(57)【要約】  細胞増殖を支持するためまたは持続的な薬物送達に使用するためのヒドロゲルの３Ｄ構造体は、架橋を介して硬いゲルに自己集合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体を用いて形成される。ヒドロゲル構造体は、３Ｄプリントに基づく方法を用いて形成される。ヒドロゲル前駆体は、カチオンを含む溶液中にペプチドの溶液を押出しすることによってヒドロゲルを生成する条件下で押出しされ、それによってカチオンはπスタック化ペプチドの架橋を可能にするか、またはそれをカチオンと共押出し、かつペプチドおよびカチオンは共押出し時点でのみ混合されることによって架橋を可能にする。ヒドロゲルの剛性は、ペプチドまたはそれらの組み合わせの選択、あるいは組み合わせの比率のいずれかによってペプチドの組み合わせを調整することによって、および／または存在するカチオンの比率を調整することによって調整され得る。
2020515537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリント方法であって、
ａ．非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体と活性化剤との混合物を含むインクを調製する工程、
ｂ．該インクを基材上にプリントする工程、および
ｃ．該インクをゲル化させる工程、
を含み、
該ヒドロゲル前駆体が複数のペプチド誘導体を含み、そして該活性化剤が架橋剤を含む、方法。
【請求項２】
前記インクを調製する工程が、前記ヒドロゲル前駆体と該活性化剤とをそれがゲル化し始めるように組み合わせること、およびゲル化する前に該ゲル化するインクをプリントすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インクを調製する工程が、前記ヒドロゲル前駆体と前記活性化剤とをそれが部分的にゲル化するように組み合わせることを含み、そして前記インクをゲル化させる工程が、ゲルが形成されるように、該部分的にゲル化したインクをさらなる活性化剤と組み合わせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インクが少なくとも１５０ｃＰの粘度を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記インクが少なくとも２５０ｃＰの粘度を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒドロゲル前駆体および活性化剤を別々のリザーバから同時プリントまたは共押出しする工程を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プリント方法であって、
ａ．非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体を含むインクを調製する工程、
ｂ．それを活性化剤と接触するように該インクをプリントする工程、および
ｃ．該インクをゲル化させる工程、
を含み、
該ヒドロゲル前駆体が複数のペプチド誘導体を含み、そして該活性化剤が架橋剤を含む、方法。
【請求項８】
前記活性化剤を含有する溶液中にプリントすることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒドロゲル前駆体および活性化剤を別々のリザーバから同時プリントまたは共押出しする工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチド誘導体が、芳香族ペプチドであるかまたは芳香族スタッキングリガンドである第３の成分に結合した少なくとも２つのペプチドを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化剤が、架橋剤、例えば、カチオンを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチド誘導体が以下の式Ｉ：
【化１】
2020515537.tif 000014
ここで、
ＡＳＬは、芳香族基を含む芳香族スタッキングリガンドであり、各ＧＡは独立してアミノ酸またはその誘導体であり、Ｘはアミノ酸またはその誘導体であり、ｎは０〜３の整数であり、そして該ペプチド誘導体は架橋カチオンの存在下でゲルを形成する、
のものである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＡＳＬがＦｍｏｃ、ＣＢｚ、芳香族アミノ酸、またはそれらの誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチド誘導体が以下の式Ｉａ：
【化２】
2020515537.tif 000015
ここで、
ＧＡ１は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）ならびにそれらの誘導体から選択され、
各ＧＡ２およびＸは、独立して
（１）中性アミノ酸アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、およびバリン（Ｖ）、正電荷を帯びたアミノ酸アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｋ）、ならびに負電荷を帯びたアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）、ならびにそれらの誘導体、ならびに
（２）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）ならびにそれらの誘導体、
から選択され、そして
ｎは０〜３の整数である、
のものである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドがペプチドの混合物を含み、そのうちのいくつかがリスト（１）由来のＧＡ２を含み、そしてそのうちのいくつかがリスト（２）由来のＧＡ２を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記インクがさらに細胞を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記インクがさらに活性剤を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記活性剤の持続送達のために、活性剤を含有する構造体をプリントする工程を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
細胞を含有する細胞支持構造体をプリントする工程を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ヒドロゲル前駆体のシートをプリントする工程を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
インクの第１層をプリントする工程、
該インクを部分的にゲル化させる工程、および。
該第１層と接触するインクの第２層をプリントする工程、
を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ゲル化したヒドロゲルが５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ゲル化したヒドロゲルが１０ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ヒドロゲル前駆体を含み、該ヒドロゲル前駆体が複数のペプチド誘導体を含み、そして架橋剤と接触してゲルを形成する、プリンタインク。
【請求項２５】
さらに細胞を含有する、請求項２４に記載のプリンタインク。
【請求項２６】
さらに活性剤を含有する、請求項２４または２５に記載のプリンタインク。
【請求項２７】
さらに架橋剤を含有する、請求項２４から２６のいずれかに記載のプリンタインク。
【請求項２８】
前記ペプチド誘導体が、芳香族ペプチドであるか、または芳香族スタッキングリガンドである第３の成分に結合した少なくとも２つのペプチドを含む、請求項２４から２７のいずれかに記載のプリンタインク。
【請求項２９】
ヒドロゲル前駆体および活性剤を含む、該活性剤の持続放出送達に使用するための組成物であって、該ヒドロゲル前駆体が複数のペプチド誘導体を含み、かつ架橋剤と接触してゲルを形成する、組成物。
【請求項３０】
前記ペプチド誘導体が、それぞれ独立して、芳香族ペプチドであるか、または芳香族スタッキングリガンドである第３の成分に結合した少なくとも２つのペプチドを含む、請求項２９に記載の使用のための組成物。
【請求項３１】
５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、請求項２９または３０に記載の使用のための組成物。
【請求項３２】
１０ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、請求項２９または３０に記載の使用のための組成物。
【請求項３３】
前記活性剤の前記持続放出は２日またはそれ以上の期間にわたる、請求項２９から３２のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項３４】
前記活性剤の前記持続放出は５日またはそれ以上の期間にわたる、請求項２９から３３のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項３５】
ヒドロゲル前駆体の患者への注射による請求項２９から３４のいずれかに記載の使用のための組成物であって、該ヒドロゲルがインサイチュでゲル化する、組成物。
【請求項３６】
ゲル化したヒドロゲルの患者への外科的挿入による請求項２９から３４のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項３７】
活性剤を患者に持続送達する方法であって、該活性剤を含むヒドロゲルまたは前駆体を該患者に投与する工程を含み、該ヒドロゲルまたは前駆体が複数のペプチド誘導体を含み、かつ架橋剤と接触してゲルを形成する、方法。
【請求項３８】
前記ペプチド誘導体が、それぞれ独立して、芳香族ペプチドであるか、または芳香族スタッキングリガンドである第３の成分に結合した少なくとも２つのペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒドロゲルが５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒドロゲルが１０ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記活性剤の前記持続放出が２日またはそれ以上の期間にわたる、請求項３７から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記活性剤の前記持続放出が５日またはそれ以上の期間にわたる、請求項３７から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
投与がヒドロゲル前駆体の患者への注射によるものであり、該ヒドロゲルがインサイチュでゲル化する、請求項３７から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
投与がゲル化したヒドロゲルの患者への外科的挿入によるものである、請求項３７から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチドが以下の式Ｉ：
【化３】
2020515537.tif 000016
ここで、
ＡＳＬは、芳香族基を含む芳香族スタッキングリガンドであり、各ＧＡは独立してアミノ酸またはその誘導体であり、Ｘはアミノ酸またはその誘導体であり、ｎは０〜３の整数であり、そして前記ペプチド誘導体が架橋カチオンの存在下でゲルを形成する、
のものである、請求項２９から３６のいずれかに記載の使用のための組成物、または請求項３７から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ＡＳＬが、Ｆｍｏｃ、ＣＢｚ、芳香族アミノ酸、またはそれらの誘導体である、請求項４５に記載の使用のための組成物または請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドが以下の式Ｉａ
【化４】
2020515537.tif 000017
ここで、
ＧＡ１は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）ならびにそれらの誘導体から選択され、
各ＧＡ２およびＸは、独立して
（１）中性アミノ酸アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、およびバリン（Ｖ）、正電荷を帯びたアミノ酸アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｋ）、ならびに負電荷を帯びたアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）、ならびにそれらの誘導体、ならびに
（２）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）ならびにそれらの誘導体
から選択され、そして
ｎは０〜３の整数である、
のものである、請求項４５または４６に記載の使用のための組成物、あるいは請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチドがペプチドの混合物を含み、そのうちのいくつかがリスト（１）由来のＧＡ２を含み、そしてそのうちのいくつかがリスト（２）由来のＧＡ２を含む、請求項４７に記載の使用のための組成物または請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
インクを押出し可能な押出機に連結された、請求項２４から２８のいずれかに記載のプリンタインクの容器を備える、細胞増殖支持構造体を作製するための装置。
【請求項５０】
押出しされた前駆体と接触するように前記薬剤を押出し可能な押出機に連結された、活性化剤の容器をさらに備える、請求項４９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、印刷法による三次元（３Ｄ）構造体の作製およびそのような構造体を用いた薬剤送達に関する。特に、本発明は、細胞および／または活性剤を含有する細胞増殖構造体を印刷すること、およびインビボ薬剤送達のための注射可能な構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
３Ｄバイオプリントは、３Ｄプリント技術を利用して、生体適合性材料、細胞および細胞培地などの支持成分から機能的な小型化された組織構築物を作製する。主な用途は、再生医療／組織工学用途に加えて、研究、創薬および毒物学のためのハイスループットインビトロ組織モデルにおける使用を含む。それは、機能成分の配置の空間的制御を伴う、層ごとの生体材料および生細胞の正確な位置決めを含む。この技術は、組織、およびさらには耳、鼻、骨、皮膚などの臓器の臨床的修復に向けて大きな進歩を遂げてきた。
【０００３】
細胞、および最終的には小型化された組織の効果的な３Ｄプリントにおける重要でありながら限定的な成分は、細胞を支持するための３Ｄ構造を形成するための足場材料（本質的に「プリンターインク」）である。このような材料は、３Ｄプリンタ機構と、足場構造内での細胞の生存能力の宿主化または維持の両方に適した特性を提供しなければならない。このようなバランスの取れた特性を得ることは、３Ｄバイオプリントの主な課題であり、多くのキーとなる特徴に依存している。
【０００４】
３Ｄバイオプリントに一般的に使用される材料には２つのクラスがある。第一のクラスは硬化性ポリマーであり、これは熱的方法によって押出成形され得、そしてしばしば足場目的のために使用される。細胞がこれらの足場上に印刷された後に播種されて、細胞がその中で成長して組織構築物を発生させるか、またはそのまま移植に使用される。
【０００５】
第二のクラスは、大量の水（＞９９％まで）を貯蔵し、細胞にとって好ましい環境を提供する材料を含む。ヒドロゲルはこのクラスに属し、そして生細胞をカプセル化するために使用される。細胞載積ヒドロゲル(cell-laden hydrogel)は、典型的には「バイオインク」と呼ばれ、熱プロセス、光架橋、またはイオン／化学架橋によって凝固するヒドロゲルが使用されバイオインクを製造することができる。
【０００６】
これらのヒドロゲルインクは、天然ポリマー（しばしば、動物組織から単離されたアルギン酸塩、ゼラチン、コラーゲン、およびヒアルロン酸を含む）または合成分子（例えば、ＰＥＧ）のいずれかに基づくことができる。天然由来のヒドロゲルを使用することの明らかな利点はそれらの固有の生理活性であるが、得られる印刷構築物はしばしば機械的完全性の欠如を示し、そしてこのようなヒドロゲルの性質を調整する能力は制限される。これに加えて、動物由来のヒドロゲルはしばしばバッチ対バッチの再現性に問題がある。
【０００７】
アルギン酸塩ゲルは、３Ｄプリント、特に押出ベースのプリントに使用される。しかし、歴史的には、ヒドロゲル中のプリントされた細胞は周囲のアルギン酸塩ゲルマトリックスを分解することができず、それらは増殖が不十分で分化していない状態のままであった。
【０００８】
いくつかの研究者は、機械的性質と細胞適合性との間の良好なバランスを達成するために、二成分のヒドロゲル混合物（例えば、ＰＥＧとヒアルロン酸との混合物）を利用してきた。しかし、非動物由来である単一成分のバイオインクは、適切な機械的特性およびゲル化特性を有し、そして様々な種類の細胞との適合性のための適切な物理的／化学的特徴をまだ実現していない。
【０００９】
やはり、細胞増殖のための３Ｄ構造が議論される一方で、これらの混合物が３Ｄプリント技術において使用され得るという示唆はないように思われる。
【００１０】
ＣＮ１０５２３８１３２には、３Ｄプリント用の生物学的インクが記載されている。生物学的インクは、水溶性天然ポリマーを架橋するための水溶性合成ポリマーを含む。生物学的インクは、伝統的な３Ｄプリントインクが成分構造において一つであり、良好な生物学的活性を有しておらず、かつて有機溶媒を利用する必要があるという欠点を克服すると言われている。（光媒介架橋による）インクの硬化を通して得られるヒドロゲルは、制御可能な機械的性質および良好な構造安定性を有すると言われている。
【００１１】
ゲルを含む構造のような生理学的条件に似た構造上で細胞増殖を支持することは別に知られている。Ｚｈａｎｇら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，ｐｐ１３６８０〜１３６８１）は、保護ジペプチド、例えばＰｈｅ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒを、繊維状足場を形成する芳香族スタッキングリガンド(aromatic stacking ligand)と組み合わせて記載している。これらは、通常の細胞増殖にとっては酸性過ぎる３〜５のｐＨで行われた。生理学的ｐＨでの研究は行われなかった。他のペプチドベースのゲルは、Ｇａｒｙ  Ｓｃｏｔｔら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第２９巻，２０１３、１４３２１〜１４３２７頁；Ｍｉ  Ｚｏｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，第３０巻，２００９，２５２３〜２５３０頁；およびＡｐｕｒｂａ  Ｄａｓら、Ｆａｒａｄａｙ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ，第１４３巻，２０９，２９３〜３０３頁に記載されている。Ｚｈｏｕら（Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，第５巻，２０１４）は、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−ＲＧＤの組み合わせに基づくヒドロゲルについて論じている。
【００１２】
ストラスクライド大学の名称の米国特許第８，４２０，６０５号は、生理学的ｐＨでペプチドまたはペプチド誘導体と共にＦｍｏｃまたはＣｂｚなどの芳香族スタッキングリガンドを含むさらなるヒドロゲルを記載している。ヒドロゲルは、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＰｈｅからｐＨ７で形成された。さらなる研究が、他のペプチドを、Ｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（ここで、Ｃ＝アラニン、バリン、ロイシンまたはフェニルアラニン）のような芳香族スタッキングリガンドと組み合わせて使用して行われた。しかし、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅから形成されたヒドロゲルは、細胞を付着させるには疎水性すぎたので、足場依存性細胞の細胞増殖に適した足場を形成しなかった。
【００１３】
ＷＯ２０１３／１２４６２０は、８より大きいｐＨのヒドロゲルを作製し、細胞を添加することができるようにヒドロゲルを液化し、次いでゲルを再形成することを記載している。
【００１４】
ＷＯ２０１３／０７２６８６は、ペプチドが「自己集合」してヒドロゲルを形成するようにペプチドが合体する、ｐＨ２〜３の、６〜１０アミノ酸含有ペプチドベースのヒドロゲルに関する。このようなヒドロゲルは、粘膜組織を通して薬学的に活性な化合物を送達するために使用されると言われている。
【００１５】
「インクジェットプリント技術を用いるペプチドナノチューブおよびナノスフェアの制御されたパターニング」，Ａｄｌｅｒ−Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．，第１４巻，２００８，ｐ２１７〜２２３には、インクジェットプリンタを用いたＦ−Ｆ、Ｆｍｏｃ−ＦＦおよびＢｏｃ−ＦＦを含む芳香族ジペプチドナノチューブのプリントが記載されている。ジペプチドの溶液をＨＦＰおよび５０％エタノール中で作製し、続いて溶媒を蒸発させることによりナノチューブおよびナノスフェアのプリントを達成した。プリントされた材料はヒドロゲルの形態ではなかった。
【００１６】
「間葉系幹細胞の増殖および多分化のための足場としての自己組織化ペプチドベースのヒドロゲル」，Ｙｕｎｇ−Ｌｉ  Ｗａｎｇら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，第１７巻、２０１７、文献１６００１９２は、Ｆｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−ＲＧＤヒドロゲルの混合物中の間葉系幹細胞の培養について記載している。この論文は、３Ｄプリントにおけるこのような材料の使用を示唆していない。
【００１７】
「アルギン酸塩／Ｆｍｏｃ−ジフェニルアラニンヒドロゲルネットワークに対する塩化カルシウム濃度の影響」，Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．ら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｃ，第６６巻，２０１６、ｐ２２１〜２２９は、Ｆｍｏｃ−ＦＦ／アルギン酸塩ゲルからのバンコマイシンの放出、および放出速度がＣａＣｌ２濃度によって制御される架橋の程度によってどのように影響されるかを記載している。この論文は、このような材料が３Ｄプリントに適していることを示唆していない。「カルシウムイオンがトリガーする、薬剤送達のためのハイブリッドヒドロゲルへのペプチドおよび多糖の共集合」、Ｙａｎｙａｈ  Ｘｉｅら、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔｓ．，第１１巻，２０１６、ｐ１８４もまた、Ｆｍｏｃ−ＦＦとアルギン酸塩との組み合わせを含むヒドロゲルに関し、そしてここでもまた、ペプチドとアルギン酸塩との両方を架橋するためのカルシウムイオンの使用について論じている。やはり、これらの材料が３Ｄプリントに使用され得たという示唆はない。
【００１８】
「生物医学的用途のための短〜超短ペプチドヒドロゲル」，Ｗｅｉ  Ｙａｎｇ  Ｓｅｏｗら、Ｍａｔ．Ｔｏｄａｙ，第１７巻，２０１４、ｐ３８１〜３８８は生物医学的用途におけるペプチドヒドロゲルの書評である。この文献は、このようなヒドロゲルがバイオプリントに使用される可能性があると推測しているが、このようなプリントをどのように実施することができるか、およびプリントの要件についての詳細はない。
【００１９】
細胞増殖を最適化するために、このようなヒドロゲルは細胞増殖を支持するのに十分堅いゲルを形成しなければならず、そして生理学的ｐＨの下でそうしなければならない。さらに、細胞のモニタリングを補助するためにゲルが光学的に透明であり、（低濃度のゲル成分、またはゲル成分間の大きな細孔サイズが細胞増殖に有益であり得るので）高濃度すぎず、必要な成長のために十分な寿命を有することが有利である。
【００２０】
徐放性薬剤送達システムは、血中循環から迅速に排除され頻繁な投与を必要とする短い半減期を有する薬剤に関する問題を解決するための大きな進歩となり得る。徐放性製剤は、薬剤をゆっくり放出し、長期間にわたってほぼ一定の薬剤濃度を維持することを目的として開発されてきた。
【００２１】
徐放性システムは、長期間にわたって薬剤の徐放を達成する任意の薬剤送達システムを含む。システムが血液または標的組織内の一定の薬剤レベルを維持することに成功した場合、それは制御放出システムと見なされる。
【００２２】
既知の徐放性システムは、親水性セルロースベースのポリマー、アルギン酸塩およびガムを含む親水性非セルロースポリマー、ならびに疎水性ポリマーに基づいている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、インビトロおよびインビボの両方で細胞増殖を支持するための代替の、好ましくは改良された構造、ならびにそれを作製するための方法を提供することである。関連した別の目的は、薬剤送達のための代替材料、特に持続的薬剤放出のための改善された材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、バイオインク、細胞増殖および薬剤送達において、例えばカチオンによって硬いゲルに架橋された自己組織化ペプチド両親媒性物質の使用に関する。
【００２５】
本発明は、好ましくは、合成芳香族部分によってキャップされたＮ末端を有する、短い（例えば、ジまたはトリ）ペプチド配列を含むそのような芳香族ペプチド両親媒性物質を使用する。このような化合物において、自己集合は、芳香族πスタッキング相互作用、および架橋剤、好ましくはカチオンと関連してβシート型水素結合配置を形成するペプチドの傾向に基づく。
【００２６】
プリント方法は、ヒドロゲル前駆体と活性化剤との混合物を使用し、ここでヒドロゲル前駆体は複数のペプチド誘導体を含み、そして活性化剤は架橋剤を含む。
【００２７】
ヒドロゲル前駆体および活性化剤ならびに細胞／薬剤の混合物は、（ゲル化されているかどうかにかかわらず）細胞増殖および徐放性薬剤送達に使用される。
【００２８】
本発明の理解を助けるために、その特定の実施形態を、例として添付の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、同時分配のためにヒドロゲル前駆体および塩化カルシウム溶液を充填した二重バレルシリンジを示す。
【図２】図２は、実験５から形成されたゲルの写真を示す。
【図３】図３は、２つのシリンジが取り付けられた三方コネクタの写真を示す。
【図４】図４は、凍結乾燥粉末から調製したプレゲルの粘度を示すグラフである。
【図５】図５は、凍結乾燥粉末と塩化カルシウム溶液から調製したプレゲルの粘度を示すグラフである。
【図６】図６は、実験１０のヒドロゲルを示す。
【図７】図７は、短期間にわたる３つのゲルタイプ（軟質、軟質から硬質、および硬質）と安定性との間の剛性差（ｋＰａ）を示すグラフである。
【図８】図８は、短期間にわたる３つのゲルタイプ（軟質、軟質から硬質、および硬質）と安定性との間の剛性差（ｋＰａ）を示すグラフである。
【図９】図９は、異なる材料の組み合わせから調製された潜在的バイオインクの粘度結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明によるインクを用いたＣｅｌｌｉｎｋ  Ｉｎｋｒｅｄｉｂｌｅプリンタを用いたプリントの写真を示す。
【図１１】図１１は、実験１４からのプリントされたゲルグリッド構造（５層）の写真を示す。
【図１２】図１２は、実験１５からのプリントされたゲルシリンダ構造の写真を示す。
【図１３】図１３は、実験１５のプリントされたゲルグリッド構造（５層）の写真を示す。
【図１４】図１４は、凍結乾燥前後の本発明によるバイオインクの粘度測定結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、プリント直後に図１０のプリンタによってプリントされた構造体の写真である。
【図１６】図１６は、１０ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓからのプロプラノロールの放出プロファイルのグラフである。
【図１７】図１７は、１０ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓからのプロプラノロールの累積放出プロファイルのグラフである。
【図１８】図１８は、１０ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓからのベタキソロールの放出プロファイルのグラフである。
【図１９】図１９は、１０ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓからのベタキソロールの累積放出プロファイルのグラフである。
【図２０】図２０は、１０ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓからのキニジンの放出プロファイルのグラフである。
【図２１】図２１は、１０ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓからのキニジンの累積放出プロファイルのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明によれば、以下の工程を含むプリント方法が提供される：
ａ．非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体と活性化剤との混合物を含むインクを調製する工程、
ｂ．インクを基材上にプリントする工程、および
ｃ．インクをゲル化させる工程、
を含み、
ヒドロゲル前駆体は複数のペプチド誘導体を含み、活性化剤は架橋剤を含む。
【００３１】
本発明の実施形態のインクはその場でゲル化され得る。インクを調製する工程は、ヒドロゲル前駆体と該活性化剤とをそれがゲル化し始めるように組み合わせることを含むことが好ましく、プリントする工程は、ゲル化するインクが完全にゲル化する前に当該ゲル化するインクをプリントすることを含む。ゲル化は一般に数秒から数分かけて起こり、ゲルが粘性になりすぎる前にプリントするための時間を見込んでいる。
【００３２】
したがって、用語「非ゲル化」は、インクがその形状を保持することができる程度まではいくらかの初期ゲル化が起こっているが、プリントが妨げられる程度までではない、液体および部分ゲルを包含する。
【００３３】
インクを調製する工程はまた、好ましくは、ヒドロゲル前駆体と活性化剤とをそれが部分的にゲル化するように組み合わせることを含み、そしてインクをゲル化させる工程は、ゲルが形成されるように、部分的にゲル化したインクをさらなる活性化剤（工程ａに用いたものと同じまたは異なる）と組み合わせることを含む。
【００３４】
好ましくは、インクは、同一かまたは異なる活性化剤を含有する溶液中にプリントされてもよく、またはそのような溶液中に直ちにまたはプリント後しばらくしてから配置されてもよい。好ましい追加のまたは代替の工程として、プリントされたインクは、特に溶液として、スプレーされるか、そうでなければ追加の活性化剤と接触されてもよい。
【００３５】
ゲル成分を組み合わせるために、この方法は、別々のリザーバからのヒドロゲル前駆体および活性化剤の同時プリントまたは共押出を含み得る。このようにして、それらはプリントおよびゲル化の直前に互いに接触される。
【００３６】
それによって別々のリザーバから非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体が活性化剤と同時プリントまたは共押出される、これらの工程の組み合わせもまた想定される。次いで、このようなプリントされたインクは、上記のようにさらなる活性化剤に晒され得る。
【００３７】
あるいは、本発明の実施形態のインクは、予めゲル化されてからプリント可能な形態に変換され得る。したがって、プリント用のインクを調製する工程は、必要に応じて、ゲル化したヒドロゲルを流動化または液化することを含む。このようにして、例えば、この方法は、ゲル化したヒドロゲルを流動化するように撹拌する工程、およびそれを流動化したインクが再ゲル化する前にプリントする工程を含み得る。撹拌の適切な形態は、ゲル化したヒドロゲルを、それをプリントするのに十分に流動性にするために、（ｉ）超音波処理、（ｉｉ）振動および（ｉｉｉ）圧力の上昇のうちの１つまたは複数または全てに供することを含む。
【００３８】
本発明によれば、同様にプリント方法が提供され、以下：
ａ．非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体を含むインクを調製する工程、
ｂ．それを活性化剤と接触するようにインクをプリントする工程、
ｃ．インクをゲル化させる工程、
を含み、
ヒドロゲル前駆体は複数のペプチド誘導体を含み、活性化剤は架橋剤を含む。
【００３９】
ゲル化を達成するためには、前駆体は架橋剤と組み合わせられなければならない。１つの方法では、これは活性化剤を含有する溶液にプリントすることによって行われる。プリントされたインクはまた、直ちにまたは少し遅れて、活性化剤を含有する溶液中に配置されてもよい。追加的にまたは代替的に、プリントされたインクは、追加の活性化剤を用いて（例えば、溶液として）スプレーされるかまたは他の方法で晒されてもよい。それ故、ゲル成分の組み合わせは押出し／プリント後に行われる。他の方法では、これは、部分的にゲル化するようにヒドロゲル前駆体とある量の活性化剤との組み合わせとしてインクを調製することによって行われ、ゲル化の完了は工程ｂでさらなる活性化剤との接触後に起こる。
【００４０】
ゲル成分を組み合わせるために、この方法は、別々のリザーバからのヒドロゲル前駆体および活性化剤の同時プリントまたは共押出を含み得る。このようにして、それらはプリントおよびゲル化の直前に互いに接触する。接触は、プリントの時点、すなわち押出しプロセスの終わり、またはプリントの開始、すなわちプリントの押出し段階の開始時に起こり得る。
【００４１】
ヒドロゲル前駆体と活性化剤とを上記の任意の方法にしたがって同時プリントし、次いでプリントしたインクを上記のようにさらなる活性化剤に供するように、これらの組み合わせもまた想定される。
【００４２】
実施例で使用されるようなペプチド誘導体は、好ましくは、芳香族基、芳香族アミノ酸または芳香族スタッキングリガンドである第三の成分に結合した少なくとも２アミノ酸またはその誘導体を含む。独立して、実施例で使用される活性化剤は架橋剤（例えば、カチオン）を含む。典型的には、カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、または細胞培養培地中に典型的に見出される他のカチオン（例えばＬｉ＋またはＮａ＋）である。追加的または代替的には、カチオンは、例えばアミノ酸中の双性イオンのカチオン部分でもあり得る。以下で使用される特定の例として、ＩＫＶＡＶ（ラミニンのフラグメント）は双性イオンであり、そして活性化剤としても使用され得る。ＩＫＶＡＶはゲル形成タンパク質であり、そのカチオン領域、その正電荷を帯びた基を介してペプチド誘導体を架橋するために使用されてもよい。カチオンを、典型的には双性イオンの一部として有する他のペプチドも活性化剤として使用され得る。異なる活性化剤の組み合わせ、例えばＩＫＶＡＶと金属カチオンとの両方もまた使用され得る。活性化剤（例えば、カチオン）の存在下でのペプチドの組み合わせは架橋して、粘性ゲルを形成する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチド誘導体は式Ｉのものである：
【００４４】
【化１】
2020515537.tif 000003
【００４５】
ここで、
ＡＳＬは芳香族基を含む芳香族スタッキングリガンドであり、各ＧＡは独立してアミノ酸またはその誘導体であり、Ｘはアミノ酸またはその誘導体であり、ｎは０〜３の整数であり、そしてペプチド誘導体は架橋カチオンの存在下でゲルを形成する。ｎは、好ましくは０、１または２であり、より好ましくは０または１であり、そしてさらなる好ましい実施形態では０（すなわち、Ｘが存在しない）である。
【００４６】
ＡＳＬの適切なオプションは文献から公知である。 例としては、Ｆｍｏｃ、ＣＢｚ、芳香族アミノ酸、およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００４７】
より好ましい実施形態では、ペプチド誘導体は式Ｉａのものである：
【００４８】
【化２】
2020515537.tif 000004
【００４９】
ここで、
ＧＡ１は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）およびそれらの誘導体から選択され、
各ＧＡ２およびＸは、以下：
（１）中性アミノ酸アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、およびバリン（Ｖ）、正電荷を帯びたアミノ酸アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）、ならびに負電荷を帯びたアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）、ならびにそれらの誘導体、ならびに
（２）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）ならびにそれらの誘導体、
から独立して選択され、そして
ｎは先に定義した通りである。
【００５０】
ヒドロゲルはペプチド誘導体の混合物を含むことができ、そのうちのいくつかはリスト（１）由来のＧＡ２を含み、そのうちのいくつかはリスト（２）由来のＧＡ２を含む。
【００５１】
本明細書に開示される発明は、細胞の増殖を送達および／または支持するために適用される。したがって、実施例において、インクは細胞をさらに含む。インクはさらに模倣ペプチド（特にホルモン、サイトカイン、酵素基質、ウイルスまたは他の生体分子の活性リガンドを生物学的に模倣するペプチド、修飾ペプチド、または任意の他の分子のような分子）を含んでいてもよい。
【００５２】
上記プリント技術のいずれかによれば、インクは、ポリエチレングリコール、ポリオキシルヒマシ油（例えばＫｏｌｌｉｐｈｏｒの商品名で販売されている）のようなゲル化剤をさらに含んでいてもよい。使用され得る別のゲル化剤は、ラミニンのフラグメント、および特にＩＫＶＡＶである。これは、ゲルを形成する５アミノ酸鎖であり、そして上記のように、活性化剤、あるいは２つまたはそれ以上の活性化剤のうちの１つとしても使用され得る。インクは、さらなる具体例として、ラミニンのフラグメント、ラクトビオン酸、成長因子、ミネラル、フィブロネクチンおよび／またはインテグリンを含み得る。他の追加の薬剤は、典型的にはＣａＣｌ２；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７；ＤＭＥＭ培地；ＰＢＳ、およびＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）の組み合わせ中でアルギン酸塩を含む。これらの追加の要素のうちの１つまたはそれ以上は、上記プリント技術のうちのいずれにおいても使用され得る。
【００５３】
インクは、さまざまな３Ｄプリント方法および環境で使用され得る。例えば、プリントは、インク（必要に応じて細胞および／または活性剤を含有する）の押出しを含み得る。プリントは、活性化剤の持続的送達のために、活性剤を含有する構造体をプリントする工程、および／または細胞を含有する細胞支持構造体をプリントする工程を含み得る。
【００５４】
構造体の用途はゲルのシートの使用を含む。したがって、この方法は、ヒドロゲル前駆体のシート（やはり、場合により細胞および／または活性剤を含有する）をプリントする工程を含む。１つの用途は経皮送達組成物（例えばパッチ）としてである。
【００５５】
多層(layers)が本発明のインクを用いてプリントされ得る。特定の方法は：
インクの第１層をプリントする工程、
該インクを部分的にゲル化させる工程、および
該第１層と接触してインクの第２の層をプリントする工程、
を含む。
【００５６】
さらに、好ましい多層のプリント方法は：
部分的にゲル化したインクの第１層をプリントする工程、および
該第１層と接触して、インクの第２層をプリントする工程、
を含む。
【００５７】
この方法は、好ましくは、第１層（または直前の層）が完全にゲル化する前に第２層（および後続の層）をプリントすることを含む。これは、隣接する層の間の結合およびその結果としてのプリント全体の完全性を向上させることがわかった。
【００５８】
部分的にゲル化したインクのプリント後、形成された構築物は、好ましくは追加の活性化剤に晒される。これは活性化剤の浴中へのプリントを介するものであってもよい。次の各層がプリントされるにつれて、構築物はまた、好ましくは活性化剤の浴中に下降され、活性化剤に晒す前に層を一体化させてもよい。別の好ましい方法では、プリントされた構築物に追加の活性化剤をスプレーするか、そうでなければそれに晒される。これらの方法の組み合わせもまた使用され得る。例えば、構築物は追加の活性化剤でスプレーされ、次いで活性化剤の浴に配置されるか、または活性化剤の浴に短時間配置されて、続いて活性化剤でスプレーされる。
【００５９】
異なる層が互いの上にプリントされている多層構造体をプリントすることができる。
【００６０】
これらの多層構造体は、上記のように追加の活性化剤に晒され得る。
【００６１】
上記のインク配合物および方法もこれらの方法と共に使用され得る。
【００６２】
本明細書に開示される発明はまた、活性剤を送達するための用途である。したがって、好ましい例において、そしてさらなる組成物に関してより詳細に記載されるように、インクは活性剤をさらに含む。
【００６３】
本明細書に広く記載されているように、ゲル成分および濃度の変動は、ある範囲の剛性値を有するゲルをもたらし得る。適切には、ゲルは１００Ｐａから１００ｋＰａの剛性を有する。本明細書に記載のほとんどの用途では、ペプチド濃度および選択は、５００Ｐａまたはそれ以上、好ましくは１ｋＰａまたはそれ以上、あるいはより好ましくは２ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有するゲルをもたらす。３Ｄプリントと薬剤送達はわずかに硬いゲルを必要とする傾向がある。より一般的には、ゲルは５ｋＰａまたはそれ以上、好ましくは１０ｋＰａまたはそれ以上、より好ましくは２０ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する。剛性のレオロジー試験は、慣用の方法、例えば標準的な技術および製造業者の説明書（例えば、Veeco Instrucments、Inc、Malvern Instruments Ltd）に従った原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、を用いて実施され得る。
【００６４】
式ＡＳＬ−ＧＡ１−ＧＡ２−Ｘ（ｎ）のペプチドを使用する本発明の特定の実施形態では、ＧＡ２はＲ、ＨおよびＫから選択されるアミノ酸である。これらの正電荷を帯びたアミノ酸の使用に基づくゲルは、カチオンのような追加の成分が存在しない場合でさえ、高レベルの剛性を示し、２０ｍＭ〜３０ｍＭのペプチド濃度に対して１０ｋＰａ以上および２０ｋＰａ以上の剛性値を示した。
【００６５】
式ＡＳＬ−ＧＡ１−ＧＡ２−Ｘ（ｎ）のペプチドを用いるさらなる特定の実施形態では、ＧＡ２はＤおよびＥから選択されるアミノ酸である。本発明のゲルは、これらの負電荷を帯びたアミノ酸に基づいて、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−Ｓとの組み合わせが１：１の比にある参照ヒドロゲル（これもまた本発明において有用である）と比較して略同様のレベルであるかまたは増加した剛性である、許容可能な剛性を有するゲルを生じた。しかし、注目すべきは、負電荷を帯びたアミノ酸に基づくこれらの特定の実施形態のゲルは、カチオンを組成物に取り込むことによって（例えば、カチオン含有水溶液のプレゲル化混合物への添加により）、それらのゲル剛性を著しく増加させやすいことである。培養されるべき広範囲の細胞のタイプまたは送達されるべき薬剤に対する個々の剛性要件は多様であるので、各個々の細胞／薬剤に対してその最適なゲル剛性要件を満たす一連のヒドロゲルを提供することは今まで実施できなかった。本発明のゲル、特に負電荷を帯びたアミノ酸を取り込んだものを使用することにより、ペプチドおよび／またはイオン（特にカチオン）濃度の変化によって最終ゲルの剛性の変化を達成することができ、これにより本発明のゲルシステムの有用性および柔軟性が改善される。
【００６６】
本発明の１つの利点は、過度に高いペプチド濃度を使用する必要なしに、３Ｄプリントに使用するための堅いゲルを製造することができることである。本発明の組成物およびゲルの調製において、最終ゲル中のペプチド誘導体の濃度は、約５ｍＭから約１００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭまたはそれ以上、好ましくは約７０ｍＭまで、または好ましくは約５０ｍＭまでであることが好ましい。特定の例では、約２０ｍＭおよび３０ｍＭのペプチド濃度に基づくゲルは両方とも高い剛性のゲルを与え、これにより過度に高いペプチド濃度を使用しなかった。
【００６７】
ゲルの性質を調整することは、許容し得ないほどの高い剛性を防止する。それにもかかわらず、本発明を使用して、非常に高い剛性を有するゲルを製造することが可能である。一般に、ゲルは約７０ｋＰａまで、好ましくは約５０ｋＰａまで、さらに好ましくは約４０ｋＰａまでの剛性を有する。
【００６８】
本発明によりさらに提供されるのは、３Ｄプリント用途で使用するための、かつヒドロゲル前駆体を含むプリンタインクそれ自体であり、ヒドロゲル前駆体は複数のペプチド誘導体を含み、架橋剤または活性化剤と接触してゲルを形成する。インクは、本明細書の他の箇所に記載されているような細胞および／または活性化剤および／または架橋剤をさらに含むことが好ましく、インクのための好ましいペプチドは本明細書の他の箇所に記載されている通りである。
【００６９】
ゲルについて議論すると、剛性（ｋＰａ）は、足場の構造的完全性を説明するために典型的に使用されるパラメータである。（３Ｄプリント用途で使用するための、かつヒドロゲルおよび／または前駆体を含む）プリンタインクについて論じると、プリント工程中の液体形態の類似のパラメータは粘度（ｃＰ＝ｍＰａ．ｓ）である。本発明において、プレゲル（ペプチドを含むが実質的にカチオンを含まない）の粘度は、典型的には１〜２５０ｃＰ、好ましくは１〜１５０ｃＰの範囲である。これは、３００〜３０，０００ｃＰの範囲のアルギン酸塩の粘度、および丁度１ｃＰを下回る水に匹敵する。部分的にゲル化したインクの粘度は、例えばこれらがいくらかの活性化剤を含み、かつさらなる活性化剤がゲル化を完了するのに必要とされる場合、適切には１００ｃＰまたはそれ以上、より適切には１５０ｃＰまたはそれ以上、さらにより適切には２００ｃＰまたはそれ以上、好ましくは２５０ｃＰまたはそれ以上、およびより好ましくは３００ｃＰまたはそれ以上である。以下の実施例では、部分的にゲル化したインクは、２５０〜３００ｃＰまたはそれ以上の初期粘度を有していた。粘度の高い値は濃厚で動きの遅い液体に対応し、粘度が低い場合は薄く動きの速い液体に対応する。我々の低粘度プレゲルの利点は、インクを使用したプリントが容易なことである。使用におけるさらなる利点は、活性化剤（好ましくはカチオン）との組み合わせが、その後の架橋（またはさらなる架橋）およびゲルの硬化をもたらすことである。より低い粘度から始めると、それがプリンタで使用するには高すぎる粘度に達する前に、硬化性インクまたは部分的にゲル化したインクを使用してプリントすることが可能になり得る。他の場所で確立されているように、それにもかかわらず、本発明のゲルは架橋後に硬いゲルに硬化することがわかった。
【００７０】
また、本発明によってさらに提供されるのは、活性剤の持続放出送達に使用するためのヒドロゲル前駆体および活性剤を含む組成物であり、ヒドロゲル前駆体が複数のペプチド誘導体を含み、架橋剤と接触してゲルを形成する。
【００７１】
本発明の持続送達組成物を使用する方法もまた本明細書に提供される。したがって、本発明は、活性剤を含むヒドロゲルまたは前駆体を患者に投与する工程を含む、活性剤を患者に持続送達する方法を提供し、ここでヒドロゲルまたは前駆体は、複数のペプチド誘導体を含み、架橋剤と接触してゲルを形成する。
【００７２】
ヒドロゲルは、本明細書の他の箇所に記載のように細胞および／または架橋剤をさらに含んでいてもよく、ゲルのための好ましいペプチドは本明細書の他の箇所に記載の通りである。
【００７３】
組成物の送達は、様々な経路によることが可能であり、経路としては、ヒドロゲル前駆体の患者への注射によること（ここで、ヒドロゲルはインサイチュでゲル化する）およびゲル化したヒドロゲルの患者への外科的挿入によることが挙げられる。
【００７４】
細胞増殖支持構造体を作製するための装置もまた本発明により提供され、本発明によるプリンタインクの容器を含み、そして本明細書の他の箇所に記載されるように、プリンタ（例えばインクを押出しすることができる押出機）に連結されるかまたはプリンタ内に含まれる。
【００７５】
装置は、押出しされた前駆体と接触するように薬剤を押出し可能な押出機に連結された活性化剤の容器をさらに含み得る。
【００７６】
本発明の特定の実施形態は、細胞支持構造体としてヒドロゲルを使用すること、すなわちその中で細胞が成長および増殖し、必要に応じて多細胞構造、オルガネラおよび／または器官もしくはその一部を形成することができるマトリックスとしての使用に関する。したがって、本発明は、ヒドロゲル形成を可能にするためにヒドロゲル前駆体を押出しすることを含む、少なくとも１つのヒドロゲルからまたはそれを含む細胞増殖支持構造体を形成する方法を提供する。
【００７７】
以下の実施例に記載するように、構造体内または構造体に付着した細胞増殖を支持するか、または薬剤送達に使用され得る３次元（３Ｄ）構造体またはマトリックスが提供される。適切には、この構造体は細胞増殖のための３Ｄフォーマットを提供するのに十分な剛性を有する。構造体はその後追加された細胞を有していてもよい。あるいは、押出しされたヒドロゲルは、ヒドロゲルの押出しおよび硬化後にヒドロゲル中で増殖し得る１つまたは複数の細胞を含み得る。
【００７８】
この方法は、好ましくは、前駆体を（非ゲル化または部分的にゲル化した形態で）押出しする工程、およびそれを硬化させるかまたは硬化を引き起こす工程を含む：より流動性の高い前駆体をより固体のヒドロゲルに変換する。前駆体の層は、最終製品に組み込まれるように１つずつ添加されることが好ましい。各連続層は、好ましくは部分的にまたは実質的に硬化したヒドロゲル、または次の堆積層の重量を支えそしてそれによって過度にゆがめられないほど十分に（おそらくまだ完全にではない）硬化しているが次の層とともに凝集ゲルを形成することができるヒドロゲルに添加される。
【００７９】
このプロセスによれば、ゲル形成を可能にするように前駆体が押出しされる。前駆体のゲルへの硬化(curing)または硬化(setting)は、前駆体と関連する硬化剤との組み合わせ／接触によって引き起こされ得る。これは典型的には１つまたはそれ以上のカチオンであり、そしてまた活性化剤とも呼ばれ得る。
【００８０】
ヒドロゲル前駆体は押出しされ、続いて薬剤と混合されてもよい（例えば、ヒドロゲルが形成される溶液に押出しされてもよい）。これは、装置が前駆体の供給源に連結された単一の押出出口を用いて操作することができるので簡単で便利な方法である。以下の実施例では、硬化剤（例えばカチオン）は溶液中に存在する。
【００８１】
あるいは、ヒドロゲル前駆体は、ヒドロゲル形成を引き起こすヒドロゲル活性化剤と組み合わせて押出しされてもよい。２つの要素、すなわちヒドロゲル前駆体および活性化剤は、共押出しまたは連続的に押出しされてもよい。押出しの前に、前駆体は活性化剤とは別に貯蔵および／または維持され、そして２つは押出しの直前にのみ一緒にされる。以下の実施例では、前駆体および硬化剤は単一の出口を介して押出しされ、したがって、ゲルは、まだゲル化されていないがゲル化の過程にあるかまたは丁度ゲルを形成しようとしている形態で押出しされる。押出は、押出機を塞ぐ可能性がある程度にゲルが形成される前に、好ましくは行われる。
【００８２】
別の局面では、本発明は、ヒドロゲル前駆体と硬化剤とを共押出しする工程を含む、少なくとも１つのヒドロゲルからまたはそれを含む３Ｄ細胞増殖支持構造体を形成する方法を提供する。以下の実施例によると、前駆体は好ましくは１つまたはそれ以上のペプチドを含み、そして薬剤は１つまたはそれ以上のカチオンを含む。
【００８３】
使用において、ヒドロゲル前駆体およびカチオンのこの混合は、ペプチドの迅速な架橋およびゲル形成を引き起こす。両成分の濃度は調整され得、そしてこのプロセスに影響を与えるであろうが、非常に適切には、これは共押出し時に本質的に瞬時に起こる。
【００８４】
ヒドロゲル前駆体および活性化剤の割合は、完全なゲル化が直ちに起こるように、すなわち共押出し時に起こるようにするものであってもよい。同様に好ましい代替例では、ヒドロゲル前駆体および活性化剤は、部分的なゲル化が共押出の間に直ちに起こり、そして形成された構築物をさらなる活性化剤に晒してゲル化プロセスを完了することができるようなものであり得る。これは、好ましくは、追加の活性化剤に晒された後に、より堅いゲルの形成を生じる。追加の活性化剤は、上記のように、すなわち追加の活性化剤の浴中に配置すること、またはスプレーすることによって適用することができる。追加の活性化剤は、同じ活性化剤であっても異なる活性化剤であってもよい。
【００８５】
ヒドロゲル前駆体は一般に本発明に適している。それらは単一ペプチドまたはペプチドの組み合わせであり得る。ペプチドは、ＦｍｏｃまたはＣｂｚなどの芳香族スタッキングリガンドを組み込んでもよく、または芳香族アミノ酸を含んでもよい。それらは、本明細書中で言及されるものを含めて、ヒドロゲル技術分野において一般的に記載される通りであり得る。このような適切なヒドロゲル前駆体は、ＧＢ１５１６４２１．２（現在未公開）およびＷＯ２０１６／０５５８１０に記載されている。適切なトリペプチドはまた、ＷＯ２０１６／０５５８１０に記載されている。
【００８６】
単独で使用され得るペプチドの例は、具体的にはＦｍｏｃ−ＦＦ；Ｆｍｏｃ−Ｓ；ＫＹＦ、ＫＦＤ、ＧＧＧ、ＰＦＦ、ＫＦＦ、ＫＹＷ、ＫＹＹ、およびＦＦＤを含む。ペプチドの組み合わせの例には、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−ＦＤ、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−ＦＥ、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−ＦＫ、およびＦ−ｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−Ｓが挙げられる。ペプチドの組み合わせが使用される場合、製造されるヒドロゲルの最終の剛性を変えるために、各構成要素の異なる割合が使用され得る。特に好ましい組み合わせは、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−Ｓを含む。およそ１：１の比率が使用され得るが、比率の変化もまたゲルの剛性を変化させるために使用され得る。
【００８７】
他の実施形態では、カチオンに対する前駆体ヒドロゲルの割合は、製造される最終ヒドロゲルの剛性を決定するために用いられてもよい。これは、溶液の濃度を変えることによって、または一緒に混合される溶液の比率を変えることによって達成され得る。
【００８８】
溶液の混合物（前駆体含有および薬剤含有）は典型的には約１：１であるが、いくつかの実施形態では、比率はヒドロゲル前駆体と薬剤（例えばカチオン溶液）との１：３から１０：１の間であり得る。より典型的には、この比は１：２と４：１との間であり、そして好ましくは１：１〜３：１である。
【００８９】
共押出しは、細胞増殖に適した水または緩衝液中へのものであり得る。ヒドロゲルが形成されると、それを水から取り出し、細胞と組み合わせるためにプレートに移してもよい。
【００９０】
カチオンは、一価、二価または三価であり得る。例えばＰＢＳのような緩衝液内でＮａ＋が使用され得る。カチオンは、例えばカルシウム塩（例えば塩化物）の形態のカルシウムイオンであり得る。あるいは、臭化カルシウムまたは炭酸カルシウムを使用してもよい。マグネシウムカチオンは、例えば塩化マグネシウムまたは臭化マグネシウムとして使用されてもよい。さらなる代替において、カチオンは鉄（例えば臭化鉄（ＩＩＩ）または硫酸鉄（ＩＩ））であってもよい。
【００９１】
押出機は、ゲル化されていない前駆体を送達する制御された方法、言い換えると、前駆体をインクとして使用する制御されたプリント方法を提供する。プリント前にインクが配置される高圧領域と、出口（通常はノズル）を介してインクが送達／押出しされる低圧領域とがある。ノズルの性質および特定の速度または幅あるいは出口の形状で前駆体を送達するための方法は、本発明の主題ではない。
【００９２】
その最も単純な形態では、押出機は二重バレルシリンジであり得る。ヒドロゲル前駆体がシリンジの一方のバレルに充填され得、カチオンを含有する溶液が他方のバレルに充填され得る。プランジャをシリンジ内に押し込むと、ヒドロゲル前駆体とカチオン溶液とがそれらが接触するように放出され、混合およびゲル化が引き起こされる。この方法を使用して、ほぼ等容量のヒドロゲル前駆体およびカチオン溶液が分配される。それ自体、ゲル化が１：１の溶液混合物上で起こるように適切な濃度で溶液を調製することが好ましい。
【００９３】
本発明を説明する代替の、そしてまた単純なシステムでは、３方向コネクタが、２つの容器（例えば注射器）に取り付けられ、１つが出口に取り付けられて使用され得る。前述のように、ヒドロゲル前駆体が一方に充填され、カチオン溶液が他方に充填され得る。容器から分配する場合（例えば、注射器上のプランジャを押し下げること）は、溶液を分配することになり、それは混合し、多かれ少なかれ直ちに出口を出るヒドロゲルを形成する。両方の注射器へのプランジャが同じ量に加圧され、１：１の比率の溶液を分配し得る。あるいは、より高い圧力を一方のプランジャに加えてもよく、それによって成分の２：１または３：１の混合物が生じ得る。
【００９４】
さらなる特定の代替において、溶液は、ノズルを通して分配するために二重チャンバのプリンタに充填され得る。溶液の量および相対比率は、ゲル形成を最適化し、ゲルの剛性を変えるために正しい比率の溶液が分配されることを確実にするように注意深く制御され得る。
【００９５】
好ましくは、ペプチド誘導体および活性化剤、ならびに他の要素を含むバイオインクが調製され得、そしてプリンタカートリッジに移されてもよい。バイオインクは形成時にゲル化し始め、そして完全ゲル化の前にプリントが起こり得る。完全なゲル化はプリント後に生じる。
【００９６】
（特に本明細書の他の箇所に記載されるような）細胞増殖支持構造体を作製するための装置が本発明によってさらに提供される。この装置は前駆体を押出し可能な押出機に連結されたヒドロゲル前駆体の容器を含む。これはヒドロゲル前駆体を充填した「３Ｄプリンタ」である。
【００９７】
好ましい装置は、押出しされた前駆体と接触するように薬剤を押出しすることができる押出機に連結された、前駆体を硬化させる薬剤の容器をさらに含むものである。このようにして、このプリンタは、例えば上記に記載されているように共押出に適している。他のプリンタは、前駆体を硬化剤を含む溶液に押出しすることができる。
【００９８】
押出機は、適切には可動ノズルを含む。別に、押出機は、適切には可変出力寸を有するノズルを含む。したがって、層の幅および形状は、細胞増殖支持構造体の「プリント」中に変更することができる。
【００９９】
本発明の組成物は乾燥体で提供され得る。例として、組成物は粉末または凍結乾燥調製物の形態であり得る。ある用途では、乾燥組成物に水を添加してゲル化前混合物を得て、これを次に架橋剤（例えば溶液中のカチオン）と混合され、ゲルを生じる。例えば、粉末はカチオン溶液で再構成され、次いでそれが完全にゲル化する前に速やかにプリントに使用される。あるいは、乾燥体を溶液中のカチオンと単一工程で組み合わせて、それ自体が自発的にゲルを形成する混合物を得る。組成物の乾燥フォーマットは、ペプチド／誘導体の水溶液を標準的な乾燥技術にかけることによって調製され得る。このような例の一つとして、ゲル化前混合物が凍結乾燥され、本発明の乾燥体を得る。乾燥粉末組成物は、それらの貯蔵および輸送の容易さのために好ましい。
【０１００】
最終ゲル組成物として提供されない本発明の組成物は、乾燥体またはゲル化前混合物として提供される。これらは（例えば水性キャリア内で）適切な量の架橋剤を示すように記録され(marked)得、所望のゲルを達成するために添加される。したがって、本発明の実施形態では、組成物は、所定容量の水性キャリアなどの所定量の架橋剤と組み合わせるために、乾燥体またはゲル化前混合物の形態で提供され、その結果、得られるゲルにおいて、ペプチド誘導体の濃度は５ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭから５０ｍＭである。したがって、この形態の生成物は、乾燥体または拡張前混合物が所与のキャリア量と組み合わされた際に得られるゲル特性を示すように記録され得る。生成物は、イオン、特にカチオンなどのキャリアの他の成分によってゲル特性がどのように変化するかを示すために記録されてもよい。
【０１０１】
本発明で使用されるゲルは、生理学的ｐＨの条件下で、一般的には約６〜約９のｐＨ、より適切には約ｐＨ６〜８の範囲のｐＨ、例えばｐＨ７〜８（人体のｐＨが典型的には約７．４である）で、測定可能な剛性を有する３次元ゲルとして自発的に形成する。例えば、粉末形態で提供される場合、既知のイオン、サプリメントなどを含有する所定量の既知の培地を添加すると、上記範囲のｐＨを有する溶液が得られ、次いで、ゲルが形成されて自然に硬化する。あるいは、ゲル化前混合物が液体形態で提供され得、次いで、所定量の媒体を添加することにより、上記のゲル化範囲内のｐＨを有する溶液が得られ、そしてゲルが形成される。
【０１０２】
ゲル形成中に、隣接するペプチドを直線状およびいくつかの場合では分岐状繊維に積み重ねることによってゲル内に繊維が形成される。この繊維含有マトリックスの形成は、適切にはＵＳ２０１３／０３３８０８４およびＵＳ８，４２０，６０５に記載されているように、芳香族スタッキングリガンドの存在によって促進される。例としては、Ｆｍｏｃ、Ｃｂｚおよびそれらの誘導体が挙げられる。芳香族スタッキング相互作用は、科学文献において認識されており、そしてよく記載されており、そして隣接／隣の芳香族基中のπ電子雲の間の引力から生じる。芳香族スタッキングは、ｐＨを含む様々な要因によって影響を受けることがあり、本明細書の他の箇所に記載されているように、その力は十分に強く、現在のゲルを生理学的ｐＨで形成することができる。本発明では、例えば、Ｆｍｏｃ基または他のＡＳＬ中の隣接π電子の間のこれらの積み重ね力によって形成された繊維は、記載された堅いゲルを作り出す。以下の好ましい実施形態は、Ｆｍｏｃまたはその誘導体を使用する。以下により詳細に記載される特定の実施例において、ＡＳＬはＦｍｏｃである。
【０１０３】
本発明の組成物は、動物、特に哺乳動物細胞、そして好ましくはヒト細胞の増殖に適している。最適な増殖のためには、細胞のタイプが異なると足場に異なる剛性が必要である。例えば、脳細胞は比較的柔らかいゲルを必要とし、一方で骨細胞は非常に硬いゲルを必要とする。しかし、ゲルの剛性は（例えば、ヒドロゲル前駆体と活性化剤の比率を変えることによって）微調整され得るので、足場はほとんどあらゆるタイプの細胞に適合するように調整することができる。好ましくは、このようなヒドロゲルは細胞増殖を支持しそして生理学的ｐＨ下でそれを行うのに十分に堅いゲルを形成する。さらに、ゲルが細胞のモニタリングを助けるために光学的に透明であり、（ゲル成分の低濃度またはゲル成分間の大きな孔径が細胞増殖に有益であり得るので）高濃度すぎず、かつ必要とされる増殖について十分な寿命を有することが有利である。
【０１０４】
持続送達のための活性剤は、本発明のために広く選択され得る。用語「活性剤」とは、活性剤を、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア、および必要に応じて追加の成分（例えば、抗酸化剤、安定剤、透過促進剤など）と組み合わせることを意図する。本発明の活化剤送達組成物は、活性剤の延長かつ制御された送達が所望される場合の用途を見出す。それらは、特に堆積部位へのアクセスが制限されている場合の用途を見いだし、そしてプレゲル（次いで、インサイチュでゲル化し、持続的送達を提供する堅いゲルを形成する）の注入（例えば皮下、非経口など）によって組成物を送達する能力によって促進される。
【０１０５】
適切な薬剤としては、限定されないが、薬理学的に活性なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、遺伝子および遺伝子産物、他の遺伝子治療薬、他の生物製剤および他の小分子が挙げられる。ポリペプチドは、限定されないが、成長ホルモン、ソマトトロピン類似体、ソマトメジン−Ｃ、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ＬＨＲＨ、ＬＨＲＨ類似体（例えばロイプロリド、ナファレリンおよびゴセレリン）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、成長ホルモン放出因子、カルシトニン、コルヒチン、ゴナドトロピン（例えば絨毛性ゴナドトロピン）、オキシトシン、オクトレオチド、ソマトトロピンとアミノ酸、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、表皮成長因子、プロラクチン、ソマトスタチン、ソマトトロピンとタンパク質、コシントロピン、リプレシン、ポリペプチド（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、セクレチン、パンクレオチミン、エンケファリン、グルカゴン、内部的に分泌され、そして血流によって分配される内分泌剤）などが挙げられる。送達され得るさらなる薬剤としては、α１抗トリプシン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および他の凝固因子、インスリンおよび他のペプチドホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび他の下垂体ホルモン、インターフェロンα、β、およびδ、エリスロポエチン、成長因子（例えばＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、インスリン様成長因子１）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＣＤ４、ｄＤＡＶＰ、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、腫瘍壊死因子、膵臓酵素、ラクターゼ、サイトカイン、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子受容体、腫瘍抑制タンパク質、細胞傷害性タンパク質、ならびに組換え抗体および抗体フラグメントなどが挙げられる。
【０１０６】
本明細書で有用な活性剤は、血友病および他の血液障害、成長障害、糖尿病、白血病、肝炎、腎不全、ＨＩＶ感染、セルブロシダーゼ欠乏およびアデノシンデアミナーゼ欠乏などの遺伝性疾患、高血圧、炎症、敗血症性ショック、自己免疫疾患（多発性硬化症、グレーブス病、全身性エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチなど）、ショックおよび消耗痛、嚢胞性線維症、乳糖不耐症、クローン病、炎症性腸疾患、胃腸および他の癌を含むがこれらに限定されない様々な症状の治療用である。
【０１０７】
活性剤は、無水または水溶液、懸濁液または薬学的に許容されるビヒクルまたはキャリアとの複合体であり得る。活性剤は、非荷電分子、分子複合体の成分または薬理学的に受容可能な塩などの様々な形態であり得る。また、身体のｐＨ、酵素などによって容易に加水分解される薬剤の単純な誘導体（プロドラッグ、エーテル、エステル、アミドなど）が使用され得る。
【０１０８】
１つより多い活性剤が組成物に取り込まれてもよいこと、および用語「剤」の使用はこのような多成分製剤も指すことを理解すべきである。組成物は、例えばヒトまたは他の動物における使用を見出す。使用環境は流体環境であり、腹膜または子宮などの任意の皮下位置または体腔を含むことができ、活性剤製剤の最終送達時点と同等である場合もそうでない場合もある。単一のゲル化組成物は、治療プログラム中に被験体に投与され得る。ゲルは、所定の投与期間中ゲル化したままであり、そして時間とともに分解し、実質的に残留物を残さないように設計されている。それゆえ、それらは除去する必要はないが、本質的にインサイチュで生分解性である。
【０１０９】
本発明の組成物は、例えば、周囲温度で１０ｍｇ／ｍＬ未満の溶解度を有する難水溶性薬剤の持続的送達に有用である。これらの疎水性薬剤の例としては、抗癌剤、抗炎症剤、抗真菌剤、制吐剤、降圧剤、性ホルモン、およびステロイドが挙げられる。これらの疎水性薬剤の典型例には、抗癌剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、およびエトポシド）；抗炎症剤（例えば、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、フルビプロフェン、ジクロフェナク、ピロキシカム、テノキシカム、ナプロキセン、アスピリン、およびアセトアミノフェン）；抗真菌剤（例えば、イトラコナゾール、ケトコナゾールおよびアムホテリシン）；性ホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、プロゲステロン、およびエストラジオール）；ステロイド（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、およびヒドロコルチゾン）；降圧剤（例えば、カプトプリル、ラミプリル、テラゾシン、ミノキシジル、およびパラゾシン）；制吐剤（例えば、オンダンセトロンおよびグラニセトロン）；抗生物質（例えば、メトロニダゾールおよびフシジン酸）；シクロスポリン；プロスタグランジン；およびビフェニルジメチルジカルボン酸；がある。
【０１１０】
正電荷を帯びた基を含むゲルは、負電荷を帯びた活性剤に使用することができ、またその逆も可能である。ゲルの化学的性質および剛性を調整する能力は、実質的に全ての活性剤に適したゲルを提供する。
【０１１１】
本発明のゲルを使用して達成可能な持続的薬剤送達は、一例では７日を超えて延長されている。しかし、一般に、ゲルは、２日以上、３日以上、好ましくは４日以上、５日以上、または６日以上にわたって活性剤を持続的なプロファイルで送達することができる。送達期間はまた、その特定の患者および／または活性剤について選択された治療計画にも依存し得る。ゲル組成物は、例えば、より長い放出プロファイルを有するより堅いゲルを提供するために、ペプチド濃度を増加させることもしくは架橋剤濃度を増加させること、またはその両方によって調整され得る。
【０１１２】
（特定の実施形態）
本発明の特定の実施形態では、本発明の任意のおよび好ましい特徴は特定の組成物に組み合わされる。ゲルは、３Ｄプリントのために、または細胞支持構造体として、または持続的な活性剤送達のために使用される。
【０１１３】
選択された特定の実施形態は、ｐＨ６〜８で５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する二価カチオンによって架橋された、ＡＳＬに連結されたジペプチドから構成されるゲルを含む。
【０１１４】
さらに選択された特定の実施形態は、（１０ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有するより堅い実施形態とともに）ｐＨ６〜８で５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する、カルシウムおよび／またはマグネシウムイオンによって架橋された、ＡＳＬに結合されたジペプチドの混合物から構成されるゲルを含む。
【０１１５】
一組の特定の実施形態において、ゲルは、
（ａ）Ｆｍｏｃ−ＦＦおよび１つまたはそれ以上の：
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｓ（すなわち、ジペプチドとモノペプチドとの混合物を生じる）、Ｆｍｏｃ−ＦＦ（すなわち、ゲルは純粋なＦｍｏｃ−ＦＦである）、Ｆｍｏｃ−ＦＳ、Ｆｍｏｃ−ＦＲ、Ｆｍｏｃ−ＦＨ、Ｆｍｏｃ−ＦＫ、Ｆｍｏｃ−ＦＤまたはＦｍｏｃ−ＦＥ
の（例えば、１：５〜５：１、好ましくは１：２〜２：１、より好ましくは約１：１の）混合物を含む。これらはｐＨ６〜８で５ｋＰａまたはそれ以上、好ましくは１０ｋＰａまたはそれ以上の剛性のゲルを形成する。
【０１１６】
３Ｄプリントの特定の実施形態では、プリント方法が提供され、以下：
ａ．非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体と活性化剤との混合物を含むインクを調製する工程、
ｂ．インクを基材上にプリントする工程、および
ｃ．インクをゲル化させる工程、
を含み、
ヒドロゲル前駆体は、ＡＳＬに結合したジペプチドから構成される複数のペプチド誘導体を含み、活性化剤は、カルシウムおよびマグネシウムならびにそれらの混合物から選択される架橋カチオンを含み、そして
ゲル化したときのインクは５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する。
【０１１７】
３Ｄプリントのさらなる特定の実施形態では、同様にプリント方法が提供され、以下：
ａ．非ゲル化形態のヒドロゲル前駆体を含むインクを調製する工程、
ｂ．インクを活性化剤と接触するようにインクをプリントする工程、
ｃ．インクをゲル化させる工程、
を含み、
ヒドロゲル前駆体は、ＡＳＬに結合したジペプチドから構成される複数のペプチド誘導体を含み、活性化剤は、カルシウムおよびマグネシウムならびにそれらの混合物から選択される架橋剤を含み、そして
ゲル化したときのインクは５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する。
【０１１８】
３Ｄプリントのさらなる特定の実施形態では、プリント方法が提供され、以下：
ａ．部分的にゲル化した形態のヒドロゲル前駆体を含むインクを調製する工程、
ｂ．インクを基材上にプリントする工程、および
ｃ．インクを完全にゲル化させる工程、
を含み、
ヒドロゲル前駆体は、複数のペプチドまたはペプチド誘導体、および必要に応じて、ポリオキシルヒマシ油またはラミニンフラグメントのようなさらなるゲル化剤をさらに含む活性化剤を含み、そして活性化剤は、金属カチオンのようなカチオン、またはＩＫＶＡＶのようなペプチド双性イオンのカチオン部分である。
【０１１９】
インクはまた、さらなる活性化剤（例えばＤＭＥＭのような細胞培養培地）を含有する溶液中に直接プリントされてもよい。
【０１２０】
３Ｄプリントのなおさらなる特定の実施形態において、プリント方法が提供され、以下：
ａ．部分的にゲル化した形態のヒドロゲル前駆体および活性化剤を含むインクを調製する工程、
ｂ．インクを基材上にプリントする工程、
ｃ．インクをさらなる活性化剤と組み合わせる工程、および
ｄ．インクを完全にゲル化させる工程、
を含み、
ヒドロゲル前駆体は複数のペプチドまたはペプチド誘導体を含む。ｃの組み合わせる工程は、好ましくは、活性化剤を含む溶液中にプリントすることによって達成される。
【０１２１】
３Ｄプリント用途に使用するための特定のプリンタインキ自体は、（１）ヒドロゲル前駆体（ここで、ヒドロゲル前駆体は、ＡＳＬに結合したジペプチドから構成される複数のペプチド誘導体を含み、カルシウムおよびマグネシウムならびにそれらの混合物から選択される架橋剤と接触してゲルを形成する）、ならびに（２）細胞および／または活性剤（ここで、ゲル化された際のインクは５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する）を含む。必要に応じて、この組成物はカチオンを含む。
【０１２２】
持続活性剤送達用途に使用するための特定の組成物は、（１）ヒドロゲル前駆体（ここで、ヒドロゲル前駆体は、ＡＳＬに結合したジペプチドから構成される複数のペプチド誘導体を含み、カルシウムおよびマグネシウムならびにそれらの混合物から選択される架橋剤と接触してゲルを形成する）、ならびに（２）活性剤（ここで、ゲル化した際のインクは５ｋＰａまたはそれ以上の剛性を有する）を含む。必要に応じて、この組成物はカチオンを含む。
【０１２３】
インクおよび組成物装置の好ましい実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されているような前駆体および硬化剤の任意のかつ好ましい実施形態を含む。
【０１２４】
（利点）
使用において、本発明を使用して様々な利点が実現され得る。公知のヒドロゲルはアルギン酸塩をベースとしており、それは様々な問題（それらは高カルシウム濃度（例えば１００ｍｍｏｌおよびそれ以上）を必要とし、それにも関わらずこのような濃度は細胞増殖にとって有害であり得る。）を抱えている。本明細書中のゲルはこれらの高濃度を使用せず、それ故細胞増殖の使用により適している。他方、アルギン酸塩ゲルは、非常に高いカルシウムレベルが使用されない限り、一般に、３Ｄプリントまたは持続的な薬剤送達に有用であるように十分堅くはない。本明細書中のペプチドゲルは、より硬くそしてより低いカチオン濃度（例えば約２０〜３０ｍｍｏｌ）で製造され得る。
【０１２５】
公知のアルギン酸塩ゲルは、それらに所望され得る特性を与えるためにコラーゲンと日常的にブレンドされるべきである。これは現在のペプチドベースのゲルには当てはまらない。公知のアルギン酸塩ゲルは弾性を有する傾向があり、細胞は弾性ゲル内ではうまく増殖せず、またこの問題は、本明細書中のペプチドゲルにおいて克服される。
【０１２６】
アルギン酸塩は、海藻由来であるため、品質に一貫性がなく、ＧＭＰ製品として製造することは困難である。これは本ペプチドゲルについては当てはまらない。アルギン酸塩ゲルは細胞に対して機能的ではないことが見出されており、それを機能的にするために、すなわち細胞増殖を可能にするために添加される追加の成分を有する必要がある。本ペプチドゲルにおいて良好な細胞増殖が達成され、追加の成分を必要とすることなく機能性を確認し、またゲルが生体適合性でありかつ細胞増殖に対して毒性がないことを確認する。
【０１２７】
さらなる利点は、本発明が薬剤送達構造体の注射を可能にすることである。手術中の３Ｄプリントも直接患者に施すことが可能である。
【０１２８】
ある種のゲルにおいて使用されるＦｍｏｃは抗炎症性であることが見出され、そしてそれ故ゲル／構造体等はこの有用な特性を取り込むことができる。
【実施例】
【０１２９】
（実施例１）
ヒドロゲルを用いた２つのプリント方法を調べた。最初に使用されたプレゲルではＣａＣｌ２溶液と混合されて部分的に架橋された材料を生成し、それを濃縮されたＣａＣｌ２溶液に分配して急速に完全に３Ｄ構造体に材料をゲル化した。第二の方法は、二重バレルシリンジを介してプレゲルをＣａＣｌ２溶液と共に分配して直ちに架橋させ、３Ｄ構造体を作製することを含むものであった。
【０１３０】
（溶液の調製）
（ヒドロゲル前駆体溶液）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓ（すなわち、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−Ｓとの混合物）凍結乾燥粉末（研究目的のみのための９１％純度のＦｍｏｃ−ＦＦを用いて製造されたバッチ）を、バランスのため風袋引きした５０ｍＬチューブに量り取った。１０、２０および３０ｍＭの濃度を有するヒドロゲル前駆体を得るために、０．２２、０．４４および０．６６ｇを使用しそして滅菌水中で再構成した。ボルテックスおよび超音波処理器の水浴を使用して、３０秒間の徹底的な混合および超音波処理を行った。さらなる使用までプレゲルを４℃で保存した。
【０１３１】
（塩化カルシウム溶液）
塩化カルシウム溶液を、０．０５５、０．２２２および１．１１０グラムの塩化カルシウムをビーカーに量り取り、滅菌水で１００ｍＬにまでの容量とすることによって５、２０および１００ｍＭの濃度で調製した。磁気ビーズおよび撹拌台を使用して、１０分間混合することによって塩化カルシウムを溶解させた。次いで、この溶液を０．２μｍのシリンジで清浄なガラスビーカーに濾過し、さらに使用するまで４℃で保存した。
【０１３２】
（３Ｄ構造体の形成）
図１に示す二重バレルシリンジを使用して３Ｄ構造体を形成した。シリンジと共に供給されたゴムピストンを、それらが複数回使用できるように接着剤でプランジャに取り付けた。ヒドロゲル前駆体をシリンジの一方の側に、そしてＣａＣｌ２溶液を他方の側に充填した。ピストンを取り付けたプランジャを挿入し、シリンジキャップを外して２００μＬのチップを上に置くことができるようにした。
【０１３３】
使用したプレゲル／ＣａＣｌ２溶液の混合物は以下の表に詳述した通りであった。
【０１３４】
【表１】
2020515537.tif 000005
【０１３５】
（結果）
最初の実験は、使用前に３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしたプレゲルおよびＣａＣｌ２溶液を使用し、使用の間にこれらの条件に戻した。３Ｄ構造体を有するガラス容器を同様の条件（３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートした。その後、３Ｄ構造体の形成が温度依存性ではないことを実証するために、室温で作業を行った。
【０１３６】
立方体を使用して、ペプチドゲルの三次元構造体能力を実証した。一片の紙を、その上に描かれた正方形（約２ｃｍ２）と共にガラス容器の下に置き、そして３Ｄ立方体用のテンプレートとして使用した。３Ｄ構造体を、分注シリンジ（実際にはノズル）を正方形の型板の左上から底へ、次いで横切って右上隅までガラス容器の中へ動かすことによって作製した。これを連続した流れで３回繰り返し、各プレゲルとＣａＣｌ２溶液との組み合わせに対して同量の材料を分配した。
【０１３７】
（構造体）
実験１、すなわち１０ｍＭプレゲル＋２０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液は立方体を生じたが、ゲルが固体ゲルを形成するのに数秒（２〜３秒）を要したので、いくらかの材料は本体に付着しなかった。
【０１３８】
実験２、すなわち１０ｍＭプレゲル＋１００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液は立方体を生じたが、ゲルが固体ゲルとして形成されるのに数秒間（２〜３秒）見えたので、いくらかの材料は再び本体から外れた。より強いＣａＣｌ２溶液はより不透明なゲル材料をもたらすことも観察された。
【０１３９】
実験４および３、すなわち２０ｍＭプレゲル＋１００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液および２０ｍＭプレゲル＋２０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液は、それぞれ、１０ｍＭプレゲル材料と同様の結果をもたらしたが、ゲル材料の形成はわずかに速くなった（１〜２秒）。
【０１４０】
実験５、図５に示すように、すなわち３０ｍＭプレゲル＋２０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液は、ゲルとして本体に付着していない材料がはるかに少ない立方体をもたらした。ゲル材料は非常に迅速に形成され、ほぼ瞬間的にゲル化して固体の３Ｄ立方体を形成するように見えた。
【０１４１】
実験６、すなわち３０ｍＭプレゲル＋１００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液は、ゲルとして本体に付着していない材料の量がずっと少ない立方体を再びもたらした。ゲル材料は非常に迅速に形成され、ほぼ瞬間的にゲル化して固体の３Ｄ立方体を形成するように見えた。より強いＣａＣｌ２溶液は、より不透明なゲル材料をもたらした。
【０１４２】
（結論）
最初にゲルをプリセットする第一の方法を使用し、次いで第二の方法として精製した（以下の考察を参照）。利用されたいくつかの方法はまた、少量のゲルに個々の細胞をカプセル化したことに注意されたい。
【０１４３】
第二の方法は、互いの上にゲル化した、多くの押し出し層から構築された３Ｄ立方体構造体を製造するのに成功した。より制御された分配システムでは、より明確でより複雑な構造体が達成可能であった。作製された３Ｄ立方体は立方体形状を保持し、そして水に浸した際にそれらの形状を再び保持した。
【０１４４】
したがって、本発明は、３Ｄプリントに似た技術を使用して３Ｄヒドロゲル構造体を作製する方法を提供する。
【０１４５】
（実施例２）
実施例１から続いて、第２の実験手順を考案し、そしてプレゲルおよびＣａＣｌ２溶液を２つの別々のシリンジから３方向コネクタを通して分配するために使用した（図３参照）。２つの成分を、取り付けられている１ｍＬピペットチップを介してコネクタの第３の開口部を通して分配した。作製されたゲル材料を短期間の安定性を実証するために５時間にわたってレオロジーについて試験した。
【０１４６】
ペプチド誘導体の迅速なゲル化を開始するのに必要な塩化カルシウム溶液の濃度を特定したので、これらの新しい条件下で形成された構造体の機械的特性に対する初期調査、および新しいバイオインクの調整可能性の評価を実施した。
【０１４７】
検討された特定の機械的特性に関して、最初にバイオインクの粘度を調べた。これが３Ｄバイオプリント技術とのその適合性を決定する際の重要な要素であるからである。
【０１４８】
完全に架橋したプリント構築物の剛性もまたレオロジーを用いて測定した。これは、３Ｄ細胞培養において非常に魅力的な特徴である調整可能性とともに、連続した材料層が堆積されるときにプリント構造体の安定性に影響を与えるだけでなく、剛性がゲルに取り込まれた細胞の挙動に影響を与えるため、重要な特性である。これらの新しいバイオインクゲルのゲル化は、標準的な細胞培養プロトコルに対する代替の条件下で引き起こされているので、ゲルの剛性は異なることがわかった。
【０１４９】
（溶液の調製）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓ凍結乾燥粉末（研究目的のみのための９１％純度のＦｍｏｃ−ＦＦを使用して製造されたバッチ）を５０ｍＬチューブに秤量した。１０、２０、３０、５０、８０、１００、２００および３００ｍＭの濃度のプレゲルを得るために、０．２２、０．４４、０．６６、１．１、１．７６、２２、４４および６６ｇを使用しそして滅菌水中で再構成した。ボルテックスおよび超音波処理用の水浴を使用して、３０秒間の徹底的な混合および超音波処理を行った。さらなる使用までプレゲルを４℃で保存した。塩化カルシウム溶液を０．５、２、５および１０ｍＭの濃度で調製した。これらの濃度では部分的な架橋は達成されるが完全なゲル化は達成されないと考えられたからである。
【０１５０】
プレゲル単独および塩化カルシウム溶液と混合したプレゲルの粘度結果を、以下の表に詳述する。
【０１５１】
【表２】
2020515537.tif 000006
【０１５２】
【表３】
2020515537.tif 000007
【０１５３】
このデータから図４および図５のグラフを作成した。プレゲル濃度の増加は次々に材料の粘度を増加させた。粘度結果はまた、塩化カルシウム溶液を添加すると、塩化カルシウム溶液を添加しない場合の同じ濃度のプレゲルと比較して材料がより粘性になることを示した。
【０１５４】
この知識を用いて、上記のように３方向コネクタを通して２つの別々のシリンジから分配されたプレゲルおよびＣａＣｌ２溶液を使用してさらなる３Ｄプリント実験を行った。
【０１５５】
（溶液の調製）
（プレゲル配合物）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓ凍結乾燥粉末（研究目的のみのための９１％純度のＦｍｏｃ−ＦＦを使用して製造されたバッチ）を５０ｍＬチューブに秤量した。１０、２０および３０ｍＭの濃度のプレゲルを得るために、０．２２、０．４４および０．６６ｇを使用しそして滅菌水中で再構成した。ボルテックスおよび超音波処理用の水浴を使用して、３０秒間の徹底的な混合および超音波処理を行った。さらなる使用までプレゲルを４℃で保存した。
【０１５６】
（塩化カルシウム溶液）
塩化カルシウム溶液を、０．２２２および１．１１０ｇの塩化カルシウムをビーカーに量り取り、滅菌水で１００ｍＬまでの容量にすることによって、２０および１００ｍＭの濃度で調製した。磁気ビーズおよび撹拌台を使用して、１０分間混合することによって塩化カルシウムを溶解させた。次いで、溶液を０．２μｍのシリンジで清浄なガラスビーカーに濾過し、さらに使用するまで４℃で保存した。
【０１５７】
（３Ｄ構造体配合物）
ＣａＣｌ２溶液と混合したプレゲルは直ちに架橋材料を形成することがわかった。
【０１５８】
図３に示すように、２つのシリンジが取り付けられた３方向シリンジコネクタに、一方のシリンジにプレゲルを、他方のシリンジにＣａＣｌ２溶液を装填した。シリンジのプランジャを同時に押圧したので、プレゲルとＣａＣｌ２溶液との混合物は５０：５０の比であった。
【０１５９】
使用したプレゲル／ＣａＣｌ２溶液の混合物は、以下の表４に詳述した通りであった。
【０１６０】
【表４】
2020515537.tif 000008
【０１６１】
（外観）
一枚の紙を、その上に描かれた正方形（４ｃｍ２）を有するガラス容器の下に置き、そして３Ｄ立方体のためのテンプレートとして使用した。３Ｄ構造体を、２つのシリンジを使用して４方向コネクタを正方形テンプレートの左上から下、次いで横切って右上隅までガラス容器内に移動することによって作成した。同量の材料が各プレゲルおよびＣａＣｌ２溶液の組み合わせに対して分配されるように、これを連続流で２回繰り返した。３つの異なるゲル濃度を３０ｍＭ、２０ｍＭおよび１０ｍＭ（硬質、軟質から硬質、軟質のゲルを表す）を選択した。
【０１６２】
成功した３Ｄ構造体の画像を、その形成直後に撮影した。実験７で形成されたヒドロゲルは軟質のゲルを生成した。実験８のヒドロゲルは、軟質から硬質のゲルを生成した。実験９からのヒドロゲルは硬質のゲルを生成した。実験１０からのヒドロゲルは、（図６に示すように）軟質のゲルを生成した。実験１１からのヒドロゲルは、軟質から硬質のゲルを生成した。そして実験１２からのヒドロゲルは硬質のゲルを生成した。
【０１６３】
（レオロジー）
形成された３Ｄ立方体の一部を取り出し、そして分配後直ちにそして３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０および３００分でレオロジー分析を行った。
【０１６４】
図７は、より高いＣａＣｌ２濃度での３つのゲルタイプ（軟質、軟質から硬質、および硬質）の間の剛性差（ｋＰａ）、および短期間にわたる安定性を示すグラフである。
【０１６５】
周波数の掃引を、一定の振動振幅および温度で、かつ０．５ｍｍの作業ギャップで、０．１Ｈｚから１００Ｈｚまで行った。得られた周波数に対する貯蔵弾性率のグラフから、サンプルの剛性を計算した。円形リーダの形状はＰＵ２０（直径２０ｍｍ）であった。
【０１６６】
図８は、低ＣａＣｌ２濃度における３つのゲルタイプ（軟質、軟質から硬質、硬質）間の剛性差（ｋＰａ）および短期間の安定性を示すグラフである。
【０１６７】
（結論）
プリントのための２つの別々の「インク」カートリッジセットアップをシミュレートする、使用された記載された方法は、３Ｄ立方体構造体を作製することに成功した。ゲル材料は多かれ少なかれ瞬間的に形成され、そしてレオロジー分析を５時間にわたり３Ｄ立方体の一部で行った。全濃度のプレゲルおよびカルシウム溶液についての３Ｄ立方体がそれらの形状を保持し、レオロジーの結果はゲルの剛性がそれがモニタリングされた期間にわたって満足のいくものでありかつ安定であったことを示した。
【０１６８】
より低濃度の塩化カルシウム（すなわち０．５および２ｍＭ）では、プレゲルの外観に影響はなかった。しかし、塩化カルシウムの濃度が増加するにつれて、これはプレゲルがより不透明になることをもたらした。プレゲル濃度が増加すると、存在する繊維の密度が増加するため、粘度が増加する。塩化カルシウムの添加はまた、繊維の架橋（または部分架橋）に起因する粘度の増加をもたらした。粘度はまた、プリントプロセス、例えばプリンタヘッドのノズルサイズ、プリント面までの距離、および温度によっても影響を受ける。結果として、正確な濃度は個々のプリンタに対して経験的に決定される。
【０１６９】
これに基づいて、開発を続け、管状および格子状の構築物を作製するための層状３Ｄプリントの探求に移行し、ゲル架橋強度およびプリントパラメータ制御の両方のさらなる最適化が可能となった。
【０１７０】
（実施例３）
次いで、第３の実験手順を、３Ｄプリンタ、および特にバイオインクが単一のカートリッジからの単一のノズルからプリントされるものを使用するために開発した。現在研究室で使用されているほとんどの３Ｄプリンタには、単一のプリントカートリッジのみが装着されている。２つのカートリッジを有し、それ故２つの材料を同時にプリントすることができるプリンタはより高価である。けれども、これはこの技術が発展するにつれて変わるかもしれない。上記の実験は、この新しいバイオインクが２つのカートリッジを有するプリンタに使用され得ることを示す。この一連の実験もまた、新しいバイオインクが単一のカートリッジのみを有するプリントに使用され得ることを示す。
【０１７１】
使用したプリンタは、Ｃｅｌｌｉｎｋ  Ｉｎｋ−ｃｒｅｄｉｂｌｅ  ３Ｄプリンタであった。
【０１７２】
これを、管状および格子状の構築物、ならびに追加の要素を含むゲル配合物を作製するための層状３Ｄプリントを調査するために使用した。
【０１７３】
（ねらい）
プリントの時点で追加の活性化剤を用いることなく、単一のプリンタカートリッジから（１つのノズルを介して）プリントされ得る材料を製造すること。
【０１７４】
この方法をまた、２つの一般的なプリント可能材料、すなわち０．１５％のＣａＣｌ２を含む４％のアルギン酸塩、および４０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７と比較して、それらの粘度特性についてバイオインク材料のさらなる組み合わせを調べるために使用した。バイオインク材料の特定の組み合わせを、特定の３Ｄ形状をプリントする能力について試験した。
【０１７５】
異なる組み合わせに含まれる追加の材料は、ラミニン配列ＩＫＶＡＶ凍結乾燥粉末；０．１５％のＣａＣｌ２を含む４％のアルギン酸塩；４０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７；ＤＭＥＭ培地；ＰＢＳおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７であった。
【０１７６】
（溶液の調製）
全てのサンプルを１．５ｍＬエッペンドルフチューブで調製した（１５ｍＬファルコンチューブで調製したスケールアップサンプルを除く）。
【０１７７】
様々なバイオインクのプリント時の粘度を図９の表に示すように試験した。得られたものの成分は表に示す通りであり、全て３つの実施例に関して以下に記載するようにして作製した。
【０１７８】
（実施例１：０．２５％（ｗ／ｖ）のＩＫＶＡＶ添加した３０ｍＭのＦＦＳ＋１ｍＬのプレゲルあたり２００μＬのＤＭＥＭ）
Ｆｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−Ｓを、１：１のモル比で存在するように秤量した。１２．５ｍｇのＩＫＶＡＶを添加した。粉末を溶解し凍結乾燥した。
【０１７９】
１５７ｍｇのＢｉｏｇｅｌｘ凍結乾燥ＦＦＳ／ＩＫＶＡＶ粉末（上記の通り）を１５ｍＬのファルコンチューブに量り入れ、そして５ｍＬのｄＨ２Ｏを添加した。次いで、チューブをボルテックスにかけ、粒子が残らなくなるまで超音波処理した。これに続いて、１ｍＬのＤＭＥＭを添加し、そしてチューブを再びボルテックスにかけて混合した。最後の超音波処理を用いて空気ポケットをすべて除去した。次いで、このバイオインクをプリンタカートリッジに移した。
【０１８０】
（実施例２：１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７中の３０ｍＭのＦＦＳ＋１ｍＬのプレゲルあたり２００μＬのＤＭＥＭ）
この粉末を室温で水に溶解することにより、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７の２０％ストック溶液を調製した。
【０１８１】
１３２ｍｇのＦｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−Ｓ（１：１）凍結乾燥粉末を１５ｍＬのファルコンチューブに量り入れ、そして５ｍＬのｄＨ２Ｏを添加した。次いで、チューブをボルテックスにかけ、粒子が残らなくなるまで超音波処理した。これに続いて、２５０μＬのストック２０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７を添加し、そしてチューブをボルテックスにかけて混合した。１ｍＬのＤＭＥＭを添加し、そしてチューブを再びボルテックスにかけた。最後の超音波処理を用いて空気ポケットをすべて除去した。次いで、このバイオインクをプリンタカートリッジに転写することができた。
【０１８２】
（実施例３：３０ｍＭのＦＦＳ＋１ｍＬのプレゲルあたり２００μＬのＤＭＥＭ）
１３２ｍｇのＦｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−Ｓ（１：１凍結乾燥粉末）を１５ｍＬのファルコンチューブに量り入れ、そして５ｍＬのｄＨ２Ｏを添加した。次いで、チューブをボルテックスにかけ、粒子が残らなくなるまで超音波処理した。これに続いて、１ｍＬのＤＭＥＭを添加し、そしてチューブを再びボルテックスにかけて混合した。最後の超音波処理を用いて空気ポケットをすべて除去した。次いで、このバイオインクをプリンタカートリッジに転写することができた。
【０１８３】
（結果）
図９に示すように、プリント直後に最高の粘度を有する従来技術の材料は、現在一般的に使用されている２つのプリント材料、すなわち０．１５％のＣａＣｌ２を有する４％のアルギン酸塩（１５８３センチポアズの粘度を有する）および４０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（４１６１センチポアズの粘度を有する）である。これはそれらが一旦プリントされるとそれらの形状を保持することを可能にする。
【０１８４】
本発明のペプチドベースのゲルについては、部分的にゲル化しかつ約２５０〜３００センチポアズまたはそれ以上の初期粘度を有するプリント可能なインクを得た。
【０１８５】
得られた組み合わせ材料の一覧ライブラリを使用して、３Ｄ押出プリンタ（Ｃｅｌｌｉｎｋ−Ｉｎｋｒｅｄｉｂｌｅ）による層状３Ｄプリントを使用して管状構築物および格子状構築物を作製するそれらの能力をさらに調査した。図１０は、Ｃｅｌｌｉｎｋ  Ｉｎｋｒｅｄｉｂｌｅプリンタを使用したプリントの写真を示す。
【０１８６】
十分にゲル化した材料をプリントすると、プリンタヘッドがフィルタとして作用し、ゲルの含水分を繊維構造体から分離した。
【０１８７】
プレゲルをそれ自体で直接ＤＭＥＭ培地の浴中にプリントすること、または希釈ＤＭＥＭで再構成されたプレゲルをプリントすることは両方とも成功した方法であった。例えば、乱れた環構造が得られ、そして材料はゲル化した。したがって、その後の実験では０％および５０％間のＤＭＥＭを使用した。
【０１８８】
組み合わせ材料のさらなる粘度研究に続いて、３つの特定の組み合わせがさらなるプリント研究のための粘度をもたらしたことを決定した。これらは、１ｍＬのプレゲルあたり２００μＬのＤＭＥＭを添加した３０ｍＭのＦＦＳＩＫＶＡＶ（すなわちＦｍｏｃ−ＦＦ、Ｆｍｏｃ−ＳおよびＩＫＶＡＶ）（実験１３および実施例１に記載の通り）；１％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７中の３０ｍＭのＦＦＳ（すなわちＦｍｏｃ−Ｓを含むＦｍｏｃ−ＦＦ）および１ｍＬのプレゲルゲルあたり２００μＬのＤＭＥＭを添加したもの（実験１４および実施例２に記載の通り）；ならびに最後に、３０ｍＭのＦＦＳおよび１ｍＬのプレゲルゲルあたり２００μＬのＤＭＥＭを添加したもの（実験１５および実施例３に記載の通り）；であった。
【０１８９】
これらの材料は、ｄＨ２Ｏ中にＦＦＳ粉末（１：１のＦｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−Ｓ）を再度水和させ、次いで、プレゲル１ｍＬあたり２００μＬのＤＭＥＭを添加することによって作製した。Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７添加のために、２０％のストック溶液を予め調製し、これをプレゲルで希釈して（例えば、１／２０）、異なる作業濃度を達成した（すなわち、１／２０の希釈は１％の溶液を与えるものであった）。次いで、ＤＭＥＭの添加を、他の２つのサンプルについて前述したのと同量で行った。これらの調査のために、すべてのサンプルを室温で一晩放置した。
【０１９０】
プリントされたリング、グリッドおよびシリンダを、材料の層を連続的に積み重ねることによってすべてのサンプルに対して達成した。図１１は、実験１４からのプリントされたゲルグリッド構造体（５層）の写真を示す。図１２は、実験１５からのプリントされたゲルシリンダ構造体の写真を示す。そして図１３は、実験１５からのプリントされたゲルグリッド構造体（５層）の写真を示す。全ての材料をプリントするのに必要とされる圧力は、５０％希釈培地で再構成された材料より４倍小さく、これは高圧がそれらを損傷する可能性があるので細胞をプリントする場合に好ましい。プリント後、室温で１時間インキュベートした後に構築物を検討したところ、構造体が追加の架橋剤なしでそれらの形状を保持していたことを示した。
【０１９１】
ペプチド誘導体は凍結乾燥粉末として安定であり、水または培養培地の添加によって補うことができる粉末の形態のバイオインクの提供は、エンドユーザーにとって安定的かつ便利な形態を表す。結果として、粉末の形態で貯蔵および輸送用に調製される可能性を有するバイオインクを調べた。
【０１９２】
バイオインクを、上記材料、および２つのさらなる組み合わせ（すなわち、ＲＧＤ（すなわちトリペプチドアルギニン−グリシン−アスパラギン酸）および他のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）（すなわち白樺から抽出されたヒドロゲル、およびwww.growdex.comから入手可能）を含むもの）に基づいて作製した。成分の異なる組み合わせを含むバイオインクを作製し、凍結乾燥粉末に凍結乾燥した。
【０１９３】
以下のバイオインクを調製した：
【０１９４】
（Ａ  ３０ｍＭ  ＦＦＳ）
５２．８ｍｇの凍結乾燥ＦＦＳ粉末（ＦＦＳ０１７ＭＣ）（すなわち、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−Ｓとの１：１凍結乾燥混合物）を、風袋引きした７ｍＬガラスバイアルに秤量し、２ｍＬのｄＨ２Ｏをこのバイアルにピペットで入れた。ボルテックスおよび超音波処理を用いて粉末を溶解／再水和させた。４００μＬのＤＭＥＭをピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。
【０１９５】
（Ｂ  ３０ｍＭ  ＦＦＳＩＫＶＡＶ（０．２５％  ｗ／ｖ））
６３．２ｍｇの凍結乾燥ＦＦＳおよびＩＫＶＡＶ粉末（ＦＦＳＩＫＶＡＶ００１ＭＣ）（すなわち、１：１のＦｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−Ｓと０．２５％ＩＫＶＡＶとの凍結乾燥混合物）を、風袋引きした７ｍＬガラスバイアルに秤量し、２ｍＬのｄＨ２Ｏをバイアルにピペットで入れた。磁気ビーズをバイアルに配置し、バイアルを、粉末を溶解／再水和するために使用される撹拌台の上に置いた。４００μＬのＤＭＥＭをピペットでバイアルに添加し、それを磁気ビーズを用いて再度混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。
【０１９６】
（Ｃ  ３０ｍＭ  ＦＦＳＲＧＤ  （比２：１：１）
８６．９ｍｇの凍結乾燥ＦＦＳおよびＲＧＤ粉末（ＦＦＳＲＧＤ００１ＭＣ）を、風袋引きをした７ｍＬガラスバイアル中へ秤量し、そして２ｍＬのｄＨ２Ｏをバイアル中へピペットで入れた。ボルテックスおよび超音波処理を用いて粉末を溶解／再水和させた。４００μＬのＤＭＥＭをピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。
【０１９７】
（Ｄ  ０．８３％  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７中の３０ｍＭ  ＦＦＳ）
５２．８ｍｇの凍結乾燥ＦＦＳ粉末（ＦＦＳＤ０１７ＭＣ）を、風袋引きをした７ｍＬガラスバイアル中へ秤量し、そして１．９ｍＬのｄＨ２Ｏをバイアル中へピペットで入れた。ボルテックスおよび超音波処理を用いて粉末を溶解／再水和させた。１００μＬの２０％ストックＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７溶液をピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。４００μＬのＤＭＥＭをピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。
【０１９８】
（Ｅ  ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中の３０ｍＭ  ＦＦＳ（１／２０希釈））
５２．８ｍｇの凍結乾燥ＦＦＳ粉末（ＦＦＳＤ０１７ＭＣ）を、風袋引きをした７ｍＬのガラスバイアル中へ秤量し、そして１．８ｍＬのｄＨ２Ｏをバイアル中へピペットで入れた。ボルテックスおよび超音波処理を用いて粉末を溶解／再水和させた。２００μＬの（１．５％濃度で供給されるように）ストックＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）溶液をピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。４００μＬのＤＭＥＭをピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。
【０１９９】
粘度測定の前に、全てのサンプルを冷蔵庫に２４時間貯蔵した。粘度測定を行い、残りのサンプルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、全てのサンプルを使用して１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で１ｍＬのバイオインクを調製した。粘度測定を繰り返す前に、これらを冷蔵庫に一晩放置した。
【０２００】
一旦調製された全てのバイオインクは、ＤＭＥＭ培地中のフェノールレッドのためにピンク色であることが観察され、これは全ての材料のｐＨが同様でありかつほぼ中性であることを示していた。凍結乾燥すると、全ての材料は微粉末を生じ、これについて、ピンク色を帯びたＫｏｌｌｉｆｏｒ  Ｐ４０７を含有するサンプルとはかけ離れた白色であることが観察された。
【０２０１】
バイオインクをｄＨ２Ｏで再水和すると、すべてのバイオインクはピンク色に戻り、以前の外観を呈した。ラミニン配列ＩＫＶＡＶを含有するバイオインク（すなわちサンプルＢ）は、最初はボルテックスにかけることができたが、ボルテックスにかけることよって超音波処理を通じて部分的にしか除去することができなかった泡を生じさせる点まで急速に粘稠になった。サンプルを直ちに調製した後、それらは冷蔵庫内で最初の２４時間のインキュベーションを行っているのと同じくらい粘稠ではないと視覚的に観察されたので、それらを一晩のインキュベーションのために冷蔵庫に戻した。後日、Ｋｏｌｌｉｆｏｒ  Ｐ４０７を含有するバイオインク（すなわちサンプルＤ）は流動溶液として残ったことが注目された。このサンプルが冷蔵庫から取り出され室温に達すると、凍結乾燥前の「硬化」状態に戻った。
【０２０２】
図１４（粘度測定結果のグラフ）に見られ得るように、バイオインクの粘度測定は、凍結乾燥前および凍結乾燥後で同等である。唯一の例外はＦｍｏｃ−ＦＦ／Ｆｍｏｃ−ＳとＲＧＤとの組み合わせであり、これは凍結乾燥前と凍結乾燥後の間に有意差があり、具体的にはゲルは凍結乾燥前よりも凍結乾燥後の方が堅いことを示す。約３５０センチポアズの粘度値が依然として押出しプリントに非常に適していたので、粘度の増加もまた有害な結果ではない。
【０２０３】
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｆｍｏｃ−ＳとＩＫＶＡＶとの組み合わせでの、凍結乾燥前と凍結乾燥後の間にも顕著な相違があった。さらに、凍結乾燥後に形成されたバイオインクは、粘度の変動が大きかった。これは、凍結乾燥粉末を再水和する際の困難さおよびその高粘度状態によるものであると考えられる。
【０２０４】
次いで、より長期間にわたる材料の安定性を評価した。以下の方法で３０ｍＭのＦＦＳバイオインクを調製した。
【０２０５】
５２．８ｍｇの凍結乾燥ＦＦＳ粉末（ＦＦＳ０１７ＭＣ）（すなわち、Ｆｍｏｃ−ＦＦとＦｍｏｃ−Ｓとの１：１混合物）を、風袋引きをした７ｍＬガラスバイアルに秤量し、そして２ｍＬのｄＨ２Ｏをバイアルにピペットで入れた。ボルテックスおよび超音波処理を用いて粉末を溶解／再水和させた。２００μＬのＤＭＥＭをピペットでバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、超音波処理を用いて気泡を除去した。
【０２０６】
この材料を４℃で３ヶ月間保存した。次いで、材料を冷蔵庫から取り出し、室温にしてから、一方が他方の中に２つの環を形成するように、機械押出式プリンタを用いてプリントした。プリントヘッドとして３０ゲージの小さい針を使用した。プリント後、構造体をＤＭＥＭに浸して、それが同じ構築物に残っているかまたは劣化しているかを評価した。
【０２０７】
図１５に見られ得るように、材料はプリント可能であり、正確なリングを形成し、一方は他方の内側に積み重ねるのにいくつかの層を必要とした。さらに、構築物はＤＭＥＭに２４時間浸漬した後も安定したままであった。
【０２０８】
（まとめ）
単一の「インク」カートリッジからプリント可能なバイオインクを開発した。押し出しプリントのための粘度を２５０〜３００センチポアズの閾値まで増加させることは、ＤＭＥＭならびにラミニン配列（ＩＫＶＡＶ）、フィブロネクチンおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７のような他の成分の添加によって達成可能であった。さらに、エンドユーザーによる再構成のためにバイオインクを調製し、それらを凍結乾燥し、貯蔵および輸送のための安定かつ便利な形態を提供することが可能であった。このようなバイオインクは冷蔵条件下で数ヶ月間安定であり、一度プリントされると安定である。
【０２０９】
Ｃｅｌｌｉｎｋ  Ｉｎｋｒｅｄｉｂｌｅ  ３Ｄプリンタを使用して３つの材料をうまくプリントし、バイオインクの追加の層を追加しかつそれらを融合させて単一の構築物を形成する必要のある構造体を形成した。
【０２１０】
（実施例４：ヒドロゲルからの薬剤の放出）
薬剤の緩効性(slow release)または遅延放出(delayed release)を提供する能力について本発明のヒドロゲルを試験した。
【０２１１】
（ねらい）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓヒドロゲルがモデル薬剤化合物の持続放出を提供する能力を評価すること。試験した薬剤はフルバスタチン、プラバスタチン、プロプラノロールおよびソタロールであった。
【０２１２】
（実験）
本研究で使用した４つのモデル化合物を以下に示す。
【０２１３】
【化３】
2020515537.tif 000009
【０２１４】
（プレゲルの調製）
・蒸留水中の上記各化合物の２ｍＭ溶液を調製し、次いで各溶液を１７．２ｍｇのＢｉｏｇｅｌｘゲル粉末を含むバイアルに添加した。
・各バイアルの内容物を、３０秒間〜１分間、交互にボルテックスにかけかつ超音波処理して、粉末が完全に溶解し、均質なプレゲル溶液が形成されるようにした。
・取り込んだ薬剤化合物を有するプレゲル溶液を必要になるまで４℃で保存した。
・一晩保存した後、フルバスタチン、プラバスタチンおよびソタロールを含むプレゲル溶液はより粘稠になったが、それでもなお易流動性であった。プロプラノロールを含有するプレゲル溶液は非常に粘稠になり、バイアルをひっくり返したとき、プレゲルは自立していた（画像については結果のセクションを参照）。
・ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中の各薬剤の２ｍＭのコントロール溶液も調製した。
【０２１５】
（放出アッセイ）
・（薬剤化合物を含む）プレゲル溶液を冷蔵保存から取り出し、室温に到達させ、次いで３０秒間ボルテックスにかけかつ超音波処理して、均一な溶液を得た。
・放出緩衝液（ＰＢＳ）および２４ウェルプレートを、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃にてインキュベーター中で予熱した。
・５００μＬの放出緩衝液をプレートの６ウェルに添加し、そして１．５ｍＬの蒸留水を周囲のウェルに添加した。
・次いで、プレートを３７℃で１５分間平衡化した。
・各プレートについて、薬剤化合物を含有するプレゲル溶液のうちの１つ（５０μＬ）を２４ウェルのインサートに添加し、そしてインサートを放出緩衝液を含有するウェルに入れた（３連で行った）。
・各２ｍＭのコントロール溶液５０μＬを２４ウェルのインサートに添加し、適切なプレート中の放出緩衝液を含有するウェルに添加した（３連で行った）。
・プレートを必要な時間インキュベーターに戻した。
・各指定された時点で（結果のセクションを参照）、ゲルサンプルおよびコントロールを含むインサートを上記の方法で調製した新しい２４ウェルのプレートに移した。
・各指定された時点で、ウェルに残っている放出緩衝液をＨＰＬＣバイアルに移し、ＨＰＬＣ分析が行われるまで４℃で保存した。
【０２１６】
（ＨＰＬＣ分析）
各時点で回収された放出緩衝液のサンプルを、「薬剤放出アッセイ」法を用いて２２０ｎｍで分析した。
【０２１７】
分析には、１１００シリーズの高速液体クロマトグラフィーポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を使用した。これは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡを含む水を使用して行った。溶離液溶媒系は、３分間水中４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの直線勾配を有し、１２分で水中８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルまで徐々に上昇した。この濃度を１６分まで一定に保ち、その後勾配を減少させ、１９分で水中４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルに到達した。次いで、データをソフトウエア「Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ」を使用して手動で処理した。
【０２１８】
（結果）
（プレゲル溶液の外観）
全ての溶液は粘性ゲルに固まる。プロプラノロールゲルは最も硬く見え、ひっくり返してもそのゲル形態を保持した。
【０２１９】
（ＨＰＬＣ分析）
放出緩衝液の３連のサンプルをＨＰＬＣによって分析し、そして各モデル薬剤化合物に対応するピークについてピーク面積を測定した。平均ピーク面積を記録し、各化合物について作成した標準曲線を用いてそれぞれの濃度を決定した。
【０２２０】
（フルバスタチン、プラバスタチンおよびソタロール）
データは、フルバスタチン、プラバスタチンおよびソタロールについて、ヒドロゲルからの薬剤の放出プロファイルはコントロールＰＢＳ溶液より遅く、そして放出時間はコントロールＰＢＳ溶液からのそれと比較して延長されたことを示した。プロプラノロールについては、放出時間およびプロフィールの両方がコントロールと比較して有意に変化し、そしてプロプラノロール含有ゲルをより詳細な研究のために同定した。
【０２２１】
（プロプラノロール）
プロプラノロールの放出プロフィールを詳細に調べたところ、表５において以下の通りであったことを見出した。
【０２２２】
保持時間：６．９〜７．０分
【０２２３】
【表５】
2020515537.tif 000010
【０２２４】
プロプラノロールの放出およびプロプラノロールの累積放出のグラフを図１６および１７に示す。
【０２２５】
プロプラノロールについては、７日間の研究全体にわたってゲルからの持続放出が観察され、７日間を超えて持続し、コントロールと比較して時間が著しく延長された。
【０２２６】
プロプラノロールを用いるさらなる２回の試験を試験したが、ペプチドの濃度が１０ｍＭおよび４０ｍＭ（上記の例では２０ｍＭではなく）であった点のみが異なっていた。両方の場合において、薬剤放出が９時間の時点までに測定可能な限界を下回っていたコントロールと比較して、有意な薬剤濃度が７２時間以上後に放出され続けた。
【０２２７】
（まとめ）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓヒドロゲルを、透明で粘性のある安定したゲルを与える、様々な薬物を含むように調製した。これらからの薬剤の放出は、コントロールと比較して延長され、そしてプロプラノロールの場合には著しくそうであった。
【０２２８】
したがって、両方の実施例は、カチオンを有するヒドロゲル前駆体の押出しを使用して３Ｄプリントヒドロゲル構造体および薬剤の緩効性／遅延放出に有効な構造体を製造することができることを示した。
【０２２９】
（実施例５：ヒドロゲル研究のさらなる薬剤放出）
上記の最初の試験の成功に続いて、以下の化合物を用いてさらなる試験を行った。
【０２３０】
（ねらい）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓヒドロゲルが先にスクリーニングされた薬剤プロプラノロールの観察された持続放出のより良い理解を得るために特定の構造的特徴を有するモデル化合物の持続放出を提供する能力を評価すること。
【０２３１】
（実験）
本研究で使用した２つのモデル化合物（ベタキソロールとキニジン）を、先に研究したプロプラノロールと一緒に以下に示す。
【０２３２】
【化４】
2020515537.tif 000011
【０２３３】
（プレゲルの調製）
（ベタキソロールプレゲル）
・蒸留水中の上記各化合物の２ｍＭ溶液を調製し、次いで各溶液を１７．２ｍｇのＢｉｏｇｅｌｘ粉末、すなわち凍結乾燥Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｆｍｏｃ−Ｓを含有するバイアルに添加した。
・各バイアルの内容物を、３０秒間〜１分間、交互にボルテックスにかけ、かつ超音波処理して、粉末が完全に溶解し、均質なプレゲル溶液が形成されるようにした。
・取り込まれた薬剤化合物を有するプレゲル溶液を必要になるまで４℃で保存した。
・一晩保存した後、ベタキソロールを含むプレゲル溶液は著しく粘稠になり、バイアルをひっくり返すとプレゲルは自立した（画像については結果のセクションを参照）。
・ＰＢＳ溶液中のベタキソロールの２ｍＭコントロール溶液も調製した。
【０２３４】
（キニジンプレゲル）
・蒸留水中の２ｍＭのキニジン溶液を調製し、その溶液を１７．２ｍｇのＢｉｏｇｅｌｘゲル粉末を含むバイアルに添加した。白色懸濁液を形成した。
・各バイアルの内容物を数分間、交互にボルテックスにかけかつ超音波処理したが、固体は溶解しなかった。
・０．５ＭのＮａＯＨを用いて溶液のｐＨを調整した。約ｐＨ１０では、濁ったわずかに粘稠な溶液を形成した。
・取り込まれた薬剤化合物を有するプレゲル溶液を必要になるまで４℃で保存した。
・一晩保存した後、キニジンを含有するプレゲル溶液は、ｐＨが約９に低下したが、有意な差は見られなかった。
・ＰＢＳ溶液中のキニジンの２ｍＭコントロール溶液も調製した。
【０２３５】
（放出アッセイ）
・（薬剤化合物を含む）プレゲル溶液を冷蔵保存から取り出し、室温に到達させ、そして３０秒間ボルテックスにかけ、かつ超音波処理して、均質な溶液が達成されることを確実にした。
・放出緩衝液（ＰＢＳ）および２４ウェルのプレートを、５％のＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃にてインキュベーター中で予熱した。
・５００μＬの放出緩衝液をプレートの６ウェルに添加し、そして１．５ｍＬの蒸留水を周囲のウェルに添加した。
・次いで、プレートを３７℃で１５分間平衡化した。
・各プレートについて、薬剤化合物を含有するプレゲル溶液のうちの１つの５０μＬを２４ウェルのインサートに添加し、インサートを放出緩衝液を含有するウェルに入れた（３連で行った）。
・５０μＬの各２ｍＭのコントロール溶液を２４ウェルのインサートに添加し、適切なプレート中の放出緩衝液を含有するウェルに添加した（３連で行った）。
・プレートを必要な時間インキュベーターに戻した。
・各指定された時点で（結果のセクションを参照）、ゲルサンプルおよびコントロールを含むインサートを上記の方法で調製した新しい２４ウェルのプレートに移した。
・各指定された時点で、ウェルに残っている放出緩衝液をＨＰＬＣバイアルに移し、ＨＰＬＣ分析が行われるまで４℃で保存した。
【０２３６】
（ＨＰＬＣ分析）
各時点で回収された放出緩衝液のサンプルを、２２０ｎｍで「薬剤放出アッセイ」法を用いて分析した。
【０２３７】
分析には、１１００シリーズの高速液体クロマトグラフィーポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を使用した。これは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡを含む水を使用して行った。溶離剤溶媒系は、３分で水中４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの直線勾配を有し、１２分で水中８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルまで徐々に上昇した。この濃度を１６分まで一定に保持し、１９分で水中４０％（ｖ  ／  ｖ）のアセトニトリルにまで勾配を減少させた。次いで、データを、ソフトウエア「Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ」を用いて手動で処理した。
【０２３８】
（結果）
（プレゲル溶液の外観）
ベタキソロール含有溶液は自己支持型ゲルに硬化したが、キニジン含有溶液は粘稠な溶液を形成した。
【０２３９】
（ＨＰＬＣ分析）
放出緩衝液の３連のサンプルをＨＰＬＣによって分析し、そして各モデル薬剤化合物に対応するピークについてピーク面積を測定した。平均ピーク面積を記録し、各化合物について作成した標準曲線を用いてそれぞれの濃度を求めた。各モデル化合物についてのこのデータの表およびグラフを以下に示す。
【０２４０】
（ベタキソロール）
放出時間を以下の表６に示す。示されるように、全体の保持時間は７．４分を表す。
【０２４１】
【表６】
2020515537.tif 000012
【０２４２】
ベタキソロールの放出およびベタキソロールの累積放出のグラフを図１８および１９に示す。
【０２４３】
（キニジン）
放出時間を以下の表７に示す。示されるように、全体の保持時間は８．５分を表す。
【０２４４】
【表７】
2020515537.tif 000013
【０２４５】
キニジンの放出およびキニジンの累積放出のグラフを図２０および２１に示す。
【０２４６】
＊キニジンのコントロールについての結果は８５％の放出のみに対応することが留意された。
【０２４７】
（検討）
上記データを先に試験したプロプラノロール（図１６および図１７において以下に示すデータ）と比較すると、ベタキソロール（図１８および図１９）およびキニジン（図２０および図２１）の両方がプロプラノロールに類似の放出プロファイルを有することが分かる。
【０２４８】
ベタキソロールはコントロールのインサートよりも１０ｍＭのＦｍｏｃ−ＦＦ／Ｓゲルから顕著によりゆっくりと放出された（５日対９時間）が、この放出はプロプラノロール（これは７日間の研究全体にわたって持続放出を示した）よりも短時間であった。ベタキソロールは、プロプラノロールと類似のアミン鎖を含むが、単一の芳香環のみを含む。ベタキソロールの放出結果は、共役芳香族系は分子の持続放出に必要ではないが、単一の芳香環を有するベタキソロールは、ナフタレン系を有するプロプラノロール（２環）よりも早く放出されるので、芳香族性の程度は放出に影響を与えることを示している。
【０２４９】
キニジンもまた、コントロールからよりも１０ｍＭのＦｍｏｃ−ＦＦ／Ｓゲルから顕著によりゆっくり放出され、持続放出がコントロールの９時間と比較して７日間の研究全体にわたって観察された。ＨＰＬＣ分析は、実験の終わりに、４．５％の薬剤が依然として残りのゲル残渣中に存在することを示した。プロプラノロールと同様に、キニジンは共役芳香族系を有するが異なる化学種を有する弱塩基性化合物である。この化合物の放出プロファイルは、特にプロプラノロール様構造とは対照的に、Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓシステムからの持続放出をもたらすのがこれらの一般的な特徴であることを示唆している。
【０２５０】
（まとめ）
Ｆｍｏｃ−ＦＦ／Ｓヒドロゲルは、単純な拡散に対して、追加のモデル化合物、ベタキソロールおよびキニジンの安定した遅い放出速度を提供することが示された。両方ともプロプラノロールと類似の放出プロファイルを示し、７日間の研究全体を通してキニジンの持続放出が起こり、ベタキソロールはやや速い速度で（５日間にわたって）放出される。これらの結果は、特に類似の化学種を有するプロプラノロールとベタキソロールとの放出を比較する際、カプセル化された分子内の芳香族性の程度が分子の放出速度に影響を及ぼし得ることを示す。
【０２５１】
したがって、本発明は、ペプチド含有ヒドロゲルの３Ｄプリント、および（例えば、細胞増殖および薬剤送達のための）それらのゲルの使用を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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