(57)【要約】  本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物、またはそれを使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物、ならびに重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。加えて、本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して、遺伝子重複によって引き起こされる疾患を治療または改善する方法に関する。
2020536501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現制御組成物であって、前記組成物は、前記重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列を標的とすることができるガイド核酸または前記ガイド核酸をコードする核酸；および１つまたは複数のエディタータンパク質または前記エディタータンパク質をコードする核酸を含み、
ここで、前記ガイド核酸は、前記重複遺伝子の前記転写調節領域内の前記標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み、
ここで、前記ガイドドメインは、前記重複遺伝子の前記転写調節領域内の前記標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み、
ここで、前記ガイドドメインは、前記重複遺伝子の前記転写調節領域内の前記標的配列のガイド核酸結合配列と相補的に結合することができ、
ここで、前記相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み、
ここで、前記ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み、
ここで、前記エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり、
ここで、前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成することができ、
ここで、前記ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、前記ガイド核酸の部分核酸と前記エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸との相互作用により形成することができる、発現制御組成物。
【請求項２】
前記転写調節領域が、プロモーター領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域、インシュレーター領域および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）からなる群より選択される１つまたは複数の領域である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項３】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記転写調節領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項４】
前記標的配列が、前記重複遺伝子のプロモーター領域内または前記プロモーター領域に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項５】
前記標的配列が、前記重複遺伝子のコアプロモーター領域内または前記コアプロモーター領域に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項４に記載の発現制御組成物。
【請求項６】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記コアプロモーター内のＴＡＴＡボックスを含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列、または前記ＴＡＴＡボックスに隣接する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の発現制御組成物。
【請求項７】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記コアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡ−３'配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の発現制御組成物。
【請求項８】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記コアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡＷＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の発現制御組成物。
【請求項９】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記コアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡＷＡＷＲ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の発現制御組成物。
【請求項１０】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記コアプロモーターに存在する５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'配列からなる群より選択される１つまたは複数の配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の発現制御組成物。
【請求項１１】
前記標的配列が、５'−ＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'配列からなる群より選択される１つまたは複数の配列の３'末端または５'末端に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項５に記載の発現制御組成物。
【請求項１２】
前記標的配列が、前記重複遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項１３】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記エンハンサー領域に隣接する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項１４】
前記標的配列が、前記重複遺伝子の前記転写調節領域内の核酸配列におけるＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項１５】
前記ＰＡＭ配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に従って決定される、請求項１４に記載の発現制御組成物。
【請求項１６】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質からなる群より選択される１つまたは複数のＣａｓ９タンパク質である、請求項１６に記載の発現制御組成物。
【請求項１８】
前記重複遺伝子が、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項１９】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項２０】
前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１９に記載の発現制御組成物。
【請求項２１】
前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質とがそれぞれ核酸の形態で１つまたは複数のベクターに存在する、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項２２】
前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項２１に記載の発現制御組成物。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のウイルスベクターである、請求項２２に記載の発現制御組成物。
【請求項２４】
前記重複遺伝子の前記発現制御組成物が、前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質とを前記ガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で含む、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項２５】
前記重複遺伝子の前記発現制御組成物がドナーをさらに含む、請求項１に記載の発現制御組成物。
【請求項２６】
真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を調節する方法であって、前記方法は、前記重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を導入する段階を含み、
ここで、前記発現制御組成物は、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸または前記ガイド核酸をコードする核酸；および１つまたは複数のエディタータンパク質または前記エディタータンパク質をコードする核酸を含み、
ここで、前記真核細胞は哺乳類細胞であり、
ここで、前記ガイド核酸は、前記重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み、
ここで、前記ガイドドメインは、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する前記標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができ、
ここで、前記ガイドドメインは、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する前記標的配列のガイド核酸結合配列と相補的に結合することができ、
ここで、前記相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み、
ここで、前記ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み、
ここで、前記エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり、
ここで、前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質とは、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成することができ、
ここで、前記ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、前記ガイド核酸の部分核酸と前記エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸との相互作用により形成することができる、方法。
【請求項２７】
前記発現制御組成物が、前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質とを前記ガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現制御組成物が、前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質とをそれぞれ核酸の形態で含む１つまたは複数のベクターを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記導入を、エレクトロポレーション、リポソーム、ウイルスベクター、プラスミド、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）から選択される１つまたは複数の方法により行う、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
遺伝子重複疾患を治療するための方法であって、前記方法は、治療対象において重複遺伝子の発現制御組成物を投与する段階を含み、
ここで、前記発現制御組成物は、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸または前記ガイド核酸をコードする核酸；および１つまたは複数のエディタータンパク質または前記エディタータンパク質をコードする核酸を含み、
ここで、前記ガイド核酸は、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み、
ここで、前記ガイドドメインは、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する前記標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができ、
ここで、前記ガイドドメインは、前記重複遺伝子の転写調節領域内に存在する前記標的配列のガイド核酸結合配列と相補的に結合することができ、
ここで、前記相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み、
ここで、前記ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み、
ここで、前記エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり、
ここで、前記ガイド核酸と前記エディタータンパク質とは、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成することができ、
ここで、前記ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、前記ガイド核酸の部分核酸と前記エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸との相互作用により形成することができる、方法。
【請求項３１】
前記遺伝子重複疾患が、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療対象が、ヒト、サル、マウスおよびラットを含む哺乳類である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与を、注入、輸液、インプランテーションまたはトランスプランテーションにより行うことができる、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物、およびそれを使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物、ならびに発現制御組成物を使用して重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。加えて、本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して、遺伝子重複によって引き起こされる疾患を治療または改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子重複は、染色体の遺伝子組換えで生じるエラーの１つであり、染色体の部分領域を複製する複製現象である。遺伝子重複とは、次世代に継代される変異の一種である。遺伝子重複は、染色体の部分領域の非複製に起因する遺伝子欠失とともに、遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０００３】
遺伝子重複は、遺伝性疾患も引き起こす。代表的には、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ）（ＣＭＴ）１Ａ型は、染色体の特異領域で起こる遺伝子重複から生じ、手足の末梢神経発達に関与する遺伝子の過剰発現は、遺伝子重複に起因して起こり、ひいては手足の奇形の原因となる。
【０００４】
したがって、遺伝子が、適切な位置、ならびに細胞増殖、死、老化および分化などの生物学的プロセスが正常に機能する適切な時期に発現されることが重要である。不適切な時期と位置で遺伝子が不適切に発現される場合、特に、遺伝子重複によって引き起こされる異常な遺伝子発現は疾患につながる可能性があるため、各遺伝子の発現を制御する分子のメカニズムを理解する必要があるのと、各遺伝子に関連する転写調節因子を同定することが重要である。遺伝子発現を正確に制御できるさまざまな転写調節因子、たとえば、プロモーター、遠位制御エレメント、および転写因子、アクチベーター、およびコアクチベーターであって、遺伝子発現の制御に関与するものがある。
【０００５】
遺伝子発現は、転写調節因子の変化により制御される可能性があり、転写調節因子の異常な変化は、遺伝子の異常発現を引き起こし、それによって疾患を誘導する可能性がある。したがって、転写調節因子の変化は、さまざまな疾患を引き起こしたり、疾患を改善および治療したりする可能性がある。
【０００６】
しかしながら、転写調節因子を制御する現在の方法は、一時的な遺伝子発現のみを制御し、継続的な遺伝子発現調節は困難である。このため、遺伝子発現の異常性または困難性に起因する疾患を治療するための基本的な治療法はない。したがって、遺伝子編集または転写調節因子の修飾により、より継続的な治療効果を示す方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
１．Ｈａｍｄａｎ，Ｈ．，Ｋｏｃｋａｒａ，Ｎ．Ｔ．，Ｊｏｌｌｙ，Ｌ．Ａ．，Ｈａｕｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２０１５）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＬＰ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｅｘｏｎｓ  ｉｎ  ｉｔｒｏｎ  １．ＡＳＮ  Ｎｅｕｒｏ  ７．  ２．Ｈａｍｄａｎ，Ｈ．，Ｐａｔｙａｌ，Ｐ．，  Ｋｏｃｋａｒａ，Ｎ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２０１８）．Ｔｈｅ  ｗｍＮ１  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｉｔｒｏｎ  １  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＬＰ１．Ｇｌｉａ．  ３．Ｍｅｎｇ，Ｆ．，Ｚｏｌｏｖａ，Ｏ．，Ｋｏｋｏｒｉｎａ，Ｎ．Ａ．，Ｄｏｂｒｅｔｓｏｖａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２００５）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｔｒｏｎｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｙｅｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｌｐ）ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８２，３４６−３５６．  ４．Ｔｕａｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｓｔｉｋｅｒｄａｒ，Ａ．，Ｋｕｈｌｍａｎｎ，Ｔ．，Ｇｏｕｊｅｔ−Ｚａｌｃ，Ｃ．，Ｚａｌｃ，Ｂ．，Ｄｉｂ，Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ａ．（２００８）．Ｓｅｐａｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＭ２０  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｓｅｒｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８，６８９５−６９０３．  ５．Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２０１７）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｔｒｏｎ  １  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＰＬＰ１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＰＬＰ１−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＡＳＮ  Ｎｅｕｒｏ  ９，１７５９０９１４１７７２０５８３．
開示
技術的課題
【０００８】
本発明は、細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を提供することに関する。
【０００９】
本発明はまた、真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御する方法を提供することに関する。
【００１０】
本発明はまた、発現制御組成物を使用して遺伝子重複疾患を治療する方法を提供することに関する。
技術的解決策
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物に関する。より具体的には、本発明は、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物、ならびに発現制御組成物を使用して重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。加えて、本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して、遺伝子重複によって引き起こされる疾患を治療または改善する方法に関する。
【００１２】
本発明は、細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を提供する。
【００１３】
一態様では、発現制御組成物は、以下のものを含み得る。
重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸；および
１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸。ガイド核酸は、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメイン
【００１４】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００１５】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成し得る。
【００１６】
ここで、相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み得る。
【００１７】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【００１８】
エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【００１９】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【００２０】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ガイド核酸の部分核酸をエディタータンパク質の部分アミノ酸と相互作用させることにより形成され得る。
【００２１】
転写調節領域は、プロモーター領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域、インシュレーター領域および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）からなる群より選択される１つまたは複数の領域であり得る。
【００２２】
標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域に位置する連続した１０〜２５ｎｔ（ヌクレオチド）配列であり得る。
【００２３】
標的配列は、重複遺伝子のプロモーター領域内またはそれに隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２４】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域内またはそれに隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域のＴＡＴＡボックス領域を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列、またはＴＡＴＡボックス領域に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２５】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡ−３'配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２６】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡＷＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２７】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡＷＡＷＲ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２８】
ここで、標的配列は、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'配列、および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'配列からなる群より選択される配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２９】
ここで、標的配列は、５'−ＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'配列からなる群より選択される配列の５'末端または３'末端に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００３０】
標的配列は、重複遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。標的配列は、重複遺伝子のエンハンサー領域に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００３１】
標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の核酸配列におけるＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００３２】
ここで、ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素に従って決定され得る。
【００３３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり得る。
【００３４】
ここで、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質からなる群より選択される１つまたは複数のＣａｓ９タンパク質であり得る。
【００３５】
重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【００３６】
重複遺伝子は癌遺伝子であり得る。
【００３７】
ここで、癌遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、ＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【００３８】
細胞は真核細胞であり得る。
【００３９】
真核細胞は哺乳類細胞であり得る。
【００４０】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、それぞれ核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在し得る。
【００４１】
ここで、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００４２】
ここで、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のウイルスベクターであり得る。
【００４３】
発現制御組成物は、ガイド核酸とエディタータンパク質とをガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で含み得る。
【００４４】
発現制御組成物はさらにドナーを含み得る。
【００４５】
本発明は、真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御する方法を提供する。
【００４６】
一態様では、真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御する方法は、発現制御組成物を真核細胞に導入することを含み得る。
【００４７】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る：
重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸；および
１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸。
【００４８】
真核細胞は哺乳類細胞であり得る。
【００４９】
ガイド核酸は、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み得る。
【００５０】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００５１】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成し得る。
【００５２】
ここで、相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み得る。
【００５３】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【００５４】
エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【００５５】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【００５６】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ガイド核酸の部分核酸をエディタータンパク質の部分アミノ酸と相互作用させることにより形成され得る。
【００５７】
発現制御組成物は、ガイド核酸とエディタータンパク質とをガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で含み得る。
【００５８】
発現制御組成物は、ガイド核酸とエディタータンパク質がそれぞれ核酸の形態で含まれる１つまたは複数のベクターを含み得る。
【００５９】
導入は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１つまたは複数の方法により行われ得る。
【００６０】
本発明は、遺伝子重複疾患を治療する方法を提供する。
【００６１】
一態様では、遺伝子重複疾患を治療する方法は、治療対象への発現制御組成物の投与を含み得る。
【００６２】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る：
重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸；および
１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸。
【００６３】
ガイド核酸は、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み得る。
【００６４】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００６５】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成し得る。
【００６６】
ここで、相補的結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み得る。
【００６７】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【００６８】
エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【００６９】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【００７０】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ガイド核酸の部分核酸をエディタータンパク質の部分アミノ酸と相互作用させることにより形成され得る。
【００７１】
遺伝子重複疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ（Ｐｏｔｏｃｋｉ−Ｌｕｐｓｋｉ）症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。
【００７２】
遺伝子重複疾患は、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌であり得る。
【００７３】
ここで、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【００７４】
治療対象は、ヒト、サル、マウスおよびラットを含む哺乳類であり得る。
【００７５】
投与は、注入、輸液、インプランテーションまたはトランスプランテーションにより行われ得る。
有利な効果
【００７６】
本発明は、発現制御組成物により重複遺伝子の発現を制御することができる。より具体的には、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物を使用することにより重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して改善または治療することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１ａ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたＴＡＴＡボックスを示す。
【図１ｂ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたエンハンサーのそれぞれのインデル頻度を示す。
【００７８】
【図２ａ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたＴＡＴＡボックスを示す。
【図２ｂ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたエンハンサーのそれぞれのインデル頻度を示す。
【００７９】
【図３】シュワン様細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の調節エレメントを標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによる遺伝子操作効果を示す。
【００８０】
【図４】ヒトＰＭＰ２２のＣＤＳを標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡにより誘導されるフレームシフト変異比を示す。
【００８１】
【図５】デュアルｓｇＲＮＡの処理によるヒトＰＭＰ２２のごく一部の欠失を示す。
【００８２】
【図６】ヒトシュワン様細胞におけるＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるヒトＰＭＰ２２のｍＲＮＡ発現の減少を示すグラフである。
【００８３】
【図７ａ】ヒト初代シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるインデル頻度の測定結果を示す。
【図７ｂ】ヒト初代シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、各標的部位のミエリン形成シグナル因子およびＲＮＰ複合体の処理の有無にかかわらずｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＰＭＰ２２の相対的なｍＲＮＡ発現比較結果（ｎ＝３、一元配置分散分析およびテューキー事後検定：＊ｐ＜０．０５）を示す。
【図７ｃ】ヒト初代シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、遠位エンハンサー部位（遠位エンハンサー領域）ＢとＣを標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるインデル頻度の測定結果を示す。
【００８４】
【図８ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、ヒトＰＭＰ２２位置のプロモーター領域を標的とする標的配列を示す。
【図８ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、左端のグラフ、中央のグラフ、ならびに右端のグラフは、ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングを使用したインデル頻度の測定結果、総インデル頻度のうちＴＡＴＡボックス１変異頻度の測定結果（ｎ＝３）、ならびにヒト初代シュワン細胞におけるミエリン形成シグナル因子およびＲＮＰ複合体の処理の有無にかかわらずｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＰＭＰ２２の相対的ｍＲＮＡ発現の比較結果（ｎ＝３、一元配置分散分析およびテューキー事後検定：＊ｐ＜０．０５）をそれぞれ示す。
【００８５】
【図９ａ】ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を示し、インデル頻度を示すグラフである。
【図９ｂ】ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を示し、高頻度のインデルを示す。
【図９ｃ】ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を示し、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲット部位を示す。
【００８６】
【図１０ａ】ヒトの全ゲノムにおいてＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される部位を示す一連の結果であり、ゲノムワイドなＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図１０ｂ】ヒトの全ゲノムにおいてＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される部位を示す一連の結果であり、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲット部位のうちＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑにより現れるオフターゲット部位を示す。
【図１０ｃ】ヒトの全ゲノムにおいてＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される部位を示す一連の結果であり、オフターゲット部位におけるインデル頻度を示すグラフである。
【００８７】
【図１１】Ｃ２２マウスにおけるＰＭＰ２２‐ＴＡＴＡ  ＲＮＡ療法を使用した治療アプローチを概略的に示す。
【００８８】
【図１２】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した疾患表現型の軽減を示す一連の結果であり、（ａ）は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で治療された坐骨神経における標的ディープシーケンシングを使用したインデル頻度を示すグラフ（ｎ＝３）であり、（ｂ）は、総インデル頻度のうちＴＡＴＡボックス１変異頻度の測定結果（ｎ＝３）を示し、（ｃ）は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で治療された坐骨神経からのｑＲＴ−ＰＣＲを使用したＰＭＰ２２の発現ｍＲＮＡの相対量を比較するグラフである。
【００８９】
【図１３ａ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によるマウスゲノムにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡのオフターゲット部位およびインデル頻度を示す一連の結果であり、オフターゲット部位を示す。
【図１３ｂ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によるマウスゲノムにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡのオフターゲット部位およびインデル頻度を示す一連の結果であり、各オフターゲット部位でのインデル頻度を示すグラフである。
【００９０】
【図１４ａ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した疾患表現型の軽減を示す一連の結果であり、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理された坐骨神経組織の半薄切片の一連の画像である。
【図１４ｂ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した疾患表現型の軽減を示す一連の結果であり、上のグラフと下のグラフは、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスにおいてｇ比が増加することを示す散布図と、ＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスにおいて有髄軸索の直径が増加することを示すグラフをそれぞれ示す。
【００９１】
【図１５】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した電気生理学的な変化を示す一連の結果であり、（ａ）遠位潜時（ＤＬ）の変化を示すグラフであり、（ｂ）運動神経伝導速度（ＮＣＶ）の変化を示すグラフであり、（ｃ）複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の変化を示すグラフ（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰの場合はｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡの場合はｎ＝１０）である。
【００９２】
【図１６ａ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因した運動行動の一連の分析結果であり、上のグラフと下のグラフは、ロータロッド試験の結果（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰの場合はｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡの場合はｎ＝１１）と、マウスが８週齢から１６週齢になるまで毎週測定したロータロッド試験の結果（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰの場合はｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡの場合はｎ＝１１）をそれぞれ示す。
【図１６ｂ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因した運動行動の一連の分析結果であり、上のグラフと下の画像は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理されたＣ２２マウスの腓腹筋重量／体重の比と、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理されたＣ２２マウスの一連の腓腹筋画像をそれぞれ示すグラフである。
【００９３】
【図１７】ＰＭＤ治療戦略を示す概略図であって、ＰＬＰ１遺伝子のＴＡＴＡボックス領域とエンハンサー領域を標的とするｓｇＲＮＡを設計した。エンハンサー領域を標的とするｓｇＲＮＡの場合、２つのｓｇＲＮＡを使用してエンハンサーを除去する戦略が示される。ここで、エンハンサー領域の上流を標的とするｓｇＲＮＡはＵｐと表示され、その下流を標的とするｓｇＲＮＡはＤｏｗｎと表示され、ＵｐとＤｏｗｎはまた、表５と６における位置に従って表示される。
【００９４】
【図１８】例示的な実施形態で使用されるＣｊＣａｓ９プラスミドを示す。
【００９５】
【図１９】ｍＰｌｐ１のＴＡＴＡボックス領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示す一連のグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用したｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｓｐ−０１を標的とするｓｇＲＮＡであり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９６】
【図２０】ｍＰｌｐ１のＴＡＴＡボックス領域を標的とするＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示す一連のグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用されるｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０１〜ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０４であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９７】
【図２１】ｍＰｌｐ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示す一連のグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用したｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０１〜ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−３６であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９８】
【図２２】ｍＰｌｐ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示すグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用したｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０１〜ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−２８であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９９】
【図２３】ｍＰｌｐ１のＴＡＴＡボックスとエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡおよびＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰｌｐのｍＲＮＡ発現レベルを示す一連のグラフである。（ａ）は、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰｌｐのｍＲＮＡ発現レベルを示し、ここで、ＴＡＴＡボックス領域を標的とするｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｓｐ−０１ならびにエンハンサーを標的とするｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０７＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−２７およびｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０８＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−２７をｓｇＲＮＡとして使用した。  （ｂ）は、ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰｌｐのｍＲＮＡ発現レベルを示し、ここで、ＴＡＴＡボックス領域を標的とするｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０２およびｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０３；ならびにエンハンサーを標的とするｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０６＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０９、ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０６＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−１０およびｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０６＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−１９をｓｇＲＮＡとして使用した。ｍＲｏｓａ２６を対照として使用した。
【０１００】
【図２４】ｈＰＬＰ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示すグラフであり、Ｊｕｒｋａｔ細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、使用したｓｇＲＮＡは、ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０１〜ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−３６であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【０１０１】
【図２５】ｈＰＬＰ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示すグラフであり、２９３Ｔ細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、使用したｓｇＲＮＡは、ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０１〜ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−３６であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
別様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同一の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。本明細書で開示される一態様は、発現制御組成物に関する。
【０１０３】
発現制御組成物は、遺伝子重複により重複遺伝子の発現を制御するための組成物である。
【０１０４】
「遺伝子重複」とは、ゲノム内に２つ以上の同一遺伝子が存在することを意味する。遺伝子重複には、ゲノム内に同じ遺伝子の２つ以上の部分を有することも含まれる。たとえば、遺伝子重複とは、ゲノム内に２つ以上の完全長Ａ遺伝子、またはゲノム内に１つの完全長Ａ遺伝子と、Ａ遺伝子の１つまたは複数の部分、たとえばエクソン１が存在することを意味し得る。たとえば、遺伝子重複とは、ゲノム内に２つの全長Ｂ遺伝子と、Ｂ遺伝子の１つまたは複数の部分、たとえばエクソン１およびエクソン２が存在することを意味し得る。遺伝子重複の種類はさまざまであり得、遺伝子重複には、ゲノム内の全長遺伝子および／または遺伝子の部分配列の重複（すなわち２つ以上）が含まれる。
【０１０５】
加えて、遺伝子重複には、染色体の部分領域を複製する複製現象が含まれ、それは染色体の遺伝子組換え中に起こる。そのような遺伝子重複とは、遺伝子変異の一種であり、次世代に継代される。遺伝子重複は、遺伝子の部分領域が複製されないために起こる遺伝子の欠失とともに、遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０１０６】
ここで、遺伝子重複の対象、すなわち２つ以上の数で存在する遺伝子を「重複遺伝子（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）」と呼ぶ。
【０１０７】
重複遺伝子は、遺伝子重複によりゲノム内の総コピー数が増加した遺伝子であり得る。
【０１０８】
重複遺伝子は、遺伝子重複により部分領域のみが重複されている変異遺伝子であり得る。ここで、変異遺伝子は、遺伝子の全配列中の１つまたは複数のヌクレオチド配列が重複されている遺伝子であり得る。あるいは、変異遺伝子は、遺伝子重複により遺伝子の部分核酸断片が複製されている遺伝子であり得る。ここで、核酸断片は、５０ｂｐ以上のヌクレオチド配列を有し得る。
【０１０９】
遺伝子重複には、全ゲノム重複が含まれる。
【０１１０】
遺伝子重複には、標的遺伝子重複が含まれる。ここで、標的遺伝子重複とは、新しい種の環境変化への分化と適応において、特定の環境に適した関連遺伝子が増幅または消失し、ほとんどの複製がトランスポゾンにより行われる遺伝子重複の一種である。
【０１１１】
遺伝子重複には、異所性組換えが含まれる。ここで、異所性組換えは、相同染色体の減数分裂中の不均等なクロスオーバーに起因する複製のために２つの染色体間の反復配列の程度に従って起こる。クロスオーバーでの重複と相互欠失が発生する。異所性組換えは、転位因子などの典型的な反復遺伝因子によって媒介され、組換えによって引き起こされる複製をもたらす。
【０１１２】
遺伝子重複には、複製のずれが含まれる。ここで、複製のずれは、ＤＮＡ複製中のエラーによる短い遺伝子配列の複製であり、ＤＮＡポリメラーゼが変性ＤＮＡ鎖に誤って付着し、ＤＮＡ鎖が再び複製されるときに起こる。複製のずれはまた、反復遺伝要素によって頻繁に媒介される。
【０１１３】
遺伝子重複には、レトロトランスポジションが含まれる。ここで、レトロトランスポジションは、レトロウイルスまたはレトロエレメント侵入細胞によって媒介される複製であって、遺伝子の逆転写が行われてレトロ遺伝子が形成され、レトロ遺伝子の組換えにより遺伝子重複が行われる。レトロトランスポジションは、レトロ転位因子などの遺伝的因子によって媒介される。
【０１１４】
遺伝子重複は、重複遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現を増加させることができる。ここで、転写されたｍＲＮＡの発現は、遺伝子重複が起こらない状態と比較して増加し得る。
【０１１５】
遺伝子重複は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を増加させることができる。ここで、タンパク質の発現は、遺伝子重複が起こらない状態と比較して増加し得る。
【０１１６】
遺伝子重複は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の機能障害を引き起こし得る。
【０１１７】
ここで、機能不全は、タンパク質の機能亢進、抑制機能、および第３の機能であり得る。
【０１１８】
遺伝子重複は、遺伝子重複疾患を引き起こし得る。
【０１１９】
「遺伝子重複疾患」とは、遺伝子重複によって引き起こされる疾患であり、重複遺伝子の異常増幅により遺伝的異常を引き起こし、過剰発現またはそれによって異常に生成されるタンパク質によって病理学的特徴を誘導するすべての疾患または障害を含む。ここで、「病理学的特徴」とは、生物の細胞レベルでの変化、ならびに疾患に基づく組織、器官および個人レベルでの変化を指す。
【０１２０】
遺伝子重複疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。
【０１２１】
遺伝子重複疾患は、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌であり得る。
【０１２２】
ここで、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【０１２３】
遺伝子重複疾患は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２４】
遺伝子重複疾患は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子またはＡＫＴ２遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２５】
遺伝子重複疾患は、重複遺伝子の転写されたｍＲＮＡの発現の異常な増加によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２６】
遺伝子重複疾患は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の異常な増加によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２７】
発現制御組成物は、重複遺伝子の転写により生成されるｍＲＮＡの発現の制御に使用され得る。
【０１２８】
発現制御組成物は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の制御に使用され得る。
【０１２９】
発現制御組成物は、重複遺伝子の人為的な修飾または操作に使用され得る。
【０１３０】
ここで、「人為的に修飾または操作（人為的に修飾、操作または改変された）」とは、天然に存在する状態ではなく、人為的に修飾された状態を指す。以下、非天然に人為的に修飾または操作された重複遺伝子は、人為重複遺伝子と同義で使用され得る。
【０１３１】
「発現制御システム」とは、人為的に操作された重複遺伝子の発現の制御に起因して起こるすべての現象、ならびに発現制御システムに直接または間接的に関与するすべての材料、組成物、方法および使用を含む用語である。
【０１３２】
発現制御組成物は、重複遺伝子の転写調節領域の人為的な操作または修飾に使用され得る。
【０１３３】
ここで、「転写調節領域（転写制御領域）」とは、遺伝子のＤＮＡに基づいてＲＮＡを合成するプロセス全体を制御する領域であり、遺伝子のＤＮＡ配列および／または遺伝子の近位ＤＮＡ配列の転写因子と相互作用するすべての領域を含む。ここで、転写因子は、活性化されるとＤＮＡの特異領域、すなわち遺伝子に近い応答エレメントに結合し、それによって遺伝子発現を促進または阻害するタンパク質であり、応答要素は、転写調節領域に含まれる。転写調節領域の種類と位置は遺伝子に従って異なり得、同じ種でも個体間で核酸配列に違いがあり得る。
【０１３４】
転写調節領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターおよび／または遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）であり得る。
【０１３５】
プロモーターは、コアプロモーター、近位プロモーターおよび／または遠位プロモーターであり得る。
【０１３６】
ここで、コアプロモーターは、転写開始部位（ＴＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写因子結合部位および／またはＴＡＴＡボックスを含み得る。
【０１３７】
ＴＡＴＡボックスは、Ｒｐｂ４／Ｒｂｐ７の転写を開始するために使用される開始部位の２５塩基対上流に位置する領域であり得る。
【０１３８】
ＴＡＴＡボックスは、ＴＳＳの３０塩基対上流に位置する領域であり得る。
【０１３９】
ＴＡＴＡボックスは、ＴＳＳの４０〜１００塩基対上流に位置する領域であり得る。
【０１４０】
たとえば、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）−３'配列を含む領域であり得る。あるいは、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）−３'配列を含む領域であり得る。
【０１４１】
たとえば、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在する５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'配列からなる群より選択される１つまたは複数の配列を含む領域であり得る。
【０１４２】
たとえば、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在するＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）が結合する領域であり得る。
【０１４３】
ここで、近位プロモーターは、ＴＳＳ、ＣｐＧ部位および／または特定の転写因子結合部位の１〜３００ｂｐ上流の領域を含み得る。
【０１４４】
エンハンサーは、エンハンサーボックス（Ｅボックス）を含み得る。
【０１４５】
インシュレーターは、エンハンサーとプロモーターとの間の相互作用を阻害する領域、または抑制されたクロマチンの拡大を妨げる領域であり得る。
【０１４６】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、ＭＡＲおよびＳＡＲなどの多数のシス作用因子が存在する領域であり得る。本明細書に開示される一態様として、発現制御組成物は、ガイド核酸を含み得る。
【０１４７】
発現制御組成物は、重複遺伝子を標的とするガイド核酸またはそれをコードする核酸配列を含み得る。
【０１４８】
「ガイド核酸」とは、標的核酸、遺伝子または染色体を認識し、エディタータンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。ここで、ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体の部分ヌクレオチド配列に相補的に結合し得る。加えて、ガイド核酸の部分ヌクレオチド配列は、エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸と相互作用し、それによってガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【０１４９】
ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体の標的領域に位置するようにガイド核酸−エディタータンパク質複合体を誘導する機能を果たし得る。
【０１５０】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの形態で存在し得、５〜１５０ｎｔの核酸配列を有し得る。
【０１５１】
ガイド核酸は、１つの連続した核酸配列を有し得る。
【０１５２】
たとえば、１つの連続した核酸配列は（Ｎ）ｍであり得、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣもしくはＧ、またはＡ、Ｕ、ＣもしくはＧを表し、ｍは１〜１５０の整数である。
【０１５３】
ガイド核酸は、２つ以上の連続した核酸配列を有し得る。
【０１５４】
たとえば、２つ以上の連続核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣもしくはＧ、またはＡ、Ｕ、ＣもしくはＧを表し、ｍとｏは１〜１５０の整数であり、ｍとｏは互いに同じでも異なっていてもよい。
【０１５５】
ガイド核酸は、１つまたは複数のドメインを含み得る。
【０１５６】
ドメインは、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、またはテールドメインであり得るが、これらに限定されない。
【０１５７】
ここで、１つのガイド核酸は、２つ以上の機能的ドメインを有し得る。ここで、２つ以上の機能的ドメインは、互いに異なっていてもよい。一例として、１つのガイド核酸は、ガイドドメインと第１の相補的ドメインを有し得る。別の例では、１つのガイド核酸は、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインを有し得る。さらに別の例では、１つのガイド核酸は、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインを有し得る。あるいは、１つのガイド核酸に含まれる２つ以上の機能的ドメインは、互いに同じであり得る。一例として、１つのガイド核酸は、２つ以上の近位ドメインを有し得る。別の例として、１つのガイド核酸は、２つ以上のテールドメインを有し得る。しかしながら、１つのガイド核酸に含まれる機能的ドメインが同じドメインであるという説明は、２つの機能的ドメインの配列が同じであることを意味しない。配列が異なっていても、機能的に同じ機能を果たす場合、２つの機能的ドメインは同じドメインであり得る。
【０１５８】
機能的ドメインについては、以下で詳しく説明する。ｉ）ガイドドメイン
【０１５９】
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列と相補的に結合することができるドメインであり、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸との特異的な相互作用のために作用する。たとえば、ガイドドメインは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸における特定のヌクレオチド配列に位置するガイド核酸−エディタータンパク質複合体を誘導する機能を果たし得る。
【０１６０】
ガイドドメインは、１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６１】
一例では、ガイドドメインは、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６２】
別の例では、ガイドドメインは、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６３】
ガイドドメインは、ガイド配列を含み得る。
【０１６４】
「ガイド配列」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列である。ここで、ガイド配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１６５】
ガイド配列は、１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６６】
一例では、ガイド配列は、１０〜２５、１５〜２５または２０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６７】
別の例では、ガイド配列は、１０〜１５、１５〜２０または２０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６８】
加えて、ガイドドメインは、追加のヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【０１６９】
追加のヌクレオチド配列を利用して、ガイドドメインの機能を改善または低下させることができる。
【０１７０】
追加のヌクレオチド配列を利用して、ガイド配列の機能を改善または低下させることができる。
【０１７１】
追加のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７２】
一例では、追加のヌクレオチド配列は、２〜１０、４〜１０、６〜１０または８〜１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７３】
別の例では、追加のヌクレオチド配列は、１〜３、３〜６または７〜１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７４】
一実施形態では、追加のヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７５】
たとえば、追加のヌクレオチド配列は、１つのヌクレオチド配列Ｇ（グアニン）、または２つのヌクレオチド配列ＧＧであり得る。
【０１７６】
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の５'末端に配置され得る。
【０１７７】
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の３'末端に配置され得る。
ｉｉ）第１の相補的ドメイン
【０１７８】
「第１の相補的ドメイン」という用語は、後述する第２の相補的ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含むドメインであり、第２の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。たとえば、第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１７９】
第１の相補的ドメインは、相補的結合により第２の相補的ドメインと二本鎖を形成し得る。ここで、形成された二本鎖は、エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸と相互作用することによりガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成するように作用し得る。
【０１８０】
第１の相補的ドメインは、５〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８１】
一例では、第１の相補的ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８２】
別の例では、第１の相補的ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
ｉｉｉ）リンカードメイン
【０１８３】
「リンカードメイン」という用語は、２つ以上のドメインを連結するヌクレオチド配列であり、それらは２つ以上の同一または異なるドメインである。リンカードメインは、共有結合または非共有結合により２つ以上のドメインと連結され得、または共有結合もしくは非共有結合により２つ以上のドメインを連結し得る。
【０１８４】
リンカードメインは、１〜３０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８５】
一例では、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８６】
別の例では、リンカードメインは、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド配列であり得る。
ｉｖ）第２の相補的ドメイン
【０１８７】
「第２の相補的ドメイン」という用語は、上記の第１の相補的ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含むドメインであり、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。たとえば、第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１８８】
第２の相補的ドメインは、相補的結合により第１の相補的ドメインと二本鎖を形成し得る。ここで、形成された二本鎖は、エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸と相互作用することによりガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成するように作用し得る。第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインに相補的なヌクレオチド配列、および第１の相補的ドメインに対して相補性を有しないヌクレオチド配列、たとえば、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成しないヌクレオチド配列を有し得、第１の相補的ドメインよりも長い塩基配列を有し得る。
【０１８９】
第２の相補的ドメインは、５〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９０】
一例では、第２の相補的ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９１】
別の例では、第２の相補的ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
ｖ）近位ドメイン
【０１９２】
「近位ドメイン」という用語は、第２の相補的ドメインに隣接して位置するヌクレオチド配列である。
【０１９３】
近位ドメインは、その中に相補的なヌクレオチド配列を有し得、相補的なヌクレオチド配列により二本鎖で形成され得る。
【０１９４】
近位ドメインは、１〜２０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９５】
一例では、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０または１５〜２０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９６】
別の例では、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５または１５〜２０ヌクレオチド配列であり得る。
ｖｉ）テールドメイン
【０１９７】
「テールドメイン」という用語は、ガイド核酸の両端のうちの１つまたは複数の端に位置するヌクレオチド配列である。
【０１９８】
テールドメインは、その中に相補的なヌクレオチド配列を有していてもよいか、相補的なヌクレオチド配列のために二本鎖で形成されていてもよい。
【０１９９】
テールドメインは、１〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０２００】
一例では、テールドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０２０１】
別の例では、テールドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０２０２】
一方、ドメイン、すなわちガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインに含まれる核酸配列の一部または全体は、選択的または追加で化学修飾を含み得る。
【０２０３】
化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、これらに限定されない。
【０２０４】
ガイド核酸は、１つまたは複数のドメインを含む。
【０２０５】
ガイド核酸は、ガイドドメインを含み得る。
【０２０６】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメインを含み得る。
【０２０７】
ガイド核酸は、リンカードメインを含み得る。
【０２０８】
ガイド核酸は、第２の相補的ドメインを含み得る。
【０２０９】
ガイド核酸は、近位ドメインを含み得る。
【０２１０】
ガイド核酸は、テールドメインを含み得る。
【０２１１】
ここで、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のドメインが存在し得る。
【０２１２】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のガイドドメインを含み得る。
【０２１３】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の第１の相補的ドメインを含み得る。
【０２１４】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のリンカードメインを含み得る。
【０２１５】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の第２の相補的ドメインを含み得る。
【０２１６】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の近位ドメインを含み得る。
【０２１７】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のテールドメインを含み得る。
【０２１８】
ここで、ガイド核酸では、１種類のドメインが重複されていてもよい。
【０２１９】
ガイド核酸は、重複の有無にかかわらずいくつかのドメインを含み得る。
【０２２０】
ガイド核酸は、同じ種類のドメインを含み得る。ここで、同じ種類のドメインは、同じ核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
【０２２１】
ガイド核酸は、２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２２】
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２３】
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２４】
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２５】
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２６】
たとえば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］からなり得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なるまたは同じ標的のためのガイド配列を含み得、２つの第１の相補的ドメインと２つの第２の相補的ドメインは、同じまたは異なる核酸配列を有し得る。ガイドドメインが異なる標的のガイド配列を含む場合、ガイド核酸は２つの異なる標的に特異的に結合し得、ここで、特異的結合は、同時にまたは連続して行われ得る。加えて、リンカードメインは、特定の酵素によって切断され、ガイド核酸は、特定の酵素の存在下で２つまたは３つの部分に分割される。本明細書に開示される例示的な一実施形態では、ガイド核酸はｇＲＮＡであり得る。
【０２２７】
「ｇＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸に関して、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的とすることができるＲＮＡを指す。加えて、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸に特異的なＲＮＡであり、それはＣＲＩＳＰＲ酵素に結合し、標的遺伝子の転写調節領域にＣＲＩＳＰＲ酵素をガイドする。
【０２２８】
ｇＲＮＡは、複数のドメインを含み得る。各ドメインに基づき、相互作用は、ｇＲＮＡ鎖の３次元構造もしくは活性型において、またはこれらの鎖間で起こり得る。
【０２２９】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子、単一ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）；または二本鎖ｇＲＮＡ（２つ以上、一般には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と呼ばれ得る。
【０２３０】
例示的な一実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相補的な結合を形成することができるガイド配列を含むドメイン；第１の相補的ドメイン；リンカードメイン；第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメインである第２の相補的ドメイン；近位ドメイン；および任意にテールドメインを５'−３'方向に含み得る。
【０２３１】
別の実施形態では、二本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相補的な結合を形成することができるガイド配列を含むドメインおよび第１の相補的ドメインを含む第１鎖、ならびに、第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメインである第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、および任意にテールドメインを５'−３'方向に含む第２鎖を含み得る。
【０２３２】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと呼ばれ、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれ得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインと第１の相補的ドメインを含み得、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよび任意にテールドメインを含み得る。
【０２３３】
さらに別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相補的な結合を形成することができるガイド配列を含むドメイン；第１の相補的ドメイン；第２の相補的ドメイン；第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって５'−３'方向に第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメインを含み得る。
【０２３４】
ここで、第１の相補的ドメインは、天然の第１の相補的ドメインと相同性を有していてもよいし、天然の第１の相補的ドメインに由来していてもよい。加えて、第１の相補的ドメインは、天然に存在する種に応じて第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２３５】
例示的な一実施形態では、第１の相補的ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第１の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第１の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２３６】
たとえば、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ−３'がもたらされる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物であり得る。
【０２３７】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２３８】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインは、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍもしくはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓの第１の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第１の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２３９】
たとえば、第１の相補的ドメインがＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'、または５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２４０】
ここで、リンカードメインは、第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結するヌクレオチド配列であり得る。
【０２４１】
リンカードメインは、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインのそれぞれと共有結合または非共有結合を形成し得る。
【０２４２】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合により第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結し得る。
【０２４３】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子に使用するのに適しており、リンカードメインを使用して、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖に連結されるか、共有結合または非共有結合により第１鎖を第２鎖と連結することにより一本鎖ｇＲＮＡを生成することができる。
【０２４４】
リンカードメインを使用して、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに連結されるか、共有結合または非共有結合によりｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと連結することにより一本鎖ｇＲＮＡを生成することができる。
【０２４５】
ここで、第２の相補的ドメインは、天然の第２の相補的ドメインと相同性を有していてもよいし、天然の第２の相補的ドメインに由来していてもよい。加えて、第２の相補的ドメインは、天然に存在する種に従って第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２４６】
例示的な一実施形態では、第２の相補的ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第２の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第２の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２４７】
たとえば、第２の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するヌクレオチド配列には下線が引かれている）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎとｍのそれぞれは、ヌクレオチドの数を表し得、ここで、ｎは１〜１５の整数であり得、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。加えて、（Ｘ）ｍは、同じヌクレオチドのｍ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｍ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２４８】
別の例において、第２の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するヌクレオチド配列には下線が引かれている）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）（Ｘ）ｍ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎとｍのそれぞれは、ヌクレオチドの数を表し得、ここで、ｎは１〜１５の整数であり得、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。加えて、（Ｘ）ｍは、同じヌクレオチドのｍ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｍ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２４９】
別の実施形態では、第２の相補的ドメインは、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍもしくはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓの第２の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第２の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２５０】
たとえば、第２の相補的ドメインがＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'、または５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するヌクレオチド配列には下線が引かれている）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有し得るヌクレオチド配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎとｍのそれぞれは、ヌクレオチドの数を表し得、ここで、ｎは１〜１０の整数であり得、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。加えて、（Ｘ）ｍは、同じヌクレオチドのｍ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｍ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２５１】
ここで、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインは、互いに相補的に結合し得る。
【０２５２】
第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインは、相補的結合により二本鎖を形成し得る。
【０２５３】
形成された二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用し得る。
【０２５４】
任意に、第１の相補的ドメインは、第２鎖の第２の相補的ドメインに相補的に結合しない追加のヌクレオチド配列を含み得る。
【０２５５】
ここで、追加のヌクレオチド配列は、１〜１５ヌクレオチド配列であり得る。たとえば、追加のヌクレオチド配列は、１〜５、５〜１０または１０〜１５ヌクレオチド配列であり得る。
【０２５６】
ここで、近位ドメインは、第２の相補的ドメインの３'端方向に位置するドメインであり得る。
【０２５７】
近位ドメインは、天然の近位ドメインと相同性を有していてもよいし、天然の近位ドメインに由来していてもよい。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に従ってヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれる近位ドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２５８】
例示的な一実施形態では、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の近位ドメイン、またはそれらに由来する近位ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２５９】
たとえば、近位ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインである場合、近位ドメインは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、近位ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６０】
さらに別の例では、近位ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインである場合、近位ドメインは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、近位ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜４０の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６１】
ここで、テールドメインは、一本鎖ｇＲＮＡの３'末端または二本鎖ｇＲＮＡの第１の鎖または第２鎖に選択的に付加され得るドメインである。
【０２６２】
テールドメインは、天然のテールドメインと相同性を有していてもよいし、天然のテールドメインに由来していてもよい。加えて、テールドメインは、天然に存在する種に従ってヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれるテールドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれるテールドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２６３】
例示的な一実施形態では、テールドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のテールドメイン、またはそれらに由来するテールドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２６４】
たとえば、テールドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインである場合、テールドメインは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、テールドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６５】
別の例では、テールドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインである場合、テールドメインは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、テールドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ−３'がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６６】
別の実施形態では、テールドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写方法に関与する３'末端に１〜１０ヌクレオチド配列を含み得る。
【０２６７】
たとえば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される場合、テールドメインはＤＮＡテンプレートの３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドまたは代替ヌクレオチドを含み得る。
【０２６８】
ｇＲＮＡは、上記のように複数のドメインを含み得るため、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され、相互作用は、各ドメインに基づき、ｇＲＮＡの三次元構造の鎖もしくは活性型において、またはこれらの鎖間で起こり得る。
【０２６９】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子）；または二本鎖ｇＲＮＡ（２つ以上、一般には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と呼ばれ得る。
二本鎖ｇＲＮＡ
【０２７０】
二本鎖ｇＲＮＡは、第１鎖と第２鎖からなる。
【０２７１】
ここで、第１鎖は、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−３'からなり、
第２鎖は、５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または
５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'
からなる。
【０２７２】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと呼ばれ得、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれ得る。
【０２７３】
ここで、第１鎖と第２鎖は、追加のヌクレオチド配列を任意に含み得る。
【０２７４】
一例では、第１鎖は、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−３'であり得る。
【０２７５】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列であり、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸上の標的配列に従って変化し得るヌクレオチド配列領域である。
【０２７６】
ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２の相補的ドメインと相補的な結合を形成することができる第１の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて変化し得る。Ｑは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜３５の整数である。
【０２７７】
たとえば、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第１の相補的ドメインまたはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２７８】
別の例では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第１の相補的ドメインまたはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２７９】
さらに別の例では、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補的ドメインまたはストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８０】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃのそれぞれは、選択的に追加のヌクレオチド配列であり、ここで、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ａ、ｂおよびｃのそれぞれは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。
【０２８１】
例示的な一実施形態では、第２鎖は５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'；または５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'であり得る。
【０２８２】
別の実施形態では、第２鎖は、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'；または５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０２８３】
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１の相補的ドメインと相補的な結合を形成することができる第２の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｈはヌクレオチドの数であり得、それは５〜５０の整数である。
【０２８４】
たとえば、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８５】
別の例では、第２の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８６】
さらに別の例では、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８７】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインと部分的または完全な相同性を有し得る近位ドメインを含むヌクレオチド配列であり、近位ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。  Ｐは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｋは、１〜２０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０２８８】
たとえば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８９】
別の例では、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９０】
さらに別の例では、近位ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９１】
（Ｆ）ｉは、テールドメインを含み、天然に存在する種のテールドメインと部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得、テールドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｆは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択されてもよく、ｉはヌクレオチドの数であり得、それは１〜５０の整数である。
【０２９２】
たとえば、テールドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９３】
別の例では、テールドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９４】
さらに別の例では、テールドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'、または５'−  ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９５】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端に１〜１０ヌクレオチド配列を含み得る。
【０２９６】
たとえば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される場合、テールドメインはＤＮＡテンプレートの３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドまたは代替ヌクレオチドを含み得る。
【０２９７】
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加されるヌクレオチド配列であり得、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。
一本鎖ｇＲＮＡ
【０２９８】
一本鎖ｇＲＮＡは、第１の一本鎖ｇＲＮＡと第２の一本鎖ｇＲＮＡに分類され得る。
第１の一本鎖ｇＲＮＡ
【０２９９】
第１の一本鎖ｇＲＮＡは、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖がリンカードメインにより連結されている一本鎖ｇＲＮＡである。
【０３００】
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−３'、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'
からなり得る。
【０３０１】
第１の一本鎖ｇＲＮＡは、追加のヌクレオチド配列を選択的に含み得る。
【０３０２】
例示的な一実施形態では、第１の一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−３'；
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'；または
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【０３０３】
別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−３'；
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【０３０４】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列であり、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸上の標的配列に従って変化し得るヌクレオチド配列領域である。
【０３０５】
ここで、（Ｑ）ｍは、第２の相補的ドメインと相補的な結合を形成することができる第１の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて変化し得る。Ｑは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜３５の整数である。
【０３０６】
たとえば、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０７】
別の例では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０８】
さらに別の例では、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０９】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含むヌクレオチド配列であり、第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結し、それによって一本鎖ｇＲＮＡを生成する。ここで、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｊは、１〜３０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３１０】
（Ｚ）ｈは、第２の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第１の相補的ドメインと相補的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて改変され得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｈはヌクレオチドの数であり得、それは５〜５０の整数である。
【０３１１】
たとえば、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１２】
別の例では、第２の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１３】
さらに別の例では、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１４】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインと部分的または完全な相同性を有し得る近位ドメインを含むヌクレオチド配列であり、近位ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｐは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｋは、１〜２０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３１５】
たとえば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１６】
別の例では、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１７】
さらに別の例では、近位ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１８】
（Ｆ）ｉは、テールドメインを含み、天然に存在する種のテールドメインと部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得、テールドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｆは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択されてもよく、ｉはヌクレオチドの数であり得、それは１〜５０の整数である。
【０３１９】
たとえば、テールドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３２０】
別の例では、テールドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３２１】
さらに別の例では、テールドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'、または５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３２２】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端に１〜１０ヌクレオチド配列を含み得る。
【０３２３】
たとえば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される場合、テールドメインはＤＮＡテンプレートの３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドまたは代替ヌクレオチドを含み得る。
【０３２４】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加されるヌクレオチド配列であり得、ここで、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。
第２の一本鎖ｇＲＮＡ
【０３２５】
第２の一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインからなる一本鎖ｇＲＮＡであり得る。
【０３２６】
ここで、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、以下のものからなり得る：
５'−［第２の相補的ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'；または
５'−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'。
【０３２７】
第２の一本鎖ｇＲＮＡは、追加のヌクレオチド配列を選択的に含み得る。
【０３２８】
例示的な一実施形態では、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｚ）ｈ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―３'であり得る。
【０３２９】
別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―３'であり得る。
【０３３０】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列であり、標的遺伝子の転写調節領域上の標的配列に従って変化することができるヌクレオチド配列領域である。（Ｑ）ｍは、第１の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第２の相補的ドメインと相補的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて変化し得る。Ｑは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜３５の整数である。
【０３３１】
たとえば、第１の相補的ドメインが、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'、または５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３３２】
（Ｚ）ｈは、第２の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第２の相補的ドメインと相補的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜５０の整数である。
【０３３３】
たとえば、第２の相補的ドメインが、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第２の相補的ドメイン、またはＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'、または５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３３４】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含むヌクレオチド配列であり、それは第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結する。ここで、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｊは、１〜３０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３３５】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃの各々は、選択的に追加されるヌクレオチド配列であり得、ここで、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ａ、ｂおよびｃは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。本明細書の例示的な一実施形態では、ガイド核酸は、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列に相補的に結合するｇＲＮＡであり得る。
【０３３６】
「標的配列」とは、標的遺伝子の転写調節領域に存在するヌクレオチド配列であり、具体的には、標的遺伝子の転写調節領域内の標的領域の部分ヌクレオチド配列であり、ここで、「標的領域」とは、標的遺伝子の転写調節領域内のガイド核酸エディタータンパク質によって修飾され得る領域である。
【０３３７】
以下、標的配列は、２種類のヌクレオチド配列情報の両方を指すために使用され得る。たとえば、標的遺伝子の場合、標的配列は、標的遺伝子ＤＮＡの転写鎖のヌクレオチド配列情報、または非転写鎖のヌクレオチド配列情報を指し得る。
【０３３８】
たとえば、標的配列は、標的遺伝子Ａの標的領域内の部分ヌクレオチド配列（転写鎖）、すなわち５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'と、それに相補的なヌクレオチド配列（非転写鎖）、すなわち５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'を指し得る。
【０３３９】
標的配列は、５〜５０ｎｔ配列であり得る。
【０３４０】
例示的な一実施形態では、標的配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列または２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３４１】
標的配列は、ガイド核酸結合配列またはガイド核酸非結合配列を含む。
【０３４２】
「ガイド核酸結合配列」とは、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的に結合していてもよい。標的配列およびガイド核酸結合配列は、標的遺伝子の転写調節領域に応じて遺伝子改変または編集される標的に従って変化し得るヌクレオチド配列であり得、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸配列に従ってさまざまな手法で設計され得る。
【０３４３】
「ガイド核酸非結合配列」とは、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的に結合していなくてもよい。加えて、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と相補性を有するヌクレオチド配列であり得、ガイド核酸結合配列と相補的に結合していてもよい。
【０３４４】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の部分ヌクレオチド配列と、標的配列に含まれる互いに異なる配列順序を有する２つのヌクレオチド配列のうちの１つのヌクレオチド配列、すなわち、互いに相補的に結合することができる２つのヌクレオチド配列のうちの１つであり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、標的配列のガイド核酸結合配列以外のヌクレオチド配列であり得る。
【０３４５】
たとえば、標的遺伝子Ａの転写調節領域内の標的領域の部分ヌクレオチド配列、すなわち５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'と、ヌクレオチド配列、すなわち、それに相補的である５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'が標的配列として使用される場合、ガイド核酸結合配列は、２つの標的配列、すなわち５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'または５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'のうちの１つであり得る。ここで、ガイド核酸結合配列が５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'である場合、ガイド核酸非結合配列は５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'であり得、ガイド核酸結合配列が５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'である場合、ガイド核酸非結合配列は５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'であり得る。
【０３４６】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の１つ、すなわち、転写鎖と同じヌクレオチド配列および非転写鎖と同じヌクレオチド配列であり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、標的配列のガイド核酸結合配列以外のヌクレオチド配列、すなわち、転写鎖と同じヌクレオチド配列および非転写鎖と同じであるヌクレオチド配列から選択されるものであり得る。
【０３４７】
ガイド核酸結合配列は、標的配列と同じ長さを有し得る。
【０３４８】
ガイド核酸非結合配列は、標的配列またはガイド核酸結合配列と同じ長さを有し得る。
【０３４９】
ガイド核酸結合配列は、５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５０】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸結合配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列または２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５１】
ガイド核酸非結合配列は、５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５２】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸非結合配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列または２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５３】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に部分的または完全に相補的に結合してもよく、ガイド核酸結合配列の長さは、ガイド配列の長さと同じであり得る。
【０３５４】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的なヌクレオチド配列、たとえば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３５５】
一例として、ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的ではない１〜８ヌクレオチド配列を有していても、含んでいてもよい。
【０３５６】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相同性を有してもよく、ガイド核酸非結合配列の長さはガイド配列の長さと同じであり得る。
【０３５７】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相同性を有するヌクレオチド配列、たとえば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相同性または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３５８】
一例では、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相同ではない１〜８ヌクレオチド配列を有していても含んでいてもよい。
【０３５９】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と相補的に結合してもよく、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と同じ長さを有していてもよい。
【０３６０】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列、たとえば、少なくとも９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３６１】
一例では、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的ではない１〜２ヌクレオチド配列を有しても含んでいてもよい。
【０３６２】
加えて、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の付近に位置するヌクレオチド配列であり得る。
【０３６３】
一例では、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６４】
加えて、ガイド核酸非結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の付近に位置するヌクレオチド配列であり得る。
【０３６５】
一例では、ガイド核酸非結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６６】
「ターゲティング」とは、標的遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列との相補的結合を指す。ここで、相補的結合は、１００％完全な相補的結合、または７０％以上１００％未満の不完全な相補的結合であり得る。したがって、「ターゲティングｇＲＮＡ」とは、標的遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列に相補的に結合するｇＲＮＡを指す。
【０３６７】
本明細書に開示される標的遺伝子は、重複遺伝子であり得る。
【０３６８】
本明細書に開示される標的遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子および／またはＡＰＰ遺伝子であり得る。
【０３６９】
本明細書に開示される標的遺伝子は、癌遺伝子であり得る。
【０３７０】
ここで、癌遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、  ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子および／またはＡＫＴ２遺伝子であり得る。
【０３７１】
例示的な実施形態では、本明細書で開示される標的配列は、重複遺伝子のプロモーター領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７２】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３７３】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３７４】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７５】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７６】
一例では、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７７】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＴＴＳを含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７８】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ結合領域を含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７９】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子の転写因子結合領域を含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８０】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＴＡＴＡボックスを含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８１】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）−３'配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８２】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）−３'配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８３】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'配列からなる群より選択される１つまたは複数の配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８４】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在するＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）結合核酸配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８５】
別の例では、標的配列は、重複遺伝子の近位プロモーター領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８６】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＴＳＳの１〜３００ｂｐの上流領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８７】
さらに別の例では、標的配列は、重複遺伝子の遠位プロモーター領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８８】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８９】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９０】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９１】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９２】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９３】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のエンハンサーボックス（Ｅボックス）を含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９４】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のイントロンに存在するエンハンサー領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９５】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子のインシュレーター領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９６】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９７】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９８】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９９】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４００】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子のサイレンサー領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０１】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０２】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０３】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０４】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０５】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子の遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０６】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０７】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０８】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０９】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１０】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１１】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４１２】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４１３】
ここで、重複遺伝子の転写調節領域は、重複遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターまたは遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）であり得る。
【０４１４】
「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列」とは、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列である。ここで、ＰＡＭ配列は、エディタータンパク質およびエディタータンパク質由来の種の種類に従って異なるヌクレオチド配列を有し得る。
【０４１５】
ここで、ＰＡＭ配列は、たとえば、以下の配列の１つまたは複数の配列（５'−３'の方向で説明される）であり得る。
【０４１６】
ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）；ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴである）；ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｗは、ＡまたはＴである）；ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）；ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｒは、ＡまたはＧである）；ＴＴＮ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）。
【０４１７】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１８】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１９】
例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２０】
別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＧＧＮＧ−３'および／または５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＧＧＮＧ−３'および／または５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２１】
さらに別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２２】
例示的な一実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＹ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＹ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２３】
別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＮ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＮ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２４】
さらに別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'、および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＶ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'、および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＶ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２５】
例示的な一実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＴＴＮ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＴＴＮ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２６】
以下、本明細書に開示される例示的な実施形態で使用され得る標的配列の例を、表１、２、３、４、５および６に列挙する。表１、２、３、４、５および６に開示される標的配列は、ガイド核酸非結合配列であり、その相補的配列、すなわちガイド核酸結合配列は、表に列挙された配列から予測され得る。加えて、表１、２、３、４、５および６に示されるｓｇＲＮＡは、エディタータンパク質に応じて、ＳｐＣａｓ９の場合はＳｐ、ＣｊＣａｓ９の場合はＣｊと命名した。
［表１］
ＳｐＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子の標的配列
【表１】
2020536501.tif 000003
［表２］
ＣｊＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子の標的配列
【表２】
2020536501.tif 000004
［表３］
ＳｐＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子の標的配列
【表３】
2020536501.tif 000005
【表４】
2020536501.tif 000006
［表４］
ＣｊＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子の標的配列
【表５】
2020536501.tif 000007
【表６】
2020536501.tif 000008
［表５］
ＳｐＣａｓ９のマウスＰｌｐ１遺伝子の標的配列
【表７】
2020536501.tif 000009
【表８】
2020536501.tif 000010
【表９】
2020536501.tif 000011
［表６］
ＣｊＣａｓ９のマウスＰｌｐ１遺伝子の標的配列
【表１０】
2020536501.tif 000012
【表１１】
2020536501.tif 000013
本明細書に開示される一態様として、発現制御組成物は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含み得る。
【０４２７】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る。
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列。
【０４２８】
重複遺伝子に関する説明は上記の通りである。
【０４２９】
転写調節領域に関する説明は上記の通りである。
【０４３０】
標的配列に関する説明は上記の通りである。
【０４３１】
発現制御組成物は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を含み得る。
【０４３２】
「ガイド核酸−エディタータンパク質複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用を介して形成される複合体を指す。
【０４３３】
ガイド核酸に関する説明は上記の通りである。
【０４３４】
「エディタータンパク質」という用語は、核酸に直接結合するか、核酸に直接結合することなく、核酸と相互作用することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【０４３５】
ここで、核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体に含まれる核酸であり得る。
【０４３６】
ここで、核酸はガイド核酸であり得る。
【０４３７】
エディタータンパク質は酵素であり得る。
【０４３８】
ここで、「酵素」という用語は、核酸、遺伝子または染色体を切断することができるドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【０４３９】
酵素は、ヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０４４０】
エディタータンパク質は、完全な活性酵素を含み得る。
【０４４１】
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の核酸、遺伝子または染色体切断機能と同じ機能を有する酵素を指す。たとえば、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素は、二本鎖ＤＮＡを完全に切断する完全な活性酵素であり得る。別の例として、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素が人為的改変によりアミノ酸配列の部分配列の欠失または置換を受ける場合、人為的に改変された酵素バリアントは、野性型酵素のように二本鎖ＤＮＡを切断し、人為的に改変された酵素バリアントは、完全な活性酵素であり得る。
【０４４２】
加えて、完全な活性酵素は、野性型酵素と比較して改善された機能を有する酵素を含み得る。たとえば、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素の修飾または操作された特定の形態は、野性型酵素よりも大きい完全な酵素活性、すなわち、二本鎖ＤＮＡを切断する活性の増加を有し得る。
【０４４３】
エディタータンパク質は、不完全または部分的に活性な酵素を含み得る。
【０４４４】
ここで、「不完全または部分的に活性な酵素」とは、野性型酵素の核酸、遺伝子または染色体切断機能のいくつかを有する酵素を指す。たとえば、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素の修飾または操作された特定の形態は、第１の機能を有する形態または第２の機能を有する形態であり得る。ここで、第１の機能は、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する機能であり、第２の機能は、二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する機能であり得る。ここで、第１の機能を有する酵素または第２の機能を有する酵素は、不完全または部分的に活性な酵素であり得る。
【０４４５】
エディタータンパク質は不活性酵素を含み得る。
【０４４６】
ここで、「不活性酵素」とは、野性型酵素の核酸、遺伝子または染色体切断機能が完全に不活性化されている酵素を指す。たとえば、野性型酵素の修飾または操作された特定の形態は、第１および第２の機能の両方が失われた形態であり得、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能と、その第２鎖を切断する第２の機能の両方が失われている。ここで、第１および第２の機能のすべてが失われている酵素は、不活性な酵素であり得る。
【０４４７】
エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
【０４４８】
ここで、「融合タンパク質」という用語は、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることにより生成されるタンパク質を指す。
【０４４９】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同じまたは異なる機能を有する機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０４５０】
融合タンパク質は、機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素のアミノ末端もしくはその近傍；酵素のカルボキシル末端もしくはその近傍；酵素の中央部；またはそれらの組合せの１つまたは複数に付加された形態であり得る。
【０４５１】
ここで、機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または（ペプチドを含む）タンパク質の単離および精製用のタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０４５２】
機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、チオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質であって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などのタンパク質を含むが、本発明はそれらに限定されない。
【０４５３】
加えて、機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在化配列またはシグナル（ＮＬＳ）または核外移行配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０４５４】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（たとえば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−α由来のＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトＰ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよび配列ＰＫＱＫＫＲＫ；デルタ（Ｄ）型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０４５５】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、特定の機能を果たさない非機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ここで、非機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素機能に影響を及ぼさないドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０４５６】
融合タンパク質は、非機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素のアミノ末端もしくはその近傍；酵素のカルボキシル末端もしくはその近傍；酵素の中央部；またはそれらの組合せの１つまたは複数に付加された形態であり得る。
【０４５７】
エディタータンパク質は、天然の酵素または融合タンパク質であり得る。
【０４５８】
エディタータンパク質は、部分的に修飾された天然酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０４５９】
エディタータンパク質は、人為的に生成された酵素または融合タンパク質であり得、それは天然には存在しない。
【０４６０】
エディタータンパク質は、部分的に修飾された人為的な酵素または融合タンパク質の形態で存在し得、それは天然には存在しない。
【０４６１】
ここで、修飾は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、付加、またはそれらの組合せであり得る。
【０４６２】
あるいは、修飾は、エディタータンパク質をコードするヌクレオチド配列内のいくつかのヌクレオチドの置換、除去、追加、またはそれらの組合せであり得る。
【０４６３】
加えて、任意に、発現制御組成物は、挿入される所望の特定のヌクレオチド配列、またはそれをコードする核酸配列を有するドナーをさらに含み得る。
【０４６４】
ここで、挿入される核酸配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の部分ヌクレオチド配列であり得る。
【０４６５】
ここで、挿入される核酸配列は、重複遺伝子の転写調節領域内に変異を導入するために使用される核酸配列であり得る。ここで、変異は、重複遺伝子の転写を妨げる変異であり得る。
【０４６６】
「ドナー」という用語は、損傷した遺伝子または核酸の相同組換え（ＨＲ）に基づく修復に役立つヌクレオチド配列を指す。
【０４６７】
ドナーは、二本鎖または一本鎖核酸であり得る。
【０４６８】
ドナーは、線形または円形で存在し得る。
【０４６９】
ドナーは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０４７０】
たとえば、ドナーは、特定のヌクレオチド配列が挿入される位置、たとえば、損傷した核酸の上流（左）および下流（右）にあるヌクレオチド配列のそれぞれと相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。ここで、挿入される特定のヌクレオチド配列は、損傷した核酸の下流のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列と、損傷した核酸の上流のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列との間に位置し得る。ここで、相同性を有するヌクレオチド配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性または完全な相同性を有し得る。
【０４７１】
ドナーは、特定の核酸配列を含み得る。
【０４７２】
ここで、特定の核酸配列は、標的遺伝子の部分ヌクレオチド配列またはそれに類似したヌクレオチド配列であり得る。標的遺伝子の部分ヌクレオチド配列は、たとえば、変異を有する標的遺伝子を編集するための変異が編集された正常な核酸配列を含み得る。あるいは、標的遺伝子の部分類似ヌクレオチド配列は、正常な標的遺伝子を変異させるための標的遺伝子の部分正常核酸配列の一部が修飾された変異誘導核酸配列を含み得る。
【０４７３】
ここで、特定の核酸配列は、外因性核酸配列であり得る。たとえば、外因性核酸配列は、標的遺伝子を有する細胞内で発現されることが所望される外因性遺伝子であり得る。
【０４７４】
ここで、特定の核酸配列は、標的遺伝子を有する細胞内で発現されることが所望される核酸配列であり得る。たとえば、特定の核酸配列は、標的遺伝子を有する細胞で発現する特定の遺伝子であり得、この場合、特定の遺伝子は、ドナーを有する発現制御組成物により細胞内でコピー数が増加し、ひいては高度に発現され得る。
【０４７５】
任意に、ドナーは、追加のヌクレオチド配列を含み得る。ここで、追加の核酸配列は、ドナーの安定性、標的への挿入の効率、または相同組換えの効率を高めるのに役立ち得る。
【０４７６】
たとえば、追加のヌクレオチド配列は、ＡおよびＴヌクレオチドリッチな核酸配列、すなわちＡ−Ｔリッチなドメインであり得る。たとえば、追加のヌクレオチド配列は、足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）であり得る。
【０４７７】
本明細書に開示されるガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、さまざまな手法で対象内に送達または導入され得る。
【０４７８】
ここで、「対象」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質、またはガイド核酸エディタータンパク質複合体が機能する生物、または生物から得られた検体またはサンプルを指す。
【０４７９】
対象は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体の標的遺伝子または染色体を含む生物であり得る。
【０４８０】
生物は、動物、動物組織または動物細胞であり得る。
【０４８１】
生物は、ヒト、ヒト組織またはヒト細胞であり得る。
【０４８２】
組織は、眼球、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、筋肉組織または血液であり得る。
【０４８３】
細胞は、線維芽細胞、シュワン細胞、神経細胞、希突起膠細胞、筋芽細胞、グリア細胞、マクロファージ、免疫細胞、肝細胞、網膜色素上皮細胞、癌細胞または幹細胞であり得る。
【０４８４】
検体またはサンプルは、標的遺伝子または染色体を含む生物から取得され得、唾液、血液、網膜組織、脳組織、シュワン細胞、希突起膠細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、マクロファージ、肝細胞、免疫細胞、癌細胞または幹細胞であり得る。
【０４８５】
好ましくは、対象は、重複遺伝子を含む生物であり得る。ここで、対象は、重複遺伝子が遺伝子重複状態にある生物であり得る。
【０４８６】
ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態もしくは混合形態で対象に送達または導入され得る。
【０４８７】
ここで、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、当該技術分野で公知の方法により、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態もしくは混合形態で対象に送達または導入され得る。
【０４８８】
あるいは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物の形態は、ベクター、非ベクターもしくはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０４８９】
ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（たとえばプラスミド）であり得る。
【０４９０】
非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
【０４９１】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０４９２】
ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０４９３】
一例では、ベクターは、ガイド核酸とエディタータンパク質をそれぞれコードする核酸配列を同時に含み得る。
【０４９４】
別の例では、ベクターは、ガイド核酸をコードする核酸配列を含み得る。
【０４９５】
一例として、ガイド核酸に含まれるドメインは、すべて１つのベクターに含まれていてもよいし、分割されて異なるベクターに含まれていてもよい。
【０４９６】
別の例では、ベクターは、エディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０４９７】
一例として、エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードする核酸配列は１つのベクターに含まれていてもよいし、分割されていくつかのベクターに含まれていてもよい。
【０４９８】
ベクターは、１つまたは複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
【０４９９】
ここで、調節／制御コンポーネントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
【０５００】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０５０１】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０５０２】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０５０３】
プロモーターは、対象特異的なプロモーターであり得る。
【０５０４】
プロモーターは、ウイルス性または非ウイルス性プロモーターであり得る。
【０５０５】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に応じて適切なプロモーターを使用してもよい。
【０５０６】
たとえば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。たとえば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。
【０５０７】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【０５０８】
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０５０９】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【０５１０】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【０５１１】
ここで、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０５１２】
一般に、ウイルスは宿主（たとえば細胞）に感染し得、それによってウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入するか、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。そのような特徴を有するウイルスを使用して、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を対象に導入することができる。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（たとえば細胞）内で一時的に発現され得る。あるいは、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、長期間にわたって（たとえば、１、２もしくは３週間、１、２、３、６もしくは９か月、１年もしくは２年、または恒久的に）対象（たとえば細胞）内で連続的に発現され得る。
【０５１３】
ウイルスのパッケージング容量は、ウイルスの種類に応じて、少なくとも２〜５０ｋｂで異なり得る。そのようなパッケージング容量に応じて、ガイド核酸もしくはエディタータンパク質を含むウイルスベクター、またはガイド核酸とエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターを設計することができる。あるいは、ガイド核酸、エディタータンパク質および追加のコンポーネントを含むウイルスベクターを設計することができる。
【０５１４】
一例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【０５１５】
別の例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【０５１６】
さらに別の例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【０５１７】
さらに別の例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、たとえば本明細書に挙げたウイルスの１つまたは複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
【０５１８】
別の例示的な実施形態では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０５１９】
非ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０５２０】
非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡ、またはそれらの混合物であり得る。
【０５２１】
非ベクターは、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、文献［Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］に記載）、脂質媒介トランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、またはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０５２２】
一例では、エレクトロポレーションを介した送達は、細胞と、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列とを、カートリッジ、チャンバまたはキュベット内で混合し、細胞に所定の持続時間および振幅で電気刺激を適用することにより行われ得る。
【０５２３】
別の例では、非ベクターは、ナノ粒子を使用して送達され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（たとえば、磁性ナノ粒子、シリカなど）または有機ナノ粒子（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた脂質など）であり得る。ナノ粒子の外表面には、付着可能な正に荷電したポリマー（たとえば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリンなど）と共役されていてもよい。
【０５２４】
特定の実施形態では、非ベクターは、脂質シェルを使用して送達され得る。
【０５２５】
特定の実施形態では、非ベクターは、エクソソームを使用して送達され得る。エクソソームは、タンパク質とＲＮＡを導入するための内因性のナノ小胞であり、それはＲＮＡを脳や別の標的器官に送達することができる。
【０５２６】
特定の実施形態では、非ベクターは、リポソームを使用して送達され得る。リポソームは、内部の水性区画を囲む単一または複数の層状脂質二重層と、比較的不透明な外部の親油性リン脂質二重層で構成される球状小胞構造である。リポソームはいくつかの異なる種類の脂質から作られ得るが、リン脂質は、最も一般には、薬物担体としてリポソームを生成するために使用される。
【０５２７】
加えて、非ベクターの送達のための組成物は、他の添加剤を含み得る。
【０５２８】
エディタータンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５２９】
エディタータンパク質は、当該技術分野で知られている方法により、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３０】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、文献［Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］に記載）、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達またはそれらの組合せにより対象に送達または導入され得る。
【０５３１】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列とともに送達され得る。
【０５３２】
一例では、エレクトロポレーションを介した導入は、ガイド核酸と共に、またはガイド核酸無しでエディタータンパク質が導入される細胞をカートリッジ、チャンバまたはキュベットにおいて混合し、細胞に所定の持続時間と振幅で電気刺激を加えることにより行われ得る。
【０５３３】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、核酸とタンパク質を混合する形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３４】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３５】
たとえば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。エディタータンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０５３６】
一例では、ガイド核酸とエディタータンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸とタンパク質型エディタータンパク質を含むガイド核酸−エディタータンパク質複合体、すなわちリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３７】
本明細書に開示されるガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体を修飾し得る。
【０５３８】
たとえば、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体の配列の修飾を誘導する。  その結果、標的核酸、遺伝子または染色体により発現されるタンパク質は、構造および／または機能について修飾され得るか、タンパク質の発現が制御または阻害され得る。
【０５３９】
ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
【０５４０】
一例では、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写調節領域を操作または修飾して、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を制御（たとえば、抑制、阻害、減少、増加、または促進）することができ、または、その活性が制御されている（たとえば、抑制、阻害、減少、増加、または促進されている）または修飾されたタンパク質を発現する。
【０５４１】
ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、遺伝子の転写および翻訳段階で作用し得る。
【０５４２】
一例では、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写を促進または阻害し、それによって標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を制御（たとえば、抑制、阻害、減少、増加または促進）し得る。
【０５４３】
別の例では、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または阻害し、それによって標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を制御（たとえば、抑制、阻害、減少、増加または促進）し得る。本明細書に開示される例示的な一実施形態では、発現制御組成物は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。
【０５４４】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ酵素またはそれをコードする核酸配列。
【０５４５】
重複遺伝子に関する説明は上記の通りである。
【０５４６】
転写調節領域に関する説明は上記の通りである。
【０５４７】
標的配列に関する説明は上記の通りである。
【０５４８】
発現制御組成物は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を含み得る。
【０５４９】
「ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体」という用語は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素との相互作用により形成される複合体を指す。
【０５５０】
ｇＲＮＡに関する説明は上記の通りである。
【０５５１】
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの主要なタンパク質コンポーネントであり、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをもたらす。
【０５５２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはポリペプチド（もしくはタンパク質）をコードする配列を有する核酸であり得る。
【０５５３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５５４】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子の研究（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４）ならびにｇＲＮＡと複合させたストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４；およびＡｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定されていた。
【０５５５】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つのローブ、すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブとヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブとを含み、各ローブはいくつかのドメインを含む。
【０５５６】
ＲＥＣローブは、アルギニンリッチなブリッジヘリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。
【０５５７】
ここで、ＢＨドメインは、アルギニンリッチな長いα−ヘリックスの領域であり、ＲＥＣ１ドメインとＲＥＣ２ドメインは、ｇＲＮＡに形成された二本鎖、たとえば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡを認識するのに重要な役割を果たす。
【０５５８】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ様ドメインを包含し、ＨＮＨドメインは、ＨＮＨ様ドメインを包含する。
【０５５９】
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、たとえば、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成しない鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、当該技術分野ではＲｕｖＣ  Ｉドメイン、ＲｕｖＣ  ＩＩドメインまたはＲｕｖＣ  ＩＩＩドメインを指すこともあり、一般にはＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩまたはＲｕｖＣ  ＩＩＩと呼ばれる。
【０５６０】
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、たとえば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ  ＩＩモチーフとＲｕｖＣ  ＩＩＩモチーフとの間に位置している。
【０５６１】
ＰＩドメインは、標的遺伝子の転写調節領域内の特定のヌクレオチド配列、すなわちプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するか、ＰＡＭと相互作用する。ここで、ＰＡＭは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて異なり得る。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５'−ＮＧＧ−３'であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。しかしながら、ＰＡＭは上記酵素の起源に応じて決定されることが一般に理解されているが、上記起源に由来する酵素の変異体に関する研究の進展に応じて、ＰＡＭは変更され得る。
【０５６２】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり得る。
【０５６３】
Ｃａｓ９は、さまざまな微生物、たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓおよびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａに由来し得る。
【０５６４】
Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡに結合して、標的遺伝子の転写調節領域の標的配列もしくは位置を切断または修飾する酵素であり、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する核酸鎖を切断することができるＨＮＨドメインと、ｇＲＮＡと非相補的な結合を形成する核酸鎖を切断することができるＲｕｖＣドメインと、標的と相互作用するＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとからなり得る。Ｃａｓ９の特異的な構造特性については、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−９４９を参照することができる。
【０５６５】
Ｃａｓ９は、天然に存在する微生物から単離されるか、組換え法または合成法によって非天然に産生され得る。
【０５６６】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５６７】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する同様のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりのＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとからなり得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照することができる。
【０５６８】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はｇＲＮＡと相互作用し、それによってｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協調してガイド配列がＰＡＭ配列を含む標的配列に接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸との相互作用についてのＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存している。
【０５６９】
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子の転写調節領域に存在する配列であり得、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識される。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて異なる配列を有し得る。すなわち、各種は、特異的に認識可能なＰＡＭ配列を有する。たとえば、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は５'−ＴＴＮ−３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり得る。ＰＡＭは上記の酵素の起源に応じて決定されることが一般に理解されているが、対応する起源に由来する酵素の変異体に関する研究の進展に応じて、ＰＡＭは変更され得る。
【０５７０】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり得る。
【０５７１】
Ｃｐｆ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに由来し得る。
【０５７２】
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに対応するＲｕｖＣ様ドメイン、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインの代わりのＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメイン、ならびにＰＡＭを認識するＰＩドメインからなり得る。Ｃｐｆ１の特異的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照することができる。
【０５７３】
Ｃｐｆ１は、天然に存在する微生物から単離されるか、組換え法または合成法によって非天然に産生され得る。
【０５７４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子の転写調節領域内の二本鎖核酸を切断する機能を有するヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０５７５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５７６】
「完全な活性」という用語は、酵素が野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と同じ機能を有する状態を指し、そのような状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。ここで、「野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能」とは、酵素が、二本鎖ＤＮＡを切断する機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能を有する状態を指す。
【０５７７】
完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５７８】
完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素を修飾または操作することにより形成されるＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０５７９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか、１つまたは複数のアミノ酸が除去されている酵素であり得る。
【０５８０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸が野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列に付加されている酵素であり得る。ここで、付加されたアミノ酸の位置は、野性型酵素のＮ末端、Ｃ末端またはアミノ酸配列であり得る。
【０５８１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能が改善された完全な活性酵素であり得る。
【０５８２】
たとえば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的に修飾または操作された形態、すなわちＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、切断される二本鎖ＤＮＡに結合しないか、それとは一定の距離を維持しながら、二本鎖ＤＮＡを切断し得る。この場合、修飾または操作された形態は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、機能活性が改善された完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能が低下した完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８４】
たとえば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の修飾または操作された特定の形態、すなわちＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、切断される二本鎖ＤＮＡに非常に近いか、それと特異的な結合を形成しながら、二本鎖ＤＮＡを切断し得る。ここで、特異的な結合は、たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異領域のアミノ酸と切断位置のＤＮＡ配列との間の結合であり得る。この場合、修飾または操作された形態は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能活性が低下した完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８６】
「不完全または部分的に活性」という用語は、酵素が、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能から選択される１つを有する状態を指す。この状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。加えて、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと呼ばれ得る。
【０５８７】
「ニッカーゼ」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖の一方の鎖のみを切断するように操作または修飾されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、一本鎖、たとえば、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸のｇＲＮＡに相補的または非相補的である鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。したがって、二本鎖を切断するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
【０５８８】
ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を含まなくてよく、このために、ＨＮＨドメインを操作または修飾してもよい。
【０５８９】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、ニッカーゼは、修飾されたＨＮＨドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５９０】
たとえば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、ニッカーゼは、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の８４０番目のアミノ酸をヒスチジンからアラニンへ変異させる変異によって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわちＳｐＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の非相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断することができる。
【０５９１】
別の例では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９である場合、ニッカーゼは、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の５５９番目のアミノ酸をヒスチジンからアラニンへ変異させる変異によって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の非相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断することができる。
【０５９２】
加えて、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を含まなくてよく、このために、ＲｕｖＣドメインを操作または修飾してもよい。
【０５９３】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、ニッカーゼは、修飾されたＲｕｖＣドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５９４】
たとえば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、ニッカーゼは、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の１０番目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンへ変異させる変異によって、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわち、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断することができる。
【０５９５】
別の例では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９とした場合、ニッカーゼは、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の８番目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンへ変異させる変異によって、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９バリアントは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断することができる。
【０５９６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５９７】
「不活性」という用語は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能の両方を失われている状態を指す。そのような状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。
【０５９８】
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインの変化により、ヌクレアーゼ不活性を有し得る。
【０５９９】
不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン内の変異により、ヌクレアーゼ不活性を有し得る。すなわち、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を含まなくてよく、このために、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを操作または修飾してもよい。
【０６００】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、修飾されたＲｕｖＣドメインおよび修飾されたＨＮＨドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０６０１】
たとえば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギン酸と８４０番目のヒスチジンの両方のアラニンへの変異により、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９バリアントであり得る。ここで、産生される不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されているため、標的遺伝子の転写調節領域内の二本鎖核酸は、完全に切断され得る。
【０６０２】
別の例では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９である場合、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の８番目のアスパラギン酸と５５９番目のヒスチジンの両方のアラニンへの変異により、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９バリアントであり得る。ここで、産生される不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＣｊＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されているため、標的遺伝子の転写調節領域内の二本鎖核酸は、完全には切断されないことがあり得る。
【０６０３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ活性、すなわち、上記のヌクレアーゼ活性に加えて、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力を有し得る。
【０６０４】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全に活性な、不完全もしくは部分的に活性な、または不活性なヘリカーゼ活性を有するように修飾されていてもよい。
【０６０５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素を人為的に操作または修飾することにより生成されるＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０６０６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および／または二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能を修飾するための人為的に操作または修飾されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０６０７】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能の第１の機能が失われた形態であり得る。
【０６０８】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能の第２の機能が失われた形態であり得る。
【０６０９】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、第１の機能と第２の機能の両方が失われた形態であり得る。
【０６１０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、ｇＲＮＡとの相互作用によりｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を形成し得る。
【０６１１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のｇＲＮＡと相互作用する機能を修飾するための人為的に操作または修飾されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０６１２】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１３】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６１４】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１５】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６１６】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１７】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６１８】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能および第２の機能を有さず、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１９】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能および第２の機能を有さず、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６２０】
ここで、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントとの間の相互作用強度に応じて、さまざまなｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が形成され得、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントに応じて、標的配列に近づくか、切断する機能に違いがあり得る。
【０６２１】
たとえば、ｇＲＮＡとの相互作用が低下したＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントにより形成されたｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡに完全に相補的に結合する標的配列に非常に接近または局在化した場合のみ、標的配列の二本鎖または一本鎖を切断し得る。
【０６２２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が修飾された形態であり得る。
【０６２３】
例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸が置換された形態であり得る。
【０６２４】
別の例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が欠失された形態であり得る。
【０６２５】
さらに別の例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が付加された形態であり得る。
【０６２６】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失および／または付加された形態であり得る。
【０６２７】
加えて、任意に、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の本来の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能およびその第２鎖を切断する第２の機能に加えて、機能的ドメインをさらに含み得る。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の本来の機能に加えて、追加の機能を有し得る。
【０６２８】
機能的ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性、または（ペプチドを含む）タンパク質の単離および精製用のタグもしくはレポーター遺伝子を有するドメインであり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０６２９】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質であって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などのタンパク質を含むが、本発明はそれらに限定されない。
【０６３０】
機能的ドメインはデアミナーゼであり得る。
【０６３１】
たとえば、シチジンデアミナーゼは、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素に対する機能的ドメインとしてさらに含まれ得る。例示的な一実施形態では、融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼ、たとえばアポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）をＳｐＣａｓ９ニッカーゼに添加することにより産生され得る。上記のように形成された［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＰＯＢＥＣ１］は、Ｃ〜ＴもしくはＵのヌクレオチド編集、またはＧ〜Ａのヌクレオチド編集に使用され得る。
【０６３２】
別の例では、アデニンデアミナーゼは、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素に対する機能的ドメインとしてさらに含まれ得る。例示的な一実施形態では、アデニンデアミナーゼ、たとえばＴａｄＡバリアント、ＡＤＡＲ２バリアントまたはＡＤＡＴ２バリアントをＳｐＣａｓ９ニッカーゼに加えることにより、融合タンパク質が産生され得る。融合タンパク質はヌクレオチドＡをイノシンに修飾するため、上記のように形成された［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＴａｄＡバリアント］、［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＤＡＲ２バリアント］または［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＤＡＴ２バリアント］は、Ａ〜Ｇのヌクレオチド編集、またはＴ〜Ｃのヌクレオチド編集に使用され得、修飾されたイノシンはポリメラーゼによってヌクレオチドＧとして認識され、それによって実質的にＡ〜Ｇのヌクレオチド編集を示す。
【０６３３】
機能的ドメインは、核局在化配列またはシグナル（ＮＬＳ）または核外移行配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０６３４】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数のＮＬＳを含み得る。ここで、１つまたは複数のＮＬＳが、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端もしくはその近傍；当該酵素のＣ末端もしくはその近傍；またはそれらの組合せに含まれ得る。ＮＬＳは、以下のＮＬＳに由来するＮＬＳ配列であり得るが、本発明はそれらに限定されない：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（たとえば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−αからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトＰ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよび配列ＰＫＱＫＫＲＫ；Ｄ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列に由来するＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ。
【０６３５】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２つ以上の部分に分割することにより調製されるスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。「スプリット」という用語は、タンパク質の機能的もしくは構造的分割またはタンパク質の２つ以上の部分へのランダムな分割を指す。
【０６３６】
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全、不完全もしくは部分的に活性な酵素または不活性な酵素であり得る。
【０６３７】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＳｐＣａｓ９は、残基６５６であるチロシンと残基６５７であるスレオニンとの間の２つの部分に分割され得、それによってスプリットＳｐＣａｓ９が生成される。
【０６３８】
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を選択的に含み得る。
【０６３９】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、構造的に野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と同じまたは類似するスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素の形成のために組み立てられ得る。
【０６４０】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量化ドメイン；インテイン；ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン；または特定の条件下でヘテロダイマーを形成するドメインであり得る。
【０６４１】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３であるセリンと残基７１４であるグリシンとの間の２つの部分に分割され得、それによってスプリットＳｐＣａｓ９が生成される。ＦＲＢドメインは２つの部分の一方に連結され、ＦＫＢＰドメインはもう一方に連結される。それによって生成されるスプリットＳｐＣａｓ９では、ＦＲＢドメインとＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境において二量体で形成され得、それによって再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素が生成される。
【０６４２】
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、それをコードする配列を有するポリペプチド、タンパク質または核酸であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントを導入するために対象に対してコドン最適化され得る。
【０６４３】
「コドン最適化」という用語は、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより高頻度または最も高頻度で使用されるコドンに置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより核酸配列を修飾して宿主細胞内での発現を向上させるためのプロセスを指す。さまざまな種は、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、ｍＲＮＡの翻訳の効率と相関することが多く、このことは、翻訳されるコドンの特性と特異的なｔＲＮＡ分子の入手可能性に依存すると考えられる。細胞内で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般にペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、所与の生物中の最適な遺伝子発現のためにコドン最適化に基づき個別に調整され得る。
【０６４４】
本明細書に開示されるｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、さまざまな送達方法およびさまざまな形態により対象に送達または導入され得る。
【０６４５】
主題関連の説明は上記の通りである。
【０６４６】
例示的な一実施形態では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０６４７】
ベクターは、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０６４８】
一例では、ベクターは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を同時に含み得る。
【０６４９】
別の例では、ベクターは、ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含み得る。
【０６５０】
たとえば、ｇＲＮＡに含まれるドメインは、１つのベクターに含まれていても、分割されて異なるベクターに含まれていてもよい。
【０６５１】
別の例では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０６５２】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は１つのベクターに含まれていても、分割されていくつかのベクターに含まれていてもよい。
【０６５３】
ベクターは、１つまたは複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
【０６５４】
ここで、調節／制御コンポーネントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
【０６５５】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０６５６】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０６５７】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０６５８】
プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
【０６５９】
プロモーターは、ウイルス性または非ウイルス性プロモーターであり得る。
【０６６０】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列）に応じて適切なプロモーターを使用してもよい。
【０６６１】
たとえば、ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。
【０６６２】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【０６６３】
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０６６４】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【０６６５】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０６６６】
一例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【０６６７】
別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスにより送達または導入され得る。さらに別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えＡＡＶにより送達または導入され得る。さらに別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、たとえば本明細書に記載のウイルスの１つまたは複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
【０６６８】
例示的な一実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、対象に送達または導入され得る。
【０６６９】
たとえば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物の形態で存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で存在し得る。
【０６７０】
一例では、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ型ｇＲＮＡおよびタンパク質型ＣＲＩＳＰＲ、すなわちリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含むｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６７１】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、文献［Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］に記載）、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達またはそれらの組合せにより対象に送達または導入され得る。本明細書に開示されるｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用して、標的遺伝子、すなわち重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作または修飾することができる。
【０６７２】
標的遺伝子の転写調節領域は、上記のｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または修飾され得る。ここで、標的遺伝子の転写調節領域の操作または修飾は、ｉ）標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷と、ｉｉ）損傷した転写調節領域の修復の両方を含み得る。
【０６７３】
ｉ）標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷、特に転写調節領域の標的配列の切断または損傷であり得る。
【０６７４】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的になり得、標的配列はＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列を含んでも含んでいなくてもよい。そのような標的配列は、ｇＲＮＡの設計に関与している者に重要な基準を提供する。
【０６７５】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的に認識され得るため、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、認識された標的配列の近くに位置し得る。
【０６７６】
標的部位での「切断」とは、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破損を指す。  切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、本発明はそれに限定されない。これ以外に、切断はさまざまな方法によって行われ得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、ここで、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断から生じ得る。二本鎖切断により、平滑末端または付着末端（もしくは粘着末端）が生じ得る。
【０６７７】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、標的配列の二本鎖の切断または損傷全体であり得る。
【０６７８】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって完全に切断され得る。
【０６７９】
別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）である場合、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の２本の一本鎖は、各ＣＲＩＳＰＲ複合体によってそれぞれ切断され得る。すなわち、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖はＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖はＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、これらの切断は、順次または同時に行われ得る。
【０６８０】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、標的配列の二本鎖のうちの一本鎖のみの切断または損傷であり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡに相補的に結合する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補的な一本鎖、またはｇＲＮＡに相補的に結合しない非ガイド核酸結合配列、すなわちｇＲＮＡと非相補的な一本鎖であり得る。
【０６８１】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）により、ｇＲＮＡに相補的に結合する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補的な一本鎖を切断してよく、ｇＲＮＡに相補的に結合しない非ガイド核酸結合配列、すなわちｇＲＮＡと非相補的な一本鎖を切断しなくてよい。
【０６８２】
別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）により、ｇＲＮＡに相補的に結合しない標的配列の非ガイド核酸結合配列、すなわちｇＲＮＡと非相補的な一本鎖を切断してよく、ｇＲＮＡに相補的に結合する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補的な一本鎖を切断しなくてよい。
【０６８３】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、核酸断片の部分的な除去であり得る。
【０６８４】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、野性型ＳｐＣａｓ９と、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡから構成される場合、第１のｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の二本鎖が切断され得、第２のｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の二本鎖が切断され得、第１および第２のｇＲＮＡならびにＳｐＣａｓ９によって核酸断片の除去がもたらされる。
【０６８５】
たとえば、２つのＣＲＩＳＰＲ複合体が、エンハンサーの上流に存在する標的配列に相補的に結合する１つのｇＲＮＡと、エンハンサーの下流に存在する標的配列に相補的に結合する他方のｇＲＮＡなどの異なる標的配列に相補的に結合する２つのｇＲＮＡと、野性型ＳｐＣａｓ９とからなる場合、第１のｇＲＮＡに相補的に結合するエンハンサーの上流に存在する標的配列の二本鎖が切断され得、第２のｇＲＮＡに相補的に結合するエンハンサーの下流に存在する標的配列の二本鎖が切断され得、それによって、核酸断片、すなわちエンハンサー領域が、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９によって除去される。
【０６８６】
ｉｉ）損傷した転写調節領域の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して行われる修復または復元であり得る。
【０６８７】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、切断された二本鎖または一本鎖の両端をつなぎ合わせることにより、ＤＮＡの二本鎖の破損を復元または修復する方法であり、一般に、二本鎖の破損（たとえば切断）によって形成された２つの適合性のある末端が頻繁に互いに接触して２つの端部を完全につなぎ合わせる場合、破損した二本鎖が回復される。ＮＨＥＪは、細胞周期全体で使用することができる修復方法であり、通常、Ｇ１期のように細胞内でテンプレートとして使用される相同ゲノムがない場合に起こる。
【０６８８】
ＮＨＥＪを使用した損傷遺伝子または核酸の修復プロセスでは、ＮＨＥＪ修復領域で核酸配列のいくつかの挿入および／または欠失（インデル）が起こり、そのような挿入および／または欠失が、リーディングフレームのシフトを引き起こし、フレームシフトされたトランスクリプトームｍＲＮＡがもたらされる。その結果、先天機能は、ナンセンス媒介の崩壊または正常なタンパク質の合成の失敗のために失われる。加えて、リーディングフレームが維持される間、かなりの量の配列の挿入または欠失が起こる変異が、タンパク質の機能が破壊を引き起こし得る。変異は遺伝子座に依存する。なぜなら、タンパク質の有意でない領域の変異よりも、有意な機能的ドメインの変異の許容度がおそらく低いからである。
【０６８９】
ＮＨＥＪによって天然状態で生成されるインデル変異を期待することは不可能であるが、特異的インデル配列が所定の破損領域で優先され、ミクロ相同性の小さな領域に由来し得る。従来、欠失の長さは１ｂｐ〜５０ｂｐの範囲であり、挿入はより短くなる傾向にあり、破損領域を直接囲む短い反復配列を頻繁に含む。
【０６９０】
加えて、ＮＨＥＪは変異を引き起こすプロセスであり、特異的な最終配列を生成する必要がない場合は、小さな配列のモチーフを欠失するのに使用することができる。
【０６９１】
発現がＣＲＩＳＰＲ複合体により標的化された転写調節領域により制御される標的遺伝子の特異的ノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して行われ得る。標的遺伝子の転写調節領域の二本鎖または２本の一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して切断され得、破損した二本鎖または二本の一本鎖は、ＮＨＥＪを介したインデルを有し、それによって、発現が転写調節領域によって制御される標的遺伝子の特異的ノックアウトを誘導する。
【０６９２】
一例では、標的遺伝子の転写調節領域の二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得、ＮＨＥＪを介して修復することにより、修復領域にさまざまなインデル（挿入および欠失）が生成され得る。
【０６９３】
「インデル」という用語は、ＤＮＡのヌクレオチド配列に部分ヌクレオチドを挿入またはＤＮＡのヌクレオチド配列から部分ヌクレオチドを欠失することによって形成されるバリエーションを指す。上記のようにｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が標的遺伝子の転写調節領域で標的配列を切断する場合、ＨＤＲまたはＮＨＥＪによる修復中に標的配列にインデルが導入され得る。
【０６９４】
相同性指向修復（ＨＤＲ）は、エラーのない修正方法であり、相同配列をテンプレートとして使用して、損傷した転写調節領域を修復または復元し、一般に、破損ＤＮＡを修復または復元、すなわち細胞の先天情報を復元し、破損ＤＮＡは、修飾されていない相補的なヌクレオチド配列の情報または姉妹染色分体の情報を使用して修復される。ＨＤＲの最も一般的な種類は相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、通常、活発に分裂している細胞のＳ期またはＧ２／Ｍ期に起こる修復または復元方法である。
【０６９５】
細胞の相補的ヌクレオチド配列または姉妹クロマチンを使用するのではなく、ＨＤＲを使用して損傷ＤＮＡを修復または復元するために、相補的ヌクレオチド配列または相同的ヌクレオチド配列の情報を使用して人為的に合成されたＤＮＡテンプレート、すなわち、相補的ヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートが細胞に提供され得、それによって破損ＤＮＡが修復される。ここで、核酸配列または核酸断片を核酸テンプレートにさらに加えて破損ＤＮＡを修復する場合、破損ＤＮＡにさらに加えられた核酸配列または核酸断片をノックインしてもよい。さらに追加された核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子、または細胞内で発現される遺伝子もしくは核酸への変異によって修飾された標的遺伝子の転写調節領域を修正するための核酸配列または核酸断片であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０６９６】
一例では、標的遺伝子酸の転写調節領域の二本鎖または一本鎖が、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得、切断部位に隣接するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートが細胞に提供され得、標的遺伝子の転写調節領域の切断されたヌクレオチド配列は、ＨＤＲを介して修復または復元され得る。
【０６９７】
ここで、相補的ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートは、破損ＤＮＡの相補的ヌクレオチド配列、すなわち切断された二本鎖または一本鎖を有し得、破損ＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片をさらに含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相補的ヌクレオチド配列および挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸テンプレートを使用して、破損ＤＮＡ、すなわち標的遺伝子の転写調節領域の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片および追加の核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子、または細胞内で発現される遺伝子もしくは核酸への変異によって修飾された標的遺伝子の転写調節領域を修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相補的ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡとの相補的な結合を有するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域の切断された二本鎖または一本鎖の右および左のヌクレオチド配列であり得る。あるいは、相補的ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡとの相補的な結合を有するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端を有するヌクレオチド配列であり得る。相補的ヌクレオチド配列は１５〜３０００ヌクレオチド配列であり得、相補的ヌクレオチド配列の長さまたはサイズは、核酸テンプレートまたは標的遺伝子の転写調節領域のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸テンプレートは、二本鎖または一本鎖の核酸であり得、線状または環状であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０６９８】
別の例では、標的遺伝子酸の転写調節領域の二本鎖または一本鎖が、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得、切断部位に隣接するヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートが細胞に提供され得、標的遺伝子の転写調節領域の切断されたヌクレオチド配列は、ＨＤＲを介して修復または復元され得る。
【０６９９】
ここで、相同ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートは、破損ＤＮＡの相同ヌクレオチド配列、すなわち切断された二本鎖または一本鎖を有し得、破損ＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片をさらに含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相同ヌクレオチド配列および挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸テンプレートを使用して、破損ＤＮＡ、すなわち標的遺伝子の転写調節領域の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片および追加の核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子、または細胞内で発現される遺伝子もしくは核酸への変異によって修飾された標的遺伝子または核酸の転写調節領域を修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相同ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡと相同性を有するヌクレオチド配列、すなわち、転写調節領域の切断された二本鎖の右および左のヌクレオチド配列であり得る。あるいは、相同ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡとの相同性を有するヌクレオチド配列、すなわち、転写調節領域の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端を有するヌクレオチド配列であり得る。相同ヌクレオチド配列は１５〜３０００ヌクレオチド配列であり得、相同ヌクレオチド配列の長さまたはサイズは、核酸テンプレートまたは標的遺伝子の転写調節領域のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸テンプレートは、二本鎖または一本鎖の核酸であり得、線状または環状であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０７００】
ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外にも、損傷した転写調節領域を修復または復元するためのさまざまな方法がある。たとえば、損傷した転写調節領域を修復または復元する方法は、一本鎖アニーリング、一本鎖破損修復、ミスマッチ修復、ヌクレオチド切断修復、またはヌクレオチド切断修復を使用する方法であり得る。
【０７０１】
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する方法で、一般に３０ヌクレオチド超の反復配列を使用する。反復配列は、（粘着末端を有するように）破損した各末端の標的核酸の二本鎖に対して一本鎖を有するように切断され、切断後、反復配列を含む一本鎖オーバーハングがＲＰＡタンパク質でコーティングされ、反復配列が互いに不適切にアニーリングすることが防がれる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的な反復配列をアニーリングすることができる配列が配置される。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップが切断され、新しいＤＮＡの合成により一定のギャップが埋められてＤＮＡ二本鎖が復元される。この修復のその結果、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失され、欠失の長さは、本明細書で使用される２つの反復の位置と、切断の進行の経路または程度を含むさまざまな要因に依存し得る。
【０７０２】
ＳＳＡは、ＨＤＲと同様に、相補配列、すなわち相補反復配列を利用するが、対照的に、標的核酸配列を修飾または修正するための核酸テンプレートは必要としない。
【０７０３】
ゲノムの一本鎖破損は、上記の修復メカニズムとは別個のメカニズム、一本鎖破損修復（ＳＳＢＲ）を介して修復される。一本鎖ＤＮＡ破損の場合、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は破損を認識し、修復機構を補充する。ＤＮＡ破損に対するＰＡＲＰ１の結合と活性は一時的であり、ＳＳＢＲは、損傷領域でのＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することにより促進される。ＳＳＢＲ複合体の最も重要なタンパク質はＸＲＣＣ１であり、それはＤＮＡの３'および５'末端処理を促進するタンパク質と相互作用してＤＮＡを安定化する。末端処理は、一般に、損傷した３'末端のヒドロキシル化状態への修復、および／または損傷した５'末端のリン酸部分への修復に関与し、末端が処理された後、ＤＮＡギャップが埋められる。ＤＮＡギャップを埋めるための２つの方法、すなわち、短いパッチ修復と長いパッチ修復があり、短いパッチ修復は、単一ヌクレオチドの挿入を含む。ＤＮＡギャップが埋められた後、ＤＮＡリガーゼが末端結合を促進する。
【０７０４】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、ミスマッチＤＮＡヌクレオチドに対して機能する。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３の各複合体は、ＡＴＰａｓｅ活性を有しており、ひいてはミスマッチの認識と修復の開始に重要な役割を果たし、ＭＳＨ２／６は、主にヌクレオチド間のミスマッチを認識し、１つまたは２つのヌクレオチドミスマッチを識別するが、ＭＳＨ２／３は、主により大きなミスマッチを認識する。
【０７０５】
塩基除去修復（ＢＥＲ）は、細胞周期全体を通じて有効であり、小さな非ヘリックス歪みの塩基損傷領域をゲノムから除去するために使用される修復方法である。損傷ＤＮＡでは、ヌクレオチドをリン酸−デオキシリボース骨格につなぎ合わせるＮ−グリコシド結合を切断することにより損傷ヌクレオチドが除去され、次いでホスホジエステル骨格が切断され、それによって一本鎖ＤＮＡの破損が生じる。それによって形成される破損した一本鎖末端が除去され、除去された一本鎖により生じたギャップが新しい相補的ヌクレオチドで埋められ、次いで新たに埋められた相補的ヌクレオチドの末端がＤＮＡリガーゼにより骨格とライゲーションされ、損傷ＤＮＡが修復される。
【０７０６】
ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから大きなヘリックス歪み損傷を除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されると、損傷領域を含む短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップが生じる。生じたギャップは、新しい相補的なヌクレオチドで埋められ、新たに埋められた相補的なヌクレオチドの端部がＤＮＡリガーゼによって骨格とライゲーションされ、損傷ＤＮＡが修復される。
【０７０７】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による標的遺伝子の転写調節領域の人為的操作の効果は、主にノックアウト（ノック−アウト）、ノックダウン、ノックイン（ノック−イン）および発現の増加であり得る。
【０７０８】
「ノックアウト」という用語は、標的遺伝子または核酸の不活性化を指し、「標的遺伝子または核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳が起こらない状態を指す。疾患を引き起こす遺伝子または異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトを介して阻害され得、タンパク質発現が防がれる。
【０７０９】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した転写調節領域では、ＮＨＥＪによってインデルが生成され、ひいては損傷した転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックアウトが誘導される。
【０７１０】
別の例では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体とドナーを使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ドナーを使用してＨＤＲによって修復され得る。ここで、ドナーは、相同ヌクレオチド配列と挿入が望まれるヌクレオチド配列を含む。ここで、挿入されるヌクレオチド配列の数は、挿入位置または目的に応じて異なり得る。損傷した転写調節領域がドナーを使用して修復されると、挿入されるヌクレオチド配列が、損傷したヌクレオチド配列領域に挿入されるため、転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックアウトが誘導される。
【０７１１】
「ノックダウン」という用語は、標的遺伝子もしくは核酸の転写および／または翻訳の減少、または標的タンパク質の発現を指す。ノックダウンを介して遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することにより、疾患の発症が予防され得るか、疾患が治療され得る。
【０７１２】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した転写調節領域では、ＮＨＥＪによってインデルが生成される、ひいては損傷した転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックダウンが誘導される。
【０７１３】
別の例では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体とドナーを使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ドナーを使用してＨＤＲによって修復され得る。ここで、ドナーは、相同ヌクレオチド配列と挿入が望まれるヌクレオチド配列を含む。ここで、挿入されるヌクレオチド配列の数は、挿入位置または目的に応じて異なり得る。ドナーを使用して損傷した転写調節領域が修復されると、挿入されるヌクレオチド配列が、損傷したヌクレオチド配列領域に挿入されるため、転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックダウンが誘導される。
【０７１４】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を使用して、標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は、標的遺伝子の転写調節領域に特異的に結合し、転写調節領域の活性は、ＣＲＩＳＰＲ−不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され、それによって標的遺伝子または染色体の発現を阻害するノックダウンが誘導される。
【０７１５】
「ノックイン」という用語は、標的遺伝子または核酸への特定の核酸または遺伝子の挿入を指し、ここで、「特定の核酸または遺伝子」とは、挿入または発現される対象の遺伝子または核酸を指す。疾患を誘発する変異遺伝子が、ノックインを介して正常な遺伝子の発現を誘導するために、正常への修正または正常な遺伝子の挿入によって疾患治療に利用され得る。
【０７１６】
加えて、ノックインは、ドナーさらに必要とし得る。
【０７１７】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体とドナーを使用して標的遺伝子または核酸が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または核酸が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷した標的遺伝子または核酸は、ドナーを使用してＨＤＲによって修復され得る。ここで、ドナーは、特定の核酸または遺伝子を含み得、特定の核酸または遺伝子を損傷した遺伝子または染色体に挿入するために使用され得る。ここで、挿入された特定の核酸または遺伝子は、タンパク質の発現を誘導し得る。
【０７１８】
「発現の増加」とは、人為的な操作前と比較して、標的遺伝子もしくは核酸の転写および／または翻訳または標的タンパク質の発現の増加を指す。疾患は、過小発現もしくは非発現の遺伝子またはタンパク質の発現を制御することにより予防または治療され得る。
【０７１９】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した転写調節領域では、ＮＨＥＪによってインデルが生成され、それによって転写調節領域の活性が増加し、正常な標的遺伝子または染色体の発現が誘導される。本明細書に開示される１つの例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、重複遺伝子の転写調節領域に人為的な操作または修飾を加えることができる。
【０７２０】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列を特異的に認識し得る。
【０７２１】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７２２】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７２３】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０７２４】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的に認識され得るため、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、認識された標的配列の近くに位置し得る。
【０７２５】
標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域で人為的な修飾が起こる部位または領域であり得る。
【０７２６】
標的配列の説明は上記の通りである。
【０７２７】
例示的な一実施形態では、標的配列は、表１、２、３および４に列挙されている１つまたは複数のヌクレオチド配列であり得る。
【０７２８】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素からなる。
【０７２９】
ｇＲＮＡは、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列に部分的または完全に相補的に結合することができるガイドドメインを含み得る。
【０７３０】
ガイドドメインは、ガイド核酸結合配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上が相補的、または完全に相補的であり得る。
【０７３１】
ガイドドメインは、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、または０〜２個のミスマッチを含み得る。
【０７３２】
ｇＲＮＡは、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【０７３３】
ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質からなる群より選択される１つまたは複数の酵素であり得る。一例では、エディタータンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質であり得る。
【０７３４】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、重複遺伝子の転写調節領域にさまざまな人為的な操作または修飾を加えることができる
【０７３５】
重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に対する以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７３６】
たとえば、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み得る。一例では、欠失ヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの連続的または非連続的な塩基対であり得る。別の例では、欠失ヌクレオチドは、２ｂｐ以上の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド断片であり得る。ここで、ヌクレオチド断片は、２〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、または４６〜５０塩基対であり得る。さらに別の例では、欠失ヌクレオチドは２つ以上のヌクレオチド断片であり得る。ここで、２つ以上のヌクレオチド断片は、それぞれ非連続的なヌクレオチド配列、すなわち１つまたは複数のヌクレオチド配列ギャップを有するヌクレオチド断片であり得、２つ以上の欠失ヌクレオチド断片による２つ以上の欠失部位を有し得る。
【０７３７】
あるいは、たとえば、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含み得る。一例では、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの連続した塩基対であり得る。別の例では、挿入されるヌクレオチドは、５つ以上の連続した塩基対からなるヌクレオチド断片であり得る。ここで、ヌクレオチド断片は、５〜１０、１１〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、または７５０〜１０００塩基対であり得る。さらに別の例では、挿入されるヌクレオチドは、特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得る。ここで、特異的遺伝子は、外部から入力された遺伝子であり、重複遺伝子を有するヒト細胞などの対象には含まれない。あるいは、特異的遺伝子は、たとえばヒト細胞のゲノムに存在する遺伝子などの重複遺伝子とともに、ヒト細胞などの対象に含まれる遺伝子であり得る
【０７３８】
あるいは、たとえば、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および挿入を含み得る。一例では、欠失ヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの連続的または非連続的な塩基対であり得る。ここで、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの塩基対；ヌクレオチド断片；または特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得、欠失および挿入は順次または同時に起こり得る。ここで、挿入されるヌクレオチド断片は、５〜１０、１１〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、または７５０〜１０００塩基対であり得る。ここで、特異的遺伝子は、重複遺伝子を有するヒト細胞などの対象の外部から入力された遺伝子であり得る。あるいは、特異的遺伝子は、たとえばヒト細胞のゲノムに存在する遺伝子などの重複遺伝子とともに、ヒト細胞などの対象に含まれる遺伝子であり得る。別の例では、欠失ヌクレオチドは、２塩基対以上からなるヌクレオチド断片であり得る。ここで、欠失ヌクレオチド断片は、２〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、または４６〜５０塩基対であり得る。ここで、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５塩基対；ヌクレオチド断片；または特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得、欠失および挿入は順次または同時に起こり得る。さらに別の例では、欠失ヌクレオチドは２つ以上のヌクレオチド断片であり得る。ここで、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５塩基対；ヌクレオチド断片；または特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得、欠失および挿入は順次または同時に起こり得る。加えて、欠失された２つ以上の部位の一部またはすべてで挿入が起こり得る。
【０７３９】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じて、重複遺伝子の転写調節領域にさまざまな人為的な操作または修飾を加えることができる。
【０７４０】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的領域に存在する５'−ＮＧＧ−３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４１】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４２】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｗは、ＡまたはＴである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４３】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４４】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'（Ｎが、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲがＡまたはＧであり、（Ｔ）が任意に含まれる配列を指す）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４５】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＴＴＮ−３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４６】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果はノックアウトであり得る。
【０７４７】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は阻害され得る。
【０７４８】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果はノックダウンであり得る。
【０７４９】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は減少し得る。
【０７５０】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果はノックインであり得る。
【０７５１】
ここで、ノックイン効果は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体と、外因性のヌクレオチド配列または遺伝子を追加で含むドナーによって誘導され得る。
【０７５２】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体とドナーによる重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果は、外因性のヌクレオチド配列または遺伝子によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現させることにより誘導され得る。
【０７５３】
ここで、ノックイン効果は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体と、挿入が望まれるヌクレオチド配列を含むドナーによって誘導され得る。本明細書で開示される一態様は、発現を制御する方法に関する。
【０７５４】
本明細書に開示される１つの例示的な実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。
【０７５５】
いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトまたは非ヒト動物からの細胞または細胞のコロニーをサンプリングし、１つまたは複数の細胞を修飾することを含み得る。培養は、ｅｘ  ｖｉｖｏのどの段階でも行われ得る。１つまたは複数の細胞は、非ヒト動物または植物に再導入され得る。
【０７５６】
この方法は、真核細胞を人為的に改変する方法であり得、それは、重複遺伝子を有する真核細胞に発現制御組成物を導入することを含む。
【０７５７】
発現制御組成物の説明は上記の通りである。
【０７５８】
一実施形態では、発現制御組成物は以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含むエディタータンパク質。
【０７５９】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７６０】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７６１】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０７６２】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、個々の核酸配列の形態で、またはガイド核酸とエディタータンパク質の結合により複合体を形成することによって、１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０７６３】
任意に、発現制御組成物は、挿入されることが望ましい核酸配列またはそれをコードする核酸配列を含むドナーをさらに含み得る。
【０７６４】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、個々の核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０７６５】
導入段階は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われ得る。
【０７６６】
たとえば、導入段階は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１つまたは複数の方法に行われ得る。
【０７６７】
たとえば、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のものであり得る。本明細書に開示される一態様は、発現を制御して遺伝子重複疾患を治療するための組成物を使用して遺伝子重複疾患を治療する方法に関する。
【０７６８】
本明細書に開示される例示的な一実施形態は、重複遺伝子の転写調節領域を治療対象に人為的に操作するための発現制御組成物の投与を含む方法を用いた遺伝子重複疾患の治療の使用に関する。
【０７６９】
ここで、治療対象には、ヒト、サルなどの霊長類、ならびにマウスおよびラットなどの齧歯類を含む哺乳類が含まれ得る。
【０７７０】
遺伝子重複疾患の説明は上記の通りである。
【０７７１】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＰＭＰ２２遺伝子の重複により生じる疾患であり得る。
【０７７２】
一例では、ＰＭＰ２２遺伝子の重複によって生じる疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、またはルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）であり得る。
−  シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）  ＣＭＴ疾患は、ヒト染色体で起こる遺伝子重複によって引き起こされる遺伝性疾患であり、手足の末梢神経の発達に関与する遺伝子が変異によって複製され、それによってシャンパンボトルを逆さにしたような形状などの変形が引き起こされる。ＣＭＴ疾患は、米国では１００，０００人中３６人に起こる比較的よく見られる遺伝性神経疾患であり、患者数は世界で２８０万人であり、韓国でも約１７，０００人と推定される。ＣＭＴ疾患は、遺伝的側面に従って、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ＣＭＴ３、ＣＭＴ４およびＣＭＴＸの合計５つのタイプに大きく分類され、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２およびＣＭＴ３が優性で、子供では５０％の確率で遺伝され、ＣＭＴ４は劣性で、２５％の確率で遺伝される。ＣＭＴ１とＣＭＴ２は、ほとんどの国内患者で優性に遺伝され（それぞれ８０％と２０〜４０％）、ＣＭＴ３とＣＭＴ４は非常にまれである。ＣＭＴＸは、Ｘ染色体に沿った母系を通じて遺伝されるが、その頻度は１０〜２０％である。ＣＭＴ１は、ニューロンの軸索を囲む髄鞘のタンパク質の形成に関与する遺伝子重複による遺伝子発現の正常なプロセスを行えないことによって引き起こされる疾患である。ＣＭＴ１は３つのタイプに分類される。ＣＭＴ１Ａは常染色体優性遺伝病であり、染色体番号１７  １７ｐ１１．２−ｐ１２に位置するＰＭＰ２２遺伝子の重複によって引き起こされ、髄鞘の重要なコンポーネントであるＰＭＰ２２の過剰発現によって引き起こされる髄鞘の構造的および機能的異常をもたらす。
【０７７３】
ＣＭＴ２は軸索異常に関連し、神経伝導速度が正常状態に近い間に運動感覚神経の活動電位がかなり低下した神経障害であり、ＣＭＴ３はきわめて希少な常染色体劣性遺伝病として幼少期に起こり、臨床症状と神経伝導速度の低下が非常に激しいタイプである。ＣＭＴ４はまた、発症年齢が早く、臨床症状が重度のタイプであり、常染色体劣性遺伝され、Ｘ染色体と関連付けられている間にＣＭＴＸが起こるタイプであり、男性のその症状は、女性の症状よりも重篤である。
デジェリン・ソッタス病（Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｓｏｔｔａｓ  ｓｙｎｄｒｏｍ、ＤＳＳ）
【０７７４】
ＤＳＳは、幼い頃に起こる脱髄性運動感覚神経障害であり、通常、常染色体優性遺伝される疾患であるが、常染色体劣性遺伝もされ、重度の脱髄性神経障害を示し、乳児期からの運動神経の異常を示し、非常に遅い神経伝導と脳脊髄液中の特定のタンパク質の増加を示すことを特徴とする。デジェリン・ソッタス病の進行速度は非常に速く、歩行障害が幼い頃から始まり、遺伝もされるが、散発的に起こる。ＣＭＴ１Ａと同様に、ＰＭＰ２２の重複がＤＳＳの一部の患者のうちに見られ、加えて、対応する遺伝子のミスセンス変異が存在することが確認された。
−  先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）ＣＨＮは、出生直後に症状が現れる神経系疾患であり、その主な症状として、呼吸不全、筋力低下、筋肉運動不調和、筋緊張の低下、反射喪失、運動協調障害（運動神経症；運動失調症）、麻痺または感覚異常が現れ、同じ割合で男女に影響を及ぼす。ＣＨＮは、運動神経と感覚神経に障害が起こる遺伝病であり、髄鞘の脱髄と髄鞘再生が繰り返される間に、髄鞘形成が減少することを特徴とする。
−  ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）
【０７７５】
ＲＬＳは、希少なタイプの遺伝性運動感覚神経障害であり、１９２６年にルーシーとレヴィー他によって最初に記述され、手足の振戦、歩行損失などが他の遺伝性運動感覚神経障害よりも深刻なケースであるが、後に同じ症状がさまざまな遺伝性運動感覚神経障害サブタイプで発見されたため、ＲＬＳは、遺伝性運動感覚神経障害に現れる１つの症状と現在見なされている。ＲＬＳの場合、ミエリンタンパク質ゼロ遺伝子としてのＭＰＺ遺伝子の変異は、ＲＬＳを有することが最初に報告された患者の遺伝子検査で発見され、他の患者では、末梢神経のミエリンタンパク質２２の遺伝子としてＰＭＰ２２遺伝子の重複があるケースが報告されている。
【０７７６】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＰＬＰ１遺伝子の重複により生じる疾患であり得る。
【０７７７】
一例では、ＰＬＰ１遺伝子の重複により生じる疾患は、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）であり得る。
−  ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）
【０７７８】
ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）（ＰＭＤ）は、中枢神経系の白質の髄鞘発育不全によるさまざまな神経症状を示す非常に希少なスダノフィル性白質ジストロフィーである。その有病率は約１／４００，０００と推定される。１８８５年にペリツェウスが初めて報告したものは、染色体Ｘ依存的に遺伝される発達性脳対麻痺を有し、疾患の初めに示される眼振、運動失調、こわばり、後天性小頭症を特徴とする１つのファミリーである。ＰＭＤの臨床徴候は、乳児期および小児期の初期に現れ、ＰＭＤの特徴的な臨床症状は、振子眼振、喘鳴、精神運動発達障害または変性、運動失調、不規則運動、不随意運動、口腔機能障害、および精神遅滞である。
【０７７９】
ＰＭＤは、オリゴデンドロサイトの減少とプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の合成障害による中枢神経系の白質の髄鞘発育不全によって引き起こされる神経変性疾患または白質ジストロフィーである。プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）は、中枢神経系の髄鞘に最も豊富に存在するタンパク質であり、染色体Ｘの長腕に位置するＰＬＰ１遺伝子（Ｘｑ２２）の変異により異常に発現または産生され、中枢神経系に髄鞘発育不全を引き起こす。ＰＭＤは、脳組織病理学的に、脂質と反応するアゾ化合物によって引き起こされるスーダンレッドに対して親和性を有し、髄鞘の分解を指し、半卵円中心、小脳および脳幹で観察される。しかしながら、分解産物が見つからないため、ＰＭＤの原因は、脱髄ではなく、髄鞘発育不全または髄鞘形成不全であると考えられる。一般に、ＰＭＤの先天型は、完全な髄鞘形成不全によって特徴付けられ、ＰＭＤの古典型は、部分的な髄鞘形成不全によって特徴付けられる。部分的な髄鞘形成不全が起こると、正常な髄質白質は虎斑の外観を示す。髄鞘形成不全を伴う病変の軸索とニューロンは、一般によく保存され、希少なオリゴデンドロサイトの数は減少し、アストロサイトと線維性グリオーシスの増加が白質に見られ、萎縮が小多脳回と小脳の顆粒層に見られる。男性患者の８０％以上で、染色体Ｘの長腕に位置するＰＬＰ１遺伝子（Ｘｑ２２）の変異が見つかっている。これらの患者のうち、１０〜３０％が遺伝子に点突然変異を有しており、この場合、より重篤な臨床症状を示すことが知られている。ＰＬＰ１遺伝子全体を複製する現象は、ＰＭＤ患者の６０〜７０％以上でより頻繁に見られる。最近、ＰＬＰ１遺伝子は染色体Ｘに位置しているため、一般に、ＰＭＤは染色体Ｘ依存的に遺伝され、家族歴を有し、ほとんどが男性に起こる。しかしながら、ＰＭＤの病因はＰＬＰ１遺伝子だけでは説明され得ず、ＰＭＤの先天型は常染色体劣性であり、ＰＭＤの成人型は常染色体優性であり、またはＰＭＤは家族歴なしで散発的に起こる。まれに、ＰＭＤの症状は女性でもほとんど発現されないことが報告されている。
【０７８０】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＭＥＣＰ２遺伝子の重複により起こる疾患であり得る。
【０７８１】
一例では、ＭＥＣＰ２遺伝子の重複によって引き起こされる疾患はＭＥＣＰ２重複症候群であり得る。
−  ＭＥＣＰ２重複症候群
【０７８２】
ＭＥＣＰ２重複症候群と呼ばれる脳疾患は、ＭＥＣＰ２遺伝子を有する染色体Ｘの特異領域で起こる遺伝物質の重複によって引き起こされる。この疾患にはさまざまな症状が伴われ、筋緊張低下、発達遅延、呼吸器感染、発語異常、発作、自閉症行動および重度の知的障害などの症状が含まれる。
【０７８３】
この疾患は遺伝性疾患であるが、家族歴がなくても起こる。ＭＥＣＰ２重複症候群は、主に男性で起こり、ＭＥＣＰ２遺伝子欠損により起こるレット症候群は、主に女性で起こる。
【０７８４】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＲＡＩ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７８５】
一例では、ＲＡＩ１遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）であり得る。
−  ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）
【０７８６】
ＰＴＬＳは、１７番染色体の短腕に１１．２領域（１７ｐ１１．２）の微小重複を有する連続遺伝子症候群であり、１９９６年にＰＴＬＳの最初の研究事例が報告された。ＰＴＬＳは、レチノイン酸誘導−１（ＲＡＩ１）遺伝子を有する１７ｐ１１．２での１．３〜３．７Ｍｂの重複により起こることが知られている。ＰＴＬＳは希少疾患とみなされ、その発生率は２０，０００人の新生児に１人と予想される。ＰＴＬＳは、さまざまな先天性異常と精神遅滞を特徴とし、ＰＴＬＳの症例の８０％は自閉症スペクトラム障害を有している。加えて、ＰＴＬＳの他の特有の特性には、睡眠時無呼吸、構造的心血管異常、異常な社会的行動、学習障害、注意欠陥障害、強迫行動および身長の低さが含まれる。
【０７８７】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＥＬＮ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７８８】
一例では、ＥＬＮ遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）であり得る。
−  ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）
【０７８９】
ＷＢＳは、特徴的な臨床所見を有する７番染色体の異常に関連する近位遺伝子症候群であり、ＷＢＳの発生率は２０，０００人の新生児に１人である。７番染色体（７ｑ１１．２３）の長腕の近位部分の微小欠失の原因として、この領域では、血管壁などの弾性組織を形成するエラスチンタンパク質の産生に関連するエラスチン遺伝子、および認知能力に関連するＬＩＭＫ１遺伝子を含むさまざまな遺伝子が位置している。そのような遺伝子の欠失により、さまざまな特徴的な外観と臨床症状が示される。７ｑ１１．２３の微小欠失はほとんどの場合には天然に起こり、微小欠失の家族歴が示されることはめったにない。ＷＢＳの子供は、わずかに隆起した小さな鼻先、長い人中、幅広な口、ふっくらした唇、小さな頬（頬部低形成）、腫れぼったい目、爪の形成障害、および外反母趾などの特徴的な外観を有している。
【０７９０】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７９１】
一例では、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患は、アラジール症候群（ＡＳ）であり得る。
−  アラジール症候群（ＡＳ）
【０７９２】
ＡＳは、肝臓の胆管の数がかなり減少し、胆汁うっ滞を誘導し、心血管系、骨格系、眼球、顔、膵臓、および神経発達の異常を伴う症候群である。  外国の報告によると、ＡＳの発生率は１／１００，０００であり、疾患の特性により、軽度の症状の患者を含む場合、その発生率は高くなると予想される。ＡＳは、２０番染色体の短腕に位置するＪＡＧＧＥＤ１遺伝子の異常により起こる。現在、原因となる変異または重複が、遺伝子検査により症例の５０〜７０％で見られることが知られている。
【０７９３】
ＡＳの臨床症状は、一般に生後３ヶ月以内に表れる。ＡＳは、黄疸と胆汁うっ滞が連続しているために新生児期によく見られ、慢性肝疾患のために小児期に見られ、成人期後期にも見られる。ＡＳにはさまざまな臨床症状があり、不完全に遺伝されることがあるため、診断が難しくなり得る。ほとんどの患者は、黄疸と胆汁うっ滞の症状、それに起因するかゆみ、乳児期に進行性肝不全を有している。黄疸は、ほとんどの患者で観察され、半数を超える患者で小児期後半まで続く。胆汁うっ滞に起因するかゆみが起こり、一部の子供は皮下組織に黄色腫を有している。肝臓の合成機能は比較的よく維持されているが、患者の約２０％は肝硬変と肝不全を発症する。
【０７９４】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＳＮＣＡ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７９５】
一例では、ＳＮＣＡ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患は、パーキンソン病であり得る。
−  パーキンソン病
【０７９６】
パーキンソン病は、通常、振戦、筋肉のこわばり、動作緩慢などの運動障害をよく示す疾患である。パーキンソン病が適切に治療されないと、運動障害が徐々に進行し、歩行や日常活動が困難になる。パーキンソン病は、主に高齢者に起こる疾患であり、年齢とともに疾患の発症リスクが徐々に増加し得る。韓国には正確な統計データはないが、パーキンソン病は１，０００人中１〜２人の割合で起こると推定される。高齢者で起こるパーキンソン病のほとんどの症例は、さまざまな研究を通じて遺伝的要因による影響が少ないことが知られている。しかしながら、４０歳未満の若い年齢で起こるパーキンソン病の一部の症例は、遺伝的要因に関連していることが知られている。
【０７９７】
パーキンソン病は、黒質に存在するドーパミンニューロンが徐々に死ぬため、ドーパミン濃度の低下によって引き起こされる疾患である。パーキンソン病の別の病理学的特徴は、脳剖検で観察されるタンパク質凝集体の形成であり、これはレビー小体と呼ばれる。レビー小体は、主要コンポーネントであるα−シヌクレインと呼ばれるタンパク質を有し、レビー小体とα−シヌクレインは、レビー小体認知症やシヌクレイノパチーなどの他の疾患にも関連している。α−シヌクレインの凝集は、中脳ではなく迷走神経と前嗅核で始まり、最終段階で中脳を介して大脳皮質に広がる。α−シヌクレインがパーキンソン病の進行に従って脳のさまざまな領域に広範囲に広がるという仮説は、α−シヌクレインが１つの細胞から放出されて別の細胞に伝達されるという最近の報告によって裏付けられている。
【０７９８】
パーキンソン病の遺伝率は、レビー小体の主要コンポーネントであるα−シヌクレインの変異体（Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ）がパーキンソン病を誘導するという報告によって最初に示唆された。その後、α−シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の重複と三重化がパーキンソン病の他の原因であると報告されていた。これは、α−シヌクレインタンパク質の変異に加えて、正常なタンパク質の過剰発現が細胞内でのα−シヌクレインの蓄積と凝集体の形成につながり、パーキンソン病の発症をもたらすことを意味する。
【０７９９】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＡＰＰ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０８００】
一例では、ＡＰＰ遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、アルツハイマー病であり得る。
−  アルツハイマー病
【０８０１】
アルツハイマー病は、記憶の進行性変性につながる脳の異常によって引き起こされる疾患である。加えて、アルツハイマー病は認知症を引き起こし、これが日常生活を妨げるのに十分な知的機能（思考、記憶および推理）の深刻な喪失をもたらす。ほとんどの場合、アルツハイマー病は６５歳を超えて起こるが、６５歳以前に発生することはめったにないとされ得る。米国では、６５〜７４歳の約３％、７５〜８４歳の約１９％、８５歳以上の約５０％がアルツハイマー病に罹患している。韓国では、農村地域に基づいた最近の調査によると、６０歳以上の人の約２１％が認知症であり、罹患者の約６３％がアルツハイマー型認知症であることが報告されている。２００６年には、世界で２６６，０００人がアルツハイマー病に罹患した。アルツハイマー病は２０５０年までに８５人に１人に影響を及ぼすと予想されている。
【０８０２】
この疾患の特徴は人によって異なるが、それらのいくつかは罹患者に共通している。初期の症状は、加齢に起因する単純な症状やストレスに起因する症状と誤解される傾向がある。疾患の初期段階では、罹患者は、名前、日付および場所が記憶から消える共通の短期記憶喪失を経験する。疾患が悪化すると、混乱、集中行動、双極性障害、言語障害、および長期記憶喪失の症状が示される。その結果、身体機能が失われ、死に至る。個人ごとに異なる症状があるため、疾患が人にどのような影響を及ぼすのかを予測することは困難である。アルツハイマー病が疑われる場合、通常、思考または行動能力が検査される診断が行われ、必要に応じて脳検査が行われる。しかしながら、正確な診断のためには、脳神経を調査する必要がある。アルツハイマー病が起こっているにもかかわらず、一般に疾患が完全に診断されるまでに時間がかかるため、診断なしで数年間疾患が進行することがある。疾患が起こった場合、平均余命は７年であり、罹患者の３％未満が診断後１４年存命している。
【０８０３】
アルツハイマー病は、神経変性疾患に分類される。この疾患の原因は完全には理解されていないが、アミロイド斑が正常なアルツハイマー病のタンパク質を修飾して斑の塊を形成し、内因性機能が失われると推定される。アルツハイマー病は、全体的な脳萎縮、心室拡大、神経原線維変化および神経炎性プラークなどの組織病理学的特徴を有している。
【０８０４】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＳＯＸ３遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子またはＬＭＢ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０８０５】
一例では、遺伝子重複疾患は、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合または常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）であり得る。
【０８０６】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、癌遺伝子の重複により生じる癌であり得る。
【０８０７】
ここで、癌遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子であり得る。
【０８０８】
一例では、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【０８０９】
本明細書に開示される例示的な一実施形態は、重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作することができる発現制御組成物を含む医薬組成物を提供する。
【０８１０】
発現制御組成物の説明は上記の通りである。
【０８１１】
例示的な一実施形態では、発現制御組成物は以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含むエディタータンパク質。
【０８１２】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８１３】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８１４】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０８１５】
ガイド核酸とエディタータンパク質のそれぞれは、核酸配列の形態で、またはガイド核酸とエディタータンパク質の結合により複合体を形成することによって、１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８１６】
任意に、発現制御組成物は、挿入されることが望ましい核酸配列またはそれをコードする核酸配列を含むドナーをさらに含み得る。
【０８１７】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーのそれぞれは、核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８１８】
医薬組成物は、追加の要素をさらに含み得る。
【０８１９】
追加の要素は、対象の体内への送達に適したキャリアを含み得る。
【０８２０】
本明細書に開示される例示的な一実施形態は、遺伝子重複疾患を治療する方法を提供し、これは、遺伝子重複疾患を治療する遺伝子重複疾患を有する生物に遺伝子改変用組成物を投与することを含む。
【０８２１】
治療方法は、生体に存在する重複遺伝子の転写調節領域を操作することにより重複遺伝子の発現を制御する治療方法であり得る。そのような方法は、生体に存在する重複遺伝子の転写調節領域を操作するための発現制御組成物を直接注入することにより行われ得る。
【０８２２】
発現制御組成物の説明は上記の通りである。
【０８２３】
例示的な一実施形態では、発現制御組成物は以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含むエディタータンパク質。
【０８２４】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８２５】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８２６】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０８２７】
ガイド核酸とエディタータンパク質のそれぞれは、核酸配列の形態で、またはガイド核酸とエディタータンパク質の結合により複合体を形成することによって、１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８２８】
任意に、発現制御組成物は、挿入されることが望ましい核酸配列またはそれをコードする核酸配列を含むドナーをさらに含み得る。
【０８２９】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーのそれぞれは、核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８３０】
ここで、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【０８３１】
ここで、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のものであり得る。
【０８３２】
遺伝子重複疾患の説明は上記のとおりである。
【０８３３】
遺伝子重複疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。
【０８３４】
加えて、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【０８３５】
発現制御組成物は、遺伝子重複疾患を有する治療対象に投与され得る。
【０８３６】
治療対象には、ヒト、サルなどの霊長類、ならびにマウスおよびラットなどの齧歯類を含む哺乳類が含まれ得る。
【０８３７】
発現制御組成物は、治療対象に投与され得る。
【０８３８】
投与は、注入、輸液、インプランテーションまたはトランスプランテーションにより行われ得る。
【０８３９】
投与は、神経内、網膜下、皮下、皮内、眼内、硝子体内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ内、および腹腔内経路から選択される投与経路を介して行われ得る。
【０８４０】
発現制御組成物の用量（所定の所望の効果を得るための薬学的有効量）は、約１０４〜１０９細胞／ｋｇ（投与対象の体重）、たとえば約１０５〜１０６細胞／ｋｇ（体重）であり、この数値範囲のすべての整数から選択され得るが、本発明はそれらに限定されない。  組成物は、投与対象の年齢、健康状態および体重、同時治療の種類、ならびに可能であれば治療の頻度および所望の効果を考慮して適切に処方され得る。
【０８４１】
重複遺伝子の転写調節領域が、本明細書に開示されるいくつかの例示的な実施形態による方法および組成物によって人為的に操作される場合、重複遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現が制御され得るため、異常に発現される重複遺伝子の発現を正常に制御する効果を得ることができる。
【実施例】
【０８４２】
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【０８４３】
これらの実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために提供されているに過ぎず、本発明の範囲が以下の実施例に限定されないことは当業者には明らかであろう。
実験方法
１．ｇＲＮＡの設計
【０８４４】
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して、ヒトＰＭＰ２２遺伝子、ヒトＰＬＰ１遺伝子、およびマウスＰＬＰ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域をスクリーニングした。ＰＭＰ２２遺伝子とＰＬＰ１遺伝子の標的領域は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類によって異なり得る。プロモーター領域（ＴＡＴＡボックス）およびエンハンサー領域（たとえば、ＥＧＲ２、ＳＯＸ１０またはＴＥＡＤ１結合領域）の標的配列；またはＳｐＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子の遠位エンハンサー領域ＢもしくはＣを、上記の表１にまとめており、ＣｊＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス）およびエンハンサー領域（たとえばＥＧＲ２またはＳＯＸ１０結合領域）の標的配列を表２にまとめている。加えて、ＳｐＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列を上記の表３にまとめており、ＣｊＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列を上記の表４にまとめている。ＳｐＣａｓ９のマウスＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列を上記の表５にまとめており、ＣｊＣａｓ９のマウスＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列は、上記の表６にまとめている。
【０８４５】
すべてのｇＲＮＡは、キメラ一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で生成した。標的配列を除くＣｊおよびＳｐ特異的なｓｇＲＮＡの骨格配列は、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'および５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'である。
２．ｇＲＮＡの構築と合成
【０８４６】
ｓｇＲＮＡをＡＡＶベクターにパッケージングするか、ＲＮＡで合成した。ウイルスベクターにｓｇＲＮＡを挿入するために、ｓｇＲＮＡの２０〜２２塩基配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計およびアニーリングし、ＢｓｍＢＩサイトを使用してｐＲＧＥＮ−ＣＡＳ９（自社開発）ベクターにライゲーションした。Ｃａｓ９および５'末端に可変標的配列を含むｓｇＲＮＡを、それぞれＣＭＶおよびＵ６プロモーターを介して発現させた。
【０８４７】
さらに、ＲＮＰによる送達システムでは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｔａｑを介した重合によって生成される２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりテンプレートを生成した後、ｓｇＲＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって転写した。転写したｓｇＲＮＡを精製し、分光法を使用して定量化した。
３．Ｃａｓ９タンパク質の精製
【０８４８】
ＮＬＳおよびＨＡエピトープを含むコドン最適化Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列をｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングし、最適な培養条件下でＩＰＴＧを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。発現させたＣａｓ９タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズを使用して精製し、適切な緩衝液で透析した。Ｃａｓ９の活性は、周知の有効なｓｇＲＮＡを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断試験で確認した。
４．細胞培養
【０８４９】
メーカーのマニュアルに従って、ヒトシュワン様細胞株（ＡＴＣＣ）およびヒト初代シュワン細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を培養した。ヒトシュワン様細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＷｅｌＧｅｎｅ）および１０％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を添加した高濃度のグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＷｅｌＧｅｎｅ）で培養した。
【０８５０】
ヒト初代シュワン細胞は、ベンダーが提供するシュワン細胞培養液（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）で維持した。分化のために、１％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）、髄鞘形成（ミエリン形成）シグナル用のＮｒｇ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）１００ｎｇ／ｍＬ、およびｄｂｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μＭを添加した低濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ（ＷｅｌＧｅｎｅ）で細胞を７日間培養した。
５．形質導入（トランスフェクション）
【０８５１】
形質導入（トランスフェクション）のために、４μｇのＣａｓ９タンパク質（ＴｏｏｌＧｅｎ）と１μｇのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体を室温で１５分間インキュベートした。その後、ＲＮＰ複合体を、１０μｌのエレクトロポレーションチップとＮｅｏｎネオンエレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してエレクトロポレーションし、２×１０５個の細胞に送達した。標的化ディープシーケンシングでは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を形質導入の７２時間後に形質導入細胞から収集した。
６．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
【０８５２】
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってヒト初代シュワン細胞からｍＲＮＡを抽出した。その後、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したメーカーのプロトコルに従って、１００ｎｇのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ発現マスターミックスでｑＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃｔ値を使用してＰＭＰ２２発現レベルを計算し、ＧＡＰＤＨを内因性対照として使用した。本研究で使用したＴａｑｍａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を下記の表７にまとめている。
［表７］
【表１２】
2020536501.tif 000014
７．標的化ディープシーケンシング
【０８５３】
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼｔａｑ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、形質導入細胞から抽出されたｇＤＮＡからＰＣＲによってオンターゲットサイトを増幅した。その後、ＰＣＲ増幅産物としてＭｉ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ペアエンドディープシーケンシングを行った。オンラインのＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して、ディープシーケンシングの結果を分析した。Ｃａｓ９によるインデルのその結果、ＰＡＭ配列の３ｂｐ上流で変異が起こったかどうかを確認した。本研究で使用したプライマーは、下記の表８にまとめている。  ［表８］
【表１３】
2020536501.tif 000015
【表１４】
2020536501.tif 000016
８．ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲットサイトの設計
【０８５４】
オフターゲットの可能性があるサイトは、オンラインツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計した。最大３ｂｐのミスマッチをオフターゲットサイトとみなした。
９．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ
【０８５５】
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ベンダーのプロトコルに従ってＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを精製した。あらかじめインキュベートしたＣａｓ９タンパク質（１００ｎＭ）およびｓｇＲＮＡ（３００ｎＭ）を、１ｍＬの反応溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）でゲノムＤＮＡ（１０μｇ）と３７℃にて８時間混合した。切断されたゲノムＤＮＡをＲＮａｓｅ  Ａ（５０μｇ／ｍＬ）で処理し、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して再度精製した。１μｇの切断されたゲノムＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓシステムを使用して断片に断片化し、ライブラリーを作成するためのアダプターをＤＮＡ断片に付加した。その後、ライブラリーは、ＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｔｅｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、３０〜４０×（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）の配列深度で全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）にかけた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断スコアを、ゲノムにおける切断された各塩基配列の位置でのＤＮＡ切断スコアリングシステムによって計算した。
１０．マウスと神経内注入
【０８５６】
本研究で使用したＣ２２マウス系統（Ｂ６；ＣＢＡＣａ−Ｔｇ（ＰＭＰ２２）Ｃ２２Ｃｌｈ／Ｈ）をＭＲＣ  Ｈａｒｗｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。Ｃ２２マウス（オス４匹、メス７匹）をＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した。神経内注入は、以前の研究と同じ方法で行った（Ｄａｉｓｕｋｅ  Ｉｎｏ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．，（２０１６）１１５）。６日齢のマウスに麻酔をかけ、手術によりマウスの坐骨神経を露出させた。神経損傷を最小限に抑えるために、坐骨切痕の終わりに、マイクロインジェクターに取り付けられている引っ張られたガラス製マイクロピペットを直ちに使用して、神経内注入を直ちに行った。マウスあたり１１μｇのＣａｓ９タンパク質と２．７５μｇのｓｇＲＮＡのＲＮＰ複合体を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにマウスに注入した。本研究で使用したすべての動物の管理、使用および処理は、国際実験動物ケア評価認証協会に従って、Ｓａｍｓｕｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＭＣ−２０１７０２０６００１）が立案したガイドラインのもとで行った。
１１．ロータロッド実験（ロータロッド試験）
【０８５７】
ロータロッド装置（Ｂ．Ｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌａｂ  ＩＮＣ．，Ｋｏｒｅａ）を使用して運動協調を評価した。この実験は、マウスのバランスと運動協調を評価するために行った。実験の前に、マウスは３日間のトレーニング期間を経た。実験では、ロータロッド実験用に水平回転ロッド（２１ｒｐｍ）を使用した。マウスの回転ロッドの保持時間を測定し、マウスを最大３００秒間ロッドにとどまらせた。
１２．電気生理学的試験
【０８５８】
電気生理学的状態を評価するために、以前の研究と同じ方法で神経伝導試験（ＮＣＳ）を行った。（Ｊｉｎｈｏ  Ｌｅｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．，（２０１５）２２，４３）。要約すると、マウスを炭酸ガスで麻酔し、実験中に１．５％イソフルランを供給するノーズコーンを使用して麻酔を維持した。毛は端から後足まで完全に除去した。ＮＣＳは、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＶｉｋｉｎｇＱｕｅｓｔ装置（Ｎａｔｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して行った。坐骨神経の運動神経伝導試験では、遠位部と近位部からの反応をそれぞれ、腱に参照電極を取り付けた腓腹筋に活動記録針電極を配置し、記録電極に近い位置に、刺激負電極を、股関節の内側の中心および眼窩後部の大腿部の中心線に向かって６ｍｍの距離で配置することにより測定した。遠位潜時（ＤＬ）、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）、および複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅を測定した。最大過刺激時にＣＭＡＰを測定した。
１３．神経の組織構造と画像
【０８５９】
マウスの坐骨神経を生検し、影響を受けたサンプルの病理学的検査を顕微鏡による分析により行った。２％グルタルアルデヒドを含む２５ｍＭカコジル酸バッファーを使用して、サンプルをそれぞれ固定した。半薄切片をトルイジンブルーで染色した。１％ＯｓＯ４で１時間インキュベーションした後、サンプルをエタノールで脱水し、プロピレンオキシドを通過させ、エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ  ８１２，Ｏｋｅｎ，Ｎａｇａｎｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋した。ライカウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、細胞を特定の厚さ（１μｍ）にスライスし、トルイジンブルーで３０〜４５秒間染色した。ｇ比（軸索直径／線維直径）は、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎ  ２プログラム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してミエリンの内径と外径を測定することにより計算した。
１４．統計分析
【０８６０】
ｍＲＮＡ発現レベルに関連するデータの統計的有意性は、ポストホックＴｕｋｅｙの多重比較を使用した一元配置分散分析によって評価した。他の種類の提示データは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｃｓｃｉｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｔｅｓｔｓ／ｍａｎｎｗｈｉｔｎｅｙ／Ｄｅｆａｕｌｔ２．ａｓｐｘ）を使用して計算した。本研究で作成したデータとグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。有意水準は０．０５に設定した。
１５．Ｐｌｐ１遺伝子ターゲティングのためのｓｇＲＮＡスクリーニング
【０８６１】
マウス線維芽細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５８）、筋芽細胞、すなわちＣ２Ｃ１２系統（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７７２）およびオリゴデンドロサイト細胞、Ｎ２０．１（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＬＵ１０８−Ｐ）をメーカーのマニュアルに従って培養した。細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＷｅｌＧｅｎｅ）および１０％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を添加した高濃度グルコース含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物のトランスフェクションのために、４μｇのＣａｓ９タンパク質と１μｇのｓｇＲＮＡまたはＣｊＣａｓ９プラスミドからなるＲＮＰ複合体（ＳｐＣａｓ９）（図１８）を調製した。その後、ＲＮＰ複合体またはＣｊＣａｓ９プラスミドを、１０μｌのエレクトロポレーションチップとＮｅｏｎエレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したエレクトロポレーションにより２×１０５個の細胞に送達した。トランスフェクションの７２時間後の標的化ディープシーケンシングでは、トランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を収集した。
１６．Ｐｌｐ１遺伝子のダウンレギュレーションアッセイ
【０８６２】
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってＮ２０．１細胞株からｍＲＮＡを抽出した。その後、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１μｇのｍＲＮＡを逆転写した。メーカーのプロトコルに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１００ｎｇのＴａｑｍａｎ遺伝子発現マスターミックスでリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＣＴ値を使用してＰｌｐ１発現レベルを計算し、Ｇａｐｄｈを内因性対照として使用した。この研究で使用したＴａｑｍａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、下記の表９にまとめている。
［表９］
【表１５】
2020536501.tif 000017
１７．  ＰＬＰ１遺伝子ターゲティングのためのｓｇＲＮＡスクリーニング
【０８６３】
ヒトリンパ芽球Ｊｕｒｋａｔ細胞株（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−１５２）およびヒト上皮２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−３２１６）をメーカーのマニュアルに従って培養した。細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＷｅｌＧｅｎｅ）および１０％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を添加した高濃度グルコース含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物のトランスフェクションのために、４μｇのＣａｓ９タンパク質と１μｇのｓｇＲＮＡまたはＣｊＣａｓ９プラスミドからなるＲＮＰ複合体（ＳｐＣａｓ９）（図１８）を調製した。その後、ＲＮＰ複合体またはＣｊＣａｓ９プラスミドを、１０μｌのエレクトロポレーションチップとＮｅｏｎエレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したエレクトロポレーションにより２×１０５個の細胞に送達した。トランスフェクションの７２時間後の標的化ディープシーケンシングでは、トランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を収集した。
実施例１．ＰＭＰ２２遺伝子のｓｇＲＮＡスクリーニング
【０８６４】
ヒトＰＭＰ２２の発現を正常範囲に減少させることができる治療的に有効なｓｇＲＮＡ配列をスクリーニングするために、ＰＭＰ遺伝子のプロモーター（ＴＡＴＡボックス）およびイントロンエンハンサー結合部位を標的とするように設計されたさまざまなｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９でヒト細胞株を形質導入した。要するに、ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞をＳｐＣａｓ９スクリーニングに使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣｊＣａｓ９に使用した。ｇＤＮＡを細胞から収集し、標的化ディープシーケンシングにかけた。ｓｇＲＮＡ配列によって誘導される変異のさまざまなパターンは、ＮＨＥＪを介したインデルによって同定された。いくつかのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡは、２つの調節部位にインデルを強く誘導した（図１ａおよび図１ｂ）。インデルの３０〜４０％が特異的ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡで誘導されることが確認された（図２ａおよび図２ｂ）。
実施例２．シュワン様細胞の遺伝子操作
【０８６５】
ｓｇＲＮＡによって引き起こされた有効なインデル変異がヒト細胞で同定されたが、その効果がシュワン細胞でも可能かどうかは不確定である。したがって、シュワン細胞におけるＰＭＰ２２発現阻害と遺伝子操作の効果を調査するために、シュワン様細胞であるｓＮＦ２．０細胞を使用してＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ効果を確認した。Ｊｕｒｋａｔ細胞で同定された有効なＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡをｓＮＦ０２．０細胞で繰り返し試験した。形質導入後、同じ高インデル頻度が同じｓｇＲＮＡによって得られたことが、ディープシーケンシング解析によって確認された。プロモーター（ＴＡＴＡボックス）部位およびエンハンサー結合部位を標的とする単一ｓｇＲＮＡの形質導入は、それぞれ３１％および５９％のインデルを誘導した（図３）。興味深いことに、ミエリン遺伝子の主要な制御因子（たとえばＥＧＲまたはＳＯＸ１０結合部位）または重要なＴＡＴＡボックスを含む４０〜５０ｂｐの小さな欠失が、デュアルｓｇＲＮＡで処理された細胞の非常に多くの細胞で見られた（図５）。
実施例３．遺伝子操作によるＰＭＰ２２の発現制御
【０８６６】
有効なｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の発現の変化を評価するために、シュワン様細胞を分化させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＰＭＰ２２を標的とするｓｇＲＮＡのほとんどがＰＭＰ２２の発現を有効に阻害した（図６）。単一ｓｇＲＮＡを使用した場合、ＰＭＰ２２の発現は、Ｃａｓ９のみで処理した対照と比較して約３０％減少し、デュアルｓｇＲＮＡを使用した場合、ＰＭＰ２２の発現は、Ｃａｓ９のみ処理した対照と比較して約５０％減少した。
実施例４．シュワン細胞の遺伝子操作
【０８６７】
ＰＭＰ２２の発現抑制と遺伝子操作効果がシュワン様細胞であらかじめ確認された後、前の結果がヒト初代シュワン細胞で同様の効果を示すかどうかが確認された。標的部位に応じたインデル頻度は、ヒト初代シュワン細胞のヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを使用して観察された。その結果、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー、およびＰＭＰ２２遺伝子のコード配列を標的とするｓｇＲＮＡのほとんどの標的部位でインデル頻度が高いことが確認された（図７ａ）。さらに、ＴＡＴＡボックスとエンハンサーをそれぞれ標的とするデュアルｓｇＲＮＡを使用した場合でも、高いインデル頻度が示された。標的部位でインデルが生じることが、遠位エンハンサー部位ＢおよびＣをコードする配列を標的とするｓｇＲＮＡを追加で使用して確認され（図７ｃ）、この場合、ＡＰＯＣ３を標的とするｓｇＲＮＡを対照として使用した。
【０８６８】
加えて、各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡがＰＭＰ２２遺伝子の発現の減少を引き起こすかどうかを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＭＰ２２はシュワン細胞の分化の最終段階で転写されるため、ヒト初代シュワン細胞は、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１（Ｎｒｇ１）およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を含む周知の分化シグナル因子で７日間処理した。その結果、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理しなかった細胞と比較して、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理した細胞ではＰＭＰ２２の発現が９倍増加することが確認された。対照的に、細胞を各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡで処理した場合、ＰＭＰ２２の発現が４〜６倍誘導されることが確認された。これは、各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の各標的部位修飾に起因したＰＭＰ２２の発現阻害によるものであると判断される（図７ｂ）。
実施例５．ヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現の減少の効果
【０８６９】
実験を、あらかじめスクリーニングされたＴＡＴＡボックス部位を標的とするｓｇＲＮＡｓの中で高いインデル効率を示し、ＴＡＴＡボックスを標的とし得るｓｇＲＮＡ＿ＴＡＴＡ＿Ｓｐ＃１（以下、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡと記載）を選択することにより、ヒト初代シュワン細胞で行った。インデルを、ヒト初代シュワン細胞にｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体を形質導入することにより誘導し（図８ｂの（ｂ））、標的化ディープシーケンシング解析を介して、総インデルの８９．５４±１．３９％がヒトＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックス部位で生成されたことが確認された（図８ｂの（ｃ））。
【０８７０】
加えて、ＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックスで形成された変異がＰＭＰ２２遺伝子の発現の減少を引き起こしたかどうかを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＭＰ２２はシュワン細胞の分化の最終段階で転写されるため、ヒト初代シュワン細胞は、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１（Ｎｒｇ１）およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を含む周知の分化シグナル因子で７日間処理した。その結果、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理しなかった細胞と比較して、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理した細胞ではＰＭＰ２２の発現が９倍増加することが確認された。対照的に、細胞をＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰと一緒に処理した場合、ＰＭＰ２２の発現が６倍誘導されることが確認された。これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２のＴＡＴＡ修飾によるＰＭＰ２２の発現阻害によるものであると判断される（図８ｂ）。分化シグナル因子とＡＡＶＳ１標的ＲＮＰの両方で処理された対照では、ＰＭＰ２２遺伝子の発現に違いは確認され得なかった。
【０８７１】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの特異性を確認するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのオフターゲット分析を行った。標的化ディープシーケンシングにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により確認されたオフターゲット部位で、シーケンシングエラー率（平均０．１％）を超えるインデル変異は確認されなかった（図９ａ）。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのオフターゲット分析は偏りのあるアプローチであり得るため、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（偏りのないシーケンシングベースのオフターゲット分析全体）も行った。その結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰにより切断された９つのオフターゲット部位を確認することができた（図１０ａ、図１０ｂ）。しかしながら、標的化ディープシーケンシングによる再分析の結果、オフターゲットサイトで異常なインデル変異は見られなかった（図１０ｃ）。
【０８７２】
これらの結果は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックスの有効かつ特異的な修飾が、ヒト初代シュワン細胞におけるＰＭＰ２２の転写レベルを制御し得ることを示している。
実施例６．ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の発現阻害による疾患表現型の軽減効果
【０８７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるＰＭＰ２２転写制御を試験するために、リポソームに囲まれたＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰをＣ２２マウスの坐骨神経に直接注入した（図１１）。この場合、Ｒｏｓａ２６（ｍＲｏｓａ２６）を標的とするＲＮＰ複合体を対照として使用した。ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰまたはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰを６日齢（ｐ６）マウスの左坐骨神経（同側）に神経内注入して送達し、右坐骨神経を内部対照（対側）として使用した。注入の４週間後、坐骨神経からゲノムＤＮＡを収集することにより、標的化ディープシーケンシングを介してＲＮＰ複合体の神経内送達効率を確認した。その結果、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰおよびＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰでそれぞれ処理されたすべての坐骨神経は、約１１％のインデル効率を示した（図１２のａ）。さらに、９８．４８±０．１５％のＴＡＴＡボックス変異が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果と一致する全体のインデルシーケンシング読み取りにおいて確認された（図１２のｂ）。
【０８７４】
加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＡＴＡボックス変異によるＰＭＰ２２の発現阻害を確認するために、坐骨神経全体から抽出したｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析をＲＮＰ処理した坐骨神経に対して行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果と同様に、ＰＭＰ２２遺伝子の発現が対照と比較して３８％減少したことが確認された（図１２のｃ）。
【０８７５】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって坐骨神経にオフターゲット変異が起こったかどうかを確認するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのオフターゲット分析を行った。その結果、マウスゲノムから３ｂｐ以上のミスマッチを含む８つのオフターゲットが確認され（図１３ａ）、標的化ディープシーケンシングを行った結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した神経（同側）からシーケンシングエラー率を超えるインデル変異は確認されなかった（図１３ｂ）。
【０８７６】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＡによって引き起こされるＰＭＰ２２の転写の減少が脱髄を防ぐことができるかどうかを試験するために、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰまたはｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理したＣ２２マウスの坐骨神経を得て、その半薄断面をトルイジンブルーで染色した（ミエリン染色）。さらに、ｇ比を測定するために、軸索直径および線維（ミエリンを含む軸索）直径を測定した。その結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した実験群では、より厚いミエリンシートが形成されたことが確認され得た（図１４ａ、図１４ｂ）。加えて、実験群をＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した場合、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理した対照と比較して、大きな直径を有する軸索の数が増加することがわかった（図１４ａ、図１４ｂ）。ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した実験群（１６．５％）で直径６μｍ以上の大きな有髄線維の数を測定した結果が、対照群よりもはっきりとした治療効果を示している（２．６％、ｐ＜０．０１）。
【０８７７】
ミエリン形成の組織学的分析の大幅な改善を考慮して、２つの群の電気生理学的プロファイルを調査した。その結果、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理された対照（図１５のａ、図１５のｂ）と比較して、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された実験群の坐骨神経では、遠位潜時（ＤＬ）が減少し、運動神経伝導速度（ＮＣＶ）が増加したことが確認され、これらの結果は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経におけるミエリンの厚さと軸索直径の増加に対応する。さらに、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経において複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅がかなり増加したことが確認され（図１５のｃ）、これは前の結果に対応する。
【０８７８】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによる組織学的および電気生理学的に改善された効果を考慮して、マウスの運動行動をロータロッド実験で分析した。その結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウス（１１〜１６週齢）は、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理されたマウス（１１〜１６週齢）よりもロッド上に長く留まることが確認された（図１６ａ）。さらに、ＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスは、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理されたマウスと比較して筋肉が増加したことが確認された（図１６ｂ）。
【０８７９】
これらの結果は、ＣＭＴ１ＡなどのＰＭＰ２２の過剰発現による脱髄を軽減または治療するためのＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの治療効果を示している。
【０８８０】
したがって、前述の結果は、ＰＭＰ２２のプロモーター部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＰＭＰ２２の発現阻害効果を示している。さらに、これらの結果は、Ｃ２２マウスの坐骨神経へのＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの直接の非ウイルス送達が、ＰＭＰ２２の過剰発現によって引き起こされる脱髄に関連する臨床的および神経病理学的表現型を改善し得ることを示している。したがって、ＰＭＰ２２の転写調節領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した修飾は、ＣＭＴ１Ａおよび脱髄性神経障害を示す他の疾患の治療に優れた戦略であると考えられる。
実施例７．ＰＬＰ遺伝子発現調節効果
【０８８１】
ＰＬＰ１遺伝子が複製されると、ＰＬＰ１遺伝子が過剰発現し、ＰＭＤ疾患の主な原因になる。したがって、ＰＭＤ疾患の治療に対してＰＬＰ１転写を制御するために、ＰＬＰ遺伝子の転写調節領域をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して人為的に改変し、その効果を確認した。
【０８８２】
このために、ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９スクリーニングを、マウスＰｌｐ１のプロモーター配列およびエンハンサー（ｗＭＮ１）のＴＡＴＡボックスに対して行い、最も高い活性を有するｓｇＲＮＡを選択し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲによりＰｌｐ１のダウンレギュレーションを確認した（図１７）。ここで、Ｐｌｐ１のエンハンサーは、ＡＳＥ（Ｈａｍｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｉｇｈｔ，２０１７）またはｗＭＮ１（Ｈａｍｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８；Ｔｕａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）領域であり得る。
【０８８３】
ｓｇＲＮＡスクリーニングの結果に基づいて、高いインデル率を有するＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９の各ｓｇＲＮＡの選択（図１９〜２２および表１０）を、Ｐｌｐ１のＴＡＴＡボックスおよびｗＭＮ１エンハンサー領域が、オリゴデンドロサイト、すなわち、Ｐｌｐ１遺伝子を発現するＮ２０．１細胞株を使用して標的にされた場合に行い、Ｐｌｐ１遺伝子のダウンレギュレーションにつながり得るものに関する研究を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。
［表１０］
【表１６】
2020536501.tif 000018
【０８８４】
スクリーニングされたｓｇＲＮＡリスト（ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ、ｍＰｌｐ１−ｗｍＮ１  ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９リードｓｇＲＮＡリスト）
【０８８５】
その結果、ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９を使用したＰｌｐ１のＴＡＴＡボックスまたはｗｍＮ１エンハンサー領域のターゲティングが、Ｐｌｐ１の有意なダウンレギュレーションをもたらすことが確認された（図２３）。加えて、ヒトＰＬＰ１遺伝子のｗｍＮ１エンハンサー領域のＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９スクリーニングを行って、インデル率（％）を確認した（図２４および２５）。
【０８８６】
したがって、ＰＬＰ１の転写調節領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した人為的な修飾は、ＰＭＤ治療の優れた戦略であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０８８７】
遺伝子重複疾患の治療薬は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して得ることができる。たとえば、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物は、重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御することにより、遺伝子重複に起因する疾患の治療薬として使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０８８８】
実施例で使用される重複遺伝子およびプライマー配列の転写調節領域の標的配列
【図１ａ】
2020536501.tif 000019
【図１ｂ】
2020536501.tif 000020
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2020536501.tif 000022
【図３】
2020536501.tif 000023
【図４】
2020536501.tif 000024
【図５】
2020536501.tif 000025
【図６】
2020536501.tif 000026
【図７ａ】
2020536501.tif 000027
【図７ｂ】
2020536501.tif 000028
【図７ｃ】
2020536501.tif 000029
【図８ａ】
2020536501.tif 000030
【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
2020536501.tif 000033
【図９ｃ】
2020536501.tif 000034
【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
2020536501.tif 000036
【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
2020536501.tif 000040
【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
2020536501.tif 000044
【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月9日(2020.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において重複遺伝子の発現を調節するための方法であって、
前記方法は、発現制御組成物を前記真核細胞に導入する段階を含み、
前記発現制御組成物は、
ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
前記ガイドＲＮＡは前記重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的領域を標的にし、
前記重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子であり、
前記転写調節領域はプロモーターまたはエンハンサーであり、
前記標的領域は、連続する１５〜２５ヌクレオチドの配列であるガイド核酸結合配列およびガイド核酸非結合配列を有する２つの鎖を有し、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列に相補的に結合するガイド配列を含み、
前記ガイド配列は、前記標的領域の前記ガイド核酸非結合配列との相同性を有するＲＮＡ配列であり、
前記ガイド配列は、前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列との０〜５ヌクレオチドのミスマッチを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６〜３０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９からなる群から選択される１または複数の配列を含むヌクレオチド配列、または、それらと８０％またはより高い相同性を有するヌクレオチド配列を含む、
ガイドＲＮＡまたは核酸と、
ＣＲＩＳＰＲ酵素、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸であって、
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり、
前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、およびストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つであり、 前記重複遺伝子の発現を前記真核細胞において低減する、
ＣＲＩＳＰＲ酵素または核酸と
を備える、方法。
【請求項２】
前記プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含むプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列または前記ガイド核酸非結合配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１〜２９５からなる群から選択される少なくとも１つのＴＡＴＡボックス配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガイド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１〜２９５からなる群から選択される少なくとも１つのＴＡＴＡボックス配列を含む、前記ガイド核酸非結合配列との相同性を有するＲＮＡ配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２〜１１５からなる群から選択される１つのガイド核酸非結合配列との相同性を有するＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現制御組成物は、ガイドＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形態で、前記ガイドＲＮＡおよび前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発現制御組成物は、前記ガイドＲＮＡおよび前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸をそれぞれ含むベクターの形態である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現制御組成物の導入は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１つまたは複数の方法によって実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
重複遺伝子を標的にするガイドＲＮＡ、または、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
前記ガイドＲＮＡは、前記重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的領域を標的にし、
前記転写調節領域はプロモーターまたはエンハンサーであり、
前記標的領域は、連続する１５〜２５ヌクレオチド配列であるガイド核酸結合配列およびガイド核酸非結合配列を有する２つの鎖を有し、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列に相補的に結合するガイド配列を含み、
前記ガイド配列は、前記標的領域の前記ガイド核酸非結合配列との相同性を有するＲＮＡ配列であり、
前記ガイド核酸非結合配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１〜２９５からなる群から選択される１つを含む配列である、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２〜１１５からなる群から選択される１つの配列であり、
前記ガイド配列は、前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列との０〜５ヌクレオチドのミスマッチを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６〜３０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９からなる群から選択される１または複数の配列を含むヌクレオチド配列、または、それらと８０％またはより高い相同性を有するヌクレオチド配列を含む、
ガイドＲＮＡまたは核酸。
【請求項１０】
前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸はベクターに含まれる、請求項９に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項１０に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２】
重複遺伝子の発現を調節するための組成物であって、
重複遺伝子を標的にするためのガイドＲＮＡ、または、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
前記ガイドＲＮＡは、前記重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的領域を標的にし、
前記転写調節領域はプロモーターまたはエンハンサーであり、
前記標的領域は、連続する１５〜２５ヌクレオチド配列のガイド核酸結合配列およびガイド核酸非結合配列を有する２つの鎖を有し、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列に相補的に結合するガイド配列を含み、
前記ガイド配列は、前記標的領域の前記ガイド核酸非結合配列との相同性を有するＲＮＡ配列であり、
前記ガイド核酸非結合配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１〜２９５からなる群から選択される１つを含む配列である、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２〜１１５からなる群から選択される１つの配列であり、
前記ガイド配列は、前記標的領域の前記ガイド核酸結合配列との０〜５ヌクレオチドのミスマッチを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６〜３０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９からなる群から選択される１または複数の配列を含むヌクレオチド配列、または、それらと８０％またはより高い相同性を有するヌクレオチド配列を含む、
ガイドＲＮＡまたは核酸と、
ＣＲＩＳＰＲ酵素、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸であって、
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり、
前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、およびストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つである、
ＣＲＩＳＰＲ酵素または核酸と
を備える組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、ガイドＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形態で前記ガイドＲＮＡおよび前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、前記ガイドＲＮＡおよび前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸をそれぞれ含むベクターの形態である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項１４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物、およびそれを使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物、ならびに発現制御組成物を使用して重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。加えて、本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して、遺伝子重複によって引き起こされる疾患を治療または改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子重複は、染色体の遺伝子組換えで生じるエラーの１つであり、染色体の部分領域を複製する複製現象である。遺伝子重複とは、次世代に継代される変異の一種である。遺伝子重複は、染色体の部分領域の非複製に起因する遺伝子欠失とともに、遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０００３】
遺伝子重複は、遺伝性疾患も引き起こす。代表的には、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ）（ＣＭＴ）１Ａ型は、染色体の特異領域で起こる遺伝子重複から生じ、手足の末梢神経発達に関与する遺伝子の過剰発現は、遺伝子重複に起因して起こり、ひいては手足の奇形の原因となる。
【０００４】
したがって、遺伝子が、適切な位置、ならびに細胞増殖、死、老化および分化などの生物学的プロセスが正常に機能する適切な時期に発現されることが重要である。不適切な時期と位置で遺伝子が不適切に発現される場合、特に、遺伝子重複によって引き起こされる異常な遺伝子発現は疾患につながる可能性があるため、各遺伝子の発現を制御する分子のメカニズムを理解する必要があるのと、各遺伝子に関連する転写調節因子を同定することが重要である。遺伝子発現を正確に制御できるさまざまな転写調節因子、たとえば、プロモーター、遠位制御エレメント、および転写因子、アクチベーター、およびコアクチベーターであって、遺伝子発現の制御に関与するものがある。
【０００５】
遺伝子発現は、転写調節因子の変化により制御される可能性があり、転写調節因子の異常な変化は、遺伝子の異常発現を引き起こし、それによって疾患を誘導する可能性がある。したがって、転写調節因子の変化は、さまざまな疾患を引き起こしたり、疾患を改善および治療したりする可能性がある。
【０００６】
しかしながら、転写調節因子を制御する現在の方法は、一時的な遺伝子発現のみを制御し、継続的な遺伝子発現調節は困難である。このため、遺伝子発現の異常性または困難性に起因する疾患を治療するための基本的な治療法はない。したがって、遺伝子編集または転写調節因子の修飾により、より継続的な治療効果を示す方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
１．Ｈａｍｄａｎ，Ｈ．，Ｋｏｃｋａｒａ，Ｎ．Ｔ．，Ｊｏｌｌｙ，Ｌ．Ａ．，Ｈａｕｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２０１５）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＬＰ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｅｘｏｎｓ  ｉｎ  ｉｔｒｏｎ  １．ＡＳＮ  Ｎｅｕｒｏ  ７．  ２．Ｈａｍｄａｎ，Ｈ．，Ｐａｔｙａｌ，Ｐ．，  Ｋｏｃｋａｒａ，Ｎ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２０１８）．Ｔｈｅ  ｗｍＮ１  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｉｔｒｏｎ  １  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＬＰ１．Ｇｌｉａ．  ３．Ｍｅｎｇ，Ｆ．，Ｚｏｌｏｖａ，Ｏ．，Ｋｏｋｏｒｉｎａ，Ｎ．Ａ．，Ｄｏｂｒｅｔｓｏｖａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２００５）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｔｒｏｎｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｙｅｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｌｐ）ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８２，３４６−３５６．  ４．Ｔｕａｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｓｔｉｋｅｒｄａｒ，Ａ．，Ｋｕｈｌｍａｎｎ，Ｔ．，Ｇｏｕｊｅｔ−Ｚａｌｃ，Ｃ．，Ｚａｌｃ，Ｂ．，Ｄｉｂ，Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ａ．（２００８）．Ｓｅｐａｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＭ２０  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｓｅｒｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８，６８９５−６９０３．  ５．Ｗｉｇｈｔ，Ｐ．Ａ．（２０１７）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｔｒｏｎ  １  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＰＬＰ１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＰＬＰ１−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＡＳＮ  Ｎｅｕｒｏ  ９，１７５９０９１４１７７２０５８３．
開示
技術的課題
【０００８】
本発明は、細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を提供することに関する。
【０００９】
本発明はまた、真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御する方法を提供することに関する。
【００１０】
本発明はまた、発現制御組成物を使用して遺伝子重複疾患を治療する方法を提供することに関する。
技術的解決策
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物に関する。より具体的には、本発明は、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物、ならびに発現制御組成物を使用して重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。加えて、本発明は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して、遺伝子重複によって引き起こされる疾患を治療または改善する方法に関する。
【００１２】
本発明は、細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を提供する。
【００１３】
一態様では、発現制御組成物は、以下のものを含み得る。
重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸；および
１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸。ガイド核酸は、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメイン
【００１４】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００１５】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成し得る。
【００１６】
ここで、相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み得る。
【００１７】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【００１８】
エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【００１９】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【００２０】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ガイド核酸の部分核酸をエディタータンパク質の部分アミノ酸と相互作用させることにより形成され得る。
【００２１】
転写調節領域は、プロモーター領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域、インシュレーター領域および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）からなる群より選択される１つまたは複数の領域であり得る。
【００２２】
標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域に位置する連続した１０〜２５ｎｔ（ヌクレオチド）配列であり得る。
【００２３】
標的配列は、重複遺伝子のプロモーター領域内またはそれに隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２４】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域内またはそれに隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域のＴＡＴＡボックス領域を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列、またはＴＡＴＡボックス領域に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２５】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２６】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡＷＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２７】
ここで、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡＷＡＷＲ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ）配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２８】
ここで、標的配列は、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４）配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７２）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３）配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５）配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６）配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７）配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７８）配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９）配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２）配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３）配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５）、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６）配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７）配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８）配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１）配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９３）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）配列、および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）配列からなる群より選択される配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００２９】
ここで、標的配列は、５'−ＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４）配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７２）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３）配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５）配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６）配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７）配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７８）配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９）配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２）配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３）配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５）配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６）配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７）配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８）配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１）配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９３）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）配列からなる群より選択される配列の５'末端または３'末端に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００３０】
標的配列は、重複遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。標的配列は、重複遺伝子のエンハンサー領域に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００３１】
標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の核酸配列におけるＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【００３２】
ここで、ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素に従って決定され得る。
【００３３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり得る。
【００３４】
ここで、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質からなる群より選択される１つまたは複数のＣａｓ９タンパク質であり得る。
【００３５】
重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【００３６】
重複遺伝子は癌遺伝子であり得る。
【００３７】
ここで、癌遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、ＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【００３８】
細胞は真核細胞であり得る。
【００３９】
真核細胞は哺乳類細胞であり得る。
【００４０】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、それぞれ核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在し得る。
【００４１】
ここで、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００４２】
ここで、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のウイルスベクターであり得る。
【００４３】
発現制御組成物は、ガイド核酸とエディタータンパク質とをガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で含み得る。
【００４４】
発現制御組成物はさらにドナーを含み得る。
【００４５】
本発明は、真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御する方法を提供する。
【００４６】
一態様では、真核細胞のゲノムに存在する重複遺伝子の発現を制御する方法は、発現制御組成物を真核細胞に導入することを含み得る。
【００４７】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る：
重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸；および
１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸。
【００４８】
真核細胞は哺乳類細胞であり得る。
【００４９】
ガイド核酸は、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み得る。
【００５０】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００５１】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成し得る。
【００５２】
ここで、相補的な結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み得る。
【００５３】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【００５４】
エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【００５５】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【００５６】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ガイド核酸の部分核酸をエディタータンパク質の部分アミノ酸と相互作用させることにより形成され得る。
【００５７】
発現制御組成物は、ガイド核酸とエディタータンパク質とをガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で含み得る。
【００５８】
発現制御組成物は、ガイド核酸とエディタータンパク質がそれぞれ核酸の形態で含まれる１つまたは複数のベクターを含み得る。
【００５９】
導入は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１つまたは複数の方法により行われ得る。
【００６０】
本発明は、遺伝子重複疾患を治療する方法を提供する。
【００６１】
一態様では、遺伝子重複疾患を治療する方法は、治療対象への発現制御組成物の投与を含み得る。
【００６２】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る：
重複遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸；および
１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸。
【００６３】
ガイド核酸は、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列を標的とすることができるガイドドメインを含み得る。
【００６４】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００６５】
ここで、ガイドドメインは、重複された遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列と相補的な結合を形成し得る。
【００６６】
ここで、相補的結合は、０〜５つのミスマッチ結合を含み得る。
【００６７】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【００６８】
エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【００６９】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【００７０】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ガイド核酸の部分核酸をエディタータンパク質の部分アミノ酸と相互作用させることにより形成され得る。
【００７１】
遺伝子重複疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ（Ｐｏｔｏｃｋｉ−Ｌｕｐｓｋｉ）症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。
【００７２】
遺伝子重複疾患は、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌であり得る。
【００７３】
ここで、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【００７４】
治療対象は、ヒト、サル、マウスおよびラットを含む哺乳類であり得る。
【００７５】
投与は、注入、輸液、インプランテーションまたはトランスプランテーションにより行われ得る。
有利な効果
【００７６】
本発明は、発現制御組成物により重複遺伝子の発現を制御することができる。より具体的には、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物を使用することにより重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して改善または治療することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１ａ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたＴＡＴＡボックスを示す。
【図１ｂ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたエンハンサーのそれぞれのインデル頻度を示す。
【００７８】
【図２ａ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたＴＡＴＡボックスを示す。
【図２ｂ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに基づく遺伝子操作によるインデル頻度（％）を示す一連の結果であり、ｓｇＲＮＡの標的部位が区分されたエンハンサーのそれぞれのインデル頻度を示す。
【００７９】
【図３】シュワン様細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の調節エレメントを標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによる遺伝子操作効果を示す。
【００８０】
【図４】ヒトＰＭＰ２２のＣＤＳを標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡにより誘導されるフレームシフト変異比を示す。
【００８１】
【図５】デュアルｓｇＲＮＡの処理によるヒトＰＭＰ２２のごく一部の欠失を示す。Ｓｏｘ１０およびＥｇｒ２の配列を含むＷＴ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０であり、その一部が欠失された変異配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３１である。Ｅｎｈ−Ｓｐ５およびＥｎｈ−Ｓｐ１６の標的配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３２および３３３である。加えて、ＴＡＴＡボックスを含むＷＴ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３４であり、その一部が欠失された変異配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３５である。ＴＡＴＡ−Ｓｐ１２およびＴＡＴＡ−Ｓｐ１４の標的配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３６および３３７である。
【００８２】
【図６】ヒトシュワン様細胞におけるＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるヒトＰＭＰ２２のｍＲＮＡ発現の減少を示すグラフである。
【００８３】
【図７ａ】ヒト初代シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるインデル頻度の測定結果を示す。
【図７ｂ】ヒト初代シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、各標的部位のミエリン形成シグナル因子およびＲＮＰ複合体の処理の有無にかかわらずｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＰＭＰ２２の相対的なｍＲＮＡ発現比較結果（ｎ＝３、一元配置分散分析およびテューキー事後検定：＊ｐ＜０．０５）を示す。
【図７ｃ】ヒト初代シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、遠位エンハンサー部位（遠位エンハンサー領域）ＢとＣを標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるインデル頻度の測定結果を示す。
【００８４】
【図８ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、ヒトＰＭＰ２２位置のプロモーター領域を標的とする標的配列（プロモーター領域の一部の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３８（上の鎖）および３３９（下の鎖））を示す。
【図８ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現減少を示すグラフであり、左端のグラフ、中央のグラフ、ならびに右端のグラフは、ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングを使用したインデル頻度の測定結果、総インデル頻度のうちＴＡＴＡボックス１変異頻度の測定結果（ｎ＝３）、ならびにヒト初代シュワン細胞におけるミエリン形成シグナル因子およびＲＮＰ複合体の処理の有無にかかわらずｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＰＭＰ２２の相対的ｍＲＮＡ発現の比較結果（ｎ＝３、一元配置分散分析およびテューキー事後検定：＊ｐ＜０．０５）をそれぞれ示す。
【００８５】
【図９ａ】ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を示し、インデル頻度を示すグラフである。
【図９ｂ】ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を示し、高頻度のインデルを示す（ＷＴのローカル配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０、インデルを含むローカル配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４１〜３４５（Ｉｎｄｅｌ−１〜−４の順））。
【図９ｃ】ヒト初代シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を示し、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲット部位を示す（オンターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６、オフターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７〜３６４（Ｏｆｆ１からＯｆｆ１８の順））。
【００８６】
【図１０ａ】ヒトの全ゲノムにおいてＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される部位を示す一連の結果であり、ゲノムワイドなＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図１０ｂ】ヒトの全ゲノムにおいてＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される部位を示す一連の結果であり、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲット分析を介して判明したオフターゲット部位のうちＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑにより現れるオフターゲット部位を示す。オンターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６であり、オフターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６５〜３７３（Ｏｆｆ１〜Ｏｆｆ９の順）である。
【図１０ｃ】ヒトの全ゲノムにおいてＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される部位を示す一連の結果であり、オフターゲット部位におけるインデル頻度を示すグラフである。オンターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６であり、オフターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６５〜３７３（Ｏｆｆ１〜Ｏｆｆ９の順）である。
【００８７】
【図１１】Ｃ２２マウスにおけるＰＭＰ２２‐ＴＡＴＡ  ＲＮＡ療法を使用した治療アプローチを概略的に示す。
【００８８】
【図１２】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した疾患表現型の軽減を示す一連の結果であり、（ａ）は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で治療された坐骨神経における標的ディープシーケンシングを使用したインデル頻度を示すグラフ（ｎ＝３）であり、（ｂ）は、総インデル頻度のうちＴＡＴＡボックス１変異頻度の測定結果（ｎ＝３）を示し、（ｃ）は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で治療された坐骨神経からのｑＲＴ−ＰＣＲを使用したＰＭＰ２２の発現ｍＲＮＡの相対量を比較するグラフである。
【００８９】
【図１３ａ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によるマウスゲノムにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡのオフターゲット部位およびインデル頻度を示す一連の結果であり、オフターゲット部位を示す。オンターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６であり、オフターゲット配列は３７４〜３８１（Ｏｆｆ１〜Ｏｆｆ８の順）である。
【図１３ｂ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によるマウスゲノムにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡのオフターゲット部位およびインデル頻度を示す一連の結果であり、各オフターゲット部位でのインデル頻度を示すグラフである。オンターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６であり、オフターゲット配列は３７４〜３８１（Ｏｆｆ１〜Ｏｆｆ８の順）である。
【００９０】
【図１４ａ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した疾患表現型の軽減を示す一連の結果であり、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理された坐骨神経組織の半薄切片の一連の画像である。
【図１４ｂ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した疾患表現型の軽減を示す一連の結果であり、上のグラフと下のグラフは、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスにおいてｇ比が増加することを示す散布図と、ＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスにおいて有髄軸索の直径が増加することを示すグラフをそれぞれ示す。
【００９１】
【図１５】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を介した電気生理学的な変化を示す一連の結果であり、（ａ）遠位潜時（ＤＬ）の変化を示すグラフであり、（ｂ）運動神経伝導速度（ＮＣＶ）の変化を示すグラフであり、（ｃ）複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の変化を示すグラフ（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰの場合はｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡの場合はｎ＝１０）である。
【００９２】
【図１６ａ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因した運動行動の一連の分析結果であり、上のグラフと下のグラフは、ロータロッド試験の結果（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰの場合はｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡの場合はｎ＝１１）と、マウスが８週齢から１６週齢になるまで毎週測定したロータロッド試験の結果（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰの場合はｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡの場合はｎ＝１１）をそれぞれ示す。
【図１６ｂ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因した運動行動の一連の分析結果であり、上のグラフと下の画像は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理されたＣ２２マウスの腓腹筋重量／体重の比と、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理されたＣ２２マウスの一連の腓腹筋画像をそれぞれ示すグラフである。
【００９３】
【図１７】ＰＭＤ治療戦略を示す概略図であって、ＰＬＰ１遺伝子のＴＡＴＡボックス領域とエンハンサー領域を標的とするｓｇＲＮＡを設計した。エンハンサー領域を標的とするｓｇＲＮＡの場合、２つのｓｇＲＮＡを使用してエンハンサーを除去する戦略が示される。ここで、エンハンサー領域の上流を標的とするｓｇＲＮＡはＵｐと表示され、その下流を標的とするｓｇＲＮＡはＤｏｗｎと表示され、ＵｐとＤｏｗｎはまた、表５と６における位置に従って表示される。
【００９４】
【図１８】例示的な実施形態で使用されるＣｊＣａｓ９プラスミドを示す。
【００９５】
【図１９】ｍＰｌｐ１のＴＡＴＡボックス領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示す一連のグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用したｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｓｐ−０１を標的とするｓｇＲＮＡであり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９６】
【図２０】ｍＰｌｐ１のＴＡＴＡボックス領域を標的とするＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示す一連のグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用されるｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０１〜ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０４であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９７】
【図２１】ｍＰｌｐ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示す一連のグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用したｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０１〜ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−３６であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９８】
【図２２】ｍＰｌｐ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示すグラフである。（ａ）は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、（ｂ）は、Ｎ２０．１細胞において確認されたインデル頻度（％）を示す。ここで、使用したｓｇＲＮＡは、ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０１〜ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−２８であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【００９９】
【図２３】ｍＰｌｐ１のＴＡＴＡボックスとエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡおよびＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰｌｐのｍＲＮＡ発現レベルを示す一連のグラフである。（ａ）は、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰｌｐのｍＲＮＡ発現レベルを示し、ここで、ＴＡＴＡボックス領域を標的とするｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｓｐ−０１ならびにエンハンサーを標的とするｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０７＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−２７およびｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０８＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−２７をｓｇＲＮＡとして使用した。  （ｂ）は、ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰｌｐのｍＲＮＡ発現レベルを示し、ここで、ＴＡＴＡボックス領域を標的とするｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０２およびｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ−Ｃｊ−０３；ならびにエンハンサーを標的とするｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０６＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０９、ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０６＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−１０およびｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０６＋ｍＰｌｐ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−１９をｓｇＲＮＡとして使用した。ｍＲｏｓａ２６を対照として使用した。
【０１００】
【図２４】ｈＰＬＰ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示すグラフであり、Ｊｕｒｋａｔ細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、使用したｓｇＲＮＡは、ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−０１〜ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｓｐ−３６であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【０１０１】
【図２５】ｈＰＬＰ１のエンハンサー（ｗＭＮ１エンハンサー）領域を標的とするＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのスクリーニング結果を示すグラフであり、２９３Ｔ細胞において確認されたインデル頻度（％）を示し、使用したｓｇＲＮＡは、ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−０１〜ｈＰＬＰ１−ｗＭＮ１−Ｃｊ−３６であり、グラフ上の標的配列に表示される数字で区別した。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
別様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同一の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。本明細書で開示される一態様は、発現制御組成物に関する。
【０１０３】
発現制御組成物は、遺伝子重複により重複遺伝子の発現を制御するための組成物である。
【０１０４】
「遺伝子重複」とは、ゲノム内に２つ以上の同一遺伝子が存在することを意味する。遺伝子重複には、ゲノム内に同じ遺伝子の２つ以上の部分を有することも含まれる。たとえば、遺伝子重複とは、ゲノム内に２つ以上の完全長Ａ遺伝子、またはゲノム内に１つの完全長Ａ遺伝子と、Ａ遺伝子の１つまたは複数の部分、たとえばエクソン１が存在することを意味し得る。たとえば、遺伝子重複とは、ゲノム内に２つの全長Ｂ遺伝子と、Ｂ遺伝子の１つまたは複数の部分、たとえばエクソン１およびエクソン２が存在することを意味し得る。遺伝子重複の種類はさまざまであり得、遺伝子重複には、ゲノム内の全長遺伝子および／または遺伝子の部分配列の重複（すなわち２つ以上）が含まれる。
【０１０５】
加えて、遺伝子重複には、染色体の部分領域を複製する複製現象が含まれ、それは染色体の遺伝子組換え中に起こる。そのような遺伝子重複とは、遺伝子変異の一種であり、次世代に継代される。遺伝子重複は、遺伝子の部分領域が複製されないために起こる遺伝子の欠失とともに、遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０１０６】
ここで、遺伝子重複の対象、すなわち２つ以上の数で存在する遺伝子を「重複遺伝子（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）」と呼ぶ。
【０１０７】
重複遺伝子は、遺伝子重複によりゲノム内の総コピー数が増加した遺伝子であり得る。
【０１０８】
重複遺伝子は、遺伝子重複により部分領域のみが重複されている変異遺伝子であり得る。ここで、変異遺伝子は、遺伝子の全配列中の１つまたは複数のヌクレオチド配列が重複されている遺伝子であり得る。あるいは、変異遺伝子は、遺伝子重複により遺伝子の部分核酸断片が複製されている遺伝子であり得る。ここで、核酸断片は、５０ｂｐ以上のヌクレオチド配列を有し得る。
【０１０９】
遺伝子重複には、全ゲノム重複が含まれる。
【０１１０】
遺伝子重複には、標的遺伝子重複が含まれる。ここで、標的遺伝子重複とは、新しい種の環境変化への分化と適応において、特定の環境に適した関連遺伝子が増幅または消失し、ほとんどの複製がトランスポゾンにより行われる遺伝子重複の一種である。
【０１１１】
遺伝子重複には、異所性組換えが含まれる。ここで、異所性組換えは、相同染色体の減数分裂中の不均等なクロスオーバーに起因する複製のために２つの染色体間の反復配列の程度に従って起こる。クロスオーバーでの重複と相互欠失が発生する。異所性組換えは、転位因子などの典型的な反復遺伝因子によって媒介され、組換えによって引き起こされる複製をもたらす。
【０１１２】
遺伝子重複には、複製のずれが含まれる。ここで、複製のずれは、ＤＮＡ複製中のエラーによる短い遺伝子配列の複製であり、ＤＮＡポリメラーゼが変性ＤＮＡ鎖に誤って付着し、ＤＮＡ鎖が再び複製されるときに起こる。複製のずれはまた、反復遺伝要素によって頻繁に媒介される。
【０１１３】
遺伝子重複には、レトロトランスポジションが含まれる。ここで、レトロトランスポジションは、レトロウイルスまたはレトロエレメント侵入細胞によって媒介される複製であって、遺伝子の逆転写が行われてレトロ遺伝子が形成され、レトロ遺伝子の組換えにより遺伝子重複が行われる。レトロトランスポジションは、レトロ転位因子などの遺伝的因子によって媒介される。
【０１１４】
遺伝子重複は、重複遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現を増加させることができる。ここで、転写されたｍＲＮＡの発現は、遺伝子重複が起こらない状態と比較して増加し得る。
【０１１５】
遺伝子重複は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を増加させることができる。ここで、タンパク質の発現は、遺伝子重複が起こらない状態と比較して増加し得る。
【０１１６】
遺伝子重複は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の機能障害を引き起こし得る。
【０１１７】
ここで、機能不全は、タンパク質の機能亢進、抑制機能、および第３の機能であり得る。
【０１１８】
遺伝子重複は、遺伝子重複疾患を引き起こし得る。
【０１１９】
「遺伝子重複疾患」とは、遺伝子重複によって引き起こされる疾患であり、重複遺伝子の異常増幅により遺伝的異常を引き起こし、過剰発現またはそれによって異常に生成されるタンパク質によって病理学的特徴を誘導するすべての疾患または障害を含む。ここで、「病理学的特徴」とは、生物の細胞レベルでの変化、ならびに疾患に基づく組織、器官および個人レベルでの変化を指す。
【０１２０】
遺伝子重複疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。
【０１２１】
遺伝子重複疾患は、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌であり得る。
【０１２２】
ここで、癌遺伝子重複によって引き起こされる癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【０１２３】
遺伝子重複疾患は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２４】
遺伝子重複疾患は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子またはＡＫＴ２遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２５】
遺伝子重複疾患は、重複遺伝子の転写されたｍＲＮＡの発現の異常な増加によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２６】
遺伝子重複疾患は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の異常な増加によって引き起こされる疾患であり得る。
【０１２７】
発現制御組成物は、重複遺伝子の転写により生成されるｍＲＮＡの発現の制御に使用され得る。
【０１２８】
発現制御組成物は、重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の制御に使用され得る。
【０１２９】
発現制御組成物は、重複遺伝子の人為的な修飾または操作に使用され得る。
【０１３０】
ここで、「人為的に修飾または操作（人為的に修飾、操作または改変された）」とは、天然に存在する状態ではなく、人為的に修飾された状態を指す。  以下、非天然に人為的に修飾または操作された重複遺伝子は、人為重複遺伝子と同義で使用され得る。
【０１３１】
「発現制御システム」とは、人為的に操作された重複遺伝子の発現の制御に起因して起こるすべての現象、ならびに発現制御システムに直接または間接的に関与するすべての材料、組成物、方法および使用を含む用語である。
【０１３２】
発現制御組成物は、重複遺伝子の転写調節領域の人為的な操作または修飾に使用され得る。
【０１３３】
ここで、「転写調節領域（転写制御領域）」とは、遺伝子のＤＮＡに基づいてＲＮＡを合成するプロセス全体を制御する領域であり、遺伝子のＤＮＡ配列および／または遺伝子の近位ＤＮＡ配列の転写因子と相互作用するすべての領域を含む。ここで、転写因子は、活性化されるとＤＮＡの特異領域、すなわち遺伝子に近い応答エレメントに結合し、それによって遺伝子発現を促進または阻害するタンパク質であり、応答要素は、転写調節領域に含まれる。転写調節領域の種類と位置は遺伝子に従って異なり得、同じ種でも個体間で核酸配列に違いがあり得る。
【０１３４】
転写調節領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターおよび／または遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）であり得る。
【０１３５】
プロモーターは、コアプロモーター、近位プロモーターおよび／または遠位プロモーターであり得る。
【０１３６】
ここで、コアプロモーターは、転写開始部位（ＴＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写因子結合部位および／またはＴＡＴＡボックスを含み得る。
【０１３７】
ＴＡＴＡボックスは、Ｒｐｂ４／Ｒｂｐ７の転写を開始するために使用される開始部位の２５塩基対上流に位置する領域であり得る。
【０１３８】
ＴＡＴＡボックスは、ＴＳＳの３０塩基対上流に位置する領域であり得る。
【０１３９】
ＴＡＴＡボックスは、ＴＳＳの４０〜１００塩基対上流に位置する領域であり得る。
【０１４０】
たとえば、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）−３'配列を含む領域であり得る。あるいは、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）−３'配列を含む領域であり得る。
【０１４１】
たとえば、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在する５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４）配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７２）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３）配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５）配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６）配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７）配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７８）配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９）配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２）配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３）配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５）配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６）配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７）配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８）配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１）配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９３）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）配列からなる群より選択される１つまたは複数の配列を含む領域であり得る。
【０１４２】
たとえば、ＴＡＴＡボックスは、プロモーターおよび／またはコアプロモーターに存在するＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）が結合する領域であり得る。
【０１４３】
ここで、近位プロモーターは、ＴＳＳ、ＣｐＧ部位および／または特定の転写因子結合部位の１〜３００ｂｐ上流の領域を含み得る。
【０１４４】
エンハンサーは、エンハンサーボックス（Ｅボックス）を含み得る。
【０１４５】
インシュレーターは、エンハンサーとプロモーターとの間の相互作用を阻害する領域、または抑制されたクロマチンの拡大を妨げる領域であり得る。
【０１４６】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、ＭＡＲおよびＳＡＲなどの多数のシス作用因子が存在する領域であり得る。本明細書に開示される一態様として、発現制御組成物は、ガイド核酸を含み得る。
【０１４７】
発現制御組成物は、重複遺伝子を標的とするガイド核酸またはそれをコードする核酸配列を含み得る。
【０１４８】
「ガイド核酸」とは、標的核酸、遺伝子または染色体を認識し、エディタータンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。ここで、ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体の部分ヌクレオチド配列に相補的に結合し得る。加えて、ガイド核酸の部分ヌクレオチド配列は、エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸と相互作用し、それによってガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【０１４９】
ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体の標的領域に位置するようにガイド核酸−エディタータンパク質複合体を誘導する機能を果たし得る。
【０１５０】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの形態で存在し得、５〜１５０ｎｔの核酸配列を有し得る。
【０１５１】
ガイド核酸は、１つの連続した核酸配列を有し得る。
【０１５２】
たとえば、１つの連続した核酸配列は（Ｎ）ｍであり得、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣもしくはＧ、またはＡ、Ｕ、ＣもしくはＧを表し、ｍは１〜１５０の整数である。
【０１５３】
ガイド核酸は、２つ以上の連続した核酸配列を有し得る。
【０１５４】
たとえば、２つ以上の連続核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣもしくはＧ、またはＡ、Ｕ、ＣもしくはＧを表し、ｍとｏは１〜１５０の整数であり、ｍとｏは互いに同じでも異なっていてもよい。
【０１５５】
ガイド核酸は、１つまたは複数のドメインを含み得る。
【０１５６】
ドメインは、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、またはテールドメインであり得るが、これらに限定されない。
【０１５７】
ここで、１つのガイド核酸は、２つ以上の機能的ドメインを有し得る。ここで、２つ以上の機能的ドメインは、互いに異なっていてもよい。一例として、１つのガイド核酸は、ガイドドメインと第１の相補的ドメインを有し得る。別の例では、１つのガイド核酸は、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインを有し得る。さらに別の例では、１つのガイド核酸は、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインを有し得る。あるいは、１つのガイド核酸に含まれる２つ以上の機能的ドメインは、互いに同じであり得る。一例として、１つのガイド核酸は、２つ以上の近位ドメインを有し得る。別の例として、１つのガイド核酸は、２つ以上のテールドメインを有し得る。しかしながら、１つのガイド核酸に含まれる機能的ドメインが同じドメインであるという説明は、２つの機能的ドメインの配列が同じであることを意味しない。配列が異なっていても、機能的に同じ機能を果たす場合、２つの機能的ドメインは同じドメインであり得る。
【０１５８】
機能的ドメインについては、以下で詳しく説明する。ｉ）ガイドドメイン
【０１５９】
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列と相補的に結合することができるドメインであり、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸との特異的な相互作用のために作用する。たとえば、ガイドドメインは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸における特定のヌクレオチド配列に位置するガイド核酸−エディタータンパク質複合体を誘導する機能を果たし得る。
【０１６０】
ガイドドメインは、１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６１】
一例では、ガイドドメインは、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６２】
別の例では、ガイドドメインは、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６３】
ガイドドメインは、ガイド配列を含み得る。
【０１６４】
「ガイド配列」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列である。ここで、ガイド配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１６５】
ガイド配列は、１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６６】
一例では、ガイド配列は、１０〜２５、１５〜２５または２０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６７】
別の例では、ガイド配列は、１０〜１５、１５〜２０または２０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１６８】
加えて、ガイドドメインは、追加のヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【０１６９】
追加のヌクレオチド配列を利用して、ガイドドメインの機能を改善または低下させることができる。
【０１７０】
追加のヌクレオチド配列を利用して、ガイド配列の機能を改善または低下させることができる。
【０１７１】
追加のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７２】
一例では、追加のヌクレオチド配列は、２〜１０、４〜１０、６〜１０または８〜１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７３】
別の例では、追加のヌクレオチド配列は、１〜３、３〜６または７〜１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７４】
一実施形態では、追加のヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１７５】
たとえば、追加のヌクレオチド配列は、１つのヌクレオチド配列Ｇ（グアニン）、または２つのヌクレオチド配列ＧＧであり得る。
【０１７６】
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の５'末端に配置され得る。
【０１７７】
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の３'末端に配置され得る。
ｉｉ）第１の相補的ドメイン
【０１７８】
「第１の相補的ドメイン」という用語は、後述する第２の相補的ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含むドメインであり、第２の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。たとえば、第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１７９】
第１の相補的ドメインは、相補的結合により第２の相補的ドメインと二本鎖を形成し得る。ここで、形成された二本鎖は、エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸と相互作用することによりガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成するように作用し得る。
【０１８０】
第１の相補的ドメインは、５〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８１】
一例では、第１の相補的ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８２】
別の例では、第１の相補的ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
ｉｉｉ）リンカードメイン
【０１８３】
「リンカードメイン」という用語は、２つ以上のドメインを連結するヌクレオチド配列であり、それらは２つ以上の同一または異なるドメインである。リンカードメインは、共有結合または非共有結合により２つ以上のドメインと連結され得、または共有結合もしくは非共有結合により２つ以上のドメインを連結し得る。
【０１８４】
リンカードメインは、１〜３０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８５】
一例では、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１８６】
別の例では、リンカードメインは、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド配列であり得る。
ｉｖ）第２の相補的ドメイン
【０１８７】
「第２の相補的ドメイン」という用語は、上記の第１の相補的ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含むドメインであり、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。たとえば、第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１８８】
第２の相補的ドメインは、相補的結合により第１の相補的ドメインと二本鎖を形成し得る。ここで、形成された二本鎖は、エディタータンパク質のいくつかのアミノ酸と相互作用することによりガイド核酸−エディタータンパク質複合体を形成するように作用し得る。第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインに相補的なヌクレオチド配列、および第１の相補的ドメインに対して相補性を有しないヌクレオチド配列、たとえば、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成しないヌクレオチド配列を有し得、第１の相補的ドメインよりも長い塩基配列を有し得る。
【０１８９】
第２の相補的ドメインは、５〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９０】
一例では、第２の相補的ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９１】
別の例では、第２の相補的ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
ｖ）近位ドメイン
【０１９２】
「近位ドメイン」という用語は、第２の相補的ドメインに隣接して位置するヌクレオチド配列である。
【０１９３】
近位ドメインは、その中に相補的なヌクレオチド配列を有し得、相補的なヌクレオチド配列により二本鎖で形成され得る。
【０１９４】
近位ドメインは、１〜２０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９５】
一例では、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０または１５〜２０ヌクレオチド配列であり得る。
【０１９６】
別の例では、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５または１５〜２０ヌクレオチド配列であり得る。
ｖｉ）テールドメイン
【０１９７】
「テールドメイン」という用語は、ガイド核酸の両端のうちの１つまたは複数の端に位置するヌクレオチド配列である。
【０１９８】
テールドメインは、その中に相補的なヌクレオチド配列を有していてもよいか、相補的なヌクレオチド配列のために二本鎖で形成されていてもよい。
【０１９９】
テールドメインは、１〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０２００】
一例では、テールドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０２０１】
別の例では、テールドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０２０２】
一方、ドメイン、すなわちガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインに含まれる核酸配列の一部または全体は、選択的または追加で化学修飾を含み得る。
【０２０３】
化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、これらに限定されない。
【０２０４】
ガイド核酸は、１つまたは複数のドメインを含む。
【０２０５】
ガイド核酸は、ガイドドメインを含み得る。
【０２０６】
ガイド核酸は、第１の相補的ドメインを含み得る。
【０２０７】
ガイド核酸は、リンカードメインを含み得る。
【０２０８】
ガイド核酸は、第２の相補的ドメインを含み得る。
【０２０９】
ガイド核酸は、近位ドメインを含み得る。
【０２１０】
ガイド核酸は、テールドメインを含み得る。
【０２１１】
ここで、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のドメインが存在し得る。
【０２１２】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のガイドドメインを含み得る。
【０２１３】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の第１の相補的ドメインを含み得る。
【０２１４】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のリンカードメインを含み得る。
【０２１５】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の第２の相補的ドメインを含み得る。
【０２１６】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の近位ドメインを含み得る。
【０２１７】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のテールドメインを含み得る。
【０２１８】
ここで、ガイド核酸では、１種類のドメインが重複されていてもよい。
【０２１９】
ガイド核酸は、重複の有無にかかわらずいくつかのドメインを含み得る。
【０２２０】
ガイド核酸は、同じ種類のドメインを含み得る。ここで、同じ種類のドメインは、同じ核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
【０２２１】
ガイド核酸は、２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２２】
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２３】
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２４】
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２５】
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同じ核酸配列を有し得る。
【０２２６】
たとえば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］からなり得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なるまたは同じ標的のためのガイド配列を含み得、２つの第１の相補的ドメインと２つの第２の相補的ドメインは、同じまたは異なる核酸配列を有し得る。ガイドドメインが異なる標的のガイド配列を含む場合、ガイド核酸は２つの異なる標的に特異的に結合し得、ここで、特異的結合は、同時にまたは連続して行われ得る。加えて、リンカードメインは、特定の酵素によって切断され、ガイド核酸は、特定の酵素の存在下で２つまたは３つの部分に分割される。本明細書に開示される例示的な一実施形態では、ガイド核酸はｇＲＮＡであり得る。
【０２２７】
「ｇＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸に関して、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的とすることができるＲＮＡを指す。加えて、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸に特異的なＲＮＡであり、それはＣＲＩＳＰＲ酵素に結合し、標的遺伝子の転写調節領域にＣＲＩＳＰＲ酵素をガイドする。
【０２２８】
ｇＲＮＡは、複数のドメインを含み得る。各ドメインに基づき、相互作用は、ｇＲＮＡ鎖の３次元構造もしくは活性型において、またはこれらの鎖間で起こり得る。
【０２２９】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子、単一ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）；または二本鎖ｇＲＮＡ（２つ以上、一般には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と呼ばれ得る。
【０２３０】
例示的な一実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相補的な結合を形成することができるガイド配列を含むドメイン；第１の相補的ドメイン；リンカードメイン；第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメインである第２の相補的ドメイン；近位ドメイン；および任意にテールドメインを５'−３'方向に含み得る。
【０２３１】
別の実施形態では、二本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相補的な結合を形成することができるガイド配列を含むドメインおよび第１の相補的ドメインを含む第１鎖、ならびに、第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメインである第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、および任意にテールドメインを５'−３'方向に含む第２鎖を含み得る。
【０２３２】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと呼ばれ、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれ得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインと第１の相補的ドメインを含み得、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよび任意にテールドメインを含み得る。
【０２３３】
さらに別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相補的な結合を形成することができるガイド配列を含むドメイン；第１の相補的ドメイン；第２の相補的ドメイン；第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって５'−３'方向に第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメインを含み得る。
【０２３４】
ここで、第１の相補的ドメインは、天然の第１の相補的ドメインと相同性を有していてもよいし、天然の第１の相補的ドメインに由来していてもよい。加えて、第１の相補的ドメインは、天然に存在する種に応じて第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２３５】
例示的な一実施形態では、第１の相補的ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第１の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第１の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２３６】
たとえば、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）がもたらされる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物であり得る。
【０２３７】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２３８】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインは、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍもしくはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓの第１の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第１の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２３９】
たとえば、第１の相補的ドメインがＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８）、または５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２４０】
ここで、リンカードメインは、第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結するヌクレオチド配列であり得る。
【０２４１】
リンカードメインは、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインのそれぞれと共有結合または非共有結合を形成し得る。
【０２４２】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合により第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結し得る。
【０２４３】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子に使用するのに適しており、リンカードメインを使用して、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖に連結されるか、共有結合または非共有結合により第１鎖を第２鎖と連結することにより一本鎖ｇＲＮＡを生成することができる。
【０２４４】
リンカードメインを使用して、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに連結されるか、共有結合または非共有結合によりｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと連結することにより一本鎖ｇＲＮＡを生成することができる。
【０２４５】
ここで、第２の相補的ドメインは、天然の第２の相補的ドメインと相同性を有していてもよいし、天然の第２の相補的ドメインに由来していてもよい。加えて、第２の相補的ドメインは、天然に存在する種に従って第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２４６】
例示的な一実施形態では、第２の相補的ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第２の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第２の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２４７】
たとえば、第２の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するヌクレオチド配列には下線が引かれている）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎとｍのそれぞれは、ヌクレオチドの数を表し得、ここで、ｎは１〜１５の整数であり得、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。加えて、（Ｘ）ｍは、同じヌクレオチドのｍ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｍ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２４８】
別の例において、第２の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するヌクレオチド配列には下線が引かれている）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）（Ｘ）ｍ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎとｍのそれぞれは、ヌクレオチドの数を表し得、ここで、ｎは１〜１５の整数であり得、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。加えて、（Ｘ）ｍは、同じヌクレオチドのｍ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｍ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２４９】
別の実施形態では、第２の相補的ドメインは、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍもしくはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓの第２の相補的ドメイン、またはそれらに由来する第２の相補的ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２５０】
たとえば、第２の相補的ドメインがＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１）、または５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１）（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するヌクレオチド配列には下線が引かれている）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有し得るヌクレオチド配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み得、５'−（Ｘ）ｎＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎとｍのそれぞれは、ヌクレオチドの数を表し得、ここで、ｎは１〜１０の整数であり得、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。加えて、（Ｘ）ｍは、同じヌクレオチドのｍ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｍ個のヌクレオチドの混合物を表し得る。
【０２５１】
ここで、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインは、互いに相補的に結合し得る。
【０２５２】
第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインは、相補的結合により二本鎖を形成し得る。
【０２５３】
形成された二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用し得る。
【０２５４】
任意に、第１の相補的ドメインは、第２鎖の第２の相補的ドメインに相補的に結合しない追加のヌクレオチド配列を含み得る。
【０２５５】
ここで、追加のヌクレオチド配列は、１〜１５ヌクレオチド配列であり得る。たとえば、追加のヌクレオチド配列は、１〜５、５〜１０または１０〜１５ヌクレオチド配列であり得る。
【０２５６】
ここで、近位ドメインは、第２の相補的ドメインの３'端方向に位置するドメインであり得る。
【０２５７】
近位ドメインは、天然の近位ドメインと相同性を有していてもよいし、天然の近位ドメインに由来していてもよい。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に従ってヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれる近位ドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２５８】
例示的な一実施形態では、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の近位ドメイン、またはそれらに由来する近位ドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２５９】
たとえば、近位ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインである場合、近位ドメインは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、近位ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６０】
さらに別の例では、近位ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインである場合、近位ドメインは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、近位ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜４０の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６１】
ここで、テールドメインは、一本鎖ｇＲＮＡの３'末端または二本鎖ｇＲＮＡの第１の鎖または第２鎖に選択的に付加され得るドメインである。
【０２６２】
テールドメインは、天然のテールドメインと相同性を有していてもよいし、天然のテールドメインに由来していてもよい。加えて、テールドメインは、天然に存在する種に従ってヌクレオチド配列に違いを有していてもよく、天然に存在する種に含まれるテールドメインに由来していてもよいか、天然に存在する種に含まれるテールドメインと部分的または完全な相同性を有していてもよい。
【０２６３】
例示的な一実施形態では、テールドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）もしくはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のテールドメイン、またはそれらに由来するテールドメインと部分的、すなわち少なくとも５０％以上、もしくは完全な相同性を有し得る。
【０２６４】
たとえば、テールドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインである場合、テールドメインは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、テールドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６５】
別の例では、テールドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインである場合、テールドメインは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）と部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。ここで、テールドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み得、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）がもたらされる。Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎはヌクレオチドの数を表し得、それは１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同じヌクレオチドのｎ個の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧのｎ個のヌクレオチドの混合物を表す。
【０２６６】
別の実施形態では、テールドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写方法に関与する３'末端に１〜１０ｎｔの配列を含み得る。
【０２６７】
たとえば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される場合、テールドメインはＤＮＡテンプレートの３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドまたは代替ヌクレオチドを含み得る。
【０２６８】
ｇＲＮＡは、上記のように複数のドメインを含み得るため、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され、相互作用は、各ドメインに基づき、ｇＲＮＡの三次元構造の鎖もしくは活性型において、またはこれらの鎖間で起こり得る。
【０２６９】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子）；または二本鎖ｇＲＮＡ（２つ以上、一般には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と呼ばれ得る。
二本鎖ｇＲＮＡ
【０２７０】
二本鎖ｇＲＮＡは、第１鎖と第２鎖からなる。
【０２７１】
ここで、第１鎖は、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−３'からなり、
第２鎖は、５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または
５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'
からなる。
【０２７２】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと呼ばれ得、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれ得る。
【０２７３】
ここで、第１鎖と第２鎖は、追加のヌクレオチド配列を任意に含み得る。
【０２７４】
一例では、第１鎖は、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−３'であり得る。
【０２７５】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列であり、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸上の標的配列に従って変化し得るヌクレオチド配列領域である。
【０２７６】
ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２の相補的ドメインと相補的な結合を形成することができる第１の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて変化し得る。Ｑは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜３５の整数である。
【０２７７】
たとえば、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第１の相補的ドメインまたはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２７８】
別の例では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第１の相補的ドメインまたはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２７９】
さらに別の例では、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補的ドメインまたはストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８０】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃのそれぞれは、選択的に追加のヌクレオチド配列であり、ここで、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ａ、ｂおよびｃのそれぞれは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。
【０２８１】
例示的な一実施形態では、第２鎖は５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'；または５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'であり得る。
【０２８２】
別の実施形態では、第２鎖は、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'；または５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０２８３】
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１の相補的ドメインと相補的な結合を形成することができる第２の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｈはヌクレオチドの数であり得、それは５〜５０の整数である。
【０２８４】
たとえば、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８５】
別の例では、第２の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８６】
さらに別の例では、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７）、または５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８７】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインと部分的または完全な相同性を有し得る近位ドメインを含むヌクレオチド配列であり、近位ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。  Ｐは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｋは、１〜２０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０２８８】
たとえば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８９】
別の例では、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９０】
さらに別の例では、近位ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８）、または５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９１】
（Ｆ）ｉは、テールドメインを含み、天然に存在する種のテールドメインと部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得、テールドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｆは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択されてもよく、ｉはヌクレオチドの数であり得、それは１〜５０の整数である。
【０２９２】
たとえば、テールドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９３】
別の例では、テールドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９４】
さらに別の例では、テールドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）、または５'−  ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９５】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端に１〜１０ヌクレオチド配列を含み得る。
【０２９６】
たとえば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される場合、テールドメインはＤＮＡテンプレートの３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドまたは代替ヌクレオチドを含み得る。
【０２９７】
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加されるヌクレオチド配列であり得、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。
一本鎖ｇＲＮＡ
【０２９８】
一本鎖ｇＲＮＡは、第１の一本鎖ｇＲＮＡと第２の一本鎖ｇＲＮＡに分類され得る。
第１の一本鎖ｇＲＮＡ
【０２９９】
第１の一本鎖ｇＲＮＡは、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖がリンカードメインにより連結されている一本鎖ｇＲＮＡである。
【０３００】
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−３'、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'
からなり得る。
【０３０１】
第１の一本鎖ｇＲＮＡは、追加のヌクレオチド配列を選択的に含み得る。
【０３０２】
例示的な一実施形態では、第１の一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−３'；
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'；または
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【０３０３】
別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−３'；
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【０３０４】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列であり、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸上の標的配列に従って変化し得るヌクレオチド配列領域である。
【０３０５】
ここで、（Ｑ）ｍは、第２の相補的ドメインと相補的な結合を形成することができる第１の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて変化し得る。Ｑは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜３５の整数である。
【０３０６】
たとえば、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０７】
別の例では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０８】
さらに別の例では、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６）、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０９】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含むヌクレオチド配列であり、第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結し、それによって一本鎖ｇＲＮＡを生成する。ここで、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｊは、１〜３０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３１０】
（Ｚ）ｈは、第２の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第１の相補的ドメインと相補的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて改変され得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｈはヌクレオチドの数であり得、それは５〜５０の整数である。
【０３１１】
たとえば、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１２】
別の例では、第２の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１３】
さらに別の例では、第２の相補的ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７）、または５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１４】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインと部分的または完全な相同性を有し得る近位ドメインを含むヌクレオチド配列であり、近位ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｐは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｋは、１〜２０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３１５】
たとえば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１６】
別の例では、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１７】
さらに別の例では、近位ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８）、または５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１８】
（Ｆ）ｉは、テールドメインを含み、天然に存在する種のテールドメインと部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得、テールドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｆは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択されてもよく、ｉはヌクレオチドの数であり得、それは１〜５０の整数である。
【０３１９】
たとえば、テールドメインがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３' （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３２０】
別の例では、テールドメインがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３２１】
さらに別の例では、テールドメインがストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）、または５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３２２】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端に１〜１０ヌクレオチド配列を含み得る。
【０３２３】
たとえば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される場合、テールドメインはＤＮＡテンプレートの３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写で使用される場合、テールドメインはＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドまたは代替ヌクレオチドを含み得る。
【０３２４】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加されるヌクレオチド配列であり得、ここで、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。
第２の一本鎖ｇＲＮＡ
【０３２５】
第２の一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインからなる一本鎖ｇＲＮＡであり得る。
【０３２６】
ここで、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、以下のものからなり得る：
５'−［第２の相補的ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'；または
５'−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'。
【０３２７】
第２の一本鎖ｇＲＮＡは、追加のヌクレオチド配列を選択的に含み得る。
【０３２８】
例示的な一実施形態では、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｚ）ｈ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―３'であり得る。
【０３２９】
別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'；または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）―３'であり得る。
【０３３０】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖のいずれかの鎖の部分配列に相補的なヌクレオチド配列であり、標的遺伝子の転写調節領域上の標的配列に従って変化することができるヌクレオチド配列領域である。（Ｑ）ｍは、第１の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第２の相補的ドメインと相補的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて変化し得る。Ｑは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜３５の整数である。
【０３３１】
たとえば、第１の相補的ドメインが、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８）、または５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３３２】
（Ｚ）ｈは、第２の相補的ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第２の相補的ドメインと相補的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインのヌクレオチド配列は、種の起源に応じて修飾され得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｍはヌクレオチドの数であり得、それは５〜５０の整数である。
【０３３３】
たとえば、第２の相補的ドメインが、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの第２の相補的ドメイン、またはＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１）、または５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１）と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３３４】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含むヌクレオチド配列であり、それは第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインに連結する。ここで、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され得、ｊは、１〜３０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３３５】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃの各々は、選択的に追加されるヌクレオチド配列であり得、ここで、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群からそれぞれ独立して選択され、ａ、ｂおよびｃは、ヌクレオチドの数であり得、それは０または１〜２０の整数である。本明細書の例示的な一実施形態では、ガイド核酸は、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列に相補的に結合するｇＲＮＡであり得る。
【０３３６】
「標的配列」とは、標的遺伝子の転写調節領域に存在するヌクレオチド配列であり、具体的には、標的遺伝子の転写調節領域内の標的領域の部分ヌクレオチド配列であり、ここで、「標的領域」とは、標的遺伝子の転写調節領域内のガイド核酸エディタータンパク質によって修飾され得る領域である。
【０３３７】
以下、標的配列は、２種類のヌクレオチド配列情報の両方を指すために使用され得る。たとえば、標的遺伝子の場合、標的配列は、標的遺伝子ＤＮＡの転写鎖のヌクレオチド配列情報、または非転写鎖のヌクレオチド配列情報を指し得る。
【０３３８】
たとえば、標的配列は、標的遺伝子Ａの標的領域内の部分ヌクレオチド配列（転写鎖）、すなわち５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）と、それに相補的なヌクレオチド配列（非転写鎖）、すなわち５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）を指し得る。
【０３３９】
標的配列は、５〜５０ｎｔ配列であり得る。
【０３４０】
例示的な一実施形態では、標的配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列または２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３４１】
標的配列は、ガイド核酸結合配列またはガイド核酸非結合配列を含む。
【０３４２】
「ガイド核酸結合配列」とは、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的に結合していてもよい。標的配列およびガイド核酸結合配列は、標的遺伝子の転写調節領域に応じて遺伝子改変または編集される標的に従って変化し得るヌクレオチド配列であり得、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸配列に従ってさまざまな手法で設計され得る。
【０３４３】
「ガイド核酸非結合配列」とは、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的に結合していなくてもよい。加えて、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と相補性を有するヌクレオチド配列であり得、ガイド核酸結合配列と相補的に結合していてもよい。
【０３４４】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の部分ヌクレオチド配列と、標的配列に含まれる互いに異なる配列順序を有する２つのヌクレオチド配列のうちの１つのヌクレオチド配列、すなわち、互いに相補的に結合することができる２つのヌクレオチド配列のうちの１つであり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、標的配列のガイド核酸結合配列以外のヌクレオチド配列であり得る。
【０３４５】
たとえば、標的遺伝子Ａの転写調節領域内の標的領域の部分ヌクレオチド配列、すなわち５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）と、ヌクレオチド配列、すなわち、それに相補的である５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１）が標的配列として使用される場合、ガイド核酸結合配列は、２つの標的配列、すなわち５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）または５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１）のうちの１つであり得る。ここで、ガイド核酸結合配列が５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）である場合、ガイド核酸非結合配列は５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１）であり得、ガイド核酸結合配列が５'−ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１）である場合、ガイド核酸非結合配列は５'−ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）であり得る。
【０３４６】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の１つ、すなわち、転写鎖と同じヌクレオチド配列および非転写鎖と同じヌクレオチド配列であり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、標的配列のガイド核酸結合配列以外のヌクレオチド配列、すなわち、転写鎖と同じヌクレオチド配列および非転写鎖と同じであるヌクレオチド配列から選択されるものであり得る。
【０３４７】
ガイド核酸結合配列は、標的配列と同じ長さを有し得る。
【０３４８】
ガイド核酸非結合配列は、標的配列またはガイド核酸結合配列と同じ長さを有し得る。
【０３４９】
ガイド核酸結合配列は、５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５０】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸結合配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列または２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５１】
ガイド核酸非結合配列は、５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５２】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸非結合配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列または２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５３】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に部分的または完全に相補的に結合してもよく、ガイド核酸結合配列の長さは、ガイド配列の長さと同じであり得る。
【０３５４】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的なヌクレオチド配列、たとえば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３５５】
一例として、ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的ではない１〜８ヌクレオチド配列を有していても、含んでいてもよい。
【０３５６】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相同性を有してもよく、ガイド核酸非結合配列の長さはガイド配列の長さと同じであり得る。
【０３５７】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相同性を有するヌクレオチド配列、たとえば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相同性または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３５８】
一例では、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相同ではない１〜８ヌクレオチド配列を有していても含んでいてもよい。
【０３５９】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と相補的に結合してもよく、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と同じ長さを有していてもよい。
【０３６０】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列、たとえば、少なくとも９０％、９５％以上の相補性または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３６１】
一例では、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的ではない１〜２ヌクレオチド配列を有しても含んでいてもよい。
【０３６２】
加えて、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の付近に位置するヌクレオチド配列であり得る。
【０３６３】
一例では、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６４】
加えて、ガイド核酸非結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の付近に位置するヌクレオチド配列であり得る。
【０３６５】
一例では、ガイド核酸非結合配列は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６６】
「ターゲティング」とは、標的遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列との相補的結合を指す。ここで、相補的結合は、１００％完全な相補的結合、または７０％以上１００％未満の不完全な相補的結合であり得る。したがって、「ターゲティングｇＲＮＡ」とは、標的遺伝子の転写調節領域に存在する標的配列のガイド核酸結合配列に相補的に結合するｇＲＮＡを指す。
【０３６７】
本明細書に開示される標的遺伝子は、重複遺伝子であり得る。
【０３６８】
本明細書に開示される標的遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子および／またはＡＰＰ遺伝子であり得る。
【０３６９】
本明細書に開示される標的遺伝子は、癌遺伝子であり得る。
【０３７０】
ここで、癌遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、  ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子および／またはＡＫＴ２遺伝子であり得る。
【０３７１】
例示的な実施形態では、本明細書で開示される標的配列は、重複遺伝子のプロモーター領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７２】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３７３】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３７４】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７５】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７６】
一例では、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７７】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＴＴＳを含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７８】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ結合領域を含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７９】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子の転写因子結合領域を含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８０】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＴＡＴＡボックスを含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８１】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）−３'配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８２】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＴＡＴＡ（Ａ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）−３'配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８３】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在する５'−ＣＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４）配列、５'−ＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）配列、５'−ＴＡＴＡＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７２）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３）配列、５'−ＧＡＴＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５）配列、５'−ＴＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６）配列、５'−ＴＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７）配列、５'−ＴＣＴＴＴＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７８）配列、５'−ＧＡＣＡＴＴＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９）配列、５'−ＴＧＡＴＡＴＣＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）配列、５'−ＴＡＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２）配列、５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３）配列、５'−ＴＴＴＡＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４）配列、５'−ＣＡＴＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５）配列、５'−ＴＡＴＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６）配列、５'−ＴＴＴＡＡＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７）配列、５'−ＧＡＴＡＡＡＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８）配列、５'−ＴＡＴＡＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）配列、５'−ＴＣＴＴＡＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）配列、５'−ＴＴＧＴＡＣＴＴＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１）配列、５'−ＣＡＴＡＴＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２）配列、５'−ＴＡＴＡＡＡＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９３）配列、５'−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）配列および５'−ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）配列からなる群より選択される１つまたは複数の配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８４】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のコアプロモーター領域に存在するＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）結合核酸配列の全体または一部を含む連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８５】
別の例では、標的配列は、重複遺伝子の近位プロモーター領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８６】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のＴＳＳの１〜３００ｂｐの上流領域に位置する１０〜２５ｎｔの連続配列であり得る。
【０３８７】
さらに別の例では、標的配列は、重複遺伝子の遠位プロモーター領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８８】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８９】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９０】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９１】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９２】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９３】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のエンハンサーボックス（Ｅボックス）を含む領域またはその付近の領域に位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９４】
たとえば、標的配列は、重複遺伝子のイントロンに存在するエンハンサー領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９５】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子のインシュレーター領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９６】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９７】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０３９８】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３９９】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４００】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子のサイレンサー領域に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０１】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０２】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０３】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０４】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０５】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子の遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）に位置する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０６】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０７】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４０８】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４０９】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１０】
本明細書に開示される標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１１】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４１２】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０４１３】
ここで、重複遺伝子の転写調節領域は、重複遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターまたは遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）であり得る。
【０４１４】
「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列」とは、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列である。ここで、ＰＡＭ配列は、エディタータンパク質およびエディタータンパク質由来の種の種類に従って異なるヌクレオチド配列を有し得る。
【０４１５】
ここで、ＰＡＭ配列は、たとえば、以下の配列の１つまたは複数の配列（５'−３'の方向で説明される）であり得る。
【０４１６】
ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）；ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴである）；ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｗは、ＡまたはＴである）；ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）；ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｒは、ＡまたはＧである）；ＴＴＮ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）。
【０４１７】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１８】
あるいは、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４１９】
例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２０】
別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＧＧＮＧ−３'および／または５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＧＧＮＧ−３'および／または５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２１】
さらに別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２２】
例示的な一実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＹ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＹ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２３】
別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＮ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＮ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２４】
さらに別の例示的な実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'、および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＶ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'、および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、およびＶ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２５】
例示的な一実施形態では、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'−ＴＴＮ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の５'−ＴＴＮ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）に隣接して位置する連続した１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０４２６】
以下、本明細書に開示される例示的な実施形態で使用され得る標的配列の例を、表１、２、３、４、５および６に列挙する。表１、２、３、４、５および６に開示される標的配列は、ガイド核酸非結合配列であり、その相補的配列、すなわちガイド核酸結合配列は、表に列挙された配列から予測され得る。加えて、表１、２、３、４、５および６に示されるｓｇＲＮＡは、エディタータンパク質に応じて、ＳｐＣａｓ９の場合はＳｐ、ＣｊＣａｓ９の場合はＣｊと命名した。
［表１］
ＳｐＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子の標的配列
【表１】
2020536501.tif 000056
［表２］
ＣｊＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子の標的配列
【表２】
2020536501.tif 000057
［表３］
ＳｐＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子の標的配列
【表１７】
2020536501.tif 000058
【表１８】
2020536501.tif 000059
［表４］
ＣｊＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子の標的配列
【表１９】
2020536501.tif 000060
【表２０】
2020536501.tif 000061
［表５］
ＳｐＣａｓ９のマウスＰｌｐ１遺伝子の標的配列
【表２１】
2020536501.tif 000062
【表２２】
2020536501.tif 000063
［表６］
ＣｊＣａｓ９のマウスＰｌｐ１遺伝子の標的配列
【表２３】
2020536501.tif 000064
【表２４】
2020536501.tif 000065
本明細書に開示される一態様として、発現制御組成物は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含み得る。
【０４２７】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る。
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）１つまたは複数のエディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列。
【０４２８】
重複遺伝子に関する説明は上記の通りである。
【０４２９】
転写調節領域に関する説明は上記の通りである。
【０４３０】
標的配列に関する説明は上記の通りである。
【０４３１】
発現制御組成物は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体を含み得る。
【０４３２】
「ガイド核酸−エディタータンパク質複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用を介して形成される複合体を指す。
【０４３３】
ガイド核酸に関する説明は上記の通りである。
【０４３４】
「エディタータンパク質」という用語は、核酸に直接結合するか、核酸に直接結合することなく、核酸と相互作用することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【０４３５】
ここで、核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体に含まれる核酸であり得る。
【０４３６】
ここで、核酸はガイド核酸であり得る。
【０４３７】
エディタータンパク質は酵素であり得る。
【０４３８】
ここで、「酵素」という用語は、核酸、遺伝子または染色体を切断することができるドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【０４３９】
酵素は、ヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０４４０】
エディタータンパク質は、完全な活性酵素を含み得る。
【０４４１】
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の核酸、遺伝子または染色体切断機能と同じ機能を有する酵素を指す。たとえば、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素は、二本鎖ＤＮＡを完全に切断する完全な活性酵素であり得る。別の例として、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素が人為的改変によりアミノ酸配列の部分配列の欠失または置換を受ける場合、人為的に改変された酵素バリアントは、野性型酵素のように二本鎖ＤＮＡを切断し、人為的に改変された酵素バリアントは、完全な活性酵素であり得る。
【０４４２】
加えて、完全な活性酵素は、野性型酵素と比較して改善された機能を有する酵素を含み得る。たとえば、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素の修飾または操作された特定の形態は、野性型酵素よりも大きい完全な酵素活性、すなわち、二本鎖ＤＮＡを切断する活性の増加を有し得る。
【０４４３】
エディタータンパク質は、不完全または部分的に活性な酵素を含み得る。
【０４４４】
ここで、「不完全または部分的に活性な酵素」とは、野性型酵素の核酸、遺伝子または染色体切断機能のいくつかを有する酵素を指す。たとえば、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型酵素の修飾または操作された特定の形態は、第１の機能を有する形態または第２の機能を有する形態であり得る。ここで、第１の機能は、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する機能であり、第２の機能は、二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する機能であり得る。ここで、第１の機能を有する酵素または第２の機能を有する酵素は、不完全または部分的に活性な酵素であり得る。
【０４４５】
エディタータンパク質は不活性酵素を含み得る。
【０４４６】
ここで、「不活性酵素」とは、野性型酵素の核酸、遺伝子または染色体切断機能が完全に不活性化されている酵素を指す。たとえば、野性型酵素の修飾または操作された特定の形態は、第１および第２の機能の両方が失われた形態であり得、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能と、その第２鎖を切断する第２の機能の両方が失われている。ここで、第１および第２の機能のすべてが失われている酵素は、不活性な酵素であり得る。
【０４４７】
エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
【０４４８】
ここで、「融合タンパク質」という用語は、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることにより生成されるタンパク質を指す。
【０４４９】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同じまたは異なる機能を有する機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０４５０】
融合タンパク質は、機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素のアミノカルボキシル末端もしくはその近傍；酵素のカルボキシルアミノ末端もしくはその近傍；酵素の中央部；またはそれらの組合せの１つまたは複数に付加された形態であり得る。
【０４５１】
ここで、機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または（ペプチドを含む）タンパク質の単離および精製用のタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０４５２】
機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、チオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質であって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などのタンパク質を含むが、本発明はそれらに限定されない。
【０４５３】
加えて、機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在化配列またはシグナル（ＮＬＳ）または核外移行配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０４５４】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（たとえば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）を有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−α由来のＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７）；筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９）；ヒトＰ５３配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０）；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１）；インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２）および配列ＰＫＱＫＫＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３）；デルタ（Ｄ）型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４）；マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７）であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０４５５】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、特定の機能を果たさない非機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ここで、非機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素機能に影響を及ぼさないドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０４５６】
融合タンパク質は、非機能的ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素のアミノ末端もしくはその近傍；酵素のカルボキシル末端もしくはその近傍；酵素の中央部；またはそれらの組合せの１つまたは複数に付加された形態であり得る。
【０４５７】
エディタータンパク質は、天然の酵素または融合タンパク質であり得る。
【０４５８】
エディタータンパク質は、部分的に修飾された天然酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０４５９】
エディタータンパク質は、人為的に生成された酵素または融合タンパク質であり得、それは天然には存在しない。
【０４６０】
エディタータンパク質は、部分的に修飾された人為的な酵素または融合タンパク質の形態で存在し得、それは天然には存在しない。
【０４６１】
ここで、修飾は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、付加、またはそれらの組合せであり得る。
【０４６２】
あるいは、修飾は、エディタータンパク質をコードするヌクレオチド配列内のいくつかのヌクレオチドの置換、除去、追加、またはそれらの組合せであり得る。
【０４６３】
加えて、任意に、発現制御組成物は、挿入される所望の特定のヌクレオチド配列、またはそれをコードする核酸配列を有するドナーをさらに含み得る。
【０４６４】
ここで、挿入される核酸配列は、重複遺伝子の転写調節領域内の部分ヌクレオチド配列であり得る。
【０４６５】
ここで、挿入される核酸配列は、重複遺伝子の転写調節領域内に変異を導入するために使用される核酸配列であり得る。ここで、変異は、重複遺伝子の転写を妨げる変異であり得る。
【０４６６】
「ドナー」という用語は、損傷した遺伝子または核酸の相同組換え（ＨＲ）に基づく修復に役立つヌクレオチド配列を指す。
【０４６７】
ドナーは、二本鎖または一本鎖核酸であり得る。
【０４６８】
ドナーは、線形または円形で存在し得る。
【０４６９】
ドナーは、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０４７０】
たとえば、ドナーは、特定のヌクレオチド配列が挿入される位置、たとえば、損傷した核酸の上流（左）および下流（右）にあるヌクレオチド配列のそれぞれと相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。ここで、挿入される特定のヌクレオチド配列は、損傷した核酸の下流のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列と、損傷した核酸の上流のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列との間に位置し得る。ここで、相同性を有するヌクレオチド配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性または完全な相同性を有し得る。
【０４７１】
ドナーは、特定の核酸配列を含み得る。
【０４７２】
ここで、特定の核酸配列は、標的遺伝子の部分ヌクレオチド配列またはそれに類似したヌクレオチド配列であり得る。標的遺伝子の部分ヌクレオチド配列は、たとえば、変異を有する標的遺伝子を編集するための変異が編集された正常な核酸配列を含み得る。あるいは、標的遺伝子の部分類似ヌクレオチド配列は、正常な標的遺伝子を変異させるための標的遺伝子の部分正常核酸配列の一部が修飾された変異誘導核酸配列を含み得る。
【０４７３】
ここで、特定の核酸配列は、外因性核酸配列であり得る。たとえば、外因性核酸配列は、標的遺伝子を有する細胞内で発現されることが所望される外因性遺伝子であり得る。
【０４７４】
ここで、特定の核酸配列は、標的遺伝子を有する細胞内で発現されることが所望される核酸配列であり得る。たとえば、特定の核酸配列は、標的遺伝子を有する細胞で発現する特定の遺伝子であり得、この場合、特定の遺伝子は、ドナーを有する発現制御組成物により細胞内でコピー数が増加し、ひいては高度に発現され得る。
【０４７５】
任意に、ドナーは、追加のヌクレオチド配列を含み得る。ここで、追加のヌクレオチド配列は、ドナーの安定性、標的への挿入の効率、または相同組換えの効率を高めるのに役立ち得る。
【０４７６】
たとえば、追加のヌクレオチド配列は、ＡおよびＴヌクレオチドリッチな核酸配列、すなわちＡ−Ｔリッチなドメインであり得る。たとえば、追加のヌクレオチド配列は、足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）であり得る。
【０４７７】
本明細書に開示されるガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、さまざまな手法で対象内に送達または導入され得る。
【０４７８】
ここで、「対象」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質、またはガイド核酸エディタータンパク質複合体が機能する生物、または生物から得られた検体またはサンプルを指す。
【０４７９】
対象は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体の標的遺伝子または染色体を含む生物であり得る。
【０４８０】
生物は、動物、動物組織または動物細胞であり得る。
【０４８１】
生物は、ヒト、ヒト組織またはヒト細胞であり得る。
【０４８２】
組織は、眼球、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、筋肉組織または血液であり得る。
【０４８３】
細胞は、線維芽細胞、シュワン細胞、神経細胞、希突起膠細胞、筋芽細胞、グリア細胞、マクロファージ、免疫細胞、肝細胞、網膜色素上皮細胞、癌細胞または幹細胞であり得る。
【０４８４】
検体またはサンプルは、標的遺伝子または染色体を含む生物から取得され得、唾液、血液、網膜組織、脳組織、シュワン細胞、希突起膠細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、マクロファージ、肝細胞、免疫細胞、癌細胞または幹細胞であり得る。
【０４８５】
好ましくは、対象は、重複遺伝子を含む生物であり得る。ここで、対象は、重複遺伝子が遺伝子重複状態にある生物であり得る。
【０４８６】
ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態もしくは混合形態で対象に送達または導入され得る。
【０４８７】
ここで、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、当該技術分野で公知の方法により、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態もしくは混合形態で対象に送達または導入され得る。
【０４８８】
あるいは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物の形態は、ベクター、非ベクターもしくはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０４８９】
ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（たとえばプラスミド）であり得る。
【０４９０】
非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
【０４９１】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０４９２】
ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０４９３】
一例では、ベクターは、ガイド核酸とエディタータンパク質をそれぞれコードする核酸配列を同時に含み得る。
【０４９４】
別の例では、ベクターは、ガイド核酸をコードする核酸配列を含み得る。
【０４９５】
一例として、ガイド核酸に含まれるドメインは、すべて１つのベクターに含まれていてもよいし、分割されて異なるベクターに含まれていてもよい。
【０４９６】
別の例では、ベクターは、エディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０４９７】
一例として、エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードする核酸配列は１つのベクターに含まれていてもよいし、分割されていくつかのベクターに含まれていてもよい。
【０４９８】
ベクターは、１つまたは複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
【０４９９】
ここで、調節／制御コンポーネントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
【０５００】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０５０１】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０５０２】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０５０３】
プロモーターは、対象特異的なプロモーターであり得る。
【０５０４】
プロモーターは、ウイルス性または非ウイルス性プロモーターであり得る。
【０５０５】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に応じて適切なプロモーターを使用してもよい。
【０５０６】
たとえば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。たとえば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。
【０５０７】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【０５０８】
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０５０９】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【０５１０】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【０５１１】
ここで、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０５１２】
一般に、ウイルスは宿主（たとえば細胞）に感染し得、それによってウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入するか、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。そのような特徴を有するウイルスを使用して、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を対象に導入することができる。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（たとえば細胞）内で一時的に発現され得る。あるいは、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、長期間にわたって（たとえば、１、２もしくは３週間、１、２、３、６もしくは９か月、１年もしくは２年、または恒久的に）対象（たとえば細胞）内で連続的に発現され得る。
【０５１３】
ウイルスのパッケージング容量は、ウイルスの種類に応じて、少なくとも２〜５０ｋｂで異なり得る。そのようなパッケージング容量に応じて、ガイド核酸もしくはエディタータンパク質を含むウイルスベクター、またはガイド核酸とエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターを設計することができる。あるいは、ガイド核酸、エディタータンパク質および追加のコンポーネントを含むウイルスベクターを設計することができる。
【０５１４】
一例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【０５１５】
別の例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【０５１６】
さらに別の例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【０５１７】
さらに別の例では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、たとえば本明細書に挙げたウイルスの１つまたは複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
【０５１８】
別の例示的な実施形態では、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０５１９】
非ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０５２０】
非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡ、またはそれらの混合物であり得る。
【０５２１】
非ベクターは、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、文献［Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］に記載）、脂質媒介トランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、またはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０５２２】
一例では、エレクトロポレーションを介した送達は、細胞と、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列とを、カートリッジ、チャンバまたはキュベット内で混合し、細胞に所定の持続時間および振幅で電気刺激を適用することにより行われ得る。
【０５２３】
別の例では、非ベクターは、ナノ粒子を使用して送達され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（たとえば、磁性ナノ粒子、シリカなど）または有機ナノ粒子（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた脂質など）であり得る。ナノ粒子の外表面には、付着可能な正に荷電したポリマー（たとえば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリンなど）と共役されていてもよい。
【０５２４】
特定の実施形態では、非ベクターは、脂質シェルを使用して送達され得る。
【０５２５】
特定の実施形態では、非ベクターは、エクソソームを使用して送達され得る。エクソソームは、タンパク質とＲＮＡを導入するための内因性のナノ小胞であり、それはＲＮＡを脳や別の標的器官に送達することができる。
【０５２６】
特定の実施形態では、非ベクターは、リポソームを使用して送達され得る。リポソームは、内部の水性区画を囲む単一または複数の層状脂質二重層と、比較的不透明な外部の親油性リン脂質二重層で構成される球状小胞構造である。リポソームはいくつかの異なる種類の脂質から作られ得るが、リン脂質は、最も一般には、薬物担体としてリポソームを生成するために使用される。
【０５２７】
加えて、非ベクターの送達のための組成物は、他の添加剤を含み得る。
【０５２８】
エディタータンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５２９】
エディタータンパク質は、当該技術分野で知られている方法により、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３０】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、文献［Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］に記載）、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達またはそれらの組合せにより対象に送達または導入され得る。
【０５３１】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列とともに送達され得る。
【０５３２】
一例では、エレクトロポレーションを介した導入は、ガイド核酸と共に、またはガイド核酸無しでエディタータンパク質が導入される細胞をカートリッジ、チャンバまたはキュベットにおいて混合し、細胞に所定の持続時間と振幅で電気刺激を加えることにより行われ得る。
【０５３３】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、核酸とタンパク質を混合する形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３４】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３５】
たとえば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。エディタータンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０５３６】
一例では、ガイド核酸とエディタータンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸とタンパク質型エディタータンパク質を含むガイド核酸−エディタータンパク質複合体、すなわちリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で対象に送達または導入され得る。
【０５３７】
本明細書に開示されるガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体を修飾し得る。
【０５３８】
たとえば、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体の配列の修飾を誘導する。  その結果、標的核酸、遺伝子または染色体により発現されるタンパク質は、構造および／または機能について修飾され得るか、タンパク質の発現が制御または阻害され得る。
【０５３９】
ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
【０５４０】
一例では、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写調節領域を操作または修飾して、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を制御（たとえば、抑制、阻害、減少、増加、または促進）することができ、または、その活性が制御されている（たとえば、抑制、阻害、減少、増加、または促進されている）または修飾されたタンパク質を発現する。
【０５４１】
ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、遺伝子の転写および翻訳段階で作用し得る。
【０５４２】
一例では、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写を促進または阻害し、それによって標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を制御（たとえば、抑制、阻害、減少、増加または促進）し得る。
【０５４３】
別の例では、ガイド核酸−エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または阻害し、それによって標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を制御（たとえば、抑制、阻害、減少、増加または促進）し得る。本明細書に開示される例示的な一実施形態では、発現制御組成物は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。
【０５４４】
発現制御組成物は、以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ酵素またはそれをコードする核酸配列。
【０５４５】
重複遺伝子に関する説明は上記の通りである。
【０５４６】
転写調節領域に関する説明は上記の通りである。
【０５４７】
標的配列に関する説明は上記の通りである。
【０５４８】
発現制御組成物は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を含み得る。
【０５４９】
「ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体」という用語は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素との相互作用により形成される複合体を指す。
【０５５０】
ｇＲＮＡに関する説明は上記の通りである。
【０５５１】
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの主要なタンパク質コンポーネントであり、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをもたらす。
【０５５２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはポリペプチド（もしくはタンパク質）をコードする配列を有する核酸であり得る。
【０５５３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５５４】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子の研究（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４）ならびにｇＲＮＡと複合させたストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４；およびＡｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定されていた。
【０５５５】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つのローブ、すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブとヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブとを含み、各ローブはいくつかのドメインを含む。
【０５５６】
ＲＥＣローブは、アルギニンリッチなブリッジヘリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。
【０５５７】
ここで、ＢＨドメインは、アルギニンリッチな長いα−ヘリックスの領域であり、ＲＥＣ１ドメインとＲＥＣ２ドメインは、ｇＲＮＡに形成された二本鎖、たとえば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡを認識するのに重要な役割を果たす。
【０５５８】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ様ドメインを包含し、ＨＮＨドメインは、ＨＮＨ様ドメインを包含する。
【０５５９】
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、たとえば、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成しない鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、当該技術分野ではＲｕｖＣ  Ｉドメイン、ＲｕｖＣ  ＩＩドメインまたはＲｕｖＣ  ＩＩＩドメインを指すこともあり、一般にはＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩまたはＲｕｖＣ  ＩＩＩと呼ばれる。
【０５６０】
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、たとえば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ  ＩＩモチーフとＲｕｖＣ  ＩＩＩモチーフとの間に位置している。
【０５６１】
ＰＩドメインは、標的遺伝子の転写調節領域内の特定のヌクレオチド配列、すなわちプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するか、ＰＡＭと相互作用する。ここで、ＰＡＭは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて異なり得る。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５'−ＮＧＧ−３'であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。しかしながら、ＰＡＭは上記酵素の起源に応じて決定されることが一般に理解されているが、上記起源に由来する酵素の変異体に関する研究の進展に応じて、ＰＡＭは変更され得る。
【０５６２】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり得る。
【０５６３】
Ｃａｓ９は、さまざまな微生物、たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓおよびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａに由来し得る。
【０５６４】
Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡに結合して、標的遺伝子の転写調節領域の標的配列もしくは位置を切断または修飾する酵素であり、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する核酸鎖を切断することができるＨＮＨドメインと、ｇＲＮＡと非相補的な結合を形成する核酸鎖を切断することができるＲｕｖＣドメインと、標的と相互作用するＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとからなり得る。Ｃａｓ９の特異的な構造特性については、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−９４９を参照することができる。
【０５６５】
Ｃａｓ９は、天然に存在する微生物から単離されるか、組換え法または合成法によって非天然に産生され得る。
【０５６６】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５６７】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する同様のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりのＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとからなり得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照することができる。
【０５６８】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はｇＲＮＡと相互作用し、それによってｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協調してガイド配列がＰＡＭ配列を含む標的配列に接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸との相互作用についてのＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存している。
【０５６９】
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子の転写調節領域に存在する配列であり得、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識される。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて異なる配列を有し得る。すなわち、各種は、特異的に認識可能なＰＡＭ配列を有する。たとえば、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は５'−ＴＴＮ−３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり得る。ＰＡＭは上記の酵素の起源に応じて決定されることが一般に理解されているが、対応する起源に由来する酵素の変異体に関する研究の進展に応じて、ＰＡＭは変更され得る。
【０５７０】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり得る。
【０５７１】
Ｃｐｆ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに由来し得る。
【０５７２】
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに対応するＲｕｖＣ様ドメイン、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインの代わりのＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメイン、ならびにＰＡＭを認識するＰＩドメインからなり得る。Ｃｐｆ１の特異的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照することができる。
【０５７３】
Ｃｐｆ１は、天然に存在する微生物から単離されるか、組換え法または合成法によって非天然に産生され得る。
【０５７４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子の転写調節領域内の二本鎖核酸を切断する機能を有するヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０５７５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５７６】
「完全な活性」という用語は、酵素が野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と同じ機能を有する状態を指し、そのような状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。ここで、「野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能」とは、酵素が、二本鎖ＤＮＡを切断する機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能を有する状態を指す。
【０５７７】
完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５７８】
完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、二本鎖ＤＮＡを切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素を修飾または操作することにより形成されるＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０５７９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか、１つまたは複数のアミノ酸が除去されている酵素であり得る。
【０５８０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸が野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列に付加されている酵素であり得る。ここで、付加されたアミノ酸の位置は、野性型酵素のＮ末端、Ｃ末端またはアミノ酸配列であり得る。
【０５８１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能が改善された完全な活性酵素であり得る。
【０５８２】
たとえば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的に修飾または操作された形態、すなわちＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、切断される二本鎖ＤＮＡに結合しないか、それとは一定の距離を維持しながら、二本鎖ＤＮＡを切断し得る。この場合、修飾または操作された形態は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、機能活性が改善された完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能が低下した完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８４】
たとえば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の修飾または操作された特定の形態、すなわちＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、切断される二本鎖ＤＮＡに非常に近いか、それと特異的な結合を形成しながら、二本鎖ＤＮＡを切断し得る。ここで、特異的な結合は、たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異領域のアミノ酸と切断位置のＤＮＡ配列との間の結合であり得る。この場合、修飾または操作された形態は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能活性が低下した完全な活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５８６】
「不完全または部分的に活性」という用語は、酵素が、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能から選択される１つを有する状態を指す。この状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。加えて、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと呼ばれ得る。
【０５８７】
「ニッカーゼ」という用語は、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の二本鎖の一方の鎖のみを切断するように操作または修飾されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、一本鎖、たとえば、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸のｇＲＮＡに相補的または非相補的である鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。したがって、二本鎖を切断するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
【０５８８】
ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を含まなくてよく、このために、ＨＮＨドメインを操作または修飾してもよい。
【０５８９】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、ニッカーゼは、修飾されたＨＮＨドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５９０】
たとえば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、ニッカーゼは、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の８４０番目のアミノ酸をヒスチジンからアラニンへ変異させる変異によって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわちＳｐＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の非相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断することができる。
【０５９１】
別の例では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９である場合、ニッカーゼは、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の５５９番目のアミノ酸をヒスチジンからアラニンへ変異させる変異によって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の非相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断することができる。
【０５９２】
加えて、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を含まなくてよく、このために、ＲｕｖＣドメインを操作または修飾してもよい。
【０５９３】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、ニッカーゼは、修飾されたＲｕｖＣドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５９４】
たとえば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、ニッカーゼは、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の１０番目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンへ変異させる変異によって、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわち、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断することができる。
【０５９５】
別の例では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９とした場合、ニッカーゼは、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の８番目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンへ変異させる変異によって、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９バリアントであり得る。それによって産生されるニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９バリアントは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有しているため、標的遺伝子の転写調節領域内の核酸の相補鎖である鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断することができる。
【０５９６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０５９７】
「不活性」という用語は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能の両方を失われている状態を指す。そのような状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。
【０５９８】
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインの変化により、ヌクレアーゼ不活性を有し得る。
【０５９９】
不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン内の変異により、ヌクレアーゼ不活性を有し得る。すなわち、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を含まなくてよく、このために、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを操作または修飾してもよい。
【０６００】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、修飾されたＲｕｖＣドメインおよび修飾されたＨＮＨドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０６０１】
たとえば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギン酸と８４０番目のヒスチジンの両方のアラニンへの変異により、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９バリアントであり得る。ここで、産生される不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されているため、標的遺伝子の転写調節領域内の二本鎖核酸は、完全に切断され得る。
【０６０２】
別の例では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９である場合、不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の８番目のアスパラギン酸と５５９番目のヒスチジンの両方のアラニンへの変異により、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９バリアントであり得る。ここで、産生される不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＣｊＣａｓ９バリアントは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されているため、標的遺伝子の転写調節領域内の二本鎖核酸は、完全には切断されないことがあり得る。
【０６０３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ活性、すなわち、上記のヌクレアーゼ活性に加えて、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力を有し得る。
【０６０４】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全に活性な、不完全もしくは部分的に活性な、または不活性なヘリカーゼ活性を有するように修飾されていてもよい。
【０６０５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素を人為的に操作または修飾することにより生成されるＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０６０６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能および／または二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する第２の機能を修飾するための人為的に操作または修飾されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０６０７】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能の第１の機能が失われた形態であり得る。
【０６０８】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能の第２の機能が失われた形態であり得る。
【０６０９】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、第１の機能と第２の機能の両方が失われた形態であり得る。
【０６１０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、ｇＲＮＡとの相互作用によりｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を形成し得る。
【０６１１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のｇＲＮＡと相互作用する機能を修飾するための人為的に操作または修飾されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０６１２】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１３】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６１４】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１５】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６１６】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１７】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６１８】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能および第２の機能を有さず、ｇＲＮＡとの相互作用が低下した形態であり得る。
【０６１９】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能および第２の機能を有さず、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
【０６２０】
ここで、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントとの間の相互作用強度に応じて、さまざまなｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が形成され得、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントに応じて、標的配列に近づくか、切断する機能に違いがあり得る。
【０６２１】
たとえば、ｇＲＮＡとの相互作用が低下したＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントにより形成されたｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡに完全に相補的に結合する標的配列に非常に接近または局在化した場合のみ、標的配列の二本鎖または一本鎖を切断し得る。
【０６２２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が修飾された形態であり得る。
【０６２３】
例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸が置換された形態であり得る。
【０６２４】
別の例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が欠失された形態であり得る。
【０６２５】
さらに別の例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が付加された形態であり得る。
【０６２６】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失および／または付加された形態であり得る。
【０６２７】
加えて、任意に、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の本来の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する第１の機能およびその第２鎖を切断する第２の機能に加えて、機能的ドメインをさらに含み得る。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の本来の機能に加えて、追加の機能を有し得る。
【０６２８】
機能的ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性、または（ペプチドを含む）タンパク質の単離および精製用のタグもしくはレポーター遺伝子を有するドメインであり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０６２９】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質であって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などのタンパク質を含むが、本発明はそれらに限定されない。
【０６３０】
機能的ドメインはデアミナーゼであり得る。
【０６３１】
たとえば、シチジンデアミナーゼは、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素に対する機能的ドメインとしてさらに含まれ得る。例示的な一実施形態では、融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼ、たとえばアポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）をＳｐＣａｓ９ニッカーゼに添加することにより産生され得る。上記のように形成された［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＰＯＢＥＣ１］は、Ｃ〜ＴもしくはＵのヌクレオチド編集、またはＧ〜Ａのヌクレオチド編集に使用され得る。
【０６３２】
別の例では、アデニンデアミナーゼは、不完全または部分的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素に対する機能的ドメインとしてさらに含まれ得る。例示的な一実施形態では、アデニンデアミナーゼ、たとえばＴａｄＡバリアント、ＡＤＡＲ２バリアントまたはＡＤＡＴ２バリアントをＳｐＣａｓ９ニッカーゼに加えることにより、融合タンパク質が産生され得る。融合タンパク質はヌクレオチドＡをイノシンに修飾するため、上記のように形成された［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＴａｄＡバリアント］、［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＤＡＲ２バリアント］または［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＤＡＴ２バリアント］は、Ａ〜Ｇのヌクレオチド編集、またはＴ〜Ｃのヌクレオチド編集に使用され得、修飾されたイノシンはポリメラーゼによってヌクレオチドＧとして認識され、それによって実質的にＡ〜Ｇのヌクレオチド編集を示す。
【０６３３】
機能的ドメインは、核局在化配列またはシグナル（ＮＬＳ）または核外移行配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０６３４】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数のＮＬＳを含み得る。ここで、１つまたは複数のＮＬＳが、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端もしくはその近傍；当該酵素のＣ末端もしくはその近傍；またはそれらの組合せに含まれ得る。ＮＬＳは、以下のＮＬＳに由来するＮＬＳ配列であり得るが、本発明はそれらに限定されない：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（たとえば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）を有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−αからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９）；ヒトＰ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０）；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２）および配列ＰＫＱＫＫＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３）；Ｄ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列に由来するＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７）。
【０６３５】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２つ以上の部分に分割することにより調製されるスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。「スプリット」という用語は、タンパク質の機能的もしくは構造的分割またはタンパク質の２つ以上の部分へのランダムな分割を指す。
【０６３６】
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全、不完全もしくは部分的に活性な酵素または不活性な酵素であり得る。
【０６３７】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＳｐＣａｓ９は、残基６５６であるチロシンと残基６５７であるスレオニンとの間の２つの部分に分割され得、それによってスプリットＳｐＣａｓ９が生成される。
【０６３８】
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を選択的に含み得る。
【０６３９】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、構造的に野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と同じまたは類似するスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素の形成のために組み立てられ得る。
【０６４０】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量化ドメイン；インテイン；ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン；または特定の条件下でヘテロダイマーを形成するドメインであり得る。
【０６４１】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３であるセリンと残基７１４であるグリシンとの間の２つの部分に分割され得、それによってスプリットＳｐＣａｓ９が生成される。ＦＲＢドメインは２つの部分の一方に連結され、ＦＫＢＰドメインはもう一方に連結される。それによって生成されるスプリットＳｐＣａｓ９では、ＦＲＢドメインとＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境において二量体で形成され得、それによって再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素が生成される。
【０６４２】
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、それをコードする配列を有するポリペプチド、タンパク質または核酸であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントを導入するために対象に対してコドン最適化され得る。
【０６４３】
「コドン最適化」という用語は、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより高頻度または最も高頻度で使用されるコドンに置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより核酸配列を修飾して宿主細胞内での発現を向上させるためのプロセスを指す。さまざまな種は、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、ｍＲＮＡの翻訳の効率と相関することが多く、このことは、翻訳されるコドンの特性と特異的なｔＲＮＡ分子の入手可能性に依存すると考えられる。細胞内で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般にペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、所与の生物中の最適な遺伝子発現のためにコドン最適化に基づき個別に調整され得る。
【０６４４】
本明細書に開示されるｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、さまざまな送達方法およびさまざまな形態により対象に送達または導入され得る。
【０６４５】
主題関連の説明は上記の通りである。
【０６４６】
例示的な一実施形態では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０６４７】
ベクターは、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０６４８】
一例では、ベクターは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を同時に含み得る。
【０６４９】
別の例では、ベクターは、ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含み得る。
【０６５０】
たとえば、ｇＲＮＡに含まれるドメインは、１つのベクターに含まれていても、分割されて異なるベクターに含まれていてもよい。
【０６５１】
別の例では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０６５２】
たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は１つのベクターに含まれていても、分割されていくつかのベクターに含まれていてもよい。
【０６５３】
ベクターは、１つまたは複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
【０６５４】
ここで、調節／制御コンポーネントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
【０６５５】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０６５６】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０６５７】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０６５８】
プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
【０６５９】
プロモーターは、ウイルス性または非ウイルス性プロモーターであり得る。
【０６６０】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列）に応じて適切なプロモーターを使用してもよい。
【０６６１】
たとえば、ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。
【０６６２】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【０６６３】
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０６６４】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【０６６５】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０６６６】
一例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【０６６７】
別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスにより送達または導入され得る。さらに別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えＡＡＶにより送達または導入され得る。さらに別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、たとえば本明細書に記載のウイルスの１つまたは複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
【０６６８】
例示的な一実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、対象に送達または導入され得る。
【０６６９】
たとえば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物の形態で存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で存在し得る。
【０６７０】
一例では、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ型ｇＲＮＡおよびタンパク質型ＣＲＩＳＰＲ、すなわちリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含むｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６７１】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、文献［Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］に記載）、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達またはそれらの組合せにより対象に送達または導入され得る。本明細書に開示されるｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用して、標的遺伝子、すなわち重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作または修飾することができる。
【０６７２】
標的遺伝子の転写調節領域は、上記のｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または修飾され得る。ここで、標的遺伝子の転写調節領域の操作または修飾は、ｉ）標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷と、ｉｉ）損傷した転写調節領域の修復の両方を含み得る。
【０６７３】
ｉ）標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷、特に転写調節領域の標的配列の切断または損傷であり得る。
【０６７４】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的になり得、標的配列はＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列を含んでも含んでいなくてもよい。そのような標的配列は、ｇＲＮＡの設計に関与している者に重要な基準を提供する。
【０６７５】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的に認識され得るため、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、認識された標的配列の近くに位置し得る。
【０６７６】
標的部位での「切断」とは、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破損を指す。  切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、本発明はそれに限定されない。これ以外に、切断はさまざまな方法によって行われ得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、ここで、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断から生じ得る。二本鎖切断により、平滑末端または付着末端（もしくは粘着末端）が生じ得る。
【０６７７】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、標的配列の二本鎖の切断または損傷全体であり得る。
【０６７８】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９である場合、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって完全に切断され得る。
【０６７９】
別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）である場合、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の２本の一本鎖は、各ＣＲＩＳＰＲ複合体によってそれぞれ切断され得る。すなわち、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖はＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、ｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖はＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、これらの切断は、順次または同時に行われ得る。
【０６８０】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、標的配列の二本鎖のうちの一本鎖のみの切断または損傷であり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡに相補的に結合する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補的な一本鎖、またはｇＲＮＡに相補的に結合しない非ガイド核酸結合配列、すなわちｇＲＮＡと非相補的な一本鎖であり得る。
【０６８１】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）により、ｇＲＮＡに相補的に結合する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補的な一本鎖を切断してよく、ｇＲＮＡに相補的に結合しない非ガイド核酸結合配列、すなわちｇＲＮＡと非相補的な一本鎖を切断しなくてよい。
【０６８２】
別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）により、ｇＲＮＡに相補的に結合しない標的配列の非ガイド核酸結合配列、すなわちｇＲＮＡと非相補的な一本鎖を切断してよく、ｇＲＮＡに相補的に結合する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補的な一本鎖を切断しなくてよい。
【０６８３】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用した標的遺伝子の転写調節領域の切断または損傷は、核酸断片の部分的な除去であり得る。
【０６８４】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、野性型ＳｐＣａｓ９と、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡから構成される場合、第１のｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の二本鎖が切断され得、第２のｇＲＮＡと相補的な結合を形成する標的配列の二本鎖が切断され得、第１および第２のｇＲＮＡならびにＳｐＣａｓ９によって核酸断片の除去がもたらされる。
【０６８５】
たとえば、２つのＣＲＩＳＰＲ複合体が、エンハンサーの上流に存在する標的配列に相補的に結合する１つのｇＲＮＡと、エンハンサーの下流に存在する標的配列に相補的に結合する他方のｇＲＮＡなどの異なる標的配列に相補的に結合する２つのｇＲＮＡと、野性型ＳｐＣａｓ９とからなる場合、第１のｇＲＮＡに相補的に結合するエンハンサーの上流に存在する標的配列の二本鎖が切断され得、第２のｇＲＮＡに相補的に結合するエンハンサーの下流に存在する標的配列の二本鎖が切断され得、それによって、核酸断片、すなわちエンハンサー領域が、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９によって除去される。
【０６８６】
ｉｉ）損傷した転写調節領域の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して行われる修復または復元であり得る。
【０６８７】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、切断された二本鎖または一本鎖の両端をつなぎ合わせることにより、ＤＮＡの二本鎖の破損を復元または修復する方法であり、一般に、二本鎖の破損（たとえば切断）によって形成された２つの適合性のある末端が頻繁に互いに接触して２つの端部を完全につなぎ合わせる場合、破損した二本鎖が回復される。ＮＨＥＪは、細胞周期全体で使用することができる修復方法であり、通常、Ｇ１期のように細胞内でテンプレートとして使用される相同ゲノムがない場合に起こる。
【０６８８】
ＮＨＥＪを使用した損傷遺伝子または核酸の修復プロセスでは、ＮＨＥＪ修復領域で核酸配列のいくつかの挿入および／または欠失（インデル）が起こり、そのような挿入および／または欠失が、リーディングフレームのシフトを引き起こし、フレームシフトされたトランスクリプトームｍＲＮＡがもたらされる。その結果、先天機能は、ナンセンス媒介の崩壊または正常なタンパク質の合成の失敗のために失われる。加えて、リーディングフレームが維持される間、かなりの量の配列の挿入または欠失が起こる変異が、タンパク質の機能が破壊を引き起こし得る。変異は遺伝子座に依存する。なぜなら、タンパク質の有意でない領域の変異よりも、有意な機能的ドメインの変異の許容度がおそらく低いからである。
【０６８９】
ＮＨＥＪによって天然状態で生成されるインデル変異を期待することは不可能であるが、特異的インデル配列が所定の破損領域で優先され、ミクロ相同性の小さな領域に由来し得る。従来、欠失の長さは１ｂｐ〜５０ｂｐの範囲であり、挿入はより短くなる傾向にあり、破損領域を直接囲む短い反復配列を頻繁に含む。
【０６９０】
加えて、ＮＨＥＪは変異を引き起こすプロセスであり、特異的な最終配列を生成する必要がない場合は、小さな配列のモチーフを欠失するのに使用することができる。
【０６９１】
発現がＣＲＩＳＰＲ複合体により標的化された転写調節領域により制御される標的遺伝子の特異的ノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して行われ得る。標的遺伝子の転写調節領域の二本鎖または２本の一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して切断され得、破損した二本鎖または二本の一本鎖は、ＮＨＥＪを介したインデルを有し、それによって、発現が転写調節領域によって制御される標的遺伝子の特異的ノックアウトを誘導する。
【０６９２】
一例では、標的遺伝子の転写調節領域の二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得、ＮＨＥＪを介して修復することにより、修復領域にさまざまなインデル（挿入および欠失）が生成され得る。
【０６９３】
「インデル」という用語は、ＤＮＡのヌクレオチド配列に部分ヌクレオチドを挿入またはＤＮＡのヌクレオチド配列から部分ヌクレオチドを欠失することによって形成されるバリエーションを指す。上記のようにｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が標的遺伝子の転写調節領域で標的配列を切断する場合、ＨＤＲまたはＮＨＥＪによる修復中に標的配列にインデルが導入され得る。
【０６９４】
相同性指向修復（ＨＤＲ）は、エラーのない修正方法であり、相同配列をテンプレートとして使用して、損傷した転写調節領域を修復または復元し、一般に、破損ＤＮＡを修復または復元、すなわち細胞の先天情報を復元し、破損ＤＮＡは、修飾されていない相補的なヌクレオチド配列の情報または姉妹染色分体の情報を使用して修復される。ＨＤＲの最も一般的な種類は相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、通常、活発に分裂している細胞のＳ期またはＧ２／Ｍ期に起こる修復または復元方法である。
【０６９５】
細胞の相補的ヌクレオチド配列または姉妹クロマチンを使用するのではなく、ＨＤＲを使用して損傷ＤＮＡを修復または復元するために、相補的ヌクレオチド配列または相同的ヌクレオチド配列の情報を使用して人為的に合成されたＤＮＡテンプレート、すなわち、相補的ヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートが細胞に提供され得、それによって破損ＤＮＡが修復される。ここで、核酸配列または核酸断片を核酸テンプレートにさらに加えて破損ＤＮＡを修復する場合、破損ＤＮＡにさらに加えられた核酸配列または核酸断片をノックインしてもよい。さらに追加された核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子、または細胞内で発現される遺伝子もしくは核酸への変異によって修飾された標的遺伝子の転写調節領域を修正するための核酸配列または核酸断片であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０６９６】
一例では、標的遺伝子酸の転写調節領域の二本鎖または一本鎖が、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得、切断部位に隣接するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートが細胞に提供され得、標的遺伝子の転写調節領域の切断されたヌクレオチド配列は、ＨＤＲを介して修復または復元され得る。
【０６９７】
ここで、相補的ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートは、破損ＤＮＡの相補的ヌクレオチド配列、すなわち切断された二本鎖または一本鎖を有し得、破損ＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片をさらに含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相補的ヌクレオチド配列および挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸テンプレートを使用して、破損ＤＮＡ、すなわち標的遺伝子の転写調節領域の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片および追加の核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子、または細胞内で発現される遺伝子もしくは核酸への変異によって修飾された標的遺伝子の転写調節領域を修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相補的ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡとの相補的な結合を有するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域の切断された二本鎖または一本鎖の右および左のヌクレオチド配列であり得る。あるいは、相補的ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡとの相補的な結合を有するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子の転写調節領域の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端を有するヌクレオチド配列であり得る。相補的ヌクレオチド配列は１５〜３０００ヌクレオチド配列であり得、相補的ヌクレオチド配列の長さまたはサイズは、核酸テンプレートまたは標的遺伝子の転写調節領域のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸テンプレートは、二本鎖または一本鎖の核酸であり得、線状または環状であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０６９８】
別の例では、標的遺伝子酸の転写調節領域の二本鎖または一本鎖が、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得、切断部位に隣接するヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートが細胞に提供され得、標的遺伝子の転写調節領域の切断されたヌクレオチド配列は、ＨＤＲを介して修復または復元され得る。
【０６９９】
ここで、相同ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートは、破損ＤＮＡの相同ヌクレオチド配列、すなわち切断された二本鎖または一本鎖を有し得、破損ＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片をさらに含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相同ヌクレオチド配列および挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸テンプレートを使用して、破損ＤＮＡ、すなわち標的遺伝子の転写調節領域の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片および追加の核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子、または細胞内で発現される遺伝子もしくは核酸への変異によって修飾された標的遺伝子または核酸の転写調節領域を修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相同ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡと相同性を有するヌクレオチド配列、すなわち、転写調節領域の切断された二本鎖の右および左のヌクレオチド配列であり得る。あるいは、相同ヌクレオチド配列は、破損ＤＮＡとの相同性を有するヌクレオチド配列、すなわち、転写調節領域の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端を有するヌクレオチド配列であり得る。相同ヌクレオチド配列は１５〜３０００ヌクレオチド配列であり得、相同ヌクレオチド配列の長さまたはサイズは、核酸テンプレートまたは標的遺伝子の転写調節領域のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸テンプレートは、二本鎖または一本鎖の核酸であり得、線状または環状であり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０７００】
ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外にも、損傷した転写調節領域を修復または復元するためのさまざまな方法がある。たとえば、損傷した転写調節領域を修復または復元する方法は、一本鎖アニーリング、一本鎖破損修復、ミスマッチ修復、ヌクレオチド切断修復、またはヌクレオチド切断修復を使用する方法であり得る。
【０７０１】
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する方法で、一般に３０ヌクレオチド超の反復配列を使用する。反復配列は、（粘着末端を有するように）破損した各末端の標的核酸の二本鎖に対して一本鎖を有するように切断され、切断後、反復配列を含む一本鎖オーバーハングがＲＰＡタンパク質でコーティングされ、反復配列が互いに不適切にアニーリングすることが防がれる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的な反復配列をアニーリングすることができる配列が配置される。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップが切断され、新しいＤＮＡの合成により一定のギャップが埋められてＤＮＡ二本鎖が復元される。この修復のその結果、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失され、欠失の長さは、本明細書で使用される２つの反復の位置と、切断の進行の経路または程度を含むさまざまな要因に依存し得る。
【０７０２】
ＳＳＡは、ＨＤＲと同様に、相補配列、すなわち相補反復配列を利用するが、対照的に、標的核酸配列を修飾または修正するための核酸テンプレートは必要としない。
【０７０３】
ゲノムの一本鎖破損は、上記の修復メカニズムとは別個のメカニズム、一本鎖破損修復（ＳＳＢＲ）を介して修復される。一本鎖ＤＮＡ破損の場合、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は破損を認識し、修復機構を補充する。ＤＮＡ破損に対するＰＡＲＰ１の結合と活性は一時的であり、ＳＳＢＲは、損傷領域でのＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することにより促進される。ＳＳＢＲ複合体の最も重要なタンパク質はＸＲＣＣ１であり、それはＤＮＡの３'および５'末端処理を促進するタンパク質と相互作用してＤＮＡを安定化する。末端処理は、一般に、損傷した３'末端のヒドロキシル化状態への修復、および／または損傷した５'末端のリン酸部分への修復に関与し、末端が処理された後、ＤＮＡギャップが埋められる。ＤＮＡギャップを埋めるための２つの方法、すなわち、短いパッチ修復と長いパッチ修復があり、短いパッチ修復は、単一ヌクレオチドの挿入を含む。ＤＮＡギャップが埋められた後、ＤＮＡリガーゼが末端結合を促進する。
【０７０４】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、ミスマッチＤＮＡヌクレオチドに対して機能する。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３の各複合体は、ＡＴＰａｓｅ活性を有しており、ひいてはミスマッチの認識と修復の開始に重要な役割を果たし、ＭＳＨ２／６は、主にヌクレオチド間のミスマッチを認識し、１つまたは２つのヌクレオチドミスマッチを識別するが、ＭＳＨ２／３は、主により大きなミスマッチを認識する。
【０７０５】
塩基除去修復（ＢＥＲ）は、細胞周期全体を通じて有効であり、小さな非ヘリックス歪みの塩基損傷領域をゲノムから除去するために使用される修復方法である。損傷ＤＮＡでは、ヌクレオチドをリン酸−デオキシリボース骨格につなぎ合わせるＮ−グリコシド結合を切断することにより損傷ヌクレオチドが除去され、次いでホスホジエステル骨格が切断され、それによって一本鎖ＤＮＡの破損が生じる。それによって形成される破損した一本鎖末端が除去され、除去された一本鎖により生じたギャップが新しい相補的ヌクレオチドで埋められ、次いで新たに埋められた相補的ヌクレオチドの末端がＤＮＡリガーゼにより骨格とライゲーションされ、損傷ＤＮＡが修復される。
【０７０６】
ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから大きなヘリックス歪み損傷を除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されると、損傷領域を含む短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップが生じる。生じたギャップは、新しい相補的なヌクレオチドで埋められ、新たに埋められた相補的なヌクレオチドの端部がＤＮＡリガーゼによって骨格とライゲーションされ、損傷ＤＮＡが修復される。
【０７０７】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による標的遺伝子の転写調節領域の人為的操作の効果は、主にノックアウト（ノック−アウト）、ノックダウン、ノックイン（ノック−イン）および発現の増加であり得る。
【０７０８】
「ノックアウト」という用語は、標的遺伝子または核酸の不活性化を指し、「標的遺伝子または核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳が起こらない状態を指す。疾患を引き起こす遺伝子または異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトを介して阻害され得、タンパク質発現が防がれる。
【０７０９】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した転写調節領域では、ＮＨＥＪによってインデルが生成され、ひいては損傷した転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックアウトが誘導される。
【０７１０】
別の例では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体とドナーを使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ドナーを使用してＨＤＲによって修復され得る。ここで、ドナーは、相同ヌクレオチド配列と挿入が望まれるヌクレオチド配列を含む。ここで、挿入されるヌクレオチド配列の数は、挿入位置または目的に応じて異なり得る。損傷した転写調節領域がドナーを使用して修復されると、挿入されるヌクレオチド配列が、損傷したヌクレオチド配列領域に挿入されるため、転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックアウトが誘導される。
【０７１１】
「ノックダウン」という用語は、標的遺伝子もしくは核酸の転写および／または翻訳の減少、または標的タンパク質の発現を指す。ノックダウンを介して遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することにより、疾患の発症が予防され得るか、疾患が治療され得る。
【０７１２】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した転写調節領域では、ＮＨＥＪによってインデルが生成される、ひいては損傷した転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックダウンが誘導される。
【０７１３】
別の例では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体とドナーを使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ドナーを使用してＨＤＲによって修復され得る。ここで、ドナーは、相同ヌクレオチド配列と挿入が望まれるヌクレオチド配列を含む。ここで、挿入されるヌクレオチド配列の数は、挿入位置または目的に応じて異なり得る。ドナーを使用して損傷した転写調節領域が修復されると、挿入されるヌクレオチド配列が、損傷したヌクレオチド配列領域に挿入されるため、転写調節領域が不活性化され、それによって標的遺伝子または染色体特異的ノックダウンが誘導される。
【０７１４】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を使用して、標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は、標的遺伝子の転写調節領域に特異的に結合し、転写調節領域の活性は、ＣＲＩＳＰＲ−不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され、それによって標的遺伝子または染色体の発現を阻害するノックダウンが誘導される。
【０７１５】
「ノックイン」という用語は、標的遺伝子または核酸への特定の核酸または遺伝子の挿入を指し、ここで、「特定の核酸または遺伝子」とは、挿入または発現される対象の遺伝子または核酸を指す。疾患を誘発する変異遺伝子が、ノックインを介して正常な遺伝子の発現を誘導するために、正常への修正または正常な遺伝子の挿入によって疾患治療に利用され得る。
【０７１６】
加えて、ノックインは、ドナーさらに必要とし得る。
【０７１７】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体とドナーを使用して標的遺伝子または核酸が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または核酸が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷した標的遺伝子または核酸は、ドナーを使用してＨＤＲによって修復され得る。ここで、ドナーは、特定の核酸または遺伝子を含み得、特定の核酸または遺伝子を損傷した遺伝子または染色体に挿入するために使用され得る。ここで、挿入された特定の核酸または遺伝子は、タンパク質の発現を誘導し得る。
【０７１８】
「発現の増加」とは、人為的な操作前と比較して、標的遺伝子もしくは核酸の転写および／または翻訳または標的タンパク質の発現の増加を指す。疾患は、過小発現もしくは非発現の遺伝子またはタンパク質の発現を制御することにより予防または治療され得る。
【０７１９】
たとえば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が編集される場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子の転写調節領域が切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷を受けた転写調節領域は、ＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した転写調節領域では、ＮＨＥＪによってインデルが生成され、それによって転写調節領域の活性が増加し、正常な標的遺伝子または染色体の発現が誘導される。本明細書に開示される１つの例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、重複遺伝子の転写調節領域に人為的な操作または修飾を加えることができる。
【０７２０】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列を特異的に認識し得る。
【０７２１】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７２２】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７２３】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０７２４】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的に認識され得るため、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、認識された標的配列の近くに位置し得る。
【０７２５】
標的配列は、重複遺伝子の転写調節領域で人為的な修飾が起こる部位または領域であり得る。
【０７２６】
標的配列の説明は上記の通りである。
【０７２７】
例示的な一実施形態では、標的配列は、表１、２、３および４に列挙されている１つまたは複数のヌクレオチド配列であり得る。
【０７２８】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素からなる。
【０７２９】
ｇＲＮＡは、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列に部分的または完全に相補的に結合することができるガイドドメインを含み得る。
【０７３０】
ガイドドメインは、ガイド核酸結合配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上が相補的、または完全に相補的であり得る。
【０７３１】
ガイドドメインは、重複遺伝子の転写調節領域内の標的配列のガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、または０〜２個のミスマッチを含み得る。
【０７３２】
ｇＲＮＡは、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインからなる群より選択される１つまたは複数のドメインを含み得る。
【０７３３】
ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質からなる群より選択される１つまたは複数の酵素であり得る。一例では、エディタータンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質であり得る。
【０７３４】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、重複遺伝子の転写調節領域にさまざまな人為的な操作または修飾を加えることができる
【０７３５】
重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に対する以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７３６】
たとえば、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み得る。一例では、欠失ヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの連続的または非連続的な塩基対であり得る。別の例では、欠失ヌクレオチドは、２ｂｐ以上の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド断片であり得る。ここで、ヌクレオチド断片は、２〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、または４６〜５０塩基対であり得る。さらに別の例では、欠失ヌクレオチドは２つ以上のヌクレオチド断片であり得る。ここで、２つ以上のヌクレオチド断片は、それぞれ非連続的なヌクレオチド配列、すなわち１つまたは複数のヌクレオチド配列ギャップを有するヌクレオチド断片であり得、２つ以上の欠失ヌクレオチド断片による２つ以上の欠失部位を有し得る。
【０７３７】
あるいは、たとえば、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含み得る。一例では、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの連続した塩基対であり得る。別の例では、挿入されるヌクレオチドは、５つ以上の連続した塩基対からなるヌクレオチド断片であり得る。ここで、ヌクレオチド断片は、５〜１０、１１〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、または７５０〜１０００塩基対であり得る。さらに別の例では、挿入されるヌクレオチドは、特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得る。ここで、特異的遺伝子は、外部から入力された遺伝子であり、重複遺伝子を有するヒト細胞などの対象には含まれない。あるいは、特異的遺伝子は、たとえばヒト細胞のゲノムに存在する遺伝子などの重複遺伝子とともに、ヒト細胞などの対象に含まれる遺伝子であり得る
【０７３８】
あるいは、たとえば、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に位置するか、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および挿入を含み得る。一例では、欠失ヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの連続的または非連続的な塩基対であり得る。ここで、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５つの塩基対；ヌクレオチド断片；または特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得、欠失および挿入は順次または同時に起こり得る。ここで、挿入されるヌクレオチド断片は、５〜１０、１１〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、または７５０〜１０００塩基対であり得る。ここで、特異的遺伝子は、重複遺伝子を有するヒト細胞などの対象の外部から入力された遺伝子であり得る。あるいは、特異的遺伝子は、たとえばヒト細胞のゲノムに存在する遺伝子などの重複遺伝子とともに、ヒト細胞などの対象に含まれる遺伝子であり得る。別の例では、欠失ヌクレオチドは、２塩基対以上からなるヌクレオチド断片であり得る。ここで、欠失ヌクレオチド断片は、２〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、または４６〜５０塩基対であり得る。ここで、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５塩基対；ヌクレオチド断片；または特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得、欠失および挿入は順次または同時に起こり得る。さらに別の例では、欠失ヌクレオチドは２つ以上のヌクレオチド断片であり得る。ここで、挿入されるヌクレオチドは、１、２、３、４または５塩基対；ヌクレオチド断片；または特異的遺伝子の部分的または完全なヌクレオチド配列であり得、欠失および挿入は順次または同時に起こり得る。加えて、欠失された２つ以上の部位の一部またはすべてで挿入が起こり得る。
【０７３９】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じて、重複遺伝子の転写調節領域にさまざまな人為的な操作または修飾を加えることができる。
【０７４０】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的領域に存在する５'−ＮＧＧ−３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４１】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４２】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｗは、ＡまたはＴである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４３】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'（Ｎは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４４】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'（Ｎが、それぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲがＡまたはＧであり、（Ｔ）が任意に含まれる配列を指す）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４５】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質である場合、重複遺伝子の人為的に操作または修飾された転写調節領域は、標的配列に存在する５'−ＴＴＮ−３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１〜５０ｂｐ、１〜４０ｂｐ、１〜３０ｂｐ、または好ましくは１〜２５ｂｐの連続したヌクレオチド配列領域に以下の１つまたは複数の改変を含み得る：
ｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの置換、
ｉｉｉ）１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される２つ以上の組合せ。
【０７４６】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果はノックアウトであり得る。
【０７４７】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は阻害され得る。
【０７４８】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果はノックダウンであり得る。
【０７４９】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は減少し得る。
【０７５０】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体による重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果はノックインであり得る。
【０７５１】
ここで、ノックイン効果は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体と、外因性のヌクレオチド配列または遺伝子を追加で含むドナーによって誘導され得る。
【０７５２】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体とドナーによる重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作する効果は、外因性のヌクレオチド配列または遺伝子によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現させることにより誘導され得る。
【０７５３】
ここで、ノックイン効果は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体と、挿入が望まれるヌクレオチド配列を含むドナーによって誘導され得る。本明細書で開示される一態様は、発現を制御する方法に関する。
【０７５４】
本明細書に開示される１つの例示的な実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る重複遺伝子の発現を制御する方法に関する。
【０７５５】
いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトまたは非ヒト動物からの細胞または細胞のコロニーをサンプリングし、１つまたは複数の細胞を修飾することを含み得る。培養は、ｅｘ  ｖｉｖｏのどの段階でも行われ得る。１つまたは複数の細胞は、非ヒト動物または植物に再導入され得る。
【０７５６】
この方法は、真核細胞を人為的に改変する方法であり得、それは、重複遺伝子を有する真核細胞に発現制御組成物を導入することを含む。
【０７５７】
発現制御組成物の説明は上記の通りである。
【０７５８】
一実施形態では、発現制御組成物は以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含むエディタータンパク質。
【０７５９】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７６０】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０７６１】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０７６２】
ガイド核酸とエディタータンパク質は、個々の核酸配列の形態で、またはガイド核酸とエディタータンパク質の結合により複合体を形成することによって、１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０７６３】
任意に、発現制御組成物は、挿入されることが望ましい核酸配列またはそれをコードする核酸配列を含むドナーをさらに含み得る。
【０７６４】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、個々の核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０７６５】
導入段階は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われ得る。
【０７６６】
たとえば、導入段階は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１つまたは複数の方法に行われ得る。
【０７６７】
たとえば、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のものであり得る。本明細書に開示される一態様は、発現を制御して遺伝子重複疾患を治療するための組成物を使用して遺伝子重複疾患を治療する方法に関する。
【０７６８】
本明細書に開示される例示的な一実施形態は、重複遺伝子の転写調節領域を治療対象に人為的に操作するための発現制御組成物の投与を含む方法を用いた遺伝子重複疾患の治療の使用に関する。
【０７６９】
ここで、治療対象には、ヒト、サルなどの霊長類、ならびにマウスおよびラットなどの齧歯類を含む哺乳類が含まれ得る。
【０７７０】
遺伝子重複疾患の説明は上記の通りである。
【０７７１】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＰＭＰ２２遺伝子の重複により生じる疾患であり得る。
【０７７２】
一例では、ＰＭＰ２２遺伝子の重複によって生じる疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、またはルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）であり得る。
−  シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）  ＣＭＴ疾患は、ヒト染色体で起こる遺伝子重複によって引き起こされる遺伝性疾患であり、手足の末梢神経の発達に関与する遺伝子が変異によって複製され、それによってシャンパンボトルを逆さにしたような形状などの変形が引き起こされる。ＣＭＴ疾患は、米国では１００，０００人中３６人に起こる比較的よく見られる遺伝性神経疾患であり、患者数は世界で２８０万人であり、韓国でも約１７，０００人と推定される。ＣＭＴ疾患は、遺伝的側面に従って、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ＣＭＴ３、ＣＭＴ４およびＣＭＴＸの合計５つのタイプに大きく分類され、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２およびＣＭＴ３が優性で、子供では５０％の確率で遺伝され、ＣＭＴ４は劣性で、２５％の確率で遺伝される。ＣＭＴ１とＣＭＴ２は、ほとんどの国内患者で優性に遺伝され（それぞれ８０％と２０〜４０％）、ＣＭＴ３とＣＭＴ４は非常にまれである。ＣＭＴＸは、Ｘ染色体に沿った母系を通じて遺伝されるが、その頻度は１０〜２０％である。ＣＭＴ１は、ニューロンの軸索を囲む髄鞘のタンパク質の形成に関与する遺伝子重複による遺伝子発現の正常なプロセスを行えないことによって引き起こされる疾患である。ＣＭＴ１は３つのタイプに分類される。ＣＭＴ１Ａは常染色体優性遺伝病であり、染色体番号１７  １７ｐ１１．２−ｐ１２に位置するＰＭＰ２２遺伝子の重複によって引き起こされ、髄鞘の重要なコンポーネントであるＰＭＰ２２の過剰発現によって引き起こされる髄鞘の構造的および機能的異常をもたらす。
【０７７３】
ＣＭＴ２は軸索異常に関連し、神経伝導速度が正常状態に近い間に運動感覚神経の活動電位がかなり低下した神経障害であり、ＣＭＴ３はきわめて希少な常染色体劣性遺伝病として幼少期に起こり、臨床症状と神経伝導速度の低下が非常に激しいタイプである。ＣＭＴ４はまた、発症年齢が早く、臨床症状が重度のタイプであり、常染色体劣性遺伝され、Ｘ染色体と関連付けられている間にＣＭＴＸが起こるタイプであり、男性のその症状は、女性の症状よりも重篤である。
デジェリン・ソッタス病（Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｓｏｔｔａｓ  ｓｙｎｄｒｏｍ、ＤＳＳ）
【０７７４】
ＤＳＳは、幼い頃に起こる脱髄性運動感覚神経障害であり、通常、常染色体優性遺伝される疾患であるが、常染色体劣性遺伝もされ、重度の脱髄性神経障害を示し、乳児期からの運動神経の異常を示し、非常に遅い神経伝導と脳脊髄液中の特定のタンパク質の増加を示すことを特徴とする。デジェリン・ソッタス病の進行速度は非常に速く、歩行障害が幼い頃から始まり、遺伝もされるが、散発的に起こる。ＣＭＴ１Ａと同様に、ＰＭＰ２２の重複がＤＳＳの一部の患者のうちに見られ、加えて、対応する遺伝子のミスセンス変異が存在することが確認された。
−  先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）ＣＨＮは、出生直後に症状が現れる神経系疾患であり、その主な症状として、呼吸不全、筋力低下、筋肉運動不調和、筋緊張の低下、反射喪失、運動協調障害（運動神経症；運動失調症）、麻痺または感覚異常が現れ、同じ割合で男女に影響を及ぼす。ＣＨＮは、運動神経と感覚神経に障害が起こる遺伝病であり、髄鞘の脱髄と髄鞘再生が繰り返される間に、髄鞘形成が減少することを特徴とする。
−  ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）
【０７７５】
ＲＬＳは、希少なタイプの遺伝性運動感覚神経障害であり、１９２６年にルーシーとレヴィー他によって最初に記述され、手足の振戦、歩行損失などが他の遺伝性運動感覚神経障害よりも深刻なケースであるが、後に同じ症状がさまざまな遺伝性運動感覚神経障害サブタイプで発見されたため、ＲＬＳは、遺伝性運動感覚神経障害に現れる１つの症状と現在見なされている。ＲＬＳの場合、ミエリンタンパク質ゼロ遺伝子としてのＭＰＺ遺伝子の変異は、ＲＬＳを有することが最初に報告された患者の遺伝子検査で発見され、他の患者では、末梢神経のミエリンタンパク質２２の遺伝子としてＰＭＰ２２遺伝子の重複があるケースが報告されている。
【０７７６】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＰＬＰ１遺伝子の重複により生じる疾患であり得る。
【０７７７】
一例では、ＰＬＰ１遺伝子の重複により生じる疾患は、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）であり得る。
−  ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）
【０７７８】
ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）（ＰＭＤ）は、中枢神経系の白質の髄鞘発育不全によるさまざまな神経症状を示す非常に希少なスダノフィル性白質ジストロフィーである。その有病率は約１／４００，０００と推定される。１８８５年にペリツェウスが初めて報告したものは、染色体Ｘ依存的に遺伝される発達性脳対麻痺を有し、疾患の初めに示される眼振、運動失調、こわばり、後天性小頭症を特徴とする１つのファミリーである。ＰＭＤの臨床徴候は、乳児期および小児期の初期に現れ、ＰＭＤの特徴的な臨床症状は、振子眼振、喘鳴、精神運動発達障害または変性、運動失調、不規則運動、不随意運動、口腔機能障害、および精神遅滞である。
【０７７９】
ＰＭＤは、オリゴデンドロサイトの減少とプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の合成障害による中枢神経系の白質の髄鞘発育不全によって引き起こされる神経変性疾患または白質ジストロフィーである。プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）は、中枢神経系の髄鞘に最も豊富に存在するタンパク質であり、染色体Ｘの長腕に位置するＰＬＰ１遺伝子（Ｘｑ２２）の変異により異常に発現または産生され、中枢神経系に髄鞘発育不全を引き起こす。ＰＭＤは、脳組織病理学的に、脂質と反応するアゾ化合物によって引き起こされるスーダンレッドに対して親和性を有し、髄鞘の分解を指し、半卵円中心、小脳および脳幹で観察される。しかしながら、分解産物が見つからないため、ＰＭＤの原因は、脱髄ではなく、髄鞘発育不全または髄鞘形成不全であると考えられる。一般に、ＰＭＤの先天型は、完全な髄鞘形成不全によって特徴付けられ、ＰＭＤの古典型は、部分的な髄鞘形成不全によって特徴付けられる。部分的な髄鞘形成不全が起こると、正常な髄質白質は虎斑の外観を示す。髄鞘形成不全を伴う病変の軸索とニューロンは、一般によく保存され、希少なオリゴデンドロサイトの数は減少し、アストロサイトと線維性グリオーシスの増加が白質に見られ、萎縮が小多脳回と小脳の顆粒層に見られる。男性患者の８０％以上で、染色体Ｘの長腕に位置するＰＬＰ１遺伝子（Ｘｑ２２）の変異が見つかっている。これらの患者のうち、１０〜３０％が遺伝子に点突然変異を有しており、この場合、より重篤な臨床症状を示すことが知られている。ＰＬＰ１遺伝子全体を複製する現象は、ＰＭＤ患者の６０〜７０％以上でより頻繁に見られる。最近、ＰＬＰ１遺伝子は染色体Ｘに位置しているため、一般に、ＰＭＤは染色体Ｘ依存的に遺伝され、家族歴を有し、ほとんどが男性に起こる。しかしながら、ＰＭＤの病因はＰＬＰ１遺伝子だけでは説明され得ず、ＰＭＤの先天型は常染色体劣性であり、ＰＭＤの成人型は常染色体優性であり、またはＰＭＤは家族歴なしで散発的に起こる。まれに、ＰＭＤの症状は女性でもほとんど発現されないことが報告されている。
【０７８０】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＭＥＣＰ２遺伝子の重複により起こる疾患であり得る。
【０７８１】
一例では、ＭＥＣＰ２遺伝子の重複によって引き起こされる疾患はＭＥＣＰ２重複症候群であり得る。
−  ＭＥＣＰ２重複症候群
【０７８２】
ＭＥＣＰ２重複症候群と呼ばれる脳疾患は、ＭＥＣＰ２遺伝子を有する染色体Ｘの特異領域で起こる遺伝物質の重複によって引き起こされる。この疾患にはさまざまな症状が伴われ、筋緊張低下、発達遅延、呼吸器感染、発語異常、発作、自閉症行動および重度の知的障害などの症状が含まれる。
【０７８３】
この疾患は遺伝性疾患であるが、家族歴がなくても起こる。ＭＥＣＰ２重複症候群は、主に男性で起こり、ＭＥＣＰ２遺伝子欠損により起こるレット症候群は、主に女性で起こる。
【０７８４】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＲＡＩ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７８５】
一例では、ＲＡＩ１遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）であり得る。
−  ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）
【０７８６】
ＰＴＬＳは、１７番染色体の短腕に１１．２領域（１７ｐ１１．２）の微小重複を有する連続遺伝子症候群であり、１９９６年にＰＴＬＳの最初の研究事例が報告された。ＰＴＬＳは、レチノイン酸誘導−１（ＲＡＩ１）遺伝子を有する１７ｐ１１．２での１．３〜３．７Ｍｂの重複により起こることが知られている。ＰＴＬＳは希少疾患とみなされ、その発生率は２０，０００人の新生児に１人と予想される。ＰＴＬＳは、さまざまな先天性異常と精神遅滞を特徴とし、ＰＴＬＳの症例の８０％は自閉症スペクトラム障害を有している。加えて、ＰＴＬＳの他の特有の特性には、睡眠時無呼吸、構造的心血管異常、異常な社会的行動、学習障害、注意欠陥障害、強迫行動および身長の低さが含まれる。
【０７８７】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＥＬＮ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７８８】
一例では、ＥＬＮ遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）であり得る。
−  ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）
【０７８９】
ＷＢＳは、特徴的な臨床所見を有する７番染色体の異常に関連する近位遺伝子症候群であり、ＷＢＳの発生率は２０，０００人の新生児に１人である。７番染色体（７ｑ１１．２３）の長腕の近位部分の微小欠失の原因として、この領域では、血管壁などの弾性組織を形成するエラスチンタンパク質の産生に関連するエラスチン遺伝子、および認知能力に関連するＬＩＭＫ１遺伝子を含むさまざまな遺伝子が位置している。そのような遺伝子の欠失により、さまざまな特徴的な外観と臨床症状が示される。７ｑ１１．２３の微小欠失はほとんどの場合には天然に起こり、微小欠失の家族歴が示されることはめったにない。ＷＢＳの子供は、わずかに隆起した小さな鼻先、長い人中、幅広な口、ふっくらした唇、小さな頬（頬部低形成）、腫れぼったい目、爪の形成障害、および外反母趾などの特徴的な外観を有している。
【０７９０】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７９１】
一例では、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患は、アラジール症候群（ＡＳ）であり得る。
−  アラジール症候群（ＡＳ）
【０７９２】
ＡＳは、肝臓の胆管の数がかなり減少し、胆汁うっ滞を誘導し、心血管系、骨格系、眼球、顔、膵臓、および神経発達の異常を伴う症候群である。  外国の報告によると、ＡＳの発生率は１／１００，０００であり、疾患の特性により、軽度の症状の患者を含む場合、その発生率は高くなると予想される。ＡＳは、２０番染色体の短腕に位置するＪＡＧＧＥＤ１遺伝子の異常により起こる。現在、原因となる変異または重複が、遺伝子検査により症例の５０〜７０％で見られることが知られている。
【０７９３】
ＡＳの臨床症状は、一般に生後３ヶ月以内に表れる。ＡＳは、黄疸と胆汁うっ滞が連続しているために新生児期によく見られ、慢性肝疾患のために小児期に見られ、成人期後期にも見られる。ＡＳにはさまざまな臨床症状があり、不完全に遺伝されることがあるため、診断が難しくなり得る。ほとんどの患者は、黄疸と胆汁うっ滞の症状、それに起因するかゆみ、乳児期に進行性肝不全を有している。黄疸は、ほとんどの患者で観察され、半数を超える患者で小児期後半まで続く。胆汁うっ滞に起因するかゆみが起こり、一部の子供は皮下組織に黄色腫を有している。肝臓の合成機能は比較的よく維持されているが、患者の約２０％は肝硬変と肝不全を発症する。
【０７９４】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＳＮＣＡ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０７９５】
一例では、ＳＮＣＡ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患は、パーキンソン病であり得る。
−  パーキンソン病
【０７９６】
パーキンソン病は、通常、振戦、筋肉のこわばり、動作緩慢などの運動障害をよく示す疾患である。パーキンソン病が適切に治療されないと、運動障害が徐々に進行し、歩行や日常活動が困難になる。パーキンソン病は、主に高齢者に起こる疾患であり、年齢とともに疾患の発症リスクが徐々に増加し得る。韓国には正確な統計データはないが、パーキンソン病は１，０００人中１〜２人の割合で起こると推定される。高齢者で起こるパーキンソン病のほとんどの症例は、さまざまな研究を通じて遺伝的要因による影響が少ないことが知られている。しかしながら、４０歳未満の若い年齢で起こるパーキンソン病の一部の症例は、遺伝的要因に関連していることが知られている。
【０７９７】
パーキンソン病は、黒質に存在するドーパミンニューロンが徐々に死ぬため、ドーパミン濃度の低下によって引き起こされる疾患である。パーキンソン病の別の病理学的特徴は、脳剖検で観察されるタンパク質凝集体の形成であり、これはレビー小体と呼ばれる。レビー小体は、主要コンポーネントであるα−シヌクレインと呼ばれるタンパク質を有し、レビー小体とα−シヌクレインは、レビー小体認知症やシヌクレイノパチーなどの他の疾患にも関連している。α−シヌクレインの凝集は、中脳ではなく迷走神経と前嗅核で始まり、最終段階で中脳を介して大脳皮質に広がる。α−シヌクレインがパーキンソン病の進行に従って脳のさまざまな領域に広範囲に広がるという仮説は、α−シヌクレインが１つの細胞から放出されて別の細胞に伝達されるという最近の報告によって裏付けられている。
【０７９８】
パーキンソン病の遺伝率は、レビー小体の主要コンポーネントであるα−シヌクレインの変異体（Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ）がパーキンソン病を誘導するという報告によって最初に示唆された。その後、α−シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の重複と三重化がパーキンソン病の他の原因であると報告されていた。これは、α−シヌクレインタンパク質の変異に加えて、正常なタンパク質の過剰発現が細胞内でのα−シヌクレインの蓄積と凝集体の形成につながり、パーキンソン病の発症をもたらすことを意味する。
【０７９９】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＡＰＰ遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０８００】
一例では、ＡＰＰ遺伝子重複によって引き起こされる疾患は、アルツハイマー病であり得る。
−  アルツハイマー病
【０８０１】
アルツハイマー病は、記憶の進行性変性につながる脳の異常によって引き起こされる疾患である。加えて、アルツハイマー病は認知症を引き起こし、これが日常生活を妨げるのに十分な知的機能（思考、記憶および推理）の深刻な喪失をもたらす。ほとんどの場合、アルツハイマー病は６５歳を超えて起こるが、６５歳以前に発生することはめったにないとされ得る。米国では、６５〜７４歳の約３％、７５〜８４歳の約１９％、８５歳以上の約５０％がアルツハイマー病に罹患している。韓国では、農村地域に基づいた最近の調査によると、６０歳以上の人の約２１％が認知症であり、罹患者の約６３％がアルツハイマー型認知症であることが報告されている。２００６年には、世界で２６６，０００人がアルツハイマー病に罹患した。アルツハイマー病は２０５０年までに８５人に１人に影響を及ぼすと予想されている。
【０８０２】
この疾患の特徴は人によって異なるが、それらのいくつかは罹患者に共通している。初期の症状は、加齢に起因する単純な症状やストレスに起因する症状と誤解される傾向がある。疾患の初期段階では、罹患者は、名前、日付および場所が記憶から消える共通の短期記憶喪失を経験する。疾患が悪化すると、混乱、集中行動、双極性障害、言語障害、および長期記憶喪失の症状が示される。その結果、身体機能が失われ、死に至る。個人ごとに異なる症状があるため、疾患が人にどのような影響を及ぼすのかを予測することは困難である。アルツハイマー病が疑われる場合、通常、思考または行動能力が検査される診断が行われ、必要に応じて脳検査が行われる。しかしながら、正確な診断のためには、脳神経を調査する必要がある。アルツハイマー病が起こっているにもかかわらず、一般に疾患が完全に診断されるまでに時間がかかるため、診断なしで数年間疾患が進行することがある。疾患が起こった場合、平均余命は７年であり、罹患者の３％未満が診断後１４年存命している。
【０８０３】
アルツハイマー病は、神経変性疾患に分類される。この疾患の原因は完全には理解されていないが、アミロイド斑が正常なアルツハイマー病のタンパク質を修飾して斑の塊を形成し、内因性機能が失われると推定される。アルツハイマー病は、全体的な脳萎縮、心室拡大、神経原線維変化および神経炎性プラークなどの組織病理学的特徴を有している。
【０８０４】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、ＳＯＸ３遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子またはＬＭＢ１遺伝子の重複によって引き起こされる疾患であり得る。
【０８０５】
一例では、遺伝子重複疾患は、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合または常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）であり得る。
【０８０６】
例示的な一実施形態では、遺伝子重複疾患は、癌遺伝子の重複により生じる癌であり得る。
【０８０７】
ここで、癌遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子であり得る。
【０８０８】
一例では、遺伝子重複疾患は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【０８０９】
本明細書に開示される例示的な一実施形態は、重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作することができる発現制御組成物を含む医薬組成物を提供する。
【０８１０】
発現制御組成物の説明は上記の通りである。
【０８１１】
例示的な一実施形態では、発現制御組成物は以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含むエディタータンパク質。
【０８１２】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８１３】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８１４】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０８１５】
ガイド核酸とエディタータンパク質のそれぞれは、核酸配列の形態で、またはガイド核酸とエディタータンパク質の結合により複合体を形成することによって、１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８１６】
任意に、発現制御組成物は、挿入されることが望ましい核酸配列またはそれをコードする核酸配列を含むドナーをさらに含み得る。
【０８１７】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーのそれぞれは、核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８１８】
医薬組成物は、追加の要素をさらに含み得る。
【０８１９】
追加の要素は、対象の体内への送達に適したキャリアを含み得る。
【０８２０】
本明細書に開示される例示的な一実施形態は、遺伝子重複疾患を治療する方法を提供し、これは、遺伝子重複疾患を治療する遺伝子重複疾患を有する生物に遺伝子改変用組成物を投与することを含む。
【０８２１】
治療方法は、生体に存在する重複遺伝子の転写調節領域を操作することにより重複遺伝子の発現を制御する治療方法であり得る。そのような方法は、生体に存在する重複遺伝子の転写調節領域を操作するための発現制御組成物を直接注入することにより行われ得る。
【０８２２】
発現制御組成物の説明は上記の通りである。
【０８２３】
例示的な一実施形態では、発現制御組成物は以下のものを含み得る：
（ａ）重複遺伝子の転写調節領域に位置する標的配列を標的とすることができるガイド核酸またはそれをコードする核酸配列；および
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含むエディタータンパク質。
【０８２４】
ここで、重複遺伝子は、ＰＭＰ２２遺伝子、ＰＬＰ１遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＲＡＩ１遺伝子、ＴＢＸ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子、ＪＡＧＧＥＤ１遺伝子、ＮＳＤ１遺伝子、ＭＭＰ２３遺伝子、ＬＭＢ１遺伝子、ＳＮＣＡ遺伝子およびＡＰＰ遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８２５】
あるいは、重複遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）遺伝子、ＦＧＦＲ１遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＣＮＥ（サイクリンＥ）遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＥＲＢＢ１遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子およびＡＫＴ２遺伝子からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子であり得る。
【０８２６】
転写調節領域の説明は上記の通りである。
【０８２７】
ガイド核酸とエディタータンパク質のそれぞれは、核酸配列の形態で、またはガイド核酸とエディタータンパク質の結合により複合体を形成することによって、１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８２８】
任意に、発現制御組成物は、挿入されることが望ましい核酸配列またはそれをコードする核酸配列を含むドナーをさらに含み得る。
【０８２９】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーのそれぞれは、核酸配列の形態で１つまたは複数のベクターに存在してもよい。
【０８３０】
ここで、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【０８３１】
ここで、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つまたは複数のものであり得る。
【０８３２】
遺伝子重複疾患の説明は上記のとおりである。
【０８３３】
遺伝子重複疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、先天性髄鞘形成不全神経障害（ＣＨＮ）、ルーシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＤ）、ＭＥＣＰ２重複症候群、Ｘ連鎖下垂体機能低下症（ＸＬＨＰ）、ポトツキ−ルプスキ症候群（ＰＴＬＳ）、ヴェロカルディオフェイシャル症候群（ＶＣＦＳ）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＷＢＳ）、アラジール症候群（ＡＳ）、成長遅延症候群、早期閉鎖頭蓋縫合、常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。
【０８３４】
加えて、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、肉腫または小細胞肺癌であり得る。
【０８３５】
発現制御組成物は、遺伝子重複疾患を有する治療対象に投与され得る。
【０８３６】
治療対象には、ヒト、サルなどの霊長類、ならびにマウスおよびラットなどの齧歯類を含む哺乳類が含まれ得る。
【０８３７】
発現制御組成物は、治療対象に投与され得る。
【０８３８】
投与は、注入、輸液、インプランテーションまたはトランスプランテーションにより行われ得る。
【０８３９】
投与は、神経内、網膜下、皮下、皮内、眼内、硝子体内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ内、および腹腔内経路から選択される投与経路を介して行われ得る。
【０８４０】
発現制御組成物の用量（所定の所望の効果を得るための薬学的有効量）は、約１０４〜１０９細胞／ｋｇ（投与対象の体重）、たとえば約１０５〜１０６細胞／ｋｇ（体重）であり、この数値範囲のすべての整数から選択され得るが、本発明はそれらに限定されない。  組成物は、投与対象の年齢、健康状態および体重、同時治療の種類、ならびに可能であれば治療の頻度および所望の効果を考慮して適切に処方され得る。
【０８４１】
重複遺伝子の転写調節領域が、本明細書に開示されるいくつかの例示的な実施形態による方法および組成物によって人為的に操作される場合、重複遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現が制御され得るため、異常に発現される重複遺伝子の発現を正常に制御する効果を得ることができる。
【実施例】
【０８４２】
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【０８４３】
これらの実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために提供されているに過ぎず、本発明の範囲が以下の実施例に限定されないことは当業者には明らかであろう。
実験方法
１．ｇＲＮＡの設計
【０８４４】
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して、ヒトＰＭＰ２２遺伝子、ヒトＰＬＰ１遺伝子、およびマウスＰＬＰ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域をスクリーニングした。ＰＭＰ２２遺伝子とＰＬＰ１遺伝子の標的領域は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類によって異なり得る。プロモーター領域（ＴＡＴＡボックス）およびエンハンサー領域（たとえば、ＥＧＲ２、ＳＯＸ１０またはＴＥＡＤ１結合領域）の標的配列；またはＳｐＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子の遠位エンハンサー領域ＢもしくはＣを、上記の表１にまとめており、ＣｊＣａｓ９のヒトＰＭＰ２２遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス）およびエンハンサー領域（たとえばＥＧＲ２またはＳＯＸ１０結合領域）の標的配列を表２にまとめている。加えて、ＳｐＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列を上記の表３にまとめており、ＣｊＣａｓ９のヒトＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列を上記の表４にまとめている。ＳｐＣａｓ９のマウスＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列を上記の表５にまとめており、ＣｊＣａｓ９のマウスＰＬＰ１遺伝子のプロモーター領域（ＴＡＴＡボックス領域）およびエンハンサー領域（たとえばｗｍＮ１エンハンサー）の標的配列は、上記の表６にまとめている。
【０８４５】
すべてのｇＲＮＡは、キメラ一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で生成した。標的配列を除くＣｊおよびＳｐ特異的なｓｇＲＮＡの骨格配列は、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８）および５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９）である。
２．ｇＲＮＡの構築と合成
【０８４６】
ｓｇＲＮＡをＡＡＶベクターにパッケージングするか、ＲＮＡで合成した。ウイルスベクターにｓｇＲＮＡを挿入するために、ｓｇＲＮＡの２０〜２２塩基配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計およびアニーリングし、ＢｓｍＢＩサイトを使用してｐＲＧＥＮ−ＣＡＳ９（自社開発）ベクターにライゲーションした。Ｃａｓ９および５'末端に可変標的配列を含むｓｇＲＮＡを、それぞれＣＭＶおよびＵ６プロモーターを介して発現させた。
【０８４７】
さらに、ＲＮＰによる送達システムでは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｔａｑを介した重合によって生成される２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりテンプレートを生成した後、ｓｇＲＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって転写した。転写したｓｇＲＮＡを精製し、分光法を使用して定量化した。
３．Ｃａｓ９タンパク質の精製
【０８４８】
ＮＬＳおよびＨＡエピトープを含むコドン最適化Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列をｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングし、最適な培養条件下でＩＰＴＧを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。発現させたＣａｓ９タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズを使用して精製し、適切な緩衝液で透析した。Ｃａｓ９の活性は、周知の有効なｓｇＲＮＡを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断試験で確認した。
４．細胞培養
【０８４９】
メーカーのマニュアルに従って、ヒトシュワン様細胞株（ＡＴＣＣ）およびヒト初代シュワン細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を培養した。ヒトシュワン様細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＷｅｌＧｅｎｅ）および１０％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を添加した高濃度のグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＷｅｌＧｅｎｅ）で培養した。
【０８５０】
ヒト初代シュワン細胞は、ベンダーが提供するシュワン細胞培養液（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）で維持した。分化のために、１％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）、髄鞘形成（ミエリン形成）シグナル用のＮｒｇ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）１００ｎｇ／ｍＬ、およびｄｂｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μＭを添加した低濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ（ＷｅｌＧｅｎｅ）で細胞を７日間培養した。
５．形質導入（トランスフェクション）
【０８５１】
形質導入（トランスフェクション）のために、４μｇのＣａｓ９タンパク質（ＴｏｏｌＧｅｎ）と１μｇのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体を室温で１５分間インキュベートした。その後、ＲＮＰ複合体を、１０μｌのエレクトロポレーションチップとＮｅｏｎネオンエレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してエレクトロポレーションし、２×１０５個の細胞に送達した。標的化ディープシーケンシングでは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を形質導入の７２時間後に形質導入細胞から収集した。
６．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
【０８５２】
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってヒト初代シュワン細胞からｍＲＮＡを抽出した。その後、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したメーカーのプロトコルに従って、１００ｎｇのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ発現マスターミックスでｑＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃｔ値を使用してＰＭＰ２２発現レベルを計算し、ＧＡＰＤＨを内因性対照として使用した。本研究で使用したＴａｑｍａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を下記の表７にまとめている。
［表７］
【表１２】
2020536501.tif 000066
７．標的化ディープシーケンシング
【０８５３】
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼｔａｑ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、形質導入細胞から抽出されたｇＤＮＡからＰＣＲによってオンターゲットサイトを増幅した。その後、ＰＣＲ増幅産物としてＭｉ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ペアエンドディープシーケンシングを行った。オンラインのＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して、ディープシーケンシングの結果を分析した。Ｃａｓ９によるインデルのその結果、ＰＡＭ配列の３ｂｐ上流で変異が起こったかどうかを確認した。本研究で使用したプライマーは、下記の表８にまとめている。
［表８］
【表１３】
2020536501.tif 000067
【表１４】
2020536501.tif 000068
８．ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲットサイトの設計
【０８５４】
オフターゲットの可能性があるサイトは、オンラインツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計した。最大３ｂｐのミスマッチをオフターゲットサイトとみなした。
９．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ
【０８５５】
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ベンダーのプロトコルに従ってＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを精製した。あらかじめインキュベートしたＣａｓ９タンパク質（１００ｎＭ）およびｓｇＲＮＡ（３００ｎＭ）を、１ｍＬの反応溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）でゲノムＤＮＡ（１０μｇ）と３７℃にて８時間混合した。切断されたゲノムＤＮＡをＲＮａｓｅ  Ａ（５０μｇ／ｍＬ）で処理し、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して再度精製した。１μｇの切断されたゲノムＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓシステムを使用して断片に断片化し、ライブラリーを作成するためのアダプターをＤＮＡ断片に付加した。その後、ライブラリーは、ＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｔｅｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、３０〜４０×（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）の配列深度で全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）にかけた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断スコアを、ゲノムにおける切断された各塩基配列の位置でのＤＮＡ切断スコアリングシステムによって計算した。
１０．マウスと神経内注入
【０８５６】
本研究で使用したＣ２２マウス系統（Ｂ６；ＣＢＡＣａ−Ｔｇ（ＰＭＰ２２）Ｃ２２Ｃｌｈ／Ｈ）をＭＲＣ  Ｈａｒｗｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。Ｃ２２マウス（オス４匹、メス７匹）をＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した。神経内注入は、以前の研究と同じ方法で行った（Ｄａｉｓｕｋｅ  Ｉｎｏ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．，（２０１６）１１５）。６日齢のマウスに麻酔をかけ、手術によりマウスの坐骨神経を露出させた。神経損傷を最小限に抑えるために、坐骨切痕の終わりに、マイクロインジェクターに取り付けられている引っ張られたガラス製マイクロピペットを直ちに使用して、神経内注入を直ちに行った。マウスあたり１１μｇのＣａｓ９タンパク質と２．７５μｇのｓｇＲＮＡのＲＮＰ複合体を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにマウスに注入した。本研究で使用したすべての動物の管理、使用および処理は、国際実験動物ケア評価認証協会に従って、Ｓａｍｓｕｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＭＣ−２０１７０２０６００１）が立案したガイドラインのもとで行った。
１１．ロータロッド実験（ロータロッド試験）
【０８５７】
ロータロッド装置（Ｂ．Ｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌａｂ  ＩＮＣ．，Ｋｏｒｅａ）を使用して運動協調を評価した。この実験は、マウスのバランスと運動協調を評価するために行った。実験の前に、マウスは３日間のトレーニング期間を経た。実験では、ロータロッド実験用に水平回転ロッド（２１ｒｐｍ）を使用した。マウスの回転ロッドの保持時間を測定し、マウスを最大３００秒間ロッドにとどまらせた。
１２．電気生理学的試験
【０８５８】
電気生理学的状態を評価するために、以前の研究と同じ方法で神経伝導試験（ＮＣＳ）を行った。（Ｊｉｎｈｏ  Ｌｅｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．，（２０１５）２２，４３）。要約すると、マウスを炭酸ガスで麻酔し、実験中に１．５％イソフルランを供給するノーズコーンを使用して麻酔を維持した。毛は端から後足まで完全に除去した。ＮＣＳは、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＶｉｋｉｎｇＱｕｅｓｔ装置（Ｎａｔｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して行った。坐骨神経の運動神経伝導試験では、遠位部と近位部からの反応をそれぞれ、腱に参照電極を取り付けた腓腹筋に活動記録針電極を配置し、記録電極に近い位置に、刺激負電極を、股関節の内側の中心および眼窩後部の大腿部の中心線に向かって６ｍｍの距離で配置することにより測定した。遠位潜時（ＤＬ）、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）、および複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅を測定した。最大過刺激時にＣＭＡＰを測定した。
１３．神経の組織構造と画像
【０８５９】
マウスの坐骨神経を生検し、影響を受けたサンプルの病理学的検査を顕微鏡による分析により行った。２％グルタルアルデヒドを含む２５ｍＭカコジル酸バッファーを使用して、サンプルをそれぞれ固定した。半薄切片をトルイジンブルーで染色した。１％ＯｓＯ４で１時間インキュベーションした後、サンプルをエタノールで脱水し、プロピレンオキシドを通過させ、エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ  ８１２，Ｏｋｅｎ，Ｎａｇａｎｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋した。ライカウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、細胞を特定の厚さ（１μｍ）にスライスし、トルイジンブルーで３０〜４５秒間染色した。ｇ比（軸索直径／線維直径）は、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎ  ２プログラム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してミエリンの内径と外径を測定することにより計算した。
１４．統計分析
【０８６０】
ｍＲＮＡ発現レベルに関連するデータの統計的有意性は、ポストホックＴｕｋｅｙの多重比較を使用した一元配置分散分析によって評価した。他の種類の提示データは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｃｓｃｉｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｔｅｓｔｓ／ｍａｎｎｗｈｉｔｎｅｙ／Ｄｅｆａｕｌｔ２．ａｓｐｘ）を使用して計算した。本研究で作成したデータとグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。有意水準は０．０５に設定した。
１５．Ｐｌｐ１遺伝子ターゲティングのためのｓｇＲＮＡスクリーニング
【０８６１】
マウス線維芽細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５８）、筋芽細胞、すなわちＣ２Ｃ１２系統（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７７２）およびオリゴデンドロサイト細胞、Ｎ２０．１（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＬＵ１０８−Ｐ）をメーカーのマニュアルに従って培養した。細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＷｅｌＧｅｎｅ）および１０％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を添加した高濃度グルコース含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物のトランスフェクションのために、４μｇのＣａｓ９タンパク質と１μｇのｓｇＲＮＡまたはＣｊＣａｓ９プラスミドからなるＲＮＰ複合体（ＳｐＣａｓ９）（図１８）を調製した。その後、ＲＮＰ複合体またはＣｊＣａｓ９プラスミドを、１０μｌのエレクトロポレーションチップとＮｅｏｎエレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したエレクトロポレーションにより２×１０５個の細胞に送達した。トランスフェクションの７２時間後の標的化ディープシーケンシングでは、トランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を収集した。
１６．Ｐｌｐ１遺伝子のダウンレギュレーションアッセイ
【０８６２】
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってＮ２０．１細胞株からｍＲＮＡを抽出した。その後、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１μｇのｍＲＮＡを逆転写した。メーカーのプロトコルに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１００ｎｇのＴａｑｍａｎ遺伝子発現マスターミックスでリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＣＴ値を使用してＰｌｐ１発現レベルを計算し、Ｇａｐｄｈを内因性対照として使用した。この研究で使用したＴａｑｍａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、下記の表９にまとめている。
［表９］
【表１５】
2020536501.tif 000069
１７．  ＰＬＰ１遺伝子ターゲティングのためのｓｇＲＮＡスクリーニング
【０８６３】
ヒトリンパ芽球Ｊｕｒｋａｔ細胞株（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−１５２）およびヒト上皮２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−３２１６）をメーカーのマニュアルに従って培養した。細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＷｅｌＧｅｎｅ）および１０％ウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を添加した高濃度グルコース含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物のトランスフェクションのために、４μｇのＣａｓ９タンパク質と１μｇのｓｇＲＮＡまたはＣｊＣａｓ９プラスミドからなるＲＮＰ複合体（ＳｐＣａｓ９）（図１８）を調製した。その後、ＲＮＰ複合体またはＣｊＣａｓ９プラスミドを、１０μｌのエレクトロポレーションチップとＮｅｏｎエレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したエレクトロポレーションにより２×１０５個の細胞に送達した。トランスフェクションの７２時間後の標的化ディープシーケンシングでは、トランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を収集した。
実施例１．ＰＭＰ２２遺伝子のｓｇＲＮＡスクリーニング
【０８６４】
ヒトＰＭＰ２２の発現を正常範囲に減少させることができる治療的に有効なｓｇＲＮＡ配列をスクリーニングするために、ＰＭＰ遺伝子のプロモーター（ＴＡＴＡボックス）およびイントロンエンハンサー結合部位を標的とするように設計されたさまざまなｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９でヒト細胞株を形質導入した。要するに、ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞をＳｐＣａｓ９スクリーニングに使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣｊＣａｓ９に使用した。ｇＤＮＡを細胞から収集し、標的化ディープシーケンシングにかけた。ｓｇＲＮＡ配列によって誘導される変異のさまざまなパターンは、ＮＨＥＪを介したインデルによって同定された。いくつかのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡは、２つの調節部位にインデルを強く誘導した（図１ａおよび図１ｂ）。インデルの３０〜４０％が特異的ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡで誘導されることが確認された（図２ａおよび図２ｂ）。
実施例２．シュワン様細胞の遺伝子操作
【０８６５】
ｓｇＲＮＡによって引き起こされた有効なインデル変異がヒト細胞で同定されたが、その効果がシュワン細胞でも可能かどうかは不確定である。したがって、シュワン細胞におけるＰＭＰ２２発現阻害と遺伝子操作の効果を調査するために、シュワン様細胞であるｓＮＦ２．０細胞を使用してＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ効果を確認した。Ｊｕｒｋａｔ細胞で同定された有効なＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡをｓＮＦ０２．０細胞で繰り返し試験した。形質導入後、同じ高インデル頻度が同じｓｇＲＮＡによって得られたことが、ディープシーケンシング解析によって確認された。プロモーター（ＴＡＴＡボックス）部位およびエンハンサー結合部位を標的とする単一ｓｇＲＮＡの形質導入は、それぞれ３１％および５９％のインデルを誘導した（図３）。興味深いことに、ミエリン遺伝子の主要な制御因子（たとえばＥＧＲまたはＳＯＸ１０結合部位）または重要なＴＡＴＡボックスを含む４０〜５０ｂｐの小さな欠失が、デュアルｓｇＲＮＡで処理された細胞の非常に多くの細胞で見られた（図５）。
実施例３．遺伝子操作によるＰＭＰ２２の発現制御
【０８６６】
有効なｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の発現の変化を評価するために、シュワン様細胞を分化させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＰＭＰ２２を標的とするｓｇＲＮＡのほとんどがＰＭＰ２２の発現を有効に阻害した（図６）。単一ｓｇＲＮＡを使用した場合、ＰＭＰ２２の発現は、Ｃａｓ９のみで処理した対照と比較して約３０％減少し、デュアルｓｇＲＮＡを使用した場合、ＰＭＰ２２の発現は、Ｃａｓ９のみ処理した対照と比較して約５０％減少した。
実施例４．シュワン細胞の遺伝子操作
【０８６７】
ＰＭＰ２２の発現抑制と遺伝子操作効果がシュワン様細胞であらかじめ確認された後、前の結果がヒト初代シュワン細胞で同様の効果を示すかどうかが確認された。標的部位に応じたインデル頻度は、ヒト初代シュワン細胞のヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを使用して観察された。その結果、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー、およびＰＭＰ２２遺伝子のコード配列を標的とするｓｇＲＮＡのほとんどの標的部位でインデル頻度が高いことが確認された（図７ａ）。さらに、ＴＡＴＡボックスとエンハンサーをそれぞれ標的とするデュアルｓｇＲＮＡを使用した場合でも、高いインデル頻度が示された。標的部位でインデルが生じることが、遠位エンハンサー部位ＢおよびＣをコードする配列を標的とするｓｇＲＮＡを追加で使用して確認され（図７ｃ）、この場合、ＡＰＯＣ３を標的とするｓｇＲＮＡを対照として使用した。
【０８６８】
加えて、各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡがＰＭＰ２２遺伝子の発現の減少を引き起こすかどうかを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＭＰ２２はシュワン細胞の分化の最終段階で転写されるため、ヒト初代シュワン細胞は、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１（Ｎｒｇ１）およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を含む周知の分化シグナル因子で７日間処理した。その結果、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理しなかった細胞と比較して、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理した細胞ではＰＭＰ２２の発現が９倍増加することが確認された。対照的に、細胞を各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡで処理した場合、ＰＭＰ２２の発現が４〜６倍誘導されることが確認された。これは、各標的部位でのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の各標的部位修飾に起因したＰＭＰ２２の発現阻害によるものであると判断される（図７ｂ）。
実施例５．ヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＰＭＰ２２の有効かつ特異的な発現の減少の効果
【０８６９】
実験を、あらかじめスクリーニングされたＴＡＴＡボックス部位を標的とするｓｇＲＮＡｓの中で高いインデル効率を示し、ＴＡＴＡボックスを標的とし得るｓｇＲＮＡ＿ＴＡＴＡ＿Ｓｐ＃１（以下、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡと記載）を選択することにより、ヒト初代シュワン細胞で行った。インデルを、ヒト初代シュワン細胞にｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体を形質導入することにより誘導し（図８ｂの（ｂ））、標的化ディープシーケンシング解析を介して、総インデルの８９．５４±１．３９％がヒトＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックス部位で生成されたことが確認された（図８ｂの（ｃ））。
【０８７０】
加えて、ＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックスで形成された変異がＰＭＰ２２遺伝子の発現の減少を引き起こしたかどうかを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＭＰ２２はシュワン細胞の分化の最終段階で転写されるため、ヒト初代シュワン細胞は、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１（Ｎｒｇ１）およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を含む周知の分化シグナル因子で７日間処理した。その結果、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理しなかった細胞と比較して、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理した細胞ではＰＭＰ２２の発現が９倍増加することが確認された。対照的に、細胞をＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰと一緒に処理した場合、ＰＭＰ２２の発現が６倍誘導されることが確認された。これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２のＴＡＴＡ修飾によるＰＭＰ２２の発現阻害によるものであると判断される（図８ｂ）。分化シグナル因子とＡＡＶＳ１標的ＲＮＰの両方で処理された対照では、ＰＭＰ２２遺伝子の発現に違いは確認され得なかった。
【０８７１】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの特異性を確認するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのオフターゲット分析を行った。標的化ディープシーケンシングにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により確認されたオフターゲット部位で、シーケンシングエラー率（平均０．１％）を超えるインデル変異は確認されなかった（図９ａ）。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのオフターゲット分析は偏りのあるアプローチであり得るため、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（偏りのないシーケンシングベースのオフターゲット分析全体）も行った。その結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰにより切断された９つのオフターゲット部位を確認することができた（図１０ａ、図１０ｂ）。しかしながら、標的化ディープシーケンシングによる再分析の結果、オフターゲットサイトで異常なインデル変異は見られなかった（図１０ｃ）。
【０８７２】
これらの結果は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックスの有効かつ特異的な修飾が、ヒト初代シュワン細胞におけるＰＭＰ２２の転写レベルを制御し得ることを示している。
実施例６．ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の発現阻害による疾患表現型の軽減効果
【０８７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるＰＭＰ２２転写制御を試験するために、リポソームに囲まれたＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰをＣ２２マウスの坐骨神経に直接注入した（図１１）。この場合、Ｒｏｓａ２６（ｍＲｏｓａ２６）を標的とするＲＮＰ複合体を対照として使用した。ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰまたはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰを６日齢（ｐ６）マウスの左坐骨神経（同側）に神経内注入して送達し、右坐骨神経を内部対照（対側）として使用した。注入の４週間後、坐骨神経からゲノムＤＮＡを収集することにより、標的化ディープシーケンシングを介してＲＮＰ複合体の神経内送達効率を確認した。その結果、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰおよびＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰでそれぞれ処理されたすべての坐骨神経は、約１１％のインデル効率を示した（図１２のａ）。さらに、９８．４８±０．１５％のＴＡＴＡボックス変異が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果と一致する全体のインデルシーケンシング読み取りにおいて確認された（図１２のｂ）。
【０８７４】
加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＡＴＡボックス変異によるＰＭＰ２２の発現阻害を確認するために、坐骨神経全体から抽出したｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析をＲＮＰ処理した坐骨神経に対して行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果と同様に、ＰＭＰ２２遺伝子の発現が対照と比較して３８％減少したことが確認された（図１２のｃ）。
【０８７５】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって坐骨神経にオフターゲット変異が起こったかどうかを確認するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのオフターゲット分析を行った。その結果、マウスゲノムから３ｂｐ以上のミスマッチを含む８つのオフターゲットが確認され（図１３ａ）、標的化ディープシーケンシングを行った結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した神経（同側）からシーケンシングエラー率を超えるインデル変異は確認されなかった（図１３ｂ）。
【０８７６】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＡによって引き起こされるＰＭＰ２２の転写の減少が脱髄を防ぐことができるかどうかを試験するために、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰまたはｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理したＣ２２マウスの坐骨神経を得て、その半薄断面をトルイジンブルーで染色した（ミエリン染色）。さらに、ｇ比を測定するために、軸索直径および線維（ミエリンを含む軸索）直径を測定した。その結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した実験群では、より厚いミエリンシートが形成されたことが確認され得た（図１４ａ、図１４ｂ）。加えて、実験群をＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した場合、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理した対照と比較して、大きな直径を有する軸索の数が増加することがわかった（図１４ａ、図１４ｂ）。ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理した実験群（１６．５％）で直径６μｍ以上の大きな有髄線維の数を測定した結果が、対照群よりもはっきりとした治療効果を示している（２．６％、ｐ＜０．０１）。
【０８７７】
ミエリン形成の組織学的分析の大幅な改善を考慮して、２つの群の電気生理学的プロファイルを調査した。その結果、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理された対照（図１５のａ、図１５のｂ）と比較して、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された実験群の坐骨神経では、遠位潜時（ＤＬ）が減少し、運動神経伝導速度（ＮＣＶ）が増加したことが確認され、これらの結果は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経におけるミエリンの厚さと軸索直径の増加に対応する。さらに、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経において複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅がかなり増加したことが確認され（図１５のｃ）、これは前の結果に対応する。
【０８７８】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによる組織学的および電気生理学的に改善された効果を考慮して、マウスの運動行動をロータロッド実験で分析した。その結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウス（１１〜１６週齢）は、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理されたマウス（１１〜１６週齢）よりもロッド上に長く留まることが確認された（図１６ａ）。さらに、ＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスは、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理されたマウスと比較して筋肉が増加したことが確認された（図１６ｂ）。
【０８７９】
これらの結果は、ＣＭＴ１ＡなどのＰＭＰ２２の過剰発現による脱髄を軽減または治療するためのＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの治療効果を示している。
【０８８０】
したがって、前述の結果は、ＰＭＰ２２のプロモーター部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＰＭＰ２２の発現阻害効果を示している。さらに、これらの結果は、Ｃ２２マウスの坐骨神経へのＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの直接の非ウイルス送達が、ＰＭＰ２２の過剰発現によって引き起こされる脱髄に関連する臨床的および神経病理学的表現型を改善し得ることを示している。したがって、ＰＭＰ２２の転写調節領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した修飾は、ＣＭＴ１Ａおよび脱髄性神経障害を示す他の疾患の治療に優れた戦略であると考えられる。
実施例７．ＰＬＰ遺伝子発現調節効果
【０８８１】
ＰＬＰ１遺伝子が複製されると、ＰＬＰ１遺伝子が過剰発現し、ＰＭＤ疾患の主な原因になる。したがって、ＰＭＤ疾患の治療に対してＰＬＰ１転写を制御するために、ＰＬＰ遺伝子の転写調節領域をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して人為的に改変し、その効果を確認した。
【０８８２】
このために、ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９スクリーニングを、マウスＰｌｐ１のプロモーター配列およびエンハンサー（ｗＭＮ１）のＴＡＴＡボックスに対して行い、最も高い活性を有するｓｇＲＮＡを選択し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲによりＰｌｐ１のダウンレギュレーションを確認した（図１７）。ここで、Ｐｌｐ１のエンハンサーは、ＡＳＥ（Ｈａｍｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｉｇｈｔ，２０１７）またはｗＭＮ１（Ｈａｍｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８；Ｔｕａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）領域であり得る。
【０８８３】
ｓｇＲＮＡスクリーニングの結果に基づいて、高いインデル率を有するＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９の各ｓｇＲＮＡの選択（図１９〜２２および表１０）を、Ｐｌｐ１のＴＡＴＡボックスおよびｗＭＮ１エンハンサー領域が、オリゴデンドロサイト、すなわち、Ｐｌｐ１遺伝子を発現するＮ２０．１細胞株を使用して標的にされた場合に行い、Ｐｌｐ１遺伝子のダウンレギュレーションにつながり得るものに関する研究を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。
［表１０］
【表１６】
2020536501.tif 000070
【０８８４】
スクリーニングされたｓｇＲＮＡリスト（ｍＰｌｐ１−ＴＡＴＡ、ｍＰｌｐ１−ｗｍＮ１  ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９リードｓｇＲＮＡリスト）
【０８８５】
その結果、ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９を使用したＰｌｐ１のＴＡＴＡボックスまたはｗｍＮ１エンハンサー領域のターゲティングが、Ｐｌｐ１の有意なダウンレギュレーションをもたらすことが確認された（図２３）。加えて、ヒトＰＬＰ１遺伝子のｗｍＮ１エンハンサー領域のＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９スクリーニングを行って、インデル率（％）を確認した（図２４および２５）。
【０８８６】
したがって、ＰＬＰ１の転写調節領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した人為的な修飾は、ＰＭＤ治療の優れた戦略であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０８８７】
遺伝子重複疾患の治療薬は、重複遺伝子の発現を制御するための発現制御組成物を使用して得ることができる。たとえば、重複遺伝子の転写調節領域を標的とすることができるガイド核酸を含む発現制御組成物は、重複遺伝子の転写調節領域を人為的に操作および／または修飾することにより重複遺伝子の発現を制御することにより、遺伝子重複に起因する疾患の治療薬として使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０８８８】
実施例で使用される重複遺伝子およびプライマー配列の転写調節領域の標的配列
【国際調査報告】
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