(57)【要約】  本発明は、とりわけ、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体に関する。これらの抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を、典型的には低減できる。治療のための方法、並びに画像化における、及びErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/3陽性腫瘍を有する対象の処置におけるこれらの抗体の使用もまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ErbB-2、ErbB-3、若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有するか、又は前記腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法における使用のための、ErbB-2標的化剤と、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体との組合せ。
【請求項２】
ErbB-2の標的化剤が、ErbB-2結合剤又は阻害剤である、請求項1に記載の組合せ。
【請求項３】
ErbB-2の標的化剤が、ErbB-2阻害剤である、請求項1又は2に記載の組合せ。
【請求項４】
ErbB-2の阻害剤が、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体である、請求項3に記載の組合せ。
【請求項５】
単一特異性抗体及び二重特異性抗体が、ErbB-2上の異なるエピトープに結合する、請求項4に記載の組合せ。
【請求項６】
異なるErbB-2エピトープが、異なる細胞外ErbB-2ドメイン上にある、請求項5に記載の組合せ。
【請求項７】
単一特異性抗体が、ErbB-2細胞外ドメインIV、ドメインIII及び/又はドメインII上のエピトープに結合できる、請求項5又は6に記載の組合せ。
【請求項８】
二重特異性抗体が、ErbB-2細胞外ドメインI上のエピトープに結合できる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項９】
単一特異性抗体が、薬物コンジュゲートを含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１０】
二重特異性抗体が、薬物コンジュゲートを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１１】
薬物コンジュゲートが、エムタンシンを含む、請求項9又は10に記載の組合せ。
【請求項１２】
単一特異性抗体がトラスツズマブである、請求項4〜11のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１３】
単一特異性抗体がトラスツズマブエムタンシンである、請求項4〜11のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１４】
二重特異性抗体が、抗体PB4188を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１５】
化学療法薬物を、それを必要とする個体に投与することを更に含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１６】
ErbB-2、ErbB-3、若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有するか、又はErbB-2、ErbB-3、若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法であって、ErbB-2の標的化剤と、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体とを、それを必要とする個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１７】
ErbB-2の標的化剤と、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体とを含む医薬組成物。
【請求項１８】
ErbB-2の標的化剤と、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体とを含むキットオブパーツ。
【請求項１９】
ErbB-2の標的化剤が、ErbB-2の結合剤又は阻害剤である、請求項16に記載の処置の方法、請求項17に記載の医薬組成物、又は請求項18に記載のキットオブパーツ。
【請求項２０】
ErbB-2の結合剤又は阻害剤が、ラパチニブ又はネラチニブである、請求項19に記載の処置の方法、医薬組成物又はキットオブパーツ。
【請求項２１】
ErbB-2の標的化剤が、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体である、請求項16に記載の処置の方法、請求項17に記載の医薬組成物、又は請求項18に記載のキットオブパーツ。
【請求項２２】
脳にErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を有するか、又は脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置における使用のための、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体。
【請求項２３】
腫瘍が、乳房腫瘍の転移である、請求項22に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
ErbB-2細胞外ドメインI上のエピトープに結合できる、請求項22又は23に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
ErbB-3細胞外ドメインIII上のエピトープに結合できる、請求項22〜24のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２６】
方法がErbB-2の標的化剤の投与を更に含む、請求項22〜25のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２７】
ErbB-2の標的化剤が、ラパチニブ又はネラチニブである、請求項26に記載の二重特異性抗体。
【請求項２８】
ErbB-2の標的化剤が、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体である、請求項26に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
方法がErbB-3の標的化剤の投与を更に含む、請求項22〜28のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３０】
ErbB-3の標的化剤が、抗体、例えばパトリツマブ、MM-121(セリバンツマブ)、又はルムレツズマブである、請求項29に記載の二重特異性抗体。
【請求項３１】
ErbB-2の阻害剤が、ErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体である、請求項29に記載の二重特異性抗体。
【請求項３２】
ErbB-2の細胞外部分上のエピトープ又はErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を有する単一特異性二価抗体が、薬物コンジュゲートを含む、請求項28又は31に記載の二重特異性抗体。
【請求項３３】
薬物が、エムタンシンを含む、請求項32に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を有する単一特異性二価抗体が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、又は同一の可変ドメインアミノ酸配列を有するバイオシミラーである、請求項28に記載の二重特異性抗体。
【請求項３５】
抗体PB4188である、請求項22〜34のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３６】
脳にErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を有するか、又は脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法であって、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年3月31日出願の欧州特許出願第17164396.8号及び2017年3月31日出願の米国特許出願第15/476260号に対する優先権を主張し、これらの内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗体の分野に関する。詳細には、本発明は、異常な細胞を伴う疾患の処置のための治療的(ヒト)抗体の分野に関する。より詳細には、本発明は、ErbB-2及びErbB-3に結合する抗体、並びにErbB-2及びErbB-3陽性細胞、特に腫瘍細胞の結合におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト上皮増殖因子受容体ファミリー(HER、集合的に、ErbBシグナル伝達ネットワークとも呼ばれる)は、膜貫通受容体チロシンキナーゼ(RTK)のファミリーである。このファミリーは、ErbB-1(又はHERl)としても公知の上皮増殖因子受容体(EGFR)、並びに相同受容体ErbB-2(HER2)、ErbB-3(HER3)及びErbB-4(HER4)を含む。これらの受容体(Yarden及びPines、2012において概説される)は、上皮細胞上で広く発現される。HER受容体又はそれらのリガンド、例えばヘレグリン(HRG)若しくは上皮増殖因子(EGF)の上方調節は、ヒト癌において頻繁な事象である(Wilson、Fridlyandら、2012)。特に、ErbB-1及びErbB-2の過剰発現は、上皮腫瘍において生じ、腫瘍浸潤、転移、化学療法に対する耐性、及び予後不良と関連する(Zhang、Berezovら、2007)。正常乳房では、ErbB-3は、管腔上皮の成長及び分化において重要であることが示されている。例えば、ErbB-3の喪失/阻害は、管腔上皮上の基底の選択的増大を生じる(Balko、Millerら、2012)。RTKの細胞外ドメインへのリガンドの結合は、同じ(ホモ二量体化)受容体サブタイプ間及び異なる(ヘテロ二量体化)受容体サブタイプ間の両方で、受容体二量体化を誘導する。二量体化は、自己リン酸化を受ける細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化でき、次に、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)及び生存促進性経路Aktによって媒介されるものを含むいくつかの下流の増殖促進性シグナル伝達経路を活性化できる(Yarden及びPines、2012に概説される)。特異的内因性リガンドは、ErbB-2については同定されておらず、従って、これは通常、ヘテロ二量体化を介してシグナル伝達すると仮定される(Sergina、Rauschら、2007)。ErbB-3は、そのリガンドの会合によって活性化され得る。これらのリガンドには、ニューレグリン(NRG)及びヘレグリン(HRG)が含まれるがこれらに限定されない。
【０００４】
ErbB受容体ファミリーのシグナル伝達の活性化の種々の様式が同定されている。これらには、シグナル伝達のリガンド依存的及びリガンド非依存的な活性化がある。過剰発現されたErbB-2は、ErbB-3リガンドの非存在下であっても、ErbB-2:ErbB-3ヘテロ二量体を介した発癌性シグナル伝達を生成することができる(Junttila、Akitaら、2009)。ErbB-2活性は、ErbB-2特異的抗体によって阻害され得る。かかるErbB-2特異的抗体は、例えば、ErbB-2陽性(HER2+)腫瘍の処置において使用される。かかる処置に伴う問題は、腫瘍がしばしばErbB-2特異的処置を逃避し、阻害抗体の存在下であっても成長し続けることである。ErbB-2陽性腫瘍、例えば、乳房、卵巣、子宮頸部及び胃の腫瘍は、上方調節されたErbB-3発現(Ocana、Vera-Badilloら、2013)及び/又はErbB-3リガンド発現(Wilson、Fridlyandら、2012)を示す腫瘍細胞の部位集団が選択的により早く成長することによって、処置を逃避し得ることが観察されている。また、ErbB-3受容体における活性化変異が同定されている。
【０００５】
臨床適用のために承認されたいくつかのモノクローナル抗体の中に、抗ErbB-2モノクローナル抗体トラスツズマブ(ハーセプチン)及びErbB-1特異的セツキシマブ(アービタックス)がある。トラスツズマブは、転移性乳癌において証明された延命効果を有する(Arteaga、Sliwkowskiら、2011)。トラスツズマブの正確な作用機構は、はっきりとは確立されていない。作用の示唆された様式は、RTKシグナル伝達の阻害及び抗体依存性細胞傷害(ADCC)の動員である。記載されてきた他の作用機構には、ErbB-2細胞外ドメインのタンパク質分解性切断を遮断すること、血管新生因子の阻害、及び受容体エンドサイトーシスの増強が含まれる。ErbB-2シグナル伝達を妨害する他の薬剤は、乳房及び他のErbB-2過剰発現癌の処置のために承認されているか、又は開発中である。例えば、化学化合物ラパチニブは、ErbB-1及びErbB-2の両方のチロシンキナーゼ活性を阻害し、ErbB-2増幅された乳癌の第1選択の処置において使用される。
【０００６】
HER2+転移性乳癌を有する患者では、単剤としての又は化学療法と組み合わせたトラスツズマブに対する耐性が、通常治療を開始して数カ月以内に生じる。HER2+転移性乳癌を有する患者のごく一部だけが、単剤トラスツズマブに応答し、進行癌における耐性のde novo機構を示唆している。これらの機構には、とりわけ、他のHERファミリーの受容体からのシグナル伝達、及びHERファミリーではないRTKからの代償的シグナル伝達が含まれる(Theryら、Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies、Eur J Cancer(2014)、第50巻、第5号、892〜901頁(ttp://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.01.003))。例えば、HER2と併せたHER3又はそのリガンドの過剰発現は、HER-2/HER-3ヘテロ二量体の形成、及びトラスツズマブに対する耐性の獲得をもたらす。従って、抗体トラスツズマブは、ErbB-3リガンドによって駆動されるシグナル伝達を遮断することにおいては無効であると考えられる(Wehrman、Raabら、2006、Junttila、Akitaら、2009、Theryら、2014)。
【０００７】
最近、モノクローナル抗体ペルツズマブが、無増悪生存期間が更に5カ月延長されることに基づいて、トラスツズマブと組み合わせた使用について承認された(Baselga、Cortesら、2012)。ペルツズマブもまた、トラスツズマブとは異なる位置においてであるが、ErbB-2に結合する。
【０００８】
ErbB-2陽性腫瘍を処置するための他の戦略は、ErbB-3を対象とする。ErbB-3結合モノクローナル抗体は、前臨床試験においてその活性が実証されている(Schoeberl、Faberら、2010)。一部のErbB-3結合モノクローナル抗体は、種々の癌の増殖及び成長を阻害できる。
【０００９】
別の戦略は、ErbB-2受容体及びErbB-3受容体の両方の結合を伴う。分子MM-111は、ErbB-2及びErbB-3に結合する2つの単鎖Fv(scFv)断片を含む人工の生物学的分子である。2つのscFvは、分子の半減期を増加させるために、変異したヒト血清アルブミン(HSA)タンパク質と会合される。予備試験において、この分子は、ErbB-3シグナル伝達及び増殖を阻害することが示された。この効果は、比較的高い量のErbB-2を発現したErbB-3陽性細胞株において主に測定された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2004/009618
【特許文献２】WO2009/157771
【特許文献３】WO2008/027236
【特許文献４】WO2010/108127
【特許文献５】米国特許出願公開第20030078385号(Arathoonら、-Genentech)
【特許文献６】米国仮特許出願第61/635,935号
【特許文献７】米国特許出願第13/866,747号
【特許文献８】PCT出願PCT/NL2013/050294(WO2013/157954A1)
【特許文献９】米国特許出願公開第2006/0212956号A1(Genentech)
【特許文献１０】WO2008/100624
【特許文献１１】米国特許第7,705,103号B2(U3 Pharma AG)
【特許文献１２】米国特許出願公開第2012/0107306号
【特許文献１３】米国特許出願公開第2011/0077163号A1
【特許文献１４】米国特許出願第12/340,436号
【特許文献１５】米国特許第8,349,574号
【特許文献１６】米国特許出願公開第2013/0071859号
【特許文献１７】国際特許出願PCT/US2014/033208
【特許文献１８】WO2013134686 A1
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Theryら、Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies、Eur J Cancer(2014)、第50巻、第5号、892〜901頁(ttp://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.01.003)
【非特許文献２】Junttila, T. T.、K. Parsonsら(2010)、「Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer」、Cancer Research 70(11):4481〜4489
【非特許文献３】Schaeferら(Cancer Cell 20、472〜486、2011年10月
【非特許文献４】Landgraf, R Breast Cancer Res. 2007; 9(1): 202〜の図1
【非特許文献５】Guarneriら、J Clin Oncol.、1985、3:818〜26; Ewer MSら、Nat Rev Cardiol 2010; 7:564〜75
【非特許文献６】Wadhwaら、Breast Cancer Res Treat 2009; 117:357〜64
【非特許文献７】J. C. Almagro1及びJ. Fransson(2008)Frontiers in Bioscience 13、1619〜1633
【非特許文献８】Tannerら、Mol Cancer Ther 2004
【非特許文献９】Shamesら、PLOS ONE、2013年2月、第8巻、第2号、1〜10頁
【非特許文献１０】Yonesakaら、Sci. transl. Med.、第3巻、第99号(2011); 1〜11頁
【非特許文献１１】DiJosephら; Blood. 2004 103(5):1807〜14.
【非特許文献１２】Mullard A. Nature Reviews Drug Discovery 12, 329〜332 (2013)
【非特許文献１３】Zolot RSら; Nature Reviews Drug Discovery 12, 259〜260 (2013)
【非特許文献１４】Mertenら; Bioconjug Chem 2015; 26:2176〜2185
【非特許文献１５】Schlomら; Cancer Res. 1992; 52(5):1067〜72.
【非特許文献１６】Rohrer T. Journal of Antibody-drug Conjugates. 2013年6月21日
【非特許文献１７】Cheng Liu及びAndreia Lee. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Antibody therapeutics-Trends in Bio/Pharmaceutical Industry 2009 [13〜17]
【非特許文献１８】Horos. (Horos Project (2017). DICOM image viewing and measuring. [Horos]. http://www.horosproject.org/)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この第1の抗原結合部位は、好ましくは、図16A又は図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847;MF3001;MF3003又はMF1898のアミノ酸配列を有するVH鎖を含む可変ドメイン中に存在する。この第2の抗原結合部位は、好ましくは、図16B又は図16E又は図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073又はMF6074のアミノ酸配列を有するVH鎖を含む可変ドメイン中に存在する。可変ドメイン中の免疫グロブリン軽鎖は、好ましくは、図16Cのアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明の抗体は、特記しない限り、好ましくは、二重特異性抗体である。
【００１４】
本発明は更に、本発明に従う抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
標識、好ましくは、in vivo画像化のための標識を更に含む、本発明に従う抗体が更に提供される。
【００１６】
本発明は、有害細胞若しくは腫瘍を含むErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性細胞を有する対象、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、本発明に従う二重特異性抗体を対象に投与する工程を含む方法もまた提供する。ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体もまた提供される。
【００１７】
本発明は、ErbB-2陽性腫瘍を有する、又はErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法であって、ErbB-2の阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む方法を更に提供する。
【００１８】
ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を発症するリスクがある抗体の処置の方法における使用のための、ErbB-2の阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体の組合せもまた提供される。
【００１９】
ErbB-2の阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を含む医薬組成物が更に提供される。
【００２０】
ErbB-2の阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を含むキットオブパーツもまた提供される。
【００２１】
脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を有する、又は脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法であって、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む方法もまた提供される。
【００２２】
脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を有する、又は脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置における使用のための、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減する、又は低減できる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合部位」とは、抗原に結合することが可能な二重特異性抗体に由来する部位、好ましくはかかる二重特異性抗体上に存在する部位を指す。未改変の抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、かかる抗体の可変ドメイン中に存在する。可変ドメインは、上記抗原結合部位を含む。抗原に結合する可変ドメインは、抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。
【００２５】
一実施形態では、本発明の抗体可変ドメインは、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む。抗原結合部位は、組み合わされたVH/VL可変ドメイン中に、又はVH領域中にだけ、若しくはVL領域中にだけ、存在し得る。抗原結合部位が、可変ドメインの2つの領域のうち一方中にだけ存在する場合、対応物の可変領域は、結合性可変領域のフォールディング及び/又は安定性に寄与し得るが、抗原の結合自体には顕著には寄与しない。
【００２６】
本明細書で使用する場合、抗原結合とは、その抗原への抗体の典型的結合能力を指す。ErbB-2に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ErbB-2に結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ErbB-1及びErbB-4に、少なくとも100分の1低く結合する。ErbB-3に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ErbB-3に結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ErbB-1及びErbB-4には結合しない。ErbBファミリーが細胞表面受容体のファミリーであることを考慮すると、結合は、典型的には、受容体を発現する細胞上で評価される。抗原への抗体の結合は、種々の方法で評価され得る。1つの方法は、抗体を抗原(好ましくは、抗原を発現する細胞)と共にインキュベートし、未結合の抗体を除去し(好ましくは、洗浄工程によって)、結合した抗体に結合する標識された抗体によって、結合した抗体を検出することである。
【００２７】
抗体による抗原結合は、典型的には、抗体のランダムな非特異的付着とは対照的に、これら2つの構造を正確に一緒に結合させる、抗体の相補性領域並びに抗原及び可変ドメインの両方の特異的三次元構造を介して媒介される(ロック及びキーと類似の相互作用)。抗体は、典型的には、抗原のエピトープを認識し、かかるエピトープは、他の化合物中にも同様に存在し得るので、ErbB-2及び/又はErbB-3に結合する本発明に従う抗体は、かかる他の化合物が同じエピトープを含む場合、他のタンパク質も同様に認識し得る。従って、用語「結合」は、別のタンパク質又は同じエピトープを含むタンパク質への抗体の結合を排除しない。かかる他のタンパク質は、好ましくは、ヒトタンパク質ではない。本発明において定義されるErbB-2抗原結合部位及びErbB-3抗原結合部位は、典型的には、出生後の、好ましくは成人のヒトでは、細胞の膜上の他のタンパク質に結合しない。本発明に従う二重特異性抗体は、典型的には、以下により詳細に概説されるように、少なくとも1×10e-6Mの結合親和性で、ErbB-2及びErbB-3に結合することが可能である。
【００２８】
用語「結合を妨害する」とは、本明細書で使用する場合、抗体が、ErbB-3上のエピトープに対するものであり、抗体が、ErbB-3への結合についてリガンドと競合することを意味する。抗体は、リガンド結合を減退させ得、リガンドがErbB-3に既に結合している場合にはこれを置き換え得、又は、例えば立体障害を介して、リガンドがErbB-3に結合する可能性を少なくとも部分的に防止し得る。
【００２９】
用語「抗体」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質性分子、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する1又は複数の可変ドメインを含む免疫グロブリンクラスのタンパク質に属するものを意味し、ここで、かかるドメインは、抗体の可変ドメイン由来であるか、又はかかる可変ドメインと配列相同性を共有する。治療的使用のための抗体は、好ましくは、処置される対象の天然抗体に可能な限り近い(例えば、ヒト対象に対してヒト抗体)。抗体結合は、特異性及び親和性に関して表現され得る。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強さについての尺度である。特異的結合は、少なくとも1×10e-6Mの、より好ましくは1×10e-7Mの、より好ましくは1×10e-9Mよりも高い親和性(KD)での結合として定義される。典型的には、治療的適用のための抗体は、最大で1×10e-10M又はそれより高い親和性を有する。本発明の二重特異性抗体等の抗体は、天然抗体の定常ドメイン(Fc部分)を含む。本発明の抗体は、典型的には、好ましくはヒトIgGサブクラスの、二重特異性全長抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトIgG1サブクラスの抗体である。本発明のかかる抗体は、良好なADCC特性を有し、ヒトへのin vivo投与の際に好ましい半減期を有し、クローナル細胞における共発現の際にホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成する改変された重鎖を提供できるCH3操作テクノロジーが存在する。
【００３０】
本発明の抗体は、好ましくは、「全長」抗体である。本発明に従う用語「全長」は、本質的に完全な抗体を含むと定義されるが、かかる抗体は、インタクトな抗体の全ての機能を有する必要はない。誤解を避けるために、全長抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む。各鎖は、定常(C)領域及び可変(V)領域を含み、これらは、CH1、CH2、CH3、VH、及びCL、VLと称されるドメインへと解体され得る。抗体は、Fab部分中に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインを介して、主にFc部分を介して、免疫系の分子及び細胞と相互作用できる。用語「可変ドメイン」、「VH/VL対」、「VH/VL」は、本明細書で相互交換可能に使用される。本発明に従う全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得る抗体を包含する。かかる変異は、これらの領域のいずれかの実質的な部分の欠失であるべきではない。しかし、得られた抗体の結合特徴を本質的に変更することなしに1又は数個のアミノ酸残基が欠失されている抗体は、用語「全長抗体」内に包含される。例えば、IgG抗体は、定常領域中に、1〜20アミノ酸残基の挿入、欠失又はそれらの組合せを有し得る。例えば、抗体自体が低いADCC活性を有する場合、抗体の定常領域を僅かに改変することによって、抗体のADCC活性は改善され得る(Junttila, T. T.、K. Parsonsら(2010)、「Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer」、Cancer Research 70(11):4481〜4489)。
【００３１】
全長IgG抗体は、それらの好ましい半減期、及び免疫原性を理由として完全に自己の(ヒト)分子に近くある必要性に起因して、好ましい。本発明の抗体は、好ましくは、二重特異性IgG抗体、好ましくは、二重特異性全長IgG1抗体である。IgG1は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて好ましい。ヒトにおけるいずれの免疫原性をも防止するために、本発明に従う二重特異性IgG抗体は、ヒトIgG1であることが好ましい。
【００３２】
用語「二重特異性」(bs)とは、抗体の1つの部分(上に定義される)が抗原上の1つのエピトープに結合する一方で、第2の部分が異なるエピトープに結合することを意味する。この異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。本発明によれば、この第1及び第2の抗原は、事実上、2つの異なるタンパク質である。好ましい二重特異性抗体は、2つの異なるモノクローナル抗体の部分を含む抗体であり、結果として、2つの異なる型の抗原に結合する。二重特異性抗体の一方のアームは、典型的には、1つの抗体の可変ドメインを含み、他方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含む。本発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるが、軽鎖可変領域は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体において同じである。異なる重鎖可変領域が同じ又は共通の軽鎖と会合している二重特異性抗体は、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体とも呼ばれる。従って、両方のアームが共通の軽鎖を含む、本発明に従う二重特異性抗体が、更に提供される。
【００３３】
好ましい二重特異性抗体は、単一細胞における2つの異なる重鎖及び1つの共通の軽鎖の共発現によって得ることができる。野生型CH3ドメインが使用される場合、2つの異なる重鎖及び1つの共通の軽鎖の共発現は、3つの異なる種、AA、AB及びBBを生じる。所望の二重特異性産物(AB)の百分率を増加させるために、CH3操作が使用でき、又は言い換えれば、本明細書の以下に定義されるような、適合性のヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用できる。
【００３４】
用語「適合性のヘテロ二量体化ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、操作されたドメインA'が、操作されたドメインB'とのヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた然りであるが、A'-A'間及びB'-B'間のホモ二量体化は減退されるように操作されている、タンパク質ドメインを指す。
【００３５】
本発明に従う用語「共通の軽鎖」とは、同一であり得るか、又はいくらかのアミノ酸配列差異を有し得る軽鎖を指すが、全長抗体の結合特異性は影響されない。例えば、本明細書で使用する場合、共通の軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸変化、重鎖とペアリングした場合に結合特異性に寄与しない又は部分的にのみ寄与する領域中のアミノ酸の変化を導入及び試験すること等によって、同一ではないがなおも機能的に等価物である軽鎖を調製及び見出すことが可能である。用語「共通の軽鎖」、「共通のVL」、「単一軽鎖」、「単一VL」は、全て、用語「再編成された」の付加あり又はなしで、本明細書で相互交換可能に使用される。機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成するために異なる重鎖と結びつき得るヒト軽鎖を共通の軽鎖として使用することは、本発明の一態様である(WO2004/009618、WO2009/157771、Merchantら、1998及びNissimら、1994)。好ましくは、共通の軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒトレパートリーにおいて頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収量及び溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はその断片若しくは機能的等価物(即ち、同じIgVκ1-39遺伝子セグメントであるが、異なるIGJκ遺伝子セグメント)である(imgt.orgにおけるIMGTデータベースワールドワイドウェブに従う命名法)。従って、共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖、好ましくは、IgVKl-39遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖、最も好ましくは、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVKl-39*01/IGJKl*01である、本発明に従う二重特異性抗体が、更に提供される。用語、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39軽鎖、又はつまりhuVκ1-39は、本出願を通じて相互交換可能に使用される。明らかに、当業者は、「共通の」が、そのアミノ酸配列が同一でない軽鎖の機能的等価物もまた指すことを認識する。機能的結合領域の形成に実質的に影響しない変異(欠失、置換、付加)が存在する、上記軽鎖の多くのバリアントが存在する。本発明の軽鎖はまた、1〜5アミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せを有する、本明細書の上で特定した軽鎖であり得る。
【００３６】
VHが、第1の抗原を特異的に認識することが可能であり、免疫グロブリン可変ドメイン中のVHとペアリングしたVLが、第2の抗原を特異的に認識することが可能である抗体もまた、企図される。得られたVH/VL対は、抗原1又は抗原2のいずれかに結合する。例えばWO2008/027236、WO2010/108127及びSchaeferら(Cancer Cell 20、472〜486、2011年10月)に記載される、かかるいわゆる「ツー・イン・ワン抗体」は、本発明の二重特異性抗体とは異なり、更に「ツー・イン・ワン」抗体と呼ばれる。かかる「ツー・イン・ワン」抗体は、同一のアームを有し、本発明の抗体ではない。
【００３７】
用語「ErbB-2」とは、本明細書で使用する場合、ヒトにおける、ERBB-2遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子又はタンパク質の代替名には、CD340;HER-2;HER-2/neu;MLN 19;NEU;NGL;TKR1が含まれる。このERBB-2遺伝子は、しばしばHER2と呼ばれる(ヒト上皮増殖因子受容体2から)。本明細書でErbB-2に対する言及がなされる場合、この言及は、ヒトErbB-2を指す。ErbB-2に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトErbB-2に結合する。ErbB-2抗原結合部位は、ヒトオルソログと他の哺乳動物オルソログとの間の配列及び三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ず結合するわけではない。ヒトErbB-2タンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、(NP_001005862.1、NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC_018928.2)である。これらの登録番号は、標的としてのErbB-2の同定のさらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるErbB-2タンパク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるもの等の、コード遺伝子中の変異等に起因して、変動し得る。ErbB-2抗原結合部位は、ErbB-2及びそれらの種々のバリアント、例えば、一部のErbB-2陽性腫瘍細胞によって発現されるものに結合する。
【００３８】
用語「ErbB-2の結合剤」とは、本明細書で使用する場合、ErbB-2に結合することが可能な任意の分子又は化合物を指す。「ErbB-2の阻害剤」とは、本明細書で使用する場合、ErbB-2の活性を直接的又は間接的に低減又は減弱させることが可能な任意の分子又は化合物を指す。かかる阻害剤は、小分子であり得、又は生物製剤、例えば抗体であり得る。
【００３９】
用語「ErbB-3」とは、本明細書で使用する場合、ヒトにおける、ERBB-3遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、HER3;LCCS2;MDA-BF-1;c-ErbB-3;c-erbb-3;erbb-3-S;p180-Erbb-3;p45-sErbb-3;及びp85-sErbb-3である。本明細書でErbB-3に対する言及がなされる場合、この言及は、ヒトErbB-3を指す。ErbB-3に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトErbB-3に結合する。ErbB-3抗原結合部位は、ヒトオルソログと他の哺乳動物オルソログとの間の配列及び三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ず結合するわけではない。ヒトErbB-3タンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、(NP_001005915.1 NP_001973.2、NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029419.12)である。これらの登録番号は、標的としてのErbB-3の同定のさらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるErbB-3タンパク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるもの等の、コード遺伝子中の変異等に起因して、変動し得る。ErbB-3抗原結合部位は、ErbB-3及びそれらの種々のバリアント、例えば、一部のErbB-2陽性腫瘍細胞によって発現されるものに結合する。
【００４０】
用語「ErbB-3の結合剤」とは、本明細書で使用する場合、ErbB-3に結合することが可能な任意の分子又は化合物を指す。「ErbB-3の阻害剤」とは、本明細書で使用する場合、ErbB-3の活性を直接的又は間接的に低減又は減弱させることが可能な任意の分子又は化合物を指す。かかる阻害剤は、パトリツマブ、MM-121(セリバンツマブ(seribantumab))、ルムレツズマブ(lumretuzumab)等の抗体であり得る。
【００４１】
ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む本発明の二重特異性抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる又は低減する。過剰なErbB-2の存在下では、ErbB-2/ErbB-3ヘテロ二量体は、ヘテロ二量体中のErbB-3鎖に対する検出可能なリガンドの非存在下で、発現細胞に成長シグナルを提供し得る。このErbB-3受容体機能は、本明細書で、ErbB-3のリガンド非依存的受容体機能と呼ばれる。このErbB-2/ErbB-3ヘテロ二量体は、ErbB-3リガンドの存在下でも、発現細胞に成長シグナルを提供する。このErbB-3受容体機能は、本明細書で、ErbB-3のリガンド誘導性受容体機能と呼ばれる。
【００４２】
用語「ErbB-3リガンド」とは、本明細書で使用する場合、ErbB-3に結合及び活性化するポリペプチドを指す。ErbB-3リガンドの例には、ニューレグリン1(NRG)及びニューレグリン2、ベータセルリン、ヘパリン結合性上皮増殖因子並びにエピレギュリンが含まれるがこれらに限定されない。この用語は、天然に存在するポリペプチドの生物学的に活性な断片及び/又はバリアントを含む。
【００４３】
本発明の好ましい一実施形態では、ErbB-3のリガンド誘導性受容体機能は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞のErbB-3リガンド誘導性成長である。好ましい一実施形態では、この細胞は、MCF-7細胞(ATCC(登録商標)HTB-22(商標));SKBR3(ATCC(登録商標)HTB-30(商標))細胞;NCI-87(ATCC(登録商標)CRL-5822(商標))細胞;BxPC-3-luc2細胞(Perkin Elmer 125058)、BT-474細胞(ATCC(登録商標)HTB-20(商標))又はJIMT-1細胞(DSMZ番号:ACC 589)である。
【００４４】
好ましい一実施形態では、このErbB-2及びErbB-3陽性細胞は、細胞表面上に、少なくとも50.000のErbB-2受容体を含む。好ましい一実施形態では、少なくとも100.000のErbB-2受容体。好ましい一実施形態では、このErbB-2及びErbB-3陽性細胞は、細胞表面上に、少なくとも1.000.000のErbB-2受容体を含む。別の好ましい一実施形態では、このErbB-2及びErbB-3陽性細胞は、細胞表面上に、1.000.000以下のErbB-2受容体を含む。現在使用されている治療、例えば、トラスツズマブ(ハーセプチン)及びペルツズマブは、臨床応答を得るために、その細胞表面上に1.000.000超のErbB-2受容体を有する悪性ErbB-2陽性細胞を有する患者のみに処方される。その細胞表面上に1.000.000超のErbB-2受容体を有するErbB-2陽性腫瘍細胞を有する患者は、典型的には、ErbB-2[+++]として分類される。患者は、例えば、免疫組織化学又は蛍光in situハイブリダイゼーションを使用して分類される。HercepTest(商標)及び/若しくはHER2 FISH(pharm Dx(商標))は共にDako Denmark A/S社によって市販され、並びに/又はMonogram Biosciences社によって市販されるHERmark(登録商標)アッセイを使用する。トラスツズマブ及びペルツズマブは、ErbB-2[+++]患者のみに処方されるが、それは、より低いErbB-2濃度を有する患者は、典型的には、トラスツズマブ及びペルツズマブで処置した場合に十分な臨床応答を示さないからである。しかし、本発明は、トラスツズマブと比較して、より低いErbB-2受容体濃度を有する細胞に対する改善された結合親和性もまた有する二重特異性抗体を提供する。実施例に示されるように、より低いErbB2発現を有するかかる細胞の増殖は、本発明に従う抗体に効率的に対抗する。かかるより低いErbB-2受容体濃度は、ErbB-2[++]又はErbB-2[+]と分類された患者の悪性細胞上に存在する。また、再発したErbB-2陽性腫瘍は、細胞1つ当たり1.000.000未満の受容体のErbB-2受容体濃度を有する場合が多い。従って、かかるErbB-2[++]又はErbB-2[+]患者、並びに再発したErbB-2陽性腫瘍を有する患者は、好ましくは、本発明に従う二重特異性抗体で処置される。従って、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体が更に提供され、この抗体は、1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有するErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法もまた提供され、この腫瘍は、細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む。ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体もまた、本明細書で提供され、この腫瘍は、細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有する。本発明に従う抗体は、典型的には、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、本明細書で以下により詳細に��明するように、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
【００４５】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【００４６】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、好ましくは、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【００４７】
腫瘍がErbB-3について陽性かどうかを確立するために、当業者は、例えば、ErbB-3増幅及び/又は免疫組織化学における染色を決定できる。生検中の少なくとも10%の腫瘍細胞が、陽性であるべきである。生検はまた、20%、30% 40% 50% 60% 70%又はそれ超の陽性細胞を含み得る。
【００４８】
本明細書で使用する場合、リガンド誘導性受容体機能は、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30、40、50 60又は少なくとも70%低減され、特に好ましい一実施形態では、このリガンド誘導性受容体機能は、80%、より好ましくは90%低減される。この低減は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体の存在下でリガンド誘導性受容体機能を決定し、それを、他の点では同一の条件下で抗体の非存在下での同じ機能と比較することによって、決定される。これらの条件は、ErbB-3リガンドの存在を少なくとも含む。存在するリガンドの量は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞株の最大成長の半分を誘導する量である。この試験のためのErbB-2及びErbB-3陽性細胞株は、好ましくは、MCF-7細胞株(ATCC(登録商標)HTB-22(商標))、SKBR3細胞株(ATCC(登録商標)HTB-30(商標))細胞、JIMT-1細胞株(DSMZ ACC 589)又はNCI-87細胞株(ATCC(登録商標)CRL-5822(商標))である。ErbB-3リガンド誘導性受容体機能を決定するための試験及び/又はリガンドは、好ましくは、実施例に特定されるような、ErbB-3リガンド誘導性成長低減についての試験である。
【００４９】
ErbB-2タンパク質は、いくつかのドメインを含む(Landgraf, R Breast Cancer Res. 2007; 9(1): 202〜の図1を、参考のために参照のこと)。これらの細胞外ドメインは、ドメインI〜IVと呼ばれる。本明細書に記載される抗体の抗原結合部位のそれぞれのドメインへの結合の場所は、マッピングされている(実施例を参照のこと)。ErbB-2のドメインI又はドメインIVに結合する抗原結合部位(第1の抗原結合部位)(第1の抗原結合部位)を有する本発明の二重特異性抗体は、種々の軽鎖と組み合わせた場合に、ErbB-2に対する顕著な結合特異性及び親和性を維持する重鎖可変領域を含む。ErbB-2のドメインI又はドメインIVに結合する抗原結合部位(第1の抗原結合部位)(第1の抗原結合部位)及びErbB-3に対する抗原結合部位(第2の抗原結合部位)を有する二重特異性抗体は、ErbB-2の別の細胞外ドメインに結合する抗原結合部位(第1の抗原結合部位)を含む二重特異性抗体と比較した場合、ErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減させるのにより有効であることが見出された。ErbB-2に結合する抗原結合部位(第1の抗原結合部位)を含む二重特異性抗体であって、この抗原結合部位が、ErbB-2のドメインI又はドメインIVに結合する抗体が、好ましい。好ましくは、この抗原結合部位は、ErbB-2のドメインIVに結合する。ErbB-2に結合し、ADCCを更に含む抗原結合部位(第1の抗原結合部位)を有する二重特異性抗体は、特にin vivoで顕著なADCC活性を有さなかった他のErbB-2結合抗体よりも、有効であることが見出された。従って、ADCCを示す本発明に従う二重特異性抗体が好ましい。第1の抗原結合部位がErbB-2のドメインIVに結合する抗体は、固有のADCC活性を有することが見出された。低い固有のADCC活性を有する、ドメインI結合性のErbB-2結合抗体は、ADCC活性を増強するために操作され得る。Fc領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、B細胞及び好中球上の異なる受容体に結合することによって、抗体機能を媒介する。これらの受容体の一部、例えば、CD16A(FcγRIIIA)及びCD32A(FcγRIIA)は、細胞を活性化して、抗原に対する応答を構築させる。他の受容体、例えばCD32Bは、免疫細胞の活性化を阻害する。(アミノ酸置換を導入することによって)より高い選択性で活性化受容体に結合するFc領域を操作することによって、抗癌Mabによる所望の細胞傷害活性を媒介するより高い能力を有する抗体が創出され得る。
【００５０】
抗体のADCCを増強するための1つの技術は、非フコシル化である(例えば、Junttila, T. T.、K. Parsonsら(2010)、「Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer」、Cancer Research 70(11):4481〜4489を参照のこと)。従って、非フコシル化されている、本発明に従う二重特異性抗体が、更に提供される。或いは、又は更に、例えば糖鎖工学(Kyowa Hakko/Biowa、GlycArt(Roche)及びEureka Therapeutics)及び変異誘発(Xencor及びMacrogenics)を含む複数の他の戦略が、ADCC増強を達成するために使用され得、これらの戦略は全て、低親和性活性化FcγRIIIaへのFc結合を改善し、及び/又は低親和性阻害性FcγRIIbへの結合を低減させようとするものである。
【００５１】
ADCCを惹起することにおける抗体又はエフェクター細胞の効力を決定するための、いくつかのin vitro方法が存在する。これらには、クロム-51[Cr51]放出アッセイ、ユーロピウム[Eu]放出アッセイ及び硫黄-35[S35]放出アッセイがある。通常、表面に露出した特定の抗原を発現する標識された標的細胞株は、その抗原に特異的な抗体と共にインキュベートされる。洗浄後、Fc受容体CD16を発現するエフェクター細胞は、典型的には、抗体標識された標的細胞と共に共インキュベートされる。標的細胞溶解は、引き続いて、典型的には、例えば、シンチレーションカウンター又は分光光度法によって、細胞内標識の放出によって測定される。好ましい試験は、実施例中に詳述される。
【００５２】
本発明の1つの利点は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞への、例えばPB4188等の本発明に従う抗体の結合が、トラスツズマブと比較して同じ程度までの内部移行を生じるという事実である。トラスツズマブ及びペルツズマブの組合せが使用される場合、これらの抗体の内部移行が増強される。しかし、この増強された内部移行は、低減されたADCCを生じる。従って、トラスツズマブと比較して本質的に同じ程度までの内部移行を生じる本発明に従う抗体は、トラスツズマブ及びペルツズマブの組合せよりも好ましいが、それは、かかる抗体を用いると、ADCC活性がより良く維持されるからである。
【００５３】
ErbB-3に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は、ErbB-3へのErbB-3リガンドの結合を妨害する。かかる抗体は、特に、ErbB-2に結合する抗原結合部位も含む二重特異性抗体において、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞株上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減させるのに、より有効である。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、ErbB-2のドメインIに結合する。実施例に示されるように、これらの特徴を有する二重特異性抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞に結合し、それらの活性(例えば、ErbB-3のリガンド誘導性受容体機能並びにErbB-2及びErbB3陽性細胞のリガンド誘導性成長)に対抗することが十分に可能である。更に、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位を含む本発明に従う二重特異性抗体は、トラスツズマブ及びペルツズマブ等の既存の抗ErbB-2治療と組み合わせた使用のために特に適切であるが、それは、トラスツズマブ及びペルツズマブが、ErbB-2の異なるドメインに結合するからである。トラスツズマブは、ErbB-2のドメインIVに結合し、ペルツズマブは、ErbB-2のドメインIIに結合する。従って、ErbB-2のドメインIに結合する本発明に従う二重特異性抗体が好ましいが、それは、これらが、同じエピトープについてトラスツズマブ及びペルツズマブと競合しないからである。
【００５５】
別の好ましい一実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第2の抗原結合部位は、ErbB-3のドメインIIIに結合する。本発明に従うかかる抗体は、ErbB-3のドメインIIIに結合しない現在使用されている抗ErbB-3結合分子、例えば、ErbB-3のドメインIに結合するMM-121(Merrimack Pharmaceuticals社;#Ab6とも呼ばれる)及びRG7116(Roche)との併用療法に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。
【００５６】
好ましくは、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体が提供され、この第1の抗原結合部位は、ErbB-2のドメインIに結合し、第2の抗原結合部位は、ErbB-3のドメインIIIに結合する。かかる抗体は、ErbB-2のドメインIに結合しない抗ErbB-2結合分子、例えば、トラスツズマブ及びペルツズマブとの、並びにErbB-3のドメインIIIに結合しない抗ErbB-3結合分子、例えば、MM-121(#Ab6)及びRG7116との併用療法に特に適切である。
【００５７】
好ましい一実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、ErbB-2のドメインIに結合し、第2の抗原結合部位は、ErbB-3のドメインIIIに結合し、この抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この抗体は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。例えば、ErbB-3に対してよりもErbB-2に対してより高い親和性を有する、Merrimack Pharmaceuticals社のMM-111等の先行技術の二重特異性化合物とは対照的に、本発明は、細胞上のErbB-2に対するErbB-2特異的アームの親和性よりも高い、細胞上のErbB-3に対する親和性を有するErbB-3特異的アームを有する二重特異性抗体を提供する。かかる二重特異性抗体は、ErbB-3の低い細胞表面濃度にもかかわらず、ErbB-3をより良く結合することが可能である。これは、ErbB-3に対する機能的活性が、先行技術の化合物と比較して増強されるという利点を提供し、これは、本発明に従うこれらの二重特異性抗体が、ErbB-3活性(例えば、リガンド誘導性成長)により良く対抗することが可能であることを意味する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「親和性」とは、KD値を指す。
【００６０】
ErbB-3陽性細胞に対する上記第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。好ましい一実施形態では、SK-BR-3細胞上のErbB-3に対するこの第2の抗原結合部位の親和性は、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、好ましくは0.99nM以下である。一実施形態では、この親和性は、1.39〜0.59nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、BT-474細胞上のErbB-3に対するこの第2の抗原結合部位の親和性は、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.0nM以下、より好ましくは0.5nM未満、より好ましくは0.31nM以下、より好ましくは0.23nM以下である。一実施形態では、この親和性は、0.31〜0.15nMの範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【００６１】
ErbB-2陽性細胞に対する上記第1の抗原結合部位の親和性(KD)は、好ましくは5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である。好ましい一実施形態では、SK-BR-3細胞上のErbB-2に対するこの第1の抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.3nM以下である。一実施形態では、この親和性は、3.0〜1.6nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、BT-474細胞上のErbB-2に対するこの第1の抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である。一実施形態では、この親和性は、4.5〜3.3nMの範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【００６２】
好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、BT-474細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性(KD)は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.7nM以下、好ましくは3.2nM以下である。一実施形態では、この親和性は、3.7〜2.7nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、SK-BR-3細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、好ましくは2.5nM以下、より好ましくは2.0nM以下である。一実施形態では、この親和性は、2.4〜1.6nMの範囲内である。重ねて、上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【００６３】
本発明の更に好ましい実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高く、この抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この抗体は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。
【００６４】
上述の、ErbB-3に対する高い親和性を有する本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB2のドメインI及び/又はErbB-3のドメインIIIに結合する。従って、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体が更に提供され、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体もまた提供され、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。特に好ましい一実施形態では、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。
【００６５】
この第2の抗原結合部位は、好ましくは、ErbB-3のドメインIIIに結合し、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である、ErbB-3陽性細胞に対する親和性(KD)を有する。好ましい一実施形態では、この第2の抗原結合部位は、ErbB-3のドメインIIIに結合し、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である、SK-BR-3細胞上のErbB-3に対する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、1.39〜0.59nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、この第2の抗原結合部位は、ErbB-3のドメインIIIに結合し、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.0nM以下、より好ましくは0.5nM以下、より好ましくは0.31nM以下、より好ましくは0.23nM以下である、BT-474細胞上のErbB-3に対する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、0.31〜0.15nMの範囲内である。
【００６６】
この第1の抗原結合部位は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合し、5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である、ErbB-2陽性細胞に対する親和性(KD)を有する。好ましい一実施形態では、この第1の抗原結合部位は、ErbB-2のドメインIに結合し、5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.5nM以下、より好ましくは2.3nM以下である、SK-BR-3細胞上のErbB-2に対する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、3.0〜1.6nMの範囲内である。SK-BR-3細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、好ましくは5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.5nM以下、より好ましくは2.4nM以下、より好ましくは2.0nM以下である。一実施形態では、この親和性は、2.4〜1.6nMの範囲内である。
【００６７】
好ましい一実施形態では、この第1の抗原結合部位は、ErbB-2のドメインIに結合し、5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、好ましくは3.9nM以下である、BT-474細胞上のErbB-2に対する親和性(KD)を有する。一実施形態では、この親和性は、4.5〜3.3nMの範囲内である。BT-474細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、好ましくは5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.7nM以下、より好ましくは3.2nM以下である。一実施形態では、この親和性は、3.7〜2.7nMの範囲内である。
【００６８】
重ねて、上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【００６９】
別の好ましい一実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減でき、この二重特異性抗体は、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない。心毒性は、ErbB-2標的化治療における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用され、それによって、心臓負荷を誘導する場合に、増加する。例えば、ドキシサイクリン(DOX)とトラスツズマブとの組合せは、重症の心臓副作用を誘導する。臨床試験により、乳癌のアジュバント設定においてトラスツズマブを投与される患者の5%〜10%が、心機能不全を発症すると推定されている(Guarneriら、J Clin Oncol.、1985、3:818〜26; Ewer MSら、Nat Rev Cardiol 2010; 7:564〜75)。しかし、レトロスペクティブ試験において、無症候性心機能不全を発症するリスクが、実際には、トラスツズマブがDOXと共にアジュバント設定において使用される場合、約25%もの高さであることが実証された(Wadhwaら、Breast Cancer Res Treat 2009; 117:357〜64)。実施例に示されるように、本発明は、ErbB-2を標的化し、心筋細胞の生存に影響を与えない、又はトラスツズマブ及びペルツズマブと比較して、顕著に低い程度までしか影響を与えない、抗体を提供する。心毒性が低減されるので、これは、重要な利点を提供する。これは、障害された心機能に罹患していない人々にとって既に有利であり、障害された心機能に罹患している人々又はそのリスクがある人々、例えば、うっ血性心不全(CHF)、左室機能不全(LVD)及び/若しくは10%以上減少した左室駆出分画(LVEF)に罹患している対象、並びに/又は心筋梗塞を有している対象等にとっては、更にいっそう有利である。従って、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない本発明に従う抗体が、好ましい。in vitroでは、心筋細胞の機能は、例えば、心筋細胞の生存度を決定することによって、BNP(B型ナトリウム利尿ペプチド、心バイオマーカーである)を決定することによって、QT延長を決定することによって、及び/又はミトコンドリア膜電位を決定することによって、測定される。
【００７０】
本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。一実施形態は、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う抗体を提供し、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
【００７１】
好ましい一実施形態では、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない抗体は、以下を含む:
-  図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは、少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、若しくは少なくとも重鎖可変領域配列、又は列挙された重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列;並びに/或いは
-  図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、若しくは少なくとも重鎖可変領域配列、又は列挙された重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列。好ましい一実施形態では、この抗体は、PB4188である。
【００７２】
本発明の別の一態様は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。アミノ酸残基番号付けは、Protein Data Bank(PDB)ID #1S78のものである。実施例に示されるように、ErbB-2のドメインIのこの領域に結合する抗体は、特に良好な結合特徴を示し、これらは、ErbB-2陽性細胞の活性(例えば、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能並びに/又はかかる細胞のリガンド誘導性成長)に対抗することが可能である。更に、かかる抗体は、トラスツズマブ(ErbB-2のドメインIVに結合する)及びペルツズマブ(ErbB-2のドメインIIに結合する)等の現在公知の抗ErbB-2モノクローナル抗体との併用療法に特に適切であるが、それは、これらが、ErbB-2の異なるドメインに結合するからである。従って、これらの抗体は、同じエピトープについての競合なしに、同時に使用できる。用語「T144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基」とは、列挙された残基に隣接する最初の約5つのアミノ酸残基以内に位置する一次アミノ酸配列中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部露出しており、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す(例えば図21Bを参照のこと)。好ましくは、T144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置するアミノ酸残基は、L139、C140、Y141、Q142、D143、I145、L146、W147、K148、D149、L159、T160、L161、I162、D163、N165、S167、R168、A169、C170、H171、C173、S174、P175、M176、C177、K178、C182、W183、G184、E185及びS186からなる群から選択される。好ましくは、この抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも2つ又は少なくとも3つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。
【００７３】
好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、この抗体は、ErbB-2のドメインIのT144、R166及びR181を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。別の一実施形態は、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ErbB-2のドメインIのT144、R166、P172、G179及びR181を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。別の一実施形態は、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ErbB-2のドメインIのT144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。
【００７４】
本発明の別の一態様は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体を提供し、この抗体は、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。アミノ酸残基番号付けは、Protein Data Bank(PDB)ID #4P59のものである。実施例に示されるように、ErbB-3のドメインIIIのこの領域に結合する抗体は、特に良好な結合特徴を示し、これらは、ErbB-3陽性細胞の活性(例えば、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能並びに/又はかかる細胞のリガンド誘導性成長)に対抗することが可能である。用語「ネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基」とは、R426から11.2Å以内に空間的に位置するErbB-3タンパク質の三次構造中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部露出しており、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す。好ましくは、ネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置するアミノ酸残基は、L423、Y424、N425、G427、G452、R453、Y455、E480、R481、L482、D483及びK485からなる群から選択される(例えば、図21C及びTable 15 (表15)を参照のこと)。好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、この抗体は、ErbB-3のドメインIIIのR426を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。好ましくは、この抗体は、ErbB-3のドメインIIIのR426を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。
【００７５】
本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ADCC活性を増強するために非フコシル化されている。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、正常CHO細胞中で産生される同じ抗体と比較した場合、Fc領域中に、N結合型炭水化物構造の、低減された量のフコシル化を含む。
【００７６】
本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトにおいて使用される。この目的のために、本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト又はヒト化抗体である。
【００７７】
ポリペプチドに対するヒトの寛容は、多くの異なる局面によって支配される。T細胞媒介性、B細胞媒介性等である免疫は、ポリペプチドに対するヒトの寛容に包含される変数の1つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくは、ヒト定常領域である。この定常領域は、天然に存在するヒト抗体の定常領域と、1又は複数の、好ましくは10以下の、好ましくは5アミノ酸以下の差異を含み得る。定常部分が、天然に存在するヒト抗体に完全に由来することが好ましい。本明細書で産生される種々の抗体は、ヒト抗体可変ドメインライブラリーに由来する。かかるこれらの可変ドメインは、ヒトである。ユニークCDR領域は、ヒト由来、合成、又は別の生物由来であり得る。可変領域は、CDR領域を別にして、天然に存在するヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する場合、ヒト可変領域とみなされる。本発明の抗体中のErbB-2結合VH、ErbB-3結合VH又は軽鎖の可変領域は、CDR領域のアミノ酸配列中の潜在的差異を数に入れずに、天然に存在するヒト抗体の可変領域と、1又は複数の、好ましくは10以下の、好ましくは5アミノ酸以下の差異を含み得る。かかる変異は、体細胞超変異に関しても天然に存在する。
【００７８】
抗体は、重鎖可変領域に関しては少なくとも、種々の動物種由来であり得る。例えば、マウス重鎖可変領域等をヒト化することは、一般的実務である。マウス重鎖可変領域の3D構造と一致する3D構造を有するヒト重鎖可変領域中へのCDR移植;マウス重鎖可変領域から既知の又は疑わしいT細胞エピトープ又はB細胞エピトープを除去することによって好ましくは実施される、マウス重鎖可変領域の脱免疫化がその中にある、これが達成され得る種々の方法が存在する。除去は、典型的には、エピトープ中のアミノ酸のうちの1又は複数を、別の(典型的には保存的)アミノ酸に置換することによるものであり、その結果、エピトープの配列は、もはやT細胞エピトープでもB細胞エピトープでもないように、改変される。
【００７９】
かかる脱免疫化されたマウス重鎖可変領域は、元のマウス重鎖可変領域よりも、ヒトにおいて免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域又はドメインは、更にヒト化、例えば、ベニヤ化等される。ベニヤ化技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外面残基は、弱く免疫原性のベニヤ化表面又は実質的に非免疫原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供するために、ヒト残基で選択的に置き換えられる。本発明において使用される動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【００８０】
本発明に従う二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト抗体の定常領域を含む。それらの重鎖定常ドメインにおける差異に従って、抗体は、5つのクラス又はアイソタイプにグループ分けされる:IgG、IgA、IgM、IgD及びIgE。これらのクラス又はアイソタイプは、対応するギリシャ文字を用いて名付けられた、上記重鎖のうち少なくとも1つを含む。好ましい一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体を提供し、その定常領域は、IgG、IgA、IgM、IgD及びIgEの定常領域の群から選択され、より好ましくは、この定常領域は、IgG定常領域、より好ましくはIgG1定常領域、好ましくは変異したIgG1定常領域を含む。例えば、アロタイプG1m1、17及びG1m3等の、IgG1の定常領域におけるいくつかのバリエーションが、天然に存在し、並びに/又は得られた抗体の免疫学的特性を変化させることなしに許容される。典型的には、約1〜10の間のアミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せが、定常領域において許容される。
【００８１】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、この抗体は、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくとも含み、又はこの抗体は、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列を含む。この抗体は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958、MF3004又はMF3991の少なくともCDR3配列、最も好ましくはMF3958の少なくともCDR3配列を含む。
【００８２】
この抗体は、好ましくは、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003若しくはMF1898のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む。この抗体は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958、MF3004又はMF3991の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、最も好ましくはMF3958の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む。
【００８３】
本発明は、ErbB-3に結合する可変ドメインを含む抗体もまた提供し、この抗体は、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくとも含み、又はこの抗体は、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列を含む。この抗体は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061又はMF6065の少なくともCDR3配列、最も好ましくはMF3178の少なくともCDR3配列を含む。
【００８４】
この抗体は、好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を、少なくとも含む。この抗体は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061又はMF6065の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、最も好ましくは、MF3178の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む。
【００８５】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域のCDR3配列、又は図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる、重鎖CDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域のCDR3配列、又は図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列を少なくとも含む。この第1の抗原結合部位は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958、MF3004又はMF3991の少なくともCDR3配列、最も好ましくは、MF3958の少なくともCDR3配列を含み、第2の抗原結合部位は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061又はMF6065の少なくともCDR3配列、最も好ましくは、MF3178の少なくともCDR3配列を含む。
【００８６】
この第1の抗原結合部位は、好ましくは、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003若しくはMF1898のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3配列、又は図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を少なくとも含む。この第1の抗原結合部位は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958、
MF3004又はMF3991の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、最も好ましくは、MF3958の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、第2の抗原結合部位は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061又はMF6065の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、最も好ましくは、MF3178の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む。
【００８７】
好ましい一実施形態は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、MF3958のCDR3配列、又はMF3958のCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なるCDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、MF3178のCDR3配列、又はMF3178のCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なるCDR3配列を少なくとも含む。
【００８８】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、MF3958のCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF3958のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なるCDR1、CDR2及びCDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、MF3178のCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF3178のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なるCDR1、CDR2及びCDR3配列を少なくとも含む。
【００８９】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、MF3958のCDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、MF3178のCDR3配列を少なくとも含む。
【００９０】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部位は、MF3958のCDR1、CDR2及びCDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、MF3178のCDR1、CDR2及びCDR3配列を少なくとも含む。
【００９１】
CDR配列は、好ましくは、抗体の結合効力又は安定性を改善するために、例えば、最適化目的のために変化させられる。最適化は、得られた抗体の安定性及び/又は結合親和性が好ましくは試験され、改善されたErbB-2又はErbB-3特異的CDR配列が好ましくは選択された後に、例えば、変異誘発手順によって実施される。当業者は、本発明に従う少なくとも1つの変更されたCDR配列を含む抗体バリアントを作製することが十分に可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。保存的アミノ酸置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の1つの疎水性残基の、別の疎水性残基への置換、及び1つの極性残基の別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、又はグルタミンのアスパラギンへの置換が含まれる。
【００９２】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、この可変ドメインのVH鎖は、図16A若しくは図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847;MF3001、MF3003若しくはMF1898のアミノ酸配列を含み;又は図16A若しくは図16Eの上述のVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16A若しくは図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847;MF3001、MF3003若しくはMF1898のアミノ酸配列を含む。ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Aに示される、以下のアミノ酸配列を含む:
-  MF1849;又は
-  MF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又は
-  MF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3991のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、以下のアミノ酸配列を含む:VH鎖MF1849;又はMF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又はMF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3991のアミノ酸配列を含む。ここで、列挙されたVH配列は、図16Aに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、より好ましくは多くて1、2、3、4又は5アミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せを有する。好ましい一実施形態では、ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、MF3958のアミノ酸配列を含み;又はこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Aに示されるMF3958のアミノ酸配列を含む。ErbB-2に結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ErbB-3に結合する可変ドメインを好ましくは更に含む二重特異性抗体である。Erb-B3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含み;又は図16B若しくは図16E若しくは図37のVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含む。Erb-B3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061若しくはMF6065のアミノ酸配列を含み;又は図16B若しくは図37のそれぞれのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061若しくはMF6065のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、MF3178のアミノ酸配列を含み;又はこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるMF3178のアミノ酸配列を含む。好ましくは、上述のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、CDR3領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、好ましくは、CDR1及びCDR2領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、好ましくは、FR4領域中にも存在しない。
【００９３】
本発明は、ErbB-3に結合する可変ドメインを含む抗体を更に提供し、この可変領域のVH鎖は、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含み、又はこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含む。ErbB3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、VH鎖MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061若しくはMF6065のアミノ酸配列を含み;又はこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、VH鎖MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061若しくはMF6065のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含み;又はこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含む。ErbB-3に結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ErbB-2に結合する可変ドメインを好ましくは更に含む二重特異性抗体である。ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16A若しくは図16EのVH鎖のアミノ酸配列を含む。ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Aに示される以下のアミノ酸配列を含む:MF1849;又はMF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又はMF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3991のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、列挙されたErb-B2結合VH配列は、図16Aに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、より好ましくは多くて1、2、3、4又は5アミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せを有する。好ましい一実施形態では、図16AのErbB-2結合VH鎖は、MF3958のアミノ酸配列を含み;又はこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、MF3958のアミノ酸配列を含む。好ましくは、上述のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、CDR3領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、好ましくは、CDR1及びCDR2領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、好ましくは、FR4領域中にも存在しない。
【００９４】
本発明に従う抗体が更に提供され、この抗体は、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域配列を含み、又はこの抗体は、MF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003若しくはMF1898の重鎖可変領域配列と、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。
【００９５】
本発明に従う抗体が更に提供され、この抗体は、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域配列を含み、又はこの抗体は、MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074の重鎖可変領域配列と、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。
【００９６】
本発明は、一実施形態では、ErbB-2に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体を提供し、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB-2のドメインIに結合する。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB-2のドメインIに結合する。本発明に従うかかる抗体は、ErbB-2のドメインIに結合しない現在使用されている抗ErbB-2結合分子、例えば、ErbB-2のドメインIVに結合するトラスツズマブ及びErbB-2のドメインIIに結合するペルツズマブとの併用療法に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。
【００９７】
ErbB-2に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体が更に提供され、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB-2のドメインIに結合し、ErbB-2陽性細胞に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性(KD)は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB-2のドメインIに結合する。好ましい一実施形態では、SK-BR-3細胞上のErbB-2に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.3nM以下である。一実施形態では、この親和性は、3.0〜1.6nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、BT-474細胞上のErbB-2に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である。一実施形態では、この親和性は、4.5〜3.3nMの範囲内である。
【００９８】
上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【００９９】
本発明は、ErbB-2に結合する2つの可変ドメインを含む抗体を更に提供し、これらの可変ドメインのVH鎖は、図16A若しくは図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847;MF3001、MF3003若しくはMF1898のアミノ酸配列;又は図16A若しくは図16Eに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16A若しくは図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847;MF3001、MF3003若しくはMF1898 VH鎖のアミノ酸配列を含む。このVHは、好ましくは、以下のアミノ酸配列を含む:VH鎖MF1849;又はMF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又はMF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む、;或いは、このVHは、以下のアミノ酸配列を含む:VH鎖MF1849;又はMF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又はMF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図16Aに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、図16A又は図16Eに示される配列を好ましくは有する、同一のVH鎖を含む。同一のVH鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。これらのVH鎖は、図16A若しくは図16E若しくは図37に示されるのと同じVH鎖配列、又は図16A若しくは図16E若しくは図37に示されるそれぞれの配列に関して、1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを別にして同じVH鎖配列を含む場合、本発明にとって同一である。
【０１００】
本発明は、一実施形態では、ErbB-3に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体を提供し、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB-3のドメインIIIに結合する。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB-3のドメインIIIに結合する。本発明に従うかかる抗体は、ErbB-3のドメインIIIに結合しない現在使用されている抗ErbB-3結合分子、例えば、ErbB-3のドメインIに結合するMM-121(#Ab6)及びRG7116との併用療法に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。
【０１０１】
ErbB-3に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体が更に提供され、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB-3のドメインIIIに結合し、ErbB-3陽性細胞に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性(KD)は、2.0nM以下、好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB-3のドメインIIIに結合する。好ましい一実施形態では、SK-BR-3細胞上のErbB-3に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、2.0nM以下、好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。一実施形態では、この親和性は、1.39〜0.59nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、BT-474細胞上のErbB-3に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.0nM以下、より好ましくは0.5nM以下、より好ましくは0.31nM以下、より好ましくは0.23nM以下である。一実施形態では、この親和性は、0.31〜0.15nMの範囲内である。
【０１０２】
重ねて、上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【０１０３】
本発明は、各々がErbB3に結合する2つの可変ドメインを含む抗体を更に提供し、これらの可変ドメインのVHは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含み;又はこれらのVH鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、VH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含む。このVHは、好ましくは、VH鎖MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061若しくはMF6065のアミノ酸配列を含み;又はこれらのVH鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、VH鎖MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061若しくはMF6065のアミノ酸配列を含む。このVHは、好ましくは、VH鎖MF3178のアミノ酸配列を含み;又はMF3178 VH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、図16B又は図16E又は図37に示される配列を好ましくは有する、同一のVH鎖を含む。同一のVH鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。これらのVH鎖は、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるのと同じVH鎖配列、又は図16B若しくは図16E若しくは図37のVH鎖配列に関して、1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを別にして同じVH鎖配列を含む場合、同一である。
【０１０４】
ErbB-3に特異的な、本発明に従う単一特異性抗体は、例えばMM-121(#Ab6)等の先行技術の化合物と比較して、ErbB-3に勝る機能的活性を有するという利点を有し、これは、本発明に従うこれらの抗体が、ErbB-3活性(例えば、ErbB-3のリガンド誘導性受容体機能並びに/又はErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長)により良く対抗することが可能であることを意味する。これは、例えば、Table 7 (表7)及び図38に示される。
【０１０５】
好ましい一実施形態では、本発明は、ErbB-2に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、この可変ドメインのVH鎖は、以下のアミノ酸配列を含む:
-  VH鎖MF1849;又はMF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又はMF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む;或いは
-  VH鎖MF1849又はMF2971若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;又はMF3004若しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む。この実施形態に従うかかる二重特異性抗体は、更に好ましくは、ErbB-3に結合する可変ドメインを含む。ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含み;又は最も好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37のVH鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のアミノ酸配列を含む。ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含み、又は図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
本発明は、好ましくは、ErbB-2に結合する可変ドメイン及びErbB-3に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、
ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、
-  図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列;又は
-  このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列
を含み;並びに
ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
-  図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列;又は
-  図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列
を含む。
【０１０７】
本発明は、好ましくは、ErbB-2に結合する可変ドメイン及びErbB-3に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、
ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、
-  図16Aに示されるVH鎖MF3991のアミノ酸配列;又は
-  このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3991のアミノ酸配列
を含み;並びに
ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
-  図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列;又は
-  図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列
を含む。
【０１０８】
図16中の配列と比較した場合、VH鎖の挙動は、典型的には、このVH鎖が、図16に示されるVH鎖のアミノ酸配列に関して、15アミノ酸超の変化を有する場合、著しく異なり始める。図16に示されるVH鎖に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せを有するVH鎖は、図16に示されるVH鎖に関して、1、2、3、4又は5アミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せ、図16に示されるVH鎖に関して、好ましくは1、2、3又は4の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せ、好ましくは1、2又は3の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せ、より好ましくは1又は2の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せ、好ましくは1の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せを、好ましくは有する。1又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せは、好ましくは、VH鎖のCDR1、CDR2及びCDR3領域中には存在しない。これらは、好ましくは、FR4領域中にも存在しない。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。
【０１０９】
好ましい一実施形態では、本発明は、図16Dに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体、又は図16Dの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Dの二重特異性抗体を提供し、この多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。挿入、欠失、置換又はそれらの組合せは、好ましくは、VH鎖のCDR3領域中には存在せず、好ましくは、VH鎖のCDR1、CDR2及びCDR3領域中には存在せず、好ましくは、FR4領域中には存在しない。
【０１１０】
ヒト背景において非ヒト残基の含量を最小化することに向け、合理的方法が進化している。種々の方法が、二重特異性抗体の抗原結合特性を別の抗体に首尾よく移植するために利用可能である。抗体の結合特性は、圧倒的に、CDR3領域の正確な配列にあり、これは、全体としての可変ドメインの適切な構造と組み合わせた、可変ドメイン中のCDR1及びCDR2領域の配列によってしばしば支持される。種々の方法が、CDR領域を別の抗体の適切な可変ドメインに移植するために、現在利用可能である。これらの方法の一部は、本明細書に参照により含まれる、J. C. Almagro1及びJ. Fransson(2008)Frontiers in Bioscience 13、1619〜1633において概説されている。従って、本発明は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ErbB-2結合部位を含む可変ドメインは、図16A又は図16Eに示されるVH CDR3配列を含み、ErbB-3結合部位を含む可変ドメインは、図16B又は図16E又は図37に示されるVH CDR3領域を含む。ErbB-2結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは、図16A又は図16E中のVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。ErbB-3結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは、図16B又は図16E又は図37中のVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図16又は図37のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有する、VH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVH又は異なる哺乳動物のものであり得る。
【０１１１】
上述の多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。挿入、欠失、置換又はそれらの組合せは、好ましくは、VH鎖のCDR3領域中には存在せず、好ましくは、VH鎖のCDR1、CDR2又はCDR3領域中には存在せず、好ましくは、FR4領域中には存在しない。
【０１１２】
図16又は図37に示される可変重鎖配列を含む可変ドメインの軽鎖は、好ましくは、生殖系列軽鎖O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はその断片若しくは機能的誘導体である(imgt.orgにおけるIMGTデータベースワールドワイドウェブに従う命名法)。用語、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39軽鎖又はつまりはhuVκ1-39が使用される。この軽鎖は、1、2、3、4又は5アミノ酸の挿入、欠失、置換又はそれらの組合せを有し得る。上述の1、2、3、4又は5アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換又はそれらの組合せは、好ましくは、VL鎖のCDR3領域中には存在せず、好ましくは、VL鎖のCDR1、CDR2若しくはCDR3領域又はFR4領域中には存在しない。
【０１１３】
種々の方法が、二重特異性抗体を産生するために利用可能である。1つの方法には、細胞における2つの異なる重鎖及び2つの異なる軽鎖の発現、並びに細胞によって産生される抗体を収集することを伴う。この方法で産生された抗体は、典型的には、重鎖及び軽鎖の異なる組合せを有する一群の抗体を含み、その一部は、所望の二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は、引き続いて、この一群の抗体から精製され得る。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、種々の方法で増加され得る。本発明の好ましい一実施形態では、この比率は、細胞において、2つの異なる軽鎖を発現させず、2つの本質的に同一の軽鎖を発現させることによって、増加される。この概念は、当技術分野で、「共通の軽鎖」方法とも呼ばれる。本質的に同一な軽鎖が、2つの異なる重鎖と一緒に機能して、異なる抗原結合部位及び付随する異なる結合特性を有する可変ドメインの形成を可能にする場合、細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、2つの異なる軽鎖の発現よりも顕著に改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比率は、2つの同一の重鎖のペアリングよりも、2つの異なる重鎖の互いとのペアリングを刺激することによって、更に改善され得る。当技術分野は、重鎖のかかるヘテロ二量体化が達成され得る種々の方法を記載している。1つの方法は、「ノブ・イントゥー・ホール」二重特異性抗体を作製することである。米国特許出願公開第20030078385号(Arathoonら、-Genentech)を参照のこと。別の及び好ましい方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第61/635,935号とそれに続く米国特許出願第13/866,747号及びPCT出願PCT/NL2013/050294(WO2013/157954A1)に記載されている。単一細胞から二重特異性抗体を産生するための方法及び手段は、開示されており、それによって、単一特異性抗体の形成よりも、二重特異性抗体の形成が優先される手段が提供される。これらの方法は、本発明においても好ましく使用され得る。従って、本発明は、(単一細胞から)本発明に従う二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、界面を形成することが可能な2つのCH3ドメインを含み、この方法は、この
細胞中に、a)第1のCH3ドメイン含有重鎖をコードする第1の核酸分子、b)第2のCH3ドメイン含有重鎖をコードする第2の核酸分子を用意する工程を含み、これらの核酸分子には、第1及び第2のCH3ドメイン含有重鎖の優先的ペアリングのための手段が提供され、この方法は、宿主細胞を培養する工程、及びこれら2つの核酸分子の発現を可能にする工程、及び培養物から二重特異性抗体を回収する工程を更に含む。この第1及び第2の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。或いは、この第1及び第2の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。
【０１１４】
好ましい一実施形態は、(単一細胞から)本発明に従う二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、界面を形成することが可能な2つのCH3ドメインを含み、この方法は、
-  a)ErbB-2に結合し、第1のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第1の核酸分子、及びb)ErbB-3に結合し、第2のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子を有する細胞を用意する工程を含み、これらの核酸分子には、これら第1及び第2のCH3ドメインの優先的ペアリングのための手段が提供され、
この方法は、上記細胞を培養する工程、及びこれら2つの核酸分子の発現を可能にする工程、及び培養物から二重特異性IgG抗体を回収する工程を更に含む。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、共通の軽鎖をコードする第3の核酸分子もまた有する。この第1、第2及び第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。或いは、この第1、第2及び第3の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。好ましい共通の軽鎖は、上記のように、O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。この第1及び第2のCH3ドメインの優先的ペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のCH3ドメイン中の、対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生するための好ましい変異は、第1のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351K及びT366K(Kabatに従う番号付け)、並びに第2のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351D及びL368Eであり、又は逆もまた然りである。従って、二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法が更に提供され、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351K及びT366K(Kabatに従う番号付け)を含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351D及びL368Eを含み、この方法は、上記細胞を培養する工程、及びこれらの核酸分子の発現を可能にする工程、及び培養物から二重特異性抗体を回収する工程を更に含む。二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法もまた提供され、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351D及びL368E(Kabatに従う番号付け)を含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351K及びT366Kを含み、この方法は、上記細胞を培養する工程、及びこれらの核酸分子の発現を可能にする工程、及び培養物から二重特異性抗体を回収する工程を更に含む。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。これらのCH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、IgG1ヘテロ二量体化ドメインである。これらのCH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくは、IgG1定常領域である。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。核酸分子(典型的には、in vitroの、単離された又は組換え核酸)は、好ましくは、図16A若しくは図16B若しくは図37に示される重鎖可変領域、又は1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16A若しくは図16B若しくは図37に示される重鎖可変領域をコードする。好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図16又は図37に示される配列を含む。別の好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図16又は図37に示される核酸と同じアミノ酸配列をコードするが、1又は複数の異なるコドンをコードするので、異なる配列を有する。例えば、かかる核酸分子は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞又はPER-C6(商標)細胞等の抗体産生細胞のためにコドン最適化される。本発明は、図16D又は図37の重鎖をコードする核酸配列を更に提供する。
【０１１６】
本発明で使用される核酸分子は、排他的ではないが典型的には、リボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)である。代替的な核酸は、当業者に入手可能である。本発明に従う核酸は、例えば、細胞中に含まれる。この核酸が細胞において発現される場合、この細胞は、本発明に従う抗体を産生する。従って、本発明は、一実施形態では、本発明に従う抗体及び/又は本発明に従う核酸を含む細胞を提供する。この細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、適切な細胞は、本発明に従う抗体及び/又は本発明に従う核酸を含むことが可能な、好ましくはそれを産生することが可能な、任意の細胞である。
【０１１７】
本発明は、本発明に従う抗体を含む細胞を更に提供する。好ましくは、この細胞(典型的には、in vitroの、単離された又は組換え細胞)は、この抗体を産生する。好ましい一実施形態では、この細胞は、ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、NS0細胞又はPER-C6(商標)細胞である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、CHO細胞である。本発明に従う細胞を含む細胞培養物が更に提供される。種々の施設及び会社が、例えば臨床使用のために、抗体の大規模産生のための細胞株を開発している。かかる細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞又はPER.C6(商標)細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生等の他の目的のためにも使用される。タンパク質及び抗体の産業規模産生のために開発された細胞株は、本明細書で、産業的細胞株と更に呼ばれる。従って、好ましい一実施形態では、本発明は、本発明の抗体の産生に、抗体の大規模産生のために開発された細胞株の使用を提供する。
【０１１８】
本発明は、本発明の細胞を培養する工程、及びこの培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を産生するための方法を更に提供する。好ましくは、この細胞は、無血清培地中で培養される。好ましくは、この細胞は、懸濁成長に適応される。本発明に従う抗体を産生するための方法によって得ることができる抗体が、更に提供される。この抗体は、好ましくは、培養の培地から精製される。好ましくは、この抗体は、アフィニティ精製される。
【０１１９】
本発明の細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞株、CHO細胞、NS0細胞、又は臨床目的のための抗体産生についてのその適切性が既知の別の細胞型である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスE1領域又はその機能的等価物によって形質転換された細胞。かかる細胞株の好ましい例は、PER.C6(商標)細胞株又はその等価物である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、CHO細胞又はそのバリアントである。好ましくは、抗体の発現のためにグルタミンシンテターゼ(GS)ベクター系を使用するバリアント。
【０１２０】
本発明は、本発明に従う抗体を含む、組成物、好ましくは医薬組成物を更に提供する。この医薬組成物は、好ましくは、(医薬的に許容される)賦形剤又は担体を含む。好ましい一実施形態では、この医薬組成物は、5〜50mMのヒスチジン、100〜300mMのトレハロース、0.1〜03g/Lのポリソルベート20又はそれらの組合せを含む。pHは、好ましくは、pH=5.5〜6.5に設定される。好ましい一実施形態では、この医薬組成物は、25mMのヒスチジン、220mMのトレハロース、0.2g/Lのポリソルベート20又はそれらの組合せを含む。pHは、好ましくはpH=5.5〜6.5、最も好ましくはpH=6に設定される。
【０１２１】
本発明の抗体は、好ましくは、標識、好ましくは、in vivo画像化のための標識を更に含む。かかる標識は、典型的には、治療的適用には必要でない。例えば診断設定では、例えば、身体中の標的細胞を可視化する際に、標識は有用であり得る。種々の標識が適しており、多くが当技術分野で周知である。好ましい一実施形態では、この標識は、検出のための放射活性標識である。別の好ましい一実施形態では、この標識は、赤外標識である。好ましくは、この赤外標識は、in vivo画像化に適している。種々の赤外標識が、当業者に入手可能である。好ましい赤外標識は、例えば、IRDye 800;IRDye 680RD;IRDye 680LT;IRDye 750;IRDye 700DX;IRDye 800RS IRDye 650;IRDye 700ホスホラミダイト;IRDye 800ホスホラミダイト(LI-COR USA;4647 Superior Street;Lincoln、Nebraska)である。
【０１２２】
本発明は、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、本発明に従う抗体又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法を更に提供する。この処置の開始前に、この方法は、好ましくは、対象が、かかるErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有するかどうか、又はそのリスクがあるかどうかを決定する工程を含む。一部の実施形態では、この対象は、ErbB-2について[+]又は[++]と分類される。別の一実施形態では、この対象は、ErbB-2について[+++]と分類される。本発明は、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明の抗体を更に提供する。代替的に考案すると、本発明は、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍の処置のための医薬又は予防剤の製造のための、本発明に従う抗体の使用を提供する。本明細書で使用する場合、用語処置は、予防を包含する。
【０１２３】
この腫瘍は、好ましくは、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性癌である。好ましくは、この陽性癌は、乳癌、例えば、初期乳癌である。しかし、本発明は、広範なErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性癌、例えば、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、黒色腫等に適用され得る。本発明に従う抗体は、典型的には、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌若しくは黒色腫を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体が更に提供され、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。好ましい一実施形態では、この抗体は、抗体PB4188である。
【０１２４】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、好ましくは、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【０１２６】
従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌若しくは黒色腫を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体が更に提供され、本発明に従うこの抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180若しくはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含み、並びに/又は本発明に従うこの抗体は、好ましくは、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【０１２７】
この対象は、好ましくはヒト対象である。この対象は、好ましくは、トラスツズマブ等のErbB-2特異的抗体を使用したモノクローナル抗体治療に適格な対象である。好ましい一実施形態では、この対象は、腫瘍、好ましくはErbB-2/ErbB-3陽性癌、好ましくはErbB-2治療耐性表現型及び/又はヘレグリン耐性表現型、好ましくはモノクローナル抗体耐性表現型を有する腫瘍/癌を含む。かかる表現型を伴う腫瘍は、現在の抗HER2レジメン、例えば(それらに限定されないが)ErbB-2に対するモノクローナル抗体治療を用いた処置を逃避し得る。
【０１２８】
患者に投与される本発明に従う抗体の量は、典型的には、治療ウインドウ中にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容できない程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が低くなるほど、治療ウインドウは典型的には大きくなる。従って、低い投薬量で十分な治療効果を発揮する本発明に従う抗体が好ましい。投薬量は、トラスツズマブについての投薬レジームの範囲中にあり得るか、又はより低くてよい。
【０１２９】
本発明は、とりわけ、例えばNRG1-β1の上方調節等の逃避機構の存在下であっても、ErbB-2受容体及びErbB-3受容体を標的化し、癌細胞株のin vitroでの強力な増殖阻害及びin vivoでの腫瘍成長阻害を生じる抗体を記載する。ErbB-2又はErbB-3のいずれかに特異的なヒト及びマウスFab結合アームの多様なパネルが同定された。これらは、重鎖のヘテロ二量体化を駆動するCH3領域中の変異を含む相補的発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって、二重特異性抗体として産生された。500超の二重特異性抗体を、小規模で産生し、3つの異なる癌細胞株に対する結合アッセイ及び機能的アッセイにおいて試験した。種々の二重特異性抗体を選択し、BxPC3細胞株を使用する同所性異種移植モデルにおいて試験した。この細胞株は、ErbB-2受容体及びErbB-3受容体の両方を発現し、成長についてErbB-3リガンドに部分的に依存する。BxPC3モデルは、堅固でストリンジェントなスクリーニングモデルである。更に、in vivoでの強い抗腫瘍活性は、JIMT-1細胞株を使用する異種移植モデルを使用して確認されている。JIMT-1細胞は、トラスツズマブに対して臨床的に耐性であった、乳癌を有する62歳の患者の胸膜転移に由来する。JIMT-1細胞は、接着性単層として成長し、ヌードマウスにおいて異種移植腫瘍を形成する。JIMT-1細胞は、そのコード配列中に同定可能な変異を示さなかった、増幅されたHER-2癌遺伝子を有する。JIMT-1細胞は、HER-2のmRNA及びタンパク質を過剰発現し、HER-1、HER-3及びHER-4のmRNA及びタンパク質のレベルは、トラスツズマブ感受性細胞株SKBR-3と類似である(Tannerら、Mol Cancer Ther 2004)。
【０１３０】
重要なことに、現在使用されているモノクローナル抗体トラスツズマブ及びペルツズマブ、並びに化学化合物ラパチニブと比較して、より良い抗腫瘍効果が、本発明に従う抗体を使用して得られた。
【０１３１】
本発明の抗体は、懸濁293F細胞における一過的トランスフェクション後に、レベル>50mg/Lで産生され得る。これらの二重特異性抗体は、70%超の収率で、98%よりも高い純度に精製され得る。分析的特徴付け試験は、二価単一特異性lgG1と匹敵する、二重特異性lgGl抗体プロファイルを示している。機能的活性に関して、本発明の二重特異性抗体は、トラスツズマブ+ペルツズマブと比較して、in vitro及びin vivoで優れた強度(potency)を実証できる。
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態は、併用療法を提供する。一実施形態では、本発明に従う抗体は、ErbB-2阻害剤又は結合剤を含むErbB-2標的化剤と組み合わされる。
【０１３３】
ErbB-2、ErbB-3結合性二重特異性抗体との併用療法における使用のための例示的なErbB-2標的化剤には、任意のErbB-2標的化剤、例えば、Erb-B2の結合剤又は阻害剤が含まれる。
【０１３４】
ErbB-2標的化剤は、小分子HER2チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ラパチニブ(Tyverb/Tykerb(登録商標))、ネラチニブアファチニブ、ツカチニブ(tucatinib)又はAZD8931であり得る。
【０１３５】
ErbB-2標的化剤は、抗体であり得る。例えば、トラスツズマブ又はペルツズマブは、異なるErbB-2エピトープに結合し、その結果、実施例に示されるように、同じエピトープについて本発明に従う抗体と競合しないので、これらの抗体が好ましい場合がある。
【０１３６】
ErbB-2標的化剤は、抗体薬物コンジュゲート、例えば、トラスツズマブエムタンシン又はDS-8201であり得る。
【０１３７】
別の一実施形態では、本発明に従う抗体は、MM-121(#Ab6)又はRG7116(Roche)と組み合わされるが、それは、これらの抗体が、異なるErbB-3エピトープに結合し、その結果、実施例に示されるように、同じエピトープについて本発明に従う抗体と競合しないからである。
【０１３８】
別の好ましい一実施形態では、ErbB-2及びErbB-3に特異的な結合化合物は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤及び/又はMAPK経路の成分の阻害剤と、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤又はSrc阻害剤等と組み合わされる。一実施形態では、ErbB-2及びErbB-3に特異的な結合化合物は、微小管破壊薬物、又はヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤と組み合わされる。驚くべきことに、本発明者らは、これらの組合せが使用される場合に、相乗効果を見出した。従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法が更に提供され、この方法は、
-  ErbB-2及びErbB-3に特異的な結合化合物、並びに
-  PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物、及びヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物
を対象に投与する工程を含む。この阻害剤は、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤又はSrc阻害剤を含む。このチロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ及び/又はネラチニブである。このPI3Ka阻害剤は、好ましくはBYL719である。一実施形態では、このAkt阻害剤は、MK-2206である。好ましい一実施形態では、このmTOR阻害剤は、エベロリムスである。好ましい一実施形態では、このSrc阻害剤は、サラカチニブである。好ましい一実施形態では、この微小管破壊薬物は、パクリタキセルである。好ましい一実施形態では、このHDAC阻害剤は、ボリノスタットである。好ましい一実施形態では、ErbB-2及びErbB-3に特異的な結合化合物は、MM-111(Merrimack Pharmaceuticals社)である。好ましい一実施形態では、ErbB-2及びErbB-3に特異的な結合化合物は、二重特異性抗体である。好ましい一実施形態では、ErbB-2及びErbB-3に特異的な結合化合物は、本発明に従う二重特異性抗体である。
【０１３９】
従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法が更に提供され、この方法は、
-  ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、並びに
-  PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物
を対象に投与する工程を含む。
【０１４０】
ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍の処置における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、この処置は、この二重特異性抗体、並びにPI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象に投与する工程を含む。好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を有する本発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と組み合わされる。この阻害剤は、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤又はSrc阻害剤を含む。このチロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ及び/又はネラチニブである。このPI3Ka阻害剤は、好ましくはBYL719である。一実施形態では、このAkt阻害剤は、MK-2206である。好ましい一実施形態では、このmTOR阻害剤は、エベロリムスである。好ましい一実施形態では、このSrc阻害剤は、サラカチニブである。好ましい一実施形態では、この微小管破壊薬物は、パクリタキセルである。好ましい一実施形態では、このHDAC阻害剤は、ボリノスタットである。
【０１４１】
このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。一実施形態では、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍は、腫瘍細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有する。
【０１４２】
一実施形態では、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる、本発明に従う抗体は、典型的には、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
【０１４３】
好ましい一実施形態では、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる、本発明に従う抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【０１４４】
好ましい一実施形態では、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる、本発明に従う抗体は、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【０１４５】
好ましくは、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む、並びに/又は図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる。
【０１４６】
好ましい一実施形態では、
-  図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択される、又はMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003若しくはMF1898の重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なるErbB-2特異的重鎖可変領域配列を含む、ErbB-2特異的重鎖可変領域配列、並びに
-  図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074の重鎖可変領域配列からなる群から選択される、又はMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074の重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なるErbB-3特異的重鎖可変領域配列を含む、ErbB-3特異的重鎖可変領域配列
を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる。好ましい一実施形態では、抗体PB4188は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物と、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる。
【０１４７】
本発明の好ましい実施形態は、ヘレグリンストレス条件下での、本発明に従う抗体の使用を提供する。ヘレグリンは、ErbB-3陽性腫瘍細胞の成長に関与する増殖因子である。典型的には、腫瘍細胞が高レベルのヘレグリン(ヘレグリンストレスと呼ばれる)を発現する場合、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びラパチニブ等の現在公知の治療は、腫瘍成長を阻害することがもはや可能ではない。この現象は、ヘレグリン耐性と呼ばれる。しかし、驚くべきことに、本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞の成長に対抗することも可能である。本明細書で使用する場合、ヘレグリンの発現レベルは、細胞が、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する場合、高いとみなされる。ヘレグリン発現レベルは、例えば、腫瘍RNAを用いたqPCRを使用して(例えば、Shamesら、PLOS ONE、2013年2月、第8巻、第2号、1〜10頁及びYonesakaら、Sci. transl. Med.、第3巻、第99号(2011); 1〜11頁等に記載されている)、又は血液、血漿若しくは血清サンプルを好ましくは使用する、例えばELISA等のタンパク質検出方法を使用して(例えば、Yonesakaら、Sci. transl. Med.、第3巻、第99号(2011); 1〜11頁等に記載されている)、測定される。従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う抗体が更に提供され、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位を含む。ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象の処置のための方法もまた提供され、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、本発明に従う抗体又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む。好ましい一実施形態は、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍の処置のための医薬の調製のための本発明に従う抗体の使用を提供し、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌若しくは黒色腫、好ましくは乳癌を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う抗体が更に提供され、この癌の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位を含む。
【０１４８】
高いヘレグリンレベルは、典型的には、転移の形成(即ち、腫瘍細胞又は腫瘍開始細胞の遊走、浸潤、成長及び/又は分化)の間に存在する。典型的には、腫瘍開始細胞は、例えばCD44、CD24、CD133及び/又はALDH1等の幹細胞マーカーに基づいて同定される。従って、これらのプロセスが、トラスツズマブ及びペルツズマブ等の現在公知の治療によって、かろうじて対抗され得る。本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞又は腫瘍開始細胞の成長及び/又は分化に対抗することが可能であるので、本発明に従うかかる抗体は、転移の形成に対抗するのにも特に適切である。従って、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象における転移の形成に対抗するための方法が、更に提供され、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与する工程を含む。転移の形成の処置又は予防における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。転移の形成の処置又は予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用が更に提供され、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫の細胞、好ましくは乳癌細胞の転移の形成の処置又は予防における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体が更に提供され、これらの細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、典型的には、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド��導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い。ErbB-3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB-2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
【０１４９】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。
【０１５０】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、好ましくは、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【０１５１】
好ましい一実施形態は、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この腫瘍の細胞は、BXPC3若しくはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%若しくは95%であるヘレグリン発現レベルを有する、方法、又はかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、図16A又は図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、又は少なくとも重鎖可変領域配列を含む。
【０１５２】
好ましい一実施形態は、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この腫瘍の細胞は、BXPC3若しくはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%若しくは95%であるヘレグリン発現レベルを有する、方法、又はかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、図16B又は図16E又は図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、又は少なくとも重鎖可変領域配列を含む。一実施形態は、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象の処置における使用のための、抗体PB4188を提供し、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。
【０１５３】
既に記載したように、本発明に従う抗体は、その細胞表面上に1.000.000未満のErbB-2受容体を有するErbB-2陽性腫瘍細胞を処置するために、特に適切である。典型的にはErbB-2[++]又はErbB-2[+]と分類される、かかる腫瘍を有する患者には、原発性腫瘍を有する患者並びに再発したErbB-2陽性腫瘍を有する患者が含まれる。トラスツズマブ(ハーセプチン)及びペルツズマブ等の現在使用されている治療は、ErbB-2[+++]と分類される、その細胞表面上に1.000.000超のErbB-2受容体を有する悪性ErbB-2陽性細胞を有する患者のみに処方される。従って、ErbB-2[++]又はErbB-2[+]と分類される患者は、好ましくは、本発明に従う抗体で処置される。従って、本発明に従う使用のための方法又は抗体が更に提供され、その対象は、腫瘍細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有するErbB-2又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する。好ましい一実施形態は、転移の形成の処置又は予防における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有し、この腫瘍細胞は、1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有する。
【０１５４】
別の好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、障害された心機能を有する、又はそのリスクがある対象において、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍に対抗するために使用される。障害された心機能とは、その対象が、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満又は80%未満、好ましくは75%未満又は70%未満である、例えば左室駆出分画(LVEF)等の心機能を有することを意味する。この健康な心機能は、例えば、健康な集団の平均心機能(例えば、平均LVEF等)である。或いは、この健康な心機能は、本発明に従う抗体を用いた抗腫瘍治療の開始前に患者において測定される機能(例えば、LVEF)である。
【０１５５】
心機能は、例えば、対象の身体診察、及び心エコー図又はMUGAスキャン等を使用したLVEFの試験によってモニタリングされる。
【０１５６】
ErbB-2は、ヘレグリン受容体複合体HER2:HER4が関与するシグナル伝達ネットワークの一部として、成体心筋細胞の成長、修復及び生存に関与する。本明細書で上に記載したように、心毒性は、ErbB-2標的化治療における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用される場合に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。例えば、ドキシサイクリンとトラスツズマブとの組合せは、重症の心臓副作用を誘導する。トラスツズマブ誘導性心機能不全の臨床症例の漸増する数にもかかわらず、その作用機構は未知である。ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍に対する現在公知の治療の心毒性の観点から、本発明に従う抗体を使用することが特に有利である。実施例に示されるように、心筋細胞の生存に影響を与えないか、又はトラスツズマブ及びペルツズマブと比較して、顕著に低い程度までしか影響を与えない抗体が、ここで提供されている。心毒性が低減されるので、これは、重要な利点を提供する。これは、障害された心機能に罹患していない人々にとって既に有利であり、障害された心機能に罹患している人々、例えば、うっ血性心不全(CHF)、左室機能不全(LVD)及び/若しくは減少した左室駆出分画(LVEF)に罹患している対象、並びに/又は心筋梗塞を有している対象等にとっては、更にいっそう有利である。従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体が更に提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満又は80%未満又は75%未満又は70%未満である心機能を有する。この心機能は、好ましくは、LVEFを含む。このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態は、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満若しくは70%未満である心機能を有する、方法、又はかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、
-  図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、若しくは少なくとも重鎖可変領域配列、又は列挙された重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列;並びに/或いは
-  図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、若しくは少なくとも重鎖可変領域配列、又は列挙された重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列
を含む。好ましい一実施形態では、この抗体は、PB4188である。
【０１５７】
一実施形態では、この二重特異性抗体は、別の場所により詳細に説明されるように、ヘレグリンストレス条件下での対象の処置における使用のためのものである。従って、ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体が更に提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満又は70%未満である心機能を有し、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。この心機能は、好ましくは、LVEFを含む。ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象の処置のための方法もまた提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満、好ましくは70%未満である心機能を有し、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む。好ましい一実施形態は、健康な心機能、好ましくは健康なLVEFと比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満又は70%未満である心機能、好ましくはLVEFを有する対象における、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍の処置のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用を提供し、この腫瘍の細胞は、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する。
【０１５８】
転移の形成の処置又は予防における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、その対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満、好ましくは70%未満である心機能を有する。転移の形成の処置又は予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用が更に提供され、その対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満、好ましくは70%未満である心機能を有する。このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。この心機能は、好ましくは、LVEFを含む。好ましい一実施形態では、この抗体は、抗体PB4188である。
【０１５９】
別の実施形態では、生存促進性経路Akt(PI3キナーゼ経路とも呼ばれる)及びMAPキナーゼ経路の種々の因子のリン酸化に対抗するための本発明に従う抗体の使用が行われる。これらは、HER3の下流の増殖促進性シグナル伝達経路である。驚くべきことに、本発明者らは、本発明に従う抗体を用いて、Akt、ERK1/2及びS6リボソームタンパク質(S6-RP)のリン酸化を顕著に阻害することに成功したが、トラスツズマブ及びペルツズマブは、これらの強い抗リン酸化効果を有さない。増殖促進PI3キナーゼ及びMAPキナーゼ経路の因子のリン酸化に対抗することは有利であるが、それは、これが、ErbB-3陽性腫瘍細胞の成長に対抗するからである。従って、Akt、ERK1/2及び/又はS6-RPのリン酸化に対抗する、好ましくはそれを阻害するための、本発明に従う抗体の使用が更に提供される。重要なことに、Aktのリン酸化は、実施例に示されるように、in vitro及びin vivoの両方で、本発明の抗体によって顕著に低減され得、又は更には完全に遮断され得る。従って、好ましい一実施形態は、Aktのリン酸化に対抗する、好ましくはそれを阻害するための、本発明に従う抗体の使用を提供する。HER3-p85複合体の形成に対抗するための、本発明に従う抗体の使用もまた提供される。HER3-p85複合体の形成は、Akt活性化における第1段階であるので、このHER3-p85複合体の形成に対抗することが有利である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB-2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体である。この抗体は、好ましくは、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。更に、又は或いは、この抗体は、好ましくは、F409及びR426、並びにネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。一実施形態では、この抗体は、図16又は図37に示される、少なくとも1つのCDR1、CDR2及びCDR3配列、又は少なくとも1つのVH配列を含む。一実施形態では、この抗体は、PB4188である。
【０１６０】
本発明は、ErbB-2陽性腫瘍を有する、又はErbB-2陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法であって、ErbB-2阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む方法もまた提供する。
【０１６１】
ErbB-2阻害剤が単一特異性抗体である場合、単一特異性抗体及び二重特異性抗体は、好ましくは、ErbB-2上の異なるエピトープに結合する。異なるErbB-2エピトープは、好ましくは、異なる細胞外ErbB-2ドメイン上にある。単一特異性抗体は、好ましくは、ErbB-2細胞外ドメインIV、ドメインII又はドメインIII上のエピトープに結合できる。二重特異性抗体は、好ましくは、ErbB-2細胞外ドメインI上のエピトープに結合できる。
【０１６２】
ErbB-2標的化剤は、薬物コンジュゲートを含み得、特に、ErbB-2阻害剤が単一特異性抗体である場合、この単一特異性抗体は、好ましくは、薬物コンジュゲート、例えば、アド-トラスツズマブエムタンシン(Kadcyla(登録商標))を含む。
【０１６３】
薬物コンジュゲートはまた、二重特異性抗体に対するもの、又は二重特異性抗体及びErbB2の標的化剤の両方に対するものであり得る。薬物コンジュゲートは、好ましくは、エムタンシンを含む。抗体-薬物コンジュゲート即ちADCは、癌を有する人の処置のための標的化治療として設計された高度に強力なバイオ医薬薬物の重要なクラスである。化学療法とは異なり、ADCは、癌細胞のみを標的化して死滅させ、健康な細胞を温存することを意図している。薬物コンジュゲートは、生物学的に活性な細胞傷害性(抗癌)ペイロード又は薬物に連結された抗体である。モノクローナル抗体のユニークな能力を細胞傷害性薬物の、癌を死滅させる能力と組み合わせることによって、抗体-薬物コンジュゲートは、健康な組織と罹患組織との間の高感度な識別を可能にする。これは、伝統的な化学療法剤とは対照的に、抗体-薬物コンジュゲートが、癌細胞を標的化して攻撃し、その結果、健康な細胞があまりひどく影響されないことを意味する。抗体薬物コンジュゲートは、DiJosephら; Blood. 2004 103(5):1807〜14. Mullard A. Nature Reviews Drug Discovery 12, 329〜332 (2013); Zolot RSら; Nature Reviews Drug Discovery 12, 259〜260 (2013); Mertenら; Bioconjug Chem 2015; 26:2176〜2185; Schlomら; Cancer Res. 1992; 52(5):1067〜72. Rohrer T. Journal of Antibody-drug Conjugates. 2013年6月21日に記載されている。ADC中への取込みに適切な薬物は、アウリスタチン(チューブリン重合酵素(Tubulin polymerase)阻害剤);マイタンシン(チューブリン脱重合);カリチアマイシン(DNA切断);デュオカルマイシン(Duocarymycin)(DNA副溝アルキル化剤);PBD二量体(DNA副溝架橋剤);及びα-アマニチン(RNAポリメラーゼII阻害剤)である。好ましい実施形態では、薬物はエムタンシンである。
【０１６４】
ErbB-2阻害剤が単一特異性抗体である場合、この単一特異性抗体は、好ましくはトラスツズマブ(CAS番号180288-69-1)である。これは、ペルツズマブ(CAS番号380610-27-5)で置き換えられ得る又はそれと組み合わされ得る。特に好ましい実施形態では、単一特異性抗体は、トラスツズマブ-エムタンシン(Kadcyla(登録商標)の名称の下でも市販されるT-DM1)である。
【０１６５】
二重特異性抗体は、好ましくは、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含み、この第1の抗原結合部位は、MF3958の少なくともCDR3配列、又はMF3958のCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なるCDR3配列を含み、この第2の抗原結合部位は、MF3178の少なくともCDR3配列、又はMF3178のCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なるCDR3配列を含む。二重特異性抗体は、好ましくは、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含み、この第1の抗原結合部位は、MF3958の少なくともCDR3配列を含み、この第2の抗原結合部位は、MF3178の少なくともCDR3配列を含む。
【０１６６】
好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含み、この第1の抗原結合部位は、MF3958の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF3958のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なるCDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、この第2の抗原結合部位は、MF3178の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列、又はMF3178のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なるCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む。
【０１６７】
好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含み、この第1の抗原結合部位は、MF3958の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、この第2の抗原結合部位は、MF3178の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む。
【０１６８】
好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、ErbB-2に結合する可変ドメイン及びErbB-3に結合する可変ドメインを含み、ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、
-  図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列;又は
-  このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列
を含み、ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
-  図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列;又は
-  図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4若しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換若しくはそれらの組合せを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列
を含む。
【０１６９】
二重特異性抗体は、好ましくは、抗体PB4188である。処置は、化学療法薬物と組み合わされ得る。従って、処置は、好ましくは、化学療法薬物を、それを必要とする個体に投与することを更に含む。多くの異なる化学療法薬物が、癌の処置のために開発されている。常に、一部の化学療法薬物は、特定の腫瘍と戦うにあたり、他の化学療法薬物よりも活性である。
【０１７０】
化学療法薬物は、例えば、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、エリブリン、カペシタビン又はカルボプラチンであり得る。
【０１７１】
本発明は、ErbB-2陽性腫瘍を有する、又はErbB-2陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法における使用のための、ErbB-2阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤;並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体の組合せを更に提供する。
【０１７２】
ErbB-2阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を含む医薬組成物が更に提供される。ErbB-2阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二価単一特異性抗体を含むErbB-2標的化剤、並びにErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む二重特異性抗体を含むキットオブパーツもまた提供される。
【０１７３】
本発明は、脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を有する、又は脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置の方法であって、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む方法を更に提供する。腫瘍は、好ましくは、乳房腫瘍の転移である。好ましくは、抗体は、ErbB-2細胞外ドメインI上のエピトープに結合できる。好ましくは、抗体は、ErbB-3細胞外ドメインIII上のエピトープに結合できる。この方法は、好ましくは、ErbB-2阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を有する単一特異性二価抗体を含むErbB-2標的化剤の投与を更に含む。好ましくは、この方法は、ErbB-2阻害剤又は結合剤、例えば、ErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を有する単一特異性二価抗体を含むErbB-2標的化剤の投与を更に含む。ErbB-2阻害剤、例えば、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープ又はErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を有する単一特異性二価抗体は、薬物コンジュゲートを含み得る。薬物は、好ましくは、エムタンシンを含む。ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を有する単一特異性二価抗体は、好ましくは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、又は同じ可変ドメインアミノ酸配列を有するバイオシミラーである。ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む抗体は、好ましくは、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、好ましくは、抗体PB4188である。脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を有する、又は脳においてErbB-2陽性及びErbB-3陽性腫瘍を発症するリスクがある個体の処置における使用のための、ErbB-2の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位及びErbB-3の細胞外部分上のエピトープに結合できる抗原結合部位を含む抗体が更に提供される。
【０１７４】
個体が腫瘍を有しており、その腫瘍が個体に提供された処置に対して良好に応答した場合、その個体は、本明細書に示される腫瘍を発症するリスクがある。特に、個体が完全な寛解状態に入っている場合、個体における腫瘍細胞の数は、従来技術、例えば、通常のMRI又はCTスキャン画像化では測定不能である。かかる個体は、残念ながら、元の腫瘍の部位(再発性腫瘍)若しくは遠位部位(転移性腫瘍)のいずれかにおいて腫瘍を発症するかなり高いリスクを有し、又は新たな起源(例えば、処置誘導性)の腫瘍を発症する。従って、リスクがある個体は、好ましくは、腫瘍を有しており、その完全な寛解状態にある個体である。
【０１７５】
ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる抗体が提供される。抗体は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。抗体は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減でき、この細胞は、1細胞当たり少なくとも100.000のErbB-2細胞表面受容体を有する。好ましくは、この細胞は、MCF-7細胞、SKBR-3細胞、NCI-N87細胞、BxPC-3細胞、BT-474細胞又はJIMT-1細胞である。第1の抗原結合部位は、好ましくは、ErbB-2のドメインI又はドメインIVに結合し得る。第2の抗原結合部位は、好ましくは、ErbB-3へのErbB-3リガンドの結合を妨害する。ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、この第1の抗原結合部位が、ErbB-2のドメインIに結合し、この第2の抗原結合部位が、ErbB-3のドメインIIIに結合する抗体もまた提供される。ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、ErbB-3陽性細胞に対するこの第2の抗原結合部位の親和性(KD)が、ErbB-2陽性細胞に対するこの第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれよりも高い抗体が更に提供される。抗体は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。抗体は、好ましくは、ErbB-2及びErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減させる。ErbB-3陽性細胞に対するこの第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、好ましくは2.0nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB-2陽性細胞に対するこの第1の抗原結合部位の親和性(KD)は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。BT 474細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性(KD)は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.2nM以下であり、及び/又はSK BR 3細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、5.0nM以下、好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.0nM以下である。ErbB-2に結合する2つの抗原結合部を含む抗体であって、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方がErbB-2のドメインIに結合する抗体が更に提供される。ErbB-2陽性細胞に対するこれらの抗原結合部位のうち少なくとも一方の親和性(KD)は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.0nM以下、より好ましくは4.0nM以下である。ErbB-3に結合する2つの抗原結合部を含む抗体であって、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方がErbB-3のドメインIIIに結合する抗体もまた提供される。ErbB-3陽性細胞に対するこれらの抗原結合部位のうち少なくとも一方の親和性(KD)は、好ましくは2.0nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。このErbB-3陽性細胞及び/又はこのErbB-2陽性細胞は、好ましくは、BT 474細胞又はSK BR 3細胞である。抗体は、好ましくは、T144、T164、R166、P172、G179、S180及びR181、並びにT144、T164、R166、P172、G179、S180又はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。これは、好ましくは、R426及びネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2Å以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。この抗体は、好ましくは、図16A又は図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列を含む。この抗体は、好ましくは、図16B又は図16E又は図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列を含む。この抗体は、好ましくは、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898からなる群から選択されるErbB2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、又はこの抗体は、MF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003若しくはMF1898のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3アミノ酸、好ましくは多くて2アミノ酸、好ましくは多くて1アミノ酸が異なるCDR配列を含む。この抗体は、好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074からなる群から選択されるErbB3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、又はこの抗体は、MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6
067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074のCDR1、CDR2及びCDR3配列と、多くて3アミノ酸、好ましくは多くて2アミノ酸、好ましくは多くて1アミノ酸が異なるCDR配列を含む。この抗体は、好ましくは、図16A若しくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003及びMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB2特異的重鎖可変領域配列を含み、又はこの抗体は、MF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003若しくはMF1898の重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む。この抗体は、好ましくは、図16B若しくは図16E若しくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073及びMF6074の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB3特異的重鎖可変領域配列を含み、又はこの抗体は、MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073若しくはMF6074の重鎖可変領域配列と、多くて15アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む。抗体は、好ましくは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)を示す。抗体は、好ましくは、ADCCを増強するために非フコシル化されている。これは、好ましくは、ヒト又はヒト化抗体である。抗体は、好ましくは、適合性のヘテロ二量体化ドメインを有する2つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。これら適合性のヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性の免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロ二量体化ドメインである。好ましくは、両方のアームが共通の軽鎖を含む。この共通の軽鎖は、好ましくは、生殖系列軽鎖、好ましくは、IgVKl-39遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖、最も好ましくは、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVKl-39*01/IGJKl*01である。抗体は、好ましくは、標識、好ましくは、in vivo画像化のための標識を更に含む。本明細書に示される二重特異性抗体を含む医薬組成物もまた提供される。ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、本発明に従う抗体又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法もまた提供される。ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための本発明の抗体もまた提供される。二重特異性抗体は、好ましくは、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない。この二重特異性抗体は、健康な心機能と比較して90%未満の心機能を有する対象への使用のためのものである。ErbB-2、ErbB-3若しくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、又はこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、
-  ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、並びに
-  PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される1又は複数の化合物、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される1又は複数の化合物
を対象に投与する工程を含む方法もまた提供される。ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍の処置における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、この処置が、ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象に、この二重特異性抗体、並びにPI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物及びHDAC阻害剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を投与する工程、好ましくは、この二重特異性抗体、並びにチロシンキナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を投与する工程を含む、二重特異性抗体もまた提供される。このチロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ及び/又はネラチニブを含む。このPI3K阻害剤は、好ましくは、BYL719である。このAkt阻害剤は、好ましくは、MK2206である。このmTOR阻害剤は、好ましくは、エベロリムスである。このSrc阻害剤は、好ましくは、サラカチニブ(saracatinib)である。この微小管標的化薬物は、好ましくは、パクリタキセルである。このHDAC阻害剤は、好ましくは、ボリノスタットである。ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象において転移の形成に対抗するための方法であって、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞が、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有し、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与する工程を含む方法もまた提供される。ErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞の転移の形成の処置又は予防における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位及びErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、このErbB-2、ErbB-3又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞が、BXPC3又はMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%又は95%であるヘレグリン発現レベルを有する二重特異性抗体もまた提供される。本発明に従う使用のための方法又は抗体であって、その対象が、細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB-2細胞表面受容体を有するErbB-2又はErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、方法又は抗体が提供される。この抗体は、好ましくは、本発明に従う抗体である。この腫瘍細胞は、好ましくは、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌又は黒色腫の細胞である。この対象は、好ましくは、健康な心機能と比較して90%未満の心機能を有する。この心機能は、好ましくは、左室駆出分画(LVEF)を含む。この対象は、好ましくは、うっ血性心不全(CHF)、左室機能不全(LVD)及び/又は10%以上減少した左室駆出分画(LVEF)に罹患している、並びに/又はこの対象は、心筋梗塞を有している。Akt、ERK及び/又はS6リボソームタンパク質の���ン酸化に対抗する、好ましくはそれを阻害するための、本発明の抗体の使用もまた提供される。
【０１７６】
明確さ及び簡潔な記述を目的として、特徴は、同じ又は別々の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載された特徴の全て又は一部の組合せを有する実施形態を含み得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】PG3178の1つのアームと組み合わせた、活性HER2×HER3二重特異性抗体中にも存在するHER2アームのパネルの単量体HER2に対する抗原滴定を示す図である。PG3025を除くHER2×HER3パネルの全てのHER2モノクローナルを、HER2抗原滴定ELISAで試験した。
【図２】リガンド刺激あり又はなしの、BxPC3細胞に対するHER2×HER3二重特異性抗体の機能的活性を示す図である。点線は、リガンド刺激あり又はなしの、このアッセイにおける参照抗体トラスツズマブの活性を示す。
【図３】MCF-7アッセイにおける、HER2及びHER3モノクローナル抗体(上のパネル)並びにそのHER2×HER3二重特異性抗体(下のパネル)の滴定曲線を示す図である。
【図４】同所性マウスモデルにおける31日目のBxPC3-luc2腫瘍サイズに対する抗体処置の効果を示す図である。BLI、バイオルミネセンスによって測定された腫瘍成長。
【図５】同所性マウスモデルにおける31日目のBxPC3-luc2腫瘍サイズに対する抗体処置の効果を示す図である。BLI、バイオルミネセンスによって測定された腫瘍成長。
【図６】MCF-7及びBxPC3-luc2のHER2発現細胞上の、二重特異性HER2×HER3抗体及びその親モノクローナル抗体のFACS分析を示す図である。MFI、平均蛍光強度。
【図７−１】HP-SEC及びCIEX-HPLCによる分析的特徴付けを示す図である。PB4188(上のパネル)、抗HER2親モノクローナル抗体(中央のパネル)、抗RSVモノクローナル参照IgG(下のパネル)。
【図７−２】図７−１の続きを示す。
【図７−３】図７−２の続きを示す。
【図７−４】図７−３の続きを示す。
【図７−５】図７−４の続きを示す。
【図７−６】図７−５の続きを示す。
【図８】抗体の連続滴定による、軟寒天におけるJIMT-1細胞増殖の阻害を示す図である。
【図９】抗体の連続滴定による、マトリゲルにおけるBT-474(上のパネル)及びSKBR3(下のパネル)細胞増殖の阻害を示す図である。
【図１０Ａ】マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG誘導性の増殖及び分岐/浸潤を示す図である。
【図１０Ｂ】親モノクローナル抗体とは対照的な、PB4188による、マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG誘導性の増殖及び分岐/浸潤の阻害を示す図である。
【図１０Ｃ】抗HER3モノクローナル抗体とは対照的な、PB4188による、マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG誘導性の増殖及び分岐/浸潤の阻害を示す図である。
【図１０Ｄ】抗HER3モノクローナル抗体とトラスツズマブとの組合せとは対照的な、PB4188による、マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG誘導性の増殖及び分岐/浸潤の阻害を示す図である。
【図１０Ｅ】PB4188及び組合せPB4188+トラスツズマブによる、マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG誘導性の増殖及び分岐/浸潤の阻害を示す図である。
【図１１−１】100ng/mlのHRGの存在下での、HER2+++N87細胞におけるPB4188の優れた阻害活性を示す図である。
【図１１−２】図１１−１の続きを示す。
【図１２】用量滴定におけるPB4188及びPB3448のADCC活性を示す図である。
【図１３】モノクローナル親抗体又はそれらの組合せと比較した、二重特異性抗体の増加したADCC活性を示す図である。
【図１４】低(上のパネル)及び高(下のパネル)HER2発現細胞に対する、トラスツズマブと比較した、非フコシル化されたPB4188のADCC活性を示す図である。
【図１５−１】高又は低FcγRバリアントを発現するレポーター細胞の存在下での、SKBR-3 HER2+++細胞に対する非フコシル化されたPB4188のADCC活性を示す図である。
【図１５−２】図１５−１の続きを示す。
【図１６Ａ−１】本発明の抗体のVH鎖、共通の軽鎖及び重鎖の核酸及びアミノ酸配列を示す図である。この図中にリーダー配列が示される場合、これは、VH鎖の一部でも抗体の一部でもなく、典型的には、タンパク質を産生する細胞におけるタンパク質のプロセシングの間に切断される。
【図１６Ａ−２】図１６Ａ−１の続きを示す。
【図１６Ａ−３】図１６Ａ−２の続きを示す。
【図１６Ａ−４】図１６Ａ−３の続きを示す。
【図１６Ａ−５】図１６Ａ−４の続きを示す。
【図１６Ａ−６】図１６Ａ−５の続きを示す。
【図１６Ａ−７】図１６Ａ−６の続きを示す。
【図１６Ａ−８】図１６Ａ−７の続きを示す。
【図１６Ａ−９】図１６Ａ−８の続きを示す。
【図１６Ａ−１０】図１６Ａ−９の続きを示す。
【図１６Ａ−１１】図１６Ａ−１０の続きを示す。
【図１６Ｂ−１】図１６Ａ−１１の続きを示す。
【図１６Ｂ−２】図１６Ｂ−１の続きを示す。
【図１６Ｂ−３】図１６Ｂ−２の続きを示す。
【図１６Ｂ−４】図１６Ｂ−３の続きを示す。
【図１６Ｂ−５】図１６Ｂ−４の続きを示す。
【図１６ＣＤ】図１６Ｂ−５の続きを示す。
【図１６Ｅ−１】図１６ＣＤの続きを示す。
【図１６Ｅ−２】図１６Ｅ−１の続きを示す。
【図１６Ｅ−３】図１６Ｅ−２の続きを示す。
【図１６Ｅ−４】図１６Ｅ−３の続きを示す。
【図１６Ｅ−５】図１６Ｅ−４の続きを示す。
【図１６Ｅ−６】図１６Ｅ−５の続きを示す。
【図１６Ｅ−７】図１６Ｅ−６の続きを示す。
【図１６Ｅ−８】図１６Ｅ−７の続きを示す。
【図１６Ｅ−９】図１６Ｅ−８の続きを示す。
【図１７】JIMT-1マウス異種移植モデルにおける腫瘍サイズに対する抗体処置の効果を示す図である。異なる処置群の腫瘍体積ノギス測定によって測定された腫瘍成長。上、60日間の腫瘍成長;下、処置期間(29日間)の最後における腫瘍成長阻害(TGI)。
【図１８】JIMT-1マウス異種移植モデルにおける異なる処置群のカプラン・マイヤー生存曲線を示す図である。
【図１９】N87のリガンド駆動される成長の阻害を示す図である。N87のHRG駆動される増殖は、親抗HER3抗体とは対照的に、PB4188によって、広範なHRGにわたって克服され得る。40ng/mlの抗体濃度で示されたデータ。
【図２０−１】BT-474細胞(上;3つの独立したアッセイ)及びSK-BR-3細胞(下;3つの独立したアッセイ)に対する125I標識されたIgG HER2×HER3(PB4188)の定常状態細胞親和性測定を示す図である。非特異的結合は、100倍過剰の未標識HER2×HER3を使用して決定した。
【図２０−２】図２０−１の続きを示す。
【図２１Ａ】エピトープマッピングHER2を示す図である。同定された重要残基は、HER2結晶構造上に黒色球として示され、同定された二次的重要残基は、灰色球として示される(PDB ID#1S78)。
【図２１Ｂ】a)検証されたPG3958エピトープ残基を薄い灰色の球として示し、周囲の残基(+/-5アミノ酸残基)を暗い灰色の球として示す、HER2結晶構造(PDB#1S78)を示す図である。b)検証されたエピトープ残基を灰色で示し、周囲の残基(+/-5残基)を黒色で示す、エピトープ領域の溶媒に露出した表面を示す図である。c)薄い灰色の検証されたエピトープ残基、及び暗い灰色の周囲の残基(+/-5残基)を用いた、エピトープ領域の詳細な表示を示す図である。d)検証されたエピトープ残基(灰色下線)、周囲の残基(黒色)及び遠位残基(灰色イタリック、a、b及びcには示されていない)を示す、HER2 PG3958エピトープ領域の一次アミノ酸配列を示す図である。図及び分析は、Yasara(www.yasara.org)で行った。
【図２１Ｃ】a)灰色球のエピトープ残基Arg426、及び黒色球の、Arg426から11.2Å半径以内の全ての、表面に露出した残基を示す、HER3結晶構造(PDB#4P59)を示す図である。b)灰色で示されるArg426及び遠位残基、及び黒色で示されるArg426から11.2Å半径以内の全ての、表面に露出した残基を用いた、エピトープ領域の溶媒に露出した表面を示す図である。c)薄い灰色のエピトープ領域中の残基Arg426及び暗い灰色の周囲の残基(全て標識されている)を示す図である。図及び分析は、Yasara(www.yasara.org)で行った。
【図２２】HER2に対するFabアーム3958のための重要結合残基の確認を示す図である。トラスツズマブを、対照抗体として含めた。結合を、FACS滴定において決定し、結合は、トラスツズマブ結合と比較したAUCとして表現される。D143Yは、この変異体へのトラスツズマブの結合もまた遮断されるので、3958エピトープの一部とはみなされない。
【図２３】HER3結晶構造中に示される、PG3178結合のための重要残基を示す図である。PG3178結合について同定された重要残基は、HER3結晶構造上で黒色球として示される(PDB ID#4P59)。
【図２４】HER3に対するPG3175のための重要結合残基としてのR426の確認を示す図である。2つの抗HER3抗体を、対照抗体として含めた。結合を、FACS滴定において決定し、結合を、WT HER3に対する結合と比較したAUCとして表現する。
【図２５】in vitroの心臓負荷下でのPB4188毒性の非存在を示す図である。3μMのアントラサイクリンドキソルビシンの存在下での、心筋細胞とPB4188又は単一特異性ベンチマーク抗体とのインキュベーション。心筋細胞の生存度を、ATPの定量化によって決定し、相対的光単位(RLU)で表現した。T、トラスツズマブ;P、ペルツズマブ。
【図２６】トラスツズマブ及びHER3抗体と比較した、HER2増幅された細胞へのPB4188の結合を示す図である。FACS滴定を、異なるHER2レベルを発現する示された細胞株に対して実施した。中央値PEシグナル値の曲線下面積を、細胞株ごとにプロットした。
【図２７】飽和濃度のPB4188、トラスツズマブ又は陰性対照抗体と共に事前インキュベートしたSKBR-3細胞への、PB4188FITCの連続滴定の結合を示す図である。PB4188FITCは、トラスツズマブ又は対照抗体の存在下で、SKBR-3に効率的に結合する。
【図２８−１】同じHER3 Fabアーム及び4つのHER2ドメインに対する異なるHER2アームから構成されたHER2×HER3二重特異性抗体による、HRGストレス条件下での細胞増殖の阻害を示す図である。
【図２８−２】図２８−１の続きを示す。
【図２９】SKBR-3細胞の成長及び形態学に対する、PB4188とラパチニブとの相乗的組合せを示す図である。左、異なる条件下で処置した細胞の顕微鏡図;右、処置条件に関してグラフ的にプロットした形態学的変化。
【図３０Ａ−１】時間経過実験における、PB4188による、N87細胞のHRG媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ+ペルツズマブ及びHRG単独を、対照として含めた。
【図３０Ａ−２】図３０Ａ−１の続きを示す。
【図３０Ａ−３】図３０Ａ−２の続きを示す。
【図３０Ｂ−１】時間経過実験における、PB4188による、SKBR-3細胞のHRG媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ+ペルツズマブ及びHRG単独を、対照として含めた。
【図３０Ｂ−２】図３０Ｂ−１の続きを示す。
【図３０Ｂ−３】図３０Ｂ−２の続きを示す。
【図３１】時間経過実験における、PB4188による、N87細胞のHRG媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ+ペルツズマブ及びラパチニブを、対照として含めた。
【図３２】Aktレベル及びAktリン酸化における変化を、PB4188の2回の週1回の用量又は4回の週1回の用量の4時間後に評価したことを示す図である。腫瘍溶解物中のリン酸化レベルを、Luminexアッセイによって評価した。分析を、2連で実施し、1群当たり5つの腫瘍を分析した。
【図３３】JIMT-1腫瘍材料に対するVera Tag分析によって分析した、HER2:HER3媒介性シグナル伝達に対するPB4188のin vivo媒介性効果を示す図である。腫瘍を、投薬の4時間後に分析し、PBS処置動物由来の腫瘍を、対照として含めた。
【図３４−１】PB4188が細胞周期進行を低減することを示す図である。アッセイ培地中に播種した細胞を、標準的(1ng/ml)又は高い(100ng/ml)濃度のHRGの存在下で、抗体の滴定と共にインキュベートした。24時間後(又はMCF-7細胞については48時間後)、細胞を、細胞周期の異なる期(G0/G1、S又はG2/M期)におけるそれらの分布について分析した。増殖指数を、S期及びG2/M期にある細胞の百分率と、G0/G1期にある細胞の百分率との間の比率として計算した。P+T、ペルツズマブ+トラスツズマブ。
【図３４−２】図３４−１の続きを示す。
【図３５−１】HER2過剰発現性癌細胞における、pH感受性色素で標識した抗体の内部移行を示す図である。1ng/mlのHRGを補充したアッセイ培地中に播種したN87(A、B)及びSKBR-3(C、D)を、100nMのpH感受性色素標識した抗体と共に、24時間インキュベートした。回収後、細胞を、APC標識した抗ヒトIgG二次抗体で染色して、細胞表面結合した抗体を検出した。細胞を、内部移行を決定するためにPE(A、C)において、抗体の表面結合を決定するためにAPC(B、D)チャネルにおいて、蛍光についてのFACSによって分析した。
【図３５−２】図３５−１の続きを示す。
【図３６】2つの異なるドナー由来の細胞を用いた、トラスツズマブ対トラスツズマブ+ペルツズマブのADCC活性を示す図である。
【図３７−１】F3178バリアントのアミノ酸及びヌクレオチドアラインメントを示す図である。CDR領域が示される。
【図３７−２】図３７−１の続きを示す。
【図３７−３】図３７−２の続きを示す。
【図３７−４】図３７−３の続きを示す。
【図３７−５】図３７−４の続きを示す。
【図３７−６】図３７−５の続きを示す。
【図３７−７】図３７−６の続きを示す。
【図３８】HRG依存的N87アッセイにおけるHER3モノクローナル抗体の滴定曲線を示す図である。PG6058、PG6061及びPG6065は、PG3178のバリアントである。PG1337は、破傷風トキソイドに特異的な陰性対照である。データは、各プレート上に存在するリガンドを用いた基底増殖に対して正規化した。
【図３９−１】HER3モノクローナル抗体のCIEX-HPLCプロファイルを示す図である。PG6058、PG6061及びPG6065は、PG3178のバリアントである。VH領域の計算された等電点(pI)及び主要ピークの保持時間(tR)が、各抗体について与えられる。
【図３９−２】図３９−１の続きを示す。
【図４０Ａ−１】HRGストレス濃度にあるHER2増幅された細胞株に対する、PB4188とのin vitro薬物組合せアイソボログラムを示す図である。
【図４０Ａ−２】図４０Ａ−１の続きを示す。
【図４０Ａ−３】図４０Ａ−２の続きを示す。
【図４０Ａ−４】図４０Ａ−３の続きを示す。
【図４０Ｂ】マトリゲル中で成長させたHER2増幅された細胞株に対する、PB4188とのin vitro薬物組合せアイソボログラムを示す図である。
【図４１】頭蓋内移植に使用した皮下腫瘍(第4継代)についての腫瘍成長曲線を示す図である。
【図４２】脳浮腫スコアリングシステムを示す図である。0から4までの脳浮腫スコアの例の代表的なT2加重MR画像。白色の矢印は腫瘍領域を示し、黄色の矢印は浮腫を指す。
【図４３】群A〜D中のマウスの組み入れ時の体重及び腫瘍体積を示す図である。群間で、体重にも腫瘍体積にも差異は見られなかった(一元配置ANOVA、p=0.43(体重)及びp=0.92(腫瘍体積))。
【図４４】4つの処置群についての治療の開始後の腫瘍体積を示す図である。平均±SEM、N=8〜6/群をグラフ化している。各群について、腫瘍体積が、少なくとも6匹の動物が生存していた時点までプロットされる。
【図４５】組み入れ時体重からのグラムで(左)及び百分率変化(右)として表現した、4つの処置群についての治療の開始後の体重を示す図である。平均のみをグラフ化している、N=8〜6/群。各群について、体重が、少なくとも6匹の動物が生存していた時点までプロットされる。
【図４６】T2加重MRIによって測定した、ビヒクルで処置したマウスについての個々の腫瘍体積を示す図である。
【図４７】T2加重MRIによって測定した、T-DM1で処置したマウスについての個々の腫瘍体積を示す図である。
【図４８】T2加重MRIによって測定した、MCLA-128で処置したマウスについての個々の腫瘍体積を示す図である。
【図４９】T2加重MRIによって測定した、T-DM1+MCLA-128で処置したマウスについての個々の腫瘍体積を示す図である。
【図５０】群A由来の1匹のマウス(M23)の代表的なT2加重MR画像を示す図である。これらの画像は、冠状断(上)及び軸位断(下)スライスを示す。
【図５１】群B由来の1匹のマウス(M35)の代表的なT2加重MR画像を示す図である。これらの画像は、冠状断(上)及び軸位断(下)スライスを示す。
【図５２】群C由来の1匹のマウス(M42)の代表的なT2加重MR画像を示す図である。これらの画像は、冠状断(上)及び軸位断(下)スライスを示す。
【図５３】群D由来の1匹のマウス(M03)の代表的なT2加重MR画像を示す図である。これらの画像は、冠状断(上)及び軸位断(下)スライスを示す。
【図５４】組み入れ時体重からのグラムで(左)及び百分率変化(右)として表現した、ビヒクルで処置したマウスについての個々の体重測定値を示す図である。
【図５５】組み入れ時体重からのグラムで(左)及び百分率変化(右)として表現した、T-DM1で処置したマウスについての個々の体重測定値を示す図である。
【図５６】組み入れ時体重からのグラムで(左)及び百分率変化(右)として表現した、MCLA-128で処置したマウスについての個々の体重測定値を示す図である。
【図５７】組み入れ時体重からのグラムで(左)及び百分率変化(右)として表現した、T-DM1+MCLA-128で処置したマウスについての個々の体重測定値を示す図である。
【図５８】各マウスについての最後のMRスキャンにおける脳中の浮腫のスコアリングを示す図である。スコアリングの時点での腫瘍体積は、群間で異なり、腫瘍体積は、脳浮腫のレベルに影響し得る。T-DM1及びT-DM1+MCLA-128処置した動物の平均腫瘍体積は、ビヒクル又はMCLA-128処置した動物と比較して小さかった。このように、結果は、注意して解釈すべきである。
【図５９】全ての群からの生存データのカプラン・マイヤープロットを示す図である。生存期間中央値は、それぞれ、ビヒクル、TDM1、MCLA-128及びT-DM1+MCLA-128で処置した動物について、13、19.5、29及び42日間であった。生存曲線は有意に異なっていた(p<0.0001、ログランク)。
【図６０】ペアワイズカプラン・マイヤープロットを示す図である。有意に長い生存期間中央値が、ビヒクル処置したマウス(13日間)と比較して、T-DM1(19.5日間)、MCLA-128(29日間)及びT-DM1+MCLA-128(42日間)で処置したマウスについて観察された。T-DM1処置したマウスとMCLA-128処置したマウスとの間で、生存期間中央値に差異は見られなかった。T-DM1+MCLA-128で処置したマウスは、T-DM1又はMCLA-128単独で処置したマウスと比較して、有意に長い生存期間中央値を有する。
【図６１】併用療法(二重及び三重)臨床試験のための試験設計を示す図である。
【図６２】併用療法臨床試験における二重処置投与を示す図である。
【図６３】併用療法臨床試験における三重処置投与を示す図である。
【実施例】
【０１７８】
(実施例1)
方法、材料及び抗体についてのスクリーニング
細胞株:
BxPC-3-luc2(Perkin Elmer 125058)、N87(ATCC(登録商標)CRL-5822(商標))、SK-BR-3(ATCC(登録商標)HTB-30(商標))、BT-474(ATCC(登録商標)HTB-20(商標))、JIMT-1(DSMZ ACC 589)、L929(Sigma Aldrich社 85011425)、K562(DSMZ ACC10)、HEK293T(ATCC(登録商標)-CRL-11268(商標))、CHO-K1(DSMZ ACC110)、MCF-7(DSMZ ACC 115)、MDA-MB-468(#300279-513、Cell line services)SK-OV-3(ATCC(登録商標)HTB-77(商標))、MDA-MB-175(ATCC-HTB-25)、MDA-MB-453(ATCC-HTB-131)、MDA-MB-361(ATCC-HTB-27)、ZR-75-1(ATCC-CRL-1500)及びMKN-45(DSMZ ACC409)細胞株を、ATCC、DSMZ又はSigma Aldrich社から購入し、10%熱不活化胎仔ウシ血清(FBS)を補充した成長培地中で慣用的に維持した。HEK293F Freestyle細胞を、Invitrogen社から取得し、293 FreeStyle培地中で慣用的に維持した。
【０１７９】
組換えヒト、ニワトリ、ラット及び交換ドメインベクターの作製(HERのクローニング)
ヒトHER2。全長ヒトHER2を、乳癌細胞株JIMT-1から単離したRNA由来のcDNAからPCRによって増幅した。ヒトHER2の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった。フォワードプライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGC、リバースドプライマー:AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG。全長増幅産物を、NheI及びXbaIで消化し、引き続いて、pcDNA3.1(Invitrogen社)の対応する部位中にクローニングした。
【０１８０】
配列を、NCBI参照配列NM_004448.2との比較によって検証した。トランスフェクション及び免疫化の目的のためにヒトHER2細胞外ドメイン(ECD)をもっぱら発現する構築物を作製するために、HER2の膜貫通ドメイン及びECDを、PCR増幅し、pVax1中に再クローニングした。トランスフェクション目的のために、別の構築物を、HER2 ECDドメインを増幅することによってpDisplayにおいて作製し、この構築物中では、HER2 ECDドメインは、PDGFR膜貫通ドメインと融合される。
【０１８１】
ヒトHER3。HER3の全長ヒトcDNAクローンを、Origene社から取得した。トランスフェクション及び免疫化の目的のためにヒトHER3 ECDをもっぱら発現する構築物を作製するために、HER3の膜貫通ドメイン及びECDを、PCR増幅し、pVax1中に再クローニングした。更に、別の構築物を、pVax1において作製し、それによって、HER3 ECDドメインを、PDGFR膜貫通ドメインに融合させた。全ての配列を、NCBI参照NM_001982.3との比較によって検証した。
【０１８２】
カニクイザルHER2細胞外ドメインを、カニクイザルcDNA-Monkey)Normal Colon Tissue(Biochain社)からPCR増幅した。カニクイザルHER2の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった:
フォワードプライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTGGTAC、リバースドプライマー:AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG。全長増幅産物を、NheI-XbaIで消化し、引き続いて、pcDNA3.1の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し、アカゲザルの利用可能な配列(XM_002800451)とアラインして、ErbB-2クローンの正確さをチェックした。
【０１８３】
カニクイザルHER3細胞外ドメインを、カニクイザルcDNA-Monkey)Normal Colon Tissue(Biochain社)からPCR増幅した。カニクイザルHER3の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった:
フォワードプライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACGGCGCTCTG、リバースドプライマー:AATAATTCTAGATTACGTTCTCTGGGCATTAGC。全長増幅産物を、NheI-XbaIで消化し、引き続いて、pcDNA3.1の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し、アカゲザルの利用可能な配列(ENSMMUP00000027321)とアラインして、HER3クローンの正確さをチェックした。
【０１８４】
ニワトリHER2配列は、参照配列NM_001044661.1に基づいた。キメラ交換ドメイン構築物を、ニワトリHER2配列のドメインIからIVを、ヒトIのドメインIからIVに交換することによって作製した。mycタグを含む配列を、哺乳動物細胞における発現のために最適化し、Geneartにおいて合成した。
【０１８５】
ラットHER3配列は、参照配列NM_001044661.1に基づいた。キメラ交換ドメイン構築物を、ラットHER3配列のドメインIからIVを、ヒトIのドメインIからIVに交換することによって作製した。mycタグを含む配列を、哺乳動物細胞における発現のために最適化し、Geneartにおいて合成した。
【０１８６】
HER2及びHER3過剰発現性細胞株の作製
細胞表面上に高レベルのHER3を発現する細胞株を作製するために、哺乳動物発現ベクターを、NotI及びKpnI消化によって全長HER3を切り出すことによって作製した。引き続いて、この断片を、pcDNA3.1(-)/hygroベクターの対応する部位中にクローニングした。ネオマイシン耐性遺伝子をコードする全長HER2及びHER3発現ベクターを使用して、細胞表面上に高レベルのHER2を発現する細胞株を作製した。トランスフェクション前に、プラスミドを、SSpI及びFspI消化によって線状化した。両方のベクターを、K562細胞中に別々にトランスフェクトし、安定なプールを、抗生物質選択後に作製した。得られた細胞株(K562-HER2及びK562-HER3)は、それらの細胞表面上に高レベルのHER2及びHER3を発現した。
【０１８７】
免疫化
HER2免疫化。4つの異なる免疫化戦略を適用した。コホート#Aについて、6匹のC57Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、14日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fc(RND systems社)タンパク質で追加免疫し、その後、28日目及び42日目に、200μl中2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で追加免疫した。コホート#Cについて、6匹のC57Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、14日目に腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で追加免疫し、その後、35日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質でタンパク質追加免疫し、49日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Eについて、6匹のC57Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質で免疫化した。引き続いて、腹腔内注射を介した、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質によるタンパク質追加免疫を、14日目及び28日目に実施し、42日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Gについて、6匹のC57Bl/6マウスを、彼らのプロトコールに従って、Genovac社(Freiburg、Germany)においてDNAワクチン接種によって免疫化した。DNAワクチン接種に使用した、エンドトキシンフリーの提供されたベクターは、pVax1中にクローニングされたHER2の膜貫通部分及び細胞外部分をコードしていた。引き続いて、DNA追加免疫を、14日目、28日目及び66日目に与えた。
【０１８８】
HER3免疫化。4つの異なる免疫化戦略を適用した。コホート#Bについて、6匹の(C57Bl/6)マウスを、腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HER3を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、14日目、28日目、49日目及び63日目に、200μl中2×106の、HER3で一過的にトランスフェクトされたL929細胞で追加免疫した。コホート#Dについて、6匹のC57Bl/6マウスを、0日目、14日目及び28日目に腹腔内注射によって、2×106の、HER3を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、49日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-3-Fcタンパク質で追加免疫し、66日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのErbb-3-Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Fについて、6匹のC57Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-3-Fcタンパク質で免疫化した。引き続いて、マウスを、14日目及び28日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-3-Fcタンパク質で追加免疫し、42日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのErbb-3-Fcタンパク質による最終追加免疫を与えた。コホート#Hについて、6匹のC57Bl/6マウスを、彼らのプロトコールに従って、Genovac社(Freiburg、Germany)においてDNAワクチン接種によって免疫化した。DNAワクチン接種に使用した、エンドトキシンフリーの提供されたベクターは、pVax1中にクローニングされたPDGFRの膜貫通部分及びHER3の細胞外部分をコードしていた。引き続いて、DNA追加免疫を、14日目、28日目及び66日目に与えた。
【０１８９】
抗体力価の決定。
免疫化されたC57Bl/6マウス由来の血清中の抗HER2力価を、ECD-Erbb-2タンパク質(Bendermedsystems社)に対するELISA、並びにHER2陰性K562、HER2低発現性細胞株MCF-7並びにHER2増幅されたSKBR-3及びBT-474細胞に対するFACS分析によって、決定した。免疫化されたC57Bl/6マウス由来の血清中の抗HER3力価を、Erbb-3-Fcタンパク質に対するELISA、並びにHER3陰性K562、HER2低発現性細胞株MCF-7並びにHER2増幅されたSKBR-3及びBT-474細胞に対するFACS分析によって、決定した。
【０１９０】
動物を屠殺する前のHER2及びHER3に対する血清力価は、それぞれ、Table 1 (表1)及びTable 2 (表2)に記載されている。全てのコホート中の動物は、HER2又はHER3に対する抗体応答を発達させた。
【０１９１】
リンパ組織の回収。
脾臓及び流入領域リンパ節を、DNAでワクチン接種した全てのマウス(コホート#G及び#H)から取り出した。単一細胞懸濁を、全ての組織から作製し、引き続いて、組織を、Trizol試薬中で溶解した。コホート#Aから#Fまで、脾臓を、最初の追加免疫後に死亡したコホート#Cの1匹のマウスを除く全てのマウスから取り出した。単一細胞懸濁を、全ての脾臓から作製し、総B細胞画分を、CD19富化(コホート#A、E、F)又は非B細胞の枯渇(コホート#B、C、D)のいずれかによって、MACS分離手順を使用して単離した。
【０１９２】
免疫化したマウスからのファージディスプレイライブラリーの作製
1つのファージライブラリーを、各マウスについて構築した。この目的のために、1群ごとの全てのマウス(1群につき5又は6匹のマウス)からの材料を使用して、以下のアプローチを使用してファージライブラリーを調製した。各個々のマウスから、RNAを単離し、cDNAを合成し、VHファミリー特異的PCRを実施した。引き続いて、マウス1匹当たりの全てのVHファミリーPCR産物を精製し、DNA濃度を決定し、消化し、共通の軽鎖を含むファージディスプレイベクター中にライゲーションして、マウス-ヒトキメラファージライブラリーを作製した。全てのファージライブラリーは、85%超の挿入頻度で、106超のクローンを含んだ。
【０１９３】
HER2及びHER3に特異的に結合するFab断片を保有するファージの選択
抗体断片を、抗体ファージディスプレイライブラリーを使用して選択した。免疫化ライブラリー及び合成ライブラリー(de Kruifら、Mol. Biol. (1995)、248、97〜105に記載される通り)を、選択に使用した。
【０１９４】
HER2ファージの選択及びスクリーニング
ファージライブラリーを、VCS-M13ヘルパーファージ(Stratagene社)を用いてレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ(Nunc)中で、2ラウンドにわたって選択した。第1ラウンドでは、ECD-Erbb-2タンパク質(Bendermedsystems社)を、イムノチューブ上にコートし、第2ラウンドでは、Erbb-2-Fc(RND systems社)を、イムノチューブ上にコートした。これらのイムノチューブを、4%脱脂粉乳(ELK)中でブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーもまた、4%ELKでブロッキングし、その後、イムノチューブにファージライブラリーを添加した。免疫チューブ中での、ファージライブラリーとコートされたタンパク質とのインキュベーションを、回転条件下、室温で2時間実施した。次いで、イムノチューブを、PBS中0.05%のTween-20で5〜10回洗浄し、その後、PBS中で5〜10回洗浄した。結合したファージを、50mMのグリシン(pH2.2)を使用して溶出し、E.coli XL-1 Blueに添加し、ファージ感染のために37℃でインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリン及びグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、37℃で終夜インキュベートした。第1ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、その後、レスキューし、増幅して、富化された第1ラウンドライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Erbb-2-Fc(RND systems社)に対して選択した。第2ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージモノクローナルミニプレップを調製した。次いで、陽性ファージクローン結合Erbb2を、乳癌細胞株BT-474への結合についてFACSにおいて同定した。全てのErbb2特異的クローンのVH遺伝子を配列決定した。VH遺伝子再編成を、VBASE2ソフトウェアを用いて確立して、ユニーククローンを同定した。次いで、全てのユニーククローンを、HEK293T細胞(陰性対照)、ErbB-2で一過的にトランスフェクトされたHEK293T細胞、及びBT-474細胞への結合について、FACSにおいてファージ形式で試験した。
【０１９５】
HER3ファージの選択及びスクリーニング
ファージライブラリーを、VCS-M13ヘルパーファージ(Stratagene社)でレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ(Nunc)中で、2ラウンドにわたって選択した。両方の選択ラウンドで、Erbb-3-Fc(RND systems社)を、イムノチューブ上にコートした。融合タンパク質のFc部分に向かう選択バイアスを克服するために、Erbb-3-Fcに対する両方の選択ラウンドを、150μg/mlのヒトIgGの存在下で実施した。これらのイムノチューブを、4%ELKでブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーを、4%ELKでブロッキングし、その後、イムノチューブにファージライブラリーを添加した。ファージライブラリーとのインキュベーションを、回転条件下、室温で2時間実施した。次いで、イムノチューブを、PBS中0.05%のTween-20で5〜10回洗浄し、その後、PBS中で5〜10回洗浄した。結合したファージを、50mMのグリシン(pH2.2)を使用して溶出し、E.coli XL-1 Blueに添加し、ファージ感染のためにインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリン及びグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、37℃で終夜インキュベートした。第1ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、ファージをレスキューし、増幅して、富化された第1ラウンドライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Erbb-3-Fc(RND systems社)に対して選択した。第2ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージモノクローナルミニプレップを調製した。陽性ファージクローンを、乳癌細胞株BT-474への結合についてFACSにおいて同定した。全ての陽性クローンのVH遺伝子を配列決定した。VH遺伝子再編成を、VBASE2ソフトウェアを用いて確立して、ユニーククローンを同定した。全てのユニーククローンを、K562細胞(陰性対照)、安定なK562-HER3細胞及びBT-474細胞への結合について、FACSにおいてファージ形式で試験した。
【０１９６】
合計36回の選択を、Erbb2及びErbb3抗原形式で実施した。全ての選択スクリーニング手順は、HER2に対する89のユニークFabクローン及びHER3に対する137のユニークFabクローンを生じた。Fabを、ユニークVDJ組換え事象を示すそのユニークHCDR3配列に基づいて、ユニークであるとみなした。一部の場合には、同一のHCDR3を有するが、CDR1及び/又はCDR2中に差異を有する、クローナルバリアントが得られた。免疫化マウスライブラリーから、親和性バリアントを反映するVH遺伝子中の置換を含むクローナルバリアントのクラスターを選択した。
【０１９７】
抗体の選択/特徴付け
モノクローナル抗体の作製
免疫化マウスファージライブラリー由来の、VH遺伝子配列及びそのいくつかの配列バリアントによって判断される、ユニーク抗体のVH遺伝子を、骨格IgG1ベクター中にクローニングした。2つの異なる産生細胞株を、プロセスの間に使用した;HEK293T及び293F Freestyle細胞。接着性HEK293T細胞を、6ウェルプレート中で、80%のコンフルエンシーまで培養した。これらの細胞を、個々のDNA-FUGENE混合物で一過的にトランスフェクトし、更に培養した。トランスフェクションの7日後、上清を回収し、培地をリフレッシュした。トランスフェクションの14日後、上清を合わせ、0.22μM(Sartorius社)を通じて濾過した。無菌上清を4℃で貯蔵した。懸濁適応させた293F Freestyle細胞を、T125フラスコ中で、3.0×106細胞/mlの密度まで、シェーカープラトーで培養した。細胞を、24深ウェルプレートの各ウェル中に、0.3〜0.5×106の生存細胞/mlの密度で播種した。これらの細胞を、個々の無菌DNA:PEl混合物で一過的にトランスフェクトし、更に培養した。トランスフェクションの7日後、上清を回収し、0.22μM(Sartorius社)を通じて濾過した。無菌上清を4℃で貯蔵した。
【０１９８】
二重特異性抗体の作製
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするために、私有のCH3テクノロジーを使用して作製した。このCH3テクノロジーは、2つの異なる重鎖分子の効率的ペアリングを可能にするために、上に記載されたように(PCT/NL2013/050294;WO2013/157954A1として公開)、CH3領域中の荷電ベースの点変異を使用する。
【０１９９】
機能的スクリーニングのためのIgG精製
IgGの精製を、アフィニティクロマトグラフィーを使用して、小規模(<500μg)、中規模(<10mg)及び大規模(>10mg)で実施した。小規模精製を、減圧濾過を使用して、24ウェルフィルタープレートにおいて無菌条件下で実施した。最初に、培地のpHを、pH8.0に調整し、引き続いて、小規模産生を、600rpmの振盪プラットフォーム(Heidolphプレートシェーカー)上で25℃で2時間、プロテインA Sepharose CL-4Bビーズ(50% v/v)(Pierce)と共にインキュベートした。次に、ビーズを、減圧濾過によって回収した。ビーズを、PBS pH7.4で2回洗浄した。IgGを、0.1Mクエン酸塩緩衝液を用いてpH3.0において溶出し、IgG画分を、Tris pH8.0で即座に中和した。緩衝液交換を、マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millipore社)を使用する遠心分離によって実施した。これらのサンプルは、PBS pH7.4の最終緩衝液中で終わった。
【０２００】
HER2/HER3特異的IgGの検証
抗体を、BT-474、HEK293T、及びHER2又はHER3を過剰発現するHEK293Tへの結合について、FACSにおいて試験した。従って、細胞を、トリプシンを使用して回収し、FACS緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.5mM EDTA)中106細胞/mlに希釈した。1〜2×105細胞を、U底96ウェルプレート中の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gで2分間遠心分離した。上清を、プレートを反転させることによって廃棄した。50μlの各IgGサンプルを、10μg/mlの濃度で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:100希釈したマウス抗ヒトIgG PE(Invitrogen社)を添加し、暗中で氷上で30〜60分間インキュベートした。FACS緩衝液を添加した後、細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、HTS設定のFACSCantoフローサイトメーターで分析した。細胞への抗体の結合を、平均蛍光強度(MFI)によって評価した。
【０２０１】
非特異的結合について試験するために、反応性ELISAアッセイを使用した。HER2抗体及びHER3抗体を、抗原フィブリノーゲン、ヘモグロビン及び破傷風毒素に対する反応性について試験した。HER2及びHER3への特異的結合を試験するために、これらの抗体を、EGFR、HER2、HER3及びHER4の精製された組換え細胞外ドメインへの結合について試験した。抗原を、MAXISORP(商標)ELISAプレートに終夜コートした。ELISAプレートのウェルを、5%BSAを含むPBS(pH7.2)で37℃で1時間ブロッキングした。選択された抗体を、PBS-2%BSA中に希釈した10μg/mlの濃度で2連で試験し、25℃で2時間結合させた。対照として、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体及び陰性対照抗体を用いて、同時に実施した。ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)で5回洗浄した。結合したIgGを、1:2000希釈したHRPコンジュゲート(ヤギ抗マウスBD)を用いて検出し、25℃で2時間結合させた。ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05% Tween 20)で5回洗浄し、結合したIgGを、OD492nm測定によって検出した。
【０２０２】
HER2/HER3特異的IgGのエピトープグループ分け
抗HER2抗体のパネルを、キメラ構築物を使用して、他の種(マウス、ニワトリ)由来のHER2 ECDに対するそれらの反応性、並びにHER2分子中の特定のドメイン、即ち、ドメインI、II、III及びIVへのそれらの結合に基づいて、ビニングした。
【０２０３】
抗HER3抗体のパネルを、キメラ構築物を使用して、他の種(カニクイザル、ラット)由来のHER3 ECDに対するそれらの反応性、並びにHER3分子中の特定のドメイン、即ち、ドメインI、II、III及びIVへのそれらの結合に基づいて、ビニングした。
【０２０４】
この目的のために、CHO-K1細胞を、リポフェクタミン/DNAミックスを使用して、適切な構築物で一過的にトランスフェクトした。キメラ交換ドメイン構築物において、ニワトリHER2又はラットHER3のドメインを、ヒト対応物によって置き換える。特異的抗体の結合を、FACSによって測定した。構築物の発現を、抗myc抗体を使用して確認した。トラスツズマブによるFACS染色を、ドメインIVへの特異的結合についての対照として含めた。各群中の抗体を、染色の強度(MFI)に基づいてランク付けできた。
【０２０５】
65の抗体のHER2パネルが、7つのビンにマッピングできた(Table 3 (表3))。
1.ドメインI特異的(25)
2.ドメインII特異的(2)
3.ドメインIII特異的(23)
4.ドメインIV特異的(7)
5.ドメインIV特異的及びマウスと交差反応性(2)
6.全ての構築物と反応性(2)
7.ヒトHER2とだけ反応性(4)
【０２０６】
トラスツズマブとの競合
HER2ドメインIVにマッピングされた2つの抗体は、SKBR-3細胞の増殖を阻害した。両方の抗体が、1アミノ酸の差異を除き、類似のCDR3を共有していた。1つの抗体PG1849を、競合ELISAにおいてトラスツズマブと競合するその能力について調査した。このELISAでは、Fc-HER2をコートし、15μg/mlの濃度のIgG抗体と共にインキュベートした。15分間のインキュベーション後、ファージを、もう1時間インキュベートした。その後、ファージを検出した。Table 4 (表4)は、PG1849及びトラスツズマブが、HER2に同時に結合できたことを実証しているが、それは、ELISAの間にシグナルの喪失が現れなかったからである。真の競合は、同じファージ及び抗体をこのアッセイにおいて組み合わせた時にだけ観察された。
【０２０７】
124の抗体のHER3パネルが、5つのビンにマッピングできた(Table 5 (表5)):
1.高いドメインIII反応性、ラット及びマウス反応性、並びにドメインIVへの軽微な反応性(8)
2.高いドメインIII反応性、ラット、ヒト及びカニクイザル反応性、ドメインIVへの軽微な反応性(8)
3.ラット、カニクイザル及びヒトHER3とだけ反応性(43)
4.ヒトHER3とだけ反応性(32)
5.全ての構築物と反応性(33)
【０２０８】
細胞株増殖アッセイ
SK-BR-3細胞を、L-グルタミン及び10%熱不活化FBSを補充したDMEM-F/12中で培養した。BxPC-3-luc2細胞を、10%熱不活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。MCF-7細胞を、100μM、NEAA 1mMのピルビン酸ナトリウム、4μg/mlのインスリン及び10%の熱不活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。
【０２０９】
SK-BR-3細胞の増殖アッセイのために、コンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、培養培地中6×104細胞/mlに希釈した。抗体を、10μg/ml及び1μg/mlの濃度に希釈し、96ウェル黒底プレート(ABgene社 AB-0932)中に100μlの体積で添加した。細胞を、6000細胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%COで3日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen社)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%COで6時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長及び590nmの蛍光波長で測定した。成長阻害の程度を、同じ濃度のトラスツズマブのものと比較した(Table 6 (表6))。
【０２１０】
MCF-7及びBxPC-3-luc2細胞の増殖アッセイのために、コンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSA及び10μg/mlのホロトランスフェリンを含むRPMI1640培地)で2回洗浄した。MCF-7細胞を、培養培地中5×104細胞/mlに希釈した。抗体を、10μg/ml及び1μg/mlの濃度に希釈し、96ウェル黒底プレート(ABgene社 AB-0932)中に100μlの体積で添加した。細胞を、1ng/mlの最終濃度のヒト組換えヒトNRG1-ベータ1/HRG1-ベータ1 EGFドメイン;(396-HB-050 RND)の存在下で、5000細胞/ウェルの密度で添加した。ヒトNRG1-ベータ1/HRG1-ベータ1 EGFドメインを、本明細書で以下、HRGと呼ぶ。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%COで5日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen社)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長及び590nmの蛍光波長で測定した。成長阻害の程度を、同じ濃度の#Ab6のものと比較した(Table 7 (表7))。
【０２１１】
BxPC-3-luc-2増殖アッセイを使用して、二重特異性抗体をスクリーニングした。BxPC-3-luc-2細胞を、培養培地中8×104細胞/mlに希釈した。抗体を、10μg/ml及び1μg/mlの濃度に希釈し、96ウェル黒底プレート(ABgene社 AB-0932)中に100μlの体積で添加した。細胞を、10ng/mlの最終濃度のヒトHRGの非存在下又は存在下で、8000細胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%COで4日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen社)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%COで4時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長及び590nmの蛍光波長で測定した。
【０２１２】
エッジ効果を最小化するために、96ウェルプレートの外側ウェルを、PBSで完全に満たした。
【０２１３】
HER2特異的IgGの親和性ランキング
本発明者らは、Devash(PNAS、1990)によって記載される方法を使用して、限定抗原-ELISAにおいて抗体をランク付けした。減少した抗原コーティング濃度の使用は、観察された交差反応性反応を排除し、高親和性/結合力の抗体を検出するために使用され得る。従って、固体支持体上の抗原濃度を徐々に減少させて、弱い免疫反応性を調査した。2.5μg/mlから開始して0.019μg/mlまでのECD-Erbb-2タンパク質の連続滴定を、MAXISORP(商標)ELISAプレートに終夜コートした。ELISAプレートのウェルを、5%BSAを含むPBS(pH7.2)中で37℃で1時間ブロッキングした。選択された抗体を、PBS-2%BSA中に希釈した10μg/mlの濃度で2連で試験し、25℃で2時間結合させた。対照として、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体及び陰性対照抗体を用いて、同時に実施した。ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)で5回洗浄した。結合したIgGを、1:2000希釈したHRPコンジュゲート(ヤギ抗マウスIgG、BD Biosciences社)を用いて検出し、25℃で2時間結合させた。ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05% Tween 20)で5回洗浄し、結合したIgGを、OD492nm測定によって検出した。PG1849、PG2916、PG2926、PG2930、PG2971、PG2973、PG3004及びPG3031を、HER2抗原滴定ELISAにおいて試験した(図1)。
【０２１４】
種々のカッパ軽鎖とのHER2 VH遺伝子の結合
異なるファージディスプレイライブラリー由来のHER2 VHの結合を調査するために、HER2抗体のパネルを、クローニングし、別のVKカッパ鎖、即ち、MEHD7945AのVLの背景で発現させた。産生されたIgGを、K562細胞及び安定なK562-HER2細胞に対するFACS分析に供した。コンビナトリアルライブラリー及び非コンビナトリアルライブラリー由来のVH遺伝子を、Table 8 (表8)に列挙する。VH鎖MF2971、MF3958、MF2916、MF2973、MF3004、MF3025、MF3031は全て、共通の軽鎖IGKV1-39と組み合わせた場合に観察されたように顕著な抗原特異性及び結合を喪失することなくMEHD7945A軽鎖と組み合わせることができた。VH鎖MF1849は、バリアントカッパ軽鎖と組み合わせることはできず、抗原特異性及び結合を保持できなかった。
【０２１５】
他のHER2及びHER3抗体
HER2又はHER3の機能を阻害する抗体は、当技術分野で公知である。さらなる抗体を、公開された情報に従って構築し、293F Freestyle細胞において発現させた。抗HER2抗体ペルツズマブ及びトラスツズマブを、米国特許出願公開第2006/0212956号A1(Genentech)に開示された情報に基づいて作製した。抗HER3抗体#Ab6は、WO2008/100624(Merrimack Pharmaceuticals社)に開示された情報に基づき、IgG1骨格ベクター中に再クローニングした。1-53及びU1-59抗HER3抗体の情報は、米国特許第7,705,103号B2(U3 Pharma AG)から得た。抗HER3 LJM716抗体の情報は、米国特許出願公開第2012/0107306号から得た。ツー・イン・ワン抗EGFR抗HER3抗体MEHD7945Aの構築のための情報は、WO2010/108127から得た。
【０２１６】
HER2×HER3二重特異性抗体のスクリーニング
HER2及びHER3抗体パネル由来のVHを、荷電した操作されたベクター中に再クローニングし、その結果、抗体重鎖の発現の際に、重鎖のヘテロ二量体化が強制され、トランスフェクション後に二重特異性抗体を生じる。3つの異なる戦略を、二重特異性IgG形式でHER2及びHER3アームを組み合わせる際に使用した:
1.HER2(リガンド非依存的成長を遮断する)×HER3(リガンド非依存的成長を遮断する)
2.HER2(リガンド非依存的成長を遮断する)×HER3(リガンド依存的成長を遮断する)
3.異なるエピトープビン由来のHER2×HER3(リガンド依存的成長を遮断する)
【０２１７】
一部の二重特異性組合せでは、群2及び3において作製した抗体は、群1と重複した。
【０２１８】
合計495の二重特異性抗体を、24ウェル形式で産生し、精製した。全ての抗体を、HER2発現性及びHER3発現性膵臓BxPC-3-luc-2細胞株(Caliper)の増殖を阻害するそれらの能力について試験した。抗体の強度を、10μg/ml及び1μg/mlの濃度で存在する抗体を用いた黒色及び白色スクリーニングにおいて、HRG依存的及びHRG非依存的設定で決定した。トラスツズマブを、同じ濃度で参照抗体並びに陰性対照抗体として含めた。1μg/mlにおける上位80のHER2×HER3二重特異性(組み合わされた阻害に基づく)の機能的活性を、図2に示す。
【０２１９】
陽性対照抗体と比較して高い阻害活性を示した抗体(合計で40)を、24ウェル形式で選択、再産生及び精製し、10μg/ml及び1μg/mlの濃度で黒色及び白色BxPC-3-luc-2スクリーニングにおいて再度試験した。これらの抗体を、HRG依存的MCF-7アッセイにおいて更に滴定し、トラスツズマブ及びペルツズマブの組合せ(1:1)並びに陰性対照抗体に対して比較した。図3は、親HER3抗体及びトラスツズマブ+ペルツズマブの組合せと比較した、3つの二重特異性抗体の滴定曲線の一例を示す。親モノクローナル抗体は、上のパネルに示され、二重特異性抗体は、下のパネルに示される(図3)。
【０２２０】
二重特異性抗体、モノクローナル及び比較例抗体についてのIC50を、Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析を使用して計算した。Graph padソフトウェアは、MCF-7アッセイにおける二重特異性抗体のIC50値、及びBxPC3アッセイにおけるそれらの阻害活性を、比較のために列挙する。12のHER2×HER3二重特異性抗体のパネルは、トラスツズマブ+ペルツズマブと比較して、より強力な阻害活性を有していた。更に、これらの二重特異性抗体は、親モノクローナルPG3178と等しく強力又はより強力であった(Table 9 (表9))。
【０２２１】
リガンド依存的細胞成長を阻害した二重特異性抗体は、HER3アーム3178、3163、3099及び3176と組み合わせたHER2アームから構成された。最も強力な二重特異性のHER2アーム及びHER3アームの両方は、二価モノクローナルとして、リガンド非依存的SKBR-3増殖(HER2アーム及びHER3アームの両方)(Table 6 (表6))又はリガンド依存的MCF-7増殖(HER3アーム)(Table 7 (表7))を阻害することも可能であった。強力な抗体の大部分は、抗HER3抗体3178と組み合わせた、ドメインIを認識するHER2アームから構成された。
【０２２２】
BxPC-3-luc2腫瘍成長の阻害
Table 9 (表9)に記載される抗体を、BxPC-3-luc2膵臓異種移植モデルにおいて試験した。BxPC-3-luc2細胞株は、HER2及びHER3の両方を発現し、HER2低発現性細胞株とみなされる。試験の開始時に8〜10週齢のCB17 SCID雌性マウスに、20μl中1×106の腫瘍細胞を、膵臓中に同所性に移植した。この目的のために、マウスを麻酔し、右側を下にして寝かせて左側を露出させ、0.5cmの切開を左側腹領域に作製した。膵臓及び脾臓を剥き出しにし、20μl中1×106の腫瘍細胞を、膵尾部の嚢下空間中に注射した。移植の1週間後、バイオルミネセンス（生物発光）(BLI)データを生成した。画像化の15分前に、全てのマウスが、150mg/kgのルシフェリン(D-ルシフェリン-EFカリウム塩、カタログ番号E6552、Promega社)の腹腔内注射を受けた。BLI画像化を、左側の表示を使用して、1週間に1回又は2回実施した。異常値動物-BLI/腫瘍体積に基づく-を除去し、マウスを、各々7匹のマウスの群中にランダムに分配した。実験8日目に、処置を開始した。抗体処置群中の動物に、3連続週にわたって毎週(0日目、7日目、14日目及び21日目)、30mg/kgの抗体を投薬した。処置の0日目に、これらの動物は、初回負荷量、即ち、60mg/kgの抗体を2回投与された。最終画像化を、31日目に実施した。
【０２２３】
2つのBxPC-3-luc2異種移植モデルを、二重特異性抗体及び親抗体の異なるパネルを用いて実行した。第1のBxPC-3-luc2異種移植モデル(図4)では、1つの群が陰性対照抗RSV抗体(対照IgG)を投与され、1つの群が対照抗体トラスツズマブを投与され、1つの群が陽性対照抗体トラスツズマブ+ペルツズマブ(1:1 v/v)を投与された。残り7つの群は、モノクローナル(PG)又は二重特異性(PB)抗体PG3004、PG3178、PB3566、PB3710、PB3443、PB3448及びPB3441のうちの1つを投与された。二重特異性抗体の組成の詳細は、Table 9 (表9)に示される。
【０２２４】
試験した5つ全ての二重特異性抗体は、腫瘍成長を阻害することができた。二重特異性HER2×HER3抗体処置した動物の平均腫瘍量(BLI)は、トラスツズマブ+ペルツズマブの組合せで処置した動物のものと類似であった(図4)。
【０２２５】
第2のBxPC-3-luc2異種移植モデル(図5)では、1つの群が陰性対照抗RSV抗体(対照IgG)を投与され、1つの群が陽性対照抗体の組合せトラスツズマブ+ペルツズマブ(1:1 v/v)を投与された。残り5つの群は、抗体PG3163、PB3986、PB3990、PB4011及びPB3883のうちの1つを投与された。二重特異性PB抗体の詳細について:Table 9 (表9)。これらの二重特異性抗体は、同じHER2アームMF2971と組み合わされた3つの異なるHER3結合アーム、及びHER3結合アームMF3163と組み合わされたさらなるHER2アームを含んだ。この実験では、対照群中の腫瘍は、第1の実験と同じレベルの加速された成長を示さず、結果の解釈を複雑化した。それにもかかわらず、トラスツズマブ+ペルツズマブと比較して、PB3883及びPB3990 HER2×HER3二重特異性は、類似の阻害活性を有していた(図5)。
【０２２６】
in vivo及びin vitroのデータに基づいて、そのHER2アームがMF2971、MF3004、MF1849から構成され、HER3アームがMF3178から構成される、二重特異性パネルの抗体を選択した。MF2971及びMF3004アームは、マウス起源のものであり、それらをヒト化した。
【０２２７】
親モノクローナル抗体と比較した二重特異性HER2×HER3抗体の結合
それらの親対応物と比較した、HER2×HER3二重特異性抗体の結合を、FACS分析によって決定した。FACSを、BxPC-3-luc2細胞及びMCF-7細胞に対して実施し、抗体の連続滴定は、2,5μg g/ml〜0,01μg g/mlの範囲であった。試験した抗体パネルは、二重特異性抗体PB3566並びにその親抗体、抗HER3抗体PG3178及び抗HER2抗体PG3004から構成された。MFIデータをプロットしたところ、両方の細胞株についてのグラフは、二重特異性PB3566が、抗HER3抗体PG3178及び抗HER2抗体PG3004と比較して、両方の腫瘍細胞株により効率的に結合することを示す(図6)。
【０２２８】
MF2971及びMF3004のヒト化
MF2971及びMF3004を、当技術分野で公知のテクノロジーに従ってヒト化した。MF2971の合計7つのヒト化/脱免疫化バリアント配列を発現させ、検証し、in vitroでモノクローナルとして、HER3特異的抗体MF3178と二重特異性形式で組み合わせて特徴付けた。7つのMF2971バリアント中のMF2971のHCDR3をMF3004のHCDR3で置き換えることによって創出したMF3004の7つのバリアント配列について、同じことを行った。全てのヒト化バリアントの発現、完全性、熱安定性及び機能的活性を分析した。産生、完全性、安定性及び機能性完全性に基づいて、MF2971のバリアント(2971-var2)を、MF3178と二重特異性形式で使用されるVHの最適なヒト化バリアントとして選択した。この2971-var2を、MF3958と改名した。二重特異性HER2×HER3組合せMF3958×MF3178は、PB4188を生じた。
【０２２９】
PB4188の大規模産生、精製及び分析的試験
懸濁適応させた293F Freestyle細胞を、エルレンマイヤーフラスコ中で、3.0×106細胞/mlの密度まで、シェーカープラトーで培養した。細胞を、4Lエルレンフラスコ中に、0.3〜0.5×106生存細胞/mlの密度で播種した。これらの細胞を、個々の無菌DNA:PEl混合物で一過的にトランスフェクトし、更に培養した。トランスフェクションの7日後、二重特異性抗体を含む馴化培地を、低速遠心分離5分間1000gによって、その後、高速遠心分離4000gで5分間によって回収した。収集された馴化培地を、5kDa Satorius hydrosartカセットで約600mlに濃縮し、引き続いて、4LのPBSに対してダイアフィルトレートした。抗体を、約35mlのMabSelectSure XL(11℃)に対して、カラム上に結合させた。特異的に結合したタンパク質を、150ml PBS、1M NaCl含有150ml PBS、100ml PBSを用いて逆流様式でカラムを洗浄することによって除去した。結合した抗体を、100mMクエン酸塩pH3.0を使用して逆流様式で溶出させ、5mlの画分を、中和のために、4mlの1Tris pH8.0を含む10mlチューブ中に収集した。溶出した抗体を、superdex 200 50/1000を使用するゲル濾過によって、更に精製した。この精製された抗体を、0.22μmシリンジフィルターを使用してフィルター滅菌した。IgG濃度を、OD280測定によって決定し、タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算した。タンパク質を、凝集(HPSEC)、純度(SDS-PAGE、nMS、IEX及びIEF)について試験した。タンパク質サンプルを-80℃で貯蔵した。
【０２３０】
分析試験及び異種移植試験のためのIgG精製
中規模精製を、HiTrap MabSelect Sureカラム及びHiTrap脱塩カラムを使用して、AKTA 100 Explorerで実施した。サンプルを、5ml/分でロードした。カラムを、2カラム体積のPBSで洗浄した。IgGを、0.1Mクエン酸塩緩衝液を用いてpH3.0で溶出した。次に、サンプルを脱塩し、PBS pH7.4の最終緩衝液中で終えた。IgGを、0.45μMフィルター(Sartorius社)を通して濾過した。IgG濃度を、プロテインAセンサーを用いてOctetを使用して測定した。タンパク質を、凝集(HPSEC)、純度(SDS-PAGE、nMS、IEX及びIEF)について試験した。タンパク質サンプルを-80℃で貯蔵した。
【０２３１】
PB4188の分析的特徴付け
PB4188(MF3958×MF3178)を、HP-SEC及びCIEX-HPLC(TSKゲル-STAT 7μmカラム、4.6mm ID×10cm L)による分析に供した。PB4188の分析プロファイルは、通常の単一特異性IgG1、例えば、親HER2アームPG3958及び抗RSVモノクローナル対照抗体の挙動と、概して一致していた(図7)。
【０２３２】
親和性決定
組換えHER2及びHER3に対するPB4188及びPB3448の一価結合親和性を、SPR(Biacore T100)によって決定した。Biacore(商標)T100(GE Healthcare社、Uppsala、Sweden)を使用して、記載された全ての実験を実施した。センサー表面準備及び相互作用分析を、25℃で実施した。緩衝液及びBiacore試薬は、GE Healthcare社から購入した。ErbB2-Fc及びERbB3-Fc(RND)を、500RUの標的固定化レベルで、酢酸カリウム緩衝液(pH5.5)中でCM5センサーチップの表面にコートした。ランニング緩衝液は、フィルター滅菌したHBS(hepes緩衝食塩水):10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005% Tween-20;0.2μm)であった。これらの二重特異性抗体を、HBS中100、50、20、10、1及び0.1nMに希釈し、CM5センサーチップの抗原カップリングした表面上に高い(30μl/分)流速で実行した。BIA評価ソフトウェアを用いて、1:1の一価相互作用についての曲線適合モデルは、HER2アームの親和性(一価相互作用)の決定を可能にし、HER2アームの親和性が決定できた。HER3アームの低オフレートに起因して、親和性は決定できなかった。HER3アームの親和性を決定するために、PB4188を、500RUの標的固定化レベルでCM5センサーチップにコートした。Her2-Fc及びHer3-Fc抗原を、HBS中100、50、20、10、1及び0.1nMに希釈し、PB4188表面上に高い流速(40μl/分)で実行した。kオン及びkオフ値を決定するために、BIA評価ソフトウェアを、一価分子をセンサーチップ表面にコートしたこと及びErbB3-Fc抗原が二価分子であることを考慮に入れるモデルと併せて使用した。PB4188及びPB3448の親和性を、Table 10 (表10)に示す。
【０２３３】
細胞上でのPB4188親和性決定
結合親和性もまた、BT-474及びSK-BR-3細胞を使用し、定常状態細胞親和性測定によって決定した。4つのIgGを分析した:1)抗HER2抗体3958及び抗HER3抗体3178を含む、PB4188(二重特異性HER2×HER3);2)抗HER3抗体3178及び抗TT(破傷風トキソイド)抗体1337を含む、PB9215(二重特異性HER3×TT);3)抗HER2抗体3958及び抗TT抗体1337を含む、PB9216(二重特異性HER2×TT);4)ハーセプチン(単一特異性HER2)。IgGを、IODO-GEN(登録商標)Precoated Iodonation Tubes(Pierce)及び付随の指示書を使用して、125Iで放射活性標識した。標識されたIgGを、25mM Tris-HCl、0.4M NaCl、0.25% BSA、5mM EDTA、0.05% NaN3中で、約1〜2×108cpm/mlの活性に希釈した。タンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kit(Pierce)を用いて決定した。BT-474及びSK-BR-3細胞を使用した、標識されたIgG及び非標識IgGのフローサイトメトリー分析は、標識化後に、結合における低減の徴候を示さなかったか、又は軽微な徴候のみを示した。定常状態細胞親和性測定を、以下のように実施した。細胞を、96ウェルプレート中に播種し、種々の濃度の標識されたIgGと共に4℃でインキュベートした。未結合の放射活性を、4時間後に除去し、細胞結合した放射活性を、ガンマウェルカウンターを使用して測定した。非特異的結合を、受容体遮断濃度(100倍過剰)の未標識の抗体を添加することによって測定した。各条件を、3連で試験し、3つの独立した実験を、抗体1つにつき実施した。KD値を、Prism6.0d(GraphPad Software)を使用して、非特異的結合について補償する非線形回帰モデルに基づいて計算した。適合された曲線を含むグラフを、両方の細胞株へのHER2×HER3 IgG(PB4188)の結合について、図20に示す。平均値を含む24全てのアッセイについてのKDデータを、Table 12 (表12)に示す。まとめると、BT-474及びSK-BR-3細胞を使用して決定した平均KD値は、それぞれ、HER2×HER3について3.2及び2.0nM、ハーセプチンについて3.7及び1.3nM、HER2×TTについて3.9及び2.3nM、並びにHER3×TTについて0.23及び0.99nMであった。従って、PB4188は、HER3と比較してより高い親和性でHER2を標的化するHER2×HER3二重特異性分子MM-111とは対照的に、HER2と比較してHER3に対してより高い親和性を示す。
【０２３４】
HER2増幅された乳癌細胞に対する抗増殖活性
軟寒天におけるJIMT-1
PB3448及びPB4188を、軟寒天におけるトラスツズマブ耐性JIMT-1細胞の成長を阻害するそれらの強度について試験した。この目的のために、96ウェル懸濁細胞培養物プレートを準備した。100μLの軟寒天下層(完全培地中0,6%の最終濃度)を注ぎ、凝固させた。次いで、10.000のJIMT-1細胞/ウェルを含む50μLの軟寒天上層(0,4%の最終濃度)を、上に添加し、凝固させ、かかる96ウェルプレートを、37℃、10%CO2で終夜インキュベートした。次の日、陰性対照抗体、ペルツズマブ+トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448及びPB4188を、10〜0,003μg/mlの範囲の半log滴定で、DMEM培地中に添加した。引き続いて、アッセイを、細胞培養インキュベーター中で8日間インキュベートした。最後に、細胞を、37℃でAlamar Blueと共に3〜5時間インキュベートし、蛍光強度を決定した(励起:560nm;蛍光:590nm)。PB3448及びPB4188によるJIMT-1増殖の用量依存的阻害の一例が示される(図8)。
【０２３５】
マトリゲルにおけるBT-474及びSKBR-3
PB3448及びPB4188を、BT-474及びSKBR-3細胞の成長を阻害するそれらの強度について試験した。3次元マトリゲルにおいて細胞を増殖させ、処置された細胞から非処置の細胞を識別するために主成分分析を使用する、Leiden、Netherlandsを本拠とするOcello社で、細胞を試験した。2000のSK-BR-3細胞又は2250のBT474細胞を、384ウェルプレート(Greiner 781091)のウェル1つ当たり15μlのマトリゲル中に播種した。次の日、10〜0.003μg/mlの範囲の抗体の半log滴定を、5ng/mlのHRGの非存在下又は存在下で培養培地中に添加した。試験抗体は、陰性対照抗体、ペルツズマブ+トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448、PB4188及び二重特異性抗EGFR×HER3ツー・イン・ワン抗体MEHD7945Aを含んだ。更に、HRGの用量依存的滴定を、陽性対照として含めた。各用量を、4連で試験した。細胞を、37℃、5%CO2で細胞培養インキュベーター中において7日間インキュベートした。次に、細胞を固定し、細胞のアクチン細胞骨格をファロイジンで染色し、核をHoechstで染色した。次に、蛍光画像を、ゲル(Z-スタック)を通じて異なるレベルで撮影し、画像を重ねた。広い範囲の形態学的特徴を測定した(合計で800)。培地処置とHRG処置との間で異なった特徴だけを、分析のために選択した。成長と関連した特徴、平均球状体面積及び球状体当たりの核は、培地処置とHRG処置との間で、最も顕著に異なっていた。マルチパラメーター分析及び単一パラメーター分析の両方を行った。単一パラメーター測定のために、t検定を実施して、培地に対して処置(HRG又は抗体)を比較した。各点についてのP値を決定した。変動性のほとんどを捕捉する高次元データの低次元組合せを見出すための方法である主成分分析(PCA)を、抗体濃度との関連で使用して、データをプロットした。図9は、HRGの存在下での、ペルツズマブ+トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448及びPB4188の効果を実証している。両方のHER2増幅された乳癌細胞株において、PB4188は、HRGの存在下で、ペルツズマブ+トラスツズマブ、PB3448及びツー・イン・ワン抗体MEHD7945Aと比較して、優れた活性を示した。
【０２３６】
HER2増幅された乳癌細胞に対する、HRGの存在下でのPB4188の優れた抗増殖活性
SKBR-3及びBT-474に対する、10ng/mlのHRGの存在下でのPB4188の活性を、HER2、HER3抗体及びそれらの組合せのパネルと比較した。アッセイを、上記のようにマトリゲルにおいて実施し、形態学的特徴を分析した。図10a中にプロットしたPCAデータは、マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG誘導性の増殖及び分岐/浸潤を示している。図10bは、抗体PB4188が、HRG誘導性表現型を完全に復帰させることができるが、親モノクローナル抗体の組合せ(PG3958+PG3178)は効果を有さないことを示している。更に、PB4188は、試験した全ての抗HER3抗体と比較して、はるかに効果的であった(図10c)。更に、個々の抗HER3抗体とトラスツズマブとの組合せ(転移性乳癌(mBC)の治療における現在の標準)は、HRG誘導性表現型を復帰させることができなかった(図10d)。HRGの存在下でPB4188にトラスツズマブを追加することで、PB4188単独と比較して、SK-BR-3細胞の増殖及び分岐/浸潤は低減された(図10e)。
【０２３７】
HER2及びHER3モノクローナル抗体と比較した、HER2増幅された胃癌細胞に対するPB4188の優れた抗増殖活性。
NRG1-β1の上方調節は、HER2標的化治療に対する重要な耐性機構である(Wilson、2012)。NRG1-β1の上方調節がPB4188による抗増殖の強度を妨害するかどうかを評価するために、抗体のパネルを、N87(HER2増幅された)胃癌細胞株に対して、100ng/mlのHRGで試験した。N87細胞を、10%熱不活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。増殖アッセイのために、N87細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSA及び10μg/mlのホロトランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗浄した。抗体を、1〜0,0001μg/mlで変動する半log滴定で希釈した。細胞を、100ng/mlの最終濃度のHRGの存在下で10000細胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で3日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen社)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長及び590nmの蛍光波長で測定した。PB4188は、抗HER2又は抗HER3モノクローナル抗体よりも優れた活性を示した(図11)。
【０２３８】
HER2×HER3二重特異性抗体は、ADCCを誘導する
ADCC活性は、癌における、治療的抗体にとって重要な抗腫瘍作用機構である。セツキシマブ及びトラスツズマブ等の、HERファミリーの受容体に対するヒトモノクローナル抗体は、ADCCを誘導する。PB4188及びPB3448のベースライン及び増強されたADCC活性を、検証されたin vitro ADCCアッセイにおいて決定した。トラスツズマブ及び陰性対照抗体を、実験中に対照抗体として含めた。全血及びPBMC画分を、健康なドナーから取得した。各抗体を、HER2高(SK-BR-3)及びHER2低(MCF-7)発現性の標的細胞に対して試験した。標的細胞に、51Cr(Amersham社)をロードし、示された濃度の抗体でオプソニン化した。全血又はPBMC画分を、RPMI1640+10%熱不活化FCS中200μLの反応において、エフェクター細胞として使用した。細胞を、4時間一緒にインキュベートし、溶解を、γ-シンチレーターを使用して上清中の放射活性を測定することによって推定した。特異的溶解の百分率を、以下のように計算し:(実験的cpm-基底cpm)/(最大cpm-基底cpm)×100、最大溶解を、抗体及びエフェクターの非存在下で5% Triton X-100及び基底溶解の存在下で決定した。図12に示されるように、二重特異性抗体PB3448は、組合せペルツズマブ+トラスツズマブと比較して、類似のADCC活性を示した。二重特異性抗体PB4188は、高い抗体濃度(10μg/ml)で有効であった。
【０２３９】
HER2×HER3二重特異性抗体は、親抗体の組合せと比較して、より高いADCCを示す
異なるADCC設定では、ADCC Reporter Bioassay(Promega社)を使用した。このバイオアッセイは、FcγRIIIa受容体、V158(高親和性)又はF158(低親和性)バリアントを安定に発現する操作されたJurkat細胞、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを使用する。このアッセイを、古典的51Cr放出アッセイに対して、ADCC Reporter Bioassayを用いて得られたデータを比較することによって検証した。これらのADCCアッセイを、384白色ウェルプレートを使用して、Promega ADCC Bioassayキットを使用して実施した。この実験設定では、SKBR-3細胞を、バイオアッセイの20〜24時間前に、30μlのアッセイ培地(4%の低IgG血清を含むRPMI)中、1000細胞/ウェルの密度でプレートした。次の日、培養培地を除去した。次に、抗体PB4188、並びにその親抗HER2 PG3958及び抗HER3 PG3178並びにそれらの組合せの連続希釈を、2連で作製した。10μl抗体希釈を、ウェルに添加した。抗体の出発濃度は10μg/mlであり、10点の半log倍連続希釈を作製して、完全用量応答曲線を提供した。最後に、5μlのADCC Bioassayエフェクター細胞(15000細胞/ウェル、V158)を添加した。これらの細胞を、37℃で6時間インキュベートした。次に、15μlのBIO-Gloルシフェラーゼ基質を添加し、5分後、発光を、プレートリーダーで検出した。得られたデータを図13に示す。PB4188二重特異性抗HER2×HER3抗体は、親HER2及びHER3モノクローナル又はそれらの組合せと比較して、より高いADCC強度を示した。
【０２４０】
PB4188のADCC増強
ADCC活性は、異なる技術によって増強され得、そのうちの1つは、フコースの除去である。フコースの除去は、いくつかのin vivoモデルにおいて、増加した抗腫瘍活性を生じている[Junttila、2010]。PB4188の活性を最大化するために、非フコシル化テクノロジーを適用し(Cheng Liu及びAndreia Lee. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Antibody therapeutics-Trends in Bio/Pharmaceutical Industry 2009 [13〜17])、それによって、Fc領域中のN結合型炭水化物構造のフコシル化を防止する。野生型PB4188と比較した、非フコシル化されたPB4188のADCC強度を、HER2低発現性細胞(MCF-7)及びHER2増幅された細胞(SK-BR-3)を使用して、ADCC51Cr放出アッセイにおいて決定した。両方の抗体を、連続希釈で適用し、陰性対照抗体及びトラスツズマブを、このアッセイ中に含めた。図14は、高HER2発現性細胞及び低HER2発現性細胞の両方における、野生型バージョン及び/又はトラスツズマブと比較した、非フコシル化されたPB4188のADCC強度における増加を示している。
【０２４１】
非フコシル化されたPB4188は、低親和性FcγRIII受容体と共に優れたADCC活性を示す
非フコシル化されたPB4188の活性を、V158(高親和性)FcγRIIIa受容体バリアント又はF158(低親和性)FcγRIIIa受容体バリアントのいずれかを含むADCCレポーター細胞に対して試験した。抗体、即ち、対照抗体、トラスツズマブ及び非フコシル化されたPB4188の連続滴定を、接着性SK-BR-3細胞に、異なるFcγRIIIaバリアントを保有するADCCレポーター細胞と組み合わせて添加した。ADCC活性を、ルシフェラーゼ活性を測定することによって測定した。非フコシル化されたPB4188は、高親和性V158 FcγRIIIa受容体バリアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、等しい活性を示した。対照的に、非フコシル化されたPB4188は、低親和性F158 FcγRIIIa受容体バリアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、優れたADCC活性を示した(図15)。
【０２４２】
JIMT-1異種移植試験
JIMT-1ヒト乳癌腫細胞を、移植の時まで、10%胎仔ウシ血清、100単位/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、25μg/mLゲンタマイシン及び2mMグルタミンを含むDMEM中で成長させた。移植当日、JIMT-1乳房細胞を、log期成長の間に回収し、冷PBS中に再懸濁した。雌性CB.17 SCIDマウス(Charles River社)は、試験1日目に8週齢であり、16.5〜20.7gの体重範囲を有していた。各マウスに、5×106の腫瘍細胞(0.2mL細胞懸濁物)を右側腹に皮下注射した。これらの腫瘍を、2次元でノギスによって測定して、1週間に2回の平均体積としてサイズをモニタリングした。腫瘍がおよそ100〜150mm3のサイズに達したところで、動物を、効力試験に登録した。異常値動物-腫瘍体積-を除去し、マウスを、各々10匹のマウスの群中にランダムに分配した。マウスに、4週間の期間にわたって、1週間に1回(抗体)又は1日1回(ラパチニブ)注射した。処置群の詳細をTable 11 (表11)に示す。
【０２４３】
腫瘍サイズを、ノギス測定によって毎週測定した。この効力試験により、両方の投薬スケジュールにおけるPB4188が、ラパチニブ又は組合せペルツズマブ及びトラスツズマブと等しく有効であり、それよりも強力であったことが明らかになった。データを図17及び18に示す。
【０２４４】
PB4188は、HRG媒介性の耐性を克服できる
NRG1-β1の上方調節は、HER2標的化治療に対する重要な耐性機構である(Wilson、2012)。PB4188を、漸増する濃度のHRG(NRG1-β1 EGF)の存在下で、連続滴定でその親抗HER3モノクローナル抗体PG3178と比較して試験した。この目的のために、N87細胞を、10%熱不活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。増殖アッセイのために、N87細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSA及び10μg/mlのホロトランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗浄した。抗体を、1〜0.0001μg/mlの範囲の半log滴定で希釈した。細胞を、漸増する濃度のHRG(0.04〜39,5nM)の存在下で10000細胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で3日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen社)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長及び590nmの蛍光波長で測定した。PB4188は、親抗HER3モノクローナル抗体と比較して優れた活性を示した(図19)。
【０２４５】
従って、例えばNRG1-β1の上方調節等の逃避機構の場合、本発明に従う二重特異性抗体が好ましい。
【０２４６】
HER2/HER3特異的IgGのエピトープマッピング
ショットガン変異誘発実験
アラニンスキャニング変異誘発を使用して、それぞれHER2及びHER3について、PG3958及びPG3178のエピトープをマッピングした。ショットガン変異誘発アッセイでは、クローンを作製し、それによって、HER2/HER3細胞外ドメイン(ECD)の各アミノ酸残基を、アラニンに置換する。次に、細胞アレイを、逆トランスフェクションによって調製した(米国特許出願公開第2011/0077163号A1)。従って、各クローンのDNAを、リポフェクタミンと混合し、この混合物を、384ウェルプレートの特化したウェル中に配置した。HEK293T細胞を、各ウェルに添加し、タンパク質の発現を、24時間後に測定した。引き続いて、抗体の反応性を、免疫蛍光染色によって測定し、結合マップ及び抗体結合のための重要残基の同定をもたらした。HER2及びHER3 ECD構築物の発現レベルを、市販のモノクローナル抗体(R&D mAb 1129(HER2)及びR&D mAb 66223(HER3))を使用してFACS分析によって検証した。
【０２４７】
HER2
HER2 ECD変異体への一価PG3958 Fabの結合を、このアッセイにおいて0.25μg/mlの濃度で試験し、ストリンジェントな洗浄条件を使用した(pH9.0、350mM NaCl)。これにより、対照mAbの結合を保持しつつ、WT HER2と比較して、PG3958 Fabの35%未満の残留結合を示した、HER2における3つの「重要」残基(T144、R166、R181)が同定された。HER2構造中の重要残基近傍に位置する2つの残基(P172、G179)は、顕著ではあるが、あまり重度ではない結合の喪失を示し、これらを「二次重要」残基と称した(Table 13 (表13)及び図21A)。これら全ての、表面に露出した残基は、HER2のドメインI中に位置し、これらは、一緒になって、HER2分子の表面上に非連続的パッチを形成する。
【０２４８】
確認実験HER2エピトープ
Table 13 (表13)に列挙される、野生型(WT)HER2 ECD及びHER2 ECDバリアントをコードする構築物を、CHO-K1細胞において発現させた。表面に露出しており、決定された重要残基に対し構造的に近傍にある3つのドメインI残基を、さらなる分析に選択した。チロシンへのT164、S180及びD143の点変異を、HER2 ECD構築物において作製し、得られた構築物もまた、CHO-K1において発現させた。L159A HER2 ECDバリアントを、対照サンプルとして、CHO-K1細胞において発現させた。
【０２４９】
FACS滴定実験においてECDバリアントへの結合について試験した二重特異性PG3958×TT抗体。HER2のドメインIVに結合する抗HER2抗体トラスツズマブを使用して、細胞表面におけるHER2 ECD発現を検証した。平均MFI値をプロットし、各曲線について、AUCを、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して計算した。WT HER2結合を使用して、データを正規化した。このFACSデータは、T144A、R166A、R181A、P172A、G179Aに加えて、変異T164Y及びS180Yが、PG3958×TT抗体の結合において顕著な低減を生じたことを示した(図22)。D143Y変異は、対照mAbの減少した結合によって実証されるように発現の重度の喪失を生じ、従って、PG3958エピトープにおけるその潜在的な役割は決定できなかった。
【０２５０】
HER3
FACSにおける、HER3 ECD変異体への、0.25μg/mlのPG3178 IgGの結合分析により、対照mAbの結合が保持されつつ、アラニンへの変異がWT HER3と比較して結合の実質的な喪失を引き起こした、2つのいわゆる「重要」残基(F409、R426)が同定された(Table 14 (表14)及び図23)。両方の残基は、HER3のドメインIII中に位置し、空間的に遠位である。更に、F409は、HER3疎水性コア中に埋められ、PG3178エピトープの一部である可能性は低くなっている。
【０２５１】
確認実験HER3エピトープ
CHO-K1細胞に、HER3 ECD変異構築物(Table 14 (表14)中に列挙した)、WT HER3 ECD及び2つの対照構築物(H407A及びY424A)をトランスフェクトした。HER3 ECDバリアントへのPG3178結合を、FACS滴定実験において試験した。HER3のドメインI(MM-121)及びドメインIII(MEHD7945A)に結合する2つの対照抗体を、細胞表面上のHER3 ECD発現を検証するために含めた。平均MFI値をプロットし、各曲線について、AUCを、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して計算した。WT HER3結合を使用して、データを正規化した。R426A変異は、PG3178結合に重要であることが示されたが、F409Aへの結合は、細胞表面発現の喪失に起因して確認できなかった(図24)。
【０２５２】
in vitroの心筋細胞に対するPB4188活性
HER2は、ヘレグリン受容体複合体HER2:HER4が関与するシグナル伝達ネットワークの一部として、成体心筋細胞の成長、修復及び生存に関与する。心毒性は、HER2標的化における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用される場合に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。ヒト幹細胞由来の心筋細胞に基づくモデル系を使用して、アントラサイクリンドキソルビシンの存在下で、トラスツズマブ並びにトラスツズマブ及びペルツズマブの組合せに対して、PB4188及びベンチマークの潜在的毒性を試験した。ヒト幹細胞由来の心筋細胞(Pluriomics BV)を、白色平底アッセイプレート(corning 655098)中に、20.000ウェルの濃度で播種した。培養の5日目に、培地を、10ng/mlのHRGを補充したグルコース及びガラクトースフリーの培養培地に置き換えた。7日目に、試験抗体を、ドキソルビシン(3μM)と組み合わせて添加した。細胞生存度を、Promega Cell力価Gloアッセイを使用して、9日目にアッセイした。単一特異性抗体は、68nMの単一濃度で試験したが、PB4188は、3μMのドキソルビシンの存在下で3つの濃度で試験した。図25は、心筋細胞の生存度が、試験した全てのPB4188濃度によって影響を受けなかったことを示している。対照的に、トラスツズマブ並びにトラスツズマブ及びペルツズマブの組合せの両方が、心筋細胞の細胞生存度を低減させた。
【０２５３】
異なるHER2レベルを有する細胞へのPB4188結合
トラスツズマブ及びHER3抗体U1-59と比較した、PB4188の結合を、異なるレベルのHER2を発現する乳癌細胞株及び胃癌細胞株に対するFACSによって分析した。細胞を、それらが数百万のHER2コピーを発現する場合、及び/又はHER2遺伝子増幅されている場合、HER2+++とみなした。以下の細胞株を使用した:MCF-7(HER2+);MDA-MB-468(HER2+、MKN-45(HER2+)、MDA-MB-175(HER2+)、MDA-MB-453(HER2++)、MDA-MB-361(HER2++)、ZR-75-1(HER2++)、JIMT-1(HER2+++)、BT-474(HER2+++)、SKBR-3(HER2+++)、SK-OV-3(HER2+++)、N87(HER2+++)。指数関数的に成長した培養物の細胞を、トリプシンによって回収し、FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA)中106細胞/mlに希釈した。1〜2×105細胞を、U底96ウェルプレート中の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gで2分間遠心分離した。上清を、上記のようにプレートを反転させ、その後1回はじくことによって廃棄した。50μlの各IgGサンプルを、3.16ng〜10μg/mlの連続希釈で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:100希釈したマウス抗ヒトIgGガンマPE(Invitrogen社)を添加し、暗中で氷上で30〜60分間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、HTS設定のFACSCantoフローサイトメーターで分析した。結合した抗体の量を、中央値蛍光によって評価した。データをプロットし、曲線下面積(AUC、中央値蛍光強度の累積測定値)を、試験した細胞株当たりで、各抗体について決定した(図26)。
【０２５４】
この実験から、PB4188が、トラスツズマブと比較して、HER2+++細胞、HER++細胞及びHER+細胞に対するより高い結合親和性を有すると結論付けられる。
【０２５５】
トラスツズマブとの同時結合
PB4188及びトラスツズマブは、HER2への結合について競合しない
PB4188は、HER2タンパク質のドメインIに結合するが、トラスツズマブの結合エピトープは、ドメインIV中に局在する。両方の抗体がHER2結合について競合しないことを実証するために、HER2増幅されたSKBR-3乳房細胞を用いた結合アッセイを実施した。最初に、未標識の抗体を、飽和濃度でSKBR-3に結合させた。次に、FITC標識されたPB4188を、滴定範囲内で添加し、蛍光をFACSによって測定した。図27は、PB4188FITCが、トラスツズマブ又は陰性対照の存在下で細胞に効率的に結合したことを実証している。SKBR-3細胞とPB4188との事前インキュベーションは、PB4188FITCが結合することを防止した。従って、トラスツズマブ及びPB4188は、HER2への結合について競合しない。
【０２５６】
HER2×HER3二重特異性分子によるHER2のドメインIの標的化は、ヘレグリン耐性を克服できる
HER2×HER3二量体上でのPB4188の配向が、HRGストレス条件下での細胞増殖を阻害するのに好ましいかどうかを試験するために、3178のHER3アーム、及びドメインI、II、III又はIVのいずれかを標的化するHER2アームから構成される二重特異性抗体を作製した。2つのHER2×HER3二重特異性抗体を、HER2ドメインI〜IVの各々のために作製した。HER2アームは以下を含んだ:ドメインIを標的化するMF3958及びMF3003;ドメインIIを標的化するMF2889及びMF2913;ドメインIIIを標的化するMF1847及びMF3001、並びにドメインIVを標的化するMF1849及びMF1898。各HER2 Fabアームを、3178のHER3 Fabアームと組み合わせ、高濃度のヘレグリンの存在下での細胞増殖を阻害するそれらの強度について試験した。抗体滴定を、HER2低発現性MCF-7細胞並びにHER2過剰発現性N87及びSK-BR-3細胞に対して実施した。N87、SK-BR-3及びMCF-7細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSA及び10μg/mlのホロトランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗浄した。抗体を、半log滴定で希釈した。細胞を、実験的に規定されたストレス濃度のHRG(10nM SK-BR-3、100nM N87及びMCF-7)の存在下で、10000細胞/ウェル(N87、SKB-BR-3)及び5000細胞/ウェルMCF-7の密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で3〜4日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen社)を添加して、増殖を評価した。吸光度を、590nmの蛍光波長を用いて550nmの励起波長で測定した。試験した全てのアッセイにおいて、HER2のドメインIを標的化する二重特異性抗体のみが、高いヘレグリン濃度の存在下で増殖を阻害することができた(図28)。
【０２５７】
in vitroでのPB4188との薬物組合せ。
PB4188を小分子薬物と組み合わせる可能性を調査するために、PB4188を、PI3K又はMAPK経路の異なるレベルにおいて妨害する薬物と組み合わせた。更に、化学療法薬物及びサイクリン阻害剤との組合せを試験した。組合せを、マトリゲルにおいてHRGの存在下で(SK-BR-3及びBT-474)、又はHRGストレス濃度の存在下で(増殖アッセイに記載したように、N87及びSK-BR-3)成長しているHER2過剰発現性細胞に対して試験した。薬物組合せの阻害効果を、画像化によって、又はAlamar Blueを本明細書で上に記載したように使用して増殖を測定することによって、試験した。最初に、EC20 PB4188及び試験する薬物を決定した。次に、交差力価測定を、PB4188及び薬物を用いて実施した。相乗作用が、チロシンキナーゼ阻害剤(アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ)、PI3Ka阻害剤BYL719、Akt阻害剤MK-2206、mTOR阻害剤エベロリムス、Src阻害剤サラカチニブ、微小管破壊薬物パクリタキセル及びHDAC阻害剤ボリノスタット(図40中で「ボロニスタット(voronistat)」とスペルミスされている)を用いて試験した全ての細胞株において観察された。図29は、形態学的変化及び細胞成長の低減を生じる、マトリゲルにおいて増殖したSKBR-3細胞に対する、PB4188とラパチニブとの相乗的組合せの一例を示す。各組合せで得られた成長阻害の程度を計算した。強度のシフトは、その効果に到達するために必要とされる単剤と比較した場合に、所望のレベルを達成するために組合せにおいて必要とされる薬物の量がどれだけ少ないかを示すアイソボログラム(Grecoら、1995)を使用して示され得る。組合せ実験の阻害値を、CHALICE(商標)Analyzerソフトウェアが使用して、アイソボログラムを生成した。HER2増幅された細胞に対する異なる薬物組合せのアイソボログラムを、図40に示す。アイソボログラム分析により、PB4188が、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット及びパクリタキセルとの相乗的薬物組合せを示したことが示された。
【０２５８】
これらのデータは、PI3K経路に対して作用する薬物が、PB4188と組み合わせて特に有効であったことを実証している。更に、チロシンキナーゼ阻害剤との組合せが有効である。更に、成長及び遊走/浸潤薬物サラカチニブとの組合せが、転移設定において好都合であり得る。
【０２５９】
リン酸化のPB4188のin vitro阻害
指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地(N87細胞:RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン;SKBR-3細胞:DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン)中で6ウェルプレート中に播種し(N87について3.75×106細胞及びSKBR-3について1.5×106細胞)、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、抗体を、5nMの最終濃度になるように添加し、細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。次いで、HRGを、100ng/mlの最終濃度になるように添加した。95%の相対湿度中で、37℃、5%COで1、3、6又は24時間の後、プレートを氷上に配置し、細胞を冷PBSで2回洗浄した。引き続いて、0.3mlの氷冷溶解緩衝液を添加し(Cell signaling RTK #9803又はIC #7018)、細胞を、氷上で最低30分間溶解させた。次に、タンパク質濃度を、BCA(Pierce #23235)を使用して測定した。タンパク質濃度を、溶解緩衝液を用いて2mg/mlに調整した。次に、溶解物を、PathScan RTK Signaling Antibody Arrays(Cell signaling #7949)又はPathScan Intracellular Signaling Antibody Arraysに適用した。全てのインキュベーションを、オービタルシェーカー上の密封ウェルを用いて室温で実施した。溶解物(75μl)を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した75μlのアレイ希釈剤緩衝液で0.8mg/mlの濃度まで2回希釈し、氷上で維持した。アレイウェルを、100μlのアレイブロック緩衝液で15分間ブロッキングした。ブロック緩衝液を除去し、溶解物をウェルに適用し、2時間インキュベートした。溶解物を吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄した。次に、100μlの検出抗体カクテルを、1ウェル当たりに適用し、1時間インキュベートした。抗体カクテルを吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄した。75μlのDylight80(商標)ストレプトアビジンを、各ウェルに添加した。Dylight80(商標)ストレプトアビジンを吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄した。マルチ-ガスケットを除去し、スライドを、脱イオン水中10mlで10秒間洗浄した。スライドを乾燥させ、Odysee(登録商標)Clxでの画像化のために処理した。スポット蛍光強度を、Image Studioソフトウェアを使用して計算した。
【０２６０】
N87及びSKBR-3では、PB4188は、トラスツズマブ+ペルツズマブの組合せとは対照的に、インキュベーションの最初の6時間の間、AKTのリン酸化を完全に遮断する。更に、強い阻害が、トラスツズマブ+ペルツズマブの組合せとは対照的に、ERK及びS6のリン酸化において観察される。PB4188は、HER2のリン酸化を阻害しない(図30)。
【０２６１】
ウエスタンブロット分析
RTK及び細胞内Pathscanアレイにおいて観察されたリン酸化阻害を検証するために、ウエスタンブロットを、HRGストレス濃度の存在下で、PB4188、組合せペルツズマブ及びトラスツズマブ、並びに対照抗体で処置した細胞に対して実施した。指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地(N87細胞:RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン;SKBR-3細胞:DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン)中で、10cmディッシュ中に播種した(N87について20×106細胞及びSKBR-3について7×106細胞)。次の日、抗体を、5nMの最終濃度になるように添加し、細胞を1時間インキュベートした。次いで、HRGを、100ng/mlの最終濃度になるように添加した。1、3、6又は24時間後、ディッシュを氷上に配置し、細胞を、冷PBSで2回洗浄し、Eppendorfチューブに移し、250μlのRIPA溶解緩衝液(20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1% NP-40、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、2.5mMピロリン酸ナトリウム、1mMベータ-グリセロホスフェート、1mM Na3VO4、1μg/mlロイペプチン)で溶解した。溶解を、氷上で30分間進行させた。細胞溶解物を遠心分離し、上清を、新しいEppendorfチューブ中に収集した。タンパク質濃度を、BCA法(Pierce)を使用して決定した。30μgの溶解物を、4〜12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen社)上で分離し、ゲル上のタンパク質を、ニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンを、5% BSAを含むTBS-Tで1時間ブロッキングし、製造者の指示(Cell Signaling Technology社)に従って、示された抗体で染色した。次いで、メンブレンを、HRPコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートし、ECL基質と共にインキュベートし、X線フィルム(Amersham社)を使用するオートラジオグラフィーに供した。全ての検出抗体は、Cell Signaling Technology社からであった:ホスホ-Akt(ser 473)#4060、総Akt #4691、ホスホ-HER2(Tyr 1221/1222)#2243、総HER2 #2242、ホスホ-HER3(Tyr 1289)#4791、総HER3 #4754、ホスホ-ERK1/2(Thr 202/Tyr 204)#4377、総ERK1/2 #4695、ホスホ-S6 RP(Ser 235/236)#2211、総S6 RP #2217、ヤギ抗ウサギHRP連結#7074。これらの結果は、PB4188が、AKTリン酸化阻害に対して顕著な影響を有するMAPK及びPI3キナーゼ経路の両方の阻害を生じる、HER3リン酸化の延長された阻害を示すことを示している(図31)。
【０２６２】
PB4188のin vivo薬物動力学
Luminexによるリン酸化タンパク質分析
2用量のPB4188及び4用量のPB4188で処置したJIMT-1移植マウスの腫瘍(100mm3)を、投薬の24時間後に取り出した。腫瘍を、瞬間凍結し、粉末に加工した。腫瘍溶解物を、凍結粉末サンプルへの冷BioRad溶解緩衝液(0.4% BioRad Factor 1、0.2% BioRad Factor 2及び2mM PMSFを補充した)を使用して、50mg腫瘍/mLの濃度に調製し、ロッカー上で4℃で60分間インキュベートして、完全な溶解を確実にした。これらのサンプルを、16000×gで4℃で10分間遠心分離し、アリコート化した。総タンパク質を、製造業者の指示に従ってBiorad DC Protein Assay試薬を使用して決定した。Luminexアッセイ:JIMT-1腫瘍溶解物サンプルを処理し、Millipore社からの市販のLuminexキット(カタログ番号48-618MAG(ロット番号2532050)、46-645MAG(ロット番号46645M-1K)を使用して、以下について分析した:総AKT AKT(Ser473)及びAKT(Thr308)。各サンプルを、2連で試験した。希釈を、全ての総分析物及びリン酸化分析物の決定のために、1ウェル当たりおよそ25μgタンパク質の標的をロードするために、サンプル希釈剤中に調製した。製造業者の仕様書に従って、Milliporeキットを使用した。
【０２６３】
PB4188で処置した腫瘍は、未処置の腫瘍と比較して、Akt発現における増加を示した。AKTのリン酸化は、2回の週1回の用量の後及び4回の週1回の用量の後の両方に、PB4188によって完全に阻害された(図32)。
【０２６４】
VeraTagアッセイによるリン酸化タンパク質分析
1又は2用量のPB4188で処置したJIMT-1移植マウスの腫瘍(100mm3又は400mm3)を取り出し、10%中性緩衝ホルマリン中で固定した。100mm3腫瘍を保有するマウスは、単一PB4188用量(25mg/kg)の24時間後に屠殺したが、400mm3腫瘍を保有するマウスは、25mg/kgの2回の週1回の用量を投与され、投薬の4時間後に屠殺した。次に、サンプルをパラフィン包埋した。厚さ7umの切片を、ミクロトーム(LEICA)を用いてスライスし、連続する番号で標識した、正に荷電したガラススライド(VWR)上に配置した。スライドを、30分間風乾し、次いで、60℃に設定した加熱オーブン中で焼いた。次のサンプルを、異なるVeraTag分析のために処理した。米国特許出願第12/340,436号に従う総HER2分析(HT2)、米国特許第8,349,574号;米国特許出願公開第2013/0071859号に従う総HER3分析(H3T)、並びに最後に、国際特許出願PCT/US2014/033208に従うHER2-HER3ヘテロ二量体(H23D)、HER3pY1289(H3pY1289)及びHER3-PI3キナーゼ(H3PI3K)。両方の投薬レジメンにおいて、HER2:HER3二量体における顕著なPB4188媒介性の低減が、未処置の対照と比較して、明らかになった。PB4188処置した腫瘍と対照との間で、総HER2、HER3又はリン酸化HER3における差異は観察されなかった。PB4188投薬の4時間後に分析した腫瘍は、未処置の対照と比較して、HER3-p85(PI3K)における顕著な低減を示した。
【０２６５】
PB4188は、HRG刺激された癌細胞において細胞周期進行を低減する
PB4188が細胞周期進行に影響を与える能力を、種々のタンパク質レベルのHER2を発現する癌細胞株において調査した。HER2+(MCF-7)、HER2+++(JIMT-1、SK-BR-3及びN87細胞)細胞を、アッセイ培地(MCF-7細胞:RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン、1mMピルビン酸ナトリウム、MEM NEAA;JIMT-1:DMEM、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン;SK-BR-3細胞:DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン;N87細胞:RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン)中に播種した。24ウェルプレートの1ウェル当たり、300.00のMCF-7、又は400.000のN87又は150.000のSK-BR-3又は150.000のJIMT-1又は細胞を、1mlのアッセイ培地中に播種し、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、PB4188又はペルツズマブ+トラスツズマブ又はPG3178又はPG1337を、1ng/ml又は100ng/mlの最終濃度のHRGの存在下で、細胞に添加した。95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2における24時間のインキュベーション(JIMT-1、N87又はSK-BR-3細胞について)又は48時間のインキュベーション(MCF-7細胞について)の後、細胞に、回収する前に2時間にわたってEdU(10μM最終濃度)を補充し、製造業者の指示に従ってClick-iT EdU AlexaFluor488キット(LifeTechnologies社、カタログ番号C10425)を使用して、EdU取込みについて染色した。FACSCantoでのフローサイトメトリーによって細胞を分析する少なくとも30分前に、細胞を、200nMのFxCycle遠赤色色素(LifeTechnologies社、カタログ番号F10348)及び100μg/mlのRNAse A(LifeTechnologies社、カタログ番号12091-039)と共にインキュベートした。事象を、AlexFluor488チャネル(EdU検出について)及びAPCチャネル(FxCycle色素による総DNA染色について)において獲得した。データを、FSC幅対FSC高さ散布図上で単一細胞をゲーティングし、APC対AlexaFluor488散布図上でG0/G1、S及びG2M期の細胞周期をサブゲーティングすることによって、それぞれEdU陰性APC低、EdU陽性及びEdU陰性APC高集団として、分析した。
【０２６６】
データは、S及びG2/M期にある細胞の百分率を、G0/G1期にある細胞の百分率によって除算することによって計算した増殖指数として表す。図34は、PB4188が、標準的(1ng/ml)又は高い(100ng/ml)濃度のHRGによって誘導された増殖を阻害することにおいて、PG3178又はペルツズマブ+トラスツズマブよりも一貫してより強力であることを示している。高濃度のHRGにおいて、PB4188は、細胞周期進行をなおも阻害する。
【０２６７】
PB4188は、受容体内部移行を誘導する
抗体の内部移行パターンを、pH感受性色素を使用して測定した。これは、WO2013134686 A1において当技術分野で記載されており、ここで、かかる色素は、抗体とカップリングされた場合、より低いpHに曝露されたときに増加した蛍光シグナルを示す。これは、色素カップリングした抗体が、標的細胞の表面から、穏やかに酸性のエンドソーム(pH6〜6.5)〜酸性のリソソーム(5.5より低いpH)中に内部移行する場合に生じる。PB4188が癌細胞において内部移行するかどうかを調査するために、抗体を、製造者の指示に従って、スクシンイミジルエステル反応性基を有するpHセンサー色素(Promega社、カタログ番号CS1783A01)にカップリングさせた。比較例として、抗HER2(トラスツズマブ、ペルツズマブ、PG3958)、抗HER3(PG3178、#Ab6)及び陰性対照(抗破傷風毒素、PG1337)の色素標識された抗体を含めた。指数関数的に成長した培養物のHER2過剰発現性SKBR-3及びN87癌細胞を回収し、1ng/mlのHRGを含む100μlのアッセイ培地(N87細胞:RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン;SKBR-3細胞:DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/mlホロトランスフェリン)中で96ウェルプレート上に播種し(1ウェル当たり15×103細胞)、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、20μlのpH感受性色素標識した抗体を添加して、100nMの最終濃度に到達させ、細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、非接着性細胞を収集し、接着性細胞をトリプシン処理することによって、細胞を回収した。FACS緩衝液(PBS 0.5% BSA 0.1%アジ化ナトリウム)で細胞を洗浄した後、細胞を、APC標識した抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch社、カタログ番号109-136-098、1:100希釈)で染色した。細胞を、PE及びAPCチャネルの中央値蛍光強度(MFI)を測定するFACSCanto(BD Biosciences社)でのフローサイトメトリーによって分析して、それぞれ、抗体の内部移行及び残留表面結合を決定した。図35に示されるデータは、PB4188がトラスツズマブと同じ程度まで内部移行するが、組合せトラスツズマブ+ペルツズマブは、増強された内部移行をもたらすことを示している。トラスツズマブ+ペルツズマブの組合せは、トラスツズマブ単独と比較して、ADCCを低減する(図36)。従って、PB4188内部移行のレベルは、ADCC強度に影響を与えないと理解される。
【０２６８】
抗HER3抗体3178バリアントの作製及び特徴付け
抗HER3抗体MF3178のバリアントを、抗体特性を改善することを目的として設計した。変異を、VH遺伝子フレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CDR1)、FR2、CDR2及び/又はFR3中に導入したが、CDR3及びFR4は改変しなかった。この設計は、翻訳後修飾(PTM)モチーフを除去するため(例えば、脱アミドモチーフNSをNQに変化させることによる)、表面疎水性を低減するため(例えば、IをTに変化させることによる)又は等電点を増加させるため(pI;例えば、QをKに変化させることによる)に導入された変異を含むが、それらに限定されない。20全てのバリアント(図37を参照のこと)を、破傷風トキソイド(TT)アームと組み合わせた二重特異性抗体として発現させ、MCF-7機能的アッセイにおいて試験したところ、20全てのバリアントが、この形式でMF3178抗体と類似の強度を有していた。20全てのバリアントを、MCF-7への結合について滴定においてFACSにおいてもこの形式で試験したところ、全てのバリアントが、非常に類似の結合プロファイルを有し、これは、全てのバリアントの親和性が類似していることを示唆している。それぞれ、10、3及び7つのアミノ酸変異を含む3つのリードバリアントMF6058、MF6061及びMF6065を、さらなる実験のために選択した(図16E及び図37の配列を参照のこと)。対応する単一特異性IgG1 PG6058、PG6061及びPG6065を大規模で産生し、精製した。図38に示されるように、HRG依存的N87細胞株増殖アッセイにおける3つのバリアントの阻害活性は、PG3178のものと類似である。3つのバリアントのCIEX-HPLCプロファイルは、図39に示されるように、電荷不均一性並びにピーク幅及び対称性に関して、PG3178のものと類似であった。主要ピークの保持時間(tR)は、抗体のpIと大まかに相関した、即ち、pIが高いほど、より長い保持時間を生じた。二重特異性抗体又は抗体の混合物の設計において、最適なtRを有する抗体バリアントを選択することは有用であるが、それは、CIEXを使用した所望の抗体成分の精製が促進され得るからである。
【０２６９】
(実施例2)
頭蓋内PDX腫瘍を有するマウスにおけるHER2及びHER3に対する二重特異性抗体MCLA-128の効力を決定した。MCLA-128の効力を、T-DM1と比較した。更に、MCLA-128及びT-DM1の組合せを、単剤処置と比較した。
【０２７０】
動物
この試験は、Janvier Labs社、Franceからのストックの43匹(11匹の予備の動物を含む)雌性NMRIヌードマウス(1週間の時間枠で年齢が一致したものを注文、およそ6週齢)において実施した。
【０２７１】
動物の収容及び取り扱い
健康モニタリング:
マウスを、Animal Unit Standard Proceduresに従って、Department of Experimental Medicine、Building 10.3、University of Copenhagenにおいて到着時に臨床的に試験した。教育を受けた職員が、獣医学の監督の下でマウスを取り扱った。全ての動物は健康であり、福祉に関する判断は行わなかった。
【０２７２】
順化:
実験手順の開始前に、14日間の順化期間を認めた。
【０２７３】
収容及び環境:
動物を、動物部屋/実験室に収容した。部屋を、12時間の光及び12時間の暗闇のサイクルになるように照射した。光は、06:00時から18:00時までオンにした。マウスを、IVC III型ケージ、Techniplast社(820cm2、高さ15.5cm、1ケージ当たり最大8/最小2匹のマウス)中に収容した。動物は、動物技師が毎日モニタリングしたが、獣医師が、1カ月おき又は技師からのリクエストにより、動物施設をモニタリングする。各ケージを、少なくとも試験ID、群及び動物番号並びに試験化合物で標識した。頭蓋内腫瘍移植後、ケージには、使い捨てプラスチックインサートを備えた。
【０２７４】
寝床:
寝床は、Brogarden/Finn Tapvei Oy社、FIN-73620 Kortteinen、FinlandのAspenウッドであった。寝床を1週間おきに交換した。
【０２７５】
環境強化:
動物に、寝床の各交換時に、Brogarden社の営巣材料を供給した。更に、各ケージは、Brogarden/Finn TapveiOy社、FIN-73620 Kortteinen、Finlandの木製の棒を含み、カスタムメイドの透明赤色プラスチック遮蔽物を含んだ。
【０２７６】
食餌及び飲用水:
ラット及びマウス用の維持食であるペレット化完全食「Altromin 1319」は自由に利用可能とし、14日毎に交換した。動物は、毎週交換される水道水への自由なアクセスを有した。頭蓋内腫瘍移植後、飲用水にエストロゲンを補充した。
【０２７７】
人道的エンドポイント
動物を、人道的理由で安楽死させた。動物を死なせるための人道的理由には、動物が永続的な苦痛、疼痛又は恐怖の徴候を示す場合が含まれるがこれらに限定されない。この試験のための具体的な人道的エンドポイントは、Table 16(表16)に列挙したスコアリングシステムによって決定される。必要に応じて、マウスを頚椎脱臼によって安楽死させた。
【０２７８】
方法
この試験のためのタイムラインは、Table 17(表17)に示される。
【０２７９】
頭蓋内腫瘍移植
NMRIヌードマウス中で成長させた皮下ST1360B PDX腫瘍(第4継代)を回収した。腫瘍成長曲線については図41を参照されたい。腫瘍移植後、ST1360B腫瘍を有するマウスにエストロゲンを補充した。腫瘍をPBSで洗浄し、表面の残留結合組織をトリミングした。腫瘍を小片へと切断し、アクターゼ(Accutase)及びコラゲナーゼIVで消化して、単一細胞の懸濁物を得た。消化を、胎仔ウシ血清を含む培地の添加によって停止させ、細胞懸濁物を、100μmフィルターを介して濾過し、PBS中で洗浄し、PBS中に再懸濁した。腫瘍細胞の生存度を、トリパンブルー染色によってチェックし、最終濃度は、1800万の生存細胞/mLであった。総細胞の生存度は、80%よりも高かった。間質細胞又は腫瘍細胞間に区別は存在しなかった。溶液は、いくらかの細胞デブリも含む。ST1360Bは、高い腫瘍細胞充実性を実証する。細胞を、接種まで氷上に維持した。
【０２８０】
マウスを、ヒプノルム(hypnorm)/ミダゾラム(1ml/100g体重)によって麻酔し、頭部の固定のために定位フレーム中に配置した。長軸方向の切開を頭皮に行って、頭蓋冠を露出させた。矢状縫合の1.5mm右及び十字縫合の0.5mm後方の頭蓋骨に、マイクロドリルを使用してドリルで穴を開けた。10μlの細胞懸濁物(180.000細胞)を、マイクロ注入ポンプ中に配置した25ゲージ針を備えた100μlシリンジを使用して、60nl/秒の速度で2〜2.5mmの深さで注射した。針を3分間放置し、その後引き抜いた。ブピバカイン(0.2mg/100g体重)及びリドカイン(1mg/100g体重)を、局所麻酔のために切開部位中に投与し、皮膚を縫合によって閉じた。マウスを、同定のために耳に穿孔し、ケージに戻し、そこで、麻酔から完全に回復するまでモニタリングした。マウスを、腫瘍接種後、1週間に少なくとも2回モニタリングし(体重及び臨床徴候)、臨床徴候又は体重減少が存在した場合にはより頻繁にモニタリングした。
【０２８１】
MR画像化
腫瘍の発達を、1週間に2回T2加重MR画像化(軸位断及び冠状断平面)によってモニタリングした。最初の画像化セッションは、腫瘍接種の19日後であった。動物を、MR画像化セッションの間麻酔した(セボフルラン、およそ4:1の比で100%O2を補充した環境大気中2〜4%)。試験への登録は、腫瘍成長及び約10〜20mm3の腫瘍体積を示す2つの病理学的MRスキャンに基づいた。組み入れ基準を満たすマウスを、4つの群のうち1つにランダム化した。登録基準を満たす最初の32匹のマウスを、試験に登録した。マウスを、全ての群が処置開始時に同じ平均腫瘍体積を示すようにランダム化した。
【０２８２】
治療
マウスに、Table 18(表18)に従って、ビヒクル、MCLA-128、T-DM1又はMCLA-128+T-DM1のいずれかを投薬した。薬物を、各投薬前に無菌食塩水中に希釈した。マウスを、試験化合物の注射前におよそ5〜10分間加熱灯下に配置して、可能な限り迅速かつ容易に手順を行った。マウスを、尾部拘束箱上に配置し、試験化合物を、単回静脈内(i.v.)ボーラス用量として側方尾部静脈中に投薬した。投薬体積は5.0mL/kgであった。
【０２８３】
治療後のMR画像化及び体重モニタリング
腫瘍成長を、治療開始後最初の2週間については1週間に2回、治療の6週間後までは毎週、T2加重MR画像化(軸位断及び冠状断平面)によってモニタリングした。動物を、MR画像化セッションの間麻酔した(セボフルラン、およそ4:1の比で100%O2を補充した環境大気中2〜4%)。
【０２８４】
動物を、人道的エンドポイント、Table 16(表16)に起因して個別に頚椎脱臼によって安楽死させた。腫瘍を有する脳を切除し、4%ホルムアルデヒド中で24〜48時間保存し、70%エタノールに移した。固定液:組織比は、少なくとも20:1であった。
【０２８５】
画像分析
腫瘍体積を、個々のスライス上に目的の領域(ROI)を描画し、ROIの体積を計算することによって、画像上で測定した。ROIを、軸位断スライス及び冠状断スライスの両方上に描画し、2つの平面中の腫瘍体積の平均を、腫瘍体積として使用した。脳中の浮腫を、0〜4のスケールで手動でスコアリングし、スコア0は脳浮腫なしであり、スコア4は大きい脳浮腫を示す。図42を参照のこと。画像分析を、Horos. (Horos Project (2017). DICOM image viewing and measuring. [Horos]. http://www.horosproject.org/)を使用して実施した。
【０２８６】
結果
組み入れ及びランダム化
最初の動物を、頭蓋内腫瘍移植の23日後に試験に組み入れた。全ての動物についての組み入れの日付及び組み入れ時腫瘍体積は、table 19(表19)に列挙される。組み入れ時の群A〜D中のマウスの体重及び腫瘍体積は、図43に示される。群間で、体重にも腫瘍体積にも差異は見られなかった(一元配置ANOVA、p=0.43(体重)及びp=0.92(腫瘍体積))。図43:群A〜D中のマウスの組み入れ時の体重及び腫瘍体積。群間で、体重にも腫瘍体積にも差異は見られなかった(一元配置ANOVA、p=0.43(体重)及びp=0.92(腫瘍体積))。
【０２８７】
治療後モニタリング
T2加重MRIを、治療の開始後3、7、10、14、21、28、35及び42日目に実施して、頭蓋内腫瘍体積を測定した。各群についての治療の開始後の平均腫瘍体積は、図44に示される。各群中の動物についての個々の腫瘍体積は、図46〜図49に示される。マウスの代表的なT2加重画像は、図50〜図53に示される。腫瘍成長は、T-DM1及びT-DM1+MCLA-128で処置したマウスでは阻害されたが、腫瘍成長遅延が、ビヒクル処置したマウスと比較して、MCLA-128で処置したマウスにおいて観察された。治療の10日後の腫瘍体積には有意な差異が存在し(p=0.009、一元配置ANOVA)、T-DM1及びT-DM1+MCLA-128処置したマウスの平均腫瘍体積は、ビヒクル処置したマウスと比較して、有意に小さかった
(p<0.05、多重比較のために補正した;Tukey)。
【０２８８】
マウスの体重を、治療の開始後注意深くモニタリングした。異なる群中のマウスの平均体重は、図45に示される。異なる群中の各マウスについての体重測定値は、組み入れ時の体重と比較したグラムで及び百分率変化として、図54〜図57に示される。個々の体重測定値から、人道的エンドポイントが満たされる前にマウスの大部分が体重を減少させたことが明らかである。
【０２８９】
脳浮腫のスコアリング
腫瘍停滞(成長なしの腫瘍の存在)が、群B及びD中の動物について見られた。屠殺の時点に最も近いMR画像の評価は、一部の動物が脳浮腫を呈したことを示した。これは、マウスの悪化しつつある状態及び安楽死の必要性に寄与し得る。脳中の浮腫を、0〜4のスケールで手動でスコアリングし、0は脳浮腫なしを示し、4は大きい脳浮腫を示す(Table 20(表20)及び図58)。T-DM1で処置した群(群B及びD)では、浮腫の増加に向かう傾向が存在した。しかし、群間で、脳浮腫に有意な差異は見出されなかった(ノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定)。浮腫スコアは、同じ時点で実施されるわけでも安楽死の時点で実施されるわけでもないので、結果を解釈する際には注意を払うべきである。また、腫瘍体積は群間で異なり、これは脳浮腫にも影響し得る。このように、この試験は、処置の影響及び脳浮腫を詳細に調査するように設計されたのではない。
【０２９０】
生存分析
マウスを、Table 16(表16)に従う人道的エンドポイントに起因して安楽死させた。徹底的なモニタリングにもかかわらず、4匹のマウスが、試験の間にケージ中で死亡しているのが見出された。ケージ中で死亡しているのが見出された動物からは、ex vivo腫瘍材料は保存しなかった。全ての群についての生存データのカプラン・マイヤープロットは、図59に示される。生存曲線は有意に異なっていた(p<0.0001、ログランク)。ビヒクル、T-DM1、MCLA-128及びT-DM1+MCLA-128動物についての生存期間中央値は、それぞれ、治療開始後13、19.5、29及び42日間であった。ペアワイズカプラン・マイヤープロットは、図60に示される。有意な(ログランク)より長い生存期間中央値が、T-DM1対ビヒクル(19.5対13日間、p=0.020)、MCLA-128対ビヒクル(29対13日間、p<0.0001)及びT-DM1+MCLA-128対ビヒクル(42対13日間、p<0.0001)について観察された。MCLA-128対T-DM1について、生存期間中央値に差異は見られなかった(29対19.5日間、p=0.10、ログランク)。T-DM1+MCLA-128で処置したマウスは、T-DM1(42対19.5日間、p=0.0005)又はMCLA-128(42対29日間、p=0.013)で処置したマウスと比較して、有意な(ログランク)より長い生存期間中央値を有した。
【０２９１】
考察
T2加重MRIによって決定されるように、T-DM1及びT-DM1+MCLA-128は、腫瘍成長を阻害したが、MCLA-128は、腫瘍成長遅延を示した。ビヒクル、T-DM1、MCLA-128及びT-DM1+MCLA-128処置したマウスについての生存期間中央値は、それぞれ、治療開始後13、19.5、29及び42日間であった。MCLA-128で処置したマウスは、ビヒクル処置した動物と比較して、有意に長い生存を有し(29対13日間、p<0.0001)、T-DM1+MCLA-128で処置したマウスは、T-DM1(42対19.5日間、p=0.0005)又はMCLA-128(42対29日間、p=0.013)で処置したマウスと比較して、有意に長い生存期間中央値を有した。T-DM1で処置した群(群B及びD)では、浮腫の増加に向かう傾向が観察された。しかし、群間で、脳浮腫に有意な差異は見出されなかった(ノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定)。結論として、MCLA-128は、単剤として、及びT-DM1との組合せで、頭蓋内ST1360BPDX腫瘍を有するマウスの生存に対する効力を示した。
【０２９２】
(実施例3)
転移性乳癌(MBC)におけるMCLA-128ベースの組合せのフェーズII試験:HER2陽性MBCにおけるMCLA-128/トラスツズマブ/化学療法
この実施例は、MCLA-128/トラスツズマブ/化学療法の投与を記載しているが、この実施例が、示されたこの具体的な治療剤の使用に限定されることは意図せず、阻害薬剤を含むErbB-2結合剤及び化学療法と組み合わせた、開示されたErbB-2及びErbB-3結合性二重特異性抗体に当てはまる。
【０２９３】
目的
HER2陽性/増幅されたMBC:MCLA-128+トラスツズマブ±ビノレルビン
主要目的:
・ペルツズマブ及びHER2抗体薬物コンジュゲート(ADC)と共にトラスツズマブを含んだ以前のHER2指向性治療で進行したHER2陽性/増幅されたMBC患者における、RECIST 1.1(治験責任医師の検討に従う)に基づく24週間の時点での臨床的有用率(clinical benefit rate)(CBR)に関して、トラスツズマブ±ビノレルビンと組み合わせたMCLA-128の効力を評価する
【０２９４】
副次的目的:
・中央の検討に従うRECIST 1.1に基づいて、24週間の時点でのCBRを評価する
・無増悪生存期間(PFS;治験責任医師及び中央の検討に従う)を評価する
・RECIST 1.1(治験責任医師及び中央の検討に従う)に基づいて、奏効率(ORR)を評価する
・RECIST v1.1(治験責任医師及び中央の検討に従う)に基づいて、奏効期間(DoR)を評価する
・全生存期間(OS)を評価する
・トラスツズマブ±ビノレルビンと組み合わせたMCLA-128の安全性及び忍容性を評価する
・トラスツズマブ±ビノレルビンと組み合わせたMCLA-128の薬物動態(PK)を特徴付ける
・トラスツズマブと組み合わせたMCLA-128の免疫原性を特徴付ける
【０２９５】
予備的目的:
・腫瘍又は血液サンプル中のバイオマーカーと抗腫瘍活性(HER2、HER3、HER2:HER3二量体、ヘレグリン及び他の潜在的バイオマーカーを含む)との間の潜在的相関を評価する
【０２９６】
試験設計
フェーズ2非盲検多施設国際試験を実施して、HER2陽性/増幅された、2つの転移性乳癌(MBC)集団において、MCLA-128ベースの組合せの効力を評価する。2つの併用処置を、欧州及び米国の7カ国において15〜20の場所で評価する。
【０２９７】
陽性蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)と組み合わせた免疫組織化学(IHC)3+又はIHC2+によって確認されたHER2過剰発現を有する、HER2陽性/増幅されたMBCを有する患者であって、ペルツズマブ及びHER2 ADCと共にトラスツズマブを含む、アジュバント/ネオアジュバント、切除不能な局所的に進行した/転移性設定での2〜4ラインのHER2指向性治療で、RECIST v1.1に従って進行した患者が適格である。登録のために、HER2状態は医療記録に基づき、引き続いて適格性を、中央実験室の検討によって、可能な限りすぐに確認する。不適格であると見出された患者は、主要目的について遡及的に評価不能であり、交代させられる場合がある。最後の以前のラインの治療での疾患の進行の報告された画像証拠は、可能であれば利用可能にすべきである。
【０２９８】
最初に、MCLA-128を、トラスツズマブと共に投与する(二重組合せ)。安全性は、Independent Data Monitoring Committee(IDMC)が検討する。二重組合せの安全性を評価した後、MCLA-128+トラスツズマブ+ビノレルビン(三重組合せ)を、二重組合せと並行して評価する(図61を参照のこと)。
【０２９９】
二重及び三重組合せを共に、IDMCによって検討される4〜6人の患者における初回安全性慣らし(run-in)を用いて2工程で評価し、その後、以下に記載するように、コホート効力増大を行った。三重組合せの継続か中止かの決定を、IDMCによる二重安全性慣らし患者の評価後に行う。両方の組合せの効力増大は、並行して継続する。
【０３００】
安全性慣らし:4〜6人の患者が、少なくとも2回の完全なサイクル(6週間)のMCLA-128+トラスツズマブを受けた後に、安全性検討をIDMCが実施する。二重組合せが安全とみなされる場合、三重組合せのための安全性慣らしを開始する。三重組合せの安全性は、4〜6人の患者が、少なくとも2回の完全なサイクル(6週間)のMCLA-128+トラスツズマブ+ビノレルビンを受けた後に、IDMCが評価する。
【０３０１】
最初の4〜6人の患者において観察された安全性(有害事象[AE]、重篤有害事象[SAE]、試験薬物との関連性、並びに他の臨床的に適切なパラメーター[例えば、実験室パラメーター]、利用可能なPK、免疫原性及びサイトカインデータ)に基づいて、IDMC、治験責任医師及び試験依頼者は、各組合せ(即ち、二重及び三重)のための可能なさらなる慣らし期間を決定する。
【０３０２】
増大:安全性慣らし後、IDMCによって忍容性があるとみなされた各併用療法を、効力について評価可能な合計で最大40人の患者まで増大させる。
【０３０３】
試験集団
組み入れ基準
患者は、試験に入るためには、以下の要件を全て満たす必要がある。
1.  いずれかの試験手順の開始前に、インフォームドコンセントにサインしている。
2.  治癒的意図でのいずれの局所治療にも適さない、転移性又は局所的に進行した疾患の証拠を有する、組織学的又は細胞学的に確認された乳癌を有する女性:
a.  スクリーニング前の12カ月以内に収集された新鮮な又はアーカイブのいずれかの、最も最近の腫瘍生検(好ましくは転移性、さもなければ原発性)に対する局所分析に基づいて、陽性蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)と組み合わせた免疫組織化学(IHC)3+陽性又はIHC2+と定義される、報告されたHER2過剰発現/増幅。
b.  アジュバント/ネオアジュバント、切除不能な局所的に進行した/転移性設定で投与された2〜4ラインのHER2指向性治療での報告された疾患進行(治験責任医師の評価による);トラスツズマブ+ペルツズマブ及びHER2抗体薬物コンジュゲート(例えば、T-DM1)が全て、以前に投与されていなければならない(いずれかの順序で)。
3.  最も最近のラインの治療時又はその後に、放射線学的方法によってRECISTバージョン1.1によって定義される測定可能な疾患。
4.  インフォームドコンセントのサインの時点で18歳以上
5.  0又は1のEastern Cooperative Oncology Group(ECOG)活動指標。
6.  治験責任医師による、12週間以上の平均余命。
7.  心エコー図(ECHO)又はマルチゲートスキャン(MUGA)により、左室駆出分画(LVEF)≧50%。
8.  適切な臓器機能:
a.  好中球絶対数(ANC)≧1.5×109/L
b.  ヘモグロビン≧9g/dL
c.  血小板≧100×109/L
d.  正常範囲内の血清カルシウム(又は補充により補正した)
e.  アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)≦2.5×正常上限(ULN)及び総ビリルビン≦1.5×ULN(肝臓関与の場合、ALT/AST≦5×ULN及び正常範囲内の総ビリルビンが許容される)
f.  65歳よりも上の患者について、コックロフト及びゴールトの式又はMDRD式に従って計算した、血清クレアチニン≦1.5×ULN又はクレアチニンクリアランス≧60mL/分
g.  血清アルブミン>3.0g/dL
【０３０４】
調査的治療及びコンパニオン治療
MCLA-128:2時間にわたって750mgの静脈内一律用量、3週間毎の1日目(q3w)。
パラセタモール/アセトアミノフェン、抗ヒスタミン薬及びコルチコステロイドによる事前薬物療法(標準的な実務による)が、全てのMCLA-128注入について義務である。
トラスツズマブ:1日目のサイクル1で、90分間にわたって8mg/kgの静脈内負荷用量、次いで、サイクル2からは、6mg/kgを、各サイクルの1日目、q3wで、30〜90分間にわたって静脈内投与する。安全性慣らし患者については、トラスツズマブ投与を、サイクル1の2日目に遅延させる。
ビノレルビン:10分間にわたって25mg/m2を静脈内、1日目及び8日目、3週間毎。安全性慣らし患者については、ビノレルビン投与を、サイクル1の2日目及び9日目に遅延させる。
【０３０５】
処置レジメン
全ての組合せについて、サイクルを3週間検討する。初回MCLA-128及び/又はトラスツズマブ投与のための注入開始後、6時間の観察期間が企図され、全ての引き続く投与については2時間の観察期間が企図される。
【０３０６】
二重組合せ(図62を参照のこと):
・安全性慣らし(4〜6人の患者):サイクル1について、MCLA-128を1日目に投与し、トラスツズマブを2日目に投与する。サイクル2からは、MCLA-128投与の完了の30分後に、トラスツズマブを1日目に投与する。
・増大:全てのサイクルについて、MCLA-128を1日目に投与し、その後、MCLA-128注入の終了の30分後にトラスツズマブを投与する。
【０３０７】
三重組合せ(図63を参照のこと):
・安全性慣らし(4〜6人の患者):サイクル1について、MCLA-128を1日目に投与し、その30分後にトラスツズマブを投与し、ビノレルビンを、2日目及び9日目に投与する。サイクル2からは、ビノレルビンを、1日目にトラスツズマブの30分後に、及び8日目に投与する。
・増大:全てのサイクルについて、MCLA-128を1日目に投与し、その30分後にトラスツズマブを投与し、その後、トラスツズマブ注入の終了の30分後にビノレルビンを投与する。
【０３０８】
二重及び三重組合せの両方について、個々の患者が同じ日に全ての薬物に対して忍容性を示さない場合、安全性慣らしサイクル1の投薬スケジュールをその患者について維持する。
【０３０９】
処置割当て:試験依頼者は、組合せに従って利用可能な安全性慣らし又は増大において、適格な患者を、二重又は三重組合せに交互に割り当てる。
【０３１０】
処置適応
・用量低減は、MCLA-128についてのトラスツズマブについても許容されない。
・SPCに従って、減少した好中球数又は上昇したビリルビンレベルの場合、ビノレルビン用量を減少又は中断させ、グレード≧2の神経毒性(NCI-CTCAE v. 4.03)が存在する場合、これを中止する。
・注入関連反応(IRR)の場合には、MCLA-128注入を中断し、重症のIRRについては、これは最終的に停止すべきである。軽度〜中程度の事象について、注入は、50%の注入速度で再開し、注入持続時間を4時間に延長することができる。
・MCLA-128及びトラスツズマブ投与は、特に、臨床的に有意なLVEF減少、うっ血性心不全の徴候又は持続性のグレード2若しくはグレード3〜4の下痢について、AEを管理するために、注入間に最大6週間遅延させることができる。
【０３１１】
処置持続時間
試験処置を、確認された進行性疾患(RECIST 1.1による)、容認できない毒性、同意の撤回、患者の服薬不履行、治験責任医師の決定(例えば、臨床的増悪)、処置中断>連続6週間、いずれかの試験薬物の休薬まで投与する。患者を、安全性については、最後の試験薬物投与の後少なくとも35±5日間にわたって、及び関連毒性の回復/安定化まで追跡し、疾患進行及び生存状態については、12カ月間にわたって追跡する。
【０３１２】
予防的及び併用薬物療法
許容
・パラセタモール/アセトアミノフェン、抗ヒスタミン薬及びコルチコステロイドの投与は、全てのMCLA-128投与について義務である。IRR又は過敏症の場合、臨床的に必要な場合、患者を、地域の臨床実務に従って管理する。
・患者の福利に必要であり、症状及びAEの支持的処置又は付随する状態の標準的な処置を含む、試験薬物の評価を妨害しないと予測される全ての薬物療法を、治験責任医師の裁量で与えてもよい。
【０３１３】
禁止
・併用慢性経口コルチコステロイド(>10mg/日のプレドニゾン等価物)、TNF-アルファ阻害剤、抗T細胞抗体(免疫抑制のリスクに起因する)。
・試験の間又は試験処置の最初の用量の4週間前の、任意の治験薬物。
・試験の間又は試験処置の最初の用量の3週間以内の、全身抗癌治療又は黄熱病ワクチン。
【０３１４】
安全性/忍容性評価
・AE(CTCAEバージョン4.03)、SAE
・実験室パラメーター:血液学、生化学、凝固、尿検査、サイトカイン
・ECG、MUGA/ECHO
・病歴、バイタルサイン、活動指標及び身体検査
・併用薬物療法
・毒性に起因する用量改変(低減、中断、遅延)、中止
【０３１５】
効力評価
腫瘍評価は、処置開始後6週間毎の、RECIST 1.1に従う造影剤を用いたCT/MRIに基づく。客観的応答は、最初の観察の少なくとも4週間後に確認すべきである。独立した放射線科医による画像の中央の検討を、全ての患者について実施する(スクリーニング及び試験中)。骨スキャンを、臨床的に必要な場合、ベースラインにおける骨転移又は試験中の疑わしい病変を有する患者について実施する。腫瘍マーカー(CA15-3、CEA、CA27-29)を、各サイクルの1日目に評価する。
【０３１６】
バイオマーカー
候補予備的バイオマーカーを、腫瘍組織(スクリーニング時、12週間後及びEOT後に任意選択)及び血液(4サイクル毎の1日目の事前投薬及び処置の終了時)において評価する。
【０３１７】
腫瘍:HER2、HER3、HER2:HER3二量体化、下流シグナル伝達タンパク質(例えば、PIK3CA)、ヘレグリン、HER2、HER3並びにMAPK及びAKTシグナル伝達経路中のタンパク質のリン酸化、PTEN等の阻害剤の発現、HER2及びHER3シグナル伝達を含む癌関連遺伝子における変異、ヘレグリン-遺伝子融合物。
【０３１８】
血液:Fc□受容体多型、血漿循環性腫瘍DNA変異、予備的血清バイオマーカー(例えば、可溶性HER2、ヘレグリン)。
【０３１９】
薬物動態
血液サンプルを収集して、血清MCLA-128及びトラスツズマブ曝露を測定する。ビノレルビンについては、PKサンプリングは実施しない。
【０３２０】
PKサンプリングを、以下の時点で実施する:
二重及び三重組合せ:MCLA-128
・サイクル1:1日目、事前投薬、EOI、並びにEOIの2、4及び22時間後、次いで、8日目(安全性慣らし三重患者については9日目)の任意の時点
・サイクル2:1日目、事前投薬、EOI(慣らし及び増大)、並びにEOIの2、4及び22時間後、次いで、8日目の任意の時点(慣らしのみ)
・サイクル3及び5:1日目、事前投薬及びEOI
・その後4サイクル毎:事前投薬
二重組合せ:トラスツズマブ
・サイクル1、1日目:事前投薬及びEOI(増大のみ)
・サイクル1、2日目:事前投薬及びEOI(慣らしのみ)
・サイクル2、1日目:事前投薬及びEOI(慣らし及び増大)
三重組合せ:トラスツズマブ
・サイクル1及び2、1日目:事前投薬及びEOI(慣らし及び増大)
【０３２１】
免疫原性
血液サンプル(5mL)を、全ての患者において収集して、サイクル1、3、5について1日目の事前投薬、その後4週間毎、及び処置の終了時の、抗MCLA-128抗体事前投薬の血清力価を評価する。
【０３２２】
サイトカイン
血液サンプルを収集して、以下のように、安全性慣らし患者において血清サイトカインパネル(TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10)を分析する:
二重組合せ(慣らしのみ):
・サイクル1:1日目、事前投薬、MCLA-128の注入の終了(EOI)の2、4及び22時間後
・サイクル1:2日目、事前投薬、トラスツズマブのEOIの2時間後
・サイクル2:1日目、事前投薬、MCLA-128のEOIの2、4及び22時間後
三重組合せ(慣らしのみ):
サイクル1及び2:1日目、事前投薬、MCLA-128のEOIの2、4及び22時間後
【０３２３】
統計的検討
サンプルサイズ
安全性慣らし:安全性慣らしにおける4〜6人の評価可能な患者は、AEを検出する力を有し、33%の真の発生率は80〜90%である。
【０３２４】
効力増大:二重又は三重組合せにおける40人の評価可能な患者は、30%を排除する適切な精度を有する(90%CIの下限>30%)。24週間の時点でのCBR率についての閾値は、PFSが5カ月(臨床的に適切)及び3.5カ月(臨床的に適切でない)の中央値の指数分布に従うという仮説に基づいて定義する。
【０３２５】
患者の最終数は、試験の間の安全性及び効力転帰に依存する。最大で約130人の患者が関与し、2つの計画された組合せレジメンの各々における合計で40人の患者、及び約10%の比率の評価不能な患者を生じる。
【０３２６】
定義
全ての効力エンドポイントを、RECIST 1.1による腫瘍評価に基づいて定義及び分析する。
・CBR:CR、PR又はSDの最良総合効果≧24週間を有する患者の割合。
・ORR:CR又はPRの最良総合効果を有する患者の割合。
・PFS:処置開始から、放射線学的進行、又は任意の原因に起因する死亡までの時間。
・PFS比:以前のレジメンによるPFSの、試験処置中のPFSに対する比。
・DoR:応答(CR又はPR)から、進行、又は根底にある癌に起因する死亡までの時間。
・OS:処置開始から、任意の原因に起因する死亡までの時間。
【０３２７】
エンドポイント
主要
24週間の時点での、治験責任医師の放射線学的検討に従うCBR
重要な副次的
24週間の時点での、中央の検討に従うCBR、並びに治験責任医師及び中央の検討に従うORR、PFS及びDoR
他の副次的:
安全性:AEの発生率、重症度及び関連性、実験室異常、SAE、ECG及びLVEF測定値、並びにバイタルサイン
忍容性:AEに起因する中止、AEに起因する用量改変、免疫原性、及びサイトカイン評価
他の効力:OS
薬物動態:MCLA-128についてはCmax、C0h、AUC、CL、Vss、tmax及びt1/2、トラスツズマブについてはCEOI及びC0h。
【０３２８】
分析集団
処置集団:少なくとも1用量のMCLA-128を受ける患者。
効力について評価可能:少なくとも2回の完全なサイクル(6週間)の処置を受け、ベースライン評価及び1回の試験中腫瘍評価を受けた、又は疾患進行に起因して早期に中止する患者。
【０３２９】
分析
患者の素質及び人口統計学を、処置集団において分析し、効力を、効力について評価可能な集団において分析し、安全性を、処置集団において分析する。
【０３３０】
定量的変数を、記述統計学を使用してまとめる。連続変数を、N、平均及び/又は中央値、標準偏差、範囲として示す。カテゴリー変数を、頻度及び百分率を使用して示す。
【０３３１】
成功主要エンドポイントのための基準:5カ月の中央値PFSを適切と仮定し、24週間の時点でのCBRについての活性閾値を45%に設定する。
【０３３２】
CBR及びORRを、90%正確二項CIを伴ってまとめる。
【０３３３】
PFS、OS及びDoRについて、生存関数を、カプラン・マイヤーの積極限法を使用して推定する;確率推定及び90%CIを、特定した時点で提供する;中央値持続時間及び90%CIもまた提供する。DoRは、応答者のみについて推定する。
【０３３４】
AEを、Medical Dictionary for Regulatory Activities(MedDRA(登録商標))の好ましい用語によって、並びに発生率及び重症度に従う臓器クラスによって作表する。AEの重症度は、CTCAE 4.03に基づく。
【０３３５】
PK、免疫原性、サイトカイン及びバイオマーカーを、中央で分析し、別々に報告する。
【０３３６】
表:
FACSによって決定された、免疫化したマウスの異なるコホートの血清力価。D=抗体力価決定の日。Table 1 (表1):HER2に対する応答。Table 2 (表2):HER3に対する応答。使用した細胞株が示される(MCF7、SKBR3、BT474)。異なるマウスを各列に示す。
【０３３７】
【表１】
2020515594.tif 000002
【０３３８】
【表２】
2020515594.tif 000003
【０３３９】
【表３】
2020515594.tif 000004
【０３４０】
【表４】
2020515594.tif 000005
【０３４１】
【表５】
2020515594.tif 000006
【０３４２】
【表６】
2020515594.tif 000007
【０３４３】
【表７】
2020515594.tif 000008
【０３４４】
【表８】
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【０３４５】
【表９】
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【０３４６】
【表１０】
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【０３４７】
【表１１】
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【０３４８】
【表１２】
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【０３４９】
【表１３】
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【０３５０】
【表１４】
2020515594.tif 000015
【０３５１】
【表１５】
2020515594.tif 000016
【０３５２】
【表１６】
2020515594.tif 000017
【０３５３】
【表１７】
2020515594.tif 000018
【０３５４】
【表１８】
2020515594.tif 000019
【０３５５】
【表１９】
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【０３５６】
【表２０】
2020515594.tif 000021
【０３５７】
(参考文献)
Arteaga CL, Sliwkowski MX, Osborne CK, Perez EA, Puglisi F, Gianni L. 2011. Treatment of HER2-positive breast cancer: current status and future perspectives. Nat Rev Clin Oncol. 2011 Nov 29;9(1):16-32.
Balko JM, Miller TW, Morrison MM, Hutchinson K, Young C, Rinehart C, Sanchez V, Jee D, Polyak K, Prat A, Perou CM, Arteaga CL, Cook RS. 2012. The receptor tyrosine kinase ErbB3 maintains the balance between luminal and basal breast epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. Jan 3;109(1):221-6.
Baselga J, Cortes J, Kim SB, Im SA, Hegg R, Im YH, Roman L, Pedrini JL, Pienkowski T, Knott A, Clark E, Benyunes MC, Ross G, Swain SM. 2012. Pertuzumab plus trastuzumab plus docetaxel for metastatic breast cancer. N Engl J Med.  Jan 12;366(2):109-19.
de Kruif et al. Mol. Biol. (1995), 248, 97-105
Ewer MS, Ewer SM. Cardiotoxicity of anticancer treatments: What the cardiologist needs to know. Nat Rev Cardiol 2010;7:564-75
Guarneri Jain KK, Casper ES, Geller NL, et al. A prospective randomized comparison of epirubicin and doxorubicin in patients with advanced breast cancer; J Clin Oncol 1985;3:818-26
Junttila TT, Akita RW, Parsons K, Fields C, Lewis Phillips GD, Friedman LS, Sampath D, Sliwkowski MX. 2009. Ligand-independent HER2/HER3/PI3K complex is disrupted by trastuzumab and is effectively inhibited by the PI3K inhibitor GDC-0941. Cancer Cell. May 5;15(5):429-40.
Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489
Merchant et al. Nature Biotechnology, Vol. 16 July 1998 pp 677-681
Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, Flynn G, Midgley C, Lane D, Winter G. 1994. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. EMBO J. 1994 Feb 1;13(3):692-8.
Ocana A, Vera-Badillo F, Seruga B, Templeton A, Pandiella A, Amir E. 2013. HER3 overexpression and survival in solid tumors: a meta-analysis. J Natl Cancer Inst. Feb 20;105(4):266-73.
Sergina NV, Rausch M, Wang D, Blair J, Hann B, Shokat KM, Moasser MM. 2007. Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER3. Nature. Jan 25;445(7126):437-41.
Schaefer et al. Cancer Cell 20, 472-486, October 2011
Schoeberl B, Faber AC, Li D, Liang MC, Crosby K, Onsum M, Burenkova O, Pace E, Walton Z, Nie L, Fulgham A, Song Y, Nielsen UB, Engelman JA, Wong KK. 2010. An ErbB3 antibody, MM-121, is active in cancers with ligand-dependent activation. Cancer Res. Mar 15;70(6):2485-94.
Shames et al. PLOS ONE, February 2013, Vol.8, Issue 2, pp 1-10
Tanner M, Kapanen AI, Junttila T, Raheem O, Grenman S, Elo J, Elenius K, Isola J. 2004. Characterization of a novel cell line established from a patient with Herceptin-resistant breast cancer. Mol Cancer Ther. 2004 Dec;3(12):1585-92.
Yarden Y, Pines G.2012.  The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.  Nat Rev CancerJul 12;12(8):553-63.
Thery J.-C. et al., Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies, Eur J Cancer (2014), Vol. 50, Issue 5, pages 892-901
Wadhwa D, Fallah-Rad N, Grenier D, et al. Trastuzumab mediated cardiotoxicity in the setting of the adjuvant chemotherapy for breast cancer: A retrospective study. Breast Cancer Res Treat 2009;117:357-64.
Wehrman TS, Raab WJ, Casipit CL, Doyonnas R, Pomerantz JH, Blau HM. 2006. A system for quantifying dynamic protein interactions defines a role for Herceptin in modulating ErbB2 interactions. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 12;103(50):19063-8.
Wilson TR, Fridlyand J, Yan Y, Penuel E, Burton L, Chan E, Peng J, Lin E, Wang Y, Sosman J, Ribas A, Li J, Moffat J, Sutherlin DP, Koeppen H, Merchant M, Neve R, Settleman J.  2012. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. Jul 26;487(7408):505-9.
Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.3, Issue 99 (2011); pp1-11
Zhang H, Berezov A, Wang Q, Zhang G, Drebin J, Murali R, Greene MI. 2007. ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies. J Clin Invest. Aug;117(8):2051-8.
Greco, Bravo, Parsons (1995) The search for synergy: a critical review from a response surface perspective. Pharmacol. Rev 47 (2): 331-85
【図１】
2020515594.tif 000022
【図２】
2020515594.tif 000023
【図３】
2020515594.tif 000024
【図４】
2020515594.tif 000025
【図５】
2020515594.tif 000026
【図６】
2020515594.tif 000027
【図７−１】
2020515594.tif 000028
【図７−２】
2020515594.tif 000029
【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８】
2020515594.tif 000034
【図９】
2020515594.tif 000035
【図１０Ａ】
2020515594.tif 000036
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2020515594.tif 000039
【図１０Ｅ】
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【図１１−１】
2020515594.tif 000041
【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
2020515594.tif 000044
【図１４】
2020515594.tif 000045
【図１５−１】
2020515594.tif 000046
【図１５−２】
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【図１６Ａ−１】
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【図１６Ａ−２】
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【図１６Ａ−３】
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【図１６Ａ−４】
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【図１６Ａ−５】
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【図１６Ａ−６】
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【図１６Ａ−７】
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【図１６Ａ−８】
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【図１６Ａ−９】
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【図１６Ａ−１０】
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【図１６Ａ−１１】
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【図１６Ｂ−１】
2020515594.tif 000059
【図１６Ｂ−２】
2020515594.tif 000060
【図１６Ｂ−３】
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【図１６Ｂ−４】
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【図１６Ｂ−５】
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【図１６ＣＤ】
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【図１６Ｅ−１】
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【図１６Ｅ−２】
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【図１６Ｅ−３】
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【図１６Ｅ−４】
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【図１６Ｅ−５】
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【図１６Ｅ−６】
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【図１６Ｅ−７】
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【図１６Ｅ−８】
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【図１６Ｅ−９】
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【図１７】
2020515594.tif 000074
【図１８】
2020515594.tif 000075
【図１９】
2020515594.tif 000076
【図２０−１】
2020515594.tif 000077
【図２０−２】
2020515594.tif 000078
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ（ａ）】
2020515594.tif 000080
【図２１Ｂ（ｂ）】
2020515594.tif 000081
【図２１Ｂ（ｃ）】
2020515594.tif 000082
【図２１Ｂ（ｄ）】
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【図２１Ｃ（ａ）】
2020515594.tif 000084
【図２１Ｃ（ｂ）】
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【図２１Ｃ（ｃ）】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2020515594.tif 000090
【図２６】
2020515594.tif 000091
【図２７】
2020515594.tif 000092
【図２８−１】
2020515594.tif 000093
【図２８−２】
2020515594.tif 000094
【図２９】
2020515594.tif 000095
【図３０Ａ−１】
2020515594.tif 000096
【図３０Ａ−２】
2020515594.tif 000097
【図３０Ａ−３】
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【図３０Ｂ−１】
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【図３０Ｂ−２】
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【図３０Ｂ−３】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
2020515594.tif 000109
【図３７−１】
2020515594.tif 000110
【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３７−５】
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【図３７−６】
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【図３７−７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０Ａ−１】
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【図４０Ａ−２】
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【図４０Ａ−３】
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【図４０Ａ−４】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
2020515594.tif 000143
【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【配列表】
2020515594000001.app
【国際調査報告】
2020515594.tif 000148
2020515594.tif 000149
2020515594.tif 000150
2020515594.tif 000151
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