(57)【要約】本発明者らは、驚くべきことに、胆汁酸塩合成及び肝臓又は腸としての輸送に特化していない組織からの細胞中でのウイルスエピソームの維持において、ＦＸＲが決定的な役割を果たすことを見出した。特に、本発明者らは、ＦＸＲアゴニストが、ＤＮＡのエピソーム及び染色体外形態において細胞中で存続するウイルス（例、ＢＫＶ及びＨＩＶ−１）の複製を阻害するために適切でありうることを示す。したがって、本発明は、治療有効量のＦＸＲアゴニストを対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてエピソームウイルスの持続性及び発現を低下させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のＦＸＲアゴニストを対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてエピソームウイルスの持続性及び発現を減少させる方法。
【請求項２】
対象が、ヒト又は非ヒト動物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象が、ネコ及びイヌのような家庭動物、ウマ、ウシ、ブタ、及びニワトリのような家畜及び農場動物である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
エピソームウイルスが、アデノウイルス科、レトロウイルス科、ヘルペスウイルス科、パポバウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、及びパルボリリナエ科に属するウイルスより選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
エピソームウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、又はレトロウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
エピソームウイルスが、ＢＫＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ８、及びＨＩＶからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
対象が免疫不全であり、高齢患者、ＡＩＤＳ患者；臓器移植患者のような慢性免疫抑制処置レジメンを受けている患者；ホジキン病又はリンパ腫のような癌を伴う患者；及びミコフェノール酸モフェチル又はナタリズマブ、リツキシマブ、又はエファリズマブのような生物製剤で処置されている自己免疫状態を伴う患者を含み、そのような自己免疫状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むが、これらに限定しない、請求項１記載の方法。
【請求項８】
対象が癌を有し、化学療法又は放射線療法のような細胞アブレーション治療とともに投与される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
対象が、免疫抑制剤を投与された移植対象である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
高度に活性な抗レトロウイルス処置後のＨＩＶリザーバーを根絶するための、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、それを必要とする対象においてエピソームウイルスの持続性及び低下を低下させるための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
多くのＤＮＡウイルスの複製中間体は、それらのライフサイクルの間にクロマチン様構造に組織化され、これはしばしばエピソームとして言及される。例えば、典型的には、パポバウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びポリオーマウイルスの環状ゲノムは、ヌクレオソーム中で組織化された細胞ヒストンで構成されるミニ染色体として存在する。他のウイルス、アルファヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス１型など）の、及びガンマヘルペスウイルス（例えばエプスタイン−バーウイルス及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなど）の潜在性ゲノムなどは、エピソームクロマチンとして維持される。以前の研究では、高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）を受けている患者は、デノボ感染を示唆する、非組込みエピソームＨＩＶ−１  ＤＮＡの増加レベルを示すことが見出された（Buzon MJ, Massanella M, Llibre JM, et al. HIV-1 replication and immune dynamics are affected by raltegravir intensification of HAART-suppressed subjects. Nat. Med. 2010; 16(4): 460-465）。また、特定の組織（例えばリンパ節及び腸関連リンパ組織など）は、エピソームウイルスＤＮＡの増加レベルを持つことが示されており、これらの組織がデノボ複製の潜在性部位であることを示唆している。したがって、エピソームウイルスの持続性を根絶する方法及び医薬組成物についての満たされていないニーズがある。
【０００３】
最近の試験では、ＦＸＲアゴニストはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置のために適切でありうることが示されており（ＷＯ２０１５０３６４４２）、ＨＢＶ複製及び肝胆汁酸代謝の恒常性変化ならびにＦＸＲ調節が相互依存的であるように見え、ＨＢＶ感染の持続性に寄与しうることが示唆されている。しかし、エピソームウイルスの持続性におけるＦＸＲの役割はまだ研究されていない。
【０００４】
発明の概要：
本発明は、それを必要とする対象におけるエピソームウイルスの持続性及び発現を低下させるための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は特許請求の範囲により定義する。
【０００５】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、驚くべきことに、胆汁酸塩合成及び肝臓又は腸としての輸送に特化されていない組織からの細胞中での活性ウイルスエピソームの維持において、ＦＸＲが決定的な役割を果たすことを見出した。特に、本発明者らは、ＦＸＲアゴニストが、ＤＮＡのエピソーム及び染色体外形態において細胞中で存続するウイルス（例、ＢＫＶ及びＨＩＶ−１）の複製を阻害するために適切でありうることを示す。
【０００６】
したがって、本発明の第１の目的は、治療有効量のＦＸＲアゴニストを対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてエピソームウイルスの持続性及び発現を低下させる方法に関する。
【０００７】
一部の実施形態では、対象は、エピソームウイルスでの感染に感受性であるヒト又は任意の他の動物（例、鳥及び哺乳動物）（例、家庭動物、例えばネコ及びイヌなど；家畜及び農場動物、例えばウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）でありうる。典型的には、前記対象は、非霊長類（例、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）及び霊長類（例、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は非ヒト動物である。一部の実施形態では、対象は農場動物又はペットである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象はヒトの乳児である。一部の実施形態では、対象はヒトの小児である。一部の実施形態では、対象は成人である。一部の実施形態では、対象は高齢のヒトである。一部の実施形態では、対象は未熟なヒトの乳児である。
【０００８】
本明細書中で使用する用語「エピソームウイルス」は、対象において持続するためにエピソーム複製を要求するウイルスを指す。エピソーム複製は、ウイルスが、宿主の染色体ＤＮＡ中への組込みを伴わず、及び分裂中の宿主細胞からの徐々の喪失を伴わず複製することができることを意味し、また、それは、前記ウイルスがエピソームで複製することを意味する。拡張により、「エピソームウイルス」はまた、そのゲノム複製及び転写の少なくともいくつかの工程で、その複製が核の染色体外形態のＤＮＡの存在を要求するウイルスを指す。例えば、レトロウイルスについて、感染に続き、線状二本鎖レトロウイルスＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が、宿主細胞中への侵入時に逆転写を用いて生成される。レトロウイルスのｄｓＤＮＡは次に、必須の複製中間体である染色体外ＤＮＡとして核中に移行する。そこで、ウイルスのｄｓＤＮＡが細胞のクロマチン中に組込まれるか、環状化して単一又は二重ＬＴＲエピソームを形成することができる。レトロウイルスはｏｒｉを保有し、宿主細胞は小さなＤＮＡウイルスの同族複製タンパク質を提供し、それは環状ＤＮＡレトロウイルスゲノムの増幅及び複製のために使用される。
【０００９】
脊椎動物に感染するエピソームウイルスの例は、アデノウイルス科、レトロウイルス科、ヘルペスウイルス科、パポバウイルス科（ポリオーマウイルス科及びパピローマウイルス科）、パルボリリナエ科に属するウイルスを含むが、これらに限定しない。
【００１０】
一部の実施形態では、エピソームウイルスはアデノウイルスである。本明細書中で使用する用語「アデノウイルス」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、二本鎖ＤＮＡゲノムを含む正二十面体ヌクレオカプシドを伴う中型サイズ（９０〜１００nm）の非エンベロープ（外側脂質二重層を伴わない）ウイルスであるアデノウイルス科のメンバーを指す。特にヒトアデノウイルスは、Ａ−Ｆ亜属及びそれらの個々の血清型を含む。ＡＦ亜属は、ヒトアデノウイルス型１、２、３、４、４ａ、５、６、７、８、９、１０、１１（Ａｄ１１Ａ及びＡｄ１１Ｐ）、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９ａ、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、及び９１を含むが、これらに限定しない。
【００１１】
一部の実施形態では、エピソームウイルスはヘルペスウイルスである。本明細書中で使用する用語「ヘルペスウイルス」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヘルペスウイルス科のメンバーを指す。姓はギリシャ語のヘルペイン（「クリープする」）に由来し、このウイルス群で典型的な潜在性の再発感染を指す。ヘルペスウイルスの例は、イルトウイルス；プロボスウイルス；サイトメガロウイルス；マルディウイルス；ラジノウイルス；マカウイルス；ロセオウイルス；シンプレックスウイルス；スクタウイルス；バリセロウイルス；ペルカウイルス；リンホクリプトウイルス；ムロメガロウイルスを含むが、これらに限定しない。特に、本発明の方法は、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、リンホクリプトウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ロセオウイルス、ヘルペスリンパ指向性ウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの持続性を根絶するために特に適切である。
【００１２】
一部の実施形態では、エピソームウイルスはパピローマウイルスである。本明細書中で使用する用語「パピローマウイルス」は、哺乳動物の皮膚及び粘膜に感染するウイルスのパピローマウイルス科からのＤＮＡウイルスに関する。ヒトＰＶ（ＨＰＶ）については、１１０を超えるＨＰＶ遺伝子型が報告されている（de Villiers, E. M., C. Fauquet, T. R. Broker, H. U. Bernard, and H. zur Hausen. 2004. Classification of papillomaviruses. Virology 324:17-27）。約５０のＨＰＶ遺伝子型が粘膜に感染することが公知である。これらの粘膜の遺伝子型は、癌とのそれらの疫学的関連性に基づいて３つの異なる群に分類される：「低リスク」ヒトパピローマウイルス（ＬＲ−ＨＰＶ）、「高リスク」ヒトパピローマウイルス（ＨＲ−ＨＰＶ）、及び「推定ハイリスク」ヒトパピローマウイルス（ｐＨＲ−ＨＰＶ）。また、ＨＲ−ＨＰＶは、外陰部、肛門、膣、陰茎、及び中咽頭の癌、ならびに膣の上皮内腫瘍、肛門の上皮内腫瘍、外陰部の上皮内腫瘍、及び陰茎の上皮内腫瘍を起こしうることが公知である。好ましくは、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶであり；より好ましくは、本発明のＨＰＶは子宮頸癌の発生についての主な原因である高リスクＨＰＶ遺伝子型（ＨＲ−ＨＰＶ）であり、より好ましくは、ＨＰＶはＨＰＶ  ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、及び８２、最も好ましくはＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８である。
【００１３】
一部の実施形態では、エピソームウイルスはポリオーマウイルスである。本明細書中で使用する用語「ポリオーマウイルス」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ポリオーマウイルス科のメンバーを指し、それは天然宿主が主に哺乳動物及び鳥類であるウイルスのファミリーである。９つのポリオーマウイルスがヒトにおいて発見されている：ＪＣＶ、ＢＫＶ、ＫＩウイルス及びＷＵウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、棘状毛髪異形成（Ｔｒｉｃｈｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｓｉｎｕｌｏｓａ）関連ポリオーマウイルス（ＴＳＶ）、ＨＰｙＶ６、ＨＰｙＶ７、及びＨＰｙＶ９。これらのヒトポリオーマウイルスのうち、ＪＣＶ、ＢＫＶ、及びＭＣＶは深刻な合併症及び疾患を起こす。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＢＫＶの持続性を根絶するために特に適切である。本明細書で使用する用語「ＢＫウイルス」又は「ＢＫＶ」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、公知の４つのＢＫＶ血清型を指す（血清型Ｉ〜ＩＶ；例、Knowles et al, J. Med. Virol. 28: 118-123, 1989）。
【００１４】
一部の実施形態では、エピソームウイルスはパルボウイルスである。本明細書中で使用する用語「パルボウイルス」は、好ましくはパルボウイルス亜科からのパルボウイルス科のメンバーであるウイルスを指す。例示的なパルボウイルスは、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス２型、ヒトパルボウイルスＢ１９、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、及びガチョウパルボウイルスを含むが、これらに限定しない。
【００１５】
一部の実施形態では、エピソームウイルスはレトロウイルスである。本明細書中で使用する用語「レトロウイルス」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡ中間体を伴う一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、宿主細胞を標的とするレトロウイルス科のメンバーを指す。レトロウイルスの例は、ウシレンチウイルス（例、ウシ免疫不全ウイルス、ジェブラナ病ウイルス）、ウマレンチウイルス（例、ウマ伝染性貧血ウイルス）、ネコレンチウイルス（例、ネコ免疫不全ウイルス）、ヒツジ／ヤギレンチウイルス（例、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、ヒツジレンチウイルス、ビスナウイルス）及び霊長類レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、ヒト免疫不全ウイルス３型（ＨＩＶ−３）を含む）、サルＡＩＤＳレトロウイルスＳＲＶ−１（ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス４型（ＨＩＶ−４）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む）、ラウス肉腫ウイルス、鳥白血病ウイルス、及び鳥骨髄芽球症ウイルス、鳥癌ミルヒルウイルス２、鳥骨髄細胞腫ウイルス２９、鳥肉腫ウイルスＣＴ１０、藤波肉腫ウイルス、ＵＲ２肉腫ウイルス、Ｙ７３肉腫ウイルス、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス、ラングールウイルス、メイソン・ファイザーサルウイルス、リスザルレトロウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、モルモットＣ型オンコウイルス、ブタＣ型オンコウイルス、フィンケル・ビスキス・ジンキンスマウス肉腫ウイルス、ガードナー・アーンスタインネコ肉腫ウイルス、ハーディ・ズッカーマンネコ肉腫ウイルス、ハーヴェー・マウス肉腫ウイルス、Ｋｉｒｓｔｅｎマウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、スナイダー・シーレンネコ肉腫ウイルス、ウーリーサル肉腫ウイルス、鳥細網内皮症ウイルス（ニワトリ合胞体ウイルス、細網内皮症ウイルス、及びトレーガーアヒル脾臓壊死ウイルスを含むが、これらに限定しない）、ウシ白血病ウイルス、及びヒトＴリンパ球向性ウイルスを含むが、これらに限定しない。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明のエピソームウイルスは、対象の腸又は肝細胞には感染しない。
【００１７】
本明細書中で使用する用語「持続性」又は「持続する」は、エピソームウイルスが対象内で維持される能力を指す。ウイルスの持続性を低下させることの意味は、ウイルスにより起こされる即時の症状、ならびにウイルス感染に関連付けられる特定のイベント又は状態も排除されうるということである。
【００１８】
本明細書中で使用する用語「発現」は、メッセンジャー又はプレゲノムのいずれかでウイルスＲＮＡ中に転写され、ウイルスタンパク質の合成及び感染性粒子の産生に導くＤＮＡウイルスゲノムの能力を指す。
【００１９】
本発明の方法は、このように、上に記載するエピソームウイルスにより媒介されるウイルス感染の処置のために特に適切である。特に、本発明の方法は、活動性、潜在性、又は再活性化感染の処置のために特に適切である。本明細書中で使用する「活動性感染」は、細胞中のエピソームウイルスの複製を指す。「エピソームウイルスの再活性化」は、潜在性感染を有する対象における活動性感染の発生を指す。本明細書中で使用する「潜在性感染」は、活動性でない感染を指す。潜在性感染を有する又は有することが疑われる対象は、エピソームウイルスに曝露された、及び／又はエピソームウイルスＤＮＡ及び／又は抗ウイルス抗体の存在が臨床的に検出された対象を含む。
【００２０】
本明細書中で使用する用語「処置」又は「処置する」は、予防的又は防止的処置、ならびに治癒的又は疾患修飾処置の両方を指し、疾患に罹患するリスクがある又は疾患に罹患した疑いのある患者、病気である、又は疾患もしくは医学的状態に苦しんでいると診断された患者の処置を含み、臨床的再発の抑制を含む。障害又は再発障害の１つ又は複数の症状を防止する、治癒する、その発症を遅延する、重症度を低下する、又は寛解するために、あるいはそのような処置の非存在において予想されるものを超えて対象の生存を延長するために、処置を、医学的障害を有する又は最終的に障害を獲得しうる対象に施してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば治療の間に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンには、導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「導入レジメン」又は「導入期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に患者に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは（部分的又は全体的に）「負荷レジメン」を用いることがあり、それは、医師が維持レジメンの間に用いるよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与しうるよりも高頻度に薬物を投与すること、又はこれらの両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での患者の維持のために、例えば患者を長期間（月又は年）にわたり寛解に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンでは、継続治療（例、毎週、毎月、毎年などの定期的な間隔で薬物を投与すること）又は間欠療法（例、中断処置、間欠処置、再発時の処置、又は特定の所定の基準［例、疾患の発現など］の達成時の処置）を用いうる。
【００２１】
本発明の方法は、任意の対象で行ってもよい。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらにより好ましくはヒトである。対象は男性又は女性でありうるが、出生前（即ち、子宮内）、新生児、乳児、若年者、青年、成人、及び老人の対象を含む、任意の年齢でありうる。このように、一部の場合では、対象は妊娠している女性対象でありうる。
【００２２】
一部の実施形態では、対象は潜在性感染を有する、又はそれが疑われる。一部の実施形態では、対象は活動性感染と診断されている。
【００２３】
一部の実施形態では、対象は免疫不全である。免疫不全の個人は、ＡＩＤＳ患者；慢性免疫抑制処置レジメンを受けている患者（例えば臓器移植患者など）；癌、例えばホジキン病又はリンパ腫などを伴う患者；及びミコフェノール酸モフェチル又は生物製剤（例えばナタリズマブ、リツキシマブ、又はエファリズマブなど）で処置されている自己免疫状態を伴う患者を含むが、これらに限定されない。そのような自己免疫状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、及び全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）（ＳＬＥ）を含むが、これらに限定しない。潜在性ポリオーマウイルス感染を有する、又は有することが疑われる、弱った免疫系を伴う高齢患者も、ポリオーマウイルスに関連付けられる疾患を発生するリスクがある。
【００２４】
一部の実施形態では、対象は癌を有しており、細胞アブレーション治療（例えば化学療法又は放射線療法など）とともに投与される。本明細書中で使用する用語「癌」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、固形腫瘍及び血液伝播性腫瘍を含むが、これらに限定しない。用語「細胞アブレーション治療」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、いくつかの異なる機構を介して迅速に増殖する細胞に対して細胞破壊効果を誘導し、究極的には細胞周期停止及び／又は細胞アポトーシスに導く治療を指す。典型的には、細胞アブレーション治療は化学療法及び放射線療法を含む。本明細書中で使用する用語「放射線療法」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、一般的に悪性細胞を制御又は殺すための癌処置の一部としての電離放射線の医学的使用を指す。本明細書中で使用する用語「化学療法」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍成長を阻害する際に有効な化学療法剤の医学的使用を指す。
【００２５】
一部の実施形態では、対象は、免疫抑制剤を用いて投与される移植対象である。一部の実施形態において、移植対象は、腎臓、骨髄、肝臓、肺、胃、骨、精巣、心臓、膵臓、及び腸からなる群より選択される少なくとも１つの移植臓器を有する。一部の実施形態では、免疫抑制剤を必要とする対象について、本明細書中に記載する化合物は、免疫抑制剤との組み合わせにおいて（同時に又は連続して）投与してもよい。本明細書中で使用する用語「免疫抑制剤」は、対象の免疫系の活性を阻害又は防止する任意の薬剤を指す。免疫抑制剤の非限定的な例は、ＣＤ２０、ＣＤ２５（例、バシリキシマブ又はダクリズマブ）、又はＣＤ３（例、ムロモナブ）に特異的に結合する抗体（例、完全ヒト又はヒト化抗体）；カルシニューリン阻害剤（例、シクロスポリン、ピメクロリムス、タクロリムス、シロリムス、及び／又はシクロスポリン）；インターフェロン（例：インターフェロンβ）；ステロイド（例、当技術分野において公知の又は本明細書中に記載するステロイドのいずれか）；インターロイキン１受容体アンタゴニスト；ミオフェノール酸モフェチル；Prograph（登録商標）；アザチオプリン；メトトレキサート；及び／又はＴＮＦ−ａ結合タンパク質（例、抗体及び／又は可溶性ＴＮＦ−ａ受容体、例、インフリキシマブ、エタネルセプト、及び／又はアダリムマブ）を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明の方法は、高度に活性な抗レトロウイルス処置（ＨＡＡＲＴ）後にＨＩＶリザーバーを根絶するために特に適している。本明細書中で使用する用語「リザーバー」は、静止しているＣＤ４＋Ｔ細胞中に存在する潜在性だが複製能力のあるＨＩＶ−１プロウイルスを指す。本明細書中で使用する用語「ＨＡＡＲＴ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、任意の高度に活性な抗レトロウイルス治療を指し、より最近では本明細書中で「ＣＡＲＴ」と互換的に使用される併用抗レトロウイルス治療、又は「ｃＡＲＴ」として言及される。ＨＡＡＲＴ及びｃＡＲＴも本明細書中で互換的に使用する。ＨＡＡＲＴは、組み合わせにおける３つ又はそれ以上の抗レトロウイルス薬物を指しうるが、通常は１つのプロテアーゼ阻害剤及び２つ又は３つの逆転写酵素阻害剤を含む。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「ＦＸＲ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ファルネソールの超生理学的レベルにより活性化される核受容体であるファルネソイドＸ受容体を指す（Forman et al., Cell, 1995, 81, 687-693）。ＦＸＲは、ＮＲ１Ｈ４、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ１４）、及び胆汁酸受容体（ＢＡＲ）としても公知である。保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びＣ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含み、ＦＸＲは、多様な天然胆汁酸（ＢＡ）（一次胆汁酸ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）ならびにそのタウリン及びグリシン抱合体を含む）に結合し、それらにより活性化される（Makishima et al., 1999；Parks et al., 1999；Wang et al., 1999）。ＦＸＲについてのヒトポリペプチド配列は、受入番号ＮＭ＿００５１２３、Ｑ９６ＲＩ１、ＮＰ＿００５１１４  ＡＡＭ５３５５１、ＡＡＭ５３５５０、ＡＡＫ６０２７１の下でヌクレオチド及びタンパク質データベース中に寄託されている。
【００２８】
本明細書で使用する用語「ＦＸＲアゴニスト」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、特にファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を標的として選択的に結合することにより機能し、Maloney et al.（J. Med. Chem. 2000, 43: 2971-2974）において記載されているアッセイにおいてバックグラウンドを少なくとも４０%上回りＦＸＲを活性化する化合物を指す。一部の実施形態では、本発明のＦＸＲアゴニストは選択的ＦＸＲアゴニストである。本明細書中で使用する用語「選択的ＦＸＲアゴニスト」は、ＬＸＲα、ＬＸＲβ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδ、ＲＸＲα、ＲＡＲγ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、ＥＲα、ＥＲβ、ＧＲ、ＡＲ、ＭＲ、及びＰＲからなる核受容体のパネルの１つ又は複数、理想的には実質的に全てに有意な交差反応性を示さないＦＸＲアゴニストを指す。有意な交差反応性を決定する方法は、J. Med. Chem. 2009, 52, 904-907において記載されている。
【００２９】
ＦＸＲアゴニストは当業者に周知である。例えば、当業者は以下の論文からＦＸＲアゴニストを容易に特定しうる：
【表１】
2020515564.tif 000002
2020515564.tif 000003
2020515564.tif 000004
2020515564.tif 000005
2020515564.tif 000006
【００３０】
典型的には、ＦＸＲアゴニストは、ステロイドＦＸＲアゴニスト及び非ステロイドＦＸＲアゴニストのクラスを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、以下の特許公報において開示されているＦＸＲモジュレーターとして作用する小分子化合物より選択する：ＥＰ１３９２７１４；ＥＰ１５６８７０６；ＥＰ２１２８１５８、ＥＰ２２８９８８３、ＪＰ２００５２８１１５５；ＵＳ２００３０２０３９３９；ＵＳ２００５０８００６４；ＵＳ２００６１２８７６４；ＵＳ２００７００１０５６２；ＵＳ２００７００１５７９６；ＵＳ２００８００３８４３５；ＵＳ２００８０３００２３５；ＵＳ２００９００６２５２６、ＵＳ２００９０１６３５５２、ＵＳ２０１０００９３８１８、ＵＳ２０１００１８４８０９；ＵＳ２０１１００７７２７３、ＵＳ２０１１０１０５４７５；ＵＳ６９８４５６０；ＵＳ７６７１０８５、ＷＯ２００００３７０７７；ＷＯ２０００４０９６５；ＷＯ２０００７６５２３；ＷＯ２００１０１７９９４；ＷＯ２００３０１５７７１；ＷＯ２００３０１６２８０；ＷＯ２００３０１６２８８；ＷＯ２００３０３０６１２；ＷＯ２００３０６００７８；ＷＯ２００３０８０８０３；ＷＯ２００３０９０７４５；ＷＯ２００４００７５２１；ＷＯ２００４０４６１６２；ＷＯ２００４０４８３４９；ＷＯ２００５０８２９２５；ＷＯ２００５０９２３２８；ＷＯ２００５０９７０９７；ＷＯ２００６０２０６８０；ＷＯ２００７０７６２６０；ＷＯ２００７０７６２６０；ＷＯ２００７０９２７５１；ＷＯ２００７１４０１７４；ＷＯ２００７１４０１８３；ＷＯ２００８０００６４３；ＷＯ２００８００２５７３；ＷＯ２００８０２５５３９；ＷＯ２００８０２５５４０；ＷＯ２００８０５１９４２；ＷＯ２００８０７３８２５；ＷＯ２００８１５７２７０；ＷＯ２００９００５９９８；ＷＯ２００９０１２１２５、ＷＯ２００９０２７２６４；ＷＯ２００９０６２８７４、ＷＯ２００９０８０５５５；ＷＯ２００９１２７３２１；ＷＯ２００９１４９７９５、ＷＯ２０１００２８９８１；ＷＯ２０１００３４６４９、ＷＯ２０１００３４６５７、ＷＯ２０１００６９６０４、ＷＯ２０１１０２０６１５、ＷＯ２０１３００７３８７、及びＷＯ２０１３０３７４８２。
【００３２】
ＦＸＲアゴニストの具体例は、ＧＷ４０６４（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３７０７７において又はＵＳ２００７／００１５７９６において開示されている）、６−エチルケノデオキシコール酸（６ＥＣＤＣＡ）、特に３α、７α−ジヒドロキシ７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイック酸（ＩＮＴ−７４７としても言及される）；６−エチルウルソデオキシコール酸、ＩＮＴ−１１０３、ＵＰＦ−９８７、ＷＡＹ−３６２４５０、ＭＦＡ−１、ＧＷ９６６２、Ｔ０９０１３１７、フェキサラミン、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、  タウロジヒドロフシジン酸塩、タウロデオキシコール酸、コール酸塩、グリココール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸、７−Ｂ−メチルコール酸、メチルリトコール酸を含むが、これらに限定しない。
【００３３】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、ＧＷ４０６４、６ＥＣＤＣＡ、及びＣＡＳ登録番号１１９２１７１−６９−９（ＷＯ２００９１２７３２１において記載され、ＰＸＸ００７とも呼ばれる）により特定される化合物からなる群より選択する：
【化１】
2020515564.tif 000007
【００３４】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、以下の式を有する化合物である：
【化２】
2020515564.tif 000008
【００３５】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、以下の式を有する化合物である：
【化３】
2020515564.tif 000009
【００３６】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、以下の式を有する化合物である：
【化４】
2020515564.tif 000010
【００３７】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、化学構造６α−エチル−ケノデオキシコール酸を有する半合成胆汁酸類似体であるオベチコール酸（ＯＣＡと略される）である。この化合物はＩＮＴ−７４７としても公知である。
【００３８】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、以下からなる群より選択する：
【化５】
2020515564.tif 000011
【００３９】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、ＷＯ２０１３００７３８７において開示されている化合物からなる群より選択する、即ち：
【化６】
2020515564.tif 000012
2020515564.tif 000013
2020515564.tif 000014
【００４０】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、ＷＯ２００９１４９７９５において開示されている化合物からなる群より選択する、即ち：
【化７】
2020515564.tif 000015
【００４１】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、ＷＯ２００８０２５５３９において開示されている化合物から成る群より選択する、即ち：
【化８】
2020515564.tif 000016
【００４２】
一部の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、ＷＯ２００８０２５５４０において記載されている化合物からなる群より選択する、即ち：
【化９】
2020515564.tif 000017
【００４３】
本発明において有用な追加のＦＸＲアゴニストは、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０９４７に記載されているようなアッセイに基づいて当業者によりルーチン的に同定することができ、その教示は、その全体を参照により本明細書中に組み入れる。典型的には、ＦＸＲアゴニストは、核内受容体ペプチドアッセイを使用して同定する。このアッセイでは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用し、推定リガンドがＦＸＲに結合するか否かをテストするために使用することができる。ＦＲＥＴアッセイは、リガンドが転写活性化のために要求されるコアクチベータータンパク質との相互作用を促進する核内受容体における立体構造変化を誘導するという原理に基づいている。ＦＲＥＴでは、蛍光ドナー分子は非放射性双極子間相互作用を介してアクセプター分子（通常は蛍光分子である）にエネルギーを移動させる。あるいは、ＦＸＲリガンドの活性を、典型的なコンセンサスＦＸＲ応答エレメントの１つ又はいくつかのコピーを含むプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子の発現に対するこれらのリガンドの効果をモニターすることにより特定する。この後のアッセイは、レポーター遺伝子、典型的にはルシフェラーゼ遺伝子の前にプロモーターを含み、細菌において簡単に増幅し、哺乳動物細胞においてトランスフェクトすることができるプラスミド構築物に頼る。このアッセイでは、ＦＸＲ転写活性に対するリガンドの結果を包括的に評価することができ、それはポジティブ（アゴニスト）又はネガティブ（アンタゴニスト）になることができる。
【００４４】
典型的には、本発明のＦＸＲアゴニストを、治療有効量で対象に投与する。上に記載するＦＸＲアゴニストの「治療有効量」により、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比でウイルス感染を処置するのに十分な量のＦＸＲアゴニストを意味する。しかし、本発明の化合物及び組成物の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療上有効な用量レベルは、多様な因子（処置されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられている特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与の時間、投与の経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置の期間；用いられる特定のアゴニストとの組み合わせにおいて使用される薬物；及び医学の分野において周知の同様の因子を含む）に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。しかし、産物の１日投与量は、成人１日当たり０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される患者への投与量の対症的な調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含む。医薬は典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。有効量の薬物は、通常、１日当たり０．０００２mg/kgから約２０mg/kg体重、特に１日当たり約０．００１mg/kgから７mg/kg体重の投与量レベルで供給する。
【００４５】
本発明のＦＸＲアゴニストは、医薬的に許容可能な賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス（例えば生分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、適当な場合に哺乳動物、特にヒトに投与した場合、有害反応、アレルギー反応、又は他の有害な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の種類の製剤補助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬品サポートとの混合物として動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態（例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒、及び経口懸濁液又は溶液など）、舌下及び頬投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与形態ならびに直腸投与形態を含む。ガレヌス適応を小腸又は結腸での特定の送達のために行ってもよい。好ましくは、医薬組成物は、注射することが可能な製剤用に医薬的に許容可能な溶媒を含む。これらは、特に等張、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）、又は乾燥、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、場合に依存し、滅菌水又は生理食塩水の添加時に、注射溶液の構成を可能にする。注射用途のための適切な医薬形態は、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、簡単な注射性が存在する程度まで流動的でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定していなければならず、微生物（例えば細菌や真菌など）の混入作用に対して保存されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩として本発明のＦＸＲアゴニストを含む溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は微生物の成長を防止するための保存剤を含む。本発明のＦＸＲアゴニストは、中性又は塩形態で組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、それは、無機酸（例えば塩酸又はリン酸など）、又は有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基（例えば、例、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄など）、及び有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散培地であってもよい。適した流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、分散液の場合では要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗可溶化薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合では、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によりもたらすことができる。滅菌注射溶液は、要求される量の活性ポリペプチドを、要求に応じて、上に列挙した種々の他の成分とともに適当な溶媒中に組み入れて、それに続く濾過滅菌により調製する。一般的に、分散液は、種々の滅菌有効成分を、基礎分散培地及び、上に列挙したものからの、要求される他の成分を含む滅菌溶媒中に組み入れることにより調製する。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、以前に滅菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望の成分をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥技術である。製剤化時に、溶液は、投与製剤に適合する様式で、治療的に有効な量で投与する。製剤は、種々の剤形、例えば上に記載する種類の注射液などで簡単に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液を、必要な場合には適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適切である。これに関連して、用いることができる滅菌水性培地は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１つの投与量を１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注射液に加えるか、又は提案された注入部位に注射する。投与量における一部の変動が、処置されている対象の状態に依存して必ず生じる。投与に関与する者は、任意の事象において、個々の対象について適当な用量を決定する。本発明のＦＸＲアゴニストは、約０．０００１から１．０ミリグラム、又は約０．００１から０．１ミリグラム、又は約０．１から１．０、又はさらには約１０ミリグラム／用量などを含むように治療混合物内で製剤化してもよい。複数用量を投与することもできる。非経口投与（例えば静脈内又は筋肉内注射など）用に製剤化された本発明のＦＸＲアゴニストに加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；及び現在使用されている他の形態を含む。
【００４６】
本発明を、以下の図及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１：Ｈ９細胞株の増殖及び細胞死に対するＦＸＲリガンドの効果。Ｈ９細胞を１×１０６個細胞/mLで開始する標準ＲＰＭＩ１６４０中で増殖させ、ＧＷ４０６４もしくはTakeda（１０μM）、又はＤＭＳＯ溶媒だけで処理した又は処理しなかった。細胞数及び生存率をCellometer Nexcelom Auto 1000デバイスにより週３回測定した後、細胞培養物（細胞及び培地）の容量を除去し、細胞濃度を約１×１０６個細胞/mLに維持するために分子を伴う新鮮培地により置き換えた。細胞増殖は、各々の培地交換で１つの播種細胞から由来する細胞数を算出する細胞増殖因子により定義した（上パネル）。培地中に放出されたＬＤＨ活性の投与量によって細胞死率をモニターした（下パネル）。
【図２】図２：活性化ＰＢＭＣの生存及び死に対するＦＸＲリガンドの効果。ＰＨＡ／ＩＬ２活性化ＰＢＭＣを、ＩＬ２を補充し、ＧＷ４０６４もしくはTakeda（１０μM）、又はＤＭＳＯ溶媒だけで処理した又は処理していない標準ＲＰＭＩ１６４０中に１×１０６個細胞/mLで播種し、１週間にわたり保管した。一定分量を採取し、細胞を、Cellometer Nexcelom Auto 1000デバイスを使用してカウントし、細胞増殖因子を、各々の培地交換に図１のように算出した（上パネル）。培地中に放出されたＬＤＨ活性の投与量によって細胞死率をモニターした（下パネル）。
【図３−１】図３：ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞の細胞生存率及びｐ２４産生に対するＦＸＲリガンドの効果。３０００万個のＨ９細胞を、標準ＲＰＭＩ中のＨＩＶ−１  ＮＬ４．３ウイルスストックの１／１００希釈液１０mL中で６時間にわたりインキュベートした。細胞を次にＲＰＭＩ中で２回洗浄し、標準ＲＰＭＩ中に１mL当たり１×１０６個細胞で播種し、１０mL培養液中のＧＷ４０６４もしくはTakeda（両方とも１０μMで）、又はＤＭＳＯ溶媒だけで処理した。示した時間に、細胞数及び生存率をCellometer Nexcelom Auto 1000デバイスにより決定し、細胞培養物（細胞及び培地）の容量を除去し、細胞濃度を約１×１０６個細胞/mLに維持するために分子を伴う新鮮培地により置き換えた。１つの播種細胞からの細胞の数により定義される細胞増殖を各々の培地交換で算出した。除去された無細胞培地を、感染力価決定及びｐ２４投与まで−２０℃で保存した。上パネル及び中央パネルは、感染後の示した時間での各々の条件における細胞増殖と細胞生存率の割合をそれぞれ示し、下パネルはｐ２４の累積産生を示す。
【図３−２】図３：ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞の細胞生存率及びｐ２４産生に対するＦＸＲリガンドの効果。３０００万個のＨ９細胞を、標準ＲＰＭＩ中のＨＩＶ−１  ＮＬ４．３ウイルスストックの１／１００希釈液１０mL中で６時間にわたりインキュベートした。細胞を次にＲＰＭＩ中で２回洗浄し、標準ＲＰＭＩ中に１mL当たり１×１０６個細胞で播種し、１０mL培養液中のＧＷ４０６４もしくはTakeda（両方とも１０μMで）、又はＤＭＳＯ溶媒だけで処理した。示した時間に、細胞数及び生存率をCellometer Nexcelom Auto 1000デバイスにより決定し、細胞培養物（細胞及び培地）の容量を除去し、細胞濃度を約１×１０６個細胞/mLに維持するために分子を伴う新鮮培地により置き換えた。１つの播種細胞からの細胞の数により定義される細胞増殖を各々の培地交換で算出した。除去された無細胞培地を、感染力価決定及びｐ２４投与まで−２０℃で保存した。上パネル及び中央パネルは、感染後の示した時間での各々の条件における細胞増殖と細胞生存率の割合をそれぞれ示し、下パネルはｐ２４の累積産生を示す。
【図４−１】図４：ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞によるＨＩＶ−１ウイルス産生に対するＦＸＲリガンドの効果。細胞を図３のように調製し、処理した。上パネル及び中央パネルは、感染後の示した時間における各々の条件についての感染力価、無感染培地１mL当たりの感染性粒子の実際の数を、対数又は線形でプロットして示し、それぞれ対数又は線形Ｙスケールでプロットしている。下パネルは、ｐ２４  １ng当たりの感染性粒子の比率を示す。
【図４−２】図４：ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞によるＨＩＶ−１ウイルス産生に対するＦＸＲリガンドの効果。細胞を図３のように調製し、処理した。上パネル及び中央パネルは、感染後の示した時間における各々の条件についての感染力価、無感染培地１mL当たりの感染性粒子の実際の数を、対数又は線形でプロットして示し、それぞれ対数又は線形Ｙスケールでプロットしている。下パネルは、ｐ２４  １ng当たりの感染性粒子の比率を示す。
【図５Ａ】図５：感染Ｈ９細胞におけるＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４用量反応。細胞を図３のように処理及び感染させ、０．２、１、及び５μMでのＧＷ４０６４、及びＤＭＳＯ溶媒だけの効果を、細胞生存率（Ａ）、感染性ビリオンの産生、感染力価（Ｂ）、及び示した時間でのｐ２４（Ｃ）１ng当たりの感染単位の比率により定義される特定の感染力についてテストした。
【図５Ｂ】図５：感染Ｈ９細胞におけるＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４用量反応。細胞を図３のように処理及び感染させ、０．２、１、及び５μMでのＧＷ４０６４、及びＤＭＳＯ溶媒だけの効果を、細胞生存率（Ａ）、感染性ビリオンの産生、感染力価（Ｂ）、及び示した時間でのｐ２４（Ｃ）１ng当たりの感染単位の比率により定義される特定の感染力についてテストした。
【図５Ｃ】図５：感染Ｈ９細胞におけるＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４用量反応。細胞を図３のように処理及び感染させ、０．２、１、及び５μMでのＧＷ４０６４、及びＤＭＳＯ溶媒だけの効果を、細胞生存率（Ａ）、感染性ビリオンの産生、感染力価（Ｂ）、及び示した時間でのｐ２４（Ｃ）１ng当たりの感染単位の比率により定義される特定の感染力についてテストした。
【図６】図６：１名のドナーからの活性化ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲリガンドの効果。３０００万個のＰＨＡ及びＩＬ２活性化ＰＢＭＣを、標準ＲＰＭＩ中のＨＩＶ−１  ＮＬ４．３ウイルスストックの１／１００希釈液１０mL中で６時間にわたりインキュベートした。細胞を次にＲＰＭＩ中で２回洗浄し、ＩＬ２を補充した標準ＲＰＭＩ中に１mL当たり１×１０６個細胞で播種し、ＧＷ４０６４もしくはTakeda（両方とも１０μMで）、又はＤＭＳＯ溶媒だけで処理した。一定分量を感染後の示した時間にサンプリングし、感染力価決定及びｐ２４投与まで−２０℃で保存した。上パネルは、全ての条件について安定したままの経時的な総細胞数の進化を示す。中央パネルは、示した時間での累積ｐ２４産生を示し、下パネルは１mL当たりの感染性粒子としての感染力価を示す。
【図７−１】図７：第２ドナーからの活性化ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲリガンドの効果。活性化ＰＢＭＣを、ＩＬ２が補充された新鮮なＲＰＭＩ及び示した分子を７日目に加えたことを除き、図６のように処理した。上パネルは、経時的な及び示したＦＸＲリガンド又は溶媒による総細胞数における変動を示す。中央パネルは、３つの実験条件における細胞生存率の進化を例証し、下パネルは、対数Ｙスケールを用いてｐ２４産生をプロットしている。
【図７−２】図７：第２ドナーからの活性化ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲリガンドの効果。活性化ＰＢＭＣを、ＩＬ２が補充された新鮮なＲＰＭＩ及び示した分子を７日目に加えたことを除き、図６のように処理した。上パネルは、経時的な及び示したＦＸＲリガンド又は溶媒による総細胞数における変動を示す。中央パネルは、３つの実験条件における細胞生存率の進化を例証し、下パネルは、対数Ｙスケールを用いてｐ２４産生をプロットしている。
【図８】図８：Ｈ９及びＰＢＭＣはＦＸＲを発現する。Ｈ９及び新鮮又はＰＨＡ−ＩＬ２活性化ＰＢＭＣの全溶解物を、ＦＸＲの存在についてウエスタンブロットにより分析した。同じ量の細胞溶解物をゲル上に沈着させ、アクチン染色はアクチンバンドの同様の強度を示した。ＦＸＲに対応するバンドがＨ９及び活性化ＰＢＭＣ溶解物において検出されたが、しかし、新鮮なＰＢＭＣではわずかにしか検出されなかった。ＦＸＲ発現は、ＰＢＭＣよりもＨ９において高いように見える。
【図９】図９：ｓｈＦＸＲレンチウイルスベクターを用いたＦＸＲ発現抑制Ｈ９細胞株の生成。細胞をｓｈＦＸＲレンチウイルスベクターで形質導入し、材料及び方法のセクションにおいて記載しているように選択した。形質導入細胞及び対照細胞を、１０μMのＧＷ４０６４の存在又は非存在において３日間にわたり培養した。細胞を次に溶解し、ＦＸＲ発現についてウエスタンブロットにより分析した。ＦＸＲ発現は有意に減少し、ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４によりさらに阻害される。
【図１０】図１０：Ｈ９細胞におけるＦＸＲ発現抑制によって、ＨＩＶ−１  ＮＬ４．３複製に対するＦＸＲアゴニストの効果が抑制される。ｓｈＦＸＲ及びｓｈＣｏｎｔ  Ｈ９細胞に、ＮＬ４．３ストックウイルスを１／１００希釈で６時間にわたり感染させた。細胞を次に洗浄し、溶媒だけ又はＧＷ４０６４を１μM及び５μMで補充した新鮮な培地（感染力価決定用）で１×１０６個細胞/mLで播種した。示した日に、細胞をカウントし、細胞懸濁液の算出した容量を各々の条件から除去し、細胞濃度を約１×１０６個/mLに保った。分子を伴う等容量の新鮮な培地を細胞バイアル中に加えた。ｐ２４濃度（Ａ）及びＨＩＶ力価（Ｂ）を各々の条件について各々の時間点で決定した。ｐ２４及びＨＩＶの力価を、４、７、及び９日にＤＭＳＯ処理したｓｈＣｏｎｔ  Ｈ９において評価した値と比べて相対的に表す。バーの上にあるアスタリスクの数は、統計的ｐ値を反映する；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１
【図１１Ａ】図１１：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の潜在性感染８．４及び１５．４  Ｊ−Ｌａｔクローンに対する効果。細胞当たり１つのサイレント組込みプロウイルスコピーを含む８．４及び１５．４クローンを、０．５ng/mLのＴＮＦα単独又は５μMのＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４もしくは６ＥＣＤＣＡの組み合わせで刺激した。プロウイルスの再活性化の結果としてＧＦＰを発現した細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ａ１及びＡ２）により定量化した。細胞生存率及びｐ２４産生をそれぞれパネルＢ１及びＢ２、ならびにＣ１及びＣ２に示す。
【図１１Ｂ】図１１：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の潜在性感染８．４及び１５．４  Ｊ−Ｌａｔクローンに対する効果。細胞当たり１つのサイレント組込みプロウイルスコピーを含む８．４及び１５．４クローンを、０．５ng/mLのＴＮＦα単独又は５μMのＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４もしくは６ＥＣＤＣＡの組み合わせで刺激した。プロウイルスの再活性化の結果としてＧＦＰを発現した細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ａ１及びＡ２）により定量化した。細胞生存率及びｐ２４産生をそれぞれパネルＢ１及びＢ２、ならびにＣ１及びＣ２に示す。
【図１１Ｃ】図１１：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の潜在性感染８．４及び１５．４  Ｊ−Ｌａｔクローンに対する効果。細胞当たり１つのサイレント組込みプロウイルスコピーを含む８．４及び１５．４クローンを、０．５ng/mLのＴＮＦα単独又は５μMのＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４もしくは６ＥＣＤＣＡの組み合わせで刺激した。プロウイルスの再活性化の結果としてＧＦＰを発現した細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ａ１及びＡ２）により定量化した。細胞生存率及びｐ２４産生をそれぞれパネルＢ１及びＢ２、ならびにＣ１及びＣ２に示す。
【図１１Ｄ】図１１：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の潜在性感染８．４及び１５．４  Ｊ−Ｌａｔクローンに対する効果。細胞当たり１つのサイレント組込みプロウイルスコピーを含む８．４及び１５．４クローンを、０．５ng/mLのＴＮＦα単独又は５μMのＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４もしくは６ＥＣＤＣＡの組み合わせで刺激した。プロウイルスの再活性化の結果としてＧＦＰを発現した細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ａ１及びＡ２）により定量化した。細胞生存率及びｐ２４産生をそれぞれパネルＢ１及びＢ２、ならびにＣ１及びＣ２に示す。
【図１１Ｅ】図１１：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の潜在性感染８．４及び１５．４  Ｊ−Ｌａｔクローンに対する効果。細胞当たり１つのサイレント組込みプロウイルスコピーを含む８．４及び１５．４クローンを、０．５ng/mLのＴＮＦα単独又は５μMのＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４もしくは６ＥＣＤＣＡの組み合わせで刺激した。プロウイルスの再活性化の結果としてＧＦＰを発現した細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ａ１及びＡ２）により定量化した。細胞生存率及びｐ２４産生をそれぞれパネルＢ１及びＢ２、ならびにＣ１及びＣ２に示す。
【図１１Ｆ】図１１：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の潜在性感染８．４及び１５．４  Ｊ−Ｌａｔクローンに対する効果。細胞当たり１つのサイレント組込みプロウイルスコピーを含む８．４及び１５．４クローンを、０．５ng/mLのＴＮＦα単独又は５μMのＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４もしくは６ＥＣＤＣＡの組み合わせで刺激した。プロウイルスの再活性化の結果としてＧＦＰを発現した細胞の割合を、フローサイトメトリー（Ａ１及びＡ２）により定量化した。細胞生存率及びｐ２４産生をそれぞれパネルＢ１及びＢ２、ならびにＣ１及びＣ２に示す。
【図１２】図１２：ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４によってＲＰＴＥＣのＢＫＶ複製が抑制される。ＲＰＴＥＣ細胞を２４ウェルプレート中に５×１０４個細胞／ウェルで播種し、ＲＥＢＭ＋２%ＦＣＳ（しかし、サプリメントを伴わない）で維持した。細胞にＢＫＶストック希釈液（１／１００）を４時間にわたり感染させ、次にＤＭＥＭで洗浄した。１mL/ウェルのＲＥＢＭ＋２%ＦＣＳ及びＧＷ４０６４又は溶媒を加えた。細胞上清中のＢＫＶ産生を感染後３日目及び５日目にｑＰＣＲによりモニターした。１０μMのＧＷ４０６４での処理によって、感染後の両方の日の偽処理細胞と比較し、上清中のウイルス力価が１．５  Ｌｏｇ１０を上回り低下した（ｐ＜１×１０−４）。標準偏差は２%未満であり、次にマーク内にある。
【００４８】
実施例：
材料＆方法
細胞株
Ｈ９細胞株は、ＨＩＶ−１複製のための許容性について選択されたＴリンパ腫Ｈｕｔ  ７８細胞株のクローン誘導体である。細胞を、１０%ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、及び抗生物質（標準ＲＰＭＩ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で０．５〜１．５×１０６個細胞/mLの範囲の濃度で５%ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。
【００４９】
ＨＥＫ２９３Ｔは、ＳＶ４０  Ｔ抗原についての温度感受性遺伝子が挿入されたヒト胎児腎臓２９３細胞株の誘導体である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０%ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５%ＣＯ２下、３７℃で維持した。
【００５０】
Ｖｅｒｏ細胞株は、正常な成体アフリカミドリザルの腎臓から開始した。Ｖｅｒｏ細胞を、１０%ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５%ＣＯ２下、３７℃で維持した。
【００５１】
ヒトＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ−Ｐ４細胞、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋  ＨＩＶ−１ＬＴＲ−β−ｇａｌ細胞（ＭＡＧＩ）を、１０%ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で５%ＣＯ２下、３７℃で維持した（１）。
【００５２】
以前にＪＣ５３−ｂｌ（クローン１３）と命名されたＴＺＭ−ｂｌは、ＨｅＬａ細胞株である。ＴＺＭ−ｂｌは、以前にＪＣ５３−ｂｌ（クローン１３）と命名されており、ＨｅＬａ細胞株である。親細胞株（ＪＣ．５３）は、大量のＣＤ４及びＣＣＲ５を安定的に発現する。ＴＺＭ−ｂｌ細胞株は、ＨＩＣ−１プロモーターの制御下でルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の別々の組込みコピーを導入することにより、ＪＣ．５３細胞から生成した。ＴＺＭ−ｂｌ細胞株は、ＨＩＶ−１の多様な分離株を用いた感染に高度に感受性である。細胞を、１０%ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で５%ＣＯ２下、３７℃で維持した。
【００５３】
潜在性ＨＩＶ感染クローン８．４及び１５．４は、ＨＩＶを発現しないが、しかし、ホルボールエステル又はＴＮＦα（２）により転写的に活性化されることができる緑色蛍光タンパク質を発現する全長ＨＩＶゲノムでトランスフェクトされたｊｕｒｋａｔの潜在性集団から由来する。
【００５４】
初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）をLonza（スイス）から取得した。ＲＰＴＥＣはヒト腎近位尿細管から分離され、皮質及び糸球体からの上皮細胞の混合物である。細胞は、Lonza（スイス）からのサプリメント及び成長因子（ヒドロコルチゾン、ｈＥＧＦ、ＦＢＳ、エピネフリン、インスリン、トリヨードサイロニン、トランスフェリン、及びゲンタマイシン／アンホテリシン−Ｂ）を伴う腎上皮基礎培地（ＲＥＢＭ）中で提供者のプロトコールに従って成長させた。
【００５５】
細胞の生存率及び数を、製造者の推奨事項に従って、Cellometer Nexcelom Auto 1000（Bioscience）を用いたトリパンブルー色素排除により測定した。
【００５６】
細胞死を、Cytotoxicity DetectionキットPLUS（Roche）を用いて、細胞培養液中に放出された細胞内乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定することによりモニターした。
【００５７】
ヒト末梢血単核細胞の調製。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、「Etablissement Francais du Sang」（リヨン）で収集された健康なドナーからの献血から調製した。簡単には、１mM  ＥＤＴＡを伴う等容量のＰＢＳを血液に加えた。３５mLの希釈血液を次に、５０mLチューブ中の１５mLのFicoll（Eurobio）に重ねて、２０℃及び６２５ｇで２０分間にわたり遠心分離した。界面でのＰＢＭＣの細胞環を収集し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＭＣを次にPercoll勾配（GE Healthcare）で実行した；３mL  ＰＢＭＣ（２５〜３０×１０６個細胞/mL）を１５mLチューブ中の６mL  Percoll  ５０%に重ねた。２０℃及び７７０gで２０分間にわたる遠心分離後、主にＴ及びＢリンパ球ならびにＮＫ細胞で構成されるペレットを収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、再懸濁し、１０%ウシ胎児血清、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、及び抗生物質（標準培地）を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で１×１０６個細胞/mLに調整した  。
【００５８】
リンパ球の活性化
ＰＢＭＣ、１×１０６個細胞/mLを、ＰＨＡ  １０μg/mL及びＩＬ２  ２０U/mLを補充した標準培地中で４８時間にわたり活性化した。培地を次に１×１０６個細胞/mLの２０U/mL  ＩＬ２を伴う標準培地により交換した。刺激されたリンパ球を次に、感染及び処置の間に２０U/mL  ＩＬ２を伴う標準培地中で維持した。
【００５９】
レンチウイルスベクター、ｓｈＲＮＡならびにｓｈＦＸＲ及びｓｈＣｏｎｔＦＸＲ  Ｈ９細胞株の生成
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、０．０１%Ｌ−ポリリジン（Ｐ４８３２  Sigma）でコーティングした１０cm培養皿に播種し、８μgのｐＰＡＸ２、４μgのｐＶＳＶＧ、及び１０μgのｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ−ｓｈＦＸＲ又は１０μgのコントロールｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ−ｓｈＭａｆＧのプラスミド混合物を用いて５０%コンフルエンシーで２，５M  ＣａＣｌ２でトランスフェクトした（表１）。細胞を６時間後に洗浄し、培地を還元血清培地（Opti-MEM、Thermo Fisher Scientific）を用いて４０時間にわたり交換した。レンチウイルス粒子を、Vivaspin 20（VS2042 Sartorius）における４５００rpmで２０分間にわたる遠心分離により、透明な上清から濃縮した（０．４５μMフィルター）。
【００６０】
Ｈ９細胞には、２４時間にわたり濃縮ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ又はｓｈＦＸＲレンチウイルス粒子を播種した３日後に形質導入した。次に、細胞を洗浄し、培地を完全ＲＰＭＩ培地でさらに２４時間にわたり交換した。翌日、培地を３μg/mLピューロマイシンを含む標準培地で交換した。３μg/mLピューロマイシン選択は、実験の終わりまで維持した。
【００６１】
ウイルス
プラスミドｐＮＬ４−３は、Ｔ細胞指向性分離株ＮＬ４−３の感染性分子クローンである（３）。ウイルスストックを、製造者の手順に従って、JetPEI Polyplus-Transfection（Ozyme）試薬を使用して、プラスミドＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞中で調製した。トランスフェクション後３日目のウイルスを含む上清を遠心分離（１，０００×ｇ、５分）により清澄化し、０．４５μM孔サイズのフィルターを通じて濾過し、残留細胞及び残骸を除去した。ウイルスストックを分注し、−２０℃で保存し、標準的な手順を用いたＭＡＧＩ細胞での解凍後にタイターした。
【００６２】
ポリオーマウイルスＢＫＶ株Ｄｕｎｌｏｐを（４）に記載されているようにＶｅｒｏ細胞中で増幅させた。ストックウイルスの滴定は、ｑＰＣＲ、BK VirusR-gene（登録商標）、Argene（bioMerieux）により実施し、１×１０１１ゲノム等価物/mLで測定した。
【００６３】
化学薬品
ＧＷ４０６４［３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３−カルボキシ−２−クロロ−スチルベン−４−イル）−オキシメチル−５−イソプロピルイソオキサゾール］はＦＸＲアゴニスト（ＥＣ５０  ９０nM）であり、インビボ及びインビトロの両方で活性である（５）。限られた生物学的利用能を呈しているが、ＧＷ４０６４は強力で選択的なＦＸＲリガンドとして広範な使用を獲得しており、この分野において「参照化合物」の地位に達している。６−ＥＣＤＣＡ（６−エチル−ケノ−デオキシコール酸）は胆汁酸塩誘導体及び強力なＦＸＲアゴニスト（ＥＣ５０  ９９nM）であり、Sigma-Aldrichから入手した（６）。合成ＦＸＲアンタゴニストＣＡＳ９３６１２３−０５−６は、本明細書中でTakedaとして言及し（特許ＷＯ２００７０５２８４３  Ａ１  ２００７０５１０に記載されている；Takeda Pharmaceuticals、日本、大阪）は、Edelris（フランス、リヨン）により合成された。これらの化合物をＤＭＳＯ中に１０mMで溶解した。尋常性白癬（ＰＨＡ−Ｍ）からのレクチン、ヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）、及びＴＮＦαはSigma-Aldrichから購入した。
【００６４】
ウエスタンブロット
細胞（Ｈ９及びＰＢＭＣ）をＰＢＳで洗浄し、ペレット状にした。細胞ペレットを溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７，４）、ＥＤＴＡ  １mM、ＮａＣｌ  １８０mM、０．５%ＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤）中に４℃で２０分間にわたり溶解した。懸濁液を次に、１７０００gで２０分間にわたり４℃で遠心分離し、全細胞抽出物を調製した。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより決定した。
【００６５】
細胞溶解物を、４〜１２%Bis-Tris Mini Gel（NuPAGE（登録商標））で１×ＭＥＳ緩衝液（NuPAGE（登録商標）MES SDS Running Buffer）中に入れた。２００Ｖで３５分間にわたる電気泳動後、タンパク質を、iBlot（登録商標）Gel Transfer Stacks Nitrocellulose（Invitrogen）プロトコールに従ってニトロセルロース膜に転写した。膜を、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．１%〜０%脂肪乳５%中で２時間にわたり飽和させた。次に、膜を１μg/mLの抗ヒトＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４モノクローナル抗体（R&D Systems）を用いて室温で１時間にわたりプローブ化し、SuperSignal（登録商標）West-Maximum Sensitivity Substrate（ThermoFisher Scientific）を使用し、ペルオキシダーゼ結合AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）と０．０８μg/mLで１時間にわたり室温で反応させた。
【００６６】
ＨＩＶ−１  ｐ２４の定量化
ｐ２４の定量化を、製造者の指示に従って、ミニVIDAS自動化デバイス（bioMerieux）を使用し、HIV P24 IIキットで実施した。培養培地を遠心分離し、無細胞上清を、４%Ｔｗｅｅｎ  ２０を伴う等容量のＰＢＳの添加により投薬前に不活性化した。
【００６７】
ＨＩＶ−１滴定
感染細胞により産生された感染単位の滴定を、ＭＡＧＩ細胞又はＴＺＭ−ｂｌ細胞を使用して実施した。簡単には、連続希釈した上清を、１ウェル当たり１〜４×１０５個ＭＡＧＩ細胞を含む２４ウェルプレート中、又は１ウェル当たり１〜４×１０４個ＴＺＭ−ｂｌ細胞を含む９６ウェルプレート中に分配した。２日間の培養後、細胞を固定し、ベータ・ガラクトシダーゼ発現について染色し、青色染色された陽性細胞を顕微鏡検査によりカウントした。感染力価を次に、上清１mL当たりの感染単位として表した。あるいは、２日間の培養後のＴＺＭ−ｂｌ細胞を溶解し、化学発光活性を、照度計を使用して読み取った。対照細胞上清を並行して処理し、ベースライン発光を感染上清からの記録値から差し引いた。感染力価を次に、任意単位の発光活性として表した。
【００６８】
結果
ＦＸＲモジュレーターを用いた処理によって、リンパ芽球様Ｈ９又はＰＢＭＣ細胞の生存及び増殖は変化しない。
リンパ芽球様細胞株Ｈ９の及びＰＨＡ−ＩＬ２活性化ＰＢＭＣの増殖又は生存に対するＦＸＲリガンドの効果を最初にテストした。Ｈ９の増殖は、ＦＸＲリガンド、アゴニストＧＷ４０６４、及びアンタゴニストTakeda（１０μM）への２週間にわたる曝露により変化することはなく（図１、上パネル）、細胞培養培地中での乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出の有意な改変も観察されなかった（図１、下パネル）。驚くべきことに、細胞上清中へのＬＤＨ放出はＧＷ４０６４の存在においてさらに低いように見え、Ｈ９細胞についてのＧＷ４０６４の保護効果を示唆する。同様に、ＦＸＲリガンドは、１週間の観察にわたって安定したままの活性化ＰＢＭＣの数を改変せず、細胞溶解も誘導しなかった（図２）。従って、両方のＦＸＲリガンドでの処理によって、Ｈ９及びＰＢＭＣの増殖生存率又は細胞死率は有意に改変されなかった。
【００６９】
ＦＸＲリガンドでの処理によって、リンパ芽球様細胞株Ｈ９及びＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製及び細胞生存が調節される。
ＨＩＶ−１  ＮＬ４．３感染リンパ芽球様細胞株Ｈ９に対するＦＸＲアゴニスト及びアンタゴニストでの処理の効果を次にテストした。アゴニストＧＷ４０６４は、Ｈ９の増殖及び生存に強い影響を有していた（図３上及び中央パネル）；実際に、生細胞の細胞数及び割合は、偽処理細胞又はアンタゴニストで処理された細胞と比較して劇的に減少した。同時に、ＧＷ４０６４処理細胞によるＨＩＶ−１  ｐ２４の総産生が、感染後７日目にプラトーに達し、それは他の２つの条件において増加し続けた（図３右パネル）。最後に、感染性粒子の数/培地１mLにより測定される感染力価の動態は、処理に依存して大きく変動した。アゴニストＧＷ４０６４によって、５日目という早期に検出された感染性粒子の急速なバーストが誘導され、その後、初期ピーク後の低下を伴った（図４上及び中央パネル）。偽又はTakeda処理細胞の動態は、感染性粒子の産生においてより遅い増加を示したが、それは感染後１２日目にアゴニスト処理細胞よりも高いレベルでピークに達した。興味深いことに（図４下パネル）、ｐ２４  １ng当たりの感染性粒子の数は、ＧＷ４０６４処理細胞が、感染性ウイルス粒子の産生が、２つの他の条件において細胞により、より遅くより低レベルでピークに達した場合、非常に早期に効率的に感染性粒子を産生することを示した。全体として、これらのデータは、ＦＸＲアゴニストがウイルス複製の短時間で効率的な促進を誘導し、その後に迅速に大量の細胞死が続くことを示す。これらの効果によって、ＦＸＲアンタゴニスト又は溶媒で処理した細胞と比較し、ウイルス複製が全体的に大幅に低下する。
【００７０】
ＨＩＶ  ＮＬ４．３複製に対するＦＸＲアゴニストの効果は用量依存的である。細胞生存率は、溶媒だけの約７０%から５μM  ＧＷ４０６４で処理した場合の４０%に用量依存的な様式で減少した（図５Ａ）。０．２μMという低濃度が、細胞の生存率に対する効果を誘導するために十分であった。１１日目の全ての条件における生存率のリバウンドは、ウイルス複製のさらなるサイクルが細胞生存に影響を及ぼしうる前に、未感染細胞又は新たに感染した細胞の進行中の細胞増殖を反映している可能性が高い。ＧＷ４０６４の濃度を増加させることによって、７日目の偽処理細胞と比較し、全てのＧＷ４０６４投与で１つ上回るＬｏｇ１０だけ感染性粒子の産生が増加した（図５Ｂ）。感染性粒子の産生は次に、用量依存的な様式において偽処理細胞による産生を下回り下落し、５μMでマイナス１  Ｌｏｇ１０に達した。最後に、ＧＷ４０６４濃度を増加させることによって、ｐ２４の１ng当たりの感染性粒子の比率により記載するように、特定の感染性に対して用量依存的な二相性の効果を有した（図５Ｃ）。偽処理細胞と比較し、最初に初期の用量依存的な特異的感染性の増加があり、後者は９及び１１日目に急激な低下があった。興味深いことに、低下の速度は、用量が減少するにつれて遅くなるように見えた。しかし、全体的なＧＷ４０６４によって、ＨＩＶ−１複製が用量依存的な様式で抑制された。
【００７１】
同様の実験を、健康なドナーからのＰＨＡ−ＩＬ２活性化ＰＢＭＣを用いて実施した。２つの異なるドナーから調製したＰＢＭＣで得られたデータを例としてここに示す。第１のドナーからのＰＢＭＣでは、ＨＩＶ−１複製を感染後７日目前に検出できず、ＧＷ４０６４処理細胞では９日目の２つの他の条件よりも有意に増加した（図６）。しかし、最も高いｐ２４産生がＧＷ４０６４処理細胞培養中で観察された場合、感染性ビリオンは滴定アッセイの条件において観察できなかった。実際に、感染性ウイルス粒子の産生は、Takeda又は溶媒とインキュベートした細胞中だけで検出された。第２のドナーからのＰＢＭＣ（図７）では、感染は７日目と早期に検出され、ｐ２４産生が感染後の同じ日に第１のドナーよりも高いレベルに達した。注目すべきことに、Takedaを用いた処理によって、他の条件との比較においてｐ２４産生は遅延した。興味深いことに、観察期間の間でのＰＢＭＣの数は、ＧＷ４０６４の存在においてだけ経時的に減少し、生存細胞の割合の減少は、培養物をＦＸＲアゴニストで処理した場合により重要であった。これらのデータは、ＧＷ４０６４を用いた処理がＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣにおけるより高い細胞死率に関連付けられることを示す。再び、感染性粒子は、偽条件又はTakeda処理培養物中でだけ検出され、アッセイの条件におけるＧＷ４０６４培養物中では検出されなかった（示さず）。２人のドナー間での複製動態の違いは、ＨＩＶ−１感染へのドナー細胞の許容度の変動を反映している可能性が高い。全体として、これらのデータによって、Ｈ９細胞株で得られたものが確認され、ｐ２４産生の早期で迅速なブーストを伴い、次に細胞死、及び全体として感染性粒子の産生の強い低下が続いた。
【００７２】
Ｈ９及びＰＢＭＣによってＦＸＲが発現する。
ＦＸＲは、肝臓、腸、及び副腎において高度に発現している。それはまた、腎近位尿細管上皮細胞において高度に発現している（７、８）。反対に、リンパ系の細胞におけるＦＸＲの発現はあまり確立されていない。ＦＸＲは、Ｈ９細胞及び活性化ＰＢＭＣにおいて、ウエスタンブロット分析（図８）により全細胞ライセート中で検出された。バンドは、非活性化ＰＢＭＣではまったく検出されないか、又は非常に弱く検出される。この違いは、ＰＢＭＣ活性化によってＦＸＲ発現が誘導されること、又は活性化後のＣＤ４＋Ｔリンパ球の濃縮によって、これらの細胞におけるＦＸＲの検出が可能になることを示唆している。
【００７３】
ＨＩＶ−１複製に対するＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の効果は、ＦＸＲ発現の非存在において消失する。
ｓｈＦＸＲレンチウイルスベクターを使用し、ｓｈＦＸＲ−Ｈ９細胞株を生成した。図９は、ＦＸＲがこの細胞株において実際に発現抑制されたことを示す。興味深いことに、コントロールＨ９の処理ならびにｓｈＦＸＲ−Ｈ９細胞の処理によって、ＦＸＲ発現がさらに低下し、ＦＸＲ活性化がそれ自体の発現を抑制することが示唆された。
【００７４】
ＧＷ４０６４（１μM）を用いたＨＩＶ−１  ＮＬ４．３を伴うｓｈＣｏｎｔ−Ｈ９細胞の処理によって、感染後４日目及び７日目にｐ２４及び感染性ウイルス粒子の初期産生の増加に導かれる（図１０Ａ、Ｂ、及びＣ）。ウイルス産生のこの初期ブーストには、９日目でのｐ２４濃度及び感染力価の強い低下が続いた。ＧＷ４０６４処理はｓｈＦＸＲ−Ｈ９細胞中でのウイルス産生に対する効果を有さず、この分子の効果がＦＸＲ活性化に実際に依存していることを明確に示している。興味深いことに、ＧＷ４０６４は既に１μMの感染性粒子の産生に対するその最大の効果に達しているように見えた。
【００７５】
ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４又は６−ＥＣＤＣＡは潜在性プロウイルスの再活性化に寄与する。
潜在性感染細胞に対するＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４及び６−ＥＣＤＣＡ（５μM）の効果を、（２）に記載されているＪｕｒｋａｔクローン８．４及び１５．４を使用してテストした。細胞を０．５ng/mLのＴＮＦαで処理した場合、ＧＦＰ＋再活性化細胞の割合は、両方のクローンについて刺激後３日目及び４日目にだけ増加した（図１１Ａ及びＢ）。しかし、再活性化によって、８．４よりも高い割合の１５．４細胞に達した。いずれかのアゴニストでの同時刺激によって、刺激後１日目に検出可能なより高い早期の再活性化が誘導された。再活性化は、クローン１５．４についての細胞死率の増加に関連付けられた（図１１Ｃ）。この効果はクローン８．４ではほとんど検出できなかった（図１１Ｄ）。なぜなら、生存細胞の分画が、ＴＮＦ処理細胞よりも同時処理条件において一貫してわずかに低い場合でさえ、再活性化細胞の分画が小さすぎてこの効果を検出可能にすることができなかった可能性が高い。細胞がＦＸＲアゴニストで同時刺激された場合、ｐ２４の産生も増加した（図１１Ｅ及びＦ）。再び、クローン１５．４はクローン８．４よりも反応性であった。
【００７６】
ＢＫＶを用いて感染させた初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）のＦＸＲリガンドを用いた処理の効果。
ＦＸＲ調節の効果を次に、高レベルのＦＸＲを発現する初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）におけるポリオーマウイルス科のメンバーであるＢＫＶの複製でテストした（データは示さず）。３及び５日間の処理後のＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４の効果の結果を図１２に示す。偽処理細胞と比較し、ＧＷ４０６４処理細胞の上清中に産生されたウイルスの力価の１．５  Ｌｏｇ１０を上回る低下が観察された。５日目の細胞数は、処理の有無にかかわらず、非感染細胞における有意に異なる細胞数を示さなかった（それぞれ４５２００＋／−１０８８８対５９４００＋／−７６６０、ｐ＞０．１３）。反対に、感染細胞の数は、未処理細胞よりも有意に低い処理細胞の数を示し（それぞれ４４８００＋／−７９８９対７４８００＋／−１３１６３、ｐ＝０．０２８）、ＦＸＲアゴニスト処理によって感染培養における細胞死率が増加したことを示唆している（示さず）。
【００７７】
結論：
驚くべきことに、本発明者らは、ＦＸＲアゴニストが、胆汁酸塩の代謝及び輸送に特化していない組織中でのウイルス複製に対して活性であることを見出した。この新たな知見は、核内受容体ＦＸＲが代謝を上回り大きく拡張する機能を有することを明確に示す。実際に、本発明者らは、複製がウイルスＤＮＡゲノム中間体を含むウイルスに対するＦＸＲアゴニスト処理の３つの主要な予想外の効果を見出した。第１に、ＦＸＲアゴニスト（アンタゴニストではない）によって、２つのパラゴンウイルスの複製が実質的に低下し、それは宿主細胞クロマチン中へのウイルスゲノム組込みの有無にかかわらず複製のＤＮＡエピソーム中間体を有し、ウイルスｍＲＮＡ転写のために宿主機構に頼る。実際に、ＨＩＶ−１に関しては、ＦＸＲアゴニストの効果は二相性であり、ウイルス産生の最初の一過性ブーストとそれに続くウイルス複製の急激で顕著な低下を伴う。第２に、別の重要で驚くべき知見は、抗ウイルス活性に関与するＦＸＲ活性化により誘導される高率の感染細胞死である。そして、第３に、予想外に、ＦＸＲアゴニストによってサイレントレトロウイルス組込みプロウイルスが再活性化される。再活性化には次に、再び細胞死率の増加が続く。ＦＸＲアゴニストにより誘導される効果におけるＦＸＲの関与の役割が、ＦＸＲ発現について無効化された細胞における任意の効果の欠如により実証されている。
【００７８】
効果が、非常に似ていない複製サイクルを伴う２つのウイルスで観察されるが、しかし、それらは、これらのＤＮＡゲノムが循環ビリオン中に含まれるゲノムから直接的に由来するか、又はゲノムＲＮＡからの逆転写により生成されたかにかかわらず、共通してエピソーム形態のＤＮＡの存在を有することが最も重要である。ウイルス転写は、このように、これらのＤＮＡ中間体から調節され、それらは宿主細胞のクロマチンに組込まれる場合と組込まれない場合がある。ＨＢＶ（その維持及び転写のために複製のエピソーム中間体に頼る別のウイルス）複製で観察される効果を考慮に入れて、これらの新たな知見は、リガンドを用いたＦＸＲ操作が、胆汁酸塩代謝に関与していない組織中でさえ、これらの特性を共有するウイルスでの感染を処置する際に興味深いことを示している。
【００７９】
重要な問題はまた、ＨＩＶ−１潜在性プロウイルスの再活性化及びＦＸＲアゴニスト処理により誘導される細胞死である。これらの知見はＨＩＶ−１感染について特に興味深く、それについては、主な治療目標が新たな直接的な抗レトロウイルス剤を開発することではもはやなく、多くの承認された直接作用型抗レトロウイルス剤は強力なウイルス抑制因子であるが、しかし、代わりに、ウイルスゲノムを永久に保有する細胞により特徴付けられるウイルスリザーバーを除去することである。潜在性プロウイルスの再活性化及び感染細胞の死の両方を好むことは、このように、感染細胞のリザーバーを減少させるための重要なツールである。
【００８０】
最先端のアッセイにより測定される不良な「アゴニスト」活性を伴う他のＦＸＲリガンドは、現在利用可能なＦＸＲアゴニストとして、又はそれよりも強力な抗ウイルス薬でありうる。ＨＩＶ又はエピソーム中間体を伴う他のウイルスに対する抗ウイルス活性に基づくアッセイは、抗ウイルス活性を伴うＦＸＲリガンドのスクリーニングのために使用することができる。あるいは、アゴニストが、ＦＸＲの制御下で、一部のこれまでに未同定の遺伝子の発現を誘導しうるが、それは染色体外ＤＮＡのクリアランスに関与しうる。
【００８１】
ＦＸＲアゴニストを用いた処置の適応を、このように、それらの複製を抑制し、感染細胞リザーバーを除去する目的を伴い、ヒトに感染する大半のＤＮＡウイルスに拡張させる。
【００８２】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献によって、本発明が関係する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示を参照により本開示中に組み入れる。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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