(57)【要約】  本出願は、共有結合的に付着された化合物および共有結合的に付着されたＤＮＡバーコードを伴うビーズ、ならびにかかるビーズの使用方法を提供する。ビーズは、化合物の多くの実質的に同一のコピー、およびＤＮＡバーコードの多くの実質的に同一のコピーを有する。化合物は、１つ以上の化学モノマーからなり、ＤＮＡバーコードは、バーコードモジュールの形態をとり、各モジュールは、対応する、および対応する化学モノマーの特定を可能にする。核酸バーコードは、連鎖状構造または直交性構造を有することができる。ビーズ結合核酸バーコードをシーケンシングする方法、ビーズから化合物を切断する方法、および放出された化合物の生物的活性を評価する方法が提供される。【選択図】図１
2020534872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物をスクリーニングするためのシステムであって、
（ａ）複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から壁によって分離され、前記壁が、前記上部穴と前記床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、
（ｂ）ピコウェル内に配置されるビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、ビーズと、
（ｃ）前記ビーズが、連鎖状ＤＮＡバーコードまたは直交性ＤＮＡバーコードのいずれかの形態をとるビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み、前記ＤＮＡバーコードが、連鎖状ＤＮＡバーコードの形態をとる場合、前記連鎖状ＤＮＡバーコードが、
（ｉ）クリックケミストリーを使用すること、または
（ｉｉ）ステップの繰り返しサイクルを使用することのうちの一方もしくは両方を使用する方法によって作製され、前記ステップの繰り返しサイクルが、部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードとハイブリダイズ可能なスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）を使用することを含み、前記ハイブリダイズが、前記スプリントオリゴ上のアニーリング部位および前記部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードの対応する相補的なアニーリング部位によって媒介され、
アニールされた前記スプリントオリゴが、ＤＮＡポリメラーゼを使用して前記部分的に作製されたＤＮＡバーコードを伸長するための鋳型として使用され、前記スプリントオリゴが、前記部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードに重合されるＤＮＡバーコードモジュールに相補的な塩基を含み、前記スプリントオリゴもまた、前記部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードに重合されるアニーリング部位に相補的な塩基を含むことと、
（ｄ）前記複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各１つずつが、１つ以上の化学ライブラリモノマーを含み、各ビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールが、対応する化学ライブラリモノマーを特定し、「化合物」という用語が、１つ以上の化学ライブラリメンバーを含む完成された生成物を指すために使用され、前記完成されたＤＮＡバーコードが、前記化合物を特定することと、を含む、システム。
【請求項２】
ビーズ結合ＤＮＡバーコードに含まれる１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールのシーケンシングを誘導可能なオリゴヌクレオチドシーケンシングプライマーをさらに含み、任意で、前記システムが、ＤＮＡシーケンシング機器を含み、前記ＤＮＡシーケンシング機器が、発光系シーケンサーではなく、ｐＨ系ＤＮＡシーケンシング機器ではない、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
複数の球状キャップをさらに含み、各キャップが、ピコウェルの前記穴にフィットすることが可能であり、前記穴が、円形であり、各キャップが、前記ピコウェルの内部にある流体の蒸発を最小化するか、または防止することが可能であり、各キャップが、前記ピコウェルの内部にある流体の漏れを最小化するか、または防止することが可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記少なくとも１つのピコウェルに配置される前記少なくとも１つのビーズが、前記少なくとも１つのビーズと結合した少なくとも１つの応答捕捉要素を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
ピコウェル内に配置される前記ビーズの前記少なくとも１つが、
前記少なくとも１つのビーズと結合した少なくとも１つの応答捕捉要素を含み、前記少なくとも１つの応答捕捉要素が、
（ａ）ポリ（ｄＴ）、
（ｂ）エクソン標的化ＲＮＡプローブ、
（ｃ）抗体、または
（ｄ）アプタマーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記ＤＮＡバーコードが、連鎖状ＤＮＡバーコードまたは直交性ＤＮＡバーコードのいずれかであり、前記ＤＮＡバーコードが、１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールを含み、１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールの各々が、化学ライブラリモノマーを特定する情報をコードし、前記連鎖状ＤＮＡバーコードまたは前記直交性ＤＮＡバーコードが、
（ａ）１つ以上の機能性核酸、および
（ｂ）化学ライブラリモノマーの同一性以外の種類の情報をコードする１つ以上の核酸のうちの一方または両方をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記ビーズ結合連鎖状ＤＮＡバーコードが、
（ｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、または
（ｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、および第２のＤＮＡバーコードモジュール、または
（ｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、および第３のＤＮＡバーコードモジュール、または
（ｉｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、および第４のＤＮＡバーコードモジュール、または
（ｉｖ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、および第５のＤＮＡバーコードモジュール、または
（ｖ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、第５のＤＮＡバーコードモジュール、第５のアニーリング部位、および第６のＤＮＡバーコードモジュールを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記ビーズが、直交性ＤＮＡバーコードであるＤＮＡバーコードを含み、前記ビーズが、外面を含み、前記直交性ＤＮＡバーコードが、
（ａ）第１のＤＮＡバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第１の核酸であって、第１の位置で前記ビーズと結合する、第１の核酸と、
（ｂ）第２のＤＮＡバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第２の核酸であって、第２の位置で前記ビーズと結合する、第２の核酸と、
（ｃ）第３のＤＮＡバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第３の核酸であって、前記第２の核酸が第３の位置で前記ビーズと結合する、第３の核酸と、を含み、
前記ビーズ上の前記第１、第２、および第３の位置が、前記ビーズの外面上の異なる位置に各々位置する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記連鎖状ＤＮＡバーコードが、
（ｉ）クリックケミストリーおよび前記スプリントオリゴを使用する前記ステップの繰り返しサイクルの両方、
（ｉｉ）クリックケミストリーおよびクリックケミストリー法ではない化学的方法の両方、
（ｉｉｉ）クリックケミストリーのみ、または
（ｉｖ）前記スプリントオリゴを使用する前記ステップの繰り返しサイクルのみを使用する方法によって作製される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各々が、切断可能なリンカーを介して、または光切断可能なリンカーである切断可能なリンカーを介して、または切断不可能なリンカーを介して前記ビーズと結合される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのビーズが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされている低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトされたコポリマーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
少なくとも１つのピコウェルが、少なくとも１つの細胞を含み、
前記複数の実質的に同一のビーズ結合化合物が、切断可能なリンカーを介して前記少なくとも１つのビーズと結合され、前記切断可能なリンカーを切断することが、前記ビーズから前記ビーズ結合化合物を放出し、放出された化合物を生成し、
前記放出された化合物が、前記少なくとも１つの細胞と接触することが可能であり、前記少なくとも１つの細胞が、
（ｉ）がん細胞ではない哺乳動物細胞、
（ｉｉ）哺乳動物がん細胞、
（ｉｉｉ）死んだ哺乳動物細胞、
（ｉｖ）アポトーシス性の哺乳動物細胞、
（ｖ）ネクローシス性の哺乳動物細胞、
（ｖｉ）細菌細胞、
（ｖｉｉ）マラリア原虫細胞、
（ｖｉｉ）代謝的に活性であるが、架橋されたゲノムを有し、細胞分裂を起こすことが不可能である細胞、または
（ｉｘ）ウイルスに感染した哺乳動物細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から分離され、壁が、前記上部穴と前記床との間に存在し、
前記穴が、円形であり、前記床が、円形であり、前記壁が、円錐台の形態をとり、前記穴が、第１の直径を有し、前記床が、第２の直径を有し、前記第１の直径が、前記第２の直径より大きい、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から分離され、壁が、前記上部穴と前記床との間に存在し、
前記穴が、円形であり、前記床が、円形であり、前記壁が、円錐台の形態をとり、前記穴が、第１の直径を有し、前記床が、第２の直径を有し、前記第１の直径が、前記第２の直径より大きく、
前記穴にぴったりとフィットするキャップをさらに含み、前記穴が、より大きなデュロメータ（より硬い）を有するポリマーにより構成され、前記キャップが、より小さなデュロメータ（より軟らかい）を有するポリマーから作製され、前記キャップおよび穴の相対デュロメータが、前記キャップを可逆的かつぴったりと前記穴にフィットさせることを可能にし、
前記キャップが、
（ｉ）前記ピコウェルに栓をし、漏れを防ぐことのみを目的としたキャップ、
（ｉｉ）受動的キャップであり、細胞培地内の細胞が前記ピコウェル内で培養されている状況で、細胞により放出される代謝産物を吸収することが可能であるキャップ、
（ｉｉｉ）能動的キャップであり、複数の本質的に同一の化合物を含むビーズの形態をとるキャップであって、
前記複数の本質的に同一の化合物の各々が、切断可能なリンカーで前記ビーズと結合される、キャップ、
（ｉｖ）能動的キャップであり、複数の同一の試薬を含むビーズの形態をとるキャップであって、前記複数の本質的に同一の試薬の各々が、切断可能なリンカーで前記ビーズと結合される、キャップである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
少なくとも１つの球状キャップをさらに含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
少なくとも１つの非球状キャップをさらに含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ＤＮＡバーコードが、任意の化学モノマーをコードしないが、代わりに
（ａ）前記ビーズと切断可能に付着している化合物のクラス、
（ｂ）ビーズ結合核酸が、ビーズ結合化合物を作製するために使用される所定の化学モノマーに対応し、所定の化学モノマーに対応する前記ビーズ結合核酸が、その化学モノマーを特定する、有機合成の多段階経路におけるステップ、
（ｃ）前記ビーズ結合化合物が、合成された日、
（ｄ）前記ビーズ結合化合物が、治療を目的とする疾患、
（ｅ）前記ビーズ結合化合物が、刺激もしくは阻害を目的とする細胞性事象、または
（ｆ）所定の化学ライブラリモノマーを前記ビーズと結合するために使用される反応条件のうちの１つ以上を特定する１つ以上の核酸を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記ビーズ結合化合物のいずれかを前記ビーズ結合ＤＮＡバーコードのいずれかと連結する任意のヘッドピースが存在しない、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記連鎖状ＤＮＡバーコードが、ＤＮＡバーコードモジュールである少なくとも１つの核酸、および
（ａ）シーケンシングプライマーのアニーリング部位として使用可能である、
（ｂ）ヘアピン構造を形成することが可能であって、前記ヘアピン構造が、前記ヘアピン構造におけるシーケンシングプライマー、前記シーケンシングプライマーのアニーリング部位、およびビーズを含み、前記ビーズが、前記シーケンシングプライマーに対して５プライムであり、前記シーケンシングプライマーの前記アニーリング部位の３プライムである、ヘアピン構造を形成することが可能である、または
（ｃ）スペーサー核酸である、少なくとも１つの機能性核酸を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記直交性ＤＮＡバーコードが、複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、前記ＤＮＡバーコードモジュールの各々が、直接性またはリンカーを介して、前記ビーズ上の異なる部位と結合され、前記複数のＤＮＡバーコードモジュールの各々が、
（ａ）シーケンシングプライマーのアニーリング部位として使用可能であるもの、
（ｂ）ヘアピン構造を形成することが可能であるものであって、前記ヘアピン構造が、前記ヘアピン構造におけるシーケンシングプライマー、前記シーケンシングプライマーのアニーリング部位、およびビーズを含み、前記ビーズが、前記シーケンシングプライマーに対して５プライムであり、前記シーケンシングプライマーの前記アニーリング部位の３プライムである、ヘアピン構造を形成することが可能であるもの、または
（ｃ）スペーサー核酸である、少なくとも１つの機能性核酸を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
ピコウェル内に存在する溶液中の化合物の濃度を制御する方法であって、前記方法が、ピコウェル内のビーズ結合化合物に適用され、前記ピコウェルが、溶液を含み、前記ビーズ結合化合物が、切断可能なリンカーを介して前記ビーズと結合され、前記方法が、
（ａ）前記ビーズ結合化合物を、前記切断可能なリンカーの切断をもたらす条件に曝露するステップであって、前記条件が、前記切断可能なリンカーを切断することが可能である光を含む、ステップ、
（ｂ）前記ビーズからの前記ビーズ結合化合物の放出を許可し、放出された化合物を生成するステップであって、放出に続いて、前記溶液中の前記放出された化合物の拡散または分散により、前記溶液中の前記化合物の実質的に均一な濃度がもたらされる、ステップ
（ｃ）前記実質的に均一な濃度の決定された濃度を生成するように前記条件を調整するステップであって、前記決定された濃度が、ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度を考慮して実行される、ステップを含む、方法。
【請求項２２】
前記条件が、光の波長、光の強度のうちの１つ以上を調整することによって、および露光の持続期間によって調整され、任意で
（ｉ）ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度が、前記ビーズから前記ビーズ結合化合物の放出をもたらし、放出される化合物を生成すると同時に決定されるか、または
（ｉｉ）ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度が、前記ビーズから前記ビーズ結合化合物の放出をもたらし、放出される化合物を生成する実質的に前の時点で決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数のピコウェルを含むピコウェルプレートと組み合わせたキャップであって、
前記キャップが、前記ピコウェルプレートと共に使用することが可能であり、
前記複数のピコウェルの各々が、穴、床、および壁によって画定可能であり、前記壁が、上部の前記穴および底部の前記床によって画定され、前記穴が、円形であり、前記床が、円形であり、前記壁が、円錐台の表面の形態をとり、
前記穴が、第１の直径を有し、前記床が、第２の直径を有し、前記第１の直径が、前記第２の直径より大きく、
前記キャップが、前記穴にぴったりとフィットすることが可能な球状キャップであり、前記穴が、より大きなデュロメータ（より硬い）を有するポリマーにより構成され、前記キャップが、より小さなデュロメータ（より軟らかい）を有するポリマーから作製され、
前記キャップおよび穴の相対デュロメータが、前記球状キャップを可逆的かつぴったりと前記穴にフィットさせることを可能にし、前記キャップが、
（ｉ）前記ピコウェルに栓をして漏れを防ぐことが可能であり、
（ｉｉ）受動的キャップであり、細胞培地内の細胞が前記ピコウェル内で培養されている状況で、細胞より放出される代謝産物を吸収することが可能であり、
（ｉｉｉ）能動的キャップであり、複数の本質的に同一の化合物を含むビーズの形態をとり、
前記複数の本質的に同一の化合物の各々が、切断可能なリンカーでビーズと結合され、前記複数のピコウェルの少なくとも１つが、水性培地を含み、前記切断可能なリンカーの切断が、前記ビーズから前記複数の本質的に同一の化合物の少なくともいくつかを前記水性培地に放出する、キャップ。
【請求項２４】
一般的に平面である上部、複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から壁によって分離され、前記壁が、前記上部穴と前記床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、
任意で、前記複数のピコウェルの少なくとも１つに配置されるビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、ビーズと、を含むシステムであって、
前記ピコウェルアレイプレートが、前記複数のピコウェルの少なくとも１つもしくは全ての上部にある前記開口を確実に覆うか、または前記複数のピコウェルの少なくとも１つもしくは全ての上部にある前記開口を事実上確実に覆うことが可能であるマットをさらに含み、前記確実に覆うことが、可逆的であり、前記マットが、任意で
（ａ）前記ピコウェルアレイプレートの前記上部の一般的な平面と接触して配置された場合に、前記複数のピコウェルの１つ以上に含まれ得る任意の代謝物、生化学物質、またはタンパク質を吸収可能である吸収面、
（ｂ）前記ピコウェルアレイプレートの前記上部の一般的な平面との可逆的な接着を維持可能である接着面のうちの１つまたは全てを含む、システム。
【請求項２５】
アッセイからのシグナルおよびビーズ上のシーケンシングの読み出しを決定し、それにより前記アッセイから目的の１つ以上の化合物を特定する方法であって、
（ａ）複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、実質的に互いに関連している前記ビーズに付着した複数の化合物、および複数のオリゴヌクレオチドを含み、各ビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドが、同じビーズに付着した前記複数の化合物を特定する、提供するステップと、
（ｂ）前記ビーズに付着した前記複数の化合物を伴う前記アッセイを実行するステップと、
（ｃ）ステップｂの前記アッセイにおける前記化合物の性能を反映する少なくとも１つのシグナルを決定するステップと、
（ｄ）前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを除去することなく、前記ビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングし、それにより各ビーズのシーケンシングの読み出しを決定するステップと、
（ｅ）ステップｄの前記シーケンシングの読み出しによって前記ビーズに付着した前記化合物を特定し、それをステップｃの前記決定されたシグナルに含まれるアッセイ性能と関連付けすることであって、前記アッセイおよび前記シーケンシングの読み出しからのシグナルを有するビーズが、目的の前記化合物を特定する、関連付けするステップと、を含む、方法。
【請求項２６】
所望される特性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングする方法であって、
（ａ）複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、前記ビーズ表面に付着した複数のオリゴヌクレオチド、および前記ビーズ表面に付着した複数の実質的に関連する化合物を含み、前記ビーズに付着した前記オリゴヌクレオチドの配列が、前記ビーズ表面に付着した前記複数の実質的に関連する化合物の同一性をコードする、提供することと、
（ｂ）前記化合物ライブラリ内の化合物の所望される特性についてのアッセイに前記複数のビーズを組み込むことと、
（ｃ）少なくとも１つのビーズからのシグナルを捕捉することであって、前記シグナルが、前記アッセイにおける前記ビーズ上の前記化合物の性能を反映する、捕捉することと、
（ｄ）前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを除去することなく、アッセイシグナルがさらに捕捉された前記少なくとも１つのビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングすることと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記シーケンシングの読み出しから少なくとも１つの化合物を特定し、それをステップ（ｃ）の前記シグナルで捕捉された対応するアッセイ性能と関連付けすることとを含む、方法。
【請求項２７】
各ビーズが、異なる複数のオリゴヌクレオチドおよび異なる複数の実質的に関連する化合物を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の化合物が、複数の化合物構成要素をタンデムに連結することにより、前記ビーズ表面に付着され、前記化合物構成要素のすべてが、前記化合物を一緒に構成する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
各ＤＮＡモジュールおよび各化合物構成要素が、経時的および代替的に組み立てられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
複数の同一の化合物中の各化合物が、切断可能なリンカーを介して前記ビーズ表面に付着される、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカー、または酸切断可能なリンカーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、ステップ（ａ）の後およびステップ（ｄ）の前に前記ビーズ表面から切断される、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物の前記所望される特性を反映する前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
各ビーズのサイズが、１μｍ〜１００μｍである、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
各ビーズのサイズが、１μｍ〜１０μｍである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
各ビーズのサイズが、約３μｍである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、複数の潜在的な標的中の標的候補を特定することをさらに含み、前記所望される特性を有する前記化合物が、前記標的候補と結合する、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）が、前記複数の潜在的な標的中で前記複数のビーズをインキュベートすることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記潜在的な標的が、タンパク質または核酸である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記シーケンシングが、単一分子リアルタイムシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンス、合成によるシーケンシング、ブリッジ増幅によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、鎖終結シーケンシング、超並列シグネチャシーケンシング、ポロニーシーケンシング、ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、ショットガンシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イルミナシーケンシング、トンネル電流ＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析を用いたシーケンシング、マイクロ流体サンガーシーケンシング、およびオリゴヌクレオチド伸長シーケンシングにより実行される、請求項２５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
所望される特性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングする方法であって、
（ａ）複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、前記ビーズ表面に付着した複数のオリゴヌクレオチド、および前記ビーズ表面に付着した複数の実質的に関連する化合物を含み、前記ビーズに付着した前記オリゴヌクレオチドの配列が、前記ビーズ表面に付着した前記複数の実質的に関連する化合物の合成履歴をコードする、提供することと、
（ｂ）前記化合物ライブラリ内の化合物の所望される特性についてのアッセイに前記複数のビーズを組み込むことと、
（ｃ）少なくとも１つのビーズからのシグナルを捕捉することであって、前記シグナルが、前記アッセイにおける前記ビーズ上の前記化合物の性能を反映する、捕捉することと、
（ｄ）前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを除去することなく、アッセイシグナルがさらに捕捉された前記少なくとも１つのビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングすることと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記シーケンシングの読み出しから少なくとも１つの化合物を特定し、それをステップ（ｃ）の前記シグナルで捕捉された対応するアッセイ性能と関連付けすることと、を含む、方法。
【請求項４３】
前記アッセイが、結合アッセイを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アッセイが、活性アッセイを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記アッセイが、競合結合アッセイまたは競合阻害アッセイを含む、請求項４２、４３、または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アッセイが、非接続化合物と他のアッセイ試薬との相互作用を含み、前記非接続化合物が、前記ビーズ表面から放出された化合物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、前記化合物を前記ビーズに接続する切断可能なリンカーを切断することにより放出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記アッセイが、複数の制限された容積内で発生し、名目上の１つのビーズが、制限された容積ごとに分散される、請求項４２〜４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記制限された容積が、水性液滴を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記水性液滴が、油媒体または疎水性液体媒体中に懸濁される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記制限された容積が、ピコウェルを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ピコウェルが、規則的なアレイに組織化される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数の制限された容積が、規則的なアレイに組織化される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記制限された容積が、前記ビーズの周囲に接着した水性媒体の層を含み、前記ビーズが、疎水性媒体に懸濁される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記アッセイ試薬が、前記オリゴヌクレオチドをシーケンシングする前に洗い流される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
前記シーケンシングステップ（ｄ）が、前記アッセイステップ（ｂ）の前に実行される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
前記ビーズ上の前記オリゴヌクレオチドが、前記シーケンシングステップの後であるが、前記アッセイステップの前に除去される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記オリゴヌクレオチドの前記除去が、酵素消化、化学的切断、熱分解、または物理的剪断を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記結合アッセイが、ＲＮＡ分子の前記ビーズとの結合を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６０】
前記ビーズからの前記シグナルが、結合したＲＮＡ分子のシーケンシングを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６１】
前記結合アッセイが、蛍光標識された結合アッセイを含み、前記ビーズ上の前記化合物と結合する分子が、フルオロフォアを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６２】
前記結合アッセイが、核酸標識された結合アッセイを含み、前記ビーズ上の前記化合物と結合する分子が、核酸タグを含み、前記アッセイからの前記シグナルが、前記ビーズ上の前記化合物と結合する分子に付着した前記核酸タグのシーケンシングをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６３】
前記所望される特性が、
（ｉ）酵素の触媒活性を阻害または刺激すること、
（ｉｉ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ１型免疫応答を刺激すること、
（ｉｉｉ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ２型免疫応答を刺激すること、
（ｉｖ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ１型免疫応答を阻害すること、
（ｖ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ２型免疫応答を阻害すること、
（ｖｉ）精製されたタンパク質、細胞系アッセイ、または生体内アッセイにより測定可能な、タンパク質のユビキチン媒介分解を刺激または阻害することのうちの１つ以上を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
所望される活性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングするためのシステムであって、
（ａ）複数の化合物が付着し、オリゴヌクレオチドがコードされたビーズを受け入れるための試料区画と、
（ｂ）前記試料区画内の複数のカプセル化区画であって、各カプセル化区画が、名目上、アッセイ媒体中に分散された単一のビーズを含み、さらに前記アッセイ媒体が、前記ビーズ上の前記化合物との相互作用がアッセイされ、測定可能なシグナルをもたらす試薬を含む、複数のカプセル化区画と、
（ｃ）シグナルを測定するための検出器と、
（ｄ）シーケンシングプラットフォームと、
（ｅ）ユーザーから１つ以上のコマンドを受信するためのユーザーインターフェイスと、を含む、システム。
【請求項６５】
前記カプセル化区画が、液滴を含む、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
前記カプセル化区画が、ピコウェルを含む、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６７】
さらに前記カプセル化区画が、アッセイ試薬を含む、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６８】
前記検出器が、光学検出器を含む、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６９】
前記シーケンサーが、光学検出器を含む、請求項６４に記載のシステム。
【請求項７０】
細胞を摂動させる方法であって、
（ａ）核酸にコードされた摂動を提供し、前記核酸にコードされた摂動で細胞を制限することと、
（ｂ）前記細胞を、制限された容積内で前記核酸にコードされた摂動と接触させることであって、前記摂動の開始および用量が、制御される、接触させることと、
（ｃ）前記細胞を、前記核酸をコードした摂動と共に特定の期間インキュベートすることと、
（ｄ）前記核酸にコードされた摂動をコードする前記核酸を前記細胞に移入することと、を含む、方法。
【請求項７１】
前記核酸にコードされた摂動が、核酸にコードされた化合物または薬物分子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記核酸にコードされた摂動が、ＤＮＡにコードされたライブラリである、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記摂動および前記摂動をコードする前記核酸が、溶液中に付着しておらず、遊離している、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記摂動および前記摂動をコードする前記核酸が、互いに付着している、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記摂動および前記摂動をコードする前記核酸が、同じ基質に付着しているが、互いに付着していない、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記摂動の前記基質への付着および前記核酸の前記基質への付着が、切断可能な付着である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記切断可能な付着が、光切断可能な付着、温度で切断可能な付着、ｐＨ感受性付着、酸で切断可能な付着、塩基で切断可能な付着、音で切断可能な付着、塩で切断可能な付着、レドックス感受性付着、または物理的に切断可能な付着からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞および前記摂動を制限することが、液滴カプセル化、エマルジョンカプセル化、ピコウェルカプセル化、マクロウェルカプセル化、物理的付着、気泡カプセル化、またはマイクロ流体制限を含む、請求項７０〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記摂動にわたる制御が、光曝露を制御する、温度曝露を制御する、ｐＨ曝露を制御する、時間曝露を制御する、音曝露を制御する、塩曝露を制御する、化学的もしくは物理的レドックス電位を制御する、または機械的撹拌暴露を制御することを含む、請求項７０〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記インキュベーションが、前記摂動を前記基質から切断した後、または前記核酸を前記基質から切断した後に、前記細胞を前記摂動に曝露することを含む、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記インキュベーションが、前記摂動を前記基質から切断することなく、または前記核酸を前記摂動から切断することなく、前記細胞を前記摂動に曝露することを含む、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸にコードされた摂動をコードする前記核酸を前記細胞に移入することが、前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることを含む、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることが、前記核酸を前記細胞膜に挿入することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることが、前記核酸を細胞表面上の生体分子に付着させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記生体分子が、タンパク質または炭水化物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることが、前記核酸上の任意のタグを介して付着することを含む、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
摂動で細胞を摂動し、前記摂動の同一性で前記細胞をコードする方法であって、
（ａ）ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリを提供することと、
（ｂ）前記ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリで細胞を制限することであって、前記ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリが、コンビナトリアル合成された化合物の１つ以上のコピーおよびコード化核酸タグの１つ以上のコピーを含み、前記化合物および前記コード化核酸が、ビーズに付着され、前記コード化核酸が、前記化合物の同一性をコードし、前記ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリおよび前記細胞が、制限化容積に制限される、制限することと、
（ｃ）前記ビーズから前記化合物を放出し、前記化合物を前記細胞と共に前記制限化容積内でインキュベートすることと、
（ｄ）任意で、前記コード化核酸タグを前記ビーズから放出することと、
（ｅ）前記コード化核酸タグを前記細胞に付着させ、それにより、前記細胞に付着された前記コード化核酸タグを介して前記化合物の同一性を維持することと、を含む、方法。
【請求項８８】
細胞を摂動し、前記摂動の同一性で前記細胞をコードし、前記摂動に対する前記細胞の応答を測定する方法であって、
（ａ）細胞を、第１の制限された容積内でビーズ結合ＤＮＡコード化ライブラリと接触させることであって、前記ビーズ結合ＤＮＡコード化ライブラリが、コンビナトリアル合成された化合物の１つ以上のコピーおよびコード化核酸タグの１つ以上のコピーを含み、前記化合物および前記コード化核酸が、ビーズに付着され、前記コード化核酸が、前記化合物の同一性をコードする、接触することと、
（ｂ）ライブラリ内の前記化合物を前記ビーズから放出し、前記ライブラリ内の前記化合物を前記第１の制限された容積内の前記細胞と共にインキュベートすることと、
（ｃ）任意で、前記第１の制限された容積内の前記ビーズから前記コード化核酸タグを放出することと、
（ｄ）前記コード化核酸タグを、前記細胞の細胞表面に捕捉し、それにより、前記細胞が、前記ライブラリ内の前記化合物に曝露され、曝露された前記化合物の同一性が、細胞表面上に捕捉されることと、
（ｅ）前記第１の制限された容積から前記細胞を放出することであって、前記コード化核酸タグが、前記細胞に付着され、前記コード化核酸タグが、前記細胞が曝露される前記化合物の同一性をコードする、放出することと、
（ｆ）以前に摂動され、核酸でタグ付けされた細胞を、第２の制限された容積内の応答検出ビーズで捕捉することであって、前記細胞が、前記細胞の細胞内容物を応答捕獲ビーズに曝露する溶解条件に曝露され、前記応答捕獲ビーズが、前記細胞内容物を捕獲する捕獲プローブ、および前記以前に摂動され、核酸でタグ付けされた細胞における前記摂動をコードする核酸タグを含む、捕捉することと、
（ｇ）前記応答捕捉ビーズを、前記第２の制限された容積内の溶解された細胞と共にインキュベートし、それにより、細胞内容物および前記応答捕捉ビーズへの前記摂動をコードする前記核酸タグの両方を捕捉することと、
（ｈ）任意で、前記摂動に対する前記細胞の前記応答を、核酸シグナルに変換することであって、前記摂動に対する前記細胞の前記応答が、核酸シグナルではない、変換することと、
（ｉ）前記応答捕獲ビーズに付着された前記核酸タグをシーケンシングし、それにより、前記摂動の同一性を前記摂動に対する前記細胞の前記応答に相関させることと、を含む、方法。
【請求項８９】
細胞を摂動させ、前記摂動に対する前記細胞の応答を捕捉する方法であって、
（ａ）ピコウェルのアレイおよび機能化された摂動ビーズのライブラリを提供することであって、前記ピコウェルが、単一の細胞および単一の機能化された摂動ビーズを収容可能であり、各機能化された摂動ビーズが、異なる複数の実質的に同一の放出可能な化合物および前記化合物をコードする複数のヌクレオチドバーコードを含み、前記ヌクレオチドバーコードが、前記細胞の細胞内容物を捕捉可能な機能化されたバーコードであり、細胞の前記細胞内容物が、前記機能化された摂動ビーズに含まれる前記摂動に対する細胞応答を含む、提供することと、
（ｂ）前記ピコウェルアレイの各ピコウェルに単一の細胞を捕捉することと、
（ｃ）単一の機能化された摂動ビーズを、単一の細胞を含む前記ピコウェルに捕捉することと、
（ｄ）前記機能化された摂動ビーズから前記化合物を放出し、前記放出された化合物と共に前記細胞をインキュベートすることであって、前記ピコウェル間の化合物が、最小限の拡散を有する、インキュベートすることと、
（ｅ）前記細胞を溶解して前記細胞内容物を放出することと、
（ｆ）前記機能化された摂動ビーズ上の機能化されたオリゴヌクレオチド上に前記細胞内容物の１つ以上の成分を捕捉することであって、前記捕捉することが、ヌクレオチドバーコードを前記細胞内容物の核酸要素と組み合わせるためのハイブリダイゼーションおよび酵素的伸長を含み、それにより、前記ヌクレオチドバーコードおよび前記細胞内容物の前記核酸要素のハイブリッドを形成する、捕捉することと、
（ｇ）前記ハイブリッドを放出し、機能化された摂動ビーズの前記ライブラリから前記ハイブリッドを収集し、前記ハイブリッドをシーケンシングし、それにより、前記摂動を、前記摂動に対する前記細胞応答に関連付けることと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、化合物のライブラリを使用するハイスループットスクリーニングに関し、化合物は、ビーズと結合されているか、またはビーズ内に含まれており、各ビーズは、１種類の化合物の複数のコピーを含み、さらに、ビーズは、ビーズ内またはビーズ上に含まれる化合物の同一性または合成履歴をコードするＤＮＡタグも含む。本開示はまた、ピコウェル内で実行されるハイスループットアッセイに関し、ピコウェルは、化合物を負荷したビーズおよびアッセイ材料を含む。本開示はさらに、ビーズ結合化合物を放出し、それらを生物学的活性についてスクリーニングすることに関する。概して、本開示は、ビーズが化合物の送達ビヒクルとして使用されるアッセイ、およびかかる化合物を負荷したビーズを作製する方法を企図する。
【０００２】
本開示は、ビーズ結合化合物に関し、各化合物は、化学ライブラリに属する１つ以上のモノマーから作製される。本開示はまた、ビーズ結合ＤＮＡバーコード、すなわち、各核酸の配列がコードである核酸（遺伝コードに関連しない）が１つの特定の化学ライブラリモノマーを指すことに関する。本開示はさらに、ビーズ結合化合物を放出し、次いで放出された化合物を生物活性についてスクリーニングすることに関する。
【０００３】
本開示はまた、一般に、用量制御された化合物を用いて細胞または少数の細胞を摂動させ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質分析によって細胞の状態の変化を分析するための方法に関する。本明細書に開示される方法は、ハイスループットスクリーニング、標的探索、または診断、および他の同様な用途の目的で、単一細胞レベルで、または複数の細胞に適用され得る。
【０００４】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５６２，９０５号、および２０１７年９月２５日にさらに出願された米国仮特許出願第６２／５６２，９１２号の利益ならびに優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
例えば、スプリットプールケミストリーを伴う、コンビナトリアルケミストリーは、大量の化合物を合成するために使用できる。この方法で作製された化合物は、医薬品化学の分野での使用を見出し、化合物は、様々な生化学的活性についてスクリーニングすることができる。これらの活性には、１つ以上のタンパク質との結合が含まれ、タンパク質は、スクリーニング試験が実行される時点で既知である。代替的に、試験されている化合物によって結合されるタンパク質は、結合事象が検出された後にのみ特定される。化合物は、既知のタンパク質を阻害または活性化するそれらの活性についてスクリーニングすることもできる（これは単に「結合」活性をスクリーニングするだけではない）。代替的に、化合物は、細胞機能を阻害または活性化するそれらの活性についてスクリーニングすることができ、分子標的は、スクリーニングの時点で研究者に知られていない。
【０００６】
スプリットプール法によって作製された化学物質の膨大なライブラリに属する化合物などの化合物のスクリーニングは、数千のマイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルのアレイを用いてスクリーニングを実施することにより容易にできる。さらに、ビーズを介して各ピコウェルに異なる化合物を提供することにより、スクリーニングを容易にすることができ、各ビーズは、同じ化合物の何百ものコピーを含み、同じビーズは、何百もの「ＤＮＡバーコード」のコピーをさらに含み、これを使用して、同じビーズと結合している化合物を特定できる。さらに、切断可能なリンカーを使用することにより、化合物のスクリーニングがさらに容易になり、切断可能なリンカーは、ビーズからの化合物の制御された放出を可能にし、その後、放出された化合物は、同じピコウェル内で生化学アッセイまたは細胞系アッセイに使用される。
【０００７】
液滴、ピコウェル、またはマイクロ流体環境などの非常に小さな制限された容積で化合物をアッセイすることは、例えば、必要とされるアッセイ試薬の量が少ないために広く有益であり、したがって、コンビナトリアルケミストリーで生成される化合物に対して限定する必要がない。化合物をビーズに負荷でき、後の時点で化合物をビーズから溶出できる任意の方法は、ビーズ結合化合物を少量の制限された容積におけるアッセイに送達するために使用され得る。ビーズへの核酸バーコードの追加により、ビーズ内に存在する化合物の同一性をアッセイ容積に沿って運搬できる。方法では、マイクロタイタープレート内の化合物のロボット工学または空間インデックス化を必要とせずに、非常に速いスループットアッセイが実行され得る。数百万から数十億の化合物が、１つの小さなバイアル内に保持され得、化合物の同一性は、各個々の化合物を含む同じビーズにタグ付けされる。
【０００８】
創薬の一般的な方法は、目的の標的を選択し、標的タンパク質または酵素と化合物の大規模なライブラリとの相互作用をモニタリングすることを伴う。多くの場合、多数の初期ヒットが身体に有毒であるか、体内の他のタンパク質と交差反応し、標的ベースの選択が薬物スクリーニングの非効率的な方法を示す。事前に選択された標的の必要性も固有の制限であり、これは、疾患の生物学的基盤が周知であり理されている必要があるためである。生物全体に対する化合物のスクリーニングは困難であり、費用がかかり、非常に低いスループット作業である。
【０００９】
細胞での従来の表現型スクリーニングには、疾患状態細胞のモデルの作製、細胞と様々な薬物ライブラリとの接触、および測定可能なアッセイによって疾患の表現型が修正されるかについてのモニタリングを伴う。根本的な生物学的メカニズムが最初に理解されているとは限らないため、かかるスクリーニング方法は表現型スクリーニングと称されるが、治癒応答を示す測定可能な表現型の変化は、関連するメトリックと見なされる。現在、様々なベースラインおよび病変細胞状態を反映する膨大な数の細胞株および疾患モデルが利用可能である。また、多数の化合物ライブラリおよび生物学的薬物候補も利用可能である。アッセイがマイクロタイタープレート形式および撮像法に限定されているため、表現型の応答を探すために、異なる細胞モデルと異なる薬物候補とを組み合わせた明白なスクリーニングキャンペーンには、技術的な制限があり、どちらもスループットが大幅に制限される。
【００１０】
スループットの制限を克服する１つの方法は、創薬にハイスループットの単一細胞スクリーニングアプローチを採用することである（例えば、Ｈｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１５：２０４−２１６，２０１６を参照されたい）。これらのアプローチは、単一の細胞が、区画に分離および単離され、個々のアッセイが、細胞の各々で実行できる。例えば、液滴カプセル化などを使用した単一細胞のｍＲＮＡシーケンシングによるゲノム解析は、アンサンブル測定に隠されている複雑な詳細を明らかにする一般的な方法である（例えば、Ｍａｃｏｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６１：１２０２−１２１４，２０１５、およびＺｉｅｇｅｎｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６５：６３１−６４３，２０１７を参照し、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。現状技術の単一細胞分析プラットフォームは、単一細胞分解能でｍＲＮＡ転写産物の定量が可能とされており、その転写状態に基づいて細胞を特徴付け、フィンガープリントする。このアプローチにより、対照から抽出された、または実験で準備された組織サンプル間の比較、および単一細胞の転写、したがってタンパク質の発現状態の検査が可能となる。トランスクリプトームシーケンシングおよびプロファイリングによる単一細胞ｍＲＮＡの測定は、疾患進行中の細胞の系統的表現型だけでなく、薬効、耐性、および治療標的の発見の分子メカニズムを調査するための重要なアプローチである（例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３３：８３−９７，２０１７、Ｗａｎｇ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３２：３５９−３６１，２０１６、およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３３：４２３−４２７，２０１７を参照されたい）。単一細胞ＲＮＡシーケンシングのアプリケーションは、トランスクリプトームの細胞間変動によって証明される細胞間不均一性を定義するために使用され、これは、薬物の有効性および特異性、転写確率、トランスクリプトームの可塑性、ならびにゲノムの進化と非常に関連している。ピコウェル内へのカプセル化も実証されている（例えば、Ｇｉｅｒａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：３９５−３９８，２０１７を参照されたい）。同様の単離法を使用して、単一細胞タンパク質の測定も可能である（Ｂｕｔｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，Ｊａｎ．２０１７，Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １７：３−４，２０１７）。
【００１１】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１、１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ、または１ＣｅｌｌＢｉＯシステムなどの自動化されたプラットフォームの商品化されたバージョンを含む、ハイスループットの単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）法の急速な増加にもかかわらず、標的にとらわれないハイスループット薬物スクリーニングおよび標的探索のための単一細胞ＲＮＡプロファイリングの適用は、異なる薬物を異なる細胞に効率的に分割できる方法の欠如によって制約される。ウェルプレート内の異なる摂動下で細胞または組織をインキュベートし、続いて単一細胞分析および転写プロファイル間の比較を行うことができるが、検査できる薬剤の数はプレートの容量によって制限される。さらに、各試料からバーコード化されたｍＲＮＡを単離して調整し、すべての試料に対して包括的なＲＮＡプロファイルを実行する必要があるため、大きなボトルネックも生じる。
【発明の概要】
【００１２】
簡単に述べると、本開示は、化合物をスクリーニングするためのシステムであって、（ａ）複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、上部穴が、床から分離され、壁が、上部穴と床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、（ｂ）ピコウェル内に配置されるビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、ビーズと、（ｃ）ビーズが、連鎖状ＤＮＡバーコードまたは直交性ＤＮＡバーコードのいずれかの形態をとるビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み、ＤＮＡバーコードが、連鎖状ＤＮＡバーコードの形態をとる場合、連鎖状ＤＮＡバーコードが、（ｉ）クリックケミストリーを使用すること、または（ｉｉ）ステップの繰り返しサイクルを使用することの方法によって作製され、ステップの繰り返しサイクルが、部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードとハイブリダイズ可能なスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）を使用することを含み、ハイブリダイズが、スプリントオリゴ上のアニーリング部位および部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードの対応する相補的なアニーリング部位によって媒介され、アニールされたスプリントオリゴが、ＤＮＡポリメラーゼを使用して部分的に作製されたＤＮＡバーコードを伸長するための鋳型として使用され、スプリントオリゴが、部分的に作製されたＤＮＡバーコードに重合されるＤＮＡバーコードモジュールに相補的な塩基を含み、（ｄ）複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各１つずつが、１つ以上の化学ライブラリモノマーを含み、各ビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールが、対応する化学ライブラリモノマーを特定し、「化合物」という用語が、１つ以上の化学ライブラリメンバーを含む完成された生成物を指すために使用され、完成されたＤＮＡバーコードが、化合物を特定することと、を含む、システムを提供する。
【００１３】
マイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルの床は、平坦である必要はない。床は、ガラス試験管または金属遠心管の底のように湾曲し得る。また、床は、円錐形遠心管のように、円錐形の形状であり得る。床は、平坦であり得るが、ノッチ、例えば、ピコウェルに位置する任意のビーズの底部の近傍でアッセイ溶液または細胞培養溶液の挙動を容易にするノッチを備え得る。平坦な床の実施形態において、本システムおよび方法は、平坦な床を必要とし得る。
【００１４】
連鎖状ＤＮＡバーコードは、有機化学の方法、例えば、クリックケミストリーにより完全に作製できる。また、直交性ＤＮＡバーコードは、例えば、クリックケミストリーを含む有機化学の方法により完全に作製できる。
【００１５】
さらに提供されるのは、複数のキャップをさらに含み、複数のキャップをさらに含み、各キャップが、異なるピコウェルの開口にフィットすることが可能であり、各キャップが、ピコウェルの内部にある流体の蒸発を最小化するか、または防止することが可能であり、ピコウェルの内部にある流体の漏れを最小化するか、または防止することが可能である、上記のシステムである。
【００１６】
さらに、包括されるのは、連鎖状ＤＮＡバーコードが、（ｉ）クリックケミストリーおよびスプリントオリゴを使用するステップの繰り返しサイクルの両方、（ｉｉ）クリックケミストリーおよびクリックケミストリー法ではない化学的方法の両方、（ｉｉｉ）クリックケミストリーのみ、または（ｉｖ）スプリントオリゴを使用するステップの繰り返しサイクルのみを使用する方法によって作製される、上記のシステムである。この特定の実施形態の場合、問題の「連鎖状ＤＮＡバーコード」は、核酸をビーズに直接的に結合するために使用される任意の化学カプラーを含まない。
【００１７】
球状キャップの実施形態において、提供されるのは、複数の球状キャップをさらに含み、各キャップが、ピコウェルの穴にフィットすることが可能であり、穴が、円形であり、各キャップは、ピコウェルの内部にある流体の蒸発を最小化するか、または防止することが可能であり、各キャップが、ピコウェルの内部にある流体の漏れを最小化するか、または防止することが可能である、上記のシステムである。
【００１８】
応答要素の実施形態において、提供されるのは、少なくとも１つのピコウェルに配置される少なくとも１つのビーズは、該少なくとも１つのビーズと結合した少なくとも１つの応答捕捉要素を含む、上記のシステムである。また、企図されるのは、少なくとも１つのピコウェルに配置される少なくとも１つのビーズは、該少なくとも１つのビーズと結合した少なくとも１つの応答捕捉要素を含み、少なくとも１つの応答捕捉要素は、（ａ）ポリ（ｄＴ）または（ｂ）エクソン標的化ＲＮＡプローブを含む、上記のシステムである。
【００１９】
また、企図されるのは、ＤＮＡバーコードが、連鎖状ＤＮＡバーコードまたは直交性ＤＮＡバーコードのいずれかであり、ＤＮＡバーコードが、１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールを含み、１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールの各々が、化学ライブラリモノマーを特定する情報をコードし、連鎖状ＤＮＡバーコードまたは直交性ＤＮＡバーコードが、（ａ）１つ以上の機能性核酸、および（ｂ）化学ライブラリモノマーの同一性以外の種類の情報をコードする１つ以上の核酸のうちの一方または両方をさらに含む、上記のシステムである。
【００２０】
以下は、「のみからなる」実施形態および「含む」実施形態を開示し、これは、ＤＮＡバーコードを構成するビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールの数に適用される。提供されるのは、１つのＤＮＡバーコードモジュールのみ、もしくは２つのＤＮＡバーコードモジュールのみ、もしくは３つのＤＮＡバーコードモジュールのみからなる、もしくは４つのＤＮＡバーコードモジュールのみなどからなるＤＮＡバーコードの実施形態であるか、またはＤＮＡバーコードは、少なくとも１つのＤＮＡバーコードモジュールを含む、もしくは少なくとも２つのＤＮＡバーコードモジュールを含む、または少なくとも３つのＤＮＡバーコードモジュールを含む、または少なくとも４つのＤＮＡバーコードモジュールなどを含む。
【００２１】
さらに、包括されるのは、ビーズ結合連鎖状ＤＮＡバーコードが、（ｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、および第２のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、および第３のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、および第４のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉｖ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、および第５のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｖ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、第５のＤＮＡバーコードモジュール、第５のアニーリング部位、および第６のＤＮＡバーコードモジュールを含む、システムである。
【００２２】
さらに、企図されるのは、ＤＮＡシーケンシングプライマーに結合可能なプライマー結合部位をさらに含む、上記のシステムであり、該プライマー結合部位は、１つ以上の第１のＤＮＡバーコードモジュール、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第５のＤＮＡバーコードモジュール、もしくは第６のＤＮＡバーコードモジュールのシーケンシングを指示することが可能であり、プライマー結合部位は、第１のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、第２のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、第３のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、第４のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、第５のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、もしくは第６のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライムに位置し、またはプライマー結合部位は、第１および第２のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、もしくは第２および第３のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、もしくは第３および第４のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、もしくは第４および第５のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、もしくは第５および第６のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置する。
【００２３】
さらに、提供されるのは、プライマー結合部位が、第１および第２のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、または第２および第３のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、または第３および第４のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、または第４および第５のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置し、または第５および第６のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置する、上記のシステムを含む。上流のＤＮＡバーコードモジュールに関連する、および下流のＤＮＡバーコードモジュールに関連するプライマー結合部位の位置に関する実施形態において、提供されるのは、プライマー結合部位が、連続するＤＮＡバーコードモジュールの各ペアおよびすべてのペアの間に位置する、上記のシステムである。
【００２４】
さらに、提供されるのは、ビーズが、直交性ＤＮＡバーコードであるＤＮＡバーコードを含み、ビーズが、外面を含み、直交性ＤＮＡバーコードが、（ａ）第１のＤＮＡバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第１の核酸であって、第１の位置でビーズと結合する、第１の核酸と、（ｂ）第２のＤＮＡバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第２の核酸であって、第２の位置でビーズと結合する、第２の核酸と、（ｃ）第３のＤＮＡバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第３の核酸であって、第２の核酸が第３の位置でビーズと結合する、第３の核酸と、を含み、ビーズ上の第１、第２、および第３の位置が、ビーズの外面上の異なる位置に各々位置する、上記のシステムである。
【００２５】
コード化の実施形態において、提供されるのは、ＤＮＡバーコードが、任意の化学ライブラリモノマーを特定しないが、代わりに、（ａ）ビーズと切断可能に付着している化合物のクラス、（ｂ）有機合成の多段階経路におけるステップ数、（ｃ）ビーズ結合化合物が、合成された日、（ｄ）ビーズ結合化合物が、治療を目的とする疾患、（ｅ）ビーズ結合化合物が、刺激もしくは阻害を目的とする細胞性事象、または（ｆ）所定の化学ライブラリモノマーをビーズと結合するために使用される反応条件を特定する１つ以上の核酸を含む、上記のシステムである。
【００２６】
リンカーの実施形態において、提供されるのは、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各々が、切断可能なリンカーを介してビーズに結合される、上記のシステムである。また、提供されるのは、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各々が、光切断可能なリンカーを介してビーズに結合される、上記のシステムである。また、提供されるのは、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各々が、切断不可能なリンカーを介してビーズに結合される、上記のシステムである。
【００２７】
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）の実施形態において、提供されるのは、少なくとも１つのビーズが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされている低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトされたコポリマーを含む、上記のシステムである。
【００２８】
放出モニターの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのピコウェルが、放出モニタービーズを含み、任意の他の種類のビーズを含まない、上記のシステムを提供する。
【００２９】
放出モニタービーズは、ビーズ結合クエンチャおよびビーズ結合フルオロフォアを含み、ビーズ結合クエンチャが、ビーズ結合フルオロフォアのすぐ近くにクエンチング的に位置され、ビーズ結合フルオロフォアの蛍光の少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％）をクエンチングすることが可能であり、ビーズ結合フルオロフォアが、第１の光切断可能なリンカーを介して結合され、放出モニタービーズを含むピコウェルは、第１のピコウェルであり、第１のピコウェルは、第１の溶液を含み、第１のピコウェルを切断条件に曝露することは、光切断可能なリンカーを切断することを可能とし、フルオロフォアが第１のピコウェルの第１の溶液に放出し、曝露することは、フルオロフォアを第１のピコウェル内の第１の溶液全体に拡散することをもたらし、拡散されたフルオロフォアを含む第１の溶液を含む第１のピコウェルに光を当てることにより取得された蛍光シグナルは、ユーザーが蛍光シグナルを使用し、放出モニタービーズからのビーズ結合フルオロフォアの放出割合を計算し、計算された放出割合をもたらし、第２のピコウェルは、第１の光切断可能なリンカーと同じ種類の光切断可能なリンカーと結合したビーズ結合化合物を含み、第２のピコウェルは、第２の溶液を含み、
【００３０】
第１のピコウェル内の放出モニタービーズから計算された放出割合の値は、第２のピコウェルの第２の溶液中の放出された化合物の濃度を計算できる。
【００３１】
所定のビーズに結合したすべての化合物の同一性に関する実施形態、または所定のビーズに結合したすべてのＤＮＡバーコードの同一性に関する実施形態において、提供されるのは、少なくとも１つのビーズが、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み、複数が、実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコードの１０００万〜１億コピーである、上記のシステムである。さらに提供されるのは、少なくとも１つのビーズが、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含み、複数が、実質的に同一のビーズ結合化合物の１０００万〜１億コピーである、上記のシステムである。
【００３２】
細胞（例えば、哺乳動物細胞、がん細胞、細菌細胞）に関する実施形態において、提供されるのは、少なくとも１つのピコウェルが、少なくとも１つの細胞を含み、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物が、切断可能なリンカーを介して少なくとも１つのビーズと結合され、切断可能なリンカーを切断することが、ビーズからビーズ結合化合物を放出し、放出された化合物を生成し、放出された化合物が、少なくとも１つの細胞と接触することが可能である、上記のシステムである。他の細胞の実施形態において、提供されるのは、少なくとも１つのピコウェルが、少なくとも１つの細胞を含み、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物が、切断可能なリンカーを介して少なくとも１つのビーズと結合され、切断可能なリンカーを切断することが、ビーズからビーズ結合化合物を放出し、放出された化合物を生成し、放出された化合物が、少なくとも１つの細胞と接触することが可能であり、少なくとも１つの細胞が、（ｉ）がん細胞ではない哺乳動物細胞、（ｉｉ）哺乳動物がん細胞、（ｉｉｉ）死んだ哺乳動物細胞、（ｉｖ）アポトーシス性の哺乳動物細胞、（ｖ）ネクローシス性の哺乳動物細胞、（ｖｉ）細菌細胞、（ｖｉｉ）マラリア原虫細胞、（ｖｉｉ）代謝的に活性であるが、架橋されたゲノムを有し、細胞分裂を起こすことが不可能である細胞、または（ｉｘ）ウイルスに感染した哺乳動物細胞である、上記のシステムである。
【００３３】
デバイスの実施形態において、提供されるのは、各ピコウェルが、ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、上部穴が、床から分離され、壁が、上部穴と床との間に存在し、穴が、円形であり、床が、円形であり、壁が、円錐台の形態をとり、穴が、第１の直径を有し、床が、第２の直径を有し、第１の直径が、第２の直径より大きい、上記のシステムである。
【００３４】
他のデバイスに関連する実施形態において、提供されるのは、各ピコウェルが、ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、上部穴が、床から分離され、壁が、上部穴と床との間に存在し、穴が、円形であり、床が、円形であり、壁が、円錐台の形態をとり、穴が、第１の直径を有し、床が、第２の直径を有し、第１の直径が、第２の直径より大きく、穴にぴったりとフィットするキャップをさらに含み、穴が、より大きなデュロメータ（より硬い）を有するポリマーにより構成され、キャップが、より小さなデュロメータ（より軟らかい）を有するポリマーから作製され、キャップおよび穴の相対デュロメータが、キャップを可逆的かつぴったりと穴にフィットさせることを可能にし、キャップが、（ｉ）ピコウェルに栓をし、漏れを防ぐことのみを目的としたキャップ、（ｉｉ）受動的キャップであり、細胞培地内の細胞がピコウェル内で培養されている状況で、細胞により放出される代謝産物を吸収することが可能であるキャップ、（ｉｉｉ）能動的キャップであり、複数の本質的に同一の化合物を含むビーズの形態をとるキャップであって、複数の本質的に同一の化合物の各々が、切断可能なリンカーでビーズと結合される、キャップ、（ｉｖ）能動的キャップであり、複数の同一の試薬を含むビーズの形態をとるキャップであって、複数の本質的に同一の試薬の各々が、切断可能なリンカーでビーズと結合される、キャップである、上記のシステムである。提供されるのは、キャップが、球状であるか、またはキャップが、非球状である、上記のシステムである。
【００３５】
マットの実施形態において、上記のシステムは、上部の一般的な平面、複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、上部穴が、床から壁によって分離され、壁が、上部穴と床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、任意で、該複数のピコウェルの少なくとも１つに配置されるビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、ビーズと、ピコウェルアレイプレートが、複数のピコウェルの少なくとも１つもしくは全ての上部にある開口を確実に覆うか、または複数のピコウェルの少なくとも１つもしくは全ての上部にある開口を事実上確実に覆うことが可能であるマットをさらに含み、確実に覆うことが、可逆的であり、マットが、任意で（ａ）ピコウェルアレイプレートの上部の一般的な平面と接触して配置された場合に、複数のピコウェルの１つ以上に含まれ得る任意の代謝物、生化学物質、またはタンパク質を吸収可能である吸収面、（ｂ）ピコウェルアレイプレートの上部の一般的な平面との可逆的な接着を維持可能である接着面のうちの１つまたは全てを含むことと、を含む。
【００３６】
生化学的アッセイの実施形態において、包含されるのは、少なくとも１つのピコウェルを含む上記のシステムであり、少なくとも１つのピコウェルは、複数の実質的に同一の化合物および複数の実質的に同一のバーコードを含むビーズを含み、少なくとも１つのピコウェルは、セレブロンＥ３ユビキチンリガーゼ、イカロスまたはアイオロスなどのセレブロンＥ３ユビキチンリガーゼの基質を含むアッセイ培地を含み、システムは、セレブロンのＥ３ユビキチンリガーゼ活性を活性化する化合物のスクリーニングを可能にするため、イカロスまたはアイオロスの細胞内濃度を低減することが可能である。
【００３７】
別の生化学的アッセイの実施形態において、企図されるのは、少なくとも１つのピコウェルを含む上記のシステムであり、少なくとも１つのピコウェルは、複数の実質的に同一の化合物および複数の実質的に同一のバーコードを含むビーズを含み、少なくとも１つのピコウェルは、ＭＤＭ２  Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ｐ５３などのＭＤＭ２  Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質を含むアッセイ培地を含み、システムは、ＭＤＭ２のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を活性化する化合物のスクリーニングを可能にするため、ｐ５３の細胞内濃度を増加することが可能である。
【００３８】
より多くのバーコード化の実施形態において、提供されるのは、ＤＮＡバーコードが、任意の化学ライブラリモノマーをコードしないが、代わりに、（ａ）ビーズと切断可能に付着している化合物のクラス、（ｂ）ビーズ結合核酸が、ビーズ結合化合物を作製するために使用される所定の化学モノマーに対応し、所定の化学モノマーに対応するビーズ結合核酸が、その化学モノマーを特定する、有機合成の多段階経路におけるステップ、（ｃ）ビーズ結合化合物が、合成された日、（ｄ）ビーズ結合化合物が、治療を目的とする疾患、（ｅ）ビーズ結合化合物が、刺激もしくは阻害を目的とする細胞性事象のうちの１つ以上を特定する１つ以上の核酸を含む、上記のシステムである。
【００３９】
任意のヘッドピースを欠く実施形態において、提供されるのは、少なくとも１つのビーズが、複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含み、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み、ビーズ結合化合物のいずれかをビーズ結合ＤＮＡバーコードのいずれかと連結する任意のヘッドピースが存在しない、上記のシステムである。
【００４０】
さらに、企図されるのは、実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコードの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％が、同一の構造を有する、上記のシステムである。さらに、企図されるのは、実質的に同一のビーズ結合化合物の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％が、同一の構造を有する、上記のシステムである。
【００４１】
さらに、供給されるのは、連鎖状ＤＮＡバーコードが、ＤＮＡバーコードモジュールである少なくとも１つの核酸を含む、上記のシステム、または連鎖状ＤＮＡバーコードが、ＤＮＡバーコードモジュールである１つの核酸のみを含む、上記のシステムである。
【００４２】
シーケンシングプライマーアニーリング部位の実施形態において、提供されるのは、連鎖状ＤＮＡバーコードが、ＤＮＡバーコードモジュールである少なくとも１つの核酸、および（ａ）シーケンシングプライマーのアニーリング部位として使用可能である、（ｂ）ヘアピン構造を形成することが可能であって、ヘアピン構造が、ヘアピン構造におけるシーケンシングプライマー、シーケンシングプライマーのアニーリング部位、およびビーズを含み、ビーズが、シーケンシングプライマーに対して５プライムであり、シーケンシングプライマーのアニーリング部位の３プライムである、ヘアピン構造を形成することが可能である、または（ｃ）スペーサー核酸である、少なくとも１つの機能性核酸を含む、上記のシステムである。
【００４３】
他のシーケンシングプライマーの実施形態において、提供されるのは、直交性ＤＮＡバーコードが、複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、ＤＮＡバーコードモジュールの各々が、直接性またはリンカーを介して、ビーズ上の異なる部位と結合され、複数のＤＮＡバーコードモジュールの各々が、（ａ）シーケンシングプライマーのアニーリング部位として使用可能である、（ｂ）ヘアピン構造を形成することが可能であって、ヘアピン構造が、ヘアピン構造におけるシーケンシングプライマー、シーケンシングプライマーのアニーリング部位、およびビーズを含み、ビーズが、シーケンシングプライマーに対して５プライムであり、シーケンシングプライマーのアニーリング部位の３プライムである、ヘアピン構造を形成することが可能である、または（ｃ）スペーサー核酸である、少なくとも１つの機能性核酸を含む、上記のシステムである。
【００４４】
スプリントオリゴについての機能言語を列挙する実施形態において、提供されるのは、連鎖状ＤＮＡバーコードを含むビーズであり、連鎖状ＤＮＡバーコードは、（ａ）スプリントオリゴが、３つの核酸を含み、３つの核酸が、第１のアニーリング部位にハイブリダイズする捕捉物である核酸であり、第２のＤＮＡバーコードモジュールにハイブリダイズする捕捉物である核酸であり、第２のアニーリング部位である核酸である、第１のＤＮＡバーコードモジュールおよび第１のスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）の第１のアニーリング部位と、（ｂ）第２のスプリントオリゴが、３つの核酸を含み、３つの核酸が、第２のアニーリング部位にハイブリダイズする捕捉物である核酸であり、第３のＤＮＡバーコードモジュールである核酸であり、第３のアニーリング部位である核酸である、第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび第２のスプリントオリゴの第２のアニーリング部位と、を含む。
【００４５】
スプリントオリゴに関連する機能言語を含む別の実施形態において、提供されるのは、第３のスプリントオリゴが、３つの核酸を含み、３つの核酸が、第３のアニーリング部位にハイブリダイズする捕捉物である核酸であり、第４のＤＮＡバーコードモジュールである核酸であり、および第４のアニーリング部位である核酸である、第３のＤＮＡバーコードモジュールおよび第３のスプリントオリゴの第３のアニーリング部位をさらに含む、上記のビーズである。
【００４６】
さらに、スプリントオリゴに関連する機能言語を含むさらに別の実施形態において、提供されるのは、（ｉ）第４のスプリントオリゴが、３つの核酸を含み、３つの核酸が、第４のアニーリング部位にハイブリダイズする捕捉物である核酸であり、第５のＤＮＡバーコードモジュールである核酸であり、および第５のアニーリング部位である核酸である、第４のＤＮＡバーコードモジュールおよび第４のスプリントオリゴの第４のアニーリング部位、（ｉｉ）応答捕捉要素、（ｉｉｉ）放出モニターのうちの１つ以上をさらに含む、上記のビーズである。
【００４７】
リンカーの実施形態において、包含されるのは、連鎖状ＤＮＡバーコードが、ビーズに結合されているが、（ｉ）あらゆる光切断可能なリンカーを介してビーズに結合されていない、（ｉｉ）あらゆる酵素的に切断可能なリンカーによりビーズに結合されていない、または（ｉｉｉ）あらゆる種類の切断可能なリンカーによりビーズに結合されていない、上記のビーズである。
【００４８】
別々の結合位置に関する実施形態において、提供されるのは、連鎖状ＤＮＡバーコードが、ビーズ上の第１の位置に結合され、ビーズはまた、ビーズ上の第２の位置に結合される化合物を含み、第１の位置が、第２の位置と同じでない、上記のビーズである。
【００４９】
表面の実施形態（内および外面）において、提供されるのは、ビーズが、外面および内面を含み、ビーズが、ビーズに結合される少なくとも１０，０００の実質的に同一の連鎖状ＤＮＡバーコードを含み、少なくとも１０，０００の実質的に同一の連鎖状ＤＮＡバーコードの少なくとも９０％が、外面に結合されている、上記のビーズである。
【００５０】
本開示を他の実施形態と区別することができる除外的な実施形態において、提供されるのは、あらゆるポリアクリルアミドも含まない上記のビーズであり、連鎖状ＤＮＡバーコードは、（ｉ）プロモーターであるあらゆる核酸も含まず、（ｉｉ）ポリＡであるあらゆる核酸も含まず、または（ｉｉｉ）プロモーターであるあらゆる核酸も含まず、かつポリＡであるあらゆる核酸も含まない。
【００５１】
放出モニタービーズの実施形態において、本開示は、水性媒体中で機能することが可能な放出モニタービーズを提供し、放出モニタービーズは、ビーズ結合クエンチャおよびビーズ結合フルオロフォアを含み、ビーズ結合クエンチャが、ビーズ結合フルオロフォアのすぐ近くにクエンチング的に位置され、ビーズ結合フルオロフォアの蛍光の少なくとも５０％をクエンチングすることが可能であり、ビーズ結合フルオロフォアが、第１の光切断可能なリンカーを介して結合され、放出モニタービーズを含むピコウェルは、第１のピコウェルであり、第１のピコウェルは、第１の溶液を含み、第１のピコウェルを切断条件に曝露することは、光切断可能なリンカーを切断することを可能とし、フルオロフォアが第１のピコウェルの第１の溶液に放出し、曝露することは、フルオロフォアを第１のピコウェル内の第１の溶液全体に拡散することをもたらし、拡散されたフルオロフォアを含む第１の溶液を含む第１のピコウェルに光を当てることにより取得された蛍光シグナルは、ユーザーが蛍光シグナルを使用し、放出モニタービーズからのビーズ結合フルオロフォアの放出割合を計算し、計算された放出割合をもたらし、第２のピコウェルは、第１の光切断可能なリンカーと同じ種類の光切断可能なリンカーと結合したビーズ結合化合物を含み、第２のピコウェルは、第２の溶液を含み、第１のピコウェル内の放出モニタービーズから計算された放出割合の値は、第２のピコウェルの第２の溶液中の放出された化合物の濃度を計算できる。他の放出モニターの実施形態において、提供されるのは、フルオロフォアが、ＴＡＭＲＡであり、クエンチャが、ＱＳＹ７である、放出モニタービーズ、および図９に示される構造を有する放出モニタービーズ、および図１０に示される構造を有する放出モニタービーズ、および少なくとも９０％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％でクエンチングすることが可能な放出モニタービーズである。
【００５２】
製造方法の実施形態において、包含されるのは、放出モニタービーズを合成するための方法であり、放出モニタービーズは、ビーズ、クエンチャ、フルオロフォア、およびフルオロフォアをビーズに結合する光切断可能なリンカーを含み、本方法は、この順序で、（ｉ）樹脂を提供すること、（ｉｉ）リジンリンカーを含む試薬が、Ｌ−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（４−メチルトリチル）−ＯＨである、リジンリンカーを樹脂にカップリングすること、（ｉｉｉ）Ｆｍｏｃ保護基を除去すること、（ｉｖ）クエンチャの源としてクエンチャ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（クエンチャ−ＮＨＳ）である試薬を使用してクエンチャをカップリングすること、（ｖ）トリフルオロ酢酸を含む試薬を使用して４−メチルトリチル保護基を除去すること、（ｖｉ）光切断可能なリンカーが、Ｆｍｏｃ−光切断可能なリンカー−ＯＨの試薬により提供される、光切断可能なリンカーをリジンのイプシロンアミノ基にカップリングすること、（ｖｉｉ）フルオロフォアをカップリングすることを含む。上記の実施形態も提供されるが、ステップの順序は考慮されない。他の方法の実施形態において、フルオロフォアが、ＴＡＭＲＡであり、クエンチャが、ＱＳＹ７である、上記の方法が提供される。
【００５３】
放出モニタービーズの有用性に関する方法において、提供されるのは、ピコウェル内に存在する溶液中の化合物の濃度を制御する方法であり、方法は、ピコウェル内のビーズ結合化合物に適用され、ピコウェルは、溶液を含み、ビーズ結合化合物は、切断可能なリンカーを介してビーズと結合され、方法は、（ａ）放出に続いて、溶液中の放出された化合物の拡散または分散により、溶液中の化合物の実質的に均一な濃度がもたらされる、ビーズ結合化合物を、切断可能なリンカーの切断をもたらす条件に曝露し、ビーズからビーズ結合化合物を放出し、放出された化合物を生成すること、（ｂ）切断可能なリンカーを切断することが可能である光を含む、条件、（ｃ）実質的に均一な濃度の決定された濃度を生成するように調整された、条件、（ｄ）ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度を考慮して実行される、決定された濃度を含む。さらに提供されるのは、条件が、光の波長、光の強度のうちの１つ以上を調整することによって、および露光の持続期間によって調整される、上記の方法、ならびにビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度が、ビーズからビーズ結合化合物の放出をもたらし、放出される化合物を生成すると同時に決定される、上記の方法、ならびにビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度が、ビーズからビーズ結合化合物の放出をもたらし、放出される化合物を生成する実質的に前の時点で決定される、上記の方法である。
【００５４】
「決定された」という用語は、ビーズを光に曝露する前に、事前に決定され、所望される濃度であると決定される濃度を意味することができる。また、「決定された」という用語は、「リアルタイム」で決定される濃度、すなわち、ビーズを光に曝露すると同時に決定される濃度を意味することができる。
【００５５】
キャップの実施形態において、包含されるのは、複数のピコウェルを含むピコウェルプレートと組み合わせたキャップであり、キャップは、複数のピコウェルを含むピコウェルプレートと共に使用することが可能であり、複数のピコウェルの各々は、穴、床、および壁によって画定可能であり、壁は、上部の穴および底部の床によって画定され、穴は、円形であり、床は、円形であり、壁は、円錐台の表面の形態をとり、穴は、第１の直径を有し、床は、第２の直径を有し、第１の直径は、第２の直径より大きく、
【００５６】
キャップは、穴にぴったりとフィットすることが可能な球状キャップであり、穴は、より大きなデュロメータ（より硬い）を有するポリマーにより構成され、キャップは、より小さなデュロメータ（より軟らかい）を有するポリマーから作製され、キャップおよび穴の相対デュロメータが、球状キャップを可逆的かつぴったりと穴にフィットさせることを可能にし、キャップは、（ｉ）ピコウェルに栓をして漏れを防ぐことが可能であり、（ｉｉ）受動的キャップであり、細胞培地内の細胞がピコウェル内で培養されている状況で、細胞より放出される代謝産物を吸収することが可能であり、（ｉｉｉ）能動的キャップであり、複数の本質的に同一の化合物を含むビーズの形態をとり、複数の本質的に同一の化合物の各々は、切断可能なリンカーでビーズと結合され、切断可能なリンカーの切断により、複数の化合物の少なくとも一部がビーズから放出され、（ｉｖ）能動的キャップであり、複数の同一の試薬を含むビーズの形態をとり、複数の本質的に同一の試薬の各々は、切断可能なリンカーでビーズと結合され、切断可能なリンカーの切断により、ビーズから複数の試薬の少なくとも一部が放出される。
【００５７】
多孔性キャップの実施形態において、提供されるのは、ピコウェルプレートおよび固体ポリマーコーティングと組み合わせた複数の多孔性キャップであり、複数の多孔性キャップの各々は、上面および下面を含み、ピコウェルプレートは、複数のピコウェルを含み、少なくとも１つの多孔性キャップは、ピコウェルに接触し、可逆的かつぴったりとピコウェルにフィットし、ピコウェルプレートおよび複数の多孔性キャップの上面の各々は、固体ポリマーコーティングで覆われており、固体ポリマーコーティングは、各キャップの上面の該少なくとも一部と接触し、上面の少なくとも一部に粘着的に付着されており、（ｉ）複数のピコウェルの各々は、水溶液を保持することが可能であり、反応の生成物は、溶液中に生成され、生成物の少なくとも一部は、複数の多孔性キャップの各々の下面により吸収され、（ｉｉ）重合することが可能な重合可能な試薬の溶液は、ピコウェルプレートと組み合わせて複数の多孔性キャップを覆って注がれ、重合可能な試薬は、重合して、ピコウェルプレートの上面の実質的にすべてをコートする実質的に平坦な表面を形成し、それにより、重合された試薬を複数の多孔質キャップの各々に固定し、（ｉｉｉ）複数の多孔性キャップのすべては、複数のピコウェルから剥離する動作により除去可能であり、接着は、複数の多孔質キャップと重合試薬との間に維持され、重合試薬に包埋した各キャップの上面に部分的に接着したキャップのアレイをもたらし、各キャップの下面は、吸収された反応生成物の分析に利用可能である。
【００５８】
これは、スプリントオリゴを使用してＤＮＡバーコードの酵素合成を誘導するための、製造方法の実施形態を提供する。提供されるのは、ビーズ結合連結ＤＮＡバーコードを作製する方法であり、ビーズ結合連鎖状ＤＮＡバーコードは、複数のＤＮＡバーコードモジュール、任意で１つ以上の機能性核酸、任意で、化学ライブラリモノマーの同一性以外の同一性をコードする１つ以上の同一性コード化核酸を含み、方法は、（ａ）第１のアニーリング部位が、第１のスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）、結合ポリヌクレオチドへの重合を触媒するＤＮＡポリメラーゼの鋳型として機能できる第１のスプリントオリゴ、ハイブリダイズされた第１のスプリントオリゴのそれらに相補的なヌクレオチドとハイブリダイズ可能であり、重合後のハイブリダイズされた第１のスプリントオリゴのそれらに相補的な重合されたヌクレオチドが、ビーズ結合第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび第２のアニーリング部位を含む、第１のＤＮＡバーコードモジュールおよび第１のアニーリング部位を含む、結合されたポリヌクレオチドをビーズに提供するステップ、（ｂ）該ビーズに、該第１のスプリントオリゴと結合されたポリヌクレオチドを提供し、該第１のスプリントオリゴを該結合されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、（ｃ）結合されたポリヌクレオチドが、遊離３’末端を有し、重合が、遊離３’末端に対してである、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を追加し、ＤＮＡポリメラーゼが該ｄＮＴＰの結合されたポリヌクレオチドへの重合を触媒することを可能にするステップ、（ｄ）第１のスプリントオリゴを洗い流すステップを含む。また、企図されるのは、第１のスプリントオリゴが、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、および第２のアニーリング部位で構成される、上記の方法である。
【００５９】
製造の実施例のさらなる方法において、提供されるのは、第１のスプリントオリゴが、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、および第１のシーケンシングプライマーアニーリング部位をコードする核酸で構成され、第１のシーケンスプライマーアニーリング部位が、シーケンスプライマーにハイブリダイズし、ハイブリダイズされたシーケンスプライマーをもたらすことが可能であり、ハイブリダイズされたシーケンシングプライマーが、第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび第１のＤＮＡバーコードモジュールのシーケンシングを指示することが可能である、上記の方法である。
【００６０】
さらに、企図されるのは、第１のスプリントオリゴ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰが、すべて同時に追加されるか、または第１のスプリントオリゴ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰが、別々の時間に各々追加される、上記の方法である。
【００６１】
ビーズの内部対外部の位置に関して、提供されるのは、ビーズが、外部の位置および内部の位置で構成され、ビーズ結合連鎖状ＤＮＡバーコードが、実質的にビーズの外側の位置で、かつビーズの内側の位置でわずかにビーズに結合されており、ビーズはまた、複数の結合された化合物を含み、複数の結合された化合物のすべてが、互いに比較した場合に、実質的に同一の構造を有し、ビーズが、実質的に疎水性ポリマーから構成される、上記の方法である。
【００６２】
さらなる方法の実施形態において、提供されるのは、（ａ）第２のアニーリング部位が、第２のスプリントオリゴ、結合された第１のより長いポリヌクレオチドへの重合を触媒するＤＮＡポリメラーゼの鋳型として機能できる第２のスプリントオリゴ、ハイブリダイズされた第２スプリントオリゴのそれらに相補的なヌクレオチドとハイブリダイズ可能であり、重合後のハイブリダイズされた第２のスプリントオリゴのそれらに相補的な重合されたヌクレオチドが、ビーズ結合第３のＤＮＡバーコードモジュールおよび第３のアニーリング部位を含む、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコード、および第２のアニーリング部位を含む、結合された第１のより長いポリヌクレオチドをビーズに提供するステップ、（ｂ）該ビーズに、該第２のスプリントオリゴと結合されたポリヌクレオチドを提供し、該第２のスプリントオリゴを該結合された第１のより長いポリヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、（ｃ）結合されたより長いポリヌクレオチドが、遊離３’末端を有し、重合が、遊離３’末端に対してである、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を追加し、ＤＮＡポリメラーゼが該ｄＮＴＰの結合されたより長いポリヌクレオチドへの重合を触媒することを可能にするステップ、（ｄ）第２のスプリントオリゴを洗い流すステップをさらに含む、上記の方法である。
【００６３】
これは、ＤＮＡバーコード全体を製造するための、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第３のＤＮＡバーコードモジュールなどの連続的な付番に関連する。これは、ＤＮＡバーコード全体の製造において、方法のステップのサイクルを何度も繰り返すことにも関連する。提供されるのは、該複数のＤＮＡバーコードモジュールの各々が、番号により特定または命名され、方法が、列挙されたステップを繰り返すことをさらに含み、第１の繰り返しとして、ＤＮＡバーコードモジュールの名前が、既存の名前に１つの番号を追加することで増加し、アニーリング部位の名前は、既存の名前に番号を１つの追加することで増加し、スプリントオリゴの名前が、既存の遠位末端ＤＮＡバーコードモジュールの名前に１つの番号を追加することで増加し、「第１のより長いポリヌクレオチド」の名前が、既存の名前に１つの番号を追加することにより変更され、列挙されたステップを繰り返すことを含むことが、１回の繰り返し、または２回の繰り返し、または３回の繰り返し、または４回の繰り返し、または５回の繰り返し、、または５回を超える繰り返し、または１０回を超える繰り返しである、上記の方法である。
【００６４】
また、企図されるのは、複数のスプリントオリゴを含む上記の方法であり、各スプリントオリゴは、シーケンスプライマーアニーリング部位を含み、シーケンシングプライマーアニーリング部位は、シーケンシングプライマーにハイブリダイズすることが可能であり、ハイブリダイズしたシーケンスプライマーをもたらし、ハイブリダイズされたシーケンシングプライマーは、少なくとも１つのビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールおよび少なくとも１つのビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールのシーケンシングを指示することが可能である。
【００６５】
これは、機能性核酸および様々な種類の有益な核酸を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを導くスプリントオリゴに関連する実施形態に関する。提供されるのは、少なくとも１つのスプリントオリゴが、機能性核酸を含むか、または少なくとも１つのスプリントオリゴが、化学ライブラリモノマーに関連する情報以外の情報をコードする、上記の方法である。提供されるのは、クリックケミストリーを介した少なくとも１つのＤＮＡバーコードモジュールを結合するステップをさらに含む、上記の方法であり、ステップは、あらゆるスプリントオリゴを使用しない。
【００６６】
簡単に述べると、本開示は、化合物をスクリーニングするためのシステムであって、（ａ）複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、上部穴が、床から分離され、壁が、上部穴と床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、（ｂ）少なくとも１つのピコウェル内に配置される少なくとも１つのビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、少なくとも１つのビーズと、（ｃ）少なくとも１つのビーズが、連鎖状ＤＮＡバーコードまたは直交性ＤＮＡバーコードのいずれかの形態をとるＤＮＡバーコードを含み、ＤＮＡバーコードが、連鎖状ＤＮＡバーコードの形態をとる場合、連鎖状ＤＮＡバーコードが、（ｉ）クリックケミストリーを使用すること、または（ｉｉ）ステップの繰り返しサイクルを使用することの方法を使用して作製され、繰り返しサイクルのステップが、部分的に作製されたＤＮＡバーコードへのアニーリングにスプリントオリゴを使用することを含み、アニールされたスプリントオリゴが、ＤＮＡポリメラーゼを使用して部分的に作製されたＤＮＡバーコードを伸長するための鋳型として使用され、スプリントオリゴが、部分的に作製されたＤＮＡバーコードに重合されるＤＮＡバーコードモジュールに相補的な塩基を含むことと、を含む、システムを提供する。
【００６７】
別の態様において、提供されるのは、ＤＮＡバーコードが、（ａ）１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールの各々が、化学ライブラリモノマーの同一性に関する情報をコードする、１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールと、（ｂ）任意で、１つ以上の機能性核酸と、（ｃ）任意で、化学ライブラリモノマーの同一性に関する情報以外の種類の情報である情報をコードする１つ以上の核酸と、を含む、上記のシステムである。
【００６８】
さらに、提供されるのは、複数のキャップをさらに含み、複数のキャップをさらに含み、各々が、異なるピコウェルの開口にフィットすることが可能であり、各々が、ピコウェルの内部にある流体の蒸発を最小化するか、または防止することが可能であり、ピコウェルの内部にある流体の漏れを最小化するか、または防止することが可能である、上記のシステムである。
【００６９】
また、包括されるのは、複数の球状キャップをさらに含み、各々が、ピコウェルの穴にフィットすることが可能であり、穴が、円形であり、各々が、ピコウェルの内部にある流体の蒸発を最小化するか、または防止することが可能であり、各々が、ピコウェルの内部にある流体の漏れを最小化するか、または防止することが可能である、上記のシステムである。
【００７０】
また、企図されるのは、少なくとも１つのビーズが、連鎖状ＤＮＡバーコードの形態をとるＤＮＡバーコードを含む場合に、連鎖状ＤＮＡバーコードが、（ｉ）シーケンシングプライマー結合部位、（ｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、（ｉｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドスプリントが、第２のＤＮＡバーコードモジュールの酵素合成を誘導するために使用できる、第１のオリゴヌクレオチドスプリントとハイブリダイズできる第１のアニーリング部位、（ｉｖ）第２のＤＮＡバーコードモジュール、（ｖ）第２のオリゴヌクレオチドスプリントが、第３のＤＮＡバーコードの合成を誘導するために使用できる、第２のオリゴヌクレオチドスプリントとハイブリダイズできる第２のアニーリング部位、（ｖｉ）第３のＤＮＡバーコードモジュール、（ｖｉｉ）第３のオリゴヌクレオチドスプリントが、第４のＤＮＡバーコードの合成に使用できる、第３のオリゴヌクレオチドスプリントとハイブリダイズできる第３のアニーリング部位を含む、上記のシステムである。
【００７１】
方法の実施形態において、提供されるのは、所望される特性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングする方法であり、（ａ）複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、ビーズ表面に付着した複数のオリゴヌクレオチド、およびビーズ表面に付着した複数の実質的に関連する化合物を含み、ビーズに付着したオリゴヌクレオチドの配列が、ビーズ表面に付着した複数の実質的に関連する化合物の合成履歴をコードする、提供することと、（ｂ）化合物ライブラリ内の化合物の所望される特性についてのアッセイに複数のビーズを組み込むことと、（ｃ）少なくとも１つのビーズからのシグナルを捕捉することであって、シグナルが、アッセイにおけるビーズ上の化合物の性能を反映する、捕捉することと、（ｄ）ビーズからオリゴヌクレオチドを除去することなく、アッセイシグナルがさらに捕捉された少なくとも１つのビーズに付着した複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングすることと、（ｅ）ステップ（ｄ）のシーケンシングの読み出しから少なくとも１つの化合物を特定し、それをステップ（ｃ）のシグナルで捕捉された対応するアッセイ性能と関連付けすることとを含む。
【００７２】
さらに詳細には、包含されるのは、アッセイが、結合アッセイを含む、またはアッセイが、活性アッセイを含む、またはアッセイが、競合結合アッセイもしくは競合阻害アッセイを含む、またはアッセイが、非連結化合物と他のアッセイ試薬との相互作用を含み、非連結化合物が、ビーズ表面から放出された化合物であり、または化合物が、ビーズに化合物を接続する切断可能なリンカーを切断することにより放出され、またはアッセイが、複数の制限された容積で生じ、通常、１つのビーズが、制限された容積ごとに分散される、上記の方法である。
【００７３】
別の態様において、さらに企図されるのは、制限された容積が、水性液滴を含む、または
水性液滴が、油媒体もしくは疎水性液体媒体中に懸濁される、または制限された容積が、ピコウェルを含む、またはピコウェルが、規則的なアレイに組織化される、または複数の制限された容積が、規則的なアレイに組織化される、上記の方法である。
【００７４】
そのうえ、さらに包含されるのは、制限された容積が、ビーズの周囲に接着した水性媒体の層を含み、ビーズが、疎水性媒体に懸濁される、上記の方法、およびアッセイ試薬が、オリゴヌクレオチドをシーケンシングする前に洗い流される、上記の方法である。シーケンシングステップ（ｄ）が、アッセイステップ（ｂ）の前に実行される、上記の方法である。さらに提供されるのは、ビーズ上のオリゴヌクレオチドが、シーケンシングステップの後であるが、アッセイステップの前に除去される、上記の方法である。さらに、企図されるのは、オリゴヌクレオチドの除去が、酵素消化、化学的切断、熱分解、または物理的剪断を含む、上記の方法、および結合アッセイが、ＲＮＡ分子のビーズとの結合を含む、上記の方法、およびビーズからのシグナルが、結合したＲＮＡ分子のシーケンシングを含む、上記の方法である。
【００７５】
さらに別の態様において、提供されるのは、結合アッセイが、蛍光標識された結合アッセイを含み、ビーズ上の化合物と結合する分子が、フルオロフォアを含む、上記の方法、または結合アッセイが、核酸標識された結合アッセイを含み、ビーズ上の化合物と結合する分子が、核酸タグを含み、アッセイからのシグナルが、ビーズ上の化合物と結合する分子に付着した核酸タグのシーケンシングをさらに含む、上記の方法である。
【００７６】
特性に関連するさらに別の方法の実施形態において、提供されるのは、所望される特性が、（ｉ）酵素の触媒活性を阻害または刺激すること、（ｉｉ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ１型免疫応答を刺激すること、（ｉｉｉ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ２型免疫応答を刺激すること、（ｉｖ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ１型免疫応答を阻害すること、（ｖ）細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なＴｈ２型免疫応答を阻害すること、（ｖｉ）精製されたタンパク質、細胞系アッセイ、または生体内アッセイにより測定可能な、タンパク質のユビキチン媒介分解を刺激または阻害することのうちの１つ以上を含む、上記の方法である。
【００７７】
システムの実施形態において、提供されるのは、所望される活性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングするためのシステムであり、（ａ）複数の化合物が付着し、オリゴヌクレオチドがコードされたビーズを受け入れるための試料区画と、（ｂ）試料区画内の複数のカプセル化区画であって、各カプセル化区画が、名目上、アッセイ媒体中に分散された単一のビーズを含み、さらにアッセイ媒体が、ビーズ上の化合物との相互作用がアッセイされ、測定可能なシグナルをもたらす試薬を含む、複数のカプセル化区画と、（ｃ）シグナルを測定するための検出器と、（ｄ）シーケンシングプラットフォームと、（ｅ）ユーザーから１つ以上のコマンドを受信するためのユーザーインターフェイスと、を含む。また、提供されるのは、カプセル化区画が、液滴を含む、上記のシステムである。別の態様において、提供されるのは、カプセル化区画が、ピコウェルを含む、またはさらにカプセル化区画が、アッセイ試薬を含む、または検出器が、光学検出器を含む、またはシーケンサーが、光学検出器を含む、上記のシステムである。
【００７８】
一態様において、本開示は、（ａ）核酸にコードされた摂動を提供し、核酸にコードされた摂動で細胞を制限することと、（ｂ）細胞を、制限された容積内で核酸にコードされた摂動と接触させることであって、摂動の開始および用量が、制御される、接触させることと、（ｃ）細胞を、核酸をコードした摂動と共に特定の期間インキュベートすることと、（ｄ）核酸にコードされた摂動をコードする核酸を細胞に移入することと、により細胞を摂動させる方法を特徴とする。
【００７９】
この態様のいくつかの実施形態において、核酸にコードされた摂動は、核酸にコードされた化合物または薬物分子である。いくつかの実施形態において、核酸にコードされた摂動は、ＤＮＡにコードされたライブラリである。
【００８０】
いくつかの実施形態において、摂動および摂動をコードする核酸は、溶液中に付着しておらず、遊離している。いくつかの実施形態において、摂動および摂動をコードする核酸は、互いに付着している。いくつかの実施形態において、摂動および摂動をコードする核酸は、同じ基質に付着しているが、互いに付着していない。いくつかの実施形態において、摂動の基質への付着および核酸の基質への付着は、切断可能な付着である。特定の実施形態において、切断可能な付着は、光切断可能な付着、温度で切断可能な付着、ｐＨ感受性付着、酸で切断可能な付着、塩基で切断可能な付着、音で切断可能な付着、塩で切断可能な付着、レドックス感受性付着、または物理的に切断可能な付着からなる群から選択される。
【００８１】
本開示のこの態様のいくつかの実施形態において、細胞および摂動を制限することは、液滴カプセル化、エマルジョンカプセル化、ピコウェルカプセル化、マクロウェルカプセル化、物理的付着、気泡カプセル化、またはマイクロ流体制限を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、摂動にわたる制御は、光曝露を制御する、温度曝露を制御する、ｐＨ曝露を制御する、時間曝露を制御する、音曝露を制御する、塩曝露を制御する、化学的もしくは物理的レドックス電位を制御する、または機械的撹拌暴露を制御することを含む。
【００８３】
特定の実施形態において、インキュベーションは、摂動を基質から切断した後、または核酸を基質から切断した後に、細胞を摂動に曝露することを含む。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、摂動を基質から切断することなく、または核酸を摂動から切断することなく、細胞を摂動に曝露することを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、核酸にコードされた摂動をコードする核酸を細胞に移入することは、核酸を細胞の細胞表面に付着させることを含む。特定の実施形態において、核酸を細胞の細胞表面に付着させることは、核酸を細胞膜に挿入することを含む。特定の実施形態において、核酸を細胞の細胞表面に付着させることは、核酸を細胞表面上の生体分子に付着させることを含む。特定の実施形態において、生体分子は、タンパク質または炭水化物である。他の実施形態において、核酸を細胞の細胞表面に付着させることは、核酸上の任意のタグを介して付着することを含む。
【００８５】
別の態様において、本開示は、摂動で細胞を摂動し、摂動の同一性で細胞をコード化する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリを提供することと、（ｂ）ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリで細胞を制限することであって、ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリが、コンビナトリアル合成された化合物の１つ以上のコピーおよびコード化核酸タグの１つ以上のコピーを含み、化合物およびコード化核酸が、ビーズに付着され、コード化核酸が、化合物の同一性をコードし、ビーズ結合ＤＮＡにコードされたライブラリおよび細胞が、制限化容積に制限される、制限することと、（ｃ）ビーズから化合物を放出し、化合物を細胞と共に制限化容積内でインキュベートすることと、（ｄ）任意で、コード化核酸タグをビーズから放出することと、（ｅ）コード化核酸タグを細胞に付着させ、それにより、細胞に付着されたコード化核酸タグを介して化合物の同一性を維持することと、を含む。
【００８６】
さらに別の態様において、本開示は、細胞を摂動し、摂動の同一性で細胞をコードし、摂動に対する細胞の応答を測定する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）細胞を、第１の制限された容積内でビーズ結合ＤＮＡコード化ライブラリと接触させることであって、ビーズ結合ＤＮＡコード化ライブラリが、コンビナトリアル合成された化合物の１つ以上のコピーおよびコード化核酸タグの１つ以上のコピーを含み、化合物およびコード化核酸が、ビーズに付着され、コード化核酸が、化合物の同一性をコードする、接触することと、（ｂ）ライブラリ内の化合物をビーズから放出し、ライブラリ内の化合物を第１の制限された容積内の細胞と共にインキュベートすることと、（ｃ）任意で、第１の制限された容積内のビーズからコード化核酸タグを放出することと、（ｄ）コード化核酸タグを、細胞の細胞表面に捕捉し、それにより、細胞が、ライブラリ内の化合物に曝露され、曝露された化合物の同一性が、細胞表面上に捕捉されることと、（ｅ）第１の制限された容積から細胞を放出することであって、コード化核酸タグが、細胞に付着され、コード化核酸タグが、細胞が曝露される化合物の同一性をコードする、放出することと、（ｆ）以前に摂動され、核酸でタグ付けされた細胞を、第２の制限された容積内の応答検出ビーズで捕捉することであって、細胞が、細胞の細胞内容物を応答捕獲ビーズに曝露する溶解条件に曝露され、応答捕獲ビーズが、細胞内容物を捕獲する捕獲プローブ、および以前に摂動され、核酸でタグ付けされた細胞における摂動をコードする核酸タグを含む、捕捉することと、（ｇ）応答捕捉ビーズを、第２の制限された容積内の溶解された細胞と共にインキュベートし、それにより、細胞内容物および応答捕捉ビーズへの摂動をコードする核酸タグの両方を捕捉することと、（ｈ）任意で、摂動に対する細胞の応答を、核酸シグナルに変換することであって、摂動に対する細胞の応答が、核酸シグナルではない、変換することと、（ｉ）応答捕獲ビーズに付着された核酸タグをシーケンシングし、それにより、摂動の同一性を摂動に対する細胞の応答に相関させることと、を含む。
【００８７】
さらに別の態様において、本開示は、（ａ）ピコウェルのアレイおよび機能化された摂動ビーズのライブラリを提供することであって、ピコウェルが、単一の細胞および単一の機能化された摂動ビーズを収容可能であり、各機能化された摂動ビーズが、異なる複数の実質的に同一の放出可能な化合物および化合物をコードする複数のヌクレオチドバーコードを含み、ヌクレオチドバーコードが、細胞の細胞内容物を捕捉可能な機能化されたバーコードであり、細胞の細胞内容物が、機能化された摂動ビーズに含まれる摂動に対する細胞応答を含む、提供することと、（ｂ）ピコウェルアレイの各ピコウェルに単一の細胞を捕捉することと、（ｃ）単一の機能化された摂動ビーズを、単一の細胞を含むピコウェルに捕捉することと、（ｄ）機能化された摂動ビーズから化合物を放出し、放出された化合物と共に細胞をインキュベートすることであって、ピコウェル間の化合物が、最小限の拡散を有する、インキュベートすることと、（ｅ）細胞を溶解して細胞内容物を放出することと、（ｆ）機能化された摂動ビーズ上の機能化されたオリゴヌクレオチド上に細胞内容物の１つ以上の成分を捕捉することであって、捕捉することが、ヌクレオチドバーコードを細胞内容物の核酸要素と組み合わせるためのハイブリダイゼーションおよび酵素的伸長を含み、それにより、ヌクレオチドバーコードおよび細胞内容物の核酸要素のハイブリッドを形成する、捕捉することと、（ｇ）ハイブリッドを放出し、機能化された摂動ビーズのライブラリからハイブリッドを収集し、ハイブリッドをシーケンシングし、それにより、摂動を、摂動に対する細胞応答に関連付けることと、により細胞を摂動させ、摂動に対する細胞の応答を捕捉する方法を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】連鎖状式ビーズ。連鎖状式ビーズにおいて、ＤＮＡバーコードは、プライマーアニーリング部位、スペーサーなどの機能、または製造日に関する情報を有する任意の他の核酸と一緒に、一本鎖で互いに接続されたすべてのＤＮＡバーコードモジュールの形態をとる。この図での番号は、構造番号ではない。番号は、ＤＮＡバーコード内の「ＤＮＡバーコードモジュール」の配列を示す。
【図２】直交性式ビーズ。直交性式ビーズにおいて、ＤＮＡバーコードは、すべてのＤＮＡバーコードモジュールの形態をとり、ＤＮＡバーコードモジュールは、１本鎖で一緒に生じるのではなく、代わりにビーズ上の異なる位置に個別に連結して生じる。この図での番号は、構造番号ではない。番号は、ＤＮＡバーコード内の「ＤＮＡバーコードモジュール」の配列を示す。
【図３−１】切断可能なリンカー、切断（ＵＶ光または化学的）、および切断生成物についての条件。Ｙｉｎｌｉａｎｇ  Ｙａｎｇ（２０１４）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓからの情報である。Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍｕｎｃｈｅｎ  Ｌｅｈｒｓｔｕｈｌ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｅ。各リンカーの左側のアルファベットは、この参照からのものである。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図４−１】本開示の組成物および方法のための例示的なアミノ酸誘導体。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図４−４】同上。
【図５】ＨｅＬａ細胞内での追加されたレナリドマイドの濃度の増加に伴う融合タンパク質の分解の増加を示す写真。上：ＩＫＺＦ１／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ（登録商標）対照の発現。レナリドマイドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモルで追加された。
【図６】ＨｅＬａ細胞内での追加されたレナリドマイドの濃度の増加に伴う融合タンパク質の分解の増加を示す写真。上：ＩＫＺＦ３／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ対照の発現。レナリドマイドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモルで追加された。
【図７】ビーズ結合ＤＮＡバーコードを作製するための方法および試薬。「ＤＮＡバーコード」の最も正確な記載は、すべてのＤＮＡバーコードモジュールの合計に含まれるすべての情報の合計である。しかし、便宜上、本明細書では、「ＤＮＡバーコード」という用語は、すべてのＤＮＡバーコードモジュールのすべての情報と、ステップ数などの情報を提供する任意の追加の核酸、またはビーズ結合化合物を構成する一般的式の化学モノマー、およびさらに、リンカー、シーケンシングプライマー結合部位、シーケンシングプライマー結合部位を有するヘアピン、もしくはスペーサーなどの機能を果たす任意の追加の核酸の合計を指すために使用される。少なくとも部分的にクリックケミストリーによってＤＮＡバーコードが作製される場合、ＤＮＡバーコードは、クリックケミストリー反応からの残留化学基を含み得る。
【図８】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の構造。この図の目的は、商品名を使用せずに化合物を特定することである。
【図９】ビーズ結合放出モニターの簡略図。放出モニターは、ユーザーに可溶性化合物の濃度の測定値、続いてビーズからの化合物のＵＶ誘発放出を提供する。好ましい実施形態において、一形式のビーズは、放出モニターであること専用であり、すなわち、このビーズは、ビーズ結合化合物も含まず、ビーズ結合ＤＮＡライブラリも含まない。「ＰＣＬ」は、光切断可能なリンカーである。
【図１０】ビーズ放出モニターの詳細図。
【図１１−１】ビーズ放出モニターの化学合成。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１２】リンカーがリジン残基を含む、二官能性リンカーを有するアミン官能化ビーズ。
【図１３】第１型のカルボキシル基で修飾されたレナリドマイドの化学合成のステップ。
【図１４】第２型のカルボキシル基で修飾されたレナリドマイドの化学合成のステップ。
【図１５】第３型のカルボキシル基で修飾されたレナリドマイドの化学合成のステップ。
【図１６】レナリドミド類似体。
【図１７−１】ＤＮＡバーコードのクリックケミストリー合成に好適なデオキシシチジン類似体の化学合成ステップ。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１８】ピコウェルの上部を覆うために配置する、およびピコウェルを密封するためのキャップ。図１８Ａは、能動的キャップを示し、化合物は、切断可能なリンカーを介して放出可能である。図１８Ｂは、別の種類の活性キャップを示し、抗体などの試薬が結合している。結合した試薬は、持続的に連結でき、切断可能なリンカーで連結することができるか、または水素結合を介して結合でき、ピコウェル内の溶液に曝露し、続いて能動的キャップから離れて、この溶液内に拡散するだけで解放可能となる。図１８Ｃは、受動的キャップを示しており、ピコウェル内の溶液から代謝産物を吸収、吸着、収集、または捕捉するために使用できる吸収された代謝産物は、その後分析することができる。
【図１９−１】図１９Ａは、ピコウェルを覆うキャップのないのピコウェルプレートである。図１９Ｂは、各ピコウェルを覆うキャップを伴うピコウェルプレートである。図１９Ｃは、１つのキャップが各ピコウェルを覆って安全にしっかりと固定されている、ピコウェルプレートを覆って注がれるポリアクリルアミド溶液である。次に、ポリアクリルアミドが多孔性キャップに浸透し、固化して、各キャップに安定した接着を形成する。図１９Ｄは、次に、固化したポリアクリルアミドの「屋根」をピコウェルプレートから剥がし、各キャップをもたらす。次に、ピコウェル溶液から移動して、各キャップに吸収された代謝産物を分析できる。好ましくは、ピコウェルプレートを覆っておよびビーズを覆って注がれる溶液は、ヒドロゲルとなり、好ましくは、ビーズはヒドロゲルから作製される。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【００８９】
排他的な実施形態において、本開示は、システム、マイクロタイタープレート、マイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルを備えたマイクロタイタープレート、および関連する方法を除外することができ、少なくとも１つのウェルは、キャップ付きであり、液体ポリマー溶液は、プレートを覆い、キャップ付きウェルを覆って注がれる。また、除外できるのは、液体ポリマーが重合して各キャップに接着する固体ポリマーを形成する上記のものである。また、除外できるのは、固形ポリマーが引き裂かれ、付着しているキャップが取り除かれる方法および結果として得られる組成物である。
【図２０】ＩＫＺＦ１遺伝子を細胞のゲノムに組み込むために使用される環状プラスミドのマップ。プラスミドは、ＩＫＺＦ１  ｍＮＥＯＮ−ｐ２ａ−ｍＳｃａｒｌｅｔ−ｗ３−２ＦＢ（９０８１塩基対）である。ＩＫＺＦ１は、Ｉｋａｒｕｓタンパク質をコードする。
【図２１】ＩＫＺＦ３遺伝子を細胞のゲノムに組み込むために使用される環状プラスミドのマップ。プラスミドは、ＩＫＺＦ３  ｍＮｅｏｎ−ｐ２ａ−ｍＳｃａｒｌｅｔ−ｗ３−２ＦＢ（９０５１  ｂｐ）である。ＩＫＺＦ３は、Ａｉｏｌｏｓタンパク質をコードする。
【図２２−１】化学モノマー（化合物１〜６）およびそのＤＮＡバーコード。
【図２２−２】同上。
【図２３】化学モノマー（化合物７〜１０）およびそのＤＮＡバーコード。
【図２４−１】化学モノマー（化合物１１〜１６）およびそのＤＮＡバーコード。
【図２４−２】同上。
【図２５−１】化学モノマー（化合物１７〜２１）およびそのＤＮＡバーコード。
【図２５−２】同上。
【図２６−１】化学モノマー（化合物２２〜１６）およびそのＤＮＡバーコード。
【図２６−２】同上。
【図２７−１】化学モノマー（化合物２７〜３０）およびそのＤＮＡバーコード。
【図２７−２】同上。
【図２８】ビーズ結合ＤＮＡバーコードのシーケンシング。この図は、５つの連続する塩基の各々についての蛍光シグナルの強度を示し、５つの連続する塩基は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である。
【図２９】ステップ付きピコウェル。
【図３０】ビーズからのフルオロフォアの放出の時間経過。これは、ビーズ結合放出モニターの作動、ｔ＝０秒、ｔ＝１秒、ｔ＝１１秒、ｔ＝７１秒での発光データの取得を示す。
【図３１】クエンチャ−フルオロフォア基質に対するアスパルチルプロテアーゼの触媒作用後の放出データ。
【図３２】ピコウェルの断面図、様々なステップを示す。
【図３３】ＵＶ用量の増加がどのようにしてビーズからのフルオロフォアの切断を増加させるかを示す滴定データ。素人の言葉において、これは、斧のより強力なスイングが、フルオロフォアをビーズから切断するのにどのように影響するかを示している（ＵＶ用量のパワーは、ジュール／ｃｍ２で測定される）。「曝露」という表記は、写真を撮るときのパラメータのみを指す。これは、写真を撮るときの単なる曝露時間である（これは、切断を行う光の曝露時間、または励起を行う光を指すものではない）。
【図３４】ＴＡＭＲＡ濃度対光束。示されているのは、遊離ＴＡＭＲＡの濃度、続いて３６５ｎｍのＵＶ光への曝露後の放出である。
【図３５−１】クエンチャ−フルオロフォア基質、および酵素によるこの基質の切断、結果として酵素を阻害する手描き図を提供する。ビーズ結合ペプスタチン−Ａ、およびビーズ結合Ｆｍｏｃ−バリン（陰性対照）の分子構造も示す。
【図３５−２】同上。
【図３６】溶解した細胞からｍＲＮＡを最終的に捕捉するためにビーズを調整し、その後ｃＤＮＡライブラリを製造するステップ。この図はまた、仮出願（単一細胞上の化合物ライブラリをスクリーニングするための組成物および方法）の１つでも生じ、本出願の優先権が主張されている。
【図３７】タグ付けが細胞膜に埋め込まれている脂質を介してＤＮＡバーコードで細胞にタグ付けされる。この図はまた、仮出願の１つ（単一細胞上の複合ライブラリをスクリーニングするための組成物および方法）でも生じ、それから、本出願の優先権が主張される。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単数形の単語は、文脈が明確にそうでないと指示しない限り、対応する複数の参照を含む。本明細書で引用されるすべての参考文献は、個々の特許、公開された特許出願、図、図面、配列表、コンパクトディスクなどと同様に、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に参照により組み込まれる。
【００９１】
略称
表１は、略称および非限定的な定義を示す。
【表１−１】
2020534872.tif 000003
【表１−２】
2020534872.tif 000004
【表１−３】
2020534872.tif 000005
【表１−４】
2020534872.tif 000006
【表１−５】
2020534872.tif 000007
【００９２】
試薬、キット、酵素、バッファー、生細胞、器具類などを入手できる。例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｅｓｔｉｌｌ，ＳＣ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＰｒｏＭｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡを参照されたい。
【００９３】
バーコードゲルビーズ、非バーコードゲルビーズ、およびマイクロ流体チップは、１ＣｅｌｌＢｉｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから入手可能である。フローサイトメトリーについてのガイダンスおよび機器が利用可能である（例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（登録商標）ユーザーガイド、品番６４３２４５、Ｒｅｖ．Ａ、２００７年１２月、３４４ページを参照）。
【００９４】
「標識された」組成物は、直接的または間接的に、分光学的、光化学的、蛍光定量的、生化学的、免疫化学的、同位体的、または化学的方法、ならびにプラズモンナノ粒子を伴う方法で検出可能である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、エピトープタグ、蛍光色素、ラマンタグ、電子密度の高い試薬、基質、または酵素が含まれ、例えば、酵素結合免疫測定法、またはフルオレットで使用される（Ｒｏｚｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８）。
【００９５】
詳細な記載についての目次
（Ｉ）ビーズ
（ＩＩ）１つのビーズ、１つの化合物（ＯＢＯＣ）
（ＩＩＩ）核酸をビーズに結合する
（ＩＶ）ＤＮＡバーコード
（Ｖ）化合物をビーズに結合する
（ＶＩ）化合物を作製するために化学モノマーを互いに結合する
（ＶＩＩ）スプリットプール合成および平行合成
（ＶＩＩＩ）ピコウェルを製作する
（ＩＸ）ビーズをピコウェル内に堆積させる
（Ｘ）ピコウェル内のビーズ結合核酸のシーケンシング
（ＸＩ）ビーズからのビーズ結合化合物を放出する
（ＸＩＩ化合物の生化学的アッセイ
（ＸＩＩＩ）化合物についての細胞系アッセイ
（ＸＩＶ）細胞での摂動−応答分析
（Ｉ）ビーズ
【００９６】
本開示の方法および組成物は、モノサイズのＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｍ  ＮＨ２ビーズ（１０、２０、３０マイクロメートルなどの直径）、標準なＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）アミノ樹脂（９０、１３０マイクロメートルなどの直径）、ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｍａｃｒｏｂｅａｄｓ（登録商標）（２８０〜３２０マイクロメートルの直径）などのビーズを使用する（上記のすべてが、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，７２０７２  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから）。これらは、ポリエチレングリコールを用いて誘導体化されたポリスチレンコアを有する（Ｐａｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．８：４１７−４２６）。ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）樹脂は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされている低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトされたコポリマーである。したがって、本開示は、ＤＮＡバーコードおよび化合物のうちの一方または両方を含むように改変されたビーズまたは樹脂を提供し、未改変のビーズは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトコポリマーの形態をとる。
【００９７】
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）は、最大２０キロダルトンの分子量の「ＰＥＧ鎖が、官能化され架橋されたポリスチレンに固定化されていることによって特徴付けされる。約２０００〜３０００ダルトンのＰＥＧ鎖を有するグラフトコポリマーは、動態速度、移動性、膨潤、および樹脂容量」の点で最適であることが証明されている（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。したがって、本開示は、約２０００〜３０００ダルトンのＰＥＧ鎖を有するグラフトコポリマーの形態をとるビーズまたは樹脂を提供する。膨潤に関して、Ｃｏｍｅｌｌａｓらは、例えば、ＤＣＭ、ＤＭＦ、メチルアルコール、水、または酵素アッセイで使用されるバッファーに浸漬したときのビーズの膨潤能力を測定するためのガイダンスを提供する（Ｃｏｍｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ（２００９）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．４：ｅ６２２２（１２ページ））。膨潤の単位は、ビーズ１グラムあたりのミリリットルである。
【００９８】
代替のビーズの実施形態において、本開示は、ＰＥＧスペーサーがアルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着される樹脂を使用し、樹脂は、微小球およびモノサイズである（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｍ樹脂）。
【００９９】
さらに代替のビーズの実施形態において、本開示は、アルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着されるＰＥＧスペーサーを有する樹脂を使用し、樹脂タイプは２つの二官能性種に存在し、第１の表面改質樹脂は、ビーズの外面の反応部位が、ビーズの内部容積の反応部位に対して直交性に保護されており、第２のハイブリッド樹脂は、切断可能および切断不可能なリガンドが、この支持に存在し、連続的な切断用に開発された（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｂ樹脂）。
【０１００】
さらに、別の実施形態において、本開示は、ＰＥＧスペーサーが、アルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着しており、マクロビーズ樹脂が、非常に大きな粒子径および高容量を示す、樹脂を使用する（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ＭＢ樹脂）。また、本開示は、ＰＥＧスペーサーが、ベンジルエーテル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着される樹脂を使用する。この樹脂は、免疫手順またはＰＥＧ修飾誘導体（ＰＥＧ結合ＰＥＧ修飾化合物）（ＴｅｎｔａＧＥｌ（登録商標）ＰＡＰ樹脂）についての合成に使用できる。
【０１０１】
さらに、ビーズは、ＨｙｐｏＧｅｌ（登録商標）２００樹脂であり得る。これらの樹脂は、低架橋ポリスチレンマトリックス（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ＣＨ−９４７１  Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にグラフトされたオリゴエチレングリコール（ＭＷ  ２００）の複合材料である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧリンカーのないアミノ官能化ポリスチレンビーズは、例えば、モノサイズのポリスチレンＭ  ＮＨ２マイクロビーズ（５、１０、２０マイクロメートルなどの直径、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，７２０７２  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから）がさらに使用され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、化合物は、ビーズへの共有結合の付着なしで、ビーズ内の細孔またはチャンバまたはトンネル内にカプセル化され得る。化合物は、様々な手段によってビーズのかかる細孔内に拡散または強制され得る。いくつかの実施形態において、化合物は、拡散によってビーズ内に負荷し得る。いくつかの実施形態において、高温を使用して、ビーズを膨潤させ、ビーズ内に化合物を負荷し得る。いくつかの実施形態において、高圧を使用して、化合物をビーズに強制し得る。いくつかの実施形態において、ビーズを膨潤させる溶媒を使用して、ビーズ内に化合物を負荷し得る。いくつかの実施形態において、真空または低圧を使用して、化合物をビーズに分割し得る。いくつかの実施形態において、穏やかな、または激しい物理的攪拌を使用して、化合物をビーズに負荷し得る。
【０１０４】
化合物が共有結合の付着なしで、ビーズ上に負荷されるかかる実施形態において、化合物は、拡散によってビーズから除荷され得る。いくつかの実施形態において、非限定的な様式で、温度、圧力、溶媒、ｐＨ、塩、バッファー、もしくは界面活性剤、またはかかる条件の組み合わせを使用して、かかるビーズから化合物を取り出し得る。いくつかの実施形態において、例えば、非架橋重合ビーズによるビーズの物理的完全性を使用して、かかるビーズ内に含まれる化合物を放出し得る。
【０１０５】
除外的な実施形態において、本開示は、上記のビーズの１つを含む、任意のビーズ、およびビーズ−化合物複合体、または任意の方法を除外することができる。
【０１０６】
本開示のビーズは、以下をさらに含む。メリフィールド樹脂（クロロメチルポリスチレン）；ＰＡＭ樹脂（４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチルポリスチレン）；ＭＢＨＡ樹脂（４−メチルベンズヒドリルアミン）；臭素化ワング樹脂（アルファ−ブロモプリオピオフェノン）；４−ニトロベンゾフェノンオキシム（カイザー）樹脂；ワング樹脂（４ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン；ＰＨＢ樹脂（ｐ−ヒドロキシベンジルアルコール；ＨＭＰＡ樹脂（４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸））；ＨＭＰＢ樹脂（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシルブタン酸）；２−クロロトリチル樹脂；４−カルボキシトリチル樹脂；リンク酸樹脂（４−［（２，４−ジメトキシペヘニル）ヒドロキシメチル）フェノキシメチル）；リンクアミド（ＲＡＭ）樹脂「Ｋｎｏｒｒ」樹脂（４−（（２，４−ジメチルフェニル）（Ｆｍｏｘ−アミノ）メチル）フェノキシアルキル）；ＰＡＬ樹脂（５−［４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル−３，５−ジメトキシフェノキシ］バレルアミドメチルポリスチレン）；シーバーアミド樹脂（９−Ｆｍｏｘ−アミノ−キサンタン−３−イル−オキシメチル）；ＨＭＢＡ樹脂（ヒドロキシメチル安息香酸）；４−スルファモイルベンゾイル樹脂「Ｋｅｎｎｅｒの安全装置」樹脂（Ｎ−（４−スルファモイルベンゾイル）アミノメチル−ポリスチレン）；ＦＭＰ−樹脂（４−（４−ホルミル−３−メトキシフェノキシ）−エチル）（ＣｈｅｍＦｉｌｅｓ  Ｒｅｓｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌ．３（３２ページ）（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ＣＨ−９４７１  Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照されたい）。
【０１０７】
本開示のビーズは、化合物の受動的なカプセル化物質として使用される上記のビーズ（化合物への共有結合的な連鎖なしに化合物を受動的に保持する）をさらに含み、非官能化ポリスチレンビーズ；シリカビーズ；アルミナビーズ；多孔性ガラスビーズ；ポリアクリルアミドビーズ；酸化チタンビーズ；アルギン酸ビーズ；セラミックビーズ；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）ビーズ；メラミンビーズ；ゼオライトベッド；ポリラクチドビーズ；デブロックコポリマーミセル；デキストランビーズなどをさらに含む。この段落に列挙されているビーズの多くは、Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ  １０５１６，ＵＳＡなどのベンダーから購入され得る。
【０１０８】
ビーズに加えて、小胞または小滴はまた、本開示のいくつかの実施形態のための化合物を送達するためのビヒクルとして使用され得る。脂質、デブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、または他の膜形成材料を使用して、化合物が負荷され得る内部容積が形成され得る。洗剤、機械的攪拌、温度、塩、ｐＨ、その他の手段を追加することにより、これらのカプセル化された容積から化合物が放出され得る。油中水滴乳濁液または水中油滴乳濁液は、アッセイ容積に送達され得る化合物を受動的にカプセル化するさらに他の手段である。
【０１０９】
受動的カプセル化が化合物を送達するために使用されるすべての実施形態において、ＤＮＡタグは、さらに受動的に負荷され得るか、または代替的に、ＤＮＡタグは、ビーズ、小胞、または液滴に共有結合的に付着され得る。
【０１１０】
除外的な実施形態において、本開示は、上記の化学物質のいずれかで作製された、または上記の化学物質のいずれか１つの誘導体で作製されたビーズまたは樹脂を除外することができる。
【０１１１】
実施形態において、ビーズは、球状体であり得、約０．１〜１マイクロメートル、約１〜５マイクロメートル、約１〜１０、約５〜１０、約５〜２０、約５〜３０、約１０〜２０、約１０〜３０、約１０〜４０、約１０〜５０、約２０〜３０、約２０〜４０、約２０〜５０、約２０〜６０、約５０〜１００、約５０〜２００、約５０〜３００、約５０〜４００、約１００〜２００、約１００〜４００、約１００〜６００、約１００〜８００、約２００〜４００、約２００〜６００、約２００〜８００マイクロメートルなどの直径を有し得る。
【０１１２】
上記の値および範囲の用語において定義可能な非球状体ビーズも提供される。例えば、軸の１つ、または一次寸法の１つ（例えば、側面）、または二次寸法の１つ（例えば、対角線）は、上記の範囲の値を含み得る。除外的な実施形態では、本開示は、上記の値または範囲のうちの１つ以上に該当する球状体ビーズ（または非球状体ビーズ）を包含する任意の試薬、組成物、システム、または方法を除外することができる。
【０１１３】
ビーズの鎖。一実施形態において、複数のビーズ二量体が提供され、ビーズ二量体は、互いに付着した２つのビーズの形態をとり、一方のビーズには複数の付着した核酸バーコード（直交性核酸モジュール、または連鎖状核酸モジュールのいずれか）が含まれており、もう一方のビーズには複数の付着された化合物が含まれ、すべての化合物は、互いに実質的に関連している（またはすべての化合物が化学構造において互いに実質的に同一である）。ビーズ二量体は、化合物が付着した第１のビーズを調整し、核酸バーコードが付着した第２のビーズを別々に調整して、次に２つのビーズを連結することで合成され得る。一態様において、ビーズは可逆的リンカーによって互いに付着され、別の態様において、ビーズは非可逆的リンカーによって互いに付着される。
【０１１４】
ビーズ透過性。実施形態において、本開示は、様々な範囲または程度の透過性を有するビーズを提供する。透過性は、溶媒によって到達可能なビーズの容積の割合として測定でき、測定の単位は、形態もしくは細孔をとるビーズの表面の割合であり、または測定の単位は、ビーズの表面（および外部媒体）と流体連通しているチャネル、ネットワーク、もしくはチャンバの形態をとるビーズの内部の割合である。本開示は、多孔性ビーズを包含することができるか、または代替的に、多孔性ビーズを除外することができる。
【０１１５】
Ｒｏｔｈｂｅｒｇの米国特許第９，０６２，３０４号は、外部および内部領域を有するビーズを開示する。「内部表面（細孔表面）」、「より大きな分子を排除するであろう好適な細孔」、任意で「内および外面の開発した差次的な機能化」さまざまな細孔径、ポリ（スチレンスルホン酸）およびポリスチレンなどのポリマーが示される。Ｒｏｔｈｂｅｒｇの図１は、ビーズの表面およびビーズの細孔の写真を提供する。Ｂｅｄｒｅの米国特許第９，７４５，４３８号は、多孔性ビーズの透過性電子顕微鏡画像を提供する。Ｓｍｉｔｈの米国特許第５，８８８，９３０号は、多孔性ビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真を提供する。表面に小さな細孔、および内部に大きな細孔を有する球状ビーズが示され、ビーズは、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、セルロース、またはポリウレタンから作製される。Ｃｏｏｋｅの米国特許第５，０４７，４３７号は、スキンレス表面（図１）および表面に外部スキンを有するビーズ（図５）を備えた球状ポリ（アクリロニトリル）コポリマーの細孔形態を開示する。Ｔｓａｏの米国特許第４，０９０，０２２号は、セルロースビーズの多孔性開口および内部空間を開示する。
【０１１６】
すべての図を含む上述される特許の各々は、それぞれが全体として参照により個々に組み込まれるように、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
いかなる限定も意味することなく、ビーズまたは微粒子の外面は、ビーズまたは微粒子全体を弾性フィルムでしっかりと包むことによって決定することができる。ビーズもしくは微粒子は、思考実験を介して包むことができるか、または包まれたビーズは、図もしくは写真で描くことができるか、またはビーズは、実際に包むことができるいかなる限定も意味することなく、ビーズの外面は、包みに物理的に接触するビーズの部分である。
【０１１８】
例えば、本開示は、表面積の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％を占める細孔を有するビーズを提供する。また、本開示は、内部チャネルまたはネットワークの容積が、ビーズの総容積の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％を占めるビーズを提供し、内部チャネルまたはネットワークは、ビーズの外面（および外部媒体）と流体連通している。
【０１１９】
さらに、本開示は、表面積の１％未満、２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満を占める細孔を有するビーズを提供する。また、本開示は、内部チャネルまたはネットワークの容積が、ビーズの総容積の１％未満、２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満を占めるビーズを提供し、内部チャネルまたはネットワークは、ビーズの外面（および外部媒体）と流体連通している。
【０１２０】
鉄心ビーズ。本開示は、鉄心ビーズまたは磁気ビーズを包含する。これらのビーズは、磁石を用いて操作し、それらを１つの反応容器から別の反応容器に、または１つの容器から別の容器に移動する。これらのビーズを使用することにより、ロボット工学による操作を強化できる。磁気ビーズの製造および使用方法が利用可能である（Ｓｚｙｍｏｎｉｆｋａ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ（１９９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．３６：１５９７−１６００；Ｌｉｕ，Ｑｉａｎ，Ｘｉａｏ（２０１１）ＡＣＳ  Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１３：５３７−５４６；Ａｌａｍ，Ｍａｅｄａ，Ｓａｓａｋｉ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：４６５−４７３）。
【０１２１】
除外的な実施形態において、本開示は、任意のビーズまたは任意のビーズの集団を除外することができ、ビーズまたは集団は、上記の値または範囲の一方を満たす。
【０１２２】
ビーズへの化合物の負荷
多くの実験において、事前に合成された化合物をビーズに負荷することが有利であり、ビーズは、化合物をアッセイに送達するためのビヒクルとして使用できる。生体標本への薬物送達に使用される標準的な技術の多くは、化合物をアッセイに送達するために適合され得る（Ｗｉｌｃｚｅｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．６４：１０２０−１０３７、Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ（２００７）Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：２０３−２０９、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｒｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．５：６５−７７を参照されたい）。
【０１２３】
事前に合成された化合物が、ビーズに負荷される、かかる実施形態において、化合物は、従来の９６、３８５、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートに保持され得る。これらのプレートにビーズが追加され得、拡散または他の活性な負荷法によって化合物が負荷される。好ましい実施形態において、含浸用に選択されたビーズは、母液から除去される際に化合物がすぐに枯渇するのを防ぐ細孔サイズまたは浸透形状を有する。ビーズの外部への拡散は、必要に応じて、熱、圧力、添加剤、または他の刺激剤によって強化される。いくつかの実施形態において、化合物を負荷したビーズは、外部衝撃によって引き起こされるまで内部内容物の漏出を防ぐ様式でキャップされ得る。多孔性ビーズの外側をキャップする１つの方法は、脂質または両親媒性分子をビーズ化合物溶液に追加して、ビーズの表面に露出した空洞が両親媒性分子によって形成された二重層によって密封されるようにすることである。いくつかの実施形態において、事前に形成された小胞は、薬物を負荷したビーズと混合され得、その結果、攪拌すると、小胞は破裂し、膜は薬物を負荷したビーズの表面上で再形成され、それによってそれらを密封する。かかるビーズの密封を実行する方法が記載される（Ｔａｎｕｊ  Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏ．：８４８を参照されたい）。シリカビーズを密封するためのさらなる実験プロトコルは、Ｓａｎｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  のＲｙａｎ  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＡＮＤ２００７−１５６０による報告の公表において利用可能であり、ｂＳＵＭ法は、Ｈｕｉ  Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（ｂＳＵＭ：Ａ  ｂｅａｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｇｉａｎｔ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１６）１４７：７７−９３に記載される。
【０１２４】
事前に合成された化合物を利用するいくつかの実施形態において、ビーズは、適切な試薬の追加により、例えば、脂質またはジブロックコポリマーを追加し、続いて攪拌することにより、化合物から生成され、それにより、小胞が形成され、それらの内部または二重層膜内に化合物を含む。いくつかの実施形態において、化合物は、マイクロ流体Ｔ接合部を介して押し出され、油相に水相の液滴を作製し、化合物は、水相内、または水相および油相の間の界面に含まれる。いくつかの実施形態において、形成された液滴は、さらに重合され、非重合水性相液滴よりも頑丈で取り扱いに対して安定なヒドロゲルを生成し得る。液滴系カプセル化およびアッセイは、Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＳＬＡＳ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖｏｌｕｍｅ：１９  ｉｓｓｕｅ：４，ｐａｇｅ（ｓ）：４８３−４９６に開示される。ゾルゲルカプセル化プロセスは、ビーズ内に化合物をカプセル化するためにさらに利用され得る。ゾルゲルビーズの形成は、Ｓｏｌ−ｇｅｌ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｘｉａｏｌｉｎ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１５：２２３に記載される。
【０１２５】
１つのビーズ、１つの化合物（ＯＢＯＣ）
コンビナトリアルライブラリの製造に使用される方法は、（１）ライブラリの調整、（２）ライブラリ内の化合物のスクリーニング、（３）化合物の構造、例えば、すべての化合物またはスクリーニングで興味深い結果が提供された化合物のみ構造を決定する３つのステップを含む（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｔｈｅ  Ｏｎｅ−Ｂｅａｄ−Ｏｎｅ−Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４１１−４４８を参照されたい）。ビーズ結合合成を介した化合物の合成の利点は、「スプリットプール」法によって化合物を迅速に作製できることである。
【０１２６】
コード戦略と組み合わせたＯＢＯＣ。ＯＢＯＣの別の特徴は、各ビーズに、化合物だけでなくコード戦略をさらに含むことである。ビーズ結合核酸が、同じビーズと結合している化合物をコードするために使用される場合、「コードする」という用語は遺伝コードを指さない。代わりに、「コードする」という用語は、ユーザーが数千の短い核酸配列の各々を単一のビーズ結合化合物と関連付けるレジェンド、キー、またはコードを所有していることを意味する。
【０１２７】
核酸が関連化合物をコードする、ビーズ結合化合物およびビーズ結合核酸を有するビーズの使用の劇的なバリエーションは、以下のとおりである。劇的なバリエーションは、複合体のライブラリを製造することであり、ライブラリの各メンバーは、小分子とＤＮＡ部分との複合体の形態をとり、ＤＮＡ部分は、小分子をコードする）。この複合体は、可溶性であり、ビーズ結合ではない。細胞または精製されたタンパク質でスクリーニングした後、複合体は、細胞または精製されたタンパク質と結合したままであり、それにより複合体を単離し、複合された核酸をシーケンシングすることで最終的に化合物を特定できる（Ｓａｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６：１６２３−１６３２を参照されたい）。
【０１２８】
ここで、この特許文書の大部分と同様に、「コードする」という用語は、遺伝コードを指すのではなく、代わりに、研究者が特定の核酸配列を使用して、それに付着している化合物の特定の既知の構造を示すという事実を指す。
【０１２９】
ＤＮＡバーコードの使用などのコード戦略を使用する代わりに、陽性をスクリーニングする（それにより陽性をスクリーニングする化合物を示す）ビーズは、エドマン分解または質量分析に供して、ビーズ結合化合物を特定できる（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１６：１２１２−１２２３を参照されたい）。ビーズ結合化合物がペプチドの場合、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して、陽性スクリーニングペプチド化合物の配列を直接的に決定できる。レーザー照射下で切断およびイオン化が同時に起こるため、直接的なシーケンシングが可能である（Ｓｏｎｇ，Ｌａｍ（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６１８０−６１８８）。
【０１３０】
コンビナトリアルライブラリのスプリットプール合成を実行する際の１つの微細なポイントは、すべての化合物が共通のモチーフを共有するように化合物を製造できることである。この戦略は、「化合物のライブラリではなく、モチーフのライブラリの生成」として記載されている（Ｓｅｐｅｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：５４２６−５４３０；Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ、４１８の前述を参照されたい）。
【０１３１】
大きなビーズの典型的な例を提供するために、ビーズは、０．１ｍｍの直径であり、同じ化合物の約１０１３コピーを保持できる（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ、前述）。ビーズ結合化合物のライブラリの調製後、各ビーズは、個々のアッセイで使用でき、アッセイは、生化学的活性、または代替的に、結合活性を測定する。アッセイは、「ビーズ上」アッセイであるか、または代替的に、化合物をビーズから切り離して、液相アッセイで使用することができる（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ、前述）。
【０１３２】
任意のタイプのビーズのパラメータは、所定のアッセイ培地で膨潤する傾向が含まれ、ビーズのポリマーは、疎水性または親水性であり、各化合物を付着させるためのビーズ上の付着部位の特定、ポリエチレングリコールなどのスペーサーかどうかの問題を使用して、ビーズの表面から各化合物をいくらか分離し、ビーズの内部容積を提供する。
【０１３３】
ビーズに化合物を付着させる必要性を考慮するが、ビーズの疎水性表面から遠く離れていることは、前述にＬａｍらが、ポリオキシエチレングラフト化スチレン（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標））が、官能化可能基がポリオキシエチレン鎖の末端にあり、したがって疎水性ポリスチレンから遠く離れているという利点を有することを開示する。水溶性リンカーを有するビーズには、ＴｅｎｔａＧｅｌ、およびポリジメチルアクリルアミドビーズ（ＰｅｐＳｙｎ（登録商標）ｇｅｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｔｈｗｉｔｃｈ，ＵＫ）が含まれる。
【０１３４】
内部容積のパラメータは利点を提供でき、ビーズ結合ＤＮＡバーコードおよびビーズ結合化合物の標的の間の相互作用を防ぐ必要がある。この利点を活用するために、ＤＮＡバーコードがビーズの内側に位置するようにビーズを製造することができ、これに対して、スクリーニングされる化合物はビーズの表面に付着される（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ、前述、４３８〜４３９で）。内部容積のこの利点は、ビーズ結合化合物が切断可能なリンカーによって付着されている場合、および化合物のアッセイが、切断および放出されている化合物に対してのみ行われる場合、無関係であり得る。
【０１３５】
Ａｐｐｅｌｌらは、化学ライブラリを合成し、続いてスクリーニングを行って活性化合物を検出するためのスプリットプール法の非限定的な例を提供する（Ａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．１：２７−３１）。ライブラリビーズは、第１のマイクロウェルプレート、ナノウェルプレート、またはピコウェルプレート上のウェルのアレイにおける各ウェルに１つずつ配置される。ビーズは、ビーズ結合化合物の約５０％を切断するために光に曝露され、ウェル内の溶液に放出される。次に、放出された化合物は、第２のマイクロウェルプレートに移され、活性化合物を含むウェルを検出するためのアッセイを行い、それにより第１のプレートのどのビーズが活性なビーズ結合化合物を含むかを特定する。次に、「活性［化合物］が単一ビーズから特定されると、ビーズが回収されて解読され、したがって、活性化合物の合成履歴および構造が得られる」（Ａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、前述）。
【０１３６】
ビーズ結合化合物をスクリーニングする細胞系スクリーニングアッセイでは、Ｓｈｉｈらは新しいタイプのビーズを提供する（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１６：１２１２−１２２３）。この新しいタイプのビーズは、「卵巣癌に指向する合成的な死リガンド」のライブラリのメンバーであるビーズ結合化合物を含む。ビーズはビオチンでさらに装飾されており、サンドイッチを作製する２つの化学物質が追加され、サンドイッチは細胞とビーズの接着を維持する。サンドイッチは、ストレプトアビジンとビオチン−ＬＸＹ３０複合体とが含まれるこのサンドイッチは、ビーズをＬＸＹ３０の受容体に接続し、これは、細胞表面上の周知であるタンパク質、すなわち、インテグリンである。前述のＳｈｉｈらの方法は、がん細胞を殺傷できる新しい分子（「ＬＬＳ２」）の発見をもたらした。上記の方法では、ビーズ結合化合物を使用し、化合物は、細胞と結合する（化合物が依然としてビーズ結合を介する場合であっても）。Ｃｈｏらは、同様の１つのビーズ、１つの化合物ライブラリを作製し、スクリーニングされる化合物は、細胞と結合するのに十分であった（上述されるサンドイッチについての任意の必要性なしに）（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）ＡＣＳ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１５：３９３−４００）。Ｃｈｏらの報告の目的は、がん細胞によって発現されるインテグリンと結合するＲＧＤ含有ペプチドを発見することであった。上記に開示された試薬および方法は、本開示に有用である。
【０１３７】
核酸をビーズに結合する（直交性式；連鎖状式）
連鎖状バーコードおよび直交性バーコードのトピックを理解する１つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連鎖状バーコード化を超える直交性バーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、平行して付着されるのは、ＤＮＡバーコードモジュールである。連鎖状バーコード化では、所定のモジュールの付着が不完全である場合（つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に結合されなかった場合）、完成されたバーコードの配列は、正確ではないであろう。「正確ではない」という表現は、不完全なカップリングを意味し、完成された正しいＤＮＡバーコードであると想定された小さな塊から欠落し得る塊を意味する。ここで、すべてのモジュールの付着に失敗したため、完成されたバーコード配列は誤りを含むであろう。対照的に、直交性バーコード化は、各個々のモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、モジュールがビーズ上の所定の部位に付着されると、すでに付着されているモジュールにさらなるモジュールは接続されないであろう。
【０１３８】
本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するため、および部分的に合成されたビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための試薬および方法を提供する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに付着する前に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとることができ、このｄｓＤＮＡは、マイトマイシンＣなどのＤＮＡ架橋剤で処理される。ｄｓＤＮＡ形態のＤＮＡバーコードの合成の完了後、このｄｓＤＮＡはｓｓＤＮＡに変換される。ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの変換は、ＤＮＡ鎖の１つにウラシル（Ｕ）残基を有する場合に有効であり、ウラシル残基の位置でのＤＮＡの切断は、ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼによって触媒される（２０１７年９月２５日に出願されたシリアル番号第６２／５６２，９０５号の図５を参照されたい。シリアル番号第６２／５６２，９０５号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記は、ビーズ結合化合物を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
【０１３９】
ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、ＤＮＡバーコードを二本鎖ＤＮＡの形態で合成することであり、相互に付着されているＤＮＡバーコードモジュールの各々は、ｄｓＤＮＡの形態をとり、二本鎖の各々は、ＤＮＡヘッドピースを介して安定化される。完成されたＤＮＡバーコードの最終的なシーケンシングのために、鎖の１つは、ＤＮＡヘッドピースから切断され、除去される。上記は、ビーズ結合化合物（この化合物が化学ライブラリのメンバーである場合）を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
【０１４０】
ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するためのさらに別の方法は、ヘアピンを形成するための自己組織化を介してＤＮＡバーコードを合成することであり、このＤＮＡバーコードは、ヘアピンの第１の突起がヘアピンの第２の突起にアニールすることで自己組織化する。
【０１４１】
合成されるＤＮＡバーコードが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとる場合、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＭＡなどの溶媒は、ＤＮＡバーコードを変性できる。上記の方法および試薬は、変性を防ぐことができる。
【０１４２】
上述されるように、「ＤＮＡバーコード」という用語は、化合物全体を特定するポリヌクレオチドを指すことができ、対照的に、「ＤＮＡバーコードモジュール」は、化合物を構成するモノマーの１つのみを指すことができる。
【０１４３】
ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用し、７−ａｚａ−ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを介してこのｄｓＤＮＡの末端を密封することである。
【０１４４】
代替の実施形態において、方法は、「連鎖状ＤＮＡバーコード化」および「直交性ＤＮＡバーコード化」の間の中間体を使用することができ、この中間体は、ＤＮＡバーコードのブロックを伴い、つまり、各ブロックは、２つのＤＮＡモジュールを含むか、または３つのＤＮＡモジュールを含むか、または４つのＤＮＡモジュールを含むか、または５つのＤＮＡモジュールなどを含む（しかし、完全長の化合物を特定するすべてのＤＮＡモジュールは含まれない）。
【０１４５】
図１は、連鎖状構造化ビーズの例示的および非限定的な図を開示する。ビーズは、複数のＤＮＡバーコード（各々がＤＮＡバーコードモジュールで作製される）および複数の化合物（各々が化学ライブラリモノマーで作製される）を含む。話を簡単にするために、「ＤＮＡバーコード」という用語は、「ＤＮＡバーコードモジュール」であるすべての核酸、およびいくつかの機能を提供するすべての核酸を含むポリマーを指すために使用される。機能は、シーケンシングプライマーについてのアニーリング部位にすることができるか、または、機能を使用して、ビーズ結合化合物の化学合成のステップを特定できる。図１は、ビーズ結合化合物をさらに示しており、各化合物は、いくつかの化学ライブラリメンバーで作製されており、各化学ライブラリメンバーは、四角形、円、または三角形で表される。図１は、各ＤＮＡバーコードモジュールに１から８まで連続して付番されることを示しており、これらの番号は、それぞれの８つの形状（四角形、円、三角形）に対応する。明確にするために、機能を果たす（および特定の化学単位を表さないまたは「コードしない」）核酸は、図には示されていない。
【０１４６】
図２は、直交性構造化ビーズの例示的および非限定的な実施形態を開示する。ビーズは、複数のＤＮＡバーコード（各々がＤＮＡバーコードモジュールで作製される）を含むが、各ＤＮＡバーコードモジュールは、ビーズ上の別々の連結部位に付着される。ＤＮＡバーコード全体は、８つのＤＮＡバーコードモジュールからなり、図では、１〜８に付番される。特定のＤＮＡバーコードからの情報が読み取られ、同じビーズと結合された化合物を特定するために使用される場合、別々に付着される各ＤＮＡバーコードモジュールの各々でＤＮＡシーケンシングを実行する必要がある。図２において、ビーズは、８つの形状（円、四角形、三角形）によって示されるように、各々が８つのユニットを有する複数の付着した化学化合物を含む。
【０１４７】
図２において、明確にするために、各ＤＮＡバーコードモジュールに付着された機能性核酸は示されていない。当然であるが、ＤＮＡバーコードモジュールの各々は、完成された完全長の化合物における化学ライブラリモノマーの位置を特定する核酸が必要である。図２に示す例では、位置は、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８である必要がある。
【０１４８】
一実施形態において、化学モノマーが最初に付着され、次に、対応するＤＮＡバーコードモジュールが付着される。代替的な実施形態において、ＤＮＡバーコードモジュールが最初に付着され、次に、対応する化学モノマーが付着される。また、「一実施形態」を使用することもあれば、「代替的な実施形態」を使用することもある有機合成の手順に従うことができる。さらに別の代替的な実施形態において、本方法は、いくつかのＤＮＡバーコードモジュールのブロックの付着と平行して、ビーズに付着したいくつかの化学モノマーのブロックのブロックごとの追加を提供する。
【０１４９】
除外的な実施形態において、除外できるものは、ビーズへの化学モノマー、ＤＮＡバーコードモジュール、または化学モノマーおよびＤＮＡバーコードモジュールの両方のブロックごとの追加を使用した試薬、組成物、および方法である。
【０１５０】
これは、ビーズ結合ポリヌクレオチドに存在し得る核酸に関係し、ビーズ結合化合物のモノマーを「コードする」または特定するのに役立つ核酸を含む。除外的な実施形態において、本開示は、「ステップ特異的ＤＮＡシーケンシングプライマー部位」をコードする核酸を除外することができる。この状況では、化合物に存在する化学モノマーごとに、対応するＤＮＡバーコードモジュールが存在する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、少なくとも１つの対応するプライマー結合部位、つまり「ステップ特異的ＤＮＡシーケンシングプライマー部位」が隣接する。また、除外できるのは、ステップ１、ステップ２、ステップ３、またはステップ４など、化合物の化学合成における特定のステップをコードまたは指定する核酸である。
【０１５１】
さらに、本開示は、スペーサーとして機能する核酸を含み得る。例えば、スペーサーは、シーケンシングプライマーのアニーリング部位である第１の部位および化学モノマーを特異する第２の部位の間に、ポリヌクレオチド鎖に沿った距離を作製できる。また、本開示は、別の核酸によって提供される情報を繰り返しまたは確認する核酸を使用することができる。また、本開示は、ＰＣＲプライマー結合部位をコードする核酸を使用することができる。ＰＣＲプライマー結合部位を有するポリヌクレオチドは２つのＰＣＲプライマー結合部位を有し、これらの部位の両方が同じ融点（ＰＣＲプライマーがＰＣＲプライマー結合部位にアニーリングするときの融点）を有するように設計されているため、ＰＣＲプライマー結合部位は、シーケンシングプライマーと区別できる。
【０１５２】
除外的な実施形態において、本開示は、スペーサーとして、または単独のスペーサーとして機能する核酸を除外することができる。また、本開示は、別の核酸によって提供される情報を繰り返しまたは確認する核酸を除外することができる。さらに、本開示は、ＰＣＲプライマー結合部位として機能する核酸を除外することができ、ＰＣＲプライマーではないプライマーのための結合部位として機能する核酸を除外することができる。
【０１５３】
さらに、本開示は、化学ライブラリが作製された日付を特定する、または特定の化合物の化学合成におけるステップを特定する、またはプライマーアニーリング配列として機能する核酸を除外することができる。
【０１５４】
特定のＤＮＡバーコードモジュールに対するシーケンシングプライマーの提供。本開示は、ＤＮＡバーコードモジュールおよび１つ以上のシーケンシングプライマーアニーリング部位を含むＤＮＡバーコードを提供する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、それ独自の専用のシーケンシングプライマー結合部位を有し得る。代替的に、ビーズ結合ＤＮＡバーコード上に存在し得るように、１つの特定のシーケンシングプライマー結合部位を使用して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の連続したＤＮＡバーコードモジュールがシーケンシングされ得る。
【０１５５】
以下に、各ＤＮＡバーコードモジュールが、それ独自の専用のシーケンシングプライマー結合部位を有する状況を記載する。本開示は、ＤＮＡシーケンシングプライマーを結合することが可能なプライマー結合部位を含むビーズ結合連鎖状バーコードを提供し、該プライマー結合部位は、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第５のＤＮＡバーコードモジュール、および第６のＤＮＡバーコードモジュールのうちの１つ以上のシーケンシングを指示することが可能であり、プライマー結合部位は、第１のＤＮＡバーコードモジュールおよびプライマー結合部位の間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第１のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第２のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第３のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第４のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第５のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライム、または間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第６のＤＮＡバーコードモジュールに対して３プライムに位置する。
【０１５６】
コード配列およびコード配列に相補的な配列。本開示は、本文書における上述または他の場所に開示されたコード配列のいずれか１つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてを包含することができる。除外的な実施形態において、除外することができるものは、本文書における上述または他の場所に開示されたコード配列のいずれか１つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてである。また、本文書の上述または他の場所に記載されるコード配列のいずれか１つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてをコードする二本鎖核酸を除外できることをさらに含む。
【０１５７】
直交性式ＤＮＡバーコード（各ＤＮＡバーコードモジュールがビーズ上の別々の位置に付着される）
直交性式ビーズの合成。直交性合成では、各ＤＮＡモジュールが、ビーズ上の別々の部位に共有結合的に付着され、その結果、ＤＮＡバーコード全体が複数のＤＮＡモジュールによって提供される。ＤＮＡバーコードが直交性構造を有する場合、ＤＮＡバーコードモジュールは、相互に付着されておらず、代わりに、ＤＮＡバーコード分子の各々すべては、その特定のＤＮＡバーコードモジュール専用のそれ独自のビーズ付着部位を有する。
【０１５８】
各ＤＮＡバーコードモジュールの合成ステップ数を特定する核酸。実施形態において、直交性ＤＮＡバーコードは、化合物合成の第１のステップを特定する短い核酸を含む。この実施形態の場合、第１の化学モノマーおよび第１のＤＮＡバーコードモジュールの平行な付着より、第１のＤＮＡバーコードモジュールは、実際には、［第１のＤＮＡバーコードモジュール］に接続された［「ステップ１」を意味する短い核酸］の２つの核酸の複合体の形態をとる。この複合体のすべてのヌクレオチドは、互いにインフレームであり、シーケンシングアッセイで読み取ることができるが、第１の短い核酸は、スペーサー核酸を介して第１のＤＮＡバーコードモジュールに任意で付着され得る。
【０１５９】
以下は、直交性ＤＮＡバーコードの上記の記載の続きである直交性ＤＮＡバーコードは、化合物合成の第２のステップを特定する短い核酸を含む。この実施形態の場合、第２の化学モノマーおよび第２のＤＮＡバーコードモジュールの平行な付着より、第２のＤＮＡバーコードモジュールは、実際には、［第２のＤＮＡバーコードモジュール］に接続された［「ステップ２」を意味する短い核酸］の２つの核酸の複合体の形態をとる。この複合体のすべてのヌクレオチドは、互いにインフレームであり、シーケンシングアッセイで読み取ることができるが、第２の短い核酸は、スペーサー核酸を介して第２のＤＮＡバーコードモジュールに任意で付着され得る。
【０１６０】
上述される方法は、任意の所定のビーズについて、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および最後のＤＮＡバーコードモジュールならびに最後の化学モノマーまで繰り返される。上記の方法は、スプリットプール合成を使用して、ビーズ結合したＤＮＡバーコードおよび化合物を作製する場合に使用できる。
【０１６１】
直交性構造は、連鎖状構造を超えて次の利点を提供する。連鎖状合成（すべてのＤＮＡバーコードモジュールが１つの連続したポリマーで相互に付着されている）の場合、中間体カップリングステップのいずれかの合成の達成を失敗すると、最終的に完成された連鎖状ＤＮＡバーコードの意味が損なわれる可能性がある。対照的に、直交性合成（ビーズ上の専用サイトに付着された各々すべてのＤＮＡバーコードモジュール）では、ＤＮＡバーコードモジュールのいずれかの付着に失敗した場合、ビーズ上の付着部位が空になるだけの結果となり、他の付着されたＤＮＡバーコードモジュールのいずれの意味も損なわれないであろう。好ましい実施形態において、各付着されたＤＮＡバーコードモジュールは、付着された第２の核酸を含み、この第２の核酸は、ステップ（ＤＮＡバーコードおよび化合物の平行合成中のステップ）を特定する。
【０１６２】
直交性合成の場合、ビーズ上のすべての付着部位を使い切ることが許容される（成長する化学ライブラリメンバーを付着するための部位）。しかしながら、直交性合成の場合、化学反応は、多くのＤＮＡバーコードモジュールの第１の付着により、ビーズ上の付着部位の集団全体が部分的にしか使用されないように設計する必要がある。以下は、直交性バーコードの化学合成中に部位を消耗する任意の限定を提供する。非修飾ビーズの場合、ＤＮＡバーコードモジュールを付着するために使用可能な部位の総数は１００％である。
【０１６３】
直交性構成ビーズの合成（第１のＤＮＡバーコードに関して）による、所定のビーズ上の付着部位を消耗する程度。以下は、第１のＤＮＡバーコードモジュールを付着することに関する。実施形態において、第１のＤＮＡバーコードモジュールの付着により、ビーズ上のＤＮＡバーコード付着部位の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％が消耗される。他の実施形態において、ビーズ上のＤＮＡバーコード付着部位の約２％未満、約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、または約５０％未満が消耗される。さらに他の実施形態において、第１のＤＮＡバーコードモジュールの付着により、ＤＮＡバーコード付着部位の２〜４％の間、２〜６％の間、２〜８％の間、２〜１０％の間、２〜１２％の間、２〜１４％の間、２〜１６％の間、２〜１８％の間、２〜２０％の間、１０〜２０％の間、１０〜２５％の間、１０〜３０％の間、１０〜３５％の間、１０〜４０％の間が消耗される。
【０１６４】
限定については、特定のＤＮＡバーコードを構成する最後のＤＮＡバーコードモジュールを付着すると、部位の２０％未満が消耗され、部位の３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、９５％未満、または９８％未満が消耗される。
【０１６５】
除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれかと適合するビーズまたは方法を除外することができる。また、除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれにも適合しないビーズまたは方法を除外することができる。
【０１６６】
以下は、各々がＤＮＡバーコードである１つ以上の核酸を含むポリマー、および２つ以上の核酸を含むポリマーに関するものであり、いくつかの核酸は、プライマーアニーリング部位またはスペーサーとして機能するなどの生化学的機能を有し、他の核酸は、情報機能を有し、かつＤＮＡバーコードである。除外的な実施形態において、本開示は、ソラレンなどのＤＮＡ架橋剤を含むＤＮＡバーコードを除外することができる。また、除外できるのは、ＤＮＡバーコードモジュールよりも高い融解温度（または低い融解温度）のプライマー結合領域を有するＤＮＡバーコードである。この温度は、単に「より高く」または「より低く」することができるか、または、少なくとも２度高く、少なくとも４度高く、少なくとも６度高く、少なくとも８度高く、もしくは少なくとも２度低く、少なくとも４度低く、少なくとも６度低く、少なくとも８度低くすることができる。
【０１６７】
また、除外できるのは、ＤＮＡリガーゼを使用したＤＮＡバーコードを作製する方法である。また、除外できるのは、ヘアピン（ｓｓＤＮＡがループ状に屈曲し、ｓｓＤＮＡの一部が同じｓｓＤＮＡの別の部分とハイブリダイズする）を構成するＤＮＡバーコードおよび方法である。さらに、除外できるのは、核酸ヘアピンを含む組成物であり、核酸ヘアピンは、例えば、化学リンカーで共有結合的に閉じられている。さらに、除外できるのは、「ヘッドピース」に直接的、または「ヘッドピース」に間接的（ＤＮＡバーコードおよびヘッドピースの間に存在する１つ以上の化学物質への共有結合を介して間接的に）のどちらかで共有結合的に連結されているＤＮＡバーコードである。
【０１６８】
他の除外的な実施形態において、除外できるのは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードであり、完成されたＤＮＡバーコードは、任意の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含まず、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のみを含む。
【０１６９】
直交性構成ビーズの合成（第２のＤＮＡバーコードに関して）による、所定のビーズ上の付着部位を消耗する程度。以下は、第２のＤＮＡバーコードモジュールを付着することに関する。実施形態において、第２のＤＮＡバーコードモジュールの付着により（直交性構成ビーズの作製の場合）、ビーズ上の残存する自由なＤＮＡバーコード付着部位の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％が消耗される。他の実施形態において、ビーズ上の残存する自由なＤＮＡバーコード付着部位の約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、または約５０％未満が消耗される。さらに他の実施形態において、第１のＤＮＡバーコードモジュールの付着により、残存する自由なＤＮＡバーコード付着部位の２〜４％の間、２〜６％の間、２〜８％の間、２〜１０％の間、２〜１２％の間、２〜１４％の間、２〜１６％の間、２〜１８％の間、２〜２０％の間、１０〜２０％の間、１０〜２５％の間、１０〜３０％の間、１０〜３５％の間、１０〜４０％の間が消耗される。
【０１７０】
除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれかと適合するビーズまたは方法を除外することができる。また、除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれにも適合しないビーズまたは方法を除外することができる。
【０１７１】
上記の実施形態は、上記の除外的な実施形態と同様に、第３のＤＮＡモジュールバーコードを付着することを伴う、または第４のＤＮＡモジュールバーコードを付着することを伴う、または第５のＤＮＡバーコードモジュールを付着することを伴う方法などにも適用できる。
【０１７２】
連鎖状式ＤＮＡバーコード（すべてのＤＮＡバーコードモジュールは１つの鎖またはポリマーに存在し、鎖またはポリマー全体がビーズ上の１つの位置に付着される）。
【０１７３】
ビーズ結合連鎖状式ＤＮＡバーコードの合成。本開示は、ビーズ結合連鎖状式ＤＮＡバーコードを提供し、ビーズは、複数の連鎖状式ＤＮＡバーコードを含み、複数の連鎖状式ＤＮＡバーコードのほとんどまたはほとんどすべては、本質的に同じ構造を有する。連鎖状式ＤＮＡバーコードは、１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールを含むことができ、ＤＮＡバーコード全体に沿ったこれらのＤＮＡバーコードモジュール（ビーズ付着末端から遠位末端への）の順序は、ビーズ結合連鎖状式ＤＮＡバーコードが合成される時間と同じ順序をとる。また、ＤＮＡバーコード全体に沿ったこれらのＤＮＡバーコードモジュールの順序は、対応する化学ライブラリモノマーが成長するビーズ結合化合物に結合される時間と同じ順序をとる。
【０１７４】
連鎖状式ＤＮＡバーコードは、この順序で、連鎖状式ＤＮＡバーコード全体をビーズに結合するために使用されるリンカーを含むことができる。また、それは、この順序で、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、および第３のアニーリング部位を含むことができる。
【０１７５】
ビーズ結合ＤＮＡバーコード内のシーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の１つの順序。シーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の実施形態において、連鎖状式ＤＮＡバーコードは、この順序で、リンカー、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第１のシーケンシングプライマー結合部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第２のシーケンシングプライマー結合部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第３のシーケンシングプライマー結合部位などを含むことができる。
【０１７６】
ビーズ結合ＤＮＡバーコード内で発生する、シーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の別の順序。別のシーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の実施形態において、連鎖状式ＤＮＡバーコードは、この順序で、リンカー、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のシーケンシングプライマー結合部位、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のシーケンシングプライマー結合部位、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のシーケンシングプライマー結合部位、第３のアニーリング部位などを含むことができる。
【０１７７】
「アニーリング部位」という用語。「アニーリング部位」という用語は、スプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）の一部であるアニーリング部位を指し、また、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコード上に存在する対応するビーズ結合アニーリング部位を指すためにも使用される。当業者は、スプリントオリゴ上の「アニーリング部位」が、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコード上の対応する「アニーリング部位」と同じＤＮＡ配列を有しないことを理解する。換言すれば、当業者は、１つの配列が、他の配列に相補的であることを理解する。したがって、ここでの記載では、両方のアニーリング部位が同じ名前を有することは重要ではない。換言すれば、スプリントオリゴ上の第２のアニーリング部位が、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコード上の第２のアニーリング部位にハイブリダイズするものとして開示されることは重要ではない。
【０１７８】
ブロックでの合成。代替的な実施形態において、成長する化合物および成長するＤＮＡバーコードモジュールの配列は、ブロックで合成することができる。例えば、２化学ライブラリ単位で構成されるブロックは、対応する２−ＤＮＡバーコードモジュールで構成されるブロックの付着と平行して、ビーズに付着できる。同様に、３化学ライブラリ単位で構成されるブロックは、対応する３  ＤＮＡバーコードで構成されるブロックの付着と並行して、ビーズに付着できる。４個のブロック、５個のブロック、６個のブロック、７個のブロック、８個のブロック、９個のブロック、１０個のブロックなどを伴うブロック合成も提供される。これらのブロック転移の実施形態の各々は、本開示によって除外することもできる。ＤＮＡバーコードモノマーのブロックごとの転移は、直交的に行うことができ、ＤＮＡバーコードモノマーの連続するブロックの各々を受け取るための固有の付着ポイントを有する。代替的に、ＤＮＡバーコードモノマーのブロックごとの転移を行って、コンカテマー構造を生成することもできる（すべてのＤＮＡバーコードモジュールは、１つの連続した直鎖状ポリマーとしてのみ発生する）。
【０１７９】
また、ビーズ結合ＤＮＡバーコードおよびビーズ結合化合物を平行してスプリットプール合成する場合、ブロックでの合成が発生する可能性がある。ブロックは、２つ以上の化学ライブラリモノマーの形態をとることができ、かつブロックは、２つ以上のＤＮＡバーコードモジュールの形態をとることができる。
【０１８０】
スプリットプール合成の位置。スプリットプール合成は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合連鎖状ＤＮＡバーコードの平行合成に使用できる。また、スプリットプール合成は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合直交性ＤＮＡバーコードの平行合成に使用できる。連鎖状ＤＮＡバーコードは、「スプリントオリゴ」法によって作製することができる。代替的に、連鎖状ＤＮＡバーコードは、クリックケミストリーによって作製することもできる。また、「スプリントオリゴ」法およびクリックケミストリーを組み合わせて使用することもできる。スプリットプール合成は、９６ウェルプレートで行うことができ、各ウェルは、０．２５マイクロメートルのフィルターで作製された床を有する。通常の重力条件下では、水溶液は、このフィルターを通過しない。しかしながら、例えば、第１の水溶液を第２の水溶液で置き換える必要がある場合、吸引を適用して、９６ウェルのすべてから任意の水溶液を除去することができる。この吸引法は、ビーズが第１の試薬セットに曝露された場合、または第１の試薬セットを洗い流す必要がある場合、またはだい１の試薬セットを第２の試薬セットで置き換える必要がある場合に使用される。マニホールドは、９６ウェルプレートを保持するために使用され（Ｒｅｓｐｒｅｐ  ＶＭ−９６マニホールド）、ポンプを使用してすべてのフィルターの底部から流体を引き出すことができる（ＢＵＣＨＩ  Ｖａｃ  Ｖ−５００ポンプ）。フィルター底部を有する９６ウェルプレートは、ＡｃｒｏＰｒｅｐ  Ａｄｖａｎｃｅ  ９６ウェル、３５０ｕＬ、０．４５ｕｍ、ＲＥＦ  ８０４８（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｕｌｔｉ−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）であった。
【０１８１】
プライマーアニーリング部位からＤＮＡバーコードモジュールまでの距離。ビーズ結合ＤＮＡバーコードをシーケンシングする目的、つまり、ＤＮＡバーコードを形成するすべてのＤＮＡバーコードモジュールをシーケンシングする目的で、シーケンシングプライマーのアニーリング部位である第１の核酸を含むポリヌクレオチド、およびＤＮＡバーコードモジュールである第２の核酸、第１の核酸は、第２の核酸のすぐ上流にあり得る。代替的に、第１の核酸は、第２の核酸の上流であり得、第１および第２の核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチドによって、または約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ヌクレオチドによって互いに分離される。分離は、単にスペーサーとして機能する核酸を用いることができるか、または代替的に、分離は、有機合成の多段階経路におけるステップ数、または化合物のクラスの数、またはビーズ結合化合物で治療できる可能性のある疾患、または日付、またはロット番号などの情報をコードする第３の核酸を用いることができる。
【０１８２】
クリックケミストリーを使用するビーズ結合連鎖状ＤＮＡバーコードの合成
クリックケミストリーは、ＤＮＡバーコードの段階的な合成に使用できる。ここで、結合できるのは、ビーズに直接的に結合された第１のＤＮＡバーコードモジュール、またはビーズ結合リンカーに結合された第１のＤＮＡバーコードモジュールである。
【０１８３】
また、結合できるのは、第１のシーケンシングプライマー結合部位である第２の核酸に付着した、第１のＤＮＡバーコードモジュールである第１の核酸の形態をとるポリヌクレオチドである。このシーケンシングプライマー結合部位により、オペレーターは第１のＤＮＡバーコードモジュールの配列を決定できる。
【０１８４】
別の例を提供すると、結合できるのは、第１のＤＮＡバーコードモジュールに直接的に結合された第２のＤＮＡバーコードモジュールである。代替的に、結合できるのは、第２のシーケンシングプライマー結合部位である第２の核酸に付着した、第２のＤＮＡバーコードモジュールである第１の核酸の形態をとるポリヌクレオチドである。このシーケンシングプライマー結合部位により、オペレーターは第２のＤＮＡバーコードモジュールの配列を決定できる。第１のＤＮＡバーコードモジュールへのリードスルーがある場合、決定できるのは、これらのＤＮＡバーコードモジュールの両方の配列である。
【０１８５】
さらに別の例を提供するために、結合できるのは、第１のＤＮＡバーコードモジュールである第１の核酸、およびＤＮＡバーコードおよび化合物の多段階平行合成におけるステップを特定する第２の核酸を含むポリヌクレオチドである。さらに、または代替的に、第２の核酸は、スプリットプール合成によって作製される化合物の一般的なクラスを特定することができる。さらに、または代替的に、第２の核酸は、スクリーニングされる化合物によって治療される疾患を特定することができる。さらに、第２の核酸は、日付または化学者の名前などを特定できる。
【０１８６】
ＤＮＡバーコードを合成するための好ましい方法を以下に示し、各ＤＮＡバーコードモジュールを徐々に付着させる、同じ反応サイクルを使用する。
【０１８７】
ステップ１．ＴＣＯ基が付着されたビーズを提供する。実際には、ビーズは、数百または数千の同様に付着されたＴＣＯ基を有し、各ＴＣＯ基は、ビーズ上の異なる部位に付着される。また、実際には、スプリットプール法を使用し、クリックケミストリーにより多数のビーズを同時に修飾する。
【０１８８】
ステップ２．［テトラジン］−［第１のＤＮＡバーコードモジュール］−［アジド］をビーズに追加し、ＴＣＯ基をテトラジン群と縮合させる。結果は、以下の構築物である：ＢＥＡＤ−ＴＣＯ−テトラジン−第１のＤＮＡバーコードモジュール−アジド。実際には、この構築物は任意のＴＣＯまたはテトラジンは含まれていないが、ＴＣＯがテトラジンと縮合した際に生成される縮合生成物が含まれる。
【０１８９】
ステップ３．任意の洗浄。
【０１９０】
ステップ４．アジドをキャップし、ＴＣＯ末端を作製するためにＤＢＣＯ−ＴＣＯを追加する。結果は以下の構造である。
【０１９１】
ＢＥＡＤ−ＴＣＯ−テトラジン−第１のＤＮＡバーコードモジュール−アジド−ＤＢＣＯ−ＴＣＯ
【０１９２】
ステップ５．任意の洗浄。
【０１９３】
ステップ６．第２のＤＮＡバーコードモジュールを付着する以下の試薬を追加する。付着は、成長するＤＮＡバーコードの遠位末端にある。試薬は：
【０１９４】
ビーズに対して［テトラジン］−［第２のＤＮＡバーコードモジュール］−［アジド］であり、ＴＣＯ基をテトラジン群と縮合させる。結果は以下の構築物である：
ＢＥＡＤ−ＴＣＯ−テトラジン−第１のＤＮＡバーコードモジュール−アジド−ＤＢＣＯ−ＴＣＯ−［テトラジン］−［第２のＤＮＡバーコードモジュール］−［アジド］
上記のスキームは、より多くのＤＮＡバーコードモジュールを段階的に追加するための一連のステップを含み、これらの追加は、より多くの化学モノマーの追加と平行する。他で述べたように、この「平行」合成は、化学モノマーを付着した後、そのモノマーを特定するＤＮＡバーコードモジュールを接続するか、あるいは、ＤＮＡバーコードモジュールを付着した後、その特定の化学モノマーによって特定される化学モノマーを付着することを伴うことができる。
【０１９５】
ＤＮＡバーコードのクリックケミストリー合成のための化合物
図１７は、ＤＮＡバーコードモジュール、最終的にはＤＮＡバーコード全体の合成中にデオキシシチジン残基（ｄＣ）を接続するのに好適な化合物の化学合成を開示する。開始物質は、Ｎ４−アセチル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴシチジンである。「ＤＭＴ」という略称は、４，４−ジメトキシトリチルを表す。この有機合成の多段階経路の最終生成物は、シトシン部分、三リン酸基、およびリボース基の３’位置に付着しているプロパルギル基を有する。プロパルギル基は、クリックケミストリーに使用され、アジド基と縮合して共有結合を生成する。縮合後の結果は、残った化学物質（核酸において自然には決して存在しない）が、実行されているクリックケミストリーからの「痕跡」として発生することである。利用可能なのは、クリックケミストリーによって作製されたＤＮＡバーコードの合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）について使用できるＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡポリメラーゼは、痕跡をわたって移動でき、痕跡は、シーケンシングのエラーを引き起こさない。ＴＢＡＩは、ヨウ化テトラブチルアンモニウムである。
【０１９６】
連鎖状形状ＤＮＡバーコードの合成
以下の記載では、ＤＮＡバーコードを作製するために、ＤＮＡバーコードモジュールが一列に組み立てられている。しかしながら、以下に示すテキスト中の図は、テキスト中の図をページに合わせるために、「ＤＮＡバーコードモジュール」の代わりに「ＤＮＡバーコード」という用語が使用される。図７は、ここに示されるのと同じステップを示すが、ビーズの図などの詳細が追加される。各追加のＤＮＡバーコードモジュールを追加するために、繰り返される一連の反応を使用できる。
【０１９７】
ＤＮＡヘアピンをコードする末端核酸を含むＤＮＡバーコードを作製するオプション。これは、３プライム末端、シーケンシングプライマーのアニーリング部位を有する核酸、塩基対でない約４塩基の形態をとる屈曲、およびシーケンシングプライマーのアニーリング部位および屈曲して塩基対を形成することが可能なシーケンシングプライマーを含むＤＮＡバーコードに関係する。繰り返すが、シーケンシングプライマーは、シーケンシングプライマーのアニーリング部位にアニーリングし、実際のシーケンシング反応は、アニールされたシーケンシングプライマーの３’末端から開始する。
【０１９８】
ＤＮＡバーコードを合成する最終的なステップを実行する際、および最終的なＤＮＡバーコードモジュールを成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに結合する際、「スプリントオリゴ」は、ＤＮＡヘアピンを包括する配列を含むことができる（ＤＮＡヘアピンは、この順序で、シーケンシングプライマーのアニーリング部位、相互にまたは任意の塩基の近くの配列と塩基対でない、いくつかのヌクレオチド、およびシーケンシングプライマーを含む）。「スプリントオリゴ」をアニーリングした後、次にＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを追加し、重合は、成長するＤＮＡバーコードの３’末端で起こり、スプリントオリゴを鋳型として使用して重合するものは、次の順序で、（１）シーケンシングプライマーのアニーリング部位、（２）他への教授を伴う塩基対を形成しない４つまたは５つのデオキシリボヌクレオチドの形態をとるヘアピンにおける屈曲、（３）シーケンシングプライマーである。
【０１９９】
ヘアピンシーケンシングプライマーの３’末端にある可逆的ターミネーター基。本開示は、ヌクレオチド／可逆的ターミネーター基の予め形成された複合体を、アニールされたシーケンシングプライマーの３’末端に付着させるための試薬、組成物、および方法を提供する。可逆的ターミネーター基は、ヘアピンシーケンシングプライマーの任意の成分であり、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である。
【０２００】
ステップ１．最初に、ピコウェル内にビーズが配置され、ビーズは、結合したポリヌクレオチドを有し、ポリヌクレオチドの５’末端は、任意でリンカーを用いてビーズに結合される。図７は、ビーズ結合ポリヌクレオチドが、第１のＤＮＡバーコードおよび第１のアニーリング部位を含むことを示す。リンカーは、核酸から作製することができるか、またはそれは、いくつかの他の化学的に作製することができる。好ましくは、リンカーは疎水性であり、好ましくは、リンカーは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを疎水性ポリスチレンビーズ、例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズから分離する。
【０２０１】
便宜上、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である第１のアニーリング部位、および可溶性「スプリントオリゴ」の一部である第１のアニーリング部位は、同じ塩基の配列を有しないが、どちらも「第１のアニーリング部位」と称される（代わりに、塩基の配列は互いに相補的であり、その結果、スプリントオリゴは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの第１のアニーリング部位にハイブリダイズでき、したがって、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型として機能し、スプリントオリゴ上にあるものをコピーすることにより、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを伸長する。
【０２０２】
また、便宜上、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である第２のアニーリング部位、および可溶性「スプリントオリゴ」の一部である第２のアニーリング部位は、同じ配列を有しないが（しかし代わりに相補的な塩基を有する）、どちらも「第２のアニーリング部位」と称される。
【０２０３】
５’末端から３’末端までのビーズ結合ＤＮＡバーコードは、以下の順序で、核酸を含み得る：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／
代替的に、５’末端から３’末端までのビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、ステップ数をコードする核酸を含み得、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、以下の順序で、核酸を有する：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／ステップ数をコードする核酸／第１のアニーリング部位／
代替的に、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、以下に示すように、機能性核酸（シーケンシングプライマーアニーリング部位）である核酸を含むことができる：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／シーケンシングプライマーアニーリング部位／第１のアニーリング部位／
これらのテキスト中の図に示されていないのは、ビーズへのＤＮＡバーコードのカップリングを媒介する任意のリンカーである。リンカーは、核酸の形態をとることができるか、またはいくつかの他の有機化学物質で作製できる。
【０２０４】
ステップ２．可溶性スプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）を追加し、このスプリントオリゴは、第１のアニーリング部位、および第２のＤＮＡバーコードモジュール、および第２のアニーリング部位で構成される。
【０２０５】
図７はまた、ハイブリダイズされたスプリントオリゴが鋳型として使用されるステップを示しており、ＤＮＡポリメラーゼは、第２のＤＮＡバーコードモジュール、および第２のアニーリング部位のビーズ結合成長ＤＮＡバーコードへの付着を触媒する。図７は、ＤＮＡポリメラーゼがスプリントオリゴを鋳型として使用し、その結果、ビーズ結合ＤＮＡバーコードが少し長く成長する（第２のＤＮＡバーコードおよび第２のアニーリング部位の共有結合的な付着による成長。テキストのすぐ下に示されているのは、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードにハイブリダイズしたスプリントオリゴの複合体である。
【０２０６】
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
図７に示されているいくつかの情報を繰り返すと、すぐ下に示されているのは、スプリントオリゴである：
【０２０７】
「第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位」
ステップ３．ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを追加して、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを伸長する。以下は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードであり、スプリントオリゴは、依然としてハイブリダイズされ、「第２のＤＮＡバーコードモジュール」である核酸および「第２のアニーリング部位」である核酸が付着されているため、ビーズ結合成長バーコードは以前より長くなる。図７はさらにこのステップを示す。スプリントオリゴは、ビーズ結合バーコードの下に表示される：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
【０２０８】
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
ステップ４．スプリントオリゴを洗浄する。スプリントオリゴは、加熱することにより、すなわち、ピコウェルプレート全体を、例えば、約６０度、約６５度、約７０度、約７５度、約８０度に約１０分間加熱することによりビーズ結合成長バーコードから解離するように促すことができ、または、代替的に、希釈ＮａＯＨをピコウェルアレイに追加して中和する。
【０２０９】
ステップ５．第２のスプリントオリゴを追加し、これは、ビーズ結合成長スプリントオリゴにハイブリダイズした後、第３のＤＮＡバーコードおよび第３のアニーリング部位のＤＮＡポリメラーゼ触媒による付着を媒介するための鋳型として使用できる。第２のスプリントオリゴは、可溶性試薬であり、以下に示す（しかし、図７には示していない）。
【０２１０】
第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位／
ステップ６．このオリゴヌクレオチドが対応するビーズ結合「第２のアニーリング部位」にアニーリングできるようにし、ＤＮＡポリメラーゼがビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長できるようにし、これにより、以下の補足物を含む：「第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位／
【０２１１】
ステップ７．第２のスプリントオリゴを洗浄する。
【０２１２】
ステップ４．以下のスプリントオリゴを追加する（この特定の追加は図７には示されていない）。
【０２１３】
第３のアニーリング部位／第４のＤＮＡバーコード／第４のアニーリング部位／
この可溶性オリゴヌクレオチドは、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの「第３のアニーリング部位」にアニーリングできる核酸を有する。アニールすると、４つのｄＮＴＰを有するＤＮＡポリメラーゼが利用され、ビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長して、さらに別のＤＮＡバーコードモジュール（第４のＤＮＡバーコード）をコードするために使用される。上記のステップのサイクルは、化合物のライブラリおよび関連するＤＮＡバーコードを平行して作製するスプリットプール手順全体で繰り返され、各ＤＮＡバーコードは、所定の化合物に関連付けされる（各ＤＮＡバーコードは、関連する化合物の化学合成の履歴を通知する）。化合物のライブラリの化学合成が完了されている場合、上記のステップのサイクルが停止される。完成されたビーズ結合ＤＮＡバーコード化学ライブラリを制御して、次にビーズは、ピコウェルアレイのピコウェルに分配できる。
【０２１４】
各ビーズのＤＮＡバーコードは、各ピコウェルに関連付けられたＤＮＡバーコードをさらに構成する。ＤＮＡバーコードは、ビーズ結合化合物を特定できる。本開示の配列シーケンシング法は、ビーズが依然としてピコウェル内にある間にピコウェル内で行われる。除外的な実施形態において、本開示は、任意のシーケンシング法を除外することができ、かつシーケンシングに使用される任意の試薬を除外することができ、シーケンシングは、ビーズ結合したＤＮＡ鋳型では実行されず、またはシーケンシングは、ピコウェル内で固定化されたビーズ結合ＤＮＡ鋳型では実行されない。
【０２１５】
シーケンシングプライマーのアニーリング部位。一実施形態において、完成されたＤＮＡバーコード内の各ＤＮＡバーコードモジュールは、独自のシーケンシングプライマーのアニーリング部位と機能的に連結され、したがって、オペレーターに各ＤＮＡバーコードモジュール上で別々のシーケンシング手順を実行する機能を提供する（この実施形態において、各ＤＮＡバーコードモジュールは、ＤＮＡバーコード全体の合成のステップを特定する（コードする）独自の核酸とも機能的に連結されていることが好ましい。
【０２１６】
別の実施形態において、各ＤＮＡバーコードは、１つのみのシーケンシングプライマーのアニーリング部位を有し、これは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの３’末端またはその近くに配置でき、シーケンシングプライマー自体は可溶性であり、ピコウェルに追加され、次にシーケンシングプライマーのアニーリング部位にハイブリダイズできる。代替的に、シーケンシングプライマーが、ＤＮＡヘアピンの一部である場合、このＤＮＡヘアピンは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを作製する最終的なステップで「スプリントオリゴ」を介して追加される。図７には、シーケンシングプライマーのアニーリング部位が示されていない。
【０２１７】
核酸の３’末端を介してビーズに結合した核酸
本発明で開示される様々な実施形態は、ＤＮＡの５’末端を介してＤＮＡをビーズにカップリングすることに関し、他の実施形態では、ＤＮＡバーコードまたはＤＮＡタグなどのＤＮＡは、それらの３’末端を介してビーズに結合され得る。ＤＮＡの３’ヒドロキシル基は、特定の化学合成条件下（例えば、光延変換）で反応する可能性があり、３’末端をレンダリングすると、損傷し、伸長、連結、または他のステップに関与できなくなる。したがって、ＤＮＡタグは、３’末端を介してビーズに付着し、不要な化学反応を防ぎ、ＤＮＡバーコードへの損傷を防ぎ得る。
【０２１８】
本開示のビーズ結合ＤＮＡバーコードに関する除外的な実施形態。除外できるのは、任意のビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、連鎖状ＤＮＡバーコードは、光切断可能なリンカーまたは切断可能なリンカーを介してビーズに連結される。
【０２１９】
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、（１）ビーズ上の第１の位置に結合された連鎖状ＤＮＡバーコード、（２）ビーズ上の第２の位置に結合され、第１の位置が第２の位置と同じではない化合物の両方を含まない。好ましい実施形態において、この「化合物」は、複数の化学ライブラリモノマーで作製される。
【０２２０】
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、外面（または外面）および内面（または内面、または内部領域）を有さず、ビーズは、ビーズに結合された少なくとも１０，０００の実質的に同一の連鎖状ＤＮＡバーコードを含まず、少なくとも１０，０００の実質的に同一の連鎖状ＤＮＡバーコードの少なくとも９０％は、外面に結合される。換言すると、除外できるのは、結合され連鎖状ＤＮＡバーコードの少なくとも９０％が、外面に結合されていない任意のビーズである。
【０２２１】
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、実質的にポリアクリルアミドで作製されるか、または任意のポリアクリルアミドを含む。
【０２２２】
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、ヒドロゲル、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むか、またはポリＡ領域を含むか、またはプロモーターおよびポリＡ領域を含む。
【０２２３】
２つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、１サイクルのみのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードがアニーリング／重合ステップを１つのみ含む、システム、試薬、および方法を包含する。この実施形態は、以下の図によって表され、第１の図は、スプリントオリゴのアニーリングを示し、第２の図は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した充填を示す。最終結果は、２つのＤＮＡバーコードモジュールを含む、ビーズ結合ＤＮＡバーコードである。この特定の手順では、ビーズ結合開始材料は、任意でリンカー（しかし好ましくは、任意の切断可能なリンカーではない）、任意で、化合物の特定以外の情報をコードする核酸、および任意で、シーケンシングプライマーまたはＤＮＡヘアピンなどの機能性核酸を含むことができる。２つの図がテキスト内で示される（すぐ下を参照されたい）：
【０２２４】
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
【０２２５】
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
３つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、２サイクルのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、２つの異なるスプリットオリゴが使用される（第１のスプリントオリゴ；第２のスプリントオリゴ）。この状況では、第１のスプリントオリゴは、第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位の構造からなり、第２のスプリントオリゴは、第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位の構造からなる。
【０２２６】
４つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、３サイクルのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、３つの異なるスプリットオリゴが使用される（第１のスプリントオリゴ；第２のスプリントオリゴ；第３のスプリントオリゴ）。この状況では、第１のスプリントオリゴは、第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位の構造からなり、第２のスプリントオリゴは、第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位の構造からなり、第３のスプリントオリゴは、第３のアニーリング部位／第４のＤＮＡバーコード／第４のアニーリング部位の構造からなる。
【０２２７】
５つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、４サイクルのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、４つの異なるスプリットオリゴが使用される（第１のスプリントオリゴ；第２のスプリントオリゴ；第３のスプリントオリゴ；第４のスプリントオリゴ）。この状況では、第１のスプリントオリゴは、第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位の構造からなり、第２のスプリントオリゴは、第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位の構造からなり、第３のスプリントオリゴは、第３のアニーリング部位／第４のＤＮＡバーコード／第４のアニーリング部位の構造からなり、第４のスプリントオリゴは、第４のアニーリング部位／第５のＤＮＡバーコード／第５のアニーリング部位の構造からなる。
【０２２８】
複数のＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成するための、複数のステップのアニーリング／重合を用いた実施形態。本開示は、連鎖状バーコードに関連し、１つのスプリントオリゴのみを使用する（２モジュールＤＮＡバーコードを作製する）、２つのスプリントオリゴのみを使用する（３モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、３つのスプリントオリゴのみを使用する（４モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、４つのスプリントオリゴのみを使用する（５モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、５つのスプリントオリゴのみを使用する（６モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、６つのスプリントオリゴのみを使用する（７モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）などのビーズ結合組成物、システム、および方法を包含する。
【０２２９】
包含されるのは、少なくとも１つのスプリントオリゴ、少なくとも２つのスプリントオリゴ、少なくとも３つのスプリントオリゴ、少なくとも４つのスプリントオリゴ、少なくとも５つのスプリントオリゴ、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも２０のスプリントオリゴ、または２０未満、１５未満、１０未満、８未満、６未満、４未満、３未満、２未満のスプリントオリゴを使用するビーズ結合組成物、システム、および方法である。これらの数は、スプリントオリゴ自体、ならびにスプリントオリゴを追加するステップの数、および成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに追加されるＤＮＡモジュールの数を示す。
【０２３０】
ＤＮＡバーコードへの損傷を低減する
直交性ＤＮＡバーコードを使用して損傷を低減する（連鎖状ＤＮＡバーコードの代わりに）。連鎖状ＤＮＡバーコードおよび直交性ＤＮＡバーコードのトピックを理解する１つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連鎖状バーコード化を超える直交性バーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、平行して付着されるのは、化学ライブラリを作製するための化合物ライブラリモノマー、および完成された完全長ＤＮＡバーコードを作製するＤＮＡバーコードモジュールである。
【０２３１】
連鎖状バーコード化では、任意の所定のモジュールの付着が不完全である場合（つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に結合されなかった場合）、完成されたバーコードの配列は、正確ではないであろう。「正確ではない」という表現は、不完全なカップリングにより塊が欠落し、完成された生成物が、完成された正しいＤＮＡバーコードであるとユーザーが想定していたことを意味する。ここで、すべてのＤＮＡモジュールの付着に失敗したため、完成されたＤＮＡバーコード配列は誤りを含むであろう。対照的に、直交性バーコード化は、各個々のＤＮＡモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、ＤＮＡモジュールが、ビーズ上の所定の部位に付着されると、すでにビーズに結合されているＤＮＡモジュールに、さらにＤＮＡモジュールを結合する必要はない。
【０２３２】
架橋剤を使用することにより損傷を低減する。本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するため、および部分的に合成されたビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための試薬および方法を提供する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに付着する前に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとることができ、このｄｓＤＮＡは、マイトマイシンＣなどのＤＮＡ架橋剤で処理される。ｄｓＤＮＡ形態のＤＮＡバーコードの合成の完了後、このｄｓＤＮＡはｓｓＤＮＡに変換される。ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの変換は、ＤＮＡ鎖の１つにウラシル（Ｕ）残基を有する場合に有効であり、ウラシル残基の位置でのＤＮＡの切断は、ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼによって触媒される（２０１７年９月２５日に出願されたシリアル番号第６２／５６２，９０５号の図５を参照されたい。シリアル番号第６２／５６２，９０５号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記は、ビーズ結合化合物を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
【０２３３】
ＤＮＡバーコードを作製するために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用して損傷を低減する。ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、ＤＮＡバーコードを二本鎖ＤＮＡの形態で合成することであり、相互に付着されているＤＮＡバーコードモジュールの各々は、ｄｓＤＮＡの形態をとり、二本鎖の各々は、ＤＮＡヘッドピースを介して安定化される。完成されたＤＮＡバーコードの最終的なシーケンシングのために、鎖の１つは、ＤＮＡヘッドピースから切断され、除去される。上記は、ビーズ結合化合物（この化合物が化学ライブラリのメンバーである場合）を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
【０２３４】
ヘアピンを含むことにより損傷を低減する。ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するためのさらに別の方法は、ヘアピンを形成するための自己組織化を介してＤＮＡバーコードを合成することであり、このＤＮＡバーコードは、ヘアピンの第１の突起がヘアピンの第２の突起にアニールすることで自己組織化する。
【０２３５】
合成されるＤＮＡバーコードが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとる場合、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＭＡなどの溶媒は、ＤＮＡバーコードを変性できる。上記の方法および試薬は、変性を防ぐことができる。
【０２３６】
ｄｓＤＮＡの密封された末端を使用することにより損傷を低減する。ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用し、７−ａｚａ−ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを介してこのｄｓＤＮＡの末端を密封することである。
【０２３７】
タンパク質性溶媒を回避、強酸および強塩基を回避、強力な還元剤および酸化剤を回避することにより損傷を低減する。化学物質の種類は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の存在と互換性があり、ビーズ結合ＤＮＡまたはビーズ結合でないＤＮＡは、タンパク質性溶媒の欠如が必要であり得、強酸性条件を回避し、ｔ−ブチルリチウムのような強塩基を回避し、水素化アルミニウムリチウムなどの強力な還元剤を回避し、いくつかのハロゲン化アルキルなどのＤＮＡ塩基と反応する試薬を回避し、いくつかの酸化剤を回避する（Ｌｕｋ  ａｎｄ  Ｓａｔｓ（２０１４）ＤＮＡ−Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４章）、Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１ｓｔ  ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。
【０２３８】
他で述べたように、「ＤＮＡバーコード」という用語は、化合物全体を特定するポリヌクレオチドを指すことができ、対照的に、「ＤＮＡバーコードモジュール」は、化合物を構成するモノマーの１つのみを指すことができる。
【０２３９】
ＤＮＡ互換性のある化学物質を使用することにより核酸への損傷を低減する。Ｓａｔｚらは、ビーズ結合核酸と互換性のある様々な化学物質を開示する（Ｓａｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６：１６２３−１６３２；Ｓａｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２７：２５８０−２５８０で補正）。前述のＳａｔｚらの記載は、ＤＮＡ／化学ライブラリメンバー複合体で実行される化学反応に関するものであるが、記載されるＤＮＡ互換性のある化学物質の種類も関連し、有機化学は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合ＤＮＡを含むビーズ上で実行される。
【０２４０】
ベンズイミダゾール化合物、イミダゾリジノン化合物、キナゾリノン化合物、イソインドリノン化合物、チアゾール化合物、およびイミダゾピリジン化合物の形成のためのＤＮＡ互換性のある反応が開示される（Ｓａｔｚら、表１、エントリー１〜６を参照されたい）。
【０２４１】
さらに、ＤＮＡ互換性のある保護基には、ａｌｌｏｃ脱保護、ＢＯＣ脱保護、ｔ−ブチルエステル加水分解、メチル／エチルエステル加水分解、ならびにヒドラジンおよびラネーニッケルによるニトロ還元が含まれると開示される（Ｓａｔｚら、表１、エントリー７〜１１を参照されたい）。
【０２４２】
さらに、試薬をＤＮＡにカップリングする方法が開示されており、結合は、すでにＤＮＡに付着されている官能基で起こる。方法には、アルキンおよびハロゲン化アリールの間の薗頭カップリングの最適化された手順であるスズキカップリング、ジメチル−１−ジアゾ−２−オキソプロピルホスホネートを使用したアルデヒドのアルキンへの変換、精製されたアルキンから直接的にトリアゾールを付加する新しい方法、ｐＨ９．４バッファーでイソシアネート試薬を用いると改善された反応が発生する、イソシアネート構成要素とアミン官能基化ＤＮＡとの反応について改善された方法が含まれる（Ｓａｔｚら、表１、エントリー１２〜１５を参照されたい）。
【０２４３】
試薬をＤＮＡにカップリングする追加の方法が開示されており、カップリングは、すでにＤＮＡに付着されている官能基で起こる。これらには、第一級アミンをＤＮＡに結合させる方法、ＤＮＡ複合化チオ尿素を形成するための最適化された手順、アミン官能化ＤＮＡ複合体と反応できる構成要素としてヘタリルハライドを使用した、第二級アミンをアルキル化および脂肪族第一級アミンをビスアルキル化、一級アミンＤＮＡ複合体をモノアルキル化する方法、ならびにＷｉｔｔｉｇ反応の方法が含まれる（Ｓａｔｚら、表１、エントリー１６〜２０を参照されたい）。
【０２４４】
ＤＮＡ修復酵素を介して損傷されたＤＮＡを低減する。酵素、ＤＮＡ損傷結合タンパク質、およびヘリカーゼを含む、様々なタンパク質は、ＤＮＡ損傷の修復に利用可能である。市販されているのは、酸化による損傷、放射線誘導性損傷、紫外線誘導性損傷、ホルムアルデヒド付加物からの損傷、およびアルキル基付加物の形態をとる損傷を修復できるＤＮＡ修復タンパク質である。損傷した塩基を除去するグリコシド酵素（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを切断しない）は、５−ホルミルウラシル、デオキシウリジン、および５−ヒドロキシメチルウラシルの修復に利用可能である。Ｔ４ＰＤＧは、ピリミジン二量体の修復に利用可能である。ｈＮＥＩＬ１およびＦｐｇは、酸化ピリミジン、酸化プリン、アプリン部位、およびピリミジン部位の修復に利用可能である。ＥｎｄｏＶＩＩＩは、酸化ピリミジンおよびピリミジン部位の修復に利用可能である。ＥｎｄｏＶは、ミスマッチの修復に利用可能である。ＨａａＧは、アルキル化プリンの修復に利用可能なグリコシラーゼである。ＤＮＡ修復酵素がギャップを残す場合、二本鎖ＤＮＡは、ギャップを有し、１つ以上の連続したデオキシリボヌクレオチドは、鎖の１つを欠損しており、ギャップを埋めるために様々なＤＮＡポリメラーゼが利用可能である（Ｃａｔａｌｏｇ（２０１８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡを参照されたい）。
【０２４５】
様々なＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ修復システムは、哺乳動物、酵母、および細菌から単離されている。これらには、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、直接修復、塩基除去修復、転写共役ＤＮＡ修復、および組換え修復を媒介するものが含まれる。鎖間ＤＮＡ架橋は、ＮＥＲおよび相同組換えを組み合わせて使用することで修復できる。直接修復には、フォトリアーゼ酵素を介したシクロブタンピリミジンダイマーおよび６〜４生成物の修復が含まれる。直接修復には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるＯ６−メチルグアニンからのＯ６−メチルの除去も含まれる。Ｓａｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：３９−８５；Ｈｕ，Ｓａｎｃａｒ（２０１７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９２：１５５８８−１５５９７を参照されたい。
【０２４６】
本開示は、ＤＮＡ修復酵素での処理によって、またはＤＮＡ修復タンパク質の複合体などによって、ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を修復するためのシステム、試薬、および方法を提供する。
【０２４７】
ＤＮＡをそれらの３’末端を介してビーズにカップリングすることにより、損傷を低減する。特定の化学変換は、核酸の露出した３’−ヒドロキシル基を損傷し得る。例えば、光延反応は、一級および二級アルコールからエステル、フェニルエーテル、チオエーテル、および様々な他の化合物への変換を可能にし、これにより、露出した３’末端が、後続の処理ステップに反応しなくなるか、または現在変更されている３’末端が、さらなる化学反応に関与する可能性がある。いくつかの実施形態において、ＤＮＡタグは、それらの３’末端を介してビーズに付着され得、したがって５’末端のみが溶液に曝露される。
【０２４８】
本開示の試薬、システム、および方法は、ビーズ結合ＤＮＡまたはビーズ結合ＤＮＡタグなどのビーズ結合核酸を包含し、ビーズへのカップリングは、ＤＮＡの３’末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）（または３’末端（ｅｎｄ））を伴う。ＤＮＡバーコードを構成するｓｓＤＮＡがｓｓＤＮＡの３’末端を介して結合されている場合、１つのシーケンシングプライマーのみをハイブリダイズすることによりシーケンシングを開始でき、このシーケンシングプライマーは、ＤＮＡバーコード全体の上流にハイブリダイズし、このハイブリダイズは、結合されたｓｓＤＮＡのビーズ結合末端であるか、またはその近くである。１つのシーケンシングプライマーのみを使用する代わりに、複数のシーケンシングプライマーを使用することができ、各シーケンシングプライマーは、上流で特定のＤＮＡバーコードモジュールにハイブリダイズする。例えば、所定のＤＮＡバーコードに５つのＤＮＡバーコードモジュールが含まれている場合、ＤＮＡは、３’末端を介してビーズに結合され、ＤＮＡバーコードは、５つの異なるプライマーアニーリング部位を含むことができ、各プライマーアニーリング部位は、所定のＤＮＡバーコードモジュールのまさに上流、またはすぐ上流に位置される。
【０２４９】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）カップリングの実施形態。他の実施形態において、ビーズに結合されるのは、ｄｓＤＮＡであり、ｄｓＤＮＡ中の鎖の１つのみの３’末端が、ビーズに結合される。ｄｓＤＮＡを伴う５’カップリングの実施形態において、結合できるのはｄｓＤＮＡであり、ｄｓＤＮＡの鎖の１つのみの５’末端が、ビーズに結合される。
【０２５０】
（Ｖ）化合物とビーズとのカップリング
本開示は、（１）化学ライブラリメンバーをビーズなどの基質に付着させるリンカー、（２）核酸バーコードをビーズなどの基質に付着させるリンカー、（３）例えば、ＵＶ光により切断可能、プロテアーゼなどの酵素により切断可能である、切断可能なリンカー、（４）切断不可能なリンカー、（５）二官能性リンカー、（６）多機能性リンカー、（７）連鎖に使用される複数のビーズを提供する。例えば、利用可能なものは、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）リンカー、４−ヒドロキシメチルフェニル酢酸リンカーである（Ｃａｍｐｅｒｉ，Ｍａｒａｎｉ，Ｃａｓｃｏｎｅ（２００５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．４６：１５６１−１５６４を参照されたい）。
【０２５１】
「切断不可能なリンカー」は、所定の有機化学手順のステップ中に使用される任意の試薬、条件、または環境によって検出可能に切断されないリンカーとして特徴付けされ得る。代替的に、「切断不可能なリンカー」は、所定の有機化学手順の他の反応物、生成物、または試薬に対して許容できないほど破壊的である試薬、条件、または環境を除いて、切断できないリンカーとして特徴付けされ得る。
【０２５２】
二官能性リンカー、または他の多機能性リンカーは、フォーク（ヒトが食物を消費するために使用するフォーク）の形態をとることができ、フォークのハンドルは、ビーズに付着されたおり、フォークの各尖叉は、さまざまな化学物質の１つに連結される。例えば、１つの尖叉は、化学ライブラリメンバーに連結できる。別の尖叉は、ＤＮＡバーコードに連結できる。さらに別のフォークの尖叉は、金属イオンに連結できる。
【０２５３】
複数のビーズの使用に関して、本開示は、（１）第２のビーズに連結された付着された核酸バーコードを含む第１のビーズであって、第２のビーズが、付着された化学ライブラリメンバーを含む、第１のビーズ、（２）第２のビーズに連結された付着された核酸バーコードを含む第１のビーズであって、第２のビーズが、付着された化学ライブラリメンバーを含み、第３のビーズが、付着され（第１のビーズおよびだい２のビーズの一方または両方に）、第３のビーズが、共有結合的に付着される試薬を含む、第１のビーズなどの複数のビーズの実施形態を提供する。付着された試薬は、酵素であることができ、酵素は、付着された化学ライブラリメンバーの活性をアッセイするために使用される。
【０２５４】
（ＶＩ）化合物を作製するためにモノマーを結合する
例示的な化学モノマー。本開示の組成物および方法のための化学モノマーとしての使用に好適なアミノ酸誘導体を図４に示す。図は、例えば、ＡｎａＳｐｅｃ  ＥＧＴ  Ｇｒｏｕｐ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ；Ｓｉｇｍａｎ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）、またはＣｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどの化学物質の供給元を示す。
【０２５５】
追加の化学モノマーは、図２２〜２７に示される。図２２〜２７の各々は、構造、化学名、および関連するＤＮＡモジュールバーコードを提供する。図の化合物１〜６（図２２）に開示されているように、それぞれのバーコードは、ＡＣＧＴ、ＡＣＴＣ、ＡＧＡＣ、ＡＧＣＧ、ＡＧＴＡ、およびＡＴＡＴである。化合物７〜１０（図２３）の場合、それぞれのバーコードは、ＡＴＧＡ、ＣＡＣＧ、ＣＡＧＣ、およびＣＡＴＡである。化合物１１〜１６（図２４）の場合、それぞれのバーコードは、ＣＧＡＧ、ＣＧＣＴ、ＣＧＴＣ、ＣＴＡＣ、ＣＴＧＴ、およびＧＡＣＴである。化合物１７〜２１（図２５）の場合、それぞれのバーコードは、ＧＡＧＡ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＧ、ＧＴＡＧ、およびＧＴＣＡである。化合物２２〜２６（図２６）の場合、それぞれのバーコードは、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＴ、ＴＡＴＣ、ＴＣＡＧ、およびＴＣＧＣである。また、化合物２７〜３０（図２７）の場合、それぞれのバーコードは、ＴＣＴＡ、ＴＧＡＴ、ＴＧＣＡ、およびＴＧＴＧである。これらのバーコードは、単なる例示である。任意の所定の化合物のライブラリについて、ＤＮＡバーコードの異なるコレクションを使用して、そのライブラリで化合物を構築するために使用される化学モノマーの各々を特定し得る。
【０２５６】
カップリング反応。以下は、化学モノマーをビーズに、および互いにカップリングすることを記載しており、すなわち、第１のステップは、切断可能なリンカーを介してビーズに第１の化学モノマーを直接的にカップリングし、その後、後続の化学モノマーは、１つずつ相互に接続される。以下に示す条件は、ＤＮＡ互換である。
【０２５７】
Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）ビーズ上で３つのアミノ酸化合物を作製する方法について記載する。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｏｔｏ−Ｌｉｎｋｅｒ、４−｛４−［１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ｝ブタン酸）で修飾されたＦｍｏｃ保護樹脂（１  ｍｇ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ、１０  ｕｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｍ−ＮＨ２、０．２３  ｍｍｏｌ／ｇ）、またはＦｍｏｃ保護を備えた別の適切なリンカーは、ＤＭＡ（１５０  ｕＬ）の反応プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ、０．４５  ｕｍ疎水性ＰＴＦＥ）の各ウェル内に懸濁された。Ｒｅｓｐｒｅｐ  ＶＭ−９６真空マニホールドを用いて、プレートの底部を真空にして溶剤を除去した。Ｆｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中の５％ピペラジン、２％ＤＢＵの混合物１５０  ｕＬに樹脂を懸濁することで除去した。プレートをＥｘｃｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｌｕｍｎａ  Ｓｅａｌで密封し、４０℃で１５分間振とうした。真空を適用して溶媒を除去し、脱保護手順を５分間繰り返した。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、１ＸＤＭＡの各１５０ｕＬで洗浄し、各洗浄の間に真空を適用して溶媒を除去した。次に、室温で２分間放置した６０ｍＭのＦｍｏｃ−アミノ酸、８０ｍＭのＯｘｙｍａ、２００ｍＭのＤＩＣ、および８０ｍＭの２，４，６−トリメチルピリジンの前活性化混合物１５０μＬを添加して、樹脂の各ウェルを適切なアミノ酸でアシル化した。プレートを再度密封し、４０度で１時間振盪した。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡおよび３ＸＤＣＭの各々１５０μＬで洗浄した。各ウェル内のビーズを１５０ｕｌのＤＣＭに再懸濁し、各ウェルの内容物をピペット操作を介して１つの容器に組み合わせた。組み合わせたビーズを完全に混合し、適切なウェル（１ｍｇ／ウェル）内に等量でピペッティングしてプレートに再分配する。真空を適用することにより溶媒を除去することで、各ウェルは次の適切なステップの準備ができる。追加のアミノ酸カップリングごとに、最初にＦｍｏｃ脱保護ステップが繰り返され、続いて目的のアミノ酸とのカップリングステップが繰り返される。スプリットプールが必要な場合は、結合および再分配の方法が繰り返される。
【０２５８】
ビーズ上でスプリットプール法により３量体アミノ酸を作製する方法を記載する。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｏｔｏ−Ｌｉｎｋｅｒ、４−｛４−［１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ｝ブタン酸）で修飾されたＦｍｏｃ保護樹脂（１  ｍｇ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ、１０  ｕｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｍ−ＮＨ２、０．２３  ｍｍｏｌ／ｇ）、または任意の他の適切なリンカーは、ＤＭＡ（１５０  ｕＬ）の反応プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ、０．４５  ｕｍ疎水性ＰＴＦＥ）の各ウェル内に懸濁された。Ｒｅｓｐｒｅｐ（登録商標）ＶＭ−９６真空マニホールドを用いて、プレートの底部を真空にして溶剤を除去した。Ｆｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中の５％ピペラジン、２％ＤＢＵの混合物１５０  ｕＬに樹脂を懸濁することで除去した。プレートをＥｘｃｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｌｕｍｎａ  Ｓｅａｌで密封し、４０℃で１５分間振とうした。真空を適用して溶媒を除去し、脱保護手順を５分間繰り返した。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、１ＸＤＭＡの各１５０ｕＬで洗浄し、各洗浄の間に真空を適用して溶媒を除去した。次に、室温で２分間放置した６０ｍＭのＦｍｏｃ−アミノ酸、８０ｍＭのＯｘｙｍａ、２００ｍＭのＤＩＣ、および８０ｍＭの２，４，６−トリメチルピリジンの前活性化混合物１５０μＬを添加して、樹脂の各ウェルを適切なＡＡでアシル化した。プレートを再度密封し、４０℃で１時間振盪した。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、１ＸＤＭＡの各々１５０ｕＬで洗浄した。追加のＡＡカップリングごとに、最初にＦｍｏｃ脱保護ステップが繰り返され、続いて目的のＡＡとのカップリングステップが繰り返される。各連続するカップリングを分析するために、１ｍｇのビーズの部分を１００ｕＬのＤＭＳＯに懸濁し、３６５ｎｍ  ＬＥＤの全出力に２時間曝露した。樹脂を濾過し、濾液をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ＳＢ−Ｃ−１８、３．０Ｘ５０ｍｍ、２．７ｕｍカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＬＣＭＳに注入する。１．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で、４分間にわたって水中の０．１％ＴＦＡ中の５％ＣＨ３ＣＮから０．１％ＴＦＡ中の１００  ＣＨ３ＣＮへの勾配、および２２０ｎｍでモニタリングを行った。
【０２５９】
レナリドマイド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））を付着させた非アミノ酸ペンダントを作製する実験。これは、脱保護後の最終的なアミノ酸に付着する。これもスピン中で行われた。樹脂の各ウェルを、ＤＭＡ中の４０ｍＭのクロロ酢酸、４０ｍＭのＯｘｙｍａ、８０ｍＭのＤＩＣ、および４０ｍＭのＴＭＰの５分間前処理した混合物１５０ｕＬでアシル化した（Ｆｍｏｃ脱保護後）。プレートを密封し、４０℃で１時間振盪した。各ウェルを３ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、および２ＸＤＭＡの各々１５０μＬで洗浄した。次に、樹脂をＤＭＡ中の１００ｍＭのＫ２ＣＯ３、および１００ｍＭのＲｅｖの懸濁液に再懸濁した。プレートを密封し、室温で３時間振盪した。樹脂を、２Ｘ５０／５０  ＤＭＡ／水、３ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、および２ＸＤＭＡの各１５０ｕＬで洗浄した。
【０２６０】
所定のビーズに付着された化合物の合成の忠実度の程度を定義する。これは完成された化合物に関係し、化合物は、化学ライブラリのメンバーである。各化学化合物は、部分的または完全に、化学モノマーから作製され得る。以下は、所定のビーズに付着された化合物の特徴である。この所定のビーズは、化合物のライブラリのスプリットプール系合成の生成物であり得、各ビーズは、固有の化合物を有する。
【０２６１】
化学ライブラリのメンバーは、固相合成を介して、ビーズ上などの固体担体上で合成できる。ペプチド結合を有する化学物質の固相合成は、以下の２つの化学基の１つを使用して特徴付けされる。第１の化学基は、Ｎ−アルファ−９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ、塩基不安定）である。第２の化学基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ、酸不安定）（Ｖａｇｎｅｒ，Ｂａｒａｎｙ，Ｌａｍ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：８１９４−８１９９を参照されたい）である。ＦｍｏｃおよびｔＢｏｃは、ペプチド基質を保護するために使用できる保護基であり、Ｆｍｏｃ基またはｔＢｏｃ基は、アルファ−アミノ基に付着される（Ｓｉｇｌｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｖｅｒｌａｎｄｅｒ（１９８３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２２：２１５７−２１６２）。
【０２６２】
好ましくは、所定のビーズに結合した化学ライブラリのメンバーの少なくとも９９．５％、少なくとも９９．０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、または少なくとも８０％は、合成が完了した後、完全に同じ化学構造を有する。化学ライブラリメンバーの多段階合成における１つ以上のステップで発生する可能性がある不完全なカップリングが起こり得る。この理由で、本開示の組成物は、以下の限定または範囲のうちの１つによって特徴付けられ、限定され得る。
【０２６３】
本開示によってさらに提供されるのは、所定のビーズに結合された化学ライブラリのメンバーの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、完全な合成後、正確に同じ化学構造を有する方法および試薬である（これらの数値は、固相合成中に発生する可能性のあるエラー、例えば、１つの成長する化合物が化学モノマーの１つを受け取ることができないことを考慮し、反映している。また、これらの数値は、固相合成中に発生する可能性のある任意のモノマーへの化学的損傷を考慮し、反映している）。
【０２６４】
除外的な実施形態において、本開示は、「正確に同じ構造」についての上記のカットオフ値の１つを満たさない任意の方法または試薬を除外することができる。
【０２６５】
代替の実施形態において、２個のビーズ、３個のビーズ、４個のビーズ、５個のビーズ、約５〜１０個のビーズ、約１０〜２０個のビーズ、約２０〜４０個のビーズ、約４０〜８０個のビーズは、ビーズの集団に、同様の等しい化合物を含む（固相合成中の化学モノマーの取り込みの任意のエラーを考慮せず、有機合成中に化学モノマーに発生する化学的損傷を考慮せずに）。
【０２６６】
クリックケミストリーの導入。Ｊｅｗｅｔｔらにより、「クリック反応が定義されている。それらは、選択的であり、高収率であり、良好な反応速度を有する。成分が周囲の生物学的環境に対して不活性であるクリック反応のサブクラスは、双直交と称される（Ｊｅｗｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３９：１２７２−１２７９）。「クリックケミストリー」は、炭素−Ｘ−炭素などのヘテロ原子連結と一緒に、小単位を連結するために使用できる。クリックケミストリーは、薬物または薬物候補の合成のために、単独で、または他の種類の化学反応と組み合わせて使用できる。クリックケミストリーは、コンビナトリアルケミストリーに使用される手順でうまく機能する。クリックケミストリーの反応は、高収率、不可逆的、酸素または水に反応しないことを特徴とする。「クリックケミストリー」で使用される化学反応のクラスには、（１）環状付加反応、特に１，３−双極性ファミリーおよびヘテロ−ディールスアルダー反応から、（２）エポキシド、アジリジン、および環状硫酸塩などの歪んだ複素環式分子と同様の求核開環反応、（４）非アルドール型のカルボニル化学、ならびに（５）酸化反応およびいくつかのマイケル付加反応と同様に、炭素−炭素多重結合への付加が含まれる。クリックケミストリー反応は、通常２０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える高い熱力学的な駆動する力によって区別されるが、対照的に、非クリックケミストリー反応は、適度な熱力学的な駆動する力のみで結合を形成することを伴う（Ｋｏｌｂ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（２００３）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．８：１１２８−１１３７，Ｋｏｌｂ，Ｆｉｎｎ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（２００１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：２００４−２０２１）。
【０２６７】
テトラジンおよびトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）。１，２，４，５−テトラジンなどのテトラジンは、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒシクロ付加を介して、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）と反応できる（Ｄｅｖａｒａｊ，Ｈａｕｎ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ（２００９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．４８：７０１３−７０１６）。
【０２６８】
バックワルド・ハートウィッグアミノ化。バックワルド・ハートウィッグアミノ化反応は、医薬品の固相合成に使用できる。このアミノ化反応は、炭素−窒素結合を合成するために使用され、反応は、ハロゲン化アリールとアミン（Ｒ１−ＮＨ−Ｒ２）が、パラジウムによって触媒され、アミンが、ハロゲン化物に置き換わるアリール生成物を生成し、アミノ基の窒素が、芳香環に直接的に付着されることを伴う。最終的な結果は、炭素（アリール基の）と窒素（アミノ基の）の結合を伴う生成物である。別の言い方をすれば、この反応は、ハロゲン化アリールを対応するアニリンに変換する。バックワルド・ハートウィッグアミノ化は、様々なアミンと互換性があり、コンビナトリアルケミストリーに好適である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒａｓｅ（２００７）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．９：１１１４−１１３７）。
【０２６９】
ヒュスゲン環化付加。ヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応は、アルキンおよび有機アジドを伴う。アルキンは、Ｒ−Ｃ＝ＣＨの構造を有する。アジドは、Ｒ−Ｎ＋＝Ｎ＝Ｎ−の構造を有する。銅触媒は、ヒュスゲン環化付加反応の速度を加速する。ヒュスゲン反応は、「クリックケミストリー」または「クリック反応」を介して機能する。ヒュスゲン反応は、銅で触媒されると、小分子剤を作製するのに好適な１，２，３−トリアゾール核を生成できる。ヒュスゲン反応は、少なくとも保護された形態の場合、アミノ酸側鎖の存在と互換性がある。１，２，３−トリアゾールで作製された分子は、ポリペプチドのアミド結合と同様の結合を有し得、したがってこれらの分子は、ペプチド結合の代替となり得る（Ａｎｇｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ（２００７）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３６：１６７４−１６８９）。
【０２７０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）。本開示は、ペプチド核酸を合成するためのスプリットプール、コンビナトリアルケミストリー、または固相化学の方法を提供する。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドの類似体である。それらは、ヌクレアーゼによる加水分解に抵抗性である。それらは、それらの標的ＲＮＡ配列に強く結合することができる。ペプチド核酸の細胞への取り込みは、「細胞透過性ペプチド」によって強化できる（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｖａｎｏｖａ，Ｇａｉｔ（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：６８３７−６８４９；Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９：１５２６−１５３４）。ペプチド核酸は、固相合成およびコンビナトリアル合成によって作製できる（Ｑｕｉｊａｎｏ，Ｂａｈａｌ，Ｇｌａｚｅｒ（２０１７）ＹａｌｅＪ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．９０：５８３−５９８；Ｄｏｍｌｉｎｇ（２００６）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．１７：１６６７−１６７０を参照されたい）。
【０２７１】
本開示は、ビーズ結合化合物を包含し、化合物は、１つのみのモノマーの形態をとる。例えば、このビーズ結合化合物は、レナリドマイドの形態をとることができるか、またはカルボン酸基が付着されたレナリドマイドの形態、またはアミノ基が、カルボン酸基を有する小さな化学部分で修飾されているレナリドマイドの形態をとることができ、またはこの化合物は、レナリドマイドの立体異性体もしくは鏡像異性体であるレナリドマイド類似体である。
【０２７２】
（ＶＩＩ）スプリットプール合成および平行合成
これは、化合物のライブラリを合成するための「スプリットプール」法の使用、ならびにビーズ結合化合物およびビーズ結合ＤＮＡバーコードの同時合成に「スプリット「プール」法が使用される方法に関する。これは、化合物の混合セットを作製するためのスプリット化およびプール化についても記載する。後のある時点で、以下に開示されているのは、非アミノ酸のカップリング、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたビーズの調整である。
【０２７３】
本開示は、化学ライブラリを生成するためのスプリットプール合成を提供する。一実施形態において、この方法は、（ａ）ビーズを異なる容器に分割する、（ｂ）各容器に異なる構成要素を追加するステップを伴う。例えば、３つの容器が使用されている場合、第１の含有物に種Ａ、第２の容器に種Ｂ、第３の容器に種Ｃを追加して反応させ、種は、容器内のビーズの付着部位に共有結合的に結合し、（ｃ）すべてのビーズを１つの容器にプールし、（ｄ）ビーズを３つの容器に分割し、（ｅ）各容器に異なる構成要素を追加し、種Ａは、第１の容器に追加され、種Ｂは、第２の容器に追加され、種Ｃは、第３の容器に追加され、種は、以前に付着されていた第１の種に共有結合的に結合する（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４４９−４５５を参照されたい）。
【０２７４】
本開示のスプリットプール合成は、各化学的カップリングステップ（化学ライブラリメンバーを作製する）の前または後のいずれかに、ＤＮＡバーコードカップリングステップを含み、このＤＮＡバーコードは、そのステップで結合されている化学物質を特定する。
【０２７５】
除外的な実施形態において、本開示は、平行合成の所定のステップについて、化学物質を付着させる前にバーコードが付着される方法および試薬を除外することができる。逆に、本開示は、平行合成の所定のステップについて、バーコードを付着させる前に化学物質が付着される方法および試薬を除外することができる。
【０２７６】
スプリットプール法で調整されるビーズ結合化学ライブラリの特徴の１つは、各ビーズに１種類の化合物のみが付着することである。カップリングが不完全な場合、例えば、所定のスプリットプールステップで、５，０００付着部位のうち、４，０００のみが目的の化学種と正常にカップリングされた場合、いくつかの不均一性が発生するであろう。
【０２７７】
平行合成。本開示の好ましい実施形態において、化合物および関連するＤＮＡバーコードの有機合成に平行合成を使用することができる。実際には、１つ以上の化学モノマーによるビーズの修飾および１つ以上のＤＮＡバーコードモジュールによる同じビーズの修飾は、厳密に平行しているわけではない。実際には、ビーズは、１つ以上の化学単位（化学モノマー）を受け取り、続いてその特定の化学単位をコードするＤＮＡバーコードモジュールを受け取る。「平行」という用語は、化学ライブラリモノマーのポリマーが成長するにつれて、ＤＮＡバーコードモジュールのポリマーも成長するという事実を指す。すべてのＤＮＡバーコードモジュールがビーズに付着されており、連鎖状構造または直交性構造を形成する場合、完全長ＤＮＡバーコードは、「ＤＮＡバーコード」と称される（ＤＮＡバーコードモジュールだけではない）。
【０２７８】
付着された化学ライブラリメンバーの総数に対する、外部に付着されたＤＮＡバーコードの数の比率。
【０２７９】
これは、ビーズの外面および内面に関する。外部に付着されたＤＮＡバーコード（内部に付着されたＤＮＡバーコードの数を考慮せず）、および付着された化学ライブラリメンバー（外部表面および内部表面の両方に付着された）を有する所定のビーズの場合、外部に付着されたＤＮＡバーコード数と、付着された化学ライブラリメンバーの総数との比率は、例えば、約０．１：１００、約０．２：１００、約０．５：１００、約１．０：１００、約２：１００、約５：１００、約１０：１００、約２０：１００、約３０：１００、約４０：１００、約５０：１００、約６０：１００、約７０：１００、約８０：１００、約９０：１００、約１：１、約１００：１５０、約１００：２００、約１００：４００、約１００：６００などであり得る。除外的な実施形態において、本開示は、上記の値の１つに適合する任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができる。
【０２８０】
典型的なビーズのＤＮＡバーコードの均一性；典型的なビーズの化学ライブラリメンバーの均一性
本開示は、任意の所定のビーズ（または任意のビーズの集団）について、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％などである「化学ライブラリの均一性」を提供する。
【０２８１】
厳密性の低い実施形態において、本開示は、任意の所定のビーズ、または代替的に、任意の所定のビーズ集団について、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である「化学ライブラリの均一性を提供する。
【０２８２】
同様に、本開示は、ＤＮＡバーコードなどのバーコードの均一性を評価するための上記のカットオフ値を提供する。
【０２８３】
ＤＮＡバーコードの均一性および化学ライブラリメンバーの均一性は、実験室マニュアルまたはノートの方法項で計画され、所望されるとおりの正確な配列に一致する総集団の割合で定義され得る。
【０２８４】
除外的な実施形態において、本開示は、上記のカットオフ値の１つ以上に適合しない任意の試薬、組成物、または方法を除外することができる。
【０２８５】
ビーズの集団の均一性を評価する場合、ビーズの集団全体にわたって均一性が所望される状況では、ビーズ＃１、ビーズ＃２、ビーズ＃３、ビーズ＃４、ビーズ＃５、ビーズ＃６、ビーズ＃７などの合計の均一性を考慮する必要がある。
【０２８６】
除外的な実施形態において、本開示は、任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができ、ＤＮＡバーコードの均一性は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％などではない。また、除外的な実施形態において、本開示は、任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができ、化学ライブラリメンバーの均一性は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％などではない。
【０２８７】
内部に付着されたＤＮＡバーコードと外部に付着されたＤＮＡバーコードの比率
本開示のいくつかの実施形態において、ＤＮＡバーコードが主に外面に付着されているビーズを製造および使用することが所望される場合がある。内部ＤＮＡバーコードを伴うビーズを作製および使用しない１つの理由は、内部空間へのＤＮＡオリゴマーの浸透が低く、内部空間へのＤＮＡリガーゼ（完成されたＤＮＡバーコードを作製するためにＤＮＡモジュールを相互に接続するためのリガーゼ）の浸透が低いことである。シーケンシングの目的で、内部ＤＮＡバーコードを作製および使用しない理由は、バーコードの最終的なシーケンシングに必要なＤＮＡを増幅するために必要な酵素の浸透が低いことである。内部ＤＮＡバーコードを伴うビーズを作製および使用しない、さらなる別の理由は、化学ライブラリのメンバーを付着させるための内部空間に費用がかかるためである。
【０２８８】
本開示は、ＤＮＡバーコードに関連するビーズを提供し、内部に付着されたＤＮＡバーコードと外部に付着されたＤＮＡバーコードの比率は、約０．１：１００、約０．２：１００、約０．４：１００、約０．８：１００、約１：１００、約２：１００、約４：１００、約８：１００、約１０：１００、約２０：１００、約４０：１００、約５０：１００、約６０：１００、約７０：１００、約８０：１００、約９０：１００、約１：１などである。
【０２８９】
また、本開示は、ＤＮＡバーコードに関連するビーズを提供し、内部に付着されたＤＮＡバーコードと外部に付着されたＤＮＡバーコードの比率は、０．１：１００を下回る、０．２：１００を下回る、０．４：１００を下回る、０．８：１００を下回る、１：１００を下回る、２：１００を下回る、４：１００を下回る、８：１００を下回る、１０：１００を下回る、２０：１００を下回る、４０：１００を下回る、５０：１００を下回る、６０：１００を下回る、７０：１００を下回る、８０：１００を下回る、９０：１００を下回る、１：１を下回るなどである。
【０２９０】
水性懸濁液中のビーズの集団は、ピコウェルアレイなどの基板に接触させることができ、その結果、ビーズがピコウェルに入り、ピコウェルを占有する。懸濁液中のビーズの数および基板中のピコウェルの数の比率を調整して、目的の占有率を達成できる。例えば、懸濁液が１つのみのビーズを含む場合、ビーズを含むすべてのピコウェルはビーズを１つのみ含み、残りのピコウェルは、いかなるビーズも含まないであろう。懸濁液が２０，０００個のビーズを含み、基板が２００，０００個のピコウェルを含む場合、少なくとも１８０，０００個のピコウェルは、完全にビーズが空になり、ビーズを含むほとんどのピコウェルは、１つのみのビーズを含む。占有されたピコウェルのごく一部は、２つのビーズを含むであろう。
【０２９１】
価値のある実施形態において、懸濁液中のビーズ数とピコウェル数の比率は、約０．２：１００、約０．４：１００、約０．６：１００、約０．８：１００、約１：１００、約２：１００、約４：１００、約６：１００、約８：１００、約１０：１００、約２０：１００、約３０：１００、約４０：１００、約５０：１００、約６０：１００、８０：１００、約１００：１００（１：１と同じ）、約２：１、約４：１、約６：１、約８：１、約１０：１などであり得る。
【０２９２】
除外的な実施形態において、本開示は、上記の値または範囲の１つに該当する任意の方法またはシステムを除外することができる。
【０２９３】
範囲の実施形態において、懸濁液中のビーズ数とピコウェル数の比率は、約０．２：１００〜約０．４：１００、約０．４：１００〜約０．６：１００、約０．６：１００〜約０．８：１００、約０．６：１００〜約１：１００、約１：１００〜約２：１００、約２：１００〜約４：１００、約４：１００〜約６：１００、約０．６：１００〜約８：１００、約８：１００〜約１０：１００、約１０：１００〜約２０：１００、約２０：１００〜約３０：１００、約３０：１００〜約４０：１００、約４０：１００〜約５０：１００、約５０：１００〜約６０：１００、約６０：１００〜８０：１００、約８０：１００〜約１００：１００（１：１と同じ）、約１００：１００（１：１と同じ）〜約２：１、約２：１〜約４：１、約４：１〜約６：１、約６：１〜約８：１、約８：１〜約１０：１などであり得る。
【０２９４】
除外的な実施形態において、本開示は、上記の値または範囲の１つに該当する任意の方法またはシステムを除外することができる。
【０２９５】
（ＶＩＩＩ）ピコウェルを製作する
ピコウェルアレイプレートを作製するためのＵＶ光、フォトマスク、フォトレジストの組み合わせ。多くのマイクロウェルまたはピコウェルを含むプレートは、本開示で使用するために以下のように作製することができる。簡単に述べると、３層のサンドイッチが組み立てられる。上部層は、フォトレジストである。中間層は、ガラスウエハである。底部層は、フォトマスクである。ピコウェルは、ＵＶ光によりフォトレジストから切り分けられるであろう。ピコウェルがフォトレジストの平らなシートから切り分けられた後、フォトレジストは、マフィンを焼くためのカップを含む一般的な金属製の皿に類似し、マフィンバッターを保持するために使用される皿のカップは、傾いた側面を有する。ＵＶ光は、フォトレジストのポリマーを分解するため、「非架橋剤」として機能する。ＵＶ処理後、溶剤が追加され、ＵＶ処理されたフォトレジストが洗い流され、清潔に見えるピコウェルが残る。
【０２９６】
傾けて回転させ、傾いた壁を作製する。傾いた壁を有するピコウェルは、以下のように作製される。フォトマスクは多くの穴を有し、各穴は、ピコウェルの所望される底部の寸法に対応する。底部の寸法は、円周、直径、および形状、つまり円形形状を含むことができる。ウェルの上部の寸法は、光源を回転するか、またはサンドイッチ（フォトマスク／ガラスウエハ／フォトレジストサンドイッチ）を保持するステージを回転させたりしながら、傾いたＵＶ光をフォトマスクの穴に向けることによって作製される。回転では、光源は、フォトマスク／ウエハ／フォトレジストサンドイッチに対して９０度の角度ではなく、代わりに、各ピコウェルの傾いた壁を切り分けるために、９０度の位置から少し傾けられる。多くのピコウェルを含む、得られるピコウェルアレイプレートは、そのまま使用できる。代替的に、このピコウェルアレイプレートは、多くのピコウェルアレイプレートを安価に作製するための型として使用できる。
【０２９７】
Ｈａｎらは、マイクロウェルが傾いた壁を有するマイクロウェルプレートを製造するための機器および試薬について記載する（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２：２６８−２７２を参照されたい）。記載されるのは、ＵＶ光源、接触ステージ、傾斜ステージ、およびＳＵ−８フォトレジストである。製造は、片面研磨シリコンウエハから開始する。ＳＵ−８フォトレジストを、ウエハ上に約０．１０〜０．１５ｍｍの厚さでコーティングする。次に、フォトレジストを、６５度のホットプレート上で１０分間、穏やかに焼き、次に、９５度のホットプレート上で３０分間、穏やかに焼く。得られたフォトレジスト／ウエハサンドイッチは、接触ステージを使用してＵＶマスクと接触する。「傾斜および回転ＵＶリソグラフィ」という用語は、マイクロウェルアレイプレートまたはピコウェルアレイプレートを製造する方法を指し、各ウェルは、傾いた壁を有する。ここでは、ウェルの床は、小さな直径を有し、ウェルの上部（ウェルの上部端が、プレートの平らな表面と接触する部分）は、幅広の直径を有する。ＵＶ光で露出するために、回転台が使用され、ＵＶ光が傾斜される（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ、前述）。マスクは、マスクの穴の各々が円形であるフォトレジストと接触する。前述のＨａｎらの図８は、ＵＶ光の方向、ＵＶマスク、フォトレジスト構造、ウエハ基板、および回転台の写真を提供する。Ｈａｎらは、円錐台の製造方法を記載する。ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの柔らかい材料を、円錐形アレイにわたって注ぎ、硬化させると、ＰＤＭＳ層が剥がれ、円錐形ウェルを形成する。
【０２９８】
ピコウェルアレイプレートの大量生産に使用する型を作製する。ピコウェルアレイプレートが製造されている場合は、エポキシをプレートにわたって注ぎ、すべてのピコウェルを充填し、充填されたすべてのピコウェルをエポキシのプラットフォームに接触できる。エポキシが固化したら、ピコ突起のアレイの付着した固体プラットフォームを除去する（ピコ突起は、目的のピコウェルの逆である）。ピコ突起を伴う固体プラットフォームは、多くのピコウェルアレイプレートの製造に使用できる再利用可能な成形である。
【０２９９】
エポキシ型（または任意の硬質な材料で作製された円錐形アレイ型から複製を作製する手順は、「ホットエンボス」と称される。簡単に述べると、基板材料を、そのガラス転移温度または軟化温度に加熱し、その時点でピコ突起を有する型が熱軟化材料に均一に押し付けられる。ピコ突起が、ピコ陥入として基材材料に移された後、型を基材から分離することができる。この開示は、好ましくは、型および基板のそれぞれのパターンとしてピコ円錐形およびピコウェルを開示する。
【０３００】
ホットエンボス、エポキシマスター、およびＳＵ−８フォトレジストなどのフォトレジストについて記載する（Ｂｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１５：１１２５−１１３０、Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ．１３：３２５−３３３、Ｌｉｕ，Ｓｏｎｇ，Ｚｏｎｇ（２０１４）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２４：記事ＩＤ：０３５００９、ｄｅｌ  Ｃａｍｐｏ  ａｎｄ  Ｇｒｅｉｎｅｒ（２００７）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１７：Ｒ８１−Ｒ９５を参照されたい）。
【０３０１】
他のマイクロウェルプレートの実施形態。プラスチックマイクロウェルアレイは、シリコン型を使用した熱成形を介して製造でき、シリコン型は、マイクロウェルのアレイ、例えば、８００，０００マイクロウェルのアレイを有する。テーパ形状、および滑らかな側壁、およびサブミクロンの許容誤差をもたらす高度な制御は、非パルス式ドライエッチングプロセスを使用して作製できる。対照的に、Ｂｏｓｃｈプロセスなどのパルス式ドライエッチングプロセスを使用する方法では、側壁が粗くなり、エッチング中に横方向の寸法を制御できない場合がある。
【０３０２】
非パルス式ドライエッチングプロセスを使用して、クロムマスクを使用した非パルス式等方性ドライエッチングプロセスによって作製されたシリコンマスター上にプラスチックを熱成形することにより、プラスチックアレイを製造する。このプロセスは、Ａｒ、ＳＦ６、Ｃ４Ｆ８の３つのガスを使用する。このプロセスは、１２００〜２０００ワットのＲＦ電力、および１５０ワットのバイアスで行われる。３つのガス間のガスフローを変化させることにより、シリコン型のテーパを微調整して、滑らかな側壁を作製できる。変更されるは、ＳＦ６とＣ４Ｆ８との比率であり、比率を変更した結果は、例えば、１８度（非常に傾斜した壁）、９度（わずかに傾斜した壁）、または２度（基板にほぼ垂直な壁）の傾きで存在する型（シリコンピラー）のテーパ壁である（Ｐｅｒｒｙ，Ｈｅｎｌｅｙ，ａｎｄ  Ｒａｍｓｅｙ（Ｏｃｔ．２６−３０，２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ．１８ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ（１７００〜１７０３ページを参照されたい）。
【０３０３】
実施形態において、本開示は、マイクロウェルのアレイを含む、基板、アレイ、グリッド、マイクロ流体デバイスなどを提供する。一実施形態において、すべてのマイクロウェルは、本質的に同じ容積を有する。この容積は、約１フェムトリットル、約２、約４、約６、約８、約１０、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約４００、約６００、約８００、または約１，０００フェムトリットルであることができる。
【０３０４】
さらに、容積は、約４０フェムトリットル〜約６０フェムトリットルの範囲など、上記の２つの隣接する値のいずれかの間の範囲の形態をとることができる。また、容積は、上記のリストで互いに直接的に隣接していない、上記の２つの値の間の範囲の形式をとることができる。
【０３０５】
さらに、容積は、約１ピコリットル、約２、約４、約６、約８、約１０、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約４００、約６００、約８００、または約１，０００、約２，０００、約５，０００、約１０，０００、約２０，０００、約５０，０００、約１００，０００、約２００，０００、約５００，０００、または約１，０００，０００ピコリットルであることができる。また、容積は、上記のリスト内で互いに直接的に隣接していない、上記の２つの値の間の範囲の形式をとることができる。
【０３０６】
除外的な実施形態において、本開示は、マイクロウェルを含む任意の基板、またはマイクロウェルを含む任意のアレイを除外することができ、各マイクロウェルの容積は、上記の値の１つによって定義可能であるか、または互いに隣接する上記の２つの値のいずれかの範囲によって定義可能であるか、またはリスト内で互いに隣接していない上記の２つの値のいずれかの範囲によって定義可能である。
【０３０７】
ピコウェル上の球状栓（キャップ化ビーズとしても知られる）。本開示は、球状栓、または代替的に、ピコウェルアレイの各ウェルごと、または実質的にすべてのウェル用の多孔性球状栓を提供する。栓の目的は、薬物、候補薬物、細胞内容物、代謝産物をウェル内に保持することである。栓は、ピコウェルの内容物を互いに単離するのにも役立つ。球状栓は、ピコウェルの上部（または開口、または口）を覆うという目的が満たされ得る限り、完全な球状である必要はない場合がある。ウェルは、上部直径および底部直径を有することができる。ウェルをキャップする前の球状栓の直径は、約１０マイクロメートル、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約７０、約９０、約１２０、または約２００マイクロメートルである。栓を追加して、ピコウェルアレイのそれにわたって簡素に流すことによりピコウェルを覆い得る。遠心分離、圧力、攪拌、または他の方法を使用して、ピコウェルの上部（または口または穴）にビーズを詰め込み、しっかりと密封することができる。いくつかの実施形態において、溶媒を使用して、キャップ化ビーズの膨潤および／またはサイズを変更することができる。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、ビーズを収縮させる溶媒に負荷され、アッセイバッファーまたは異なる溶媒に置き換えられると、キャップ化ビーズは、それらの元のサイズに戻るか、または膨潤して、それにより、ピコウェルをしっかりと密封する。いくつかの実施形態において、温度を使用して、キャップ化ビーズを膨潤または細断し、ピコウェルの口でより良好な密封を得ることができる。必要に応じて、キャップ化ビーズをその位置に保持し、ステップ付きピコウェルアレイにおけるステップの１つによって、ピコウェル内にさらに落下することを防ぎ得る。
【０３０８】
キャップ化ビーズは、本開示の化合物を運ぶ同じ種類のビーズであり得るか、または異なる種類のビーズであり得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、実際には、ビーズ自体を有する化合物であり得る。キャップ化ビーズは、ピコウェルからの分子の拡散を防止または遅延させる受動的キャップとして機能し得るか、またはビーズは、活性ビーズであり得、キャップ化ビーズに付着された機能的な部分を使用して、ピコウェルから試薬を捕捉し得る。いくつかの実施形態において、多孔性キャップ化ビーズは、ピコウェル内で実行される細胞系アッセイから放出された代謝産物を受動的に捕捉し得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、脂質、タンパク質、炭水化物、および核酸などの細胞物質を非特異的に捕捉し得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、抗体を用いて機能化し、健康、疾患、溶解、または固定された細胞から放出されたタンパク質を特異的に捕捉し得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、細胞の核酸を特異的に捕捉するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて機能化され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡ機能化されたキャップ化ビーズを使用して、キャップされたピコウェル内の細胞から放出されたマイクロＲＮＡを捕捉し得る。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、２つのビーズ、ピコウェル内部の化合物含有ビーズ、およびピコウェルの口を覆うキャップ化ビーズを含む。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズはまた、化合物を有するビーズである。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、複合ビーズから放出された材料を捕捉する。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、複合ビーズから放出された化合物の試料を捕捉する。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、複合ビーズから放出されたＤＮＡバーコードを捕捉する。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、それらがキャップするピコウェル内から放出される異なる種類の分析物を捕捉する。
【０３０９】
キャップおよびピコウェルの相対的な硬度。好ましい装置は、マイクロタイタープレートであり、各マイクロタイターは、その底面に何千ものピコウェルを含む。キャップが適切に位置する能力、または各ピコウェルを密封する能力は、キャップの硬度に対する、ピコウェルの穴およびピコウェルの内壁を構成するプラスチックの硬度の機能であり得る。
【０３１０】
プラスチックの硬度は、「デュロメータ」の値の観点において定義できる。硬度は、圧入に対する材料の耐性として定義され、試験される。球状栓の硬度、およびピコウェルの壁の硬度は、その「デュロメータ」の観点において定義できる。硬度は、例えば、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００であり得る。これらのデュロメータ値のいずれかをプラスチック物質または他の物質に帰する場合、使用されるスケールも明記する必要がある。例えば、スケールは、より柔らかい材料に使用されるＡＳＴＭ  Ｄ２２４０タイプＡスケール、またはより硬い材料に使用されるＡＳＴＭ  Ｄ２２４０タイプＤスケールにすることができる（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｍａｎｕａｌ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ａｌｂｒｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ，ＭＡを参照されたい）。
【０３１１】
ピコウェルの形状。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、ピコウェルの上部および底部で円筒の直径がほぼ同じである円筒形ピコウェルであり得る。いくつかの実施形態において、ピコウェルはわずかなテーパを有し得、ピコウェルの上部は、ピコウェルの底部よりもわずかに大きい。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、円錐ピコウェルであり得、角度は１度〜３０度の間のどこかで法線から外れている。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、ステップ付きピコウェルであり、ピコウェルは、上部の直径から底部の直径まで不連続なステップを有する（直径が上部から底部に滑らかに変化する円錐ピコウェルとは対照的に）。いくつかの実施形態において、ステップ付きピコウェルは、ピコウェルの開口の近くに幅広い円筒、およびピコウェルの底部の近くに狭い円筒を有する。いくつかの実施形態において、ステップ付きピコウェルは、上部から底部への複数の不連続なステップを有し得る。多ステップ付きピコウェルのいくつかの実施形態において、すべての段の直径は、その下の段の直径より大きくてもよい。いくつかの実施形態において、小さなビーズは、ステップ付きピコウェルの底部に堆積され得、キャップ化ビーズは、ステップ付きピコウェルの最上部の開口に堆積され得る。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、２つを超えるビーズを含み得る。
【０３１２】
ステップ付きピコウェルを作製する方法。図２９は、ステップ付きピコウェルを開示した。示される実施形態は、３つの区画および２つのステップを有する。上部区画は最も広く、ピコウェルがキャップされている状況で、上部区画の大部分がキャップで占められ、キャップを受け入れるように構成される。中央区画は、主に試薬によって、または試薬単独で占められるように構成される。試薬は、バッファー、酵素基質、１つ以上の塩、およびジチオトレイトール、ＲＮＡｓｅ阻害剤、グリセロール、もしくはＤＭＳＯなどの防腐剤または安定剤を含むことができる。最下部区画は、ビーズ、すなわち、ＤＮＡライブラリおよび放出可能な化合物の両方が結合したビーズで占められるように構成される。ＤＮＡバーコードおよび解放可能な化合物を有することに加えて、同じビーズは、「応答捕捉要素」を有することもできる。キャップ化ビーズをその位置に保持し、ステップ付きピコウェルにおけるステップの１つによって、ピコウェル内にさらに落下することを防ぐ。図２９では、構造１は、キャップであり、構造２は、ビーズであり、構造３は、第１のステップのすぐ上に位置する上部領域である。構造４は、中央領域であり、アッセイ試薬を配置するのに使用できる。中央領域は、第２のステップのすぐ上である。中央領域内のアッセイ試薬は、最も低い領域に拡散できる。構造５は、最も低い領域であり、ビーズを配置し、かつ１つ以上の細胞を配置するのに使用できる。
【０３１３】
ビーズが占める最も低い区画の空間について（ピコウェル内にビーズが１つのみ存在すると仮定する）、ビーズの直径は、最も低い区画の直径の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％であり得る（ピコウェルが円形ウェルであると仮定する）。ピコウェルが円形ウェルでない場合、上記の値は、ウェルの最も広い寸法を参照できる。除外的な実施形態において、本開示は、上記のパラメータのいずれも満たさないシステムまたはビーズを除外することができる。
【０３１４】
さらに、ビーズが占める空間について（ピコウェル内にビーズが１つのみ存在すると仮定する）、ビーズの約５０％は、最も低い区画にあり、および同じビーズの約５０％は、中央区画にあり、これらのパラメータはまた、約５５％が最も低いおよび約６５％が中央、約６０％が最も低いおよび約４０％が中央、６５％が最も低いおよび約４５％が中央、約７０％が最も低いおよび約３０％が中央、約７５％が最も低いおよび約２５％が中央、約８０％が最も低いおよび約２０％が中央、約８５％が最も低いおよび約１５％が中央、約９０％が最も低いおよび約１０％が中央、約９５％が最も低いおよび約５％が中央、ならびに約１００％が最も低い区画であり得る。これらの計算を行うために、ビーズが占める空間は、ビーズが多孔性ではないと（仮説的に）仮定する。除外的な実施形態において、本開示は、上記のパラメータのいずれも満たさないシステムまたはビーズを除外することができる。
【０３１５】
円錐および円筒ピコウェルと同様に、成形システムの使用は、ステップ付きピコウェルを作製するための１つの好ましい実施形態である。この目的のために、多層柱のアレイを含む型が所望され、熱可塑性または他の硬化性ポリマー基板に打ち込むと、ステップ付きピコウェルの跡が形成され得る。複数のステップを備えた層状柱アレイ、異なる直径の各ステップは、（上に行くほど小さくなる）、多層リソグラフィプロセスで形成され得る。簡単に述べると、マイクロピラーアレイの第１の層を架橋するために、第１のフォトレジストの第１の層が、第１のマスクを介して曝露される。フォトレジストの第２の層は、第１の層（以前に曝露された）に直接的に堆積され得、第２のフォトマスクを使用して、後に第２のフォトレジストの第２のパターンが架橋され得る。多層パター化の最後に、レジストの積層は、架橋されていない領域を洗い流すために開発され、多層柱のアレイを残すことができる。多層柱アレイを作製するための詳細なプロトコルは、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｐｅｒｄｉｇｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ  ８ｔｈ，２０１１）．Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｎ．Ｌａｓｋｏｖｓｋｉ，ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎに見出され得る。多層柱アレイのアレイが作製されると、標準のプロセスが使用され、型を使用してステップ付きピコウェルアレイをインプリントし得る。
【０３１６】
キャップ化ビーズを除去する。多くの実施形態において、ピコウェル内の化学的摂動に対する反応、分析物、または細胞応答を研究するためにキャップ化ビーズを採取することが有利である。いくつかの実施形態において、ピコウェルアレイを反転させ、機械的攪拌を使用することにより、キャップ化ビーズをピコウェルの口から取り除くことができる。いくつかの実施形態において、ピコウェルを収縮させるために溶媒を使用して、ピコウェルの口から容易に取り除くことができる。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズよりも高い密度の液体をピコウェルアレイの上部に追加し、浮力によってキャップ化ビーズを上昇させ、高密度媒体の上部に浮遊させることができる。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズを互いに架橋して、キャップ化ビーズをピコウェルアレイの上部から剥離することができるキャップ化シートに変換することができる。いくつかの実施形態において、架橋ゲルをキャップされたピコウェル上に注ぐことができ、架橋ゲルは、キャップ化ビーズおよびそれら自体に架橋し、キャップビーズが、剥離することができる架橋シートに埋め込まれるようにする。
【０３１８】
ピコウェルの相対的な位置を、剥離した層の形態で保持する。キャップ化ビーズが、剥離することができるゲル層に噛み合わされるような実施形態では、互いに対するおよびピコウェルに対するキャップ化ビーズの相対的な位置は、剥離された層に保持されることを理解されたい。これにより、ピコウェル、ピコウェルでのアッセイ、ピコウェル内のビーズ、およびキャップ化ビーズに捕捉されたあらゆる材料を直接的に接続できる。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、位置合わせマーカーを使用して、ピコウェルアレイの相対的な特徴を、剥離された層のキャップ化ビーズに向けることができる。
【０３２０】
ピコウェルの位置合わせおよび整列を可能にする基準マーカー。ピコウェルを不規則なアレイに配置すると、ピコウェルアレイのイメージング中にシフトおよびドリフトを簡単に特定できる。いくつかの実施形態において、イメージング中に光学的および機械的ドリフトの検出を容易にするために、ピコウェルは不規則な順序で配置される。いくつかの実施形態において、ピコウェルアレイは、イメージング中のシフトおよびドリフトを特定するのを助けるための基準マーカーを含む。いくつかの実施形態において、基準マーカーは、ピコウェルアレイのピコウェル間に散在する、容易に特定可能な形状、パターン、または特徴である。いくつかの実施形態において、少数のピコウェルは、それ自体が容易に特定可能なパターンで配置され、イメージング中の光学的または機械的ドリフトの場合に容易な位置合わせを可能にすることができる。いくつかの実施形態において、蛍光ビーズなどの外部マーカーをピコウェルアレイ上に霧状にして、基準パターンを提供することができる。
【０３２１】
キャップフリーマットの実施形態。キャップフリーマットの実施形態は、少なくともいくつかの形態または例では、「キャップレスフィルム」の形態をとることができる。ピコウェルの上部にある開口を密封する代わりに、例えば、ピコウェル内にあり得る任意の細胞培養培地または酵素アッセイ培地の蒸発を防止するために、マットを介して密封することができる。好ましくは、マットは、所定のピコウェルアレイ内のすべてのピコウェルを覆うようなサイズである。代替的に、マットは、アレイ内のピコウェルの所定の区画を覆うようなサイズにすることができる。マットは、ピコウェルプレートの上部に固定して、ピコウェルを覆い、ピコウェルの間にあるピコウェルプレートのほぼ平坦な上面も覆うことができる。確実な接触は、（ｉ）例えば、マットの上部に置かれ、マットの上部の重りとして機能する硬いゴム製プラテンによって、一定の圧力を維持すること、（ｉｉ）硬いゴム製プラテンなどの重りに接続されたマットを使用すること、（ｉｉｉ）マット全体に適用できるリバーシブル化学接着剤（マットが吸収マットではない場合）のうちの１つ以上によって達成できる。マットが吸収マットになる場合、マットには、可逆的な化学接着剤で囲まれた円形の吸収パッドが含まれる。ここで、マットはピコウェルアレイと接触して整列し、円形の吸収パッドが各ピコウェルの開口のみを覆い、開口から「こぼれ出して」ピコウェルプレートの平面に接触しないようにする。
【０３２２】
ピコウェルプレートの実質的な平面と接触するためのマットとして使用するための、およびピコウェルのキャップレス密封化で使用するための膜が利用可能である。Ｄｏｗ  Ｆｉｌｍ  Ｔｅｘ、ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ、Ｍｉｃｒｏｄｙｎ  Ｎａｄｉｒ、Ｔｏｒａｙ、ＴｒｉＳｅｐ、Ｓｙｎｄｅｒ、Ｎｏｖａｍｅｍ、Ｅｖｏｎｉｋ、およびＡｑｕａｐｏｒｉｎフラットシート膜などのフラットシート膜は、ワシントン州ケントのＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐから入手可能である。これらには、ポリアミド−ＴＦＣ、セルロースアセテート、ポリアミド−尿素−ＴＦＣ、セルロースアセテートブレンド、ポリピペラジン−アミド−ＴＦＣ、ＰＥＳ、複合ポリアミド−ＴＦＣ、ＰＥＳ、ＰＡＮ、ＰＶＤＦ、ＰＳＵＨ、ＲＣ、ＰＥＳＨ、ポリエーテルエーテルケトン、およびポリイミドなどで作製された膜が含まれる。分子量カットオフの観点での細孔サイズには、１５０Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、５００Ｄａ、９００Ｄａ、６００Ｄａ、１，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ  ７０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、４００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ、８００，０００Ｄａ、３５００Ｄａ、０．００５マイクロメートル、０．０３０マイクロメートル、０．０５マイクロメートル、０．１０マイクロメートル、０．２０マイクロメートルなどが含まれる。本開示のシステム、組成物、試薬、および方法に関して、これらのカットオフ値は、他のクラスの化合物を除外して、特定のクラスの化合物の選択的な収集を可能にすることができる。例えば、上記の膜のいくつかは、小分子代謝産物が通過して吸収性マットによって吸収されることを可能にする一方で、タンパク質および他の高分子を除外することができる。水、金属イオン、塩、代謝産物、タンパク質、および核酸を含むすべての分子に対して不透過性であるフラットシート膜も、本開示のシステム、組成物、および方法での使用に利用可能である。
【０３２３】
可逆的な接着は、「分子ベルクロ」、例えば、メタロポルフィリン含有ポリマーとピリジン含有ポリマーとによって媒介さる（Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｎａｍｙｓｌｏ，Ｌｅｄｅｒｌｅ，Ｈｕｂｅｒ（２０１８）ｅＸＰＲＥＳＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．１２：５５６−５６８）。他の分子ベルクロ接着剤は、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ｓｓＤＮＡの相補鎖（ピコウェルプレートの平らな上面に共有結合的に付着された１種類のｓｓＤＮＡ、およびマットに共有結合的に付着された他の種類のｓｓＤＮＡ）、カテコール側鎖を含むコポリマーなどを伴う（Ｓｉｅｖｅｒｓらの前述を参照されたい）。また、可逆的な接着は、ガリウム接着剤によって媒介でき、接着の程度は、温度のわずかな変化によって制御できる（Ｍｅｔｉｎ  Ｓｉｔｔｉ（Ｍａｙ  １８，２０１６）Ｓｗｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｓｔｉｃｋ．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｇａｌｌｉｕｍ  ｃｏｕｌｄ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗｓ  ｉｔｓ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｏ  ｂｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｏｎ  ａｎｄ  ｏｆｆ  ｗｉｔｈ  ｅａｓｅ．Ｍａｘ−ｐｌａｎｃｋ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）。さらに別のリバーシブル接着剤は、オランダのズウォルのＤＳＭ−Ｎｉａｇａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である。
【０３２４】
吸収性物質（非特定の吸収剤；特定の吸収剤）。マットに組み込んで吸収特性を提供できる吸収性物質には、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ａｇａｒｏｓｅ（登録商標）などの「分子ふるい」ビーズ、およびＤＥＡＥセルロース、カルボキシメチルセルロース、ホスホセルロースで作製されたイオン交換ビーズ、または上記の任意の組み合わせが含まれ、すべて１つの吸収性マットに組み合わされる。吸収性リガンドには、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で使用されるものが含まれる（ＢｉｏＲａｄカタログ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡを参照されたい）。特定の吸収剤には、ｐｏｌｙＡテールとのハイブリダイズによってｍＲＮＡを捕捉できるｐｏｌｙ（ｄＴ）などの応答捕捉要素が含まれる。また、応答捕捉要素には、エクソン標的化ＲＮＡプローブ、抗体、およびアプタマーが含まれる。これらのいずれか、または任意の組み合わせをマットに共有結合的に付着させ、吸収性マットを作製することができ、吸収性マットをピコウェルの上面に接触させると、ピコウェルの内側にある可能性のある水性アッセイ培地または水性細胞培養培地を捕捉できる。
【０３２５】
（ＩＸ）ピコウェルにビーズを堆積させる
ピコウェルを伴うプレートは、９６ウェルプレートの形態をとることができ、これらの９６ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。また、ピコウェルを伴うプレートは、２４ウェルプレートの形態をとることができ、これらの２４ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。９６ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液０．１〜０．２ｍＬを使用して充填できる。２４ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液０．５ｍＬを使用して充填できる。懸濁液は、使い捨てチップ付きの通常のピペットを使用して追加できる。懸濁液中にあるビーズの数は、１つのビーズのみを含むピコウェルの約３分の１、２つのビーズを含むピコウェルの約３分の１、およびビーズを含まないか、または２つ以上ビーズのいずれかを含むビーズの約３分の１をもたらすことができる。また、懸濁液中のビーズの数は、状況に起因することができ、１つ以上のビーズを含むウェルの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％は、これらのウェルの１つのみのビーズを含む。
【０３２６】
ビーズが定着した後、あらゆる余分な液体は、９６ウェルプレートの各ウェルの壁にピペットチップを接触させるか、２４ウェルプレートの各ウェルの壁にピペットチップを接触させて、余分な液体を取り除くことで除去できる。
【０３２７】
アッセイ試薬に関しては、ピコウェルが反応の実行に使用される場合、例えば、ＤＮＡシーケンシング、生化学アッセイ、または培養細胞のアッセイの場合、すでに沈降したビーズを含むピコウェルにアッセイ試薬を追加できる。ビーズ懸濁液の最初の追加について上述したように、アッセイ試薬の追加はピペットを使用する。アッセイ試薬がすでに各ピコウェルにある溶液と平衡化されている後、９６ウェルプレートの９６ウェルの各々にある、あらゆる余分な溶液、または２４ウェルプレートの２４ウェルの各々にある、あらゆる余分な溶液は、９６ウェルプレートの９６ウェルの各々の壁に接触するか、または２４ウェルプレートの２４ウェルの各々の壁に接触するピペットチップで抜き取ることができる。
【０３２８】
ピコウェルアレイのフローセルの実施形態。ピコウェルアレイは、フローセルの一部であり得、入口および出口を備えた流体チャンバが、ピコウェルアレイの上部に取り付けられている。かかる実施形態において、本開示のビーズ、細胞、および他のアッセイ材料は、入口から流入し、出口を通って流出し得る。重力または遠心力を使用して、ビーズがフローセルを通って流れるときに、ビーズをピコウェルに留める。
【０３２９】
（Ｘ）ピコウェル内のビーズ結合核酸のシーケンシング
ビーズ結合核酸は、ビーズに付着したままシーケンシングできる。代替的に、または追加的に、ビーズ結合核酸は、ビーズからのＤＮＡバーコードの切断後にシーケンシングされ得る。
【０３３０】
シーケンシングの前にビーズからＤＮＡバーコードを切断する。いくつかの実施形態において、本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードがビーズから切断され、それにより、増幅の前、またはシーケンシングの前、または核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列同定技術の前に、可溶性形態でＤＮＡバーコードを放出する方法を包含することができる。
【０３３１】
除外的な実施形態。実施形態において、本開示は、任意の方法、関連する試薬、システム、組成物、またはビーズを除外することができ、ビーズ結合ＤＮＡバーコードは、増幅の前、またはシーケンシングの前、または核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列同定技術の前に切断される。また、本開示は、ＤＮＡバーコードを含むポリヌクレオチドが切断されるか、または、ＤＮＡバーコードの一部のみを含む核酸が、増幅の前、シーケンシングの前、もしくは核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列同定技術の前に切断される任意の方法を除外することができる。
【０３３２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。ＰＣＲ法およびｑＰＣＲ法は、（１）高温でＤＮＡ鋳型を変性させ、低減された温度でプライマーをアニーリングし、最後にＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるように、ＤＮＡ合成を介してプライマーを伸長させる、３ステップの方法に依存する（Ｇａｄｋａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｌｉｏｎ（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１−６）。ｑＰＣＲは、「リアルタイムＰＣＲ」とも称される（Ｋｒａｌｉｋ  ａｎｄ  Ｒｉｃｃｈｉ（２０１７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８（９ページ）。
【０３３３】
ＰＣＲ法およびｑＰＣＲ法の最近の変更または改善には、ヘリカーゼ依存（ＨＤＡ）増幅の使用、内部増幅標準の使用、ロックド核酸（ＬＮＡ）の使用、および阻害剤に結合する添加剤の使用が含まれる（Ｇａｄｋａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｌｉｏｎ（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１−６）。ロックド核酸は、その標的を極めて正確に認識して結合するという利点を提供する。
【０３３４】
ｑＰＣＲは、標的ＤＮＡ分子の増幅および定量を同時に行うことができる。ｑＰＣＲ法は、応答曲線が特定の蛍光しきい値に到達するために必要な増幅サイクルの数を比較する（Ｐａｂｉｎｇｅｒ，Ｒｏｄｉｇｅｒ，Ｋｒｉｅｇｎｅｒ（２０１４）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１：２３−３３）。Ｒｅｆｓｌａｎｄらは、ｑＰＣＲを実施するための明らかに典型的な条件の簡潔な記載を提供する（Ｒｅｆｓｌａｎｄ，Ｓｔｅｎｇｌｅｉｎ，Ｈａｒｒｉｓ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８：４２７４−４２８４）。
【０３３５】
ＰＣＲプライマーの設計および検証、ならびにアニーリング温度（Ｔａ）、融解温度（Ｔｍ）、伸長ステップの温度、バッファーの種類などの変数に関するガイダンスが利用可能である（Ｂｕｓｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｕｇｇｅｔｔ（２０１７）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１４：１９−２８）。
【０３３６】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）。ＤＮＡは、ビーズに付着させたまま増幅できる。増幅された形態のＤＮＡは、増幅されていないＤＮＡの配列よりも簡単である。ローリングサークル増幅法では、ＤＮＡタグ（ＤＮＡバーコード）を一本鎖に作製する。一本鎖になると、スプリントオリゴが、タグＤＮＡの末端を架橋するために追加され、その後スプリントオリゴの伸長およびライゲーションが続く。ＤＮＡポリメラーゼ（マイナス５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）を使用すると、ＤＮＡが、スプリントオリゴの伸長を触媒した後、連結可能な接合部が保証される。次いで、環状化されたＤＮＡは、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを加えることにより、ローリングサークル増幅に供され得る。ＤＮＡバーコードタグでローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実行する機能により、任意の生き残ったＤＮＡ分子を簡単にシーケンシングできる十分な量に熱増幅できるため、ＤＮＡに損傷を与え得る合成化学物質を使用できる。ＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ消化、ニッキング、および高温での融解、または水酸化ナトリウムでの処理によって一本鎖を作製することができる。
【０３３７】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の詳細は、ＲＣＡの実施に使用できる次の手順で明らかになる。
【０３３８】
ステップ１：ビーズ結合ｓｓＤＮＡで開始される。ビーズ結合ＤＮＡが最初に（ｄｓＤＮＡ）から二本鎖になっている場合、ＲＣＡに使用しない鎖は、チミン（Ｔ）の残基が、ビーズ結合末端またはそのすぐ近くで、ウラシル（Ｕ）の残基に置き換えられるように調整できる。この方法でｄｓＤＮＡを調製すると、ウラシルＮグリコシダーゼを使用して、ウラシル残基を切断し、それによって不安定な糖リン酸を（ＤＮＡ骨格の一部として）残すことができ、この不安定な位置は、ヌクレアーゼ処理によって切断することができる（Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３４１９−３４２３）。
【０３３９】
ステップ２：「スプリントオリゴ」をビーズ結合ｓｓＤＮＡに追加する。スプリントオリゴは、ビーズに共有結合的に結合されているｓｓＤＮＡの末端（５’末端）で約１０〜２０塩基対にハイブリダイズするように設計されており、ビーズ結合ｓｓＤＮＡのフリー末端（３’末端）で約１０〜２０塩基対にもハイブリダイズする。スプリントオリゴは、ｓｓＤＮＡのビーズ結合端をビーズ結合ｓｓＤＮＡのフリー末端に近接させる必要はない。必要なのは、巨大なループを形成するために、ビーズ結合ｓｓＤＮＡ配列の遠端をつなぎ合わせることのみである。
【０３４０】
ステップ３：スルホロブスＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加して、このポリメラーゼがｓｓＤＮＡの巨大なループを鋳型として使用し、片端でスプリントオリゴに共有結合的に付着される相補的な巨大なループを作製する。
【０３４１】
ステップ４：ＤＮＡリガーゼを使用して、相補的な巨大なループを共有結合的に閉鎖し、環状のｓｓＤＮＡが生成される。ＲＣＡの間に「ローリング」を行うのは、この閉鎖されたｓｓＤＮＡの輪である。
【０３４２】
ステップ５：鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを追加し、ｄＮＴＰを追加する。追加されたＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰをビーズ結合ｓｓＤＮＡに共有結合的に付着させ、ビーズ結合ｓｓＤＮＡの遠位末端は、「ローリングサークル」上にあるものの相補的なコピーを作製するために伸長され、次にさらに伸長され、「ローリングサークル」上にあるもののさらに別の相補的なコピーを作製し、さらに伸長され、「ローリングサークル」上にあるもののさらに別の相補的なコピーを作製する。潜在的に無限の増幅のこのプロセスの間、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性により、ＤＮＡポリメラーゼの継続的な活性が可能になる。
【０３４３】
任意に、本開示の方法は、蛍光分子ビーコンを介したローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のリアルタイムモニタリングを含む（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｇｕｌｌｂｅｒｇ，Ｒａａｐ（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ６６（７ページ））。ＲＣＡ用試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｙｇｎｉｓ  ＴｒｕｅＰｒｉｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴｒｕｅＰｒｉｍｅ（登録商標）ＲＣＡキット）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、およびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ５００（登録商標）増幅キット）から入手可能である。フルオロフォアおよびクエンチャは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。
【０３４４】
ステップ６．ＲＣＡによって増幅されたｓｓＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用し、プライマーが追加され、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが追加され、ＰＣＲ産物は、その後、次世代シーケンシングによってシーケンシングされる。
【０３４５】
本開示の一態様では、ＲＣＡ増幅されたｓｓＤＮＡは、ＰＣＲ産物を作製するＰＣＲ増幅の前にビーズから切断される。本開示の別の態様において、ＰＣＲ産物を作製するＰＣＲ増幅は、ビーズからＲＣＡ増幅されたｓｓＤＮＡを切断することなく作製できる。
【０３４６】
Ｂａｎｅｒらが記載したように、「ＲＣＡ反応により、環状分子への補体のタンデムコピーの多くを表す鎖を生成できる」（Ｂａｎｅｒ，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５０７３−５０７８）。枯草菌相ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、その鎖置換活性および高い処理能力のため、好適な酵素である。ＲＣＡは、Ｌｉらによって同様に特徴付けされ、「ＲＣＡでは、環状鋳型は、鎖置換特性を有するＤＮＡポリメラーゼｐｈｉ２９によって等温で増幅される。長い一本鎖ＤＮＡ産物は、何千もの配列反復を含む：（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｚｈｏｎｇ（２００７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７９：９０３０−９０３８）。
【０３４７】
本開示のＤＮＡバーコードのシーケンシングは、いかなる限定を意味することなく、Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｏｒｎの米国特許第８，６３２，９７５号の方法を用いることができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、本開示のＤＮＡバーコードは、例えば、サンガーシーケンシング法などの合成によるシーケンシングを使用する方法によって、または「次世代シーケンシング」を使用する方法によってシーケンシングすることができる。
【０３４８】
ＤＮＡシーケンシングのためのイルミナ法。ＤＮＡシーケンシングのためのイルミナ法は、以下のとおりである。ＤＮＡは、超音波処理により１００〜４００塩基対（ｂｐ）のサイズ範囲に断片化できる（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍａｇｒｉｎｉ，Ｄｅｍｅｔｅｒ（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．１０：ｅ１００４４６２）。イルミナ法では、ＤＮＡライブラリが作製され、細胞からのＤＮＡの断片または細胞から、ＤＮＡアダプタ（断片の末端に付着される）によって修飾される。反応生成物はサンドイッチの形態をとり、シーケンシングされるＤＮＡはサンドイッチの中央にある。反応生成物は、（第１のアダプタ）−（シーケンシングされるＤＮＡ）−（第２のアダプタ）の形態をとる。アダプタ−ＤＮＡ−アダプタ複合体は、さらに別のアダプタに関連付けられ、この他のアダプタは、固体表面に共有結合的に付着される。固体表面は、平らなプレートであり得る。固体表面は、平面から突き出る多くのアダプタの芝生を有する。アダプタは、サンドイッチ内であるアダプタの１つに相補的なＤＮＡ配列を有する。実際に、芝生は、２種類のアダプタを含み、１つのアダプタは、複合体内のアダプタの１つに結合（ハイブリダイズ）し、複合体をプレートに非共有結合的に係留する。これらは、「第１の芝生結合アダプタ」および「第２の芝生結合アダプタ」と称され得る。ＤＮＡポリメラーゼの第１の課題は、係留された（ただし非共有結合的に結合した）ＤＮＡを鋳型として使用して、娘鎖を作製することであり、ＤＮＡ重合が発生すると、娘鎖は「第１の芝生結合アダプタ」に共有結合的に付着した形態になる。この共有結合的な連結は、ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用によって生成される。娘鎖が完全に合成された後、遠位末端（媒体に突き出る末端）は、上記で称されたサンドイッチにおける第２のアダプタに相補的なＤＮＡ配列を含む。この相補的なＤＮＡ配列により、新しく合成された娘ＤＮＡの遠位末端が屈曲し、「第２の芝生結合アダプタ」にハイブリダイズすることができる。上記で記載されているのは、サンドイッチの両方のアダプタがどのように使用されるか、ならびに「第１の芝生結合アダプタ」および「第２の芝生結合アダプタ」の両方がどのように使用されるかである。
【０３４９】
その後、反応のサイクルが何度も実行され、その結果、元のｄｓＤＮＡの増幅されたバージョンのクラスターになる。実際に、クラスターは共有結合的に付着された（係留された）ｓｓＤＮＡ分子の形態をとり、これらのｓｓＤＮＡ分子のすべては、元のｄｓＤＮＡ（生細胞または組織から単離されたｄｓＤＮＡ）の鎖の１つのみに対応する。係留されたｓｓＤＮＡ分子のこのクラスターは、「ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）」と称される。ポロニーの生成は、「ブリッジ増幅」と称される手法によるものである。最後に、ブリッジ増幅およびポロニーの作製後、固体表面に共有結合的に付着されたリバース鎖は、その係留から切断され、洗い流されて廃棄され、フォワード鎖のみが残る。
【０３５０】
イルミナ（登録商標）法に関する情報は、Ｇｏｏｄｗｉｎ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＭｃＣｏｍｂｉｅ（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１７：３３３−３５１、Ｇｉｅｒａｈｎ，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｈｕｇｈｅｓ（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４：３９５−３９８、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｌｅｅ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２６：１１３５−１１４５、Ｒｅｕｔｅｒ，Ｓｐａｃｅｋ，Ｓｎｙｄｅｒ（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．５８：５８６−５９７、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＹｏｕＴｕｂｅでの５分間のビデオ）から入手可能である。
【０３５１】
オリゴヌクレオチド連結および検出によるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）。ＳＯＬｉＤは、色素標識された分子からの蛍光強度を測定して、ＤＮＡ断片の配列を決定する。ＤＮＡ断片のライブラリは、シーケンシングされる試料から調製され、クローンビーズ集団の調整に使用される（各磁気ビーズの表面に１種類の断片のみ）。ビーズに付着された断片には、すべての断片の開始配列が既知および同一の両方であるように、付着された普遍的なＰ１アダプタ配列が与えられる。ＰＣＲが行われ、ビーズに付着したＰＣＲ産物がスライドに共有結合的に結合する。
【０３５２】
次に、プライマーは、ライブラリ鋳型内のＰ１アダプタ配列にハイブリダイズする。４つの蛍光標識された二塩基プローブのセットは、シーケンシングプライマーへの連結について競合する。二塩基プローブの特異性は、各連結反応の第１および第２のすべての塩基を調査することによって達成される。連結、検出、および切断の複数のサイクルは、最終的な読み取りの長さを決定するサイクルの数を伴って実行される。一連の連結サイクルに続いて、伸長産物が除去され、鋳型は、２巡目の連結サイクルのｎ−１位置に相補的なプライマーでリセットされる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．７：３３６−３３７を参照されたい）。
【０３５３】
ｐＨ系ＤＮＡシーケンシング。ｐＨ系ＤＮＡシーケンシングは、ポリメラーゼ触媒による伸長反応の副産物として生成される水素イオンを測定することにより、塩基の取り込みが決定されるシステムおよび方法である。作動可能に結合したプライマーおよびポリメラーゼをそれぞれ有するＤＮＡ鋳型を反応チャンバまたはマイクロウェルに負荷し、その後、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の追加および洗浄の繰り返しサイクルを行う。ＤＮＡ鋳型は、鋳型がクローン集団として固体支持体に付着される。各かかる取り込みにより、水素イオンが放出され、水素イオンを放出する鋳型の集団が集合し、反応チャンバの局所ｐＨに検出可能な変化を引き起こす（Ｐｏｕｒｍａｎｄ（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：６４６６−６４７０を参照されたい）。本開示は、ｐＨ系ＤＮＡシーケンシングを除外することができる。
【０３５４】
連鎖状ＤＮＡバーコードに関しては、連鎖状ＤＮＡバーコード全体を１回の実行でシーケンシングできる（連鎖状ＤＮＡバーコード全体のシーケンシングには１つのシーケンシングプライマーのみが必要である）。代替的に、連鎖状ＤＮＡバーコードを構成する一部またはすべてのＤＮＡバーコードモジュールを、別々にシーケンシングに供することができる（別々にシーケンシングされたＤＮＡバーコードモジュールの各々は、その独自のシーケンシングプライマーを取得する）。直交性ＤＮＡバーコードに関しては、ＤＮＡバーコードモジュールの各々が、ビーズ上の独自の部位に付着されるため、直交性ＤＮＡバーコードを構成するＤＮＡバーコードモジュールの各々は、それ独自の専用のシーケンシングプライマーが必要である。
【０３５５】
除外的な実施形態。実施形態において、本開示は、マイクロフルイディクス、油媒体中に存在する水性液滴、水性試薬を含む第１のチャネルが、オイルを含む第２のチャネルと連結され、連結領域から始まる第３のチャネルを介して油媒体を移動する水性液滴を生成することにより作製される水性液滴を伴う、任意のシステム、デバイス、デバイスの組み合わせ、および方法を除外することができる。マイクロフルイディクスデバイスおよび試薬が記載される（例えば、Ｂｒｏｕｚｅｓ，Ｍｅｄｋｏｖａ，Ｓａｖｅｎｅｌｌｉ（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６：１４１９５−１４２００、Ｇｕｏ，Ｒｏｔｅｍ，Ｈａｙｍａｎ（２０１２）Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．１２：２１４６−２１５５、Ｄｅｂｓ，Ｕｔｈａｒａｌａ，Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：１１５７０−１１５７５、Ｓｃｉａｍｂｉ  ａｎｄ  Ａｂａｔｅ（２０１５）Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．１５：４７−５１を参照されたい）。
【０３５６】
他の除外的な実施形態において、除外できるのは、「ＤＮＡヘッドピース」を構成する任意の試薬、組成物、核酸、もしくはビーズ、または「ＤＮＡヘッドピース」に共有結合的に付着される試薬、組成物、核酸、もしくはビーズである。ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｐｒｉｃｅ，Ｐａｅｇｅｌ（２０１７）ＡＣＳ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９：１８１−１９２は、ＤＮＡヘッドピースの例を提供し、ビーズは、アジドＤＮＡヘッドピースを伴って機能化される。
【０３５７】
シーケンシング法およびシーケンシング試薬に関する追加の除外的な実施形態。実施形態において、本開示は、ＤＮＡシーケンシングにおける「可逆的ターミネータ」の使用を伴わない試薬、システム、または方法を除外することができる。また、除外できるのは、メトキシ保護基を含まない任意の試薬、システム、または方法である。さらに、除外できるのは、ＤＮＡシーケンシングを伴うが、シーケンシングされているＤＮＡが、ポリヌクレオチドの順序に関する情報が検出および収集されているときに、ビーズに共有結合的に付着されていない、任意の試薬、システム、または方法である。さらに、除外できるのは、シーケンシング反応を行う前にＤＮＡ鋳型を増幅する、例えば、ＰＣＲ技術またはローリングサークル技術により増幅する任意の試薬、システム、または方法である。実施形態において、除外できるのは、例えば、連結される（１つの単一の核酸上に存在する化学ライブラリのメンバーの合成に関するすべての情報）核酸バーコード化のようなバーコード化の任意の方法である。別の態様において、除外できるのは、例えば、直交する（ビーズ上の複数の付着位置に分散している化合物ライブラリの所定のモノマーの合成に関する情報）核酸バーコード化のようなバーコード化の任意の方法である。ＤＮＡリガーゼに関する除外的な実施形態において、本開示は、核酸バーコードのモジュールを接続するためにＤＮＡリガーゼを使用する任意の試薬、システム、または方法を除外することができる。
【０３５８】
フルオロフォア、クエンチャ、およびＦＲＥＴ系アッセイ。本開示は、化学ライブラリのメンバーをスクリーニングするため、または化学ライブラリの単離されたメンバーを特徴付けするためのフルオロフォアおよびクエンチャを提供する。ＦＲＥＴは、フェルスター共鳴エネルギー移動である。
【０３５９】
アッセイは、ビーズ結合化学ライブラリ上で実行できる。また、アッセイは、ビーズからの切断後すぐに、フリー化学ライブラリメンバーで実行でき、すなわち、ビーズと同じマイクロウェルで、またはビーズと同じヒドロゲルマトリックスの近傍で実行される。さらに、アッセイは、あらゆるビーズに付着されていないか、またはビーズから切断されて次に精製されている、可溶性の化学ライブラリメンバーで実行できる。
【０３６０】
本開示の試薬として好適なフルオロフォアには、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６３３、Ａ６４７、Ａｌｅｘａ  ６８０、フルオレセイン、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、クマリン、Ａｌｅｘａ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ６６０、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６４７ｎ、Ｓｅｔａｕ−６６５（ＳＥＴＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッド、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、およびジョー色素（４’−５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−６−カルボキシフルオレセイン）、ＳＹＢＲグリーンＩ（４９７ｎｍを吸収、５２０  ｎｍを発光）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）（４９２ｎｍを吸収、５１８ｎｍを発光）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）（４９２ｎｍを吸収、５１８ｎｍを発光）、ＦＩＴＣ、およびローダミンが含まれる。クエンチャには、ＴＡＭＲＡクエンチャ、ブラックホールクエンチャ−１（ＢＨＱ１）、ブラックホールクエンチャ−２（ＢＨＱ２）、およびＤＡＢＣＹＬクエンチャが含まれる。この特許文書における他の場所で開示されているように、ＴＡＭＲＡは、フルオロフォアであり得、クエンチャでもあり得ることに注意されたい。
【０３６１】
ガイダンスは、ＦＲＥＴ系アッセイ用の試薬で利用可能であり、ＦＲＥＴ試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャが含まれる（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ（２００６）Ｃｈｏｏｓｉｎｇ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：１７−２９を参照されたい）。ＦＲＥＴ系アッセイの例は、「ＳｃｅＤペプチド」の基質を用いたシグナルペプチダーゼ（ＳｐｓＢ）の活性測定を含む。ペプチドに付着したＦＲＥＴペアは、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）５−（（２−アミノエチル）アミノ）−１−ネフタレンスルホン酸である（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００９）ＦＥＢＳＪ．２７６：３２２２−３２３４を参照されたい）。別の例は、ＫＶＳＬＮＦＰＩＬのペプチド基質を用いたＨＩＶ−１プロテアーゼのアッセイに由来する。ドナー／アクセプタＦＲＥＴペアは、ＥＤＡＮＳ（ドナー）およびＤＡＢＣＹＬ（アクセプタ）であった。ＥＤＡＮＳ蛍光は、非蛍光ＤＡＢＣＹＬへの共鳴エネルギー移動を介してＤＡＢＣＹＬによって消光され得る（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．２０：６０６−６１５を参照されたい）。さらに別の例は、ボツリヌス毒素のアッセイに由来する。ＳＮＡＰ−２５の活性は、ＢｏＮＴ−Ａの基質を使用して測定できる。ＦＲＥＴ系アッセイでは、基質は、Ｎ末端に連結したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を有し、およびＣ末端に連結したクエンチャは、４−（４−ジメチルアミノフェニル）ジアゼニル安息香酸（ＤＡＢＳＹＬ）である。ペプチド基質は、ＳＮＡＰ−２５のアミノ酸１９０〜２０１に対応される（Ｒａｓｏｏｌｙ  ａｎｄ  Ｄｏ（２００８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：４３０９−４３１３を参照されたい）。
【０３６２】
本開示は、酵素阻害剤、酵素活性剤を発見および同定し、所定のタンパク質の生体内分解の速度を増強することができる化合物を発見するために、化合物のライブラリをスクリーニングするための試薬、組成物、ならびに方法を提供する。これらの試薬、組成物、および方法は、ＦＲＥＴ系アッセイを使用でき、代替的に、ＦＲＥＴ系アッセイ以外のアッセイを使用することもできる。
【０３６３】
分子ビーコンが記載される（Ｂａｒｕｃｈ，Ｊｅｆｆｅｒｅｙ，Ｂｏｇｙｏ（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１４：２９−３５を参照されたい）。分子ビーコンは、フルオロフォアがリンカーを介してクエンチャに結合している試薬である。リンカーは、ヌクレアーゼによって切断可能であり得、したがって、ヌクレアーゼ活性を測定する。本開示は、ヌクレアーゼ阻害因子を特定するために、代替的に、ヌクレアーゼ活性化因子を特定するために、化学ライブラリをスクリーニングするための方法を提供する。Ｆｅｎｇらは、様々なヌクレアーゼの活性を測定するための分子ビーコンの使用およびＦＲＥＴ系アッセイの使用についてを記載した（Ｆｅｎｇ，Ｄｕａｎ，Ｌｉｕ（２００９）ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８：５３１６−５３２１）。Ｆｅｎｇらは、様々な制限酵素の活性を測定するためのＦＲＥＴ系アッセイの使用を示した。
【０３６４】
（ＸＩ）ビーズ結合化合物を放出する
切断可能なリンカー。提供されるのは、切断できないリンカーである。また、提供されるのは、切断可能なリンカーである（Ｈｏｌｍｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ（（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２３１８−２３１９、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：７８５１−７８５２、およびＹｏｏ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３３５８−３３６４を参照されたく、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．７４：８３５−８５１により引用される）。切断可能なリンカーには、アルカリ加水分解に存在するアシルスルホンアミドリンカー、ならびに穏やかな条件下で切断される活性化Ｎ−アルキル誘導体、およびアリール−シリコン結合に基づくトレースレスリンカー、およびシリルエーテル連結に基づくトレースレスリンカーも含まれる（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．７４：８３５−８５１の８３９および８４２ページき記載される）。さらに、提供されるのは、切断時にＣ末端アルデヒドを生成する酒石酸に基づくリンカーであり、切断は、過ヨウ素酸酸化によるものであるＰａｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．８：４１７−４２６を参照されたい）。
【０３６５】
図３は、本開示の組成物および方法に好適な様々な切断可能なリンカーを開示する。図３は、Ｙｉｎｌｉａｎｇ  Ｙａｎｇ（２０１４）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓの表１から複製される。Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍｕｎｃｈｅｎ  Ｌｅｈｒｓｔｕｈｌ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｅ。図３から、本開示に好ましい切断可能なリンカーは、ａ、ｃ、ｄ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｔのリンカーである。リンカーｐが、本明細書に開示される実験結果で使用された。これらの切断条件は、ＤＴＴ（リンカーａ）、Ｎａ２ＳＯ４（リンカーｃ）、Ｎａ２ＳＯ４（リンカーｄ）、ＵＶ光（リンカーｐ）、ＵＶ光（リンカーｑ）、ＵＶ光（リンカーｒ）、およびＴＥＶプロテアーゼ（リンカーｔ）である。これらの特定の切断条件は穏やかであり、ビーズを損傷したり、ビーズ結合化合物を損傷したり、ビーズ結合化合物の化学ライブラリメンバー（単位）を損傷したりすることはない。
【０３６６】
クリックケミストリーと互換性のある化学的に切断可能なリンカー。Ｑｉａｎら（２０１３）は、クリックケミストリーと互換性のある多くの切断可能なリンカーについて記載する（Ｑｉａｎ，Ｍａｒｔｅｌｌ，Ｐａｃｅ（２０１３）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．１４：１４１０−１４１４）。これらには、アゾ結合を有するリンカーが含まれ、アゾ結合は、亜ジチオン酸塩で切断可能である。このリンカーの構造は以下のとおりである：Ｒ１−ベンゼン１−Ｎ＝Ｎ−ベンゼン２−Ｒ２。第１のベンゼン環は、Ｒ１に対してパラの水酸基を有し、第２のベンゼン環は、Ｒ２に連結するカルボニル基を有し、このカルボニル基は、アゾ部分に対してパラである。
【０３６７】
光切断可能なリンカー本開示は、ｏ−ニトロベンジル基を有する光切断可能なリンカーを包含する。この基は、３３０〜３７０ｎｍでの照射により切断できる（Ｓａｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ（２００７）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１８：２７５−２７９、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｇｒｉｅｒ，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ（２０１８）ＡＣＳ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＤＯＩ：１０．１０２１を参照されたい）。ｏ−ニトロベンジルリンカーよりも光分解時間が短いリンカーは、２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）リンカーである。ｏ−ニトロベンジルリンカーのバリエーションは、ｏ−ニトロベンジルアミノリンカーである。ペプチド鎖に付着し、その後切断されると、このリンカーはアミドを放出する。ｏ−ニトロベラトリル基を有するリンカーが利用可能であり、これらは非置換ｏ−ニトロベンジルリンカーよりも短い光分解時間、およびより大きな放出収率を有する。フェナシルリンカー、ベンゾインリンカー、およびピバロイルリンカーも利用可能である（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）ＡＣＳ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＤＯＩ：１０．１０２１を参照されたい）。
【０３６８】
光切断可能なエーテル結合を有するリンカーが利用可能である。この光切断可能なリンカーは、リンカーがビーズに付着されており、切断可能な基が「Ｒ基」である場合に使用でき、切断後、解放された基は、ＲＯＨの形態をとる（Ｇｌａｔｔｈａｒ  ａｎｄ  Ｇｉｅｓｅ（２０００）Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２：２３１５−２３１７を参照されたい）。光切断可能なエステル結合を有するリンカーも利用可能である（Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９７５）９７：１５７５、Ｒｅｎｉｌ  ａｎｄ  Ｐｉｌｌａｉ（１９９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３５：３８０９−３８１２、Ｈｏｌｍｅｓ（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：２３７０−２３８０を参照されたく、Ｇｌａｔｔｈａｒ  ａｎｄ  Ｇｉｅｓｅ、前述によって引用される）。リンカーのエーテル結合は、酸、塩基、酸化、還元、およびフッ化物感受性シリル−酸素結合、および光分解によって切断できる（Ｇｌａｔｔｈａｒ  ａｎｄ  Ｇｉｅｓｅ、前述）。
【０３６９】
ペプチド（Ｒ１）および核酸（Ｒ２）を連結するために使用されている別の光切断可能なリンカーは、以下のとおりである。Ｒ１は、ベンジル基のメチレン部分に直接的に接続される。メチレン基に対するパラは、環が付着したニトロ基である。メチレン部分に対するメタは、環が付着したエチル基である。エチル基の１炭素は、リン酸を有する。このリン酸の酸素原子にＲ２基が付着される（Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：４６２６−４６３１）。
【０３７０】
Ａｋｅｒｂｌｏｍらは、アミノ、ヒドロキシル、ブロモ、およびメチルアミノ基、ならびに４−ニトロフェノキシカルボニル活性化ヒドロキシルおよびアミノ基を含む、アルファ−メチル２−ニトロベンジルタイプの光不安定性リンカーを開示する（Ａｋｅｒｂｌｏｍ  ａｎｄ  Ｎｙｒｅｎ（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．３：１３７−１４８を参照されたい）。カテプシンＢは、標的配列である「バリン−シトルリン」を有するリンカーを切断できる（Ｄａｌ  Ｃｏｒｓｏ，Ｃａｚｚａｍａｌｌｉ，Ｎｅｒｉ（２０１７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８：１８２６−１８３３）。
【０３７１】
酵素切断可能なリンカー。プロテアーゼなどの酵素によって切断可能なリンカーが利用可能である（Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ｗａｇｎｅｒ（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍ．２０：５７１−５８２を参照されたい）。ヒドロキシメチルフェノキシリンカーは、キモトリプシンで切断することができる（Ｍａｌｔｍａｎ，Ｂｅｊｕｇａｍ，Ｆｌｉｔｓｃｈ（２００５）Ｏｒｇａｎｉｃ  ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈｅｍ．３：２５０５−２５０７）。タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断可能なリンカーが利用可能である（Ｗｅｅｒａｐａｎａ，Ｓｐｅｅｒｓ，Ｃｒａｖａｔｔ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２：１４１４−１４２５、Ｄｉｅｔｅｒｉｃｈ，Ｌｉｎｋ，Ｇｒａｕｍａｎｎ（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：９４８２−９４８７を参照されたい）。ＬＶＰＲＧおよびＬＶＰＲＧＳのリンカー配列は、トロンビンによって切断できる（Ｊｅｎｎｙ，Ｍａｎｎ，Ｌｕｎｄｂｌａｄ（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．３１：１−１１）。プラスミン切断可能なリンカーが利用可能である（Ｄｅｖｙ，Ｂｌａｃｈｅｒ，Ｎｏｅｌ（２００４）ＦＡＳＥＢＪ．１８：５６５−５６７）。
【０３７２】
ビーズ結合放出モニター。本開示は、ビーズ結合化合物の放出を評価することが可能な新規かつ固有の放出モニターを提供する。放出モニターは、フルオロフォアおよびクエンチャのビーズ結合複合体の形態をとり、フルオロフォアは、切断可能なリンカーを介してビーズに接続される。好ましくは、切断可能なリンカーは、光切断可能なリンカーである。好ましくは、ビーズ結合放出モニターは、専用のピコウェル内に配置され、そのピコウェルは、他の種類のビーズを含まない。光切断可能なリンカーが切断されると、フルオロフォアはビーズから放出され、ピコウェル内の媒体に拡散し、ビーズ結合クエンチャからある程度の距離を達成し、その結果、放出量に比例する蛍光が増強する。蛍光の増強により、ピコウェル内にある遊離フルオロフォアの濃度の計算が可能になり、さらに重要なことに、他のウェル内にある他のビーズから放出される化合物の量の計算が可能になる。
【０３７３】
要約すると、ビーズ結合放出モニターは、それ独自の専用のウェル内に位置し、他のウェルは、薬物候補であるビーズ結合化合物を含む。
【０３７４】
図８は、ビーズ結合放出モニターの好ましい非限定的な例の簡易化されたバージョンを開示する。放出モニターは、フルオロフォアの近くに保持されるクエンチャの形態をとり、フルオロフォアのクエンチングをもたらす。実施形態において、クエンチングは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９５％などである。ピコウェルにおいて、１つのビーズは、放出モニター専用であり、もう１つのビーズまたは複数のビーズは、化合物を付着することおよびＤＮＡライブラリを付着することに使用される。ピコウェル内のすべてのビーズをＵＶ光に曝露すると、フルオロフォアおよび化合物が同時に切断される。ＱＳＹ７は、好ましいクエンチャである。ＱＳＹ７の構造およびＣＡＳ番号は、以下のとおりである（下記を参照されたい）：
【０３７５】
ＣＡＳ名／番号：キサンチリウム，９−［２−［［４−［［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］カルボニル］−１−ピペリジニル］スルホニル］フェニル］−３，６−ビス（メチルフェニルアミノ）−，塩化物３０４０１４−１２−８
【０３７６】
クエンチャからのフルオロフォアの分離に起因する蛍光の増加を使用して、同時に放出される化合物のピコウェル内の濃度を推測することができる。また、クエンチャからのフルオロフォアの分離に起因する蛍光の増加を使用して、ピコウェル内に遊離形態で存在する分子（以前はビーズ結合化合物であった化合物の形態をとる分子）の数を推測できる。より好ましい実施形態において、放出モニターは、クエンチャおよびフルオロフォアを含み、切断は、フルオロフォアの放出を生じる（クエンチャの放出はない）。この実施形態は、以下のあまり好ましくない実施形態よりも低いバックグラウンドノイズを提供する。あまり好ましくない実施形態では、切断によりクエンチャが放出され、読み出しは、ビーズ結合フルオロフォアからの蛍光の増強の形態をとる。
【０３７７】
放出モニターは、ユーザーに可溶性化合物の濃度の測定値、続いてビーズからの化合物のＵＶ誘発放出を提供する。好ましい実施形態では、一形式のビーズは、放出モニターであること専用である。「専用」とは、このビーズがビーズ結合化合物も含まず、ビーズ結合ＤＮＡライブラリも含まないことを意味する。
【０３７８】
一般的な命題として、化合物が感光性リンカーの切断によってビーズから放出されたからといって、その化合物が可溶性化合物になっていると推測されるべきではない。まず、化合物が「疎水性」または「水不溶性」と見なされるからといって、分子が溶媒中で自由に移動しないという意味ではないことに注意されたい。例えば、コレステロールでさえ、水への溶解度は測定可能である（Ｓａａｄ  ａｎｄ  Ｈｉｇｕｃｈｉ（１９６５）Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．５４：１２０５−１２０６を参照されたい）。さらに、ビーズ結合水不溶性化合物の生化学的有効性は、界面活性剤、洗浄剤、ＤＭＳＯなどの添加剤、またはヒト血清アルブミンなどの担体によって増加させることができる。したがって、放出モニターを使用して、ピコウェルに上記の薬剤の１つが含まれる条件下で、水溶性が制限されるか、もしくは水溶性でない化合物の全体的な濃度を評価でき、または代替的に、水不溶性化合物は、ピコウェルの内部で培養される生細胞の原形質膜の近くに放出される。
【０３７９】
図９は、ビーズ結合放出モニターの好ましい実施形態の簡略的なバージョンを開示し、図１０は、ビーズ結合放出モニターのこの好ましい実施形態の完全かつ詳細な構造を開示する。
【０３８０】
図３０は、ビーズ放出モニターの使用を示すデータを提供し、ビーズは、ピコウェル内にある。光切断可能なリンカーを使用して結合されるビーズ結合フルオロフォアは、ＴＡＭＲＡ（励起波長５３０  ｎｍ、発光波長５７０  ｎｍ）である。図は、ビーズからのフルオロフォアの放出の時間経過を示す。これは、ビーズ結合放出モニターの作動、ｔ＝０秒、ｔ＝１秒、ｔ＝１１秒、ｔ＝７１秒での蛍光データの取得を示す。図３０はまた、４つの小さい図のうちの２つについて、小さい図の拡大を示す差し込み図を含む。図３０は、アスパルチルプロテアーゼであるカテプシン−Ｄと「ペプチドＱ−フルオロ基質」およびビーズとのインキュベーションから得られた。試薬を４度でウェル内に配置した。３６５ｎｍの紫外光を使用して、フルオロフォアをビーズから切断し、それによりフルオロフォアを放出し、それをクエンチャから分離した。このアッセイの目的は、別のウェルで行われた放出の時間経過を評価することであり、別のウェルは、異なる種類のビーズを含む。異なる種類のビーズは、同じ光切断可能なリンカーを有していたが、この光切断可能なリンカーは、ペプスタチン−Ａに付着していた。ペプスタチン−Ａの放出は、同じアッセイ培地内にあるアスパルチルプロテアーゼと結合して阻害することができる。ビーズ結合ペプスタチン−Ａおよびアスパルチルプロテアーゼを用いたこの設定は、陽性対照として機能する。
【０３８１】
ＵＶは、２０倍の対物レンズを通して曝露された。画像は、Ｇａｉｎ＝５で取得され、曝露は、４００ｍｓであった。ＴＡＭＲＡで、５３０ｎｍで励起する。ＴＡＭＲＡは、５７０ｎｍで発光する。
【０３８２】
図３５は、酵素アッセイに関するさらなる詳細を開示し、ビーズ結合ペプスタチン−Ａは放出され、放出されたペプスタチン−Ａは、酵素阻害をもたらす。光切断可能なペプスタチン−Ａ（陽性対照）および共有結合Ｃｙ５ラベルを表示する１０μｍのＴｅｎｔａＧｅｌビーズを、ＰＢＳＴバッファーで光切断可能なＦｍｏｃ−バリン（陰性対照）を表示する１０μｍのＴｅｎｔａＧｅｌビーズと混合した。このビーズ集団はピコウェルに導入され、その後、バッファーがカテプシンＤプロテアーゼおよびペプチドＱ−蛍光基質（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５２５  ｎｍ）を含むプロテアーゼ阻害アッセイに交換された。ウェルを空気でカプセル化し、スライド全体をＵＶ（３６５ｎｍ、７７Ｊ／ｃｍ２）に曝露し、光不安定性リンカーを切断し、化合物を放出して約１３μＭに到達させた。フローセルを、インキュベートした（３０分、３７℃）。陽性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン−Ｄによるペプチドタンパク質分解を阻害すべきであり、蛍光シグナルが低くなる。陰性対照ビーズを含むウェルは、いかなるカテプシン−Ｄ阻害も示すべきではなく、蛍光強度が空のウェルと同様であるべきである。
【０３８３】
クエンチャおよびフルオロフォアの用語は、所定の化学物質について、すぐ近傍で発生する他の化学物質に応じて変化できる。ビーズ結合型放出モニターの実験室データで使用されるＴＡＭＲＡは、フルオロフォアであるが、他の状況下では、ＴＡＭＲＡは、クエンチャであり得る。ＴＡＭＲＡは、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡを含むＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのクエンチャとして機能する。
【０３８４】
実験の設定および実験室データの追加説明。本開示は、空気で区分された充填済みピコウェル内のリン酸バッファー（１０ｍＭリン酸、１５４ｍＭナトリウム、ｐＨ８．０）中の制御された５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）濃度に関するデータを提供する。捕捉された蛍光画像（１０ｍｓ、２  ｍｓの曝露）および平均ピクセル強度（ｎ≧１００）によって定量化されたウェル領域は、濃度対蛍光強度の検量線を生成する。上記のデータは、標準曲線の形態をとり、遊離ＴＡＭＲＡの様々な所定の濃度（２、１０、３０、６０、１００ｍＭのＴＡＭＲＡ）での蛍光を示す。この標準曲線は、２つの異なる条件下で調整され、すなわち、写真画像は、２ミリ秒の曝露または１０ミリ秒の曝露で撮影された。標準曲線を調整するのに使用した実験は、ピコウェル内で行われたが、この実験においていかなるビーズも使用していない（既知の量のＴＡＭＲＡ）。データは単に、検量線とも称され得る標準曲線の形態をとるため、写真画像は、この特許文書には示されていない。
【０３８５】
実験の設定は、以下を含む。スキームＸ）の場合、ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｌｙｓ（ＰＣＬ１−Ｔａｍｒａ）−ＱＳＹ７ビーズ構造。ＱＳＹ７（灰）は、Ｔａｍｒａフルオロフォア（オレンジ）をクエンチするが、光切断可能なリンカー（紫）を介してビーズに共有結合的に付着する。ＵＶ（３６５ｎｍ）からの照射により、本来の場所で化合物の定量的な放出を提供する。
【０３８６】
図３１は、クエンチャ−フルオロフォア基質に対するアスパルチルプロテアーゼの触媒作用後の発光データを開示する。より高い蛍光は、酵素がより触媒的に活性であることを意味する。蛍光が低いことは、酵素が、触媒的に活性が低いことを意味し、すなわち、酵素は、遊離阻害剤によってより阻害され、阻害剤は、ビーズから遊離し、遊離は、光切断可能なリンカーの切断によって得られる。画像は、ＵＶ放出およびカテプシン−Ｄアッセイのインキュベーション後に捕捉した（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５２５ｎｍ）。陽性対照ビーズを含むウェルは、Ｃｙ５フルオロフォアによってスペクトル的に特定できる（λｅｘ＝６４５ｎｍ、λｅｍ＝６６５ｎｍ、オレンジの偽色）。切片を、開口ウェル容積にわたるラインプロットで分析し、陰性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン−Ｄ阻害を誘発しない。陽性対照ビーズを含むウェル内のアッセイ容積は暗く、強い阻害を示す。空のウェル内のアッセイ容積は、陰性対照ビーズを含むウェルに匹敵する。
【０３８７】
図３２は、以下の手順を示す。さらにスキームＸ）に関しては、ピコウェル基質（１ウェルあたり４６ｐＬ）をフローセルに封入し、ウェルを真空下で湿らせ、ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｌｙｓ（ＰＣＬ１−ＴＡＭＲＡ）−ＱＳＹ７ビーズの懸濁液を導入し、フローセルにわたって空気を引き込み、各ウェルを区画化する（上）。放出された化合物（ＴＡＭＲＡ）濃度（下）を定量化するために蛍光顕微鏡画像を撮影する前に、フローセルを、制御された光束でＵＶ  ＬＥＤ（λ平均値３６５ｎｍ）によって照射し、平衡化する（２０分）（図３２）。詳細には、図３２は、ピコウェルの断面図を示し、フローセル内でピコウェルが湿潤するステップ、懸濁液中のビーズがピコウェルを覆って導入され、ピコウェルごとに１つのビーズをもたらすステップ、過剰な分散液を減らし、メニスカスがピコウェルプレートの平らな上面の表面の下に落ちるようにするために、フローセル全体に空気を引き込むステップ、制御されたＵＶ曝露（３６５  ｎｍ）、一部のＴＡＭＲＡの放出をもたらすステップ、蛍光顕微鏡で蛍光シグナルを検出してＴＡＭＲＡからの発光を誘発するステップ（５３１／４０  ｎｍで励起）（５９４／４０  ｎｍで発光）を示す。「スラッシュ４０」という表記は帯域幅を指し、すなわち、これは、カットオフフィルターが５３１ｎｍプラス２０ｎｍおよびマイナス２０ｎｍの範囲、ならびに５９４ｎｍ、プラス２０ｎｍおよびマイナス２０ｎｍの範囲に光を制限したことを意味する（このスラッシュ表記は、励起波長および発光波長にも使用できる）。
【０３８８】
本発明者らは、以下のデータを示す写真を取得した（図３３を参照されたい）。フルオロフォア（ＴＡＭＲＡ）の蛍光発光（λｅｘ５３１／４０ｎｍ、λｅｍ５９３／４０）は、ピコウェルフローセル内でＵＶ  ＬＥＤ（３６５ｎｍ）に曝露した後、１０μｍのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｌｙｓ（ＰＣＬ１−ＴＡＭＲＡ）−ＱＳＹ７ビーズから放出された。Ａ）ＱＳＹ７のＦＲＥＴクエンチング効果により、ＵＶ曝露前（０Ｊ／ｃｍ２）のバックグラウンドを上回る有意な発光はない。ＴＡＭＲＡ放出は、（Ｂ）２５Ｊ／ｃｍ２、（Ｃ）２５７Ｊ／ｃｍ２、（Ｄ）４８９Ｊ／ｃｍ２、（Ｅ）７２１Ｊ／ｃｍ２、（Ｆ）９５３Ｊ／ｃｍ２のＵＶ曝露に続いて平衡（２０分）に達することができ、次に、適切な曝露時間を使用して画像化した。ＴＡＭＲＡ濃度を測定するために、各ビーズを囲う容積内で蛍光発光を測定した（図３３）。「スラッシュ４０」という表記は帯域幅を指し、すなわち、これは、カットオフフィルターが５３１ｎｍプラス２０ｎｍおよびマイナス２０ｎｍの範囲に光を制限したことを意味する（このスラッシュ表記は、励起波長および発光波長にも使用できる）。
【０３８９】
以下は、本発明者らによる、ビーズ結合放出モニターのＵＶ曝露（３６５  ｎｍ）後のピコウェル（４５ｐＬ）内のビーズ放出ＴＡＭＲＡの濃度試験および使用からの蛍光データのいくつかの解釈である（図３４を参照されたい）。使用した画像解析は、ビーズ充填ウェル（ｎ≧１４）を囲う溶液の平均ピクセル強度であり、画像の曝露時間に対して正規化され、ピコウェル内の既知のＴＡＭＲＡ濃度の標準曲線と相関した。エラーバーは、ＲＳＤ％から計算された１σを表す。ＵＶ放出化合物濃度は、１．１μＭ（８．９のＲＳＤ％）、５４．３μＭ（５．２のＲＳＤ％）、１４２μＭ（４．２のＲＳＤ％）、１７４μＭ（７．７のＲＳＤ％）、１９７．３μＭ（１０．１のＲＳＤ％）であった（図３４）。
【０３９０】
（ＸＩＩ）化合物の生化学的アッセイ（細胞系ではないアッセイ）
ピコウェル内のビーズを使用して、様々な生化学的アッセイが可能である。非限定的な例には、結合アッセイ、酵素アッセイ、触媒アッセイ、蛍光系アッセイ、発光系アッセイ、散乱系アッセイなどが含まれる。以下に例を示す。
【０３９１】
プロテアーゼおよびペプチダーゼの阻害剤に感受性である生化学的アッセイ。目的は、プロテアーゼを阻害する薬物を検出および開発すること、特定のプロテアーゼまたはペプチダーゼの混合物、好適な切断可能な基質を使用することができるアッセイ、および候補薬物化合物による阻害の程度に感受性な色系アッセイまたは蛍光系アッセイをスクリーニングすることである。例えば、１つの試薬は、ビーズ結合化合物であることができ、化合物は、活性についてまだ試験されていない。別の試薬は、ビーズ結合ペプスタチン（ＨＩＶ−１プロテアーゼの確立された阻害剤）の形態をとることができる（Ｈｉｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．５：ｅ１０９４０（７ページ））。さらに別の試薬は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの切断可能な基質であり得、ＨＩＶ−１プロテアーゼによる切断は、色の変化または蛍光の変化が生じる。特定のアッセイ（所定のマイクロウェルにおいて）で色の違い（または蛍光の違い）が生じる陽性クリーニング薬物候補が特定される。切断可能な基質は、クエンチャおよび蛍光剤に共有結合的に結合して隣接する感受性ペプチドの形態をとる。切断前は、クエンチャが近くにあるため、フルオロフォアは蛍光を発しないが、切断後、蛍光が生じる（Ｌｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．１２：ｅ０１７３９１９（１１ページ）、Ｅｋｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４８：５７５３−５７５９、Ｃａｒｍｏｎａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１：１９７１−１９７６を参照されたい）。本開示の試薬および方法は、上記に開示された技術を包含する。
【０３９２】
ユビキチンリガーゼを阻害する化合物の酵素系スクリーニングアッセイは、試薬が、ＭＤＭ２（酵素）およびｐ５３（基質）を含む。出願人は、以下の技術に基づいて実用試験を実施した。ＭＤＭ２は、細胞内のｐ５３の量を制御する。ＭＤＭ２は、いくつかのがんで過剰発現される。ＭＤＭ２は酵素であり、「生体内研究は、精製されたＭＤＭ２が示されており、ｐ５３のユビキチン化に十分である」（Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０：１２９４１−１２９５０）。出願人の目的は、ＭＤＭ２の阻害剤を発見することであり、これらの阻害剤は、ｐ５３のユビキチン化を低減し、それによりその後のｐ５３の分解を低減することが予想される。細胞におけるｐ５３の予想される増加を考慮すると、上記の特性を有する阻害剤は、がんの治療に有用であると予想される。
【０３９３】
出願人らは、ＭＤＭ２／ＨＤＭ２によって媒介されるｐ５３のユビキチン化に対するレナリドマイドの影響を評価するために、以下の酵素系アッセイを使用した。出願人は、以下のキットからの試薬を使用した：ＭＤＭ２／ＨＤＭ２ユビキチンリガーゼキット−ｐ５３基質（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。アッセイで使用した試薬の１つは、共有結合的に結合した抗体を含むビーズであった。ビーズは、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｍ  ＮＨ２（カタログ番号Ｍ３０１０２，Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であり、抗体は、マウスで生合成された抗ヒトｐ５３モノクローナル抗体であった。ＭＤＭ２は、ｐ５３を基質として使用できるＥ３リガーゼであり、ＭＤＭ２は、ｐ５３のユビキチン化を触媒する。
【０３９４】
がんを低減するためにｐ５３を活性化する目的。ＭＤＭ２、「ｐ５３」と称される転写因子、および抗がん療法の関係が、以下の記載により提案される。記載は、「ＭＤＭ２は、ｐ５３をユビキチン化するＥ３ユビキチンリガーゼであり、プロテアソーム分解の標的とする」である（Ｏｒｔｉｚ，Ｌｏｚａｎｏ（２０１８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３７：３３２−３４０）。ｐ５３は、腫瘍抑制活性を有する。ｐ５３活性は、ＭＤＭ２により阻害さる。Ｗｕらによれば、ＭＤＭ２は、「ｐ５３結合タンパク質」である（Ｗｕ，Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｃｈｅｒｎｏｖ（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ．６：ｅ  ２０３５を参照されたい）。例えば、ＭＤＭ２およびｐ５３の間の相互作用を遮断することにより、化合物がｐ５３のユビキチン化を妨げ、化合物は、抗がん剤として機能することが予測される。
【０３９５】
スクリーニングアッセイの目的。スクリーニングアッセイの目的は、ｐ５３のユビキチン化に影響を与える化合物、例えば、ｐ５３のユビキチン化を刺激する化合物およびｐ５３のユビキチン化を阻害する化合物を発見することである。詳細には、目的は、阻害または活性化する化合物を発見することであり、それらの効果は、ＭＤＭ−２、およびＥ１リガーゼ、Ｅ２リガーゼ、またはＥ３リガーゼのいずれかを介する。ＭＤＭ２は、「マウス二重微小染色体」を意味する。ＭＤＭ２は、「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」と称されている。ＭＤＭ２が細胞内で生じる場合、証拠により、ｐ５３のユビキチン化を触媒する活性には、ＣＵＬ４Ａ、ＤＤＢ１、ＲｏＣ１などの多くの他のタンパク質が必要であることを示唆する（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｖｒｉｌｏｖａ（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．５：１７１９−１７２９、Ｎａｇ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：８１５２−８１５５を参照されたい）。Ｂａｎｋｓらは、ｐ５３およびＭＤＭ２を伴う物理的相互作用を記載しており、「Ｌ２ＤＴＬ、ＰＣＮＡ、およびＤＤＢ１／ＣＵＬ４Ａ複合体が、ｐ５３腫瘍抑制因子およびその制御因子ＭＤＭ２／ＨＤＭ２と物理的に相互作用することを見出した」（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｖｒｉｌｏｖａ（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．５：１７１９−１７２９）。Ｎａｇらは、ｐ５３およびＭＤＭ２を伴う物理的相互作用をさらに記載しており、「Ｃｕｌ４Ａは、Ｅ３リガーゼとして機能し、ユビキチン−プロテアソーム経路を介していくつかの制御性タンパク質のタンパク質分解に関与する。ここでは、Ｃｕｌ４Ａが、ＭＤＭ２およびｐ５３と関連することを示す」（Ｎａｇ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：８１５２−８１５５）。
【０３９６】
ｐ５３ユビキチン化の修飾因子のビーズ系アッセイからの所望される読み出し。化合物をスクリーニングして、陽性スクリーニングヒットが生じた場合、すなわち、ＡＦ４８８蛍光が多く生じた場合、これは活性剤が発見されたことを意味する。化合物をスクリーニングして、陽性クリーニングヒットが生じた場合、蛍光が減少する場合、これは阻害剤が発見されたことを意味する。ｐ５３のユビキチン化を阻害する化合物は、化合物が、がんの治療に使用できることを示唆する。また、化合物は、ｐ５３のユビキチン化を特異的に阻害し、すなわち、化合物は、他のタンパク質のユビキチン化を阻害しない、または化合物は、他のタンパク質のユビキチン化を阻害するが、ｐ５３よりも重度ではなく、さらに、化合物が、がんを治療するのに使用できることも示唆する。
【０３９７】
材料。材料には、Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏｃｈｅｍからのＥ３リガーゼキットＫ−２００Ｂが含まれる。Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍカタログは、Ｍｄｍ２／ＨＤＭ２ユビキチンリガーゼキット−ｐ５３基質のようなキットを記載する。以下は、このキットの一部であるＭｄｍ２に関するものである。このキットには、セレブロンは含まれない。レナリドマイドおよび類似の化合物は、セレブロンまたはＭｄｍ２のいずれかと結合でき、最終結果は、ユビキチンリガーゼの活性化である。材料は、Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｇｌａｓｓ顕微鏡スライド、２５ｍｍｘ７５ｍｍ（Ｇｌｏｂｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）をさらに含む。Ｃｏｒｎｉｎｇ撹拌機／ホットプレート（０〜１０の設定）６９８ワット、モデルＰＣ−４２０。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）。メチルテトラジン（ｍＴＥＴ）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＴｅｎｔａＧｅｌビーズＭ  ＮＨ２（カタログ番号Ｍ３０１０２）（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ）。パラフィルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。図８は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の構造を示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）の構造は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−Ｎａｎｏｇｏｌｄ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）の製品情報に示される。
【０３９８】
（ＸＩＩＩ）化合物についての細胞系アッセイ
ピコウェル内で行われる細胞系アッセイは、ヒト細胞、非ヒト細胞、ヒトがん細胞、非ヒトがん細胞、細菌細胞、マラリア原虫細胞などの寄生虫の細胞を使用することができる。また、細胞系アッセイは、「殺傷されたが代謝的に活性な」ヒト細胞または非ヒト細胞を用いて行うことができ、すなわち、それらのゲノムは、代謝を可能にするが細胞分裂を防ぐために架橋されている（Ｄｕｂｅｎｓｋｙの米国特許公開番号第２００７／０２０７１７０号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、細胞系アッセイは、アポトーシス性の細胞、ネクローシス性の細胞、または死細胞で行うことができる。細菌細胞を用いた細胞系アッセイは、抗生物質のスクリーニングに使用できる。ウイルスに感染したヒト細胞は、抗ウイルス剤のスクリーニングに使用できる。細胞の組み合わせは、細胞系アッセイについて提供される。例えば、樹状細胞およびＴ細胞の組み合わせは、抗原提示を刺激するか、または代替的に、抗原提示を損なう化合物をスクリーニングおよび同定するために提供される。
【０３９９】
細胞系アッセイは、例えば、正常組織の生検、固形腫瘍、または血液がんからの生検、または循環固形腫瘍細胞から得られる細胞の初代培養に基づくことができる。また、細胞系アッセイは、１回以上継代されている細胞に基づくことができる。
【０４００】
ピコウェル内で行われる細胞系アッセイは、１つの細胞のみを含む、または２つの細胞、３つの細胞、４つの細胞、５つの細胞、または約２つの細胞、約３つの細胞、約４つの細胞、約５つの細胞、または複数の細胞、または３つ未満の細胞、４つ未満の細胞、５つ未満の細胞などを含む培養を使用できる。
【０４０１】
出願人は、以下の技術に基づいて実用試験を実施した。これは、レナリドマイド（試験化合物）が転写因子のユビキチン媒介性タンパク質分解を阻害する例示的な実施形態の化合物をスクリーニングするための細胞系アッセイを記載する。転写因子は、イカロスおよびアイオロスを含む。
【０４０２】
本開示は、ビーズ結合化合物上の化合物をスクリーニングする細胞系アッセイを提供し、スクリーニングは、多くのピコウェルを有するプレートで行われる。細胞系アッセイの構成要素は、ビーズ結合化学ライブラリを保持するためのピコウェルを含み、各ビーズは、実質的に１つのみの均一な種類の化合物が付着している。化合物は、切断可能なリンカーを介して放出される。哺乳動物細胞は、ピコウェル内で培養される。ピコウェルは、培養培地をさらに含む。現在開示されているレナリドマイドの非限定的な例は、所定の標的タンパク質のユビキチン化を制御する他の化合物を発見するための化学ライブラリをスクリーニングするために使用できる原理証明の例である。
【０４０３】
細胞系アッセイの短い記載。組換え細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のタンパク質分解を誘発する化合物を検出およびスクリーニングするための試薬として使用され、陽性スクリーニング化合物を特定する読み出しは、緑色の細胞が無色の細胞になるか、または緑色が低下した細胞になる状況である。この細胞系アッセイのメカニズムに関して、緑色の細胞が無色の細胞になるか、または緑色が低下した細胞が生じるレナリドマイドの作用メカニズムは、レナリドマイドが「セレブロン」と称されるタンパク質と結合することである。細胞内では、セレブロンは、「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」と称されるタンパク質の複合体の一部である。セレブロンは、レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドの抗がん剤の直接的な標的である。Ｅ３ユビキチンリガーゼの通常の構成的活性、およびセレブロンとのその関係は、「セレブロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼを結合することにより、［標的タンパク質の］プロテオソーム分解を促進する」と記載されている（Ａｋｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：６１８７−６２００を参照されたい）。Ｅ３ユビキチンリガーゼの通常の活性とは対照的に、レナリドマイド、サリドマイド、またはポマリドマイドなどの薬剤を追加した場合、その結果、「レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化および分解を促進（複数可）し、これらの薬剤の各々は、転写因子ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の分解を誘発する」（Ｋｒｏｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ．５２３：１８３−１８８）。
【０４０４】
用語に関して、セレブロンは、「Ｅ３リガーゼ」と称され、また「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」とも称されるタンパク質の複合体の一部であると記載されている。一般に、セレブロン自体は、「Ｅ３リガーゼとは称されない。次の抜粋は、「セレブロン」という単語の使用方法を示す。Ａｋｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：６１８７−６２００によると、「サリドマイドがＥ３リガーゼ基質受容体セレブロンと結合すると、ＤＤＢ１−ＣＵＬ４Ａ−Ｒｏｃ１−ＲＢＸ１  Ｅ３ユビキチンリガーゼが関与することにより、［基質の］プロテオソーム破壊が促進される。」一貫して、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１０１４１−１０１５７は、「セレブロンは、タンパク質［基質］ユビキチン化を媒介するために、ｃｕｌｌｉｎ−４  ＲＩＮＧ  Ｅ３リガーゼの基質受容体として機能する」と開示する。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ．１２４：５３６−５４５では、「サリドマイドはＣＲＢＮ  ［セレブロン］と結合して、ＣＲＢＮ、ＤＤＢ１、およびＣＵＬ４で構成されるＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の機能を変化させる」と述べている。Ｌｏｐｅｚ−Ｇｉｒｏｎａ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２６：２３２６−２３３５では、「研究により、Ｅ３リガーゼタンパク質セレブロン（ＣＲＢＮ）がサリドマイドの直接的な分子標的であることが特定され、ＣＲＢＮおよびＤＤＢ１は、Ｃｕｌ４ＡおよびＲｏｃ１と機能的なＥ３リガーゼ複合体を形成する」と述べている。
【０４０５】
出願人によって考案および使用された細胞系アッセイの全体像を見るには、第１のステップは、レナリドマイドを細胞に追加する。最終的なステップは、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３が機能低下することである。ＩＫＺＦ１が、ＧＦＰとの融合タンパク質として生じる場合、最終的なステップは、融合タンパク質全体が、プロテアソームによって分解されることである。同様に、ＩＫＺＦ３が、ＧＦＰとの融合タンパク質として生じる場合、最終的なステップは、融合タンパク質全体が、プロテアソームによって分解されることである。ＧＦＰ分解の結果、以前は緑色の蛍光を発していた細胞が、蛍光を発しない細胞に転換する。
【０４０６】
細胞系アッセイの長い記載。これは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（タンパク質の複合体）のタンパク質の名称、この複合体と結合するタンパク質の名称、およびこの複合体の標的であるタンパク質の名称に関連する。これらの名称については、公開されている文献は一貫していない。タンパク質をタンパク質の名称で参照することもあれば、タンパク質をコードする遺伝子の名称を使用してタンパク質を参照することもある。このため、以下の報告では、「セレブロン」（タンパク質の名称）および「ＣＲＢＮ」（遺伝子の名称）など、タンパク質名と遺伝子名とを一緒に使用している。また、「イカロス」は、タンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、ＩＫＺＦ１である。また、「アイオロス」はタンパク質の名称であり、ＩＫＺＦ３は、遺伝子の名称である。「Ｃｕｌｌｉｎ−ｒｉｎｇフィンガーリガーゼ−４」は、タンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、ＣＲＬ４である。「ｃｕｌｌｉｎ−１の制御因子」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、ＲＯＣ１である。ＲＯＣ１は、ＲＢＸ１（Ｊｉａ  ａｎｄ  Ｓｕｎ（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ．４：１６．ＤＯＩ：１０．１１８６としても知られている。「Ｃｕｌｌｉｎ−４Ａ」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、ＣＵＬ４Ａである。Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｙｅ，Ｃｈｏｐｒａ（２０１８）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．ＤＯＩ：１０．１１３６、Ｃｈｅｎ，Ｐｅｎｇ，Ｈｕ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．５：１０６６７、Ｍａｔｙｓｋｉｅｌａ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ．５３５：２５２−２５７、Ａｋｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：６１８７−６２００を参照されたい）。
【０４０７】
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ユビキチン残基の標的タンパク質への転移を触媒し、その結果、標的タンパク質は分解のためにプロテアソームに移送される。Ｅ３リガーゼは、標的タンパク質の１つ以上のリジン残基へのユビキチンの結合を触媒する。ヒトは、約６１７の異なるＥ３ユビキチンリガーゼ酵素を発現する（Ｓｈｅａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１５２３−１５３２を参照されたい）。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｃｕｌｌｉｎ−４（ＣＵＬ４ＡまたはＣＵＬ４Ｂ）、Ｃｕｌｌｉｎｓ−１（ＲｏＣ１）の制御因子、およびＲＩＮＧ  Ｂｏｘドメインタンパク質（ＲＢＸ１）のタンパク質の複合体である。上述されるように、ＲｏＣ１は、ＲＢＸ１と同じタンパク質である（Ｊｉａ  ａｎｄ  Ｓｕｎ（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ．４：１６．ＤＯＩ：１０．１１８６を参照されたい）。セレブロン（ＣＲＢＮ）がＥ３ユビキチンリガーゼ複合体に連結されると、生じるより大きな複合体は、ＣＲＬ４ＣＲＢＮと称される（Ｍａｔｙｓｋｉｅｌａ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ．５３５：２５２−２５７）。「ＣＲＬ４」という用語は、「Ｃｕｌｌｉｎ−４  ＲＩＮＧリガーゼ」を意味する（Ｇａｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１６４：２３３−２４４、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：８０３−８０９）。セレブロンの文献を読む際には、上記の命名法の不一致を考慮する必要がある。
【０４０８】
以下は、上記で開示された短い抜粋のより長いバージョンである。以下に示すのは、さらに別の形式の命名法、つまり、「ＣＲＬ４ＣＲＢＮ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ」という用語である。より長い報告は、様々な名称および細胞性事象をより完全に統合する。「セレブロン（ＣＲＢＮ）およびＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の間の関係は、「ＤＤＢ１−ＣＵＬ４Ａ−Ｒｏｃ１−ＲＢＸ１  Ｅ３ユビキチンリガーゼを利用することにより、［標的タンパク質の］プロテオソーム分解を促進する」と記載されている（Ａｋｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：６１８７−６２００）。抗がん剤に関しては、「レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化および分解を促進する。これらの化合物は、ＣＲＢＮと結合し、ＣＲＬ４ＣＲＢＮ  Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質アダプタであり、これらの薬剤の各々は、転写因子ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の分解を誘導する」（Ｋｒｏｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ．５２３：１８３−１８８）。
【０４０９】
これは、任意の所定のマイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルがビーズを含む、細胞系アッセイに関連し、ビーズは、共有結合的に連結された化合物を有し、化合物は、切断可能なリンカーを介して付着され、ウェルは、１つ以上の培養された哺乳動物細胞を含む。本開示の化合物および薬物候補に対する応答は、１つ以上のバイオマーカーによって評価され得る。
【０４１０】
バイオマーカーには、診断バイオマーカー、所定の患者が所定の薬物に対して応答する（より良くなる）かを予測するバイオマーカー、および所定の患者が所定の薬物に対して許容できない毒性を経験するかを予測するバイオマーカーが含まれる（Ｂｒｏｄｙ，Ｔ．（２０１６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ：Ｓｔｕｄｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ  ＦＤＡ  ａｎｄ  ＩＣＨ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。本開示は、さらに別の種類のバイオマーカー、つまり、薬物療法が開始されている後に、所定の薬物に対する患者の応答をモニタリングするバイオマーカーを使用する。一例を挙げると、以下は、バイオマーカー「ペルオキシレドキシン６（ＰＲＤＸ６）」および肺癌に関するものである。Ｈｕｇｈｅｓらによると、「細胞株からの細胞培地のＰＲＤＸ６レベルは、ゲフィチニブ治療対ビヒクルＰＲＤＸ６の経時的な蓄積後に増加し、ゲフィチニブ感受性と正の相関があった。血清ＰＲＤＸ６レベルは、ゲフィチニブ療法の過程で血清ＰＲＤＸ６の療法変更の最初の２４時間に著しく増加し、抗ＥＧＦＲ剤に対する応答をモニタリングするための画像化系戦略よりも優れている。」バイオマーカーは、応答の有効性のより直接的な測定、つまり、腫瘍サイズおよび数の低減を検出するための「画像化」の使用よりも優れていることに注意されたい（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．２２：３３３−３４４）。抗がん剤に対する応答をモニタリングする他のバイオマーカーには、卵巣癌のプラチン療法に対する応答をモニタリングするためのＣＡ１２５、および卵巣癌の化学療法に対する応答をモニタリングするための血清ＨＳＰＢ１が含まれる（Ｒｏｈｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３６：１０１５−１０２２、Ｓｔｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３６：３３２１−３３２７を参照されたい）。
【０４１１】
サイトカイン発現。応答は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファなどの発現されるサイトカインを測定することにより評価できる。これらの特定のサイトカインは、これらのサイトカインの１つを特異的に認識する抗体を有する金ナノ構造を使用して同時に測定でき、検出は、プラズモン共鳴を伴う（Ｓｐａｃｋｏｖａ，Ｗｒｏｂｅｌ，Ｈｏｍｏｌａ（２０１６）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ．１０４：２３８０−２４０８、Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．８：２６６７−２６７６）。単一のＴ細胞などの単一の細胞により発現されるサイトカインは、マイクロウェルを含むデバイスで、蛍光抗体を介して測定できる（Ｚｈｕ，Ｓｔｙｂａｙｅｖａ（２００９）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８１：８１５０−８１５６）。上記の方法は、本開示のための試薬および方法として有用である。
【０４１２】
いくつかの実施形態において、サイトカインに対する抗体をピコウェルの壁に付着させることができ、薬物曝露の機能として細胞から放出されるか、または差次的に放出されるサイトカインは、ピコウェルの壁に結合した抗体により捕捉することができる。捕捉されたサイトカインは、標識された抗体の第２のセットによって特定され得る。いくつかの実施形態において、サイトカインに対する抗体をキャップ化ビーズに付着させることができる。次いで、キャップ化ビーズは、剥離され、例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析計、または他の分析技術によるさらなる分析に供され得る、架橋ヒドロゲルシートに埋め込まれ得る。
【０４１３】
アポトーシス。アポトーシスでのリアルタイムデータ、および単一細胞のアポトーシスにおける初期事象は、表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ）および局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）を使用して測定できる（Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ，Ｓｃｈａｓｆｏｏｒｔ（２０１６）Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｒｅｓ．７：４８−５４、Ｌｏｏ，Ｌａｕ，Ｋｏｎｇ（２０１７）Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ．８：３３８．ＤＯＩ：１０．３３９０を参照されたい）。前述のＳｔａｊａｎｏｖｉｃは、チトクロムＣ、ＥｐＣａｍ、およびＣＤ４９ｅの細胞からの放出を検出する。前述のＬｏｏらは、チトクロムＣの細胞からの放出を測定し、検出は、ＤＮＡアプタマーを伴う（このＤＮＡアプタマーは、抗体のように機能する）。Ｚｈｏｕらは、ＳＥＲＳを使用して単一細胞の初期アポトーシスを検出し、測定されるのは、細胞膜上のホスファチジルセリンである（Ｚｈｏｕ，Ｗａｎｇ，Ｙｕａｎ（２０１６）Ａｎａｌｙｓｔ．１４１：４２９３−４２９８を参照されたい）。アポトーシスに関するデータの収集に加えて、ＳＥＲＳは、有糸分裂の段階、代謝産物の放出、原形質膜と結合した生体分子の発現に関するデータを収集することにより、薬物活性を評価するために使用できる（Ｃｉａｌｌａ−Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４６：３９４５−３９６１を参照されたい）。プラズモン共鳴は、アポトーシスで生じるタンパク質変性およびＤＮＡ断片化を測定できる（Ｋａｎｇ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ（２０１４）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．８：４８８３−４８９２を参照されたい）。プラズモン共鳴（ＳＥＲＳ）は、アルファヘリックス形態およびベータシート形態における有糸分裂タンパク質の割合を測定することにより、がん細胞および正常細胞を識別できる（Ｐａｎｉｋｋａｎｖａｌａｐｐｉｌ，Ｈｉｒａ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ（２０１４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６：１５９−１５９６８）。上記の方法は、本開示のための試薬および方法として好適である。
【０４１４】
アポトーシスは、プラズモン共鳴を使用しないが、その代わりに、抗切断カスパーゼ３抗体を使用した免疫細胞化学を使用する方法において培養された細胞で測定することもできる（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１６：１２１２−１２２３）。
【０４１５】
細胞系アッセイに関する一般的な情報。本開示の細胞系アッセイは、ヒトがん細胞、固形腫瘍からの細胞、血液性がんからの細胞、ヒト幹細胞、ヒト肝細胞、病原菌、感染性細菌、細菌に感染したヒト細胞、ウイルスに感染したヒト細胞などからの応答を試験するために使用され得る。アッセイは、遊走などの細胞の形態学的応答、ならびに遺伝的応答および生化学的応答を検出することができる。
【０４１６】
本開示のアッセイは、ピコウェルの内側に位置する細胞の応答を検出するように、またはピコウェルのアレイの上部の層として位置する栄養培地中など、ピコウェルの外側に位置する細胞の応答を検出するように設計され得る。また、本開示のアッセイは、細胞の応答を検出するように設計することができ、細胞およびビーズは培地内に位置し、細胞は、培地内に位置し、ビーズは、培地の上部または下部にあり、細胞は、培地の上部に位置し、ビーズは、培地の上部または中部または下部に位置する。
【０４１７】
本開示は、ピコウェルアレイに細胞の集団を提供する。実施形態において、細胞集団の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％が、ピコウェルの内側に存在する（ピコウェルの上部に位置するいかなる領域にも存在しない）。実施形態において、ウェルの内側に存在する細胞の割合であり、残りは、ウェルのアレイの上部に存在する栄養培地の層に位置し、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、または「約６０％〜約９０％」の範囲など、これらの数値の２つによって定義される範囲であり得る。
【０４１８】
細胞のマトリックス。細胞の生物学的活性のアッセイでは、細胞は、ビーズから放出された化合物に曝露されるか、または細胞は、ビーズに結合化合物に曝露され、好適なマトリックスには、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ビトロネクチン、オステオポンチン、コラーゲン、ＲＧＤ配置を含むペプチド、ＲＧＤ配置を含むポリペプチド、ラミニン、ラミニン／フィブロネクチン複合体、ラミニン／エンタクチン複合体などの１つ以上を含むものが含まれる。好適なマトリックスには、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（登録商標）細胞および組織接着剤、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）など、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．から入手可能な製品も含まれる。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１５）Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ（２０ページ），Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，Ｏｒｉｖｅ，Ｐｅｄｒａｚ（２００５）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２２：３０３−３１５を参照されたい。除外的な実施形態において、本開示は、上記のマトリックスの１つまたは上記のポリマーの１つを含む任意の組成物または方法を除外することができる。
【０４１９】
実施形態において、本開示は、アレイを提供し、個々のピコウェルは、ビーズ、１つ以上の細胞、ならびに溶液（いかなるマトリックスも含まない）、またはマトリックス、または溶液およびマトリックスの組み合わせのいずれかを含む。マトリックスは、ヒドロゲル、ポリリジン、ビトロネクチン、ＭａｔｒｉＧｅｌ（登録商標）などであり得る。
【０４２０】
ビーズ結合化合物またはビーズ放出化合物の活性が、実行され得る。活性を評価するためのアッセイには、酵素の活性化または阻害、細胞シグナル伝達カスケードまたは個々の細胞シグナル伝達タンパク質の活性化または阻害、抗体（または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、抗体の可変領域）との結合、リガンドまたは基質の酵素（または抗体、または抗体の可変領域）との結合の阻害が含まれる。
【０４２１】
上記のアッセイについて、読み出しは、例えば、クエンチャ（Ｆ−Ｑ）に連鎖状フルオロフォアを含む蛍光アッセイで決定することができる。リンカーは、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ、またはホスホリパーゼにより切断可能となるように設計できる（Ｓｔｅｆｆｌｏｖａ，Ｚｈｅｎｇ（２００７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．１２：４７０９−４７２１を参照されたい）。「分子ビーコン」という用語は、この種類のＦ−Ｑ分子を指すが、「分子プローブ」は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのように、ハイブリダイゼーションによってＦおよびＱの分離が誘導される構築物を指すことにも使用されている（Ｔｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０８、Ｔｓｏｕｒｋａｓ，Ｂｅｈｌｋｅ，Ｂａｏ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１３１９−１３３０）。
【０４２２】
薬物曝露に応じた転写プロファイリング。本開示のＤＮＡバーコードは、応答捕捉要素を含むように改変され得、応答捕捉要素は、バーコードのコード化部分によりてコードされる摂動に対する細胞の応答を捕捉する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡバーコードは、ポリＴ部分（チミジンヌクレオチドの複数の繰り返し）で終結し得、ポリＴ配列を使用して、溶解された細胞から放出されるポリＡ終結ｍＲＮＡ分子を捕捉し得る。いくつかの実施形態において、応答捕捉配列は、目的の遺伝子に相補的であり得、それにより、この実施形態のビーズへのハイブリダイゼーションを介して所望される遺伝子の発現プロファイルを捕捉する。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、転写プロファイルがビーズ上に捕捉される単一細胞ピコウェルを含み得る。他のいくつかの実施形態において、複数の細胞は、転写プロファイルが捕捉されているピコウェル内に含まれ得る。
【０４２３】
１つの例示的なワークフローにおいて、以下の手順は、薬物に対する細胞の転写応答を追跡し得る。（ａ）ウェルあたり単一の細胞を捕捉するように設計されたピコウェルを提供する。（ｂ）化合物を負荷したＤＮＡバーコードビーズをピコウェルに導入し、１つのビーズが、ピコウェルごとに存在するようする。（ｃ）化合物を、適切な方法により各ピコウェル内のビーズから放出する（実施形態のビーズに適切な、ＵＶ切断可能リンカーを介して付着される化合物のＵＶ処理剤、ビーズを酸切断可能、塩基切断可能、温度切断可能な化合物に浸漬した場合の拡散など）。（ｄ）ピコウェルを、ピコウェル内に内容物を保持するキャップ化ビーズを介して、またはピコウェルの上部にあるエアバリアまたは油バリアなどの他の手段によって、互いに単離し得る。（ｅ）ピコウェル内の細胞を、ビーズから放出された化合物の存在下で一定時間インキュベートする。（ｆ）好適な時間の後、例えば、１時間、２時間、５時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、１日間、３日間、１週間、２週間、１か月、またはアッセイに基づいた別の適切な時間で、細胞を、溶解方法により溶解する。溶解方法は、洗浄剤の添加、凍結および解凍の繰り返しサイクル、加熱、膜破壊ペプチドの添加、機械的攪拌、または他の好適な手段を伴い得る。（ｇ）溶解すると、細胞の内容物がピコウェル内のビーズに曝露され、その時点でピコウェルのビーズ上の応答捕捉要素は、それらが意図する応答の捕捉を可能とする。いくつかの実施形態において、応答捕捉は、各ピコウェル内の細胞（または複数の細胞）の完全なｍＲＮＡプロファイルを捕捉するポリＴ配列である。いくつかの実施形態において、応答捕捉要素は、細胞から特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を捕捉するように設計される。いくつかの実施形態において、細胞の転写応答は、化合物の用量（または濃度）の機能として捕捉され得る。
【０４２４】
（ＸＩＶ）細胞での摂動−応答分析
本明細書に記載される方法は、摂動ライブラリおよび細胞のライブラリを含み得る。いくつかの実施形態において、摂動および細胞は、制限された環境でインキュベートされる。インキュベーション中または後に、摂動を特定するバーコード（「摂動バーコード」）が、それがインキュベーションされている細胞に移行され得る。本方法は、摂動から細胞を放出する（すなわち、分離または除去する）こと、および摂動バーコードと共に細胞内容物が捕捉される第２の制限に細胞を供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第２の制限は、細胞特異的なバーコードを含み得、その後、細胞内容物および摂動バーコードを研究するために使用され得、それにより摂動を細胞応答に関連付ける。
【０４２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、２つの応答、摂動バーコードによりコードされた摂動反応および測定応答を含み得る。摂動応答において、細胞は、摂動に供され得る。測定応答において、摂動の結果としての細胞応答が、測定され得る。いくつかの実施形態において、測定応答は、測定バーコードを含み得る。他の実施形態において、方法は、摂動バーコードを測定応答に引き継ぐこと、および測定応答に含まれる測定バーコードおよび摂動バーコードの両方を捕捉することにより、摂動を細胞応答に関連付けることを含み得る。
【０４２６】
本明細書に記載される方法は、摂動バーコードによりコードされる摂動応答を含み得る。摂動応答は、細胞を摂動に供し、続いて、供された摂動に対する細胞の細胞応答を測定することを含む。摂動バーコードは、細胞応答を測定する前または後のいずれかに解読され、したがって、摂動の同一性を測定された細胞応答に関連付けし得る。
【０４２７】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡコードされた、ビーズ結合化合物ライブラリを提供することを含み、化合物は、ビーズから放出され得、ＤＮＡコードされた、ビーズ結合化合物ライブラリと細胞のライブラリを接触させ、接触は、第１の制限された容積内に１つ以上の細胞と共にビーズを制限し、ビーズから化合物を放出し、第１の制限された容積内で細胞と共に化合物をインキュベートすることにより実行され得る。いくつかの実施形態において、同時またはインキュベーション後のいずれかで、化合物を特定するＤＮＡバーコードは、ビーズから放出され、細胞に付着され得る。ＤＮＡバーコードが付着された細胞は、第１の制限された容積から放出され、第２の制限された容積内に再び制限され、第２の制限された容積は、細胞を溶解する試薬、ならびに細胞内容物および細胞によって運搬されるビーズ特異的バーコードを捕捉するメカニズムを有する。いくつかの実施形態において、細胞内容物およびバーコードを捕捉するために使用されるメカニズムは、捕捉バーコードを使用することを伴い得、単一細胞または細胞の小さなクラスターを固有に特定するように機能し得る。いくつかの実施形態において、捕捉バーコードおよびビーズ特異的バーコードは、連結され得る。いくつかの実施形態において、個々にバーコード化された材料を含む制限された容積のすべてを併合し、細胞およびビーズに特異的であるバーコード化された細胞内容物およびバーコードのプールを作製し得る。バーコード化された材料のプールは、個々の細胞応答を研究し、細胞応答を引き起こした摂動にそれらを連結するためにシーケンシングより分析され得る。
【０４２８】
いくつかの実施形態において、方法は、液滴内の個々の細胞を捕捉することを含む。細胞は、細胞が経験する摂動を固有に特定するために、それらの細胞膜上に核酸バーコードを含み得る。細胞は、液滴内で溶解され得、細胞のｍＲＮＡおよび細胞膜に結合された核酸バーコードは、バーコード化された捕捉オリゴヌクレオチド（「捕捉バーコード」）のセットで捕捉され得る。各液滴は、異なる固有のバーコード化された捕捉オリゴヌクレオチドを含み得、１つの液滴内のバーコードは、実質的に同一の配列の区間を有する。ｍＲＮＡおよび細胞膜に結合されたバーコードは、逆転写酵素を使用して液滴バーコード化されたオリゴヌクレオチドにコピーされ得る。核酸材料は、液滴を破壊することにより、液滴から一緒にプールされ得る。すべての核酸材料は、個々の細胞の転写プロファイルを研究し、それを転写プロファイルに関連する摂動に関連付けるために、シーケンシングされ得る。
【０４２９】
本明細書に記載される方法は、細胞のライブラリを２つのバーコード化された制限、摂動制限および溶解制限に供することを含み得る。細胞は個別に、または小さなクラスターとして制限され得る。バーコードは、細胞を摂動させながら細胞に導入されたバーコード、および細胞を溶解させながら導入されたバーコードを含み得る。いくつかの実施形態において、摂動バーコードは、細胞により溶解ステップに運搬され得る。いくつかの実施形態において、溶解バーコードは、細胞内容物および／または摂動バーコードに適用され得、細胞内容物を細胞が経験する摂動に関連付ける、バーコード化された細胞内容物の確立をもたらす。いくつかの実施形態において、摂動ビーズは、応答捕獲プローブをさらに含み得る。この場合、２つの区画化ステップの代わりに、単一のピコウェル区画化ステップで十分であり得る。かかる実施形態において、複合バーコードは、細胞応答を捕捉することができるように機能化され得る。いくつかの実施形態において、摂動バーコードは、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テールがハイブリダイズし得るポリ（Ｔ）セグメントで終わる。
【０４３０】
いくつかの実施形態において、単一細胞の摂動応答分析のワークフローは以下のとおりである：（１）機能化された摂動ビーズを提供し、摂動バーコードは、捕捉配列で終了し、捕捉配列は、ｍＲＮＡの捕捉のためのポリ（Ｔ）ヌクレオチド、または他の細胞応答を捕捉するための他の適切な捕捉プローブのセットを含み得、（２）ピコウェルアレイ内の細胞のライブラリを捕捉し、（３）機能化された摂動のライブラリを、同じピコウェル内に捕捉し、ここで、いくつかの実施形態では、単一細胞および単一機能化されたビーズがウェルごとに捕捉され、他の実施形態では、細胞のクラスターがピコウェル内に捕捉され得、（４）任意で、ピコウェルを油媒体で覆い、ウェル間の試薬の相互汚染を防止し、（５）摂動ビーズから化合物を放出し、摂動ビーズから放出された化合物と共に各ウェル内の細胞をインキュベートし、（６）ピコウェルを覆って溶解バッファーを流すことにより、ピコウェル内の細胞を溶解し、（７）摂動バーコードの先端に直接的に、ｍＲＮＡまたは他の細胞応答を捕捉し、（８）ポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して、細胞応答を摂動バーコードにコピーし、（９）超音波処理によりピコウェルからビーズを放出し、次に、放出されたビーズから伸長された摂動バーコードを切断するか、または単純に、ビーズが依然としてピコウェル内にある間に摂動バーコードをビーズから切断し、（１０）切断されたヌクレオチド（伸長された摂動バーコード）を適切なライブラリ調製方法に供し、調製されたヌクレオチドをシーケンシングする。いくつかの実施形態において、シーケンシングされたヌクレオチドは、細胞が供された摂動／化合物を特定する摂動バーコード、および摂動バーコードにより特定された摂動／化合物に供された細胞のｍＲＮＡ発現に対応する応答区域の２つの区域を含む。このワークフローは、図３６に示され、任意で、プロセスのＱＣのためのイメージングステップを伴う。逆転写酵素法は、捕捉されたＲＮＡをビーズ付着ＤＮＡ上に伸長し、それにより細胞内容物情報を機能化されたビーズに転送するのに機能し得る。その後、ビーズをプールし、抽出し、シーケンサーで分析できる。いくつかの実施形態において、単一細胞からのＤＮＡは、機能化されたビーズ上の特異的なプライマーにさらに捕捉され得る。かかる実施形態において、ポリメラーゼは、逆転写酵素を置き換えてもよい。
【０４３１】
いくつかの実施形態において、摂動および細胞応答の捕捉は、図３７に記載されるように、２つの異なる制限において起こり得る。摂動バーコードは、細胞応答捕獲制限に供される前に、細胞表面に移行され得る。細胞応答捕獲はまた、細胞表面上で運搬される摂動バーコードを捕獲することを伴い、それにより細胞応答を細胞が曝露される摂動に直接的に関連付ける。いくつかの実施形態において、細胞応答の捕捉は、Ｄｒｏｐ−ｓｅｑ法により達成することができる。いくつかの実施形態において、細胞応答の捕捉は、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞機器、Ｒａｉｎｄａｎｃｅ単一細胞分析プロトコル、ＢｉｏＲａｄ単一細胞単離機器、Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏ単一細胞分析プロトコル、ＧｉｇａＧｅｎ機器およびプロトコル、ならびに／または任意の他の市販の単一細胞分析機器もしくはサービスなどの任意の市販の単一細胞分析機器で生じ得る。
【０４３２】
いくつかの実施形態において、細胞懸濁液は、摂動ビーズにより制限を受ける細胞の開始点として使用され得る。細胞を水性培地に懸濁する方法または細胞を懸濁液で培養する方法は、当業者に周知である。細胞を懸濁する方法および細胞を懸濁液で培養する方法もまた、当技術分野において記載される。例えば、いくつかの実施形態において、球状体細胞培養は、単離において単一細胞よりも多くの細胞間相互作用シグネチャを捕捉するので、摂動の開始点として使用され得る（例えば、Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２：２０７−２１８，２０１４、Ｆｅｎｎｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１０８−１１５，２０１３、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：１１８９１，２０１５、Ｚａｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：１９１０３，２０１６を参照されたく、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ハイスループット摂動を受けるために単一細胞の代わりにオルガノイドが使用され得る（例えば、Ｆｏｌｅｙ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：５５９−５６２，２０１７、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：３３４，２０１６、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ  Ａｐｒｉｌ  ２０１７、Ｓｋａｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２１：１３９９−１４１１，２０１６、Ｂｏｅｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２１：９３１−９４１，２０１６を参照されたく、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４３３】
いくつかの実施形態において、細胞は、疾患モデルから得られる。本明細書に記載される方法は、疾患モデル細胞にわたる化合物の大規模なハイスループットスクリーニングを可能にし、摂動／化合物ライブラリ内の１つ以上の化合物への曝露により治療応答が得られるかを確認する。他の実施形態において、細胞は、様々な系統の健康な細胞である。本明細書に記載される方法は、様々な化合物に対する細胞応答の大規模ハイスループットマッピングを可能にする。いくつかの実施形態において、細胞上のコンビナトリアル化合物ライブラリの不偏的なスクリーニングにより収集されたデータは、薬物−細胞の相互作用の既知のマップに基づく新規薬物予測を可能にする。
【０４３４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される制限は、液滴制限を含む。いくつかの実施形態において、液滴は、油マトリックス中に水性液滴を含む。いくつかの実施形態において、液滴は、水相および油相の混合を含むマイクロ流体接合部で生成される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体接合部は、細胞、摂動ビーズ、および油相を含む。細胞およびビーズを用いて液滴を作製するためのマイクロ流体構築の一実施形態は、「Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ」法により示される（例えば、Ｍａｃｏｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６１：１２０２−１２１４，２０１５を参照されたい）。
【０４３５】
いくつかの実施形態において、方法は、ヒドロゲル制限を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される制限は、ヒドロゲル制限を含み、細胞およびビーズは、それらの自由拡散を防止するヒドロゲルマトリックスに包埋される。いくつかの実施形態において、細胞およびビーズが互いに近接するように共局在化することは、偶然に生じる。いくつかの実施形態において、ビーズは、細胞に接着する結合部分を含み、その後、細胞−ビーズ二重鎖は、ヒドロゲルに包埋される。いくつかの実施形態において、細胞へのビーズの近接は、そのビーズから放出された化合物が、拡散誘発交差反応性を伴わずにその細胞のみを摂動させることを確実にする（細胞間隔は、ヒドロゲル中の化合物の拡散半径よりも遠い）。いくつかの実施形態において、摂動後、細胞は、溶解バッファーをヒドロゲルに通すことによって溶解され、放出された細胞内容物は、細胞に近接するビーズ上に捕捉される。いくつかの関連する刊行物は、Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．５０：２２，２０１７、Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｅｒ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ９：１３８５−１３９４，２００９、Ｇｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０：６０７６，２００９，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１７６１〜１７６３ページ、１７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｉｃｒｏＴＡＳ，２０１３、および米国特許公開番号第ＵＳ２００３０１７５８２４  Ａ１号であり、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法において使用される制限は、ピコウェル制限を含み、個々のビーズおよび細胞は、微細加工されたピコウェル内に捕捉され、アッセイは、ピコウェルのアレイ内で実行され得る。細胞およびビーズをピコウェルのアレイに負荷するための詳細な手順は、例えば、Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｓ，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．６：３３８８３，２０１６に記載される。いくつかの実施形態において、摂動ビーズは、応答捕捉プローブをさらに含み、２つの区画化ステップの代わりに、単一のピコウェル区画化ステップで十分である。かかる実施形態において、摂動バーコードは、細胞応答を捕捉することができるように機能化され得る。いくつかの実施形態において、摂動バーコードは、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テールがハイブリダイズし得るポリ（Ｔ）セグメントで終わる。
【０４３７】
いくつかの実施形態において、単一細胞の摂動応答分析のワークフローは以下のとおりである（例えば、図３６を参照されたい）：（１）機能化された摂動ビーズを提供し、摂動バーコードは、捕捉配列で終了し、捕捉配列は、ｍＲＮＡの捕捉のためのポリ（Ｔ）ヌクレオチド、または他の細胞応答を捕捉するための他の適切な捕捉プローブのセットを含み得、（２）ピコウェルアレイ内の細胞のライブラリを捕捉し、（３）機能化された摂動のライブラリを、同じピコウェル内に捕捉し、ここで、いくつかの実施形態では、単一細胞および単一機能化されたビーズがウェルごとに捕捉され、他の実施形態では、細胞のクラスターがピコウェル内に捕捉され得、（４）任意で、ピコウェルを油媒体で覆い、ウェル間の試薬の相互汚染を防止し、（５）摂動ビーズから化合物を放出し、摂動ビーズから放出された化合物と共に各ウェル内の細胞をインキュベートし、（６）ピコウェルを覆って溶解バッファーを流すことにより、ピコウェル内の細胞を溶解し、（７）摂動バーコードの先端に直接的に、ｍＲＮＡまたは他の細胞応答を捕捉し、（８）ポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して、細胞応答を摂動バーコードにコピーし、（９）超音波処理によりピコウェルからビーズを放出し、次に、放出されたビーズから伸長された摂動バーコードを切断するか、または単純に、ビーズが依然としてピコウェル内にある間に摂動バーコードをビーズから切断し、（１０）切断されたヌクレオチド（伸長された摂動バーコード）を適切なライブラリ調製方法に供し、調製されたヌクレオチドをシーケンシングする。いくつかの実施形態において、シーケンシングされたヌクレオチドは、細胞が供された摂動／化合物を特定する摂動バーコード、および摂動バーコードにより特定された摂動／化合物に供された細胞のｍＲＮＡ発現に対応する応答区域の２つの区域を含む。
【０４３８】
いくつかの実施形態において、細胞応答は、形態学的応答として光学的に測定される。いくつかの実施形態において、細胞応答は、摂動後の測定されたシグナルの差異を研究するために、特定の細胞の特性を標識することにより測定される。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内に操作された応答であり、好ましい刺激は、細胞に操作された応答を発現させる。いくつかの実施形態において、操作された応答は、レポーター遺伝子である。いくつかの実施形態において、操作された応答は、蛍光タンパク質の発現である。
【０４３９】
いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞のトランスクリプトームを含む。いくつかの実施形態において、転写応答は、細胞のｍＲＮＡ含有量を捕捉し、ｍＲＮＡ転写物の発現レベルを分析することにより測定される（例えば、Ｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １７：６３，２０１６、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：３８１，２０１７、Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌ  ４：２４３，２０１６を参照されたく、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内のタンパク質または酵素の発現および／または翻訳後活性化状態を含む。いくつかの実施形態において、細胞応答を捕捉することは、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドを使用して細胞からポリ（Ａ）ｍＲＮＡを捕捉することを含む。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内のエンハンサＲＮＡの発現レベルを含む（例えば、Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４５：３０１７，２０１７を参照されたく、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内の新生転写物のレベルを含む。いくつかの実施形態において、新生転写応答は、Ｇｌｏｂａｌ  Ｒｕｎ−Ｏｎシーケンシング（ＧＲＯ−Ｓｅｑ）により捕捉される（例えば、Ｇａｒｄｉｎｉ，Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４６８：１１１−１２０，２０１７、およびＤａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：４３３，２０１５を参照されたく、開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、細胞応答は、タンパク質濃度を含み、タンパク質は、ＤＮＡタグ付き抗体により特定され、さらに適切なタグがビーズに移行される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞応答は、イメージング、ゲノム分析、または分子生物学およびシーケンシングにおける任意の他の手段により捕捉され得る。
【実施例】
【０４４０】
実施例１．第１のワークフロー
本開示は、以下に「第１のワークフロー」および「第２のワークフロー」として概説される方法を含む方法を提供する。
第１のワークフローは、（１）ＤＥＬＢを生成する、（２）ビーズをピコウェル内へ、（３）アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する、（４）ビーズ結合化合物を放出する、（５）アッセイの読み出しを測定する、（６）アッセイの読み出しをランク付けする、および（７）ＤＥＬＢの新しいセットを生成するステップを含む。
【０４４１】
ＤＥＬＢを生成する。第１に、ビーズ（ＤＥＬＢ）にＤＮＡコード化ライブラリを作製する。各ビーズは、完全に同じ化合物の集団を含むが、製造された化合物の一部が不完全なカップリングを有する、または偶発的な酸化などの化学的損傷を受けていると、これとは少し異なるものが生じ得る。
【０４４２】
ビーズをピコウェル内へ。次に、ビーズをピコウェル内に堆積する。好ましい実施形態において、各ピコウェルは、１つのビーズのみを得る。各ピコウェルは、円形上端、円形下端、固体円形底部、開口上部、および壁を有することができる。壁の底部は、円形上端および円形下端により画定する。好ましい実施形態において、壁は、傾いており、円形上端の直径は、円形下端の直径よりも大きい。このように、壁（単独で表示）は、逆円錐台の切片に類似する。ピコウェルアレイを調整し得るため、ビーズの冗長性が存在する。つまり、ピコウェル内に配置された数千のビーズのうちの２つのビーズが完全に同じ化合物を含むように、アレイを調整できる。冗長性は、例えば、２ビーズ、３ビーズ、４ビーズ、５ビーズ、１０ビーズ、２０ビーズ、４０ビーズ、６０ビーズ、８０ビーズ、１００ビーズなど、または約２、約３、約４、約１０、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約５００、約１，０００ビーズなど、または２超、５超、１０超、２０超、４０超、６０超、８０超、１００超、２００超、５００超、１，０００超ビーズなどであり得る。
【０４４３】
アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する。各ビーズ結合化合物の生化学的活性を評価するために使用できる試薬を各ピコウェルに導入する。生化学的活性は、結合活性、酵素阻害活性、酵素活性化活性、生哺乳動物細胞の活性（分子標的が即知でない）、生哺乳動物細胞の活性（分子標的が即知である）などの形態をとることができる。試薬は、ＦＲＥＴ試薬および酵素の形態をとることができる。ＦＲＥＴ試薬は、プロテアーゼ基質を介してクエンチャに連結されたフルオロフォアであり得る。酵素は、そのプロテアーゼの基質であり得、プロテアーゼにより切断可能である。ビーズ結合化合物は、プロテアーゼを阻害する能力について試験されている。
【０４４４】
アッセイ材料を負荷した後、各ピコウェルをフィルムによりキャップすることができ、またはピコウェルの多くもしくはすべてを１つのフィルムによりキャップすることができ、またはピコウェルの多くもしくはすべてを、ピンプルを有するフィルムによりキャップすることができ、各ピンプルは、ピコウェルにフィットし、または各ピコウェルは、多孔性球を用いてフィットさせる。実施形態において、球の容積の約５％、容積の約１０％、容積の約２０％、容積の約３０％、または球の体積の約４０％が、ピコウェルにフィットする（残りは、表面と同じ高さか、または表面の上に存在する）。実施形態において、ピンプルの約５％、約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９０％、または約１００％が、ピコウェルにフィットする。
【０４４５】
ビーズ結合化合物を放出する。ビーズ結合化合物の放出をもたらすステップを実行する。実施形態において、ステップは、所定のビーズに付着された化合物の約０．１％、約０．２％、約０．１％、約０．２％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９９％、または約１００％の放出をもたらし得る。放出は、光により、化学試薬により、酵素により、温度の変動により、それらの任意の組み合わせになどによりもたらされ得る。
【０４４６】
放出は、（ｉ）単一放出、（ｉｉ）複数放出、（ｉｉｉ）連続的放出の形態をとることができる。例えば、複数放出は、紫外光のいくつかの発光の形態をとることができ、各発光は、その光発光の開始時にビーズへの付着を生じるビーズ結合化合物の約１０％を切断するのに十分である。例えば、連続的放出は、１時間にわたって連続的に光を発光する形態をとることができ、遊離化合物の濃度が着実な増加をもたらす。この状況では、遊離化合物（切断された化合物）の濃度が着実に増加することは、その化合物の標的を滴定する目的のためであり得る。この種の滴定実験は、所定の化合物の効力を評価するために使用できる。非限定的な例を提供するために、単一放出法では、露光期間の後に、読み出しが行われる次の期間が続き、連続的放出法では、読み出しが行われる期間の一部、ほとんど、またはすべての期間、露光が連続する。
【０４４７】
除外的な実施形態において、本開示は、単一放出を使用する、複数放出を使用する、または連続的放出を使用する任意の方法、試薬、組成物、またはシステムを除外することができる。
【０４４８】
アッセイの読み出しを測定する。上記で開示された生化学的活性、およびその活性に対する放出された化合物の影響を検出する。この生化学的活性は、酵素活性、レポーター遺伝子の活性、遺伝的活性（例えば、転写または翻訳の速度）、結合活性（例えば、抗原に対する抗体）、細胞活性（例えば、遊走の変化、細胞シグナル伝達経路の変化、形態学の変化）の形態をとることができる。活性は、蛍光、発色活性、発光、光学顕微鏡、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ、分子ビーコン、質量分析、ラマン分光法、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）、表面プラズモン結合発光（ＳＰＣＥ）、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）などにより検出できる。検出は、蛍光検出もしくは光学顕微鏡などの完全に遠隔の方法を用いて、または代替的に、ピコウェルから試料を取得することを伴う方法を用いることができる。一実施形態において、反応物質および生成物の混合物を含む試料は、ピコウェルの１つに部分的に挿入された球状の多孔性スポンジを介して分析のために回収することができる。
【０４４９】
アッセイの読み出しをランク付けする。このステップにおいて、複数の異なる化合物（１つの特定のビーズに関連する各種類の化合物）からのアッセイ読み出しは、生化学的活性を活性化、阻害、または何らかの方法で調節する能力に関してランク付けする。
【０４５０】
ＤＥＬＢの新しいセットを生成する。上術されるステップは、生化学的活性を示す様々な化合物をユーザーに対して情報を与える。情報は、最大活性を有する１つの化合物の形態をとり得、残りは、約半分の最大活性またはそれ以下を有する。代替的に、情報は、類似の最大活性を有するいくつかの化合物の形態をとり得、他の化合物は、約半分の最大活性またはそれ以下を有する。ＤＥＬＢの新しいセットは、以下のように作製できる。以下の非限定的な戦略のうちの１つ以上に基づいて、ＤＥＬＢの新しいセットを製造するための基盤として、１つ以上の最高ランクの化合物（リード化合物）を使用できる：（ｉ）脂肪族鎖を同族体で置き換える、例えば、プロパノール側鎖をブタノール側鎖で置き換えるなど（ｉｉ）脂肪族鎖を異性体で置換する、例えば、プロパノール側鎖をイソプロパノール側鎖で置き換えるなど、（ｉｉｉ）ペプチド結合をペプチド結合の類似体で置き換える、例えば、ペプチダーゼにより加水分解できない結合を用いてなど、（ｉｖ）ある種類の荷電基を別の種類の荷電基で置き換える、例えば、リン酸基をホスホン酸、硫酸塩、スルホン酸、またはカルボキシル基で置き換えるなど。
【０４５１】
実施例２．第２のワークフロー
代２のワークフローは、キャップで密封されたピコウェルを伴う。キャップは、ピコウェルの直径よりわずかに大きい直径の球の形態をとることができ、この直径は、ピコウェルの上部の縁で測定される（ピコウェルの底部では測定されない）。ピコウェルプレート全体を穏やかな重力遠心に供することにより、キャップをピコウェルの上部にぴったりとフィットさせることができる。第２のワークフローでは、キャップは、リンカーを含むビーズの形態をとり、各リンカーは、化合物に連結される。リンカーは、切断可能なリンカーであり、切断すると化合物が放出され、細胞への拡散が可能になる。この種類のキャップは、「能動的キャップ」と称される。第２のワークフローは、（１）ＤＥＬＢを生成する、（２）アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する、（３）ＤＥＬＢでピコウェルをキャップする、（４）キャップとして機能するビーズからビーズ結合化合物を放出する、（５）アッセイの読み出しを測定する、（６）ビーズ上にあるＤＮＡバーコードの配列を決定する、（７）アッセイの読み出しをランク付けする、および（８）ＤＥＬＢの新しいセットを生成するステップを含む。
【０４５２】
実施例３．放出制御
これは、ビーズ結合化合物の放出の制御およびモニタリングに関連する。出願人は、ビーズ結合放出モニターを合成するために以下の手順を考案した。図１１および以下のテキストを参照されたい。
【０４５３】
図１１は、ビーズ結合放出モニターの上記の例示的な実施形態の有機合成におけるステップを記載する。
【０４５４】
ステップ１．樹脂を提供する
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）樹脂（Ｍ３０１０２、１０μｍ  ＮＨ２、０．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１０ｍｇ；ＭＢ１６０２３０、１６０μｍ  ＲＡＭ、０．４６ｍｍｏｌ／ｇ、２ｍｇ）を、チューブ（１．５  ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に量り入れ、膨潤（４００μＬ、ＤＭＡ）した。
【０４５５】
樹脂をフリットスピンカラム（ＭｏＢｉＣｏｌ（登録商標）スピンカラム、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移行し、溶媒を真空でフィルターを通して除去し、ペンダントＦｍｏｃを脱保護した（ＤＭＡ内に２％ＤＢＵを含む５％ピペラジン、４００μＬ；４０°Ｃで２ｘ１０分）。ＭｏＢｉＣｏｌスピンカラムは、１０マイクロメートルの大きなフリットおよびルアーロックキャップを有する。
【０４５６】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４５７】
ステップ２．樹脂へのリジンリンカーの結合
Ｌ−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（２１μｍｏｌｅ、６．６ｅｑ．）、ＤＩＥＡ（４２μｍｏｌｅ、１３．３ｅｑ．）、ＣＯＭＵ（２１μｍｏｌｅ、６．６ｅｑ．）を含む溶液を調整し、ＤＭＡ（３５０μＬ）内で混合し、インキュベートし（１分、室温）、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし（１５分、４０°Ｃ）、遊離アミンをアミド化する。樹脂を真空で濾過し、この反応を１回繰り返した。
【０４５８】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４５９】
ステップ３．Ｆｍｏｃ保護基を除去する
ペンダントＦｍｏｃを脱保護した（ＤＭＡ内に２％ＤＢＵを含む５％ピペラジン、４００μＬ；４０°Ｃで２ｘ１０分）。
【０４６０】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４６１】
ステップ４．クエンチャを結合する
ＱＳＹ７−ＮＨＳ（４．９μｍｏｌｅ、１．５５ｅｑ．）、Ｏｘｙｍａ（９．５ｅｑ、３．３ｅｑ．）、ＤＩＣ（２１μｍｏｌｅ、６．６ｅｑ．）、ＴＭＰ（３．５μｍｏｌｅ、１．１ｅｑ．）を含む溶液を調整し、ＤＭＡ（３５０μＬ）内で混合し、インキュベートし（１分、室温）、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし（１４時間、４０°Ｃ）、遊離アミンをアミド化する。
【０４６２】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４６３】
無水酢酸（８０μｍｏｌｅ、２５．３ｅｑ．）、ＴＭＰ（８０μｍｏｌｅ、２５．３ｅｑ．）を含む溶液を調整し、ＤＭＡ（４００μＬ）内で混合し、次いで、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートした（２０分、室温）。
【０４６４】
樹脂を真空で濾過し、洗浄し（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ）、ＤＣＭ内でインキュベートし（１時間、室温）、次いで、真空で濾過し、真空チャンバ内で乾燥した（３０分、２．５ＰＳＩ）。
【０４６５】
ステップ５．Ｍｔｔ保護基を除去する
ＴＦＡ（９６μＬ）、メタノール（１６μＬ）を含む、Ｍｔｔ脱保護カクテルを調製し、ＤＣＭ（１４８８μＬ）内で混合し、６：１：９３％のＴＦＡ：メタノール：ＤＣＭ溶液を得た。
【０４６６】
Ｍｔｔ脱保護カクテルを完全に乾燥した樹脂（４００μＬ）に加え、混合し、真空で濾過することにより溶出し、その後順次に、Ｍｔｔ脱保護カクテル（４ｘ  ４００μＬ）のアリコートを加え、混合し、インキュベートし（５分、室温）、室温で２０分の合計インキュベーション時間で溶出した。
【０４６７】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ；２％ＤＩＥＡを含む１ｘ  ＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４６８】
ステップ６．光切断可能なリンカーをリジンのイプシロン−アミノに結合する
Ｆｍｏｃ−ＰＣＬ−ＯＨ（３２μｍｏｌｅ、１０ｅｑ．）、Ｏｘｙｍａ（３２μｍｏｌｅ、１０ｅｑ．）、ＤＩＣ（５０μｍｏｌｅ、１５．８ｅｑ．）、ＴＭＰ（３２μｍｏｌｅ、１０ｅｑ．）を含む溶液を調整し、ＤＭＡ（４００μＬ）内で混合し、インキュベートし（１分、室温）、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし（１４時間、４０℃）、遊離ε−アミンをアミド化する。
【０４６９】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４７０】
ステップ７．以前に結合された光切断可能なリンカーからＦｍｏｃ保護基を除去する
ペンダントＦｍｏｃを脱保護した（ＤＭＡ内に２％ＤＢＵを含む５％ピペラジン、４００μＬ；４０°Ｃで２ｘ１０分）。
【０４７１】
樹脂を真空で濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
【０４７２】
ステップ８．フルオロフォアを結合する
ＴＡＭＲＡ（６μｍｏｌｅ、１．９ｅｑ．）、ＴＭＰ（２４μｍｏｌｅ、７．６ｅｑ．）、ＣＯＭＵ（１６μｍｏｌｅ、５ｅｑ．）を含む溶液を調整し、ＤＭＡ（４００μＬ）内で混合し、インキュベートし（１分、室温）、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、混合しながらインキュベートし（２時間、４０℃、８００ＲＰＭ）、遊離アミンをアミド化する。
【０４７３】
樹脂を真空で濾過し、洗浄し（２ｘＤＭＡ、４００μＬ；３ｘＤＣＭ、４００μＬ；２ｘＤＭＡ、４００μＬ；２ｘＤＭＳＯ）、ＤＭＳＯ内で混合しながらインキュベートした（１６時間、４０°Ｃ）。
【０４７４】
以下は、上記で開示された検査手法のより広範な説明を提供する。
【０４７５】
ビーズに付着された二官能性リンカー。二官能性リンカーを溶液中で合成し、アミン官能化ビーズに付着した。図１１は、リジンから開始する有機合成の経路を開示する。リジン−ＢｏｃをＴＣＯリンカーで接続した。リンカーの主要部分は、一端に窒素を伴うポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の形態をとる。Ｂｏｃは、この連結反応において脱離基であった。使用されたＴＣＡは、実際にはヒドロキシ−ＴＣＯのラセミ体であった。このＴＣＯ誘導体のヒドロキシル基を、二重結合の片側から４つの炭素原子に位置する炭素原子に接続した（これは、二重結合の他方の側から３つの炭素原子に位置するのと同じである）。図１１に示すように、多段階合成における第１の生成物は、Ｂｏｃ−リジン−リンカー−ＴＣＯの形態をとった。かつてヒドロキシ−ＴＣＯの一部であったヒドロキシル基は、ＴＣＯ基に依然として付着しており、アミノ化ポリエチレングリコール基とＴＣＯ基との間に位置する（図１１）。
【０４７６】
合成経路の第２のセットは、ＨＣｌによる処理および光切断可能なリンカー（ＰＣＬ）の追加を伴う。この第２のステップの生成物は、Ｂｏｃ基が光切断可能なリンカーで置き換えられていることを除いて、第１のステップの生成物と同じである。リジン部分は、第２のステップの生成物において中心的な位置をとる。リジン部分に関して、このリジン部分は、遊離カルボキシル基を有し、手順の第３のステップでは、アミノ化されたビーズは、この遊離ヒドロキシル基に接続され、ビーズ結合試薬が合成され、試薬は、２つの分岐の形態をとり、一方の分岐の末端は、ＴＣＯタグであり、他方の分岐の末端は、切断可能な結合を有する芳香環である。化学モノマーを光切断可能なリンカーの遠位端に付着させるには、最初にＦｍｏｃ基を除去し、ここで、Ｆｍｏｃ基を水素原子に置き換える。
【０４７７】
Ｆｍｏｃを除去する。Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔらによれば、「Ｆｍｏｃは、除去中に生成されたジベンゾフルベンを捕捉するのに優れているため、主に第二級アミンにより除去される」（Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９：２４５５−２５０４）。代替的に、Ｆｍｏｃは、Ｐｄ／ＢａＳＯ４を用いた触媒水素化分解により、または液体アンモニアおよびモルホリンもしくはピペリジンにより除去できる。
【０４７８】
Ｆｍｏｃ基の除去に続いて、化学モノマーを付着する。次に、出願人は、カルボン酸基を有する化学モノマーを縮合させ、その結果、アミド結合を生成した。
【０４７９】
実施例４．活性化合物についてのセレブロン系アッセイ
化合物の細胞系アッセイ（セレブロン系アッセイ）から結果。細胞系アッセイのための試薬および方法。出願人は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓｅｓ，ＶＡ）から入手したＣＣＬ−２  ＨｅＬａ細胞を使用した。細胞培地は、ＨＥＰＥＳで緩衝されたＧｉｂｃｏ  ＤＭＥＭ高グルコース培地であった。細胞培養の上の大気は、３７度のインキュベーターで、５％の二酸化炭素が補充された大気である。細胞培地は、ＤＭＥＭ  ＋  １０％ウシ胎児血清に、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を追加、ならびにさらに非必須アミノ酸およびペニシリン＋ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を追加したものである。ＨｅＬａ細胞に、ＬＴＲ−ＣＴＣＦ−プロモーター−ＩＫＺＦ１（またはＩＫＺＦ３）−ｍＮｅｏｎ−Ｐ２Ａ−ｍＳｃａｒ−ＬＴＲ−ＣＴＣＦの形態をとる構築物をトランスフェクトした。ｍＳｃａｒｌｅｔは、陽性対照として使用される要素である。ｍＳｃａｒｌｅｔは、「ｍＳｃａｒｌｅｔ」と称される赤い蛍光タンパク質をコードする（Ｂｉｎｄｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４：５３−５６を参照されたい）。プロモーターは、基質の迅速な開始誘導および滴定を可能にするドキシサイクリン可換プロモーターである。Ｐ２Ａは、２つの他のポリペプチドの間に位置する要素である。Ｐ２Ａは、翻訳中に２つの別々のポリペプチドを生成するように機能するため、ｍＳｃａｒポリペプチドが、ＩＫＺＦ１／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる融合タンパク質のユビキチン化および分解による影響を受けることなく、赤色光を生成する陽性対照として機能できる。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、ナメクジウオのニシナメクジウオの多量体黄色蛍光タンパク質（Ａｌｌｅｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に由来する。Ｐ２Ａは、Ｐ２Ａタンパク質内のある部位で自己切断を可能にする領域である。より正確には、Ｐ２Ａペプチドは、リボソームに２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップさせ、２Ａペプチドおよびそのすぐ下流のペプチドの間の切断をもたらす（Ｋｉｍ，Ｌｅｅ，Ｌｉ，Ｃｈｏｉ（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．６：ｅ１８５５６（８ページ）。
【０４８０】
試験化合物についての細胞系アッセイの有効性を示す。以下は、レナリドマイドおよびレナリドマイドの類似体の形態をとる試験化合物についての細胞系アッセイの使用を示す。図５は、レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの結果を開示し、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ｍＳｃａｒｌｅｔ）を発現した。追加したレナリドマイドの濃度を上げると、緑色蛍光が次第に少なくなり、最高濃度で緑色蛍光が消えた。しかし、レナリドマイドは、実質的に赤色蛍光を減少させなかった。上：ＩＫＺＦ１／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ対照の発現。レナリドマイドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモルで追加された。
【０４８１】
図６は、レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの結果を開示し、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ｍＳｃａｒｌｅｔ）を発現した。追加したレナリドマイド濃度を上げると、緑色蛍光が次第に少なくなり、最高濃度で緑色蛍光が消えた。しかし、レナリドマイドは、実質的に赤色蛍光を減少させなかった。上：ＩＫＺＦ３／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ対照の発現。レナリドマイドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモルで追加された。
【０４８２】
レナリドマイドが、融合タンパク質のタンパク質分解をもたらす経路を要約するには、最初にレナリドマイドをＨｅＬａ細胞に追加する。次に、レナリドマイドをこれらの細胞内で自然に生じるセレブロンに結合する。このセレブロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとの複合体で生じる。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、組換えＩＫＺＦ１融合タンパク質（または組換えＩＫＺＦ３融合タンパク質）にユビキチンをタグ付けすることにより、レナリドマイドに応答する。最終的な結果は、ユビキチンタグ付き融合タンパク質が、細胞のプロテアソームで分解されることである。
【０４８３】
ピコウェルプレートのコーティング。これは、ピコウェルプレートの上面に適用される溶液について記載するが、必ずしもピコウェルの内部に入り、コートするわけではない。これは、ピコウェルプレートの上面に適用され、ピコウェルに入る溶液、およびピコウェルの底面をコーティングする溶液についても当てはまる。出願人は、乾燥プラスチックにＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）１２７（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の溶液を追加した。その結果、表面は親水性であり、もはや疎水性ではない。その後、表面を水で洗浄した。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を追加し、このＰＢＳは、ピコウェルの内部に入る。移動する空気は、真空により適用され、その結果、ピコウェル内の小さな気泡が膨張し、気泡は、ＰＢＳに置き換わり、最終結果は、ピコウェルの多くがＰＢＳで満たされることである。次に、ＰＢＳをビトロネクチンコーティング溶液（ＡＦ−ＶＭＢ−２２０）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で置き換えた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）１２７は、Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘ（ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３）ｙ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ＺＯＨである。ビトロネクチンコーティング溶液を適用した後、３７度で３０分間インキュベートし、コーティング溶液をピコウェルに入れた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２７は、ピコウェルを分離する隆起をコーティングし、ビトロネクチンは、ピコウェルの底部にある。ＨｅＬａ細胞は、ビトロネクチンに付着し、ビトロネクチンに付着すると、ピコウェルの底部に接着する。
【０４８４】
ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーを介して正常にトランスフェクトされた細胞についてスクリーニングした。トランスフェクションの成功を判断するために、２つの基準を同時に使用した。まず、レナリドマイドをフローサイトメトリーによる選別の２日前に細胞培地に追加した。陽性細胞は、赤色陽性および緑色陰性であり、赤色陽性は、細胞にｍＳｃａｒをコードする遺伝子がトランスフェクトされたことを意味し、緑色陰性は、レナリドマイドが、実際に、融合タンパク質ＩＫＺＦ１／ｍＮｅｏｎ（または融合タンパク質ＩＫＺＦ３／ｍＮｅｏｎ）のユビキチン化および分解を促進したことを意味する。ドキシサイクリンに関して、レンチウイルスベクター構築物の発現を誘導するために、ドキシサイクリンを３マイクロモルで使用した。ドキシサイクリンによる濃度／誘導曲線は、Ｇｏ  ａｎｄ  Ｈｏ（２００２）Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４：２５８−２７０）により示される。レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクションした後、以下の条件を使用して、成長細胞でのＩＫＺＦ１の発現を最小限に抑えた。条件は、ドキシサイクリンを培地の外に残すこと、および構築物に「絶縁配列」を使用することである。絶縁配列は、構築物の外側のプロモーターからのリードスルーを防ぐ。絶縁配列が記載されている（Ａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１２：６４０−６４６、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．１２：ｅ０１７６０１３を参照されたい）。絶縁配列は、構築物の外側にあるプロモーターが、構築物の一部であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を駆動するのを防ぐ。細胞をピコウェルに入れるために、細胞は、ピコウェルプレートの上面に、［細胞数］／［ピコウェル数］の比率で移行できる。この比率は、例えば、約１細胞／４０ウェル、約１細胞／２０ウェル、約１細胞／１０ウェル、約２細胞／１０ウェル、約４細胞／１０ウェル、約８細胞／１０ウェル、約１６細胞／１０ウェル、約３２細胞／１０ウェル、約５０細胞／１０ウェル、約１００細胞／１０ウェルなどであり得る。細胞は、ピコウェルの底部をコートするビトロネクチンに付着するとすぐに、ピコウェルでのアッセイに使用できる。
【０４８５】
レンチウイルス構築物および細胞培養の詳細。これは、ＩＫＺＦ１／３のレポーター細胞株の構築、ピコウェルでのそれらの培養、およびバルクレナリドマイドでのアッセイに関するものである。レポーター構築物を運搬するプラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してパーツから組み立てた（添付の地図を参照されたい）。レポーター構築物を有するレンチウイルス、およびＵｂＣ駆動ｒｔＴＡ−Ｍ２．２を、ＬｅｎｔｉＸ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で、第３世代パッケージングシステム（キメラＣＭＶプロモーター、ｔａｔタンパク質なし）を使用して作製した。プラスミドは、カルシウム沈殿法によりトランスフェクトした。ウイルス上清を、推奨されるＬｅｎｔｉＸ培地および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内で回収し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。宿主ＨｅＬａ細胞は、標準的な条件で培養されたＡＴＣＣから入手した。ウイルス上清を、サブコンフルエントなＨｅＬａ培養に適用し、２４時間後にドキシサイクリンを含むＬｅｎｔｉＸ培地に交換した。クローン選択の２日前に、レナリドマイドを培養物に追加した。クローンを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を介して選択し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（陰性）およびＣｙ３チャネル（陽性）の両方でゲーティングした。アッセイの前にレナリドマイドなしでクローンを１０日間増殖した。最も安定した発現レベルのクローンを、スクリーニングに使用した。
【０４８６】
これは、ビーズで細胞を密封し、多孔性ビーズを通して細胞を溶解する実験を説明している。ピコウェルのパターン化された底部を有する９６ウェルプレート（ＭｕＷｅｌｌｓ）を、ウェルの上部を不動態化するために真空を適用せずに、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７洗浄剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて処理した。３０分間のインキュベーション後、過剰な洗浄剤を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または蒸留Ｈ２Ｏで洗い流す。ウェルをエタノールで洗い流し、気流を伴うバイオセーフティキャビネットで乾燥させた。ウェルを強力な真空下でＰＢＳで完全に湿らせ、ＰＢＳをＶｉｒｔｏｎｅｃｔｉｎコーティング試薬（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）と置き換えた。プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。ビトロネクチンコーティング試薬を除去し、レポーター細胞を所望される密度で播種した。細胞播種の瞬間から、アッセイの間中、培地はディッシュに留まる。光切断可能な化合物を運搬するＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズは、ビトロネクチンコーティングの前、または細胞播種後に播種できる。ＰＥＧポリマービーズを、ウェル数を超えて過多に培養物の上部に負荷する。
プレートを４００ｒｃｆで１分間スピンする。３６５ｎｍ  ＬＥＤ光源を使用して、適切な時間、ビーズから化合物を光放出する。イメージング（蛍光レポーターの読み出し）までＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
【０４８７】
構築物。図２０および図２１は、関連する構築物を開示する。これらの図の各々は、ＨｅＬａ細胞ゲノムに組み込まれる配列を開示し、図の各々は、担体配列（レンチウイルスに属する配列）を開示する。レンチウイルスに属する配列は、約１時から約９時までであり、この配列は、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）で囲まれる。約９時から約１時までの配列を、ＨｅＬａ細胞ゲノムに組み込む。詳細には、最初にプラスミドを、プロデューサー細胞（ＨＥＫ９３Ｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にトランスフェクトする。プロデューサー細胞は、レンチウイルスを産生し、その後放出する。その後、放出されたレンチウイルスは、ＨｅＬａ細胞に感染し、核酸をＨｅＬａ細胞ゲノムに組み込む。
【０４８８】
光学。現在の細胞培養実験では、出願人は、ＨＢＯ  １００に接続されたＥＢＱ１００絶縁水銀ランプ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓステージ付きのＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００−Ｍ  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ）に接続されていた。出願人らはまた、水銀ランプを備えたフィルターキューブを使用し、フィルターキューブは励起の波長を制御し、発光の検出の波長も制御した。画像は、Ｂａｓｌｅｒ  ＡＣＡ２４４０−３５ＵＭ（Ｂａｓｌｅｒ  ＡＧ，２２９２６，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で捕捉した。水銀ランプの代替としてハロゲンランプを使用した。マイクロウェルプレート、ピコウェルプレートなどを、プレートホルダーおよびコントローラー付きの「ＸＹステージ」で所定の位置に保持した。光学用のＸＹステージおよび他の正確な位置決めステージは、Ｎｅｗｍａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ  Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｇａｒｉｔａ，ＣＡ、Ａｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ  ＧｍＢＨ，７６２２８  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。
【０４８９】
実施例５．活性化合物についてのＭＤＭ２系アッセイ
アミノ基を含むようにガラスを修飾する。シリカ基質は、複数の「官能性シラン」の１つ以上を介して、アミノ基を含むように修飾できる。これらの「官能性シラン」は、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−アミノプロピル−トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＥＡＰＴＥＳ）、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ）、およびＮ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン（ＡＨＡＭＴＥＳ）である。これらの試薬とガラスとの反応は、気相または液相で行うことができる（Ｚｈｕ，Ｌｅｒｕｍ，Ｃｈｅｎ（２０１２）２８：４１６−４２３を参照されたい）。
【０４９０】
化合物の生化学的アッセイの結果（ＭＤＭ２系アッセイ）。実験方法。以下の試薬をガラススライドに適用した。ガラススライドをアミノ基を有するように修飾した。試薬は、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｍＴＥＴであった。ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドである。ＮＨＳは、活性化エステルの一種である。ＮＨＳは、マイクロビーズまたはマイクロアレイスライドの表面活性化などの生体共役反応反応に有益である（Ｋｌｙｋｏｖ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（２０１５）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．７：６４４３−６４４８）。
【０４９１】
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。ｍＴＥＴは、メチルテトラジンである。この試薬をＤＭＳＯと混合し、次に、２マイクロリットルの容量をスライドガラスに適用した。混合物は、１０マイクロリットルの５０ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｍＴＥＴを３０マイクロリットルのＤＭＳＯと混合することにより作製した。ＮＨＳ基を、スライドガラスのアミノ基と反応させ、その結果、ｍＴＥＴ基をスライドガラスに固定した。ｍＴＥＴの目標は、スライドとビーズとの間に共有結合的な連結を作製することである。
【０４９２】
ＴＣＯおよびテトラジンは、「クリックケミストリー」反応を媒介できる。これらのクリックケミストリー反応の例は、テトラジンで官能化された抗体を使用して、ＴＣＯで官能化されたＤＮＡと結合することである。または、ＴＣＯで修飾された抗体を使用して、テトラジン修飾ビーズと結合する（ｖａｎ  Ｂｕｇｇｅｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．６：２２６７５（ＤＯＩ：１０．１０３８）、Ｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１８：３５２−３６０、Ｈａｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：６６０−６６５を参照されたい）。
【０４９３】
詳細には、スライドガラスを、パラフィルムのシートをスライドの上部に適用することにより調整し、パラフィルムは、中央から切り取られた穴を有し、上記の混合物の液滴を、スライドガラスに対して直接的に穴に適用した。混合物を適用する前に、パラフィルムにおける開口領域（穴）に混合物を適用した後の液体の浸出を防ぐために、パラフィルムとスライドとの間に密着したシールを作製するために、パラフィルムを上に置いたスライドガラスを完全な熱で９０秒間加熱した。２マイクロリットルの液滴が、パラフィルムのカットされた穴に位置するスライドガラスを、室温で一晩インキュベートした。インキュベーション中、スライドガラスは、ペトリ皿の内側にあり、ディッシュは、ペトリ皿の上部および側面を覆うカバーガラスで覆われた。一晩のインキュベーションの前に、水が液滴から蒸発するのを防ぐために、正方形のパラフィルムを、液滴を覆っておよびパラフィルム周囲を覆って配置した。
【０４９４】
スライド／ビーズ／抗体の複合体を作製するための独創的な方法。出願人の方法は、ＴＣＯにより官能化されたビーズを使用した。ビーズのＴＣＯ基は、メチルテトラジン官能化スライドのビーズへの共有結合的な付着を媒介した。また、ビーズのＴＣＯ基は、メチルテトラジン官能化抗ｐ５３抗体のビーズへの共有結合的な付着を媒介した。
【０４９５】
驚くべきことに、出願人らは、第１のステップが、スライドおよびビーズを接触させることである場合に、その後の抗体の追加は、抗体のビーズへの共有結合的な付着をもたらさないであろうことを見出した。また、驚くべきことに、出願人は、第１のステップが、ビーズを抗体と接触させることである場合に、その後この混合物をスライドに移しても、ビーズのスライドへの共有結合的な付着をもたらさないであろうことを見出した。好ましい方法において、これらの３つの試薬すべて、スライド、ビーズ、および抗体は、同時に互いの接触をもたらす。別の好ましい実施形態において、ビーズおよび抗体を最初に混合して、ビーズと抗体の共有結合的な連結を開始し、次にすぐに、または数分以内に、この混合物をスライドに適用し、結果は、スライドへのビーズの共有結合的な連結である。
【０４９６】
酵素系スクリーニングアッセイの性質。アッセイは、ビーズが付着したスライドガラスの形態をとる。ビーズは、転写因子ｐ５３への結合に特異的である付着抗体を含む。この抗体は、ヒトｐ５３およびユビキチン化ヒトｐ５３に結合できる。これまでのところ、アッセイ方法は以下の試薬間のサンドイッチを伴うことを理解できる：
スライド／共有結合的に結合するビーズ／ビーズ結合抗ｐ５３  Ａｂ／ユビキチン化ｐ５３
このアッセイからの読み出しは、ユビキチン化ｐ５３であり、ユビキチン化ｐ５３は、ユビキチンに特異的である蛍光抗体により検出される。詳細には、抗体は、ヤギで作製されたポリクローナル抗体であり、抗体は、フルオロフォア（ＡＦ４８８）でタグ付けされている。図８は、ＡＦ４８８の構造を開示する。この蛍光抗体は、ユビキチンに結合する。したがって、ユビキチン化ｐ５３が検出された場合、以下のサンドイッチが存在する：
スライド／共有結合的に結合するビーズ／ビーズ結合結合抗ｐ５３  Ａｂ／ユビキチン化ｐ５３／蛍光Ａｂ
【０４９７】
実施例６．ピコウェル内においてＤＮＡをシーケンシングする
ビーズ結合ＤＮＡバーコードのシーケンシングを実行し、ビーズは、ピコウェルごとに１つのビーズをピコウェル内に位置した。アッセイ法は、蛍光ヌクレオチドの一過性結合を介した一度に１つずつのビーズ結合ＤＮＡバーコード上の各位置を調査することを伴う。各ビーズは、約１００アトモルの結合ＤＮＡバーコードを含み、結合は、クリックケミストリーによるものであった。この数は、ビーズごとに結合した約６，０００万のオリゴヌクレオチドに相当する。ＤＮＡバーコード上の各塩基について、アッセイは、同時に４つすべての蛍光ｄＮＴＰを追加する。いかなる限定を意味することなく、４つの蛍光ｄＮＴＰは、ＡＦ４８８−ｄＧＴＰ、ＣＹ３−ｄＡＴＰ、ＴｅｘａｓＲｅｄ−ｄＵＴＰ、およびＣＹ５−ｄＣＴＰであった。蛍光シグナルを取得し、次にＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、ＮＩＨ）により処理し、対応する数値を提供する。データは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部であった５つの連続したヌクレオチド（すべて連続）のシーケンシングからである。ビーズ結合ＤＮＡバーコードは、ＤＮＡヘアピン領域を含む。ＤＮＡヘアピン領域の塩基は、それ自体にアニールしてヘアピンが形成され、ＤＮＡヘアピンの３’末端ヌクレオチドは、シーケンシングプライマーとして機能した。一過性結合によるシーケンシングは、この３’末端で開始した。シーケンシングアッセイを３回、つまり３つの異なるビーズを使用して実施し、１つのＤＮＡバーコード配列を３つのビーズの各々に使用した。換言すると、３つのビーズの各々は、他の２つのビーズにより提供されるものと同一の読み出しをシーケンシングすることを提供することが期待される。
【０４９８】
図２８は、シーケンシング結果を開示し、シーケンシングは、ビーズ結合ＤＮＡバーコード上で行った。示されるのは、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、第４の塩基、および第５の塩基を調査した結果である。これらの塩基の各々について、別々のヒストグラムバーを介して別々に示されているのは、それぞれＡＦ４８８−ｄＧＴＰ、ＣＹ３−ｄＡＴＰ、ＴｅｘａｓＲｅｄ−ｄＵＴＰ、およびＣＹ５−ｄＣＴＰを用いた調査により生成された蛍光発光である。４つのヒストグラムバーの各々は、ＡＦ４８８−ｄＧＴＰ（黒色の輪郭、灰色の内部）、ＣＹ３−ｄＡＴＰ（黒色の輪郭、白色の内部）、ＴｅｘａｓＲｅｄ−ｄＵＴＰ（黒色一色のヒストグラムバー）、およびＣＹ５−ｄＣＴＰ（灰色一色のヒストグラムバー）の異なるグラフィックスを有する。水溶液で膨潤させた後、ビーズの直径は、１０〜１４マイクロメートルであった。ピコウェルの容積は、１２ピコリットルであった。
【０４９９】
調査した鋳型配列は、５’−ＣＴＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＴ−３’であった。この特定のシーケンシングアッセイでは、５つの連続した塩基を調査し、最大の蛍光シグナルを与えた蛍光ｄＮＴＰは、蛍光ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＧＴＰであり、ｄＣ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡ、およびｄＣである鋳型上の配列に対応する。したがって、シーケンシング結果は、１００％正確であった。結果は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードをシーケンシングできること、つまり、ＤＮＡバーコードが依然としてビーズに結合していることを示す。換言すると、ビーズ結合ＤＮＡバーコードは、シーケンシング可能である。
【０５００】
実施例７．細胞のバーコード化
バーコード化の概念についての導入。これは、バーコード化の概念を導入する。一般的なバーコード化技術は、所定の単一細胞のトランスクリプトームをバーコード化することである。図３６および図３７は、将来のシーケンシングに備えて、トランスクリプトームが捕捉および増幅される手順のステップを示す。図３６は、ｍＲＮＡを放出するための細胞の溶解、その後の逆転写を示す。図３７は、固定化されたポリ（ｄＴ）を介したｍＲＮＡの捕捉、その後の逆転写、および最終的なシーケンシングを示す。シーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用できる。
【０５０１】
所定の細胞からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の一部または大部分は、共通のバーコードを用いてタグ付けでき、このタグ付けにより、研究者は、任意の所定のｍＲＮＡ配列について、所定の細胞に関するそのコード化配列の起源を特定できる。例えば、１００の異なる単一細胞からの別々のトランスクリプトームの各々を表す核酸が、一緒に混合され、１００の異なる単一細胞の各々からの核酸は、その独自のバーコードを有し、次に、以下の利点が生じるであろう。利点は、すべてのトランスクリプトームからの核酸を１つの試験管で一緒に混合し、次に、次世代シーケンシングに供することができることであり、バーコードにより、ユーザーは同じ細胞からの情報を特定できる。
【０５０２】
上記の利点は、以下のように別の方法で記載される。ｍＲＮＡバーコードを使用する場合、所定の単一の細胞は、その細胞からのｍＲＮＡ分子の一部または大部分からの情報がｃＤＮＡの対応する分子に変換されるように処理され、これらのｃＤＮＡ分子の各々は、完全に同じＤＮＡバーコードを有する。このバーコード化手順は、１０、２０、１００、数百、または１，０００を超える異なる細胞で繰り返すことができ、これらの細胞の各々からのｃＤＮＡ分子は、固有の細胞特異的なバーコードを有することにより識別される。この方法により、研究者は、すべての細胞からのすべてのバーコード化されたｃＤＮＡ分子のプールから、すべて１回のシーケンシングでＤＮＡシーケンシングを実行できる（シーケンシング前に、すべてのバーコード化されたｃＤＮＡ分子が混合される）（Ａｖｉｔａｌ，Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｙａｎａｉ（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１５：１１０を参照されたい）。
【０５０３】
原形質膜にタグを付けるバーコードと比較した、核酸にタグを付けるバーコード。化学物質のライブラリを調整するためのガイダンスが利用可能であり、各化学物質、または化学物質の各クラスのすべてのメンバーは、固有のＤＮＡバーコードに関連付けられる（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：５３８１−５３８３、Ｂｏｓｅ，Ｗａｎ，Ｃａｒｒ（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６：１２０．ＤＯＩ  １０．１１８６を参照されたい）。上記のバーコード化の例を念頭に置いて、以下は、特定の単一細胞にも適用できる別の種類のバーコード化を提供する。本開示は、細胞の原形質膜に安定して付着されるタグの形態をとる細胞関連バーコード化を提供する。
【０５０４】
原形質膜結合に付着する少なくとも２種類のバーコードの選択肢。所与の細胞の原形質膜にタグを付けるために使用されるバーコードは、細胞の種類を特定する第１のバーコード、および細胞に曝露された摂動因子を特定する第２のバーコードを含み得る。例えば、第１のバーコードは、健康なヒト対象、臨床研究番号７からのヒト対象番号３８、ヒト原発性結腸直腸がん細胞株、５回継代されたヒト原発性結腸直腸がん細胞株、多発性骨髄腫を有する多発性骨髄腫ヒト対象、多発性骨髄腫を有する未治療ヒト対象番号２３、または多発性骨髄腫を有する治療経験のあるヒト対象番号３２に由来するものとして細胞を特定できる。
【０５０５】
また、バーコードは、その特定の単一細胞に与えられた「摂動因子」を特定できる（バーコードの前または後に与えられる）。「摂動因子」は、抗がん剤、抗がん剤の組み合わせ、組み合わせて生成された化合物、または抗体薬剤および小分子剤の組み合わせであり得る。バーコード化を、所定の単一細胞を追跡するために使用でき、かつその細胞を、１つ以上の細胞シグナル伝達経路による活性化または阻害、遊走の増加または減少、アポトーシス、ネクローシス、１つ以上のＣＤタンパク質（ＣＤ；分化クラスター）の発現の変化、１つ以上のがん遺伝子の発現の変化、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現の変化などのその後の挙動と相関させるために使用できる。発現は、転写速度、細胞内の所与のポリペプチドのレベル、所与のタンパク質の位置の細胞質ゾルから膜結合型への変化などに関してであり得る。
【０５０６】
膜結合糖タンパク質の細胞表面オリゴ糖のタグ付け。方法および試薬は、ＤＮＡバーコードなどのタグを生細胞の原形質膜に接続することが可能である。タグ付けは、膜結合型糖タンパク質のオリゴ糖鎖を攻撃して共有結合的に結合する反応性部分を有するＤＮＡバーコードの共有結合複合体からなる試薬で達成できる。文献では、ヒドラジドビオシチンを使用して、ビオチンを膜結合糖タンパク質上の炭水化物に接続できることが確立されている。本開示は、ビオチンがＤＮＡバーコードで置き換えられている場合を除いて、この試薬を使用する。炭水化物は、アルデヒドを形成するために酸化される必要がある。ヒドラジドは、アルデヒドと反応してヒドラジ連結を形成する。オリゴ糖上のシアル酸成分は、１ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で簡単に酸化される。酸化ステップ、およびヒドラジド連結ステップを実行する場合、一級アミン基を有するバッファーは避ける必要がある。例えば、「ＥＺ−ＬｉｎｋＨｙｄｒａｚｉｄｅ  Ｂｉｏｃｙｔｉｎ．番号２８０２０．ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（２０１６）の指示書（４ページ）、Ｂａｙｅｒ（１９８８）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０：２７１−２８１、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４２：５１９−５２６、Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ，Ｂｉｂｅｌ，Ｗａｔｔｓ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：３７８−３８６を参照されたい。
【０５０７】
生細胞上の糖タンパク質のオリゴ糖部分にタグ付けする別の方法は、過ヨウ素酸酸化およびアニリン触媒オキシム連結を使用することである。この方法では、シアル酸の穏やかな過ヨウ素酸酸化を使用してから、次に、アニリンの存在下でアミノキシタグと連結する。この方法のバリエーションでは、ガラクトースオキシダーゼを使用して、オリゴ糖の末端ガラクトース残基および末端Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基にアルデヒドを導入できる。ガラクトースオキシダーゼは、炭素６で酸化を触媒して、アルデヒドを生成する。アルデヒドの生成後、アニリン触媒による連結を使用してアミノキシビオチンと結合できる（Ｒａｍｙａ，Ｃｒａｖａｔｔ，Ｐａｕｌｓｏｎ（２０１３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２３：２１１−２２１を参照されたい）。本開示は、ビオチンをＤＮＡバーコードで置き換え、アミノキシ−ＤＮＡバーコードのアニリン触媒による連結を提供する。
【０５０８】
細胞表面に結合した抗体により媒介されるタグ付け。本開示は、細胞の原形質膜にバーコードを付着させるための方法および試薬を提供し、付着は、膜結合タンパク質に特異的に結合する抗体により媒介される。抗体は、トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）で共有結合的に修飾でき、この修飾は、４度で一晩インキュベートして実施できる（Ｄｅｖａｒａｊ，Ｈａｕｎ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ（２００９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．４８：７０１３−７０１６のサポート情報（５ページ）を参照されたい）。抗体のこの共有結合的な修飾は、試薬、トランス−シクロオクテンスクシンイミジルカーボネートを用いて実行できる（Ｄｅｖａｒａｊ，Ｈａｕｎ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ（２００９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．４８：７０１３−７０１６）。次に、抗体−テトラジン複合体を細胞と接触させて、膜結合抗体を得ることができる。膜結合抗体は、テトラジン部分をそれぞれ有しており、これにより、抗体をＤＮＡバーコード−テトラジン複合体に曝露するなど、クリックケミストリーを介して抗体のタグ付けを可能にする。
【０５０９】
テトラジンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）試薬を使用して、抗体の遊離アミノ基に導入できる（ｖａｎ  Ｂｕｇｇｅｎｕｍ，Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｍｕｌｄｅｒ（２０１６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．６：２２６７５を参照されたい）。抗体に１つ以上のテトラジン基が含まれると、ＴＣＯ−ＤＮＡバーコードである試薬を介してＤＮＡバーコードを付加することにより、抗体をさらに修飾できる。この修飾抗体を手に入れれば、抗体は、タグ付け生細胞に使用でき、抗体は、細胞の膜結合タンパク質に結合する。
【０５１０】
テトラジン−ＤＮＡバーコードの複合体が調整できる。次に、この複合体を細胞培地に導入することができ、培地は、細胞を含み、細胞は、付着された抗体−ＴＣＯ複合体を有する。テトラジン−ＤＮＡバーコードが、膜結合抗体−ＴＣＯ複合体と接触すると、クリックケミストリー反応をもたらし、細胞は、ＤＮＡバーコードでタグ付けされる。このクリックケミストリー反応は、３７度で３０分間実行できる。
【０５１１】
上記の手順における使用に好ましい抗体は、原形質膜の膜結合タンパク質にしっかりと特異的に結合するものであり、膜結合タンパク質は、例えば、細胞膜あたり５０，０００コピーを超える高い存在量で生じ、膜結合タンパク質は、細胞表面で安定しており、細胞の内部にそれほど再循環せず、膜結合膜は、培養培地内にそれほど脱落しない。
【０５１２】
膜結合タンパク質にアジドでタグ付け、続いて、オクチン複合体を用いたクリックケミストリー。アジドは、リポ酸リガーゼ酵素を介して生細胞の膜結合タンパク質上に導入し、その後、ＤＮＡバーコードに複合されたフッ素化オクチン化合物を付着できる。フッ素化オクチン化合物のフルオロフォアへの複合が記載される（Ｊｅｗｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３９：１２７２−１２７９、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｔｉｎｇ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１４８３−１４８７を参照されたい）。繰り返すが、「Ｔｉｎｇおよび同僚は、リポ酸リガーゼを使用して哺乳動物細胞表面タンパク質にアジドを導入し、その後、タンパク質をフッ素化シクロオクチン複合化蛍光色素−複合化蛍光色素で標識化できた」（Ｊｅｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ、前述）。
【０５１３】
実施例７．ピコウェルを覆うキャップ
キャップ化ピコウェル。各ピコウェルは球でキャップされ、各ピコウェルに１つの球があり、球はピコウェルの穴（上部開口）にフィットする。球をピコウェルプレートに適用するには、球を成長培地に入れて懸濁し、次に、ピコウェルプレートの上面に適用し、球を沈降させる。次に、各ピコウェルの穴に球をしっかりと固定するために、プレート全体を遠心機に入れ、低重力で回転させる。
【０５１４】
能動的キャップおよび受動的キャップ図１８Ａは、ピコウェルの上部に挿入された能動的キャップを示し、図１８Ｂは、ピコウェルの上部に挿入された受動的キャップを示す。好ましくは、キャップは、ピコウェルプレートを作製するために使用される材料よりも柔らかい材料で作製され、その結果、ピコウェルの穴に押し込まれた際にキャップがわずかに変形し、その結果、漏れを防ぎぴったりとフィットする。実施形態において、本開示は、能動的キャップ、受動的キャップ、または能動的キャップおよび受動的キャップの両方のうちの１つ以上を提供する。各キャップは、独立しており、他のキャップのいずれにも接続されていない。代替的な実施形態において、例えば、プレートの上面に置くことが可能なポリマーのシートを介して、より多くのキャップを一緒に接続し得、複数のキャップは、ポリマーのシートの底部から突出しており、突出したキャップは、各ピコウェルにフィットするように一定の間隔である。ピコウェルの床に位置することが可能なビーズの代わりに能動的キャップを使用し得る。能動的キャップは、実質的に同一の化合物の多くの付着されたコピーを含み、各化合物は、能動的キャップ（ここでは球状ビーズの試料において示される）に付着され、切断により、ピコウェル内に存在する溶液への化合物の放出が生じる（図１８Ａ）。
【０５１５】
受動的キャップに関しては、受動的キャップは、多孔性であり、それはスポンジのように機能する。生化学反応から生成物を吸収するため、ユーザーの目的が、ピコウェル内の培養物である生きている生物細胞に対する所定の化合物の影響を決定することである場合、生成物の収集を容易にする。換言すると、化合物は、細胞を刺激して応答し、応答は、１つ以上の代謝物の発現の増加（または減少）の形態をとり、いくつかの代謝物は、受動的キャップに向かって拡散し、受動的キャップにより吸収される。次に、ユーザーは、受動的キャップを収集し、受動的キャップに吸収されている代謝物を分析できる（図１８Ｂ）。
【０５１６】
キャップのアレイに付着するポリマーマット。図１９は、多孔性キャップのアレイの各キャップに接着することが可能なポリマーマットを示す。接着したら、ポリマーマットを剥がして除去し、アレイ内のその各多孔性キャップを共に運ぶことができる。その結果として、多孔性キャップを伴うポリマーマットは、多孔性キャップに関連する代謝物または他の化学物質を測定するアッセイに使用できる。
【０５１７】
段階的な例を提供するために、数千のピコウェルのアレイにおける各ウェルは、１つのビーズを含むことができ、各ビーズは、１種類の化合物を含み、化合物は、切断可能なリンカーを介して付着される。ピコウェルは、溶液および培養された細胞も含む。ピコウェルは、多孔性キャップで密封されており、多孔性キャップは、溶液と接触し、培養された細胞から放出された代謝物を捕捉（試料；吸収；吸収）できる。代謝物は、化合物の代謝物であるか、または代謝産物は、サイトカイン、インターロイキン、中間代謝物の生成物、マイクロＲＮＡ分子、エキソソームなどの形態をとることができる。最後に、ポリアクリルアミドの溶液をピコウェルプレートを覆って注ぎ、ポリアクリルアミドを何千もの多孔性キャップに浸漬し、次に、キャップの各々およびすべてにしっかりと接着されるマットの形態で固化する。次に、固化したマットを除去し、各キャップを吸収された代謝物について別々に分析する。
【０５１８】
好ましい実施形態において、ポリアクリルアミドゲルを使用して、キャップ化ビーズを噛み合わせ層またはマットに架橋する。ポリアクリルアミド溶液の２０％溶液を作製するプロトコルは、ピコウェルアレイを覆って注ぎ、キャップ化ビーズを硬化および噛み合わせることができる。４ｍｌの４０％ビス−アクリルアミド溶液および２ｍｌの１．５ＭトリスｐＨ  ８．８を、１．８ｍｌの蒸留脱イオン水に追加する。キャップされたピコウェルアレイを覆ってこの混合物を注ぐ直前に、８０マイクロリットルのフリーラジカル初期化過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、１０％ストック溶液）、および８マイクロリットルのフリーラジカル安定剤Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を追加して、ゲルの架橋を開始する。完全に架橋する前にゲル層を注ぎ、キャップされたピコウェルアレイを覆って完全に架橋させる。完全に架橋されると（操作に十分な硬さ、またはおよそ６０分の硬化）、ピンセットを使用してポリアクリルアミド層を剥がすことができる。キャップ化ビーズをピコウェルの上部から持ち上げ、ポリアクリルアミド層に付着していることがわかる。この挙動は、ポリアクリルアミドビーズ、Ｔｅｎｔａｇｅｌビーズ、ポリスチレンビーズ、およびシリカビーズを含む多数のビーズ種で観察できる。
【０５１９】
漏れを防止するキャップの有効性を測定する。実施形態において、キャップの有効性は、光切断可能なリンカーを有するビーズを使用することにより決定できる。ピコウェルの画像、または１つの特定のピコウェルアレイ内のいくつかのピコウェルの画像は、ピコウェルをＵＶ光に曝露する直前、およびピコウェルをＵＶ光に曝露した後の時間枠で捕捉できる。例えば、画像は、ｔ＝マイナス１０秒で、ならびにｔ＝１０秒、２０秒、４０秒、６０秒、２分、４分、８分、１５分、６０分、９０分、２時間、３時間、および４時間で捕捉できる。２時間での所定のウェルの蛍光が、ｔ＝１０秒で見られる蛍光の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または約１００％に等しい場合に、優れた有効性を示すことができ、背景画像のサブトラクションは、ｔ＝マイナス１０秒で取得した。ピコウェルの外側のピコウェルプレートの領域、例えば、キャップのすぐ近くの画像を撮影することもできる。プレートの表面（ピコウェルの外側）の領域とおよびキャップのすぐ近くの領域の蛍光が、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５未満、０．０１％未満、０．００５％未満、または０．００１％未満の場合に、優れた有効性を示すことができる。この比較は、ウェル内の流体の体積に関係なく、かつプレートの上部およびキャップの外側にあるいかなる流体の体積に関係なく行うことができ、ここでは、比較は、光検出器により捕捉された視野全体を単に考慮に入れてもよい。代替的、流体の深さ（ピコウェルの深さ、ピコウェルプレート上部の流体の深さ）を修正して比較を行うこともできる。また、代替的に、比較は、ピコウェルプレートの表面全体にわたる任意の漏出性のフルオロフォアの拡散を考慮に入れてもよい。
【０５２０】
バーコードが本開示の試薬および方法にどのようにフィットするのか。以下は、本開示の試薬および方法のさらなる実施形態を提供する。
【０５２１】
試薬および能力。微視的ビーズが、提供される。微視的ビーズは、複数の第１のリンカーにより共有結合的に修飾することができ、各々が、モノマーとの固相合成によりカップリングすることが可能であり、固相合成の完了により、化学ライブラリのメンバーが作製される。化学ライブラリのこのメンバーは、ビーズ結合である。同じ微視的ビーズは、第２のリンカーにより共有結合的に修飾され得、各々が、複数のＤＮＡバーコードと結合することが可能である。ＤＮＡバーコードのこのメンバーは、ビーズ結合である。
【０５２２】
実施例９．現在の開示のＤＮＡバーコード
これは、紙に印刷する、またはコンピュータ言語で保存することのできる、一連の情報に関し、ＤＮＡ配列と化合物ライブラリメンバーとを関連付ける「ＤＮＡバーコード」を提供する。このＤＮＡバーコードは、「レジェンド」または「キー」と称され得る。ＤＮＡバーコードは、特定のＦＤＡ承認抗がん剤の類似体など、特定のクラスの化合物を特定できる核酸も提供し、またはユーザーの名前を特定する、またはビーズ結合化学ライブラリで試験する特定の疾患を特定できる。
【０５２３】
実施例１０．レナリドミド類似体
図１３、１４、および１５は、レナリドマイドの３つの異なる誘導体への変換を開示しており、各誘導体は、カルボン酸基を有する。これらのカルボン酸基の各々は、その後、ビーズ−リンカー複合体と縮合するために使用することができる。この状況では、カルボン酸基が、ビーズ−リンカー複合体に縮合され、それは、以前にＦｍｏｃで占められていた位置に付着する。
【０５２４】
第一級アミンから開始し、それをカルボン酸に変換する（図１３）。出願人は、第一級アミンを有する化合物をカルボキシル基を有する化合物に変換することにより、化合物のライブラリを生成するアプローチをとる。図１３は、レナリドマイドから開始することを開示する。レナリドマイドは、第一級アミンを有する。これに、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）中の無水コハク酸を追加する。無水コハク酸は、第一級アミノ基と縮合し、カルボン酸基を有するレナリドマイドをもたらす。図における「ｃａｔ．」という用語は、触媒的であることを意味する。
【０５２５】
その後、このカルボン酸基をビーズに連結することができる。したがって、もたらされる複合体は、以下である：ＢＥＡＤ−コハク酸部分−レナリドマイド
【０５２６】
図１４は、リナリドマイドから開始して、ｔ−ブチル−ブロモ酢酸を追加して、中間体を与えることを開示する。次に、中間体をＦｍｏｃＯＳｕ（ｏ−スクシンイミド）で処理し、レナリドマイドのカルボン酸誘導体である最終生成物を生成する。次いで、カルボン酸部分は、遊離アミノ基、例えば、付着されたＦｍｏｃ基を有していた遊離アミノ基と縮合することができる。代替的に、カルボン酸は、ビーズ上に存在する化学モノマーの遊離アミノ基と縮合することができ、縮合の結果は、互いに付着された２つの化学モノマーである。
【０５２７】
図１５は、レナリドマイドを開始物質として開示する。レナリドミドは、３−カルボキシベンズアルデヒドと反応し、アルデヒド基は、アミノ基と縮合し、レナリドイミドのさらに別の種類のカルボン酸誘導体をもたらす。
【０５２８】
図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、新規かつ固有のビーズ結合化合物のライブラリを生成するための、出願人のさらに別のアプローチを開示し、化合物は、ビーズから放出され、次いで細胞系アッセイまたは無細胞アッセイでの活性が試験される。３つの化合物の各々は、レナリドマイド類似体であり、第一級アミンは、ベンゼン環の固有の位置にある。
【０５２９】
実施例１１．結合応答捕捉要素を有するビーズと一緒に細胞を含むピコウェル
本開示は、化合物に対する細胞の応答を評価するための試薬、システム、および方法を提供し、測定される応答は、トランスクリプトームの変化の形態をとる。「トランスクリプトームの変化」とは、いかなる限定も意味せずに、細胞内の各々およびすべての種類の固有のｍＲＮＡの量の変化、ならびに細胞内の予め決定された一連のｍＲＮＡ分子の量の変化を指すことができる。「トランスクリプトームの変化」は、検出下限未満から検出可能になるまでの変化、ならびに検出可能から検出下限未満に低下するまでの変化が含まれ、これらの変化は、ビーズ結合化合物の放出に関連する。
【０５３０】
ピコウェルアレイに洗浄剤または界面活性剤を追加することにより、細胞を溶解できる。例えば、洗浄剤を含むバッファーの体積は、その中に何千ものピコウェルを含むマイクロウェルに分注できる。洗浄剤をすべてのピコウェルに拡散させ、細胞内の溶解を引き起こし、ｍＲＮＡを放出させ、最終的にビーズ結合「捕捉応答要素」により結合することができる。
【０５３１】
細胞溶解。細胞は、凍結および解凍の１回以上のサイクルにより溶解できる（Ｂｏｓｅ，Ｗａｎ，Ｃａｒｒ（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６：１２０．ＤＯＩ  １０．１１８６）。細胞はまた、振盪しながらペルフルオロ−１−オクタノールで溶解することもできる（Ｍａｃｏｓｋｏ，Ｂａｓｕ，Ｓａｔｉｊａ（２０１５）Ｃｅｌｌ．１６１：１２０２−１２１４、Ｚｉｅｇｅｎｈａｉｎ（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．６５：６３１−６４３、Ｅａｓｔｂｕｒｎ，Ｓｃｉａｍｂｉ，Ａｂａｔｅ（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２：ｅ１２８）。また、細胞は、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標））およびプロテアーゼの組み合わせにより溶解できる（Ｅａｓｔｂｕｒｎ，Ｓｃｉａｍｂｉ，Ａｂａｔｅ（２０１３）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８５：８０１６−８０２１）。細胞の溶解は、ｍＲＮＡの放出をもたらす。ｍＲＮＡは、溶解した細胞と同じピコウェルに存在するビーズにより捕捉される。ビーズは、膨大な数のビーズ結合ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、２つの核酸を含み、第１の核酸は、共通のＤＮＡバーコードを含み、第２の核酸は、「応答捕捉要素」を含む。目的は、細胞内のすべてのｍＲＮＡを無差別に捕捉することであり、「応答捕捉要素」は、ポリ（ｄＴ）の形態をとることができる。このポリ（ｄＴ）は、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テールに結合する。
【０５３２】
より多くの細胞溶解条件。細胞溶解は、ナトリウム塩を含む洗浄剤、例えば、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００  ｍＭＮａＣｌを含む０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくは１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはカリウム塩を含む洗浄剤、例えば、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌを含む０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌを含む０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌを含む０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくは１５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌを含む０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００への曝露により影響され得る。曝露は、約４度、または室温（２３度）で１０分間、２０分間、４０分間、または６０分間などで行うことができる。
【０５３３】
本開示は、発現プロファイルに対する化合物の影響を評価することができる。ビーズ結合捕捉要素は、目的の１つ以上のｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズできる１つ以上のデオキシリボヌクレオチドの形態をとることができ、１つ以上のｍＲＮＡ分子は、特定の疾患に関連する。例えば、結腸がんなど、様々な疾患の発現プロファイルが利用できる（Ｌｌａｒｅｎａ（２００９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１５５（ｅ２２１８２）、ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ（Ｓｐｅｎｔｚｏｓ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：７９１１−７９１８）、およびｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：１６７９−１６８８）。同様の例を挙げると、特徴付けされるのは、肝臓に転移している非肝腫瘍細胞に関連するｍＲＮＡに対して放出された化合物の影響である（Ｂａｒｓｈａｃｋ，Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ｂｒｏｎｆｅｌｄ（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１５  Ｓｕｐｐｌ．１１０２６、Ｂａｒｓｈａｃｋ（２０１０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４２：１３５５−１３６２を参照されたい）。
【０５３４】
トランスクリプトームを捕捉する。それらのポリＡ基を固定化されたポリ（ｄＴ）にハイブリダイズすることによりｍＲＮＡを捕捉する方法が利用可能である（Ｄｕｂｉｌｅｙ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２２５９−２２６５、Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ａｓｏ，Ｓｈｉｍａｄａ（１９９８）ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．４４：２２５６−２２６３、Ｄ．Ｓ．Ｈａｇｅ（２００５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，５４９ページを参照されたい）。
【０５３５】
溶解された細胞から放出されたｍＲＮＡ分子を捕捉した後、ビーズ結合ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡからの逆転写を支持するプライマーとして機能し、ビーズ結合相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をもたらし、このビーズ結合ｃＤＮＡは、シーケンシングできる。代替的に、ビーズ結合ｃＤＮＡは、ビーズから放出させることができ、ビーズ結合「応答捕捉要素」は、光切断可能なリンカーなどの切断可能なリンカーを用いてビーズに結合される。光切断可能なリンカーを使用する場合、ビーズ結合化合物（化学モノマーライブラリから作製された化合物）を放出するための条件を切断するが、ビーズ結合「応答捕捉要素」をさらに切断しない。
【０５３６】
細胞が、ビーズ結合化合物またはビーズから放出された化合物に曝露される場合、例えば、化合物への曝露の有無にかかわらずトランスクリプトームの変化を特徴付けることにより、細胞を遺伝的応答についてスクリーニングすることができる。また、表現型応答、例えばアポトーシス、１つ以上の細胞シグナル伝達タンパク質の活性の変化、または１つ以上のＣＤタンパク質の細胞表面発現の変化について細胞をスクリーニングすることができる。ＣＤは、分化クラスターである（Ｌａｌ（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．８：７９９−８０４、Ｂｅｌｏｖ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４４８３−４４８９、ＩＵＩＳ／ＷＨＯ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ＣＤ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（１９９４）Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇ．７２：８０７−８０８、ＩＵＩＳ−ＷＨＯ  Ｎｏｂｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１９８４）Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇ．６２：８０９−８１１を参照されたい）。いくつかの表現型応答アッセイでは、細胞を溶解してはいけない。
【０５３７】
本開示は、例えば、単一細胞をピコウェル内で曝露が生じる１つの種類の薬物に曝露することにより、異なる薬物を異なる細胞に分配するという満たされていない必要性に対処する。
【０５３８】
本開示はまた、バーコード化されたｍＲＮＡを調製する必要性を排除し、ｍＲＮＡは、細胞から放出され、続いてｃＤＮＡを調製する（この種類のバーコードでは、トランスクリプトームが、対応するｃＤＮＡのライブラリにカバーされると、所定の細胞からのすべてのｍＲＮＡが、同じバーコードを受け取る）。
【０５３９】
摂動因子を伴う細胞インキュベーション中のパラメータ。任意の所定の化合物またはいくつかの他の種類の摂動因子について、光、温度、細胞培地のｐＨ、音、濃度、および試薬への曝露時間（試薬は、ビーズから放出された化合物、酵素基質、サイトカイン、既に確立された薬物である化合物、塩であり得る）、機械的攪拌、細胞表面タンパク質に対する抗体などを変動または制御できるパラメータである。
【０５４０】
細胞をバーコード化する。細胞は、ビーズ結合化合物と、またはビーズ結合切断可能なリンカーからの切断後の化合物とインキュベートすることができる。インキュベーション中または後に、細胞は、摂動因子を特定する膜結合バーコードを用いてバーコード化できる。この膜結合バーコードは、細胞膜のオリゴ糖、細胞膜のポリペプチド、または細胞膜のリン脂質に結合することができる。
【０５４１】
ポリ（ｄＴ）以外の応答捕捉要素。メッセンジャーＲＮＡは、５プライムの７メチルグアノシンキャップを介して捕捉できる。この方法は、ポリＡテールが短い場合に特に有益である（Ｂｌｏｗｅｒ，Ｊａｍｂｈｅｋａｒ（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ．８：ｅ７７７００を参照されたい）。また、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのコード化領域に特異的な固定化されたＤＮＡを使用して捕捉できる。この方法は、「ＲＮＡエクソーム捕捉」と称され、この名前のバリエーションである。Ｃｉｅｓｌｉｋらによれば、「トランスクリプトミクスを捕捉するために固有なのは、エクソン標的化ＲＮＡプローブを使用した一晩の捕捉反応（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション）である」（Ｃｉｅｓｌｉｋ（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２５：１３７２−１３８１）。
【０５４２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）。本開示は、所定の細胞内のｍｉＲＮＡの発現プロファイル、または代替的に、所定の種のｍｉＲＮＡにより特異的に結合されるｍＲＮＡの集団の発現プロファイルに対する、放出されたビーズ結合化合物の影響を評価することができる（Ｊａｉｎ，Ｇｈｏｓｈ，Ｂａｒｈ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．５：１２８３２）。例えば、本開示は、（１）ビーズ結合化合物、（２）ビーズ結合ＤＮＡバーコード、および（３）ビーズ結合応答捕捉要素を含むビーズを提供し、応答捕捉要素は、ｍｉＲＮＡを捕捉するか、または応答捕捉要素が、ｍｉＲＮＡの種（応答捕捉要素の一部として）を含むかのいずれかである。マイクロＲＮＡの発現プロファイルは、様々な種類のがん、例えば、乳がん、乳がんで見出されている（Ｔａｎｊａ（２００９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：１５  Ｓｕｐｐｌ．５３８）。
【０５４３】
トランスクリプトーム全体からｍＲＮＡの選択された集団を捕捉する方法が利用可能である。選択性は、ｍｉＲ−３４ａなどの１種類のマイクロＲＮＡを「プルダウン」アッセイの架橋化合物として使用することにより付与できる。簡単に言えば、「ｍｉＲ−３４ａでプルダウンされた転写産物は、成長因子のシグナル伝達および細胞周期の進行におけるその役割について豊富である」（Ｌａｌ，Ｔｈｏｍａｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（２０１１）ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７：ｅ１００２３６３）。捕獲されるｍＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−３４Ａに結合するものである。
【０５４４】
ｍＲＮＡを捕捉し、発現レベルを分析するためのさらなる方法が、利用可能である（Ｂａｃｈｅｒ（２０１６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１７：６３、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４：３８１、Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ（２０１６）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌ．４：２４３、Ｇａｒｄｉｎｉ（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２：４４３）。エンハンサーＲＮＡにおいて変化の形態をとる細胞応答を測定できる（Ｒａｈｍａｎ（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４５：３０１７を参照されたい）。
【０５４５】
本発明は、本開示の組成物、試薬、方法、システム、診断、実験室データなどにより限定されるべきではない。また、本発明は、本明細書に開示される、あらゆる好ましい実施形態により限定されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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