(57)【要約】本明細書では、ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗体および関連ポリペプチドが提供される。抗体および／またはポリペプチドは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとして構成することができる。抗体および／またはポリペプチドは、キメラ抗原受容体として構成することもできる。本明細書で提供される抗体および関連ポリペプチドを使用した、癌、例えば膵癌の検出および処置の方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗体、その抗原結合部分、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ｇ．配列番号４または１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｈ．配列番号５または１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｉ．配列番号６または１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号１または７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｋ．配列番号２または８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｌ．配列番号３または９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ以上の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、単離された抗体、その抗原結合部分、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
以下の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項３】
以下の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ｄ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項４】
以下の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項５】
以下の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項６】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ｇ．配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｈ．配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｋ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｌ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項７】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ｇ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｈ．配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｋ．配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｌ．配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項８】
配列番号１３〜１７および２１２５から選択される配列を有する重鎖を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項９】
配列番号１８〜２０および配列番号２６〜２８から選択される配列を有する軽鎖を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１０】
配列番号１３〜１７から選択される配列を有する重鎖と、配列番号１８〜２０から選択される配列を有する軽鎖とを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１１】
配列番号２１〜２５から選択される配列を有する重鎖と、配列番号２６〜２８から選択される配列を有する軽鎖とを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１２】
ＣＤＲに含まれない配列中に保存的置換をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１３】
前記抗体またはポリペプチドが、
免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１４】
前記単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲが、癌細胞の表面上にある抗原に特異的に結合する、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１５】
前記単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲが、癌幹細胞の表面上にある抗原に特異的に結合し、正常な腸細胞に特異的に結合しない、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲ。
【請求項１６】
２つの結合部位を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、第１の結合部位が請求項１〜１５のいずれかに記載の抗原結合部分を含み、第２の結合部位が、Ｔ細胞に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。
【請求項１７】
Ｔ細胞に特異的に結合する抗体の前記抗原結合部分が、抗体の抗ＣＤ３抗原結合部分である、請求項１６に記載の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。
【請求項１８】
少なくとも１つの抗原結合部分がｓｃＦｖである、請求項１６〜１７のいずれかに記載の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、ＣＡＲ、またはＢｉＴＥと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、ＣＡＲ、またはＢｉＴＥをコードする、核酸。
【請求項２１】
前記核酸配列のうちの１つ以上が、配列番号２９〜４４から選択される配列を含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項２０〜２１のいずれかに記載の核酸。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれかに記載の単離された抗体、その抗原結合部分、ＣＡＲ、またはＢｉＴＥを含む、細胞。
【請求項２４】
前記細胞が免疫細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞からなる群から選択される、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
前記単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲが細胞表面上で発現する、請求項２３〜２５のいずれかに記載の細胞。
【請求項２７】
癌を処置することを必要とする対象において癌を処置する方法であって、請求項２３〜２６のいずれかに記載の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
癌を処置することを必要とする対象における癌を処置する方法であって、請求項２０〜２２に記載の核酸を前記対象に投与することを含み、前記対象のＴ細胞は、前記核酸によってコードされた前記ポリペプチドを発現させる、方法。
【請求項２９】
前記癌が
膵癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肝癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項２７〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
患者由来の生体試料中のＣＥＡＣＡＭ６を検出する方法であって、
ａ）前記患者由来の前記生体試料を、糖ペプチドを含む第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗体と接触させて、前記第１の抗体と前記ＣＥＡＣＡＭ６との間に第１の複合体を形成すること、
ｂ）前記第１の複合体を、第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗体であって、前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが異なっている、第２の抗体と接触させて、第２の複合体を形成することであって、前記第２の複合体が、前記第１の抗体と、ＣＥＡＣＡＭ６と、第２の抗体とを含む、形成すること、
ｃ）前記第２の複合体を検出し、それによりＣＥＡＣＡＭ６を検出すること、を含む、方法。
【請求項３１】
前記生体試料が、血清、血液、または血漿試料を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のエピトープが配列番号５１またはそのフラグメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のエピトープが配列番号１０１またはそのフラグメントを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のエピトープが配列番号７７またはそのフラグメントを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の抗体が、検出可能な標識を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、ビオチン基、酵素、色素、発光基、および蛍光基からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の抗体が固体支持体上に固定されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の抗体がヒト化抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒト化抗体が請求項１〜１３のいずれか１項に記載のヒト化抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記患者が膵癌に罹患しているかまたは膵癌の危険性がある、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。２０１８年２月２７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーはＧ６５２７−００３００＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、大きさは７４，２９１バイトである。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、十分に確立された治療法である。当初、マウス抗体は治療薬として使用されていたが、その有用性はマウス特異的配列に対するヒトの免疫応答によって妨げられていた。この応答は、マウス特異的配列がヒト配列に置き換えられたヒト化抗体の使用により改善された。後の修正には、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）を形成する毒性分子の共有結合、２価抗体を形成する２つの異なる結合部位、ならびに抗原に対する１つの結合部位およびＴ細胞上のＣＤ３分子へのその他の結合部位を有する切断型抗体が含まれる（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢＩＴＥ抗体）。抗体結合部位は、トランスフェクトした細胞が所望の抗原を認識することができるＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞などの他の免疫細胞内へ導入することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成するために使用されてきた。このアプローチは、免疫認識を回避するよう腫瘍が修飾することができる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の認識を必要としない免疫受容体をトランスフェクトされた細胞に持たせる。その上、標的にされた癌細胞と抗体を結合させると、トランスフェクトされた細胞（Ｔ細胞、ＮＫまたはＮＫＴ）は、活性化され、それらの殺滅能力が増強される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
癌細胞の表面上に存在する抗原に特異的に結合する抗体試薬、例えば、ヒト化抗体、ＢＩＴＥおよびＣＡＲが本明細書に記載される。Ｔ細胞によって発現するとき、このようなＣＡＲは、免疫系による癌細胞の認識および標的化を可能にする。したがって、癌の処置におけるこれらの修飾抗体およびＣＡＲ−Ｔ療法の使用に関する組成物および方法が本明細書に提供される。
【０００４】
一態様において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、この抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲが、
ａ．配列番号４または１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号５または１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号６または１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号１または７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２または８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号３または９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ以上の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、単離された抗体、その抗原結合部分、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
いくつかの態様において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号１３〜１７および配列番号２１〜２５から選択される配列を有する重鎖を含むことができる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号１８〜２０および配列番号２６〜２８から選択される配列を有する軽鎖を含むことができる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号１３〜１７から選択される配列を有する重鎖と、配列番号１８〜２０から選択される配列を有する軽鎖とを含むことができる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号２１〜２５から選択される配列を有する重鎖と、配列番号２６〜２８から選択される配列を有する軽鎖とを含むことができる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、ＣＤＲに含まれない配列において保存的置換を含むことができる。
【０００５】
いくつかの実施形態において、抗体またはポリペプチドは、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）からなる群から選択することができる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、癌細胞の表面上にある抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、癌幹細胞の表面上にある抗原に特異的に結合することができ、正常な腸細胞に特異的に結合しない。
【０００７】
一態様において、２つの結合部位を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、第１の結合部位が本明細書に記載される抗原結合部分を含み、第２の結合部位がＴ細胞に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞に特異的に結合する抗体の抗原結合部分は、抗体の抗ＣＤ３抗原結合部分であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部分はｓｃＦｖであり得る。
【０００８】
一態様において、本明細書に記載される単離された抗体、その抗原結合部分、ＣＡＲ、またはＢｉＴＥと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書に記載される。
【０００９】
一態様において、本明細書に記載される単離された抗体、その抗原結合部分、ＣＡＲ、またはＢｉＴＥをコードする核酸が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、この核酸は、配列番号２９〜４４から選択される配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、この核酸はｃＤＮＡであり得る。
【００１０】
一態様において、本明細書に記載される単離された抗体、その抗原結合部分、ＣＡＲ、またはＢｉＴＥを含む細胞が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、この細胞は免疫細胞であり得る。いくつかの実施形態において、この細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、細胞表面上に発現することができる。
【００１１】
一態様において、癌を処置することを必要とする対象において癌を処置する方法であって、本明細書に記載される細胞を対象に投与することを含む、方法が明細書に記載される。一態様において、癌を処置することを必要とする対象において癌を処置する方法であって、本明細書に記載される核酸を対象に投与することを含み、対象のＴ細胞が、核酸によってコードされるポリペプチドを発現する、方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、癌は、膵癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肝癌、および前立腺癌からなる群から選択することができる。
患者からの生物学的試料中のＣＥＡＣＡＭ６を検出する方法も提供される。本方法は、患者由来の生体試料を、糖ペプチドを含む第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗体と接触させて、第１の抗体とＣＥＡＣＡＭ６との間に第１の複合体を形成することと、第１の複合体を、第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗体であって、第１のエピトープおよび第２のエピトープが異なっている、第２の抗体と接触させて、第２の複合体を形成することであって、第２の複合体が第１の抗体と、ＣＥＡＣＡＭ６と、第２の抗体とを含む、形成することと、第２の複合体を検出し、それによりＣＥＡＣＡＭ６を検出することと、を含むことができる。生体試料は、血清、血液、または血漿試料であり得る。第１のエピトープは、配列番号５１もしくはそのフラグメント、配列番号１０１もしくはそのフラグメント、または配列番号７７もしくはそのフラグメントを含むことができる。第２の抗体は、検出可能な標識を含むことができる。検出可能な標識は、ビオチン基、酵素、色素、発光基、および蛍光基からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、第１の抗体は、固体支持体上に固定することができる。第１の抗体は、ヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体は、配列番号１〜２８のいずれかのアミノ酸配列であり得る。患者は、膵癌に罹患している患者、または膵癌の危険性がある患者であり得る。いくつかの実施形態において、患者は膵炎に罹患している患者であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本特許ファイルまたは出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の複製物は、請求および所要の料金の支払いに応じて、特許庁によって提供されることになる。
【００１３】
【図１】プロテインＡ精製ＰＴＡ−２３５７ヒト化バリアント抗体のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示している。試料をＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）上にロードし、２００Ｖで３０分間泳動した。製造元が推奨するようにゲルを調製および泳動した。レーンは以下に示すとおりであった：レーン１：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、＃ＳＭ１８１１）レーン２：１．０μｇＰＴＡ−２３５７キメラＩｇＧ１抗体レーン３：１．０μｇＰＴＡ−２３５７ＶＨ１／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体レーン４：１．０μｇＰＴＡ−２３５７ＶＨ２／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体レーン５：１．０μｇＰＴＡ−２３５７ＶＨ２／ＶＫ３ＩｇＧ１抗体レーン６：１．０μｇＰＴＡ−２３５７ＶＨ３／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体レーン７：１．０μｇＰＴＡ−２３５７ＶＨ４／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体。
【図２】プロテインＡ精製ＰＴＡ−２３５８ヒト化バリアント抗体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図示している。試料は、ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；カタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）上にロードし、２００Ｖで３０分間泳動した。製造元が推奨するようにゲルを調製および泳動した。レーンは以下に示すとおりであった：レーン１：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃ＳＭ１８１１）レーン２：１．０μｇＰＴＡ−２３５８キメラＩｇＧ１抗体レーン３：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ１／ＶＫ１ＩｇＧ１抗体レーン４：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ２／ＶＫ１ＩｇＧ１抗体レーン５：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ２／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体レーン６：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ３／ＶＫ１ＩｇＧ１抗体レーン７：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ４／ＶＫ１ＩｇＧ１抗体レーン８：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ４／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体レーン９：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ５／ＶＫ１ＩｇＧ１抗体レーン１０：１．０μｇＰＴＡ−２３５８ＶＨ５／ＶＫ２ＩｇＧ１抗体。
【図３Ａ】小細胞肺癌（ＣＳＣＬＣ）細胞に結合しているＮＳ０由来ヒト化バリアント抗体を用いた競合アッセイおよびフローサイトメトリー分析を示す。さまざまな濃度の各ヒト化抗体を固定濃度のマウス抗体（０．１μｇ／ｍｌ  ＰＴＡ−２３５７または０．３μｇ／ｍｌ  ＰＴＡ−２３５８）と混合し、ＣＳＣＬＣ細胞とともにインキュベートした。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＦｃを介して結合を検出した。データは、正規化された％陽性事象としてプロットした（Ｒ２においてゲート処理）。（図３Ａ）ＰＴＡ−２３５７はヒト化抗体をリードする。（図３Ｂ）および（図３Ｃ）ＰＴＡ−２３５８はヒト化抗体をリードする。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図４−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント１を示す。
【図４−２】同上。
【図５−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント２を示す。
【図５−２】同上。
【図６−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント３を示す。
【図６−２】同上。
【図７−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント４を示す。
【図７−２】同上。
【図８−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント５を示す。
【図８−２】同上。
【図９−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＫバリアント１を示す。
【図９−２】同上。
【図１０−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＫバリアント２を示す。
【図１０−２】同上。
【図１１−１】ＰＴＡ−２３５７の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＫバリアント３を示す。
【図１１−２】同上。
【図１２−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント１を示す。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント２を示す。
【図１３−２】同上。
【図１４−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント３を示す。
【図１４−２】同上。
【図１５−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント４を示す。
【図１５−２】同上。
【図１６−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＨバリアント５を示す。
【図１６−２】同上。
【図１７−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＫバリアント１を示す。
【図１７−２】同上。
【図１８−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＫバリアント２を示す。
【図１８−２】同上。
【図１９−１】ＰＴＡ−２３５８の可変重鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ＶＫバリアント３を示す。
【図１９−２】同上。
【図２０】ＨＴＫ２９細胞から成長した腫瘍球がＭＡｂ１０９による結合を示すことを実証している。ＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を幹細胞培養培地で１０日間成長させ、腫瘍球（癌幹細胞で濃縮）を形成した。親および腫瘍球をウエスタンブロット法のために収集した。上、抗ＣＥＡＣＡＭ６ポリペプチド抗体（対照；クローン９Ａ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ．５９８９９）を用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥ後の総ＨＴ２９細胞ライセートおよび腫瘍球（および陽性対照としてＣＥＡＣＡＭ６を発現するＣａｐａｎ１細胞ライセート）のブロット法；下、１０日間成長したＨＴ２９細胞ライセートまたは腫瘍球の２つのタンパク質濃度（２５ｍｇおよび３５ｍｇ）をＳＤＳ  ＰＡＧＥに供し、ＭＡｂ１０９またはベータアクチンでブロットした。
【図２１】ＰＮＧアーゼＦ処理後の膵癌細胞株ＢｘＰＣ３ＴＣＬに対するＭＡｂ１０９の反応性を分析するイムノブロットの結果を示す。
【図２２】癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーの構造を示す。
【図２３】ＣＥＡＣＡＭ６の構造、ＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸配列、およびこのアミノ酸配列内の１２の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を示す。
【図２４】Ｃ６ｆ１−ｐＦＵＳＥコンストラクト（配列番号５１）を示す。
【図２５】ＨＥＫ−２９３細胞がＭＡｂ１０９グリコエピトープを合成する生合成機構を含んでいることを示すイムノブロット法の実験結果を示す。
【図２６】種々のグリコシダーゼを用いたＨＥＫ野生型Ｃ６ｆ１の処理を示すイムノブロット法の実験結果を示す。
【図２７】ＨＥＫ  Ｌｅｃ１細胞内で発現したＣＥＡＣＡＭ６フラグメント１グリカンを示す。
【図２８】ＨＥＫ  Ｌｅｃ１細胞内で発現したＭＡｂ１０９エピトープがＥｎｄｏＨ耐性であることを示すイムノブロット法の実験を示す。
【図２９】Ｅｎｄｏ  Ｈ処理後にＨＥＫ  Ｌｅｃ１細胞内で発現したＣＥＡＣＡＭ６フラグメント１グリカンを示す。
【図３０】ＣＥＡＣＡＭ５（配列番号５５）ＣＥＡＣＡＭ６（配列番号５６）およびＣＥＡＣＡＭ８（配列番号５７）についてのＣ末端の配列アラインメントを示す。
【図３１】Ｃ６ｆ１の３００ＱＡＨ３０２から３００ＨＴＴ３０２への特定部位の変異誘発がＭＡｂ１０９の反応性を消失させることを示すイムノブロット法の実験結果を示す。
【図３２】ＣＥＡＣＡＭ８の３つのアミノ酸が変異すると、ＭＡｂ１０９グリコエピトープが発現することを示すイムノブロット法の実験結果を示す。
【図３３】ＣＥＡＣＡＭ６エピトープのグリコシル化部位の下流のＣＥＡＣＡＭ８アミノ酸の変異がＭＡｂ１０９エピトープの発現をもたらすことを示すイムノブロット法の実験結果を示す。
【図３４】Ｃ６ｆ１中の各Ｎ結合型シークオンの欠失（Ｎ→Ｑ）（配列番号５１）の効果を示すイムノブロット法の実験結果を示す。
【図３５】たった１個のＡｓｎＸＳｅｒ／Ｔｈｒシークオンの変異がＭＡｂ１０９結合活性を除去することを示す構造分析を示す（配列番号５１）。
【図３６】配列番号５１における追加の変異を要約する。
【図３７】３００〜３１８ペプチドセグメントの変異およびＭＡｂ１０９結合の測定値を要約する。
【図３８】合成ペプチド（配列番号１０２）および合成グリコペプチド（配列番号１０２）が３０マイクロモル濃度でＭＡｂ１０９結合を阻害しなかったことを示す実験結果を要約する。
【図３９】ＭＡｂ１０９結合活性に対するＣ末端ペプチドの効果を示す実験結果を要約する。
【図４０】ヒト血清中のＣＥＡＣＡＭ６の検出のためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４１】ＭＡｂ１０９を用いたヒト血清中のＣＥＡＣＡＭ６グリコエピトープの検出のためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４２】非罹患患者、慢性膵炎患者、および膵癌患者の第１のセットの血清中のＭＡｂ１０９を使用した、ＣＥＡＣＡＭ６グリコエピトープの検出のためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４３】非罹患患者、慢性膵炎患者、および膵癌患者の第２のセットの血清中のＭＡｂ１０９を使用した、ＣＥＡＣＡＭ６グリコエピトープの検出のためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
癌細胞、例えば肺癌細胞、結腸癌細胞、または膵癌細胞に存在する抗原に特異的に結合する抗体および関連ポリペプチドが本明細書に記載される。抗原、ＣＥＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ、「分化クラスター６６ｃ」、癌胎児性抗原関連細胞接着分子６、ＣＥＡＬ、およびＮＣＡとしても既知）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質である。例示的なＣＥＡＣＡＭ６アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２４７４．４であり得る。ＣＥＡＣＡＭ６をコードする例示的なｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００２４８３．６であり得る。ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する例示的な抗体は、マウス抗体ＭＡｂ１０９であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する例示的なヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ１０９に基づくことができる。このような抗体およびポリペプチドは、例えば、癌の診断、予後、および／または処置を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）抗体に関する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、癌についてのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＡＲ−Ｔ療法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、癌細胞表面抗原などの抗原を結合する抗体の抗原結合部分と、結合する同じ抗体の別の抗原結合部分とを含む抗体および／またはポリペプチドに関する。「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」または「ＢＩＴＥ」は、免疫エフェクター細胞上の癌抗原と活性化抗原とを同時に結合する抗体を称する。本明細書で使用する場合、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」または「ＢＩＴＥ」は、免疫エフェクター細胞上の癌抗原と活性化抗原とを同時に結合する抗体を称する。本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、細胞シグナル伝達ドメインおよび／または細胞活性化ドメインに連結した抗原結合ドメイン（抗体の抗原結合部分（例えば、ｓｃＦＶ））を含む人工的に構築された複合ポリペプチドを称する。いくつかの実施形態において、細胞シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、細胞活性化ドメインはＴ細胞活性化ドメインであり得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞および他の免疫細胞の特異性および反応性を、選択された標的へとＭＨＣに制限されない様式で向け直し、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識する能力を付与し、したがって、腫瘍回避の主要な機序を迂回する。その上、Ｔ細胞内発現させると、ＣＡＲは有利なことに、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。最も一般的には、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の可変重および軽領域の融合に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成される。あるいは、Ｆａｂに由来するｓｃＦｖを（例えば、Ｆａｂライブラリーから得られる抗体の代わりに）使用してもよく、種々の実施形態において、このｓｃＦｖは膜貫通ドメインに、次いで細胞内シグナル伝達ドメインに融合する。「第１世代」ＣＡＲには、抗原結合の際にＣＤ３ゼータシグナルを単に提供するものが含まれる。「第２世代」ＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７）および活性化（ＣＤ３Ｑの両方を提供するものが含まれる。「第３世代」のＣＡＲには、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１３７）および活性化（ＣＯ３Ｑ）を提供するものが含まれる。種々の実施形態において、ＣＡＲは、抗原に対して高い親和性または結合力を有するように選択される。ＣＡＲのさらなる詳細は、例えば、これらの各々が全体として参照により本明細書に援用されるＭａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１４  １２３：２６２４−３５、Ｒｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１４  １６：１４４１−１４５８、Ｈｏｙｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１２  ９７：１６２２、Ｂｙｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４  ３２：３０３９−４７、Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９  ６９：４５５９−４５６２、およびＴａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１２  １８：６４３６−６４４５において認めることができる。
【００１６】
「癌細胞」は、インビボ、エクスビボ、または組織培養のいずれかにおける、新たな遺伝材料の取り込みを必ずしも包含しない自然発生的なまたは誘導された表現型の変化を有する癌性細胞、前癌細胞、または形質転換細胞である。形質転換は、形質転換ウイルスを用いた感染および新たなゲノム核酸の取り込み、または外来性核酸の取り込みから生じる可能性があるが、自然発生的に、または発癌物質への曝露後に生じることもでき、それにより内在性遺伝子を変異させることができる。形質転換／癌は、例えば、形態学的変化、細胞の不死化、異常な成長制御、病巣形成、足場への非依存性、悪性、接触阻害の喪失および成長の密度制限、成長因子または血清への非依存性、腫瘍特異的マーカー、侵襲性または転移、ならびにヌードマウスなどの適切な動物宿主における腫瘍成長と関連している。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＣＵＬＴＵＲＥ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：ＭＡＮＵＡＬ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨ．（３ｒｄ  ｅｄ．，１９９４）を参照されたい。本明細書で使用する場合、「癌」という用語は、身体の器官および系の正常な機能を妨げる細胞の制御されていない成長を称する。癌または腫瘍に罹患している対象は、対象の体内に存在する客観的に測定可能な癌細胞を有する対象である。この定義には、良性および悪性の癌、ならびに休止状態の腫瘍または微小転移が含まれる。元の場所から移動し、重要な器官に播種する癌は、最終的に、影響を受けた器官の機能劣化を経て対象の死亡をもたらす可能性がある。
【００１７】
一態様において、癌細胞の表面上の抗原に特異的に結合する単離された抗体、その抗原結合部分、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、この抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲが、
ａ．配列番号４または１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号５または１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号６または１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号１または７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２または８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号３または９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ以上の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、単離された抗体、その抗原結合部分、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書に記載される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｅ．配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
ｆ．配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号１３〜１７および配列番号２１〜２５から選択される配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号１８〜２０および配列番号２６〜２８から選択される配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号１３〜１７から選択される配列を有する重鎖と、配列番号１８〜２０から選択される配列を有する軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、配列番号２１〜２５から選択される配列を有する重鎖と、配列番号２６〜２８から選択される配列を有する軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、ＣＤＲに含まれない配列において保存的置換を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、癌細胞の表面上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、例えば、正常細胞への結合と比較して、癌細胞の表面上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、癌幹細胞の表面上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、癌幹細胞の表面上の抗原に特異的に結合し、正常な腸細胞に特異的に結合しない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体の抗原結合部分を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（商標））が、本明細書に記載される。ＢｉＴＥは、２つの異なる結合部位（例えば、２つのアーム＝２つの異なる結合部位）を有するｍｏａｂの構造である。通常、１つの部位（例えば、アーム）は腫瘍抗原に向けられ、他の部位（例えば、アーム）はＣＤ３抗原に向けられる。したがって、ＢｉＴＥは、各々がアームまたは結合部位に寄与している２つのモノクローナル抗体のキメラとして考えることができる。ＢｉＴＥが結合すると、腫瘍細胞とＴ細胞との間を架橋している。ＢｉＴＥ分子は、少なくとも２つのｓｃＦｖドメインを含むことができ、それらの各々は異なるエピトープ特異性を有する。ＢｉＴＥ分子は、１）いかなるＴ細胞とも、および２）腫瘍細胞の殺滅を向け直す特異的な抗原発現腫瘍細胞とも関与する。いくつかの実施形態において、いかなるＴ細胞へも関与する、例えば、いかなるＴ細胞にも結合するｓｃＦｖドメインは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖであり得る。ＢｉＴＥの非限定例は、ブリナツモマブである。ＢｉＴＥは、当技術分野で、例えば、Ｏｂｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．ｍＡｂｓ  ２０１４  ６：１５７１−１５８４、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０１４  ２７：３１−３７、およびＷｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ２０１３  １６：１４９−１５２においてさらに記載され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、抗体、その抗原結合フラグメント、および／またはＣＡＲは、単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗体、その抗原結合フラグメント、および／またはＣＡＲは、精製されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗体、その抗原結合フラグメント、および／またはＣＡＲは、操作されたポリペプチドである。
【００２６】
本明細書に記載される抗体、その抗原結合フラグメント、またはＣＡＲが配列番号１〜１２の配列と同一ではない少なくとも１つのＣＤＲを含む実施形態において、その少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列は当業者に周知の方法によって選択することができる。例えば、Ｆｕｊｉｉ，２００４，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ“ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２４８：３４５−３４９（その全体が参照により本明細書に援用される）は、特に図２および第３．３節において、関心対象の何らかのＣＤＲについてのライブラリーを作成する方法について記載している。これにより、当業者は、本明細書に記載される特定のＣＤＲ配列の保存的置換バリアントを含む代替ＣＤＲを同定することができ、このことは、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合フラグメント中に存在するときに、癌細胞表面抗原を結合することになる抗原またはその抗原結合フラグメントを結果的に生じることになる。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌細胞に特異的に結合することができる。Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．において記載される方法によって、当業者は、既知の重鎖フラグメントと組み合わせるとき所望の結合挙動を付与することになる軽鎖配列についてスクリーニングすることもでき、その逆もまた同様である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、抗体−薬剤複合体に含めることができる。薬剤は、例えば、本明細書の他所に記載される化学療法分子であり得る。いくつかの実施形態において、抗体および／またはその抗原結合部分ならびに化学療法薬は、互いに直接複合体形成ならびに／または結合することができ、例えば、抗体−薬剤複合体であり得る。いくつかの実施形態において、結合は、例えば、水素結合、静電相互作用、またはファンデルワールス相互作用による非共有結合であり得るが、結合はまた、共有結合であってもよい。「複合体形成された」の意味するところは、少なくとも２つの分子の共有結合である。
【００２８】
抗体−薬剤複合体における使用のためのリンカー、および抗体−薬物複合体を作製する方法は、当技術分野で既知であり、本明細書に記載される組成物に適合させることができる。例示的な抗体−薬剤複合体には、抗体およびＭＭＡＥが、パラアミノ安息香酸スペーサーであるバリンおよびシトルリンを含むカテプシン開裂可能なリンカーによって連結された、４−メルカプト吉草酸およびモモメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）複合体（例えば、ブレンツキシマブＭＭＡＥおよびグレンバツムマブＭＭＡＥ）を介して抗体およびメルタンシンが結合しているメルタンシン複合体（例えば、ビバツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、およびロルボツズマブメルタンシン）と、マレイミドおよびカプロン酸付着基とを含むことができるが、これらに限定されない。適切なリンカー技術を含む抗体−薬剤複合体のさらなる考察は、例えば、これらの各々がその全体として参照により本明細書に援用される“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ”Ｅｄ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇａｉｌ  Ｌｅｗｉｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２０１３、Ｚｏｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ２０１３  １２：２５９−２６０、およびＤｕｃｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔｕｍｐ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ２０１０  ２１：５−１３において認めることができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲをコードする核酸に関する。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号２９〜４４から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡである。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの類似体のポリマー分子組込み単位を称する。核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの一本鎖核酸であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ、例えばイントロンを欠失している核酸であり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲをコードする核酸は、ベクターによって含める。本明細書に記載される態様のいくつかにおいて、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲ、またはその何らかのモジュールをコードする核酸配列は、ベクターに操作可能に連結される。「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主細胞への送達のためにまたは異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸コンストラクトを称する。本明細書で使用する場合、ベクターはウイルス性または非ウイルス性であり得る。「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連しているときに複製することができ、遺伝子配列を細胞に移動させることができる何らかの遺伝要素を包含する。ベクターには、クローン形成ベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含むことができるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを称する。発現した配列はしばしば、細胞にとって異種性となるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加の要素を含むことがあり、例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有することがあり、したがってそのことが２つの生物において、例えば発現のためのヒト細胞において、ならびにクローン形成および増幅のための原核生物宿主において維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質を産生すること、ならびに適宜、タンパク質を分泌することに関与する細胞過程を称し、適用可能な場合、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳ならびにタンパク質の折りたたみ、修飾およびプロセシングを含むがこれらに限定されない。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に操作可能に連結されたときにインビトロまたはインビボでＲＮＡへ転写された核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コードする領域の前後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列と、３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、および個々のコードするセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含むことがあり、または含まないことがある。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化されることになる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを称する。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲをコードする核酸を含むことができる。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで何らかの核酸を細胞内に移入させる目的で利用してもよい。多数の形態のウイルスベクターが当技術分野で既知である。
【００３４】
「組換えベクター」が意味するのは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」である。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態において、他の適切な組成物および療法と組み合わせることができることは理解されるべきである。いくつかの実施形態において、ベクターはエピソーム性である。適切なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡ中に維持する手段を提供し、それにより染色体組込みの潜在的な影響を排除する。
【００３５】
一態様において、本明細書に記載される単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲを含む細胞が本明細書に記載されれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書に記載される単離された抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲをコードする核酸を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞である。本明細書で使用する場合、「免疫細胞」は、免疫応答において役割を担っている細胞を称する。免疫細胞は造血起源であり、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞はＴ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；Ｂ細胞またはＴ細胞などのリンパ球であり、いくつかの実施形態において、細胞は、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、または顆粒球などの骨髄細胞である。
【００３７】
本明細書に記載される技術の態様は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲ、または本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲをコードする核酸、または本明細書に記載される細胞を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物である。本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、製薬産業における使用が承認された薬学的に許容される担体と組み合わせた活性薬を称する。「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症のない、妥当な利益／危険比に見合った化合物、材料、組成物、および／または剤形を称するために本明細書で採用される。
【００３８】
中に溶解または分散した有効成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野で十分に理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。典型的には、このような組成物は、液状溶剤または懸濁剤のいずれかとして注射可能なものとして調製されるが、液剤または懸濁剤に適した固体形態を溶液中で使用前に調製することもできる。調製物は、乳化することもできるか、またはリポソーム組成物として提示することもできる。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分と適合性がある賦形剤と、本明細書に記載される治療方法での使用に適した量で混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。さらに、所望の場合、組成物は、有効成分の有効性を強化または維持する湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。本明細書に記載される治療用組成物は、成分の薬学的に許容される塩を中に含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成された酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成）が含まれる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることもできる。生理学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。例示的な液体担体は、有効成分および水に加えて材料を含んでいない、または生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理学的塩類溶液、またはリン酸緩衝塩類溶液など、その両方などの緩衝液を含んでいる滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、複数の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質などの塩を含むことができる。液体組成物は、水に加えて、および水を除外するように、液相を含むこともできる。このような追加の液相の例次的なは、グリセリン、綿実油などの植物油、および水油エマルションである。特定の障害または容態の処置において有効であることになる本発明で使用される活性薬の量は、障害または容態の性質に依存することになり、標準的な臨床技術により決定することができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲを含む、または本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲをコードする核酸を含む組成物は、凍結乾燥物であり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、治療有効量の本明細書に記載される組成物を含む注射器に関する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、治療有効量の本明細書に記載される組成物を含む容器、例えば、バッグおよび／または滅菌容器に関する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」、「有効量」または「有効用量」という句は、腫瘍または悪性腫瘍の処置、予防、または管理において治療上または審美上の利益を提供する量、例えば、腫瘍または悪性腫瘍の少なくとも１つの症状、兆候、またはマーカーの統計的に有意な低下を提供する量を称する。治療有効量の決定は十分に、当業者の能力の範囲内である。概して、治療有効量は、対象の病歴、齢、容態、および性別、ならびに対象の医学的容態の重症度および種類、ならびに他の薬学的に活性のある薬剤の投与とともに変えることができる。
【００４２】
一態様において、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲ、または本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲをコードする核酸を対象に投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、対象は、癌および／または悪性腫瘍の処置の必要にある。いくつかの実施形態において、対象は、膵癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肝癌、および前立腺癌の処置の必要にある。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象を処置する方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、対象における癌を処置する方法である。
【００４４】
一態様において、癌を処置することを必要とする対象において癌を処置する方法であり、本方法は、本明細書に記載される細胞、例えば、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲを含む細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞である。
【００４５】
一態様において、癌を処置することを必要とする対象において癌を処置する方法であり、本方法は、本明細書に記載される核酸（例えば、抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲをコードする核酸）を対象に投与することを含み、ここで、対象の免疫細胞は、核酸によってコードされるポリペプチドを発現させる。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＴ細胞である。核酸は、例えば、細胞型特異的プロモーターおよび／または所望の細胞型に選択的に結合する組成物の使用によって、特定の細胞型を標的とすることができる。例えば、アプタマーへの核酸の結合は、的を絞った送達を可能にすることができる（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、核酸は、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達することができる。正に帯電したカチオン性送達システムは、核酸分子（負に帯電）の結合を促進し、また負に帯電した細胞膜における相互作用を増強して、細胞による核酸の効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、核酸に結合するか、または核酸を封入するベシクルもしくはミセルを形成するよう誘導されるかが可能である（例えば、Ｋｉｍ  ＳＨ．，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ１２９（２）：１０７−１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与されたときの核酸の分解をさらに防止する。カチオン阻害性核酸複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、それらの全体が参照により本明細書に援用されるＳｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ３２７：７６１−７６６、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００、Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたい）。核酸の全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），上述、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），上述）、オリゴフェクタミン、「ｓｏｌｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８、Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ＭＥ．，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ１６（印刷に先立つ電子公開）、Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ（２��０７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７、Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、全身投与のためにシクロデキストリンとの複合体を形成する。核酸およびシクロデキストリンの投与のための方法および医薬組成物は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号において認めることができる。核酸の的を絞った送達は、例えば、それらの各々が全体として参照により本明細書に援用されるＩｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ２００６  ２３：１６３１−１６４０、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２００４  ４３２：１７３−８およびＬｏｒｅｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４，４９７５−４９７７（２００４）において説明される。例として、核酸は、免疫細胞上に発現する受容体のリガンド、例えばＴＣＲを含むリポソーム内に阻害剤を封入することによって免疫細胞を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、リポソームは、免疫細胞に特異的なアプタマーを含むことができる。
【００４６】
本明細書で使用する「腫瘍」は、身体の器官および系の正常な機能を妨げる制御されていない細胞腫瘍成長を称する。「癌」および「悪性腫瘍」という用語は、転移性である腫瘍、すなわち、浸潤性となり、元の腫瘍部位から遠隔の組織内に腫瘍成長を播種する腫瘍を称する。癌または腫瘍に罹患している対象とは、対象の体内に存在する客観的に測定可能な癌細胞を有する対象である。この定義には、良性腫瘍および悪性癌、ならびに潜在的に休眠している腫瘍または微小転移が含まれる。元の場所から移動し、他の重要な器官に播種する癌は、最終的に、影響を受けた器官の機能的な悪化を経て対象の死亡をもたらす可能性がある。白血病などの造血系の癌は、対象における正常な造血区画を打ち負かす可能性があり、それにより、最終的に死亡を引き起こす造血不全（貧血、血小板減少症および好中球減少症の形態における）をもたらす。
【００４７】
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系の癌、乳癌、腹膜の癌、子宮頚癌、絨毛癌、大腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頚部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫（ＧＢＭ）、肝癌、肝細胞癌、上皮内腫瘍、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌または子宮内膜癌、尿路系の癌、外陰腫瘍、ならびに他の癌腫および肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（軽度悪性／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高度悪性免疫芽球性ＮＨＬ、高度悪性リンパ芽球性ＮＨＬ、高度悪性小非分割細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍と関係するものなど）、およびメーグス症候群と関連する異常な血管増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＣＡＲ−Ｔ療法などのＣＡＲ免疫細胞療法に関する。ＣＡＲ−Ｔ療法および関連する療法は、標的となる細胞型（例えば、癌細胞）に特異的に結合して対象を処置するＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の養子細胞移入に関する。いくつかの実施形態において、療法の一部として投与される細胞は、対象にとって自家性であり得る。いくつかの実施形態において、療法の一部として投与される細胞は、対象にとって自家性ではない。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＡＲを発現するように操作および／または遺伝子改変される。ＣＡＲ−Ｔ療法のさらなる考察は、例えば、これらの各々が全体として参照により本明細書に援用されるＭａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ２０１４  １２３：２６２４−３５、Ｒｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２０１４  １６：１４４１−１４５８、Ｈｏｙｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ２０１２  ９７：１６２２、Ｂｙｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ２０１４  ３２：３０３９−４７、Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００９  ６９：４５５９−４５６２、およびＴａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２０１２  １８：６４３６−６４４５において認めることができる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は霊長類、齧歯類、飼育動物または狩猟用動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルなどが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが含まれる。飼育動物および狩猟用動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ種、例えば、飼い猫、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、魚類、例えば、マス、ナマズおよびサーモンが含まれる。患者または対象には、上述の何らかの部分セット、例えば、上述のすべてが含まれるが、ヒト、霊長類または齧歯類などの１つ以上の群または種は除外される。ある特定の実施形態において、対象は、哺乳類動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「患者」、「個体」、および「対象」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用される。
【００５０】
好ましくは、対象は、哺乳類動物である。哺乳類動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。例えば、種々の癌の動物モデルを表す対象として、例えば、ヒト以外の哺乳類動物を有利に使用することができる。さらに、本明細書に記載される方法は、飼育動物および／またはペットを処置するために使用することができる。対象は、雄性でも雌性でもかまわない。
【００５１】
対象は、処置を必要とする容態（例えば、癌）またはこのような容態と関連する１つ以上の合併症に苦しんでいるまたは罹患しているものとして以前に診断されたかまたは同定されたものであり得るが、必要に応じて、容態または容態と関連する１つ以上の合併症のための処置を以前に受ける必要はなかった。あるいは、対象は、処置を必要とする容態またはこのような容態と関連する１つ以上の合併症に罹患していると以前に診断されたことがない対象でもあり得る。例えば、対象は、容態に対する１つ以上の危険因子もしくは容態と関連する１つ以上の合併症を呈するもの、または危険因子を呈さない対象であり得る。特定の容態のための処置の「必要のある対象」は、その容態に罹患している、その容態に罹患していると診断された、またはその容態を発症する危険性がある対象であり得る。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「寛解」は、疾患、障害または医学的容態に関して使用するとき、目的が、症状または容態の進行または重症度を逆転させること、緩和すること、寛解させること、抑制すること、遅延させること、または停止させることである容態のための治療処置を称する。「処置すること」という用語は、容態の少なくとも１つの副作用または症状を軽減または緩和することを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが低減した場合、処置は概して「有効」である。あるいは、容態の進行が低減または一時停止した場合、処置は「有効」である。すなわち、「処置」には、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置の非存在下で予想されるであろう症状の進行または悪化の休止または少なくとも遅延も含まれる。有益なまたは所望の臨床結果には、１つ以上の症状の緩和、欠陥の程度の減少、腫瘍または悪性腫瘍の安定した（すなわち悪化していない）状態、腫瘍成長および／または転移の遅滞または遅延、ならびに処置の非存在下で予想される寿命と比較した寿命の延長が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、「投与する」という用語は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲ、または抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲをコードする核酸、または本明細書に記載されるこのような試薬を含む細胞の、所望の部位で薬剤の少なくとも部分的な局在化を結果的に生じる方法または経路によって対象内へ配置することを称する。本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲ、または抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲをコードする核酸、または本明細書に開示の本明細書に記載されるこのような試薬を含む細胞を含む医薬組成物を、対象における有効な処置を結果的に生じる何らかの適切な経路によって投与することができる。
【００５３】
薬剤の投薬量範囲は効力に依存し、所望の効果、例えば、腫瘍成長の遅延または腫瘍の大きさの縮小を生じるのに十分な量を包含する。投薬量は、容認できない有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。概して、投薬量は、患者の齢、容態、および性別によって異なり、当業者によって決定することができる。何らかの合併症の場合には、投薬量は個々の医師によって調整することもできる。いくつかの実施形態において、投薬量は、０．００１ｍｇ／体重ｋｇ〜０．５ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態において、用量範囲は、５μｇ／体重ｋｇ〜１００μｇ／体重ｋｇである。あるいは、用量範囲は、血清レベルを１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬに維持するように用量設定されてもよい。全身投与については、対象に、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれより多量などの治療量が投与され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において（例えば、抗体薬剤複合体を投与するとき）、用量は約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約２ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約４ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約５ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約６ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約８ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態（例えば、抗体またはその抗原結合部分を投与するとき）において、用量は約１００ｍｇ／ｍ２〜約７００ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は約２５０ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は約３７５ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は約５００ｍｇ／ｍ２であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態（例えば、ＢｉＴＥを投与するとき）において、用量は、１日当たり約０．５〜約９０ｕｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態（例えば、ＢｉＴＥを投与するとき）において、用量は、１日当たり約５〜約６０ｕｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は１日当たり約５μｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は１日当たり約１５ｕｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は１日当たり約６０ｕｇ／ｍ２であり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態（本明細書に記載される細胞を投与するとき）において、投薬量は体重１ｋｇ当たり約１×１０５個細胞〜約１×１０８個細胞であり得る。いくつかの実施形態において、投薬量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０６個細胞〜約１×１０７個細胞であり得る。いくつかの実施形態において、投薬量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０６個細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１用量の細胞を投与することができる。いくつかの実施形態において、細胞の投与は、例えば、１回、２回、またはそれより多数回繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、細胞の投与は、例えば、毎日、毎週、または毎月ベースで投与することができる。
【００５８】
先に列挙した用量の投与は、繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、用量は、１日に１回、または１日に複数回、例えば、１日に３回与えられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、先に列挙した用量は、数週間または数か月間、毎日投与される。処置期間は、対象の臨床上の進展および療法に対する応答性に依存する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、用量は静脈内投与することができる。いくつかの実施形態において、静脈内投与は、約１０分〜約３時間の時間にわたって生じる注入であり得る。いくつかの実施形態において、静脈内投与は、約３０分〜約９０分の時間にわたって生じる注入であり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、用量は、ほぼ毎週投与することができる。いくつかの実施形態において、用量は、毎週投与することができる。いくつかの実施形態において、用量は、約１２週間〜約１８週間にわたって毎週投与することができる。いくつかの実施形態において、用量は、約２週間ごとに投与することができる。いくつかの実施形態において、用量は、約３週間ごとに投与することができる。いくつかの実施形態において、用量は、約２週間ごとに投与される約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約３週間ごとに投与される約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約２週間ごとに静脈内投与される約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約３週間ごとに静脈内投与される約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、ほぼ毎週静脈内投与される約２００ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約２週間ごとに静脈内投与される約２００ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約３週間ごとに静脈内投与される約２００ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２であり得る。いくつかの実施形態において、合計で約２〜約１０回の用量が投与される。いくつかの実施形態において、合計４回の用量が投与される。いくつかの実施形態において、合計５回の用量が投与される。いくつかの実施形態において、合計６回の用量が投与される。いくつかの実施形態において、合計７回の用量が投与される。いくつかの実施形態において、合計８回の用量が投与される。いくつかの実施形態において、投与は合計約４週間〜約１２週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は合計約６週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は合計約８週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は合計約１２週間行われる。いくつかの実施形態において、初回用量は、その後の用量よりも約１．５〜約２．５倍多くすることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、用量は、約１ｍｇ〜約２０００ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約３ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約１０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約３０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約１０００ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約２０００ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、毎日静脈内注入により与えられる約３ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、毎日静脈内注入により与えられる約１０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、用量は、週３回の静脈内注入により与えられる約３０ｍｇであり得る。
【００６２】
治療有効量とは、腫瘍の大きさ、腫瘍の成長などにおいて統計的に有意で測定可能な変化を生じるのに十分である薬剤の量である（有効性の測定を、後で本明細書に記載される）。このような有効量は、臨床試験および動物研究において評価することができる。
【００６３】
薬剤は、経時的に注射によってまたは徐々に注入することによって静脈内投与することができる。所定の経路に適切な製剤を考慮して、例えば、本明細書に記載される方法および組成物において有用な薬剤は、静脈内、鼻腔内、吸入、腹腔内、筋肉内、皮下、共振器内に投与することができ、ペリスタ手段によって、所望の場合、または当業者によって既知の他の手段によって送達することができる。本明細書で使用する化合物は、癌に罹患している患者に経口、静脈内または筋肉内投与することが好ましい。腫瘍塊への直接的な局所投与も特に考えられる。
【００６４】
少なくとも１つの薬剤を含有する治療用組成物は、例えば、単位用量で従来通りに投与することができる。「単位用量」という用語は、治療用組成物に関して使用されるとき、対象のための単位投薬量として適切な物理的に離散した単位を称し、各単位は、必要な生理学的に許容される希釈剤、すなわち、担体、またはビヒクルと関係する所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性材料を含有する。
【００６５】
組成物は、投薬量製剤に適合する様式で、治療有効量で投与される。投与されることになる量およびタイミングは、処置されることになる対象、有効成分を利用する対象の系の能力、および所望の治療効果の程度に依存する。
【００６６】
投与されるのに必要な有効成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個人に特有である。しかしながら、全身適用に適した投薬量範囲は、本明細書に開示されており、投与経路に依存する。投与に適切な制度もさまざまであるが、初回の投与と、それに続くその後の注射または他の投与による１時間以上の間隔での反復投与が典型的である。あるいは、インビボ療法のために指定された範囲内に血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が考えられる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、方法は、併用療法の一部として、本明細書に記載される医薬組成物を１つ以上の追加の化学療法薬、生物製剤、薬剤、または処置とともに投与することをさらに含む。いくつかのこのような実施形態において、化学療法薬生物製剤、薬剤、または処置は、放射線療法、手術、ゲムシタビン、シスプラスチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、ＡＭＧ４７９、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ＡＢＴ−７３７、ＰＩ−１０３、ならびにイピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブを含むがこれらに限定されないチェックポイント阻害剤からなる群から選択される。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「化学療法」または「化学療法薬」という用語は、異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置において治療上の有用性を有する何らかの化学薬を称する。このような疾患には、腫瘍、新生物および癌、ならびに過形成の成長を特徴とする疾患が含まれる。本明細書で使用する化学療法薬は、化学薬および生物薬の両方を包含する。これらの薬剤は、癌細胞が持続的な生存のために依存する細胞活動を阻害するように機能する。化学療法薬のカテゴリーには、アルキル化薬／アルカロイド薬、代謝拮抗薬、ホルモンまたはホルモン類似体、および種々の抗新生物薬が含まれる。これらの薬剤のすべてではないにしても、ほとんどは癌細胞に直接毒性があり、免疫刺激を必要としない。一実施形態において、化学療法薬は、固形腫瘍などの新生物を処置する上で使用する薬剤である。一実施形態において、化学療法薬は放射性分子である。当業者は、使用する化学療法薬を容易に特定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ８６  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７  ｉｎ  Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ、Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ，Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９５、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ  Ｓ，Ｋｎｏｂｆ  Ｍ  Ｆ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ  Ｈ  Ｊ（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９３を参照されたい）。本明細書に記載される二重特異性および多重特異性ポリペプチド薬は、追加の化学療法薬と併用することができる。
【００６９】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載される医薬組成物を投与される対象に１つ以上の化学療法薬を投与することをさらに含む。化学療法薬の非限定例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化薬；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチルローロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチンなどのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照されたい）；ジネミシンＡを含むジネミシン；クロドロナートなどのビスホスホナート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連する発色タンパク質エンジイン抗生物質発色団）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどのミトマイシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのピリミジン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎抗体；フロリン酸などの葉酸増し液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；エリプチニウムアセタート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラレリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，オレゴン州ユージーン市）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクラリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ニュージャージー州プリンストン地区）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有のアルブミン操作したパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，イリノイ州シャンバーグ村）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，フランス共和国アントニー市）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵおよびロイコボリンを用いたイリノテカンの処置投与計画を含む）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン処置投与計画（ＦＯＬＦＯＸ）���含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；細胞増殖を低減させるＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）））およびＶＥＧＦ−Ａの阻害薬、ならびに先のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を挙げることができる。
【００７０】
本明細書で使用する「細胞障害性薬」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、およびそのフラグメントおよび／またはバリアントを含む細菌、真菌、植物または動物の起源の小分子毒素または酵素活性のある毒素などの毒素を含むよう企図される。
【００７１】
「放射線療法」の意味するところは、正常に機能する能力または細胞を完全に破壊する能力を制限するように、細胞に十分な損傷を誘導する定向性ガンマ線またはベータ線の使用である。処置の投薬量および持続期間を決定するために、当技術分野で既知の多くの方法があることは認められるであろう。典型的な処置は、１回の投与として与えられ、典型的な投薬量は１日当たり１０〜２００単位（グレイ）の範囲である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、追加の免疫療法を対象に投与することをさらに含むことができる。本明細書で使用する場合、「免疫療法」は、患者自身の免疫系を誘導して腫瘍と戦うように設計された治療戦略の多様なセットを称し、表在性膀胱癌のための膀胱内ＢＣＧ免疫療法、悪性黒色腫および腎細胞癌などに対する特異的な免疫応答を生じるワクチン、患者由来の樹状細胞に前立腺酸ホスファターゼペプチドを負荷して、前立腺由来細胞に対する特異的免疫応答を誘導する、前立腺癌のためのＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔの使用、１つ以上の免疫細胞型を刺激するサイトカイン、成長因子および／またはシグナル伝達分子（例えば、インターロイキン）の投与、患者への再導入に先立ち、腫瘍抗原に特異的なリンパ球および／または樹状細胞のエクスビボ増殖および／または刺激、イミキモド、養子細胞移入、ならびに／あるいは例えば、国際特許公開第ＷＯ２００３／０６３７９２号および米国特許第８，３２９，６６０号において説明される方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫療法はＮＫ応答を刺激する。いくつかの実施形態において、免疫療法は養子細胞移入アプローチである。
【００７３】
癌に対する所与の処置の有効性は、熟練した臨床医によって判断することができる。しかしながら、例えば、腫瘍の兆候または症状のいずれか１つもしくはすべてが有益な様式で変化するか、または他の臨床上認められる症状が、例えば、本明細書に記載される薬剤を用いた処置後の少なくとも１０％改善されるかもしくはさらに寛解する場合、処置は、当用語が本明細書で使用される場合、「有効な処置」とみなされる。有効性は、入院または医学的介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化不全である（すなわち、疾患の進行が停止している）ことによって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、および／または本明細書に記載されている。
【００７４】
疾患の処置に有効な量は、それを必要とする哺乳類動物に投与されたときに、当疾患に対して当用語が本明細書で定義されるような有効な処置を結果的にもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、例えば、癌の物理的指標、例えば、腫瘍の大きさ、腫瘍質量、腫瘍密度、血管新生、腫瘍成長率などを評価することによって判断することができる。
【００７５】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用するいくつかの用語および句の意味を以下に提供する。特に断りのない限り、または文脈から暗黙的でない限り、次の用語および句には、以下で提供される意味が含まれる。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本定義は、特定の実施形態を説明する上で支援するために提供されるのであって、特許請求される本発明を制限するものではない。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。当技術における用語の使用と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内で提供される定義が勝るものとする。
【００７６】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において採用されるある特定の用語をここにまとめる。
【００７７】
「低下する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する／抑制する」という用語はすべて、統計的に有意な量の低下を意味するために本明細書で使用される。いくつかの実施形態において、「低減する」、「低減」または「低下する」または「阻害する／抑制する」は典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置のない状態）と比較して少なくとも１０％の低下を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより大きな低下を含むことができる。本明細書で使用する場合、「低減」または「阻害／抑制」は、参照レベルと比較した場合の完全な阻害／抑制または低減を包含しない。「完全な阻害／抑制」とは、参照レベルと比較して１００％の阻害／抑制である。低下は、好ましくは、所与の障害のない個体についての正常範囲内として許容されるレベルまで低くあることができる。
【００７８】
「上昇した」、「上昇」、「増強する」、または「活性化する」はすべて、統計的に有意な量の上昇を意味するために本明細書で使用される。いくつかの実施形態において、「上昇した」、「上昇」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して１００％の上昇もしくは１０〜１００％の何らかの上昇を含む、参照レベルと比較して少なくとも１０％の上昇、例えば、対照と比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大１００％の上昇、あるいは参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の上昇、または２倍〜１０倍以上の何らかのもしくはそれより大きな上昇を意味することができる。マーカーまたは症状の脈絡において、「上昇」とは、このようなレベルにおける統計的に有意な上昇である。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物とは、霊長類、齧歯類、飼育動物または狩猟用動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが含まれる。飼育動物および狩猟用動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ種、例えば、飼い猫、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、魚類、例えば、マス、ナマズおよびサーモンが含まれる。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用される。
【００８０】
好ましくは、対象は哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、癌の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、雄性でも雌性でもかまわない。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を示すために本明細書で相互交換可能に使用される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、その大きさまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを称する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は比較的大きなポリペプチドに関してしばしば使用されるのに対し、「ペプチド」という用語は小さなポリペプチドに関してしばしば使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は一部分が一致する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびそのフラグメントを称するとき、本明細書で相互互換可能に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントならびに上述の他の等価物、バリアント、フラグメント、および類似体が含まれる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体の単位を組み込んだ何らかの分子、好ましくはポリマー分子を称する。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの１本の核酸鎖であり得る。あるいは、いかなる二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であってもよい。一態様において、核酸はＤＮＡであり得る。別の態様では、核酸はＲＮＡであり得る。適切な核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の適切な核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。
【００８３】
本明細書で使用する「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリペプチドの場合、天然源において認められる核酸もしくはポリペプチドとともに存在する、および／または細胞が発現するとき、もしくは分泌されたポリペプチドの場合には分泌されるときに、核酸もしくはポリペプチドとともに存在するであろう、少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを称する。化学的に合成された核酸もしくはポリペプチドまたはインビトロでの転写／翻訳を用いて合成されたものは「単離された」とみなされる。「精製された」または「実質的に精製された」という用語は、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれより多量を含む、単離された核酸またはポリペプチドの少なくとも９５重量％である当核酸またはポリペプチドを称する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「操作された」とは、人間の手によって操作された態様を称する。例えば、抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲの配列が人間の手によって操作されて、天然に存在する場合の抗体の配列とは異なるとき、「操作された」とみなされる。通常の慣行であり、当業者に理解されているように、実際の操作が先行する実体に対して行われたとしても、操作されたポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの後代およびコピーは典型的にはなおも、「操作された」と称される。
【００８５】
「Ｋａｂａｔの番号付け」、「Ｋａｂａｔの定義」、および「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書では相互互換可能に使用される。当技術分野で認識されているこれらの用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１および／またはＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２において説明されるような、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりも可変性の高い（すなわち、超可変性である）アミノ酸残基を番号付けするシステムを称する。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非連続アミノ酸の両方に由来するポリペプチド上に形成することができる。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒による処理の際に喪失される。エピトープは、典型的には、独特な空間的立体配座において少なくとも３個、より通常は少なくとも５個、約９個、または約８〜１０個のアミノ酸を含む。「エピトープ」には、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって従来通り結合した構造単位が含まれる。エピトープは、抗体についての最小結合部位を定義し、したがって抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、単離における可変ドメインによって結合した構造の単位を表す。「抗原決定基」および「エピトープ」も、本明細書で相互交換可能に使用することができる。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学活性のある表面の分類が含まれ、ある特定の実施形態において、特定の三次元構造特徴、および／または特定の電荷特徴を有し得る。
【００８７】
「結合力」とは、抗原結合分子（本明細書に記載される抗体またはその抗体フラグメントなど）と適切な抗原との間の結合強度の尺度である。結合力は、抗原決定基と抗原結合分子上の抗原決定基の抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子上に存在する適切な結合部位の数の両者と関連している。典型的には、抗原結合タンパク質（本明細書に記載される抗体または抗体の一部など）は、１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、または１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤで（すなわち、１０７〜１０１２リットル／モルまたは１０８〜１０１２リットル／モルなど、１０５〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）、これらの同種のまたは特異的な抗原に結合することになる。１０−４モル／リットルを超えるいかなるＫＤ値（または１０４Ｍ−１を下回るいかなるＫＡ値）も、非特異的結合を示すと概して考えられる。意味のある（例えば、特異的）と考えられる生物学的相互作用についてのＫＤは典型的には、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲にある。相互作用が強いほど、そのＫＤは低くなる。例えば、本明細書に記載される抗体またはその部分にある結合部位は、２００ｎＭ未満などの５００ｎＭ未満、または５００ｐＭ未満などの１０ｎＭ未満の親和性で所望の抗原に結合することになる。抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析ならびに／または放射性免疫検定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイならびに当技術分野でそれ自体既知のこれらの異なる変法などの競合結合アッセイを含むそれ自体既知の何らかの適切な様式と、本明細書で言及されている他の技術とで測定することができる。
【００８８】
したがって、本明細書で使用する場合、「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、癌細胞の細胞表面上に存在する抗原などの標的に、本明細書に記載されるペプチド（例えば、抗体、ＣＡＲまたはその一部）が、ＫＤ１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）またはそれ未満、例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、またはそれ未満で結合する能力を称する。特異的結合は、例えば、ポリペプチド薬の親和性および結合力、ならびにポリペプチド薬の濃度によって影響を受けることができる。当業者は、適切な細胞結合アッセイにおけるポリペプチド薬の用量設定などの何らかの適切な方法を使用して、本明細書に記載されるポリペプチド薬が標的を選択的に結合する適切な条件を決定することができる。標的に特異的に結合したポリペプチドは、非類似の競合因子によって置き換えられることはない。ある特定の実施形態において、抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中の標的抗原を優先的に認識するとき、抗原を特異的に結合するといわれている。
【００８９】
いくつかの実施形態において、癌細胞に特異的に結合する試薬は、非癌細胞と比較して癌細胞に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、癌細胞に特異的に結合する試薬は、同じ細胞型の非癌性細胞と比較して癌細胞に特異的に結合する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）またはそれ未満、例えば１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、またはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−５Ｍ〜１０−６Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−６Ｍ〜１０−７Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−７Ｍ〜１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、約１０−１１Ｍ〜１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で癌細胞に結合する。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を称する。この用語は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖からなる抗体、ならびに全長抗体およびその抗原結合部分を含む種々の形態も称し、例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、その機能的に活性のあるエピトープ結合フラグメント、二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））および一本鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，４２３−４２６（１９８８））（これらは参照により本明細書に援用される）。（概して、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ＮＤ  ｅｄ．（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）を参照されたく、これらは参照により本明細書に援用される）。
【００９２】
各重鎖は、該重鎖の可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記）および該重鎖の定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、該軽鎖の可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略記）および該軽鎖の定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬドメインからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに分割され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存領域が散在していてもよい。したがって、各ＶＨ領域およびＶＬ領域は、Ｎ末端からＣ末端へ次のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。この構造は、当業者に周知である。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を称する。重鎖および軽鎖の可変領域の各々には３つのＣＤＲがあり、可変領域の各々についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系によって異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによる系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））は、抗体のいかなる可変領域へも適用可能な明白な残基番号付け系を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと称されることがある。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））ならびにＣｈｏｔｈｉａ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）およびＮａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３（１９８９））によって説明されてきた。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、先の系のうちの１つに厳密に従うことはできないものの、それにもかかわらずＫａｂａｔ  ＣＤＲと重複することになるが、特定の残基または残基の群、さらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響することがないという予測または実験上の発見に鑑みて、短縮または延長する可能性がある。本明細書で使用する方法は、これらの系のいずれかによって定義されるＣＤＲを利用してもよいが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ定義のＣＤＲを使用する。
【００９４】
本明細書で相互交換可能に使用する、抗体の「抗原結合フラグメント」または「抗原結合部分」という用語は、本明細書に記載される抗体の１つ以上のフラグメントを称し、該フラグメントは、本明細書で先に定義した結合親和性をなおも有する。完全抗体のフラグメントは、抗体の抗原結合機能を実行できることが示されてきた。抗体の「抗原結合部分」という用語に従って、結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから構成される一価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ジスルフィド架橋を介してヒンジ領域において互いに連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＦＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント、ならびに（ｖ）ＶＨドメインまたはＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＤＨ３、もしくはＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３（ｄＡｂ）からなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）、またはＶＬドメインのみを含む単一ドメイン抗体も標的エピトープへ特異的に結合することも示されてきた）。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、これらはさらに合成リンカー、例えば、ポリ−Ｇ４Ｓアミノ酸配列（配列番号４６として開示の「Ｇ４Ｓ」）、ならびにＶＬおよびＶＨ領域が一価の分子（単一鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として既知）を形成するために結合する単一のタンパク質鎖として調製することができる組換え法を用いて互いにさらに連結されてもよい（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。抗体の「抗原結合部分」という用語は、このような単鎖抗体を含むことも意図している。「ダイアボディ」などの他の形態の単鎖抗体も同様に本明細書で含まれる。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現する二価の二重特異性抗体だが、同じ鎖の上で結合することができる２つのドメインには短過ぎるリンカーを使用し、それにより、該ドメインを異なる鎖の相補性ドメインと対形成させて、２つの抗原結合部位を形成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖の定常ドメインを称する。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野で既知である。
【００９５】
さらに、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、該抗体または抗体部分と１つ以上のさらなるタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。このような免疫接着分子に関連しているのは、四量体ｓｃＦｖ分子を調製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１）、ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を生成するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジニル、例えば、ヘキサヒチジニルタグ（配列番号４５として開示の「ヘキサヒスチジニルタグ」）の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７１０５８）である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、およびこれらの機能的に活性のあるエピトープ結合フラグメントであり得る。
【００９７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列への個々の置換、欠失または付加が「保存的に修飾されたバリアント」であり、この変更が結果的に、アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸との置換を生じ、標的抗原（例えば、癌細胞上に存在するエピトープ）を特異的に結合する能力を保持することを認識することになる。このような保存的に修飾されたバリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられ、除外されない。
【００９８】
いくつかの実施形態において、抗体試薬の保存的に修飾されたバリアントは、ＣＤＲ以外の変化を含むことができ、例えば、抗体試薬の保存的に修飾されたバリアントは、配列番号１〜１２のうちの１つ以上の配列を有するＣＤＲを含むことができる。
【００９９】
所与のアミノ酸は、類似の物理化学的特徴を有する残基によって置き換えることができ、例えば、ある脂肪族残基を別のものに（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いになど）、置換すること、またはある極性残基の別のものへの置換（Ｌｙｓ−Ａｒｇ間、Ｇｌｕ−Ａｓｐ間、またはＧｌｎ−Ａｓｎ間）によって置き換えることができる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換は周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、天然または参照ポリペプチドの所望の活性、例えば、抗原結合活性および特異性が保持されていることを確認するために、本明細書に記載されるアッセイのいずれか１つにおいて検査することができる。
【０１００】
アミノ酸は、これらの側鎖の特性の類似性によって分類することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）非帯電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１０１】
あるいは、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいて複数の群に分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保守的な置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とすることになる。
【０１０２】
特定の保守的置換には、例えば、ＡｌａからＧｌｙもしくはＳｅｒへ、ＡｒｇからＬｙｓへ、ＡｓｎからＧｌｎへもしくはＨへ、ＡｓｐからＧｌｕへ、ＣｙｓからＳｅｒへ、ＧｌｎからＡｓｎへ、ＧｌｕからＡｓｐへ、ＧｌｙからＡｌａもしくはＰｒｏへ、ＨｉｓからＡｓｎもしくはＧｌｎへ、ＩｌｅからＬｅｕもしくはＶａｌへ、ＬｅｕからＩｌｅもしくはＶａｌへ、ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕへ、ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、もしくはＩｌｅへ、ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕもしくはＴｙｒへ、ＳｅｒからＴｈｒへ、ＴｈｒからＳｅｒへ、ＴｒｐからＴｙｒへ、ＴｙｒからＴｒｐへ、および／またはＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕへを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲは、本明細書に記載される配列のバリアント、例えば、抗体ポリペプチドの保存的置換のバリアントであり得る。いくつかの実施形態において、バリアントは、保存的に修飾されたバリアントである。保存的置換のバリアントは、例えば、天然のヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。本明細書で称される「バリアント」とは、天然または参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、１つまたは複数の欠失、挿入または置換のために天然または参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然または参照ＤＮＡ配列と比較したとき、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、活性、例えば、関連する標的ポリペプチド、例えば癌細胞表面エピトープに対して、抗原特異的結合活性を保持するバリアントタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を包含する。広範な種々のＰＣＲベースの部位特異的変異誘発アプローチも当技術分野で既知であり、当業者によって適用することができる。
【０１０４】
置換バリアントの例としては、ＣＤＲの配列を変えない、例えば、ＶＨまたはＶＬドメインにおけるアミノ酸の保存的置換が挙げられる。ＣＤＲに含まれない配列における保存的置換は、野生型のまたは天然に存在する配列、例えば、抗体配列のヒトまたはマウスのフレームワークおよび／または定常領域に対する置換であり得る。
【０１０５】
バリアントのアミノ酸またはＤＮＡの配列は、天然または参照配列と好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高く同一である。天然配列と変異配列との間の相同性の程度（同一性百分率）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用される自由に利用可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のＢＬＡＳＴｐまたはＢＬＡＳＴｎ）を使用して２つの配列を比較することによって決定することができる。
【０１０６】
天然アミノ酸配列の変更は、当業者に既知の多くの技術のうちのいずれかによって達成することができる。変異は、例えば、天然の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションに続いて、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、特定オリゴヌクレオチドの部位特異的変異誘発手順を採用して、必要とされる置換、欠失、または挿入によって変更した特定のコドンを有する変更したヌクレオチド配列を提供することができる。このような変更を行うための技術は非常に十分に確立されており、例えば、それらの全体が参照により本明細書に援用されるＷａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６）、Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５）、Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ１９８５，１２−１９）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）、ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２号によって開示されているものを含む。
【０１０７】
ポリペプチドの適切な立体配座を維持することに関与しないいかなるシステイン残基も、概してセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合（複数可）をポリペプチドに付加して、その安定性を改善したり、オリゴマー化を促進したりすることができる。
【０１０８】
本明細書に開示する抗体は、本明細書に開示するＶＨまたはＶＬ領域のいずれか１つ、例えば配列番号１〜２８のいずれか１つを含むことができる。ＶＨまたはＶＬ領域が配列番号１〜２８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高く同一であるアミノ酸を含む抗体も考えられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は完全ヒト抗体である。いくつかの態様において、抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、ヒト化抗体または抗体試薬である。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合部分、またはＣＡＲは、キメラ抗体または抗体試薬である。いくつかの態様において、抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲは、組換えポリペプチドである。
【０１１０】
「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域が、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）によって説明されるように、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に対応するまたはこれに由来する抗体を称する。しかしながら、ヒト抗体は、例えば、ＣＤＲにおいて、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含有している可能性がある（例えば、インビトロでランダムにもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）。本明細書に記載される組換えヒト抗体は可変領域を有しており、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含有することもある（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。しかしながら、特定の実施形態によると、このような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のためにトランスジェニックである動物を使用する場合、体細胞のインビボ変異誘発）に供されるため、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に関連または由来するものの、ヒト抗体生殖系列レパートリー内にインビボで天然には存在しない配列である。特定の実施形態によると、この種の組換え抗体は、選択的変異誘発または復帰変異またはその両方の結果である。好ましくは、変異誘発は、親抗体よりも大きな標的への親和性、および／または親抗体よりも小さな非標的構造への親和性をもたらす。
【０１１１】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種由来の重鎖および軽鎖の可変領域の配列と別の種の定常領域配列とを含有する抗体を称する。ヒト化抗体は、ヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基と、非ヒト抗体、例えばマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと称される）に実質的に由来する相補性決定領域を有する。それらの全体が参照により本明細書に援用されるＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）およびＷＯ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号およびＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。定常領域（複数可）も、存在する場合、ヒト免疫グロブリンに実質的または完全に由来する。ヒト可変ドメインは、通常、そのフレームワーク配列がＣＤＲの由来する（マウス）可変領域ドメインと高度の配列同一性を呈するヒト抗体から選択される。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じかまたは異なるヒト抗体配列の領域に実質的に類似していてもよい。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であっても、いくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。その全体が参照により本明細書に援用されるＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／２２６５３を参照されたい。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体（またはその抗原結合部分）を称し、その中で存在するいかなる定常領域も、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。その故に、おそらくＣＤＲを除く、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、１つ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体試薬（例えば、抗体またはＣＡＲ）は、天然の生体分子ではない。例えば、ヒト起源の抗原に対して惹起されたマウス抗体は、人間の介入および操作、例えば、人間によって実行される製造工程のない自然においては生じないであろう。キメラ抗体も、例えば、複数の種から得られ、組換え分子内へと集合した配列を含むという点で、天然の生体分子ではない。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるヒト抗体試薬は天然の生体分子ではなく、例えば、ヒト抗原に対して向かった完全ヒト抗体は、自然界で負の選択を受けるであろうし、ヒトの体内では天然では認められない。
【０１１４】
従来より、モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ株の天然分子として産生されてきた。その技術に加えて、本明細書に記載される方法および組成物は、モノクローナル抗体の組換えＤＮＡ発現を用意する。これにより、選択された宿主種において、ヒト化抗体ならびに一連の抗体誘導体および融合タンパク質の産生が可能となる。細菌、酵母、トランスジェニック動物、およびニワトリ卵における抗体の産生も、ハイブリドーマ系産生系の代替である。トランスジェニック動物の主な利点は、再生可能源由来の潜在的な高い収量である。
【０１１５】
抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野で既知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介（または特定部位のの）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および以前に調製されたバリアントまたは当抗体の非バリアント版のカセット変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載される少なくとも１つの抗体、部分またはポリペプチドをコードする核酸配列は、ライゲーションのための平滑末端化したまたは千鳥末端化した末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適宜の粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼとのライゲーションを含む従来技術に従ってベクターＤＮＡを用いて組換えることができる。このような操作のための技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８２および１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，１９８７，１９９３によって開示されており、モノクローナル抗体分子、その抗原結合領域、またはＣＡＲをコードする核酸配列を構築するために使用することができる。
【０１１６】
ＤＮＡなどの核酸分子は、転写および翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、このような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「操作可能に連結されて」いる場合、ポリペプチドを「発現することができる」といわれる。操作可能な連結は、調節ＤＮＡ配列および発現することになっているＤＮＡ配列が、回復可能な量のペプチドまたは抗体部分として遺伝子発現を可能にするような方法で接続された連結である。遺伝子発現に必要とされる調節領域の正確な性質は、類似の技術分野において周知であるように、生物ごとに異なることがある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７−１９９３を参照されたい。
【０１１７】
したがって、本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲの発現は、原核細胞または真核細胞のいずれかで起こり得る。適切な宿主には、酵母、昆虫、真菌、鳥類および哺乳類の細胞をインビボもしくはインサイツのいずれかで含む細菌もしくは真核生物の宿主、または哺乳類、昆虫、鳥類もしくは酵母の起源の宿主細胞が含まれる。哺乳類細胞または組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコの起源であり得るが、いずれかの他の哺乳類細胞を使用してもよい。さらに、例えば、酵母ユビキチン加水分解酵素系の使用により、ユビキチン−膜貫通ポリペプチド融合タンパク質のインビボでの合成を達成することができる。そのように産生された融合タンパク質は、インビボで加工されるか、またはインビトロで精製および加工され、特定のアミノ末端配列を有する本明細書に記載される抗体またはその部分の合成を可能にする。その上、直接的な酵母（または細菌）発現における開始コドン由来メチオニン残基の保持と関係する問題を回避することができる。Ｓａｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，７Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７０５（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，７Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．６９８（１９８９）。酵母がグルコース富化培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵素をコードする活発に発現する遺伝子からプロモーターおよび終結要素を組み込んだ一連の酵母遺伝子発現系のいずれかを利用して、本明細書に記載される組換え抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲを得ることができる。既知の解糖系遺伝子は、非常に効率的な転写制御シグナルも提供することができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよび終結因子シグナルを利用することができる。
【０１１８】
昆虫における本明細書に記載される抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲの産生を達成することができる。例えば、昆虫宿主に、当業者に既知の方法によって膜貫通ポリペプチドを発現させるように操作したバキュロウイルスを感染させることによってである。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，１９９３を参照されたい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、導入されたヌクレオチド配列は、レシピエント宿主において自律複製可能なプラスミドまたはウイルスベクターへと組み込まれる。広範な種々のベクターのいずれかをこの目的のために採用することができ、当ベクターは当業者に既知であり、利用可能である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，１９９３を参照されたい。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する上での重要な因子には、ベクターを含有するレシピエント細胞が当ベクターを含有しないレシピエント細胞から認識および選択され得る簡便さ、特定の宿主において所望であるベクターのコピー数、および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル輸送することができることが望ましいかどうかが含まれる。
【０１２０】
当技術分野で既知の例となる原核生物ベクターには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製可能なプラスミドなどのプラスミドが含まれる。抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲをコードするｃＤＮＡの発現に有用な他の遺伝子発現要素には、ＳＶ４０初期プロモーターなどのウイルス転写プロモーターおよびエンハンサー要素が含まれるが、これらに限定されない。（Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，３Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３））、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，７９ＰＮＡＳ６７７７（１９８２））、およびモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，４１Ｃｅｌｌ８８５（１９８５））、（ｂ）ＳＶ４０後期領域に由来するものなどの、スプライス領域およびポリアデニル化部位（Ｏｋａｙａｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、ならびに（ｃ）ＳＶ４０などにおけるポリアデニル化部位（Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。免疫グロブリンｃＤＮＡ遺伝子は、発現要素としてＳＶ４０初期プロモーターおよびそのエンハンサー、マウス免疫グロブリンＨ鎖プロモーターエンハンサー、ＳＶ４０後期領域ｍＲＮＡスプライシング、ウサギＳ−グロビン介在配列、免疫グロブリンおよびウサギＳ−グロビンポリアデニル化部位、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化要素を使用して、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（後述）およびＷｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，５１Ｇｅｎｅ２１（１９８７）によって説明されているように発現させることができる。
【０１２１】
一部がｃＤＮＡ、一部がゲノムＤＮＡから構成される免疫グロブリン遺伝子については（Ｗｈｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎ．４９９（１９８７））、転写プロモーターはヒトサイトメガロウイルスであり得、プロモーターエンハンサーはサイトメガロウイルスおよびマウス／ヒト免疫グロブリンであり得、ｍＲＮＡスプライシングおよびポリアデニル化領域は天然の染色体免疫グロブリン配列であり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、齧歯類細胞におけるｃＤＮＡ遺伝子の発現については、転写プロモーターはウイルスＬＴＲ配列であり、転写プロモーターエンハンサーはマウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーおよびウイルスＬＴＲエンハンサーのいずれかまたは両方であり、スプライス領域は３１ｂｐより大きなイントロンを含有しており、ポリアデニル化および転写終結領域は、合成されている免疫グロブリン鎖に対応する天然の染色体配列に由来する。他の実施形態において、他のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を先に列挙した発現要素と組み合わせて、哺乳類細胞における当タンパク質の発現を達成する。
【０１２３】
各融合遺伝子は、発現ベクター内で集合することができ、または発現ベクター内へ挿入することができる。あるいは、発現ベクターを使用せずにｍＲＮＡまたはＤＮＡを使用することができる（「むき出しのｍＲＮＡ」または「むき出しのＤＮＡ」）。次いで、キメラ免疫グロブリン鎖遺伝子産物を発現することができるレシピエント細胞に、抗体、その抗原結合部分、もしくはＣＡＲ、またはキメラＨ鎖もしくはキメラＬ鎖をコードする遺伝子を単独でトランスフェクトするか、あるいはキメラＨ鎖遺伝子およびキメラＬ鎖遺伝子を同時トランスフェクトする。トランスフェクトしたレシピエント細胞は、組み込まれた遺伝子の発現を可能にする条件下で培養され、発現した免疫グロブリン鎖または未処置の抗体もしくはフラグメントが培養物から回収される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、抗体、その抗原結合フラグメント、ＣＡＲ、もしくはキメラＨ鎖およびＬ鎖、またはこれらの部分をコードする融合遺伝子は、次いで、レシピエント細胞を同時トランスフェクトするために使用される別個の発現ベクターにおいて集合する。各ベクターは、細菌系での選択のために設計された第１の選択可能遺伝子、および真核生物系での選択のために設計された第２の選択可能遺伝子という２つの選択可能遺伝子を含有することができ、各ベクターは異なる対の遺伝子を有する。この戦略は結果として、細菌系における融合遺伝子の産生を最初に指示し、増幅を可能にするベクターを生じる。細菌宿主内でそのように産生および増幅された遺伝子は、その後、真核細胞を同時トランスフェクトするために使用され、所望のトランスフェクトされた遺伝子を運ぶ同時トランスフェクトされた細胞の選択を可能にする。細菌系における使用のための選択可能な遺伝子の非限定例は、アンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子、およびクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子である。真核生物のトランスフェクタントにおける使用のための選択可能な遺伝子には、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔと指定）およびＴｎ５由来のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏと指定）が含まれる。あるいは、キメラＨ鎖およびＬ鎖をコードする融合遺伝子を同じ発現ベクター上で集合させることができる。
【０１２５】
発現ベクター、むき出しのｍＲＮＡまたはむき出しのＤＮＡのトランスフェクションおよび本明細書に記載されるキメラ、ヒト化、または複合ヒト抗体の産生のために、レシピエント細胞株は骨髄腫細胞であり得る。骨髄腫細胞は、トランスフェクトした免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンを合成、集合、分泌することができ、免疫グロブリンのグリコシル化についての機序を備えている。例えば、いくつかの実施形態において、レシピエント細胞は組換えＩｇ産生骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ８２８７）である。ＳＰ２／０細胞は、トランスフェクトされた遺伝子によってコードされた免疫グロブリンのみを産生する。骨髄腫細胞は、培養液中でまたはマウスの腹腔内で成長することができ、そこで分泌された免疫グロブリンは腹水から得ることができる。他の適切なレシピエント細胞には、ヒトもしくは非ヒト起源のＢリンパ球、ヒトもしくは非ヒト起源のハイブリドーマ細胞、または種間ヘテロハイブリドーマ細胞などのリンパ系細胞が含まれる。
【０１２６】
本明細書に記載されるキメラ、ヒト化、もしくは複合ヒト抗体コンストラクト、抗体、その抗原結合部分、および／またはＣＡＲを運ぶ発現ベクターまたはむき出しのｍＲＮＡまたはむき出しのＤＮＡは、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質体融合、リン酸カルシウム沈殿、およびジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンの適用などの生化学的手段、ならびに電気穿孔法、直接的な微量注射、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントなどの機械的手段を含む種々の適切な手段のうちのいずれかによって、適切な宿主細胞内へ導入することができる。当業者に既知のようなＪｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２４０Ｓｃｉｅｎｃｅ１５３８（１９８８）。
【０１２７】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の軽鎖をコードする第１の発現ベクター、およびヒト化抗体の重鎖をコードする第２の発現ベクターで形質転換された宿主を、各鎖が発現するような条件下維持することと、このように発現した鎖の集合によって形成されたヒト化抗体を単離することとを含む工程によって調製されるヒト化抗体の産生のための方法およびシステムが本明細書で提供される。第１および第２の発現ベクターは、同じベクターとすることができる。本明細書では、ヒト化抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を組み込んだ発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換した宿主も提供される。
【０１２８】
通常、ヒト化抗体およびヒト抗体バリアントにおけるＣＤＲ領域は実質的に同一であり、より通常は、それらが由来するマウスまたはヒトの抗体内の対応するＣＤＲ領域と同一である。通常は望ましくないが、結果として生じるヒト化免疫グロブリンまたはヒト抗体バリアントの結合親和性にかなりの影響を与えることなく、ＣＤＲ残基の１つ以上の保存的アミノ酸置換を行うことが時々可能である。時折、ＣＤＲ領域の置換は、結合親和性を増強することができる。
【０１２９】
さらに、マウスまたは他の種由来の遺伝子、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性の抗体分子スプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（それらの全体が参照により本明細書に援用されるＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８（１９８４）、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４（１９８５）を参照されたい）を使用することができる。キメラ抗体とは、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有するもの、例えばヒト化抗体など、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０１３０】
キメラ抗体の可変セグメントは、典型的には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部に連結されている。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、不死化Ｂ細胞など、種々のヒト細胞から周知の手順に従って単離することができる（そのすべての内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ８７／０２６７１）。抗体は、軽鎖および重鎖のいずれの定常領域も含有することができる。重鎖定常領域には、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、および時にはＣＨ４領域を含むことができる。治療目的のために、ＣＨ２ドメインを欠失させまたは省略することができる。
【０１３１】
さらに、本明細書に記載されるように、ヒトにおける療法のために、機能的活性を維持しながら、潜在的な免疫原性を低下させるように組換えヒト化抗体をさらに最適化することができる。この点において、機能的活性は、本明細書に記載される組換え抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲと関係する１つ以上の既知の機能的活性を示すことができるポリペプチドを意味する。このような機能的活性には、癌細胞への結合および／または抗癌活性が含まれる。さらに、機能的活性を有するポリペプチドは、例えば、用量の依存性の有無の下での生物学的アッセイなどの特定のアッセイにおいて測定されるように、成熟型を含む、本明細書に記載される参照抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲの活性と同様であるが必ずしも同一ではない活性を呈することを意味する。用量依存性が存在する場合、参照抗体、その抗原結合部分、またはＣＡＲのものと同一である必要はなく、むしろ本明細書に記載される参照抗体、その抗原結合フラグメント、および／またはＣＡＲのものと実質的に類似している必要がある（すなわち、候補ポリペプチドは、本明細書に記載される抗体、抗原結合フラグメント、および／またはＣＡＲに対してより高い活性、または約２５倍以下、約１０倍以下、または約３倍以下の低い活性を呈することになる）。
【０１３２】
本明細書に開示する材料および方法は、患者由来の生物試料中のＣＥＡＣＡＭ６を検出するために概してかつ種々に有用である。いくつかの実施形態において、検出ステップは、患者由来の生物試料を、グリコペプチドを含む第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗体と接触させて、第１の抗体とＣＥＡＣＡＭ６との間に第１の複合体を形成することと、続いて、第１の複合体を、第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗体であって、第１および第２のエピトープが異なっている、第２の抗体と接触させて、第２の複合体を形成することであって、第２の複合体が、第１の抗体、ＣＥＡＣＡＭ６、および第２の抗体を含む、形成することと、次いで、第２の複合体を検出し、それによりＣＥＡＣＡＭ６を検出することと、を含むことができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、生物試料は、血液、血清、血漿、尿、糞便、または生検試料であり得る。いくつかの実施形態において、第１の抗体は、固体支持体、例えば、ポリスチレンもしくはポリカーボネートのマイクロウェルもしくはディップスティックなどの固体マトリックス、膜、またはガラス支持体（例えば、ガラススライド）の上に固定することができる。ある特定の実施形態において、第２の抗体は、酵素、色素、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチンなどの検出可能なレポーター部分または標識を含有することができる。複合体に結合したままの第２の抗体の量は、特定の検出可能なレポーター部分または標識に適切な方法を使用して測定することができる。放射性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が概して適切である。分光法を使用して、色素（例えば、酵素反応の比色生成物を含む）、発光基、および蛍光基を検出することができる。ビオチンは、異なるレポーター基（通常は放射性基または蛍光基または酵素）に連結したアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基は概して、基質の添加（概して特定の期間）によって検出した後、反応生成物を分光分析、分光測光または他の分析によって検出することができる。標準物質および標準添加物を使用して、試料中の抗原のレベルを決定することができる。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「投与すること」という用語は、所望の部位での薬剤の少なくとも部分的な送達を結果的にもたらす方法または経路による、本明細書に開示する化合物の、対象内への配置を称する。本明細書に開示する化合物を含む医薬組成物は、対象において有効な処置を結果的にもたらす何らかの適切な経路によって投与することができる。
【０１３５】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を称し、概して２標準偏差（２ＳＤ）以上の差を意味する。
【０１３６】
操作実施例または他所で示す場合を除き、本明細書で使用する成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されると理解するべきである。「約」という用語は、百分率と共に使用するとき、平均±１％を意味し得る。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「を含んでいる」または「を含む」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であろうとそうでなかろうと、非特定の要素の包含に対して開かれている組成物、方法、およびそれらの個々の構成要素（複数可）に関して使用される。
【０１３８】
「からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法、およびこれらの個々の構成要素を称し、それらは、実施形態の該説明において列挙されていないいかなる要素も除外する。
【０１３９】
本明細書で使用する場合、「本質的に〜からなる」という用語は、所与の実施形態に必要とされる要素を称する。この用語は、該実施形態の基本的および新規のまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を与えない要素の存在を可能にする。
【０１４０】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形の用語には、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示物が含まれる。同様に、「または」という語は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料は、本開示の実施または検査において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載される。「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、ラテン語の〜の目的のための例として（ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ）に由来し、非限定例を示すために本明細書で使用する。したがって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義である。
【０１４１】
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって刊行された“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６（ＩＳＢＮ０−９１１９１０−１９−０）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）、Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｘ，２００９（ＩＳＢＮ−１０：０７６３７６６３２１）、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２００９，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．において認めることができる。
【０１４２】
特に明記しない限り、本発明は、例えば、それらの全体が参照により本明細書にすべて援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）、またはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ  Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ  Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ．ａｌ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、およびＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｂｙ  Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｊｅｎｎｉｅ  Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８）において説明されるように、標準的な手順を用いて実施した。
【０１４３】
他の用語は、本明細書において、本発明の種々の態様の説明内で定義する。
【０１４４】
参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願、および同時継続中の特許出願を含む、本出願のいたるところで引用されたすべての特許およびその他の公開物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るこのような公開物において説明された方法論を説明および開示する目的のために、参照により本明細書で明らかに援用される。これらの公開物は、本出願の出願日に先立って該公開物の開示のみのために提供される。この点に関して、先行発明によって、または何らかの他の理由のために、本発明者らがこのような開示に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての陳述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願者が利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関するいかなる承認も構成するものではない。
【０１４５】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に制限するよう意図するものではない。本開示の具体的な実施形態および本開示のための実施例が、説明目的のために本明細書に記載されているが、種々の等価の改変は、関連技術分野の当業者が認識することになるように、本開示の範囲内で可能である。例えば、方法のステップまたは機能は所与の順序で提示されるが、代替の実施形態は異なる順序で機能を実行してもよく、または機能が実質的に同時に実行されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本開示の態様は、必要な場合、先の参考文献および出願の組成、機能および概念を採用して、本開示のなおもさらなる実施形態を提供するように改変することができる。その上、生物学的機能的等価性の考慮により、種類または量における生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を行うことができる。これらのおよび他の変更は、発明を実施するための形態に鑑みて本開示に対して行うことができる。このような改変はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれるよう意図されている。
【０１４６】
上述の実施形態のいずれかの具体的な要素は、他の実施形態の要素に対して組み合わせたり置換したりすることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態と関係した利点をこれらの実施形態の文脈で説明してきたが、他の実施形態もこのような利点を呈することがあり、およびすべての実施形態が本開示の範囲内に収まるようこのような利点を必ずしも呈する必要はない。
【０１４７】
本明細書に記載される技術は、次の実施例によってさらに説明され、該実施例は、さらに限定しているものと決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１４８】
実施例１
ヒト化抗体可変領域配列の設計
ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８Ｖ領域の構造モデルを、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢを使用して作成し、分析して、抗体の結合特性に不可欠である可能性が高いマウスＶ領域の重要なアミノ酸を特定した。ＣＤＲ内に含有される残基（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両定義を使用）は、多くのフレームワーク残基とともに重要であると見なされた。ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８のＶＨおよびＶＫ配列はいずれも、典型的なフレームワーク残基を含有し（図４〜１９を参照されたい）、特に抗体が決定的な位置における非常に共通した配列立体配座を有するＶＨにおいてそうであり、例えば、Ｋａｂａｔ残基４５〜４９（ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８の両方についてＬＥＷＩＧ（配列番号４７））ならびにＰＴＡ−２３５７について９０〜９４（ＹＹＣＡＲ（配列番号４８））およびＰＴＡ−２３５８についてＹＹＣＮＡ（配列番号４９））である。ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８のＣＤＲモチーフは、多くのマウス抗体に匹敵する。
【０１４９】
ＰＴＡ−２３５７のヒト化について、ヒトＶＨ１−１８＊０１生殖系列フレームワークを重鎖のためのテンプレートとして選択し、ＶＫ１−３９＊０１生殖系列フレームワークを軽鎖のためのテンプレートとして選択した（両方ともマウスＶＨおよびＶＫに対して６２％の同一性）。ＰＴＡ−２３５８のヒト化について、ヒトＶＨ１−ｆ＊０１生殖系列フレームワークを重鎖のためのテンプレートとして選択し、ＶＫ７−３＊０１生殖系列フレームワークを軽鎖のためのテンプレートとして選択した（それぞれマウスＶＨおよびＶＫと６４％および７７％の同一性）。両方の抗体について、多くのマウスフレームワーク残基がＣＤＲの立体配座に重要であると特定され、これらの多様な数がバリアントに含まれていた。
【０１５０】
ＰＴＡ−２３５７のヒト化について、５つのＶＨバリアントおよび３つのＶＫバリアントを設計し、同様に、ＰＴＡ−２３５８については、５つのＶＨおよび３つのＶＫバリアントを設計した（図４〜１９を参照されたい）。
【０１５１】
ヒト化可変領域のクローニングおよび発現
すべてのＶＨおよびＶＫ領域の遺伝子を、アニールし、ライゲートし、ＰＣＲ増幅した一連の重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成して、完全長の合成Ｖ領域を得た。次に、集合したバリアントを、それぞれＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖のための発現ベクターｐＡＮＴＶｈＧ１およびｐＡＮＴＶｋ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ）内へと直接クローン形成した。
【０１５２】
ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８について、ヒト化重鎖および軽鎖のすべての組み合わせ（すなわち、各抗体について合計１５組）を、電気穿孔法を介してＮＳ０細胞に安定してトランスフェクトした。各組み合わせについて、電気穿孔した細胞を５ｘ９６ウェルの組織培養プレート内に分配し、２００ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ８４０７）を使用して選択した。各コンストラクトについてのメトトレキサート耐性コロニーを含有するウェルを試料採取し、ＩｇＧ１発現レベルを検査し、最適な発現株を選択し、Ｔ１７５フラスコへと連続的に増殖させ、液体窒素下で凍結させた。１５組すべてについて抗体を発現する細胞株を作製した。
【０１５３】
さらに、初回評価を提供するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１６６８）を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８の両方についてのヒト化重鎖および軽鎖のすべての組を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、抗体精製のために細胞培地を収集した。簡潔には、安定しかつ一過性のトランスフェクション由来のヒト化抗体バリアントを、１ｍｌのプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃１１−００３４−９３）上で細胞培養上清から精製し、予測されるアミノ酸配列に基づいた吸光係数Ｅｃ（０．１％）を用いてＯＤ２８０ｎｍによって定量した。ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８についてのＥｃ（０．１％）値はそれぞれ、１．４０および１．４４である。
【０１５４】
ＮＣＩ−Ｈ１８７古典的小細胞肺癌細胞へのバリアント抗体の結合
ＮＣＩ−Ｈ１８７古典的小細胞肺癌細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−５８０４）に対するＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８抗体のＣＨＯ−Ｋ１に一過性に発現したヒト化バリアントの結合を、競合アッセイおよびその後のフローサイトメトリー分析により評価した。ＮＣＩ−Ｈ１８７細胞を収穫し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ＃１３１５１−０１４）中で再懸濁し、次いで７０ミクロンの細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５２３５０）で濾過して多細胞凝集体をばらばらにした。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ）中へ入れて４×１０６細胞／ｍｌに希釈し、氷上で維持した。
【０１５５】
各バリアント−２３５７およびバリアント−２３５８抗体（８μｇ／ｍｌ−０．２９６μｇ／ｍｌ）の希釈系列を、Ｖ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８９４）中で５０μｌ／ウェルで一定濃度の関連マウス参照抗体（０．１μｇ／ｍｌ  ＰＴＡ−２３５７または０．３μｇ／ｍｌ  ＰＴＡ−２３５８）と事前に混合した。５０μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加して、０．０５μｇ／ｍｌまたは０．１５μｇ／ｍｌのマウス参照抗体中４μｇ／ｍｌ〜０．１４８μｇ／ｍｌの最終濃度範囲を得た。プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌの二次抗体（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ２７７２、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＦＩＴＣ結合）中で再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。
【０１５６】
細胞を２回洗浄し、１７５μｌの最終容量のＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、ＦＡＣＳチューブに移した。蛍光をフローサイトメトリーで測定し、データ曲線は正規化した％陽性事象（Ｒ２においてゲート処理）としてプロットした。曲線から各抗体についてのＩＣ５０値を決定し、検査抗体の結果をキメラ抗体の結果で除することによって、相対的なＩＣ５０値を計算した。（表１および２を参照されたい）。
【０１５７】
ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８についてのリードヒト化バリアントを選択し（表３を参照されたい）、安定してトランスフェクトしたＮＳ０細胞から精製した材料を使用して、濃度範囲を広げて、競合フローサイトメトリーアッセイ（一過性材料について説明）において再検査した（図３Ａ〜３Ｃを参照されたい）。図３（ａ）は、表４に要約した相対的なＩＣ５０値を有するＰＴＡ−２３５７リードについての結合曲線を示す。選択したリードはすべて、キメラ抗体の１．５倍以内に結合する。図３（ｂ）および（ｃ）は、これもまた表４に要約した相対的なＩＣ５０を有するＰＴＡ−２３５８リードについての結合曲線を示す。選択したリードはすべて、キメラ抗体の３倍以内に結合し、２つを除くすべてが１．５倍以内に結合する。
【０１５８】
考察
ＣＤＲグラフト結合技術を使用して構築された、ＮＣＩ−Ｈ１８７細胞に特異的なヒト化抗体を本明細書に記載される。ヒト化抗体は、単一のヒト生殖系列フレームワーク配列をテンプレートとして使用して、マウスＣＤＲおよびＣＤＲの正しい立体配座に重要であると特定したいくつかの追加のフレームワーク残基を組み込んで構築した。バリアントは、ヒト配列に組み込まれるマウス残基の数を最小限にするように設計した。ＰＴＡ−２３５７およびＰＴＡ−２３５８の両方について、１５個の候補ヒト化抗体を最初にＮＣＩ−Ｈ１８７細胞への結合について検査した。表４は、本明細書に記載されるアッセイにおいて特に良好な性能を有するＰＴＡ−２３５７抗体の５つのバリアントおよびＰＴＡ−２３５８抗体の８つのバリアントを示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１５９】
実施例２
正常細胞上のＣＤ６６ｃとの交差反応なしに癌幹細胞（ＣＳＣ）上のＣＤ６６ｃの標的化を可能にする、悪性形質転換中に独特に発現する癌特異的グリカンエピトープに対するモノクローナル抗体の開発が本明細書に記載される。
【０１６０】
ＣＤ６６ｃおよび大腸幹細胞集団。Ｇｅｍｅｉらは、ＣＤ６６ｃが大腸癌幹細胞（ＣＳＣ）のマーカーであるが、正常な幹細胞集団では発現しないことを実証した。彼らは以下を実証した：
（ａ）ＣＤ６６ｃは大腸癌において多量に発現するが、隣接する正常組織においては発現していない、
（ｂ）ＣＤ６６ｃの発現は、病変の悪性度による勾配に従っており、正常組織から腺腫へ、および腺腫から癌腫へと上昇した。
（ｃ）その発現が患者の予後および生存と相関することが実証されてきた検証済みのＣＳＣマーカーであるＣＤ１３３（Ｌｉ，Ｚ．２０１３．ＣＤ１３３：ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２：１７．２５．ＰＭＩＤ：２３８１５８１４）を使用して、正常組織由来のＣＤ１３３陽性細胞がほぼ完全にＣＤ６６ｃ陰性であるのに対し、腫瘍由来のＣＤ１３３陽性細胞がすべてＣＤ６６ｃ陽性であることを実証した、
（ｄ）ＣＤ６６ｃ明細胞（フローサイトメトリーによって測定）は、大腸腫瘍細胞の肝転移で有意に増加した、
（ｅ）ＣＤ６６ｃ明細胞は、原発患者の腫瘍から成長した結腸球体において富んでいた、
（ｆ）大腸癌患者由来のＣＤ６６ｃ明細胞のみがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける巨視的腫瘍を形成したのに対し、ＣＤ６６ｃ鈍細胞は形成しなかった、ならびに
（ｇ）ヒトＣａｃｏ．２細胞株（高ＣＤ６６ｃ発現株）におけるＳｉＲＮＡからＣＤ６６ｃへは、対照細胞による頑強な腫瘍形成にもかかわらず、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいてインビトロでの増殖を低減させ、アポトーシスおよび壊死を増大させ、腫瘍形成を予防する。
【０１６１】
これらのデータは、腫瘍形成に重要な新規大腸ＣＳＣ抗原としてのＣＤ６６ｃが、ＣＤ１３３などの他のマーカーとは異なり、正常大腸幹細胞では存在しないかまたは非常に低いレベルで発現することを検証した。
【０１６２】
ＣＤ６６ｃおよび大腸癌幹細胞
多くの腫瘍のバルク集団における発現に加えて、ＣＤ６６ｃはＣＳＣの重要なマーカーであり、ＣＥＡＣＡＭ６の発現は腫瘍細胞のＣＳＣ特性を伝えることさえできる。Ｈａｒａｇｕｃｈｉらは、種々の消化管腫瘍細胞株由来のサイドポピュレーション（ＳＰ）細胞を特徴付けた。ＳＰ表現型は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２などの蛍光色素を排出する高レベルのＡＢＣトランスポーターが原因であり、種々の正常および悪性組織の幹細胞集団に対応することが示されてきた。これらの腫瘍株におけるＳＰ集団のマーカーを特定するために、彼らは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用してヒト肝細胞癌ＨｕＨ７細胞のＳＰと非ＳＰとの間で差次的に発現する遺伝子を分析した。彼らは、ＣＤ６６ｃを非ＳＰ細胞と比較してＳＰ集団において最も差次的に上方調節された遺伝子として同定した。
【０１６３】
Ｃｈｅｎらは、膵癌細胞におけるＣＤ６６ｃレベルの上昇が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、インビトロでの移動および浸潤、インビボでの転移を促進したのに対し、ｓｈＲＮＡ仲介性ＣＤ６６ｃノックダウンは逆の効果を有することを示した。ＥＭＴは、ＣＳＣを生成する１つの機序であると考えられており、膵臓への転移において重要な役割を担っていることが示されてきた。それゆえ、ＥＭＴを促進することにより、ＣＤ６６ｃは癌幹細胞の特性を直接誘導することができる。
【０１６４】
癌幹細胞におけるＣＤ６６ｃの役割についての特に強力な証拠は、大腸癌において実証されてきた。Ｉｌａｎｔｚｉｓらは、ヒト大腸細胞株におけるＣＤ６６ｃの過剰発現が細胞分極の喪失を誘導し、その分化能を阻害し、ヌードマウスにおけるその腫瘍形成能を上昇させることを発見した。Ｇｅｍｅｉらは、ＣＤ６６ｃが大腸ＣＳＣのマーカーであるが、正常な腸幹細胞のマーカーではないという直接的な証拠を提供した。これらの著者は、正常な組織および癌組織における検証された幹細胞マーカーであるＣＤ１３３とＣＤ６６ｃとの間の相関関係を検討した。驚くべきことに、彼らは、ＣＤ６６ｃが、幹細胞集団が存在する正常な陰窩の基底ではなく、成熟細胞が脱落した頂点でのみ発現し、対照的に、ＣＤ６６ｃが癌組織の陰窩全体に発現することを発見した。さらに、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ１３３の発現は正常組織では相互に排他的ですが、大腸腫瘍では共発現する。これらのデータは、ＣＳＣとその正常幹細胞対応部分との間に非常にわずかな文書化された分子レベルの差があるため、驚くべきである。癌幹細胞の十分に実証された多くのマーカー（例えば、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＬＧＲ５など）も、正常な幹細胞の対応物を単離するために使用される。対照的に、ＣＤ６６ｃは、正常な幹細胞集団には存在しない独特なＣＳＣマーカーである。
【０１６５】
正常な幹細胞および癌幹細胞は、大腸癌において特に十分に説明されてきており、この２つを区別する薬剤および生物製剤を特定するための優れたシステムとなっている。先に記載のように、正常条件下では、大腸幹細胞集団は解剖学的に限定されており、陰窩に制限される。腸内の細胞は代謝回転が絶え間なく、幹細胞は陰窩を上って絨毛に移動し、次いで除去される一過性の増幅細胞を形成する。このプロセスは、Ｒ．ｓｐｏｎｄｉｎｓのための受容体であり、およびＷｎｔシグナル伝達受容体複合体の一部であるＬｇｒ５マーカーを有する陰窩の基底にある細胞によって駆動される。近年のデータは、この集団が、以前は腸幹細胞集団を表すと考えられていた陰窩の基底から＋４の位置に静止集団も生じさせることを示している。ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ａｄｌｅｆｌｕｏｒマーカーと同様に、およびＣＥＡＣＡＭ６とは異なり、Ｌｒｇ５は、正常な幹細胞集団および大腸癌幹細胞集団の両方を標識する。
【０１６６】
細胞表面マーカーを使用して大腸ＣＳＣを特定する代替案は、スフェロイドアッセイのような機能アッセイを使用することである。スフェロイドアッセイは、ＣＳＣが、より分化した腫瘍細胞ではなく、無血清培地でスフェロイドを形成するという観察を使用している。予備試験において、本発明者らは、コロスフェアアッセイを使用して、コロスフェアがモノクローナル抗体１０９．１２によって検出される抗原を発現しているかどうかを判定した。モノクローナル抗体１０９．１２によって検出される抗原は、結腸球体において発現している（図２０）。抗原はバルク腫瘍細胞集団においても発現するので、抗原の量はバルク集団に比べて結腸球体においては濃縮されない。それゆえ、これらのデータは、モノクローナル抗体１０９．１２抗原が大腸癌幹細胞集団において発現しているという初めての証拠を表している。
【０１６７】
参考文献
Ｆｅｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｎｏｒｍａｌ  ｆｒｏｍ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．“Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１３  ４２：１２４５−５６。
Ｗｉｔｔ  Ｈａｍｅｒ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｃ．Ｄｅ，ｅｔ．ａｌ．“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ａ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ａｓｓａｙ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００５  ５３：２３−２４。
【０１６８】
実施例３
材料および方法
Ｃ６ｆ１フラグメント−Ｃ６ｆ１と呼ばれるＣＥＡＣＡＭ６の５７０ヌクレオチドフラグメントを、ＥｃｏＲＩ制限部位を含有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位を含有する逆方向プライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動し、生成物の大きさを確認し、製造元の指示によってＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して所望の大きさのバンドを切り出して精製した。次に、ＰＣＲ産物を、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩの両酵素を１ｕＬ含有する２０ｕＬ反応液中で３７℃で一晩、制限酵素で消化した。生成物を再度１％アガロースゲル上で泳動して、生成物の大きさを確認し、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して精製した。ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩを用いて以前に処理されたｐＦＵＳＥベクターへのフラグメントのライゲーションは、製造元の指示によってＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して実施した。結果として得られたプラスミドをＴｏｐ１０ＦコンピテントＥ．ｃｏｌｉへと形質転換し、ゼオシンを含有する寒天プレート上に播種した。単一のコロニーを選択し、５ｍＬ培養液中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを使用してプラスミドを精製した。ＤＮＡ配列は、アガロースゲル上での大きさおよびヌクレオチド配列決定の両方によって検証した。
【０１６９】
Ｃ６ｆ１フラグメントの精製−Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステムを使用して、Ｃ６ｆ１の精製を行った。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０結合／洗浄緩衝液（緩衝液Ａ）および１００ｍＭクエン酸ｐＨ３．０緩衝液（緩衝液Ｂ）と組み合わせたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨｉＴｒａｐ  ＨＰプロテインＡカラムを使用して、上清からＣ６ｆ１を精製した。プロテインＡカラムを使用したＣ６ｆ１精製についてのプロトコルを以下の表１に列挙する。画分は、緩衝液Ｂで溶離まで５ｍＬごとに採取し、その後、プロトコルの完了まで２．５ｍＬごとに収集した。
【０１７０】
表７．プロテインＡカラムによるＣ６Ｆ１精製のためのプロトコル
プロテインＡカラムの各画分２０マイクロリットルをポリアクリルアミドゲル上で泳動し、ＰＶＤＦに転写し、ＭＡｂ１０９を使用してブロットして、ＭＡｂ１０９反応性Ｃ６ｆ１を含有する画分を同定した。次に、反応性画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０ＫＤａ遠心フィルターを使用して濃縮した後、２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５で３０ｍＬの容積にした。次に、試料をＢｉｏｌｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステムに負荷し、２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５（緩衝液Ａ）および１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）含有２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５を使用するＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑｆｆカラムを用いてさらに精製／濃縮した。Ｑｆｆカラムを使用したＣ６ｆ１精製／濃縮のためのプロトコルを以下の表２に列挙する。画分は、緩衝液Ｂでの溶離まで５ｍＬごとに採取し、その後、プロトコルの完了まで２ｍＬごとに収集した。
【表７】
2020515286.tif 000008
【０１７１】
表８．Ｑｆｆカラムを使用したＣ６ｆ１精製／濃縮のためのプロトコル
Ｑｆｆカラム由来の各画分２０マイクロリットルをポリアクリルアミドゲル上で泳動し、ＰＶＤＦに転写し、ＭＡｂ１０９を使用してブロットして、ＭＡｂ１０９反応性Ｃ６ｆ１を含有する画分を同定した。次に、反応性画分を一緒にプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ３０ＫＤａ遠心フィルターおよびＭｉｌｌｉＱ水へと交換した緩衝液を使用して濃縮した。容積が１ｍＬ未満に一旦濃縮されたら、精製したＣ６ｆ１を微量遠心管に入れ、速度真空装置において完全に乾燥させた。最終試料は、所望の容積のｍｉｌｌｉＱ中で再懸濁し、使用するまで−２０℃で保存した。
【表８】
2020515286.tif 000009
【０１７２】
ＨＥＫ  Ｌｅｃ１懸濁細胞内でのＣ６ｆ１の発現−細胞を増殖させ、トランスフェクション時までＥｘ−Ｃｅｌｌ／Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地の５０：５０混合物中で維持した。トランスフェクション時に、細胞を遠心分離によって収集し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３培地のみの中に２．５ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁する。次に、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３培地中でＤＮＡおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をそれぞれ２．５ｕｇ／ｍＬおよび０．５ｕｇ／ｍＬの終濃度で使用して細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間、細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３培地中で維持した。２４時間後、バルプロ酸（ＶＰＡ）含有Ｅｘ−ＣｅｌｌまたはＥＳＦ培地を添加して培養物を１：１に希釈して、２．２ｍＭの終濃度にした。次に、ＣＯ２インキュベーター内のプラットフォーム振盪器上で５日間、組換え糖タンパク質産生のために培養物を維持した。５日後、培養物を遠心分離して、所望のＣ６ｆ１糖タンパク質を含有する懸濁培地から細胞を分離した。さらに、細胞培養培地を０．４２ｕｍ真空フィルターに通した後、プロテインＡカラムを備えたＢｉｏＲａｄクロマトグラフィーシステムを使用して精製した。
【０１７３】
ＭＡｂ１０９結合活性：１００ｎｇの精製Ｃ６ｆ１を、真空マニホルドを使用してＰＶＤＦ膜上での各反応について三つ組でスポット処理した。ＴＢＳ−Ｔ含有５％ミルク溶液中で膜を４℃で一晩ブロックした。ストックＭＡｂ１０９（０．１ｕｇ／ｕＬ）をブロッキング溶液で１：３０００に０．０３ｎｇ／ｕＬの終濃度まで希釈した後、各競合剤を添加して、室温で３０分間インキュベートした。次に、抗体／競合溶液をＣ６ｆ１スポット処理したストリップとともに室温で１時間インキュベートした。１時間後、ストリップをＴＢＳ−Ｔで３回、各洗浄で５分間洗浄した。二次抗体は、１：５０００に希釈され、室温で３０分間インキュベートされたＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰとした。製造元の指示によって、３回のＴＢＳ−Ｔ洗浄を繰り返した後、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬを添加した。ブロットは、Ｘ線フィルムに１０分間露光した後、現像した。現像後、フィルムを走査し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して濃度測定を実施した。
【０１７４】
ＣＥＡＣＡＭ６フラグメント／変異体のクローン形成および発現−Ｃ６ｆ１のフラグメントのＰＣＲクローン形成は、Ｃ６ｆ１−ｐＦＵＳＥをテンプレートとして使用して、製造元の指示によってＱｉａｇｅｎ製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼを使用して実施した。ｐＦＵＳＥベクターへのクローン形成を促進するために、順方向および逆方向ＰＣＲプライマーをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢｌｇＩＩ制限部位を使用して設計した。プライマー配列は次のとおりである。Ｉｇ１Ｆ：ＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣ、Ｉｇ１Ｒ：ＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＣ、Ｉｇ２Ｆ：ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧＧ、Ｉｇ２Ｒ：ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＡＴＴ、ペプチド３Ｆ：ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣ、およびペプチド３Ｒ；ＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＧＡＧＴ。ＰＣＲ産物は、Ｐｒｏｍｅｇａ制限酵素を使用して形質転換したＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素で制限酵素消化し、エタノール／クロロホルム沈殿させ、製造元の指示によってＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して調製したｐＦＵＳＥベクターへとライゲートした。Ｔｏｐ１０Ｆコンピテント細胞を形質転換し、ゼオシンを含有する寒天プレート上に播種した。いくつかのクローンを選択し、成長させ、プラスミド調製した後、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩによる制限酵素消化、ならびにＤＮＡ配列決定を使用して挿入物を検証した。
【０１７５】
Ｃ６ｆ１およびＣ８ｆ１の特定部位の変異誘発は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ特定部位の変異誘発キットを製造元のプロトコルによって使用して実施した。Ｃ６ｆ１の３００ＱＡＨ３０２から３００ＨＴＴ３０２へのおよびＣ８ｆ１の３００ＨＴＴ３０２から３００ＱＡＨ３０２への両方についてのプライマーは、Ｃ６ｆ１の３００ＨＴＴ３０２順方向：ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣおよび逆方向：ＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣとした。Ｃ８ｆ１の３００ＱＡＨ３０２順方向：ＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＣおよび逆方向：ＧＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣ。ＸＬ−１ブルーコンピテント細胞を使用してＰＣＲ産物を形質転換し、ゼオシンを含有する寒天プレート上に播種した。いくつかのクローンを選択し、成長させ、プラスミドを調製した後、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩによる制限酵素消化、ならびにＤＮＡ配列決定を使用して挿入物を検証した。
【０１７６】
実施例４
ＭＡｂ１０９エピトープの特徴付け。
本発明者らは、酵素処理を使用して、ＭＡｂ１０９によって認識されたエピトープを特徴付けた。ＭＡｂ１０９は、ヒト膵臓腺癌（ＰＤＡＣセル（ｃｅｌ））１株であるＮ結合型グリカン質のＢｘＰＣ３細胞と反応することを示してきた。の全細胞溶解物は、ＭＡｂ１０９を用いたイムノブロット法によって分析されたものである。図２１の左側のパネルに示すように、ＭＡｂ１０９は、８５ｋＤのおよその分子量を有するポリペプチドと反応した。ヒトＮ結合型グリカンを除去するグリコシル化塩基であるＰＮＧアーゼＦ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）で可溶化物を処理すると、ＭＡｂ１０９の反応性が消失した。イムノブロットしたものを市販の抗ＣＥＡＣＡＭ６ポリペプチド抗体で探索すると、約４５ｋＤのポリペプチドを検出した（右側のパネル）。分子量の移行は、ポリペプチド上のＮグリカンの除去と一致していた。これらのデータは、ＭＡｂ１０９エピトープが脊椎動物のＮ結合型グリカンを加水分解するＰＮＧアーゼＦによるＣＥＡＣＡＭ６の処理に感受性があることを示した。
【０１７７】
図２２に示すように、ＣＥＡＣＡＭ６はＣＥＡファミリーのメンバーである。ＭＡｂ１０９はＣＥＡＣＡＭ５および６と反応しますが、ＣＥＡＣＡＭ８とは反応しない。ＣＥＡＣＡＭ６はＣＥＡＣＡＭ５よりも非常に小さく、それゆえ、ＭＡｂ１０９によって認識されるエピトープは、これら２つのタンパク質に共通する配列とは関連していない。図２３に示すように、ＣＥＡＣＡＭ６は、３つのドメインであるＶ、Ｃ１、およびＣ２を、１２個の潜在的なＮ結合型構造とともに含有する。
【０１７８】
ＶドメインをコードするｃＤＮＡ配列をＣ１およびＣ２ドメインのｃＤＮＡ配列から除去し、先に説明したようにｐＦＵＳＥベクターへと部分クローン形成した。このベクター内のタンパク質の領域は、Ｃ６ｆ１と称することになる。図２５に示すように、ベクターをＨＥＫ−２９３細胞内で発現させると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＭＡｂ１０９を使用したイムノブロット法により予測される分子量である糖タンパク質を生成した。Ｃ６ｆ１  １０９エピトープは、ＰＮＧアーゼＦに感受性があった。ＣＥＡＣＡＭ６ポリペプチドに対する市販の抗体を使用すると、このエピトープは予想通りイムノブロット法後に残存していたが、処理したタンパク質の分子量は低減し、このことは、ＰＮＧアーゼＦによるＣ６ｆ１上でのＮ−グリカンの除去と一致していた。
【０１７９】
種々のグリコシダーゼを用いたＨＥＫ細胞由来のＣ６ｆ１の処理は、図２６に示すように、ＭＡｂ１０９結合の喪失を結果として生じなかった。Ｃ６ｆ１は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性を欠いた変異体ＨＥＫ細胞（Ｌｅｃ１ＨＥＫ）内で発現したが、その結果、完全に加工されず、本質的にマンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＭａｎおよびＧｌｃＮＡｃ）を含有するＮ−グリカンを生じ、主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。これらのＮ−グリカンは、エンドベータ−ガラクトシダーゼＦおよびＨの両方のグリコシダーゼに対して感受性がある。ＭＡｂ１０９は、Ｌｅｃ１ＨＥＫにおいて発現したＣ６ｆ１への強い結合を示した。当エピトープは、ＰＮＧアーゼＦ処理に対して感受性があるままである。Ｃ６ｆ１Ｌｅｃ１上のＮ−グリカンは、Ｅｎｄｏ  Ｆ処理には感受性があるが、ＭＡｂ１０９は依然として当Ｎ−グリカンに結合する。したがって、当エピトープは、拡張したＮ−グリカン構造に依存するようには見えなかった。Ｌｅｃ１ＨＥＫ細胞内で発現したＣＥＡＣＡＭ６フラグメント１Ｎ−グリカンを図２７に示す。
【０１８０】
図２８に示すように、Ｌｅｃ１Ｃ６ｆ１をエンド−ベータ−ガラクトシダーゼＦまたはＨで処理すると、結果的にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の加水分解が生じ、当タンパク質に付着した単一のＧｌｃＮＡｃが残る。Ｅｎｄｏ  Ｈ処理後にＬｅｃ１ＨＥＫ細胞内で発現したＣＥＡＣＡＭ６フラグメント１Ｎ−グリカンを図２９に示す。
【０１８１】
実施例５
ＭＡｂ１０９エピトープの特徴付け：変異誘発分析。
ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、およびＣＥＡＣＡＭ８のＣ末端アミノ酸配列のアライメントアライメントを図３０に示す。ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６は、ＭＡｂ１０９によって認識されるエピトープを発現し、ＣＥＡＣＡＭ８は認識しない。配列間の主な違いは、Ｃ６ｆ１配列のアミノ酸３００の領域にあった。ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６の両方は、セグメントＱＡＨを含んでいた。ＣＥＡＣＡＭ８における対応するセグメントはＨＴＴであった。
【０１８２】
先に説明したように、本発明者らは、この領域に関して特定部位の変異誘発を実施した。この実験の結果を図３１に示す。Ｃ６ｆ１のＱＡＨがＨＴＴに変更された変異誘発実験により、ＭＡｂ１０９による結合が排除された。Ｃ６ｆ１のＱＡＨがＨＴＴに変更された変異誘発実験により、ＭＡｂ１０９による結合が排除された。逆に、図３２に示すように、ＣＥＡＣＡＭ８のＨＴＴがＱＡＨに変更された変異誘発実験は結果として、ＭＡｂ１０９の結合を生じた。ＣＥＡＣＡＭ８のＨ３００ＱまたはＴ３０２Ｈのいずれかを変更しても、ＭＡｂ１０９結合が陽性にならなかった。しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ８のＨ３００ＱおよびＴ３０２Ｈ（Ａ３０１Ｔではない）の両方を変更すると、図３３に示すような結合における結果を生じた。これらの実験は、ＭＡｂ１０９結合またはエピトープの生合成のいずれかにＨ３００およびＴ３０２が必要とされることを示唆した。
【０１８３】
Ｃ６ｆ１上の他の場所にあるＮ結合型構造がＭＡｂ結合に関与することができるかどうかを判定するために、９個のＮ結合型シークオンの各々を順番に変異させた。図３４に示すように、Ｎ３０９がＮ３０９Ａに変異したとき、ＭＡｂ結合は存在せず、このシークオンのグリカンのみが関与していたことを示した。
【０１８４】
図３５は、ＱＡＨ領域に対するＮ３０９の位置を示す。これらは両方ともＣ２領域にある。Ｃ６ｆ１のシステインがベータ−メルカプトエタノール処理によって還元され、続いてヨードアセトアミドで還元的アルキル化されて再結合を遮断し、結果的に生じる糖タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡｂ１０９を使用したウエスタンブロット法に供し、抗体はまだ結合していた。まとめると、これらのデータは、二次タンパク質構造がＭＡｂ１０９結合に関与する可能性は低いことを示唆したが、エピトープの生合成に関与することができた。Ｑ３００からＶ３１８付近で、Ｃ６ｆ１の一部としてペプチドセグメントについて追加の変異誘発実験を実施した。結果を図３６に示す。
【０１８５】
ＭＡｂ１０９結合に及ぼす変異の影響を、ドットブロットアッセイを使用してさらに分析した。天然Ｃ６ｆ１をニトロセルロース上にスポット処理し、乾燥後、ニトロセルロースをＢＳＡ溶液でブロッキングし、洗浄した。ＭＡｂ１０９を変異型Ｃ６ｆ１と２時間プレインキュベートし、この溶液をドットブロットに適用する。２時間後、ニトロセルロースを洗浄し、ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体で探索して、ドットブロットへのＭＡｂ１０９の結合を検出した。変異型Ｃ６ｆ１が活性ありの場合、変異型Ｃ６ｆ１は、ＭＡｂ１０９の結合について効率的に競合し、活性のないＣ６ｆ１は、ＭＡｂ１０９結合と競合しない。これらの実験の結果を図３７に要約する。特定の残基は、緑色、赤色、または橙色で示す。緑色は、このアミノ酸の変化がＭＡｂ１０９結合活性を保持するＣ６ｆ１を産生したことを意味する。赤色は、このアミノ酸の変化がＭＡｂ１０９結合活性を喪失するＣ６ｆ１を生成したことを意味する。橙色は、このアミノ酸の変化がＭＡｂ１０９結合活性のすべてではなくほとんどを喪失するＣ６ｆ１を産生したことを意味する。
【０１８６】
ペプチドおよびグリコペプチド合成技術を使用して、Ｑ３００からＲ３２６へのペプチドおよびＮ３０９において単一のＧｌｃＮＡｃ残基を有する同じペプチドをＭＡｂ結合について検査した。これらの配列を図３８に示す。ペプチドＱ３００からＲ３２６へは、（Ｐ融合ベクター内で）Ｆｃに融合したＣ６ｆ１がトリプシンで処理されたときに生成されるトリプシン消化性ペプチドであるため、Ｖ３１８のＣ末端にさらなる８個のアミノ酸を付加した。３０ｎマイクロモル濃度の濃度では、いずれのペプチドもＭＡｂ結合を阻害しなかった。この結果は、Ｎ３０９に単一のＧｌｃＮＡｃを有するＱ３００からＲ３２６へだけがエピトープに含有されていないことを示唆した。
【０１８７】
ＭＡｂ１０９が結合するＣ末端の最小グリコペプチドを簡素化するために、合成ｃＤＮＡを合成して発現ベクター内へ挿入し、ＨＥＫ−Ｔ細胞内で発現させた。ＴＥＶ切断部位、その切断部位へのＴＥＶの容易な接近を可能にする短鎖リンカー、Ｈｉｓタグ、およびＧＦＰをコードする配列を、最終的なＶ３１８の下流に挿入した。図３９に示すように、グリコペプチド＃６は、ＨＥＫ細胞内で発現するとき、アフィニティー精製すると、ＭＡｂ結合活性を示した。しかしながら、Ｎ末端に２７個のアミノ酸を欠くグリコペプチド＃１０は活性がなかった。グリコペプチド＃８であるＱ３００−Ｖ３１８は不活性であり、合成グリコペプチドの結果と一致した。グリコペプチド＃６と＃７との間の主な違いは、＃７がＣ２５９を含有していないことであり、このことは概して、Ｃ２９９とジスルフィド結合を形成する。
【０１８８】
Ｃ２９９Ａ含有の変異体Ｃ６ｆ１も活性がなかった（先を参照されたい）。まとめると、これらの結果は、Ｃ２５９とＣ２９９との間に自然に形成されるジスルフィドループがＭＡｂ１０９エピトープの生合成に必要とされることを示唆する。次に、Ｃ２５９Ａ変異を導入し、このグリコペプチドを発現させて、この仮説を検証した。Ｃ２５９Ａ変異を有する＃６グリコペプチド配列は不活性であった。
【０１８９】
これらのデータは、ＭＡｂ１０９の結合には、Ｎ３０９に付着した最少で単一のＧｌｃＮＡｃ残基を必要とするかもしれず、また、近くに他の残基も必要とするかもしれないことを示唆した。この結合は、還元およびアルキル化ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでＰＶＤＦ上でのウエスタンブロット法の後のグリコペプチドがＭＡｂ１０９結合活性を示すので、二次ペプチド構造（ジスルフィド）を必要とするようには見えない。さらに、Ｃ２９９Ａおよび２５９Ａのいずれかの変異は結果的にＭＡｂ結合の喪失を生じるので、これらのシステイン間のジスルフィド架橋は、エピトープの生合成のために存在しなければならない。そのため、ニトロセルロース上での生合成および／またはＭＡｂ１０９の結合には以下が必要と思われる：ジスルフィド架橋Ｃ２５９−Ｃ２９９、Ｎ３０９上でのＧｌｃＮＡｃ、Ｑ３００およびＨ３０２、ならびにＳ３０４
【０１９０】
ＭＡｂ１０９は、ベータ−メルカプトエタノールおよびヨードアセトアミド反応、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによる変性およびニトロセルロース膜への転写の後、グリコペプチドおよびＣ６ｆ１に結合しているので、Ｍａｂ１０９結合はジスルフィド架橋Ｃ２５９−Ｃ２９９を必要としない。しかし、変異および切断実験により、このジスルフィド架橋はエピトープ発現にとって必要とされるように思われる。Ｎ３０９上のＧｌｃＮＡｃ含有の合成グリコペプチドＱ３００からＲ３２６へはＭＡｂ１０９によって結合されなかったので、ＭＡｂ１０９エピトープの一部であるＧｌｃＮＡｃ−Ｎ３０９に加えてグリコペプチドの修飾がなければならず、この修飾は、ジスルフィド架橋Ｃ２５９−Ｃ２９９を必要としなければならない。
【０１９１】
実施例６
膵癌試料におけるＭａｂ１０９エピトープの検出。
ＥＬＩＳＡウェル上にコーティングされたＭＡｂ１０９を使用して膵癌血清および非罹患対照血清由来の血清からエピトープを捕捉する捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。図４０に示すように、市販のポリクローナル抗体を使用して、捕捉されたＣＥＡＣＡＭ６を検出した。正常な血清および複製されたアッセイにおけるＣＥＡＣＡＭ６のレベルは１．０および３．５ｎｇ／ｍＬであった。膵癌患者由来の血清中のＣＥＡＣＡＭ６のレベルは、１５４．３４および１４６．６４ｎｇ／ｍＬであった。
【０１９２】
捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、試料のより大きなコホートにおいてＭａｂ１０９によって認識されるＣＥＡＣＡＭ６エピトープを検出した。図４１に示すように、膵癌患者由来の血清と非罹患血清においてＭａｂ１０９によって認識されるＣＥＡＣＡＭ６エピトープのレベル間には統計的に有意な差があった（ｐ＝０．０３６）。図４２および４３は、慢性膵炎、膵癌に苦しんでいる患者、および非罹患対照に由来する血清中のＭａｂ１０９によって認識されたＣＥＡＣＡＭ６エピトープのレベルを比較するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020515286.tif 000013
【図３Ｃ】
2020515286.tif 000014
【図４−１】
2020515286.tif 000015
【図４−２】
2020515286.tif 000016
【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2020515286.tif 000054
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
2020515286.tif 000065
【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
2020515286.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月27日(2019.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020515286000001.app
【国際調査報告】
2020515286.tif 000071
2020515286.tif 000072
2020515286.tif 000073