(57)【要約】  本開示は、複数のトランスポザーゼのハイスループットスクリーニングを行って、トランスポザーゼの所望の特徴に影響する希少な突然変異を同定するための組成物および方法を提供する。本開示のハイスループットスクリーニング方法を促進する本開示の組成物が提供される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法であって、
（ａ）第１の末端配列を含む第１のオリゴヌクレオチドの転位を誘導するのに十分な条件下で、第１のトランスポザーゼを第１の核酸試料と接触させ、それにより、前記第１の末端配列の第１の複数の挿入部位を有する第１の転位した核酸試料を生成するステップ；
（ｂ）第２の末端配列を含む第２のオリゴヌクレオチドの転位を誘導するのに十分な条件下で、第２のトランスポザーゼを第２の核酸試料と接触させ、それにより、第２の複数の挿入部位を有する第２の転位した核酸試料を生成するステップであって、前記第２のトランスポザーゼが、少なくとも１つのアミノ酸により前記第１のトランスポザーゼとは異なるアミノ酸配列を有する、ステップ；
（ｃ）前記第１の転位した核酸試料の前記第１の複数の挿入部位の少なくとも一部分をシークエンシングし、それにより、シークエンシングリードの第１のセットを生成するステップであって、シークエンシングリードの前記第１のセットのそれぞれが、前記第１の末端配列の前記挿入部位の１つを含む、ステップ；
（ｄ）前記第２の転位した核酸試料の前記第２の複数の挿入部位の少なくとも一部分をシークエンシングし、それにより、シークエンシングリードの第２のセットを生成するステップであって、シークエンシングリードの前記第２のセットのそれぞれが、前記第２の末端配列の前記挿入部位の１つを含む、ステップ；
（ｅ）シークエンシングリードの前記第１のセットをシークエンシングリードの前記第２のセットと比較するステップ；および
（ｆ）比較するステップ（ｅ）に基づいて前記第２のトランスポザーゼが前記第１のトランスポザーゼとは有意に異なる確率を割り当てるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
比較するステップ（ｅ）が、
シークエンシングリードの前記第１のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を算出し、それにより、頻度値の第１のセットを生成するステップ；
シークエンシングリードの前記第２のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を算出し、それにより、頻度値の第２のセットを生成するステップ；
各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基について頻度値の前記第１のセットと頻度値の前記第２のセットとの絶対差分を算出し、それにより、絶対差分値のセットを生成するステップ；および
前記絶対差分値のそれぞれを平均し、それにより、モチーフ間距離を決定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
割り当てるステップ（ｆ）が、
シミュレートされたランダムな配列リードにより定義されるモチーフ間距離の確率プロットを生成するステップ；および
ステップ（ｅ）において決定された前記モチーフ間距離および前記モチーフ間距離の確率プロットのそれぞれに基づいて、前記第２のトランスポザーゼが前記第１のトランスポザーゼとは有意に異なる確率の値を割り当てるステップ
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
比較するステップ（ｅ）が、
前記第１の転位した核酸試料中の前記第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第１のシークエンシング深さを算出するステップ；
前記第２の転位した核酸試料中の前記第２の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第２のシークエンシング深さを算出するステップ；および
カバレージの前記第１のシークエンシング深さをカバレージの前記第２のシークエンシング深さと比較するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
割り当てるステップ（ｆ）が、
平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、形状差異の目視検査、およびパーセンタイルベースのメトリクス算出のうちの少なくとも１つを行うステップ
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
比較するステップ（ｅ）が、
前記第１の転位した核酸試料中の前記第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第１のＧＣ含量比率を算出するステップ；
前記第２の転位した核酸試料中の前記第２の挿入部位に対応する位置における前記第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第２のＧＣ含量比率を算出するステップ；および
前記第１のＧＣ含量比率と前記第２のＧＣ含量比率との差異を同定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
割り当てるステップ（ｆ）が、
平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、形状差異の目視検査、およびパーセンタイルベースのメトリクス算出のうちの少なくとも１つを行うステップ
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
５’から３’へ、
（ａ）第１のトランスポゾン末端配列、
（ｂ）一意識別子（ＵＩＤ）バーコード、および
（ｃ）第２のトランスポゾン末端配列
を含む核酸であって、転位することができる、核酸と、
トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列と
を含む組成物。
【請求項９】
前記核酸が、５’から３’へ、前記一意識別子（ＵＩＤ）バーコードと前記第２のトランスポゾン末端配列との間に位置する選択可能なマーカーをさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＵＩＤバーコードが、前記トランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列と関連付けられている、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
要素（ａ）〜（ｃ）を含む前記核酸が、前記トランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列を含まない、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
第１のベクターが、要素（ａ）〜（ｃ）を含む前記核酸を含み、第２のベクターが、前記トランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
要素（ａ）〜（ｃ）を含む前記核酸が、前記トランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列をさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記トランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列が、前記第１のトランスポゾン末端配列の５’に位置する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＵＩＤバーコードが、上限および下限を含めて５〜２００塩基対を含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＵＩＤバーコードが、上限および下限を含めて１０〜１００塩基対を含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＵＩＤバーコードが、上限および下限を含めて１０〜５０塩基対を含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＵＩＤバーコードが、上限および下限を含めて１５〜２５塩基対を含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＵＩＤバーコードが、上限および下限を含めて４〜２５塩基対を含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＵＩＤバーコードが、前記トランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列と関係付けられている、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記トランスポザーゼが野生型トランスポザーゼである、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記野生型トランスポザーゼが、任意の種から単離または誘導されたものである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記野生型トランスポザーゼが野生型ＴｎＡａトランスポザーゼである、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記野生型ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記野生型トランスポザーゼが野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記野生型Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記トランスポザーゼが突然変異体トランスポザーゼである、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記突然変異体トランスポザーゼが、野生型トランスポザーゼと比べて増加したトランスポザーゼ活性を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記突然変異体トランスポザーゼが、野生型トランスポザーゼと比較して低減した挿入部位バイアスを有する、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記突然変異体トランスポザーゼが、少なくとも１つの公知のまたは天然に存在する突然変異を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記突然変異体トランスポザーゼが突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７ＫまたはＭ５０Ａを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７Ｋを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＭ５０Ａを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７ＫおよびＭ５０Ａを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記突然変異体トランスポザーゼが突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記突然変異体トランスポザーゼが、配列番号１７の配列のナンバリングに従って、Ｔｎ５トランスポザーゼ中の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６に機能的に相当する位置における突然変異を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７の配列のナンバリングに従って、位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６における突然変異を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７の配列のナンバリングに従って、Ｒ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｙ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４Ｋ、Ｅ５４Ｖ、Ｍ５６Ａ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、Ｋ２１２Ｍ、Ｙ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｒ３２２Ｋ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ、Ｋ３３０Ｒ、Ｋ３３３Ａ、Ｋ３３３Ｒ、Ｒ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｎ３４８Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｓ４３８Ａ、Ｋ４３８Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｇ４６２ＤまたはＡ４６６Ｄを含む、請求項３９または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７の配列のナンバリングに従って、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡまたはＬ３７２Ｐを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７の配列のナンバリングに従って、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４５】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７の配列のナンバリングに従って、Ｋ２１２Ｍを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４７】
前記トランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼである、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記突然変異誘発されたトランスポザーゼが、少なくとも１つの天然に存在しない突然変異を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列または前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列が、
（ａ）突然変異誘発原に曝露されたものであるか、または
（ｂ）ランダム突然変異生成、部位特異的突然変異生成、もしくはこれらの組合せに供されたものである、請求項４７または４８に記載の組成物。
【請求項５０】
突然変異誘発された前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列または前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする前記配列が、野生型トランスポザーゼをコードする配列である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
野生型トランスポザーゼをコードする前記配列または前記野生型トランスポザーゼが、任意の種から単離または誘導されたものである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記野生型トランスポザーゼが野生型ＴｎＡａトランスポザーゼである、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記野生型ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記野生型トランスポザーゼが野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５５】
前記野生型Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
突然変異誘発された前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする前記一意的な核酸配列または前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする前記配列が、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５７】
突然変異体トランスポザーゼをコードする前記配列または前記突然変異体トランスポザーゼが、任意の種から単離または誘導されたものである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記突然変異体トランスポザーゼが、野生型トランスポザーゼと比べて増加したトランスポザーゼ活性を有する、請求項５６または５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記突然変異体トランスポザーゼが、野生型トランスポザーゼと比較して低減した挿入部位バイアスを有する、請求項５６、５７、または５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記突然変異体トランスポザーゼが、少なくとも１つの公知のまたは天然に存在する突然変異を含む、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記突然変異体トランスポザーゼが突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼである、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号２による配列のＰ４７ＫまたはＭ５０Ａを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号２による配列のＰ４７Ｋを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号２による配列のＭ５０Ａを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６６】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号２による配列のＰ４７ＫおよびＭ５０Ａを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６８】
前記突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記突然変異体トランスポザーゼが突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記突然変異体トランスポザーゼが、配列番号１７の配列に従って、Ｔｎ５トランスポザーゼ中の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６に機能的に相当する位置における突然変異を含む、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７による配列の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６における突然変異を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７２】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７による配列のＲ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｙ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４Ｋ、Ｅ５４Ｖ、Ｍ５６Ａ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、Ｋ２１２Ｍ、Ｙ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｒ３２２Ｋ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ、Ｋ３３０Ｒ、Ｋ３３３Ａ、Ｋ３３３Ｒ、Ｒ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｎ３４８Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｓ４３８Ａ、Ｋ４３８Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｇ４６２ＤまたはＡ４６６Ｄを含む、請求項６９または７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡまたはＬ３７２Ｐを含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７４】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが、配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐを含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７５】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１７による配列のＫ２１２Ｍを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項７７】
前記突然変異誘発原が物理的突然変異誘発原である、請求項４９〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記物理的突然変異誘発原が電離放射線である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記物理的突然変異誘発原が紫外放射線である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８０】
前記突然変異誘発原が化学的突然変異誘発原である、請求項４９〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記化学的突然変異誘発原が、活性酸素種、金属、脱アミノ化剤またはアルキル化剤である、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記ランダム突然変異生成が、
（ａ）前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列を物理的突然変異誘発原および／もしくは化学的突然変異誘発原と接触させるステップ、
（ｂ）前記突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする前記配列をエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供するステップ、または
（Ｃ）（ａ）と（ｂ）との組合せ
を含む、請求項４９〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記物理的突然変異誘発原が紫外線放射線である、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記化学的突然変異誘発原がアルキル化剤を含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８５】
前記アルキル化剤がＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記化学的突然変異誘発原がメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８７】
前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性遺伝子である、請求項８〜８６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８８】
請求項８〜８７のいずれか１項に記載の組成物を含むベクター。
【請求項８９】
請求項８〜８７のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項９０】
請求項８８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９１】
前記細胞が細菌である、請求項８９または９０に記載の細胞。
【請求項９２】
複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法であって、
（ａ）複数の細胞のうちの少なくとも１つの細胞が複数の請求項１〜７９のいずれか１項に記載の組成物のうちの少なくとも１つの組成物により形質転換されるために好適な条件下で前記複数の組成物を前記複数の細胞に導入するステップであって、前記複数のトランスポザーゼが、野生型、突然変異体または突然変異誘発形態の少なくとも１つのトランスポザーゼを含む、ステップ；
（ｂ）第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、選択可能なマーカーおよび第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で前記複数のトランスポザーゼのうちの少なくとも１つのトランスポザーゼを発現させるステップ；
（ｃ）挿入部位反復配列、前記第１の末端配列および前記ＵＩＤバーコードを含む（ｂ）における前記転位した核酸の挿入部位における核酸配列をシークエンシングするステップ；
（ｄ）前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼについて挿入部位コンセンサス配列を生成するステップ、ならびに
（ｅ）第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とは別個の挿入部位コンセンサス配列を有する第１のトランスポザーゼを選択するステップ
を含む、方法。
【請求項９３】
（ｅ）の前記第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼが、同じトランスポザーゼの野生型形態である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
（ｅ）の前記第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼが、同じトランスポザーゼの突然変異体形態である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
（ｅ）の前記第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼが、同じトランスポザーゼの突然変異誘発形態である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
（ｅ）の前記第１のトランスポザーゼが野生型トランスポザーゼであり、（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼが野生型トランスポザーゼである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記発現ステップ（ｂ）が、前記第１の末端配列、前記ＵＩＤバーコード、前記選択可能なマーカーおよび前記第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼを発現させるステップを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
前記発現ステップ（ｂ）が、前記第１の末端配列、前記ＵＩＤバーコード、前記選択可能なマーカーおよび前記第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で前記複数のトランスポザーゼのうちの前記少なくとも１つのトランスポザーゼを一過的に発現させるステップを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
前記発現ステップ（ｂ）が、前記第１の末端配列、前記ＵＩＤバーコード、前記選択可能なマーカーおよび前記第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で前記複数のトランスポザーゼのうちの前記各トランスポザーゼを一過的に発現させるステップを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１００】
前記複数の細胞が複数の細菌細胞を含む、請求項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記複数のトランスポザーゼが少なくとも１００個のトランスポザーゼを含み、前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼが、一意的な核酸配列によりコードされる、請求項９２または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記複数のトランスポザーゼが少なくとも５００個のトランスポザーゼを含み、前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼが、一意的な核酸配列によりコードされる、請求項９２または１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記複数のトランスポザーゼが少なくとも１０００個のトランスポザーゼを含み、前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼが、一意的な核酸配列によりコードされる、請求項９２または１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複数のトランスポザーゼが少なくとも５０００個のトランスポザーゼを含み、前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼが、一意的な核酸配列によりコードされる、請求項９２または１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記複数のトランスポザーゼが少なくとも１０，０００個のトランスポザーゼを含み、前記複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼが、一意的な核酸配列によりコードされる、請求項９２または１００に記載の方法。
【請求項１０６】
ベクターが、前記複数の組成物のうちの各組成物を含む、請求項９２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
ベクターが、プラスミド、発現ベクター、またはウイルスベクターを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ベクターが前記細胞内で複製されない、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
ベクターが構成的プロモーターを含み、前記組成物が前記構成的プロモーターの制御下にある、請求項１０６〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記複数のトランスポザーゼが、２つまたはそれより多くの野生型トランスポザーゼを含む、請求項９２〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記複数のトランスポザーゼが、同じトランスポザーゼの野生型、突然変異体および突然変異誘発形態のうちの２つまたはそれより多くを含む、請求項９２〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記複数のトランスポザーゼが、同じトランスポザーゼの野生型および突然変異誘発形態を含む、請求項９２〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記複数のトランスポザーゼが、同じトランスポザーゼの野生型、突然変異体および突然変異誘発形態を含む、請求項９２〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記シークエンシングが次世代シークエンシング（ＮＧＳ）である、請求項９２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップをさらに含む、請求項９２〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記分析するステップが、
（ａ）第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、および第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するステップであって、前記転位が、（ｅ）の前記選択された突然変異誘発されたトランスポザーゼにより媒介され、前記ＵＩＤバーコードが、（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼと関連付けられている、ステップ、
（ｂ）第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、および第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するステップであって、前記転位が、（ｅ）の前記選択された突然変異誘発されたトランスポザーゼの野生型形態により媒介され、前記ＵＩＤバーコードが前記第２のトランスポザーゼと関連付けられている、ステップ、
（ｃ）（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼおよび前記第２のトランスポザーゼのそれぞれのトランスポザーゼ活性または転位頻度のいずれかを測定するステップ、ならびに
（ｄ）前記第２のトランスポザーゼと比較して増加したトランスポザーゼ活性および／もしくは増加した転位頻度を有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または
（ｅ）前記第２のトランスポザーゼと比較して減少したトランスポザーゼ活性および／もしくは減少した転位頻度を有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記選択された第１のトランスポザーゼが活性亢進トランスポザーゼである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記分析するステップが、
（ａ）（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列を（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とアライメントするステップ、および
（ｂ）前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列がより多くの数の可変位置を含有する場合に、前記第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または
（ｃ）前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列がより少ない数の可変位置を含有する場合に、前記第２のトランスポザーゼと比較して増加した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記分析するステップが、
（ａ）（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列を（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とアライメントするステップ、および
（ｂ）前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において増加した配列変動を含有する場合に、前記第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または
（ｃ）前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において減少した配列変動を含有する場合に、前記第２のトランスポザーゼと比較して増加した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記分析するステップが、
（ａ）（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列を（ｅ）の前記第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とアライメントするステップ、および
（ｂ）前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において増加した配列変動を含有する場合に、前記第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または
（ｃ）前記選択された第１のトランスポザーゼの前記挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において減少した配列変動を含有する場合に、前記第２のトランスポザーゼと比較して増加した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記選択された第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、前記第２のトランスポザーゼが、前記突然変異誘発されたトランスポザーゼの野生型形態である、請求項１１５〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼが、前記第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有する、請求項１１５〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼが、前記第２のトランスポザーゼに存在しない所望の特徴を有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記選択された第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、前記方法が、（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼまたはその配列内の少なくとも１つの突然変異を同定するステップをさらに含む、請求項９２〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記選択された第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、前記方法が、（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼまたはその配列内の各突然変異を同定するステップをさらに含む、請求項９２〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記配列が、（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼのアミノ酸配列である、請求項１２４または１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記配列が、（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼをコードする核酸配列である、請求項１２４または１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記同定するステップが、（ｅ）の前記選択された第１のトランスポザーゼをコードする前記核酸配列をシークエンシングするステップを含む、請求項１２４〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[01]本出願は、２０１７年８月３０日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６２／５５２，２１４号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の組込み
[02]２０１８年８月２８日に作成された６０．４ＫＢのサイズの「ＲＭＳＩ−０１０＿００１ＷＯ  ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
開示の分野
[03]本開示は、分子生物学の分野、より詳細には、突然変異体および突然変異誘発されたトランスポザーゼの迅速かつ効率的なハイスループットスクリーニングを可能とするための分子ツールを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
[04]突然変異体および突然変異誘発されたトランスポザーゼの迅速かつ効率的なハイスループットスクリーニングを可能として、分子ツールとしてのトランスポザーゼの使用のための所望の特徴に繋がる希少な突然変異を同定するための分子ツールに対する長く求められていたが満たされていない必要性が当該技術分野において存在する。本開示は、これらの長く求められていたが満たされていない必要性を解決するためのシステムおよび方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[05]本開示は、複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法であって、（ａ）第１の末端配列を含む第１のオリゴヌクレオチドの転位を誘導するのに十分な条件下で、第１のトランスポザーゼを第１の核酸試料と接触させ、それにより、第１の末端配列の第１の複数の挿入部位を有する第１の転位した核酸試料を生成するステップ；（ｂ）第２の末端配列を含む第２のオリゴヌクレオチドの転位を誘導するのに十分な条件下で、第２のトランスポザーゼを第２の核酸試料と接触させ、それにより、第２の複数の挿入部位を有する第２の転位した核酸試料を生成するステップであって、第２のトランスポザーゼが、少なくとも１つのアミノ酸により第１のトランスポザーゼとは異なるアミノ酸配列を有する、ステップ；（ｃ）第１の転位した核酸試料の第１の複数の挿入部位の少なくとも一部分をシークエンシングし、それにより、シークエンシングリードの第１のセットを生成するステップであって、シークエンシングリードの第１のセットのそれぞれが、第１の末端配列の挿入部位の１つを含む、ステップ；（ｄ）第２の転位した核酸試料の第２の複数の挿入部位の少なくとも一部分をシークエンシングし、それにより、シークエンシングリードの第２のセットを生成するステップであって、シークエンシングリードの第２のセットのそれぞれが、第２の末端配列の挿入部位の１つを含む、ステップ；（ｅ）シークエンシングリードの第１のセットをシークエンシングリードの第２のセットと比較するステップ；および（ｆ）比較するステップ（ｅ）に基づいて第２のトランスポザーゼが第１のトランスポザーゼとは有意に異なる確率を割り当てるステップを含む、方法を提供する。
【０００４】
[06]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、比較するステップ（ｅ）は、シークエンシングリードの第１のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を算出し、それにより、頻度値の第１のセットを生成するステップ；シークエンシングリードの第２のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を算出し、それにより、頻度値の第２のセットを生成するステップ；各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基について頻度値の第１のセットと頻度値の第２のセットとの絶対差分を算出し、それにより、絶対差分値のセットを生成するステップ；および絶対差分値のそれぞれを平均し、それにより、モチーフ間距離を決定するステップを含む。
【０００５】
[07]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、比較するステップ（ｅ）は、シークエンシングリードの第１のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を測定または決定し、それにより、頻度値の第１のセットを生成するステップ；シークエンシングリードの第２のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を測定または決定し、それにより、頻度値の第２のセットを生成するステップ；各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基について頻度値の第１のセットと頻度値の第２のセットとの絶対差分を測定または決定し、それにより、絶対差分値のセットを生成するステップ；および絶対差分値のそれぞれを平均し、それにより、モチーフ間距離を決定するステップを含む。
【０００６】
[08]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、割り当てるステップ（ｆ）は、シミュレートされたランダムな配列リードにより定義されるモチーフ間距離の確率プロットを生成するステップ；およびステップ（ｅ）において決定されたモチーフ間距離およびモチーフ間距離の確率プロットのそれぞれに基づいて、第２のトランスポザーゼが第１のトランスポザーゼとは有意に異なる確率の値を割り当てるステップを含む。
【０００７】
[09]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、比較するステップ（ｅ）は、第１の転位した核酸試料中の第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第１のシークエンシング深さを算出するステップ；第２の転位した核酸試料中の第２の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第２のシークエンシング深さを算出するステップ；およびカバレージの第１のシークエンシング深さをカバレージの第２のシークエンシング深さと比較するステップを含む。
【０００８】
[010]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、比較するステップ（ｅ）は、第１の転位した核酸試料中の第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第１のシークエンシング深さを測定または決定するステップ；第２の転位した核酸試料中の第２の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第２のシークエンシング深さを測定または決定するステップ；およびカバレージの第１のシークエンシング深さをカバレージの第２のシークエンシング深さと比較するステップを含む。
【０００９】
[011]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、割り当てるステップ（ｆ）は、平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｆｆ）検定、パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、形状差異の目視検査、およびパーセンタイルベースのメトリクス算出のうちの少なくとも１つを行うステップを含む。
【００１０】
[012]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、比較するステップ（ｅ）は、第１の転位した核酸試料中の第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第１のＧＣ含量比率を算出するステップ；第２の転位した核酸試料中の第２の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第２のＧＣ含量比率を算出するステップ；および第１のＧＣ含量比率と第２のＧＣ含量比率との差異を同定するステップを含む。
【００１１】
[013]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、比較するステップ（ｅ）は、第１の転位した核酸試料中の第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第１のＧＣ含量比率を測定または決定するステップ；第２の転位した核酸試料中の第２の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第２のＧＣ含量比率を測定または決定するステップ；および第１のＧＣ含量比率と第２のＧＣ含量比率との差異を同定するステップを含む。
【００１２】
[014]本開示の複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、割り当てるステップ（ｆ）は、平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、形状差異の目視検査、およびパーセンタイルベースのメトリクス算出のうちの少なくとも１つを行うステップを含む。
【００１３】
[015]本開示は、５’から３’へ、（ａ）第１のトランスポゾン末端配列、（ｂ）一意識別子（ＵＩＤ）バーコード、および（ｃ）第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸であって、転位することができる、核酸と、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列とを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、核酸が、５’から３’へ、一意識別子（ＵＩＤ）バーコードと第２のトランスポゾン末端配列との間に位置する選択可能なマーカーをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードは、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列と関連付けられている。
【００１４】
[016]本開示の組成物のある特定の実施形態では、要素（ａ）〜（ｃ）を含む核酸は、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列を含まない。ある特定の実施形態では、第１のベクターが、要素（ａ）〜（ｃ）を含む核酸を含み、第２のベクターが、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列を含む。
【００１５】
[017]本開示の組成物のある特定の実施形態では、要素（ａ）〜（ｃ）を含む核酸は、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列は、第１のトランスポゾン末端配列の５’に位置する。ある特定の実施形態では、ベクターは、要素（ａ）〜（ｃ）を含む核酸およびトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列を含む。
【００１６】
[018]本開示の組成物のある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードは、上限および下限を含めて５〜２００塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードは、上限および下限を含めて１０〜１００塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードは、上限および下限を含めて１０〜５０塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードは、上限および下限を含めて１５〜２５塩基対を含む。
【００１７】
[019]本開示の組成物のある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードは、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列と関係付けられている。本明細書において使用される場合、関係付けられているという用語は、データベース中の記録により、ＵＩＤバーコードの核酸配列が、トランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列と対応付けられていることを表すことを意図する。本開示の方法のある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードおよびトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列は、方法の開始前にシークエンシングされてもよい。さらに、本開示の方法のある特定の実施形態では、ＵＩＤバーコードおよびトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列は、方法の開始前に関係付けられてもよい。
【００１８】
[020]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは野生型トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。
【００１９】
[021]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは野生型トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼは野生型ＴｎＡａトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、野生型ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
[022]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは野生型トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
[023]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは突然変異体トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比べて増加したトランスポザーゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して低減した挿入部位バイアスを有する。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、少なくとも１つの公知のまたは天然に存在する突然変異を含む。
【００２２】
[024]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは突然変異体トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、少なくとも１つの公知のまたは天然に存在する突然変異を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。
【００２３】
[025]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは突然変異体トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＰ４７ＫまたはＭ５０Ａを含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＰ４７Ｋを含む。突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７Ｋを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＭ５０Ａを含む。突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＭ５０Ａを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＰ４７ＫおよびＭ５０Ａを含む。突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７ＫおよびＭ５０Ａを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
[026]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは突然変異体トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、配列番号１７による配列の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６におけるＴｎ５トランスポザーゼ中の突然変異に機能的に相当する位置における突然変異を含む。
【００２５】
[027]ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。本開示の突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼとしては、例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ４６７３１において提供される突然変異を挙げることができるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６における突然変異を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列のＲ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｙ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４Ｋ、Ｅ５４Ｖ、Ｍ５６Ａ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、Ｋ２１２Ｍ、Ｙ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｒ３２２Ｋ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ、Ｋ３３０Ｒ、Ｋ３３３Ａ、Ｋ３３３Ｒ、Ｒ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｎ３４８Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｓ４３８Ａ、Ｋ４３８Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｇ４６２ＤまたはＡ４６６Ｄを含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してトランスポザーゼ活性を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＲ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ、およびＳ４４５Ａが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してトランスポザーゼ活性を増加させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＲ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、およびＬ３７２Ｐが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してＤＮＡ切断活性を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＫ３３３ＡおよびＫ３３３Ｒが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して鎖移動活性（ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＹ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｒ３２２Ｋ、Ｋ３３３ＡおよびＫ３３３Ｒが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して転位頻度を増加させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＹ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４ＫおよびＥ５４Ｖが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、トランスポザーゼ阻害因子の発現を無効にする突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＭ５６Ａが挙げられるがこれに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡまたはＬ３７２Ｐを含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐ（本明細書において「活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼと称されることもある）を含む。突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して標的特異性を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＫ２１２Ｍが挙げられるがこれに限定されない。
【００２６】
[028]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、（ａ）突然変異誘発原に曝露されたものであるか、または（ｂ）ランダム突然変異生成、部位特異的突然変異生成、もしくはこれらの組合せに供されたものである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発原は物理的突然変異誘発原である。ある特定の実施形態では、物理的突然変異誘発原は電離放射線である。ある特定の実施形態では、物理的突然変異誘発原は紫外放射線である。ある特定の実施形態では、突然変異誘発原は化学的突然変異誘発原である。ある特定の実施形態では、化学的突然変異誘発原は、活性酸素種、金属、脱アミノ化剤またはアルキル化剤である。
【００２７】
[029]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、（ａ）突然変異誘発原に曝露されたものであるか、または（ｂ）ランダム突然変異生成、部位特異的突然変異生成、もしくはこれらの組合せに供されたものである。ある特定の実施形態では、ランダム突然変異生成は、（ａ）突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列を物理的突然変異誘発原および／もしくは化学的突然変異誘発原と接触させるステップ、（ｂ）突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列をエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供するステップ、または（Ｃ）（ａ）と（ｂ）との組合せを含む。ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異生成はアラニンスキャニングを含む。ある特定の実施形態では、物理的突然変異誘発原は紫外線（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｎｔ）放射線である。ある特定の実施形態では、化学的突然変異誘発原はアルキル化剤を含む。ある特定の実施形態では、アルキル化剤はＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）を含む。ある特定の実施形態では、化学的突然変異誘発原はメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を含む。
【００２８】
[030]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、野生型トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼをコードする配列または野生型トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。
【００２９】
[031]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、野生型トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼをコードする配列または野生型トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼは野生型ＴｎＡａトランスポザーゼである。野生型トランスポザーゼが野生型ＴｎＡａトランスポザーゼである実施形態を含むある特定の実施形態では、野生型ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
[032]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、野生型トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼをコードする配列または野生型トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、野生型トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。野生型トランスポザーゼが野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである実施形態を含むある特定の実施形態では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
[033]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列または突然変異体トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、少なくとも１つの天然に存在しない突然変異を含む。
【００３２】
[034]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列または突然変異体トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、突然変異生成の前に、突然変異体トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比べて増加したトランスポザーゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、突然変異生成の前に、突然変異体トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して低減した挿入部位バイアスを有する。ある特定の実施形態では、突然変異生成の前に、突然変異体トランスポザーゼは、少なくとも１つの公知のまたは天然に存在する突然変異を含む。ある特定の実施形態では、突然変異生成の前に、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異生成の前に、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。
【００３３】
[035]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列または突然変異体トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＰ４７ＫまたはＭ５０Ａを含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＰ４７Ｋを含む。突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７Ｋを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＭ５０Ａを含む。突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＭ５０Ａを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼはＰ４７ＫおよびＭ５０Ａを含む。突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼがＰ４７ＫおよびＭ５０Ａを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
[036]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列または突然変異体トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは、配列番号１７による配列の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６におけるＴｎ５トランスポザーゼ中の突然変異に機能的に相当する位置における突然変異を含む。
【００３５】
[037]本開示の組成物のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、突然変異誘発された突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする一意的な核酸配列または突然変異誘発されたトランスポザーゼをコードする配列は、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列である。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼをコードする配列または突然変異体トランスポザーゼは、任意の種から単離または誘導されたものである。ある特定の実施形態では、突然変異体トランスポザーゼは突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。本開示の突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼとしては、例えば、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ４６７３１において提供される突然変異を挙げることができるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列の位置３０、４０、４１、４７、５４、５６、６２、９７、１１０、１８８、２１２、３１９、３２２、３２６、３３０、３３３、３４２、３４４、３４５、３４８、３７２、４３８、４４５、４６２、または４６６における突然変異を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列のＲ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｙ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４Ｋ、Ｅ５４Ｖ、Ｍ５６Ａ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、Ｋ２１２Ｍ、Ｙ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｒ３２２Ｋ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ、Ｋ３３０Ｒ、Ｋ３３３Ａ、Ｋ３３３Ｒ、Ｒ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｎ３４８Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｓ４３８Ａ、Ｋ４３８Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｇ４６２ＤまたはＡ４６６Ｄを含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してトランスポザーゼ活性を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＲ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ、およびＳ４４５Ａが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してトランスポザーゼ活性を増加させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＲ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、およびＬ３７２Ｐが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してＤＮＡ切断活性を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＫ３３３ＡおよびＫ３３３Ｒが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して鎖移動活性（ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＹ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｒ３２２Ｋ、Ｋ３３３ＡおよびＫ３３３Ｒが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して転位頻度を増加させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＹ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４ＫおよびＥ５４Ｖが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、トランスポザーゼ阻害因子の発現を無効にする突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＭ５６Ａが挙げられるがこれに限定されない。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡまたはＬ３７２Ｐを含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐ（本明細書において「活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼと称されることもある）を含む。突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼが配列番号１７による配列のＥ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して標的特異性を減少させる突然変異を含み、該突然変異としては、配列番号１７による配列のＫ２１２Ｍが挙げられるがこれに限定されない。
【００３６】
[038]本開示の組成物のある特定の実施形態では、選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性遺伝子である。本開示の例示的な抗生物質抵抗性遺伝子は、抗生物質への抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）を付与し、抗生物質としては、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。本開示の追加の抗生物質抵抗性遺伝子は、例えば、ａｒｄｂ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／ｂｒｏｗｓｅｇｅｎｅ．ｓｈｔｍｌ）に見出すことができる。
【００３７】
[039]本開示は、本開示の組成物を含むベクターを提供する。
【００３８】
[040]本開示は、本開示の組成物を含む細胞を提供する。本開示は、本開示の組成物を含む本開示のベクターを含む細胞を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は細菌細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は酵母細胞である。
【００３９】
[041]本開示は、複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法であって、（ａ）複数の細胞のうちの少なくとも１つの細胞が複数の組成物のうちの少なくとも１つの組成物により形質転換されるために好適な条件下で複数の本開示の組成物を複数の細胞に導入するステップであって、複数のトランスポザーゼが、野生型、突然変異体または突然変異誘発形態の少なくとも１つのトランスポザーゼを含む、ステップ；（ｂ）第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、選択可能なマーカーおよび第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で複数のトランスポザーゼのうちの少なくとも１つのトランスポザーゼを発現させるステップ；（ｃ）挿入部位反復配列、第１の末端配列およびＵＩＤバーコードを含む（ｂ）における転位した核酸の挿入部位における核酸配列をシークエンシングするステップ；（ｄ）複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼについて挿入部位コンセンサス配列を生成するステップ、ならびに（ｅ）第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とは別個の挿入部位コンセンサス配列を有する第１のトランスポザーゼを選択するステップを含む、方法を提供する。
【００４０】
[042]本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｅ）の第１のトランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、（ｅ）の第２のトランスポザーゼは、同じトランスポザーゼの野生型形態である。ある特定の実施形態では、（ｅ）の第１のトランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、（ｅ）の第２のトランスポザーゼは、同じトランスポザーゼの突然変異体形態である。ある特定の実施形態では、（ｅ）の第１のトランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、（ｅ）の第２のトランスポザーゼは、同じトランスポザーゼの突然変異誘発形態である。
【００４１】
[043]本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｅ）の第１のトランスポザーゼは野生型トランスポザーゼであり、（ｅ）の第２のトランスポザーゼは野生型トランスポザーゼである。
【００４２】
[044]本開示の方法のある特定の実施形態では、発現ステップ（ｂ）は、第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、選択可能なマーカーおよび第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼを発現させるステップを含む。
【００４３】
[045]本開示の方法のある特定の実施形態では、発現ステップ（ｂ）は、第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、選択可能なマーカーおよび第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で複数のトランスポザーゼのうちの少なくとも１つのトランスポザーゼを一過的に発現させるステップを含む。ある特定の実施形態では、発現ステップ（ｂ）は、第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、選択可能なマーカーおよび第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するのに十分な条件下で複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼを一過的に発現させるステップを含む。
【００４４】
[046]本開示の方法のある特定の実施形態では、複数の細胞は複数の細菌細胞を含む。
【００４５】
[047]本開示の方法のある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは少なくとも１００個のトランスポザーゼを含み、複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼは、一意的な核酸配列によりコードされる。ある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは少なくとも５００個のトランスポザーゼを含み、複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼは、一意的な核酸配列によりコードされる。ある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは少なくとも１０００個のトランスポザーゼを含み、複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼは、一意的な核酸配列によりコードされる。ある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは少なくとも５０００個のトランスポザーゼを含み、複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼは、一意的な核酸配列によりコードされる。ある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは少なくとも１０，０００個のトランスポザーゼを含み、複数のトランスポザーゼのうちの各トランスポザーゼは、一意的な核酸配列によりコードされる。
【００４６】
[048]本開示の方法のある特定の実施形態では、ベクターは、複数の組成物のうちの各組成物を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、発現ベクター、またはウイルスベクターを含む。ある特定の実施形態では、ベクターは細胞内で複製されない。ある特定の実施形態では、ベクターは構成的プロモーターを含み、組成物は構成的プロモーターの制御下にある。
【００４７】
[049]本開示の方法のある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは、２つまたはそれより多くの野生型トランスポザーゼを含む。
【００４８】
[050]本開示の方法のある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは、同じトランスポザーゼの野生型、突然変異体および突然変異誘発形態のうちの２つまたはそれより多くを含む。ある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは、同じトランスポザーゼの野生型および突然変異誘発形態を含む。ある特定の実施形態では、複数のトランスポザーゼは、同じトランスポザーゼの野生型、突然変異体および突然変異誘発形態を含む。
【００４９】
[051]本開示の方法のある特定の実施形態では、シークエンシングは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）である。
【００５０】
[052]本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップをさらに含む。
【００５１】
[053]本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、分析するステップは、（ａ）第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、および第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するステップであって、転位が、（ｅ）の選択された突然変異誘発されたトランスポザーゼにより媒介され、ＵＩＤバーコードが、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼと関連付けられている、ステップ、（ｂ）第１の末端配列、ＵＩＤバーコード、および第２のトランスポゾン末端配列を含む核酸の転位を誘導するステップであって、転位が、（ｅ）の選択された突然変異誘発されたトランスポザーゼの野生型形態により媒介され、ＵＩＤバーコードが第２のトランスポザーゼと関連付けられている、ステップ、（ｃ）（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼおよび第２のトランスポザーゼのそれぞれのトランスポザーゼ活性または転位頻度のいずれかを測定するステップ、ならびに（ｄ）第２のトランスポザーゼと比較して増加したトランスポザーゼ活性および／もしくは増加した転位頻度を有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または（ｅ）第２のトランスポザーゼと比較して減少したトランスポザーゼ活性および／もしくは減少した転位頻度を有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップを含む。ある特定の実施形態では、選択された第１のトランスポザーゼは活性亢進トランスポザーゼである。
【００５２】
[054]本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、分析するステップは、（ａ）（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列を（ｅ）の第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とアライメントするステップ、および（ｂ）選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列が、より多くの数の可変位置を含有する場合に、第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または（ｃ）選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列がより少ない数の可変位置を含有する場合に、第２のトランスポザーゼと比較して増加した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップを含む。
【００５３】
[055]本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、分析するステップは、（ａ）（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列を（ｅ）の第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とアライメントするステップ、および（ｂ）選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において増加した配列変動を含有する場合に、第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または（ｃ）選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において減少した配列変動を含有する場合に、第２のトランスポザーゼと比較して増加した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップを含む。
【００５４】
[056]本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、分析するステップは、（ａ）（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列を（ｅ）の第２のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列とアライメントするステップ、および（ｂ）選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において減少した配列変動を含有する場合に、第２のトランスポザーゼと比較して増加した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップ、または（ｃ）選択された第１のトランスポザーゼの挿入部位コンセンサス配列が１つもしくは複数の位置において増加した配列変動を含有する場合に、第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有するとして（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼを同定するステップを含む。
【００５５】
[057]（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップを方法がさらに含む実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、選択された第１のトランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼであり、第２のトランスポザーゼは、突然変異誘発されたトランスポザーゼの野生型形態である。
【００５６】
[058]（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップを方法がさらに含む実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼは、第２のトランスポザーゼと比較して減少した挿入部位バイアスを有する。
【００５７】
[059]（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップを方法がさらに含む実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼは、第２のトランスポザーゼに存在しない所望の特徴を有する。
【００５８】
[060]（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼの少なくとも１つの特徴を分析するステップを方法がさらに含み、選択された第１のトランスポザーゼが、突然変異誘発されたトランスポザーゼである実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼまたはその配列内の少なくとも１つの突然変異を同定するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼまたはその配列内の各突然変異を同定するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、配列は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼのアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、配列は、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼをコードする核酸配列である。ある特定の実施形態では、同定するステップは、（ｅ）の選択された第１のトランスポザーゼをコードする核酸配列をシークエンシングすることを含む。
【００５９】
[061]特許出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含有する。（１つまたは複数の）カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の納付と共に請求により庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】[062]図１は、Ｔｎ５トランスポザーゼの転位のカットアンドペースト機構を描写する一連の図式である。（１）トランスポゾンはドナーＤＮＡ（青）に元々位置し、２つの逆方向反復末端配列（黒）により囲まれたトランスポザーゼ遺伝子（緑）を含む。トランスポザーゼの発現は転位を開始させる。（２）トランスポザーゼ分子（橙色の楕円）は末端配列においてトランスポゾンの各末端に結合し、これらは二量体化して、トランスポゾンがループ構造を形成する複合体を形成する。（３）複合体はドナーＤＮＡから切除されて、トランスポゾンループ全体を有する遊離トランスポソームを形成する。（４）トランスポソームは標的ＤＮＡ（赤）に結合して９ｂｐをカバーし、この９ｂｐは最終的に複製される。（５）標的は９ｂｐオーバーハングと共に対向する鎖において切断され、末端配列は標的部位の末端と連結して新たな位置においてトランスポゾンを挿入し、オーバーハングは補充（ｆｉｌｌｅｄ）されて、挿入の両側において９ｂｐの反復した標的領域を作製する。
【図２】[063]図２は、タグメンテーションのプロセスを描写する図式である。トランスポソームは２つのＤＮＡ「アーム」をＤＮＡ標的に挿入して、それをせん断すると同時にタグ付けを行う。
【図３】[064]図３Ａ〜Ｂは、作製の方法に応じた、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリー末端の配列バイアスを実証する一対のグラフである。各塩基（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）のパーセンテージをライブラリー断片の末端位置に対するその塩基の位置に対してプロットしている。「０」は、せん断、または挿入が起こった位置を表す。（Ａ）機械的せん断および末端修復により作製されたライブラリー、（Ｂ）Ｔｎ５タグメンテーションにより作製されたライブラリー。
【図４】[065]図４Ａ〜Ｂは、Ｔｎ５の挿入およびＴｎ５挿入部位のコンセンサス配列を描写する一対の図式である。（Ａ）二量体の２つのトランスポザーゼ分子はそれぞれ、標的の対向する鎖上の異なる位置（位置＋１および＋９）において侵入する。挿入が起こると、オフセット切断およびフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）によりトランスポゾンの両末端において標的（黄色）の反復が最終的に作製される。（Ｂ）帰結として、Ｔｎ５挿入部位のコンセンサス配列はパリンドロームであり（２つの重なり合う逆方向トランスポザーゼの選好性から）、中央に反復領域を有する。Ｔｎ５のコンセンサス挿入部位を示す。
【図５】[066]図５は、ＴｎＡａ−ＴｐｎおよびＴ５−Ｔｐｎ挿入部位コンセンサス配列の比較を提供するグラフである。ＮＧＳライブラリーを作製するためにそれぞれ使用したＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］およびＴｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］の挿入部位のコンセンサス配列。コンセンサス配列は本質的に図３に記載されるように導出した。
【図６】[067]図６は、Ａｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊｅｏｔｇａｌｉにおける４つのＴｎＡａ挿入部位を描写する図式である。Ａｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊｅｏｔｇａｌｉ  ＫＣＴＣ  ２２４２９において見出される４つのＴｎＡａトランスポゾンの挿入部位を示しており、トランスポゾン逆方向末端配列を灰色で強調し、直接的に反復された挿入部位を黄色で強調している。緑色の強調は、挿入部位反復の不完全性を示す。挿入物１は、１０塩基の完全な反復を有する。挿入物２は、Ｔｎ５型の９塩基の完全な反復を有する。挿入物３は、不完全なＴｎ５型の９塩基の反復を有する。挿入物４は、８塩基の完全な反復を有する。
【図７】[068]図７は、移動可能で選択可能なバーコード領域の概要の図式である（縮尺通りではない）。移動可能で選択可能なバーコードは３つの成分を含む。モバイルユニットは２つのトランスポゾン末端配列（赤）を含み、これらのトランスポゾン末端配列は、一意識別子バーコード（ＵＩＤ、ピンク）および抗生物質抵抗性遺伝子（黄色）のような選択可能なマーカーを挟む。このユニットは、トランスポザーゼ遺伝子の発現により移動させることができる。トランスポザーゼ遺伝子自体は、移動可能ユニットに近接している必要はない。
【図８−１】[069]図８は、トランスポザーゼ突然変異体バーコード転位およびスクリーニングの概要を描写する一連の図式である（縮尺通りではない）。（１）何千ものベクターのライブラリーが作製される。各ベクターは、それぞれが特定の個々の突然変異体トランスポザーゼおよび特定の個々の移動可能で選択可能なバーコード領域を有するという点で互いに異なる。作製されると、ライブラリーはクローニングされてベクターのストックを作製する。ライブラリーは、バーコードおよび突然変異体トランスポザーゼを含む領域にわたりシークエンシングされる。各バーコードは互いに異なり、また特定の突然変異体に関連付けされているので、その後に各突然変異体の同定のために使用することができる。（２）宿主細菌は、ライブラリーを用いて形質転換され、各突然変異体トランスポザーゼは細胞内で一過的に発現される（プロモーターは構成的であるがベクターは複製されない）。（３）突然変異体トランスポザーゼが機能的な場合、２つの分子が２つの末端配列に結合して二量体複合体が形成され、移動可能で選択可能なバーコード領域が切除されて遊離トランスポソームが形成される。（４）移動可能領域を供給する単一の元々のベクター分子のみが存在し、ベクターは複製できないので、各細胞中に単一のトランスポソームのみが存在する。このトランスポソームは染色体上の標的領域に結合することができ、標的選好性はトランスポザーゼ突然変異体の性質により決定される。（５）挿入が起こり、挿入の効率がトランスポザーゼ突然変異体の性質により決定される。挿入は、バーコードおよび選択可能なマーカーの染色体への組込みを結果としてもたらす。細菌は抗生物質抵抗性となり、適切な抗生物質の適用により選択することができる。多くのクローン（場合により数百万）を選択することができる。これらは、各突然変異体について（異なる部位への）多くの異なる転位事象を伴う、数千の異なる突然変異体トランスポザーゼにより推進される転位事象を表す。（６）各挿入部位およびバーコードは次にＮＧＳによりシークエンシングされる。各バーコードを特定の突然変異体トランスポザーゼと関係付けることができるので、また、多くの挿入部位を各バーコード挿入についてシークエンシングすることができるので、挿入部位のコンセンサス配列を決定し、それを特定の突然変異体トランスポザーゼに関係付けることができる。このようにして、異なる挿入部位バイアスを示すトランスポザーゼを同定することができる。図９Ａ〜Ｃも参照。（７）いずれの突然変異体トランスポザーゼが特定の挿入バイアスまたは活性の（または他の）特徴を有するのかを同定することにより、ならびにそれらが共通して有する突然変異および突然変異部位を同定することにより、鍵となる機能的な位置、特定の突然変異および有用な組合せを記載することができる。
【図８−２】図８は、トランスポザーゼ突然変異体バーコード転位およびスクリーニングの概要を描写する一連の図式である（縮尺通りではない）。（１）何千ものベクターのライブラリーが作製される。各ベクターは、それぞれが特定の個々の突然変異体トランスポザーゼおよび特定の個々の移動可能で選択可能なバーコード領域を有するという点で互いに異なる。作製されると、ライブラリーはクローニングされてベクターのストックを作製する。ライブラリーは、バーコードおよび突然変異体トランスポザーゼを含む領域にわたりシークエンシングされる。各バーコードは互いに異なり、また特定の突然変異体に関連付けされているので、その後に各突然変異体の同定のために使用することができる。（２）宿主細菌は、ライブラリーを用いて形質転換され、各突然変異体トランスポザーゼは細胞内で一過的に発現される（プロモーターは構成的であるがベクターは複製されない）。（３）突然変異体トランスポザーゼが機能的な場合、２つの分子が２つの末端配列に結合して二量体複合体が形成され、移動可能で選択可能なバーコード領域が切除されて遊離トランスポソームが形成される。（４）移動可能領域を供給する単一の元々のベクター分子のみが存在し、ベクターは複製できないので、各細胞中に単一のトランスポソームのみが存在する。このトランスポソームは染色体上の標的領域に結合することができ、標的選好性はトランスポザーゼ突然変異体の性質により決定される。（５）挿入が起こり、挿入の効率がトランスポザーゼ突然変異体の性質により決定される。挿入は、バーコードおよび選択可能なマーカーの染色体への組込みを結果としてもたらす。細菌は抗生物質抵抗性となり、適切な抗生物質の適用により選択することができる。多くのクローン（場合により数百万）を選択することができる。これらは、各突然変異体について（異なる部位への）多くの異なる転位事象を伴う、数千の異なる突然変異体トランスポザーゼにより推進される転位事象を表す。（６）各挿入部位およびバーコードは次にＮＧＳによりシークエンシングされる。各バーコードを特定の突然変異体トランスポザーゼと関係付けることができるので、また、多くの挿入部位を各バーコード挿入についてシークエンシングすることができるので、挿入部位のコンセンサス配列を決定し、それを特定の突然変異体トランスポザーゼに関係付けることができる。このようにして、異なる挿入部位バイアスを示すトランスポザーゼを同定することができる。図９Ａ〜Ｃも参照。（７）いずれの突然変異体トランスポザーゼが特定の挿入バイアスまたは活性の（または他の）特徴を有するのかを同定することにより、ならびにそれらが共通して有する突然変異および突然変異部位を同定することにより、鍵となる機能的な位置、特定の突然変異および有用な組合せを記載することができる。
【図８−３】図８は、トランスポザーゼ突然変異体バーコード転位およびスクリーニングの概要を描写する一連の図式である（縮尺通りではない）。（１）何千ものベクターのライブラリーが作製される。各ベクターは、それぞれが特定の個々の突然変異体トランスポザーゼおよび特定の個々の移動可能で選択可能なバーコード領域を有するという点で互いに異なる。作製されると、ライブラリーはクローニングされてベクターのストックを作製する。ライブラリーは、バーコードおよび突然変異体トランスポザーゼを含む領域にわたりシークエンシングされる。各バーコードは互いに異なり、また特定の突然変異体に関連付けされているので、その後に各突然変異体の同定のために使用することができる。（２）宿主細菌は、ライブラリーを用いて形質転換され、各突然変異体トランスポザーゼは細胞内で一過的に発現される（プロモーターは構成的であるがベクターは複製されない）。（３）突然変異体トランスポザーゼが機能的な場合、２つの分子が２つの末端配列に結合して二量体複合体が形成され、移動可能で選択可能なバーコード領域が切除されて遊離トランスポソームが形成される。（４）移動可能領域を供給する単一の元々のベクター分子のみが存在し、ベクターは複製できないので、各細胞中に単一のトランスポソームのみが存在する。このトランスポソームは染色体上の標的領域に結合することができ、標的選好性はトランスポザーゼ突然変異体の性質により決定される。（５）挿入が起こり、挿入の効率がトランスポザーゼ突然変異体の性質により決定される。挿入は、バーコードおよび選択可能なマーカーの染色体への組込みを結果としてもたらす。細菌は抗生物質抵抗性となり、適切な抗生物質の適用により選択することができる。多くのクローン（場合により数百万）を選択することができる。これらは、各突然変異体について（異なる部位への）多くの異なる転位事象を伴う、数千の異なる突然変異体トランスポザーゼにより推進される転位事象を表す。（６）各挿入部位およびバーコードは次にＮＧＳによりシークエンシングされる。各バーコードを特定の突然変異体トランスポザーゼと関係付けることができるので、また、多くの挿入部位を各バーコード挿入についてシークエンシングすることができるので、挿入部位のコンセンサス配列を決定し、それを特定の突然変異体トランスポザーゼに関係付けることができる。このようにして、異なる挿入部位バイアスを示すトランスポザーゼを同定することができる。図９Ａ〜Ｃも参照。（７）いずれの突然変異体トランスポザーゼが特定の挿入バイアスまたは活性の（または他の）特徴を有するのかを同定することにより、ならびにそれらが共通して有する突然変異および突然変異部位を同定することにより、鍵となる機能的な位置、特定の突然変異および有用な組合せを記載することができる。
【図９Ａ−１】[070]図９Ａ〜Ｃは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のための挿入部位の単離および調製のための例示的な方法を描写する一連の図式である。（Ａ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ＰＣＲ）。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は、１つの末端挿入部位およびバーコードを有する染色体の逆方向セクションを含む。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの１つの末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの１つの挿入部位末端およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｂ）挿入部位の両方の末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）末端配列間の領域内で切断しない（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位全体、バーコードおよび抗生物質選択断片を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は染色体の逆方向セクションを含み、アンプリコンの末端は挿入部位およびバーコードを有する。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの両方の末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの挿入部位およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｃ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするための捕捉。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。加えて、ＤＮＡはランダムにせん断される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）ＤＮＡはサイズ分別され、シークエンシングアダプターがライゲートされる。増幅を適用することができる。（４）鎖は分離され、挿入部位の１つの末端のみを単離するためにハイブリッドキャプチャーが適用される。（５）ライブラリーは増幅され、シークエンシングのために準備済みとなる。
【図９Ａ−２】図９Ａ〜Ｃは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のための挿入部位の単離および調製のための例示的な方法を描写する一連の図式である。（Ａ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は、１つの末端挿入部位およびバーコードを有する染色体の逆方向セクションを含む。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの１つの末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの１つの挿入部位末端およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｂ）挿入部位の両方の末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）末端配列間の領域内で切断しない（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位全体、バーコードおよび抗生物質選択断片を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は染色体の逆方向セクションを含み、アンプリコンの末端は挿入部位およびバーコードを有する。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの両方の末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの挿入部位およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｃ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするための捕捉。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。加えて、ＤＮＡはランダムにせん断される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）ＤＮＡはサイズ分別され、シークエンシングアダプターがライゲートされる。増幅を適用することができる。（４）鎖は分離され、挿入部位の１つの末端のみを単離するためにハイブリッドキャプチャーが適用される。（５）ライブラリーは増幅され、シークエンシングのために準備済みとなる。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｃは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のための挿入部位の単離および調製のための例示的な方法を描写する一連の図式である。（Ａ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は、１つの末端挿入部位およびバーコードを有する染色体の逆方向セクションを含む。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの１つの末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの１つの挿入部位末端およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｂ）挿入部位の両方の末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）末端配列間の領域内で切断しない（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位全体、バーコードおよび抗生物質選択断片を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は染色体の逆方向セクションを含み、アンプリコンの末端は挿入部位およびバーコードを有する。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの両方の末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの挿入部位およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｃ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするための捕捉。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。加えて、ＤＮＡはランダムにせん断される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）ＤＮＡはサイズ分別され、シークエンシングアダプターがライゲートされる。増幅を適用することができる。（４）鎖は分離され、挿入部位の１つの末端のみを単離するためにハイブリッドキャプチャーが適用される。（５）ライブラリーは増幅され、シークエンシングのために準備済みとなる。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｃは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のための挿入部位の単離および調製のための例示的な方法を描写する一連の図式である。（Ａ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は、１つの末端挿入部位およびバーコードを有する染色体の逆方向セクションを含む。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの１つの末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの１つの挿入部位末端およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｂ）挿入部位の両方の末端をシークエンシングするためのインバーションＰＣＲ。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）末端配列間の領域内で切断しない（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。これは、挿入部位全体、バーコードおよび抗生物質選択断片を遊離させる。（３）断片は分子内ライゲーションにより環状化される。（４）次に、外向きプライマーを使用してインバーションＰＣＲが実行される。（５）標的分子は環状であるので、ＰＣＲ生成物は染色体の逆方向セクションを含み、アンプリコンの末端は挿入部位およびバーコードを有する。次にこれらの断片を使用してＮＧＳライブラリーを作製することができ、アンプリコンの両方の末端がシークエンシングされて、トランスポザーゼの挿入部位およびＵＩＤバーコードが明らかにされる。（Ｃ）挿入部位の１つの末端をシークエンシングするための捕捉。（１）標的染色体に挿入される移動性マーカーおよびバーコードを示す。それぞれが異なる挿入を伴う、全ての異なるクローンの染色体ＤＮＡが単離される。（２）バーコードに隣接して切断する（１つまたは複数の）制限酵素が、ＤＮＡを消化するために使用される。加えて、ＤＮＡはランダムにせん断される。これは、挿入部位の片側、バーコードおよび短い近くの領域を遊離させる。（３）ＤＮＡはサイズ分別され、シークエンシングアダプターがライゲートされる。増幅を適用することができる。（４）鎖は分離され、挿入部位の１つの末端のみを単離するためにハイブリッドキャプチャーが適用される。（５）ライブラリーは増幅され、シークエンシングのために準備済みとなる。
【図１０】[071]図１０は、最小試験ベクターの概要を提供する図式である（縮尺通りではない）。最小試験ベクター全体の全体的なレイアウトを示す。それは、２つの隣接した領域を含み、１つ目はトランスポザーゼ発現ユニット、２つ目は移動可能な選択可能ユニットである。これらの２つの領域のそれぞれは、ＰＣＲ用のプライミング部位として使用することができる短い非機能的ストレッチにより挟まれている。トランスポザーゼユニットはトランスポザーゼ遺伝子（様々）および発現シグナルからなり、発現はｔｅｔプロモーターにより構成的に推進される。移動可能な選択可能ユニットは本質的に図７に記載される通りであるが、但し、バーコードはまだ付加されておらず（制限−クローニング部位は存在する）、選択可能なマーカーはその天然プロモーターから構成的に発現されるカナマイシン抵抗性遺伝子である。
【図１１】[072]図１１は、精製された最小試験ベクターアンプリコンの可視化のためのアガロースゲルの写真である。ＰＣＲ増幅された最小試験ベクターを精製した。さらなる使用の前にこのＰＣＲ増幅された最小試験ベクターを７．５％のＴＢＥアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ下で可視化した。Ｔｎ５生成物（２７３４ｂｐ）はＴｎＡａ生成物（２６７４ｂｐ）よりわずかに大きいことが予測され、全てのバンドは正しい位置にある。ＴｎＡａ二重突然変異体生成物（レーン４）は単一塩基欠失を有することがその後に示され、ここではさらに考慮しない。
【図１２】[073]図１２Ａ〜Ｂは、環状化最小試験ベクターの製造のためのアガロースゲルの一対の写真である。ＰＣＲ増幅された最小試験ベクターを環状化後の形質転換のために調製した。異なるステップにおいて、試験試料を７．５％のＴＢＥアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ下で可視化した。（Ａ）平滑末端作製およびリン酸化後の直鎖状ベクター。（Ｂ）ライゲーション後のベクター。レーン１〜３は、リン酸化されたベクターを用いたライゲーションを示す。レーン４〜６は、リン酸化されておらず、したがって連結も環状化もしないことが予測されるベクターを用いたライゲーションを示す。矢印は環状化分子を指し示す。
【図１３】[074]図１３は、ＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］の挿入部位のインバーションＰＣＲの可視化のためのアガロースゲルの写真である。セルフライゲートされた環状化挿入部位のインバーションＰＣＲからの分離された生成物のＴＢＥアガロースゲル。
【図１４】[075]図１４Ａ〜Ｃは、ＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］最小試験ベクターを使用した９つの挿入部位の配列およびコンセンサスを描写する一連の図式である。９つの挿入部位の両側をシークエンシングした。元々の部位（前）の挿入を再び作製し、反復領域を同定した（灰色の強調で示す）。（Ａ）は、左手側の挿入部位におけるアライメントされた部位を示す。（Ｂ）は、反復の長さの差異を相殺するために必要とされる中央の空白と共に、左手および右手の両側の挿入部位におけるアライメントされた部位を示す。元々の挿入部位、およびそれらの反転相補体の両方を含めている。（Ｃ）は、（Ｂ）に由来するウェブロゴコンセンサスを示し、中央塩基（Ｎ）は意味を有するには不十分な表示であるので、この位置を除外している。
【図１５】[076]図１５Ａ〜Ｆは、ベクター成分をクローニングし、最終構築物を調製するプロセスを描写する一連の図式である。（Ａ）元々の最小試験ベクター。（Ｂ）これは、３つの別々のプラスミドに部分的にクローニングされ、シークエンシングされる。（Ｃ）トランスポザーゼは突然変異誘発および増幅され、バーコードＵＩＤが移動可能領域にクローニングされる。（Ｄ）突然変異体トランスポザーゼは、バーコード化された移動可能領域を有するプラスミドにクローニングされる。（Ｅ）発現断片およびトランスポザーゼ−移動可能断片ＤＮＡは制限消化により２つのインプットプラスミドから切断され、精製される。（Ｆ）２つの断片がアセンブリーＰＣＲにより連結および増幅された後、環状化および形質転換のために準備済みとなる。
【図１６】[077]図１６Ａ〜Ｂは、部位特異的飽和突然変異生成構築物を作製するプロセスを描写する一対の図式である。（Ａ）野生型トランスポザーゼ遺伝子は、バーコード化された移動可能領域に隣接して、適切な位置においてクローニングされる。プラスミド全体を増幅するために、トランスポザーゼ遺伝子内の外向きプライマーが使用される。プライマーのうちの１つはランダムな配列のヌクレオチドトリプレットを有するので、トランスポザーゼ内の単一の位置は、全ての可能なコドンに突然変異誘発される。プラスミドはライゲーションにより再び環状化され、宿主を形質転換するために使用される。（Ｂ）Ｔｎ５ハイパーヌクレアーゼトランスポザーゼ最小試験ベクターの配列（配列番号６）によるナンバリングで、トランスポザーゼＴｎ５の位置Ｋ２１２、Ｈ２１３およびＰ２１４を突然変異誘発するために使用されるプライマーの例。
【図１７】[078]図１７は、参照Ｔｎ５−Ｅ５４Ｋおよび突然変異体Ｐ２１４Ｎという２つのトランスポザーゼ構築物についての開始部位バイアスを描写するリード中の位置の関数としての「Ｃ」で開始するリードの比率のプロットである。グラフは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中の挿入部位の配列リードにおける最初の２０個の位置のそれぞれについて「Ｃ」で開始するリードの比率を指し示した。上下の矢印は、リード中の各位置についての２つのグラフ間の絶対差分を指し示す。
【図１８】[079]図１８は、モチーフＡおよびＢにおける配列の数を考慮して、モチーフ間距離についての統計的に有意な距離スコアの確率の間の関係性を実証するグラフである。
【図１９】[080]図１９は、様々なＴｎ５突然変異体および参照Ｔｎ５  Ｅ５４Ｋについての開始部位バイアスプロットを示す一連のグラフである。ｘ軸はリード中の位置を指し示し、ｙ軸はその位置において「Ｔ」、「Ｃ」、「Ｇ」または「Ａ」を有するリードの比率を指し示す。
【図２０】[081]図２０は、様々なＴｎ５突然変異体および参照活性亢進Ｔｎ５突然変異体（配列番号１）についての開始部位バイアスを示す配列ロゴである。ロゴは、各トランスポザーゼについてのリードのアライメントに基づいてＷｅｂｌｏｇｏ３を使用して生成される。
【図２１】[082]図２１は、低カバレージ領域においてカバレージの向上を有する突然変異体を描写するグラフである。バックグラウンド遺伝子型Ｂは活性亢進Ｔｎ５突然変異体（実線）であり、これは、ＢＡＴＳ実験において突然変異体を生成させた実際のバックグラウンド遺伝子型である。
【図２２】[083]図２２は、低カバレージ領域においてより低いカバレージを有する突然変異体を描写するグラフである。バックグラウンド遺伝子型Ｂは活性亢進Ｔｎ５突然変異体（実線）であり、これは、ＢＡＴＳ実験において突然変異体を生成させた実際のバックグラウンド遺伝子型である。
【図２３】[084]図２３は、遺伝子座のＧＣ含量に応じて参照または２つの突然変異体トランスポザーゼによる遺伝子座への移動可能エレメントの挿入を触媒する確率を描写するグラフである。
【図２４】[085]図２４は、遺伝子座のＧＣ含量に応じて参照または３つの突然変異体トランスポザーゼによる遺伝子座への移動可能エレメントの挿入を触媒する確率を描写するグラフである。
【図２５−１】[086]図２５は、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼ（配列番号６）を有する最小試験ベクター全体の注釈付き配列を示す図である。Ｔｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］遺伝子（破線による下線）は、位置１６５〜１６７の開始コドンおよび位置１６２３〜１６２５の終止コドンと共に位置１６８〜１６２２にわたる。Ｅ５４Ｋ突然変異は位置３５１〜３５３にわたる。Ｍ５６Ａ突然変異は位置３５７〜３５９にわたる。Ｌ３７２Ｐ突然変異は位置１３０５〜１３０７にわたる。Ｔｅｔ−３５部位は位置５３〜５８にわたる。Ｔｅｔ−１０部位は位置６６〜７１にわたる。ＢｇｌＩＩ制限部位は位置１〜６にわたる。ＸｂａＩ制限部位は位置１２４〜１２９にわたる。ＢａｍＨＩ制限部位は位置１６４７〜１６５２にわたる。位置１６７９〜１７０２にわたるバーコードクローニング部位は、ＳｐｅＩ（１６７９〜１６８４）、ＳｔｕＩ（１６８８〜１６９３）、およびＡｓｕＩＩ（１６９７〜１７０２）の３つの制限部位を包含する。ＬＨＳ  ＥＳ部位は１６５８〜１６７６にわたる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ部位は位置１５４〜１５８にわたる。カナマイシン抵抗性遺伝子（点線の下線）は、位置１８５１〜１８５３の開始コドンおよび位置２６５４〜２６５６の終止コドンと共に位置１８５４〜２６５３にわたる。ＲＢＳは位置１８４１〜１８４３にわたる。ＭｆｅＩ制限部位は２６７８〜２６８３にわたる。ＡｖｒＩＩ制限部位は位置２７２９〜２７３４にわたる。さらに、図２５に示すプライマー配列を表Ｄに列記する。
【図２５−２】図２５は、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼ（配列番号６）を有する最小試験ベクター全体の注釈付き配列を示す図である。Ｔｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］遺伝子（破線による下線）は、位置１６５〜１６７の開始コドンおよび位置１６２３〜１６２５の終止コドンと共に位置１６８〜１６２２にわたる。Ｅ５４Ｋ突然変異は位置３５１〜３５３にわたる。Ｍ５６Ａ突然変異は位置３５７〜３５９にわたる。Ｌ３７２Ｐ突然変異は位置１３０５〜１３０７にわたる。Ｔｅｔ−３５部位は位置５３〜５８にわたる。Ｔｅｔ−１０部位は位置６６〜７１にわたる。ＢｇｌＩＩ制限部位は位置１〜６にわたる。ＸｂａＩ制限部位は位置１２４〜１２９にわたる。ＢａｍＨＩ制限部位は位置１６４７〜１６５２にわたる。位置１６７９〜１７０２にわたるバーコードクローニング部位は、ＳｐｅＩ（１６７９〜１６８４）、ＳｔｕＩ（１６８８〜１６９３）、およびＡｓｕＩＩ（１６９７〜１７０２）の３つの制限部位を包含する。ＬＨＳ  ＥＳ部位は１６５８〜１６７６にわたる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ部位は位置１５４〜１５８にわたる。カナマイシン抵抗性遺伝子（点線の下線）は、位置１８５１〜１８５３の開始コドンおよび位置２６５４〜２６５６の終止コドンと共に位置１８５４〜２６５３にわたる。ＲＢＳは位置１８４１〜１８４３にわたる。ＭｆｅＩ制限部位は２６７８〜２６８３にわたる。ＡｖｒＩＩ制限部位は位置２７２９〜２７３４にわたる。さらに、図２５に示すプライマー配列を表Ｄに列記する。
【図２６−１】[087]図２６は、Ｐ４７Ｋ突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（配列番号７）を有する最小試験ベクター全体の注釈付き配列を示す図である。ＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］遺伝子（破線による下線）は、位置１６５〜１６７の開始コドンおよび位置１５６３〜１５６５の終止コドンと共に位置１６８〜１５６２にわたる。Ｐ４７Ｋ突然変異は位置３３０〜３３２にわたる。Ｔｅｔ−３５部位は位置５３〜５８にわたる。Ｔｅｔ−１０部位は位置６６〜７１にわたる。ＢｇｌＩＩ制限部位は位置１〜６にわたる。ＸｂａＩ制限部位は位置１２４〜１２９にわたる。ＮｃｏＩ制限部位は位置１６３〜１６８にわたる。ＭｌｕＩ制限部位は位置２５８〜２６３にわたる。ＢａｍＨＩ制限部位は位置１５８７〜１５９２にわたる。位置１６７９〜１７０２にわたるバーコードクローニング部位は、ＳｐｅＩ（１６１９〜１６２４）、ＳｔｕＩ（１６２８〜１６３３）、およびＡｓｕＩＩ（１６３７〜１６４２）の３つの制限部位を包含する。ＬＨＳ  ＥＳ部位は１５９８〜１６１６にわたる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ部位は位置１５４〜１５８にわたる。カナマイシン抵抗性遺伝子（点線の下線）は、位置１７９１〜１７９３の開始コドンおよび位置２６０４〜２６０６の終止コドンと共に位置１７９４〜２６０３にわたる。ＲＢＳは位置１７８１〜１７８３にわたる。ＭｆｅＩ制限部位は２６１８〜２６２３にわたる。ＡｖｒＩＩ制限部位は位置２６３６〜２６４１にわたる。ＲＨＳ  ＥＳ部位は位置２６２６〜２６４４にわたる。さらに、図２６に示すプライマー配列を表Ｄに列記する。
【図２６−２】図２６は、Ｐ４７Ｋ突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（配列番号７）を有する最小試験ベクター全体の注釈付き配列を示す図である。ＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］遺伝子（破線による下線）は、位置１６５〜１６７の開始コドンおよび位置１５６３〜１５６５の終止コドンと共に位置１６８〜１５６２にわたる。Ｐ４７Ｋ突然変異は位置３３０〜３３２にわたる。Ｔｅｔ−３５部位は位置５３〜５８にわたる。Ｔｅｔ−１０部位は位置６６〜７１にわたる。ＢｇｌＩＩ制限部位は位置１〜６にわたる。ＸｂａＩ制限部位は位置１２４〜１２９にわたる。ＮｃｏＩ制限部位は位置１６３〜１６８にわたる。ＭｌｕＩ制限部位は位置２５８〜２６３にわたる。ＢａｍＨＩ制限部位は位置１５８７〜１５９２にわたる。位置１６７９〜１７０２にわたるバーコードクローニング部位は、ＳｐｅＩ（１６１９〜１６２４）、ＳｔｕＩ（１６２８〜１６３３）、およびＡｓｕＩＩ（１６３７〜１６４２）の３つの制限部位を包含する。ＬＨＳ  ＥＳ部位は１５９８〜１６１６にわたる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ部位は位置１５４〜１５８にわたる。カナマイシン抵抗性遺伝子（点線の下線）は、位置１７９１〜１７９３の開始コドンおよび位置２６０４〜２６０６の終止コドンと共に位置１７９４〜２６０３にわたる。ＲＢＳは位置１７８１〜１７８３にわたる。ＭｆｅＩ制限部位は２６１８〜２６２３にわたる。ＡｖｒＩＩ制限部位は位置２６３６〜２６４１にわたる。ＲＨＳ  ＥＳ部位は位置２６２６〜２６４４にわたる。さらに、図２６に示すプライマー配列を表Ｄに列記する。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
[088]本開示は、並列的に複数のトランスポザーゼをスクリーニングして、例えば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）において使用するための分子ツールとしてのトランスポザーゼの望ましい機能を付与しまたは増進させる希少な突然変異を迅速かつ効率的に同定するための組成物およびハイスループット方法を提供する。本開示の組成物は、一意識別子（ＵＩＤ）バーコードを転位可能な核酸に組み込み、該核酸は、挿入時に、ＵＩＤバーコードを挿入部位反復配列に近接して配置させる。ＵＩＤバーコードを含有する転位可能な核酸を移動させたトランスポザーゼの核酸配列とＵＩＤバーコードを関係付けることにより、およびＵＩＤバーコードを挿入部位反復配列に近接して有することにより、ＵＩＤバーコードを移動させた複数のトランスポザーゼの中からの１つのトランスポザーゼの素性およびそのトランスポザーゼの挿入部位選好性を決定するために最小の長さの配列が得られなければならない。本開示の方法は、潜在的に数十億もの挿入部位をシークエンシングする負担を課す、何百万もの突然変異誘発されたトランスポザーゼのスクリーニングのために使用されることが意図される。本開示の組成物および方法は、シークエンシング負担を最小化すると共に、単一の実験から得ることができる情報を最大化するように設計される。
バーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）
[089]本開示は、野生型トランスポザーゼまたは公知の突然変異体トランスポザーゼと比較して転位の間の減少したバイアスの標的選択を示すトランスポザーゼの突然変異生成およびスクリーニングの方法を提供する。本開示の方法により同定されるトランスポザーゼは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）への応用の他に、分子生物学の分野における他の応用のために使用することができる。
【００６２】
[090]本開示の方法に供されるトランスポザーゼとしては、任意のトランスポザーゼを挙げることができる。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼはＡｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｅｓｔｕａｒｉｉに由来する。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、野生型ＴｎＡａトランスポザーゼ（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼ）または突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（例えば、配列番号３〜５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するトランスポザーゼ）である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較して増加転位活性を有する突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐ（突然変異体の位置は配列番号６のナンバリングによる）のうちの１つまたは複数を含む突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐを含む突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼ）である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較して低減した標的特異性を有する突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｋ２１２Ｍを含み、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較して低減した標的特異性を有する突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである。
【００６３】
[091]例示的なトランスポザーゼの配列を以下に提供する（突然変異を太字とし、下線を引いている）。
【００６４】
[092]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｗ１２５Ｇ（配列番号１８）。
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[093]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｅ１４６Ａ（配列番号１９）。
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[094]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｅ１４６Ｃ（配列番号２０）。
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[095]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｅ１４６Ｎ（配列番号２１）。
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[096]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｅ１４６Ｓ（配列番号２２）。
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[097]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｐ２１４Ｓ（配列番号２３）。
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[098]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体Ｇ２５１Ａ（配列番号２４）。
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[099]「活性亢進」Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｅ５４Ｋ  Ｍ５６Ａ  Ｌ３７２Ｐ）（配列番号１）。
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181       SNVIAVCDRE ADIHAYLQDK LAHNERFVVR SKHPRKDVES GLYLYDHLKN QPELGGYQIS
241       IPQKGVVDKR GKRKNRPARK ASLSLRSGRI TLKQGNITLN AVLAEEINPP KGETPLKWLL
301       LTSEPVESLA QALRVIDIYT HRWRIEEFHK AWKTGAGAER QRMEEPDNLE RMVSILSFVA
361       VRLLQLRESF TPPQALRAQG LLKEAEHVES QSAETVLTPD ECQLLGYLDK GKRKRKEKAG
421       SLQWAYMAIA RLGGFMDSKR TGIASWGALW EGWEALQSKL DGFLAAKDLM AQGIKLE*
[0100]野生型ＴｎＡａトランスポザーゼ（突然変異なし）（配列番号２）。
1        MNNAQWAKST FGQADLGDPR RTTRLVKLAE TLANDPGKPF VSITQSPADMEGAYRFIRNE
61       HVNADAIAKA GYLVTAAQAA KHNLLLALED TTAITYSHRS VRDELGHVNQ GNNYRGILAH
121      SVLLFAPEQQ ELVGLIEQSR WTRDISTRGK KHVRTQTPYE EKESFKWQSA SVNLSARLGT
181      KMADVISVCD READIYEYLQ YKLSKQHRFV VRSMQSRHIE QSEQKLYDYA AGLESAGQKQ
241      IHIAQKGGRK ARTATVDIVF APVTLQVPAN KRGESLSLYY VGCEERADDK NALNWHLLTT
301      EPVQSKADAL NIIRYYEHRW LVEEYHKAWK TDGTDIENAR LQSKDNIERL VTISAFIAVR
361      IVQLKFAREQ PDEISCEQVL SPKAWKLLWI KRVSRTLPDT VPSMKWAYTE LAKLGGWKDT
421      KQTGKASVKV LWQGWFKLQT ILEGYDLAKS LEADLLE*
[0101]二重突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（Ｐ４７Ｋ  Ｍ５０Ａ）（配列番号３）。
1        MNNAQWAKST FGQADLGDPR RTTRLVKLAE TLANDPGKPF VSITQSKADAEGAYRFIRNE
61       HVNADAIAKA GYLVTAAQAA KHNLLLALED TTAITYSHRS VRDELGHVNQ GNNYRGILAH
121      SVLLFAPEQQ ELVGLIEQSR WTRDISTRGK KHVRTQTPYE EKESFKWQSA SVNLSARLGT
181      KMADVISVCD READIYEYLQ YKLSKQHRFV VRSMQSRHIE QSEQKLYDYA AGLESAGQKQ
241      IHIAQKGGRK ARTATVDIVF APVTLQVPAN KRGESLSLYY VGCEERADDK NALNWHLLTT
301      EPVQSKADAL NIIRYYEHRW LVEEYHKAWK TDGTDIENAR LQSKDNIERL VTISAFIAVR
361      IVQLKFAREQ PDEISCEQVL SPKAWKLLWI KRVSRTLPDT VPSMKWAYTE LAKLGGWKDT
421      KQTGKASVKV LWQGWFKLQT ILEGYDLAKS LEADLLE*
[0102]単一突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（Ｍ５０Ａ）（配列番号４）。
1        MNNAQWAKST FGQADLGDPR RTTRLVKLAE TLANDPGKPF VSITQSPADAEGAYRFIRNE
61       HVNADAIAKA GYLVTAAQAA KHNLLLALED TTAITYSHRS VRDELGHVNQ GNNYRGILAH
121      SVLLFAPEQQ ELVGLIEQSR WTRDISTRGK KHVRTQTPYE EKESFKWQSA SVNLSARLGT
181      KMADVISVCD READIYEYLQ YKLSKQHRFV VRSMQSRHIE QSEQKLYDYA AGLESAGQKQ
241      IHIAQKGGRK ARTATVDIVF APVTLQVPAN KRGESLSLYY VGCEERADDK NALNWHLLTT
301      EPVQSKADAL NIIRYYEHRW LVEEYHKAWK TDGTDIENAR LQSKDNIERL VTISAFIAVR
361      IVQLKFAREQ PDEISCEQVL SPKAWKLLWI KRVSRTLPDT VPSMKWAYTE LAKLGGWKDT
421      KQTGKASVKV LWQGWFKLQT ILEGYDLAKS LEADLLE*
[0103]単一突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（Ｐ４７Ｋ）（配列番号５）。
1        MNNAQWAKST FGQADLGDPR RTTRLVKLAE TLANDPGKPF VSITQSKADMEGAYRFIRNE
61       HVNADAIAKA GYLVTAAQAA KHNLLLALED TTAITYSHRS VRDELGHVNQ GNNYRGILAH
121      SVLLFAPEQQ ELVGLIEQSR WTRDISTRGK KHVRTQTPYE EKESFKWQSA SVNLSARLGT
181      KMADVISVCD READIYEYLQ YKLSKQHRFV VRSMQSRHIE QSEQKLYDYA AGLESAGQKQ
241      IHIAQKGGRK ARTATVDIVF APVTLQVPAN KRGESLSLYY VGCEERADDK NALNWHLLTT
301      EPVQSKADAL NIIRYYEHRW LVEEYHKAWK TDGTDIENAR LQSKDNIERL VTISAFIAVR
361      IVQLKFAREQ PDEISCEQVL SPKAWKLLWI KRVSRTLPDT VPSMKWAYTE LAKLGGWKDT
421      KQTGKASVKV LWQGWFKLQT ILEGYDLAKS LEADLLE*
[0104]「活性亢進」Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｅ５４Ｋ  Ｍ５６Ａ  Ｌ３７２Ｐ）を有する最小試験ベクター（配列番号６）。
1        AGATCTCCAT CGAATGGCCA GATGATTAAT TCCTAATTTT TGTTGACACT CTATCATTGA
61       TAGAGTTATT TTACCACTCC CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAATGAAT AGTTCGACAA
121      AAATCTAGAA ATAATTTTGT TTAACTTTAT GATGGAGCA TACCATGGCC CACCACCACC
181      ACCACCACCA TATGATCACC TCTGCCCTGC ATCGCGCGGC TGATTGGGCG AAATCCGTCT
241      TCTCATCAGC GGCACTGGGC GACCCGCGGC GTACCGCGCG TCTGGTTAAT GTGGCGGCTC
301      AGCTGGCTAA ATACAGCGGG AAAAGTATTA CGATCAGTAG CGAAGGGTCA AAAGCGGCAC
361      AAGAAGGAGC ATATCGTTTT ATCCGCAATC CGAATGTCTC CGCCGAGGCC ATCCGCAAAG
421      CGGGCGCCAT GCAAACAGTG AAATTGGCAC AGGAATTCCC GGAACTGTTG GCCATTGAGG
481      ATACCACATC GCTTAGCTAT CGTCACCAAG TCGCAGAAGA ACTGGGAAAA TTAGGCTCTA
541      TTCAGGATAA ATCTCGTGGT TGGTGGGTGC ACTCTGTTTT ATTACTGGAA GCGACCACCT
601      TCCGTACCGT GGGGCTGCTG CATCAGGAAT GGTGGATGCG GCCAGATGAC CCAGCGGACG
661      CCGACGAAAA AGAATCTGGT AAATGGTTGG CGGCTGCGGC GACCTCGCGC CTCCGTATGG
721      GTTCCATGAT GAGCAACGTC ATTGCAGTGT GCGATCGCGA AGCTGATATT CATGCGTACC
781      TTCAGGATAA ACTGGCGCAC AACGAGCGCT TCGTCGTGCG CAGCAAACAT CCCCGTAAGG
841      ACGTCGAATC AGGTCTGTAT TTGTATGACC ATCTGAAAAA TCAGCCGGAA CTGGGAGGAT
901      ATCAAATTTC GATCCCGCAG AAGGGAGTCG TGGATAAACG CGGCAAACGT AAAAATCGTC
961      CAGCTCGCAA AGCCAGCTTG AGTTTGCGCA GCGGTCGTAT TACCCTCAAA CAGGGGAACA
1021     TTACCCTGAA CGCTGTACTC GCGGAGGAGA TCAATCCCCC CAAGGGCGAA ACACCGTTAA
1081     AATGGTTACT GTTAACATCT GAACCCGTTG AGAGTCTGGC TCAAGCACTG CGCGTGATCG
1141     ATATTTACAC CCATCGCTGG CGCATTGAAG AATTCCATAA AGCATGGAAG ACCGGCGCGG
1201     GCGCGGAACG CCAACGTATG GAAGAACCGG ATAACCTCGA ACGGATGGTC AGCATCCTGA
1261     GCTTTGTTGC GGTACGTCTG CTTCAGCTGC GTGAAAGCTT TACGCCACCG CAGGCGCTGC
1321     GCGCGCAGGG CCTCCTGAAA GAAGCGGAGC ATGTTGAGTC ACAGAGCGCA GAAACCGTTC
1381     TGACTCCCGA CGAATGTCAA CTCCTGGGCT ATCTGGACAA GGGGAAACGT AAACGTAAAG
1441     AGAAAGCAGG CAGCCTCCAG TGGGCATATA TGGCGATCGC ACGGTTAGGA GGCTTCATGG
1501     ACAGCAAACG TACGGGTATT GCGAGCTGGG GTGCGCTGTG GGAAGGCTGG GAAGCTTTGC
1561     AGAGTAAACT TGATGGTTTC TTAGCCGCGA AGGATCTGAT GGCACAGGGG ATTAAACTCG
1621     AGTAACGGAC GAACGCAAAC AAACGTGGAT CCTTCAGCTG TCTCTTATAC ACATCTGAAC
1681     TAGTTGTAGG CCTAAATTCG AACTGATCCT TCAACTCAGC AAAAGTTCGA TTTATTCAAC
1741     AAAGCCACGT TGTGTCTCAA AATCTCTGAT GTTACATTGC ACAAGATAAA AATATATCAT
1801     CATGAACAAT AAAACTGTCT GCTTACATAA ACAGTAATAC AAGGGGTGTT ATGAGCCATA
1861     TTCAACGGGA AACGTCTTGC TCTAGGCCGC GATTAAATTC CAACATGGAT GCTGATTTAT
1921     ATGGGTATAA ATGGGCTCGC GATAATGTCG GGCAATCAGG TGCGACAATC TATCGATTGT
1981     ATGGGAAGCC CGATGCGCCA GAGTTGTTTC TGAAACATGG CAAAGGTAGC GTTGCCAATG
2041     ATGTTACAGA TGAGATGGTC AGACTAAACT GGCTGACGGA ATTTATGCCT CTTCCGACCA
2101     TCAAGCATTT TATCCGTACT CCTGATGATG CATGGTTACT CACCACTGCG ATCCCCGGGA
2161     AAACAGCATT CCAGGTATTA GAAGAATATC CTGATTCAGG TGAAAATATT GTTGATGCGC
2221     TGGCAGTGTT CCTGCGCCGG TTGCATTCGA TTCCTGTTTG TAATTGTCCT TTTAACAGCG
2281     ATCGCGTATT TCGTCTCGCT CAGGCGCAAT CACGAATGAA TAACGGTTTG GTTGATGCGA
2341     GTGATTTTGA TGACGAGCGT AATGGCTGGC CTGTTGAACA AGTCTGGAAA GAAATGCATA
2401     AGCTTTTGCC ATTCTCACCG GATTCAGTCG TCACTCATGG TGATTTCTCA CTTGATAACC
2461     TTATTTTTGA CGAGGGGAAA TTAATAGGTT GTATTGATGT TGGACGAGTC GGAATCGCAG
2521     ACCGATACCA GGATCTTGCC ATCCTATGGA ACTGCCTCGG TGAGTTTTCT CCTTCATTAC
2581     AGAAACGGCT TTTTCAAAAA TATGGTATTG ATAATCCTGA TATGAATAAA TTGCAGTTTC
2641     ATTTGATGCT CGATGAGTTT TTCTAACACG ATATCGTCAA TTGCTAGATG TGTATAAGAG
2701     ACAGGCTGGA CAACGAGAGT AGTTACGTCC TAGG
[0105]単一突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（Ｐ４７Ｋ）を有する最小試験ベクター（配列番号７）。
1        AGATCTCCAT CGAATGGCCA GATGATTAAT TCCTAATTTT TGTTGACACT CTATCATTGA
61       TAGAGTTATT TTACCACTCC CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAATGAAT AGTTCGACAA
121      AAATCTAGAA ATAATTTTGT TTAACTTTAT GATGGAGCTA TACCATGGCC CACCACCACC
181      ACCACCACCA TATGAATAAT GCACAGTGGG CGAAATCGAC GTTTGGTCAG GCCGACCTCG
241      GGGACCCCCG TCGTACAACG CGTTTAGTCA AGCTTGCCGA AACACTTGCC AACGATCCGG
301      GGAAACCCTT TGTCTCGATT ACCCAGAGCA AAGCCGATAT GGAAGGTGCC TATCGTTTTA
361      TTCGCAATGA GCATGTGAAT GCTGATGCCA TTGCTAAAGC CGGCTACCTG GTGACCGCAG
421      CACAAGCTGC GAAGCATAAT CTGCTTCTGG CACTTGAAGA TACCACGGCC ATCACCTATT
481      CCCACCGCTC TGTGCGCGAT GAACTCGGCC ATGTTAACCA GGGTAATAAT TACCGTGGCA
541      TTCTTGCACA TTCCGTGCTG TTGTTTGCCC CGGAACAGCA AGAGCTGGTC GGACTGATTG
601      AACAGAGTCG CTGGACCCGT GATATTTCAA CCCGTGGCAA AAAGCATGTC CGTACACAAA
661      CTCCGTATGA AGAAAAAGAA AGCTTCAAAT GGCAGTCTGC TTCAGTTAAT CTGTCGGCAC
721      GTCTGGGCAC CAAAATGGCG GACGTCATCT CGGTTTGCGA TCGTGAGGCG GATATCTACG
781      AGTACCTGCA GTACAAACTG TCAAAACAGC ATCGTTTTGT AGTACGTAGT ATGCAGTCCC
841      GTCATATCGA GCAGTCCGAA CAGAAGTTGT ACGATTACGC CGCGGGTTTG GAATCGGCAG
901      GGCAGAAACA AATTCACATT GCGCAGAAAG GGGGCCGCAA GGCGCGTACC GCAACAGTCG
961      ACATTGTGTT TGCCCCGGTG ACTTTACAGG TGCCGGCGAA TAAACGTGGT GAATCCCTCT
1021     CGCTGTACTA CGTGGGCTGC GAAGAACGCG CTGATGATAA AAATGCTTTG AATTGGCACC
1081     TGCTGACCAC GGAACCCGTC CAATCAAAAG CGGACGCACT GAACATTATT CGCTACTATG
1141     AACACCGGTG GCTGGTCGAA GAATACCACA AAGCCTGGAA AACCGACGGT ACTGACATTG
1201     AGAACGCTCG CCTCCAAAGC AAAGACAACA TCGAGCGCTT GGTAACGATC TCGGCATTCA
1261     TCGCTGTTCG TATCGTCCAG CTGAAATTTG CCCGGGAACA ACCGGATGAA ATCAGTTGTG
1321     AACAAGTTCT TTCTCCGAAG GCATGGAAAT TACTGTGGAT TAAACGTGTG AGCCGCACGT
1381     TGCCGGATAC AGTGCCGTCT ATGAAATGGG CCTATACTGA ATTGGCTAAA CTGGGAGGGT
1441     GGAAAGATAC CAAACAGACC GGTAAAGCGA GTGTTAAGGT CCTCTGGCAG GGTTGGTTCA
1501     AACTGCAAAC AATCTTGGAA GGCTACGATC TTGCCAAATC CTTGGAAGCG GACTTGCTCG
1561     AGTAACGGAC GAACGCAAAC AAACGTGGAT CCTTCAGCTG TCTCTTATAC ACATCTGAAC
1621     TAGTTGTAGG CCTAAATTCG AACTGATCCT TCAACTCAGC AAAAGTTCGA TTTATTCAAC
1681     AAAGCCACGT TGTGTCTCAA AATCTCTGAT GTTACATTGC ACAAGATAAA AATATATCAT
1741     CATGAACAAT AAAACTGTCT GCTTACATAA ACAGTAATAC AAGGGGTGTT ATGAGCCATA
1801     TTCAACGGGA AACGTCTTGC TCTAGGCCGC GATTAAATTC CAACATGGAT GCTGATTTAT
1861     ATGGGTATAA ATGGGCTCGC GATAATGTCG GGCAATCAGG TGCGACAATC TATCGATTGT
1921     ATGGGAAGCC CGATGCGCCA GAGTTGTTTC TGAAACATGG CAAAGGTAGC GTTGCCAATG
1981     ATGTTACAGA TGAGATGGTC AGACTAAACT GGCTGACGGA ATTTATGCCT CTTCCGACCA
2041     TCAAGCATTT TATCCGTACT CCTGATGATG CATGGTTACT CACCACTGCG ATCCCCGGGA
2101     AAACAGCATT CCAGGTATTA GAAGAATATC CTGATTCAGG TGAAAATATT GTTGATGCGC
2161     TGGCAGTGTT CCTGCGCCGG TTGCATTCGA TTCCTGTTTG TAATTGTCCT TTTAACAGCG
2221     ATCGCGTATT TCGTCTCGCT CAGGCGCAAT CACGAATGAA TAACGGTTTG GTTGATGCGA
2281     GTGATTTTGA TGACGAGCGT AATGGCTGGC CTGTTGAACA AGTCTGGAAA GAAATGCATA
2341     AGCTTTTGCC ATTCTCACCG GATTCAGTCG TCACTCATGG TGATTTCTCA CTTGATAACC
2401     TTATTTTTGA CGAGGGGAAA TTAATAGGTT GTATTGATGT TGGACGAGTC GGAATCGCAG
2461     ACCGATACCA GGATCTTGCC ATCCTATGGA ACTGCCTCGG TGAGTTTTCT CCTTCATTAC
2521     AGAAACGGCT TTTTCAAAAA TATGGTATTG ATAATCCTGA TATGAATAAA TTGCAGTTTC
2581     ATTTGATGCT CGATGAGTTT TTCTAACACG ATATCGTCAA TTGCTAGATG TGTATAAGAG
2641     ACAGGCTGGA CAACGAGAGT AGTTACGTCC TAGG
[0106]野生型Ｔｎ５トランスポザーゼ（配列番号１７）。
1        MITSALHRAA DWAKSVFSSA ALGDPRRTAR LVNVAAQLAK YSGKSITISS EGSEAMQEGA
61       YRFIRNPNVS AEAIRKAGAM QTVKLAQEFP ELLAIEDTTS LSYRHQVAEE LGKLGSIQDK
121      SRGWWVHSVL LLEATTFRTV GLLHQEWWMR PDDPADADEK ESGKWLAAAA TSRLRMGSMM
181      SNVIAVCDRE ADIHAYLQDK LAHNERFVVR SKHPRKDVES GLYLYDHLKN QPELGGYQIS
241      IPQKGVVDKR GKRKNRPARK ASLSLRSGRI TLKQGNITLN AVLAEEINPP KGETPLKWLL
301      LTSEPVESLA QALRVIDIYT HRWRIEEFHK AWKTGAGAER QRMEEPDNLE RMVSILSFVA
361      VRLLQLRESF TLPQALRAQG LLKEAEHVES QSAETVLTPD ECQLLGYLDK GKRKRKEKAG
421      SLQWAYMAIA RLGGFMDSKR TGIASWGALW EGWEALQSKL DGFLAAKDLM AQGIKI
[0107]野生型トランスポザーゼと比較して変化した挿入バイアスを有する突然変異体トランスポザーゼを同定する既存の方法は、（１）複数の突然変異体トランスポザーゼを生成するステップ；（２）複数の突然変異体トランスポザーゼのうちの第１の突然変異体トランスポザーゼを宿主生物細胞に挿入するステップ；（３）第１の突然変異体トランスポザーゼにより媒介される少なくとも１０の転位を誘導するステップ；（４）第１の突然変異体トランスポザーゼの挿入バイアスを同定するステップ；および（５）第１の突然変異体トランスポザーゼとは異なる挿入バイアスを有する突然変異体トランスポザーゼが同定されるまで第２およびその後の突然変異体トランスポザーゼを用いてステップ（２）〜（４）を繰り返すステップを含み得る。第１、第２、およびその後の突然変異体トランスポザーゼが含む（１つまたは複数の）突然変異はその後に、突然変異体トランスポザーゼのそれぞれをシークエンシングすることにより特徴付けられる。ステップ（１）〜（４）を行うことは問題ではなく、様々な方法で達成することができる。ステップ１は標準的な遺伝子突然変異生成の方法論であり、ステップ２〜４は標準的なトランスポゾンベースの挿入突然変異生成（遺伝子ノックアウト）の方法論である。突然変異生成技術は十分に確立されている。突然変異生成はランダムであってもよく、またはトランスポザーゼ遺伝子中の特定の位置に特異的であってもよい。突然変異生成は、例えば、点突然変異、欠失および／または挿入の作製を含み得る。トランスポザーゼは典型的にトランスポゾンに組み込まれ、これはベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）内に通常位置する。ベクターは、標的宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株）中で機能する複製起点を有してもよいし、有しなくてもよい。トランスポゾン含有ベクターは次に、宿主を（例えば、トランスフェクションによりまたは電気的もしくは化学的コンピテント細胞を使用することにより）形質転換するために使用される。トランスポザーゼが宿主中に存在すると、トランスポザーゼは典型的に、天然のまたはクローニングされた人工的な発現シグナルから発現される。トランスポザーゼタンパク質は次にトランスポゾン末端配列と会合し、転位を開始させる。試験トランスポゾンは典型的に選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）を有する。ベクタードナーＤＮＡが複製できない場合、トランスポゾンおよびそのマーカーが転位により複製能力のある標的（異なる複製コンピテントプラスミドまたは染色体）に挿入されたクローンのみが選択条件（例えば、適切な抗生物質の存在）下で生存可能となる。これらの生存クローンは次に、トランスポゾン挿入バイアスに関して調べられる。これは、ハイブリダイゼーションキャプチャー、アンカードマルチプレックスＰＣＲ（２０１４、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０、ｐ１４７９〜１４８４）またはインバースＰＣＲ、およびその後のシークエンシングにより挿入部位を同定することにより行うことができる。十分な挿入部位が特徴付けられた場合、挿入部位コンセンサス配列を導出し、挿入バイアス（および元々の野生型からの可能な変動）を確立することが���きる。
【００６５】
[0108]現実的な制限はステップ（５）にある。非常に希少なクローンは、（影響なしまたは不活性の多くのクローンの中から）挿入バイアスが所望のように変化しているクローンである。これらの非常に希少なクローンを見出すために、著しく多くの数のクローンを例えば上記のステップ１〜４に記載されるようにスクリーニングしなければならない。挿入バイアスにおける差異のみならず、挿入バイアスにおける所望の変化について多数のクローンをスクリーニングすること（すなわち、ステップ５）を達成する現行の方法は、労働集約的であり、生来的に低いスループットであり、したがって、著しい時間および多くのリソースを犠牲にしても、多くの有用なクローンの同定を結果としてもたらす可能性は低い。
【００６６】
[0109]本開示の方法は、多数のクローンをスクリーニングしてトランスポザーゼにおける希少な突然変異を同定するための手段について長く求められていたが満たされていない必要性に対する解決策を提供する。詳細には、本開示は、十分な数のクローン、および十分な数の挿入事象がスクリーニングされるように並列的に多数の突然変異体トランスポザーゼをスクリーニングして、野生型と比較して異なるトランスポザーゼ活性および異なる挿入部位バイアスを示す突然変異体トランスポザーゼ（およびそれらが有する特定の突然変異）を同定する方法を提供する。さらには、本開示の方法は、野生型と比較して異なるトランスポザーゼ活性および／または異なる挿入部位バイアスだけでなく、野生型と比較して所望のトランスポザーゼ活性（例えば、活性亢進）および所望の挿入部位バイアス（例えば、低減した挿入部位バイアス）を示す突然変異体トランスポザーゼ（およびそれらが有する特定の突然変異）を同定するために使用されてもよい。
【００６７】
[0110]野生型トランスポザーゼについての挿入バイアスコンセンサスは、十分な数のトランスポゾン挿入部位を同定およびシークエンシングすることにより導出することができる。突然変異体トランスポゾンにより推進される転位からの十分な挿入部位のシークエンシングにより、その突然変異体についての挿入バイアスを同定し、トランスポゾンの野生型バージョンと比較することができる。挿入部位コンセンサスの導出およびそのトランスポザーゼの野生型バージョンと比較した任意の所与の突然変異体トランスポザーゼの挿入バイアスの同定は、同時または逐次的なものであってもよい。これらの手順が同時かつ同じスクリーニング実験において行われる場合、試料間の交差汚染が防止されなければならない。これらの手順が同時かつ同じスクリーニング実験において行われる場合、あらゆる挿入部位において、トランスポザーゼ全体および挿入部位の両方をシークエンシングして、いずれの野生型または突然変異体トランスポザーゼがいずれの部位において挿入を推進したかを同定することもまた重要である。この並列のスクリーニング方法は、各挿入部位（数十億であり得る）および各挿入部位（数十億であり得る）において挿入される各突然変異体トランスポザーゼを特徴付けるシークエンシング能力がある限り、数千の（または数百万もの）異なる突然変異体トランスポゾンの混合物を用いて行われてもよい。残念なことにそのような能力を欠いており、あらゆる挿入部位においてトランスポザーゼ遺伝子全体（約１．５ｋｂ）をシークエンシングするという要件はこのアプローチを制限する。
【００６８】
[0111]この問題を解決するために、トランスポザーゼのサイズにより課されるシークエンシング負担を低減させることができる。この目的のために、各突然変異体トランスポザーゼ遺伝子が短い（１５〜２５ｂｐ）一意識別子（ＵＩＤ）配列、またはバーコードでタグ化されるように突然変異体トランスポザーゼのライブラリーを生成することができる。各突然変異体と関連付けられているＵＩＤバーコードが公知であるように、転位実験における使用前にタグ化突然変異体ライブラリーがシークエンシングされれば、突然変異体トランスポザーゼを同定するためにシークエンシングする必要があるのはバーコードのみとなる。バーコードが転位後に挿入部位に隣接して現れるように配置されている場合、単一の短いシークエンシングリードはバーコードおよび挿入部位の両方をカバーし得る。現行のＮＧＳ方法論は、したがって、数億もの挿入ならびにそれらのそれぞれを推進した突然変異体トランスポザーゼが有する素性および突然変異に関する情報を伝え得る。
【００６９】
[0112]ＵＩＤバーコードを使用することにより、トランスポザーゼ自体を挿入部位に運ぶ必要すらなく、バーコードを挿入することのみが必要とされる。トランスポゾン末端配列により挟まれた領域の外側に位置する遺伝子からトランスポザーゼを発現させることができる。トランスポザーゼタンパク質はＥＳ−トランスポザーゼ複合体を形成し、介在領域の切除および他の場所への挿入を引き起こす。介在領域がＵＩＤバーコードを有する場合、それは新たな部位に転位される。
【００７０】
[0113]ＵＩＤ含有挿入部位を同定およびシークエンシングする必要がある。第１のステップは、転位が起こったクローンを同定および単離することである。原理的に、方法は、上記の「既存の」ステップ２〜４において記載したものと同じである。選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーもまたＵＩＤバーコードと共に新たな挿入部位に転位するように、ループ領域内の末端配列の間に位置することができる。ＵＩＤバーコードおよび各末端において末端配列で挟まれた選択可能なマーカーを含むこのＤＮＡ構築物は、移動可能で選択可能なバーコード領域と本明細書において称される。それは、機能のために別々のトランスポザーゼ遺伝子の発現を必要とする（図７）。
【００７１】
[0114]トランスポザーゼ突然変異体バーコード転位およびスクリーニングの基本的な方法論の概要を図８に示す。最初に、それぞれが移動可能で選択可能なＵＩＤに関連付けられている突然変異体トランスポザーゼのライブラリーが生成およびシークエンシングされる。宿主細菌がライブラリーを用いて形質転換され、各突然変異体トランスポザーゼが一過的に発現され、二量体複合体が形成され、移動可能な、選択可能なＵＩＤが切除されて染色体に挿入される。細菌はしたがって抗生物質抵抗性となり、選択することができる。各挿入部位およびバーコードが次にＮＧＳによりシークエンシングされる。多くの挿入部位が各バーコード（換言すれば、各突然変異体）についてシークエンシングされるので、挿入部位についてのコンセンサス配列を決定し、それを特定の突然変異体トランスポザーゼに関係付けることが可能である。
【００７２】
[0115]図８（パネル６）に示す例において、挿入部位の１つの末端のみがシークエンシングされる。これを達成するための方法を図９（Ａ）および図９（Ｃ）に示し、これらは、挿入部位の１つの末端を切除し、次にインバーションＰＣＲまたはハイブリッドキャプチャーのいずれかにより必要とされる領域を単離することを伴う。Ｔｎ５のトランスポザーゼについて、挿入は９ｂｐ反復を作製することが公知であるので、これはコンセンサスを生成するために十分である。しかしながら、ＴｎＡａ−Ｔｐｎは、間に様々な空間を伴う互い違いの切断を作製するようである。この場合、正しいアライメントを行うことができるように、挿入の両方の末端をシークエンシングする必要がある。
【００７３】
[0116]これを達成するための方法を図９（Ｂ）に示す。この事例では、挿入部位全体が切除されて環状化され、次に１つのアンプリコン上の両方の挿入末端を増幅するためにインバーションＰＣＲが適用され、次にシークエンシングされる。
転位機構およびタグメンテーション
[0117]現代の分子遺伝学の出現以来、挿入配列（ＩＳ）およびトランスポゾン（Ｔｎ、複雑な形態のＩＳ）は、主に遺伝子ノックアウトを作製するために、研究ツールとして大規模に使用されてきた。最近ではこれらのノックアウトシステムは精巧なものとなっており（例えば、Ｗｅｔｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  ｍＢｉｏ  ６：ｅ００３０６〜ｅ００３１５）、それらの使用はより多様なものとなっている（例えば、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３４：３２０〜３２３）。トランスポゾンならびにトランスポザーゼ（Ｔｐｎ）およびトランスポゾンＤＮＡ末端配列（ＥＳ）のようなそれらの成分は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の急速に進歩している分野において使用されており、ＮＧＳライブラリーを作製するためのトランスポザーゼの使用は、いまやよく確立された技術である。方法は、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（２００８）（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４２：２６９〜２８６；その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載および総説があるように、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｔｎ５−Ｔｐｎ）のような「カットアンドペースト機構」により作動する種類のトランスポザーゼを典型的に使用する（図１）。
【００７４】
[0118]「カットアンドペースト」による転位は、トランスポゾンまたはＩＳを挟む末端配列へのトランスポザーゼタンパク質の結合、および次に二量体複合体の形成を伴い、介在するＩＳ  ＤＮＡはループアウトされる。この複合体は次にドナー部位から切除されて、ＩＳ  ＤＮＡのループを有する遊離トランスポソーム（Ｔｓｏｍｅ）が形成される。トランスポソームは次にＤＮＡ標的部位に侵入してＤＮＡ標的部位は切断され、ＩＳループが挿入される。プロセスにおいて、切断がオーバーハング末端を伴う場合、反復した標的ＤＮＡの短い領域を挿入部位に作製することができ、Ｔｎ５の場合、９ｂｐオーバーハングが作製され、挿入部位の９ｂｐの反復がトランスポゾンを挟む。
【００７５】
[0119]この機構はＮＧＳライブラリーを作製するために以下の通りに適合させることができる：最初に、精製されたトランスポザーゼはＤＮＡ「アーム」を有しており、ＤＮＡ「アーム」は本質的に、切断型のトランスポゾン末端配列である。最終の活性複合体は二量体トランスポソームであり、これは、２つのトランスポザーゼおよび２つのＤＮＡ末端配列を含み、ＤＮＡ末端配列（すなわち、ＤＮＡ「アーム」はそれぞれ、２つの活性部位のそれぞれに金属イオン補因子（例えば、Ｍｇ２＋）を有する。
【００７６】
[0120]トランスポソームを標的ＤＮＡと接触させた時に、２つは通常の転位事象と同様に相互作用する。しかしながら、この場合、アームはループにより連結されないため、効果は標的ＤＮＡを切断することであり、この切断は、切断部位の端部の１つにそれぞれが融合したアームにより挟まれる（図２）。標的ＤＮＡはこうしてせん断末端において断片化およびタグ化（それゆえ「タグメンテーションされる」という用語）され、その後にこのＤＮＡはＮＧＳライブラリーに入れられる。
【００７７】
[0121]ＤＮＡの機械的せん断の後に、修復および断片末端へのタグの付加を伴うより伝統的なライブラリー作製方法の代わりにより単純な上記の方法を使用することができる。タグメンテーションの主な欠点は、トランスポソームによるせん断にはバイアスがあり、ある特定の配列において優先的に起こるということである（図３）。このバイアスは、トランスポザーゼライブラリー作製システムが使用された場合にシークエンシングデータの不均一な広がりを結果としてもたらす。対照的に、機械的せん断方法はバイアスをほとんど有さず、せん断は標的にわたりランダムに起こる。
【００７８】
[0122]その天然の方式で作動する親トランスポゾンでさえ、それが挿入される標的の配列においてバイアスを示す。天然のトランスポゾン転位および人工的なトランスポソームタグメンテーションは、同じトランスポザーゼタンパク質およびＤＮＡ末端配列を利用するので、類似のバイアスを示す。選好性は、少なくとも一部のレベルにおいて、標的における（場合により、トランスポザーゼ結合フットプリント内の）近接的に局所的な一次配列に依存する。
【００７９】
[0123]トランスポソームは二量体構造であるので、挿入部位のコンセンサス配列は通常、ある程度までパリンドロームである。各ＤＮＡアームの切断部位および挿入位置は挿入部位内でオフセットされるので、パリンドロームの中心は、各切断末端において反復される配列を含有する（図４Ａおよび図４Ｂ）。
突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ
[0124]Ｔｎ５トランスポザーゼの公知の突然変異および機能的な位置の要約はｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ４６７３１において見出すことができる。
【００８０】
[0125]Ｔｎ５トランスポザーゼのこれらの公知の突然変異および機能的な位置のうち、Ｔｎ５トランスポザーゼが分子ツールとして使用される時に最も多くの場合に利用されるという意味で恐らく最も重要なものとしては、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐが挙げられるがこれらに限定されない。組合せで、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐは、「活性亢進」Ｔｎ５トランスポザーゼを結果としてもたらすことができる（例えば、ＵＳ７，０８３，９８０を参照；その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。各突然変異は、分子ツールとしてトランスポザーゼに付与する利点において根本的に異なるが、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐは同じ原理で作動する。Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐは自己調節に逆らい、トランスポザーゼ活性の内在性阻害を緩和する。トランスポザーゼ活性の阻害は、通常、致死的なレベルの転位を防止するために、その天然の状況においてトランスポゾンの適格性にとって極めて重要な要件である。しかし、トランスポザーゼ活性の阻害は、トランスポザーゼが分子ツールとして使用される場合には欠点となる。
【００８１】
[0126]Ｅ５４Ｋは、元々の「標準」の他に、その後の活性亢進突然変異体において使用された。Ｅ５４Ｋは、トランスポザーゼによるトランスポゾン末端配列の認識を向上させる。
【００８２】
[0127]Ｍ５６Ａはトランスポザーゼサブユニットの活性に影響しないがむしろ、メチオニン残基の喪失は、発現中の内部翻訳開始部位からのＮ末端切断型のトランスポザーゼの産生を防止する。天然の発現系において、Ｎ末端切断型のトランスポザーゼは全長型のトランスポザーゼに結合して、不活性のヘテロ二量体を形成する。
【００８３】
[0128]Ｌ３７２Ｐは、ＣおよびＮ末端の相互作用（二量体化および末端配列結合を抑制する相互作用）を低減させることにより、より効率的な二量体化および末端配列結合を促進する。
【００８４】
[0129]本開示は、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６ＡおよびＬ３７２Ｐを含有する「活性亢進」型のＴｎ５トランスポザーゼ（「Ｔｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］」）を使用する。
トランスポゾンＡａ
[0130]本開示は他のトランスポザーゼを提供し、他のトランスポザーゼとしては、本明細書において「ＴｎＡａトランスポザーゼ、またはＴｎＡａ−Ｔｐｎ」と称される、Ｔｎ５トランスポザーゼに関するトランスポザーゼが挙げられるがこれに限定されない。ＴｎＡａ−ＴｐｎはＡｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｅｓｔｕａｒｉｉに由来し、例えば、ＮＧＳライブラリーを作製するために使用されてもよい。ＴｎＡａ−Ｔｐｎトランスポザーゼは、アミノ酸レベルで野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対して４２％の同一性を有する。
【００８５】
[0131]本開示は、単一突然変異または二重突然変異のいずれかを有する突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼを提供する。本開示の突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼの単一突然変異または二重突然変異は、Ｔｎ５トランスポザーゼのＥ５４ＫおよびＭ５６Ａ活性亢進突然変異（配列番号１によるＴｎ５トランスポザーゼのＥ５４ＫおよびＭ５６Ａ活性亢進突然変異のナンバリング）に機能的に対応し得る。これらの突然変異はそれぞれ、ＴｎＡａトランスポザーゼＰ４７ＫおよびＭ５０Ａ突然変異（配列番号２〜５のいずれか１つによるＰ４７ＫおよびＭ５０Ａ  ＴｎＡａトランスポザーゼ突然変異のナンバリング）である。Ｔｎ５トランスポザーゼのＬ３７２Ｐ突然変異に機能的に対応する突然変異は、この突然変異がＴｎ５トランスポザーゼにおいて見出されるドメインに対応するドメインをＴｎＡａトランスポザーゼは含有しないので、ＴｎＡａトランスポザーゼにおいて作製することができない。
【００８６】
[0132]Ｐ４７Ｋを含む単一突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼ（「ＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］」）は、ＮＧＳライブラリーを作製するために使用されているが、それはＴｎ５トランスポザーゼと比較して一部の別個の特徴を示す。最も著しくは、突然変異体および野生型ＴｎＡａトランスポザーゼの両方について、挿入部位バイアスは別個であるだけでなく、明確なコンセンサスを決定することは難しい。
【００８７】
[0133]コンセンサス配列をＴｎＡａトランスポザーゼ推進性の挿入について導出した場合、コンセンサス配列は最初の数塩基（−８〜＋２、図５）について鮮明に定義されたが、配列はその後に定義を失う。さらには、コンセンサス配列中にパリンドロームは見られない。
【００８８】
[0134]コンセンサス配列における乏しい定義および明確なパリンドロームの欠如は、ＴｎＡａトランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼよりも隆起の小さい標的結合の要件を有するためである可能性がある。Ｔｎ５トランスポザーゼは９塩基のずれた切断と共に標的を不変的に攻撃して挿入時に９塩基の反復を作製するようである一方、データは、ＴｎＡａトランスポザーゼは、その切断における９塩基のオフセットに限定されない可能性を指し示す。
【００８９】
[0135]図６において、Ａｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊｅｏｔｇａｌｉの全的にシークエンシングされたゲノムにおけるＴｎＡａの４つの天然の挿入部位を示す（受託番号ＡＨＴＨ０１０００００９、ＡＨＴＨ０１００００２０、ＡＨＴＨ０１００００２６およびＡＨＴＨ０１００００４１）。４つの天然の挿入部位のうち、１つの挿入部位のみが完全なＴｎ５様の９塩基の直接反復を作製する。他の３つの挿入部位は異なる長さであるか、または不完全である。そのような変動は、大きいスケールで反復された場合、挿入点（コンセンサス解析のアンカーとなる）を越えて不正確なコンセンサス配列を結果としてもたらす。
バーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）
[0136]バーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）の新規のハイスループット並列方法は、本明細書に記載されるように、および一部の実施形態では、実施例８および１２に記載されるように行われてもよい。活性亢進Ｔｎ５（配列番号１）は、参照トランスポザーゼとして使用されてもよい。活性亢進Ｔｎ５における突然変異に加えて突然変異を有するいくつもの構築物を生成することができる。突然変異体トランスポザーゼ領域およびバーコード化された移動可能領域を含むアンプリコンが、構築され、環状化され、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用されてもよい。活性のトランスポザーゼは、移動可能領域のＥ．ｃｏｌｉゲノムへの「ジャンプ」を触媒してカナマイシン耐性コロニーを結果としてもたらし得る。ゲノムＤＮＡは単離されてもよく、一部の例示的な実施形態では、ＵＩＤ（バーコード）およびゲノム挿入部位（ジャンプ部位）を含有するゲノムＤＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングレディーライブラリーが調製されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する前に、ＰａｃＢｉｏまたはバーコードとそれらの関連付けられるトランスポザーゼ配列との関連付けを確立するための他のロングリードシークエンシング技術を使用してライブラリーがシークエンシングされてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する前にライブラリー中に存在するバーコードもまた、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングを使用して、別々にシークエンシングされてもよい。
バーコードへの遺伝子型の効果的なマッピング
[0137]ＢＡＴＳ実験の解析の１つの実証における全体的な情報フローは３つのステップで機能する：
[0138]１．ロングリードＰａｃＢｉｏシークエンシングランからの遺伝子型バーコードデータＧを処理して、公知の配列を含有する構築物内からバーコードおよび遺伝子型をそれと同時に抽出する。このプロセスを遺伝子型セグメント化と称した。我々はｐｙｔｈｏｎにおいて正規表現を使用して公知の配列を認識し、それにより可変の遺伝子型およびバーコードを単離した。プロセスは反復的最適化であり、遺伝子型セグメント化のための正規表現におけるミスマッチ、挿入または欠失の許容される数を変化させることによりＧとＪ（ジャンプ部位セグメント化から；以下を参照）との間の重なり合うバーコードの数を最適化した。
【００９０】
[0139]２．ショートリードＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングランからのジャンプ部位データＪを処理して、公知の配列を含有する構築物内からバーコードおよびジャンプ部位（挿入部位）をそれと同時に抽出する。これもまた、反復的なセグメント化プロセスであった。この場合、我々は、公知の配列の構築物内からのセグメント化されたバーコードのみからなる第３のデータセットＢとの重なり合いを使用した。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する前にライブラリーからの切除されたバーコードをシークエンシングすることによりデータセットＢを生成した。Ｒ２から得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ挿入物の長さは１塩基対〜６０塩基対で異なった。モチーフ解析のために、少なくとも２０塩基対のＤＮＡ挿入物のみを使用することができ、カバレージ・サブサンプリング・バイ・ローカス（ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｓｕｂ−ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｂｙ  ｌｏｃｕｓ）アプローチ（ＣＳＳＬ）のために、より短いＤＮＡ挿入物を使用することができ、加えて、全長Ｒ１もまた後者の方法において使用することができる（後に議論する）。
【００９１】
[0140]３．遺伝子型データの処理。注意点は、ＰａｃＢｉｏにおけるようなロングリードシークエンシングは高度にエラープローンであるということである。我々は専用のポリッシングステップを使用して、ロングリードシークエンシングに特徴的な多量の挿入および欠失を取り除いた。このために、我々は、プログラムｃｌｕｓｔａｌを使用して、予測されるＴｎ５配列とのトランスポザーゼ配列のペアワイズアライメントを使用した。その後、典型的にポリヌクレオチド反復である全ての挿入を欠失させ、全ての欠失を「Ｎ」として補充した。バーコードの長さが２０塩基対となるように制御した。
【００９２】
[0141]４．遺伝子型バーコードおよびバーコードを介したジャンプデータセットの交差。注意点は、バーコードにおけるシークエンシングエラーは１つまたは複数のデータセットにおいてバーコードを認識不可能なものとし得るという点に存在する。編集距離またはレーベンシュタイン距離のアプローチはバーコードの重なり合いをわずかに改善させたが、バーコードの正確な重なり合いはデータセットＧとＪとのマッピングのために十分であった一方、多数のリードを前提とすれば距離ベースの方法はコンピューターにより実行可能でなかった。バーコード−遺伝子型の関連付けをバーコード−遺伝子型カウントマトリックスＢＧにおいて捕捉した。遺伝子型をジョイントコドン遺伝子型として定義し、これは、記載されるデータセットにおいて単一突然変異のみが標的化されたとしても、バックグラウンド遺伝子型と比較して任意の数の突然変異を有し得る遺伝子型を表すために使用される一般的用語である。ＢＧにおける行はバーコードを表し、列は遺伝子型を表す。遺伝子型のモチーフを定義するために、ＢＧにおける列（遺伝子型を表す）における各非０エントリーを使用して関連するバーコード（行識別子）を抽出した。各バーコードについて、それらのバーコードを有するジャンプデータＪにおける全てのリードを回収し、アライメントされたＤＮＡ配列パイルアップを作製し（２０塩基対）、モチーフを生成した。カバレージサブサンプリングのアプローチのために、バーコード化されたリード識別子を有するセグメント化されたＲ２ジャンプデータのＤＮＡ挿入物から生成されたアライメントされたｂａｍファイルにおけるデータは代わりに横断的であった。バーコードを次にマトリックスＢＧにおいてたどって、遺伝子型を得た。
【００９３】
[0142]５．注意点は、元々のバーコード多様性における低い複雑性に起因して単一のバーコードが複数の遺伝子型にマッピングされる可能性があるということに存在する。単一の遺伝子型にマッピングされるバーコード（純粋なバーコード）のみを抽出するために、好都合にマトリックスＢＧを使用した。同じ交差ステップ（ステップ４）を次に、純粋なバーコードのみに対して容易に行うことができる。
モチーフ間距離の解析
[0143]本開示のバーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）の方法は、突然変異体遺伝子型およびその好ましい挿入モチーフの両方に関する豊富な情報を同時に生成する。しかしながら、いくつもの態様は、切断バイアスの解析に適用される伝統的なモチーフベースの方法論を制限する。これらの各制限について、解析論における革新がこれらの方法の部分として開発されており、それは本明細書に記載される。
遺伝子型当たりの少数のジャンプはモチーフ間距離の統計解釈を必要とする
[0144]ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する突然変異体酵素の進化および選択を伴う研究において、ＤＮＡ切断部位の５’末端における組合せ配列モチーフの解析が典型的に強調される。位置重みマトリックスまたは位置頻度マトリックスの形態でのモチーフとしてのそのような部位の解析では、ゲノムカバレージバイアスのための代理としてこの５’バイアスが使用される。これらのマトリックスは次いで、Ｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：６）により記載されたものと類似の方式でバイアスプロットとして可視化することができる。第１の制限は、ＢＡＴＳ実験の超並列的性質に起因して、高い突然変異体ライブラリー多様性が、突然変異体当たりで得られるＤＮＡ挿入部位（ジャンプ部位）の数を制限する可能性があるということである。その結果は、５’バイアスモチーフとしての挿入部位の典型的な解析が、ゲノムへの少なすぎるジャンプ、すなわち、少なすぎるサンプリング事象の結果として、ヒトの目で区別するにはあまりに困難となるということである。異なるアプローチは、リードの数を組み込んだモチーフエントロピーを使用することである。しかしながら、異なるアプローチがＢＡＴＳ実験のために本明細書において提案され、これは、以下に記載されるように、適切な統計解釈と共に、モチーフ間のネットワーク距離のアプローチを使用する。
【００９４】
[0145]我々の研究において２つのトランスポザーゼのモチーフ間の距離は、ゲノムへのトランスポザーゼ突然変異体のジャンプの配列リードの位置頻度マトリックスから算出した。最初に、参照トランスポザーゼと試験トランスポザーゼとの間の位置１に「Ｃ」を有するリードの比率における絶対差分を算出する（図１７）。この算出を位置２〜２０について繰り返し、リード中の全２０の位置にわたる絶対差分を足し合わせる。類似の算出をヌクレオチド「Ｔ」、「Ａ」および「Ｇ」について行う。全２０の位置における４つ全てのヌクレオチドについての絶対差分を足し合わせ、２０で割ることにより位置当たりの平均差異を得る。この差異を距離またはモチーフ間距離と呼ぶ。本明細書において、距離スコアおよびモチーフ間距離という用語は交換可能に使用され得る。
【００９５】
[0146]モチーフ間距離は、比較における２つのモチーフのそれぞれにおける配列の数に依存するので、直接的に解釈することができない。我々は、シミュレートされたデータセットの補間と連結させて、算出された距離、および２つのモチーフのそれぞれにおけるリードの数（以下に記載される）を前提として、ｐ値についての平滑化ルックアップを提供するブートストラップ法を開発した。ブートストラップの結果を図１８に示し、これは、両方のモチーフにおける配列の数が距離に対して有する効果を実証する。
【００９６】
[0147]ｐ値を調べるために使用されるこの累積分布関数は確率密度関数から得られ、確率密度関数は、ランダムなバックグラウンドサンプリングにより経験的に生成された。実験のために、バックグラウンドゲノムをｋ−ｍｅｒ（本出願において２０塩基対）としてランダムにサンプリングし、各回にａおよびｂ配列と共に２つのパイルアップを収集し、プロセスを多くの回数繰り返し、各回においてａおよびｂと共に距離を保存した。その後に、距離をビンｄにビン化し、データを値ａ、ｂおよびｄおよびｃを用いて表に変換し、ｄは距離のビン、ｃはビンｄにおいて距離が観察された回数である。その後、カウントを確率ｐ、およびその後に累積的確率に変換した。例えば、０．９５より大きい距離スコア値を有意として解釈してもよい。
【００９７】
[0148]このアプローチにおける主要な注意点は、これもまた任意の所与の距離尺度をとることができる簡便なルックアップ機能を用いて、シミュレートされたデータを密にサンプリングされたデータセットに変換することであった。得られる距離の大きいダイナミックレンジに起因して、サンプリングは、より低い配列カウントａおよびｂに向かって密度を増した。おおよそのｐ値のルックアップを可能とするために十分に密であるサンプリングはしかしながら、コンピューターによる処理が困難であった。我々は代わりに、ｐｙｔｈｏｎ  ｓｃｉｐｙライブラリーにおける補間パッケージを使用して所与のａおよびｂ（ａ  ａｎ  ｂ）において距離−確率ドメインにわたり補間を行って、真のサンプリング値の間のより多くのデータポイントを生成した。これは、関連するｐ値を正確に得るために必要とされる必要とされるサンプリング密度を我々に提供した。次に、補間を再び使用して、ａ、ｂおよびｄをインプットとして用いてシミュレートされたデータのフィッティングを行って、ｐ値ｐへの容易なアクセスを可能とし、これは、数千のモチーフを伴う全対全の比較統計を可能とするために十分に迅速である。
【００９８】
[0149]ジャンプ部位バイアスを図で示す別の方法は、配列ロゴをプロットすることによる。各トランスポザーゼについてジャンプ部位ヌクレオチド配列バイアスを決定するために、ウェブサイト「ＷｅｂＬｏｇｏ３」（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｔｈｒｅｅｐｌｕｓｏｎｅ．ｃｏｍ／；Ｃｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４：１１８８〜１１９０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：６０９７〜６１００）を使用して、変種配列ロゴを生成した。各変種について各々のジャンプ部位を含有する複数の６０塩基対配列をこの目的のためにアライメントした。配列ロゴを図２０に示す。ヌクレオチド文字を含有する山の全体的な高さはその位置における配列保存を指し示し、山内のヌクレオチド文字の高さはその位置における各々のヌクレオチドの相対頻度を指し示す。この解析は、トランスポザーゼ変種−ＤＮＡ相互作用にとって重要なある特定のヌクレオチド位置および組成の重要性を強調する。しかしながら、バックグラウンドノイズに寄与するものから重要なヌクレオチド位置を分離するために、十分なジャンプ配列の検査が必要とされる。これは、より多く（１７７より多い）配列から構築された全ての他の変種におけるこのバックグラウンドシグナルの非存在と対照的に変種Ｅ１４６Ｃについて８６の配列から生成されたモチーフにおいて観察された低い全体的なバックグラウンドシグナルにより明確に示される（表Ｆを参照）。
ＢＡＴＳ実験からのデータのモチーフ間距離解析の代替としてのカバレージ・サブサンプリング・バイ・ロシ
[0150]別の制限は、精製されたＤＮＡのタグメンテーションの形態でのライブラリー調製の状況におけるように、５’−モチーフはカバレージバイアスの本質を十分に捕捉しない可能性があるということである。ライブラリー調製プロトコールにおける重要な目標は、標的化されるゲノムまたはトランスクリプトームの均一で完全なカバレージを得ることであり、５’バイアスは、ゲノムカバレージと単に部分的に関係付けられるもの、または単に審美的特徴に過ぎないとして見られ得る。また、単一の位置重みマトリックスとして、または単一の位置頻度マトリックスとしてのモチーフの表示は、平均化された結合強度関連のプロファイルを本質的に捕捉し、潜在的に可変の（１つまたは複数の）距離における隣接する塩基の結合尤度を十分に利用しない。マルコフモデルまたはニューラルネットワークのようなより複雑なモデルの使用は、より多くのリードを本質的に必要とし、モデルの順序と共に強くスケール変更して、限られたデータにおいて差異を検出するためのそれらの有用性をより低くする。ゲノムにわたるカバレージの点で結果を直接的に解釈できることが理想的である。数千の突然変異体が潜在的に並列でスクリーニングされ得るＢＡＴＳのような高度に多重化された実験においてゲノムにわたるカバレージは十分でないという事実は、低い配列リード数からのカバレージの直接的な標的化を効果的に除外して、モチーフ解析の代理の使用を結果としてもたらす。しかしながら、本開示は、ＢＡＴＳ実験からのジャンプのゲノム遺伝子座を使用することにより比較用ゲノムカバレージが実際にアクセス可能であることを示す。
【００９９】
[0151]カバレージ・サブサンプリング・バイ・ロシ（Ｃｏｖｅｒａｇｅ  Ｓｕｂ−Ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｌｏｃｉ；ＣＳＳＬ）は、適切な参照ゲノムへのトランスポザーゼジャンプ部位のシークエンシングされたゲノムＤＮＡ挿入物を最初にマッピングすることにより機能し、参照カバレージ分布として働く十分なカバレージを有する参照データセットＲの予測されるカバレージにゲノム遺伝子座を関連付ける。目的の試料データセットＳは、同じゲノム座標を使用することにより分布Ｒから効果的にサンプリングされる。効果的に、ゲノム遺伝子座は、参照遺伝子型Ｒからのデータを目的の試料遺伝子型Ｓにマッピングさせるための合理的な関連付けを作製する。参照遺伝子型Ｒは、例えば、通常のライブラリー調製実験、または市販の酵素を用いるタグメンテーションを使用するライブラリー調製においてタグメンテーションにおいて適用される野生型形態のＴｎ５トランスポザーゼであり得る一方、試料遺伝子型Ｓは、ＢＡＴＳまたは関連する実験における部位特異的突然変異生成またはランダム突然変異生成を起源とする突然変異体遺伝子型を指すことがある。各試料遺伝子型について、試料分布Ｓは、ゲノム遺伝子座を介して参照分布Ｒからサンプリングされ、その後に２つの分布ＲおよびＳは、統計的検定、例えば、１）平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、２）異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、３）他のパラメトリックまたはノンパラメトリック検定、４）形状差異の目視検査、５）パーセンタイルベースのメトリクス、例えば、親分布における平均カバレージの２５％未満においてサンプリングされた遺伝子座のパーセンテージ、または形状の差異を検出するための任意の他の方法を使用して比較される。このようにして、参照Ｒより良好にそれらの遺伝子座にアクセスできるまたはバックグラウンドＢトランスポザーゼがアクセスできる突然変異体が選択され得る。
【０１００】
[0152]方法における追加の柔軟性は、試料Ｓが互いに比較されてもよいということである。例えば、突然変異体試料Ｓ１は、Ｓ１が元々突然変異している野生型またはバックグラウンド遺伝子型Ｂに対して比較されてもよく、野生型またはバックグラウンド遺伝子型Ｂについての分布もまた、参照Ｒを使用してＣＳＳＬにより得られる。
【０１０１】
[0153]一例として、実施例１２におけるものと同じＢＡＴＳ実験からのデータに対してＣＳＳＬ解析を行い、その結果を図２１および図２２に指し示す。この実験において、参照遺伝子型Ｂはトランスポザーゼ活性亢進Ｔｎ５であり、参照データセットＢを結果としてもたらす。試料データセットＳは、活性亢進Ｔｎ５におけるものに加えてそれぞれが突然変異を有するＴｎ５突然変異体に由来する。統計的検定をＢとのＳの比較に対して行い、マン−ホイットニー検定およびコルモゴロフ−スミルノフ検定の両方についての結果として得られるｐ値を表Ｆに指し示す。図２１におけるデータは、２つの突然変異体、Ｗ１２５ＧおよびＧ２５１Ａ、ならびに参照活性亢進Ｔｎ５についてのデータを示す。２つのトランスポザーゼ突然変異体と関連付けられている移動可能エレメントは、活性亢進Ｔｎ５で生成される参照データセットＢでより低いカバレージを示す傾向があるゲノム中の遺伝子座に挿入された。参照トランスポザーゼＲ、またはバックグラウンドトランスポザーゼＢの低いカバレージを有する領域における向上したカバレージは、例えば、以下に記載するように、変種コーリングにおいて有益である。図２１および図２２におけるデータは、単に可視化の目的で、３つの３データポイントの平均の算出およびプロットにより平滑化した。
【０１０２】
[0154]同様に、突然変異Ｅ１４６Ａ、Ｅ１４６Ｃ、Ｅ１４６ＮおよびＥ１４６ＳについてのデータのＣＳＳＬ解析の結果を図２２に示す。Ｔｎ５の位置Ｅ１４６における特定の突然変異は、参照トランスポザーゼにより十分にカバーされたゲノム中の遺伝子座におけるゲノムへの優先的な挿入を結果としてもたらすことが図２２から明らかである。そのため、位置Ｅ１４６におけるこれらの突然変異はバイアスの増加を有する。これは、突然変異体の間のバイアスの差異およびこれがどのようにゲノムの低カバレージ領域対高カバレージ領域への挿入についてのトランスポザーゼ突然変異体の選好性に関連するかの決定におけるこの方法の有用性をさらに説明する。
【０１０３】
[0155]低カバレージ領域は、典型的に、変種コーラーについての証拠の欠如に起因して、ＳＮＰおよびインデルのような偽の変種コールの原因である。反対に、ゲノムにおける反復に起因して等しいマッピング品質を有する複数の位置を有するリードの不正確なアライメントもまた、そのような領域中の過度のカバレージの領域と相関して、アライメント由来のエラーの導入に起因する偽の変種コールを結果としてもたらし得る。そのような状況において、カバレージサブサンプリングは、高カバレージ領域中のカバレージの欠如を伴う突然変異体の選択に適する。サブサンプリングはまた、例えば、生物学的コード領域などの目的の領域のような最も関連する領域、変種コーリングについての標的遺伝子座のリスト、または任意の他の遺伝子座特異的な基準に制限される可能性がある。
【０１０４】
[0156]それゆえ、大きい数の遺伝子型を用いる超並列ＢＡＴＳ実験の間に得られるより低いリード数であっても、ゲノムカバレージは、モチーフ解析のための要件なしにアクセスされ得る。別の形態のＣＳＳＬにおいて、分布Ｒ、ＳおよびＢは、ＧＣ含量、より高次元のｋ−ｍｅｒ頻度、または遺伝子座の関数としての公知のＤＮＡ修飾パターンのような選択された記述的特徴に変換され得る。ゲノムレベルでのＧＣバイアスの点でライブラリー調製技術を比較することが一般的慣習である。ＣＳＳＬは、ＢＡＴＳ実験の間にＧＣ非バイアスの酵素について選択するための効果的な方法を提供する。
【０１０５】
[0157]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体が変化したＧＣバイアスを示すかどうかを確立する目的で、上記のＢＡＴＳ実験からのデータを解析した。参照トランスポザーゼ（活性亢進Ｔｎ５）および突然変異体についてのジャンプ部位（挿入部位）を参照ゲノムにマッピングし、１００ｂｐウインドウのＧＣ含量を算出した。図２３および図２４は、標的ＤＮＡのＧＣ含量の関数としての所与のトランスポザーゼの挿入の確率のプロットである。図２３は、２つの突然変異体および参照活性亢進Ｔｎ５についてのジャンプ部位データを示す。２つの突然変異体、Ｐ２１４Ｓ（配列番号２３）およびＧ２５１Ａ（配列番号２４）は、参照トランスポザーゼよりもより低いＧＣ含量について有意に増加した選好性を有する（ｐ値について表Ｇを参照）。Ｔｎ５突然変異体Ｇ２５１Ａが低ＧＣ遺伝子座について増加した挿入選好性を有することは、同じ突然変異体が図２１に指し示されるように低カバレージの遺伝子座である遺伝子座において挿入について増加した確率を有することの機序である可能性がある。
【０１０６】
[0158]図２４は、３つのＴｎ５突然変異体からのジャンプ部位データを示す。これらの３つの突然変異体、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６ＡおよびＥ１４５Ｓは、参照トランスポザーゼと比較して高ＧＣ遺伝子座への挿入のより高い確率を有する。平均および曲線形状における差異についてのそれぞれマン−ホイットニー検定およびコルモゴロフ検定を行い、ｐ値を表Ｇに指し示す。
定義
[0159]本開示の全体を通じて使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しなければ複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）への言及は複数のそのような方法を含み、「トランスポザーゼ」（ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）への言及は、１つまたは複数のトランスポザーゼおよび当業者に公知のその均等物への言及を含む、などである。
【０１０７】
[0160]本開示は、単離または実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を提供する。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドまたはタンパク質、またはその生物学的活性部分は、その天然に存在する環境において見出されるような該ポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常一緒にあるまたは相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。したがって、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により製造された場合に他の細胞材料および培養培地のいずれも実質的に含まず、または化学合成された場合に化学的前駆体および他の化学物質のいずれも実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの由来となる生物のゲノムＤＮＡ中で該ポリヌクレオチドに天然に隣接する配列（最適にはタンパク質をコードする配列）（すなわち、該ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの由来となる細胞のゲノムＤＮＡ中で該ポリヌクレオチドに天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。細胞材料を実質的に含まないタンパク質としては、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量）未満の汚染性タンパク質を有するタンパク質の調製物が挙げられる。本開示のタンパク質またはその生物学的活性部分が組換えにより製造される場合、最適には、培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または目的のタンパク質ではない化学物質を表す。
【０１０８】
[0161]本開示は、開示されるＤＮＡ配列の断片、変種、突然変異体（突然変異）およびこれらのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質を提供する。本開示の全体を通じて使用される場合、「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の部分またはアミノ酸配列の部分、およびそれゆえ、それによりコードされるタンパク質を指す。コーディング配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性、およびそれゆえ、本明細書に記載されるような標的ＤＮＡ配列に対するＤＮＡ認識または結合活性を保持するタンパク質断片をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードしないか、またはプロモーター活性を保持しない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、および本開示の全長ポリヌクレオチドまでの範囲内であり得る。
【０１０９】
[0162]本開示の核酸またはタンパク質は、最終のデスティネーションベクターにその後に集合させることができる標的ベクター中の単量体単位および／または繰返し単位を予備集合させることを含むモジュール式アプローチにより構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の繰返し単量体を含んでもよく、最終のデスティネーションベクターにその後に集合させることができる標的ベクター中の繰返し単位を予備集合させることによるモジュール式アプローチにより構築することができる。本開示は、この方法により製造されるポリペプチドの他に、これらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュール式アプローチで製造されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
【０１１０】
[0163]「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間、または２つのタンパク質の間）の特異的な非共有結合性相互作用を指す。そのような特異的結合は、天然の生物学的状況において起こるものを常にではないが通常反映する特定の構造モチーフの間の特異的な相互作用に通常基づく。
【０１１１】
[0164]「配列特異的結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的な非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。「配列特異的結合」という用語は、強くて狭い配列選好性に限定されず、多様なポリヌクレオチド標的において結合できるが一部について他よりも選好性を有する分子により示される弱い選好性も含む。そのような結合は、「半ランダム配列結合」または「バイアス付き配列結合」とも称され得る。
【０１１２】
[0165]「優先的に結合する」という用語は、標的ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）内の配列へのトランスポザーゼまたはトランスポソーム（活性または不活性）の結合の階層的順序を指す。本開示のトランスポザーゼまたはトランスポソーム（活性または不活性）はある特定の部位に優先的に結合するので、これらの優先される配列は代替的な配列よりも容易に占有される。これらの優先される配列は占有されるので、トランスポザーゼまたはトランスポソーム（活性または不活性）は、代替的な、優先されない配列により自由に結合する。飽和濃度において、トランスポザーゼまたはトランスポソーム（活性または不活性）は全ての利用可能な配列に結合するが、優先される部位が最初に占有される傾向がある。したがって、低濃度の本開示のトランスポザーゼまたはトランスポソーム（活性または不活性）において、最初に占有される配列は「優先的に結合される」。
【０１１３】
[0166]「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、組成物および方法が記載された要素を含むが、他を除外しないことを意味する意図である。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」は、意図する目的のために使用される場合に組合せに対して何らかの本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、微量の汚染物または不活性の担体を除外しない。「からなる」は、微量より多くの他の成分の要素および実体的な方法ステップを除外することを意味する。これらの各移行句により定義される実施形態は本開示の範囲内である。
【０１１４】
[0167]本明細書において使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。
【０１１５】
[0168]「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡもしくは任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物としてはまた、キャップ付加、ポリアデニル化、メチル化、および編集のようなプロセスにより修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボース化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質が挙げられる。
【０１１６】
[0169]非共有結合により連結された成分ならびに非共有結合により連結された成分の製造および使用の方法が開示される。様々な成分は、本明細書に記載されるような様々な異なる形態をとることができる。例えば、非共有結合により連結された（すなわち、作動可能に連結された）タンパク質は、当該技術分野における１つまたは複数の問題を回避する一時的な相互作用を可能とするために使用されてもよい。非共有結合により連結された成分、例えばタンパク質が、会合および解離する能力は、そのような会合が所望の活性のために必要とされる状況下でのみまたは該状況下で主に機能的な会合が起こることを可能とする。連結は、所望の効果を可能とするのに十分な継続時間のものであり得る。
【０１１７】
[0170]「結合部位」または「結合配列」は、結合のための十分な条件が存在すればトランスポザーゼ、ＤＮＡアダプター、および／またはトランスポソームが結合する核酸の部分を定義する標的核酸配列である。
【０１１８】
[0171]「コンセンサス配列」は、結合配列または結合部位の１つより多くのバリエーション中に存在する、結合のための十分な条件が存在すればトランスポザーゼ、ＤＮＡアダプター、および／またはトランスポソームが結合する核酸の部分を定義する標的核酸配列である。本開示のトランスポザーゼ、ＤＮＡアダプター、および／またはトランスポソームは第１の配列に結合することを好み得るが、その配列を含む全ての部位が占有されている場合、本開示のトランスポザーゼ、ＤＮＡアダプター、および／またはトランスポソームは第２の配列に結合することがあり、第１および第２の配列はコンセンサス配列を含む。例えば、第１および第２の配列をアライメントすると１つまたは複数の塩基が異なることがあるが、不変の残りの塩基はコンセンサス配列を含むことができる。
【０１１９】
[0172]「標的」および「インプット」ＤＮＡという用語は、本開示の全体を通じて交換可能に使用され得る。
【０１２０】
[0173]「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、共有結合により連結されて一緒になった少なくとも２つのヌクレオチドを指す。単一の鎖の描写はまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、描写された単一の鎖の相補鎖を包含することができる。本開示の核酸はまた、同じ構造を保持するか、または同じタンパク質をコードする実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。
【０１２１】
[0174]本開示の核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよい。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖である場合であっても二本鎖配列を含有してもよい。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖である場合であっても一本鎖配列を含有してもよい。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらのハイブリッドを含んでもよい。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組合せを含有してもよい。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンなどの塩基の組合せを含有してもよい。本開示の核酸は、非天然のアミノ酸修飾を含むように合成されてもよい。本開示の核酸は、化学合成法または組換え法により得られてもよい。
【０１２２】
[0175]本開示の核酸は、その配列全体、またはその任意の部分が天然に存在しないものであってもよい。本開示の核酸は、天然に存在しない１つまたは複数の突然変異、置換、欠失、または挿入を含有してもよく、それにより全体的な核酸配列は天然に存在しないものであってもよい。本開示の核酸は、結果として得られる配列が天然に存在しないものとなる、１つまたは複数の重複、逆位または反復配列を含有してもよく、それにより全体的な核酸配列は天然に存在しないものであってもよい。本開示の核酸は、天然に存在しない、修飾、人工、または合成ヌクレオチドを含有してもよく、それにより全体的な核酸配列は天然に存在しないものであってもよい。
【０１２３】
[0176]遺伝コードにおける重複性を考慮すると、複数のヌクレオチド配列が任意の特定のタンパク質をコードすることができる。全てのそのようなヌクレオチド配列が本明細書において想定される。
【０１２４】
[0177]本開示の全体を通じて使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、もしくはより多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたり第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
【０１２５】
[0178]本開示の全体を通じて使用される場合、「実質的に同一」という用語は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０もしくはより多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたり少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的であるかどうかを指す。
【０１２６】
[0179]本開示の全体を通じて使用される場合、「完全な相補性」という用語は、第１および第２の配列が、核酸デュプレックスの長さに沿って塩基のギャップおよびミスマッチのいずれもなしに互いにハイブリダイズすることを指す。例えば、第１および第２の配列は、ワトソン−クリック塩基対形成規則に従って完全な相補性で互いにハイブリダイズすることができる。
【０１２７】
[0180]本開示の全体を通じて使用される場合、「不完全な相補性」という用語は、第１および第２の配列が、核酸デュプレックスの長さに沿って１つまたは複数の塩基の１つもしくは複数のギャップおよび１つもしくは複数のミスマッチのいずれもなしに互いにハイブリダイズすることを指す。例えば、第１および第２の配列は、核酸デュプレックスの長さに沿って７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または間の任意のパーセンテージの互いにハイブリダイズする塩基と共に互いにハイブリダイズすることができる。
【０１２８】
[0181]本開示の全体を通じて使用される場合、核酸を記載するために使用される場合の「変種」という用語は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の部分もしくは断片；（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列もしくはその部分の相補体；（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）参照される核酸、その相補体、もしくはこれらと実質的に同一の配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を指す。
【０１２９】
[0182]本開示の全体を通じて使用される場合、ペプチドまたはポリペプチドを記載するために使用される場合の「変種」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを指す。変種はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味することができる。
【０１３０】
[0183]アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換は、小さな変化を典型的に伴うものとして当該技術分野において認識されている。これらの小さな変化は、当該技術分野において理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することにより、部分的に同定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５〜１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシー指数のアミノ酸を置換して、それでもなおタンパク質機能を保持することができる。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質を結果としてもたらす置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能とし、これは、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号明細書（参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１３１】
[0184]類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを結果としてもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行うことができる。アミノ酸の疎水性（ｈｙｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響される。その観察に合致して、生物学的機能が互換性のアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性により明らかにされるような、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存することが理解される。
【０１３２】
[0185]本明細書において使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、Ｂ、またはＣに示されるように定義することができる。一部の実施形態では、融合ポリペプチドおよび／またはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸による置換である。例示的な保存的置換を表Ａに示す。
【０１３３】
[0186]
【０１３４】
【表１】
2020534803.tif 000003
[0187]あるいは、保存的アミノ酸は、表Ｂに記載されるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９７５）、ｐｐ．７１〜７７）に記載されるように分類することができる。
【０１３５】
[0188]
【０１３６】
【表２】
2020534803.tif 000004
[0189]あるいは、例示的な保存的置換は表Ｃに示される。
【０１３７】
[0190]
【０１３８】
【表３】
2020534803.tif 000005
[0191]本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つまたは複数の挿入、欠失、または置換、または任意のこれらの組合せの他に、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を有するポリペプチドを含むことが意図されると理解されるべきである。本開示のポリペプチドまたは核酸は、１つまたは複数の保存的置換を含有してもよい。
【０１３９】
[0192]本開示の全体を通じて使用される場合、「１つより多く」の上述のアミノ酸置換という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０またはより多くの記載されるアミノ酸置換を指す。「１つより多く」という用語は、２、３、４、または５つの記載されるアミノ酸置換を指すことができる。
【０１４０】
[0193]本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、それらの配列全体、またはその任意の部分が天然に存在しないものであってもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在しない１つまたは複数の突然変異、置換、欠失、または挿入を含有してもよく、それにより全体的なアミノ酸配列は天然に存在しないものであってもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、結果として得られる配列が天然に存在しないものとなる、１つまたは複数の重複、逆位または反復配列を含有してもよく、それにより全体的なアミノ酸配列は天然に存在しないものであってもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在しない、修飾、人工、または合成アミノ酸を含有してもよく、それにより全体的なアミノ酸配列は天然に存在しないものであってもよい。
【０１４１】
[0194]本開示の全体を通じて使用される場合、「配列同一性」は、デフォルトのパラメーターを使用して、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ｆｔｐサイトから検索できる、２つの配列をブラスト解析するためのスタンドアローンで実行可能なＢＬＡＳＴ  エンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用することにより決定されてもよい（ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１９９９、１７４、２４７〜２５０；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。「同一の」または「同一性」という用語は、２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈において使用される場合、指定されたパーセンテージの残基が、各配列の指定された領域にわたり同じであることを指す。パーセンテージは、２つの配列を最適にアライメントし、指定された領域にわたり２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を指定された領域中の位置の総数により割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出することができる。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つもしくは複数のずれた末端を生成し、比較の指定された領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、算出の分子ではなく分母に含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等と考えることができる。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０のようなコンピューター配列アルゴリズムを使用することにより行うことができる。
【０１４２】
[0195]本開示の全体を通じて使用される場合、「内因性」という用語は、核酸またはタンパク質配列が、それが導入される標的遺伝子または宿主細胞と天然に関連付けられることを指す。
【０１４３】
[0196]全てのパーセンテージおよび比は、別に指し示さなければ、重量により算出される。
【０１４４】
[0197]全てのパーセンテージおよび比は、別に指し示さなければ、全組成物に基づいて算出される。
【０１４５】
[0198]本開示の全体を通じて与えられるあらゆる最大数値の限定は、下限数値の限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるそのような下限数値の限定を含む。本開示の全体を通じて与えられるあらゆる最小数値の限定は、上限数値の限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるそのような上限数値の限定を含む。本開示の全体を通じて与えられるあらゆる数値範囲は、より狭い数値範囲が本明細書に全て明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内に入るあらゆるそのようなより狭い数値範囲を含む。
【０１４６】
[0199]本明細書において開示される値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。そうではなく、別段の規定がなければ、各そのような値は、記載された値およびその値の周囲の機能的に同等の範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「２０μｍ」として開示される値は、「約２０μｍ」を意味することが意図される。
【０１４７】
[0200]任意の相互参照されるまたは関連する特許または出願などの、本明細書において参照されるあらゆる文献は、明示的に除外されるか、またはそれ以外に限定されなければ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。任意の文献の参照は、それが、本明細書において開示もしくは特許請求される任意の発明に関して先行技術であること、またはそれが単独で、もしくは任意の他の１つもしくは複数の参照との任意の組合せで、任意のそのような発明を教示、示唆もしくは開示していることを認めるものではない。さらに、この文献中の用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれる文献中の同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する場合、この文献中でその用語に割り当てられた意味または定義が優先される。
【０１４８】
[0201]本開示の特定の実施形態を実例により説明し、記載してきたが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく様々な他の変更および修飾を行うことができる。添付の特許請求の範囲における範囲は、本開示の範囲内である全てのそのような変更および修飾を含む。
【実施例】
【０１４９】
[0202]本明細書において開示される発明がより効率的に理解され得るように、実施例を以下に提供する。これらの実施例は、実例を挙げた説明の目的のものに過ぎず、いかなる意味でも本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきである。それ以外に記載する場合を除いて、これらの実施例の全体を通じて、標準的な組換えＤＮＡ、または他の分子生物学技術は、（１）ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、４ｔｈ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）、（２）商用キットおよび試薬の供給業者、（３）ウェブベースのプロトコールの集合、例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ｏｎ−Ｌｉｎｅ（ｐｒｏｔｏｃｏｌ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／）のいずれかにより記載される方法に従って実行した。それ以外に記載する場合を除いて、これらの実施例の全体を通じて、タンパク質発現、精製、アッセイおよび可視化および他の標準的なタンパク質製造技術は、商用キットおよび試薬の供給業者により推奨される方法に従って実行した。
【０１５０】
実施例１
転位試験アンプリコンの設計および構築
[0203]最終的な並列バーコード転位および（１つまたは複数の）スクリーニング実験において使用される最終構築物において必要とされる基本的な成分を図８のパート１および２に示す。しかしながら、基本的な方法論を試験および開発するために、初期ＤＮＡ構築物は、突然変異体トランスポザーゼまたはバーコードのいずれかを有する必要はない。代わりに、それぞれ個々に基づいて、野生型または限られた数の活性亢進トランスポザーゼを用いて事前の実験を実行したので、ＵＩＤは不必要である。これらの単純な初期型の組換えＤＮＡ構築物を「最小試験ベクター」と称する。さらなる単純化のために、構築物はクローニングおよび精製される必要はなく、ＰＣＲのみにより作製および維持されるＤＮＡ試験材料を使用して事前の試験を実行した。
【０１５１】
[0204]したがって、初期の異なる最小試験ベクターを直鎖状アンプリコンとして作製および維持した。それぞれ異なるトランスポザーゼを有する５つの異なる最小試験ベクターを構築した。構築物の１つは活性亢進型のＴｎ５トランスポザーゼ（突然変異Ｅ５４Ｋ  Ｍ５６Ａ  Ｌ３７２Ｐ、配列番号１）を有していた。他の４つの構築物は異なる型のＴｎＡａトランスポザーゼを有していた。１つ目は野生型トランスポザーゼ（配列番号２）であり、２つ目は２つの突然変異（Ｐ４７ＫおよびＭ５０Ａ、配列番号３）を有していた。残りの２つのトランスポザーゼはそれぞれ、単一突然変異（Ｍ５０Ａ、配列番号４、またはＰ４７Ｋ、配列番号５）のみを有していた。５つの構築物の全体構造を図１０に示す。
【０１５２】
[0205]活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼを有する最小試験ベクター全体の注釈付き配列（配列番号６）を図２５に示す。Ｔｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］遺伝子は、位置１６５〜１６７の開始コドンおよび位置１６２３〜１６２５の終止コドンと共に位置１６８〜１６２２にわたる。Ｅ５４Ｋ突然変異は位置３５１〜３５３にわたる。Ｍ５６Ａ突然変異は位置３５７〜３５９にわたる。Ｌ３７２Ｐ突然変異は位置１３０５〜１３０７にわたる。Ｔｅｔ−３５部位は位置５３〜５８にわたる。Ｔｅｔ−１０部位は位置６６〜７１にわたる。ＢｇｌＩＩ制限部位は位置１〜６にわたる。ＸｂａＩ制限部位は位置１２４〜１２９にわたる。ＮｃｏＩ制限部位は位置１６３〜１６８にわたる。ＢａｍＨＩ制限部位は位置１６４７〜１６５２にわたる。位置１６７９〜１７０２にわたるバーコードクローニング部位は、３つの制限部位、ＳｐｅＩ（１６７９〜１６８４）、ＳｔｕＩ（１６８８〜１６９３）、およびＡｓｕＩＩ（１６９７〜１７０２）を包含する。ＬＨＳ  ＥＳ部位は１６５８〜１６７６にわたる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ部位は位置１５４〜１５８にわたる。カナマイシン抵抗性遺伝子は、位置１８５１〜１８５３の開始コドンおよび位置２６５４〜２６５６の終止コドンと共に位置１８５４〜２６５３にわたる。ＲＢＳは位置１８４１〜１８４３にわたる。ＭｆｅＩ制限部位は２６７８〜２６８３にわたる。ＡｖｒＩＩ制限部位は位置２７２９〜２７３４にわたる。ＲＨＳ  ＥＳ部位は位置２６８６〜２７０４にわたる。さらに、図２５に示すプライマー配列を表Ｄに列記する。
【０１５３】
[0206]Ｐ４７Ｋ突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼを有する最小試験ベクター全体の注釈付き配列（配列番号７）を図２６に示す。ＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］遺伝子は、位置１６５〜１６７の開始コドンおよび位置１５６３〜１５６５の終止コドンと共に位置１６８〜１５６２にわたる。Ｐ４７Ｋ突然変異は位置３３０〜３３２にわたる。Ｔｅｔ−３５部位は位置５３〜５８にわたる。Ｔｅｔ−１０部位は位置６６〜７１にわたる。ＢｇｌＩＩ制限部位は位置１〜６にわたる。ＸｂａＩ制限部位は位置１２４〜１２９にわたる。ＮｃｏＩ制限部位は位置１６３〜１６８にわたる。ＭｌｕＩ制限部位は位置２５８〜２６３にわたる。ＢａｍＨＩ制限部位は位置１５８７〜１５９２にわたる。位置１６７９〜１７０２にわたるバーコードクローニング部位は、３つの制限部位、ＳｐｅＩ（１６１９〜１６２４）、ＳｔｕＩ（１６２８〜１６３３）、およびＡｓｕＩＩ（１６３７〜１６４２）を包含する。ＬＨＳ  ＥＳ部位は１５９８〜１６１６にわたる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ部位は位置１５４〜１５８にわたる。カナマイシン抵抗性遺伝子は、位置１７９１〜１７９３の開始コドンおよび位置２６０４〜２６０６の終止コドンと共に位置１７９４〜２６０３にわたる。ＲＢＳは位置１７８１〜１７８３にわたる。ＭｆｅＩ制限部位は２６１８〜２６２３にわたる。ＡｖｒＩＩ制限部位は位置２６３６〜２６４１にわたる。ＲＨＳ  ＥＳ部位は位置２６２６〜２６４４にわたる。さらに、図２６に示すプライマー配列を表Ｄに列記する。
【０１５４】
[0207]最小試験ベクターの構成要素を標準技術により作製し、全長ベクターをＰＣＲにより集合させた。プライマーペアＴＰＣＲ−２−ＦおよびＴＰＣＲ−１−Ｒ（以下の表Ｄの他に、上記の配列番号６および７を参照）を使用するＰＣＲによりベクターのストックを作製した。配列をサンガーシークエンシングにより確認した。
【０１５５】
[0208]
【０１５６】
【表４】
2020534803.tif 000006
[0209]初期の構築の試みにおいて、２つの突然変異（Ｐ４７ＫおよびＭ５０Ａ）を有するＴｎＡａトランスポザーゼを有する最小試験ベクターはまた、単一塩基欠失突然変異を有していた。正しいベクターを後に作製したが、初期試験（以下）からの結果は、したがって、この構築物を含まない。
【０１５７】
実施例２
直鎖状アンプリコンを用いた初期の形質転換および転位試験
[0210]５つの異なる最小試験ベクターアンプリコンをＰＣＲにより作製した。増幅は、プライマーペアＴＰＣＲ−２−ＦおよびＴＰＣＲ−１−Ｒ（表Ｄの他に、上記の配列番号６および７を参照）ならびに以下のサイクリングプロファイル：
４℃、保持／９５℃、２分／（９８℃、３０秒／５８℃、３０秒／７２℃、２分）Ｘ２０／４℃、保持
を使用して、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｉＦｉポリメラーゼを用いて行った。
【０１５８】
[0211]ＱＩＡｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ生成物を精製し、分光法により定量化し、−２０℃で貯蔵した。
【０１５９】
[0212]Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂへのエレクトロポレーション用の最小試験ベクターアンプリコンを調製するために、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーンキット（＃５）を使用して試料をさらに精製した。各場合に１μｇの試料をロードし、これを最終的に３０μＬの超純水中に溶出した。図１１に示すように、アガロースゲル上で５μｌ（約１７０ｎｇ）を分離することにより試料の完全性を確認した。
【０１６０】
[0213]２０μｌのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を１ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベット中のＤＮＡ（３３ｎｇの最小試験ベクターまたは１ｎｇの対照ｐＥＴ２９プラスミドのいずれか）に加え、２０Ｋｖ、２００オーム、２５μＦでパルスした。時間定数は５．５〜５．７で変化させた。５００μｌのＳＯＣを加えた後、細胞を３７℃で５０分間インキュベートした。次に、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ寒天に非希釈の試料（１００μｌ）をプレーティングした。ペトリ皿を終夜３７℃でインキュベートした後、プレートをコロニー数についてスコア付けした。
【０１６１】
[0214]ｐＥＴ２９プラスミド対照の場合にのみ、コロニーが観察された。
【０１６２】
実施例３
環状化アンプリコンを用いた初期の形質転換および転位試験
[0215]上記のように、最小試験ベクターが移動可能な、選択可能な領域をＥ．ｃｏｌｉの染色体に効果的に送達しないことは、アンプリコンが細胞に入る時に損傷しているという事実に起因している可能性がある。そのような損傷は、エキソヌクレアーゼの攻撃によりアンプリコンの末端において十分に起こり得る。あるいは、または加えて、直鎖状ＤＮＡは、環状ＤＮＡほどは効率的にＥ．ｃｏｌｉを形質転換しない可能性がある。これらの可能性に対処し、プラスミドＤＮＡを伴う伝統的な形質転換をより近く模倣するために、最小試験アンプリコンを環状化させる効果を形質転換前のライゲーションにより試験した。
【０１６３】
[0216]Ｔｎ５トランスポザーゼ［ハイパー］およびＴｎＡａトランスポザーゼ［Ｍ５０Ａ］を有する最小試験ベクターを再びＰＣＲにより作製した。前回と同様に増幅はプライマーペアＴＰＣＲ−２−ＦおよびＴＰＣＲ−１−Ｒ（表Ｄの他に、配列番号６および７）を使用して行ったが、今回はＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２Ｇ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｒｅａｄｙｍｉｘおよび以下のサイクリングプロファイル：
４℃、保持／９５℃、２分／（９８℃、３０秒／５８℃、３０秒／７２℃、２分）Ｘ１５／４℃、保持
を用いた。
【０１６４】
[0217]加えて、トランスポザーゼ成分を欠き、移動可能なカナマイシン領域のみ（１１１７ｂｐの断片、上記の配列番号６におけるヌクレオチド１６１７〜２７３４）を含むより短いバージョンの最小試験ベクターを作製した。これもまた、ＴＰＣＲ−２−ＦプライマーをＴＰＣＲ−３−Ｆ（表Ｄ、上記の配列番号６）で置き換えた以外は上記と同様に２Ｇ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｒｅａｄｙｍｉｘおよび全長鋳型を使用してＰＣＲ増幅により行った。
【０１６５】
[0218]全ての場合にアンプリコンをＴＢＥアガロースゲル上で分離し、ＱＩＡｇｅｎゲル精製キットを使用して精製した後、分光法により定量化した。２Ｇ  Ｒｏｂｕｓｔは３’−Ａ−オーバーハングを残すことができるので、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｉＦｉポリメラーゼ（０．５ＵのＨｉＦｉ、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、２５μｌ中、７２℃、５分間）を使用してオーバーハング末端を平滑末端に変換した。平滑末端化したＰＣＲ生成物をＱＩＡｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。完全性をＴＢＥアガロースゲル（図１２Ａに示す）上で確認し、試料をデンシトメトリーにより定量化した。試料濃度は４０〜１００ｎｇ／μｌであった。
【０１６６】
[0219]ライゲーションによるアンプリコンの環状化を可能とするために、５’末端をリン酸化する必要がある（ＰＣＲプライマーはリン酸化されていなかった）。これは、２０μｌの反応液中１０μｌ（４００〜１０００ｎｇ）のアンプリコンＤＮＡを使用して、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓポリヌクレオチドキナーゼを使用して行った。この後に、１０μｌ（２００〜５００ｎｇ）のリン酸化されたアンプリコンを、標準的な（迅速でない）リガーゼ緩衝液中でＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓリガーゼを使用して２０μｌの反応中でセルフライゲートさせた。ライゲーションは１６℃で終夜行った。リン酸化処理を行っていない同等の量（５μｌ、２００〜５００ｎｇ）の同じアンプリコンを同様にライゲートさせた。ライゲーションの５μｌの試料（５０〜１２５ｎｇのＤＮＡ）をアガロースゲル（図１２Ｂに示す）上で分離し、それにより、アンプリコンの一部が環状化され、一部が連結して多量体複合体を形成していることが確認された。Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーンキット（＃５）を使用して残りのライゲーション混合液をさらに精製し、１２μｌの超純水中で溶出させて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂの形質転換のための調製を行った。
【０１６７】
[0220]形質転換は、本質的に以前（実施例３）に記載された通りに行ったが、３μｌの精製ライゲーション混合液を使用し（精製中に起こり得る喪失に起因して最終濃度は不明）、形質転換細胞を３７℃で３時間インキュベートした後、移動可能領域の転位が起こり得る期間を最大化するために１５０μｌのアリコートをプレーティングした。
【０１６８】
[0221]ＴｎＡａトランスポザーゼ［Ｍ５０Ａ］を有する最小試験ベクター、および短縮型の移動可能なカナマイシン領域のみのベクターの両方の場合、わずかなコロニーのみが見られた（平均５個／プレート）。これらは恐らく、不規則的な組換え推進性の挿入事象を表す。対照的に、Ｔｎ５トランスポザーゼ［ハイパー］を有する最小試験ベクターを用いた形質転換は、多過ぎてカウントできないコロニーを結果としてもたらし、転位が起こったことを指し示した。多くの数のコロニーは、部分的に、プレーティング前の長期（３時間）のインキュベーションの間に起こった可能性がある細胞分裂に起因し得ることを留意すべきである。
【０１６９】
[0222]Ｍ５０Ａ型突然変異は細菌中での活性二量体の発現のレベルで作用することが公知であるので、ＴｎＡａトランスポザーゼ［Ｍ５０Ａ］を有する最小試験ベクターが識別可能な数の転位事象を生成しないことは予想外ではなく、発現はこの場合に限定的でない可能性がある。代わりに、活性増進性の突然変異Ｐ４７Ｋが必要とされる可能性がある。
【０１７０】
[0223]Ｐ４７Ｋ突然変異体バージョンを使用した場合にＴｎＡａトランスポザーゼ推進性の転位が検出可能なレベルまで増加し得るかどうかを試験するために、そのバージョンのトランスポザーゼを有する最小試験ベクターを用いて実験を繰り返した。この実験において３つの最小試験ベクターを比較し、それらは、Ｔｎ５からの活性亢進トランスポザーゼ、ＴｎＡａからの野生型トランスポザーゼ、およびＴｎＡａからのＰ４７Ｋ突然変異体トランスポザーゼを有していた。
【０１７１】
[0224]実験は本質的に以前と同様であったが、以下の特定の詳細を用いた：最小試験ベクター鋳型ＤＮＡの新たなワーキングストックを作製した。増幅は以前のようにＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｉＦｉを用いて行い、増幅されたＤＮＡを０．７５％のＴＢＥアガロースゲル上で分離し、ＱＩＡｇｅｎゲル精製キットを使用して適切なアンプリコンを単離した。ＤＮＡを分光法により定量化し、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ  ８．０）中−２０℃で貯蔵した。
【０１７２】
[0225]以前のように２５μｌの反応液中で鋳型（１００〜２００ｎｇ）としてワーキングストックを使用してＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｉＦｉポリメラーゼを用いて実験試料を増幅させた。ＱＩＡｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを使用して試料を精製し、以前のように定量化を行った。この場合、平滑末端化は必要とされなかったので、各ＤＮＡ試料を５０ｎｇ／μｌの最終濃度で直ちにリン酸化した。次に、以前のように、この１０μｌ（５００ｎｇ）を２０μｌの最終体積でセルフライゲートさせた後、精製した。
【０１７３】
[0226]形質転換は上記に記載した通りであったが、形質転換細胞を３７℃で１時間インキュベートした後、プレーティングした。プレーティング前の細胞分裂に起因するコロニー数の増加の可能性を最小化するために発現時間を低減させた。１００μｌの非希釈および５０μｌの１：１０希釈の両方の試料をプレーティングした。
【０１７４】
[0227]野生型ＴｎＡａトランスポザーゼを有する最小試験ベクターの場合、わずかなコロニーのみが見られた（非希釈試料で平均４７個／プレート）。対照的に、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼを有する最小試験ベクターおよびＰ４７Ｋ突然変異体ＴｎＡａトランスポザーゼを有する最小試験ベクターの両方での形質転換は、それぞれ１１２および６３コロニー／プレートの１：１０希釈試料からの平均数を与えた。このことから、我々は、これらの２つの場合に、総形質転換混合物において１．２ｘ１０４および０．６ｘ１０４の転位事象が捕捉されたと算出する。
【０１７５】
実施例４
試料調製、形質転換および転位を向上させる方法
[0228]本明細書に記載される挿入部位スクリーニング実験は理想的には多数の転位事象が捕捉されることを必要とする。さらには、これらのそれぞれは、特定のＵＩＤタグ化移動可能領域と組み合わせてのみ作用する単一突然変異体トランスポザーゼにより推進されるべきである。可能な限り、無関連のトランスポザーゼとＵＩＤバーコード化領域とのクロストークは回避されるべきである。そのような交差反応性は、２つの異なる構築物が同時に同じ細菌宿主を形質転換させる場合に起こり得る。これは、例えば、ＰＣＲまたはライゲーションステップの間に異成分マルチマーを形成することにより、２つの異なる構築物が形質転換前に連結されていなければ、乏しい可能性であると考えることができる。
【０１７６】
[0229]細菌の形質転換またはその後の転位の数および効率を向上させる方法論における任意の変更は有用な改善である。同様に、交差反応の可能性を低減させる任意の改善は有益である。
【０１７７】
[0230]プロセスに行われる改善を以下に記載する：
[0231]ＰＣＲ由来の欠陥のある構築物が含まれる可能性を低減させるために、ゲル精製ステップを直鎖状ベクターの最初の増幅の直後に組み込み、これは、その後のステップのために正しいサイズの選択的なＤＮＡ回収を可能とする。
【０１７８】
[0232]環状化におけるライゲーション効率を向上させるために、同じ制限部位（例えば、オーバーハング末端を生成する制限部位）を含むように両方の増幅プライマーのステップを改変した。増幅およびゲル精製後に、ＰＣＲ生成物を制限酵素で消化した後、精製する。その後、環状化はより効率的となり、その理由は、オーバーハング化適合性末端はライゲーションを促進するからである。そのようなプライマーペアの例は、プライマーＴＰＣＲ−２ＲＥＥｃｏ−ＦおよびＴＰＣＲ−１ＲＥＥｃｏ−Ｒ（表１に示すＴＰＣＲ−２−ＦおよびＴＰＣＲ−１−Ｒの改変型）である。
【０１７９】
[0233]ライゲーション後に残っている直鎖状の分子を取り除くために、試料をエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩで消化するステップを組み込んだ。
【０１８０】
[0234]ライゲーション由来の多量体構築物が含まれる可能性を低減させるために、ライゲーションの直後にゲル精製ステップを組み込んだ。結果として、環状の単量体分子のみが単離および精製され、かつ／または濃縮された環状の単量体分子がその後の形質転換のために使用される。
【０１８１】
[0235]これらの追加のステップのうちの１つまたは複数を任意の組合せで使用して、本開示の方法を最適化することができる。
【０１８２】
実施例５
挿入部位の単離および予備シークエンシングの初期試験
[0236]挿入部位の単離の予備試験を行うために、移動可能領域の転位が起こった限られた数のクローンをプールし、挿入部位を増幅させ、少数の場合には、クローニングおよびシークエンシングした。２つのプールを試験した。１つの場合ではプールは５つの個々のクローンを含有し、第２の場合には８０のクローンがあった。両方の場合において、転位はＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］により推進し、クローンは実施例３および４に記載されるように生成した。
【０１８３】
[0237]小さいプールを作製するために、５つのコロニーを爪楊枝で取って単一のＬｕｒｉａブロス培養物（カナマイシン３０ｕｇ／ｍｌ）に入れ、終夜培養し、遠心分離でペレット化した後、ゲノムＤＮＡの単離のために使用した。より大きいプールのために、８０のコロニーを有するペトリ皿の寒天の表面から直接的にコロニーを回収した。これらを擦り取って、ペトリ皿に加えた１ｍＬのＬｕｒｉａブロスに入れ、細胞の均質混合物を作製した。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＤＮＡを単離した。両方の場合に、Ｓｉｇｍａ  ＧｅｎＥｌｕｔｅ細菌ゲノムキットを使用してゲノムＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ細胞から単離した。
【０１８４】
[0238]本質的に図９（Ｂ）に概説されるように、挿入部位の両方の末端のシークエンシングを可能とするインバーションＰＣＲの方法論により挿入部位を次に単離した。
【０１８５】
[0239]詳細には、互いに適合性のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中で５つの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの混合物を用いて１μｇのゲノムＤＮＡを消化した。消化は２０Ｕの各酵素で８０μｌの最終体積で行い、３７℃で終夜インキュベートした。これらの制限酵素のいずれも移動可能領域配列内で切断せず、したがって、挿入部位周囲のゲノムＤＮＡ内でのみ消化する。消化したＤＮＡをＺｙｍｏ  ＤＮＡクリーンキット（＃５）を使用して精製した後、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｉＦｉポリメラーゼ（０．５ＵのＨｉＦｉ、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、２５μｌ中、７２℃、５分間）を使用してオーバーハング末端を補充および平滑化した。以前のようにＺｙｍｏキットを用いてＤＮＡを精製した後、分光法により定量化した。濃度は、５および８０コロニープールについてそれぞれ１０．３ｎｇ／μｌおよび１５．３ｎｇ／μｌであった。
【０１８６】
[0240]これに続いて、標準的なリガーゼ緩衝液中でＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓリガーゼを使用して異なる体積（０．１〜５μｌ）のＤＮＡを１０μｌの反応液中でセルフライゲートさせた。ライゲーションは１６℃で終夜行った。次に、全ての１０μｌのライゲーション混合液を最終の１２５μｌ反応体積（０．６２５Ｕのロングレンジ酵素、１．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー）に直接的に入れて、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅ  ＰＣＲキットを使用してインバーションＰＣＲを実行した。使用したプライマーはＫａｎ−ＡＦおよびＩＰＣＲ−Ｒ（表Ｄならびに配列番号６および７）であった。増幅サイクルは以下の通りであった：
４℃、保持／９４℃、３分／（９４℃、１５秒／５７℃、２０秒／７２℃、３分）Ｘ３０／４℃、保持。
【０１８７】
[0241]インバーションＰＣＲ後に１０μｌの生成物をアガロースゲル（図１３）上で可視化した。複数の生成物バンドが得られ、より多くの開始コロニー数を用いることでより多くの種類が作製されることが分かる。初期ライゲーションにおける少量のＤＮＡは、ゲル上にほとんど「にじみ」がないきれいなバンドを結果としてもたらす。より少ないサイクル数でのより多い初期ＤＮＡレベルは類似の結果を与える可能性がある。
【０１８８】
[0242]Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーンキット（＃５）を使用してインバーションＰＣＲの生成物を精製した後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターおよびクローニングキットを使用してクローニングした。このために使用したインバーションＰＣＲ生成物は、５および８０コロニープールについてライゲーション混合液中それぞれ０．５μｌおよび０．１μｌの消化した標的ＤＮＡを利用した増幅からのものであった（図１３、レーン３および８）。
【０１８９】
[0243]個々のコロニーをペトリ皿から採取し、これらをＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２Ｇポリメラーゼ、および元々のインバーションＰＣＲのために使用したものと同じプライマー（Ｋａｎ−ＡＦおよびＩＰＣＲ−Ｒ、表Ｄ、配列番号６および７）を使用するコロニーＰＣＲに供した。増幅産物を分離し、アガロースゲル上で可視化して、いくつもの異なるサイズの生成物の区別を可能とした。プラスミドＤＮＡをこれらのクローンから単離し、ＤＮＡをプライマーＩＰＣＲ−ＦおよびＩＰＣＲ−Ｒ（表Ｄ、配列番号６および７）を使用するサンガーシークエンシングに供した。これにより、９つ（５および８０コロニープールからそれぞれ３つおよび６つ）の完全な挿入部位の性質を確立した。挿入部位を図１４に示す。
【０１９０】
[0244]９つのうち、４つの挿入事象のみが９塩基反復を作製した。３つは１０塩基反復であり、８および１１塩基反復も１つずつあった。コンセンサス挿入部位を生成するために、右手および左手の両方の切断部位においてアライメントを固定し、中央にスペースを挿入することによる補完により差異を考慮した。データベース由来の配列およびそれらの反転相補体を使用してコンセンサスを生成し、これは、鎖選択に起因する任意の見かけのバイアスに対抗するためであった。より多くの数の挿入物部位が解析される場合、これは必要ないはずである。結果は、特に反復領域の境界からの位置−２、−３および−４（パリンドロームの左側）において高度にバイアスされた挿入部位を示す。この実験において、それらの位置におけるバイアスは、図５に示すように、タグメンテーション反応について各位置においておおよそ４０％のＣであったのと比較して、ＣＣＣについて１００％であった。より著しいバイアスは、トランスポザーゼは、見境ない転位を促進するように設計された緩衝液、温度、および補因子を含む人工的な環境ではなく、トランスポザーゼが活性を厳格に制限するように進化したその天然の環境において作用するという事実に起因し得る。さらには、低濃度（単一のトランスポソーム／細胞）、および場合により、トランスポソームが分解前に存在する可能性がある短い期間もまた、極度のバイアスを促進する可能性がある。
【０１９１】
実施例６
検証される出発材料の構築
[0245]上記した初期の概念実証実験では、ＰＣＲにより集合および維持された最小試験ベクターが利用された。そのため、ワーキングストックおよび試験試料内にＰＣＲの間にエラー（突然変異）を獲得した亜集団が存在する可能性がある。スクリーニング実験のために、可能な限り、トランスポザーゼに意図的に標的化された突然変異のみが含まれることが好ましい。これを達成するために、出発材料をクローニングし、それが意図しない突然変異を有していないことを確認することが必要である。
【０１９２】
[0246]スクリーニング実験のためのクローニングおよびベクター製造に関する実験プロトコールを図１５に概説し、ベクターは依然としてＰＣＲにおいて集合させるが、しかしながらこの場合、ベクターはクローニングおよびシークエンシングされた出発材料から集合させる。出発材料自体は２つの別々の部分を含み、トランスポザーゼ発現シグナル（ｔｅｔ−プロモーターおよびリボソーム結合部位を含む）は残りのベクターとは別々に維持される。これは、ベクターが安定であり、トランスポザーゼ推進性の再配列または不安定性がないことを確実にするためである。２つの異なるベクター成分は小さい程度の配列重なり合いを有し、これによりそれらをＰＣＲにより集合させ、増幅することが可能となる。ＰＣＲは、望ましくない突然変異の出現の可能性を低減させるために、中等度の量の開始鋳型、高忠実度ポリメラーゼおよび少数の増幅サイクルを伴う。
【０１９３】
[0247]検証される出発材料を作製するために、異なる初期試験ベクター（図１５Ａ）のワーキングストックを使用して、図１５Ｂに示す構築物を作製するために必要とされる領域を単離およびクローニングした。１つのプラスミドはＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩプロモーター断片（配列番号６および７における位置１〜１９４から）を有する。２つのプラスミドはＮｃｏＩ−ＸｈｏＩトランスポザーゼ断片を有し、Ｔｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］およびＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］の両方をクローニングした（それぞれ配列番号６における位置１６３〜１６２２、および配列番号７における１６３〜１５６２から）。１つのプラスミドはＸｈｏＩ−ＡｖｒＩＩ移動可能断片（配列番号６における位置１６１７〜２７３４から）を有する。
【０１９４】
[0248]クローニングした領域をシークエンシングしたところ、正しいことが示された。
【０１９５】
実施例７
インプットベクターの構築および実験ベクターの製造
[0249]最終的に２つのインプットベクターが必要とされることがあり（図１５Ｄ以降）、プロモーター領域を有する１つ目は、上記のように作製した（実験６）。
【０１９６】
[0250]突然変異型トランスポザーゼ（Ｔｎ５−Ｔｐｎ［ハイパー］およびＴｎＡａ−Ｔｐｎ［Ｐ４７Ｋ］の両方が含まれる）および完全な移動可能な選択可能な領域（ＵＩＤバーコードを含む）を有する第２の種類のインプットベクターの作製を図１５（Ｂ〜Ｄ）に概説する。
【０１９７】
[0251]最初のステップにおいて、２０ｂｐのランダム配列を含むＵＩＤバーコードを、移動可能領域（図１５においてＳｐｅＩ部位とＡｓｕＩＩ部位との間）を有する以前に配列検証されたプラスミドに挿入する。１０７〜１０８クローンの「バーコード化された、移動可能な、選択可能なライブラリー」がしたがって作製され、各クローンは、異なるバーコードで標識された移動可能領域を有する（図１５Ｃ）。
【０１９８】
[0252]次のステップにおいて、（上記の、以前に配列検証された）トランスポザーゼを突然変異生成およびクローニングに供する（図１５Ｄ）。突然変異生成は、エラープローンＰＣＲ、特異的突然変異生成、これらの組合せおよび／または他の方法のいずれかによる。突然変異生成は、点突然変異、および／または欠失、および／または挿入の作製および／または異なるトランスポザーゼの間の組換えを含むことができる。ランダム突然変異生成の方法論は、トランスポザーゼ内の重要な位置の同定および新たな突然変異の発見に特に適する。部位特異的突然変異生成の方法論は、特定の位置の詳細な研究に適する。特定の位置をスクリーニングする方法の例を図１６に示す。
【０１９９】
[0253]突然変異生成後に、ＤＮＡ断片のサブセットをシークエンシングすることにより突然変異の率および／または種類を決定することができる。突然変異誘発されたトランスポザーゼは次に、バーコード化された、移動可能な、選択可能なライブラリーの適切な部位にクローニングされる（図１５においてＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片として）。公知の数の、異なるクローンの限られたサイズのプールを作製するために、クローニングは厳格に制御される。１０３〜１０８のプールを作製する。クローンのこれらのプールを培養した後、一次ストックとして貯蔵する。
【０２００】
[0254]細胞のワーキングストックを次に作製し、さらなる培養後にプラスミドＤＮＡを培養物から単離する。
【０２０１】
[0255]後にスクリーニングのために使用される突然変異体のプールを表すプラスミドの場合、シークエンシングライブラリーは、ＵＩＤバーコードおよび関連付けられた突然変異体トランスポザーゼを特徴付けできるように作製される。これを達成するための１つの方法は、関連するＤＮＡ断片（図１５においてＮｄｅＩ−ＡｓｕＩＩ制限断片上）を単離した後、ＳＭＲＴｂｅｌｌシークエンシングアダプターを取り付けた後、Ｐａｃｂｉｏシステムを使用してシークエンシングすることである。他のシークエンシング方法もまた役立つ。
【０２０２】
[0256]最終ステップにおいて、形質転換ベクターが作製される。最初に、完全な直鎖状ベクターを作製するために、図１５Ｅに示すように、２つの構成要素を単離する必要がある。簡潔に述べれば、プラスミドＤＮＡを制限酵素で切断して発現領域断片およびトランスポザーゼ−移動可能領域断片（図１５においてそれぞれＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩ断片およびＮｃｏ−ＡｖｒＩＩ断片として）を遊離させ、これらを次にゲル精製により単離する。後者のために選択した特定のプールサイズは、スクリーニングに最終的に含まれる突然変異体の数を決定する。
【０２０３】
[0257]その後、図１５Ｆに示すように、２つの領域を連結し、アセンブリーＰＣＲにより増幅する。このために、ＰＣＲは、混合鋳型として両方の断片、および外側末端のみのためのプライマー（例えば、プライマーペアＴＰＣＲ−２ＲＥＥｃｏ−ＦおよびＴＰＣＲ−１ＲＥＥｃｏ−Ｒ、表Ｄ）を使用して実行される。
【０２０４】
[0258]直鎖状ベクターを作製した後、実施例３および４に記載したように、突然変異体トランスポザーゼおよび移動可能領域を宿主に送達するために使用される環状ベクターが調製される。
【０２０５】
実施例８
突然変異体トランスポザーゼの作製およびスクリーニング
[0259]方法がその全体として意図する使用のために適することを実証するために、図１６に記載されるように、試験トランスポゾン内の限られた数の以前に同定された重要な位置をそれぞれ部位特異的な飽和突然変異生成に供する。次に、代表的な公知の数のクローンが最終ライブラリー中に含まれるような方式で突然変異型トランスポザーゼ試料をプールする。それ以外に、手順は本質的に実験７、３、４および５に記載される通りであるが、限られたスケールであり、限られた数の突然変異体および試料に調整され、十分なＮＧＳ能力を使用し、プールされた挿入部位に対して、最終ステップにおいて、部位および関連付けられたバーコードを同定および計数する。これを達成するために、転位が起こったクローンを単離した後に、以前に記載した方法の１つを使用して、染色体ＤＮＡを精製し、挿入部位を単離し、増幅する。挿入部位断片を次にＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの添加によりシークエンシングのために調製し、次にシークエンシングする。
【０２０６】
[0260]シークエンシング後に、リードをＵＩＤバーコードにより選別し、挿入部位をＥ．ｃｏｌｉ参照配列に対してアライメントする。これにより、各バーコードについて全ての異なる挿入部位を計数した後、挿入部位においてアンカーされて、互いにアライメントすることができる。挿入の両方の末端がシークエンシングされる場合、反復長さを決定することができ、適切なスペーシングを適用することができるか、または挿入部位を長さに従ってビン化し、別々に解析することができる。アライメントを行ったら、（挿入部位に対する）各位置における４つの塩基のそれぞれの比率を決定し、バイアスを決定し、コンセンサスを導出することができ、突然変異体遺伝子型を次にバイアスプロファイルに関連付ける。可能な場合、同一の突然変異（但し、異なるバーコードを有する）を同定し、これらを確認して、類似のバイアスプロファイルが見出されるかどうかを決定する。同じ位置における異なる突然変異を同様に解析する。
【０２０７】
[0261]バイアスの調査に加えて、挿入部位数（転位可能性を反映する）とのトランスポザーゼの活性の相関を調べる。ヌルおよび低活性の突然変異体は、元々のライブラリー中に存在するバーコードにより表されるが、挿入部位コレクション中では表されないので、容易に同定される。活性変化が起こらなかった場合、挿入の数は、非突然変異型の親トランスポザーゼで得られるものと類似する。しかしながら、挿入部位コレクション中で過剰表示されるバーコードは、少なくともこの実験の条件下でより高い活性を示すトランスポザーゼ突然変異体を表す。再び、これに関与する突然変異は、バーコードを突然変異体のライブラリーに対して相互参照することにより同定される。
【０２０８】
実施例９
新規の突然変異体の同定
[0262]新規の突然変異体および重要な位置の同定は、スクリーニングされる突然変異体ライブラリーがランダムまたは半ランダム突然変異生成により生成されること、および多数の突然変異体がスクリーニングされることを必要とする。それ以外に、手順は本質的に実施例７、３、４、５および８に記載される通りであるが、はるかにより大きいスケールであり、最終ステップにおいてディープＮＧＳを使用して挿入部位および関連付けられるバーコードを同定する。
【０２０９】
[0263]典型的なスクリーニング実験は、したがって、１ｘ１０５またはより多くの突然変異体トランスポザーゼのライブラリーを利用し、１ｘ１０７またはより多くの転位事象を目標とすることを伴う。これは、突然変異体の元々のプールのある比率は不活性であるので、調べた突然変異体当たり１００より多くの転位を平均でもたらすはずである。
【０２１０】
[0264]シークエンシング後に、リードをＵＩＤバーコードにより選別し、挿入部位をＥ．ｃｏｌｉ参照配列に対してアライメントし、結果を実施例８に記載されるように解析する。大きい数を伴うことに起因して、より詳細な解析を実行する前に、起こり得るバイアス種の変種を同定するために、情報内容について挿入部位を予備スクリーニングする。
【０２１１】
実施例１０
組換えおよび飽和突然変異生成
[0265]実施例９に記載した解析から、有用な新規の突然変異の位置および種類が得られる。本質的に実施例８に記載したように、これらの新たに同定した位置を部位特異的な飽和突然変異生成およびスクリーニングに供するさらなる実験を次に実行する。このようにして、目的の各位置におけるあらゆる可能な突然変異が調べられる。これらの突然変異体は、個々に、および特異的にまたはランダムに組み換えられて試験される。
【０２１２】
実施例１１
ライブラリー生成
[0266]選択した突然変異体トランスポザーゼをクローニングし、発現させ、精製する。これらの突然変異体トランスポザーゼを次に使用して、タグメンテーションによるＮＧＳライブラリーを作製する。そのようなライブラリーの挿入バイアスを次に評価する。
【０２１３】
実施例１２
バーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）
[0267]本質的に実施例８に記載したように、上記のバーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）の新規の超並列方法を使用する実験を行った。活性亢進Ｔｎ５（配列番号１）を参照トランスポザーゼとして使用した。活性亢進Ｔｎ５におけるものに加えて突然変異を有するいくつもの構築物を作製した。突然変異体トランスポザーゼ領域およびバーコード化された移動可能領域を含むアンプリコンを構築し、環状化させ、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。活性のトランスポザーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムへの移動可能領域の「ジャンプ」を触媒して、カナマイシン耐性コロニーを結果としてもたらした。ゲノムＤＮＡを単離し、ＵＩＤ（バーコード）およびゲノム挿入部位（ジャンプ部位）を含有するゲノムＤＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングレディーライブラリーを調製した。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する前に、ＰａｃＢｉｏを使用してライブラリーをシークエンシングして、バーコードとそれらの関連付けられたトランスポザーゼ配列との関連付けを確立した。また、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する前にライブラリー中のバーコードを、例えばＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングを使用して別々にシークエンシングした。
【０２１４】
実施例１３
バーコードへの遺伝子型の効果的なマッピング
[0268]ＢＡＴＳ実験の解析の１つの実証における全体的な情報フローは３つのステップで機能する：
[0269]１．ロングリードＰａｃＢｉｏシークエンシングランからの遺伝子型バーコードデータＧを処理して、公知の配列を含有する構築物内からバーコードおよび遺伝子型をそれと同時に抽出する。このプロセスを遺伝子型セグメント化と称した。我々はｐｙｔｈｏｎにおいて正規表現を使用して公知の配列を認識し、それにより可変の遺伝子型およびバーコードを単離した。プロセスは反復的最適化であり、遺伝子型セグメント化のための正規表現におけるミスマッチ、挿入または欠失の許容される数を変化させることによりＧとＪ（ジャンプ部位セグメント化から；以下を参照）との間の重なり合うバーコードの数を最適化した。
【０２１５】
[0270]２．ショートリードＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングランからのジャンプ部位データＪを処理して、公知の配列を含有する構築物内からバーコードおよびジャンプ部位（挿入部位）をそれと同時に抽出する。これもまた、反復的なセグメント化プロセスであった。この場合、我々は、公知の配列の構築物内からのセグメント化されたバーコードのみからなる第３のデータセットＢとの重なり合いを使用した。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する前にライブラリーからの切除されたバーコードをシークエンシングすることによりデータセットＢを生成した。Ｒ２から得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ挿入物の長さは１塩基対〜６０塩基対で異なった。モチーフ解析のために、少なくとも２０塩基対のＤＮＡ挿入物のみを使用することができ、カバレージ・サブサンプリング・バイ・ローカス（ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｓｕｂ−ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｂｙ  ｌｏｃｕｓ）アプローチ（ＣＳＳＬ）のために、より短いＤＮＡ挿入物を使用することができ、加えて、全長Ｒ１もまた後者の方法において使用することができる（後に議論する）。
【０２１６】
[0271]３．遺伝子型データの処理。注意点は、ＰａｃＢｉｏにおけるようなロングリードシークエンシングは高度にエラープローンであるということである。我々は専用のポリッシングステップを使用して、ロングリードシークエンシングに特徴的な多量の挿入および欠失を取り除いた。このために、我々は、プログラムｃｌｕｓｔａｌを使用して、予測されるＴｎ５配列とのトランスポザーゼ配列のペアワイズアライメントを使用した。その後、典型的にポリヌクレオチド反復である全ての挿入を欠失させ、全ての欠失を「Ｎ」として補充した。バーコードの長さが２０塩基対となるように制御した。
【０２１７】
[0272]４．遺伝子型バーコードおよびバーコードを介したジャンプデータセットの交差。注意点は、バーコードにおけるシークエンシングエラーは１つまたは複数のデータセットにおいてバーコードを認識不可能なものとし得るという点に存在する。編集距離またはレーベンシュタイン距離のアプローチはバーコードの重なり合いをわずかに改善させたが、バーコードの正確な重なり合いはデータセットＧとＪとのマッピングのために十分であった一方、多数のリードを前提とすれば距離ベースの方法はコンピューターにより実行可能でなかった。バーコード−遺伝子型の関連付けをバーコード−遺伝子型カウントマトリックスＢＧにおいて捕捉した。遺伝子型をジョイントコドン遺伝子型として定義し、これは、記載されるデータセットにおいて単一突然変異のみが標的化されたとしても、バックグラウンド遺伝子型と比較して任意の数の突然変異を有し得る遺伝子型を表すために使用される一般的用語である。ＢＧにおける行はバーコードを表し、列は遺伝子型を表す。遺伝子型のモチーフを定義するために、ＢＧにおける列（遺伝子型を表す）における各非０エントリーを使用して関連するバーコード（行識別子）を抽出した。各バーコードについて、それらのバーコードを有するジャンプデータＪにおける全てのリードを回収し、アライメントされたＤＮＡ配列パイルアップを作製し（２０塩基対）、モチーフを生成した。カバレージサブサンプリングのアプローチのために、バーコード化されたリード識別子を有するセグメント化されたＲ２ジャンプデータのＤＮＡ挿入物から生成されたアライメントされたｂａｍファイルにおけるデータは代わりに横断的であった。バーコードを次にマトリックスＢＧにおいてたどって、遺伝子型を得た。
【０２１８】
[0273]５．注意点は、元々のバーコード多様性における低い複雑性に起因して単一のバーコードが複数の遺伝子型にマッピングされる可能性があるということに存在する。単一の遺伝子型にマッピングされるバーコード（純粋なバーコード）のみを抽出するために、好都合にマトリックスＢＧを使用した。同じ交差ステップ（ステップ４）を次に、純粋なバーコードのみに対して容易に行うことができる。
【０２１９】
実施例１４
モチーフ間距離の解析
[0274]バーコード補助トランスポザーゼスクリーニング（ＢＡＴＳ）の新規の超並列方法は、突然変異体遺伝子型およびその好ましい挿入モチーフの両方に関する豊富な情報を同時に生成する。しかしながら、いくつもの態様は、切断バイアスの解析に適用される伝統的なモチーフベースの方法論を制限する。これらの各制限について、解析論における革新が開発される必要があり、それを以下に記載する。
遺伝子型当たりの少数のジャンプはモチーフ間距離の統計解釈を必要とする
[0275]ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する突然変異体酵素の進化および選択を伴う研究において、ＤＮＡ切断部位の５’末端における組合せ配列モチーフの解析が典型的に強調される。位置重みマトリックスまたは位置頻度マトリックスの形態でのモチーフとしてのそのような部位の解析では、ゲノムカバレージバイアスのための代理としてこの５’バイアスが使用される。これらのマトリックスは次いで、Ｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：６）により記載されたものと類似の方式でバイアスプロットとして可視化することができる。第１の制限は、ＢＡＴＳ実験の超並列的性質に起因して、高い突然変異体ライブラリー多様性が、突然変異体当たりで得られるＤＮＡ挿入部位（ジャンプ部位）の数を制限する可能性があるということである。その結果は、５’バイアスモチーフとしての挿入部位の典型的な解析が、ゲノムへの少なすぎるジャンプ、すなわち、少なすぎるサンプリング事象の結果として、ヒトの目で区別するにはあまりに困難となるということである。異なるアプローチは、リードの数を組み込んだモチーフエントロピーを使用することである。しかしながら、異なるアプローチがＢＡＴＳ実験のために本明細書において提案され、これは、以下に記載されるように、適切な統計解釈と共に、モチーフ間のネットワーク距離のアプローチを使用する。
【０２２０】
[0276]我々の研究において２つのトランスポザーゼのモチーフ間の距離は、ゲノムへのトランスポザーゼ突然変異体のジャンプの配列リードの位置頻度マトリックスから算出した。最初に、参照トランスポザーゼと試験トランスポザーゼとの間の位置１に「Ｃ」を有するリードの比率における絶対差分を算出する（図１７）。この算出を位置２〜２０について繰り返し、リード中の全２０の位置にわたる絶対差分を足し合わせる。類似の算出をヌクレオチド「Ｔ」、「Ａ」および「Ｇ」について行う。全２０の位置における４つ全てのヌクレオチドについての絶対差分を足し合わせ、２０で割ることにより位置当たりの平均差異を得る。この差異を距離またはモチーフ間距離と呼ぶ。
【０２２１】
[0277]モチーフ間距離は、比較における２つのモチーフのそれぞれにおける配列の数に依存するので、直接的に解釈することができない。我々は、シミュレートされたデータセットの補間と連結させて、算出された距離、および２つのモチーフのそれぞれにおけるリードの数（以下に記載される）を前提として、ｐ値についての平滑化ルックアップを提供するブートストラップ法を開発した。モチーフ間距離の確率プロットとして本明細書において定義されるブートストラップの結果を図１８に示し、これは、両方のモチーフにおける配列の数が距離に対して有する効果を実証する。
【０２２２】
[0278]ｐ値を調べるために使用されるこの累積分布関数は確率密度関数から得られ、確率密度関数は、ランダムなバックグラウンドサンプリングにより経験的に生成された。実験のために、バックグラウンドゲノムをｋ−ｍｅｒ（本出願において２０塩基対）としてランダムにサンプリングし、各回にａおよびｂ配列と共に２つのパイルアップを収集し、プロセスを多くの回数繰り返し、各回においてａおよびｂと共に距離を保存した。その後に、距離をビンｄにビン化し、データを値ａ、ｂおよびｄおよびｃを用いて表に変換し、ｄは距離のビン、ｃはビンｄにおいて距離が観察された回数である。その後、カウントを確率ｐ、およびその後に累積的確率に変換した。例えば、０．９５より大きい距離スコア値を有意として解釈してもよい。
【０２２３】
[0279]このアプローチにおける主要な注意点は、これもまた任意の所与の距離尺度をとることができる簡便なルックアップ機能を用いて、シミュレートされたデータを密にサンプリングされたデータセットに変換することであった。得られる距離の大きいダイナミックレンジに起因して、サンプリングは、より低い配列カウントａおよびｂに向かって密度を増した。おおよそのｐ値のルックアップを可能とするために十分に密であるサンプリングはしかしながら、コンピューターによる処理が困難であった。我々は代わりに、ｐｙｔｈｏｎ  ｓｃｉｐｙライブラリーにおける補間パッケージを使用して所与のａおよびｂ（ａ  ａｎ  ｂ）において距離−確率ドメインにわたり補間を行って、真のサンプリング値の間のより多くのデータポイントを生成した。これは、関連するｐ値を正確に得るために必要とされる必要とされるサンプリング密度を我々に提供した。次に、補間を再び使用して、ａ、ｂおよびｄをインプットとして用いてシミュレートされたデータのフィッティングを行って、ｐ値ｐへの容易なアクセスを可能とし、これは、数千のモチーフを伴う全対全の比較統計を可能とするために十分に迅速である。
【０２２４】
[0280]実施例１２に記載したＢＡＴＳ実験の開始部位バイアスを位置頻度マトリックスの点で算出し、図１９に例示されるようにバイアスプロットを生成した。モチーフ間の距離を算出し、結果を表Ｅに示す。
【０２２５】
[0281]これらのデータは、位置Ｅ１４６、Ｗ１２５およびＧ２５１における突然変異は、参照トランスポザーゼ活性亢進Ｔｎ５の挿入部位モチーフとは有意に異なる挿入部位モチーフを結果としてもたらすことを示す。
【０２２６】
[0282]
【０２２７】
【表５】
2020534803.tif 000007
[0283]ジャンプ部位バイアスを図で示す別の方法は、配列ロゴをプロットすることによる。各トランスポザーゼについてジャンプ部位ヌクレオチド配列バイアスを決定するために、ウェブサイト「ＷｅｂＬｏｇｏ３」（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｔｈｒｅｅｐｌｕｓｏｎｅ．ｃｏｍ／；Ｃｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４：１１８８〜１１９０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：６０９７〜６１００）を使用して、変種配列ロゴを生成した。各変種について各々のジャンプ部位を含有する複数の６０塩基対配列をこの目的のためにアライメントした。配列ロゴを図２０に示す。ヌクレオチド文字を含有する山の全体的な高さはその位置における配列保存を指し示し、山内のヌクレオチド文字の高さはその位置における各々のヌクレオチドの相対頻度を指し示す。この解析は、トランスポザーゼ変種−ＤＮＡ相互作用にとって重要なある特定のヌクレオチド位置および組成の重要性を強調する。しかしながら、バックグラウンドノイズに寄与するものから重要なヌクレオチド位置を分離するために、十分なジャンプ配列の検査が必要とされる。これは、より多く（１７７より多い）配列から構築された全ての他の変種におけるこのバックグラウンドシグナルの非存在と対照的に変種Ｅ１４６Ｃについて８６の配列から生成されたモチーフにおいて観察された低い全体的なバックグラウンドシグナルにより明確に示される（表Ｆを参照）。
【０２２８】
実施例１５
ＢＡＴＳ実験からのデータのモチーフ間距離解析に対する代替としてのカバレージ・サブサンプリング・バイ・ロシ
[0284]別の制限は、精製されたＤＮＡのタグメンテーションの形態でのライブラリー調製の状況におけるように、５’−モチーフはカバレージバイアスの本質を十分に捕捉しない可能性があるということである。ライブラリー調製プロトコールにおける重要な目標は、標的化されるゲノムまたはトランスクリプトームの均一で完全なカバレージを得ることであり、５’バイアスは、ゲノムカバレージと単に部分的に関係付けられるもの、または単に審美的特徴に過ぎないとして見られ得る。また、単一の位置重みマトリックスとして、または単一の位置頻度マトリックスとしてのモチーフの表示は、平均化された結合強度関連のプロファイルを本質的に捕捉し、潜在的に可変の（１つまたは複数の）距離における隣接する塩基の結合尤度を十分に利用しない。マルコフモデルまたはニューラルネットワークのようなより複雑なモデルの使用は、より多くのリードを本質的に必要とし、モデルの順序と共に強くスケール変更して、限られたデータにおいて差異を検出するためのそれらの有用性をより低くする。ゲノムにわたるカバレージの点で結果を直接的に解釈できることが理想的である。数千の突然変異体が潜在的に並列でスクリーニングされ得るＢＡＴＳのような高度に多重化された実験においてゲノムにわたるカバレージは十分でないという事実は、低い配列リード数からのカバレージの直接的な標的化を効果的に除外して、モチーフ解析の代理の使用を結果としてもたらす。しかしながら、この方法の開示において、我々は、ＢＡＴＳ実験からのジャンプのゲノム遺伝子座を使用することにより比較用ゲノムカバレージが実際にアクセス可能であることを示す。
【０２２９】
[0285]カバレージ・サブサンプリング・バイ・ロシ（Ｃｏｖｅｒａｇｅ  Ｓｕｂ−Ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｌｏｃｉ；ＣＳＳＬ）は、適切な参照ゲノムへのトランスポザーゼジャンプ部位のシークエンシングされたゲノムＤＮＡ挿入物を最初にマッピングすることにより機能し、参照カバレージ分布として働く十分なカバレージを有する参照データセットＲの予測されるカバレージにゲノム遺伝子座を関連付ける。我々は、同じゲノム座標を使用することにより分布Ｒから目的の試料データセットＳを効果的にサンプリングする。効果的に、ゲノム遺伝子座は、参照遺伝子型Ｒからのデータを目的の試料遺伝子型Ｓにマッピングさせるための合理的な関連付けを作製する。参照遺伝子型Ｒは、例えば、通常のライブラリー調製実験、または市販の酵素を用いるタグメンテーションを使用するライブラリー調製においてタグメンテーションにおいて適用される野生型形態のＴｎ５トランスポザーゼであり得る一方、試料遺伝子型Ｓは、ＢＡＴＳまたは関連する実験における部位特異的突然変異生成またはランダム突然変異生成を起源とする突然変異体遺伝子型を指すことがある。各試料遺伝子型について、試料分布Ｓは、ゲノム遺伝子座を介して参照分布Ｒからサンプリングされ、その後に２つの分布ＲおよびＳは、統計的検定、例えば、１）平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、２）異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、３）他のパラメトリックまたはノンパラメトリック検定、４）形状差異の目視検査、５）パーセンタイルベースのメトリクス、例えば、親分布における平均カバレージの２５％未満においてサンプリングされた遺伝子座のパーセンテージ、または形状の差異を検出するための任意の他の方法を使用して比較される。このようにして、参照Ｒより良好にそれらの遺伝子座にアクセスできるまたはバックグラウンドＢトランスポザーゼがアクセスできる突然変異体が選択され得る。
【０２３０】
[0286]方法における追加の柔軟性は、試料Ｓが互いに比較されてもよいということである。例えば、突然変異体試料Ｓ１は、Ｓ１が元々突然変異している野生型またはバックグラウンド遺伝子型Ｂに対して比較されてもよく、野生型またはバックグラウンド遺伝子型Ｂについての分布もまた、参照Ｒを使用してＣＳＳＬにより得られる。
【０２３１】
[0287]一例として、実施例１２におけるものと同じＢＡＴＳ実験からのデータに対してＣＳＳＬ解析を行い、結果を図２１および図２２に指し示す。この実験において、参照遺伝子型Ｂは、参照データセットＢを結果としてもたらす活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼである。試料データセットＳは、活性亢進Ｔｎ５におけるものに加えて突然変異をそれぞれ有するＴｎ５突然変異体に由来する。統計的検定をＢとのＳの比較に対して行い、マン−ホイットニー検定およびコルモゴロフ−スミルノフ検定の両方についての結果として得られたｐ値を表Ｆに指し示す。図２１におけるデータは、２つの突然変異体、Ｗ１２５ＧおよびＧ２５１Ａ、ならびに参照活性亢進Ｔｎ５についてのデータを示す。２つのトランスポザーゼ突然変異体と関連付けられる移動可能エレメントは、活性亢進Ｔｎ５で生成される参照データセットＢでより低いカバレージを示す傾向があるゲノム中の遺伝子座に挿入された。参照トランスポザーゼＲ、またはバックグラウンドトランスポザーゼＢの低いカバレージを有する領域における向上したカバレージは、例えば、以下に記載するように、変種コーリングにおいて有益である。図２１および図２２におけるデータは、単に可視化の目的で、３つの３データポイントの平均の算出およびプロットにより平滑化した。
【０２３２】
[0288]同様に、突然変異Ｅ１４６Ａ、Ｅ１４６Ｃ、Ｅ１４６ＮおよびＥ１４６ＳについてのデータのＣＳＳＬ解析の結果を図２２に示す。Ｔｎ５の位置Ｅ１４６における特定の突然変異は、参照トランスポザーゼにより十分にカバーされたゲノム中の遺伝子座におけるゲノムへの優先的な挿入を結果としてもたらすことが図２２から明らかである。そのため、位置Ｅ１４６におけるこれらの突然変異はバイアスの増加を有する。これは、突然変異体の間のバイアスの差異およびこれがどのようにゲノムの低カバレージ領域対高カバレージ領域への挿入についてのトランスポザーゼ突然変異体の選好性に関連するかの決定におけるこの方法の有用性をさらに説明する。
【０２３３】
[0289]
【０２３４】
【表６】
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[0290]低カバレージ領域は、典型的に、変種コーラーについての証拠の欠如に起因して、ＳＮＰおよびインデルのような偽の変種コールの原因である。反対に、ゲノムにおける反復に起因して等しいマッピング品質を有する複数の位置を有するリードの不正確なアライメントもまた、そのような領域中の過度のカバレージの領域と相関して、アライメント由来のエラーの導入に起因する偽の変種コールを結果としてもたらし得る。そのような状況において、カバレージサブサンプリングは、高カバレージ領域中のカバレージの欠如を伴う突然変異体の選択に適する。サブサンプリングはまた、例えば、生物学的コード領域などの目的の領域のような最も関連する領域、変種コーリングについての標的遺伝子座のリスト、または任意の他の遺伝子座特異的な基準に制限される可能性がある。
【０２３５】
[0291]それゆえ、大きい数の遺伝子型を用いる超並列ＢＡＴＳ実験の間に得られるより低いリード数であっても、ゲノムカバレージは、モチーフ解析のための要件なしにアクセスされ得る。別の形態のＣＳＳＬにおいて、分布Ｒ、ＳおよびＢは、ＧＣ含量、より高次元のｋ−ｍｅｒ頻度、または遺伝子座の関数としての公知のＤＮＡ修飾パターンのような選択された記述的特徴に変換され得る。ゲノムレベルでのＧＣバイアスの点でライブラリー調製技術を比較することが一般的慣習である。ＣＳＳＬは、ＢＡＴＳ実験の間にＧＣ非バイアスの酵素について選択するための効果的な方法を提供する。
【０２３６】
[0292]Ｔｎ５トランスポザーゼ突然変異体が変化したＧＣバイアスを示すかどうかを確立する目的で、上記のＢＡＴＳ実験からのデータを解析した。参照トランスポザーゼ（活性亢進Ｔｎ５）および突然変異体についてのジャンプ部位（挿入部位）を参照ゲノムにマッピングし、１００ｂｐウインドウのＧＣ含量を算出した。図２３および図２４は、標的ＤＮＡのＧＣ含量の関数としての所与のトランスポザーゼの挿入の確率のプロットである。図２３は、２つの突然変異体および参照活性亢進Ｔｎ５についてのジャンプ部位データを示す。２つの突然変異体、Ｐ２１４Ｓ（配列番号２３）およびＧ２５１Ａ（配列番号２４）は、参照トランスポザーゼよりもより低いＧＣ含量について有意に増加した選好性を有する（ｐ値について表Ｇを参照）。Ｔｎ５突然変異体Ｇ２５１Ａが低ＧＣ遺伝子座について増加した挿入選好性を有することは、同じ突然変異体が図２１に指し示されるように低カバレージの遺伝子座である遺伝子座において挿入について増加した確率を有することの機序である可能性がある。
【０２３７】
[0293]図２４は、３つのＴｎ５突然変異体からのジャンプ部位データを示す。これらの３つの突然変異体、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６ＡおよびＥ１４５Ｓは、参照トランスポザーゼと比較して高ＧＣ遺伝子座への挿入のより高い確率を有する。平均および曲線形状における差異についてのそれぞれマン−ホイットニー検定およびコルモゴロフ検定を行い、ｐ値を表Ｇに指し示す。
【０２３８】
[0294]
【０２３９】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月14日(2020.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のトランスポザーゼをスクリーニングする方法であって、
（ａ）第１の末端配列を含む第１のオリゴヌクレオチドの転位を誘導するのに十分な条件下で、第１のトランスポザーゼを第１の核酸試料と接触させ、それにより、前記第１の末端配列の第１の複数の挿入部位を有する第１の転位した核酸試料を生成するステップ；
（ｂ）第２の末端配列を含む第２のオリゴヌクレオチドの転位を誘導するのに十分な条件下で、第２のトランスポザーゼを第２の核酸試料と接触させ、それにより、第２の複数の挿入部位を有する第２の転位した核酸試料を生成するステップであって、前記第２のトランスポザーゼが、少なくとも１つのアミノ酸により前記第１のトランスポザーゼとは異なるアミノ酸配列を有する、ステップ；
（ｃ）前記第１の転位した核酸試料の前記第１の複数の挿入部位の少なくとも一部分をシークエンシングし、それにより、シークエンシングリードの第１のセットを生成するステップであって、シークエンシングリードの前記第１のセットのそれぞれが、前記第１の末端配列の前記挿入部位の１つを含む、ステップ；
（ｄ）前記第２の転位した核酸試料の前記第２の複数の挿入部位の少なくとも一部分をシークエンシングし、それにより、シークエンシングリードの第２のセットを生成するステップであって、シークエンシングリードの前記第２のセットのそれぞれが、前記第２の末端配列の前記挿入部位の１つを含む、ステップ；
（ｅ）シークエンシングリードの前記第１のセットをシークエンシングリードの前記第２のセットと比較するステップ；および
（ｆ）比較するステップ（ｅ）に基づいて前記第２のトランスポザーゼが前記第１のトランスポザーゼとは有意に異なる確率を割り当てるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
比較するステップ（ｅ）が、
シークエンシングリードの前記第１のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を算出し、それにより、頻度値の第１のセットを生成するステップ；
シークエンシングリードの前記第２のセットについて各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基の頻度を算出し、それにより、頻度値の第２のセットを生成するステップ；
各ヌクレオチド位置における各可能なヌクレオチド塩基について頻度値の前記第１のセットと頻度値の前記第２のセットとの絶対差分を算出し、それにより、絶対差分値のセットを生成するステップ；および
前記絶対差分値のそれぞれを平均し、それにより、モチーフ間距離を決定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
割り当てるステップ（ｆ）が、
シミュレートされたランダムな配列リードにより定義されるモチーフ間距離の確率プロットを生成するステップ；および
ステップ（ｅ）において決定された前記モチーフ間距離および前記モチーフ間距離の確率プロットのそれぞれに基づいて、前記第２のトランスポザーゼが前記第１のトランスポザーゼとは有意に異なる確率の値を割り当てるステップ
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
比較するステップ（ｅ）が、
前記第１の転位した核酸試料中の前記第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第１のシークエンシング深さを算出するステップ；
前記第２の転位した核酸試料中の前記第２の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料内の定義された長さのセグメントにおけるカバレージの第２のシークエンシング深さを算出するステップ；および
カバレージの前記第１のシークエンシング深さをカバレージの前記第２のシークエンシング深さと比較するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
割り当てるステップ（ｆ）が、
平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、形状差異の目視検査、およびパーセンタイルベースのメトリクス算出のうちの少なくとも１つを行うステップ
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
比較するステップ（ｅ）が、
前記第１の転位した核酸試料中の前記第１の複数の挿入部位に対応する位置における第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第１のＧＣ含量比率を算出するステップ；
前記第２の転位した核酸試料中の前記第２の挿入部位に対応する位置における前記第１の参照核酸試料中の定義された長さの核酸セグメントについての第２のＧＣ含量比率を算出するステップ；および
前記第１のＧＣ含量比率と前記第２のＧＣ含量比率との差異を同定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
割り当てるステップ（ｆ）が、
平均の差異についてのマン−ホイットニー検定、異なる分布形状についてのコルモゴロフ−スミルノフ検定、パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、形状差異の目視検査、およびパーセンタイルベースのメトリクス算出のうちの少なくとも１つを行うステップ
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のトランスポザーゼは前記第１のトランスポザーゼと比較して、一つまたはそれ以上の変異を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
挿入バイアスが異なったトランスポザーズを見いだすための請求項８に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
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