(57)【要約】本開示は、ミオミキサータンパク質の融合促進活性に関する。このポリペプチドは、ミオメーカータンパク質を含む非筋細胞において発現されたときに、ミオメーカータンパク質のみを発現する細胞と比較して、その細胞と筋細胞との融合を増加させ、他の非筋細胞との融合は増加させない。筋細胞への外因性遺伝物質の送達におけるこのタンパク質およびそれを発現する細胞の使用についても記載する。2020508668.tif 000014
2020508668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサー（Myomixer）ポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換された細胞。
【請求項２】
ヒト細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項３】
非筋細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項４】
線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項５】
外因性核酸が、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、請求項1記載の細胞。
【請求項６】
細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカー（Myomaker）ポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換されている、請求項1記載の細胞。
【請求項７】
外因性核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれている、請求項1記載の細胞。
【請求項８】
外因性核酸が、前記細胞によりエピソーム的に保持されている、請求項1記載の細胞。
【請求項９】
検出マーカーおよび／または選択マーカーを発現する、請求項1記載の細胞。
【請求項１０】
ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子を発現するよう形質転換されている、請求項1記載の細胞。
【請求項１１】
細胞内で活性なプロモーターの制御下にある外因性ミオミキサータンパク質をコードする核酸を、非筋細胞に移入する工程を含む、非筋細胞融合パートナーを調製する方法。
【請求項１２】
前記細胞が安定的に形質転換される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が一過的にトランスフェクトされる、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
検出マーカーをコードする核酸または検出マーカーを生成するのに十分な核酸を前記細胞に移入する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
外因性核酸が、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換される、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
外因性核酸が、選択マーカーをさらにコードする、請求項11記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子を発現するよう形質転換される、請求項11記載の方法。
【請求項２１】
（a）（i）非筋細胞において外因性のミオミキサータンパク質および
（ii）ミオメーカータンパク質
を発現する非筋細胞を用意する工程、ならびに
（b）非筋細胞を筋肉と接触させる工程
を含む、非筋細胞を筋細胞に融合する方法であって、
ミオミキサータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合することになる、
前記方法。
【請求項２２】
非筋細胞がヒト細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
非筋細胞が線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
工程（b）がインビトロで実施される、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
工程（b）がインビボで実施される、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
非筋細胞が、検出マーカーまたは選択マーカーを発現する、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
非筋細胞が、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換される、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
筋細胞が、単離された筋細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
筋細胞が、インタクトな筋組織内に存在する、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
筋細胞が、筋芽細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
（a）外因性ミオミキサータンパク質およびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞を用意する工程であって、非筋細胞が、関心対象の遺伝子をさらに含む、工程、ならびに
（b）非筋細胞を筋細胞と接触させる工程
を含む、関心対象の遺伝子を筋細胞に送達する方法であって、
ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ前記関心対象の遺伝子を筋細胞に送達することになる、
前記方法。
【請求項３２】
非筋細胞が、ヒト細胞である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
非筋細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
工程（b）が、インビトロで実施される、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
工程（b）が、インビボで実施される、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
非筋細胞が、検出マーカーまたは選択マーカーを発現する、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
非筋細胞が、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換される、請求項31記載の方法。
【請求項３８】
筋細胞が、単離された筋細胞である、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
筋細胞が、インタクトな筋組織内に存在する、請求項31記載の方法。
【請求項４０】
筋細胞が病的表現型を示し、かつ前記関心対象の遺伝子がその遺伝子型を修正する、請求項31記載の方法。
【請求項４１】
病的表現型が、正常遺伝子産物の低発現または非存在である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
病的表現型が、欠陥遺伝子産物の発現である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
筋細胞が、先天性ミオパシー、サルコペニア、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、ポンペ病、または横紋筋肉腫に関連する病的表現型を有する、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
非筋細胞が、対象内の、筋肉を含む罹患した筋組織に送達される、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
送達が、筋肉内注射によって行われる、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
送達が、少なくとも1回繰り返される、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
前記対象に二次療法が施される、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
非筋細胞が、エクスビボで筋細胞に送達され、その後、対象に移植される、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
筋細胞が、インタクトな筋組織内に含まれる、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
筋細胞が、筋芽細胞である、請求項31記載の方法。
【請求項５１】
真核生物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサーポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、発現カセット。
【請求項５２】
外因性核酸が、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、請求項51記載の発現カセット。
【請求項５３】
真核生物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項51記載の発現カセット。
【請求項５４】
検出マーカーおよび／または選択マーカーをコードする、請求項51記載の発現カセット。
【請求項５５】
ミオミキサーまたはミオメーカー以外の関心対象の遺伝子をコードする外因性核酸を含む、請求項51または53記載の発現カセット。
【請求項５６】
複製可能ベクター内に含まれる、請求項51記載の発現カセット。
【請求項５７】
複製可能ベクターが、ウイルスベクターである、請求項56記載の発現カセット。
【請求項５８】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項57記載の発現カセット。
【請求項５９】
複製可能ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項56記載の発現カセット。
【請求項６０】
非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子中に配合されている、請求項59記載の発現カセット。
【請求項６１】
（a）対象由来の非筋細胞を用意する工程、
（b）（i）非筋細胞において外因性のミオミキサーおよびミオメーカータンパク質ならびに
（ii）1つまたは複数の治療遺伝子
を発現する1つまたは複数の発現カセットを、非筋細胞に導入する工程、ならびに
（c）非筋細胞を、遺伝的欠陥を有する筋細胞と接触させる工程
を含む、対象における細胞内の遺伝的欠陥を修正する方法であって、
ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ1つまたは複数の治療遺伝子を筋細胞に送達し、それによって遺伝的欠陥を修正することになる、
前記方法。
【請求項６２】
非筋細胞が、ヒト細胞である、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
非筋細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項61記載の方法。
【請求項６４】
工程（b）および／または（c）が、インビトロまたはインビボで実施される、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
工程（b）がインビトロで実施され、かつ工程（c）がインビボで実施される、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
非筋細胞が、検出マーカーまたは選択マーカーを発現する、請求項61記載の方法。
【請求項６７】
1つまたは複数の治療遺伝子が、Cas9と、少なくとも1つの治療sgRNAとを含む、請求項61記載の方法。
【請求項６８】
筋細胞が、単離された筋細胞である、請求項61記載の方法。
【請求項６９】
筋細胞が、インタクトな筋組織内に存在する、請求項65記載の方法。
【請求項７０】
遺伝的欠陥が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー変異である、請求項61記載の方法。
【請求項７１】
遺伝的欠陥が、先天性ミオパシーである、請求項61記載の方法。
【請求項７２】
遺伝的欠陥が、ポンペ病である、請求項61記載の方法。
【請求項７３】
遺伝的欠陥が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項61記載の方法。
【請求項７４】
非筋細胞が、対象内の、筋肉を含む罹患した筋組織に送達される、請求項65記載の方法。
【請求項７５】
送達が、筋肉内注射によって行われる、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
送達が、少なくとも1回繰り返される、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
前記対象に二次療法が施される、請求項74記載の方法。
【請求項７８】
非筋細胞が、エクスビボで筋細胞と接触し、その後、対象に移植される、請求項65記載の方法。
【請求項７９】
筋細胞が、インタクトな筋組織に含まれる、請求項65記載の方法。
【請求項８０】
筋細胞が、筋芽細胞である、請求項61記載の方法。
【請求項８１】
1つまたは複数の発現カセットが、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む、請求項61記載の方法。
【請求項８２】
1つまたは複数の発現カセットが、検出マーカーおよび／または選択マーカーをコードする、請求項61記載の方法。
【請求項８３】
発現カセットが、複製可能ベクター内に含まれる、請求項61記載の方法。
【請求項８４】
複製可能ベクターが、ウイルスベクターである、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
複製可能ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子中に配合されている、請求項86記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、2017年2月24日に出願された米国仮出願番号62/463,365からの優先権の恩典を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援に関する条項
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金番号R01AR067294-01の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
背景
1. 分野
本開示は、概して、発生生物学、細胞生物学および分子生物学の分野に関連する。より具体的には、ミオミキサー（Myomixer）タンパク質の筋細胞融合促進活性に関連する。
【０００４】
2. 関連技術の説明
骨格筋は、ヒトの体重の約40％と見積もられる、体内で最も大きな組織である。骨格筋の形成には、Pax7およびMyoDによる筋細胞運命の決定、その後の筋肉構造および機能を確立する多数の遺伝子の発現から始まる一連のイベントが関与する（Bentzinger et al., 2012; Buckingham et al., 2014）。このプロセスにおいて基礎となる工程は、多核筋原線維を形成する単核筋芽細胞の融合である（Rochlin et al., 2010; Demonbreun et al., 2015; Krauss et al., 2017; Simionescu et al., 2011; Abmayr & Pavlath, 2012）。同様に、損傷に応答して、成体筋肉組織内の筋原性前駆細胞が活性化され、融合し、新しい筋原線維を形成する（Yin et al., 2013; Doles & Olwin, 2015; Brack & Rnado, 2012）。筋芽細胞融合の初期工程の多くは他の融合性の細胞型のそれらと似ているが（Chen & Olson, 2005）、個々の細胞型、例えば筋芽細胞の融合の構成要素および分子的基礎は、十分に定義づけられていない。
【０００５】
筋芽細胞融合は、骨格筋線維の形成に必要とされる複雑かつ厳重に制御されたプロセスである（Chen and Olson, 2005）。この融合プロセスは、融合性筋芽細胞が非筋細胞型と合胞体を形成しないよう、高度に細胞型特異的でなければならない。骨格筋発生を支配する転写メカニズムは、詳細に解明されているが（Bentzinger et al., 2012; Berkes and Tapscott, 2005; Buckingham 2006; Kang and Krauss, 2010）、筋芽細胞融合を調整するメカニズムは十分に理解されていないままであり、筋芽細胞融合を直接的に調節する筋特異的タンパク質は、いかなる生物においても同定されていない（Abmayr & Pavlath, 2012; Rochlin et al et al., 2010）。これに対して、細胞・細胞接着およびアクチン力学に関与する多数のタンパク質が、筋芽細胞融合に関連付けられている（Charrasse et al., 2007; Charrasse et al., 2002; Schwander et al., 2003; Griffinet et al., 2009; Yagami-Hiromasa et al., 1995）。しかし、これらのタンパク質のいずれも、哺乳動物の筋芽細胞融合に必要かつ十分なほど筋特異的ではなく、このことは、このプロセスの筋特異的要素が未発見のままであることを示唆している。
【発明の概要】
【０００６】
概要
したがって、本開示にしたがい、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサーポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換された細胞が提供される。細胞は、ヒト細胞、非筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。外因性核酸は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。細胞はさらに、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカー（Myomaker）ポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換され得る。外因性核酸は、細胞の染色体に組み込まれ得る。外因性核酸は、細胞によりエピソーム的に保持され得る。細胞は、検出マーカーおよび／または選択マーカーを発現し得る。細胞は、ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子、例えば治療遺伝子またはマーカー遺伝子を発現するよう形質転換され得る。
【０００７】
別の態様において、非筋細胞融合パートナーを調製する方法であって、細胞内で活性なプロモーターの制御下にある外因性ミオミキサータンパク質をコードする核酸を、非筋細胞に移入する工程を含む方法が提供される。細胞は、安定的に形質転換または一過的にトランスフェクトされ得る。この方法はさらに、検出マーカーをコードする核酸または検出マーカーを生成するのに十分な核酸を細胞に移入する工程を含み得る。外因性核酸は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。細胞はさらに、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換され得る。細胞は、ヒト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。外因性核酸はさらに、選択マーカーをコードし得る。細胞は、ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子、例えば治療遺伝子またはマーカー遺伝子を発現するよう形質転換され得る。
【０００８】
さらに別の態様において、非筋細胞を筋細胞に融合する方法であって、
（a）（i）非筋細胞において外因性のミオミキサータンパク質および
（ii）ミオメーカータンパク質
を発現する非筋細胞を用意する工程、ならびに
（b）非筋細胞を筋肉と接触させる工程
を含み、ミオミキサータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合することになる、方法が提供される。非筋細胞は、ヒト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。工程（b）は、インビトロで実施またはインビボで実施され得る。非筋細胞は、検出マーカーまたは選択マーカーを発現し得る。非筋細胞はさらに、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換され得る。筋細胞は、単離された筋細胞であり得る、インタクトな筋組織内に存在する筋細胞であり得る、および／または筋芽細胞であり得る。
【０００９】
さらなる態様において、関心対象の遺伝子を筋細胞に送達する方法であって、（a）外因性ミオミキサータンパク質およびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞を用意する工程であって、非筋細胞がさらに、関心対象の遺伝子を含む、工程、ならびに（b）非筋細胞を筋細胞と接触させる工程を含み、ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ関心対象の遺伝子を筋細胞に送達することになる、方法が提供される。非筋細胞は、ヒト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。工程（b）は、インビトロで実施またはインビボで実施され得る。
【００１０】
非筋細胞は、検出マーカーまたは選択マーカーを発現し得る。非筋細胞はさらに、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換され得る。筋細胞は、単離された筋細胞であり得る、またはインタクトな筋組織内に存在し得る、または筋芽細胞であり得る。筋細胞は病的表現型を示し得、関心対象の遺伝子がその遺伝子型を修正する、例えば病的表現型は、正常遺伝子産物の低発現もしくは非存在、または欠陥遺伝子産物の発現である。
【００１１】
筋細胞は、先天性ミオパシー、サルコペニア、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、ポンペ病、または横紋筋肉腫に関連する病的表現型を有し得る。非筋細胞は、例えば筋肉内注射によって、対象内の、筋肉を含む罹患した筋組織に送達され得る、および／または送達は、少なくとも1回繰り返される、および／または二次療法が、対象に施される。非筋細胞は、エクスビボで筋細胞に送達され、その後、対象に移植され得る、例えば筋細胞は、インタクトな筋組織内に含まれる。
【００１２】
なおさらなる態様において、真核生物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサーポリペプチドをコードする外因性核酸を含む発現カセットが提供される。外因性核酸は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。発現カセットはさらに、真核生物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得る。発現はさらに、検出マーカーおよび／または選択マーカーをコードし得る。発現カセットは、ミオミキサーまたはミオメーカー以外の関心対象の遺伝子をコードする外因性核酸を含み得る。発現カセットは、複製可能ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター）または非ウイルスベクター（例えば、リポソームもしくはナノ粒子中に配合された非ウイルスベクター）内に含まれ得る。
【００１３】
さらなる態様において、対象における細胞内の遺伝的欠陥を修正する方法であって、
（a）対象由来の非筋細胞を用意する工程、
（b）（i）非筋細胞において外因性のミオミキサーおよびミオメーカータンパク質ならびに
（ii）1つまたは複数の治療遺伝子
を発現する1つまたは複数の発現カセットを、非筋細胞に導入する工程、ならびに
（c）非筋細胞を、遺伝的欠陥を有する筋細胞と接触させる工程
を含み、ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ1つまたは複数の治療遺伝子を筋細胞に送達し、それによって遺伝的欠陥を修正することになる、方法が提供される。非筋細胞は、ヒト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。工程（b）および／もしくは（c）は、インビトロもしくはインビボで実施され得る、または工程（b）はインビトロで実施され、工程（c）はインビボで実施され得る。
【００１４】
非筋細胞は、検出マーカーまたは選択マーカーを発現し得る。1つまたは複数の治療遺伝子は、Cas9と、少なくとも1つの治療sgRNAとを含み得る。筋細胞は、単離された筋細胞であり得る。筋細胞は、インタクトな筋組織内に存在し得る。遺伝的欠陥は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー変異、先天性ミオパシー、ポンペ病、または筋萎縮性側索硬化症であり得る。非筋細胞は、例えば筋肉内注射によって、対象内の、筋肉を含む罹患した筋組織に送達され得る。送達は、少なくとも1回繰り返され得る。二次療法が、対象に施され得る。
【００１５】
非筋細胞は、エクスビボで筋細胞と接触し、その後、対象に移植され得る。筋細胞は、インタクトな筋組織内に含まれ得る。筋細胞は、筋芽細胞であり得る。1つまたは複数の発現カセットは、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含み得る。1つまたは複数の発現カセットは、検出マーカーおよび／または選択マーカーをコードし得る。発現カセットは、複製可能ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター）または非ウイルスベクター、例えば、リポソームもしくはナノ粒子中に配合された非ウイルスベクター内に含まれ得る。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「a」または「an」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、「含む」という単語と共に使用されるとき、「a」または「an」という単語は、1つまたは2つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第2またはそれ以上を意味し得る。本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な実施例は、本開示の好ましい態様を示すものであるが、例にすぎず、本開示の精神および範囲内での様々な変更および改変が詳細な説明から当業者に明らかとなることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の局面をさらに示すために含まれている。本開示は、本明細書に示される具体的態様の詳細な説明と共にこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってより理解され得る。
【図１Ａ】ミオミキサーは、膜タンパク質であり、筋芽細胞融合に必須である。（図1A）WTおよびミオミキサーKO初代筋芽細胞を1週間分化させ、MY32抗体（ミオシン）およびHoechstで染色し、これにより筋芽細胞融合におけるミオミキサーの必要性が示された。スケールバー、50μm。
【図１Ｂ】ミオミキサーは、膜タンパク質であり、筋芽細胞融合に必須である。（図1B）WTおよびミオミキサーKO初代筋芽細胞培養物（n=3）における核の定量（グラフの凡例は、上から下／左から右である）。*P＜0.05、***P＜0.001、スチューデントt検定。
【図１Ｃ】ミオミキサーは、膜タンパク質であり、筋芽細胞融合に必須である。（図1C）DM中での4日間の後のWTまたはミオミキサーKO初代筋芽細胞培養物におけるミオミキサー、ミオシンおよびGapdh発現を示すウェスタンブロット。
【図１Ｄ】ミオミキサーは、膜タンパク質であり、筋芽細胞融合に必須である。（D）ミオミキサーのアミノ酸配列および種間相同性（SEQ ID NO:9〜31）。塩基性残基は青色、酸性残基は赤色、ロイシンは黄色である。保存されたアミノ酸が強調表示されている。ss、二次構造；HH、ヘリックス；CC、コイル。
【図１Ｅ】ミオミキサーは、膜タンパク質であり、筋芽細胞融合に必須である。（図1E）C末端FLAGタグを有するミオミキサーの細胞表面局在化を示す、ミオミキサートランスフェクトC2C12筋芽細胞の生細胞染色。FLAG染色および膜透過処理後にラミニンを染色した。
【図１Ｆ】ミオミキサーは、膜タンパク質であり、筋芽細胞融合に必須である。（図1F）レトロウイルス-ミオミキサー感染293細胞およびWT C2C12細胞の細胞質（C)および膜（M）画分のウェスタンブロット分析（分化後第4日）。α-チューブリンおよびGapdhブロットを、細胞質タンパク質の陽性対照として使用した。インスリン受容体β、N-カドヘリン、EGF受容体ブロットを、膜タンパク質の陽性対照として使用した。
【図２−１】ミオミキサーは、筋発生および成体筋再生の間に特異的に発現される。（図2A）C2C12分化の間のミオミキサー、ミオシンおよびGapdhの発現を示すウェスタンブロット。（図2B）成長培地（GM）におけるおよび分化培地（DM）への移し替えから2日後のPax7+およびTwist2+骨格筋前駆体におけるミオミキサーのRNA-seqデータ（グラフの凡例は、上から下／左から右である）。FPKM：マップされた読み取り値100万個あたりの転写物の塩基1キロあたりのフラグメント。（図2C）qPCRによって検出された舌筋発生の間のミオミキサー転写物の発現（n=4）。（図2D）示されている組織におけるミオミキサーおよびGapdhの発現を示すウェスタンブロット。SKM、骨格筋。（図2E）E12.5およびE15.5のマウス胚の横断面におけるミオミキサー転写物発現を示すインサイチューハイブリダイゼーション。スケールバー、250μm（a）、500μm（b）、200μm（c）。画像cは、画像bに示される囲まれた領域の拡大図である。M：筋節由来筋肉塊；Sc、肩甲骨前筋塊；EP、伸筋原基；FP、屈筋原基；IP、肋間筋原基；I、肋間筋；TB、上腕三頭筋；P、深胸筋；ECRL、長橈側手根伸筋；B、腕橈骨筋；R、とう骨；PL、長掌筋。（図2F）qPCRによって決定された、1ヶ月齢WTマウス由来のCTX損傷骨格筋におけるミオミキサーmRNA発現（n=3）。（図2G）ミオミキサー（赤色）およびミオシン（MY32：緑色）の免疫染色を示す、第4日および第7日のCTX損傷筋の断面。スケールバー、20μm。（図2H）qPCRによって検出された、WT筋と比較してのmdxにおけるミオミキサー mRNA発現の上方調節（n=4）。*P＜0.05、***P＜0.001、スチューデントt検定。
【図２−２】図２−１の説明を参照のこと。
【図３】ミオミキサーは、筋発生に必須である。（図3A）ミオミキサーKO四肢における筋肉の欠如を明らかにするために解剖し皮を剥いだ、E17.5のWTおよびミオミキサーKO胚。（図3B）E17.5四肢筋のH＆E染色は、ミオミキサーKO胚における筋線維の欠如を示す。スケールバー、50μm。（図3C）MY32（ミオシン）抗体を用いたE17.5四肢筋の免疫組織化学。WT筋線維は多核化を示すが、これはミオミキサーKO切片においては見られない。スケールバー、50μm。（図3D）遺伝子タイピングは、ミオミキサーsgRNAターゲティング領域における異なるタイプの欠失を示している。WTバンドは743 bpである。（図3E）E17.5 WTおよびミオミキサーKO胚の前肢組織におけるミオミキサーおよびGapdhのウェスタンブロット分析。
【図４−１】ミオミキサーはミオメーカーに結合し、細胞融合を誘導するよう共働する。（図4A）ミオミキサーおよび／またはFLAG-ミオメーカーを発現するレトロウイルスを感染させた10T1/2細胞またはC2C12筋芽細胞を用いて共免疫沈降アッセイを行った。IP、免疫沈降；IB、免疫ブロット。（図4B）ミオメーカー、ミオミキサーまたはその両方を発現するレトロウイルスを感染させ、4日間分化させたC2C12細胞のMY32（ミオシン）免疫染色。Hoechstを用いて核を対比染色した。スケールバー、50μm。（図4C）BのC2C12細胞における核の定量（n=3）（グラフの凡例は、上から下／左から右である）。（図4Dおよび図4E）ミオメーカー、ミオミキサーまたはその両方を発現するレトロウイルスを感染させたGFP標識10T1/2線維芽細胞。感染2日後、細胞をCherry標識C2C12細胞と混合し、1週間分化させた。核を対比染色するGFP、RFP（Cherry）およびHoechstの蛍光画像。スケールバー、100μm。（図4F）ウェスタンブロットによって検出された、10T1/2線維芽細胞におけるミオミキサーおよびミオメーカーの過剰発現。（図4G)異なる細胞型におけるミオミキサーおよびミオメーカーの融合活性の要約。（図4H）1週間の分化後の、C2C12細胞（WTまたはミオミキサー KO）とミオメーカーおよび／またはミオミキサーを発現するレトロウイルスを感染させた10T1/2-GFP線維芽細胞の混合培養物のGFPおよびMY32（ミオシン）免疫染色（赤色）の蛍光画像。Hoechstを用いて核を対比染色した。スケールバー、50μm。
【図４−２】図４−１の説明を参照のこと。
【図５−１】ミオミキサーシングルガイド（sg）RNAのCRISPRスクリーニング戦略および検証。（図5A)ゲノムワイドCRISPR機能喪失スクリーンの概要。C2C12筋芽細胞に、Cas9およびsgRNAを発現する組み換えレンチウイルスを感染させた。ピューロマイシンの添加により、ウイルスDNAがゲノムに組み込まれ、その後、Cas9およびsgRNAを安定的に発現しその標的遺伝子をノックアウトする細胞を選択する。細胞を1週間、分化培地（低血清）に移し替えた。トリプシン消化を用いて、筋芽細胞から筋管を分離した。配列決定により、スクリーン「ヒット」を同定した。その遺伝子がC2C12筋芽細胞の分化または融合に必須である場合、この遺伝子の機能喪失は、筋管形成を妨げ、これらの変化した細胞は、筋芽集団に現れるであろう。筋芽細胞 対 筋管で同定されたsgRNAの比は、筋芽細胞の分化または融合におけるその標的遺伝子の機能を反映する。（図5B）MY32抗体を用いたウェスタンブロット分析は、筋芽細胞（高トリプシン）と比較してトリプシン分離した筋管（低トリプシン）においてミオシン重鎖発現が豊富であることを示している。（図5C)このスクリーンで同定された選択された遺伝子（「ヒット」）の一覧。ヒット（増量スコア＞2.5）を、Pax7+衛星細胞およびTwist2+筋原性前駆体の分化の間に上方調節（＞2.5倍）される遺伝子、ならびにC2C12分化（GSE4694）の間に上方調節（＞1.5倍）される遺伝子と比較した。（図5D）C2C12分化の間のミオミキサープロモーターに対するMyodおよびミオゲニンの占有力学を示すクロマチン免疫沈降配列決定データ（GSM915183、GSM915185、GSM915186、GSM915165、GSM915159、GSM915163、GSM915166、GSM915164）の分析。（図5E）ミオミキサー遺伝子は、3つのエクソンにまたがり、そのORFは、エクソン3に限定される。遺伝子型分析におけるsgRNAおよびプライマーの位置が示されている。（図5F）CRISPRによるミオミキサーの妨害後のC2C12細胞由来のゲノムPCRフラグメントの配列決定（SEQ ID NO:50〜54）。（図5G）MY32（ミオシン重鎖）抗体およびHoechst染色を用いたWTおよびミオミキサーKO C2C12細胞の免疫染色は、融合におけるミオミキサーの必要性を示している。スケールバー、50μm。（図5H）WTおよびミオミキサーKO C2C12細胞における核の定量（n=3）（グラフの凡例は、上から下／左から右である）。（図5I）WTおよびミオミキサー KO C2C12細胞におけるミオミキサー、ミオシンおよびGapdhの発現を示すウェスタンブロット。（図5J）qPCRによって検出されたWTおよびミオミキサー KO C2C12細胞における示された転写物のRNA発現（グラフの凡例は、上から下／左から右である）。*P＜0.05、***P＜0.001、スチューデントt検定。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−３】図５−１の説明を参照のこと。
【図６】C2C12細胞分化の間の遺伝子発現。示されている時点で分化させたC2C12細胞からRNAを単離し、ミオゲニンまたはミオミキサー発現をqPCRによって測定した（n=3）（グラフの凡例は、上から下／左から右である）。
【図７】ミオミキサーKO胚由来のゲノムDNAの配列決定。E17.5のミオミキサー KO胚を単離し、ゲノムDNA配列を尾部DNAから決定した（SEQ ID NO:55〜57）。
【図８】ミオメーカー発現の測定。qPCRを用いて、（図8A)WTおよびミオミキサーKO C2C12細胞（n=3）ならびに（図8B)WTおよびミオメーカーKO E17.5マウス後肢（WTはn=6、KOは9）におけるミオメーカー発現を測定した。両方のパネルにおいて、グラフの凡例は、上から下／左から右である。
【図９】ミオメーカーのタンパク質およびDNA配列。
【図１０】ミオミキサーのタンパク質およびDNA配列。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
例示的態様の説明
膜融合は、ウイルス・細胞融合、細胞内小胞融合および細胞・細胞融合を含めて、複数のタイプが存在する（Chen and Olson 2005）。異なる融合メカニズムの間には類似点が存在するが、細胞・細胞融合については、特に細胞内膜に直接結合する融合性タンパク質に関して、他の融合プロセスと比較して判明していることが比較的少ない。
【００１９】
骨格筋形成は、多核化筋線維を形成する筋芽細胞の融合を通じて起こる。筋芽細胞融合および筋形成に必要とされる遺伝子についてのゲノムワイドCRISPR機能喪失スクリーンから、本発明者らは、ミオミキサーと呼ばれる小さな筋特異的ペプチドを発見した。ミオミキサーの発現は、インビトロおよびインビボで、筋芽細胞の分化と同時に起こり、胚形成の間の融合および骨格筋形成に必須である。ミオミキサーは、細胞膜に局在し、そこで融合性膜タンパク質であるミオメーカーとの結合を通じて細胞・細胞融合を促進する。本発明者らは、ミオミキサー・ミオメーカーの対が、筋発生の間の筋線維形成における重要な工程を制御していると結論づけている。
【００２０】
ミオミキサーの発見は、本発明者らによる強力な筋芽細胞融合タンパク質としてのミオメーカーの以前の発見に基づいている。ミオメーカー活性を強化する能力は、この根底にある根本的な細胞プロセスの活用をさらに促進し、非筋細胞と筋細胞の融合を誘導するミオメーカーの能力の強化は、筋修復を強化するための興味深い戦略である。本開示のこれらおよび他の局面は、以下に記載されている。
【００２１】
I. ミオメーカーおよびミオミキサー
A. ミオメーカー
ミオメーカーと命名された膜貫通タンパク質8c（Tmem8c）は、脊椎動物間で高度に保存されている221残基のほとんど特徴づけられていないタンパク質である。その遺伝子は、ヒト染色体9q34.2に存在する。それは、このタンパク質を通じて均等に分布しているおおよそ20アミノ酸の6つの推定らせん領域を含む。マウスミオメーカーのDNAおよびタンパク質配列は、それぞれ、SEQ ID NO:1および2として提供され、ヒトミオメーカーのDNAおよびタンパク質配列は、それぞれ、SEQ ID NO:3および4として提供される。
【００２２】
ミオメーカーは、筋芽細胞融合の間に一過的に発現され、インビボおよびインビトロで細胞膜の結合を誘導するのに必要かつ十分である。ミオメーカーは、筋芽細胞融合の時期に特異的に発現される筋特異的細胞膜タンパク質であり、多核化筋線維の形成に必要とされる。カドヘリン、β-1インテグリン、MOR23およびAdam12（Charrasse et al., 2007, Charrasse et al., 2002, Schwander et al., 2003, Griffinet et al., 2009 and Yagami-Hiromasa et al., 1995）を含む表面糖タンパク質が筋芽細胞融合に影響することが知られているが、ミオメーカーは、インビボで筋芽細胞融合に絶対的に必要となることが同定された唯一の筋特異的タンパク質である。ミオメーカー-/-マウスにおける多核化筋線維の非存在は、すべての骨格筋の形成におけるこの膜タンパク質の必要性を示している。
【００２３】
筋芽細胞融合は、綿密な細胞・細胞相互作用およびその後の細胞の結合を誘導するアクチン・細胞骨格力学が関与する膜融着を必要とする多段階プロセスである。ミオメーカーは、筋芽細胞融合および筋芽細胞に対する線維芽細胞の融合を刺激するその能力により示されるように、膜融合反応に関与することが明らかである。ミオメーカー単独では線維芽細胞の融合を誘導することができないことは、その融合活性を発揮するために活性化またはさらなる筋芽細胞タンパク質を必要とし得ることを示唆しており、これは膜結合を可能にする膜の接近並置の必要性を反映していると考えられる。さらなる筋芽細胞タンパク質が融合に必要とされるさらなる証拠は、WT筋芽細胞がミオメーカー-/-筋芽細胞と融合することができるという本発明者らの発見である。筋芽細胞融合時の相対する細胞上の膜タンパク質の間の相互作用の必要性は、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエ（Drosophila）において示されており（Abmayr and Pavlath 2012およびPowell and Wright 2011）、このことは、筋芽細胞融合の分子的調節が、主として融合性タンパク質の発現を必要とするウイルス・細胞融合のそれと相違することを示唆している（Oren-Suissa & Podbilewicz）。アクチン・細胞骨格の変化は、細胞・細胞融合に必要とされる（Wilson and Snell 1998; Shilagardi et al., 2013）。このパラダイムと一致して、ミオメーカーの活性は、融合に必要とされる細胞骨格イベントを妨げるサイトカラシンDおよびラトランキュリンBによって打ち消され、このことは、ミオメーカーがその機能を発揮するために細胞骨格に依存していることを示している。
【００２４】
B. ミオミキサー
マウスミオミキサーは、84アミノ酸長のマイクロペプチドである（図1D）。ミオミキサーのオルトログは、多様な脊椎動物種間で保存されている（図1D）。ミオミキサーの小さなサイズは、それを、100アミノ酸未満の未プロセシングORFにより特徴づけられるマイクロペプチドのカテゴリーに収める（Marquez-Medina et al., 2015）。これに関して、特筆すべきことに、今日までに同定されているマイクロペプチドの大部分が膜に埋め込まれているものである（Anderson et al., 2015; 2016）。マウスミオミキサーのタンパク質およびDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO:5および6に示される。ヒトミオミキサーのタンパク質およびDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO:7および8に示される。
【００２５】
ミオミキサーのアミノ酸配列は、おそらく100アミノ酸より小さいORFは典型的に注釈付けされないという理由から、魚類または両生類において注釈付けされていない。しかし、本発明者らは、様々な残基、特に多くのアルギニンおよび両親媒性残基が保存されている魚類、カエルおよびカメのゲノムにおいて、推定ミオミキサーオルトログを同定した（図1D）。様々な種由来のこのタンパク質は、N末端疎水性セグメント、それに続く正に荷電したヘリックスおよび隣接する疎水性ヘリックスを含む。哺乳動物および有袋動物由来のミオミキサータンパク質はまた、他の生物において失われている特有のC末端ヘリックスを含む（図1D）。
【００２６】
本発明者らは、明白なミオメーカーオルトログも欠くショウジョウバエにおいてミオミキサー関連遺伝子を見出しておらず、このことは、ミオミキサー-ミオメーカータンパク質の協力関係が、高等脊椎動物の創作物であることを示唆している。おそらく、脊椎動物の大きな筋肉の形成が、ショウジョウバエのようなより単純な生物の基礎的な細胞・細胞融合イベントの上にこの強固な融合機構を必要とする。
【００２７】
本発明者らは、ミオミキサーと、心筋細胞の筋小胞体に局在しそこでSERCAカルシウムATPaseに作用しその活性を刺激する（Nelson et al., 2016）心臓特異的マイクロペプチドDWORF（ドワーフオープンリーディングフレーム）の間にいくつかの特筆すべき類似点を見出した。本発明者らは、多くの膜タンパク質の活性が、未だ未解明のマイクロペプチドとの連携によって支配されている可能性があると推測している。
【００２８】
そのN末端が長い疎水性セグメントを含むので、それは推定膜アンカーであると考えられる。そのC末端にFLAGタグを有するミオミキサーを発現するインタクトなC2C12筋芽細胞の免疫染色は、そのタンパク質が細胞表面上に存在することを明らかにした（図1E）。これらの発見と一致して、膜画分および細胞質画分へのC2C12筋管の分画は、膜へのミオミキサーの局在化を示した（図1F）。同様に、ミオミキサー発現レトロウイルスを感染させた293細胞において、このタンパク質は、膜に選択的に局在化する（図1F）。
【００２９】
II. ペプチドおよびポリペプチド
特定の態様において、本開示は、ミオミキサータンパク質分子に関連し得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、概ね、全長タンパク質を表す。これに対して、ペプチドは、通常約3〜約100アミノ酸であるものと定義される。上記の「タンパク質系」の用語はすべて、本明細書で言い換え可能に使用され得る。ヒトミオミキサーポリペプチド配列は、SEQ ID NO:7で提供され、マウスミオミキサーポリペプチド配列は、SEQ ID NO:5で提供される。
【００３０】
特定の態様において、タンパク質組成物は、少なくとも1つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。さらなる態様において、タンパク質組成物は、生体適合性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、本明細書に記載される方法および量にしたがいある生物に適用または投与したときに、有意な有害効果を生じない物質を表す。そのような有害または望ましくない効果は、有意な毒性または有害な免疫学的反応等である。好ましい態様において、生体適合性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む組成物は、通常、各々が本質的に毒素、病原体および有害な免疫原を含まない哺乳動物タンパク質もしくはペプチドまたは合成性タンパク質もしくはペプチドである。
【００３１】
タンパク質組成物は、標準的な分子生物学技術を通じたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然源からのタンパク質化合物の単離、またはタンパク質物質の化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって生成され得る。様々な遺伝子に関するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列がすでに開示されており、当業者に公知の電子化されたデータベースにおいて見い出され得る。1つのそのようなデータベースは、National Center for Biotechnology InformationのGenbankおよびGenPeptデータベース（ワールドワイドウェブはncbi.nlm.nih.gov）である。これらの公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示される技術を用いてまたは当業者に公知のようにして増幅および／または発現され得る。あるいは、タンパク質は、組み換え生産または天然源から精製され得る。短いペプチド分子は、従来技術にしたがい、溶液中または固体支持体上で合成され得る。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコルにしたがい使用され得る。例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、Stewart and Young (1984); Tam et al. (1983); Merrifield (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照のこと。
【００３２】
特定の態様において、タンパク質化合物は、精製され得る。一般に、「精製」は、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド組成物が様々な他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを除去するよう分画に供されており、かつその組成物が、例えばその特定または所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対する当業者に公知であろうタンパク質アッセイによって評価され得るように、その活性を実質的に保持していることを表す。
【００３３】
III. 核酸
本開示の特定の態様において、ミオミキサーおよびミオメーカー由来のまたはそれらをコードする核酸が提供される。特定の局面において、核酸は、これらの遺伝子の野生型または修飾型を含み得る。特定の局面において、核酸は、転写される核酸をコードするまたはそれを含む。他の局面において、核酸は、SEQ ID NO:6もしくは8の核酸セグメント、またはその生物学的に機能的な等価物を含む。特定の局面において、核酸は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
【００３４】
「核酸」という用語は、当技術分野で周知である。「核酸」は、本明細書で使用される場合、概ね、ヌクレオ塩基を含むDNA、RNAまたはその誘導体もしくはアナログの分子（すなわち、鎖）を表す。ヌクレオ塩基は、例えば、DNA（例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」もしくはシトシン「C」）またはRNA（例えば、「A」、「G」、ウラシル「U」もしくは「C」）で見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基を含む。「核酸」という用語は、各々「核酸」という用語の亜属として「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、約3〜約100ヌクレオ塩基長の分子を表す。「ポリヌクレオチド」という用語は、約100ヌクレオ塩基長を超える少なくとも1つの分子を表す。
【００３５】
これらの定義は、概ね、一本鎖分子を表すが、特定の態様においては、その一本鎖分子に部分的に、実質的にまたは完全に相補的な追加の鎖も含み得る。したがって、核酸は、ある分子を含む特定の配列の1つまたは複数の相補鎖または「相補体」を含む二本鎖分子または三本鎖分子を含み得る。本明細書で使用される場合、一本鎖核酸は、「ss」という接頭辞によって示され得、二本鎖核酸は、「ds」という接頭辞によって示され得、三本鎖核酸は、「ts」という接頭辞によって示され得る。
【００３６】
1. 核酸の調製
核酸は、当業者に公知の任意の技術、例えば、化学合成、酵素生産または生物学的生産によって作製され得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例は、ホスホジエステル、ホスファイトもしくはホスホラミダイト化学および例えば参照により本明細書に組み入れられるEP 266 032に記載される固相技術を用いるインビトロ化学合成により、または各々参照により本明細書に組み入れられるFroehler et al. (1986)および米国特許第5,705,629号に記載されるデオキシヌクレオシドH-ホスホナート中間体を通じて作製された核酸を含む。本開示の方法において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドが使用され得る。様々な異なるメカニズムのオリゴヌクレオチド合成が、例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号に開示されている。
【００３７】
酵素により生産される核酸の非限定的な例は、増幅反応、例えばPCR（商標）において酵素により（例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号を参照のこと）、または参照により本明細書に記載される米国特許第5,645,897号に記載されるオリゴヌクレオチドの合成により生産されるものを含む。生物学的に生産される核酸の非限定的な例は、生細胞において生産（すなわち、複製）される組み換え核酸、例えば、細菌において複製される組み換えDNAベクターを含む（例えば、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al. 2001を参照のこと）。
【００３８】
2. 核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心勾配により、または当業者に公知の任意の他の手段により精製され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al. 2001を参照のこと）。
【００３９】
特定の局面において、本開示は、単離された核酸である核酸に関する。本明細書で使用される場合、「単離された核酸」という用語は、1つまたは複数の細胞の総ゲノムおよび転写された核酸のバルクを含まないよう単離されたまたはそうでなければ含まないようにされた核酸分子（例えば、RNAまたはDNA分子）を表す。特定の態様において、「単離された核酸」は、細胞成分のバルクまたはインビトロ反応成分、例えば高分子、例えば脂質もしくはタンパク質、小さい生物学的分子等を含まないよう単離されたまたはそうでなければ含まないようにされた核酸を表す。
【００４０】
3. 核酸セグメント
特定の態様において、核酸は、核酸セグメントである。本明細書で使用される場合、「核酸セグメント」という用語は、核酸の小フラグメント、例えば、非限定的な例として、ミオミキサーの一部のみをコードするもの、である。したがって、「核酸セグメント」は、ミオミキサー遺伝子の約10ヌクレオチド〜全長の遺伝子配列の任意の部分を含み得る。特定の態様において、核酸セグメントは、プローブまたはプライマーであり得る。本明細書で使用される場合、「プローブ」は、概ね、検出法または組成物において使用される核酸を表す。本明細書で使用される場合、「プライマー」は、概ね、伸長または増幅法または組成物において使用される核酸を表す。
【００４１】
4. 核酸相補体
本開示はまた、ミオミキサーをコードする核酸に相補的である核酸を包含する。特定の態様において、本開示は、SEQ ID NO:6または8に示される配列に相補的な核酸または核酸セグメントを包含する。核酸は、標準的なワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型結合相補性法則にしたがい別の核酸と塩基対を形成することができる場合、別の核酸の「相補体」であるまたは別の核酸に「相補的」である。本明細書で使用される場合、「別の核酸」は、別個の核酸または同じ核酸の空間的に隔離された配列を表し得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補体」という用語はまた、すべて未満のヌクレオ塩基が対応するヌクレオ塩基と塩基対を形成しない場合でさえも別の核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズすることができる連続的なヌクレオ塩基または半連続的なヌクレオ塩基（例えば、1つまたは複数のヌクレオ塩基部分がその分子内に存在しない）の配列を含む核酸を表す。特定の態様において、「相補的」な核酸は、約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％〜約100％およびそこから派生する任意の範囲のヌクレオ塩基配列がハイブリダイゼーション時に一本鎖または二本鎖核酸分子と塩基対を形成することができる配列を含む。特定の態様において、「相補的」という用語は、当業者によって理解されているように、ストリンジェントな条件下で別の核酸鎖または二重鎖とハイブリダイズし得る核酸を表す。
【００４３】
特定の態様において、「部分的に相補的」な核酸は、一本鎖もしくは二本鎖核酸に対して低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る配列を含む、またはヌクレオ塩基配列の約70％未満がハイブリダイゼーション時に一本鎖もしくは二本鎖核酸分子と塩基対を形成することができる配列を含む。
【００４４】
5. 発現構築物
特定の態様において、ミオミキサーを発現させるために発現構築物が使用される。発現は、レシピエント細胞においてミオミキサーの発現を誘導する様々な調節要素、例えばウイルスおよび哺乳動物の両方の供給源由来のエンハンサー／プロモーターを含む適切なシグナルがベクター内に提供されることを必要とする。宿主細胞におけるメッセンジャーRNAの安定性および翻訳性を最適化するよう設計された要素もまた定義されている。薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に関連付ける要素である生産物を発現する恒久的、安定的な細胞クローンの構築のための多くの優性薬物選択マーカーの使用条件も提供される。
【００４５】
本願を通じて、「発現構築物」という用語は、その核酸コード配列の一部またはすべてが転写され得るミオミキサーをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を含むことが意味されている。「ベクター」という用語は、それを複製させることができる細胞に導入するためにその中に核酸配列を挿入することができるキャリア核酸分子を表すために使用される。核酸配列は、それがそのベクターを導入する特定の細胞にとって外部物質であることまたはその配列が細胞内の配列と相同であるがその配列が通常見いだされる宿主細胞の核酸内の位置にないことを意味する、「外因性」であり得る。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）ならびに人工染色体（例えば、YAC）を含む。当業者は、両方とも参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al. (2001)およびAusubel et al. (1994)に記載される標準的な組み換え技術を通じてベクターを構築する技能を備えている。
【００４６】
「発現ベクター」という用語は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを表す。いくつかの例において、RNA分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の例において、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムを生成する上で、翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の転写および場合により翻訳に必要とされる核酸配列を表す様々な「制御配列」を含み得る。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も提供するおよび以下に記載される核酸配列も含み得る。
【００４７】
「プロモーター」は、転写の開始および率を制御する核酸配列の一領域である制御配列である。それは、調節タンパク質および分子、例えばRNAポリメラーゼおよび他の転写因子が結合し得る遺伝的要素を含み得る。「機能的に配置される」、「機能的に連結される」、「制御下にある」および「転写制御下にある」というフレーズは、プロモーターが、ある核酸配列に対して、その配列の転写開始および／または発現を制御する上で正しい機能的位置および／または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を表す「エンハンサー」とともに使用される場合とそうでない場合がある。
【００４８】
プロモーターは、そのコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することによって取得され得る、自然界である遺伝子または配列に付随するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、自然界である核酸配列に付随するものであり得る。あるいは、その自然環境において核酸配列に通常付随しないプロモーターを表す組み換えまたは異種プロモーターの制御下にそのコード核酸セグメントを配置することによって一定の利点が得られる。組み換えまたは異種エンハンサーもまた、その自然環境において核酸配列に通常付随しないエンハンサーを表す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに任意の他の原核生物、ウイルスまたは真核生物細胞から単離されるプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「自然界に存在しない」、すなわち異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を変化させる変異を含むプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列の合成による生産に加えて、配列は、本明細書に開示される組成物に関連して、組み換えクローニングおよび／またはPCR（商標）を含む核酸増幅技術を用いて生産され得る（各々参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,202号、同第5,928,906号を参照のこと）。さらに、非核オルガネラ、例えばミトコンドリア、クロロプラスト等内での配列の転写および／または発現を誘導する制御配列も使用され得ることが想定されている。
【００４９】
通常、発現のために選択された細胞型、オルガネラおよび生物においてDNAセグメントの発現を効率的に誘導するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要である。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用を理解している、例えば参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al. (2001)を参照のこと。使用されるプロモーターは、構成性、組織特異的、誘導性および／または適当な条件下で導入されたDNAセグメントの高レベル発現を誘導するのに有用であり得る、例えば組み換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産において有用である。プロモーターは、異種性または内因性であり得る。
【００５０】
組織特異的プロモーターまたは要素の特定およびそれらの活性を特徴づけるためのアッセイは、当業者に周知である。そのような領域の例は、ヒトLIMK2遺伝子（Nomoto et al. 1999）、ソマトスタチン受容体2遺伝子（Kraus et al., 1998）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Lareyre et al., 1999）、ヒトCD4（Zhao-Emonet et al., 1998）、マウスアルファ2（XI）、コラーゲン（Tsumaki, et al., 1998）、D1Aドパミン受容体遺伝子（Lee, et al. 1997）、インスリン様成長因子II（Wu et al., 1997）、ヒト血小板内皮細胞接着分子-1（Almendro et al., 1996）を含む。
【００５１】
特異的開始シグナルもまた、コード配列の効率的翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供される必要があり得る。当業者は、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができる。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするよう所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことが周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成性のいずれかであり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサー要素を含めることによって強化され得る。
【００５２】
本開示の特定の態様において、内部リボソーム侵入部位（IRES）要素の使用は、多遺伝子または多シストロン性のメッセージを生成するために使用される。IRES要素は、5’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャンモデルを迂回し、内部位置で翻訳を開始することができる（Pelletier and Sonenberg, 1988）。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のIRES要素（Pelletier and Sonenberg, 1998）ならびに哺乳動物メッセージ由来のIRES（Macejak and Sarnow, 1991）が記載されている。IRES要素は、異種オープンリーティングフレームに連結され得る。各々IRESによって隔てられた、複数のオープンリーティングフレームが同時に転写され、多シストロン性メッセージを生成し得る。IRES要素により、各オープンリーティングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能となる。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するよう単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現され得る（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号を参照のこと）。
【００５３】
ベクターは、複数の制限酵素部位を含み、そのいずれもがベクターを消化するために標準的な組み換え技術と共に使用され得る核酸領域であるマルチクローニング部位（MCS）を含み得る。参照により本明細書に組み入れられるCarbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998およびCocea, 1997を参照のこと。「制限酵素消化」は、核酸分子内の特定の部位のみで機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を表す。これらの制限酵素の多くは、市販されている。そのような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性配列をベクターにライゲートできるよう、MCS内で切断する制限酵素を用いて直鎖化または断片化される。「ライゲーション」は、互いに対して連続的である場合も連続的でない場合もある2つの核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを表す。制限酵素およびライゲーション反応に関連する技術は、組み換え技術分野の当業者に周知である。
【００５４】
大部分の転写される真核生物RNA分子は、RNAスプライシングを受け、その主たる転写物からイントロンを取り除く。ゲノム真核生物配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適当なプロセシングを確実にするために、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（参照により本明細書に組み入れられる、Chandler et al., 1997を参照のこと）。
【００５５】
本開示のベクターまたは構築物は、通常、少なくとも1つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写の個別終結に関与するDNA配列から構成される。したがって、特定の態様において、RNA転写物の生産を終了させる終結シグナルが想定される。ターミネーターは、インビボで、所望のメッセージレベルを達成するために必要となり得る。
【００５６】
真核生物系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出させる新規転写物の部位特異的切断を可能にする特定のDNA配列を含み得る。これは、約200個のA残基のストレッチ（ポリA)を転写物の3’末端に付加するよう特異的な内因性ポリメラーゼに指示する。このポリA尾部で修飾されたRNA分子は、より安定であり、より効率的に翻訳されるようである。したがって、真核生物に関する他の態様において、ターミネーターはRNAの切断のためのシグナルを含むのが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位要素は、メッセージレベルを向上させるおよび／またはそのカセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるよう機能し得る。
【００５７】
本開示において使用されることが想定されているターミネーターは、例えば、遺伝子の終結配列、例えばウシ成長ホルモンターミネーターまたはウイルス終結配列、例えばSV40ターミネーターを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されるまたは当業者に公知の任意の公知の転写ターミネーターを含む。特定の態様において、終結シグナルは、例えば配列短縮化による、転写可能または翻訳可能な配列の欠如であり得る。
【００５８】
発現、特に真核生物発現においては、典型的に、転写物の適当なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルが含められる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本開示の実施の成功に重要であるとは考えられておらず、および／または任意のそのような配列が使用され得る。好ましい態様は、便利でありかつ／または様々な標的細胞において十分に機能することが公知であるSV40ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を向上させ得るまたは細胞質輸送を促進し得る。
【００５９】
宿主細胞内でベクターを増幅するために、それは、複製を開始させる特別な核酸配列である1つまたは複数の複製起点（しばしば、「ori」と称される）を含み得る。あるいは、宿主細胞が酵母の場合、自律複製配列（ARS）が使用され得る。
【００６０】
本開示の特定の態様において、本開示の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。そのようなマーカーは、その発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞に付与する。通常、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、負選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
【００６１】
通常、薬物選択マーカーの導入が、形質転換体のクローニングおよび同定を補助する、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件付与に基づき形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、スクリーン可能なマーカー、例えばその基礎が比色分析であるGFPを含む他のタイプのマーカーも想定されている。あるいは、スクリーン可能な酵素、例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）が利用され得る。当業者はまた、FACS分析と共に用いられる場合がある免疫学的マーカーの利用方法を熟知している。使用されるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要とは考えられていない。選択およびスクリーン可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００６２】
IV. 筋肉疾患
本開示は特に、筋肉障害の分析および処置との関連性が見いだされる。特に、筋細胞が正常な機能に必要とされる十分な（または任意の）遺伝子産物を生成できないまたは異常なタンパク質が生成される筋肉障害において、遺伝子またはタンパク質を送達するための体細胞融合の使用が特に望ましい。
【００６３】
以下は、本開示にしたがい対処され得る様々の障害の一般的議論である。
【００６４】
A. 筋ジストロフィー
筋ジストロフィー（MD）は、筋骨格系が弱体化し、運動が妨げられる筋肉疾患のグループである。筋ジストロフィーは、進行性の骨格筋衰弱、筋タンパク質における欠陥ならびに筋細胞および組織の死により特徴づけられる。
【００６５】
1860年代に、成長とともに徐々に衰弱し、歩行能力を失い、若年で死亡した少年の報告が、医学文献で注目された。その後の10年で、フランス人神経学者Guillaume Duchenneは、この疾患の最も一般的かつ重篤な形態、現在では彼の名前であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーという名前を持っている、を有する13名の少年を総合的に調査した。
【００６６】
すぐに、この疾患に2つ以上の形態があることが明らかにされた。他の主要な形態は、ベッカー型、肢帯型、先天型、顔面肩甲上腕型、筋緊張型、眼咽頭型、遠位型およびエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーである。これらの疾患は、主に男性に影響するが、女性はこの疾患遺伝子のキャリアとなり得る。ほとんどのタイプのMDは、心臓、胃腸系、神経系、内分泌腺、眼および脳を含む身体系で発病する多系統障害である。
【００６７】
上段落で列挙されている9つの主要なタイプの筋ジストロフィーとは別に、様々なMD様状態も同定されている。他の形態のMDおよびMD様状態を有する個体においては、正常な知的、行動、腸および性機能が確認される。知能障害を引き起こす可能性があるMDに罹患した個体は、能力障害に関連する問題を通じてではなく、分子的特徴を通じて診断される。しかし、DMDの影響を強く受けた患者の3分の1は、認識障害、行動、視力および発話の問題を有し得る。
【００６８】
これらの状態は、一般的に遺伝性であり、異なる筋ジストロフィーは様々な遺伝パターンで起こる。しかし、（遺伝歴のない）出生前段階でのジストロフィン遺伝子の変異および栄養不良もまた、DMDに侵された人々の約33％で起こり得る。デュシェンヌ型およびベッカー型の筋ジストロフィーの主な原因は、機能性タンパク質ジストロフィンおよびジストロフィン関連タンパク質複合体を適切に生成する筋肉組織の細胞骨格損傷である。
【００６９】
ジストロフィンタンパク質は、筋線維膜において見いだされ、そのらせん形の性質ゆえに、バネまたは衝撃吸収材のように振る舞うことができる。ジストロフィンは、アクチン（細胞骨格）と筋鞘として知られている筋細胞の細胞膜のジストログリカン（細胞外）を連結する。機械的安定性に加えて、ジストロフィンはまた、カルシウムレベルを調節する。
【００７０】
筋ジストロフィーの診断は、筋生検の結果、クレアチンホスホキナーゼ（CpK3）の増加、筋電図検査、心電図検査およびDNA分析に基づく。
【００７１】
身体試験および患者の病歴は、医師が筋ジストロフィーのタイプを決定する助けとなる。異なるタイプの筋ジストロフィーによって個別の筋肉群が影響を受ける。
【００７２】
しばしば、筋肉量が減少する（消耗）が、これは、一部のタイプの筋ジストロフィーが筋肉をより大きく見せるよう脂肪および結合組織を集合させることから、確認するのが困難であり得る。これは、仮性肥大と呼ばれる。
【００７３】
筋ジストロフィーの治療法は知られていないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって大きな前進がみられる。理学療法、作業療法、装具装着（例えば、短下肢装具）、言語療法ならびに整形外科器具（例えば、車椅子およびスタンディングフレーム）が助けとなり得る。不活動（例えば、床上安静、長時間の着座）および筋原線維肥大を増進するボディビルディングの取り組みは、この疾患を悪化させる。
【００７４】
いずれの形態の筋ジストロフィーに対しても特別な処置は存在しない。理学療法、有酸素運動、低強度タンパク同化ステロイド、プレドニゾン補給は、拘縮を防ぎ、筋肉の張りを維持するのを助け得る。いくつかの例において、生活品質を改善するために、整形器具（補助的に使用される矯正装具）および矯正装具術が必要とされ得る。エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーおよび筋緊張型筋ジストロフィーにおいて起こる心臓の問題は、ペースメーカーを必要とし得る。筋緊張型筋ジストロフィーにおいて起こる筋緊張症（強い収縮後の筋肉の弛緩の遅れ）は、キニン、フェニトインまたはメキシレチン等の医薬を用いて処置され得るが、現実的な長期間処置は見いだされていない。
【００７５】
作業療法は、MDを有する個人が可能な範囲で最も独立したレベルで彼／彼女らの日常生活（自己摂食、セルフケア活動等）の活動およびレジャー活動を送るのを支援する。これは、補装具の使用または省エネルギー技術の使用によって達成され得る。作業療法は、その個人の機能およびアクセシビリティを向上させるよう家庭および職場の両方で個人の環境に変化を与え得る。作業療法はまた、MDに付随し得る心理社会的変化および認知低下に対処し、その家族および個人に対して支援およびその疾患についての教育を提供する。
【００７６】
赤身肉、水産物、豆類、オリーブ油、抗酸化物質、例えば葉菜およびピーマン、ならびにブルーベリー、チェリー等の果物の食事摂取を増やすことが助言される。あらゆる食物アレルギーでチェックされるように、加工食品、トランス脂肪ならびにカフェイン含有およびアルコール含有飲料の摂取を減らすことも助言される。
【００７７】
診断、神経学、GI栄養価、呼吸ケア、心臓ケア、整形外科、心理社会学、リハビリテーションおよび口腔ケアが、すべて患者の生涯を通じて、疾患管理の不可欠部分を形成する。
【００７８】
筋ジストロフィーを有する人々の予後は、その障害のタイプおよび進行度によって異なる。いくつかの症例は穏やかであり、正常な生存期間にわたって非常にゆっくりと進行し得るが、他は重度の筋衰弱、機能不能および歩行能力喪失をもたらす。筋ジストロフィーを有する一部の子供は、幼少期に死亡するが、他は中等度の能力障害のみで成人する。影響を受ける筋肉は様々であるが、骨盤、肩、顔面の周囲またはその他の領域であり得る。筋ジストロフィーは、大人に影響し得るが、より重度の形態は、幼少期に発生する傾向がある。
【００７９】
B. 筋萎縮性側索硬化症
ルー・ゲーリック病と呼ばれることもある筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、いつの時点でも20,000人もの米国人に影響を及ぼしており、毎年米国において5,000件の新しい症例が診断されている。ALSは、すべての人種的および民族的背景の人々に影響する。男性は、この疾患を診断される可能性が女性よりも約1.5倍高い。ALSは、人生の最盛期に発症し、40歳〜70歳の間に診断されることが最も一般的である。しかし、それよりも若年および老年で診断される可能性もある。ALS症例の約90〜95％は、無作為に発症し、このことは、個体がこの疾患の家族歴を有さないこと、および他の家族構成員がこの疾患を発症する危険が高いわけではないことを意味する。ALS症例の約5〜10％において、この疾患の家族歴が確認される。
【００８０】
ALSは、随意筋を制御するニューロンを攻撃する進行性の神経学的疾患である。ALSにおいて失われる運動ニューロンは、脳、脳幹および脊髄内に存在する専門化された神経細胞である。これらのニューロンは、身体において神経系から筋肉への連結部として機能し、それらの機能は、正常な筋肉の動きに必要とされる。ALSは、脳および脊髄の両方の運動ニューロンを変性させ、それによって体内の筋肉へのメッセージを開始および送信する能力を失わせる。筋肉が機能しなくなると、それらは徐々に萎縮および収縮する。ALSは、非常に小さな症状、例えば影響を受けた筋肉の衰弱から始まり得る。この衰弱が最初に見られる場所は人によって異なるが、衰弱および萎縮は、疾患の進行とともに、身体の他の部分に拡大する。
【００８１】
初期症状は、一方の足または腕にのみ影響し得、それが歩行または走行時のぎこちなさおよびよろめきの原因となる。対象はまた、物体を持ち上げる困難さまたは手先の器用さを必要とする作業における困難さに苦しみ得る。最終的に、個体は、起立または歩行または日常生活の活動を行う上での手および腕の使用が不可能になるであろう。この疾患の後期段階において、隔膜および胸部の筋肉が衰弱しすぎると、患者は、呼吸のために人工呼吸器が必要となる。ALSを有する大部分の人は、通常診断を受けてから3〜5年後に呼吸不全により死亡するが、一部は診断後10年またはそれ以上生存する。
【００８２】
おそらく、ALSの最も悲劇的なアイロニーは、それが人の精神を害さず、運動ニューロンにのみ影響を及ぼすことである。性格、知性、記憶および自覚性は影響を受けず、視覚、嗅覚、触覚、聴覚および味覚も同様である。しかし、同時に、ALSは、大きな声で明瞭に発話する個人の能力を大きく損なわせ、最終的に発話および発声を完全に妨げる。初期の発話関連症状は、鼻声の発話品質、単語の発音の困難さ、および会話の困難さを含む。呼吸するための筋肉が衰弱すると、患者は、理解されるのに十分大声で発話するのが困難になり、最終的に、広範囲の筋ジストロフィーは、発話能力を完全に失わせる。患者はまた、咀嚼および嚥下の困難さを経験し、これは栄養管が必要となる時点まで時間と共に悪化する。
【００８３】
C. ポンペ病
II型糖原病（ポンペ病または酸性マルターゼ欠損症とも呼ばれる）は、体全体の筋肉および神経細胞に損傷を与える常染色体劣性代謝障害である。それは、リソソーム酸性アルファ-グルコシダーゼ酵素の欠損に起因するリソソームにおけるグリコーゲンの蓄積によって引き起こされる。それは、リソソーム代謝の欠陥を伴う唯一の糖原病であり、1932年にドイツ人病理学者J.C.Pompeによって同定された最初の糖原病である。グリコーゲンの蓄積は、全身で進行性筋衰弱（ミオパシー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系における様々な身体組織に影響する。
【００８４】
例外はあるが、アルファ-グルコシダーゼのレベルは、個体が有し得るGSD IIのタイプを決定する。個体の筋肉により多くのアルファグルコシダーゼが存在することは、症状が生涯の後半に発生し、よりゆっくりと進行することを意味する。GSD IIは、広義には、症状が発生する年齢に基づき2つの発病形態に分類される。幼児発病形態は通常、4〜8ヶ月で診断され、筋肉は正常なように見えるが、彼らが自身の頭を持ち上げられないまたは回転させられないほど軟弱であり脆弱である。この疾患が進行すると、心筋が厚くなり、次第に機能しなくなる。処置をしないと、通常、心不全および呼吸低下により死亡する。後期発症形態は、1〜2歳以降に発病し、幼児発症形態よりもゆっくりと進行する。最初の症状の1つは、足から始まり胴および腕のより小さな筋肉、例えば隔膜および呼吸に必要とされる他の筋肉に移行する筋力の漸減である。呼吸不全が、最も多い死因である。心筋の肥大化および調律異常は、主な特徴ではないが、いくつかの症例で発生する。
【００８５】
幼児形態は通常、生涯の最初の数ヶ月以内に医学的注意を引くことになる。通常見られる特徴は、心肥大（92％）、緊張低下（88％）、心筋症（88％）、呼吸困難（78％）、筋衰弱（63％）、摂食困難（57％）および成長障害（53％）である。主な臨床所見は、フロッピーベビーの外見、運動能力のマイルストーンの遅れおよび摂食困難を含む。中等度の肝腫大が存在する場合がある。顔面の特徴は、巨舌、開いた口、大きく見開いた眼、（呼吸困難に起因する）鼻孔の開きおよび乏しい顔面の筋緊張を含む。心肺への影響は、呼吸速度の上昇、呼吸の際の副筋の使用、反復性の胸部感染症、（心肥大に起因する）左下領域における空気流入減少、不整脈および心不全の兆候により認められる。未処置症例における死亡年齢の中央値は、8.7ヶ月であり、通常、心肺不全が原因である。
【００８６】
この形態は、主として心臓への影響の相対的欠如の点で幼児形態と相違する。その発症は、より潜行性であり、よりゆるやかに進行する。心臓への影響が見られることもあるが、幼児形態よりも軽度である。骨格への影響がより大きく、下肢に偏向する。後期発症の特徴は、咳の障害、反復性の胸部感染症、緊張低下、進行性の筋衰弱、運動能力のマイルストーンの遅れ、嚥下または咀嚼の困難および肺活量低下を含む。予後は症状の発症年齢に依存し、より良い予後はより後期に発症する疾患に関連する。
【００８７】
診断手法は、胸部X線、心電図検査および心エコー検査を含む。典型的所見は、非特異的伝導障害を示す肥大した心蔵のそれらである。生化学的調査は、血清クレアチンキナーゼ（典型的に10倍増加）ならびに血清アルドラーゼ、アスパルテートトランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの低評価を含む。診断は、皮膚生検（線維芽細胞）、筋生検（筋細胞）または白血球細胞のいずれかにおいて酸性アルファグルコシダーゼ活性を概算することによって行われる。サンプルの選択は、その診断研究所で利用可能な設備に依存する。その後期発症形態において、調査に対する所見は、幼児形態のそれらと同様であるが、クレアチニンキナーゼがいくつかの症例において正常であり得ることが警告される。診断は、適当なサンプルにおける酵素活性の概算による。
【００８８】
この疾患は、第17染色体の長腕上、17q25.2〜q25.3（塩基対75,689,876〜75,708,272）の遺伝子（酸性アルファ-グルコシダーゼ：酸性マルターゼとしても公知）における変異によって引き起こされる。報告されている変異の数は、現時点（2010年）で289個であり、その67個は非病原性変異であり、197個は病原性変異である。残りは、疾患との関連性について今も評価中である。その遺伝子は、およそ20kbにまたがり、20個のエクソンを含み、その最初のエクソンは非コード性である。推定触媒部位ドメインのコード配列は、その中央で、101 bpのイントロンによって隔てられている。プロモーターは、「ハウスキーピング」遺伝子に特徴的な特徴を有する。そのGC含量は、高く（80％）、明白なTATAおよびCCAATモチーフを欠いている。
【００８９】
ほとんどの症例は、3つの変異に起因するようである。トランスバージョン（T→G）変異が、この障害を有する成人の間で最も多い。この変異は、RNAスプライシングの部位を妨げる。その遺伝子は、リソソームヒドロラーゼであるタンパク質 - 酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする。このタンパク質は、通常、グリコーゲン、マルトースおよびイソマルトースのアルファ-1,4およびアルファ-1,6結合を分解し、細胞のグリコーゲンの1〜3％の分解に必要とされる酵素である。この酵素の欠損は、影響を受けた個体のリソソームおよび細胞質における構造的に正常なグリコーゲンの蓄積をもたらす。リソソームにおける過剰なグリコーゲン貯蔵は、他のオルガネラの正常な機能を妨害し、細胞損傷を引き起こし得る。
【００９０】
心臓および呼吸器の合併症は、症候的に処置される。理学療法および作業療法が、一部の患者に対して有益であり得る。食事の変更は、一時的な改善を提供し得るが、この疾患の進行を変化させないであろう。遺伝的カウンセリングは、将来の妊娠におけるリスクに関する情報を家族に提供し得る。
【００９１】
2006年4月28日、米国食品医薬品局は、デューク大学研究者のチームによって開発されたポンペ病患者に対する最初の処置であるMyozyme（アルグルコシダーゼアルファ、rhGAA）に関する生物学的製剤承認申請（BLA）を認可した。これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞において生成された生物学的に活性な組み換えヒトアルグルコシダーゼアルファを用いる酵素置換療法に基づくものであった。Myozymeは、FDAオーファンドラッグ指定に分類され、優先審査の下で承認された。FDAは、Myozymeを、その溶液の静脈内輸注による投与について承認した。Myozymeの安全性および有効性は、最初の輸注時点で1ヶ月〜3.5歳の年齢の範囲のポンペ病を有する39名の幼児発症患者における2つの別々の臨床試験において評価された。Myozyme処置は、人工呼吸器なしでの生存率および全体生存率を明らかに延長する。早期の診断および早期の治療は、より良い結果をもたらす。処置は、発熱、潮紅、発疹、心拍数増加およびショックさえも含む副作用を伴わない場合はないが、これらの状態は通常、管理可能である。
【００９２】
この疾患に対する新しい治療選択肢は、Lumizymeと呼ばれる。LumizymeおよびMyozymeは、同じジェネリック成分（アルグルコシダーゼアルファ）および製造者（Genzyme Corporation）を有する。これら2つの製品の違いは、製造プロセスにある。現在、Myozymeは160Lバイオリアクターを用いて製造され、Lumizymeは4000Lバイオリアクターを使用する。製造プロセスの相違から、FDAは、2つの製品が生物学的に相違すると宣言している。さらに、Lumizymeは、8歳以上の患者における心肥大の証拠を有さない後期発症（非幼児）型ポンペ病に対する置換療法としてFDA承認されている。Myozymeは、幼児発症型ポンペ病の置換療法としてFDA承認されている。ポンペ病を有する個体の予後は、症状の発症および重篤度によって異なる。処置を行わなければ、この疾患は幼児および小児で特に致死的となる。
【００９３】
グルコースの分解を補助するMyozyme（アルグルコシダーゼアルファ）は、組み換え形態のヒト酵素酸性アルファ-グルコシダーゼであり、現在は、失われた酵素を置換するためにも使用されている。現時点で酵素置換療法（ERT）で処置されたポンペ病患者の最大コホートが参加した研究において、知見は、Myozyme処置が、未処置の過去の対照集団と比較して幼児発症型ポンペ病患者の人工呼吸器なしでの生存率および全体生存率を明確に延長することを示した。さらに、この研究は、新生児検診によって促進され得る6ヶ月齢より前のERTの開始が、この大きな被害をもたらす障害に関連する死亡率および能力障害を減少させる大きな可能性を示すことを実証している。台湾および米国のいくつかの州は、新生児検診を開始し、早期診断および早期治療開始の下でのそのような計画の結果がこの疾患の結末を劇的に改善し、これらの新生児の多くは正常な運動発達のマイルストーンを達成した。
【００９４】
処置応答に影響する別の要因は、特に酸性アルファ-グルコシダーゼを完全に欠損しているポンペ病幼児において重篤である、輸注される酵素に対する抗体の生成である。これらの抗体を除去する免疫寛容療法は、処置結果を改善した。
【００９５】
後期発症処置研究（LOTS）は、2010年に公開された。この研究は、若年および成人ポンペ病患者におけるaグルコシダーゼアルファ（aglucosidase alfa）の安全性および有効性を評価するために行われた。LOTSは、米国および欧州の8箇所の主要拠点において90名の患者を参加させた無作為化、二重盲検、プラセボ対照研究であった。参加者は、aグルコシダーゼアルファまたはプラセボのいずれかを18ヶ月の間2週に一回投与された。研究参加者の平均年齢は、44歳であった。その結果は、78週で、aグルコシダーゼアルファで処置された患者が、彼らの6分間歩行距離を、3メートル減少させたプラセボ群と比較して、平均でおよそ25メートル増加させたことを示した（P=0.03）。プラセボ群は、基準値からの改善を示さなかった。両グループにおける平均基準6分間歩行距離は、およそ325メートルであった。aグルコシダーゼアルファで処置された患者群におけるパーセント推定強制肺活量は、78週で1.2パーセント増加した。これに対して、それは、プラセボ群においておよそ2.2パーセント減少した（P=0.006）。
【００９６】
D. 横紋筋肉腫
一般的にはRMSと称される横紋筋肉腫は、癌細胞が骨格筋前駆体から発生すると考えられている癌、特に肉腫（結合組織の癌）の一タイプである。それはまた、筋組織に付着した状態、腸に巻き付いた状態、または任意の解剖学的位置で見いだされ得る。大部分は、本来的に骨格筋を欠く領域、例えば頭部、頸部および尿生殖路において起こる。
【００９７】
その2つの最も多い形態は、胎児性横紋筋肉腫および胞巣状横紋筋肉腫である、年少児に多い前者において、癌細胞は、典型的な6〜8週の胚のそれらに似ている。年長児および10代の若者に多い後者において、それらは、典型的な10〜12週の胚のそれらに似ている。
【００９８】
横紋筋肉腫は、比較的稀な形態の癌である。それは、1〜5歳の子供に最も多く、15〜19歳の10代の若者でも見られるが、これはより稀である。この癌はまた、成人の癌でもあるが、それは稀である。St. Jude Children's Research Hospitalは、横紋筋肉腫が、子供で最も多い軟組織肉腫であると報告している。軟組織肉腫は、子供の癌の約3％を占める。
【００９９】
横紋筋肉腫の診断は、病理学者によって行われ、彼または彼女は、顕微鏡下で腫瘍の生検を試験し、その腫瘍細胞の形態（外観）および免疫組織化学染色の結果に基づき横紋筋肉腫の診断に至るであろう。横紋筋肉腫の診断は、骨格筋細胞への分化の認定に依存する。タンパク質myoD1およびミオゲニンは、通常、発生段階の骨格筋細胞において見いだされる転写因子タンパク質であり、これは筋肉が成熟し神経支配がなされた後に消失する。したがって、myoD1およびミオゲニンは、通常、正常な骨格筋において見いだされず、横紋筋肉腫の有用な免疫組織化学マーカーとして機能する。初期の兆候は、ステロイド処置に非応答性の偽腫瘍として誤診断され得る。
【０１００】
ヒアリン化線維中隔によって隔てられた腫瘍細胞の結節を示す顕微鏡写真（50x、HE染色）。挿入図：多染色体の核および不十分な細胞質を有する非粘着性大型腫瘍細胞（200x、HE染色）。診断は、耳介後部先天性胞巣状横紋筋肉腫であった。横紋筋肉腫の様々な異なる組織学的サブタイプが存在し、その各々が異なる臨床的および病理学的特徴を有している。この腫瘍の予後および臨床的挙動もまた、部分的に組織学的サブタイプに依存する。これらの腫瘍をサブクラス分類するために複数の分類体系が提案されている。最新の分類体系である「横紋筋肉腫の国際分類」は、Intergroup Rhabdomyosarcoma Studyによって作成された。この分類系は、以前の体系の要素を組み合わせ、これらを腫瘍タイプに基づく予後に関連付ける試みをしている。
【０１０１】
国際分類スキームに適合しない横紋筋肉腫のいくつかのさらなるサブタイプが存在する。多形性横紋筋肉腫は通常、子供よりも成人で発生し、したがって、この分類系に含まれない。硬化性横紋筋肉腫は、Folpeらによって最近特徴づけられた稀な横紋筋肉腫サブタイプであり、それはこの分類系に含まれない。ブドウ状および紡錘細胞横紋筋肉腫は、古典的には、胎児性横紋筋肉腫のサブタイプとみなされていたが、それらは、古典的な胎児性横紋筋肉腫よりも良好な臨床挙動および予後を有する。
【０１０２】
横紋筋肉腫に対する処置は、化学療法、放射線療法およびときに手術からなる。腫瘍を取り除く手術は、腫瘍の位置によっては困難または不可能な場合がある。転移の証拠がない場合、化学療法および放射線と組み合わせた手術が、最良の予後を提供する。その腫瘍が転移していない患者は通常、腫瘍のサブタイプによっては長期生存の可能性が高い。St Jude's Children's Research Hospitalは、限局性横紋筋肉腫と診断された子供の70％超が長期生存することを報告している。
【０１０３】
E. サルコペニア
サルコペニア（「肉付きの不足（poverty of flesh）」を意味するギリシャ語由来）は、加齢に伴う骨格筋量（25歳以降毎年0.5〜1％の喪失）、質および強度の退行性喪失である。サルコペニアは、フレイル症候群の一要素である。2009年の時点で、医学文献において一般的に受け入れられているサルコペニアの定義はなかった。
【０１０４】
サルコペニアは、最初に、筋線維と脂肪の置き換わり等の要因により引き起こされる筋組織の「質」の低下、線維症の増加、筋代謝の変化、酸化ストレスおよび神経筋接合部の変性を伴う筋萎縮（筋肉のサイズの減少）によって特徴づけられる。これらの変化が合わさって、筋肉の機能の漸進的喪失およびフレイルティが引き起こされる。
【０１０５】
現在、運動不足は、サルコペニアの大きな危険因子であると考えられている。筋肉だけでなく筋肉、神経筋応答、内分泌機能、毛細血管アクセス（vasocapillary access）、腱、間接、靭帯および骨の筋骨格系全体が、完全性を維持するために、定期的かつ一生涯にわたる運動に依存している。運動および活動の増加は、高齢者においてさえも、サルコペニアの状況に有益であることが示されている。しかし、高度に訓練されたアスリートでさえも、サルコペニアの影響を経験する。成人期を通してトレーニングおよび競技を継続するマスタークラスのアスリートでさえも、筋肉量および強度の漸進的喪失を示し、30歳以降、スピードおよび強度イベントにおける記録が徐々に下降する。
【０１０６】
簡単な周囲測定は、個体が重度のサルコペニアを患っているかいないかを決定するのに十分なデータを提供しない。サルコペニアはまた、異なるタイプの筋線維の周囲部の減少によって特徴づけられる。骨格筋は、異なるミオシン変種の発現により特徴づけられる異なる線維タイプを有する。サルコペニアの間に、「2型」線維周縁（II型）は減少するが、「I型」線維周縁（I型）はほとんど〜全く減少せず、神経支配された2型線維は、しばしば、遅筋1型線維運動神経による再神経支配によって1型線維に変換される。
【０１０７】
衛星細胞は、筋線維に隣接する小さな単核細胞である。衛星細胞は通常、損傷または運動によって活性化される。これらの細胞は、その後分化し、筋線維に融合し、その機能の維持を助ける。1つの学説は、サルコペニアが一部、衛星細胞の活性化の不良によって引き起こされるというものである。したがって、損傷した筋肉を修復するまたは栄養シグナルに応答する能力が損なわれる。
【０１０８】
極端な筋肉の喪失は、多くの場合、同化シグナル、例えば成長ホルモンおよびテストステロンの減少ならびに異化シグナル、例えば炎症促進性サイトカインの促進の両方の結果である。
【０１０９】
工業化された集団の肉体的活動の減少および寿命の増加により、サルコペニアは、大きな健康問題となっている。サルコペニアは、高齢者が独立して生活する能力を失い得る程度まで進行し得る。さらに、サルコペニアは、集団ベースの研究における能力障害の重要な独立予測因子であり、乏しい平衡感覚、歩行速度、転落および骨折に関連付けられる。サルコペニアは、これも不活動により引き起こされ、運動により緩和される、骨の喪失である、骨粗鬆症の筋肉版と考えることもできる。骨粗鬆症とサルコペニアの組み合わせは、高齢集団においてしばしば見られる有意なフレイルティを引き起こす。
【０１１０】
運動は、サルコペニアの処置における大きな関心対象とみなされている。短期間の抵抗運動に応答して骨格筋のタンパク質合成能力（ability）および能力（capacity）が上昇することを示す報告がいくつか存在する。また、運動は、高齢対象において身体的能力（強度および可動性）を改善し得ることも報告されている。しかし、長期的な観点でそのような知見を示す調査は不十分である。
【０１１１】
現在、サルコペニアの処置に関して承認されている薬剤はない。可能性のある治療戦略は、テストステロンまたは同化ステロイドの使用を含むが、これらの薬剤の長期的使用は、男性において前立腺症状の懸念があるため意見の分かれるところであり、そして女性においては男性化の懸念があるため本質的に禁忌となっている。最近の実験結果は、テストステロン処置が有害な心血管現象を誘導し得ることを示した。DHEAおよびヒト成長ホルモン等の薬剤を含む他の承認されている医薬は、この状況下でほとんどまたは全く効果を有さないことが示されている。選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（SARM）を含む臨床開発中の新しい治療法は、最近の結果によって証明されるように、この分野において大きな可能性を示している。非ステロイド性のSARMは、それらが筋肉に対するテストステロンの同化作用の間で大きな選択性を示すが、見かけ上、アンドロゲン作用、例えば男性における前立腺刺激または女性における男性化をほとんどまたは全く示さないことから、特に関心対象となっている。
【０１１２】
V. 遺伝子移入
本開示にしたがい、非筋細胞は、ミオミキサー遺伝子および任意でミオメーカー遺伝子ならびに／または関心対象のさらなる遺伝子、例えば治療遺伝子の遺伝子移入に供される。遺伝子移入法は、一般に、ウイルスおよび非ウイルスの2つの一般カテゴリーに分類される。これらの方法の適性は、対象物の個別の制約、例えば移入される遺伝子のサイズおよび構造、ならびに遺伝物質を送達する細胞のタイプによって決定される。当業者は、一般的に使用されており、その多くは市販されている多数の異なるシステムから適当な選択を行うことができる。以下は、両タイプの方法の一般的議論である。
【０１１３】
A. ウイルス形質転換
細胞に効率的に感染または侵入し、ウイルス遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込み安定的に発現させる特定のウイルスベクターの能力は、多くの異なるウイルスベクターシステムの開発および応用を実現した（Robbins et al., 1998）。ウイルスシステムは、現在、エクスビボおよびインビボでの遺伝子移入のためのベクターとして使用するために開発されている。例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、現在、癌、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、腎臓病および関節炎等の疾患の処置について評価されている（Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998; 米国特許第5,670,488号）。以下に記載される様々なウイルスベクターは、具体的な遺伝子療法適用ごとに、個別の利点および不利点を示す。
【０１１４】
アデノウイルスベクター。アデノウイルスは、30〜35 kbの範囲のサイズのゲノムを含む、直鎖状の二本鎖DNAを含む（Reddy et al., 1998; Morrison et al., 1997; Chillon et al., 1999）。本開示にしたがうアデノウイルス発現ベクターは、遺伝子組み換え形態のアデノウイルスを含む。アデノウイルス遺伝子移入の利点は、非分裂細胞を含む幅広い細胞型に感染する能力、中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い感染性および高力価に成長する能力を含む（Wilson, 1996）。さらに、宿主細胞のアデノウイルス感染は、アデノウイルスDNAがエピソーム様式で複製することができるため、染色体に組み込まれず、他のウイルスベクターに付随する潜在的な遺伝毒性を示さない。アデノウイルスはまた、構造的に安定であり（Marienfeld et al., 1999）、大規模増幅後にもゲノム再配置が検出されなかった（Parks et al., 1997; Bett et al., 1993）。
【０１１５】
アデノウイルスゲノムの主な特徴は、初期領域（E1、E2、E3およびE4遺伝子）、中間領域（pIX遺伝子、Iva2遺伝子）、後期領域（L1、L2、L3、L4およびL5遺伝子）、主要後期プロモーター（MLP）、逆方向末端反復（ITR）およびΨ配列である（Zheng, et al., 1999; Robbins et al., 1998; Graham and Prevec, 1995）。初期遺伝子E1、E2、E3およびE4は、感染後にこのウイルスから発現され、ウイルス遺伝子発現、細胞遺伝子発現、ウイルス複製および細胞アポトーシス阻害を調節するポリペプチドをコードする。さらにウイルス感染時に、MLPが活性化され、アデノウイルスのカプシド形成に必要とされるポリペプチドをコードする後期（L)遺伝子が発現される。中間領域は、アデノウイルスカプシドの成分をコードする。アデノウイルスの逆方向末端反復（ITR；長さ100〜200 bp）は、シス要素であり、複製起点として機能し、ウイルスDNA複製に必要とされる。Ψ配列は、アデノウイルスゲノムのパッケージングに必要とされる。
【０１１６】
遺伝子移入ベクターとして使用するアデノウイルスを生成する一般的アプローチは、E2、E3およびE4プロモーターの誘導に関与するE1遺伝子の除去（E1-）である（Graham and Prevec, 1995）。その後、1つまたは複数の治療遺伝子がE1遺伝子の位置に組み換え挿入され得、治療遺伝子の発現は、E1プロモーターまたは異種プロモーターによって誘導される。E1-、非複製性ウイルスは、その後、イントランスでE1ポリペプチドを提供する「ヘルパー」細胞株（例えば、ヒト胚性腎細胞株293）内で増幅される。したがって、本開示において、E1コード配列が除去された位置に形質転換構築物を導入することが好都合であり得る。しかし、アデノウイルス内での構築物の挿入位置は、本開示において重要ではない。あるいは、E3領域、E4領域の位置またはその両方が除去され得、そこに真核生物細胞において機能的であるプロモーターの制御下にある異種核酸配列が遺伝子移入に使用するアデノウイルスゲノムに挿入される（各々個別に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,670,488号；米国特許第5,932,210号）。
【０１１７】
レトロウイルスベクター。本開示の特定の態様において、遺伝子送達のためのレトロウイルスの使用が想定されている。レトロウイルスは、RNAゲノムを含むRNAウイルスである。宿主細胞がレトロウイルスに感染すると、そのゲノムRNAがDNA中間体に逆転写され、これが感染した細胞の染色体DNAに組み込まれる。この組み込まれたDNA中間体は、プロウイルスと称される。レトロウイルスの具体的利点は、それらが、免疫原性ウイルスタンパク質を発現することなく、宿主DNAに組み込まれることによって、関心対象の遺伝子（例えば、治療遺伝子）を分裂細胞に安定的に感染させることができることである。理論上、組み込まれたレトロウイルスベクターは、感染した宿主細胞の生涯にわたって維持され、関心対象の遺伝子を発現する。
【０１１８】
レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスDNAは、3つの遺伝子：gag、polおよびenvを有し、これらに2つの長末端反復（LTR）配列が隣接している。gag遺伝子は、内部構造（マトリクス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；pol遺伝子は、RNA依存性DNAポリメラーゼ（リバーストランスクリプターゼ）をコードし、env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。5'および3'LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進するよう機能する。LTRは、ウイルス複製に必要とされるすべての他のシス作用性配列を含む。
【０１１９】
本開示の組み換えレトロウイルスは、ネイティブウイルスの構造的、感染性遺伝子の一部が除去され、それが標的細胞に送達したい核酸配列で置換されるように遺伝的に修飾され得る（各々参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,858,744号；米国特許第5,739,018号）。ウイルスによる細胞の感染後、ウイルスはその核酸を細胞内に注入し、レトロウイルスの遺伝物質が宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。移入されたレトロウイルスの遺伝物質は、その後、宿主細胞内で転写されタンパク質に翻訳される。他のウイルスベクターシステムと同様、ベクター生成時または治療時の複製可能レトロウイルスの生成が、主な懸案事項である。本開示における使用に適したレトロウイルスベクターは、通常、標的細胞に感染し、それらのRNAゲノムを逆転写し、逆転写されたDNAを標的細胞のゲノムに組み込むことができるが、その標的細胞内で感染性のレトロウイルス粒子を生成するよう複製することができない欠陥性レトロウイルスベクターである（例えば、標的細胞に移入されたレトロウイルスゲノムは、ビリオン構造タンパク質をコードする遺伝子であるgag、および／またはリバーストランスクリプターゼをコードする遺伝子であるpolに欠陥を有する）。したがって、プロウイルスの転写および感染性ウイルスの構築は、適当なヘルパーウイルスの存在下でまたは混入ヘルパーウイルスを同時生産せずにカプシド形成を可能にする適当な配列を含む細胞株内で行われる。
【０１２０】
ヘルペスウイルスベクター。I型およびII型単純ヘルペスウイルス（HSV)は、70〜80の遺伝子をコードする、およそ150 kbの二本鎖、直鎖状DNAゲノムを含む。野生型HSVは、溶解により細胞に感染することができ、特定の細胞型（例えば、ニューロン）において潜伏状態を確立することができる。アデノウイルスと同様、HSVもまた、筋肉（Yeung et al., 1999）、耳（Derby et al., 1999）、眼（Kaufman et al., 1999）、腫瘍（Yoon et al., 1999; Howard et al., 1999）、肺（Kohut et al., 1998）、神経（Garrido et al., 1999; Lachmann and Efstathiou, 1999）、肝臓（Miytake et al., 1999; Kooby et al., 1999）および膵島（Rabinovitch et al., 1999）を含む様々な細胞型に感染することができる。
【０１２１】
HSVウイルス遺伝子は、細胞のRNAポリメラーゼIIによって転写され、大まかに3つの区別可能なフェーズまたは速度論クラスで遺伝子産物が転写およびその後に合成されるよう時間的に調節される。これらの遺伝子のフェーズは、最初期（IE）またはアルファ遺伝子、初期（E)またはベータ遺伝子および後期（L)またはガンマ遺伝子と称される。ウイルスのゲノムが新たに感染した細胞の核に到達すると直ちに、IE遺伝子が転写される。これらの遺伝子の効率的発現は、事前のウイルスタンパク質の合成を必要としない。IE遺伝子の生産物は、転写を活性化させ、ウイルスゲノムの残りの部分を調節するために必要とされる。
【０１２２】
治療遺伝子送達において使用するために、HSVは、非複製性にされなければならない。非複製性HSVヘルパーウイルス非含有細胞株を生成するプロトコルは、報告されている（各々参照によりその全体が個別に本明細書に組み入れられる、米国特許第5,879,934号；米国特許第5,851,826号）。アルファ4またはVmw175としても公知である1つのIEタンパク質、感染細胞ポリペプチド4（Infected Cell Polypeptide 4; ICP4）は、ウイルスの感染およびIEからそれ以降の転写への移行の両方に必ず必要となる。したがって、その複合的、多機能的性質およびHSV遺伝子発現の調節における中心的役割から、ICP4は、典型的に、HSV遺伝子研究の標的となっている。
【０１２３】
ICP4を欠くHSVウイルスの表現型研究は、そのようなウイルスが遺伝子移入目的で潜在的に有用であることを示している（Krisky et al., 1998a）。それらを遺伝子移入に望ましいものにするICP4を欠失したウイルスの1つの特性は、それらが5つのその他のIE遺伝子：ICP0、ICP6、ICP27、ICP22およびICP47のみを発現し、ウイルスDNAの合成を誘導するタンパク質およびウイルスの構造タンパク質をコードするウイルスゲノムを発現しないことである（DeLuca et al., 1985）ことである。この特性は、遺伝子移入後の宿主細胞の代謝または免疫応答に対する可能性のある有害な影響を最小限に抑えるために望ましい。ICP4に加えて、IE遺伝子ICP22およびICP27をさらに欠失させることは、HSVの細胞毒性を実質的に改善減少させ、初期および後期ウイルスゲノム発現を防止する（Krisky et al., 1998b）。
【０１２４】
遺伝子移入におけるHSVの治療能は、様々なインビトロモデルシステムにおいておよびインビボで、パーキンソン病（Yamada et al., 1999）、網膜芽細胞腫（Hayashi et al., 1999）、大脳内および皮内腫瘍（Moriuchi et al., 1998）、B細胞悪性腫瘍（Suzuki et al., 1998）、卵巣癌（Wang et al., 1998）およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Huard et al., 1997）等の疾患に関して実証されている。
【０１２５】
アデノ随伴ウイルスベクター。パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（AAV）は、遺伝子送達療法のために徐々に使用されるようになっているヒトウイルスである。AAVは、他のウイルスシステムにおいては見いだされていない様々な有利な特徴を有する。第一に、AAVは、非分裂細胞を含む幅広い宿主細胞に感染することができる。第二に、AAVは、異なる種由来の細胞に感染することができる。第三に、AAVは、何らかのヒトまたは動物疾患に関連付けられておらず、組み込み後に宿主細胞の生物学的特性を変化させるようではない。例えば、ヒト集団の80〜85％は、AAVにさらされていると見積もられる。最後に、AAVは、幅広い物理的および化学的条件に適しており、そのため、それらは、生産、貯蔵および輸送要件に適合する。
【０１２６】
AAVゲノムは、4681ヌクレオチドを含む直鎖状、一本鎖のDNA分子である。AAVゲノムは、一般に、各末端におよそ145 bp長の逆方向末端反復（ITR)が隣接する内部非反復ゲノムを含む。ITRは、DNA複製起点を含む、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての、複数の機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、AAV複製（rep）およびカプシド（cap）遺伝子として公知の2つの大きなオープンリーディングフレームを含む。repおよびcap遺伝子は、ウイルスが複製することおよびウイルスゲノムをビリオンにパッケージすることを可能にするウイルスタンパク質をコードする。それらの見かけ上の分子量にしたがい命名された、Rep 78、Rep 68、Rep 52およびRep 40という少なくとも4つのウイルスタンパク質のファミリーが、AAV rep領域から発現される。AAV cap領域は、VP1、VP2およびVP3という少なくとも3つのタンパク質をコードする。
【０１２７】
AAVは、AAVビリオンを形成するためにヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニア）の同時感染を必要とするヘルパー依存性ウイルスである。ヘルパーウイルスの同時感染の非存在下で、AAVは、ウイルスゲノムを宿主細胞の染色体に挿入するが、感染性ビリオンは生産されない潜伏状態を確立する。その後のヘルパーウイルスによる感染は、組み込まれたゲノムを「救済」し、それが複製でき、そのゲノムを感染性AAVビリオンにパッケージできるようにする。AAVは異なる種由来の細胞に感染することができるが、ヘルパーウイルスは宿主細胞と同じ種のものでなければならない（例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスが同時感染したイヌ細胞内で複製するであろう）。
【０１２８】
AAVは、AAVゲノムの内部非反復部分を除去し、ITRの間に異種遺伝子を挿入することによって関心対象の遺伝子を送達するよう改変されている。異種遺伝子は、標的細胞において遺伝子発現を誘導することができる異種プロモーター（構成性、細胞特異的または誘導性）に機能的に連結され得る。異種遺伝子を含む感染性組み換えAAV（rAAV）を生産するために、適当なプロデューサー細胞株が、異種遺伝子を含むrAAVベクターでトランスフェクトされる。プロデューサー細胞は、同時に、それら各々の内因性プロモーターまたは異種プロモーターの制御下にAAV repおよびcap遺伝子を有する第2のプラスミドでトランスフェクトされる。最後に、プロデューサー細胞に、ヘルパーウイルスを感染させる。
【０１２９】
レンチウイルスベクター。レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子gag、polおよびenvに加えて、調節または構造機能を有する他の遺伝子も含む複雑なレトロウイルスである。より高い複雑性は、このウイルスが、その生活サイクルを、潜伏感染の過程におけるように、変更できるようにする。レンチウイルスのいくつかの例は、ヒト免疫不全ウイルス：HIV-1、HIV-2およびサル免疫不全ウイルス：SIVを含む。レンチウイルスベクターは、HIVビルレンス遺伝子を多重弱毒化することによって生成される、例えば遺伝子env、vif、vpr、vpuおよびnefが、そのベクターを生物学的に安全にするよう除去される。
【０１３０】
組み換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボおよびエクスビボの両方の遺伝子移入ならびに核酸配列の発現のために使用され得る。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスDNAは、レトロウイルスで見いだされる3つの遺伝子：gag、polおよびenvを有し、これらに2つの長末端反復（LTR）配列が隣接する。gag遺伝子は、内部構造（マトリクス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；pol遺伝子は、RNA依存性DNAポリメラーゼ（リバーストランスクリプターゼ）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。5'および3'LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進するよう機能する。LTRは、ウイルス複製に必要とされるすべての他のシス作用性配列を含む。レンチウイルスは、vif、vpr、tat、rev、vpu、nefおよびvpxを含むさらなる遺伝子を有する。
【０１３１】
ゲノムの逆転写（tRNAプライマー結合部位）および粒子へのウイルスRNAの効率的カプシド形成（Psi部位）に必要な配列が、5’LTRに隣接する。カプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスRNAのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠失している場合、そのシス欠陥は、ゲノムRNAのカプシド形成を妨げる。しかし、得られる変異体は、依然として、すべてのビリオンタンパク質の合成を誘導することができる。
【０１３２】
レンチウイルスベクターは、当技術分野で公知である；Naldini et al., (1996)；Zufferey et al., (1997)；米国特許第6,013,516号；および同第5,994,136号を参照のこと。一般に、ベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸の組み込みのため、選択のためおよび宿主細胞への核酸の移入のための必須配列を有するよう構成される。関心対象のベクターのgag、polおよびenv遺伝子もまた、当技術分野で公知である。したがって、関連遺伝子が、選択されたベクターにクローニングされ、その後、関心対象の標的細胞を形質転換するために使用される。
【０１３３】
他のウイルスベクター。遺伝子送達のためのウイルスベクターの開発および利用性は、絶えず改善され進化している。他のウイルスベクター、例えばポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス（Gnant et al., 1999；Gnant et al., 1999）、アルファウイルス；例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（Lundstrom, 1999）、レオウイルス（Coffey et al., 1999）およびA型インフルエンザウイルス（Neumann et al., 1999）は、本開示において使用されることが想定されており、標的システムの必須の特性にしたがい選択され得る。
【０１３４】
キメラウイルスベクター。キメラまたはハイブリッドウイルスベクターは、治療遺伝子送達において使用するために開発されており、本開示において使用されることが想定されている。キメラポックスウイルス／レトロウイルスベクター（Holzer et al., 1999）、アデノウイルス／レトロウイルスベクター（Feng et al., 1997; Bilbao et al., 1997；Caplen et al., 2000)およびアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクター（Fisher et al., 1996；米国特許第5,871,982号）が報告されている。
【０１３５】
これらの「キメラ」ウイルス遺伝子移入システムは、2つまたはそれ以上の親ウイルス種の好ましい特徴を利用することができる。例えば、Wilsonらは、以下に記載される、アデノウイルスの一部、AAV 5'および3’ITR配列および選択された導入遺伝子を含むキメラベクター構築物を提供する（個別に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,871,983号）。
【０１３６】
B. 非ウイルス形質転換
本開示において使用する細胞または組織の形質転換のための適当な核酸送達方法は、本明細書に記載されるまたは当業者に公知である、核酸（例えば、DNA）を導入することができる実質的に任意の方法を含むと考えられる。そのような方法は、DNAの直接送達、例えば、マイクロ注射（参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub, 1985；米国特許第5,789,215号）を含む、注射によるもの（各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号）；エレクトロポレーションによるもの（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,215号）；リン酸カルシウム沈降によるもの（Graham and Van Der Eb, 1973；Chen and Okayama, 1987；Rippe et al., 1990）；DEAE-デキストランの後にポリエチレングリコールを用いるもの（Gopal, 1985）；直接超音波ローディングによるもの（Fechheimer et al., 1987）；リポソーム媒介トランスフェクションによるもの（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolau et al., 1987；Wong et al., 1980；Kaneda et al., 1989；Kato et al, 1991）；微粒子射出によるもの（各々参照により本明細書に組み入れられる、PCT出願番号WO 94/09699および95/06128；米国特許第5,610,042号、同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌によるもの（各々参照により本明細書に組み入れられる、Kaeppler et al., 1990；米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号）；またはPEGを通じたプロトプラストの形質転換によるもの（各々参照により本明細書に組み入れられる、Omirulleh et al., 1993；米国特許第4,684,611号および同第4,952,500号）；乾燥／阻害を通じたDNA取り込みによるもの（Potrykus et al., 1985）を含むがこれらに限定されない。これらのような技術の適用を通じて、オルガネラ、細胞、組織または生物は、安定的または一過的に形質転換され得る。
【０１３７】
注射：特定の態様において、核酸は、1回または複数回の注射（例えば、針注射）、例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内のいずれか、を通じてオルガネラ、細胞、組織または生物に送達され得る。ワクチンの注射方法は、当業者に周知である（例えば、生理食塩水溶液を含む組成物の注射）。本開示のさらなる態様は、直接マイクロ注射による核酸の導入を含む。直接マイクロ注射は、核酸構築物をゼノパス卵母細胞に導入するために使用されている（Harland and Weintraub, 1985）。
【０１３８】
エレクトロポレーション。本開示の特定の態様において、核酸は、エレクトロポレーションを通じてオルガネラ、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、高電圧放電への細胞およびDNAの懸濁物の暴露によるものである。この方法のいくつかの派生型において、標的レシピエント細胞をエレクトロポレーションによる形質転換に対して未処置細胞によりも感受性にするために、特定の細胞壁分解酵素、例えばペクチン分解酵素が使用される（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,253号）。あるいは、レシピエント細胞は、機械的創傷によって形質転換に対してより感受性にされ得る。
【０１３９】
エレクトロポレーションを用いた真核生物細胞のトランスフェクションは、大いに成功している。この様式で、マウスプレBリンパ球が、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子を用いてトランスフェクトされ（Potter et al., 1984）、ラット肝細胞が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いてトランスフェクトされている（Tur-Kaspa et al., 1986）。
【０１４０】
細胞、例えば植物細胞においてエレクトロポレーションによる形質転換を行うために、いずれかの脆い組織、例えば細胞の懸濁培養物または胚発生カルスが使用され得る、あるいは未成熟な胚または他の有機組織が直接的に形質転換され得る。この技術において、選択された細胞の細胞壁が、それらを制御された様式でペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）または機械的創傷にさらすことによって部分的に分解され得る。インタクトな細胞のエレクトロポレーションによって形質転換されたいくつかの種の例は、トウモロコシ（米国特許第5,384,253号；Rhodes et al., 1995；D'Halluin et al., 1992）、小麦（Zhou et al., 1993）、トマト（Hou and Lin, 1996）、大豆（Christou et al., 1987）およびタバコ（Lee et al., 1989）を含む。
【０１４１】
植物細胞のエレクトロポレーション形質転換のために、プロトプラストも使用され得る（Bates, 1994；Lazzeri, 1995）。例えば、子葉由来プロトプラストのエレクトロポレーションによるトランスジェニック大豆植物の作製は、参照により本明細書に記載される国際特許出願番号WO 9217598においてDhir and Widholmにより記載されている。プロトプラスト形質転換が報告されている種の他の例は、大麦（Lazerri, 1995）、ソルガム（Battraw and Hall, 1991）、トウモロコシ（Bhattacharjee et al., 1997）、小麦（He et al., 1994）およびトマト（Tsukada, 1989）を含む。
【０１４２】
リン酸カルシウム。本開示の他の態様において、核酸は、リン酸カルシウム沈降を用いて細胞に導入される。ヒトKB細胞は、この技術を用いて、アデノウイルス5 DNA（Graham and Van Der Eb, 1973）でトランスフェクトされた。また、この様式で、マウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3およびHeLa細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Chen and Okayama, 1987）、ラット肝細胞が、様々なマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Rippe et al., 1990）。
【０１４３】
DEAE-デキストラン：別の態様において、核酸は、DEAE-デキストランとその後のポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この様式で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫および赤白血病細胞に導入された（Gopal, 1985）。
【０１４４】
超音波ローディング。本開示のさらなる態様は、直接超音波ローディングによる核酸の導入を含む。LTK-線維芽細胞は、超音波ローディングによりチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Fechheimer et al., 1987）。
【０１４５】
リポソーム媒介トランスフェクション。本開示のさらなる態様において、核酸は、脂質複合体、例えばリポソーム内に封入され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体によって特徴づけられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、過剰な水溶液中にリン脂質が懸濁されたときに自然に形成される。その脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再配置を行い、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する（Ghosh and Bachhawat, 1991）。リポフェクタミン（Gibco BRL）またはスーパーフェクト（Qiagen）を用いて複合体化された核酸も想定されている。
【０１４６】
インビトロでのリポソーム媒介核酸送達および外来DNAの発現は、大いに成功している（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolau et al., 1987）。培養ニワトリ胚、HeLaおよびヘパトーマ細胞におけるリポソーム媒介送達および外来DNAの発現の実現可能性もまた実証されている（Wong et al., 1980）。
【０１４７】
本開示の特定の態様において、リポソームは、血球凝集ウイルス（HVJ）と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに内包されるDNAの細胞侵入を促進することが示されている（Kaneda et al., 1989）。他の態様において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化され得るまたはそれと共に用いられ得る（Kato et al., 1991）。なおさらなる態様において、リポソームは、HVJおよびHMG-1の両方と複合体化され得るまたはそれらと共に用いられ得る。他の態様において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。
【０１４８】
受容体媒介トランスフェクション。なおさらに、核酸は、受容体媒介送達ビヒクルを通じて標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において起こり得る受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布の観点から、この送達方法は、本開示にさらなる特異性を与える。
【０１４９】
特定の受容体媒介遺伝子ターゲティングビヒクルは、細胞受容体特異的リガンドおよび核酸結合剤を含む。他は、送達したい核酸が機能的に付加されている細胞受容体特異的リガンドを含む。様々なリガンドが、受容体媒介遺伝子移入に使用されており（Wu and Wu, 1987；Wanger et al., 1990；Perales et al., 1994；Myers, EPO 0273085）、これらはこの技術の実施可能性を確立している。別の哺乳動物細胞型に関する特異的送達も報告されている（Wu and Wu, 1993；参照により本明細書に組み入れられる）。本開示の特定の局面において、リガンドは、標的細胞集団において特異的に発現される受容体に対応するよう選択される。
【０１５０】
他の態様において、細胞特異的核酸ターゲティングビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、リポソームと共に特異的結合リガンドを含み得る。送達される核酸は、リポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。したがってリポソームは、標的細胞の受容体に特異的に結合し、その成分を細胞に送達する。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（EGF）が、EGF受容体の上方調節を示す細胞への核酸の受容体媒介送達において使用されるシステムにおいて機能的であることが示されている。
【０１５１】
なおさらなる態様において、標的指向送達ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、これは好ましくは細胞特異的結合を誘導する1つまたは複数の脂質または糖タンパク質を含む。例えば、ラクトシル-セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（galactose-terminal asialganglioside）がリポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察されている（Nicolau et al., 1987）。本開示の組織特異的形質転換構築物が、同様の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが想定されている。
【０１５２】
C. レシピエント細胞
非筋レシピエント細胞は、実質的に任意の細胞型であり得るが、特に、線維芽細胞（皮膚、毛髪等に豊富）または赤血球細胞（循環および筋肉との接触の点で理想的）であり得る。骨髄の細胞および脂肪幹細胞もまた、これらの細胞も非常に豊富であるという理由で、想定されている。さらに、筋前駆細胞も、筋肉に融合する「通常の」細胞型であることから、使用され得る。
【０１５３】
VI. 治療処置
本開示は、治療遺伝子を筋組織に送達するためにミオミキサー（およびミオメーカー）を発現する非筋細胞を用いる筋疾患の処置を想定している。これは、本発明者らの知る限り、非筋細胞キャリアを用いて筋特異的細胞融合を誘導する技術を実用可能とした最初の例である。
【０１５４】
特定の態様において、ミオミキサー/ミオメーカーおよび治療遺伝子を発現する非筋細胞が、筋細胞および／または組織が1つまたは複数の遺伝子産物を欠き、疾患表現型を示している対象の部位にまたはその付近に送達されることが想定される。あるいは、細胞は、組織適合細胞源または患者由来の細胞のいずれかを用いてエクスビボで融合され得、その後、疾患部位に、疾患部位付近にまたは疾患部位近辺に注射され得る。両方の例において、非筋細胞と筋細胞の融合は、治療遺伝子、したがってその遺伝子産物を、その遺伝子産物を欠く筋細胞に送達し、それによって疾患表現型を解消するまたは減少させる。これらの形質転換細胞はまた、全身投与され得る。例えば、骨髄細胞が収集され、ミオミキサー/ミオメーカーおよび治療遺伝子の発現が強制され、そしてこれらの細胞が患者に移植（すなわち、骨髄移植）され得る。
【０１５５】
A. CRISPR/Cas9
DMDおよび他の遺伝的欠陥を修復するためのCRISPR/Cas9システムの使用は、本開示において特に関心対象となる。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）は、短い反復塩基配列を含むDNA座である。各反復の後に、過去のウイルスへの暴露に由来する短い「スペーサーDNA」セグメントが続く。CRISPRは、配列決定された真正細菌ゲノムのおよそ40％および配列決定された古細菌の90％で見いだされている。CRISPRは、多くの場合、CRISPRに関連するタンパク質をコードするcas遺伝子を伴う。CRISPR/Casシステムは、外来遺伝子要素、例えばプラスミドおよびファージに対する耐性を付与し、後天性免疫の形態を提供する原核生物免疫系である。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiのように、これらの外来遺伝子要素を認識し抑制する。
【０１５６】
反復は、1987年に、細菌である大腸菌（Escherichia coli）に関して初めて報告された。2000年に、同様のクラスター化された反復が、さらなる細菌および古細菌において同定され、Short Regularly Spaced Repeats（SRSR）と命名された。SRSRは、2002年にCRISPRに改名された。一部が推定ヌクレアーゼまたはヘリカーゼタンパク質をコードする遺伝子群が、CRISPR反復に関連することが見いだされた（casまたはCRISPR関連遺伝子）。
【０１５７】
2005年に、3人の独立した調査者が、CRISPRスペーサーが様々なファージDNAおよび染色体外DNA、例えばプラスミドに対して相同性を示すことを示した。このことは、CRISPR/casシステムが細菌における適応免疫において役割を有し得る表れであった。Kooninらは、スペーサーが、RNA干渉と呼ばれるシステムを使用する真核生物細胞のように、RNA分子のテンプレートとして機能することを提唱した。
【０１５８】
2007年に、Barrangou、Horvath（Daniscoの食品工学科学者）らは、それらがスペーサーDNAによってファージ攻撃に対するストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）の耐性を変化させ得ることを示した。DoudnaおよびCharpentierは、独立して、細菌がどのようにしてそれらの免疫防御においてスペーサーを配備するのかを学ぶために、CRISPR関連タンパク質を調査していた。彼らは、合同で、Cas9と呼ばれるタンパク質に依存する単純なCRISPRシステムを研究した。彼らは、細菌が、スペーサーおよび回文DNAを、後に細胞がtracrRNAおよびCas9を使用してそれをcrRNAと呼ばれる断片に切断する長いRNA分子に転写することによって侵入ファージに応答することを見出した。
【０１５９】
2012年までに、CRISPRは、最初にヒト細胞培養物におけるゲノム改変／編集ツールとして役立つことが示された。それ以降、それは、パン酵母（出芽酵母（S. cerevisiae））、ゼブラフィッシュ、線虫（C.エレガンス（C. elegans））、植物、マウスおよび様々な他の生物を含む幅広い生物において使用されている。さらに、CRISPRは、科学者が特定の遺伝子を標的とするおよび活性化または抑制することができるようにするプログラム可能な転写因子を生成するよう改変されている。現在、数万のガイドRNAのライブラリが、入手可能である。
【０１６０】
CRISPRが生きた動物における疾患症状を解消することができることの最初の証拠は、MITの調査者が希少な肝臓障害のマウスを治癒した2014年3月に示された。2012年以降、CRISPR/Casシステムは、マウスおよび霊長類のような真核生物においてさえも機能する遺伝子編集（特定の遺伝子の抑制、増強または変更）に使用されている。cas遺伝子および特別設計されたCRISPRを含むプラスミドを挿入することによって、生物のゲノムは任意の所望の位置で切断され得る。
【０１６１】
CRISPR反復は、24〜48塩基対の範囲のサイズである。それらは通常、ダイアド対称性を示し、このことは、真に回文的でないものの二次構造、例えばヘアピンが形成されることを暗示している。反復は、同様の長さのスペーサーによって隔てられている。いくつかのCRISPRスペーサー配列は、プラスミドおよびファージの配列と正確に一致するが、いくつかのスペーサーは、原核生物のゲノムと一致する（自己ターゲティングスペーサー）。新たなスペーサーは、ファージ感染に応答して直ちに追加され得る。
【０１６２】
CRISPR関連（cas）遺伝子は、多くの場合、CRISPR反復・スペーサーアレイに関連する。2013年時点で、40を超える異なるCasタンパク質ファミリーが報告されている。これらのタンパク質ファミリーの中で、Cas1は、異なるCRISPR/Casシステムの間で偏在しているようである。cas遺伝子と反復構造の特定の組み合わせが、8つのCRISPRサブタイプ（Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、ApernおよびMtube）を定義するために使用され、そのいくつかは、反復関連ミステリアスタンパク質（repeat-associated mysterious proteins: RAMP）をコードするさらなる遺伝子モジュールに関連する。一つのゲノム内に2つ以上のCRISPRサブタイプが発生し得る。CRISPR/Casサブタイプの散在的分布は、このシステムが微生物の進化の間に水平遺伝子移動に供されることを示唆している。
【０１６３】
外因性DNAは、Cas遺伝子によってコードされるタンパク質により小さな要素（約30塩基長）にプロセシングされるようであり、これはその後、何らかの方法で、CRISPR座のリーダー配列付近に挿入される。CRISPR座由来のRNAは、構成的に発現され、Casタンパク質により、隣接する反復配列を有する個々の外因性配列要素から構成される小さなRNAにプロセシングされる。このRNAは、他のCasタンパク質を、RNAまたはDNAレベルで外因性遺伝子要素を抑制するよう誘導する。証拠は、CRISPRサブタイプ間の機能的多様性を示唆している。Cse（CasサブタイプEcoli）タンパク質（大腸菌においてCas A〜Eとも呼ばれる）は、機能的な複合体Cascadeを形成し、これは、CRISPR RNA転写物を、Cascadeが保持するスペーサー・反復単位にプロセシングする。他の原核生物において、Cas6は、CRISPR転写物をプロセシングする。興味深いことに、大腸菌におけるCRISPRに基づくファージ不活性化は、Cas1およびCas2ではなく、CascadeおよびCas3を必要とする。ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）および他の原核生物において見いだされるCmr（Cas RAMPモジュール）タンパク質は、小さなCRISPR RNAと機能的複合体を形成し、相補的な標的RNAを認識および切断する。RNAガイドCRISPR酵素は、V型制限酵素に分類される。
【０１６４】
その全体が参照により組み入れられる米国特許公開2016/0058889も参照のこと。
【０１６５】
B. 併用療法
本開示の細胞はまた、1つまたは複数の他の「標準的」治療と組み合わせて使用され得る。組み合わせて提供される場合、これらの組成物は通常、1つまたは複数の疾患パラメータの減少を達成するのに効果的な併用量で投与される。このプロセスは、対象を、例えば両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的配合物を用いて、または対象を2つの別個の組成物または配合物と同時に接触させることによって、両方の薬剤／治療と同時に接触させることを含み得る。あるいは、数分から数週間の範囲の間隔をあけて、1つの処置が他の処置の前に行われ得るまたは1つの処置の後に他の処置が行われ得る。通常、その治療が細胞／対象に対して依然として有利な併用効果を達成することができるように、各送達間で相当な期間が経過しないことが確実にされる。そのような例において、細胞は、相互から約12〜24時間以内に、相互から約6〜12時間以内に、または約12時間のみの時間的遅延で、両方の様式と接触することが想定される。いくつかの状況において、数日（2、3、4、5、6または7）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）が各々の投与の間であけられる場合であるが、処置の時間を有意に延長することが望ましいことがある。いずれかの治療の2回以上の実施が望ましいことも想定される。
【０１６６】
C. 薬学的組成物および投与
治療適用が企図される場合、意図される適用に適した形態で薬学的組成物を調製することが必要である。一般に、これは、発熱物質、およびヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。
【０１６７】
一般に、送達ベクターに安定性を付与し、標的細胞による取り込みを可能にするために、および融合のための細胞を培養するために、適当な塩および緩衝液を用いることが望ましい。緩衝液はまた、組み換え細胞が患者に導入される場合にも用いられる。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物はまた、接種源（inocula）とも称される。「薬学的または薬理学的に許容される」というフレーズは、動物またはヒトに投与された際に、有害な、アレルギー性のまたは他の厄介な反応を生じない分子および組成物を表す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来的な媒体または薬剤が本開示のベクターまたは細胞と不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的活性成分も、組成物に組み込まれ得る。
【０１６８】
本開示の活性組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。本開示にしたがうこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を通じて利用可能である限り、任意の一般的な経路を通じて行われ得る。そのような経路は、経口、経鼻、口腔、直腸、膣内または局所経路を含む。あるいは、投与は、同所、皮内、皮下、腹腔内または静脈内注射によるものであり得る。筋肉内注射が好ましい。そのような組成物は、通常、薬学的に許容される組成物として投与される。
【０１６９】
活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与され得る。遊離塩基または薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中でならびに油中で調製され得る。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
【０１７０】
注射用途に適した薬学的形態は、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。すべての例において、その形態は、滅菌性でなければならず、注射器利用容易性が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の混入活動に対して防御されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性が、例えばコーティング、例えばレクチンの使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の活動の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの例で、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０１７１】
滅菌注射溶液は、適当な溶媒中に必要量の活性化合物を、必要に応じて上記の様々な他の成分と共に組み込み、その後にろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本分散媒および上記の中からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を事前に滅菌ろ過されたその溶液から生成する減圧乾燥および凍結乾燥である。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当業者に周知である。任意の従来的な媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的活性成分も、組成物に組み込まれ得る。
【０１７３】
経口投与の場合、本開示のポリペプチドは、賦形剤に組み込まれ、非消化性口内洗浄液および歯磨剤の形態で使用され得る。口内洗浄液は、必要量の活性成分を適当な溶媒、例えばホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）に組み込むことによって調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素ナトリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分はまた、ジェル、ペースト、粉末およびスラリーを含む歯磨剤に分散され得る。活性成分は、水、結合剤、研磨剤、芳香剤、発泡剤および保湿剤を含み得るペースト状歯磨剤に治療有効量で添加され得る。
【０１７４】
配合された場合、溶液は、投与用配合物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。配合物は、様々な剤形、例えば注射溶液、薬物放出カプセル等で容易に投与される。水溶液による非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要に応じて適当に緩衝化されるべきであり、希釈液は最初に十分な塩またはグルコースを用いて等張性にされるべきである。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に理解されるであろう。例えば、１回分の用量は、１mlの等張性NaCl溶液に溶解され得、1000 mlの皮下注入液に添加され得るかまたは提唱される注入部位に注射され得るかのいずれかである（例えば、"Remington's Pharmaceutical Science," 15th Ed., 1035-1038および1570-1580を参照のこと）。処置される対象の状態に依存して、一定の用量の変動が必然的に生じるであろう。投与を担当する人間は、いかなる場合も、個々の対象に適した用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、FDA Office of Biologics標準により必要とされる滅菌性、発熱性、全体的安全性および純度の標準に合致すべきである。
【０１７５】
VIII. キット
本明細書に記載される用途での使用に関して、キットも本開示の範囲に含まれる。そのようなキットは、1つまたは複数の容器、例えばバイアル、チューブ等を収容するよう区画化されたキャリア、パッケージまたは容器を含み得、この方法で使用される個別の要素、特にミオミキサー発現構築物またはそれを含む形質転換細胞の1つを含む各々の容器が、任意で、ミオメーカー発現構築物またはそれを含む形質転換細胞をさらに含む。本開示のキットは、典型的に、上記の容器ならびに、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用説明書を含むパッケージ同封物を含む、商業的末端利用者の観点から望ましい材料を含む1つまたは複数の他の容器を含む。加えて、その組成物が特定の治療用途で使用されることを示すラベルが、容器上に提供され得、インビボまたはインビトロ利用のいずれかのための手引き、例えば上記のようなもの、も示し得る。手引およびまたは他の情報はまた、キットと共に含まれる同封物に含まれ得る。
【実施例】
【０１７６】
IX. 実施例
以下の実施例は、本開示の様々な局面をさらに説明するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本開示を実施する際に十分機能することが本発明者らによって発見された技術および／または組成物であり、したがってその実施に関する好ましい様式を構成するものとみなされ得ることが当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている個々の態様において多くの変更が加えられ得、そしてそれでもなお同様または類似の結果が得られ得ることを理解すべきである。
【０１７７】
実施例1 - 方法
レンチウイルスライブラリの作製およびC2C12細胞の感染。マウスGeCKOv2 CRISPRノックアウト収集ライブラリは、Feng Zhang氏からの寄贈物であった（Addgeneプラスミド＃1000000052）（Sanjana et al., 2014）。ライブラリレンチウイルス生産のために、1.8 x 107個のLenti-X 293T細胞（Clontech、カタログ番号632180）を、25 mlの（1％ペニシリン／ストレプトマイシン、10% FBSを含有する）DMEM中、15 cm組織培養プレート上にプレーティングした。12時間後、16.9μgのpsPAX2プラスミド、5.6μgのpMD2.Gプラスミドおよび22.5μgのGeCKOプラスミドライブラリと共にFuGENE6（Promega、＃E2692）を用いてトランスフェクトを行った。2日後、レンチウイルス含有上清を、0.45μmフィルターを通じて濾過し、Lenti-X Concentrator（Clontech、PT4421-2）を製造元のプロトコルにしたがい用いて濃縮した。psPAX2ベクターは、Didier Trono氏からの寄贈物であった（Addgeneプラスミド＃12260）。pMD2.Gベクターは、Didier Trono氏からの寄贈物であった（Addgeneプラスミド＃12259）。新たに作製されたレンチウイルスの一部を使用して、その力価を測定した。簡単に説明すると、C2C12細胞を異なる量のウイルスストックに2日間感染させ、その後にさらに2日間のピューロマイシン選択（2μg/ml）を行った。細胞生存率を測定し、感染率として参照した。このウイルス力価に基づき、調節された量のウイルスストックを使用して、大部分の細胞が2個未満のレンチウイルス粒子を取り込むよう0.2の標的MOIでC2C12細胞に感染させた。感染から2日後、ピューロマイシン（Invitrogen）を終濃度2μg/mlで添加し、感染細胞を2日間選択した。選択後、細胞を（1％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する）DMEM中2％ウマ血清に移し替え、分化第3日に新鮮な培地を交換しつつ1週間分化させた。分化後、37℃で（PBS中に希釈した）0.00625％トリプシンと共に5分間インキュベートすることによって筋管をプレートから剥離させ、プレートをPBSで穏やかに2回洗浄し、そこから剥離させた細胞を混合し、300 x gで5分間遠心分離した。ついで筋管を、0.25％トリプシンを用いて剥離させ、PBSで2回洗浄してすべての細胞を収集し、これを300 x gで5分間沈降させた。
【０１７８】
リードアウト配列決定のためのゲノムDNAの精製およびライブラリの調製。筋芽細胞および筋管由来のゲノムDNAを、MasterPure（商標）DNA Purification Kit（MC85200）を製造元の説明書にしたがい用いて精製した。本発明者らは、Herculase II Fusion DNA Polymerase（Agilent、＃600675）を用いて、バーコード、スタッガーおよびIllumina配列決定プライマーを添加するための2回の連続するPCR反応（最初の反応は18サイクル、第2の反応は12サイクル）を行った（Sanjana et al., 2014）。PCR産物を、Agencourt AMPure XP磁気ビーズを用いて精製し、DNAを、Qubit Fluorometric Quantitationによって分析した。精製されたPCR産物を、75 bpシングルリードでHiseq 2500において配列決定した。
【０１７９】
配列決定データの分析。ライブラリ内のGeCKO sgRNA配列の参照リストをAddgene（addgene.org/pooled-library/zhang-mouse-gecko-v2/のワールドワイドウェブ）からダウンロードし、逆多重化したFASTQファイルを、ミスマッチのない固有のアラインメントを必要とするBowtie 2を用いて参照ファイルにマッピングした。sgRNAの定量および遺伝子スコアの計算を、sgRSEA（bchen4.github.io/sgrsea/）を用いて行った。
【０１８０】
培養細胞におけるミオミキサーCRISPR sgRNAノックアウト実験。ミオミキサー ORF領域を標的とする2つのガイド
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を、Feng Zhang氏からの寄贈物であるlenti-CRISPR v2ベクター（Addgeneプラスミド＃52961）に個別にクローニングした（Sanjana et al., 2014）。ミオミキサーCRISPR-sgRNAおよび対照（空のlenti-CRISPR v2）レンチウイルスを作製し、これを用いてC2C12または初代筋芽細胞に感染させ、その後にレンチウイルスCRISPRライブラリに対して実施したのと同様の手順でピューロマイシン選択を行った。選択後、細胞を1週間分化培地に移し替え、その後に免疫染色、RNA、タンパク質およびゲノムDNA抽出および分析を行った。これらの細胞におけるミオミキサーのターゲティングを検証するため、ターゲティング領域を増幅するプライマー
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PCR産物のサイズは、非標的細胞の場合、743 bpであった）を用いてゲノムDNAを増幅した。PCR産物をゲル精製し、pCRII Topoベクター（ThermoFisher、K460001）にクローニングし、配列決定した。
【０１８１】
定量リアルタイムPCR（qPCR）。総RNAを、TRIZOL（Invitrogen）を用いて培養細胞またはマウス組織から抽出し、iScript（商標）Reverse Transcription Supermix（1708841）を用いてcDNAを合成した。遺伝子発現を、KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（KK4605）を用いる標準的なqPCRアプローチを用いて評価した。分析は、以下のSybrプライマーを用いて、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）において行った：
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。2ΔΔCt法を使用して、18S rRNA発現に対して正規化された遺伝子発現における相対変化を分析した。
【０１８２】
Pax7+およびTwist2+筋前駆細胞の単離およびRNA-seq分析。Twist2+筋前駆細胞は、Pax7+衛星細胞と異なり、筋肉のホメオスタシスおよび再生の間に特定の線維型に寄与する筋原性前駆細胞の集団である（Liu et al., 2017）。Twist2+筋前駆細胞は、タモキシフェン注射から10日後に、8週齢のTwist2-CreERT2;R26-tdTOマウスの骨格筋組織からのFACS選別によって新たに単離した。Pax7+衛星細胞は、インテグリン-7陽性およびCD45/CD31/Sca1陰性集団としてのFACS選別によって単離した。RNAの質を、Agilent 2100によって検証した。バイオアナライザーおよびRNA-seqは、UTSW GenomicsおよびMicroarray Core Facilityが、Illumina HiSeq 2500を用いて行った。
【０１８３】
レトロウイルスの発現。ミオミキサーコード配列のオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologiesが合成し、In-Fusion（登録商標）HD Cloning Plus Kit（Clontech、＃638910）を用いてpMXs-Puro Retroviral Vector（Cell Biolabs、＃RTV-012）（Kitamura et a., 2003）に連結した。配列決定による正確な挿入の検証の後、プラスミドを、一晩の培養下、Stable3細胞内で増幅し、その後にNucleoBond（登録商標）Xtra Maxi Columns（＃740414.10）を用いてプラスミド調製を行った。N末端タグ付加Signal FLAG（SF)ミオメーカーを発現するレトロウイルスプラスミドを用いて、ミオメーカーを過剰発現させた（Millay et al., 2016）。トランスフェクトの12時間前に1皿あたり5 x 106細胞の密度となるよう10 cm細胞培養皿にプレーティングしたPlatinum-E細胞（Cell Biolabs、＃RV-101）に、10マイクログラムのレトロウイルスプラスミドDNAを、FuGENE 6（Promega、＃E2692）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトから2日後、ウイルス培地を、0.45μmセルロースシリンジフィルターを通じてろ過し、終濃度6μg/mlとなるようポリブレン（Sigma）と混合した。感染2日後、細胞をPBSで2回洗浄した。融合実験のために、ウイルス感染C2C12および10T1/2細胞を混合し（ウェルあたり5 x 104のC2C12細胞および2 x 105の線維芽細胞）、6ウェルプレート上にプレーティングした。プレーティングから12時間後、細胞を1週間の間、筋芽細胞分化培地（1％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM中2％ウマ血清）に移し替え、培地を分化第3日に交換した。
【０１８４】
細胞培養および蛍光タンパク質標識。10T1/2線維芽細胞およびC2C12細胞を、DMEM中10％FBSおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシンの下で維持した。GFPを発現するレンチウイルスおよびCherryを発現するレトロウイルスを、上記のようにして作製した。レンチウイルスGFPのためのパッケージングベクターは、Miguel Ramalho-Santos氏からの寄贈物であるpLove-GFPであり（Addgeneプラスミド＃15949）（Blelloch et al., 2007）、レトロウイルスCherryは、pMXs-Cherry（Cell Biolabs、＃RTV-012）である。感染の12時間前に、細胞を、10 cm皿に、2 x 106の密度となるよう播種した。細胞を、実験に使用する前に、2日間感染させた。
【０１８５】
膜分画。膜の分画は、Mem-PER（商標）Plus Membrane Protein Extraction Kit（ThermoFisher、＃89842）を用いて行った。簡単に説明すると、細胞を、細胞スクレイパーを用いてプレートの表面から削り取ることによってPBS中に懸濁させた。300 x gで5分間の細胞懸濁物の遠心分離の後、細胞プレートを2回洗浄し、4℃で10分間、絶えず混合しながら透過処理した。4℃、16,000 x gで15分間の遠心分離の後に、その細胞質ゾル画分（上清）を収集した。その膜画分（ペレット）を再懸濁し、4℃で30分間、絶えず混合しつつ溶解させた。その膜画分を、4℃で15分間の16,000 x gの遠心分離の後に上清として収集した。タンパク質サンプルを4 x Laemmliサンプル緩衝液と混合し、ウェスタンブロット分析によって分析した。
【０１８６】
免疫沈降およびウェスタンブロット分析。細胞を氷冷PBSで洗浄し、コンプリートプロテアーゼ阻害剤（Sigma）およびPhoSTOPホスファターゼ阻害剤（Sigma)を補充したIP-A緩衝液（50 mM TRIS、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1％ Triton X-100）に15分間溶解させた。細胞溶解産物を、25G 5/8針を通じてそれらを通過させることによって機械的に分離させ、その後に4℃で1時間絶えず混合した。ついで溶解産物を、20,817 x gで15分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。総溶解産物の10％をインプットとして使用し、残りの量を共免疫沈降に使用した。抗FLAG M2親和性樹脂（Sigma、A220)を、製造元の指示にしたがいIP-A緩衝液中で平衡化させた。サンプルあたり100μlの樹脂を使用した。共免疫沈降は、12時間の間、絶えず混合しつつ、4℃、2mlの総量で行った。樹脂を、高塩（700 mM NaCl）中で洗浄し、溶出を、室温で6時間、絶えず混合しつつ、200μg/mLの終濃度のFLAGペプチド（Sigma、F390）を用いて行った。SDS-PAGEは、以下に記載されるようにして行った。
【０１８７】
タンパク質を、RIPA緩衝液（Sigma、R0278）を用いて細胞または組織から単離した。タンパク質濃度を、BCA Protein Assay Reagent（ThermoFisher Scientific、23225）およびその後のNanoDropによる測定を用いて決定した。タンパク質サンプルを、4x Laemmliサンプル緩衝液（BIO-RAD、＃161-0747）と混合し、20〜40μgのタンパク質を投入し、Mini-PROTEAN（登録商標）TGX（商標）Precast Gelsにより分離し、フッ化ポリビニリデン（PVDF）膜（Millipore）に転写し、室温で1時間、5％無脂肪ミルク中でブロックし、ついで4℃で一晩、5％ミルク中に希釈された以下の一次抗体と共にインキュベートした：Gapdh（Thermofisher、MA5-15738）、N-カドヘリン（Santa Cruz Biotechnology、sc7939）、インスリン受容体β（Cell Signaling Technology、＃3020）、EGF受容体（Cell Signaling Technology、＃2646）、チューブリン（Sigma、T-6199）、ミオミキサー（R&D Systems、＃AF4580）、FLAG（Sigma、F3165）、ミオシン（Sigma、M4273）。HRP結合二次抗体：ロバ抗ヒツジIgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology、sc-2473）、ヤギ抗マウスIgG(H + L)-HRPコンジュゲート（BIO-RAD、＃170-6516）およびヤギ抗ウサギIgG(H + L)-HRPコンジュゲート（BIO-RAD、＃170-6515）を、1：5,000希釈した。免疫検出は、Western Blotting Luminol Reagent（Santa Cruz Biotechnology、sc2048）を用いて行った。
【０１８８】
免疫染色。細胞を、10分間、4％ PFA/PBS中で固定し、PBS中0.2％ Triton X-100を用いて透過処理し、室温で1時間、3％ BSA/PBSを用いてブロックした。細胞を、4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートし、その後に以下に示されるようにAlexa Fluor結合二次抗体と共にインキュベートした。生細胞の膜染色のために、細胞を最初に氷冷PBSで洗浄し、氷上で15分間、3％ BSA/PBS中でブロックした。ついで、一次抗体のインキュベートを、氷上で30分間、FLAGに対する抗体（氷冷1％ BSA/PBS中1：500希釈のM2マウス抗FLAGシグマ、F3165）を用いて行った。一次抗体のインキュベート後、細胞を氷冷PBSで洗浄し、室温で10分間、4％ PFA/PBSで固定した。ついで細胞を、室温で30分間、Alexa-Fluor二次抗体（ThermoFisher、A21422）と共にインキュベートした。ラミニン染色のために、細胞を、PBS中0.2％ Triton X-100を用いて透過処理し、そして3％ BSA/PBSを用いて1時間ブロックした。細胞を、一次抗体（ウサギ抗ラミニン1：500、室温で1時間）と共にインキュベートし、その後に二次抗体（ThermoFisher、A21206）および核を対比染色するためのHoechstと共にインキュベートした。
【０１８９】
筋肉切片の免疫染色のために、8μmの未処理のまま包埋した凍結切片を、4％ PFAを用いて10分間固定し、0.01％ Triton X-100を用いて15分間透過処理し、ついでその切片を、内因性マウスIgからのバックグラウンド染色を防ぐために、M.O.Mブロッキングキット（Vector Laboratories）と共に1時間インキュベートした。その後、切片を、PBSおよび0.01％ Triton X-100中で調製された10％正常ロバ血清中で30分間ブロックし、ヒツジ抗ミオミキサー（R&D、AP4580、1：100希釈）およびマウス抗MY32一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。一次抗体は、Alexa Fluor 568および488（Life Technologies, 1:500）を用いて可視化した。DAPI（Sigma、1μg/mL）を用いて核の対比染色を行った。染色は、Zeiss LSM780共焦点顕微鏡において可視化した。
【０１９０】
組織化学のために、マウス抗骨格ミオシン（MY-32クローン；1：200希釈）を、Mouse-on-Mouse Blocking & Immunodetection Kitおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）と共にパラフィン切片に使用した。以前に記載された免疫ペルオキシダーゼ法（Cianga et al., 1999; Borvak et al., 1998）にしたがい、結合したミオシン抗体を、ジアミノベンゼジン（diamonobenzedine）クロマゲン（DAKO-Agilent, Carpinteria, CA）を用いて検出し、スライドを、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【０１９１】
ミオミキサー変異マウスの作製。すべての動物実験は、University of Texas Southwestern Medical CenterのInstitutional Animal Care and Use Committeeによる承認を得た。B6C3F1マウスを、卵母細胞ドナーとして使用した。過剰排卵雌B6C3F1マウス（6週齢）を、B6C3F1種付け雄と交配させた。受精卵を収集し、37℃で1時間、M16培地（100 U/mlペニシリンおよび50 mg/mlストレプトマイシンを含む卵子培養用のブリンスター培地）中で維持した。受精卵を、M2培地（M16培地および20mM HEPES）に移した。Cas9 mRNAおよびミオミキサーsgRNA（＃1および＃2）を前核および細胞質に注射した。注射された受精卵を、37℃で1時間、M16培地中で培養し、ついで偽妊娠ICR雌マウスの卵管に移した。E17.5胚を収集し、組織学および遺伝子発現アッセイ用に処理した。尾部ゲノムDNAを抽出し、ターゲティング領域を増幅するプライマー
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、野生型マウスの場合、PCR産物のサイズは743 bpである）を用いる遺伝子タイピングのために使用した。
【０１９２】
組織の収集および調製。インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）、免疫組織化学（IHC）および従来的な組織学のためのマウス胚を、妊娠母体から収集し、全体を画像化し、4％パラホルムアルデヒド中で浸漬固定した。その後のパラリン処理、包埋、切片化およびH&E染色は、標準的な手法により行った（Shehan & Hrapchak, 1980；Woods & Ellis, 1996）。
【０１９３】
RNAインサイチューハイブリダイゼーション。ミオミキサーORFに対応するプローブ鋳型を、pCRII-TOPO（Invitrogen、ThermoFisher、K460001）にクローニングした。35S標識されたセンスおよびアンチセンスプローブを、Maxiscriptキット（Ambion, Inc, Austin, TX）を用いたインビトロ転写による直鎖化されたcDNA鋳型から、それぞれ、Sp6およびT7 RNAポリメラーゼによって作製した。放射性同位体インサイチューハイブリダイゼーションは、以前に記載されたようにして行った（Shelton et a., 2000）。シグナルは、14日間のオートラジオグラフ暴露後に明らかになった。
【０１９４】
顕微鏡観察。胚全体画像を、Zeiss Stemi SV-11立体光学解剖顕微鏡においてOptronics MacrofireデジタルCCDカメラおよびPictureFrame 2.0ソフトウェア（Optronics, Goleta, CA）を用いて取得した。すべての組織学的調製物の観察および撮影を、明視野および入射角暗視野照明装置（Nikon USA, Mellville, NY）を備えたNikon E600顕微鏡写真機において行った。画像は、Nikon Elements 4.20.00ソフトウェアを用いて、1.25倍、4倍、10倍（ISH）および20倍（IHC、H&E）対物倍率で撮影した。
【０１９５】
実施例2 - 結果
筋形成の新しい調節因子を同定するため、本発明者らは、図5Aに図示されているように、マウスC2C12筋細胞の分化および融合に必要とされる遺伝子についてのゲノムワイドCRISPR機能喪失スクリーンを行った。簡単に説明すると、彼らは、CRISPR遺伝子編集のための130,209個のシングルガイド（sg）RNAのプールおよびCas9を含むレンチウイルスライブラリを用いて6000万個のC2C12筋芽細胞に感染させた（Sanajan et al., 2014）。レンチウイルス感染は、ライブラリの460倍提示となる感染多重度で行った。2日間のピューロマイシン選択の後、筋管形成を促進するため、筋芽細胞培養物を、1週間、分化培地（DM）に移し替えた。この培養物を、低トリプシン（0.00625％）への短い暴露に供し、皿に付着した単核筋芽細胞を残しつつ筋管の剥離を促進した。その後の0.25％トリプシン処理により、筋芽細胞を放出させた。筋管および筋芽細胞集団の分離のための対照として、本発明者らは、筋管集団に非常に豊富に存在するミオシン重鎖をウェスタンブロット分析によって検出した（図5B）。
【０１９６】
筋芽細胞および筋管集団におけるsgRNA表現を、高スループット配列決定によって一覧にし、複数の筋芽細胞に豊富なsgRNAによって標的とされた遺伝子を、それらの相対量に基づき採点した。この分析は、筋芽細胞に豊富な複数の独立したCRISPR sgRNAによって標的とされた多数の遺伝子を明らかにした。本発明者らは、筋芽細胞の分化または融合に特異的に必要とされる遺伝子を同定することを予定していたので、彼らは、これらの遺伝子を、C2C12筋芽細胞（Chen et al., 2006）ならびにPax7+衛星細胞およびTwist2+筋原性前駆体（Liu et al., 2017）の分化の間に上方調節される転写物と比較することによって、このリストを縮小した（図5C）。5つの遺伝子が、これらの基準を満たした（図5C）。Gm7325と注釈付けされたこのリスト上の1つの新規の遺伝子は、初期スクリーンにおいて3つの独立したsgRNAによって標的とされ、かつC2C12筋芽細胞ならびにPax7+およびTwist2+筋前駆体の分化の間に最も上方調節される機能未知の遺伝子として目立つ存在であった（図5C）。この遺伝子はまた、筋原性転写因子であるMyoDおよびミオゲニンのゲノム結合における保存されたピークに関連し（図5D）（Yue et al., 2014）、MyoDの推定標的として同定された（Fong et al., 2012）。
【０１９７】
胚性幹（ES）および生殖細胞において発現される遺伝子としてGm7325を記載する刊行物は1つ存在するが、その機能は解明されなかった（Chen et a., 2005）。本願において、本発明者らは、Gm7325が、筋芽細胞の融合に必要とされ、細胞膜の混合を促進することを示し、したがって彼らは、このタンパク質をミオミキサーと命名した。以下の実験において、本発明者らは、筋芽細胞の融合および筋形成の制御におけるこのタンパク質の鍵となる役割を実証する。
【０１９８】
マウスミオミキサー遺伝子は、3つのエクソンにまたがり、そのオープンリーディングフレーム（ORF）はエクソン3に存在する（図5E）。筋芽細胞融合におけるミオミキサーの必要性を確認するため、本発明者らは、C2C12細胞およびマウス初代筋芽細胞におけるこの遺伝子を、ミオミキサーORF内でCas9および122塩基対（bp）によって隔てられた一対のsgRNAを発現するレンチウイルスにより破壊した（図5E）。これらの安定的に選択された細胞培養物からsgRNA標的配列に隣接するプライマーを用いて生成されたゲノムPCRフラグメントの配列決定は、ミオミキサーORFを破壊する多数のインデル変異を明らかにした（図5F）。
【０１９９】
ミオミキサー遺伝子の破壊は、C2C12細胞および初代マウス筋芽細胞の融合を妨げたが、分化のマーカーであるミオシン重鎖の発現には影響しなかった（図5G〜5Iおよび図1A〜C）。筋核の単核 対 多核細胞の比率の定量は、7日間のDMへの移し替え後に、ミオミキサーsgRNA対により標的とされた筋芽細胞の約89％が単核であったことを示した（図1B）。本発明者らは、ミオミキサーノックアウト（KO）培養物において5つを超える核を有する筋管を観察しなかったのに対して、野生型（WT）培養物における筋核の約82％が、5つを超える核を有する筋管に含まれていた（図1B）。ウェスタンブロット分析は、KO培養物におけるミオミキサータンパク質の非存在を確認した（図5Iおよび1C）。MyoDおよびミオゲニンは、Myh8（ミオシン重鎖8）と同様に、分化したミオミキサーKO細胞において正常に発現され（図5J）、これにより、筋分化に非依存的な筋芽細胞融合の選択的阻止が示された。
【０２００】
マウスミオミキサーのORFは、84アミノ酸長であるマイクロペプチドをコードする（図1D）。このアミノ酸を、アミノ酸24〜84に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析によって検出した（図1C）。ミオミキサーのオルトログは、様々な脊椎動物種間で保存されている（図1D）。ミオミキサーのアミノ酸配列は、おそらく100アミノ酸より小さいORFは典型的に注釈付けされないという理由から、魚類または両生類において注釈付けされていない。しかし、本発明者らは、様々な残基、特に多くのアルギニンおよび両親媒性残基が保存されている魚類、カエルおよびカメのゲノムにおいて、推定ミオミキサーオルトログを同定した（図1D）。様々な種由来のタンパク質は、N末端疎水性セグメント、それに続く正に荷電したヘリックスおよび隣接する疎水性ヘリックスを含む。哺乳動物および有袋動物由来のミオミキサータンパク質はまた、他の生物において失われている特有のC末端ヘリックスを含む（図1D）。
【０２０１】
そのN末端は長い疎水性セグメントを含むので、本発明者らは、それが膜アンカーとして機能している可能性があると推定する。実際、そのC末端にFLAGタグを有するミオミキサーを発現するインタクトなC2C12筋芽細胞の免疫染色は、そのタンパク質が細胞表面上に存在することを明らかにした（図1E）。これらの発見と一致して、膜および細胞質画分へのC2C12筋管の分画により、膜へのミオミキサーの局在化が示された（図1F）。同様に、ミオミキサー発現レトロウイルスを感染させた293細胞において、本発明者らは、このタンパク質が、膜に選択的に局在化することを見いだした（図1F）。
【０２０２】
ミオミキサータンパク質の発現は、C2C12筋芽細胞の分化の間に上方調節され、筋芽細胞融合後に低下した（図6Aおよび図2A）。同様に、ミオミキサーは、筋再生に寄与する、単離されたPax7+衛星細胞およびTwist2+成体マウス前駆細胞の分化の間に強く上方調節された（図2B）。出生前および出生後の筋発生の間に、ミオミキサーの転写物は、E14.5で発現のピークを示し、その後に低下した（図2C）。ウェスタンブロット分析は、E13.5のマウス胚由来の四肢組織におけるおよび出生後第2日の骨格筋におけるミオミキサータンパク質の存在を明らかにし、一方、このタンパク質は、正常なマウスの成体筋肉においてまたは非筋組織において検出不可能であった（図2D)。E12.5およびE15.5のマウス胚切片のインサイチューハイブリダイゼーションは、専ら四肢および体壁を通じた発生期の骨格筋における、ミオミキサーの集中的発現を示した（図2E）。成体筋肉の心臓毒（CTX）損傷に応答して、ミオミキサーの発現が急速に上方調節され、損傷後第3日にピークに達し、その後低下した（図2F）。CTX処理筋肉の免疫染色はまた、再生領域のミオシン陽性筋細胞におけるミオミキサーの堅調な発現を示した（図2G）。筋再生におけるその潜在的役割と一致して、ミオミキサーの発現は、筋ジストロフィーの進行の間に筋変性および筋再生を行うmdxマウスの筋肉において上方調節された（図2H)。
【０２０３】
インビボでの筋形成におけるミオミキサーの関与の可能性を評価するため、本発明者らは、C2C12細胞および初代筋芽細胞においてこの遺伝子を効果的に標的とすることが示された同じsgRNA対を用いたCRISPR-Cas9変異誘発によって、マウス胚発生の間にこの遺伝子を不活性化させた。受精卵に、Cas9 mRNAおよびsgRNAを注射し、その後に偽妊娠雌マウスに移植した。胎生第17.5日（E17.5）に胚を収集し、分析した。分析した65個の胚から、本発明者らは、骨格筋を欠如しているようであり、内部器官および骨が見えるほぼ透明の9個の動かない胚を得た（図3A）。
【０２０４】
四肢、体壁および隔膜筋肉組織にまたがる組織学的切片は、ミオミキサーKO胚における多核化された筋線維の非存在を明らかにした（図3B）。代わりに、推定筋形成領域は、ミオシン発現に関して染色された単核細胞によって形成されていた（図3C）。筋肉以外の組織は、これらの胚において正常なようであった。2つのsgRNAの切断部位は、ミオミキサー遺伝子の第3エクソン内で122塩基対離れていた。この領域を増幅するプライマーを用いたPCRは、異なるインデルを反映する、107〜470 bpの範囲の欠失を含む変異マウスを示した（図3Dおよび図73）。後肢のウェスタンブロットは、KO胚におけるミオミキサータンパク質の非存在を確認した（図3E）。
【０２０５】
ミオミキサー変異マウスの筋肉表現型は、融合性筋タンパク質であるミオメーカー（Millay et al., 2016; 2013）を欠くマウスを連想させるものであり、このことは、筋芽細胞融合のこれらの2つの調節因子の間の機能的相互作用を示唆している。実際、共免疫沈降アッセイにおいて、FLAGタグ付加ミオメーカーは、10T1/2線維芽細胞および分化したC2C12細胞においてミオミキサーと共免疫沈降した（図4A)。
【０２０６】
筋芽細胞融合におけるミオミキサーとミオメーカーの間の機能的相互作用をさらに評価するために、本発明者らは、C2C12筋芽細胞において各タンパク質をレトロウイルスにより発現させ、筋管形成を観察した。図4Bに示されるように、ミオミキサーは、C2C12細胞の融合を大きく亢進した。さらに、ミオミキサーとミオメーカーがC2C12細胞において同時に過剰発現された場合、それらは、多量の多核化筋管の形成を促進し、それらの相乗作用的活性を示した（図4Bおよび図4C）。
【０２０７】
ミオメーカーは、10T1/2線維芽細胞と筋芽細胞の融合を誘導することができる（Millay et al., 2016; 2013）。異種細胞の融合の促進に関してミオミキサーがミオメーカーと協働し得るかどうかを試験するため、本発明者らは、GFP標識10T1/2細胞にミオメーカーおよびミオミキサーレトロウイルスを感染させた（図4D）。着目すべき点として、10T1/2細胞におけるミオミキサーおよびミオメーカーの同時発現は、培養物中にわずかな単核GFP標識線維芽細胞しか残らないような、C2C12筋管への劇的な融合を誘導した（図4E）。ただし、ミオメーカーを発現する10T1/2細胞はC2C12細胞と融合したが、ミオミキサーを発現する10T1/2細胞は、融合しなかった（図4E）。加えて、ミオミキサーまたはミオメーカーの同時の強制発現は、同一細胞でインシス（in cis）発現されようが別々の細胞でイントランス（in trans）発現されようが、10T1/2細胞のみの融合を誘導しなかった（データ示さず）。ウェスタンブロットは、適当な細胞におけるミオメーカーおよびミオミキサーの発現を確認した（図4F）。本発明者らは、他方の発現レベルに対するいずれかのタンパク質の効果を観察せず、このことは、それらの相乗作用が、いずれかのタンパク質の安定性に対する効果を反映したものではないことを示している。融合に関するミオミキサーおよびミオメーカーの効果の要約が、図4Gに示されている。
【０２０８】
細胞融合におけるミオミキサーに対するミオメーカーの機能的依存性を試験するため、本発明者らは、ミオメーカーを発現する10T1/2細胞をWTまたはミオミキサーKO C2C12筋芽細胞と混合し、それらを1週間DMに移し替え、その後にそれらをミオシンに関して染色した。注目すべき点として、ミオメーカーを発現する10T1/2細胞はWT C2C12細胞と融合したが、それらはミオミキサーKO C2C12細胞とは融合することができなかった（図4H）。このことは、ミオメーカーが、イントランスでの細胞融合に関して、ミオミキサーに依存することを暗示している。実際、ミオメーカーは、ミオミキサーKO筋芽細胞および胚において正常に発現され、これにより正常な筋融合および発生におけるミオミキサーに対するミオメーカーの依存性が示唆された（図8）。
【０２０９】
インビボおよびインビトロでの筋芽細胞の融合におけるミオミキサーの必要性、ミオメーカーと共に相乗作用的に融合を促進するその能力、ならびにこれらのタンパク質間の物理的および機能的相互作用は、それらが骨格筋の多核化の重要な工程を支配していることを示している。ミオミキサーとミオメーカーの組み合わせは筋芽細胞への線維芽細胞の融合を劇的に刺激するが、これらのタンパク質は、線維芽細胞のみの融合を誘導することができない（図4G）。したがって、さらなる筋原性パートナーが、筋芽細胞融合の特異性に寄与している可能性がある。
【０２１０】
本発明者らは、ショウジョウバエにおいてミオミキサー関連遺伝子を見出しておらず、これは明白なミオメーカーオルトログも欠いており、このことはミオミキサー・ミオメーカータンパク質協力関係が高等動物の創作であることを示唆している。おそらく、脊椎動物の大きな筋肉の形成が、ショウジョウバエのような単純な生物の基礎的な細胞・細胞融合の上に、この強固な融合機構を必要とする。
【０２１１】
ミオミキサーの小さなサイズは、それを、100アミノ酸未満の未プロセシングORFにより特徴づけられるマイクロペプチドのカテゴリーに収める（Marquez-Medina et al., 2015）。これに関して、特筆すべきことに、今日までに同定されているマイクロペプチドの大部分が膜に埋め込まれているものである（Anderson et al., 2015; 2016）。本発明者らは、ミオミキサーと、心筋細胞の筋小胞体に局在しそこでSERCAカルシウムATPaseに作用しその活性を刺激する（Nelson et al., 2016）心臓特異的マイクロペプチドDWORF（ドワーフオープンリーディングフレーム）の間にいくつかの特筆すべき類似点を見出している。本発明者らは、多くの膜タンパク質の活性が、未だ未解明のマイクロペプチドとの関係によって支配されている可能性があると推測している。
【０２１２】
本願で開示され特許請求される方法および組成物はすべて、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく製造および実施することができる。本開示の組成物および方法は、好ましい態様の観点で記載されているが、本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物ならびに／または方法および該方法の工程もしくは工程の順序に変更が適用され得ることが当業者に理解されるであろう。より詳細に、化学的および生理学的の両面で関連する特定の薬剤が、同一または同様の結果を達成しつつ、本明細書に記載される薬剤と置き換えられ得ることが理解されるであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様の置換物および改変物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０２１３】
X. 参考文献
以下の参考文献は、それらが例示的な手法または本明細書に示されるそれらを補助するその他の詳細を提供する程度まで、個別に参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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