(57)【要約】  エネルギー代謝を調節するポリペプチド及びそのエネルギー代謝異常に関連する疾患の治療薬の製造における使用。前記ポリペプチドは、脂肪の吸収を減少させ、肝臓中の脂肪蓄積を減少させ、脂肪代謝を調節することができ、一般的なポリペプチド製品と比較して、経口投与できる利点を有するため、脂肪代謝を調節するヘルスケア製品の有効成分として使用することができる。
2020509768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｍ１−Ｚａ−Ｍ２で表されるエネルギー代謝を調節するポリペプチド。
（式中、Ｍ１、Ｍ２は、それぞれ独立して５、４、３、２又は１以下のアミノ酸残基を有するポリペプチドセグメントであるか、又は存在せず、
Ｚａは、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｘ６−Ｐｒｏ−Ｘ７−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘ８−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏであり、
ここで、Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐであるか、又は存在せず、
Ｘ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒであるか、又は存在せず、
Ｘ３は、Ｔｒｐ、Ｇｌｙであるか、又は存在せず、
Ｘ４は、Ｌｅｕであるか、又は存在せず、
Ｘ５は、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
Ｘ６は、Ａｌａ又はＶａｌであり、
Ｘ７は、Ｔｙｒ又はＳｅｒであり、
Ｘ８は、Ｔｈｒ又はＰｒｏであり、
前記Ｚａは、必要に応じてアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有していてもよく、前記アミノ酸の置換、挿入及び欠失の合計は４以下である。）
【請求項２】
前記Ｚａは、
配列番号１：ＹＬＧＡＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号２：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号４：ＹＬＮＮＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号５：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＴＬＥＰ、
配列番号６：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号７：ＹＬＤＨＷＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号８：ＹＬＤＰＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号９：ＹＬＤＨＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１０：ＹＬＤＱＧＬＧＡＰＡＰＡＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１１：ＹＬＤＳＧＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ
からなる群より選択される１つである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｍ１、Ｍ２は、いずれも存在しない、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｚａは、ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰであり、Ｍ１は、存在せず、且つＭ２は、Ａｒｇであり、或いは、
前記Ｚａは、ＹＬＧＡＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰであり、Ｍ１は、存在せず、且つＭ２は、Ｔｈｒである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項３に記載のポリペプチドの少なくとも６つの連続したアミノ酸を含み、且つアミノ酸残基の合計は１８以下である、エネルギー代謝を調節するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１２：ＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１３：ＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１４：ＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１５：ＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１６：ＰＳＰＤＰＬＥＰ
のいずれか１つを含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１２：ＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１３：ＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１４：ＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１５：ＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１６：ＰＳＰＤＰＬＥＰ
のいずれか１つである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む担体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の担体はトランスフェクションされ、タンパク質を発現可能な条件下で請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生できる宿主細胞。
【請求項１２】
治療有効量の請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項１３】
エネルギー代謝異常に関連する疾患の治療薬の製造における、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項１２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
脂肪代謝異常に関連する疾患の治療薬の製造における、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項１２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
前記疾患は、脂肪吸収の減少、血中脂質の低下、脂肪消耗の増加、又は脂肪蓄積の減少から恩恵を受けることができる疾患である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記疾患は、肥満症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
経口投与が可能である、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項１２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
体重を減らすためのヘルスケア製品の製造における、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１９】
有效量の請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項８に記載の薬学的に許容される塩を含む、体重を減らすためのヘルスケア製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学分野に関し、具体的には、エネルギー代謝を調節するポリペプチド及びそのエネルギー代謝異常、特に脂肪代謝異常に関連する疾患の治療薬の製造における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、世界中で重要で日々深刻化する健康問題となっており、多くの一般的な疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、高血圧、２型糖尿病、血中脂質異常、冠状動脈性心疾患、骨関節炎及び複数種の悪性腫瘍）の発生を誘発する危険因子である。肥満は、運動能力及び生活の質を低下させることでより深刻な問題を引き起こす場合もある。肥満と肥満に起因する疾患の発生は、すべての先進国で増加している。
【０００３】
脂肪肝は、肝細胞内の脂肪が過剰に蓄積することによって引き起こされる病変をいう。脂肪肝を引き起こす原因は、例えば、アルコール依存症、不規則な食事、座りがち等多くある。中国での発症率は日々高くなり、人々の健康にとって大きな脅威になっている。
【０００４】
しかし、現在、肥満及びそれに起因する疾患（非アルコール性脂肪肝を含む）を治療する薬物及び方法には欠陥があるため、肥満及び非アルコール性脂肪肝に対する治療には、より効果的で副作用がより少ない薬物及び方法を開発する必要がある。
【０００５】
オステオカルシンは、骨芽細胞で合成、分泌されるビタミンＫ依存性カルシウム結合タンパク質であって、非コラーゲン酸性糖タンパク質であり、その分子中のビタミンＫ依存性グルタミン酸残基は、オステオカルシンがＣａ２＋に結合するための重要な官能基である［１，２］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、脂肪吸収を低下させ、肝臓脂肪、末梢血中脂質を減少させ、脂肪細胞の体積を小さくする等の機能を有し、効果的に肝細胞に蓄積した脂肪を除去し、血中脂質レベルを低下させ、体内の脂肪組織を縮小させることができ、脂肪性肝炎の治療、高血圧の調節及び他の心血管疾患の治療に効果があるオステオカルシンに由来するエネルギー代謝を調節可能なポリペプチドを予想外に発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある態様によれば、Ｍ１−Ｚａ−Ｍ２で表されるエネルギー代謝を調節するポリペプチドが提供される。
ここで、Ｍ１、Ｍ２は、それぞれ独立して５、４、３、２又は１以下のアミノ酸残基を有するポリペプチドセグメントであるか、又は存在せず、
Ｚａは、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｘ６−Ｐｒｏ−Ｘ７−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘ８−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏであり、
ここで、Ｘ１は、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐであるか、又は存在せず、
Ｘ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒであるか、又は存在せず、
Ｘ３は、Ｔｒｐ、Ｇｌｙであるか、又は存在せず、
Ｘ４は、Ｌｅｕであるか、又は存在せず、
Ｘ５は、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
Ｘ６は、Ａｌａ又はＶａｌであり、
Ｘ７は、Ｔｙｒ又はＳｅｒであり、
Ｘ８は、Ｔｈｒ又はＰｒｏであり、
前記Ｚａは、必要に応じてアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有していてもよく、前記アミノ酸の置換、挿入又は欠失の合計は４以下、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、最も好ましくは１である。
【０００８】
さらに、本発明のいくつかの実施形態において、前記ポリペプチドにおけるＺａは、
配列番号１：ＹＬＧＡＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号２：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号４：ＹＬＮＮＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号５：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＴＬＥＰ、
配列番号６：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号７：ＹＬＤＨＷＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号８：ＹＬＤＰＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号９：ＹＬＤＨＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１０：ＹＬＤＱＧＬＧＡＰＡＰＡＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１１：ＹＬＤＳＧＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ
からなる群より選択される１つである。
さらに、本発明の別の実施形態において、前記ポリペプチドにおけるＭ１、Ｍ２は、いずれも存在しない。或いは、さらなる実施形態において、前記ポリペプチドにおけるＺａはＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰであり、Ｍ１は存在せず、Ｍ２はＡｒｇであり、即ち、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３に示される。他の実施形態において、前記ポリペプチドにおけるＺａはＹＬＧＡＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰであり、Ｍ１は存在せず、Ｍ２はＴｈｒであり、即ち、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１８に示される。
【０００９】
本発明の他の態様によれば、
配列番号１：ＹＬＧＡＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号２：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号３：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、
配列番号４：ＹＬＮＮＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号５：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＴＬＥＰ、
配列番号６：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号７：ＹＬＤＨＷＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号８：ＹＬＤＰＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号９：ＹＬＤＨＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１０：ＹＬＤＱＧＬＧＡＰＡＰＡＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１１：ＹＬＤＳＧＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ
からなる群より選択される少なくとも６つの連続したアミノ酸を含み、そのアミノ酸残基の合計が１８以下、例えば、１７、１６、１５、１４以下である、エネルギー代謝を調節するポリペプチドが提供される。
さらに、前記ポリペプチドは、
配列番号１２：ＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１３：ＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１４：ＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１５：ＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１６：ＰＳＰＤＰＬＥＰ
のいずれか１つを含む。
さらに、
配列番号１２：ＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１３：ＰＹＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１４：ＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１５：ＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、
配列番号１６：ＰＳＰＤＰＬＥＰ
のいずれか１つである。
【００１０】
本発明の他の態様によれば、本発明のポリペプチドの薬学的に許容される塩が提供される。
【００１１】
本発明の他の態様によれば、脂肪吸収を低下させ、血中脂質のレベルを低下させ、非アルコール性脂肪肝を軽減し、体内脂肪組織を縮小させる等の作用を有する本発明のポリペプチド又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチドを含む担体が提供される。
本発明の他の態様によれば、前記担体はトランスフェクションされ、タンパク質を発現可能な条件下で本発明のポリペプチドを産生できる宿主細胞が提供される。
【００１４】
本発明の他の態様によれば、治療有効量の前記本発明のポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物が提供される。
本発明に記載のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物は、エネルギー代謝、特に脂肪代謝を調節する作用を有する。
【００１５】
本発明の他の態様によれば、エネルギー代謝（より好ましくは脂肪代謝）異常に関連する疾患の治療薬の製造における本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物の使用であって、前記疾患は、脂肪吸収の減少、血中脂質の低下、脂肪消耗の増加又は脂肪蓄積の減少から恩恵を受けることができる疾患、例えば、肥満症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高血糖、高コレステロール、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患である使用が提供される。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、脂肪代謝異常に関連する疾患の治療方法であって、前記治療を必要とする被験体に治療有効量の本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物を投与することを含み、前記疾患は、脂肪吸収の減少、血中脂質の低下、脂肪消耗の増加、又は脂肪蓄積の減少から恩恵を受けることができる疾患、例えば、肥満症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高血糖、高コレステロール、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患である方法が提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物は、脂肪代謝異常に関連する疾患の治療薬及び方法に用いられる既知の組成物のいずれかと併用することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物は、脂肪代謝異常に関連する疾患の治療に用いられ、前記疾患は、脂肪吸収の減少、血中脂質の低下、脂肪消耗の増加又は脂肪蓄積の減少から恩恵を受けることができる疾患、例えば、肥満症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患である。
【００１９】
本発明の他の態様によれば、体重を減らすためのヘルスケア製品の製造における、本発明のポリペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００２０】
本発明の他の態様によれば、本発明のポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を含む体重を減らすためのヘルスケア製品が提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物は、通常の投与方法、好ましくは経口により投与することができる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、脂肪の吸収に直接影響を与えることができ、経口投与が可能であるため、従来のポリペプチド投与の不便さが軽減され、ポリペプチドの残基が非常に少なく、コストが大幅に低減され、薬物として非常に顕著な潜在的な利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】高脂肪飼料でＣ５７ＢＬ／６マウスを１２週間飼育して得られた肥満及び非アルコール性脂肪肝モデル（Ｄｉｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ−Ｏｂｅｓｉｔｙ  ＆  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＤＩＯ−ＮＡＦＬＤ）と正常対照との体重比較を示す。ここで、ＮＤは正常飼料、ＨＦＤは高脂肪飼料を示す。
【図２】高脂肪飼料で６週間連続して飼育したＤＩＯ−ＮＡＦＬＤマウスに異なる濃度のＩＳＡＰ１及びＯＣＮ（マウスオステオカルシン）を注射した後、対照群（高脂肪飼料マウスのみ）と比較して得られた、マウスに対するＩＳＡＰ１の注射の影響を示す。図１（Ａ）は、ＮＤ対照群、ＨＦＤ対照群、及び毎日腹腔内注射したＯＣＮ又はＩＳＡＰ１群のマウスの精巣上体脂肪パッドの変化を示す。図１（Ｂ）は、各群の精巣上体脂肪パッドの平均質量を示す。図１（Ｃ）は、各群の精巣上体脂肪パッドの組織切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。図１（Ｄ）は、ダブルブラインド条件下でＨ＆Ｅ染色切片に基づいて計算して得られた脂肪細胞の平均表面積を示す。統計分析：ＨＦＤ対照群との比較。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図３】高脂肪飼料で６週間連続して飼育したＤＩＯ−ＮＡＦＬＤマウスに異なる濃度のＩＳＡＰ１及びＯＣＮを注射した後、対照群（高脂肪飼料マウスのみ）と比較して得られた、マウス肝臓に対するＩＳＡＰ１の腹腔内注射の影響を示す。図３（Ａ）は、各群のマウスの肝臓外観の代表的な写真である。図３（Ｂ）は、各群のマウス肝臓組織切片のＨ＆Ｅ染色を示す。図３（Ｃ）は、各群のマウス肝臓をオイルレッドＯで染色した後、ダブルブラインド条件下で得られた非アルコール性脂肪肝細胞が蓄積した表面積を示す。統計分析：ＨＦＤ対照群との比較。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。各群では、それぞれ６匹のマウスが分析に用いられた。
【図４】高脂肪飼料で６週間連続して飼育したＤＩＯ−ＮＡＦＬＤマウスに異なる濃度のＩＳＡＰ１及びＯＣＮを注射した後、対照群（高脂肪飼料マウスのみ）と比較して得られた、マウス肝臓機能及び血中脂質に対するＩＳＡＰ１の注射の影響を示す。図４（Ａ）は、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の場合を示す。図４（Ｂ）は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の場合を示す。図４（Ｃ）は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の場合を示す。図４（Ｄ）は、血清総コレステロール（ＴＣ）の場合を示す。図４（Ｅ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の場合を示す。図４（Ｆ）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の場合を示す。統計分析：＊：ＨＦＤ対照群との比較。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。＃：ＮＤ対照群との比較。＃：Ｐ＜０．０５、＃＃：Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１。各群では、それぞれ６匹のマウスが分析に用いられた。
【図５】小腸脂肪吸収に対するＩＳＡＰ１及びＯＣＮの胃内投与の影響を示す。ＮＤで飼育した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに滅菌オリーブオイルを胃内投与した後（３０分間）、ＩＳＡＰ１及びＯＣＮを腹腔内注射した３０分間後に、マウスを安楽死させ、解剖して小腸を得、十二指腸に近い空腸を凍結して切片を作製し、オイルレッドＯで染色し、ヘマトキシリンで二重染色（Ａ）した。ダブルブラインド条件下でオイルレッドＯ陽性領域に対してＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量分析を行い、当該面積と小腸絨毛の総面積との比（Ｂ）を計算する。統計分析：生理食塩水＋オリーブオイル群との比較。＊＊＊：ｐ＜０．００１、Ｎ＝３。
【図６】ＩＳＡＰ１及びＩＳＡＰ２のそれぞれとヒトＧＰＲＣ６Ａとの結合及び受容体の内在化を示す。図６（Ａ）は、ヒトＧＰＲＣ６ＡのＨｅｌａ細胞における過剰発現を示す。図６（Ｂ）は、ＩＳＡＰ１、ＯＣＮ及びＯＣＮ−２２、並びにＩＳＡＰ２、ｈＯＣＮ及びｈＯＣＮ−２２とｈｕＧＰＲＣ６Ａ過剰発現Ｈｅｌａ細胞の細胞膜との結合実験を示す。図６（Ｃ）は、ＧＰＲＣ６Ａ過剰発現Ｈｅｌａ細胞におけるＧＰＲＣ６Ａの内在化に対する、Ｃｙ−５標識が付いているＯＣＮ（Ｃｙ５−ＯＣＮ）、Ｃｙ−５標識が付いているＯＣＮ−２２（Ｃｙ５−Ｏｃｎ２２）、Ｃｙ−５標識が付いているＩＳＡＰ２（Ｃｙ５−ＩＳＡＰ２）の影響を示す。
【図７】ＯＣＮ、ＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ２、ＩＳＡＰ３を胃内投与した後の７週間内のマウスに対する影響を示す。図７（Ａ）は、マウスの体重変化を示す。図７（Ｂ）は、マウス糞便中のトリグリセリドの含有量の比較を示す。
【図８】異なる種に由来するＩＳＡＰの配列の比較を示す。
【図９】小腸脂肪吸収に対するＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６の胃内投与の影響を示す。ＮＤで飼育した野生型Ｃ５７／ｂマウス１５匹を３匹／群で５群に分け、そのうちの３群を実験群とし、それぞれＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６を胃内投与し、２群を対照群とし、１週間連続して生理食塩水を毎日胃内投与した後、３つの実験群及び１つの対照群に滅菌オリーブオイルを胃内投与し、１つの対照群に生理食塩水を胃内投与し、２０分間後にマウスを安楽死させ、解剖して小腸を取り出し、十二指腸に近い空腸を凍結して切片を作製し、オイルレッドＯで染色した後、ヘマトキシリンで二重染色した。ダブルブラインド条件下でオイルレッドＯ陽性領域に対してＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量分析を行い、当該面積と小腸絨毛の総面積との比を計算した。統計分析：生理食塩水＋オリーブオイル群との比較。＊＊＊：ｐ＜０．００１、Ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書において、用語「エネルギー代謝を調節するポリペプチド」は、「インスリン分泌関連ポリペプチド（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＩＳＡＰ）」とも呼ばれ、オステオカルシンに由来するか又はオステオカルシンから誘導されるエネルギー代謝を調節できるポリペプチド及びそのバリアントを指す。
【００２５】
本明細書において、用語「保存的アミノ酸置換」とは、元のアミノ酸配列を類似する性質を有する他のアミノ酸残基で置換することを指す。例えば、リジン残基、アルギニン残基及びヒスチジン残基は、塩基性側鎖を有する点で類似する。また、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基は、酸性側鎖を有する点で類似する。さらに、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基及びシステイン残基は、非荷電の極性側鎖を有する点で類似し、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基及びメチオニン残基は、非極性側鎖を有する点で類似する。さらに、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基及びヒスチジン残基は、芳香族側鎖を有する点で類似する。従って、性質が類似する前記アミノ酸によるアミノ酸置換は、いかなる性質の変化も引き起こすことがないことは、当業者にとって明らかなものである。
【００２６】
本明細書で用いられるアミノ酸の略称及び名称を下表に示す。
2020509768.tif 000003
【００２７】
本明細書において、用語「脂肪代謝異常に関連する疾患」とは、遺伝及び／又は環境に起因する脂肪代謝障害を特徴とする疾患又はその合併症をいい、例えば、肥満症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書において、用語「非アルコール性脂肪肝」とは、アルコール以外の要因による肝細胞内の脂肪の過度の蓄積を主特徴とする臨床病理症候群をいう。
【００２９】
本明細書において、用語「インスリン抵抗性」とは、血糖を下げるインスリンの機能の低下により細胞がグルコースを効果的に下げ燃焼できない状態をいう。インスリン抵抗性が強い場合、生体において過剰なインスリンが生成されることで、高血圧、脂質異常症、心臓病及び糖尿病等が引き起こされる。特に２型糖尿病の場合において、筋肉及び脂肪組織がインスリンの増加を識別できないため、インスリンが効かない。
【００３０】
本明細書において、明示的に定義されていない用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
【００３１】
具体的な実施形態
【００３２】
本発明で用いたＤＭＥＭは、Ｓｉｇｍａから購入した。５００ｍｌ培地あたり１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１％非必須アミノ酸、１ｇグルコース、０．７５ｇ重炭酸ナトリウム、０．１ｇウシ血清アルブミン及び１．５ｍｌのＨＥＰＥＳ（４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）を補充した。
３Ｔ３Ｌ１は、ＡＴＣＣから購入した。
ＩＳＡＰ１の配列は、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−  Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号１８）である。ＩＳＡＰ２の配列は、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号２）である。ＩＳＡＰ３の配列は、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号３）である。ＩＳＡＰ４の配列は、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号１５）である。ＩＳＡＰ５の配列は、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号１６）である。ＩＳＡＰ６の配列は、Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号１４）である。
【００３３】
動物実験は、全て中国科学院先端技術研究所の動物倫理委員会によって承認され、倫理委員会の要求に従って行われた。
【００３４】
実施例１
ＩＳＡＰ１の機能研究
１、高脂肪食飼育による肥満及び非アルコール性脂肪肝モデルの構築
健康な６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６  ＳＰＦマウス（体重１８−２２ｇ）は、広東実験動物センターから購入した。２群に分け、深セン先進研究院ＳＰＦ動物舎で飼育した。対照群の場合、マウスに正常飼料（ＮＤ）（正常飼料：脂肪５％、炭水化物５３％、タンパク質２３％、総カロリー２５Ｊ／ｇ）を摂取させ、自由に飼料及び水を摂取するようにして１２週間飼育した。実験群の場合、マウスに高脂肪飼料（ＨＦＤ）（高脂肪飼料Ｄ１２４５１，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．）を摂取させ、自由に飼料及び水を摂取するようにして１２週間飼育した。その後、生理学的指標を検出した。高脂肪飼料で飼育したマウスの体重は４０ｇを超え、肥満及び非アルコール性脂肪肝モデル（ＤＩＯ−ＮＡＦＬＤ）の構築に成功したと考えられる。構築中のマウス体重と対照群との比較を図１に示す。矢印は、高脂肪飼料の摂取開始時点である。
【００３５】
２、ＤＩＯ−ＮＡＦＬＤマウスに対するＩＳＡＰ１の腹腔内注射の影響
２．１  精巣上体脂肪パッドに対するＩＳＡＰ１の腹腔内注射の影響
高脂肪飼料で飼育したマウスの体重が４０ｇを超え、血糖が１０ｍＭｏｌよりも高くなったときに、ＤＩＯ−ＮＡＦＬＤマウスに対して６週間かけてＩＳＡＰ１の腹腔内注射を行った。具体的には、各群に６匹のマウスがあり、ＩＳＡＰ１を０．０１％ＢＳＡ生理食塩水溶液に溶解し、一日一回、２０ｐｍｏｌ／ｇ、２ｐｍｏｌ／ｇの用量でＤＩＯ−ＮＡＦＬＤマウスに腹腔内注射した。ＯＣＮ（マウスオステオカルシンタンパク質）はＩＳＡＰ１と同様であり、濃度は６ｐｍｏｌ／ｇであった。６週間後、９５％ＣＯ２を用いてマウスを安楽死させ、その精巣上体脂肪パッド組織を採取し、重量を測定した後、パラフィン切片を作製し、顕微鏡で脂肪細胞の面積を観察した。
【００３６】
実験結果を図２に示す。図２（Ａ）は、ＮＤ対照群、ＨＦＤ対照群及び毎日ポリペプチドを腹腔内に注射した群のマウス脂肪の全体的な外観であり、ＨＦＤ対照群と比較して、ＩＳＡＰ１の投与により脂肪組織が顕著に減少したことを示す。図２（Ｂ）は、各群のマウスの精巣上体脂肪パッドの平均質量を示す。ＨＦＤ対照群と比較して、ＩＳＡＰ１の投与により精巣上体脂肪パッドの重量は顕著に低下したことを示す。図２（Ｃ）は、各群の精巣上体脂肪パッドに対するＨ＆Ｅ染色を示す。ＨＦＤ対照群と比較して、ＩＳＡＰ１の使用により脂肪細胞が顕著に小さくなったことを示す。図２（Ｄ）は、ダブルブラインド条件下で、Ｈ＆Ｅ染色切片に基づいて算出した脂肪細胞の平均表面積を示す。ＩＳＡＰ１により脂肪細胞が顕著に小さくなったことを示す。統計分析：ＨＦＤ対照群と比較した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００３７】
２．２  肝臓に対するＩＳＡＰ１の腹腔内注射の影響
ステップ２．１において、脂肪組織を採取すると同時に肝臓を採取し、外観の写真を撮った後、一部の肝臓組織を凍結し、切片を作製し、オイルレッドＯで染色した後、顕微鏡で観察し、そして同じ面積に対して定量分析を行った。実験結果を図３に示す。図３（Ａ）は、各群のマウスの肝臓外観の代表的な写真であり、色が薄いほど、脂肪含有量が高い。ＨＦＤ＋ビヒクルにより肝臓脂肪が顕著に蓄積したが、ＩＳＡＰ１の腹腔内注射により肝臓内の脂肪蓄積が顕著に減少した。図３（Ｂ）は、各群のマウスの肝臓のＨ＆Ｅ染色を示す。薄色は、細胞内で染色された脂肪を示す。図３（Ｃ）は、各群のマウスの肝臓をオイルレッドＯで染色した後、ダブルブラインド条件下で得られた非アルコール性脂肪肝細胞が蓄積した表面積を示す。肝臓において、ＩＳＡＰ１は、ＨＦＤ対照と比較して、脂肪の割合が大幅に減少し、これは、ＩＳＡＰ１が肝臓細胞中の脂肪含有量を減少したことを示す。
【００３８】
２．３  マウスの肝臓機能及び血中脂質に対するＩＳＡＰ１の腹腔内注射の影響
ステップ２．１において、マウスを安楽死させる前に、尾静脈から採血し、ロシュ血糖測定器（型番：ｃｏｂａｓ８０００）を用いて製造業者の説明書に従ってアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、血清コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を測定した。実験及び結果を図４に示す。２ｐｍｏｌ／ｇの用量においても、ＨＦＤ対照と比較して、ＩＳＡＰ１は、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＡＳＴ、コレステロール及びＬＤＬを効果的に減少させた。
【００３９】
上記の結果から分かるように、ＩＳＡＰ１の腹腔内注射は、マウスの体内の脂肪代謝に顕著な影響を与え、肝臓細胞及び脂肪細胞中の脂肪の蓄積を減少させ、脂肪代謝を改善し、非アルコール性脂肪肝の進行を効果的に緩和することができる。
【００４０】
３、  ＩＳＡＰ１とヒトＧＰＲＣ６Ａとの結合
３．１  Ｈｅｌａ細胞におけるｈＧＰＲＣ６Ａの過剰発現
１）細胞塗布：Ｈｅｌａ細胞懸濁液を１．６×１０５／ｍＬの密度で６ウェルプレート（各ウェルに２ｍＬのＤＭＥＭ培地がある）に塗布し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
２）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従ってｈＧＰＲＣ６過剰発現担体（ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ６１）をＨｅｌａ細胞中にトランスフェクションし、トランスフェクションの４時間後に正常培地に交換した。
３）トランスフェクションの４８時間後に、培地を捨て、滅菌ＰＢＳでプレート底の細胞を２回洗浄し、３００μＬのＴｒｉｚｏｌ溶液を加え、ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ）の説明書に従って細胞ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ酵素で処理した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カナダ）キット用いてＤＮＡＥｎｇｉｎｅによりｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法により各時点の蛍光ＰＣＲ生成物をリアルタイムに監視、分析することで（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ）、ｈＧＰＲＣ６Ａの発現量を測定した。必要に応じて、ピューロマイシンを用いて選別して安定発現細胞株を得た後、ｑＰＣＲを用いてその遺伝子発現を測定した。実験結果を図６Ａに示す。ヒトＧＰＲＣ６Ａは、Ｈｅｌａ中で安定して大量に発現した。
【００４１】
３．２  ＯＣＮの異なるポリペプチドとｈＧＰＲＣ６Ａを過剰発現するＨｅｌａ細胞の細胞膜との結合実験
実験結果を図６Ｂに示す。ＩＳＡＰ１は、ＯＣＮとほぼ一致する膜結合能を有する一方、ＯＣＮ−２２は、ＧＰＲＣ６Ａと結合できるが、親和性が１０倍悪かった。これは、ＩＳＡＰ１が受容体ｈＧＰＲＣ６Ａと相互に作用するＯＣＮのコアドメインであることを示す。
【００４２】
４、正常マウスにおける小腸脂肪吸収に対するＩＳＡＰ１の急激な胃内投与の影響
６週齢の雄の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３匹／群で４群に分け、滅菌オリーブオイル溶液２００μＬ（Ｓｉｇｍａ）を腸に注入し、３０分間後に、ＯＣＮ及びＩＳＡＰ１（濃度：６ｐｍｏｌ／ｇ）を腹腔内注射し、３０分間後にマウスを安楽死させ、小腸サンプルを収集した。サンプルは、十二指腸から盲腸までの部分であり、同じ長さの３つのセグメントを取った。十二指腸に近いセグメントを予冷した生理食塩水溶液でリンスした後、凍結して切片を作製し、オイルレッドＯで染色した後、脂肪吸収を観察した。
【００４３】
実験結果を図５に示す。（Ａ）十二指腸に近い空腸を凍結して切片を作製し、オイルレッドＯで染色し、ヘマトキシリンで二重染色した。（Ｂ）ダブルブラインド条件下でオイルレッドＯ陽性領域に対してＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量分析を行い、その面積と小腸絨毛の総面積との比を計算した。食塩水対照に対して、ＩＳＡＰ１は、オリーブオイル吸収をＯＣＮよりも効果的に低減させたことが分かった。
【００４４】
５、ＨＦＤマウスに対するＩＳＡＰ１の胃内投与の影響
６週齢の雄の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを６匹／群で６群に分け、第１群に正常飼料（ＮＤ）を摂取させ、第２から６群に高脂肪飼料（ＨＦＤ）を摂取させた。第２群を対照群とし、第３から６群を実験群とし、７週間かけてそれぞれ２ｐｍｏｌ／ｇ（体重）でＯＣＮ、ＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ２、ＩＳＡＰ３を毎日胃内投与し、週に一度体重を測った。実験結果を図７Ａに示す。同図から分かるように、ＨＦＤ対照群に対して、ＩＳＡＰ１群では、体重が顕著に低下した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００４５】
７週目のマウスの糞便を収集し、６０℃で３日ベーキングして乾燥させた後、１ｍｇ取り、クロロホルムとメタノール（２：１）の混合溶液１ｍｌに浸漬し、その後、組織ホモジナイザーにより糞便を粉砕し、遠心分離した後、上澄みを取り、ロシュ血液生化学分析装置用いてトリグリセリドを測定した。実験結果を図７Ｂに示す。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ＨＦＤ対照群と比較して、ＩＳＡＰ１群の糞便中のトリグリセリドの含有量は顕著に高くなり、ＩＳＡＰ１の胃内投与により腸管中のトリグリセリドの吸収が顕著に低減されたことを示す。
【００４６】
実施例２
ＩＳＡＰ２の機能研究
１、ＩＳＡＰ２とヒトＧＰＲＣ６Ａとの結合
１．１  Ｈｅｌａ細胞中におけるｈＧＰＲＣ６Ａの過剰発現
１）細胞塗布：Ｈｅｌａ細胞懸濁液を１．６×１０５／ｍＬの密度で６ウェルプレート（各ウェルに２ｍＬのＤＭＥＭ培地がある）に塗布し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
２）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従ってｈＧＰＲＣ６過剰発現担体（ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ６１）をＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４時間後に正常培地に交換した。
３）トランスフェクションの４８時間後に、培地を捨て、滅菌ＰＢＳでプレート底の細胞を２回洗浄し、３００μＬのＴｒｉｚｏｌ溶液を添加し、ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ）の説明書に従って細胞ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ酵素で処理した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カナダ）キットを用いてＤＮＡＥｎｇｉｎｅによりｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをテンプレートとし、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法により各時点の蛍光ＰＣＲ生成物をリアルタイムに監視、分析することで（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ）、ｈＧＰＲＣ６Ａの発現量を測定した。必要に応じて、ピューロマイシンで選別して安定発現細胞株を得た後、ｑＰＣＲを用いてその遺伝子発現を測定した。実験結果を図６Ａに示す。ヒトＧＰＲＣ６Ａは、Ｈｅｌａ中で安定して大量に発現した。
【００４７】
２、ＩＳＡＰ２及びｈＯＣＮとｈＧＰＲＣ６Ａが過剰発現するＨｅｌａ細胞の細胞膜との結合実験
実験方法は、実施例に記載の方法と基本的に同じであり、実験結果を図６Ｂに示す。ｈＯＣＮと比較して、ＩＳＡＰ２は、ほぼ一致する膜結合能を有するが、ｈＯＣＮ−２２は、このような能力を有しない。実施例１における「３．２」の結果と組み合わせると、ＩＳＡＰ１及びＩＳＡＰ２はそれぞれＯＣＮとｈＯＣＮのコアドメインであり、いずれも受容体ｈＧＰＲＣ６Ａと相互に作用することが証明された。これによって、ＩＳＡＰ１及びＩＳＡＰ２は同じ機能を有し、ｈＧＰＲＣ６Ａにより後続の信号伝送及び生物学的挙動を引き起こすことが実証された。
【００４８】
２．３  Ｃｙ５標識が付いているＯＣＮ、ｈＯＣＮ２２、ＩＳＡＰ２は、ＧＰＲＣ６Ａを過剰発現するＨｅｌａ細胞中でＧＰＲＣ６Ａの内在化を促進する。
ｈＧＰＲＣ６ＡＨｅｌａ発現細胞懸濁液を１．６×１０５／ｍＬの密度で予めゼラチンコートカバーガラスが置かれた２４ウェルプレート（各ウェルに０．５ｍＬのＤＭＥＭがある）に塗布し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。細胞を処理する前に、無血清培地で４時間飢餓状態にした後、各ウェルに１００ｎＭのＣｙ５−ＯＣＮ、Ｃｙ５−ｈＯＣＮ２２、Ｃｙ５−ＩＳＡＰ２を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、ポリメタノールで細胞を３０分間固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｓｉｇｍａ）を加えて１０分間インキュベートし、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で１０秒インキュベートし、製造業者の説明書に従って、蛍光共焦点顕微鏡を用いて細胞及び染色を観察して撮影した。実験結果を図６Ｃに示す。Ｃｙ５−ＯＣＮ及びＣｙ５−ＩＳＡＰ２は細胞内部に分布する一方、Ｃｙ５−ｈＯＣＮ２２は細胞外部に分布することが観察された。これは、Ｃｙ５−ＯＣＮ及びＣｙ５−ＩＳＡＰ２がいずれも受容体に結合し、内在化作用により細胞内に入り、エネルギー代謝の調節作用を奏することを証明した。
【００４９】
２．４  ＨＦＤマウスに対するＩＳＡＰ２の胃内投与の影響
６週齢の雄の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを６匹／群で６群に分け、第１群に正常飼料（ＮＤ）を摂取させ、第２から６群に高脂肪飼料（ＨＦＤ）を摂取させた。第２群を対照群とし、第３から６群を実験群とし、７週間かけてそれぞれ２ｐｍｏｌ／ｇ（体重）でＯＣＮ、ＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ２、ＩＳＡＰ３を毎日胃内投与し、週に一度体重を測った。実験結果を図７Ａに示す。同図から分かるように、ＨＦＤ対照群に対して、ＩＳＡＰ２群では、体重が顕著に低下した。
【００５０】
７週目のマウスの糞便を収集し、６０℃で３日ベーキングして乾燥させた後、１ｍｇ取り、クロロホルムとメタノール（２：１）の混合溶液１ｍｌに浸漬し、その後、組織ホモジナイザーにより糞便を粉砕し、遠心分離した後、上澄みを取り、ロシュ血液生化学分析装置用いてトリグリセリドを測定した。実験結果を図７Ｂに示す。ＨＦＤ対照群と比較して、ＩＳＡＰ２群の糞便中のトリグリセリドの含有量は顕著に高くなり、ＩＳＡＰ２の胃内投与により腸管中のトリグリセリドの吸収が顕著に低減されたことを示す。
【００５１】
実施例３
ＩＳＡＰ３の機能研究
１、ＨＦＤマウスに対するＩＳＡＰ３の胃内投与の影響
６週齢の雄の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを６匹／群で６群に分け、第１群に正常飼料（ＮＤ）を摂取させ、第２から６群に高脂肪飼料（ＨＦＤ）を摂取させた。第２群を対照群とし、第３から６群を実験群とし、７週間かけてそれぞれ２ｐｍｏｌ／ｇ（体重）でＯＣＮ、ＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ２、ＩＳＡＰ３を毎日胃内投与し、週に一度体重を測った。実験結果を図７Ａに示す。同図から分かるように、ＨＦＤ対照群に対して、ＩＳＡＰ３群では、体重が顕著に低下した。
【００５２】
７週目のマウスの糞便を収集し、６０℃で３日ベーキングして乾燥させた後、１ｍｇ取り、クロロホルムとメタノール（２：１）の混合溶液１ｍｌに浸漬し、その後、組織ホモジナイザーにより糞便を粉砕し、遠心分離した後、上澄みを取り、ロシュ血液生化学分析装置用いてトリグリセリドを測定した。実験結果を図７Ｂに示す。ＨＦＤ対照群と比較して、ＩＳＡＰ３群の糞便中のトリグリセリドの含有量は顕著に高くなり、ＩＳＡＰ３の胃内投与により腸管中のトリグリセリドの吸収が顕著に低減されたことを示す。
【００５３】
ＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ２、ＩＳＡＰ３の配列を比較すると、ＩＳＡＰ１に対して、ＩＳＡＰ２は、４つの挿入、２つの置換及び１つの欠失を有し、ＩＳＡＰ１に対して、ＩＳＡＰ３は、４つの挿入、３つの置換を有し、ＩＳＡＰ２に対して、ＩＳＡＰ１は、４つの欠失、２つの置換及び１つの挿入を有することが分かった。上記のことから、この３つのポリペプチドは、互いにバリアントであると考えられ、エネルギー代謝の調節能を顕著に低下させることなく（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％を超えない低下）、この３つの配列をベースにして当業者に知られているアミノ酸の置換、挿入及び欠失を行うことができると推定される。図８に示される異なる複数の生物由来の相同配列を比較すると、配列番号２：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、配列番号４：ＹＬＮＮＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、配列番号５：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＴＬＥＰ、配列番号６：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰ、配列番号７：ＹＬＤＨＷＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、配列番号８：ＹＬＤＰＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、配列番号９：ＹＬＤＨＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰ、配列番号１０：ＹＬＤＱＧＬＧＡＰＡＰＡＰＤＰＬＥＰ、配列番号１１：ＹＬＤＳＧＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰの間の差は小さく、任意の２つの配列の差が４つ以下のアミノ酸の置換である場合が多いため、これらの配列は類似する生物学的機能を有することが推定され、いずれも本発明の範囲内に含まれるべきである。好ましくは、欠失、置換及び挿入の合計は、４以下、例えば、３、２、１である。また、配列番号１は、配列番号１８と比較して１つのアミノ酸残基のみが欠失したため、配列番号１も配列番号１８と同様の機能を有することが推定される。
【００５４】
また、ＩＳＡＰ２に対して、ＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ３は、ＩＳＡＰ２末端に１つの挿入を有することに相当し、これは、エネルギー代謝の調節能を顕著に低下させることなく（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％を超えない低下）、ポリペプチドの末端に複数のアミノ酸残基を追加できることを示す。好ましくは、末端に５以下、例えば、４、３、２、１又は０のアミノ酸残基を添加することができる。
【００５５】
実施例４
ＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６の機能
正常マウスにおける小腸脂肪吸収に対するＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６の急激な胃内投与の影響
１５匹の６週齢の雄の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３匹／群で５群に分け、そのうちの３群を実験群とし、それぞれ２ｐｍｏｌ／ｇ（体重）でＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６を胃内投与し、２群を対照群とし、１週間かけて等体積の生理食塩水を毎日胃内投与し、８日目にそれぞれＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６及び生理食塩水を胃内投与した３０分間後に、３つの実験群及び１つの対照群に滅菌オリーブオイル２００μＬを胃内投与し、１つの対照群に生理食塩水２００μＬを胃内投与し、５０分間後に、９５％ＣＯ２でマウスを安楽死させ、解剖して小腸を取り出し、十二指腸に近い空腸を凍結して切片を作製し、オイルレッドＯで染色した後、ヘマトキシリンで二重染色した。ダブルブラインド条件下でオイルレッドＯ陽性領域に対してＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量分析を行い、当該面積と小腸絨毛の総面積との比を計算した。統計分析：生理食塩水＋オリーブオイル群との比較。＊＊＊：ｐ＜０．００１、Ｎ＝３。
【００５６】
実験結果を図９に示す。ダブルブラインド条件下でオイルレッドＯ陽性領域に対してＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量分析を行い、当該面積と小腸絨毛の総面積との比を計算した。明らかなように、食塩水対照に対して、ＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６は、オリーブオイル吸収を非常に効果的に減少させ、それらはＩＳＡＰ１、ＩＳＡＰ２、ＩＳＡＰ３の生物学的機能と相当することが実証された。図８の配列比較から分かるように、配列番号１２：ＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰと配列番号１５：ＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰ、配列番号１３：ＰＹＰＤＰＬＥＰと配列番号１６：ＰＳＰＤＰＬＥＰは、配列の類似度が非常に高く、また、様々な種間においても非常に保存的な配列であるため、類似する生物活性を有することで、これらのポリペプチド及びそのバリアントも経口投与により脂肪の吸収及び代謝に影響を与えることができると考えられる。つまり、エネルギー代謝の調節能を顕著に低下させることなく（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％を超えない低下）、これらの配列に対して当業者に知られているアミノ酸の置換、挿入及び欠失を行うことができる。また、ＩＳＡＰ４、ＩＳＡＰ５、ＩＳＡＰ６はより短いため、コストが低くなり、安定性がより良好で、脂肪代謝異常に関連する疾患の治療薬の製造に適用できる。
【００５７】
本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許文献は、それぞれが具体的かつ単独で参照により全体として本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本出願（本明細書における如何なる定義を含む）に準ずる。
【００５８】
同等のスキーム
本明細書では本発明のいくつかの実施形態が明確に開示されているが、以上の説明は、制限的ではなく、例示的なものである。当業者にとって、本明細書及び特許請求の範囲の内容を参照することにより、本発明の様々な変形が明らかになる。本発明の全ての範囲は、特許請求の範囲、その同等のスキームの全ての範囲、本明細書及び本発明の変形に基づいて定められるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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