(57)【要約】本発明は、（ａ）アマトキシン；（ｂ）小分子のＰＳＭＡ標的部分；および（ｃ）任意に前記アマトキシンと前記小分子のＰＳＭＡ標的部分を連結するリンカ−を含むＰＳＭＡ標的コンジュゲ−トに関する。本発明はさらに、このようなコンジュゲ−トを含む医薬組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アマトキシン；（ｂ）２−［３−（１，３−ジカルボキシ−プロピル）ウレイド］ペンタン二酸（Ｉ）または６−アミノ−２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）ウレイド］−ヘキサン酸（ＩＩ）に基づくＰＳＭＡ結合部分；および（ｃ）前記アマトキシンと前記ＰＳＭＡ結合部分とを連結するリンカーを含むコンジュゲート。
【請求項２】
以下の構造ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩを有する請求項１に記載のコンジュゲート。
2020534319.tif 000210
（式中、各Ｌはリンカーであり、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｂは分岐リンカー要素であり、ＲはＨ、Ｃ１−６−アルキルおよびｐ−ブロモベンジルから選択される。）
【請求項３】
以下の構造ＶＩＩまたはＶＩＩＩを有する請求項１に記載のコンジュゲート。
2020534319.tif 000211
（式中、各Ｌがリンカーであり、Ａｍａがアマトキシンであり、Ｂが三官能性リンカー要素であり、ＥＭが半減期延長部分であり、ＲがＨ、Ｃ１−６−アルキルおよびｐ−ブロモベンジルから選択される）
【請求項４】
前記半減期延長部分が抗体、好ましくはヒト抗体のＦｃ部分を含む、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
各Ｌが独立に、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ１−、−Ｃ（Ｒ２）２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ３−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−フェニレン−、２，５−ジオキソ−１，３−ピロリジニレン、１，２，３−トリアゾリレン（式中、Ｒ１は、Ｃ１−６−アルキル、−ＣＯＯＨ、アミノ酸の側鎖のリストから選択され；Ｒ２は、Ｃ１−６−アルキルのリストから選択され；Ｒ３は、Ｃ１−６−アルキルのリストから選択され、Ｂは、オルニチン、リジン、１，３，４−三置換マレイミドおよび１，３，４−三置換スクシンイミドから選択され、ｎは６〜６０の範囲から独立して選択される整数である）のリストから選択されるｎ個のリンカー要素を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
各Ｌが独立に、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｙ、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｙ、Ｎ，Ｏ−二置換p−アミノベンジルオキシ、および２，５−ジオキソ−１，３−ピロリジニレン、１，２，３−トリアゾリレン（式中、ｘおよびｙは、２〜１２の範囲から独立に選択される整数である）から選択されるリンカー要素の１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前期ＰＳＭＡ結合部分が、構造ＩＩＩまたはＶまたはＶＩＩの場合にはカルボキサミド基−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−を介して、または構造ＩＶ、ＶＩまたはＶＩＩＩの場合にはカルボキサミド基−ＮＲ−Ｃ（＝Ｏ）−または尿素基−ＮＲ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−を介して、リンカーＬに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
構造ＩＩＩまたはＶまたはＶＩＩを有し、リンカーＬが構造
（Ａｏｃ要素）ａ−（ポリペプチド）ｂ−（アルキレン）ｃ−（ＰＥＧ）ｄ−（チオール要素）ｅ−アルキレン）ｆ−（自己崩壊要素）ｇ
(式中、ａからｇまでの因子の各々は独立に、前記因子の少なくとも１つが１であることを条件として、０および１から選択される)
を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
構造ＩＶまたはＶＩまたはＶＩＩＩを有し、リンカー（Ｌ−）２−Ｂ−Ｌが構造
［（Ａｏｃ要素）ａ−（ポリペプチド）ｂ−（ＰＥＧ）］２−Ｂ−アルキレン）ｃ−（自己崩壊要素）ｄ
（式中、ａからｇまでの因子の各々は独立に、前記因子の少なくとも１つが１であることを条件として、０および１から選択される）
を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記アマトキシンが、１位のアスパラギン酸残基の側鎖を介してリンカーＬに結合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記アマトキシンがカルボキサミド結合を介して結合され、特に、前記コンジュゲートが化合物ＨＤＰ  ３０．２５９７
2020534319.tif 000212
である、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記アマトキシンが、３位のジヒドロキシイソロイシン残基の側鎖を介してリンカーＬに結合されるか、または前記アマトキシンが、４位のトリプトファン残基のインドール窒素原子を介してリンカーＬに結合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記アマトキシンが、４位のトリプトファン残基のインドール環のフェニレン部分を介してリンカーＬに結合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記アマトキシンが、エーテル結合を介して前記インドール環の６´位に結合される、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
以下のリストから選択される化合物である請求項１３に記載のコンジュゲート。
2020534319.tif 000213
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【請求項１６】
前記コンジュゲートが、三官能性リンカーＢのアジド部分の反応に起因する１，２，３−トリアゾールおよび前記アマトキシンを前記三官能性リンカーＢに連結する前記リンカーＬのアルキン部分を含み、前記アルキン部分が、プロピオル酸、３−ブチン酸、４−ペンチノイン酸、５−ヘキシン酸、ジベンジルシクロオクチン（ＤｉＢＯ）、ジベンジルアザシクロオクチノン（ＤＢＣＯ）およびビシクロ［６．１．０］ノン−４−イン（ＢＣＮ）からなる群から選択される、請求項３または４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
以下の構造ＩＸを有する請求項３、４または１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
2020534319.tif 000235
（式中、ＰＳＭＡ結合部分は、２−［３−（１，３−ジカルボキシ−プロピル）ウレイド］ペンタン二酸または６−アミノ−２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）ウレイド］−ヘキサン酸に基づく。）
【請求項１８】
前記Ｌ−Ａｍａが以下のリストから選択される、請求項３、４、１６および１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
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【請求項１９】
以下のリストから選択される化合物である請求項１８に記載のコンジュゲート。
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【請求項２０】
前記Ｆｃ部分が配列番号１または配列番号３からなる、請求項４、１６〜１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項２２】
がんが乳がん、膵臓がん、胆管がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群より選択される、患者におけるがんの治療に使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(a)アマトキシン;(b)小分子のPSMA標的化部分;および(c)任意に前記アマトキシンと前記小分子のPSMA標的化部分を連結するリンカーを含むPSMA標的コンジュゲートに関する。さらに、本発明は、半減期延長部分をさらに含む前記コンジュゲートに関する。本発明はさらに、このようなコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アマトキシンは、タマゴテングタケ(Amanita phalloides)キノコに見出される8つのアミノ酸から構成される環状ペプチドである(図1参照)。アマトキシンは、哺乳動物細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIを特異的に阻害し、それにより罹患細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。細胞中の転写の阻害は、成長および増殖の停止を引き起こす。共有結合ではないが、アマニチンとRNAポリメラーゼIIとの複合体は非常に強固である(KD= 3 nM)。この酵素からのアマニチンの解離は極めて緩慢なプロセスであり、したがってそれにより罹患細胞の回復の可能性が低くなる。転写の阻害が長時間続く場合、細胞はプログラム細胞死(アポトーシス)を受ける。
【０００３】
腫瘍療法のための細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用が1981年に既に探索されており、それは抗Thy1．2抗体をα-アマニチンに、ジアゾ化を介してTrp(アミノ酸4;図1参照)のインドール環に付着しているリンカーを使用してカップリングすることによるものである(Davis & Preston,Science 213(1981)1385-1388)。DavisおよびPrestonは、付着の部位を7'位と同定した。MorrisおよびVentonも、7'位における置換が細胞毒性活性を維持する誘導体をもたらすことを実証した(Morris & Venton,Int．J．Peptide Protein Res．21(1983)419-430)。
【０００４】
特許出願の欧州特許出願第1859811A1号公報(2007年11月28日公開)は、β-アマニチンのアマトキシンアミノ酸1のγC原子がアルブミンに、またはモノクローナル抗体HEA125、OKT3、もしくはPA-1に直接、すなわち、リンカー構造なしでカップリングしているコンジュゲートを記載した。さらに、乳がん細胞(MCF-7)、バーキットリンパ腫細胞(Raji)およびTリンパ腫細胞(Jurkat)の増殖に対するこれらのコンジュゲートの阻害効果が示された。リンカー、例として、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などのような要素を含むリンカーの使用が示唆されたが、そのような構築物は実際には示されておらず、さらなる詳細、例えば、アマトキシン上の付着部位は提供されなかった。
【０００５】
特許出願WO 2010/115629およびWO 2010/115630(いずれも2010年10月14日に公開)は、ヒト化抗体huHEA125のような抗EpCAM抗体のような抗体が、(i)アマトキシンアミノ酸1のγC原子、(ii)アマトキシンアミノ酸4の6'C原子、または(iii)アマトキシンアミノ酸3のδC原子を介して、それぞれの場合において、直接的に、または抗体とアマトキシンとの間のリンカーを介してアマトキシンに結合されるコンジュゲートを記載している。示唆されているリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などのような要素を含む。さらに、乳がん細胞(細胞株MCF-7)、膵臓がん腫(細胞株Capan-1)、結腸がん(細胞株Colo205)、および胆管がん(細胞株OZ)の増殖に対するこれらのコンジュゲートの阻害効果が示された。
【０００６】
特許出願WO 2012/119787は、標的結合部分は、トリプトファンアミノ酸4上の付加的な付着部位、すなわち1'-N位でリンカーを介してアマトキシンに結合することができ、そのようなアマトキシンとその標的である哺乳動物細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIとの相互作用に干渉しないことを記載している。
【０００７】
これまで、アマトキシンは、標的化部分として、抗体分子のような大きな生体分子に結合されてきた。しかし、このような大型生体分子は、生産プロセスや商品コストの面で大きな課題となっている。従って、代わりに小分子ベースの標的化部分を使用することが非常に望ましい。しかし、安全性に関しては一定の深刻な懸念がある。
【０００８】
第一に、アマトキシンは、このような大きな生体分子と結合すると比較的毒性がないこと、および標的細胞内で内在化した後に生体分子担体が切断された後にのみ細胞毒性活性を発揮することが知られている一方で、小分子ベースのターゲティングドメインを担持するアマトキシンコンジュゲートがこのような毒性プロファイルを維持できるかどうかは、これまで知られていない。アマトキシンの毒性、特に肝臓細胞に対する毒性に照らして、標的化腫瘍治療のためのアマトキシンコンジュゲートがその標的細胞に特異的なままであることがとりわけ重要である。これに関連して、コンジュゲート構造のわずかな変化は、治療アプローチのためのアマトキシンコンジュゲートの治療ウインドウおよび安全性についての劇的な結果を有し得る。
【０００９】
第二に、相当数の小分子薬物コンジュゲート(SMDC)がこれまでに開発され、試験されている。その多くは良好な選択性(選択性(S) =受容体陰性細胞に対するIC 50/受容体陽性細胞に対するIC 50)を示したが、標的化指数はかなり不良であった(標的化指数(TI) =遊離毒素IC 50/コンジュゲートのIC 50、両方とも受容体陽性細胞株)。既知のSMDCに関する詳細を実施例Aおよび下記の表1〜5に示す。
【００１０】
このように、治療用の抗体ベースのアマトキシンコンジュゲートの開発において、すでに著しい進歩がなされている。しかしながら、このようなコンジュゲートに関連するいくつかの問題があり、これまで十分に解決されていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、アマトキシンコンジュゲートにおける抗体ベースの構造に置き換わる代替標的化部分の開発には、依然として大きな、満たされていないニーズがあった。この課題に対する解決策、すなわち、標的化部分としてのNAAG (N-アセチルアスパルチルグルタミン酸)の特定の誘導体の同定は、先行技術によって提供されても示唆されてもいなかった。
【００１２】
本発明は、アマトキシンが、2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA標的化部分と結合することができ、このようなコンジュゲートは優れた選択性および標的化指数値を示すという予想外の知見に基づいている。
2020534319.tif 000003
【００１３】
インテグリンαvβ3とのコンジュゲートのような他の小分子に基づくアマトキシンコンジュゲートは、医薬化合物としての展開に適した特性を有する化合物をもたらしていなかったので、この知見は特に驚くべきものであった(実施例A.2参照)。
【００１４】
したがって、1つの態様において、本発明は、(a)アマトキシン; (b)2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA結合部分;および(c)前記アマトキシンおよび前記PSMA結合部分を連結するリンカーを含むコンジュゲートに関する。
【００１５】
第二の態様において、本発明は、(a)アマトキシン; (b)2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA結合部分; (c)半減期延長部分;および(d)前記アマトキシン、前記PSMA結合部分、および前記半減期延長部分を連結する少なくとも1つのリンカーを含むコンジュゲートに関する。
第三の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
第四の態様において、本発明は、患者のがんの治療における使用のための本発明のコンジュゲートに関するものであり、特に、がんが、乳がん、膵臓がん、胆管がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は様々なアマトキシンの構造式を示す。太字の数字(1〜8)は、アマトキシンを形成する8つのアミノ酸の標準的番号付与を指定する。アミノ酸1、3および4中の原子の標準的指定も示される(それぞれ、ギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、および1'〜7'の数字)。
【図２】図2は、LNCaP (PSMA + +)細胞株におけるDUPA-α-アマニチンコンジュゲートの細胞毒性-グラフ表示を示す。注:すべてのDUPAコンジュゲートとアマニチンとの直接比較は、一つの実験では実施されなかった。グラフに示したアマニチン曲線は、HDP 30.2284とアマニチンとの直接比較に由来する。
【図３】図3は、22RV1(PSMA + -)細胞株におけるDUPA-α-アマニチンコンジュゲートの細胞毒性-グラフ表示を示す。注:すべてのDUPAコンジュゲートとアマニチンとの直接比較は、一つの実験では実施されなかった。グラフに示したアマニチン曲線は、HDP 30.2284とアマニチンの直接比較から導き出されている。
【図４】図4は、PC-3(PSMA -)細胞株におけるDUPA-α-アマニチンコンジュゲートの細胞毒性-グラフ表示を示す。注:すべてのDUPAコンジュゲートとアマニチンとの直接比較は、一つの実験では実施されなかった。グラフに示したアマニチン曲線は、HDP 30.2284とアマニチンとの直接比較に由来する。
【図５】図5は、非コンジュゲートα-アマニチンと比較した3つの前立腺がん細胞株における2つの最も強力なDUPA α-アマニチンコンジュゲートHDP 30.2284およびHDP 30.2301の細胞毒性を示す。注:すべてのHDP 30.2284およびHDP 30.2301とアマニチンとの直接比較は、一つの実験では、実施されなかった。グラフに示したアマニチン曲線は、HDP 30.2284とアマニチンとの直接比較に由来するものである。
【図６】図6は、DUPA-Fc-アマニチンコンジュゲートの生産に関する2段階の「プログラムアンドアーム」戦略を示している。
【図７】図7Aは、Fcをプログラミングしアーミングするための三官能性DUPA含有リンカーを示し、図7Bは、DUPA-FcをアーミングするためのカテプシンB切断可能な自己崩壊リンカーを有するアマニチン-DBCOリンカーを示す。
【図８】図8は、Fc-LPETGポリペプチドの構造およびアミノ酸配列を示す。
【図９】図9は、三官能性DUPA含有リンカー(λ=210nm;勾配:0〜1分5% B; 1〜14分40% B; 14〜19分45% B; 19〜20分100% B; 20〜21分100% B; 21〜22分5%B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル;流速= 1,4ml/分)の分析用RP-HPLCを示す。
【図１０】図10は、DBCO-アマニチンリンカー(λ=305nm;勾配:0分5% B; 0-15分100% B; 15-18分100% B; 18-18.50分100% B; 18.50-22分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル流速= 1,4ml/分)の分析RP-HPLCを示す。
【図１１】図11は、天然の非還元条件(λ=280nm;緩衝液:0.05%NaN 3 + 0.1mol/l Na 2 SO 4 in 0.1mol/l NaPO 4 pH 6.7;流速: 0.35ml/分)における精製Fc-LPETGのSEC-HPLCを示す。
【図１２】図12は、天然の非還元条件下(λ=280nm;緩衝液:0.05%NaN 3 + 0.1mol/l Na 2 SO 4、0.1mol/l NaPO 4pH 6.7;流速: 0.35ml/分)における精製DUPA-FcのSEC-HPLCを示す。
【図１３Ａ】図13は、天然の非還元条件下、λ= 280nmおよび(B) λ= 310nmにおける精製DUPA-Fc-アマニチン(A)のSEC-HPLC(緩衝液:0.05%NaN 3 + 0.1mol/l Na 2 SO 4、0.1mol/l NaPO 4pH 6.7;流速: 0.35ml/分)を示す。
【図１３Ｂ】図13は、天然の非還元条件下、λ= 280nmおよび(B) λ= 310nmにおける精製DUPA-Fc-アマニチン(A)のSEC-HPLC(緩衝液:0.05%NaN 3 + 0.1mol/l Na 2 SO 4、0.1mol/l NaPO 4pH 6.7;流速: 0.35ml/分)を示す。
【図１４Ａａ】図14は、DUPA-Fc-アマニチンのキャラクタリゼーションを示す。図14 Aは、Fc-LPETGG(パネルa)、DUPA-Fc(パネルb)およびDUPA-Fc-アマニチン(パネルc)のデコンボリューション後のHRESI-MS分析を示す。図14 Bは還元(+βME)および非還元(-βME)条件下のSDS-PAGE分析を示す。図14 Cは非還元条件(-βME)下での抗α-アマニチンウエスタンブロットを示す。SDS-PAGEは、非還元条件下でFc-LPETG (レーン1)、DUPA-Fc(レーン2)およびDUPA-Fc-アマニチン(レーン3)に対して実施し、その後、アマニチンの免疫検出によるクマシーブルーによる染色またはウエスタンブロット分析を行った。
【図１４Ａｂ】図14は、DUPA-Fc-アマニチンのキャラクタリゼーションを示す。図14 Aは、Fc-LPETGG(パネルa)、DUPA-Fc(パネルb)およびDUPA-Fc-アマニチン(パネルc)のデコンボリューション後のHRESI-MS分析を示す。図14 Bは還元(+βME)および非還元(-βME)条件下のSDS-PAGE分析を示す。図14 Cは非還元条件(-βME)下での抗α-アマニチンウエスタンブロットを示す。SDS-PAGEは、非還元条件下でFc-LPETG (レーン1)、DUPA-Fc(レーン2)およびDUPA-Fc-アマニチン(レーン3)に対して実施し、その後、アマニチンの免疫検出によるクマシーブルーによる染色またはウエスタンブロット分析を行った。
【図１４Ａｃ】図14は、DUPA-Fc-アマニチンのキャラクタリゼーションを示す。図14 Aは、Fc-LPETGG(パネルa)、DUPA-Fc(パネルb)およびDUPA-Fc-アマニチン(パネルc)のデコンボリューション後のHRESI-MS分析を示す。図14 Bは還元(+βME)および非還元(-βME)条件下のSDS-PAGE分析を示す。図14 Cは非還元条件(-βME)下での抗α-アマニチンウエスタンブロットを示す。SDS-PAGEは、非還元条件下でFc-LPETG (レーン1)、DUPA-Fc(レーン2)およびDUPA-Fc-アマニチン(レーン3)に対して実施し、その後、アマニチンの免疫検出によるクマシーブルーによる染色またはウエスタンブロット分析を行った。
【図１４Ｂ】図14は、DUPA-Fc-アマニチンのキャラクタリゼーションを示す。図14 Aは、Fc-LPETGG(パネルa)、DUPA-Fc(パネルb)およびDUPA-Fc-アマニチン(パネルc)のデコンボリューション後のHRESI-MS分析を示す。図14 Bは還元(+βME)および非還元(-βME)条件下のSDS-PAGE分析を示す。図14 Cは非還元条件(-βME)下での抗α-アマニチンウエスタンブロットを示す。SDS-PAGEは、非還元条件下でFc-LPETG (レーン1)、DUPA-Fc(レーン2)およびDUPA-Fc-アマニチン(レーン3)に対して実施し、その後、アマニチンの免疫検出によるクマシーブルーによる染色またはウエスタンブロット分析を行った。
【図１５Ａ】図15は、4つの前立腺がん細胞株におけるDUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの細胞毒性を、Fc-DUPA-リンカー単独および200倍のモル過剰PSMA阻害剤2-PMPAの存在下でのコンジュゲートと比較して示す。
【図１５Ｂ】図15は、4つの前立腺がん細胞株におけるDUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの細胞毒性を、Fc-DUPA-リンカー単独および200倍のモル過剰PSMA阻害剤2-PMPAの存在下でのコンジュゲートと比較して示す。
【図１６】図16はCb17 Scid雄マウス(n = 3)におけるDUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの血中薬物動態を示す。バイコンパートメントモデルとFcRnリサイクルに関連した二相性消失プロファイルを観測した。
【図１７】図17は、Cb 17 Scidマウス LNCaP 異種移植モデル(n = 8-9)におけるDUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの抗腫瘍効果を示したものである。
【００１８】
提案された投与スキームは、相対体重グラフスキームによって示されるように、完全に許容された。観察された悪液質はLNCaPモデルと関連しており、ビヒクル注入群でも観察される。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
本発明を以下に詳述する前に、本発明は本明細書に記載の特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解すべきである。それというのも、それらは変動し得るためである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではなく、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【００２０】
特に、本明細書で使用する用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集: (IUPAC Recommendations)」(Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されているように定義されている。
【００２１】
以下の本明細書および特許請求の範囲全体にわたり、特に文脈が要求しない限り、語「含む（comprise）」、ならびに変化形、例えば、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、記述される整数、組成物もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味する一方、任意の追加の整数、組成物もしくはステップまたは整数、組成物もしくはステップの群も場合により存在し得、追加の整数、組成物もしくはステップまたは整数、組成物もしくはステップの群が存在しない実施態様も含むことが理解される。このような後者の実施態様において、用語「含む（comprising）」は、「からなる」と同一範囲で使用される。
【００２２】
いくつかの文献が本明細書の本文全体にわたり引用される。本明細書に引用される文献(例として、全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の説明書、指示書、GenBank受入番号配列寄託など)のそれぞれは、前掲か後掲かにかかわらず、各特許法の下で可能な程度で参照により全体として本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先の発明を根拠にそのような開示より先行する権利がないことを認めるものとして解釈されない。
【００２３】
目下、本発明はさらに記載される。以下の節において、本発明の様々な態様がより詳細に定義される。このように定義されるそれぞれの態様は、矛盾することが明確に示されない限り、任意の他の1つまたは複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される任意の他の1つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００２４】
本発明は、アマトキシンが、2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA標的化部分と結合することができ、このようなコンジュゲートは優れた選択性および標的化指数値を示すという予想外の知見に基づいている。
【００２５】
したがって、1つの態様において、本発明は、(a)アマトキシン; (b)2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA結合部分;および(c)前記アマトキシンおよび前記PSMA結合部分を連結するリンカーを含むコンジュゲートに関する。
【００２６】
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、テングタケ（Ａｍａｎｉｔａ）属から単離され、Wieland T.およびFaulstich H. (Wieland T, Faulstich H.、CRC Crit Rev Biochem.5(1978)185-260)に記載の８つのアミノ酸から構成される全ての環状ペプチドを含み、これらは(i) (すなわち、トリプトファンのアミノ酸残基のインドール部分は、特に６’位が水素原子を担持する場合、６’位における酸素含有置換基を有さない)および(ii)（すなわち、天然存在のアマトキシンのチオエーテルスルホキシド部分は、スルフィドまたはスルホンにより置き換えられている）に従う規定の位置を含み、さらにそれらの全ての化学誘導体；さらにそれらの全ての半合成アナログ；さらに、チオエーテルスルホキシド部分がスルフィド、スルホン、または硫黄とは異なる原子で置き換えられているすべての合成または半合成アナログ；天然化合物のマスター構造（環状、８つのアミノ酸）に従うビルディングブロックから構成されるさらにそれらの全ての合成アナログ；さらにヒドロキシル化アミノ酸に代えて非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する全ての合成または半合成アナログ、さらに全ての合成または半合成アナログを含み、それぞれの場合において、任意のそのような誘導体またはアナログは、少なくとも上記の（ｉ）および（ｉｉ）位を担持し、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩの阻害により機能的に活性である。特に、「アマトキシン」という用語には、図1に示された全ての構造が含まれる。
【００２７】
機能的に、アマトキシンは、哺乳動物RNAポリメラーゼIIを阻害するペプチドまたはデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、上記定義のリンカー分子または標的結合部分と反応させることができる官能基(例えば、カルボン酸基またはカルボン酸誘導体、例えば、カルボキサミドまたはヒドロキサム酸、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールもしくはチオール捕捉基)を有するものである。本発明のコンジュゲートに特に好適なアマトキシンは、図1に示されるα-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマヌリン、もしくはアマヌリン酸のジ-デオキシバリアント、またはアマニン、アマニンアミド、γ-アマニン、もしくはγ-アマニンアミドのモノ-デオキシバリアントならびにそれらの塩、化学誘導体、半合成アナログ、および合成アナログである。
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、90%より高い、特に95%より高い純度を有する。
【００２８】
本発明に関して、用語「純度」は、存在するコンジュゲートの総量を指す。例えば、90%より高い純度は、本発明のコンジュゲートを含む1mgの組成物中に、90%より高い、すなわち、900μgを超えるそのようなコンジュゲートが存在することを意味する。残りの部分、すなわち、不純物としては、未反応出発材料ならびに他の反応物質、溶媒、開裂産物および/または副生物を挙げることができる。
【００２９】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートを含む組成物は、100mg超、特に500mg超、および特に1g超のそのようなコンジュゲートを含む。したがって、従来技術のコンジュゲートの複雑な調製において、例えば、天然存在のスルホキシドの部分的還元からほぼ必ず存在し得る微量の本発明のコンジュゲートは、明示的に除外される。
【００３０】
本発明の文脈において、用語「PSMA」は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCPII)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI (NAALADase I)、またはNAAGペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原の略称である。PSMAはヒトのFOLH1(葉酸ヒドロラーゼ1)遺伝子にコードされる酵素である。
【００３１】
本発明の文脈において、「2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)に基づくPSMA結合部分」という用語は、基本的に構造Iからなる部分を指し、ここで、ペンタン二酸の5位のカルボン酸基にリンカーが結合している。
【００３２】
本発明の文脈において、「6-アミノ-2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA結合部分」という用語は、基本的に構造IIからなる部分を指し、ここで、リンカーはヘキサン酸部分の6-アミノ基に結合する。
【００３３】
本発明の文脈における「リンカー」は、2つの成分を連結しており、各々がリンカーの一端に結合している構造を指す。リンカーが結合である場合、アマトキシンとPSMA標的化部分との直接的な結合は、アマトキシンがRNAポリメラーゼIIと相互作用する能力を低下させる可能性がある。特定の実施形態では、リンカーは、2つの成分間の距離を増加させ、これらの成分の間、本件ではPSMA標的化部分とアマトキシンとの間の立体干渉を緩和する。具体的な実施形態では、リンカーは、主鎖に1原子と70原子の連続鎖(例えば、 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, および70原子）を有する。すなわち、リンカーの長さは、アマトキシン部分とPSMA-標的化部分との間の原子または結合の数によって測定された最短の接続として定義され、ここでリンカー主鎖の一方の側がアマトキシンと反応しており、他方の側がPSMA-標的化部分のカルボキシル基またはアミノ基と反応しているかまたは反応可能である。特定の実施形態では、リンカーは20〜70原子、より詳細には25〜60原子、より詳細には30〜55原子、より詳細には35〜50原子の間の連続鎖を有する。本発明の文脈において、リンカーは、特に、任意選択で置換されたC1-20-アルキレン、C1-20-ヘテロアルキレン、C2-20-アルケニレン、C2-20-ヘテロアルケニレン、C2-20-アルキニレン、C2-20-ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基である。リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等のような1以上の構造要素を含むことができる。リンカーはまた、これらの構造要素の2つ以上の組合せを含むことができる。これらの構造要素の各1つは、リンカー中に1回以上、例えば、2回、3回、4回、5回、または6回存在することができる。いくつかの実施形態において、リンカーはジスルフィド結合を含むことができる。リンカーは、アマトキシンおよびPSMA標的化部分に対して、単一工程または２工程以上の後続工程のいずれかで結合されなければならないことが理解される。その目的のために、リンカーは、特に近位末端および遠位末端に、2つの基を担持し、(i)連結される成分の1つに存在する基、特にアマトキシンまたはPSMA標的化部分上の活性化された基に共有結合を形成することができるか、または(ii)アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化されるか、または形成することができる。従って、このようなカップリング反応の結果である化学基(例えば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合など)は、リンカーの遠位末端および近位末端にあることが好ましい。
【００３４】
特定の実施形態では、リンカーLは、C、O、NおよびSから独立に選択される1〜20原子の間、特に2〜18原子の間、より詳細には5〜16原子の間、さらに詳細には6〜15原子の間の直鎖である。特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも60%はC原子である。特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合によって連結されている。
【００３５】
特定の実施形態では、リンカーLは、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、またはN、O、およびSから選択される1〜4個のヘテロ原子を含むヘテロアラルキレン基であり、前記リンカーは任意に置換されている。
【００３６】
「アルキレン」という用語は、1〜10個の炭素原子を有する基を含む、1〜20個の炭素原子を有する二価直鎖飽和炭化水素基を指し、特定の実施形態では、アルキレン基は、低級アルキレン基であってもよく、「低級アルキレン」という用語は、1〜6個の炭素原子を有するアルキレン基を指し、特定の実施形態では、1〜5個または1〜4個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。アルキレン基の例としては、メチレン(−CH2−)、エチレン(−CH2 -CH2−)、n−プロピレン、n−ブチレン、n−ペンチレン、およびn−ヘキシレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
用語「アルケニレン」は、2〜20個の炭素原子を有する二価の直鎖基を指し、ここで、炭素-炭素結合の少なくとも1つは二重結合であり、他の結合は、単結合またはさらなる二重結合であり得る。「アルキニレン」という用語は、2〜20個の炭素原子を有する基を指し、ここで、炭素-炭素結合の少なくとも1つは三重結合であり、他の結合は、単結合、二重結合またはさらなる三重結合であり得る。アルケニレン基の例には、エテニレン(−CH=CH−)、1−プロペニレン、2−プロペニレン、1−ブテニレン、2−ブテニレン、3−ブテニレンなどが含まれる。アルキニレン基の例としては、エチニレン、1-プロピニレン、2-プロピニレン等が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、「シクロアルキレン」は、二価環が任意の安定な単環系または多環系の一部であり、そのような環は3〜12個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子は有さず、かつ、そのような環が完全に飽和されている場合を指し、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環系または多環系の一部であり、そのような環が3〜12個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、かつ、そのような環が少なくとも部分的に不飽和である(ただし、任意のアリーレン環を除く)場合を指すことを意図する。シクロアルキレンの例としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロヘプチレンが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルケニレンの例としては、限定されるものではないが、シクロペンテニレンおよびシクロヘキセニレンが挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「ヘテロシクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルケニレン」は、任意の安定な単環または多環の環系の一部であり、そのような環は3〜約12原子を有し、この場合、この環は炭素原子および少なくとも1つのヘテロ原子、特にN、OおよびSからなる群から独立して選択される少なくとも1つのヘテロ原子からなり、ヘテロシクロアルキレンは完全に飽和しているそのような環を指し、ヘテロシクロアルケニレンは少なくとも部分的に不飽和である環を指す(ただし、任意のアリーレンまたはヘテロアリーレン環は除く)。
【００４０】
用語「アリーレン」は、二価環または環系が任意の安定な単環系または多環系の一部であることを意味することを意図しており、この場合、そのような環または環系は3〜20個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子は有さず、この環または環系はフェニレンを含む「4n+2」π電子則によって定義される芳香族部分からなる。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「ヘテロアリーレン」とは、任意の安定な単環系または多環系の一部であり、そのような環または環系が3〜20原子を有し、環または環系が「4n+2」π電子則によって定義される芳香族部分からなり、炭素原子および1以上の窒素、硫黄、および/または酸素ヘテロ原子を含む二価環または環系をいう。
【００４２】
本発明の文脈において、「置換された」という用語は、示された原子の通常の原子価、または置換された基の適切な原子の原子価を超えていないこと、および置換により安定な化合物が得られるという条件で、リンカーの主鎖に存在する1つ以上の水素が示された基からの選択で置き換えられることを示すことを意図する。「任意に置換された」という用語は、本明細書で定義されるように、リンカーが1以上の置換基で置換されていないかまたは置換されていることを意味することを意図する。置換基がケト(またはオキソ、すなわち=O)基、チオ基またはイミノ基などである場合、リンカー主鎖原子上の2つの水素が置換される。例示的置換基には、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、(チオ)エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、(チオ)アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、パーフルオロアルキルを含むハロアルキル(トリフルオロメチルなど)、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ(任意に例えばアルキル、アリール、またはヘテロアリールにより、一置換または二置換された)、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル(任意に例えばアルキル、アリール、またはヘテロアリールにより、一置換または二置換された)、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、(チオ)ウレイド、(アリールチオ)ウレイド、アルキル(チオ) ウレイド、シクロアルキル(チオ)ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、または-O(CH2 )n-OH, -O(CH2 )n-NH2, -O(CH2 )nCOOH, -(CH2 )nCOOH, -C(O)O(CH2 )nR, -(CH2 )nN(H)C(O)OR, または -N(R)S(O)2 R(式中、nは1-4であり、Rは水素、-アルキル、-アルケニル、-アルキニル、-シクロアルキル、-シクロアルケニル、-(C-結合ヘテロシクロアルキル)、-(C-結合ヘテロシクロアルケニル)、-アリール、-ヘテロアリールから独立に選択される）であって、多重度の置換が許容されるものを含む。ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどのような置換基、または−OH、−NHRなどのような官能基は、適切な場合、それら自体が置換され得ることが、当業者によって理解される。置換部分自体も適宜置換できることは当業者にも理解されるであろう。
【００４３】
特定の実施形態では、リンカーLは、ジスルフィド(-S-S-)、エーテル(-O-)、チオエーテル(-S-)、アミン(-NH-)、エステル(-O-C(=O)-または-C(=O)-O-)、カルボキサミド(-NH-C(=O)-または-C(=O)-NH-)、ウレタン(-NH-C(=O)-O-または-O-C(=O)-NH-)、および尿素部分(-NH-C(=O)-NH-)のいずれかから選択される部分を含む。
【００４４】
本発明の特定の実施形態では、リンカーＬは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、およびヘテロアラルキレン基のリストから選択されるｍ個の基を含み、ここで、各基は任意に独立して置換されていてもよく、リンカーはさらに、次の部分の1つから独立して選択されるn個の部分を含む：ジスルフィド（-S-S-）、エーテル（-O-）、チオエーテル（-S-） 、アミン（-NH-）、エステル（-O-C（= O）-または-C（= O）-O-）、カルボキサミド（-NH-C（= O）-または-C（= O） -NH-）、ウレタン（-NH-C（= O）-O-または-OC（= O）-NH-）、および尿素部分（-NH-C（= O）-NH-）、 m = n + 1。特定の実施形態では、mは2でありnは1であるか、またはmは3でありnは2である。特定の実施形態では、リンカーは、2個または3個の非置換アルキレン基、およびそれぞれ1個または2個の、非置換アルキレン基が連結された、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン、または尿素部分を含む。
特定の実施形態では、直鎖中のC原子は、任意に置換されたメチレン基(-CH2 -)の独立した一部である。特にそのような実施形態では、任意の置換基は、ハロゲンおよびC1-6-アルキル、特にメチルから独立して選択される。
特定の実施形態では、リンカーLは安定なリンカーである。
【００４５】
本発明の文脈において、用語「安定なリンカー」は、(i)酵素の存在下、および(ii)細胞内還元環境において安定であるリンカーを指す。
特定の実施形態において、安定なリンカーは、(i)酵素-切断可能サブ構造、および/または(ii)ジスルフィド基を含まない。特定のこのような実施形態では、リンカーは、12個までの原子、特に2〜10個、より具体的には4〜9個、最も具体的には6〜8個の原子の長さを有する。
【００４６】
特に他の実施形態では、リンカーは切断可能リンカーである。
本発明との関連において、用語「切断可能リンカー」は、(i)化学的切断により切断可能であるリンカー、または(ii)還元可能なリンカーを指す。
【００４７】
特定のそのような実施形態では、リンカーは還元によって切断可能である。本発明の文脈において、「還元により切断可能」という用語は、細胞内還元環境において切断され得るリンカー、特にジスルフィド基を含有するリンカーを指し、細胞内還元環境による内在化後に標的結合部分に結合した毒素積荷の細胞内放出をもたらす(Shenら、(1985) J. Biol.Chem. 260:10905-10908を参照のこと)。
【００４８】
特定のこのような実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合、特に
2020534319.tif 000004
（ここで、R1〜R4が独立してHおよびメチルから選択される）
部分を含む。
【００４９】
特定の他のそのような実施形態では、リンカーは、化学的切断、特に加水分解またはタンパク質分解によって切断可能であり、特にそのような化学的切断は酵素によって触媒される。
【００５０】
本発明の文脈において、用語「化学的切断は酵素によって触媒される」は、酵素によって、特にカテプシンBのようなリソソームペプチダーゼによって切断され得、内在化後に標的化抗体に結合された毒素積荷の細胞内放出を生じるリンカーをいう(Dubowchikら、(2002) Bioconjug Chem.13:855−69を参照のこと)。特定の実施形態では、切断可能リンカーは: Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Val-Ala、Phe-CitおよびVal-Citから選択されるジペプチドを含み、特に、切断可能リンカーが、ジペプチドと毒性負荷量との間のp-アミノベンジル(PAB)スペーサーをさらに含む。
このような実施形態において、リンカーはヒドラゾン基を含む。特に、このような実施形態では、切断はリソソームにおける加水分解によって起こる。
【００５１】
特定の実施形態において、リンカーは自己崩壊リンカーである。
【００５２】
本発明の文脈において、「自己崩壊リンカー」という語は、切断可能な結合を含むリンカーを指し、切断後に、断片化が起こり、前記切断後に毒素にまだ付着しているリンカーの部分を除去する。
【００５３】
特にそのような実施態様において、切断可能な結合は、ポリペプチド、特にジペプチドのC末端間のアミド結合、および任意にN-置換されたp-アミノベンジル(PAB)スペーサーのアミノ基である。
【００５４】
特に、そのような実施形態において、切断可能リンカーは、構造L 1 -L*-L 2を含む。
2020534319.tif 000005
（ここで、R'はHおよびメチルから選択され、L1はL*をアマトキシンに連結するリンカーの一部であり、特に、L1は-NHまたは-O基、特に-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH-O-、または-C(=O)-O基を介してL*に連結し、L2はL*をPSMA標的化部分に連結するリンカーの一部であり、特に、L1は-(CH2 )m部分（mは1から8、特に1から5から選択される整数である）を介して、または-(CH2 CH2 O)n部分（nは1から3、特に1から2から選択される整数である）を介して、L*に連結する。）
【００５５】
特に他のそのような実施形態において、L*は以下の構造を有する
2020534319.tif 000006
【００５６】
ある実施形態において、リンカー部分L1 -L*は、-(切断可能結合)-NR'-フェニル-CH2 -O-C(=O)-を含み、ここでR'はHおよびメチルから選択され、カルボニル基は、アマトキシンの1位におけるアスパラギン酸残基の側鎖の末端カルボン酸部分の一部である。
【００５７】
特に他の実施形態では、リンカー部分L1-L*は-(切断可能な結合)-NR'-フェニル-CH2-O-基を含み、ここで酸素原子はアマトキシンの4位のトリプトファン残基のインドール環の6'位にエーテル結合を形成する。
【００５８】
特定の実施形態では、リンカーLは、C、O、NおよびSから独立に選択される1〜4原子の間、特に1〜3原子の間、より詳細には1〜2原子の間、およびさらにただ1原子の直鎖である。特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも50%はC原子である。特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合によって連結されている。
【００５９】
特にそのような実施形態では、このような切断可能リンカーに含まれる構造L 1 -L*-L 2は、最大20個の原子、特に6〜18個、より詳細には8〜16個、および最も詳細には10〜15個の原子の長さを有する。特にこのような実施形態では、本発明によるアマトキシンと切断可能なジスルフィド基とを連結するリンカーの部分は、3または4個のC原子、特に3個のC原子の直鎖である。特定の実施形態では、直鎖中の3または4個のC原子が単結合によって連結されている。特定の実施形態では、リンカーはn-プロピレン基である。
標的結合部分へのリンカーの結合は、当業者に周知の種々の方法、特に抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の分野で達成され得る。
特定の実施形態では、本発明は、構造 III, IV, VまたはVIを有するコンジュゲートに関する。
2020534319.tif 000007
2020534319.tif 000008
（ここで、各Lはリンカーであり、Amaはアマトキシンであり、Bは分岐リンカー要素であり、RはH、C1-6-アルキルおよびp-ブロモベンジルから選択される。）
【００６０】
本発明の文脈において、用語「分岐リンカー要素」は、少なくとも3つの付着部位を含み、そのためこのような要素の組み込みは、2つのPSMA結合部分を含む分岐構築物がアマトキシンに結合される、要素に関する。
【００６１】
特定の実施形態では、それぞれのLは、独立して、-CH2 -, -CHR1 -, -C(R2)2-, -O-, -S-, -NH-, -NR3 -, -C(=O)−、−フェニレン−、2,5−ジオキソ−1,3−ピロリジニレンのリストから独立して選択されるn個のリンカー要素を含み、ここで、R1は、C1-6−アルキル、−COOH、アミノ酸の側鎖のリストから選択され、R2は、C1-6−アルキルのリストから選択され、R3は、C1-6−アルキルのリストから選択され、Bは、1,3,4−三置換マレイミドおよび1,3,4−三置換スクシンイミドから選択され、nは、5〜60から独立して選択される整数である。
【００６２】
特定の実施形態では、リンカーLは、C、O、NおよびSから独立して選択される少なくとも5個、特に少なくとも10個、より具体的には10〜20個の原子、特に10〜18個の原子、より具体的には10〜16個の原子、さらにより具体的には10〜15個の原子の直鎖である。特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも60%はC原子である。特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合によって連結されている。
【００６３】
具体的な実施形態では、各Lは: -(CH2)x-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、-(O-CH2 -CH2 -)y 、 -(CH2-CH2 -O-)y、N,O-二置換p-アミノベンジルオキシ、および2,5-ジオキソ-1,3-ピロリジニレン（ここでxおよびyは2〜14の範囲から独立に選択される整数である）から独立して選択されるリンカー要素の1つまたは複数を独立に含む。
【００６４】
特定の実施形態では、リンカーLは、8-アミノオクタン酸ベースの要素-NH-(CH2)7-C(=O)(Aoc要素を含む。特定のこのような実施形態では、-NH-(CH2)7-C(=O)要素のアミノ末端は、構造IIIまたはVによるPSMA結合部分の末端カルボン酸とアミド結合を形成しているか、または構造IVまたはVIによるPSMA結合部分の末端アミノ基への尿素結合の一部である。
【００６５】
特定の実施形態では、リンカーLは、Phe-Phe-、-Phe-Phe-Cys-、および-Phe-Phe-His-Glu-His-Glu-Cys(N末端からC末端)から選択されるポリペプチドを含む。特に、このような実施形態では、前記ポリペプチドのN末端は、8-アミノオクタン酸ベースのエレメント-NH-(CH2)7-C(=O)-とペプチド結合を形成する。
【００６６】
特定の実施形態において、前記リンカーはチオエーテル部分を含む。
【００６７】
特に、このような実施形態では、このようなコンジュゲートは、チオール含有リンカー部分、第二のリンカー部分を有するL-SH、チオール反応性基-Xを含むL-Xのカップリングに起因する。特にそのような実施形態では、チオール含有リンカー部分は、リンカーの一部であるポリペプチドのシステイン残基の遊離-SH基である。
したがって、このような実施形態において、本発明は、一般式PSMA-結合部分-L-X*-S-L-AmaまたはPSMA-結合部分-L-S-X*-L-Amaのコンジュゲートに関するものであり、ここで、-X*はチオール基のチオール反応性基へのカップリングに起因する部分である。
【００６８】
本発明の文脈において、「チオール反応性基X」という用語は、特に6.0〜8.0の範囲のpH値において、特に6.5〜7.5の範囲のpH値においてチオール基と選択的に反応する基を指し、特に「選択的に」という用語は、少なくとも1つの遊離システイン残基を含む第二部分とチオール反応性基を含む分子のカップリング反応の10%未満が、リジン残基などの第二部分の非システイン残基とカップリング反応であり、特に5%未満、特に2%未満であることを意味する。特定の実施形態では、チオール反応性基は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、3位に脱離基、特に-Brおよび置換チオール(例えば、US 9,295,729参照)から選択される脱離基を有するマレイミド、4位に脱離基、特に-Brおよび置換チオール(例えば、US 9,295,729参照)から選択される脱離基を有する1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン、メチルスルホニルベンゾチアゾール、メチルスルホニルフェニルテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール(Toda et al.、Angew.Chem.Int.Engl.、52(2013) 12592-6を参照)、3-アリールプロピオニトリル(Kolodych et al, Bioconjugate Chem. 2015, 26, 197−200を参照),、および5-ニトロ-ピリジン-2-イル-ジスルフィド（...- LSS-（5-ニトロ-ピリジン-2-イル））から選択される。
【００６９】
特定の実施形態において、PSMA結合部分−リンカー構築物中に存在するチオール基とそれぞれ反応し得る2つの官能基を含む分岐試薬が、カップリングにおいて使用される。結果として、2つのPSMA結合部分含有鎖が分岐リンカー要素Bに連結される。特定の実施形態では、分岐試薬は、3位および4位に2つの脱離基を有するマレイミドであり、特に3,4-ジブロモマレイミド、3,4-ビス(アリールチオ)-マレイミド、特に3,4-ジフェニルチオ-マレイミド、および3,4-ビス(ヘテロアリールチオ)-マレイミド、特に3,4-ビス(2-ピリジニル-スルファニル)-マレイミドから選択される。特定の他の実施形態では、分岐試薬は、3位および4位に2つの脱離基を有する1,2−ジヒドロピリダジン−3,6−ジオン、特に4,5−ブロモ−1,2−ジヒドロピリダジン−3,6−ジオン、4,5−ビス(アリールチオ)−1,2−ジヒドロピリダジン−3,6−ジオン、特に4,5−ジフェニルチオ−1,2−ジヒドロピリダジン−3,6−ジオン、および4,5−ビス(ヘテロアリールチオ)−1,2−ジヒドロピリダジン−3,6−ジオン、特に4,5−ビス(2−ピリジニル−スルファニル)−1,2−ジヒドロピリダジン−3,6−ジオンである。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明によるコンジュゲートにおいて分岐リンカー要素Bが存在する場合、PSMA結合部分と前記分岐リンカー要素Bとの間のリンカーは、それぞれ、少なくとも-(O-CH2 -CH2 -)y*or -(CH2-CH2 -O-)y*部分を含み、ここでyは、6〜14の範囲、特に8〜12の範囲から独立に選択される整数である。
【００７１】
特定の実施形態では、チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分は、チオール置換アセトアミド;チオール置換スクシンイミド;チオール置換コハク酸;チオール置換ヘテロアリール、特にチオール置換ベンゾチアゾール、チオール置換フェニルテトラゾールおよびチオール置換フェニルオキサジアゾール;ならびにジスルフィドから選択される。特定の実施形態では、チオール基のチオール反応性基へのカップリングに起因する部分は、チオール置換スクシンイミドである。
【００７２】
特定の実施形態では、セクション[0069]（段落0048）の一般式中に存在する部分L-X*-S中のリンカーLは、次の部分群から選択される:
(アマトキシン側) -(CH2)2 -S-S-(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)3 -S-S-(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)2 -S-S-(CH2)3-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)3 -S-S-(CH2)3-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)4 -S-S-(CH2)4-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-(CH2)2 -CMe2-S-S-(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)2 -S-S-CMe 2 -(CH2)2-X-S- (PSMA 結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)3 -S-S-CMe 2 -(CH2)2-X-S- (PSMA 結合側);
(アマトキシン側) -(CH2)3 -S-S-CHMe-(CH2)2-X-S- (PSMA 結合側);
(アマトキシン側)-(CH2)2 CHMe-S-S-CHMe-(CH2)2-X-S- (PSMA 結合側);
(アマトキシン側)-(CH2)2 CHMe-S-S- (PSMA 結合側);
(アマトキシン側)-(CH2)3 -S-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S- (PSMA-結合側)
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S- (PSMA-結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S- (PSMA-結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S- (PSMA-結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);
(アマトキシン側)-CH2 -C6H4 -NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S- (PSMA-結合側);
(アマトキシン側) -CH2 -C6H4 -NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S- (PSMA結合側);であって、ジペプチド配列に隣接する-NH-および-COは、それぞれジペプチドのカルボキシ末端およびアミノ末端へのアミド結合を形成するリンカーのアミノ部分およびカルボニル部分を表す。
【００７３】
本発明の文脈において、「チオール基のチオール反応性基へのカップリングに起因する部分」とは、(i)システイン残基の硫黄原子によってチオール反応性基に存在する脱離基Yの求核置換、例えば、例えば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、4,6-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノ基、アルキルスルホンまたはヘテロアリールスルホン、(ii)チオール反応性基の活性化二重結合へのシステイン残基のHS基の付加、または(iii)活性化されたジスルフィドまたはメタンチオスルホネートとシステイン残基の硫黄原子とのジスルフィド交換、例えば脱離基としてのピリジン-2-チオール、5-ニトロピリジン-2-チオールまたはメタンスルフィネート;または(iv)システイン残基の硫黄原子とチオール反応性基の一部である反応性部分との間の安定な結合をもたらす任意の他の化学反応から生じる構造を指す。
【００７４】
チオール基のカップリングから生じる一次部分は、任意にさらに誘導体化されてもよく、例えば、マレイミドから生じるスクシンイミジルチオエーテルは、加水分解されてスクシンアミド酸チオエーテルになり得る。
【００７５】
別の実施形態において、リンカーは、1,3双極子環状付加(クリック化学)における二重または三重結合と1,3双極子の反応に起因する少なくとも1つの5員環を含む。
【００７６】
特定の実施形態では、前記PSMA結合部分は、構造III、VまたはVIIの場合にはカルボキサミド基-C(=O)-NH-を介して、または構造IV、VIまたはVIIIの場合にはカルボキサミド基-NR-C(=O)-または尿素基-NR-C(=O)-NH-を介してリンカーLに結合される。
【００７７】
特定の実施形態において、該リンカーが尿素部分を介してPSMA-標的化部分に接続され、尿素部分は、構造IIに従ったPSMA-標的化部分に本来存在する一次アミノ基のカルバミン酸誘導体…-リンカー-NH-C(=O)-Z（ここで、Zは一次アミンによって置換されうる離脱基である）との反応から生じる。
【００７８】
構造III、VまたはVIIを有する本発明のコンジュゲートの特定の実施形態において、リンカーLは下記の一般的構造
(Aoc要素) a-(ポリペプチド)b-(アルキレン)c-(PEG)d-(チオール要素) e-(アルキレン)f-(自己崩壊要素)g
（前記因子a〜gの各々は、前記因子の少なくとも1つが1であることを条件として、0および1から独立に選択される）
を有する。
【００７９】
このような実施態様において、用語「Aoc要素」は、セクション[0074](段落0052)で定義される群を指し、用語「ポリペプチド」は、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘクサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、特にセクション[0075] (段落0053)で定義されるポリペプチドを指す。用語「アルキレン」は、n-C1-6-アルキル基で任意に置換される(CH2)nを指し、nは、2〜8の範囲で選択される整数である。用語「PEG」は(O-CH2 -CH2 -)y または -(CH2-CH2 -O-)y,（ｙは6〜１４の範囲から選択される整数）を指す。用語「チオール要素」は、チオエーテル、ジスルフィドまたは要素-S-X-を指し、ここで、Xはセクション[0079](段落0057)で定義される群を指し、用語「自己崩壊要素」は、セクション[0061]から[0063](段落0044)で定義される酵素切断可能な構造を指す。当業者に即座に明らかになるであろうが、この節に記載された一般的概念は、本発明に従い、前記一般的概念の個々の構成要素間の適切な連鎖を形成するために必要とされる特定の連鎖要素を潜在的に含む。例えば、構造IIによるPSMA結合部分とAoc要素との間の尿素結合の場合には、さらなるカルボニル部分が存在し、ポリペプチド-アルキレン結合の場合には、前記結合は、ポリペプチドのアルキレン基とC末端との間にアミド結合を形成するアミノ基を含む。
【００８０】
構造IVまたはVIを有する本発明のコンジュゲートの特定の実施形態において、リンカー(L-)2 -B-Lは構造
[(Aoc要素)a-(ポリペプチド)b-(PEG)]2 -B-アルキレン)c-(自己崩壊要素)d
(前記因子a〜dの各々は、前記因子の少なくとも1つが1であることを条件として、0および1から独立に選択される)
を有する。
【００８１】
このような実施形態では、用語はセクション[0090]（段落0066）で上記定義されるように使用される。
特定の実施形態では、前記アマトキシンは、1位のアスパラギン酸残基の側鎖を介してリンカーLに結合される。
【００８２】
特にそのような実施形態では、前記アマトキシンは、エステル結合Ama-C(=O)-O-L-…を介して、またはヒドロキサム酸結合Ama-C(=O)-NH-O-L-…を介して結合される。
特に他の実施形態では、前記アマトキシンはカルボキサミド結合を介して結合される。
【００８３】
特にそのような実施形態では、前記コンジュゲートは化合物HDP 30.2597である。
2020534319.tif 000009
特定の実施形態では、前記アマトキシンは、3位のジヒドロキシイソロイシン残基の側鎖を介してリンカーLに結合される。
特定の実施では、前記アマトキシンは、4位のトリプトファン残基のインドール窒素原子を介してリンカーLに結合される。
特定の実施形態では、前記アマトキシンは、4位のトリプトファン残基のインドール環のフェニレン部分を介してリンカーLに結合される。
特にそのような実施形態では、前記アマトキシンは、エーテル結合を介して前記インドール環の6'位に結合する。
【００８４】
特にそのような実施形態において、前記コンジュゲートは、以下のリストから選択される化合物である:
2020534319.tif 000010
2020534319.tif 000011
2020534319.tif 000012
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2020534319.tif 000029
2020534319.tif 000030
【００８５】
第二の態様において、本発明は、2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA結合部分に連結されたアマトキシンを含むコンジュゲートのバージョンに関するものであり、前記コンジュゲートは薬物動態学的半減期が延長されている。
【００８６】
約70kDa未満のタンパク質およびペプチドの血清からのクリアランスの主な経路は、腎臓による糸球体濾過である。低分子化合物ならびに蛋白質ベースの治療薬の薬物動態学的半減期を延長するために、様々な戦略が開発されている。タンパク質ベースの治療のために、そのような戦略は、限定されるものではないが、合成ポリマーベースの融合物、例えばポリエチレングリコール(PEG)、およびタンパク質融合構築物の使用を含む。融合タンパク質は製薬業界で数十年にわたって使用され、そうでなければ短い半減期の熱薬の薬学的性質を改善してきた(レビューについては、 Strohl W.R., 2015, Fusion proteins for half-life extension of biologics as a strategy to make biobetters; BioDrugs 29, 215-239を参照のこと)。これらには、例えば、免疫グロブリン(抗体)、血清アルブミン、カルボキシ末端ペプチド(CTP)の定常断片(Fc)部分の使用、および融合構築物の設計のためのその他が含まれる。
【００８７】
抗体Fc(断片結晶化可能)断片への接合は、G型免疫グロブリン(IgG)の血清中での長い半減期を担う上皮細胞による新生児Fc受容体(FcRn)リサイクルプロセスを大きさを増加させ、利用することによりペプチドクリアランス割合を低下させるために適用される一般的な方法である(Strohl W.R.、2015、BioDrugs 29、215-239)。
特定の実施形態において、上記に開示されるコンジュゲートは、三官能性リンカーを介して半減期延長部分にさらに連結される。
【００８８】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記に開示されるコンジュゲートは、抗体、好ましくはヒト抗体、最も好ましくはヒトIgG型抗体の定常断片(Fc)部分に三官能性リンカーを介して連結される。
【００８９】
本発明者らは、上記に開示したアマトキシン-DUPAコンジュゲートの薬物動態学的半減期が、抗体の定常断片(Fc)部分に連結することによって有意に延長できることを見出した。驚くべきことに、前記コンジュゲートは、アマトキシン、2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸(I)または6-アミノ-2-[3-(1,3ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸(II)に基づくPSMA結合部分、および抗体の定常断片(Fc)部分を含み、それらのPSMA結合活性ならびにアマトキシン標的RNAポリメラーゼIIに対するそれらの機能活性を保持した。
【００９０】
本発明の文脈において、用語「半減期延長部分」は、「延長部分」(EM)とも呼ばれ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合ペプチドまたは融合タンパク質、小分子、天然または合成化学化合物を含むが、これらに限定されるものではない、前記コンジュゲートの血漿半減期を増大させる、および/または血漿からのクリアランスを経時的に低下させるのに役立つ、前記コンジュゲートへの取り込みの前、中または後である、コンジュゲートの任意の部分または成分を指す。前記半減期延長部分は、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは断片もしくはその誘導体、アルブミンもしくはヒト血清アルブミンもしくは断片もしくはその誘導体、トランスフェリンもしくはヒトトランスフェリンもしくは断片もしくはその誘導体、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ-サブユニット由来のCTPペプチド、エラスチン様ペプチド(ELP)反復配列、プロリン-アラニン-セリン(PAS)ポリマー、グリシン残基のホモポリマーなどのホモアミノ酸ポリマー(HAP)、人工ゼラチン様タンパク質(GLP)、非正確反復ペプチド配列(XTEN)、様々な長さのポリエチレングリコール(PEG)、またはそれらの断片もしくは誘導体、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００９１】
特定の実施形態では、本発明は、構造VIIまたはVIIIを有するコンジュゲートに関する。
2020534319.tif 000031
（ここで、各Lはリンカーであり、Amaはアマトキシンであり、Bは三官能性リンカー要素であり、EMは半減期延長部分であり、RはH、C1-6-アルキルおよびp-ブロモベンジルから選択される。）
さらなる特定の実施形態では、前記半減期延長部分が抗体、好ましくはヒト抗体のFc部分を含む、構造VIIまたはVIIIを有するコンジュゲートに関する。
【００９２】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、構造VIIまたはVIIIを有するコンジュゲートに関するものであり、ここで、コンジュゲートは、三官能性リンカーBのアジド部分と前記アマトキシンを前記三官能性リンカーBに連結するリンカーLのアルキン部分との反応に起因する1,2,3-トリアゾールを含み、前記アルキン部分は、プロピオル酸、3-ブチン酸、4-ペンチノイン酸、5-ヘキシン酸、ジベンジルシクロオクチン(DiBO)、ジベンジルアザシクロオクチノン(DBCO)およびビシクロ[6.1.0]ノン-4-イン (BCN)からなる群から選択される。
【００９３】
さらなる特定の実施形態は、本発明は、構造IXを有するコンジュゲートに関する。
2020534319.tif 000032
（ここで、PSMA結合部分は、2-[3-(1,3-ジカルボキシ-プロピル)ウレイド]ペンタン二酸または6-アミノ-2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)ウレイド]-ヘキサン酸に基づく）。
【００９４】
他の好ましい実施形態において、前記L-Amaは、以下のリストから選択される:
2020534319.tif 000033
2020534319.tif 000034
2020534319.tif 000035
2020534319.tif 000036
2020534319.tif 000037
2020534319.tif 000038
【００９５】
なおさらなる好ましい実施形態において、本発明は、以下のリストから選択されるコンジュゲートに関する：
2020534319.tif 000039
2020534319.tif 000040
2020534319.tif 000041
2020534319.tif 000042
2020534319.tif 000043
2020534319.tif 000044
【００９６】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態において、前記Fc部分は、配列番号1を含む。
第三の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
第四の態様において、本発明は、患者のがんの治療における使用のための本発明のコンジュゲートに関するものであり、特に、がんが、乳がん、膵臓がん、胆管がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。
【００９７】
本明細書において使用される、疾患または障害を「治療する（treat）」、「治療すること（treating)」またはその「治療(treatment)」は、以下の1つ以上を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度を軽減すること；（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発症を制限または予防すること；（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）障害に既に罹患した患者における障害の再発を制限または予防すること；および（ｅ）障害の症状を既に示した患者における症状の再発を制限または予防すること。
【００９８】
本明細書において使用される治療は、本発明によるコンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与することを含み得、「投与すること」としては、インビボ投与、およびエクスビボでの、例えば、静脈移植片での組織への直接的投与が挙げられる。
特定の実施形態において、治療有効量の本発明のコンジュゲートが使用される。
【００９９】
「治療有効量」は、意図される目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、要因、例えば、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受容する動物のサイズおよび種、ならびに投与目的により変動する。それぞれの個々の症例における有効量は、当分野において確立された方法に従って当業者が経験的に決定することができる。
【０１００】
別の態様において、本発明は、本発明によるアマトキシン、またはアマトキシンと標的結合部分との本発明のコンジュゲートを含み、1つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、および/または保存剤をさらに含む医薬組成物に関する。
【０１０１】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されていること、または米国薬局方、もしくは動物、より特定するとヒトにおける使用のための他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【０１０２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与される薬剤の形態で使用される。他には、特に注射剤および注入剤を含む非経口剤が含まれる。注射剤は、アンプルの形態で、またはいわゆる調製済み注射剤、例えば、調製済み注射器または使い捨ての注射器として、およびこれに加えて複数回の抜取りのための穿刺用フラスコ中で配合される。注射剤の投与は、皮下(s．c．)、筋肉内(i．m．)、静脈内(i．v．)または皮内(i．c．)適用の形態であり得る。特に、それぞれ好適な注射配合物を、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子またはコロイド分散系、例えば、ヒドロゾルとして製造することが可能である。
【０１０３】
注射用配合物はさらに、水性等張希釈剤により溶解または分散させることができる濃縮物として製造することができる。注入剤は、等張溶液、脂肪エマルション、リポソーム配合物およびマイクロエマルションの形態で調製することもできる。注射剤と同様、注入配合物は、希釈用濃縮物の形態で調製することもできる。注射用配合物は、例えば、ミニポンプによる入院療法および通院療法の両方における持続性注入剤の形態で適用することもできる。
【０１０４】
非経口薬物配合物に、例えば、アルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調節物質、錯体形成物質もしくはポリマー物質を、特にタンパク質もしくはポリマーへの本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの吸着に影響を与えるための物質として添加することが可能であり、または材料、例えば、注射機器もしくは包装用材料、例えば、プラスチックもしくはガラスへの本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの吸着を低減させる目的で、それらを添加することもできる。
【０１０５】
標的結合部分を含む本発明のアマトキシンは、非経口剤におけるマイクロ担体またはナノ粒子に、例えば、ポリ(メタ)アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸またはポリエーテルウレタンベースの微細分散粒子などに結合させることができる。非経口配合物は、例えば、本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートをそれぞれ微細分散、分散および懸濁形態で、もしくは医薬品中の結晶の懸濁液として導入する場合には「複数単位原理(multiple unit principle)」に基づき、または本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートを続いて植込される配合物中に、例えば、錠剤もしくはロッド剤(rod)中に封入する場合には「単一単位原理(single unit principle)」に基づき、デポー製剤として改変することもできる。単一単位および複数単位配合物のこれらの植込剤またはデポー医薬品は、いわゆる生分解性ポリマー、例えば、乳酸およびグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ(メタ)アクリレートまたは多糖などからなることが多い。
【０１０６】
非経口剤として配合される本発明の医薬組成物の製造の間に添加される補助剤および担体は、特に、滅菌水（Ａｑｕａ  ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ）、ｐＨ値調節物質、例えば、有機または無機の酸または塩基およびそれらの塩など、ｐＨ値調整用の緩衝物質、等張化用物質、例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなど、それぞれテンシド（ｔｅｎｓｉｄｅ）および界面活性剤、ならびに乳化剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、もしくは例えば、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））など、脂肪油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油もしくはヒマシ油など、脂肪酸の合成エステル、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび中性油（例えば、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））など、ならびにポリマー補助剤、例えば、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンなど、有機溶媒の溶解度を増加させる添加剤、例えば、プロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど、または錯体形成物質、例えば、シトレートおよび尿素など、保存剤、例えば、安息香酸ヒドロキシプロピルエステルおよびメチルエステル、ベンジルアルコールなど、酸化防止剤、例えば、亜硫酸ナトリウムなど、ならびに安定剤、例えば、ＥＤＴＡなどである。
【０１０７】
好ましい実施形態において懸濁液として本発明の医薬組成物を配合する場合、本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの状況を防止するための増粘剤、または堆積物の再懸濁性を確保するためのテンシドおよび多価電解質ならびに/または錯体形成剤、例えば、EDTAなどを添加する。活性成分と種々のポリマーとの複合体を得ることも可能である。このようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）またはポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルである。本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートは、包接化合物の形態で、例えば、シクロデキストリンとともに液体配合物中に取り込むこともできる。特定の実施形態において、分散剤を追加の補助剤として添加することができる。凍結乾燥物の製造のため、足場剤、例えば、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、PVPまたは種々のゼラチンを使用することができる。
【実施例】
【０１０８】
以下において、非限定的な実施例により本発明をより詳細に説明する。
A.  小分子薬物コンジュゲート(SMDC)の背景
１．SMDCに関する公表情報のレビュー
SMDCに関する先行技術を研究するために、以下の小分子標的に取り組むための既知のアプローチが研究された:
・葉酸受容体α (FR α)
・コレシストキニン2型受容体(CCKBR)
・炭酸脱水酵素IX (CAIX)
・インテグリン
・ゴンドトロピン放出レセプター(GnRH)
・前立腺特異的膜抗原(PSMA)
・ソマトスタチン受容体2(SSTR2)
・ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)
・ボンベシン受容体
・ゴンドトロピン放出受容体(GnRH)
【０１０９】
選択性S (S = IC50(受容体陰性細胞)/IC50(受容体陽性細胞))および標的化指数TI (TI = IC50(遊離毒素)/IC50(コンジュゲート)、受容体陽性細胞株における）に関連するデータを同定した。所定の標的に対して異なる先行技術文書が見出され得る場合には、最も高い標的化指数を有する文献が選択された。これらの解析結果を表1〜5にまとめた。さらなるSMDCは表６にまとめた。
【０１１０】
要約すると、最も強力な良好な選択性因子をもつ結合剤として最もよく記載されているのは、葉酸とDUPAである。しかし、多くの場合、受容体陰性細胞株に対するIC 50値は報告されておらず、主に使用されている毒素(DM1、アウリスタチン、ビンブラスチン、ツブリシン、パクリタキセル、ドセタキセル)の標的化指数値はかなり低い。
【０１１１】
２．追加の小分子-アマトキシンコンジュゲートの生成
上記実施例A.1に示されるSMDCに関する先行技術の研究で得られたデータを補完するために、多数のアマニチンベースのSMDCが生成された。表7にこれらの構築物の結果を示す。
【０１１２】
【表１】
2020534319.tif 000045
【０１１３】
【表２】
2020534319.tif 000046
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
【表６】
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【表７】
2020534319.tif 000051
【０１１８】
B  DUPA-アマトキシンコンジュゲートの合成
実施例1
(S)-ジ-tert-ブチル2-(3-((S)-6-アミノ-1-(tert-ブトキシ)-1-オキソヘキサン-2-イル)ウレイド)ペンタンジオエート(HDP 30.1570)
ステップ1:  (9S,13S)-トリ-tert-ブチル3,11-ジオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,10,12-トリアザペンタデカン9,13,15-トリカルボキシレート(HDP 30.1567)
2020534319.tif 000052
【０１１９】
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF; 20ml)中のジスクシンイミジルカーボネート(DSC) (1g、3.90mmol)の溶液に、α,γ−ジ−tert-ブチルL−グルタミン酸(1.16g、3.90mmol)を0℃で少しずつ添加した。50分後、トリエチルアミン(TEA; 541μl、3.90mmol)を添加した。完全変換後、α‐tert-ブチル‐γ‐カルボキシベンジルL‐リジン(1.46g、3.90mmol)とTEA (1.08ml、7.8mmol)を0℃で添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌した。DMFを除去し、残留物をメチルtert-ブチルエーテル(MTBE; 50ml)で取り込んだ。有機層を15%クエン酸溶液(2x50ml)、水(2x50ml)、飽和炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)溶液(2x50ml)および水(30ml)で順次洗浄した。有機層をマグネシウム(MgSO4)上で乾燥し、ろ過して濃縮した。得られた黄色油状物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中のMTBEの0〜60%勾配)により精製し、シロップとして尿素HDP 30.1567(2.34g,97%)を得た。
【０１２０】
ステップ2: (S)‐ジ-tert-ブチル2-(3-((S)‐6‐アミノ‐1‐(tert‐ブトキシ)‐1‐オキソヘキサン‐イル)ウレイド)ペナンジオエート(HDP 30.1570)
2020534319.tif 000053
【０１２１】
HDP 30.1567(2.32g、3.73mmol)を、MeOH (50ml)中およびPd‐Cの存在下で室温で2時間水素化した。次いで、混合物を濾過し、MeOHで洗浄した。溶液は減圧下で濃縮した。無色油をtert-ブタノール(tBuOH)(50ml, pH= 8)に溶解し、1M HCl (3.44ml,3.44mmol)を滴加した。生成物を一晩凍結乾燥し、無色固体(1.84g,94%)としてHDP 30.1570を得た。
2020534319.tif 000054
【０１２２】
ステップ3:（S）-ジ-tert-ブチル2-（3-（（S）-1-（tert-ブトキシ）-6-（（（（2,5-ジオキソピロリジン-1-イル）オキシ）カルボニル）アミノ）- 1-オキソヘキサン-2-イル）ウレイド）ペンタンジオエート（HDP 30.1579）
2020534319.tif 000055
【０１２３】
DMF (10ml)中のDSC (256mg、1mmol)の溶液に、DMF (10ml)中のHDP 30.1570(524mg、1mmol)およびTEA (139μl、1mmol)の溶液を0℃で10分間かけて滴下した。反応混合物を0℃で1時間撹拌した。室温で3時間かき混ぜた後、反応混合物を高真空下で蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中のアセトンの0〜50%勾配)により精製した。純粋な画分を合わせ、1,4-ジオキサンから一晩蒸発・凍結乾燥し、生成物を無色粉末(544mg、86%)とした。
2020534319.tif 000056
【０１２４】
実施例2
(S)‐5‐(tert-ブトキシ)‐4‐(3‐((S)‐1,5‐ジ‐tert ‐ブトキシ‐1,5‐ジオキソペンタン‐2‐イル)ウレイド)‐5‐オキソペンタノイン酸(HDP 30.2178)
【０１２５】
ステップ1: (S)‐5‐ベンジル1‐tert-ブチル2‐(3‐((S)‐1,5‐ジ‐tert‐ブトキシ‐1,5‐ジオキソペンタン‐2‐イル)ウレイド)ペンタネジオエート(HDP 30.2175)
2020534319.tif 000057
【０１２６】
DSC(1.73g、6.76mmol)のDMF 31.6ml)溶液に、α,γ‐ジ-tert-ブチルL‐グルタミン酸(2g、6.76mmol)を0℃で少しずつ添加した。50分後、TEA (937μl,6.76mmol)を追加した。完全変換後、α‐tert-ブチル‐γ‐ベンジルL‐グルタミン酸(2.23g、6.76mmol)とTEA (1.87ml、13.52mmol)を0℃で添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌した。DMFを真空中で除去し、残渣をMTBE (100ml)に溶解した。有機層を15%クエン酸溶液(2x100ml)、水(2x100ml)、飽和NaHCO3溶液 (2x100ml)および水(80ml)で順次洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた黄色油状物をシリカゲルカラム(ヘキサン中の酢酸エチル(EtOAc)の0〜33%勾配)上のクロマトグラフィーにより精製し、尿素HDP 30.2175を無色シロップ(3.02g、77%)として得た。
2020534319.tif 000058
【０１２７】
ステップ2: (S)‐5‐(tert‐ブトキシ)‐4‐(3‐((S)‐1,5‐ジ‐tert‐ブトキシ‐1,5‐ジオキソペンタン‐2‐イル)ウレイド)‐5‐オキソペンタン酸(HDP 30.2178)
2020534319.tif 000059
【０１２８】
HDP 30.2175(3.02g,5.21mmol)を酢酸エチル(EtOAc; 27.3ml)中で室温で水素化し、Pd‐Cの存在下で一晩加水分解した。次いで、混合物を濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、DUPA前駆体HDP 30.2178を無色透明シロップ(2.45g、96%)とした。
2020534319.tif 000060
【０１２９】
実施例3
DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys試薬(HDP 30.2225)
ステップ1: (tBuO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-CysTrt試薬 (HDP 30.2185)
2020534319.tif 000061
【０１３０】
試薬および条件。i) a) Fmoc-Phe-OH、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)、(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、DMF、60℃、40W、10分;b)20% ピペリジン/DMF, 60°C, 40 W、3 分、ii) a) Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40W、10分; b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; iii) a) Fmoc-Phe-OH, HOBt, HBTU, DIPEA, DMF, 60°C, 40 W, 10 分; b) 20% ピペリジン/DMF, 60°C, 40 W, 3 分; iv) HDP 30.2178、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; v) TFE/AcOH/DCM(1:1:8)、23℃、1時間30分。
【０１３１】
DUPA−ペプチド前駆体HDP 30.2185を、上記の条件で、H−Cys(Trt)−(2−ClTrt)樹脂(391mg、0.25mmol)から出発するマイクロ波支援Fmoc固相ペプチド合成によって調製した。樹脂結合ペプチドを、トリフルオロエタノール(TFE)/酢酸(AcOH)/ジクロロメタン(DCM) (1:1:8)混合物(10ml、2時間30分)で洗浄することによって樹脂から切断した。次に、樹脂を新しいTFE/AcOH/DCM (1:1:8)混合物(10ml、2分)、DCM (10ml、2分)およびMeOH (10ml、2分)で順次洗浄した。濾液を収集し、真空中で濃縮して、214mgの生成物(68%)を得た。
2020534319.tif 000062
【０１３２】
ステップ2: DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys試薬(HDP 30.2225)
2020534319.tif 000063
【０１３３】
HDP 30.2185(109mg、85.6μmol)を、トリフルオロ酢酸(TFA)/トリイソプロピルシラン(TIS)/H2O(95:5:5)カクテル(8ml)および1,4−ジチオトレイトール(DTT) (362mg)で処理し、アルゴン下、室温で1時間30分間撹拌した。混合物をトルエン(2×8ml)と共蒸発させた。冷MTBE (40ml)を添加すると、固体が沈殿した。沈殿物を0℃での遠心分離によって単離し、収集し、さらなる冷MTBE (40ml)で洗浄し、0℃で遠心分離し、収集した。ペレットをアセトニトリル(ACN)/H2O(1:1、v:v、2ml)に溶解し、分取逆相高速パーフォマンス液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)によりC18カラム[λ=210nm;勾配:0分5% B;15〜18分100% B; 18.50〜22分5% B; A=0.05% TFAを含む水、B=アセトニトリル]で少しずつ精製した。標的化合物を含有するチューブを合わせ、蒸発させ、tBuOH/H2O(4:1、v:v、5ml)中で一晩凍結乾燥させて、試薬HDP 30.2225を白色粉末として得た(122.9mg、85%)。
2020534319.tif 000064
【０１３４】
実施例4
DUPA-Aoc-Phe-Phe-OSu (HDP 30.2401)
ステップ1: (ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-OH試薬(HDP 30.2393)
2020534319.tif 000065
【０１３５】
試薬および条件。i) a) Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; ii) a) Fmoc-Aoc-OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分;b）20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; iii) HDP 30.2178、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; iv) TFE/AcOH/DCM(1:1:8)、23℃、1時間30分。
【０１３６】
DUPA−ペプチド前駆体HDP 30.2393を、上記の条件で、H−Phe−(2−ClTrt)樹脂(417mg、0.25mmol)から出発するマイクロ波支援Fmoc固相ペプチド合成によって調製した。樹脂結合ペプチドを、TFE/AcOH/DCM (1:1:8)混合物(10ml、2時間30分)で洗浄することによって樹脂から切断した。次に、樹脂を新しいTFE/AcOH/DCM (1:1:8)混合物(10ml、2分)、DCM (10ml、2分)およびMeOH (10ml、2分)で順次洗浄した。濾液を集め、真空中で濃縮して、131,15mgの生成物(57%)を得た。
2020534319.tif 000066
【０１３７】
ステップ2: (ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-OSu試薬(HDP 30.2401)
2020534319.tif 000067
【０１３８】
HDP 30.2393(131.01mg、0.15mmol)を、アルゴン下、室温でテトラヒドロフラン(THF; 2.5ml)に溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC; 52.61mg、0.26mmol)およびTHF (各200μl)に溶解したN−ヒドロキシスクシンイミド(HOSu; 29.34mg、0.26mmol)を連続的に添加した。
【０１３９】
反応混合物をアルゴン下室温で18時間撹拌した。DCCを濾別し、少量のTHFで洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣を0.05% TFA (5:1、6ml)を含むACN/MeOHに再溶解し、15ml遠心管に移し、0℃に冷却し、遠心分離した(4500rpm、3分)。固体残渣を廃棄し、上清を回収し、減圧下で蒸発させ、0.05%TFA (5ml)を含むtBuOHで一晩凍結乾燥して、147.77mg (97%)のHDP 30.2401を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000068
【０１４０】
実施例5
DUPA-Aoc-Phe-Phe-(His-Glu)2-Cys試薬(HDP 30.2579)
ステップ1: (tBuO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-(HisTrt-GluOtBu)2-CysTrt試薬 (HDP 30.2557)
2020534319.tif 000069
【０１４１】
試薬および条件。i) a) Fmoc−Glu(OtBu)−OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分;b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40W、3分；ii)a）Fmoc−His(Trt)−OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; iii)a)Fmoc−Glu(OtBu)−OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; iv) a）Fmoc−His(Trt)−OH、HOBt、HBTU、DMF、60℃、40 W、10分；b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; v) a）Fmoc−Phe−OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、10分;vi)a)Fmoc−Phe−OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; b)20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; vii) a）Fmoc−Aoc−OH、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分;b）20%ピペリジン/DMF、60℃、40 W、3分; viii) HDP 30.2178、HOBt、HBTU、DIPEA、DMF、60℃、40 W、10分; ix) TFE/AcOH/DCM(1:1:8)、23℃、1時間30分。
【０１４２】
DUPA−ペプチド前駆体HDP 30.2557を、上記の条件で、H−Cys−(2−ClTrt)樹脂(391mg、0.25mmol)から出発するマイクロ波支援Fmoc固相ペプチド合成によって調製した。樹脂結合ペプチドを、トリフルオロエタノール(TFE)/酢酸(AcOH)/ジクロロメタン(DCM) (1:1:8)混合物(10ml、2時間30分)で洗浄することによって樹脂から切断した。次に、樹脂を新しいTFE/AcOH/DCM (1:1:8)混合物(10ml、2分)、DCM (10ml、2分)およびMeOH (10ml、2分)で順次洗浄した。濾液を収集し、真空中で濃縮して、284mgの生成物(47%)を得た。
2020534319.tif 000070
【０１４３】
ステップ2: DUPA-Aoc-Phe-Phe-(His-Glu)2-Cys試薬(HDP 30.2579)
2020534319.tif 000071
HDP 30.2557(284mg、0.118mmol)をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5)カクテル(6ml)およびDTT (150mg)で処理し、アルゴン下、室温で1時間30分間撹拌した。混合物をトルエン(2×6ml)と共蒸発させた。冷MTBE (40ml)を添加すると、固体が沈殿した。沈殿物を0℃での遠心分離によって単離し、収集し、さらなる冷MTBE (40ml)で洗浄し、0℃で遠心分離し、収集した。ペレットをACN/H2O(9:1、v:v、1.5ml)に溶解し、分取RP−HPLCによりC18カラム上で少しずつ精製した[λ=246nm;勾配:0分5% B;15〜18分100% B; 18.50〜22分5% B; A=0.05% TFAを含む水、B=アセトニトリル]。製品を含んでいる分画物は、DUPA-ペプチド試薬HDP 30.2579を白色固体(115.38mg、70%)として一晩結合させ、蒸留し、そして乾燥させ、OBOH/H2O(4:1、v:5ml)を蒸留した。
2020534319.tif 000072
【０１４４】
実施例6
1,1,1-トリフェニル-5,8,11-トリオキサ-2-チアトリデカン-13-アミン(HDP 30.2383)
ステップ1: 1−ブロモ−2−(2−(2−(2−ブロモエトキシ)エトキシ)エタン(HDP 30.0381)
2020534319.tif 000073
【０１４５】
トリフェニルホスフィン(Ph3P;0.5g、230.8mmol)を乾燥DCM (190ml)に溶解し、混合物を0℃に冷却した。臭素(11.8ml、230,8mmol)を滴下した。5分後、DCM (11.8ml)に溶解したテトラエチレングリコール(20.0ml、115.4mmol)を滴下し、反応混合物を室温まで解凍し、74時間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、飽和NaHCO3溶液(400ml)でpH 7に希釈した。10%チオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3)溶液(20ml)を追加し、相を分離した。有機相を飽和塩化ナトリウム(NaCl)溶液(100ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。残渣をn-ヘキサン(400ml)に取り、30分間振盪した。結晶を濾別し、n-ヘキサン(2×50ml)で取り、超音波処理し、濾別した。
濾液を集め、蒸発させ、蒸留して(140℃、0.0062 mbar)、34.70g(94%)のHDP 30.0381を無色油として得た。
【０１４６】
ステップ2:  1−アジド-2−(2−(2−(2−ブロモエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタン(HDP 30.0388)
2020534319.tif 000074
HDP 30.0381(4.8g、15.0mmol)を無水DMF (30ml)に溶解した。NaN3(975mg、15.0mmol)を添加し、反応混合物をアルゴン下、室温で21時間撹拌し、ステップ3で直接使用した。
【０１４７】
ステップ3: 13-アジド-1,1,1-トリフェニル-5,8,11-トリオキサ-2-チアトリデカン(HDP 30.2382)
2020534319.tif 000075
トリフェニルメタンチオール(4.17g、15.0mmol)をDMF (30ml)に溶解し、0℃に冷却した。メタノール酸ナトリウム(NaOMe; 2.78ml、15.0mmol、MeOH中30%溶液)を添加した。2分後、反応混合物HDP 30.0388を添加し、反応物を室温まで解凍し、1時間30分間撹拌した。DMFを蒸発させ、残渣をEtOAc (100ml)で取り、飽和塩化アンモニウム(NH4Cl)溶液(100ml)、飽和NaHCO3溶液(100ml)、H2O(100ml)および飽和NaCl溶液(100ml)で順次洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラム(330g、勾配:0〜20%のMTBE/トルエン、λ= 285nm)で精製した。生成物を含む画分を集め、蒸発させて3.12gのHDP 30.2382とした。
【０１４８】
ステップ4:  1,1,1-トリフェニル-5,8,11-トリオキサ-2-チアトリデカン-13-アミン(HDP 30.2383)
2020534319.tif 000076
HDP 30.2382(478mg、1mmol)をTHF (20ml)に溶解した。トリフェニルホスフィン(525mg、2mmol)およびH2O(2ml)を順次添加した。反応混合物を室温で42時間撹拌した。蒸発後、粗生成物をシリカゲルカラム(40g、勾配:DCM/MTBE/MeOH 0〜100%(6:3:1、v:v:v)、DCM中1% TEA、1% TEA、λ= 235nm)で精製した。生成物を含む画分を集め、蒸発させて、354mg (77%)のHDP 30.2383を黄色がかったオイルとして得た。
2020534319.tif 000077
【０１４９】
実施例7
1,1,1-トリフェニル-5,8,11,14,17,20,23-ヘプタオキサ-2-チアペンタコサン-25-アミン
(HDP 30.2407)
ステップ1:  1,23-ジブロモ-3,6,9,12,15,18,21-ヘプタオキサトリコサン(HDP 30.2397)
2020534319.tif 000078
無水メタンスルホン酸(4.7g、27.0mmol)を無水DCM (80ml)にアルゴン下で溶解し、0℃に冷却した。DCM (20ml)に溶解したオクタエチレングリコール(5.0g、13.5mmol)を添加した。DIPEA (9.18ml、54mmol)を0℃で希釈せずに添加した。反応混合物を0℃で5分間撹拌し、次いで室温まで解凍した。出発物質の完全な変換(4時間)後、THF (100ml)中の臭化リチウム(LiBr; 11.72g、135.0mmol)を添加し、反応混合物を還流下(60℃)で30分間加熱した。6時間後、混合物を冷却し、真空中で蒸発させた。残渣をH2O(100ml)に溶解し、DCM (2×100ml)で抽出した。合わせた有機相を飽和NaCl溶液(100ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、蒸発させて、橙色油として5.78g(86%)のHDP 30.2397を得、後続を精製せずに次のステップに使用した。
ステップ2:  1-アジド-23-ブロモ-3,6,9,12,15,18,21-ヘプタオキサトリコサン(HDP 30.2402)
2020534319.tif 000079
HDP 30.2402を、本明細書の実施例6、ステップ2に記載のように調製した。
【０１５０】
ステップ3:  25-アジド-1,1,1-トリフェニル-5,8,11,14,17,20,23-ヘプタオキサ-2-チアペンタコサン(HDP 30.2403)
2020534319.tif 000080
HDP 30.2403を、実施例6、ステップ3に記載されるように調製し、1.93g(51%)の生成物を得た。
2020534319.tif 000081
【０１５１】
ステップ4:  1,1,1-トリフェニル-5,8,11,14,17,20,23-ヘプタオキサ-2-チアペンタコサン-25-アミン(HDP 30.2407)
2020534319.tif 000082
【０１５２】
HDP 30.2403(654mg、1mmol)をTHF (20ml)に溶解し、トリフェニルホスフィン(525mg、2mmol)を加えた。トリフェニルホスフィンが完全に溶解した後、H2O(2ml)を添加し、反応混合物を開放タップを用いて室温で一晩撹拌した。
【０１５３】
蒸発後、生成物をシリカゲルカラム(40g、溶離液:DCM/MeOH 0〜100%(4:1、v:v)、DCM中1% TEA、1% TEA、λ= 235nm)で精製した。
【０１５４】
生成物に対応する画分を合わせ、蒸発させた。残渣をシクロヘキサン(10ml)およびDCM (2ml)に再溶解し、沈殿物を濾過した。濾液を蒸発させ、凍結乾燥して、622.7mg (99%)のHDP 30.2407を黄色がかったオイルとして得た。
2020534319.tif 000083
【０１５５】
実施例8
1,1,1-トリフェニル-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-ウンデカオキサ-2-チアヘプタトリアコンタン-37-アミン
(HDP 30.2585)
ステップ1:  1,35-ジブロモ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-ウンデカオキサペンタトリアコンタン(HDP 30.2564)
2020534319.tif 000084
HDP 30.2564を、本明細書の実施例6、ステップ1に記載されるように調製し、黄色がかったオイルとして1.74g(57%)の生成物を得た。
2020534319.tif 000085
【０１５６】
ステップ2:  1-アジド-35-ブロモ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-ウンデカオキサペンタトリアコンタン(HDP 30.2575)
2020534319.tif 000086
HDP 30.2575を、実施例6、ステップ2に記載のように調製した。
【０１５７】
ステップ3:  37-アジド-1,1,1-トリフェニル-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-ウンデカオキサ-2-チアヘプタトリアコンタン(HDP 30.2576)
2020534319.tif 000087
HDP 30.2576を、本明細書の実施例5、ステップ3に記載のように調製し、1.94gの材料(90%)を得た。
【０１５８】
ステップ4:  1,1,1-トリフェニル-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-ウンデカオキサ-2-チアヘプタトリアコンタン-37-アミン(HDP 30.2581)
2020534319.tif 000088
HDP 30.2581を、本明細書の実施例5、ステップ4に記載のように調製し、627mg (22%)の生成物を黄色がかったオイルとして得た。
2020534319.tif 000089
【０１５９】
実施例9
DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG4-SH試薬
(HDP 30.2439)
ステップ1:  (ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-PEG4-S(Trt)試薬(HDP 30.2409)
2020534319.tif 000090
【０１６０】
HDP 30.2401(20mg、0.020mmol)をTHF (237μl)に溶解し、HDP 30.2383(9.29mg、0.021mmol)およびNaHCO3(1.81mg、0.022mmol)をH2O(158μl)に溶解し、HDP 30.2401溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応物を0.2Mクエン酸溶液(237μl)で酸性化した。EtOAc (237μl)を加え、有機化合物を抽出した(×2)。合わせた水相をクエン酸でpH= 3に酸性化し、EtOAc (3×237μl)で抽出した。有機相をH2O、NaCl飽和溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発させ、15.8mg (59%)のHDP 30.2409を白色固体として凍結乾燥した。
2020534319.tif 000091
【０１６１】
ステップ2:  DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG4-SH 試薬(HDP 30.2439)
2020534319.tif 000092
【０１６２】
HDP 30.2409(15.8mg、11.6μmol)をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5)カクテル(2ml)で処理し、アルゴン下、室温で1時間30分間撹拌した。混合物をトルエン(2×2ml)と共蒸発させた。冷MTBE (10ml)を添加すると、固体が沈殿した。混合物を0℃で遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿物を追加の冷MTBE (10ml)で洗浄し、0℃で遠心分離し、回収し、一晩凍結乾燥して、試薬HDP 30.2439を白色粉末として得た(6.7mg、61%)。
2020534319.tif 000093
【０１６３】
実施例10
DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG8-SH試薬
(HDP 30.2466)
ステップ1:  (ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-PEG8-S(Trt)試薬(HDP 30.2461)
2020534319.tif 000094
【０１６４】
HDP 30.2401(78.0mg、0.077mmol)をTHF (0.93ml)に溶解し、HDP 30.2407(50.8mg、0.081mmol)およびNaHCO3(7.12mg、0.085mmol)をH2O(0.62ml)に溶解し、HDP 30.2401溶液に加えた。反応混合物を室温で8時間撹拌した。反応物を減圧下で蒸発させ、残渣をACN/H2O(9:1、v:v、500μl)に再溶解し、C18カラム上の分取HPLCで2回に分けて精製した[λ=210nm;勾配:0〜1分5% B;1〜14分54% B;14〜26分100% B;26〜30分100% B;30〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、凍結乾燥して、46.38mg (40%)のHDP 30.2461を白色固体として得た。
2020534319.tif 000095
【０１６５】
ステップ2:  DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG8-SH 試薬(HDP 30.2466)
2020534319.tif 000096
【０１６６】
HDP 30.2461(46mg、30.0μmol)をTFA/TIS/H2O(95:5:5、5ml)/DTT(260mg)カクテルで処理し、アルゴン下、室温で1時間30分間撹拌した。混合物をトルエン(2×5ml)と共蒸発させた。MeOH (200μl)に溶解した残渣を冷MTBE (13ml)に滴下し、固体の沈殿を生じさせた。混合物を0℃で遠心分離し、沈殿を収集し、さらなる冷MTBE (13ml)で洗浄し、0℃で遠心分離し、収集した。ペレットをACN/H2O(5:5、v:v、200μl)に溶解し、C18カラム上の分取HPLCで精製した[λ=210nm;勾配:0〜1分5% B;1〜14分54% B;14〜26分100% B;26〜30分100% B;30〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、凍結乾燥して、18.1mg (54%)のHDP 30.2466を白色固体として得た。
2020534319.tif 000097
【０１６７】
実施例11
DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG12-SH 試薬(HDP 30.2585)
(HDP 30.2585)
ステップ1:  (ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-PEG12-S(Trt)試薬(HDP 30.2584)
2020534319.tif 000098
【０１６８】
HDP 30.2401(50.0mg、0.045mmol)をTHF (545μl)に溶解し、HDP 30.2581(41.3mg、0.051mmol)およびNaHCO3溶液(4.16mg、0.050mmol)をH2O(362μl)に溶解し、HDP 30.2401溶液に添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応物を減圧下で蒸発させ、残渣をACN/H2O(1:1、v:v、400μl)に再溶解し、C18カラム上の分取HPLCで精製した[λ=210nm;勾配:0.5% B; 15分100% B; 18分100% B; 18.5分5% B; 22分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]。生成物を含む画分を蒸発させ、43.75mg (57%)のHDP 30.2584を白色凍結乾燥粉末として凍結乾燥した。
2020534319.tif 000099
【０１６９】
ステップ2:  DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEG12-SH 試薬(HDP 30.2585)
2020534319.tif 000100
【０１７０】
HDP 30.2584(43.18mg、43.0μmol)をTFA/TIS/H2O(95:5:5、6ml)/ DTT (120mg)カクテルで処理し、アルゴン下、室温で1時間30分間撹拌した。混合物をトルエン(2×6ml)と共蒸発させた。ACN (200μl)に溶解した残渣を冷MTBE (40ml)に滴下し、固体の沈殿を生じさせた。混合物を0℃で遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿物を追加の冷MTBE (40ml)で洗浄し、0℃で遠心分離し、回収した。ペレットをACN/H2O(8:2、v:v、200μl)に溶解し、C18カラム上の分取HPLCによって精製した[λ=210nm;勾配:0〜1分5% B;1〜14分54% B;14〜26分100% B;26〜30分100% B;30〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、凍結乾燥して、18.2mg (55%)のHDP 30.2585を白色固体として得た。
2020534319.tif 000101
【０１７１】
実施例12
DUPA-Aoc-Phe-Phe-N-(1-アミド-2-メルカプト)ブタン試薬
(HDP 30.2614)
ステップ1: (tBuO)2DUPAtBu-Aoc-Phe-Phe-N-(1-アミド-2-(S-トリチルチオ)ブタン試薬 (HDP 30.2612)
2020534319.tif 000102
HDP 30.2612は、実施例9に記載されているように、3-トリチルスファニル-ブチルアミンをアミン化合物として用いたステップ1で作成し、30.29mg (56%)の生産物を得た。
2020534319.tif 000103
【０１７２】
ステップ2:  DUPA-Aoc-Phe-Phe-N-(1-アミド-2-メルカプト)ブタン試薬(HDP 30.2614)
2020534319.tif 000104
【０１７３】
HDP 30.2614は、実施例9に記載のとおり、ステップ2で調製され、白粉として6.10mg (30%)の製品を提供した。
2020534319.tif 000105
【０１７４】
実施例13
6'(6-N-マレイミド-ヘキシル)-α-アマニチン
(HDP 30.0880)
ステップ1:  1,7-ジメチル-10-オキサ-4-アザトリシクロ[5.2.1.02,6]dec-8-en-3,5-ジオン、エキソ異性体(HDP 30.0891)
2020534319.tif 000106
【０１７５】
4.00g(41.2mmol)の2,5−ジメチルフランおよび5.93g(61.7mmol、1.5当量)のマレイミドを30mlのジエチルエーテル(Et2O)に溶解し、Parr反応器中で90℃に12時間加熱した。得られた沈殿物を濾別し、MeOHから再結晶して、6.62g(83%)の結晶(融点:137℃)を得た。
2020534319.tif 000107
【０１７６】
ステップ2:  4-(6-ブロモヘキシル)-1,7-ジメチル-10-オキサ-4-アザトリシクロ[5.2.1.02,6]dec-8-en-3,5-ジオン、エキソ異性体(HDP 30.0916)
2020534319.tif 000108
【０１７７】
386mg (2mmol)のHDP 30.0891および1.952g(8mmol)の1,6−ジブロモヘキサンを20mlのDMFに溶解し、276mg (2mmol)の炭酸カリウムを添加し、懸濁液を50℃で3時間加熱した。その後、DMFを蒸発させ、残渣を100mlのDCMに取った。無機塩を濾過により除去し、珪藻土(3g)を濾液に添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を、勾配n−ヘキサン−酢酸エチルで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、HDP 30.0916(483mg)をワックス状結晶として68%収量で得た。
2020534319.tif 000109
【０１７８】
ステップ3:  6'-(6-(1,7-ジメチル-10-オキサ-4-アザトリシクロ[5.2.1.02,6]dec-8-en-3,5-ジオン-4-イル-ヘキシル)-α-アマニチン(HDP 30.0903)
2020534319.tif 000110
【０１７９】
アルゴン下、室温で、34.5mg (37.5μmol)の減圧乾燥α−アマニチンを1000μlの乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。HDP 30.0916(106.8mg、8当量)および1M水酸化ナトリウム(41.2μl、1.1当量)を添加した。室温で3時間後、反応混合物をDMSO中の1M AcOH溶液41.2μlでpH = 5に酸性化した。溶媒を真空中で除去し、残渣を、5〜100% MeOHの勾配を有するC18カラム上の分取RP−HPLCによって精製した。生成物を含有する画分を蒸発させて、27.2mg (59%)のHDP 30.0903を無色固体として得た。
2020534319.tif 000111
【０１８０】
ステップ4:  6'-(6-N-マレイミド-ヘキシル)-α-アマニチン(HDP 30.0880)
2020534319.tif 000112
【０１８１】
HDP 30.0903(27.2mg、22.7μmol)を3000μlの乾燥DMSOに溶解した。反応混合物を100℃に加熱し、1.5時間撹拌した。40℃に冷却した後、DMSOを真空中で除去し、残渣を上記の方法による分取HPLCによって精製した。17.3〜18.1分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させた。残渣を3mltBuOHから凍結乾燥して、23.6mg (94%)のHDP 30.0880をオフホワイトの粉末として得た。
2020534319.tif 000113
【０１８２】
実施例14
6'-O- [3-（5-ニトロ-ピリジン-2-イルジスルファニル）プロピル）]-α-アマニチン
(HDP 30.0951)
ステップ1:  6'-O-(3-S-トリチルスルファニル-プロピル)-α-アマニチン(HDP 30.0517)
2020534319.tif 000114
【０１８３】
アルゴン下で、46mg (50μmol)の減圧乾燥α−アマニチンを2500μlの乾燥DMSOに溶解した。3−(S−トリチル)−メルカプトプロピル−1−ブロミド(159mg、8当量)、続いて60μlの1M水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を添加した。室温で1.5時間後、反応混合物をDMSO中の50μlの1M AcOHでpH=5に酸性化し、溶媒を蒸発させた。残渣を200μlのMeOHに溶解し、10mlのMTBEで満たした遠心管に滴下した。得られた沈殿物を0℃に10分間冷却し、遠心分離(4000×g)によって単離し、続いて10mlのMTBEで洗浄した。上清を捨て、ペレットを750μlのMeOHに溶解し、C18カラム(250×21.2mm、Luna RP−18、10μm、100Å)上の分取HPLCで3回に分けて精製した[勾配:0分5 % B; 5分5 % B 20分100 % B; 25分100 % B; 27分5 % B、35分5% B;流速30ml/分]。21.1〜21.8分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させて36.5mg (59%)のHDP 30.0517を無色固体として得た。
2020534319.tif 000115
【０１８４】
ステップ2:  6'-O-[3-(5-ニトロ-ピリジン-2-イルジスルファニル)プロピル)]-α-アマニチン(HDP 30.0951)              
2020534319.tif 000116
【０１８５】
ステップ1生成物(5.00mg、4.05μmol)に、200μlのTFAに溶解した2,2'−ジチオビス(5−ニトロピリジン) (DTNP)(6.28mg、5当量)を添加した。4分後、揮発性物質を留去し、残渣を1000μlのMeOHと共蒸発させた。粗製品はステップ1と同様にRP-HPLCで浄化した。18.46〜19.28分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させた。残渣を2mlのtBuOHから2.99mg (64%)のHDP 30.0951にわずかに黄色がかった固体として凍結乾燥した。
2020534319.tif 000117
【０１８６】
実施例15
6'-O-[3-(5-ニトロ-ピリジン-2-イルジスルファニル)ブチル)]-α-アマニチン
(HDP 30.2587)
ステップ1:   6'-O-(3-S-トリチルスルファニル-ブチル)-α-アマニチン(HDP 30.1168)
2020534319.tif 000118
【０１８７】
アルゴン下で、38mg (41.3μmol)の減圧乾燥α−アマニチンを乾燥DMSO (1150μl)に溶解した。1−ブロモ−3−トリチルスルファニル−ブタン(68.1mg、4当量)、続いて2M水酸化リチウム(LiOH)溶液(25μl、1.2当量)を添加した。室温で26時間後、反応混合物をDMSO中の1M AcOH(50μl、1.2当量)で酸性化し、溶媒を蒸発させた。残渣を400μlのMeOHに溶解し、10mlのMTBEで満たした遠心管に滴下した。得られた沈殿物を0℃に10分間冷却し、遠心分離(4000×g)によって単離し、続いて10mlのMTBEで洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを800μlのMeOHに溶解し、C18カラムで分取HPLC上で2回に分けて精製した(250×21.2mm、Luna RP−18、10μm、100Å)[λ=305nm;勾配:0分5 % B; 15分100 % B 18分100 % B; 18.5分5 % B; 22分5% B;0.05% TFAを含むA=水、0.05% TFAを含むB=メタノール;流量30ml/分;]。生成物に対応する画分を集め、溶媒を蒸発させて、31.3mg (61%)のHDP 30.1168を無色固体として得た。
2020534319.tif 000119
【０１８８】
ステップ2:  6'-O-[3-(5-ニトロ-ピリジン-2-イルジスルファニル)ブチル)]-α-アマニチン(HDP 30.2587)
2020534319.tif 000120
【０１８９】
HDP 30.1168(31.17mg、2.6μmol)に、TFA (260μl、5.0当量)中の2,2'−ジチオビス(5−ニトロピリジン) (DTNP)0.5M溶液を添加し、混合物を室温でボルテックスした。4分後、反応混合物を10mlの冷MTBE/n−ヘキサン(1:1)混合物に滴下した。沈殿物を0℃に10分間冷却し、0℃での遠心分離によって単離した。上清を廃棄し、ペレットを400μlのMeOHに溶解し、ステップ1に記載の条件と同様に2つのステップで精製した。18.46〜19.28分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させた。残渣をtBuOH/H2O(4:1、10ml)から凍結乾燥して、17.92mg (59%)のHDP 30.2587を黄色がかった粉末として得た。
2020534319.tif 000121
【０１９０】
実施例16
6'-O-[3-(3-アミノ-1,1-ジメチル-プロピルジスルファニル)-プロポキシ]-α-アマニチン(HDP 30.1172)
2020534319.tif 000122
【０１９１】
HDP 30.0951(10.0mg、8.09μmol)を15ml遠心管に秤量し、TFA中の0.5M DTNP溶液(80.94μl、5当量)に溶解した。反応混合物を室温で4分間撹拌した。次に、反応混合物をMTBE/n−ヘキサン(1:1、10ml)で希釈した。沈殿物を0℃に10分間冷却し、遠心分離(4000×g)によって単離し、続いてMTBE (10ml)で洗浄した。上清を捨て、ペレットを500μlのMeOHに溶解した。4−アミノ−2−メチルブタン−2−チオールHDP 30.1157(17mg、9当量)を添加した。1時間後、混合物を0.05% TFAを含むMTBE(10ml)で粉砕し、エーテルをデカントし、0.05% TFAを含む新鮮なMTBE(10ml)で置き換えた。得られた沈殿物をMeOH (200μl)に溶解し、C18カラム(250×21.2mm、Luna RP−18、10μm、100Å)上の分取HPLCで精製した[λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]。生成物に対応する画分を集め、溶媒を蒸発させて、8.05mg (81%)のHDP 30.1172を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000123
【０１９２】
実施例17
6'-O-(6-アミノヘキシル)-α-アマニチン(HDP 30.0134)
ステップ1:  6'-O-(6-Boc-アミノヘキシル)-α-アマニチン(HDP 30.0132)
2020534319.tif 000124
【０１９３】
α‐アマニチン(105mg,114μmol)と6‐(Boc‐アミノ)ヘキシルブロミド(128mg,457μmol)のDMSO (3.5ml)溶液を2M LiOH溶液(68.6μl,137.1μmol)で処理した。周囲温度で40分間撹拌した後、反応混合物を、AcOH (7.84μl)の添加によって酸性化し、次いで、混合物を、所望のエーテル中間体を沈殿させるために、MTBE (40mL)を含有するフラスコに滴下した。上清をデカントし、廃棄した。沈殿物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=水; B=メタノール]によって精製して、HDP 30.0132(84.37mg、66%)を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000125
【０１９４】
ステップ2:  6'-O-(6-アミノヘキシル)-α-アマニチン(HDP 30.0134)
2020534319.tif 000126
【０１９５】
HDP30.0132(152mg、136μmol)にTFA (5mL)を加え、反応混合物を周囲温度で2分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0分5% B;0〜1分30% B;1〜10分39% B;10〜13分100% B;13〜18分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]によって精製した。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、凍結乾燥して、誘導体HDP 30.0134(118.67mg、86%)を得た。
2020534319.tif 000127
【０１９６】
実施例18
6'-[H-Val-Ala-PAB]α-アマンチン(HDP 30.1702)
ジペプチドp−アミノベンジルブロミドを、Jeffreyら（J. Med.Chem.2005, 48, 1344-1358)によって開示された方法の適応によって、対応するベンジルアルコールから合成した。一般的な方法は、以下のスキームによって例示される:
2020534319.tif 000128
【０１９７】
ステップ1:  Boc-Val-Ala-PAB-OTBDMS (HDP 30.1683)
Boc−Val−Ala−PAB−OH(HDP 30.1680、8.28g、21.04mmol)をDMF (50ml)に溶解し、DIPEA (8.61ml、52.61mmol)およびtert−ブチルジメチル−クロロシラン(TBDMSCl) (10.99ml、31.56mmol)を添加した。30分後、DMFを蒸発させ、残渣を200mlのEtOAcに溶解し、100mlの0.2Mクエン酸溶液、水、飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中0〜100% MTBEの勾配を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を合わせ、蒸発させて9.12g(85%)の生成物を固体として得た。
2020534319.tif 000129
【０１９８】
ステップ2:  Boc-Val-Ala(SEM)-PAB-OTBDMS (HDP 30.1687)
ステップ1の生成物(9.12g、17.96mmol)のTHF (100mL)リチウムビス(トリメチルシリル)アミド(LiHMDS) (26.94mL、THF中1M溶液)溶液に、0℃で添加した。10分後、 無希釈の2−(トリメチルシリル)−エトキシメチルクロリド(SEMCl)(6.36ml、35.92mmol)を0℃で添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。変換後、200mlのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH=6.40)を添加し、生成物をEtOAc (2×50ml)で抽出した。有機層を合わせ、クエン酸ナトリウム緩衝液(pH= 4.76)200ml、飽和NaHCO3溶液100mlおよびNaCl溶液100mlで洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の0〜50%のMTBEの勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、白色泡状物として純粋な生成物(7.51g、66%)を得た。
2020534319.tif 000130
【０１９９】
ステップ3:  Boc-Val-Ala(SEM)-PAB-OH (HDP 30.1688)
ステップ2の生成物(7.51g、11.96mmol)のTHF (200mL)溶液に、n−テトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF) (14.35mL、THF中1M溶液、14.35mmol)を添加した。20分後、珪藻土(20g)を反応混合物に添加し、揮発性物質を減圧下で除去した。残りの固体をシリカゲルカラムの頂部に適用し、ヘキサン中0〜50%アセトンの勾配で溶出した。純粋な画分を合わせ、蒸発させて、生成物(6.16g、100%)を白色泡状物として得た。
2020534319.tif 000131
【０２００】
ステップ4:  Boc-Val-Ala(SEM)-PAB-Br (HDP 30.1690)
ステップ3の生成物(4.73g、9.03mmol)のDCM (100mL)溶液に、メタンスルホン酸無水物(1.89g、DCM中1M溶液、10.84mmol)、続いてDIPEA (3.69mL、21.47mmol)をアルゴン下0℃で添加した。35分後、臭化リチウム(LiBr) (3.92g、THF溶液、45.16mmol)を0℃で添加した。10分後、反応混合物を室温で3時間撹拌し、200mlのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH= 6.40)を添加し、混合物を200mlのMTBEで希釈した。有機層をクエン酸ナトリウム緩衝液(pH= 4.76)200ml、飽和NaHCO3溶液200mlおよびNaCl溶液200mlで順次洗浄した。有機層を合わせ、MgSO4で乾燥させ、濃縮し、ヘキサン中0〜100% MTBEの勾配でシリカカラムで精製した。生成物を含む画分を合わせ、減圧下で蒸発させ、凍結乾燥して、純粋な生成物(5.96g、93%)を得た。
2020534319.tif 000132
【０２０１】
ステップ5:  6'-[Boc-Val-Ala(SEM)-PAB]α-アマニチン(HDP 30.1698)
2020534319.tif 000133
アルゴン下、室温で、57mg (62.02μmol)の減圧乾燥α−アマニチンを3000μlの乾燥ジメチルアセトアミド(DMA)に溶解した。ステップ4の生成物(145.5mg、248.1μmol)および0.2M炭酸セシウム(Cs2CO3)(372.2μl、74.43μmol)を添加した。室温で4時間後、反応混合物を10μlのAcOHでpH = 5に酸性化した。溶媒を真空中で除去し、残渣をC18カラム上の分取HPLCによって精製した[λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=水; B=メタノール]。生成物を含有する画分を蒸発させて、54.46mg (62%)のHDP 30.1698を得た。
2020534319.tif 000134
【０２０２】
ステップ6:  6'-[H-Val-Ala-PAB]α-アマニチン(HDP 30.1702)
2020534319.tif 000135
【０２０３】
BocおよびSEM保護工程5の生成物(134.29mg、94.25μmol)を5mlのTFAに溶解した。2分後、混合物を室温で蒸発乾固し、5mlの水に再溶解し、3.2%アンモニアを滴下して加えてpH 10に調整した。得られた懸濁液を凍結乾燥し、RP18−HPLC[λ=305nm;勾配:0〜2分5% B;2〜10分20% B;10〜10.5分25% B; 10.5〜13分100% B;13〜14分5% B;0.05% TFAを含むA=水; B=アセトニトリル]に適用し、純粋な画分を蒸発させ、68.59mg (55%)の無色粉末に凍結乾燥した。
2020534319.tif 000136
【０２０４】
実施例19
6 '-[（6-マレイドヘキサンアミド] -Val-Cit-PAB）-α-アマンチン
(HDP 30.1919)
2020534319.tif 000137
【０２０５】
Boc-Val-Cit-PAB-OHを出発材料とした実施例18ステップ1〜6の方法を繰り返し、実施例25で報告した手順を適用して標記物質を無色粉末として得た:
2020534319.tif 000138
【０２０６】
実施例20
6'-[H-Val-Ala-(N-メチル)-PAB]-α-アマニチン(HDP 30.1584)
2020534319.tif 000139
【０２０７】
出発材料としてBoc-Val-Ala-(N-メチル)-PAB-OHを用いて実施例17ステップ1-6の方法を繰り返すことにより、表題物質を無色の粉末として受け取った:
2020534319.tif 000140
【０２０８】
実施例21
6'-[(2-ブロモ-アセトアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン(HDP 30.1704)
2020534319.tif 000141
【０２０９】
HDP 30.1702(15mg、11.5μmol)を乾燥DMF (457.26μl)に溶解した。ブロモ酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(229.2μl、22.9μmol、2.0当量)の0.1M溶液およびDIPEAの0.1M溶液(458.4μl、45.84μmol、4.0当量)を加え、反応混合物を室温で撹拌した。1時間後、反応混合物をMTBE (40ml)で希釈した。沈殿物を0℃に10分間冷却し、遠心分離(4000×g)によって単離し、続いてMTBE (40ml)で洗浄した。上清を捨てた。ペレットを乾燥し、MeOH (200μl)に再溶解し、分取RP−HPLCによりC18カラムで精製し[λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水;0.05% TFAを含むB=メタノール]、凍結乾燥後に6.26mg (42%)の生成物を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000142
【０２１０】
実施例22
6'-O-[6-(2-ブロモアセトアミド)ヘキシル]-α-アマニチン(HDP 30.1619)
2020534319.tif 000143
HDP 30.1619は、アマニチン前駆体としてHDP 30.0134から出発して、本明細書の実施例21に記載の手順を用いて調製した。生成物を白色粉末として単離した(12.34mg、83%)。
2020534319.tif 000144
【０２１１】
実施例23
6'-[(3,4-ビス(フェニルチオ)-3-マレイドプロパンアミド)-Val-Ala-PAB)-α-アマンチン
(HDP 30.1751)
ステップ1:3,4-ジブロモ-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-カルボン酸メチルエステル(HDP 30.1621)
【０２１２】
3,4‐ジブロモ‐N‐メチルエステルマレイミドを、Castanedaら(Tetrahedron Lett. 2013, 54, 3493-3495)によって開示された手順を適用することによって、対応する3,4‐ジブロモマレイミドから合成した。
2020534319.tif 000145
【０２１３】
3,4−ジブロモマレイミド(5g、19.92mmol)をTHF (175ml)に溶解した。N−メチルモルホリン(2.16ml、19.92mmol)およびクロロギ酸メチル(1.51ml、19.92mmol)をアルゴン下室温で添加した。反応混合物をアルゴン下室温で20分間撹拌し、次いでDCM (200ml)で希釈した。有機相を水(200mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮し、凍結乾燥して、6.15g(100%)の生成物を得た。
2020534319.tif 000146
【０２１４】
ステップ2: 3,4‐ジブロモ‐2,5‐ジオキソ‐2,5‐ジヒドロ‐ピロール‐1‐イル)‐酢酸tert‐ブチルエステル(HDP 30.1732)
2020534319.tif 000147
【０２１５】
HDP 30.1621(2.23g,7.13mmol)をDCMに溶解し、tert‐ブチルグリシンモノアセテート(1.36g,7.13mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間30分間撹拌した。その後、混合物を蒸発させ、残渣をDCMに再溶解した。珪藻土(25g)を添加し、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を、ヘキサン中0〜50% MTBEの勾配でシリカゲルカラムで精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、2.31g(88%)のHDP 30.1732を白色結晶として得た。
2020534319.tif 000148
【０２１６】
ステップ3:  [2,5-ジオキソ-3-フェニルスルファニル-4-(1-ビニル-ペンタ-1,3-ジエニルスルファニル)-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル]-酢酸tert-ブチルエステル(HDP 30.1660)
2020534319.tif 000149
【０２１７】
2.31g(6.26mmol)のHDP 30.1732をMeOH (50ml)に溶解した。酢酸ナトリウム(NaOAc)(1.18g、14.40mmol)およびチオフェノール(PhSH) (1.47ml、14.40mmol)を室温で添加した。2時間後、珪藻土(12g)を反応混合物に添加し、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を、ヘキサン中0〜20% MTBEの勾配でシリカゲルカラムで精製した。生成物に対応する画分を合わせ、濃縮して、2.55g(95%)の標的物質を黄色油として得た。
2020534319.tif 000150
【０２１８】
ステップ4: (2,5‐ジオキソ‐3,4‐ビス‐フェニルスルファニル‐2,5‐ジヒドロ‐ピロール‐1‐イル)‐酢酸(HDP 30.1730)
2020534319.tif 000151
【０２１９】
HDP 30.1660(2.55g,5.96mmol)をTFA (30ml)に溶解し、室温で5分間撹拌した。その後、TFAをトルエン(2×30ml)と真空中で共蒸発させて、橙色油状物としてHDP 30.1730(2.78g)を得、これをさらに精製することなく次の反応に使用した。
2020534319.tif 000152
【０２２０】
ステップ4: 2,5‐ジオキソピロリジン‐1‐イル2‐(2,5‐ジオキソ‐3,4‐ビス(フェニルチオ)‐2,5‐ジヒドロ‐1H‐ピロール‐1‐イル)酢酸(HDP 30.1746)
2020534319.tif 000153
【０２２１】
HDP 30.1730(2,78g,max 6,26mmol)をTHF (60ml)に溶解し、HOSu (793mg、6.56mmol)を加えた。28mlのTHFに溶解したDCC(1.42g、6.89mmol)を添加した。室温で22時間撹拌した後、ジシクロヘキシル尿素(DCU)を濾過し、濾液を蒸発させた。残渣をDCM (60ml)に再溶解し、追加のDCUを吸引濾過した。残渣をDCM中0〜20% MTBEの勾配でシリカゲルカラムで精製した。生成物を含有する画分を蒸発させて、化合物(2.12g、72%)を橙色固体として得た。
2020534319.tif 000154
【０２２２】
ステップ5： 6'-[(3,4-ビス(フェニルチオ)-3-マレイド-エタン-アミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン(HDP 30.1751)
2020534319.tif 000155
【０２２３】
2mlの乾燥DMFに溶解したHDP 30.1702(15.00mg、11.46μmol)に、続いて1.72ml (34.39μmol)のHDP 30.1746溶液(DMF中20mM)およびDIPEA (5.85μl、34.39μmol)を添加した。室温、アルゴン下で2時間後、混合物を真空中で蒸発させ、残渣をMeOH (200μl)に溶解し、10mlの冷MTBEに滴下し、0℃で遠心分離した。沈殿物を回収し、追加の10mlのMTBEで洗浄し、再び遠心分離した。粗生成物を乾燥させ、次いで分取RP−HPLC[λ=305nm;勾配:0分5% B;0〜1分30% B;1〜10分39% B;10〜13分100% B;13〜18分5% B; A=水; B=メタノール]によって精製した。生成物を含有する画分を濃縮し、凍結乾燥して9.27mg (52%)の生成物を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000156
【０２２４】
実施例24
6'-[(3-マレイミドプロパンアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
(HDP 30.1699)
2020534319.tif 000157
【０２２５】
HDP 30.1702(17.09mg、14.3μmol)を乾燥DMF (350μl)に溶解した。DMF (350μl)に溶解した3−(マレイミド)プロパン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BMPS) (7.62mg、28.6μmol、2.0当量)、および希釈していないDIPEA (9.79μl、57.2μmol、4.0当量)を添加した。アルゴン下、室温で1時間30分間撹拌した後、混合物を40mlの冷MTBEに滴下し、0℃で遠心分離した。沈殿物を集め、40mlのMTBEで洗浄し、再び遠心分離した。粗生成物を乾燥し、RP18−HPLC[λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]によって精製した。純粋な画分を凍結乾燥して、12.51mg (65%)の表題生成物6'−[(3−マレイドプロパンアミド)−Val−Ala−PAB]α−アマニチンを白色粉末として得た。
2020534319.tif 000158
【０２２６】
実施例25
6'-[(6-マレイミドヘキサンアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
(HDP 30.2254)
2020534319.tif 000159
【０２２７】
HDP 30.1702(23.49mg、17.9μmol)を乾燥DMF (400μl)に溶解した。DMF (562μl)に溶解した6−(マレイミド)ヘキサン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ECMS) (11.07mg、35.9μmol)およびDIPEA (12.21μl、7.16μmol)を添加した。アルゴン下、室温で2時間後、混合物を40mlの冷MTBEに滴下し、0℃で遠心分離する。沈殿物を集め、40mlのMTBEで洗浄し、再び遠心分離した。粗生成物を乾燥し、RP18−HPLC[λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]によって精製した。純粋な画分を凍結乾燥して、21.03mg (86%)の表題生成物6'−[(6−マレイドヘキサンアミド)−Val−Ala−PAB]−α−アマニチンを白色粉末として得た。
2020534319.tif 000160
【０２２８】
実施例26
6'-O-[6-((Glu-ウレイド-Lys)-ウレイド)-ヘキシル]-α-アマニチン
(HDP 30.1585)
ステップ1：  6'-O-[6-((Glu(t BuO)3-ウレイド-Lys)-ウレイド)-ヘキシル]-α-アマニチン(HDP 30.1581)
2020534319.tif 000161
【０２２９】
6'−O−(−6−アミノヘキシル)−α−アマニチン(HDP 30.0134、欧州特許第2621536号に開示されているように合成)のDMF (1ml)溶液(11.32mg、10mmol)に、DMF (1ml)中のHDP 30.1579(12.57mg、20mmol)の溶液を添加し、DIPEA (5.10μl、30mmol)をそのまま添加した。17時間後、水(100μl)を加え、混合物を高真空下で濃縮した。粗生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=水; B=メタノール]によって精製し、純粋な画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、コンジュゲートHDP 30.1581(13.38mg、87%)を無色残渣として得た。
2020534319.tif 000162
【０２３０】
ステップ2: 6'-O-[6-((Glu-ウレイド-Lys)-ウレイド)-ヘキシル]-α-アマニチン(HDP 30.1585)
2020534319.tif 000163
【０２３１】
HDP 30.1581(13.38mg、8.73μmol)をTFA (1mL)に溶解し、室温で2分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣を再びTFA (1ml)に溶解し、混合物を室温で5分間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。粗生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B;0.05% TFAを含むA=水;0.05% TFAを含むB=メタノール]によって精製し、純粋な画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、生成物HDP 30.1585(6.82mg、57%)を無色固体として得た。
2020534319.tif 000164
【０２３２】
実施例27
6'-O-[-((Glu-ウレイド-Lys)-ウレイド-Val-Ala-(N-メチル)PAB]-α-アマニチン
(HDP 30.1592)
ステップ1:  6'-O-[(Glu(t BuO)3-ウレイド-Lys)-ウレイド-Val-Ala-(N-メチル)PAB]-α-アマニチン(HDP 30.1588)
2020534319.tif 000165
【０２３３】
DMF (1ml)中のHDP 30.1584(7.68mg、5.81mmol)の溶液に、DMF (1ml)中のHDP 30.1579(7.30mg、11.61mmol)の溶液を添加し、DIPEA (3.95μl、23.23mmol)をそのまま添加した。22時間後、H2O(100μl)を添加し、混合物を高真空下で濃縮した。粗生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=水; B=メタノール]によって精製し、純粋な画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、コンジュゲートHDP 30.1588(8.42mg、84%)を無色残渣として得た。
2020534319.tif 000166
【０２３４】
ステップ2: 6'-O-[-((Glu-ウレイド-Lys)-ウレイド-Val-Ala-(N-メチル)PAB]-α-アマニチン(HDP 30.1592)
2020534319.tif 000167
【０２３５】
HDP 30.1588(8.42mg、4.89μl)をTFA (1mL)に溶解し、室温で2分間撹拌した後、減圧蒸発させた。残渣を再びTFA (1ml)に溶解し、混合物を室温で5分間撹拌し、次いで真空下で濃縮した。粗生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B;0.05% TFAを含むA=水;0.05% TFAを含むB=メタノール]によって精製し、純粋な画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、生成物HDP 30.1592(4.37mg、58%)を無色固体として得た。
2020534319.tif 000168
【０２３６】
実施例28
6'-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-ジチアプロピル]-α-アマニチン
(HDP 30.2246)
2020534319.tif 000169
【０２３７】
DMSO (1.5ml)中のHDP 30.2225(13.4mg、15.6μmol)の溶液に、DMSO (1.6ml)中のHDP 30.0951(17.9mg、15.6μmol)の溶液を、アルゴン下、室温で添加した。DIPEA (5.15μl、3.0μmol)を希釈せずに添加した。反応混合物を室温で3時間20分間撹拌した。橙色の粗生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜1分5% B;1〜14分54% B;14〜16分60.6% B;16〜23分100% B;23〜26分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]によって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2246(11.36mg、40%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000170
【０２３８】
実施例29
6'-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys-ジスルファニル)ブチル)]-α-アマニチン
(HDP 30.2589)
2020534319.tif 000171
【０２３９】
MeOH (135μl)中のHDP 30.2225(2.27mg、2.6μmol)の溶液に、MeOH (280μl)中のHDP 30.2587(3.07mg、2.6μmol)の溶液を、アルゴン下、室温で添加した。DIPEA (0.9μl、5.2μmol)を希釈せずに添加した。反応混合物を室温で24時間撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣をMeOH (200μl)に溶解し、分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0分5% B; 15分100% B; 18分100% B; 18.50分100% B; 22分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]によって精製した。生成物を含有する画分を濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2589(2.79mg、58%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000172
【０２４０】
実施例30
6'-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-アミド-2-メチルブタン-2-イル)ジスルファニル)-プロピル]-α-アマニチン
(HDP 30.2609)
ステップ1: 6'-O-[3-((ButO)2DUPAOtBu-Aoc-Phe-Phe-(4-アミド-2-メチルブタン-2-イル)-ジスルファニル)-プロピル]-α-アマニチン(HDP 30.2606)
2020534319.tif 000173
【０２４１】
HDP 30.1172 (5.07mg、4.6 μmol) およびNaHCO 3(0.92mg、10.9 μmol) をH 2 O/THF 混合物(20:80、248 μl) に分解し、HDP 30.2401 (5.13mg、5.03 μmol) を追加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣をMeOH (200μl)に溶解し、分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]によって精製した。生成物を含有する画分を濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2606(6.38mg、75%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000174
【０２４２】
ステップ2: 6'-O-[3-(DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-アミド-2-メチルブタン-2-イル)ジスルファニル)-プロピル]-α-アマニチン(HDP 30.2609)
2020534319.tif 000175
【０２４３】
HDP 30.2606(6.10mg、3.0μmol)をTFA (1mL)に溶解し、室温で2分間振盪した。次いで、TFAを蒸発させ、残渣をTFA (1ml)に溶解し、室温でさらに5分間(×2)振盪した。最後に、TFAをトルエン(2×1ml)と共蒸発させた。
【０２４４】
試料をACN/H2O(8:2、200μl)に溶解し、C18カラム上の分取RP−HPLCによって精製した[λ=305nm;勾配:0分5% B; 15分100% B; 18分100% B; 18.50分100% B; 22分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]。生成物を含む画分を蒸発させ、1.1mg (20%)のHDP 30.2609を白色粉末として凍結乾燥した。
2020534319.tif 000176
【０２４５】
実施例31
6'-O-[3-DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-アミド-ブタン-2-イル)ジスルファニル)-プロピル]-α-アマニチン
(HDP 30.2618)
2020534319.tif 000177
【０２４６】
MeOH (423μl)中のHDP 30.2614(4.64mg、5.5μmol)の溶液に、HDP 30.0951(6.31mg、5.5μmol)をアルゴン下、室温で添加した。DIPEA (1.88μl、11μmol)を希釈せずに加えると、反応混合物は強い黄色に変わった。反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣をMeOH (200μl)に溶解し、分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜1分5% B;1〜14分54% B;14〜16分61% B;16〜19分100% B;19〜22分100% B;22〜25分5% B A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]によって精製した。生成物を含有する画分を濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2618(4.69mg、47%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000178
【０２４７】
実施例32
6'-O-[3-DUPA-Aoc-Phe-Phe-(4-アミド-ブタン-2-イル)ジスルファニル)-ブチル]-α-アマニチン
(HDP 30.2619)
2020534319.tif 000179
【０２４８】
HDP 30.2619を、HDP 30.2587およびHDP 30.2614を前駆体として使用することによって、本明細書中の実施例29に記載されるように調製し、白色粉末として2.9mg (60%)の最終コンジュゲートを得た。
2020534319.tif 000180
【０２４９】
実施例33
6'-O-[6-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)-ヘキサンアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
(HDP 30.2284)
2020534319.tif 000181
【０２５０】
DMSO (1ml)中のHDP 30.2225(12.97mg、15.1μmol)の溶液に、DMSO (2ml)中のHDP 30.2254(21.03mg、15.1μmol)の溶液を、アルゴン下、室温で添加した。DIPEA (5.15μl、3.0μmol)を希釈せずに添加した。反応混合物を室温で20 h 撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]に注入した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2284(14.53mg、43%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000182
【０２５１】
実施例34
6'-O-[3-((3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEGn)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)-プロパンアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
2020534319.tif 000183
【０２５２】
HDP 30.1699(5.24mg、3.9μmol)をDMSO (520μl)に溶解した。DMSO (260μl)に溶解したHDP 30.2439(5.7mg、3.9μmol、1.0当量)、およびDIPEA (1.33μl、7.8μmol、2.0当量)を連続的に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で24時間撹拌し、次いで、生成物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜1分5% B; 14分54% B; 18分69% B;19〜20分100%;21〜22分5% B; A=0.05% TFA、B=アセトニトリルを含む水]によって精製して、3.54mg (43%)の生成物HDP 30.2471を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000184
【０２５３】
HDP 30.2474およびHDP 30.2680を、それぞれ前駆体としてHDP 30.2466およびHDP 30.2585から出発して、上記のように調製した。合成により、2.95mg (41%)のHDP 30.2474および1.08mg (20%)のHDP 30.2680を得た。
2020534319.tif 000185
【０２５４】
実施例35
6'-O-[(3,4-ビス-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)-アセトアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
(HDP 30.2300)
2020534319.tif 000186
【０２５５】
DMSO (5.6ml)中のHDP 30.1751(21mg、14μmol)の溶液に、HDP 30.2225(23.2mg、27μmol)の溶液をアルゴン下室温で添加した。DIPEA (13.82μl、81μmol)を希釈せずに添加した。反応混合物を室温で49 h 撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]に注入した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2300(4.0mg、10%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000187
【０２５６】
実施例36
6'-O-[(3,4-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-PEGn)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)-プロパンアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
2020534319.tif 000188
【０２５７】
HDP 30.1751(2.41mg、1.62μmol、1.0当量)をMeOH (347μl)に溶解した。MeOH中のHDP 30.2585の0.03 M溶液(230μl、7.29μmol、4.5当量)およびMeOH中のNaOAcの0.1M溶液(140μl、12.64μmol、7.8当量)を連続的に添加し、混合物をアルゴン下室温で20時間撹拌した。
【０２５８】
混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をACN/H2O(1:1、200μl)に溶解し、分取RP−HPLCによりC18カラムで精製した[λ=210nm;勾配:0〜1分5%〜30% B;1〜18分50% B;18〜20分100% B;20〜22分100% B;22〜23分5% B;23〜25分5% B; A=0.05% TFAを含む水、B=アセトニトリル]。生成物に対応する画分を集め、蒸発させ、凍結乾燥して(tBuOH/H2O、4:1、3ml)、3.12mg (49%)のHDP 30.2595を黄色がかった粉末として得た。
2020534319.tif 000189
【０２５９】
HDP 30.2490およびHDP 30.2595は、それぞれ、前駆体としてのHDP 30.2466およびHDP 30.2585から出発して、上記のように調製した。合成により、黄色がかった粉末として1.86mg (37%)のHDP 30.2490および3.12mg (49%)のHDP 30.2595を得た。
2020534319.tif 000190
【０２６０】
実施例37
6'-O-[6-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)-ヘキシル]α-アマンチン(HDP 30.2301)
2020534319.tif 000191
【０２６１】
DMF (0.5ml)中のHDP 30.0880(20.48mg、18.6μmol)の溶液に、DMF (0.5ml)中のHDP 30.2225(16.0mg、18.6μmol)の溶液を、アルゴン下、室温で添加した。TEA (5.18μl、37.2μmol)を希釈せずに添加した。反応混合物を室温で4日撹拌した。反応混合物を分取RP−HPLC [λ=268nm;勾配:0〜1分5% B;1〜14分54% B;14〜26分100% B;26〜30分100% B;30〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=アセトニトリル]に注入した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮し、24時間凍結乾燥して、化合物HDP 30.2301(6.03mg、17%)を白色固体として得た。
2020534319.tif 000192
【０２６２】
実施例38
6'-O-[3-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)-プロパンアミド)-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン (HDP 30.2535)
本願実施例33に報告される同じ手順を使用することによって、所望の化合物が白色粉末として得られた(2.84mg、43%)。
2020534319.tif 000193
【０２６３】
実施例39
6'-O-[6-(3-(((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-2,5-ジオキソピロリジン-1-yl)-ヘキサンアミド]-Val-Cit-PAB]α-アマンチン (HDP 30.2537)
2020534319.tif 000194
本願実施例33に報告される同じ手順を使用することによって、所望の化合物が白色粉末として得られた(6.42mg、83%)。
2020534319.tif 000195
【０２６４】
実施例40
6'-O-[2-((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-アセトアミド-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン
(HDP 30.2515)
2020534319.tif 000196
【０２６５】
ACN/H2O(1:1、v:v) (2.60mg、2μmol、4mM)中のHDP 30.1704の溶液およびACN/H2O(1:1、v:v) (1.71mg、2μmol、4mM)中のHDP 30.2225の溶液を混合し、Na2CO3/NaHCO3緩衝液(100mM、pH= 9.3、750μl)で希釈して、pH= 9.0に到達させ、1.14mMに等しいHDP 30.2225の最終濃度を得た。反応混合物を室温で1時間半減撹拌し、生成物を分取RP−HPLCによりC18カラムで精製した[λ=305nm;勾配:0〜5分5% B;20〜25分100% B;27〜35分5% B; A=0.05% TFAを含む水; B=0.05% TFAを含むメタノール]。生成物を2.61mg (62%)の白色粉末として単離した。
2020534319.tif 000197
【０２６６】
実施例41
6'-O-[6-(2-((DUPA-Aoc-Phe-Phe-Cys)-スルファニル)-アセトアミド)-ヘキシル]-α-アマンチン
(HDP 30.2523)
2020534319.tif 000198
【０２６７】
HDP 30.2523を、アマニチン前駆体としてHDP 30.1619から出発して、本明細書中の実施例40に記載されるように調製した。生成物を白色粉末として単離した(5.68mg、67%)。
2020534319.tif 000199
【０２６８】
実施例42
6'-O-[2-((DUPA-Aoc-Phe-Phe-(His-Glu)2-Cys)-スルファニル)-アセトアミド-Val-Ala-PAB]-α-アマンチン(HDP 30.2594)
2020534319.tif 000200
【０２６９】
HDP 30.2594を、アマニチン前駆体としてHDP 30.1704から出発して、本明細書中の実施例40に記載のように調製した。生成物を白色粉末(1.24mg)として単離した。
2020534319.tif 000201
【０２７０】
C.  DUPA-アマトキシンコンジュゲートに関するデータ
図2〜5は、細胞毒性研究からの結果を示し、表8は、効率的なDUPA−α−アマニチンコンジュゲートの選択性(S)および標的化指数(TI)値を示す。
【表８】
2020534319.tif 000202
【０２７１】
D. 半減期延長DUPA-アマトキシンコンジュゲートの合成とキャラクタリゼーション
実施例43
本発明者らは、図6に示すように、ヒトIgG1 Fc上にDUPA−アマニチンコンジュゲートを接ぎ合わせるための2ステップ「プログラムアンドアーム」ストラテジーを開発した。Fcタンパク質を、最初に、PSMA標的化部分、SrtA基質およびアジドハンドルを含有する三官能性リンカーのソーターゼA (SrtA)媒介ライゲーションによってPSMA発現細胞を標的化するようにプログラムした(図7)。SrtAは、抗体および抗体断片の部位特異的修飾に広く使用されている黄色ブドウ球菌由来のソーターゼトランスペプチダーゼである(参照、 L. K., Guimares C. P., Sehrawat S., Spooner E., Barrasa M. I., Ploegh H. L. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2013, 110, 1428-1433; Kornberger P., Skerra A. mAbs 2014, 6, 354-366; Wagner K., Kwakkenbos M. J., Claassen Y. B., Maijoor K., Bohne M., van der Sluijs K. F., Witte M. D., van Zoelen D., J., Cornelissen L. A., Beaumont T., Bakker A. Q., Ploegh H. L., Spits H. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2014, 111, 16820-16825; Dickgiesser S., Rasche N., Nasu D., Middel S., Horner S., Avrutina O., Diederichsen U., Kolmar H. ACS Chem.Biol.2015, 10(9), 2158-2165）。SrtAによって触媒される反応は、C末端選別モチーフLPXTG (Xは任意のアミノ酸に等しい)とN末端オリゴグリシンとの間の新しいアミド結合の形成をもたらす(Chen L.ら、Sci.Rep.2016,6, article number: 31899)。
【０２７２】
C末端SrtA認識配列LPETGを有するヒトIgG1 Fc断片をコードする発現プラスミドをクローニングし、Expi293F TM細胞における一過性発現のために使用した。N末端切断の形成を防止するために、追加のN末端TEVプロテアーゼ(タバコエッチングウイルス核封入体−エンドペプチダーゼ)切断部位を導入した。さらに、哺乳動物細胞を生産系として使用し、製造および分析プロセスを単純化する場合に生じる不均一性の問題を回避するために、CH2ドメインのN297における独特のグリコシル化部位を遺伝的に除去した(Dmitrij Hristodorov, Rainer Fischer, Lars Linden Mol.Biotechnol.2013, 54, 1056-1068)。構築物は、その化学的修飾の前にタンパク質A上で精製され、Fc−LPETG (図6)として指定されるC末端SrtAタグ含有IgG1 Fc断片の約122.5mg/Lの産生をもたらし、単量体純度は>99%であった。
【０２７３】
Fc-LPETGペプチド転移にN-末端GGGを用い、アジド官能性基を毒素の結合に用いる三官能性DUPA含有リンカー(図7A)を、PSMA-標的化部分にPEG3-PEG3-Orn(N3)-Lys(Gly-Gly-Gly)リンカーを追加することによって設計し、SPPSによって組み立てた。
【０２７４】
この目的のために、Fc−LPETG構築物(図6)を、活性最適化SrtA (eSrtA) (Chen I., Dorr B., Liu D. R. Proc.Natl.Acd.Sci.USA 2011, 108, 1139-11404)の触媒作用下で、大過剰の三官能性DUPA含有リンカー(図7A)と反応させた。ライゲーション条件を最適化して、最大結合収率を確実にし、逆反応を最小限にした。SDS-PAGE分析(図14 B)によれば、ほぼ定量化され、反応は順調に進んだ。過剰な試薬を、天然の非還元条件下でサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。DUPA−Fcコンジュゲート(プログラムFc;図6)は、還元および非還元条件下でSDS−PAGEによってジスルフィド結合Fcニ量体であることが確認された(図14)。非還元条件下でのESI−MS分析(図14 A、パネルb)は、Fcニ量体について予想される分子量をさらに確認した。しかしながら、デコンボリューションの結果は、1〜2分子のリンカーで修飾されたFcのバージョンに割り当てられる2つの異なるピークを明らかにし、平均リンカー対抗体比(LAR)は1.62となった(図14 A、パネルb)。
【０２７５】
SrtA媒介コンジュゲーションに続いて、本発明者らは、続いて、DUPA−Fcコンジュゲートの化学量論および残基特異性を保存する穏やかで化学選択的な反応である、ストレイン促進アジドアルキン環状付加(SPAAC)を調査し(Thomas J. D., Cui H., North J. P., Hofer T., Rader C., Burke Jr T. R. Bioconjugate Chem.2012,23(10),2007−2013)、DUPA−Fcコンストラクトをジベンゾシクロオクチン(DBCO)−アマニチン誘導体で「アーム」した(図7B)。この概念証明試験のために、本発明者らは、非修飾α−アマニチンを放出し、標的細胞に送達するその可能性のために、カテプシンB−切断可能リンカー戦略を選択した。
【０２７６】
コンジュゲート化反応は、20倍過多DBCO−アマニチンで行われ、続いて、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー(SEC−FPLC)によって精製されて、過多遊離毒素誘導体を除去し、約19mg/Lの全DUPA−Fc−アマニチンコンジュゲートを得た(プログラムアンドアームFc;図6)。
【０２７７】
α-アマニチンの最終コンジュゲートへの取り込みは、DUPA-Fcよりも高分子への移行を示す非還元条件下のSDS-PAGEとα-アマニチンの免疫検出を伴うウエスタンブロット分析により確認された(図14 B,14 C)。抗体リンカー分子数に関してDUPA-Fcからの不均一性は、SDS-PAGEで示され、デコンボリューションされた質量スペクトルによって確認されたように、1から2の範囲の薬物対抗体比(DAR)を持つ不均一な種の形成につながった。平均DARは、1.72に等しいと計算され、DUPA−Fcについて報告されたLAR値と一致した(図14 A、パネルc)。
【０２７８】
ステップ1: 三官能性DUPA含有リンカーの合成
AmphiSpheres(登録商標)40 RAM樹脂(703mg、0.267mmol)をDCM中で1時間膨潤させ、洗浄し、DMF中に30分間再懸濁した。樹脂をDMF中20%ピペリジン(30秒、室温で2分間、30 W、50℃)で脱保護し、次いでFmoc−Lys(Mtt)−OH (4.0当量)、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアミニウムテトラフルオロホウ酸(TBTU; 3.99当量)、DMF (8ml)中DIPEA (8.0当量)で室温で1時間、次いでMW照射下(30 W、50℃、3分間)で振盪した。カップリングを2回繰り返し、その間に数回のDMF洗浄を行った。Fmocを、上記の条件下でDMF (3ml)中の20%ピペリジン中に樹脂を懸濁することによって除去した。次いで、各カップリングは、MW照射(30 W、50℃、3分、x3)下でDMF (8ml)中でFmocで保護されたアミノ酸(4.0相当)、TBTU (3.99相当)、DIPEA (8.0相当)で樹脂を振とうし、次いで、本明細書に記載の条件でFmoc除去することによって実施した。保護されたDUPA試薬(3.0当量)を、MW照射(30 W、50℃、3分、x3)下でTBTU (2.99当量)、DIPEA (6.0当量)を使用することによってカップリングした。切断の前に、樹脂結合ペプチドをDCM/TIS/TFA (97:2:1、4ml)に懸濁し、室温で10分間振盪することによってMttを除去した。HPLC (約20サイクル)でフィルター内にMtt-OHが検出できない限り、手順を繰り返した。次に、リジン側鎖を、予め結合したFmoc−Gly−Gly−Gly−OHと反応させた。次いで、樹脂をDCMで徹底的に洗浄し、真空下で乾燥させた。ペプチドを樹脂から切断し、TFA/アニソール/TIS/H2O(94:2:2:2、20ml)カクテルで室温で2時間完全に脱保護した。混合物を予め冷却したMTBE (40ml)中で4回に分けて沈殿させ、ペレットを0℃で10分間の遠心分離によって収集した。ペレットを回収し、真空中で乾燥させ、RP−HPLC [λ=210nm;勾配:0分5% B; 14分40% B; 19分45% B;20〜21分100% B; 22分5% B; A=0.05% TFA、B=アセトニトリルを含む水;流動割合: 30ml/分]による精製のためにACN/H 2 O(1:1、v:v)に溶解した。所望の化合物を直接的に凍結乾燥して、119.46mg (28%)の所望のリンカーを白色粉末として得た。
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【０２７９】
以下のスキームは、三官能性DUPA含有リンカーのMW支援SPPSを示す。
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i) a)DMF中20%ピペリジン、rt、30秒(x1)、W= 30、T= 50℃、3分(x2)、b) Fmoc-Lys(Mtt)-OH (4当量)、TBTU (3.99当量)、DIPEA (8当量)、rt、1時間、W= 30、T= 50℃、3分(x1);ii-v) a) DMF中20%ピペリジン、rt、30秒(x1)、W= 30、T= 50℃、3分(x2)、b-c）AA-OH (4当量)、TBTU (3.99当量)、DIPEA (8当量)、W= 30、T= 50℃、3分(x3);vi) a)DMF中20%ピペリジン、rt、30秒(x1)、W= 30、T= 50℃、3分(x2)、b4、(3当量), TBTU (2.99 当量)、DIPEA (6.0当量), W= 30, T= 50°C, 3 分 (x 3); vii) a) TFA/TIS/DCM (1/2/97, 4 ml), rt, 10分 (x 20), viii)a) Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH (4当量)、TBTU (3.99当量)、DIPEA (8当量)、1時間、rt、W= 30、T= 50℃、3分(x3)、b)DMF中20%ピペリジン、rt、30s (x1)、W= 30、T= 50℃、3分(x2) [x3]; ix) TFA/アニソール/TIS/H2O(94/2/2/2, 20 ml), rt, 2時間.
【０２８０】
ステップ2: アマニチン-DBCOリンカーの合成
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【０２８１】
アマニチン−DBCO誘導体を、上記のスキームに示すように、アマニチン前駆物質HDP 30.1702から合成し、その合成は、本明細書中上記の方法(実施例18)に従って達成した。プレカスターHDP 30.1702(80.32mg、0.067mmol)を無水DMF (1.6ml)に溶解した。ジベンゾシクロオクチン−N−スクシンイミジルエステル(DBCO−SE) (29.8mg、0.074mmol)をDMF (1.6ml)に溶解し、DIPEA (22.9μl、0.13mmol)を溶液に添加した。反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。
【０２８２】
H2O(100μl)を添加することによって反応を停止させ、DMFを真空中で蒸発させた。残渣をメタノール(MeOH) (2ml)に溶解し、予め冷却したMTBE (40ml)に滴下し、0℃で遠心分離した。ペレットをMTBE (40ml)で洗浄し、回収し、真空中で乾燥させた。化合物をRP−HPLC [λ=305nm;勾配:0〜15分5% B; 18分100% B; 1,5〜22分5% B; A=0.05% TFAを含む水、B=アセトニトリル;流動割合: 30ml/分]によって精製し、生成物に対応する画分を直接的に凍結乾燥して、77.88mg (78%)のアマニチン−DBCO誘導体を白色粉末として得た。
2020534319.tif 000206
【０２８３】
ステップ3: タンパク質発現のためのプラスミドのクローニング
プラスミドベクターpEXPR-TEV-G5-H20C-Fc-LPETGG (H. Kolmar教授、TU Darmstadt, Germanyにより提供された)は、配列番号1のアミノ酸配列をコードする。このプラスミドを、TEV切断部位、H20領域、免疫グロブリンのCH2およびCH3領域を表すFcドメイン、ならびにSrtAタグから構成されるFc−LPETGポリペプチドの発現のために使用した(図8を参照のこと)。
【０２８４】
配列番号1:
2020534319.tif 000207
【０２８５】
配列番号2:
2020534319.tif 000208
【０２８６】
配列番号3:
2020534319.tif 000209
【０２８７】
ステップ4: タンパク質Fc-LPETGGの発現および精製
Expi 293FTMセルは、製造業者の指示に従い、PEI試薬(ポリエチレンイミン)を使用してFc-LPETGG構築物と一時的にトランスフェクトされた。Expi293FTM細胞を、フラスコ当たり500mlのExpi293培養培地の最終容量を有する2lフラスコ中で培養した。
【０２８８】
1.5mlのPEI試薬(H2O中1mg/ml)と500μgのDNAを50mlのOpti-MEM培地に混ぜてトランフェクションコンプレックスを調製した。室温で15分間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を、425ml容量のExpi293FTM細胞の懸濁液に添加した。トランスフェクションの16時間後、細胞を460×g、室温で20分間遠心分離し、上清を廃棄し、500mlの新鮮なExpi293F発現培地を添加した。トランスフェクション後6日目に、細胞を3488×gおよび4℃で40分間遠心分離した。細胞上清を、10947×g、4℃で20分間、もう一度遠心分離した。培養培地を500mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で希釈し、1.2、0.65、0.45、0.22μm滅菌フィルターを通して遠心分離した。最終溶液をタンパク質Aカラムに適用した。カラムを結合緩衝液(PBS pH 7.4)で洗浄し、溶出緩衝液(グリシン0.1M pH 3.0)で溶出した結合画分を、中和緩衝液(Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)1M pH 9.0)で中和した。収集したタンパク質サンプルを、SrtA緩衝液(Tris−HCl 50mM pH 7.4、NaCl 150mM)に対して4℃で一晩透析した。タンパク質濃度Abs280 nmで4.8mg/ml (培養液122.5mg/l)と決定した。
【０２８９】
ステップ5: ペプチド三官能性DUPA含有リンカーのFc−LPETG断片へのソルターゼA (SrtA)媒介ライゲーション
eSrtAを、チェンら、PNAS 2011 108(28)11399−11404によって記載されるように調製した。タンパク質A精製Fc−LPETG (40mg、20.65μM)を、SrtA反応緩衝液(Tris−HCl 50mM pH 7.5、NaCl 150mM、CaCl25mM)中の三官能性DUPA含有リンカー(50当量、1mM)と、ソーターゼA  5変異（pentamutant）(eSrtA)酵素(0.125当量、2.6μM)の存在下で混合した。反応を25℃で18時間進行させ、次いで、HiLoadTM26/600 SuperdexTM200pgカラム上でSEC−FPLCを使用して精製し、eSrtAおよび過剰のペプチドを除去した。カラムを最初にPBS緩衝液(pH 7.4)で平衡化し、次いでカラム平衡化に使用したのと同じ緩衝液を使用してDUPA含有Fc 15を溶出した。カラムからのフロースルーを、Amicon（登録商標）Ultra−15遠心濾過器(MWCO 50000)を使用して濃縮し、0.22μm滅菌フィルター(Sterile Millex（登録商標）Filter)を通して濾過した。Abs280 nm(MW= 58461.89Da, ε280=74675.1 cm-1M-11)により、DUPA-Fcコンジュゲートの濃度は3.6mg/ml (27.87mg)と決定した。
【０２９０】
ステップ6:  DBCO-アマニチンリンカーのDUPA-Fc構築物へのSPAACによる結合
DBCO−アマニチンリンカー(20当量、12.18mg)をACN/H 2 O(3:1、1.28ml)に溶解し、PBS緩衝液(pH 7.4、8.46ml)中のDUPA−Fc(24mg、48.6μM)に添加した。DMSO (2.24ml)を添加した。混合物を37℃で24時間インキュベートした。精製は、HiLoadTM16/600 SuperdexTM200pgカラム上でSEC−FPLCによって行った。コンジュゲートを、生物学的アッセイに使用する前に、0.22μm滅菌フィルターを通して濾過した最終容量7.5mLまで濃縮した。DUPA-Fc-アマニチンコンジュゲートの濃度は、Abs 280 nm(MW= 61425.21Da,ε280=85500cm-1M -11)により3.16mg/ml (23.7mg)と決定した。
【０２９１】
実施例44
DUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの細胞毒性を、Fc-DUPAリンカー単独および200倍モル過剰のPSMA阻害剤2-PMPAの存在下でのコンジュゲートと比較して、4つの前立腺がん細胞株において試験した。
【０２９２】
DUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの細胞傷害作用は、PSMA発現細胞株LNCaPおよびC4_2 PSMA (+++);22RV1 PSMA (+)においてのみ観察される。PSMA陽性細胞株におけるEC50は、5.04〜15.17 nMの範囲で観察された。コンジュゲートの活性は2‐PMPAにより完全に阻害された。予想されたように、コンジュゲートの活性は、PSMA陰性PC3細胞株において観察されなかった。コンジュゲートは、優れたインビトロ良好な選択性を示した(図15)。
【０２９３】
Cb17 Scid雄マウス(n = 3)を用いて、DUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの血中薬物動態が検討された。バイコンパートメントモデルとFcRnリサイクルに関連した二相性消失プロファイルを観測した。急速排泄相半減期を82分間測定し、投与5分〜4時間後の初期時点で観察する。投与後4時間以降は、ゆっくりとした消失相が明確に観察された。この相の半減期を5.5日と測定した(図16)。
DUPA-Fc-α-アマニチンコンジュゲートの抗腫瘍効果をCb 17 ScidマウスLNCaP異種移植モデル(n = 8〜9)で試験した
【０２９４】
提案された投与スキームは、相対体重グラフスキームによって示されるように、完全に許容された。観察された悪液質はLNCaPモデルと関連しており、ビヒクル注入群でも観察される。
【０２９５】
DUPA-Fc-α-アマニチン抱合体の抗腫瘍作用は明らかに用量および投与頻度に依存しており、1mg/kgを週1回投与し、0.5mg/kgを週2回投与したところ、治療開始後25日目に全投与動物で完全奏効が得られた。0.25mg/kgを週3回投与し、0.5mg/kgを週1回投与すると、同様の腫瘍反応が得られた。すなわち、わずかな腫瘍退縮をもたらし、25日目まで腫瘍成長を抑制した。0.25mg/kgを週2回投与すると、投与期間中の腫瘍成長が抑制されたが、in vivoでの有効性は限定的であった。0.25mg/kgを週1回投与した場合、腫瘍増殖がわずかに遅延したのみであったが、投与期間終了時にはビヒクル投与群と統計学的に有意差は認められなかった(図17)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａａ】
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【図１４Ａｂ】
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【図１４Ａｃ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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