(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルス、特にＨ１亜型１のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルスに結合し、かつ／またはそれを中和することができる新規な化合物、特にペプチド性の大環状ペプチドおよびそのような化合物を含む医薬組成物に関する。本発明は、インフルエンザウイルス感染の診断、予防および／または治療におけるペプチド模倣化合物の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−Ｘ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ｘ５−［Ｍｅｔ／Ｎｌｕ］−ＣａｐＣ
を含む化合物であって、
ＣａｐＮおよびＣａｐＣの各々は、０〜１０残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ１は、任意の荷電、親水性または極性ＬまたはＤアミノ酸および任意の非標準的な親水性、荷電または極性ＬまたはＤアミノ酸であり；
Ｘ２は、疎水性、脂肪族または芳香族の標準的または非標準的アミノ酸であり、ただし、Ｘ２は、プロリンではなく；
Ｘ３は、小さいまたは中程度の脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸であり；
Ｘ４は、小さい脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸であり；および
Ｘ５は、任意の極性または荷電ＬまたはＤ−アミノ酸であり、
前記化合物は、Ｈ１亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を含むＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡに特異的に結合することができる、化合物。
【請求項２】
Ｈ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルス株を中和することがさらにできる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｈ１亜型のＨＡを含む前記Ａ型インフルエンザウイルス株は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９またはＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１は、アルギニン、リジン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、オルニチン、シトルリンであり；
Ｘ２は、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンであり；
Ｘ３は、バリン、イソロイシン、アロ−イソロイシン、Ｌ−２−アミノ酪酸もしくはメチオニンまたはその近い誘導体であり；
Ｘ４は、アラニン、Ｌ−２−アミノ酪酸、トリフルオロアラニン、２−アミノ−３−ブテン酸、２−アミノ−３−ブチン酸またはその誘導体であり；および
Ｘ５は、グリシン、アラニンまたはセリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
ＣａｐＮは、［Ｐｒｏ｜Ｇｌｙ］−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−ＰｒｏおよびＣａｐＮであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、結合されていないか；
ＣａｐＮは、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ｐｒｏ／Ｇｌｙ］であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、［Ｇｌｙ｜Ｐｒｏ］−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｄｓｐ−Ｐｒｏであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、ｌｙ−Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ＣａｐＮおよびＣａｐＣ中のＣｙｓ残基間のシステイン架橋を介して連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙであり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；または
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓであり、かつＣａｐＣは、Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ＣａｐＮおよびＣａｐＣ中のシステイン残基間のシステイン架橋を介して連結されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
配列：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−［Ｇｌｕ／Ａｒｇ］−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｌＬｅｕ／Ｐｈ５］−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ａｌｕ／Ａｂｕ］−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［Ｍｅｔ／Ｎｌｕ］−ＣａｐＣ
を含み、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、請求項５において定義されるとおりである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号３）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｎｌｕ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号４）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号６）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号７）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号８）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号９）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号１０）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１１）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１２）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１３）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＤ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（配列番号１４）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１５）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＤ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１６）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１７）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１８）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号１９）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号２０）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号２１）；および
システイン架橋を介して環化されているＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ（配列番号２２）
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項９】
インフルエンザの診断、予防および／または治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
インフルエンザの診断、予防および／または治療のための薬剤の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。本発明は、インフルエンザウイルス、特にＨ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルスに結合し、かつ／またはそれを中和することができる新規な化合物およびそのような化合物を含む医薬組成物に関する。本発明は、インフルエンザウイルス感染の診断、予防および／または治療における、インフルエンザウイルスに結合し、かつ／またはインフルエンザウイルスを中和する化合物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
季節性Ａ型インフルエンザは、主要な公衆衛生上の問題であり、毎年、世界で２５０，０００人を超える人々が死亡し、同時に多額の経済的負担をもたらしている。新しいウイルスが出現し、免疫がほとんどない人々に感染すると生じる新型インフルエンザは、人々の健康の大きい脅威にさえなり、例えば１９１８年に世界的に流行した「スペイン風邪」では推定５千万人が死亡した。感染者の５０％を超える死亡率を示した高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）の懸念が続いている。Ｈ５およびＨ７インフルエンザウイルスは、世界の特定の場所の家禽に地域的に流行する。これらのウイルスは、現在、ヒト間で易感染する能力はないように思われるが、トリＨ５型に関する最近のデータでは、哺乳類インビボモデル系において、このウイルスの空気感染による伝播が可能となるのに僅か数個のアミノ酸変化で十分であることが示されている。
【０００３】
最近、ＣＲ９１１４（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットにおいて開示）、ＣＲ６２６１（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットにおいて開示）、ＦＩ６（Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，８５０−８５６（２０１１）において記載）など、Ａ型および／またはＢ型インフルエンザウイルスを広く中和することができる抗体が報告されている。これらの抗体は、多様なヘマグルチニンタンパク質と相互に作用し、インフルエンザ株を広範囲にわたって中和することが示された。それらの効能および幅広さの結果として、今日、症状の重い患者の治療および高リスク群に属する人々の予防に適用するために、そうした抗体の開発が進められている。しかし、製品の価格がかなり高いことおよび非経口投与であることにより、より多くの人々におけるモノクローナル抗体の使用が制限されると予想される。
【０００４】
現在、インフルエンザ感染の予防および／または治療に利用できる他の薬剤も厳しい制限がある。ノイラミニダーゼ阻害剤のオセルタミビルおよびザナミビルならびにＭ２阻害剤のアマンタジンおよびリマンタジンなどの抗ウイルス薬は、感染後に遅く投与されると効果が小さく、また広範な使用により耐性ウイルス株が出現する可能性がある。さらに、成人のオセルタミビルの使用には、吐き気、嘔吐、精神的作用および腎臓イベントなどの副作用を伴う。
【０００５】
さらに、インフルエンザワクチンの効果は、（高齢の）高リスク患者にとって次善のものであることが示されており、循環インフルエンザウイルスの恒久的な抗原性の変化のために、インフルエンザワクチン株と循環インフルエンザ株との間の可能な限り近い適合を確保するために、インフルエンザワクチンの生成を毎年適応させる必要がある。
【０００６】
インフルエンザ感染を予防および／または治療するための代替の対策としての、ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する新規の抗インフルエンザウイルス作用の発見も、このタンパク質の膨大な配列多様性によって妨げられている。したがって、報告されているヘマグルチニンリガンドは、現在、少数の関連性の高いインフルエンザ株に対してのみ活性を示している。最近発見された広域中和抗体は、インフルエンザＨＡの幹領域上の特異的なエピトープを標的化する。このエピトープへの結合は、ウイルスエスケープの確率の低さおよび結合の幅広さの増大に関連し、既存の抗インフルエンザウイルス薬の最も重要な問題を解決する。しかし、抗体は、大分子であり、生成が難しく、かつ費用がかかり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
季節的流行の高い経済的インパクトおよび世界的流行の継続するリスクだけでなく、Ａ型インフルエンザウイルスに起因する呼吸器疾患の重症度を考慮すると、Ａ型インフルエンザウイルスに対して広範な活性を有し、インフルエンザ感染を予防または治療するための薬剤として使用することができる新しい有効な阻害剤が依然として要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、例えば、Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）に特異的に結合することができる新規な化合物、特にペプチド性の直鎖状および大環状化合物を提供する。本発明の化合物の少なくともいくつかは、例えば、Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルス株に対する中和活性を有する。少なくともいくつかの化合物は、少なくとも２種の異なるＨ１インフルエンザウイルス株に対する中和活性を有する。
【０００９】
ある種の実施形態では、本発明の化合物は、以下の配列／式を含む：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−Ｘ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ｘ５−［Ｍｅｔ／Ｎｌｕ］−ＣａｐＣ
（ここで、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、０〜１０残基を含む任意のアミノ酸配列であり得；
Ｘ１は、任意の荷電、親水性または極性ＬまたはＤアミノ酸および任意の非標準的な親水性、荷電または極性ＬまたはＤアミノ酸であり；
Ｘ２は、疎水性、脂肪族または芳香族の［標準的または非標準的］アミノ酸であり、ただし、Ｘ２は、プロリンではなく；
Ｘ３は、小さいまたは中程度の脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸、好ましくは１５０Ｄａ未満であり；
Ｘ４は、小さい脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸、好ましくは１００Ｄａ未満であり；および
Ｘ５は、任意の極性または荷電ＬまたはＤ−アミノ酸である）。
【００１０】
ある種の実施形態では、化合物は、１１〜１７のアミノ酸長である。
【００１１】
ある種の実施形態では、化合物は、以下の配列／式を有する：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−［Ｇｌｕ／Ａｒｇ］−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−｛Ｌｅｕ／Ｐｈ５］−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ａｌｕ／Ａｂｕ］−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［Ｍｅｔ／Ｎｌｕ］−ＣａｐＣ
（ここで、ＣａｐＮは、［Ｐｒｏ｜Ｇｌｙ］−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣ＝Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−ＰｒｏおよびＣａｐＮであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＮは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、結合されていないか；
ＣａｐＮは、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ｐｒｏ／Ｇｌｙ］であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、［Ｇｌｙ｜Ｐｒｏ］−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｄｓｐ−Ｐｒｏであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、ｌｙ−Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、Ｃｙｓ残基間のシステイン架橋を介して連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙであり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；または
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓであり、かつＣａｐＣは、Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、システイン残基間のシステイン架橋を介して連結されている）。
【００１２】
ある種の実施形態では、化合物は、
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号３）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｎｌｕ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号４）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号６）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号７）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号８）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号９）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号１０）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１１）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１２）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１３）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＤ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（配列番号１４）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１５）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＤ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１６）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１７）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１８）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号１９）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号２０）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号２１）；および
システイン架橋を介して環化されているＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ（配列番号２２）
からなる群から選択される。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、インフルエンザの診断、予防および／または治療に使用するための、本明細書に記載の化合物にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に至る研究において、新規なインフルエンザウイルス結合および／または中和化合物が開発された。特に、広範囲のインフルエンザウイルスを中和する抗体の作用を模倣する一連のペプチド性の直鎖状および大環状化合物が提供されるが、アミノ酸長が１１〜１７にすぎないことが好ましい。本発明の化合物は、少なくとも例えばＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス株に対して競合的な結合活性を有することが示された。本発明の化合物の少なくともいくつかは、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルス株に対する中和活性を有することも示された。本発明の化合物には、小サイズ（１．３〜１．９ｋＤａ）である、低コストの化学製品である、多量体形式への操作が容易である、注射によらない投与経路を可能にすることができる高い安定性を有するなど、例えば抗ヘマグルチニン抗体に比べていくつかの利点がある。
【００１６】
したがって、第１の態様では、本発明は、以下の配列を含む化合物を提供する：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−Ｘ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ｘ５−［Ｍｅｔ／Ｎｌｕ］−ＣａｐＣ
（ここで、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、０〜１０残基を含む任意のアミノ酸配列であり得；
Ｘ１は、任意の荷電、親水性または極性ＬまたはＤアミノ酸および任意の非標準的な親水性、荷電または極性ＬまたはＤアミノ酸であり；
Ｘ２は、疎水性、脂肪族または芳香族の［標準的または非標準的］アミノ酸であり、ただし、Ｘ２は、プロリンではなく；
Ｘ３は、小さいまたは中程度の脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸、好ましくは１５０Ｄａ未満であり；
Ｘ４は、小さい脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸、好ましくは１００Ｄａ未満であり；および
Ｘ５は、任意の極性または荷電ＬまたはＤ−アミノ酸である）。
【００１７】
本発明の化合物は、同時係属中の特許出願国際公開第２０１６／１２４７６８号パンフレットに記載される単一ドメイン抗体ＳＤ１０３８のＣＤＲ３配列に基づく。２０アミノ酸長のＣＤＲ３の配列は、Ｈｉｓ１−Ｖａｌ２−Ｓｅｒ３−Ｌｅｕ４−Ｔｙｒ５−Ａｒｇ６−Ａｓｐ７−Ｐｒｏ８−Ｌｅｕ９−Ｇｌｙ１０−Ｖａｌ１１−Ａｌａ１２−Ｇｌｙ１３−Ｇｌｙ１４−Ｍｅｔ１５−Ｇｌｙ１６−Ｖａｌ１７−Ｔｙｒ１８−Ｔｒｐ１９−Ｇｌｙ２０（配列番号２３）として定義される。
【００１８】
このＣＤＲ３配列を使用して、フレームワーク領域の環化および種々のリンカーを用いることによって複数の環状ペプチドが設計された。
【００１９】
したがって、本発明によれば、Ｘ１は、アルギニン、リジン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸、グルタミンまたはアスパラギンなどの任意の荷電、親水性または極性ＤまたはＬ−アミノ酸およびオルニチン、シトルリンなどの任意の非標準的な親水性、荷電または極性ＬまたはＤアミノ酸であり得；
Ｘ２は、疎水性、脂肪族または芳香族の標準的または非標準的アミノ酸であり得、ただし、Ｘ２は、プロリンではなく；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、アロ−Ｉｌｅ、ＡｂｕまたはＭｅｔおよびその近い誘導体など、任意の小さい（すなわち＜１００Ｄａ）または中程度（すなわち＜１５０Ｄａ）の脂肪族または疎水性Ｌ−アミノ酸であり得；
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｂｕ、トリフルオロアラニン、２−アミノ−３−ブテン酸、２−アミノ−３−ブチン酸またはその誘導体など、任意の小さい（すなわち＜１００Ｄａ）脂肪族、疎水性Ｌ−アミノ酸であり得；および
Ｘ５は、任意の極性または荷電ＬまたはＤ−アミノ酸であり得る。
【００２０】
本発明によれば、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、存在しなくてもよいか、または任意の単一アミノ酸もしくは２〜１０アミノ酸鎖であり得、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、例えば、直接的なＮ−Ｃ末端環化、リンカー配列の挿入またはシステイン架橋により、共有結合によって連結されて大環状分子を形成し得る。ＣａｐＮとＣａｐＣとの結合には他の方法も可能である。
【００２１】
本発明のある種の実施形態では、
ＣａｐＮは、［Ｐｒｏ｜Ｇｌｙ］−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−ＰｒｏおよびＣａｐＮであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＮは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、結合されていないか；
ＣａｐＮは、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ｐｒｏ／Ｇｌｙ］であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、［Ｇｌｙ｜Ｐｒｏ］−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｄｓｐ−Ｐｒｏであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、ｌｙ−Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ＣａｐＮおよびＣａｐＣ中のＣｙｓ残基間のシステイン架橋を介して連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；または
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓであり、かつＣａｐＣは、Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ＣａｐＮおよびＣａｐＣ中のシステイン残基間のシステイン架橋を介して連結されている。
【００２２】
ある種の実施形態では、
Ｘ１は、アルギニン、リジン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、オルニチン、シトルリンであり；
Ｘ２は、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンであり；
Ｘ３は、バリン、イソロイシン、アロ−イソロイシン、Ｌ−２−アミノ酪酸もしくはメチオニンまたはその近い誘導体であり；
Ｘ４は、アラニン、Ｌ−２−アミノ酪酸、トリフルオロアラニン、２−アミノ−３−ブテン酸、２−アミノ−３−ブチン酸またはその誘導体であり；および
Ｘ５は、グリシン、アラニンまたはセリンである、化合物が提供される。
【００２３】
本発明の化合物は、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９および／またはＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。
【００２４】
ある種の実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるＡ型インフルエンザウイルス株に特異的に結合することができる。
【００２５】
ある種の実施形態では、化合物は、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９および／またはＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９などのＨ１亜型のＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルス株を中和することもできる。ある種の実施形態では、化合物は、Ｈ１亜型のＨＡを含む少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルス株を中和することができる。
【００２６】
ある種の実施形態では、化合物は、系統発生第１群の他の亜型、例えばＨ２、Ｈ５および／またはＨ９亜型のＨＡを含む少なくとも１種のインフルエンザウイルスに結合することができる。
【００２７】
本明細書中で使用する「特異的に結合する」という用語は、抗原性生体分子の混合物を含有する試料中の対象のタンパク質、すなわちＨＡのエピトープに結合するが、実質的に他の分子を認識し、かつそれに結合しない化合物を指す。通常、本発明の化合物は、第１群のＡ型インフルエンザウイルスのＨＡに１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、より一層好ましくは１０ｎＭ未満、さらに好ましくは１ｎＭの親和性定数（Ｋｄ値）で結合する。
【００２８】
本明細書を通して使用するＡ型インフルエンザウイルスに関連した「インフルエンザウイルス亜型」という用語は、ウイルス表面タンパク質のヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミダーゼ（Ｎ）の様々な組み合わせによって特徴付けられるＡ型インフルエンザウイルス株を指す。Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、そのＨの数、例えば「Ｈ１もしくはＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」または「Ｈ１インフルエンザウイルス」、「Ｈ５インフルエンザウイルス」などにより、あるいはＨの数とＮの数との組み合わせ、例えば「インフルエンザウイルス「Ｈ１Ｎ１」または「Ｈ５Ｎ１」亜型として表され得る。インフルエンザウイルス「亜型」という用語には、具体的には、そのような亜型内の個々の全てのインフルエンザウイルス「株」が含まれ、それらは、通常、ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼの変異の結果として相違しており、異なる病原性プロファイルを示し、自然分離株および人工の変異体または再集合体などを含む。このような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」と称され得る。したがって、本明細書では、「株」および「分離株」という用語は、互換的に使用され得る。Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、それらの系統発生群を参照することによりさらに分類することができる。こうして、系統発生解析により、インフルエンザヘマグルチニンの２つの主要グループへの細分化、とりわけ系統発生第１群におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型（「グループ１」インフルエンザウイルス）ならびにとりわけ系統発生第２群におけるＨ３、Ｈ４、Ｈ７およびＨ１０亜型（「グループ２」インフルエンザウイルス」）への細分化が示された。
【００２９】
本発明のアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸もしくは例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれらのバリアントのいずれでもあり得、またはタンパク質中に天然に見出されないバリアントのいずれでもあり得る。表４は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。ユニバーサルな遺伝暗号のコドンによって直接コードされる２０種のアミノ酸は、標準または標準的なアミノ酸と呼ばれる。他のものは、非標準または非標準的と呼ばれる。一部のアミノ酸は、特別な特性を有し、例えば、システインは、他のシステイン残基への共有ジスルフィド結合を形成することができ、プロリンは、ポリペプチド骨格への周期性を形成し、グリシンは、他のアミノ酸よりもフレキシブルである。
【００３０】
本発明の化合物に関連して、本明細書中で使用する「中和する」または「中和」という用語は、その中和のメカニズムにかかわらず、インビトロでおよび／または対象のインビボでインフルエンザウイルスの複製を阻害する化合物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ウイルスと細胞膜とが融合した後、ウイルスがターゲット細胞に結合することを阻害することにより、インフルエンザウイルスを中和する。本発明の化合物に関連して、本明細書中で使用する「交差中和する」または「交差中和」という用語は、Ａ型インフルエンザの異なる亜型のインフルエンザウイルス株を中和する能力を指す。中和活性は、例えば、本明細書中に記載のように測定することができる。中和活性の代替の測定法は、例えば、ＷＨＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，２００５，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００２．５に記載されている。通常、本発明の化合物は、例えば、実施例で記載するような、インビトロでのウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）による測定で１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下の中和活性を有する。
【００３１】
ある種の実施形態では、本発明の化合物は、以下の配列を有する：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−［Ｇｌｕ／Ａｒｇ］−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｌＬｅｕ／Ｐｈ５］−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ａｌｕ／Ａｂｕ］−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［Ｍｅｔ／Ｎｌｕ］−ＣａｐＣ
（ここで、ＣａｐＮは、［Ｐｒｏ｜Ｇｌｙ］−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣ＝Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−ＰｒｏおよびＣａｐＮであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、結合されていないか；
ＣａｐＮは、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−［Ｐｒｏ／Ｇｌｙ］であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、［Ｇｌｙ｜Ｐｒｏ］−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｄｓｐ−Ｐｒｏであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓ−Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ＣａｐＮおよびＣａｐＣ中のＣｙｓ残基間のシステイン架橋を介して連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、ＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；
ＣａｐＮは、Ｌｅｕであり、かつＣａｐＣは、Ｇｌｙであり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ヘッドトゥテール結合によって連結されているか；または
ＣａｐＮは、｛Ｓｕｃ｝−Ｃｙｓであり、かつＣａｐＣは、Ｃｙｓ−｛ＮＨ２｝であり、かつＣａｐＮおよびＣａｐＣは、ＣａｐＮおよびＣａｐＣ中のシステイン残基間のシステイン架橋を介して連結されている）。
【００３２】
本出願を通して使用されるように、Ｓｕｃ＝スクシニル；Ｐｈ５＝（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸；Ａｂｕ＝Ｌ−２−アミノ酪酸およびＮｌｕ＝Ｌ−ノルロイシンである。ペプチド配列において［］間に示されるアミノ酸残基は、可能な代替残基を示す一方、ペプチド配列において｛｝間に示されるアミノ酸残基は、アミノ酸残基を除外する可能性を有する可能な選択肢を示す。
【００３３】
本発明によれば、「ヘッドトゥテール結合」は、直鎖状ペプチドのＣおよびＮ末端間でのペプチド結合の形成を意味する。
【００３４】
ある種の実施形態では、化合物は、
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号２）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号３）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｎｌｕ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号４）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号６）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号７）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号８）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号９）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号１０）；
システイン架橋を介して環化されているＳｕｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１１）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１２）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１３）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＤ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（配列番号１４）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１５）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＤ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１６）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈ５−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１７）；
Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号１８）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号１９）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ（配列番号２０）；
ヘッドトゥテール結合を介して環化されているＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号２１）；および
システイン架橋を介して環化されているＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ（配列番号２２）
からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の化合物は、当該技術分野でよく知られた手順のいずれかで、特に自動固相ペプチド合成装置を用いて行う十分に確立された化学的合成手順後、クロマトグラフィーによる精製を行うことによって作製され得る。
【００３６】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の化合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。「薬学的に許容される賦形剤」は、好適な組成物を調製するために本発明の化合物などの活性分子と組み合わされる不活性な物質であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒性であり、かつ製剤の他の成分と適合性がある賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野に広く適用され、知られている。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療薬、予防薬および／または診断薬をさらに含み得る。前記さらなる治療薬および／または予防薬は、例えば、インフルエンザウイルス感染を予防および／または治療することもできる薬剤、例えばＭ２阻害剤（例えば、アマンタジン、リマンタジン）および／またはノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル、オセルタミビル）であり得る。これらは、本発明の化合物と併用することができる。本明細書中の「併用」は、別個の製剤としてもしくは１つの組み合わせ製剤としての同時投与、または別個の製剤としての連続投与計画に従った任意の順序での投与を意味する。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、インフルエンザの診断、予防および／または治療に使用するための、本明細書に記載の化合物を提供する。本発明は、インフルエンザの診断、予防および／または治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載の化合物の使用をさらに提供する。本明細書で使用される「インフルエンザ」または「インフルエンザウイルス感染または疾患」という用語は、インフルエンザウイルスにより細胞または対象が感染することによってもたらされる病態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる呼吸器疾患を指す。本明細書で使用される「インフルエンザウイルス感染」という用語は、細胞または対象におけるインフルエンザウイルスの増殖および／または存在による侵襲を意味する。インフルエンザウイルス感染は、小さい集団で起こり得るが、季節的流行で世界中に広がり、悪くすれば数百万の人々が危険になる世界的流行に至るおそれもある。本発明は、このような季節的流行および潜在的な大流行を引き起こすインフルエンザ株の感染を中和することができる化合物を提供する。ある種の実施形態では、化合物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染、好ましくはＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス株などの系統発生第１群由来のＡ型インフルエンザウイルス株によって引き起こされるＡ型インフルエンザウイルス感染の診断、予防および／または治療における使用のためのものである。
【００３８】
本発明は、対象においてインフルエンザを予防および／または治療するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載の化合物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む方法をさらに提供する。「治療有効量」という用語は、インフルエンザウイルスの感染から生じる状態を予防、緩和および／または治療するのに有効である、本明細書で定義される化合物の量を指す。予防および／または治療は、インフルエンザに感染しやすい患者群を対象とすることができる。このような患者群として、限定されるものではないが、例えば高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳および好ましくは≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者、および抗ウイルス化合物で治療されたが、十分な抗ウイルス反応を示さない既に感染している患者が挙げられる。
【００３９】
本発明の化合物は、例えば、静脈内投与、鼻腔内投与、経口吸入、肺内投与、皮下投与、皮内投与、硝子体内投与、経口投与、筋肉内投与などにより患者に投与され得る。最適な投与経路は、活性分子の物理化学的特性、臨床症状の緊急性、活性分子の血漿濃度と必要な治療効果との関係などのいくつかの要因に影響されるであろう。
【００４０】
本発明は、試料におけるＡ型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、ａ）診断有効量の本発明の化合物を前記試料と接触させる工程と、ｂ）その化合物が試料中の分子に特異的に結合するか否かを決定する工程とを含む方法をさらに提供する。試料は、限定されないが、（潜在的に）感染した対象からの血液、血清、組織または他の生体物質などの生体試料であり得る。（潜在的に）感染した対象は、ヒト対象であり得るが、インフルエンザウイルスのキャリアーとして疑われる動物も、本発明の化合物を用いてインフルエンザウイルスの存在について検査され得る。
【００４１】
以下の非限定的な実施例において本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４２】
実施例１：本発明の化合物の合成
一般式：
ＣａｐＮ−Ｔｙｒ−Ｘ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ｘ５−［Ｍｅｔ｜Ｎｌｕ］−ＣａｐＣを含む本発明の２２種の化合物のセットが設計された。本発明の例示化合物が表１に列記される。
【００４３】
【表１】
2020500169.tif 000002
【００４４】
【表２】
2020500169.tif 000003
【００４５】
全てのペプチドは、後述のように手動固相Ｆｍｏｃペプチド化学反応によって作製された。アミノ酸側鎖の官能基は、Ｎ−Ｂｏｃ（Ｗ）、Ｏ−ｔ−Ｂｕ（Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｙ）、Ｃーｔ−Ｂｕ（Ｃ）およびＮ−Ｐｂｆ（Ｒ）基（Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル、ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ．ブチル、Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル、Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）として保護された。
【００４６】
全ての化学物質（天然および非天然アミノ酸、レジン、試薬および溶媒）は、市販業者から入手した。ペプチドの純度および種類をＨＰＬＣおよび質量分析により評価した。
【００４７】
直鎖状ペプチド
直鎖状ペプチドをＲｉｎｋアミドＭＢＨＡレジン（０．５３ｍｍｏｌ／ｇ）上の手動固相Ｆｍｏｃ化学反応によって作製した。レジンをＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で１時間膨潤させ、ＤＭＦ中において２０％ピペリジンで処理して（２×１５分）Ｆｍｏｃを除去した。全てのアシル化反応は、２当量のＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）の存在下において、０．９５当量のＨＢＴＵ（（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）により活性化された３倍過剰のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて行い、カップリング時間は、１．５〜２時間を用いた。Ｎ末端スクシニル化は、ＤＩＰＥＡ（１０当量）の存在下において、無水コハク酸（５当量）によるペプチドレジンの処理によって行った（１時間）。
【００４８】
ペプチドをレジンから切断し、トリフルオロ酢酸／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／水（９０：５：２．５：２．５）を用いて３時間脱保護した。レジンを濾過により除去し、その後、濾液を氷冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに注いで、粗ペプチドの沈殿物を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）によって最終精製を行った。
【００４９】
ジスルフィド環化ペプチド
ジスルフィド環化は、ヨウ素酸化によってもたらされた。上述のように作製した粗製の直鎖状ペプチド前駆体を水／アセトニトリル（７：３）中に溶解させ、ヨウ素溶液（メタノール中０．１Ｍ）を、反応混合物の持続的な変色が得られるまで加えた。その後の凍結乾燥により粗製の環化ペプチドが得られ、これをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００５０】
ヘッドトゥテールラクタム環化ペプチド
直鎖状ペプチドを、上述のプロトコルに従って、グリシンを予め添加した２−クロロトリチルクロリドレジン（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）上の手動固相Ｆｍｏｃ化学反応によって作製した。ジクロロメタン／ヘキサフルオロイソプロパノール／トリフルオロエタノール／トリイソプロピルシラン（６．５：２：１：０．５）の混合物中で１時間ペプチドレジンを回旋させることにより、レジンからペプチドを切断した。レジンを濾別し、冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルの添加によって濾液からペプチドを沈殿させた。ペプチドを真空下で乾燥させ、次のラクタム環化工程においてそのまま使用した。
【００５１】
側鎖を保護した直鎖状ペプチドをＤＭＦ（０．００１Ｍ）に溶解させることにより、高希釈度でラクタム環化を行い、これにＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、２当量、０．００４Ｍ）およびＮ−メチルモルホリン（６当量、０．０１２Ｍ）のＤＭＦ溶液を滴下した。完全転化が観察されるまで反応混合物を室温で撹拌した。溶媒を減圧除去して環化ペプチドを得、これをトリフルオロ酢酸／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／水（９０：５：２．５：２．５）の混合物により室温で３時間処理して完全に脱保護した。反応混合物を氷冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに注いで、粗ペプチドの沈殿物を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣによって最終精製を行った。
【００５２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム上において流速０．８ｍＬ／分、カラム温度３０℃で行った。１０％Ｂから開始して５０％Ｂに至る２％Ｂ／分の線形ＡＢ勾配を適用した後、９０％Ｂまで２．６％Ｂ／分の線形ＡＢ勾配を適用した（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡ／ＡＣＮ）。検出は、ダイオードアレイ（ＤＡＤ）および質量選択検出器（ＭＳＤ）を用いて行った。ペプチド質量を実測質量から計算して（ｍ／ｚ）比に変えた。
【００５３】
実施例２：インフルエンザＨＡへの化合物の結合および他のＨＡバインダーとの化合物の競合
結合競合試験は、ＨＡの既知のエピトープと、特性が明らかにされている他のＨＡ結合タンパク質（例えば、ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１およびＨＢ８０．４など）との競合について本発明の化合物を試験するように計画した。エピトープは、ＨＡの幹領域（ＨＡのウイルス膜中心部）または対照の目的でＨＡの球状部領域（ＨＡのウイルス膜末端部）のいずれかに位置した。競合が観察された場合、両方の分子は、ＨＡ表面の類似したまたは少なくとも重複するエピトープに結合すると見なされた。ＨＡ球状部領域および幹領域−バインダーとの競合は、非特異的結合であると判断した。
【００５４】
本明細書では、ＨＡ−特異的バインダーが結合した、完全長のビオチン化三量体ＨＡタンパク質（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅｓ、１０μＬ、０．５ｎＭ  ５０μＬ中の最終濃度）によるＡｌｐｈａＬＩＳＡ競合アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を採用した。室温（ＲＴ）で１時間のインキュベーション後、ＨＡを認識するストレプトアビジンドナービーズ（１０μｇ／ｍＬを１０μＬ）と、用いたＩｇＧを認識する抗Ｆｃビーズ（１０μｇ／ｍＬ）との２種のビーズにより、ＨＡとバインダーとの相互作用を検出した。室温でさらに１時間のインキュベーションを行えば、活性化したドナービーズ（６８０ｎｍ）とアクセプタービーズとが非常に接近し、アクセプタービーズの発光信号としてエネルギー移動（一重項酸素）を測定することができる（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）。このホモジニアスアッセイフォーマットのシグナル強度は、両方の結合パートナー間の結合強度（親和性／結合力）に正比例する。競合種（化合物）は、親和性および濃度（通常、１００ｎＭ〜０．５ｐＭの範囲で試験する）に依存してＡｌｐｈａＬＩＳＡのシグナルを攪乱させることがあり、ＳＰＳＳの標準４パラメータロジスティック非線形回帰モデルによりフィッティングされるシグモイド状の阻害剤曲線をもたらす。算出されたｐＩＣ５０値を表２に示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
本発明の化合物は、よく知られる結合分子との競合により示されるように、ＨＡに結合する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて、最良の化合物ＣＰ１４１０８５は、１３ｎＭのＩＣ５０に達した。最も強力でないペプチドは、１０μＭ範囲のＩＣ５０で競合した。２種のＨ１株Ｈ１／ＣａｌおよびＨ１／Ｎｃａにおいて活性が実証され、これは、２種の最も豊富なＨ１幹領域エピトープを表し、かつＮＣＢＩインフルエンザデータベースにおいて利用可能な配列に基づいて、２０１１年時点で全ての幹領域エピトープの配列バリエーションの６０％を網羅した。結論として、本発明の化合物は、１０μＭ〜ほぼ１０ｎＭの範囲におけるよく知られるＨＡ結合分子との競合により示されるように、ＨＡに結合する。
【００５７】
実施例３：化合物のインフルエンザウイルス中和活性および細胞毒性
哺乳類細胞のインフルエンザウイルス感染を予防する能力について、ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）により化合物を解析した。この目的のために、ヒトの肺上皮由来のＣａｌｕ−３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−５５）を９６ウェルプレートに播種し（４Ｅ＋０４細胞／ウェル）、完全ＤＭＥＭ（１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳＨＩｏｒｉｇｉｎ：Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｇｉｂｃｏ）中、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２で少なくとも７日間インキュベートした。密集度約９０％でＣａｌｕ−３細胞が極性化され、密着結合が構築されればＶＮＡを行う準備が整う。分析日に、化合物ストック（ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ５％ＤＭＳＯに溶解、初期濃度５００ｎＭ）から、不完全ＤＭＥＭ（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）中、２倍希釈で試料希釈プレートを調製した。試料希釈プレートを遠心分離（１０００ｇで１５分間）して、潜在凝集物を除去した。その後、不完全ＤＭＥＭ中の５ＴＣＩＤ５０／５０μＬインフルエンザウイルス（Ｃａｌｕ−３細胞で予め用量設定）を試料希釈プレートに添加し、３７℃および１０％ＣＯ２で１時間インキュベートした。細胞から培地を除去し、３％ＦＢＳを添加した５０μＬの不完全ＤＭＥＭで置き換えた。その後、１００μＬウイルス／化合物混合物を細胞に添加し、ＦＢＳの最終濃度が１％である総量１５０μＬの分析容量を得た。３７℃および１０％ＣＯ２で４日間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２００μＬ／ウェルの８０％アセトンにより室温（ＲＴ）で１５分間固定した。インフルエンザの感染レベルをインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）ＥＬＩＳＡで決定した。一次抗体、抗インフルエンザ−Ａ−ＮＰ（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｃｌｏｎｅ  ５Ｄ８）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０００に希釈して使用し、３００ｒｐｍで振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。洗浄用−緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で細胞を３回洗浄した後、二次抗体（抗マウスＨＲＰ、１：２０００）を添加し、３００ｒｐｍで振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＰＯＤ化学発光基質を添加し、２〜５分間インキュベートし、その後、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにより発光を読み取った。ＳＰＳＳソフトウェアを使用し、化合物のｐＩＣ５０を算出した。結果を表３に示す。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
結論として、本発明のいくつかの化合物は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａに対してマイクロモル濃度の中和活性に達し、これは、タンパク質分解安定性の増大を示している。
【００６０】
【表５】
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【国際調査報告】
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