(57)【要約】  対象への移植用ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞画分を増殖させる方法、特に、移植可能ＮＫ細胞画分を提供する方法とその使用のためのプロトコルが提供され、これらは癌や他の疾患を治療するための細胞の移植及び注入における用途に利用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ細胞画分を必要とする対象への移植用の、移植可能なＮＫ細胞の画分を調製する方法であって、
（ａ）前記対象に対してＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合のＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を取得する工程と、
（ｂ）細胞増殖を可能にする条件の下で前記ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分をエクスビボで培養する工程であって、前記条件が、栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドの供給を含む工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の８〜１０日後に前記ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分に新しい栄養素、血清、ＩＬ−１５及びニコチンアミドを補充して増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を得る工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の１４〜１６日後に前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を回収する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を洗浄及び濃縮する工程と
を含み、前記対象への移植のための、移植可能なＮＫ細胞の画分を得る、方法。
【請求項２】
前記ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分はヒトＮＫ細胞画分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分はアフェレーシスで入手したものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エクスビボ培養では支持細胞層がない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血清はヒト血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞増殖を可能にする前記条件は、１０％ヒト血清を供給することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＬ−１５は、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ニコチンアミドは、５．０ｍＭのニコチンアミドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記栄養素は、最小必須細胞培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞画分は、少なくとも下記の条件を満たすＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合のドナー由来である、請求項１に記載の方法。
（ａ）Ａ及びＢ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラス１タイピングにおいて４種のクラス１対立遺伝子の内の少なくとも２種がＨＬＡ適合しており、且つ
（ｂ）（ＭＦＩ≦１０００）のレシピエントのドナー特異的抗ＨＬＡ抗体が存在しない。
【請求項１１】
工程（ａ）の前記ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞を少なくとも４０〜９０％含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｄ）の前記回収は、工程（ｂ）の１４日後に前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第１の部分を回収する工程と、工程（ｂ）の１６日後に前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第２の部分を回収することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の部分は前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の約５０％を含み、前記第２の部分は前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の残りを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｅ）において生成される、前記洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、以下のパラメータによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【請求項１５】
工程（ｂ）の前記培養をフラスコ内にて行い、前記フラスコ１個当たり２００〜３００×１０６個の細胞とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に従って調製した、移植可能ＮＫ細胞画分。
【請求項１７】
以下のパラメータによって特徴付けられる、請求項１６に記載の移植可能ＮＫ細胞画分。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【請求項１８】
フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）培養バッグで提供される、請求項１６に記載の移植可能ＮＫ細胞画分。
【請求項１９】
以下のパラメータによって特徴付けられる、移植可能ヒトＮＫ細胞画分。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【請求項２０】
血液疾患の治療を必要とするヒト対象において血液疾患を治療する方法であって、
（ａ）抗癌モノクローナル抗体を前記対象に投与する工程と、
（ｂ）少なくとも１種の免疫抑制剤を前記対象に投与する工程と、
（ｃ）栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを用いたエクスビボ培養によって増殖させた、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合のＮＫ細胞画分をそれを必要とする前記対象に移植する工程と、
（ｄ）ＩＬ−２を前記対象に投与して、前記対象の前記血液疾患を治療する工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記免疫抑制剤は、化学療法免疫抑制剤及び／又は放射線である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記血液疾患は、血液系腫瘍である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液疾患は、多発性骨髄腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記多発性骨髄腫は、下記の少なくとも１種によって特徴付けられる、請求項２３に記載の方法。
（ａ）最初の自家幹細胞移植の２〜１８ヶ月後に再発した疾患、
（ｂ）同種幹細胞移植の少なくとも４ヶ月後に再発し、活動性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の証拠のない疾患、
（ｃ）プロテアソーム阻害剤と免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む少なくとも２種類の治療後の再発性／難治性疾患、
（ｄ）血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＤ骨髄腫タンパク質（Ｍタンパク質）が０．５ｇ／ｄＬ以上、及び
（ｅ）尿中Ｍタンパク質が２００ｍｇ／２４回採取以上。
【請求項２５】
前記血液疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＨＬは、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞ＮＨＬである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＨＬは下記の少なくとも１種によって特徴付けられる、請求項２５に記載の方法。
（ａ）従来の治療に失敗した再発性／難治性疾患、
（ｂ）自家幹細胞移植の少なくとも６０日後に再発した疾患、
（ｃ）同種幹細胞移植の少なくとも４ヶ月後に再発し、活動性移植片対宿主病の証拠がない疾患、及び
（ｄ）直径１．５ｃｍ以上の測定可能な疾患。
【請求項２８】
前記血液系腫瘍は多発性骨髄腫であり、前記抗癌モノクローナル抗体はエロツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記血液系腫瘍はＮＨＬであり、前記抗癌モノクローナル抗体はリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）を３回行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）は、前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の第１の用量を投与し、その２日後に前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の第２の用量を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）は３回、即ち、前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の前記第１の用量の投与の９〜１１日前、３日前、及び１１日後に行う、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＮＫ細胞画分は、１×１０７個／ｋｇ〜５×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の用量と前記第２の用量を合わせると、計２×１０７個／ｋｇ〜２×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）前記ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量は、各々、１×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は、２×１０７個／ｋｇである、又は
（ｂ）前記ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量は、各々、５×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は、１×１０８個／ｋｇである、又は
（ｃ）前記ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量は、各々、１×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は、２×１０８個／ｋｇである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）前記ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量は、各々、１×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は、２×１０７個／ｋｇである、又は
（ｂ）前記ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量は、各々、５×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は、１×１０８個／ｋｇである、又は
（ｃ）前記ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量は各々、１×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は、２×１０８個／ｋｇである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分の前記対象への投与は、前記移植用画分の供給後１時間以内、及び前記画分の最終生成物放出後１０時間以内に行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の前記対象への投与は、フィルター又はポンプを使用せずに、注入によって１５分以上６０分以内で行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の免疫抑制剤は、シクロホスファミド及び／又はフルダラビンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
（ｉ）前記少なくとも１種の免疫抑制剤は、シクロホスファミド（４０ｍｇ／ｋｇ）とフルダラビン（２５ｍｇ／ｍ２）との両方を含み、
（ｉｉ）前記シクロホスファミドは、前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の５日前に投与し、前記フルダラビンは、前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞の輸注の５日前、４日前及び３日前の各々で投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記工程（ｄ）は、前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞の輸注後に６×１０６単位のＩＬ−２を投与することを含み、前記投与を
（ｉ）前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注当日、及び
（ｉｉ）前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の２日後、及び
（ｉｉｉ）前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の４日後に行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（ｃ）は、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従って調製した移植可能ＮＫ細胞画分を移植することを含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を増殖する方法、増殖ＮＫ細胞集団を必要とする対象への移植用の増殖ＮＫ細胞集団の選択、及び血液系腫瘍の治療のために臨床環境での移植用に適切なエクスビボ増殖ＮＫ細胞画分の治療的使用に関する。本発明は、増殖ＮＫ細胞画分を含むキットも想定している。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（以下「ＮＫ」とも略する）細胞は、免疫反応に関与するリンパ系細胞である。このような細胞は様々な機能を有し、特に腫瘍細胞、発癌性形質転換を起こしている細胞、及び生体内の他の異常細胞を死滅させる、自然免疫監視機構の重要な構成要素である。ＮＫ細胞を用いた養子免疫療法の臨床経験から、ＮＫ細胞集団のインビボでの機能性（死滅能力、輸送、局在化、持続性及び増殖）を維持し、更にそれを強化しながら、ＮＫ細胞集団を効果的且つ効率的に増殖させるより良い方法の必要性が重視されている。
【０００３】
Ｔ細胞とは異なり、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、癌細胞を死滅させるのに特定の腫瘍抗原の存在を必要とはせず、ＮＫ細胞による標的の認識は、活性化シグナルと阻害シグナルのバランスによって調節される。腫瘍特異的抗原の認識を必要とせずに腫瘍細胞を死滅させるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のこの能力によって、Ｔ細胞に勝る利点が得られ、これは免疫療法のエフェクターとしての研究において興味深いものである。ＮＫ細胞は、近年、様々な難治性の血液系腫瘍や転移性固形腫瘍の患者における免疫療法の有望なツールとしてかなりの注目を集めている。しかし、抗原認識とは無関係にＮＫ細胞が癌細胞を死滅させる能力にも関わらず、ＮＫ細胞ベースの免疫療法の完全な治療可能性はまだ実現されていない。これまでの実験プロトコルの結果は主に部分寛解に限定されており、限界的な有効性は、注入されたＮＫ細胞の数が比較的少ないこと、ＮＫ細胞のインビボ持続性が短いこと、及び／又はＮＫ細胞のインビボでの機能性が低いことに主に起因している。従って、ＮＫ細胞集団を効果的に増殖させ、インビボで養子注入されたＮＫ細胞の機能性を高めるエクスビボＮＫ培養法の開発は、ＮＫ細胞免疫療法の臨床適用性を改善する上で欠かせない。
【０００４】
ＮＫ細胞のインビトロ増殖及び活性化に関する幾つかの方法が検討されている。このような方法としては、ＰＢＭＣから濃縮したＮＫ細胞をサイトカインと共に一晩及び長期培養すること、又はＮＫ細胞をＰＢＭＣ等の支持細胞、遺伝子改変Ｋ５６２細胞（Malmberg et al.の米国特許公開第２０１５０２２４１４３号を参照）、及びエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（例えば、Lee, et alの米国特許公開第２０１５０１５２３８７号を参照）と共培養することが挙げられる。ＮＫ細胞増殖のための他の方法が報告されている。Frias et al.（Exp Hematol 2008; 36: 61-68）は、臍帯血から選択したＮＫ前駆細胞（ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＣＤ５６−）を無血清培地中、間質細胞層で成長させ、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＦＬ及びＩＬ−２でＮＫ分化を誘導し、細胞傷害性培養ＮＫ細胞の数を増加させた。Harada et al.（Exp Hematol. 2004;32:614-21）は、ウィルムス腫瘍細胞株由来の細胞上でＮＫ細胞を成長させた。Waldmann et al.（米国特許公開第２００７０１６０５７８号）は、望ましくないサイトカイン産生を抑制するために、ＩＬ−１５／Ｒリガンドアクチベーターの複合体を使用して培養中の全血、骨髄又は脾臓細胞からのＮＫ細胞とＣＤ８−Ｔ細胞の増殖の強化について記載している。Campana et al.（米国特許公開第２００９００１１４９８号）は、ＩＬ−１５と４−１ＢＢを発現し、ＭＨＣ−Ｉ又はＩＩの発現が弱いか又は発現しない白血病細胞の存在下での移植用のＮＫ細胞のエクスビボ培養及び活性化について記載している。Childs et al.（米国特許公開第２００９０１０４１７０号）は、ＩＬ−２の存在下での照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞との共培養によるＮＫ細胞のエクスビボ増殖及び活性化について記載している。Tsai（米国特許公開第２００７００４８２９０号）は、他のアプローチを用い、研究や潜在的治療用途のために、照射３Ｔ３由来のＯＰ−９Ｓ細胞を用いた不死化ＮＫ前駆細胞のエクスビボ培養によって造血幹細胞から連続ＮＫ細胞株を得た（上述の参考文献の全てを本明細書の一部を構成するものとして援用する）。
【０００５】
増殖したＮＫ細胞集団の治療的使用は、４０を超える完了、アクティブ、補充又は認可臨床試験（臨床試験（ｄｏｔ）ｇｏｖのウェブサイトを参照）の対象となっており、血液系腫瘍や固形腫瘍等の様々な癌性病態の治療に向け、様々なプロトコルによって増殖されたＮＫ細胞の適用が検討されている。増殖ＮＫ細胞集団は通常、細胞障害性を維持することが分かっている。しかし、これまでの結果から、安全なだけでなく、様々な形態の悪性腫瘍を標的とする上で十分に有効なＮＫ増殖及び治療プロトコルを設計するのが困難なことが強調されている。
【０００６】
本発明者らは、サイトカイン及びＮＡＤ前駆体ニコチンアミドと共に培養したＮＫ細胞の効率的なエクスビボ増殖とその機能性の強化について記載しており、動物モデルにおける標的器官（例えば、脾臓、骨髄及び末梢血）への増殖ＮＫ細胞の局在化及び生着の増加を報告している（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８０７４０号及びFrei, et al, Blood, 2011;118:4035を参照）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の幾つかの実施形態の様相によれば、ＮＫ細胞画分を必要とする対象への移植用の、移植可能ＮＫ細胞画分を調製する方法であって、
（ａ）対象に対してＨＬＡ半合致（ハプロタイプ一致）又はＨＬＡ不適合のＣＤ３枯渇（除去）ＮＫ細胞画分を取得する工程と、
（ｂ）細胞増殖を可能にする条件下でＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分をエクスビボ培養する工程であって、上記の条件が、栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の８〜１０日後にＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分に新しい栄養素、血清、ＩＬ−１５及びニコチンアミドを補充して増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を得る工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の１４〜１６日後に増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を回収する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を洗浄及び濃縮する工程と
を含み、対象への移植のための、移植可能ＮＫ細胞画分を得る、方法を提供する。
【０００８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分はヒトＮＫ細胞画分である。
【０００９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分はアフェレーシスで入手したものである。
【００１０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、エクスビボ培養では支持細胞層がない。
【００１１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血清はヒト血清である。
【００１２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細胞増殖を可能にする条件は１０％ヒト血清を供給することを含む。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＩＬ−１５は２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ニコチンアミドは５．０ｍＭのニコチンアミドを含む。
【００１５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、最小必須細胞培地を含む栄養素を供給することを含む。
【００１６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＮＫ細胞画分は、少なくとも下記条件を満たすＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合のドナー由来である。
（ａ）Ａ及びＢ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラス１タイピングにおいて４種のクラス１対立遺伝子の内の少なくとも２種がＨＬＡ適合しており、且つ
（ｂ）（ＭＦＩ≦１０００）のレシピエントのドナー特異的抗ＨＬＡ抗体が存在しない。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）のＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞を少なくとも４０〜９０％含む。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｄ）の回収は、工程（ｂ）の１４日後に増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第１の部分を回収することと、工程（ｂ）の１６日後に増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第２の部分を回収することとを含む。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、第１の部分は増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の約５０％を含み、第２の部分は増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の残りを含む。
【００２０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｅ）によって生成される、洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、以下のパラメータによって特徴付けられる。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｂ）の培養はフラスコ内にて行い、フラスコ１個当たり２００〜３００×１０６個の細胞とする。
【００２２】
本発明の幾つかの実施形態の様相によれば、本発明の方法に従って調製した移植可能ＮＫ細胞画分を提供する。
【００２３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、移植可能ＮＫ細胞画分は、以下のパラメータによって特徴付けられる。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【００２４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、移植可能ＮＫ細胞画分は、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）培養バッグで提供する。
【００２５】
本発明の幾つかの実施形態の様相によれば、移植可能ヒトＮＫ細胞画分は、以下のパラメータによって特徴付けられる。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【００２６】
本発明の幾つかの実施形態の様相によれば、血液疾患の治療を必要とする対象において血液疾患を治療する方法であって、
（ａ）抗癌モノクローナル抗体を対象に投与する工程と、
（ｂ）少なくとも１種の免疫抑制剤を対象に投与する工程と、
（ｃ）栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを用いたエクスビボ培養によって増殖させた、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分をそれを必要とする対象に移植する工程と、
（ｄ）ＩＬ−２を対象に投与して、対象の血液疾患を治療する工程と
を含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象及びＮＫ細胞画分は、ヒト対象及びヒトＮＫ細胞画分である。
【００２８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、免疫抑制剤は、化学療法免疫抑制剤及び／又は放射線である。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血液疾患は血液系腫瘍である。
【００３０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血液疾患は多発性骨髄腫である。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、多発性骨髄腫は、下記の少なくとも１種によって特徴付けられる。
（ａ）最初の自家幹細胞移植の２〜１８ヶ月後に再発した疾患、
（ｂ）同種幹細胞移植の少なくとも４ヶ月後に再発し、活動性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の証拠がない疾患、
（ｃ）プロテアソーム阻害剤と免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む少なくとも２種類の治療後の再発性／難治性疾患、
（ｄ）血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＤ骨髄腫タンパク質（Ｍタンパク質）が０．５ｇ／ｄＬ以上、及び
（ｅ）尿中Ｍタンパク質が２００ｍｇ／２４回採取以上。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血液疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
【００３３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＮＨＬは、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞ＮＨＬである。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＮＨＬは下記の少なくとも１種によって特徴付けられる。
（ａ）従来の治療に失敗した再発性／難治性疾患、
（ｂ）自家幹細胞移植の少なくとも６０日後に再発した疾患、
（ｃ）同種幹細胞移植の少なくとも４ヶ月後に再発し、活動性移植片対宿主病の証拠がない疾患、及び
（ｄ）直径１．５ｃｍ以上の測定可能な疾患。
【００３５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血液系腫瘍は多発性骨髄腫であり、抗癌モノクローナル抗体はエロツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）である。
【００３６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血液系腫瘍はＮＨＬであり、抗癌モノクローナル抗体はリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２）である。
【００３７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）を３回行う。
【００３８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｄ）は、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の第１の用量を投与し、その２日後に増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の第２の用量を投与することを含む。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）は３回、即ち、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の第１の用量の投与の９〜１１日前、３日前、及び１１日後に行う。
【００４０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＮＫ細胞画分は、１×１０７個／ｋｇ〜５×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞を含む。
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、第１の用量と第２の用量を合わせると、計２×１０７個／ｋｇ〜２×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞を含む。
【００４２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、
（ａ）ＮＫ細胞画分の第１の用量と第２の用量は、各々、１×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は２×１０７個／ｋｇである、又は
（ｂ）ＮＫ細胞画分の第１の用量と第２の用量は、各々、５×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は１×１０８個／ｋｇである、又は
（ｃ）ＮＫ細胞画分の第１の用量と第２の用量は、各々、１×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は２×１０８個／ｋｇである。
【００４３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分の対象への投与は、移植用画分の供給後１時間以内、及び画分の最終生成物放出後１０時間以内に行う。
【００４４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の対象への投与は、フィルター又はポンプを使用せずに、注入によって１５分以上６０分以内で行う。
【００４５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも１種の免疫抑制剤はシクロホスファミド及び／又はフルダラビンを含む。
【００４６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、
（ｉ）少なくとも１種の免疫抑制剤は、シクロホスファミド（４０ｍｇ／ｋｇ）とフルダラビン（２５ｍｇ／ｍ２）の両方を含み、
（ｉｉ）シクロホスファミドは、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の５日前に投与し、フルダラビンは、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞の輸注の５日前、４日前及び３日前の各々で投与する。
【００４７】
幾つかの実施形態によれば、本発明の方法は、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞の輸注後に６×１０６単位のＩＬ−２を投与することを更に含み、この投与を
（ｉ）増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注当日、及び
（ｉｉ）増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の２日後、及び
（ｉｉｉ）増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の４日後に行う。
【００４８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、本明細書で詳述する移植可能増殖ＮＫ細胞画分を調製する方法のいずれかに従って調製した移植可能ＮＫ細胞画分を移植することを含む。
【００４９】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法及び材料を、本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法及び／または材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、対象への移植用のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞画分を増殖すると同時に、エクスビボ及び／又はインビボで細胞の機能を維持又は増強する方法に関する。一実施形態では、ニコチンアミド及び／又は他のニコチンアミド部分及びＮＫ細胞成長因子を用いたＮＫ細胞のエクスビボ培養によって、治療的エクスビボ増殖ＮＫ細胞調製物（対象への注入に適したパラメータを有する機能的ＮＫ細胞の増殖集団を含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞画分の減少と共にＮＫ細胞の確実な増殖））として使用するＮＫ細胞集団の産生が促進される。特にこの点で、本発明を用いて移植可能ＮＫ細胞画分とその使用のためのプロトコルを提供することができ、癌や他の疾患の治療用の細胞移植及び注入への用途に使用することができる。非限定的な用途としては、同種養子免疫療法や併用免疫療法、及び増感剤や他の抗癌モダリティを挙げることができる。
【００５１】
本発明の原理及び実施については、以下の説明を参照してより良く理解されよう。
【００５２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が、以下の記載に示す、及び／または図面及び／または実施例で例示する、構成の詳細及び要素の配置及び／または方法に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、また、さまざまな手段で実施または実行することが可能である。
【００５３】
ナチュラルキラー（以下「ＮＫ」とも略する）細胞は、免疫反応に関与するリンパ系細胞であり、腫瘍細胞に対して自発的な非ＭＨＣ制限細胞障害活性を示す。従って、生存可能なＮＫ細胞の数をエクスビボで効果的に増大させ、その機能を効果的に増強するための臨床グレードのプロトコル（例えば、間質層なし、最小限のサイトカイン）の開発、及びリンパ節へのホーミングの可能性とその注入後のインビボでの恒常性増殖によって、固形腫瘍、造血器悪性腫瘍等の癌性病態の治療用のＮＫ細胞による養子免疫療法の成果を改善することができる。
【００５４】
本発明は、本明細書で更に詳細に記載するように、特定の濃度を超えるニコチンアミドを用いたＮＫ細胞の培養に基づいて、臨床環境での移植に適した増殖ＮＫ細胞画分を調製及び特徴付けるための臨床的に適切な条件を提供する。従って、本発明は、その実施形態では、非ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３＋）の増殖の誘導を伴わずに、機能的に成熟したＮＫ細胞の移植可能ＮＫ細胞画分の産生のための臨床的に適切な培養条件、移植可能ＮＫ画分及びその選択基準を提供すると共に、癌性疾患、特に血液系腫瘍の治療におけるその使用のための臨床プロトコルを提供する。
【００５５】
従って、本発明の実施形態の一様相によれば、ＮＫ細胞画分を必要とする対象への移植用の移植可能ＮＫ細胞画分を調製する方法であって、
（ａ）対象に対してＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合のＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を取得する工程と、
（ｂ）細胞増殖を可能にする条件（前記条件は、栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）の下で前記ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分をエクスビボ培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の８〜１０日後に前記ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分に新しい栄養素、血清、ＩＬ−１５及びニコチンアミドを補充して増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を得る工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の１４〜１６日後に、前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を回収する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を洗浄及び濃縮する工程と
を含み、前記対象への移植のための、移植可能ＮＫ細胞画分を得る方法が提供される。
【００５６】
本明細書で使用する「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」という用語は、自然免疫応答に関与する大型顆粒リンパ球を意味する。機能的には、ＮＫ細胞は、パーフォリンやグランザイムプロテアーゼ等の様々なタンパク質を含む細胞質顆粒のエキソサイトーシスを介して、様々な標的に対して細胞溶解活性を示す。死滅は、抗原に対する事前の感作を必要としない、接触依存的な非貪食性プロセスで誘発される。ヒトＮＫ細胞は、細胞表面マーカーであるＣＤ１６とＣＤ５６の存在、及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の非存在によって特徴付けられる。ヒト骨髄由来ＮＫ細胞は、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖［ゼータ（ζ）−ＴＣＲ］を更に含有するので、ＣＤ２＋ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＣＤ３−の表現型によって更に特徴付けられ、また多くの場合、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０又はＮＫｐ４４によって特徴付けられる。ＮＫＴ細胞やＣＤ８ＮＫＴ等の非ＮＫ細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方の特徴及び細胞表面マーカーを有する。一実施形態では、本発明の方法を用いて細胞集団から成熟ＮＫ細胞をエクスビボ増殖させる。本明細書で使用する「成熟ＮＫ細胞」という用語は、特徴的な表面マーカーとＮＫ細胞機能を有するが、更なる分化の能力を有しない委任ＮＫ細胞として定義される。本明細書において、成熟ＮＫ細胞としては、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞（これは増殖し、多量のサイトカインを産生することができる）、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞（強い細胞傷害性を示す）、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ９４ｈｉｇｈ細胞及びＣＤ５６ｄｉｍＣＤ９４ｈｉｇｈ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、ＮＫ前駆細胞、又はＮＫ前駆細胞と成熟ＮＫ細胞の混合集団を増殖する。ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ９４及び他のマーカーの細胞表面発現を、例えば、ＦＡＣＳ分析又は免疫組織染色技術によって確認することができる。
【００５７】
本明細書で使用する「前駆細胞」という用語は、１個以上の成熟エフェクター細胞に分裂することができる、及び／又は１個以上の成熟エフェクター細胞への分化を受けることができる未成熟な細胞を意味する。リンパ球前駆細胞としては、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫの各系譜の成熟細胞を生じさせることが可能な多能性造血幹細胞が挙げられる。Ｂ細胞系譜では（即ち、成熟Ｂ細胞を生じさせる発達経路では）、前駆細胞としては、免疫グロブリン遺伝子の再編成や発現によって特徴付けられるプロＢ細胞及びプレＢ細胞も挙げられる。Ｔ細胞及びＮＫ細胞の系譜では、前駆細胞としては、骨髄由来の両能性Ｔ／ＮＫ前駆細胞［例えば、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（ｈｉ）ＣＤ７（＋）細胞及びＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（ｈｉ）Ｌｉｎ（−）ＣＤ１０（＋）細胞］、及び胸腺内の前駆細胞（例えば、二重陰性（ＣＤ４とＣＤ８に関して）及び二重陽性の胸腺細胞（Ｔ細胞系譜）及び委任ＮＫ前駆細胞が含まれる）が挙げられる。
【００５８】
本発明のＮＫ細胞は、このような細胞を含む任意の供給源に由来することができる。ＮＫ細胞は多くの組織で見られ、例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、肺、腸、脱落膜から得ることができ、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）から得ることもできる。通常、不均一なリンパ球細胞集団を含む臍帯血、末梢血、動員末梢血及び骨髄を使用して、研究及び臨床用途のために多数のＮＫ細胞を得る。
【００５９】
ＮＫ細胞移植の臨床経験から、同種ＮＫ細胞の場合には宿主への生着を成功させることができ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率が低いことが分かっている。移植の候補（例えば、「対象」）の身元が分かっている場合、ＨＬＡ適合（適合性）等のパラメータを確認し、選択基準として使用することができる。
【００６０】
従って、特定の実施形態によれば、ＮＫ細胞画分はＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ドナー由来である。ＮＫ細胞ドナーは血縁ドナーであってもよく、非血縁ドナーであってもよい。
【００６１】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択するＮＫ細胞は、４種のＨＬＡクラスＩの内の少なくとも２種（ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラスＩタイピング）、４種のＨＬＡクラスＩの内の少なくとも３種（ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラスＩタイピング）、又は４種のＨＬＡクラスＩの内の４種（ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラスＩタイピング）が対象とＨＬＡ適合するドナーに由来する。ある実施形態によれば、アフェレーシスユニットは、４種のＨＬＡクラスＩの内の少なくとも２種（ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラスＩタイピング）を有し、（平均蛍光強度（ＭＦＩ）≦１０００）のレシピエント（宿主、対象）のドナー特異的抗ＨＬＡ抗体が存在しないドナーに由来する。ＭＦＩ値は抗体の量又は力価を表す。通常、クラスＩ  ＨＬＡ（又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ））抗原は、特定のＨＬＡに対する同種抗血清、細胞傷害性の補体、及び死滅細胞を特定するための色素を使用したマイクロ細胞傷害性アッセイによってＮＫ細胞上で決定する。ＨＬＡクラスＩＩは通常、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって決定し、混合リンパ球集団の培養後のリンパ球増殖を測定する。ＨＬＡ  ＤＲ抗原は、濃縮Ｂ細胞を用いたマイクロ細胞傷害性アッセイでＢ細胞抗血清によって特定できる。抗血清の代わりに特定のモノクローナル抗体を用いることができる。
【００６２】
血液画分を採取する他の一般的な方法はアフェレーシスであり、この方法では、通常、遠心分離によりドナーの全血を血液成分（例えば、血漿、白血球及び赤血球）に分離し、選択した成分を操作（例えば、白血球画分の培養）のために取り出し、残りをドナーに返す。アフェレーシスには、体液（例えば、血漿）や他の血液成分を枯渇させずに、特定の血液画分（例えば、白血球画分）が大量に得られるという利点がある。アフェレーシスは、必要な体外量が小さい連続フロー遠心分離に基づいて行うか、或いは、成分を複数のサイクルで分離するが、通常は時間が掛かり、ドナー血液の体外量が大きいことを特徴とする、血液の断続的フロー遠心分離に基づいて行うことができる。多くの適切なアフェレーシス装置が市販されている。通常、アフェレーシスはドナー末梢血からの血液成分の分離に応用されている。
【００６３】
従って、本発明の一実施形態の一様相によれば、本方法はＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を培養することを含み、ＮＫ細胞画分はアフェレーシスで入手したものである。特定の実施形態では、ＮＫ細胞画分は、ＰＣＳ２又はＭＣＳ８１５０  Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓアフェレーシス機器（マサチューセッツ州ボストン、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ社）を使用してドナーから得たアフェレーシスユニットに由来する。ある実施形態では、ＮＫ細胞画分は、ドナーの末梢血から得たアフェレーシスユニットに由来する。
【００６４】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞を新鮮な細胞集団から培養することができ、他の実施形態では、保存した細胞集団（凍結保存や解凍細胞等）又は事前に培養した細胞集団からＮＫ細胞を培養する。
【００６５】
「バフィーコート」やアフェレーシスユニット等のリンパ球画分を処理して、特定の定義された細胞集団を濃縮又は精製又は単離することができる。「精製する」及び「単離する」という用語は絶対的な純度を要求しておらず、どちらかといえば、相対的な用語として意図されている。従って、例えば、精製リンパ球集団とは、特定細胞がその供給源組織にあるよりも濃縮されている集団である。実質的に純粋なリンパ球の調製物は、所望の細胞が調製物中に存在する全細胞の少なくとも５０％を示すように濃縮することができる。ある実施形態では、実質的に純粋な細胞集団は、調製物中の全細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又はそれ以上を示す。
【００６６】
リンパ球を濃縮及び単離する方法は当技術分野で周知であり、所望の集団に基づいて適切な方法を選択することができる。例えば、一アプローチでは、赤血球を除去することによって原材料のリンパ球を富化する。密度に基づいて赤血球をリンパ球や他の細胞から分離する。次いで、リンパ球に富んだ画分を選択的に回収することができる。リンパ球とその前駆細胞は、様々な商業的供給源から入手可能な標準的なリンパ球分離媒体（ＬＳＭ）等の分離媒体を使用した遠心分離によって濃縮することもできる。或いは、リンパ球／前駆細胞は、様々な親和性に基づく手順を用いて濃縮することができる。多くの抗体媒介親和性調製方法、例えば、抗体結合磁気ビーズ等が当技術分野で知られている。リンパ球濃縮は、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ（商標）や、全リンパ球、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の濃縮用に処方した他の密度勾配培地等、不要な細胞をネガティブに選択する市販の調製物を使用して行うこともできる。
【００６７】
血液、骨髄、リンパ球調製物（例えば、アフェレーシスユニット）又は組織試料からのＮＫ細胞の選択方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Litwin et alの米国特許第５，７７０，３８７号を参照）（この特許を本明細書の一部を構成するものとして援用する）。最も一般的に使用されるのは、ＣＤ５６＋細胞の単離と精製に基づくプロトコルであり、通常は単核細胞の分画の後にＣＤ３＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋等の非ＮＫ細胞の枯渇を行う。２種以上のプロトコルの組み合わせを用いて、非ＮＫ混入物からより高い純度のＮＫ細胞集団を得ることができる。Ｔ細胞やＮＫＴ細胞等の非ＮＫ細胞はＧＶＨＤ等の抗原特異的反応に寄与し、ＮＫ細胞移植の潜在的な利点を損なうため、ＮＫ細胞調製物の純度は臨床応用にとって非常に重要である。ＮＫ細胞を単離するための市販のキットには、一段階手順（例えば、ＣＤ５６マイクロビーズ及びＣＤ５６＋、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋単離キット（カリフォルニア州オーバーン、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社））、多段階手順、例えば、ＣＤ３＋の枯渇又は部分的枯渇、Ｔ細胞を認識して除去する非ＮＫ細胞抗体（例えば、ＯＫＴ−３）、Ｂ細胞、幹細胞、樹状細胞、単球、顆粒球及び赤血球細胞を用いた枯渇が含まれる。従って、ある実施形態では、ＮＫ細胞集団はＮＫ細胞について選択又は濃縮を行い、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分とすることができる。幾つかの実施形態では、ＣＤ３枯渇画分はＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＣＤ３−細胞及び／又はＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＣＤ３−細胞を含む。特定の実施形態では、培養用に選択したＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞を少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％含む。幾つかの実施形態では、培養用に選択したＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞を４０％〜９０％、５０％〜８０％、５５〜７５％、６０％〜７０％含む。幾つかの実施形態では、培養用に選択したＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞を４０〜９０％含む。
【００６８】
表現型に従ってＮＫ細胞を選択する方法としては、免疫検出及びＦＡＣＳ分析が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＮＫ細胞画分は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｔ細胞枯渇セット（（ＬＳ枯渇セット（１６２−０１）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用して免疫磁気選択によってＣＤ３細胞を除去する。
【００６９】
更なる実施形態では、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を処理して微量の赤血球を除去する。従って、幾つかの実施形態では、ＣＤ３細胞の枯渇に続いて、ＮＫ細胞画分を赤血球（ＲＢＣ）溶解に付した後に、培養を行う。特定の実施形態では、赤血球溶解は、塩化アンモニウムカリウム（ＡＣＫ）緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して行う。
【００７０】
ＮＫ細胞は短期又は長期の培養によってエクスビボで培養できる。本発明者らは、ＮＫ細胞を成長因子及びニコチンアミド及び／又は他のニコチンアミド部分と共に、短くて７日間又は長くて３週間培養した結果、サイトカインと共に培養したが、ニコチンアミド及び／又は他のニコチンアミド部分が０．１ｍＭ未満であった細胞と比較して、培養ＮＫ細胞の優先的増殖及び／又は機能性の増強が生じることを実証した（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８０７４０号を参照）。移植用の臨床的に適切なＮＫ細胞画分を調製する場合、重要なエクスビボＮＫ細胞増殖を行い、増殖ＮＫ細胞画分の治療上有利な機能を維持しながら、長い処理期間を要しないことが望ましい。
【００７１】
従って、特定の実施形態では、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分は１４〜１６日の期間に亘って培養する。
【００７２】
本発明のこの様相によれば、ＮＫ細胞のエクスビボ培養は、ＮＫ細胞にエクスビボで細胞増殖用の条件を提供し、ＮＫ細胞をニコチンアミド部分と共にエクスビボで培養して、ＮＫ細胞の集団をエクスビボで増殖することによって行うことができる。
【００７３】
本明細書で使用する「培養する」には、ＮＫ細胞の維持に必要な化学的及び物理的条件（例えば、温度、ガス）及び成長因子の提供が含まれる。一実施形態では、ＮＫ細胞の培養には、ＮＫ細胞にＮＫ細胞増殖用の条件を提供することが含まれる。ＮＫ細胞の増殖をサポートすることができる化学的条件の例としては、緩衝液、栄養素、血清、ビタミン及び抗生物質、及び成長（即ち、培養）培地で通常供給するサイトカイン及び他の成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、細胞増殖の条件は、栄養素、血清及びサイトカインを含む。一実施形態では、ＮＫ培地は、ＭＥＭα（イスラエル国Ｂｅｔ  ＨａＥｍｅｋ、ＢＩ社）等の最小必須培地（ＭＥＭ）及び血清を含む。幾つかの実施形態では、血清は培地の２〜２０％、５〜１５％又は５〜１０％を供給する。特定の実施形態では、血清はヒト血清であり、培地の１０％を供給する。特定の実施形態では、培地は１０％ヒトＡＢ血清（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＭＥＭαである。本発明での使用に適した他の培地としては、グラスゴー培地（カリフォルニア州カールズバッド、Ｇｉｂｃｏ）、ＲＰＭＩ培地（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はＤＭＥＭ（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）が挙げられるが、これらに限定されない。培地の多くは、ビタミン補助剤としてニコチンアミドを含んでいる（例えば、ＭＥＭα（８．１９μＭのニコチンアミド）、ＲＰＭＩ（８．１９μＭのニコチンアミド）、ＤＭＥＭ（３２．７８μＭのニコチンアミド）及びグラスゴー培地（１６．３９μＭのニコチンアミド））が、本発明の方法は、培地処方に含まれるニコチンアミド及び／又はニコチンアミド部分を補足する外因的添加ニコチンアミド、又は培地成分濃度の全体的な調整によって生じるものに関することに留意されたい。
【００７４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細胞増殖を可能にする条件下でＮＫ細胞を培養することは、細胞に栄養素、血清及びサイトカインを供給することを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の成長因子は、サイトカイン及び／又はケモカインを含む。サイトカインと他の成長因子は、典型的には０．５〜１００ｎｇ／ｍＬ、又は１．０〜８０ｎｇ／ｍＬ、より典型的には５〜７５０ｎｇ／ｍＬ、更に典型的には５．０〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度（このような濃度の１０倍までが企図され得る）で供給され、例えば、Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州ロッキーヒル）から市販されている。一実施形態では、細胞増殖を可能にする条件は、サイトカインであるインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の供給を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞は、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と共に培養する。
【００７５】
更に、この点において、新規サイトカインが継続的に発見され、その一部は本発明のＮＫ細胞増殖方法において用途を見出すことができることが理解されよう。細胞をヒト対象に導入（又は再導入）する用途の場合、リンパ球培養用のＡＩＭ  Ｖ（登録商標）無血清培地又はＭＡＲＲＯＷＭＡＸ（登録商標）骨髄培地等の無血清製剤を使用するのが好ましいことが多い。このような培地製剤及び補助剤は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＧＩＢＣＯ）（カリフォルニア州カールズバッド）等の商業的供給源から入手可能である。培養にはアミノ酸、抗生物質及び／又はサイトカインを補充して、最適生存率、増殖、機能性及び／又は生存を促進することができる。
【００７６】
一実施形態によれば、ＮＫ細胞画分は、栄養素、血清、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）及びニコチンアミド及び／又はニコチンアミド部分と共に培養する。本明細書で使用する「ニコチンアミド部分」という用語は、ニコチンアミドを意味すると共に、ニコチンアミド、その誘導体、類似体及び代謝産物、例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ等に由来する生成物を意味し、これらは、ＮＫ細胞の増殖及び／又は活性化を効果的且つ優先的に増強することができる。ニコチンアミドの誘導体、類似体及び代謝産物のスクリーニング及びそのエクスビボＮＫ培養増殖に対する効果についての評価は、後述のように維持したＮＫ培養に添加して行うか、死滅アッセイや運動性アッセイ等の機能アッセイに添加して行うか、又は当該技術分野で周知のハイスループットアッセイ用に設計された自動スクリーニングプロトコルで行うことができる。
【００７７】
本明細書で使用する「ニコチンアミド類似体」という語句は、上述のアッセイや類似のアッセイにおいてニコチンアミドと同様に作用することが知られている任意の分子を意味する。ニコチンアミド類似体の代表的な例として、ベンズアミド、ニコチンチオアミド（ニコチンアミドのチオール類似体）、ニコチン酸及びα−アミノ−３−インドールプロピオン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
「ニコチンアミド誘導体」という語句は、ニコチンアミド自体又はニコチンアミド類似体の任意の構造的誘導体を更に意味する。このような誘導体の例としては、置換ベンズアミド、置換ニコチンアミド及びニコチンチオアミド及びＮ置換ニコチンアミド及びニコチンチオアミド、３−アセチルピリジン及びニコチン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の一実施形態では、ニコチンアミド部分はニコチンアミドである。
【００７９】
本発明の幾つかの実施形態での使用に適したニコチンアミド又はニコチンアミド部分の濃度は通常、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。ニコチンアミドの例示的な有効濃度は、増殖及びＮＫ細胞機能に対するこのような濃度のニコチンアミドの効果に基づいて、約０．５〜約１５ｍＭ、１．０〜１０．０ｍＭ、通常は２．５又は５．０ｍＭとすることができる。本発明の幾つかの実施形態によれば、ニコチンアミドを供給する際の濃度範囲（ｍＭ）は、約０．５、約０．７５、約１．０、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２．０、約２．２５、約２．５、約２．７５、約３．０、約３．２５、約３．５、約３．７５、約４．０、約４．２５、約４．５、約４．７５、約５．０、約５．２５、約５．５、約５．７５、約６．０、約６．２５、約６．５、約６．７５、約７．０、約７．２５、約７．５、約７．７５、約８．０、約８．２５、約８．５、約８．７５、約９．０、約９．２５、約９．５、約９．７５、約１０．０、約１１．０、約１２．０、約１３．０、約１４．０、約１５．０、約１６．０、約１７．０、約１８．０及び約２０．０ｍＭである。全ての有効な中間濃度が企図される。特定の実施形態では、増殖を可能にする条件は１．０〜１０．０ｍＭのニコチンアミドを含む。更に他の実施形態では、増殖を可能にする条件は５．０ｍＭのニコチンアミドを含む。
【００８０】
ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド部分の適切な濃度は、ＮＫ増殖及び／又は活性、例えば、細胞培養又は機能の任意のアッセイに従って決定することができる。ニコチンアミドの適切な濃度は、同じＮＫ細胞源（例えば、臍帯血、骨髄又は末梢血調製物）を用いて同じアッセイ及び同様の培養条件下（ニコチンアミドへの曝露期間、ニコチンアミドへの曝露時間）で試験した、ニコチンアミドが０．１ｍＭ未満の「対照」培養と比較した場合に、培養でのその使用により、培養でのＮＫ細胞の増殖及び／又は機能を「増強」させる、即ち増大をもたらす濃度である。
【００８１】
一部の研究によると、栄養素、血清、サイトカイン及びニコチンアミドを用いた培養による精製ＮＫ細胞のエクスビボ増殖では培地の補充や培養期間中の操作は必要ないが、他の研究では、ＮＫ細胞培養中の様々な間隔での培地の補充（「栄養補給」）が推奨されている。本発明のある実施形態では、培養期間中、ＮＫ細胞画分に「栄養補給」を行う。従って、特定の実施形態では、移植用の移植可能ＮＫ細胞画分の調製は、エクスビボ培養の開始から８〜１０日後にＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分に新しい栄養素、血清、ＩＬ−１５及びニコチンアミドを補充することを含む（工程（ｂ））。幾つかの実施形態では、エクスビボ培養の開始から８〜９日後、エクスビボ培養の開始から９〜１０日後、又はＣＤ３枯渇ＮＫ細胞の培養開始から８〜１０日後に補充を行う。幾つかの実施形態では、補充（又は「栄養補給」）は、ＮＫ細胞分画培養の培地の約３０〜８０％、約４０〜７０％又は約４５〜５５％を除去し、除去した培地と同じ組成を有し、同じレベルの栄養素、血清、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）及びニコチンアミドを有する新しい培地（その量は除去した培地の量と同様（例えば、同等））で置換することを含む。幾つかの実施形態では、補充（又は「栄養補給」）は、ＮＫ細胞分画培養の培地の約５０％を除去し、除去した培地を、同じ組成を有し、同じレベルの栄養素、血清、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）及びニコチンアミドを有する新しい培地（その量は除去した培地の量と同様（例えば、同等））で置換することを含む。他の実施形態では、栄養補給後の培地量は、ＮＫ細胞培養の開始（「播種」）時の元の培地量の約２倍に達する。
【００８２】
ＮＫ細胞集団は様々な方法と装置を用いて培養することができる。培養装置の選択は通常、培養の規模と目的に基づく。細胞培養のスケールアップでは専用の装置を使用するのが好ましい。大規模な臨床グレードのＮＫ細胞産生用の装置は、例えば、Spanholtz et al.（PLoS ONE 2010;5:e9221）及びSutlu et al.（Cytotherapy 2010, Early Online 1-12）に詳述されている。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分の培養（例えば、本方法の工程（ｂ）及び／又は工程（ｃ））は、フラスコ中、１００〜４０００×１０６個（細胞）／フラスコの細胞密度で行う。特定の実施形態では、ＮＫ細胞画分の培養（例えば、エクスビボ培養の開始及び／又は「栄養補給」）は、フラスコ中、２００〜３００×１０６個（細胞）／フラスコの細胞密度で行う。ある実施形態では、フラスコは、Ｇ−Ｒｅｘ培養装置（Ｇ−Ｒｅｘ  １００Ｍ又は閉鎖系Ｇ−Ｒｅｘ  ＭＣＳ（ミネソタ州セントポール、ＷｏｌｆＷｉｌｓｏｎ社）等のガス透過性膜を含むフラスコである。
【００８３】
培養フラスコ中の細胞密度は、培養期間中の細胞の増殖と共に増加することが理解されよう。従って、幾つかの実施形態では、培養における増殖の過程で、ＮＫ細胞画分のＮＫ細胞の培養は、１００〜４０００×１０６個（細胞）／フラスコ、１００〜４０００×１０６個（細胞）／フラスコ、１００〜４０００×１０６個（細胞）／フラスコ、１００〜４０００×１０６個（細胞）／フラスコ、２００〜３０００×１０６個（細胞）／フラスコ、３００〜２０００×１０６個（細胞）／フラスコ、４００〜１０００×１０６個（細胞）／フラスコ、２５０〜８００×１０６個（細胞）／フラスコ、１００〜６００×１０６個（細胞）／フラスコ、又は１５０〜５００×１０６個（細胞）／フラスコの細胞密度で行う。特定の実施形態では、フラスコ中での培養期間に亘って、ＮＫ細胞画分のＮＫ細胞の培養は１００〜３０００×１０６個（細胞）／フラスコの細胞密度で行う。
【００８４】
ＮＫ細胞の培養は、支持細胞又は支持細胞層の有無に関わらず行うことができる。支持細胞層のないエクスビボ培養は、培養細胞（ＮＫ細胞を含む）の臨床応用に非常に有利である。従って、一実施形態によれば、ＮＫ細胞集団の培養は支持細胞層又は支持細胞なしで行う。
【００８５】
ある実施形態では、ＮＫ細胞培養の開始（工程（ｂ））から１４〜１６日後にＣＤ３枯渇ＮＫ細胞を培養物から回収する。細胞の回収は、付着した細胞を切り離す（例えば、培養容器の表面を「削り取る」）ことによって手作業で行うか、又は細胞を培養容器から効率的に洗い流し、細胞を自動的に収集するように設計された細胞回収装置によって行うことができる。特定の実施形態では、細胞回収装置（例えば、Ｇ−Ｒｅｘ  ＭＣＳの回収装置（ミネソタ州セントポール、ＷｏｌｆＷｉｌｓｏｎ社）によって、培養容器から増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を回収する。
【００８６】
幾つかの実施形態では、培養物から増殖ＮＫ細胞画分を回収することによって、培養容器から細胞の大部分又は殆ど全てを除去する。他の実施形態では、回収を２以上の段階で行うことができ、回収されない細胞を後で回収するまで培養物に残すことができる。ある実施形態では、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の回収を２段階で行い、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第１の部分を回収した後、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第２の部分を回収する。これら２個の部分の回収は、第１の部分と第２の部分の回収の間に数時間、数日又はそれ以上の間隔をあけて行うことができる。回収した２個の部分は、ほぼ等しい割合の培養物（例えば、等量の培養ＮＫ細胞）を含んでいてもよく、又は一方の部分に含まれる培養ＮＫ細胞の割合が他方より多くてもよい。ある実施形態では、回収は、工程（ｂ）（培養の開始）の約１４日後に増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞の第１の部分を回収する工程と、その約２日後に増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の第２の部分を回収することを含む。特定の実施形態では、エクスビボ培養の開始から１４日後に第１の部分を回収し、エクスビボ培養の開始から１６日後に第２の部分を回収する。
【００８７】
ある実施形態では、第１の部分と第２の部分はほぼ等しい、即ち、第１の（回収）部分は増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の約５０％を含み、第２の（回収）部分は、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の残りを含む。
【００８８】
移植用の増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を調製するために、回収した細胞から培地を洗い流し、重要なパラメータを評価し、臨床的に妥当な期間に亘って量を注入に適した濃度に調整する必要がある。
【００８９】
回収後、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を培地がなくなるまで手作業で洗浄することができ、好ましくは臨床応用のために、閉鎖系を用いた自動化装置を使用して洗浄する。洗浄した細胞を輸液（例えば、例示的な輸液は８％ｗ／ｖＨＳＡと６．８％ｗ／ｖデキストラン−４０を含む）で再構成することができる。幾つかの実施形態では、再構成を閉鎖系で行う。幾つかの実施形態では、本発明の方法と組成物での使用の適合性に関して輸液をスクリーニングする。適切な輸液を選択する基準の例としては、細菌、酵母又はカビの成長がないこと、内毒素含有量が０．５Ｅｕ／ｍＬ未満であること、及び透明で異物のない外観を示す安全性試験が挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用する「繁殖」又は「増殖」という用語は、成長、例えば、細胞成長、及び細胞数の増大を意味する。本明細書において、繁殖と増殖は、インキュベーション期間中に生じるＮＫ細胞数の増加に関する。ＮＫ細胞の表現型を示す細胞のインビトロ又はインビボでの繁殖は、例えば、ＩＬ−２、エプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球株等による刺激後の既知の現象である。
【００９１】
当技術分野で周知の細胞増殖に関するアッセイとしては、クローン原性アッセイ（細胞を低密度で播種及び増殖し、コロニーをカウントする）、機械的アッセイ［フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ（商標））、ヨウ化プロピジウム］（細胞数を機械的に測定する）、代謝アッセイ（例えば、テトラゾリウム塩、例えば、ＸＴＴ、ＭＴＴ等の取り込み）（生細胞の数を測定する）、直接増殖アッセイ（例えば、ブロモデオキシウリジン、チミジンの取り込み）（成長する集団のＤＮＡ合成を測定する）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明に従って有効濃度のニコチンアミド及び／又は他のニコチンアミド部分を用いて培養したＮＫ細胞集団の細胞増殖は、培地にＮＫ細胞を播種してから所定時間後（例えば、約１０時間、１２時間、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月又はそれ以上の経過後）に測定し、抗ＣＤ５６マーカーと抗ＣＤ３マーカーを使用したＦＡＣＳ分析によって確認し、集団のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞画分の特定及び定量化を実施する。ＮＫ細胞の増殖は、培養前の元のＮＫ細胞画分と比較して、ＮＫ細胞の倍増（例えば、増殖又は倍増増殖）として表すことができる。幾つかの実施形態では、本発明に従って有効濃度のニコチンアミドに曝露したＮＫ細胞の集団に関しては、約５日間、約７日間、約１２日間、約１４日間、約１６日間、約１８日間、約２１日間、約２５日間、約３０日間又はそれ以上の培養後、ＮＫ細胞集団が少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍又はそれ以上に増加する。他の実施形態では、有効濃度のニコチンアミドに曝露し、ＦＡＣＳ（商標）によって確認されるＮＫ細胞の集団の増殖は、ニコチンアミド及び／又は他のニコチンアミド部分を０．１ｍＭ未満として同一条件下で培養したＮＫ細胞の場合と比較して、少なくとも約１．２倍、約１．３倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍である。
【００９２】
本明細書で使用する「機能」又は「ＮＫ細胞機能」という用語は、ＮＫ細胞に起因する任意の生物学的機能を意味する。ＮＫ細胞機能の非限定的な例としては、例えば、細胞傷害性、アポトーシスの誘導、細胞運動性、定方向遊走、サイトカイン及び他の細胞シグナル応答、サイトカイン／ケモカイン産生及び分泌、活性化及び抑制性細胞表面分子のインビトロでの発現、移植宿主における細胞ホーミング及び生着（インビボ保持）、及びインビボでの疾患又は疾患プロセスの変化が挙げられる。幾つかの実施形態では、ニコチンアミド及び／又は他のニコチンアミド部分への曝露によって増強されるＮＫ細胞機能としては、ＣＤ６２Ｌ表面マーカーの発現の増加、遊走応答の増加、及びＮＫ細胞のより高い細胞傷害活性の内の少なくとも１種が挙げられると共に、ホーミングの増加及び注入ＮＫ細胞のインビボ保持が挙げられる。
【００９３】
移植における細胞のホーミング／生着及び保持に重要な、ＣＤ６２Ｌ、ＣＸＣＲ−４、ＣＤ４９ｅ等の接着分子及び遊走分子に関するアッセイは当技術分野で周知である。細胞でのＣＤ６２Ｌ発現は、例えば、フローサイトメトリー、免疫検出、定量的ｃＤＮＡ増幅、ハイブリダイゼーション等によってアッセイすることができる。一実施形態では、ＮＫ細胞の異なる集団でのＣＤ６２Ｌ発現の検出は、蛍光標識特異的抗ヒトＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体［例えば、ＣＤ６２Ｌ  ＰＥ、カタログ番号３０４８０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）］に細胞を曝露し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって細胞を分類して行う。
【００９４】
細胞遊走に関するアッセイは当技術分野でよく知られている。細胞の遊走は、例えば、遊出アッセイ又はギャップ閉鎖アッセイによってアッセイすることができる。２チャンバー技法等の遊出アッセイでは、バリア（例えば、フィルター）によって細胞を刺激から分離し、起点からの細胞の損失、バリアを横切る細胞の蓄積、又はその両方を特定の間隔でカウントすることによって細胞の遊走を検出する。ギャップ閉鎖アッセイでは、細胞を目に見えるギャップ（刻み付き寒天プレート、円周囲等）の周辺に配置し、刺激を与えながらインキュベートする。刺激に応答した細胞運動による細胞間の隙間の閉鎖は、サイトメトリー、免疫検出、顕微鏡法／形態計測等を用いて視覚化する。一実施形態では、ＮＫ細胞の異なる集団の遊走能は、ＳＤＦ（２５０ｎｇ／ｍＬ）に応じて「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ」（商標）遊出アッセイによって確認する。
【００９５】
注入又は移植した細胞のホーミング及びインビボ保持に関するアッセイは当技術分野でよく知られている。本明細書で使用する「ホーミング」という用語は、注入又は移植した細胞が宿主の標的器官に到達して生存する能力を意味する。例えば、ＮＫ細胞標的器官はリンパ組織とすることができ、肝細胞標的器官は肝実質とすることができ、肺胞細胞標的器官は肺実質等とすることができる。本明細書で使用する「インビボ保持」（「生着」としても知られる）という用語は、注入又は移植した細胞が増殖して標的器官で生存し続ける能力を意味する。移植したＮＫ細胞のホーミング及びインビボ保持をアッセイするための動物モデルとしては、免疫不全の小型哺乳動物（例えば、ＳＣＩＤマウス及びＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス等）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＣＩＤ−Ｈｕマウスモデルには、ヒト胎児胸腺と肝臓組織又は胎児ＢＭ組織を移植したＣ．Ｂ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウスを採用して、移植したヒトＮＫ細胞の保持と治療可能性を評価するための適切なモデルを得る。移植した細胞のホーミングとインビボ保持はヒト宿主対象でも評価することができる。一実施形態では、ホーミングとインビボ保持のアッセイは、例えば、本発明に従って有効濃度のニコチンアミドを用いて培養した約１５×１０４個、約１５×１０５個、約１５×１０６個、約１５×１０７個又はそれ以上のヒトＮＫ細胞を注入し、注入から所定時間後（例えば、注入から約５時間、約１０時間、約１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月又はそれ以上後）に屠殺した照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで行う。マウスを屠殺した際に、脾臓、骨髄、末梢血及び他の器官の試料について、ヒト特異的抗体を使用してヒトＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ４５＋）の存在をＦＡＣＳで評価する。インビボ保持率はドナー表現型（例えば、ヒト細胞のＣＤ４５）を示す器官の細胞の割合で表す。
【００９６】
細胞傷害性（「細胞死滅」）に関するアッセイは当技術分野でよく知られている。リダイレクト死滅アッセイでの使用に適した標的細胞の例としては、癌細胞株、原発性癌細胞、固形腫瘍細胞、白血病細胞、又はウイルス感染細胞が挙げられる。特に、Ｋ５６２、ＢＬ−２、ｃｏｌｏ２５０及び原発性白血病細胞を使用することができるが、他の多くの細胞型のいずれかを使用することができ、当技術分野ではよく知られている（例えば、Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135を参照）。細胞死滅は、細胞生存率アッセイ（例えば、色素排除、クロム遊離、ＣＦＳＥ）、代謝アッセイ（例えば、テトラゾリウム塩）及び直接観察法によって評価する。
【００９７】
一旦増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を洗浄して濃縮すれば、移植への使用の適合性に関して増殖画分を評価することができる。適切な移植可能ＮＫ細胞画分を選択する際の典型的な基準としては、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の割合、細胞生存率、ＣＤ３＋細胞画分のサイズ、内毒素の存在、微生物汚染等が挙げられる。増殖ＮＫ細胞画分のＣＤ５６＋細胞、ＣＤ３＋細胞及びＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の含有量は移植ＮＫ細胞の生着を成功させるのに重要であり、従って、エクスビボ増殖を進める上で重要な基準であることに留意されたい。従って、特定の実施形態では、本発明の方法の工程（ｅ）で生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、約６０％〜約９０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞、約６８％〜約８５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞、約７２％〜約８２％のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞、及び約７６〜７９％のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞によって特徴付けられる。一実施形態では、本発明の方法の工程（ｅ）で生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、少なくとも６０％、少なくとも６４％、少なくとも７０％、少なくとも７４％、少なくとも８０％又は少なくとも８５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞によって特徴付けられる。更なる実施形態では、本発明の方法の工程（ｅ）で生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、少なくとも７０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞によって特徴付けられる。ＣＤ５６細胞マーカー及びＣＤ３細胞マーカーによるＮＫ細胞表現型の特定については上で詳細に記載されている。
【００９８】
移植を目的とした細胞画分に同種Ｔ（ＣＤ３＋）細胞が存在すると、ＧＶＨＤのリスクが非常に高くなるため問題である。従って、移植可能な増殖ＮＫ細胞画分の適合性に関する重要なパラメータは、ＣＤ３＋細胞の量又は割合である。従って、特定の実施形態では、本発明の方法によって生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が１．０×１０５〜１．０×１０６個であることによって特徴付けられる。更なる実施形態では、本発明の方法によって生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が７．０×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が６．５×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が６．０×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．５×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が４．５×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が４．０×１０５個未満、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が３．５×１０５個未満、又は患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が３．０×１０５個未満であることによって特徴付けられる。一実施形態では、本発明の方法によって生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が７．０×１０５個未満であることによって特徴付けられる。患者の体重１Ｋｇ当たりで表される、本発明の方法によって生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分のＣＤ３＋の分率、割合又は含有量の計算は、患者（即ち、対象）に移植された（例えば、注入された）ＣＤ３＋細胞の総量に関することに留意されたい。本発明の方法の工程（ｅ）によって生成する洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分中のＣＤ３＋細胞の分率、割合又は含有量は、ＣＤ３＋細胞に対するＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の比で表すこともでき、或いは、本発明の方法によって生成される洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分の体積分率（例えば、ＣＤ３＋細胞／ｍＬ）又は重量分率（ＣＤ３＋細胞／１００ｇ）で表すこともできる。ＣＤ３＋細胞マーカーの特定については上で詳細に記載されている。
【００９９】
移植用の増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の無菌性と安全性は、特に内毒素含有量と細菌、真菌、ウイルス及びマイコプラズマ汚染の存在をモニターすることによって保証される。幾つかの実施形態では、移植用に選択された増殖ＮＫ細胞画分は、洗浄及び濃縮後の内毒素含有量が５Ｅｕ／ｍＬ以下である。幾つかの実施形態では、移植用の増殖ＮＫ細胞画分は、洗浄及び濃縮後に微生物（例えば、グラム陽性微生物）を含まないことで特徴付けられる。
【０１００】
幾つかの実施形態では、移植に適した増殖ＮＫ細胞画分は約５０％〜約８５％の生存率によって特徴付けられる。幾つかの実施形態では、生存率が約５５％、約６０％、約６３％、約６５％、約６８％、約７０％、約７５％、約７８％、約８０％、約８２％、約８３％、約８４％〜約８５％又はそれ以上の増殖ＮＫ細胞画分を選択する。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＮＫ細胞画分は生細胞が少なくとも７０％である。更なる実施形態では、移植に適した増殖ＮＫ細胞画分は、洗浄及び濃縮後に生細胞が少なくとも７０％であることによって特徴付けられる。更なる実施形態では、移植に適した増殖ＮＫ細胞画分は生細胞が少なくとも８５％である。
【０１０１】
本明細書で使用する「生存率」という用語は、生存細胞と非生存細胞との区別を意味する。細胞生存率は形態学的変化によって判断してもよく、特定の色素の排除又は他の色素の取り込みと保持から推測される膜透過性及び／又は生理学的状態の変化によって判断してもよい。細胞生存率の評価は当技術分野でよく知られており、アッセイ（例えば、色素排除、クロム遊離）、代謝アッセイ（例えば、テトラゾリウム塩）及び直接観察法が挙げられるが、これらに限定されない（Coder, D., Current Protocols in Cytometry, 1997, John Wiley and Sons, Inc., Unit 9.2, 9.2.1-9.2.14）。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞画分、ＣＤ３＋細胞画分、生存率、内毒素及び微生物含有量のパラメータは、ＮＫ細胞培養前、ＮＫ細胞培養中、第１の部分及び／又は第２の部分の回収後、及び／又は増殖ＮＫ細胞画分の洗浄及び濃縮後に採取した試料でモニターする。幾つかの実施形態では、任意のアフェレーシスユニットからの試料の採取は、処理前（１００×１０６個（細胞））、ポストカラム（ＣＤ３枯渇）前培養試料（１０×１０６個（細胞））、増殖後洗浄前（１０ｍＬの試料）、最初の注入日（０日目）の洗浄及び濃縮した最終増殖ＮＫ細胞産物（１０×１０６個（細胞））及び２回目の注入（＋２日目）の洗浄及び濃縮した最終増殖ＮＫ細胞産物（１０×１０６個（細胞））又はその任意の組み合わせにて行う。
【０１０３】
従って、特定の実施形態によれば、本発明の方法によって生成される、洗浄及び濃縮した増殖ＮＫ細胞画分は、以下のパラメータによって特徴付けられる。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【０１０４】
上述の基準を満たす増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分は、それを必要とする対象（例えば、患者）への移植に使用することができる。本節と後に続く節で説明するように、上述の移植用ＮＫ細胞画分のエクスビボ増殖（培養）、選択及び調製のための方法のいずれか、及びその実施形態の各々を単独又は様々な組み合わせで用いて、増殖ＮＫ細胞画分を移植する方法に影響を与えることができる。
【０１０５】
従って、幾つかの実施形態では、本明細書に記載の移植可能ＮＫ細胞画分を調製するための方法のいずれかに従って調製した移植可能ＮＫ細胞画分が提供される。特定の実施形態では、移植可能ＮＫ細胞画分は、以下のパラメータによって特徴付けられる。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、洗浄及び濃縮後、移植可能ＮＫ細胞画分を（例えば、移植（注入）場所への移送のために）容器に移す。幾つかの実施形態では、容器は培養バッグである。ガス透過率が高く、水分損失が少なく、柔軟性があり、光透過率が高い不活性材料で構成された培養バッグが望ましい。特定の実施形態では、移植可能増殖ＮＫ細胞画分は、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）培養バッグで提供される。
【０１０７】
他の実施形態では、以下のパラメータによって特徴付けられる移植可能ヒトＮＫ細胞画分が提供される。
（ａ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞が少なくとも７０％、
（ｂ）生存率が少なくとも７０％、
（ｃ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞数が５．０×１０５個未満、
（ｄ）注入の際の、患者の体重１Ｋｇ当たりの内毒素が５ＥＵ以下、及び
（ｅ）グラム陽性微生物なし。
【０１０８】
本発明の増殖ＮＫ細胞画分は、それを必要とする対象への移植に使用することができる。
【０１０９】
本明細書で使用する「移植」という用語は、細胞療法、養子移植、細胞免疫療法等の状況において、治療効果が期待される細胞を対象、好ましくはそれを必要とする対象へ、例えば、疾患又は病態に対する患者の治療として投与することを意味する。このような細胞療法は、血管への接続を介して対象の体内に治療用細胞画分を導入することを含むため、本明細書で使用するＮＫ細胞の「移植」及び「投与」は、「注入」と同じ意味である。通常、治療用細胞画分は、例えば、中心静脈カテーテル（例えば、ヒックマンカテーテル）を介して対象に静脈内注入する。治療用細胞画分の対象への注入速度はポンプで制御するか、又は補助なしで重力によって供給し、細胞画分と入口カテーテルとの高さの差によって調整することができる。幾つかの実施形態では、ポンプ及び／又はフィルターを使用せず、重力送りによって増殖ＮＫ細胞画分を静脈内に移植（注入、投与）する。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、移植を必要とする対象は血液疾患に罹患している。幾つかの実施形態では、対象は血液系腫瘍に罹患している。特定の実施形態では、本明細書に記載の増殖ＮＫ細胞画分又は方法を用いた治療が適応となる血液系腫瘍は多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫である。
【０１１１】
従って、幾つかの実施形態では、血液疾患の治療を必要とする対象において血液疾患を治療する方法であって、
（ａ）抗癌モノクローナル抗体を対象に投与する工程と、
（ｂ）少なくとも１種の免疫抑制剤を対象に投与する工程と、
（ｃ）栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを用いたエクスビボ培養によって増殖させた、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分をそれを必要とする対象に移植する工程と、
（ｄ）ＩＬ−２を前記対象に投与して、対象の血液疾患を治療する工程と
を含む方法が提供される。
【０１１２】
本明細書で使用する「対象」又は「患者」は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダとすることができる。特定の実施形態では、対象はヒトである。更なる実施形態では、対象はヒトであり、ＮＫ細胞画分はヒトＮＫ細胞画分である。
【０１１３】
本明細書で使用する「ＮＫ細胞画分を必要とする対象」とは、疾患、障害又は病態を治療又は改善するために本発明のＮＫ細胞画分の移植、輸注、注入又は埋め込みを必要とする対象である。一実施形態では、対象は血液疾患を有する（診断されている）か、又は血液疾患に罹患している。幾つかの実施形態では、血液疾患は細胞増殖性障害である。他の実施形態では、血液疾患は血液系腫瘍である。
【０１１４】
本明細書で使用する「〜のリスク」又は「〜の確率」という用語は、出来事の可能性を意味する。幾つかの実施形態では、個体における出来事（例えば、ＮＫ細胞画分の生着又は非生着、非再発死亡率等）のリスク又は確率は、治療を受けた群と同様の治療を受けていない群との比較データから計算されたリスクを意味する。幾つかの実施形態では、リスク又は確率の上昇や低下は、検討中の結果に関する治療群と対照群との差を反映する。幾つかの実施形態では、特定の出来事又は状態のリスク又は確率の上昇や低下は相対的なものに過ぎず、数値では表されない。
【０１１５】
本明細書で使用する「細胞増殖性障害」という用語は、細胞の非制御又は異常な成長又はその両方が、（癌性であるかないかに関わらず）望ましくない病態又は疾患の発症につながる可能性がある状態を意味する。本発明の細胞増殖性障害の例としては、細胞分裂が調節解除される様々な病態が挙げられる。本明細書で使用する「急速分裂細胞」という用語は、同じ組織内の隣接又は並置する細胞間で予測又は観察される速度を超えた速度で分裂する任意の細胞と定義する。細胞増殖性障害には前癌又は前癌状態が含まれる。細胞増殖性障害には癌が含まれる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて癌の症状を治療又は軽減する。「癌」という用語は固形腫瘍を包含すると共に、血液腫瘍及び／又は悪性腫瘍を包含する。特定の実施形態では、血液系腫瘍は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）又は多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、本発明の方法と組成物とキットは、全ての年齢層の対象の治療に用いることができる。特定の実施形態では、対象又は患者は１８歳を超え７０歳未満である。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は多発性骨髄腫を有している場合がある。更なる実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）は以下の基準の内の少なくとも１種によって特徴付けられる：（ａ）最初の自家幹細胞移植の２〜１８ヶ月後に再発した疾患、（ｂ）同種幹細胞移植の少なくとも４ヶ月後に再発し、活動性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の証拠がない疾患、（ｃ）プロテアソーム阻害剤と免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む少なくとも２種類の治療後の再発性／難治性疾患、（ｄ）血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＤ骨髄腫タンパク質（Ｍタンパク質）が０．５ｇ／ｄＬ以上、及び（ｅ）尿中Ｍタンパク質が２００ｍｇ／２４回採取以上。幾つかの実施形態では、多発性骨髄腫は、血清ＩｇＥ骨髄腫タンパク質（Ｍタンパク質）が０．５ｇ／ｄＬ以上であることによっても特徴付けられ、ＮＫ治療の開始前に４週間以上血漿交換を受けている。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は、本明細書に記載の基準の２種以上によって特徴付けられる多発性骨髄腫を有する。
【０１１８】
ＮＫ細胞画分を必要とする対象は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有している場合がある。幾つかの実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、ＣＤ２０発現がフローサイトメトリー又は免疫組織化学的検査によって確認されたＣＤ２０陽性Ｂ細胞ＮＨＬである。更なる実施形態では、ＮＨＬは以下の特徴の内の少なくとも１種によって特徴付けられる：（ａ）従来の治療に失敗した再発性／難治性疾患、（ｂ）自家幹細胞移植の少なくとも６０日後に再発した疾患、（ｃ）同種幹細胞移植の少なくとも４ヶ月後に再発し、活動性移植片対宿主病の証拠がない疾患、及び（ｄ）直径１．５ｃｍ以上の測定可能な疾患。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は、本明細書に記載の基準の２種以上によって特徴付けられるＮＨＬを有する。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は、以下の基準に従って更に定義することができる。基準とは、カルノフスキーによるパフォーマンススコアが少なくとも６０％であること、及び以下のように定義される、適切な臓器機能である。ａ．心臓機能：心エコー、放射性核種スキャン又は心臓ＭＲＩによる左室駆出率（ＬＶＥＦ）が４０％以上、ｂ．肺機能：室内空気での酸素飽和度が少なくとも９０％であり、肺機能検査の結果、ＦＶＣとＦＥＶ１が年齢の予測の５０％以上であり、ｃＤＬＣＯが予測の５０％以上、ｃ．腎機能：クレアチニンクリアランス試験（コッククロフト・ゴールト式による）で４０ｍＬ／分以上、又はクレアチニンが１．５ｍｇ／ｄＬ以下、ｄ．肝機能：総血清ビリルビンが１．５×原則正常範囲の上限以下、肝トランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）が３×原則正常範囲の上限未満、ｅ．血液：総白血球（ＷＢＣ）数≧３０００／μＬ、絶対好中球数（ＡＮＣ）≧１０００／μＬ、血小板数≧７５０００／μＬ及びヘモグロビン≧８．０ｇ／ｄＬ（異常が疾患関連の骨髄関与に起因する場合には免除される場合がある）、及びｆ．カルシウム（多発性骨髄腫患者の場合のみ）：治療登録前２週間以内の補正カルシウム値が１１．５ｍｇ／ｄＬ未満。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、適格な対象は、ＮＡＭ−ＮＫ細胞注入前の少なくとも３日間はプレドニゾン又は他の免疫抑制薬を中止する必要がある（予備レジメン前投薬を除く）。性的に活発で妊娠可能性のある女性、及び妊娠可能性のあるパートナーを持つ男性は、治療中と治療完了後４か月間は効果的な避妊を行うことに同意するよう求められる場合がある。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、以下のいずれかの理由で対象を治療の検討から除外することができる。
１．高力価のドナー特異的抗ＨＬＡ抗体（ＭＦＩ＞１０００）。
２．活動性で未治療のＣＮＳの関与。
３．慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、又は高悪性度リンパ腫（バーキットリンパ腫／リンパ芽球性リンパ腫）。
４．妊娠中または授乳中。
５．多発性骨髄腫の対象の場合：妊娠の可能性がある女性は、治療開始から１４日以内（抗癌抗体投与開始の２４時間前）に血清又は尿妊娠検査が陰性（最低感度２５ＩＵ／Ｌ又は同等単位のＨＣＧ）でなければならない。
６．ＱＴ／ＱＴｃ間隔の印付きベースライン延長（例えば、５００ミリ秒を超えるＱＴｃ間隔の表示）。
７．ニューヨーク心臓協会の機能分類基準（付録ＩＩＩ）がクラスＩＩ以上、又はサイトカイン療法の心合併症のリスクを増加させる可能性が高い重篤な心不整脈（例えば、心室頻拍、頻繁な異所性心室興奮、又は慢性治療を必要とする上室性頻脈性不整脈）。
８．免疫抑制療法を必要とする活動性自己免疫疾患。
９．現在慢性薬物療法を受けている重度の喘息の病歴（吸入ステロイドのみを必要とする軽度の喘息の病歴は適格である）。
１０．胸部Ｘ線又は胸部ＣＴスキャンのスクリーニングにおける新規又は進行性肺浸潤物［肺専門医による研究が許可されている場合を除く。感染に起因する浸潤物は、１週間の適切な治療後（真菌感染症が推定又は実証された場合は４週間後）に安定／改善（関連する臨床的改善を伴う）していなければならない］。
１１．活動性で非制御の細菌性、真菌性又はウイルス性感染症−全ての事前の感染症は最適な治療によって回復していなければならない。
１２．本発明の方法で使用される任意の治療剤に対する既知の過敏症。
１３．ＭＭ患者のみ：本発明のＮＫ細胞画分の投与前２週間以内の事前の放射線療法、４週間以内の手術又は３週間以内の化学療法（メルファラン又はモノクローナル抗体の場合は６週間以内）。
１４．ＮＫ細胞画分による治療開始前１４日以内の治験薬の投与。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞ドナー（例えば、ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合、血縁又は非血縁と特定するアフェレーシスの候補）は以下の基準に従って選択する。
１．Ａ及びＢ遺伝子座の中間解像度ＤＮＡベースのクラスＩタイピングの最小値（４種のクラスＩ対立遺伝子の内の少なくとも２種）並びに選択ドナーに対する（ＭＦＩ≦１０００）のレシピエントの抗ＨＬＡ抗体の不在に基づく、ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合の血縁ドナー／レシピエントの組み合わせ。
２．１２歳〜７０歳：年齢（＜３５歳）を優先し、その次にＨＬＡマッチングを行う（ＨＬＡ半合致とし、該当なしの場合には完全不適合のドナー）。
３．体重が少なくとも４０キログラム。
４．医療提供者によって評価された一般的な健康状態。
５．次のように定義された適切な臓器機能：血液：ヘモグロビン、ＷＢＣ、試験正常範囲の上限と下限１０％以内の血小板（ヘモグロビン値は性別による）、肝臓：ＡＬＴ＜２×正常上限値、及び腎臓：血清クレアチニン＜１．８ｍｇ／ｄＬ。
６．ドナー感染症検査パネル（ＣＭＶ抗体、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｃ型肝炎抗体、ＨＩＶ  ＰＣＲ、ＨＩＶ１／２抗体、ＨＴＬＶＡ１／２抗体、急速血漿（ＲＰＲ）トレポネーマ、トリパノソーマ・クルージ（Ｔ．Ｃｒｕｚｉ）、ＮＡＴによるＨＣＶ、ＮＡＴによるＨＩＶ、及びＮＡＴ又は現在のパネルごとのＷＮＶ（ウエストナイルウイルス）を含む）の完了；ＨＩＶと活動性Ｂ型肝炎に対して陰性でなければならない。
７．妊娠していないこと：妊娠可能性がある女性は、アフェレーシスから７日以内に妊娠検査で陰性でなければならない。
８．アフェレーシスを受けることができ、進んで対応できる。
９．自発的な書面による同意（１８歳未満のドナーの場合は同意書を使用）。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は骨髄破壊的療法又は移植前処置を受ける。特定の実施形態では、対象は、本発明の組成物を移植又は投与する前、それと同時及びその後に骨髄破壊的療法又は移植前処置を受ける。骨髄破壊療法又は移植前処置には、全身照射（ＴＢＩ）、免疫療法、及び化学療法及び／又は免疫抑制療法を含むことができる。
【０１２４】
腫瘍標的化及び抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を促進するために、幾つかの実施形態では、疾患特異的モノクローナル抗体をそれを必要とする対象に投与することができる。従って、幾つかの実施形態では、血液系腫瘍が多発性骨髄腫である場合、１種以上のＭＭ特異的モノクローナル抗体（エロツズマブ等）をそれを必要とする対象に投与する。本発明の方法に有用なエロツズマブの投与量の例は、対象（患者）の体重１Ｋｇ当たり１０ｍｇである。血液系腫瘍がＮＨＬである場合、１種以上のＮＨＬ特異的モノクローナル抗体（リツキシマブ等）をそれを必要とする対象に投与する。本発明の方法に有用なリツキシマブの投与量の例は、対象（患者）１ｍ２当たり３７５ｍｇである。特定の実施形態では、疾患特異的モノクローナル抗体治療においてモノクローナル抗体の投与を３回行う。即ち、ＮＫ細胞画分の投与（注入、移植）の１０日前の最初の投与を行い、ＮＫ細胞画分の投与（注入、移植）の３日前に２回目の投与を行い、ＮＫ細胞画分の投与（注入、移植）の１１日後に３回目（最終）の投与を行うが、幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分の最終（２回目）の投与（注入、移植）の約１週間後に行う。ある実施形態では、疾患特異的モノクローナル抗体の投与は、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の初回投与の９〜１１日前、初回投与の３日前、及び初回投与の１１日後に行う。
【０１２５】
注入、モノクローナル抗体投与に対する反応及び毒性のモニタリングに関しては標準的なガイドラインに従う。エロツズマブの投与は通常、注入開始前に、デキサメタゾン、ジフェニルヒドラミン等のＨ１ブロッカー、ラニチジン等のＨ２ブロッカー及びアセトアミノフェン等の前投薬レジメンと一緒に行う。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は、ＮＫ細胞画分の投与（注入、移植）の前に免疫抑制療法の前処置療法を受ける。適切な免疫抑制剤としては、アルキル化剤、プリン類似体、代謝拮抗剤等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の免疫抑制剤は化学療法免疫抑制剤とも見なされる。特定の実施形態では、免疫抑制療法はシクロホスファミドとフルダラビンの投与を含む。本発明の方法に有用なシクロホスファミドの投与量の例は、対象（患者）の重量１Ｋｇ当たり４０ｍｇであり、本発明の方法に有用なフルダラビンの投与量の例は、対象（患者）１ｍ２当たり２５ｍｇである。特定の実施形態では、シクロホスファミドの投与は、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞の投与（移植、注入）の５日前に行い、フルダラビンの投与は、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞の投与（移植、注入）の５日前、４日前及び３日前の各々で行う。或いは、フルダラビンとシクロホスファミドの投与は、免疫抑制剤の最終投与がＮＫ細胞画分投与の開始の２日前又は３日前に完了するように調整することができる。
【０１２７】
本発明の方法によれば、幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分をそれを必要とする対象へ２回投与する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞画分の投与は、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分の第１の用量を投与し、その２日後に増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分の第２の用量を投与することを含む。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、対象（患者）への投与用ＮＫ細胞画分は、１×１０７個／ｋｇ〜５×１０８個／ｋｇ、２×１０７個／ｋｇ〜２×１０８個／ｋｇ、５×１０７個／ｋｇ〜１×１０８個／ｋｇ、又は２×１０７個／ｋｇ〜５×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞を含む。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分の前記第１の用量と前記第２の用量を合わせると、計２×１０７個／ｋｇ〜２×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞を含む。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分の第１の用量と第２の用量は各々、１×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は２×１０７個／ｋｇである。他の実施形態では、ＮＫ細胞画分の第１の用量と第２の用量は各々、５×１０７個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は１×１０８個／ｋｇである。更に他の実施形態では、ＮＫ細胞画分の第１の用量と第２の用量は、各々、１×１０８個／ｋｇの増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞を含み、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の総用量は２×１０８個／ｋｇである。
【０１２９】
ＮＫ細胞画分の投与は通常、入院患者への処置として行う。本明細書に記載のＮＫ細胞画分の投与は注入によって行い、特定の実施形態では、対象（患者）へのＮＫ細胞画分の注入は、移植可能ＮＫ細胞画分の到着１時間以内と洗浄及び濃縮した増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分の最終生成物放出後１０時間以内に行う。特定の実施形態では、洗浄及び濃縮した増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分は投与するまで室温で保持し、使用前に冷蔵しない。
【０１３０】
従って、幾つかの実施形態では、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合ＮＫ細胞画分の対象への投与は、移植用ＮＫ細胞画分の供給後１時間以内とＮＫ細胞画分の最終生成物放出後１０時間以内に行う。幾つかの実施形態では、増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分の対象への投与は静脈内注入によって行い、フィルター又はポンプを使用せずに注入ごとに１５分以上６０分以内で行う。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分を必要とする対象は、ＮＫ細胞画分投与後にインターロイキン２（ＩＬ−２）の支持レジメンを受ける。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、ＩＬ−２の皮下（ＳＣ）投与は６ＭＵの用量で行い（重量が４５キログラム未満の患者の場合、ＩＬ−２用量は３ＭＵ／ｍ２）、最初のＮＫ細胞画分投与（移植、注入）の日と、２回目のＮＫ細胞画分投与（移植、注入）の日と、２回目のＮＫ細胞画分投与（移植、注入）の２日後の計３回行う。幾つかの実施形態では、ＩＬ−２の投与は、ＮＡＭ−ＮＫ細胞注入の日にＮＡＭ−ＮＫ細胞注入から４時間以降に行う。ある実施形態では、最初の２回のＩＬ−２投与はＮＫ細胞注入のための入院の一部として行う。３回目のＩＬ−２投与は外来の状況で行うことができる。従って、特定の実施形態では、ＩＬ−２投与は増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞の輸注後に６×１０６単位のＩＬ−２を投与することを含み、この投与を
（ｉ）前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注当日、及び
（ｉｉ）前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の２日後、及び
（ｉｉｉ）前記増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞の輸注の４日後に行う。
【０１３３】
更に、患者が１回目又は２回目の投与でグレード２以上のＩＬ−２注入関連毒性を経験した場合、ＩＬ−２の投与を最大４８時間保持することができる。毒性が４８時間以内にグレード１以上まで回復した場合、計画した全ての用量でＩＬ−２を投与することができるが、残りの用量の投与は、少なくとも２４時間空けて行うべきである。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、対象は以下のいずれか又は全てを受けることができる：注入サポート（例えば、ジフェニルヒドラミン又はデクスクロルフェニラミン、ヒドロコルチゾン及びアセトアミノフェン）、支持サイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）、必要に応じた血液製剤、抗ウイルス、抗菌、ＰＣＰ及び／又は真菌の予防、ＣＭＶ、ＥＢＶ及びＨＨＶ６監視、及び必要に応じてＩＶ免疫グロブリン。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、対象は、血液疾患用の追加治療のいずれか又は全てを受ける。当該治療は、免疫抑制治療、化学療法及び放射線療法から成る群から選択される治療とすることができる。
【０１３６】
従って、幾つかの実施形態では、血液疾患の治療を必要とする対象において血液疾患を治療する方法であって、
（ｉ）対象に対してＨＬＡ半合致又はＨＬＡ不適合のＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を取得する工程と、
（ｉｉ）細胞増殖を可能にする条件（この条件は、栄養素、血清、ＩＬ−１５及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）の下で、ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分をエクスビボ培養する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の８〜１０日後にＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分に新しい栄養素、血清、ＩＬ−１５及びニコチンアミドを補充して増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を得る工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）の１４〜１６日後に増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を回収する工程と、
（ｖ）工程（ｉｖ）の増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分を洗浄及び濃縮して、対象への移植用の移植可能ＮＫ細胞画分を得る工程と、
（ｖｉ）抗癌モノクローナル抗体を対象に投与する工程と、
（ｖｉｉ）少なくとも１種の免疫抑制剤を対象に投与する工程と、
（ｖｉｉｉ）（ｖ）の増殖ＣＤ３枯渇ＨＬＡ半合致又は不適合ＮＫ細胞画分をそれを必要とする対象に移植する工程と、
（ｉｘ）ＩＬ−２を対象に投与して、対象の血液疾患を治療する工程と
を含む方法が提供される。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞画分注入溶液は、その使用（例えば、移植、注入）を実施するまで８〜２０℃でバッグに保存する。幾つかの特定の実施形態では、ＮＫ細胞画分の移植（投与、注入）を行う前に、それを必要とする対象の安全性評価をＮＫ細胞移植の当日に行うが、安全性評価としては通常、身体検査、ＣＢＣ、血液化学検査（例えば、少なくとも血清クレアチニン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びマグネシウム）、バイタルサイン：重量、温度、血圧、脈拍及び呼吸数、及び併用薬の投与（ＲＢＣ及び血小板輸血を含む）が挙げられる。
【０１３８】
増殖ＮＫ細胞画分を必要とする対象へのその注入は、通常、個々の部位診療の制限に従い、患者の中心静脈カテーテルを介した注入によって行う。
【０１３９】
本発明の血液疾患の治療方法を用いて、血液系腫瘍（ＭＭ及びＮＨＬが挙げられるが、これらに限定されない）を治療することができる。本明細書で使用する「血液疾患の治療」又は「血液系腫瘍の治療」という用語は、血液疾患の症状又は徴候を軽減することを意味する。幾つかの実施形態では、血液疾患又は血液系腫瘍の治療の評価は、経時的な症状の抑制、臨床パラメータの改善、入院の減少、及び再発又は死亡のリスクの低下に従って行うが、これらに限定されない。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の増殖ＮＫ細胞画分の注入によって、本明細書に記載の方法に従って培養及び／又は投与を行っていないＮＫ細胞の注入と比較した場合に、注入されたＮＫ細胞のインビボ増殖が成功する確率が高まる。幾つかの実施形態では、インビボ増殖の成功は注入後７日目と１４日目に測定する。
【０１４１】
他の実施形態では、本明細書に記載の増殖ＮＫ細胞画分の注入によって、本明細書に記載の方法に従って培養及び／又は投与を行っていないＮＫ細胞の注入と比較した場合に、対象の末梢血におけるＮＫ細胞の機能が高まる。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞の機能は注入後７日目と１４日目に測定する。
【０１４２】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載の増殖ＮＫ細胞画分の注入によって、本明細書に記載の方法に従って培養及び／又は投与を行っていないＮＫ細胞の注入と比較した場合に、ＮＫ細胞画分の好ましい疾患応答注入の確率が高まる。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞の機能は注入後２８日目及び注入の１年後に測定される。特定の実施形態では、血液系腫瘍はＮＨＬであり、ＮＨＬの疾患応答基準はＮＨＬの国際ワーキンググループ応答基準に従って評価する（詳細についてはCheson, et al, J Clin Oncol 2014;32:3059-68を参照）。更なる特定の実施形態では、血液系腫瘍はＭＭであり、ＭＭの疾患応答基準は以下の基準に従って評価する。
【０１４３】
形質細胞白血病の均一応答基準
厳密な完全寛解（ｓＣＲ）：
ｓＣＲにはＣＲ（下で定義）に加え、次の全てが必要である。
・骨髄中に悪性形質細胞がない（フローサイトメトリーで確認）
・末梢血中に悪性形質細胞がない（フローサイトメトリーで確認）
・正常な遊離軽鎖比（ＦＬＣ）
【０１４４】
完全寛解（ＣＲ）：
ＣＲには次の全てが必要である。
・骨髄穿刺液中の形質細胞が５％未満
・末梢血中に形質細胞がない
・血清及び尿中に元のモノクローナルパラプロテインがない（通常の電気泳動及び免疫固定法で確認）
・髄外疾患がない
【０１４５】
非常に良好な部分寛解（ＶＧＰＲ）
ＶＧＰＲには次の全てが必要である。
・骨髄穿刺液中の形質細胞が５％未満
・末梢血中に形質細胞がない
・血清中モノクローナルパラプロテインの抑制が９０％以上、且つパラプロテイン＜１００ｍｇ／２４時間２
・髄外疾患がない
【０１４６】
部分寛解（ＰＲ）
部分寛解には次の全てが必要である。
・骨髄穿刺液中の形質細胞が５％〜２５％
・末梢血中の形質細胞が１％〜５％
・血清中モノクローナルパラプロテインの抑制が５０％以上、２４時間尿中モノクローナルパラプロテインの抑制が９０％以上で２００ｍｇ／２４時間３未満
・髄外疾患のサイズの減少が５０％以上
【０１４７】
安定状態（ＳＤ）
ｓＣＲ、ＣＲ、ＶＧＰＲ、ＰＲ又は進行性疾患（下で定義）の基準を満たさない患者は安定状態（ＳＤ）であると見なされる。
・血清中及び尿中Ｍタンパク質が測定できない場合、正常な血清κ／λＦＬＣ比も必要である。
・血清中及び尿中Ｍタンパク質が測定できない場合、Ｍタンパク質の代わりに、関与するＦＬＣレベルと関与しないＦＬＣレベルの差を９０％以上減少させる必要がある。
・血清中及び尿中Ｍタンパク質が測定できない場合、Ｍタンパク質の代わりに、関与するＦＬＣレベルと関与しないＦＬＣレベルの差を５０％以上減少させる必要がある。
【０１４８】
進行性疾患
ＣＲ又はｓＣＲからの進行には次の１種以上が必要である。
・骨髄穿刺液中の形質細胞の増加が２５％超、又は絶対増加が１０％以上
・末梢血中の形質細胞の絶対増加が５％超
・血清中モノクローナルパラプロテインのレベルの増加が２５％超で、絶対増加が５ｇ／Ｌ以上
・２４時間尿中タンパク質電気泳動の増加が２５％超で、絶対増加が少なくとも２００ｍｇ／２４時間
・高カルシウム血症
・溶解性骨病変の明確な増大
・髄外疾患のサイズ又は数の明確な増加
【０１４９】
幾つかの実施形態では、本発明の製品、組成物又はキットは、移植に適した増殖ＮＫ細胞画分をそれを必要とする対象に投与するための説明書を更に含む。
【０１５０】
本発明の製品、組成物又はキットの幾つかの実施形態では、増殖ＮＫ細胞画分を必要とする対象への移植に適した増殖ＮＫ細胞画分は、生存ＮＫ細胞総数が少なくとも７×１０８個である。幾つかの実施形態では、増殖ＮＫ細胞画分を必要とする対象への移植に適した増殖ＮＫ細胞画分は、生存ＮＫ細胞総数が少なくとも８×１０８個、少なくとも１０×１０８個、少なくとも１５×１０８個、少なくとも２０×１０８個、又は少なくとも２５×１０８個である。
【０１５１】
本発明の選択細胞集団は、その細胞集団自体をそれを含む培地と共に提供してもよく、培地から単離してもよく、薬学的に許容し得る担体と細胞生着及び／又は臓器機能を促進し得る更なる剤（例えば、免疫抑制剤、抗生物質、成長因子）と組み合わせてもよい。従って、本発明の細胞集団は、滅菌生理食塩水や水性緩衝液等の薬学的に許容し得る担体又は希釈剤にて投与することができる。このような担体及び希釈剤の使用は当技術分野で周知である。
【０１５２】
本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分（例えば、細胞）を含む１種以上の単位剤形を含み得るＦＤＡ承認キットや製品等のパック又はディスペンサー装置にて提供することができる。パックは、例えば、金属又はプラスチック箔を含んでいて、ブリスターパック等とすることができる。パック又はディスペンサー装置には投与用の説明書を添付することができる。パック又はディスペンサー装置には医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知を添付することもでき、この通知は、ヒト又は動物投与用の組成物の形式の機関による承認を反映している。このような通知には、例えば、処方薬又は承認された製品挿入物に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベルが含まれる場合がある。上で更に詳述したように、薬学的に許容し得る担体で処方した本発明の製剤を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、表示病態の治療用にラベルを貼ることもできる。
【０１５３】
本発明の方法に従って調製した細胞はそれ自体を対象に投与してもよく、適切な担体又は賦形剤と混合した医薬組成物として対象に投与してもよい。
【０１５４】
本明細書で使用する「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体や賦形剤等の他の化学成分を含む、本明細書に記載の１種以上の有効成分の調製物を意味する。医薬組成物の目的は生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１５５】
以下、「生理学的に許容し得る担体」及び「薬学的に許容し得る担体」という語句（これらは互換的に使用することができる）は、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を意味する。これらの語句にはアジュバントが含まれる。
【０１５６】
本明細書における「賦形剤」という用語は、医薬組成物に添加して有効成分の投与を更に容易にする不活性物質を意味する。薬物の処方と投与の技術は「Remington’s Pharmaceutical Sciences」（ペンシルバニア州イーストン、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）の最新版に見出すことができるが、これを本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１５７】
よって、本発明に従って使用する医薬組成物は、賦形剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容し得る担体を用いて従来の方法で処方することができ、これによって、有効成分を薬学的に使用可能な製剤に加工し易くなる。適切な処方は選択した投与経路に依存する。
【０１５８】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理的塩緩衝液等の生理学的に適合性のある緩衝液で処方することができる。
【０１５９】
本発明の状況での使用に適した医薬組成物は、所期の目的を達成するのに有効な量の有効成分を含む組成物を包含する。より具体的には、「治療有効量」とは、障害（例えば、白血病、多発性骨髄腫）の症状を予防、軽減又は改善するか、又は治療中の対象の生存期間を延長するのに有効な有効成分（例えば、増殖ＣＤ３枯渇ＮＫ細胞）の量を意味する。
【０１６０】
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６１】
本明細書に記載の有効成分の毒性と治療効果は、インビトロ、細胞培養又は実験動物での標準的な製薬手順によって確認することができる。このようなインビトロ、細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータは、ヒトで使用する用量範囲を策定する際に用いることができる。用量は使用剤形や用いる投与経路に応じて変わり得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の病態を考慮して個々の医師で選択することができる（例えば、Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1.参照）。
【０１６２】
治療する病態の重症度と応答性に応じて、単回又は複数回の投与とすることができる。投与する組成物の量は、当然のことながら、治療する対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医師の判断等に依存する。
【０１６３】
本明細書で使用する「約」は、±１０％を指す。
【０１６４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０１６５】
「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
【０１６６】
「から実質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程及び／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程及び／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０１６７】
本明細書において、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数をも対象とする。例えば、「化合物（a compound）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
【０１６８】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、及びその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６といった範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【０１６９】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常に示す範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、それらの間の分数及び整数の全部を含むことを意図する。
【０１７０】
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的な組み合わせ、または適当な他の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される所定の特徴は、その要素なしでは特定の実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須要件であると捉えてはならない。
【国際調査報告】
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