(57)【要約】  本発明者らは初めて、正常な及び異常なヒト肥満細胞（ＭＣ）におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路の活性化を実証する。これらの結果は、本発明者らに、肥満細胞の増殖に対する、ヘッジホッグ経路、特に古典的経路の阻害の結果を探索することを促す。本発明者らは、ヘッジホッグ阻害剤が肥満細胞の増殖を阻害し、肥満細胞のアポトーシスを誘発することを実証する。したがって、本発明は、治療有効量のヘッジホッグ阻害剤を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における肥満細胞疾患の処置法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のヘッジホッグ阻害剤を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における肥満細胞疾患の処置法。
【請求項２】
肥満細胞疾患が、肥満細胞活性化症候群；肥満細胞症；特発性蕁麻疹；慢性蕁麻疹；アトピー性皮膚炎；特発性アナフィラキシー；ＩｇＥにより媒介される及びＩｇＥにより媒介されないアナフィラキシー；血管浮腫；アレルギー疾患；過敏性腸症候群；肥満細胞性胃腸炎；肥満細胞性大腸炎；線維筋痛症；腎線維症；アテローム性動脈硬化症；心筋虚血；高血圧；うっ血性心不全；掻痒；慢性掻痒；慢性腎不全に続発する掻痒；肥満細胞に関連した心臓、血管、腸、脳、腎臓、肝臓、膵臓、筋肉、骨、及び皮膚の容態；ＣＮＳ疾患、例えばパーキンソン病及びアルツハイマー病；代謝疾患、例えば糖尿病；鎌状赤血球症；自閉症；慢性疲労症候群；ループス；慢性ライム病；間質性膀胱炎；多発性硬化症；がん；片頭痛；乾癬；好酸球性食道炎；好酸球性胃腸炎；チャーグ・ストラウス症候群；好酸球増加症候群；好酸球性筋膜炎；好酸球性胃腸障害；慢性特発性蕁麻疹；心筋炎；ヒルシュスプルング病関連腸炎；術後腸閉塞；創傷治癒；脳卒中；一過性脳虚血発作；疼痛；神経痛；末梢神経障害；急性冠動脈症候群；膵炎；皮膚筋炎；線維性皮膚疾患；がん関連疼痛；潰瘍性大腸炎；炎症性腸疾患；放射線性腸炎；セリアック病；グルテン性腸症；放射線性膀胱炎；膀胱痛症候群；肝炎；肝線維症；肝硬変；関節リウマチ；全身エリテマトーデス；及び血管炎からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
肥満細胞疾患が、皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；及び全身性無痛性肥満細胞症からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
肥満細胞症の発病が、特にＫＩＴの突然変異が原因である、チロシンキナーゼ受容体ＫＩＴの恒常的活性化に起因する、請求項２の方法。
【請求項５】
ヘッジホッグ阻害剤が、ビスモデギブ又はＧＡＮＴ６１である、請求項１の方法。
【請求項６】
ヘッジホッグ阻害剤が、ＰＫＣ４１２（ミドスタウリン）、アファチニブ、アリトレチノイン、アキシチニブ、バフェチニブ、ベキサロテン、ＢＩ−２５３６、ボスチニブ、ブリバニブ、カネルチニブ、セディラニブ、ＣＰ７２４７１４、クリゾチニブ、ダサチニブ、ダヌセルチブ、ドビチニブ、Ｅ７０８０、エルロチニブ、エベロリムス、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、リンシチニブ、マシチニブ、モテサニブ、ネラチニブ、ニロチニブ、ＮＶＰ ＴＡＥ−６８４、ＯＳＩ−０２７、ＯＳＩ−４２０、ＯＳＩ−９３０、パゾパニブ、ペリチニブ、ＰＦ５７３２２８、レゴラフェニブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、サラカチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＴＡＥ２２６、ＴＡＥ６８４、タンデュチニブ、テラチニブ、タウチニブ、テムシロリムス、トセラニブ、トファシチニブ、トザセルチブ、トレチノイン、バンデタニブ、バタラニブ、ベムラフェニブ、ボリノスタット、及びＷＺ４００２などのチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて患者に投与される、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、肥満細胞疾患の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
肥満細胞疾患は、ヒトの健康において特に懸念されている。例えば、肥満細胞症は、１つ以上の組織における異常な肥満細胞の病的な増殖及び蓄積によって特徴付けられる疾患である。肥満細胞症には、皮膚に限定して発症する皮膚肥満細胞症（ＣＭ）（小児により多い）及び全身性肥満細胞症（ＳＭ）という２つの病型がある。全身性肥満細胞症では、肥満細胞は、１つ以上の皮膚外組織に蓄積する。全身性肥満細胞症は肥満細胞疾患の１０％を占め、全身性肥満細胞症の大半（８０％）は、チロシンキナーゼ受容体ＫＩＴの機能獲得型Ｄ８１６Ｖ突然変異を示し、幹細胞因子の活性化とは独立して、ＫＩＴシグナル伝達の恒常的活性化を誘導する。この突然変異により、肥満細胞の産生は増加し、皮膚外臓器への蓄積（骨髄、リンパ節、肝臓、消化管、脾臓）が起こり、これは臓器不全をもたらし得る。残念なことに、活性化させるＤ８１６Ｖ ＫＩＴ突然変異は、ＦＤＡによって認可されている全身性肥満細胞症の現在利用可能なチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるイマチニブによる処置に対する耐性を伴うことが知られている。したがって、肥満細胞症の処置のための新規な効果的な治療薬は優先事項である。
【０００３】
ヘッジホッグシグナル伝達経路は、胚細胞において重要な役割を果たし、動物の発達の重要な調節因子の１つである。ヘッジホッグシグナル伝達経路に関連している、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアン・ヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、及びデザート・ヘッジホッグ（Ｄｈｈ）という３つのヘッジホッグタンパク質（Ｈｈ）が存在する。ヘッジホッグタンパク質はＰａｔｃｈｅｄ１受容体に結合する。Ｐａｔｃｈｅｄ１受容体はＳｍｏ活性を阻害し、Ｐａｔｃｈｅｄ−１にヘッジホッグタンパク質が結合すると、この阻害は軽減され、細胞の運命の決定及び増殖に関与しているＧＬＩ転写因子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３が活性化される。ヘッジホッグ経路の異常な活性化は、多種多様ながん、例えば基底細胞癌、膵臓癌、髄芽腫、小細胞肺癌、及び前立腺癌に罹患している患者において関与している。しかしながら、肥満細胞症におけるこのシグナル伝達経路の役割は依然として研究されていない。
【０００４】
発明の要約：
本発明は、肥満細胞疾患の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明：
本発明は、治療有効量のヘッジホッグ阻害剤を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における肥満細胞疾患の処置法に関する。
【０００６】
本明細書において使用する「肥満細胞」という用語は、過敏症反応を媒介する造血系由来細胞を指す。肥満細胞は、過敏症反応を媒介する細胞質内顆粒（ヒスタミン、コンドロイチン硫酸、プロテアーゼ）の存在、高いレベルのＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）によって特徴付けられ、発達のために幹細胞因子及びＩＬ３（サイトカイン）を必要とする。成熟肥満細胞は、循環中には見られないが、体中の様々な組織に存在する。
【０００７】
本明細書において使用する「肥満細胞疾患」という用語は、病的な肥満細胞の増殖及び／又は活性化（例えば脱顆粒）によって特徴付けられるあらゆる疾患を指す。肥満細胞疾患の例としては、肥満細胞活性化症候群；肥満細胞症；特発性蕁麻疹；慢性蕁麻疹；アトピー性皮膚炎；特発性アナフィラキシー；ＩｇＥにより媒介される及びＩｇＥにより媒介されないアナフィラキシー；血管浮腫；アレルギー疾患；過敏性腸症候群；肥満細胞性胃腸炎；肥満細胞性大腸炎；線維筋痛症；腎線維症；アテローム性動脈硬化症；心筋虚血；高血圧；うっ血性心不全；掻痒；慢性掻痒；慢性腎不全に続発する掻痒；肥満細胞に関連した心臓、血管、腸、脳、腎臓、肝臓、膵臓、筋肉、骨、及び皮膚の容態；ＣＮＳ疾患、例えばパーキンソン病及びアルツハイマー病；代謝疾患、例えば糖尿病；鎌状赤血球症；自閉症；慢性疲労症候群；ループス；慢性ライム病；間質性膀胱炎；多発性硬化症；がん；片頭痛；乾癬；好酸球性食道炎；好酸球性胃腸炎；チャーグ・ストラウス症候群；好酸球増加症候群；好酸球性筋膜炎；好酸球性胃腸障害；慢性特発性蕁麻疹；心筋炎；ヒルシュスプルング病関連腸炎；術後腸閉塞；創傷治癒；脳卒中；一過性脳虚血発作；疼痛；神経痛；末梢神経障害；急性冠動脈症候群；膵炎；皮膚筋炎；線維性皮膚疾患；がん関連疼痛；潰瘍性大腸炎；炎症性腸疾患；放射線性腸炎；セリアック病；グルテン性腸症；放射線性膀胱炎；膀胱痛症候群；肝炎；肝線維症；肝硬変；関節リウマチ；全身エリテマトーデス；及び血管炎からなる群より選択される任意の疾患が挙げられる。
【０００８】
本明細書において使用する「肥満細胞症」という用語はその一般的な意味を有し、病的な肥満細胞が組織内に蓄積する一群の障害を説明する。特に、該用語は、皮膚肥満細胞症及び全身性肥満細胞症（無痛性又は進行型）を含む。肥満細胞症の発病は、チロシンキナーゼ受容体ＫＩＴの恒常的活性化に起因する。肥満細胞症患者の大半における、ＫＩＴの調節解除されたチロシンキナーゼ活性は、タンパク質のアミノ酸８１６内の突然変異（Ｄ８１６Ｖ）に起因し、これはまた、インビトロ及びインビボにおいてイマチニブ又はメシル酸イマチニブに対する耐性も付与する。特に、本発明の方法は、全身性肥満細胞症の処置に特に適している。本明細書において使用する「全身性肥満細胞症」すなわち「ＳＭ（systemic mastocytosis）」という用語は、その場所及び悪性度に応じて世界保健機関（２０１６）によって定義された全身性肥満細胞症の５つのカテゴリーを包含する：無痛全身性肥満細胞症（ＩＳＭ）、くすぶり型全身性肥満細胞症（ＳＳＭ）、血液腫瘍を伴う全身性肥満細胞症（ＳＭ−ＡＨＮ）、侵襲性全身性肥満細胞症（ＡＳＭ）、及び肥満細胞白血病（ＭＣＬ）。侵襲性肥満細胞症及び肥満細胞白血病の患者の予後は、細胞の侵襲的性質及び主腫瘍から細胞が脱着する傾向に因り悪い。これらの腫瘍の全てではないが多くは、それらを恒常的に活性化させる、チロシンキナーゼ受容体ＫＩＴ（幹細胞因子受容体）における突然変異を有し、これにより、悪性肥満細胞（ＭＣ）の制御不能な増殖が起こる。成人全身性肥満細胞症における臨床症状は不均一であり、皮膚疾患（通常、色素性蕁麻疹）、肥満細胞メディエーター遊離症状（頭痛、潮紅、意識朦朧、失神、アナフィラキシーなど）、及び直接的又は間接的な臓器損傷（溶解性骨病変、骨粗鬆症、又は骨折による骨痛、肝脾腫、骨髄における発症による血球減少）を含む。さらに、全身性肥満細胞症患者の約２０％は、かなりの及び時には孤立性の血中好酸球増加症を呈する場合がある。特に、本発明の方法は、ＫＩＴ突然変異（例えば、Ｄ８１６Ｖ又はΔ４１７〜４１９ｉｎｓＹ突然変異）を有する患者の処置に特に適している。「ＫＩＴ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトＫＩＴを指す。ＫＩＴはまた、「ｋｉｔ」、「ｃ−ｋｉｔ」、「ＣＤ１１７」又は「幹細胞因子受容体」としても知られている。例示的なナイーブＫＩＴアミノ酸配列が、アクセッション番号Ｐ１０７２１の下でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに提供されている。ＫＩＴ突然変異を検出する方法は当技術分野において周知であり、典型的にはＰＣＲアッセイを含む。
【０００９】
本明細書において使用する「肥満細胞活性化症候群」すなわち「ＭＣＡＳ（mast cell activation syndrome）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、肥満細胞の不適切な活性化から生じる臨床徴候及び臨床症状の集合を包含し、ここでは肥満細胞の増殖も、又はさもなくば蓄積も観察されない。１つの実施態様によると、肥満細胞活性化症候群は、以下に定義されているような、Molderingsの基準、又はValentの診断基準、又はAkinの診断基準によって定義されている症候群に相当する。第一の実施態様では、肥満細胞活性化症候群は、Molderings et al.（Molderings et al., Journal of Hematology & Oncology, 2011, 4:10）に従って定義されている。
【００１０】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、予防的処置又は防止的処置、並びに、治癒的処置又は疾患修飾的処置（疾患に罹るリスクがあるか又は疾患に罹っていることが疑われる患者、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態を患っていると診断されている患者の処置を含む）の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいは、このような処置を行なわなかった時に予想される生存期間を超えて患者の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか又は最終的に障害に罹る可能性のある患者に処置が投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に患者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は、（部分的に又は全体に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、患者が長期間（数か月又は数年間）にわたり寛解を保つために、病気の処置中に患者の維持のために使用される、治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、定期的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば、疼痛、疾患の徴候など］）の到達時の処置を使用し得る。
【００１１】
本明細書において使用する「ヘッジホッグ経路」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達を指す。主経路は、ヘッジホッグ分泌細胞内においてヘッジホッグ前駆体タンパク質（４５ｋＤａ）の誘導によって開始される古典的経路であり、その後、前駆体は、自己触媒的プロセシング及び修飾を受ける。前駆体は、２０ｋＤａのＮ末端シグナルドメインと２５ｋＤａのＣ末端触媒ドメインに切断される。続いて、コレステロール分子が、Ｎ末端ドメインのカルボキシ末端に共有結合し、これはその後、ヘッジホッグリガンドとして細胞質ゾルから分泌される。ヘッジホッグを受容する細胞の表面上には、経路の２つのタンパク質が存在する。一方は、１２回膜貫通タンパク質であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）であり、ヘッジホッグリガンドと相互作用し、他方は、７回膜貫通タンパク質であるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）であり、これはシグナル伝達物質である。ヘッジホッグリガンドの非存在下では、ＰｔｃｈはＳｍｏと相互作用することによりその機能を阻害し、下流シグナル伝達カスケードの活性化を妨げる。
【００１２】
一旦、ヘッジホッグリガンドがヘッジホッグ相互作用性タンパク質と共にＰｔｃｈに結合すると、Ｓｍｏ阻害は解かれる：これにより、下流シグナル伝達カスケードが活性化される。この活性化により、融合プロテインキナーゼＡ、ＧＬＩ、及びおそらく他の成分のサプレッサーを含む微小管上の巨大分子複合体から、転写因子ＧＬＩが遊離する。ＧＬＩは核内に進入し、ヘッジホッグ経路の遺伝子をはじめとするいくつかの遺伝子の転写を改変させる。非古典的経路は、ヘッジホッグリガンドの非存在下、又はヘッジホッグ受容体とヘッジホッグリガンドとの間のあらゆる相互作用の非存在下において、Ｇｌｉ転写因子を活性化する。例えば、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、機能的なＳｍａｄ経路を通して、かつヘッジホッグ受容体シグナル伝達とは独立して、Ｇｌｉ１因子及びＧｌｉ２因子を活性化する（Dennler S et al, Induction of sonic hedgehog mediators by transforming growth factor-beta: Smad3-dependent activation of Gli2 and Gli1 expression in vitro and in vivo. Cancer Res. 2007）。
【００１３】
本明細書において使用する「ヘッジホッグ阻害剤」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヘッジホッグ経路を阻害することが知られている１つ以上の分子を指す。特に、本発明のヘッジホッグ阻害剤は、古典的経路の阻害剤、又は非古典的経路の阻害剤である。
【００１４】
ヘッジホッグ阻害剤は当技術分野において周知であり、典型的には以下の刊行物に記載されている：
【００１５】
【表１】
2020519581.tif 000002
2020519581.tif 000003
2020519581.tif 000004
2020519581.tif 000005
【００１６】
いくつかの実施態様では、ヘッジホッグ阻害剤は、国際特許出願の国際公開公報第２０１４１９１７３６号及び国際公開公報第２０１０１４７９１７号に記載されている化合物から選択される。
【００１７】
ヘッジホッグ阻害剤の具体例としては、ゼルンボンエポキシド、スタウロスポリン、６−ヒドロキシスタウロスポリン、アルシリアフラビンＣ、５，６−ジヒドロキシアルシリアフラビンＡ、フィサリンＦ、フィサリンＢ、シクロパミン、ＨＰＩ−１、ＨＰＩ−２、ＨＰＩ−３、及びＨＰＩ−４、三酸化二ヒ素（ＡＴＯ）、亜ヒ酸ナトリウム、フェニルアルシン、ＧＡＮＴ−５８、ＧＡＮＴ−６１、及びゼルンボン（Kim et al., 2010, PNAS, 107:13432-37; Beauchamp et al. 2011, JCI 121:148-60; Lauth et al 2007, PNAS 104:8455-60; Hosoya et al., 2008, ChemBioChem 9:1082-92; Hyman et al, 2009, 106:14132-37；及びMas et al, 2010, Biochem. Pharm. 80:712-23、これらは全てここにその全体が参照により組み入れられる）が挙げられるがこれらに限定されない。他の例は、ビスモデギブ（ＧＤＣ−０４４９、ジェネンテック社）、ＢＭＳ−８３３９２３（ＸＬ１３９）、ＩＰＩ−９２６（インフィニティ・ファーマシューティカルズ社）、ＬＤＥ２２５、ＬＥＱ５０６（ノバルティス・ファーマシューティカルズ社）、ＴＡＫ−４４１（ミレニアム・ファーマシューティカルズ社）、及びＰＦ−０４４４９９１３（ファイザー社）を単独で又は併用療法で含む。
【００１８】
ヘッジホッグ阻害剤の他の例としては、４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩が挙げられる。
【００１９】
いくつかの実施態様では、本発明のヘッジホッグ阻害剤は、
【化１】
2020519581.tif 000006
で示される式によって特徴付けられるビスモデギブである。
【００２０】
上記のような本発明のヘッジホッグ阻害剤の「治療有効量」によって、化合物の十分量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されるであろうことが理解されるであろう。任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効量レベルは、任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成；被験者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知である同様な因子をはじめとする、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることは、十分に当業者の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、成人１人あたり１日あたり０．０１〜１，０００mgの広い範囲におよび変更されてもよい。好ましくは、該組成物は、処置される予定の被験者への症状による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含有している。薬物の有効量は通常、０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）/日、特に約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）/日の用量レベルで供給される。
【００２１】
いくつかの実施態様では、本発明のヘッジホッグ阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて患者に投与される。本明細書において使用する「チロシンキナーゼ阻害剤」という用語は、受容体型及び／又は非受容体型チロシンキナーゼの選択的又は非選択的阻害剤として作用する、様々な治療剤又は治療薬のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連する化合物は、当技術分野において周知である。チロシンキナーゼ阻害剤の例としては、ＰＫＣ４１２（ミドスタウリン）、アファチニブ、アリトレチノイン、アキシチニブ、バフェチニブ、ベキサロテン、ＢＩ−２５３６、ボスチニブ、ブリバニブ、カネルチニブ、セジラニブ、ＣＰ７２４７１４、クリゾチニブ、ダサチニブ、ダヌセルチブ、ドビチニブ、Ｅ７０８０、エルロチニブ、エベロリムス、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、リンシチニブ、マシチニブ、モテサニブ、ネラチニブ、ニロチニブ、ＮＶＰ ＴＡＥ−６８４、ＯＳＩ−０２７、ＯＳＩ−４２０、ＯＳＩ−９３０、パゾパニブ、ペリチニブ、ＰＦ５７３２２８、レゴラフェニブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、サラカチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＴＡＥ２２６、ＴＡＥ６８４、タンデュチニブ、テラチニブ、タウチニブ、テムシロリムス、トセラニブ、トファシチニブ、トザセルチブ、トレチノイン、バンデタニブ、バタラニブ、ベムラフェニブ、ボリノスタット、及びＷＺ４００２が挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用するのに適したさらなるチロシンキナーゼ阻害剤及び関連する化合物は、例えば、米国特許出願公開公報第２００７/０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、第５，６３９，７５７号、第５，７２８，８６８号、第５，８０４，３９６号、第６，１００，２５４号、第６，１２７，３７４号、第６，２４５，７５９号、第６，３０６，８７４号、第６，３１３，１３８号、第６，３１６，４４４号、第６，３２９，３８０号、第６，３４４，４５９号、第６，４２０，３８２号、第６，４７９，５１２号、第６，４９８，１６５号、第６，５４４，９８８号、第６，５６２，８１８号、第６，５８６，４２３号、第６，５８６，４２４号、第６，７４０，６６５号、第６，７９４，３９３号、第６，８７５，７６７号、第６，９２７，２９３号、及び第６，９５８，３４０号に記載され、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる。特に、本発明のヘッジホッグ阻害剤は、マシチニブと組み合わせて患者に投与される。マシチニブの化学名は、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イルチアゾール−２−イルアミノ）フェニル］ベンズアミド（ＣＡＳ番号７９０２９９−７９−５）である。いくつかの実施態様では、本発明のヘッジホッグ阻害剤は、ＰＫＣ４１２（ミドスタウリン）と組み合わせて患者に投与される。本明細書において使用する「ＰＫＣ４１２」又は「ミドスタウリン」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｎ−［（９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｒ）−２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９，１３−エポ���シ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピローロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン−１１−イル］−Ｎ−メチル−ベンズアミド（ＣＡＳ番号：１２０６８５−１１−２）を指す。該用語はまた、ＣＧＰ４１２３１、ＣＧＰ４１２５１、及びＮ−ベンゾイルスタウロスポリンとしても知られている。ＰＫＣ４１２は、慣用的なＰＫＣアイソフォーム（α、β、及びγ）、Ｓｙｋ、ＦＬＫ１、Ａｋｔ、ＰＫＡ、ｃ−Ｋｉｔ、Ｃ−Ｆｇｒ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＴ３、ＰＤＦＲβ、ＶＥＧＦＲ１、及びＶＥＧＦＲ２をはじめとする、いくつかのセリン／トレオニン及びチロシンキナーゼの細胞透過性で可逆性の阻害剤であり、ＩＣ５０値の範囲は８０〜５００nMである。
【００２２】
本発明のヘッジホッグ阻害剤は、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせることにより、治療組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又はあらゆる種類の製剤化助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性成分を単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。小腸又は大腸に特に送達するために、生薬への応用が実施され得る。好ましくは、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。本発明のヘッジホッグ阻害剤を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。本発明のヘッジホッグ阻害剤は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいだろう。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他の様々な成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。製剤化時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のようなタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下点滴療法用の液体１０００mlに加えるか又は提案された注入部位に注射し得る。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。本発明のヘッジホッグ阻害剤は、治療用混合物内において、１用量あたり、約０．０００１〜１．０mg、又は約０．００１〜０．１mg、又は約０．１〜１．０mg、又はさらには約１０mgを含むように製剤化され得る。複数の用量を投与してもよい。静脈内注射又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明のヘッジホッグ阻害剤の他に、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形剤；リポソーム製剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【００２３】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと捉えられるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ヘッジホッグ標的遺伝子の発現。ａ）ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株、ＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ細胞株、及びＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７細胞株におけるＧＬＩ１、ＧＬＩ３、及びＢｃｌ２のイムノブロット；ｂ）ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株、ＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ細胞株、白血病肥満細胞、及び初代肥満細胞における、アクチンのｍＲＮＡに対して標準化された、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３の相対的ｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施した。３回の独立した実験を３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図１Ｂ】ヘッジホッグ標的遺伝子の発現。ａ）ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株、ＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ細胞株、及びＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７細胞株におけるＧＬＩ１、ＧＬＩ３、及びＢｃｌ２のイムノブロット；ｂ）ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株、ＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ細胞株、白血病肥満細胞、及び初代肥満細胞における、アクチンのｍＲＮＡに対して標準化された、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３の相対的ｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施した。３回の独立した実験を３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図２】２μM又は５μMのプルモルファミンによる刺激（１２又は２４時間）後の、ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。
【図３Ａ】ビスモデギブは、肥満細胞の増殖を阻害する。ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。ｄ）ＤＭＳＯ又はビスモデギブを用いて処置された、ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図３Ｂ】ビスモデギブは、肥満細胞の増殖を阻害する。ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。ｄ）ＤＭＳＯ又はビスモデギブを用いて処置された、ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図３Ｃ】ビスモデギブは、肥満細胞の増殖を阻害する。ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。ｄ）ＤＭＳＯ又はビスモデギブを用いて処置された、ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図３Ｄ】ビスモデギブは、肥満細胞の増殖を阻害する。ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、２０、又は５０μMのビスモデギブを用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。ｄ）ＤＭＳＯ又はビスモデギブを用いて処置された、ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図４Ａ】ＧＡＮＴ６１は、肥満細胞の増殖を阻害する。Ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。Ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。Ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。Ｄ）ＤＭＳＯ又はＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図４Ｂ】ＧＡＮＴ６１は、肥満細胞の増殖を阻害する。Ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。Ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。Ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。Ｄ）ＤＭＳＯ又はＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図４Ｃ】ＧＡＮＴ６１は、肥満細胞の増殖を阻害する。Ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。Ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。Ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。Ｄ）ＤＭＳＯ又はＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図４Ｄ】ＧＡＮＴ６１は、肥満細胞の増殖を阻害する。Ａ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴの集密率。Ｂ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの集密率。Ｃ）１４４時間の間における、ＤＭＳＯ（対照）、１０、３０、又は５０μMのＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｋ４１７の集密率。Ｄ）ＤＭＳＯ又はＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株及びＤ８１６Ｖ細胞株におけるＧＬＩ１のイムノブロット。３回の独立した実験を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して３回ずつ実施した。データは、平均値±標準偏差として示される。
【図５Ａ】ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異を有する又は有さない様々な肥満細胞系統におけるＧＬＩ転写因子の発現分析。Ａ）ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３Ｌ、及びＧＬＩ３Ｒの発現をウェスタンブロット分析によって決定した。β−アクチンをこれらの実験におけるローディング内部対照として使用した。ＧＬＩ２は、いずれの細胞系統にも検出されなかった（データは示されていない）。Ｂ）棒グラフは、β−アクチンを用いての標準化後のウェスタンブロットデータから計算されたＧＬＩ３Ｒ／ＧＬＩ３Ｌ比を示す。Ｃ）ＧＬＩ１タンパク質の発現レベルは、肥満細胞株におけるＧＬＩ３Ｒ（ＧＬＩ３の抑制形）の発現レベルと逆相関している。
【図５Ｂ】ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異を有する又は有さない様々な肥満細胞系統におけるＧＬＩ転写因子の発現分析。Ａ）ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３Ｌ、及びＧＬＩ３Ｒの発現をウェスタンブロット分析によって決定した。β−アクチンをこれらの実験におけるローディング内部対照として使用した。ＧＬＩ２は、いずれの細胞系統にも検出されなかった（データは示されていない）。Ｂ）棒グラフは、β−アクチンを用いての標準化後のウェスタンブロットデータから計算されたＧＬＩ３Ｒ／ＧＬＩ３Ｌ比を示す。Ｃ）ＧＬＩ１タンパク質の発現レベルは、肥満細胞株におけるＧＬＩ３Ｒ（ＧＬＩ３の抑制形）の発現レベルと逆相関している。
【図５Ｃ】ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異を有する又は有さない様々な肥満細胞系統におけるＧＬＩ転写因子の発現分析。Ａ）ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３Ｌ、及びＧＬＩ３Ｒの発現をウェスタンブロット分析によって決定した。β−アクチンをこれらの実験におけるローディング内部対照として使用した。ＧＬＩ２は、いずれの細胞系統にも検出されなかった（データは示されていない）。Ｂ）棒グラフは、β−アクチンを用いての標準化後のウェスタンブロットデータから計算されたＧＬＩ３Ｒ／ＧＬＩ３Ｌ比を示す。Ｃ）ＧＬＩ１タンパク質の発現レベルは、肥満細胞株におけるＧＬＩ３Ｒ（ＧＬＩ３の抑制形）の発現レベルと逆相関している。
【図６】ＧＡＮＴ６１は肥満細胞の増殖を阻害し、肥満細胞のアポトーシスを誘発する。ＲＯＳＡ ＷＴ及びＲＯＳＡ Ｄ８１６Ｖを、漸増量のＧＡＮＴ６１ヘッジホッグ阻害剤を用いて処置し、細胞増殖又は細胞アポトーシスに関連したタンパク質の発現を、ウェスタンブロットによって決定した。ｍＴＯＲ、ｐ−ＡＫＴ、ＡＫＴ、ＭＹＣ（上）、カスパーゼ３、ＢＣＬ２、及びＢＣＬＸ−Ｌ（下）のタンパク質発現レベルは、ＧＡＮＴ６１を用いて処置されたＲＯＳＡ ＷＴ及びＲＯＳＡ Ｄ８１６Ｖの両方において用量依存的に減少した。β−アクチンは、ローディング対照として使用された。
【図７】Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞イメージングシステムを使用した、ＲＯＳＡ ＫＩＴ４１７肥満細胞の細胞増殖に対する、ＰＫＣ４１２及びビスモデギブの併用効果。様々な用量のビスモデギブ及びＰＫＣ４１２（ミドスタウリン）を組み合わせて、ＲＯＳＡ４１７細胞株を処置し、細胞増殖に対するそれらの効果を決定した。分析は、３００nMのＰＫＣ４１２と組み合わせた２０μMのビスモデギブが、完全にＲＯＳＡ Ｋ４１７の増殖を阻害することを示す。
【図８】ビスモデギブとＰＫＣ４１２の組合せは、ＰＫＣ４１２単独又はビスモデギブ単独と比較して、ＲＯＳＡ ＷＴ及びＲＯＳＡ４１７の細胞死を有意に増加させる。Ａ）２０μMのビスモデギブと３００nMのＰＫＣ４１２の組合せは、ＲＯＳＡ ＷＴにおいて８０％の細胞死亡率を誘発する。Ｂ）２０μMのビスモデギブと３００nMのＰＫＣ４１２の組合せは、ＲＯＳＡ４１７において７０％の細胞死亡率を誘発する。
【００２５】
実施例：
方法
細胞培養
様々な肥満細胞型（臍帯血ＣＤ３４＋細胞に由来する初代肥満細胞、ヒトＭＣＬ由来細胞株ＨＭＣ−１、樹立された３つのヒト肥満細胞株ＲＯＳＡ−ＷＴ及びＲＯＳＡ−Ｄ８１６Ｖ、ＲＯＳＡ ＫＩＴΔ４１７−４１９ｉｎｓＹ（Saleh R et al, A new human mast cell line expressing a functional IgE receptor converts to tumorigenic growth by KIT D816V transfection Blood 2014）、並びに肥満細胞症白血病患者の末梢血から選別された白血病肥満細胞）を使用して、肥満細胞増殖におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の関与を示し、増殖停止及びアポトーシスに対するヘッジホッグ阻害剤の能力を実証した。ヒトＭＣＬ由来細胞株ＨＭＣ−１は、フランス、パリのMichel Arock博士によって親切にも贈呈された。２つのサブクローン、すなわち、ＫＩＴ Ｖ５６０Ｇを発現しているＨＭＣ−１．１、並びにＫＩＴ Ｖ５６０Ｇ及びＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現しているＨＭＣ−１．２を使用した。
【００２６】
ヒト初代肥満細胞、患者の白血病肥満細胞、及びＲＯＳＡ ＫＩＴ−ＷＴ細胞株を、１００Ｕ/mlのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ/Ｓ）（インビトロジェン社）、１％のピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社）、１％のビタミン（インビトロジェン社）、１％のグルタミン（インビトロジェン社）、２％の非必須アミノ酸（インビトロジェン社）、１％の市販のインシュリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウム溶液（インビトロジェン社）、１００ng/mlのヒト幹細胞因子の存在下における０．３％のウシアルブミン（ＢＳＡ）（ミルテニーバイオテク社）の補充された、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）−グルタマックス（登録商標）（インビトロジェン社）中で培養した。「ＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ」肥満細胞、「ＲＯＳＡ ＫＩＴΔ４１７−４１９ｉｎｓＹ」肥満細胞、及び突然変異したＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）を有するＨＭＣ−１株は、上記と同じ培地中で増殖させるが、ヒト幹細胞因子の非存在下で増殖させる。
【００２７】
ウェスタンブロット及びＲＴ−ｑＰＣＲ：
上記の各種細胞に由来する５００万個の細胞を一晩かけて飢餓させた後、細胞を、様々な用量のヘッジホッグ経路の化学物質アゴニスト（例えばプルモルファミン）又はアンタゴニスト（例えばＧａｎｔ６１）を用いて、いくつかの時間経過をかけて処置した。次いで、細胞を収集してＲＮＡ又はタンパク質を抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲ又はウェスタンブロット分析による遺伝子発現分析を実施した。ヘッジホッグ遺伝子Ｇｌｉ１−２−３、Ｓｍｏ、Ｐａｔｃｈ受容体、ＳＨＨ−ＩＨＨ−ＤＨＨリガンド、及び腫瘍サプレッサーＢｃｌ２遺伝子を調べた。アポトーシス（Ｂｃｌ２、カスパーゼ３、Ｂｃｌ−ｘｌ）及びＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ経路に関与するタンパク質である、ヘッジホッグタンパク質（Ｇｌｉ１及びＧｌｉ３）を調べた。
【００２８】
細胞増殖及びアポトーシスアッセイ
細胞増殖の動態アッセイを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して１００００個の細胞/ウェルで３回ずつ、１週間の間に、化合物Ｇａｎｔ６１、ビスモデギブを個々に又は組み合わせたものの存在下又は非存在下において実施して、肥満細胞増殖に対するそれらの効果を決定した。化合物を初日に様々な用量で加え、培地は７日間にわたり変更しなかった。週の終わりに、肥満細胞の死滅を、７−アミノ−アクチノマイシン生存判定染色溶液を使用してフローサイトメトリーによって調べた。
【００２９】
結果
肥満細胞におけるヘッジホッグ標的遺伝子の発現
肥満細胞（ＭＣ）におけるヘッジホッグ活性を評価するために、本発明者らは、様々な肥満細胞型（初代肥満細胞株、白血病肥満細胞株、及びヒト肥満細胞株）におけるＧＬＩ１−２−３遺伝子の発現を探索した（材料及び方法を参照）。ウェスタンブロット（図１ａ）及びＲＴ−ｑＰＣＲ（図１ｂ）によって得られた予備調査結果は、様々な細胞型において様々な発現パターンを有するＧＬＩ１及び／又はＧＬＩ２及び／又はＧＬＩ３の発現を実証し、これにより初めて、正常な及び異常なヒト肥満細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化が実証された。
【００３０】
肥満細胞における古典的なヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化
肥満細胞におけるヘッジホッグ古典的経路を探索するために、本発明者らは、ヒト肥満細胞株におけるＳＭＯアゴニストであるプルモルファミンによる刺激後に、ＧＬＩ１タンパク質の発現を分析した。ＧＬＩ１の発現は、プルモルファミンによる刺激後、特にＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖにおいて刺激から２４時間後に明瞭に増加した（図２）。これらの予備調査結果により本発明者らは、肥満細胞増殖に対する、ヘッジホッグ経路の阻害の結果、特に古典的経路の阻害の結果を探索した。
【００３１】
ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害は、肥満細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘発する
漸増量のビスモデギブ（１０、２０、５０μM）を介したヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害は、用量依存的にＲＯＳＡ細胞株の増殖を妨げた（図３）。この阻害は、ＲＯＳＡ ＫＩＴ ＷＴ細胞株においてよりもＫＩＴの突然変異したＲＯＳＡ細胞株（ＲＯＳＡ ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ及びＫ４１７）における方がより壮大であった（図３ｂ及び３ｃ）
【００３２】
肥満細胞の増殖はまた、ＧＡＮＴ６１を用いての処置後にも阻害された。この阻害は、ビスモデギブによる阻害よりも劇的であり、効果はこれもまたＫＩＴの突然変異したＲＯＳＡ細胞株における方がより大きかった（図４）。細胞増殖を阻害する他に、ＧＡＮＴ６１により肥満細胞が死滅した。この細胞死は、５％（５μMのＧＡＮＴ６１）から９０％超（５０μMのＧＡＮＴ６１、データは示されていない）の範囲におよび、用量依存的であった。興味深いことに、ＧＡＮＴ６１は、白血病肥満細胞死も誘発した（データは示されていない）。
【００３３】
どのような細胞型であれ、このような細胞死の誘導は、ＧＡＮＴ６１と比べてビスモデギブでははるかにあまり重要ではなかった（データは示されていない）。
【００３４】
肥満細胞症におけるヘッジホッグ経路の関与
図５は、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異を有する又は有さない様々な肥満細胞系統における、ＧＬＩ転写因子の発現分析を示す。
【００３５】
図６は、ＧＡＮＴ６１が肥満細胞の増殖を阻害し、肥満細胞のアポトーシスを誘発することを示す。
【００３６】
図７は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞イメージングシステムを使用した、ＲＯＳＡ ＫＩＴ４１７肥満細胞の細胞増殖に対する、ＰＫＣ４１２及びビスモデギブの併用効果を示す。
【００３７】
図８は、ビスモデギブとＰＫＣ４１２の組合せが、ＰＫＣ４１２単独又はビスモデギブ単独と比較して、ＲＯＳＡ ＷＴ及びＲＯＳＡ４１７の細胞死を有意に増加させることを示す。
【００３８】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、ここに参照することにより本開示に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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