(57)【要約】  下記の化合物（Ｆ）（１ａ）又は（１ｂ）：【化１】2020508969.tif 000008（式中、‐  Ｒ1は‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐（ＣＨ2）mＯＣＨ3、Ｃ1‐Ｃ6ハロアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、又はヘテロアリールから選択され、式中、Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、Ｃ1‐Ｃ6ハロアルキル、Ｃ3‐Ｃ6シクロアルキル、‐ＣＨ2‐（Ｃ3‐Ｃ6シクロアルキル）、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、式中、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4であり、式中Ｒ4は、シクロアルキル、複素環、アリールもしくはヘテロアリール、又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、式中、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、又はヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＯＨ、‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨ‐Ｒ6、又はカルボン酸アイソスターから選択され、式中、Ｒ6はＣ1‐Ｃ4アルキルから選択され、ｎ、ｍ及びｒは０、１、２、３、４又は５）と、当該化合物の使用に関する。【選択図】図１ａ
2020508969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１ａ）又は（１ｂ）、特に（１ａ）を含む化合物であって、
【化１】
2020508969.tif 000007
式中、
‐  Ｒ1は‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐（ＣＨ2）mＯＣＨ3、Ｃ1‐Ｃ6ハロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、式中
‐  ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
‐  ｍは０、１、２、３、４又は５であり、
‐  Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、Ｃ1‐Ｃ6ハロアルキル、Ｃ3‐Ｃ6シクロアルキル、‐ＣＨ2‐（Ｃ3‐Ｃ6シクロアルキル）、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、式中
‐  ｒは１、２、３、４又は５であり、
‐  Ｒ3は、
‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4であり、式中
‐  Ｒ4は、
‐  置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリール、又は
‐  ‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、式中、
‐  Ｌは、
‐  Ｃ1‐Ｃ5アルキル、
‐  置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、
‐  Ｒ5は‐ＯＨ、‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨ‐Ｒ6、又はカルボン酸アイソスターから選択され、式中、
‐  Ｒ6はＣ1‐Ｃ4アルキル、特にＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｒ1はＣ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐（ＣＨ2）mＯＣＨ3、シクロアルキル、特にＣ3‐Ｃ6シクロアルキル、更に特段にはＣ6シクロアルキル又はＣ1‐Ｃ6ハロアルキルから選択され、特にＲ1はＣ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ又はＣ1‐Ｃ6ハロアルキルから選択され、式中、ｍは０、１、２、３、４又は５である
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、更に特段にはメチル、エチルもしくはイソプロピル、Ｃ1‐Ｃ4ハロアルキル、特に‐ＣＨ2ＣＦ3、‐ＣＨＦＣＦ3、‐ＣＦ2ＣＦ3、‐ＣＨＦ2、‐ＣＨ2Ｆもしくは‐ＣＦ3、更に特段には‐ＣＨ2ＣＦ3もしくはＣＦ3、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択され、特にＲ1は‐Ｂｒ、‐ＣＦ3又はエチルから選択され、更に特段にはＲ1はエチルであり、式中、ｍは０、１、２又は３である
請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1nのｎは０、１又は２であり、特にｎは１であり、更に特段にはＲ1はパラ置換である
請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3、特にＨ、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、ｒは１、２、３、４又は５であり、式中、特にｒは１、２又は３であり、更に特段にはｒは１又は２である
請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ2アルキル、又は‐（ＣＨ2）2ＯＣＨ3から選択され、特にＲ2はＣ1‐Ｃ2アルキルであり、更に特段にはＲ2は‐ＣＨ3である
請求項１ないし５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4、又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択される
請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ4は置換もしくは非置換アリール、特に置換もしくは非置換Ｃ6アリール、より好ましくはフェニル、又は置換もしくは非置換ヘテロアリール、特に置換もしくは非置換Ｃ6ヘテロアリール、更に特段には２‐ピリジル又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、特にＲ4は‐Ｌ‐Ｒ5である
請求項１ないし７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、特にＬはＣ6アリール又はＣ6ヘテロアリール、特にピリジル、又はＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキルから選択される
請求項１ないし８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯＮＨ2、‐ＣＯＮＨ‐Ｒ6、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨから選択され、更に特段には‐ＣＯＯＨであり、Ｒ6はＣ1‐Ｃ4アルキル、特にＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される
請求項１ないし９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ3は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｌ‐Ｒ5であり、式中、ＬはＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、Ｒ5は‐ＣＯＯＨ又は‐ＮＨ2から選択され、特に‐ＣＯＯＨであり、あるいは
Ｒ3は‐ＮＨ‐Ｌ‐Ｒ5であり、式中、Ｌは置換もしくは非置換アリール、特に６員置換もしくは非置換アリール、更に特段にはフェニル、又は置換もしくは非置換ヘテロアリール、特に６員置換もしくは非置換のヘテロアリール、更に特段には２‐ピリジルであり、Ｒ5は‐ＣＯＯＨ又は‐ＮＨ2から選択され、特に‐ＣＯＯＨである
請求項１ないし１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
薬品として使用するための請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
癌治療に使用するための請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
オーロラＡの阻害剤として使用するための請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物を、特に薬学的有効量でそれを必要とする患者に投与することを含み、更に特段には前記疾患は癌である
ことを特徴とする疾患を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーロラＡの選択的阻害剤としてのチアゾリジノン誘導体クラス、及び癌治療における当該誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らはオーロラＡの新規な選択的阻害剤を同定した。オーロラＡは有糸分裂を介する適切な進行に必須の進化的に保存されたセリン／スレオニンキナーゼであり、癌に有意に関わるため最も集中的に研究されたキナーゼ標的の１つである。このキナーゼの強力な阻害剤が多く知られているが、そのほとんどはオーロラＢも阻害する。オーロラＢは顕著に細胞質分裂に必要とされ、キナーゼドメインにおいてオーロラＡとの配列相同性が８５％を超える染色体パッセンジャータンパク質である。
【０００３】
現在までに報告されているオーロラＡに最も選択的な阻害剤の１つであるアリセルチブ（ＭＬＮ８２３７）（Ｇｒｏｏｔら、Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ、２０１５年、第５号、２８５頁（非特許文献１））は現在、様々な固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍の治療用に高度な臨床試験下にある。興味深いことに、アリセルチブ及びその近縁のＭＬＮ８０５４（Ｈｏａｒら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００７年、第２７号、４５１３〜４５２５頁（非特許文献２））は、ＣｈＥＭＢＬ（Ｇａｕｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２０１２年、第４０号、Ｄ１１００〜Ｄ１１０７（非特許文献３））に収載している５０ｎＭより優れた力価を有する１１，２８６種のキナーゼ阻害剤中に存在する、Ｂｅｍｉｓ及びＭｕｒｃｋｏ（Ｂｅｍｉｓ及びＭｕｒｃｋｏ、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、１９９６年、第３９号、２８８７〜２８９３頁（非特許文献４））に定義されているような４，８７４種の骨格中の独特な骨格に属す。更に、骨格の多様性はオーロラＡキナーゼ阻害剤の間で非常に高く、ＣｈＥＭＢＬに収載された５０ｎＭより優れた力価を有する３２９種の阻害剤中に１７４種の様々な骨格が存在する。このことから、各阻害剤が各骨格に対して既に最適化された化合物を表すこと、また、この特定のキナーゼに対する更なる選択的阻害剤を発見するには様々な骨格を同定することが必要であることが示唆される。
【０００４】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｏｏｔら、Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ、２０１５年、第５号、２８５頁
【非特許文献２】Ｈｏａｒら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００７年、第２７号、４５１３〜４５２５頁
【非特許文献３】Ｇａｕｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２０１２年、第４０号、Ｄ１１００〜Ｄ１１０７
【非特許文献４】Ｂｅｍｉｓ及びＭｕｒｃｋｏ、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、１９９６年、第３９号、２８８７〜２８９３頁
【非特許文献５】Ｋｉｌｃｈｍａｎｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  第５９号、７１８８〜７２１１頁
【非特許文献６】Ｆａｂｉａｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００５年、第２３号、３２９〜３３６頁
【非特許文献７】Ｋａｒａｍａｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８年、第２６号、１２７〜１３２頁
【非特許文献８】Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００３年、第１６１号、２６７〜２８０頁
【非特許文献９】Ｅｖａｎｓ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２００６年、第６２号、７２〜８２頁
【非特許文献１０】Ｌｅｓｌｉｅら、Ｎａｔｏ  Ｓｃｉ  Ｓｅｒ  ＩＩ  Ｍａｔｈ、２００７年、２４５頁
【非特許文献１１】Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ  Ｘｄｓ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、１２５〜１３２頁
【非特許文献１２】Ｗｉｎｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１１年、第６７号、２３５〜２４２頁
【非特許文献１３】Ａｄａｍｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、２１３〜２２１頁
【非特許文献１４】Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、４６８〜５０１頁
【非特許文献１５】ＤｅＬａｎｏ、Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２年）、Ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ
【非特許文献１６】Ｗａｌｌａｃｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、１９９５年、第８号、１２７〜１３４頁
【非特許文献１７】Ｍｅｒｄｅｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０００年、第１４９号、８５１〜８６２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは本明細書では、オーロラＡを特異的に阻害する化合物を提供する。これらの化合物は医薬として使用するためのものであり、癌の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、一般式（１ａ）又は（１ｂ）、特に（１ａ）を含む化合物に関する；
【０００８】
【化１】
2020508969.tif 000003
【０００９】
式中、
‐  Ｒ1は、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐（ＣＨ2）mＯＣＨ3、Ｃ1‐Ｃ6ハロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、式中
‐  ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
‐  ｍは０、１、２、３、４又は５であり、
‐  Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1‐Ｃ6アルキルもしくはＣ1‐Ｃ6ハロアルキル、Ｃ3‐Ｃ6シクロアルキル、‐ＣＨ2‐（Ｃ3‐Ｃ6シクロアルキル）、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、式中
‐  ｒは１、２、３、４又は５であり、
‐  Ｒ3は、
‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4であり、式中
‐  Ｒ4は、
‐  置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリール、又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、式中、
‐  Ｌは、
‐  Ｃ1‐Ｃ5アルキル、
‐  置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、
‐  Ｒ5は‐ＯＨ、‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨ‐Ｒ6、又はカルボン酸アイソスターから選択され、式中、
‐  Ｒ6はＣ1‐Ｃ4アルキル、特にＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される。
【００１０】
本明細書で開示する化合物は特異的にオーロラＡを、その触媒ポケットに結合することにより阻害する。
【００１１】
式（１ａ）又は（１ｂ）の阻害剤は、オーロラＡの、Ｒ‐スパインの歪み、αＣへリックスの外側への変位、Ｌｙｓ１６２とＧｌｕ１８１の間の塩橋の欠如、及びＡｓｐ１５６、Ｔｈｒ２９２及びＬｙｓ２５８間の水素結合ネットワークの破壊を含む不活性ＤＦＧ‐モチーフ配座を誘導する。アクチベータータンパク質ＴＰＸ２はＬｙｓ１６２とＧｌｕ１８１との間に塩橋の形成を誘導するので、式（１ａ）又は（１ｂ）の阻害剤はＡＴＰ結合のみならずＴＰＸ２によるオーロラＡ活性化も阻害する。式（１ａ）の化合物中のチアゾリジノンの両環外結合がＺ配置にあれば、オーロラＡへの結合が最適になる。式（１ａ）又は（１ｂ）の阻害剤はオーロラＡのＡＴＰ結合領域のＡＴＰ結合ポケットに結合し、Ｌｅｕ１３９、Ｖａｌ１４、Ａｌａ１６０及びＬｅｕ２６３と疎水性接触面を形成する。これらの阻害剤のフェニル部分はＬｅｕ１９４、Ａｒｇ１９５、Ｌｅｕ１９６、Ｌｅｕ２１０及びＰｈｅ２７５と疎水性接触面を形成することによりオーロラＡの疎水性裏ポケットに結合する。阻害剤結合により、結合時に、式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物のフェニル環と相互作用するオーロラＡのＰｈｅ２７５の上方回転が誘導される。式（１ａ）又は（１ｂ）の阻害剤の４‐ピリジン環は、Ａｌａ２１３との水素結合を形成することでオーロラＡのヒンジ領域に結合する。
【００１２】
式１（ｂ）の化合物はラセミ混合物である。立体中心は星印で示す。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐（ＣＨ2）mＯＣＨ3、シクロアルキル、特にＣ3‐Ｃ6シクロアルキル、更に特段にはＣ6シクロアルキル又はＣ1‐Ｃ6ハロアルキルから選択され、式中、ｍは０、１、２、３、４又は５である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ又はＣ1‐Ｃ6ハロアルキルから選択され、式中、ｍは０、１、２、３、４又は５である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、Ｃ1‐Ｃ4ハロアルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択され、式中、ｍは０、１、２又は３である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ3アルキル、‐ＣＨ2ＣＦ3、‐ＣＨＦＣＦ3、‐ＣＦ2ＣＦ3、‐ＣＨＦ2、‐ＣＨ2Ｆもしくは‐ＣＦ3、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択され、式中、ｍは０、１、２又は３である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、メチル、エチルもしくはイソプロピル、‐ＣＨ2ＣＦ3もしくはＣＦ3、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択され、式中、ｍは０、１、２又は３である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、Ｃ1‐Ｃ4ハロアルキル、‐Ｏ（ＣＨ2）mＣＨ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択され、式中、ｍは０、１、２又は３である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1‐Ｃ3アルキル、‐ＣＨ2ＣＦ3、‐ＣＨＦＣＦ3、‐ＣＦ2ＣＦ3、‐ＣＨＦ2、‐ＣＨ2Ｆもしくは‐ＣＦ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、メチル、エチルもしくはイソプロピル、‐ＣＨ2ＣＦ3もしくはＣＦ3、‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ又は‐Ｆから選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、‐Ｂｒ、‐ＣＦ3又はエチルから選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｒ1はエチルである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｒ1nのｎは０、１又は２であり、特に１である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｒ1nのｎは１であり、Ｒ1はパラ置換である。
【００２５】
Ｒ1は、オーロラＡの疎水性裏ポケットに結合する式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物のフェニル部分における置換基である。従って、好適な置換基はアルキル、ハロアルキル又はハロゲンなどの疎水性部分を含む。式（１ａ）又は（１ｂ）の強力な阻害剤は、パラ位にある小型のアルキル置換基（Ｒ1）、例えば４‐メチル又は４‐エチルを特徴とする。
【００２６】
いくつかの実施形態では、Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ6アルキル、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、式中、ｒは１、２、３、４又は５である
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、式中、ｒは１、２又は３であり、特にｒは１又は２である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ2アルキル、又は‐（ＣＨ2）2ＯＣＨ3から選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｒ2はＣ1‐Ｃ2アルキルである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｒ2は‐ＣＨ3である。
【００３１】
式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物中のチアゾリジノン部分は、オーロラＡのＡＴＰ結合領域と相互作用する。環内窒素原子（Ｒ2）の置換基は、オーロラＡのＶａｌ１４７と疎水性接触面を形成し得る。従って、この位置にはメチルやエチルなどの小型の疎水性置換基が必要である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択される。
【００３４】
式（１ａ）又は（１ｂ）の阻害剤の４‐ピリジン環は、Ａｌａ２１３と水素結合を形成することによりオーロラＡのヒンジ領域に結合する。２‐ピリジル位置が置換又は非置換アミノ基などの水素結合受容体で置換されれば、第２の水素結合が形成される場合もある。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリール、又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、式中、特にＲ4は‐Ｌ‐Ｒ5である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は置換もしくは非置換Ｃ6アリール、置換もしくは非置換Ｃ6ヘテロアリール、又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、特にＲ4は‐Ｌ‐Ｒ5である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｒ4はフェニル、又は２‐ピリジル、又は‐Ｌ‐Ｒ5であり、特にＲ4は‐Ｌ‐Ｒ5である。
【００３８】
式（１ａ）又は（１ｂ）の阻害剤の結合は２‐ピリジル位置のアミノ基の置換基により更に増強可能である。このような置換基、例えばフェニル又はピリジルはオーロラＡのＧｌｙ２１６及びＬｅｕ２６３と疎水性接触面を形成し得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は‐Ｌ‐Ｒ5である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＬはＣ6アリール、Ｃ6ヘテロアリール、又はＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキルから選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｌはピリジル又はＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキルから選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、スキーム（１）に従って、Ｒ5は‐ＯＨ、‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨ‐Ｒ6又はカルボン酸アイソスターから選択され、式中、Ｒ6はＣ1‐Ｃ4アルキル、特にＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＮＨ2、‐ＣＯＮＨ‐Ｒ6、‐ＣＯＯＨ、テトラゾールから選択され、Ｒ6はＣ1‐Ｃ4アルキル、特にＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾールから選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾールから選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、又は‐ＣＯＯＨから選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は‐ＣＯＯＨである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｌ‐Ｒ5であり、式中、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、Ｒ5は‐ＣＯＯＨ又は‐ＮＨ2から選択され、特に‐ＣＯＯＨである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ‐Ｌ‐Ｒ5であり、式中、Ｌは置換もしくは非置換アリール、特に６員置換もしくは非置換アリール、更に特段にはフェニル、又は置換もしくは非置換ヘテロアリール、特に６員置換もしくは非置換のヘテロアリール、更に特段には２‐ピリジルであり、Ｒ5は‐ＣＯＯＨ又は‐ＮＨ2から選択され、特に‐ＣＯＯＨである。
【００５１】
【化２】
2020508969.tif 000004
【００５２】
スキーム（１）．カルボン酸アイソスター
式（１ａ）又は（１ｂ）の最も強力な阻害剤は、オーロラＡのＧｌｙ２１６及びＬｅｕ２６３と疎水性接触面を形成可能なリンカーＬ、ならびにオーロラＡのＡｒｇ１３７と水素結合を形成可能なカルボキシレート基（Ｒ5）などの水素結合受容体に特徴付けられる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐ＮＨ‐Ｒ4から、特にＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は置換もしくは非置換アリール又は置換もしくは非置換ヘテロアリール又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1は‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、又はＣ1‐Ｃ4ハロアルキルから選択され、
‐  Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ4アルキル又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、ｒは１、２又は３であり、特にｒは２である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は置換もしくは非置換アリール又は置換もしくは非置換ヘテロアリール又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1は‐Ｂｒ、‐ＣＦ3、又はＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、
‐  Ｒ2はＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は置換もしくは非置換アリール又は置換もしくは非置換ヘテロアリール又は‐Ｌ‐Ｒ5から選択され、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1はエチルであり、
‐  Ｒ2は‐ＣＨ3である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は‐Ｌ‐Ｒ5であり、ＬはＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1は‐Ｉ、‐Ｂｒ、‐Ｃｌ、‐Ｆ、Ｃ1‐Ｃ4アルキル、又はＣ1‐Ｃ4ハロアルキルから選択され、
‐  Ｒ2はＨ、Ｃ1‐Ｃ4アルキル又は‐（ＣＨ2）rＯＣＨ3から選択され、ｒは１、２又は３であり、特にｒは２である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は‐Ｌ‐Ｒ5であり、ＬはＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1は‐Ｂｒ、‐ＣＦ3、又はＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、
‐  Ｒ2はＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は‐Ｌ‐Ｒ5であり、ＬはＣ1‐Ｃ5アルキル、特にＣ1‐Ｃ3アルキル、置換もしくは非置換アリール、又は置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1はエチルであり、
‐  Ｒ2は‐ＣＨ3である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特に‐ＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は‐Ｌ‐Ｒ5であり、ＬはＣ6アリールもしくはＣ6ヘテロアリール、又はＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段にはＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1は‐Ｂｒ、‐ＣＦ3、又はＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、
‐  Ｒ2はＣ1‐Ｃ2アルキルから選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は‐ＮＨ2、‐ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ‐Ｒ4、‐ＮＨＣ（＝Ｓ）‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ‐Ｒ4から、特にＮＨ‐Ｒ4又は‐ＮＨＣ（＝Ｏ）‐Ｒ4から選択され、
‐  Ｒ4は‐Ｌ‐Ｒ5であり、Ｌはピリジル、又はＣ1‐Ｃ3アルキルから選択され、Ｒ5は‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2、‐ＣＯＯＨ、テトラゾール、特に‐ＣＨ2ＯＨ、‐ＮＨ2又は‐ＣＯＯＨ、更に特段には‐ＣＯＯＨから選択され、
‐  Ｒ1はエチルであり、
‐  Ｒ2は‐ＣＨ3である。
【００６１】
本発明の第２の態様は、薬品として使用するための本発明の第１の態様に従った化合物に関する。
【００６２】
本発明の第３の態様は、癌治療に使用するための本発明の第１の態様に従った化合物に関する。
【００６３】
本発明の第４の態様は、オーロラＡの阻害剤として使用するための本発明の第１の態様に従った化合物に関する。
【００６４】
第５の態様は、本発明の第１の態様に従った化合物を、特に薬学的有効量でそれを必要とする患者に投与することを含む、疾患を治療又は予防する方法に関するものであり、更に特段には前記疾患は癌である。
【００６５】
本発明の化合物は、有糸分裂を経た適切な進行のために必須の、進化的に保存されたセリン／スレオニンキナーゼであるオーロラＡの選択的阻害剤である。細胞増殖に役割を担い、また多くのヒト癌において発現プロファイルを上昇させることから、オーロラＡは抗癌標的である。本発明の化合物がオーロラＡに結合すると、オーロラＡキナーゼ活性を示すオーロラＡのＴｈｒ２８８の自己リン酸化が減少し、分裂中期の染色体配置が不良になり、紡錘体微小管でのオーロラＡ局在が損なわれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、一般式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物は塩の形態で、特に薬学的に許容される塩の形態で単離できる。前述の実施形態も全て同様である。いくつかの実施形態では、一般式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物は、互変異性体、水和物又は溶媒和物の形態で単離してもよい。このような塩は、例えば塩基性窒素原子を有する一般式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物から、好ましくは有機又は無機酸を用いて酸付加塩として形成し、特に、このような方法で薬学的に許容可能な塩を形成する。適切な無機酸は塩酸、硫酸、又はリン酸等のハロゲン酸であるが、これらに限定されるものではない。好適な有機酸は、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸又はスルファミン酸等であるが、これらに限定されるものではない。このような有機酸は酢酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸であってもよいが、これらに限定されるものではない。塩は、例えば、酸性水素を担持する窒素原子を有する一般式（１ａ）又は（１ｂ）の化合物から、有機又は無機塩基との塩としても形成し得る。好適なカチオンの例には、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムカチオン、又は有機窒素塩基、例えばプロトン化モノ‐、ジ‐もしくはトリ‐（２‐ヒドロキシエチル）アミンのカチオンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
遊離形態の新規化合物とその塩の形態の新規化合物との密接な関係を鑑み、上記及び下記の遊離化合物への言及は、必要に応じて便宜的に、対応する塩にも及ぶと理解されるべきである。水和物又は溶媒和物も同様である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、有効成分としての本発明に従った少なくとも１種の化合物、及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、遊離形態の本発明に従った少なくとも１種の化合物を有効成分として含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、有効成分としての遊離形態の本発明に従った少なくとも１種の化合物、及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、塩、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、水和物又は溶媒和物の形態の本発明に従った少なくとも１種の化合物を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、塩、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、水和物又は溶媒和物の形態の本発明に従った少なくとも１種の化合物、及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体を含む。
【００７０】
更に、本発明は、特に上述した疾患の治療に使用可能な、有効成分として本明細書で上述した少なくとも１種の化合物を含む医薬製剤に関する。当該医薬製剤は、特に癌治療方法に使用し得る。
【００７１】
用語及び定義
本明細書の文脈において、用語「Ｒ‐スパイン」はキナーゼの活性状態においてカラムを形成する４つの保存疎水性アミノ酸残基を指す。
【００７２】
本明細書の文脈において、用語「ＤＦＧモチーフ」はキナーゼの活性化ループのＮ末端における保存Ａｓｐ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙモチーフを指す。触媒的に活性な状態の配座に対して活性化ループがフリップアウトしていれば、キナーゼは触媒的に不活性である。不活性配座は「ＤＦＧ‐アウト配座」と称され、一方、活性配座は「ＤＦＧ‐イン配座」と称される。
【００７３】
用語「置換」は、親部分への置換基の付加を指す。
【００７４】
「置換基」は保護されていても保護されていなくてもよく、親部分の１つの利用可能な部位又は多数の利用可能な部位に付加することが可能である。置換基は、他の置換基で更に置換されてもよく、また直接に、又はアルキル、アミドもしくはヒドロカルビル基などの連結基により親部分に結合してもよい。本明細書に従い得る「置換基」には、ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、カルボキシル、脂肪族基、脂環基、アルコキシ、置換オキシ、アリール、アラルキル、アミノ、イミノ、アミドフッ化化合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
本明細書中で使用しているように、用語「アルキル」とは、特に最大６個の炭素原子を含有する飽和直鎖又は分岐炭化水素部分を指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ‐ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アルキル基は通常１〜約６個の炭素原子を含む（Ｃ1‐Ｃ6アルキル）。
【００７６】
本明細書中で使用しているように、用語「シクロアルキル」とは、飽和もしくは不飽和（もしくは部分不飽和）の環、又は３〜１０個、特に５〜１０個の炭素原子を含有する多環構造を形成する相互結合アルキル基を指す。シクロアルキル基の例には、シクロプロパン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ノルボルナン、デカリン又はアダマンタン（トリシクロ［３．３．１．１］デカン）等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。シクロアルキル基は通常、５〜１０個の炭素原子（Ｃ5‐Ｃ10シクロアルキル）、特に５〜６個の炭素原子（Ｃ5‐Ｃ6シクロアルキル）を含む。
【００７７】
本明細書で使用するようなアルキル又はシクロアルキル基は任意に更なる置換基を含んでもよい。シクロアルキル基上の置換は、シクロアルキル基の１個又は２個の原子を介してシクロアルキル基に結合可能なアリール、複素環又はヘテロアリール置換基も包含する。
【００７８】
本明細書中で使用しているように、用語「アルケニル」とは、特に最大６個の炭素原子を含んで少なくとも１個の炭素‐炭素二重結合を有する直鎖又は分枝炭化水素鎖部分を指す。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、ブテニル、１‐メチル‐２‐ブテン‐１‐イル、１，３‐ブタジエンなどのジエン、等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。本明細書で使用するようなアルケニル基は任意に別の置換基を含んでもよい。
【００７９】
本明細書中で使用しているように、用語「アルキニル」とは、特に最大６個の炭素原子を含んで少なくとも１個の炭素‐炭素三重結合を有する直鎖又は分枝炭化水素部分を指す。アルキニル基の例には、エチニル、１‐プロピニル、１‐ブチニル等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。本明細書で使用するようなアルキニル基は任意に別の置換基を含んでもよい。
【００８０】
本明細書中で使用しているように、用語「複素環」とは、３〜１０個、特に５〜６個の炭素原子を含有する飽和又は不飽和環又は多環構造を形成する相互結合アルキル基を指し、ここでは少なくとも１個の炭素原子が酸素、窒素又は硫黄原子で置換されて非芳香族構造を形成する。簡素化するため、複素環は、例えば、Ｃ5‐Ｃ10複素環とも呼ばれ、少なくとも１個の炭素原子が酸素、窒素又は硫黄原子で置換されて環構造を形成する。本明細書で使用するような複素環式基は任意に別の置換基を含んでもよい。複素環式基上の置換は、複素環式基の１個又は２個の原子を介して複素環式基に結合可能なアリール、シクロアルキル又はヘテロアリール置換基（インドールと同等）も包含する。
【００８１】
本明細書中で使用しているように、用語「アリール」は、炭素原子間で二重結合と単結合とを交互に有して芳香環構造、特に６員（Ｃ6）〜１０員（Ｃ10）環、又は多環構造、特に６員環を形成する炭化水素を指す。
【００８２】
用語「ヘテロアリール」は、アリール化合物と同等の５〜１０員環又は多環構造、特に５〜６員環構造を含む芳香族構造を指し、ここでは少なくとも１員は酸素又は窒素又は硫黄原子である。簡素化するために、ヘテロアリールは例えばＣ5〜Ｃ10ヘテロアリールとも呼ばれ、ここでは少なくとも１個の炭素原子が酸素、窒素又は硫黄原子で置換されて芳香族構造を形成する。例えば、Ｃ5ヘテロアリールは、少なくとも１個の炭素原子が酸素、窒素又は硫黄原子で置換されている５員環構造を含む。
【００８３】
本明細書で使用するようなアリール又はヘテロアリール基は任意に更なる置換基を含んでもよい。ヘテロアリール基上の置換は、ヘテロアリール基の１個又は２個の原子を介してヘテロアリールに結合可能なアリール、シクロアルキル又は複素環式置換基（インドールと同等）も包含する。アリール基についても同様である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１ａ】オーロラＡ選択的阻害剤９へのフェニルイミノ‐チアゾリジノンヒット化合物７の最適化を示す説明図。Ｒ1及びＲ2の変形体を有する類似体の構造及び活性。
【図１ｂ】２‐ピリジル置換基の最適化。ＳＩ＝選択指数：ＩＣ50（オーロラＢ／ＩＮＣＥＮＰ）／ＩＣ50（オーロラＡ）。
【図２】オーロラＡに結合した４‐チアゾリジノン誘導体の結晶構造を示す説明図。化合物の周囲に１シグマで等高線を付けた２Ｆo‐Ｆc電子密度図は、ポケット内の化合物の明確な位置を強調するために示す。結晶構造はＰＤＢコード４ＺＴＱ、４ＺＴＲ及び４ＺＴＳ、分解能２．８〜２．９Åを指す。オーロラＡの触媒ポケットは７７（ａ）、９（ｂ）及び８８（ｃ）に結合すると不活性配座を獲得する。下のパネルは化合物とタンパク質との相互作用の概略図を示す。破線は水素結合、特に阻害剤のアミノピリジン部分とヒンジ領域（Ａ２１３）との相互作用、ならびにアニオン性カルボキシル基又はテトラゾール基とＲ１３７及びＲ２２０のグアニジニウム基との相互作用を示す。疎水性相互作用に関与する残基は円弧で強調する。
【図３】有糸分裂紡錘体におけるオーロラＡの局在化を９が阻害することを示す写真。化合物９で一晩処理し、ＤＮＡ（青）、オーロラＡ（緑）及びＴＰＸ２（赤）について染色したＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞の典型的な画像。ＴＰＸ２は対照細胞内でオーロラＡと共局在する（最上段）。９は紡錘体微小管でのオーロラＡ局在化を阻害するが、中心体オーロラＡには影響を及ぼさない。オーロラＡは中心体でも存在するが、１（ＭＬＮ８２３７）で処理した細胞内の紡錘体微小管には存在しない。
【図４ａ】阻害剤９がオーロラＢの機能を損なうことなく細胞内でオーロラＡ特異的阻害表現型を産生することを示す画像。表示した化合物と共に一晩インキュベートした後のＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞の典型的な画像。ｐＴｈｒ２８８オーロラＡ（赤）、α‐チューブリン（緑）、及びＤＮＡ（青）について細胞を染色した。分裂中期プレート上の染色体の配置不良は、白い矢印で示す。
【図４ｂ】指示化合物と一晩インキュベートし、ｐＨｉｓ‐Ｈ３（赤）及びＤＮＡ（青）で染色した後のＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞の典型的な画像
【図４ｃ】１００ｎＭのノコダゾールを用いて前中期に同調させ、表示した阻害剤で処理した細胞由来の溶解液のウエスタンブロット画像。β‐アクチンを負荷対照として使用した。
【図４ｄ】表示した化合物で４８時間処理した細胞のＤＮＡ含有量分析グラフ。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【図５ａ】グルタチオン（ＧＳＨ）に対する９のインビトロ反応性を示す説明図。阻害剤９（３０μＭ）を、ｐＨ＝７．０のＨ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（４：１）中でＧＳＨ（５ｍＭ）と共にインキュベートし、反応させ、次いでＬＣ‐ＭＳを行った。修飾類似体の反応スキーム及び構造。
【図５ｂ】ｔ＝０時間及びｔ＝１４時間後の反応混合物のＬＣクロマトグラム。保持時間ｔret＝１．２９分で形成した生成物は９のＧＳＨ付加物として、ＭＳにより同定する。９‐メチルカルバゾール（ｔret＝２．４４分）を内部標準として使用した。
【図５ｃ】ｔret＝１．７８分で化合物９の吸収ピーク（３１０ｎｍ）の積分によって判定される、反応過程中の化合物９の濃度グラフ。２つの独立した実験の平均を示しており、ＳＤは全データ点で＜５％である。
【図５ｄ】ＨＴＲＦ生化学アッセイでのオーロラＡ阻害の表
【図５ｅ】表示した濃度で９又はｒａｃ‐９２と共に一晩インキュベートした細胞の細胞ｐＴｈｒ２８８オーロラＡレベルのグラフ。実験を２回繰り返し、エラーバーはＳＤを表す。誘導体ｒａｃ‐９２は生化学的アッセイにおいてＩＣ50が２４ｎＭであるが、細胞内のｐＴｈｒ２８８レベルを低下させることはない。数値は２回の独立した実験の平均ＩＣ50±ＳＤを表す。
【図６】既知のオーロラ阻害剤の構造及びＩＣ50値を示す説明図
【００８５】
実験
本明細書に開示の化合物は、Ｋｉｌｃｈｍａｎｎら（Ｋｉｌｃｈｍａｎｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  第５９号、７１８８〜７２１１頁（非特許文献５）、特にスキーム１〜４、７１９１頁の段落「合成」、及び７１９７頁の実験の項を参照されたい）に従って合成する。反応スキーム（２）及び（３）は、Ｋｉｌｃｈｍａｎｎら（非特許文献５）に記載の反応を要約したものである。同様に、同等の化合物が合成可能である。
【００８６】
式（１ａ）の化合物を反応スキーム（２）に従って合成する。温度及び反応時間は、Ｒ1がメチルでありＲ2がエチルである化合物に最適である。他の置換基については、温度及び反応時間を適切に調整するか、又はそれに応じて他のパラメータを変えることが必要となる可能性がある。
【００８７】
スキーム（２）の反応工程は以下の通りである：
工程１：Ｒ1n‐アニリンのＥｔＯＨ溶液をＲ2‐イソチオシアネートで処理し、７８℃で１２時間撹拌する。次いで溶液をＮａＯＡｃ及びクロロ酢酸エチルで処理し、７８℃で更に５時間撹拌する。ＥｔＯＨを真空中で蒸発させ、粗生成物を油状物として提供する。
【００８８】
工程２：工程１の粗反応生成物とピペリジンのＥｔＯＨ溶液をｔｅｒｔ‐ブチル（４‐ホルミル‐ピリジン‐２‐イル）カルバメートで処理し、７５℃で１５時間撹拌する。溶液を０℃に冷却し、濾過する。フィルター上の固体を氷冷ＥｔＯＨで洗浄し、ＴＦＡに添加する。４時間後、溶液をＨ2Ｏ及びＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、ＮａＯＨで中和する。有機相をＨ2Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ4・２Ｈ2Ｏで乾燥させ、真空中で蒸発させて固体生成物を提供する。
【００８９】
工程３ａ：Ｌがアルキルである化合物を得るために、工程２の反応生成物とピリジンとの溶液をＢｏｃ保護アミノカルボン酸（例えば、Ｎ‐（ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニル）‐３‐アミノプロピオン酸）で処理し、一晩撹拌する。次いで、溶液をＥｔＯＡｃで処理し、Ｈ2Ｏで洗浄し、真空中で蒸発させる。粗生成物をＴＦＡ／ＴＨＦ（１：１）に再溶解し、５時間撹拌する。次いで混合物をＨ2Ｏで希釈し、ＮａＯＨで中和する。有機相をＨ2Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ4・２Ｈ2Ｏで乾燥させ、真空中で蒸発させ、凍結乾燥後に固体生成物を提供する。カルボン酸を得るためには、ｔｅｒｔ‐ブチル‐カルボン酸（例えば、ｔｅｒｔ‐ブチルマロン酸）を使用してもよい。
【００９０】
あるいは、工程２の反応生成物、ピリジン、及びＲ4に対応する無水物の溶液を使用する。例えば、無水コハク酸を添加し、１２時間撹拌する。ＥｔＯＡｃを添加した後、有機相を１ＭのＨＣｌ、鹹水及びＨ2Ｏで洗浄する。溶媒を真空中で蒸発させ、粗生成物をＲＰ‐ＨＰＬＣにより精製し、固体生成物を提供する。
【００９１】
無水グルタル酸の場合、工程２の反応生成物、ピリジン及び無水物の溶液を１００℃まで１時間加熱する。沈殿物を濾過し、ＥｔＯＡｃ及びＨ2Ｏで洗浄する。生成物を高真空中で一晩乾燥させ、固体生成物を提供する。
同様に他の化合物が製造可能である。
【００９２】
工程３ｂ：Ｌがアリール又はヘテロアリールである（両方ともスキーム中では「Ａｒ」と称する）化合物を得るために、工程２の生成物、Ｐｄ2（ｄｂａ）3、キサントホス、Ｃｓ2ＣＯ3及びＡｒ‐Ｂｒが入ったフラスコに、アルゴン下で脱気ジオキサンを添加する。懸濁液を脱気し、アルゴンを再充填し（５回）、次いで１００℃まで加熱した。反応混合物を１００℃で一晩撹拌した後、室温に冷却し、濾過し、真空中で濃縮した。粗化合物をＦＣにより精製し、固体生成物を提供する。同様に他の化合物が生成可能である。
【００９３】
【化３】
2020508969.tif 000005
【００９４】
スキーム（２）：式１（ａ）の化合物の合成
式（１ｂ）の化合物は反応スキーム（３）に従って合成する。反応はスキーム（２）に従って合成した分子から開始する。
【００９５】
【化４】
2020508969.tif 000006
【００９６】
スキーム（３）：式１（ｂ）の化合物を得るための式１（ａ）の化合物の還元
式１（ｂ）の化合物はラセミ混合物である（＊は立体中心である）。
【実施例】
【００９７】
チアゾリジノン阻害剤
本発明者らは、化合物７から出発してフェニルイミノ‐チアゾリジノンを調べた（図１ａ）。初期のＳＡＲプロファイリングから、８でのＮ‐フェニル置換基の変形体において最適化できる可能性が示され（図１ａ）、また、その位置にアルキル、ハロゲン、ヒドロキシもしくはメトキシ置換フェニル環又は３‐ピリジル環を有する７の数種の類似体が不活性であることから４‐ピリジン環の本質的役割が指摘された。追加の類似体を調べ、８による活性の初期増加が更に改善され得るか否かを試験した（図１ａ）。活性プロファイリングから、８の最適な４‐エチルフェニルイミノ置換基（６３〜７０及び９３、図１ａ）が確認され、チアゾリジノンの環内窒素原子上には小型のアルキル置換基（７５〜７８、図１ａ）が必要であることが確認された。更に、７６及び７８の結晶構造により、チアゾリジノン核の両環外二重結合のＺ立体化学が確立された。
【００９８】
オーロラＡと複合した７７の別の結晶構造（図２）から、アシル基又は芳香族基で置換した２‐ピリジル位置にアミノ基を配置することによりヒンジ結合相互作用が促進される可能性が示唆された。このアプローチにより顕著な有効性増加が実際得られ、Ａｒｇ１３７と相互作用すると予想されるカルボキシレート又はテトラゾール基での置換基を示す８１〜８３及び８７、９及び８８でナノモル値が低値になった（図１ｂ）。
【００９９】
これらの阻害剤は、その生理学的活性化剤ＩＮＣＥＮＰと複合的に使用するオーロラＢに対してオーロラＡには顕著に選択的であった。更に詳細に分析を行うため、最も強力な阻害剤９（オーロラＡに結合するにはＩＣ50＝２±０．５ｎＭ、ＩＮＣＥＮＰとの複合体においてオーロラＢに結合するにはＩＣ50＝１４９±３ｎＭ）を選択した。何故ならこの化合物は細胞上で試験する場合でも最も強力だからである（下記参照）。活性部位特異的結合競合アッセイを用いた４５６キナーゼのカイノームスキャン（Ｆａｂｉａｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００５年、第２３号、３２９〜３３６頁（非特許文献６））に続いて、結合親和性の判定は、９が著しく選択的であり、オーロラＡ（ＫD＝５ｎＭ）、オーロラＢ（ＩＮＣＥＮＰ無し、ＫD＝１０ｎＭ）及びオーロラＣ（ＫD＝１１ｎＭ）にのみ強く結合することを示した（Ｋａｒａｍａｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８年、第２６号、１２７〜１３２頁（非特許文献７））。なお、生化学的阻害及び結合親和性の測定は両方とも、Ｔ２８８で自己リン酸化する遊離オーロラＡを用いて行い、同等の値を示したことに留意されたい。これに対して、オーロラＢの生化学的阻害は、キナーゼ単独では不活性であることからそのアクチベータータンパク質ＩＮＣＥＮＰとの複合体で測定し、阻害は遊離オーロラＢで測定したＫD値と比較して１５倍弱かった。
【０１００】
活性化タンパク質ＴＰＸ２を排除するオーロラＡへの９の結合
原子レベルでの阻害機序を理解するために、本発明者らは、最も高い親和性の阻害剤９、及びそのフェニルテトラゾール類似体８８（ＰＤＢコード４ＺＴＱ、４ＺＴＲ及び４ＺＴＳ、解像度２．８〜２．９Å、図２）を用いて、初期のＳＡＲ研究から、７７との複合体中のオーロラＡの結晶構造を解明した。３種全ての阻害剤は、アデニン結合領域内のＡＴＰポケット（Ｌｅｕ１３９、Ｖａｌ１４７、Ａｌａ１６０、Ｌｅｕ２６３）に結合し、疎水性裏ポケット（Ｌｅｕ１９４、Ａｒｇ１９５、Ｌｅｕ１９６、Ｌｅｕ２１０、Ｐｈｅ２７５）を占領する。阻害剤は、他のオーロラＡ阻害剤複合体（ＰＤＢコード４ＪＢＱ、４ＪＡＩ、２Ｊ５Ｏ、２ＢＭＣ、３Ｐ９Ｊ、３Ｒ２２、３ＦＤＮ、３Ｋ５Ｕ、及び４ＢＯＧ）にも見られる不活性ＤＦＧモチーフ配座を誘導し、これは以下の４つの特徴的な特性を有する：（１）Ｒ‐スパイン（残基Ｌｅｕ１９６、Ｇｌｎ１８５、Ｐｈｅ２７５、Ｈｉｓ２５４、及びＡｓｐ３１１）の破壊、（２）活性状態と比較したαＣヘリックスの外側への変位（約２．５Å）、（３）Ｌｙｓ１６２とＧｌｕ１８１との間の塩橋の欠如、及び（４）Ａｓｐ２５６‐Ｔｈｒ２９２‐Ｌｙｓ２５８水素結合ネットワークの破壊。
【０１０１】
この配座では、Ａｓｐ２７４はＡＴＰポケットから離れて位置しており、Ｐｈｅ２７５は上方に回転し、それにより阻害剤のフェニルイミノ部分と接触する。更に、Ｔｒｐ２７７（又は、９の場合はＨＲＤモチーフのＡｒｇ２５５）は、従来のＤＦＧ‐ｉｎ又はＤＦＧ‐ｏｕｔ配座とは明らかに異なる配置の、オーロラキナーゼに特異的であるＧｌｎ１８５及びＡｓｐ２７４とＨ結合を形成し、これにより阻害剤選択性に寄与すると考えられる。阻害剤のピリジン／アミノピリジン基は、ヒンジ領域においてＡｌａ２１３と１又は２個の水素結合に関与する。最終的に、９の末端カルボキシレートは、オーロラＡ（ＰＤＢコード２Ｘ８１）に結合した構造中のアリセチルブに類似したＡｒｇ１３７及びＡｒｇ２２０と塩橋を形成する。従ってこのことは７７と比較して９のより強い親和性を説明するものである。
【０１０２】
オーロラＡでは、ＤＦＧモチーフにＴｒｐ２７７が続く。トリプトファン蛍光実験から、結晶構造の検査に示唆されるように、９とその類似体７７及び８８が結合するとＴｒｐ２７７の環境が混乱することが示され、ＤＦＧループ及びＴｒｐ２７７の再配置と、これらの阻害剤の結合時に生じるＧｌｎ１８５との相互作用を反映している。このことから、ＤＦＧモチーフの再配置もまた溶液中で起こることが示唆された。これらの結晶構造の更なる分析から、この再配列が、微小管関連活性化因子タンパク質ＴＰＸ２（ＰＤＢコード１０Ｌ５又は４Ｃ３Ｐ）への結合時に発生するαＣヘリックスの回転と、それに続くＬｙｓ１６２とＧｌｕ１８１間の塩橋形成とを両立できないことが示された。
【０１０３】
この仮説を検証するために、本発明者らは、マイクロスケール熱泳動（ＫD＝７９５±１２９ｎＭ）を用いて標識ＴＰＸ２1‐43へのオーロラの結合を測定した。本発明者らは、３回の独立した測定において、この結合が過剰な９の存在下で実際に無効化されることを見出した。９とＴＰＸ２との間の不適合性は、他の報告と同様のオーロラＡ活性の３倍の増加を誘導したＴＰＸ２結合が、９による阻害をＩＣ50＝２．０ｎＭからＩＣ50＝１．４μＭまで減少させたという事実により更に証明された。対照のヒト細胞では、ＴＰＸ２はオーロラＡが紡錘体微小管へ局在化することは促進するが中心体への局在化は促進しない。これらの知見から、９の添加により局在化が厳密に紡錘体微小管上で起こることを防止できる可能性が高まった。実際、本発明者らは、オーロラＡは９の存在下で中心体に局在したままであるが、アリセチブ（１）の場合のように、紡錘体微小管から顕著に変位することを見出した（図３）。
【０１０４】
細胞内でオーロラＡを選択的に阻害する化合物９
本発明者らは、ヒト組織培養細胞の有糸分裂進行に対する９の影響を試験することに着手した。基準阻害剤１（アリセチブ）でも観察されるように、また有糸分裂を経て適時に進行させるためのオーロラＡの役割から予測されるように、９でＨｅＬａ細胞を処理すると結果的に、有糸分裂指数が用量依存的に増加した。有糸分裂指数は４μＭの９での約１５％から、１０μＭの９での約２５％を経て、２５μＭの９での約４０％に増加した。０．２５μＭのアリセルチブでは結果として有糸分裂指数は約３０％になった。阻害剤９はまた、オーロラＡキナーゼ活性を示す自己リン酸化部位であるオーロラＡ  Ｔｈｒ２８８のリン酸化も減少させた（ＩＣ50＝７６０ｎＭ）。更に、適切な紡錘体動態のためのオーロラＡ活性の要件に則し、９は、６μＭの表現型ＥＣ50値で分裂中期に不良染色体配置を誘導した（図４ａ）。４μＭの阻害剤９でＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞中約２０％の不整列染色体が観察された。１０μＭ及び２５μＭの９で、それぞれ約８０％及び約８５％の不整列染色体が検出された。０．２５μＭのアリセルチブでほぼ１００％の不整列染色体が観察された。
【０１０５】
オーロラＡキナーゼ阻害剤の多くはまた、細胞状況でオーロラＢを標的とする。このことが９の場合にも当てはまるか否かを検討するために、オーロラＢによる初期有糸分裂中に付与されるヒストン修飾であるホスホ‐ヒストンＨ３  Ｓｅｒ１０の分布を調査した。本発明者らは、９で処理した細胞ではこの特徴が変化しないままであるのに対し、オーロラＢ阻害剤ＺＭ４４７４３９（９４）で処理した細胞では存在しないことを見出した（図４ｂ／ｃ）（Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００３年、第１６１号、２６７〜２８０頁（非特許文献８））。更に、９４での処理の際にフローサイトメトリーにて観察した８Ｎ及び１６ＮのＤＮＡ含有量を持つ細胞の大量蓄積は、オーロラＢ不活性化後の不良細胞質分裂を証明するものであり、９を１０μＭで供給した場合でも発生しなかった（図４ｄ）。本発明者らは、基準阻害剤アリセルチブを含む他のオーロラＡ阻害剤とは対照的に、阻害剤９は細胞内のオーロラＢ活性に影響を及ぼさないことを結論付けた。
【０１０６】
ヒト細胞に対する９の効果がオーロラＡ阻害に特異的であるか否かを明解に試験するために、本発明者らは、結晶構造の試験で９に非感受性であると予測されたＧＦＰ‐オーロラＡ‐Ａｒｇ１３７Ａｌａ又はＧＦＰ‐オーロラＡ‐Ｔｒｐ２７７Ａｌａ変異体を発現する細胞を用いて表現型レスキュー実験を行った。本発明者らは、これらのタンパク質が９の添加に非感受性であることを見出した。このことはこの化合物により通常誘導される表現型が実際にオーロラＡ阻害に引き起こされることを実証するものであった。
【０１０７】
グルタチオンと中程度の反応性を示す化合物９
オーロラＡに対して高い選択性があるにもかかわらず、９の細胞活性（ＥＣ50＞１μＭ）はその生化学的活性（ＩＣ50＝２ｎＭ）よりはるかに弱かった。この低い活性が９の求電子性二重結合の共有結合反応により生じる可能性があるか否かを知るために、本発明者らは生理学的条件下で細胞内求核剤グルタチオン（ＧＳＨ）に対する９の反応性を測定した。ＧＳＨ付加物への変換は実際に検出されたが、程度は限られ（５ｍＭのＧＳＨを用い、ｐＨ７．４、３７℃、２４時間後では５０％変換、図５）、細胞内で阻害剤のかなりの部分が未反応のままであり、オーロラＡの阻害に利用可能であることが示唆された。にもかかわらず、求電子性二重結合の無い９の類似体を代替物として調べた。ジアステレオ異性シクロプロパンｒａｃ‐８９／ｒａｃ‐９０は、それらの前駆体７９より４００倍以上活性が低かった。一方、その還元型二重結合類似体ｒａｃ‐９１はわずか７倍活性が低いだけであり、９の還元型二重結合類似体ｒａｃ‐９２もまた依然として非常に強力であった（ＩＣ50＝２４ｎＭ）。しかしこの誘導体は、ＧＳＨ付加物を形成できないにもかかわらず、細胞内でいかなる活性も示さなかった。
【０１０８】
総括すると、これらのデータから、上記に示したオーロラＡ及びＢに対する９の細胞活性ｖｓ生化学的活性のＩＣ50値間の矛盾（オーロラＡ：生化学ＩＣ50＝２．０ｎＭ、細胞ＩＣ50（ｐＴ２８８）＝７６０ｎＭ、オーロラＢ／ＩＮＣＥＮＰ：生化学ＩＣ50＝１４９ｎＭ、細胞ＩＣ50（ｐＨ３）＞２５μＭ）を説明するにはＧＳＨ反応性では不十分であることが示唆されている。この活性の差は恐らく、インビトロアッセイ（２０μＭ）と比較して細胞内ＡＴＰ濃度が高いという結果（１ｍＭ）や、ＴＰＸ２などの競合リガンドの存在（図４ｄ）、ならびに細胞取込を減少させる可能性のあるカルボキシレート基の存在にあると考えられる。同じ効果が恐らく、阻害剤１（オーロラＡ：生化学ＩＣ50＝０．０４ｎＭ、細胞ＩＣ50（ｐＴ２８８）＝６．７ｎＭ、オーロラＢ／ＩＮＣＥＮＰ：生化学ＩＣ50＝１．１ｎＭ、細胞ＩＣ50（ｐＨ３）＝１．５μＭ）、ならびに別のオーロラＡ選択的阻害剤であるＭＫ‐５１０８（オーロラＡ：生化学ＩＣ50＝０．０６４ｎＭ、細胞ＩＣ50（ｐＴ２８８）＝３００ｎＭ、オーロラＢ／ＩＮＣＥＮＰ：生化学ＩＣ50＝１．４９ｎＭ、細胞ＩＣ50（ｐＨ３）＞１０μＭ）について報告された弱い細胞活性ｖｓ生化学的活性を説明していると考えられる。
【０１０９】
材料及び方法
化学．試薬は全て商業者から購入し、精製を加えることなく使用した。シリカゲル６０（Ｆｌｕｋａ、０．０４０〜０．０６３ｎｍ、２３０〜４００メッシュ、ＡＳＴＭ）を用いてフラッシュクロマトグラフィー精製を実施した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ上でポジティブモードの電子スプレーイオン化（ＥＳＩ‐ＭＳ）により低分解能質量スペクトルを得た。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ上で記録されたポジティブモードの電子スプレーイオン化（ＨＲ‐ＥＳＩ‐ＭＳ）により高分解能質量スペクトルを得た。1Ｈ及び13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ３００分光計（それぞれ３００ＭＨｚ及び７５ＭＨｚ）、又はＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩ  ４００分光計（それぞれ４００ＭＨｚ及び１０１ＭＨｚ）上で測定した。溶媒シグナルに対して1Ｈ及び13Ｃ化学シフトを見積もり、共鳴多重度はｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット）、ｑ（クワルテット）、ｐ（ペンテット）及びｍ（マルチプレット）；ｂｒ＝ブロードピークとして報告する。化合物純度は、２５４ｎｍ又は３１０ｎｍの検出波長で分析逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）により評価した。試験化合物の純度は全化合物で＞９５％であった。分析ＲＰ‐ＨＰＬＣは、Ｄｉｏｎｅｘ  Ａｃｃｌａｉｍ  ＲＳＬＣ  １２０カラム（Ｃ１８、３．０×５０ｍｍ、粒径２．２μｍ、１２０Å孔径）を使用したＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣシステム（ＤＡＤ‐３０００  ＲＳフォトダイオードアレイ検出器）上、１．２ｍＬ／ｍｉｎ-1の流速で行った。データを記録し、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（バージョン６．８）及びＸｃａｌｉｂｕｒ（バージョン２．２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で処理した。分析ＲＰ‐ＨＰＬＣの溶離剤は以下の通りであった：（Ａ）０．０５％ＴＦＡを含有するｍｉｌｌｉＱ脱イオン水、及び（Ｄ）０．０５％ＴＦＡを含有するＨＰＬＣグレードのアセトニトリル／ｍｉｌｌｉＱ脱イオン水（９：１）。分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：Ａ／Ｄ（７：３）から１００％Ｄ（２．２分）、続いて１００％Ｄ（１分）。予備ＲＰ‐ＨＰＬＣは、Ｒｅｐｒｏｓｐｈｅｒ１００カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社、Ｃ１８‐ＤＥ、１００×３０ｍｍ、粒径５μＭ、孔径１００Å）、及び２１４ｎｍで動作するＷａｔｅｒｓ４８９Ｔｕｎａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣ４０００  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより行った。分取ＲＰ‐ＨＰＬＣの溶離剤は以下の通りであった：（Ａ）０．１％ＴＦＡを含有するｍｉｌｌｉＱ脱イオン水、及び（Ｄ）０．１％ＴＦＡを含有するＨＰＬＣグレードのアセトニトリル／ｍｉｌｌｉＱ脱イオン水（９：１）。
【０１１０】
化合物１、７、９、６３〜７０、７５〜８１、８４〜８６、８８、９３及びｒａｃ‐８９〜９２を以下のように分析した：Ａ／Ｄ（７：３）から１００％Ｄ（２．２分）、続いて１００％Ｄ（１分）；２５４ｎｍでの検出。これらの化合物の保持時間は１．０２分〜２．３３分の範囲であった。
【０１１１】
化合物８、８２、８３及び８７を以下のように分析した：Ａ／Ｄ（７：３）から１００％Ｄ（２．２分）、続いて１００％Ｄ（１分）；３１０ｎｍでの検出。これらの化合物の保持時間は１．４３分〜１．８５分の範囲であった。
【０１１２】
図１に示す化合物は、Ｋｉｌｃｈｍａｎｎら（Ｋｉｌｃｈｍａｎｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、第５９号、７１８８〜７２１１頁、特にスキーム１〜４、７１９１頁の段落「合成」、及び７１９７頁の実験の項を参照のこと（非特許文献５））に従って合成した。
【０１１３】
オーロラＡ精製．ヒトオーロラＡキナーゼドメインのクローン（ｐＥＴ２４‐ｄベクター中の残基１２２〜４０３）はＭｏｎｔｏｙａ研究所（コペンハーゲン大学）から無償で提供された。構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ細胞に形質転換し、タンパク質発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて２０℃で１２時間誘導した。細胞を４℃、２５分間の６，０００×ｇで回収し、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス‐ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁した。細胞破壊は氷上で冷却する超音波処理により行い、その後、１１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離を行って破片を除去した。オーロラＡは、製造業者の取扱説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ社製のＮｉＮＴＡ樹脂を使用し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ローディング後、樹脂を溶解緩衝液で洗浄し、続いて６％溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス‐ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ＝８．０）で２回目の洗浄を行った。タンパク質を１００％溶出緩衝液で溶出した。溶出液をＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて最終緩衝液（２０ｍＭのトリス‐ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ＝８．０）に交換した。Ｈｉｓタグの切断はＴＥＶプロテアーゼにより４℃で一晩行った。タグ及び少量の不純物を２回目のニッケルアフィニティークロマトグラフィー工程で除去した。最終緩衝液中で平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより、凝集オーロラＡと可溶オーロラＡとを分離した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ‐１５濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて可溶オーロラＡを濃縮した。タンパク質濃度はＵＶ吸光度により判定した。オーロラＡを液体窒素中で急速冷凍し、−１８℃で保存した。
【０１１４】
ＨＴＲＦキナーゼアッセイ．オーロラＡ及びオーロラＢキナーゼは、Ｃｉｓｂｉｏ社（フランス）製の均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）ＫｉｎＥＡＳＥ  ＳＴＫ２キットを用いてアッセイした。上記のように発現及び精製したオーロラＡについて、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．０２％のＮａＮ3、０．１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、０．０１％のＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、１ｍＭのＤＴＴ）中の３ｎＭのオーロラＡキナーゼドメイン、１μＭのビオチン化ＳＴＫ２基質及び２０μＭのＡＴＰ（約Ｋm）、ならびに試験化合物又はＤＭＳＯ対照（最終ＤＭＳＯ濃度は２％）のいずれかを用いて酵素反応（総量１０μＬ）を行った。オーロラＢについては、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．０２％のＮａＮ3、０．１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、０．０１％のＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、１ｍＭのＤＴＴ）中の８ｎＭのオーロラＢ／ＩＮＣＥＮＰ複合体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｎｏ．１４‐８３５）、１μＭのビオチン化ＳＴＫ２基質、２０μＭのＡＴＰ（Ｋｍ＝２６μＭ）、ならびに試験化合物又はＤＭＳＯ対照（最終ＤＭＳＯ濃度は２％）のいずれかを用いて酵素反応（総量１０μＬ）を行った。両酵素について、反応を室温で３０分間行い、ＥＤＴＡ、ユウロピウムクリプテートで標識した抗ホスホ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒ抗体、及びＸＬ‐６６５共役ストレプトアビジン（最終濃度６２．５ｎＭ）を含有する１０μＬの検出緩衝液を添加して反応を停止した。室温で１時間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯマイクロプレートリーダー（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ３８４ウェルプレート、白色、非結合、小量）を用いて３１７ｎｍでの励起（ラグタイム６０μｓ、積分時間５００μｓ）の後に６２０ｎｍ（ユーロピウムクリプテート）及び６６５ｎｍ（ＸＬ‐６６５）で蛍光を測定した。各ウェルで蛍光比（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ）を計算し、結果を以下のように表した：特異的シグナル＝比（試料）−比（陰性対照）、式中、比＝６６５ｎｍ／６２０ｎｍ×１０4。ゼロから完全阻害までの濃度範囲をカバーする１０種の異なる濃度で、３倍連続希釈により化合物を測定した。各濃度を二重に測定し、各ＩＣ50値について２つの独立した判定を行った。４パラメータロジスティックモデル（ＩＤＢＳ社製ＸＬｆｉｔ）を用いてＩＣ50曲線を作成した。
【０１１５】
カイノームプロファイリング．ＤｉｓｃｏｖｅＲｘにより化合物９のカイノームプロファイリングを行った。合計４５６種のキナーゼをアッセイした（ｓｃａｎＭＡＸ）。ほとんどのアッセイで、キナーゼでタグ付けしたＴ７ファージ株を、ＢＬ２１株由来の大腸菌宿主中、２４ウェルブロック内で並行して増殖させた。大腸菌を対数増殖期まで増殖させ、凍結ストックのＴ７ファージに感染させ（感染多重度＝０．４）、溶解するまで３２℃で振盪しながらインキュベートした（９０〜１５０分）。溶解物を遠心分離し（６０００ｇ）、濾過し（０．２μｍ）、細胞片を除去した。残りのキナーゼはＨＥＫ‐２９３細胞内で生成し、続いてｑＰＣＲ検出用のＤＮＡでタグ付けした。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを室温で３０分間ビオチン化小分子リガンドで処理し、キナーゼアッセイ用親和性樹脂を作成した。リガンド結合したビーズを過剰ビオチンでブロックし、ブロッキング緩衝液（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＤＴＴ）で洗浄し、未結合リガンドを除去し、非特異的ファージ結合を減少させた。１×結合緩衝液（２０％のＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、６ｍＭのＤＴＴ）中でキナーゼ、リガンド結合した親和性ビーズ、及び試験化合物を組み合わせることにより結合反応を組み立てた。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中の４０×ストックとして調製し、直接希釈してアッセイ液とした。反応は全て、最終量０．０４ｍｌになるようにポリプロピレン製３８４ウェルプレート中で実施した。アッセイプレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートし、親和性ビーズを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次にビーズを溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．５μＭの非ビオチン化親和性リガンド）に再懸濁し、室温で３０分間振盪しながらインキュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲにより測定した。化合物１１４を１μＭでスクリーニングし、一次スクリーン結合相互作用の結果を対照（ＰｏＣ）の％として報告した。ＰｏＣ＝（試験化合物シグナル−陽性対照シグナル）／（ＤＭＳＯシグナル−陽性対照シグナル）。全キナーゼについて１μＭの９のＰｏＣ値をＴＲＥＥｓｐｏｔ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社）により可視化した。ＫD値を判定するために、１００％ＤＭＳＯ中、１００×の最終試験濃度で９の１１段階３倍連続希釈液を調製し、続いてアッセイ液中に１倍に希釈した（最終ＤＭＳＯ濃度＝１％）。ＫD値は、Ｈｉｌｌ式により標準用量反応曲線で判定した。
【０１１６】
結晶化、構造解明及び精密化．オーロラＡキナーゼドメインを１５０μＭに濃縮し、ＭｇＳＯ4及び対応する化合物（ＤＭＳＯに溶解）と、それぞれ最終濃度２ｍＭ及び１５０μＭになるように混合した。氷上で１５分間複合体をインキュベートした後、結晶化実験を開始した。１８℃でハンギングドロップ蒸気拡散法を行い、１μｌのサンプル溶液と１μｌのリザーバ溶液とを混合し、５００μｌのリザーバ溶液に対して平衡化することにより結晶を得た。凍結保護下、液体窒素中で結晶を急速冷凍した。各複合体で見出された結晶化溶液は以下の通りであった：７７／オーロラＡでは０．３Ｍのクエン酸アンモニウム二塩基性、２５％のＰＥＧ３３５０（凍結保護剤として添加した１０％のＭＰＤ）；９／オーロラＡでは０．１ＭのトリスｐＨ８．０、２８％のＰＥＧ４Ｋ（凍結保護剤として添加した２０％のグリセロール）：及び８８／オーロラＡでは５％のＭＰＤ、０．１ＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０％のＰＥＧ  １０Ｋ（凍結保護剤として添加した２０％のＭＰＤ）。
【０１１７】
スイスＶｉｌｌｉｇｅｎにあるＰａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔのＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅのビームラインＸ０６ＤＡでデータを収集した。但し、同様にＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅのビームラインＸ０６ＳＡで収集した７７／オーロラＡ複合体についてのデータセットは除外した。波長は１Åであり、温度は１００Ｋであった。データをＭＯＳＦＬＭ／ＳＣＡＬＡ（Ｅｖａｎｓ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２００６年、第６２号、７２〜８２頁（非特許文献９）；Ｌｅｓｌｉｅら、Ｎａｔｏ  Ｓｃｉ  Ｓｅｒ  ＩＩ  Ｍａｔｈ、２００７年、２４５頁（非特許文献１０））、又はＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ  Ｘｄｓ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、１２５〜１３２頁（非特許文献１１））で集積及びスケーリングした。テンプレートとしてリガンドを用いずに、ＣＣＰ４（Ｗｉｎｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１１年、第６７号、２３５〜２４２頁（非特許文献１２））及びＰＢＤ１ＯＬ５中のＰｈａｓｅｒを使用して分子置換により構造を解明した。非対称単位当たり１分子で、Ｐ６1２２空間群において全複合体が結晶化した。第１回目の剛体精密化を行い、続いてシミュレーティッドアニーリングを行った（Ａｄａｍｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、２１３〜２２１頁（非特許文献１３））。化合物の存在は初期電子密度図に示された。これらはＰｈｅｎｉｘ社製ＬｉｇａｎｄＦｉｔを用いて適合させた（Ａｄａｍｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、２１３〜２２１頁（非特許文献１３））。その後、収束するまで、数回の精密化（Ｐｈｅｎｉｘ及びＲｅｆｍａｃ５（Ｗｉｎｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１１年、第６７号、２３５〜２４２頁（非特許文献１２））（ＴＬＳを使用する）及びモデル構築（Ｃｏｏｔ）（Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ、２０１０年、第６６号、４６８〜５０１頁（非特許文献１４））を行った。最終モデルにはＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ外れ値は無く、Ｎ末端及びＣ末端でそれぞれ８及び１５残基を欠いている。また、７７、９及び８８の構造を有するオーロラＡの複雑な構造において、活性化ループ中に１３残基が見られなかった（残基２７９〜２９１）。図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ、Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２年）、Ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ（非特許文献１５））及びＬｉｇｐｌｏｔ（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、１９９５年、第８号、１２７〜１３４頁（非特許文献１６））を用いて編集した。
【０１１８】
ＴＰＸ２精製．ＧＳＴ及びＴＥＶ切断部位の後続のヒトＴＰＸ２  Ｎ末端ドメイン（残基１〜４３）のクローンは、Ｃｏｎｔｉ研究所（ＭＰＩ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）から無償で入手した。０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて２０℃で１２時間、大腸菌ＢＩ２１（ＤＥ３）細胞内でＴＰＸ２タンパク質を発現させた。細胞を破壊し、可溶画分を上記で説明したように単離した。ＴＰＸ２は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス、ｐＨ＝７．５で平衡化したＧＳＴｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製した。ＧＳＴ‐ＴＰＸ２は、１０ｍＭの還元型グルタチオンを添加した最終緩衝液を用いて溶出した。ＴＥＶプロテアーゼを用いて４℃で一晩かけてＧＳＴタグを切断した。最終緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーの最終工程でＴＰＸ２（１〜４３）を単離した。タンパク質濃度はＵＶ吸光度により判定した。ＴＰＸ２を液体窒素中で急速冷凍し、−１８℃で保存した。
【０１１９】
マイクロスケール熱泳動．Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５タンパク質標識キットＲＥＤ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＴＰＸ２を標識した。製造業者の取扱説明書に従い、濃度４４μＭのペプチドを添加した添付の標識化緩衝液中、室温で３０分かけて標識化を行った。最終緩衝液及び０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて標識ＴＰＸ２を４００ｎＭに調整した。０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０を添加した最終緩衝液にリガンド含有又は非含有オーロラＡキナーゼを溶解し、ＤＭＳＯ／リガンド濃度を一定に保ちながら（それぞれ最終濃度０．５％及び１２５μＭ）、同一緩衝液中で一連の１２種の希釈液（１：１）を調製した。最終タンパク質濃度は４．４ｎＭ〜１５０μＭであった。熱泳動実験では、各タンパク質希釈液を等量の標識ＴＰＸ２と混合し、最終濃度を蛍光標識ＴＰＸ２では２００ｎＭ、リガンドでは１２５μＭ、オーロラＡでは２．２ｎＭ〜７５μＭにした。４℃で３０分間インキュベートし、９，６００×ｇで２分間遠心分離した後、溶液をＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ親水性キャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に充填した。熱泳動は、室温で５秒／３０秒／５秒のレーザオフ／オン／オフ時間で測定した。装置パラメータは、１５％のＬＥＤ強度及び８０％のＭＳＴ出力に調整した。３回の独立した測定のデータを、１０秒後に熱泳動シグナルを用いて分析した（ＮＴ．Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア、バージョン１．５．４１、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。オーロラＡが４．７μＭを超える測定点は排除した。
【０１２０】
細胞培養実験．１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）培地を含む高グルコースＤＭＥＭ中、３７℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内でＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞を培養した。プラスミドトランスフェクションするために、細胞を８０〜９０％コンフルエントの状態で播種した。１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに含まれる４μｇのプラスミドＤＮＡ及び１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中に含まれる４μｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を並行して５分間インキュベートし、２０分間混合し、各ウェルに添加した。全てのオーロラＡクローンは、全長オーロラＡをテンプレートとして適切なＰＣＲプライマー対を用いて構築した。増幅生成物をｐｃＤＮＡ３‐ＧＦＰベクターにサブクローニングした（Ｍｅｒｄｅｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０００年、第１４９号、８５１〜８６２頁（非特許文献１７））。適切なプライマーと共に部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｎｏ.２１０５１５）を用いてＧＦＰ‐オーロラＡR137A及びＧＦＰ‐オーロラＡW277Aを設計した。有糸分裂指数及び染色体不整列表現型を判定するために、分析前に、様々な濃度の化合物と共に細胞を２０時間インキュベートした。細胞を同様に、０．２５μＭのＭＬＮ８２３７（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社、Ｎｏ．Ｓ１１３３）又は５μＭのＺＭ４４７４３９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社、Ｎｏ．Ｓ１１０３）で処理した。フローサイトメトリー分析には、５０ｎＭのＭＬＮ８０３７及び２．５μＭのＺＭ４４７４３９を使用した。レスキュー実験では、初めにＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ細胞をＧＦＰ‐オーロラＡ、ＧＦＰ‐オーロラＡR137A又はＧＦＰ‐オーロラＡW277Aで２０時間かけてトランスフェクトし、続いて９と共に更に２０時間インキュベートし、その後、細胞を冷メタノールで固定し、染色した。細胞周期進行に対する化合物９の影響を評価するために、ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター）を用いてヨウ化プロピジウム染色後にＤＮＡ含有量を分析した。
【０１２１】
間接免疫蛍光法．免疫蛍光では、細胞を冷メタノール中で固定し、ＰＢＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０を添加したＰＢＳ）中で洗浄し、以下の一次抗体で染色した；１：２００ウサギ抗ｐＴ２８８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｃ３９Ｄ８）、１：２００ウサギ抗ｐＨ３Ｓ１０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｄ２Ｃ８）、１：５００マウス抗α‐チューブリン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６１２７０９）、１：３００マウス抗ＧＦＰ（ＭＡＢ３５８０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、１：２００抗ＴＰＸ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ｓｃ‐３２８６３）、及び抗オーロラＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、４５８９００）。二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５６８に結合した抗マウス、及びＡｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５６８に結合した抗ウサギであり、これらは全て１：５００で使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。６３×ＮＡ１．０油浸対物レンズを用いたＡｘｉｏｃａｍ  ＭＲｍ（Ｂ／Ｗ）ＣＣＤカメラを装備したＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡で共焦点画像を取得し、相対画像強度をシリーズ内に維持しながらＩｍａｇｅＪ及びＡｄｏｂｅ社のＰｈｏｔｏｓｈｏｐで画像処理した。
【０１２２】
自家トリプトファン蛍光．結合実験は、オーロラＡ（７７、９及び８８ではそれぞれ５００ｎＭ、３７５ｎＭ及び１５０ｎＭ）と、緩衝液（最終ＤＭＳＯ濃度１％）中の様々な濃度（０〜１００μＭ）の様々な化合物とを混合し、次いで室温で１５分間インキュベートすることにより行った。トリプトファン蛍光スペクトルは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社）、ならびにＣｏｒｎｉｎｇ９６ウェルハーフエリア、平底、非結合表面、ブラックポリスチレンプレートを用いて室温で記録した。２８４ｎｍ（帯域幅±５ｎｍ）で励起し、３４０ｎｍ（帯域幅±１０ｎｍ）発光した。タンパク質濃度が最も高いウェルからゲインを計算した。各測定は３重に行った。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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