(57)【要約】  本発明は、ｃＭＥＴに高いアフィニティで結合し、ｃＭＥＴ発現腫瘍細胞を標的とすることができる抗体及びヘテロ二量体免疫グロブリン分子を提供する。本発明はまた、本明細書に開示される本発明の抗体またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子を用いて抗−ｃＭＥＴ抗体薬物複合体を生成する方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトｃ−ＭＥＴに少なくとも１０-8Ｍのアフィニティで結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトｃ−ＭＥＴバリアントＮ３７５Ｓに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトｃ−ＭＥＴのＳＥＭＡドメイン中に含まれるエピトープに結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトｃ−ＭＥＴのＩＰＴドメイン１−４中に含まれるエピトープに結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒトｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤに対する組換えヒトＨＧＦ組換え体の結合を、０．９×１０-9Ｍ以下の濃度で、固相中のＨＧＦを用いる酵素結合免疫吸着アッセイで５０％阻害する、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＦａｂである、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＦ（ａｂ’）2である、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧ型抗体である、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列版応１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に従う配列のうち少なくとも１つの配列を含む、請求項６から９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列版応１及び配列番号２、または配列番号３及び配列番号４、または配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８に従う重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、さらに診断または治療薬剤と結合する、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
ヘテロ二量体免疫グロブリン分子であって、
(iii)        ヒトｃ−ＭＥＴに特異的に結合する、第１及び／または第２のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメント、及び
(iv)          抗体ヒンジ部、抗体ＣＨ２ドメイン及び抗体ＣＨ３ドメインであって、ハイブリッドタンパク質−タンパク質相互作用界面ドメインを含み、前記相互作用界面ドメインは、第１メンバーのＣＨ３ドメインのアミノ酸セグメント及び第２メンバーのＣＨ３ドメインのアミノ酸セグメントによって形成され、第１鎖のタンパク質−タンパク質界面ドメインは第２鎖のタンパク質−タンパク質界面ドメインと、前記相互作用ドメイン内において、免疫グロブリンスーパーファミリーの同じメンバーの対応するアミノ酸セグメントのホモ二量化によって相互作用し、ここで第１改変免疫グロブリン鎖はポリペプチド配列（”ＡＧ−ＳＥＥＤ”）：
2020500835.tif 000006
を有し、かつ、第２改変免疫グロブリン鎖はポリペプチド配列（”ＧＡ−ＳＥＥＤ”）：
2020500835.tif 000007
を有し、ここで第１及び／または第２ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に従う少なくとも２つのアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子。
【請求項１４】
ヘテロ二量体免疫グロブリン分子が更に診断または治療薬剤と結合する、請求項１３に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン分子。
【請求項１５】
治療薬剤が細胞毒である、請求項１２に記載の抗体または請求項１４に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン分子。
【請求項１６】
ヘテロ二量体免疫グロブリン分子がアフコシル化した、請求項１５に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン分子
【請求項１７】
請求項１５に記載の抗体、または請求項１５または１６に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン分子であって、がんの治療に用いられる、抗体またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明分野）
本発明は、抗ｃ−ＭＥＴ特異的抗体及びその抗体薬物複合体に関し、がんの治療に有用である。本発明は更に、本発明の抗体またはその抗体薬物複合体の生成方法を提供する。
【０００２】
（背景）
肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）は、またｃ−ＭＥＴ（間葉上皮転換）としても知られているが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＴＫであり、化学的に変質させたヒト骨肉腫細胞中で発がん性ＴＲＰ−ＭＥＴ融合タンパク質として最初に特定された。間葉系細胞によるｃ−ＭＥＴの発現及びそのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、または散乱因子ＳＦ）の分泌は、細胞分化、増殖、生存、細胞骨格相互作用、細胞脱離、散乱、運動及び侵襲性に関与している（Birchmeier 他 (2003) Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 4, 915-925）。プロテオグリカン（デコリン）はｃ−ＭＥＴのリガンドとなる（Goldoni 他 (2009) J.Cell Biol. 185, 743-75）。マクロ細胞レベルでは、ｃ−ＭＥＴは、例えば、胚形成では創傷治癒及び器官再生のような、様々な機能を有する。腫瘍形成は、転移性細胞拡散を可能にする上皮から間葉系の表現型へのがん細胞形状の形態学的変化によって特徴づけられる。一般に、高いｃ−ＭＥＴ発現は、初代腫瘍に比べて転移性病巣で見つかり、転移におけるｃ−ＭＥＴの関与を強調している（Cipriani 他 (2009) Lung Cancer 63, 169-179）。
【０００３】
ｃ−ＭＥＴはジスルフィド結合したα鎖−β鎖ヘテロダイマーであって、単一の前駆体タンパク質からタンパク分解的に切断されたものである。それは、ＳＥＭＡと呼ばれる７枚ブレードのプロペラドメイン、プレキシン、セマフォリン及びインテグリンに関連するＰＳＩドメイン及び４つのＩＰＴドメインの反復で構成される大きな細胞外領域で構成され、免疫性グロブリン、プレキシン及び転写因子に相動性を示す。α−及びβ鎖の間のフリン切断箇所は、ブレード４及び５の間に位置する。単一膜貫通領域に、細胞内チロシンキナーゼ領域が続く。受容体に結合するリガンドは、（ＭＥＴの）二量化及びチロシン残基１２３０、１２３５及び１２３５の自己リン酸化を誘発し、Ｓｒｃホモロジー２タンパク質（ＳＨ２）のドッキング部位であるチロシン１３４９及び１３５６のトランスリン酸化を導く（Birchmeier 他 (2003) Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 4, 915-925）。Ｓｒｃ補充（Src recruitment）は続いて、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路を含む、細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。
【０００４】
ＨＧＦはジスルフィド結合α−鎖−β−鎖ヘテロダイマーであり、単一の前駆体タンパク質からプロセッシングされる（Lokker 他 (1992) EMBO J. 11, 2503-2510）。ＨＧＦα−鎖は、４つのクリングルドメインが続くＮ−末端領域で構成される一方、ＨＧＦβ−鎖は、１つのセリンプロテアーゼホモロジードメイン（ＳＰＨ）のみから成る。ＨＧＦは、プロテオグリカンヘパリンと結合し、ＨＧＦ−ホモダイマーを溶液中で形成する。そのｃ−ＭＥＴとの相互作用については、２：２  ｃ−ＭＥＴ：ＨＧＦ複合体におけるリガンド誘発二量化が提案されている（Niemann (2013)  Biochim.Biophys.Acta 1834, 2195-2204.; Stamos 他. (2004)  EMBO J. 23, 2325-2335）。ＨＧＦにはｃ−ＭＥＴ上で二つの結合部位が予測されている。ＨＧＦβ−鎖がＳＥＭＡドメインのブレード２及び３に低いアフィニティで結合することが提案されている一方（Gherardi 他. (2003)  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100, 12039-12044; Stamos 他. (2004)  EMBO J. 23, 2325-2335）、ＨＧＦのα−鎖がｃ−ＭＥＴに高いアフィニティで結合する結合部位が２つ提案されている。第１のモデルにおいて、ＮＫ１と呼ばれる、短縮されたＮ−末端ＨＧＦフラグメントのＩＰＴドメイン３及び４が高いアフィニティ結合部位を有することが提案されている一方、第２の提案されたモデルでは、ＮＫ１のＳＥＭＡドメインブレード５への結合は、ＨＧＦのα−鎖のｃ−ＭＥＴへの高いアフィニティ結合部位を構成する（Youles 他. (2008) J.Mol.Biol. 377, 616-622）。
【０００５】
腫瘍形成及び転移におけるｃ−ＭＥＴの関与のため、いくつかのＨＧＦ及びｃ−ＭＥＴに向けられた抗体が近年開発され、そのうちのいくつかは、臨床試験で評価されている（Prat 他. (2014) Biomedicines 2, 359-383）。ＨＧＦ−中和抗体、例えば、リロツムマブ及びフィクラツズマブはリガンドのみを標的とし、そのため恒常的なｃ−ＭＥＴ活性化を伴うがんにおいては不十分である。更に、ＨＧＦは、組織の細胞外マトリックス中に非プロセス型前駆体タンパク質として大量に貯蔵され、抗ＨＧＦ抗体の効率を妨げる。ｃ−ＭＥＴについては、抗体が受容体のいくつかのエピトープに対して開発されている。オナルツズマブ（oa 5D5, MetMAb, RO5490258）及びエミベツズマブ（LY2875358）は臨床的な開発において最も進んでおり、第ＩＩＩ及び第ＩＩ相試験の段階にそれぞれある。両抗体の結合エピトープがｃ−ＭＥＴ  ＳＥＭＡドメイン内にあるとしても、一価のオナルツズマブは主にＨＧＦ−競合を通じて作用する一方（Merchant 他. (2013) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 110, E2987-E2996）、二価のエミベツズマブは、リガンド結合をブロックする他、受容体の分解を誘発する（Liu 他. (2014)  Clin.Cancer Res. 20, 6059-6070）。３つの追加的な抗ｃ−ＭＥＴ抗体が、現在第Ｉ相試験で臨床的に評価されている：二価のＡＢＴ−７００ (ｈ２２４Ｇ１１、ＡＤＤＣ−強化ＡＲＧＸ−１１１（ＷＴ５２−Ｅ）（Basilico 他. (2014)  J.Clin.Invest 124, 3172-3186; Hultberg 他. (2015)  Cancer Res. 75, 3373-3383）及び二価のｃ−ＭＥＴ分解抗体ＳＡＩＴ３０１(Oh 他. (2012)  Mol.Cells 34, 523-529)。ＡＲＧＸ−１１１及びエミベツズマブがオーバーラップエピトープを占めるのに対し、ＳＡＩＴ３０１の正確な結合部位は知られていない。後者はｃ−ＭＥＴの分解をＬＲＩＧ媒介リソソーム経路を通じて誘発する（Lee 他. (2014)  Oncogene 33, 34-43）。これはおそらく、ＬＭＨ８７がＳＥＭＡプロペラの頂点のブレード３及び４上に結合するのと同じ作用機序であると推測される（Greenall 他. (2012) PLoS.One. 7, e34658;  Prat 他. (2014)  Biomedicines 2, 359-383）。しかしながら、ＳＡＩＴ３０１及びＬＭＨ８７は、オーバーラップエピトープを共通にしない。別のｃ−ＭＥＴ分解抗体はＤＮ３０であり、これは第４ＩＰＴドメインに結合し、メタロプロテアーゼＡＤＡＭ−１０を通じて分解を誘発し、リガンド結合とは競合しない（Vigna 他. (2015) Mol. Oncol. 9, 1760-1772）。いくつかの二価の抗ｃ−ＭＥＴ抗体は、部分的に又は完全な受容体活性作用を引き起こす傾向があり、治療適用のためには部分的に一価の形式を必要とする。ｃ−ＭＥＴ標的抗体、例えばオナルツズマブ、の有害事象は主として、上皮の完全性及び創傷治癒を調節するｃ−ＭＥＴ／ＨＧＦ軸の封鎖を伴う浮腫及び血栓性の事象である
したがって、引き続き、既存技術において入手可能な抗ｃ−ＭＥＴの限界を克服する、がんの治療のため高アフィニティ抗ｃ−ＭＥＴ抗体及び対応する抗体薬物複合体のレパートリーを拡張する必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の概要）
本件発明者は、驚くべきことに、ｃ−ＭＥＴに高いアフィニティで結合し、ｃ−ＭＥＴ発現腫瘍を効率的に阻害するために用い得る抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントを発見した。
第１実施形態において、本発明は抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ヒトｃ−ＭＥＴに対し少なくとも１０-8Ｍのアフィニティで結合するものを提供する。
ある実施形態に従うと、上記のとおり開示された本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトｃ−ＭＥＴバリアントＮ３７５Ｓに結合する。
ある実施形態において、上記のとおり開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトｃ−ＭＥＴのＳＥＭＡドメイン中に含まれるエピトープに結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する。
ある実施形態に従うと、上記のとおり開示された本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトｃ−ＭＥＴのＩＰＴドメイン１−４の中に含まれるエピトープに結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する。
ある実施形態において、上記のとおり開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、０．８８×１０-9Ｍ以下の濃度で、固相でＨＧＦを用いた酵素結合免疫吸着アッセイにおいて組換えヒトＨＧＦのヒトｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤへの結合を５０％阻害する。
ある実施形態に従うと、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖである。
ある実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体である。
【０００７】
ある実施形態に従うと、上記のとおり開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のうちの少なくとも１つの配列を含む。
ある実施形態に従うと、上記のとおり開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び配列番号４、又は配列番号５及び配列番号６に従う重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、更に診断、または治療薬剤と結合する。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、ヘテロ二量化免疫グロブリン分子を提供し、該分子は、
（ｉ）第１及び／または第２ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントであって、ヒトｃ−ＭＥＴに特異的に結合するもの、及び
（ｉｉ）抗体のヒンジ部、抗体のＣＨ２ドメイン及び抗体のＣＨ３ドメインであって、ハイブリッドタンパク質−タンパク質相互作用界面ドメインを含み、該相互作用界面ドメインは、第１メンバーのＣＨ３ドメインのアミノ酸セグメント及び前記第２メンバーのＣＨ３ドメインのアミノ酸セグメントによって形成され、第１鎖の前記タンパク質−タンパク質界面ドメインは第２鎖のタンパク質−タンパク質界面ドメインと、免疫グロブリンスーパーファミリーの同じメンバーの対応するアミノ酸セグメントの前記界面ドメイン内でのホモ二量化によって相互作用し、
ここで、第１の遺伝子組み換え免疫グロブリン鎖は、ポリペプチド配列（”ＡＧ−ＳＥＥＤ”）：
2020500835.tif 000002
を有し、
第２の遺伝子組み換え免疫グロブリン鎖は、ポリペプチド配列（”ＧＡ−ＳＥＥＤ”）：
2020500835.tif 000003
を有し、
前記第１及び／または第２のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のうちの少なくとも２つのアミノ酸配列を含む。  
【０００９】
ある実施形態において、本発明のヘテロ二量化免疫グロブリン分子は更に、診断、または治療薬剤と結合する。
ある実施形態に従うと、本発明のヘテロ二量化免疫グロブリン分子は、細胞毒と結合する。
ある実施形態において、本発明のヘテロ二量化免疫グロブリン分子は、アフコシル化（afucosylated）される。
ある実施形態において、上記の通り開示された本発明の抗体またはヘテロ二量化免疫グロブリン分子は、がんの治療において用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の抗体またはヘテロ二量化免疫グロブリン分子のエピトープ・ビニング。
【図２】ＨＧＦ置換ＥＬＩＳＡの結果。
【図３】抗体薬物複合体のための細胞毒性アッセイで、細胞毒デュオカルマイシンＳＡ（ＤＭＳＡ）に非共有結合したものを用いた。結果は、細胞毒の効果が試験した細胞株それぞれによるｃ−ＭＥＴ発現に依存することを示す。
【図４】抗体薬物複合体のための細胞毒性アッセイで、細胞毒モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に非共有結合したものを用いた。結果は、細胞毒の効果が、試験した細胞株それぞれによるｃ−ＭＥＴ発現に依存することを示す。
【図５】ｃ−ＭＥＴシグナル伝達の本発明の抗体による阻害を、ｃ−ＭＥＴ特異的リン酸化アッセイで評価したもの。阻害は、示されているように、本発明の抗体またはヘテロ二量化免疫グロブリン分子について濃度１６７ｎＭで評価した。ＭｅｔＭａｂ及びエミベツズマブはコントロールを表す。
【図６】抗体特性の概要。ヒトｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤに対する本発明の抗体の概算ＫＤ（oa CS06: 3x10-10M, oa B10v5: 4.17x10-10M, B10v5 IgG1: 1.88x10-10M, CS06 IgG1: 1.34x10-10M）。本発明のバイパラトピック（biparatopic）二重特異性ヘテロ二量化免疫グロブリン分子は、Ｆａｂフラグメント  ＣＳ０６及びＢ１０ｖ５(“bp CS06xB10v5”: 1.96x10-11M)を含む。
【図７】配列番号１
【図８】配列番号２
【図９】配列番号３
【図１０】配列番号４
【図１１】配列番号５
【図１２】配列番号６
【図１３】配列番号７
【図１４】配列番号８
【図１５】配列番号９
【図１６】配列番号１０
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（配列表）
配列番号１  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＢ１０軽鎖アミノ酸配列
配列番号２  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＢ１０重鎖アミノ酸配列
配列番号３  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＦ０６軽鎖アミノ酸配列
配列番号４  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＦ０６重鎖アミノ酸配列
配列番号５  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＢ１０ｖ５軽鎖アミノ酸配列
配列番号６  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＢ１０ｖ５重鎖アミノ酸配列
配列番号７  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＣＳ０６軽鎖アミノ酸配列
配列番号８  抗−ｃ−ＭＥＴクローンＣＳ０６重鎖アミノ酸配列
配列番号９  ＡＧ−ＳＥＥＤ
配列番号１０  ＧＡ−ＳＥＥＤ
配列番号１１  ヒトＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴ）
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は以下に詳細に記載されるが、この発明は本明細書に記載される特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されるものではないことが、それらが変化し得ることから、理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するだけのためであり、添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明のスコープを限定することは意図するものではないことがまた理解されるべきである。別途規定されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語はは、当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。
以下において、本発明の要素が記載されるであろう。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されるが、それらは、追加的な実施形態を作り出すために任意の方法及び任意の数を組み合わせてよいことが理解されるべきである。さまざまに記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を、明示的に記載された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／または好ましい要素とともに組合せる実施形態を支持し、包含するものであると理解されるべきである。更に、この出願における全ての記載された要素の任意の順列及び組合せは、文脈上別途示されない限り、本件出願の記載によって開示されたものと考えられるべきである。
【００１３】
この明細書及びこれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別途要請されない限り、「含む（comprise）」という用語及びその変化形、例えば、「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」は、述べられた要素、整数または工程が含まれることを意味するが、任意のその他の述べられていない要素、整数または工程を除くことを意味しない。「から成る（consist of）」という用語は、「含む（comprise）」という用語の特定の実施形態であって、ここでは任意のその他の述べられていない要素、整数または工程は除かれる。本発明の文脈において、「含む（comprise）」という用語は、「から成る（consist of）」という用語を包含する。
「１つの（ａ）」及び「１つの（an）」及び「その（the）」という用語及び本発明を記載する文脈（とりわけ特許請求の範囲の文脈）において用いられるそれに類似する言及は、本明細書において別途示されているか、明らかに文脈上矛盾しないかぎり、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に該当するそれぞれ別々の値を個別に言及することの簡易な方法として用いられるに過ぎないことを意図している。本明細書において別途示されていない限り、それぞれの個々の値は、本明細書において個別に列挙されたものとして本明細書に組み込まれる。明細書中のいかなる用語も、任意の請求されていない要素が発明の実施に不可欠であると解釈されてはならない。
【００１４】
いくつかの文書がこの明細書の文章を通じて引用される。本明細書で参照されるそれぞれの文書（全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、指示書等）は、上記または下記のいずれにおいても本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。本明細書において何物も、先の発明のせいで、本発明がそのような開示よりも日時が先であるところの権利を有しないことを認めるものであると解釈されてはならない。
記載された課題は、本発明によって、好ましくは、添付された特許請求の範囲に記載された内容によって、解決される。
本願発明者は、驚くべきことに、本発明の抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗体結合フラグメントが、高いアフィニティでｃ−ＭＥＴに結合し、効果的にｃ−ＭＥＴ発現腫瘍を抑制することができることを発見した。
【００１５】
記載された課題は、本発明の抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントによる第一の実施形態に従って解決され、該本発明の抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトｃ−ＭＥＴに少なくとも１０-8Ｍのアフィニティで結合する。例えば、本発明の抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｃ−ＭＥＴに少なくとも１０-8Ｍ、例えば少なくとも１×１０-9Ｍ、２×１０-9Ｍ、３×１０-9、４×−１０-9Ｍ、５×１０-9Ｍ、６×１０-9Ｍ、７×１０-9Ｍ、８×１０-9Ｍ、９×１０-9Ｍのアフィニティ、または少なくとも約１０-8Ｍから約１０-10Ｍのアフィニティで結合する。本発明の抗ｃ−ＭＥＴ抗体に用いられるように「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。この用語はまた、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体、または例えば、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体を指す。「抗原結合フラグメント」という用語は、本発明で用いられる場合、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体  （ｄＡｂ）、ディアボディ（diabody）、多重特異性抗体、二重特異性抗体（dual specific antibody）、二重特異性抗体（bispecific antibody）、その機能的に活性なエピトープ結合フラグメント（functionally active epitope-binding fragment thereof）及び単鎖を指す（例えば、Huston 他., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)及びBird 他., Science 242, 423-426 (1988), これらは本明細書に参照によって組み込まれる）。（一般的には、Hood 他., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 及び Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)を参照。これらは参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書で用いられる場合、ｃ−ＭＥＴは、ＭＥＴがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ（UniProtKB データベースエントリ（antry） P08581)を指し、肝細胞増殖因子受容体（Hepatocyte Growth Factor Receptor）として参照されてもよい。
【００１６】
Ｆａｂフラグメントという用語は、本発明の抗体の抗原結合抗体フラグメントを指し、例えば、ＩｇＧ型免疫グロブリンのパパイン処理によって得ることが可能であり、２つのＦａｂフラグメントとＦｃドメインが結果として得られる。機能的な態様及びＦａｂフラグメントを得るための方法（pmthod）は、例えば、"Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies” D.J. King著, CRC Press, 1998, chapter 2.4.1; Zaho 他. Protein Expression and Purification 67 (2009) 182-189; S.M. Andrew, J.A. Titus, Fragmentation of immunoglobulin G, Curr. Protoc. Cell Biol. (2003) Unit 16.14 (Chapter 16)に記載されている。本発明のヘテロ二量体二重特異性（bispecific）免疫グロブリン分子は、例えばまた、ＥＧＦＲに特定的に結合する第１のｓｃＦｖフラグメントを含んでもよい。「ｓｃＦＶ」という用語は、本発明で用いられる場合、リンカーによって結合された抗体重鎖可変部ドメイン（または領域；ＶＨ）及び抗体軽鎖可変部ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を指し、定常部ドメイン、例えば本発明のｓｃＦｖフラグメントは、例えば、１つの軽鎖可変部ドメイン（ＶＬ）またはその部分及び１つの重鎖可変部ドメイン（ＶＨ）またはその部分から成る結合分子を含んでよく、各可変部ドメイン（またはその部分）は、同じまたは異なる抗体に由来する。ｓｃＦｖ分子は好ましくは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入されたリンカーを含み、それは例えば、アミノ酸グリシン及びセリンを含むペプチド配列を含んでもよい。例えば、ペプチド配列は、アミノ酸配列（Gly4 Ser)nを含んでよく、ここでｎは１−６の整数であって、例えば、ｎは１、２、３、４、５または６であってよく、好ましくはｎは４である。ｓｃＦｖ分子及びそれらを得る方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第5,892,019、Ho 他. 1989. Gene 77:51; Bird 他. 1988 Science 242:423; Pantoliano 他. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic 他. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen 他. 1991. Protein Engineering 4:837.に記載されている。
【００１７】
ある実施形態に従うと、上記開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは例えばマウスまたはヒトｃ−ＭＥＴに、好ましくはヒトｃ−ＭＥＴに結合し、該ヒトｃ−ＭＥＴは、配列番号１１に従ったアミノ酸配列を有するもの、または完全長のｃ−ＭＥＴ及びＣ−ＭＥＴバリアントＮ３７５Ｓなどのシグナルペプチドが取り除かれたｃ−ＭＥＴ、例えば、アミノ酸１−２４が切除されたものの両方を含む。例えば、上記開示された本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ｃ−ＭＥＴバリアントＮ３７５Ｓ（rs33917957）に特異的に結合するが、例えばNat Genet. 1997 May;16(1):68-73に開示された次のようなｃ−ＭＥＴバリアントに結合してもよい：c-MET R970C (METR970C)、c-MET T992I (METT992I)、METM1149T、METV1206L、METV1238I、METD1246N、METY1248C、METL1213V、METD1246H、METY1248H、METM1268T、META320V、METN375Sであってシグナルペプチドが切除されたもの (例えば、UniProtKB P08581のアミノ酸１−２４)。
【００１８】
ある実施形態において、上記開示された本発明の抗体または本発明のその抗原結合フラグメントは、ヒトｃ−ＭＥＴのＳＥＭＡドメインに含まれるエピトープに結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、成熟したヒトｃ−ＭＥＴ（UniProtKB P08581）のアミノ酸５２−４９６中に含まれるエピトープに、例えば、ヒトｃ−ＭＥＴのアミノ酸５２−４９６、または例えばアミノ酸２７−５１５に含まれる線状または構造エピトープに結合してもよく、それによりｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害してもよい。「エピトープ」という用語は、本発明で用いられる場合、線状エピトープと構造エピトープを含有し、線状エピトープの場合、連続するアミノ酸は抗体によって認識され、構造エピトープの場合、抗体はアミノ酸をそれらが適切な配置または構造を成熟し、正しく折りたたまれたタンパク質の中で採用する限度において認識する。構造エピトープは、例えばヒトｃ−ＭＥＴのような、タンパク質の三次元構造とその一次アミノ酸配列の両方によって決定される。典型的には、エピトープは少なくとも３以上、通常少なくとも５または８、１０アミノ酸を含み、例えば、エピトープは、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸を含んでもよい。典型的には、またエピトープは２０残基未満（例えばアミノ酸または核酸）、例えば１５残基未満、または１２残基未満の長さである。
【００１９】
本発明の抗体は、例えば、ＳＥＭＡドメインに含まれるエピトープに、少なくとも１０-8Ｍ、例えば少なくとも１×１０-9Ｍ、２×１０-9Ｍ、３×１０-9、４×−１０-9Ｍ、５×１０-9Ｍ、６×１０-9Ｍ、７×１０-9Ｍ、８×１０-9Ｍ、９×１０-9Ｍのアフィニティで結合してもよい。
ある実施形態に従うと、上記開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトｃ−ＭＥＴの免疫グロブリンプレキシン転写（ＩＰＴ）領域１−４に含まれるエピトープに結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する。例えば、ヒトｃ−ＭＥＴ（UniProtKB P08581）のＩＰＴ領域はアミノ酸５６２−６５５（ＩＰＴ領域１）、６５６−７３９（ＩＰＴ領域２）、７４１−８４２（ＩＰＴ領域３）及びアミノ酸８５６−９５２（ＩＰＴ領域４）を含む。本発明の抗体は、例えば、領域１、ＩＰＴ領域２、ＩＰＴ領域３又はＩＰＴ領域４に含まれるエピトープに、上記開示されたアフィニティで結合してもよく、例えばアフィニティは少なくとも１０-8Ｍ、例えば少なくとも１ｘ１０-9Ｍ、２ｘ１０-9  Ｍ、３ｘ１０-9、４ｘ−１０-9Ｍ、５ｘ１０-9Ｍ、６ｘ１０-9Ｍ、７ｘ１０-9Ｍ、８ｘ１０-9Ｍ、９ｘ１０-9Ｍである。ある態様において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＰＴ領域１に結合し、ｃ−ＭＥＴシグナル伝達を阻害する。上記開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えばまた、エピトープが構造エピトープである場合、１より多くのＩＰＴ領域に結合してもよい。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＰＴ領域１及び２、または２及び３、または３及び４、または１及び４、または１及び３、または２及び４、または例えばＩＰＴ領域１、２、３及び４に含まれるエピトープに結合してもよい。
【００２０】
ある実施形態に従うと、上記開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換えヒトＨＧＦ組換え体のヒトｃ−ＭＥＴ細胞外領域（ＥＣＤ）に対する結合を、濃度０．９ｘ１０-9Ｍ以下、例えば約０．１ｘ１０-9Ｍ以下、０．２ｘ１０-9Ｍ以下、０．３ｘ１０-9Ｍ以下、０．５ｘ１０-9Ｍ以下、０．７５ｘ１０-9Ｍ以下で、固相中のＨＧＦを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）中で５０％阻害する。例えば、上記開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒトｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤに対するＨＧＦ結合の阻害は、その原理について、Analytical Biochemistry 361 (2007) 1−6に記載されているバイオレイヤー干渉法を用いて評価してもよい。例えば、異なる商業的に入手可能な技術を用いてもよく、例えば、Biacore, 2000, 3000, T100, Flexchip, S51, 及びA100またはdotLab (Axela Biosensors), MultiSPRinter (東洋紡), Proteomic Processor (Lumera), SPRi-Plex (GenOptics), BIND (SRU Biosystems), Epic (コーニング), ProteOn XPR (バイオ・ラッド)をそれぞれ製造者の指示書に従って用いてもよい。ある実施例においては、Octet Data Acquisition及び分析ソフトウェアを備えたOctet Red96 platform (ForteBio) を用いてもよい。測定は、例えば、３０℃で１０００ｒｐｍの軌道センサー撹拌を用いて、体積２００μｌを、９６ウェルマイクロプレート（黒）中で製造者の指示書に従って行ってもよい。例えば、ＥＬＩＳＡ  MaxiSorp（登録商標）プレートを、約１から約１．５ｐｍｏｌの組換えＨＧＦで、一晩４℃で覆い、続いてMaxisorb（登録商標）プレートを１−５％ＢＳＡ（例えば１％、２％、３％、４％、５％ＢＳＡ）、ＰＢＳ−Ｔ中のＢＳＡでブロッキングしてもよい。ビオチン標識されたｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤを、濃度約０．１ｐｍｏｌから約２ｐｍｏｌ、例えば、約０．１２５ｐｍｏｌ、０．１５ｐｍｏｌ、０．１７５ｐｍｏｌ、０．２ｐｍｏｌ、０．２５ｐｍｏｌ、０．３ｐｍｏｌ、０．４ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、０．６ｐｍｏｌ、０．７ｐｍｏｌ、０．８ｐｍｏｌ、０．９ｐｍｏｌ、１．０ｐｍｏｌから約１．２５ｐｍｏｌ、１．５ｐｍｏｌ、１．７５ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌで、続いて例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを濃度約０．２ｎＭから約２００ｎＭ、例えば約０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１．０ｎＭ、１．２５ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、２．５ｎＭ、３ｎＭ、３．５ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭから約１５ｍＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３２．５ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４２．５ｎＭ、４５ｎＭ、４７．５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、または例えば約１５ｎＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３２．５ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４２．５ｎＭ、４５ｎＭ、４７．５ｎＭ、５０ｎＭから約５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、または例えば約５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０���Ｍ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭから約１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭで連続希釈したものとともにインキュベートしてもよい。ビオチン化されたｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤの固定されたＨＧＦへの結合は、続いて、例えば、ＨＲＰ−結合ストレプトアビジンを用いて、約１：１００から約１：１０，０００、例えば１：２５０、１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：２５００、１：３０００、１：４０００、１：４５００、１：５０００、１：７，５００、１：８０００、１：９０００で希釈し、続いて例えばUltra TMB ELISA基質溶液及び硫酸を添加することによって視覚化してもよい。結果として得られる、本発明の抗ｃ−ＭＥＴ抗体またはその抗原結合フラグメントを添加していないＨＧＦに結合したｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤの吸収は、ＨＧＦ結合１００％として定義してもよい。例えば、コントロールは、抗−鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ＳＥＥＤイソタイプ  コントロール抗体を約０．２ｎＭから約２００ｎＭ、例えば０．２５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭの濃度で含んでもよい。データは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度の対数に対する％ＨＧＦ結合でプロットしてもよい。例えば、上記アッセイで用いられた組換えＨＧＦは、商業的なソースから入手してもよく、または、たとえば昆虫細胞中で、Biotechnol. Prog. 2000, 16, 146-151に記載されたように製造してもよい。ｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤフラグメントは、例えば上述のようにＥＬＩＳＡアッセイ中で用いてもよく、ヒトｃ−ＭＥＴのアミノ酸２４−９６３、または例えばヒトｃ−ＭＥＴのアミノ酸５２−９５２（例えば、シグナルペプチド及び膜貫通ドメインが欠けたｃ−ＭＥＴ、または例えば商業的に入手可能なｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質）を含む。
【００２１】
ある実施形態において、上記のとおり開示された本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）2フラグメント、またはｓｃＦｖフラグメントであって、上記のとおり開示された本発明の抗体と同じ結合特性を有する。「抗原結合フラグメント」という用語は、本発明で用いられる場合、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント、抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメントまたはｄＡｂフラグメント（例えば、Ward 他 (1989) Nature 341 544-46参照）であって、ＶＨドメインを含むもの、または例えば、配列番号１−配列番号８の本発明の抗体のいずれかに含まれる軽鎖及び重鎖の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を指してもよい。「ｓｃＦｖ」という用語は、本発明で用いられる場合、リンカーで結合した抗体重鎖可変部ドメイン（または領域；ＶＨ）及び抗体軽鎖可変部ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を指し、定常部ドメインを欠き、例えば本発明のｓｃＦｖフラグメントは、例えば、１つの軽鎖可変部ドメイン（ＶＬ）またはその部分及び１つの重鎖可変部ドメイン（ＶＨ）またはその部分から成る結合分子を含んでもよく、ここで、各可変部ドメイン（またはその部分）は同じまたは異なる抗体に由来する。ｓｃＦｖ分子は、好ましくはＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入されたリンカーを含み、それは、例えばペプチド配列であってアミノ酸グリシン及びセリンを含むものを含んでもよい。例えば、ぺプチド配列は、アミノ酸配列(Gly4 Ser)nを含んでもよく、ここでｎは１−６の整数、例えば、ｎは１、２、３、４、５または６であってよく、好ましくはｎ＝４である。ｓｃＦｖ分子及びそれらを得る方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第5,892,019号、Ho 他. 1989. Gene 77:51; Bird 他. 1988 Science 242:423; Pantoliano 他. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic 他. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen 他. 1991. Protein Engineering 4:837に記載されている。「ｄｉ−ｓｃＦｖ」という用語は、本発明の抗原結合フラグメントについて用いられる場合、２つのｓｃＦｖフラグメントであって、互いにリンカーを通じて結合し、例えば、Cancer Research 54, 6176-618,. December 1, 1994, またはChem Commun (Camb). 2007 Feb 21;(7):695-7に開示されているようなものを指す。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、例えばまた、ディアボディ（diabodies）を含んでもよく、ここで「ディアボディ（diabodies）」は、小さな抗体フラグメントであって、２つの抗原結合部位を有し、フラグメントが同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中で軽鎖可変部ドメイン（ＶＬ）に結合する重鎖可変部ドメイン（ＶＨ）を含むものを指す。同じ鎖上の２つのドメインの間でペアを形成するには短すぎるリンカーを用いることによって、該ドメインは、別の鎖の相補性ドメインとペアを形成させられ、２つの抗原結合部位を生成する（例えば、EP0 404097 B1; WO 93/11161, 及びHollinger 他., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照）。例えば、本発明の抗原結合フラグメントは、ペプシンまたはパパインのようなペプチド加水分解酵素による消化によって得てもよい：ペプシンは、ジスルフィド結合の下のタンパク質切断をもたらし、Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントを結果として与え、パパインによるタンパ���質切断は、ジスルフィド結合の上を切断し、２つのＦａｂフラグメントをもたらす。したがって、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、それ自体、軽鎖がジスルフィド結合によってＶH−ＣH1につながったＦａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ’）2は、温和な条件下で還元されて、ヒンジ部におけるジスルフィド結合を切断し、それによってＦ（ａｂ’）2二量体はＦａｂ’単量体に変換される。前述の抗体フラグメントは、完全な抗体のペプシン及びパパインによる消化によって決定されるが、そのようなフラグメントは、新たに化学的にまたは組換えＤＮＡ技術を用いて合成してもよい。
【００２２】
ある実施形態に従うと、本発明の抗体はＩｇＧ型抗体である。「ＩｇＧ型抗体」という用語は、本発明の抗体について用いられる場合、ＩｇＧクラス抗体を指し、ヒトでは４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）を含む（Alberts, B. 他., Chapter 23: The Immune System, In Molecular Biology of the Cell, 3d Edition, Garland Publishing, Inc., New York, N.Y.）。本発明の抗体は従って、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型抗体であってもよく、好ましくは、本発明の抗体はＩｇＧ１型抗体である。本発明のＩｇＧ１型抗体は、例えば、そのＦｃ領域に例えばDuncan 他., Nature 332:563 (1988), Sondermann 他., Nature 406:267 (2000); Wines 他., J. Immunol. 164:5313 (2000); Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao 他., J. Exp. Med. 178:661 (1993)に記載されたような例えば、ＥＵナンバリング（EU index）３３０番目及び３３１番目のアミノ酸の変異、または例えばＥＵナンバリング２３４番目、２３５番目及び２３７番目での、ＦｃγＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａまたはＦｃｇＩＩＩ結合及び／または相補性Ｃ１ｑ結合を低減することによるＦｃが仲介するエフェクタ機能を低減するための置換を更に含んでもよい。
【００２３】
ある実施形態に従うと、本発明の抗体はまたはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含んでもよく、重鎖は配列番号２、配列番号４、または配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
【００２４】
好ましい実施形態に従うと、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１及び配列番号２、または配列番号３及び配列番号４、または配列番号５及び配列番号６、または配列番号７及び配列番号８に従うアミノ酸配列を含む軽鎖及び重鎖を含む。上記の通り開示された本発明の抗体の軽鎖及び重鎖は、例えば、また１以上の、例えば１、２、３またはそれ以上の次の変異をＥＵナンバリング（EU index）に従ってそのそれぞれのアミノ酸配列に含むキネティックバリアント（kinetic variant）を含んでもよい。例えば、上記の通り開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖及び重鎖は、キネティックミュテーション（kinetic mutation）を含んでもよく、それは例えば、本発明の抗体がｃ−ＭＥＴに結合するうえでの解離速度を変化させてもよい。例えば、配列番号１に従う軽鎖配列は、１以上の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはすべての以下の変異を含んでもよい：Ｖ３Ａ、Ｔ１１Ｖ、Ｔ１４Ｓ、Ｒ１８Ｓ、Ｒ４３Ｑ、Ｌ４５Ｐ、Ｅ７４Ｄ、Ｔ８５Ｎ、Ｓ８６Ｔ、Ａ９０Ｔ、Ｔ９２Ｓ、Ｇ１００Ａ。そこではナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングに従って提供される。配列番号２に従う重鎖配列は、ＩＭＧＴナンバリングに従ってQ6E変異を含んでもよく、例えば、配列番号３に従う軽鎖配列は１以上の、例えば、１、２、３、４または（ＩＭＧＴナンバリング中の）全ての変異を含んでもよい：Ｑ１Ｓ、Ｌ２Ｙ、Ｓ７Ｐ、Ｋ４４Ｑ、Ｉ５１Ｖ、Ｖ７１Ｉ、または例えば、配列番号４に従う重鎖配列は、１以上の、例えば、１、２、３、４、５、６または（ＩＭＧＴナンバリング中の）すべての変異、Ｑ５Ｖ、Ａ１９Ｖ、Ｍ１１５Ｉ、Ｍ１１５Ｌ、Ｍ１１５Ｖ、Ｍ１１５Ａ、Ｍ１１５Ｆを含んでもよく、または例えば、配列番号５に従う軽鎖配列は、１以上の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または（ＩＭＧＴナンバリング中の）すべての変異、Ｅ１Ｓ、Ｐ２Ｙ、Ｅ１７Ｑ、Ｔ２０Ｒ、Ｐ２２Ｔ、Ｒ４５Ｋ、Ｌ５１Ｖ、Ｔ８５Ｎ、Ｓ９３Ｒ、Ｆ１０３Ｙを含んでもよく、または例えば、配列番号８に従う重鎖配列は、１以上の、例えば、１、２、３、４、５、６または（ＩＭＧＴナンバリング中の）すべての変異、Ｑ３Ｒ、Ｙ３７Ｎ、Ｎ６６Ｉ、Ｑ１１０Ｓ、Ｄ１１１．１Ｙ、Ｙ１１．２Ｄ、Ｓ１２６Ｙを含んでもよい。上記の通り開示された軽鎖及び重鎖配列は、例えば、両方とも１以上の上記開示された変異を含んでもよく、または例えば重鎖配列のみ、または軽鎖配列のみ、上記開示されたとおり、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれたものが、１以上またはすべての上記の通り開示された変異を含んでもよい。したがって、上記の通り開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１以上（例えば１、２、３または４）の上記の通り開示された変異を含む軽鎖又は重鎖配列を含んでよい。
【００２５】
ある実施例において、本発明の抗体はＩｇＧ型抗体であり、上記の通り開示された配列番号７及び配列番号８（ＣＳ０６）、または配列番号５及び配列番号６（Ｂ１０ｖ５）に従うアミノ酸配列を含む軽鎖及び重鎖を含み、少なくとも、１０-9Ｍ、例えば３×１０-10、４×−１０-10  Ｍ、５×１０-10  Ｍ、６×１０-10Ｍ、７×１０-10Ｍ、８×１０-10Ｍ、９×１０-10Ｍのアフィニティでヒトｃ−ＭＥＴに結合する。ある実施例において、本発明のヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、バイパラトピック二重特異性（bispecific）ヘテロ二量体免疫グロブリン分子であり、配列番号７及び配列番号８を含む第１のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメント並びに配列番号５及び配列番号６を含む第２のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントを含み、そこでは第１のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントは、ＡＧ−ＳＥＥＤと融合してもよく、及び第２のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントはＧＡ−ＳＥＥＤと融合してもよく、または、例えば，そこでは第１のＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントはＧＡ−ＳＥＥＤと融合してもよく、第２のＦａｂまたはｓｃＦｖはＡＧ−ＳＥＥＤと融合してもよい。「ＳＥＥＤ」という用語は、本発明のヘテロ二量体分子についてまたはその文脈で用いられる場合、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣH３ヘテロ二量体を指し、WO2007/110205 A2, Protein Engineering, Design & Selection vol. 23 no. 4 pp. 195−202, 2010において開示されるとおりである。これらのヘテロ二量体分子は、ヒトＩｇＧ  及びＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの誘導体であり、相補的なヒトＳＥＥＤ  ＣH３  ヘテロ二量体を生成し、それはヒトＩｇＡ及びＩｇＧ  ＣH３配列の交互セグメント（alternating segments）で構成される。結果として得られるＳＥＥＤ  ＣH３ドメインのペアは、哺乳類細胞中で「ＳＥＥＤボディ（SEEDbodies）」（Ｓｂ）を形成するため発現する時、好ましくは１：１の比でヘテロ二量体を形成するように結合する。「ＧＡ−ＳＥＥＤ」という用語は、本明細書においては、ＳＥＥＤ分子が、ＩｇＧ配列で始まり、ＩｇＡ配列が続くことを示す一方、「ＡＧ−ＳＥＥＤ」は、ＳＥＥＤ分子がＩｇＡ−由来配列で始まり、ＩｇＧ−由来配列が続くという事実を指す。例えば、バイパラトピック二重特異性（bispecific）ヘテロ二量体免疫グロブリン分子は少なくとも１×１０-9 Ｍ、例えば少なくとも２×１０-11、３×−１０-11  Ｍ、４×１０-11  Ｍ、５×１０-11Ｍ、６×１０-11Ｍ、７×１０-11Ｍ、８×１０-11Ｍ、９×１０-11Ｍのアフィニティでヒトｃ−ＭＥＴに結合する。 
【００２６】
ある実施形態に従うと、上記の通り開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは更に、診断または治療薬剤と結合する。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントについて用いられる場合、診断薬剤という用語は、ｃ−ＭＥＴ、好ましくは上記の通り開示されたヒトｃ−ＭＥＴ及び／またはｃ−ＭＥＴバリアントに特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを検出するために用いることができる実体を指す。例えば、診断薬剤は、放射性アイソトープ、蛍光プローブ、フルオロフォア、化学発光体（chemiluminesceres）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオンまたはビオチン、またはストレプトアビジンであって、ｃ−ＭＥＴに結合した本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを検出できるものであってよい。「結合する（coupled）」という用語は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントについて用いられる場合、染料、放射性同位体、蛍光プローブ、フルオロフォア、化学発光体（chemiluminesceres）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、ビオチン、またはストレプトアビジンが、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに例えば、非共有結合し、またはイオン的にまたは疎水的相互作用により結合（boun）し、または共有結合してもよいという事実を指す。例えば、上記の通り開示された検出可能な標識、例えば、蛍光プローブ、染料、または酵素のようなものの、上記の通り開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントへの結合は、例えば、Methods Cell Biol. 2001;63:185-204; Methods Mol Biol. 2010;588:43-8; Curr Protoc Mol Biol. 2001 May; Chapter 11:Unit 11.1. に開示されているような、当該技術分野で既知の方法に従って行われよい。
【００２７】
本発明に従った検出可能な標識の例として、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに結合してもよいものとしては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）、β−ガラクトシダーゼ、タバコエッチウィルス核−包含−a−エンドペプチダーゼ（Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase（「ＴＥＶプロテアーゼ」)が挙げられる。例えば上記の通り開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと結合してもよいフルオロフォアは、1,8-ANS、4-メチルウンベリフェロン、 7-アミノ-4-メチルクマリン、 7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン、 アクリジン、Alexa Fluor 350（商標）、Alexa Fluor 405（商標）、AMCA、AMCA-X、ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Rho13、ATTO Rho14、ATTO Rho101、Pacific Blue、Alexa Fluor 430（商標）、Alexa Fluor 480（商標）、Alexa Fluor 488（商標）、BODIPY 492/515、Alexa Fluor 532（商標）、Alexa Fluor 546（商標）、Alexa Fluor 555（商標）、Alexa Fluor 594（商標）、BODIPY 505/515、Cy2、cyQUANT GR、FITC、Fluo-3、Fluo-4、GFP (EGFP)、mHoneydew、Oregon Green（商標）488、Oregon Green（商標）514、 EYFP、DsRed、DsRed2、dTomato、Cy3.5、フィコエリスリン(PE)、ローダミンレッド、 mTangerine、mStrawberry、mOrange、mBanana、テトラメチルローダミン(TRITC)、 R-フィコエリスリン、ROX、DyLight 594、Calcium Crimson、Alexa Fluor 594（商標）、 Alexa Fluor 610（商標）、Texas Red、mCherry、mKate、Alexa Fluor 660（商標）、 Alexa Fluor 680（商標）アロフィコシアニン、DRAQ-5、カルボキシナフトフルオレセイン、C7、DyLight 750、Cellvue NIR780、DM-NERF、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、FAM、ヒドロキシクマリン、IRDye(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、 リサミンローダミンＢ、Marina Blue、 メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、PyMPO、5-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、 6- カルボキシローダミン、6-カルボキシテトラメチルアミノ、 Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、ダンシルクロリド、HEX、6-JOE、NBD (7-ニトロベンゾ-2-オキサ-l,3-ジアゾール)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット（cresyl fast violet）、クレシルブルーバイオレット（cresyl blue violet）、 ブリリアントクレシルブルー、 パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、レアアース金属クリプテート、ユウロピウムトリスビピリジンジアミン、ユウロピウムクリプテートまたはキレート、ジアミン、ジシアニン、またはラホヤブルー染料（La Jolla blue dye）のうちの１つであってよい。
【００２８】
例えば、上記の通り開示された本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに結合してもよいフルオロフォアはまた、量子ドットを含んでもよい。量子ドットという用語は、本発明で用いられる場合、半導体材料の単一球形ナノ結晶（single spherical nanocrystal of semiconductor material）を指し、ナノ結晶の半径は、その半導体材料の励起子ボーア半径のサイズより小さいか、同じである（励起子ボーア半径の値は、半導体特性についての情報を含む以下のようなハンドブックに掲載のデータから計算することができる：the CRC Handbook of Chemistry and Physics, 83rd ed., Lide, David R. (Editor), CRC Press, Boca Raton, Fla. (2002))。量子ドットは当該技術分野で既知であり、以下のような参考文献に記載されている：Weller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 41-53 (1993), Alivisatos, J. Phys. Chem. 100: 13226-13239 (1996), and Alivisatos, Science 271: 933-937 (1996)。量子ドットは、例えば、直径約１ｎｍから約１０００ｎｍ、例えば１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、または５００ｎｍ、好ましくは少なくとも約２ｎｍから約５０ｎｍであり、より好ましくは、ＱＤは少なくとも直径約２ｎｍから約２０ｎｍ（例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｎｍ）である。ＱＤは、その実質的に均一なナノメーターサイズによって特徴づけられ、しばしば約１０％から１５％の多分散またはサイズ範囲を示す。ＱＤは励起すると電磁放射線を放射することが可能であり（すなわち、ＱＤはフォトルミネッセントであり）、１以上の第１半導体材料の「核（core）」を含み、第２半導体材料の「殻（shell）」に囲まれていてもよい。半導体殻によって囲まれたＱＤ核は、「核／殻（core/shell）」ＱＤとして参照される。囲んでいる「殻（shell）」材料は、好ましくは核材料のバンドギャップエネルギーよりも大きいバンドギャップエネルギーを有し、「核」基質の原子間隔に近い原子間隔を有するように選択してよい。核及び／または殻は半導体材料であり得て、ＩＩ−ＶＩ族（ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＵＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ及びこれらに類するもの）及びＩＩＩ−Ｖ族（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ及びこれらに類するもの）及びＩＶ族（Ｇｅ、Ｓｉ及びこれらに類するもの）材料、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ及びその合金または混合物が挙げられるがこれらに限られるものではない。好ましい殻材料としては、ＺｎＳが挙げられる。量子ドットは、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと任意の当該技術分野において既知の方法によって結合してもよく、そのような方法は、Nanotechnology. 2011 Dec 9;22(49):494006; Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 84 (2011) 360−368に開示されている。
【００２９】
ある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、47Ｃａ、14Ｃ、137Ｃｓ、157Ｃｒ、57Ｃｏ、60Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、123Ｉ、125Ｉ、129Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、75Ｓｅ、85Ｓｒ、35Ｓ、201Ｔｈまたは3Ｈのような放射性同位体と結合してもよく、好ましくは、前記放射性同位体は更なる分子、例えば  キレート剤に組み込まれる。例えば本発明のアミノドナーを含む基質と共有結合をする更なる分子として用いてもよい典型的なキレート剤としては、ＤＰＴＡ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン-四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール-O, O'-ビス(2-アミノエチル)-N, N, N', N'-四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＨＥＤＴＡ（N-(2-ヒドロキシエチル)-エチレンジアミン-N,N',N'-三酢酸）、ＤＴＰＡ（2-[ビス[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]-エチル]アミノ]酢酸）またはＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロ-ドデカン-1,4,7,10-四酢酸）がある。
【００３０】
ある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは治療薬剤と結合してもよい。本発明において「治療薬剤」という用語は、例えば本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントについて用いられる場合、治療目的に有用な任意の化合物を指す。例えば、本発明の治療薬剤又は化合物は例えばがんのような悪性腫瘍の治療のために患者に投与される任意の化合物であってよい。がんの例としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、切除不能中皮腫、乳がん、胃部または食道胃接合部（ＧＥＪ）の、胃部腺がん、胸腺腫、卵巣がん、腺様嚢胞がん、転移性腺様嚢胞がん、膀胱がん、腎臓明細胞がん、頭部／頸部扁平上皮がん、肺扁平上皮がん、悪性黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）または三種陰性乳がん、リンパ増殖性疾患、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ−陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄細胞白血病配列１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）または頭頚部扁平上皮がん（squamous head and neck cancer）（ＳＨＮＣ）が挙げられるがこれらに限られるものではない。
【００３１】
治療薬剤としては、親水性及び疎水性化合物が挙げられるがこれらに限られるものではない。したがって、治療薬剤は、例えば、薬のような分子、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、アプタマー及び小分子を含んでもよい。タンパク質治療薬剤としては、例えば、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体及びその他の細胞性または血中タンパク質及びフラグメント、並びにそれらの誘導体が挙げられ、その異常な発現は１以上の障害を引き起こす。例えば、本発明にしたがった治療薬剤としてはまた、ある特定の実施形態において、化学療法剤、細胞増殖抑制または細胞傷害剤が挙げられる。例えば、細胞傷害剤として本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに結合してもよいものとしては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗生物質、有糸分裂阻害剤、ホルモンまたはホルモン拮抗剤の中の１つがあげられる。アルキル化剤としては、例えば、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、エストラムスチンホスファート、イホスファミド、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（フェニルアラニンマスタード）、プロカルバジン、チオテパ、ウラシルマスタードを挙げてよく、代謝拮抗薬としては例えば、クラドリビン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ、５−フルオロデオキシウリジン）、フルダラビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、メトトレキサート（アメトプテリン）、６−チオグアニン、ペントスタチン、ピボブロマン、テガフール、トリメトレキサート、グルクロネートを挙げてよく、抗生物質としては例えば、アクラルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プリカマイシン（ミトラマイシン）を挙げてよく、または有糸分裂阻害剤としては例えばエトポシド（ＶＰ−１６、べプシド）、テニポシド（ＶＭ−２６、Ｖｕｍｏｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンを挙げてよく、ホルモンまたはホルモン拮抗薬としては例えば、ブセレリン、結合型ウマエストロゲン（プレマリン）、コルチゾン、クロロトリアニセン（Ｔａｃｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、エチニルエストラジオール（Ｅｓｔｉｎｙｌ）、フルオキシメステロン（Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ）、フルタミド、ゴセレリンアセテート（Ｚｏｌａｄｅｘ）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（Ｄｅｌａｌｕｔｉｎ）、リュープロリド、メドロキシプロゲステロンアセテート（Ｐｒｏｖｅｒａ）、メゲストロールアセテート（Ｍｅｇａｃｅ）、プレドニゾン、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、テストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）、テストステロンを用いられるものとして挙げてよい。細胞増殖抑制または抗悪性腫瘍化合物として上記の通り開示されたものは当該技術分野において既知であり、例えばD. S. Fischer & T. M. Knobf (1989), The cancer chemotherapy handbook (3rd ed.). Chicago: Year Book Medical and Association of Community Cancer Centers (Spring, 1992), Compendia-based drug bulletin, Rockville, MDに認められる。上記の通り開示された診断または治療薬剤、例えば、上記の通り開示された検出可能な標識、または上記の通り開示された治療薬剤は、例えば、少なくとも１つの本発明の抗体の軽鎖と、または少なくとも１つの本発明の抗体の重鎖と結合してもよい。例えば、上記の通り開示された診断または治療薬剤は本発明の抗体の１つの軽鎖または各軽鎖、または例えば本発明の抗体、抗原結合フラグメントの１つの重鎖または各重鎖に結合してもよい。
【００３２】
ある態様において、診断または治療薬剤は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント中のシステインまたはヒスチジン残基の選択的化学修飾によって共有結合してもよい。例えば、本発明の抗体のヒンジ部ジスルフィドは、標的性標識に用いられる遊離スルフヒドリルをつくるため選択的に還元することができる。例えば、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）による部位特異的還元は、J. Biolg. Chemistry Vol. 275, No. 39, Issue of September 29, pp. 30445−30450, 2000に記載のとおり行ってもよい。例えば、ＭＥＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、５ｍＭ  ＤＴＰＡに、濃度５０ｍＭで溶解し、続いて、本発明の抗体濃度に対して１０倍過剰の溶液（例えば、３００μＭ）に添加してもよい。前記還元は、続いて室温で、例えば６０分進めてもよい。還元に続いて、本発明の抗体溶液は、０．１Ｍ  ＴＭＡＰ、ｐＨ８．２、２５μＭ  ＤＴＰＡ中、２分、１５０×ｇであらかじめ平衡にしておいてもよいBio-Spin 30カラムを通してもよい。上記の通り開示された治療または診断薬剤との結合は、続いて例えば０．１Ｍテトラメチルアンモニウムホスファート、ｐＨ８．５中、ジエチレントリアミン五酢酸抜きで、室温で約２０分間、メルカプトエチルアミンを用いて還元反応中に行ってもよい。本発明の抗体は例えば、上記の通り開示された治療または診断薬剤に対して１０倍過剰で存在してもよく、例えば本発明の抗体は約２００μＭの濃度で存在してもよい。未反応試薬は、例えば、０．１ＭアンモニウムアセタートとｐＨ６．５にあらかじめ平衡にしておき、２分間、１５０ｘｇでＢｉｏ−Ｓｐｉｎ３０カラムを用いて遠心分離して取り除いてもよく、そこで遠心分離は全ての小分子量材料が取り除かれるまで繰り返してよい。あるいは、Methods Mol Biol. 2013;1045:189-203に記載されたように、部位特異的結合を、チオール−反応性リンカーを用いて、上記の通り開示された診断または治療薬剤を上記の通り開示された本発明の抗体及び／または抗原結合フラグメントと結合するために用いてもよい。ある態様において、上記の通り開示された診断または治療薬剤は、例えば本発明の抗体または抗原結合フラグメントと酵素仲介生体共益反応を用いて結合してもよい。例えば、ソルターゼＡ（srtA）またはトランスグルタミナーゼ(TGase)-仲介結合生体共益反応を、診断または治療薬剤を本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと結合させるため用いてもよい(例えばBiomolecules 2013, 3, 870-888; WO2012059882 A1, WO2014145441 A1参照)。ＳＥＥＤボディ（SEEDbodies）はまた、例えば、上記の通り開示された技術を用いて類似の方法で改変されてもよい。
【００３３】
ある実施形態に従うと、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子は第１及び／または第２ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントを含み、それは上記開示されたように特異的にヒトｃ−ＭＥＴに結合し、抗体ヒンジ部、抗体ＣH２ドメイン及び抗体ＣH３ドメインは、ハイブリッドタンパク質−タンパク質相互作用界面ドメインを含み、そこでは各前記相互作用界面ドメインが第１メンバーのＣＨ３ドメインのアミノ酸セグメント及び前記第２メンバーのＣＨ３ドメインのアミノ酸セグメントによって形成され、そこでは第１の鎖の前記タンパク質−タンパク質界面ドメインが第２の鎖のタンパク質−タンパク質界面と免疫グロブリンスーパーファミリーの同じメンバーの対応するアミノ酸セグメントのホモ二量化によって前記相互作用ドメイン内で相互作用し、ここで第１組換え免疫グロブリン鎖またはメンバーがポリペプチド配列（「ＡＧ−ＳＥＥＤ」）：
2020500835.tif 000004
を含み、かつ、第２組換え免疫グロブリン鎖またはメンバーがポリペプチド配列（「ＧＡ−ＳＥＥＤ」）：
2020500835.tif 000005
を含み、ここで、第１及び／又は第２ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列のうち少なくとも２つを含む。
【００３４】
例えば、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、１つのＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントであって、配列番号１及び配列番号２、または例えば配列番号３及び配列番号４、または例えば配列番号５及び配列番号６、または例えば配列番号７及び配列番号８を含むものを上記開示されたように含んでもよい。ヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、上記開示されたように例えば２つのＦａｂ、または２つのｓｃＦｖ、または１つのＦａｂ及び１つのｓｃＦｖを含んでもよく、それぞれが配列番号１及び配列番号２、または例えば配列番号３及び配列番号４、または例えば、配列番号５及び配列番号６、または例えば、配列番号７及び配列番号８を含んでもよい。例えば、第１Ｆａｂは配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよく、かつ第２のＦａｂは、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列を含んでもよく、または例えば、第１のＦａｂは配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよく、かつ第２のＦａｂは配列番号１及び配列番号２、または例えば、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列を含んでもよく、例えば、第１のＦａｂは、配列番号７及び配列番号８のアミノ酸配列を含んでもよく、かつ第２のＦａｂは、例えば配列番号１及び配列番号２、または配列番号３及び配列番号４、または例えば、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよく、またはある実施例において第１のＦａｂは、配列番号１及び配列番号２、または配列番号３及び配列番号４、または例えば、配列番号５及び配列番号６の軽鎖及び重鎖配列を含んでもよく、かつ第２のＦａｂは配列番号７及び配列番号８の重鎖及び軽鎖配列を含んでもよい。ある実施例において、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、上記開示された発明に従うと、１つのＦａｂまたはｓｃＦｖのみを含み、例えば、Ｆａｂ−ＧＡ−ＳＥＥＤ及び、ＦａｂまたはｓｃＦｖを欠くＡＧ−ＳＥＥＤ、または例えば、ｓｃＦｖ−ＧＡ−ＳＥＥＤ及びＦａｂまたはｓｃＦｖを欠くＡＧ−ＳＥＥＤ、または例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖを欠くＧＡ−ＳＥＥＤ及びＦａｂ−ＡＧ−ＳＥＥＤ、または例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖを欠くＧＡ−ＳＥＥＤ及びｓｃＦｖ−ＡＧ−ＳＥＥＤを含んでよく、ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントは、以下の軽鎖及び重鎖のペアを含む：配列番号１及び配列番号２、または例えば、配列番号３及び配列番号４、または例えば、配列番号５及び配列番号６、または例えば、配列番号７及び配列番号８であって、これらは更に上記開示されたように変異を含んでもよい。ある実施形態において、上記の通り開示された本発明のその抗原結合フラグメントは、例えば更に、ＧＡ−ＳＥＥＤまたはＡＧ−ＳＥＥＤと融合し、ＳＥＥＤボディ（SEEDbody）をヘテロ二量化によって形成してもよく、それは例えば、上記の通り開示された２つの本発明の抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明のＦａｂ、またはｓｃＦｖは、共有結合でＧＡ−ＳＥＥＤに融合してもよく、または、本明細書において開示される通り、ペプチド結合によりペプチドリンカーを介してＡＧ−ＳＥＥＤに融合してもよく、ここでＦａｂまたはｓｃＦｖは、上記開示された通り本発明の軽鎖及び重鎖配列を含み、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下のう���の１つの軽鎖及び重鎖の組み合わせを含んでもよい：配列番号１、配列番号２；配列番号３、配列番号４；配列番号５、配列番号６；または配列番号７、配列番号８。本発明のＳＥＥＤボディ（SEEDbody）は、例えば抗−ｃＭＥＴ  Ｂ１０（配列番号１及び２に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＧＡ−ＳＥＥＤ及び抗−ｃＭＥＴクローンＦ０６（配列番号３及び４に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＡＧ−ＳＥＥＤを含んでもよく、または例えば抗−ｃＭＥＴクローンＢ１０ｖ５（配列番号５及び６に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＧＡ−ＳＥＥＤ、及び抗−ｃＭＥＴクローンＣＳ０６（配列番号７及び８に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＡＧ−ＳＥＥＤを含んでもよく、または例えば抗−ｃＭＥＴ  Ｂ１０（配列番号１及び２に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＡＧ−ＳＥＥＤ及び抗−ｃＭＥＴクローンＦ０６（配列番号３及び４に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＧＡ−ＳＥＥＤを含んでもよく、または例えば、抗−ｃＭＥＴクローンＢ１０ｖ５（配列番号５及び６に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＡＧ−ＳＥＥＤ及び抗−ｃＭＥＴクローンＣＳ０６（配列番号７及び８に従うアミノ酸配列を含む）に融合したＧＡ−ＳＥＥＤを含んでもよく、ここでＳＥＥＤボディ（SEEDbodies）の軽鎖及び重鎖は、上記開示されたように診断または治療薬剤に結合してもよい。例えば、本発明のＳＥＥＤボディ（SEEDbody）は、１、２、３または４つの軽鎖が上記の通り開示された治療または診断薬剤と結合（coupled）、または結合（attached）したもの、及び／または、１、２、３または４つの重鎖が上記の通り開示された治療または診断薬剤と結合（coupled）、または結合（attached）したものを含んでもよい。上記の通り開示されたＳＥＥＤボディ（SEEDbodies）は、例えば、ある実施形態に従うと、上記の通り開示されたキネティックバリアントであって、それぞれのアミノ酸配列中に１以上の、例えば１、２、３またはそれ以上の上記開示された変異を含むものを包含してもよい。
【００３５】
ある実施形態において、上記の通り開示された本発明の抗体、または上記の通り開示されたヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、細胞毒と結合する。例えば、上記の通り開示された本発明の抗体、またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子と結合した細胞毒は、例えばまた「結合薬剤（ペイロード）」として参照されてもよい。本発明に従って用いてもよい細胞毒は、例えば、２つの主なクラスにグルーピングすることが可能であり、第１のクラスとしては微小管会合を阻害する細胞毒が挙げられ、第２のクラスの細胞毒はＤＮＡ構造を標的とする。典型的には、細胞毒は、本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子と上記開示されたようにリンカーを介して結合する。「リンカー」または「リンカーペプチド」という用語は、合成または人工アミノ酸配列であって、２つの分子を連結または結合するもの、例えば、２つのポリペプチド配列であって、２つのポリペプチド領域、または例えばタンパク質と細胞増殖抑制薬または細胞毒を結合するものを指す。「合成」または「人工」という用語は、本発明で用いられる場合、アミノ酸配列であって、天然起源ではないものを指す。例えば、上記開示された通り本発明のヘテロ二量体免疫グロブリン分子または本発明の抗体に共有結合してもよいリンカーは、開裂可能または開裂不可能である。「開裂可能」という用語は、本発明において用いられる場合、プロテアーゼ、酸によって、または（例えばグルタチオンに媒介されるまたはグルタチオンに敏感な（glutathion sensitive））ジスルフィド体の還元によって開裂されてよいリンカーを指す。例えば、開裂可能なリンカーは、バリン−シトルリン・リンカー、ヒドラゾン・リンカー、またはジルスルフィド・リンカーを含んでよい。開裂不可能なリンカーは、例えば、本発明のアミノドナー含有基質に共有結合してもよく、ＭＭＡＦへのマレイミドカプロイル・リンカー（ｍｃ−ＭＭＡＦ）、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＭＣＣ）、またはメルカプト−アセトアミドカプロイル・リンカーを含む。例えば、本発明のヘテロ二量体二重特異性（bispecific）免疫グロブリン分子に共有結合するリンカーはまた、WO2010/138719に記載された、または例えばWO 2014/093379に記載されたリンカーを含んでもよい。したがって、本発明によるリンカーに、例えば共有結合してもよい細胞毒としては、ドキソルビシン、カリケアマイシン、アウリスタチン、メイタンシン、デュオカルマイシン（ｄｕｏａｒｍｙｃｉｎ）およびそれらの類似体、α−アマニチン（ａｍａｉｔｉｎ）、ツブリシン及びそれらの類似体を含む。細胞毒をリンカーに共有結合させる方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Mol. Pharmaceutics 2015,12, 1813-1835で開示された方法に従って行うことができる。細胞毒は、例えば、Ｆａｂ−抗−ヒトＦｃフラグメントであって開裂不可能なリンカーを介して細胞毒と結合したものを用いて、本発明の抗体であってヒトＩｇＧ部分を含むものと非共有結合してもよい。例えば、そのようなＦａｂ−抗−ヒトＦｃ−細胞毒結合体の市販の製剤を用いてもよく、それは細胞毒α−アマチニン(例えば、Moradec社によって製造されたFab-抗-ヒトFc-NC-AAMT)を含む。そのような抗体���物複合体の使用、評価の原則は、例えば、J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2016 May 24の記載に従って行われてもよい。
【００３６】
ある実施形態に従うと、上記の通り開示されたヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、アフコシル化（afucosylated）されている。「アフコシル化（afucosylated）」という用語は、本発明に従ってヘテロ二量体免疫グロブリン分子について用いられる場合、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子がフコース糖を欠く、または例えば、わずかな量のフコースしかそのＮ−グリカン構造に有さないこと、例えば５％、４％、３％、２％未満または１％未満のフコシル化されたＮ-グリカンしか上記の通り開示された本発明のヘテロ二量体免疫グロブリン分子の任意の製剤において有さないことを指す。ある態様において、上記の通り開示された本発明の抗体は、アフコシル化されてよい。典型的には、上記の通り開示された本発明の抗体のヒトＩｇＧ１のＡｓｎ297に結合したＮ-グリカンは、そのＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を著しく強化し、それによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改善する。アフコシル化された、上記の通り開示され本発明に従ったヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、例えば、Glycobiology. 2012;22:897-911に記載のとおり、ＧＤＰ−フコーストランスポーターSLC35C1を欠く、例えば、CHO-gmt5細胞のような細胞株をその生成のために用いて入手してよい。あるいは、GDP-6-デオキシ-D-リキソ-ヘキスロースレダクターゼ（Glycobiology. 2010 Dec;20(12):1607-18に記載）の同時発現を、上記の通り開示されたアフコシル化されたヘテロ二量体免疫グロブリン分子または本発明の抗体及び／またはその抗原結合フラグメントを製造するために用いてもよい。
【００３７】
ある態様において、本発明は、上記の通り開示された本発明の抗体であって配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号8に従うアミノ酸配列、または上記の通り開示された任意のそれらのキネティックバリアント（kinetic variant）を含むものをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。「単離された」という用語は、本発明に従ったポリヌクレオチドについて用いられる場合、例えば細胞及びその他の成分から分離されたポリヌクレオチドを指し、その中でポリヌクレオチドは通常は本来結合していて、例えば、単離されたポリヌクレオチドは、質量に基づいて、少なくとも純度８０％、９０％、９５％、すなわち混入成分を欠いているものである。例えば、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子であって、それが由来する微生物の天然起源のゲノムに直前まで（５’及び３’方向に）隣接していた配列から分離されたものを指してもよい。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」は、ベクターに挿入されたＤＮＡ分子であって、プラスミド、発現プラスミド、またはウィルスベクターのようなもの、または、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたものを含んでもよい。したがって、本発明はまた、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある態様において、本発明はまた、上記の通り開示された本発明の抗体またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子の製造における前記ポリヌクレオチドの使用に関係する。ある態様において、本発明はまた、上記の通り開示された本発明の抗体またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子の、異種細胞株における発現による製造に関係する。例えば、上記の通り開示された本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子の発現のために用いられてよい発現プラスミドは、例えば、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐ４Ｘ３、ｐ４Ｘ４、ｐ４Ｘ５、ｐ４Ｘ６、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡＣＹＣ１７７、ＰＲＳ４２０を含んでもよく、またはウィルス性ベクターシステムが用いられる場合、例えばｐＢＡＢＥｐｕｒｏ、ｐＷＰＸＬ、ｐＸＰ−由来ベクターは、例えばｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐ４Ｘ３、ｐ４Ｘ４、ｐ４Ｘ５、ｐ４Ｘ６、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡＣＹＣ１７７、ＰＲＳ４２０を含んでもよく、またはウィルス性ベクターシステムが用いられる場合、例えばｐＢＡＢＥｐｕｒｏ、ｐＷＰＸＬ、ｐＸＰ−由来ベクターを含んでもよい。
【００３８】
ある態様において、本発明は、少なくとも１つのホスト細胞であって、少なくとも１つの上記の通り開示された本発明のポリヌクレオチドを含むもの、例えば、ポリヌクレオチド、またはベクターまたは発現ベクターであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のうちの少なくとも１つをコードするもの、及び上記の通り開示された本発明の抗体またはヘテロ二量体免疫グロブリン分子の製造におけるその使用を提供する。例えば、本発明に従って用いられるホスト細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞であってよい。例えば本発明のホスト細胞は、Sf9、Sf21、S2、Hi5、またはBTI-TN-5B1-4細胞から選択される昆虫細胞であってよく、または例えば本発明のホスト細胞は、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）から選択される酵母細胞であってよく、または例えば本発明のホスト細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＮＳ０、ｐｅｒ．Ｃ６、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ−１、Ｃｏｓ−７、ＰＣ−１２、３Ｔ３、Ｖｅｒｏ、ｖｅｒｏ−７６、ＰＣ３、Ｕ８７、ＳＡＯＳ−２、ＬＮＣＡＰ、ＤＵ１４５、Ａ４３１、Ａ５４９、Ｂ３５、Ｈ１２９９、ＨＵＶＥＣ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｃａｃｏ−２、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＢＨＫ、ＡＧＥ１．ＨＮ、Ｎａｍａｌｗａ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、ＨｅｐＧ２、Ｌ−９２９、ＲＡＢ−９、ＳＩＲＣ、ＲＫ１３、１１Ｂ１１、１Ｄ３、２．４Ｇ２、Ａ−１０、Ｂ−３５、Ｃ−６、Ｆ４／８０、ＩＥＣ−１８、Ｌ２、ＭＨ１Ｃ１、ＮＲＫ、ＮＲＫ−４９Ｆ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＲＭＣ、ＣＶ−１、ＢＴ、ＭＤＢＫ、ＣＰＡＥ、ＭＤＣＫ．１、ＭＤＣＫ．２、及びＤ−１７から選択される哺乳類細胞であってよい。
【００３９】
ある実施形態に従うと、上記の通り開示されたヘテロ二量体免疫グロブリン分子、または上記の通り開示された本発明の抗体は、がんの治療のための薬の製造に用いられてもよい。例えば、上記開示されたように細胞毒に結合した本発明の抗体、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子は、がんに罹りそれを必要とする患者に投与するための医薬組成物に製剤化されてよい。本発明に従った医薬組成物は、例えば、上記開示されたように細胞毒に結合した本発明のヘテロ二量体免疫グロブリン分子、また上記開示された抗体薬物複合体（例えば、上記の通り開示された細胞毒に結合した本発明の抗体）を約１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌから約７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１２ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌまで、または例えば約１０ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌまで、約７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１２ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌまで、または例えば２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌから約７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１２ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で含んでよい。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、更に１以上の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。様々な剤形のための薬学的許容される賦形剤は、当該技術分野において既知であり、媒体、希釈剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、滑剤、着色剤、顔料、矯味剤、甘味料、香料、可塑剤及び任意の許容される補助剤であって、例えば吸収促進剤、浸透促進剤、界面活性剤、補助界面活性剤、及び特別なオイルが挙げられる。適した賦形剤は、例えば、剤形、意図する投与方法、意図する放出速度及び製造信頼性に基づいて選択してよい。一般的なタイプの賦形剤の例としては、様々なポリマー、ワックス、カルシウムホスファート、糖及びそれらに類するものが挙げられる。
【００４１】
ある態様において、本発明はまた、対象に治療効果量の上記の通り開示された医薬組成物を投与することを含む、治療方法を提供する。例えば、本発明の治療方法は、がんに罹患し、それを必要とする人に約０．００１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの本発明の医薬組成物を、または約０．００５ｍｇ／ｋｇから約４５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約３５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇから約２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３２．５ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４２．５ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇを投与することを含んでよい。本明細書で用いられる場合、「ｍｇ／ｋｇ」という用語は、本発明の医薬組成物（ｍｇ）／体重（ｋｇ）を指す。例えば、薬学的に効果的な量の本発明の医薬組成物を、がんに罹患した個体に投与してよい。薬学的に効果的な量は、個体、治療するがんのタイプ、個体の体重及び年齢、疾患のレベルまたは投与経路、例えば静脈内（ｉ．ｖ）又は皮下、に依存する。ある態様において、本発明はまた、がんに罹患した患者を上記のとおり開示された本発明の抗体、または上記の通り開示された本発明のヘテロ二量体免疫グロブリン分子で治療する方法を提供する。例えば、前記方法は、それを必要とする患者に（例えば、がん患者に）、本発明の抗体を上記開示された濃度及び服用量含む医薬組成物を投与することを含んでよい。例えば、ある態様において、本発明の医薬組成物は、高いレベルのｃ−ＭＥＴ、または本明細書で開示される任意のｃ−ＭＥＴのバリアントを発現する腫瘍を患う患者に用いてよい。本発明の治療方法で用いられる場合、「高いレベル」という用語は、ｃ−ＭＥＴ発現レベルがコントロール組織（例えば、健康な個体より得られた組織、または、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロット法、免疫組織化学によってｃ−ＭＥＴを発現しないと評価された細胞株）よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍高いことを指す。例えば、患者の腫瘍中のｃ−Ｍｅｔ発現は、腫瘍組織上で評価してよく、それらは針吸引で得られ、または免疫組織化学的方法による外科的生検であってよく、または患者の血液中の血中腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）をｃ−ＭＥＴ増幅を評価するために用いてもよく、Mol Cancer Res. 2016 Jun;14(6):539-47に記載のとおりそれは高いｃ−ＭＥＴ発現と相関する。腫瘍組織サンプル、または血液サンプルをがんに罹患した個体から得ることは、本発明の一部を形成するものではない。
【００４２】
ある態様において、上記の通り開示された本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、またはＳＥＥＤボディ（SEEDbodies）は、例えば、サンプル中のｃ−ＭＥＴ発現を検出するため診断目的に用いられてもよい。本発明で用いられる場合、「サンプル」という用語は、腫瘍組織、または健康なドナー、例えば、がんに罹患していないヒト対象のコントロール組織から得られた、または由来する組織サンプルを指す。サンプルはまた、ヒト以外の霊長類に由来してもよく、または哺乳類起源、例えばマウスまたはラット起源であってもよい。サンプルという用語はまた、例えば針生検の方法によって組織サンプルから得られた単一または個別の細胞を指してもよく、ここでヒト対象からサンプルを得ることは本発明の一部を形成するものではない。サンプルは、固定されていない生細胞を含んでもよく、または例えばホルマリン固定され、パラフィン包摂された組織または細胞のような固定された組織または細胞を含んでもよい。本発明に従うとサンプルという用語は、例えば、またがん細胞株、例えばＫＰ−４、Ｕ８７ＭＧ、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＭＫＮ−４５、またはＥＢＣ−１及びこれらに類するもの、例えば、ＡＴＣＣから得ることができるものからの細胞を指してもよい。ｃ−ＭＥＴ発現をサンプル中で検出することは、サンプルを、上記の通り開示された本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、またはＳＥＥＤボディ（SEEDbodies）と、ｃ−ＭＥＴに特定的に結合することを許容する条件下で接触させ、続いて、上記の通り開示された本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、またはＳＥＥＤボディ（SEEDbody）を、好ましくは、上記開示されたように結合した検出可能な標識を検出する手段によって検出することを含む。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、さらに発明を例示することを意図するものである。それらは本発明の内容またはスコープをそこに限定することを意図していない。
【００４４】
実施例１：ＨＧＦ競合ＥＬＩＳＡ−本発明の抗体による置換
組換えヒトＨＧＦの、組換えヒトｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤに結合する本発明の抗体との競合を、固相中のＨＧＦを用いるＥＬＩＳＡによって検出した。このため、１．２５ｐｍｏｌのＨＧＦを９６ウェルMaxiSorp（登録商標）プレート上、一晩、４°Ｃで固定化した。プレートをＰＢＳ−Ｔ中、２％ＢＳＡでブロックした後、連続希釈(0.2-200 nM)した抗体とともにあらかじめインキュベートした１．１３ｐｍｏｌのビオチン化ｃ-ＭＥＴ  ＥＣＤをプレートに添加した。ＨＲＰ−標識されたストレプトアビジンを用い、続いて１工程のＵｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ基質溶液及び硫酸の添加をすることによって結合が明らかになった。結果として得られたＨＧＦに結合したｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤであって、抗−ｃ−ＭＥＴに向けられた抗体の添加抜きのものについての吸収は、１００％ＨＧＦ結合であると規定された。抗−ＨＥＬ  ＳＥＥＤを、無関係なイソタイプコントロール抗体として用いた。データを、抗体濃度の対数に対する％ＨＧＦ結合としてプロットし、GraphPad Prism 5(登録商標)を用いて、可変傾斜（variable slope）（４ＰＬ）によるシグモイド型用量−反応曲線にフィットさせた。
【００４５】
実施例２：受容体リン酸化アッセイ−ｃ−ＭＥＴシグナル伝達の阻害
本発明の抗体及び本発明のヘテロ二量体免疫グロブリン分子の結合の、ｃ−ＭＥＴ仲介シグナル伝達のリン酸化レベルへの効果を評価するため、ｃ−ＭＥＴをｃ−ＭＥＴ補足電気化学発光法（ＥＣＬ）ＥＬＩＳＡ（ＭＳＤアッセイ）によって決定した。全ての試薬はMeso Scale Discoveryから入手し、製造者の指示書に従って調製した。簡潔に述べると、処置の前日、細胞を９６−ウェル組織培養プレート（Sigma-Aldrich）に蒔き、血清を飢餓にして、連続希釈抗体（０−１６７ｎＭ  飢餓媒体中）で１時間、３７℃、５％  ＣＯ2で処置した。１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で５分、３７°Ｃで刺激した後、細胞をプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Calbiochem）を補った氷温の溶解緩衝液に溶解した。電極を含む高結合９６−ウェルプレート（Meso Scale Discovery)をキャプチャー抗トータルｃ−ＭＥＴ抗体（capture anti-total c-MET (Cell Signaling Technologies) antibody(Abcam)）でコートし、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を補ったＰＢＳ中、３％のＢｌｏｃｋＡでブロッキングした。細胞溶解液とともにインキュベートした後、抗ホスホｃ−ＭＥＴ（anti-phospho c-MET (Cell Signaling Technologies)）、抗ホスホ−チロシン抗体（anti-phospho-tyrosine antibody(R&D Systems)）とともに、供給者が推薦する検出物質によって検出を行った。SECTOR(登録商標) Imager 6000 (Meso Scale Discovery)で測定を行った。ホスホ−ＡＫＴ（phospho-AKT）レベルの定量化のため、ホスホ（Ｓｅｒ４７３）／全ＡＫＴアッセイ全細胞溶解液キット（Phospho(Ser473)/Total AKT Assay Whole Cell Lyate Kit (Meso Scale Discovery)）を用いた。用量応答曲線を抗体濃度の対数に対するＥＣＬシグナルとしてプロットした。ＩＣ50値を３ＰＬフィッティングモデルによってGraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)を用いて計算した。例えば、図５のデータを参照のこと。
【００４６】
実施例３：バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いたｃ−ＭＥＴバインダーのエピトープ・ビニング
エピトープ・ビニング実験を、二重特異性抗体（bispecific antibodies）として用いられたｃ−ＭＥＴ抗体とともに行い、文献からの参照抗体と比較した（MetMAb, Emibetuzumab, h224G11）。バイオレイヤー干渉法を用いたバイオセンサー実験を抗−ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーチップ（Forte Bio）を備えたOctet Red プラットフォーム（Forte Bio）上で行った。全てのデータを３０℃でカイネティック緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４，０．１％ＢＳＡ，０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で収集した。ヒトｃ−ＭＥＴ  ＥＣＤ−Ｈｉｓ（ＨＧＦＲ，肝細胞増殖因子受容体細胞外ドメイン）を生成し、インハウス精製した。バイオセンサーチップをＰＢＳ中３０秒間平衡化した。続いて、ＰＢＳ中の二価ＩｇＧを２５ｎＭ及び一価の１−アーム抗体５０ｎＭを、バイオセンサーチップ上に、一次抗体として２００秒間固定化した。チップを４００ｎＭの無関係なコントロール抗体（抗鶏卵リゾチーム、抗−ＨＥＬ  ＳＥＥＤ、ＰＢＳ中希釈）でクエンチ（quench）し、引き続いて二次抗体がバイオセンサーチップに結合することを最小化した。カイネティック緩衝液中、６０秒間、ベースラインを獲得した後に、ヒトｃ−ＭＥＴ−ＥＣＤを固定化された一次抗体に６００秒間さらした。その後、二次抗−ｃ−ＭＥＴ抗体の、固定化された一次抗体に結合したｃ−ＭＥＴ−ＥＣＤに対する相互作用を６００秒間解析した。二次抗体結合の解析は、無関係なイソタイプコントロール（抗−ＨＥＬ  ＳＥＥＤ）と比較してより高い結合度［ｎＭ］によって特徴づけられる同時結合と区別することによって視覚的に解析した。
【００４７】
実施例４：細胞毒性アッセイ
本発明の抗体薬物複合体の細胞毒性を評価するため、細胞毒と本発明の抗体のＦｃ部分が、抗ヒトＦｃ−Ｆａｂ毒素複合体（MORADEC, catalog number AH205-AM）を介して非共有結合した結合体を用いた。
細胞生存率を、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイ(Promega)を用いて定量化し、製造者の指示書に従って行った。簡潔に述べると、細胞を分離し、乳白色の細胞培養用９６ウェルプレートの内側ウェルに播種した。播種細胞数は、１ウェルあたり８，０００から１５，０００生細胞の範囲であり、８０μｌ細胞株特異培地中の細胞株に依存する。細胞は少なくとも3時間、加湿チャンバー中、３７°Ｃ、５％ＣＯ2でＡＤＣ処置（５０から最終的に０．０１ｎＭまでの範囲）の前に、複製して細胞株特定培地中で接着させた。７２時間後、細胞生存率をウェルあたり１００μｌのCellTiter-Glo（登録商標）試薬を添加し、続いてプレートシェーカー上２分間３５０ｒｐｍで混合し、暗所室温で１０分間インキュベートすることによって検出した。Synergy 4 プレートリーダー(chapter 3.9及び3.10)で、ウェルあたり0.5秒の読み取り時間（read time）により発光を測定した（感度：１７０）。培地とCellTiter-Glo（登録商標）試薬のみを加えたウェル中のバックグラウンド発光を差し引いた。データは、非処置細胞生存率のパーセンテージに対する抗体濃度の対数をプロットし、GraphPad Prism 5 (chapter 3.10)を用いて３ＰＬモデルでフィッティングした。２回行った少なくとも３つの独立した実験からのデータを用いて平均ＩＣ50を計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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