(57)【要約】  本発明は、新規な組換え型二機能性融合タンパク質、その調製方法および用途を提供する。具体的に、提供される二機能性融合タンパク質は、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体およびヒトＳＩＲＰαの外側における第１の機能領域と直列に接続されることによって構成される。インビトロ実験により確認されたように、これはヒトＣＤ２０およびヒトＣＤ４７に同時に結合することができる。抗体依存性、細胞媒介の細胞毒および補体依存の細胞傷害活性を介してＣＤ２０陽性腫瘍細胞に治療効果を及ぼす同時に、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との結合を阻害することができる。マクロファージが腫瘍細胞を攻撃するように活性化し、著しい抗腫瘍活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型二機能性融合タンパク質であって、
ＣＤ２０に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント、および
ＣＤ４７に特異的に結合するペプチド、
を含み、
前記ペプチドは前記抗体または前記抗体フラグメントに結合している、
組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗体または前記抗体フラグメントは、配列番号５の重鎖可変領域および配列番号７の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗体は、リツキシマブ、オビヌツズマブ、およびオファツムマブからなる群から選択される、請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項４】
前記ペプチドがＳＩＲＰαに由来する、請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項５】
前記ペプチドはヒトＳＩＲＰαの第一細胞外ドメインである、請求項４に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体は重鎖および軽鎖を含み、前記ペプチドは前記抗体の前記重鎖のＮ末端に結合している、請求項５に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体は重鎖および軽鎖を含み、前記ペプチドは前記抗体の前記重鎖のＣ末端に結合している、請求項５に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項８】
前記重鎖は配列番号５の重鎖可変領域を含み、前記軽鎖は配列番号７の軽鎖可変領域を含む、請求項６または７に記載の組換え型二機能性融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクタ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクタを含有し、またはゲノムに請求項９に記載のポリヌクレオチドが組込まれた、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１２】
医薬組成物であって、
（ｉ）請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質、および
（ｉｉ）薬学的に許容されるベクタ、
を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＤ２０タンパク質を発現する腫瘍を処置するための、請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質の使用。
【請求項１４】
前記ＣＤ２０タンパク質を発現する前記腫瘍は、胃がん、肝臓がん、白血病、腎臓がん、肺がん、小腸がん、骨腫瘍、前立腺がん、直腸結腸がん、乳がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、副腎がん、および膀胱がんからなる群から選択される、請求項１３に記載の組換え型二機能性融合タンパク質の使用。
【請求項１５】
組換え型二機能性融合タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の宿主細胞を発現に適した条件下で培養すること、
（ｂ）請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質を培養物から単離すること、
を含む、請求項１に記載の組換え型二機能性融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に属し、特に新規な組換え型二機能性融合タンパク質、その調製方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球膜の表面に発現する膜貫通タンパク質であり、その生物学的機能はいまだに不明であり、カルシウムイオンチャネルとしてＢ細胞の免疫反応を促進する可能性がある。ＣＤ２０は、初期細胞と形質細胞を除くすべての発生段階におけるＢ細胞膜に発現する。同時に、ＣＤ２０は、Ｂリンパ腫、慢性Ｂリンパ球性白血病、有毛細胞白血病、およびメラノーマ幹細胞にも発現する。市販が承認されている、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体薬としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、オブリンムマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）がある。これらの抗体薬の作用機序はいずれもＡＤＣＣとＣＤＣによるものである。しかしながら、臨床治療の過程において、何人かの患者は、一定期間の治療を受けた後にＣＤ２０が細胞から剥離するように誘導し、それによって抗体薬に対する感受性を失い得ることが分かった。一方、何人かの患者は、低親和性遺伝子型（１５８Ｆ）Ｆｃｇａｍｍａ受容体（ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ）を発現し、リツキシマブに対しても耐性を有した。したがって、リツキシマブに対する患者の耐性をいかにして克服するかは、抗体医薬品の研究開発の分野において話題となっている。
【０００３】
ＣＤ４７は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質でもあり、赤血球を含むほぼすべての細胞表面に発現する。ＣＤ４７のリガンドには、接着因子（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、トロンボスポンジン−１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、およびシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰｓ）が含まれる。ＣＤ４７は、細胞遊走、Ｔ細胞、樹状細胞活性化、軸索発達などを含む様々な生物学的機能を有する。さらに、ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαと相互作用することによりマクロファージの食作用を阻害することができる。このように、ＣＤ４７は、いわゆる「Ｄｏｎ'ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」というシグナルを伝達し、血液細胞などの正常な細胞がマクロファージによって貪食されるのを防ぐことができる。
【０００４】
研究により示されたように、正常組織細胞がＣＤ４７を発現する他、多くの腫瘍細胞は、ＣＤ４７を過剰発現し、マクロファージ表面のＳＩＲＰαに結合することによってマクロファージが腫瘍細胞を貪食することを防止する。これは、腫瘍が生体の免疫監視を回避するメカニズムの一つだと考えられる。ＣＤ４７の発現が高い腫瘍には、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病細胞（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌などがある。
【０００５】
研究により示されたように、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα結合活性を遮断するＣＤ４７−特異的抗体を腫瘍担持マウスに注射すると、マウスにおける腫瘍増殖を有意に阻害した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新規な組換え型二機能性融合タンパク質、その調製方法および用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様において、組換え型二機能性融合タンパク質が提供される。上記組換え型二機能性融合タンパク質は、以下を含む：
第１の結合構造ドメイン（Ｄ１）；および
第２の結合構造ドメイン（Ｄ２）。
【０００８】
前記第１の結合構造ドメインは標的分子ＣＤ２０タンパク質に特異的に結合する。
【０００９】
第２の結合構造ドメインは標的分子ＣＤ４７タンパク質に特異的に結合する。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、前記Ｄ１はＣＤ２０タンパク質に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【００１１】
別の好ましい実施形態では、前記Ｄ２はＣＤ４７タンパク質に特異的に結合するポリペプチドフラグメントであり、前記ポリペプチドフラグメントがＳＩＲＰαに由来する。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、前記Ｄ１および前記Ｄ２はリンカーペプチドによって連結され、好ましくは、前記リンカーペプチドは抗体定常領域配列を含む。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、前記Ｄ１および前記Ｄ２はリンカーペプチドによって連結され、好ましくは、前記リンカーペプチドは抗体可変領域配列を含む。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、Ｄ１は抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり、Ｄ２はヒトＳＩＲＰα膜の外側における第１の機能領域（ＳＩＲＰα／ドメイン１、ＳＤ１）であり、Ｄ２はＤ１の重鎖定常領域の末端に連結される。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、Ｄ１は抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり、Ｄ２はヒトＳＩＲＰα膜の外側における第１の機能領域（ＳＩＲＰα／ドメイン１、ＳＤ１）であり、Ｄ２はＤ１の重鎖可変領域の先端に連結される。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示す重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示す軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、Ｄ２のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示されている。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、上記組換え型二機能性融合タンパク質はホモ二量体である。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、ジスルフィド結合によって結合された４本のポリペプチド鎖（２本の重鎖と２本の軽鎖）を含み、Ｄ２は上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖のＣ端またはＮ端に結合する。
【００２０】
本発明の第２の態様において、本発明の第１の態様に係る組換え型二機能性融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドが提供される。
【００２１】
本発明の第３の態様において、本発明の第２の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクタが提供される。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、上記ベクタは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルス、または他のベクタを含む。
【００２３】
本発明の第４の態様において、本発明の第３の態様に係るベクタを含むか、またはゲノムにおいて本発明の第２の態様に係るポリヌクレオチドと一体化した、遺伝子操作された宿主細胞が提供される。
【００２４】
本発明の第５の態様において、免疫複合体が提供される。この免疫複合体は以下を含む：
（ａ）本発明の第１の態様に係る組換え型二機能性融合タンパク質；および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、上記カップリング部分は、蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影）の造影剤からなる群から選択されるか、または検測可能な産物を生成できる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（ＩＬ−２など）、抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ−ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）、または任意の形態のナノ粒子などから選択される。
【００２６】
本発明の第６の態様において、以下を含む医薬組成物が提供される。
（ｉ）本発明の第１の態様に係る組換え型二機能性融合タンパク質、または本発明の第５の態様に係る免疫複合体；および
（ｉｉ）薬学的に許容されるベクタ。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、上記医薬組成物は注射剤の形態である。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、上記医薬組成物は腫瘍を治療するための医薬を調製するためのものであり、好ましくは上記腫瘍は胃癌、肝臓癌、白血病、腎臓癌、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、副腎腫瘍、または膀胱腫瘍からなる群から選択される。
【００２９】
本発明の第７の態様において、薬品を調製するための、本発明の第１の態様に係る組換え型二機能性融合タンパク質、または本発明の第５の態様に係る免疫複合体の用途が提供される。上記薬品は、ＣＤ２０タンパク質を発現する腫瘍を治療または予防するためである。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、上記腫瘍は、胃癌、リンパ腫、肝臓癌、白血病、腎臓癌、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、または副腎腫瘍を含む。
【００３１】
本発明の第８の態様において、組換え型二機能性融合タンパク質を調製するための方法が提供される。この方法は以下を含む：
（ａ）発現に適した条件下で本発明の第４の態様に係る宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）本発明の第１の態様に係る組換え型二機能性融合タンパク質を培養物から単離すること。
【００３２】
本発明の第９の態様において、腫瘍を治療する方法が提供される。上記方法は、それを必要とする対象に本発明の第１の態様に係る組換え型二機能性融合タンパク質または本発明の第５の態様に係る免疫複合体を投与する工程を含む。
【００３３】
本発明の範囲内で、本発明の上記各技術的特徴および以下（実施形態など）に具体的に説明される各技術的特徴を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることを理解すべきである。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１タンパク質の構造および作用様式を示す。
【図２】ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質の構造および作用様式を示す。
【図３Ａ】ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１ヌクレオチド配列を示し、図３Ａは重鎖ヌクレオチド配列である。
【図３Ｂ】ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１ヌクレオチド配列を示し、図３Ｂは軽鎖ヌクレオチド配列である。
【図３Ｃ】ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのヌクレオチド配列を示し、図３Ｃは重鎖ヌクレオチド配列である。
【図３Ｄ】ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのヌクレオチド配列を示し、図３Ｄは軽鎖ヌクレオチド配列である。
【図４Ａ】ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１アミノ酸配列を示し、図４Ａは重鎖アミノ酸配列である。
【図４Ｂ】ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１アミノ酸配列を示し、図４Ｂは軽鎖アミノ酸配列である。
【図４Ｃ】ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂアミノ酸配列を示し、図４Ｃは重鎖アミノ酸配列である。
【図４Ｄ】ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂアミノ酸配列を示し、図４Ｄは軽鎖アミノ酸配列である。
【図５Ａ】ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示し、図５ＡはＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を示す。
【図５Ｂ】ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示し、図５ＢはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を示す。
【図６ＡＢ】標的の親和性活性を示し、図６Ａおよび６ＢはＣＤ２０標的に対する親和性活性を示す。
【図６ＣＤ】標的の親和性活性を示し、図６Ｃおよび６ＤはＣＤ４７標的に対する親和性活性を示す。
【図７】ＣＤ４７標的の競合的結合活性を示す。
【図８】ＡＤＣＣおよびＣＤＣの活性分析を示し、ＡおよびＢはＡＤＣＣの活性を示し、ＣおよびＤはＣＤＣの活性を示す。
【図９】マクロファージの食作用活性の促進を示す。
【図１０Ａ】インビボ抗腫瘍活性を示し、図１０ＡはＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１のインビボ抗腫瘍活性を示す。
【図１０Ｂ】インビボ抗腫瘍活性を示し、図１０ＢはＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのインビボ抗腫瘍活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、意外にも遺伝子組換え型二機能性融合タンパク質（ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１）を取得し、抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体とヒトＳＩＲＰα膜の外側における第１の機能領域（ＳＩＲＰα−Ｄｏｍａｉｎ  １，ＳＤ１）が直列に接続されることにより構成される。ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１はホモ二量体に属し、１８０ｋＤａの分子量を有する。細胞株をスクリーニングした後、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いてこのタンパク質の安定発現細胞株を調製し、発酵培養により５００ｍｇのタンパク質を調製した。インビトロ実験により確認されたように、このタンパク質は、ヒトＣＤ２０およびヒトＣＤ４７の両方に同時に結合し、抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）の活性を介して、ＣＤ２０陽性腫瘍細胞に対する治療効果を発揮し、そしてＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断し、それによって腫瘍細胞を攻撃するようにマクロファージを活性化することができる。ヒトリンパ腫モデルによるインビボ薬力学実験により確認されたように、ＣＤ２０Ａｂ−ＳＤ１は有意な抗腫瘍活性を有し、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１で治療されたマウスの生存率は１００％であり、一方、単にリツキシマブで治療されたマウスの生存率はわずか６７％であった。したがって、本発明に係るＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１は、リツキシマブに対して無効または耐性であるＢ細胞リンパ腫およびＢリンパ球性白血病患者を治療するための優れた治療効果を有する抗腫瘍薬として開発されることができる。
【００３６】
本発明を具体的に説明する前に、本発明は記載された特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変化し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することを目的としており、限定を意図するものではないこともまた理解すべきである。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲のみによって限定されるべきである。
【００３７】
本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用されるとき、特定の列挙された値に関して使用されるとき、用語「約」は、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用されるとき、表現「約１００」は、９９から１０１との間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００３８】
本発明に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書に例示する。
【００３９】
ＳＩＲＰα
シグナル調節タンパク質α（ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  α，  ＳＩＲＰα）は、ＳＨ２ドメインのタンパク質チロシンホスファターゼ基質１とも呼ばれて、免疫グロブリンスーパーファミリーの膜貫通タンパク質に属する。ＳＩＲＰαはＣＤ４７に対する重要な表面受容体であり、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達経路は免疫系において負の調節的役割を有する。
【００４０】
好ましい実施形態では、上記ＳＩＲＰα膜の外側における第１の機能的領域（ＳＩＲＰα−Ｄｏｍａｉｎ  １，  ＳＤ１）のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＡＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＰＶＶＳＧＰＡＡＲＡＴＰＱＨ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９）。
【００４１】
抗ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０はＢリンパ球膜の表面に発現する膜貫通タンパク質である。ＣＤ２０は、初期細胞と形質細胞を除くすべての発生段階でＢ細胞膜に発現する。同時に、ＣＤ２０は、Ｂリンパ腫、慢性Ｂリンパ球性白血病、有毛細胞白血病、およびメラノーマ幹細胞にも発現する。市販が承認されている、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体薬としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、オブリンムマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）がある。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子組換え型二機能性融合タンパク質を調製するために使用される抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、オブリンムマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）からなる群から選択される。
【００４２】
本発明の他の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）；
【００４３】
そのコーディングヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）；
【００４５】
そのコーディングヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体（ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１）の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＡＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＡＡＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＡＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＰＶＶＳＧＰＡＡＲＡＴＰＱＨ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）；
【００４７】
そのコーディングヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体（ＣＤ２０ｍＡＢ−ＳＤ１）の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＨＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）。
【００４９】
そのコーディングヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）。
【００５０】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体（ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ）の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＡＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＡＰＶＶＳＧＰＡＡＲＡＴＰＱＨＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＡＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＡＡＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３）；
【００５１】
そのコーディングヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１）。
【００５２】
本発明の別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ２０抗体（ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ）の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＨＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）。
【００５３】
そのコーディングヌクレオチド配列は：
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２）。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０抗体は、単鎖抗体であり、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に、必要におじてリンカーペプチドを有する。上記リンカーペプチドの長さは、好ましくは１〜１５個のアミノ酸、より好ましくは３〜１０個のアミノ酸である。
【００５５】
二機能性融合タンパク質ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ
本発明者らは、驚くべきことに、以下のことを見出した：本発明に従って構築された二機能性融合タンパク質（特異的に結合された標的分子ＣＤ２０タンパク質の結合構造ドメインと特異的に結合された標的分子ＣＤ４７タンパク質の結合構造ドメインを含む。）は、ＣＤ２０陽性腫瘍に対して有意な抑制効果を有し、リツキシマブによるＣＤ２０陽性腫瘍への治療効果を強化し、リツキシマブに対して抵抗性を発生するＣＤ２０陽性腫瘍を治療し、リツキシマブの増感剤として使用することができる。
【００５６】
したがって、本発明は、第１の結合構造ドメイン（本明細書では「Ｄ１」とも呼ばれる）および第２の結合構造ドメイン（本明細書では「Ｄ２」とも呼ばれる）を含む組換え型二機能性融合タンパク質を提供する。そのうち、Ｄ１は標的分子ＣＤ２０タンパク質に特異的に結合し、Ｄ２は標的分子ＣＤ４７タンパク質に特異的に結合する。
【００５７】
本発明によれば、組換え型二機能性融合タンパク質は、単一の多機能性ポリペプチドであってよく、または互いに共有結合または非共有結合している２つ以上のポリペプチドの多量体複合体であってよい。本開示から明らかになるように、ＣＤ２０分子およびＣＤ４７分子に同時に結合する能力を有するいずれの結合構築物も組換え型二機能性融合タンパク質と見なされる。
【００５８】
当業者には理解されるように、本発明に係る任意の組換え型二機能性融合タンパク質またはその変異体は、標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を使用して構築することができる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、上記特異的に結合された標的分子ＣＤ２０タンパク質の結合構造ドメインは、抗ＣＤ２０抗体であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示す重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示す抗軽鎖可変領域を含む。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態では、上記特異的に結合された標的分子ＣＤ４７タンパク質の結合構造ドメインは、上記ＳＩＲＰαに由来し、好ましくはＳＩＲＰα膜の外側における第１の機能領域である。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態では、上記組換え型二機能性融合タンパク質において、Ｄ２はＤ１のＣ端またはＮ端に連結されており、その連結の方式としては、頭−頭の連結、頭−尾の連結、尾−尾の連結またはその組み合わせであり得る。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１）は、ジスルフィド結合によって結合された４本のポリペプチド鎖（２本の重鎖と２本の軽鎖）を含む。Ｄ２は、上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖のＣ末端に結合し、好ましくは重鎖とＤ２との結合によって形成されたポリペプチドのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されて、そのコードされたポリヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示される。軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されて、そのコードされたポリヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示される。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ）は、ジスルフィド結合によって結合された４本のポリペプチド鎖（２本の重鎖および２本の軽鎖）を含む。Ｄ２は、上記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の重鎖Ｎ末端に連結されて、好ましくは、重鎖とＤ２との結合によって形成されたポリペプチドのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示されて、そのコードされたポリヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される。軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０に示されて、そのコードされたポリヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２に示される。
【００６４】
結合構造ドメイン
本発明に係る組換え型二機能性融合タンパク質は、少なくとも２つの独立した結合構造ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を含む。本明細書中で使用される場合、表現「結合構造ドメイン」は、特定目的のタンパク質に特異的に結合できる任意のペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場分子、ペプチドディスプレイ分子またはポリペプチド含有構築物を意味する。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的に結合する」などは、抗原結合構造ドメインが５００ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする特定の抗原と複合体を形成し、通常の試験条件下で他の無関係のタンパク質に結合しないことを意味する。好ましくは、「無関係のタンパク質」は、互いに９５％未満のアミノ酸同一性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドである。
【００６６】
本発明の文脈において使用可能な抗原結合構造ドメインの例示的な分類は以下を含む：抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ））、特定の抗原と特異的に相互作用する受容体分子、特定の抗原に特異的に結合された受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質、抗原結合足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、ＨＥＡＴリピートタンパク質、ＡＲＭリピートタンパク質、三角テトラペプチドリピートタンパク質、および天然存在的反復配列タンパク質に基づく他の足場など［例えば、Ｂｏｅｒｓｍａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２０１１、Ｃｕｒｒ。Ｏｐｉｎ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。２２：８４９−８５７、およびその中に引用されている参考文献を参照のこと）およびそのアプタマーまたは他の部分。
【００６７】
２つの分子が互いに特異的に結合しているかどうかを決定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば平衡透析法、表面プラズモン共鳴法などを含む。例えば、本発明の文脈において使用される場合、抗原結合構造ドメインは、表面プラズモン共鳴測定法により測定される場合、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約０．５ｐＭ未満、約０．２ｐＭ未満、約０．１ｐＭ未満、または約０．０５ｐＭ未満のＫＤで特定の抗原またはその一部のポリペプチドに結合する。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「表面プラズモン共鳴」とは、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａｃｏｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ部署、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、バイオセンサ−マトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによるリアルタイム相互作用の光学現象の分析をいう。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ＫＤ」は、特定のタンパク質−タンパク質の相互作用（例えば、抗体−抗原の相互作用）の平衡解離定数を指す。他に示さない限り、本明細書に開示されるＫＤ値は、２５℃で表面プラズモン共鳴測定法によって決定されるＫＤ値をいう。
【００７０】
抗体および抗体の抗原結合フラグメント
上記のように、「抗原結合構造ドメイン」（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなり得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、特定の抗原（例えば、ＣＤ２０タンパク質またはＣＤ４７タンパク質）に特異的に結合されるかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、４本のポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ））を含む免疫グロブリン分子およびそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つの構造ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常ドメインは１つの構造ドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。それらの間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保守的な領域が介在する。それぞれのＶＨとＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順に配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であり得るか、または天然にもしくは人工的に改変され得る。２つ以上のＣＤＲに対する並行分析に基づいて、アミノ酸コンセンサス配列を限定することができる。
【００７１】
本発明に係る組換え型二機能性融合タンパク質のＤ１および／またはＤ２の成分は、インタクトな抗体分子の抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなってもよい。本明細書で使用されるように、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に入手可能な合成または遺伝子改変のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。任意の適切な標準的技術、例えば、タンパク質分解消化または関連操作でコードされた抗体可変ドメインおよび場合に応じる抗体定常ドメインのＤＮＡの組換え遺伝子工程技術などを利用して、例えば、インンタクトな抗体分子から抗体の抗原結合フラグメントを派生させる。そのようなＤＮＡは既知であるかおよび／または例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む。）から容易に入手可能または合成可能なものである。上記ＤＮＡに対しては、配列測定を行うほか、化学的にまたは分子生物学的技術を使用することによって操作を行うことができる。例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切なレイアウトに整列させるか、またはコドンを導入して、システイン残基を生成して、アミノ酸を修飾、付加または削除などすることができる。
【００７２】
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては以下を含む：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような独立相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束を受けるＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド。本明細書中で使用される場合、表現「抗原結合フラグメント」はまた、構造ドメイン特異的抗体、単一構造ドメイン抗体、構造ドメイン欠損抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ抗体、トリボディ抗体、テトラボディ抗体、ミニ抗体、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインのような他の工程化分子も包含する。
【００７３】
抗体の抗原結合フラグメントは、一般に少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成を有し、典型的には、１つ以上のフレームワーク配列と隣接するか、またはリーディングフレームに適合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬ構造ドメインと会合したＶＨ構造ドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨ構造ドメインとＶＬ構造ドメインは、任意の適切な配置で互いに対向して配置されてよい。例えば、可変領域は二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含んでよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬ構造ドメインを含んでよい。
【００７４】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有会合した少なくとも１つの可変ドメインを含んでよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に存在し得る可変ドメインと定常ドメインの非限定的な例示的なレイアウトは、以下を含む：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）；）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。上記の例示的レイアウトのいずれかを含む、可変ドメインと定常ドメインのレイアウトのいずれにおいて、可変ドメインと定常ドメインは互いに直接接続されてもよく、または完全もしくは部分のヒンジ領域もしくファージョイント領域によって接続されてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間に柔軟または半柔軟な結合を形成する少なくとも２つ（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個、またはそれ以上）のアミノ酸組成で構成することができる。さらに、抗原結合フラグメントは、上に列挙した任意の可変ドメインおよび定常ドメインのレイアウトを有する、互いにおよび／または１つ以上の単量体ＶＨまたはＶＬ構造ドメイン（例えば、ジスルフィド結合を介して）が非共有会合したホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
【００７５】
本発明に係る組換え型二機能性融合タンパク質は、ヒト抗体および／または組換えヒト抗体もしくはそのフラグメントを含むか、またはそれらからなり得る。本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。しかしながら、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない（例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３の中の）アミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでよい。しかしながら、本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種（マウスなど）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００７６】
本発明に係る組換え型二機能性融合タンパク質は、組換えヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、生成または単離される全てのヒト抗体を含む。例えば、宿主細胞（以下にさらに説明）にトランスフェクトされた組換え発現ベクタを用いて発現された抗体、組換えヒト抗体コンビナトリアルライブラリ（以下にさらに説明）から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えばＴａｙｌｏｒら、（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７〜６２９５参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングする任意の他の手段によって調製、発現、生成または単離された抗体である。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発を受け（または、ヒトＩｇ配列にとってトランスジェニック動物を使用する場合は、インビボ体細胞の突然変異誘発を受け）る。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域におけるアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それと関連するにもかかわらず、インビボのヒト抗体生殖系列ライブラリ内に天然には存在しない配列である可能性がある。
【００７７】
腫瘍のターゲティング機能
本発明の別の方面において、組換え型二機能性融合タンパク質は腫瘍細胞をターゲティングするために使用されることができる。
【００７８】
本発明に係る組換え型二機能性融合タンパク質は、薬物、毒素、放射性同位体、または細胞生存率に有害な他の物質にコンジュゲート（カップリング）することができる。あるいは、薬物または毒素は、細胞を直接殺すことがなく、細胞が他の外来物質により容易に攻撃されるようにする物質であってよい。腫瘍のターゲティング機能に関する他の実施形態では、本発明に係る組換え型二機能性融合タンパク質は、それ自体が薬物、毒素または放射性同位体にコンジュゲートすることがなく、他の抗腫瘍抗体などの他の抗原結合分子（本明細書において「協力分子」と呼ぶ）に合わせて投与される。
【００７９】
本発明に係る腫瘍ターゲティングに関する特定の実施形態によれば、組換え型二機能性融合タンパク質（または協力抗体）は、以下の群から選択される１つまたは複数の細胞傷害薬にコンジュゲートすることができる：カリケアマイシン、エスクロモサス、メトトレキサ−ト、ドキソルビシン、メルファキシン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ラトロタキセル、テシタスタット、オラタキセル（ｏｒａｔａｘｅｌ）、ドセタキセル、ドラスタチン１０、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＨＥ、およびメイタンシンベースの化合物（例、ＤＭ１、ＤＭ４など）。組換え型二機能性融合タンパク質（または協力抗体）は、さらにまたは選択的に、ジフテリア毒素、緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リシン毒性タンパク質Ａ鎖、アカシア毒性タンパク質Ａ鎖、アルファルファ根毒性タンパク質Ａ鎖、α−ケルセチン、アブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、カーネーション毒性タンパク質、フィトラッカアメリカ−ナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質などの毒素にコンジュゲートされてもよい。組換え型二機能性融合タンパク質（または協力抗体）は、さらにまたは選択的に、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１８６Ｒｈ、１８７Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、７７Ｂｒ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、６４Ｃｕ、１２１Ｐｂ、２２４Ｒａおよび２２３Ｒａからなる群から選択される１つ以上の放射性同位体にコンジュゲートされてもよい。したがって、本発明のこの態様は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または抗体−放射性同位体コンジュゲート（ＡＲＣ）である組換え型二機能性融合タンパク質を含む。
【００８０】
医薬組成物および投与方法
本発明はさらに組成物を提供する。好ましい実施形態では、この組成物は、上記の抗体もしくはその活性フラグメントもしくはその融合タンパク質、または上記の組換え型二官能性融合タンパク質、および薬学的に許容されるベクタを含む医薬組成物である。一般に、これらの物質は、毒性のない、不活性かつ薬学的に許容される水性ベクタ媒体中に配合することができる。ｐＨは、調製される物質の性質および治療されるべき病状によって変化することがあるが、通常約５〜８、好ましくは約６〜８である。調製された医薬組成物は、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または局所投与を含むがこれらに限定されない従来の経路によって投与することができる。
【００８１】
本発明に係る医薬組成物は、腫瘍の予防および治療に使用することができ、さらに、他の治療薬と同時に使用することもできる。
【００８２】
本発明に係る医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％、さらに好ましくは０．１〜８０重量％）の本発明に係る特異的結合分子（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容されるベクタまたは賦形剤を含有する。そのようなベクタとしては、食塩水、緩衝液、デキストロ−ス、水、グリセロ−ル、エタノ−ル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は投与方法に適合させるべきである。本発明に係る医薬組成物は、注射剤の形態、例えば、生理食塩水またはグルコ−スおよび他の補助剤を含有する水溶液を用いて常法により調製することができる。注射剤や液剤などの医薬組成物は、無菌条件下で調製するのが好ましい。活性成分の投与量は、治療上有効な量、例えば１日当たり、約１マイクログラム／１キログラム体重〜約５ミリグラム／１キログラム体重である。さらに、本発明に係るポリペプチドは他の治療薬と共に使用することもできる。
【００８３】
医薬組成物が使用される場合、安全かつ有効な量の免疫複合体が哺乳動物に投与される。ここで、安全かつ有効な量は通常、少なくとも約１０マイクログラム／１キログラム体重である。そして、ほとんどの場合は、約８ミリグラム／１キログラム体重以下である。好ましくは、この用量は、約１０マイクログラム／１キログラム体重〜約１ミリグラム／１キログラム体重である。もちろん、具体的な用量はまた、投与経路、患者の健康状況などの要因も考慮すべきである。これは、熟練した医師の能力範囲以内にあることである。
【００８４】
材料と方法
【００８５】
ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ発現ベクタの構築およびタンパク質の製造
リツキシマブ重鎖コード配列のカルボキシ末端またはアミノ末端は、ヒトＳＩＲＰαの外側における第１の機能領域（ＳＩＲＰαドメイン１、ＳＤ１）の遺伝子コード配列と連結し、配列の両端で２つのクローニング部位点（アミノ末端にあるＨｉｎｄＩＩＩおよびカルボキシ末端にあるＳａｌＩ）を付加することによって、ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｈ−ＳＤ１またはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｈ遺伝子コード配列を形成した。次に、ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｈ−ＳＤ１、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｈ遺伝子配列およびリツキシマブ軽鎖遺伝子コード配列（ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｌ）を合成するために蘇州省心生物技術有限公司に委託し、合成した配列をｐＭａｃ−ＨおよびｐＭａｃ−Ｌ発現ベクタ（Ｍａｃｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．から購入）にそれぞれクローニングし、ｐＭａｃ−ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｈ−ＳＤ１、ｐＭａｃ−ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ−ＨおよびｐＭａｃ−ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｌ発現ベクタを形成した。
【００８６】
ｐＭａｃ−ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｈ−ＳＤ１またはｐＭａｃ−ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ−ＨベクタをそれぞれｐＭａｃ−ＣＤ２０ｍＡｂ−Ｌ発現ベクタと一緒にＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣから購入）に同時トランスフェクトし、一連の圧力スクリーニングを行い、安定的にＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１またはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質を発現できるＣＨＯ細胞株を調製した。増幅培養の後、５００ｍｇのＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１またはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質を調製した。
【００８７】
２、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
１ｍｇのＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１またはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質に対してＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を行った。
【００８８】
標的結合活性（ＦＡＣＳ）：
２つの腫瘍細胞を用いて、ＣＤ２０およびＣＤ４７に対するＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質の結合活性をそれぞれ鑑定し、それらを単一標的対照タンパク質と比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２０−ＣＤ４７＋）を用いてＣＤ４７の標的結合活性を分析し、Ｒａｊｉ−ＣＤ４７ＫＯ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ４７−）を用いてＣＤ２０の標的結合活性を分析した。
【００８９】
ＣＤ４７標的競合結合活性（ＦＡＣＳ）
異なる濃度のＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質、陽性対照タンパク質ＳＩＲＰα−Ｆｃおよびリツキシマブを、それぞれ２５ｎＭビオチンにより標記されたＳＩＲＰα−Ｆｃ（Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＩＲＰα−Ｆｃ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、混合物をＪｕｒｋａｔ細胞と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、蛍光により標記されたストレプトアビジン（ＦＩＴＣ−Ｓｔｒｅｐ）と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１００μｌの冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した。最後に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて、ＳＩＲＰα−Ｆｃと細胞との結合状況を分析した。
【００９０】
５、ＡＤＣＣ
１０６／ｍｌのＲａｊｉ細胞またはＣＤ４７ノックアウトＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ−ＣＤ４７ＫＯ）（標的細胞）をそれぞれ１ｍＭのＣＦＳＥ（１：５００）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、１０分ごとに１回均等に混合した。ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞（エフェクター細胞）の密度を６×１０５／ｍｌに調節した。エフェクター細胞を標的細胞と２：１の比率で混合して、異なる濃度のＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ、陽性対照タンパク質であるリツキシマブ、および陰性対照タンパク質であるハーセプチン／トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。インキュベ−ションが完了後に、細胞培養プレ−トを室温で１０分間静置し、室温に平衡化した後、２０μｌのＰＩ（ヨウ化プロピオン酸、Ｐｒｏｐｏｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、ロ−ガンで吹いたり打ったりすることによって均等に混合した後、ＦＡＣＳ分析技術によって異なるタンパク質濃度における細胞ＰＩ染色の陽性率を分析し、以下の式に従ってＡＤＣＣ活性を計算した：
％Ｌｙｓｉｓ＝（Ｓａｍｐｌｅ％ＰＩ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ−Ｎｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ％ＰＩ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ）／（１００−Ｎｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ％ＰＩ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ）＊１００。
【００９１】
最後に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＬｙｓｉｓ％と濃度との関係をプロットした。
【００９２】
６、ＣＤＣ
第１の実験では、Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）を、それぞれ異なる濃度のＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１、陽性対照タンパク質であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、および陰性対照タンパク質であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）と混合しました。第２の実験では、Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）を、それぞれ異なる濃度のＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂと混合した。次いで一定濃度のウサギ補体を上記混合系に添加し、３７℃で、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中で４時間インキュベートした。インキュベ−ションが完了後、細胞培養プレ−トを室温で１０分間静置し、室温に平衡化した後、２０μｌのＰＩ（ヨウ化プロピオン酸）色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、ロ−ガンで吹いたり打ったりすることによって均等に混合した後、ＦＡＣＳ分析技術によって異なるタンパク質濃度における細胞ＰＩ染色の陽性率を分析し、以下の式に従ってＣＤＣ活性を計算した：
Ｌｙｓｉｓ％＝Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｌｙｓｉｓ％−Ｎｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｙｓｉｓ％
【００９３】
最後に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＬｙｓｉｓ％と濃度との関係をプロットした。
【００９４】
７、食作用活性
マウスマクロファージ（Ａｎａ−１）を９６ウェル細胞培養プレ−トに１ウェルあたり１×１０５細胞で添加し、細胞を細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に置いて１６〜１８時間培養した。ＣＦＳＥにより標記された標的細胞（ＨＬ−６０）を、それぞれ異なる濃度のＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ、陽性対照タンパク質であるＳＩＲＰａＤ１−Ｆｃ、および陰性対照タンパク質であるリツキシマブと混合し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４５分間インキュベートした後、マクロファージ（Ａｎａ−１）を含む培養プレ−トに細胞を移し、同じ条件下で２時間培養を続け、培養プレ−トを取り出し、懸濁した標的細胞を洗い流し、マクロファージを集め、ＦＡＣＳを用いてマクロファージのＣＦＳＥ蛍光強度を分析した。
【００９５】
８、インビボ抗腫瘍薬効果試験
第１の実験では、Ｒａｊｉ細胞インサイチュ腫瘍モデルを用いて、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１のインビボ抗腫瘍活性を研究した。３０匹の免疫不全マウスの尾静脈にＬａｊｉ細胞を注射し、各マウスに５×１０６細胞を注射し、注射後の翌日にマウスをランダムに５つのグループに分け、１番目のグループでＰＢＳを腹腔内注射し、２番目のグループでＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３番目のグループでＳＤ１−Ｆｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、４番目のグループでリツキシマブ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、５番目のグループでＳＤ１−Ｆｃおよびリツキシマブ（２．５＋２．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。週に一回、５回投与した。マウスの状態を毎日観察し、体重を測定した。
【００９６】
第２の実験では、Ｒａｊｉ細胞皮下腫瘍モデルを用いて、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのインビボ抗腫瘍活性を比較して研究した。４０匹の免疫不全マウスにＲａｊｉ細胞を皮下接種し、各マウスに６×１０６の細胞を接種し、腫瘍容積が約１２０ｍｍ３となった時、ランダムに５つのグループに分け、１グループに８匹のマウスがいる。１番目のグループでＰＢＳを腹腔内注射し、２番目のグループでＡＤＣＣ増強リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ＡＤＣＣ＋）（２．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３番目のグループでＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、４番目のグループでＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、５番目のグループでリツキシマブおよびＳＩＲＰａＤ１−Ｆｃ（３＋３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。週１回、５回連続投与した。治療期間中、動物の体重と腫瘍の大きさを週に２回測定し、臨床症状を毎日記録し、測定の２８日後にすべての動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、腫瘍の重量を測定して撮影した。
【００９７】
本発明の主な利点は以下の通りである：
【００９８】
（１）本発明により設計された組換え型二機能性融合タンパク質（ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ）は有意な抗腫瘍活性を有し、その腫瘍抑制効果が単一のリツキシマブによる治療よりも著しく高く、２つの単一標的点（リツキシマブおよびＳＩＲＰａＤ１−Ｆｃ）薬の複合治療効果よりもはるかに優れている。
【００９９】
（２）本発明により設計された組換え型二重機能融合タンパク質ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂの腫瘍抑制効果は、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１の治療効果よりも有意に優れている。
【０１００】
（３）本発明の組換え型二機能性融合タンパク質（ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ）は、リツキシマブに対して無効または耐性が出ている腫瘍患者を治療するために使用することができる。
【０１０１】
本発明は、具体的な実施例を参照して以下にさらに詳細に説明する。それらの実施例は、本発明を説明するためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。以下の実施例において詳細な条件が示されていない実験方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）などに記載の条件のような従来の条件に従って、または製造業者によって推薦される条件に従って行われる。他に特定されない限り、百分率および部数は重量ベ−スで計算される。以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、他に特別な説明がなければ、市販の供給元から入手可能である。
【０１０２】
実施例１  ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ発現ベクタ構築
ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのタンパク質構造は、図１および図２に示すように、それぞれ１本の重鎖遺伝子および１本の軽鎖遺伝子によってコードされる４本のポリペプチド鎖（２本の重鎖および２本の軽鎖）が対応するセカンドフローキーの接続によって構成される。そのうち、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１の重鎖遺伝子コード配列は１７４９個のヌクレオチドからなる（図３Ａ）。ここで、ＣＤ２０ｍＡｂ重鎖は、１３５０個のヌクレオチドを有し、４５０個のアミノ酸（１〜４５０）をコーディングする。ＳＤ１配列は、３９９個のヌクレオシドを有し、１３３個のアミノ酸（４５１〜５８３）をコーディングする。対応するアミノ酸配列を図４Ａに示す。ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂの重鎖遺伝子コード配列は１７８２個のヌクレオチドからなり（図３Ｃ）。そのうち、ＳＤ１配列は、３９９個のヌクレオチドを有し、１３３個のアミノ酸（１〜１３３）をコーディングする。連結ペプチド鎖は、３０個のヌクレオチドを有し、１０個のアミノ酸（１３４〜１４３）をコーディングする。ＣＤ２０ｍＡｂ重鎖は、１３５３個のヌクレオチドを有し、４５１個のアミノ酸（１４４〜５９４）をコーディングする。対応するアミノ酸配列を図４Ｃに示す。ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂの軽鎖はすべて、６３９個のヌクレオチド（図３Ｂ、３Ｄ）を有し、２１３個のアミノ酸（１〜２１３）をコーディングする（図４Ｂ、４Ｄ）。
【０１０３】
実施例２  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により確認されたように、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質凝集体含量はすべて３％未満であり、低分子量成分（フラグメント化）は１〜３％であり、タンパク質の完全性が非常に良好であることを示した（図５Ａ、５Ｂ）。
【０１０４】
実施例３  二重標的点結合活性
フローサイトメトリーを用いてＣＤ２０とＣＤ４７に対するＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１とＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質の結合活性をそれぞれ分析した結果、両方の構造のタンパク質の二つの標的点に対する結合活性はいずれも高く、ＥＣ５０がいずれもナノモルレベルにあった。ＣＤ２０との結合活性については、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１とリツキシマブが類似し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０８ｎＭ（ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１）および０．０６ｎＭ（リツキシマブ）であり、一方ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂの活性はやや低く、ＥＣ５０が０．４ｎＭであった。ＣＤ４７との親和性活性については、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂがＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１よりも有意に良好であり、前者のＥＣ５０が０．０９ｎＭであり、後者のＥＣ５０が２．７２ｎＭであった。
【０１０５】
実施例４  ＣＤ４７標的点競合的結合活性
我々は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用してＣＤ４７に対するＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂの競合的結合活性を分析した。図７に示すように、両方の構造のタンパク質は、ＳＩＲＰαとＪｕｒｋａｔ細胞との結合を有意に阻害したが、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ（ＥＣ５０＝１９．７４ｎＭ）の阻害活性は、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１（ＥＣ５０＝４７６．２ｎＭ）より有意に優れている。
【０１０６】
実施例５  ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性
ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質はＡＤＣＣ（図８のＡ、Ｂ）およびＣＤＣ（図８のＣ、Ｄ）活性の両方を有し、両方の構造のタンパク質のＡＤＣＣに有意な差別はないが、リツキシマブより有意に優れた。Ｒａｊｉ細胞に対しては、ＥＣ５０がそれぞれ、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１＝０．１４ｎｇ／ｍｌ；ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ＝０．１５ｎｇ／ｍｌ；リツキシマブ＝３．８２ｎｇ／ｍｌであった。Ｒａｊｉ−ＣＤ４７ＫＯ細胞に対しては、ＥＣ５０がそれぞれ、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１＝０．１４ｎｇ／ｍｌ；ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ＝０．１０ｎｇ／ｍｌ；リツキシマブ＝１．１３ｎｇ／ｍｌであった。両方の構造のタンパク質はいずれも強いＣＤＣ活性を有するが、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂ（ＥＣ５０＝３．３６ｎＭ）の活性がＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１（ＥＣ５０＝１０．９７ｎＭ）よりも有意に優れている。
【０１０７】
実施例６：マクロファージの食作用活性
マウスマクロファージ（Ａｎａ−１）を用いて、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質が腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用活性を促進することを研究した。図９に示すように、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂは強い食作用活性（ＥＣ５０＝０．３μｇ／ｍｌ）を有し、陽性対照タンパク質ＳＩＲＰａＤ１−Ｆｃ（ＥＣ５０＝０．１４μｇ／ｍｌ）に相当する。一方、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１は全く食作用活性を示さなかった。
【０１０８】
実施例７：インビボ抗腫瘍活性
我々は、Ｒａｊｉ細胞インサイチュ腫瘍モデルを用いて、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１タンパク質のインビボ抗腫瘍活性を調べた。図１０Ａに示すように、未治療群のマウスは治療開始後３８日以内に全部死亡し、リツキシマブおよびＳＩＲＰａＤ１−Ｆｃのような単一の標的で治療された群ではマウスの生存率が大幅に向上し、実験の終わりまでに、生存率がそれぞれ６７％および８３％であった。しかし、二重標的組換えタンパク質ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１で治療された群では、生存率が１００％であり、これは単一標的のみに作用した薬物よりも著しく良好であった。
【０１０９】
Ｒａｊｉ細胞皮下腫瘍モデルを用いて、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂタンパク質のインビボ抗腫瘍活性を比較して研究した。図１０Ｂに示すように、未治療群のマウスは、腫瘍が急速に成長し、体積が増加し続け、実験の終わりまでに、腫瘍体積が約２５００ｍｍ３に達した一方、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１またはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂによる治療を受けた群のマウスは、腫瘍の成長が遅く、平均腫瘍体積が縮小し続き、実験の終わりまでに、２群のマウスの平均腫瘍体積はいずれも、治療開始時の体積より小さかった。さらに驚くべきことには、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂによる治療を受けた８匹のマウスのうち、５匹のマウスの腫瘍が完全に消失した一方、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１による治療を受けた８匹のマウスのうちの２匹のみは腫瘍が完全に消失しした。これは、ＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂのインビボ抗腫瘍活性がＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１より優れたことを示した。リツキシマブとＳＩＲＰａＤ１−Ｆｃを組み合わせて使用した場合、治療効果は、ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１またはＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂよりも明らかに悪かった（図１０Ｂの右上図）。
【０１１０】
本発明の研究に示すように、遺伝子組換え型二機能性融合タンパク質ＣＤ２０ｍＡｂ−ＳＤ１およびＳＤ１−ＣＤ２０ｍＡｂは、良好な二重標的結合活性を有する新規な融合タンパク質である。生物学的研究に示すように、このタンパク質は同時に、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、およびＣＤ４７の標的遮断などの活性を有し、ＣＤ２０、ＣＤ４７の標的が陽性である癌への治療に使用できる。
【０１１１】
本出願において言及された全ての文献は、それぞれの文献が単独に参照として引用されたように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本発明の上記の記載内容を読んだ後に、当業者は本発明を様々に変更または修正することができ、これらの同等の形式は同様に本出願の添付した特許請求の範囲に記載の範囲に含まれることを理解されたい。
【図１】
2020509737.tif 000002
【図２】
2020509737.tif 000003
【図３Ａ】
2020509737.tif 000004
【図３Ｂ】
2020509737.tif 000005
【図３Ｃ】
2020509737.tif 000006
【図３Ｄ】
2020509737.tif 000007
【図４Ａ】
2020509737.tif 000008
【図４Ｂ】
2020509737.tif 000009
【図４Ｃ】
2020509737.tif 000010
【図４Ｄ】
2020509737.tif 000011
【図５Ａ】
2020509737.tif 000012
【図５Ｂ】
2020509737.tif 000013
【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
2020509737.tif 000015
【図７】
2020509737.tif 000016
【図８】
2020509737.tif 000017
【図９】
2020509737.tif 000018
【図１０Ａ】
2020509737.tif 000019
【図１０Ｂ】
2020509737.tif 000020
【配列表】
2020509737000001.app
【国際調査報告】
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