(57)【要約】本明細書において開示されるのは、被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法であって、ＰＤ−１／ＣＤ２７９阻害剤、ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２７４阻害剤、またはそれらの組合せを被験者に投与することを含む方法である。また本明細書において開示されているのは、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者のペムブロリズマブ処置に対する応答を決定する方法であって、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出することを含む方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法であって、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、前記被験者が少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在によって特徴づけられる方法。
【請求項２】
ペムブロリズマブ処置に対するナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者の応答を決定する方法であって、
−  前記被験者から試料を得るステップ；
−  少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するステップ
を含み、
少なくとも１つのＪＡＫ活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在は、前記被験者がペムブロリズマブ処置に応答することを示す、
方法。
【請求項３】
前記被験者にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を妨げる化合物を投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンシオ）、デュルバルマブ（イムフィンジ）、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＰＤＲ００１、セミプリマブ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＪＡＫ３活性化突然変異が、Ｍ５１１Ｉ、Ａ５７２Ｖ、Ａ５７３Ｖ、Ｒ６５７Ｑ、Ｖ７２２Ｉ、Ｖ６７４Ａ、Ｌ８５７Ｐ、Ｒ４０３Ｈ、Ｑ５０１Ｈ、Ｅ９５８Ｋ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＪＡＫ３活性化突然変異がＡ５７２Ｖである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＤ−Ｌ１構造的再配列がＰＤ−Ｌ１遺伝子における突然変異である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異が、挿入、欠失、置換、転座、逆位、微小逆位、重複、縦列反復、切断点（複数可）（突然変異）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子の前記突然変異が前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子の３’ＵＴＲを破壊する、請求項７〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法であって、ＰＤ−１阻害剤、ＣＤ２７９阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＤ２７４阻害剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される阻害剤を被験者に投与することを含む方法。
【請求項１１】
ペムブロリズマブの投与をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫が節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫が再発および／または難治性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含む、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットであって、前記プライマーがＪＡＫ３およびＰＤ−Ｌ１遺伝子のゲノム領域を濃縮する、キット。
【請求項１５】
前記少なくとも一対のプライマーが、配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号５および６、配列番号７および８、配列番号９および１０、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号３９および４０、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号４５および４６ならびに配列番号４７および４８からなる群より選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
次世代シークエンシングのために、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキット。
【請求項１７】
請求項２〜１３のいずれか一項の方法による使用のための、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１０月６日に出願されたＳＧ仮出願第１０２０１７０８２６２Ｒ号の優先権の利益を主張し、その内容は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、がんの検出および処置のためのバイオマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）は、アジア、メキシコおよび南米の集団に好発するまれであり、侵攻性の悪性腫瘍である。日本を除き、それは、アジアでは最も一般的な成熟Ｔ細胞リンパ腫である。腫瘍細胞は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に常に感染し、細胞傷害性表現型によって特徴づけられる。
【０００４】
免疫チェックポイント阻害剤は、一部の血液悪性腫瘍を含む多くのがんの処置の状況を変化させている。非小細胞肺がん、黒色腫および膀胱がんを含むいくつかの固形腫瘍に関する研究では、免疫組織化学（ＩＨＣ）ＰＤ−Ｌ１陽性はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断に対する応答のより高い可能性と一致すると一般的に結論づけられている。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍患者では、より低いが明確な応答速度も認められた。これらの観察は、ＰＤ−１遮断療法の絶対的選択基準として、患者１人当たりの単一の腫瘍標本に基づいてＰＤ−Ｌ１免疫組織化学を採用することの多くの落とし穴を強調している。
【０００５】
節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞鼻型リンパ腫（ＥＮＫＬ）は、アジア、メキシコおよび南米の集団に好発するまれであり、侵攻性の悪性腫瘍である。現在までのところ、ＥＮＫＬの処置に利用可能な標的療法はない。ＥＮＫＬを伴うアントラサイクリンをベースにしたレジメンは不良な結果と関連するため、Ｌ−アスパラギナーゼをベースにしたレジメンは、ＳＭＩＬＥ（デキサメタゾン、メトトレキサート、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、エトポシド）レジメンと同様に、特に播種性疾患患者の臨床転帰を有意に改善している。しかしながら、ＳＭＩＬＥまたはＳＭＩＬＥ様レジメンは依然として症例の最大４０〜５０％で失敗し、ＳＭＩＬＥに関連する毒性はまたより高齢の患者での使用を妨げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに、疾患がまれであるので、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）を管理するためのＦＤＡが承認した標的レジメンはまだ存在せず、療法に対する応答のバイオマーカーを同定することを困難にした。このように、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を同定する方法およびそれを処置する方法に対する満たされていないニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様において、本発明は、被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法に言及し、当該方法は、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者は、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在によって特徴づけられる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ペムブロリズマブ処置に対するナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者の応答を決定する方法に言及し、この方法は、被験者から試料を得るステップ；少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するステップを含み、少なくとも１つのＪＡＫ活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在は、被験者がペムブロリズマブ処置に応答することを示す。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットに言及し、このキットは、検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含み；プライマーは、ＪＡＫ３およびＰＤ−Ｌ１遺伝子のゲノム領域を濃縮する。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、次世代シークエンシングのための少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットに言及する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法に従って使用するための、本明細書中に開示されるキットに言及する。
【００１２】
本発明は、非限定的な例および添付図面と併せて検討すると、詳細な記載を参照して、より良好に理解されるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ペムブロリズマブで後に処置された患者由来の１１例の前処理したナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫腫瘍のゲノムプロファイルを示す。図１Ａは、１１対のＮＫＴＬ−正常全ゲノムシークエンシングデータにおいて見出された反復性および相互排他的な非サイレントゲノム変化の階段プロットを示す。階段プロットの上部は、非サイレント変異の数を示す。図１Ｂは、本試験で検証されたＰＤ−Ｌ１構造的再配列の模式図を示す。図１Ｃは、ペンボリズマブでの処置前後にペンボリズマブから完全な応答を達成したＮＫＴＬ１患者のポジトロン放出断層撮影−コンピューター断層撮影前面および側面走査を示す。
【図２（１）】図２は、ペムブロリズマブを投与した節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者１１例の、複数の系列の処置が無効となった後の処置のスケジュールを示す。
【図２（２）】図２は、ペムブロリズマブを投与した節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者１１例の、複数の系列の処置が無効となった後の処置のスケジュールを示す。
【図２（３）】図２は、ペムブロリズマブを投与した節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者１１例の、複数の系列の処置が無効となった後の処置のスケジュールを示す。
【図３】図３は、ペムブロリズマブで処置した患者の初期腫瘍１１例における再発体細胞突然変異遺伝子を示す。上位から下位の遺伝子への順序付けの優先順位は、ペムブロリズマブ療法から完全な応答を達成した患者のコホート内の遺伝子の再発および相互排他性による。ｗＡｎｎｏｖａｒの１ｋゲノムおよびＥｘＡＣデータベースからの１％のＭＡＦを、カットオフとして使用する。
【図４（１）】図４は、ペムブロリズマブに対して完全に応答したナチュラルキラー／ｔ細胞リンパ腫患者において同定されたＰＤ−Ｌ１再配列およびＪＡＫ３活性化変異の検証を示している。サンガーシークエンシングを用いて、全ゲノムシークエンシングにより同定された各ＰＤ−Ｌ１構造的再配列の切断点とＪＡＫ３変異を確認した。野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１の遺伝子構造を、参照として上段に示す。予測される再配列されたＰＤ−Ｌ１の各々に関係する切断点を、以下に示す。白色の矢印は、イントロンと転写の方位を表す。すべての腫瘍は、ペムブロリズマブが投与される前の生検である。ＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１は、再配列したＰＤ−Ｌ１を有していた。ＮＫＴＬ２９およびＮＫＴＬ３０は、ＪＡＫ３  ｐ．Ａ５７３Ｖに翻訳されるＧ＞Ａ突然変異を有することが確認された。
【図４（２）】図４は、ペムブロリズマブに対して完全に応答したナチュラルキラー／ｔ細胞リンパ腫患者において同定されたＰＤ−Ｌ１再配列およびＪＡＫ３活性化変異の検証を示している。サンガーシークエンシングを用いて、全ゲノムシークエンシングにより同定された各ＰＤ−Ｌ１構造的再配列の切断点とＪＡＫ３変異を確認した。野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１の遺伝子構造を、参照として上段に示す。予測される再配列されたＰＤ−Ｌ１の各々に関係する切断点を、以下に示す。白色の矢印は、イントロンと転写の方位を表す。すべての腫瘍は、ペムブロリズマブが投与される前の生検である。ＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１は、再配列したＰＤ−Ｌ１を有していた。ＮＫＴＬ２９およびＮＫＴＬ３０は、ＪＡＫ３  ｐ．Ａ５７３Ｖに翻訳されるＧ＞Ａ突然変異を有することが確認された。
【図５】図５は、全ゲノムシークエンシングデータから推測されるＮＫＴＬ２６中のＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲを破壊する縦列重複の模式図を示す。９ｐ２４．１内の野生型領域は、３つのブロック（Ｑ、Ｒ、Ｓ）に分けられており、それぞれが異なる色で示されている。Ｑ−Ｒ間およびＲ−Ｓ間の境界は、縦列重複の切断点を示す。再配列はヘテロ接合であり、概略図には、整合する正常な標本中の野生型対立遺伝子と、腫瘍中の野生型および変異型対立遺伝子との両方が示されている。腫瘍内のＰＤ−Ｌ１の全コピー数は、３である。突然変異体対立遺伝子は、３’ＵＴＲが破壊されたＰＤ−Ｌ１をもつ。野生型対立遺伝子はＱ＋Ｒ＋Ｓを含み、突然変異体対立遺伝子はＱ＋Ｒ１＋Ｒ＋Ｓを含む。突然変異体対立遺伝子のＲ１＋Ｒ＋Ｓのゲノム領域が転写されると、３’ＵＴＲ破壊ＰＤ−Ｌ１および野生型ＰＤ−Ｌ１がそれぞれＲ１およびＲから転写される。２本の点線は、野生型ゲノムスケールでの縦列重複の境界を示す。
【図６（１）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（２）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（３）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（４）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（５）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（６）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（７）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（８）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（９）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図６（１０）】図６は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ由来のクローン性クラスタープロットを示す。ＳｃｉＣｌｏｎｅは、コピー−２数のゲノム領域から喚起され、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴わない一塩基変異体のみを分析することが推奨された。従って、ＣＡＮＶＡＳを用いて、コピー数とＬＯＨ情報を得た。ヘテロ接合性突然変異のみを分析したので、１００％のがん細胞分画の腫瘍に対する創始クローンは、ＳｃｉＣｌｏｎｅからのクラスタープロットの５０％マーク付近に存在するクラスターを、せいぜい生ずるであろう。
【図７（１）】図７は、３２対の腫瘍−正常節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫サンプルからの全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）データによって明らかにされる頻繁な体細胞ＰＤ−Ｌ１構造的再配列（ＳＲ）を例示する。図７Ａは、３２の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫未処理サンプルの拡張コホートにおける再発突然変異した遺伝子の階段プロットを示す。各遺伝子に影響を及ぼす変異の種類は、階段プロットの底部に付加される。図７Ｂは、新鮮凍結ＷＧＳサンプル中に検出された体細胞ＳＲの３軌跡サーコス表示を示す。最も外側の軌跡は、ｈｓ３７参照ゲノム由来の主なヒト染色体を表している。中央の軌道は、最小０個（内側の軌道）から最大８個（外側の軌道）まで、対応するゲノム領域にＳＲ切断点をもつ独特なサンプルの数を表すヒストグラムである。内側の軌道には黒色アークがあり、それぞれがＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲを破壊したＳＲである。図７Ｃは、３２の未処理試料のコホートにおいて検証されたＰＤ−Ｌ１構造的再配列の模式図を示す。
【図７（２）】図７は、３２対の腫瘍−正常節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫サンプルからの全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）データによって明らかにされる頻繁な体細胞ＰＤ−Ｌ１構造的再配列（ＳＲ）を例示する。図７Ａは、３２の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫未処理サンプルの拡張コホートにおける再発突然変異した遺伝子の階段プロットを示す。各遺伝子に影響を及ぼす変異の種類は、階段プロットの底部に付加される。図７Ｂは、新鮮凍結ＷＧＳサンプル中に検出された体細胞ＳＲの３軌跡サーコス表示を示す。最も外側の軌跡は、ｈｓ３７参照ゲノム由来の主なヒト染色体を表している。中央の軌道は、最小０個（内側の軌道）から最大８個（外側の軌道）まで、対応するゲノム領域にＳＲ切断点をもつ独特なサンプルの数を表すヒストグラムである。内側の軌道には黒色アークがあり、それぞれがＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲを破壊したＳＲである。図７Ｃは、３２の未処理試料のコホートにおいて検証されたＰＤ−Ｌ１構造的再配列の模式図を示す。
【図７（３）】図７は、３２対の腫瘍−正常節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫サンプルからの全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）データによって明らかにされる頻繁な体細胞ＰＤ−Ｌ１構造的再配列（ＳＲ）を例示する。図７Ａは、３２の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫未処理サンプルの拡張コホートにおける再発突然変異した遺伝子の階段プロットを示す。各遺伝子に影響を及ぼす変異の種類は、階段プロットの底部に付加される。図７Ｂは、新鮮凍結ＷＧＳサンプル中に検出された体細胞ＳＲの３軌跡サーコス表示を示す。最も外側の軌跡は、ｈｓ３７参照ゲノム由来の主なヒト染色体を表している。中央の軌道は、最小０個（内側の軌道）から最大８個（外側の軌道）まで、対応するゲノム領域にＳＲ切断点をもつ独特なサンプルの数を表すヒストグラムである。内側の軌道には黒色アークがあり、それぞれがＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲを破壊したＳＲである。図７Ｃは、３２の未処理試料のコホートにおいて検証されたＰＤ−Ｌ１構造的再配列の模式図を示す。
【図７（４）】図７は、３２対の腫瘍−正常節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫サンプルからの全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）データによって明らかにされる頻繁な体細胞ＰＤ−Ｌ１構造的再配列（ＳＲ）を例示する。図７Ａは、３２の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫未処理サンプルの拡張コホートにおける再発突然変異した遺伝子の階段プロットを示す。各遺伝子に影響を及ぼす変異の種類は、階段プロットの底部に付加される。図７Ｂは、新鮮凍結ＷＧＳサンプル中に検出された体細胞ＳＲの３軌跡サーコス表示を示す。最も外側の軌跡は、ｈｓ３７参照ゲノム由来の主なヒト染色体を表している。中央の軌道は、最小０個（内側の軌道）から最大８個（外側の軌道）まで、対応するゲノム領域にＳＲ切断点をもつ独特なサンプルの数を表すヒストグラムである。内側の軌道には黒色アークがあり、それぞれがＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲを破壊したＳＲである。図７Ｃは、３２の未処理試料のコホートにおいて検証されたＰＤ−Ｌ１構造的再配列の模式図を示す。
【図８（１）】図８は、３２の未処理ＮＫＴＬサンプルのコホート内で同定されたＰＤ−Ｌ１再配列のサンガー検証を示す。サンガーシークエンシングを用いて、全ゲノムシークエンシングにより同定された各ＰＤ−Ｌ１構造的再配列の切断点（破線における）を確認した。野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１の遺伝子構造を、参照として上段に示す。サンガーシークエンシングＳＲのクロマトグラムは、再配列されたＰＤ−Ｌ１の模式図に付随している。白色矢印は、イントロンと転写の方位を示す。すべての腫瘍は、ペムブロリズマブが投与される前の生検である。ＮＫＴＬ６には、３’ＵＴＲ欠失と上流の７３ｂｐの逆位イントロン配列（複合体＊）の挿入を組み合わせた再配列が存在する。ＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１は、ペムブロリズマブ処置コホート由来のサンプルである。ＮＫＴＬ４、ＮＫＴＬ６、ＮＫＴＬ１１、ＮＫＴＬ１５、ＮＫＴＬ１６およびＮＫＴＬ１７は、普及未処置コホートのサンプルである。いずれの腫瘍も、何らかの処置が実施される前の初回生検である。
【図８（２）】図８は、３２の未処理ＮＫＴＬサンプルのコホート内で同定されたＰＤ−Ｌ１再配列のサンガー検証を示す。サンガーシークエンシングを用いて、全ゲノムシークエンシングにより同定された各ＰＤ−Ｌ１構造的再配列の切断点（破線における）を確認した。野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１の遺伝子構造を、参照として上段に示す。サンガーシークエンシングＳＲのクロマトグラムは、再配列されたＰＤ−Ｌ１の模式図に付随している。白色矢印は、イントロンと転写の方位を示す。すべての腫瘍は、ペムブロリズマブが投与される前の生検である。ＮＫＴＬ６には、３’ＵＴＲ欠失と上流の７３ｂｐの逆位イントロン配列（複合体＊）の挿入を組み合わせた再配列が存在する。ＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１は、ペムブロリズマブ処置コホート由来のサンプルである。ＮＫＴＬ４、ＮＫＴＬ６、ＮＫＴＬ１１、ＮＫＴＬ１５、ＮＫＴＬ１６およびＮＫＴＬ１７は、普及未処置コホートのサンプルである。いずれの腫瘍も、何らかの処置が実施される前の初回生検である。
【図８（３）】図８は、３２の未処理ＮＫＴＬサンプルのコホート内で同定されたＰＤ−Ｌ１再配列のサンガー検証を示す。サンガーシークエンシングを用いて、全ゲノムシークエンシングにより同定された各ＰＤ−Ｌ１構造的再配列の切断点（破線における）を確認した。野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１の遺伝子構造を、参照として上段に示す。サンガーシークエンシングＳＲのクロマトグラムは、再配列されたＰＤ−Ｌ１の模式図に付随している。白色矢印は、イントロンと転写の方位を示す。すべての腫瘍は、ペムブロリズマブが投与される前の生検である。ＮＫＴＬ６には、３’ＵＴＲ欠失と上流の７３ｂｐの逆位イントロン配列（複合体＊）の挿入を組み合わせた再配列が存在する。ＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１は、ペムブロリズマブ処置コホート由来のサンプルである。ＮＫＴＬ４、ＮＫＴＬ６、ＮＫＴＬ１１、ＮＫＴＬ１５、ＮＫＴＬ１６およびＮＫＴＬ１７は、普及未処置コホートのサンプルである。いずれの腫瘍も、何らかの処置が実施される前の初回生検である。
【図８（４）】図８は、３２の未処理ＮＫＴＬサンプルのコホート内で同定されたＰＤ−Ｌ１再配列のサンガー検証を示す。サンガーシークエンシングを用いて、全ゲノムシークエンシングにより同定された各ＰＤ−Ｌ１構造的再配列の切断点（破線における）を確認した。野生型（ＷＴ）ＰＤ−Ｌ１の遺伝子構造を、参照として上段に示す。サンガーシークエンシングＳＲのクロマトグラムは、再配列されたＰＤ−Ｌ１の模式図に付随している。白色矢印は、イントロンと転写の方位を示す。すべての腫瘍は、ペムブロリズマブが投与される前の生検である。ＮＫＴＬ６には、３’ＵＴＲ欠失と上流の７３ｂｐの逆位イントロン配列（複合体＊）の挿入を組み合わせた再配列が存在する。ＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１は、ペムブロリズマブ処置コホート由来のサンプルである。ＮＫＴＬ４、ＮＫＴＬ６、ＮＫＴＬ１１、ＮＫＴＬ１５、ＮＫＴＬ１６およびＮＫＴＬ１７は、普及未処置コホートのサンプルである。いずれの腫瘍も、何らかの処置が実施される前の初回生検である。
【図９（１）】図９は、ＰＤ−Ｌ１の異常な融合転写物を例示する。パネル「ＮＫＴＬ１６」は、サンプルＮＫＴＬ１６における第６染色体へのＰＤ−Ｌ１転座のゲノムおよびトランスクリプトーム構造を示す。パネル「ＮＫＴＬ６」は、３’ＵＴＲ欠失が上流の７３ｂｐ逆位イントロン配列の挿入を伴ったサンプルＮＫＴＬ６における複雑な染色体内再配列を示す。パネル「ＮＫＴＬ１５」は、サンプルＮＫＴＬ１５における縦列重複を示す。パネル「ＮＫＴＬ４」は、サンプルＮＫＴＬ４における染色体内欠失を示す。パネル「ＮＫＴＬ１７」は、サンプルＮＫＴＬ１７における染色体内欠失も示す。破線と矢印は、それぞれ切断点と融合方向を示す。Ｑ、Ｒ、Ｓブロックは、転写産物ブロックを表す。三角形は転写の方向を表し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルは黒矢印で示す。異常および野生型ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ転写物レベルは、全トランスクリプトームシークエンシングデータから得られ、それぞれ、暗灰色および明灰色で示される。随伴するコピー数（ＣＮ）の変化も、縦列重複事象について示されている。キメラｃＤＮＡ上のサンガーシークエンシングで切断点検証を行い、症例ごとにクロマトグラムを表示した。
【図９（２）】図９は、ＰＤ−Ｌ１の異常な融合転写物を例示する。パネル「ＮＫＴＬ１６」は、サンプルＮＫＴＬ１６における第６染色体へのＰＤ−Ｌ１転座のゲノムおよびトランスクリプトーム構造を示す。パネル「ＮＫＴＬ６」は、３’ＵＴＲ欠失が上流の７３ｂｐ逆位イントロン配列の挿入を伴ったサンプルＮＫＴＬ６における複雑な染色体内再配列を示す。パネル「ＮＫＴＬ１５」は、サンプルＮＫＴＬ１５における縦列重複を示す。パネル「ＮＫＴＬ４」は、サンプルＮＫＴＬ４における染色体内欠失を示す。パネル「ＮＫＴＬ１７」は、サンプルＮＫＴＬ１７における染色体内欠失も示す。破線と矢印は、それぞれ切断点と融合方向を示す。Ｑ、Ｒ、Ｓブロックは、転写産物ブロックを表す。三角形は転写の方向を表し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルは黒矢印で示す。異常および野生型ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ転写物レベルは、全トランスクリプトームシークエンシングデータから得られ、それぞれ、暗灰色および明灰色で示される。随伴するコピー数（ＣＮ）の変化も、縦列重複事象について示されている。キメラｃＤＮＡ上のサンガーシークエンシングで切断点検証を行い、症例ごとにクロマトグラムを表示した。
【図９（３）】図９は、ＰＤ−Ｌ１の異常な融合転写物を例示する。パネル「ＮＫＴＬ１６」は、サンプルＮＫＴＬ１６における第６染色体へのＰＤ−Ｌ１転座のゲノムおよびトランスクリプトーム構造を示す。パネル「ＮＫＴＬ６」は、３’ＵＴＲ欠失が上流の７３ｂｐ逆位イントロン配列の挿入を伴ったサンプルＮＫＴＬ６における複雑な染色体内再配列を示す。パネル「ＮＫＴＬ１５」は、サンプルＮＫＴＬ１５における縦列重複を示す。パネル「ＮＫＴＬ４」は、サンプルＮＫＴＬ４における染色体内欠失を示す。パネル「ＮＫＴＬ１７」は、サンプルＮＫＴＬ１７における染色体内欠失も示す。破線と矢印は、それぞれ切断点と融合方向を示す。Ｑ、Ｒ、Ｓブロックは、転写産物ブロックを表す。三角形は転写の方向を表し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルは黒矢印で示す。異常および野生型ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ転写物レベルは、全トランスクリプトームシークエンシングデータから得られ、それぞれ、暗灰色および明灰色で示される。随伴するコピー数（ＣＮ）の変化も、縦列重複事象について示されている。キメラｃＤＮＡ上のサンガーシークエンシングで切断点検証を行い、症例ごとにクロマトグラムを表示した。
【図９（４）】図９は、ＰＤ−Ｌ１の異常な融合転写物を例示する。パネル「ＮＫＴＬ１６」は、サンプルＮＫＴＬ１６における第６染色体へのＰＤ−Ｌ１転座のゲノムおよびトランスクリプトーム構造を示す。パネル「ＮＫＴＬ６」は、３’ＵＴＲ欠失が上流の７３ｂｐ逆位イントロン配列の挿入を伴ったサンプルＮＫＴＬ６における複雑な染色体内再配列を示す。パネル「ＮＫＴＬ１５」は、サンプルＮＫＴＬ１５における縦列重複を示す。パネル「ＮＫＴＬ４」は、サンプルＮＫＴＬ４における染色体内欠失を示す。パネル「ＮＫＴＬ１７」は、サンプルＮＫＴＬ１７における染色体内欠失も示す。破線と矢印は、それぞれ切断点と融合方向を示す。Ｑ、Ｒ、Ｓブロックは、転写産物ブロックを表す。三角形は転写の方向を表し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルは黒矢印で示す。異常および野生型ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ転写物レベルは、全トランスクリプトームシークエンシングデータから得られ、それぞれ、暗灰色および明灰色で示される。随伴するコピー数（ＣＮ）の変化も、縦列重複事象について示されている。キメラｃＤＮＡ上のサンガーシークエンシングで切断点検証を行い、症例ごとにクロマトグラムを表示した。
【図９（５）】図９は、ＰＤ−Ｌ１の異常な融合転写物を例示する。パネル「ＮＫＴＬ１６」は、サンプルＮＫＴＬ１６における第６染色体へのＰＤ−Ｌ１転座のゲノムおよびトランスクリプトーム構造を示す。パネル「ＮＫＴＬ６」は、３’ＵＴＲ欠失が上流の７３ｂｐ逆位イントロン配列の挿入を伴ったサンプルＮＫＴＬ６における複雑な染色体内再配列を示す。パネル「ＮＫＴＬ１５」は、サンプルＮＫＴＬ１５における縦列重複を示す。パネル「ＮＫＴＬ４」は、サンプルＮＫＴＬ４における染色体内欠失を示す。パネル「ＮＫＴＬ１７」は、サンプルＮＫＴＬ１７における染色体内欠失も示す。破線と矢印は、それぞれ切断点と融合方向を示す。Ｑ、Ｒ、Ｓブロックは、転写産物ブロックを表す。三角形は転写の方向を表し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルは黒矢印で示す。異常および野生型ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ転写物レベルは、全トランスクリプトームシークエンシングデータから得られ、それぞれ、暗灰色および明灰色で示される。随伴するコピー数（ＣＮ）の変化も、縦列重複事象について示されている。キメラｃＤＮＡ上のサンガーシークエンシングで切断点検証を行い、症例ごとにクロマトグラムを表示した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
近年、免疫チェックポイント（ＩＣＰ）阻害剤は、多くの悪性腫瘍の処置において有望な客観的奏効率（ＯＲＲ）を示している。注目すべきことに、ある結果は、再発または難治性（ＲＲ）ホジキンリンパ腫（ＨＬ）におけるプログラム化デス−１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）阻害剤の使用からの８０％の客観的奏効率を示している。現在、非小細胞肺がん、黒色腫および膀胱がんを対象とした臨床試験では、一般的に、プログラムされたデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の免疫組織化学（ＩＨＣ）陽性はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断に対する応答の可能性がより高いことと一致すると結論づけられている。興味深いことに、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍を有する患者では、より低いが明確な奏効率も認められた。これらの観察は、腫瘍からより多くの情報を利用することができ、ＰＤ−１遮断療法のために患者を選択する現在の事実上の基準を増大させることができることを示唆する。
【００１５】
本発明者らは、プログラムされた細胞死１（ＰＤ−１）遮断療法により完全な応答（ＣＲ）を達成した再発または難治性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＲＲ  ＮＫＴＬ）患者における再発性遺伝子変化を同定した。
【００１６】
シークエンシング技術の進歩に伴い、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、後成的修飾因子、ＤＤＸ３Ｘ遺伝子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子における生殖細胞系の遺伝的素因を変化させる再発性体細胞突然変異がナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）患者で見出されているが、これらの研究のどれも全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）技術を用いていない。ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫ゲノムを、標的化可能なゲノム変化のための高シークエンシング処理能力およびゲノムワイド様式で探索するために、全ゲノムシークエンシングデータを用いて、ペムブロリズマブ処置に対するその後の臨床的応答データを有する１１の前処理したナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫腫瘍の体細胞変化を研究した。
【００１７】
対になったナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）腫瘍正常サンプルの全ゲノムシークエンシングにより、腫瘍の３６％（１１例中４例）で高度に再発するプログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２７４）遺伝子内に体細胞切断点クラスターが存在することが示された。これらの構造的再配列（ＳＲ）は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を破壊することが確認され、ＰＤ−Ｌ１キメラ転写物の異常発現をもたらす。
【００１８】
１つの例では、再発または難治性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）を有する１１人の個体を、ペムブロリズマブで処置したところ、ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列が応答例４人全員に認められたが、非応答例４人には認められなかった。理論に拘束されることなく、ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列はＰＤ−１遮断に対する応答およびＭ２−マクロファージシグネチャーの低下と関連し、それによりＰＤ−Ｌ１再配列ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に対するＰＤ−１遮断療法の使用が可能となり、ひいてはこれらの患者に対する処置成績が改善すると考えられた。
【００１９】
本明細書において開示されるのは、被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法であり、この方法は、治療有効量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者の分子ゲノムプロファイルは、少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在によって特徴づけられる。一実施例において、被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法が開示されており、この方法は、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者は、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在によって特徴づけられる。
【００２０】
このように、一実施例において、構造的再配列によってＰＤ−Ｌ１遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が破壊される。別の例では、ＰＤ−Ｌ１構造的再配列は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子の変異である。さらに別の例では、ＰＤ−Ｌ１遺伝子の突然変異は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子の３’ＵＴＲを破壊する。
【００２１】
一実施例において、ＪＡＫ３活性化突然変異は、いずれか１つ以上の以下の突然変異であるが、これらに限定されない：Ｍ５１１Ｉ、Ａ５７２Ｖ、Ａ５７３Ｖ、Ｒ６５７Ｑ、Ｖ７２２Ｉ、Ｖ６７４Ａ、Ｌ８５７Ｐ、Ｒ４０３Ｈ、Ｑ５０１Ｈ、Ｅ９５８Ｋ。別の実施例において、ＪＡＫ３活性化突然変異は、ＪＡＫ３遺伝子（ＪＡＫ３  ＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＩＤ：ＮＭ＿０００２１５）における一塩基置換（ｐ．Ａ５７２Ｖまたはｐ．Ａ５７３Ｖ）である。言い換えれば、一実施例において、ＪＡＫ３活性化変異はＡ５７２Ｖである。用語「ＪＡＫ３活性化突然変異」と「ＪＡＫ３突然変異」は、互換性があると考えられる。
【００２２】
本明細書中で使用される「突然変異」という用語は、生物または遺伝要素のゲノムのヌクレオチド配列の永久的な変化を指す。突然変異は、限定されるものではないが、挿入、欠失、置換、転座、逆位、微小逆位、重複、縦列反復、切断点（複数可）（突然変異）、およびそれらの組合せであり得る。
【００２３】
本明細書中で使用される「構造的再配列」という用語は、関連する核酸配列の全体的構造に変化をもたらす１つ以上の突然変異を指す。「構造的再配列」はゲノム領域にわたり、この突然変異の境界は切断点として知られている。例えば、切断点が遺伝子内に存在する場合、ここに開示する突然変異は、前記遺伝子の構造の変化をもたらす。このような構造的再配列は、関連する遺伝子または核酸配列を包含する染色体構造の変化をも参照することができる。したがって、１つの例において、突然変異は、微小逆位、逆位、転座、縦列反復、もしくは切断点（突然変異）、またはそれらの組合せである。
【００２４】
本明細書中で使用される「逆位」という用語は、特定の配列内の核酸配列の逆位を指し、それによって、その配列が以前にあった方向と比較して逆向きに切り出され、挿入される。言い換えると、関連する核酸配列は、突然変異の結果として端部から端部に逆転される。用語「微小逆位」は、長さが５０〜１０００ｂｐ（塩基対）の核酸配列を意味する。一実施例において、突然変異は、長さ１５０〜２５０ｂｐの微小逆位である。一実施例において、突然変異は、長さが２００〜２１０ｂｐの微小逆位である。別の実施例において、この変異は、約２０６ｂｐの長さの微小逆位である。
【００２５】
本明細書において使用される「再発」または「常習性」という用語は、例えば医学的状態のような過去の状態の再発を指す。長期の再発期間を有することが知られている医学的状態（例えばマラリア）が存在する。本文脈において、「再発」という用語は、以前に医学的状態が存在し（例えば、特定の疾患の存在）、被験者において処置された、またはもはや存在しなかった、現在被験者において再発または再表面化したシナリオを指す。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「難治性」は、いかなる試みられた形態の処置にも応答しない疾患または状態を指す。例えば、がんは、がん処置に応答しない（または抵抗性である）場合、難治性であるといわれる。難治性がんは、抵抗性がんとしても知られている。
【００２７】
したがって、一実施例において、本明細書に記載されるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫は、再発した、および／または難治性のナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である。一実施例において、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫は、再発したナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である。別の実施例において、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫は、難治性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である。
【００２８】
再発した、または難治性のナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）患者におけるペムブロリズマブに対する応答
化学療法レジメンを含むＬ−アスパラギナーゼに再発した、または難治性（ＲＲ）であったシンガポール、中国および香港からのナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者１１例を、平均２線（１〜５線の処置範囲）の処置後に、本試験に組み入れた（表１）。これらのペムブロリズマブで処置した患者１１例の診断時年齢中央値は４２歳（２７〜６６歳の範囲）、ペムブロリズマブで処置してからの追跡期間中央値は１１ヵ月（２〜２５ヵ月の範囲）であった。患者の６４パーセント（６４％；１１例中７例）は完全な応答（ＣＲ）を達成し、一方患者の３６％（１１例中４例）は進行性疾患（ＰＤ）であった。２例（ＮＫＴＬ２６およびＮＫＴＬ３１）はペムブロリズマブから２年超寛解を維持しており、それは、再発した、または難治性のナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＲＲ  ＮＫＴＬ）では稀少な発生と考えられる。最新のペムブロリズマブで処置した症例（ＮＫＴＬ２８）は、少なくとも６か月間、進行中の寛解を達成した。ペンボリズマブ（応答する患者について）の応答の継続期間の中央値は、１４カ月であった。
【００２９】
【表１（１）】
2020536111.tif 000002
【００３０】
【表１（２）】
2020536111.tif 000003
【００３１】
したがって、一実施例において、被験者は、以前にＳＭＩＬＥ（デキサメタゾン、メトトレキサート、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼおよびエトポシド）療法に応答しなかった。別の実施例において、被験者は以前にＳＭＩＬＥに応答していた。すなわち、被験者は、以前にＳＭＩＬＥ療法に応答したが、疾患が再び起こったかまたは再発した。別の実施例において、被験者は、デキサメタゾン、メトトレキサート、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼもしくはエトポシド、またはそれらの組合せのいずれか１つ以上の化合物で以前に処置されていた。
【００３２】
ＰＤ−Ｌ１陽性はナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）患者におけるペムブロリズマブへの応答を層別化できなかった
ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１陽性がペムブロリズマブへの応答を予測できるかどうかを検証するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて、前処置したＮＫＴＬ腫瘍１１例全例におけるＰＤ−Ｌ１の陽性率を測定した。同一の病理医が、一貫性を確保するために、本試験のすべての腫瘍においてＰＤ−Ｌ１陽性を評価した（表２）。腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１陽性率は、完全な応答を達成した患者でも進行性疾患を達成した患者でも大きく異なっていた。完全な応答が得られた患者の前処置した腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１陽性率は６％〜１００％の範囲であり、一方進行性疾患を有する患者の中でのＰＤ−Ｌ１染色強度は３５％〜９０％の範囲であった。したがって、ＰＤ−Ｌ１染色強度は、完全な応答を達成した患者と疾患が進行した患者とを区別できなかった。興味深いことに、ＮＫＴＬ２９は、ＰＤ−Ｌ１について陽性に染色された腫瘍細胞の６％のみを有したが、ペムブロリズマブから完全な応答を達成した。このＰＤ−Ｌ１の低い完全な応答症例とは別に、進行例疾患の４例全例がＰＤ−Ｌ１に対して強く染色され、ＰＤ−Ｌ１に対して陽性に染色された腫瘍細胞は平均６９％（範囲：５０％〜９０％）であった。これは、ＰＤ−１遮断療法からの抗腫瘍活性が、ベースラインのＰＤ−Ｌ１陽性が低い黒色腫および非小細胞肺がん患者においても観察されたことを報告した臨床試験と一致している。対照的に、本明細書に開示される方法は、ＰＤ−Ｌ１陽性が低い一部の患者がＰＤ−１遮断に対して良好な反応を有する可能性があることを示す。要約すると、理論に拘束されることなく、これは、当技術分野で知られていることと合わず、当技術分野で示されるような免疫組織化学染色に基づくように、ＰＤ−１遮断に対する完全な応答を達成した被験者は、達成しなかった被験者よりもそれらの腫瘍において高いＰＤ−Ｌ１陽性と有意に関連するはずである。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
再発／難治性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）ペムブロリズマブ処置患者１１例の全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）および解析
ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）におけるＰＤ−１遮断療法に対する応答のゲノムバイオマーカーを同定するために、全ゲノムシークエンシングを、続いてペムブロリズマブで処置した１１人の患者から得た腫瘍−正常ペアサンプルで行った。ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）腫瘍および全血または頬スワブを、それぞれ平均深さ６６．６ｘおよび３７．５ｘまでシークエンシングした（表３）。体細胞変異体を呼ぶと、各ペアサンプルに対してＭｂ当たり平均１．１５個の一塩基変異体（ＳＮＶ）とｍｉｃｒｏＩｎｄｅｌｓが得られた。サンプル当たり平均３９（範囲：１〜８０）の体細胞非サイレントタンパク質コード変異体が同定され、新鮮凍結ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）サンプルの全体エクソームシークエンシングに関する以前の報告（範囲：４１〜４２）と同等である。合計で１０個の遺伝子が反復的に変異していることがわかった（図３）。その中で、完全な応答を達成した患者の初期腫瘍のうち、ＰＤ−Ｌ１構造的再配列（ＳＲ）とＪＡＫ３活性化変異（ｐ．Ａ５７３Ｖ）のみが再発し、互いに排他的であった。さらに、ＰＤ−Ｌ１構造的再配列は、ペムブロリズマブに完全な応答を達成した患者の初期腫瘍７例中４例（５７％）で同定された最も頻度の高い体細胞変化である（図１Ａ）。これらのＰＤ−Ｌ１構造的再配列は、ＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲを破壊する染色体間転座（ＮＫＴＬ２８およびＮＫＴＬ３１）、縦列重複（ＮＫＴＬ２６）ならびに微小逆位（ＮＫＴＬ１）からなる（図１Ｂ）。ペムブロリズマブで完全な応答が得られた初発患者、ＮＫＴＬ１のペムブロリズマブ療法前後の例示的なポジトロン放出断層撮影−コンピューター断層撮影（ＰＥＴ−ＣＴ）スキャンは、この患者の治療転帰を確認するものである（図１Ｃ）。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
従って、一実施例において、被験者中のナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法が開示されており、この方法は、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者は、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化体細胞突然変異の存在によって特徴づけられる。別の実施例において、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異は、活性化体細胞突然変異である。さらなる実施例において、１つのＪＡＫ３活性化変異が存在する。尚他の実施例において、ＪＡＫ３活性化突然変異は、ｐ．Ａ５７３Ｖである。
【００３７】
従って、一実施例において、本明細書で言及される突然変異は、微小逆位、逆位、転座、縦列反復、または切断点（突然変異）である。別の実施例において、突然変異は、転座、縦列反復（もしくは縦列重複）、または微小逆位である。
【００３８】
ＮＫＴＬ２８とＮＫＴＬ３１では、ＰＤ−Ｌ１のエクソン７が、それぞれ２ｑ２４．２に、ＰＤ−Ｌ１のイントロン６が６ｐ１２．２に転座していた（図４）。ＮＫＴＬ２６では、縦列重複の右側の切断点はＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲ内に位置し、左側の切断点は約３２  ｋｂｐ上流にあることが確認された（図４）。この重複事象により、ＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲ破壊型のコピーおよび野生型コピーが得られた（図５）。ＮＫＴＬ１における最終的なＰＤ−Ｌ１構造的再配列は、ＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲ内に完全に内在する２０６ｂｐの微小逆位からなっていた（図４）。これらの身体的変化は、ペムブロリズマブで疾患が進行した４人の患者由来の初期腫瘍では認められなかった。
【００３９】
本発明者らのゲノムパイプラインによる配列解析の他に、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）の既知の再発性変異遺伝子について、人為的な影響を避けるために目視検査がまた実施された。メラノーマにおける免疫チェックポイント遮断に対する耐性と関連することが知られている抗原提示およびインターフェロンγ経路に関連する遺伝子の突然変異は、解析したコホートでは認められない。
【００４０】
ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）におけるＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲの調節活性
４つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列はすべて、２０６ｂｐにわたりＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲ内に完全に位置する微小逆位を除いて、ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲの全体もしくは一部、またはＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ機能を失うことが予測された。ＰＤ−Ｌ１発現の調節におけるこの微小逆位の機能的意義を決定するために、野生型および変異体（２０６ｂｐの逆位を有する）ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲを、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムにクローン化し、リンパ腫および白血病細胞株、すなわちＮＫ−Ｓ１、Ｋ−５６２およびＪｕｒｋａｔにトランスフェクトした（図１０Ａ）。結果から、野生型ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲは、レポータータンパク質のルシフェラーゼ活性を効果的に抑制することができ、同定された微小逆位は、ＮＫ−Ｓ１、Ｋ−５６２およびＪｕｒｋａｔ細胞株におけるこの抑制を緩和することができることが示される（Ｐ＝０．０１、Ｐ＝０．０１およびＰ＝０．０３、両側ｔ検定；図１０Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ  ＳＲを保有するこれら４つの腫瘍では、中程度から高レベル（範囲：２０％〜１００％）のＰＤ−Ｌ１陽性が観察された（表２）。理論に拘束されることなく、これらの結果は、これらのナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）腫瘍がＰＤ−Ｌ１発現をアップレギュレートすることによって、いかにして免疫監視を回避するかを直接説明するものであると考えられている。
【００４１】
ＰＤ−Ｌ１構造的再配列およびＪＡＫ３活性化突然変異はナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）においてクローン性である
ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列およびＪＡＫ３活性化突然変異からのＰＤ−１遮断に対する応答のメカニズムは未だ解明されていないが、これらの変化のクローン性が、ペムブロリズマブの単剤レジメンから、前処置した腫瘍にＰＤ−Ｌ１およびＪＡＫ３の変化があった患者における完全な応答を支持できるかどうかを検討した。体細胞の一塩基変異体から、１０症例のクローンアーキテクチャの溶液を得ることができた（ＳｃｉＣｌｏｎｅはＮＫＴＬ１のクローン性溶液を持たなかった）。完全な応答例４例、進行性疾患例１例の計５例に、クローン性構造が認められた（表４および図６）。同定された体細胞ＰＤ−Ｌ１およびＪＡＫ３突然変異は、対応する前処置した腫瘍の創設クローン中に存在した。これらの結果を考慮すると、クローン性解析は、ペムブロリズマブ療法の単剤レジメンから完全な応答を達成した患者における応答の程度を支持するものと考えられる。
【００４２】
【表４】
2020536111.tif 000006
【００４３】
【表５】
2020536111.tif 000007
【００４４】
免疫療法、特にＰＤ−１遮断療法は、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を含むいくつかのがんの処置に有望であることが示されている。ＰＤ−１遮断に対して完全な応答を達成した７名のＮＫＴＬ患者のうち４名（５７％）は、それらの腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列のためのクローン性構造を有することが示される。ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列も最近、患者がペムブロリズマブで完全な応答を達成した卵巣がんの１症例で同定され、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫におけるＰＤ−１遮断療法に対する応答の潜在的バイオマーカーとしての役割をさらに支持した。
【００４５】
また本明細書において開示されるのは、ペムブロリズマブ処置に対するナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者の応答を決定する方法であり、この方法は、被験者から試料を得るステップ；少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在もしくは非存在を検出するステップを含む。別の実施例において、少なくとも１つのＪＡＫ活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在は、被験者が処置に応答することを示す。別の実施例において、処置は、本明細書に開示される化合物または処置である。さらに別の実施例において、処置はペムブロリズマブである。
【００４６】
本明細書中で使用されるように、用語「応答」は、処置に対する感受性と同義的に使用することもできる。用語「感受性」は、何か、例えば疾患が他の何か、例えば、前記疾患に対する処置によって影響を受ける可能性が高い傾向を指す。この作用は、特徴または参照されている処置に依存して、陽性または陰性のいずれかであり得る。例えば、被験者が特定の処置に対して感受性である場合、前記被験者の特定の処置に対する感受性は陽性効果である。用語「感受性」は、例えば、反応性または感受性と交換することができる。
【００４７】
従って、一実施例において、本明細書に開示される方法は、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者のペムブロリズマブ処置に対する感受性を決定する方法である。
【００４８】
すべてのナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫は、診断的にＥＢＥＲ＋（エプスタイン−バーウイルスの存在を示す）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質であり、ＬＭＰ１はＰＤ−Ｌ１を恒常的にアップレギュレートすると考えることができる。理論に拘束されることなく、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫は、本来ＰＤ−Ｌ１＋であるため、ＰＤ−１阻害剤に応答すると推測された。実際、以前の臨床試験における再発／難治性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者は、ペムブロリズマブに対して初期の応答を示した。
【００４９】
従って、一実施例において、被験者におけるナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置する方法が開示されている。別の例において、本方法は、ＰＤ−１阻害剤、ＣＤ２７９阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＤ２７４阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される阻害剤を被験者に投与することを含む。さらに別の実施例において、被験者は、ＰＤ−１阻害剤、ＣＤ２７９阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＤ２７４阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される阻害剤を投与されることになっている。
【００５０】
また本明細書に開示されているのは、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を処置するための医薬の製造において本明細書に開示されているような化合物または阻害剤の使用である。
【００５１】
本明細書中で使用される「阻害剤」という用語は、特定の受容体、または関連する受容体の群の活性を阻害または遮断することができる化合物を指す。種々の化合物および薬物は、単一の作用に限定されず、従って、たとえそれらが構造的および／または化学的に異なるとしても、同じ受容体の阻害剤であると考えることができる。すなわち、特定の受容体の阻害は、１つより多い阻害剤が使用される実施例におけるこれらの化合物の特徴である。
【００５２】
したがって、一実施例において、本明細書に開示される阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の遮断をもたらす阻害剤である。別の実施例において、阻害剤は、限定されるものではないが、ＰＤ−１阻害剤、ＣＤ２７９阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＤ２７４阻害剤、およびそれらの組合せである。さらに別の実施例において、本明細書に開示される方法は、ＰＤ−１阻害剤、ＣＤ２７９阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＤ２７４阻害剤およびそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない阻害剤を被験者に投与することを含む。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、最初の感染または疾患の予防的阻害、および腫瘍成長または細菌による感染のような未処置の感染または疾患プロセスの天然の経過を変化させるための治療的介入の両方を指す。また、疾患を処置することは、疾患または病理学的状態が発生し始めた後に、例えば腫瘍の成長を阻害もしくは抑制する、腫瘍を除去する、疾患もしくは病理学的状態の少なくとも１つの徴候もしくは症状を改善する、または病態生理学的プロセスを妨げる、治療的介入を指す。
【００５４】
一実施例において、被験者に投与される処置または化合物は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を妨げる化合物である。つまり、これらの化合物は、処置に対する被験者の応答に影響を及ぼす免疫チェックポイントを標的としている。一実施例では、これらの標的免疫チェックポイントは、共抑制性免疫チェックポイント分子である。別の例において、これらの共阻害性免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＰＤ−Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、およびＧＡＬ９であるが、これらに限定されない。さらなる実施例において、被験者に投与すべき処置または化合物は、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法である。さらに別の例において、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法は、ＰＤ−１遮断療法である。
【００５５】
従って、一例において、被験者に投与すべき処置または化合物は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を妨げる化合物である。別の実施例において、被験者に投与すべき処置または化合物は、ＰＤ−１を標的とする化合物である。これらの化合物は、限定されるものではないが、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンシオ）、デュルバルマブ（イムフィンジ）、ピジリズマブ（Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）、ＡＭＰ−２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＭＰ−５１４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｏｆｉ）、およびこれらの組合せであり得る。一実施例において、投与すべき化合物は、本明細書に開示されている他の任意の化合物と組み合わせたペムブロリズマブ（キートルダ）である。別の実施例において、化合物は、ペムブロリズマブ（キートルダ）である。
【００５６】
その後、１１人の患者中４人が進行し、病死している。これらの進行性症例におけるＰＤ−Ｌ１およびＪＡＫ３遺伝子の変化は認められなかった。理論に拘束されることなく、この初期の「偽寛解」は、ペムブロリズマブの初回投与により一過性に遮断されたＰＤ−Ｌ１をアップレギュレートするエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などの外因性因子に起因すると考えられる。したがって、腫瘍における高いＰＤ−Ｌ１陽性は、必ずしもＰＤ−１遮断に対する良好な応答と同等であるとは限らない。さらに、ＰＤ−Ｌ１免疫組織化学スコアもコホート内で大きく変動し（６％、２＋〜１００％、３＋）、被験者ＮＫＴＬ２５およびＮＫＴＬ２７は共に、前処置した腫瘍に対するＰＤ−Ｌ１染色グレードが高いにもかかわらず疾患が進行しており、その結果ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫におけるＰＤ−１遮断に対する応答のバイオマーカーとしてＰＤ−Ｌ１陽性単独の有効性に疑問が投げかけられている。ＰＤ−Ｌ２遺伝子内に再配列は同定されず、ＰＤ−Ｌ１は構造的再配列に関して常に５’再配列パートナーとして働いた。これは、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２の過剰発現がゲノム増幅、ＪＡＫ２またはＰＤ−Ｌ２転座のような多様なメカニズムによって達成される他の血液悪性腫瘍とは対照的であり（表５）、異なる腫瘍が免疫回避のための別のメカニズムを進化させていることを示唆している。
【００５７】
ＰＤ−Ｌ１およびＪＡＫ３の変化の普及を測定するために、より対になった腫瘍−正常ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）腫瘍３２例および対応する末梢血リンパ球について、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を実施し、その臨床病理学的情報を以下の表６に列挙した。病原性ウイルスが腫瘍細胞中に存在することが知られているため、これらのサンプル中の対応する末梢血中に悪性細胞が存在しないことを、シークエンシングデータをＥＢＶゲノムにマッピングすることによって検証した。１１人のペムブロリズマブで処置した患者のコホートと同様に、この延長された３２のＮＫＴＬサンプルのコホートにおいて、その後のペムブロリズマブ処置を有さなかった；ＰＤ−Ｌ１もまた、コホートにおいて最も再発的に改変された遺伝子であることが見出された（図７Ａ）。構造的再配列に関しても、ＰＤ−Ｌ１は最も再配列された遺伝子であることが顕著に明らかになった（図７Ｂ）。これらのナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ腫瘍）におけるＰＤ−Ｌ１の変化の形態には、ＰＤ−Ｌ１のゲノム領域内の構造的切断点クラスターが関与しており、症例の２５％（３２例中８例）に認められた（図７Ｃ）。ＰＤ−Ｌ１の遺伝子座内に見出されたすべての構造的再配列は、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング法を用いて検証された（図８）。また、バイオインフォマティクス解析により、ＴＰ５３、ＤＤＸ３Ｘ、ＳＴＡＴ３、ＦＡＴ４およびＪＡＫ３などの遺伝子における再発性の非サイレント短変異体が再同定されており（６．３％、３２人中２人）、以前に研究されたコホートと同様の病態が示唆されている。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列（ＳＲ）を有する腫瘍における異常転写物の存在を、決定した。利用可能な全トランスクリプトームシークエンシング（ＷＴＳ）データを有するＰＤ−Ｌ１  ＳＲの各々について、ＳａｎｇｅｒシークエンシングによりＰＤ−Ｌ１キメラ転写産物を同定し、検証することが可能であった（図９）。
【００６０】
また本明細書に開示されているのは、本明細書に記載される方法を実施するためのキットである。したがって、一実施例において、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキット、検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含むキットが開示されている。さらに別の実施例において、検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含む、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットが開示されており、プライマーは、ＪＡＫ３およびＰＤ−Ｌ１遺伝子のゲノム領域を濃縮する。
【００６１】
一実施例において、少なくとも一対のプライマーは、本明細書の表８および９に挙げられるようなプライマー対であるが、これに限定されない。別の実施例において、プライマー対は、限定されるものではないが、配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号５および６、配列番号７および８、配列番号９および１０、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号３９および４０、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号４５および４６ならびに配列番号４７および４８である。さらに別の例において、次世代シークエンシングのための、少なくとも１つのＪＡＫ３活性化突然変異または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットが開示されている。さらに別の例において、本明細書に開示されるキットは、本明細書に開示される方法に従って使用するためのものである。
【００６２】
要約すると、４３のナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）サンプル（１１のサンプルがその後ペムブロリズマブで処置され、３２のサンプルが処置されなかった）の全コホートにおいて、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫における高頻度（２７．９％、４３中１２）の体細胞ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ構造的再配列が、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫がどのようにして免疫監視を回避できるかを説明できることが示され、それによってこれらの患者をより良好に処置するためにＰＤ−１阻害剤を使用するための基礎が提供される。
【００６３】
記述された完全応答症例における再発ＪＡＫ３活性化突然変異の存在は、ＪＡＫ３活性化突然変異を有する単発肺がん患者におけるＰＤ−１遮断の長期的利益を示す報告とも一致する。
【００６４】
全ゲノムシークエンシングデータを用いて、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫におけるＰＤ−１遮断療法に対する応答とゲノム特徴が相関することが示され、患者がゲノムスクリーニングを介してＰＤ−１遮断療法に対してより良好に選択され得ることが示された。
【００６５】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素（単数）または要素（複数）、制限（単数）または制限（複数）がない場合に適当に実施することができる。従って、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、拡張的にかつ限定されることなく読むものとする。さらに、本明細書に用いられる用語および表現は、記述の用語として使用され、限定されるものではなく、このような用語および表現の使用において、示され、記載された特徴またはその一部の何らかの等価物を除外する意図はなく、特許請求された発明の範囲内で種々変更が可能であると認められる。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されているその中で具体化されている発明の修正および変形は当業者に依拠し得、そのような修正および変形は本発明の範囲内であると考えられることは理解されるべきである。
【００６６】
本願で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指示しない限り複数の参照を含む。例えば、「遺伝マーカー」という用語は、混合物およびそれらの組合せを含む複数の遺伝マーカーを含む。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「約」は、製剤の成分の濃度との関連において、典型的には、記載値の＋／５％、より典型的には記載値の＋／４％、より典型的には記載値の＋／３％、より典型的には、記載値の＋／２％、さらにより典型的には記載値の＋／１％、さらにより典型的には記載値の＋／０．５％を意味する。
【００６８】
本開示全体を通して、特定の実施形態を範囲フォーマットで開示することができる。範囲フォーマットでの説明は単に簡便性および簡潔性のために過ぎず、開示された範囲の範囲に柔軟性のない限界と解釈すべきではないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能なすべての下位範囲ならびに当該範囲内の個々の数値を具体的に開示したものであると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、具体的に開示されたサブ範囲、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびに当該範囲内の個別の数、例えば１、２、３、４、５および６を有するものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００６９】
また、ある実施形態は、本明細書中に広く包括的に記載することができる。より狭い種および一般的開示内に入る亜属的群分けの各々も、開示の一部を構成する。これには、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を削除する、但し書きまたは負の限定を有する実施形態の一般的な記述が含まれる。
【００７０】
本発明は、本明細書に広く一般的に記載されている。より狭い種および一般的開示内に入る亜属的群分けの各々も、本発明の一部を構成する。これには、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を削除する、但し書きまたは負の限定を有する実施形態の一般的な記述が含まれる。
【００７１】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的な実施例内にある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がまたそれによって任意の個々の要素またはマーカッシュ群の要素の従属群に関して記載されていることを認識するであろう。
【実施例】
【００７２】
実験の章
以下の実施例は、本発明の態様が実施され得る方法、または本発明の特定の態様の実施に適した調製され得る材料を例示する。
【００７３】
実施例１−材料と方法
患者と方法
再発または難治性（ＲＲ）ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者１１人を、ペムブロリズマブで処置した。ＲＥＣＩＳＴ基準を用いて放射線走査により応答を評価した。全ゲノム塩基シークエンシング（ＷＧＳ）を用いて、すべてのペムブロリズマブ投与前の腫瘍および１１人の患者の整合正常値を、分子的にプロファイリングした。
【００７４】
試験設計
再発または難治性（ＲＲ）ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、研究コホートは、シンガポール、中国および香港からのＬ−アスパラギナーゼベースの化学療法レジメンが無効であった再発または難治性（ＲＲ）ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を有する患者１１人からなる。以前にシークエンシングされなかったＮＫＴＬ１、ＮＫＴＬ２５、ＮＫＴＬ２６、ＮＫＴＬ４３、ＮＫＴＬ４４およびＮＫＴＬ４５を、以前の研究から含めた。患者は、細胞傷害性、ＣＤ３ε＋およびＥＢＥＲ＋表現型を有する２００８年の世界保健機関分類に従って、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫と診断された。４３人の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者の初期腫瘍および血液／頬スワブサンプルを採取し、そのうち１１人がＬ−アスパラギナーゼベースの化学療法レジメンに失敗し、その後ペムブロリズマブで処置された。応答判定は、ＰＥＴ／ＣＴまたはＣＴ／ＭＲＩまたはＥＢＶ  ＰＣＲの併用を用いて行った。全ゲノムシークエンシングを用いて、ペムブロリズマブ前の腫瘍および整合正常対をすべて分子的にプロファイリングした。応答の継続期間（ＤｏＲ）は、ペムブロリズマブの開始の日から増悪または死亡の日までを算出した。ＤｏＲ中央値は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いて推定した。ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ（２００４／４０７／Ｆ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（ＮＵＳ−ＩＲＢ−１０−２５０）およびＳｕｎ  Ｙａｔ−ｓｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＹＢ２０１５−０１５−０１）からの施設内審査委員会が、本試験を承認した。この試験の被験者は全員、書面によるインフォームドコンセントを提出した。また、本研究は、ヘルシンキ宣言を遵守した。
【００７５】
節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、本試験の全被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られた。節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫は、細胞傷害性、ＣＤ３ε＋およびＥＢＥＲ＋表現型を有する２００８年の世界保健機関分類に従って診断された３。ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ（２００４／４０７／Ｆ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（ＮＵＳ−ＩＲＢ−１０−２５０）およびＳｕｎ  Ｙａｔ−ｓｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＹＢ２０１５−０１５−０１）からの施設内審査委員会が、本試験を承認した。４０人の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫患者の初期の腫瘍および血液サンプルを採取し、そのうち６人はまた、再発または難治性（ＲＲ）状態に進行した後にペムブロリズマブで処置された。これらのペムブロリズマブで処置された患者のうち４人はシンガポールから、残りの２人の患者は中国からであった。身体的徴候（例えば末梢血ＥＢＶ負荷およびＰＥＴまたはＣＴスキャン）の組み合わせを用いて、ペムブロリズマブで処置された患者の臨床応答を判定した。これら６名の患者の中で、新鮮凍結腫瘍は１名の患者について入手可能であり、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は５名の患者について入手可能であった。全４０例の腫瘍−血液サンプルについてＷＧＳデータを作成した。シークエンシングおよびアラインメントの統計量は、表７に見出すことができる。
【００７６】
【表７（１）】
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【００７７】
【表７（２）】
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【００７８】
【表７（３）】
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【００７９】
【表７（４）】
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【００８０】
【表７（５）】
2020536111.tif 000013
【００８１】
ゲノムＤＮＡ抽出
スナップ凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織由来のゲノムＤＮＡおよび全血を、前述のように抽出した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．組織ＤＮＡキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者の指示に従って用いて、頬スワブゲノムＤＮＡを精製した。質および量は、他に記載されているように評価した。
【００８２】
ＮＫ細胞の単離と活性化
休止期および活性化ＮＫ細胞をベースラインとして用い、腫瘍サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１の相対的発現を比較した。ＮＫ細胞単離は、シンガポールの保健科学局から得たヒトアフェレーシス錐体血液を用いて行った。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、４００×ｇで３０分間密度遠心法により末梢血単核細胞を取得した。製造業者のプロトコルに従い、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＮＫ細胞を単離した。フローサイトメトリーによるＣＤ３−およびＣＤ５６＋発現で測定したところ、ＮＫ細胞の純度は９０％を超えていた。
【００８３】
単離された細胞を、２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を含むかまたは含まない５％熱不活性化ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）に懸濁した。４８ウェルプレート上に１×１０６細胞を播種し、ＣＤ２５−ＦＩＴＣ（クローン：Ｍ−Ａ２５１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ６９−ＢＶ４２１（クローン：ＦＮ５０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のアップレギュレーションとしてフローサイトメトリーにより４８時間後にＮＫ細胞の活性化を決定した。
【００８４】
ＮＫ細胞単離は、シンガポールの保健科学局から入手したヒトアフェレーシス錐体血液を用いて行った。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、４００×ｇで３０分間密度遠心法により末梢血単核細胞を取得した。血小板の除去は、１２０×ｇで１０分間の緩徐遠心分離により行った。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って用いて、開始細胞濃度１×１０８細胞／ｍｌでＮＫ細胞を単離した。
【００８５】
単離したＮＫ細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ生存性色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した後、ＣＤ３−Ｖ５００（クローン：ＵＣＨＴ１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ５６−ＰｅＣｙ７（クローン：Ｂ１５９；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に特異的なモノクローナル抗体で表面染色し、分離の効率を測定した。フローサイトメトリーによるＣＤ３−ＣＤ５６＋発現で測定したところ、ＮＫ細胞の純度は９０％を超えていた。
【００８６】
単離された細胞を、２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を含む、または含まない５％熱不活性化ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。４８ウェルプレート上に１×１０６細胞を播種し、ＣＤ２５−ＦＩＴＣ（クローン：Ｍ−Ａ２５１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ６９−ＢＶ４２１（クローン：ＦＮ５０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のアップレギュレーションとしてフローサイトメトリーにより４８時間後にＮＫ細胞の活性化を決定した。
【００８７】
全ゲノムシークエンシング
すべてのシークエンシングライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ  Ｎａｎｏ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製した。ＨｉＳｅｑ  ２０００またはＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｔｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、それぞれ２ｘ１０１ｂｐまたは２ｘ１５１ｂｐとして、末端対シークエンシングを行った。ＦＦＰＥ材料からのゲノムＤＮＡの高い断片化のため、ＦＦＰＥ腫瘍サンプルのためのライブラリー調製の前にサイズ選択ステップを実施した。ＦＦＰＥサンプルから約２００ｂｐの増幅可能なＤＮＡ断片をシークエンシングライブラリー構築に使用し、ＰＤ−Ｌ１遺伝子内のＳＲの発見に明確に偽陰性を避ける。
【００８８】
あるいは、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫について、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を、本研究で記述した腫瘍−正常サンプルの全４０対について実施した。すべてのシークエンシングライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ  Ｎａｎｏ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製した。ＦＦＰＥ材料中のゲノムＤＮＡの高い断片化のため、ＦＦＰＥ腫瘍サンプルのためのライブラリー調製に先立ってサイズ選択ステップを実施した。ＨｉＳｅｑ  ２０００またはＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｔｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、それぞれ２ｘ１０１ｂｐまたは２ｘ１５１ｂｐとして、末端対シークエンシングを行った。腫瘍および正常の平均のＷＧＳデータの網羅率は、それぞれ６８．９倍および４２．２倍である。
【００８９】
全トランスクリプトームシークエンシング
ＲＮＡ抽出、および質と量の評価は、前述のように行った。シークエンシングライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製し、ＨｉＳｅｑ  ２５００、ＨｉＳｅｑ  ３０００またはＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｔｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、それぞれ２ｘ１０１ｂｐ、２ｘ１５１ｂｐまたは２ｘ１５１ｂｐの読み取り長で、全トランスクリプトームシークエンシング（ＷＴＳ）を行った。
【００９０】
ＲＮＡ転写産物の定量と標準化
ＲＮＡ読み取りは、ＳＴＡＲを用いて、ｈｓ３７ｄ５とＥＢＶ−１の組み合わせた参照に２パスモードでアラインメントした。ＤＥＳｅｑ２により遺伝子数を正規化し、両側解析順位和検定を用いて差次発現における有意性を算出した。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５と考慮した。
【００９１】
ｃＤＮＡ合成とリアルタイム
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、利用可能なＲＮＡを有するサンプルについて逆転写を行った。
【００９２】
全ゲノムおよび全トランスクリプトームシークエンシング
節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、本研究の節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫検体からＷＧＳデータを作成するために、スナップ凍結腫瘍組織およびＦＦＰＥ腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ、および全血を、前述のように抽出した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．組織ＤＮＡキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者の指示に従って用いて、頬スワブゲノムＤＮＡを精製した。質および量は、他に記載されているように評価した。全ゲノムシークエンシングを、本研究で記述したすべての腫瘍および全血または頬スワブサンプルについて実施した。すべてのシークエンシングライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ  Ｎａｎｏ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製した。ＦＦＰＥ腫瘍サンプルのライブラリー調製前に、サイズ選択ステップを実施した。ＲＮＡ抽出、ならびに質および量の評価は、前述のように行った２２。シークエンシングライブラリーは、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏを有するＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製した。
【００９３】
体細胞変異体の検出とフィルタリング
シークエンシング読み取りは、ＢＷＡ−ＭＥＭを用いてｈｓ３７ｄ５ヒト参照ゲノムにアラインメントした。Ｓｔｒｅｌｋａ２およびＭｕＳＥを用いて、体細胞短変異体を検出した。その後、短変異体にはｗＡｎｎｏｖａｒによる注釈が付けられた。
【００９４】
構造的再配列のゲノム解析
すべての下流分析に先立ち、ｇＤＮＡシークエンシング読み取りを、ＢＷＡ−ＭＥＭを用いてｈｓ３７ｄ５ヒト参照ゲノムにアラインメントし、ＰＣＲ重複物を、Ｓａｍｂａｍｂａによりマークした。体細胞構造的再配列（ＳＲ）を同定するために、Ｍａｎｔａを、腫瘍−血液対サンプルの整列したｇＤＮＡ読み取りに適用した。ＰＤ−Ｌ１の遺伝子領域内の予測されたＳＲはすべて、Ｓａｎｇｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで検証した。ｇＤＮＡシークエンシングデータからの予測されたＳＲが転写産物をもたらすかどうかを決定するために、ＰＣＲに基づく検証およびＳａｎｇｅｒシークエンシングのためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、利用可能な対応するＲＮＡからｃＤＮＡを得た。
【００９５】
構造変異の検出とフィルタリング
ＤＮＡ読み取りは、ＢＷＡ−ＭＥＭを用いてｈｓ３７ｄ５ヒト参照ゲノムにアラインメントし、ＰＣＲ重複は、Ｓａｍｂａｍｂａにより除去した。読み取り対は、それらが予想される方向で、および／または予想される挿入サイズ内で参照ゲノムと整列しなかった場合、不一致としてマークした。読み取りのいずれの末端も参照ゲノムと一致しなかった場合、読み取りにはクリップとしてフラッグが付けられた。
【００９６】
体細胞構造的再配列（ＳＲ）の検出はＭａｎｔａによって行われ、各候補ＳＲは以下のフィルタリング基準に供された：１）ＳＲは、少なくとも３つの不一致な読み取り対と少なくとも３つのソフトクリッピングされた読み取りによって支持され、すべての支持読み取りの合計は少なくとも１０である；２）適合する正常サンプル中に存在する不一致およびソフトクリッピングされた読み取りがゼロである；３）腫瘍および適合する正常サンプルの両方で少なくとも２０Ｘのカバー率；および４）ＳＲは少なくとも１０００ｂｐのサイズである。
【００９７】
ゲノム領域内にＳＲを有する固有サンプル、すなわちＳＲランドスケープのヒストグラムを、ｈｓ３７ｄ５の主要染色体に沿って１００ｋｂｐのステップで１Ｍｂｐ平均化滑り窓を用いて表にした。推定ＳＲの切断点をＢＥＤＰＥフォーマットに変換し、ＳＲランドスケープとともにＣＩＲＣＯＳを用いてリンクとして可視化した。
【００９８】
体細胞変異の検出
ＷＧＳデータはＦｒｅｅＢａｙｅｓ６（−Ｘ−ｕ−Ｃ５−ｍ３０−ｑ２０）を用いて解析し、スコアが３０未満の変異体はフィルターで除外した。一塩基変異体は、腫瘍から喚起され、対応する正常なデータではない場合にのみ、体細胞性であると予測される。
【００９９】
体細胞一塩基変異体およびインデルの検出
ＷＧＳデータの体細胞一塩基変異体とインデルは、ＦｒｅｅＢａｙｅｓを用いて喚起された。スコアが３０未満の候補変異体は、フィルターで除外した。変異体は、腫瘍から喚起された場合にのみ体細胞性であり、対応する正常なデータではないと予測された。
【０１００】
腫瘍クローン性の解析
ＳｃｉＣｌｏｎｅを用いて、腫瘍のクローン性構造を解析した。ＣＡＮＶＡＳを用いて、各腫瘍のコピー数およびヘテロ接合性情報の消失を解析し、これをＳｃｉＣｌｏｎｅによるクローン性解析の入力として用いた。
【０１０１】
ＰＣＲとＳａｎｇｅｒシークエンシング
再発または難治性（ＲＲ）ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、ＰＣＲ条件およびシークエンシングに関する詳細が、以前に記載されていた。プライマーはＰｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを用いて設計し、ペムブロリズマブで処置したＮＫＴＬ患者１１人の発見コホートについて配列を表６に挙げる。Ｓａｎｇｅｒ配列をｈｓ３７参照ゲノムにアラインメントし、ＢＬＡＴで確認した。あるいは、後にペムブロリズマブで処置されなかったＮＫＴＬ患者３２人の普及コホートについても、プライマー配列を表７に列挙する。
【０１０２】
【表８】
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【０１０３】
【表９（１）】
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【０１０４】
【表９（２）】
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【０１０５】
組織学的研究とスコア化
再発または難治性（ＲＲ）ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫に対して、抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（ＳＰ２６３、Ｖｅｎｔａｎａ）を用いてＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ解析を行った。ＰＤ−Ｌ１陽性は、細胞膜で陽性に染色された腫瘍細胞のパーセンテージとして評価された。あるいは、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、ＰＤ−Ｌ１発現を細胞膜での染色として評価し、陽性腫瘍細胞のパーセンテージおよび染色強度に基づいてスコア化した。以下の等級付けを用いた：０、染色なし、１＋、弱、２＋中程度および３＋強染色。同じ病理医が、すべてのＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ染色を再検討した。この試験で使用したサンプルについて入手可能なＨスコアを、表１０に含める。
【０１０６】
【表１０（１）】
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【０１０７】
【表１０（２）】
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【０１０８】
細胞系および構築物
Ｋ−５６２とＪｕｒｋａｔ細胞系統はＡＴＣＣから購入し、ＮＫ−Ｓ１は自家で発生させた。ＬＧＣ標準は、Ｋ−５６２およびＪｕｒｋａｔ細胞株を認証した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に維持し、Ｋ−５６２およびＮＫ−Ｓ１を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１０％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃で成長させ、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いてマイコプラズマ汚染についてルーチンにチェックした。
【０１０９】
節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、ＡＴＣＣおよび院内ＮＫ−Ｓ１細胞株由来のＫ−５６２およびＪｕｒｋａｔ細胞株を用いて、ＰＤ−Ｌ１の３’ＵＴＲ内で認められた最小の構造的再配列の調節効果を研究コホートで検討した。
【０１１０】
ＳＮＫ６細胞株由来の野生型ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲ（ＥＮＳＴ０００００３８１５７３．８）を、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化した。サンプルＮＫＴＬ１で同定された再配列を再現する部分的に逆転した３’ＵＴＲについて、突出を有する３個の個々の片を、野生型サンプル（ＳＮＫ６）から増幅し、ＰＣＲにより一緒に連結した。Ｑ５  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてクローニングを行った。全長野生型および突然変異体ＰＤ−Ｌ１  ３’ＵＴＲをクローン化するために使用されるすべてのクローニングプライマーを、表１１に記載する。
【０１１１】
【表１１（１）】
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【表１１（２）】
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【０１１２】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
再発または難治性（ＲＲ）ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫については、Ｋ−５６２およびＪｕｒｋａｔについて、それぞれ５×１０４細胞および６×１０４細胞を４８ウェルプレート上に３つ１組で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２５０ｎｇプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＮＫ−Ｓ１細胞については、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２×１０５細胞を１μｇプラスミドＤＮＡで２４ウェルプレート上に３つ１組で電気穿孔した。使用したパルスパラメータは、以下であった：電圧１３００、幅１０、および番号３。あるいは、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫について、Ｋ−５６２細胞について、２．５ｘ１０５細胞を４８ウェルプレート上に３つ１組で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２５０ｎｇプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＮＫ−Ｓ１およびＪｕｒｋａｔ細胞について、２．５×１０５細胞を、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇプラスミドＤＮＡで２４ウェルプレート上に３つ１組で電気穿孔した。
【０１１３】
４８時間後、細胞を、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。発光は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ＋  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性をＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性で分割し、結果を空ベクター対照（模擬）に標準化した。統計学的有意性は、両側ｔ検定により算出した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５と考慮した。すべての実験を、少なくとも２回繰り返した。
【０１１４】
データの可用性
４３のナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）−正常／血液対のＷＧＳデータおよび２８のＮＫＴＬの全トランスクリプトームシークエンシング（ＷＴＳ）データは、研究アクセッションコード：ＥＧＡＳ００００１００２４２０の下でヨーロッパゲノムアーカイブ（ＥＧＡ）に寄託されている。
【０１１５】
【表１２（１）】
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【０１１６】
【表１２（２）】
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【０１１７】
【表１２（３）】
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【０１１８】
【表１２（４）】
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【０１１９】
【表１２（５）】
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【０１２０】
【表１２（６）】
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【０１２１】
【表１２（７）】
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【０１２２】
【表１２（８）】
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【０１２３】
【表１２（９）】
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【０１２４】
【表１２（１０）】
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【０１２５】
【表１２（１１）】
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【０１２６】
【表１２（１２）】
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【０１２７】
【表１２（１３）】
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【０１２８】
【表１２（１４）】
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【０１２９】
【表１２（１５）】
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【０１３０】
【表１２（１６）】
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【０１３１】
【表１２（１７）】
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【０１３２】
【表１２（１８）】
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【０１３３】
【表１２（１９）】
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【０１３４】
【表１２（２０）】
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【０１３５】
【表１２（２１）】
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【０１３６】
【表１２（２２）】
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【図１】
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【図２（１）】
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【図２（２）】
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【図２（３）】
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【図３】
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【図４（１）】
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【図４（２）】
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【図５】
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【図６（１）】
2020536111.tif 000051
【図６（２）】
2020536111.tif 000052
【図６（３）】
2020536111.tif 000053
【図６（４）】
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【図６（５）】
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【図６（６）】
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【図６（７）】
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【図６（８）】
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【図６（９）】
2020536111.tif 000059
【図６（１０）】
2020536111.tif 000060
【図７（１）】
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【図７（２）】
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【図７（３）】
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【図７（４）】
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【図８（１）】
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【図８（２）】
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【図８（３）】
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【図８（４）】
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【図９（１）】
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【図９（２）】
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【図９（３）】
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【図９（４）】
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【図９（５）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020536111.tif 000075
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