方法は、細胞をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化因子（例えば、抗ＣＤ３抗体）、ＴＣＲ共刺激因子（例えば、抗ＣＤ２８抗体）、ＩＬ−２、及びｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）と接触させることを含み得る。ＴＣＲ活性化因子とＴＣＲ共刺激因子との組み合わせは、ＴＣＲライゲーションと呼ばれる。増殖培養は約８〜１５日間、例えば、約１０〜１４日間、例えば、１０、１１、１２、１３、又は１４日間であり得る。
【０１２１】
ＴＣＲ共刺激因子は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＧＩＴＲ、Ｂ７−１／２、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０又はＣＤ４０に対する抗体又はリガンドであり得る。ＴＣＲ活性化因子及びＴＣＲ共刺激因子は、固相に固定化され得る。抗体は固体支持体（例えば、ビーズ）上に、ＣＤ２８抗体対ＴＣＲ／ＣＤ３抗体が約１：１０〜約１０：１の比率などの可変濃度で提供され得る。２つ以上のＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子及び／又は２つ以上のＴＣＲ共刺激因子が、本方法において使用され得る。
【０１２２】
ラパマイシンは細胞を活性化因子と接触させる前、それと同時に、及び／又はその後に、細胞と接触させる。ラパマイシンは、好ましくはＴｒｅｇ増殖の全体にわたって存在する。ラパマイシンは、１つ以上の工程で添加され得る。従って、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、単離されたＴ細胞は、活性化因子（ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体）及びラパマイシンで同時に刺激され得る。この方法において、その後の増殖及び継代はラパマイシンの存在下で行われ得るが、活性化因子の存在下では行われ得ない。
【０１２３】
ラパマイシンは、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜約２μＭ、又は約１μＭの濃度で使用することができる。「ラパマイシン」はSigma、Calbio Chem、LC Labs等から「シロリムス、ラパミューン、AY-22989、RAPA、NSC-226080」とも呼ばれている、分子重量９１４．２のたんぱく質キナーゼ阻害剤である。ラパマイシンは、A.G. Scientific Inc.（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）のような種々の商業的供給源から入手可能である。特定の態様では、ラパマイシンは、約１０〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば約５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０、７５、１００、１２５、又は１５０ｎｇ／ｍＬなどの濃度で培養物中に存在する。
【０１２４】
Ｔｒｅｇ増殖培養物は約５０〜１０００ＩＵ／ｍＬ、例えば、約１００〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜４００ＩＵ／ｍＬ、３００〜４００ＩＵ／ｍＬ、３５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４００〜６００ＩＵ／ｍＬ、４５０〜５５０ＩＵ／ｍＬ、５００〜７５０ＩＵ／ｍＬ、又は７００〜１０００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＬ−２を含み得る。
【０１２５】
増殖培養物はＴｒｅｇ増殖のさらなる増強のために、アデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）もしくはそのアゴニスト、ＴＮＦＲ２もしくはそのアゴニスト、及び／又は全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を含み得る。Ａ２ＡＲ、ＴＮＦＲ２、又はそれらのアゴニストは、約０．５〜５μｇ／ｍＬ、例えば、約１．０〜３．０μｇ／ｍＬ、２．０〜２．５μｇ／ｍＬ、２．２〜２．８μｇ／ｍＬ、３．０〜３．５μｇ／ｍＬ、３．５〜４．０μｇ／ｍＬ、又は４．０〜５．０μｇ／ｍＬなどの濃度で培養物中に存在し得る。ＡＴＲＡは約１〜５０ｎＭ、例えば、約５〜１５ｎＭ、１０〜２０ｎＭ、１５〜２５ｎＭ、２０〜３０ｎＭ、３０〜４０ｎＭ、又は４０〜５０ｎＭの濃度で培養物中に存在し得る。
【０１２６】
本発明において提供される方法によって、又は当技術分野において公知の他の方法によって増殖されたものなどの増殖Ｔｒｅｇを、抑制活性を有するＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの単離のための選択工程に供してもよい。ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの選択は、当該技術分野で公知の方法によって行うことができる。例えば、ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇの選択には、ポジティブ又はネガティブ選択を用いることができる。選択は、遠心分離、細胞エルトリエーション、磁気分離、接着、補体溶解又はフローサイトメトリーを含み得る。１つの方法では、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳのような細胞ソーティングを用いて、ＣＤ９＋Ｔ細胞を単離するか、又はＣＤ９−Ｔ細胞を除去する。
【０１２７】
本明細書で産生されるＴｒｅｇは、インビトロで同系Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。例えば、試験Ｔ細胞と増殖前のＴ細胞が、１：１の比の場合、免疫抑制細胞は、好ましくは少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％の増殖抑制、すなわち、対照と比較した細胞数の減少を達成する。
【０１２８】
Ｃ．遺伝子組換えＴ細胞
Ｔｒｅｇは、遺伝子操作されたＴＣＲ及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のような抗原受容体を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、宿主細胞（例えば、自己又は同種異系Ｔ細胞）は、癌抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変される。複数のＣＡＲ及び／又はＴＣＲ（例えば、異なる抗原に対する）が、Ｔ細胞に添加され得る。
【０１２９】
適切な修飾方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＡｕｓｕｂｅｌ、前出を参照のこと。例えば、細胞はＨｅｅｍｓｋｅｒｋら、２００８及びＪｏｈｎｓｏｎら、２００９に記載される形質導入技術を使用して、癌抗原に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように形質導入され得る。
【０１３０】
完全長ＴＣＲ  α及びβ（又はγ及びδ）鎖をコードするＲＮＡのエレクトロポレーションは、レトロウイルスで形質導入されたＴＣＲ鎖及び内因性ＴＣＲ鎖の対合によって引き起こされる自己反応性に関する長期の問題を克服するための代替として使用され得る。一過性トランスフェクション戦略においてこのような選択的対合が起こったとしても、導入されたＴＣＲ  α及びβ鎖は一過性にのみ発現されるので、おそらく生成された自己反応性Ｔ細胞は、しばらく後にこの自己反応性を失うであろう。導入されたＴＣＲ  α及びβ鎖発現が減少すると、正常な自己Ｔ細胞のみが残る。これは、完全長ＴＣＲ鎖が安定なレトロウイルス形質導入によって導入される場合には見られない。その場合は、導入されたＴＣＲ鎖を決して失わず、患者に常に存在する自己反応性を引き起こす。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、細胞が１つ以上の抗原受容体をコードする遺伝子工学によって導入された１つ以上の核酸、及びそのような核酸の遺伝子工学産物を含む。いくつかの実施形態において、核酸は異種である。すなわち、例えば、操作される細胞及び／又はそのような細胞が由来する生物において通常は見出されない、別の生物又は細胞から得られるものなどの、細胞又は細胞から得られる試料中には通常は存在しない。いくつかの実施形態では、核酸が天然には存在しない（例えば、キメラ）、天然由来でない核酸である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲが抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原が細胞の表面上に発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の文脈においてＴＣＲと同様に細胞表面上で認識される、細胞内タンパク質のペプチド抗原などのプロセシングされたペプチド抗原である。
【０１３３】
代表的な抗原受容体（ＣＡＲ及び組換えＴＣＲを含む）、並びに受容体を操作及び細胞に導入する方法には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００／１４２５７、ＷＯ２０１３／１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４／０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７に記載されるものを含む。特許第６，４５１，９９５号、第７，４４６，１９０号、第８，２５２，５９２号、第８，３３９，６４５号、第８，３９８，２８２号、第７，４４６，１７９号、第６，４１０，３１９号、第７，０７０，９９５号、第７，２６５，２０９号、第７，３５４，７６２号、第７，４４６，１９１号、第８，３２４，３５３号、及び第８，４７９，１１８号、欧州特許公開番号ＥＰ２５３７４１６号、並びに／又はＳａｄｅｌａｉｎら、Cancer Discov. 2013; 3(4):388-398; Ｄａｖｉｌａら（2013)PLoS ONE 8(4): e61338; Ｔｕｒｔｌｅら、Curr. Opin. Immunol. 2012; 24(5): 633-39; Ｗｕら、Cancer, 2012, 18(2): 160-75に記載されているものを含む。いくつかの態様において、遺伝子操作された抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されるようなＣＡＲ、及び国際特許出願公開第ＷＯ／２０１４０５５６６８Ａ１号に記載されるＣＡＲを含む。
【０１３４】
キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体がａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、操作された抗原受容体は、活性化又は刺激性ＣＡＲを含むＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）、及び／又は阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖら、２０１３を参照のこと）を含む。ＣＡＲは一般に、いくつかの態様において、リンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して、１つ以上の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（又はリガンド）結合ドメインを含む。このような分子は、典型的には天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体と組み合わせたこのような受容体を介するシグナル、及び／又は共刺激受容体単独を介するシグナルを模倣又は近似する。
【０１３６】
本開示の特定の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸（免疫原性（ｈＣＡＲ）を減少させるためにヒト化されたＣＡＲを含む）を含む、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、核酸の使用に関する。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の抗原間の共有空間を含むエピトープを認識し得る。特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／又はその抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態では、その特異性が受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
【０１３７】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者のための細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子であり得ることが意図される。特定の実施形態において、本発明は、全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡ又はコード領域を含む。抗原結合領域又は領域は、米国特許第７，１０９，３０４号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるような、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の断片を含み得る。フラグメントはまた、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであり得る。より具体的な実施形態において、フラグメントは、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用のために最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
【０１３８】
前記配置は、ダイアボディ又はマルチマーのような多量体であり得る。マルチマーは、軽鎖及び重鎖の可変部分のダイアボディへのクロスペアリングによって形成される可能性が最も高い。構築物のヒンジ部分は完全に欠失されることから、第１のシステインを維持させること、セリン置換ではなくプロリンになること、第１のシステインまで切断されることなど、複数の選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は削除することができる。安定及び／又は二量体化する任意のタンパク質が、この目的に役立ち得る。Ｆｃドメインの１つ、例えばヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２又はＣＨ３ドメインのみを使用することができる。二量体化を改善するために修飾されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分のみを使用することもできる。ＣＤ８αの一部を使用することもできる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸が膜貫通ドメイン及び改変ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としてはＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供される追加のシグナルはＮＫ細胞の完全な活性化に重要であり、インビボ持続性及び養子免疫療法の治療的成功を改善するのに役立ち得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは養子療法によって標的化される特定の細胞型において発現される抗原（例えば、癌マーカー）、及び／又は正常又は非罹患細胞型において発現される抗原のような減衰応答を誘導することが意図される抗原のような、特定の抗原（又はマーカー又はリガンド）に対する特異性を用いて構築される。従って、ＣＡＲは典型的にはその細胞外部分において、１つ以上の抗原結合分子（例えば、１つ以上の抗原結合フラグメント、ドメイン、もしくは部分、又は１つ以上の抗体可変ドメイン、及び／又は抗体分子）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲがモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）鎖に由来する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などの抗体分子の抗原結合部分を含む。
【０１４１】
キメラ抗原受容体の特定の実施形態において、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称され得る）は、腫瘍関連抗原又は病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、デクチン−１などのパターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原が含まれる。腫瘍関連抗原はそれが腫瘍細胞の細胞表面上で発現される限り、任意の種類のものであり得る。腫瘍関連抗原の具体例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓなどが挙げられる。特定の実施形態において、ＣＡＲは、低量の腫瘍関連抗原が存在する場合、持続性を改善するためにサイトカインと共発現され得る。例えば、ＣＡＲはＩＬ−１５と共発現される場合がある。
【０１４２】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列はゲノムＤＮＡ供給源、ｃＤＮＡ供給源から得ることができ、又は合成することができ（例えば、ＰＣＲを介して）、又はそれらの組み合わせであってもよい。ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に依存して、イントロンがｍＲＮＡを安定化することが見出されているので、ｃＤＮＡ又はその組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために、内因性又は外因性の非コード領域を使用することがさらに有利であり得る。
【０１４３】
キメラ構築物は、裸のＤＮＡとして、又は適切なベクター中で免疫細胞に導入され得ることが意図される。裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによって細胞を安定にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡは一般に、発現のための適切な方向でプラスミド発現ベクターに含まれるキメラ受容体をコードするＤＮＡをいう。
【０１４４】
あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター）を使用して、キメラ構築物を免疫細胞に導入し得る。本開示の方法に従って使用するための適切なベクターは、免疫細胞において非複製性である。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、ここで、細胞中に維持されるウイルスのコピー数は細胞の生存度を維持するのに十分に低い（例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、又はＢＰＶに基づくベクター）。
【０１４５】
いくつかの態様では、抗原特異的結合又は認識成分は、１つ以上の膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲがＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例において、膜貫通ドメインは受容体複合体の他の部分との相互作用を最小限にするために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を回避するために、アミノ酸置換によって選択又は改変される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、いくつかの態様におけるドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖に由来するもの（すなわち、その少なくとも膜貫通領域を含む）、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、及びＤＡＰ分子が含まれる。あるいは、いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは合成である。いくつかの態様において、合成膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンのような主に疎水性残基を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。
【０１４７】
特定の実施形態において、免疫細胞を遺伝的に改変するために本明細書中に開示されるプラットホーム技術は（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を使用する非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζ、又は他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）抗原認識ドメインを細胞表面に連結する可変長の細胞外ドメインを有するＣＡＲ、及び、場合によっては、（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞をロバストかつ数値的に拡大し得る、Ｋ５６２由来の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む。
【０１４８】
３．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体が天然に存在するＴ細胞からクローニングされた組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はＴＣＲを含む。「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は可変鎖及びβ鎖（それぞれＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られる）又は可変γ及びδ鎖（それぞれＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られる）を含み、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはαβ形態である。
【０１４９】
典型的にはαβ及びγδ形態で存在するＴＣＲが一般に構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は異なる解剖学的位置又は機能を有し得る。ＴＣＲは細胞の表面上に、又は可溶性形態で見出すことができる。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（又はＴリンパ球）の表面上に見出され、ここで、ＴＣＲは一般に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することに関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は短い細胞質尾部を含み得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端の短い細胞質尾部を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲがシグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質に関連する。
【０１５０】
従って、本明細書中の目的のために、ＴＣＲとは、ＭＨＣ分子中に結合した特定の抗原ペプチド、すなわちＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分のような、任意のＴＣＲ又は機能的フラグメントを含む。ＴＣＲの「抗原結合部分」又は抗原結合フラグメントは互換的に使用することができるが、ＴＣＲの構造ドメインの一部を含むが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）と結合する分子を指す。いくつかの場合において、抗原結合部分はＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変鎖及び可変β鎖）を含み、これは、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体（例えば、一般に、各鎖が３つの相補性決定領域を含む場合）に結合するための結合部位を形成するのに十分である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは会合して、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによって抗原認識を付与し、ペプチド特異性を決定し、ペプチド特異性を決定するループ、つまり免疫グロブリンに類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される（Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３はプロセシングされた抗原を認識することを担う主要なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１はまた、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されているが、β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域がさらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含むことができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンのように、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、ａ鎖、β鎖）はＮ末端に２つの免疫グロブリンドメイン、可変ドメイン（例えば、Ｖａ又はＶｐ；典型的にはＫａｂａｔら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Dept.Health and Human Services、Public Health Service National Institutes of Health,1991,5th ed.」に基づくアミノ酸１〜１１６）、及び細胞膜に近接する１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメイン又はＣａ、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメイン又はＣｐ、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７〜２９５）を含み得る。例えば、いくつかの場合において、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜−近位定常ドメイン、及びＣＤＲを含む２つの膜−遠位可変ドメインを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインはシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、２つの鎖の間に連結を形成する短い連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、ＴＣＲはα鎖及びβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有する可能性がある。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖が膜貫通ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは正に荷電している。場合によっては、ＴＣＲ鎖は細胞質尾部を含む。いくつかの場合において、この構造は、ＴＣＲがＣＤ３のような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲはタンパク質を細胞膜に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置又は複合体の不変サブユニットと会合させることができる。
【０１５４】
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物において３つの異なる鎖（γ、δ、及びε）及びζ鎖を有することができる多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含み得る。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、これは、これらの鎖が正に荷電したＴ細胞受容体鎖と会合することを可能にする特徴である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖の細胞内尾部はそれぞれ、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られる単一の保存されたモチーフを含み、一方、各ＣＤ３ζ鎖は３つを有する。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する。これらのアクセサリー分子は負に荷電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞へシグナルを伝播させる役割を果たす。ＣＤ３鎖及びζ鎖はＴＣＲとともに、Ｔ細胞受容体複合体として知られるものを形成する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲが２つの鎖α及びβ（又は場合によりγ及びδ）のヘテロ二量体であってもよく、又は単鎖ＴＣＲ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲがジスルフィド結合又はジスルフィド結合などによって連結された２つの別個の鎖（α鎖及びβ鎖又はγ鎖及びδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、癌抗原）に対するＴＣＲが同定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸が公的に入手可能なＴＣＲ  ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの様々な供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは生物学的供給源、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマ、又は他の公的に利用可能な供給源から得られる。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、インビボから単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、高親和性Ｔ細胞クローンを患者から単離し、ＴＣＲを単離することができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマ又はクローンであり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原のためのＴＣＲクローンはヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、又はＨＬＡ）を用いて操作されたトランスジェニックマウスにおいて生成されている。例えば、腫瘍抗原を参照のこと（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、２００９；Ｃｏｈｅｎら、２００５を参照のこと）。いくつかの実施形態においては、標的抗原に対してＴＣＲを単離するためにファージディスプレイが用いられる（例えば、Ｖａｒａ−Ｒｏｈｅｎａら、２００８、Ｌｉ、２００５参照）。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識から合成的に生成され得る。
【０１５６】
４．自殺遺伝子
本開示のＴ細胞のＣＡＲ及び／又はＴＣＲは、１つ以上の自殺遺伝子を含み得る。本明細書で使用される「自殺遺伝子」という用語は、殺傷のために細胞を選択的に標的化するために使用され得る遺伝子として定義される。例えば、自殺遺伝子はプロドラッグの投与時に、その宿主細胞を死滅させる化合物への遺伝子産物の移行をもたらし得る。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）及びガンシクロビル、アシクロビル、又はＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼ及びシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼ及び５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）及びＡＺＴ；並びにデオキシシチジンキナーゼ及びシトシンアラビノシドである。
【０１５７】
大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、いわゆる自殺遺伝子であり、プロドラッグの６−メチルプリンデオキシリボシドを、毒性を有するプリン６−メチルプリンに変換する。プロドラッグ療法で使用される自殺遺伝子の他の例は、大腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子及びＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１５８】
例示的な自殺遺伝子には、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３、又は誘導性カスパーゼ９が含まれる。一実施形態では、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ３）の切断型を、セツキシマブによって除去することができる自殺抗原として使用することができる。本開示において使用され得る当該分野において公知のさらなる自殺遺伝子としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チトクロームｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン−α、γ−リアーゼ（ＭＥＴ）、及びチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が挙げられる。
【０１５９】
５．遺伝子発現の修飾
いくつかの実施形態において、本開示の細胞はグルココルチコイド受容体、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβ−ＲＩＩ）、及び／又はＣＩＳＨのような特定の遺伝子の改変された発現を有するように改変される。１つの実施形態において、細胞は、内因性ＴＧＦβを枯渇させるためのサイトカインシンクとして機能し得る、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＤＮ）を発現するように改変され得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、改変された遺伝子発現は遺伝子における破壊（例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス又はフレームシフト突然変異（例えば、二対立遺伝子フレームシフト突然変異）、遺伝子の全部又は一部（例えば、１つ以上のエキソン又は部分）の欠失、及び／又はノックイン）をもたらすことによって実施される。例えば、改変された遺伝子発現は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼ、並びに遺伝子の配列又はその一部を標的とするように特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む、配列特異的ヌクレアーゼ又は標的ヌクレアーゼによってもたらされ得る。
【０１６１】
ＮＲ３ＣＳ（グルココルチコイド受容体）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介ノックダウンのための例示的なｇＲＮＡ配列（グルココルチコイド受容体）には、Ex3 NR3C1 sG1  5-TGC TGT TGA GGA GCT GGA-3（配列番号３）及びEx3 NR3C1 sG2  5-AGC ACA CCA GGC AGA GTT-3（配列番号４）が含まれる。ＴＧＦ−β受容体２の例示的なｇＲＮＡ配列には、EX3 TGFBR2 sG1  5-CGG CTG AGG AGC GGA AGA-3（配列番号５）及びEX3 TGFBR2 sG2  5-TGG-AGG-TGA-GCA-ATC-CCC-3（配列番号６）が含まれる。Ｔ７プロモーター、標的配列、及びオーバーラップ配列は、配列TTAATACGACTCACTATAGG（配列番号７）＋標的配列＋gttttagagctagaaatagc（配列番号８）を有し得る。
【０１６２】
ＩＶ．使用方法
本開示の特定の実施形態は、炎症性障害又は免疫介在性障害を処置又は予防するための、本明細書中に提供されるＢｒｅｇ集団及び／又はＴｒｅｇ集団の使用のための方法に関する。この方法は治療有効量のＢｒｅｇ及び／又はＴｒｅｇを対象に投与することを含み、それによって、対象における炎症性障害又は免疫介在性障害を処置又は予防する。
【０１６３】
本発明の方法に従って生成されたＴｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇは、実験的及び治療的使用を含む多くの潜在的使用を有する。特に、このような細胞集団は、望ましくない又は不適切な免疫応答を抑制するのに極めて有用であると考えられる。このような方法では、少数のＴ細胞及び／又はＢ細胞を患者から取り出し、次いで操作し、エクスビボで増殖させた後、それらを患者に再注入する。このようにして治療され得る疾患の例は、自己免疫疾患及び抑制された免疫活性が所望される状態（例えば、同種移植寛容）である。治療方法は、哺乳動物を提供すること、哺乳動物からＴ細胞及び／又はＢ細胞を得ること；上記の本方法の方法に従ってエクスビボでＴ細胞及び／又はＢ細胞を増殖させること；及び増殖させたＴｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇを処置される哺乳動物に投与すること、を含み得る。
【０１６４】
１つの実施形態において、自己免疫疾患又は炎症性疾患（例えば、ＩＬ−１０レベルの低下に関連する）に罹患している対象に、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇの集団を投与する。この実施形態の一態様では、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞集団は患者自体から単離される（すなわち、対象はドナーである）。この実施形態の別の態様では、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞集団は、対象ではないドナーから単離される。この実施形態の一態様では、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞集団はいくつかのドナー（例えば、いくつかのドナーの臍帯血）からプールされる。本実施形態によれば、それを必要とする対象への制御性Ｂ細胞集団を投与することは、患者において、治療対象となる病気を制御、低減、又は排除するのに十分なＩＬ−１０産生レベルの増加をもたらす。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇ集団は、それらを対象に導入する前に、自己免疫疾患などの障害に特異的な抗原と接触される。例えば、制御性細胞は糖尿病を予防又は治療するために対象に投与する前に、インスリン又はＧＡＤ−６５などの自己抗原に曝露されてもよい。
【０１６６】
一実施形態では、対象は自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アディソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性血小板減少症及び精巣炎、赤血球性血球減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック多発性皮膚炎（ｓｐａｔｅ−ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経症候群、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、瘢痕性類天疱瘡症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状エリテマトーデス（ｄｉｓｃｏｉｄ  ｌｕｐｕｓ）、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維禁炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（軽度変化症、限局性糸球体硬化症、巨大腎症など）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多内分泌腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、多発性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎（結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、又は疱疹状皮膚炎の皮膚炎血管炎ヘルペス性皮膚炎血管炎など）、白斑、ウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。従って、本明細書中に開示される方法を使用して処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、血管炎、又は乾癬を含むが、これらに限定されない。対象はまた、喘息のようなアレルギー性障害を有し得る。
【０１６７】
さらに別の実施形態において、対象は移植された器官又は幹細胞のレシピエントであり、そして増殖された制御性細胞（例えば、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇ）は、拒絶を予防及び／又は処置するために使用される。特定の実施形態では、対象が移植片対宿主病を有するか、又は発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、関連ドナー又は非関連ドナーのいずれかからの幹細胞を使用又は含有する任意の移植の起こり得る合併症である。ＧＶＨＤには急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候には、皮膚の剥離又は水疱形成を伴い、広がり、より重度になることがある、手及び足の赤みがかった皮膚の発疹が含まれる。急性ＧＶＨＤはまた、胃及び腸に影響を及ぼし得、この場合、痙攣、悪心、及び下痢が存在する。皮膚及び眼の黄色化（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響を及ぼしたことを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいてランク付けされる：ステージ／グレード１は軽度であり；ステージ／グレード４は重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植後３ヶ月又はそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は急性ＧＶＨＤの症状と類似しているが、さらに、慢性ＧＶＨＤは眼の粘液腺、口の唾液腺、及び胃の内層及び腸を滑らかにする腺にも影響を及ぼし得る。本明細書中に開示される制御性Ｂ細胞の集団のいずれかが利用され得る。移植臓器の例としては、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺及び／又は心臓などの固形臓器移植、又は膵島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄、又は造血もしくは他の幹細胞などの細胞移植が挙げられる。移植片は、顔の組織などの複合移植片であり得る。免疫抑制性ＣＤ１９＋細胞などの制御性Ｂ細胞は、移植前、移植と同時に、又は移植後に投与することができる。いくつかの実施形態では、制御性Ｂ細胞が、移植前に、例えば、移植前に少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、又は少なくとも１ヶ月投与される。１つの特定の非限定的な例において、治療有効量の制御性Ｂ細胞の投与は、移植の３〜５日前に起こる。
【０１６８】
移植を受けている患者に投与される制御性細胞サブセットは投与前に、移植された材料に特異的な抗原で感作され得る。この実施形態によれば、移植レシピエントは移植された材料に対する免疫／炎症応答が減少し、従って、移植された組織の拒絶の可能性が最小限に抑えられる。同様に、移植片対宿主病の処置に関して、制御性細胞サブセットは、宿主に特異的な抗原で感作され得る。この実施形態によれば、レシピエントは、自己抗原に対する免疫／炎症応答が低下するであろう。
【０１６９】
さらなる実施形態において、治療有効量の制御性細胞（例えば、Ｔｒｅｇ及び／又はＢｒｅｇ）の対象への投与は、対象における炎症を処置又は阻害する。従って、この方法は炎症プロセスを阻害するために、治療有効量の制御性細胞を対象に投与する工程を包含する。炎症性障害の例としては、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス又は細菌感染に起因する慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される方法はまた、アレルギー性障害を処置するために使用され得る。
【０１７０】
制御性細胞の投与は免疫抑制又は炎症の阻害が所望される場合はいつでも、例えば、疾患又は炎症の最初の徴候又は症状において利用され得る。これらは、疼痛、浮腫、高温などの一般的なものであってもよく、又は罹患した器官の機能不全に関連する特定の徴候又は症状であってもよい。例えば、腎移植拒絶反応では血清クレアチニンレベルの上昇があり得るが、ＧＶＨＤでは発疹があり得、喘息では息切れ及び喘鳴があり得る。
【０１７１】
制御性細胞の投与はまた、目的の対象における免疫介在性疾患を予防するために利用され得る。例えば、制御性細胞は移植の前に、移植レシピエントである対象に投与され得る。別の例では、制御性細胞がＴ細胞枯渇なしに同種骨髄移植を受けている対象に投与される。さらなる例において、制御性細胞は、糖尿病の家族歴を有する対象に投与され得る。他の例において、制御細胞は喘息発作を予防するために、喘息を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量の制御性細胞が症状に先立って対象に投与される。制御性細胞の投与は、制御性細胞を含まない他の治療を受けた患者と比較して、その後の免疫学的事象又は症状（喘息発作など）の発生率又は重症度の減少、又は患者の生存の改善をもたらす。
【０１７２】
治療の有効性は、当業者に公知の多くの方法によって測定することができる。一実施形態において、白血球数（ＷＢＣ）は、対象の免疫系の応答性を決定するために使用される。ＷＢＣは、対象における白血球の数を測定する。当技術分野で周知の方法を使用して、対象の血液試料中の白血球を他の血液細胞から分離し、計数する。白血球の正常値は、約４，５００〜約１０，０００白血球／μｌである。より少ない数の白血球は、対象における免疫抑制の状態を示し得る。
【０１７３】
別の実施形態において、対象における免疫抑制は、Ｔリンパ球数を使用して決定され得る。当該分野で周知の方法を使用して、対象の血液サンプル中の白血球は、他の血液細胞から分離される。Ｔリンパ球は、例えば、免疫蛍光又はＦＡＣＳのような当該分野で標準的な方法を使用して、他の白血球から分化される。Ｔ細胞数の減少、又はＴ細胞の特定の集団は、免疫抑制の測定として使用され得る。治療前のＴ細胞の数（又は特定の集団における細胞の数）と比較した、Ｔ細胞の数、又はＴ細胞の特定の集団における減少は、免疫抑制が誘導されたことを示すのに使用できる。
【０１７４】
さらなる実施形態において、Ｔ細胞の活性化、増殖、又は特異的抗原に対する応答を含むサイトカイン応答を測定するための試験が行われる。いくつかの例において、Ｔｒｅｇ又はＢｒｅｇ細胞の数は、対象由来のサンプルにおいて測定され得る。追加の例では、ＩＬ−１０のようなサイトカインは、対象からサンプルで測定される。
【０１７５】
他の例では、炎症を評価するために、炎症部位における好中球浸潤を測定することができる。好中球浸潤を評価するために、ミエロペルオキシダーゼ活性を測定することができる。ミエロペルオキシダーゼは、多形核白血球及び単球のアズール好性顆粒中に存在する血液タンパク質である。それは、ハロゲン化物イオンのそれらのそれぞれの次亜ハロゲン酸への酸化を触媒し、これらのハロゲン酸は食細胞による微生物死滅のために使用される。従って、組織におけるミエロペルオキシダーゼ活性の減少は好中球浸潤の減少を反映し、そして炎症の阻害の尺度として役立ち得る。
【０１７６】
別の例において、対象の有効な処置は、対象におけるサイトカインレベルを測定することによってアッセイされ得る。体液又は細胞サンプル中のサイトカインレベルは、従来の方法によって決定される。例えば、酵素結合イムノスポット又は「ＥＬＩＳＰＯＴ」アッセイなどのイムノスポットアッセイを使用することができる。イムノスポットアッセイは、単一細胞レベルでサイトカイン分泌を検出するための高感度かつ定量的なアッセイである。イムノスポットの方法及び適用は当該分野で周知であり、そして例えば、ＥＰ９５７３５９に記載される。標準的なイムノスポットアッセイの変法は当技術分野で周知であり、本開示の方式におけるサイトカイン産生の変化を検出するために使用することができる（例えば、米国特許第５，９３９，２８１号及び米国特許第６，２１８，１３２号を参照されたい）。
【０１７７】
別の実施形態では、刺激された制御性Ｂ細胞の治療的に有効な量を対象に投与すると、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋抑制性Ｔ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋のような制御性Ｔ細胞の産生又は活性が誘導される。さらなる実施形態において、治療有効量の刺激された制御性Ｂ細胞の投与は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を減少させる。さらなる実施形態において、治療有効量の刺激された制御性Ｂ細胞の投与は、免疫介在性疾患に関与する対象の非制御性Ｂ細胞によって産生される抗体の産生を減少させる。さらなる実施形態において、制御性Ｂ細胞は、炎症細胞の流入又は先天性免疫細胞によって媒介される損傷を阻害し得る。従って、これらの細胞型の全てを測定することができる。さらなる実施形態では、サイトカイン産生を測定することができる。
【０１７８】
増殖の抑制は、当技術分野で周知の多くの方法を用いて評価することができる。１つの実施形態において、細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジン取り込みを測定することによって定量化される。増殖細胞は、新たに合成されたＤＮＡに標識ＤＮＡ前駆体を取り込み、その結果、液体シンチレーション計数によって測定される取り込み量は、細胞増殖の相対的尺度となる。別の実施形態において、細胞増殖は、増殖アッセイにおいて、チミジンアナログである５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を使用して定量される。ＢｒｄＵは、チミジンと同様の様式で細胞ＤＮＡに組み込まれ、そして抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂを使用してフローサイトメトリーによって定量される。
【０１７９】
治療有効量の制御性Ｂ細胞は非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、又は関節内注射、又は注入を含む多くの経路によって投与することができる。
【０１８０】
免疫抑制を誘導するか、炎症を処置又は阻害する際に使用するための制御性細胞の治療有効量は、処置される対象において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するために、又は自己免疫もしくは同種免疫疾患の退行を引き起こすために必要な、又は自己免疫疾患によって引き起こされる症状（例えば、疼痛及び炎症）を軽減し得る、制御性細胞の量であり得る。それは、疼痛、浮腫及び高温などの炎症に関連する症状を軽減するのに必要な量であり得る。それはまた、移植された器官の拒絶を減少又は予防するために必要な量であり得る。
【０１８１】
制御性細胞集団は疾患と一致する治療レジメン、例えば、疾患の進行を阻害し、疾患の再発を予防するために、疾患状態を改善するための１日から数日間にわたる単回又は数回の用量、又は長期間にわたる定期的な用量で投与することができる。製剤に使用されるべき正確な用量はまた、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度に依存し、そして開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。制御性細胞の治療有効量は、治療される対象、苦痛の重症度及びタイプ、並びに投与方法に依存する。いくつかの実施形態において、ヒト対象の治療に使用することができる用量は、少なくとも３．８×１０４、少なくとも３．８×１０５、少なくとも３．８×１０６、少なくとも３．８×１０７、少なくとも３．８×１０８、少なくとも３．８×１０９、又は少なくとも３．８×１０１０制御性細胞／ｍ２の範囲である。ある実施形態では、ヒト対象の治療に使用される線量が約３．８×１０９  から約３．８×１０１０  の制御性細胞／ｍ２の範囲である。追加の実施形態において、治療的に有効な量の制御性細胞は、体重ｋｇ当たり約５×１０６細胞から体重ｋｇ当たり約７．５×１０８細胞、例えば体重ｋｇ当たり約２×１０７細胞から約５×１０８細胞、又は体重ｋｇ当たり約５×１０７細胞から約２×１０８細胞まで変化し得る。制御性細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別、及び生理学的状態に基づいて、当業者によって容易に決定される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から外挿することができる。
【０１８２】
増殖した制御性Ｔ細胞及び／又はＢ細胞は免疫介在性障害の処置のために、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与され得る。併用療法には、１つ以上の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、又はデキサメタゾン又はプレドニゾンなどのグルココルチコイド）、抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン又はプレドニゾンなどのグルココルチコイド、又はアセチルサリチル酸、イブプロフェン又はナプロキセンナトリウムなどの非ステロイド性抗炎症薬）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１０やトランスフォーミング成長因子−β）、ホルモン（例えばエストロゲン）、ワクチンが含まれる。さらに、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）；  ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ、又はＢ細胞を認識する）；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；又はケモカイン、インターロイキン又はそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２、抗ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）が挙げられるが、これらに限定されない、免疫抑制剤又は寛容原性物質を投与することができる。そのような追加の薬剤は、所望の効果に応じて、制御性Ｂ細胞の投与の前、間、又は後に投与することができる。細胞及び薬剤のこの投与は、同じ経路によるか、又は異なる経路によるか、及び同じ部位又は異なる部位のいずれかであり得る。
【０１８３】
Ｖ．キット
いくつかの実施形態において、例えば、制御性免疫細胞の産生のための１つ以上の培地及び成分を含み得るキットが提供される。そのような製剤は、Ｂ細胞又はＴ細胞と組み合わせるのに適した形態で、因子のカクテルを含んでもよい。試薬系は、必要に応じて、水性媒体又は凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器又は他の容器を含み、その中に、構成要素が配置され得、そして好ましくは、適切に分注される。キット中に２つ以上の成分が存在する場合、キットはまた、一般に、第２、第３、又は他の追加の容器を含み、その中に追加の成分が別々に配置され得る。しかし、成分のさまざまな組み合わせを１つのバイアル中に含めてもよい。キットの成分は、乾燥粉末として提供することができる。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末を適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が別の容器手段で提供されることも想定される。キットはまた、典型的には、商業的販売のためにキット構成要素を密閉して収容するための手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形又はブロー成形プラスチック容器を含み得る。キットはまた、使用説明書（例えば、印刷又は電子フォーマット（例えば、デジタルフォーマット））を含み得る。
【実施例】
【０１８４】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例において開示される手法が本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって見いだされた技術を代表しており、そのため、本発明の実践において十分に機能することが当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるのであろう。
【０１８５】
［実施例１−制御性Ｔ細胞の増殖］
臍帯血又は末梢血から単離した休止期ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ９の発現を評価した。いずれのＴ細胞集団もＣＤ４＋ＣＤ９＋  Ｔ細胞の割合はわずかであった。しかしながら、臍帯血から単離されたＴ細胞は９．６１％であり、末梢血から単離されたＴ細胞が６．４０％であるのと比較して、ＣＤ４＋ＣＤ９＋  Ｔ細胞の割合が高かった（図１Ａ）。ＩＬ−２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、及びラパマイシンでＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させた後、ＴｒｅｇのＣＤ９発現を分析した。臍帯血から増殖させたＴｒｅｇは、末梢血から増殖させたＴｒｅｇ（２５．６％）と比較して、ＣＤ４＋ＣＤ９＋  Ｔ細胞の割合が高い（５４．５％）ことが改めて見出された（図１Ｂ）。
【０１８６】
さらに、ＣＤ４  Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化して、Ｔｒｅｇ抑制能力の測定のためのエフェクターＴ細胞を産生した。ＣＦＳＥアッセイにおいて、陽性対照は、ほぼ９５％のエフェクターＣＤ４  Ｔ細胞が増殖を示した。しかしながら、ＣＤ４  Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの１：５又は１：１の比率でのＴｒｅｇｓの添加は、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を抑制することができた（図１Ｃ）。臍帯血Ｔｒｅｇの添加は、１：５の比で約９４．８％から３３．９％に、１：１の比で１３．１％に活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を減少させた。末梢血Ｔｒｅｇｓも抑制機能を示したが（８０．２％から、１：５で６３．８％、１：１で３５．３％）、その抑制レベルは臍帯血Ｔｒｅｇより低かった。これらの結果から、臍帯血中のＣＤ＋  Ｔ細胞の割合が高いことから、ＣＤ９＋  ＴｒｅｇはＣＤ９−  Ｔｒｅｇよりも免疫抑制作用が強いことが示唆された。
【０１８７】
Ｔｒｅｇ抑制機能に対するＣＤ９発現の効果をさらに評価するために、増殖したＴｒｅｇを、抑制活性のいくつかのマーカーの発現についてアッセイした。ＣＤ９＋  ＴｒｅｇとＣＤ９−  Ｔｒｅｇを比較したところ、ＣＤ９＋  ＴｒｅｇはＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５、ニューロフィリン、ＴＩＧＩＴなどの抑制活性マーカーの発現が高いことが示された（図２Ａ）。
【０１８８】
さらに、ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇは、ＣＤ９−  Ｔｒｅｇと比較して、臍帯血又は末梢血から拡張された場合、より高い抑制活性を有する（図２Ｂ−２Ｄ）。具体的にはＣＤ９＋末梢血Ｔｒｅｇが、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を、１：１で４６．５％、１：５で２２．６％抑制したが、ＣＤ９末梢血Ｔｒｅｇは、それぞれ４１．３％及び８．５％の増殖抑制であった（図２Ｂ）。Ｔｒｅｇが増強された臍帯血は、ＣＤ９−  ＴｒｅｇのＣＤ９＋の抑制機能の間でさらに顕著な違いを示した。ＣＤ９＋  Ｔｒｅｇは、１：１で８９．０％、１：５で５１．２％の活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を抑制したが、ＣＤ９−  Ｔｒｅｇはそれぞれ７９．５％、３１．６％で増殖を抑制した（図２Ｃ）。このように、臍帯血から増殖したＣＤ９＋  ＴｒｅｇはＣＤ９−  Ｔｒｅｇのほぼ２倍の抑制能を有していた。
【０１８９】
Ｔ細胞を、ＴＣＲライゲーション、ＩＬ−２、及びラパマイシンによって増殖させた。ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖及び炎症性サイトカイン産生に対するそれらの抑制効果を測定した。新鮮な臍帯血から増殖させ、ＴＣＲライゲーション及びＩＬ−２で増殖させたＴｒｅｇは、ほとんど抑制機能を有さないことが観察された（図３Ａ）。しかし、新鮮な臍帯血から増殖させ、ＴＣＲライゲーション、ＩＬ−２、及びラパマイシンで増殖させたＴｒｅｇは、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生の阻害並びにエフェクターＴ細胞の増殖の減少によって観察されるように、非常に抑制的であった（図３Ｂ）。
【０１９０】
［実施例２−制御性Ｂ細胞の増殖］
ＩＦＮγ、ＴＮＦαのレベル、及びＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を測定することにより、種々の方法により増殖させた制御性Ｂ細胞の抑制機能を分析した。まず、血液試料からＢ細胞を単離する。臍帯血又は末梢血を採取し、フィコール分離を行う。次いで、細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ１ｄ、及びａｑｕａ  ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｄｙｅについて染色する。細胞を、暗所、室温で１５〜２０分間、モノクローナル抗体の各々とともにインキュベートする。次に、２ｍＬの溶解緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、細胞を室温で３〜５インキュベートする。次いで、Ｔ細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、２ｍＬのＰＢＳを添加し、細胞を１５００ｒｐｍで５分間再び遠心分離した後、上清を廃棄する。次に、選別を行い、ＣＤ１９＋又はＣＤ１９＋ＣＤ１ｄｈｉＣＤ５＋細胞を選択する。増殖はまた、全Ｂ細胞から行ってもよい。細胞を計数し、適切な細胞培養プレート又はフラスコを選択する。
【０１９１】
増殖のために、全Ｂ細胞又はＢ細胞サブセットを、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−４、ＣｐＧ並びに１つのシグナル伝達阻害剤を含む培地中で培養した。シグナル伝達阻害剤は、ＦＯＸＯ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、又はＳＴＡＴ６阻害剤であった。数日後、培地の半分を、ＩＬ−４及びシグナル伝達阻害剤を含有する新鮮な培地と交換した。さらに２〜３日目に、培地の半分を、ＩＬ−２１、ＣＤ４０Ｌ、及びシグナル伝達阻害剤を含有する培地で再び置換した。さらに、いくつかのアッセイでは、ＩＬ−２１を含む培地にＩＬ−３３を添加した。ＩＬ−２１＋ＩＬ−３３、ＩＬ−２１＋ＦＯＸＯ１阻害剤、及びＩＬ−２１＋ＳＴＡＴ６阻害剤の組み合わせはすべて、高度に抑制的なＢｒｅｇを産生することが観察された（図２Ａ〜２Ｃ）。
【０１９２】
次に、活性化Ｂｒｅｇに対するｍｉＲＮＡ−１５５阻害剤の効果を測定した。ＢｒｅｇをｍｉＲＮＡ−１５５阻害剤とともに１〜２時間インキュベートした。次に、Ｂｒｅｇを、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化したＣＤ４  Ｔ細胞と共培養して、それらの抑制活性を測定した。Ｂｒｅｇを、２５、５０、又は１００μｇの濃度でｍｉＲＮＡ−１５５阻害剤とともにインキュベートした。図５Ｂで観察されるように、ｍｉＲＮＡ−１５５阻害剤とのインキュベートは、Ｂｒｅｇの抑制活性をさらに増加させた。
【０１９３】
本明細書に開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又はステップの順序に変形を適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じ又は類似の結果が達成され得ることが理解されるのであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様な置換及び修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
【０１９４】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中に記載したものを補足する例示的な手順上又はその他の詳細を提供する範囲で、参照として明確に本明細書に組み入れられる。
Cohen et al., J Immunol. 175:5799-5808, 2005.  Current Protocols in Immunology, Ed Coligan et al, Wiley, 1994.  Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods, 110:29-36, 1988.
EP 957359  Fast et al., Transfusion 44:282-5, 2004.  Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215), 2013.  He Y, et al. Journal of immunology research, 7, 2014.
Heemskerk et al. Hum Gene Ther. 19:496-510, 2008.
International Patent Publication No. WO2000/06588  International Patent Publication No. WO2000/06588  International Publication No. PCT/US95/01570  International Publication No. WO2000/06588  International Publication No. WO2005/035570  Janeway et al, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 433, 1997.  Johnson et al. Blood 114:535-46, 2009.  Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003.  Li, Nat Biotechnol. 23:349-354, 2005.  Olsson et al. J. Clin. Invest. 86:981-985, 1990.  Parkhurst et al., Clin Cancer Res. 15: 169-180, 2009.  PCT Patent Publication No. WO2001/083517  Taitano et al., The Journal of Immunology, 196, 2016.  U.S. Patent 7,109,304  U.S. Patent No. 5,939,281  U.S. Patent No. 5,939,281  U.S. Patent No. 6,218,132  U.S. Patent No. 6,218,132  U.S. Patent No. 6,264,951  U.S. Patent No. 6,426,331  U.S. Patent No. 7,488,490  U.S. Patent No. 7,488,490  U.S. Patent Publication No. 2007/0078113  Varela-Rohena et al., Nat Med. 14: 1390-1395, 2008.  WO2014/055668  Wong et al., Cytotherapy, 4: 65-76, 2002.
【図１Ａ−Ｄ】
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【図２Ａ】
2020525010.tif 000003
【図２Ｂ】
2020525010.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020525010.tif 000006
【図３Ａ】
2020525010.tif 000007
【図３Ｂ】
2020525010.tif 000008
【図３Ｃ】
2020525010.tif 000009
【図４Ａ】
2020525010.tif 000010
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020525010.tif 000018
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